(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の理化学的性質を有する大腸菌JM109(pUCE100 B-40)(FERM BP-6867)由来の耐熱性クレアチンアミジノハイドロラーゼ。
(a)作用；１モルのクレアチンを加水分解し、１モルのザルコシン及び１モルの尿素を生成する。
(b)基質特異性；クレアチンに基質特異性を有する。
(c)至適pH；7.0〜8.0
(d)安定pH範囲；4.0〜11.0
(e)作用適温の範囲；45℃付近
(f)熱安定性；53℃
(g)Km値；8.6mM
(h)分子量；92,000（ゲル濾過法）
【請求項２】
請求項１記載の耐熱性クレアチンアミジノハイドロラーゼ生産能を有する大腸菌JM109(pUCE100 B-40)(FERM BP-6867)を培養し、その培養物から耐熱性クレアチンアミジノハイドロラーゼを採取することを特徴とする耐熱性クレアチンアミジノハイドロラーゼの製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、耐熱性クレアチンアミジノハイドロラーゼ及びその製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
クレアチンアミジノハイドロラーゼは、クレアチンを加水分解してザルコシン及び尿素を生成する触媒作用を有する酵素であり、ヒトの血清中又は尿中のクレアチン量の測定に用いることができ、腎臓病をはじめとする各種の疾患の診断薬として利用することができる。
従来、アルカリゲネス属由来のクレアチンアミジノハイドロラーゼは、Ｋｍ値がおおよそ１３ｍＭであり、また、耐熱性が４５℃程度であるため、より低いＫｍ値を示し、しかも、将来における試薬の液状化での流通、販売を考慮し、より高い温度に対し安定なクレアチンアミジノハイドロラーゼが求められていた。更に、従来、遺伝子改変により、クレアチンアミジノハイドロラーゼの耐熱化を行なった場合、Ｋｍ値が原株と同等か、更に悪化してしまうことが多く、改変により耐熱性及びＫｍ値が向上したものは存在しなかった。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、耐熱性クレアチンアミジノハイドロラーゼ及びその製造法を提供することを目的とするものである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、上記目的に鑑み更に検討し、アルカリゲネス由来のクレアチンアミジノハイドラーゼ遺伝子（特開平８−８９２５５号公報記載）の遺伝子改変を行なった結果、耐熱性クレアチンアミジノハイドラーゼが得られること等を見出し、本発明を完成した。
【０００５】
即ち、本発明は、下記の理化学的性質を有する耐熱性クレアチンアミジノハイドロラーゼであり、
（ａ）作用；１モルのクレアチンを加水分解し、１モルのザルコシン及び１モルの尿素を生成する。
（ｂ）基質特異性；クレアチンに基質特異性を有する。
（ｃ）至適ｐＨ；７．０〜８．０
（ｄ）安定ｐＨ範囲；４．０〜１１．０
（ｅ）作用適温の範囲；４５℃付近
（ｆ）熱安定性；５３℃
（ｇ）分子量；９２，０００（ゲル濾過法）
また、本発明は、前記の理化学的性質を有する耐熱性クレアチンアミジノハイドロラーゼ生産能を有する微生物を培養し、その培養物から耐熱性クレアチンアミジノハイドロラーゼを採取することを特徴とする耐熱性クレアチンアミジノハイドロラーゼの製造法である。
【０００６】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の耐熱性クレアチンアミジノハイドロラーゼは、例えば、次のようにして得ることができる。
先ず、単離したアルカリゲネス・エスピー．ＫＳ−８５株由来クレアチンアミジノハイドロラーゼ遺伝子を含む組み換え体プラスミドｐＵＣＥ１００ＤＮＡ（特開平８−８９２５５号公報記載）を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９（ｐＵＣＥ１００）（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４８０３）から、例えば、ＱＩＡＧＥＮ（フナコシ社製）を利用することにより抽出、精製する。
