(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＴＰ（アデノシン三リン酸）をルシフェラーゼ及び溶存酸素の存在下でルシフェリンと反応させてＡＭＰ（アデノシン一リン酸）及び発光を生成せしめ、生成した発光量を測定することによりアデニンヌクレオチドを検査する方法において、
検体中のＡＴＰを、ルシフェラーゼ及び溶存酸素の存在下でルシフェリンと反応させてＡＭＰ及び発光を生成せしめる第１反応と、
該第１反応で生成したＡＭＰを、リン酸基転移酵素であるＡＰＰ（ＡＭＰ−polyPホスホトランスフェラーゼ）の存在下で、化学合成により生成されたポリリン酸化合物であってリン酸基数nが１０〜１００個直鎖状に重合したポリリン酸（polyＰn；ｎ＝１０〜１００）又はバクテリア由来のポリリン酸化合物であってリン酸基数nが１０〜１０００個直鎖状に重合したポリリン酸（polyＰn；n＝１０〜１０００）と反応させてＡＤＰ（アデノシン二リン酸）を生成させる第２反応と、
該第２反応で生成したＡＤＰを、ポリリン酸合成酵素であるＰＰＫの存在下で、前記ポリリン酸と反応させてＡＴＰを生成させる第３反応と、からなり、
前記第１反応から第３反応を繰り返し実行させることにより、前記第１反応によって消耗したＡＴＰを前記第２反応及び第３反応によって再生させ、前記第１反応による発光量を持続させて該発光量を計測することを特徴とする生物発光によるアデニンヌクレオチドの検査方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明は、動植物の代謝・成合成系において生成される、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）又はそれらの混合物など、いわゆるアデニンヌクレオチドの検査方法に関するもので、例えば、生物発光によりＡＴＰを測定し、食品工場などで目に見えない微生物を検出して清浄度を検査したり、食肉、鮮魚、野菜など食物の鮮度を測定することに応用できるものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来、汚れの指標成分であるＡＴＰと、触媒となる酵素（例えば、ホタルルシフェラーゼ）とを反応させると、蛍光発光することが知られている。
【化１】
0003864026.tif 000002
【０００３】
しかしながら、上記蛍光発光の測定では、発光の安定性が悪く、発光が非常に短時間に消失するという欠点を有しており、感度と精度を獲得するため、反応時間の厳密な制御と、短時間で消失する発光を捕らえるための特別なルミノメータの使用を必要とする問題点がある。
【０００４】
そこで、特開平8-47399号公報には、「ルシフェラーゼにより発生する生物発光を測定する方法において、ポリリン酸化合物又はその塩、及びスルフヒドリル化合物の共存下で生物発光反応を行う」ことを特徴とする技術が開示されている。これにより、生物発光の増強という新規な効果を得られ、一般的なルミノメータの使用により生物発光反応の測定が可能で、普及率が高まるという効果がある。特開平8-47399号でのポリリン酸化合物とは３個程度のリン化物（ＭＩ３Ｐ）が結合した化合物である。
【０００５】
しかしながら、上記特開平8-47399に開示される方法は、ＡＴＰの再生系がないため、ＡＴＰが消費されるに従い、経時的に発光が減衰する欠点を有する。従って、発光量をそのまま減衰することがなく安定に持続することは不可能である。
【０００６】
ところで、本出願人らは特願2000-7332号によって、以下の反応式で示される生物発光によるアデニンヌクレオチドの検査方法を提案している。
【化２】
0003864026.tif 000003
【０００７】
