(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式［１］
【化１】
0003776229.tif 000012
（式中のＲ1及びＲ2は、それぞれ同一又は異なる炭素数１〜１４のアルキル基、アリール基又はハロゲン化アリール基、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5及びＲ6は、それぞれ同一又は異なる水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アリール基、アルコキシ基又はアリーロキシ基である）
で表されるＮ,Ｎ'−ジ置換−９,９'−ビスジヒドロアクリジン誘導体から成るペルオキシダーゼ測定用化学発光試薬。
【請求項２】
Ｎ,Ｎ'−ジ置換−９,９'−ビスジヒドロアクリジン誘導体がＮ,Ｎ'−ジメチル−９,９'−ビスジヒドロアクリジンである請求項１記載のペルオキシダーゼ測定用化学発光試薬。
【請求項３】
一般式［２］
【化２】
0003776229.tif 000013
（式中のＲ1及びＲ2は、それぞれ同一又は異なる炭素数１〜１４のアルキル基、アリール基又はハロゲン化アリール基、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5及びＲ6は、それぞれ同一又は異なる水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アリール基、アルコキシ基又はアリーロキシ基、Ｘn-はｎ価の陰イオン、ｎは１又は２である）
で表されるＮ,Ｎ'−ジ置換−９,９'−ビスアクリジニウム塩類を溶媒中において、還元剤を用いて還元処理することにより得られた反応混合物から成るペルオキシダーゼ測定用化学発光試薬。
【請求項４】
Ｎ,Ｎ'−ジ置換−９,９'−ビスアクリジニウム塩類がＮ,Ｎ'−ジメチル−９,９'−ビスアクリジニウムジナイトレートである請求項３記載のペルオキシダーゼ測定用化学発光試薬。
【請求項５】
溶媒中において、一般式［２］
【化３】
0003776229.tif 000014
（式中のＲ1及びＲ2は、それぞれ同一又は異なる炭素数１〜１４のアルキル基、アリール基又はハロゲン化アリール基、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5及びＲ6は、それぞれ同一又は異なる水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アリール基、アルコキシ基又はアリーロキシ基、Ｘn-はｎ価の陰イオン、ｎは１又は２である）
で表されるＮ,Ｎ'−ジ置換−９,９'−ビスアクリジニウム塩類を、水素化リチウムアルミニウム、水素化リチウムホウ素又は水素化ナトリウムホウ素を還元剤として用いて還元処理することを特徴とする、一般式［１］
【化４】
0003776229.tif 000015
（式中のＲ1〜Ｒ6は、前記と同じ意味をもつ）
で表されるＮ,Ｎ'−ジ置換−９,９'−ビスジヒドロアクリジン誘導体から成るペルオキシダーゼ測定用化学発光試薬の製造方法。
【請求項６】
溶媒中において、一般式［２］
【化５】
0003776229.tif 000016
（式中のＲ1及びＲ2は、それぞれ同一又は異なる炭素数１〜１４のアルキル基、アリール基又はハロゲン化アリール基、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5及びＲ6は、それぞれ同一又は異なる水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アリール基、アルコキシ基又はアリーロキシ基、Ｘn-はｎ価の陰イオン、ｎは１又は２である）
で表されるＮ,Ｎ'−ジ置換−９,９'−ビスアクリジニウム塩類を、水素化リチウムアルミニウム、水素化リチウムホウ素又は水素化ナトリウムホウ素を還元剤として用いて還元処理したのち、残存する還元剤を分解し、次いで分解生成物を除去することを特徴とする反応混合物から成るペルオキシダーゼ測定用化学発光試薬の製造方法。
【請求項７】
Ｎ,Ｎ'−ジ置換−９,９'−ビスアクリジニウム塩類がＮ,Ｎ'−ジメチル−９,９'−ビスアクリジニウムジナイトレートである請求項５又は６記載のペルオキシダーゼ測定用化学発光試薬の製造方法。
【請求項８】
還元剤が水素化リチウムアルミニウムである請求項５、６又は７記載のペルオキシダーゼ測定用化学発光試薬の製造方法。
【請求項９】
溶媒が環状エーテル類である請求項５〜８のいずれかに記載のペルオキシダーゼ測定用化学発光試薬の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は新規な化学発光試薬及びその製造方法に関するものである。さらに詳しくは、本発明は、制御された化学発光が可能な化学発光試薬として、化学発光分析による種々の物質の検出及び定量などに用いられる化学発光試薬及びこのものを効率よく製造する方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
