(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
不溶性担体粒子を使用するイムノアッセイ法であって、
（ｉ）抗原および／又は抗体を実質的に吸着していない状態にある不溶性磁性担体粒子を使用し、
（ｉｉ）該不溶性磁性担体粒子に対して、被検試料中の抗原性物質を吸着もしくは結合させ、
（ｉｉｉ）該抗原性物質に特異的に反応するラベル化抗体であり且つ該不溶性担体粒子に固相化された抗原性物質には特異的に反応するが、ネイティブな状態で液相中に存在する抗原性物質には実質的に反応しない抗体を上記（ｉｉ）の処理により得られた該不溶性磁性担体粒子と反応させて、
（ｉｖ）該抗原性物質と反応したラベル化抗体の標識を指標に測定を行うことを特徴とするイムノアッセイ法。
【請求項２】
被検試料中の抗原性物質を不溶性磁性担体粒子に吸着もしくは結合させた後、該被検試料を洗浄により除去することなく、抗原性物質に特異的に反応する抗体を反応させることを特徴とする請求項１記載のイムノアッセイ法。
【請求項３】
該ラベル化抗体を、被検試料中の抗原性物質を吸着もしくは結合させた不溶性磁性担体粒子と反応させた後、磁場の作用下該不溶性磁性担体粒子と未反応ラベル化抗体とを分離し、次に該抗原性物質と反応したラベル化抗体の標識を指標に測定を行うことを特徴とする請求項１又は２記載のイムノアッセイ法。
【請求項４】
前記抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一記載のイムノアッセイ法。
【請求項５】
前記抗体がポリクローナル抗体であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一記載のイムノアッセイ法。
【請求項６】
前記不溶性磁性担体粒子が、水性液体媒体に実質的に不溶性である微粒子であって且つ有機高分子物質相と磁性物質の相とからなる微粒子であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか一記載のイムノアッセイ法。
【請求項７】
前記不溶性磁性担体粒子が、有機高分子物質からなる皮膜相と磁性物質からなる芯相とからなる微粒子であることを特徴とする請求項１〜６のいずれか一記載のイムノアッセイ法。
【請求項８】
前記不溶性磁性担体粒子が、平均粒径０．０１〜２０ミクロンの範囲のラテックス粒子で且つ磁性物質からなる核を有するものであることを特徴とする請求項１〜７のいずれか一記載のイムノアッセイ法。
【請求項９】
前記不溶性磁性担体粒子が、平均粒径０．１〜６ミクロンの範囲のラテックス粒子で且つ磁性物質からなる核を有するものであることを特徴とする請求項１〜７のいずれか一記載のイムノアッセイ法。
【請求項１０】
該イムノアッセイが、磁性粒子用臨床検査用自動機器において、検体試料の分注から測定結果の取得までが自動化されて行うことのできることを特徴とする請求項１〜９のいずれか一記載のイムノアッセイ法。
【請求項１１】
被検試料中の抗原性物質が、ＨｂＡ１ｃであることを特徴とする請求項１〜１０のいずれか一記載のイムノアッセイ法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、生体試料などの流体中における抗原性物質を、磁性粒子を利用して免疫学的に測定する方法（イムノアッセイ法）に関する。
背景技術
近時、病院、検査センター等においては、人手不足、コスト削減、あるいは多量検体処理の要請等の点から、臨床検査等の諸検査の自動化、及び／又は測定時間の短縮化が図られてきた。このような自動化に適した方法として、不溶性磁性担体粒子を利用して抗原性物質を定性ないし定量する方法が注目されるに至っている。このような不溶性磁性担体粒子を利用する目的の一つは、アッセイ上避けられないＢ／Ｆ分離を、磁場作用を利用して簡便に行い得るようにしようというにある。
また、こうした不溶性磁性担体粒子を利用しての免疫化学分野においては、該磁性担体に測定しようとする抗原又は抗体と同一の抗原又は抗体を担持せしめておいた不溶性磁性粒子（感作不溶性磁性粒子）を使用することが行われてきた。当分野において公知のものとしては、例えば特開平０６−１６０３８７号公報、特開平０７−７２１５５号公報に記載されているように、生体試料などの流体（被検試料）中における抗原性物質を測定する場合、該抗原性物質に特異的に結合する抗体もしくはそのフラグメントを予め担持させた不溶性磁性粒子を該被検試料と混合して、該不溶性磁性粒子に結合した該抗原性物質の程度を測定することにより、前記抗原性物質を検出又は定量するものである。
しかしながら、不溶性磁性粒子に予め抗体などを担持しておいて、アッセイに使用する場合には、その感作不溶性磁性粒子の安定性の問題が避けられず、どうしても試薬の使用期限、調製の困難さなどの問題が残る。また、感作不溶性磁性粒子は、長期保存するとどうしてもその懸濁液に沈殿が生じ易いという問題もある。
省力化や大量の数の検体を短時間で処理するために完全に自動化された臨床検査等の検査機器導入においては、アッセイ上、通常Ｂ／Ｆ分離のための洗浄処理が必要であるが、この工程を少しでも省いたり、簡潔に行うことは、測定の効率化・迅速化のためには避けられない命題である。また、こうした目的のため、最近では、不溶性磁性粒子を担体としたイムノアッセイ系の開発が試みられているが、それに使用する不溶性磁性粒子は洗浄工程により損失が避けられず、それに担持する貴重な抗体などを消耗させる原因ともなっている。このように磁性粒子を用いた臨床検査用の自動機器には、そのデメリットとして、比較的に多量の磁性粒子を使用しているため、通常の免疫測定法に比べて多量の抗体等が必要となる。また、洗浄回数が多いことによる粒子のロスが問題となっている。
発明の開示
本発明者は鋭意研究の結果、被検試料中の抗原性物質の測定に際して該抗原性物質に特異的な抗体を担持させた不溶性磁性担体粒子を用いるのではなく、該抗体等が実質的に吸着していない状態にある不溶性磁性担体粒子を用意し、測定試料たる該抗原性物質自体を不溶性磁性担体粒子に吸着させ、該吸着した抗原物質に特異的なラベル化抗体を反応させることにより、自動化に適した態様で効率的に被検試料中の抗原性物質を測定できることを見出して、本発明を完成した。
本発明のイムノアッセイ法は、より詳しくは、抗体等が実質的に吸着していない状態にある不溶性磁性担体粒子を用意して、次に被検試料中の抗原性物質を不溶性磁性担体粒子に吸着もしくは結合させ、該吸着された抗原性物質に特異的に反応するラベル化抗体を反応させて、不溶性磁性担体粒子上の抗原性物質を選択的に測定することを可能にしている。
本発明においては、定量性の確保を容易とする点からは、生体試料の濃度及び不溶性担体粒子懸濁液の緩衝液濃度などは、生体試料中の抗原性物質がその存在量に比例して不溶性担体粒子に吸着されるよう、測定項目の特性により条件を選ぶことが好ましい。
すなわち、本発明は、
〔１〕  不溶性担体粒子を使用するイムノアッセイ法であって、
（ｉ）抗原および／又は抗体を実質的に吸着していない状態にある不溶性磁性担体粒子を使用し、
（ｉｉ）該不溶性磁性担体粒子に対して、被検試料中の抗原性物質を吸着もしくは結合させ、
（ｉｉｉ）該抗原性物質に特異的に反応するラベル化抗体であり且つ該不溶性担体粒子に固相化された抗原性物質には特異的に反応するが、ネイティブな状態で液相中に存在する抗原性物質には実質的に反応しない抗体を上記（ｉｉ）の処理により得られた該不溶性磁性担体粒子と反応させて、
