(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体試料を光照射によって切断する方法であって、支持体の片面上に生体試料と厚さ３〜６μｍの黄色のアラミドフィルムとを設置し、生体試料に光を照射して生体試料の目的部分を切断することを特徴とする方法。
【請求項２】
支持体の生体試料を保持する面の反対側から光を照射して生体試料の目的部分を切断する、請求項１に記載の切断方法。
【請求項３】
生体試料が、生体組織片、細胞、染色体または微生物である、請求項１又は２に記載の切断方法。
【請求項４】
光がレーザー光である、請求項１から３の何れか１項に記載の切断方法。
【請求項５】
光が紫外線レーザー光である、請求項１から４の何れか１項に記載の切断方法。
【請求項６】
支持体が、ガラス支持体である請求項１から５の何れか１項に記載の切断方法。
【請求項７】
支持体の片面上に厚さ３〜６μｍの黄色のアラミドフィルムを設置し、その上に生体試料を設置する、請求項１から６の何れか１項に記載の切断方法。
【請求項８】
目的部分の切断を顕微鏡下で行なう、請求項１から７の何れか１項に記載の切断方法。
【請求項９】
請求項１から８の何れかに記載の切断方法により生体試料を切断し、切断した試料を回収することを特徴とする、生体試料の切断回収方法。
【請求項１０】
支持体の片面上に厚さ３〜６μｍの黄色のアラミドフィルムを設置して成る、生体試料切断用の装置。
【請求項１１】
支持体がガラス支持体である請求項１０に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、生体試料の切断方法、およびそれに用いる装置に関する。より詳細には、本発明は、生体試料に光を照射することによって、生体試料の目的部分を切断することを特徴とする方法およびそれに用いる装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
マイクロアレイ法は、スライドガラス上にスポットさせたＤＮＡと調べたい組織や細胞から抽出したＲＮＡから作製した標識プローブとをハイブリダイズさせてシグナルを検出し、このシグナルの強度からハイブリダイズしたスポットに相当する遺伝子の相対的な発現量を測定する方法である。このようなマイクロアレイ技術の開発が進んだことにより、数千から数万の多数の遺伝子の発現を一度に解析することが可能になった。この方法により、癌や白血病など複数の遺伝子異常が関与する疾患でどのような遺伝子の発現異常が起こっているかを網羅的に調べることができる。このような疾患の原因や発症機構などの解明などを目的とした研究においては、生体試料から特定の細胞のみを抽出することが重要である。
【０００３】
例えば、ヒト腫瘍の分子的研究では、ヒト腫瘍細胞におけるタンパク質又は核酸の発現を定量的に又は定性的に評価することが必要となるが、そのためいは腫瘍細胞と正常細胞とを分別して回収し、それぞれの細胞における標的核酸又は標的タンパク質の発現量を分析して両者を比較することが必要である。
【０００４】
しかしながら、侵入性腫瘍の組織では、多くの細胞種（例えば、腫瘍細胞、基質細胞、内皮細胞、正常上皮細胞及び炎症細胞など）が存在する。腫瘍細胞におけるタンパク質又は核酸の発現を定量的に又は定性的に正確に評価するためには、腫瘍組織に存在する多数の細胞種の中から、腫瘍細胞のみを回収することが必要であり、そのためには生体試料を標的位置で切断することが必要である。
【０００５】
生体組織片、細胞、染色体および微生物等の生体試料を標的位置で切断し、切断した試料を回収するための方法としては、試料にレーザー光を照射して切断・回収する方法（レーザーキャプチャーマイクロダイセクション法）が知られている（Emmert-Buck,M.R. et al., Science 274, 998-1001, 1996；及びBonner, R.R. et al.: Science, 278, 1481-1482, 1997）。この方法は、 生体試料をフィルムに貼り付け、標的部位を切断した後、フィルムを剥離することにより切断片を回収する方法である。しかしながら、これら従来の方法では、フイルムの厚さが薄いため、操作性が悪く、特に支持体へのフィルムの設置の取り扱いが困難という問題があり、またレーザー光による切断の切れ具合（シャープさ）にも改善の余地があった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、生体組織片、細胞、染色体および微生物等の生体試料を標的位置で切断し、切断した試料を回収するための新規な方法を提供することを解決すべき課題とした。即ち、本発明は、 生体試料をフィルムに付着させ、標的部位を切断した後、フィルムを剥離することにより切断片を回収する方法であって、操作性に優れ、レーザー光による切断の切れ具合（シャープさ）が良好な方法を提供することを解決すべき課題とした。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、生体試料に付着させるフィルムとして厚さ３〜６μｍの着色フィルムを使用することにより、上記課題を解決した生体試料を標的位置で切断するための優れた方法を提供できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
