(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
微量のＡＴＰ（アデノシン三リン酸）の検出可能なＡＴＰの検出方法であって、
微量のＡＴＰの存在下に、ＡＭＰ（アデノシン一リン酸）、ＡＤＫ（アデニレートキナーゼ）、化学合成により生成されたポリリン酸化合物であってリン酸基数nが１０〜１００個直鎖状に重合したポリリン酸（polyＰn；n＝１０〜１００）又はバクテリア由来のポリリン酸化合物であってリン酸基数nが１０〜１０００個直鎖状に重合したポリリン酸（polyＰn；n＝１０〜１０００）、及びＰＰＫ（ポリリン酸キナーゼ）を混合し、前記ＡＭＰを、前記ＡＤＫの存在下で前記ＡＴＰと反応させて２分子のＡＤＰ（アデノシンニリン酸）に変換せしめる第１の反応と、
該２分子のＡＤＰを、前記ＰＰＫの存在下で前記ポリリン酸化合物と反応させて２分子のＡＴＰとリン酸基数の減少したポリリン酸化合物に変換せしめる第２の反応と、を一対の反応系となし、
該一対の反応系を複数回実行させることにより、その反応回数に応じて２のべき乗でＡＴＰを増加させ、
該増加したＡＴＰを、ルシフェラーゼ及び溶存酸素の存在下でルシフェリンと反応させて発光を生成させ、
該生成した発光量を測定することによりＡＴＰを検出することを特徴とするＡＴＰの検出方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明は、動植物の代謝・生合成系において生成されるＡＴＰの量を、連鎖的に増加させ、増加したＡＴＰを生物発光によって検出することにより、従来検出できなかった極微量のＡＴＰの検出を可能になすものであり、食品工場などで目に見えない微生物を検出して清浄度を検査したり、食肉、鮮魚、野菜など食物の鮮度を測定することに応用できるものである。
【０００２】
【従来の技術】
ＡＴＰは生きた生物の指標である。従って、微生物由来のＡＴＰを生物発光に供することによって、光を指標にした微生物の衛生検査が行われている。（例えば、特公平6-34757,登録第1911659号）しかし、微量の微生物の場合にはＡＴＰに由来する生物発光が十分に行われない。
【０００３】
そこで、特開平8-47399号公報には、「ルシフェラーゼにより発生する生物発光を測定する方法において、ポリリン酸化合物又はその塩、及びスルフヒドリル化合物の共存下で生物発光反応を行う」ことを特徴とする技術が開示されている。これにより、生物発光の増強という新規な効果を得られ、一般的なルミノメータの使用により生物発光反応の測定が可能で、普及率が高まるという効果がある。
【０００４】
しかしながら、上記特開平8-47399に開示される方法は、生物発光の安定の技術であって、ＡＴＰ量を増加させる技術ではなく、ＡＴＰが消費されるに従い、経時的に発光が減衰する欠点を有する。
【０００５】
また、特開平9-234099号には、以下の反応式で示される生物発光法によるサイクリックＡＭＰの定量法が開示されている。
【化１】
0003864033.tif 000002
【０００６】
この方法は、サイクリックＡＭＰをサイクリック３’,５’−ヌクレオチドホスホジエステラ−ゼで加水分解して反応系にＡＭＰを生成せしめる（反応１）と、マグネシウムイオン、微量のＡＴＰの存在下に、該ＡＭＰをアデニレートキナーゼと反応させてＡＤＰに変換せしめる（反応２）と、マグネシウムイオン、ホスホエノールピルビン酸の存在下で、該ＡＤＰをピルビン酸キナーゼと反応させて、ＡＴＰ及びピルビン酸に変換せしめる（反応３）と、ルシフェリン、マグネシウムイオン（又は他の金属イオン）及び溶存酸素の存在下で、ＡＴＰをルシフェラーゼと反応させ発光を生成せしめる（反応４）と、（反応４）で生成した発光量を測定することによりサイクリックＡＭＰを定量する方法（METHODSIN ENZYMOLOGY 38,62-65;1974）を特徴としている。
