(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ハイブリドーマ１Ａ７（ＡＴＣＣ受託番号第ＨＢ−１１７８６号）によって生成される、モノクローナル抗体１Ａ７。
【請求項２】
ＡＴＣＣ受託番号第ＨＢ−１１７８６号で寄託された、抗体産生細胞およびモノクローナル抗体１Ａ７を生成するその子孫。
【請求項３】
薬学的に受容可能な賦形剤中に、請求項１に記載のモノクローナル抗体１Ａ７を含有する、薬学的組成物。
【請求項４】
請求項１に記載のモノクローナル抗体１Ａ７および薬学的に受容可能な賦形剤を含有する、ワクチン。
【請求項５】
アジュバントを含む、請求項４に記載のワクチン。
【請求項６】
個体における免疫応答を誘発するための組成物であって、有効量の請求項１に記載のモノクローナル抗体１Ａ７を含む、組成物。
【請求項７】
個体においてＧＤ２関連疾患を処置するための組成物であって、有効量の請求項１に記載のモノクローナル抗体１Ａ７を含む、組成物。
【請求項８】
前記ＧＤ２関連疾患が、メラノーマ、神経芽細胞腫、神経膠腫、柔組織肉腫、および小細胞ガンからなる群より選択される、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記個体が臨床的に検出可能な腫瘍を有する、請求項７または８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記組成物が、前記ＧＤ２関連疾患を緩和するための組成物である、請求項７〜９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記個体内で以前に検出された腫瘍が、処置されており、そしてモノクローナル抗体１Ａ７の投与時に臨床的に検出不可能である、請求項７または８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記組成物が、臨床的に検出可能な腫瘍の再発の危険性を減少させるための組成物である、請求項７、８または１１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１３】
請求項２に記載のハイブリドーマまたはその子孫により生成される、モノクローナル抗体。
【請求項１４】
請求項２に記載のハイブリドーマまたはその子孫から精製された、モノクローナル抗体。
【請求項１５】
前記抗体が検出可能な標識をさらに含む、請求項１、１３、または１４のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１６】
前記検出可能な標識が、放射性標識、蛍光標識および化学発光標識からなる群より選択される、請求項１５に記載の抗体。
【請求項１７】
ヒトにおける抗ＧＤ２免疫学的応答を誘発するに効率的な、ＡＴＣＣ受託番号第ＨＢ−１１７８６号で寄託されたハイブリドーマにより生成されるモノクローナル抗体１Ａ７であって、該モノクローナル抗体１Ａ７は、配列番号２および配列番号４それぞれに含まれる軽鎖可変領域配列および重鎖可変領域配列を有する、モノクローナル抗体１Ａ７。
【請求項１８】
ヒトにおける抗ＧＤ２免疫学的応答を誘発するに効率的な、ＡＴＣＣ登録番号ＨＢ−１１７８６で寄託された抗体生成細胞またはモノクローナル抗体１Ａ７を生成するその子孫から精製した抗体。
【請求項１９】
配列番号２および配列番号４それぞれに含まれる軽鎖可変領域配列および重鎖可変領域配列を含む抗体。
【請求項２０】
腫瘍細胞に結合する抗ＧＤ２抗体の存在を検出するための方法であって、請求項１または１３〜１９のいずれか１項に記載の抗体が抗ＧＤ２抗体に結合し得る条件下で、該腫瘍細胞を該抗体と接触させる工程、および結合した抗体を検出する工程を包含する、方法。
【請求項２１】
サンプル中の抗ＧＤ２抗体を検出または定量するためのキットであって、適切なパッケージング中に請求項１または１３〜１９のいずれか１項に記載の抗体を含有する、キット。
【請求項２２】
サンプル中の抗ＧＤ２抗体を検出するための方法であって、以下の工程を包含する方法：
ａ）該サンプル中の抗体を、安定な複合体を形成し得る条件下で、請求項１または１３〜１９のいずれか１項に記載の抗体と接触させる工程；および
ｂ）工程ａ）で形成された任意の安定な複合体を検出する工程。
【請求項２３】
キットであって、以下：
（ａ）適切な容器中の請求項１または１３〜１９のいずれか１項に記載の抗体；および
（ｂ）投与経路を示す説明書
を含む、キット。
【請求項２４】
前記抗体が抗ＧＤ２を結合し得る、請求項２３に記載のキット。
【請求項２５】
検出可能な標識で標識されている抗免疫グロブリン試薬をさらに含む、請求項２３または請求項２４に記載のキット。
【請求項２６】
モノクローナル抗体１Ａ７を調製する方法であって、該方法は、請求項２に記載のハイブリドーマまたはその子孫に由来する抗体を精製する工程を包含する、方法。
【請求項２７】
モノクローナル抗体１Ａ７を調製する方法であって，該方法は，請求項２に記載の子孫のハイブリドーマを増殖する工程を包含する、方法。
【請求項２８】
生物学的サンプル中の抗ＧＤ２抗体を検出するための方法であって、該方法は以下：
（ａ）請求項２１に記載のキットを提供する工程；および
（ｂ）前記容器中に提供された抗体と、該生物学的サンプル中の任意の抗ＧＤ２抗体とを接触させる工程
を包含する、方法。
【請求項２９】
前記生物学的サンプルが、ＧＤ２抗原関連癌を有すると疑われる個体から得られる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記サンプルが、黒色腫、神経芽腫、神経膠腫、肉腫、および小細胞癌からなる群より選択される癌を有すると疑われる個体から得られる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記生物学的サンプルが、請求項１または１３〜１９のいずれか１項に記載の抗体で処置された個体から得られる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
個体における抗ＧＤ２免疫学的応答を誘発するための、請求項１または１３〜１９のいずれか１項に記載の抗体を含む、薬学的組成物。
【請求項３３】
請求項３２に記載の組成物であって、前記個体がヒトである、組成物。
【請求項３４】
請求項３２または請求項３３に記載の組成物であって、前記免疫学的応答が抗ＧＤ２抗体の産生を含む、組成物。
【請求項３５】
請求項３２または請求項３３に記載の組成物であって、前記免疫学的応答がＧＤ２特異的Ｔ細胞の産生を含む、組成物。
【請求項３６】
アジュバントを含む、請求項３２から３５に記載の組成物。
【請求項３７】
請求項３６に記載の組成物であって、前記アジュバンドがＱＳ−２１である、組成物。
【請求項３８】
サンプル中の抗ＧＤ２抗体を決定するための方法であって、該方法は、以下の工程：
ａ）請求項２３〜２５のいずれか１項に記載のキットを提供する工程
ｂ）該サンプル中の抗体と、該キットの抗体とを、安定な複合体の形成を可能にする条件下で接触させる工程；
ｃ）もし存在すれば、工程ａ）において形成された該安定な複合体を検出する工程；および
ｄ）工程ｂ）において検出された安定な複合体の非存在、存在または量と、該サンプル中の抗ＧＤ２抗体の非存在、存在または量とを相関させる工程、
を包含する、方法。
【請求項３９】
サンプルから抗ＧＤ２抗体を精製するための方法であって、該方法は、以下の工程：
ａ）請求項２３〜２５のいずれか１項に記載のキットを提供する工程
ｂ）抗ＧＤ２抗体と該キットの抗体との間で複合体を形成して、複合体を形成する工程
ｃ）該サンプルの他の成分から該複合体を分離する工程；および
ｄ）該複合体から該抗ＧＤ２抗体を回収する工程、
を包含する、方法。
【請求項４０】
前記サンプルが、ＧＤ２抗原関連癌を有すると疑われる個体から得られる、請求項３８または請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記サンプルが、黒色腫、神経芽腫、神経膠腫、肉腫、および小細胞癌からなる群より選択される癌を有すると疑われる個体から得られる、請求項３８または請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
前記サンプルが、請求項１または１３〜１９のいずれか１項に記載の抗体により処置された個体から得られる、請求項３８または請求項３９に記載の方法。
【請求項４３】
滅菌されている、請求項３または請求項３２〜３７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４４】
個体におけるＧＤ２関連腫瘍の再発を遅延させるための組成物であって、該組成物が、請求項１または１３〜１９のいずれか１項に記載の抗体の有効量を含む、組成物。
【請求項４５】
個体におけるＧＤ２関連腫瘍の発症を遅延させるための組成物であって、該組成物が、請求項１または１３〜１９のいずれか１項に記載の抗体の有効量を含む、組成物。
【請求項４６】
ＧＤ２関連腫瘍を有する個体を処置するための組成物であって、該組成物が、請求項１または１３〜１９のいずれか１項に記載の抗体の有効量を含む、組成物。
【請求項４７】
ＧＤ２関連腫瘍を有する個体において抗ＧＤ２免疫学的応答を誘発するための組成物であって、該組成物が、請求項１または１３〜１９のいずれか１項に記載の抗体の有効量を含む、組成物。
【請求項４８】
前記ＧＤ２関連腫瘍が、黒色腫である、請求項４４から請求項４７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４９】
前記組成物が、アジュバンドを含む、請求項４４から請求項４８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５０】
前記アジュバンドが、水酸化アルミニウムである、請求項４９に記載の組成物。
【請求項５１】
前記組成物が、１ｍｇ〜４ｍｇの量の抗体を含む、請求項４４から請求項５０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５２】
前記組成物が、１ｍｇの量の抗体を含む、請求項４４から請求項５０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５３】
前記組成物が、２ｍｇの量の抗体を含む、請求項４４から請求項５０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５４】
前記抗体が、投与前に熱処理される、請求項４４から請求項５３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５５】
個体におけるＧＤ２関連腫瘍の再発を遅延するためのキットであって、以下：
（ａ）請求項４４または請求項４８から請求項５４のいずれか１項に記載の組成物；および
（ｂ）１週間の間隔で、該組成物を投与することを記載する説明書、
を含む、キット。
【請求項５６】
個体におけるＧＤ２関連腫瘍の再発を遅延するためのキットであって、以下：
（ａ）請求項４４または請求項４８から請求項５４のいずれか１項に記載の組成物；および
（ｂ）２週間の間隔で、該組成物を投与することを記載する説明書；
を含む、キット。
【請求項５７】
個体におけるＧＤ２関連腫瘍の発症を遅延するためのキットであって、以下：
（ａ）請求項４５または請求項４８から請求項５４のいずれか１項に記載の組成物；および
（ｂ）１週間の間隔で、該組成物を投与することを記載する説明書；
を含む、キット。
【請求項５８】
個体におけるＧＤ２関連腫瘍の発症を遅延するためのキットであって、以下：
（ａ）請求項４５または請求項４８から請求項５４のいずれか１項に記載の組成物；および
（ｂ）２週間の間隔で、該組成物を投与することを記載する説明書、
を含む、キット。
【請求項５９】
ＧＤ２関連腫瘍を有する個体を処置するためのキットであって、以下：
（ａ）請求項４６または請求項４８から請求項５４のいずれか１項に記載の組成物；および
（ｂ）１週間の間隔で、該組成物を投与することを記載する説明書、
を含む、キット。
【請求項６０】
ＧＤ２関連腫瘍を有する個体を処置するためのキットであって、以下：
（ａ）請求項４６または請求項４８から請求項５４のいずれか１項に記載の組成物；および
（ｂ）２週間毎に、該組成物を投与することを記載する説明書、
を含む、キット。
【請求項６１】
ＧＤ２関連腫瘍を有する個体を処置するためのキットであって、以下：
（ａ）請求項４７から請求項５４のいずれか１項に記載の組成物；および
（ｂ）１週間の間隔で、該組成物を投与することを記載する説明書；
を含む、キット。
【請求項６２】
ＧＤ２関連腫瘍を有する個体における抗ＧＤ２応答を誘発するためのキットであって、以下：
（ａ）請求項４７から請求項５４のいずれか１項に記載の組成物；および
（ｂ）２週間毎に、該組成物を投与することを記載する説明書；
を含む、キット。
【請求項６３】
請求項１または１３〜１９のいずれか１項に記載の抗体を含む、組成物。
【請求項６４】
前記抗体が、抗ＧＤ２免疫学的応答またはガングリオシドＧＤ２に対する能動免疫を誘発するに十分な量存在する、請求項６３に記載の組成物。
【請求項６５】
請求項６３または請求項６４に記載の組成物であって、該組成物が、薬学的に受容可能な賦形剤をさらに含む、組成物。
【請求項６６】
請求項６５に記載の組成物であって、該組成物が、アジュバンドをさらに含む、組成物。
【請求項６７】
請求項１または１３〜１９のいずれか１項に記載の抗体の使用であって、ＧＤ２関連腫瘍を有する個体における抗ＧＤ２免疫学的応答またはガングリオシドＧＤ２に対する能動免疫を誘発するための医薬品を製造するための使用。
【請求項６８】
前記抗ＧＤ２免疫学的応答が、抗ＧＤ２抗体の生成または抗ＧＤ２反応性Ｔ細胞の生成である、請求項６７に記載の使用。
【請求項６９】
請求項４４から５４のいずれか１項に記載の組成物であって、前記ＧＤ２関連腫瘍が神経芽細胞腫である、組成物。
【請求項７０】
請求項４４から５４のいずれか１項に記載の組成物であって、前記ＧＤ２関連腫瘍が神経膠腫である、組成物。
【請求項７１】
請求項４４から５４のいずれか１項に記載の組成物であって、前記ＧＤ２関連腫瘍が肉腫である、組成物。
【請求項７２】
請求項４４から５４のいずれか１項に記載の組成物であって、前記ＧＤ２関連腫瘍が小細胞肺癌である、組成物。
【請求項７３】
個体におけるＧＤ２関連腫瘍の再発を遅延するためのキットであって、該キットは（ａ）請求項４４または４８〜５４のいずれか１項に記載の組成物；および（ｂ）該組成物を１ヶ月に１回の間隔で投与することを示す説明書、を含む、キット。
【請求項７４】
個体におけるＧＤ２関連腫瘍の再発を遅延するためのキットであって、該キットは（ａ）請求項４４または４８〜５４のいずれか１項に記載の組成物；および（ｂ）該組成物を１週間に１回、続いて１ヶ月に１回の間隔で、または２週間に１回、続いて１ヶ月に１回の間隔で投与することを示す、キット。
【請求項７５】
個体におけるＧＤ２関連腫瘍の発症を遅延するためのキットであって、該キットは、（ａ）請求項４５または４８〜５４のいずれか１項に記載の組成物；および（ｂ）該組成物を１ヶ月に１回の間隔で投与することを示す説明書、を含む、キット。
【請求項７６】
個体におけるＧＤ２関連腫瘍の発症を遅延するためのキットであって、該キットは、（ａ）請求項４５または４８〜５４のいずれか１項に記載の組成物；および（ｂ）該記組成物を１週間に１回、続いて１ヶ月に１回の間隔で投与することを示す説明書、を含む、キット。
【請求項７７】
個体におけるＧＤ２関連腫瘍の発症を遅延するためのキットであって、該キットは、（ａ）請求項４５または４８〜５４のいずれか１項に記載の組成物；および（ｂ）該組成物を２週間に１回、続いて１ヶ月に１回の間隔で投与することを示す説明書、を含む、キット。
【請求項７８】
ＧＤ２関連腫瘍を有する個体を処置するためのキットであって、該キットは、（ａ）請求項４６または４８〜５４のいずれか１項に記載の組成物；および（ｂ）該組成物を１ヶ月に１回の間隔で投与することを示す説明書、を含む、キット。
【請求項７９】
ＧＤ２関連腫瘍を有する個体を処置するためのキットであって、該キットは、（ａ）請求項４６または４８〜５４のいずれか１項に記載の組成物；および（ｂ）該組成物を１週間に１回、続いて１ヶ月に１回の間隔で、または２週間に１回、続いて１ヶ月に１回の間隔で投与することを示す、キット。
【請求項８０】
抗ＧＤ２免疫学的応答を誘発するためのキットであって、該キットは、（ａ）請求項４７〜５４のいずれか１項に記載の組成物；および（ｂ）該組成物を１ヶ月に１回、２週間に１回、続いて１ヶ月に１回の間隔で、または２週間に１回、続いて１ヶ月に１回の間隔で投与することを示す説明書、を含む、キット。
【請求項８１】
ＧＤ２関連腫瘍を有する個体におけるＧＤ２関連腫瘍の再発を遅延するための医薬品の製造のための、請求項１または１３〜１９のいずれか１項に記載の抗体の使用。
【請求項８２】
個体におけるＧＤ２関連腫瘍の発生を遅延するための医薬品の製造のための、請求項１または１３〜１９のいずれか１項に記載の抗体の使用。
【請求項８３】
ＧＤ２関連腫瘍を有する個体を処置するための医薬品またはＧＤ２関連腫瘍を有する個体において抗ＧＤ２免疫学的応答を誘発するための医薬品の製造のための、請求項１または１３〜１９のいずれか１項に記載の抗体の使用。
【請求項８４】
請求項３２に記載の薬学的組成物であって、前記抗体が、ヒトにおいて抗ＧＤ２免疫学的応答を誘発するに十分な量で存在する、組成物。
【請求項８５】
ＧＤ２関連腫瘍を処置するか、またはその再発を遅延させるか、またはその発生を遅延させるための医薬品の製造のための、請求項１または１３〜１９のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項８６】
ＧＤ２関連腫瘍を処置するか、またはその再発を遅延させるか、またはその発生を遅延させるための医薬品の製造のための、請求項１または１３〜１９のいずれか１項に記載の抗体の使用。
【発明の詳細な説明】
関連出願の引用
本出願は、1995年１月17日に出願された、米国特許出願第08/372,676号の一部継続出願であり、その全てが参考として本明細書中に援用される。
政府の援助による研究の下で行われた発明に対する権利に関する陳述
本発明は、研究の一部を米国Public Health Service および国立衛生研究所 の援助でなされた。政府は、本発明において所定の権利を有する。
発明の背景
医学研究における多くの進歩にもかかわらず、依然としてガンは米国における死亡原因の第２位である。例えば、外科的切除、放射線療法、および化学療法のような臨床医療の伝統的な様式は、特に固形の腫瘍に対して顕著な失敗率を有する。失敗は、最初の腫瘍が非応答性であるため、あるいは起源部位における再増殖、または転移による再発のためのいずれかにより起こる。ガンは、依然として医学の研究および発達の中心点である。
新生物細胞が免疫監視機構により正常に調節されているという仮説に基づくと、興味深いアプローチは、腫瘍に向かって逆戻りする罹患した個体における免疫系を再焦点化することである。細胞の腫瘍形成性の形質転換を反映する異常な抗原を発現するので、ガンの多くのタイプは、免疫系に感受性であるはずである。抗体またはＴ細胞は、標的抗原（特に、免疫エフェクター機能を回復し得るかもしれない腫瘍細胞上で発現される）を指向し、従って腫瘍を除去するかまたは病理学的結果を軽減する。
このアプローチには、いくつかの潜在的な落とし穴が存在する。第１に、標的腫瘍抗原が細胞から分離され得、それにより、腫瘍特異的免疫成分の接近をブロックする。第２に、標的抗原の発現が異種であり得ることである。この場合、特異的免疫応答は罹患した個体の実質的なサブクラスにおいては非効果的であるか、または変異を回避する危険性が高い。第３の困難は、一般に腫瘍特異的抗原は自己抗原に関して抗原性であるか、または不規則な発現様式における自己抗原を含む。このことは、腫瘍関連抗原は、しばしば免疫原性に乏しい（おそらく、これらに対して活性かつ進行中の免疫抑制による）ことを意味する。さらにガン患者は、免疫抑制されがちであり、そして特定のＴ依存性抗原に対してのみ応答する。
多くの特性は、ガングリオシドが、好ましくは特定の腫瘍タイプの抗体媒介性殺傷のための標的抗原の他のタイプであり得ることを示唆する。ガングリオシド様GD2は、単純な、明確に定義された構造を有し、そして発現レベルは抗体の結合に影響されない。インビトロの研究は、ガングリオシド様GD2およびGD3に対するモノクローナル抗体が、潜在的に腫瘍細胞に指向され得るリンパ球応答を増強することを示している。さらに、特定のガングリオシドは、腫瘍細胞の固形の基質への接着に関連し、そして抗体はこの接着を阻害する。これらに対する免疫応答は、腫瘍細胞の除去が成功しない場合でさえ、病状の拡大を減少し得る。
特に、グリコスフィンゴリピドGD2は、ヒト神経外胚葉起源の腫瘍（悪性メラノーマ、神経芽細胞腫、神経膠腫、柔組織肉腫、および肺の小細胞ガンを包含する）により高密度で発現される。GD2抗原は、脳および末梢神経における低いレベルを除いて、ほとんどの正常組織中に存在しない。
メラノーマは、新規の治療様式が早急に必要であるヒト疾患の１つである。これは、皮膚ガンの特に攻撃的な形態であり、そしてこれは、通常の無防備な太陽照射を受けた個体において増大した頻度で起こる。初期段階において、メラノーマは、皮膚-表皮の接合点における増殖により特徴付けられ、これは、すぐに近接の組織を侵し、そして広く転移する。毎年、世界中で70,000人の患者が診断され、そして25,000人の死亡が報告されている。American Cancer Societyは、2000年までに、75人のアメリカ人のうちの１人が、その生存中にメラノーマと診断されると予測する。
幸運にも、メラノーマは、ガングリオシドが標的抗原としてかなりの見込みを有するガンの１つである（Livingston (1995) Immunol. Rev. 145: 147-166）。GD2の発現の増大が、悪性メラノーマ細胞の大多数において観察されている。いくつかのマウスモノクローナル抗GD2抗体が、無胸腺の（nu/nu）マウス中で神経外胚葉起源の腫瘍の増殖を抑制すること、または転移性メラノーマの患者において緩解を引き起こすことが報告された。ヒト−マウスキメラ抗GD2抗体は、転移性神経芽細胞腫を有する患者において緩解する。このメカニズムは、抗体依存性細胞傷害性（ADCC）または補体媒介性細胞傷害性（CMC）を含むと考えられる。臨床的な応答は、GM2、GD2、およびGD3に対するモノクローナル抗体を用いた処置により得られている。GM2を含有するガングリオシドワクチンを用いた能動免疫化は、58人の患者中50人において抗GM2抗体を産生し、彼らは、抗体ネガティブ患者よりも平均して長生きした。
神経芽細胞腫は、乳児および小児期の初めに起こる非常に悪性の腫瘍である。ウィルムス腫瘍を除いて、これは子供において最も一般的な腹膜後の腫瘍である。この腫瘍は、リンパ節、肝臓、骨、肺、および骨髄の広範な関与を有し、早期に転移する。原発性腫瘍は切除により解消し得るが、再発率が高い。
小細胞肺ガンは、肺ガンの最も悪性の、そして最も増殖の早い形態である。肺ガンの新しい症例の20〜25％の原因であり、そして60,000症例が、1996年に米国で診断される。一般に、原発性腫瘍は、化学療法に応答性であるが、すぐに広範囲に転移する。診断時の平均的な生存期間は約１年であり、５年の生存率は５〜10％にすぎない。
GD2に対する免疫反応性を提供するための単純かつ信頼性のある治療ストラテジーが存在すれば、これらのタイプのガンのための臨床的な見通しが改善されるかもしれない。
不幸にも、GD2が活性なワクチンの成分として決して理想的ではない理由がいくつか存在する。１つ目に、GD2は提供が制限され、そして精製が困難である。当然、GD2がガングリオシドであるために、単純な組換え技術によっては生じ得ない。２つ目に、一般にガングリオシドは、および特にGD2は、免疫原性に乏しい。これらをヒトにおいてより免疫原性にするためには、KLHのようなタンパク質キャリアとこれらを結合することが不可欠であった（米国特許第5,308,614号；WO 94/16731）。
同様に、抗GD2抗体の受動投与は、長期医療に対するアプローチとして決して理想的ではない。受動的に提供されなければならない抗体の量が重要である。これは、抗免疫グロブリンまたは抗イディオタイプの形成を導き得、次いで次の各投与量の応答性の減少を導き得る。そしておそらく最も重要なことは、腫瘍根絶（特に腫瘍に指向する細胞傷害性Ｔ細胞）において重要であり得る免疫応答の成分を宿主に提供し損なうことである。
それでは、他にどのようにすればGD2に対する活性な免疫応答を得られるであろうか。LindemannおよびJerneのネットワーク仮説は、GD2に対する天然の免疫寛容およびGD2の提供の不足の両方を克服する方法を提案する。これは、それ自身が免疫原性であり得、抗イディオタイプと呼ばれる二次レベルの抗体の生成を導く可変領域エピトープを、抗体が含むという事実に基づく。この仮説によれば、所定の腫瘍関連抗原を用いた免疫化は、この腫瘍関連抗原（Ab1）に対する抗体の産生を生じ、これは精製され、抗イディオタイプ（Ab2）を生成するための第２回目の免疫化において使用される。これらのAb2分子（Ab2βと呼ばれる）のいくつかは、Ab1のパラトープ中に適合し、そして腫瘍関連抗原の代用物として使用され得る。従って、Ab2βを用いた免疫化は、Ab1により同定された対応するオリジナルの腫瘍関連抗原を認識する抗-抗イディオタイプ抗体（Ab3）の生成を導き得る。理想は、Ab2が、それをより免疫原性にする異なる状況において腫瘍抗原に構造的に関連している特性を表すことである。
従って、他の場所で、種々の腫瘍関連抗原に対する応答を誘発するために、抗イディオタイプを用いる努力がされてきた。研究者の１つのグループは、メラノーマ関連ガングリオシドGM3に関連する抗イディオタイプを作製した（Kandaら、Yamamotoら、Hastingsら）。Salehら、およびCheungらは、GD2に対する抗イディオタイプを作製した。他の抗イディオタイプは、早期の臨床試験に入っている：例えば、Mittelmanらは、高分子量メラノーマ関連抗原（MAA）に関連する抗イディオタイプを用いている。Chattopadhyayらは、メラノーマ関連プロテオグリカンに対する抗イディオタイプを開発した。Chapmanらは、ガングリオシドGD3に関連する抗イディオタイプを用いてメラノーマ患者を処置している。これらの試験のほとんどは、まだほぼフェーズＩレベルであり、結果はまだ未決定である。
強調される重要なことは、腫瘍治療に用いられるための全ての潜在的な抗イディオタイプが、ケースバイケースを基礎として評価されなければならないことである。第１に、Ab1に対して惹起された抗体の一部分だけが、Ab1のパラトープに対するこれらの反応性において限定される（すなわち、宿主個体中の他の潜在的な抗体と共有される特性に対して非反応性である）。第２に、抗イディオタイプは、必ずしも免疫原性でない。第３に、一部分の免疫原性の抗イディオタイプのみがオリジナルの腫瘍抗原に対する応答性を誘発し、かつ組織特異性のより少ない他の抗原に対する応答を誘発しない。これらの特性は、その可変領域のアミノ酸配列を含有する抗イディオタイプの構造に関連する。同じAb1に対して惹起された異なる抗イディオタイプは、この点において異なり、そして別々に評価されなければならない。さらに、誘発された抗腫瘍応答は、免疫化された個体の免疫学的状態に依存する。
発明の開示
本開示は、1A7と命名された特定のモノクローナル抗イディオタイプ抗体を概説する。この抗体は、抗GD2応答を誘発し得ることが確認されている。この抗体は、GD2に対する免疫寛容の回避を提供する所望の特性の全てを有し、そしてGD2関連疾患の処置に適切である。
1A7から誘導される多くの他の化合物もまた記載される。これらは、他の免疫グロブリン分子と1A7とを区別する、1A7重鎖および軽鎖可変領域に基づくポリヌクレオチドおよびポリペプチドを特に含む。広範なこのような産物が予期される。好ましい誘導化合物には、インタクトな1A7のヒト化型（version）、1A7重鎖の相補性決定領域由来のポリペプチドフラグメント、および1A7可変領域のコード領域を含有するワクシニアウイルスベクターが含まれる。特に好ましい化合物は、重鎖定常領域に接着した、GM-CSFまたはIL-2を有するポリペプチド領域を含有する1A7抗体融合分子、１本鎖VH-VLまたはVL-VH可変領域、およびこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
本発明の化合物および組成物は、とりわけ、個体内の体液性免疫応答または細胞性免疫応答を誘発するために使用され得る。これらは、進行性疾患の治療、および予防医療（特に、アジュバントセッティングにおける再発の危険性を減少させるため）を包含するGD-2関連疾患を検出または処置するために使用され得る。
