(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の一般式（Ｉ）：
【化１】
0003769668.tif 000009
〔式中、Ｒ1及びＲ2はそれぞれ独立に水素原子又は低級アルキル基を示し；Ｒ3は水素原子、低級アルキル基、又は＝ＣＨＲ4（Ｒ4は低級アルキル基を示す）を示し；----は単結合又は二重結合を示し；１３個のＸのうち少なくとも５個のＸは重水素原子又はトリチウム原子を示し、残りのＸ（ただし１３個のＸが重水素原子又はトリチウム原子である場合を除く）は水素原子を示す〕で表される化合物の混合物。
【請求項２】
請求項１に記載の一般式（Ｉ）で表される化合物の混合物の製造方法であって、下記の一般式（II）：
【化２】
0003769668.tif 000010
（式中、Ｒ1及びＲ2はそれぞれ独立に水素原子又は低級アルキル基を示し；Ｒ3は水素原子、低級アルキル基、又は＝ＣＨＲ4（Ｒ4は低級アルキル基を示す）を示し；----は単結合又は二重結合を示す）で表される化合物を酸触媒の存在下に重水素化溶媒又はトリチウム化溶媒で処理する工程を含む方法。
【請求項３】
酸触媒が重水素化酸触媒又はトリチウム化酸触媒である請求項２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は重水素又はトリチウム標識されたステロイド化合物及び該ステロイド化合物の製造方法に関するものである。
【０００２】
ステロイドはパーヒドロシクロペンタノフェナンスレンを基本骨格に有する動物及び植物脂質の総称であり、生体構成成分或いはホルモンに代表される生体機能物質として動・植物組織に広く存在している。様々な生理活性を有するステロイドが多数知られており、生体機能の解明或いは新しい医・農薬の開発を目的とした研究が広範な分野に渡り盛んに行われている。このような研究において、同位体標識ステロイドは、生合成、代謝、或いは受容体機構等の解明に必要不可欠な手段として利用されている。重水素標識体の主な利用局面はGC-MS定量分析における標準物質としての利用であるが、精度の高い定量を実現するためにはMSイオンピークがサンプル由来のピークと重ならない高標識体が必要となる。また、放射活性を利用するトリチウム標識体の場合には、タンパク質との結合実験等では低標識体は実用にならず、高放射活性体が必要である。
【０００３】
従来、同位体標識ステロイドは様々な手法により合成が行われているが、ステロイド骨格のＢ、Ｃ、及びＤ環を効率的に高度に重水素化又はトリチウム化する方法は開発されていない。特に、現在、動植物の生体内での機能が注目されている５α−ステロイド−８，１４−ジエン−３β−オールのＢ、Ｃ、及びＤ環を重水素又はトリチウムで高度に標識化した化合物は知られていない。
【０００４】
一方、本発明者らは、ステロイド-５，７−ジエン（３−１、３−２、及び３−３）をプロトン酸触媒下にプロトン溶媒中で加熱することにより、対応する５α−ステロイド−８，１４−ジエン−３β−オール（２−１、２−２、及び２−３）を合成し、その反応機構の研究により、８，１４−ジエンは、５，７−ジエンがプロトン化−脱プロトン化を繰り返して生成する種々のステロイドジエンの平衡混合物の中で熱力学的に最も安定なジエンとして得られることを明らかにしている (H. Seto et al., J. Chem. Soc., Perkin Trans., 1, 2000, 1697)。
【０００５】
【化３】
0003769668.tif 000002
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、動植物の生体内での機能が注目されている５α−ステロイド−８，１４−ジエン−３β−オールのＢ、Ｃ、及びＤ環を重水素又はトリチウムで高度に標識した化合物を提供することにある。また、本発明の別の課題は、上記の標識化合物を効率的に製造する方法を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記の平衡には上記スキーム中の共役ジエン（８、９、１０、及び１１）も関与しているとの仮説の下に、この平衡反応では、プロトン化−脱プロトン化の繰り返しによって５α−ステロイド−８，１４−ジエン−３β−オール（上記２−１、２−２、及び２−３）のＢ、Ｃ、及びＤ環上にある１３個の水素原子が全て溶媒及び酸触媒の水素原子と置換する可能性を考えた。そこで、本反応を重水素又はトリチウムで標識した酸触媒及び溶媒を用いて行ったところ、ステロイド−５，７−ジエン−３β−オールを原料として重水素又はトリチウムで高度に標識化された５α−ステロイド−８，１４−ジエン−３β−オールを得ることに成功した。本発明は上記の知見を基にして完成されたものである。
