(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：２６、２８、４５、５２および５４から成る群より選択されるアミノ酸配列を含む、精製されたタンパク質。
【請求項２】
配列番号：２６、２８および４５から成る群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の精製されたタンパク質。
【請求項３】
（ａ）配列番号：２６、２８、４５、５２および５４から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｂ）１個ないし数個の保存的アミノ酸置換により、（ａ）に規定されるアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を含むタンパク質であって、ここで該タンパク質は対応する（ａ）のタンパク質と実質的に同一の活性を有する、前記タンパク質；
（ｃ）配列番号：２５、２７、４４、５１および５３から成る群より選択される核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質；および
（ｄ）配列番号：２５、２７、４４、５１および５３から成る群より選択される核酸配列の相補配列に高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質であって、ここで該タンパク質は対応する（ｃ）のタンパク質と実質的に同一の活性を有する、前記タンパク質；
から成る群より選択される、精製されたタンパク質。
【請求項４】
（ａ）のアミノ酸配列が、配列番号：２６、２８および４５から成る群より選択され、そして、（ｃ）及び（ｄ）の核酸配列が配列番号：２５、２７および４４から成る群より選択される、請求項３に記載の精製されたタンパク質。
【請求項５】
請求項１または２に記載のタンパク質をコードしている単離された核酸分子。
【請求項６】
配列番号：２５、２７、４４、５１および５３からなる群より選択される配列を含む、単離された核酸分子。
【請求項７】
配列番号：２５、２７および４４からなる群より選択される配列を含む、請求項６に記載の単離された核酸分子。
【請求項８】
（ａ）配列番号：２５、２７、４４、５１および５３からなる群より選択される配列からなる核酸；および
（ｂ）配列番号：２５、２７、４４、５１および５３からなる群より選択される核酸配列の相補配列と、高ストリンジェンシー条件下においてハイブリダイズし、かつ、対応する（ａ）の核酸がコードするタンパク質と実質的に同一のトランスアシラーゼ活性を有するタンパク質をコードする核酸；
からなる群より選択される、単離された核酸分子。
【請求項９】
（ａ）および（ｂ）の核酸配列が、配列番号：２５、２７および４４から成る群より選択される、請求項８に記載の単離された核酸分子。
【請求項１０】
請求項５ないし９のいずれか１項に記載の核酸分子によってコードされるトランスアシラーゼ。
【請求項１１】
請求項１ないし４のいずれか１項に記載のタンパク質または請求項１０に記載のトランスアシラーゼに結合する抗体または抗体フラグメント。
【請求項１２】
抗体が単クローン性抗体である、請求項１１記載の抗体または抗体フラグメント。
【請求項１３】
請求項１ないし４いずれか１項に記載のタンパク質または請求項１０に記載のトランスアシラーゼに結合する抗体フラグメントであって、該抗体フラグメントがＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）2もしくはＦｖフラグメントまたはその組み合わせである、前記抗体フラグメント。
【請求項１４】
請求項５ないし９のいずれか１項に記載の核酸分子に機能的に連結したプロモーター配列を含む、組換え体核酸分子。
【請求項１５】
請求項１４に記載の組換え体核酸分子を用いて形質転換された細胞。
【請求項１６】
請求項１４に記載の組換え体核酸分子を含み、植物、細菌、昆虫、真菌および非ヒト哺乳動物から成る群より選択される、トランスジェニック生物。
【請求項１７】
核酸配列を識別する方法であって、以下：
（ａ）該核酸配列を配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、４４、４９、５１、５３、５５および５７から成る群より選択される配列に相補的なヌクレオチドの少なくとも３０個連続したヌクレオチドに、高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズさせ；そして
（ｂ）トランスアシラーゼをコードするものとして該核酸配列を識別する；
または、
（ａ’）該核酸配列を配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、４４、４９、５１、５３、５５および５７から成る群より選択される配列の少なくとも３０個連続したヌクレオチドに、高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズさせ；そして
（ｂ’）トランスアシラーゼをコードする核酸に相補的なものとして該核酸配列を識別する；
ことを含む、前記方法。
【請求項１８】
（ａ）および（ａ’）に記載の配列が配列番号：２５、２７、４４、５１および５３からなる群より選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
（ａ）および（ａ’）に記載の配列が配列番号：２５、２７および４４からなる群より選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
該核酸配列をハイブリダイズさせることを超高ストリンジェンシー条件下で行う、請求項１７ないし１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
工程（ａ）または（ａ’）がＰＣＲ反応中に達せられる、請求項１７ないし２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
工程（ａ）または（ａ’）がライブラリースクリーニング中に達せられる、請求項１７ないし２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
核酸配列をイチイ（Ｔａｘｕｓ）属から単離する、請求項１７ないし２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
パクリタキセル生合成経路における第二中間体を合成する方法であって：
請求項１０に記載のトランスアシラーゼまたは請求項１ないし４のいずれか１項に記載のタンパク質であるトランスアシラーゼの少なくとも一つと第一中間体を接触させ；そして
トランスアシラーゼによりアシル基を第一中間体に転移させるが、このときアシル基の転移は、パクリタキセル生合成経路における第二中間体を生じさせるものである；
ことを含む、前記方法。
【請求項２５】
トランスアシラーゼをトランスジェニック非ヒト生物中で発現させ、第二中間体の合成がｉｎ  ｖｉｖｏで達せられる、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
アシル基をタキソイドに転移させる方法であって：
請求項１０に記載のトランスアシラーゼまたは請求項１ないし４のいずれか１項に記載のタンパク質であるトランスアシラーゼの少なくとも一つとタキソイドを接触させ；そして
トランスアシラーゼによりアシル基をタキソイドに転移させる；
ことを含む、前記方法。
【請求項２７】
アシル基をタキソイドに転移させる方法であって：
（ａ）配列番号２８に示されるアミノ酸配列を有するトランスアシラーゼ、および
（ｂ）配列番号１または配列番号２７の配列に相補的なヌクレオチドの少なくとも３０個連続したヌクレオチドに、高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるトランスアシラーゼであって、（ａ）のトランスアシラーゼと実質的に同一の活性を有する、トランスアシラーゼ、
から成る群より選択されるトランスアシラーゼと５−ヒドロキシル基を含むタキソイドを接触させ；そして
トランスアシラーゼによりアシル基をタキソイドの５位に転移させる；
ことを含む、前記方法。
【請求項２８】
アシル基をタキソイドに転移させる方法であって：
（ａ）配列番号２６に示されるアミノ酸配列を有するトランスアシラーゼ、および
（ｂ）配列番号３または配列番号２５の配列に相補的なヌクレオチドの少なくとも３０個連続したヌクレオチドに、高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるトランスアシラーゼであって、（ａ）のトランスアシラーゼと実質的に同一の活性を有する、トランスアシラーゼ、
から成る群より選択されるトランスアシラーゼと２−ヒドロキシル基を含むタキソイドを接触させ；そして
トランスアシラーゼによりアシル基をタキソイドの２位に転移させる；
ことを含む、前記方法。
【請求項２９】
アシル基をタキソイドに転移させる方法であって：
（ａ）配列番号４５に示されるアミノ酸配列を有するトランスアシラーゼ、および
（ｂ）配列番号１１または配列番号４４の配列に相補的なヌクレオチドの少なくとも３０個連続したヌクレオチドに、高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるトランスアシラーゼであって、（ａ）のトランスアシラーゼと実質的に同一の活性を有する、トランスアシラーゼ、
から成る群より選択されるトランスアシラーゼと１０−ヒドロキシル基を含むタキソイドを接触させ；そして
トランスアシラーゼによりアシル基をタキソイドの１０位に転移させる；
ことを含む、前記方法。
【請求項３０】
トランスアシラーゼをトランスジェニック非ヒト生物中で発現させ、タキソイドの合成がｉｎ  ｖｉｖｏで達せられる、請求項２７ないし２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
タキソイドが、タキサ−４（２０），１１（１２）−ジエン−５α−オールである、請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
タキソイドが、２−デベンゾイルタキサンである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
タキソイドが、１０−デアセチルバッカチンＩＩＩである、請求項２９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
＜発明の分野＞
本発明は、トランスアシラーゼ酵素、および TaxolTMおよび関連タキソイド（taxoids）を製造するためのこのような酵素の使用方法に関する。
【０００２】
＜政府援助の承認＞
本発明は、National Cancer Institute Grant CA−55254号に基づいて政府援助を得た。当政府は、本発明に当然の権利を有する。
【０００３】
＜序論＞
複合ジテルペノイド タキソール（TaxolTM）（paclitaxel；パクリタキセル）（Wani et al., J.Am.Chem.Soc. 93:2325-2327,1971）は、卵巣癌および乳癌を含めた広範囲の癌に対して優れた活性を有する強力な抗有糸分裂薬である（Arbuck and Blaylock, TaxolTM: Science and Applications, CRC Press, Boca Raton, 397-415,1995; Holmes et al., ACS Symposium Series 583:31-57,1995）。TaxolTMは、最初、タイヘイヨウイチイ（Pacific yew）（タクサス・ブレビフォリア（Taxus brevifolia））の樹皮から単離された。何年もの間、TaxolTMは、もっぱらイチイ樹皮から得られていたが、収穫物の破壊的性質に関連した天然源からの化合物の低収率が、新規な TaxolTM製造法を開発させた。TaxolTMは、現在、様々なイチイ（Taxus）種の針状葉（再生可能な供給源）中に存在する前進したタキサン（taxane）代謝産物からの半合成によって主に製造されている（Holton et al., TaxolTM: Science and Applications, CRC Press, Boca Raton, 97-121,1995）。しかしながら、この薬物への増加した需要ゆえに（癌介入経過中の初期の使用および新規な治療用途両方のための）（Goldspiel, Pharmacotherapy 17:110S-125S,1997）、利用可能性および費用は、相変わらず重要な問題である。TaxolTMの完全な化学合成は、経済的に実行可能ではない。したがって、この薬物およびその直接の前駆体の生物学的製造はなお、予見可能な将来のために選択される方法であろう。このような生物学的製造は、自然のままの Taxus 植物か、Taxus 細胞培養物（Ketchum et al., Biotechnol.Bioeng. 62:97-105,1999）かまたは、潜在的可能性として、微生物系（Stierle et al., J.Nat.Prod. 58:1315-1324,1995）に頼ることがありうる。いずれの場合にも、Taxol の生物学的生産収率を改善することは、生合成経路、反応の順序、特に、律速段階を触媒する酵素、およびこれらタンパク質をコードしている遺伝子の詳細な理解に依る。この経路に関与する酵素をコードしている遺伝子の単離は、生産性生物におけるこれら遺伝子の過発現が、薬物の収率を顕著に改善すると考えられうることから、特に重要な目的である。
【０００４】
TaxolTM生合成経路は、12を越える異なった工程を必要とすると考えられるが（Floss and Mocek, Taxol: Science and Applications, CRC Press, Boca Raton, 191-208,1995; および Croteau et al., Curr.Top.Plant Physiol. 15:94-104,1996）、しかしながら、この複雑な経路の酵素反応および中間体が規定されているものは極めて少ない。TaxolTM経路の最初に委ねられる酵素は、共通の前駆体ゲラニルゲラニル二リン酸（Hefner et al., Arch.Biochem.Biophys. 360:62-74,1998）をタキサジエンへと環化するタキサジエンシンターゼ（Koepp et al., J.Biol.Chem. 270:8686-8690,1995）である（図1）。環化した中間体は、引き続き、少なくとも8回の酸素化工程、脱水素、オキセタンへのエポキシド転位、および数回のアシル化を行う修飾を受ける（Floss and Mocek, TaxolTM: Science and Applications, CRC Press, Boca Raton, 191-208,1995; Croteau et al., Curr.Top.Plant Physiol. 15:94-104,1996）。タキサジエンシンターゼは、T．brevifolia から単離され且つ特性決定され（Hezari et al., Arch.Biochem.Biophys. 322:437-444,1995）、作用機構が決定され（Lin et al., Biochemistry 35:2968-2977,1996）、そして該当するcDNAクローンが単離され且つ発現されている（Wildung and Croteau, J.Biol.Chem. 271:9201-9204,1996）。
【０００５】
TaxolTM生合成の第二の具体的な工程は、タキサジエン−5α−ヒドロキシラーゼによって触媒される酸素化である（図1）。シトクロムP450として特性決定される酵素は、Taxus ミクロソーム標品中において、二重結合転位を伴うタキサ−4（5），11（12）−ジエンのタキサ−4（20），11（12）−ジエン−5α−オールへの立体特異的ヒドロキシル化を触媒することが示されている（Hefner et al., Chem.Biol. 3:479-489,1996）。
【０００６】
TaxolTM生合成の第三の具体的な工程は、得られた酢酸エステルが、更に効率よく酸素化されて、チトクロムP450反応に最適化されたミクロソーム標品中の一連の前進したポリヒドロキシル化 TaxolTM代謝産物になることから（図1）、アセチルCoA依存性トランスアセチラーゼによるタキサ−4（20），11（12）−ジエン−5α−オールの酢酸タキサ−4（20），11（12）−ジエン−5α−イルへのアセチル化であると考えられる（Walker et al., Arch.Biochem.Biophys. 364:273-279,1999）。この酵素は、誘導されたイチイ細胞培養物（タクサス・カナデンシス（Taxus canadensis）およびタクサス・クスピデタ（Taxus cuspidata））から単離されており、操作上可溶性の酵素は、陰イオン交換、疎水的相互作用、および固定化補酵素A樹脂上のアフィニティークロマトグラフィーの組合せによって部分精製された。このアセチルトランスアシラーゼは、それぞれ4．7および9．0のpIおよびpH最適条件、およびゲル浸透クロマトグラフィーによって決定される約50，000の分子量を有する。この酵素は、タキサジエノールおよびアセチルCoAそれぞれについて4．2μMおよび5．5μMのKm値を有する補基質に高選択性および高親和性を示す。この酵素は、より前進した TaxolTM前駆体である10−デアセチルバッカチンIIIまたはバッカチンIIIをアセチル化することはない。このアセチルトランスアシラーゼは、一価および二価の金属イオンに感受性ではなく、チオールに支配される試薬によって弱く阻害されるだけであり、そして概して、他のO−アセチルトランスアシラーゼの性質と同様の性質を示す。Taxus からのこのアセチルCoA：タキサジエン−5α−オールO−アセチルトランスアシラーゼ（Walker et al., Arch.Biochem.Biophys. 364:273-279,1999）は、タクサス・キネンシス（Taxus chinensis）から最近単離され且つ記載されたアセチルCoA：10−ヒドロキシタキサンO−アセチルトランスアシラーゼ（Menhard and Zenk, Phytochemistry 50:763-774,1999）とは、寸法、基質選択性および速度論が実質的に異なると考えられる。
【０００７】
TaxolTM生合成の最初のアシル化工程を触媒するアセチルCoA：タキサ−4（20），11（12）−ジエン−5α−オールO−アセチルトランスアシラーゼをコードしている遺伝子および他のアシル転移工程をコードしている遺伝子の獲得は、遺伝子操作および in vitro 合成によって TaxolTM収率を増加させる努力において重要な前進であると考えられる。
【０００８】
＜発明の要旨＞
本発明は、12種類のアンプリコン（ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を用いて1対のプライマーによって増幅されるDNAの領域）の発見に由来する。これらアンプリコンは、トランスアシラーゼ、例えば、配列番号：25、27、44、49、51、53、55および57に示される核酸配列によってコードされる配列番号：26、28、45、50、52、54、56および58に示されるトランスアシラーゼを決定するのに用いることができる。これら配列は、Taxus 属から単離され、それぞれのトランスアシラーゼは、TaxolTMおよび関連タキソイド、更には、TaxolTM生合成経路内の中間体の合成製造に有用である。これら配列は、引き続きの in vitro 使用のためのトランスアシラーゼを生じるかまたは、トランスジェニック生物中の TaxolTMおよびタキソイドの生産レベルを変化させるようにトランスアシラーゼを in vivo で生じるトランスジェニック生物の生成に用いることもできる。
【０００９】
本発明のもう一つの側面は、配列番号：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21および23に示される核酸配列、および配列番号：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22および24にそれぞれ示される該当するアミノ酸配列、更には、この核酸配列およびアミノ酸配列のフラグメントを提供する。これら配列は、完全長さトランスアシラーゼに該当する核酸配列およびアミノ酸配列を単離するのに有用である。これらアミノ酸配列および核酸配列は、該当するトランスアシラーゼを認識する特異的結合物質を生じるのにも有用である。
【００１０】
したがって、本発明のもう一つの側面は、開示された配列とは異なるアミノ酸配列および核酸配列を有するトランスアシラーゼおよびトランスアシラーゼのフラグメントの識別を規定する。例えば、本発明は、一つまたはそれ以上の保存的アミノ酸置換によって異なる、またはトランスアシラーゼ活性を維持しながら、与えられたアミノ酸配列と少なくとも50％配列同一性を有するトランスアシラーゼアミノ酸配列を提供する。
【００１１】
トランスアシラーゼおよびトランスアシラーゼのフラグメントをコードしている核酸配列は、標準的な分子生物学技術を用いてベクター中にクローン化することができる。次に、これらベクターを用いて、宿主細胞を形質転換することができる。したがって、宿主細胞は、増加したレベルのトランスアシラーゼかまたは低下したレベルのトランスアシラーゼを発現するように変更することができる。
