(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
フェノール類（Ａ）と、β−１，３グリコシル糖化合物（Ｂ）とを、β−１，３グルカナーゼ活性を有する酵素剤（Ｃ）の存在下で反応させるフェノール系配糖体の製造方法であって、β−１，３グルカナーゼ活性を有する酵素剤（Ｃ）が、ストレプトマイセスｓｐＤＩＣ−１０８菌株（微工研条寄第２５３号）から得られる糖転移酵素、キタラーゼ又はドリセラーゼであることを特徴とするフェノール系配糖体の製造方法。
【請求項２】
β−１，３グリコシル糖化合物（Ｂ）が、β−１，３グルコシル多糖又はβ−１，３グルコシルオリゴ糖である請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
フェノール類（Ａ）が、下記の一般式（Ｉ）
【化１】
0003796810.tif 000003
（式中、Ｘは水素原子、水酸基又はニトロ基を表す。）で示される化合物である請求項１又は２に記載の製造方法。
【請求項４】
フェノール類（Ａ）が、ハイドロキノン、又はｐ−ニトロフェノールである請求項１又は２に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、抗酸化剤、抗菌剤、酵素活性測定試薬などに有用な、フェノール系配糖体の製造方法に関する。更に詳しくは、β−１，３グルカナーゼ活性を有する酵素剤を利用した糖転移反応により、フェノール類からフェノール系配糖体を製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来フェノール系配糖体は自然界に少量ではあるが広く存在し、また優れた生理活性を有するにも関わらず低毒性であることから、食品、医薬品、化粧品など様々な分野での利用が期待されてきた。
【０００３】
例えば、ウワウルシやコケモモなどの植物に含有されるハイドロキノン−β−Ｄ−グルコピラノシド（アルブチン）は、利尿作用をはじめ、抗酸化作用（Biosci. Biotech. Biochem. 56巻、1658〜1659頁、1992年）、メラニン色素抑制作用（Proc. Jpn. Soc. Invest. Dermatol. 12巻、138〜139頁、1988年）などを有することが知られている。
【０００４】
また、カテコール、レゾルシノールの配糖体が皮膚色素沈着症の予防および治療に有効で、皮膚外用剤の成分として利用できること（特開平４−１１１５号公報）や、頭皮のフケの発生を防止し、頭髪に潤いとしなやかさを与える顕著な作用効果を有することから頭髪化粧料の成分として利用できること（特開平４−５２１８号公報）も知られている。
【０００５】
ハイドロキノン配糖体、カテコール配糖体、レゾルシノール配糖体などが種々の薬理あるいは生理活性を有する優れた物質であることは前述したとおりであるが、その活性はこれらフェノール系配糖体中の非糖部分、即ち、フェノール類部分が担っていることも知られている。
【０００６】
しかし、フェノール類自体に毒性があったり、反応性に富むために不安定であったり、水に対する溶解度が低く扱いにくい等の様々な問題点があり、フェノール類を食品、医薬品、化粧品などとして使用する際に不都合があり、これらを無毒化、安定化、水溶化のなされた配糖体の形で用いることが望まれていた。
【０００７】
フェノール系配糖体は、自然界に存在する物質であることから、該配糖体を得る方法として、植物などから抽出する方法が考えられているが、含量が低い上に夾雑物が多く、必要量の精製品を得るのは非常に困難である。
【０００８】
化学合成によってフェノール系配糖体を作ることも可能であるが、構造選択的に合成する為には、水酸基の保護、脱保護などといった煩雑な操作を必要とし、反応工程が多段階におよぶだけでなく、なお立体異性体の混入は避けられず、目的物の分離精製が非常に困難なものとなる。
