(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（Ｉ）
【化３】
0003843692.tif 000006
で示される（±）−２−ノルボルナノンに、マイクロバクテリウム（Microbacterium）属およびキャンディダ（Candida）属からなる群より選ばれる微生物であり、該化合物のカルボニル基を光学選択的に還元する能力を有する微生物の菌体及び／または該菌体処理物を作用させることを特徴とする、下記一般式（ＩＩ）で表される（＋）−ｅｎｄｏ−ノルボルネオールの製造方法。
【化４】
0003843692.tif 000007
【請求項２】
微生物がマイクロバクテリウムテスタセウム（Microbacterium testaceum）またはキャンディダパラプシロシス（Candida parapsilosis）からなる群より選ばれる微生物である請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
下記一般式（Ｉ）
【化５】
0003843692.tif 000008
で示される（±）−２−ノルボルナノンに、ロドスポリジウム（Rhodosporidium）属、メツニコウィア（Metschnikowia）属、キャンディダ（Candida）属、ピチア（Pichia）属、オクロバクトラム（Ochrobactrum）属、オブセウムバクテリウム（Obseumbacterium）属、ペントーサ（Pentosa）属、プロテウス（Proteus）属およびモルガネラ（Morganella）属からなる群より選ばれる微生物であり、該化合物のカルボニル基を光学選択的に還元する能力を有する微生物の菌体及び／または該菌体処理物を作用させることを特徴とする、下記一般式（ＩＩＩ）で表される（−）−ｅｎｄｏ−ノルボルネオールの製造方法。
【化６】
0003843692.tif 000009
【請求項４】
微生物がロドスポリジウムトルロイデス（Rhodosporidium toruloides）、メツニコウィアインテスティナリス（Metschnikowia intestinalis）、ピチア メタノリカ（Pichia methanolica）、オクロバクトラム ｓｐ．（Ochrobactrum sp.）、オブセウムバクテリウム プロテウス（Obseumbacterium proteus）、ペントーサ アグロメランス（Pentosa agglomerans）、プロテウス ミラビリス（Proteus mirabilis）およびモルガネラ モルガニイ（Morganella morganii）からなる群より選ばれる微生物である請求項３に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、微生物の菌体及び／または該菌体処理物を利用して（±）−２−ノルボルナノンのカルボニル基を光学選択的に還元し、（＋）−ｅｎｄｏ−ノルボルネオールまたは（−）−ｅｎｄｏ−ノルボルネオールを製造する方法に関する。光学活性ｅｎｄｏ−ノルボルネオールは医薬、農薬の重要な合成中間体である。
【０００２】
【従来の技術】
光学活性ｅｎｄｏ−ノルボルネオールは生理活性又は薬理活性成分（医薬品、農薬など）の中間原料として有用な物質であることが知られている。
この光学活性ｅｎｄｏ−ノルボルネオールのラセミ体からの製造方法としては、ラセミ体のｅｎｄｏ−ノルボルネオールのエステルをリパーゼ等の酵素で立体選択的に加水分解する方法（特開平８−５６６９３号公報及び J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1 (1993), (10), 1093）や、ラセミ体のｅｎｄｏ−ノルボルネオールをリパーゼ等の酵素で立体選択的にアシル化する方法（Tetrahedron Lett. (1992), 33(9), 1201及び Bull. Chem. Soc. Jpn. (1993), 66(2), 573）等の光学分割法が知られている。
【０００３】
また（＋）−ｅｎｄｏ−ノルボルネオールの製造法としては、化学合成法として、ノルボルネンのパラジウム触媒による不斉ハイドロシリル化による方法（Tetrahedron: Asymmetry (1998), 9(21), 3903）が、酵素法として、ラセミ体の２−ノルボルナノンをウマ肝臓由来アルコールデヒドロゲナーゼで立体選択的に還元する方法（J. Am. Chem. Soc. (1976), 98(26), 8476）等が知られている。