【００１２】
本発明のもう一つの側面は、完全長さトランスアシラーゼをコードしている核酸配列を単離する方法を提供する。これら方法は、配列番号：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、44、49、51、53、55および57に示される核酸配列のいずれかの少なくとも10個連続したヌクレオチドを、第二核酸配列であってトランスアシラーゼをコードする第二核酸配列にハイブリッド形成させることを含む。この方法は、例えば、ノーザンブロット、サザンブロットおよびポリメラーゼ連鎖反応（PCR）の場合に行うことができる。したがって、本発明は、更に、この方法によって識別されるトランスアシラーゼを提供する。
【００１３】
本発明のなおもう一つの側面は、少なくとも一つのタキソイドに少なくとも一つのアシル基を加える方法を含む。これら方法は、in vivo または in vitro で行うことができるし、TaxolTM生合成経路の各種中間体にアシル基を加えるのに、および必ずしも TaxolTM生合成経路中ではない関連タキソイドにアシル基を加えるのに用いることができる。
【００１４】
＜詳細な記述＞
I．定義；
哺乳動物：この用語は、ヒトおよび非ヒト哺乳動物両方を含む。同様に、“患者”という用語は、ヒトおよび獣医学的対象両方を含む。
【００１５】
タキソイド：“タキソイド”は、Kinston et al., Progress in the Chemistry of Organic Natural Products, Springer-Verlag, 1993 に記載のタキサン（Taxane）環構造に基づく化学物質である。
【００１６】
単離された：“単離された”生体成分（核酸またはタンパク質または細胞小器官など）は、その成分が天然に存在する生物の細胞中の他の生体成分、すなわち、他の染色体および染色体外DNA、RNA、タンパク質および細胞小器官から実質的に分離されたまたは精製された成分である。“単離された”核酸およびタンパク質には、標準的な精製法によって精製された核酸およびタンパク質が含まれる。この用語は、宿主細胞中の組換え発現によって製造された核酸およびタンパク質、更には、化学合成された核酸も含む。
【００１７】
オルソログ：“オルソログ（ortholog）”は、異なった種に由来する遺伝子と同様である機能を示すタンパク質をコードする遺伝子である。
同族体：“同族体”は、共通の先祖配列を有し、その先祖配列を有する種が二つの種に分離する場合に分かれた二つのヌクレオチド配列である。
【００１８】
精製された：“精製された”という用語は、絶対純度を必要とするのではなく、むしろ、相対的用語とされる。したがって、例えば、精製された酵素または核酸標品は、対象のタンパク質またはヌクレオチドがそれぞれ、ある生物中のその天然の環境にそのタンパク質またはヌクレオチドがあるよりも高濃度であるものである。例えば、酵素の標品は、その標品中の酵素含量が、標品中の全タンパク質含量の少なくとも50％である場合に精製されたと見なすことができる。
【００１９】
ベクター：“ベクター”は、宿主細胞中に導入され、それによって形質転換された宿主細胞を生じる核酸分子である。ベクターには、複製起点のような核酸配列が含まれうるが、これは、宿主細胞中でベクターを複製させる。ベクターには、1種類またはそれ以上のスクリーニング可能マーカー、選択可能マーカーまたはレポーター遺伝子および当該技術分野において知られている他の遺伝要素も含まれうる。
【００２０】
形質転換された：“形質転換された”細胞は、分子生物学技術によって核酸が導入された細胞である。本明細書中で用いられる“トランスフォーメーション”という用語は、ウイルスベクターを用いたトランスフェクション、プラスミドベクターを用いた形質転換、およびエレクトロポレーション、リポフェクションおよびパーティクルガン加速による裸のDNAの導入を含めた、このような細胞中に核酸分子を導入しうる全ての技術を包含する。
【００２１】
DNA構築物：“DNA構築物”という用語は、cDNA、ゲノムDNA、合成DNAまたはRNA起源の核酸分子を全て含む意味である。“構築物”という用語は、一本鎖または二本鎖であってよく、しかも本発明のトランスアシラーゼ遺伝子の一つまたはそれ以上をコードしている完全なまたは部分的な天然に存在するヌクレオチド配列に基づいていてよい核酸セグメントを示す意味である。このようなヌクレオチド配列が、意図的に操作された、例えば、部位特異的突然変異誘発を施されたヌクレオチド配列、および遺伝コードの結果として縮重している配列を含むこということは理解される。縮重ヌクレオチド配列は全て、そのヌクレオチド配列によってコードされるトランスアシラーゼが下記のトランスアシラーゼ活性を維持している限りにおいて、本発明の範囲内に含まれる。
【００２２】
組換え体：“組換え体”核酸は、それが発現される生物中に天然に存在しない配列を有するものであり、または二つの、それ以外の場合には分離したより短い配列の人為的組合せによって製造される配列を有する。この人為的組合せは、しばしば、化学合成によって、またはより一般的には、単離された核酸セグメントの人為的操作によって、例えば、遺伝子操作技術によって行われる。“組換え体”は、人為的に操作されているが、遺伝子が単離された生物中で見出される同様の制御配列およびコーディング領域を含有する核酸を記載するのにも用いられる。
【００２３】
特異的結合物質：“特異的結合物質”は、本発明のトランスアシラーゼに特異的に結合することができる物質であり、これには、多クローン性抗体、単クローン性抗体（ヒト化単クローン性抗体を含めた）、およびFab、F（ab’）2およびFvフラグメントのような単クローン性抗体フラグメント、更には、タンパク質上のエピトープに特異的に結合することができる任意の他の物質が含まれうる。
【００２４】
cDNA（相補的DNA）：“cDNA”は、転写を決定する内部非コーディングセグメント（イントロン）および調節配列を欠いた1本のDNAである。cDNAは、細胞から抽出されるメッセンジャーRNAからの逆転写によって実験室で合成される。
【００２５】
ORF（読み取り枠）：“ORF”は、終止コドンを全く含まないアミノ酸をコードする一連のヌクレオチドトリプレット（コドン）である。これら配列は、通常は、それぞれのポリペプチド中に翻訳可能である。
【００２６】
機能的に結合した：第一核酸配列は、その第一配列が第二核酸配列と機能的関係にある場合は常に、第二核酸配列と“機能的に結合”している。例えば、プロモーターは、そのプロモーターがコーディング配列の転写または発現に影響を与える場合、そのコーディング配列に機能的に結合している。概して、機能的に結合したDNA配列は連続していて、しかも二つのタンパク質コーディング領域を連結することが必要な場合、同じ読み枠中にある。
【００２７】
プローブおよびプライマー：核酸のプローブおよびプライマーは、本発明によって提供されるアミノ酸配列および核酸配列に基づいて容易に製造することができる。“プローブ”は、検出可能な標識またはレポーター分子に結合した単離された核酸を含む。典型的な標識には、放射性同位体、リガンド、化学発光物質および酵素が含まれる。標識の方法および種々の目的に適した標識選択の指針は、例えば、Sambrook et al.(eds.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd ed., vols.1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, および Ausubel et al.(eds.) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York（定期改訂を含む）,1987 に論じられている。
【００２８】
“プライマー”は、短い核酸、好ましくは、10ヌクレオチド長さまたはそれ以上のDNAオリゴヌクレオチドである。プライマーは、相補的な標的DNA鎖に核酸ハイブリダイゼーションによってアニーリングして、プライマーと標的DNA鎖との間にハイブリッドを形成後、DNAポリメラーゼ酵素によって標的DNA鎖に沿って伸長することができる。プライマー対は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）または当該技術分野において知られている他の核酸増幅法によって核酸配列の増幅に用いることができる。
【００２９】
プローブおよびプライマーを製造し且つ使用する方法は、例えば、Sambrook et al.(eds.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd ed., vols.1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989; Ausubel et al.(eds.) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York（定期改訂を含む）,1987; および Innis et al., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press: San Diego, 1990 のような参考文献に記載されている。PCRプライマー対は、既知の配列から、例えば、Primer（Version 0．5，（著作権）1991, Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge, MA）のようなその目的に予定される計算機プログラムを用いることによって誘導することができる。当業者は、特定のプローブおよびプライマーの特異性が、そのプローブまたはプライマーの長さと共に増加するということを理解するであろう。したがって、例えば、20個連続したヌクレオチドを含むプライマーは、15ヌクレオチドだけの対応するプライマーより高い特異性を有する標的にアニーリングするであろう。したがって、より高い特異性を得るためには、例えば、10個、20個、25個、30個、35個、40個、50個またはそれ以上連続したヌクレオチドを含むプローブおよびプライマーを選択することができる。
【００３０】
配列同一性：二つの核酸配列間のまたは二つのアミノ酸配列間の類似性は、それら配列間で共有する配列同一性のレベルによって表される。配列同一性は、典型的には、同一性百分率によって表され、その百分率が高いほど、二つの配列は一層類似している。
【００３１】
比較のために配列を整列する方法は、当該技術分野において周知である。種々のプログラムおよび整列アルゴリズムは、Smith & Waterman, Adv.Appl.Math. 2:482,181; Needleman & Wunsch, J.Mol.Biol. 48:443,1970; Pearson & Lipman, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 85:2444,1988; Higgins & Sharp, Gene 73:237-244,1988; Higgins & Sharp, CABIOS 5:151-153,1989; Corpet et al., Nucl.Acids Res. 16:10881-10890,1988; Huang, et al., CABIOS 8:155-165,1992; および Pearson et al., Meth.in Mol.Biol. 24:307-331,1994 に記載されている。Altshul et al., J.Mol.Biol. 215:403-410,1990 は、配列整列法および相同性計算の詳細な考察を与える。
【００３２】
National Center for Biotechnology Information（NCBI）Basic Local Alignment Search Tool（BLASTTM，Altschul et al., J.Mol.Biol. 215:403-410,1990）は、National Center for Biotechnology Information（NCBI，Bethesda, MD）を含めたいくつかの源からおよびインターネットで、配列分析プログラムblastp、blastn、blastx、tblastnおよびtblastxに関連して用いるのに入手可能である。BLASTTMは、インターネットで利用することができる。このプログラムを用いて配列同一性を決定する方法の説明は、インターネットで利用可能である。
【００３３】
約30アミノ酸より大きいアミノ酸配列の比較には、BLASTTMプログラムの“Blast 2シークエンス”関数を、暗黙値パラメーターに設定された暗黙値BLOSUM62マトリックス（11のギャップ存在コストおよび1の残基ギャップコスト）を用いて用いる。短いペプチド（約30アミノ酸より少ない）を整列する場合、整列は、Blast 2シークエンス関数を用いて、暗黙値パラメーターに設定されたPAM30マトリックス（オープンギャップ9、伸長ギャップ1のペナルティー）を用いて行われるはずである。対照標準配列になお一層大きい類似性を有するタンパク質は、この方法によって評価された場合、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％または少なくとも95％配列同一性のような増加した同一性百分率を示すであろう。
【００３４】
トランスアシラーゼ（アシルトランスフェラーゼのより古い呼称）活性：トランスアシラーゼ活性を示す酵素は、アシル基を転移させ、担体に結合しているアシル基（アシル−担体）を反応物に転移させる反応を触媒することによってエステルかまたはアミドを形成し、それによって、反応物に結合したアシル基（アシル−反応物）を形成することができる。
【００３５】
トランスアシラーゼ：トランスアシラーゼは、上記のトランスアシラーゼ活性を示す酵素である。しかしながら、全てのトランスアシラーゼが同じ担体および反応物を認識するのではない。したがって、トランスアシラーゼ酵素−活性検定は、具体的なトランスアシラーゼ酵素の特異性に依って異なった基質および反応物を用いる必要がある。当業者は、下記の検定が、トランスアシラーゼ活性検定の代表的な例であること、および類似の検定を用いて、別の基質および反応物に対して向けられるトランスアシラーゼ活性を調べることができるということを理解するであろう。
【００３６】
実質的な類似性：第一核酸は、他の核酸（またはその相補鎖）と最適に整列された場合（適当なヌクレオチド欠失またはギャップ挿入を用いて）、第二核酸に“実質的に類似”していて、例えば、少なくとも約50％、75％、80％、85％、90％または95％のヌクレオチド塩基にヌクレオチド配列同一性が存在する。配列類似性は、The National Center for Biotechnology Information から入手可能なBLASTTM配列分析ソフトウェア（blastn）を用いて二つの核酸のヌクレオチド配列を比較することによって決定することができる。このような比較は、暗黙値設定に設定されたソフトウェアを用いて行うことができる（期待値＝10，フィルター＝暗黙値，種類＝500対，アラインメント＝500，アラインメントビュー＝標準，ギャップ存在コスト＝11，残基の存在＝1，残基のギャップコスト＝0．85）。同様に、第一ポリペプチドと第二ポリペプチドは、それらが、暗黙値設定を用いたBLASTソフトウェア（blastp）を用いて最適に整列され且つ比較された場合に少なくとも約75％〜90％またはそれ以上の配列同一性を示すならば、実質的に類似している。
【００３７】
II．アセチルCoA：タキサ−4（20），11（12）−ジエン−5α−オールO−アセチルトランスアシラーゼの特性決定；
A．酵素精製およびライブラリー構築；
生化学的研究は、TaxolTM生合成経路の第三の具体的な中間体が、酢酸タキサ−4（20），11（12）−ジエン−5α−イルであるということを示しているが、これは、この代謝産物が、最終生成物への途中の一連のポリヒドロキシタキサンの前駆体として役立つためである（Hezari and Croteau, Planta Medica 63:291-295,1997）。タキサジエノールをC5酢酸エステルに変換する、原因となる酵素タキサジエノールアセチルトランスアシラーゼは、したがって、TaxolTM収率を増加させる適当な生産性生物における過発現の目的のためのcDNA単離に重要な候補である（Walker et al., Arch.Biochem.Biophys. 364:273-279,1999）。
【００３８】
この酵素は、部分的に精製され、反応パラメーターに関して特性決定されているが（Walker et al., Arch.Biochem.Biophys. 364:273-279,1999）；しかしながら、公表された分別プロトコールは、遺伝子の逆遺伝クローニングの試みに必要とされるアミノ酸ミクロシークエンシングに適した純粋なタンパク質を生じない。［遺伝子には、類似性に基づくクローニングアプローチを可能にするデータベース中の同族体またはオルソログ（すなわち、他のテルペノイドまたはイソプレノイドO−アセチルトランスアシラーゼ）がないということに注目することも重要である。］
ジャスモン酸メチルに誘導される Taxus canadensis 細胞を豊富な酵素源として用いて、ミクロシークエンシングのための均一タンパク質を効率よく生じるために、新規な単離および精製プロトコール（図3および下記のプロトコールを参照されたい）が開発された。そのタンパク質は、N−ブロックされていて、V8（エンドプロテイナーゼGlu−C，Roche Molecular Biochemical, Nutley, New Jersey）タンパク質分解または臭化シアン（CNBr）切断によって内部的に配列決定されうるペプチドを生じることができなかったが、endolysC（エンドプロテイナーゼLys−C，Roche Molecular Biochemical, Nutley, New Jersey）およびトリプシンを用いた処理は、ペプチドの混合物を生じた。これらの内5種類は、高性能液体クロマトグラフィー（HPLC）によって分離され、質量分析（MS）によって確認され、そしてクローニング作業に有用な配列情報を生じうると考えられる（図2）。
【００３９】
cDNAライブラリー構築には、適当なジャスモン酸メチル誘導性T．cuspidata 懸濁細胞系をmRNA単離のために選択したが、これは、TaxolTMの生産が、この系（必要ならば、適当な差引ライブラリーの製造を可能にする）において極めて誘導可能であったからである。異なった Taxus 種とともに用いられる実験プロトコールの混合は、全ての Taxus 種が極めて近縁であることが知られているし且つ数人の分類学者により、基本的な種T．baccata の地理学的変種であると考えられることから（Bolsinger and Jaramillo, Silvics of Forest Trees of North America (revised), Pacific Northwest Research Station, USDA, p.17, Portland, OR，1990; および Voliotis, Isr.J.Botany. 35:47-52,1986）、有意の制約ではない。したがって、T．canadensis およびT．cuspidata からのゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼおよびタキサジエンシンターゼ（TaxolTM生合成の初期段階）をコードしている遺伝子は、極めて小さい配列差しか示さない。したがって、Taxus 細胞からの高品質mRNAの単離の方法が開発されており（Qiagen, Valencia, California）、この材料を、Stratagene, La Jolla, California から入手可能である市販キットを用いたcDNAライブラリー構築に用いた。
【００４０】
B．逆遺伝クローニング；
タンパク質分解酵素を用いて生じ且つ配列決定された5種類のペプチド（図2）の内、配列番号：30、31および33のペプチドは、証明された二つだけの他の植物アセチルトランスアシラーゼ、すなわち、インドールアルカロイド生合成に関与するデアセチルビンドリンO−アセチルトランスアシラーゼ（St.Pierre et al., Plant J. 14:703-713,1998）および花の香りの芳香族エステルの生合成に関与するベンジルアルコールO−アセチルトランスアシラーゼ（Dudareva et al., Plant J. 14:297-304,1998）の配列に若干の類似性を示すことが判明した。植物起源の推定上の芳香族O−ベンゾイルトランスアシラーゼには、類似点がほとんど見出されなかった（Yang et al., Plant Mol.Biol. 35:777-789,1997）。この5種類のペプチド配列（図2）の内、配列番号：30は、コドン縮重考察に基づくプライマー設計に最も適当であったので、二つのこのような前進縮重プライマーAT−FOR1（配列番号：34）およびAT−FOR2（配列番号：35）を合成した（図4）。トリプシンペプチドILVYYPPFAGR（配列番号：30）を用いたデータベースの検索は、既知のおよび未知の機能のいくつかの遺伝子入力項目の中でこの配列の二つの可能な変異型を示した（これら入力項目を表1に挙げる）。これら遠縁の配列の考察は、二つの追加の前進縮重プライマー（AT−FOR3（配列番号：36）およびAT−FOR4（配列番号：37））の設計を可能にしたし、しかも縮重復帰プライマー（AT−REV1（配列番号：38））が設計された遠位共通配列の識別を可能にした（図4）。（表1の既存のデータベース配列入力項目を用いた Taxus 配列の整列は、Taxus 配列と任意の前記遺伝子との間の有意の相同性の欠如を示す。）
【００４１】
【表１】
0003730918.tif 000002
【００４２】
PCR増幅は、前進および復帰プライマーのそれぞれの組合せを用いて行われ、Taxus 細胞ライブラリーcDNAを標的として誘導した。この増幅は、クローニングおよび配列決定により、種々のプライマーからの起点を有する12種類の関連するが異なったアンプリコン（それぞれ約900bp）を生じた（表2）。これらアンプリコンは、“プローブ1”〜“プローブ12”と称され、それらヌクレオチドおよび考えられるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号：1〜24として挙げられる。
【００４３】
【表２】
0003730918.tif 000003
【００４４】
0003730918.tif 000004
【００４５】
特に、プライマーAT−FOR1（配列番号：34）およびAT−REV1（配列番号：38）に由来するプローブ1は、精製されたタンパク質の配列番号：31〜33に該当するタンパク質分解ペプチドをほぼ一致してコードしている約900bpDNAフラグメントを増幅した。これら結果は、アンプリコンプローブ1が、タキサジエノールアセチルトランスアシラーゼの標的遺伝子であったことを示唆した。次に、プローブ1を32Pで標識し、ジャスモン酸メチルに誘導されるT．cuspidata 懸濁細胞λZAPIITMcDNAライブラリーのスクリーニングにおいてハイブリダイゼーションプローブとして用いた。標準的なハイブリダイゼーションおよび精製の手順は、最終的には、TAX1（配列番号：28）、TAX2（配列番号：26）およびTAX6（それぞれ、配列番号：27、25および44）と称される3種類の完全長さの独特のクローンの単離をもたらした。
【００４６】
C．配列分析および機能性発現；
クローンTAX1は、1317ヌクレオチド（nt；配列番号：27）の読み取り枠を有し、49，079kDaの計算分子量を有する439アミノ酸（aa；配列番号：28）の推定タンパク質をコードする。クローンTAX2は、1320nt（配列番号：25）の読み取り枠を有し、50，089kDaの計算分子量を有する440aa（配列番号：26）の推定タンパク質をコードする。プローブ6（配列番号：3）は、TAX1（配列番号：27）に80％のヌクレオチドレベル相同性を有することが判明しており、プローブ6の完全長さ型は、別のタキソイドアセチルトランスフェラーゼをコードしうるということが示唆された。プローブ6を、32P標識し、Taxus 細胞懸濁cDNAライブラリーをスクリーニングするプローブとして用いたが、完全長さcDNAが得られ、TAX6と称された。クローンTAX6は、1320nt（配列番号：44）の読み取り枠を有し、49，000kDaの計算分子量を有する440aa（配列番号：45）の推定タンパク質をコードする。
【００４７】
TAX1（配列番号：28）およびTAX2（配列番号：26）のサイズは、ゲル浸透クロマトグラフィー（Walker et al., Arch.Biochem.Biophys. 364:273-279,1999）およびSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS−PAGE）によって決定される天然のタキサジエノールトランスアセチラーゼの分子量（MW約50，000）と一致する。TAX1（配列番号：28）およびTAX2（配列番号：26）両方の推定のアミノ酸配列は、植物における二次代謝の異なった経路に関与する他のアセチルトランスアシラーゼの配列にも僅かながら似ている（50〜56％同一性；64〜67％類似性）（St.Pierre et al., Plant J. 14:703-713,1998; および Dudareva et al., Plant J. 14:297-304,1998）。トリプシンペプチドフラグメントからのアミノ酸配列情報と比較した場合、TAX1（配列番号：28）は極めて近い対合（91％同一性）を示したが、TAX2（配列番号：26）は、保守的相違（70％同一性）を示した。
【００４８】
49，052kDaのTAX6（配列番号：45）計算分子量は、ゲル浸透クロマトグラフィーによって決定される天然のTAX6（配列番号：45）タンパク質の分子量（約50kDa）と一致して、そのタンパク質が機能性モノマーであることが示され、しかも関連のモノマー性タキサジエン−5α−オールトランスアセチラーゼのサイズ（MW＝49，079）と極めて似ている。Taxus cuspidata からのアセチルCoA：10−デアセチルバッカチンIII−10−O−アセチルトランスフェラーゼは、Taxus chinensis から最近単離され且つ71，000の分子量で報告されたアセチルCoA：10−ヒドロキシタキサン−O−アセチルトランスフェラーゼとはサイズが実質的に異なると考えられる（Menhard and Zenk, Phytochemistry 50:763-774,1999）。
【００４９】
TAX6（配列番号：45）の推定のアミノ酸配列は、TAX1（配列番号：28）の配列（64％同一性；80％類似性）および植物における二次代謝の異なった経路に関与する他のアセチルトランスフェラーゼの配列（56〜57％同一性；65〜67％類似性）に似ている（Dudareva et al., Plant J. 14:297-304,1998; St-Pierre et al., Plant J. 14:703-713,1998）。更に、TAX6（配列番号：45）およびTAX2（配列番号：26）は両方とも、他のアシルトランスフェラーゼにおいて見出されるモチーフHXXXDG（配列番号：48）（それぞれ、TAX6（配列番号：45）中の残基H162、D166およびG167、およびTAX2（配列番号：26）中の残基H159、D163およびG164）を有し（Brown et al., J.Biol.Chem. 269:19157-19162,1994; Carbini and Hersh, J.Neurochem. 61:247-253,1993; Hendle et al., Biochemistry 34:4287-4298,1995; および Lewendon et al., Biochemistry 33:1944-1950,1994）；この配列要素は、アシルCoAから基質アルコールへのアシル基転移において機能することが示唆されている（St.Pierre et al., Plant J. 14:703-713,1998）。
【００５０】
推定上のタキサジエノールアセチルトランスアシラーゼの同一性を決定するために、TAX1（配列番号：28）、TAX2（配列番号：26）およびTAX6（配列番号：45）を、インフレームで発現ベクターpCWori＋（Barnes, Methods Enzymol. 272:3-14,1996）中にサブクローン化し、E．coli JM109細胞中で発現させた。形質転換された細菌を培養し、イソプロピルβ−D−チオガラクトシド（IPTG）を用いて生じさせ、細胞不含抽出物を調製し、タキサジエノールアセチルトランスアシラーゼ活性について前に開発された検定法（Walker et al., Arch.Biochem.Biophys. 364:273-279,1999）を用いて評価した。クローンTAX1（プローブ1に直接的に該当する）は、放射化学分析によって決定したところ、高レベルのタキサジエノールアセチルトランスアシラーゼ活性を示し（生成物への基質の20％変換）；この組換え体酵素の生成物は、ガスクロマトグラフィー−質量分析（GC−MS）によって酢酸タキサジエニル−5α−イルと確認された（図5A〜5G）。クローンTAX2は、タキサジエノールアセチルトランスアシラーゼ活性を示さなかったし、［3H］タキサジエノールおよびアセチルCoA補基質について不活性であった。しかしながら、クローンTAX2は、TaxolTM生合成経路の後の方の工程の酵素をコードしうる（TAX2は、プローブ2に該当することが示されている）。TAX1（配列番号：28）またはTAX2（配列番号：26）から発現された組換え体タンパク質はどちらも、前進した TaxolTM前駆体10−デアセチルバッカチンIIIをバッカチンIIIにアセチル化することができなかった。したがって、機能的に発現された活性の証明、および組換え体酵素の基質特異性および他の物理的および化学的性質の天然型との類似点に基づいて、クローンTAX1は、Taxus タキサジエノールアセチルトランスアシラーゼをコードすることが確認された。
【００５１】
更に、異種によって発現されたTAX6（配列番号：45）を、陰イオン交換クロマトグラフィー（O−ジエチルアミノエチルセルロース，Whatman, Clifton, NJ）および限外濾過（Amicon Diaflo YM10メンブラン，Millipore, Bedford, MA）によって部分精製して、干渉性加水分解酵素を細菌抽出物から除去し、そして組換え体酵素が、10−デアセチルバッカチンIIIのバッカチンIIIへの変換を触媒することを確認したが；この後者は、TaxolTM（パクリタキセル）生合成経路における最後のジテルペン中間体である。TAX6（配列番号：45）の最適pHは、7．5であることが確認されたが、半最大速度はpH6．4および7．8においてであった。10−デアセチルバッカチンIIIおよびアセチルCoAのKm値は、Lineweaver-Burk 分析によって、それぞれ10μMおよび8μMであることが確認された（両方のプロットについてR2＝0．97）。TAX6（配列番号：45）のこれら反応速度定数は、それぞれ4μMおよび6μMのタキサジエノールおよびアセチルCoAのタキサ−4（20），11（12）−ジエン−5α−オールアセチルトランスフェラーゼプロセッシングKm値に匹敵する。TAX6（配列番号：45）は、この酵素が、10−デアセチルバッカチンIIIの1β−、7β−または13α−ヒドロキシル基をアセチル化しないし、タキサ−4（20），11（12）−ジエン−5α−オールの5α−ヒドロキシル基もアセチル化しないことから、タキソイドの10−ヒドロキシル基を高度のレギオ選択性でアセチル化すると考えられる。
【００５２】
III．TaxolTM経路の他のトランスアシラーゼ；
A．概要；
トランスアシラーゼ活性のスクリーニングは、下記のように、最初に基質を入手するおよび／または合成することによって行うことができる。cDNAクローンTAX2、TAX5、TAX7、TAX9、TAX10、TAX12およびTAX13（それぞれ、配列番号：25、49、51、59、53、55および57）に由来する個々のトランスアシラーゼ酵素を、下記のように細菌中で発現させる。発現される酵素に粗精製手順を施し、そして次の基質、すなわち、2−デベンゾイル−7，13−ジアセチルバッカチンIII、N−デベンゾイルタキソール、ベンゾイルCoAおよび補基質バッカチンIIIおよびフェニルイソセリニルCoAに作用するそれらの能力についてスクリーニングする。これらスクリーニング検定からの結果は、上述のクローンの内のどれがデベンゾイルタキソール−N−ベンゾイルトランスフェラーゼであるかおよびどれがバッカチンIII−13−O−フェニルイソセリニルトランスフェラーゼであるか決定することができる。
【００５３】
B．適当な基質の製造；
1．  2−デベンゾイル−7，13−ジアセチルバッカチンIII；
基準10−デアセチルバッカチンIIIは、Hauser Chemical Research Inc.（Boulder, CO）か、Dabur India Ltd.（New Delhi, India）かまたは Natland International Corp.（Morrisville, NC）から入手した。（2α，5α）−ジヒドロキシタキサ−4（20），11（12）−ジエンは、Robert Williams（Colorado State University, Boulder, CO）からの寛大な贈物であった。ジャスモン酸メチルは、Bedoukian Research,Inc.（Danbury, CT）から入手した。ナトリウム塩としてのベンゾイル補酵素Aは、Sigma Chemical Co.（St.Louis, MO）から購入した。［7−14C］安息香酸は、NEN Life Sciences Products（Boston, MA）から購入した。他の試薬は全て、特に断らない限り、Aldrich Chemical Co.（Milwaukee, WI）から購入し、更に精製することなく用いた。
【００５４】
2−デベンゾイル−7，13−ジアセチルバッカチンIIIの合成は、最初に、7，13−ジアセチルバッカチンIIIを次のように合成することによって開始した。10−デアセチルバッカチンIII（160mg，294μmol）の乾燥CH2Cl2（5mL）中撹拌溶液に、窒素下において25℃で、無水酢酸（20当量）、ジメチルアミノピリジン（20当量）およびトリエチルアミン（50μL，361μmol）を加えた。16時間後、反応を、EtOAc（50mL）を用いて希釈し、水（10mL）を用いて急冷した。その混合物を15分間撹拌し、水性画分を分離し、EtOAc（2x25mL）を用いて抽出した。合わせた有機画分を、ブライン、0．1N  HCl、水を用いて洗浄し、無水MgSO4上で乾燥させた。有機溶媒を減圧下で蒸発させ、粗生成物を、シリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー（EtOAc：ヘキサン，60：40，v／v）によって精製して、純粋な7，13−ジアセチルバッカチンIIIを生じた（図11を参照されたい）（180mg，91％収率，1H−NMRで99％純度）。1H−NMR（300MHz，CDCl3）δ：1．10（s，CH3），1．14（s，CH3），1．74（s，CH3），1．77（ddd，J＝1．8，10．8および14．7Hz，H−6β），1．90（d，J＝1．2Hz，ビニル−CH3），1．97（s，C（O）CH3），2．12（s，C（O）CH3），2．14（s，C（O）CH3），2．17（d，J＝8．7Hz，H−14），2．29（s，C（O）CH3），2．53（ddd，J＝7．2，9．6および14．4Hz，H−6α），3．89（d，J＝6．9Hz，H−3），4．09（d，J＝8．4Hz，H−20α），4．24（d，J＝8．4Hz，H−20β），4．91（dd，J＝1．8および9．6Hz，H−5），5．53（dd，J＝7．2および10．5Hz，H−7），5．60（d，J＝6．9Hz，H−2），6．10（dt，J＝1．2および8．7Hz，H−13），6．19（s，H−10），7．39−8．01（芳香族プロトン）。APCI−MS：m／z671（PH＋）。
【００５５】
水素化ビス（2−メトキシエトキシ）アルミニウム（トルエン中65＋wt％，3当量）を、7，13−ジアセチルバッカチンIII（170mg，253μmol）の乾燥THF（2mL）中0℃撹拌溶液に滴加した。0℃で30分間撹拌後、飽和NH4Clの滴加によって反応を急冷した。混合物を10分間撹拌後、室温まで加温し、EtOAc（50mL）を用いて希釈後、水（10mL）を加えた。水性相を分離し、EtOAc（2x25mL）を用いて再度抽出した。合わせた有機画分を、ブラインおよび水を用いて洗浄後、無水MgSO4上で乾燥させた。溶媒を蒸発させ、粗生成物を、シリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー（ヘキサン中40〜60％EtOAc勾配）によって精製して、2−デベンゾイル−7，13−ジアセチルバッカチンIIIを生じた（図11を参照されたい）（60mg，42％収率，1H−NMRで99％純度）。1H−NMR（300MHz，CDCl3）δ：1．04（s，CH3），1．22（s，CH3），1．77（s，CH3），1．85（ddd，J＝1．8，10．8および14．4Hz，H−6β），1．90（d，J＝1．2Hz，ビニル−CH3），2．02（s，C（O）CH3），2．14（s，C（O）CH3），2．15（s，C（O）CH3），2．20（s，C（O）CH3），2．58（ddd，J＝7．2，9．6および14．4Hz，H−6α），2．65（d，J＝5．1Hz，C−2でOH），3．58（d，J＝6．9Hz，−3H），3．90（dd，J＝5．4および6．5Hz，H−2），4．49（d，J＝9．6Hz，H−20α），4．63（d，J＝9．6Hz，H−20β），4．97（dd，J＝1．8および9．6Hz，H−5），5．55（dd，J＝7．2および10．7Hz，H−7），6．15（dt，J＝1．2および9．6Hz，H−13），6．18（s，H−10），不明瞭なH−14プロトンシグナル。APCI−MS：m／z567（PH＋）。
【００５６】
［7−14C］ベンゾイル補酵素Aの合成に関して、長鎖アシルCoAエステルの合成について記載された方法から次の方法を用いた（Rasmussen et al., Biochem.J. 265:849-855,1990）。［7−14C］安息香酸（3．3mg，27μmol，sp．ac．18．5Ci／mol）のCH2Cl2：THF（5：2，v／v，1．4mL）中の窒素下溶液に、CH2Cl2中の1Mトリエチルアミン（3．0μL，30μmol）を一度に加えた。混合物を一緒に室温で10分間撹拌した。クロロギ酸エチル（2．57μL，2．9mg，27μmol）を一度に加え、反応を室温で1時間撹拌した。溶媒を蒸発させ、残留物を0．5mLのt−ブタノール中に溶解させた。ナトリウム塩としての補酵素A（23mg，0．5mLの0．4M  NaHCO3中に溶解した3μmol）をそのブタノール溶液に加え、反応混合物を室温で0．5時間撹拌した。その反応混合物を、1M  HCl（200μL）を用いて急冷し、15mM  NaH2PO4（pH4．8）を用いてpH5に調整した。溶媒を真空中において室温で（5時間）蒸発させた。残留するt−ブタノールを除去し、試料を乾燥メタノール中に溶解させ、溶媒を真空下で除去した。残りの残留物を、15mM  NaH2PO4（pH6．9，7mL）中に再懸濁させた。粗生成物を、C18 Sep-Pak カートリッジ（500mgのC18シリカゲル，Millipore Corp, Milford, MA）を用いて精製したが、これは、最初、メタノール（2x6mL）および水（2x6mL）を用いて洗浄後、最後に、15mM  NaH2PO4（pH6．9，2x6mL）を用いて平衡化されていた。粗製試料の全量をカラム上に充填し、15mM  NaH2PO4（pH6．9）中で増加するメタノールの5mL部分を用いて溶離して、［7−14C］ベンゾイル補酵素Aをナトリウム塩として生じた（10〜15％メタノール中で溶離される）。合成CoAチオエステルの化学純度（99％）は、分析用TLC（n−ブタノール：H2O：AcOH，5：3：2，v／v／vを用いて展開されるシリカゲル）、および同時クロマトグラフィーで分離される基準ベンゾイル補酵素A（Rf＝0．4）との比較によって評価した。TLCプレートは25℃で自然乾燥させ、合成生成物の放射化学純度は、基準標準と共泳動したプレートの掻き取られる領域、およびその上下両方の領域の液体シンチレーション計数によって99％であると決定された。そのように単離された［7−14C］ベンゾイルCoAを凍結乾燥させ、水（10mL）中に再懸濁させて、15mM  NaH2PO4まで再構成させた後、1N  HClを用いて注意深くpH5に調整した。その溶液を、エーテル（3x5mL）を用いて抽出して、微量有機不純物を除去し、残留エーテルを窒素流下で蒸発させて、［7−14C］ベンゾイル補酵素Aの1．35mM溶液を生じた。
【００５７】
2．  N−デベンゾイルタキソールの製造；
N−デベンゾイルタキソールは、ブタ腎からの過剰単位のN−アシルアミノ酸アミドヒドロラーゼ（Sigma Chemical Co., St.Louis, MO）を、約5mgのN−デベンゾイル−（N−フェニルアセチルタキソール）懸濁液（Hauser Chemical Research（Boulder, CO）からの贈物）に加えることによって製造することができる。得られた溶液を室温で撹拌する。18時間後、その溶液を、1N  HClを用いてpH3まで酸性にし、エーテルを用いて抽出する。水性画分を凍結乾燥させ、残りの残留物は最小量の緩衝液中に溶解させることができ、粗生成物は、陽イオン交換カラムクロマトグラフィーによって精製することができる。精製されたN−デベンゾイルタキソールは、NH4OHの希溶液を用いて沈澱させ、氷上に0．5時間置き、遠心分離して生成物をペレットにすることができる。上澄みを傾瀉し、沈澱を、最小量の水を用いて洗浄し、生成物を凍結乾燥させる。単離された生成物は、Varian Mercury 300上の1H−NMR（溶媒および内部標準としてデュテリウム置換クロロホルムを用いる）および直接注入質量分析（大気圧化学イオン化法での Hewlett-Packard Series 1100MSDシステム）によって確証することができる。
【００５８】
3．  フェニルイソセリニルCoAの合成；
