(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
不活化狂犬病ウイルス抗原及び不活化Ａ型肝炎ウイルス抗原を必須成分として含有し、選択的に無毒化破傷風トキソイドまたは不活化日本脳炎ウイルス抗原のいずれかを含有することもある混合ワクチン。
【請求項２】
当該不活化狂犬病ウイルス抗原、不活化Ａ型肝炎ウイルス抗原、無毒化破傷風トキソイド及び不活化日本脳炎ウイルス抗原の最終濃度が各々５〜30μg/ml、0.05〜1.0μg/ml、２〜10Lf/ml及び10〜40μg/mlになるように混合し、これを100〜400μg/mlのアルミニウムゲルに吸着させることを特徴とする前記請求項１記載の混合ワクチン。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、不活化狂犬病ウイルス抗原及び不活化Ａ型肝炎ウイルス抗原を必須成分として含有し、さらに選択的に無毒化破傷風トキソイドまたは不活化日本脳炎ウイルス抗原のいずれかを含有することもある混合ワクチンに関するものである。本発明により得られる混合ワクチンにより、狂犬病ウイルス及びＡ型肝炎ウイルス、さらには破傷風菌又は日本脳炎ウイルスに対する免疫を効率的に賦与することが可能となる。
【０００２】
【従来技術】
ヒトの狂犬病は、狂犬病に罹患している動物、特にイヌ、ネコなどの咬傷により感染するウイルス性疾患であり、ウイルスは咬傷部の皮下組織および筋肉内で増殖し、末梢神経から侵入して中枢神経系に到達して脳炎を起こすものであるが、発症した場合、死亡率はほとんど100％という致死率の高い疾患である。狂犬病ワクチンは、古くは動物脳で、現在では初代ニワトリ胚細胞、初代ハムスター腎細胞あるいはヒト２倍体細胞などを用いた組織培養によって狂犬病ウイルスを培養し、β−プロピオラクトン（ＢＰＬ）や紫外線によって不活化後、精製・濃縮して調製されている。これらのワクチンは狂犬病ウイルスで暴露された後の治療の目的で６〜８回接種されるが、暴露前の２〜３回のワクチン接種によってもほぼ確実に発症を防ぐことができる。
狂犬病ワクチンは暴露後の治療に用いられる場合が多く、接種回数が多いために、アルミゲル沈降型ワクチンでは副反応の心配が生じ通常はアジュバントは用いられてはいない。しかしながら、予防の目的としてワクチンを用いる場合には、沈降精製百日咳ジフテリア破傷風混合ワクチンのような通常のワクチンと同様な２〜３回の接種となり、アジュバントによる副反応の心配はほとんどなく、アルミゲルなどのアジュバントにより免疫効果をより一層高めることが可能となる。
インド、タイ、中国などの狂犬病の蔓延している地域の住民にとってはもちろん、日本のように狂犬病の根絶した国々においても、狂犬病の流行している国への海外渡航者にとっては、予防のためのワクチン接種の必要性が非常に高いと考えられる。
【０００３】
Ａ型肝炎は、Ａ型肝炎ウイルスに汚染された飲食物などの摂取により経口的に感染し、急性的に肝炎を発症する疾患である。Ａ型肝炎ワクチンは、アフリカミドリザル腎細胞やヒトの二倍体細胞を用いた組織培養によってＡ型肝炎ウイルスを大量培養することで製造される。アフリカミドリザル腎細胞を用いる場合、培養したウイルスを有機溶剤処理、遠心、酵素処理、ゲル濾過などによって精製したウイルスをホルマリンなどによって不活化して調製されている。これらのワクチンは、２〜３回の接種により感染防御に充分な程度の免疫を与えることができる。さらに、アルミゲルなどのアジュバントを添加により免疫効果をより一層高めることが可能となる。