（ｉｖ）該抗原性物質と反応したラベル化抗体の標識を指標に測定を行うことを特徴とするイムノアッセイ法；
〔２〕  被検試料中の抗原性物質を不溶性磁性担体粒子に吸着もしくは結合させた後、該被検試料を洗浄により除去することなく、抗原性物質に特異的に反応する抗体を反応させることを特徴とする上記〔１〕記載のイムノアッセイ法；
〔３〕  該ラベル化抗体を、被検試料中の抗原性物質を吸着もしくは結合させた不溶性磁性担体粒子と反応させた後、磁場の作用下該不溶性磁性担体粒子と未反応ラベル化抗体とを分離し、次に該抗原性物質と反応したラベル化抗体の標識を指標に測定を行うことを特徴とする上記〔１〕又は〔２〕記載のイムノアッセイ法；
〔４〕  前記抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする上記〔１〕〜〔３〕のいずれか一記載のイムノアッセイ法；
〔５〕  前記抗体がポリクローナル抗体であることを特徴とする上記〔１〕〜〔３〕のいずれか一記載のイムノアッセイ法；
〔６〕  前記不溶性磁性担体粒子が、水性液体媒体に実質的に不溶性である微粒子であって且つ有機高分子物質相と磁性物質の相とからなる微粒子であることを特徴とする上記〔１〕〜〔５〕のいずれか一記載のイムノアッセイ法；
〔７〕  前記不溶性磁性担体粒子が、有機高分子物質からなる皮膜相と磁性物質からなる芯相とからなる微粒子であることを特徴とする上記〔１〕〜〔６〕のいずれか一記載のイムノアッセイ法；
〔８〕  前記不溶性磁性担体粒子が、平均粒径０．０１〜２０ミクロンの範囲のラテックス粒子で且つ磁性物質からなる核を有するものであることを特徴とする上記〔１〕〜〔７〕のいずれか一記載のイムノアッセイ法；
〔９〕  前記不溶性磁性担体粒子が、平均粒径０．１〜６ミクロンの範囲のラテックス粒子で且つ磁性物質からなる核を有するものであることを特徴とする上記〔１〕〜〔７〕のいずれか一記載のイムノアッセイ法；
〔１０〕  該イムノアッセイが、磁性粒子用臨床検査用自動機器において、検体試料の分注から測定結果の取得までが自動化されて行うことのできることを特徴とする上記〔１〕〜〔９〕のいずれか一記載のイムノアッセイ法；及び
〔１１〕  被検試料中の抗原性物質が、ＨｂＡ１ｃであることを特徴とする上記〔１〕〜〔１０〕のいずれか一記載のイムノアッセイ法を提供する。
本発明のその他の目的、特徴、優秀性及びその有する観点は、以下の記載より当業者にとっては明白であろう。しかしながら、以下の記載及び具体的な実施例等の記載を含めた本件明細書の記載は本発明の好ましい態様を示すものであり、説明のためにのみ示されているものであることを理解されたい。本明細書に開示した本発明の意図及び範囲内で、種々の変化及び／又は改変（あるいは修飾）をなすことは、以下の記載及び本明細書のその他の部分からの知識により、当業者には容易に明らかであろう。本明細書で引用されている全ての特許文献及び参考文献は、説明の目的で引用されているもので、それらは本明細書の一部としてその内容はここに含めて解釈されるべきものである。
発明を実施するための最良の形態
本発明では、ラベル化抗体、特にはラベル化モノクローナル抗体を液相中の抗原性物質と実質的に反応させることなく、不溶性磁性担体に吸着・固相化された抗原性物質と選択的に反応させることが可能である。従って、本発明の好ましい態様によれば、上記イムノアッセイ法において、被検試料中の抗原性物質を不溶性担体に吸着させた後、該被検試料を洗浄により除去することなく、前記抗原性物質に対するモノクローナル抗体を反応させることが可能である。
すなわち、本発明のより好ましい具体例においては、使用するモノクローナル抗体として、不溶性担体粒子に吸着された抗原とは反応するが、液相中の未吸着の抗原性物質とは実質的に反応しないものを選ぶことにより、未吸着成分による妨害作用を実質的に除外することが可能である。
（抗原性物質）
本発明のイムノアッセイ法により測定されるべき抗原性物質は、不溶性磁性担体への吸着（ないし結合）が可能で、且つ該抗原性物質に対応するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体の少なくとも一方の作成ないし入手が可能である限り特に制限されないが、不溶性磁性担体への吸着の容易性の点からは、生体試料中に１００μｇ／ｍＬ以上（更には１ｍｇ／ｍＬ以上）もしくは（総タンパク重量の）１％以上含まれる物質であることが好ましい。また、上記ポリクローナル抗体ないしモノクローナル抗体作成の容易性の点からは、上記抗原性物質は分子量１０，０００以上の物質（蛋白質等）であることが好ましい。
本発明のイムノアッセイ法により測定されるべき「抗原性物質」は、これに対応するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体の少なくとも一方の作成ないし入手が可能なものであればよい。「抗原性物質」は、例えば蛋白質、ポリペプチド、遺伝子工学的に産生された組換え蛋白質など種々のものが挙げられるが、当該イムノアッセイ分野で公知のものであっても、新規なものであってもよい。代表的な抗原性物質としては、ＨｂＡ１ｃが挙げられる。
（抗原性物質に特異的な抗体）
本発明において、「抗原性物質に特異的に反応する抗体」としては、ポリクローナル抗体および／又はモノクローナル抗体のいずれを用いることも可能であり、さらに天然型（ｉｎｔａｃｔ）分子並びにそれらのフラグメント及び誘導体も表わしてよいものであり、Ｆ（ａｂ’）２，Ｆａｂ’及びＦａｂといった抗体フラグメントを包含してよい。モノクローナル抗体を製造する好適な方法の例には、ハイブリドーマ法（Ｇ．Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｃ．Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６，ｐｐ．４９５−４９７（１９７５））；Ｂｒｏｄｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１−６３，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８７）が挙げられる他、抗体に関して以下の文献が挙げられる：Ｊ．Ｊ．Ｌａｎｇｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄ．），“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．１２１（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｐａｒｔ  Ｉ：Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８６）あるいはそこで引用された文献（それらの中にある記載はそれを参照することにより本明細書の開示に含められる）。