フェニルイソセリニルCoAは、N−ベンゾイル−（2R，3S）−3−フェニルイソセリン（200mg）を5mLの水中に溶解させることによって製造することができる。得られた溶液を、1N  HClを用いてpH2まで酸性にし、5時間還流させることができる。反応混合物を室温まで冷却し、エーテルを用いて抽出し、水性画分を凍結乾燥させる。残りの粗生成物を、最小量の水中に溶解させ、希NH4OHを用いてpH5に調整して、（2R，3S）−3−フェニルイソセリンを再結晶させることができる。生成物純度は、1H−NMR（溶媒および内部標準としてD2Oを用いる）によって評価することができる。過剰単位のアシル−補酵素Aシンテターゼ（Sigma Chemical Co., St.Louis, MO）および補酵素A（Sigma Chemical Co., St.Louis, MO）を、適当な緩衝液（pH8）中に溶解させた（2R，3S）−3−フェニルイソセリン（Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI）の溶液に加える。生成物は、C18カラムクロマトグラフィーによって精製することができ、生成物は純度は、シリカゲルTLCおよび1H−NMR（溶媒および内部標準としてD2Oを用いる）によって決定することができる。
【００５９】
B．酵素の粗製単離
TAX2、TAX5、TAX7、TAX9、TAX10、TAX12およびTAX13（それぞれ、配列番号：25、49、44、60，51、53、55および57）を、次のプロトコールを用いて細菌中で発現させた。組換え体酵素の典型的な製造には、推定上のトランスアシラーゼ遺伝子を含むpCWori＋ベクターを用いて形質転換されたE．coli 培養物それぞれを、50μg／mLアンピシリンを補足した5mLの Luria-Bertani 培地中において37℃で一晩成長させた。これら培養物から1mLを、個々に、100mLの Terrific Broth 培地（500mLの水中に6gバクトトリプトン（Difco Laboratories, Spark, MD）、12g酵母エキス（EM Science, Cherryhill, NJ）および2mLグリセロール）の別々のアリコートに加え、37℃で成長させた。3時間後、その培地に、誘導用の1mMイソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシドおよび50μg／mLアンピシリンを補足し、培養物を25℃で成長させた。18時間後、細菌を遠心分離によって採取し、25mLの検定用緩衝液（25mM Mopso，pH7．4）中に再懸濁させ、0℃での音波処理によって破壊した。得られたホモジネートを15，000gで遠心分離して、破片をペレットにした。得られた上澄みを90，000gで遠心分離して、可溶性酵素画分を与えた。
【００６０】
C．スクリーニング検定；
それぞれの可溶性酵素標品の1mLアリコートを、2−デベンゾイル−7，13−ジアセチルバッカチンIII（500μM）および［7−14C］ベンゾイル補酵素A（500μM，9．3μCi）と一緒に31℃で1．5時間インキュベートした。その反応混合物を、エーテル（2mL）を用いて抽出し、有機相を取り出し、真空中で濃縮した。得られた検定用粗生成物をアセトニトリル（50μL）中に溶解させ、そして Packard Radiomatic 放射能検出系A100（Canberra, IN，Meriden, CT）に連結した Perkin Elmer HPLC  ISS200を用いた放射性HPLCによって分析した（代表的なクロマトグラムについては、図12Aおよび12Bを参照されたい）。試料を、Vydac（Hesperia, CA）C18カラム（5μ250x4．6mm）上において、30：70CH3CN：H2O〜60：40CH3CN：H2Oから出発する30分間にわたる直線勾配を1mL／分で用い、次に、5分間にわたる直線勾配で100％CH3CNにし、100％CH3CNで5分間保持し、最後に、初期条件まで5分間にわたって戻す溶離によって分離した。A228で吸収し且つ基準7，13−ジアセチルバッカチンIIIと同様の保持時間について一致する放射能応答を有する検出された生合成生成物は、TAX2と称されるクローンを有する単一E．coli JM109形質転換細胞から発現される酵素の大規模製造（4L）への作業に送られた。推定のTAX2（配列番号：26）ベンゾイルトランスフェラーゼ（約50μg）の大規模製造によって生じた生成物は、大気圧化学イオン化（APCI）方式の Hewlett-Packard Series 1100MSDを用いた組合せ液体クロマトグラフィー−質量分析（LC−MS）によって分析した。アセトニトリル（200μL）中に溶解した試料を、Phenomenex（Torrance, CA）Curosil−Gカラム（5μ250x4．6mm）上に充填し（5μL）、これを、30：70CH3CN：H2Oを用いて1mL／分で5分間溶離し、80：20CH3CN：H2Oまで55分間にわたって直線的に増加させた後、5分間保持した（0．1分間にわたる初期条件までの回復および10分間の平衡化を伴う）。カラム溶出液は、分析のために質量分析計のAPCI入口に送られた（代表的なスペクトルについては、図13Aを参照されたい）。追加の酵素生成物（約500μg）を、シリカゲルTLC（酢酸エチル：ヘキサン，60：40，v／v）によって精製した。基準7，13−ジアセチルバッカチンIII（Rf＝0．33）と共泳動したバンドを単離し、内部標準としての0．5mLデュテリウム置換クロロホルム中に溶解させ、そして Varian Mercury 300装置を用いたプロトン核磁気共鳴分光法（1H−NMR）によって分析した。
【００６１】
D．速度論的特性決定検定；
組換え体 Taxus TAX2（配列番号：26）遺伝子を含むE．coli JM109細胞の大規模（4L）培養物を、上記のように成長させ、採取し、抽出した。可溶性酵素画分の調製、および適当なサイズ（約50kDa）のタンパク質が機能的に可溶性の形で発現されたという証明後、そのタンパク質画分（100mL）を、O−ジメチルアミノエチル−セファロース（2．8x20cm，Sigma Chemical Co.（St.Louis, MO））のカラムに加えたが、これは、予め、3mMジチオトレイトールおよび1M  NaClを含有する25mM Mopso 緩衝液（pH7．4）を用いて洗浄後、この緩衝液（NaCl不含）を用いて平衡化されていた。非結合物質の除去後、平衡緩衝液中0〜200mM  NaClの直線勾配（3mL／分で200mL全量）を用いてタンパク質を溶離した。ベンゾイルトランスフェラーゼ活性を含有する画分（約175mM  NaClで溶離する）を一緒にし（約100mL）、限外濾過（Amicon YM10メンブラン，Millipore, Bedford, MA）および反復希釈を施して、塩濃度を約5mMまで減少させた。この酵素標品を、異種によって発現された2−デベンゾイル−7，13−ジアセチルバッカチンIII−2−O−ベンゾイルトランスフェラーゼ（TAX2；配列番号：26）の速度論的評価に用いたが、これは、バッカチンIII−13−O−フェニルイソセリニルトランスアシラーゼおよびデベンゾイルタキソール−N−ベンゾイルトランスアシラーゼのような他のトランスアシラーゼ酵素を生じるのに用いることができる。
【００６２】
速度論的評価には、タンパク質濃度および時間に関する直線性を最初に決定し、そして2−デベンゾイル−7，13−ジアセチルバッカチンIII（0〜100μM）および［7−14C］ベンゾイルCoA（0〜1000μM）の濃度を独立して変化させたが、残りの反応物は飽和状態（2mM）で維持した。二重逆数プロットを、設定される各データについて作成し、最適線（R2＝0．99）の式を決定した（KaleidaGraph, 3．08型，Synergy Software, Reading, PA）。ベンゾイルトランスフェラーゼ活性へのpHの影響を調べるために、酵素標品（1mL，約80〜100μgタンパク質）を150μLまで濃縮（Nanosep 30ミクロコンセントレーター，Gelman Laboratory, Ann Arbor, MI）後、検定の前に、いずれも3mMジチオトレイトールを含有する25mMの Mes（pH6）、Mopso（pH7）、グリシン（pH8）、Capso（pH9）または Caps（pH10および11）緩衝液1．35mLをそれぞれ用いて希釈した。
【００６３】
E．予想活性；
TAX5、TAX7、TAX9、TAX10、TAX12およびTAX13（それぞれ、配列番号：50、52、60、54、56および58）の推定のアミノ酸配列と、ベンゾイルトランスフェラーゼとして規定されるTAX2（配列番号：2）のその配列との比較は、TAX13が、Taxus cuspidata タキサン−2α−O−ベンゾイルトランスフェラーゼに最も高いアミノ酸類似性（74％）および同一性（68％）を有するペプチド配列をコードしていることを示し（下の表3および図14および15を参照されたい）、TAX13は、別のタキサンベンゾイルトランスフェラーゼをコードするということが示唆された。
【００６４】
【表３】
0003730918.tif 000005
【００６５】
更に、TAX2、TAX5、TAX7、TAX9、TAX10、TAX12およびTAX13（それぞれ、配列番号：25、49、44、60、51、53、55および57）の推定のペプチド配列と、二重機能フェニルプロパノイル／ベンゾイルトランスアシラーゼ（すなわち、Dianthus caryophyllus から単離されるアントラニル酸ヒドロキシシンナモイル／ベンゾイルトランスフェラーゼ（PCHCBT）（Yang et al., Plant Mol.Biol. 35:777-789,1997））のその配列との比較は、TAX7およびPCHCBTの推定のペプチド間で最も高い類似性（67％）および同一性（約56％）を示し（表3、図14および15を参照されたい）、TAX7は、C13フェニルイソセリニル（フェニルプロパノイド）トランスフェラーゼをコードするということが示唆された。
【００６６】
IV．アセチルCoA：タキサ−4（20），11（12）−ジエン−5α−オールO−アセチルトランスアシラーゼをコードする遺伝子の単離；
A．実験概要；
新規に設計された単離および精製法を、Taxus canadensis からの均一なタキサジエン−5α−オールアセチルトランスアシラーゼの製造について下に記載する。精製されたタンパク質は、N末端ブロックされていたので、タンパク質分解消化によって生じるフラグメントの内部アミノ酸ミクロシークエンシングを必要とした。そのようにして生じたペプチドフラグメントを、HPLCによって精製し、配列決定し、一つの適当な配列を用いて、一組の縮重PCRプライマーを設計した。いくつかのプライマー組合せを用いて、一連の12種類の関連した遺伝子特異的DNA配列を増幅させた（プローブ1〜12）。これら遺伝子特異的配列の内の9種類をハイブリダイゼーションプローブとして用いて、誘導される Taxus cuspidata 細胞cDNAライブラリーをスクリーニングした。この計画は、9種類の完全長さトランスアシラーゼcDNAクローンの単離を成功させた。これらクローンの内の一つの同一性は、上記のペプチドフラグメントへの配列対合によっておよび Escherichia coli におけるトランスアシラーゼ活性の異種機能性発現によって確認された。
【００６７】
B．細胞の培養；
Taxus 種細胞培養の開始、増殖および誘導、試薬、基質および標準液の合成手順、およびトランスアシラーゼ単離、特性決定および検定の一般的な方法は、以前に記載されている（Hefner et al., Arch.Biochem.Biophys. 360:62-75,1998; および Walker et al., Arch.Biochem.Biophys. 364:273-279,1999）。Taxus 種と称される全てが、近縁の亜種であると考えられることから（Bolsinger and Jaramillo, Silvics of Forest Trees of North America (revised), Pacific Northwest Research Station, USDA, Portland, OR，1990；および Voliotis, Isr.J.Botany 35:47-52,1986）、様々な“種”のタンパク質と遺伝子との間には僅かな配列差および／または対立遺伝子変異しか考えられなかったので、Taxus 細胞源は、操作上の要件について選択した。したがって、Taxus canadensis 細胞は、トランスアシラーゼを高レベルで発現するので、それらをトランスアシラーゼ源として選択し、そして Taxus cuspidata 細胞は、TaxolTMを高レベルで生じるので、それらをcDNAライブラリー構築用に選択した。
【００６８】
C．酵素の単離および精製；
関連したテルペノールトランスアシラーゼ遺伝子は、相同性に基づくクローニングを可能にするデータベースで利用できない（下を参照されたい）。したがって、標的トランスアセチラーゼをクローニングするためのタンパク質に基づく（逆遺伝）アプローチが必要とされた。この逆遺伝アプローチは、部分アミノ酸配列を入手し、縮重プライマーを生じさせ、PCRを用いてcDNAの一部分を増幅させ、そして増幅したフラグメントをプローブとして用いてcDNAライブラリー中の正しいクローンを検出することを必要とした。
【００６９】
残念ながら、アフィニティークロマトグラフィー工程を含めた、前に記載された部分タンパク質精製プロトコールは、アミノ酸ミクロシークエンシングのための純粋なタンパク質を生じなかったし、そのプロトコールは、タンパク質を有用な量で生じることがなかったし、トランスアセチラーゼを特定のタンパク質に割り当てさせる充分に単純化されたSDS−PAGEバンドパターンを与えることがなかった（Walker et al., Arch.Biochem.Biophys. 364:273-279,1999）。更に、アフィニティークロマトグラフィー工程、更には、初期の陰イオン交換および疎水性相互作用クロマトグラフィー工程における多数の変更は、操作時の酵素の不安定性のために、標品の比活性を向上させることができなかった。更に、製造規模の5倍の増加は、最低限に改善された回収しか生じなかった（概して、＜5％の全収率は全出発タンパク質の＞99％の除去に伴う）。更に、酵素が均一になるまで精製され得なかったし、ポリオール（スクロース、グリセロール）、還元剤（Na2S2O5、アスコルビン酸塩、ジチオトレイトール、β−メルカプトエタノール）および他のタンパク質（アルブミン、カゼイン）の添加によって安定性を向上させる試みも成功しなかったことから（Walker et al., Arch.Biochem.Biophys. 364:273-279,1999）、このアプローチは断念せざるを得なかった。
【００７０】
上記の問題を克服するために、次の単離および精製法を用いた。それぞれの分別工程後のタキサジエノールアセチルトランスアシラーゼの純度を、Laemmli（Laemmli, Nature 227:680-685,1970）によるSDS−PAGEによって評価し；それぞれの精製工程後の全タンパク質の定量は、Bradford, Anal.Biochem. 72:248-254,1976 の方法によって、またはクーマシーブルー染色によって行い、そしてトランスアシラーゼ活性は、Walker et al., Arch.Biochem.Biophys. 364:273-279,1999 に記載の方法を用いて評価した。
【００７１】
タンパク質染色の手順は記載されている（Wray et al., Anal.Biochem. 118:197-203,1991）。T．canadensis 細胞不含抽出物の調製および引き続きの全手順は、特に断らない限り、0〜4℃で行われた。細胞（40gバッチ）を、液体窒素中で凍結させ、乳鉢および乳棒を用いて1．5分間充分に粉末にした。得られた凍結粉末を、3mMジチオトレイトール（DTT）、XAD−4ポリスチレン樹脂（12g）およびポリビニルポリピロリドン（PVPP，12g）を含有する氷冷30mM  HEPES緩衝液（pH7．4）225mLに移して、低分子量の樹脂性およびフェノール性化合物を吸収させた。そのスラリーを30分間ゆっくり撹拌し、その混合物を、4層のチーズクロスを介して濾過して、固体吸収剤および粒状物を除去した。濾液を7000gで30分間遠心分離して、細胞破片を除去後、100，000gで3時間、次に0．2−μm濾過を行って、酵素源として用いられる可溶性タンパク質画分を生じた（約200mL緩衝液中）。
【００７２】
この可溶性酵素画分に、限外濾過（DIAFLOTMYM30メンブラン，Millipore, Bedford, Massachusetts）を施して、その画分を200mL〜40mLに濃縮し且つタキサジエン−5α−オールアセチルトランスアシラーゼ（Walker et al., Arch.Biochem.Biophys. 364:273-279,1999 において50，000Daで予め決定された）より低分子量のタンパク質を選択的に除去した。蠕動ポンプを用いて、その濃縮物（40mL）を、O−ジエチルアミノエチルセルロースのカラム（2．8X10cm，Whatman DE−52，Fairfield, New Jersey）に加えたが（2mL／分）、これは、“平衡緩衝液”（3mM  DTTを含有する30mM  HEPES緩衝液（pH7．4））を用いて平衡化されていた。60mLの平衡緩衝液を用いて洗浄して非結合物質を除去後、50mM（25mL）、125mM（50mL）および200mM（50mL）NaClを含有する同緩衝液の段階勾配を用いてタンパク質を溶離した。
【００７３】
それら画分を、前に記載のように検定し（Walker et al., Arch.Biochem.Biophys. 364:273-279,1999）、タキサジエン−5α−オールアセチルトランスアシラーゼ活性を含有する画分（125−mMおよび200−mM画分）を一緒にし（100mL，約160mM）、そして3mM  DTTを含有する30mM  HEPES緩衝液（pH7．4）を用いた限外濾過（DIAFLOTMYM30メンブラン，Millipore, Bedford, Massachusetts）および反復希釈によって5mM  NaCl（160mL）まで希釈した。
【００７４】
280−nm流出液検出器に連結した Pharmacia FPLCシステムで行われる高分解能陰イオン交換およびヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーによって更に精製を行った。上記の標品を、分離用陰イオン交換カラム（10X100mm，Source 15Q，Pharmacia Biotech., Piscataway, New Jersey）に加えたが、これは、予め、“洗浄用緩衝液”（3mM  DTTを含有する30mM  HEPES緩衝液（pH7．4））および1M  NaClを用いて洗浄後、洗浄用緩衝液（NaCl不含）を用いて平衡化されていた。非結合物質を除去後、加えられたタンパク質を、平衡緩衝液中0〜200mM  NaClの直線勾配（215mL全量；3mL／分）を用いて溶離した（図3Aを参照されたい）。トランスアセチラーゼ活性を含有する画分（約80mM  NaClで溶離する）を一緒にし、上記のように、3mM  DTTを含有する30mM  HEPES緩衝液（pH7．4）を希釈剤として用いた限外濾過によって5mM  NaClまで希釈した。脱塩されたタンパク質試料（70mL）を、分析用陰イオン交換カラム（5X50mm，Source 15Q，Pharmacia Biotech., Piscataway, New Jersey）に加えたが、これは、前のように洗浄し且つ平衡化されていた。このカラムを、200mM  NaClまで溶離する浅い直線塩勾配（275mL全量，1．5mL／分，3．0mLずつの画分）を用いて展開させた。タキサジエノールアセチルトランスアシラーゼは、約55〜60mM  NaClで溶離し（図3Bを参照されたい）、適当な画分を一緒にし（15mL）、30mM  HEPES緩衝液（pH6．9）中で45mLに再構成し、セラミックヒドロキシアパタイトカラム（10X100mm，Bio-Rad Laboratories, Hercules, California）に加えたが、これは、予め、200mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH6．9）を用いて洗浄後、“平衡緩衝液”（3mM  DTTを含有する30mM  HEPES緩衝液（pH6．9）（リン酸ナトリウム不含））を用いて平衡化されていた。この平衡緩衝液を用いて、弱く結合した物質を脱着させ、そして結合したタンパク質は、平衡緩衝液中0〜40mMリン酸ナトリウムの勾配（125mM全量，3．0mL／分で，3．0mLずつの画分）によって溶離した（図3Cを参照されたい）。最も高い活性を含有する、10mMリン酸ナトリウムで27mLを越えて溶離する画分を一緒にしたが、これは、SDS−PAGEによって、約95％純度のタンパク質を生じることが示された（微量の混入物は約35kDaで示された。図3Dを参照されたい）。トランスアシラーゼ活性のレベルは、上記の単離および精製プロトコールにおける各工程後に測定した。記録された活性レベルを表4に示す。
【００７５】
【表４】
0003730918.tif 000006
【００７６】
D．タキサジエノールアセチルトランスアシラーゼのアミノ酸ミクロシークエンシング；