一方、（−）−ｅｎｄｏ−ノルボルネオールの製造法としては、ラセミ体の２−ノルボルナノンをクルブラリア  ルナタ（Cruvularia lunata）またはロドトルラ  ルブラ（Rhodotorula rubra）の菌体を用いて立体選択的に還元する方法（J. Org. Chem. (1980), 45(22), 4432）等も知られている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、光学分割法や化学合成法は、工程数が多いことや手法が煩雑であることから、工業化に当たっては効率的ではなく、また、哺乳動物由来の酵素を用いる方法は、使用酵素の大量入手の困難性や高価な点で、実用的ではない。
さらに、クルブラリア  ルナタ（Cruvularia lunata）またはロドトルラ  ルブラ（Rhodotorula rubra）を使用した方法では、１００ｍｇ／ｌと収率も低く、実用的でないため、これらの方法は、いずれも光学活性ｅｎｄｏ−ノルボルネオールを経済的に有利に製造する方法とは言い難い。
【０００５】
【問題を解決するための手段】
本発明者らは、経済的に優れ、簡便な方法で光学活性ｅｎｄｏ−ノルボルネオールを得るために、（±）−２−ノルボルナノンのカルボニル基を光学選択的に還元する能力を有する微生物を鋭意スクリーニングした結果、（＋）−ｅｎｄｏ−ノルボルネオールが微生物を用いた反応で製造できること、及び、これまでに報告のない微生物の菌体及び／または該菌体処理物が光学活性ｅｎｄｏ−ノルボルネオールを光学純度高く、従来よりも高収率で生成することを見いだし、本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち本発明の要旨は、下記一般式（Ｉ）
【０００７】
【化７】
0003843692.tif 000002
【０００８】
で示される（±）−２−ノルボルナノンに、該化合物のカルボニル基を光学選択的に還元する能力を有する微生物の菌体及び／または該菌体処理物を作用させることを特徴とする、下記一般式（ＩＩ）で表される（＋）−ｅｎｄｏ−ノルボルネオールまたは下記一般式（ＩＩＩ）で表される（−）−ｅｎｄｏ−ノルボルネオールの製造方法に存する。
【０００９】
【化８】
0003843692.tif 000003
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明における反応基質である（±）−２−ノルボルナノンは公知物質であり、容易に入手可能なものである。
本発明に用いることの出来る微生物は、（±）−２−ノルボルナノンを立体選択的に還元する能力を有するものであれば特に問題なく、通常、（±）−２−ノルボルナノンを含む水溶液に微生物を作用させ、その反応液を薄層クロマトグラフィーやガスクロマトグラフィーを用い、基質および生成物を定性・定量する事により活性が確認できる。
上記微生物として、具体的には以下のものが例として挙げられる。
（＋）−ｅｎｄｏ−ノルボルネオールを生産できる微生物としては、マイクロバクテリウム属またはキャンディダ属に属する微生物が挙げられ、このうち、マイクロバクテリウム  テスタセウム（Microbacterium testaceum）またはキャンディダ  パラプシロシス（Candida parapsilosis）が好ましい。上記微生物に関し、具体的な生産株としては、マイクロバクテリウム  テスタセウム  JCM1353株、キャンディダ  パラプシロシス CBS604株等が挙げられる。
（−）−ｅｎｄｏノルボルネオールを生産できる微生物としては、ロドスポリディウム属、メツニコウィア属、キャンディダ属、ピチア属、オクロバクトラム属、オブセウムバクテリウム属、ペントーサ属、プロテウス属、モルガネラ属等が挙げられ、このうち、ロドスポリディウム  トルロイデス（Rhodosporidium toruloides）、メツニコウィア  インテスティナリス（Metschnikowia intestinalis）、キャンディダ  グイリエモンディ（Candida guilliermondii）、ピチア  メタノリカ（Pichia methanolica）、オクロバクトラム  ｓｐ．（Ochrobactrum sp.）、オブセウムバクテリウム  プロテウス（Obseumbacterium proteus）、ペントーサ  アグロメランス（Pentosa agglomerans）、プロテウス  ミラビリス（Proteus mirabilis）、モルガネラ  モルガニー  ｓｕｂｓｐ．  