(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
化合物（Ｉ）の製造法であって、化合物（Ｉ）は、
【化１】
0003730917.tif 000004
の化合物（Ａ）とポリマーとを含み、該ポリマーは、ラクチド単位とグリコリド単位と酒石酸単位とを含んでおり、該ポリマー中のラクチド単位の比率は７１％以上７３％までであり；グリコリド単位の比率は２６％以上２８％までであり；酒石酸単位の比率は１％以上３％までであり；また、化合物（Ａ）のアミノ基は該ポリマーの酸単位のカルボキシル基とイオン結合しており；
前記製造法は、化合物（Ａ）の水溶液と前記ポリマー又はその塩とを、アセトニトリルと水との混合物中（アセトニトリル：水の重量比は約３：１）で、約０℃〜５℃の温度で、化合物（Ｉ）の生成が完了するまで反応させるステップを含む化合物（Ｉ）の製造法。
【請求項２】
前記温度が約２．５℃であり；また前記製造法が化合物（Ｉ）を単離するという追加のステップを含む、請求項１に記載の製造法。
【請求項３】
化合物（Ｉ）のマイクロ粒子の製造法であって、化合物（Ｉ）は、
【化２】
0003730917.tif 000005
の化合物（Ａ）とポリマーとを含み、該ポリマーは、ラクチド単位とグリコリド単位と酒石酸単位とを含んでおり、該ポリマー中のラクチド単位の比率は７１％以上７３％までであり；グリコリド単位の比率は２６％以上２８％までであり；酒石酸単位の比率は１％以上３％までであり；また、化合物（Ａ）のアミノ基は該ポリマーの酸単位のカルボキシル基とイオン結合しており；
前記製造法は、
化合物（Ｉ）の酢酸エチル溶液をイソプロピルアルコール中に噴霧して化合物（Ｉ）のマイクロ粒子分散物を得るステップであって、
化合物（Ｉ）の酢酸エチル溶液中の濃度は約８％〜約１２％（Ｗ／Ｗ）であり；化合物（Ｉ）の溶液をネブライザからイソプロピルアルコール中にスプレーする速度は約４．９ｍｌ／分〜約５．１ｍｌ／分であり；ネブライザの周波数設定は、ネブライザが化合物（Ｉ）の酢酸エチル溶液の大きな液滴を断続的に噴出することがないようなものであり；イソプロピルアルコールの体積は酢酸エチルの体積に比べて約２０〜３０倍の体積過剰であり；そしてイソプロピルアルコールの温度は約−６０℃〜約−７８℃であるステップと；
イソプロピルアルコールを約０℃〜２２℃に温まらせるステップと；前記マイクロ粒子をイソプロピルアルコールから単離するステップとを含む、化合物（Ｉ）のマイクロ粒子の製造法。
【請求項４】
スプレー速度が約５ｍｌ／分であり、イソプロピルアルコールの体積が酢酸エチルの体積に比べて約２０倍の体積過剰である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ポリマーが７２％のラクチド単位と２７％のグリコリド単位と１％の酒石酸単位とを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
マイクロ粒子が約１０ミクロン〜約１００ミクロンの平均サイズを有する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
マイクロ粒子が約４０ミクロン〜約７０ミクロンの平均サイズを有する、請求項６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は、徐放性複合体である化合物（Ｉ）の製造法に関する。化合物（Ｉ）は、式：
【０００２】
【化３】
0003730917.tif 000002
【０００３】
を有する化合物（Ａ）とポリ−（ｌ）−乳酸−グリコール酸−酒石酸（poly-(l)-lactic-glycolic-tartaric acid:Ｐ（ｌ）ＬＧＴ）を含むコポリマーとを含み、化合物（Ａ）のアミノ基はＰ（ｌ）ＬＧＴのカルボキシル基とイオン結合している。
背景技術