【０００９】
また酵素による製造方法、具体的にはβ−グルコシダーゼを用いる方法としては、特開平５−１７６７８５号公報に、更にセルラーゼを用いる方法は、特開平６−２８４８９７号公報に開示されている。しかし、いずれもアルブチンの反応収率が極めて低い（各特許の実施例から計算した値は、前者で約１．５％、後者で約０．０５％）という欠点があった。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明が解決しようとする課題は、β−１，３グルカナーゼ活性を有する酵素剤を用いて、抗酸化剤、抗菌剤、酵素活性測定試薬などに有用な、β型フェノール系配糖体を収率よく製造する製造方法を提供することにある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、フェノール類と、β−１，３グルコシル化合物とを、β−１，３グルカナーゼ活性を有する酵素剤の存在下で反応させることにより、フェノール系配糖体を収率良く製造できることを見いだし、本発明を完成するに至った。
【００１２】
即ち、本発明は、フェノール類（Ａ）と、β−１，３グリコシル糖化合物（Ｂ）とを、β−１，３グルカナーゼ活性を有する酵素剤（Ｃ）の存在下で反応させるフェノール系配糖体の製造方法である。
【００１３】
本発明の製造方法は、特に、β−１，３グリコシル糖化合物（Ｂ）が、β−１，３グルコシル多糖又はβ−１，３グルコシルオリゴ糖であることを特徴とする製造方法や、β−１，３グルカナーゼ活性を有する酵素剤（Ｃ）が、ストレプトマイセスｓｐＤＩＣ−１０８菌株（微工研条寄第２５３号）から得られる糖転移酵素、キタラーゼ又はドリセラーゼであることを特徴とする製造方法や、
【００１４】
特にフェノール類（Ａ）が、下記の一般式（Ｉ）
【００１５】
【化２】
0003796810.tif 000002
【００１６】
（式中、Ｘは水素原子、水酸基又はニトロ基を表す。）
で示される化合物であることを特徴とする製造方法や、またはフェノール類（Ａ）が、ハイドロキノン、又はｐ−ニトロフェノールであることを特徴とする製造方法を含むものである。
【００１７】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に用いるフェノール類（Ａ）としては、フェノール、ハイドロキノン、カテコール、レゾルシノール、ニトロフェノール、２−クロロ−４−ニトロフェノールなどが例示され、好ましくはハイドロキノン、ｐ−ニトロフェノールが挙げられる。
【００１８】
β−１，３グリコシル糖化合物（Ｂ）としては、カードラン、パキマン、パラミロン、シゾフィラン、ラミナラン、酵母細胞壁、ラミナリオリゴ糖などが例示され、好ましくはカードラン、ラミナリオリゴ糖が挙げられる。
【００１９】
本発明に使用するβ−１，３グルカナーゼ活性を有する酵素剤（Ｃ）は、それ自体公知であるが、該酵素がフェノール類（Ａ）に対して糖転移活性を示すことは知られていなかった。
【００２０】
この種の酵素剤（Ｃ）としては、ストレプトマイセスｓｐＤＩＣ−１０８菌株（微工研条寄第２５３号）から得られる糖転移酵素であるＳＧＴａｓｅ、キタラーゼ（和光純薬工業株式会社）や、ドリセラーゼ（協和発酵工業株式会社）が例示される。
【００２１】
これらの酵素剤（Ｃ）は、そのまま用いてもよいし、固定化あるいは修飾して用いてもよい。ストレプトマイセスｓｐＤＩＣ−１０８菌株（微工研条寄第２５３号）から得られるＳＧＴａｓｅの製造方法、精製方法、特徴に関しては特公平４−３７７１９号公報に記載されているが、以下にその概略を示す。
【００２２】
