(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ディールス−アルダー反応法であって、
（ａ）構造式
【化１】
0003816004.tif 000015
（式中、Ｒ3は、Ｈ及びＲ1ＣＯ−からなる群から選択され、ここで、Ｒ1は、炭素原子５〜７個の単環式アリール又は低級アルキルであり、Ｒ4、Ｒ5及びＲ6は、独立して、Ｈ、ヒドロキシル及び低級アルキルからなる群から選択され、Ｒ7は、炭素原子１〜１０個のヒドロカルビル基である）
を有する５，７−ジエンステロールと、ジエノフィルと、触媒量の外来性エチレン性不飽和Ｃ12〜Ｃ24脂肪族カルボン酸とを混合する工程と、
（ｂ）前記５，７−ジエンステロールのディールス−アルダー付加物の形成を可能にするのに十分な期間、前記混合物を維持する工程と
を含む方法（ここで、低級アルキルとは、炭素原子１〜６個のアルキル基をいう）。
【請求項２】
前記ジエノフィルを、（ｉ）酸化性ジエノフィル前駆体及び（ii）前記前駆体を酸化させて前記ジエノフィルを形成するのに有効な酸化剤からその場で生成し、前記ジエノフィル前駆体が構造式Ｘ−ＮＨ−ＮＨ−Ｙ（式中、Ｘ及びＹは、−ＣＯＯＨ、−ＣＨＯ、−ＮＯ2、−ＣＮ、−ＣＯＯＲ8及び−ＣＯＲ8（ここで、Ｒ8は低級アルキルである）からなる群から独立して選択される電子吸引基から選択されるか、あるいは、Ｘ及びＹは、互いに結合して−（ＣＯ）−Ｚ−（ＣＯ）−架橋を形成し、ここで、Ｚは、４個までの環置換基を有する炭素原子５〜７個の単環式アリーレン、低級アルキレン又は−ＮＲ2であり、ここで、Ｒ2は、低級アルキル、Ｈ又は炭素原子５〜７個及び５個までの環置換基の単環式アリールであり、前記環置換基は、−（ＣＨ2）n−ＮＨ2、−（ＣＨ2）n−ＣＯＯＨ、−ＮＯ2、ハロゲン及び低級アルキルからなる群から選択され、ｎは、０〜６の整数である）を有する、請求項１記載の方法（ここで、低級アルキルとは、炭素原子１〜６個のアルキル基をいう）。
【請求項３】
前記酸化性ジエノフィルがフタルヒドラジドである、請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記酸化剤が次亜塩素酸塩である、請求項２記載の方法。
【請求項５】
（ａ）構造式
【化２】
0003816004.tif 000016
（式中、Ｒ3は、Ｈ及びＲ1ＣＯ−からなる群から選択され、ここで、Ｒ1は、炭素原子５〜７個の単環式アリール又は低級アルキルであり、Ｒ4、Ｒ5及びＲ6は、独立して、Ｈ、ヒドロキシル及び低級アルキルからなる群から選択され、Ｒ7は、炭素原子１〜１０個のヒドロカルビル基である）
を有する５，７−ジエンステロールと、
（ｂ）ジエノフィルと、
（ｃ）少なくとも０．０２７５重量％の外来性エチレン性不飽和Ｃ12〜Ｃ24脂肪族カルボン酸と
を含むディールス−アルダー反応混合物（ここで、低級アルキルとは、炭素原子１〜６個のアルキル基をいう）。
【請求項６】
前記エチレン性不飽和Ｃ12〜Ｃ24脂肪酸がリノレン酸、リノール酸、オレイン酸又はこれらの混合物である、請求項５記載の混合物。
【請求項７】
前記５，７−ジエンステロイド化合物がコレスタ−５，７，２４−トリエン−３−オールである、請求項５記載の混合物。
【請求項８】
前記ジエノフィルが構造式Ｘ−Ｒ＝Ｒ−Ｙ（式中、Ｒは、いずれもＮ又はＣ−Ｑであり、ここで、Ｑは、Ｈであるか、いっしょになって第三の結合を形成し、Ｘ及びＹは、−ＣＯＯＨ、−ＣＨＯ、−ＮＯ2、−ＣＮ、−ＣＯＯＲ8及び−ＣＯＲ8（ここで、Ｒ8は低級アルキルである）からなる群から独立して選択される電子吸引基から選択されるか、あるいは、Ｘ及びＹは、互いに結合して−（ＣＯ）−Ｚ−（ＣＯ）−架橋を形成し、ここで、Ｚは、低級アルキレン、４個までの環置換基を有する炭素原子５〜７個の単環式アリーレン又は−ＮＲ2であり、ここで、Ｒ2は、Ｈ、炭素原子５〜７個及び５個までの環置換基の単環式アリール又は低級アルキルであり、前記環置換基は、−（ＣＨ2）n、−ＮＨ2、−ＣＯＯＨ、−ＮＯ2、ハロゲン及び低級アルキルからなる群から選択され、ｎは、０〜６の整数である）を有する、請求項５記載の混合物（ここで、低級アルキルとは、炭素原子１〜６個のアルキル基をいう）。
【請求項９】
（ａ）構造式
【化３】
0003816004.tif 000017
（式中、Ｒ3は、Ｈ及びＲ1ＣＯ−からなる群から選択され、ここで、Ｒ1は、炭素原子５〜７個の単環式アリール又は低級アルキルであり、Ｒ4、Ｒ5及びＲ6は、独立して、Ｈ、ヒドロキシル及び低級アルキルからなる群から選択され、Ｒ7は、炭素原子１〜１０個のヒドロカルビル基である）
を有する５，７−ジエンステロールを含むステロールの混合物をジエノフィルと反応させて前記５，７−ジエンステロールをディールス−アルダー付加物に転換する工程と、
（ｂ）前記ディールス−アルダー付加物又は改質されたディールス−アルダー付加物を前記混合物から分別する工程と
を含む、ステロールの混合物から５，７−ジエンステロールを単離するための方法であって、
少なくとも触媒量のエチレン性不飽和Ｃ12〜Ｃ24脂肪族カルボン酸を前記混合物に加えることを含む方法（ここで、低級アルキルとは、炭素原子１〜６個のアルキル基をいう）。
【請求項１０】
前記エチレン性不飽和Ｃ12〜Ｃ24脂肪酸がリノレン酸、リノール酸、オレイン酸又はこれらの混合物である、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
５，７−ジエンステロールとジエノフィルとの間のディールス−アルダー付加物の形成を促進するためのエチレン性不飽和Ｃ12〜Ｃ24脂肪族カルボン酸の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は、ディールス−アルダー反応を活性化する方法に関する。より具体的には、本発明は、ステロール５，７−ジエンにおけるディールス−アルダー反応の活性化に関する。
【０００２】
発明の背景
ステロールの工業生産のための特定の方法では、保護工程として及びさらに精製のために、ディールス−アルダー付加が有用である。ディールス−アルダー付加は、２５−ヒドロキシビタミンＤ3の工業生産に有用であることがわかっている。現在の技術水準では、工業的な２５−ヒドロキシビタミンＤ3生産の経済性はディールス−アルダー反応の収率によって強く影響される。したがって、工業的なステロール生産においてディールス−アルダー反応の収率を最大限にすることが望ましい。
【０００３】
ディールス−アルダー反応は、ジエンへのジエノフィルの周知の化学的付加である。ディールス−アルダー反応を活性するための教本的方法は、電子放出基を使用してπ供与体ジエンの電子密度を高める。同様に、電子吸引基を使用してπ受容体の電子密度を減らし、それにより、その求電子性を高める。一部の工程、たとえば工業的なステロール生産では、官能基を提供してディールス−アルダー反応のための電子供与体を活性化することは可能ではないし、実践的でもない。工業的なステロール生産においてディールス−アルダー反応を促進するための手段が求められる。
【０００４】
当該技術では、２５−ヒドロキシビタミンＤ3の半合成工業生産は、二重突然変異酵母の発酵から５，７，２４−コレスタトリエニルエステルを鹸化させて遊離５，７，２４−コレスタトリエノール（７−デヒドロコレステロール又はプロビタミンＤ3としても知られる）を形成することを伴う。ここで、突然変異酵母は、開示を引用例として含める米国特許第５，４６０，９４９号に記載されているように、ジモステロール−２４−メチルトランスフェラーゼにおけるｅｒｇ６突然変異及びエルゴスタ−５，７，２４（２８）−トリエノール−２２−デヒドロゲナーゼ酵素（ｅｒｇ５）の発現における突然変異を含む。
