(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列を有するα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ酵素活性を有するタンパク質。
【請求項２】
配列番号２の塩基配列で示される、請求項１に記載のタンパク質をコードする遺伝子のＤＮＡ。
【請求項３】
請求項２に記載のＤＮＡの内、少なくともコーディング領域を含んでなる組換えベクター。
【請求項４】
請求項３に記載の組換えベクターが組換えベクターｐＧＨ２であること、を特徴とする組換えベクター。
【請求項５】
請求項３又は４に記載の組換えベクターを麹菌に導入してなる形質転換体。
【請求項６】
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＭＥＬ−Ａｂｆ（ＦＥＲＭ  Ｐ−１７９５０）。
【請求項７】
請求項５又は６に記載の形質転換体を利用すること、を特徴とするα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ酵素活性を有するタンパク質を生産する方法。
【請求項８】
請求項１に記載のタンパク質を使用すること、を特徴とするアラビノースの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、麹菌のα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ遺伝子に関するものである。詳細には、本発明は、Aspergillus oryzaeより新規に単離したα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ遺伝子を用いて、α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼを大量に生産させ、ヘミセルロースを分解して燃料アルコールなどの物質へと変換するなど様々な産業分野に利用することを可能にするものである。
【０００２】
【従来の技術】
Ｌ−アラビノースは細胞壁の構成糖であり、Ｌ−アラビノースのみが１，２−α、１，３−α、１，５−α結合したものがＬ−アラビナンであり、ガラクトースやキシロースと結合したものが、アラビノガラクタン（１，３−α、１，６−α結合）、アラビノキシラン（１，２−α、１，３−α結合）であり、植物の細胞壁多糖として広く存在する。これらアラビノースを含む多糖は、非常に分解が困難で、天然資源として有効に利用できないことが大きな問題点となっている。特にアラビノキシランを主成分とするヘミセルロースは、天然界において２番目に多量に存在する多糖であるにもかかわらず、有効な分解方法が開発されておらず、資源活用の必要性が望まれているバイオマスである。
【０００３】
これらのＬ−アラビノース含有多糖の分解酵素には、エンド型分解酵素のｅｎｄｏ−アラビナナーゼとエキソ型分解酵素のＬ−アラビノフラノシダーゼがある。中でもＬ−アラビノフラノシダーゼはアラビノースと他の糖類との結合であるアラビノフラノシル基の結合を切断するため、Ｌ−アラビノースを含有する複合多糖の分解に有効であると考えられている。実際にヘミセルロースの主成分であるアラビノキシランはキシラナーゼにより、βキシラン主鎖を分解することが可能であるが、アラビノフラノシル基側鎖を分解するＬ−アラビノフラノシダーゼを共存させないと効率的な分解ができない。また、アラビノガラクタンやペクチンなどにもアラビノフラノシル基側鎖が存在し、同様に効率的な分解にはＬ−アラビノフラノシダーゼが必要である。
【０００４】
このように、α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼは、Ｌ−アラビノース含有多糖の分解に有効であることから、ヘミセルロース資源の燃料への変換、パルプの非木質化、植物資源の飼料への利用、ワイン発酵中におけるブドウのモノテルペングリコシドの加水分解、アラビノースの製造、ヘミセルロース含有廃水の処理など、様々な利用方法が期待されている。
【０００５】
これまでの商業的に利用されているアラビノース多糖の分解酵素は、Aspergillus niger由来のものである。この酵素には２種類のアラビノフラノシダーゼと１種類のｅｎｄｏ−Ｌ−アラビナナーゼが含まれている。しかしながら酵素生産性が低く、天然アラビノース多糖を分解して効率的な資源利用することは実用化されていない。特に本菌株のアラビノフラノシダーゼでは、ヘミセルロースなどアラビノース複合多糖を発酵性糖類にまで分解することはできない。
【０００６】
以上のように、ヘミセルロースなどの植物多糖を有効に資源活用するためには、アラビノース多糖を効率よく分解できるα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼの探索、開発が非常に重要となっている。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
発明者が解決しようとする課題は、ヘミセルロースを発酵性糖類へ変換し、燃料アルコールなどの物質へ変換することなどをはじめ様々な産業に利用可能なα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼを、効率よく生産させることである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明は、上記目的を達成するためになされたものであって、各方面から検討の結果、遺伝子工学的手法によることとし、鋭意研究の結果、α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼをコードする塩基配列の決定に成功し、更に該遺伝子を含有した形質転換体の作成、該遺伝子の発現（しかも真核生物による高発現）、該形質転換体の培養によるα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ又はα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ酵素活性を有するタンパク質の製造（しかも大量製造）、そしてこの酵素（又は酵素活性を有するタンパク質）の利用を現実に確認するのに成功し、本発明の完成に至ったものである。
以下、本発明について詳述する。
【０００９】