【０００７】
しかしながら、この方法は、サイクリックＡＭＰから変換されたＡＭＰを、ＡＤＰに変換し、さらに該ＡＤＰをホスホエノールピルビン酸の存在下でピルビン酸キナーゼの反応によりＡＴＰとしてＡＴＰのリサイクルが行われるが、ＡＴＰ量が増加しているわけではない。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記従来技術の問題点を解決し、極微量のＡＴＰでも検出可能になすことを目的とするもので、従来法とは全く異なる観点でＡＴＰ量を連鎖的に増加させる新規な方法を提案するとともに、該方法で増加されたＡＴＰを生物発光により検出することによって、従来検出できなかった極微量のＡＴＰの検出を可能とする新規な方法を提供することを目的とするものである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するため本発明は、微量のＡＴＰ（アデノシン三リン酸）の検出可能なＡＴＰの検出方法であって、微量のＡＴＰの存在下に、ＡＭＰ（アデノシン一リン酸）、ＡＤＫ（アデニレートキナーゼ）、化学合成により生成されたポリリン酸化合物であってリン酸基数nが１０〜１００個直鎖状に重合したポリリン酸（polyＰn；n＝１０〜１００）又はバクテリア由来のポリリン酸化合物であってリン酸基数nが１０〜１０００個直鎖状に重合したポリリン酸（polyＰn；n＝１０〜１０００）、及びＰＰＫ（ポリリン酸キナーゼ）を混合し、前記ＡＭＰを、前記ＡＤＫの存在下で前記ＡＴＰと反応させて２分子のＡＤＰ（アデノシンニリン酸）に変換せしめる第１の反応と、該２分子のＡＤＰを、前記ＰＰＫの存在下で前記ポリリン酸化合物と反応させて２分子のＡＴＰとリン酸基数の減少したポリリン酸化合物に変換せしめる第２の反応と、を一対の反応系となし、該一対の反応系を複数回実行させることにより、その反応回数に応じて２のべき乗でＡＴＰを増加させ、該増加したＡＴＰを、ルシフェラーゼ及び溶存酸素の存在下でルシフェリンと反応させて発光を生成させ、該生成した発光量を測定することによりＡＴＰを検出する、という技術的手段を講じた。
【００１０】
反応系の１回目の反応において、ＡＤＫ（アデニレートキナーゼ）によって微量のＡＴＰとＡＭＰが直ちに反応し、２分子のＡＤＰに変換される（第１の反応）。次いで、該２分子のＡＤＰはＰＰＫ（ポリリン酸キナーゼ）によってポリリン酸（リン酸基数；n）と反応し、２分子のＡＴＰとリン酸基数nが２つ減少したポリリン酸（リン酸基数；n-2）に変換される（第２の反応）。そして、反応系の２回目の反応に移るが、このとき、反応系１回目で生じた前記２分子のＡＴＰが２分子のＡＭＰと反応し、４分子のＡＤＰに変換される（第１の反応）。次いで、該４分子のＡＤＰはＰＰＫの存在下で前記ポリリン酸（リン酸基数；n-2）と反応し、４分子のＡＴＰとポリリン酸（リン酸基数；n-6）に変換される（第２の反応）。以下、反応系の３回目、反応系の４回目、反応系の５回目…と複数回繰り返されることによりＡＴＰが増加する。この反応は、反応系の１回目に存在する微量のＡＴＰが引き金になり、以降、連鎖的に起こり、ＡＭＰとポリリン酸が存在する限り長時間継続し、反応系の反応回数に応じて２のべき乗でＡＴＰが増加することになる。
【００１１】
また、前記ポリリン酸化合物として化学合成により生成されたポリリン酸化合物を用いる場合には、１０〜１００個のリン酸基（ＰＯ３基）が直鎖状に重合したものを用いるとよい。ポリリン酸化合物（PolyPn）とはn個のリン酸基が直鎖状につながったものである。ポリリン酸化合物の１分子中にはリン酸基が少なくとも１０〜１００個つながっているので、請求項１の第２の反応におけるＡＤＰからＡＴＰへの変換が容易に行われ、ＡＴＰを増加させる際のリン酸基の補給が少量となり経済的になる。また、多数のリン酸基の存在により反応系の反応時間が継続する。