医薬組成物をインビボで制御放出させるための多くの薬物送達系が開発、試験、及び利用されている。例えば、ポリ（ＤＬ−乳酸）、ポリ（グリコール酸）、ポリ（ε−カプロラクトン）及び他の種々コポリマー類などのポリエステル類が、プロゲステロンなどの生物活性分子の放出に使用されている。これらはマイクロカプセル、フィルム、またはロッドの形態である（Ｍ．Ｃｈａｓｉｎ及びＲ．Ｌａｎｇｅｒ共編、Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ａｓ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ，１９９０）。ポリマー／治療薬組成物を、例えば皮下又は筋肉内に埋め込むと、治療薬は特定の時間をかけて放出される。このような生体適合性、生分解性のポリマー系は、内包した治療薬をポリマーマトリックスから拡散させるように設計されている。治療薬が放出されると、投薬系(poller)はインビボで分解されるので、埋植片の外科的除去が不要になる。投薬系の分解に寄与する因子はよくわかっていないが、ポリエステルに関するそのような分解は、エステル結合がポリマー成分の非酵素的自己触媒的加水分解に使われやすいことによって調節されているのであろうと考えられている。
【０００４】
いくつかのＥＰＯ公開特許及び米国特許が、治療薬のインビボでの放出速度及び期間を調節するポリマーマトリックスの設計とその役割の問題を取り扱っている。
【０００５】
例えば、Ｄｅｌｕｃａ（ＥＰＯ公開番号０４６７３８９  Ａ２）は、疎水性の生分解性ポリマーとタンパク質又はポリペプチドとの間の物理的相互作用について記載している。形成された組成物は、患者に導入後マトリックスからの拡散的放出を持続する疎水性ポリマーと治療薬との混合物であった。
【０００６】
Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ（米国特許第４，７６７，６２８号）は、治療薬の放出を、ポリマーデバイス中に均一に分散させることによって制御した。開示によれば、当該製剤は、二つの相を重ね合わせることによって、制御された連続放出を提供する。第一は、薬物を製剤表面から拡散依存的に浸出させる相、第二は、ポリマーの分解によって誘導された水路（水性チャネル）によって放出させる相の二つである。
【０００７】
ＰＣＴ公開特許ＷＯ９３／２４１５０には、塩基性基を有するペプチドとカルボキシ末端ポリエステルを含む徐放性製剤が開示されている。
米国特許第５，６１２，０５２号は、典型的にはカルボキシル含有ポリエステル鎖で作られた陽イオン交換マイクロ粒子について記載している。このマイクロ粒子上に塩基性の生物活性薬を固定し、吸収性のゲル形成液体ポリエステル内での制御放出系を提供している。
【０００８】
化合物（Ａ）は、米国特許第５，５５２，５２０号に記載されクレームされている。
出願人のＰＣＴ公開ＷＯ９７／４００８５には、乳酸単位と、グリコール酸単位と、酒石酸又はパモ酸のようなヒドロキシ−ポリカルボン酸単位とを含む生分解性ポリエステル、及び前記ポリエステルの製造法を開示している。更に詳しくは、それぞれ６５／３３／２の比率のポリ−ラクチド−グリコリド−酒石酸ポリマーを開示している。
【０００９】
出願人のＰＣＴ公開ＷＯ９４／１５５８７には、遊離ＣＯＯＨ基を有するポリエステルと、有効なイオン生成可能アミンを少なくとも一つ有する生物活性ペプチドとのイオン性複合体(conjugate)を開示している。更に詳しくは、コポリマーをリンゴ酸又はクエン酸と反応させることによってポリマーをポリカルボン酸性にしていることを開示している。米国特許第５，６７２，６５９号はＷＯ９４／１５５８７の米国国内移行出願の継続出願である。米国特許第５，８６３，９８５号は米国特許第５，６７２，６５９号の継続である。係属中の米国出願第０９／２３７，４０５号は米国特許第５，８６３，９８５号の一部継続出願であるが、さらに、クエン酸、ε−カプロラクトン、及びグリコリドを含まねばならないポリエステル；直前に記したポリエステルとポリペプチドを含む組成物；酒石酸を構成成分の一つとして含まねばならないポリエステル；直前に記したポリエステルとポリペプチドを含む組成物；そしてロッドの形状をした前記組成物（これは場合により生分解性ポリマーで被覆される）が追加開示されている。
【００１０】
出願人のＰＣＴ公開ＷＯ９７／３９７３８は、ＷＯ９４／１５５８７に記載のような徐放性のイオン性複合体のマイクロ粒子の製造法を開示している。
前述の特許、出願特許、及び公開特許の内容は、その全体を本願に引用して援用する。
発明の開示
本発明は、ポリマーと化合物（Ａ）を含む徐放性イオン性複合体の好適な実施の形態を製造するための好適な方法に関する。当該徐放性イオン性複合体は、複合体から化合物（Ａ）が０次放出されるという驚くべき結果と非自明性が特徴である。本発明の方法の更なる利点は、使用される溶媒が副反応を防止すること、及び以前に開示された方法よりも安価に利用できることである。