Ａ型肝炎は世界中に広く分布しており、その浸淫度はその国の環境衛生に依存している。発展途上国では、しばしば流行が見られ予防のためのワクチンの接種が望まれており、また日本のように流行が少ない国では中高年以下の年齢層でのＡ型肝炎ウイルスに対する抗体保有率が低く、発展途上国など海外の浸淫地域への旅行者や赴任者にとっては、予防のためのワクチン接種が強く望まれている。
【０００４】
破傷風菌は、常在菌として土壌中に広く分布し、刺傷などの外傷部位から体内に入ると、嫌気的条件下で増殖した菌の産生する毒素が神経細胞と結合し、病的症状を発揮する。ひとたび発病したら、高度医療の整った地域でも10〜20％の致命率と言われている。破傷風の予防に用いるトキソイド（ワクチン）としては、沈降破傷風トキソイドがある。本ワクチンは破傷風菌を液体培地などで培養し、除菌後硫安塩析及びイオン交換クロマトグラフィー等の精製を行いホルマリン処理により無毒化したトキソイドをアルミニウムゲルに吸着させ調製している。破傷風は感染を早期に確実に診断することは難しく、一度発症したら治癒は困難で、トキソイド接種が唯一の予防策である。ワクチンは、基礎免疫として２回、その後10年おきに追加接種すれば十分な防御レベルを維持できるので、世界中どこでも、いつでも常在な破傷風菌の感染から逃れるため、全ての人々がトキソイドの接種を受けることが必要十分条件であると言える。
【０００５】
日本脳炎は、日本ではコガタアカイエカが媒介する日本脳炎ウイルスによって起こる発熱、髄膜刺激症状並びに脳炎症状を主症状とする重篤な疾病である。近年、日本での患者発生数は激減したものの西日本での発生が未だに報告される。また、日本以外の極東、東南アジア一帯にも日本脳炎は広く発生しており、ウイルス非常在性地域からこれらの常在性地域への旅行者への感染予防が必要となってきている。日本脳炎ワクチンは、日本脳炎ウイルスをマウス脳内に接種し、死亡直前に採脳して硫酸プロタミン法並びに高速遠心法等でウイルスを精製し、ホルマリンで不活化することによって得られる。予防としては、基礎免疫に１〜２週間隔で２回、追加免疫を１年後に行うことになっている。日本脳炎ワクチンの接種は、今後も海外渡航者や致命率が高いと言われる高齢者の予防のために、非常に重要である。
【０００６】
【発明の解決しようとする課題】
現在、狂犬病、Ａ型肝炎、破傷風又は日本脳炎に対するワクチンの接種はそれぞれ個別に実施されている。従って、全てのワクチン接種を望んでもその繁雑さのために、特に発展途上国においては、各ワクチン接種は充分には達成できない場合が多い。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
発明者らは、種々鋭意研究を重ねた結果、狂犬病ワクチン及びＡ型肝炎ワクチンを組み合わせた混合ワクチンを調製した。さらに選択的に破傷風ワクチン又は日本脳炎ワクチンのいずれかを組み合わせて３種混合ワクチンを調製した。好ましくは、不活化狂犬病ウイルス抗原、不活化Ａ型肝炎ウイルス抗原、無毒化破傷風トキソイド及び不活化日本脳炎ウイルス抗原の最終濃度が各々５〜30μg/ml、0.05〜1.0μg/ml、２〜10Lf/ml及び10〜40μg/mlになるように混合し、これを100〜400μg/mlのアルミニウムゲルに吸着させた沈降型の混合ワクチンも調製した。さらに、これらの混合ワクチンを、発展途上国の集中する熱帯地域での使用にも耐えうるワクチンとするために、ラクトースなどの安定剤を添加して凍結乾燥を行い、凍結乾燥型の３種混合ワクチンを開発するに至った。
