(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ−アシル−Ｄ−アミノ酸に作用して対応するＤ−アミノ酸を生成する反応を触媒する作用を有するＤ−アミノアシラーゼであって、配列表の配列番号：２記載のアミノ酸配列を有することを特徴とするＤ−アミノアシラーゼ。
【請求項２】
水性媒体中でＮ−アセチル−Ｄ−トリプトファンからＤ−トリプトファンを生成する反応を触媒する際におけるＮ−アセチル−Ｄ−トリプトファンの濃度が５０ｇ／ｌの場合の反応速度が、Ｎ−アセチル−Ｄ−トリプトファンの濃度が５ｇ／ｌの場合の反応速度に対して少なくとも４０％である請求項１に記載のＤ−アミノアシラーゼ。
【請求項３】
Ｎ−アセチル−Ｄ−トリプトファンの濃度が１００ｇ／ｌの場合の反応速度が、Ｎ−アセチル−Ｄ−トリプトファンの濃度が５ｇ／ｌの場合の反応速度に対して少なくとも２０％である請求項２に記載のＤ−アミノアシラーゼ。
【請求項４】
Ｎ−アシル−Ｄ−アミノ酸に作用して対応するＤ−アミノ酸を生成する反応を触媒する作用を有するＤ−アミノアシラーゼをコードする塩基配列からなるＤＮＡであって、
配列表の配列番号：１記載の塩基配列からなることを特徴とするＤ−アミノアシラーゼをコードする塩基配列からなるＤＮＡ。
【請求項５】
Ｄ−アミノアシラーゼが水性媒体中でＮ−アセチル−Ｄ−トリプトファンからＤ−トリプトファンを生成する反応を触媒する際のＮ−アセチル−Ｄ−トリプトファンの濃度が５０ｇ／ｌの場合の反応速度が、Ｎ−アセチル−Ｄ−トリプトファンの濃度が５ｇ／ｌの場合の反応速度に対して少なくとも４０％である請求項４に記載のＤ−アミノアシラーゼをコードする塩基配列からなるＤＮＡ。
【請求項６】
Ｎ−アセチル−Ｄ−トリプトファンの濃度が１００ｇ／ｌの場合の反応速度が、Ｎ−アセチル−Ｄ−トリプトファンの濃度が５ｇ／ｌの場合の反応速度に対して少なくとも２０％である請求項５に記載の塩基配列からなるＤＮＡ。
【請求項７】
請求項４に記載の塩基配列からなるＤＮＡを含むプラスミド。
【請求項８】
請求項７に記載のプラスミドによって形質転換された形質転換体。
【請求項９】
請求項８に記載の形質転換体を培養して、該形質転換体に組み込まれたプラスミドの有する塩基配列によりコードされたＤ−アミノアシラーゼを生産させることを特徴とするＤ−アミノアシラーゼの産生方法。
【請求項１０】
水性媒体中でＮ−アシルアミノ酸にＤ−アミノアシラーゼを作用させて対応するＤ−アミノ酸を生産する光学活性アミノ酸の生産方法であって、該Ｄ−アミノアシラーゼが請求項１に記載のＤ−アミノアシラーゼであることを特徴とする光学活性アミノ酸の生産方法。
【請求項１１】
前記Ｄ−アミノアシラーゼが水性媒体中でＮ−アセチル−Ｄ−トリプトファンからＤ−トリプトファンを生成する反応を触媒する際のＮ−アセチル−Ｄ−トリプトファンの濃度が５０ｇ／ｌの場合の反応速度が、Ｎ−アセチル−Ｄ−トリプトファンの濃度が５ｇ／ｌの場合の反応速度に対して少なくとも４０％である請求項１０に記載の生産方法。
【請求項１２】
Ｎ−アセチル−Ｄ−トリプトファンの濃度が１００ｇ／ｌの場合の反応速度が、Ｎ−アセチル−Ｄ−トリプトファンの濃度が５ｇ／ｌの場合の反応速度に対して少なくとも２０％である請求項１１に記載の生産方法。
【請求項１３】
Ｄ−アミノアシラーゼを、請求項８に記載の形質転換体を培養して得られる培養液、該培養液から分離された形質転換体又はそれらの処理物の形でＮ−アシルアミノ酸に作用させる請求項１０に記載の生産方法。
【請求項１４】
Ｎ−アシルアミノ酸濃度が５０ｇ／ｌ以上である請求項１０に記載の製造方法。
【請求項１５】
Ｎ−アシルアミノ酸濃度が１００ｇ／ｌ以上である請求項１４記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、産業上実用的な基質濃度で高活性を示し、特にＮ−アセチル−ＤＬ−トリプトファンよりＤ−トリプトファンを立体選択的に効率よく生成する事を可能とするな新規なＤ−アミノアシラーゼ及びそれを用いたＮ−アシルアミノ酸からＤ−アミノ酸を製造する方法に関する。さらに本発明は、このＤ−アミノアシラーゼをコードする塩基配列、それを含有するプラスミド及びこのプラスミドにより形質転換された形質転換体に関する。さらに本発明は、この形質転換体を用いたＤ−アミノアシラーゼの生産方法に関する。また、本発明は、この形質転換体、その培養液及びこれらの処理物の形でＤ−アミノアシラーゼをＮ−アシルアミノ酸に作用させてＮ−アシルアミノ酸から対応する光学活性Ｄ−アミノ酸を製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
Ｄ−アミノ酸は様々な農薬、抗生物質、医薬品の中間体として重要な化合物であり、その合成法が盛んに研究されている。現在、ＤＬ−アミノ酸の分割は物理化学的、化学的、酵素的方法で行なう事が出来るが、酵素的方法が最も簡便であり、有利な方法と考えられる。酵素的方法の一つとして例えば、Ｄ−アミノアシラーゼを用いてＮ−アセチル−ＤＬ−アミノ酸を加水分解し、対応するＤ−アミノ酸を直接生産する方法が知られている。
【０００３】
Ｄ−アミノアシラーゼの起源としては、シュウドモナス（Pseudomonas）属（特公昭６０−３１４７７号公報）、ストレプトミセス（Streptomyses）属（特公昭５３−３６０３５号公報）、アルカリゲネス（Alcaligenes）属（特公平０７−８３７１１号公報）ロドコッカス属(Rhodococcus)、ピメロバクター(Pimelobacter)属（特開平０６−２２７７８９号公報）アースロバクター(Arthrobacter)属、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属、エルビニア(Erwinia)属、エシュリヒア(Eschheria)属、フラボバクテリウム(Flavobacterium)属、ノカルディア(Nocardia)属、プロタミノバクター（Protaminobacter）属、キサントモナス(Xanthomonas)属（特開平１１−１１３５９２号公報）、アミコラトプシス(Amycolatopsis)属（特開平１１−９８９８２号公報）、セベキア(Sebekia)属（特開平１１−３１８４４２号公報）、ヒポミセス(Hypomyces)属、フザリウム(Fusarium)属、オーリクラリア(auricularia)属、フィシウム(Pythium)属、メニスポロプシス(Menisporopsis)属（特開平１２−４１６８４号公報）などの細菌、放線菌またはかびに属する微生物が知られており、これらに由来するＤ−アミノアシラーゼをＮ−アシルアミノ酸に作用させてＤ−アミノ酸を製造することが報告されている。