化学発光分析法は、酵素の触媒活性によって化学発光物質が中間体を経て励起状態となり、この状態から基底状態に戻る際に放出される発光量を測定して酵素活性を定量し、この酵素活性と相関性を有する物質の量を定量する分析方法であって、化学反応により化学発光物質を発光させるため光源が不要であり、光源に起因するバックグラウンドの上昇などがないため測定の高感度化が可能である。したがって、測定対象物質と特異的に結合しうる物質を酵素標識し、この酵素標識物質と測定対象物質との複合体を形成させたのち、この複合体中の標識酵素の活性を測定することにより測定対象物質を測定する種々の分析方法が開発されている。
このように、酵素を標識物質として用いる分析方法としては、例えば抗原抗体反応を利用する免疫学的測定法、核酸の相補性を利用する核酸ハイブリダイゼーションアッセイ法、その他にアビジン−ビオチン、ホルモン−ホルモン受容体、糖−レクチンなどの特異的な親和性を利用する方法などが知られている。化学発光分析に用いられる酵素としては、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコ−スオキシダーゼ、デヒドロゲナーゼなどが挙げられるが、取り扱いやすさ、入手しやすさなどの点でペルオキシダーゼが好適に用いられる。そして化学発光物質にルミノールを用い、発光増強剤にｐ−ヨードフェノールを用いる化学発光系が開発されているが、この化学発光系では、低濃度領域におけるペルオキシダーゼ活性の測定感度は必ずしも充分とは云えない。
また、化学発光試薬として、古くから用いられているルシゲニン（Ｎ,Ｎ'−ジメチル−９,９'−ビスアクリジニウムジナイトレート）は、アルカリ性水溶液中で微光を呈し、過酸化水素を加えると強く発光することが知られており、種々の微量分析に利用されている。しかしながら、このルシゲニンは過酸化水素とアルカリの存在で定量的に発光するので、過酸化水素の定量には利用することができるが、この反応による発光を制御して発光量で酵素活性を測定する化学発光分析法には利用しにくいと云う問題点がある。この問題点を解決する手段として、標識酵素にグルコースオキシダーゼを用いて、グルコースの酸化反応により生成する過酸化水素をアルカリ存在下にルシゲニンに作用させることにより、測定対象物質の濃度に依存した化学発光を行う方法などが実施されている。
しかしながら、グルコースオキシダーゼを標識酵素とする化学発光分析法は、試薬の調製及び発光系の操作が煩雑であり、したがって、過酸化水素を基質とするペルオキシダーゼを標識酵素に用いる化学発光分析に使用することができる安価で、かつ高感度な化学発光物質の開発が望まれていた。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、このような事情のもとで、過酸化水素の存在下にペルオキシダーゼの量に依存して発光し、ペルオキシダーゼ活性の測定に利用しうる安価で、かつ高感度な新規な化学発光試薬を提供することを目的としてなされたものである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、前記目的を達成するために鋭意研究を重ねた結果、特定の構造のＮ,Ｎ'−ジ置換−９,９'−ビスジヒドロアクリジン誘導体、及びＮ,Ｎ'−ジ置換−９,９'−ビスアクリジニウム塩類を還元することによって得られる反応混合物が、特定のアルカリ性ｐＨ条件下において、過酸化水素とは反応せず、過酸化水素とペルオキシダーゼの存在下に、ペルオキシダーゼの量に依存して化学発光すること、そして、これらを化学発光試薬として用いることにより、その目的を達成しうることを見い出し、この知見に基づいて本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、
（１）一般式［１］
【化６】
0003776229.tif 000002
（式中のＲ1及びＲ2は、それぞれ同一又は異なる炭素数１〜１４のアルキル基、アリール基又はハロゲン化アリール基、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5及びＲ6は、それぞれ同一又は異なる水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アリール基、アルコキシ基又はアリーロキシ基である）
で表されるＮ,Ｎ'−ジ置換−９,９'−ビスジヒドロアクリジン誘導体から成るペルオキシダーゼ測定用化学発光試薬、
（２）Ｎ,Ｎ'−ジ置換−９,９'−ビスジヒドロアクリジン誘導体がＮ,Ｎ'−ジメチル−９,９'−ビスジヒドロアクリジンである第(１)項記載のペルオキシダーゼ測定用化学発光試薬、
（３）一般式［２］
【化７】
0003776229.tif 000003
（式中のＲ1及びＲ2は、それぞれ同一又は異なる炭素数１〜１４のアルキル基、アリール基又はハロゲン化アリール基、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5及びＲ6は、それぞれ同一又は異なる水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アリール基、アルコキシ基又はアリーロキシ基、Ｘn-はｎ価の陰イオン、ｎは１又は２である）