【０００８】
すなわち、本発明は、下記の式（Ｉ）：
【化４】
0003769668.tif 000003
〔式中、Ｒ1及びＲ2はそれぞれ独立に水素原子又は低級アルキル基を示し；Ｒ3は水素原子、低級アルキル基、又は＝ＣＨＲ4（Ｒ4は低級アルキル基を示す）を示し；----は単結合又は二重結合を示し；１３個のＸのうち少なくとも５個のＸは重水素原子又はトリチウム原子を示し、残りのＸ（ただし１３個のＸが重水素原子又はトリチウム原子である場合を除く）は水素原子を示す〕で表される化合物を提供するものである。
【０００９】
別の観点からは、本発明により、上記式（Ｉ）で表される化合物の製造方法であって、下記の一般式（II）：
【化５】
0003769668.tif 000004
（式中、Ｒ1及びＲ2はそれぞれ独立に水素原子又は低級アルキル基を示し；Ｒ3は水素原子、低級アルキル基、又は＝ＣＨＲ4（Ｒ4は低級アルキル基を示す）を示し；----は単結合又は二重結合を示す）で表される化合物を酸触媒の存在下に重水素化溶媒又はトリチウム化溶媒で処理する工程を含む方法が提供される。この発明の好ましい態様として、酸触媒が重水素化酸触媒又はトリチウム化酸触媒である上記方法が提供される。
【００１０】
【発明の実施の形態】
Ｒ1及びＲ2はそれぞれ独立に水素原子又は低級アルキル基を示す。本明細書において低級アルキル基という場合には直鎖状、分枝鎖状、環状、又はそれらの組み合わせのいずれでもよく、低級とは炭素数１〜６個程度を示す。Ｒ1及びＲ2は水素原子又はメチル基であることが好ましい。Ｒ3は水素原子、低級アルキル基、又は＝ＣＨＲ4（Ｒ4は低級アルキル基を示す）を示す。Ｒ3が示す低級アルキル基としてはメチル基又はエチル基が好ましい。Ｒ4が示す低級アルキル基としてはメチル基が好ましい。----は単結合又は二重結合を示す。Ｒ３が二価の基である場合には、23-24位は単結合となる。１３個のＸのうち少なくとも５個のＸは重水素原子又はトリチウム原子を示し、残りのＸ（ただし１３個のＸが重水素原子又はトリチウム原子である場合を除く）は水素原子を示すが、１３個のＸのうち少なくとも７個のＸが重水素原子又はトリチウム原子であることが好ましく、より好ましくは８個以上、特に好ましくは９個以上のＸが重水素原子又はトリチウム原子である。
【００１１】
本発明の方法は、一般式（Ｉ）で表される重水素化又はトリチウム化された５α−ステロイド−８，１４−ジエン−３β−オールを製造するにあたり、一般式（II）で表されるステロイド−５，７−ジエン−３β−オールを酸触媒の存在下に重水素化溶媒又はトリチウム化溶媒で処理することを特徴としている。重水素化又はトリチウム化された溶媒としては、例えば、重水素化はトリチウムで置換された水のほか、重水素化はトリチウムで置換された直鎖脂肪族アルコール（例えば、メチルアルコール、エチルアルコール、プロピルアルコール、ブチルアルコール等）を用いることができるが、これらに限定されることはない。重水素化又はトリチウム化された溶媒とともにベンゼン、トルエン、エーテル、テトラヒドロフラン等の非プロトン溶媒を用いてもよい。通常、一般式（II）で表される化合物の重量に対して１０〜１００倍重量程度の溶媒が用いられる。重水素又はトリチウム化された溶媒の同位体純度は、高いほど短時間で高い同位体標識化が計られるが、98% 以上であれば問題なく目的が達せられる。
【００１２】
酸触媒としては、例えば、塩酸、硫酸、硝酸などのプロトン酸を用いることができる。酸触媒として重水素又はトリチウム置換した酸触媒を用いることが好ましい。通常、一般式（II）で表される化合物に対して２〜５０当量の酸触媒が用いられる。反応は、一般的には、一般式（II）で表される化合物を上記溶媒に溶解して酸触媒の存在下で加熱して反応させればよい。通常、反応温度は８０〜１００℃であり、反応時間は４〜１００時間程度である。
【００１３】
