(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記のプローブのいずれか１つと同一であるか又はそれと完全に相補的な配列と同一である単離された核酸プローブ：
２９０４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）、
２８７３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）、
２８８１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）、
２８８７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）、又は
２８７９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）。
【請求項２】
少なくとも２つの核酸プローブを含んでなる単離された核酸プローブのセットであって、各プローブが請求項１の異なる１つのプローブからなる核酸プローブのセット。
【請求項３】
下記のいずれか１つのプローブセットからなる、単離された核酸プローブのセット：
２９０４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）、２８６８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）および２８６１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）；又は
２８８１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）、２８７３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）および２８８７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）。
【発明の詳細な説明】
本発明は、麦酒醸造環境中において麦酒の腐敗に関与する、Pediococcus sp.およびLactobacillus sp.を含む生物の検出のための核酸、プローブ、キットおよび方法に関する。
発明の背景
微生物のコンタミネーションによる麦酒腐敗を防止することは、商業的麦酒醸造所の主要な関心事である。麦酒を腐敗させることが示されている、または麦酒腐敗と関連づけられてきた主要な生物は、Lactobacillus属およびPediococcus属のメンバーである（The Prokaryotes, Vol.II, 2nd Edition, Balows, et al, Eds., 1991を参照のこと）。これらの細菌は、非常に少ない数で存在するかもしれず、伝統的な培養方法によればその検出には３日から５日あるいはそれ以上が必要である。
Pediococcus属のメンバーは、しばしば四分子を形成するグラム陽性球菌である。これらは、複雑な栄養要求性を有しており、種々の糖を発酵させることができる。これらは、種々の生息地において見いだされる条件的嫌気性菌であり、極めて頻繁に植物の発酵に関与する。この属には８つの種がある；麦酒腐敗の原因となることが知られている属の主要メンバーはP. damnosusである。
Lactobacillus属は、グラム陽性非胞子桿状菌を含み、厳格に発酵性の代謝を利用し、複雑な栄養要求性を有している。これらは、水、乳製品、肉製品および魚製品、植物および発酵植物、ならびに哺乳動物の口腔および腸管を含む、種々の生息地において見いだされる。
いくつかの研究により、麦酒を腐敗させうる細菌の株が同定されており、それらの種の中でそのように関連づけられた株の相対的な数は、重要な順に、Lactobacillus brevis、P. damnosus、L. casei、L. lindneri、L. coryniformis、L. buchneri、L. plantarumおよびL. curvatusである。
麦酒腐敗生物を検出するための現行の方法は、古典的な微生物学および細菌によるコンタミネーションの存在または不在の一般的な検出に頼っている。これらの方法としては、（ａ）培養；（ｂ）直接蛍光抗体（ＤＦＡ）；および（ｃ）培養確認のための核酸プローブがある。腐敗生物の正確な同定には、古典的な生化学試験およびコッホの条件の満足、すなわち新鮮な麦酒を”再感染”させてそれが腐敗することを示すことが必要である。
発明の記述
本発明の１つの目的は、麦酒の腐敗の原因となるが腐敗していない麦酒には存在しない生物のリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）およびリボソームＤＮＡ（ｒＤＮＡ）中の独特の核酸配列に相補的な核酸を提供することである。本発明の別の目的は、通常のアッセイ条件下においてプローブに対してアクセス可能とされうる標的領域にハイブリダイズすることができる核酸プローブを提供することである。本発明の目的は更に、（１）P. damnosusと非Pediococcus種とを特異的に識別する；（２）麦酒腐敗の原因となるPediococcus株の大半と他の種とを特異的に識別する；（３）L. brevisと非Lactobacillus種とを特異的に識別する；（４）Lactobacillus種のクラスター（クラスターは、L. fructivorans、L. casei、L. curvatus、L. brevisおよびL. buchneriからなる細菌の群である）と非クラスター種とを特異的に識別する；（５）P. damnosusおよびL. brevisの群と他の種とを特異的に識別する；（６）麦酒腐敗の原因となるPediococcus種およびLactobacillus種の大半と他の種とを特異的に識別する；あるいは（７）PediococcusおよびLactobacillus（および関連する種）の大半と他の種とを特異的に識別する；プローブを提供することである。