モルガニー（Morganella morganii subsp. morganii）が好ましい。上記微生物に関し、具体的な生産菌株としては、ロドスポリディウム  トルロイデス  IFO0559株、メツニコウィア  インテスティナリス IFO1605株、キャンディダ  グイリエモンディ IFO0566株、ピチア  メタノリカ ATCC58403株、オクロバクトラム  ｓｐ． IFO12950株、IFO12952株及びIFO12953株、オブセウムバクテリウム  プロテウス ATCC12841株、ペントーサ  アグロメランス JCM1236株、プロテウス  ミラビリス IFO3849株、モルガネラ  モルガニー  ｓｕｂｓｐ．  モルガニー IFO3848株等が挙げられる。
【００１１】
ここで、ＩＦＯは大阪発酵研究所、JCMは理化学研究所  微生物系統保存施設、ＡＴＣＣはAmerican Type Culture Colectionの略であり、  これらの菌株はいずれも容易に入手可能である。
上記微生物は、ＵＶ照射やニトロソグアニジン処理等の通常の変異処理により得られる変異株、細胞融合もしくは遺伝子組換え法などの遺伝学的手法により誘導される組換え株などのいずれの株であってもよい。
本発明の製造方法においては、上記微生物の１種あるいは２種以上が菌体及び／または菌体処理物として用いられる。具体的には、上記微生物を培養して得られた菌体をそのまま、あるいは培養して得られた菌体を公知の手法で処理したもの、即ち、アセトン処理したもの、風乾または凍結乾燥処理したもの、菌体を物理的または酵素的に破砕したもの等の菌体処理物を用いることができる。また、これらの菌体または菌体処理物から、（±）−２−ノルボルナノンに作用し光学活性ｅｎｄｏ−ノルボルネオールに変換するする能力を有する酵素画分を粗製物あるいは精製物として取り出して用いることも可能である。さらには、このようにして得られた菌体、菌体処理物、酵素画分等を通常の固定化技術を用いて、すなわち、ポリアクリルアミド、カラギーナンゲル等の担体に固定化したもの等を用いることも可能である。そこで本明細書において、「菌体及び／または該菌体処理物」の用語は、上述の菌体、菌体処理物、酵素画分、及びそれらの固定化物全てを含有する概念として用いられる。
【００１２】
また、上記微生物は、通常、培養して用いられるが、この培養については定法通り行うことができる。本微生物の培養の為に用いられる培地には本微生物が資化しうる炭素源、窒素源、及び無機イオン等が含まれる。炭素源としては、グルコース、フルクトース、サッカロース等の炭水化物、グリセロール、マンニトール、キシリトール、リビトール等のポリアルコール類、有機酸その他が適宜使用される。窒素源としては、ＮＺアミン、トリプトース、酵母エキス、ポリペプトン、肉エキス、大豆抽出物などの有機窒素源、あるいは硫酸アンモニウム塩、硝酸アンモニウム塩などの無機窒素源、その他などが適宜使用される。無機イオンとしては、リン酸イオン、マグネシウムイオン、鉄イオン、マンガンイオン、モリブデンイオンその他が必要に応じ適宜使用される。好気的条件下に、ｐＨ約３〜１０、好ましくはｐＨ６〜８、温度４〜５０℃、好ましくは２５〜４０℃の適当な範囲に制御しつつ１〜１００時間行う。
【００１３】
次に、本発明の製造方法について具体的に説明する。
本発明においては、原料として（±）−２−ノルボルナノンを用い、これに水性媒体中で上記特定の微生物の菌体又は該菌体処理物を作用させて、光学活性ｅｎｄｏ−ノルボルネオールを製造する。
反応の方法としては、ａ）上記培養微生物の菌体及び／または該菌体処理物と（±）−２−ノルボルナノンとを水性媒体中で接触させる方法、ｂ）（±）−２−ノルボルナノン含有培地用い、培養と反応を同時に行う方法、ｃ）培養終了後、２−ノルボルナノンを添加して更にそのまま反応を行う方法等が挙げられ、これらは適宜用いることができるが、工業的には、微生物増殖に転用されるエネルギーロスが無い方が好ましいため、上記ａ）の方法が好ましい。
【００１４】
反応系中での（±）−２−ノルボルナノンの濃度は０．０００１〜５０％、好ましくは０．０１〜５％の範囲が望ましく、必要ならば反応の間、（±）−２−ノルボルナノンは追補添加される。