いかなる特定の理論に拘泥するわけではないが、本発明の方法における反応は平衡反応であることから、反応時間を長くすることにより、速度論的同位体効果によって重水素或いはトリチウムがステロイド環に濃縮され、一般式（Ｉ）における１３個のＸが全て重水素又はトリチウムで置換された化合物を製造することが可能である。また、反応時間を適宜調節することにより、適宜の数のＸが重水素化又はトリチウム化された化合物を製造することができる。例えば、４〜４８時間程度で７〜９個のＸが重水素又はトリチウムで置換された化合物を製造することができる。なお、上記一般式（Ｉ）で表される本発明の化合物の範囲には、それぞれ個数の異なるＸ及び／又はそれぞれ異なる位置のＸが重水素化又はトリチウム化された2種以上の化合物の任意の混合物が包含される。
【００１４】
一般式（Ｉ）で表される本発明の化合物は、動植物の生体内での機能が注目されている５α−ステロイド−８，１４−ジエン−３β−オ−ルの分子レベルでの研究に有用である。例えば、５α−ステロイド−８，１４−ジエン−３β−オ−ルの生体内生産量、器官若しくは細胞内での局在、輸送、代謝、又は受容体タンパク質を含む結合タンパク質の研究に有用である。また、一般式（Ｉ）で表される本発明の化合物は、種々の生理活性ステロイド化合物の高度同位体標識化合物の合成原料として利用することもできる。
【００１５】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。
以下の実施例において、高速液体クロマトグラフィー (HPLC) は カラムとしてSenshu Pak PG-S60-5251 (20 mm i.d. ×25 cm; Senshu Scientific Co.) を用い、溶出速度 9.0 ml/min で行った。GC-MS 分析は Automass JMS-AM SUN (JEOL, Tokyo)にて EI モード (70 eV) で行い、カラムは DB-5 column (0.25 mm×15 m, 0.25-mmfilm thickness, J & W Scientific, Folsom, CA) を用いた。分析時のカラムオーブンの温度は次のように設定した。すなわち、80℃で１分間保持した後、30℃/minで320℃まで昇温し、そのまま５分間保持した。キャリアガスとしてはヘリウムを用い、流速 １mL/min とした。サンプル注入部の温度は 280℃とした。GC-MS 分析用のトリメチルシリル化はサンプルの極微量 (約 1μg) をマイクロチューブに取り、10〜20μL のN-メチル-N-トリメチルシリルトリフルオロアセトアミドで80℃で30分間処理し、そのまま分析した。MSスペクトルの表示は、M+ はそれぞれの化合物に相当する非標識体の分子イオンピークを示し、m/z M+ -2 以上の領域に現れるピークのみを示した。イオン強度は、この領域の最大ピーク(100%) に対する%で示した。
【００１６】
例１
【化６】
0003769668.tif 000005
【００１７】
コレスタ-5,7-ジエン-3β-オール（3-1）を重水素化エタノール (ethyl alcohol-d, 99.5+ atom % D) 中、37%重水素化塩酸(deuterium chloride、D2O中37 wt.%溶液, 99.5 atom % D) 存在下に加熱還流し、４、８、２４、４８時間反応後の 5α-コレスタ-8,14-ジエン-3β-オール-dn（1-1）への重水素の取り込みを検証した。各時間毎に得られた（1-1）を分離精製し、トリメチルシリル化剤で前処理した後、GC-MS 分析を行った。得られた（1-1）のトリメチルシリル化体（13-1）の m/z 454 以上の領域に現れるイオンピークの分布を表１に示した。非標識体 (12-1) の分布は、 m/z: 454 (M+-2, 1%), 455 (M+-1, 20), 456 (M+,100), 457 (M++1, 43), 458 (M++2, 11), 459 (M++3, 2)なので、いずれのサンプルもこの領域では非標識体と重なるイオンピークを持たないことがわかる。このことは、本重水素標識体は、主な利用局面であるGC-MS定量分析において、高精度の定量分析を実現する優れた標準物質になることを示している。
【００１８】
【表１】
0003769668.tif 000006
【００１９】
【化７】
0003769668.tif 000007