上記の多重製造からの精製タンパク質（＞95％純度，約100pmol，50μg）に、分離用SDS−PAGE（Laemmli, Nature 227:680-685,1970）を施した。タキサジエノールアセチルトランスアシラーゼに該当する50kDaにおけるタンパク質バンドを切り取った。V8プロテアーゼを用いた処理または臭化シアン（CNBr）を用いた処理は、配列決定可能なペプチドを生じることができなかったが、endolysC（Caltech Sequence/Structure Analysis Facility, Pasadena, CA）およびトリプシン（Fernandez et al., Anal.Biochem. 218:112-118,1994）を用いた in situ タンパク質分解は、HPLCによって決定される多数のペプチドを生じたので、これらのいくつかを分離し、質量分析法（Fernandez et al., Electrophoresis 19:1036-1045,1998）によって確認し、エドマン分解配列決定法を施したが、これにより、5種類の異なった且つ独特のアミノ酸配列（配列番号：29〜33と称される）が得られた（図2）。
【００７７】
E．cDNAライブラリー構築および関連操作；
cDNAライブラリーは、最大 TaxolTM生産までジャスモン酸メチルを用いて16時間誘導されたT．cuspidata 懸濁培養細胞から単離されるmRANから構築した。T．cuspidata 細胞からの全RNAの単離に最適なプロトコールは、100mM  Tri−HCl（pH7．5）、4Mグアニジンチオシアナート、25mM  EDTAおよび14mMβ−メルカプトエタノールを含有する緩衝液を用いて経験的に開発された。細胞（1．5g）を、PolytronTM超音波装置（Kinematica AG，Switzerland；出力設定7で4X15秒バースト）を用いて0〜4℃で破壊し、得られたホモジネートを、2％（v／v）トリトンX−100に調整し、氷上で15分間放置した。次に、等量の3M酢酸ナトリウム（pH6．0）を加え、その混合溶液を氷上で更に15分間インキュベート後、4℃において15，000gで30分間遠心分離した。得られた上澄みを、0．8容量のイソプロパノールと混合し、氷上で5分間放置後、4℃において15，000gで30分間遠心分離した。得られたペレットを、1mM  EDTAを含有する20mMトリスHCl（pH8．0）8mL中に溶解させ、250mM  MOPS緩衝液（pH7．0）中2M  NaClの2mLの添加によってpH7．0に調整し、そしてこの溶液を核酸単離用カラム（Quiagen, Valencia, California）に、製造者の取扱説明書にしたがって通過させることによって全RNAを回収した。次に、ポリ（A）＋mRNAを、全RNAから、オリゴ（dT）ビーズ（OligotexTMmRNA Kit, Qiagen）上のクロマトグラフィーによって精製し、この物質を用いて、Stratagene, La Jolla, California 製のλZAPIITMcDNA合成キットおよび GigapackTMIII金パッケージングキットを製造者の取扱説明書にしたがって用いてライブラリーを構築した。
【００７８】
特に断らない限り、DNA操作およびクローニング（Sambrook et al.(eds.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd ed., vols.1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY，1989）のための、およびPCR増幅法（Innis et al., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, New York, 1990）のための標準法を用いた。DNAは、ABI PrismTM373DNAシークエンサーにおいて AmplitaqTM（Hoffmann-La Roche INC., Nutley, New Jersey）DNAポリメラーゼおよびサイクルシークエンス法（蛍光シークエンス法）を用いて配列決定した。E．coli 菌株XL1−Blue およびXL1−Blue MRF’（Stratagene, La Jolla, California）を、PCR産物の常套クローニングおよびcDNAライブラリー構築にそれぞれ用いた。E．coli XL1−Blue MRF’細胞は、正のプラークからの精製pBluescriptSKの in vivo 切り取りに用いられ、切り取られたプラスミドは、E．coli SOLR細胞を形質転換するのに用いられた。
【００７９】
F．縮重プライマー設計およびPCR増幅；
コドン縮重のために、得られた5種類のトリプシンペプチドフラグメント（図2の配列番号：30）の内の一つの配列だけが、PCRプライマー構築に適していた。AT−FOR1（配列番号：34）およびAT−FOR2（配列番号：35）と称される二つのこのような縮重前進プライマーを、この配列に基づいて設計した（図4）。NCBI Blast 2．0データベース検索プログラム（Genetics computer Group, Program Manual for the Wisconsin Package, version 9, Genetics computer Group, 575 Science Drive, Madison, WI，1994）を用いて、植物由来のほとんど規定されていないトランスアシラーゼ（St.Pierre et al., Plant J. 14:703-713,1998; Dudareva et al., Plant J. 14:297-304,1998; および Yang et al., Plant Mol.Biol. 35:777-789,1997）および未知の機能の多数の寄託された配列の中でこの配列要素について検索することは、AT−FOR3（配列番号：36）およびAT−FOR4（配列番号：37）と称される二つの追加の縮重前進プライマーが設計されたこの要素の二つの可能な配列変異型（FYPFAGR（配列番号：39）およびYYPLAGR（配列番号：40））の識別を可能にした（図4）。この比較に用いられる配列を表1に挙げる。機能的に規定されたおよび規定されていない配列のこの領域を用いて、一つのこのような共通配列要素（DFGWGKP）（配列番号：41）が認められ且つ復帰プライマーAT−REV1（配列番号：38）の設計に用いられた縮重復帰プライマーを設計する目的のために保存領域を検索した（Taxus 配列のデータベース中の遺伝子への類似性の明らかな欠如は、図6の参照によって理解されうる）（図4）。4個の前進プライマーおよび1個の復帰プライマーのこのセットは、異なった数のイノシンを包含し、72〜216重に縮重していた。残りの4個のタンパク質分解ペプチドフラグメント配列（図2の配列番号：29、配列番号：31、配列番号：32、配列番号：33）は、プライマー設計にほとんど適していないだけでなく、他の関連配列と類似していないことが判明したので（NCBI  BLASTTM検索により）、これらは、Taxus トランスアシラーゼ遺伝子のより特異的な配列要素であるということが示唆された。
【００８０】
前進プライマー（150μM）および復帰プライマー（150μM）それぞれを、Taqポリメラーゼ（2mM  MgCl2を含有する3U／100μL反応）を用い且つ誘導T．cuspidata 細胞cDNAライブラリー（108PFU）を鋳型として用いて行われる別々のPCR反応において、次の、すなわち、94℃5分間、32サイクルの94℃で1分間、40℃で1分間および74℃で2分間、そして最後に74℃5分間の条件下で用いた。得られたアンプリコン（種々のプライマー組合せによって増幅した領域）を、アガロースゲル電気泳動（Sambrook et al.(eds.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd ed., vols.1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY，1989）によって分析し、それら生成物を、ゲルから抽出し、pCR  TOPOT7（Invitrogen, Carlsbad, California）中に連結し、E．coli TOPIOF’細胞（Invitrogen, Carlsbad, California）中に形質転換した。プラスミドDNAを、個々の形質転換細胞から製造し、インサートを完全に配列決定した。
【００８１】
プライマーAT−FOR1（配列番号：34）およびAT−REV1（配列番号：38）の組合せは、900−bpアンプリコンを生じた。そのアンプリコンのクローニングおよび配列決定は、“プローブ1”（配列番号：1）および“プローブ2”（配列番号：3）と称される二つの独特の配列を示した（表2）。残りのプライマー組合せについての結果を表2に示す。
【００８２】
G．ライブラリースクリーニング；
4種類の別々のライブラリースクリーニング実験を、プローブとしての放射性標識アンプリコン（上記のプローブ1〜12）のいろいろな組合せを用いて設計した。放射性標識プローブ1（配列番号：1）の使用は、TAX1（配列番号：27）およびTAX2（配列番号：25）の識別をもたらし、放射性標識プローブ6（配列番号：11）の使用は、TAX6（配列番号：44）の識別をもたらした。放射性標識プローブ10（配列番号：19）およびプローブ12（配列番号：23）の混合物から成るプローブは、TAX10（配列番号：44）およびTAX12（配列番号：55）の識別をもたらした。最後に、放射性標識プローブ3、4、5、7および9の混合物を含有するプローブは、TAX5、TAX7、TAX9およびTAX13（それぞれ、配列番号：49、51、59および57）の識別をもたらした。これら個々のライブラリースクリーニング実験の詳細を下に与える。
【００８３】
TAX1（配列番号：27）およびTAX2（配列番号：25）の識別は、PCRによって増幅されプローブ1（配列番号：1）の1μgを用いて行われ、得られたアンプリコンをゲル精製し、［α−32P］CTP（Feinberg and Vogelstein, Anal. Biochem. 137:216-217,1984）を用いてランダムに標識し、そしてハイブリダイゼーションプローブとして用いて、E．coli XL1−Blue MRF’において成長した5X105プラークのメンブランリフトをスクリーニングした。ファージDNAを、120℃で3〜4分間の迅速サイクルでオートクレーブ処理することによってナイロン膜に架橋させた。冷却後、膜を、2XSSC中で5分間、次に6XSSC（100mL全量中に0．5％SDS、5Xデンハート試薬、0．5gフィコール（400型，Pharmacia, Piscataway, New Jersey）、0．5gポリビニルピロリドン（PVP−10）および0．5gウシ血清アルブミン（Fraction V，Sigma, Saint Louis, Missouri）を含有する）中で5分間洗浄した。次に、ハイブリダイゼーションを、6XSSC、0．5％SDSおよび5Xデンハート試薬中において68℃で20時間行った。次に、ナイロン膜を、0．1％SDSを含む2XSSC中において25℃で5分間2回洗浄後、1XSSCおよび0．1％SDSを用いて68℃で2X30分間洗浄した。洗浄後、それら膜を、Kodak（Rochester, New York）XARフィルムに−70℃で17時間暴露した（Sambrook et al.(eds.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd ed., vols.1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY，1989）。
【００８４】
正のシグナルを示すプラーク（全約600）の内、60プラークを、2回の追加のハイブリダイゼーションによって精製した。精製されたλZAPIIクローンを、pBluescriptIISK（−）ファージミドとして in vivo で切り取り、E．coli SOLR細胞（Stratagene, La Jolla, California）中に形質転換させた。それぞれのcDNAインサートのサイズは、PCRによってT3およびT7プロモータープライマーを用いて決定し、サイズ選択されるインサート（＞1．5kb）を両末端から部分的に配列決定して、独特の配列種類に分類し且つそれぞれの完全長さ型を獲得した（必要ならば、新規に設計された5’−プローブを用いて更にスクリーニングすることによって）。
【００８５】
下に与えられる結果によって例示される同様の基本的スクリーニングプロトコールは、E．coli 中での発現による機能の試験のための完全長さインフレーム推定トランスアシラーゼクローンの全範囲を獲得する目的で、表2に記載のプローブの全てを用いて繰り返すことができる。プローブ1（配列番号：1）の場合、TAX1（配列番号：27および配列番号：28）およびTAX2（配列番号：25および配列番号：26）と称される二つの独特の完全長さクローンを単離した。
【００８６】
追加のトランスアシラーゼTAX6（配列番号：44）は、40ngの放射性標識プローブ6（配列番号：11）を用いてT．cuspidata ライブラリーをスクリーニングすることによって識別された。この完全長さクローンは、プローブ6（配列番号：11）に99％一致し、そしてその推定のアミノ酸配列は、プローブ6（配列番号：12）のその配列と99％一致し、このプローブはその同族体に位置していることが示された。
【００８７】
40ngの放射性標識プローブ10（配列番号：19）および40ngの放射性標識プローブ12（配列番号：23）の使用は、別々のハイブリダイゼーションスクリーニング実験において、完全長さトランスアシラーゼTAX10（配列番号：53および配列番号：54）およびTAX12（配列番号：55および配列番号：56）の識別をもたらした。
【００８８】
［α−32P］CTP（Feinberg and Vogelstein, Anal. Biochem. 137:216-217,1984）を用いてランダムに標識されたプローブ3、4、5、7および8（それぞれ、配列番号：5、7、9、13および15）をそれぞれ約6ng含有するプローブ混合物の使用は、完全長さトランスアシラーゼTAX5（配列番号：49）、TAX7（配列番号：51）およびTAX9（配列番号：50）を識別させたが、これらは、それぞれ、プローブ5（配列番号：9）、7（配列番号：13）および9（配列番号：17）に該当する。更に別の完全長さトランスアシラーゼTAX13（配列番号：57）も識別されたが、しかしながら、このトランスアシラーゼは、表2で識別されるプローブのいずれにも該当しない。
【００８９】
H．E．coli 中のcDNA発現；
適当なプラスミドの完全長さインサートフラグメントを切り取り、発現ベクターpCWori＋（Barnes, Methods Enzymol. 272:3-14,1996）中にインフレームでサブクローン化する。この手順には、標準的なPCRプロトコール（Innis et al., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press: San Diego, 1990）または Quick Change Mutagenesis System（Stratagene, La Jolla, California）のような市販キットを用いた発現ベクター中への方向性連結のために、内部制限部位の脱離および適当な5’−および3’制限部位の付加が含まれうる。例えば、プローブ6（配列番号：11）に該当する完全長さトランスアシラーゼは、ベクターpCWori＋（Barnes, Methods Enzymol. 272:3-14,1996）中への方向性連結のために、プライマーセット（5’−GGGAATTCCATATGGCAGGCTCAACAGAATTTGTGG−3’（配列番号：46）および3’−GTTTATACATTGATTCGGAACTAGATCTGATC−5’（配列番号：47））を用いて、推定の完全長さアセチルトランスフェラーゼ遺伝子を増幅させ且つNdeIおよびXbaI制限部位を5’−および3’末端にそれぞれ包含して得られた。組合せpCWori＋プラスミドは全て、ポリメラーゼ反応により、確実に誤りが導入されていないように配列決定することによって確認された後、標準法によってE．coli JM109中に形質転換される。
【００９０】
それぞれの完全長さインサートについて単離された形質転換細胞を、50μg／mLアンピシリンを補足した Luria-Bertani 培地50mL中において37℃でA600＝0．5まで成長させ、そして1−mL接種材料を、50μg／mLアンピシリンおよびチアミンHCl（320mM）を含有する Terrific Broth（500mL水中に6gバクト−トリプトン、DIFCO Laboratories, Spark, Maryland、12g酵母エキス，EM Science, Cherryhill, New Jersey, および2mLグリセロール）の大規模（100mL）培地に加え、28℃で24時間成長させた。1mMイソプロピルβ−D−チオガラクトシド（IPTG）を用いて誘導後約24時間に、細菌細胞を遠心分離によって採取し、30mMリン酸カリウム（pH7．4）または25mM  MOPSO（pH7．4）から成る検定用緩衝液中での音波処理によって破壊後、遠心分離して可溶性酵素標品を生じ、これをトランスアシラーゼ活性について検定することができる。
【００９１】
I．酵素検定；
アセチルCoA：タキサ−4（20），11（12）−ジエン−5α−オールO−アセチルトランスアシラーゼの具体的な検定は、前に記載されている（本明細書中に援用される、Walker et al., Arch.Biochem.Biophys. 364:273-279,1999）。概して、タキソイドアシルトランスアシラーゼの検定には、アセチルCoA（または他のアシルまたはアロイルCoAエステル）からタキサンアルコールへのCoA依存性アシル転移、およびGC−MS（またはHPLC−MS）分析による構造の確認のための生成物エステルの単離およびクロマトグラフィー分離が含まれる。このような検定の別の例については、Menhard and Zenk, Phytochemistry 50:763-774,1999 を参照されたい。
【００９２】
TAX6（配列番号：45）の活性は、Walker et al., Arch.Biochem.Biophys. 364:273-279,1999 に記載の標準的な条件下において、10−デアセチルバッカチンIII（400μm，Hauser Chemical Research inc., Boulder, CO）および［2−3H］アセチルCoA（0．45μCi，400μM（NEN，Boston, MA））を補基質として用いて検定した。TAX6（配列番号：45）酵素標品は、逆相放射性HPLC分析により、基準バッカチンIII（Dr.David Bailey of Hauser Chemical Research Inc., Boulder, COによって寛大に提供された）のものに正確に該当する7．0分の保持時間（一致した放射性およびUV痕跡）を有する単一生成物を生じた（図9Aおよび9B）。生合成生成物の同一性は、更に、組合せLC−MS（液体クロマトグラフィー−質量分析）分析によってバッカチンIIIと証明され（図10Aおよび10B）、これは、生成物および基準標準について一致した保持時間（8．6x0．1分）および質量スペクトルを示した。最後に、シリカゲル分析用TLCによって精製された生合成生成物の試料は、基準バッカチンIIIのものと一致する1H−NMRスペクトルを生じたので、この酵素を10−デアセチルバッカチンIII−10−O−アセチルトランスフェラーゼ（TAX6（配列番号：45））と確認し、該当する遺伝子が単離されたことも確認した。
【００９３】
【実施例】
1．トランスアシラーゼタンパク質および核酸配列；
上記のように、本発明は、トランスアシラーゼおよびトランスアシラーゼ特異的核酸配列を提供する。これらトランスアシラーゼ配列の本明細書中の条件を用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）は、現在、トランスアシラーゼをコードしている核酸配列を識別するおよび製造する好ましい方法として利用することができる。例えば、トランスアシラーゼ配列のPCR増幅は、植物cDNAライブラリーからの直接PCRによってかまたは植物細胞から抽出されるRNAを鋳型として用いた逆転写PCR（RT−PCR）によって行うことができる。トランスアシラーゼ配列は、植物ゲノムライブラリーまたは植物ゲノムDNAから増幅させることができる。直接PCRおよびRT−PCR両方の方法および条件は、当該技術分野において知られており、Innis et al., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press: San Diego, 1990 に記載されている。
【００９４】