【００１１】
本発明は、化合物（Ｉ）の製造法に関する。化合物（Ｉ）は、
【００１２】
【化４】
0003730917.tif 000003
【００１３】
の化合物（Ａ）とポリマーとを含み、該ポリマーは、ラクチド単位とグリコリド単位と酒石酸単位とを含んでおり、該ポリマー中のラクチド単位の比率は７１％以上７３％までであり；グリコリド単位の比率は２６％以上２８％までであり；酒石酸単位の比率は１％以上３％までであり；また、化合物（Ａ）のアミノ基は該ポリマーの酸単位のカルボキシル基とイオン結合している。
その製造法は、化合物（Ａ）の水溶液と前記ポリマー又はその塩とを、アセトニトリルと水との混合物中（アセトニトリル：水の重量比は約３：１）で、約０℃〜５℃の温度で、化合物（Ｉ）の生成が完了するまで反応させるステップを含む。
【００１４】
前記製造法の好適な方法は、反応混合物の温度が約２．５℃であり；また該方法は化合物（Ｉ）を単離するという追加のステップも含む。
別の態様において、本発明は前述の化合物（Ｉ）のマイクロ粒子の製造法を含む。該方法は、化合物（Ｉ）の酢酸エチル溶液をイソプロピルアルコール中に噴霧して化合物（Ｉ）のマイクロ粒子分散物を得るステップであって、
化合物（Ｉ）の酢酸エチル溶液中の濃度は約８％〜約１２％（Ｗ／Ｗ）であり；化合物（Ｉ）の溶液をネブライザからイソプロピルアルコール中にスプレーする速度は約４．９ｍｌ／分〜約５．１ｍｌ／分であり；ネブライザの周波数設定は、ネブライザが化合物（Ｉ）の酢酸エチル溶液の大きな液滴を断続的に噴出する(spit)ことがないようなものであり；イソプロピルアルコールの体積は酢酸エチルの体積に比べて約２０〜３０倍の体積過剰であり；そしてイソプロピルアルコールの温度は約−６０℃〜約−７８℃であるステップと；
イソプロピルアルコールを約０℃〜２２℃に温まらせるステップと；前記マイクロ粒子をイソプロピルアルコールから単離するステップとを含む。
【００１５】
前記製造法の好適な方法は、スプレー速度が約５ｍｌ／分であり、イソプロピルアルコールの体積が酢酸エチルの体積に比べて約２０倍の体積過剰である。
前記製造法の好適な方法は、ポリマーが７２％のラクチド単位と２７％のグリコリド単位と１％の酒石酸単位とを含む。
【００１６】
前記製造法の好適な方法は、マイクロ粒子が約１０ミクロン〜約１００ミクロンの平均サイズを有する。
前記製造法の好適な方法は、マイクロ粒子が約４０ミクロン〜約７０ミクロンの平均サイズを有する。
【００１７】
パラメータ又は量に関して本明細書中で使用している“約”という用語は、パラメータ又は量が、記載したパラメータ又は量の±５％以内であることを意味する。
【００１８】
本明細書中で使用している“マイクロ粒子”という用語は、化合物（Ａ）とポリ−ラクチック−コ−グリコリック−コ−Ｌ−（＋）−酒石酸ポリマーとを含むイオン性複合体のミクロンサイズの粒子のことで、好ましくは本質的に球形である。
【００１９】
本願では、アミノ酸を当該技術分野で公知の標準の三文字略号で表す。例えば、Ｐｈｅ＝フェニルアラニン、Ａｂｕ＝α−アミノ酪酸。
一般的手順：
コポリマーの形成：Ｌ−ラクチド、グリコリド、及びＬ（＋）−酒石酸からなるコポリマーは、当業者に周知かつ本明細書中で実施している方法に従って製造できる。すなわち、グリコリド、Ｌ−ラクチド、及びＬ（＋）−酒石酸の各モノマーと、２−エチルヘキサン酸第一スズのトルエン中溶液を反応器に装入する。Ｌ−ラクチド、グリコリド、及びＬ（＋）−酒石酸のモル比率はそれぞれ約７２／２７／１である。
【００２０】
Ｌ（＋）−酒石酸は、予め好ましくはアブデルハルデン乾燥器中のシリカゲル上で約１０時間乾燥させる。次に、反応器を真空下に置き、攪拌しながらトルエンを除去する。次に、反応器を酸素除去窒素雰囲気下で、好ましくは油浴に浸けて加熱し（温度＝約１８０℃〜１９０℃）、攪拌を約１２５ｒｐｍに上げる。浸漬の前に加熱テープ（例えばＴｈｅｒｍｏｌｙｎｅタイプ４５５００、入力制御設定＝４）を反応器の蓋上に置く。反応器の内容物が完全に溶融するのに要した時間を記録する。通常は、装荷量約３００ｇで約１８０℃の場合、約１５分である。合成中、毎時間試料を取り、ＧＰＣで分析して残存モノマーのパーセンテージを測定し、数平均分子量（Ｍｎ）分布と重量平均分子量（Ｍｗ）分布のための値を得る。典型的な反応時間は約９〜１５時間のオーダーである。最終ポリマーも滴定で分析して酸価をｍｅｑ／ｇで測定し、ＧＣで分析して残存未反応モノマー含有量を測定する。更なる分析は、ＩＲ（特徴的なＣ＝Ｏピークの検出）；ＮＭＲ（ポリマー中のラクチドとグリコリド含有量の測定）及び残存スズ（２−エチルヘキサン酸第一スズを触媒として使用するため、残存スズを測定）などである。