従って、本発明は、モノクローナル抗体1A7、およびそれを産生するハイブリドーマ細胞株を包含する。また、1A7の同定特性（identifying characteristic）を有する抗体を包含する。
本発明の別の実施態様は、モノクローナル抗体1A7の免疫学的活性を有するポリペプチドをコードする配列を含有するポリヌクレオチドであり、ここでこのポリペプチドは、モノクローナル抗体1A7の可変領域由来の少なくとも５つの連続するアミノ酸を含有する。可変領域は、1A7の軽鎖または重鎖のいずれかに由来し得る。好ましくは、５つの連続するアミノ酸配列は、1A7の免疫学的反応性において役割を担い、そして相補性決定領域に由来し得る。別の実施態様は、1A7軽鎖または重鎖コード配列と安定な二重鎖を形成し得るが、以前に記載された他の免疫グロブリン分子のコード配列と安定な二重鎖を形成し得ない、少なくとも20の連続するヌクレオチドの単離されたポリヌクレオチドである。これらのポリヌクレオチドのいくつかは、クローニングベクター、発現ベクターの形態であり得、または宿主細胞にトランスフェクトされ得る。
また、モノクローナル抗体1A7の免疫学的活性を有するポリペプチドも包含され、ここで、このポリペプチドは、モノクローナル抗体1A7の可変領域由来の、少なくとも５つの連続するアミノ酸を含有する。可変領域は、軽鎖または重鎖に由来し得る。好ましくは、５つの連続するアミノ酸は、1A7の免疫学的反応性において役割を担い、そして相補性決定領域に由来し得る。インタクトな1A7、1A7の機能的に活性なフラグメント、融合タンパク質、ヒト化抗体、多抗原性タンパク質、および他の1A7のポリペプチド誘導体を包含する。特に興味深いのは、１本鎖可変領域、およびサイトカインを含有する融合タンパク質である。
別の実施態様は、モノクローナル抗体1A7、本発明のポリヌクレオチド、または本発明のポリペプチド、および薬学的に受容可能な賦形剤を含有する薬学的組成物またはワクチンである。
本発明のさらなる実施態様は、個体において免疫応答を誘発する方法であり、この方法は、有効量の本発明のモノクローナル抗体1A7またはポリヌクレオチドまたはポリペプチドを個体に投与する工程を包含する。免疫応答は、体液性または細胞性免疫性のいずれか（好ましくは両方）を包含し得る。
なお別の実施態様は、個体におけるGD2関連疾患の処置方法であり、この方法は、本発明のモノクローナル抗体1A7またはポリヌクレオチドまたはポリペプチドを投与する工程を包含する。疾患は、メラノーマ、神経芽細胞腫、神経膠腫、柔組織肉腫、および小細胞ガンであり得る。個体は、臨床的に検出可能な腫瘍を有し得るか、または腫瘍は既に処置され、そして検出不可能になり得る。この方法は、疾患を緩和するため、または再発の危険性を減少させるためであり得る。
本発明のさらなる実施態様は、サンプル中の抗GD2抗体または1A7ポリヌクレオチドを検出または定量するためのキットであり、このキットは適切なパッケージング中に、本発明のモノクローナル抗体1A7またはポリヌクレオチドまたはポリペプチドを含有する。また、本発明に包含される試薬またはキットの使用により、このような抗体またはポリヌクレオチドを検出するための方法が包含される。
【図面の簡単な説明】
図１は、1A7および隣接した残基の軽鎖可変領域のcDNA配列（配列番号１）およびアミノ酸配列（配列番号２）を示す。
図２は、1A7および隣接した残基の重鎖可変領域のcDNA配列（配列番号３）およびアミノ酸配列（配列番号４）を示す。
図３は、1A7可変領域のアミノ酸配列を、先行技術による15の軽鎖および重鎖免疫グロブリン配列と比較したリストである。パネルＡは、軽鎖の比較を示す；パネルＢは、重鎖の比較を示す。パネルＣは、軽鎖および重鎖（配列番号５および６）の可変領域コンセンサス配列を示し、これらを1A7の可変領域と比較する。1A7の可変領域は重鎖のVDJ接合部についてのスプライシングの差異およびさらなる16の点差異を示す。
図４は、サンドイッチラジオイムノアッセイによるサルAb3のAb2（1A7）への結合を示すグラフである。白四角は、サルPRO#685由来のAb3を示す；白丸は、サルPRO#778由来のAb3を示す。
図５は、サルAb3によるAb1-Ab2結合（またはその逆）の阻害を示す棒グラフである。各対のバーについて、左側のバーは、標識されたAb1を用いたAb2-Ab3を示す；右側のバーは、標識されたAb2を用いたAb1-Ab3を示す。
図６は、異なる濃度のAb1およびサルAb3の存在下における、125Ｉ標識14G2a抗体の、GD2ポジティブメラノーマ細胞株M21/P6への結合の阻害を示す棒グラフである。平行阻害曲線を、サル血清由来の精製されたAb1またはAb3のいずれかを用いて得た。各３つのバーについて、左側のバーは14G2aを用いたコントロール結合を示す；中央の（網目状の線を引いた）バーはサルPRO#685由来のAb3の結合を示す；右側のバーはサルPRO#778由来のAb3の結合を示す。
図７は、サルAb3の腫瘍細胞への結合の、FACS分析からのグラフである。パネルＡは、免疫前Ab3および免疫Ab3を用いて標識したGD2を発現するM21/P6細胞で観察される染色を示す。パネルＢは、GD2を発現しない別の細胞株において観察される染色を示す。パネルＣは、GD2特異的抗体14G2aを用いるか、または抗体を用いないM21/P6細胞のコントロール染色を示す。
図８は、ELISAによるAb1およびサルAb3の異なるガングリオシドへの結合を示す棒グラフである。各対のバーについて、左側（黒）のバーはサルPRO#685由来のAb3の結合を示す；右側（網目状の線を引いた）のバーは抗GD2 14G2aによるコントロール結合を示す。この実験は、抗イディオタイプ1A7を用いた免疫化の際に誘導される抗体が抗原特異的であることを示す。
図９は、14G2aおよびサルAb3による、125Ｉ標識14G2a抗体の精製されたGD2に対する結合の阻害を示す棒グラフである。各３つのバーについて、左側（黒）のバーはサルPRO#778を示す；中央（白）のバーは14G2aを示す；右側（網目状の線を引いた）のバーはサルPRO#685を示す。
図10は、14G2aおよびサルAb3の異なるガングリオシドへの結合を示すブロット分析の、ハーフトーンの複写物である。レーン１はサルPRO#685；レーン２はサルPRO#778；レーン３は14G2a；レーン４はサル抗IID10；レーン５はPBS-BSAである。
図11は、1A7重鎖または軽鎖可変領域をコードする領域を含有するワクシニアベクターを作製するためのモデルプラスミド構築の地図である。
図12は、データベース検索において、1A7軽鎖可変領域をコードする配列に最も密接に適合した10個のポリヌクレオチド配列を示す。これらの配列を、配列番号７〜16と称する。
図13は、データベース検索において、1A7重鎖可変領域をコードする配列に最も密接に適合した10個のポリヌクレオチド配列を示す。これらの配列を、配列番号17〜26と称する。
発明を実施するための形態
本発明者らは、GD2に対する腫瘍特異的応答を回復し得る抗イディオタイプ抗体を発見した。この抗体を1A7と称する。代表的には、1A7により誘発される免疫応答は、体液性成分および細胞性成分の両方を包含し、従って、GD2関連腫瘍に関連する臨床状態の緩和において有用であると期待される。本発明は、1A7抗体分子、そのポリヌクレオチドおよびポリペプチド誘導体、ならびに診断および処置においてこれらの化合物を使用するための方法を包含する。
代表的には、ガン患者は、GD2を包含する種々の腫瘍関連抗原（TAA）に寛容である。1A7は免疫寛容をうまく回避し、そしてGD2に対する免疫応答を誘発する。ネットワーク理論によれば、Ab1は、抗腫瘍モノクローナル抗体を表す；Ab2は、抗イディオタイプモノクローナル抗体を表す；そしてAb3は抗-抗イディオタイプモノクローナル抗体を表す。1A7は、Ab1と同じ特異性でAb3を刺激するAb2であり、従って、腫瘍抗原を有する腫瘍に対するエフェクター機能を回復し得る。オリジナルのTAAに対して反応性のAb3応答を、本明細書中でAb1'という。
理論に束縛されることは望まないが、１つの解釈は、1A7結合部位が、それをより免疫原性にする１つ以上の他のエピトープの状況において、GD2中のエピトープに少なくとも部分的に類似する領域を提示し得ることである。1A7のエピトープに類似し得るGD2のエピトープは、1A7を生成するために使用されるAb1（14G2a）により同定される。結果として、1A7は、GD2に対する正常な免疫寛容を回避し、そして抗GD2応答を誘発し得る。
図１および２は、1A7軽鎖および重鎖可変領域のヌクレオチドコード領域に加えて、対応するアミノ酸翻訳産物をそれぞれ示す。これらの配列を、他の公知の免疫グロブリン分子配列の配列と比較した（実施例２）。本発明者らは、1A7のポリヌクレオチドおよびポリペプチド可変領域配列の両方が独特であることを見出した。
1A7軽鎖可変領域の配列に最も密接に適合した50のデータベース配列の中で、同一なものはなかった。1A7は、第２のCDRに含まれる残基50および55における２置換の差異によって５つの最も密接な配列とは異なる。これらの位置におけるこの２つの差異は、非保存的置換であり、そして他の軽鎖配列と比較して持続していた。
1A7重鎖可変領域の配列に最も密接に適合した50のデータベース配列の中で、同一なものはなかった（図３、パネルＡおよびＢ）。以下に、比較により導き出される要点をまとめる。
・重鎖フラグメントと最も密接に適合した。２つの欠失および12の置換の差異が存在した。
・完全長の重鎖可変領域との最も密接な適合は、以下の特性を有した：３つの欠失および17の置換の差異が存在した。
・1A7は、１つを除いて全ての配列と長さが異なるが、これはVDJ接合部における１〜８残基の挿入または欠失による。同じ長さの配列については、26の置換の差異が存在した。
・全ての他の比較は、少なくとも22個の挿入、欠失および置換の差異の全てを示した。差異は、可変領域中いたる所に現れた。
図３パネルＣは、1A7アミノ酸軽鎖および重鎖配列と、データベース配列より導き出されたコンセンサス配列との比較を提供する。重鎖VDJ接合部についてのスプライシングの差異以外に、1A7とコンセンサス配列との間に、約16個の差異（これは抗体成熟の間の体細胞変異によりおそらく発生した）があるようである。
1A7の免疫学的活性を有する1A7誘導体の開発において特に興味深いものは、VDJ接合部の一部を含有するポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の領域である。興味深いものはまた、1A7アミノ酸配列とコンセンサス配列との間の、少なくとも１つ、好ましくは２つ、そしてより好ましくは３つ以上の点の差異にわたる領域である。
1A7軽鎖および重鎖定常領域の完全な配列は決定されていないが、他のマウス免疫グロブリン分子の定常領域と同一またはほぼ同一であることが期待される。
マウスκ軽鎖定常領域については、２つのタンパク質アロタイプをコードする４つの遺伝的アロタイプが、Solinら、(1993) Immunogenetics 37: 401-407により公表されている（これは本明細書中で参考として援用される）。Solinらの図１は、マウスおよびラットの免疫グロブリンκ鎖遺伝子配列を示し、異なる株のκ鎖定常領域内の配列を比較し、そしてアロタイプ的差異を強調する。これは、BALB/c、PL、SJL、およびM.spretusについてのκ鎖定常領域配列を含む。他の天然に存在するアロタイプが可能である。
新生マウス由来のマウスγ1重鎖定常領域DNA配列が、Honjoら、(1979) Cell 18: 559-568により公表されている（これは、本明細書中で参考として援用される）。Honjoらの図５は、コードされるタンパク質配列と共に生殖細胞系DNA配列を示す。ラインの上に示されるのは、マウスミエローマMOPC21から得られる別のタンパク質配列である。他の天然に存在するアロタイプが可能である。
1A7抗体およびその誘導体は、例えば抗GD2免疫応答を誘発するため、GD2関連疾患を処置するため、および抗GD2の存在を検出するための試薬として有用である。
本出願に記載される特定の化合物、組成物、および方法は、一般に免疫化学の伝統的な技術により日常的に生成される1A7およびその誘導体に関する。これは化学的結合あるいは賦形剤またはアジュバントと混合することにより別の化合物にカップリングした1A7を包含する。これは、Fab、F(ab')2、Fab'、ならびに単離された重鎖および軽鎖のような免疫グロブリンフラグメントを包含する。第１世代治療は、このような化合物および組成物に基づく治療である。
本出願に記載される他の化合物、組成物、および方法は、上記の分類の外側にある1A7のポリヌクレオチドおよびポリペプチド誘導体に関する。代表的には、組成物は遺伝子操作により生成されるが、あるいは他の方法および方法の組み合わせによっても獲得され得る。この分類は、単離されたポリヌクレオチドフラグメント、組換えポリヌクレオチド、操作されたペプチドフラグメントおよび融合ペプチド、ならびに配列データに基づいた化学合成により調製されたポリヌクレオチドまたはポリペプチドを包含する（しかし、これらに限定されない）。好ましい化合物は、1A7 CDRのポリペプチドフラグメント、サイトカインエフェクター成分を含有する抗体融合タンパク質、１本鎖可変領域タンパク質、およびこれらをコードするポリヌクレオチド、1A7ポリヌクレオチドを含有する治療的プラスミド、ならびにワクシニアベクターのようなベクターを包含する。
他に明確に記載するか、またはこれらの性質に必要とされることがない限りは、本発明で具体化される特定の化合物の作製方法または使用方法は、本発明の他の化合物に適切に適用され得る。
本発明の薬学的組成物および処置様式は、特にヒトにおいてGD2に対する応答を誘発することが所望される場合いつでも有効に加えられ得る。メラノーマ、神経芽細胞腫、神経膠腫、柔組織肉腫、および小細胞ガン（小細胞肺ガンを含む）を包含するGD2関連腫瘍を有するヒト患者は、特に適切な被験体である。被験体は疾患の進行性の形態を有し得、この場合、目的は、疾患進行の軽減または逆行、および副作用の改善を包含し得る。被験体は、既に処置された病気の経歴を有し得、この場合、代表的には目的は、臨床的な病状の再発の危険性の縮小または遅延を包含する。
さらに、本発明の抗体および誘導体はまた、診断試薬として使用するためのプローブ、プライマー、およびポリペプチドとして使用され得る。これらの適用を、以下のセクションでより詳細に記載する。
定義
「1A7」は、14G2aと呼ばれる抗GD2モノクローナル抗体に対して惹起された特定の抗イディオタイプ抗体である。1A7の生成および特徴付けは、実施例１で記載される。
1A7の「免疫学的活性」は、以下の活性の任意のものをいう：モノクローナル抗体14G2aに特異的に結合する能力；1A7の14G2aへの結合、または特定の様式において14G2aのGD2への結合を阻害する能力；およびGD2に対する免疫応答を誘発する能力。特異的免疫応答は、抗体、Ｂ細胞、Ｔ細胞、およびこれらの任意の組み合わせ、ならびにこれらに由来して得られるエフェクター機能を包含し得る。抗体媒介性機能ADCCおよび補体媒介性細胞溶解（CDC）が包含される。Ｔ細胞応答には、Ｔヘルパー細胞機能、細胞傷害性Ｔ細胞機能、炎症／インデューサーＴ細胞機能、およびＴ細胞媒介性抑制が含まれる。これらの判定基準のいくつかにより、特異的免疫応答を誘発し得る化合物は、「免疫原性」といわれる。
1A7「活性」または「機能」は、任意の1A7の免疫学的活性、あるいはGD2関連疾患の改善または緩和における1A7の役割を含む、本開示において1A7に与えられた任意の他の生物学的活性をいう。
1A7の「可変領域」は、1A7軽鎖の可変領域または1A7重鎖の可変領域の、単独または組み合わせのいずれかをいう。
本明細書中でいうGM-CSF、IL-2、および他の生物学的に活性な分子は、同じ生物学的または生理学的機能を有するそれぞれの親分子に基づいたフラグメントおよび誘導体を包含することが意味される。
「ポリヌクレオチド」は、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、および任意のアナログの組み合わせにおけるアナログを含有する任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態である。ポリヌクレオチドは、任意の三次元構造を有し得、そして既知または未知の任意の機能を行い得る。用語「ポリヌクレオチド」には、二本鎖、一本鎖、および三重らせん分子が含まれる。他に特定または要求されない限り、ポリヌクレオチドである本明細書中に記載する本発明のいずれの実施態様も、二本鎖形態、および二本鎖形態を形成することが知られるか、または予測される２つの相補的一本鎖形態の各々を包含する。
以下のものは、ポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子または遺伝子フラグメント、エクソン、イントロン、mRNA、tRNA、rRNA、リボザイム、cDNA、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離DNA、任意の配列の単離RNA、核酸プローブ、およびプライマー。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログ、ウラシル、フルオロリボースおよびチオエートのような他の糖および結合基、ならびにヌクレオチド分岐のような修飾されたヌクレオチドを含み得る。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって妨げられ得る。ポリヌクレオチドは、例えば、標識成分との結合によって、重合後にさらに修飾され得る。この定義に包含される他のタイプの修飾は、キャップ、１つ以上の天然に存在するヌクレオチドのアナログでの置換、およびタンパク質、金属イオン、標識成分、他のポリヌクレオチド、または固体支持体に付着するための手段の導入である。
本明細書中で用いられる用語「組換え」ポリヌクレオチドは、ゲノム、cDNA、半合成、または合成起源のポリヌクレオチドを意味し、いずれも天然には存在しないかまたは天然には見出されない配置で別のポリヌクレオチドと結合されている。
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、本明細書で相互に交換して用いられ、任意の長さのアミノ酸のポリマーをいう。このポリマーは、線状または分岐状であり得、修飾されたアミノ酸またはアミノ酸アナログを含み得、そして非アミノ酸により妨げられ得る。この用語はまた、天然に、あるいは介在（例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化(lipidation)、アセチル化、リン酸化、または標識成分との結合のような任意の他の操作または修飾）によって修飾されたアミノ酸ポリマーを包含する。他に記載されないかまたは示されない限りは、用語1A7ポリペプチドは、本明細書中に記載するように、インタクトな1A7抗体、ならびにより小さなおよびより大きな機能的に等価なポリペプチドを含む1A7活性を有する任意のポリペプチドモノマーまたはポリマーを包含する。
「融合ポリペプチド」は、天然に存在する位置とは異なる配列中の位置における領域を含むポリペプチドである。この領域は、通常異なるタンパク質中に存在し得、そして融合ポリペプチドにおいて結合される；または、これらは、通常同じタンパク質中に存在し得るが、融合ポリペプチド中の新しい配置に置かれる。
使用される状況に関連するフラグメントの少なくとも１つの機能的特性を保存すると同時に、1A7ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの「機能的に等価なフラグメント」は、付加、欠失、または置換の任意の組み合わせにより、天然の配列から変化する。1A7ポリヌクレオチドの機能的に等価なフラグメントは、発現系において使用される場合、1A7に機能的に等価であるポリペプチドをコードするか、またはハイブリダイゼーションアッセイにおいて使用される場合、1A7ポリヌクレオチドと類似のハイブリダイゼーション特異性を有するかのいずれかである。1A7ポリペプチドの機能的に等価なフラグメントは、代表的には、１つ以上の以下の特性を有する：モノクローナル抗体14G2aに結合する能力；1A7の14G2aへの結合、または特異的様式における14G2aのGD2への結合を阻害する能力；および1A7により誘発される免疫応答と類似の抗原特異性を有する免疫応答を誘発する能力。
「細胞株」または「細胞培養物」は、インビトロで増殖または維持された高等真核生物細胞を示す。細胞の子孫は親細胞と（形態学的、遺伝子型的、または表現型的のいずれかで）完全には同一でない場合があることは理解される。
「ベクター」は、インビトロまたはインビボのいずれかで標的細胞に送達されるべき異種ポリヌクレオチドを含む組換えDNAまたはRNAのプラスミドまたはウイルスをいう。異種ポリヌクレオチドは、治療の目的のための目的の配列を含み得、そして必要に応じて発現カセットの形態であり得る。本明細書中で使用されるように、ベクターは、最終的な標的細胞または被験体において複製能力を有する必要はない。この用語は、ポリヌクレオチドの複製のためのクローニングベクター、およびポリヌクレオチドコード配列の翻訳のための発現ベクターを包含する。また、ウイルス粒子中にキャプシド化されるか、または覆われたポリヌクレオチドを含有するウイルスベクターも含む。
「宿主細胞」は、遺伝的に変化した、または、組み換えプラスミドあるいはベクターのような、外因性ポリヌクレオチドの投与により遺伝的に変化し得る真核細胞を示す。遺伝的に変化した細胞をいう場合、この用語は、最初の変化した細胞、およびその子孫の両方をいう。
「異種の」は、比較される実体の残りの部分とは遺伝子型的に区別される実体に由来することを意味する。例えば、ポリヌクレオチドは、遺伝子操作技術により、異なる起源由来のプラスミドまたはベクター中に配置され得、そして異種ポリヌクレオチドとなる。この天然のコード配列から除去され、そして天然には連結されていることが見出されないコード配列に作動可能に連結されたプロモーターは、異種プロモーターである。
「シグナル配列」または「リーダー配列」は、細胞性の膜（通常小胞体）を通して新しく合成される分泌タンパク質または膜タンパク質を指示する短いアミノ酸配列である。シグナル配列は、代表的には、ポリペプチドのＮ末端部分にあり、そして代表的には、生合成と細胞からのポリペプチドの分泌との間に除去される。
「単離された」ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、それが天然で会合する物質が実質的にないものである。実質的にないとは、それが天然で会合する物質が少なくとも50％、好ましくは少なくとも70％、より好ましくは少なくとも80％、そしてなおより好ましくは少なくとも90％ないことを意味する。
ポリヌクレオチドの「安定な二重鎖」、または生化学的反応における任意の２つ以上の成分の間で形成される「安定な複合体」は、任意の随意の洗浄工程またはその間に起こり得る他の操作を包含する、二重鎖または複合体の形成と、その後の検出との間で十分に長期間持続する二重鎖または複合体をいう。
「生物学的サンプル」は、血液および生物学的起源の他の液体サンプル、バイオプシー標本または組織培養物、あるいはそれらから得られる細胞およびその子孫のような固形の組織サンプルを包含する種々のサンプルタイプを包含する。この定義はまた、それらの獲得後に任意の方法（例えば、試薬での処理、可溶化、またはタンパク質もしくはポリヌクレオチドのようなある成分の富化による）により操作されたサンプルを含む。この用語は、任意の種から得られる多くの種類の臨床的なサンプルを包含し、そしてまた、培養物中の細胞、細胞上清、および細胞溶解物を包含する。
「ワクチン」は、ヒトまたは動物用途の薬学的組成物であり、これは特定の標的または標的群に対する一定の程度の特異的免疫学的反応性をレシピエントに付与する意図で投与される。免疫学的反応性は、標的に対して免疫学的に反応性である抗体または細胞（特に、Ｂ細胞、形質細胞、Ｔヘルパー細胞、および細胞傷害性Ｔリンパ球、およびそれらの前駆体）、あるいはその任意の組み合わせであり得る。本発明の目的では、この標的は、主に腫瘍関連抗原GD2であるが、14G2aに結合される任意の腫瘍関連抗原もまた包含する。免疫学的反応性は、実験目的のため、特定の状態の処置のため、特定の物質の排除のため、または予防のために望まれ得る。活性なワクチンは、ワクチン成分の非存在が維持されるレシピエント中で免疫応答を誘発することが意図されるワクチンである。
「アジュバント」は、本明細書中で、用いられる状況に依存する２つの意味を有する。薬学的調製物の文脈において、アジュバントは免疫原性を増強する抗体、ポリヌクレオチド、またはポリペプチドと組み合わせて提供される化学的または生物学的因子である。ガンの診断または管理の文脈において、アジュバントは臨床的に検出可能な腫瘍塊を有さないが、ガンの病歴による再発の危険性を有すると推測される被験体のクラスをいう。
通常は、固形の腫瘍として出現するガンのタイプをいう場合、「臨床的に検出可能な」腫瘍は、腫瘍塊を基礎として、すなわち、CATスキャン、Ｘ線、または触診のような手順により検出可能な腫瘍である。ポジティブな生化学的、組織学的、または免疫学的な知見はそれ自身、この定義を満たすためには不十分である。
本明細書中で用いられる、「処置」は、処置された個体または細胞の天然の過程を変化させる試みにおける臨床的な介入をいい、そして予防のため、または臨床病理の過程においてのいずれかに行われ得る。所望の効果は、疾患の発生または再発の防止、症状の軽減、疾患の直接または間接的な病理学的結果の減少、転移の防止、疾患進行速度の低下、疾患状態の改善または緩和、および緩解または予後の改善を包含する。
疾患の状態に関連した「病理」は、満足な状態、正常な生理学、または罹患した個体の生活の質を危険にさらす全てである。これは、罹患した組織のまだ罹患していない領域への破壊的な侵略、正常な組織機能を犠牲にした増殖、異常なまたは抑制された生物学的活性、炎症性あるいは免疫学的応答の増大あるいは抑制、他の病原性生物体または因子に対する増大した感受性、ならびに痛み、熱、吐き気、疲労、気分変化、およびかかりつけの医師により決定され得る他の特徴のような所望されない臨床的な症状を包含する（しかし、これらに限定されない）。
「有効量」は、有利なまたは所望の臨床結果をもたらすのに十分な量である。有効量は、１回またはそれ以上の投与で投与され得る。本発明の目的では、有効量の1A7ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、免疫応答、特に抗GD2応答を誘導する量である。処置に関して、有効量は、GD2関連疾患の進行を緩和、改善、安定化、逆行、あるいは遅延、または他の疾患の病理学的結果を減少させるのに十分な量である。
「個体」は、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトである。哺乳動物は、飼育動物、競技動物およびペットを含むが、これらに限定されない。
一般的技術
本発明の実施は、特に示さない限り、当業者の範囲内である分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学、および免疫学の従来の技術を使用する。このような技術は、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」、第２版（Sambrookら，1989);「Oligonucleotide Synthesis」(M.J. Gait編，1984)；「Animal Cell Culture」(R.I. Freshney編、1987);「Methods in Enzymology」（Academic Press, Inc.）；「Handbook of Experimental Immunology」(D.M. Wei & C.C. Blackwell編);「Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells」(J. M. Miller & M.P. Calos編，1987)；「Current Protocols in Molecular Biology」(F. M. Ausubelら編，1987)；「PCR: The Polymerase Chain Reaction」(Mullisら編，1994)；「Current Protocols in Immunology」（J. E. Coliganら編，1991)のような文献に十分に説明されている。