【０００５】
鹸化手順は、特に有機物におけるエステル加水分解が望まれる場合、当該技術で一般的である。鹸化反応は、強塩基による、通常は加熱を伴う処理を含む。
【０００６】
鹸化反応生成物はまた、スクアレン、飽和及び不飽和脂肪酸を含む脂肪酸ならびに非共役化ジエノール及び一不飽和ステロールを含むことができる他のステロールを含む。コレスタトリエノール及び、ラノステロール、４，４−ジメチルチモステロール、４−メチルチモステロール、チモステロール、コレスタ−７，２４−ジエン−３β−オールを含む他のステロールをその混合物から分別するためには、通常、pHを約７〜８pH単位に調節し、鹸化物をヘプタンで抽出し、ヘプタン抽出物を水洗する。洗浄したヘプタン抽出物を濃縮し、酢酸エチルと混合する。これは「ステロール抽出物」と呼ばれる。
【０００７】
従来技術のディールス−アルダー保護及び／又は精製工程では、ステロール抽出物をジエノフィルと反応させてコレストラトリエノールの５，７−ジエンのディールス−アルダー付加物を形成し、その間、非共役化ジエノール及び他のステロールを未反応のままにしておく。ジエノフィルは通常、フタルヒドラジドに対する水性漂白剤（次亜塩素酸ナトリウム）の反応からその場で生成されたフタルヒドラジンである。そして、ディールス−アルダー付加物をクロマトグラフィーによって未反応の酵母ステロール混合物から分別し、コレスタトリエノールを再生し、さらに精製し、使用して２５−ヒドロキシビタミンＤ3を製造する。この反応シーケンスは、開示を引用例として含める米国特許第５，３９１，７７７号に例示されている。
【０００８】
米国特許第５，２０８，１５２号は、基質が、離脱基を有する環式共役化ジエンである場合のディールス−アルダー反応の触媒を記載している。これらのジエンはステロールとは似ていない。
【０００９】
米国特許第４，５０３，１９５号は、ディールス−アルダー触媒としてのジ及びトリフェニル化カチオンラジカルポリマー（カチオンラジカルはＶＡ族元素、たとえば窒素、リン又はヒ素である）の使用を開示している。
【００１０】
米国特許第４，４１３，１５４号及び米国特許第４，３８４，１５３号は、モレキュラーシーブ／ゼオライト上での１，３−ブタジエンと４−ビニルシクロヘキセンとのディールス−アルダー反応を開示している。
【００１１】
発明の概要
本発明にしたがって、少なくとも触媒量の不飽和Ｃ12〜Ｃ24脂肪族カルボン酸の存在がステロイド５，７−ジエンとジエノフィル（好ましくは、酸化性ジエノフィル前駆体及び酸化剤からその場で生成される）との間のディールス−アルダー付加物の形成を促進するということが期せずしてわかった。本発明によると、少なくとも触媒量の不飽和Ｃ12〜Ｃ24脂肪族カルボン酸を外来的にディールス−アルダー反応に提供する。
【００１２】
ステロイド５，７−ジエンは、いかなる当該化合物であってもよい。試験した当該化合物はすべて、少なくとも触媒量のＣ12〜Ｃ24不飽和カルボン酸が加えられると、ディールス−アルダー反応を起こし、付加物の収率が高まった。エルゴステロール及び５，７，２４−コレスタトリエノールが好ましいステロイド５，７−ジエンであり、５，７，２４−コレスタトリエノールが特に好ましい。
【００１３】
本発明はまた、以下の工程を含む、５，７−ジエンステロールとでディールス−アルダー付加物を形成する改良された方法を意図する。５，７−ジエンステロールとジエノフィルと混合して反応混合物を形成し、それによって５，７−ジエンステロールをディールス−アルダー付加物に転換する。５，７−ジエンステロールは構造式
【００１４】
【化４】
0003816004.tif 000002
【００１５】
（式中、Ｒ3は、Ｈ及びＲ1ＣＯ−からなる群から選択され、Ｒ1は、炭素原子５〜７個の単環式アリール又は低級アルキルであり、Ｒ4、Ｒ5及びＲ6は、独立して、Ｈ、ヒドロキシル及び低級アルキルからなる群から選択され、Ｒ7は、Ｃ1〜Ｃ10ヒドロカルビル基である）
を有する。一つの好ましい実施態様では、５，７−ジエンステロイド化合物はコレスタ−５，７，２４−トリエン−３−オールである。場合によっては、改質されたディールス−アルダー付加物を提供するため、ディールス−アルダー付加物のさらなる化学転換を実施する。ディールス−アルダー付加物又は改質されたディールス−アルダー付加物を混合物から分別する。
【００１６】
本発明は、少なくとも触媒量のエチレン性不飽和Ｃ12〜Ｃ24脂肪酸をディールス−アルダー反応混合物に加えることを意図する。好ましくは、エチレン性不飽和Ｃ12〜Ｃ24脂肪酸は、リノレン酸、リノール酸、オレイン酸又はこれら二種もしくは三種すべて酸の混合物である。
【００１７】
一つの実施態様では、ジエノフィルは構造式Ｘ−Ｒ＝Ｒ−Ｙを有する。式中、Ｒ基は、いずれもＮ又はＣ−Ｑであり、Ｑ基は、Ｈであるか、いっしょになって第三の結合を形成し、Ｘ及びＹは、−ＣＯＯＨ、−ＣＨＯ、−ＮＯ2、−ＣＮ、−ＣＯＯＲ8及び−ＣＯＲ8（Ｒ8は低級アルキルである）からなる群から独立して選択される電子吸引基から選択されるか、あるいは、Ｘ及びＹは、互いに結合して−（ＣＯ）−Ｚ−（ＣＯ）−架橋を形成し、Ｚは、低級アルキレン、４個までの環置換基を有する炭素原子５〜７個の単環式アリーレン又は−ＮＲ2であり、Ｒ2は、低級アルキル、Ｈ又は５個までの環置換基を有する炭素原子５〜７個の単環式アリールであり、環置換基は、−（ＣＨ2）n−ＮＨ2、−（ＣＨ2）n−ＣＯＯＨ、−ＮＯ2、ハロゲン及び低級アルキルからなる群から選択され、ｎは、０〜６である整数である。
【００１８】
もう一つの実施態様では、ジエノフィルを、（ｉ）酸化性ジエノフィル前駆体及び（ii）前駆体を酸化させてジエノフィルを形成するのに有効な酸化剤からその場で生成する。ジエノフィル前駆体は構造式Ｘ−ＮＨ−ＮＨ−Ｙを有する。式中、Ｘ及びＹは、−ＣＯＯＨ、−ＣＨＯ、−ＮＯ2、−ＣＮ、−ＣＯＯＲ8及び−ＣＯＲ8（Ｒ8は低級アルキルである）からなる群から独立して選択される電子吸引基から選択されるか、あるいは、Ｘ及びＹは、互いに結合して−（ＣＯ）−Ｚ−（ＣＯ）−架橋を形成し、Ｚは、低級アルキレン、４個までの環置換基を有する炭素原子５〜７個の単環式アリーレン又は−ＮＲ2であり、Ｒ2は、低級アルキル、Ｈ又は５個までの環置換基を有する炭素原子５〜７個の単環式アリールであり、環置換基は、低級アルキル、ハロゲン、−ＮＯ2、−（ＣＨ2）n−ＮＨ2及び−（ＣＨ2）n−ＣＯＯＨからなる群から選択され、ｎは、０〜６である整数である。好ましくは、酸化性ジエノフィル前駆体はフタルヒドラジンである。好ましくは、酸化剤は次亜塩素酸塩（たとえばＮａＯＣｌ又は次亜塩素酸ナトリウムの水溶液）である。
【００１９】
本発明はさらに、少なくとも触媒量の外来的に加えられるエチレン性不飽和Ｃ12〜Ｃ24脂肪酸と、ステロイド５，７−ジエンと、上記で論じたジエノフィルとを初めに含むディールス−アルダー反応混合物を意図する。
【００２０】
本発明は多くの利点を有し、そのいくつかを以下に挙げる。
【００２１】
本発明の一つの利点は、ディールス−アルダー付加物が高められた収率で形成されることである。
【００２２】