【０００８】
【発明の効果】
本発明による混合ワクチンは、免疫原性、安定性ともに、それぞれの単味ワクチンに比べて同等以上であり、特にアルミゲルを用いた沈降型混合ワクチンでは、単味ワクチンで通常用いられている抗原量でも単味ワクチンの２倍以上の中和抗体を産生することが明らかとなった。その結果、数種のワクチンを１回の接種で行う簡便さに加えて製造コストの低減も可能となり、経済面での大きな利点が見い出された。また、当該混合ワクチンは、凍結乾燥を行なっても、力価の低下は認められず、むしろ同等以上の力価を有することが明らかとなった。従って、本発明により発展途上国の集中する熱帯地域での使用にも耐えうる混合ワクチンの提供が可能となった。
以下、本発明の実施例を記す。
【０００９】
【実施例】
実施例１  不活化狂犬病ワクチン原液の調製
伝染性の疾患に感染していない７〜10日卵のニワトリ胎児を集め、頭部を取り去って残りを鋏で細切した後、 0.2％トリプシンで消化し5％コウシ血清（ＦＢＳ）加ＹＬＥ50mlに１×108の細胞を浮遊して、ローラーボトルで 37 ℃に培養した。翌日、ＰＢＳで１回洗浄し、さらにＰＢＳを加えて１時間孵卵器に置いてよく洗った後、狂犬病ウイルス株の一つであるＨＥＰ Flury株をニワトリ胎児初代細胞に馴化して得られたＣＥＦ Clone Sウイルス（国立予防衛生研究所より分与）を 100倍に希釈して加え、１時間吸着後、重曹を0.4％に加えた１９９培地を50ml加え35℃で６日間培養した。６日目の培養液を集め、１万倍になるようにβ−プロピオラクトン（ＢＰＬ）を加え１時間37℃で不活化し、再び１万倍になるようにＢＰＬを加え１時間加温した。pHが低下した場合重曹を加えてpH7.8以上に補正した。
次に、限外濾過器で濃縮した後、高速遠心機で19,000rpm（55,000xg）、３時間遠心してウイルスを沈殿させ、この沈渣を0.01MＰＢＳに浮遊し不活化狂犬病ワクチン原液とした。
【００１０】
実施例２  不活化Ａ型肝炎ワクチン原液の調製
ミドリザル腎由来のＧＬ３７細胞を10％ＦＢＳ加ＭＥＭ培地で１〜４週間培養し、細胞シートを0.05％トリプシンで消化した後遠心（1,000rpm、３分間）してその沈渣を８％ＦＢＳ加ＭＥＭにて浮遊させた。Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）をこの細胞浮遊液に接種（M.O.I=0.1）し、37℃で１時間吸着させた後、ローラーボトルで１週間培養した。なお、製造用細胞株及びウイルス株は国立予防衛生研究所より分与されたマスターセル及び種ウイルスから継代し、使用した。さらに、１週間に１回２％ＦＢＳ加ＭＥＭ培地で置き換え２週間培養した。培養終了後培地を除去し、１％ＮＰ４０（半井化学社製）を含む可溶化液で細胞を可溶化後、遠心（3,000rpm, 30分間）により細胞を分離し、ウイルス浮遊液を得た。このウイルス浮遊液に最終濃度が７％となるようにポリエチレングリコール（ＰＥＧ）6000を添加し、４℃で２〜３時間攪拌後一夜静置した。次に、遠心（5,000rpm, 30分間）により沈殿物を回収し、可溶化液を加えてホモジナイザーで沈殿物をほぐし、遠心（8,000rpm，30分間）により不溶性の沈殿物を除去して遠心上清を回収した。上清に等量のクロロホルムを添加し、５〜15分間攪拌してクロロホルム層を完全に分離除去した。ウイルスを含む水層に、RNaseＡ（シグマ社製）を最終濃度が20μg/mlとなるように添加し、37℃で１〜２時間処理した。