ＳＧＴａｓｅは、ストレプトマイセスｓｐＤＩＣ−１０８菌株を振盪培養、通気培養等で、ｐＨ５．０〜８．０、培養温度２０〜５０℃で１〜６日培養した培養液中に生産される。その作用は、β−１，３グリコシル糖化合物（例えばカードラン、ラミナラン、パキマン、酵母細胞壁など）及びその部分分解物を加水分解し、ビオース、トリオースを主成分とするオリゴ糖を生成する。
【００２３】
更に、その際、適当な受容体（例えば多糖、オリゴ糖、配糖体など）が存在すると、生成したオリゴ糖をβ−１，３グリコシド結合を介して受容体に転移させる。その作用温度は１０〜７０℃で、至適温度は４０〜６０℃である。また作用ｐＨは４．０〜８．５で、至適ｐＨは５．０〜７．０である。ＳＤＳ−ＰＡＧＥから求められる分子量は約３．４万である。
【００２４】
酵素剤（Ｃ）は、β−１，３グリコシル糖化合物（Ｂ）を加水分解し、種々のフェノール類（Ａ）に糖転移させ、フェノール系配糖体を生成させる。
本発明によるフェノール系配糖体の製造方法は、より具体的には、以下に示すような操作で行なわれる。
【００２５】
反応容器、例えば、ねじ口ビンや三角フラスコ中で、フェノール類（Ａ）と、β−１，３グリコシル糖化合物（Ｂ）とを反応溶媒に混和させ、酵素剤（Ｃ）を作用させる。用いるフェノール類（Ａ）は、反応溶媒に対して５０重量／容量％以下、好ましくは０．１〜３０重量／容量％混和させる。
【００２６】
β−１，３グリコシル糖化合物（Ｂ）は、反応溶媒に対して５０重量／容量％以下、好ましくは０．１〜３０重量／容量％混和させる。酵素剤（Ｃ）は、反応溶媒に対して、５０重量／容量％以下、好ましくは０．１〜３０重量／容量％を用いる。これらの原料は、必ずしも反応溶媒に完全溶解している必要はないが、溶解している方が好ましい。
【００２７】
反応溶媒は、水もしくは緩衝液でよいが、これに水溶性有機溶媒を加えてもよい。水溶性有機溶媒の例としては、例えば、メタノール、エタノール、プロパノールなどの炭素数１〜３のアルコール、アセトン、アセトニトリル、ジメチルホルムアミドなどが挙げられ、好ましくは炭素数１〜３のアルコール、アセトニトリルが挙げられる。
【００２８】
反応溶媒に占める水溶性有機溶媒の割合は、０〜８０容量／容量％、好ましくは０〜６０容量／容量％である。緩衝液の種類については特に限定されるものではないが、例えば酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、コハク酸緩衝液、トリス緩衝液などを用いることができ、好ましくは酢酸緩衝液である。
【００２９】
緩衝液のｐＨは３〜８の範囲内に設定できるが、用いる酵素剤の至適ｐＨに調整するのが望ましい。上述の反応液を１０〜７０℃、好ましくは４０〜６０℃の温度条件下で適当時間振盪する。通常１〜２日間で反応の進行は止まる。
反応終了後、生成フェノール系配糖体を精製する場合は、一般的な方法を適宜利用して行なうことができ、精製方法は特に限定されない。
【００３０】
例えば、活性炭クロマトグラフィーや逆相クロマトグラフィー（例えば固定相がＯＤＳで移動相がアセトニトリル水溶液）などにより反応液から分取することができる。
【００３１】
【実施例】
以下に実施例を挙げ、本発明を更に詳細に説明するが、本発明は元よりこれらに限定されるものではない。
【００３２】
（実施例１）  ハイドロキノンからのフェノール系配糖体の製造例
１重量／容量％のハイドロキノンと、５重量／容量％のラミナリペンタオースとを含む２０ｍＭの酢酸緩衝液ｐＨ５．０に、１重量／容量％のドリセラーゼを加え、この混合液を５０℃で振盪することにより反応させた。
【００３３】