本発明の利点は、ステロイド共反応体の費用に比較して触媒が非常に廉価であることである。
【００２３】
本発明のもう一つの利点は、ディールス−アルダー付加を共役化ジエン官能基の保護に使用する場合、ディールス−アルダー付加物形成の促進が、すでに存在する５，７−ジエン含有ステロールのより大きな保護につながることである。
【００２４】
本発明のもう一つの利点は、ディールス−アルダー反応を使用して精製を支援する場合、ディールス−アルダー付加物形成の促進が、すでに存在する５，７−ジエン含有ステロールのより容易な分別につながることである。
【００２５】
本発明のさらなる利点は、半合成ステロール生産において内在性の不飽和脂肪酸を運び出すために酸による鹸化反応の中和が不要であることである。
【００２６】
なおさらなる利点は、以下の開示から当業者には明らかになるであろう。
【００２７】
発明の詳細な説明
本発明は、一部には、開示を引用例として本明細書に含める米国特許第５，３９１，７７７号の方法に対する改良である。米国特許第５，３９１，７７７号は、コレスタ−５，７−ジエン−３β−２５−ジオール及び他のステロイド５，７−ジエンを複雑なステロール溶液から分別するためのディールス−アルダー反応の使用を記載している。５，７−ジエン含有ステロイドをジエノフィル又は酸化剤と組み合わせた酸化性ジエノフィル前駆体と反応させて、ジエンのディールス−アルダー付加物を得る。
【００２８】
詳細な説明及び請求の範囲では、以下のように定義する多数の術語を参照する。
【００２９】
本明細書で使用する「外来性」又は「外来的に加えられる」とは、適当な不飽和脂肪酸が、すでにステロールといっしょになっているのではなく、５，７−ジエン含有ステロールに別に加えられることをいう。たとえば、これは、抽出された細胞から得られたステロール抽出物中に存在する不飽和脂肪酸をいうものではない。
【００３０】
「アルキル」は、分岐鎖状又は非分岐鎖状の飽和炭化水素基をいう。本明細書では、好ましいアルキル基は炭素原子１〜１２個を含有する。「低級アルキル」とは、炭素原子１〜６個、より好ましくは１〜４個のアルキル基をいう。
【００３１】
「アルキレン」とは、分岐鎖状又は非分岐鎖状の飽和炭化水素鎖である分子断片をいい、たとえばエチレン（−ＣＨ2−ＣＨ2−）を含む。「アルケニレン」とは、不飽和炭化水素鎖である分子断片をいい、たとえばエテニレン（−ＣＨ＝ＣＨ−）を含む。
【００３２】
「ヒドロカルビル」とは、分岐鎖状又は非分岐鎖状の、飽和又は不飽和の炭化水素基をいう。
【００３３】
「ハロ」又は「ハロゲン」とは、フルオロ、クロロ、ブロモ又はヨード基をいう。ハロのうち、クロロ及びブロモが一般に好ましく、クロロが一般にもっとも好ましい。
【００３４】
「場合による」又は「場合によっては」とは、その後に記述される事象又は状況が起こってもよいし起こらなくてもよく、記述が、その事象又は状況が起こる場合及びそれが起こらない場合を含むことをいう。たとえば、「場合によっては置換されているフェニル」とは、フェニルが置換されていてもよいし置換されていなくてもよく、その記述が非置換フェニル及び置換があるフェニルの両方を含むことをいう。
【００３５】
本明細書で使用する「ステロール」とは、フェナントレン配置にある３個の縮合シクロヘキサン環（Ａ、Ｂ及びＣ）と、末端シクロペンタン環（Ｄ）とを含む縮合環系シクロペンタ〔α〕−フェタントレンの不飽和ヒドロキシル基含有誘導体をいう。以下のステロイドの例は、基及び置換基の位置を記述するために本明細書で使用する番号付け系を例示する。
【００３６】
【化５】
0003816004.tif 000003
【００３７】
いくつかの５，７−ジエン含有ステロールが本発明の強化されたディールス−アルダー反応の適用のための候補である。これらは、天然５，７−ジエン含有ステロールの他に、天然ステロールの類似体及び新規な合成５，７−ジエン含有ステロールを含む。公知の天然５，７−ジエン含有ステロールがいくつかある。
【００３８】
本質的に、ステロールは、スクアレンの製造の経路を共有する複雑な生合成サイクルでアセテートから誘導される。アセチル補酵素Ａ（ＣｏＡ）がアセトアセチルＣｏＡと反応して３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）を形成する。ＨＭＧ−ＣｏＡは、酵素ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素によって触媒される不可逆反応でメバロネートに還元される。メバロネートがホスホリル化され、脱炭酸化されてイソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）になる。異性化、縮合及び脱水素の連続工程を経て、ＩＰＰはゲラニルピロリン酸（ＧＰＰ）に転換される。ＧＰＰがＩＰＰと合わさってファルネシルピロリン酸（ＦＰ）を形成し、その２個の分子が還元的に縮合されて、ステロールの炭素３０個の前駆体であるスクアレンを形成する。
【００３９】
米国特許第５，４６０，９４９号は、酵母におけるスクアレン及び特定のステロールの蓄積量を増すための、ステロール生合成酵素の発現で特定の単一又は二重の欠損を有する突然変異体酵母におけるＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性を有するポリペプチドをコード化する構造遺伝子の発現レベルを高めることを含む方法を記載している。
【００４０】
スクアレンの蓄積はステロール製造を高める傾向にある。酵母中で、スクアレンがスクアレンエポキシドに転換され、それが次いで環化されてラノステロールを形成する。ラノステロールは、４位に２個のメチル基を有し、１４位に１個のメチル基を有し、８（９）位に二重結合を有し、１７位の炭素に結合した式ＣＨ3ＣＨ（ＣＨ2）2ＣＨ＝Ｃ（ＣＨ3）2の８炭素側鎖を有している。続いてラノステロールが１４及び４位で脱メチル化されてチモステロール（コレスタ−８，２４−ジエノール）を形成し、これが側鎖の１７位でメチル化され、最終的に、自然に産出する野生型酵母のもっとも豊富なステロールであるエルゴステロール（エルゴスタ−５，７，２２−トリエノール）に転換される。例１で例示的に使用する二重突然変異ｅｒｇ５−ｅｒｇ６酵母では、ｅｒｇ６突然変異のせいで、１７位の側鎖はメチル化されていない。加えて、ｅｒｇ５突然変異がＣ−２２での脱水を停止させて、Ｃ−１７側鎖におけるコレステロールタイプ不飽和が起こらなくなる。
【００４１】
ヒトを含む、ほ乳類のような動物では、ラノステロールはまた、５，７−ジエン含有ステロールの合成における中間体である。一つの経路では、ラノステロールは、２４，２５−ジヒドロラノステロールに転換されたのち、４α−メチル−△8−コレステロール、４α−メチル−△7−コレステロール、△7−コレステロール、７−デヒドロコレステロール（５，７−ジエン）に転換され、さらにコレステロールに転換される。１７位の側鎖は、動物における通常のステロール合成でさらにアルキル化されることはない。Principles of Biochemistry, 6th Ed., Abraham White et al., eds., McGraw-Hill Book Company(New York: 1978), p. 619-630
【００４２】