続いて、DNaseＩ（宝酒造社製）を最終濃度が20〜40μg/mlになるように添加して、37℃で２〜３時間処理した。さらに、ProteinaseＫ（メルク社製）を最終濃度が50μg/mlになるように添加して、37℃で１〜２時間処理した。ＨＡＶ含有酵素処理液１容に対し、１容の2.5Ｍリン酸バッファー（pH 7.5）と0.8容のエトキシエタノール・ブトキシエタノール（2:1 V/V）混液を加え攪拌し、遠心（2,000rpm，10分間）後、中間層（ウイルス濃縮層）を採取して0.1％ Tween-80（和光純薬社製）加リン酸バッファー（pH7.2〜7.6）に懸濁した。この操作を再度繰り返した。この液をセファクリルS-400HR（ファルマシア社製）ゲルクロマトカラムに通液してゲル濾過を行い、ウイルス画分をプールし、無菌濾過したものを最終精製ウイルス液とした。この精製ウイルス液を抗原濃度が20μg/mlになるよう0.002％Tween-80加ＰＢＳで希釈し、等量の0.05％ホルマリン溶液を加え、37℃で12日間不活化したものを不活化Ａ型肝炎ワクチン原液とした。
【００１１】
実施例３  無毒化破傷風トキソイド原液の調製
国立予防衛生研究所より分与された破傷風菌毒素産生株Harvard A-47株を牛肉透析外液培地に植付け34〜37℃、５〜８日間静置培養又はタンク培養し、毒素液を得た。この毒素液を除菌ろ過した後、硫安塩析法及びイオン交換クロマトグラフィー等の方法で防御抗原である破傷風毒素を精製した。この精製毒素液にホルマリンを0.4 W/V％添加、37℃中にて抗原性を損失しない様に無毒化し、安定剤としてゼラチンを0.02 W/V％、保存剤としてチメロサールを0.01 W/V％加えたものを無毒化破傷風トキソイド原液とした。
【００１２】
実施例４  不活化日本脳炎ワクチン原液の調製
日本脳炎ウイルス中山予研株又は北京株を３〜５日齢の乳のみマウス脳に２〜３代継代し、その脳乳剤の遠心上清を製造用ウイルスとした。生後３〜５週の健康なマウスの脳内にこの製造用ウイルスを接種し、脳炎症状を示した死亡直前の脳を採集した。この脳に0.010MＰＢＳ（pH8.0）を加えて磨砕し、遠心機（4,000rpm、60分間）により遠心した。この遠心上清に硫酸プロタミンを１ml当たり1.35mg添加して混和、氷水中に２時間静置した。その後、遠心機により遠心し（4,000rpm、20分間）、その上清をとり、炭末を0.8 W/V％になるように加え、氷水内で20分間かき混ぜた。この炭末処理液は、メンブランフィルターでろ過し、ろ過液をウイルス浮遊液とした。
ウイルス浮遊液にホルマリンを0.08 W/V％になるように加え、かき混ぜ、４〜５℃の冷室に約３ヶ月間保存し、ウイルスの不活化を行い、不活化が終了したものを不活化ウイルス浮遊液とした。不活化ウイルス浮遊液を限外ろ過濃縮により約1/5量にした濃縮液は、超高速遠心機により遠心（30,000rpm、60分間）、沈渣を0.010 MＰＢＳ（pH7.1）に浮遊した。この浮遊液に安定剤としてゼラチンを0.02 W/V％、ポリソルベート80を0.01 V/V％、保存剤としてホルマリンを0.005 W/V％、チメロサールを0.01 W/V％になるように加え不活化日本脳炎ワクチン原液とした。
【００１３】
実施例５  各種ワクチンの調製
実施例１の狂犬病ワクチン原液を抗原価が２（５IU/ml）相当となるように0.01MＰＢＳ pH7.4で希釈し、等量のラクトース15.0％(W/V)グルタミン酸ナトリウム0.2％(W/V)、ゼラチン0.04％(W/V)加0.01MＰＢＳ（pH7.4）と混合して最終バルクを調製し、２mlバイアルに１mlずつ分注後、凍結乾燥したものを凍結乾燥狂犬病ワクチンとする。