で表されるＮ,Ｎ'−ジ置換−９,９'−ビスアクリジニウム塩類を溶媒中において、還元剤を用いて還元処理することにより得られた反応混合物から成るペルオキシダーゼ測定用化学発光試薬、
（４）Ｎ,Ｎ'−ジ置換−９,９'−ビスアクリジニウム塩類がＮ,Ｎ'−ジメチル−９,９'−ビスアクリジニウムジナイトレートである第(３)項記載のペルオキシダーゼ測定用化学発光試薬、
（５）溶媒中において、一般式［２］
【化８】
0003776229.tif 000004
（式中のＲ1及びＲ2は、それぞれ同一又は異なる炭素数１〜１４のアルキル基、アリール基又はハロゲン化アリール基、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5及びＲ6は、それぞれ同一又は異なる水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アリール基、アルコキシ基又はアリーロキシ基、Ｘn-はｎ価の陰イオン、ｎは１又は２である）
で表されるＮ,Ｎ'−ジ置換−９,９'−ビスアクリジニウム塩類を、水素化リチウムアルミニウム、水素化リチウムホウ素又は水素化ナトリウムホウ素を還元剤として用いて還元処理することを特徴とする、一般式［１］
【化９】
0003776229.tif 000005
（式中のＲ1〜Ｒ6は、前記と同じ意味をもつ）
で表されるＮ,Ｎ'−ジ置換−９,９'−ビスジヒドロアクリジン誘導体から成るペルオキシダーゼ測定用化学発光試薬の製造方法、
（６）溶媒中において、一般式［２］
【化１０】
0003776229.tif 000006
（式中のＲ1及びＲ2は、それぞれ同一又は異なる炭素数１〜１４のアルキル基、アリール基又はハロゲン化アリール基、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5及びＲ6は、それぞれ同一又は異なる水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アリール基、アルコキシ基又はアリーロキシ基、Ｘn-はｎ価の陰イオン、ｎは１又は２である）
で表されるＮ,Ｎ'−ジ置換−９,９'−ビスアクリジニウム塩類を、水素化リチウムアルミニウム、水素化リチウムホウ素又は水素化ナトリウムホウ素を還元剤として用いて還元処理したのち、残存する還元剤を分解し、次いで分解生成物を除去することを特徴とする反応混合物から成るペルオキシダーゼ測定用化学発光試薬の製造方法、
（７）Ｎ,Ｎ'−ジ置換−９,９'−ビスアクリジニウム塩類がＮ,Ｎ'−ジメチル−９,９'−ビスアクリジニウムジナイトレートである第(５)又は(６)項記載のペルオキシダーゼ測定用化学発光試薬の製造方法、
（８）還元剤が水素化リチウムアルミニウムである第(５)、(６)又は(７)項記載のペルオキシダーゼ測定用化学発光試薬の製造方法、及び、
（９）溶媒が環状エーテル類である第(５)〜(８)項のいずれかに記載のペルオキシダーゼ測定用化学発光試薬の製造方法、
を提供するものである。
【０００５】
【発明の実施の形態】
本発明の化学発光試薬［１］であるＮ,Ｎ'−ジ置換−９,９'−ビスジヒドロアクリジン誘導体（以下、本発明のビスジヒドロアクリジン誘導体と略称することがある）は、一般式［１］
【化１１】
0003776229.tif 000007
で表される構造を有するものである。
この一般式［１］において、Ｒ1及びＲ2は、それぞれ炭素数１〜１４のアルキル基、アリール基又はハロゲン化アリール基である。ここで、炭素数１〜１４のアルキル基としては、直鎖状、分岐状のいずれであってもよく、例えばメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、オクチル基などが挙げられる。アリール基としては、炭素数６〜１４のものが好ましく、特にフェニル基が好ましい。また、ハロゲン化アリール基としては、炭素数６〜１４のものが好ましく、特にフッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子のハロゲン原子が、環上に１個又は２個以上導入されたフェニル基が好ましく挙げられる。このハロゲン化アリール基におけるハロゲン原子の結合位置については特に制限はない。また、Ｒ1及びＲ2は、たがいに同一であってもよいし、異なっていてもよい。
【０００６】
一方、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5及びＲ6は、それぞれ水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アリール基、アルコキシ基又はアリーロキシ基である。ここで、ハロゲン原子としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子が挙げられる。アルキル基としては、炭素数１〜１４の直鎖状又は分岐状のアルキル基が好ましく、例えば、前記Ｒ1及びＲ2のうちの炭素数１〜１４のアルキル基の説明において例示したものと同じものを挙げることができる。アリール基としては、炭素数６〜１４のものが好ましく、例えばフェニル基、トリル基、ビフェニル基、ナフチル基、アントリル基などが挙げられ、アルコキシ基としては、炭素数１〜１４の直鎖状又は分岐状のアルコキシ基が好ましく、例えばメトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、ブトキシ基、ペントキシ基、ヘキソキシ基、オクトキシ基などが挙げられる。アリーロキシ基としては、炭素数６〜１４のものが好ましく、例えばフェニルオキシ基、トリルオキシ基などが挙げられる。このＲ3、Ｒ4、Ｒ5及びＲ6は、たがいに同一であってもよいし、異なっていてもよい。