この検査方法は、ＡＴＰをルシフェラーゼ及び溶存酸素の存在下でルシフェリンと反応させてＡＭＰ及び発光を生成せしめる反応（１）及び反応（２）において、生成したＡＭＰからＡＴＰを新たに再生する系として、汚れ由来ＡＴＰ（５）と生成したＡＭＰとをアデニレートキナーゼ（ＡＤＫ）の存在下で反応させてＡＤＰに変換せしめる反応（３）と、この生成したＡＤＰをポリリン酸キナーゼ（ＰＰＫ）の存在下でポリリン酸化合物（polyPn）反応させて、ＡＴＰ及びポリリン酸化合物（polyPn-1）に変換せしめる反応（４）とを備えたことを特徴としている。つまり、反応（１）において、発光する際に生じるＡＭＰがＡＴＰまで再生されることにより、発光量の減衰を抑制することができる。すなわち、発光時間を持続させることにより、アデニンヌクレオチドの検出感度を向上させて、食品工場などで目に見えない微生物を検出して清浄度を検査したり、食肉、鮮魚、野菜など食物の鮮度を測定することに応用できるものである。
【０００８】
また、このとき予め反応系にＡＭＰを存在させておくことによって、少量のＡＴＰから膨大な光を生じさせることもできる。すなわち、予め存在するＡＭＰだけでは、ＡＴＰは生じないが、少量のＡＴＰが反応系に添加されるとすぐにＡＭＰとＡＴＰが反応し、２分子のＡＤＰに変換され、さらにＡＴＰまで変換される。少量のＡＴＰが引き金になって、このＡＴＰの増幅ともいうべき反応が何度も繰り返し起こることにより、多量のＡＴＰが生じるのである。ここで初めてルシフェラーゼを添加し、この多量のＡＴＰを生物発光により検出することによって、簡便ではあるが、非常に感度の悪い検出器によっても、アデニンヌクレオチドの検出感度を向上させて、食品工場などで目に見えない微生物を検出して清浄度を検査したり、食肉、鮮魚、野菜など食物の鮮度を測定することに応用できるものである。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、さらに少量のアデニンヌクレオチドの検出を安定に行うためには、克服しなければならない問題があった。
【００１０】
すなわち、反応（３）において、ＡＭＰからＡＤＰに変換する際、アデニレートキナーゼ（ＡＤＫ）及び測定に供されるべき少量の汚れ由来ＡＴＰを使用して、２分子のＡＤＰが生成される。そして、反応（４）において、生成された２分子のＡＤＰからポリリン酸キナーゼ（ＰＰＫ）によって２分子のＡＴＰが生成される。従って、上記反応系では、測定に供されるべき汚れ由来ＡＴＰが、測定用（反応（１））と再生系（反応（３）及び反応（５））との両方に寄与するから、極端に希薄なＡＴＰを測定しようとする場合は以下の問題点があった。
【００１１】
つまり、ＡＴＰの量が最初に十分に存在する場合は、蛍光発光の安定性がよく、発光が長時間継続して問題はないが、極端に希薄なＡＴＰを測定しようとすると、最初の再生系の反応（反応（５）及び反応（３））がうまくいかず（希薄なＡＴＰと希薄なＡＭＰでは出会う確率が低く、反応が起こりにくい）、蛍光発光の安定性が悪く、発光が非常に短時間に消失する虞（おそれ）がある。
【００１２】
本発明は、上記問題点にかんがみ、極端に希薄なＡＴＰをも検出できるように、再生系に汚れ由来ＡＴＰを全く使用することなく、新規なＡＴＰ再生系を組み入れた生物発光によるアデニンヌクレオチドの検査方法を提供することを技術的課題とする。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するため本発明は、ＡＴＰ（アデノシン三リン酸）をルシフェラーゼ及び溶存酸素の存在下でルシフェリンと反応させてＡＭＰ（アデノシン一リン酸）及び発光を生成せしめ、生成した発光量を測定することによりアデニンヌクレオチドを検査する方法において、検体中のＡＴＰを、ルシフェラーゼ及び溶存酸素の存在下でルシフェリンと反応させてＡＭＰ及び発光を生成せしめる第１反応と、該第１反応で生成したＡＭＰを、リン酸基転移酵素であるＡＰＰ（ＡＭＰ−polyPホスホトランスフェラーゼ）の存在下で、化学合成により生成されたポリリン酸化合物であってリン酸基数nが１０〜１００個直鎖状に重合したポリリン酸（polyＰn；n＝１０〜１００）又はバクテリア由来のポリリン酸化合物であってリン酸基数nが１０〜１０００個直鎖状に重合したポリリン酸（polyＰn；n＝１０〜１０００）と反応させてＡＤＰ（アデノシン二リン酸）を生成させる第２反応と、該第２反応で生成したＡＤＰを、ポリリン酸合成酵素であるＰＰＫの存在下で、前記ポリリン酸と反応させてＡＴＰを生成させる第３反応と、からなり、前記第１反応から第３反応を繰り返し実行させることにより、前記第１反応によって消耗したＡＴＰを前記第２反応及び第３反応によって再生させ、前記第１反応による発光量を持続させて該発光量を計測するようにしたものである。
【００１４】
これにより、ＡＭＰからＡＴＰに変換せしめる再生反応系において、汚れ由来ＡＴＰを使用することなくＡＭＰからＡＤＰを経てＡＴＰに変換せしめるので、極端に希薄なＡＴＰ濃度であっても、ＡＴＰ量に依存せず、ポリリン酸化合物のリン酸基（ＰＯ３基）の量に依存して生物発光の光量の増強と発光時間の持続効果が得られるから、アデニンヌクレオチドの検出感度を向上させて、食品工場などで目に見えない微生物を検出して清浄度を検査したり、食肉、鮮魚、野菜など食物の鮮度を測定することができる。さらに、汚れの指標成分であるＡＴＰに加え、ＡＭＰ又はＡＤＰを測定することもできる。
【００１５】
また、前記ポリリン酸化合物は、化学合成により生成されたポリリン酸化合物の場合には、少なくとも１０〜１００個のリン酸基が直鎖状に重合したものを用いるとよい。これにより、ポリリン酸化合物の１分子中にリン酸基（ＰＯ３基）が少なくとも１０〜１００個含まれているので、ＡＤＰからＡＴＰへの変換が容易に行われ、ＡＴＰを再生する際の補給が少量となり経済的になる。さらに、ポリリン酸化合物が熱にさらされた場合であっても、リン酸基（ＰＯ３基）が直鎖状に重合しているので、耐熱性があり、品温が摂氏６０〜７０℃程度の被検査物に対しても測定が可能となる。そして、リン酸基（ＰＯ３基）が直鎖状に重合しているため、細菌中に存在する酵素によっても分解されにくい。
【００１６】
そして、前記ポリリン酸化合物は、バクテリア由来のポリリン酸化合物の場合には、少なくとも１０〜１０００個のリン酸基が直鎖状に重合したものを用いると、少なくとも１０〜１０００個のリン酸基が直鎖状に重合しているので、耐熱性、耐菌性が向上する。
【００１７】
さらに、前記ポリリン酸化合物は、ポリリン酸合成酵素の触媒作用により、ＡＴＰから生合成すれば、ポリリン酸化合物の収率を向上して、ポリリン酸化合物を安価に生成することが可能となる。
【００１８】
【発明の実施の形態】
本発明の実施の形態を説明する。まず、本発明の生物発光反応の測定法は次の反応式で表される。
【化３】
0003864026.tif 000004
【００１９】
上記反応において、（１）のようにＡＴＰ、ルシフェリン、溶存酸素（図示せず）及び酵素の失活抑制を目的としたマグネシウムイオンなど金属イオン（図示せず）に、ルシフェラーゼを作用させると、ＡＭＰ、ピロリン酸、オキシルシフェリン、炭酸ガス（図示せず）及び光を生成する第１反応（２）が行われ、このルシフェラーゼにより発生する光を測定することで、汚れの指標成分であるＡＴＰを検出し、食品工場などの清浄度判定をすることができる。
【００２０】
次に、生成したＡＭＰからＡＴＰへの新たな再生系であるが、生成したＡＭＰを、AMP−polyPホスホトランスフェラーゼ（リン酸基転移酵素：ＡＰＰ）の存在下でポリリン酸化合物（polyPn）と反応させてＡＤＰに変換せしめる第２反応（３）と、生成したＡＤＰを、ポリリン酸キナーゼ（ＰＰＫ）の存在下で前記ポリリン酸化合物（polyPn−１）と反応させて、ＡＴＰ及びポリリン酸化合物（polyPn-２）に変換せしめる第３反応（４）とからなる。