【０００４】
しかしながら、これらＤ−アミノアシラーゼは実用的な基質濃度での活性が充分ではなく、産業上実用的なＤ−アミノアシラーゼが望まれていた。特にＮ−アセチル−Ｄ−トリプトファンの加水分解については、実用的な基質濃度での酵素の活性は低く、産業上満足のできる酵素とは呼べなかった。近年、Ｎ−アセチル−Ｄ−トリプトファンに作用してＤ−トリプトファンを生成することの出来るＤ−アミノアシラーゼとしてＴｏｋｕｙａｍａらがヒポミセス(Hypomyces)属のＤ−アミノアシラーゼ（特開平１３−２７５６８８号公報）をＣｈｉｒｏｔｅｃｈＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｉｍｉｔｅｄ社のＴａｙｌｏｒらがアルカリゲネス（Alcaligenes）属のＤ−アミノアシラーゼ（ＷＯ００／２３５９８）を報告しているが、どちらのＤ−アミノアシラーゼも１０ｇ／ｌ程度までのＮ−アセチル−Ｄ−トリプトファンを加水分解するに過ぎず、実用的な基質濃度での反応を触媒できる酵素とは言い難い。
【０００５】
Ｄ−アミノ酸は医薬品原料などとして重要な化合物であり、安価な製法開発が望まれている。しかしながら、Ｄ−アミノ酸を効率よく触媒する事が出来るＤ−アミノアシラーゼはこれまで一切知られていなかった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、産業上実用的な基質濃度で充分な高活性を示し、Ｎ−アシル−ＤＬ−アミノ酸よりＤ−アミノ酸を効率よく生成する事が出来る新規なＤ−アミノアシラーゼ及びそれを用いたＮ−アシルアミノ酸からの対応するＤ−アミノ酸の製造方法を提供することにある。本発明の他の目的は、このＤ−アミノアシラーゼの生産及びＤ−アミノアシラーゼを用いたＤ−アミノ酸の製造に有用な材料としてのＤ−アミノアシラーゼをコードする塩基配列からなるＤＮＡ、この塩基配列からなるＤＮＡを組み込んだプラスミド及びこのプラスミドで形質で宿主を形質転換して得られた形質転換体を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を解決すべく、種々の微生物由来のＤ−アミノアシラーゼについて、それらの性質を評価した。基質濃度と反応速度の相関性を調べたところ、驚くべき事に公知のＤ−アミノアシラーゼにおいては、基質濃度が高いほど反応速度は著しく低下するといった現象、すなわち基質による酵素活性の阻害現象を見出す事が出来た。この現象は特に基質がＮ−アセチル−Ｄ−トリプトファンの場合が著しく、それゆえに従来のＤ−アミノアシラーゼにおいては実用的な基質濃度でＮ−アセチル−ＤＬ−トリプトファンよりＤ−トリプトファンを効率的に生成する事が困難となっているのではないかと考察するに至った。
【０００８】
そこで、本発明者らは様々な微生物について、Ｎ−アセチル−Ｄ−トリプトファンに対して阻害のかかりにくく、基質濃度が高い場合も高活性を示す新規なＤ−アミノアシラーゼの探索した結果、メチロバクテリウム（Methylobacterium）属に属する微生物及びノカルディオイデス（Nocardioides）属に属する微生物において、目的に適う新規なＤ−アミノアシラーゼ活性を有する微生物を発見した。そして、メチロバクテリウム（Methylobacterium）属に属する微生物由来のＤ−アミノアシラーゼを種々の精製方法を組合せて、配列番号：３に示されるＮ末端アミノ酸残基の配列の決定に成功した。さらに本発明者等は配列表の配列番号：１に示される塩基配列を有するＤＮＡを獲得することにより、この塩基配列を有するＤＮＡ断片を含んだプラスミドによる形質転換体を取得し、上記のＤ−アミノアシラーゼを活性型として産生させること、さらには実用的な基質濃度においてＮ−アシルアミノ酸から対応するＤ−アミノ酸を高効率的で製造することに成功し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
上記の本発明者らによる新たな知見に基づいて成された本発明は以下の各態様を含むものである。
（１）  Ｎ−アシル−Ｄ−アミノ酸に作用して対応するＤ−アミノ酸を生成する反応を触媒する作用を有するＤ−アミノアシラーゼであって、水性媒体中でＮ−アセチル−Ｄ−トリプトファンからＤ−トリプトファンを生成する反応を触媒する際におけるＮ−アセチル−Ｄ−トリプトファンの濃度が５０ｇ／ｌの場合の反応速度が、Ｎ−アセチル−Ｄ−トリプトファンの濃度が５ｇ／ｌの場合の反応速度に対して少なくとも４０％である事を特徴とするＤ−アミノアシラーゼ。
（２）  Ｎ−アセチル−Ｄ−トリプトファンの濃度が１００ｇ／ｌの場合の反応速度が、Ｎ−アセチル−Ｄ−トリプトファンの濃度が５ｇ／ｌの場合の反応速度に対して少なくとも２０％である上記項目（１）に記載のＤ−アミノアシラーゼ。
（３）  メチロバクテリウム（Methylobacterium）属又はノカルディオイデス（Nocardioides）属に属する微生物由来である上記項目（１）に記載のＤ−アミノアシラーゼ。
（４）  メチロバクテリウム（Methylobacterium）属に属する微生物がメチロバクテリウム・メソフィリカム（Methylobacterium mesophilicum）種、ノカルディオイデス（Nocardioides）属に属する微生物がノカルディオイデス・サーモリラシナス（Nocardioides thermolilacinus）種である上記項目（３）に記載のＤ−アミノアシラーゼ。
（５）  ノカルディオイデス・サーモリラシナス（Nocardioides thermolilacin
us）種に属する微生物がノカルディオイデス・サーモリラシナス（Nocardioides
thermolilacinus）ＡＴＣＣ３５８６３株である上記項目（４）に記載のＤ−アミノアシラーゼ。
（６）Ｎ−アシル−Ｄ−アミノ酸に作用して対応するＤ−アミノ酸を生成する反応を触媒する作用を有するＤ−アミノアシラーゼであって、
（Ａ）配列表の配列番号：２記載のアミノ酸配列または
（Ｂ）該アミノ酸配列に対して前記触媒活性を維持し得る範囲内で１以上のアミノ酸残基の挿入、欠失または置換を行って得られる変異アミノ酸配列を有することを特徴とするＤ−アミノアシラーゼ。
（７）  水性媒体中でＮ−アセチル−Ｄ−トリプトファンからＤ−トリプトファンを生成する反応を触媒する際におけるＮ−アセチル−Ｄ−トリプトファンの濃度が５０ｇ／ｌの場合の反応速度が、Ｎ−アセチル−Ｄ−トリプトファンの濃度が５ｇ／ｌの場合の反応速度に対して少なくとも４０％である上記項目（６）に記載のＤ−アミノアシラーゼ。