細菌のリボソームには３種の異なるＲＮＡ分子があり、少なくともEscherichia coliにおいては、５Ｓ、１６Ｓおよび２３ＳｒＲＮＡと称されている。真核生物においては、一般に５Ｓ、１８Ｓ、２８Ｓおよび５．８Ｓと称される４種の異なるｒＲＮＡがある。これらの名前は、歴史的に、沈降速度で決定されるＲＮＡ分子の大きさに関連している。しかし、実際には、ｒＲＮＡ分子の大きさは生物によって異なる。それにもかかわらず、５Ｓ、１６Ｓおよび２３ＳｒＲＮＡは、いかなる細菌のｒＲＮＡ分子についても称されている、当該技術分野で認知された名前であり、本明細書においてもこの慣用法を使用する。
図面の説明
図１はサンドイッチアッセイの図である。
定義
本明細書および請求の範囲を通して用いられる場合、“プローブ”の語は、合成または生物学的に製造される、１０から２５０塩基の長さの核酸を表し、これは設計または選択によって、予め決められた条件下で標的核酸配列と特異的かつ優先的にハイブリダイズしうる特異的なヌクレオチド配列を含み、さらに、場合により検出のための、またはアッセイの性能を上げるための部分を有する。最小限度の１０ヌクレオチドは、統計的に特異性を獲得し、安定なハイブリダイゼーション生産物を形成するために一般に必要であり、最大限度の２５０ヌクレオチドは、一般にミスマッチ配列を決定し、優先的なハイブリダイゼーションを行なうために反応パラメーターを調整しうる配列の上限を示す。従って、一般に、好ましいプローブの長さは１０から２５０ヌクレオチドの間であろう。場合によっては、プローブはある特定のアッセイ条件下で的確にまたは最適に機能するために適する成分を含有してもよい。例えば、（エンドキャッピング等により）核酸分解酵素による分解に対する抵抗性を改良するため、（フルオレセイン、32Ｐ、ビオチン等のような）検出リガンドを付与するため、あるいは固体の支持体への捕捉を容易にする（例えばポリ−デオキシアデノシンの“テール”をつける）ためにプローブを修飾してもよい。
“優先的なハイブリダイゼーション”または“優先的にハイブリダイズする”とは、相対的な意味において用いられる。すなわち、１つのハイブリダイゼーション反応生産物は、同一の条件下において他のハイブリダイゼーション反応生産物よりも安定である。条件によっては、ハイブリダイゼーション反応生産物は、１つの標的に関して形成されるが他の潜在的結合相手については形成されない。ハイブリダイゼーション反応生産物の安定性を比較し、どちらがより安定かを評価する、すなわちどちらが“優先的に”結合しているかを決定することは通常の技術者の能力の範囲内である。
本明細書において用いる場合、“ホモロジー”および“相同である”の語は、２個またはそれ以上の核酸配列間の類似の度合を表すことを意味し、生物間の分類学的な類似度合を意味するものではない。類似の度合はパーセンテージで表わし、例えば２個の配列間が９０％ホモロジーであるとは、第１の配列の塩基の９０％が第２の配列の塩基と同一にマッチすることを意味する。
“Lactobacillus種のクラスター”とはL. fructivorans、L. casei、L. curvatus、L. brevisおよびL. buchneriからなる群より選択されるLactobacillus種の群を意味する。
“特異的”とは、ヌクレオチド配列が予め決められた標的配列にハイブリダイズし、非標的配列には実質的にハイブリダイズしないこと、または非標的配列に対するハイブリダイゼーションが最小限であることを意味する。
“ハイブリダイゼーション”は、予め決められた反応条件下において、核酸の２本の部分的にもしくは完全に相補的な鎖が逆平行になるように並び、特異的かつ安定な水素結合で核酸の２本鎖を形成し、核酸の塩基が互いに対になるという明白な規則に従って行われる過程である。
“実質的なハイブリダイゼーション”とは、その結果を観察した者がその結果を臨床的な状態において陽性と考えるであろうハイブリダイゼーションの程度を意味する。“バックグラウンドノイズ”と考えられるデータは実質的なハイブリダイゼーションではない。
“ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件”とは、約０．９モルＮａＣｌの塩溶液中で約３５℃から６５℃の条件を意味する。ストリンジェンシーはまた、ハイブリダイゼーション溶液中に存在するイオン種の濃度およびタイプ、存在する変性剤のタイプおよび濃度、およびハイブリダイゼーションの温度等の反応パラメーターによって左右されるかもしれない。一般に、ハイブリダイゼーション条件がよりストリンジェントになるにしたがって、安定なハイブリッドが形成されるためにはより長いプローブが好ましい。一般に、ハイブリダイゼーションが行なわれる条件のストリンジェンシーによって、用いられるべき好ましいプローブの性質が決められるだろう。当業者はそのような関係をよく理解しており、たやすく操作することができる。
“Lactobacillus sp.”とは、種にかかわらず、Lactobacillus属のいずれのメンバーをも指す。
“Pediococcus sp.”とは、種にかかわらず、Pediococcus属のいずれのメンバーをも指す。
”大半”とは、株に言及する場合には、既知の株の半分以上、または少なくとも２５株の代表的標品が試験されるときには試験された株の半分以上を意味する。種に言及する場合には、既知の種の半分以上、または代表的な数の種が試験されるときには試験された種の半分以上を意味する。