なお、本発明において用いることのできるベクターＤＮＡとしては、上記プラスミドベクターＤＮＡに限定されることなくそれ以外の、例えば、バクテリオファージベクターＤＮＡ、プラスミドベタターＤＮＡ等を用いることができる。具体的にはｐＵＣ１１８（宝酒造社製）等が好ましい。
【０００７】
次いで、配列番号１に示されるアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつクレアチンアミジノハイドロラーゼ活性、好ましくは、耐熱性クレアチンアミジノハイドロラーゼ活性を有するタンパク質をコードする耐熱性クレアチンアミジノハイドロラーゼ遺伝子を得るには、如何なる方法でもよく、例えば、この組み換え体プラスミドＤＮＡに、例えば、ハイドロキシルアミン、亜硝酸等の化学変異剤やＰＣＲ法を用いてランダムに変換する方法等の点変異、市販のキットを利用する部位特異的な置換または欠失変異を生じさせるための周知技術である部位特定変異誘導法；この組み換え体プラスミドＤＮＡを選択的に開裂し、次いで選択されたオリゴヌクレオチドを除去または付加し、連結する方法；オリゴヌクレオチド変異誘導法等が挙げられる。
【０００８】
上記処理後の組み換え体ＤＮＡを脱塩カラム、ＱＩＡＧＥＮ（フナコシ社製）等を用いて精製し、種々の組み換え体ＤＮＡを得る。
【０００９】
このようにして得られた種々の組み換え体ＤＮＡを用いて、例えば、大腸菌Ｋ１２、好ましくは大腸菌ＪＭ１０９（東洋紡社製）、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ〔フナコシ（株）製〕等を形質転換または形質導入し、種々のクレアチンアミジノハイドロラーゼ遺伝子断片を保有する組み換え体ＤＮＡを含む形質転換体または形質導入体を得ることができる。
【００１０】
そして、例えば、形質転換体の場合、得られた形質転換体（その中に種々の耐熱性クレアチンアミジノハイドロラーゼ遺伝子を含む組み換え体プラスミドＤＮＡを含有している。）より、目的の性質（耐熱性及びＫｍ値の低い）を有する耐熱性クレアチンアミジノハイドロラーゼを生産する株を得るには、次のような方法を用いることができる。
【００１１】
先ず、得られた上記形質転換体を各コロニー毎にＴＹ培地（５０μｇ  Ａｍｐｉｃｉｌｉｎ，ｌｍＭ  ＩＰＴＧ添加）等で液体培養し、組み換え体プラスミドＤＮＡに含まれる種々の耐熱性クレアチンアミジノハイドロラーゼを誘導生産させる。培養後、得られた培養物に対し超音波破砕を行ない、その粗酵素抽出液に対し５０℃、３０分間の熱処理後の残存活性、ラインウエーバー・バークのプロットによるＫｍ値の測定を行なう。また、各変異株の測定結果に対し、同様にして抽出、処理、測定した野生型タンパク質と比較を行ない目的とする形質転換体を選択する。
【００１２】
上記のようにして得られた耐熱性クレアチンアミジノハイドロラーゼ生産能を有する形質転換体または形質導入体、好ましくは、エッシェリシア属に属する菌株を用いて耐熱性クレアチンアミジノハイドロラーゼを生産するには、下記のようにして行なうことができる。
上記微生物を培養するには、通常の固体培養法で培養してもよいが、なるべく液体培養法を採用して培養するのが好ましい。
【００１３】
また、上記微生物を培養する培地としては、例えば、酵母エキス、ペプトン、肉エキス、コーンステイープリカー、大豆もしくは小麦麹の浸出液等の１種以上の窒素源に、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化第２鉄、硫酸第２鉄もしくは硫酸マンガン等の無機塩類の１種以上を添加し、更に必要により糖質原料、ビタミン等を適宜添加したものが用いられる。
【００１４】