PCRプライマーの選択は、増幅されるcDNA（または遺伝子）の部分にしたがって行われる。プライマーは、cDNA、読み取り枠、cDNA分子全体または遺伝子配列全体の小セグメントを増幅させるように選択することができる。増幅条件の変更は、異なった長さのプライマーを適応させるのに必要とされることがありうるが；このような考慮は、当該技術分野において周知であり、Innis et al., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press: San Diego, 1990; Sambrook et al.(eds.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd ed., vols.1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989; および Ausubel et al.(eds.) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York（定期改訂を含む）,1987 に論じられている。例として、追加のトランスアシラーゼに該当するcDNA分子は、TAX1およびTAX2配列の5’および3’末端間の相同性領域に対して向けられたプライマーを用いて増幅させることができる。このような反応のプライマー例は、
プライマー1：5’CCT  CAT  CTT  TCC  CCC  ATT  GAT  AAT3’（配列番号：42）
プライマー2：5’AAA  AAG  AAA  ATA  ATT  TTG  CCA  TGC  AAG3’（配列番号：43）
これらプライマーは、単に例示するものであり；多数の異なったプライマーが、与えられた核酸配列から誘導されうるということは当業者に理解されるであろう。これら増幅法によって得られるPCR産物の再配列決定は、増幅した配列の確認を容易にし且つトランスアシラーゼ配列間の天然の変異に関する情報を提供するように提示される。トランスアシラーゼ配列から誘導されるオリゴヌクレオチドは、このような配列決定法で用いることができる。
【００９５】
トランスアシラーゼ配列から誘導されるオリゴヌクレオチドは、本発明の範囲内に包含される。好ましくは、このようなオリゴヌクレオチドプライマーは、トランスアシラーゼ配列の少なくとも10〜20個連続したヌクレオチドの配列を含む。増幅特異性を増加させるために、これら配列の少なくとも15個、20個、25個、30個、35個、40個、45個または50個連続したヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプライマーを用いることもできる。
【００９６】
A．他の植物種中のトランスアシラーゼ；
トランスアシラーゼ遺伝子のオルソログは、Taxus 遺伝子の多数の他のメンバーに存在する。トランスアシラーゼ核酸配列の本明細書中の条件を用いて、これら他の種においてトランスアシラーゼオルソログをコードするcDNAおよび遺伝子の標準法によるクローニングがここで可能になる。上記のように、開示されたトランスアシラーゼ遺伝子のオルソログは、トランスアシラーゼ生物活性を有し、典型的には、NCBI Blast 2．0（暗黙値パラメーターに設定されるギャップ付きblastp）を用いて、開示されたトランスアシラーゼ配列のアミノ酸配列を含む完全長さ整列について計数される少なくとも50％配列同一性の所有を特徴とする。基準配列へのなお一層大きい類似性を有するタンパク質は、この方法で評価された場合、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも90％または少なくとも95％配列同一性のような増加した同一性百分率を示すであろう。
【００９７】
慣用的なハイブリダイゼーション法およびPCR増幅法は両方とも、トランスアシラーゼオルソログをコードしている配列をクローン化するのに利用することができる。これら技術の両方に共通するのは、トランスアシラーゼ核酸配列から誘導されるプローブまたはプライマーのハイブリダイゼーションである。更に、ハイブリダイゼーションは、ノーザンブロット、サザンブロットまたはPCRの場合に行われることがありうる。
【００９８】
直接PCR増幅を、様々な植物種のいずれかから製造されるcDNAまたはゲノムライブラリーについて行うことができるし、またはRT−PCRを、標準法を用いて植物細胞から抽出されるmRNAを用いて行うことができる。PCRプライマーは、トランスアシラーゼ配列の少なくとも10個連続したヌクレオチドを含むであろう。当業者は、トランスアシラーゼ核酸配列と、増幅される標的核酸との間の配列差が、より低い増幅効率を生じることがありうるということを理解するであろう。これを補うために、より長いPCRプライマーまたはより低いアニーリング温度を増幅サイクル中に用いることができる。より低いアニーリング温度を用いた場合、特異性を増加させるのに、ネスティド（nested）プライマー対を用いた増幅の逐次的循環が必要でありうる。
【００９９】
慣用的なハイブリダイゼーション技術には、ハイブリダイゼーションプローブを、好ましくは、放射性標識のような検出可能な標識と結合させるが、そのプローブは、好ましくは、少なくとも10ヌクレオチド長さである。当該技術分野において周知のように、ハイブリダイゼーションプローブの長さの増加は、増加した特異性を与える傾向がある。トランスアシラーゼ核酸配列から誘導される標識プローブは、植物cDNAまたはゲノムライブラリーにハイブリッド形成することができ、ハイブリダイゼーションシグナルは当該技術分野にいて知られている方法を用いて検出することができる。次に、ハイブリッド形成性コロニーまたはプラーク（用いられるライブラリーの種類に依る）を精製し、そのコロニーまたはプラーク中に含有されるクローン化配列を単離し且つ特性決定する。
【０１００】
或いは、トランスアシラーゼのオルソログは、発現ライブラリーのイムノスクリーニングによって得ることができる。開示されたトランスアシラーゼ核酸配列の本明細書中の条件を用いて、酵素は、異種発現系（例えば、E．coli）において発現され且つ精製され、そしてトランスアシラーゼに特異的な抗体（単クローン性または多クローン性）を生じさせるのに用いることができる。抗体は、本明細書中に示されるトランスアシラーゼアミノ酸配列に由来する合成ペプチドに対して生じることもありうる。抗体を生じさせる方法は、当該技術分野において周知であり、概して、Harlow and Lane, Antibodies,A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. 1988 に記載されている。次に、このような抗体を用いて、植物から製造される発現cDNAライブラリーをスクリーニングすることができる。このスクリーニングにより、トランスアシラーゼオルソログが決定されるであろう。選択されたcDNAは、スクリーニング検定および酵素活性検定によって確認することができる。
【０１０１】
B．TaxolTMトランスアシラーゼ変異型；
トランスアシラーゼアミノ酸配列（配列番号：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、45、50、52、54、56および58）および該当するcDNA（配列番号：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、44、49、51、53、55および57）の条件を用いて、これら配列の変異型をここで生じることができる。
【０１０２】
変異型トランスアシラーゼには、開示されたトランスアシラーゼ配列とはアミノ酸配列が異なるが、トランスアシラーゼ生物活性を保持しているタンパク質が含まれる。このようなタンパク質は、部位特異的突然変異誘発またはポリメラーゼ連鎖反応のような標準法を用いて、トランスアシラーゼをコードしているヌクレオチド配列を操作することによって生じることができる。最も簡単な変更には、1個またはそれ以上のアミノ酸の類似した生化学的性質を有するアミノ酸に代わる置換が含まれる。これらいわゆる“保存的置換”は、得られたタンパク質の活性への最小限の影響を有すると考えられる。表5に、タンパク質中の元のアミノ酸の代わりに置換されることができる且つ保存的置換と考えられるアミノ酸を示す。
【０１０３】
【表５】
0003730918.tif 000007
【０１０４】
酵素機能または他の特徴のより実質的な変化は、表4に記載されたものよりもあまり保存的でない置換を選択することによって、すなわち、（a）置換領域中のポリペプチド主鎖の、例えば、シートまたはらせんコンホメーションとしての構造；（b）標的部位の分子の電荷または疎水性；または（c）側鎖の嵩を維持することへのそれらの作用が一層有意に異なる残基を選択することによって得ることができる。概して、タンパク質特性の最大変化を生じると考えられる置換は、（a）親水性残基、例えば、セリルまたはトレオニルが疎水性残基、例えば、ロイシル、イソロイシル、フェニルアラニル、バリルまたはアラニルに代わって（またはによって）置換される；（b）システインまたはプロリンが、任意の他の残基に代わって（またはによって）置換される；（c）陽性側鎖を有する残基、例えば、リシル、アルギニルまたはヒスチジルが、陰性残基、例えば、グルタミルまたはアスパルチルに代わって（またはによって）置換される；または（d）嵩高側鎖を有する残基、フェニルアラニンが、側鎖を有していないもの、例えば、グリシンに代わって（またはによって）置換される置換であろう。これらアミノ酸置換または欠失または付加の作用は、一つの TaxolTM前駆体の別の  TaxolTM前駆体への変換を触媒する誘導タンパク質の能力を分析することによってトランスアシラーゼ誘導体について評価することができる。
【０１０５】
変異型トランスアシラーゼcDNA遺伝子は、標準的なDNA突然変異誘発技術、例えば、M13プライマー突然変異誘発によって生じることができる。これら技術の詳細は、Sambrook et al.(eds.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd ed., vols.1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, Ch.15 に与えられている。このような技術の使用により、トランスアシラーゼcDNAまたは遺伝子配列とは僅かに異なるが、なお、トランスアシラーゼ生物活性を有するタンパク質をコードしている変異型を生じることができる。本明細書中に具体的に開示されたものの誘導体であり、しかもヌクレオチドの欠失、付加または置換によって開示されたものとは異なるが、なお、トランスアシラーゼ生物活性を有するタンパクをコードしているDNA分子およびヌクレオチド配列は、本発明によって包含される。最も簡単な形でのこのような変異型は、分子が導入される具体的な生物のコドン使用傾向に適合するコーディング領域の変更により、開示された配列とは異なることがありうる。
【０１０６】
或いは、そのコーディング領域は、ヌクレオチド配列は実質的に変更されているが、それにもかかわらず、開示されたトランスアシラーゼアミノ酸配列と同一のまたは実質的に類似したアミノ酸配列を有するタンパクをコードするような方法でコーディング領域を変更するように、遺伝コードの縮重を利用することによって変更することができる。例えば、TAX2（配列番号：26）の15番目のアミノ酸残基はアラニンである。これは、ヌクレオチドコドントリプレットGGGによって読み取り枠（ORF）中にコードされる。遺伝コードの縮重のために、三つの他のヌクレオチドコドントリプレット、すなわち、GCA、GCCおよびGCTもアラニンをコードする。したがって、ORFのヌクレオチド配列は、コードされるタンパク質のアミノ酸組成またはタンパク質の特性に影響を与えることなく、これら三つのコドンのいずれかにこの位置で変化することができる。遺伝コードの縮重に基づいて、変異型DNA分子は、上記のような標準的なDNA突然変異誘発技術を用いてまたはDNA配列の合成によって、本明細書中に開示されたcDNAおよび遺伝子配列から誘導することができる。したがって、本発明は、トランスアシラーゼタンパク質をコードするが、遺伝コードの縮重によって開示された核酸配列とは異なる核酸配列も包含する。
【０１０７】
トランスアシラーゼの変異型は、上記のトランスアシラーゼアミノ酸および核酸配列とのそれらの配列同一性によって規定することもできる。上記のように、トランスアシラーゼは、トランスアシラーゼ生物活性を有し、開示されたトランスアシラーゼ配列と少なくとも60％配列同一性を共有する。このようなタンパク質をコードする核酸配列は、トランスアシラーゼのアミノ酸配列に遺伝コードを単純に適用することによって容易に決定することができ、そしてこのような核酸分子は、配列の部分に該当するオリゴヌクレオチドを組み立てることによって容易に製造することができる。
【０１０８】
前に述べられているように、トランスアシラーゼの変異型を識別するもう一つの方法は、核酸ハイブリダイゼーションである。トランスアシラーゼcDNAおよび遺伝子配列から誘導される核酸分子には、開示された TaxolTMトランスアシラーゼ核酸分子またはそれらのフラグメントにいろいろな条件下でハイブリッド形成する分子が含まれる。概して、ハイブリダイゼーション条件は、例えば、超高ストリンジェンシー、高ストリンジェンシーおよび低ストリンジェンシーの種類に分類される。約600塩基対長さまたはそれ以上であるプローブの条件を、三つの該当する種類で下に与える。
【０１０９】
超高ストリンジェンシー（90％配列同一性を共有する配列を検出する）：
5xSSC中において65℃で16時間ハイブリダイゼーション；
2xSSC中において室温で各15分間2回洗浄；
0．5xSSC中において65℃で各20分間2回洗浄。
【０１１０】
高ストリンジェンシー（80％配列同一性またはそれ以上を共有する配列を検出する）：
5xSSC中において65℃で16時間ハイブリダイゼーション；
2xSSC中において室温で各20分間2回洗浄；
1xSSC中において55℃で各30分間1回洗浄；。
【０１１１】
低ストリンジェンシー（50％を越える配列同一性を共有する配列を検出する）：
6xSSC中において室温で16時間ハイブリダイゼーション；
3xSSC中において室温で各20分間2回洗浄；
（20〜21℃）。
【０１１２】
ハイブリダイゼーションによって決定されるトランスアシラーゼをコードしている配列は、形質転換ベクター中に包含され且つ宿主細胞中に導入されて、トランスアシラーゼを生じることができる。
【０１１３】
2．植物中へのトランスアシラーゼの導入；
特定の植物特性の決定に関与するタンパク質をコードしているcDNA（または遺伝子）を単離した後、その特定の植物特性を変更するために、標準的な技法を用いて、そのcDNAをトランスジェニック植物中で発現させることができる。基本的なアプローチは、cDNAを形質転換ベクター中にクローン化して、cそのDNAが、植物細胞中でのcDNAの発現を支配する制御配列（例えば、プロモーター）に機能的に結合するようにすることである。次に、形質転換ベクターを、種々の技法の（例えば、エレクトロポレーション）いずれかによって植物細胞中に導入し、そして導入されたcDNAを含有する子孫植物を選択する。好ましくは、形質転換ベクターの全部または一部分が、植物細胞のゲノム中に安定して組み込まれている。植物細胞中に組み込まれていて、しかも導入されたcDNAおよび発現を制御するための結合した配列（導入された“導入遺伝子”）を含有する形質転換ベクターのその部分は、組換え発現カセットと称されることがありうる。
【０１１４】
導入された導入遺伝子を含有する子孫植物の選択は、変更された表現型の検出に基づいて行うことができる。このような表現型は、形質転換ベクター中にクローン化されたcDNAから直接的に生じることがありうるし、または形質転換ベクター中に包含される優勢な選択可能マーカー遺伝子の包含の結果として、化学物質（抗生物質など）への増加した耐性として現れることがありうる。
【０１１５】
クローン化cDNA配列を用いた形質転換による植物特性の変更の成功例は、技術的および科学的文献において充実している。当該技術分野における知見を詳しく説明するのに役立つ選択された実施例には、次が含まれる。
【０１１６】
米国特許第5，571，706号（“Plant Virus Resistance Gene and Methods”）
米国特許第5，677，175号（“Plant Pathogen Induced Proteins”）
米国特許第5，510，471号（“Chimeric Gene for the Transformation of Plants”）
米国特許第5，750，386号（“Pathogen-Resistance Transgenic Plants”）
米国特許第5，597，945号（“Plants Genetically Enhanced for Disease Resistance”）
米国特許第5，589，615号（“Process for the Production of Transgenic Plants with Increased Nutritional Value Via the Expression of Modified 2S Storage Albumins”）
米国特許第5，750，871号（“Transformation and Foreign Gene Expression in Brassica Species”）
米国特許第5，268，526号（“Overexpression of Phytochrome in Transgenic Plants”）
米国特許第5，262，316号（“Genetically Transformed Pepper Plants and Methods for their Production”）
米国特許第5，569，831号（“Transgenic Tomato Plants with Altered Polygalacturonase Isoforms”）
これら実施例には、形質転換ベクター選択、形質転換技術、および導入されるcDNAを過発現するように設計される構築物の構築の説明が含まれる。トランスアシラーゼアミノ酸配列および核酸配列の前述のおよび本明細書中の条件を考慮して、当業者が、増加したトランスアシラーゼ活性を有する植物を生じるために、cDNA、またはこれら分子の同族体または誘導体を植物中に導入することができるであろうということは、したがって明らかである。更に、植物中での1種類またはそれ以上のトランスアシラーゼの発現は、TaxolTMおよび関連化合物の増加した生産を有する植物を生じさせることができる。
【０１１７】
A．ベクター構築、プロモーターの選択；
植物細胞の安定なトランスフェクションにまたはトランスジェニック植物の樹立に適した多数の組換えベクターは、Weissbach and Weissbach, Methods for Plant Molecular Bilogy, Academic Press, 1989; および Gelvin et al., Plant and Molecular Biology Manual, Kluwer Academic Publishers, 1990 に記載のものを含めて、記載されている。典型的には、植物形質転換ベクターには、5’−および3’調節配列の転写制御下の一つまたはそれ以上のクローン化植物遺伝子（またはcDNA）および優勢な選択可能マーカーが含まれる。このような植物形質転換ベクターは、典型的には、プロモーター調節領域（例えば、誘導性または構成性の、環境的にまたは発生的に調節される、または細胞または組織特異的な発現を制御する調節領域）、転写開始出発部位、リボソーム結合部位、RNAプロセッシングシグナル、転写終結部位および／またはポリアデニル化シグナルも含有する。
【０１１８】
cDNAを発現するのに有用でありうる構成性植物プロモーターの例には、大部分の植物組織中で構成性高レベル発現を与えるカリフラワーモザイクウイルス（CaMV）35Sプロモーター（例えば、Odel et al., Nature 313:810,1985; Dekeyser et al., Plant Cell 2:591,1990; Terada and Shimanoto, Mol.Gen.Genet. 220:389,1990; および Benfey and Chua, Science 250:959-966,1990 を参照されたい）；ノパリンシンターゼプロモーター（An et al., Plant Physiol. 88:547,1988）；およびオクトピンシンターゼプロモーター（Fromm et al., Plant Cell 1:977,1989）が含まれる。Taxus 種のアグロバクテリウム属（Agrobacterium）に媒介される形質転換が行われているが、得られたカルス培養物は、TaxolTMを生じることが示されている（Han et al., Plant Science 95:187-196,1994）。したがって、強力なプロモーター（CaMVプロモーターのような）の影響下での記載のトランスアシラーゼの一つまたはそれ以上の包含は、このような形質転換された細胞における TaxolTMおよび関連タキソイドの生産収率を増加させると考えられる。
【０１１９】
