(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の酵素化学的性質を有するキチナーゼＣ−１又はキチナーゼＣ−３。
Ａ．キチナーゼＣ−１
（１）キチンに作用し、キチンを可溶性のＮ−アセチルキトオリゴ糖にまで加水分解する。
（２）至適 pH ：40℃で7.8−8.2
（３）至適温度：pH8.0で50℃
（４）pH安定性：40℃で5.5−9.0で安定
（５）熱安定性：pH8.0で50℃で一時間の処理に安定
（６）分子量：約69000（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法）
（７）等電点：3.6
Ｂ．キチナーゼＣ−３
（１）キチンに作用し、キチンを可溶性のＮ−アセチルキトオリゴ糖にまで加水分解する。
（２）至適 pH ：40℃で7.8−8.2
（３）至適温度：pH8.0で50℃
（４）pH安定性：40℃で5.5−9.0で安定
（５）熱安定性：pH8.0で50℃で一時間の処理に安定
（６）分子量：約81000（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法）
（７）等電点：3.9
【請求項２】
請求項１記載のキチナーゼＣ−１又はキチナーゼＣ−３の製造方法であって、ビブリオ属に属し、該キチナーゼＣ−１又はキチナーゼＣ−３産生能を有する微生物を培養し、その培養物からキチナーゼＣ−１又はキチナーゼＣ−３を採取することを特徴とする前記方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、ビブリオ属に属する微生物によって生産される新規キチナーゼＣ−１およびキチナーゼＣ−３に関するものである。本発明の酵素は、種々の用途に利用されるキチンを効率的に分解するので、キチンの有効利用を図る上で、極めて重要である。
【０００２】
【従来の技術】
キチンは、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンが多数β−（1,４）−結合した多糖であり、自然界に幅広く分布している。キチナーゼは、キチンを加水分解し、Ｎ−アセチルキトオリゴ糖を経て、Ｎ−アセチルキトビオースにまで分解する。キチナーゼ（ＥＣ３・２・１・14）は、微生物界に幅広く分布し、ストレプトマイセス属微生物を中心に研究が行われている。一方、ビブリオ属微生物が生成するキチナーゼに関する研究は、内田ら（発酵工学  第57巻  第３号 131-140 1979)によって最初に報告されている。さらに、最近、高橋ら（J. Ferment. Bioeng. Vol-75 457-459 1993)によっても報告されている。
【０００３】
しかしながら、上記キチナーゼは、キチナーゼ活性及び熱安定性の点で満足できるものではなかった。すなわち、これらの酵素の活性は、いずれもタンパク質１mg当たり10ユニット未満であり、熱安定性においても、50℃で１時間以上安定性を保持することはできなかった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、高いキチナーゼ活性を有し、かつ高い熱安定を有する新規なキチナーゼを提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、上記課題を解決すべく、海洋性細菌由来のキチナーゼの探索を行った結果、ビブリオ属に属するＨ−８株が、高いキチナーゼ活性を有し、かつ熱安定性にも優れる新規なキチナーゼを産生することを見出し、本発明を完成した。
【０００６】
即ち、本発明は、下記の酵素化学的性質を有するキチナーゼＣ−１又はキチナーゼＣ−３である。
Ａ．キチナーゼＣ−１
（１）キチンに作用し、キチンを可溶性のＮ−アセチルキトオリゴ糖にまで加水分解する。
（２）至適 pH ：40℃で7.８−8.２
（３）至適温度：pH8.０で50℃
（４）pH安定性：40℃で5.５−9.０で安定
（５）熱安定性：pH8.０で50℃で一時間の処理に安定
（６）分子量：約69000（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法）
（７）等電点：3.６
Ｂ．キチナーゼＣ−３
（１）キチンに作用し、キチンを可溶性のＮ−アセチルキトオリゴ糖にまで加水分解する。
（２）至適 pH ：40℃で7.８−8.２
（３）至適温度：pH8.０で50℃
（４）pH安定性：40℃で5.５−9.０で安定
（５）熱安定性：pH8.０で50℃で一時間の処理に安定
（６）分子量：約81000（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法）
（７）等電点：3.９