なお、培地の初発ｐＨは、７〜９に調整するのが適当である。また培養は、３０〜４２℃、好ましくは３７℃前後で６〜２４時間、通気撹拌深部培養、振とう培養、静置培養等により実施するのが好ましい。培養終了後、該培養物より耐熱性クレアチンアミジノハイドロラーゼを採取するには、通常の酵素採取手段を用いることができる。
【００１５】
培養物から、例えば、濾過、遠心分離等の操作により菌体を分離し、洗菌する。この菌体から耐熱性クレアチンアミジノハイドロラーゼを採取することが好ましい。この場合、菌体をそのまま用いることもできるが、超音波破砕機、フレンチプレス、ダイナミル等の種々の破壊手段を用いて菌体を破壊する方法、リゾチームの如き細胞壁溶解酵素を用いて菌体細胞壁を溶解する方法、トリトンＸ−１００等の界面活性剤を用いて菌体から酵素を抽出する方法等により、菌体から耐熱性クレアチンアミジノハイドロラーゼを採取するのが好ましい。
【００１６】
このようにして得られた粗酵素液から耐熱性クレアチンアミジノハイドロラーゼを単離するには、通常の酵素精製に用いられる方法が使用できる。例えば、硫安塩析法、有機溶媒沈澱法、イオン交換クロマトグラフ法、ゲル濾過クロマトグラフ法、吸着クロマトグラフ法、電気泳動法等を適宜組み合わせて行なうのが好ましい。
【００１７】
得られた耐熱性クレアチンアミジノハイドロラーゼの理化学的性質は、下記の通りである。
（１）作用
１モルのクレアチンを加水分解し、１モルのザルコシン及び１モルの尿素を生成する。
【００１８】
（２）基質特異性
クレアチンに基質特異性を有する。
【００１９】
（３）至適ｐＨ
緩衝液として、５０ｍＭ酢酸ナトリウム−酢酸緩衝液（ｐＨ４．０〜５．５）、５０ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．５〜６．５）、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５〜８．０）、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０〜９．０）、５０ｍＭ  ＣＨＥＳ緩衝液（ｐＨ９．０〜１０．０）及び５０ｍＭ  ＣＡＰＳ緩衝液（ｐＨ１０．０〜１１．０）を用い、夫々のｐＨにおいて、温度３７℃で１０分間酵素反応を行なった結果、その相対活性は、図１に示す通りであった。図１より、本酵素の至適ｐＨは、７．０〜８．０であった。
（４）作用適温の範囲
後述の活性測定法における反応液と同一組成よりなる反応液を用い、種々の温度にて本酵素の活性測定を行なった結果、図２に示す通りであった。図２より、本酵素の作用適温の範囲は、４５℃付近であった。
【００２０】
（５）安定ｐＨ範囲
緩衝液として、５０ｍＭ酢酸ナトリウム−酢酸緩衝液（ｐＨ４．０〜５．５）、５０ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．５〜６．５）、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５〜８．０）、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０〜９．０）、５０ｍＭ  ＣＨＥＳ緩衝液（ｐＨ９．０〜１０．０）及び５０ｍＭ  ＣＡＰＳ緩衝液（ｐＨ１０．０〜１１．０）を用い、ｐＨ４．０〜１１．０において２５℃で１７時間夫々処理した後、本酵素の残存活性を測定した結果、図３に示す通りであった。図３より、安定ｐＨ範囲は、ｐＨ４．０〜１１．０であった。
（６）熱安定性
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）を用いて、各温度で３０分間処理した場合の熱安定性の結果は、図４に示す通りであり、本酵素は、５３℃付近迄安定であった。
【００２１】
（７）酵素活性測定法
本酵素の活性の測定は、下記条件下で行なった。なお、１分間に１マイクロモルの尿素を生成する酵素活性を１単位とする。
（試薬調製）
１液；基質液）
クレアチン６．６３ｇを５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．７）５００ｍｌに溶解する。