【００１２】
さらに、前記ポリリン酸化合物としてバクテリア由来のポリリン酸化合物を用いる場合には、少なくとも１０〜１０００個のリン酸基が直鎖状に重合したものを用いるとよい。ポリリン酸化合物の１分子中にリン酸基が少なくとも１０〜１０００個つながっているので、ＡＤＰからＡＴＰへの変換がさらに容易に行われ、リン酸基の補給が少量となり経済的となる。また、多数のリン酸基により反応系の反応時間が長時間継続する。
【００１３】
そして、前記ポリリン酸化合物は、ポリリン酸合成酵素の触媒作用により、ＡＴＰから生合成すれば、ポリリン酸化合物の収率を向上して、ポリリン酸化合物を安価に生成することが可能となる。
【００１４】
ＡＴＰを連鎖的に増幅させる方法により極微量のＡＴＰを増幅させ、ルシフェラーゼ及び溶存酸素の存在下でルシフェリンと反応させてＡＭＰ及び発光を生成せしめ、生成した発光量を測定すると、増加した分のＡＴＰに相当する光量が得られるため、従来検出できなかった極微量のＡＴＰが検出できるようになる。原理的には、最初の反応系に存在する一分子のＡＴＰをも検出できるものである。
【００１５】
【発明の実施の形態】
本発明の実施の形態を説明する。以下に本発明の理論的な反応式を示す。
【化２】
0003864033.tif 000003
【００１６】
反応の触媒となるアデニレートキナーゼ（ＡＤＫ）は、アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）とアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）とを反応させたとき、２分子のアデノシン二リン酸(ＡＤＰ)を生じさせる酵素である。また、ポリリン酸キナーゼ（ＰＰＫ）は、ＡＤＰとポリリン酸（PolyP）とを反応させ、ＡＴＰとポリリン酸（PolyPn-2）とに変換する酵素である。
【００１７】
本発明では、ＡＤＫの存在下で、微量のＡＴＰをＡＭＰと反応させて２分子のＡＤＰに変換せしめる第１の反応（１式）と、ＰＰＫの存在下で、該２分子のＡＤＰをポリリン酸化合物（リン酸基数；ｎ）と反応させて２分子のＡＴＰとリン酸基数ｎが２個減少したポリリン酸化合物（リン酸数；ｎ−２）に変換せしめる第２の反応（２式）とを一対の反応系となし、該一対の反応系を複数回繰り返して行うことにより、その反応回数に応じて２のべき乗でＡＴＰを増幅させるのである。
【００１８】
これにより、反応系の１回目の反応において、ＡＤＫの触媒作用によってＡＴＰとＡＭＰとが直ちに反応し、２分子のＡＤＰに変換される（式１）。次いで、該２分子のＡＤＰは、ＰＰＫの触媒作用によってポリリン酸（リン酸基数；ｎ）と反応し、２分子のＡＴＰとリン酸基数ｎが2個減少したポリリン酸（リン酸基数；ｎ−２）に変換される（式２）。そして、反応系の２回目の反応に移るが、このとき、反応系１回目で生じた前記２分子のＡＴＰがＡＤＫの存在下で２分子のＡＭＰと反応し、４分子のＡＤＰに変換される（式３）。次いで、該４分子のＡＤＰはＰＰＫの存在下でポリリン酸（リン酸基数；ｎ−２）と反応し、４分子のＡＴＰとポリリン酸（リン酸基数；ｎ−６）に変換される（式４）。以下、反応系の３回目、反応系の４回目、反応系の５回目…と複数回繰り返されることによりＡＴＰが増加する。この反応は、反応系の１回目に存在する微量のＡＴＰが引き金になり、以降、連鎖的に起こり、ＡＭＰとポリリン酸が存在する限り長時間継続し、反応系の反応回数に応じて２のべき乗でＡＴＰが増加することになる。
【００１９】