高等植物、たとえばタバコ、綿、大豆、トマト及びアルファルファでは、１７位の側鎖がobtusifoliolの形成でメチル化され、いくつかの工程をはさんだのち、その付加された炭素原子でさらにメチル化されて、最終的に、合成における分岐点である中間体△7−アベナステロールを形成する。一つの経路ではスチグマスタ−５，７，２４（２８）−トリエン−３β−オールが形成され、それがスチグマスタ−５，７−ジエン−３β−オール及びシトステロール又はスチグマステロールにつながる。もう一つの経路では、△7−アベナステロールがスチグマスタ−７−エン−３β−オール、７−デヒドロスチグマステロール（５，７−ジエン）を形成したのち、スチグマステロールを形成する。たとえば、米国特許第５，５８９，６１９号及びその中の引用例を参照すること。
【００４３】
本発明の方法でディールス−アルダー反応に付され、本発明のもう一つの方法にしたがって単離し、精製することができる５，７−ジエン含有ステロールは、一般構造式
【００４４】
【化６】
0003816004.tif 000004
【００４５】
（式中、Ｒ3はＨ又はＲ1ＣＯ−であり、Ｒ1は低級アルキル又は炭素原子５〜７個の単環式アリールであり、Ｒ4、Ｒ5及びＲ6は、独立して、Ｈ、ヒドロキシル及び低級アルキルからなる群から選択される）
を有する。Ｒ3基は、Ｈ以外であるならば、しばしばヒドロキシル保護基と考えられる。典型的なＲ3基は、Ｈ、ＣＨ3ＣＯ−及びＣ6Ｈ5ＣＯ−である。Ｒ4、Ｒ5及びＲ6がＨ又はＯＨ以外であるならば、好ましくはメチル又はエチル、より一般的にはメチルである。Ｒ7は、直鎖状でも分岐鎖状でもよく、飽和でも不飽和でもよい炭素原子１〜１０個のヒドロカルビル基である。
【００４６】
好ましい５，７−ジエンステロールの構造式が以下に示され、７−デヒドロエピステロール、７−デヒドロアベナステロール、エルゴステロール、エルゴスタ−５，７，２２，２４−テトラエノール、スチグマスタ−５，７，２４（２８）−トリエン−３β−オール、スチグマスタ−５，７−ジエン−３β−オール、７−デヒドロシトステロール、コレスタ−５，７，２４−トリエン−３β−オール及び７−デヒドロコレステロールを含む。
【００４７】
【化７】
0003816004.tif 000005
0003816004.tif 000006
0003816004.tif 000007
【００４８】
本発明の方法は、突然変異酵母から得ることができるようなステロールの混合物からコレスタ−５，７，２４−トリエン−３β−オールを単離し、精製するのに特に有用である。突然変異酵母抽出物中のステロールの混合物は通常、トリエンの他にも、酵母代謝産物スクアレン、ラノステロール、４，４−ジメチルチモステロールなどを含有する。また、酵母抽出物溶液中に存在する他のジエン、たとえば５，７−ジエンを有する他のステロールがジエノフィルと反応することもできる。
【００４９】
また、特定の５，７−ジエン含有ステロールが単離される組成物中に存在する他のステロール化合物が、たとえば炭素原子８〜１０個の側鎖Ｒ7中及びＡ又はＢステロイド環中に二以上のエチレン性不飽和の位置を含むということが考えられる。これらのジエン化合物は通常、共役化されていないエチレン性不飽和を含有するが、５，７−二重結合は、考えられる５，７−ジエン含有ステロール中では共役化されている。考えられる５，７−ジエン含有ステロールはまた、α，βエチレン性不飽和を有するということもできる。
【００５０】
本発明の一つの実施態様では、ステロールの混合物を、少なくとも触媒量の外来的に加えられる不飽和Ｃ12〜Ｃ24カルボン酸の存在で、構造式Ｘ−Ｒ＝Ｒ−Ｙ（式中、Ｒ基は、いずれもＮ又はＣ−Ｑであり、Ｑ基は、Ｈであるか、いっしょになって第三の結合を形成する）を有するジエノフィルと反応させる。たとえば、この実施態様におけるジエノフィルは構造Ｘ−Ｎ＝Ｎ−Ｙ、Ｘ−（ＣＱ）＝（ＣＱ）−Ｙ又はＸ−Ｃ＝Ｃ−Ｙを有する。置換基Ｘ及びＹは、−ＣＯＯＨ、−ＣＨＯ、−ＮＯ2、−ＣＮ、−ＣＯＯＲ8及び−ＣＯＲ8（Ｒ8は低級アルキルである）からなる群から独立して選択される電子吸引基であるか、あるいは、Ｘ及びＹは、互いに結合して−（ＣＯ）−Ｚ−（ＣＯ）−架橋を形成することができる。後者の場合、すなわちＸとＹとが結合されている場合、Ｚ結合は、低級アルキレン、低級アルケニレン、４個までの環置換基を有する炭素原子５〜７個の単環式アリーレン、−Ｓ−又は−ＮＲ2−であり、Ｒ2は、低級アルキル、Ｈ又は５個までの環置換基を有する炭素原子５〜７個の単環式アリールである。環置換基は、−（ＣＨ2）n−ＮＨ2、−（ＣＨ2）n−ＣＯＯＨ、−ＮＯ2、ハロゲン及び低級アルキルからなる群から選択され、ｎは、０〜６である整数である。本明細書では、ジエノフィルと５，７−ジエン含有ステロールとのこのタイプの反応を反応タイプ（１）と呼ぶこともある。
【００５１】
前述した基の中のジエノフィルは、市販されてもいるし、合成有機化学の当業者に公知の出発原料及び技術を使用して容易に合成することもできる。本明細書で有用な特定のジエノフィルの例は以下を含む。
【００５２】
【化８】
0003816004.tif 000008
【００５３】
これらのジエノフィルは、多数の供給元、たとえばAldrich Chemical社（米ウィスコンシン州ミルウォーキー）から市販されている。当業者によって理解されるように、このようなジエノフィルはまた、従来技術を使用して容易に合成することもできる。たとえば、S. W. Moje and P. Beak, J. Org. Chem., 39(20): 2951(1974)及びK. Rufenachk, Helv. Chim. Acta, 51: 518(1968)を参照すること。
【００５４】
もう一つの実施態様では、ジエノフィル前駆体を使用し、適当な酸化剤でその場でジエノフィルに転換する。ここで、５，７−ジエン含有ステロールを含有するステロール混合物を、少なくとも触媒量のＣ12〜Ｃ24カルボン酸の存在で、ジエノフィル前駆体及び前駆体を活性ジエノフィルに酸化させるのに有効な酸化剤と同時に反応させる。本明細書では、以下に記すジエノフィル前駆体及び酸化体を、５，７−ジエン含有ステロールを含有する混合物とともに使用する反応を反応タイプ（２）と呼ぶこともある。
【００５５】
ジエノフィル前駆体は構造式Ｘ−ＮＨ−ＮＨ−Ｙを有する。式中、Ｘ及びＹは、−ＣＯＯＨ、−ＣＨＯ、−ＮＯ2、−ＣＮ、−ＣＯＯＲ8及び−ＣＯＲ8（Ｒ8は低級アルキルである）からなる群から独立して選択される電子吸引基であるか、あるいは、Ｘ及びＹは、互いに結合して−（ＣＯ）−Ｚ−（ＣＯ）−架橋を形成することができる。Ｘ及びＹが互いに結合して−（ＣＯ）−Ｚ−（ＣＯ）−架橋を形成するジエノフィル前駆体の例では、Ｚ結合は、低級アルキレン、低級アルケニレン、４個までの環置換基を有する炭素原子５〜７個の単環式アリーレン、−Ｓ−又は−ＮＲ2−であり、Ｒ2は、Ｈ、低級アルキル又は５個までの環置換基を有する炭素原子５〜７個の単環式アリールである。環置換基は、低級アルキル、ハロゲン、−ＮＯ2、−（ＣＨ2）n−ＮＨ2及び−（ＣＨ2）n−ＣＯＯＨからなる群から選択され、ｎは、０〜６である整数である。
【００５６】
好ましくは、この実施態様では、Ｚは、−（ＣＨ2）n−ＮＨ2又は−（ＣＨ2）n−ＣＯＯＨ（ｎは、０〜６である整数である）である２個までの置換基で置換されている炭素原子５〜７個の単環式アリーレンである。前述した基の中のジエノフィル前駆体は、市販されてもいるし、合成有機化学の当業者に公知の出発原料及び技術を使用して容易に合成することもできる（たとえば、H. D. K. Drew and H. H. Hatt, J. Chem. Soc. 16(1937)を参照）。本明細書で有用な特定のジエノフィルの例（同じく、そのような化合物は市販されてもいるし、容易に合成することもできる）は以下を含む。
