(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ω−３系高度不飽和脂肪酸を含有する長鎖脂肪酸と低級アルコールとから構成される脂肪酸エステルを、リパーゼを用いて直鎖高級アルコールと選択的アルコリシス反応させることを特徴とする、ω−３系高度不飽和脂肪酸エステルの精製方法。
【請求項２】
リパーゼがリゾムコール属又はリゾプス属に属する微生物由来のものである、請求項１記載のω−３系高度不飽和脂肪酸エステルの精製方法。
【請求項３】
ω−３系高度不飽和脂肪酸を含有する長鎖脂肪酸が魚油由来のものである、請求項１記載のω−３系高度不飽和脂肪酸エステルの精製方法。
【請求項４】
ω−３系高度不飽和脂肪酸がドコサヘキサエン酸である、請求項１記載のω−３系高度不飽和脂肪酸エステルの精製方法。
【請求項５】
脂肪酸エステルがエチルエステルである、請求項１記載のω−３系高度不飽和脂肪酸エステルの精製方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ω−３系高度不飽和脂肪酸エステルの精製方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、高度不飽和脂肪酸の有する生理活性作用が注目されている。特に、エイコサペンタエン酸（以下、EPAと称する。）やドコサヘキサエン酸（以下、DHAと称する。）は、動脈硬化症、血栓症などの成人病に対する予防効果や制癌作用、学習能の増強作用などの多くの生理活性作用を有していることが知られている。そして、その利用法について様々な検討がなされている。
【０００３】
EPAやDHAを主体とした高度不飽和脂肪酸を精製する方法としては、例えば(1) クロマトグラフィーによる方法、(2) 液-液分配による方法、(3) 低温溶剤分別結晶化法、(4) 尿素付加による方法、(5) 二重結合への付加物による方法、(6) 蒸留による方法、およびこれらを組合せた方法が知られている。
【０００４】
しかし、(2) 〜(5) の方法においては、溶剤を使用しなければならず、溶剤の除去工程が必要となるため、工程が煩雑である。また、(1) の方法では高純度の精製はできるが、溶剤及びカラムの使用等で製造コストが掛かり過ぎてしまうため、事業的に採算が合わない。(6) の方法においては、処理コストは比較的安価であるが、目的とするフラクションの回収率はあまり高いものではない。
したがって、高度不飽和脂肪酸を低コストな処理方法によって高収率かつ高純度に精製できる方法の開発が望まれている。
【０００５】
高度不飽和脂肪酸を精製する方法としては、これまでに常温、常圧下で反応が進行するリパーゼを用いた方法が注目されている。リパーゼによる高度不飽和脂肪酸の精製法には、油脂をリパーゼで加水分解し未分解のグリセリド画分中に濃縮する方法（選択的加水分解反応）、あるいは高度不飽和脂肪酸を含有する脂肪酸混合物とアルコールとからなる反応混液にリパーゼを作用させ、高度不飽和脂肪酸以外の脂肪酸をエステル化し、高度不飽和脂肪酸を遊離脂肪酸画分中に精製する方法（選択的エステル化反応）等が知られている。
【０００６】
医薬品原料として高度不飽和脂肪酸を高純度に精製する場合には、選択的エステル化反応による高度不飽和脂肪酸の濃縮法の方が有効である。その例として、これまでに、魚油（EPA11%、DHA8%）から尿素付加法によりDHA27%（EPA27%）に濃縮した脂肪酸混合物を得、該混合物、そのメチルエステル体及び低級アルコールからなる反応混液に、n-ヘキサンを加えた系でリゾムコール属（Rhizomucor属）の微生物が生産するリパーゼを用いてエステル化反応（この場合は、メチルエステルとアルコールとの間のアシドリシス反応も進行している。）することにより、遊離脂肪酸画分中にDHA を72% まで濃縮する方法が知られている（JAOCS, Vol.66, no.8, p1120（1989))。