実施例２のＡ型肝炎ワクチン原液を蛋白濃度が2μg/mlとなるように0.01MＰＢＳ（pH7.4）で希釈し、同様に凍結乾燥したものを凍結乾燥Ａ型肝炎ワクチンとした。
実施例３の破傷風トキソイド原液を抗原濃度が８Lf/mlとなるように0.01MＰＢＳ（pH7.4）で希釈し、等量の400μg/ml水酸化アルミニウムゲル溶液（pH7.4）と混合したものを沈降破傷風トキソイドとした。
実施例４の日本脳炎ワクチン原液を蛋白濃度が30μg/mlとなるように0.01MＰＢＳ（pH7.4）で希釈し、日本脳炎の単味ワクチンとした。
【００１４】
実施例６  凍結乾燥狂犬病・Ａ型肝炎混合ワクチンの調製
実施例１の狂犬病ワクチン原液を抗原価が４(10 IU/ml)相当となるように、また実施例２のＡ型肝炎ワクチン原液を蛋白濃度が４μg/mlとなるようにそれぞれ0.01MＰＢＳ（pH7.4）で希釈し、これらの希釈液を等量混合後、さらに等量のラクトース 15.0W/V％、グルタミン酸ナトリウム 0.2W/V％、ゼラチン0.04W/V％加0.01MＰＢＳ（pH7.4）と混合して最終バルクを調製し、２mlバイアルに１mlずつ分注後、凍結乾燥したものを凍結乾燥狂犬病・Ａ型肝炎混合ワクチンとした。
【００１５】
実施例７  沈降狂犬病・Ａ型肝炎混合ワクチンの調製
実施例１の狂犬病ワクチン原液を抗原価が４(10 IU/ml)相当となるように、また実施例２のＡ型肝炎ワクチン原液を蛋白濃度が４μg/mlとなるようにそれぞれ0.01MＰＢＳ（pH7.4）で希釈し、これらの希釈液を等量混合後、さらに等量の400μg/ml水酸化アルミニウムゲル溶液（pH7.4）と混合したものを沈降狂犬病・Ａ型肝炎混合ワクチンとした。
【００１６】
実施例８  沈降狂犬病・Ａ型肝炎・破傷風混合ワクチンの調製
実施例１の狂犬病ワクチン原液を抗原価が６(15 IU/ml)相当となるように、また実施例２のＡ型肝炎ワクチン原液を蛋白濃度が６μg/mlとなるように、更に実施例３の破傷風トキソイド原液を抗原濃度が24Lf/mlとなるようにそれぞれ0.01MＰＢＳ（pH7.4）で希釈し、これらの希釈液を等量混合後、さらに等量の400μg/ml水酸化アルミニウムゲル溶液（pH7.4）と混合したものを沈降狂犬病・Ａ型肝炎・破傷風混合ワクチンとした。
【００１７】
実施例９  凍結乾燥沈降狂犬病・Ａ型肝炎・破傷風混合ワクチンの調製
実施例１の狂犬病ワクチン原液を抗原価が12（30IU/ml）相当となるように、また実施例２のＡ型肝炎ワクチン原液を蛋白濃度が12μg/mlとなるように、更に実施例３の破傷風トキソイド原液を抗原濃度が48Lf/mlとなるようにそれぞれ0.01MＰＢＳ（pH7.4）で希釈し、これらの希釈液を等量混合する。この混合液と等量の800μg/ml水酸化アルミニウムゲル溶液（pH7.4）とを混合したものに、さらに等量のラクトース15.0W/V％、グルタミン酸ナトリウム0.2W/V％、ゼラチン0.04W/V％加0.01MＰＢＳ（pH7.4）とを混合して最終バルクを調製し、２mlバイアルに１mlずつ分注後、凍結乾燥したものを凍結乾燥沈降狂犬病・Ａ型肝炎・破傷風混合ワクチンとした。
【００１８】
実施例１０  凍結乾燥狂犬病・Ａ型肝炎・日本脳炎混合ワクチンの調製