ポリリン酸（PolyPｎ）とはｎ個のリン酸基がつながったもので、例えば、化学合成されたポリリン酸は１００個ほどのリン酸基がつながったものである。また、バクテリアから取り出したものは１０００個近いリン酸基がつながったものである。
【００２０】
例えば、本発明で用いられるポリリン酸化合物（PolyPn）は、以下の構造式によって表される。ここで、（PolyPn）は１０≦ｎ≦１０００の範囲が好ましい。
【化３】
0003864033.tif 000004
【００２１】
前記ポリリン酸化合物は、バクテリア由来のポリリン酸化合物であって、少なくとも１０〜１０００個のリン酸基が重合しているので反応性が向上する。
【００２２】
ポリリン酸合成酵素の触媒作用により、ＡＴＰから生合成すれば、ポリリン酸化合物の収率を向上して、ポリリン酸化合物を安価に生成することが可能となる。例えば、以下の反応式に示すようにポリリン酸化合物を、ＡＴＰから生合成する。
【化４】
0003864033.tif 000005
【００２３】
上記反応式によるポリリン酸化合物の生合成は、例えば、特開平5-153993号公報などに開示された従来のポリリン酸の製造方法を利用すればよい。本実施形態では、ポリリン酸合成酵素を触媒として、ポリリン酸合成酵素とＡＴＰと酵素の失活抑制を目的としたマグネシウムなどの金属イオンを反応させ、ポリリン酸化合物を生合成する。本実施形態に使用されるポリリン酸合成酵素はポリリン酸合成酵素を生合成し得るものであればよい。
【００２４】
本発明者らは、ＡＴＰの連鎖的増幅反応について、ポリリン酸及びポリリン酸キナーゼの代わりにクレアチンキナーゼ及びクレアチンリン酸を使用しても反応が起こることを確認した。すなわち、２分子のＡＤＰを２分子のＡＴＰに変換することのできるリン酸化合物と酵素であれば、原理的にはＡＴＰを連鎖的に増幅反応を起こさせると考えられる。しかし、ポリリン酸はポリリン酸キナーゼと組み合わせることにより、一分子で多数のＡＴＰを合成する能力があるので、連続して起こるＡＴＰの増幅反応に有利である。
【００２５】
【実施例１】
ＡＴＰを無添加で反応させた条件と、ＡＴＰを添加して反応させた条件とを比較するため、以下の条件で発光の経時的変化を調べた。
【００２６】
Ｉ．ＡＴＰ無添加で反応させた場合
（イ）ポリリン酸キナーゼ10μｌ
（ロ）アデノシン１リン酸（ＡＭＰ）7.5μｌ
（ハ）３ｍＭポリリン酸22.5μｌ
（ニ）ポリリン酸キナーゼ（ＰＰＫ）15μｌ
（ホ）アデニレートキナーゼ（ＡＤＫ）3μｌ
（ヘ）蒸留水17μｌ
合計 75μｌ
上記（イ）〜（へ）の試料を混合し、測定時間ごとにサンプリング（5μｌ）を行い、ベーリンガーマンハイム社製のＡＴＰ測定キットにより、ＡＴＰ容量を測定した。
【００２７】
ＩＩ．ＡＴＰ添加で反応させた場合
（イ）ポリリン酸キナーゼ緩衝液10μｌ
（ロ）アデノシン１リン酸（ＡＭＰ）7.5μｌ
（ハ）３mM ポリリン酸22.5μｌ
（ニ）ポリリン酸キナーゼ（ＰＰＫ）15μｌ
（ホ）アデニレートキナーゼ（ＡＤＫ）3μｌ
（ヘ）1.65μMＡＴＰ5 μｌ
（ト）蒸留水12μｌ
合計 75μｌ
Ｉ．と同様に上記（イ）〜（ト）の試料を混合し、測定時間ごとにサンプリング（5μｌ）を行い、ベーリンガーマンハイム社製のＡＴＰ測定キットにより、ＡＴＰ容量を測定した。
【００２８】
上記Ｉ．の結果及びＩＩ．の結果を図1に示す。この結果から、ＡＴＰを添加して反応させた場合（反応ＩＩ．）、反応後３０分からＡＴＰ量が急激に上昇し、１８０分経過後にはピークに達する。これに対し、ＡＴＰ無添加で反応させた場合（反応Ｉ．）、ＡＴＰ量が増加することはなく、低水準のまま推移する。従って、本発明では、微量ＡＴＰの存在が引き金となって、ＡＴＰの連鎖的増加が起こったことが分かる。従って、わずかな量のＡＴＰでもＡＴＰ量を増加させて感度よく検出することができ、食品検査、衛生検査の精度を向上することが可能である。また、安価でかつ簡単なルミノメータによりＡＴＰを検出することができる。
