(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
クワ属(Morus)植物から選択される１種又は２種以上の植物の抽出物を有効成分とするセリンプロテアーゼ阻害剤。
【請求項２】
クワ(Morus)属植物から選択される１種又は２種以上の植物の抽出物を有効成分とするエラスターゼ阻害剤。
【請求項３】
クワ(Morus)属植物から選択される１種又は２種以上の植物の抽出物を有効成分とするトリプシン阻害剤。
【請求項４】
クワ(Morus)属植物から選択される１種又は２種以上の植物の抽出物を有効成分とするキモトリプシン阻害剤。
【請求項５】
クワ(Morus)属植物から選択される１種又は２種以上の植物の抽出物を有効成分とするプラスミン阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、セージ(Salvia officinalis L.)及びクワ(Morus)属から選択される１種又は２種以上の植物の抽出物を有効成分とするセリンプロテアーゼ阻害剤に関し、更に詳しくは、膵炎治療剤，急性動脈炎，肺気腫，動脈硬化，関節リュウマチ，癌の転移・浸潤等の治療剤として、また、皮膚のはり・弾力を回復維持することで皮膚の老化を防止し、若々しい肌の状態を維持する効果が期待されるセリンプロテアーゼ阻害剤、及びセリンプロテアーゼの一種であるエラスターゼ，トリプシン，キモトリプシン，プラスミン阻害剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
生体内には、トリプシン，キモトリプシン，トロンビン，プラスミン，エラスターゼ等種々のセリンプロテアーゼが存在し、それらの酵素が何らかの要因により異常に活性化されると、炎症，疼痛，アレルギー，血液異常，組織破壊などの疾患を引き起こすと考えられている。例えば、急性膵炎或いは慢性膵炎の急性病変期には、種々の要因により活性化した膵蛋白分解酵素による膵臓組織の破壊と、活性化した酵素の血中への逸脱による全身の組織、臓器障害など重篤な症状が発現することが知られている。その原因として膵セリンプロテアーゼ、特にキーエンザイムとしてトリプシンの関与が重視されており、近年上記の状態を改善する治療薬として幾つかの合成抗トリプシン剤が開発上市されている。また、紫外線曝露や加齢、種々の炎症刺激などにより、エラスチン破壊酵素であるエラスターゼが過剰発現することによって、エラスチンが変性・破壊されることが、皮膚の弾力性低下につながると考えられており、エラスターゼの働きを抑て、皮膚に弾力やハリを与えるエラスチンの変性・破壊を防止することが皮膚の老化防止に重要である。更に、好中球エラスターゼ阻害剤は、急性動脈炎，肺気腫，動脈硬化，関節リュウマチ，癌の転移・浸潤などの治療薬としての使用が期待されている。
【０００３】
かかるセリンプロテアーゼ阻害剤としては、数多く知られているが、その大部分は活性中心のセリンの水酸基と不可逆的に結合して失活させる不可逆的阻害剤であり、酵素を再生させることが出来ないため副作用が懸念される。一方可逆的な阻害剤としては基質類似のアルデヒド，ケトン，ボロニックアシッド等が知られている。
【０００４】
しかしながら、これまでのセリンプロテアーゼ阻害剤の多くは、可逆的なものであっても、その体内動態，副作用などの問題が解決されていなかったり、作用効果が不十分であったり、安定性が悪かったりして、有効な効果を得るにはかなりの量を含有させなければならないものも存在していた。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
そこで、本発明においては、連用しても副作用などの問題がなく、高い安全性を有するセリンプロテアーゼ阻害剤を提供することを目的とした。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は広く種々の天然物についてセリンプロテアーゼ阻害作用を調べた結果、セージ(Salvia officinalis L.)及びクワ属(Morus)植物の抽出物が、優れたセリンプロテアーゼ阻害作用を有し、しかも内服，外用にかかわらず、副作用の問題がなく、安全性が高いことを見いだし、本発明を完成するに至った。
【０００７】