実施例１の狂犬病ワクチン原液を抗原価が６(15 IU/ml)相当となるように、また実施例２のＡ型肝炎ワクチン原液を蛋白濃度が６μg/mlとなるように、更に実施例４の日本脳炎ワクチン原液を蛋白濃度が180μg/mlとなるようにそれぞれ0.01MＰＢＳ（pH7.4）で希釈し、これらの希釈液を等量混合する。この混合液と等量のラクトース15.0W/V％、グルタミン酸ナトリウム0.2W/V％、ゼラチン0.04W/V％加 0.01MＰＢＳ（pH7.4）とを混合して最終バルクを調製し、２mlバイアルに１mlずつ分注後、凍結乾燥したものを凍結乾燥狂犬病・Ａ型肝炎・日本脳炎混合ワクチンとした。
【００１９】
実施例１１  凍結乾燥沈降狂犬病・Ａ型肝炎・日本脳炎混合ワクチンの調製
実施例１の狂犬病ワクチン原液を抗原価が12(30 IU/ml)相当となるように、また実施例２のＡ型肝炎ワクチン原液を蛋白濃度が12μg/mlとなるように、更に実施例４の日本脳炎ワクチン原液を蛋白濃度が360μg/mlとなるようにそれぞれ0.01MＰＢＳ（pH7.4）で希釈し、これらの希釈液を等量混合する。この混合液と等量の800μg/ml水酸化アルミニウムゲル溶液（pH7.4）とを混合したものに、さらに等量のラクトース15.0W/V％、グルタミン酸ナトリウム0.2W/V％、ゼラチン0.04W/V％加0.01MＰＢＳ（pH7.4）とを混合して最終バルクを調製し、２mlバイアルに１mlずつ分注後、凍結乾燥したものを凍結乾燥沈降狂犬病・Ａ型肝炎・日本脳炎混合ワクチンとした。
【００２０】
実施例１２  不活化狂犬病ワクチンの力価試験
実施例５〜１１で調製した▲１▼凍結乾燥狂犬病ワクチン、▲２▼凍結乾燥狂犬病・Ａ型肝炎混合ワクチン、▲３▼沈降狂犬病・Ａ型肝炎混合ワクチン、▲４▼沈降狂犬病・Ａ型肝炎・破傷風混合ワクチン、▲５▼凍結乾燥沈降狂犬病・Ａ型肝炎・破傷風混合ワクチン、▲６▼凍結乾燥狂犬病・Ａ型肝炎・日本脳炎混合ワクチン及び▲７▼凍結乾燥沈降狂犬病・Ａ型肝炎・日本脳炎混合ワクチンについて、生物学的製剤基準の乾燥組織培養不活化狂犬病ワクチンの力価試験法に従い力価試験を実施した。
【００２１】
力価試験は下記の通り行った。
検体及び参照不活化狂犬病ワクチン（以下「参照品」という。）をそれぞれ0.013 MＰＢＳ（pH7.0）を用いて５倍段階希釈し、それぞれの４段階を作った。体重約12ｇのマウス10匹以上を１群とした。各希釈に１群ずつを用い、１匹当たり0.5mlずつを２回、１週間隔で腹腔内に注射した。第１回免疫注射の２週間後に各群の動物に、１匹当たり攻撃用ウイルスＣＶＳ株浮遊液0.03mlを脳内に注射して14日間観察した。別に、10匹以上のマウスを１群とし、適当に段階希釈した攻撃用ウイルス浮遊液の各希釈に１群ずつを用い、１匹当たり0.03mlを脳内に注射して14日間観察した。これらの観察の最終日に麻ひを示す動物は死亡に算入した。攻撃用ウイルス浮遊液0.03ml中のLD50数は 10〜100でなければならない。試験の成績を統計学的に処理して比較するとき、検体の力価は参照品と同等以上でなければならない。
試験の成績は統計学的に処理して参照品との相対力価で示した。その成績を表１に示した。
【００２２】
【表１】
0003752264.tif 000002
【００２３】
表１に示したように、狂犬病ワクチンをＡ型肝炎ワクチン、さらにＡ型肝炎ワクチンと破傷風トキソイドあるいはＡ型肝炎ワクチンと日本脳炎ワクチンと混合することにより、単味の狂犬病ワクチンと比較して、同等以上の成績が得られた。また、アルミゲルを添加した沈降型ワクチンは液状ワクチンに比べて免疫効果が高く、同一の抗原濃度で２倍以上の免疫効果を発揮することが確認された。さらに、凍結乾燥することによっても力価の低下は認められず、むしろ同等以上の成績が得られた。