【００２１】
この反応の要点について以下に述べる。まず、反応（１）によりＡＴＰが消費されて、発光し、反応（２）でＡＭＰが生成するが、このＡＭＰは反応（３）によりＡＤＰに変換された後、反応（４）ではＡＤＰがＡＴＰに再生される。そして、このＡＴＰは再び反応（１）に供され、ＡＴＰが消費されて発光する。以下、ＡＴＰの消費系となる反応（１）（２）と、ＡＴＰの再生系となる反応（３）（４）とが同時に連続的に繰り返し行われる。このＡＴＰの再生系においては、汚れ由来ＡＴＰを使用することなくＡＭＰからＡＤＰを経てＡＴＰに変換せしめるので、極端に希薄なＡＴＰ濃度であっても、ＡＴＰ量に依存せず、ポリリン酸化合物のリン酸基（ＰＯ３基）の量に依存して生物発光の発光時間の持続効果が得られる。
【００２２】
ところで、前記ＡＭＰからＡＤＰに再生する第２反応（３）においては、AMP−polyPホスホトランスフェラーゼ（リン酸基転移酵素：ＡＰＰ）の存在下で、ポリリン酸化合物（polyPn）を前記ＡＭＰと反応させると、ポリリン酸化合物からリン酸基（ＰＯ３基）が１個消費されて、ＡＤＰ及びポリリン酸化合物（polyPn-1）に変換される。そして、前記ＡＤＰからＡＴＰに再生する第３反応（４）においては、ポリリン酸キナーゼ（ＰＰＫ）の存在下で、ポリリン酸化合物（polyPn−１）と前記ＡＤＰとを反応させると、ポリリン酸化合物（polyPn-1）からリン化物（ＭＩ３Ｐ）がさらに１個消費されて、ＡＴＰ及びポリリン酸化合物（polyPn-２）に変換される。このとき、ポリリン酸化合物としては、化学合成により生成されたポリリン酸化合物の場合には、少なくとも１０以上のリン酸基（ＰＯ３基）が直鎖状に重合したものでなければ、反応に寄与しない。
【００２３】
つまり、ポリリン酸化合物（polyPn）として１０≦ｎ≦１００のものを用いると、１分子中にリン化物（ＭＩ３Ｐ）が少なくとも１０〜１００個含まれているから、ＡＭＰからＡＤＰへの変換、及びＡＤＰからＡＴＰへの変換の際に、リン酸基（ＰＯ３基）が不足することがなく変換がスムーズに行われる。このため、再生系においては、リン酸基（ＰＯ３基）の供給が少量でよく、経済的になる。
【００２４】
さらに、ポリリン酸化合物が熱にさらされた場合であっても、リン酸基（ＰＯ３基）が直鎖状に重合しているので、耐熱性があり、品温が摂氏６０〜７０℃程度の被検査物に対しても測定が可能となる。そして、リン酸基（ＰＯ３基）が直鎖状に重合しているため、細菌中に存在する酵素であっても分解されにくい。
【００２５】
例えば、本発明で用いられるポリリン酸化合物（polyPn）は、以下の構造式によって表される。ここで（polyPn）は１０≦ｎ≦１００の範囲が好ましい。
【化４】
0003864026.tif 000005
【００２６】
前記ポリリン酸化合物は、バクテリア由来のポリリン酸化合物の場合には、少なくとも１０〜１０００個のリン化物が直鎖状に重合したものを用いると、１０〜１０００個のリン酸基（ＰＯ３基）が重合しているので、耐熱性、耐菌性が向上する。
【００２７】
ポリリン酸合成酵素の触媒作用により、ＡＴＰから生合成すれば、ポリリン酸化合物の収率を向上して、ポリリン酸化合物を安価に生成することが可能となる。例えば、以下の反応式に示すようにポリリン酸化合物を、ＡＴＰから生合成する。
【化５】
0003864026.tif 000006
【００２８】
上記反応式によるポリリン酸化合物の生合成は、例えば、特開平5-153993号公報などに開示された従来のポリリン酸の製造方法を利用すればよい。本実施形態では、ポリリン酸合成酵素を触媒として、ポリリン酸合成酵素とＡＴＰと酵素の失活抑制を目的としたマグネシウムなどの金属イオンとを反応させ、ポリリン酸化合物を生合成する。本実施形態に使用されるポリリン酸合成酵素はポリリン酸化合物を生合成し得るものであればよい。