α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ遺伝子又は該遺伝子を含有するα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子（以下、単にα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ遺伝子ということもある）をクローニングするため、フスマ培養を行なった麹菌Aspergillus oryzaeの菌体よりｍＲＮＡを調製し、このｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡライブラリーを構築する。このライブラリーの塩基配列を網羅的に決定し、各配列と既知遺伝子データベースとのホモロジーを検索する。これらのｃＤＮＡクローンからThermotoga maritimaのα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ遺伝子と高いホモロジーを示すクローンを検索し、本クローンからＡ．ｏｒｙｚａｅのα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ遺伝子を単離する。単離したα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ遺伝子は、これを宿主に導入して発現せしめる。
【００１０】
宿主としては、各種微生物が適宜使用可能であるが、本発明においては真核生物を利用することが可能であって、目的酵素を効率よく大量に生産できるという特徴を有する。真核生物、例えば麹菌Ａ．ｏｒｙｚａｅは清酒、醤油、味噌などの我が国の伝統的発酵産業で使用されてきた糸状菌である。本菌株の特徴は、上記発酵産業で有用なタンパク質を非常に大量に生産することである。本菌株が持つ高い蛋白生産能と醸造微生物としての安全性から、異種蛋白生産の宿主として注目されている（Biotechnology, 6, 1419 (1988)、特開昭62-272988）。発明者らの研究から、Ａ．ｏｒｙｚａｅを用いた異種蛋白生産においては、Aspergillus属などの近種の遺伝子であれば、その生産能はさらに増大することが認められた。特にＡ．ｏｒｙｚａｅの遺伝子を、Ａ．ｏｒｙｚａｅの高発現プロモーター制御下で発現させた場合、非常に大量のタンパク質が生産されることを見いだした（特願平11-154271、特願2000-36754）。本発明は、この系を利用することによって、α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ遺伝子を麹菌で効率的に発現せしめ、α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ遺伝子を大量生産することにはじめて成功したものである。
【００１１】
上記により単離したα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ遺伝子は、単独で、あるいは麹菌のチロシナーゼ遺伝子（ｍｅｌＯ遺伝子：Biochem. Biophys. Acta., 1261(1), p.151, 1995）のプロモーターや固体培養において特異的に大量発現する麹菌由来のグルコアミラーゼ遺伝子（ｇｌａＢ）のプロモーター（特願平11-154271、特開平11-243965）のような高発現プロモーターと共に、Ａ．ｏｒｙｚａｅにて発現させて、高純度な酵素蛋白を大量に生産させるものである。
【００１２】
遺伝子導入方法としては常法が適宜利用されるが、例えば宿主としては、ｎｉａＤ変異株（硝酸を資化できない麹菌変異株：Nitrate Reductase欠損株）を用いる公知方法により、目的遺伝子であるα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ遺伝子と形質転換用マーカー遺伝子であるｎｉａＤ遺伝子（Unkle, E. S. et al., Mol．Gen. Genet., 218, p.99-104, 1989）を同時に導入する。この遺伝子導入の際に、ベクター配列などの異種遺伝子を排除することにより、異種遺伝子を全く含まないセルフクローニング株の形質転換体を得ることができる。そしてこの形質転換体を培養することにより、目的酵素を菌体内又は菌体外に大量分泌させることができる。
【００１３】
このように本発明によれば、α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ遺伝子をＡ．ｏｒｙｚａｅから単離するのに成功し、酵素蛋白をＡ．ｏｒｙｚａｅによって大量に生産させることに成功したものである。そのうえ更に、該異種遺伝子を導入する場合、Ａ．ｏｒｙｚａｅ以外の異種ＤＮＡが混入しない方法を採用することにより、セルフクローニング株となり、組換え微生物の規制からも除外されるという著効が奏される。
以下、本発明を更に具体的に説明する。
【００１４】
ｃＤＮＡライブラリーを網羅的に塩基配列を決定したデータベースより、Thermotoga maritimaのα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ遺伝子と相同性を示すクローンを抽出した。このｃＤＮＡクローンをプローブとして、Ａ．ｏｒｙｚａｅのＥＭＢＬ３ファージライブラリーより、染色体のα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ遺伝子を含むポジティブクローンを選択した。得られたポジティブクローンをテンペレートとして、α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼのコーディング領域、プロモーター領域、ターミネーター領域を含む全長３．８ｋｂについてその全塩基配列を決定した。その結果、α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ遺伝子は５つのイントロンを含み、遺伝子から推定されるタンパク質のアミノ酸配列は４８１残基であり、Thermotoga maritimaのα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼとのホモロジーはアミノ酸レベルで３８％であった。また本遺伝子のプロモーター領域には、−２３６ｂｐにＣＡＡＴ、−１８８ｂｐにＴＡＴＡＡ−ｂｏｘとそれに引き続くＣＴ−ｒｉｃｈ  ｒｅｇｉｏｎの真核生物プロモーターに特徴的な配列が存在していた。
