(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ビリルビンオキシダーゼ含有液に、一般式(１):
【化１】
0003863231.tif 000008
［式中、Ｒ1とＲ2は共に水素原子であるか、または一緒になって、低級アルキル基で置換されていてもよいベンゼン環を形成する。Ｒ3は水素原子または低級アルキル基である］；
一般式(２)
【化２】
0003863231.tif 000009
［式中、Ｒ4およびＲ5のいずれか一方は水素原子または低級アルキル基であり、他方はそれが結合する窒素原子と隣接する５位の炭素原子との間で二重結合を形成する］；または
一般式(３)：
【化３】
：
0003863231.tif 000010
［式中、Ｒ6は水素原子または低級アルキル基である］
で示される含窒素複素環化合物のメルカプト誘導体の一種または二種以上を配合することを特徴とするビリルビンオキシダーゼの安定化方法。
【請求項２】
含窒素複素環化合物のメルカプト誘導体が２−メルカプト−１−メチルイミダゾール、３−メルカプト−１，２，４−トリアゾール、６−メルカプトプリン、３−メルカプト−４−メチル−４Ｈ−１，２，４−トリアゾール、および、２−メルカプトベンズイミダゾールである請求項１記載のビリルビンオキシダーゼの安定化方法。
【請求項３】
ビリルビンオキシダーゼ含有液に緩衝剤を添加し、ｐＨ７.０から１２.０の間の緩衝能下に保存することを特徴とする請求項１および２記載のビリルビンオキシダーゼの安定化方法。
【請求項４】
緩衝剤としてＮ，Ｎ−ビス(２−ヒドロキシエチル）グリシン、２−(エチルアミノ）エタノール、ジエタノールアミン、または、ホウ酸緩衝剤を用いることを特徴とする請求項３記載のビリルビンオキシダーゼの安定化方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ビリルビンオキシダーゼの安定化方法、さらに詳しくは、ビリルビンオキシダーゼを液状で保存する場合において、ビリルビンオキシダーゼの酵素活性を長期間安定に保持することのできる安定化方法および該方法を適用したビリルビンオキシダーゼ試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ビリルビンオキシダーゼは、ビリルビンをビリベルジンに酸化させる反応を触媒する酵素であり、臨床検査上、生体中のビリルビンの光学的測定法および測定試薬に用いられる。
ビリルビンオキシダーゼを用いてビリルビンを測定する試薬(本明細書においては、ビリルビンオキシダーゼ試薬と称する）としては総ビリルビン測定用試薬および直接ビリルビン測定用試薬とが挙げられ、ビリルビンオキシダーゼはその凍結乾燥品のごとき粉末を緩衝液に溶解ないしは分散し、水性液状にして使用される。
総ビリルビン測定用試薬には、ｐＨ６.０〜９.０の範囲の緩衝液、例えば、Ｎ−(２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸(略称ＡＣＥＳ）緩衝液などのグッド緩衝液、またはリン酸緩衝液が用いられ、反応促進のために、コール酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム(略称ＳＤＳ）などの直接化剤を該緩衝液に添加するのが好ましい。
【０００３】
直接ビリルビン測定用試薬には、ｐＨ３.０〜４.５の範囲の緩衝液、例えば、乳酸−乳酸ナトリウム緩衝液、クエン酸緩衝液などが用いられる。
ビリルビンオキシダーゼとしては、例えば、ミロセシウム属由来ビリルビンオキシダーゼ、エビタケ(Trachydermatsumodae）の産生するビリルビンオキシダーゼ等多くのものが知られており、その使用量は所望の酵素活性を示す範囲で適宣用いられるが、通常、反応液中に０.０４〜１０単位／ml、好ましくは、総ビリルビン測定用には０.０８〜４単位／ml、直接ビリルビン測定用には、０.４〜８単位／mlの範囲で用いられる。