（８）  Ｎ−アセチル−Ｄ−トリプトファンの濃度が１００ｇ／ｌの場合の反応速度が、Ｎ−アセチル−Ｄ−トリプトファンの濃度が５ｇ／ｌの場合の反応速度に対して少なくとも２０％である上記項目（７）に記載のＤ−アミノアシラーゼ。
（９）  Ｎ−アシル−Ｄ−アミノ酸に作用して対応するＤ−アミノ酸を生成する反応を触媒する作用を有するＤ−アミノアシラーゼをコードする塩基配列からなるＤＮＡであって、
（ａ）配列表の配列番号：１記載の塩基配列または
（ｂ）配列番号：１の塩基配列に対して該塩基配列がコードするＤ−アミノアシラーゼの作用が維持される範囲内で１以上の塩基の挿入、欠失または置換を行って得られる変異塩基配列
からなることを特徴とするＤ−アミノアシラーゼをコードする塩基配列からなるＤＮＡ。
（１０）  前記変異塩基配列が、前記配列番号：１の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするものである上記項目（９）に記載の塩基配列からなるＤＮＡ。
（１１）  Ｄ−アミノアシラーゼの水性媒体中でＮ−アセチル−Ｄ−トリプトファンからＤ−トリプトファンを生成する反応を触媒する際のＮ−アセチル−Ｄ−トリプトファンの濃度が５０ｇ／ｌの場合の反応速度が、Ｎ−アセチル−Ｄ−トリプトファンの濃度が５ｇ／ｌの場合の反応速度に対して少なくとも４０％である上記項目（９）に記載の塩基配列からなるＤＮＡ。
（１２）  Ｎ−アセチル−Ｄ−トリプトファンの濃度が１００ｇ／ｌの場合の反応速度が、Ｎ−アセチル−Ｄ−トリプトファンの濃度が５ｇ／ｌの場合の反応速度に対して少なくとも２０％である上記項目（１１）に記載の塩基配列からなるＤＮＡ。
（１３）  上記項目（９）に記載の塩基配列からなるＤＮＡを含むプラスミド。
（１４）  上記項目（１３）に記載のプラスミドによって形質転換された形質転換体。
（１５）  上記項目（１４）に記載の形質転換体を培養して、該形質転換体に組み込まれたプラスミドの有する塩基配列によりコードされたＤ−アミノアシラーゼを生産させることを特徴とするＤ−アミノアシラーゼの産生方法。
（１６）  水性媒体中でＮ−アシルアミノ酸にＤ−アミノアシラーゼを作用させて対応するＤ−アミノ酸を生産する光学活性アミノ酸の生産方法であって、該Ｄ−アミノアシラーゼが水性媒体中でＮ−アセチル−Ｄ−トリプトファンからＤ−トリプトファンを生成する反応を触媒する際におけるＮ−アセチル−Ｄ−トリプトファンの濃度が５０ｇ／ｌの場合の反応速度が、Ｎ−アセチル−Ｄ−トリプトファンの濃度が５ｇ／ｌの場合の反応速度に対して少なくとも４０％であることを特徴とする光学活性アミノ酸の生産方法。
（１７）  Ｎ−アセチル−Ｄ−トリプトファンの濃度が１００ｇ／ｌの場合の反応速度が、Ｎ−アセチル−Ｄ−トリプトファンの濃度が５ｇ／ｌの場合の反応速度に対して少なくとも２０％である上記項目1６記載の生産方法。
（１８）  メチロバクテリウム（Methylobacterium）属又はノカルディオイデス（Nocardioides）属に属する微生物由来である上記項目１６に記載の生産方法。
（１９）  メチロバクテリウム（Methylobacterium）属に属する微生物がメチロバクテリウム・メソフィリカム（Methylobacterium mesophilicum）種、ノカルディオイデス（Nocardioides）属に属する微生物がノカルディオイデス・サーモリラシナス（Nocardioides thermolilacinus）種である上記項目１８記載の生産方法。
（２０）  ノカルディオイデス・サーモリラシナス（Nocardioides thermolilacinus）種に属する微生物がノカルディオイデス・サーモリラシナス（Nocardioides thermolilacinus）ＡＴＣＣ３５８６３株である上記項目１９記載の生産方法。
（２１）  Ｎ−アシルアミノ酸濃度が５０ｇ／ｌ以上である上記項目１６に記載の製造方法。
（２２）  Ｎ−アシルアミノ酸濃度が１００ｇ／ｌ以上である上記項目２１記載の製造方法。
（２３）  水性媒体中でＮ−アシルアミノ酸にＤ−アミノアシラーゼを作用させて対応するＤ−アミノ酸を生産する光学活性アミノ酸の生産方法であって、該Ｄ−アミノアシラーゼが請求項６に記載のＤ−アミノアシラーゼであることを特徴とする光学活性アミノ酸の生産方法。
（２４）  前記Ｄ−アミノアシラーゼが水性媒体中でＮ−アセチル−Ｄ−トリプトファンからＤ−トリプトファンを生成する反応を触媒する際のＮ−アセチル−Ｄ−トリプトファンの濃度が５０ｇ／ｌの場合の反応速度が、Ｎ−アセチル−Ｄ−トリプトファンの濃度が５ｇ／ｌの場合の反応速度に対して少なくとも４０％である上記項目２３に記載の生産方法。
（２５）  Ｎ−アセチル−Ｄ−トリプトファンの濃度が１００ｇ／ｌの場合の反応速度が、Ｎ−アセチル−Ｄ−トリプトファンの濃度が５ｇ／ｌの場合の反応速度に対して少なくとも２０％である上記項目２４に記載の生産方法。
（２６）  Ｄ−アミノアシラーゼを、請求項１４に記載の形質転換体を培養して得られる培養液、該培養液から分離された形質転換体又はそれらの処理物の形でＮ−アシルアミノ酸に作用させる上記項目２３に記載の生産方法。
（２７）  Ｎ−アシルアミノ酸濃度が５０ｇ／ｌ以上である上記項目２３に記載の製造方法。（２８）  Ｎ−アシルアミノ酸濃度が１００ｇ／ｌ以上である上記項目２７記載の製造方法。
【００１０】
本発明にかかるＤ−アシルアミラーゼを用いることで産業上実用的な基質濃度を用いて改善された反応速度でのＮ−アシルアミノ酸からの対応するＤ−アミノ酸の製造が可能となる。更に、本発明によれば、この有用なＤ−アシルアミラーゼの遺伝子組み換え技術を用いた生産に有用な塩基配列からなるＤＮＡ、それを組み込んだプラスミド及びこのプラスミドで宿主を形質転換した形質転換体を提供することができる。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明にかかるＤ−アミノアシラーゼは、Ｎ−アシル−Ｄ−アミノ酸に作用して対応するＤ−アミノ酸を生成する反応を触媒する作用を有する酵素であり、特にＮ−アセチル−Ｄ−トリプトファンに対して阻害がかかりにくく、基質濃度が高い場合も高活性を示すことに特徴を有するものである。このＮ−アセチル−Ｄ−トリプトファンによる阻害作用は、以下に記載する基質濃度と反応速度との関係により規定することができる。
Ｉ．水性媒体中においてＮ−アセチル−Ｄ−トリプトファンの濃度が５０ｇ／ｌの場合の反応速度が、Ｎ−アセチル−Ｄ−トリプトファンの濃度が５ｇ／ｌの場合の反応速度に対して少なくとも４０％である。