このような一般式［１］で表されるＮ,Ｎ'−ジ置換−９,９'−ビスジヒドロアクリジン誘導体の例としては、Ｎ,Ｎ'−ジメチル−９,９'−ビスジヒドロアクリジン、Ｎ,Ｎ'−ジエチル−９,９'−ビスジヒドロアクリジン、Ｎ,Ｎ'−ジフェニル−９,９'−ビスジヒドロアクリジン、Ｎ,Ｎ'−ジ−ｍ−クロロフェニル−９,９'−ビスジヒドロアクリジンなどが挙げられるが、もちろんこれらに限定されるものではない。これらの中で、特にＮ,Ｎ'−ジメチル−９,９'−ビスジヒドロアクリジンが好適である。
一方、化学発光試薬［２］は、一般式［２］
【化１２】
0003776229.tif 000008
で表されるＮ,Ｎ'−ジ置換−９,９'−ビスアクリジニウム塩類を溶媒中において、還元剤を用いて還元処理することにより得られた反応混合物から成るものである。
前記一般式［２］において、Ｒ1〜Ｒ6は、前記一般式［１］におけるＲ1〜Ｒ6と同じである。また、Ｘn-はｎ価の陰イオンであり、ｎは１又は２である。Ｘn-の例としては、各種ハロゲンイオン（Ｆ-、Ｃｌ-、Ｂｒ-、Ｉ-）、ＮＯ3-、ＣｌＯ4-、ＳＯ42-、ＣＯ32-などの無機陰イオン、ＣＨ3ＣＯＯ-、ＣＨ3ＳＯ4-、Ｃ2Ｈ5ＳＯ4-、ｐ−トルエンスルホン酸イオンなどの有機イオンが挙げられる。
このような一般式［２］で表されるＮ,Ｎ'−ジ置換−９,９'−ビスアクリジニウム塩類の例としては、Ｎ,Ｎ'−ジメチル−９,９'−ビスアクリジニウム塩、Ｎ,Ｎ'−ジエチル−９,９'−ビスアクリジニウム塩、Ｎ,Ｎ'−ジフェニル−９,９'−ビスアクリジニウム塩、Ｎ,Ｎ'−ジ−ｍ−クロロフェニル−９,９'−ビスアクリジニウム塩などが挙げられるが、もちろんこれらに限定されるものではない。これらの中で、特にＮ,Ｎ'−ジメチル−９,９'−ビスアクリジニウムジナイトレートが好適である。
【０００７】
次に、本発明の化学発光試薬［１］であるＮ,Ｎ'−ジ置換−９,９'−ビスジヒドロアクリジン誘導体の製造方法について説明する。
本発明のビスジヒドロアクリジン誘導体は、任意の方法によって製造することができるが、以下に示す本発明方法によれば、効率よく製造することができる。本発明の製造方法においては、溶媒中において、前記一般式［２］で表されるＮ,Ｎ'−ビス置換−９,９'−ビスアクリジニウム塩類を、還元剤を用いて還元処理することにより、対応する前記一般式［１］で表されるＮ,Ｎ'−ビス置換−９,９'−ビスジヒドロアクリジン誘導体が効率よく得られる。
前記一般式［２］で表されるＮ,Ｎ'−ジ置換−９,９'−ビスアクリジニウム塩類の例としては、前記と同様に、Ｎ,Ｎ'−ジメチル−９,９'−ビスアクリジニウム塩、Ｎ,Ｎ'−ジエチル−９,９'−ビスアクリジニウム塩、Ｎ,Ｎ'−ジフェニル−９,９'−ビスアクリジニウム塩、Ｎ,Ｎ'−ジ−ｍ−クロロフェニル−９,９'−ビスアクリジニウム塩などが挙げられるが、もちろんこれらに限定されるものではない。これらの中で、特にＮ,Ｎ'−ジメチル−９,９'−ビスアクリジニウムジナイトレートが好適である。
一方、本発明の化学発光試薬［２］は、本発明方法によれば、前記一般式［２］で表されるＮ,Ｎ'−ジ置換−９,９'−ビスアクリジニウム塩類を、還元剤を用いて還元処理したのち、残存する還元剤を分解し、次いで分解生成物を除去して反応混合物を得ることにより、製造される。なお、一般式［２］で表されるＮ,Ｎ'−ジ置換−９,９'−ビスアクリジニウム塩類については、前記と同様である。
本発明の化学発光試薬［１］及び［２］の製造方法において用いられる還元剤としては、例えば水素化リチウムアルミニウム、水素化リチウムホウ素、水素化ナトリウムホウ素などが挙げられるが、これらの中で、特に水素化リチウムアルミニウムが好適である。これらの還元剤は単独で用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いてもよい。また、反応溶媒としては、反応試薬に対して実質上不活性であり、かつ反応試薬に対する溶解性又は分散性を有するものであればよく、特に制限はないが、例えばテトラヒドロフランやジオキサン類などの環状エーテル類が好適である。この反応溶媒は１種用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【０００８】
反応温度は特に制限はなく、用いる原料、還元剤及び溶媒の種類などに応じて、適宜選定されるが、一般的には、−１０〜１５０℃、好ましくは０〜１２０℃、特に好ましくは２０〜９０℃の範囲である。反応時間は、用いる原料、還元剤及び溶媒の種類や反応温度などにより異なり、一概に定めることはできないが、通常は１分〜一昼夜、好ましくは１０分〜１２時間、特に好ましくは３０分〜５時間の範囲である。