ところが、ビリルビンオキシダーゼは、液状で非常に不安定で、低温においてもpH９.２〜９.７の０.１Ｍリン酸緩衝液中で９６時間安定であるに過ぎず［アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー(Agric.Biol.Chem.)、第４６巻第８号、２０３１〜２０３４頁、１９８２年］、また、常温(２５℃）において本酵素の安定ｐＨで保存する場合であっても、１４日間後には、１０.５％の残存活性しか示さない。
【０００４】
一般に、ビリルビンオキシダーゼ試薬は凍結乾燥品のごとき粉末で市販されているが、この場合、用時、必要量を液状に調製しなければならず、手間がかかるほか、一旦調製すると短期間のうちに使用しなければならない。一方、ビリルビンオキシダーゼ試薬が液状で入手できれば、ビリルビンの測定操作を簡便に行うことができるが、そのためにはビリルビンオキシダーゼが液状で長期間安定であることが必要である。
従来、ビリルビンオキシダーゼを液状で安定化する方法として、ｐＨ８以上、好ましくはｐＨ８〜１０のアルカリ性緩衝液で、例えばジエチルバルビツール酸ナトリウム・塩酸緩衝液、トリスヒドロキシアミノメタン・塩酸緩衝液など、または、これらの緩衝液に乳糖アラニン、グリシン、牛アルブミン、シクロデキストリン等の安定化剤、窒化ソーダ等を適宣添加配合した溶液で保存する方法(特開昭60-151561）、ｐＨ７〜９付近のリン酸緩衝液、トリス・塩酸塩緩衝液、ジメチルグルタル酸−ＮａＯＨ緩衝液で保存する方法(特開昭61-209587）、そしてｐＨ５〜１０.５の０.１Ｍリン酸緩衝液で保存する方法(特公昭62-33880）等が知られている。しかし、これらの方法を用いてもビリルビンオキシダーゼの活性を長期間保持することは困難である。
【０００５】
また、ビリルビンオキシダーゼの活性を安定化する他の方法として、アスパラギン酸および／又はトリプトファンを添加する方法(特開平６−２８４８８６）があり、これらの安定化剤の中で、トリプトファンに安定化効果があるが、ビリルビンオキシダーゼ含有試液にトリプトファンを添加した場合、保存中に徐々に茶色に着色してしまい、吸光度変化を測定するビリルビン測定用試薬には不向きである。
最近、ビリルビンオキシダーゼの活性を長期間安定に保持する方法として、ハロゲン化物によるビリルビンオキシダーゼの安定化方法(特開平７−２０３９６２）および、Ｎ，Ｎ−ビス(２−ヒドロキシエチル）グリシン等の緩衝剤と酒石酸ナトリウムカリウム等のカルボン酸類によるビリルビンオキシダーゼの安定化方法(特開平８−６６１９６）等が公開された。これらの安定化方法を用いれば、冷蔵(７℃）で一年間保存後でも約５０％の残存活性を保持することができるが、さらなる長期安定化が望まれていた。
【０００６】
【本発明が解決しようとする課題】
かかる事情に鑑み、本発明は、不安定なビリルビンオキシダーゼを水性液状で長期間安定に保存する方法、および、該方法を適用した安定なビリルビンオキシダーゼ試薬を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、意外にも、一般式(１):
【化４】
0003863231.tif 000002
［式中、Ｒ1とＲ2は共に水素原子であるか、または一緒になって、低級アルキル基で置換されていてもよいベンゼン環を形成する。Ｒ3は水素原子または低級アルキル基である］；
一般式(２)
【化５】
0003863231.tif 000003
［式中、Ｒ4およびＲ5のいずれか一方は水素原子または低級アルキル基であり、他方はそれが結合する窒素原子と隣接する５位の炭素原子との間で二重結合を形成する］；または
一般式(３)：
【化６】
：
0003863231.tif 000004