【００２１】
前記コポリマーの精製／ナトリウム塩の形成：残存モノマー（通常＜５％（Ｗ／Ｗ））を除去し、コポリマーをワンステップでそのナトリウム塩の形に転化する（イオン塩の形成を促進するため）。ポリ−Ｌ−ラクチック−コ−グリコリック−コ−Ｌ（＋）−酒石酸コポリマー（ＰＬＧＴＡ）を超音波処理浴中で超音波処理によりアセトンに溶解し、ＰＬＧＴＡが１９〜２１重量％の濃度範囲の溶液を得る。
【００２２】
この溶液に、ＮａＯＨ又はＮａ2ＣＯ3のような無機塩基の弱溶液（好ましくは０．２Ｍの炭酸ナトリウム、Ｎａ2ＣＯ3を使用する）を、最終的なナトリウム濃度がコポリマーのカルボキシル基の１〜２倍モル過剰、好ましくは１．２倍モル過剰になるような量加える。この溶液を室温で約１５〜６０分間、好ましくは３０分間攪拌させておき、ナトリウム塩の形成を助ける。次にこれを約５０〜３００ｍｌ／分、好ましくは約１００ｍｌ／分でジャケット付き反応器に入れる。反応器中には循環浴を用いて約１〜４℃、好ましくは２．５℃に冷却された脱イオン水が入っている。水の量はアセトンよりも２０〜３０倍体積過剰、好ましくはアセトンに対し２０：１の体積過剰である。析出中にポリマーが凝集しないように、攪拌器モーターに接続したパドルを用いて、水面に乱流を作り出すに足る速度で水を攪拌する。
【００２３】
析出が完了したら、モノマーの除去を助けるために分散物をさらに３０〜６０分間攪拌させておき、その後に遠心ボトルに入れ、遠心分離する。上清を廃棄し、ケーキを別の脱イオン水に再懸濁し、再度遠心分離して、好ましくは凍結乾燥により乾燥させる。
【００２４】
化合物（Ａ）とポリマーのイオン性複合体の製造：合成には化合物（Ａ）をコポリマーのナトリウム塩に結合させることが必要である。これを、両方が可溶な媒体、好ましくはアセトニトリル：水＝３：１（Ｗ／Ｗ）中で行い、次いで、結果として生じたイオン性複合体を脱イオン水中に析出させ、生成した水不溶性の複合体析出物を回収する。
【００２５】
化合物（Ａ）の酢酸塩の脱イオン水中溶液を、１２，０００ＭＷのＰＬＧＴＡ（７１／２８／１〜７３／２６／１）の洗浄Ｎａ塩のアセトニトリル中溶液（２４〜２６％（Ｗ／Ｗ）の範囲の溶液）に加える。これに弱塩基、好ましくは０．５ＭのＮａ2ＣＯ3を加えるが、その量は結果的にＮａが化合物（Ａ）の酢酸塩の酢酸塩含有量の約１．０５倍モル過剰になるようにする。これを約５分間攪拌させておき、アルカリ環境、好ましくはｐＨ８を提供し、化合物（Ａ）の酢酸塩基を中和する。アセトニトリル：水のおよその重量比は３：１である。必要な標的負荷量（通常約８％〜約１２％）に基づき、必要な化合物（Ａ）の量が決定される。これから、化合物（Ａ）の酢酸塩を中和するのに必要な炭酸ナトリウム水溶液の体積が決定され、最後に、所望の最終のアセトニトリル：水（加えた炭酸ナトリウムを含む）の体積比約３：１に基づいて化合物（Ａ）を溶解するための水の体積が算出される。
【００２６】
化合物（Ａ）−コポリマーの溶液を約０〜５℃、好ましくは２．５℃で約１０〜１５分間攪拌させておき、二成分間のイオン結合を促進し、共有結合を阻害する（低温の使用により）。次にこの溶液を約５０〜３００ｍｌ／分の速度で、前記アセトニトリル−水（３：１）溶液中のアセトニトリルの体積よりも約２０〜３０：１の体積過剰の脱イオン水中に入れ、表面攪拌が提供されるに足る速度で攪拌し、凝集を防止する。これを循環浴に接続したジャケット付き反応器中で約１℃〜４℃、好ましくは１．７℃に冷却する。
【００２７】
析出が完了したら、分散物をさらに３０〜６０分間攪拌させておき、水溶性の化合物（Ａ）−オリゴマー化合物の除去を補助する（オリゴマーはＰＬＧＴＡの低分子量画分であるが、水溶性のため望ましくない）。その後に遠心ボトルに入れ、遠心機中で約５０００ｒｐｍで約１５分間遠心分離する。得られた遠心分離ケーキを脱イオン水に再懸濁し、再度遠心分離する。次にこれを凍結乾燥により２日間凍結して乾燥させ、化合物（Ｉ）（ＰＬＧＴＡにイオン結合した化合物（Ａ））を回収する。負荷量は、未結合の化合物（Ａ）に関する上清のＨＰＬＣ分析と、窒素分析（化合物（Ａ）の窒素含有量はわかっており、ポリマーはいかなる窒素も含まない）によって測定される。化合物（Ａ）を化合物（Ｉ）から抽出した後にＨＰＬＣ分析をしても負荷量が測定できる。