【００２９】
なお、本実施の形態においては、ＡＴＰの検査方法を主として述べたが、これに限定されることはなく、ＡＤＰ、ＡＭＰ又はそれらの混合物など、いわゆるアデニンヌクレオチドの検査方法に応用されるものである。これにより、食肉、鮮魚、野菜など食物の鮮度を測定することにも応用することができる。
【００３０】
【実施例１】
ポリリン酸によるＡＴＰの再生反応に際し、ポリリン酸キナーゼ（ＰＰＫ）及びAMP−polyP ホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＰ）の２つの酵素を使用することで、ＡＴＰの再生反応にどのように寄与するかを実験した。
【００３１】
I．供試材料
（イ）ポリリン酸キナーゼ緩衝液（ＰＰＫbuffer）３μｌ
（ロ）0.1mM（濃度）アデノシン１リン酸（ＡＭＰ）３μｌ
（ハ）30 mM（濃度）ポリリン酸化合物（PolyP）３μｌ
（ニ）イオン交換水１９μｌ
（ホ）ポリリン酸キナーゼ（ＰＰＫ）１μｌ
（へ）AMP−polyP ホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＰ）１μｌ
合計 ３０μｌ（容量）
上記（イ）〜（へ）の供試材料を、温度３０℃の条件でインキュベートし、反応後５分、１５分、６０分に１０μｌずつサンプリングを行った。そして、１０μｌルシフェリン及び５μｌルシフェラーゼを添加済みの測定用ウェルに全量を添加し、生成する発光量をルミノメータ（ＡＲＶＯ社製）にて測定した。
【００３２】
発光量からそれぞれの経過時間におけるＡＴＰ容量を知ることが可能であり、これを図１に示す。これにより、反応後５分、１５分、６０分と時間を経るとともにＡＴＰ容量が増加していることが分かる。この実験からポリリン酸キナーゼ（ＰＰＫ）及びAMP−polyP ホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＰ）の２つの酵素によりＡＭＰからＡＴＰを生成することができることが示された。従って、これらの反応はＡＴＰ再生系として使うことが可能であるとともに、ＡＭＰを生物発光により検出することも可能であることが分かった。
【００３３】
【実施例２】
ポリリン酸によるＡＴＰの再生反応系あり（本発明）と、ＡＴＰの再生反応系なし（従来技術）とを比較するため、以下の条件で発光の経時的変化を調べた。
【００３４】
I．ポリリン酸によるＡＴＰの再生反応系ありの場合
（イ）ポリリン酸キナーゼ緩衝液（ＰＰＫbuffer）３μｌ
（ロ）0.1mM（濃度）アデノシン１リン酸（ＡＭＰ）３μｌ
（ハ）30 mM（濃度）ポリリン酸化合物（PolyP）３μｌ
（ニ）イオン交換水１９μｌ
（ホ）ポリリン酸キナーゼ（ＰＰＫ）１μｌ
（へ）AMP−polyP ホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＰ）１μｌ
合計 ３０μｌ（容量）
【００３５】
IＩ．ＡＴＰの再生反応系なし（コントロール）の場合
（ト）1.65μＭ（濃度）アデノシン３リン酸（ＡＴＰ）３μｌ
（チ）イオン交換水２７μｌ
合計 ３０μｌ（容量）
【００３６】
上記（イ）〜（へ）の再生反応系ありの試料と、上記（ト）〜（チ）の再生反応系なしの試料とを、それぞれ温度３０℃の条件の下、２０分間インキュベートし、それぞれ１０μｌルシフェリン及び５μｌルシフェラーゼを添加済みの測定用ウェルに全量を添加した。そして、生成する発光量をルミノメータ（ＡＲＶＯ社製）にて測定し、発光の経時的変化を調べた。発光量の測定は、反応開始後１４分間にわたって、反応直後、６分経過後、１３分経過後の発光量を測定する方法により行った。
【００３７】