【０００７】
上述の選択的エステル化反応は、高度不飽和脂肪酸を高純度に精製するには非常に有効な方法である。しかし、この方法では、油脂を一旦加水分解し遊離脂肪酸とした上で反応させる必要があるため、遊離脂肪酸の状態で酸化が進行してしまう懸念がある。さらに、クロマトグラフィー等によって高度不飽和脂肪酸を高純度に精製する場合、選択的エステル化反応により得られた脂肪酸混合物を低級アルコールの脂肪酸エステル体に変換した後に精製しなければならず、その結果、二段階の変換反応が必要となるため、非効率的である。
【０００８】
精製工程中での遊離脂肪酸の酸化安定性を考慮すると、脂肪酸エステルの形態が酸化に対してより安定であることから、脂肪酸エステルを基質として用いたリパーゼ反応により、安定にかつ効率よく高度不飽和脂肪酸を精製する方法の開発が要望される。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ω−３系高度不飽和脂肪酸エステルの精製方法を提供することを目的とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題に基づいて鋭意研究を行ない、リパーゼによるω−３系高度不飽和脂肪酸の効率的な精製方法について検討した結果、ω−３系高度不飽和脂肪酸を含有する長鎖脂肪酸と低級アルコールとから構成される脂肪酸エステル混合物を原料とし、直鎖高級アルコールの存在下で、有機溶媒を含まない反応系で直接リパーゼを作用させてアルコリシス反応を行うと、高度不飽和脂肪酸エステルは未反応のままで、高度不飽和脂肪酸以外の脂肪酸エステルが優先的に高級アルコールとアルコール交換されて、容易にワックスエステルが生成することを見出した（選択的アルコリシス反応）。その際、生成したワックスはリパーゼの作用を受けにくく、可逆的な分解反応やエステル交換反応は起こりにくいので、未反応の脂肪酸エステル画分中に高度不飽和脂肪酸エステルを高収率かつ高純度に精製できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は、ω−３系高度不飽和脂肪酸を含有する長鎖脂肪酸と低級アルコールとから構成される脂肪酸エステルを、リパーゼを用いて直鎖高級アルコールと選択的アルコリシス反応させることを特徴とするω−３系高度不飽和脂肪酸エステルの精製方法である。
【００１２】
さらに、本発明は、ω−３系高度不飽和脂肪酸を含有する長鎖脂肪酸と低級アルコールとから構成される脂肪酸エステルを、リパーゼを用いて直鎖高級アルコールと選択的アルコリシス反応させ、得られる反応産物から脂肪酸エステルを分画し、リパーゼを用いて再度直鎖高級アルコールと選択的アルコリシス反応させることを特徴とするω−３系高度不飽和脂肪酸エステルの精製方法である。
【００１３】
リパーゼとしては、例えばリゾムコール属又はリゾプス属に属する微生物由来のものが挙げられ、ω−３系高度不飽和脂肪酸を含有する長鎖脂肪酸としては魚油由来のものが挙げられ、ω−３系高度不飽和脂肪酸としてはドコサヘキサエン酸が挙げられ、脂肪酸エステルとしてはエチルエステルが挙げられる。
【００１４】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１５】
【発明の実施の形態】
本発明に使用する高度不飽和脂肪酸含有油脂原料は、海産動物油、例えばマグロ、カツオ、イワシ、サバ、サンマ、アジ、イカ又はタラ等から得られる魚油がEPA、DHAを多く含むため好ましい。魚油の抽出方法としては、マグロ若くはカツオの頭部、又はイワシ、サバ、サンマ若くはアジの全魚体、又はイカ若しくはタラの肝臓を採取し、これを煮取り抽出、溶剤抽出、圧搾抽出する方法等が挙げられる。
【００１６】
本発明において、精製の対象となる高度不飽和脂肪酸としては、少なくとも４〜６個の二重結合を有する脂肪酸であって、鎖式構造のメチル基末端から３番目の位置から二重結合が始まっているω−３系高度不飽和脂肪酸、例えばEPAやDHA等が挙げられる。