【００２８】
化合物（Ｉ）の噴霧化：患者への注射によく適合した製剤を提供するために、化合物（Ｉ）をマイクロスフェアに製剤化する。それには、化合物（Ｉ）を酢酸エチル中に溶解し、超音波噴霧（ａ．ｋ．ａ．噴霧）を用いて溶液を約−６０℃〜−７８℃の低温エタノール、イソプロパノール、又はヘキサンとイソプロパノールの混合物、好ましくはイソプロパノール中にスプレーする。化合物（Ｉ）の溶液が冷イソプロパノールに接触すると化合物（Ｉ）のマイクロスフェアが形成される。化合物（Ｉ）／酢酸エチル溶液は０．２μｍフィルタを通すことによって滅菌できる。
【００２９】
化合物（Ｉ）を酢酸エチルに、好ましくは超音波処理／攪拌によって溶解し、約８％〜約１２％（Ｗ／Ｗ）溶液、好ましくは１２％溶液を得る。この濃度はポリマーの分子量及び化合物（Ａ）の負荷量によるが、いずれもが溶液の粘度を変え得る。これを約４．９０ｍｌ／分〜５．１０ｍｌ／分、好ましくは５．００ｍｌ／分で工業用アトマイザ又はネブライザに入れる（出力−約７０％、振幅−約８０％、周波数−約３４〜３５ｋＨｚ、好ましくは３４．５０ｋＨｚ；一般的に、ネブライザは、約８％〜約１２％（Ｗ／Ｗ）の濃度の化合物（Ｉ）／酢酸エチル溶液を（“大きな液滴を断続的に噴出”させずに）均一にスプレーできる周波数を発生させるほど強力でなくてはならない。この濃度で固体のマイクロスフェアが形成される。また、４０〜７０ミクロンの平均粒径が得られるような周波数でなくてはならない。その粒径であれば２１ゲージ又は１９ゲージ針により容易に注射できる）。そして、酢酸エチルの体積よりも２０〜３０倍、好ましくは２０倍過剰の体積のイソプロパノール（ＩＰＡ）中に噴霧する。イソプロパノールは約−６０℃〜−７８℃に冷却されている。冷却は、例えば反応器のジャケット、ドライアイスの添加、又は冷却コイルの挿入によって達成できる。そして少なくとも２００ｒｐｍで攪拌する（マイクロスフェアの凝集を防止するため）。約６℃の温度の脱イオン水を、好ましくは１．５Ｌ／分でネブライザジャケットに供給し、局所的な熱作用を除去する。局所的熱作用があると酢酸エチルの蒸発のためにネブライザの先端を汚しかねないからである。溶液を均一に噴霧するとオフホワイトの粒子分散物がＩＰＡ中に形成されるのが見える。これを約３０分〜２時間かけて約０℃〜２２℃に解凍し、その後に１２５μｍのシーブを通し（注射できない大きな滴／粒子をすべて除去するため）、Ｗｈａｔｍａｎ  ｎｏ．１のろ紙を用いて真空ろ過する。フィルタケーキをさらにＩＰＡで濯ぎ、真空乾燥する。
【００３０】
本発明を以下の実施例によって説明するが、その詳細によって本発明が制限されるものではない。
発明の実施の形態
実施例１
Ｐ（ｌ）ＬＧＴＡ（７２／２７／１）と化合物Ａのイオン性複合体
ステップＡ：３００ｇのＰ（ｌ）ＬＧ／酒石酸コポリマー（ｌ−ラクチド：グリコリド：酒石酸＝７２：２７：１）の合成
反応器に、グリコリド（Ｐｕｒａｃ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，オランダ、６８．７１ｇ）、ラクチド（Ｐｕｒａｃ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，オランダ、２２７．５３ｇ）、及びＬ（＋）−酒石酸（Ｒｉｅｄｅｌ−ｄｅ  Ｈａｅｎ，Ｓｅｅｌｚｅ、ドイツ、品番３３８０１、３．７５ｇ）の各モノマーと、２−エチルヘキサン酸第一スズ（Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス，ＵＳＡ、品番Ｓ−３２５２）のトルエン（Ｒｉｅｄｅｌ−ｄｅ  Ｈａｅｎ，Ｓｅｅｌｚｅ、ドイツ）中溶液（０．０９８２Ｍ、４．４７ｍｌ）を装入した。これは、Ｌ−ラクチド、グリコリド、及びＬ（＋）−酒石酸のモル比率がそれぞれ７１．８１％；２６．８２％；及び１．３６％に相当した。
【００３１】