本明細書中で引用される全ての特許、特許出願、論文、および刊行物（いずれも前出、および後出）は、本明細書中で参考として援用される。
これらの技術は、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの産生に適用可能であり、それ自体、本発明を作成し、そして実施する場合に考慮され得る。特定の実施態様に特に有用な技術を以下のセクションに考察する。
モノクローナル抗体1A7の生成および選択方法
特定の投薬を受けたことがないマウスを、抗イディオタイプ応答を獲得するために14G2a抗GD2抗体を用いて免疫化することにより1A7を得た。14G2aは、GD2の独特のエピトープに結合する。同系のBALB/cマウスを14G2a(Ab1)を用いて４回免疫化し、そしてその脾臓細胞を、非分泌性マウスミエローマP3-653細胞と融合した。
本発明者らが所望する全ての特性を有する抗イディオタイプを得るために、以下の４つの重要な工程を包含する多数のスクリーニングプロセスを用いた：(1)14G2aに結合する抗体に対するポジティブ選択；(2)アイソタイプまたはアロタイプ決定因子を認識する抗体に対するネガティブ選択；(3)GD2への14G2aの結合を阻害する能力に対するポジティブ選択；および(4)マウスおよびウサギの両方において、オリジナルの腫瘍関連抗原（GD2）に対する体液性免疫応答を誘導する能力に対するポジティブ選択。
14G2a免疫原のイディオタイプ成分に特異的であり、そしてアイソタイプまたはアロタイプ決定因子と反応しないいくつかの抗イディオタイプ（Ab2）ハイブリドーマを得た。抗14G2aが14G2aのパラトープに対するものかどうかを決定するために、放射性標識した14G2aのGD2ポジティブ細胞株M21/P6への結合を、Ab2ハイブリドーマ培養上清の種々の量の存在下で調べた。少量の５μlの培養上清で、試験したAb2の３つは、少なくとも70％の結合を阻害した。1A7は、最も高いレベルの阻害を示した。従って、1A7をさらなる研究のために増殖させ、そして腹水液から精製し、一方、他は予備に取っておいた。
精製したAb2をワクチンとして調製し、そして特定の投薬を受けたことがないマウスおよびウサギに注入した。４回の注入後、血清サンプルを、免疫化したAb2だけではなくGD2に対しても結合するAb3の存在について力価測定した。これらのスクリーニング段階の全てを通過するAb2を1A7と名付けた。1A7を得るために用いられる方法のさらなる詳細を、実施例１で提供する。
1A7で免疫化された動物において産生されるAb3を、さらに特徴付けた。マウスおよびウサギの両方に由来する免疫血清は、GD2関連細胞株M21/P6への結合について14G2aと競合し、そして放射性ヨウ素化14G2aの1A7への結合を阻害した。これは、マウスおよびウサギ中の抗-抗Id(Ab3)が、14G2aとイディオトープを共有し得、そしておそらくAb1と同じエピトープに結合することを示す。非ヒト霊長類（カニクイザル）への1A7の投与もまた、GD2に対する活性を包含する特異的免疫応答を生成する（実施例３）。
本発明者らはまた、1A7の軽鎖および重鎖可変領域をコードする核酸配列および翻訳されるタンパク質配列を導き出した（実施例２）。
本発明はまた、検出可能なシグナルを生産し得る標識に結合した1A7を包含する。これらの結合した抗体は、例えば抗GD2の定量または腫瘍イメージングのような検出系において有用である。このような標識は当業者に公知であり、そして放射性同位元素、酵素、蛍光化合物、化学発光化合物、および生物発光化合物を包含するが、これらに限定されない。標識は、1A7と共有結合し得るか、または２次抗体、プロテインＡ、またはビチオン−アビジン複合体のような二次試薬を介して1A7に結合する。
1A7抗体の調製
本発明の1A7抗体は、いくつかの方法で調製され得る。
1A7抗体は、受託番号第HB-11786号でATCCに寄託されたハイブリドーマ、またはそれらの子孫から、最も簡便に得られる。例えば、細胞は適切な培地で培養され得、そして、消費された培地は、抗体の供給源として使用され得る。必要に応じて、マトリックスで被覆したチャンネルまたはビーズおよび細胞同時培養物（co-culture）が、抗体産生細胞の増殖を促進するために含有され得る。大量の抗体を産生するためには、通常は腹水を得るのがより便利である。腹水を生じさせる方法は、一般に、ハイブリドーマ細胞を免疫学的に組織適合性でも免疫寛容でもない哺乳類（特にマウス）に注射する工程を包含する。必要に応じて、哺乳類に適切な組成物（例えば、プリスタン）を予め投与することによって、腹水の産生を促進する。
あるいは、1A7は、本開示で提供される配列データおよびその他の情報を、タンパク質合成の標準的方法と併せて使用して化学的に合成され得る。適切な方法は固相Merrifield技術である。Applied Biosystems. Inc.(Foster City、CA)により製造されるような、自動ペプチド合成装置が市販されている。
1A7はまた、Sambrookら(1989)に記載のような、日常的な組換え法の使用によっても得ることができる。例えば、本明細書中で提供される配列および情報を使用して、1A7の重鎖または軽鎖のいずれかをコードするポリヌクレオチドは、適切な発現ベクター（それは転写のためのコントロール配列（例えばプロモーター）を含有する）にクローニングされ得る。次いで、発現ベクターは、宿主細胞に導入される。宿主細胞を、ポリヌクレオチドが転写され、そしてタンパク質に翻訳されるような適切な条件の下で増殖させる。1A7の重鎖および軽鎖は別に産生され得、次いでジスルフィド結合の再配列により結合し得る。あるいは、1A7の各鎖をコードする別のポリヌクレオチドを有するベクター、または別の転写物として両方の鎖をコードする単一のポリペプチドを有するベクターは、単一の宿主細胞にトランスフェクトされ得、それは次いで、分子全体を産生し得、そして組み立て（assemble）得る。好ましくは、宿主細胞は、分子の正常な炭水化物補足物を供給し得る、より高等な真核細胞である。このように宿主細胞中で産生される1A7は、当該分野の標準的な技術を使用して精製され得る。次いで、これらの方法のいずれかによる1A7の産生に使用するための、1A7をコードするポリヌクレオチドは、1A7を産生するハイブリドーマから得ることができるか、あるいは、本明細書中に提供されるDNA配列から、合成的にまたは組換え的に産生され得る。
抗体を単離する方法は、当該分野において周知である。例えば、HarlowおよびLane(1988)Antibodies:A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory、New Yorkを参照のこと。1A7抗体は、IgG1サブクラスのマウス免疫グロブリンであり、そして、このアイソタイプの免疫グロブリンに適切な任意の技術によって単離され得る。精製方法には、塩析（例えば、硫酸アンモニウムを使用して）、イオン交換クロマトグラフィー（例えば、陽イオン性または陰イオン性の交換カラム上で中性pHにおいて行われ、段階的にイオン強度のグラジエントを増加させながら溶出される）、ゲル濾過クロマトグラフィー（ゲル濾過HPLCを含む）、およびアフィニティー樹脂（例えば、プロテインＡ、プロテインＧ、ハイドロキシアパタイト、および抗免疫グロブリン）上でのクロマトグラフィーが挙げられ得る。1A7はまた、14G2aパラトープを含有するアフィニティーカラム上で、例えば精製Ab1またはAb3の形態で精製され得る。好ましくは、1A7はBALB/c腹水から、プロテイン-A-CL-セファロースTM4Bを使用するクロマトグラフィーと、それに続くDEAE-セファロースTM4Bイオン交換カラム上でのクロマトグラフィーにより精製される。
1A7を個体に投与しようとする場合、1A7は好ましくは少なくとも80％の純度であり、より好ましくは、少なくとも90％の純度であり、さらにより好ましくは、少なくとも95％の純度であり、そして発熱物質および他の混入物がない。この場合は、純度パーセントは、調製物の全タンパク質含量の重量パーセントで算出され、そして、1A7が精製された後の組成物に意図的に添加される成分は包含しない。
1A7抗体の用途
1A7抗体は、多くの目的のために使用され得る。これらは1A7またはGD2に対する抗体応答を誘発する工程、1A7またはGD2に対するＴ細胞応答を誘発する工程、および種々の型の腫瘍を処置する工程を包含する。これらの用途は、後のセクションでより十分に詳しく記載する。
1A7はまた、抗1A7(Ab3)、抗GD2(Ab1'）または14G2a(Ab1)を精製するのに使用され得る。この方法は、抗体を含む生物学的サンプルを、1A7ポリペプチドと接触させる工程、複合体を生産する工程、および複合体からAb3またはAb1を回収する工程を包含する。代表的には、アフィニティーカラム精製のために、1A7ポリペプチドをアフィニティーマトリックスに結合させる。このような方法は、当該分野では日常的であり、本明細書中に詳細に記載する必要はない。
本発明はまた、生物学的サンプルにおいて、抗1A7または抗GD2を検出する方法を包含する。（14G2aと同様に）1A7と交差反応すれば、抗GD2を検出することができる。この活性を有する抗GD2は、GD2関連疾患の経過の間に、自発的に生じ得る。この活性を有する抗GD2は、1A7またはそれらの誘導体による治療過程を受けた個体において、特に自発的に生じ得るようである。これらの方法は、臨床的装置（例えば、個体における抗体レベルのモニタリング）、および抗1A7または抗GD2の商業的産生が所望される工業的装置において適用し得る。
このアッセイ方法は、サンプル中の任意の抗1A7または抗GD2標的抗体と、1A7抗体またはポリペプチドとを、標的と1A7の間で安定な複合体を形成させるのに適切な条件下で接触させる工程、および形成した任意の安定な複合体を検出する工程を包含する。サンプルは、アッセイを行う前に、必要に応じて抗体活性を富化することによって、適切に調製される。インタクトな1A7を使用する場合、一般的には、存在し得る任意の抗マウス免疫グロブリン活性をサンプルから除去することが好ましい。抗マウス免疫グロブリン抗体は、例えば、正常マウスIgGで沈澱させるか、またはマウスIg吸着による吸着によってサンプルから除去され得る。抗マウス免疫グロブリン抗体（特に、Fc領域に特異的な抗体）の結合は、アッセイ試薬を慎重に選択することによって、最小化し得る。1A7のF(ab')2またはFabフラグメントおよびより少ないマウス決定基を有する他の試薬が適切である。
サンプルを適切に調製した後、1A7と任意の存在し得る標的抗体との間で複合体を形成させ得る条件において、サンプルと過剰な1A7の機能的等価物とを混合する。次いで複合体の量を決定し、そして予想される範囲内で、既知量の標的抗体を含有する標準サンプルで形成される複合体と比較する。複合体形成は、免疫沈降または比濁分析により観察され得るが、標識（例えば、125Iのような放射性同位体、ペルオキシダーゼおよびβ-ガラクトシダーゼのような酵素、あるいはフルオレセインのような蛍光色素）によって標識される試薬を使用するために、一般により感受性が高い。
抗体アッセイは、全てが液相において行われ得る。例えば、抗GD2は、標識1A7と混合され得る。あるいは、サンプル中の抗GD2は、1A7上の結合部位に対し、標識抗GD2と競合させるのに使用され得る。一般的には、結合標識物と非結合標識物とが、結合パーセントを定量するために分離される。適切な分離方法には、ゲル濾過クロマトグラフィー、およびサンプルが得られる種の免疫グロブリンに対する抗体での沈澱（必要に応じて、ポリエチレングリコール存在下で）が挙げられる。あるいは、結合標識物と非結合標識物との割合は、例えば、蛍光/クエンチング標識ペア、または酵素/インヒビター標識ペアを使用して、インサイチュで測定され得る。例えば、米国特許第3,996,345号(Ullmanら)を参照のこと。
固相（例えば、ポリエチレン試験管、マイクロタイタープレートウェル、またはマグネティックビーズ）に結合した試薬を使用して捕獲アッセイを行うことは、通常、より便利である。競合型捕獲アッセイにおいて、サンプル中の非標識標的抗体は、1A7に結合するために、標識アナログ試薬と競合する。1A7は、固相支持体に直接結合し得るか、または、例えば、抗免疫グロブリンを使用して後に捕獲され得る。このアッセイにおいて、固相に結合する標識の量は、サンプル中の抗GD2の量に対し反比例の相関がある。
サンドイッチ型捕獲アッセイにおいて、標的抗体は、直接または第２の試薬を介して、固相に結合する1A7により捕獲される。洗浄後、抗GD2は、適切な種の抗免疫グロブリン、あるいは標識が直接的または間接的に結合する第２の1A7抗体を使用して検出される。あるいは、抗免疫グロブリンは固相に結合され得、そして標識1A7はサンドイッチ型アッセイを完結させるのに使用される。使用される抗免疫グロブリンがアイソタイプ特異性である場合、抗体のクラスもまた決定され得る。このアッセイのタイプにおいて、固相に結合する標識の量は、サンプル中の抗GD2の量と正の相関を示した。特異的抗体を測定する他の方法も当該分野で公知であり、そして1A7を特異的試薬として使用することにより抗1A7または抗GD2を測定するのに適用され得る。
1A7はまた、細胞の抗1A7活性または抗GD2活性のレベルを測定するのに使用され得る。１つの例において、1A7は細胞懸濁液中の抗GD2発現細胞（おそらく1A7に結合するレセプターを発現するＢリンパ腫またはＴリンパ腫）を同定するのに使用される。1A7は標識され、そして、細胞懸濁液に混合され得る。あるいは、非標識1A7は細胞と混合され得、続いて標識抗マウス免疫グロブリンまたはプロテインＡのような標識２次試薬と混合され得る。この目的に適切な標識には、放射性標識および蛍光標識が挙げられる。蛍光標識を使用すると、蛍光活性化セルソーターにおいて、抗GD2細胞を非特異性細胞から分離させることもできる。第２の実施例において、抗GD2発現細胞は、組織切片において検出される。代表的には、この組織を固定し、そして適切な培地に包埋し、1A7で重層し、次いで蛍光マーカーまたは酵素マーカーと結合した第２の抗免疫グロブリンで発色する。
1A7のポリヌクレオチド誘導体
本発明は、本明細書中で提供されるポリヌクレオチド配列に基づき、抗イディオタイプ抗体1A7または1A7のフラグメントをコードする種々のポリヌクレオチドを提供する。1A7重鎖または軽鎖可変領域配列の多くの異なる組み合わせを含む種々の実施態様を本セクションに記載する。一般に、本発明の1A7ポリヌクレオチドは、1A7分子に独特である少なくとも１つの特徴をコードする（他の免疫グロブリンと比較して）。好ましくは、この特徴は、ある程度1A7の免疫学的反応性に関連する。
本発明は、少なくとも約70の連続するヌクレオチド、好ましくは少なくとも約80の連続するヌクレオチド、より好ましくは、少なくとも約100の連続するヌクレオチド、そしてさらにより好ましくは、配列番号１に記載の少なくとも約150のヌクレオチドを含む1A7軽鎖可変領域の一部をコードするポリヌクレオチドを包含する。本発明はまた、少なくとも約25の連続するヌクレオチド、好ましくは少なくとも約30の連続するヌクレオチド、そしてさらにより好ましくは、それらのCDR1コード配列の少なくとも約35の連続するヌクレオチドを含む1A7軽鎖可変領域の一部をコードするポリヌクレオチドを包含する。本発明はまた、少なくとも約20の連続するヌクレオチド、好ましくは少なくとも約25の連続するヌクレオチド、そしてさらにより好ましくは、それらのCDR2またはCDR3のコード配列の少なくとも約35の連続するヌクレオチドを含む1A7軽鎖可変領域の一部をコードするポリヌクレオチドを包含する。
本発明はまた、少なくとも約70の連続するヌクレオチド、好ましくは少なくとも約80の連続するヌクレオチド、より好ましくは、少なくとも約100の連続するヌクレオチド、そしてさらにより好ましくは、配列番号３に記載の少なくとも約150のヌクレオチドを含む1A7重鎖可変領域の一部をコードするポリヌクレオチドを包含する。本発明はまた、それらのCDR1コード配列の15の連続するヌクレオチドを含む1A7軽鎖可変領域の一部をコードするポリヌクレオチドを包含する。本発明はまた、少なくとも約20の連続するヌクレオチド、好ましくは少なくとも約25の連続するヌクレオチド、そしてさらにより好ましくは、それらのCDR2またはCDR3のコード配列の少なくとも約35の連続するヌクレオチドを含む1A7軽鎖可変領域の一部をコードするポリヌクレオチドを包含する。
本発明は、1A7の免疫学的活性を有するポリペプチドをコードする、単離された1A7ポリヌクレオチドを包含し、ここで、このポリペプチドは、配列番号２に示す1A7の可変軽鎖の少なくとも５アミノ酸をコードする。別の実施態様では、本発明は、1A7の免疫学的活性を有するポリペプチドをコードする、単離された1A7ポリヌクレオチドを包含し、ここで、このポリヌクレオチドは、配列番号４に示す1A7の可変重鎖の少なくとも５アミノ酸をコードする。このポリヌクレオチド配列は、コドンへの使用、安定性を最適化するため、またはクローニングを容易にするため、あるいは他のいくつかの目的のために設計された変更を有する配列番号１（図１）または配列番号３（図２）に示される配列と同様であり得る。配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列が与えられるとき、そのようなポリヌクレオチドを設計することは、当業者の範囲内である。1A7相補性決定領域（CDR）の少なくとも５アミノ酸をコードするポリヌクレオチドが好ましい。
本発明はまた、機能的に等価な改変体および1A7の誘導体、ならびにそれらの機能的に等価なフラグメントをコードするポリヌクレオチドを包含し、これらは、これらによりコードされるポリペプチドの特性を増強するか、減少させるか、あるいは顕著な影響を与えない。これらの機能的に等価な改変体、誘導体、およびフラグメントは、免疫応答（好ましくは、抗GD2免疫応答）を誘導する能力を示す。例えば、コードされるアミノ酸配列を変化させないようなDNA配列の変化、およびアミノ酸残基の保存的置換、１つまたは数個のアミノ酸の欠失または付加、ならびにアミノ酸アナログによるアミノ酸残基の置換を生じるような変化は、コードされるポリペプチドの特性に顕著に影響を与えない変化である。
本発明の1A7ポリヌクレオチドは、例えば同一の転写ユニット内におけるさらなるコード配列のようなさらなるコード配列、プロモーターリボソーム結合部位およびポリアデニル化部位のような制御エレメント、同一または異なるプロモーターの制御下におけるさらなる転写ユニット、宿主細胞のクローニング、発現、および形質転換を可能にする配列、ならびに本発明の実施態様を提供するのに所望され得るようなこのようないずれかの構築物を包含し得る。
本発明は、少なくとも約15の連続するヌクレオチド、好ましくは少なくとも約20のヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約25の連続するヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約35の連続するヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約50の連続するヌクレオチド、さらにより好ましくは少なくとも約75のヌクレオチド、さらにより好ましくは少なくとも約100のヌクレオチド、さらにより好ましくは少なくとも約200のヌクレオチド、そしてさらにより好ましくは少なくとも約300のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドを包含し、このポリヌクレオチドは、1A7の軽鎖または重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドと安定なハイブリッドを形成するが、本出願の出願の時において公知である他の免疫グロブリンコード領域とはハイブリッドを形成しない。この試験には、任意の組み合わせの条件を用い得るが、ただし、試験ポリヌクレオチドが必要とされる特異性を示す、少なくとも１組の条件が存在する。好ましくは、試験ポリヌクレオチドが結合する1A7コード配列は、配列番号１および３に示される配列である。公知の免疫グロブリン配列は、1A7の配列と同様の階層（hierarchy）に属するので、本試験は、試験ポリヌクレオチドの1A7配列とのハイブリダイゼーションと、最も密接に関連する配列とのハイブリダイゼーションとを比較することによって行われ得る。適切なものとして、配列番号１または３に最も密接に関連する配列の約10のパネルが好ましい。試験ポリペプチドが二重鎖を形成すべきでない配列は、配列番号７〜16に記載の軽鎖可変領域コード配列、および配列番号17〜26に記載の重鎖可変領域コード配列である。
ハイブリダイゼーション反応は異なる「ストリンジェンシー」の条件下で行われ得る。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーを増大させる条件が公表されている。例えば、SambrookおよびManiatisを参照のこと。関連する条件の例としては、（ストリンジェンシーを増加する順に）：25℃、37℃、50℃および68℃のインキュベーション温度；10×SSC、6×SSC、1×SSC、0.1×SSC（ここで、SSCは0.15Ｍ NaClおよび15mMクエン酸緩衝液）の緩衝液濃度、および他の緩衝系を用いるそれらの等価物；０％、25％、50％および75％のホルムアミド濃度；５分間〜24時間までのインキュベーション条件；１回、２回またはそれを超える洗浄工程；１、２または15分の洗浄インキュベーション時間；および6×SSC、1×SSC、0.1×SSC、または脱イオン水の洗浄溶液が挙げられる。
「Tm」は、ワトソン−クリック塩基対合によって逆平行に水素結合した相補鎖より作製されたポリヌクレオチド二本鎖の50％が、実験条件下で一本鎖に解離する摂氏度の温度である。Tmは以下の標準式に従って予測され得る：
Tm＝81.5+16.6log[Na+]+0.41(%G/C)-0.61(%F)-600/L
ここで、[Na+]はモル／Ｌで表したカチオン（通常ナトリウムイオン）濃度であり；（％G/C）は二本鎖における全残基のパーセントとしてのＧおよびＣ残基の数である；（％Ｆ）は溶液中のホルムアミドパーセント（重量/容量）であり；そしてＬは二本鎖の各鎖におけるヌクレオチドの数である。
1A7のフラグメントをコードする有用な1A7ポリヌクレオチドは（例えば、配列番号１または配列番号３に基づいて）ポリヌクレオチドフラグメントを生じさせ、そして目的の機能について、それによりコードされるポリペプチドを試験することによって同定することができる。あるいは、特定のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドフラグメントを調製し、そして目的の機能を試験し得る。あるいは、所望の特性を有する、1A7ポリペプチドがあれば、ポリヌクレオチドは、それをコードするように設計され得る。
1A7ポリマー、融合タンパク質、ヒト化免疫グロブリン、単一鎖可変領域、および他の目的の特定のポリペプチドに対する領域をコードするポリヌクレオチドは、これらの全ての実施態様に包含される。これらのポリペプチドについては、後のセクションに記載する。
本発明はまた、検出可能な標識と共有結合したポリヌクレオチドを提供する。このようなポリヌクレオチドは、例えば、関連のヌクレオチド配列の検出用プローブとして有用である。
1A7ポリヌクレオチドの調製:
本発明のポリヌクレオチドは、化学合成、組換えクローニング法、PCR、またはそれらの任意の組み合わせを用いて得ることができる。
化学的ポリヌクレオチド合成の方法は、当該分野で周知であり、本明細書中に詳細に記載する必要はない。当業者は、所望のポリヌクレオチドを得るために、DNA合成器を使用するか、または市販のサービスに注文することによって、本明細書中に提供する配列データを使用し得る。
あるいは、1A7ポリヌクレオチド配列は、1A7抗体を産生する細胞株、1A7クローニングベクター、または1A7発現ベクターから得ることができる。所望の配列をコードするRNAまたはDNAは、単離され得、増幅され得、そして標準的な組換え技術により処理され得る。このような技術には、制限ヌクレアーゼによる消化、およびポリメラーゼ連鎖反応（PCR）による増幅、またはそれらの適切な組み合わせが挙げられる。PCR技術は、米国特許第4,683,195号、同第4,800,159号、同第4,754,065号および同第4,683,202号、ならびにPCR: The Polymerase Chain Reaction, Mullisら編，Birkauswer Press, Boston(1994)に記載されている。所望の配列を含むポリヌクレオチドを適切なベクターに挿入し得、次いで、このベクターを、複製および増幅のための適切な宿主細胞に導入し得る。ポリヌクレオチドは当該分野で公知の任意の手段によって宿主細胞に挿入し得る。直接取り込み、エンドサイトーシス、トランスフェクション、接合またはエレクトロポレーションにより外因性ポリヌクレオチドを導入することによって細胞を形質転換する。一旦導入すれば、外因性ポリヌクレオチドは非組込みベクター（例えば、プラスミド）として細胞内に維持され得るか、または宿主細胞ゲノムに組み込まれ得る。増幅されたDNAは、標準的な方法によって宿主細胞から単離され得る。例えば、Sambrookら(1989)を参照のこと。RNAもまた、形質転換された宿主細胞から得ることができ、これはDNA依存性RNAポリメラーゼを使用して得ることができる。
ワクチンとして使用する場合、Hornら((1995) Human Gene Therapy 6:565-573）（これは、投与に適した医薬用のプラスミドDNAを生産する）の方法により、1A7ポリヌクレオチドを含むプラスミドが好適に調製される。
1A7ポリヌクレオチドを含むクローニングベクターおよび発現ベクター
本発明は、さらに、1A7ポリヌクレオチドを含む種々のベクターを含む。これらのベクターは組換えポリペプチドの発現のためにならびに1A7ポリヌクレオチドの供給源として使用され得る。クローニングベクターは、それらが含有する1A7ポリヌクレオチドの複製コピーを得るために、または将来の回収のために、寄託所にポリヌクレオチドを保存する手段として使用され得る。発現ベクター（およびこれらの発現ベクターを含む宿主細胞）を用いて、それらが含有するポリヌクレオチドから生産されるポリペプチドを得ることができる。それらはまた、遺伝子治療におけるように、個体において1A7ポリペプチドを発現することが望ましく、従ってポリペプチドを合成し得るインタクトな細胞を有する場合に使用され得る。適切なクローニングベクターおよび発現ベクターには、当該分野で公知の任意ベクター、例えば、細菌発現系、哺乳動物発現系、酵母発現系および昆虫発現系で使用されるベクターが挙げられる。特異的ベクターおよび適切な宿主細胞は当該分野で公知であり、本明細書中に詳細に記載する必要はない。例えば、GacesaおよびRamji, Vectors, John Wiley & Sons (1994)を参照のこと。
クローニングベクターおよび発現ベクターは、代表的には、選択マーカー（例えば、ベクターで形質転換した宿主細胞の生存または増殖に必要なタンパク質をコードする遺伝子）を含むが、このようなマーカー遺伝子は、宿主細胞に同時導入された別のポリヌクレオチド配列上に保有され得る。選択遺伝子が導入されているこれらの宿主細胞のみが、選択的条件下で増殖する。典型的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質または他のトキシン物質（例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセート）に対して耐性を与えるか；（ｂ）栄養要求性の欠陥を相補するか；または（ｃ）複合培地から利用できない重要な栄養を補給するかのいずれかである。適切なマーカー遺伝子の選択は、宿主細胞に依存し、そして異なる宿主用の適切な遺伝子は、当該分野で公知である。クローニングベクターおよび発現ベクターはまた、典型的には、宿主によって認識される複製系を含有する。
適切なクローニングベクターは標準的な技術に従って構築され得るか、または当該分野で入手可能な非常に多数のクローニングベクターから選択され得る。選択されたクローニングベクターは、用いようとする宿主細胞に従って変化し得る一方、有用なクローニングベクターは、一般に、自己複製する能力を有するか、特定の制限エンドヌクレアーゼに対する単一の標的を保有し得るか、またはこのベクターを含有するクローンを選択するにおいて使用され得るマーカー用の遺伝子を保有し得る。適切な例としては、プラスミドおよび細菌性ウイルス（例えば、pUC18、mp18、mp19、pBR322、pMB9、ColE1、pCR1、RP4、ファージDNA、ならびにpSA3およびpAT28のようなシャトルベクター）が挙げられる。これらのクローニングベクターおよび他の多くのクローニングベクターは、BioRad、Stratagene、およびInvitrogenのような供給業者から入手可能である。