次に、表１のデータを基にして、各サンプルの dn 体の分布と１分子当りの平均重水素原子取り込み数を計算した(表２)。本反応の機構（平衡反応）及び速度論的同位体効果から予想した様に、重水素が効率的に取り込まれた。４時間で既に 7.3 個、反応時間を延長するとその取り込みは徐々に増加し、48 時間後には 9.1 個に達した。このことは、本反応をトリチウム化したエタノール及びトリチウム化した塩酸を用いて行えば、非常に高い放射活性を有する[5,6,6,7,7,11,11,12,12,15,16,16,17-3H13]-5α-コレスタ-8,14-ジエン-3β-オールの製造も可能であることを示している。
【００２０】
【表２】
0003769668.tif 000008
【００２１】
例２：[5,6,6,7,7,11,11,12,12,15,16,16,17-2H13]-5α-コレスタ-8,14-ジエン-3β-オール(1-1)
市販のコレスタ-5,7-ジエン-3β-オール(3-1: 98 mg)を重水素化エタノール (4 ml、99.5+ atom % D) に溶解し、47% 重水素化塩酸 (0.2 ml、D2O中37 wt.% 溶液, 99.5 atom % D) を加え、窒素気流下５時間加熱還流した。減圧下にエタノールを留去し、水を加えてエーテルで抽出した。エーテル層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で洗浄した後、硫酸ナトリウムにて乾燥した。溶媒を留去後、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（へキサンー酢酸エチル、4:1）及び高速液体クロマトグラフィーで精製し、表題の化合物42 mg (43%)を得た。
【００２２】
colorless scales, mp 111-113℃ (MeOH)
1H-NMR(600 MHz) δ 0.82 (3H, s,18-H3), 0.868 (3H, d, J 6.8 Hz, 26-H3), 0.871 (3H, d, J 6.8 Hz, 27-H3), 0.94(3H, d, J 6.4 Hz, 21-H3), 0.99 (3H, s, 19-H3)
トリメチルシリル体 (13-1)のEI-MS m/z 460 (M++4, 3%), 461 (M++5, 16), 462 (M++6, 52), 463 (M++7, 95),464 (M++8, 100), 465 (M++9, 59), 466 (M++10, 23), 467 (M++11, 6), 468(M++12, 2)。
本化合物の融点、HPLC の溶出時間、ガスクロマトグラフィーの保持時間 [(1-1)及びそのトリメチルシリル化体(13-1)] は5α-コレスタ-8,14-ジエン-3β-オール(2-1)及びそのトリメチルシリル化体(12-1)のものとそれぞれ完全に一致した。さらに、その1H-NMRスペクトルで、 18, 19, 21, 26 及び 27位の各メチルプロトン、及び３位プロトンのケミカルシフトと分裂パターンは(2-1)のものと完全に一致した [H. Seto et al., J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1, 2000, 1697]。MS より計算した (1-1) の重水素原子取り込み数は 7.4 であった。
【００２３】
例３：[5,6,6,7,7,11,11,12,12,15,16,16,17-2H13]-カンペスタ-8,14-ジエノール(1-2)
市販のカンペステロールより常法 [W.K. Kircher and F.U. Rosenstein, Lipids, 9, 333-337, 1974] に従って合成したカンペスタ-5,7-ジエノール(3-2, 50 mg) を重水素化エタノール (2 ml, 99.5+ atom % D) に溶解し、47% 重水素化塩酸 (0.1 ml、D2O中37 wt.% 溶液, 99.5 atom % D) を加え、窒素気流下５時間加熱還流した。上記 (1-1) の場合と同様の後処理を行い、精製操作を経て表題の化合物22 mg (44%)を得た。
【００２４】
Rt=32.0 min
colorless scales, mp 111-113℃(MeOH)