【００５７】
【化９】
0003816004.tif 000009
【００５８】
本発明で考えられる５，７−ジエン含有ステロール製造法では、一以上の不飽和Ｃ12〜Ｃ24カルボン酸、たとえばリノレン酸、リノール酸及びオレイン酸を外来的にディールス−アルダー反応溶液に加える。工業銘柄のオレイン酸は廉価であり、その市販銘柄中に存在する不純物であるリノール酸及びリノレン酸もまた、本発明の反応における有効成分である。工業銘柄オレイン酸が本発明の方法で非常に好ましい不飽和Ｃ12〜Ｃ24カルボン酸である。
【００５９】
不飽和酸は、極微量、たとえば反応溶液の約０．０２重量％で有用である。しかし、より多量に存在することによってその有用性が減じられることはない。好ましくは、低めの量、約０．０５〜約５重量％、もっとも好ましくは約０．１〜約０．５重量％が使用される。
【００６０】
不飽和酸は、酵母発酵からのステロール抽出物中に異なる量で存在する。通常、差違は細胞抽出工程の結果である。このような抽出はしばしば、細胞溶解物中に通常に存在する不飽和酸の大部分を取り出す。
【００６１】
苛性アルカリ鹸化／抽出溶液のpHを下げるための酸の添加は、プロトン化されたとき有機相に可溶性になる内在性不飽和酸の相対量を、有機相により不溶性であり、抽出の水相により可溶性である電離形態の内在性不飽和酸に対して変化させることができる。有機相はステロール抽出物である。pHだけでなく、有機相を洗浄するために使用される水の温度もまた、ステロール抽出物中に残る内在性不飽和酸の量に影響する。したがって、ディールス−アルダー反応中に存在する内在性不飽和酸の量は０．０２重量％未満であることができ、低いディールス−アルダー付加物収率をもたらす。
【００６２】
抽出の前又は最中に鹸化反応のpHを下げることは、実践的な観点から、いくつかの理由のために推奨できない。第一に安全性である。苛性アルカリ溶液への濃縮酸、たとえば硫酸の添加は、ホットスポットならびに苛性アルカリの跳びはねを生じさせる発熱反応であり、さらに、反応器に関して構造的問題を招くおそれもある。第二の理由は、炭化、すなわち溶液中の黒色物質の形成である。第三の理由は、溶液のゲル化及び石鹸形成である。後二つの点は、５，７−ジエンを取り扱い、溶液からうまく分別する問題につながる。総じて、最良の実施方法は、抽出の前又は最中に酸を鹸化反応に加えないことである。
【００６３】
ステロールの鹸化及び酵母からの抽出は、当業者によって察知されるような非常に多様な溶媒を使用して実施することができる。現在の技術水準は、鹸化した５，７−ジエン含有ステロールを抽出してステロール抽出物を形成するためにヘキサン又はヘプタン、好ましくはヘプタンを使用することである。
【００６４】
本発明の方法では、内在性不飽和Ｃ12〜Ｃ24カルボン酸の添加が、ディールス−アルダー反応溶液における最小量の不飽和酸の存在を提供する。このように、外来的に提供される不飽和酸による利用可能な５，７−ジエン含有ステロールのディールス−アルダー反応の増強は、高いディールス−アルダー付加物収率が得られることと、低い収率が内在性不飽和酸を多く除去しすぎた結果ではないこととを保証するのに役立つ。
【００６５】
本明細書で有用である不飽和Ｃ12〜Ｃ24カルボン酸の例を以下に記す。Ｃ18不飽和脂肪酸の使用が好ましく、工業銘柄のオレイン酸が特に好ましい。
【００６６】
【化１０】
0003816004.tif 000010
【００６７】
「不飽和Ｃ12〜Ｃ24カルボン酸」の範囲に入らない化合物の例は、以下に示す、不飽和アルコールであるオレイルアルコール及びＣ18飽和脂肪酸であるステアリン酸を含む。
【００６８】
【化１１】
0003816004.tif 000011
【００６９】
ジエノフィル前駆体を活性ジエノフィルに酸化することができるならば、ディールス−アルダー付加物の形成を妨げる酸化剤又はステロール混合物中のステロールのいずれかと他の方法で有害に相互作用する酸化剤を除き、いかなる酸化剤をも使用することができる。酸化剤の例は、次亜塩素酸ナトリウム、ペルオキシキ一硫酸カリウム、四酢酸鉛、ヨードベンゼンジアセテート、Ｎ−ブロモスクシンイミド及び次亜塩素酸tert-ブチルを含む。好ましくは水性次亜塩素酸ナトリウムを使用する。
【００７０】
前述の反応、すなわち、ステロール混合物と、構造Ｘ−Ｒ＝Ｒ−Ｙを有するジエノフィルとの反応（反応１）又は構造Ｘ−ＮＨ−ＮＨ−Ｙのジエノフィル前駆体及び酸化剤からその場で形成されるジエノフィルとの反応（反応２）のいずれもディールス−アルダー付加物を形成させる。これらの反応は、以下のスキームで例示される。
【００７１】
【化１２】
0003816004.tif 000012
【００７２】
いずれのタイプの反応も、不活性雰囲気中、非反応性溶媒中で実施される。極性有機溶媒、たとえば酢酸エチル、プロピオン酸メチル及び酪酸エチルが、ステロールを溶解状態に維持するのに有用である。多くの極性有機溶媒が公知であり、選択は好みの問題であり、考慮すべき要素がいくつかある。ハロゲン化溶媒、たとえばクロロメタンを使用することもできるが、安全性及び取り扱いを考慮すると、工業的な状況では比較的好ましくない。除去しやすさに関して、沸点が低めの溶媒が好ましい。本発明の方法には混合溶媒系もまた有用である。たとえば、コレスタ−５，７，２４−トリエン−３−オールを製造するのに考えられる半合成法では、鹸化反応からステロール抽出物を製造するために使用されるヘプタンが完全には除去されず、その結果、ディールス−アルダー付加工程のための反応溶液が極性有機溶媒の他にヘプタンを含有するようになる。
【００７３】
反応２では、酸化剤を、選択した溶媒中ステロイド及びジエノフィル前駆体の溶液に徐々に加えることが好ましい。反応２は、０℃〜約２５℃、好ましくは室温（約２０℃）で実施される。反応２を起こすためには、少なくとも約１５分間、好ましくは少なくとも１時間を考慮すべきである。
【００７４】
反応１又は反応２を使用してディールス−アルダー付加物を調製したのち、付加物を反応混合物から取り出し、再生して、５，７−ジエン含有ステロイドを単離形態で得る。反応混合物からの付加物の取り出しは、たとえば、ディールス−アルダー付加物を優先的に拘束するシリカゲルカラムを使用してクロマトグラフィー的に実施することが好ましい。
【００７５】
ディールス−アルダー付加物の化学的及び物理的性質は、ジエノフィルに存在する置換基を操作することにより、また、Ｒ3を変えることにより、変化させることができる。たとえば、塩基性置換基、たとえば−（ＣＨ2）n−ＮＨ2（ｎは、０〜６である整数である）などを含むジエノフィルの使用により、ディールス−アルダー付加物に塩基性を付与することができる。その場合、付加物は、塩基性分子であり、酸抽出を使用してステロール混合物から分別することができる。同様に、酸性置換基、たとえば−（ＣＨ2）n−ＣＯＯＨ（ｎは、０〜６である整数である）などを含むジエノフィルの使用により、ディールス−アルダー付加物に酸性を付与することができる。その場合、付加物は、酸性分子であり、塩基性抽出を使用してステロール混合物から分別することができる。
【００７６】