好適には、モノクローナル抗体は、Ｋｏｅｈｌｅｒ  ＆  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５−４９７，１９７５）らの報告した細胞融合法により得ることが出来る。この方法自体は常法であり、あらためて述べる必要はないが、この方法においては、目的とするモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞を効率よく選別する必要がある。大量検体処理が容易であることから、９６穴プレートに所定の抗原を固相化させ、それにハイブリドーマ細胞の培養上清を反応させ、更に酵素標識抗マウスイムノグロブリンを反応させる、いわゆるＥＬＩＳＡ法（酵素免疫測定法）による選別が行われることが多い。この際、抗原は固相化されているため、抗原が固相化されている状態で抗体を反応させるアッセイ系を組む場合には、この選別法でよいが、ＥＬＩＳＡ法で選別して得たハイブリドーマ細胞の産生するモノクローナル抗体の中に、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）のように、抗原と抗体とを液相中で反応させるアッセイ系では反応しないという抗体が存在する場合が、見受けられることがある。
このような現象自体は当分野においては公知ないし周知のことであるが、本発明のイムノアッセイ法においてこのようなモノクローナル抗体を用いることにより、液相中の抗原性物質の阻害を受けずに、不溶性担体粒子に固相化された抗原性物質と特異的に反応させることが可能となる。
代表的なモノクローナル抗体としては、例えば特許第２６７７７５３号に記載されたようなものが挙げられる。特に代表的なモノクローナル抗体としては、例えば特許第２６７７７５３号に記載された抗ＨｂＡ１ｃモノクローナル抗体が挙げられる。
抗体としては通常ＩｇＧが用いられるが、ペプシン、パパインなどの消化酵素あるいはジチオスレイトール、メルカプトエタノールなどの還元剤を用いて、Ｆ（ａｂ’）２，Ｆａｂ’，Ｆａｂなどの低分子化したものを用いても良い。また、ＩｇＧだけでなくＩｇＭあるいはこれをＩｇＧと同様の処理で低分子化したフラグメントを用いても良い。認識エピトープの異なるモノクローナル抗体を２種類以上組み合わせても使用できる。
（抗体のラベル化）
本発明の抗体は、適当な標識でラベルされていることができる。
標識としては、酵素、酵素基質、酵素インヒビター、補欠分子類、補酵素、酵素前駆体、アポ酵素、蛍光物質、色素物質、化学ルミネッセンス化合物、発光物質、発色物質、磁気物質、金属粒子、例えば金コロイドなど、放射性物質などを挙げることができる。酵素としては、脱水素酵素、還元酵素、酸化酵素などの酸化還元酵素、例えばアミノ基、カルボキシル基、メチル基、アシル基、リン酸基などを転移するのを触媒する転移酵素、例えばエステル結合、グリコシド結合、エーテル結合、ペプチド結合などを加水分解する加水分解酵素、リアーゼ、イソメラーゼ、リガーゼなどを挙げることができる。酵素は複数の酵素を複合的に用いて検知に利用することもできる。
例えば酵素的サイクリングを利用することもできる。代表的な酵素標識としては、西洋ワサビペルオキシダーゼなどのペルオキシダーゼ、大腸菌β−Ｄ−ガラクトシダーゼなどのガラクトシダーゼ、マレエート・デヒドロゲナーゼ、グルコース−６−フォスフェート・デヒドロゲナーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコアミラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、カタラーゼ、ウシ小腸アルカリホスファターゼ、大腸菌アルカリホスファターゼなどのアルカリフォスファターゼなどが挙げられる。アルカリホスファターゼを用いた場合、４−メチルウンベリフェリルフォスフェートなどのウンベリフェロン誘導体、ニトロフェニルホスフェートなどのリン酸化フェノール誘導体、ＮＡＤＰを利用した酵素的サイクリング系、ルシフェリン誘導体、ジオキセタン誘導体などの基質を使用したりして、生ずる蛍光、発光などにより測定できる。ルシフェリン、ルシフェラーゼ系を利用したりすることもできる。カタラーゼを用いた場合、過酸化水素と反応して酸素を生成するので、その酸素を電極などで検知することもできる。電極としてはガラス電極、難溶性塩膜を用いるイオン電極、液膜型電極、高分子膜電極などであることもできる。酵素標識は、ビオチン標識体と酵素標識アビジン（ストレプトアビジン）に置き換えることも可能である。標識は、複数の異なった種類の標識を使用することもできる。こうした場合、複数の測定を連続的に、あるいは非連続的に、そして同時にあるいは別々に行うことを可能にすることもできる。
本発明においては、信号の形成に４−ヒドロキシフェニル酢酸、１，２−フェニレンジアミン、テトラメチルベンジジンなどと西洋ワサビ・ペルオキシダーゼ、ウンベリフェリルガラクトシド、ニトロフェニルガラクトシドなどとβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコース−６−リン酸・デヒドロゲナーゼなどの酵素試薬の組合わせも利用でき、ヒドロキノン、ヒドロキシベンゾキノン、ヒドロキシアントラキノンなどのキノール化合物、リポ酸、グルタチオンなどのチオール化合物、フェノール誘導体、フェロセン誘導体などを酵素などの働きで形成しうるものが使用できる。蛍光物質あるいは化学ルミネッセンス化合物としては、フルオレセインイソチオシアネート、例えばローダミンＢイソチオシアネート、テトラメチルローダミンイソチオシアネートなどのローダミン誘導体、ダンシルクロリド、ダンシルフルオリド、フルオレスカミン、例えばフィコシアニン、フィコエリスリンなどのフィコビリプロテイン、アクリジニウム塩、ルミフェリン、ルシフェラーゼ、エクォリンなどのルミノール、イミダゾール、シュウ酸エステル、例えば、ユーロピウム（Ｅｕ）、テルビウム（Ｔｂ）、サマリウム（Ｓｍ）などの希土類キレート化合物、７−アミノ−４−メチルクマリンなどのクマリン誘導体などが挙げられる。
抗体と標識の結合には、吸着などの物理的な手法、あるいは縮合剤などを用いたり、活性化されたものなどを用いた及び／又は間にスペーサー分子を化学結合で導入したりする化学的な方法、さらには相互の化学的な結合反応を利用した手法などにより行うことが出来る。標識するには、チオール基とマレイミド基の反応、ピリジルジスルフィド基とチオール基の反応、アミノ基とアルデヒド基の反応などを利用して行うことができ、公知の方法あるいは当該分野の当業者が容易になしうる方法、さらにはそれらを修飾した方法の中から適宜選択して適用できる。縮合剤としては、例えばホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、ヘキサメチレンジイソシアネート、ヘキサメチレンジイソチオシアネート、Ｎ，Ｎ’−ポリメチレンビスヨードアセトアミド、Ｎ，Ｎ’−エチレンビスマレイミド、エチレングリコールビススクシニミジルスクシネート、ビスジアゾベンジジン、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド、スクシンイミジル  ３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、Ｎ−スクシンイミジル  ４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、Ｎ−スルホスクシンイミジル  ４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、Ｎ−スクシンイミジル  （４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート、Ｎ−スクシンイミジル  ４−（１−マレイミドフェニル）ブチレート、Ｎ−（ε−マレイミドカプロイルオキシ）コハク酸イミド（ＥＭＣＳ），イミノチオラン、Ｓ−アセチルメルカプトコハク酸無水物、メチル−３−（４’−ジチオピリジル）プロピオンイミデート、メチル−４−メルカプトブチリルイミデート、メチル−３−メルカプトプロピオンイミデート、Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルメルカプトアセテートなどが挙げられる。
（不溶性磁性担体粒子）
本発明で使用する不溶性磁性担体粒子は、好ましくは水性液体媒体に実質的に不溶性である微粒子であって且つ有機高分子物質相と磁性物質の相とからなる微粒子である。代表的な不溶性磁性担体粒子は、有機高分子物質からなる皮膜相と磁性物質からなる芯相とからなる微粒子である。該不溶性磁性担体粒子は、例えば、四三酸化鉄（Ｆｅ３Ｏ４）、三二酸化鉄（γ−Ｆｅ２Ｏ３）、各種フェライト、鉄、マンガン、ニッケル、コバルト、クロムなどの金属、コバルト、ニッケル、マンガンなどの合金からなる微粒子またはこれらの磁性粒子を内部に含んだラテックス、ゼラチン、リポソームなどである。好適には、該磁性物質の核を取り囲むラテックス皮膜から構成されるラテックス粒子が挙げられる。本来ラテックスとは、ゴムの木を傷付けたときに浸出する乳液のことであるが、本発明でいうラテックスとは、水性液中において不連続な微粒子が懸濁している懸濁液ないし乳濁液をいう。本発明で使用する不溶性磁性担体粒子は、該磁性粒子の核の表面を有機物等で表面処理した微粒子が好ましく用いられるが、これらに制限されるものではない。
こうしたラテックス粒子は、定量的にイムノアッセイを行う場合、通常は、粒子の大きさの均一性、表面状態の制御、内部構造の選択などが高度の次元で要求されるが、このような試薬向けの良好なラテックス粒子は、市販品の中から選択して用いることが可能である。上記粒子を構成するのに使用できる有機高分子物質としては、例えば、従来技術（特公昭５８−１１５７５号公報等）にいうところの有機高分子物質の微粒子のためのものなどが挙げられるが、これらに制限されるものではない。該有機高分子物質としては、例えば、ポリスチレン、ポリアクリロニトリル、ポリメタクリロニトリル、ポリメタクリル酸メチル、ポリカプラミド、ポリエチレンテレフタレートなどの疎水性重合体、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリ（２−オキシエチルアクリレート）、ポリ（２−オキシエチルメタクリレート）、ポリ（２，３−ジオキシプロピルアクリレート）、ポリ（２，３−ジオキシプロピルメタクリレート）、ポリエチレングリコールメタクリレートなどの架橋した親水性重合体、またはそれぞれのモノマーの２−４種程度の共重合体などが挙げられる。ラテックスの材質は特に制限されないが、ポリスチレンラテックス等のスチレン系ラテックス、アクリル酸系ラテックス等が好ましく用いられる。表面の疎水性が強いラテックス（例えばポリスチレンラテックス）を用いることは、タンパク質ないしペプチドの吸着をスムーズにする上で好ましい。更には、種々の変性ラテックス（例えば、カルボン酸変性ラテックス）等を必要に応じて用いてもよい。本発明においては、上記不溶性担体として、ポリスチレンラテックス等のラテックスが特に好ましく用いられる。ラテックス粒子としては、乳化剤を用いない乳化重合によって得られるポリスチレン粒子が特に好ましく用いられる。このようなラテックスは、表面の負電荷同士の反発に基づき、乳化剤なしでも安定に存在できる。代表的な市販の不溶性磁性担体粒子としては、ベリタス（ＶＥＲＩＴＡＳ）社のＤｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ−２７０  Ｅｐｏｘｙ，Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ−２７０  Ａｍｉｎｅ，Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ−２７０  Ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  Ａｃｉｄ，Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ−２７０  Ｔｏｓｙｌａｃｔｉｖａｔｅｄ，Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ−４５０  Ｅｐｏｘｙ，Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ−４５０  Ｔｏｓｙｌａｃｔｉｖａｔｅｄ，ＪＳＲ社のＩＭＭＵＴＥＸ−ＭＡＧ，藤倉化成（株）のＳＭＧ−１１など他、Ｂａｎｇｓ社などから入手可能である。
不溶性磁性担体粒子の粒径は、０．０１μｍ〜２０μｍのものが用いられ、０．１μｍ〜６μｍの範囲内の粒径を有する不溶性磁性粒子が好ましい。不溶性磁性粒子に抗原性物質を吸着もしくは結合させる方法としては、被検体中の抗原性物質を物理的に吸着もしくは結合させるか、あるいは化学的に結合させることにより行われる。好適には、物理的に吸着もしくは結合させる。
被検試料中の抗原性物質をラテックス粒子に吸着させるためには、ラテックス粒子を懸濁させる緩衝液については、ＥＬＩＳＡ等でプレートに抗原を固相化させる場合と基本的に同じ技術が使用可能である。ラテックス粒子によっては、自然凝集を起こしやすいものもあるが、このような場合には、弱アルカリ性のグリシン緩衝液もしくはホウ酸緩衝液に懸濁させておくことが安定性の点から好ましい。ラテックス濃度に関しては、０．０５〜１重量パーセントの懸濁液として用いることが好ましい。
（抗原−抗体反応）
本発明においては、被検試料中の抗原性物質を固相化した後、該抗原性物質に対して特異的に反応するラベル化抗体を反応させ、ラテックス等からなる不溶性磁性担体上の抗原性物質をラベル化する。この際に用いる水性溶液は、該抗体がラテックス等からなる不溶性担体に吸着するのを防ぐために、Ｔｗｅｅｎ  ２０等の界面活性剤を０．１〜０．３％程度含んでいることが好ましい。
本発明の反応を行う容器は特に限定されないが、通常のチューブ（試験管；例えばポリスチレン製）状の容器を用いることが可能である。多数検体の同時処理が容易な点を考慮すれば、複数のウエル（穴）を有するＥＬＩＳＡ用プレート（例えば、９６−ウエルＥＬＩＳＡ用プレート（ＮＵＮＣ−ＩＭＭＵＮＯ  ＰＬＡＴＥ等）を用いることが可能である。後述するように、光学的手法による測定を容易とする点からは、実質的に透明な容器を用いて反応を行うことが好ましい。なお、後述するような自動分析機を利用する場合には、通常は、該分析機中の反応槽中で反応を行わせることとなる。
（測定）
不溶性磁性担体粒子の標識の程度を測定する方法は、特に制限されない。例えば、標識を定性的ないし半定量的に測定する場合には、既知の試料の濁度の程度との比較から、上記不溶性担体粒子の標識の程度を目視によって判定することも可能である。該標識を定量的に測定する場合、簡便性の点からは、例えば光学的に測定することが好ましい。