本発明によれば、（１）他の非Pediococcus種と比較して、P. damnosusのｒＲＮＡまたはｒＤＮＡに優先的にハイブリダイズする；（２）他の種と比較して、麦酒腐敗の原因となるPediococcus株の大半に優先的にハイブリダイズする；（３）非Lactobacillus種と比較して、L. brevisに優先的にハイブリダイズする；（４）他の種と比較して、Lactobacillus種のクラスター（L. fructivorans、L. casei、L. curvatus、L. brevisおよびL. buchneriからなる群より選択される）に優先的にハイブリダイズする；（５）他の種と比較して、P.damnosusおよびL. brevisの群に優先的にハイブリダイズする；（６）他の種と比較して、麦酒腐敗の原因となるPediococcus種およびLactobacillus種の大半に優先的にハイブリダイズする；および（７）PediococcusおよびLactobacillus（および関連する種）の大半と他の種とを特異的に識別する；約１０−２５０ヌクレオチドを含む核酸が提供される。本発明の核酸は、同一のハイブリダイゼーション条件下において、被験試料中に存在するかもしれない非標的生物または宿主もしくは環境的マトリックスのｒＲＮＡまたはｒＤＮＡに実質的にハイブリダイズしない。
本発明の核酸は、麦酒の腐敗の原因となるであろう生物の存在を検出するために有用である。上記ヌクレオチドの少なくとも１０個の連続した核酸に対して相補的であるか、またはそれと少なくとも９０％相同であるプローブも、本発明の他の観点をなす。
本発明の１つの態様は、麦酒腐敗微生物の１６Ｓ  ｒＲＮＡまたはｒＤＮＡの領域に対して相補的であるかまたはそれにハイブリダイズする核酸およびプローブである。特に重要な１６Ｓ  ｒＲＮＡの領域には、当業者によく知られた標準である大腸菌（E.coli）の相同の領域の番号を参照して、下記に示すものが含まれる。
P. damnosus：16S ｒRNA位置285-320,450-485および1435-1470；
L. brevis：16S rRNA位置75-105および450-485；
P. damnosusまたはL. brevis：16S rRNA位置805-840；
PediococcusおよびLactobacillus：16S rRNA位置120-150,210-245,280-315,485-515および750-785。
本発明の他の態様は、麦酒腐敗微生物の２３Ｓ  ｒＲＮＡまたはｒＤＮＡの領域にハイブリダイズする核酸およびプローブである。特に重要な２３Ｓ  ｒＲＮＡの領域には、当業者によく知られた標準である大腸菌（E.coli）の相同の領域の番号を参照して、下記に示すものが含まれる。
P. damnosus：23S rRNA位置700-740,870-910,925-960,1130-1165および1205-1245。
L. brevis：23S rRNA位置280-320,325-363,1130-1165,1265-1300および1480-1512。
P. damnosusおよびL. brevis：23S rRNA位置600-635。
好ましくは、核酸組成物は、下記よりなるプローブの群により定義される配列の群から選択される配列中のいずれか１０個の連続したヌクレオチドを含む配列の少なくとも９０％に対して相補的であるかまたはそれと相同である：２８５８、２８６１、２８６７、２８７６、２８７７、２８６８、２８６９、２８８０、２８９１、２８９２、２８９５、２８９９、２９０４、２８９６、２８７３、２８８１、２８８７、２８７５、２９０１、２８５４、２８７９および２９０２。これらのプローブの配列は後記に提示される。
本発明のさらに他の態様には、麦酒腐敗微生物の存在を検出するためのキットが含まれる。このキットは、少なくとも２種類の核酸を含む１組の核酸を含む。それぞれの核酸は長さ１０−２５０ヌクレオチドであり、異なる塩基配列組成のものである。それぞれの核酸は、下記プローブにより定義される配列の群から選択されるいずれか１０個の連続したヌクレオチドを含む配列の少なくとも９０％に対して相補的であるかまたはそれと相同である：２８５８、２８６１、２８６７、２８７６、２８７７、２８６８、３８６９、２８８０、２８９１、２８９２、２８９５、２８９９、２９０４、２８９６、２８７３、２８８１、２８８７、２８７５、２９０１、２８５４、２８７９および２９０２。２プローブサンドイッチアッセイにおける１組の核酸は、麦酒腐敗微生物の検出に特に適している。このキットはさらに試薬、組成物、指示書、使い捨て器具、および簡便なアセンブリー中で市販しうる適当なパッケージを含む。
本発明のさらに他の態様には、麦酒腐敗微生物の存在を検出するための方法が含まれる。この方法は、標的を含有する疑いのある試料を少なくとも１種類の核酸と接触させる工程を含む。この核酸は、（１）P. damnosus；（２）他の種ではなく、麦酒腐敗の原因となるPediococcus株の大半；（３）他のLactobacillus種ではなく、L. brevis；（４）他の種ではなく、Lactobacillus種のクラスター（L. fructivorans、L. casei、L. curvatus、L. brevisおよびL. buchneriからなる）；（５）他の種ではなく、P. damnosusおよびL. brevisの群；（６）他の種ではなく、麦酒腐敗の原因となるPediococcus株およびLactobacillus種の大半；および（７）他の種ではなく、PediococcusおよびLactobacillus（および関連する種）の大半；のｒＲＮＡまたはｒＤＮＡと優先的にハイブリダイズする約１０−２５０ヌクレオチドを有する。この方法は、核酸が標的ｒＲＮＡまたはｒＤＮＡと優先的に結合して核酸複合体を形成するようにハイブリダイゼーション条件を試料に付与し、そして標的生物（１または２以上）の存在を指示するものとして複合体を検出する工程を含む。好ましくは本発明の核酸は、下記プローブにより定義される配列よりなる群から選択されるいずれか１０個の連続したヌクレオチドを含む配列に対して少なくとも９０％相同である：２８５８、２８６１、２８６７、２８７６、２８７７、２８６８、２８６９、２８８０、２８９１、２８９２、２８９５、２８９９、２９０４、２８９６、２８７３、２８８１、２８８７、２８７５、２９０１、２８５４、２８７９および２９０２。