II．Ｎ−アセチル−Ｄ−トリプトファンの濃度が１００ｇ／ｌの場合の反応速度が、Ｎ−アセチル−Ｄ−トリプトファンの濃度が５ｇ／ｌの場合の反応速度に対して少なくとも２０％である。
【００１２】
本発明にかかるＤ−アミノアシラーゼは上記の阻害に関する特性Ｉを有するものであり、上記阻害に関する特性Ｉ及びIIの両方を有するものが好ましい。従って、少なくとも上記阻害に関する特性ＩのＤ−アミノアシラーゼ活性を有する酵素であれば、いかなる微生物由来であっても、もしくは公知のＤ−アミノアシラーゼを遺伝子組換により改変したものであっても、本発明に包含されるものとする。
【００１３】
更に、上記特性Ｉに関しては、Ｎ−アセチル−Ｄ−トリプトファンの濃度が５０ｇ／ｌの場合の反応速度が、Ｎ−アセチル−Ｄ−トリプトファンの濃度が５ｇ／ｌの場合の反応速度に対して少なくとも５０％、特に少なくとも６０％である事が更に好ましい。また、上記特性IIに関しては、Ｎ−アセチル−Ｄ−トリプトファンの濃度が１００ｇ／ｌの場合の反応速度が、Ｎ−アセチル−Ｄ−トリプトファンの濃度が５ｇ／ｌの場合の反応速度に対して少なくとも２５％、特に少なくとも３０％である事が更に好ましい。
【００１４】
また本発明における基質濃度と反応速度の関係は次の様にして確認する事ができる。例えば、１０ｇ／ｌ、５０ｇ／ｌ、１００ｇ／ｌ、２００ｇ／ｌの基質（Ｎ−アセチル−Ｄ−トリプトファン）をそれぞれ含む１００ｍＭのリン酸緩衝液２００μｌに反応に十分な活性量の酵素液を２００μｌ添加し３０℃において適当な時間反応させる。この反応によって生成するＤ−トリプトファンの量をＨＰＬＣ法などで測定する事により、各基質濃度における酵素活性（反応速度）を比較する事ができる。本発明において反応速度を測定する際の水性媒体は、酵素反応を進行させることができるものであれば特に限定されず、水はもちろんの事、リン酸、トリス、クエン酸、酢酸、ホウ酸、グリシン、ＨＥＰＥＳ、ＭＯＰＳ、ＭＥＳ、ＣＡＰＳ、ＣＨＥＳ、ＰＩＰＥＳなどから適宜一種または二種以上選択して成る成分を水に含有させた緩衝液を用いることができる。反応温度はＤ−アミノアシラーゼが活性を発現できる、至適温度を含む温度範囲から選択することができ、例えば３０℃〜６０℃に維持する事が特に望ましい。また反応ｐＨも、Ｄ−アミノアシラーゼが活性を維持できる範囲であればよく、特に至適ｐＨを含むｐＨ６〜１１に維持する事が望ましい。また酵素は菌体の培養液そのものや該培養液より遠心分離などによって分離、回収して得られる菌体、また該菌体の抽出物、磨砕物、分離精製物を使用できる。また本発明において反応速度を測定する際の酵素の使用量や反応時間は有意に反応速度が測定できる条件、例えば反応速度の測定時間内で反応が飽和状態に達しない条件であればよく、基質となるＮ−アセチル−Ｄ−トリプトファンの濃度が５ｇ／ｌの場合にＤ−トリプトファンの生成蓄積濃度が０．２ｇ／ｌ〜１ｇ／ｌ程度の条件である事が望ましい。
【００１５】
本発明にかかるＤ−アミノアシラーゼの物性は以下のとおりである。
至適ｐＨ：ｐＨ８〜１０（最適はｐＨ９）
至適温度：６０℃
熱安定性：４０℃／２０時間の熱処理で８０％の残存活性を示す。
【００１６】
本発明におけるＤ−アミノアシラーゼの一態様は、配列表の配列番号：２に記載のアミノ酸配列、あるいは配列番号：２に記載のアミノ酸配列に１もしくは２以上、好ましくは数個のアミノ酸がＤ−アミノアシラーゼ活性が維持し得る範囲内で置換、欠失、修飾または挿入または付加されたアミノ酸配列を有する。
【００１７】
本発明におけるＤ−アミノアシラーゼをコードするポリヌクレオチドは配列表の配列番号：１に記載の塩基配列を含む。配列番号：１に示す塩基配列は、配列番号：２に示すタンパク質をコードする。ただし、配列番号：２に示すアミノ酸配列をコードする塩基配列には、配列番号：１に示す塩基配列のみならず、異なるコドンに基づくあらゆる塩基配列が含まれる。更に適宜置換、欠失、修飾または挿入または付加を導入する事によりポリヌクレオチドのホモログを得る事も可能である。本発明におけるポリヌクレオチドのホモログは配列番号：１に示す塩基配列に対して、これによりコードされるＤ−アシルアミラーゼが所定の酵素活性を維持し得る範囲内で塩基の置換、欠失または付加を行って得られるものである。このホモログには、例えば、配列番号：１の塩基配列の相補配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズできる塩基配列を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。
【００１８】
このストリンジェントな条件でのハイブリダイゼ−ションは、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ；Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅに記載の方法によって行なう事ができ、市販のシステムとしては、ＧｅｎｅＩｍａｇｅシステム（アマシャム）を挙げる事ができる。具体的には以下の操作によってハイブリダイゼ−ションを行なう事ができる。試験すべきＤＮＡまたはＲＮＡ分子を転写した膜を製品プロトコールに従って、標識したプローブとプロトコール指定のハイブリダイゼ−ションバッファー中でハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼ−ションバッファーの組成は、０．１重量％ＳＤＳ、５重量％デキストラン硫酸、１／２０溶のキット添付のブロッキング試薬及び２〜７×ＳＳＣからなる。ブロッキング試薬としては例えば、１００×Ｄｅｎｈａｒｄｔ‘ｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ、２％（重量／容量）Ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ、２％（重量／容量）ＦｉｃｌｌTM４００、２％（重量／容量）ポリビニルピロリドンを５倍濃度で調整したものを１／２０に希釈して使用する事ができる。２０×ＳＳＣは、３Ｍ塩化ナトリウム、０．３Ｍクエン酸溶液であり、ＳＳＣは、より好ましくは３〜６×ＳＳＣ、更に好ましくは４〜５×ＳＳＣの濃度で使用する。ハイブリダイゼ−ションの温度は４０〜８０℃、より好ましくは５０〜７０℃、更に好ましくは５５〜６５℃の範囲であり、数時間から一晩のインキュベーションを行なった後、洗浄バッファーで洗浄する。洗浄の温度は、好ましくは室温、より好ましくはハイブリダイゼーション時の温度である。洗浄バッファーの組成は６×ＳＳＣ＋０．１重量％ＳＤＳ溶液、より好ましくは４×ＳＳＣ＋０．１重量％ＳＤＳ溶液、更に好ましくは１×ＳＳＣ＋０．１重量％ＳＤＳ溶液、最も好ましくは０．１×ＳＳＣ＋０．１重量％ＳＤＳ溶液である。このような洗浄バッファーで膜を洗浄し、プローブがハイブリダイズしたＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子をプローブに用いた標識を利用して識別する事ができる。