［式中、Ｒ6は水素原子または低級アルキル基である］
で示される含窒素複素環化合物のメルカプト誘導体の一種または二種以上を液状のビリルビンオキシダーゼ試薬に添加することにより、ビリルビンオキシダーゼの安定性が飛躍的に向上することを見いだし、本発明を完成するに至った。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明は、ビリルビンオキシダーゼ含有液に前記一般式(１)、(２)または(３)で示される含窒素複素環化合物のメルカプト誘導体の一種または二種以上を配合することを特徴とするビリルビンオキシダーゼの安定化方法、およびそのように調製される安定なビリルビンオキシダーゼ試薬を提供するものである。
本発明の好ましい態様においては、ビリルビンオキシダーゼ含有液に緩衝剤を添加し、ｐＨ７．０〜１２．０の間に緩衝能をもたせ、これに前記一般式(１)、(２)または(３)で示される含窒素複素環化合物のメルカプト誘導体の一種または二種以上を配合することを特徴とするビリルビンオキシダーゼの安定化方法、およびそのように調製される安定なビリルビンオキシダーゼ試薬を提供するものである。
本発明で用いられる含窒素複素環化合物のメルカプト誘導体の具体例としては、２−メルカプト−１−メチルイミダゾール、３−メルカプト−１，２，４−トリアゾール、６−メルカプトプリン、３−メルカプト−４−メチル−４Ｈ−１，２，４−トリアゾール、および、２−メルカプトベンズイミダゾール等が挙げられ、好ましくは２−メルカプト−１−メチルイミダゾールおよび３−メルカプト−１，２，４−トリアゾールである。
【０００９】
含窒素複素環化合物のメルカプト誘導体の添加量は、十分な安定化効果が得られる量であれば特に限定するものではなく、一般に用時のビリルビンオキシダーゼ水性液中の最終濃度が５ｍＭ以上であれば所望の安定化効果が得られ、通常、最終濃度として５ｍＭ〜７５０ｍＭ、好ましくは、１０ｍＭ〜５００ｍＭ、さらに好ましくは１５ｍＭ〜２５０ｍＭである。また、これら含窒素複素環化合物のメルカプト誘導体は必要に応じてそのアルカリ金属塩や塩酸塩などの形態で用いてもよい。
本発明で用いられる上記の緩衝剤は、ビリルビンオキシダーゼの安定なｐＨ域(ｐＨ７．０〜１２．０）において緩衝能を有するものに限られない。またこれらは単独で、または２種以上を組み合わせて用いることができる。好ましい緩衝剤は、２−モルホリノエタンスルホン酸一水和物(略号ＭＥＳ）、ビス(２−ヒドロキシエチル）イミノトリス(ヒドロキシメチル）メタン(略号Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ）、Ｎ−(２−アセトアミド）イミノ二酢酸(略号ＡＤＡ）、ピペラジン−１，４−ビス(２−エタンスルホン酸）(略号ＰＩＰＥＳ）、Ｎ−(２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸(略号ＡＣＥＳ）、２−ヒドロキシ−３−モルホリノプロパンスルホン酸(略号ＭＯＰＳＯ）、Ｎ，Ｎ−ビス(２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸(略号ＢＥＳ）、３−モルホリノプロパンスルホン酸(略号ＭＯＰＳ）、Ｎ−トリス(ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸(略号ＴＥＳ）、２−［４−(２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジン］エタンスルホン酸(略号ＨＥＰＥＳ）、ピペラジン−１，４−ビス(２−ヒドロキシ−３−プロパンスルホン酸）二水和物(ＰＩＰＳＯ）、３−［Ｎ，Ｎ−ビス(２−ヒドロキシエチル）アミノ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸(略号ＤＩＰＳＯ）、２−ヒドロキシ−Ｎ−トリス(ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸(略号ＴＡＰＳＯ）、２−ヒドロキシ−３−［４−(２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジン］プロパンスルホン酸一水和物(略号ＨＥＰＰＳＯ）、３−［４−(２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジン］プロパンスルホン酸(略号ＥＰＰＳ）、Ｎ−［トリス(ヒドロキシメチル）メチル］グリシン(略号Ｔｒｉｃｉｎｅ）、Ｎ，Ｎ−ビス(２−ヒドロキシエチル）グリシン(略号Ｂｉｃｉｎｅ）、Ｎ−トリス(ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸(略号ＴＡＰＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−２−アミノエタンスルホン酸(略号ＣＨＥＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−２−ヒドロキシ−３−アミノプロパンスルホン酸(略号ＣＡＰＳＯ）、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸(略号ＣＡＰＳ）、２−(エチルアミノ）エタノール(略号ＥＡＥ）、ジエタノールアミン(略号ＤＥＡ）、トリス(ヒドロキシメチル）アミノメタン(略号Ｔｒｉｓ）、トリス(ヒドロキシメチル）アミノメタンマレイン酸塩(略号Ｔｒｉｓ−マレイン酸）、グリシンアミド、グリシルグリシン、グリシン、ホウ酸緩衝剤[ホウ酸(Ｈ3ＢＯ4)および四ホウ酸ナトリウム(Ｎａ2Ｂ4Ｏ7)]、または、リン酸緩衝剤[リン酸水素二ナトリム(Ｎａ2ＨＰＯ4)およびリン酸二水素ナトリム(ＮａＨ2ＰＯ4)]であり、さらに好ましくは、Ｎ，Ｎ−ビス(２−ヒドロキシエチル）グリシン(Ｂｉｃｉｎｅ)、Ｎ−トリス(ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸(ＴＡＰＳ)、Ｎ−シクロヘキシル−２−アミノエタンスルホン酸(ＣＨＥＳ)、Ｎ−シクロヘキシル−２−ヒドロキシ−３−アミノプロパンスルホン酸(ＣＡＰＳＯ)、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸(ＣＡＰＳ)、２−(エチルアミノ）エタノール(ＥＡＥ)、ジエタノールアミン(ＤＥＡ)、または、ホウ酸緩衝剤であり、特に好ましくはＮ，Ｎ−ビス(２−ヒドロキシエチル）グリシン(Ｂｉｃｉ��ｅ)およびホウ酸緩衝剤である。緩衝剤の添加量は、十分に安定化効果が得られる量であれば特に限定するものではなく、一般に用時のビリルビンオキシダーゼ含有液中の最終濃度が１０ｍＭ以上であれば、所望の安定化効果が得られ、通常、最終濃度として１０ｍＭ〜１Ｍ、好ましくは、１０ｍＭ〜１００ｍＭとする。
【００１０】
これら含窒素複素環化合物のメルカプト誘導体の一種または二種以上と緩衝剤の一種または二種以上との組み合わせのうち、好ましい組み合わせは、２−メルカプト−１−メチルイミダゾール、３−メルカプト−１，２，４−トリアゾール、６−メルカプトプリン、３−メルカプト−４−メチル−４Ｈ−１，２，４−トリアゾール、および、２−メルカプトベンズイミダゾールから選ばれる一種または二種以上とＮ,Ｎ−ビス(２−ヒドロキシエチル）グリシン(Ｂｉｃｉｎｅ)、Ｎ−シクロヘキシル−２−ヒドロキシ−３−アミノプロパンスルホン酸(ＣＡＰＳＯ)、２−(エチルアミノ）エタノール(ＥＡＥ)、ジエタノールアミン(ＤＥＡ)、およびホウ酸緩衝剤から選ばれる一種または二種以上の組み合わせであり、さらに好ましくは、２−メルカプト−１−メチルイミダゾール、３−メルカプト−１，