また、上で示唆したように、ディールス−アルダー付加物の調製ののち、Ｒ3に存在する基を、所望の結晶化及び／又は沈殿特性を付与する官能基に転換することができる。たとえば、３位に存在するヒドロキシル基をベンゾエート種に容易に転換することができ、それが逆に付加物をより結晶質にし、ステロール混合物からより分別しやすくする。
【００７７】
そして、還元剤、たとえばリチウムアルミニウムヒドリド（ＬＡＨ）、ジイソブチルアルミニウムヒドリド（ＤｉＢＡＬ）、Red-Al（登録商標）（Aldrich Chemical社（ウィスコンシン州Milwaukee）から市販されているナトリウムビス（２−メトキシ−エトキシ）アルミニウムヒドリドのトルエン溶液）などによる付加物の処理により、たとえばディールス−アルダー付加を利用する保護又は精製工程から５，７−ジエン含有ステロイドを再生する。リチウムアルミニウムヒドリドが特に好ましい。反応は、まず低温、すなわち１０℃以下（同じく、氷／水浴によって得ることができる）で進行し、少なくとも約３０分後、少なくとも約５０℃で少なくとも数分間温まらせる。そして、過剰な還元剤及びその塩又は誘導体を、たとえば加水分解及びCelite（商標）などに通すろ過によって除去する。反応混合物の蒸発が５，７−ジエン含有ステロイドを提供する。
【００７８】
そして、当業者によって容易に察知される多数の技術のいずれかを使用して、再生した５，７−ジエン含有ステロイドの精製を実施することができる。たとえば、精製は、たとえばメタノール、エタノールなどを使用する再結晶によって、又は、沈殿もしくはクロマトグラフィー技術を使用して実施することができる。
【００７９】
今や放棄されている、５，７−ジエン含有ステロイドがコレスタ−５，７，２４−トリエン−３β−オールであるその親米国特許出願第０７／８６９，３２８号を引用する米国特許第５，３９１，７７７号で述べられているように、単離し、精製した物質を使用してコレスタ−５，７−ジエン−３β，２５−ジオールを調製することができる。コレスタ−５，７−ジエン−３β，２５−ジオールは、陽光又は他の十分に確立された光化学的方法によって２５−ヒドロキシビタミンＤ3に転換することができる生物学的に重要なヒドロキシル化プロビタミンＤ3代謝産物である。このようなビタミンＤ3誘導体は、多数の状況で、たとえば局所医薬製剤（皮膚疾患などの治療用）で、経口ビタミン組成物で、また家畜飼料添加物として有用である。
【００８０】
上記反応の変形では、分子がディールス−アルダー付加物の形態で保護されている間に、５，７−ジエン含有ステロイドの一以上の座の化学転換を実施することができる。たとえば、△24二重結合を、２４−アミノ−２５−ヒドロキシル種、２４，２５−ジヒドロキシル種などに転換することができる。また、化合物が付加物形態にあるとき、ステロイドのＡ環を酸化することもできる。ディールス−アルダー付加物に対して実施することができる化学転換の例は、前記特許出願第０７／８６９，３２８号に記載されている。
【００８１】
例１．酵母の調製
本発明のディールス−アルダー反応に使用するためのコレスタ−５，７，２４−トリエン−３β−オールを多く含む組成物を調製するには、酵母株ＡＴＣ１５６２が有用である。酵母株ＡＴＣ１５６２は株ＡＴＣ１５５１に由来する。二重突然変異酵母株ＡＴＣ１５５１の構成は米国特許第５，４６０，９４９号に論じられており、その開示を引用例として本明細書に含める。簡潔にいうと、株ＡＴＣ０３１５ｒｃ（ＡＴＣＣ７４０９０、１９９１年９月１６日寄託）をプラスミドｐＡＲＣ３０４Ｓ（ＡＴＣＣ４０９１６、１９９０年１１月９日）で形質転換して株ＡＴＣ１５５１を形成すると、これが、培養においてエアレーションを制限した場合でも、多量のステロール蓄積をもたらした。ＡＴＣ１５５１（ｍａｔａ、ｅｒｇ５、ｅｒｇ６、ＴＲＰ１＋、ＵＲＡ３＋）酵母をＭＣ５酵母（ｍａｔα、ｉｎｏ−、ｉｎｏ−）と交配させて酵母株ＬＳ１００３−１Ｂ（ｍａｔａ、ｅｒｇ５、ｅｒｇ６、ＴＲＰ１＋、ＵＲＡ３＋）を形成した。ＡＴＣ１５５１を別に酵母株ＪＧＹ２３０（ｍａｔα、ｈｉｓ３−１、ｅｒｇ５）と交配させて酵母株ＬＳ１００１−３Ｂを形成した。株ＬＳ１００３−１Ｂ及びＬＳ１００１−３Ｂを交配させて、コレスタ−５，７，２４−トリエン−３β−オールを多く含む酵母ステロール抽出物を調製するのに有用である株ＡＴＣ１５６２（ｍａｔａ／ｍａｔα、ｅｒｇ５／ｅｒｇ５、ｅｒｇ６／ｅｒｇ６、ＴＲＰ１＋／ＴＲＰ１＋、ＵＲＡ３＋／ＵＲＡ３−）又は（ｍａｔａ／ｍａｔα、ｅｒｇ５／ｅｒｇ５、ＴＲＰ１／ｔｒｐ１、ＵＲＡ３／ｕｒａ３）を形成した。
【００８２】
例２：細胞由来反応溶液におけるディールス−アルダー反応
この例は、ディールス−アルダー抽出物の収率の変動範囲を実証する。
【００８３】
ステロールバッチ６、９、１０、１１及び１２は、例１に記載した二重突然変異株ＡＴＣ１５６２の発酵の製造鹸化／抽出実験から得た。
【００８４】
各ステロールバッチの酢酸エチル／ヘプタン溶液を使用して反応を準備した。フタルヒドラジド及び次亜塩素酸塩を、フタルヒドラジド：次亜塩素酸ナトリウム：５，７−ジエン（コレスタトリエノール）の比が４：２：１になるように攪拌溶液に加えて、ディールス−アルダー反応溶液を形成した。
【００８５】
バッチ６、９、１１及び１２はすべてディールス−アルダー付加物を約９０％の収率で与えた。バッチ１０からのディールス−アルダー付加物の収率は不確かであった。バッチ１０の最初の実験では１００％の収率が得られた。しかし、バッチ１０の貯蔵ドラムからの浸漬サンプルを使用したその後の試験では、２５〜４１％のディールス−アルダー付加物の収率しか得られず、コレスタトリエノールの転換は不完全であった。
【００８６】
【表１】
0003816004.tif 000013
【００８７】
例３：酵母ステロール抽出物の画分を使用するエルゴステロールのモデル反応
ディールス−アルダー付加物形成を促進したコレスタ−５，７，２４−トリエン−３−オールのディールス−アルダー付加物の大規模製造に関して、ステロール抽出物中の５，７−ジエンのモデル化合物としてエルゴステロールを用いる研究を実施して、ｅｒｇ５及びｅｒｇ６二重突然変異酵母発酵からのステロール抽出物中の成分を単離し、特定した。
【００８８】
例２に記載の試験手順を三つの研究で使用した。ステロール抽出物の代わりに、これらの研究の標準原料は通常、酢酸エチル約５０重量％及びヘプタン５０重量％からなる溶媒中エルゴステロール（Aldrich、９５％）の２重量％溶液１９gであった。
【００８９】
上述したエルゴステロール原料でのディールス−アルダー付加物の収率（比較対照実験）は、２０％未満、一般には５％未満であり、エルゴステロールの転換は不完全であった。実験２３２ではディールス−アルダー付加物収率は０％であり、未反応エルゴステロールが４６％であった。
【００９０】
Ａ）典型的なステロール抽出物を用いたディールス−アルダー付加物形成の全反応生成物の添加は、エルゴステロールとの反応を促進する成分がなおも存在していたということを示した。
【００９１】
実験１９６で反応Ｇ−８（ステロール抽出物を用いる典型的な実験）からの約６重量％生成物溶液を原料に加えたとき、ディールス−アルダー付加物収率は６８％であった。実験１９７では、わずか０．８重量％Ｇ−８生成物溶液を原料に加えたとき、収率は２８％に低下し、未反応エルゴステロールが３０％であった。
【００９２】