本発明のプローブは、麦酒または環境試料中の麦酒腐敗生物の特異的検出のための核酸ハイブリダイゼーションアッセイの開発の基礎を提供する。本発明のプローブはまた、麦酒を腐敗させることが示されている微生物の存在を確認するための基礎を提供する。
本発明のプローブの開発に際して最初にとられた段階は、目的とする感受性を備えた特異的核酸プローブに対して標的として作用する可能性のある１６Ｓまたは２３Ｓ  ｒＲＮＡの領域を同定することであった。これには、どのプローブ標的部位が、（１）P. damnosus；（２）麦酒腐敗の原因となるPediococcus株の大半；（３）L. brevis；（４）Lactobacillus sp.のサブグループ；（５）P. damnosusおよびL. brevisの群；（６）麦酒を腐敗させることが示されているPediococcus種およびLactobacillus種の大半の群；および（７）PediococcusおよびLactobacillusおよび関連する種の大半の群；に対して独特であるかを発見することを含んでいた。これは、次のような部位を見いだすことを含んでいた。
１．  P. damnosusと他のPediococcusおよび非Pediococcus種との間では相違する；
２．  試験されたPediococcus株の大半と他の種との間では相違する；
３．  L. brevisと他のLactobacillusおよび非Lactobacillus種との間では相違する；
４．  Lactobacillus種のクラスター（L. fructivorans、L. casei、L. curvatus、L. brevisおよびL. buchneri）と他の種との間では相違する；
５．  P. damnosusおよびL. brevisの群と他の種との間では相違する；
６．  ２５株の代表的試料により表して、麦酒腐敗の原因となることが示されているすべての生物について同様であるが、次に近い進化的隣接生物の配列との間では相違する；および
７．  PediococcusおよびLactobacillusおよび関連する種の大半の間では同様であるが、L. minutus、L. lacti、Micrococcus属のメンバーおよびPectinatus属のメンバーを除く他の種との間では相違する。
上記の分析を行うために、P. damnosusおよびL. brevisの１６Ｓおよび２３ＳｒＲＮＡ配列の正確な並び方を明らかにした。P. damnosusおよびL. brevis双方の本質的に完全な１６Ｓおよび２３Ｓ  ｒＲＮＡ配列を、標準的な実験室プロトコルにより決定した。このようにして得られたｒＤＮＡを酵素増幅法（例えばWeissburg, 1991, J. Bacteriol. 173:697-703に記載されたもの，これを本明細書の一部としてここに引用する）により生産された生成物からプラスミドベクター中にクローニングした。P. damnosusおよびL. brevisの配列を他のLactobacillus種、グラム陽性生物およびE.coli（標準参照配列として当業者に広く使用されている）を含む他のユーバクテリアｒＲＮＡ配列の相同配列と対比した。
決定されたP. damnosusおよびL. brevisの１６Ｓおよび２３Ｓ  ｒＲＮＡ配列に基づいて、２２個のプローブを設計し、合成し、試験した。これらのプローブの特異的挙動は、それらを用いるアッセイ形式に著しく依存する。逆にアッセイ形式は特定のプローブのある最適な特性を指示するであろう。
不都合なレベルの交差反応性を生じることなく、P. damnosusおよびL. brevisに関して本発明の異例な包括性および排他性を備えたプローブを形成しうるという発見は、予想も予期もできないものであった。
第１群の好ましいプローブは、P. damnosusと他の種とを識別することができる。
P. damnosus特異的16S rRNAプローブ
P. damnosusプローブ2858（28mer 46% G+C）（SEQ ID NO:1）
0003749540.tif 000002
P. damnosusプローブ2861（29mer 48% G+C）（SEQ ID NO:2）
0003749540.tif 000003
P. damnosusプローブ2867（28mer 61% G+C）（SEQ ID NO:3）
0003749540.tif 000004
第２群の好ましいプローブは、Pediococcus麦酒腐敗株の大半を検出することができる。
Pediococcus属の大半の23S rRNAプローブ
Pediococcus属プローブ2876（32mer 50% G+C）（SEQ ID NO:4）
0003749540.tif 000005
Pediococcus属プローブ2877（31mer 58% G+C）（SEQ ID NO:5）
0003749540.tif 000006
第３群の好ましいプローブは、L. brevisに特異的である。
L. brevis特異的16S rRNAプローブ
L. brevisプローブ2868（28mer 43% G+C）（SEQ ID NO:6）
0003749540.tif 000007
L. brevisプローブ2869（32mer 41% G+C）（SEQ ID NO:7）
0003749540.tif 000008
L. brevis特異的23S rRNAプローブ
L. brevisプローブ2880（31mer 45% G+C）（SEQ ID NO:8）
0003749540.tif 000009
L. brevisプローブ2891（33mer 48% G+C）（SEQ ID NO:9）
0003749540.tif 000010
L. brevisプローブ2829（30mer 53% G+C）（SEQ ID NO:10）
0003749540.tif 000011
L. brevisプローブ2895（32mer 53% G+C）（SEQ ID NO:11）