発現ベクターは、一般に、目的の1A7ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する複製可能なポリヌクレオチド構築物である。1A7ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、プロモーター、エンハンサーおよびターミネーターのような適切な転写制御エレメントに作動可能に連結される。発現（すなわち、翻訳）のために、リボソーム結合部位、翻訳開始部位、および停止コドンのような１つ以上の翻訳制御エレメントもまた、通常必要とされる。これらの制御エレメント（転写エレメントおよび翻訳エレメント）は、1A7遺伝子に由来し得るか、またはそれらは異種であり得る（すなわち、他の遺伝子または他の生物に由来し得る）。また、1A7ポリペプチドが細胞膜を通過すること、またはそこに止まることを可能にするために、あるいは細胞から分泌させるために、シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチド配列が包含され得る。酵母、トリおよび哺乳動物細胞を含む真核生物細胞での発現に適切な多数の発現ベクターが当該分野で知られている。発現ベクターの１つの例は、pcDNA3（Invitrogen, San Diego、CA)であり、ここでは、転写はサイトメガロウイルス（CMV）初期プロモーター／エンハンサーによって駆動される。このベクターはまた、目的の1A7ポリヌクレオチドの挿入のための複数の制限酵素の認識部位を含む。発現ベクター（系）の別の例は、バキュロウイルス／昆虫系である。
目的のポリヌクレオチドを含むベクターは、塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、DEAE-デキストラン、または他の物質を使用するエレクトロポレーション、トランスフェクション；マイクロプロジェクタイルボンバードメント(microprojectile bombardment)；リポフェクション；および感染（ここでベクターは以下に記するワクシニアウイルスのような感染性因子である）を含む任意の多くの適切な手段によって宿主細胞に導入され得る。ベクターまたは1A7ポリヌクレオチドを導入する手段の選択は、しばしば、宿主細胞の性質に依存する。
一旦、適切な宿主細胞、例えばE. coliまたはCOS-7に導入されると、本明細書中に記載の任意のアッセイを用いて1A7ポリペプチドの発現が測定され得る。例えば、1A7ポリペプチドの存在は、培養上清（1A7ポリペプチドが分泌される場合）または細胞溶解物のRIAまたはELISAによって検出され得る。
1A7ポリヌクレオチドに特に有用な発現ベクターは、1A7ポリヌクレオチド配列を含むワクシニアウイルスであり、これはまたワクチン調製において使用され得る（Moss(1991) Science 252:1662-1667）。1A7ポリペプチドフラグメントを含む1A7ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列をワクシニアに導入するために、目的のポリヌクレオチド配列を、まず、複製に必須でないワクシニアDNAに相同な隣接配列と共にワクシニアウイルスプロモーターを含むプラスミドに挿入する。次いで、プラスミド含有細胞をワクシニアに感染させ、これにより、プラスミドとウイルスとの間の低レベルの相同組換えがもたらされ、ワクシニアプロモーターおよび1A7ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列がワクシニアウイルスのゲノムに移入される。代表的には、1A7ポリヌクレオチドはウイルスtk（チミジンキナーゼ）遺伝子に挿入される。tk部位への挿入により、野生型と比較してウイルスは10,000倍を越えて減弱される（Flexnerら(1980)Vaccine 88（Cold Spring Harbor Laboratory)、179-184）。組換えウイルスは、tk-表現型によって同定される。好ましくは、1A7ポリヌクレオチドの発現は、ワクシニア初期／後期プロモーター（7.5K）の制御下であり、それにより、得られる1A7ポリペプチドは、ウイルスのライフサイクルを通じて感染細胞において発現され得る。しかし、pH６または合成プロモーターのような当該分野で公知の他のプロモーターが使用され得る。1A7ポリペプチドの発現は、組換えワクシニアで感染させた細胞または生存組換えワクシニアウイルスで免疫化された個体で生じる。限定されないが、WR、ALVACおよびNYVACを含むワクシニアのいくつかの株のうちの任意の１つが使用され得る。
本発明のワクシニアベクターは、1A7ポリペプチドをコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含有し得る。ワクシニアベクターはまた、所望の結果を増強し、容易にし、または調節する他のポリペプチド（例えば、限定されないが、IL-2、IL-4およびGM-CSFを含むリンホカイン）をコードするポリヌクレオチド配列を含み得る。好ましいリンホカインは、GM-CSFである。好ましいGM-CSF構築物は、３’非翻訳領域由来のAU-リッチエレメントおよびヘアピンループを形成し得る５’非翻訳領域における配列を排除したものである。また、scFvs、キメラ、およびポリマー（以下に記載）のような1A7ポリペプチドを含む組換え1A7変異体をコードするワクシニアベクターが本発明に包含される。
1A7ポリヌクレオチドで形質転換した宿主細胞
本発明の他の実施態様は、1A7ポリヌクレオチド、および1A7ポリヌクレオチド配列を有する上述のようなベクターで形質転換された宿主細胞である。原核生物および真核生物の両方の宿主細胞が使用され得る。原核生物宿主としては細菌細胞（例えば、E. coliおよびマイコバクテリア）を包含する。真核生物宿主の中には、酵母、昆虫、トリ、植物および哺乳動物細胞がある。宿主系は当該分野で公知であり、本明細書中に詳細に記載する必要はない。哺乳動物宿主細胞の１つの例は、European Collection of Cell Cultures(英国)から得ることができるNS0である。例えば、CMVプロモーターによって駆動される、プラスミドでのNS0細胞のトランスフェクション、その後のグルタミンシンテターゼを用いるこのプラスミドの増幅により、タンパク質産生のための有用な系が提供される（Cockettら(1990)Bio/Technology 8:662-667）。
本発明の宿主細胞は、とりわけ、1A7ポリヌクレオチドの貯蔵場所としてまたは1A7ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの産生のためのビヒクルとして使用され得る。これらはまた、1A7ポリペプチドのインビボでの発現のためのビヒクルとして使用され得る。
1A7ポリヌクレオチドの用途
本発明のポリヌクレオチドはいくつかの用途を有する。1A7ポリヌクレオチドは、例えば、1A7または1A7フラグメントの産生のための発現系において有用である。それらはまた、当業者に周知の方法を用いて、サンプル中の1A7ポリヌクレオチドまたは関連の配列の存在についてアッセイするためのハイブリダイゼーションプローブとしても有用である。さらに、1A7ポリヌクレオチドはまた、所望のポリヌクレオチドの増幅を生じるためのプライマーとしても有用である。本発明のポリヌクレオチドはまた、ワクチンを含む薬学的組成物および遺伝子治療において有用である。
1A7ポリヌクレオチドはまた、1A7をコードする配列を検出するためのハイブリダイゼーションプローブとして使用され得る。適切なサンプルは、遺伝子治療における使用のために、エクソビボで形質転換された細胞を含む。１つの例示において、DNAまたはRNAがサンプルから抽出され、そして必要に応じてゲル上で泳動し、および/または制限ヌクレオアーゼで消化される。処理されたサンプルのポリヌクレオチドは、一般的には、洗浄に適切な培地に移される。次いで、サンプルが、適合する1A7配列を含む場合、安定な二重鎖の形成を可能にする条件下で、サンプルのポリヌクレオチドを1A7ポリヌクレオチドプローブと接触させる。形成されるいずれかの安定な二重鎖は、任意の適切な方法により検出される。例えば、1A7ポリヌクレオチドプローブは、標識された形態で供給され得、そして、洗浄後のサンプルと共に標識が残存することは、形成された安定な二重鎖の量を直接反映している。第２の例示において、ハイブリダイゼーションはインサイチュで行われる。適切に調製された組織サンプルは、標識1A7プローブで重層され、そこに含まれる1A7コード配列の位置を示す。
短い1A7ポリヌクレオチドもまた、PCR反応のプライマーとして使用され得、特に、プライマーとハイブリダイズする領域を含む、より長い配列を増幅するのに使用され得る。これはさらなる遺伝子操作のためのポリヌクレオチドを産生するために、先に行われ得る。これはまた、1A7をコードするポリヌクレオチドが、例えば診断目的のサンプル中に存在するか否かを決定するのに、分析的に行われ得る。
本発明のポリヌクレオチドは、発現系において1A7ポリペプチド、インタクトな1A7、下記のような1A7の組換え型を産生するのに使用され得る。
1A7ポリヌクレオチドの別の用途は、ワクチンおよび遺伝子治療にある。一般的な原理は、そこにコードされたポリペプチドの発現を促進または減弱のいずれかをするようにポリヌクレオチドを投与することである。従って、本発明は、免疫応答を誘導する方法、および有効量の1A7ポリヌクレオチドを個体に投与する工程を包含する治療方法を包含する。これらの方法において、1A7ポリペプチドをコードする1A7ポリヌクレオチドを、直接または1A7ポリヌクレオチドでトランスフェクトした細胞を介するかのいずれかで個体に投与する。好ましくは、1A7ポリヌクレオチドは環状プラスミドの形態であり、好ましくは超らせん配置の形態である。好ましくは、1A7ポリヌクレオチドは、細胞内で複製する。従って、1A7ポリヌクレオチドを、標的組織型の細胞において本質的に活性である異種プロモーターのような適切なプロモーターに作動可能に連結させる。好ましくは、一旦細胞核に入れると、プラスミドは環状の非複製エピソーム分子として存続する。例えば、より免疫原性であるかまたは所望のHLAモチーフを有するＴ細胞エピトープを含む分子を提供するために、プラスミド構築物を用いてインビトロ変異誘発を行い得る。
1A7ポリヌクレオチドを含むプラスミドが真核生物細胞において発現され得るか否かを決定するために、例えばCOS-7細胞、CHO細胞、またはHeLa細胞のような真核生物細胞は、プラスミドでトランスフェクトされ得る。次いで、1A7ポリペプチドの発現を、イムノアッセイ（例えば、ウェスタンブロット）によって測定する。得られた1A7ポリペプチドが、例えば標的エピトープまたは酵素標識のようなタグ（tag）を用いて融合されるようにプラスミドを構築することにより、より小さい1A7ポリペプチドの発現が検出され得る。さらに、ペプチドを精製し、そして本明細書中に記載の機能アッセイの１つを行うことによって、発現された1A7ポリペプチドの特徴付けが達成され得る。
遺伝子治療の１つの様式において、本発明のポリヌクレオチドは、エクソビボで細胞の遺伝子を改変するのに使用される。このストラテジーにおいて、ドナーから取り出した細胞または細胞株から得られた細胞は、７ポリペプチドをコードするベクターでトランスフェクトまたは形質導入され、次いでレシピエントに投与される。トランスフェクションに適切な細胞には、末梢血単核細胞が挙げられる。
遺伝子治療の他の様式において、本発明のポリヌクレオチドは、インビボで細胞の遺伝子を改変するのに使用される。この目的は、1A7またはGD2の抗体応答の誘発、1A7またはGD2のＴ細胞応答の誘発、および種々の型のガンの処置であり得る（しかし、これらに限定されない）。これらの用途は、後のセクションで、より十分に詳細を記載する。
1A7のポリペプチド誘導体
本発明は、1A7の可変領域の少なくとも一部を含むポリペプチドフラグメントを包含する。好ましいフラグメントは、1A7の免疫学的活性を有するフラグメントである。
他の免疫グロブリンと実質的に異なるアミノ酸配列を含むフラグメント、およびCDRを含むフラグメントもまた好ましい。１つの実施態様では、本発明は、少なくとも25の連続するアミノ酸、より好ましくは、配列番号２に記載の30の連続するアミノ酸、またはそれらのCDR1の５つの連続するアミノ酸、あるいは少なくとも７つの連続するアミノ酸、好ましくはそれらのCDR2またはCDR3の少なくとも９つの連続するアミノ酸を含む、1A7重鎖可変領域のポリペプチドフラグメントを包含する。本発明はまた、少なくとも25の連続するアミノ酸、より好ましくは配列番号４に記載の30の連続するアミノ酸、またはそれらのCDR2の７つの連続するアミノ酸、あるいは少なくとも８つの連続するアミノ酸、好ましくはそれらのCDR1またはCDR3の少なくとも10の連続するアミノ酸を含む、1A7軽鎖可変領域のポリペプチドフラグメントを包含する。
1A7ポリペプチドフラグメントのサイズは、所望の機能を供給するのに必要とされる唯一の最小のサイズであり得る。それは必要に応じて、さらなる配列を含み得、それは所望により1A7に固有のまたは異なる供給源由来のものであってもよい。1A7フラグメントは、1A7可変領域配列由来の５つの連続するアミノ酸のみを含み得る。1A7軽鎖または重鎖可変領域由来の７アミノ酸、より好ましくは約10アミノ酸、より好ましくは約15アミノ酸、より好ましくは約25アミノ酸、より好ましくは約50アミノ酸、より好ましくは約75アミノ酸を含むポリペプチドもまた包含される。1A7軽鎖または重鎖の全可変領域を含むポリペプチドは、さらにより好ましい。
本発明は、1A7に機能的に等価であるか、または改変されているが測定可能な1A7の免疫学的活性を有する、修飾された1A7ポリペプチドを含む。改善された1A7の免疫学的活性を有するフラグメントは好ましい。修飾されたポリペプチドの例には、アミノ酸残基の保存的置換、およびアミノ酸の１つ以上の欠失または付加が挙げられ、機能的活性に顕著に有害な変化を及ぼさない。
この１つの例には、原型の1A7配列と比較して、１つ以上のアミノ酸置換を包含する1A7ポリペプチドが挙げられる。置換は、１つ以上のアミノ酸の改変または修飾から、領域の完全な再設計（redesign）（例えば、可変領域）までの範囲に及び得る。アミノ酸置換は、存在する場合、好ましくはペプチドの折り畳みまたは機能的特性に有害に影響を及ぼさないような、保存的置換である。保存的置換が行われ得る、機能的に関連するアミノ酸のグループは、グリシン/アラニン；バリン/イソロイシン/ロイシン；アスパラギン/グルタミン；アスパラギン酸/グルタミン酸；セリン/トレオニン/メチオニン；リジン/アルギニン；およびフェニルアラニン/チロシン（tryosine）/トリプトファンである。本発明のポリペプチドは、グリコシル化または未グリコシル化の形態で存在し得、翻訳後修飾され得（例えば、アセチル化、およびリン酸化）、あるいは合成的に修飾され得る（例えば、標識基の付加）。
本発明はまた、１つ以上の1A7ポリペプチドを含む融合タンパク質を包含する。1A7融合ポリペプチドは、例えば、化学的合成によって、またはペプチド領域が所望の関係でコードされる、ポリヌクレオチドの作製および翻訳によって調製され得る。あるいは、融合タンパク質は、タンパク質の異なる機能領域に対するコード領域を含むプラスミドで同時トランスフェクトすることにより、構築される発現系において提供され得る。
融合ポリペプチドに含まれるのに有用な異種配列は、宿主細胞からの分泌を提供する配列を含み、免疫学的反応性を増強させるか、あるいは当該ポリペプチドのイムノアッセイ支持体またはワクチンキャリアへのカップリングを容易にする。１つの例として、スタフィロコッカスエンテロトキシンＡ（SEA）（Dohlstenら、(1994)Proc. Natl.Acad.Sci.USA 91:8945-8949）のような細菌性「スーパー抗原」がある。好適な実施例において、1A7ポリペプチドは生物学的反応修飾物質（特に、免疫原性を増強し得るサイトカイン）と融合される。生物学的反応修飾物質の例には、サイトカイン、ならびにGM-CSF、インターロイキン-2（IL-2）、インターロイキン-4（IL-4）、およびγ-インターフェロンのようなリンホカインが挙げられる。特にGM-CSFおよびIL-2が好ましい。この好ましい編成は、免疫グロブリン重鎖のC-末端に融合しようとするサイトカインエフェクターユニットのためのものである。
1A7軽鎖および1A7重鎖の両方を含む1A7ポリペプチド誘導体は、別の軽鎖および重鎖として形成され得、次いで組み立てられ得るか、あるいは両方の鎖に対する発現系によりインサイチュで組み立てられることにより、形成され得る。このような発現系は、軽鎖および重鎖に対する別個の転写可能な領域を含むプラスミドでトランスフェクトするか、あるいは各鎖に対するプラスミドで同一の細胞を同時トランスフェクトすることにより、産生され得る。第３の方法では、重鎖をコードする領域を有する適切なプラスミドを、重鎖消失変異体にトランスフェクトする。例えば、重鎖消失変異体は2×107個の1A7細胞を供給者の指示に従ってフルオレセイン標識ウサギ抗マウスIgG（Ｈ鎖特異的、DAKO  Corporation, Carpinteria, CA)で処理することによって得ることができる。染色したおよび染色されていない細胞集団をフルオレセイン活性化セルソーターで分析する。未染色細胞を滅菌チューブに回収し、そして限界希釈によって１細胞／ウェルにて96ウェルプレートに入れる。次いで、培養上清を、ヤギ抗マウスIgG(重鎖特異的）およびヤギ抗マウスκを用いるELISAによってアッセイする。κポジティブおよびIgGネガティブ表現型を有するクローンを少なくとも３回サブクローニングして安定な1A7(-H)変異体を得る。推定重鎖消失変異体(1A7(-H))クローン由来のmRNAを単離し得、そして軽鎖可変領域cDNAの配列を決定する。1A7VHについてのmRNAの逆方向PCRを、２セットの5'-および3'-プライマーで行い、1A7(-H)cDNAのクローニングに用いる（実施例２）。重鎖消失変異体は検出可能なDNAバンドを生じるべきでない。次いで、これらの細胞のトランスフェクションは、適切な重鎖プラスミド構築物を用いて進行し得る。
本発明はまた、重鎖および軽鎖の１対が第１の抗体から得られ、重鎖および軽鎖の他の１対が、別の第２の抗体から得られる、ハイブリッド抗体を包含する。本発明の目的のために、軽鎖および重鎖の１対は1A7から得られる。１つの実施例において、各軽-重鎖対は、GD2の異なるエピトープに結合する。このようなハイブリッドはまた、キメラの重鎖または軽鎖を用いて形成され得る。
別の実施態様は、1A7のヒト化型である。「ヒト化」抗体は、よりヒト免疫グロブリンに類似させるために、少なくとも一部の配列をその最初の形態から改変した抗体である。１つの型において、重鎖および軽鎖の定常領域は、ヒト配列で置き換えられる。これは、1A7可変領域および異種免疫グロブリン定常領域を含む融合ポリペプチドである。別の型において、CDR領域は1A7アミノ酸配列を含む一方、可変フレームワーク領域がヒト配列に変換される。例えば、欧州特許第0329400号を参照のこと。第３の型において、可変領域は、ヒトおよびマウス可変領域の共通配列を設計することによって、ならびに共通配列の間で異なる、CDR以外の残基を変換することにより、ヒト化される。
本発明により意図される、別の1A7誘導体は、1A7重鎖または軽鎖がさらなる特性を提供するように改変された抗体である。例えば、アミノ酸の配列を変化させると、得られる1A7ポリペプチドの免疫原性が大きくなり得る。この変化は１つ以上のアミノ酸の変化から領域（例えば、定常領域ドメイン）の完全な再設計までの範囲にわたる。意図される変化は、補体結合、膜レセプターとの相互作用、および他のエフェクター機能に影響する。組換え1A7抗体を設計して、エフェクター細胞への（リンホカインのような）物質の特異的送達を助けることもできる。また、種々の免疫グロブリンドメインが、天然に見出される以外の配列で配置されるタンパク質も意図される。
また、本発明は、1A7の単一鎖可変領域フラグメント（「scFv」）を含む。単一鎖可変領域フラグメントは、短い連結ペプチドを用いることによって、軽鎖および／または重鎖可変領域を連結することによって作製される（Birdら(1988)Science 242:423-426）。十分な可撓性および長さを有する任意のペプチドがscFv中でリンカーとして使用され得る。通常、リンカーは免疫原性をほとんどまたは全く有しないように選択される。連結ペプチドの例は(GGGGS)3であり、これは、１つの可変領域のカルボキシ末端と別の可変領域のアミノ末端との間の約3.5nmを架橋する。他のリンカー配列もまた使用され得、そしてさらなる機能（例えば、薬剤、または固体支持体に結合する手段）を提供し得る。
重鎖または軽鎖の全体または任意の部分が、任意の組み合わせで使用され得る。代表的には、全可変領域がscFvに含まれる。例えば、軽鎖可変領域は重鎖可変領域に連結され得る。あるいは、軽鎖可変領域の一部を重鎖可変領域またはその一部に連結し得る。重鎖可変領域が1A7由来であり、そして軽鎖可変領域が別の免疫グロブリン由来であるscFvもまた意図される。また、２つの相を有するscFv（ここで、１つの成分が1A7ポリペプチドであって、もう１つの成分がＴ細胞エピトープのような異なるポリペプチドである）を構築することも可能である。
scFvは、任意の順序（例えばVH--(リンカー)--VLまたはVL--(リンカー)--VH）で組み立て得る。特定の発現系におけるこれらの２つのコンフィグレーションの発現レベルに差が認められ得るが、この場合、これらのうちの１つが好ましくあり得る。（Ｘ)--(リンカー)--(Ｘ)--(リンカー)--(Ｘ)（ここで、Ｘは1A7ポリペプチド、または1A7ポリペプチドと他のポリペプチドとの組合せである）のようなタンデムscFvも作製され得る。別の実施態様では、単一鎖1A7抗体ポリペプチドは、リンカーポリペプチド、または僅かに短い非可撓性のリンカーを有さない。可能なコンフィグレーションは、VL--VHおよびVH--VLである。この連結は、鎖中でVLとVHの間の相互作用を可能にするためには短すぎ、そして鎖は各末端で、VL/VH抗原結合部位とホモダイマーを形成する。このような分子は、当該分野において「二価抗体（diabodies）」と呼ばれる。
単一鎖可変領域は、組換えまたは合成のいずれかで生産し得る。scFvの合成的生産では、自動合成装置を使用し得る。scFvの組換え生産では、scFvをコードするポリヌクレオチドを含有する適切なプラスミドを、酵母、植物、昆虫または哺乳動物細胞のような真核細胞、あるいはE. coli.のような原核細胞のいずれかの適切な宿主細胞に導入し得、そして発現したタンパク質を、標準的なタンパク質精製技術を用いて単離し得る。
1A7 scFvの生産に特に有用な系は、E. coli.におけるプラスミドベクターpET-22b(+)（Novagen, Madison, WI)である。pET-22b(+)は、発現したタンパク質を適切なアフィニティー樹脂上で精製することを可能にする、６つの連続するヒスチジン残基からなるニッケルイオン結合ドメインを含有する。使用し得るベクターの別の例は前記のpcDNA3（Invitrogen, San Diego, CA)である。
発現の条件は、scFvポリペプチドが最適の三次構造を保証し得るような条件とすべきである。使用するプラスミド（特に、プロモーターの活性）および宿主細胞に応じて、生産の速度を調節する必要があり得る。例えば、より弱いプロモーターの使用、またはより低温での発現が、原核細胞系において適切に折り畳まれたscFvの生産を最適化するのに必要であり得る。あるいは、真核細胞においてscFvを発現することが好ましくあり得る。
好ましい単一鎖可変領域は、配列番号２に記載の少なくとも10の連続するアミノ酸および配列番号４に記載の少なくとも10の連続するアミノ酸（特に、ここで配列番号２に記載のアミノ酸および配列番号４に記載のアミノ酸は５〜20アミノ酸のリンカーポリペプチドで連結される）、またはモノクローナル抗体1A7の軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含む。
また、本発明は、複数の1A7ポリペプチドを含有する、1A7ポリペプチドのポリマー形態を包含する。１つの実施態様は、必要に応じてキャリアに結合する、1A7ポリペプチドの線状ポリマーである。これらの線状ポリマーは、単一1A7ポリペプチド、または異なる1A7ポリペプチドとの組合せの複数コピーを含み得、そしてタンデム1A7ポリペプチドまたは他のアミノ酸配列と区別される1A7ポリペプチドを有し得る。別の実施態様は、1A7多抗原性ペプチド（MAP）である。MAPは、放射状に分岐するリジン樹状突起を有する小さな免疫学的不活性コアを有し、そのリジン樹状突起上に多数の1A7ポリペプチドが共有結合している。Posnettら(1988) J. Biol. Chem. 263:1719-1725; Tam(1989) Meth. Enz. 168:7-15を参照のこと。その結果は、コアに対する1A7ポリペプチドの高いモル比を有する大きなマクロ分子である。MAPは有用で効果的な免疫原であり、そしてイムノアッセイに有用な抗原である。1A7 MAPを産生するためのコアは、標準的なペプチド合成技術により作製され得るか、または市販されている（Quality Contorolled Biochemicals,Inc.、Hopkinton、MA）。典型的なコアマトリックスは、３つのレベルのリジンおよび８アミノ酸からなる。
本発明の別の実施態様では、1A7ポリペプチドの免疫原性を、発現系で調製することによって増強し得、この系では、例えば、1A7ポリペプチドがＢ型肝炎ウイルスと会合するような粒子形成タンパク質でポリペプチドが組み立てられる。例えば、米国特許第4,722,840号を参照のこと。1A7ポリペプチドが粒子形成タンパク質コーディング配列に直接連結する構築物は、抗GD2応答に関して免疫原性であるハイブリッドを生じる。ベクターはまた、例えば、プレＳペプチドのような免疫原性HBVエピトープを含み、そして、HBVに対する応答を刺激する。このような発現系は、酵母または哺乳動物細胞を含む真核細胞内で提供され得る。
別の実施態様において、1A7ポリペプチドをキャリア分子に結合し得る。これは抗GD2を誘発するための適切なエピトープを含む1A7ペプチドに好適であるが、免疫原性であるには小さすぎる。当該分野で公知のいずれかの結合方法が使用され得る。宿主に対し有害ではない任意のキャリアを使用し得る。適切なキャリアは、タンパク質；ポリサッカライド（ラテックス機能化セファロース(latex functionalized Sepharose)、アガロース、セルロース、セルロースビーズなど）；ポリマー性アミノ酸（ポリグルタミン酸、ポリリジンなど）：アミノ酸コポリマー；および不活性ウイルス粒子、またはサルモネラのような弱毒化細菌のような典型的に大きくかつゆっくりと代謝されるマクロ分子である。特に有用なキャリアタンパク質は、血清アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン（KLH）、特定の免疫グロブリン分子、チログロブリン、オボアルブミン、破傷風トキソイドである。KLHは特に好ましい。
本発明の1A7ポリペプチドは、多くの方法で同定され得る。例えば、軽鎖および重鎖の可変領域は、一緒になって可変領域アミノ酸配列全体にわたる一連の短いポリペプチドを調製することによって、スクリーニングし得る。長さが20または50のアミノ酸である一連のポリペプチドを用いて、各1A7可変領域は、有用な機能特性について調査され得る。また、可能性として興味深い、D2の形状を有するポリペプチド、またはイディオタイプ-抗イディオタイプ接触に関与するようなポリペプチドを同定するための、タンパク質配列のコンピューター解析も可能である。
当業者は、所望の特性を有する他の1A7ポリペプチドを得るため、本セクションに記載の1A7の種々の適用は種々の様式で組み合わせられ得るということを、容易に理解する。例えば、修飾された残基を有する1A7ポリペプチドは、MAPに含まれ得る。別の例では、1A7 scFvは、IL-2のようなサイトカインに融合される。全てのこのような組み合わせは、本発明において意図される。
1A7ポリペプチドの調製
本発明のポリペプチドは、1A7抗体のタンパク質分解を含む任意の適切な手順、組換え方法、または化学合成により作製され得る。
1A7ポリペプチド、特に約50までのアミノ酸の短いポリペプチドは、本明細書中に提供される配列データおよび他の情報に基づいて、化学合成によって簡便に作製される。