【００２９】
【発明の効果】
以上のように本発明によれば、微量のＡＴＰをＡＤＫの存在下でＡＭＰと反応させて２分子のＡＤＰに変換せしめる第１の反応と、ＰＰＫの存在下で、該２分子のＡＤＰをポリリン酸化合物（リン酸基数；ｎ）と反応させて２分子のＡＴＰとポリリン酸化合物（リン酸基数；ｎ−２）に変換せしめる第２の反応とを一対の反応系となし、該一対の反応系を複数回繰り返し実行させることにより、その反応回数に応じて２のべき乗でＡＴＰを増幅させるので、反応系の１回目に存在する微量のＡＴＰが引き金になり、以降、連鎖的にＡＴＰの増加が起こる。そして、ＡＴＰの連鎖的増加は、ＡＭＰとポリリン酸が存在する限り長時間継続し、反応系の反応回数に応じて２のべき乗でＡＴＰが増加することになる。この後、増加したＡＴＰを生物発光で検出すると、反応系の１回目に添加する微量のＡＴＰに比べて、膨大な光量の増強が起こる。
【００３０】
ポリリン酸とＡＤＰとを反応させてＡＴＰを合成する際、連鎖的にＡＴＰを増加させることが可能となる。これにより、生物発光の光量の増強効果を得るとともに、発光時間を持続させることができる。
【００３１】
また、前記ポリリン酸化合物は、化学合成により生成されたポリリン酸化合物であって、少なくとも１０〜１００個のリン酸基が直鎖状に重合したものを用いるとよい。これにより、ポリリン酸化合物の１分子中にリン酸基（-ＰＯ３-）が少なくとも１０〜１００個含まれているので、ＡＤＰからＡＴＰへの連続的な変換が容易に行われる。
【００３２】
そして、前記ポリリン酸化合物は、バクテリア由来のポリリン酸化合物であって、少なくとも１０〜１０００個のリン酸基が直鎖状に重合したものを用いると、ＡＤＰからＡＴＰへの変換がさらに容易に行われ、リン酸基の補給が少量となり経済的となる。また、多数のリン酸基により反応系の反応時間が長時間継続する。
【００３３】
さらに、前記ポリリン酸化合物は、ポリリン酸合成酵素の触媒作用により、ＡＴＰから生合成すれば、ポリリン酸化合物の収率を向上して、ポリリン酸化合物を安価に生成することが可能となる。
【００３４】
ＡＴＰを連鎖的に増幅させる方法により極微量のＡＴＰを増幅させ、ルシフェラーゼ及び溶存酸素の存在下でルシフェリンと反応させてＡＭＰ及び発光を生成せしめ、生成した発光量を測定すると、増加した分のＡＴＰに相当する光量が得られるため、従来検出できなかった極微量のＡＴＰが検出できるようになり、例えば、ＡＴＰの増幅を伴わない方法と比較して1000倍以上の明るさで検出できることになり、生物発光の測定の感度と精度が格別に向上する。
【００３５】
また、本発明ではＡＴＰの増幅が起こるため、従来の方法では検出できなかった極微量のＡＴＰを検出できる。そのために、食品工場などで目に見えない微生物を検出して清浄度を検査したり、食肉、鮮魚、野菜など食物の鮮度を測定することに応用できるものである。このように、微量有害微生物の検出による衛生管理に応用する他、ＡＴＰを生ずる、あるいは、ＡＴＰを消費するような一般的な生化学反応の検査にも応用できる。また、ＡＴＰを検出することによって、ルミノール反応にかわる科学捜査などへの応用も考えられる。また、ＡＴＰの合成生産などにも応用することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  ＡＴＰの連鎖的増幅反応においてＡＴＰを無添加で反応させた場合とＡＴＰを添加して反応させた場合とを比較した図である。
【図１】
0003864033.tif 000006