ラテックス等からなる不溶性磁性担体粒子の標識の光学的測定法としては、公知の方法が利用可能である。
本発明では、試料検体の測定処理；検体の分注処理からアッセイ結果を測定するまでを自動化された機器、例えば磁性粒子を用いた臨床検査用自動機器を使用して行うことができる。こうした臨床検査用自動機器としては、例えばバイエル社：アドビア（商品名）、ダイナボット社：アーキテクト（商品名）、ＩＭＸ（商品名）、ベックマン社：アクセス（商品名）、ロッシュ社：エクルーシス（商品名）、富士レビオ：ルミパルス（商品名）等が挙げられる。こうした機器は、免疫（抗原抗体反応を利用した）測定系で広く利用されており、そうしたものであれば本発明のイムノアッセイ法で制限なく使用できる。これらの機器の特徴としては、アクセスランダムに多項目の測定が可能、測定感度が高い、広範囲で測定が可能、短時間で測定が可能、分注から結果出しまでの工程が全て自動であるために測定精度が高い、専用カートリッジを使用しているためにコンタミネーション等が少ない等のメリットがある。
ところで、通常の試料中の抗原を測定する場合には従来の臨床検査用自動機器では、抗体感作磁性粒子が使用され、（ａ）一次反応として（１）磁性粒子と試料中の抗原の反応後に（２）洗浄、（ｂ）二次反応として（３）抗原に対する第二の抗体（マーカーとして酵素、蛍光物質などの標識を使用）との反応後に（４）洗浄、（ｃ）三次反応として（５）マーカーに対する基質との反応、（６）測定との手順であった。しかしながら、本発明にしたがえば、（ａ）一次反応として（１）磁性粒子と試料中の抗原の反応、（ｂ）二次反応として（２）抗原に対する第二の抗体（マーカーとして酵素、蛍光物質などの標識を使用）との反応後に（３）洗浄、（ｃ）三次反応として（５）マーカーに対する基質との反応、（６）測定というように洗浄回数を減らすことができ、粒子の減少が大幅に改善される。
また、ラテックス粒子の凝集を光学的に検出する方法では、比較的に多くの粒子を使用することが条件となるが、本法では粒子に結合した物質の量を検出するため、粒子量及びマーカー標識抗体量も従来法に比べて１０倍以上少ない量で測定が可能となる。
本発明にしたがえば、従来法で使用する抗体複合体に関し、その作製法に困難性があるとか、使用濃度での不安定性があるとかの、製造上の問題点を回避することが可能であり、単一の抗体のみの使用により、物質の安定性が改善され、製造ロット間の差もなく、安定製造が可能となる。モノクローナル抗体のみを使用して、その利点を生かすことができる。例えば、抗体のロット間差というものを排除でき、安定した品質で信頼性の高い試薬を提供できる。
本発明では、試薬である不溶性担体粒子は、それに抗原などを感作させたものでないので、試薬キットにおいて粒子のロット間差の問題を大幅に改善でき、また磁性体がコアで表面がプラスチックで形成されているものであって、抗原性物質の吸着もしくは結合性能が優れている。
本発明で使用可能な不溶性磁性担体粒子を使用できる測定用機器としては、例えば富士レビオ、ルミパルス（ＡＬＰ−ＡＭＰＰＤ）；ベックマン、アクセス（ＡＬＰ−ＬｕｍｉｇｅｎＰＰＤ）；同、ルミワード（ＡＬＰ−ＬｕｍｉｇｅｎＰＰＤ）；日本ＤＰＣ、イムライズ（ＡＬＰ−ＡＭＰＰＤ）；バイエル、ＡＣＳ（アクリジミウムエステル）；オーソ、ビトロスＥＣｉ（ＨＲＰ−ルミノール）；プレシジョン、ＨｉＭＩＣＯ；ダイナボット、アーキテクト（アクリジミウムエステル）；ロッシュ、ピコルミ（ルテニウム複合体）；東ソー、ＡＩＡ−６００ＩＩ（ＡＬＰ−４ＭＵＰ）などが挙げられ、酵素を使用した化学発光、ルテニウム複合体を用いた電気化学発光、アクリジニウムエステルを用いた化学発光などを使用しているものが挙げられる。
（ヘモグロビンＡ1ｃ測定例）
本発明のイムノアッセイ法の特徴をよく示す一つの実施態様として、以下にヘモグロビンＡ1ｃ（ＨｂＡ１ｃ）の測定例について述べるが、本発明のイムノアッセイ法はヘモグロビンＡ1ｃの測定に限定されるものではない。
ここに上記「ヘモグロビンＡ1ｃ」は、ヘモグロビン（Ｈｂ）のβ鎖Ｎ末端のアミノ酸残基であるバリンのα−アミノ基にグルコースが非酵素的に結合し、グリコシル化ヘモグロビンとなったものであり、このヘモグロビンＡ1ｃの血中量は糖尿病の比較的長期の血糖コントロール状態を反映する。したがって、このＨｂＡ１ｃを測定することは、血糖コントロール状態を知る上で臨床的に極めて有意義である（例えば、日本臨床，４８，増刊号，３１５−３２２（１９９０）参照）。
ヘモグロビンはα鎖２本、β鎖２本からなるヘテロテトラマーであるが、ヘモグロビンＡ1ｃは２本のβ鎖のうち１本のＮ末端のαアミノ基がグリコシル化していることが特徴であり、従って、ヘモグロビンＡ1ｃに特徴的な反応部位は１カ所である。換言すれば、ヘモグロビンＡ1ｃに特異的なモノクローナル抗体との反応性の面からは、ヘモグロビンＡ1ｃは一価抗原として機能する。
本発明のイムノアッセイ法によれば、ヘモグロビンＡ1ｃの測定に関しては、例えば、被検試料（例えば、全血に精製水を加えて溶血したもの）を不溶性磁性担体粒子（ラテックス被覆磁性粒子）に吸着させ、ラベル化抗ヘモグロビンＡ1ｃモノクローナル抗体を反応させることにより、ラテックス膜上のヘモグロビンＡ1ｃを選択的にラベルすることができ、この選択的にラベルされた標識の程度を測定することにより、ヘモグロビンＡ1ｃを定量することができる。例えば、ＨＰＬＣなどで測定したヘモグロビンＡ1ｃ％値が既知の標準試料を、本発明のイムノアッセイ法により同時に定量して検量線を作成することにより、この検量線に基づき未知の試料のヘモグロビンＡ1ｃの分画％値を求めることができる。
（抗ＨｂＡ１ｃモノクローナル抗体）
抗ＨｂＡ１ｃモノクローナル抗体としては、吸着ないし固相化されたＨｂＡ１ｃに対して実質的に反応し、固相化されたＨｂＡ０と実質的に反応しない（好ましくは、更に液相中のＨｂＡ１ｃ及びＨｂＡ０と実質的に反応しない）抗ＨｂＡ１ｃモノクローナル抗体であれば、特に制限なく用いることができる。糖化ペプチドを免疫原としてモノクローナル抗体を作製すると、このようなモノクローナル抗体を得ることができる。ＨｂＡ１ｃおよびＨｂＡ０に対する反応性は、例えば特許第２６７７７５３号に記載されたようにして測定することが可能である。
本発明においては、抗ＨｂＡ１ｃモノクローナル抗体は、ＨｂＡ１ｃと特許第２６７７７５３号に記載されたイムノプレートリーダーのスケールで１．０以上（更には２．０以上）の反応性を示すことが好ましく、また、ＨｂＡ０とは０．１以下（更には０．０５以下）の反応性を示すことが好ましい。
本発明においては、抗ＨｂＡ１ｃモノクローナル抗体は、未変性のＨｂＡ１ｃやＨｂＡ０、さらには変性したＨｂＡ０などとは、液相中では１０μｇ／ｍＬ（更には２０μｇ／ｍＬ）でも反応性を示さず、一方、変性ＨｂＡ１ｃとは液相中で１μｇ／ｍＬ（更には０．５μｇ／ｍＬ）以下でも反応性を示すことが好ましい。
次に、本発明においてＨｂＡ１ｃを測定する場合の好ましい一実施態様について述べる。
本発明においては、各チューブに、通常、被検試料として溶血液１〜２０μＬ（更には２〜５μＬ）程度を採取する。実際に用いる溶血液としては、被検試料（例えば、全血５０μＬに純水１ｍＬを加えたもの）を５〜１０倍程度にグリシン緩衝液等で希釈して用いることもできる。