【００１７】
抽出した魚油は、アルカリ触媒等を用いて低級アルコール存在下でエステル化する。低級アルコールとしては、例えば炭素数１〜４のものが挙げられる。そして、脂肪酸エステルとなったものを、尿素付加による方法、又は分子蒸留若しくは精密蒸留等の蒸留法等により高度不飽和脂肪酸を所望の含有量に粗濃縮する。
【００１８】
次に、前記脂肪酸エステルを用いて選択的アルコリシス反応（以下「アルコリシス反応」という）を行う。
アルコリシス反応に使用するリパーゼとしては、リゾムコール属（Rhizomucor属）に属する微生物、好ましくはリゾムコール・ミーハイ（Rhizomucor miehei）が産生するリパーゼ（ノボノルディスク（株）製、Lipozyme IM ）、あるいはリゾプス属（Rhizopus属）に属する微生物、好ましくはリゾプス・デレマー（Rhizopus delemar）が生産するリパーゼ（田辺製薬（株）製、タリパーゼ原末120,000U/g）等が挙げられる。
【００１９】
リパーゼの使用形態については、そのまま使用しても固定化剤に固定して使用してもよく、特に制限されるものではないが、固定化剤（例えば、アクリル樹脂、イオン交換樹脂、セラミックス担体、セライト等）に固定して使用することが、リパーゼが安定化され、繰り返し反応や長時間の連続使用を行っても再現性よく酵素活性が維持できる点で好ましい。
【００２０】
リパーゼの使用量は、その活性や所望の高度不飽和脂肪酸の濃縮度によっても異なるが、適宜決定すればよく、特に制限されるものではない。例えば、リゾムコール・ミーハイ（Rhizomucor miehei）が産生する、イオン交換樹脂に固定化されたリパーゼ（ノボノルディスク（株）製、Lipozyme IM ）、又はリゾプス・デレマー（Rhizopus delemar）が産生する、セライト若しくはセラミックス担体で固定化したリパーゼ（田辺製薬（株）製、タリパーゼ原末120,000U/g）を用いたときは、反応混液の0.1〜50%（重量%、以下同様）、好ましくは0.5〜10%が適量である。
【００２１】
アルコリシス反応を行なうための反応混液中の脂肪酸エステルと直鎖高級アルコールとの原料比（モル比）は、1:1〜1:20、好ましくは1:2〜1:10程度で行なわれる。また、水分量については、固定化リパーゼに対して０〜200%、好ましくは０〜100%が適量である。なお、直鎖高級アルコールとしては、例えば炭素数８〜18のものが挙げられる。
【００２２】
アルコリシス反応は、通常行なわれているリパーゼ反応の条件で行なってよい。即ち、上記リパーゼを用いて、10〜70℃（10℃未満ではリパーゼの反応速度が遅くなり、70℃を超えるとリパーゼの失活が著しい。）、好ましくは15〜60℃の温度条件で、脂肪酸エステルの酸化的劣化を防止するため窒素気流下で、１〜72時間、好ましくは１〜30時間行なう。
なお、エステル化反応をバッチ法で行なう場合は、静置しても反応が進行するが、撹拌した方が好ましい。
【００２３】
一回のリパーゼ処理により、所望の高度不飽和脂肪酸を含む脂肪酸エステル画分を得ることができるが、更に高純度化を望む場合には、一回目の反応によって得られた高度不飽和脂肪酸エステルを、前記と同様の条件下で再度アルコリシス反応を繰り返せばよい。すなわち、一回目のアルコリシス反応により得られる反応産物から脂肪酸エステルを分画し、この脂肪酸エステル画分を、リパーゼを用いて再度直鎖高級アルコールとアルコリシス反応させ、脂肪酸エステル画分を分取する。その結果、更に高純度に高度不飽和脂肪酸エステルを精製することができる。
【００２４】
また、アルコリシス反応を連続的に反応させるため、固定化リパーゼを充填したカラム法を用いても行なうことができる。
アルコリシス反応後は、反応混液からリパーゼおよび水分を除去し、油分のみの混合物をキャピラリーガスクロマトグラフィーにより分析する。