上記I．の結果及びIＩ．の結果を図２に示す。この結果から、ＡＴＰの再生反応なしの場合、反応直後ピークに達した発光量が、６分経過後には６分の１以下に減少し、以下、経時的に徐々に減少する。従って、従来の測定法では精巧なルミノメータが必要となることが分かる。これに対し、ポリリン酸によるＡＴＰの再生反応系ありの場合、反応直後ピークに達した発光量が、６分経過後は発光量の減衰が抑えられ、高水準のまま安定していることが分かる。従って、本発明では、精巧なルミノメータを用いれば、わずかな量のＡＴＰでも検出することができ、食品検査、衛生検査の精度を向上することが可能である。一方、食品検査、衛生検査において、従来のＡＴＰの検出範囲内で基準を満たしてあれば、高価な高精度ルミノメータを使用するのではなく、安価でかつ簡単なルミノメータによりＡＴＰを検出することができる。
【００３８】
また、例えば、濃度が１００nＭ以上の高濃度のＡＴＰを測定する場合、従来の特願2000-7332であっても、ＡＴＰが豊富に存在して発光量が強く測定に影響を受けることがないが、例えば、濃度が１００ｎＭ以下の極端に希薄なＡＴＰを測定しようとする場合、本発明のようにＡＴＰ濃度に左右されずに再生系が安定的に働く検査方法のほうが適している。
【００３９】
【発明の効果】
以上のように本発明によれば、生成したＡＭＰを、リン酸基転移酵素（AMP-PolyPホスホトランスフェラーゼ：ＡＰＰ）の存在下でポリリン酸化合物と反応させてＡＤＰを生成させる反応と、ポリリン酸合成酵素の存在下で、前記ＡＤＰをポリリン酸化合物と反応させてＡＴＰを生成させる反応とからなるＡＴＰの再生反応系を備えるので、ＡＭＰからＡＴＰに変換せしめる再生反応系において、汚れ由来ＡＴＰを使用することなくＡＭＰからＡＤＰを経てＡＴＰに変換せしめるので、極端に希薄なＡＴＰ濃度であってもＡＴＰ量に依存せず、ポリリン酸化合物のリン酸基（ＰＯ３基）の量に依存して生物発光の光量の増強と発光時間の持続効果が得られるから、アデニンヌクレオチドの検出感度を向上させて、食品工場などで目に見えない微生物を検出して清浄度を検査したり、食肉、鮮魚、野菜など食物の鮮度を測定することができる。本発明は、予めＡＭＰを存在させておいてＡＴＰを合成するＡＴＰの増幅（特願2000-7332）には使えない。しかし、極微量のアデニンヌクレオチドに対して、連続した生物発光の光量を得ることができる。
【００４０】
また、前記ポリリン酸化合物は、化学合成により生成されたポリリン酸化合物であって、少なくとも１０〜１００個のリン化物が直鎖状に重合したものを用いるとよい。これにより、ポリリン酸化合物の１分子中にリン酸基（ＰＯ３基）が少なくとも１０〜１００個含まれているので、ＡＤＰからＡＴＰへの変換が容易に行われ、ＡＴＰを再生する際の補給が少量となり経済的になる。さらに、ポリリン酸化合物が熱にさらされた場合であっても、リン酸基（ＰＯ３基）が直鎖状に重合しているので、耐熱性があり、品温が摂氏６０〜７０℃程度の被検査物に対しても測定が可能となる。そして、リン酸基（ＰＯ３基）が直鎖状に重合しているため、細菌中に存在する酵素によっても分解されにくい。
【００４１】
そして、前記ポリリン酸化合物は、バクテリア由来のポリリン酸化合物であって、少なくとも１０〜１０００個のリン酸基が直鎖状に重合したものを用いると、少なくとも１０〜１０００個のリン酸基（ＰＯ３基）が直鎖状に重合しているので、耐熱性、耐菌性が向上する。
【００４２】
さらに、前記ポリリン酸化合物は、ポリリン酸合成酵素の触媒作用により、ＡＴＰから生合成すれば、ポリリン酸化合物の収率を向上して、ポリリン酸化合物を安価に生成することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＡＴＰ再生の経過時間におけるＡＴＰ容量変化を示す
【図２】本発明と従来のものとの相対発光量の経時的変化を示す。
【図１】
0003864026.tif 000007
【図２】
0003864026.tif 000008