セージ(Salvia officinalis L.)は、シソ科(Labiatae)アキギリ属(Salvia)の植物の一種で、高さ３０〜７０ｃｍ，全草に白い軟毛が密生する常緑多年草であり、ヨーロッパでは、古くから香草及び民間薬として利用されてきた。このセージ(Salvia officinalis L.)の抽出物の生理作用に関しては、抗菌作用（特開平７−２６７８７３号公報，特開平８−１１９８７２号公報等）、抗酸化作用（特開平３−９９８４号公報）、皮膚過酸化脂質生成抑制作用（特開昭６１−２４５２２号公報）、抗炎症作用（特開平１−８３０２２号公報，特開昭６０−１５６６１８号公報等）、ヒアルロニダーゼ阻害作用（特開平１−１２８９３３号公報）、微生物由来のプロテアーゼ阻害作用（特開平１−１２８９３４号公報）等が開示されている。しかしながら、セージ抽出物が、セリンプロテアーゼ、特にエラスターゼ，トリプシン，キモトリプシン及びプラスミンに対し、高い阻害活性を示すことはこれまで知られていなかった。
【０００８】
クワ属(Morus)属は、クワ科(Moraceae)植物の一種で、果実を食用にすること、また葉を蚕の飼料にするために数種が広く栽培されている。また、クワ属植物の根皮を桑白皮、葉を桑葉、果実を桑たいと呼び、それぞれ生薬として利用されてきた。例えば、桑白皮は、消炎性利尿剤，緩下剤として利用されてきており、その抽出物に対しては、チロシナーゼ阻害作用（特開昭５０−１３５２３６号公報他），微生物由来のプロテアーゼ阻害作用（特開平６−２５０００号公報），抗菌作用（特開平８−１５１３２５号公報他）などが開示されている。桑葉はペントサン，ガラクタン，グルコース，カロチン，タンニンなどを含み、中国で駆風薬として、日本では民間で桑茶として利用されており、桑葉抽出物の抗酸化作用（特開昭６０−４２４８５号公報），活性酸素消去作用（特開平８−１４３４６６号公報）等が開示されている。さらに、桑たい中には、有機酸，粘液質，色素，糖分などを含有し、利尿，鎮咳に効果があるといわれ、生食したり、醸酒用にも利用される。しかしながら、クワ属植物が、セリンプロテアーゼ、特にエラスターゼ，トリプシン，キモトリプシン及びプラスミンに対し、高い阻害活性を示すことはこれまで知られていなかった。
【０００９】
【発明の実施の形態】
【００１０】
本発明においてセージ(Salvia officinalis L.)の抽出物を得る際、抽出に供する部位は特に限定されないが、葉，花及び全草を生のまま若しくは乾燥させて用いることができる。
【００１１】
本発明において用いられるクワ(Morus)属植物としては、クワ（ヤマグワ，ノグワ）(Morus bombycis Koidz. , Morus japonica L.H.Bailey non Sieb. , Morus alba L.var.stylosa Bur.)、マグワ（カラヤマグワ，トウグワ）(Morus alba L. , Morus atropurpure Roxb.)、ロソウ（ログワ，マルバグワ，モチグワ）(Morus multicaulis Perr. , Morus latifolia(Bur.)Poir. , Morus alba L.var.latifolia Bur. , Morus alba L.var.multicaulis Loud.)、オガサワラグワ(Morus boninensis Koidz.)、イチベイ(Morus argutidens Koidz.)、シマグワ(Morus australis Poir. , Morus acidosa Griff)、ハマグワ(Morus bombycis Koidz. var.maritima Koidz.)、ハチジョウグワ(Morus kagayamae Koidz.)、モウコグワ(Morus mongolica(Bur.)Schneid , Morus alba L.var.mongolica Bur.)、クロミグワ(Morus nigra L.)、アカミグワ(Morus rubra L.)、ノグワ（ケグワ）(Morus tiliaefolia Makino)等が例示されるが、特に限定されない。これらのクワ属植物の抽出物を得る際に抽出に供する部位は特に限定されないが、根皮，樹皮，葉，実，花から選択される１種又は２種以上の部位の抽出物を得るのが好ましく、さらには、葉からの抽出物が、セリンプロテアーゼ活性の点から最も好ましい。
【００１２】
本発明において用いられるセージ及びクワ属植物の抽出物を得る際の抽出溶媒としては、精製水、エタノール，メタノール，イソプロパノール，イソブタノール，n-ヘキサノール，メチルアミルアルコール，2-エチルブタノール，n-オクチルアルコールなどのアルコール類、グリセリン，エチレングリコール，エチレングリコールモノメチルエーテル，エチレングリコールモノエチルエーテル，プロピレングリコール，プロピレングリコールモノメチルエーテル，プロピレングリコールモノエチルエーテル，トリエチレングリコール，1,3-ブチレングリコール，ヘキシレングリコール等の多価アルコール又はその誘導体、アセトン，メチルエチルケトン，メチルイソブチルケトン，メチル-n-プロピルケトンなどのケトン類、酢酸エチル，酢酸イソプロピルなどのエステル類、エチルエーテル，イソプロピルエーテル，n-ブチルエーテル等のエーテル類などの極性溶媒から選択される１種又は２種以上の混合溶媒が好適に使用でき、また、リン酸緩衝生理食塩水等の無機塩類を添加した溶媒をも用いることができるが、特に限定はされない。本発明の目的には、セリンプロテアーゼ阻害作用の点から、極性溶媒が好ましく、さらには、メタノール，エタノール，1,3-ブチレングリコール，プロピレングリコール，精製水から選択される１種又は２種以上の混合溶媒、特にエタノール水溶液を溶媒とすることが好ましい。