即ち、本発明によれば、生体試料を光照射によって切断する方法であって、支持体の片面上に生体試料と厚さ３〜６μｍの着色フィルムとを設置し、生体試料に光を照射して生体試料の目的部分を切断することを特徴とする方法が提供される。
本発明は、切断した試料を回収することをさらに含むことを特徴とする、生体試料の切断回収方法にも関する。
【０００９】
本発明の別の側面によれば、支持体の片面上に厚さ３〜６μｍの着色フィルムを設置して成る、生体試料切断用の装置が提供される。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本発明による生体試料を光照射によって切断する方法は、支持体の片面上に生体試料と厚さ３〜６μｍの着色フィルムとを設置し、生体試料に光を照射して生体試料の目的部分を切断することを特徴とする。
本発明の一例においては、支持体の生体試料を保持する面の反対側から光を照射して生体試料の目的部分を切断することができる。本発明の別の例においては、生体試料を保持する支持体の上下を逆にして、生体試料を保持する面から光を照射して生体試料の目的部分を切断することもできる。即ち、本発明においては、光を照射する方向は特に限定されない。
本発明で用いる生体試料は、生体に由来するものであればその種類は特には限定されないが、例えば、生体組織片、細胞、染色体または微生物などが挙げられる。生体試料としては、例えば疾患部位（例えば、癌など）を含む生体試料を用いることができ、この場合、本発明の方法により疾患の細胞（例えば、癌細胞）を正常細胞から分離して、回収することができる。
【００１１】
本発明で用いる光は好ましくはレーザー光であるが、その理由は、レーザー光は一定表面上の小さな領域に容易かつ効果的に集中することができる光であるからである。レーザー光の波長は通常、１５０〜１０，０００ｎｍ程度であり、特に好ましくは紫外線レーザー光（１８０〜４００ｎｍの波長）である。レーザー光の場合、そのビーム径は、生体試料の種類や厚み等によって適宜に設定する必要があるが、通常は、１μｍ〜５０μｍ程度とすることができる。また、光の強度は、生体試料の種類や厚み、切断片の大きさ等によって適宜とすることができる。例えば、生体試料が組織切片の場合には０．５〜３．０Ｊ／ｃｍ2 程度、細胞の場合には０．１〜３．０Ｊ／ｃｍ 2程度、染色体および微生物の場合には０．０１〜３．０Ｊ／ｃｍ2程度とすることができる。
【００１２】
本発明で用いる支持体は、光を透過できるものであればその種類は特に限定されないが、好ましくは透明支持体であり、例えば、ガラス支持体（スライドガラズ又はカバーガラスなど）やポリエチレンテレフタレート支持体などが挙げられる。
【００１３】
本発明で用いる着色フィルムは厚さが３〜６μｍであることを特徴とする。厚さが３μｍ未満であると、操作性が劣り、支持体への設置操作などが煩雑となるため好ましくなく、厚さが６μｍを超えると光による切断が困難になり好ましくない。本発明では透明フィルムではなく着色フィルムを用いることを特徴とするが、これを着色フィルムを用いることにより光による切断が容易になるという効果が得られることを利用したものである。
【００１４】
本発明で用いることができる着色フィルムの具体例としては、黄色を有するアラミドフィルムを挙げることができる。このようなアラミドフィルムの具体例としては、テレフタル酸とパラフェニレンジアミンの重合体（パラフェニレンテレフタルアミド、以下PPTAとも称する）（Kevlar（登録商標）、Twaron（登録商標）、テクノーラ（登録商標）など）を挙げることができる。
【００１５】
アラミドフィルムなどの着色フィルムは公知の方法で作成することができ、例えば、アラミドポリマーを濃硫酸に溶解し、このドープを脱気する。次に、適当な大きさのスリットを有するダイから、鏡面に磨いたタンタル製のベルトにキャストし、空気を吹きつけて、流延ドープを光学等方化し、ベルトとともに、硫酸水溶液の中に導いて凝固させる。このときにフィルム自身にカッピングを持たせることができる。次いで凝固フィルムをベルトからひきはがし、温水中、炭酸ナトリウム水溶液中、次いで２５℃水中を走行させて洗浄する。洗浄の終了した含水率約２８０％のフィルムをまず室温でロールの周速差を利用して長尺方向（ＭＤ）に一軸延伸を行い、次いでテンターに入れて入口に近いところで幅方向（ＴＤ）に延伸しテンターの中央付近は１５０度に定長加熱して乾燥し、更にテンターの出口付近には赤外線ランプをとりつけて４００℃で熱処理したのち、長尺フィルムを巻き取ることにより、ＰＰＴＡフィルムを得ることができる。