このようにして、原料のＮ,Ｎ'−ジ置換−９,９'−ビスアクリジニウム塩類に対応するＮ,Ｎ'−ジ置換−９,９'−ビスジヒドロアクリジン誘導体が生成する。反応終了後、反応混合液中の過剰の還元剤を加水分解し、固形物をろ別したのち、ろ液のpHを所望の値に調整し、このＮ,Ｎ'−ジ置換−９,９'−ビスジヒドロアクリジン誘導体溶液を、そのまま化学発光試薬として用いてもよいし、また、固形物をろ別したのち、ろ液から目的のＮ,Ｎ'−ジ置換−９,９'−ビスジヒドロアクリジン誘導体を常法に従って単離し、化学発光試薬として用いてもよい。
本発明の化学発光試薬［１］及び［２］は、塩基性条件下に、過酸化水素及びペルオキシダーゼの存在で反応して発光するので、この反応により過酸化水素の検出及びペルオキシダーゼの定量などに利用することが可能であり、ペルオキシダーゼを標識物質として用いることにより、さらに、種々の物質の定量に用いることが可能になる。
【０００９】
本発明の化学発光試薬［１］及び［２］は、pH７.５〜１３の塩基性条件下において、過剰の過酸化水素の存在下、ペルオキシダーゼの濃度に依存した量で発光する。この発光はフェノール性化合物などの発光増強剤によって増強することが認められる。このようなフェノール性化合物としては、例えばｐ−ヒドロキシ桂皮酸、ｐ−フェニルフェノール、ｐ−（４−クロロフェニル）フェノール、ｐ−（４−ブロモフェニル）フェノール、ｐ−（４−ヨードフェニル）フェノール、ｐ−ヨードフェノール、ｐ−ブロモフェノール、ｐ−クロロフェノール、６−ヒドロキシベンゾチアゾール、２−ナフトール、ホタルルシフェリンなどが挙げられる。これらの中で、ｐ−ヨードフェノール、ｐ−フェニルフェノール及び６−ヒドロキシベンゾチアゾールが好適である。これらのフェノール性化合物は、単独で用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
本発明の化学発光試薬［１］を使用する場合には、Ｎ,Ｎ'−ジ置換−９,９'−ビスジヒドロアクリジン誘導体として、また化学発光試薬［２］を使用する場合には、製造の出発原料であるＮ,Ｎ'−ジ置換−９,９'−ビスアクリジニウム塩類に換算して、好ましくは１０-6〜１モル／リットル、より好ましくは１０-4〜１０-2モル／リットルの範囲の濃度で用いられ、またその使用量は、通常１０〜５００μｌ、好ましくは５０〜３００μｌの範囲が有利である。さらに、前記発光増強剤の使用量は、本発明の化学発光試薬に対して、通常０.０１〜１００倍モル、好ましくは０.１〜１０倍モルの範囲で選ぶのがよい。また、その濃度としては、１０-6〜１モル／リットルの範囲が好ましく、特に１０-4〜１０-2モル／リットルの範囲が好ましい。
この化学発光反応に用いる過酸化水素の量は、本発明の化学発光試薬に対して、充分に過剰な量であればよく、特に制限はないが、化学発光試薬に対して、通常３〜１万倍モル、好ましくは１０〜１０００倍モルの範囲で選ぶのが有利である。また、ペルオキシダーゼを標識物質として、抗体や核酸などを標識して種々の物質を定量する場合には、このペルオキシダーゼとしては、特に限定されるものではないが、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）が好ましく用いられる。
この化学発光反応は塩基性条件下で行われるので、通常塩基性緩衝液が用いられる。この塩基性緩衝液としては、例えばトリス緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液などの中から、任意に選択して用いることができる。また、所望により、反応時に界面活性剤やキレート剤などの添加剤を用いることができる。
本発明の化学発光試薬においては、その成分であるＮ,Ｎ'−ジ置換−９,９'−ビスジヒドロアクリジン誘導体が、ペルオキシダーゼによる過酸化水素の分解反応で生成する発生期の酸素により酸化されて、Ｎ,Ｎ'−ジ置換−９,９'−ビスジヒドロアクリジニウム化合物となり、さらに過剰に存在する過酸化水素と反応して励起状態のジオキセタン構造を形成したのち、アルカリで分解されてアクリドンを生成し、基底状態に戻り発光するものと考えられる。
【００１０】
【実施例】
次に、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明は、これらの例によってなんら限定されるものではない。
実施例１
化学発光試薬の調製
ルシゲニン１mgを試験管に採り、これにＮ,Ｎ−ジメチルホルムアミド１５０μｌを加えて溶解させたのち、撹拌下にテトラヒドロフラン１ml中へ加えてルシゲニンをテトラヒドロフラン中に微分散させた。次いで、これに水素化リチウムアルミニウム粉末１５０mgを添加して、室温下に６時間撹拌して還元処理したのち、反応混合液を氷冷下に脱イオン水中へ少量ずつ注入して過剰量の水素化リチウムアルミニウムを分解させた。次に、生成した水酸化アルミニウムなどの沈殿をろ別してから、ろ液のpHを１Ｎ塩酸で７.０に調整することにより、Ｎ,Ｎ'−ジメチル−９,９'−ビスジヒドロアクリジン溶液から成る化学発光試薬２.５ｇを得た。