【００１５】
今回クローニングしたα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼはThermotoga maritimaのものと３８％の相同性を示しており、耐熱性が期待される。一方、既にクローニングされているAspergillus nigerのものとは３０％の相同性しか示さず、Aspergillus nigerとAspergillus nidulansのα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼが７７％の相同性を示すことから考えても、本酵素は糸状菌における新規なα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼであるといえる。
【００１６】
次に、この遺伝子のコーディング領域を、A. oryzaeでの高発現プロモーターであるme1Ｏプロモーター下流に連結し、α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼの麹菌での高生産を検討した。A. oryzaeの遺伝子発現ベクターにα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ遺伝子のコーディング領域(ATG下流1.8kb(1128-3009))を連結し（図７）、A. oryzaeのniaD変異株に導入した。その結果、me1Ｏプロモーター制御下において菌体内に大量のα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼが分泌された。この酵素蛋白を精製し、ヘミセルロースに対する反応を検討した結果、ヘミセルロースを分解する活性が認められた。
【００１７】
以上の結果より、クローニングした遺伝子断片には、α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ活性を有する蛋白がコードされていることが確認できた。またこの遺伝子を用いて、α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ蛋白を高生産させることが可能であり、生産されたタンパク質はヘミセルロースの分解の他様々な産業分野で応用が可能であることも確認した。
【００１８】
得られた形質転換体の内、好適なもののひとつを工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ  Ｐ−１７９５０として寄託した。ｍｅｌＯプロモーターの塩基配列は、配列番号５及び図８に示す。
【００１９】
以上の結果より、クローニングした遺伝子断片には、α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ活性を有する蛋白がコードされていることが確認できた。またこの遺伝子を用いて、α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ蛋白を高生産することが可能であり、生産されたタンパク質は、酵素自体が試薬として有用であるだけでなく、様々な産業分野での応用が可能であり、例えば次のような用途への応用が非限定的に例挙される：ヘミセルロース資源の発酵性糖類への変換、更にこれらの燃料アルコールへの変換、パルプの非木質化、ヘミセルロース等難消化性植物資源の可消化による飼料化、ワイン発酵中におけるブドウのモノテルペングリコシドの加水分解、木質材料その他ヘミセルロース等アラビノース複合多糖含有物質の発酵性糖類への分解（例えば、アラビノースの製造、ヘミセルロースの分解、廃水処理への応用等）。その他、医薬品、化粧品、飲食品への応用も可能である。
以下、本発明の実施例について述べる。
【００２０】
【実施例１】
α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ遺伝子のクローニング
フスマ培養から得られたｍＲＮＡによるｃＤＮＡライブラリー（ＥＳＴライブラリー）の中より、Thermotoga maritimaのα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ遺伝子に相同性の高いクローンＪＺ３４７６を選択した。次にＥＭＢＬ３ファージを用いたアスペルギルス・オリゼーＯ−１０１３株（工業技術院生命工学工業技術研究所寄託  ＦＥＲＭ  Ｐ−１６５２８）の染色体ジーンライブラリーより、プラークハイブリダイゼーション法によりα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ遺伝子をクローニングした。ＥＳＴ配列を元にプローブを作成するため、以下に記載する配列のヌクレオチドプライマーを２種類合成した。次いで、これらのプライマーを用い、A. oryzae RIB 40株のゲノムをテンペレートとしてＰＣＲを行い、反応生成物をランダムプライムラベリング法により蛍光標識してプローブとした。
【００２１】
上記２種類のオリゴＤＮＡプライマーの内、一方は、センスプライマーであって、その塩基配列は配列番号３（図５）に示され、他方は、アンチセンスプライマーであって、その塩基配列は配列番号４（図６）に示される。
【００２２】
この方法により約１００００個のファージクローンの中から、上記のプローブとハイブリダイズするクローンλＡＦ５４を単離した。上記のオリゴＤＮＡをプライマーとしてジデオキシ法によりＤＮＡ塩基配列を決定し、本クローンが確かに目的のα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ遺伝子であることを確認した。
【００２３】
【実施例２】
α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ遺伝子の塩基配列の決定
ポジティブクローンλＡＦ５４株をテンペレートとしてα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ遺伝子の全塩基配列の決定を行なった。プロモーター部分、コーディング領域、ターミネーター部分をあわせて、３．８ｋｂの配列を決定した（配列番号２：図３、図４）。上記配列の内、１位置から１１２７の位置までがプロモーター部分であり、１１２８の位置から３００９の位置までの領域がコーディング領域であり、３０１０の位置から３７５２の位置までがターミネーター部分である。