全体の分子のフラグメントである特定の1A7ポリペプチドは、インタクトな1A7の酵素的切断から代替的に調製され得る。タンパク質分解酵素の例としては、トリプシン、キモトリプシン、ペプシン、パパイン、V8プロテアーゼ、サブチリシン、プラスミン、およびトロンビンが挙げられるが、これらに限定されない。インタクトな1A7は、１つ以上のプロテイナーゼと共に、同時にまたは連続してインキュベートされ得る。あるいは、またはさらに、インタクトな1A7はジスルフィド還元剤で処理され得る。次いで、ペプチドは、当該分野に公知の技術（ゲル濾過クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、および逆相HPLCが挙げられるが、これらに限定されない）により互いから分離され得る。
1A7ポリペプチドはまた、本出願の他の場所に提供される情報に従ってそれをコードするポリヌクレオチドを得、そしてそれを適切な発現系に導入することにより作製され得る。代表的には、1A7ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、適切なプロモーターのコントロール下で発現ベクターに連結され、そして意図される宿主細胞を遺伝子的に改変するために使用される。真核生物宿主系と原核生物宿主系の両方が用いられ得る。次いで、ポリペプチドを、溶解された細胞または培地から単離し、そしてその意図する使用に必要とされる程度まで精製する。本発明を用いる使用に適切な原核生物宿主細胞の例としては、E. coliが挙げられる。真核生物宿主細胞の例としては、トリ細胞、昆虫細胞、植物細胞、および動物細胞（例えば、COS7細胞、HeLa細胞、CHO細胞）が挙げられる。
特定の適用において、1A7ポリペプチドが植物種子のような適切な貯蔵媒体中で発現される場合、1A7ポリペプチドは精製することなく用いられ得る（Fiedlerら(1995) Biotechnology 13:1090-1093）。ほとんどの適用について、ポリペプチドは他の細胞成分から少なくとも部分的に精製されることが一般的には好ましい。好ましくは、ポリペプチドは全タンパク質の重量パーセントとして少なくとも約50％の純度である。より好ましくは、タンパク質は少なくとも約50〜70％の純度である。臨床上の用途では、ポリペプチドは、別のセクションに与えられた基準に従って、少なくとも約80％純度である。
1A7ポリペプチドの特徴付け
本発明の1A7ポリペプチドはいくつかの方法で特徴付けされ得る。例えば、1A7ポリペプチドは、14G2aに特異的に結合するその能力について、14G2aとインタクトな1A7との間の結合を特異的に阻害するその能力について、または14G2aとGD2との間の結合を特異的に阻害する能力について試験され得る。あるいは、1A7ポリペプチドは免疫応答、好ましくは抗GD2応答を誘発するそれらの能力について試験され得る。1A7ポリペプチドはまた、GD2関連腫瘍のようなGD2関連疾患を緩和または改善するそれらの能力について試験され得る。それらの特性のうち１つのみが、ポリペプチドが本発明に適合するように存在させるのに必要であるが、これらの特性のうち好ましくは１を越えて存在することが理解される。
1A7ポリペプチドが14G2aに結合する能力はイムノアッセイにより試験され得る。任意の形態の直接結合アッセイが適切である。このようなアッセイの１つでは、14G2aまたは代替の1A7ポリペプチドが標識される。適切な標識としては、125Ｉのような放射性同位体、ペルオキシダーゼのような酵素、フルオレセインのような蛍光標識、および化学発光標識が挙げられる。代表的には、その他の結合パートナーを、（例えば、マイクロタイタープレート上に被覆することにより）不溶化して洗浄を容易にする。標識成分を不溶化成分と合わせた後、固相を洗浄し、そして結合標識量を測定する。別のこのようなアッセイは、サンドイッチアッセイであり、ここで推定の1A7ポリペプチドは固相上の第１の抗免疫グロブリンにより捕獲され、そして第２の抗免疫グロブリンを用いて発色される。不溶化抗免疫グロブリンまたは標識抗免疫グロブリンのいずれか一方、または両方は14G2aである。これらの例のいずれかにおいて、1A7の結合の程度は固相に結合した標識の量に直接的に関連する。
阻害アッセイを行うために、推定の1A7ポリペプチドを、1A7の14G2aに対する結合または14G2aのGD2に対する結合を低減させるその能力について滴定する。反応において阻害されるいずれかの結合対が標識されるが、他方は代表的に洗浄を容易にするために不溶化される。GD2（これが使用される場合）は、精製ガングリオシドとして、またはM21/P6のようなGD2発現細胞株として提供され得る。1A7ポリペプチドは、代表的には標識成分と混合され、次いでこの混合物を固相に結合させる。1A7の特徴を有するポリペプチドは、コントロールポリペプチドと比較して、固相に付着する標識量を比較的に減少する。この試験は、直接的に結合を測定するより感度が良好であり得る。なぜなら、1A7とAb1との間のより低い親和性相互作用は、安定な結合を形成するには弱すぎるかもしれないが、充分な濃度で存在する場合、別のリガンド-レセプター対の結合を用いて妨げるには充分であるからである。
Fe様エフェクター成分を有するようなペプチドを含有する1A7ポリペプチドまたは分子は、免疫エフェクター反応、特に補体媒介性細胞溶解（CMC）および抗体依存性細胞性細胞傷害性（ADCC）を媒介するそれらの能力について試験され得る。適切なアッセイは、本開示の別の場所に記載される。
1A7ポリペプチドを特徴付ける別の方法、特に治療における用途に対して意図される方法は、免疫応答を生じるそられの能力を試験することである。免疫応答を特徴付けるための適切な技術は、後のセクションに記載する。
ポリペプチドの用途
ポリペプチドフラグメント、融合タンパク質、および1A7の他の誘導体は多くの用途を有する。この用途は、一般に本開示において先に概略したようにインタクトな1A7抗体の用途と同様である。ある誘導体は特定の用途について所望の効果を有し得る。例えば、ヒト化または単鎖可変領域分子はヒトへの投与に対して望ましくあり得る。なぜならそれらは抗マウスアイソタイプ応答をほとんど刺激しないようであるからである。サイトカインを含む融合タンパク質はより免疫原性であり得る。
これらの化合物の好適な用途は、1A7またはより好ましくはGD2への抗体応答を誘発する工程、1A7またはより好ましくはGD2へのＴ細胞性応答を誘発する工程、およびGD2が関連する種々のタイプのガンを処置する工程を包含する。これらの用途は後のセクションにおいてより十分に詳述する。
1A7抗体ならびにポリヌクレオチドおよびポリペプチド誘導体を含む薬学的組成物およびワクチン
本発明は、1A7抗体、または1A7のポリヌクレオチドあるいはポリペプチド誘導体を、単独または組み合わせるかのいずれかで含む薬学的組成物およびワクチンを包含する。このような薬学的組成物およびワクチンは、免疫応答の誘発およびGD2関連疾患の処置に対して、単独かまたは他の形態の治療（例えば、化学療法または放射線療法）と組み合わせるかのいずれかで有用である。
薬学的組成物は、個体への直接投与のためのワクチンを含む。ワクチンは、1A7抗体、ポリヌクレオチド、またはポリペプチド誘導体、あるいはそれらの組み合わせを包含し得る。
裸の1A7ポリヌクレオチドを含有するワクチンは、遺伝子免疫化に使用され得る（一般的にTangら(1992) Nature 356:152-154を参照のこと）。一旦細胞核に入ると、1A7コード領域を含むプラスミドは環状の非複製エピソームとして存続し得、これは用量依存的かつ長期の発現に導く（Spoonerら(1995) Gene Therapy 2:173-180）。ポリヌクレオチドを用いる免疫化が細胞性ならびに体液性応答を生じることが示されている（Spoonerら(1995); Wangら(1995) Human Gene Therapy 6:407-418）。遺伝子免疫化は、感染の危険がなく免疫応答を誘発するビヒクルとしての生微生物または弱毒微生物の多くの利点を有する。
好ましくは、1A7ポリヌクレオチドは、プロモーター、エンハンサーおよびシグナル配列のような転写および翻訳のための適切な制御配列を含有するプラスミドベクターの形態である。１またはそれ以上の1A7ポリヌクレオチドが単一クローニングベクター内で使用され得るか、または複数のベクターが使用され得る。ポリヌクレオチドワクチンにおける使用について好ましい1A7コード領域は1A7 scFvをコードする。ポリヌクレオチドワクチンはまた、免疫応答を増強する他の物質に対するコード領域を含み得る。好ましい例はGM-CSFである。
ワクチンとしての使用に適切な1A7ポリヌクレオチドの別の好ましい実施態様はウイルスベクターである。例としては、アデノウイルス、アデノ随伴レトロウイルス（AAV）、およびSV40が挙げられる。特に好ましくは、ワクシニアベクターであり、それにより1A7ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドが免疫原性ウイルス粒子と共に発現される。scFvのような1A7ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組換えワクシニアは、１用量当たり約107〜108プラーク形成単位で直接ワクチン接種のために使用され得る。ワクシニアは、非経口にて(例えば、皮下または筋肉内注射によって)、ならびに鼻孔内のような粘膜を介して、経口にて、または吸入によって投与され得る。あるいは、ワクシニアは、ワクシニア感染細胞を介して投与され得る。この技術において、腫瘍細胞のような適切な細胞を培養中のワクシニアで感染させる。次いで、感染細胞を個体に再導入する。ワクシニアで細胞を感染させる方法およびそれらの感染細胞を再導入する方法は記載されている（例えば、Moss(1991)を参照のこと）。
他の1A7ポリヌクレオチドワクチンは、当該分野に公知の他の送達ビヒクルを用いて設計され得る。別のこのような送達ビヒクルはカチオン性リポソームであり、これはDNAがその電荷によって容易に付着され得るためである。
ワクチンはまた、1A7抗体、そのポリペプチド誘導体、またはそれらの組み合わせから調製され得る。タンパク質は、特に100アミノ酸またはそれ未満のアミノ酸の場合、その免疫原性を増強させるために、必要に応じて化学的に処理され得る。これは、例えば、グルタルアルデヒドでの架橋；あるいは、キーホールリンペットヘモシアニン（KLH）または破傷風トキソイドのようなタンパク質キャリアへの連結を含み得る。
活性成分として1A7抗体、またはポリヌクレオチドあるいはポリペプチド誘導体を含む薬学的組成物の調製は、薬学的な調製物の調製について一般的に受け入れられる手順に従って行われる。例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences 18版（1990）、E.W. Martin編、Mack Publishing Co.、PAを参照のこと。意図される使用および投与の様式に依存して、薬学的組成物の調製においてさらに活性成分を処理することが望ましくあり得る。適切な処理は、滅菌する工程、適切な非毒性および非阻害成分と混合する工程、用量単位に分割する工程、および送達デバイスに封入する工程を包含し得る。
薬学的に投与可能な液体組成物は、例えば、本明細書中に包含されるベクターを液体賦形剤（例えば、水、生理食塩水、水性デキストロース、グリセロール、またはエタノール）中に溶解または分散することにより調製され得る。この組成物はまた、必要に応じて医薬剤、製剤、アジュバント、キャリア、および湿潤剤または乳化剤のような補助物質、ならびにpH緩衝化剤を含有し得る。
本発明のタンパク質ワクチンは、代表的にアジュバントを含み、これは賦形剤またはキャリアと同じであり得るか、またはこれらに加えられ得る。アジュバントの例としては、水酸化アルミニウム、ミョウバン、QS-21（米国特許第5,057,540号）、前駆体および修飾形態（例えば、DHEA-S、DHEAのスルホン化形態）を含むDHEA（米国特許第5,407,684号および同第5,077,284号）、β-２-ミクログロブリン（WO91/16924）、ムラミルジペプチド、ムラミルトリペプチド（米国特許第5,171,568号）、モノホスホリルリピドＡ（米国特許第4,436,728号；WO92/16231）およびその誘導体（例えば、DetoxTMの種々の形態および発生）、およびBCG（米国特許第4,726,947号）が挙げられるが、これらに限定されない。他の適切なアジュバントは、アルミニウム塩、スクワレン混合物（SAF-1）、ムラミルペプチド、サポニン誘導体、マイコバクテリウム壁調製物、ミコール酸誘導体、非イオン性ブロック共重合体界面活性剤、Quil A、コレラ毒素Ｂサブユニット、ポリホスファゼンおよび誘導体、ならびにTakahashiら(1990) Nature 344:873-875に記載されているような免疫刺激性複合体（ISCOM）である。獣医学的用途および動物における抗体の生産のために、完全または不完全フロイントアジュバントが使用され得る。アジュバントの選択は、特にヒトへの使用を意図する場合は、部分的には、アジュバントの存在下におけるワクチンの安定性、投与経路、およびアジュバントの調節受容性に依存する。例えば、ミョウバンは、ヒトにおけるアジュバントとしての使用について米国食品医薬品局（FDA）によって認可されている。
1A7抗体またはペプチド誘導体を含有する好ましいワクチン組成物を、水酸化アルミニウムと混合することにより調製し、そして約48℃まで約30分間インキュベートする。さらにより好ましくは1A7およびQS-21、またはRibiTMPCを含有するワクチン組成物である。QS-21およびRibiTMPCは、同等に好ましく；そしてそれらの間の選択は利用性に基づいてなされる。
本発明の薬学的組成物は、組成物の形態に対して適切な様式により投与される。代表的な経路としては、皮下、筋肉内、腹膜腔内、皮内、経口、鼻腔内、皮内、および肺内（すなわち、噴霧器による）が挙げられる。ヒトへの使用のための本発明のタンパク質ワクチンは、代表的には非経口経路、最も代表的には皮内、皮下、筋肉内経路により投与される。
経口、鼻腔内、または局所投与のための薬学的組成物は、錠剤、カプセル、粉末、液体、および懸濁液を含む固体、半固体、または液体形態で供給され得る。注射用の組成物は、液体溶液または乳液のような懸濁液として、あるいは注射前の液体中での溶解または懸濁に適した固体形態として供給され得る。呼吸管を経る投与について、好ましい組成物は、適切な噴霧器デバイスを用いて使用される場合、固体かまたは液体噴霧かのいずれかを提供する組成物である。必要でないが、薬学的組成物は、好ましくは正確な量の投与に適切な単位用量形態で供給される。また、本発明により意図されるものは、遅延放出形態または持続放出形態であり、それにより活性な化合物の相対的に一貫したレベルが、延長された期間にわたって提供される。
多くの代替ワクチン組成物は、本明細書中に記載のものに限定されず、免疫応答の誘導において意図した効果を生じ得る。全てのこのような組成物は、本発明内に包含されるが、ただしそれらは活性成分として1A7ポリヌクレオチドまたはポリペプチドを含む。本発明の薬学的組成物は、確立されてもまたは実験的であっても、これが臨床上所望される限り、治療の他の様式と合わせて使用され得る。
特異的免疫応答を誘発する能力についての1A7化合物および組成物の試験
本発明に包含される化合物は、特異的免疫応答を誘発するそれらの能力について評価され得る。従って、試験化合物は適切な薬学的組成物として調製され、そして試験被験体に投与される。初期段階の研究を、好ましくはマウスまたはウサギのような小動物、必要に応じて、次に非ヒト霊長類、次いで最後にヒトにおいて行う。免疫原性を、好ましくは、事前の抗1A7応答を伴わないで個体において試験する。
適切な試験用量における試験組成物は、適切な免疫化スケジュールで投与される。予測される範囲内で異なる用量およびスケジュールを比較することは適切であり得る。
サンプル（通常、血液サンプル）を、処置の間定期的に回収し、そして特異的免疫応答についてアッセイする。応答としては、抗体、ヘルパーインデューサーＴ細胞、または細胞傷害性Ｔ細胞、またはそれらの組み合わせが挙げられ得る。スクリーニング試験として、サンプルを抗1A7応答について測定し得る。目的は、典型的には、ガン治療に有用な組成物を同定することであるので、サンプルを、好ましくは、直接実験または阻害タイプの実験で明らかなように、抗GD2応答について測定する。
このセクションでは、免疫応答をモニターするのに適したアッセイのいくつかの制限されない例を概説する。
体液性応答における抗1A7（Ab3）および抗GD2（Ab1'）活性の存在を、好ましくは、血清とオートロガスな免疫グロブリンとの第１のプレインキュベーション後、または適切なアフィニティー樹脂上で吸着してアイソタイプおよびアロタイプ決定基に対する抗体活性を除去した後に決定する。次いで、吸着された血清を、例えば、ELISAまたはRIAを用いてAb3またはAb1'活性について試験する。例えば、予め反応させた血清の異なる希釈物を、マイクロタイタープレート上に被覆された1A7（または1A7ポリペプチド）と反応させる。非関連Ab2をコントロールとして用いる。洗浄後、Ab3-1A7複合体を、例えば125I標識された1A7を用いて、均一サンドイッチアッセイにおいて標識する。このアッセイの結果を、1A7ポリペプチドの投与前に得られた結果（実施例１）と比較する。あるいは、GD2ポジティブ細胞（例えば、M21/P6細胞）への結合を免疫フローサイトメトリーを用いて試験し得る。第３の例において、Ab3の特異性をウェスタンブロットにより決定する。GD2をSDS-PAGEにより分離し、そしてニトロセルロースフィルターにブロットする。次いでフィルターをAb3を含有する血清とインキュベートし、そして反応を適切に標識した抗免疫グロブリンにより発現する。Ab3がGD2に結合する場合、適切な分子量でのバンドが現れるはずである。
所望される場合、Ab3の特異性はさらに特徴付けられ得る。例えば、競合アッセイを行い、Ab3がAb1イディオトープを共有するか否かを決定し得る。さらに、競合実験を行い、ここでAb3を、1A7と14G2aとの間の結合の阻害について試験する。阻害は、Ab3および14G2aが少なくともいくつかの類似の結合決定基を含むことを示す。14G2aのGD2への結合とAb3の競合がまた測定され得る。
本発明の組成物を特徴付ける別の方法は、細胞傷害性である抗体を誘発するその能力を試験することである。補体媒介性細胞傷害性（CMC）の決定のために、GD2を発現するM21/P6標的細胞を51Crで標識する。標識は、約106細胞を約200μCiのNa2SO4と共に37℃で60分間インキュベートし、続いて洗浄することによって達成され得る。このアッセイは、抗体を含有すると考えられる血清を添加し、そしてインキュベートすることによって行なわれる。次いで、M21/P6細胞を予め吸着したモルモット血清（または他の補体源）を添加する。37℃での適切なインキュベーション期間の後、次いで、51Cr放出の程度を測定し、そして未オプソニン化コントロール細胞の51Cr放出の程度と比較する。51Crの放出はCMC活性と相関する（Herlynら(1981) Int. J. Cancer 27:769）。
本発明の組成物を特徴付ける別の方法は、ADCC応答に関与する抗GD2抗体を誘発するその能力を試験することによる（Chereshら(1986) Cancer Research 46:5112-5118）。このアッセイでは、培養ヒトM21/P6細胞（これは、それらの表面でGD2を発現する）が51Crで標識され、標的細胞として使用される。正常ヒト末梢血単核細胞（PBMC）がエフェクター細胞として使用される。免疫化された被験体からの血清を含むAb3は、供給されてADCC反応を媒介する。好ましくは、ADCCアッセイは、100：１のエフェクター：標的細胞比にて、熱不活化血清の存在下で４時間行われるが、他の適切な条件もまた用いられ得る。次いで、51Cr放出の量を測定する。
本発明の1A7抗体、ポリヌクレオチドおよびポリペプチドはまた、細胞性免疫応答を誘発するそれらの能力によって特徴付けられ得る。本明細書中で用いられるように、「細胞性免疫応答」はＴ細胞を含む応答であり、そしてインビトロまたはインビボで観測され得る。被験体を1A7組成物で免疫化し、そして細胞を応答をアッセイするために回収する。被験体が小動物である場合、細胞は典型的には脾臓から得られる。ヒトを含む、より大きな動物について、細胞は典型的には末梢血から得られる。適切な細胞集団を、標準的な分離技術（典型的にはFicoll HypaqueTMのような適切な媒体上での遠心分離を含む）によりサンプルから回収する。
細胞性免疫応答を検出する１つの方法は、Ｔ細胞増殖活性についてアッセイすることによる。この試験では、細胞性免疫応答を、1A7ポリペプチドと共にインキュベートした末梢血単核細胞（PBMC）の増殖によって測定する。所要数の1A7ポリペプチドの投与後にPBMCを単離し、種々の濃度の1A7ポリペプチドとインキュベートする。PHAのような非特異的マイトジェンをポジティブコントロールとして用いる；非関連抗イディオタイプ抗体とのインキュベーションをネガティブコントロールとして用いる。好ましくは、刺激細胞は、応答細胞（特に組織適合性クラスII抗原に関して）とオートロガスである。PBMCの適切な期間（代表的には５日）のインキュベーション後、［3Ｈ］チミジン取込みを測定する。所望であれば、いずれのＴ細胞サブセットが増殖するかの決定がフローサイトメトリーを用いて行われ得る。必要に応じて、脾臓Ｔ細胞は、モノクローナル抗体RL.172（抗CD4+）またはモノクローナル抗体168（抗CD8+）および補体とのインキュベーションによって、増殖アッセイ前にCD4+またはCD8+細胞いずれかを予め枯渇し得る。
細胞性免疫応答を検出する別の方法は、Ｔ細胞傷害性（CTL）活性について試験することである。この試験では、富化Ｔ細胞集団を、標準的51Cr放出アッセイ（Kantorら（1992) J. Natl. Cancer Inst. 84;1084-1091）においてエフェクターとして用いる。51Cr放出アッセイの例は以下の通りである。GD2ポジティブ腫瘍細胞（代表的には、１〜２×106細胞）を標的細胞として約200μCiのNa251CrO4（Amersham Corp., Arlington Heights, III)で37℃で60分間放射性標識し、続いて、徹底的に洗浄して取り込まれなかったアイソトープを除去する。次いで、共に培地に再懸濁したＴ細胞および標的（１×104／ウェル）を、96ウェルＵ底プレート（Costar Corp.)中、種々のエフェクター：標的比にて組み合わせる。プレートを100×ｇで５分間遠心して細胞接触を開始させ、そして５％CO2にて37℃で４または16時間インキュベートする。インキュベーション後、上清をSupernatant Collection System (Skatron, Inc., Sterling, VA)を用いて収集し、そして放射活性をガンマカウンター（Beckman Instruments)で定量する。51Crの自然放出をエフェクターの非存在下における標的のインキュベーションによって決定し、他方、51Crの最大または全放出を0.1％Triton X-100中における標的のインキュベーションによって決定する。51Crの特異的放出パーセントは自然放出および最大放出に関連して計算される。
1A7ポリペプチドを特徴付ける別の方法は、以下のセクションに概説されるように、GD2関連疾患の進行を改善し、遅延させ、またはその程度を減少させるそれらの能力を試験することである。
免疫応答を誘発するための薬学的組成物の使用および疾患の処置
前のセクションに概説したように、本発明に包含される組成物は、個体への投与のために使用され得る。それらは実験的な目的のため、または抗GD2源を得るために投与され得る。
本発明の組成物は、特にGD2関連疾患を有するヒト個体への投与に適している。GD2関連疾患は、GD2ガングリオシドの発現が罹患した組織部位で変更（通常、細胞-表面発現における増加）される疾患である。関連の疾患は、GD2に対する活性免疫応答が臨床上の利益を付与する疾患である。特に関連の疾患は、GD2関連ガンであり；特にメラノーマ、神経芽細胞腫、神経膠腫、肉腫、および小細胞肺ガンである。
本発明の組成物は、いくつかの目的を意図して個体に投与され得る。例えば、本発明の種々の組成物は、免疫応答を誘発するために使用され得る。これは抗1A7特異的応答、およびより好ましくは抗GD2応答を包含する。所望の応答は特異的な抗体応答；特異的Ｔヘルパーインデューサー応答（repines）、または特異的細胞傷害性Ｔ細胞応答であり得る。ADCC応答または細胞傷害性Ｔ細胞性応答は、特に、ガン治療の情況において好ましい。なぜなら免疫系のこれらの武器（arm）が免疫監視機構における重要なエフェクターエレメントであると考えられるからである。抗体応答の存在は、日常的な臨床的モニターについての簡便な手段を提供し得る。従って、いくつかの成分の免疫応答を組み合わせて含む応答は、特に好ましい。
抗体応答、ADCC、抗体媒介性細胞溶解活性、Ｔ細胞増殖活性、および細胞傷害性Ｔ細胞活性を測定および特徴付けるためのアッセイが、本開示の別の場所に全て記載される。
腫瘍発現GD2のようなGD2関連疾患を処置する方法はまた、本発明に包含される。この方法は、所望の効果（存在する腫瘍塊の軽減または再発の防止）を達成するのに有効な量の薬学的組成物を投与する工程を包含する。
用量
インビボでのGD2関連疾患の処置のために、投与される薬学的組成物の量は、所望の効果を生じるのに有効な量である。有効量は１回投与または連続投与において提供され得る。
インタクトな1A7について、マウスは、CFAおよびIFA中に乳状化した約100μgのKLH結合1A7を、それぞれ少なくとも約３回および典型的には少なくとも４回の投与を必要とする。サルは約2mgを必要とする。ヒトに適切に投与され得るインタクトな1A7の範囲は、約10μg〜20mg、好ましくは200μg〜15mg、より好ましくは500μg〜10mg、さらにより好ましくは1mg〜4mg、およびさらにより好ましくは2mgである。より小さなペプチドおよび融合タンパク質は、重量当たりの基準でより有効であり、そして好ましい用量はインタクトな分子を用いるよりも低用量であってもよい。適切な用量は、動物モデルにおけるインタクトな1A7とそれらの誘導体の種々の用量の比較、およびヒトの使用に対して適切に測ることにより容易に決定され得る。
投与されるべき1A7ポリヌクレオチドの量は、投与の経路、個体の状態、および所望の目的のようないくつかの要因に依存する。代表的には、直接的に投与する場合、投与当たりの量は約10μg〜１mg、好ましくは25μg〜500μg、より好ましくは30μg〜250μg、さらに好ましくは50〜100μgである。
投与は、代表的には、免疫応答の誘発のような所望の測定可能なパラメーターが検出されるまで１週間、または２週間基準で行われる。次いで投与は、適切に、２週間または１カ月毎に、より頻度の少ない基準で継続され得る。
本発明の種々の化合物は、単独で使用され得るか、または所望の目的を促進するあるいは所望の補助治療を提供する他の活性剤と組み合わせて使用され得る。
本発明の任意の組成物の投与のための正確な用量およびタイミングは、処置される個体、抗体を合成する個体の免疫系の許容量、投与の経路、所望の保護の程度、および前の用量に対する免疫学的および臨床的応答に依存する。免疫学的応答は前のセクションに提供したアッセイにより評価され得る。示唆される指針に従って、投与するに適切な量の選択は、投与する医師の責任である。
治療のための適切な被験体、および所望の効果
任意のGD2関連症状の病理学的効果の危険性にあると考えられる被験体を含む適切な被験体は、本発明の薬学的組成物を用いる処置に適している。GD2関連ガンの病歴を有する被験体は、特に適している。
実施例のセクションに記載される臨床研究は、予めマウス免疫グロブリンで処置されていない被験体を除外するように設計される。この概念は、そのように処置された被験体の集団が、循環する抗マウス免疫グロブリン（HAMA）を有し得ることである。この選択基準は初期の試験を容易にするために実行される。しかし、本発明者らはHAMAの存在が治療に対して障害であるとは考えない。なぜなら1A7の目的は応答を誘発することであり、循環系に残存しないことではないからである。患者は、より代表的には、以前のマウス免疫グロブリンでの処置の病歴に関わりなく、治療について選択される。もちろん、ヒト化1A7およびscFvのような特定の操作された化合物について、ほとんどのマウスアイソタイプ決定基は削除され、そして可能性のあるレシピエントにおけるHAMAの存在はさらにほとんど考えられない。