環境、ホルモン、化学物質および／または発生のシグナルに応答して調節される種々の植物遺伝子プロモーターも、植物細胞におけるcDNAの発現に用いることができ、（a）熱（Callis et al., Plant Physiol. 88:965,1988; Ainley, et al., Plant Mol.Biol. 22:13-23,1993; および Gilmartin et al., The Plant Cell 4:839-949,1992）；（b）光（例えば、エンドウrbcS−3Aプロモーター，Kuhlemeier et al., Plant Cell 1:471,1989 およびトウモロコシrbcSプロモーター，Shaffner and Sheen, Plant Cell 3:997,1991）；（c）アブシジン酸のようなホルモン（Marcotte et al., Plant Cell 1:969,1989）；（d）創傷（例えば、wunI，Siebertz et al., Plant Cell 1:961,1989）；および（e）ジャスモン酸メチルまたはサリチル酸のような化学物質（Gatz et al., Ann.Rev.Plant Physiol. Plant Mol.Biol. 48:9-108,1997）によって調節されるプロモーターが含まれる。
【０１２０】
或いは、組織特異的（例えば、根、葉、花および種子）プロモーター（Carpenter et al., The Plant Cell 4:557-571,1992; Denis et al., Plant Physiol. 101:1295-1304,1993; Opperman et al., Science 263:221-223,1993; Stockhause et al., The Plant Cell 9:479-489,1997; Roshal et al., Embo.J. 6:1155,1987; Schernthaner et al., Embo J. 7:1249,1988; および Bustos et al., Plant Cell 1:839,1989）は、コーディング配列に融合されて、それぞれの器官において具体的な発現をすることができる。
【０１２１】
或いは、天然のトランスアシラーゼ遺伝子プロモーターを用いることができる。トランスアシラーゼ核酸配列の本明細書中の条件を用いて、当業者は、標準的な分子生物学技術を用いて該当するプロモーター配列を決定することができるということを理解するであろう。当業者は、有効なプロモーター活性を得るために、完全ではないプロモーター配列を用いることができるということも理解するであろう。この配列の特定の領域が有効なプロモーター活性を与えるかどうかの決定は、選択された配列領域をトランスアシラーゼcDNA（下に論及されるNOS3’調節領域のような適当な3’調節領域と連結して）に機能的に結合させ、トランスアシラーゼが発現されるかどうか決定することによって容易に確かめることができる。
【０１２２】
植物形質転換ベクターには、RNAプロセッシングシグナル、例えば、イントロンも含まれうるが、これは、導入遺伝子中のORF配列の上流または下流に位置しうる。更に、発現ベクターには、植物遺伝子の3’非翻訳領域、例えば、ジャガイモのPI−IIターミネーター領域のようなmRNAのmRNA安定性を増加させる3’ターミネーター領域、またはオクトピンまたはノパリンシンターゼ（NOS）3’ターミネーター領域からの追加の調節配列も含まれうる。天然のトランスアシラーゼ遺伝子3’調節配列を用いてもよい。
【０１２３】
最後に、上記のように、植物形質転換ベクターには、形質転換細胞の容易な選択を可能にする優勢な選択可能マーカー遺伝子も含まれうる。このような遺伝子には、抗生物質耐性遺伝子（例えば、ハイグロマイシン、カナマイシン、ブレオマイシン、G418、ストレプトマイシンまたはスペクチノマイシンへの耐性）および除草剤耐性遺伝子（例えば、ホスフィノトリシンアセチルトランスアシラーゼ）をコードしているものが含まれる。
【０１２４】
B．ベクター中の TaxolTMトランスアシラーゼ配列の整列；
形質転換ベクター中のトランスアシラーゼ配列の具体的な整列は、望まれる配列の発現の種類によって選択される。
【０１２５】
ほとんどの場合、増加したトランスアシラーゼ活性が望まれるが、トランスアシラーゼORFは、CaMV35Sプロモーターのような構成性高レベルプロモーターに機能的に結合している。上記のように、増加したトランスアシラーゼ活性は、トランスアシラーゼcDNAまたは遺伝子の変異型、例えば、トランスアシラーゼORFの正確なヌクレオチド配列とは異なるが、トランスアシラーゼ生物活性を保持しているタンパク質をコードする形を含有する形質転換ベクターを植物中に導入することによって得ることもできる。
【０１２６】
C．形質転換法および再生法；
単子葉類および双子葉類両方の植物細胞の形質転換および再生は、現在、常套法であり、適当な形質転換法は、専門家によって決定されうる。方法の選択は、形質転換される植物の種類によって異なり；当業者は、与えられる植物種類への具体的な方法の適合を認識するであろう。適当な方法には、植物プロトプラストのエレクトロポレーション；リポソームに媒介される形質転換；ポリエチレングリコール（PEG）に媒介される形質転換；ウイルスを用いた形質転換；植物細胞のマイクロインジェクション；植物細胞のミクロプロジェクティルボンバードメント（micro-projectile bombardment）；真空浸潤（vacuum infiltration）；およびアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）（AT）に媒介される形質転換が含まれるが、これに制限されるわけではない。植物を形質転換し且つ再生する典型的な方法は、この項の初めに挙げた特許文献に記載されている。
【０１２７】
D．形質転換された植物の選択；
形質転換ベクターを用いた植物の形質転換および再生後、形質転換ベクター中に包含される優勢な選択可能マーカーを用いて、形質転換された植物を選択することができる。典型的には、このようなマーカーは、形質転換された植物の実生に抗生物質耐性を与えるので、形質転換細胞の選択は、適当な濃度の抗生物質に実生を暴露することによって行うことができる。
【０１２８】
形質転換された植物を選択し且つ成熟するまで成長させた後、それらを、TaxolTMおよび関連化合物の生産レベルを評価する本明細書中に記載の方法を用いて検定することができる。
【０１２９】
3．異種発現系における組換え体 TaxolTMトランスアシラーゼの生産；
種々の酵母菌株および酵母由来ベクターは、異種タンパク質の発現に一般的に用いられる。例えば、Invitrogen（Carlsbad, California）から得られるピキア・パストリス（Pichia pastoris）発現系は、本発明を実施するのに用いることができる。このような系には、適当な Pichia pastoris 菌株、ベクター、試薬、形質転換細胞、配列決定用プライマーおよび培地が含まれる。入手可能な菌株には、KM71H（原栄養株）、SMD1168H（原栄養株）およびSMD1168（pep4突然変異株）が含まれる（Invitrogen Product Catalogue, 1998, Invitrogen, Carlsbad, CA）。
【０１３０】
非酵母真核ベクターは、本発明による変更されたヌクレオチドによってコードされるタンパク質の発現に等しく便利に用いることができる。転写、翻訳および翻訳後修飾を行うことができる遺伝的および細胞性の制御要素を含有する哺乳動物ベクター／宿主細胞系は、当該技術分野において周知である。このような系の例は、周知のバキュロウイルス系、遺伝子発現の制御を可能にするキイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）からの調節要素を利用するエクジソン誘導性発現系、および種々の哺乳動物細胞系における高レベル発現を可能にするシンドビスウイルス発現系であるが、これらはいずれも、Invitrogen, Carlsbad, California から入手可能である。
【０１３１】
一つまたはそれ以上のトランスアシラーゼをコードしているクローン化発現ベクターは、クローン化ヌクレオチドの発現のために、いろいろな細胞種類のいずれにも形質転換されうる。多数の異なった種類の細胞を用いて、修飾された核酸分子を発現することができる。例には、形質転換された細胞および形質転換されていない細胞を含めた、酵母、真菌、昆虫、哺乳動物および植物が含まれる。例えば、用いられうる一般的な哺乳動物細胞には、HeLa細胞、SW−527細胞（ATCC受託＃7940）、WISH細胞（ATCC受託＃CCL−25）、Daudi 細胞（ATCC受託＃CCL−213）、Mandin-Darby ウシ腎細胞（ATCC受託＃CCL−22）およびチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞（ATCC受託＃CRL−2092）が含まれる。一般的な酵母細胞には、Pichia pastoris（ATCC受託＃201178）およびパン酵母（Saccharomyces cerevisiae）（ATCC受託＃46024）が含まれる。昆虫細胞には、Drosophila melanogaster（ATCC受託＃CRL−10191）、ワタキバガ（cotton bollworm）（ATCC受託＃CRL−9281）およびトリコプルシア・ニ卵細胞ホモフラジェレート（Trichoplusia ni egg cell homoflagellates）からの細胞が含まれる。用いることができる魚類細胞には、ニジマス（ATCC受託＃CCL−55）、サケ（ATCC受託＃CRL−1681）およびゼブラダニオ（ATCC受託＃CRL−2147）からの細胞が含まれる。用いることができる両生類細胞には、ウシガエル、トノサマガエル（Rana castebelana）（ATCC受託＃CCL−41）からの細胞が含まれる。用いることができる爬虫類細胞には、ラッセルクサリヘビ（Russell's viper）（ATCC受託＃CCL−140）からの細胞が含まれる。用いられうる植物細胞には、クラミドモナス（Chlamydomonas）細胞（ATCC受託＃30485）、シロイヌナズナ（Alabidopsis）細胞（ATCC受託＃54069）およびトマト植物細胞（ATCC受託＃54003）が含まれる。これら細胞種類の多くは、一般的に用いられ、ATCCから、更には、Pharmacia（Uppsala, Sweden）および Invitrogen のような市販供給業者から入手可能である。
【０１３２】
発現されたタンパク質は、細胞内に蓄積することがありうるし、または細胞から分泌されることがありうる。次に、このような発現されたタンパク質を集め且つ精製することができる。次に、このタンパク質を、活性および安定性について特性決定することができるし、本発明によるいろいろな方法のいずれかを実施するのに用いることができる。
【０１３３】
4．トランスアシラーゼ特異的結合物質の生成；
本発明のトランスアシラーゼ酵素への抗体およびそれらのフラグメントは、酵素の精製に有用でありうる。トランスアシラーゼ配列の条件は、これら酵素への特異的抗体基剤結合物質の生産を可能にする。
【０１３４】
単クローン性抗体または多クローン性抗体は、トランスアシラーゼ、トランスアシラーゼの一部分またはそれらの変異型に生じることがありうる。最適には、これら抗原上のエピトープに対して生じた抗体は、酵素を特異的に検出するであろう。すなわち、トランスアシラーゼに対して生じた抗体は、トランスアシラーゼを認識し且つ結合すると考えられるが、他のタンパク質を認識することまたはそれに結合することはほとんどないと考えられる。抗体が抗原に特異的に結合しているという確認は、多数の標準的な免疫検定法のいずれか一つ、例えば、ウェスタンブロッティング，Sambrook et al.(eds.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd ed., vols.1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989 によって行うことができる。
【０１３５】
ある与えられた抗体標品（TAX1（配列番号：28）に対してマウスで生じた標品など）が、ウェスタンブロッティングによってトランスアシラーゼを特異的に検出することを確認するためには、全細胞タンパク質を細胞から抽出し、SDS−ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動にかける。次に、それらタンパク質をウェスタンブロッティングによって膜（例えば、ニトロセルロース）に移し、抗体標品をその膜と一緒にインキュベートする。膜を洗浄して非特異的に結合した抗体を除去後、特異的に結合した抗体の存在を、アルカリ性ホスファターゼのような酵素に結合した抗マウス抗体の使用によって検出するが、5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリルリン酸／ニトロブルーテトラゾリウムの適用は、免疫局在性（immuno-localized）アルカリ性ホスファターゼによる濃青色化合物の生産を引き起こす。
【０１３６】
トランスアシラーゼを特異的に検出する抗体は、この技法により、トランスアシラーゼバンド（トランスアシラーゼの分子量によって決定されるゲル上の位置を有する）だけを実質的に結合することが示されるであろう。他のタンパク質への抗体の非特異的結合は起こりうるが、（自動ラジオグラフィーによって定量することができる）ウェスタンブロット上のより弱いシグナルとして検出可能でありうる。この結合の非特異的性状は、ウェスタンブロット上において特異的抗トランスアシラーゼ結合による強い主要シグナルに相対して得られる弱いシグナルによって、当業者に認識されるであろう。
【０１３７】
トランスアシラーゼに特異的に結合する抗体は、本明細書中で“特異的結合物質”と称される分子の種類に属する。本発明のトランスアシラーゼに特異的に結合することができる特異的結合物質には、多クローン性抗体、単クローン性抗体、およびFab、F（ab’）2およびFvフラグメントのような単クローン性抗体フラグメント、更には、タンパク質上の一つまたはそれ以上のエピトープに特異的に結合することができる任意の他の物質が含まれうる。
【０１３８】
免疫源として用いるのに適した実質的に純粋なトランスアシラーゼは、トランスフェクションされた細胞、形質転換された細胞または野生型細胞から単離することができる。最終標品中のタンパク質濃度は、例えば、Amicon フィルター装置での濃縮により、数ミリグラム／ミリリットルのレベルに調整する。或いは、トランスアシラーゼのペプチドフラグメントを免疫源として用いてよい。このようなフラグメントは、標準法を用いて化学合成することができるし、または全トランスアシラーゼ酵素の切断後、所望のペプチドフラグメントの精製によって得ることができる。3または4アミノ酸長さ程度の短いペプチドは、主要組織適合遺伝子複合体（MHC）分子の場合のMHCクラスIまたはMHCクラスIIのような免疫系に提示された場合、免疫原性である。したがって、開示されたトランスアシラーゼアミノ酸配列の少なくとも3個、好ましくは、少なくとも4個、5個、6個またはそれ以上連続したアミノ酸を含むペプチドは、抗体を産生するための免疫原として用いることができる。
【０１３９】
タンパク質上の天然に存在するエピトープは、しばしば、ペプチド配列が直鎖状分子として認められる場合のペプチド中に隣接して配置されていないアミノ酸残基を含むので、抗体を産生させるのに、トランスアシラーゼアミノ酸配列からのより長いペプチドフラグメントを利用することが好都合でありうる。したがって、例えば、アミノ酸配列の少なくとも10個、15個、20個、25個または30個連続したアミノ酸残基を含むペプチドを用いてよい。自然のままのトランスアシラーゼへの単クローン性抗体または多クローン性抗体、またはそのペプチドフラグメントは、下記のように製造することができる。
【０１４０】
A．ハイブリドーマ融合による単クローン性抗体産生；
本明細書中に記載のように識別され且つ単離されるトランスアシラーゼ酵素の種々のエピトープのいずれかへの単クローン性抗体は、Kohler & Milstein, Nature 256:495,1975 の古典的方法またはその派生的方法によってネズミハイブリドーマから製造することができる。簡単にいうと、マウスに、数マイクログラムの選択されたタンパク質を数週間にわたって繰り返し接種する。次に、そのマウスを屠殺し、脾臓の抗体産生性細胞を単離する。それら脾臓細胞を、ポリエチレングリコールによってマウス骨髄腫細胞と融合させ、そしてアミノプテリンを含む選択培地（HAT培地）上でのその系の成長によって、過剰の非融合細胞を破壊する。首尾よく融合した細胞を希釈し、その希釈液のアリコートを微量滴定プレートのウェル中に入れ、そこで培養物の成長を続ける。抗体産生性クローンは、ELISAのような、Engvall, Enzymol. 70:419,1980 によって最初に記載されたような免疫検定法またはその派生的方法により、ウェルの上澄み液中の抗体の検出によって識別される。選択された正のクローンを増殖させ、それらの単クローン性抗体生成物を使用のために採取することができる。単クローン性抗体産生の詳細な手順は、Harlow & Lane, Antibodies,A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. 1988 に記載されている。
【０１４１】
B．免疫感作による多クローン性抗体産生；
一つのタンパク質の異種エピトープへの抗体を含有する多クローン性抗血清は、過発現されたタンパク質を用いて適当な動物を免疫感作することによって製造することができるが、これは、免疫原性を増加させるように変更されることがありうるしまたは未変更でありうる。有効な多クローン性抗体産生は、抗原および宿主種の両方に関する多数の因子によって影響される。例えば、小型分子は、他の分子より免疫原性が少ない傾向があり、担体およびアジュバントの使用を必要とすることがありうる。更に、宿主動物は、接種部位および用量に応答して、低力価抗血清を生じる不適切なまたは過剰の抗原用量によって異なる。多数の皮内部位に投与される低用量（ngレベル）の抗原は、最も信頼できると考えられる。ウサギに関する有効な免疫感作プロトコールは、Vaitukaitis et al., J.Clin.Endocrinol.Metab. 33:988-991,1971 に見出されうる。
【０１４２】
ブースター注射は、規則的な間隔で与えることができ、そして半定量的に、例えば、既知の濃度の抗原に対する寒天中の二重免疫拡散法によって決定されるその抗体力価が降下し始めた時に抗血清を採取することができる。例えば、Ouchterlony et al., Chapter 19, in Wier (ed.), Handbook of Experimental Immunology, Blackwell, 1973 を参照されたい。抗体のプラトー濃度は、通常は、0．1〜0．2mg／mL血清（約12μM）の範囲内である。抗原への抗血清の親和性は、慣用法を用いて競合的結合曲線を作成することによって決定される。
【０１４３】
C．cDNAの注射によって生じる抗体；
抗体は、本発明のトランスアシラーゼに対して、マウスのような実験動物においてそれら酵素を発現するDNAベクターの皮下注射によって生じさせることができる。実験動物への組換えベクターの供給は、Biolistic システムの掌中型を用いて行うことができる（Sanford et al., Particulate Sci.Technol. 5:27-37,1987, Tang et al., Nature (London) 356:153-154,1992 によって記載のように）。この目的に適した発現ベクターには、ヒトβアクチンプロモーターかまたはサイトメガロウイルス（CMV）プロモーターの転写制御下において酵素のcDNAを発現するものが含まれうる。動物体内でDNA発現を引き起こすように裸のDNAを動物に投与する方法は周知であり、例えば、米国特許第5，620，896号（“DNA Vaccines Against Rotavirus Infections”）；同第5，643，578号（“Immunization by Inoculation of DNA Transcription Unit”）；および同第5，593，972号（“Genetic Immunization”）、およびそこに引用される参考文献に記載されている。
【０１４４】
D．抗体フラグメント；
抗体フラグメントは、全抗体の代わりに用いることができ、原核生物宿主細胞において容易に発現させることができる。“抗体フラグメント”とも称される単クローン性抗体の免疫学的に有効な部分を製造するおよび使用する方法は周知であり、Better & Horowitz, Methods Enzymol. 178:476-496,1989; Glockshuber et al., Biochemistry 29:1362-1367,1990; および米国特許第5，648，237号（“Expression of Functional Antibody Fragments”）；同第4，946，778号（“Single Polypeptide Chain Binding Molecules”）；および同第5，455，030号（“Immunotherapy Using Single Chain Polypeptide Binding Molecules”）、およびそこに引用される参考文献に記載のものを含む。
【０１４５】
5．TaxolTM in vivo 産生；