【００１９】
本発明による新規なＤ−アミノアシラーゼには、Methylobacterium mesophilicum ＭＴ１０８９４株由来のもの及びNocardioides thermolilacinus ＡＴＣＣ３５８６３株由来のものが含まれる。Methylobacterium mesophilicum ＭＴ１０８９４株は千葉県茂原市の土壌から分離した。その菌学的性質を示すと表１の通りである。
【００２０】
【表１】
0003765758.tif 000002
【００２１】
以上の菌学的緒性質を「バージェイーズ・マニュアル・オブ・システマチック・バクテリオロジー第１巻（１９８４）ウイリアムス＆ウイルキンス[Bergey's Manual of Systematic Bacteriology Vol.1(1984) Williams&Wilkins]」、「バージェイーズ・マニュアル・オブ・デターミティブ・バクテリオロジー第９版（１９９４）ウイリアムス＆ウイルキンス[Bergey's Manual of Determinative Bacteriology Ninth Edition(1994) Williams&Wilkins]」、「ジー  アイ  バロー  &アール  ケイ  エイ  フェルタム版：コーエン  アンド  スチールス  マニュアル  フォー  ザ  アイデンティフィケーション  オブ  メディカル  バクテリア  第3版  ケンブリッジ  ユニバーシティ  プレス  （１９９３） [G.I Barrow and R.K.A.Feltham ed.,Cowan&Steel's Mannual for the Identification of Medical Bacteria 3rd .ed,Cambridge univ.press,(1993)]」の分類に当てはめて本株の同定を行った結果、本菌株はMethylobacterium mesophilicumに属すると考えられた。この菌株ＭＴ１０８９４は受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１７７７１として茨城県つくば市東１丁目１番１号経済産業省産業技術総合研究所生命工学工業研究所に２０００年３月８日付けで寄託され、平成１４年１月２１日付けのブタペスト条約に基づく国際寄託への移管により寄託番号はＦＥＲＭ  ＢＰ−７８５６に変更された。
【００２２】
本発明の新規なＤ−アミノアシラーゼをコードするＤＮＡは、例えば、以下の様な方法によって単離することができる。微生物からゲノムＤＮＡを精製し、制限酵素によって消化した後に得られたＤＮＡを超遠心分離もしくは電気泳動等によって、その長さによって分画する。その分画試料のＤＮＡを回収してプラスミドに組み込むことによってプラスミドライブラリーを作成し、その中からＤ−アミノアシラーゼ活性を持つクローンを選抜してＤ−アミノアシラーゼ遺伝子をコードするＤＮＡを含むプラスミドを取得する。そのプラスミドの塩基配列を解析することによって、目的のＤ−アミノアシラーゼ遺伝子をコードするＤＮＡの塩基配列が判明し、ＤＮＡの塩基配列からコードされているＤ−アミノアシラーゼのアミノ酸配列を推定することが出来る。
【００２３】
上記のようにして単離された本発明のＤ−アミノアシラーゼをコードするＤＮＡを、例えば宿主が大腸菌の場合、ｐＵＣ１８やｐＫＫ２２３−３、ｐＢＲ３２２、ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII  ＳＫ（＋）、ｐＳＣ１０１などに代表される発現用のプラスミドに組み込むことにより、Ｄ−アミノアシラーゼ発現プラスミドが提供される。尚、形質転換に使用する宿主生物としては、組換えベクターが安定、かつ自律的に増殖可能で、さらに外来性ＤＮＡの形質が発現できるものであればよく、例として大腸菌が挙げられるが、特に大腸菌に限定されるものではない。
【００２４】
そして、本発明においては該プラスミドで形質転換して得られた形質転換体を公知の情報に基づいて、培養することができ、本発明のＤ−アミノアシラーゼを産生させることができる。培地としては炭素源、窒素源、無機物及びその他の栄養素を適量含有する培地ならば合成培地または天然培地のいずれでも使用可能である。培養は前記培養成分を含有する液体培地中で振とう培養、通気攪拌培養、連続培養、流加培養などの通常の培養方法を用いて行なう事が出来る。培養条件は、培養の種類、培養方法により適宜選択すればよく、菌株が生育しＤ−アミノアシラーゼを産生できる条件であれば特に制限はない。
【００２５】
また、本発明におけるＤ−アミノ酸の製造方法においては、Ｄ−アミノアシラーゼを、上記のＤ−アミノアシラーゼ生産菌の培養液そのものや、該培養液より遠心分離によって分離・回収して得られる形質転換菌体、該形質転換菌体の菌体処理物の形で利用することもできる。ここでいう菌体処理物とは、該形質転換菌体の抽出物や磨砕物、該抽出物や磨砕物のＤ−アミノアシラーゼ活性画分を分離・精製して得られる分離物、該形質転換菌体や該形質転換菌体の抽出物、磨砕物、分離物を適当な担体を用いて固定化した固定化物の事を示している。また宿主微生物由来の活性成分が該培養液そのものや、該培養液より遠心分離によって分離・回収して得られる形質転換菌体、該形質転換菌体の菌体処理物の本来の目的とする反応の反応性や選択性に悪影響を及ぼす場合が考えられる。この場合、該培養液そのものや、該培養液より遠心分離によって分離・回収して得られる形質転換菌体、該形質転換菌体の菌体処理物を反応に先立ってか、もしくは反応と同時に、有機溶媒処理または熱処理を施す事によって反応性や選択性を改善する事が可能である。有機溶媒としてはメタノール、エタノールなどのアルコール類やアセトン、ＴＨＦ、ＤＭＦ、ＤＭＩ、ＤＭＳＯなどの水溶性の有機溶媒やトルエンやベンゼンなどの芳香族系有機溶媒、酢酸エチルや酢酸ブチルなどのエステル類、ヘキサンやヘプタンなどの炭化水素類、ジクロロメタンやクロロホルムなどのハロゲン化炭化水素類、ジエチルエーテルなどのエーテル類などから、適宜一種または二種以上選択して使用する事ができる。有機溶媒の使用量はＤ−アミノアシラーゼ活性の安定な範囲で使用すれば良い。また熱処理を行なう場合、４０℃〜７０℃程度で行なう事ができる。Ｄ−アミノアシラーゼの安定性を考慮すれば４５℃〜５５℃で行なう事が望ましい。熱処理時間はＤ−アミノアシラーゼ活性の安定な範囲であればよく、３０分〜１００分も行なえば充分である。