２，４−トリアゾール、６−メルカプトプリン、３−メルカプト−４−メチル−４Ｈ−１，２，４−トリアゾール、および、２−メルカプトベンズイミダゾールから選ばれる一種または二種以上とＮ,Ｎ−ビス(２−ヒドロキシエチル）グリシン(Ｂｉｃｉｎｅ)およびホウ酸緩衝剤から選ばれる一種または二種の組み合わせで、最も好ましい組み合わせは２−メルカプト−１−メチルイミダゾールと３−メルカプト−１，２，４−トリアゾールから選ばれる一種または二種とＮ，Ｎ−ビス(２−ヒドロキシエチル）グリシン(Ｂｉｃｉｎｅ)およびホウ酸緩衝剤から選ばれる一種または二種の組み合わせである。
【００１１】
これらの含窒素複素環化合物のメルカプト誘導体と緩衝剤との組み合わせによるビリルビンオキシダーゼの安定化効果は、さらにカルボン酸類の一種または二種以上を組み合わせた場合において著しく安定性が向上する。これら含窒素複素環化合物のメルカプト誘導体と緩衝剤に組み合わせるカルボン酸としては、酒石酸、酒石酸ナトリウム、酒石酸カリウム、酒石酸水素カリウム、酒石酸ナトリウムカリウム、クエン酸ナトリウムが好ましく、酒石酸ナトリウムカリウムが特に好ましい。
ビリルビンオキシダーゼとしては公知の酵素がいずれも用いられ、例えば、ミロセシウム(Myrothecium)属菌、例えばミロセシウム・ベルカリア(Myrothecium verrucaria)由来ビリルビンオキシダーゼ、エビタケ(Trachydermatsumodae）の産生するビリルビンオキシダーゼ、ペニシリウム・ジャンシネラム(Penicillium janthinellum)由来ビリルビンオキシダーゼ、バチルス・リヒェニフォルミス(Bacillus licheniformis)由来ビリルビンオキシダーゼ、アガリカス・ビスポラス(Agaricus bisporus)菌茸由来ビリルビンオキシダーゼ等が挙げられる。ビリルビンオキシダーゼの使用量は所望の酵素活性を示す範囲で適宣用いられるが、  通常、反応液中に０.０４〜１０単位／ml、好ましくは、総ビリルビン測定用には０.０８〜４単位／ml、直接ビリルビン測定用には、０.４〜８単位／mlの範囲で用いられる。
【００１２】
本発明によるビリルビンオキシダーゼの安定化には、上記のように調製される緩衝剤と、含窒素複素環化合物のメルカプト誘導体の１種または２種以上を配合したビリルビンオキシダーゼ含有液のｐＨ値を、通常、ｐＨ７．０〜１２．０、好ましくはｐＨ８．０〜１１．０、さらに好ましくはｐＨ９．０〜１１．０とする。
上記ビリルビンオキシダーゼ試薬には、必要により、通常の緩衝剤や防腐剤等の他の成分を添加してもよい。また、含窒素複素環化合物のメルカプト誘導体を用いてビリルビンオキシダーゼを安定化する際に、ジチオスレイトール、Ｌ−システイン、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン、メチオニン、メルカプトエタノール等のメルカプト基を有する化合物やヒスチジン等の還元剤を一緒に添加しておけば、ビリルビンオキシダーゼの安定化効果はさらに良くなる。
【００１３】
本発明により、ビリルビンオキシダーゼを安定化するには、ビリルビンオキシダーゼ含有液に、前記緩衝剤の一種または二種以上と含窒素複素環化合物のメルカプト誘導体の一種または二種以上との組み合わせで添加することにより達成され、また、この組み合わせにカルボン酸類の一種または二種以上を添加することにより、さらに安定性が良くなる。実際上は、緩衝剤を常法に従って、通常のｐＨ調整剤、例えば塩酸、硫酸、乳酸、酢酸などの無機酸または有機酸、あるいは水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、などの無機塩基または有機塩基を用いて適当なｐＨ領域を有する緩衝液を調製し、これにビリルビンオキシダーゼを分散または溶解させ、その前後に含窒素複素環化合物のメルカプト誘導体の一種または二種以上を添加する方法により行われる。