組換えベクターおよびそれらベクターを発現するトランスジェニック生物の生成は、トランスアシラーゼの産生を制御するために重要である。これらベクターは、トランスアシラーゼ産生を減少させるのにまたはトランスアシラーゼ産生を増加させるのに用いることができる。トランスアシラーゼ産生の減少は、トランスアシラーゼをコードしている核酸配列を標的とするアンチセンス配列または触媒性核酸配列の包含によって生じるであろうと考えられる。逆に、増加したトランスアシラーゼ産生は、トランスアシラーゼをコードしている少なくとも一つの追加の配列をベクター中に含むことによって達せられうる。次に、これらベクターを宿主細胞中に導入することができ、それによって、トランスアシラーゼ産生を変化させることができる。増加した産生の場合、得られたトランスアシラーゼは、in vitro 系でも in vivo でも、TaxolTM、他のタキソイド、TaxolTM生合成経路の中間体および他の生成物の増加した産生のために用いることができる。
【０１４６】
TaxolTMおよび関連タキソイドの in vivo での増加した産生は、Taxus 属に由来する細胞などの宿主細胞を、一つまたはそれ以上のトランスアシラーゼをコードしている一つまたはそれ以上の核酸配列を含有するベクターを用いて形質転換することによって得ることができる。更に、異種または相同のトランスアシラーゼ配列は、構成性プロモーターまたは誘導性プロモーターの制御下に置くことができる。これは、増加したトランスアシラーゼ産生をもたらすので、トランスアシラーゼの発現および／または活性レベルによって引き起こされる TaxolTM産生への律速作用を全て排除するであろう。
【０１４７】
6．TaxolTM in vitro 製造；
現在、TaxolTMは、Hezari and Croteau, Planta Medica 63:291-295,1997 に記載の半合成法によって製造されている。この方法は、TaxolTM生合成経路における中間体である10−デアセチルバッカチンIIIまたはバッカチンIIIを抽出後、in vitro 技法を用いて TaxolTMの製造を完成させることを含む。TaxolTM生合成経路においてより多くの酵素が識別されるにつれて、TaxolTMを in vitro で完全に合成すること、または少なくとも、in vitro で行うことができる工程数を増加させることが可能になるかもしれない。したがって、本発明のトランスアシラーゼを用いて、合成法または半合成法での TaxolTMおよび関連タキソイドの製造を容易にすることができる。したがって、本発明は、増加したレベルの TaxolTMを生じるトランスジェニック生物のみならず、10−デアセチルバッカチンIIIおよびバッカチンIIIのような重要な中間体の増加したレベルを生じるトランスジェニック生物を生じることも可能にする。
【０１４８】
本発明の理論を多数の態様および実施例で詳しく説明し且つ記載してきたが、このような理論から逸脱することなく、本発明を配置および細部において変更することができるということは、当業者に明らかなはずである。本発明者は、請求の範囲の精神および範囲の範囲内である変更を全て請求の範囲に記載する。
【０１４９】
添付の配列表に挙げられる核酸配列およびアミノ酸配列は、ヌクレオチド塩基の標準的な文字略語およびアミノ酸の三文字コードを用いて示される。それぞれの核酸配列の一方の鎖のみを示すが、相補鎖は、示された鎖のいずれの意味によっても含まれると理解される。
【０１５０】
【配列表】
配列番号：1は、プローブ1のヌクレオチド配列である。
配列番号：2は、プローブ1の推定のアミノ酸配列である。
配列番号：3は、プローブ2のヌクレオチド配列である。
配列番号：4は、プローブ2の推定のアミノ酸配列である。
配列番号：5は、プローブ3のヌクレオチド配列である。
配列番号：6は、プローブ3の推定のアミノ酸配列である。
配列番号：7は、プローブ4のヌクレオチド配列である。
配列番号：8は、プローブ4の推定のアミノ酸配列である。
配列番号：9は、プローブ5のヌクレオチド配列である。
配列番号：10は、プローブ5の推定のアミノ酸配列である。
配列番号：11は、プローブ6のヌクレオチド配列である。
配列番号：12は、プローブ6の推定のアミノ酸配列である。
配列番号：13は、プローブ7のヌクレオチド配列である。
配列番号：14は、プローブ7の推定のアミノ酸配列である。
配列番号：15は、プローブ8のヌクレオチド配列である。
配列番号：16は、プローブ8の推定のアミノ酸配列である。
配列番号：17は、プローブ9のヌクレオチド配列である。
配列番号：18は、プローブ9の推定のアミノ酸配列である。
配列番号：19は、プローブ10のヌクレオチド配列である。
配列番号：20は、プローブ10の推定のアミノ酸配列である。
配列番号：21は、プローブ11のヌクレオチド配列である。
配列番号：22は、プローブ11の推定のアミノ酸配列である。
配列番号：23は、プローブ12のヌクレオチド配列である。
配列番号：24は、プローブ12の推定のアミノ酸配列である。
配列番号：25は、完全長さアシルトランスアシラーゼクローンTAX2（本明細書中において“TAX02”とも称される）のヌクレオチド配列である。
配列番号：26は、完全長さアシルトランスアシラーゼクローンTAX2の推定のアミノ酸配列である。
配列番号：27は、完全長さアシルトランスアシラーゼクローンTAX1（本明細書中において“TAX01”とも称される）のヌクレオチド配列である。
配列番号：28は、完全長さアシルトランスアシラーゼクローンTAX1の推定のアミノ酸配列である。
配列番号：29は、トランスアシラーゼペプチドフラグメントのアミノ酸配列である。
配列番号：30は、トランスアシラーゼペプチドフラグメントのアミノ酸配列である。
配列番号：31は、トランスアシラーゼペプチドフラグメントのアミノ酸配列である。
配列番号：32は、トランスアシラーゼペプチドフラグメントのアミノ酸配列である。
配列番号：33は、トランスアシラーゼペプチドフラグメントのアミノ酸配列である。
配列番号：34は、AT−FOR1  PCRプライマーである。
配列番号：35は、AT−FOR2  PCRプライマーである。
配列番号：36は、AT−FOR3  PCRプライマーである。
配列番号：37は、AT−FOR4  PCRプライマーである。
配列番号：38は、AT−REV1  PCRプライマーである。
配列番号：39は、AT−FOR3  PCRプライマーの設計を可能にしたアミノ酸配列変異型である。
配列番号：40は、AT−FOR4  PCRプライマーの設計を可能にしたアミノ酸配列変異型である。
配列番号：41は、AT−REV1  PCRプライマーの設計を可能にした共通アミノ酸配列である。
配列番号：42は、トランスアシラーゼを識別するのに有用なPCRプライマーである。
配列番号：43は、トランスアシラーゼを識別するのに有用なPCRプライマーである。
配列番号：44は、完全長さアシルトランスアシラーゼクローンTAX6（本明細書中において“TAX06”とも称される）のヌクレオチド配列である。
配列番号：45は、完全長さアシルトランスアシラーゼクローンTAX6の推定のアミノ酸配列である。
配列番号：46は、TAX6を識別するのに有用なPCRプライマーである。
配列番号：47は、TAX6を識別するのに有用なPCRプライマーである。
配列番号：48は、トランスアシラーゼ中で共通して見出される6アミノ酸モチーフである。
配列番号：49は、完全長さアシルトランスアシラーゼクローンTAX5（本明細書中において“TAX05”とも称される）のヌクレオチド配列である。
配列番号：50は、完全長さアシルトランスアシラーゼクローンTAX5の推定のアミノ酸配列である。
配列番号：51は、完全長さアシルトランスアシラーゼクローンTAX7（本明細書中において“TAX07”とも称される）のヌクレオチド配列である。
配列番号：52は、完全長さアシルトランスアシラーゼクローンTAX7の推定のアミノ酸配列である。
配列番号：53は、完全長さアシルトランスアシラーゼクローンTAX10のヌクレオチド配列である。
配列番号：54は、完全長さアシルトランスアシラーゼクローンTAX10の推定のアミノ酸配列である。
配列番号：55は、完全長さアシルトランスアシラーゼクローンTAX12のヌクレオチド配列である。
配列番号：56は、完全長さアシルトランスアシラーゼクローンTAX12の推定のアミノ酸配列である。
配列番号：57は、完全長さアシルトランスアシラーゼクローンTAX13のヌクレオチド配列である。
配列番号：58は、完全長さアシルトランスアシラーゼクローンTAX12の推定のアミノ酸配列である。
配列番号：59は、完全長さアシルトランスアシラーゼクローンTAX9（本明細書中において“TAX09”とも称される）のヌクレオチド配列である。
配列番号：60は、完全長さアシルトランスアシラーゼクローンTAX9の推定のアミノ酸配列である。
配列番号：61〜76は、図6に示されるアミノ酸配列である。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図1は、Taxol 生合成経路の概略を示す。タキサジエンシンターゼによるゲラニルゲラニル二リン酸のタキサジエンへの環化およびタキサジエン5α−ヒドロキシラーゼによるタキサジエン−5α−オールへのヒドロキシル化（a）、タキサ−4（20），11（12）−ジエン−5α−オール−O−アセチルトランスフェラーゼ（TAX1の遺伝子産物）によるタキサジエン−5α−オールのアセチル化（b）、タキサン−2α−O−ベンゾイルトランスフェラーゼ（TAX2；配列番号：25の遺伝子産物）による2−デベンゾイル“タキソイド型”中間体の10−デアセチルバッカチンIIIへの変換（c）、10−デアセチルバッカチンIII−10−O−アセチルトランスフェラーゼ（TAX6の遺伝子産物）による10−デアセチルバッカチンIIIのバッカチンIIIへの変換（d）、および Taxol を形成するためのバッカチンIIIへの側鎖結合（e）を示す。破線矢印は、未決定の若干の工程を示す。
【図２】  図2は、精製タキサジエノールアセチルトランスアシラーゼのendolysCおよびトリプシンタンパク質分解によって生じるペプチド配列を示す。
【図３】  図3A〜3Dは、いくつか異なったカラムからの溶離プロフィールを含む。
図3Aは、Source HR15Q（10X100mm）分離用スケール陰イオン交換クロマトグラフィー上のアセチルトランスアシラーゼの溶離プロフィールであり；
図3Bは、分析用スケール Source HR15Q（5X50mm）カラムクロマトグラフィー上の溶離プロフィールであり；そして
図3Cは、セラミックヒドロキシアパタイトカラム上の溶離プロフィールである。実線は、280nmでのUV吸光度であり；点線は、相対トランスアセチラーゼ活性（dpm）であり；そして陰影線は溶離勾配（塩化ナトリウムまたはリン酸ナトリウム）である。
図3Dは、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー後のタキサジエン−5α−オールアセチルトランスアシラーゼ（50kDa）の純度を示す銀染色された12％SDS−PAGEの写真である。微量の混入物が約35kDaで存在する。
【図４】  図4は、12種類のハイブリダイゼーションプローブが得られた誘導 Taxus 細胞ライブラリーcDNAを増幅させるのに用いられた4種類の前進（AT−FOR1、AT−FOR2、AT−FOR3、AT−FOR4）および一つの復帰（AT−REV1）縮重プライマーを示す。イノシン位置を“I”で示す。前進プライマーはそれぞれ、別々のPCR反応で復帰プライマーと対合した。プライマーAT−FOR1（配列番号：34）およびAT−FOR2（配列番号：35）は、トリプシンフラグメント配列番号：30から設計され；残りのプライマーは、配列番号：30に基づくデータベース検索によって誘導された。
【図５】  図5A〜5Gは、完全長さアシルトランスアシラーゼクローンTAX1（配列番号：28）およびTAX2（配列番号：25）を用いて形質転換されたイソプロピルβ−D−チオガラクトシド（IPTG）に誘導されるE．coli JM109細胞からの可溶性酵素抽出物と一緒のタキサジエン−5α−オールのインキュベーション中に形成される生合成酢酸タキサジエン−5α−イルの連結ガスクロマトグラフィー−質量分析（GC−MS）分析法によって得られたデータを示す。
図5Aおよび5Bは、基準タキサジエン−5α−オールのGCおよびMSそれぞれのプロフィールを示し；
図5Cおよび5Dは、基準酢酸タキサジエン−5α−イルのGCおよびMSそれぞれのプロフィールを示し；
図5Eは、完全長さクローンTAX1（配列番号：27）を用いて形質転換されたE．coli JM109に由来する可溶性酵素画分と一緒のタキサジエン−5α−オールおよびアセチル補酵素Aのインキュベーション後の、タキサジエン−5α−オール（11．16分）、酢酸タキサジエン−5α−イル（11．82分）、脱水タキサジエン−5α−オール（“TOH−H2O”ピーク）、および混入物フタル酸ビス−（2−エチルヘキシル）（“BEHP”ピーク，可塑剤，CAS117−81−7，緩衝液から抽出される）のGCプロフィールを示す。
パネルFは、組換え体酵素によって生合成形成された酢酸タキサジエン−5α−イルの質量スペクトルを示し（図5EのGCプロフィール中の11．82分ピーク）；
図5Gは、完全長さクローンTAX2を用いて形質転換されたE．coli JM109細胞に由来する可溶性酵素画分と一緒のインキュベーションによってタキサジエン−5α−オールおよびアセチル補酵素Aから生じる生成物のGCプロフィールを示す（このクローンがトランスアシラーゼ反応において不活性であることを示す酢酸タキサジエン−5α−イルの不存在に留意されたい）。
【図６】  図6A〜6Nは、表1に挙げたTAX1（配列番号：28）およびTAX2（配列番号：25）の推定のアミノ酸配列のパイルアップ（pileup）を示す。太字斜体下線（および太字斜体）の残基は、数少ない保存領域を示す。前進矢印（左から右へ）は、縮重前進PCRプライマーが設計された保存領域を示す。逆矢印（右から左へ）は、復帰PCRプライマーが設計された領域を示す（図4を参照されたい）。
【図７】  図7は、Taxus トランスアシラーゼ配列（プローブ1〜12，TAX1（配列番号：28）およびTAX2）と、表1に記載の GenBank データベースから得られる規定のおよび未知の機能の最も近縁の配列との間の推定のペプチド配列関係の系統樹を示す。
【図８】  図8は、TaxolTMおよび関連の後期タキソイド中に存在するオキセタンの形成について仮定される生合成スキームを示し、この場合、4（20）−エン−5α−オールを酢酸4（20）−エン−5α−イルに変換後、4（20）−エポキシ−5α−アセトキシ基へのエポキシ化、そして次に、4−アセトキシオキセタン残基への分子内転位を行う。
【図９】  図9Aおよび9Bは、組換え体アセチルトランスフェラーゼ（TAX6（配列番号：45）の遺伝子産物）によって10−デアセチルバッカチンIIIおよび［2−3H］アセチルCoAから生じる生合成生成物（Rt＝7．0±0．1分）の放射性HPLC（高性能液体クロマトグラフィー）分析を示す。
図9AはUVプロフィールを示し、図9Bは一致放射能プロフィールを示すが、これらは両方とも、基準バッカチンIIIの保持時間と一致する。酵素標品については、推定上のDBAT遺伝子を含むpCWori+ベクターを用いて形質転換されたE．coli 細胞を、アンピシリンを補足した5mL Luria-Bertani 培地中において37℃で一晩成長させ、この接種材料から1mLを、1mLにつき1mM  IPTG、1mMチアミンHClおよび50μgアンピシリンを補足した100mL Terrifec Broth 培地（500mL水中に、6gバクトトリプトン，Difco Laboratories, Spark, MD、12g酵母エキス，EM Science, Cherryhill, NJおよび2mLグリセロール）中に加え且つ成長させた。24時間後、この細菌を遠心分離によって採取し、20mLの検定緩衝液（25mM Mopso，pH7．4）中に再懸濁させた後、0〜4℃での音波処理によって破壊した。得られたホモジネートを15，000gで遠心分離して破片を除去し、1mLアリコートの上澄みを、10−デアセチルバッカチンIII（400μM）および［2−3H］アセチル補酵素A（0．45μCi，400μM）と一緒に31℃で1時間インキュベートした。この反応混合物を、エーテルを用いて抽出し、溶媒を真空中で濃縮した。粗生成物（5回のこのような検定からプールされる）を、シリカゲル薄層クロマトグラフィー（TLC；70：30の酢酸エチル：ヘキサン）によって精製した。基準バッカチンIII（標準に関してRf＝0．45）と共泳動したバンドを単離し、放射性HPLCによって分析して、上記の新規な放射性生成物を示した。中空ベクター対照を用いて形質転換されたE．coli の抽出物は、同一の方法によって検定された場合、検出可能な生成物を生じなかった。
【図１０】  図10Aおよび10Bは、10−デアセチルバッカチンIIIおよびアセチルCoAを補基質として用いて組換え体アセチルトランスフェラーゼによって生じる生合成生成物（Rt＝8．6±0．1分）（図10A）および基準バッカチンIII（Rt＝8．6±0．1分）（図10B）についての、組合せ逆相HPLC−大気圧化学イオン化MS（質量分析法）分析からの結果を示す。診断用質量スペクトルフラグメントは、m／z605（M＋NH4+）、587（MH+）、572（MH+−CH3）、527（MH+−CH3COOH）および509（MH+−（CH3COOH＋H2O））にある。組換え体酵素の製造および生成物単離については、図9Aおよび9Bの説明を参照されたい。
【図１１】  図11は、2−デベンゾイル−7，13−ジアセチルバッカチンIII：塩化メチレン、無水酢酸、4−（N，N’−ジメチルアミノ）ピリジン、トリエチルアミン、25℃で18時間（a）、テトラヒドロフラン、Red−Al（トルエン中65＋％）、0℃で30分間（b）の合成および利用、およびベンゾイル補酵素Aの存在下においてタキサン−2α−O−ベンゾイルトランスフェラーゼによって触媒される反応（c）の概略を示す。
【図１２】  図12Aおよび12Bは、組換え体TAX2ベンゾイルトランスフェラーゼ（配列番号：25）によって2−デベンゾイル−7，13−ジアセチルバッカチンIIIおよび［7−14C］ベンゾイルCoAから生じる生合成生成物（Rt＝21．9±0．1分）の放射性HPLC分析を示す。図12Aは一致UVプロフィール（A228）を示し、図12Bは放射能プロフィール（mVで）を示すが、これらは両方とも、基準7，13−ジアセチルバッカチンIIIの保持時間と正確に一致する。中空ベクター対照を用いて形質転換された対照E．coli の抽出物は、同一の方法によって検定された場合、検出可能な生成物を生じなかった。
【図１３】  図13Aおよび13Bは、2−デベンゾイル−7，13−ジアセチルバッカチンIIIおよびベンゾイルCoAを補基質として用いてTAX2（配列番号：25）組換え体ベンゾイルトランスフェラーゼによって生じる生合成生成物（Rt＝43．6±0．1分）（図13A）および基準7，13−ジアセチルバッカチンIII（Rt＝43．6±0．1分）（図13B）についての、連結逆相HPLC−大気圧化学イオン化MS分析からの結果を示す。診断用イオンは、m／z688（P＋NH4+）、671（PH+）、652（P+−H2O）、611（PH+−CH3COOH）、593（m／z652−CH3COO）、551（m／z611−CH3COOH）および489（m／z611−PhCOOH）にある。
【図１４】  図14は、TAX01、TAX02、TAX05、TAX06、TAX07、TAX09、TAX10、TAX12、TAX13（それぞれ、配列番号：28、26、50、45、52、60、54、56および58）と称される単離された完全長さT．cuspidata アシルトランスフェラーゼ、およびPCHCBT（Dianthus（Entrez データバンクにあるタンパク質識別番号［PID］cab06427および GenBank 受託番号Z84383）のアントラニル酸ヒドロキシシンナモイル／ベンゾイルトランスフェラーゼを示す）の推定のアミノ酸配列の中での対の関係の系統樹を示す。垂直軸に沿った距離は、配列間の相違に比例し；水平軸に沿った距離は有意ではない。
【図１５】  図15A〜15Dは、6種類のトランスアシラーゼ（TAX05、TAX07、TAX09、TAX10、TAX12およびTAX13）、更には、TAX01（タキサジエン−5α−オールアセチルトランスフェラーゼ、受託番号AF190130）、TAX02（タキサン−2α−O−ベンゾイルトランスフェラーゼ、受託番号AF297618）、TAX06（10−デアセチルバッカチンIII−0−O−アセチルトランスフェラーゼ、受託番号AF193765）およびPCHCBT（アントラニル酸ヒドロキシシンナモイル／ベンゾイルトランスフェラーゼ、受託番号Z84383）の推定のアミノ酸配列比較を示す。黒枠内の残基は、比較される配列の少なくとも3個の位置同一性を示し；同様のアミノ酸を太字斜体下線で示す。整列は、PileUp プログラム（Wisconsin Package Version 10；Genetics Computer Group, Madison, WI）を用いて作成した。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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