0003749540.tif 000012
第４群のプローブは、Lactobacillus種のクラスターに特異的である。好ましいものは次のものである。
Lactobacillus sp.のクラスター23S rRNAプローブ
Lactobacillusクラスタープローブ2899（32mer 47% G+C）（SEQ ID NO:12）
0003749540.tif 000013
第５群のプローブは、P. damnosusおよびL. brevisの両方を検出することができる。好ましいものは次のものである。
P. damnosusおよびL. brevis 16S rRNAプローブ
P. damnosusおよびL. brevisプローブ2904（30mer 43% G+C）（SEQ ID NO:13）
0003749540.tif 000014
P. damnosusおよびL. brevis 23S rRNAプローブ
P. damnosusおよびL. brevisプローブ2896（32mer 44% G+C）（SEQ ID NO:14）
0003749540.tif 000015
第６群のプローブは、Pediococcus種およびLactobacillus種の大半およびすべての麦酒腐敗生物とハイブリダイズする。好ましいものは次のものである。
16S rRNA麦酒腐敗生物プローブ
麦酒腐敗生物プローブ2873（28mer 64% G+C）（SEQ ID NO:15）
0003749540.tif 000016
麦酒腐敗生物プローブ2881（28mer 57% G+C）（SEQ ID NO:16）
0003749540.tif 000017
麦酒腐敗生物プローブ2887（30mer 63% G+C）（SEQ ID NO:17）
0003749540.tif 000018
23S rRNA麦酒腐敗生物プローブ
麦酒腐敗生物プローブ2875（32mer 50% G+C）（SEQ ID NO:18）
0003749540.tif 000019
麦酒腐敗生物プローブ2901（32mer 44% G+C）（SEQ ID NO:19）
0003749540.tif 000020
第７群のプローブは、PediococcusおよびLactobacillus種の大半とハイブリダイズするであろう。好ましいものは次のものである。
PediococcusおよびLactobacillus種の大半16S rRNAプローブ
Pediococcus/Lactobacillusプローブ2854（27mer 48% G+C）（SEQ ID NO:20）
0003749540.tif 000021
Pediococcus/Lactobacillusプローブ2879（28mer 54% G+C）（SEQ ID NO:21）
0003749540.tif 000022
PediococcusおよびLactobacillus種の大半23S rRNAプローブ
Pediococcus/Lactobacillusプローブ2902（31mer 58% G+C）（SEQ ID NO:22）
0003749540.tif 000023
本発明のプローブは「サンドイッチ」アッセイに用いることができる。図１に示すように、「サンドイッチ」アッセイでは１対のプローブを同時に使用する。「捕捉」プローブ１２と命名される１つのプローブは、好ましくは高い標的特異性を有するプローブにホモポリマー３’テールを加えることによって作製される二官能性ヌクレオチドである。このテールは、ガラスビーズまたはフィルターディスク等の固体表面１０上で、相補的ホモポリマー１１とハイブリダイズする。Pediococcus/Lactobacillus ｒＲＮＡの場合における、捕捉プローブ１２のその標的１５へのハイブリダイゼーションは、標的１５と固体支持体１０との複合体形成をもたらす。好ましくはある程度の特異性を有する検出プローブ１３は、放射能活性、蛍光、化学発光、着色またはその他の検出部分を含む実際上あらゆる種類の検出部分１４を使用することのできる検出機構の一部を構成する。検出プローブは、KramerおよびLizardi（Nature 339）に記載されるように、ＲＮＡ配列として増幅可能なＱ−ベータミディバリアント中に組み込むことができる。
綿棒または液体アリコート等の試料は、総核酸含量を放出するように処理される。破砕された麦酒腐敗生物を含むと推定される試料を、グアニジンイソチオシアネート等のカオトロピックバッファー中において、捕捉プローブ、検出プローブ、ならびにオリゴ−デオキシチミジンであらかじめ誘導化しておいた磁気粒子ビーズの存在下でインキュベートする。
もしも標的分子（PediococcusまたはLactobacillus属の麦酒腐敗微生物）が存在するならば、図１に示されるように、ビーズ−捕捉プローブ−標的−検出プローブのハイブリダイゼーション複合体が形成される。反応管の底部付近に磁石が存在すると、磁気粒子−ハイブリダイゼーション複合体が管の側面に付着し、試料マトリックス、未結合プローブおよびハイブリダイズしないその他の成分を除去することができる。ビーズ−捕捉プローブ−標的−検出プローブ複合体の再水和および変性を繰り返すと、有意にバックグラウンドを減少することができる。最終的検出は、ビーズを膜上にスポットして、適当な方法、例えば検出プローブが放射性同位元素で標識されている場合にはオートラジオグラフィー等の方法によってアッセイすることにより実施する。もしくは、検出プローブは増幅可能なミディバリアントプローブでありうる。
本発明をよりよく説明するために、以下の非限定的な実施例を示す。
実施例１  プローブのハイブリダイゼーション挙動のドットブロット分析