Ｂ）ステロール抽出物からのディールス−アルダー付加物のクロマトグラフィー精製からの「洗固体」の添加は、それらが、エルゴステロールとの反応を促進する成分を含有することを示した。
【００９３】
これらの研究では、ステロール抽出物のシリカゲルクロマトグラフィー画分を、エルゴステロールを使用するモデルディールス−アルダー反応に加えた。
【００９４】
ディールス−アルダー付加物画分の前にシリカカラムから溶離したカラム流出液の合わせた画分を回転エバポレータで濃縮し、残留物を、０．４、０．７、１．５及び３重量％で、エルゴステロールとのモデル反応に加えた。エルゴステロールディールス−アルダー付加物収率は、非線形的に６０〜６８％の範囲であった。
【００９５】
カラム流出液の別々の画分を、同じく濃縮して溶媒を除去し、３重量％で上記エルゴステロールモデルディールス−アルダー付加反応に加えると、０〜約６５％の範囲のエルゴステロールディールス−アルダー付加物のディールス−アルダー付加物収率が得られ、画分の大部分はゼロ収率を示した。ディールス−アルダー付加物収率ゼロの反応では、エルゴステロールの約５０〜６０％が消費された。いくつかの画分は、６２〜６５％のエルゴステロールディールス−アルダー付加物収率を示し、エルゴステロールの消費が１００％であった。エルゴステロールディールス−アルダー付加物の６２〜６５％収率を有するいくつか画分は非常に粘ちょうであり、主に脂肪酸及び他の長鎖化合物でできていた。
【００９６】
この研究の結論は、脂肪酸又は他の長鎖化合物が、ディールス−アルダー付加反応収率を高めることができるいくつかのステロール抽出物の候補成分であるということである。ディールス−アルダー付加物収率は、０．４重量％未満のしきい値を超える活性化化合物の量に影響されなかった。
【００９７】
例４：エルゴステロールを用いるモデル反応に対する種々の化合物の影響
いくつかのディールス−アルダー活性化候補化合物をエルゴステロールとのディールス−アルダーモデル反応に加えた。この例は、不飽和有機酸がディールス−アルダー付加反応活性化化合物であることを実証した。
【００９８】
外来的に提供される多様な化合物を用いて、本明細書で上記した酸化性ジエノフィルを用いる１９ｇスケールでのエルゴステロールとのモデルディールス−アルダー付加反応を実施した。研究の結果は以下のとおりであった。
【００９９】
Triton（登録商標）X-100（Rohm & Haas社、ポリエチレングリコールｐ−イソオクチルフェニルエーテル）、ステアリン酸及びオレイルアルコールを加えた反応は、本質的に、ディールス−アルダー反応を活性化することはできなかった。Tween（登録商標）80（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）及びTween（登録商標）20（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート）によってディールス−アルダー反応は適度に活性化された。高純度のリノレン酸、リノール酸及びオレイン酸ならびに工業銘柄のオレイン酸はすべてディールス−アルダー付加物を与え、エルゴステロールの転換は完全であった。データを以下に提示する。
【０１００】
添加物なしで４０〜５０℃の反応温度を用いた実験２２９では、０．０４％のディールス−アルダー付加物の収率が得られ、未反応のエルゴステロールが１９％であった。
【０１０１】
Triton（登録商標）X-100（ポリエチレングリコールｐ−イソオクチルフェニルエーテル）０．５７gを用いた実験２２４では、０％のディールス−アルダー付加物の収率が得られ、未反応のエルゴステロールが５０％であった。
【０１０２】
ステアリン酸０．５７gを用いた実験２５０では、１６％のディールス−アルダー付加物の収率が得られ、未反応のエルゴステロールが０％であった。
【０１０３】
オレイルアルコール０．５８gを用いた実験２５７では、０％のディールス−アルダー付加物の収率が得られ、未反応のエルゴステロールが５４％であった。
【０１０４】
Tween（登録商標）80（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）０．５７gを用いた実験２３３では、４９％のディールス−アルダー付加物の収率が得られ、未反応のエルゴステロールが０％であった。
【０１０５】
Tween（登録商標）20（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート）０．５７gを用いた実験２３４では、３６％のディールス−アルダー付加物の収率が得られ、未反応のエルゴステロールが０％であった。
【０１０６】
リノール酸（Aldrich、９９％）０．５７gを用いた実験２４９では、６２％のディールス−アルダー付加物の収率が得られ、未反応のエルゴステロールが０％であった。
【０１０７】
リノール酸（Aldrich、９９％）０．０４４gを用いた実験２５１では、５９％のディールス−アルダー付加物の収率が得られ、未反応のエルゴステロールが０％であった。リノール酸は全反応原料の約０．２重量％であった。リノール酸とエルゴステロールとのモル比は０．６１：１であり、活性化が不飽和酸の化学量論的添加を要しないことを示した。
【０１０８】
リノレン酸（Aldrich、９９％）０．０３４gを用いた実験２５２では、５３％のディールス−アルダー付加物の収率が得られ、未反応のエルゴステロールが０％であった。
【０１０９】
オレイン酸（Aldrich、９９％）０．３７６gを用いた実験２５４では、６３％のディールス−アルダー付加物の収率が得られ、未反応のエルゴステロールが０％であった。
【０１１０】
オレイン酸（Aldrich、９９％）０．１４gを用いた実験２５６では、５８％のディールス−アルダー付加物の収率が得られ、未反応のエルゴステロールが０％であった。
【０１１１】
工業銘柄のオレイン酸（Aldrich、９０％）０．１４gを用いた実験２５５では、５９％のディールス−アルダー付加物の収率が得られ、未反応のエルゴステロールが０％であった。
【０１１２】
工業銘柄のオレイン酸（Aldrich、９０％）０．１４gを用い、実験２５５よりも高速で攪拌した実験２７３では、６５％のディールス−アルダー付加物の収率が得られ、未反応のエルゴステロールが０％であった。この実験及び後すべての実験における攪拌機の設定は、別段示さない限り「４」であった。
【０１１３】
工業銘柄のオレイン酸（Aldrich、９０％）０．１４gを用い、攪拌の代わりに音波処理した実験２７４では、４６％のディールス−アルダー付加物の収率が得られ、未反応のエルゴステロールが０％であった。フタルヒドラジドは、初めは微細懸濁液であったが、漂白剤添加の間にフラスコの底に見えるほど凝集した。
【０１１４】
この例から結論をまとめると、ディールス−アルダー反応を活性化するための添加物の非存在では、エルゴステロールと反応性ジエノフィルからはディールス−アルダー付加物は本質的に形成されなかった。界面活性剤Triton（登録商標）X-100（Rohm & Haas社、ポリエチレングリコールｐ−イソオクチルフェニルエーテル）もまた、ディールス−アルダー反応を活性化することはできなかった。飽和ステアリン酸及び不飽和アルコールであるオレイルアルコールもまた、反応を活性化することはできなかった。リノール酸、リノレン酸及びオレイン酸は、工業銘柄のオレイン酸を含め、すべてがディールス−アルダー反応を促進した。