【００１４】
本発明のビリルビンオキシダーゼ試薬は、液状でも、または、粉末などの固形状であってもよい。液状の試薬の調製は、上述したように、ｐＨ７．０〜１２．０の間に緩衝能をもったビリルビンオキシダーゼ含有液に５ｍＭ以上の含窒素複素環化合物のメルカプト誘導体の一種または二種以上を配合することにより行われる。
固形状の試薬の調製は、上記の緩衝剤の一種または二種以上と含窒素複素環化合物のメルカプト誘導体の一種または二種以上を配合したビリルビンオキシダーゼ含有液を凍結乾燥してもよく、また、粉末状のビリルビンオキシダーゼに、前記緩衝剤の一種または二種以上と含窒素複素環化合物のメルカプト誘導体の一種または二種以上とを、それぞれ、液状にした際の濃度が１０ｍＭ以上および５ｍＭ以上となるように配合することにより行われる。
【００１５】
本発明のビリルビンオキシダーゼ試薬はキットの形態にすることもでき、例えば、粉末状のビリルビンオキシダーゼと、含窒素複素環化合物のメルカプト誘導体の一種または二種以上と緩衝剤との固形状混合物とそれを溶解するための緩衝液との組み合わせ、あるいは粉末状ビリルビンオキシダーゼと緩衝剤との固形状混合物または凍結乾燥品とそれを溶解するための含窒素複素環化合物のメルカプト誘導体の一種または二種以上を含有する緩衝液との組み合わせ等があり、それらは用時混合して用いられる。
本発明の方法および試薬は、ビリルビンオキシダーゼを液状で極めて安定に保存でき、ビリルビンオキシダーゼを用いる測定法、例えば、総ビリルビン測定、直接ビリルビン測定に有効に使用できる。
【００１６】
【実施例】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。実施例におけるビリルビンオキシダーゼの残存活性は、つぎのようにして測定した。
活性測定用試薬
試料    ：ビリルビンオキシダーゼ(ミロセシウム属由来）
第１試液：５０ｍＭ  リン酸緩衝液  ｐＨ７.２
１％  コール酸ナトリウム
第２試液：ビリルビンの管理血清  ５ｍｇ／ｄｌ
[市販の管理血清(ネスコール(日本商事(株)製))に、ビリル    ビン(ＩＣＮ社製)を５ｍｇ／ｄｌとなるように添加したもの]
活性測定法
０.０２単位／ｍｌ以下となるように調製したビリルビンオキシダーゼ溶液２μｌに第１試液２７０μｌを添加し、３７℃で５分間インキュベートした後、第２試液９０μｌを加えて３分後から５分後までの４５０ｎｍにおける吸光度変化を測定し、１分間あたりの吸光度変化の量で活性を示した。酵素１単位(Ｕ）は、本条件下、１分間に１μｍｏｌｅのアルブミン結合ビリルビンを酸化するのに必要な酵素量と定義される。
【００１７】
実施例１
２−メルカプト−１−メチルイミダゾールによるビリルビンオキシダーゼの長期安定化効果
基本処方として、２５ｍＭビシン緩衝液に酒石酸ナトリウムカリウム２５ｍＭを添加した処方に、ビリルビンオキシダーゼ４Ｕ／ｍｌを添加し、ｐＨ１０.０に調整した処方を用いた。
この基本処方に２−メルカプト−１−メチルイミダゾール(以下ＭＭＩと称す）２５ｍＭを含有するように調製した酵素液(ｐＨ１０．０）を７℃で保存し、８ヶ月後と１１ヶ月後の残存活性を上記測定方法により測定し基本処方と比較した。その結果を表１に示す。
【表１】
0003863231.tif 000005
表１より、従来技術をもちいた基本処方では７℃１１ヶ月保存後で４２．３％の残存活性しか残すことができないが、２−メルカプト−１−メチルイミダゾールを添加した場合、７℃保存１１ヶ月後でも８４．８％の残存活性を保っていることがわかる。
【００１８】
実施例２
各種含窒素複素環化合物のメルカプト誘導体によるビリルビンオキシダーゼの安定化効果