【００１６】
本発明の方法では、支持体の片面上に厚さ３〜６μｍの着色フィルムを設置し、その上に生体試料を設置してもよいし（この場合は下側から、支持体、着色フィルム、生体試料という順番の構成になる）、あるいは、支持体の片面上に生体試料を設置し、その上に厚さ３〜６μｍの着色フィルムを設置してもよいが（この場合は下側から、支持体、生体試料、着色フィルムという順番の構成になる）、好ましくは前者である。
本発明によれば、支持体の片面上に厚さ３〜６μｍの着色フィルムとを設置して成る、生体試料切断用の装置も提供される。
【００１７】
本発明の方法において生体試料の目的部分の切断を行なうためには、生体試料を好適な方法で染色することが好ましい。
本発明で用いることができる生体試料は、例えば、ヘマトキシリン・エオシンにより染色することができ、これにより、顕微鏡による可視化の下、特定の細胞集団の位置を識別することが可能になり、標的細胞を全体の組織から単離回収することが可能になる。
【００１８】
本発明の方法では、目的部分の切断を顕微鏡下で行なうことが好ましい。
具体的には、本発明による生体試料の切断方法は、例えば、上面に着色フィルムと生体試料（回収したい標的細胞を含む生体試料）を保持した透明支持体を顕微鏡のステージに設置し、顕微鏡のアイピースまたはＣＣＤカメラで撮像した画像をモニターで確認しながら、透明支持体を介して生体試料の標的領域を決定する。標的領域の決定は、色素による染色又は免疫的染色などにより行なうことができる。
【００１９】
次に、例えばレーザー光（好ましくは、紫外線レーザー光など）照射装置のような光照射手段より光を発生させ、光のビーム径を絞り、生体試料の標的切断部位に沿って支持体の下側より生体試料に光を照射し、生体試料を切断する。光学顕微鏡の視野の光学中心上へレーザーの焦点を合わせることによって、活性化エネルギーが生体試料に接する着色フィルムの標的領域に集中的に供給されることになる。また、レーザー照射の持続期間は、必要なエネルギー量が標的切断部位に向けられるように適宜調節することができる。
【００２０】
本発明はさらに、上記した切断方法により生体試料を切断し、さらに切断した試料を回収することを特徴とする、生体試料の切断回収方法にも関する。
レーザー光の十分なエネルギーが生体試料の標的細胞と接触する着色フィルムの表面に吸収されると、接着層が着色フィルムと標的細胞との間で形成される。これにより、フィルムを除去して回収することにより、標的細胞を他の生体試料から分離回収することができる。
【００２１】
分離回収される試料の大きさは、光（好ましくはレーザー光）の直径及びパルスの持続期間を変えることによって変更することができる。本発明の方法によれば、小さな１μｍ〜１００μｍ程度の大きさの試料を回収することができる。さらに、レーザー光は、一つの細胞の直径よりも小さい範囲に集中して照射することも可能なので、単一の標的細胞又はその一部のみを分離回収することも可能である。
【００２２】
切断した試料の回収の方法は特に限定されないが、例えば、切断のために照射したレーザー光のレンズの焦点をずらし、レーザーの径を広げパワーを分散させることにより切片をきるのではなく、切断された試料を支持体から剥がし上方へ飛ばすことができる。かくして支持体から剥がされた試料をマイクロチューブキャップなどの容器に回収することができる。
本発明の生体試料の切断方法の実施に使用できる装置としては、例えば、ＣＲＩ−３３７  Laser ScissorsTM 337/120モジュール（米国セル・ロボテック社製）などを挙げることができる。
【００２３】
上記のようにして切断回収された標的試料は溶解して保存し、目的とする分析に供することができる。標的細胞中に含まれるＤＮＡ又はＲＮＡを分析する場合には、回収した試料をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）反応に供し、続いて、通常の遺伝子解析法（例えば、サザンブロット、ノザンブロット、ドットブロットハイブリダイゼーション、あるいは配列決定等）に供することができる。
【００２４】
例えば、ｍＲＮＡは、オリゴｄＴ上でのカラムクロマトグラフィーを用いて回収した試料から抽出することができる。標的細胞から回収されたｍＲＮＡはさらに、ＲＴ−ＰＣＲ法により増幅することができ、これをさらに分析することができる。
【００２５】
標的細胞中に含まれる特定のタンパク質又はポリペプチドを分析する場合には、回収した試料を、標識した基質を用いる酵素アッセイ、標識した抗体を用いるイムノアッセイ、生化学アッセイなどに供することができる。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されることはない。