【００２６】
本発明のＤ−アミノアシラーゼをＮ−アシル−Ｄ−アミノ酸に作用させる際には、Ｄ−アミノアシラーゼの活性や安定性など反応性にとって好ましい条件を選択することが望ましい。
【００２７】
反応に用いる媒体としては、水あるいは各種緩衝液からなる水性媒体を用いることができる。緩衝液としては、リン酸、トリス、クエン酸、酢酸、ホウ酸、グリシン、ＨＥＰＥＳ、ＭＯＰＳ、ＭＥＳ、ＣＡＰＳ、ＣＨＥＳ、ＰＩＰＥＳなどから適宜一種または二種以上選択して成る成分を水に含有させた緩衝液を挙げることができる。
【００２８】
また、反応効率や生産物の収率を更に向上させるために各種の添加剤を必要に応じて用いることができる。Ｄ−アミノアシラーゼには金属イオン、例えばＺｎ2+やＣｏ2+などで活性化されるものもあるため、これら２価金属を反応液に添加する事もできる。また逆に金属イオンにより阻害を受ける場合にはＥＤＴＡなどのキレート剤を添加する事もできる。
【００２９】
本発明におけるＤ−アミノ酸の製造に用いる原料（Ｎ−アシルアミノ酸）としては、Ｎ−アシル−Ｄ−アミノ酸を含むものであって、ＤＬ体、Ｄ体の割合の多い光学活性体、Ｄ体のみからなるものなどを用いることができる。
【００３０】
出発原料の濃度は特に制限はないが通常１ｇ／ｌ〜３００ｇ／ｌ程度の濃度で用いられる。とりわけ反応性や経済性を鑑みれば、好ましくは５０ｇ／ｌ以上、より好ましくは１００ｇ／ｌ以上で、好ましくは２００ｇ／ｌ以下の濃度が好適である。反応温度はＤ−アミノアシラーゼがその活性を発現できる温度に維持する事が好ましく、特に３０〜６０℃に維持する事が望ましい。また反応ｐＨも、Ｄ−アミノアシラーゼがその活性を発現できるｐＨに維持する事が好ましく、特にｐＨ６〜１１に維持する事が望ましい。
【００３１】
本発明の新規なＤ−アミノアシラーゼは種々のＮ−アシルアミノ酸のＤ体から対応するＤ−アミノ酸を生じる性質を有しており、本発明のＤ−アミノアシラーゼを用いてＮ−アシル−ＤＬ−アミノ酸より光学活性アミノ酸を工業的に有利に製造する事が可能である。適応可能なＮ−アシル−ＤＬ−アミノ酸としては特に制限されず、広い範囲の化合物から選択できる。代表的な好ましいＮ−アシル−ＤＬ−アミノ酸としては、Ｎ−アシル−ＤＬ−メチオニン、Ｎ−アシル−ＤＬ−ロイシン、Ｎ−アシル−ＤＬ−トリプトファン、Ｎ−アシル−ＤＬ−５−ヒドロキシトリプトファン、Ｎ−アシル−ＤＬ−フェニルアラニン、Ｎ−アシル−ＤＬ−フェニルグリシン、Ｎ−アシル−ＤＬ−ホモフェニルアラニン、Ｎ−アシル−ＤＬ−ビスホモフェニルアラニン、Ｎ−アシル−ＤＬ−ｐ−ニトロフェニルアラニン、Ｎ−アシル−ＤＬ−ｐ−フルオロフェニルアラニン、Ｎ−アシル−ＤＬ−ｐ−クロロフェニルアラニン、Ｎ−アシル−ＤＬ−ｐ−ブロモフェニルアラニン、Ｎ−アシル−ＤＬ−ｐ−メトキシフェニルアラニン、Ｎ−アシル−ＤＬ−チロシン、、Ｎ−アシル−ＤＬ−ｐ−シアノフェニルアラニン、Ｎ−アシル−ＤＬ−２−ピリジルアラニン、Ｎ−アシル−ＤＬ−３−ピリジルアラニン、Ｎ−アシル−ＤＬ−４−ピリジルアラニン、Ｎ−アシル−ＤＬ−o―ベンジルセリン、Ｎ−アシル−ＤＬ−Ｓ−フェニルシステイン、Ｎ−アシル−ＤＬ−１−ナフチルアラニン、Ｎ−アシル−ＤＬ−２−ナフチルアラニンなどを挙げることが出来る。更に好ましいＮ−アシル−ＤＬ−アミノ酸としてはＮ−アセチル−ＤＬ−アミノ酸が挙げられ、とりわけＮ−アセチル−Ｄ−フェニルアラニン、Ｎ−アセチル−Ｄ−トリプトファンに対して高い基質特異性を示す。
【００３２】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００３３】
尚、反応性及び光学純度は、反応で生成するＤ−アミノ酸及び残存するＮ−アシルアミノ酸を高速液体クロマトグラフィ法（カラム：ＣＲＯＷＮＰＡＫ ＣＲ（−）（ダイセル化学工業製）、カラム温度４０℃、移動相：ＨＣｌＯ4水溶液ｐＨ１．５、０〜１５％メタノール（ｖ／ｖ）、流速０．８ｍｌ／ｍｉｎ、検出２１０ｎｍ）で測定し、評価した。
【００３４】
実施例１：メチロバクテリウム  メソフィリカム（Methylobacterium mesophilicum）ＭＴ１０８９４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８５６）の培養
下記の組成の液体培地にあらかじめブイヨン寒天プレートに生育させた菌体を接種し３０℃、４０時間振とう培養してＤ−アミノアシラーゼの活性を有する菌体を得た。
（培地組成）
Ｎ−アセチル―ＤＬ−ロイシン：５ｇ／Ｌ
グルコース：      １０ｇ／Ｌ
ペプトン：１０ｇ／Ｌ
リン酸２水素カリウム：１ｇ／Ｌ
リン酸１水素カリウム：１ｇ／Ｌ
硫酸マグネシウム７水和物：０．１ｇ／Ｌ
イーストエキス：０．５ｇ／Ｌ
ｐＨ７．０（ＫＯＨで調整）。
【００３５】
実施例２：ノカルディオイデス・サーモリラシナス（Nocardioides thermolilacinus）（ＡＴＣＣ３５８６３）の培養
下記の組成の液体培地にあらかじめブイヨン寒天プレートに生育させた菌体を接種し３０℃、１００時間振とう培養してＤ−アミノアシラーゼの活性を有する菌体を得た。
（培地組成）
Ｎ−アセチル―ＤＬ−ロイシン：５ｇ／Ｌ
Ｃｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ  Ｌｉｑｕｉｄ ｍｅｄｉｕｍ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ（Ｏｘｏｉｄ）：５ｇ／Ｌ
イーストエキス：２ｇ／Ｌ
ビタミンアッセイカザミノ酸：１０ｇ／Ｌ
ｐＨ  ７．２（ＫＯＨで調整）。
【００３６】
実施例３：メチロバクテリウム  メソフィリカム（Methylobacterium mesophilicum）ＭＴ１０８９４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８５６）及びノカルディオイデス・サーモリラシナス（Nocardioides thermolilacinus）（ＡＴＣＣ３５８６３）由来Ｄ−アミノアシラーゼの基質濃度と反応速度の相関性
（粗酵素溶液）