治療に適したヒト被験体は２つの群を包含し、これは臨床上の基準により区別され得る。
「進行性の疾患」または「高い腫瘍負荷」を有する患者は、臨床上測定可能な腫瘍を有する患者である。臨床上測定可能な腫瘍は、腫瘍塊に基づいて検出され得るものである（例えば、触診、CATスキャン、またはＸ線による；それら自身についてポジティブの生物学的マーカーまたは組織病理学的マーカーは、この集団を同定するに充分ではない）。本発明に包含される薬学的組成物は、これらの患者に投与されて、それらの症状を緩和する目的で抗GD2応答を誘発する。理想的には、腫瘍塊の減少が結果として起こるが、全ての臨床上の改善は利益を構成する。臨床上の改善は、減少された危険性または腫瘍の病理学的結果の進行速度あるいは減少速度を含む。
適切な被験体の第２の群は、当業者に「アジュバント群」として知られている。これらはGD2関連ガンの病歴を有する個体であるが、別の様式の治療に応答性である。以前の治療は外科的切除、放射線療法、および伝統的な化学療法が含まれ得る（しかし、これらに限定されない）。結果として、これらの個体は臨床上測定可能な腫瘍を有しない。しかし、個体は、（元来の腫瘍部位近く、または転移によるかいずれかで）、疾患の進行に対して危険であると考えられる。
この群は、さらに危険性の高い個体と危険性の低い個体に再分割され得る。再分割は、初期処置の前または後に観測される特性に基づいてなされる。これらの特性は臨床分野で公知であり、そしてそれぞれ異なるGD2関連ガンについて適切に規定される。危険性の高い亜群の代表的な特性は、腫瘍が近傍の組織を侵しているか、またはリンパ節の関与を示す特性である。
本発明に包含される薬学的組成物を、アジュバント群、またはこれらの亜群のいずれかの患者に、抗GD2応答を誘発するために投与する。理想的には、組成物はガンの再発を遅延させるか、またはさらに良好に、再発の危険性を低減させる（すなわち、治癒速度を改善する）。このようなパラメーターは、他の患者集団および他の治療様式と比較して決定され得る。
もちろん、これらの２つの患者集団の間でのクロスオーバーが可能であり、そして本発明の薬学的組成物を適切である任意の時間に投与し得る。例えば、1A7治療は高い腫瘍負荷を有する患者の伝統的な治療の前、または治療間に行われ得、そして腫瘍が臨床上検出できなくなるまで継続され得る。1A7治療は、最初にアジュバント群であった患者において継続され得るが、再発の徴候を示している。医師は、本発明の組成物がどのように、またはいつ使用されるべきか決定する決定権を有する。
上述のカテゴリーのそれぞれの免疫学的状態が、いくつかの基準によって互いに異なることは当該分野において認識されている。例えば、活性疾患を有する患者は、腫瘍関連病理学、または最近の放射線療法あるいは化学療法のいずれかによって一般に免疫抑制される。それらの免疫系は、腫瘍部位からの腫瘍関連抗原のバラージ（barrage）下であり得る。対照的に、緩解された患者は自己抗原に対してより強い活性な抑制を有し得る。従って、抗イディオタイプに基づくワクチンの抗腫瘍性応答を誘発する能力、または臨床上の症状を改善する能力は、それぞれの患者のカテゴリーについて別々に決定されなくてはならない。
他の臨床上の適応
本発明の種々の化合物および組成物は他の臨床上の適応を有する（このセクションでは概説のみを提供する）。
１つの適応はエクスビボでの細胞の処置である。これは実験的な目的のため、またはGD2関連疾患を有する個体の処置のために所望され得る。１つの例において、1A7抗体、またはポリヌクレオチドまたはポリペプチド誘導体は、ドナーまたは適切な細胞株から得られた末梢血細胞のような細胞培養物に投与される。これは、例えば、Ｔ細胞活性を刺激する目的でなされ得る。約0.5〜2μg/mLの1A7がこの目的のための有効用量である。所望される場合、次いで、刺激された細胞を、受動免疫を伝達する目的で、レシピエントに投与し得る。第２の例において、ドナー細胞を遺伝的に本発明の発現ベクターを用いて改変して、レシピエントへの細胞の投与後、1A7抗体の継続分泌を提供する。
本発明はまた、1A7抗体およびポリペプチド誘導体を用いて、ラジオシンチグラフィーまたは放射線療法の間に、標識された抗GD2抗体（例えば、14G2a）を受けた個体から標識（特に放射性標識）を取り除くための組成物および方法を包含する。放射性標識抗体を用いる有効なイメージングは、しばしば、浄化するのに数日を要する過剰の循環放射性標識抗体により妨害される。従って、1A7抗体またはポリペプチド誘導体は、標識抗GD2の投与後、指定された時間に個体に投与される。この意図は、腫瘍以外の部位（例えば、循環系および間質介在空間）で1A7ポリペプチドが抗GD2と複合体化することであり、そしてそれによりそのクリアランスを促進する。結果として、影響されない組織における標識のレベルは減少し、そして腫瘍の画像は（近傍の組織と比較して）増強される。同様に、放射性核種が腫瘍部位の照射のために被験体に与えられる場合、影響されない組織の付帯的曝露を減少させることが所望される。従って、本発明は、放射性標識された抗GD2抗体を治療用量で投与し、そして続いて過剰モルの1A7を投与する処置方法を包含する。
これらの適用のいずれかにおいて、1A7ポリペプチドの量は、腫瘍部位で局在化しない任意の抗GD2とを見出して（locate）結合するように、標識抗GD2よりも十分に過剰モルで選択される。投与のタイミングおよび1A7ポリペプチドの量は、放射性標識抗体の性質、用いられる放射性同位体のタイプ、および個体の状態に依存する。好ましくは、1A7ポリペプチドの抗GD2抗体に対するモル比は、少なくとも約5:1、より好ましくは約25:1〜200:1である。好ましくは、1A7ポリペプチドは、個体が抗GD2抗体を受けた５〜24時間後に投与される。
本発明はまた、個体を1A7で抗GD2抗体に結合させるに十分な時間処置する工程を包含する腫瘍細胞に結合した抗GD2抗体の存在を検出する方法、および形成された任意の複合体の存在を検出する方法を包含する。1A7についての意図は、腫瘍細胞に予め付着した抗GD2を検出すること；あるいは、多価抗GD2/1A7免疫複合体を形成することにより抗GD2の腫瘍細胞への結合を促進することである。前者の例において、抗GD2が検出可能なレベルによりまたは標識が付着可能な手段により提供される。後者の例において、抗GD2または1A7のいずれかが標識により提供される。適切な標識は111In、131Iおよび99mTcのような放射性標識を含む。抗GD2および1A7は（通常連続的に）被験体に投与され、そして腫瘍部位への蓄積を可能にする。次いで、腫瘍はラジオシンチグラフィーの標準的な技術を用いて検出されるかまたは可視化される。
診断キット
本発明は1A7抗体、ポリヌクレオチド、またはポリペプチドを含むキットを包含する。本発明の1A7ポリヌクレオチドまたはポリペプチドを用いる診断手順は、診断研究所、実験研究所、実施者、または個々の個人により行われ得る。本発明により包含されるキットは、抗GD2または抗1A7活性について、または1A7コード配列についてアッセイを行い得るキットを含む。これらの成分のうちの１つの変更は、例えば、GD2関連疾患の存在または疾患に対して指向する処置により生じ、代表的に健常な個体由来のサンプルと比較される。臨床上のサンプルは、必要に応じて試験される標的の富化のために予め処置される。次いで、使用者は診断成分中の変化したレベルまたは変更を検出するためにキットに含まれる試薬を適用する。
各キットは手順を特異的にする試薬を含むことが必要である：試薬1A7抗体またはポリペプチド（サンプル中の抗1A7または抗GD2を検出するために使用される）；またはポリヌクレオチドをコードする試薬1A7（サンプル中のポリヌクレオチドをコードする1A7を検出するために使用される）。必要に応じて、試薬はサンプル中の標的と形成される任意の複合体の検出を可能にする標識と結合され得る。別の選択において、第２の試薬が提供され、その標的が見出された後に第１の試薬と合わせることが可能である。例えば、標識抗マウスIgGは、インタクトな1A7と共に使用される第２の試薬として提供され得る。標識アビジンは、第１の試薬がビオチンと結合している場合、第２の試薬として提供され得る。
このキットは、種々の生物学的サンプル（液体のサンプル、細胞懸濁液、および組織サンプルを共に含む）について用いられ得る。キット形態において供され得る1A7抗体、ポリペプチド、およびポリヌクレオチドを用いる適切なアッセイは、本開示の別の場所に記載されるものを含む。
各試薬は、在庫品保存のため、そして試験が行われる場合、反応媒体を後で交換するまたは反応媒体への添加のために適切な固体形態または液体緩衝液で供給される。適切なパッケージングが提供される。このキットは、必要に応じて、手順において有用なさらなる成分を提供し得る。これらの必要に応じた成分としては、緩衝液、捕獲試薬、発現試薬、標識、反応表面、検出手段、コントロールサンプル、使用説明書、および説明的資料が挙げられる。
寄託
先の記載は、とりわけ、1A7コードポリヌクレオチド、1A7ポリペプチドフラグメント、および他の誘導体を用いて、モノクローナル抗体1A7を調製するための詳細な方法を提供する。
当業者の実施者は、本発明の実施態様を、本明細書中に提供される1A7についての配列データを参考にすることにより実施し得る。あるいは、実施者は1A7抗体産生細胞から1A7抗体、または1A7コードポリヌクレオチドを最初に精製することにより本発明を実施し得る。1A7抗体を産生するハイブリドーマ細胞株は、ブダペスト条約に基づいてアメリカンタイプカルチャーコレクション（ATCC）に寄託されており、そして受託番号第HB-11786号が与えられている。
以下の実施例は例示として提供され、本発明を限定しない。
実施例
実施例１：  1A7抗イディオタイプ抗体の生成および特徴付け
モノクローナル抗イディオタイプ抗体産生ハイブリドーマ細胞株1A7を作製し、そして以下の記載に従って同定を行った。所望の特異性および機能性を有する抗体を得るためには、免疫化手順およびスクリーニング手順の両方の局面が重要であった。1A7は、初期に産生された多くのAb2の１つであり、そしてもっとも望ましい特性を備えた候補として同定された。
1A7は、抗イディオタイプ応答のための免疫原として14G2aマウスモノクローナル抗体を用いることにより得られた。14G2aは、ガングリオシドファミリーの他のメンバーには存在しないGD2の独特のエピトープに結合する。応答動物もまたマウスであったため、生成したAb2は14G2aのイディオタイプの特性に対して指向されることが予想された。しかし、これらのほんの一部のみが14G2aのパラトープに対して指向され、さらにより小さい割合が免疫原性であり、そしてAb3を誘発し得、そしてさらにより小さな割合が腫瘍関連抗原と交差反応するAb3を誘発する。
14G2aをオートロガスな種において十分に免疫原性とするために、これをキャリアKLHに結合させ、フロイントアジュバント中に乳化した。これを投与と投与との間が２週間のみの通常でないスケジュールで、レシピエント動物に反復投与した。このスケジュールに従って、５匹のマウスを免疫化した。約３匹のマウスで、４回目の免疫化後にのみ実質的な応答が起こった。応答動物に、５回目の14G2a静注投与によって追加免疫を行い、脾臓細胞を単離し、そして各動物から個別にハイブリドーマを調製した。クローニングは標準的な技術に従って行った。
スクリーニング手順は、以下の四つの重要な工程を包含した：(1)14G2aに結合する抗体に対するポジティブ選択、(2)アイソタイプまたはアロタイプ決定基を認識する抗体に対するネガティブ選択、(3)GD2に対する14G2aの結合を阻害する能力に対するポジティブ選択、および(4)マウスおよびウサギの両方において、オリジナルの腫瘍関連抗原（GD2）に対する体液性免疫応答を誘導する能力に対するポジティブ選択。このセクションの残り部分（rest）は、続くセクションでより詳細に示されるスクリーニング手順の概要を提供する。
初期スクリーニングはイムノアッセイによって行い、14G2aと反応するが、同じアロタイプ決定基またはアイソタイプ決定基を共有する他の標的モノクローナル抗体とは反応しないクローンを同定した。決定的なアッセイは、14G2aが固相に固着され、培養上清を重層し、そして放射性ヨウ素標識14G2aで発現されるサンドイッチRIAであった。このアッセイでは、ハイブリドーマ上清中の抗体が、機能的に二価であって、かつ捕獲14G2aと発現する14G2aとの間をつなぎ得ることが要求される。イディオタイプ特異的であり、かつこのアッセイで強いシグナルを発した数個のクローンをさらなる研究用に選択した。
14G2aのGD2への結合をブロックするためにAb2を必要とする競合アッセイにより次のスクリーニングを行った。これによると、Ab2が14G2aのパラトープを認識したことが立証された。GD2は、細胞表面でGD2を発現するヒトメラノーマ細胞株である、M21/P6細胞の形態で提供された。このアッセイの性質上、Ab2が腫瘍細胞上でその特定の提示様式で、14G2aと腫瘍抗原との間の相互作用をブロックすることが必要である。最低限、それ以前のスクリーニング試験を通過した候補のAb2は、14G2aの細胞への結合を少なくとも75％阻害することが必要であった。この最低条件を実質的に超えたAb2は約３個あり、1A7がほぼ最高レベルの阻害を提供した。
最終的なスクリーニング試験は、候補のAb2をレシピエントに注入したときに、所望の特異性のAb3を誘発し得るか否かを決定することであった。マウス腹水から十分な量のAb2を調製し、そしてマウスおよびウサギで試験を行った。試験動物由来の血清を、最初、免疫化に使用した同じ標識Ab2を用いるサンドイッチイムノアッセイでAb3の存在についてアッセイした。次いで、ポジティブの試験結果を示す血清を、腫瘍関連抗原、すなわちGD2に対して反応するAb3の能力についてアッセイした。GD2の調製物を用いてマイクロタイタープレートを被覆し、系列希釈した試検血清を重層し、そして標識抗免疫グロブリンを用いて、結合したAb3を検出した。GD2に結合するAb3の力価により、抗GD2誘導物質としてのその能力の反映としてAb2の「質」を規定した。
モノクローナル抗体1A7は最高の質を有する抗イディオタイプとして明らかにされ、そして本発明で具体化される種々の化合物、組成物、および手順の原型の基礎となる。1A7を産生する細胞株を、２回の限界希釈により再度クローニングし、株の安定性を確認した。
材料
抗体：モノクローナル抗体14G2aを産生するハイブリドーマ細胞株は、Scripps Research Institutionより入手した。14G2aはIgG2aκとしてサブタイプ化された。14G2aの特異性は、GD2を発現する細胞を用いるイムノペルオキシダーゼ染色および流動微小蛍光測定分析によって再確認した。本明細書中に記載した種々の実験において、他のモノクローナル抗体およびミエローママウス免疫グロブリンをコントロールとして使用した。
プリスタンで誘発した個々のマウスに、２〜10×106個の生存細胞を腹腔内注入することによって、14G2aハイブリドーマおよびその他の細胞株の腹水を調製した。この腹水から45％飽和硫酸アンモニウム沈殿およびその後のProtein Ａ Sepharose(TM)CL-4B (Eyら（1978) Immunochemistry 15:429）上のクロマトグラフィーによってIgG画分を単離した。単離されたIgGの純度は免疫拡散法、免疫電気泳動、および高圧液体クロマトグラフィー(HPLC)分画によってチェックした。
抗体のKLHとのカップリング：Maloneyら（1985；Hybridoma 4:191）によって記載された方法に従って、14G2aをキーホールリンペットヘモシニアン(KLH)とカップリングした。抗体ストック溶液(1mg/ml)を新たに希釈したグルタルアルデヒド溶液の存在下（最終濃度0.05％）PBS中でKLH(1mg/ml)と混合した。混合物を室温で１時間回転させ、次いで、PBSに対して４℃で完全に透析した。
同系BALB/cマウスの免疫化：BALB/cの雌を、２ヶ月の期間にわたって４回免疫化した。最初の注入は、完全フロイントアジュバントで乳化した100μgの14G2aを用いて腹腔内に与えた。次の２回の注入は、不完全フロイントアジュバント中、KLHとカップリングした100μgの14G2aを皮下注入または腹腔内注入のいずれかで与えた。マウスは時々採血を行い、そして14G2aのF(ab')2フラグメントおよびコントロールとしてプールした正常BALB/cマウス血清IgGを用いることにより、結合アッセイ中のELISAによって血清を抗Id活性についてチェックした。融合の３日前に、PBS中の14G2aを静脈内に注入してマウスを追加免疫した。
抗イディオタイプハイブリドーマの生成
ハイブリドーマ株の生成に用いた融合パートナーは、ATCCからNo.CRL-1580として入手でき、P3X63Ag8.653と祖先が関係するマウス非分泌性ミエローマ細胞株P3-653であった。樹立ヒト細胞株を他の箇所で記載されたように(Seonら(1984)J. Immunol. 132:2089)５％ウシ胎児血清を加えたRPMI 1640中で培養した。
ハイブリドーマは、本質的に、OiおよびHerzenberg((1980)Selected Methods of Cellular Immunology、MishellおよびShiigi編、Freeman Publs.、351〜372）の方法に従って生成した。50％ポリエチレングリコール（PEG、分子量約4500）の存在下、免疫化マウス由来の脾臓細胞を、P3-653細胞と1:1〜10:1の割合で混合した。次いで、融合細胞を洗浄し、そして培養した。ヒポキサンチン-アミノプテリン-チミジン培地を用いてハイブリッドを選択した。
抗イディオタイプ抗体(Ab2)を分泌するハイブリドーマクローンの初期選択
RIAによってハイブリドーマクローンの初期スクリーニングを行った。精製14G2aをクロラミンT法（Hunter (1970) Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 133:989）によって放射性ヨウ素標識した。アッセイはマイクロタイタープレートのウェルを14G2a抗体（またはコントロール）で500ng/ウェルで被覆することによって行った。４℃で一晩インキューベートした後、プレートをPBS中の１％ウシ血清アルブミン(BSA)でブロックした。100μlのハイブリドーマの培養上清または20×濃縮物をウェル中室温で４時間インキュベートした。PBSで洗浄後、さらにプレートを室温で４時間または４℃で一晩、標識14G2aとインキュベートし、洗浄し、そしてカウントした。抗体が２つの14G2a分子の間をつなぎ得ることが必要であるので、このRIAは抗体特異性についてストリンジェントな試験である。
ELISAを、プレート被覆および検出試薬の両方としてサブクラス特異的抗免疫グロブリンを用いて類似の様式で行った。一般に、特定のIgGサブクラスの抗体が、プロテインＡクロマトグラフィーによって安定で簡単に精製され、かつ有用なエフェクター機能を有し得るので所望される。
所望の特性を備えるこれらのスクリーニングアッセイから多くのモノクローナルAb2分泌細胞株が明らかにされた。その中にモノクローナル抗体1A7が存在した。
Ab2が14G2aイディオタイプに特異的であることの確認
Ab2のイディオタイプ特異性はAb1への直接結合により確認された。種々の精製Ab2を125Iで標識し、そしてモノクローナル抗TAA Ab1のパネルで被覆したプレートへの結合について試験した。1A7は14G2aとほぼ独占的に結合した；試験された他のAb1のいずれとも交差反応性は実質的になかった。
14G2aイディオタイプに対する特異性は、競合実験でさらに確立された。約25,000cpmの種々の標識Ab2を、Ab2、Ab1、およびその他のマウス免疫グロブリンを含む非標識競合物質のパネルの異なるメンバーと混合した。次いでこのAb2を、14G2a被覆プレートへの結合について試験した。最も良いAb2については、競合物質としてAb2または14G2aのいずれかを用いて、90％より大きい阻害が得られた。潜在的な競合物質としてコントロールの免疫グロブリンを用い、5μgの濃度までは、阻害は実質的に得られなかった。
14G2aパラトープに対して指向された抗イディオタイプについてのスクリーニング
Ab2が14G2aのパラトープに対して指向されるか否かを決定するため、Ab2を使用して放射性標識14G2aのGD2への結合について競合させた。これは膜構成要素としてGD2を発現するヒトガン細胞株であるM21/P6細胞を用いて行った。
このアッセイを行うために、M21/P6細胞を96ウェルの組織培養プレート中でコンフルエントな単層として増殖させた。試験Ab2の種々の希釈物（培養上清または精製抗体のいずれか）を標識14G2aと混合し、次いで、培養細胞に添加した。アッセイの阻害パーセントを次式に従って計算した。
0003816103.tif 000002
ここでRTはインヒビターを有する実験ウェルの平均cpm；RCは平均バックグラウンドcpm；およびRMAXはいかなるインヒビターをも有さない平均最大結合である。
３個のAb2 (1A7を含む）は、約25ngという少量でGD2発現細胞に対する標識14G2aの結合を阻害した。精製コントロール抗体は阻害を示さなかった。
これまでに記載されたスクリーニング試験においてポジティブの試験結果を示す抗体産生クローンを使用して、Ab2の供給源として腹水を調製した。Ab2を標準的な技術によりプロテインＡおよびプロテインＧアフィニティー樹脂を用いるクロマトグラフィーにより精製した。
腫瘍特異的免疫応答を誘発し得る抗イディオタイプのスクリーニング
これらの実験の主要な目的は、抗GD2免疫応答を誘発し得る抗イディオタイプを見出すことであったので、次のスクリーニング工程は、動物モデルにおいてその免疫原性を試験することである。Ab2は免疫原性でなければならないだけでなく、また、腫瘍抗原GD2に戻り交差反応するAb3を惹起させ得なければならない。
従って、GD2発現細胞との競合実験において最も強い結果を与えるモノクローナル抗体が、この部分の研究における試験のために提示された。特異的な阻害を示す他の２つの抗体は、1A7がこの試験において所望の特性を示さなかった場合の予備に保持された。
従って、1A7をワクチン組成物として調製し、そして試験動物に注入した。最初に、本発明者らは、等容量(0.1ml)のフロイント完全アジュバントまたはフロイント不完全アジュバントの存在下で、キャリアKLHと結合した1A7(1:1比率）50μgを用いて、同系BALB/cマウス(６〜８週齢）を０、14、28、および42日目に皮下に免疫化した。血液サンプルを４回目の免疫化の10日後に各マウスから取り、そしてサンドイッチRIAによる全Ab3応答（抗アイソ/アロ/イディオタイプ）、およびAb3血清によるAb2(プレート上の1A7)に対するAb1(14G2a)結合の阻害によって抗-抗イディオタイプ応答について分析した。さらに、血清を、GDポジティブメラノーマ細胞(M21/P6)に対する125I-14G2a結合の阻害についてチェックした。さらに、マイクロタイタープレートに被覆した精製GD2に対する血清の直接結合を、ELISAアッセイにより測定した。３匹のBLBA/cマウスからの代表的なデータを表１に示す。
0003816103.tif 000003
GD-2ネガティブ細胞株または非関連ガングリオシド（例えば、GD3およびGM3）との反応はなかった。結果を３連の測定値の平均値として示す。(S.D.＜10％）。
次に、本発明者らは、抗id 1A7ワクチンの３つの異なる処方を用いて、アロジェニックなC57BL/6マウス（６〜８週齢）を免疫化した：(I)1A7-KLH+フロイントアジュバント；(ii)1A7-KLH＋QS-21(マウスあたり10μg）；(iii)1A7＋QS-21(マウスあたり10μg）。結果を表２に示す。
0003816103.tif 000004
結果を３連の測定値の平均値として示す。（S.D.＜10％）。GD-2ネガティブ細胞株または非関連ガングリオシド（例えば、GD3およびGM3）との反応はなかった。
３つのワクチン調製物間の比較により、C57BL/6アロジェニックマウスにおいて、1A7-KLHおよびフロイントアジュバントは、1A7-KLHおよびQS-21とほぼ同一の体液性免疫応答を誘導したことが示唆される。全Ab3応答の生成は、1A7＋QS-21免疫化マウスにおいてより少なかった；しかし、メラノーマ細胞に対するAb1の結合は、非常にさらに強く阻害され、そして抗GD2抗体(AbI')の産生は他の２群に匹敵した。従って、1A7に対するKLHの結合のさらなる利点はなかった。KLHは、C57BL/6マウスにおいて、強い抗アイソタイプおよび抗アロタイプ応答を誘導した。1:100希釈の免疫マウス血清は、M21/P6メラノーマ細胞およびEL4リンパ腫細胞と強く反応したが、FACS分析により非関連結腸ガン腫LS174-T細胞とは反応しなかった。
本発明者らはまた、Ｔ細胞増殖アッセイによる種々の刺激に対して異なって免疫化したマウス群由来の脾臓細胞のＴ細胞応答を比較した。C57BL/6マウスおよびBALB/cマウスの３つの全ての群からの代表的なデータを表３に示す。
0003816103.tif 000005
データを３連のウェルの平均CPMとして示す(S.D.＜10％）。S.I.=刺激指標。S.I.＞3.0をポジティブとして任意にみなす。
これらの結果は、C57BL/6マウスにおいて、３つ全てのレジメを用いた免疫化は、1A7特異的、M21/P6メラノーマ細胞特異的およびEL4細胞特異的な増殖応答、コントロール3H1に対するある程度の反応を誘導し、そしてコントロール細胞株LS174-Ｔ細胞またはガングリオシドGD2またはGD3に対しては反応を誘導しなかったことを示した。また、これらのデータは、Ｔ細胞活性化のために、GD2は細胞表面オリゴペプチドに結合することが必要であるという仮定を支持する。また、これらの３つのレジメのいずれかで得られる刺激指標に有意な差異はなかった。C57BL/6マウスにおいて、1A7＋QS-21は1A7-KLH＋QS-21または1A7-KLH＋フロイントと同じくらい良好であった。
Ｔ細胞媒介性DTH応答を誘導するこれらのワクチンの能力を評価するために、1A7-KLH＋フロイント、1A7-KLH＋QS-21および1A7＋QS-21で免疫化したC57BL/6マウスに照射M21/P6細胞または照射LS174-T（コントロール）細胞を皮内足蹠注射をした。別の実験において、マウスに精製CD2または精製GD3を皮内足蹠注射をした。マウスを、24時間および48時間での接種部位におけるDTH応答の発生について観察した。免疫化マウスの３つの全ての群において、GD2ポジティブM21/P6細胞に指向された顕著なDTH応答が発生したが、GD2ネガティブLS174-Ｔ細胞では発生しなかった（データは示さず）。しかし、免疫化マウス群のいずれにおいても、GD2またはGD3に指向されたDTH反応はなかった。
次に、ウサギを1A7-KLH＋QS-21および1A7＋QS-21を用いた免疫化研究のために選択した。関連する組成物およびウサギにおけるガングリオシドの組織分布は、ヒトのものと類似する(75)。３匹のウサギの各群を、50μgのQS-21と混合した500μgの1A7、または50μgのQS-21と混合した500μgの1A7-KLHのいずれかで免疫化した。０、14、28および42日目に筋肉内注射をした。血液サンプルを４回目の免疫化の10日後に採集し、そしてAb3(Ab1')応答およびＴ細胞増殖について分析した。表４は誘導された体液性免疫応答を示す。
0003816103.tif 000006
結果を３連の測定値の平均値として示す(S.D.＜10％）。GD-2ネガティブ細胞株または非関連ガングリオシド(GD3、GM3など）との反応はなかった。PBS-BSAコントロールで得られたO.D.値は0.08であった。
KLH結合1A7＋QS-21は、３匹全てのウサギにおいて、より高レベルの抗アイソタイプおよび抗アロタイプ応答を誘導した。Ab3およびGD2ポジティブ細胞結合阻害反応は、３匹全ての1A7＋QS-21免疫化ウサギにおいてより良好であった。各群における３匹のウサギのうち２匹が抗GD2抗体を惹起し、そしてこの応答は、1A7-KLH＋QS-21群と比較して1A7＋QS-21免疫化群においてより良好であった。
従って、これらの実験において、1A7＋QS-21は、マウスおよびウサギにおいて所望の抗腫瘍応答を惹起し得、そして1A7へのKLH結合のさらなる利点はなかった。ウサギAb3血清は、インビトロADCCアッセイよりM21/P6およびEL4細胞に対して細胞傷害性であり、そしてウサギ血清における抗GD2抗体のアイソタイプは、極微量のIgＭと共に大部分がIgG型であった。ウサギ血清におけるAb1'抗体はまた、FACS分析により、メラノーマ細胞と反応したが、GD-2ネガティブガン腫細胞とは反応しなかった。表５はPBL形質転換アッセイについて免疫化ウサギからの代表的なデータを示す。