【０１１５】
当該飽和酸の濃度を０．２重量％から２重量％に増すと、不飽和酸による活性化にわずかな改善が見られ、より触媒量と同調して、非化学量論的量が必要であることを明確にした。より高速の攪拌により、おそらくは不飽和酸との接触の促進から生じるわずかな改善が注目されたが、音波処理は、機械的混合に比べて活性化を抑圧した。
【０１１６】
モデル反応における最良のディールス−アルダー付加物収率６０〜６５％が、ステロールの細胞抽出物バッチでの９０％超に対して、オレイン酸が存在するときのエルゴステロールとの典型的なディールス−アルダー付加物収率よりもなおも低いことが注目される。しかし、これらの６０〜６５％収率は、酵母ステロール抽出画分を使用してエルゴステロールとのモデル反応を活性化した例３で得られた収率と合致する。
【０１１７】
例５：エルゴステロールとのディールス−アルダー反応に対する種々の量のオレイン酸の影響
磁気攪拌棒を備えた５０mlのErlenmeyerフラスコ中、エルゴステロールの酢酸エチル（１９g、ＡＣＳ試薬用、純度９９．５％）溶液に工業銘柄のオレイン酸（純度９０％）を異なる量で加えた。フタルヒドラジド（２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン、１７０．１７g/mol、ウィスコンシン州MilwaukeeのAldrich社の純度９９％フタルヒドラジド）及び次亜塩素酸ナトリウム（１５〜１６％ＮａＯＣｌ水性溶液中７４．４４g/mol）を周囲温度でフタルヒドラジド：次亜塩素酸ナトリウム：エルゴステロールのモル比４：２：１で加えた。
【０１１８】
【表２】
0003816004.tif 000014
【０１１９】
この例は、ディールス−アルダー付加反応の実質的な促進に要する不飽和脂肪酸の最小有効量が０．０２重量％超かつ０．０２７重量％未満であることを実証した。不飽和脂肪酸の量がより多くなると収率増大は横ばいになるが、この重量％範囲では低下は認められなかった。
【０１２０】
例６：酵母からのディールス−アルダー付加物に対する内在性脂肪酸の影響
酵母細胞抽出物固体から得られたステロールバッチを使用して実験２０４〜２２３を実施した。
【０１２１】
バッチ２７ステロールを用いた実験２１０及び実験２１４では、それぞれ９１％のディールス−アルダー付加物の収率が得られた。得られたままのバッチ２７は以下の性質を有するものであった。トリエノール３．５０％、全脂肪酸含量３１．９mg/ml
【０１２２】
バッチ２８ステロールを用いた実験２１３では、７８％のディールス−アルダー付加物の収率が得られた。得られたままのバッチ２８は以下の性質を有するものであった。トリエノール３．５６％、全脂肪酸含量６mg/ml
【０１２３】
バッチ２９ステロールを用いた実験２１９では、７５％のディールス−アルダー付加物の収率が得られた。得られたままのバッチ２９は以下の性質を有するものであった。トリエノール３．８５％、全脂肪酸含量４mg/ml
【０１２４】
バッチ１ステロールを用いた実験２１８では、９０％のディールス−アルダー付加物の収率が得られた。得られたままのバッチ１は以下の性質を有するものであった。トリエノール３．６７％、全脂肪酸含量８０mg/ml
【０１２５】
バッチ２ステロールを用いた実験２２０及び実験２２１では、９０％のディールス−アルダー付加物の収率が得られた。得られたままのバッチ２は以下の性質を有するものであった。トリエノール４．７９％、全脂肪酸含量８．６mg/ml
【０１２６】
バッチ３ステロールを用いた実験２１７では、８０％のディールス−アルダー付加物の収率が得られた。得られたままのバッチ３は以下の性質を有するものであった。トリエノール４．０２％、全脂肪酸含量５．０mg/ml
【０１２７】
事前に評価したバッチ２２〜２６の脂肪酸含量は以下のとおりであった。バッチ２２：２２．６mg/ml、バッチ２３：０．５mg/ml、バッチ２４：３４．４mg/ml、バッチ２５：０．９mg/ml、バッチ２６：２２．３mg/ml
【０１２８】
ディールス−アルダー反応の前に取り出したバッチ又はバッチのサンプルに関して、当該技術で公知の方法にしたがって脂肪酸分析を実施した。
【０１２９】
ディールス−アルダー収率は脂肪酸含量の増大とともに増大した。これらの結果の控えめな解釈は、高いディールスアルダー付加物収率のために低い脂肪酸含量が決して必要ではないということである。
【０１３０】
例７：オレイン酸を添加する場合と添加しない場合でのディールス−アルダーコレスタトリエノール付加物収率の直接比較
上記例は、エルゴステロールからのディールス−アルダー付加物形成に対する外来性不飽和酸の添加の影響を報告した。この例では、二重突然変異体の酵母ステロール抽出物からのコレスタ−５，７，２４−トリエン−３β−オールからのディールス−アルダー付加物形成に対する外来性不飽和酸の添加の影響をモニタした。
【０１３１】
例２に記載したようにして、バッチ１０浸漬サンプルでは、外来性不飽和酸を加えなかったとき、２５〜４１％のディールス−アルダー付加物の収率が得られ、トリエノールの転換は不完全であった。工業銘柄のオレイン酸の添加がディールス−アルダー付加物収率を８２％超まで高め、トリエノールの転換を完全にした。
【０１３２】
工業銘柄のオレイン酸１重量％を用いた実験２７９では、バッチ１０ディップから８３％のディールス−アルダー付加物収率が得られた。
【０１３３】
工業銘柄のオレイン酸０．２重量％を用いた実験２８２では、バッチ１０ディップから８２％のディールス−アルダー付加物収率が得られた。
【０１３４】
同様に、実験２８６〜２９６において、貯蔵から得られたままのバッチ３、６、７、８、９及び１１からの浸漬サンプルでは、２１〜５６％のコレスタトリエノールディールス−アルダー付加物が得られ、コレスタトリエノールの転換は不完全であった。バッチ３、６、７、８、９及び１１では、これらの得られたままのサンプル中の内在性Ｃ16及びＣ18不飽和脂肪酸の濃度は３８〜８５ppm（０．００３８〜０．００８５重量％）であった。
【０１３５】
実験２９７では、上述したバッチ７浸漬サンプルを外来性の工業銘柄オレイン酸０．２重量％とともに使用すると、７４％のディールス−アルダー付加物の収率が得られた。
【０１３６】
実験３００では、上述したバッチ９浸漬サンプルを外来性の工業銘柄オレイン酸０．２重量％とともに使用すると、６８％のディールス−アルダー付加物の収率が得られた。
【０１３７】
オレイン酸の添加は、洗浄処理の違いから生じるステロール抽出物中の不飽和酸含量に対するディールス−アルダー付加物形成の感受性をなくす。外来性の添加は、酵母細胞固体抽出及び洗浄の間に特定の不飽和酸濃度を制御する必要性をなくす。オレイン酸の直接添加は、通常に存在する不飽和酸を多く除去しすぎた上流側での取り扱いの違いから生じる低いディールス−アルダー付加物収率の可能性をなくす。たとえば、一般的な実験では約０．２重量％のオレイン酸添加が添加される。好ましくは、必要なオレイン酸の最小量を使用して、後続の洗浄及びクロマトグラフィー工程に対する有害作用を最小限にする。
【０１３８】
前記から、本発明の本質及び範囲を逸することなく多様な変形及び変更を実現しうることが理解されよう。提示した具体例に対する限定を意図せず、それが推量されるべきではないことを理解しなければならない。開示は、請求の範囲に該当する変形を請求の範囲によって包含することを意図する。