２液；発色液）
ρ−ジメチルアミノベンズアルデヒド１０ｇを５００ｍｌの特級エタノールに溶解し、レジン水５７５ｍｌ、濃塩酸７５ｍｌを混合したものと混合する。
【００２２】
（測定手順）
１）１液  ０．９ｍｌを３７℃にて５分間プレインキュベーションする。
２）酵素液（１〜２Ｕ／ｍｌ程度に調整）０．１ｍｌを混合し、３７℃において１０分間反応させる。
３）１０分間の反応後、上記２液２ｍｌを混合する。
４）２液と混合後、２５℃にて２０分間放置し、後に４３５ｎｍの吸光度を測定する。（ＯＤｓａｍｐｌｅ）
５）ブランク値の測定は、１液０．９ｍｌを３７℃にて１０分間インキュベーションした後、上記２液２ｍｌを混合し、更に酵素液０．１ｍｌを混合、２５℃にて２０分間放置し、その後４３５ｎｍの吸光度を測定することによって行なった。（ＯＤｂｌａｎｋ）
【００２３】
（活性の計算）
Ｕ／ｍｌ＝△ＯＤ※×１８．０６＊×希釈倍率
※（△ＯＤ＝ＯＤｓａｍｐｌｅ−ＯＤｂｌａｎｋ）
（＊尿素検量線より算出した係数）
【００２４】
（８）Ｋｍ値
上記の活性測定法を用い、本酵素のＫｍ値を測定したところ、ラインウエーバー・バークのプロットから、Ｋｍ値は、８．６ｍＭ（クレアチンに対して）であった。
（９）分子量
９２，０００（ゲル濾過法）
【００２５】
【実施例】
以下、本発明を実施例により更に具体的に説明する。
【００２６】
（実施例１）
（１）組み換え体プラスミドｐＵＣＥ１００ＤＮＡの調製
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９（ｐＵＣＥ１００）（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４８０３）を、ＴＹ培地（１％バクトートリプトン、０．５％ペプトン、０．２５％ＮａＣｌ）２０ｍｌに接種して、３７℃で１８時間振とう培養し培養物を得た。この培養物を６０００ｒｐｍで１０分間遠心分離することにより集菌して菌体を得た。この菌体よりＱＩＡＧＥＮ  ｔｉｐ−１００を用いて組み換え体プラスミドｐＵＣＥ１００ＤＮＡを抽出して精製し、組み換え体プラスミドｐＵＣＥ１００ＤＮＡを７０μｇ得た。
【００２７】
（２）変異操作
上記組み換え体プラスミドＤＮＡ１００μｇの内、２μｇを用いてＸＬ１−ＲＥＤ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）（増殖の際、プラスミドの複製にエラーを起こし易く変異を生じ易い。）をＤ．Ｍ．Ｍｏｒｒｉｓｏｎの方法（Ｍｅｔｈｏｄｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，６８，３２６−３３１，１９７９）に従って形質転換し、約１５００の形質転換株を得たその内のコロニー５００個をＴＹ培地２０ｍｌに全て植菌し、３７℃、１８時間振とう培養した。培養後、この培養物を６０００ｒｐｍで１０分間遠心分離することにより集菌して菌体を得た。この菌体よりＱＩＡＧＥＮ  ｔｉｐ−１００（フナコシ社製）を用いてプラスミドｐＵＣＥ１００を抽出して精製し、被変異組み換え体プラスミドｐＵＣＥ１００ＤＮＡを７０μｇ得た。このプラスミド５μｇを用い、Ｄ．Ｍ．Ｍｏｒｒｉｓｏｎの方法（Ｍｅｔｈｏｄ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，６８，３２６−３３１，１９７９）に従って大腸菌ＪＭ１０９株（東洋紡社製）を形質転換した結果、約２０００個の変異を受けたプラスミドを保有する形質転換株約２０００個を得た。
【００２８】
(3)耐熱性及び基質との反応性が向上した変異株のスクリーニング
先ず、得られた上記形質転換体を各コロニー毎に2mlのTY培地（50μg Ampicilin,1mM IPTG添加）で液体培養し、プラスミドに含まれる種々の耐熱性クレアチンアミジノハイドロラーゼを誘導生産させた。培養後、得られた培養物に対し超音波破砕を行ない、その粗酵素抽出液に対し50℃、30分間の熱処理後の残存活性を測定し、耐熱性が良好であったものについて、ラインウエーバー・バークのプロットによるKm値の測定を行なった。また、各変異株の測定結果に対し、同様にして抽出処理し、測定した野生型クレアチンアミジノハイドロラーゼと比較を行ない目的を満たす変異株を選択したところ、変異株大腸菌(E.coli)JM109(pUCE100  B-40)より、耐熱性クレアチンアミジノハイドロラーゼを得た。