【００２４】
また、Thermotoga maritimaとのホモロジー検索の結果から、α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼには５つのイントロンが存在し、そのコーディング領域は１８８２ｂｐであり、塩基配列から推定されるタンパク質は、４８１残基であることが明らかとなった。（配列番号１：図１、図２）。
【００２５】
【実施例３】
α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ遺伝子麹菌への導入
得られたα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ遺伝子の中のコーディング領域（配列番号２の１１２８−３００９）を麹菌の高発現プロモーターであるme1Ｏプロモーター下流に連結した。さらにこの融合遺伝子を麹菌発現ベクターであるpIN93のPstIサイトに挿入したα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ発現プラスミドpGH2を構築した。（図７）このpGH2をA. oryzaeのniaD変異株Aspergillus oryzae 1013-niaD (工業技術院生命工学工業技術研究所寄託FERM P-17707）に導入し、硝酸資化能が回復した株を遺伝子導入株として選択した。このようにして得た形質転換体の内、そのひとつをAspergillus oryzae MEL-Abfと命名し、工業技術院生命工学工業技術研究所にFERM P-17950として寄託した。
【００２６】
得られた遺伝子導入株を、DPY培地にて液体培養を行い、菌体内のα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ活性を測定した。（表１）α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ活性の測定はVan der Veenらの方法に従い行った。(Van der Veen, P., Flipphi, M.J., Voragen, A.G.J. & Visser, J. (1991) Archi Microbiol 157, 23-28）
【００２７】
（表１）
0003773778.tif 000002
【００２８】
その結果、α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ遺伝子を導入した形質転換体は、菌体内に非常に高いα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ活性が認められた。この結果、単離したα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ遺伝子には、α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ活性を有する蛋白がコードされていることが確認できた。
【００２９】
【実施例４】
組み換えα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼの大量生産
実施例３で作成した、α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ遺伝子導入株を培養し、組換えα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼの大量生産を試みた。３ＬのCz-Dox培地で、３０℃で１０日間培養した菌体を遠心分離などで集菌して、液体窒素下でパウダー状になるまですりつぶした。この破砕した菌体（乾燥重量８ｇ）に、１００ｍｌの５０ｍＭのリン酸バッファー(ｐＨ７．０）を加え、よく混合した後、遠心分離によって固形分を除去した。
このようにして得られた菌体抽出液を、５０ｍＭのリン酸バッファーで透析し、低分子画分を除いた後、これをα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ粗酵素液とし、１００ｍｌを得た。
【００３０】
【発明の効果】
本発明により、麹菌のα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼを大量に生産することがはじめて可能となり、従来活用が困難であったヘミセルロース資源の分解などパイマス利用に広く利用することができる。また本発明は麹菌の酵素を麹菌で生産させるため、生産される酵素蛋白は非常に安全性が高く、パイオマスからの燃料製造だけでなく食品、医薬品、化粧品産業などへも応用が可能な画期的な技術である。
【００３１】
【配列表】
0003773778.tif 000003
0003773778.tif 000004
0003773778.tif 000005
0003773778.tif 000006
0003773778.tif 000007
0003773778.tif 000008
0003773778.tif 000009
【図面の簡単な説明】
【図１】α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼのアミノ酸配列を示す。
【図２】同上続きを示す。
【図３】α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ遺伝子の塩基配列を示す。
【図４】同上続きを示す。
【図５】センスプライマーを示す。
【図６】アンチセンスプライマーを示す。
【図７】麹菌発現プラスミドｐＧＨ２の構築及びその制限酵素地図を示す。
【図８】ｍｅｌＯプロモーターの塩基配列を示す。
【図１】
0003773778.tif 000010
【図２】
0003773778.tif 000011
【図３】
0003773778.tif 000012
【図４】
0003773778.tif 000013
【図５】
0003773778.tif 000014
【図６】
0003773778.tif 000015
【図７】
0003773778.tif 000016
【図８】
0003773778.tif 000017