本発明において、リパーゼによる脂肪酸エステルのアルコール交換率は、次式Ｉ：
0003773315.tif 000002
【００２５】
によって算出することができる。
上記のアルコール交換率を算出することによって、高度不飽和脂肪酸を含む脂肪酸エステル画分の収率を求めることができる。例えば、アルコール交換率が60%の場合には、脂肪酸エステル画分の収率は、100%から60%を差し引いた値（40%）となる。
【００２６】
このようにして行なったアルコリシス反応後の反応混液中には、高度不飽和脂肪酸が高純度に精製された脂肪酸エステル画分、生成したワックスエステル画分、交換された低級アルコール、及び未反応の高級アルコールが含まれている。したがって、脂肪酸エステル画分を分取するためには、ワックス及びアルコールを除去し精製する必要がある。
脂肪酸エステル画分を分取する方法としては、溶剤液−液分配による方法、クロマトグラフィーによる方法、低温結晶化分別による方法、蒸留による方法等が挙げられる。
【００２７】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明は、これら実施例にその技術的範囲を限定するものではない。
【００２８】
〔実施例１〕
カツオ油を、ナトリウムエチラートを触媒としてエタノール中でエチルエステル化反応させ、カツオ油エチル（DHA 22.7%,EPA9.2%）を得た。このカツオ油エチル5gを原料として、ラウリルアルコール7gを加え（モル比1:2）、リゾムコール・ミーハイ（Rhizomucor miehei）の固定化リパーゼ（ノボノルディスク（株）製、Lipozyme IM ）0.5gを加えて、140振とう／分（振幅6cm）で往復振とうしながら、30℃で24時間アルコリシス反応を行った。このときのアルコール交換率を測定するため、反応混液中のワックスエステルおよび脂肪酸エチルエステルの組成をキャピラリーガスクロマトグラフィーにより分析した。得られた値に基づいて式Ｉによりアルコール交換率を算出した。その結果、アルコール交換率は58.6%であった。そのときの未反応の脂肪酸エチルエステル画分中の脂肪酸組成は、DHA46.3%、EPA10.4%であり、DHAの回収率は86.0%であった。反応混液中の酸価を測定したところ3.8であり、加水分解反応はほとんど起こらなかった。
【００２９】
〔実施例２〕
実施例１で得られた反応混液10g をシリカゲル（ワコーゲルC-200 、和光純薬（株）製）750gを充填したカラム（ガラス製、内径60mm×長さ1,000 mm) に供して、ヘキサン５L 、ヘキサン−ベンゼン(85:15) ５L 、ヘキサン−ジエチルエーテル(95:5) 10L、ヘキサン−ジエチルエーテル(85:15) 15L の順に25ml/分の流速で連続的に流下し、各フラクションごとに集めた。集めたフラクションのうち、ヘキサン−ジエチルエーテル(95:5)フラクションについて、ロータリーエバポレーターにより溶剤を留去することによって、脂肪酸エチルエステル画分（DHA 46.3%,EPA 10.4% ）を得た。これを原料として、ラウリルアルコール3.5gを加え（モル比1:2)、リゾムコール・ミーハイ（Rhizomucor miehei）の固定化リパーゼ（ノボノルディスク（株）製、Lipozyme IM ）0.25g を加え、140振とう／分（振幅6cm）で往復振とうしながら、再度24時間のアルコリシス反応（30℃) を行った。このときのアルコール交換率を実施例１と同様にして算出した結果、41.3%であった。そのときの未反応の脂肪酸エチルエステル画分中の脂肪酸組成は、DHA70.3%、EPA 9.5%であり、DHAの回収率は80.2%であった。反応混液中の酸価を測定したところ2.1であり、加水分解反応はほとんど起こらなかった。
【００３０】
〔実施例３〕