この溶液について、高速液体クロマトグラフィーにより分析した結果、Ｎ,Ｎ'−ジメチル−９,９'−ビスジヒドロアクリジン０.０１８重量％溶液であることが確認された。収率６２％。
実施例２
化学発光試薬の調製
ルシゲニン１mgを試験管に採り、これにＮ,Ｎ−ジメチルホルムアミド１５０μｌを加えて溶解させたのち、撹拌下に１,４−ジオキサン１ml中へ加えてルシゲニンを１,４−ジオキサン中に微分散させた。次いで、これに水素化リチウムアルミニウム粉末１５０mgを添加して、８０℃で２時間撹拌して還元処理したのち、反応混合液を氷冷下にメタノール中へ少量ずつ注入して過剰量の水素化リチウムアルミニウムを分解させた。次に、生成した沈殿をろ別してから、ろ液より溶媒を減圧下に留去することにより、固形物から成る化学発光試薬０.７mgを得た。
この固形物について、高速液体クロマトグラフィーにより分析した結果、Ｎ,Ｎ'−ジメチル−９,９'−ビスジヒドロアクリジン６５重量％のものであることが確認された。収率６２％。
【００１１】
実施例３
化学発光試薬の調製
ルシゲニン１mgを試験管に採り、これにＮ,Ｎ−ジメチルホルムアミド１５０μｌを加えて溶解させたのち、撹拌下に１,４−ジオキサン１ml中へ加えてルシゲニンを１,４−ジオキサン中に微分散させた。次いで、これに水素化リチウムアルミニウム粉末１５０mgを添加して、８０℃で２時間撹拌して還元処理したのち、反応混合液を氷冷下に脱イオン水中へ少量ずつ注入して過剰量の水素化リチウムアルミニウムを分解させた。次に、生成した水酸化アルミニウムなどの沈殿をろ別してから、ろ液のpHを１Ｎ塩酸で７.０に調整することにより、Ｎ,Ｎ'−ジメチル−９,９'−ビスジヒドロアクリジン溶液から成る化学発光試薬２.５ｇを得た。
この溶液について、高速液体クロマトグラフィーにより分析した結果、Ｎ,Ｎ'−ジメチル−９,９'−ビスジヒドロアクリジン０.０２重量％溶液であることが確認された。収率６８％。
実施例４
ペルオキシダーゼ活性の測定
Ｎ,Ｎ'−ジメチル−９,９'−ビスジヒドロアクリジン（実施例１で得られたもの）４.０×１０-6モル／リットル、ｐ−ヨードフェノールを１０-3モル／リットルの濃度で含有する０.１モル／リットルトリス塩酸緩衝液（pH８.４）１００μｌに、種々の濃度水準の西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）水溶液５０μｌを混合し、これに０.００３４重量％過酸化水素水溶液５０μｌを加え、ルミノメーター（ダイアヤトロン社製ルミナスＣＴ−９０００Ｄ）で０〜５秒間発光量を積算したところ、ＨＲＰを５×１０-19モル／ａｓｓａｙまで測定可能であった。
実施例５
ペルオキシダーゼ活性の測定
実施例３で調製した化学発光試薬を０.１モル／リットルトリス塩酸緩衝液（pH８.４）で１０倍に希釈した溶液１０μｌ、及びｐ−ヨードフェノールを１０-3モル／リットルの濃度で含有する０.１モル／リットルトリス塩酸緩衝液（pH８.４）１００μｌの混合液に、種々の濃度水準のＨＲＰ水溶液５０μｌを混合し、これに０.００３４重量％過酸化水素水溶液５０μｌを加え、ルミノメーター（ダイアヤトロン社製ルミナスＣＴ−９０００Ｄ）で０〜５秒間発光量を積算した結果、第１表に示すようにＨＲＰを５×１０-19モル／ａｓｓａｙまで測定することが可能であった。
【００１２】
【表１】
0003776229.tif 000009
【００１３】
実施例６
ペルオキシダーゼ活性の測定
Ｎ,Ｎ'−ジメチル−９,９'−ビスジヒドロアクリジン（実施例１で得られたもの）を４.０×１０-5モル／リットル及びｐ−フェニルフェノールを１０-3モル／リットルの濃度で含有する０.１モル／リットルトリス塩酸緩衝液（pH８.４）１００μｌに、種々の濃度水準のＨＲＰ水溶液５０μｌを混合し、これに０.００３４重量％過酸化水素水溶液５０μｌを加えルミノメーター（ダイアヤトロン社製ルミナスＣＴ−９０００Ｄ）で０〜５秒間発光量を積算した結果、第２表に示すようにＨＲＰを５×１０-19モル／ａｓｓａｙまで測定することが可能であった。
【００１４】
【表２】
0003776229.tif 000010
【００１５】
比較例１
ルミノール（３−アミノフタル酸ヒドラジド）５.６×１０-5モル／リットル及びｐ−ヨードフェノールを１０-3モル／リットルの濃度で含有する０.１モル／リットルトリス塩酸緩衝液（pH８.４）１００μｌに、種々の濃度水準のＨＲＰ水溶液５０μｌを混合したのちこれに０.００３４重量％過酸化水素水溶液５０μｌを加え、ルミノメーター（ダイアヤトロン社製ルミナスＣＴ−９０００Ｄ）で０〜５秒間発光量を積算した結果、第３表に示すようにＨＲＰを１０-17モル／ａｓｓａｙまで測定できることが認められた。
【００１６】
【表３】
0003776229.tif 000011
【００１７】
参考例１
不溶性担体固定化ポリクローナル抗体の製造
抗原に特異的反応性を有する兎由来のポリクローナル抗体を１０ミリモル／リットルリン酸緩衝生理食塩水（pH７.４）（ＰＢＳ）に１０mg／mlの濃度で溶解した溶液を、白色マイクロプレート（ラボシステム社製）の各ウェルに０.１mlずつ加え、３７℃の温度で１時間放置したのち、ＰＢＳで洗浄してから、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）水溶液を０.３mlずつ加えて３７℃の温度で１時間放置してポストコーティング処理を実施してポリクローナル抗体固定化白色マイクロプレートを得た。