周知の方法によるドットブロット分析は、市販品として容易に入手可能なニトロセルロース、ナイロンまたは他の誘導化膜等のフィルター上に、核酸または一群の核酸を固定化することを含む。ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかをそのように固定化し、続いて種々の条件下（ストリンジェンシー）で、興味ある核酸配列もしくはプローブとのハイブリダイゼーションを試験することができる。ストリンジェントな条件下では、標的配列に対する相補性が大きい核酸配列を有するプローブは、配列の相補性が小さいプローブに比べて、高レベルのハイブリダイゼーションを示す。
本発明のプローブをドットブロットで試験する。１００ナノグラムのＲＮＡをフェノール抽出およびトリフルオロ酢酸セシウム勾配上での遠心分離により精製し、変性させ、そしてナイロン膜上にスポットする。オリゴヌクレオチドの５’末端に、確立されているポリヌクレオチドキナーゼ反応によって32Ｐ−リン部分を付加して、プローブを放射性標識する。プローブのハイブリダイゼーションは、１．０８Ｍ  ＮａＣｌ、６０ｍＭリン酸ナトリウムおよび６ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ｐＨ７．４の存在下で、６０℃の温度で実施する。ハイブリダイズしなかったプローブはハイブリダイゼーション条件の３分の１の塩濃度で洗浄して除去する。フィルターをＸ線フィルムに露光し、３時間のオートラジオグラフィー露光の後、ハイブリダイゼーションシグナルの強さを調べる。次の表１は結果の要約である。
16S rRNAを標的としたP. damnosusプローブ
プローブ2858：  すべてのP. damnosus株
プローブ2861：  すべてのP. damnosus株；Lactobacillusの１つの単離物
プローブ2867：  すべてのP. damnosus株
16S rRNAを標的としたL. brevisプローブ
プローブ2868：  L. brevisに特異的。このプローブはL. brevisとして同定されたいくつかの単離物を検出しなかったが、これは、いくつかの環境的単離物の不正確な同定のためであると考えられる。
プローブ2869：  L. brevisに特異的
16S rRNAを標的としたP. damnosusおよびL. brevisプローブの群
プローブ2904：  P. damnosusおよびL. brevis。また、L. buchineriおよびLactobacillusの他の関連する種を検出する。
16S rRNAを標的としたすべての麦酒腐敗生物
プローブ2873：  Pediococcus株およびLactobacillus株の大半；１つの腐敗単離物を除くすべて。
プローブ2881：  Pediococcus株およびLactobacillus株の大半；また、多くのグラム陽性ユーバクテリアを検出する。
プローブ2887：  Pediococcus株およびLactobacillus株の大半；腐敗単離物のすべて。
16S rRNAを標的としたPediococcus種およびLactobacillus種の大半のプローブの群
プローブ2854：  Pediococcus株およびLactobacillus株の大半および２つのBacillus種。
プローブ2879：  Pediococcus株およびLactobacillus株の大半。また、いくつかのグラム陽性バクテリアを検出する。
23S rRNAを標的としたPediococcus麦酒腐敗生物の大半の群のプローブ
プローブ2876：  Pediococcus株のほとんど。また、いくつかのLactobacillus単離物を検出する。
プローブ2877：  Pediococcus株のほとんど。また、いくつかのLactobacillus単離物を検出する。
23s rRNAを標的としたL. brevisプローブ
プローブ2880：  L. brevis特異的。L. brevisとして同定されたいくつかの単離物を検出しないが、これはいくつかの環境的単離物の不正確な同定のためであろう。
プローブ2891：  L. brevis特異的。
プローブ2892：  L. brevis特異的。
プローブ2895：  L. brevis特異的。
23S rRNAを標的としたLactobacillus属の亜群のプローブ
プローブ2899：  Lactobacillus種のほとんど。おそらくいくつかのPediococcus株を検出する。
23S rRNAを標的としたP. damnosusおよびL. brevisの群のプローブ
プローブ2896：  P. damnosusおよびL. brevis。また、少々のLactobacillusの他の種を検出する。
23S rRNAを標的としたすべての麦酒腐敗生物
プローブ2875：  Pediococcus株およびLactobacillus株の大半；いくつかの腐敗単離物を検出しない。
プローブ2901：  Pediococcus株およびLactobacillus株の大半；いくつかの腐敗単離物を検出しない。
23S rRNAを標的としたPediococcus株およびLactobacillus種の大半の群のプローブ
プローブ2902：  PediococcusおよびLactobacillus株の大半。また、いくつかのグラム陽性ユーバクテリアを検出する。
ドッドプロットアッセイの結果を下記の表２に示す。この表中で、++++は最も強いシグナルの観察を示し；+++は強いシグナルの観察を示し；++は若干弱いシグナルが観察されたが、確かにハイブリダイゼーション陽性であることを示し；+は弱いシグナルを示し、+-は非常に弱い、ようやく検知できるシグナルを示し；-はシグナルが観察されないことを示す。ＮＤはアッセイを実施しなかったことを示す。プローブが少なくとも一つの標的に強く結合する（++++または+++）が、第二の標的に対しては弱いハイブリダイゼーション（+または+-）しか示さない場合には、該プローブは、++++または+++の結果を与える標的にのみ実質的にハイブリダイズするとみなされる。
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実施例２  二重プローブハイブリダイゼーション