次いで、各チューブに、磁性ラテックス粒子懸濁液（例えば０．１２μｍ磁性粒子被覆ラテックス、０．２％濃度）を１００〜３００μＬ（更には１５０〜２００μＬ）程度加えて、３７℃で１〜３０分（更には３〜１０分）程度放置して、ラテックスに試料中のＨｂＡ１ｃを吸着させる。この際用いる磁性ラテックス粒子懸濁液は、磁性ラテックス粒子原液をグリシン緩衝液等で希釈して用いることが好ましい。
次いでラテックスに吸着させたＨｂＡ１ｃに、適当な標識でラベルされた抗ＨｂＡ１ｃモノクローナル抗体（例えばマウス腹水由来のモノクローナル抗体）を含む溶液を１００〜３００μＬ（更には１５０〜２００μＬ）程度加え、３７℃で２〜３０分（更には３〜１０分）程度放置（インキュベーション）して、ＨｂＡ１ｃとラベル化モノクローナル抗体とを反応させる。この際に用いるモノクローナル抗体溶液の濃度は、たとえば抗ＨｂＡ１ｃモノクローナル抗体の希釈系列を作り、最適濃度を求めることが好ましい。希釈に用いる緩衝液は、たとえば、０．０５〜０．１Ｍグリシン緩衝液（ＧＢＳ；ｇｌｙｃｉｎｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ；ｐＨ８．２〜８．５，０．１５Ｍ  ＮａＣｌを含む）などをあげることができる。この際用いる緩衝液には界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ  ２０等）を０．１〜０．５％（更には０．２〜０．３％）程度加えておくことが、モノクローナル抗体のラテックス表面への物理吸着を防ぐ点から好ましい。
当分野においては、不溶性磁性担体粒子としてラテックス粒子を使用している場合、このラテックス試薬（抗原、抗体等が担持されたラテックス）について、常に同等の品質のものを作り、非特異凝集や沈殿が生ずることを防止しつつ、安定な状態で保存することは容易なことではない。
これに対し、本発明によれば、不溶性磁性担体（ラテックス等）に抗原や抗体は実質的に感作されていないため、該不溶性磁性担体として市販の未感作磁性ラテックスをそのまま使用することが可能となる。更に抗体についても必ずしも精製品である必要はなく、また試薬が単純なため保存安定性を高く保つことが可能となり、製造業者にとっても有利な方法といえる。上述したように本発明によれば、試薬の製造が単純、容易であるため、保存安定性の高い試薬を用いた方法を提供することが出来る。
本発明のイムノアッセイ法を適用するにあたっては、それぞれの方法における通常の条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて、本発明の当該対象物質あるいはそれと実質的に同等な活性を有する物質に関連した測定系を構築すればよい。
これらの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照することができる〔例えば、入江  寛編，「ラジオイムノアッセイ」，講談社，昭和４９年発行；入江  寛編，「続ラジオイムノアッセイ」，講談社，昭和５４年発行；石川栄治ら編，「酵素免疫測定法」，医学書院，昭和５３年発行；石川栄治ら編，「酵素免疫測定法」（第２版），医学書院，昭和５７年発行；石川栄治ら編，「酵素免疫測定法」（第３版），医学書院，昭和６２年発行；Ｈ．Ｖ．Ｖｕｎａｋｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄ．），“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．７０（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｐａｒｔ  Ａ），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８０）；Ｊ．Ｊ．Ｌａｎｇｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄ．），“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．７３（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｐａｒｔ  Ｂ），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８１）；Ｊ．Ｊ．Ｌａｎｇｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄ．），“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．７４（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｐａｒｔ  Ｃ），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８１）；Ｊ．Ｊ．Ｌａｎｇｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄ．），“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．８４（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｐａｒｔ  Ｄ：Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８２）；Ｊ．Ｊ．Ｌａｎｇｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄ．），“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．９２（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｐａｒｔ  Ｅ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８３）；Ｊ．Ｊ．Ｌａｎｇｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄ．），“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．１２１（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｐａｒｔ  Ｉ：Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８６）；Ｊ．Ｊ．Ｌａｎｇｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄ．），“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．１７８（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａｎｔｉｇｅｎｓ，ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｍｉｃｒｙ），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）；Ｍ．Ｗｉｌｃｈｅｋ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄ．），“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．