１００ｍＭホウ酸緩衝液にビリルビンオキシダーゼ２Ｕ／ｍｌ、および下記表２に示す物質２５ｍＭを含有するように調製した酵素液(ｐＨ１０．０）を苛酷な条件(３０℃）で保存し、６日後の残存活性を上記測定方法により測定し基本処方と比較した。その結果を表２に示す。
【表２】
0003863231.tif 000006
表２に示すごとく、２−メルカプト−１−メチルイミダゾール、３−メルカプト−１，２，４−トリアゾール、６−メルカプトプリン、３−メルカプト−４−メチル−４Ｈ−１，２，４−トリアゾール、および、２−メルカプトベンズイミダゾールで安定化の効果が大きいことが認められた。特に２−メルカプト−１−メチルイミダゾールの効果が顕著であった。
【００１９】
実施例３
２−メルカプト−１−メチルイミダゾールの添加濃度と安定化効果との関係
１００ｍＭホウ酸緩衝液にビリルビンオキシダーゼ２Ｕ／ｍｌを含有するように調製した酵素液(ｐＨ１０．０）に種々の濃度の２−メルカプト−１−メチルイミダゾールを添加し３０℃で保存し、５日後の残存活性を上記測定方法により測定し比較した。その結果を表３に示す。
【表３】
0003863231.tif 000007
表３より、２−メルカプト−１−メチルイミダゾールは５ｍＭ〜７５０ｍＭの間で安定化効果を示すことがわかった。また７５０ｍＭ以上添加すると安定化効果は弱くなることがわかった。
【００２０】
実施例４
２−メルカプト−１−メチルイミダゾール添加処方と無添加処方との比較
２−メルカプト−１−メチルイミダゾールを添加した処方と２−メルカプト−１−メチルイミダゾール無添加の処方とを総ビリルビン測定用試薬および直接ビリルビン測定用試薬に適用した調製時の試薬で相関関係を調べた。総ビリルビン測定用試薬に適用した場合の結果を図１に、また、直接ビリルビン測定用試薬に適用した場合の結果を図２に示す。総ビリルビン測定用試薬および直接ビリルビン測定用試薬としてはＶＬ  Ｔ−ＢＩＬおよびＶＬ  Ｄ−ＢＩＬ(日本商事(株）製）を用いた。
図１および図２より、２−メルカプト−１−メチルイミダゾールを添加した処方でも、無添加のものと変わらない性能を示し、これら安定化剤の添加によってもビリルビン測定性能が影響されないことがわかった。
【００２１】
実施例５
７℃で１年間保存した試薬と調製時の試薬との比較
２−メルカプト−１−メチルイミダゾールを添加し、７℃で１年間保存した試薬を用いて、調製時の試薬との相関関係を調べた。その結果を図３に示す。
図３より、７℃で１年間経過しても調製時と変わらない性能を示すことがわかった。
【００２２】
【発明の効果】
本発明によれば、ｐＨ７．０〜１２．０の間に緩衝能をもたせたビリルビンオキシダーゼ含有液に前記一般式(１)、(２)または(３)で示される含窒素複素環化合物のメルカプト誘導体の一種または二種以上を添加するという非常に簡単で、経済的な方法により、ビリルビンオキシダーゼを液状で長期間安定化させることができ、ビリルビンの測定毎に新たにビリルビンオキシダーゼ試薬を調製する必要がなく、一度調製したビリルビンオキシダーゼ試薬を長期間に亙って使用することができ、あるいはまた、入手されるビリルビンオキシダーゼ試薬溶液をそのまま測定に使用できるため所望の総ビリルビンおよび直接ビリルビンの測定がきわめて簡便にかつ容易に行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  総ビリルビン測定用試薬に適用した場合のＭＭＩ添加処方と無添加処方との相関関係を示すグラフである。
【図２】  直接ビリルビン測定用試薬に適用した場合のＭＭＩ添加処方と無添加処方との相関関係を示すグラフである。
【図３】  総ビリルビン測定用試薬に適用した場合のＭＭＩ添加処方における、調製時と７℃１年保存後との相関関係を示すグラフである。
【図１】
0003863231.tif 000011
【図２】
0003863231.tif 000012
【図３】
0003863231.tif 000013