【００２６】
【実施例】
実施例１：本発明の方法によるマイクロダイセクション
（１）アラミドフィルムの作製
非磁性フィルムとしてのアラミドフィルムは以下の公知の方法で作成した。ηinh（対数粘度）が5.5のＰＰＴＡポリマーを平均粒径80ｎｍのコロイド状シリカを0.005重量％含む濃硫酸にポリマー濃度11.5％になるように溶解し、このドープを約70℃に保ったまま、真空下に脱気した。0.15ｍｍ×300ｍｍのスリットを有するダイから3.5ｍ/分の吐出線速度で、鏡面に磨いたタンタル製のベルト（12ｍ/分で移動）にキャストし、相対湿度約85％の約90℃の空気を吹きつけて、流延ドープを光学等方化し、ベルトとともに、−５℃の１５重量％硫酸水溶液の中に導いて凝固させた。このときにフィルム自身にカッピングを持たせることができる。次いで凝固フィルムをベルトからひきはがし、約４０℃の温水中、炭酸ソーダの１％水溶液中、次いで２５℃水中を走行させて洗浄した。洗浄の終了した含水率約２８０％のフィルムをまず室温でロールの周速差を利用して長尺方向（ＭＤ）に１.２倍に一軸延伸を行い、次いでテンターに入れて入口に近いところで幅方向（ＴＤ）に１.２倍に延伸しテンターの中央付近は１５０度に定長加熱して乾燥し、更にテンターの出口付近には赤外線ランプをとりつけて４００℃で熱処理したのち、長尺フィルムを巻き取った。得られたＰＰＴＡフィルムは、透明性にすぐれ、３．８μｍ又は４．２μｍの厚さをもっていた。
【００２７】
（２）切断用試料の調製
スライドガラス（波長３７７ｎｍのレーザーを透過するもの）に２ｃｍ角のアラミドフィルム（実施例１で得たもの、厚さ３．８μｍ又は４．２μｍ）を載せ、Nail Polishを用いて接着した。
マウス精巣組織をプラスチック製の凍結容器（たとえばMILES社製Cryomond）にサクラ精機社製のＯ．Ｃ．Ｔコンパウンドを入れ、試料組織を包埋した。液体窒素下で約３０から４０秒以内で試料を凍結させた。凍結試料を凍結切片作成装置（クライオスタット）にて約８μｍの厚さにて薄切した。薄切切片をフイルムを貼り付けた上記作成スライドグラスの上に直接貼り付けた。
【００２８】
凍結切片を貼り付けたスライドグラスを定法（「染色法のすべて」医歯薬出版株式会社出版、１９８８年ｐ２〜）に従ってヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色を行なった。ヘマトキシリンはマイヤーヘマトキシリン液（和光純薬製）、エオジンは１％エオジン液（和光純薬製）を用いた。
【００２９】
（３）レーザーによる試料の切断
顕微鏡でスライドガラス上の試料を観察し、ＬＳ−３３７  Laser ScissorsTM 337/120モジュール（システム全体の構成はＣＲＩ−３３７）（米国セル・ロボテック社製）を用いて試料を標的部位で切断した（マイクロダイセクション）。マイクロダイセクションの条件は以下の通りである。
窒素励起パルスレーザー
波長３３７ｎｍ
出力１〜１２０μＪ／パルス（可変）（カッティング時は６５〜８０％、１００ｐｐｓで行うので、約８０μＪ／パルス程度）
【００３０】
続いて、レーザー光のレンズの焦点を下方にずらすことにより、レーザーの径を広げパワーを分散させることにより切断された切片をスライドガラスから剥がし、上方へ飛ばすことにより、切断切片をマイクロチューブキャップに回収した。
【００３１】
マイクロダイセクションの前後の試料、並びに切断かつ回収された標的部位の試料の様子を図１に示す。図１に示す通り、本発明の方法により組織の標的部位をうまく切断および回収することができた。
【００３２】
実施例２：本発明の方法と比較例との比較
スライドガラスの上に載せるフィルムの材質と厚さを以下の表1の通りに変更した以外は、実施例１と同様に生体試料を載せ、マイクロダイセクションを行なった。
フィルムのスライドガラスへの貼付適性（操作性）、マイクロダイセクション適性、切れ具合（シャープカット）について○、△、×の3段階で評価した結果を以下の表1に示す。
【００３３】
【表１】
0003773831.tif 000002
【００３４】
表1の結果から、本発明の方法が優れていることが分かる。
【００３５】
【発明の効果】
本発明により、生体試料をフィルムに付着させ、標的部位を切断した後、フィルムを剥離することにより切断片を回収する方法であって、操作性に優れ、レーザー光による切断の切れ具合（シャープさ）が良好な方法を提供することが可能になった。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、マウス精巣試料をマイクロダイセクションにより回収した場合の結果を示す図である。
【図１】
0003773831.tif 000003