カツオ油を、ナトリウムエチラートを触媒としてエタノール中でエチルエステル化反応させてカツオ油エチルを得、さらに分子蒸留機を用いてDHAおよびEPAを粗濃縮した高度不飽和脂肪酸エチル（DHA44.9%,EPA12.5%）を得た。この高度不飽和脂肪酸エチル5gを原料として、ラウリルアルコール7gを加え（モル比1:2）、リゾムコール・ミーハイ（Rhizomucor miehei）の固定化リパーゼ（ノボノルディスク（株）製、Lipozyme IM ）0.5gを加えて、140振とう／分（振幅6cm）で往復振とうしながら、30℃で24時間アルコリシス反応を行った。このときのアルコール交換率を実施例１と同様にして算出した結果、42.8%であった。そのときの未反応の脂肪酸エチルエステル画分中の脂肪酸組成は、DHA 68.2%、EPA 12.5%であり、DHAの回収率は82.9%であった。反応混液中の酸価を測定したところ3.3であり、加水分解反応はほとんど起こらなかった。
【００３１】
〔実施例４〕
カツオ油を、ナトリウムエチラートを触媒としてエタノール中でエチルエステル化反応させてカツオ油エチルを得、さらに尿素付加による方法および分子蒸留機を用いた方法によりDHAおよびEPAを粗濃縮した高度不飽和脂肪酸エチル（DHA69.5%,EPA6.9%）を得た。この高度不飽和脂肪酸エチル5gを原料として、ラウリルアルコール7g を加え（モル比1:2）、リゾムコール・ミーハイ（Rhizomucor miehei）の固定化リパーゼ（ノボノルディスク（株）製、Lipozyme IM ）0.5gを加えて、140振とう／分（振幅6cm）で往復振とうしながら、30℃で24時間アルコリシス反応を行った。このときのアルコール交換率を実施例１と同様にして算出した結果、30.5%であった。未反応の脂肪酸エチルエステル画分中の脂肪酸組成はDHA89.3%、EPA5.5%であり、DHAの回収率は73.2%であった。反応混液中の酸価を測定したところ3.1であり、加水分解反応はほとんど起こらなかった。
【００３２】
〔実施例５〕
カツオ油を、ナトリウムエチラートを触媒としてエタノール中でエチルエステル化反応させてカツオ油エチル（DHA22.7 %,EPA9.2%）を得た。このカツオ油エチル5gを原料として、ラウリルアルコール7gを加え（モル比1:2）、セラミックス担体（日本ガイシ（株）、SM-10）で固定化したリゾプス・デレマー（Rhizopus delemar）のリパーゼ（田辺製薬（株）製、タリパーゼ原末120,000U/g））0.5gおよび蒸留水0.1mlを加えて、140振とう／分（振幅6cm）で往復振とうしながら、30℃で24時間アルコリシス反応を行った。このときのアルコール交換率を実施例１と同様にして算出した結果、51.8%であった。未反応の脂肪酸エチルエステル画分中の脂肪酸組成はDHA44.1%、EPA14.5%であり、DHAの回収率は93.6%であった。反応混液中の酸価を測定したところ3.8であり、加水分解反応はほとんど起こらなかった。
【００３３】
〔実施例６〕
実施例５で得られた反応混液10g をシリカゲル（ワコーゲルC-200 、和光純薬（株）製）750gを充填したカラム（ガラス製、内径60mm×長さ1,000 mm) に供して、ヘキサン５L 、ヘキサン−ベンゼン(85:15) ５L 、ヘキサン−ジエチルエーテル(95:5) 10L、ヘキサン−ジエチルエーテル(85:15) 15L の順に25ml/分の流速で連続的に流下し、各フラクションごとに集めた。集めたフラクションのうち、ヘキサン−ジエチルエーテル(95:5)フラクションについて、ロータリーエバポレーターにより溶剤を留去することによって、脂肪酸エチルエステル画分（DHA 44.1%,EPA 14.5% ）2.7gを得た。