Ｌ（＋）−酒石酸は、予めアブデルハルデン乾燥器中のシリカゲル（Ｒｉｅｄｅｌ−ｄｅ  Ｈａｅｎ，Ｓｅｅｌｚｅ、ドイツ）上で約１０時間乾燥させた。次に、反応器（液体窒素トラップ経由でポンプに接続されている）を真空下（０．０４ｍｂａｒ）に置き、約５０分間攪拌しながらトルエンを除去した。次に、反応器を酸素除去窒素雰囲気下（ＢＯＣ  ｇａｓｅｓ、ダブリン、アイルランド、湿分８ＶＰＭ）で、油浴（温度＝〜１８０℃）に浸け、攪拌を約１２５ｒｐｍに上げた。浸漬の前に加熱テープ（Ｔｈｅｒｍｏｌｙｎｅタイプ４５５００、入力制御設定＝４）を反応器の蓋上に置いた。反応器の内容物が完全に溶融するのに要した時間を記録した。典型的には、装荷量が約３００ｇ、約１８０℃で約１５分であった。合成中、毎時間試料を取り、ＧＰＣで分析して残存モノマーのパーセンテージを測定し、数平均分子量（Ｍｎ）分布と重量平均分子量（Ｍｗ）分布のための値を得た。典型的な反応時間は約１５時間のオーダーであった。最終ポリマーも滴定で分析して酸価をｍｅｑ／ｇで測定し、ＧＣで分析して残存未反応モノマー含有量を測定した。更なる分析は、ＩＲ（特徴的なＣ＝Ｏピークの検出）；ＮＭＲ（ポリマー中のラクチドとグリコリド含有量の測定）及び残存スズ（２−エチルヘキサン酸第一スズを触媒として使用するため、残存スズを測定）などであった。
【００３２】
ステップＢ：前記コポリマーの精製／ナトリウム塩の形成
残存モノマー（通常＜５％（Ｗ／Ｗ））を除去し、コポリマーをワンステップでそのナトリウム塩の形に転化した（イオン塩の形成を促進するため）。１２，０００ｇ／ｍｏｌの７２／２７／１ポリ−Ｌ−ラクチック−コ−グリコリック−コ−Ｌ（＋）−酒石酸コポリマー（滴定による酸価＝０．２３１ｍｅｑ／ｇ）８１．０５ｇを超音波処理浴（Ｂｒａｎｓｏｎ，Ｄａｎｂｕｒｙ，コネチカット州，ＵＳＡ）中で超音波処理により３２４．２４ｇのアセトン（Ｒｉｅｄｅｌ−ｄｅ  Ｈａｅｎ，Ｓｅｅｌｚｅ、ドイツ）に溶解し、ＰＬＧＴＡの濃度が２０．００重量％の溶液を得た。
【００３３】
この溶液に、５６．１７ｍｌの０．２ＭのＮａ2ＣＯ3（Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｇｉｌｌｉｎｇｈａｍ，Ｄｏｒｓｅｔ，ＵＫ）を加えたので、ナトリウムはコポリマーのカルボキシル基よりも１．２倍モル過剰になった。この溶液を室温で約３０分間攪拌させておき、ナトリウム塩の形成を補助した。次にこれを〜１００ｍｌ／分で８．２Ｌの脱イオン水（アセトンよりおよそ２０：１の体積過剰で、約２．５℃に冷却されている）の入った１０Ｌのジャケット付き反応器に入れた。この水は、析出中にポリマーが凝集しないように、攪拌器モーターに接続したパドルを用いて、水面に乱流を作り出すに足る速度で攪拌された。
【００３４】
析出が完了したら、モノマーの除去を助けるために分散物をさらに３０分間攪拌させておいた後遠心ボトルに入れ、５０００ｒｐｍで約１５分間、Ｓｏｒｖａｌｌ遠心機（ＤｕＰｏｎｔ  Ｓｏｒｖａｌｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、デラウェア州，ＵＳＡ）中で遠心分離した。上清を廃棄し、ケーキを別の脱イオン水に再懸濁し、再度遠心分離して、冷蔵庫（−１３℃）で一晩凍結させ、その翌日に小型の凍結乾燥器（Ｅｄｗａｒｄｓ，Ｃｒａｗｌｅｙ，ウェストサセックス州，ＵＫ）で乾燥させた。この凍結乾燥器は冷却剤を含まない。５日間の凍結乾燥後、６５．３７ｇの洗浄コポリマーを回収した。この収率は８０．６５％であった。
【００３５】
ステップＣ：化合物（Ｉ）の製造
１．２７ｇの化合物（Ａ）の酢酸塩（Ｂａｔｃｈ  ９７Ｋ−８５０１、Ｋｉｎｅｒｔｏｎ  Ｌｔｄ．，ダブリン、アイルランド、力価(potency)＝８５．８％（力価とはペプチド酢酸塩中に存在する遊離塩基ペプチドの割合のことである）；酢酸塩＝１０．８７％）の、脱イオン水５．８７ｇ中溶液を、１２，０００ＭＷのＰＬＧＴＡ（７２／２７／１）の洗浄Ｎａ塩８．０１ｇの、アセトニトリル（Ｒｉｅｄｅｌ  ｄｅ−Ｈａｅｎ）２４．８４ｇ中溶液（２４．３８％（Ｗ／Ｗ）に加えた。これに２．４１ｍｌの０．５ＭのＮａ2ＣＯ3（これは、Ｎａが化合物（Ａ）−酢酸塩の酢酸塩含有量よりも１．０５倍過剰に相当する）を加え、約５分間攪拌させておいてアルカリ環境（ｐＨ８）を提供し、化合物（Ａ）の酢酸塩基を中和した。アセトニトリル：水のおよその重量比は３：１であった。必要な標的負荷量に基づき、必要な化合物（Ａ）の量が決定された。これから、化合物（Ａ）の酢酸塩を中和するのに必要な炭酸ナトリウム水溶液の体積が決定され、最後に、所望の最終のアセトニトリル：水（加えた炭酸ナトリウムを含む）の体積比約３：１に基づいて化合物（Ａ）を溶解するための水の体積が算出された。
【００３６】