実施例１及び２で示した方法により得られたメチロバクテリウム  メソフィリカム（Methylobacterium mesophilicum）ＭＴ１０８９４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８５６）及びノカルディオイデス・サーモリラシナス（Nocardioides thermolilacinus）（ＡＴＣＣ３５８６３）を用いて菌体溶液（０.１ｇ／０.１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７.８）１ｍｌ）を調製し、超音波菌体破砕機により破砕、冷却遠心機にて破砕菌体を沈殿させた上清を粗酵素溶液とする。
（基質溶液）
Ｎ−アセチル−Ｄ−トリプトファンの濃度が２００ｇ／ｌとなるように０.１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７.８）に溶解したものを基質溶液とした。
（測定）
基質溶液を０.１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７.８）で容量希釈して５、２５、５０、１００ｇ／ｌの基質溶液を２００μｌ調製した。粗酵素溶液を２００μｌ添加、３０℃で１時間反応後、１Ｍリン酸０.４ｍｌを添加して反応を停止した。１Ｎ水酸化ナトリウム０.４ｍｌを添加して析出した未反応アセチル体を溶解し、遠心分離にて菌体破砕物除去後、反応液中の生成Ｄ−トリプトファンをＨＰＬＣにて測定した。基質濃度５ｇ／ｌとしたときの反応速度を１００とし、２５、５０、１００ｇ／ｌとしたときの各菌株由来のＤ−アミノアシラーゼによるＤ−トリプトファン生成速度の相対値を表２に示す。
【００３７】
【表２】
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【００３８】
比較例１：公知の菌株由来Ｄ−アミノアシラーゼの基質濃度と反応速度の相関性
公知のＤ−アミノアシラーゼ保有菌株であるアルカリゲネス  デニトリフィカンス  サブスウピーシーズ  キシロースオキシダンス  ＭＩ４（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ  ｓｕｂｓｐ．ｘｙｌｏｓｏｄａｎｓ  ＭＩ４）（ＦＥＲＭ  Ｐ−９４１３）、ストレプトマイセス  ツイルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｔｕｉｒｕｓ）（ＩＦＯ１３４１８）由来のＤ−アミノアシラーゼの基質濃度と反応速度の関係について調べた。それぞれの菌株の調製方法について以下に記す。アルカリゲネス  デニトリフィカンス  サブスウピーシーズ  キシロースオキシダンス  ＭＩ４（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ  ｓｕｂｓｐ．ｘｙｌｏｓｏｄａｎｓ  ＭＩ４）（ＦＥＲＭ  Ｐ−９４１３）は実施例１記載の方法と同様に行なった。ストレプトマイセス  ツイルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｔｕｉｒｕｓ）（ＩＦＯ１３４１８）は下記の組成の液体培地にて３０℃で４８時間培養を行なった。
（培地組成）
Ｄ−バリン：４ｇ／Ｌ
グルコース：１０ｇ／Ｌ
ペプトン：１０ｇ／Ｌ
リン酸２水素カリウム：１ｇ／Ｌ
リン酸１水素カリウム：１ｇ／Ｌ
硫酸マグネシウム７水和物：０．５ｇ／Ｌ
イーストエキス：１０ｇ／Ｌ
塩化コバルト：１ｍｇ／ｍｌ
ｐＨ７．０（ＫＯＨで調整）
粗酵素液の調製方法、基質液の調製方法、酵素活性の測定方法は実施例３に記載の通りに行なった。基質濃度５ｇ／ｌとしたときの反応速度を１００とし、２５、５０、１００ｇ／ｌとしたときの各菌株由来のＤ−アミノアシラーゼによるＤ−トリプトファン生成速度の相対値を表３に示す
【００３９】
【表３】
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【００４０】
実施例４：メチロバクテリウム  メソフィリカム（Methylobacterium mesophilicum）ＭＴ１０８９４（ＦＥＲＭ ＢＰ−７８５６）由来Ｄ−アミノアシラーゼのＮ末端アミノ酸配列決定
実施例１に示される方法でメチロバクテリウム  メソフィリカムを培養して菌体を回収し、１ｍＭ  ＤＴＴ（Dithiothreitol）を添加した０.１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７.８）に懸濁した。懸濁液の状態で超音波破砕機によって菌体を破砕し、冷却遠心分離にて菌体破砕物を除去し、粗酵素溶液を得た。この粗酵素溶液に対して硫安を添加し、３０〜６０％の沈殿画分を脱塩後、ＤＥＡＥトヨパールカラムに通してパス画分を回収した。この画分をさらにフェニルトヨパール、Ｑ−セファロースによるクロマトグラフィーに供し、Ｄ−アミノアシラーゼ活性を持つ画分を得た。この画分についてドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、分子量約５６ｋＤａの位置にバンドを確認した。この５６ｋＤａタンパク質についてＮ末端アミノ酸配列の分析を行ったところ、配列番号：３に示す様にThr-Asp-Ser-Thr-Arg-と決定された。
【００４１】
実施例５：メチロバクテリウム  メソフィリカム（Methylobactrium mesophilicum）ＭＴ１０８９４（ＦＥＲＭ ＢＰ−７８５６）のゲノミックＤＮＡライブラリー作成
実施例１に示した培養方法でメチロバクテリウム  メソフィリカム（Methylobactrium mesophilicum）を２日間培養し、遠心分離で菌体を回収し、リン酸バッファー（ｐＨ７.８）で洗浄した。この菌体より「基礎生化学実験法２  抽出・分離・精製  阿南功一他著  丸善株式会社出版」記載によるバクテリアゲノムＤＮＡの分離方法に従い、ゲノムＤＮＡを調製した。調製したゲノムＤＮＡを制限酵素Sac Iで完全消化して超遠心分離法にてＤＮＡの長さによって分画し、３ｋｂ以上のＤＮＡを回収した。それらのＤＮＡと、制限酵素SacIで消化して５'末端を脱リン酸化したベクターｐＵＣ１８とをＤＮＡ連結反応に供し、プラスミドライブラリーを作成した。このプラスミドライブラリーによって大腸菌ＤＨ５αを形質転換したものを５０μｇ/ｍｌのアンピシリンを添加したＬＢ（Luria-Bertani）アガロース培地に塗布して静置培養し、コロニーを出現させた。
【００４２】
実施例６：プラスミドライブラリーからのＤ−アミノアシラーゼ活性スクリーニング