本発明中で述べる水性媒体としては、リン酸カリウムやトリス塩酸塩等を含有する緩衝能力を有する水溶液が一般的には用いられるが、反応中、ｐＨをモニターし、塩酸や水酸化ナトリウム等の酸・アルカリによりｐＨ変化を制御するのであれば緩衝成分を省略することもできる。また、基質の溶解度を増加させるためメタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、アセトン、ジオキサン、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルフォキシド等の親水性溶媒を添加してもよい。さらに、基質や生成物による反応阻害を抑えるために酢酸エチル、酢酸ブチル、ヘキサン、イソプロピルエーテル、四塩化炭素、１―オクタノール等の疎水性溶媒を添加することもできる。
反応液中には還元反応のエネルギー源として、グルコース、エタノール、イソプロピルアルコール、蟻酸等が基質の１〜１０倍モル等量含まれていることが好ましい。また、還元反応において補酵素として利用される酸化型または還元型のニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）またはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）を０．００１〜０．１％添加すると効果的である。さらに、補酵素の還元型への再生を促進するために、グルコース脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、蟻酸脱水素酵素等を添加することも効果的である。
【００１５】
反応条件は、微生物の種類によっても異なるが、通常、４〜７０℃、好ましくは２０〜５０℃、さらに好ましくは２８〜４２℃の範囲で行い、ｐＨは通常３〜１０、好ましくは５〜９、さらに好ましくは６〜８の範囲で行う。反応時間は、原料基質の仕込み濃度にもよるが、通常、１〜７２時間程度の間で行われる。
反応形態としては、バッチ法でも連続法でも何れでも構わないが、連続法の場合には、（±）−２−ノルボルナノン、微生物の菌体及び／または該菌体処理物を、必要に応じて、適宜添加して行われ、また、目的生成物から分離された菌体をリサイクル使用しても良い。
上記反応で得られた光学活性ｅｎｄｏ−ノルボルネオールの採取方法としては、微生物などの固形分を遠心分離、フィルタープレス、限外濾過などの通常の分離装置によりを除去した後に反応液を有機溶媒による抽出、晶析、カラムクロマトグラフィー、濃縮、蒸留などの分離精製手段に供することにより分離することができ、分離精製手段は単独でまたは複数の手段を組み合わせて利用できる。
【００１６】
前記有機溶媒としては例えばブタノールなどのアルコール類、ヘキサン、シクロヘキサン、トルエン等の炭化水素類、クロロホルム、塩化メチレンなどのハロゲン化炭化水素類、酢酸エチル、酢酸ノルマルブチルなどのエステル類、ケトン類、エーテル類、これらの混合溶媒などが利用できる。
【００１７】
【実施例】
以下に実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
グルコース５％、ペプトン０．５％、リン酸二水素カリウム０．２％、リン酸水素二カリウム０．１％、硫酸マグネシウム０．０２％、酵母エキス０．１％（ｐＨ６．５）の組成からなる培地にロドスポリジウム  トルロイデス（Rhodosporidium toruloides）IFO0559株を接種し，３０℃で２４時間好気的に培養した。培養終了後，培養液（２ｍｌ）を集め、遠心分離後、菌体を、グルコース５％、（±）−２−ノルボルナノン１％、ＮＡＤ+０．０３％、ＮＡＤＰ+０．０３％、グルコースデヒドロゲナーゼ（天野製薬）０．０１％、リン酸カリウムバッファー５０mM（ｐＨ６．０）からなる反応液５００μｌに懸濁し、３０℃で振とう反応させた。反応開始２４時間後に培養液２００μｌをサンプリングし酢酸ノルマルブチル２００μｌで抽出したサンプルをＧＬＣにて分析した。分析にはキャピラリーカラムγ−ＤＥＸ２２５（ＳＵＰＥＬＣＯ製）を使用した。
【００１８】
生成した（−）−ｅｎｄｏ−ノルボルネオールの濃度は３．８１ｇ／Ｌ（転換率３８．１％）、この光学純度は８４．０％  ｅ．ｅ．であった。
その他各種微生物について同様の実験を行った結果を以下に示す
【００１９】
【表１】
0003843692.tif 000004
【００２０】
【表２】
0003843692.tif 000005
【００２１】
【発明の効果】
本発明の方法によれば、光学活性ｅｎｄｏ−ノルボルネオールを微生物を用いた方法で、光学純度高く、従来よりも高収率で生成することが出来る。