化合物（Ａ）−コポリマーの溶液を約２．５℃で約１５分間攪拌させておき、二つの間のイオン結合を促進し、共有結合を阻害した。次にこの溶液を〜１００ｍｌ／分で、６３０ｍｌ（アセトニトリルよりもおよそ２０：１の体積過剰）の脱イオン水に入れ、３５０ｒｐｍで攪拌し（表面攪拌を提供し、化合物（Ａ）−コポリマーの凝集を防止する）、循環浴に接続した６Ｌのジャケット付き反応器中で約１．７℃に冷却した。
【００３７】
析出が完了したら、分散物をさらに３０分間攪拌させておき、水溶性の化合物（Ａ）−オリゴマー化合物の除去を補助した。その後に遠心ボトルに入れ、Ｓｏｒｖａｌｌ遠心機（ＤｕＰｏｎｔ  Ｓｏｒｖａｌｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、デラウェア州，ＵＳＡ）で５０００ｒｐｍで約１５分間遠心分離した。得られた遠心分離ケーキを脱イオン水に再懸濁し、再度遠心分離した。次にこれを凍結乾燥により２日間凍結して乾燥させた。８．３０ｇの標記生成物を回収した（収率９１．３８％）。負荷量は、未結合の化合物（Ａ）に関する上清のＨＰＬＣ分析と、窒素分析（化合物（Ａ）の窒素含有量はわかっており、ポリマーはいかなる窒素も含まない）によって測定した。化合物（Ａ）を化合物（Ｉ）から抽出した後にＨＰＬＣ分析をしても負荷量が測定できる。本実施例では１１．２５％であった。
【００３８】
ステップＤ：化合物（Ｉ）の噴霧化
ステップＣの化合物（Ｉ）８．２７ｇを、超音波処理／攪拌（室温）により６０．７７ｇの酢酸エチルに溶解して１２．００％（Ｗ／Ｗ）の溶液を得た。これを５ｍｌ／分で、出力＝約７０％、振幅＝約８０％、周波数＝３４．５０ｋＨｚに設定した工業用アトマイザ／ネブライザ（Ｍａｒｔｉｎ  Ｗａｌｔｅｒ  Ｐｏｗｅｒｓｏｎｉｃ  Ｍｏｄｅｌ  ＭＷ４００ＧＳＩＰ、フランスのＳｏｄｅｖａから入手）に入れ、ジャケット付き反応器中で、約−７４±４℃に冷却（冷却は反応器ジャケットを通じて達成）された１．３５Ｌのイソプロピルアルコール（ＩＰＡ）（酢酸エチルの体積よりも２０倍体積過剰）中に噴霧し、２００ｒｐｍで攪拌した（マイクロスフェアの凝集を防止するため）。６℃の温度の脱イオン水を、１．５Ｌ／分でネブライザのジャケットに供給し、局所的な熱作用を除去した。局所的熱作用があると酢酸エチルの蒸発のためにネブライザの先端を汚しかねないからである。溶液を均一に噴霧するとオフホワイトの粒子分散物がＩＰＡ中に形成されるのが見えた。これを約３０分〜２時間かけて約０℃〜４℃に解凍し、その後に１２５μｍのシーブを通し（注射できない大きな滴／粒子をすべて除去するため）、Ｗｈａｔｍａｎ  ｎｏ．１のろ紙を用いて真空ろ過した。フィルタケーキをさらにＩＰＡで濯ぎ、真空乾燥した。６．８８ｇの注射可能材料が得られた（収率８３．１９％）。化合物（Ｉ）のマイクロ粒子の平均粒径は約５４ミクロンであった。
【００３９】
化合物（Ｉ）のマイクロ粒子からの化合物（Ａ）のインビボの放出は、以下の記載に従って試験でき、また実際に試験した。インビボ研究は、化合物（Ｉ）のマイクロ粒子を雄のビーグル犬に筋肉内投与した後の化合物（Ａ）のインビボ放出特性を、化合物（Ａ）投与後のその薬物動態特性によって評価した。
【００４０】
化合物（Ｉ）のマイクロ粒子の医薬製剤を後脚の筋肉に筋肉内投与した。化合物（Ｉ）のマイクロ粒子を含有する照射又は非照射医薬製剤の１回筋肉内投与（化合物（Ｉ）中の化合物（Ａ）の負荷量が１１．２３％という測定値に基づき、注射されたマイクロ粒子の量は化合物（Ａ）の５ｍｇに相当する）を、６匹のイヌで構成される各群にそれぞれ一製剤ずつ行った。血清試料中の化合物（Ａ）の定量と薬物動態分析は以下のように実施する。
【００４１】
イヌからの血液採取は、注射前（時間０）、５、１５、及び３０分；１、２、４、８、及び１２時間；１、２、３、及び４日；以後最初の月は週２回（例えば月曜日と木曜日）；最後に、２ヶ月目以降、化合物（Ａ）の血清中濃度が検出できなくなる実験終了までは週１回実施する。しかしながら、血液採取の実際の時間は記録して薬物動態分析に使用した。時間０（筋肉内投与前）と筋肉内注射後７、２１、３５、５６、及び８４日時点の血液試料（５ｍｌ）、及び残りの採取時間の血液試料（４ｍｌ）は、指定の時間に頚静脈又は橈側皮静脈から採取した。
【００４２】
試料は二つに分けた。一つは、所定の時間に採取された約２．５ｍｌ又は３．５ｍｌを、それぞれ５０及び８０μｌのアプロチニン溶液（１０ｍｌのＴｒａｓｙｌｏｌ（登録商標）５０００００ＫＪＵを凍結乾燥し、２ｍｌのｐ．ｐ．ｉ．水に再希釈）を含む試験管に入れ、残りの約１．５ｍｌは試験管に入れて放置した。