1H-NHR (300 MHz) δ 0.78 (3H, d, J 6.9 Hz, 26-H3), 0.81 (3H, d, J 6.8 Hz, 27-H3), 0.82 (3H, s, 18-H3),0.86 (3H, d, J 6.8 Hz, 28-H3), 0.93 (3H, d, J 6.2 Hz, 21-H3), 0.99 (3H, s,19-H3), 3.63 (1H, br tt, J 10.9 and 4.7 Hz, 3-H), 5.36 (0.09 H, br t, J 2.5,15-H)
トリメチルシリル体 (13-2) のEI-MS m/z 473 (M++3, 1%), 474 (M++4, 5),475 (M++5, 22), 476 (M++6, 63), 477 (M++7, 100), 478 (M++8, 78), 479 (M++9,38), 480 (M++10, 13), 481 (M++11, 4), 482 (M++12, 1)。
本化合物の融点、HPLCの溶出時間、ガスクロマトグラフィーの保持時間 [(1-2) 及びそのトリメチルシリル化体(13-2)] はカンペスタ-8,14-ジエノール(2-2) 及びそのトリメチルシリル化体(12-2) のものとそれぞれ完全に一致した。さらに、その1H-NMR スペクトルで 18, 19, 21, 26, 27 及び 28位の各メチルプロトン、及び３位プロトンのケミカルシフトと分裂パターンは (2-2) のものと完全に一致した[H. Seto et al., J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1, 2000, 1697]。MSより計算した(1-2) の重水素原子取り込み数は 7.0 であった。
【００２５】
例４：[5,6,6,7,7,11,11,12,12,15,16,16,17-2H13]-シトスタ-8,14-ジエノール(1-3)
市販のβ-シトステロールより常法 [H.W. Kircher, Lipids, 9, 623-624, 1974]に従って合成したシトスタ-5,7-ジエノール(3-3, 50 mg) を重水素化エタノール (2 ml, 99.5+ atom % D) に溶解し、47%重水素化塩酸 (0.1 ml、D2O中37 wt.% 溶液, 99.5 atom % D) を加え、窒素気流下５時間加熱還流した。上記 (1-1) の場合と同様の後処理及び精製操作を経て表題の化合物25 mg (50%)を得た。
【００２６】
Rt=30.0 min
colorless scales, mp 105-106℃(MeOH)
1H-NHM(300 MHz) δ 0.82 (3H,s, 18-H3), 0.82 and 0.84 (each 3H, each d, each J 7.2 Hz, 26- and 27-H3),0.86 (3H, t, J 7.3 Hz, 29-H3), 0.95 (3H, d, J 6.1 Hz, 21-H3), 0.99 (3H, s,19-H3),3.63 (1H, tt, J 10.8 and 4.9 Hz, 3-H), 5.36 (0.07 H, br t, J 2.5 Hz,15-H);
トリメチルシリル体 (13-3) のEI-MS m/z 487 (M++3, 2%), 488 (M++4, 8),489 (M++5, 34), 490 (M++6, 80), 491 (M++7, 100), 492 (M++8, 75), 493 (M++9,33), 494 (M++10, 11), 495 (M++11, 3)。
本化合物の融点、HPLC の溶出時間、ガスクロマトグラフィーの保持時間 [(1-3)及びそのトリメチルシリル化体(13-3) ]はシトスタ-8,14-ジエノール(2-3) 及びそのトリメチルシリル化体(12-3)のものとそれぞれ完全に一致した。さらに、その1H-NMR スペクトルで18, 19, 21, 26, 27 及び 29位の各メチルプロトン、及び３位プロトンのケミカルシフトと分裂パターンは (2-3) のものと完全に一致した [H.Seto et al.,J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1, 2000, 1697]。MS より計算した (1-2) の重水素原子取り込み数は 6.7 であった。
【００２７】
【発明の効果】
本発明により、様々な生理活性ステロイドの生体内生量の定量分析やタンパク質との結合実験等、多様な研究の場で様々に利用可能なステロイドの高度同位元素標識体が提供される。