２時間後、反応液を高速液体クロマトグラフィー（以下ＨＰＬＣと略す）分析に付し、フェノール系配糖体の生成を確認した（図１）。ＨＰＬＣ分析には昭和電工株式会社製ＮＨ２Ｐカラムを用い、カラム温度４０℃、溶離液７３容量／容量％アセトニトリル水溶液、流速０．７ｍｌ／ｍｉｎ、検出ＵＶ２８０ｎｍで行った。図１中の横軸は溶離時間（分）を縦軸は２８０ｎｍでの吸光度を表わす。
【００３４】
検出されたピークの内、図１中に矢印で示したピークを分取し、これをＮＭＲによる構造解析に供した。その結果、ハイドロキノン−β−Ｄ−グルコピラノシド（アルブチン）と同定した。アルブチンのハイドロキノンに対するモル収率は約４．９％であった。
【００３５】
（実施例２）  ｐ−ニトロフェノールからのフェノール系配糖体の製造例１
１重量／容量％のｐ−ニトロフェノールと、４重量／容量％のラミナリペンタオースを含む２０ｍＭの酢酸緩衝液ｐＨ５．０に、０．４重量／容量％のＳＧＴａｓｅを加え、この混合液を５０℃で振盪・反応させた。２時間後、反応液をＨＰＬＣ分析に付し、フェノール系配糖体の生成を確認した（図２）。図２中の横軸は溶離時間（分）を、縦軸は３００ｎｍでの吸光度を表わす。
【００３６】
ＨＰＬＣ分析には、ジーエルサイエンス株式会社製のＯＤＳ−２カラムを使用し、カラム温度４０℃、溶離液２０容量／容量％アセトニトリル水溶液、流速０．７ｍｌ／ｍｉｎ、検出ＵＶ３００ｎｍとした。図２中の矢印で示したピークを分取し、ＮＭＲで解析した結果、これをｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシドと同定した。
【００３７】
（実施例３）ｐ−ニトロフェノールからのフェノール系配糖体の製造例２
１重量／容量％のｐ−ニトロフェノールと、４重量／容量％のラミナリペンタオースとを含む２０ｍＭの酢酸緩衝液ｐＨ５．０に、０．４重量／容量％のキタラーゼを加え、この混合液を５０℃で振盪・反応させた。２時間後、反応液をＨＰＬＣ分析に付し、フェノール系配糖体の生成を確認した（図３）。
【００３８】
ＨＰＬＣ分析は、ジーエルサイエンス株式会社製のＯＤＳ−２カラムを使用し、カラム温度４０℃、溶離液２０容量／容量％アセトニトリル水溶液、流速０．７ｍｌ／ｍｉｎ、検出ＵＶ３００ｎｍで行った。図３中の横軸は溶離時間（分）を縦軸は３００ｎｍでの吸光度を表わす。図３中に矢印で示したピークを分取し、ＮＭＲで解析した結果、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシドと同定した。該配糖体の収率は約０．５％であった。また、ｐ−ニトロフェノールのオリゴ糖配糖体の生成も確認され、これらを併せた収率は約５．９％であった。
【００３９】
【発明の効果】
本発明は、β−１，３グルカナーゼ活性を有する酵素剤を用いて、抗酸化剤、抗菌剤、酵素活性測定試薬などに有用な、β型フェノール系配糖体を収率よく製造する製造方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１で得られた、アルブチンを含む酵素反応終了液のＨＰＬＣ分析結果である。横軸は溶離時間（分）を、縦軸は２８０ｎｍでの吸光度を表わす。
【図２】図２は、実施例２で得られた、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシドを含む酵素反応終了液のＨＰＬＣ分析結果である。横軸は溶離時間（分）を、縦軸は３００ｎｍでの吸光度を表わす。
【図３】図３は、実施例３で得られた、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシドを含む酵素反応終了液のＨＰＬＣ分析結果である。横軸は溶離時間（分）を、縦軸は３００ｎｍでの吸光度を表わす。
【図１】
0003796810.tif 000004
【図２】
0003796810.tif 000005
【図３】
0003796810.tif 000006