また、本発明は、ビブリオ属に属し、キチナーゼＣ−１またはキチナーゼＣ−３産生能を有する微生物を培養し、その培養物からキチナーゼＣ−１またはキチナーゼＣ−３を採取することを特徴とするキチナーゼＣ−１またはキチナーゼＣ−３の製造方法である。
【０００７】
以下、本発明を詳細に説明する。
Ｈ−８株は、静岡県浜名湖にて採取した底泥より分離された。
Ｈ−８株の菌学的性質は下記に示すが、培地は、マリンアガー（Bacto Marine Agar 2216)(Difco 社製）あるいはマリンブロス（Bacto Marine Broth 2216)(Difco社製）を用いた。これらの培地に本菌株を植菌し30℃で24から48時間培養し、光学顕微鏡及び透過型電子顕微鏡を用いて形態観察を行った。また、本菌株は、塩化ナトリウムを要求することから、生化学的性状の試験は75％人工海水を用いて培地を作成するか、あるいは培地中に３％塩化ナトリウムを添加することによって行った。
0003820418.tif 000002
【０００８】
0003820418.tif 000003
【０００９】
0003820418.tif 000004
【００１０】
0003820418.tif 000005
【００１１】
0003820418.tif 000006
【００１２】
0003820418.tif 000007
0003820418.tif 000008
以上の菌学的性質からバージーズ・マニュアル・オブ・デターミネイティブ・バクテリオロジー第８版の分類基準に従って公知の菌株と比較した結果、グラム陰性桿菌で、極毛性の鞭毛を有し、通性嫌気性、またＯＦテストで発酵性であり、好塩性で発光性をもたず、オキシダーゼ陽性、ＧＣ含量が４５．８％である等の理由から本菌株は、ビブリオ属に所属すると考えられた。そして、本菌株は、ビブリオｓｐ．Ｈ−８株として工業技術院生命工学技術研究所に寄託番号FERM P-14737として寄託されている（寄託日：平成７年１月19日）。
【００１３】
キチナーゼＣ−１及びキチナーゼＣ−３は、ビブリオ属に属するキチナーゼ生産菌を培地で培養し、培養物から得ることができる。キチナーゼ生産菌としては、ビブリオ属に属し、キチナーゼＣ−１及びキチナーゼＣ−３を産生するものであれば、いずれの菌株でも用いることができる。また、これら微生物の人工的変異方法、例えば紫外線照射、Ｘ線照射、変異誘起剤処理など、あるいは自然発生による変異株、また遺伝子操作、細胞融合による変異株でもキチナーゼＣ−１又はキチナーゼＣ−３を生産するものであればいずれも本発明に用いることができる。このようなキチナーゼ生産能を有する菌株を選定するには、菌株の培養物を取り出し、そのキチナーゼ活性を測定することにより行うことができる。キチナーゼ生産株のうち、代表的な株としては、ビブリオｓｐ．Ｈ−８株（FERM P-14737) を挙げることができる。
【００１４】
本発明の微生物の培養には微生物の培養に一般的に用いられる培養方法を用いることができる。培地としては資化可能な炭素源、窒素源、無機物および必要な生育、生産促進物質を程よく含有する培地であれば合成培地、天然培地いずれでも使用可能である。本酵素は、誘導酵素のため炭素源として、キチン又はキチンオリゴ糖を用いることが必須である。また、そのほかに炭素源としてグルコース、澱粉、デキストリン、麦芽糖、マンノース、フラクトース、シュークロース、アラビノース、マンニトール、糖蜜などを単独または組み合わせて用いられる。更に、菌の資化能によっては炭化水素、アルコール類、有機酸なども用いられる。窒素源としては塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、尿素、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、乾燥酵母、コーン・スチーブ・リカー、大豆粉、カザミノ酸などが単独または組み合わせて用いられる。そのほか、食塩、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、炭酸カルシウム、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、硫酸第一鉄、塩化カルシウム、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、硫酸銅などの無機塩類や海水を必要に応じて加える。更に使用菌の生育やキチナーゼの生産を促進する微量成分を適当に添加することができる。
【００１５】
培養法としては、一般の培養方法が用いられるが、液体培養法、とくに深部攪拌培養法がもっとも適している。培養温度は16〜60℃、特に30〜42℃が適当であり、培養中の培地のpHはアンモニア水や炭酸アンモニウム溶液、塩酸溶液などを添加して、６〜11、特に７〜９に維持することが望ましい。液体培養で通常６〜96時間培養をおこなうと、目的物質のキチナーゼＣ−１及びキチナーゼＣ−３が菌体外に生成される。培養物中の生成量が最大に達したときに培養を停止する。