参考例２
ペルオキシダーゼ酵素標識モノクローナル抗体の製造
抗原に特異的反応性を有するマウス由来のモノクローナル抗体を１０ミリモル／リットルリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（pH７.４）に１.０mg／mlの濃度で溶解した溶液１mlに、Ｎ−（ｍ−マレイミド安息香酸）−Ｎ−サクシンイミドエステル（ＭＢＳ）の１０mg／ml濃度のジメチルホルムアルミド溶液０.１mlを添加し、２５℃の温度で３０分間反応させた。次いで、この反応混合液をセファデックスＧ−２５を充填したカラムを用い、０.１モル／リットルリン酸緩衝液（pH６.０）でゲルろ過を行い、マレイミド化モノクローナル抗体と未反応ＭＢＳとを分離した。
一方、ペルオキシダーゼ酵素としてホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の１.０mg／mlのＰＢＳ溶液に、Ｎ−サクシンイミジル−３−（２−ピリジルチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）の１０mg／ml濃度のエタノール溶液を添加し、２５℃の温度で３０分間反応させた。次いで、この反応混合液をセファデックスＧ−２５を充填したカラムを用い、１０ミリモル／リットル酢酸緩衝液（pH４.５）でゲルろ過して精製し、ピリジルジスルフィド化ＨＲＰを含有する画分を採取したのち、これをコロジオンバック中において氷冷下に約１０倍に濃縮した。次に、これに０.１モル／リットルジチオスレイトールを含有する０.１モル／リットル酢酸緩衝生理食塩水（pH４.５）１mlを添加して、２５℃の温度で３０分間撹拌してＨＲＰ分子中に導入したピリジルジスルフィド基を還元したのち、この反応混合液をセファデックスＧ−２５を充填したカラムを用いてゲルろ過し、チオール化ＨＲＰを含有する画分を得た。
次に、マレイミド化モノクローナル抗体とチオール化ＨＲＰとを混合し、コロジオンバックを用いて氷冷下に４mg／mlの蛋白質濃度まで濃縮し、４℃で一昼夜放置したのち、ウルトロゲルＡｃＡ４４（ＳＥＰＲＡＣＯＲ社）を充填したカラムを用いてゲルろ過し、ペルオキシダーゼ酵素標識モノクローナル抗体を得た。
【００１８】
実施例７
同時サンドイッチ法ＣＬＥＩＡによるα−フェトプロティン（ＡＦＰ）の測定
兎抗ヒトＡＦＰポリクローナル抗体を固定化した白色マイクロプレートに、精製したヒトＡＦＰ（標準物質）を０〜８００ng／mlの範囲で含有する２％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液（pH７.４）５０μｌとペルオキシダーゼ酵素標識マウス抗ヒトＡＦＰモノクローナル抗体を約３μｇ／mlの濃度で含有する２％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液（pH７.４）１００μｌとを加え、３７℃の温度で１時間インキュベートした。次に、ウェル内の溶液を吸引除去したのち、生理食塩水で洗浄してから、各ウェルに実施例３で調製した化学発光試薬を０.１モル／リットルトリス塩酸緩衝液（pH８.４）で１０倍に希釈した溶液１０μｌ、及びｐ−ヨードフェノールを１０-3モル／リットルの濃度で含有する０.１モル／リットルトリス塩酸緩衝液（pH８.４）２４０μｌを加え、これに０.００３４重量％過酸化水素の０.１モル／リットルトリス塩酸緩衝液（pH８.４）５０μｌを注入して発光させ、この発光量をルミノメーター（ダイアヤトロン社製ルミナスＣＴ−９０００Ｄ）で０〜５秒間積算して測定し、この値を標準物質濃度に対してプロットすることにより、図１に示される濃度依存性の良い検量線を得た。この検量線を用いて血清検体中のヒトＡＦＰを０.０５ng／mlの濃度まで測定することが可能であった。
実施例８
同時サンドイッチ法ＣＬＥＩＡによるプロラクチン（ＰＲＬ）の測定
兎抗ヒトＰＲＬポリクローナル抗体を固定化した白色マイクロプレートに、精製したヒトＰＲＬ（標準物質）を０〜２００ng／mlの範囲で含有する２％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液（pH７.４）５０μｌとペルオキシダーゼ酵素標識マウス抗ヒトＰＲＬモノクローナル抗体を約２μｇ／mlの濃度で含有する２％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液（pH７.４）１００μｌとを加え、３７℃の温度で１時間インキュベートした。次いで、ウェル内の溶液を吸引除去し、生理食塩水で洗浄してから、各ウェルに実施例３で調製した化学発光試薬を０.１モル／リットルトリス塩酸緩衝液（pH８.４）で１０倍に希釈した溶液１０μｌ及びｐ−ヨードフェノールを１０-3モル／リットル含有する０.１モル／リットルトリス塩酸緩衝液（pH８.４）２４０μｌを加えた。これに０.００３４重量％過酸化水素の０.１モル／リットルトリス塩酸緩衝液（pH８.４）５０μｌを注入して発光させ、この発光量を発光測定装置ルミノメーター（ダイアヤトロン社製ルミナスＣＴ−９０００Ｄ）で０〜５秒間積算して測定し、この値を標準物質濃度に対してプロットすることにより、図２に示される濃度依存性の良い検量線を得た。この検量線を用いて血清検体中のヒトプロラクチンを０.１ng／mlの濃度まで測定することが可能であった。