0003816103.tif 000007
結果を３連の測定値の平均値として示す(S.D.＜10％）。刺激指標＞3.0をポジティブとして任意にみなす。
表５に示された結果は、1A7-KLH＋QS-21および1A7-QS-21の両方を用いたウサギの免疫化は、抗Id 1A7、照射GD2ポジティブM21/P6細胞およびEL4細胞に対するPBLにおいてＴ細胞増殖を誘導したが、GD2ネガティブLS174-Ｔ細胞に対して、またはGD2およびGD3に対するPBLにおいてＴ細胞増殖を誘導しないことを示した。正常アイソタイプ適合コントロールAb2に対する有意でない刺激があった(S.I.＜3.0)。種々の刺激に対する刺激指標は、免疫化ウサギの両群においてほぼ同一であった。
実施例２：1A7重鎖および軽鎖配列の獲得
1A7抗体についてのポリヌクレオチド配列を、1A7産生細胞株由来のメッセンジャーRNAを単離することにより得た。各配列決定のために、1×107 1A7ハイブリドーマ細胞から全RNAを単離した。オリゴチミジレート−セルロースカラムの２サイクルのクロマトグラフィーに通す通過により、メッセンジャーRNAを調製した。mRNAの収量は約10μgであった。第１鎖cDNAを、SuperScript Preamplificationキット(GIBCO/BRL)を用いて合成した。
重鎖可変領域を配列決定するために、PCRをマウスγ1定常領域のアミノ酸126〜119に対応する逆方向プライマー：
5'-CCCAAGCTTCCAGGGRCCARKGGATARACIGRTGG-3'
およびマウス可変領域サブグループのN末端リーダー配列に対応する正方向プライマーの種々の混合物を用いてcDNA上で行った。正の反応を与えるアミノ酸-20〜-12に対応する正方向プライマーは：
5'-ACTAGTCGACATGGCTGTCYTRGBGCTGYTCYTCTG-3'
であった。
cDNAの増幅フラグメントを、pT7プラスミド中にサブクローニングし、そしてNovaBlueコンピテント細胞を、供給者(Novagen)により提供されたプロトコルを用いて形質転換した。組換えコロニーを色選択（color selection）により釣り上げ、そしてプラスミドDNAをミニプレップ手順により調製した。二本鎖プラスミドのDNA配列を、Sequenase Version 2.0キット(USB,Cleveland,Ohio)を用いて決定した。プラスミド中のDNA挿入物の配列を、プラスミドに特異的なプライマー；すなわちT7プロモーター(TAATACGACTCACTATAGGG)およびU-19(GTTTTCCCAGTCACGACGT)を用いて両方向から決定した。少なくとも８クローンを配列決定のために釣り上げた。
1A7軽鎖可変領域の配列を類似の様式において決定した。PCRにおいてポジティブな結果を生じる正方向および逆方向プライマーは：
5'-ACTAGTCGACATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCT-3'
5'-CCCAAGCTTACTGGATGGTGGGAAGATGGA-3'
であり、これはリーダー配列のアミノ酸-19〜-10、およびマウスκ鎖定常領域の122〜116に対応した。
PCR増幅におけるエラー率を最小にするために、pfu DNAポリメラーゼ(Stratagene,San Diego)を、この後の全ての実験における増幅のために使用した。この耐熱性DNAポリメラーゼを用いた変異頻度は、Taq DNAポリメラーゼと比較して1/10である。
単離したcDNAが1A7重鎖および軽鎖に対応するという確認を、単離した抗体のＮ末端のアミノ酸配列決定により得る。50μgの精製した1A7抗体を、サンプル充填緩衝液（50mM Tris-HCl, pH6.8, 1％ SDS, 1％グリセロール，0.1％ β-メルカプトエタノール）で希釈し、そして100℃で３分間加熱する。変性させたタンパク質を、SDSを含む7.5％ ポリアクリルアミドゲル（BioRad Miniprotean II Dual Slab Cell）上に載せ、そして200Vで１時間電気泳動を行う。ゲル内のタンパク質を、Towbinら（(1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 78: 4350-4354）に記載の手順により、ポリビニリデンジフルオライド（PVDF）膜に150mAで一晩トランスファーする。トランスファー緩衝液は、25mM Tris、192mM グリシン、20％(v/v)メタノールを含有する。膜を、50％メタノール−50％酢酸中の0.1％ クマシーブリリアントブルー中に迅速に浸すことにより染色し、続いて10％酢酸を加えた40％メタノールを含む溶液で洗浄する。膜を室温で乾燥させた後、染色された重鎖および軽鎖のバンドを清潔な剃刀の刃で切り出す。膜スライス上のタンパク質に対し、パルス化−液体化学（pulsed-liquid chemistry）およびオンラインのフェニルエチオヒダンチオンアミノ酸同定を使用するApplied Biosystem Model 477Aタンパク質シークエンサーを用いる自動化エドマン分解により、Ｎ-末端のマイクロシークエンシングを行う。各タンパク質を10〜15の分解サイクルにかけ、そして各サイクルからの変換した切断産物を、逆相HPLCにより解析した。
モノクローナル抗体1A7の重鎖および軽鎖の可変領域についての核酸配列および対応する翻訳物を、図１および図２に示す。
重鎖および軽鎖のポリヌクレオチドおよびアミノ酸配列を、PDB、SwissProt、PIR、SPUpdate、GenPept、およびGPUpdateデータベースから入手可能な配列と共に、National Center for Biotechnology InformationのBLASTアルゴリズムを用いて比較した。この比較を1995年12月16日に行った。
図12は、1A7軽鎖可変領域をコードする配列に対する10個の最も密接に適合したポリヌクレオチド配列を示す。図13は、1A7重鎖可変領域をコードする配列に対する10個の最も密接に適合したポリヌクレオチド配列を示す。
図３は、1A7軽鎖および重鎖アミノ酸配列と、BLAST調査において見出された15個の最も密接した配列との比較図である。パネル(A)は、軽鎖比較を示す。パネル(B)は重鎖比較を示す。適合配列についてのデータベース同定を、表６に示す：
0003816103.tif 000008
1A7軽鎖可変領域の配列と最も密接に適合した50個のデータベース配列間で、どの配列も同一ではなかった。1A7は、第２の相補性決定領域(CDR2)に含まれる残基50および55での２個の置換差異により、５個の最も密接した配列とは異なった。これらの位置での２個の差異は、非保存的な置換であり、そして他の軽鎖配列と比較して持続された。
1A7重鎖可変領域の配列と最も密接に適合した50個のデータベース配列間では、いずれも同一ではなかった。以下にこの比較から導き出された主要点を要約する。
・最も密接な適合は残基９で始まる重鎖フラグメントとである（名称gp|M36221|MUSIGHAEB 1)。残基1と97との間に（VDJ接合部の前に）６個の置換、残基97の後に６置換差異があり、そして1A7はVDJ接合部について２残基短かった。
・完全長重鎖可変領域との最も密接な適合は以下の特性を有した（名称gp|U01185|MMU01185):残基１と97との間に10個の置換差異、残基97の後に７個の置換があり、そして1A7はVDJ接合部について３残基短かった。
・1A7は、VDJ接合部について１〜８残基の挿入または欠失により１つを除いて全配列が長さにおいて異なった。等しい長さの配列について(名称pir|S11106|S11106)、残基１と97との間に18個の置換差異、そして残基97の後に８個の置換があった。
・他の全ての比較により、残基１と97との間に少なくとも14個の置換差異が示された。
・他の全ての比較により、残基97の後に少なくとも４個の置換差異が示された。
・他の全ての比較により、全部で少なくとも22個の挿入、欠失および置換差異が示された。
・差異は可変領域全体にわたって現れた。
15個の最も密接に適合したVLおよびVH領域のアミノ酸コンセンサス配列を設計し、そして1A7配列と比較した。これを図3(C)に示す。VDJ接合部についてのスプライシング差異とは別に、1A7と原型配列との間に約16個の差異があるようである。これらの差異のうち２個は軽鎖に存在し、14個は重鎖に存在する。７個はCDRに生じるが、９個は可変領域フレームワークに生じる。点差異は、生殖系列可変領域配列の体細胞変異から生じたようである。
実施例３：非ヒト霊長類における免疫原としての1A7
ヒトにより密接に関連するモデルとして、本発明者らは、カニクイザル(Macaca fascicularis)におけるGD2特異的体液性応答の誘導について抗Id 1A7の効果を調べた。カニクイザルにおけるGD2の正常組織分布は、ヒトのものと非常に類似している。このように、この霊長類モデルは、これらの薬剤により誘導される毒性を評価するため、そして最初の臨床試験のための有用投与量を確立するために理想的である。
カニクイザル（群あたり２匹、２〜４kg体重）は、アジュバントとして100μgのQS 21と混合した精製Ab2(2mg)の４回の筋肉内注射を受けた。コントロールのサルを、同様の方法でQS 21と混合した非関連Ab2である3H1で免疫化した。全ての注射を２週間間隔で行った。サルを各免疫化の10日後に採血した。
血清をサンドイッチRIAによるAb3応答およびAb1へのAb2結合の阻害について分析した。これらのアッセイのために、血清を正常マウス免疫グロブリン(500μg/ml)で前処理し、抗アイソタイプおよび抗アロタイプ反応をブロックした。250ngの1A7(Ab2)を96ウェルプレートに被覆した。ブロッキングの後、50μlの異なる濃度のPRO＃685またはPRO＃778(Ab3)を添加し、そして振盪しながら室温で２時間インキュベートした。洗浄の後、90,000cpmの125I-1A7を各ウェルに添加し、そして室温で1.5時間インキュベートした。次いで、このプレートを洗浄し、そして結合放射能を測定した。
結果を図４に示す。1A7で免疫化したサル(PRO 685およびPRO 778)由来のAb3血清は、免疫化Ab2(1A7)に特異的に結合した。非関連Ab2(3H1)と最少の反応性を有した。
図５は、サルAb3血清がまた、放射性標識Ab2とAb1との結合を阻害したことを示す。500ngの1A7(Ab2)または14G2a(Ab1)を96ウェルプレートに被覆した。ブロッキングの後、50μlの異なる濃度のPRO＃685(Ab3)を50μlの125I-14G2aまたは125I-1A7(90,000cpm)と共に各ウェルに添加した。1.5時間のインキュベーションの後、プレートを洗浄し、そして結合放射能をカウントした。免疫前血清、または非関連Ab2である3H1で免疫化したサル(PRO 541およびPRO 667)から得られた血清による阻害はなかった。これらの結果は、サルAb3血清がAb1とイディオタイプを共有することを示す。
免疫化サルの血清における抗GD2反応を測定するために、精製GD2(250ng/ウェル）を96ウェルプレートに吸収した。１％BSAを含むPBSを用いてウェルをブロッキングした後、試験血清およびAb1を同じ緩衝液で希釈し、そしてウェルに添加し、そして室温で一晩インキュベートした。洗浄の後、結合抗体を２次抗体としてアルカリフォスファターゼ標識抗マウスまたは抗ヒトIg試薬を用いて検出した。両方のサル由来の血清はポジティブな試験結果を示した。
1A7免疫化サル血清がCD2ポジティブメラノーマ細胞に特異的に結合するかどうか決定するために、メラノーマ細胞株M21/P6に対するサルAb3血清の結合を試験した。M21/P6細胞(２×106）を、異なる濃度のPRO＃685、PRO＃778(Ab3)または14G2a(Ab1)とインキュベートし、そして結合抗体量を測定した。
図６は４回目の免疫化後に採集された血清が、メラノーマ細胞と反応したが、抗原ネガティブMCF-7乳ガン細胞株とは反応しなかったことを示す。Ab3血清はまた、ELISAによりマイクロタイタープレートに被覆された精製GD2に特異的に結合した。免疫前サルまたは非関連Ab2(3H1)免疫化サル由来のコントロール血清は、GD2と測定可能な結合を示さなかった。並行実験において、サルPRO 685由来の同じAb3をCEA（非関連腫瘍特異的抗原）で被覆されたプレート上で比較し、そしてネガティブであった。
次いで、Ab3抗体を吸収およびAb2-Sepharose 4Bで作製したアフィニティーカラムからの溶出により血清から精製した。次いで、溶出抗体をSepharose 4Bに結合させた正常マウスIgからなる免疫吸着性カラムに通過させ、抗アイソタイプおよび抗アロタイプ反応性画分を取り除いた。通過した抗体を濃縮し、そして精製Ab3として使用した。サル血清由来の精製Ab3を、異なるアッセイで精製Ab1(14G2a)の反応性と比較した。本発明者らは、サル＃PRO 685由来の10mlの血清から2.6mgの精製Ab3（すなわち、1mlの血清あたり約260μgのAb3）を回収し、そしてサル＃PRO 778由来の血清からは少し少ない精製Ab3を回収した。
M21/P6細胞に対するAb3の結合を、フローサイトメトリーにより分析した。標的細胞M21/P6またはコントロール細胞MOLT-4(0.2％BSAを補ったPBS中の５×105）を、Ab3およびAb1の異なる希釈物と４℃で１時間インキュベートした。PBSで洗浄した後、染色をFITC標識２次抗体を用いて行い、そしてFACScanフローサイトメーターで分析した。
結果を図７に示す。パネルＡにおいて、腫瘍細胞(M21/P6)を、免疫前血清およびQS-21と混合した1A7で免疫化したサル由来のAb3血清(1:100希釈）と反応させた。この反応をヤギ抗ヒト(F(ab')2IgG-FITC標識抗体で発現させた。パネルＢにおいて、GD2を発現しないMOLT-4細胞を、免疫前血清および1A7＋QS-21に対して惹起した免疫サルAb3血清と反応させた。パネルＣにおいて、腫瘍細胞(M21/P6)を、PBS-BSAコントロールおよび精製Ab1(14G2a)と反応させた。反応を、ヤギ抗マウスF(ab')2IgG-FITC標識抗体で発現させた。この結果は、免疫前血清ではなく免疫血清由来のAb3がGD2産生M21/P6細胞に特異的であったことを示す。
図８は、Ab3が特異的な様式でGD2標的抗原に直接結合することが示された実験からの結果を示す。250ngの異なるガングリオシドを96ウェルプレートに被覆した。ブロッキングの後、50μgの異なる濃度のPRO＃685(Ab3)および14G2a(Ab1)を添加し、そして室温で４時間インキュベートした。結合抗体をアルカリフォスファターゼ結合２次抗体を用いて検出した。
図９は対応する阻害実験を示す。異なるガングリオシド(250ng)を、前のように96ウェルプレートに被覆した。異なる濃度のAb3およびAb1を90,000cpmの125I-14G2aとともに添加した。このプレートを振盪しながら室温で２時間インキュベートし、洗浄し、そしてカウントした。阻害パーセントを計算し、そしてAb1およびAb3の濃度に対してプロットした。
免疫化血清および種々のガングリオシドに対する抗GD2抗体に対する精製Ab3の反応性もまた、イムノブロッティングにより測定した（図10）。精製ガングリオシド(各２μgのGM3、GM2、GM1、GD3、GD2、およびGT1b）を、１cm間隔でPVDFセルロース膜の細片上にスポットした。３％BSAを含むPBSを用いてブロッキングした後、この細片を、PRO＃685(Ab3)またはPRO＃778(Ab3)または14G2a(Ab1)、または非関連Ab2に対して惹起させた非関連サルAb3である11D10、およびPBSコントロールと共にインキュベートした；各抗体を10μg/ml（5mlの総溶液）で使用した。インキュベーションを振盪しながら室温で４時間行った。洗浄の後、この細片をアルカリフォスファターゼ標識２次抗体（1:1000希釈）と共に、室温で２時間インキュベートした。
この結果は、1A7-QS21免疫化サルAb3抗体が、Ab1と同一の抗原GD2と結合することをはっきりと証明した。
サルにおけるAb3応答の誘導は、いくつかの正常組織においてGD2の存在にかかわらず動物における明らかな副作用をいずれも引き起こさなかった。軽い局所隆起および刺激が、多重免疫化の結果として注入部位に観察されたのみであった。サルを、日常的に身体的検査および体重測定によりチェックした。これらによって、異常性または神経学的問題の徴候はいずれも示されなかった。７ヶ月後に得られた解剖標本の免疫組織化学的分析は、抗Id 1A7＋QS-21ワクチン処置により誘導された毒性がなかったことを示した。
実施例４：高腫瘍負荷を持つ患者における1A7抗体ワクチンの臨床使用
本発明者らは、臨床使用のための精製1A7抗体9.7gを得た。この抗体をGMP条件下でTSD BioServicesにより精製した。本発明者らは、FDAガイドラインに従って抗体調製に関するすべての規定の試験を完了した。本発明者らは、進行性のメラノーマ患者における1A7＋QS-21の使用についてFDAから最近認可を受けた(BB-IND#6183)。
本研究の目的は、免疫応答（体液性および細胞性両方）の種々の成分に対する第１世代ワクチンの効果を決定すること、最適の免疫調節投与量および抗Id抗体の毒性を決定すること、および臨床条件に対する利益が存在するかどうかを決定することである。
転移メラノーマを有する適格な患者をGD2抗原を有するとして確定する。患者は、６ヶ月以上の余命を有し、栄養が適切で、妊娠しておらず、Southwest Oncology Group performance scoreが０であり、少なくとも４週間の間すべて先の抗ガン治療をおこなっておらず、mAb治療を以前にうけておらず、非ステロイド抗炎症剤またはシメチジンまたは他のH2レセプターアンタゴニストの継続使用がなく、適切な血液カウントを有しおよびインフォームドコンセントにサインする能力を有さなければならない。
本研究のすべての患者を、筋肉内経路により、100μgのQS-21アジュバントと混合した１mg、２mg、４mg、または８mgの1A7のいずれかで免疫化した。患者は、４つの投与量レベルの１つに無作為に選択した。患者の総数は約12〜32の間である。４回の合計投与量について注射を隔週で行う。腫瘍の進行が見出されるまで毎月注射して治療を継続する。患者を過敏症、血清疾患、および他の潜在的な副作用について注意深くモニターする。
造血細胞ならびに腎機能および肝機能に対する効果を決定するために定期的に血液サンプルを得る。全ての患者は最初の免疫化の前に白血球搬出法を受ける研究に入る（前治療）。さらに、Ab3およびAb1'抗体の血清レベルおよび細胞傷害性Ｔ細胞応答を決定するために、1A7の各注射の前に血液サンプルを得る。体液性応答の特異性を免疫フローサイトメトリー、ラジオイムノアッセイ、およびドットブロット分析により確認する。マウス抗体に対する抗グロブリン応答をサンドイッチRIAにより試験する。血清をまた、抗GD2 mAbのGD2抗原に対する結合を阻害する能力について試験する。患者の免疫プロフィールを、抗id抗体、精製GD2抗原、および照射腫瘍細胞に対する患者のリンパ球の増殖応答、ならびにGD2ポジティブHLA適合細胞株またはオートロガスな腫瘍細胞（ポジティブの場合）に対する患者のリンパ球の細胞傷害性を試験することによりさらに評価する。
Ab2を用いた免疫化により誘導される体液性免疫の発達を、異なる時点（治療前、３回および４回の免疫化後、および次いで治療が継続する場合注射前に月に一度）で患者から得た血清を試験することにより評価する。血清を、最初に、サンドイッチRIAによる総ヒト抗マウス抗体（HAMA)応答（抗アイソタイプおよび抗アロタイプ）について試験する。簡単に述べれば、マイクロタイタープレートを1A7で被覆し、そして患者の血清の異なる希釈物とインキュベートする。洗浄後、抗原抗体反応を、均一サンドイッチRIAで125I標識1A7を用いて発現させる。本研究では、1A7をインタクトなIgGとして注射するため、患者のHAMA応答が上昇すると予想される。
次いで、ポジティブ応答の免疫化した患者由来の血清を、抗-抗イディオタイプ抗体（Ab3)の存在について試験する。血清を、正常マウス免疫グロブリンを含む緩衝液で希釈し、アイソタイプおよびアロタイプの決定基に対してヒト抗体をブロックし、ついでRIAにより抗1A7の存在について調査する。非関連のAb2をコントロールとして用いる。洗浄後、抗原抗体反応を、上記の均一サンドイッチRIAで、125I標識抗id試薬を用いて発現させる。前処理非免疫血清および正常ドナー由来の血清を、これらのアッセイでコントロールとして用いる。
抗体が1A7に対して検出される場合、この血清を、マイクロタイタープレートに結合した14G2aに対する125I標識1A7の結合を阻害するその能力について調査するか、またはこのプレート上の1A7に対する放射性標識14G2aの結合を阻害するその能力について調査する。非関連のAb1-Ab2系をコントロールとして用いる。これは患者の血清中のAb3が、14G2a(Ab1)とイディオタイプを共有するかどうかを実証する。Ab3血清によるAb1-Ab2結合のこの阻害アッセイはまた、Ab3が真の抗-抗イディオタイプであるかどうかを実証する。
天然の標的抗原に対して向けられる体液性免疫応答を評価するために、患者のAb3血清を、RIA中でGD2を発現することが知られている細胞株との反応性について、およびまた抗ヒトIgGおよびIgMトレーサー試薬を用いるFACS分析により試験する。さらに、この血清を、マイクロタイタープレート上に被覆したGD2抗原の可溶化精製調製物に対する反応性について試験する。この抗原抗体反応を、125標識抗ヒトIg試薬を用いることにより検出する。非免疫血清をコントロールとして用いる。非関連の抗原をまたこのアッセイで用いる。GD2抗原に結合するヒトAb3血清のアイソタイプを、抗ヒトアイソタイプ特異的試薬を用いるELISAにより決定する。
Ab3およびAb1が同じ抗原決定基に結合することを実証するために、Agポジティブ腫瘍細胞株またはGD2抗原に対する14G2a結合のAb3血清による阻害を、RIAで決定する。患者血清中のAb3が腫瘍細胞に特異的に結合する場合、ADCCエフェクター細胞または補体と組み合わせこれらの細胞を溶解するAb3の能力を、標準ADCCまたは補体媒介性細胞溶解(CMC)アッセイで実証し得る。
応答の定量：
宿主Ab3（抗1A7抗体）およびAb1'（抗腫瘍抗体）の反応性はこの実施例の鍵となる測定である。患者の血清における抗-抗id抗体（Ab3)の発現を、以下のRIA阻害研究により定量する。簡単に述べれば、マイクロタイタープレートを14G2a(Ab1)で被覆し、そして固定量の125I標識Ab2と反応させる。標準阻害曲線を精製14G2aをインヒビターとして用いて作成する。次に、抗-アイソ-アロタイプ活性の涸渇した患者の血清を、異なる希釈で、Ab1-Ab2反応を阻害する能力について調査し、そして血清中のAb1様抗体の量を標準阻害曲線から推定する。Ab3応答の誘導および持続時間を異なる投与量レベル間で比較する。多くの投与量でAb3応答または持続時間の間に統計上の差がない場合、精製GD2抗原で被覆したプレートに対するELISAアッセイによる血清中の特異的抗腫瘍応答(Ab1')の力価を異なる投与量レベルの間で比較する。
抗1A7ポジティブの患者血清で抗GD2が検出されない場合、それは、Ab1が患者の腫瘍細胞に結合しているか、または低親和性であるからであり得る。このことを決定するために、患者のPBMCを、インビトロで腫瘍特異的抗体の誘導のために、抗原またはAb2で刺激する。PBMCを、治療前およびその後４回目の免疫化の１ヶ月後に収集した血液から得、改変Mishell-Dutton培養中の種々の濃度の1A7または非関連のAb2(10μg〜100ng）、またはGD2抗原と培養する。培養上清を回収し、そしてまずELISAアッセイにより特異的ヒト免疫グロブリンの産生について、およびラジオイムノアッセイにより1A7の不溶化の調製物に対する結合について調査する。さらに、この上清を、125I標識14G2aからAb2への間の反応を阻害するそれらの能力によってイディオタイプを有する分子の内容について試験する。さらに、この上清を、RIAまたはELISAアッセイ（感度＞1ng)により、125I標識抗ヒトIg試薬を用いた結合アッセイで14G2a Agポジティブヒトミエローマ細胞およびAgネガティブガン腫細胞とのそれらの反応性について調査する。この作用の特異性を、同じアイソタイプの非関連のAb2とPBMCをインキュベートすることによりモニターする。Ab3ポジティブ患者のみがこのインビトロ研究に含まれるので、1A7で刺激したPBMCは1A7に結合する抗体を分泌し、そしてポジティブコントロールとして働くはずである。
ネットワーク仮説によれば、1A7で免疫化した患者は、結局、抗イディオタイプ1A7の特異性を模倣し得るAb4応答（抗-抗-抗-id)をまた誘導し得る。この可能性を研究するため、Ab3ポジティブ患者の血清（抗アイソタイプおよび抗アロタイプ抗体を涸渇した）を、ELISAまたはRIAにより14G2a(Ab1)と反応することにより抗イディオタイプ活性について測定する。ポジティブおよびネガティブコントロールをAb3アッセイに記載のように含める。このアッセイのための血清を最後の治療の３ヶ月後に得る。
細胞媒介性免疫
腫瘍関連糖脂質GD2に特異的なＴ細胞応答が1A7処理メラノーマ患者で生成されるかどうかを、以下の基準により試験する：（１）腫瘍細胞上のGD2を標的にするＴ細胞応答が存在するか、および（２）この応答が免疫化を繰り返すことで増加するかどうか。分析を２つのフェーズで進行させる。第１は、与えられたすべてのPBMCサンプル由来のＴ細胞が、1A7に対するインビトロ免疫化の後増殖し得るかどうかを決定することである。これが起った場合、次の工程は、これらのＴ細胞が、オートロガスなGD2を有するメラノーマ腫瘍細胞またはオートロガスなCTLと共通に単一HLA抗原を共有するアロジェニックGD2発現メラノーマ細胞に対するサイトカインを溶解または放出し得るかどうかを決定することである。
本研究に参加した患者は最初の免疫化の前に白血球搬出され、そしてFicoll HypaqueTM分離した末梢血単核細胞（PBMC）を調製し、そして将来の研究のために低温保存する。これらのPBMCは、（１）次の研究のために抗原提示フィーダー細胞を提供し、（２）Ｔ細胞応答についてベースラインとして供され、および（３）免疫学的研究のためのトランスフェクション標的であるオートロガスなEBV細胞株を生成するために使用される。さらに、各免疫化の後、60mlの末梢血を引き抜き、Ficoll HypaqueTM分離し、そしてＴ細胞応答の決定のために低温保存する。研究されるべきＴ細胞応答は、特異的な細胞傷害性Ｔ細胞の生成、サイトカイン産生性Ｔ細胞、および抗原に応答するＴ細胞培養の増殖である。利用できるならば、皮膚腫瘍バイオプシーを患者から得、腫瘍浸潤リンパ球（TIL)の供給源を提供する。同様の研究をTILを用いて行い、腫瘍バイオプシーがGD2特異的細胞の供給源になるかどうかを決定する。また、腫瘍バイオプシーは、細胞傷害性アッセイ、サイトカイン産生、および増殖アッセイのための重要なオートロガス標的として働く腫瘍細胞の供給源を提供する。
Ｔ細胞のインビトロ機能活性を以下のように測定する：Ficoll HypaqueTM分離PBMC(1〜3×106)を、0.1〜100μg/mlの抗id 1A7抗体に対して、培地単独、IL-2(10 Cetus units/ml)、の存在下でインキュベートする。細胞培養培地は、10％ヒトAB血清、ゲンタマイシン、ピルビン酸ナトリウム、非必須アミノ酸、Ｌ-グルタミンおよび10 Cetusユニット/mlの組換えIL-2を補充したIscoves培地を含む。７日毎に、培養を、０日目に使用した適切な抗原で予備感作した、照射したオートロガスなPBLで刺激する。インビトロ感作の方法は、Rivolitiniら(1995)J.Immunol.154:2257-2265により最近記載された方法に類似する。開始21日および週に一度、増殖細胞を細胞表面表現型および細胞傷害性能力ならびにサイトカイン産生能力について評価する。最初に、すべてのＴ細胞を、1A7抗id分子の配列を含有するcDNAでトランスフェクトされたオートロガスなかつアロジェニックなEBV細胞を認識および溶解するそれらの能力について試験する。1A7をトランスフェクトしたオートロガスなEBV細胞の10％より多くを溶解する培養物を、NK感受性株K562、LAK感受性株Daudi、利用可能であればオートロガスな腫瘍、および他のメラノーマ腫瘍細胞を有するHLA適合および非適合GD2に対してさらに試験する。好ましくは、40を超えるクラスIおよびクラスII抗原の両方を発現する各々良く特徴付けられたメラノーマ腫瘍細胞株のパネルを使用する。さらに、GM-CSFアッセイを行い、特異的な細胞傷害性に加えて、またはその代りにサイトカインの特異的な放出があるかどうかを決定する。作用因子に対する培養物の増殖を、インビトロ刺激後の細胞数の増加により決定する。