実施例５で出現した個々のコロニーをＬＢ培地（１％バクトトリプトン、０.５％バクトイーストエキストラクト、１％塩化ナトリウム、ｐＨ７.０）で３７℃一晩液体振盪培養し、遠心分離によって形質転換体を沈殿させ、０.１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７.８）にて一回洗浄後、再び遠心分離にて菌体を回収した。回収した菌体を破砕したものを粗酵素溶液とし、基質であるＮ−アセチル−Ｄ−トリプトファンと反応させてＤ−トリプトファンを生成するＤ−アミノアシラーゼ活性を有する形質転換体を選抜した。以下にその測定法を示す。
（粗酵素溶液）
上記回収菌体を０.１ｍｇ/ｍｌの濃度になるように０.１Ｍのリン酸バッファー（ｐＨ７.８）に懸濁し、超音波菌体破砕機にて菌体を破砕した後、冷却遠心機にて破砕菌体を沈殿させた上清を粗酵素溶液とした。
（基質溶液）
Ｎ−アセチル−Ｄ−トリプトファンの濃度が１０ｇ／ｌとなるように０.１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７.８）に溶解したものを基質溶液とした。
（測定）
基質溶液２００μｌに対し粗酵素溶液２００μｌ添加、３０℃、１時間反応後、１Ｍリン酸０.４ｍｌを添加して反応を停止した。遠心分離にて菌体破砕物除去後、反応液中の生成Ｄ−トリプトファンをＨＰＬＣにて測定した。
【００４３】
実施例７：Ｄ−アミノアシラーゼ遺伝子をコードするＤＮＡの塩基配列決定
実施例６より得られたＤ−アミノアシラーゼ活性を有する形質転換体よりプラスミドを抽出し、その物理的地図を調べたところ、図１の様であることが判明した。さらにその塩基配列の解析を行った。塩基配列の決定はPE Applied Biosystems社、BigDye Teminator Cycle Sequencing kitを用い、同社製Genetic Analyzer 310にて行った。その結果配列番号１に示すＤ−アミノアシラーゼ遺伝子をコードするＤＮＡの塩基配列が得られた。該Ｄ−アミノアシラーゼ遺伝子の塩基配列をアミノ酸翻訳したものを配列番号２に示す。そのＮ末端のアミノ酸配列は実施例４に示したＮ−末端アミノ酸配列分析の結果と一致した。また、該アミノ酸配列からＤ−アミノアシラーゼの分子量は約５３ｋＤａと推定された。
【００４４】
実施例８：メチロバクテリウム  メソフィリカム（Methylobacterium mesophilicum）ＭＴ１０８９４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８５６）由来Ｄ−アミノアシラーゼ遺伝子を含むＤＮＡによって形質転換した大腸菌を用いたＮ−アセチル−ＤＬ−トリプトファンを基質としたときの反応評価
（菌体懸濁液の調製）
実施例７の図１で示されるプラスミドで形質転換した大腸菌をアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ培地で終夜３７℃振とう培養を行なった。培養後、遠心分離により集菌、０.１Ｍのリン酸バッファー（ｐＨ７.８）で洗浄後に菌体を０.１Ｍのリン酸バッファー（ｐＨ７.８）に懸濁した。
（Ｎ−アセチル−ＤＬ−トリプトファン溶液の調製）
Ｎ−アセチル−Ｄ−トリプトファンの濃度が２００ｇ／ｌとなるように０.１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７.８）に溶解したものを基質溶液とした。
（測定）
上記菌体懸濁液２.５ｍｌと基質溶液２.５ｍｌをあらかじめ４０℃に保温し、この２つの溶液を混合した後４０℃で反応を行った（反応基質濃度：１００ｇ／ｌ）。反応開始２０時間後に反応液１００μｌを採取し、同量の１ＮＮａＯＨを添加して反応を停止した。その後、ＨＰＬＣ移動相で１／２００に希釈して、遠心分離によって菌体を沈殿させ、上清をＨＰＬＣによって分析し、生成したＤ−およびＬ−トリプトファン、そして基質であるＮ−アセチル−ＤＬ−トリプトファンの濃度を測定した。その結果を表４に示す。
【００４５】
【表４】
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【００４６】
＊（生成Ｄ−トリプトファン［ｍＭ］）÷（生成Ｄ−トリプトファン［ｍＭ］+生成Ｌ−トリプトファン［ｍＭ］+残存Ｎ−アセチル−ＤＬ−トリプトファン［ｍＭ］）。
【００４７】
実施例９：メチロバクテリウム  メソフィリカム（Methylobacterium mesophilicum）ＭＴ１０８９４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８５６）由来Ｄ−アミノアシラーゼ遺伝子を含むＤＮＡによって形質転換した大腸菌のＮ−アセチル−ＤＬ−アミノ酸に対する基質特異性
実施例７の図１で示されるプラスミドで形質転換した大腸菌のＮ−アセチル−ＤＬ−アミノ酸に対する基質特異性を比較した。本実施例においては、基質であるＮ−アセチル−ＤＬ−アミノ酸濃度を５ｇ／ｌに設定して４０℃で１６時間反応を行った。Ｎ−アセチル−ＤＬ−トリプトファンを基質とした時のＤ−アミノアシラーゼ活性を１００として、各種Ｎ−アセチル−ＤＬ−アミノ酸に対する相対活性を、またその時の光学純度及び反応収率を求めた。その結果を表５に示す。
【００４８】
【表５】
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【００４９】
＊：（生成Ｄ−アミノ酸［ｍＭ］）÷（生成Ｄ−アミノ酸［ｍＭ］+生成Ｌ−アミノ酸［ｍＭ］+残存Ｎ−アセチル−ＤＬ−アミノ酸［ｍＭ］）
【００５０】
【発明の効果】
本発明により、メチロバクテリウム  メソフィリカム（Methylobacterium mesophilicum）ＭＴ１０８９４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８５６）などに由来する新規なＤ−アミノアシラーゼ及びそれをコードするＤＮＡが提供される。本発明のＤ−アミノアシラーゼは産業上の有用性に優れた酵素であり、Ｎ−アシルアミノ酸から対応するＤ−アミノ酸を高効率で製造することができる。
【００５１】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】組替えプラスミドｐＵＳＤＡ３の物理的地図を示す図である。図中、oriはプラスミドの複製開始点を、Amprはアンピシリン耐性マーカーを、SacI，HincII，PstI，XhoIは各々制限酵素認識部位をそれぞれ示す。また、太矢印はＤ−アミノアシラーゼのＯＲＦの位置と向きを示す。
【図１】
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