工程内試験のためには、広範な通常の麦酒醸造ミクロフローラの中から特定の腐敗微生物を検出することが最も適切であろう。このタイプのサンドイッチアッセイのためには、次の捕足プローブと検出プローブの組が好ましい対または組の例である。
P. damnosus 16S rRNA：プローブ2858＋プローブ2861
プローブ2861＋プローブ2867
L. brevis 16S rRNA：プローブ2868＋プローブ2869
P. damnosusおよびL. brevis 16S rRNA：プローブ2904＋プローブ2868+2861
すべての麦酒腐敗微生物の群16S rRNA：プローブ2881＋プローブ2873+2887
PediococcusおよびLactobacillusの大半の群16S rRNA：
プローブ2854＋プローブ2879
L. brevis 23S rRNA：プローブ2880＋プローブ2891
プローブ2892＋プローブ2895
P.damnosusおよびL. brevis 23S rRNA：プローブ2896＋プローブ2880+2876
すべての麦酒腐敗微生物の群23S rRNA：プローブ2875＋プローブ2901+2899
PediococcusおよびLactobacillusの大半の群23S rRNA：
プローブ2902＋プローブ2875+2901
実施例３  麦酒醸造および最終製品についての麦酒腐敗生物の検出
瓶、缶、樽または他の容器からの綿棒またはアリコートを処理してＤＮＡを得る。本発明のプローブを逆向き相補性の本発明の第二プローブと一緒に用いて、ポリメラーゼ連鎖反応により、LactobacillusのｒＲＮＡをコードする標的生物の遺伝子セグメントを酵素的に増幅する。得られた材料を続いてサンドイッチアッセイでアッセイする。本明細書に記載したプローブ／プライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応自体を非常に特異的にしてもよく、または同時出願中のUSSN 359,158に記載されているようなプローブを用いて反応をより一般化し、次にサンドイッチアッセイを用いて増幅産物を標的生物として同定してもよい。
最終製品試験のためには、ほとんどの正常麦酒醸造ミクロフローラは除去されているかまたは不活性化されているであろうから、より一般的に標的化されたプローブが適当であろう。この特定のアッセイのためには、次の補足プローブ及び検出プローブが好ましい対の例である。
P. damnosus 16S rRNA：プローブ2858＋プローブ2861
プローブ2861＋プローブ2867
L. brevis 16S rRNA：プローブ2868＋プローブ2869
P. damnosusおよびL. brevis 16S rRNA：プローブ2904＋プローブ2868+2861
すべての麦酒腐敗微生物の群16S rRNA：プローブ2881＋プローブ2873+2887
PediococcusおよびLactobacillusの大半の群16S rRNA：
プローブ2854＋プローブ2879
L. brevis 23S rRNA：プローブ2880＋プローブ2891
プローブ2892＋プローブ2895
P.damnosusおよびL. brevis 23S rRNA：プローブ2896＋プローブ2880+2876
すべての麦酒腐敗微生物の群23S rRNA：プローブ2875＋プローブ2901+2899
PediococcusおよびLactobacillusの大半の群23S rRNA：
プローブ2902＋プローブ2875+2901
実施例４  細胞染色によるin situハイブリダイゼーション
本発明のプローブは細胞学的染色試薬として使用することができる。液体サンプルを顕微鏡スライドに載せる。固定および溶解の後、プローブのハイブリダイゼーションをその場で行う。例えば、プローブ2858を蛍光標識で標識して、検体の染色に用いる。試料中にP. damnosusが存在すると、蛍光顕微鏡下に蛍光を発する小体が観察される。
実施例５  培養後の麦酒腐敗生物の存在の確認
修飾ＭＲＳ寒天プレート（Lawrence et al., 1979, J. Instit. for Brewing 85:119）上または液体濃厚培養等のPediococcus/Lactobacillus/麦酒腐敗生物用の標準的培養工程の後、試料をPediococcus/Lactobacillus/麦酒腐敗生物の存在について試験する。一つの方法は実施例２に記載したサンドイッチアッセイを用いることによる。純粋な培養物は必要ない。
【配列表】
配列番号：１
配列の長さ：２８塩基
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直線状
ハイポセティカル配列：ＮＯ
アンチセンス：ＮＯ
配列
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配列番号：２
配列の長さ：２９塩基
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直線状
ハイポセティカル配列：ＮＯ
アンチセンス：ＮＯ
配列
0003749540.tif 000033
配列番号：３
配列の長さ：２８塩基
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直線状
ハイポセティカル配列：ＮＯ
アンチセンス：ＮＯ
配列
0003749540.tif 000034
配列番号：４
配列の長さ：３２塩基
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直線状
ハイポセティカル配列：ＮＯ
アンチセンス：ＮＯ
配列
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配列番号：５
配列の長さ：３１塩基
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直線状