１８４（Ａｖｉｄｉｎ−Ｂｉｏｔｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９０）；Ｊ．Ｊ．Ｌａｎｇｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄ．），“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．２０３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｍｏｄｅｌｉｎｇ：Ｃｏｎｃｅｐｔｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｐａｒｔ  Ｂ：Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ，ａｎｄ  Ｄｒｕｇｓ），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９１）あるいはそこで引用された文献（それらの中にある記載はそれを参照することにより本明細書の開示に含められる）。
実施例
以下に実施例を掲げ、本発明を具体的に説明するが、この実施例は単に本発明の説明のため、その具体的な態様の参考のために提供されているものである。これらの例示は本発明の特定の具体的な態様を説明するためのものであるが、本願で開示する発明の範囲を限定したり、あるいは制限することを表すものではない。本発明では、本明細書の思想に基づく様々な実施形態が可能であることは理解されるべきである。
全ての実施例は、他に詳細に記載するもの以外は、標準的な技術を用いて実施したもの、又は実施することのできるものであり、これは当業者にとり周知で慣用的なものである。
実施例１
粒子表面積と得られるシグナルとの関係
溶血液：ヒトから採取した赤血球５μＬに精製水５００μＬを加えて溶血させ、被検試料とした。
ビオチン標識抗ＨｂＡ１ｃモノクローナル抗体：ビオチン化試薬として、ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ（ＰＩＥＲＣＥ社製、Ｎｏ．２１３３５）を用い、該試薬に添付のマニュアル通りに抗ＨｂＡ１ｃモノクローナル抗体のビオチン化を行った。未反応のビオチンは、透析を繰り返すことにより除去した。抗ＨｂＡ１ｃモノクローナル抗体は、特許第２６７７７５３号公報に記載のものを使用した（このモノクローナル抗体は、ヘモグロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ）測定用試薬「ラピディア  オート  ＨｂＡ１ｃ」（富士レビオ販売、株式会社エスアールエル製造）に使用のものを使うこともできる）。
不溶性磁性担体粒子としては、ＳＭＧ−１１（藤倉化成株式会社）を使用した。この磁性ラテックス粒子の物性は、粒子径（ｎｍ）：９９０，密度：１．５８というものであった。不溶性磁性担体粒子は、水希釈液とし、２．５％、０．２５％及び０．０２５％のものを調製した。２．５％の１００μＬの磁性ラテックス粒子水希釈液中のその粒子数は、３．１２Ｅ＋０９、表面積（ｍ２）は、９．５９Ｅ−０３で、０．２５％のものではその粒子数は、３．１２Ｅ＋０８、表面積（ｍ２）は、９．５９Ｅ−０４で、０．０２５％のものではその粒子数は、３．１２Ｅ＋０７、表面積（ｍ２）は、９．５９Ｅ−０５であった。
１００μＬの磁性ラテックス粒子水希釈液に溶血液５μｌを添加し、室温で５分間放置して、抗原性物質を吸着せしめた。次にビオチン化抗ＨｂＡ１ｃモノクローナル抗体０．０７ｍｇ／ｍｌ  ５０μｌを添加する。混合液を室温で５分間放置した後、ＡＬＰ用緩衝液（１％  ＢＳＡ，５０ｍＭイミダゾール，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，１ｍＭ  ＭｇＣｌ２，０．１ｍＭ  ＺｎＣｌ２，０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０，ｐＨ７．６）で１回洗浄する。次に、アビジン−ＡＬＰ（＊５０００；ＤＡＫＯ  Ｄ−３６５）１００μｌを添加する。混合液を室温で５分間放置した後、ビオチン−アビジン系を使用しているので、ＡＬＰ用緩衝液で４回洗浄する。ＡＭＰＰＤ（Ｌｕｍｉｇｅｎ  ＰＰＤ，和光純薬）１００μｌを添加した後、白色プレートに移し、１０分後の発光量を測定した。結果を図１に示す。
その結果、溶血液中のタンパク量は１０μｇ程度と推定されるので、磁性粒子濃度２．５％表面積９．６Ｅ−０３  ｍ２ではタンパク量が少なく、このため反応中に凝集が起こり、その内部に入ってしまったものは測定できなくなることが推定された。そして、１μｍの粒子を使用する場合には９．６Ｅ−０３  ｍ２程度が妥当と思われた。
実施例２
抗体量とシグナルの関係
０．０２５％磁性ラテックス粒子水希釈液１００μｌ（不溶性磁性担体粒子としては、実施例１と同様のものを使用）に溶血液５μｌ（実施例１と同様に調製）を添加し、室温で５分間放置した後、ビオチン化抗ＨｂＡ１ｃモノクローナル抗体（実施例１と同様に調製）を０．０４８ｍｇ／ｍｌ（５０μｌ，２．４μｇ），０．００４８ｍｇ／ｍｌ（５０μｌ，０．２４μｇ）あるいは０．０００４８ｍｇ／ｍｌ（５０μｌ，０．０２４μｇ）を添加する。混合液を室温で５分間放置した後、ＡＬＰ用緩衝液（１％  ＢＳＡ，５０ｍＭイミダゾール，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，１ｍＭ  ＭｇＣｌ２，０．１ｍＭ  ＺｎＣｌ２，０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０，ｐＨ７．６）で１回洗浄する。次に、実施例１と同様のアビジン−ＡＬＰ  １００μｌを添加する。混合液を室温で５分間放置した後、ビオチン−アビジン系を使用しているので、ＡＬＰ用緩衝液で４回洗浄する。実施例１と同様のＡＭＰＰＤ  １００μｌを添加した後、白色プレートに移し、１０分後の発光量を測定した。
結果を図２に示す。その結果、抗ＨｂＡ１ｃモノクローナル抗体量として、０．２５μｇ程度で十分であることが判明した。
実施例３
直接標識抗体での測定
測定の簡略化、再現性の向上を目的として抗ＨｂＡ１ｃモノクローナル抗体を直接ＡＬＰで標識した。
（１）  アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ；オリエンタル酵母）をフルオレッセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ；ドータイト）で標識した。先ず、１０ｍｇ／ｍＬのＡＬＰ（１００μＬ）を０．１ＭのＮａＨＣＯ３緩衝液（４００μＬ）に添加し、次にジメチルホルムアミド（ＤＭＦ，１ｍＬ）に４ｍｇのＦＩＴＣを溶解して得たＦＩＴＣ溶液の１０μＬを添加した（ＡＬＰに対して１０倍量のＦＩＴＣ）。混合物を室温で１０分間撹拌した後、ＰＤ−１０（ファルマシア）を使用して回収した。溶出には０．１ＭのＮａＨ２ＰＯ４緩衝液、ｐＨ７．５を使用した。１．７ｍＬのＦＩＴＣ標識ＡＬＰ液を回収できた。