実施例９
同時サンドイッチ法ＣＬＥＩＡによるヒト絨毛性ゴナドトロピンβ鎖(βｈＣＧ)の測定
兎抗ヒトβｈＣＧポリクローナル抗体を固定化した白色マイクロプレートに、精製したβｈＣＧ（標準物質）を０〜２００mIU／mlの範囲で含有する２％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液（pH７.４）５０μｌとペルオキシダーゼ酵素標識マウス抗βｈＣＧモノクローナル抗体を約２μｇ／mlの濃度で含有する２％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液（pH７.４）１００μｌとを加え、３７℃の温度で１時間インキュベートした。次に、ウェル内の溶液を吸引除去したのち、生理食塩水で洗浄してから、各ウェルに実施例３で調製した化学発光試薬を０.１モル／リットルトリス塩酸緩衝液（pH８.４）で１０倍に希釈した溶液１０μｌ及びｐ−ヨードフェノールを１０-3モル／リットル含有する０.１モル／リットルトリス塩酸緩衝液（pH８.４）２４０μｌを加え、これに０.００３４重量％過酸化水素の０.１モル／リットルトリス塩酸緩衝液（pH８.４）５０μｌを注入して発光させた。この発光量をルミノメーター（ダイアヤトロン社製ルミナスＣＴ−９０００Ｄ）で０〜５秒間積算して測定し、この値を標準物質濃度に対してプロットすることにより、図３に示される濃度依存性の良い検量線を得た。この検量線を用いて血清検体中のβｈＣＧを０.１mIU／mlの濃度まで測定することが可能であった。
【００１９】
比較例２
ルミノールを用いる同時サンドイッチ法ＣＬＥＩＡによるα−フェトプロティン（ＡＦＰ）の測定
兎抗ヒトＡＦＰポリクローナル抗体を固定化した白色マイクロプレートに、精製したヒトＡＦＰ（標準物質）を０〜８００ng／mlの範囲で含有する２％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液（pH７.４）５０μｌとペルオキシダーゼ酵素標識マウス抗ヒトＡＦＰモノクローナル抗体を約３μｇ／mlの濃度で含有する２％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液（pH７.４）１００μｌとを加え、３７℃の温度で１時間インキュベートした。次に、ウェル内の溶液を吸引除去したのち、生理食塩水で洗浄してから、各ウェルにルミノールを５.６×１０-5モル／リットル、ｐ−ヨードフェノールを１０-3モル／リットルの濃度で含有する０.１モル／リットルトリス塩酸緩衝液（pH８.４）１００μｌを加え、これに０.００３４重量％過酸化水素の０.１モル／リットルトリス塩酸緩衝液（pH８.４）５０μｌを注入して発光させた。この発光量をルミノメーター（ダイアヤトロン社製ルミナスＣＴ−９０００Ｄ）で０〜５秒間積算して測定し、この値を標準物質濃度に対してプロットすることにより、図４に示される濃度依存性を有する検量線を得た。この検量線を用いて血清検体中のヒトＡＦＰを２.０ng／mlの濃度まで測定することが可能であった。
【００２０】
【発明の効果】
本発明の化学発光試薬は、過酸化水素とペルオキシダーゼの存在下に、ペルオキシダーゼの濃度に依存して化学発光する性質を有することを利用して、ペルオキシダーゼ酵素を高感度で検出することができる。さらに、ペルオキシダーゼを標識物質として抗原、抗体、核酸などを標識した酵素標識物を用いて、酵素免疫測定法により抗体、抗原などを、ウェスタンプロット法により蛋白質を、そしてサザーン及びノーザンプロット法により酵素標識核酸プローブを用いてＤＮＡ及びＲＮＡなどの核酸を、それぞれ特異的に、かつ高感度で測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、実施例７記載の反応系を用いて化学発光させた化学発光量をヒトＡＦＰ（標準物質）の濃度の関数としてプロットして作成したヒトＡＦＰ測定用の検量線である。
【図２】図２は、実施例８記載の反応系を用いて化学発光させた化学発光量をヒトＰＲＬ（標準物質）の濃度の関数としてプロットして作成したヒトＰＲＬ測定用の検量線である。
【図３】図３は、実施例９記載の反応系を用いて化学発光させた化学発光量をβｈＣＧ（標準物質）の濃度の関数としてプロットして作成したβｈＣＧ測定用の検量線である。
【図４】図４は、比較例２記載の反応系を用いて化学発光させた化学発光量をヒトＡＦＰ（標準物質）の濃度の関数としてプロットして作成したヒトＡＦＰ測定用の検量線である。
【図１】
0003776229.tif 000017
【図２】
0003776229.tif 000018
【図３】
0003776229.tif 000019
【図４】
0003776229.tif 000020