ハイポセティカル配列：ＮＯ
アンチセンス：ＮＯ
配列
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配列番号：６
配列の長さ：２８塩基
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直線状
ハイポセティカル配列：ＮＯ
アンチセンス：ＮＯ
配列
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配列番号：７
配列の長さ：３２塩基
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直線状
ハイポセティカル配列：ＮＯ
アンチセンス：ＮＯ
配列
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配列番号：８
配列の長さ：３１塩基
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直線状
ハイポセティカル配列：ＮＯ
アンチセンス：ＮＯ
配列
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配列番号：９
配列の長さ：３３塩基
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直線状
ハイポセティカル配列：ＮＯ
アンチセンス：ＮＯ
配列
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配列番号：１０
配列の長さ：３０塩基
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直線状
ハイポセティカル配列：ＮＯ
アンチセンス：ＮＯ
配列
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配列番号：１１
配列の長さ：３２塩基
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直線状
ハイポセティカル配列：ＮＯ
アンチセンス：ＮＯ
配列
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配列番号：１２
配列の長さ：３２塩基
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直線状
ハイポセティカル配列：ＮＯ
アンチセンス：ＮＯ
配列
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配列番号：１３
配列の長さ：３０塩基
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直線状
ハイポセティカル配列：ＮＯ
アンチセンス：ＮＯ
配列
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配列番号：１４
配列の長さ：３２塩基
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直線状
ハイポセティカル配列：ＮＯ
アンチセンス：ＮＯ
配列
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配列番号：１５
配列の長さ：２８塩基
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直線状
ハイポセティカル配列：ＮＯ
アンチセンス：ＮＯ
配列
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配列番号：１６
配列の長さ：２８塩基
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直線状
ハイポセティカル配列：ＮＯ
アンチセンス：ＮＯ
配列
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配列番号：１７
配列の長さ：３０塩基
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直線状
ハイポセティカル配列：ＮＯ
アンチセンス：ＮＯ
配列
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配列番号：１８
配列の長さ：３２塩基
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直線状
ハイポセティカル配列：ＮＯ
アンチセンス：ＮＯ
配列
0003749540.tif 000049
配列番号：１９
配列の長さ：３２塩基
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直線状
ハイポセティカル配列：ＮＯ
アンチセンス：ＮＯ
配列
0003749540.tif 000050
配列番号：２０
配列の長さ：２７塩基
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直線状
ハイポセティカル配列：ＮＯ
アンチセンス：ＮＯ
配列
0003749540.tif 000051
配列番号：２１
配列の長さ：２８塩基
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直線状
ハイポセティカル配列：ＮＯ
アンチセンス：ＮＯ
配列
0003749540.tif 000052
配列番号：２２
配列の長さ：３１塩基
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直線状
ハイポセティカル配列：ＮＯ
アンチセンス：ＮＯ
配列
0003749540.tif 000053
【図１】
0003749540.tif 000054