【００４３】
赤血球の凝固後、試験管を３００００ｒ．ｐ．ｍ．、＋４℃で２０分間遠心分離した。アプロチニンを含む血清を取り出し、二つの画分にして、試料を化合物（Ａ）について分析するまで−２０℃で保管した。
【００４４】
血清試料中の化合物（Ａ）の濃度はラジオイムノアッセイ法によって分析した。ブランクのイヌ血漿及び化合物（Ａ）の標準溶液を用いた標準曲線は毎日作製した。この方法では、イヌ血清試料中の化合物（Ａ）の定量限界は約０．０５０ナノグラム（ｎｇ）／ｍｌである。曲線下面積（ＡＵＣ）と最大血清濃度（Ｃmax）は供給された用量によってノーマライズした（各動物に投与した用量はμｇ／ｋｇで表される）。吸収率指数(index of the absorption rate)（Ｃmax／ＡＵＣ）も算出した。
【００４５】
前記実験結果を図１に示す。
化合物（Ａ）又はその医薬上許容しうる塩、化合物（Ｉ）又は化合物（Ｉ）のマイクロ粒子は、経口、非経口（例えば、筋肉内、腹腔内、静脈内もしくは皮下注射、又は移植）、鼻腔、膣、直腸、舌下又は局所の各投与経路で投与でき、各投与経路に適切な剤形にするために医薬上許容しうる担体と共に製剤化できる。
【００４６】
経口投与用の固体剤形は、カプセル、錠剤、ピル、散剤及び顆粒剤である。そのような固体剤形では、活性化合物を、少なくとも一つの不活性な医薬上許容しうる担体、例えばショ糖、ラクトース、又はデンプンと混合する。このような剤形は、普通に実践されているように、そのような不活性希釈剤以外にも追加の物質、例えばステアリン酸マグネシウムのような滑沢剤を含むこともできる。カプセル、錠剤、及びピルの場合、剤形は緩衝剤を含んでもよい。錠剤及びピルはさらに腸溶コーティングを用いて調製することもできる。
【００４７】
経口投与用の液体剤形は、医薬上許容しうるエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップ、エリキシルなどで、当該技術分野で普通に使用されている不活性希釈剤、例えば水を含む。そのような不活性希釈剤のほかにも、組成物は、湿潤剤、乳化剤及び懸濁剤、並びに甘味剤、風味剤及び香味剤などのアジュバントを含むこともできる。
【００４８】
非経口投与用の製剤は、滅菌した水性又は非水性の溶液、懸濁液、又はエマルジョンなどである。非水性溶媒又はビヒクルの例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油及びコーン油のような植物油、ゼラチン、及びオレイン酸エチルのような注射可能有機エステル類である。このような剤形は、保存剤、湿潤剤、乳化剤及び分散剤のようなアジュバントを含むこともできる。これらの滅菌は、例えば、細菌除去フィルタによるろ過、組成物への殺菌剤配合、組成物の照射、又は組成物の加熱によって行うことができる。これらはまた、固体の滅菌組成物の形態に製造することもでき、その場合、使用直前に滅菌水又はその他の滅菌された注射媒体に溶解して使用できる。
【００４９】
直腸又は膣投与用の組成物は、好ましくは坐剤で、活性物質のほかにココアバター又は坐剤用ワックスのような賦形剤を含むことができる。
鼻腔又は舌下投与用の組成物も、当該技術分野で周知の標準賦形剤と共に調製される。
【００５０】
化合物（Ｉ）のマイクロ粒子は非経口投与又は経口投与で投与されるのが好ましい。
患者に投与される化合物（Ｉ）のマイクロ粒子の有効用量は、担当の医師や獣医が決定できるが、化合物（Ａ）について考えている適正な用量と化合物（Ｉ）のマイクロ粒子中の化合物（Ａ）の負荷量に左右される。そのような用量は公知であるか、又は当業者であれば決定することができる。好ましくは、該用量は、患者の体内で少なくとも２００ピコグラム／ｍｌの化合物（Ａ）という濃度になるはずである。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、イヌにおける化合物（Ｉ）の試料からの化合物（Ａ）のインビボ放出特性を示す図である。化合物（Ｉ）の試料は、約１１．２５％の化合物（Ａ）からなり、ポリマーはｌ−ラクチド：グリコリド：酒石酸（７２：２７：１）であり、化合物（Ｉ）はマイクロ粒子として筋肉内投与される。照射サンプルは、コバルト源からのγ線で照射された化合物（Ｉ）の試料のことである。
【図１】
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