６回までのインビトロ刺激の後、これらの研究の可能な結果は、両方の1A7でトランスフェクトしたEBV細胞、ならびにオートロガスな腫瘍および／またはHLA適合アロジェニックメラノーマ腫瘍細胞株に対するＴ細胞細胞傷害性における動力学的増加である。これは、抗id 1A7分子を用いるそれら自身の腫瘍細胞に対する患者の成功した免疫化を示す。次いで、認識された抗原が腫瘍細胞上のGD2であるかどうかを決定するための研究を行い、そして認識の可能な機構を同定する。
本研究の目的は以下を含む：（１）免疫系の種々のアームにおけるGD2に対する免疫応答を誘発するための最適投与量の決定；Ｔ細胞応答が特に好ましい；
（２）理想的には、ガンの緩解または緩和。
本研究の完了時、第２の研究を、最適免疫調節投与量を用いて設計する。第２の研究における総患者数は、統計学的モデルに基づき、16〜25の間である。
実施例５：アジュバント設定における1A7抗体ワクチンの臨床使用
本研究の目的は、GD2関連のガンに対して処置され、そして疾患の臨床的症状を有さない患者において、1A7の効果を確認することを含む。理想的には、1A7は、危険性または再発率を減らす最適投与量を与えられる。
適格な患者は、GD2ポジティブの小細胞肺ガンを有する患者である。全ての患者は、標準的な化学療法の後、完全な臨床的緩解に入らなければならず、そして６週間以内に化学療法および放射線照射療法を完了しなければならない。患者は、余命６ヶ月以上、栄養が適切で、妊娠しておらず、Southwest Oncology Group performance scoreが０であり、モノクローナル抗体治療を受けた経緯がなく、非ステロイド抗炎症剤またはシメチジンまたは他のH2レセプターアンタゴニストを継続使用しておらず、適当な血液カウントであり、およびインフォームドコンセントにサインする能力を有さなければならない。
1A7の種々の投与量レベルを適切なアジュバントと組み合わせる。１つの候補はQS-21である。QS-21分子は、キラール酸3,28-O-bisグリコシドの一般構造を有するトリテルペングリコシドから成る。それは約２：１の代表的な比で、V-1およびV-2と称される２つの構造異性体から成る。両方の異性体はアジュバント活性を有する。QS-21はＴ依存性抗原および非結合のＴ非依存性抗原の両方に対する応答を促進することが示されている。QS-21はまた、サブユニット抗原ワクチン、および抗原特異的Ｔ細胞増殖に対する、主要組織適合複合体-制限クラスi細胞傷害性Ｔリンパ球の誘導を増加する。100μgのQS-21を、Memorial Sloan-Kettering Cancer Center,NYで行われた試験において、投与量あたりの最適量のアジュバントとして確立した。他の候補であるRibiTMPCは、Ribi Immunochem Research Inc.,Hamilton Montanaから得られ、そして製造業者の指示に従って使用する。
患者は、２週間毎に１回の1A7の筋肉内注射を合計４回の注射として受ける。患者は、100μgのQS-21と混合して１回の注射あたり１mg、２mg、または４mgのいずれかの1A7で免疫化する。治療を毎月行い24ヶ月継続し、次いで３ヶ月毎にまたは腫瘍の進行が検出されるまで継続する。患者の総数は９人〜24人の間である。
血液サンプルを各処置前に毎月に得る。Ab3(抗1A7)、Ab1'(抗Gd2)およびヒト抗マウス抗体（HAMA)の血清レベルを、標準的なイムノアッセイにより測定する。これらの応答の特異性を、放射性標識した細胞の間接免疫沈降およびSDS-PAGEにより確認する。血清をまた、標識1A7のM21/P6細胞または精製GD2への結合を阻害する能力について試験する。
ワクチンがＴ細胞免疫を誘導しているかどうかを決定するために、血液の１つのユニットの軟膜をFicoll HypaqueTM上で遠心分離する。末梢血単核細胞（PBMC)を取り出し、洗浄し、そしてリンパ球前駆体の頻度を決定する。CD3、CD28、およびCD45Rマーカーについての免疫染色を、３色フローサイトメトリーを用いて、サプレッサーＴ細胞由来の細胞傷害性Ｔ細胞を測定および選別するために使用する。1A7抗体および精製腫瘍抗原に対する増殖応答を決定する。細胞傷害性アッセイを、HLA適合結腸ガン細胞株またはオートロガスな腫瘍細胞を用いて行う。CD8+CD28+CD45R+細胞のサプレッサー細胞機能を、Ｂ細胞免疫グロブリン分泌の抑制として測定する。
各レシピエントの臨床的な特徴を定期的にモニターし、そして処置のききめを決定するためにコントロール集団と比較する。より多くの患者が研究に参加する必要があれば、1A7処置の投与量および頻度を調製する。コントロールと比較して危険性または進行速度を有意に増大させる1A7の投与量を同定する。
実施例６--1A7ポリペプチドフラグメントをコードする組換えワクシニアベクターの構築
組換えワクシニアウィルス(rvv)は、免疫寛容に打ち勝つ強力な因子を提供し得る。ワクシニアウイルスは高度に免疫原性であり、体液性および細胞媒介性免疫応答の両方を刺激する。ワクシニアはまた、細胞のMHC複合体とともにTAAを提示し得る。
この実施例はプラスミド構築および組換えワクシニアウイルスの産生を記載する。一般的なワクシニアベクター(rvv)の構築スキームを図11に示す。本発明者らは、National Center for Biotechnology Information(NCBI)からBLASTプログラムにより、ワクシニアウイルスの野生型WR株のTK遺伝子の完全な配列(GenBank，受託番号第J02425号)を検索した。Aitschulら、(1990)J.Mol.Biol.215:403-410。この配列データから、TK配列のヌクレオチド22〜39および727〜708にそれぞれ対応する正方向PCRプライマーおよび逆方向PCRプライマー５'-CAGATGGAAGGGCCCAACおよび５'-GATTGATGCATATCATTACCを合成した。Hrubyら、(1983) Pro.Natl.Acad.Sci.USA 80:3411-3415。プラスミドpGEM-7Zf(+)(Promega)への挿入のために、ApaI部位（下線）を正方向プライマーに導入し、そしてNsiI部位（下線）を逆方向プライマーに導入した。ワクシニアの野生型WR株由来のDNAを単離し、そしてTK遺伝子をPCRにより増幅した。予想されるサイズのDNAフラグメント（約700bp)を、PCRにより得た。このDNAを低融点アガロースでの電気泳動により分離し、そしてGELase(Epicentre Tech.)を用いた消化により精製した。TK DNAフラグメントを、ApaIおよびNsiIを用いた消化の後、pGEM-7Zf(+)に連結した。得られたプラスミド(pGEM-TK)を、標準的な形質転換技術により増幅した。挿入を制限マッピングにより確認した。
プロモーター7.5Kを、7.5Kプロモーター配列のヌクレオチド69〜88および335〜312に対応する、正方向プライマー５'-GTTATCGATGTCGAATAGCCおよび逆方向プライマー５'-TTGCTGCAGATTGAGTACTGTTCTを用いたPCRにより、野生型ワクシニアウイルスから増幅した。Cochranら(1985)J.Virol.54:30-37。ClaI部位（正方向）およびPstI部位(逆方向）がプライマー中に含められた。増幅したDNAフラグメントをPstIを用いて消化した。より小さなオリゴヌクレオチドを用いてポリヌクレオチドアダプターを合成し、ポリヌクレオチドキナーゼにより５'末端でリン酸化した。半リン酸化アダプターを、PstI消化されPCR増幅された7.5KプロモーターDNAフラグメントに連結した。この産物を、ClaI/EcoRI消化されたpGEM-TKを用いて消化した。
1A7ポリペプチドをコードするcDNA挿入片を、pVVのNcoI部位とXmaI(SmaI)部位との間に挿入する。このプラスミドはまた、scFv cDNAの5'末端にVHのリーダー配列を含む。所望の場合には、E.coli βガラクトシダーゼのcDNAを含むワクシニアコントロールプラスミドを構築し得る。
rvvの構築;rvvを、Mackettらの手順(DNA Cloning,第II巻、D.M.Glover編、IRL Press 1985)に従って、CV-1細胞を用いて、ワクシニアプラスミドおよびワクシニアウイルスの野生型WR株の相同的組換えにより構築する。βガラクトシダーゼを発現する組換えウイルスクローンを、5'-ブロモデオキシウリジンおよび5-ブロモ-4-クロロ-3-インドイル-β-Ｄ-ガラクトシダーゼ(Ｘ-Gal)の存在下で、TK-143B細胞の増殖により選択する。青色の組換えウイルスを、パスツールピペットにより採集し、そしてプラークを精製する。クローン選択の第２の工程として、抽出したDNAのサザンブロットを、プローブとして1A7 cDNAを用いて行う。rvvのさらなる選択を、ELISAによるウイルス感染CV-1または任意の他の真核細胞の培養上清のアッセイにより行う。細胞に結合した1A7ポリペプチドがrvvに存在する場合（すなわち、リーダー配列を欠失する場合）、細胞溶解物をアッセイする。プローブとして14G2aを用いるウエスタンブロッティングもまた行う。ワクシニアウイルスにより合成された1A7ポリペプチドの生物学的活性を、上記のように細胞結合阻害アッセイにより決定する。1A7ポリヌクレオチドを含むrvvクローンを、0.1％ニュートラルレッドを用いた染色により選択し、そして上記のようにプラークを精製する。ウイルスクローンを、標準的技術を用いて高力価溶解物に増殖させる(Mackettら(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79:7415-7419)。代表的には、最も高い量の1A7ポリペプチドを産生するクローンを、さらなる研究のために選択する。
組換えワクシニアウイルスにより発現される1A7ポリペプチド（外来タンパク質）のアッセイ：CV-1細胞を、25cm2フラスコまたは６ウェルクラスターフラスコ中で、10％ウシ胎児血清、ならびに１mlあたり100ユニットのペニシリンおよび100μgのストレプトマイシンを補充したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)中で増殖させる。細胞に、30のMOIでrvvを接種する。このウイルスを組織培養インキュベーター中で37℃で２時間吸収させ、続いて接種物を培養培地で交換し、そしてインキュベーションを続けた。上清を指示された時間のインキュベーション後取り出し、そして分泌された1A7ポリペプチドをアッセイする。コントロールとして、擬似（mock)感染細胞由来の上清を使用する。1A7ポリペプチドのアッセイを、本明細書の開示で記載したように、14G2aに対する結合について試験することにより行い得る。rvv-lacZにより産生されるβ-Ｄ-ガラクトピラノシドを、基質としてp-ニトロ-β-Ｄ-ガラクトピラノシドを用いて、Miller (Experiments in Molecular Genetics,Cold Spring Harbor Pines 1972)に従ってアッセイする。アッセイの前に、ウイルス感染細胞由来の培養上清をβ-プロピオネートで処理して、ウイルスを不活化する（Corcoranら、(1988)J.Parasit.74:763)。NFS60細胞による3Hチミジンの取り込みを、細胞増殖の尺度として使用する（Jaffeeら、(1993)Cancer Res.53:2221-2226）。擬似感染CV-1細胞由来の上清の存在下での3Hチミジンの取り込みによる放射能をバックグラウンドとして引く。ポジティブコントロールとして、かつ生物学的活性の標準のために、インタクトな1A7を使用する。あるいは、GM-CSFの標準溶液を、QinおよびChatterjee(1996)Gene Therapyに記載されるように使用し得る。
ワクシニア1A7ワクチンの試験：ワクシニアの投与のために、104〜107pfuのウイルス力価をマウスに注射する。注射は、皮下、筋肉内、皮内または腹腔内であり得る。免疫化を毎週行う。マウスを、Ab3(Ab1'を含む）の決定のために各免疫化の７日後に採血する。Ｔ細胞免疫性の発生についての試験を、追加抗原刺激免疫化の10日後に行う。マウスはまた、腫瘍チャレンジにより試験し得、ここで腫瘍細胞を用いた注射後の生存をモニターする。
ウイルス感染した腫瘍細胞によるワクシニアの投与のために、オートロガスな腫瘍細胞を、10％(容量/容量)ウシ胎児血清、２mMグルタミンおよびゲンタマイシンを含むイーグル培地中で維持する。75cm2フラスコにおけるコンフルエントな細胞の単層に、（３×108）プラーク形成単位(pfu)のrvvを接種する。37℃で２時間後、接種物をDMEMで交換し、そしてインキュベーションをもう24時間続けた。顕微鏡下の検査の後、細胞をかき取ることにより回収し、そしてPBSで２回洗浄し、そして所望の濃度(103〜105/200μl）でPBS中に再懸濁する。雌性C57BL/6マウス（６〜８週齢）を、Harlan Bioproducts for Science Inc.,(IN)から購入する。動物を、後左横腹に細胞ワクチンを用いて皮下に注射し、そして２週間後、腫瘍細胞をチャレンジのために後右横腹に注射する。腫瘍チャレンジ後のマウスの生存および腫瘍の存在を、毎日モニターする。腫瘍が測定可能な場合、腫瘍を２次元でカリパスにより毎週測定し、そして容量を式（幅2×長さ）/2を用いて計算する。触診できるが、正確な容量の測定のためには小さすぎる腫瘍は、ゼロ容量として記録するが、腫瘍の発生はポジティブとして記録する。腫瘍容量を、120日の観察期間にわたって実際に腫瘍を発達させる腫瘍についてのみ平均する。ゼロ値には、最終的に腫瘍を発達させるが、所定の時点で腫瘍がなかったマウスが含まれる。
統計学的評価を、SigmaStat software(Jandel,Inc.San Rafael,CA,USA)を用いて行う。0.05未満のＰ値を、統計学的有意差を示すとみなす。
実施例７  1A7単鎖可変領域分子の発現および特徴付け
本出願中の他に列挙する配列データに基づいて、単鎖1A7誘導体VH--(GGGS)3--VLのためのcDNA構築物を、標準的組換えクローニング技術により調製する。この構築物を、pET-22b(+)プラスミドベクター(Novagen,Madison,WI)に組み込み、そしてE.coli内で発現する。配列分析を行い、プラスミド構築物を確認する。この構築物はフレームワークのVLに連結されたVHのカルボキシ末端を含み、そしてリーダー領域は含まない。pET-226(+)は、６つの連続したヒスチジン残基(His6）からなるニッケルイオン結合ドメインを含む。His6ドメインはニッケルに対して高親和力を有し、これを組換え1A7 scFvの精製のために使用する。
細胞結合競合アッセイを、1A7 scFvがインタクトは1A7により示される抗原模倣性を保持するかどうかを調べるために行う。CD2ポジティブM21/P6細胞(50μl容量中に１×105細胞/ウェル）を、96ウェルプレート中に入れた。この細胞を、漸増濃度の1A7または1A7 scFvフラグメントの非存在下および存在下で、[125I]14G2a(Ab1)、100,000 cpmを用いて室温で２時間インキュベートする。阻害％を標準的な式に従って計算する。
候補1A7ポリヌクレオチドワクチンを以下のように免疫原性について試験する。２群の10〜15匹の雌性C57BL/6マウス（６〜８週齢）を、必要に応じてKLHとカップリングさせた50〜100μgの精製プラスミドの投与量を用いて筋肉内に免疫する。種々の投与経路（例えば、筋肉内、皮内、皮下および腹腔内）を比較する。
マウスを、上記のようにAb3(Ab1'を含む）産生の決定のために各免疫化の７日後に採血する。各群からの３匹のマウスを、追加抗原刺激免疫化の10日後、Ｔ細胞増殖アッセイ用の脾臓を単離するために屠殺する。効果が特異的であるかどうかを決定するために、以下のコントロールを使用する：(a)1A7ポリヌクレオチド挿入片を含まないプラスミド；(b)反対方向に1A7ポリヌクレオチド挿入片を含むプラスミド；および(c)非関連Ab2をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミド。
実施例８：1A7ポリヌクレオチドまたはポリペプチド誘導体を含有するワクチンを試験するための動物モデルの開発
多くの異なるフラグメント、構築物、プラスミド、および融合タンパク質が、GD2関連腫瘍のための第２世代のワクチンとして、本発明で意図される。動物を、候補ワクチンが免疫応答を誘発し得るかどうかを試験するために適切である限り、示された実施例で確立した。最終的に、目的は腫瘍治療においてワクチンを使用することであり、そしてこの最終目的のために候補ワクチンをスクリーニングするために使用し得る動物モデルを有することが望ましい。
従って、本発明者らは、(57BL/6)マウスEL4リンパ腫モデルを開発した。
Cheungら（1993,Int,J,Cancer 54:499-505)は、マウスリンパ腫EL4細胞がGD2を高密度で発現することを報告した。本発明者らは、最初、MAb 14G2aがEL4細胞に結合するかどうかを見たかった。本質的に100％のEL4細胞（Suzanne Rosenberg博士,Univ.of Marylandより供与）が、FACS分析により14G2aと高い蛍光強度で結合した。細胞結合阻害曲線は、1A7が、125I標識14G2aのEL4細胞に対する結合を効果的に阻害し得ることを示した。抗Id 1A7+QS-21を用いたC57BL/6マウスの免疫化は、インビトロADCCアッセイにおいて、EL4細胞に結合し、そしてEL4細胞を殺傷する抗GD2抗体を誘導した。また、免疫化C57BL/6マウス由来の脾臓細胞は、照射EL4細胞の存在下でインビトロＴ細胞増殖を示した。従って、同系免疫コンピテントC57BL/6マウスにおけるマウスEL4リンパ腫は、抗Id A7をベースにしたワクチンの効力を評価するための適切な動物モデルとして供され得る。
100,000のEL4細胞をC57BL/6マウスに皮下注射する。これは宿主に対して致死的であり、そして平均の生存時間は約４週間である。平均の生存時間は腫瘍細胞の接種物に依存するので、投与量に相関する時間曲線を、１群あたり10匹のマウスを用い、皮下注射で、103、104、105、106、および107腫瘍細胞／マウスを用いて作成する。緩慢に増殖するまたは急速に増殖する腫瘍に進行する投与量を決定する。皮下腫瘍モデルは、本発明者らがマウスを屠殺することなく腫瘍増殖および宿主免疫応答をより近密にモニターすることを可能にする。EL4細胞はまた、腹腔内注射し得、それは、腹腔内転移を伴って急速に増殖する。腹膜腔内モデルは、全身的に進行する腫瘍に対する免疫応答を研究するために適合され得る。
ワクチンの５つの異なる形態を調査し、そして効果を比較した。ワクチンは：
(i)1A7-QS21(本発明者らの標準コントロールとして）
(ii)照射EL4細胞（ポジティブコントロール）
(iii)GD2-KLH+QS-21(抗原ワクチン)
(iv)1A7-プラスミド
(v)1A7-ワクシニア構築物
抗-抗Id(Ab3)および抗GD2抗体の血清レベルを、本開示中に記載のように測定する。代表的には、血液サンプルを、ワクチン接種の前および各免疫化の10日後に得、そして抗GD2抗体をアッセイする。免疫応答強度、ワクチン（追加抗原注射）の複数回注射の効果、体液性応答の持続時間、および動物間の体液性応答の変動を免疫応答が発達する時間経過にわたって決定する。腫瘍チャレンジの生存と抗GD2力価を比較することで、体液性応答レベルと腫瘍保護との間に任意の相関関係が存在するか否かが確立される。免疫応答の特異性を、ELISA、RIA、DotBlot分析およびFACS分析により調べる。血清Ab3もまたインビトロADCCまたはCMCアッセイにより研究する。標的細胞はEL4である。マウス血清中の抗GD2抗体のアイソタイプを、アイソタイプ特異的試薬を用いてELISAにより決定する。
細胞性免疫応答を、Ｔ細胞増殖アッセイおよび細胞傷害性Ｔリンパ球（CTL)アッセイを用いてアッセイする。増殖アッセイを用い、ワクチン接種マウスから種々の刺激に対する細胞の増殖応答を評価する。脾臓細胞を実験ワクチンまたはコントロールワクチンで免疫した動物より回収し、そしてインビトロ培養に移す。次いで、脾臓細胞を、培地単独、植物性血球凝集素（PHA)、照射EL4細胞、精製GD2、抗Id 1A7または無関係のAb2のいずれかを用いて刺激する。細胞増殖を、培養５日後、次いで[3H]チミジン取り込みによる18時間の刺激により測定する。PHAを用いた脾臓細胞の刺激はＴ細胞の最大増殖を示し、そして培地単独を用いて培養したものはベースラインの増殖である。脾臓細胞培養は、抗原提示細胞を含む細胞タイプが混在している。上記の刺激物でパルスした細胞は、これらの細胞による抗原のプロセッシングおよび反応性Ｔリンパ球増殖を生じる。異なってワクチン接種したマウスの増殖応答を比較することにより、任意の特定のワクチンが他のワクチンより利点を有するかどうかを決定し得る。
Ｔ細胞のどのサブセットが誘導されているかを決定するために、フローサイトメトリーにより増殖細胞の表現型を決定する。あるいは、脾臓Ｔ細胞を、モノクローナル抗体RL.172(抗CD4+)またはmAb.168(抗CD8+)および補体とのインキュベーションにより、増殖アッセイの前に、CD4+またはCD8+細胞のいずれかを涸渇させる。
腫瘍保護のために重要であり得ると考えられるエフェクター機構の１つは、抗原特異的なCTL殺傷である。EL4またはGD2特異的CTL活性を、ワクチンがこのタイプの細胞応答を誘導するかどうかを決定するためにアッセイする。脾臓細胞をワクチン接種したマウスから回収し、そして照射EL4腫瘍細胞およびIL-2と、５日間同時培養し、Ag特異的CTLを拡張する。次いで、この脾臓細胞を、種々のエフェクター対標的比で、51Cr標識された標的細胞と混合し、そして次いで放出された放射能についてアッセイする。この標的細胞はEL4細胞およびMC38細胞である。MC38は、同じマウス系統由来のマウス結腸腫瘍細胞株であり、そしてそれ故同じH-2単相型を共有するが、異なる表面抗原マーカーを有する。これら腫瘍細胞の両方が51Crを取り込み、そして自発的な放出は低い。マウスのワクチン接種は、EL4細胞を特異的に溶解しそしてMC38細胞に特異的に溶解しないCTLの産生を刺激するはずである。
異なってワクチン接種されたマウス中のCTL活性を比較することにより、異なるレベルのCTL応答を刺激するワクチンの特定のタイプを決定する。また、生成されたこのタイプの免疫応答に影響するために、異なるアジュバントまたはサイトカインが必要かどうかが決定される。
実施例９：誘導ワクチンの効力の評価
異なるワクチン接種の効力を、先の実施例で概説された動物モデルを用いるワクチンにより生じる腫瘍保護の度合いにより測定する。腫瘍保護を、免疫応答の他の測定と比較し、腫瘍保護と体液性または細胞性応答のレベルとの間に任意の相関関係が存在するかどうかを決定する。
腫瘍増殖を防ぐワクチン接種の能力を評価するために、ワクチン接種されたマウスを腫瘍細胞の致死数でチャレンジする。免疫化スケジュールを、上述のように、体液性および細胞性免疫応答を評価することにより決定する。有意な免疫応答を誘導するために必要な免疫化のスケジュールおよび回数は、異なるタイプのワクチン間で変動するようである。15匹のマウスを、無関係のAb2で免疫化したマウスの１群を含む各ワクチン接種群において使用する。血液サンプルを、体液性応答をモニターするために、各免疫化の７日後に得る。ひとたび免疫化したら、10匹のマウスを、先に確立された皮下注射されるEL４細胞の致死数でチャレンジする。異なるワクチン接種群の生存を、Kaplan-Meier分析を用いて比較する。各ワクチン接種群中の他の５匹のマウスをCTLアッセイに用いる。これらの研究は、腫瘍チャレンジ時の免疫状態および腫瘍増殖の保護についての情報を与える。異なるタイプのワクチンをまた、保護免疫応答を刺激するそれらの能力について比較する（抗Idタンパク質、細胞、GD2-KLHまたはDNA)。
腫瘍保護のレベルを、腫瘍チャレンジで生存するマウスの数および免疫マウスが生存し得る腫瘍細胞の投与量により評価する。腫瘍保護のレベルを、腫瘍保護免疫応答を刺激するワクチンの各々について測定する。
腫瘍保護の特異性を、C57BL/6マウスで皮下増殖するMC38のような非関連の腫瘍細胞を用いて評価する。マウスの群を、異なるワクチンでワクチン接種し、次いでEL4またはMC38細胞のどちらかでチャレンジする。このマウスを毎日観察し、そしてマウスの２つの群の間の生存比較を、Kaplan-Meier分析を用いて行う。
確立された腫瘍、C57BL/6を有するマウスの処置におけるワクチン治療の効果を評価するために、マウスに適切な数のEL4細胞を皮下注射し、そして次いで24時間後、異なるワクチンまたは非関連のAb2ワクチンで免疫化する。このマウスを毎週免疫し、腫瘍増殖および生存を追跡する。
腫瘍を有する同系GD2抗原に対する保護免疫に関連する免疫エフェクターアームを決定するために、実験を行う。免疫Ab3血清（Ab1'含有）または免疫Ｔリンパ球サブセット（CD4+またはCD8+)またはNK細胞の養子免疫細胞移入を、細胞増殖を許容する放射線照射の致死量以下の投与量で先に処置した投薬されたことのないレシピエントC57BL/6マウスに行う。次いで、このレシピエントマウスおよび先にワクチン免疫したポジティブコントロールマウスに、致死数の腫瘍細胞を注射し、そして腫瘍増殖および生存について追跡する。
実施例10：誘導ワクチンの臨床使用
先の実施例の動物腫瘍モデルにおけるプラスミドを用いる有望な結果は、ヒト使用のためのプラスミドベクターの開発に至る。pcDNA3ベクターを、適切なAb2βフラグメントの組込みについてConryらに従って改変する。この改変は、ネオマイシン遺伝子の欠失、およびそれをTn903カナマイシン耐性遺伝子で置き換えることを含む。ヌクレオチド5004-208に対応するアンピシリン耐性遺伝子およびウイルス配列もまた欠失させる。このプラスミドを、Good Manufacturing Practice(GMP)条件下、大規模で調製する。精製したプラスミドを、５mg/mlのアリコートで−70℃で保存する。
ワクシニア構築物を、ワクシニアのWyeth-仔ウシ適合株中に作製する。このワクシニア株を、痘瘡ワクチン接種のために使用し、そしてガン患者において安全であることを示した。rvvのクローンを釣り上げ、プラークを精製する。rvvを、保証された真核生物細胞株を用いて、GMP条件下で増殖させる。ウイルスを、ショ糖勾配遠心分離により濃縮する。
最初の研究を６人の進行性のメラノーマ患者で行う。結果に依存して、抗IdをベースとしたDNAワクチンを、ワクチン接種患者で腫瘍特異的免疫を増大するために、標準コントロール1A7+QS-21ワクチンと組み合わせる。
追加引用文献：
腫瘍抗原としてのガングリオシド
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【図１】
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【図２】
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【図３（Ａ）】
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【図３（Ｂ）】
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【図３（Ｃ）】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７（Ａ）】
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【図７（Ｂ）】
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【図７（Ｃ）】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２（Ａ）】
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【図１２（Ｂ）】
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【図１３（Ａ）】
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【図１３（Ｂ）】
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