【００１３】
抽出方法としては、室温，冷却又は加温した状態で浸漬して抽出する方法、水蒸気蒸留等の蒸留法を用いて抽出する方法、生の植物から圧搾して抽出物を得る圧搾法等が例示され、これらの方法を単独で、又は２種以上を組み合わせて抽出を行う。
【００１４】
抽出の際の植物と溶媒との比率は特に限定されるものではないが、植物１に対して溶媒０．５〜１０００重量倍、特に抽出操作、効率の点で０．５〜１００重量倍が好ましい。また、抽出温度は、常圧下で室温から溶剤の沸点以下の範囲とするのが便利であり、抽出時間は抽出温度などによって異なるが、２時間〜２週間の範囲とするのが好ましい。
【００１５】
また、このようにして得られたセージ及びクワ属植物の抽出物は、抽出物をそのまま用いることもできるが、セリンプロテアーゼ阻害作用を失わない範囲内で脱臭，脱色，濃縮等の精製操作を加えたり、さらにはカラムクロマトグラフィー等を用いて分画物として用いてもよい。これらの抽出物や精製物，分画物は、これらから溶媒を除去することによって乾固物とすることもでき、さらにアルコールなどの溶媒に可溶化した形態、或いは乳剤の形態で提供することができる。
【００１６】
本発明のセリンプロテアーゼ阻害剤は、当分野で公知の化合物と混合し、非経口投与，経口投与又は外部投与に適した、医薬品，医薬部外品，化粧品，食品の形で使用することができる。食品においては、油脂製品や乳化製品、清涼飲料等に添加することができる。医薬品では経口剤，外用剤，注射剤，吸入剤，点鼻・点眼剤等に添加することができ、これらの使用方法に応じて、錠剤，液剤，注射剤，軟膏，クリーム，ローション，エアゾール剤，座剤等の所望の剤型にすることができる。また、必要に応じて賦形剤，基剤，乳化剤，安定剤，溶解助剤，矯味剤，保存剤，芳香剤，着色剤，コーティング剤などを適宜配合することができる。医薬部外品・化粧品としては、化粧水，乳液，クリーム等に添加することができ、必要に応じて油分，保湿剤，紫外線吸収剤，水溶性高分子，酸化防止剤，界面活性剤，金属イオン封鎖剤，抗菌防腐剤等が配合できる。
【００１７】
医薬品として利用する場合の植物抽出物の投与量は、使用する植物の種類，抽出溶媒，精製の程度や、患者の年齢，症状等により大きく変動するが、一般には、経口投与の場合、乾燥重量として５〜５００mg/日の範囲である。食品や化粧品に配合する場合は、その効果や添加した際の香り、色調の点から考え、０．００１〜５重量％の濃度範囲とすることが望ましい。
【００１８】
【実施例】
さらに本発明の特徴について、実施例により詳細に説明する。
【００１９】
実施例１〜実施例６
表１に示した植物の各部５００ｇを、５０容量％エタノール水溶液５０００ｍｌに浸漬し、室温で一週間静置することにより抽出した。その後、植物体を濾別除去し、溶媒を減圧留去した後、得られた固形分を５０容量％エタノール水溶液にて再溶解し５０ｍｌとし、実施例１〜６を得た。
【００２０】
【表１】
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【００２１】
実施例のセリンプロテアーゼ阻害作用を、好中球エラスターゼ，トリプシン，α-キモトリプシン，プラスミンを用いて検討した。結果を表２にまとめて示す
。
【００２２】
好中球エラスターゼ活性阻害
実施例１〜実施例６を用いて、好中球エラスターゼ活性阻害率を測定した。好中球エラスターゼ活性は、サクシニル（Ｏ−メチル）−アラニル−アラニル−プロリル−バリル−４−メチル−クマリル−７−アミド（９μＭ濃度，ペプチド化学研究所社製）を基質として、３７℃にて１時間ヒト好中球由来のエラスターゼ（１μg/ml，Ｓｉｇｍａ社製）と反応させた後、分解生成物である7-アミノ-4-メチルクマリンの生成量を、励起波長３５５nm，蛍光波長４６０nmで蛍光強度を測定することにより評価した。実施例をそれぞれ０．１mg/ml添加した場合、及び実施例未添加の場合について酵素活性を測定し、下記の式（１）を用いて好中球エラスターゼ活性阻害率を算出した。
【００２３】
【数１】
0003796340.tif 000003
【００２４】
トリプシン活性阻害