【００１６】
培養物からキチナーゼＣ−１及びキチナーゼＣ−３の分離、精製は、酵素をその培養物から単離精製するために常用される方法に従っておこなわれる。例えば培養物を濾過により培養濾液と菌体に分け、培養ろ液を硫酸アンモニウム等を用い、塩析によって沈澱物を得る。この沈澱物を溶解、透析、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー等の手順で精製することができる。
【００１７】
以上の手順で生成されたキチナーゼＣ−１は、以下の酵素化学的性質を有している。
（１）キチンに作用し、キチンを可溶性のＮ−アセチルキトオリゴ糖にまで加水分解する。
（２）至適 pH ：40℃で7.８−8.２
（３）至適温度：pH8.０で50℃
（４）pH安定性：40℃で5.５−9.０で安定
（５）熱安定性：pH8.０で50℃で一時間の処理に安定
（６）分子量：約69000（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法）
（７）等電点：3.６
キチナーゼＣ−３は、以下の酵素化学的性質を有している。
（１）キチンに作用し、キチンを可溶性のＮ−アセチルキトオリゴ糖にまで加水分解する。
（２）至適 pH ：40℃で7.８−8.２
（３）至適温度：pH8.０で50℃
（４）pH安定性：40℃で5.５−9.０で安定
（５）熱安定性：pH8.０で50℃で一時間の処理に安定
（６）分子量：約81000（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法）
（７）等電点：3.９
以上の酵素化学的性質及び後述の酵素活性について、本発明のキチナーゼと公知のキチナーゼとを比較したところ、50℃で１時間以上安定である点、及び、酵素活性がタンパク質１mg当たり、10ユニット以上である点で、公知のキチナーゼと明らかに相違する。そこで、キチナーゼＣ−１及びキチナーゼＣ−３を新規酵素と認定した。
【００１８】
本発明の酵素の用途としては、例えばカビのプロトプラスト化のための試薬または、Ｎアセチルキトビオースの製造のために用いることができる。
【００１９】
【実施例】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
［実施例１］
キチン粉末５g/L 、ペプトン５g/L 、酵母エキス１g/L 、グルコース５g/L 、りん酸第二鉄0.01g/L 、天然海水1000mlの組成を有する前培養培地（殺菌前 pH 7.５) 30mlを300ml フラスコに加え、ビブリオｓｐ．Ｈ−８株を種菌として植菌し、37℃、24時間培養した。このようにして得られた前培養液を 100Ｌ容量の発酵槽中の上記組成と同一組成の培地30Ｌに５％v/v の割合で植菌し、40℃で通気攪拌方式（回転数100rpm, 通気量0.7vvm) により18時間培養を行った。この際、pHは7.８になるように調整しながら培養した。
［実施例２］
実施例１で得られた培養液30Ｌを1000rpm で遠心分離し、培養上清を得た。上清を硫酸アンモニウムで塩析し（80％飽和）、沈澱物をろ過後、20mM 酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.０）２Ｌに懸濁し、再び濾過後、そのろ液を粗酵素液とした。次に、50ＦＴ-Ｃ-110透析チューブ（三光純薬製) に上記粗酵素を入れ、20mM酢酸ナトリウム緩衝液40Ｌを透析液として透析を行った。透析した酵素懸濁液をＤＥＡＥトヨパール ＨＷ-55(東ソー社製) を用いて、キチナーゼ活性画分の分画を行った。このＤＥＡＥトヨパールＨＷ-55 による分画を２回行うことで、精製キチナーゼＣ−１を140mg 及び精製キチナーゼＣ−３を120mg 得ることができた。
［実施例３］
キチナーゼＣ−１及びキチナーゼＣ−３の活性の測定には、シャーレの変法（Agr. Biol. Chem. Vol 35, No.7, 1154-1156, 1971) を用いた。なお、キチナーゼ１ユニットは、１分間に１μmol のＮ−アセチルグルコサミンを遊離する活性を有する量とする。
【００２０】
上記方法に従って、キチナーゼＣ−１及びキチナーゼＣ３の活性を測定した。その結果、タンパク質１mgあたり、キチナーゼＣ−１の活性は、11.5ユニットまた、キチナーゼＣ−３の活性は、10.8ユニットであった。
【００２１】
【発明の効果】
本発明は、高活性で、かつ、熱安定性に優れる新規なキチナーゼを提供する。