【００２４】
実施例１３  不活化Ａ型肝炎ワクチンの力価試験
実施例５〜１１で調製した▲１▼凍結乾燥Ａ型肝炎ワクチン、▲２▼凍結乾燥狂犬病・Ａ型肝炎混合ワクチン、▲３▼沈降狂犬病・Ａ型肝炎混合ワクチン、▲４▼沈降狂犬病・Ａ型肝炎・破傷風混合ワクチン、▲５▼凍結乾燥沈降狂犬病・Ａ型肝炎・破傷風混合ワクチン、▲６▼凍結乾燥狂犬病・Ａ型肝炎・日本脳炎混合ワクチン及び▲７▼凍結乾燥沈降狂犬病・Ａ型肝炎・日本脳炎混合ワクチンについて、生物学的製剤基準の乾燥組織培養不活化Ａ型肝炎ワクチンの力価試験法に従い、力価試験を実施した。
【００２５】
力価試験の方法を以下に示す。
検体及び参照不活化Ａ型肝炎ワクチン（以下「参照品」という。）をそれぞれ生理食塩液を用いて希釈し、対数等間隔の段階希釈を作った。生後約５週のラット５匹以上を１群とし、各希釈に１群ずつを用いた。１匹当たり１mlを１回腹腔内に注射した。免疫注射の５週後に全ての動物から採血し、血清を分けた。各血清の抗Ａ型肝炎ウイルス抗体価を酵素抗体法、その他適当な方法で測定した。試験の成績を統計学的に処理して比較するとき、検体の力価は参照品と同等か、それ以上でなければならない。
力価試験成績は統計学的に処理して参照品との相対力価で表した。その成績を表２に示した。
【００２６】
【表２】
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【００２７】
表２に示したように、Ａ型肝炎ワクチンを狂犬病ワクチン、さらに狂犬病ワクチンと破傷風トキソイドあるいは狂犬病ワクチンと日本脳炎ワクチンと混合することにより、単味のＡ型肝炎ワクチンと比較して同等以上の成績が得られた。また、アルミゲルを添加した沈降型ワクチンは液状ワクチンに比べて免疫効果が高く、同一の抗原濃度で２倍以上の免疫効果を発揮することが確認された。さらに、凍結乾燥することによっても力価の低下は認められず、むしろ同等以上の成績が得られた。
【００２８】
実施例１４  破傷風トキソイドの力価試験
実施例５、８および９で調製した▲１▼沈降破傷風トキソイド、▲２▼沈降狂犬病・Ａ型肝炎・破傷風混合ワクチン及び▲３▼凍結乾燥沈降狂犬病・Ａ型肝炎・破傷風混合ワクチンについて、生物学的製剤基準の沈降破傷風トキソイドの力価試験法に従い力価試験を実施した。
【００２９】
力価試験の方法を以下に示す。
検体及び標準沈降破傷風トキソイド（以下「標準品」という。）をそれぞれ0.02 W/V％ゼラチン加 0.017MＰＢＳ（pH7.0）を用いて希釈し、対数的等間隔の段階希釈を作る。体重300〜400gのモルモット１０匹以上を１群とした。検体及び標準品の各希釈に１群ずつを用い、１匹当たり２mlを１回皮下に注射した。免疫注射の４週間後に、それぞれのモルモットを約50LD50の毒素で攻撃して、７日間観察した。また、非免疫対照群の体重約400gのモルモット３匹以上を１群とし、その３群以上を用いて攻撃に用いた毒素のLD50数を測定するとき、その値は25〜100でなければならない。試験の成績を統計学的に処理して比較するとき、検体の力価は40国際単位以上でなければならない。
力価試験の成績は統計学的に処理して国際単位で表した。その成績を表３に示した。
【００３０】
【表３】
0003752264.tif 000004
【００３１】
表３に示したように、破傷風トキソイドを狂犬病ワクチン及びＡ型肝炎ワクチンと混合することにより、単味の破傷風トキソイドと比較して、高い抗体力価を示した。また、凍結乾燥することによっても力価の低下は認められず、むしろ同等以上の成績が得られた。