トリプシン活性は、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）０．３mlに、ブタ膵臓由来トリプシン（４０００〜５０００USPunit/mg，和光純薬社製）溶液（４０μg/ml）０．０３mlを添加して３０℃で５分間インキュベートを行い、基質としてＢＡＰＡ（N-α-ベンゾイル-DL-アルギニン-p-ニトロアニリド塩酸塩）０．０２mlを加えて更に３０℃で３０分間インキュベートした後、２０％酢酸溶液を０．３ml添加して反応を停止し、４０５nmの吸光度を測定することにより評価した。実施例をそれぞれ０．１mg/ml添加した場合、及び実施例未添加の場合について酵素活性を測定し、式（２）を用いてトリプシン活性阻害率を算出した。
【００２５】
【数２】
0003796340.tif 000004
【００２６】
α-キモトリプシン活性阻害
α-キモトリプシン活性は、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）０．４mlに、α-キモトリプシンタイプ７溶液（０．６５μg/ml０．１Ｍリン酸緩衝液，Ｓｉｇｍａ社製）０．０５mlを加え、３７℃で５分間インキュベートを行い、基質としてサクシニル−アラニル−アラニル−プロリル−フェニルアラニン−p-ニトロアニリド塩酸塩溶液（３．０ｍＭ  ５０％ＤＭＳＯ溶液）０．０２mlを加えて、更に３７℃で３０分間インキュベートした後、２０％酢酸溶液を０．３ml添加して反応を停止し、４０５nmの吸光度を測定することにより評価した。実施例をそれぞれ０．１mg/ml添加した場合、及び実施例未添加の場合について酵素活性を測定し、式（２）を用いてα-キモトリプシン活性阻害率を算出した。
【００２７】
プラスミン活性阻害
プラスミン活性は、直径９cmのシャーレにプラスミノーゲン除去フィブリノーゲンタイプ２の０．６％水溶液４mlを入れ、ｐＨ７．４の０．１Ｍリン酸緩衝液４mlを加えて攪拌し、トロンビン（１０unit/ml）０．１mlを滴下し、ゆっくりと混和し３０分間静置し、フィブリンゲルを調製した。プラスミン溶液（１０unit/ml）をシャーレのゲル上に添加し、３７℃で２時間インキュベートし、フィブリンゲルの溶解した面積を測定した。実施例をそれぞれ０．１mg/ml添加した場合、及び実施例未添加の場合について酵素活性を測定し、式（３）を用いてプラスミン活性阻害率を算出した。
【００２８】
【数３】
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【００２９】
【表２】
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【００３０】
表２に示した結果より、本発明の実施例１〜６は、好中球エラスターゼ，トリプシン，α-キモトリプシン，プラスミンに対して、危険率１％で有意な活性阻害作用を有することが示された。
【００３１】
続いて、本発明の各実施例について熱及び光に対する安定性を評価した。各実施例を１００℃で１０分間熱処理した場合、及び３カ月間露光保存した場合のそれぞれについて、０．１ｍｇ／ｍｌ添加時の好中球エラスターゼ活性阻害率を測定し、未処理の場合の好中球エラスターゼ活性阻害率と比較して表３に示した。表３より明らかなように、いずれの実施例も熱及び光に対し非常に良好な安定性を示し、１００℃で１０分間の熱処理及び３カ月間の露光保存によっても、好中球エラスターゼ活性阻害作用の低下はほとんど見られなかった。
【００３２】
【表３】
0003796340.tif 000007
【００３３】
また、本発明の各実施例について、培養ヒト線維芽細胞に対する細胞毒性を評価した。ヒト由来線維芽細胞を、１ウェル当たり２．０×１０4個となるように９６穴マイクロプレートに播種し、２４時間後に、実施例のそれぞれを１．０ｍｇ／ｍｌ含有する１．０容量％牛胎仔血清添加ダルベッコ修正基礎栄養培地培地にて３７℃で２４時間さらに培養して、生細胞数を計測して細胞生存率を求め、５０％致死濃度（ＬＤ50）を算出した。その結果、表３に示すように、いずれの実施例においてもＬＤ50は１００．０ｍｇ／ｍｌ以上であり、試験した濃度では細胞毒性は認められなかった。
【００３４】
【発明の効果】
以上詳述したように、セージ(Salvia officinalis L.)及びクワ属(Morus)植物の抽出物を含有する本発明のセリンプロテアーゼ阻害剤は、エラスターゼ，トリプシン，キモトリプシン，プラスミン等のセリンプロテアーゼ阻害に対し優れた作用を示し、本発明にかかるセリンプロテアーゼ阻害剤は、膵炎治療剤，急性動脈炎，肺気腫，動脈硬化，関節リュウマチ，癌の転移・浸潤等の治療剤として、また、皮膚のはり・弾力を回復維持することで皮膚の老化を防止し、若々しい肌の状態を維持する効果が期待される。