上記で得られたＦＩＴＣ標識ＡＬＰ（ＡＬＰ−ＦＩＴＣ）をマレイミド化した。先ず、上記回収ＡＬＰ−ＦＩＴＣをセントリコン３０（ミリポア）で５００μＬに濃縮した。次に、Ｎ−（ε−マレイミドカプロイルオキシ）コハク酸イミド（ＥＭＣＳ，６ｍｇ）をＤＭＦ（１ｍＬ）に溶解して得たＥＭＣＳ溶液の１０μＬを添加した（ＡＬＰ−ＦＩＴＣに対して２０倍量のＥＭＣＳ）。混合物を室温で３０分間撹拌した後、ＰＤ−１０（ファルマシア）を使用して回収した。溶出には５ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含有する０．１ＭのＮａＨ２ＰＯ４緩衝液、ｐＨ６．３を使用した。１．７ｍＬのマレイミド化ＡＬＰ−ＦＩＴＣ液を回収できた。
一方、抗ＨｂＡ１ｃモノクローナル抗体（実施例１で使用と同じもの）をＳＨ化した。１９．１ｍｇ／ｍＬの抗ＨｂＡ１ｃモノクローナル抗体（５２．４μＬ）を０．１ＭのＮａＨ２ＰＯ４緩衝液、ｐＨ７．５（４５０μＬ）に添加し、そこにＳ−アセチルメルカプトコハク酸無水物（ＡＭＳＡ，６ｍｇ）をＤＭＦ（１ｍＬ）に溶解して得たＡＭＳＡ溶液の１０μＬを添加した（抗体に対して５０倍量のＡＭＳＡ）。混合物を室温で３０分間撹拌した後、５０ｍＭのＥＤＴＡを含有する１Ｍ  Ｔｒｉｓ緩衝液、ｐＨ７．０（２０μＬ）と１Ｍ塩酸ヒドロキシルアミン液、ｐＨ７．０（２０μＬ）とを加えた。混合物を室温で１５分間撹拌した後、ＰＤ−１０（ファルマシア）を使用して回収した。溶出には５ｍＭのＥＤＴＡを含有する０．１ＭのＮａＨ２ＰＯ４緩衝液、ｐＨ６．３を使用した。１．７ｍＬのＳＨ化抗体（ＳＨ化ＩｇＧ）液を回収できた。
次に、上記で調製したマレイミド化ＡＬＰ−ＦＩＴＣとＳＨ化ＩｇＧの全量を混和した。混合比は推定で、ＡＬＰ：ＩｇＧ＝１．５：１（モル比）である。室温で２時間反応した後セントリコン（ミリポア）で５００μＬに濃縮し、ゲルろ過（使用担体：スーパーローズ１２：ファルマシア）して、ＡＬＰ標識抗ＨｂＡ１ｃモノクローナル抗体を得た。
（２）  実施例１と同様の磁性ラテックス粒子０．０２５％  １００μｌに、実施例１と同様の溶血液５μｌを添加し、室温で５分間放置した後、ＡＬＰ標識抗ＨｂＡ１ｃモノクローナル抗体を添加した。抗体は、ＩｇＧとして５μｇ／ｍｌ  ５０μｌを添加した。なお、抗体をＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで希釈したものとＢＳＡ入り緩衝液で希釈したものを比較のため使用した。混合液を室温で５分間放置した後、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで４回洗浄した。実施例１と同様のＡＭＰＰＤ  １００μｌを添加した後、白色プレートに移し、１５分後の発光量を測定した。結果を図３に示す。
抗体を添加する際にタンパクが共存すると、バックグラウンドが下がるのが観察された。バックグラウンドが下がることで再現性の向上を期待できる。アビジン−ＡＬＰよりもシグナルが上がっていることが確認された。図４には、ヘモグロビンＡ1ｃ（ＨｂＡ１ｃ）測定用試薬「ラピディア  オート  ＨｂＡ１ｃ」（富士レビオ販売、株式会社エスアールエル製造）のラテックス凝集法との相関を調べた結果を示す。良好な相関性があることが確認された。
実施例４
不溶性磁性担体粒子の違いによる比較
操作及び試薬は実施例３と同様のものを使用した。実施例１〜３で用いた藤倉化成株式会社製のものとベリタス社製のものとを比較した。測定に使用する磁性粒子のｔｏｔａｌ表面積を同じにして測定を行った。
ベリタス社製粒子は、粒径２．８μｍ，粒子濃度４．０Ｅ＋０９粒子／ｍｌで計算上の面積２．４６Ｅ−１１、ａｓｓａｙあたりの表面積を９．５９Ｅ−０５  ｍ２／ｐａｒｔｉｃｌｅ（ｍ２にするのは１μｌ必要）で、ベリタス社製粒子に関しては水で１００倍に希釈し、その１００μｌを使用した。
各磁性粒子１００μｌ（表面積で９．５９Ｅ−１１ｍ２）に溶血液５μｌを添加後、室温で５分間放置した。次に混合物に、ＡＬＰ標識抗ＨｂＡ１ｃモノクローナル抗体を添加した。抗体は、ＩｇＧとして５μｇ／ｍｌ  ５０μｌを添加した。混合物室温で５分間放置した後、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで４回洗浄し、実施例１と同様のＡＭＰＰＤ  １００μｌを添加した後、白色プレートに移し、１５分後の発光量を測定した。
結果を図５に示す。なお、キャリブレータは、ヘモグロビンＡ1ｃ（ＨｂＡ１ｃ）測定用試薬「ラピディア  オート  ＨｂＡ１ｃ」（富士レビオ販売、株式会社エスアールエル製造）を使用した。
産業上の利用可能性
本発明のイムノアッセイ法によれば、煩雑な前処理を行うことなく、簡便且つ迅速に被検試料中の抗原性物質の測定が可能となるため、同時に多数検体を並列的に処理することも極めて容易となる。加えて、このようなアッセイ法は、全自動化された臨床検査機器に好適に適用可能であるため、測定の自動化、大量処理が可能となる。更に、本発明によればアッセイ法自体のみならず、試薬の製造という点についても有利な点がある。すなわち、一般に、磁性ラテックス試薬（ラテックスに抗原、抗体等が結合されている）の製造は、同じ品質のものを作ることは必ずしも容易ではない。また、保存中に凝集や沈殿が生じるのを防ぐためのノウハウも必要である。一般に、ラテックス診断薬の価格のうちで素材ラテックスのコストは低く、試薬の価格の過半を占めるのは、生物材料と、それをラテックス粒子に被覆するための工程に要するコストである。これに対し、本発明によれば、ラテックス等の不溶性磁性担体に抗原や抗体は実質的に感作されておらず、市販の試薬用の不溶性磁性担体（ラテックス等）をそのまま使用することも可能なため、新たな「ラテックス試薬」を製造することは必須でなくなる。加えて、本発明においては、抗体についても、必ずしも精製品である必要はなく、その必要量も大幅に低減せしめることができ、測定試薬の製造が容易となり、保存安定性の面でも極めて有利である。
本発明は、前述の説明及び実施例に特に記載した以外も、実行できることは明らかである。上述の教示に鑑みて、本発明の多くの改変及び変形が可能であり、従ってそれらも本件添付の請求の範囲の範囲内のものである。
【図面の簡単な説明】
図１は、磁性ラテックス粒子にＨｂＡ１ｃを吸着させる工程を含む標識抗ＨｂＡ１ｃモノクローナル抗体を使用したＨｂＡ１ｃ測定における不溶性磁性担体粒子の粒子表面積と得られるシグナルとの関係を示す。
図２は、磁性ラテックス粒子にＨｂＡ１ｃを吸着させる工程を含む標識抗ＨｂＡ１ｃモノクローナル抗体を使用したＨｂＡ１ｃ測定における系に存在する抗体量とシグナルとの関係を示す。
図３は、磁性ラテックス粒子にＨｂＡ１ｃを吸着させる工程を含む標識抗ＨｂＡ１ｃモノクローナル抗体を使用したＨｂＡ１ｃ測定において、標識として直接検知可能なものを用いた場合の結果を示す。
図４は、磁性ラテックス粒子にＨｂＡ１ｃを吸着させる工程を含む標識抗ＨｂＡ１ｃモノクローナル抗体を使用したＨｂＡ１ｃ測定法とラテックス凝集法との相関を示す。
図５は、磁性ラテックス粒子にＨｂＡ１ｃを吸着させる工程を含む標識抗ＨｂＡ１ｃモノクローナル抗体を使用したＨｂＡ１ｃ測定法において、使用不溶性磁性担体粒子の違いによる測定への影響を示す。
【図１】
0003863493.tif 000002
【図２】
0003863493.tif 000003
【図３】
0003863493.tif 000004
【図４】
0003863493.tif 000005
【図５】
0003863493.tif 000006