【００３２】
実施例１５  日本脳炎ワクチンの力価試験
実施例５、１０及び１１で調製した日本脳炎ワクチン、凍結乾燥狂犬病・Ａ型肝炎・日本脳炎混合ワクチン及び凍結乾燥沈降狂犬病・Ａ型肝炎・日本脳炎混合ワクチンについて、生物学的製剤基準の日本脳炎ワクチンの力価試験法に従い力価試験を実施した。
【００３３】
力価試験の方法を以下に示す。
検体及び参照日本脳炎ワクチン（以下「参照品」という）をそれぞれ0.010MＰＢＳ（pH7.0〜7.2）を用いて希釈し、対数的等間隔の希釈を作った。生後約４週のマウス10匹以上を１群とし、各希釈に１群ずつを用いた。１匹当たり0.5mlを７日間隔で２回腹腔内に注射する。第２回注射の７日後に、全ての動物から採血し、血清を採り56℃30分加熱した。各群の血清を子ウシ血清加 Hanks液で適当に希釈し、希釈血清と攻撃用ウイルス浮遊液の等量を混合し、36±１℃に1.5時間置き、各混合液をそれぞれ４枚以上の内径約70mmのペトリ皿に培養したニワトリ胚細胞培養上に0.4mlずつ接種した。別に攻撃用ウイルス浮遊液と子ウシ血清加 Hanks液の等量を混合し、36±１℃に1.5時間置いたものを10枚以上の細胞培養に0.4mlずつ接種し対照とした。全てのペトリ皿を36±１℃の炭酸ガス調節ふ卵器に収め1.5時間置いた後、第一次重層寒天培地を重層して、再び炭酸ガス調節ふ卵器で２日培養した。第二次重層寒天培地を重層して、更に炭酸ガス調節ふ卵器に、１日ないし２日置いた後、全てのペトリ皿のプラック数を数えた。試験群のプラック数と対照群のプラック数を比較して、減少率を求め、各血清の中和抗体価を算出した。対照ペトリ皿の平均プラック数は50〜150でなければならない。試験の成績を統計学的に処理して比較するとき、検体の力価は参照品と同等以上でなければならない。
力価試験の成績は統計学的に処理して参照品との相対力価で表した。その成績を表４に示した。
【００３４】
【表４】
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【００３５】
表４に示したように、日本脳炎ワクチンを狂犬病ワクチン及びＡ型肝炎ワクチンと混合することにより、単味の日本脳炎ワクチンと比較して同等以上の成績が得られた。また、凍結乾燥することによっても力価の低下は認められず、むしろ同等以上の成績が得られた。さらに、アルミゲルを添加した沈降型ワクチンは液状ワクチンに比べて免疫効果が高く、同一の抗原濃度でも２倍以上の免疫効果を発揮することが確認された。
【００３６】
実施例１６  各種ワクチンの性状分析
実施例５〜１１で調製した全てのワクチンを、25℃で３ヶ月間保存し性状観察、水素イオン濃度測定、力価試験および異常毒性否定試験を実施した。性状観察は肉眼で行い、水素イオン濃度測定および異常毒性否定試験は生物学的製剤基準に従って実施した。また力価試験は実施例１２〜１５の方法と同様に実施した。その成績を表５に示した。
【００３７】
【表５】
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【００３８】
表５に示したように、本発明により得られた混合ワクチンは、保存前と３ヶ月後において、性状、水素イオン濃度、力価及び異常毒性はほとんど変化は認められず、いずれのワクチンも安定性及び安全性に優れていることが確認された。また、実施例１２〜１５の成績とも考えあわせると、これらの混合ワクチンは実用性及び効果面においても優れていることが明らかにされた。