大腸菌(E.coli)JM109(pUCE100  B-40)は、工業技術院生命工学工業技術研究所FERM BP-6867に（FERM P-15971号より移管）として寄託されている。
【００２９】
（実施例２）
上記のようにして得られた変異株大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９（ｐＵＣＥ１００  Ｂ−４０）を、１ｍＭイソプロピル−β−Ｄ−ガラクトシドを含むＴＹ培地（１％バクト−トリプトン、０．５％バクト−イーストエクストラクト、０．５％ＮａＣｌ，ｐＨ７．５）１００ｍｌの分注された坂口フラスコで１６時間振とう培養したのち、同様に調製した３０Ｌ培養槽中のＴＹ培地２０Ｌに火炎接種した。接種後、回転数４５０ｒｐｍ、通気量２０Ｌ／ｍｉｎ、３７℃にて約２０時間培養した。
【００３０】
培養終了後、培養液２０Ｌからマイクローザー（旭化成社製、ＰＷ−３０３）を用いて菌体を集菌し、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）にて菌体を洗浄した後、菌体を同緩衝液約１０Ｌに懸濁した。
ステップ１（粗酵素液の調整）：上記菌体懸濁液（１０Ｌ）に、リゾチーム２０ｇ（５０ｍＭリン酸緩衝、ｐＨ７．５、１００ｍｌ）及び０．５５Ｍ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０、１Ｌを添加、混合し、３０℃で一晩放置した後、５％プロタミン水溶液（ｐＨ８．０）５００ｍｌを撹拌しながら滴下して除核酸処理を行なった。この水溶液を１０ｍＭ  ＣＡＰＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０．０）（以下緩衝液Ａとする）に対して透析した。
【００３１】
ステップ２（ＤＥＡＥ−セルロース処理）：透析液（約２８Ｌ）に、湿重量で約３ｋｇのセルロースを添加、混合して、耐熱性クレアチンアミジノハイドロラーゼを吸着させた後、５％グリセリン及び０．０５％２−メルカプトエタノール含有緩衝液ＡにてＤＥＡＥ−セルロースを洗浄し、次いで、０．５Ｍ  ＫＣｌ含有緩衝液Ａにて耐熱性クレアチンアミジノハイドロラーゼを溶出して限外濃縮した。
ステップ３（ＤＥＡＥ−セファロースＣＬ−４Ｂ処理）：濃縮液（約１．０Ｌ）に、緩衝液Ａで緩衝化された湿重量で約１．０ｋｇのＤＥＡＥ−セファロースＣＬ−４Ｂを添加、混合して、耐熱性クレアチンアミジノハイドロラーゼを吸着させ０．０５Ｍ  ＫＣｌ含有  緩衝液ＡにてＤＥＡＥ−セファロースＣＬ−４Ｂを洗浄し、次いで、０．１Ｍ  ＫＣｌ含有、緩衝液Ａにて耐熱性クレアチンアミジノハイドロラーゼを溶出して、限外濃縮した。
ステップ４（セファタリルＳ−２００処理）：濃縮液（約１．０Ｌ）をカラムに詰めたセファクリルＳ−２００にて分子ふるいを行ない、活性画分（２．２ｇ）を収集した。活性画分の比活性は、９Ｕ／ＯＤ２８０ｎｍであった。
【発明の効果】
本発明によれば、耐熱性クレアチンアミジノハイドロラーゼが効率よく製造でき、本発明は、産業上有用である。
【００３２】
【配列表】
0003773160.tif 000002
0003773160.tif 000003
0003773160.tif 000004
【図面の簡単な説明】
【図１】本酵素の至適ｐＨを示す図。
【図２】本酵素の作用適温の範囲を示す図。
【図３】本酵素の安定ｐＨ範囲を示す図。
【図４】本酵素の熱安定性を示す図。
【図１】
0003773160.tif 000005
【図２】
0003773160.tif 000006
【図３】
0003773160.tif 000007
【図４】
0003773160.tif 000008