このうちの2.5gを原料として、ラウリルアルコール3.5gを加え（モル比1:2)、セラミックス担体（日本ガイシ（株）、SM-10）で固定化したリゾプス・デレマー（Rhizopus delemar）のリパーゼ（田辺製薬（株）製、タリパーゼ原末120,000U/g））0.25g および蒸留水を加え、140振とう／分（振幅6cm）で往復振とうしながら、再度24時間のアルコリシス反応（30℃）を行った。このときのアルコール交換率を実施例１と同様にして算出した結果、31.9%であった。未反応の脂肪酸エチルエステル画分中の脂肪酸組成は、DHA 60.3% 、EPA 18.5% であり、DHAの回収率は94.2%であった。反応混液中の酸価を測定したところ2.8であり、加水分解反応はほとんど起こらなかった。
【００３４】
〔実施例７〕
カツオ油を、ナトリウムエチラートを触媒としてエタノール中でエチルエステル化反応させてカツオ油エチルを得、さらに分子蒸留機を用いてDHAおよびEPAを粗濃縮した高度不飽和脂肪酸エチル（DHA44.9%，EPA9.2%）を得た。この高度不飽和脂肪酸エチル5gを原料として、ラウリルアルコール7gを加え（モル比1:2）、セラミックス担体（日本ガイシ（株）、SM-10）で固定化したリゾプス・デレマー（Rhizopus delemar）のリパーゼ（田辺製薬（株）製、タリパーゼ原末120,000U/g））0.5gおよび蒸留水0.1mlを加えて、140振とう／分（振幅6cm）で往復振とうしながら、30℃で24時間アルコリシス反応を行った。このときのアルコール交換率を実施例１と同様にして算出した結果、32.4%であった。未反応の脂肪酸エチルエステル画分中の脂肪酸組成はDHA62.3%、EPA15.0%であり、DHAの回収率は93.9%であった。反応混液中の酸価を測定したところ3.5であり、加水分解反応はほとんど起こらなかった。
【００３５】
〔実施例８〕
カツオ油を、ナトリウムエチラートを触媒としてエタノール中でエチルエステル化反応させてカツオ油エチルを得、さらに尿素付加による方法および分子蒸留機を用いた方法により、DHAおよびEPAを粗濃縮した高度不飽和脂肪酸エチルエステル（DHA69.5%,EPA6.9%）を得た。この高度不飽和脂肪酸エチルエステル5gを原料として、ラウリルアルコール7gを加え（モル比1:2）、セラミックス担体（日本ガイシ（株）、SM-10）で固定化したリゾプス・デレマー（Rhizopus delemar）のリパーゼ（田辺製薬（株）製、タリパーゼ原末120,000U/g））0.5gおよび蒸留水0.1mlを加えて、140振とう／分（振幅6cm）で往復振とうしながら、30℃で24時間アルコリシス反応を行った。このときのアルコール交換率を実施例１と同様にして算出した結果、17.6%であった。未反応の脂肪酸エチルエステル画分中の脂肪酸組成はDHA84.8%、EPA6.8%であり、DHAの回収率は99.3%であった。反応混液中の酸価を測定したところ3.3であり、加水分解反応はほとんど起こらなかった。
【００３６】
〔実施例９〕
カツオ油を、ナトリウムエチラートを触媒としてエタノール中でエチルエステル化反応させてカツオ油エチル（DHA22.7 %,EPA9.2%）を得た。このカツオ油エチル1.5gを原料として、ラウリルアルコール10.5gを加え（モル比1:10）、リゾムコール・ミーハイ（Rhizomucor miehei）の固定化リパーゼ（ノボノルディスク（株）製、Lipozyme IM ）0.5gを加えて、140振とう／分（振幅6cm）で往復振とうしながら、30℃で24時間アルコリシス反応を行った。このときのアルコール交換率を実施例１と同様にして算出した結果、78.6%であった。未反応の脂肪酸エチルエステル画分中の脂肪酸組成はDHA74.2%、EPA 6.4%であり、DHAの回収率は70.0%であった。反応混液中の酸価を測定したところ2.2であり、加水分解反応はほとんど起こらなかった。
【００３７】
〔実施例１０〕
カツオ油を、ナトリウムエチラートを触媒としてエタノール中でエチルエステル化反応させてカツオ油エチル（DHA22.7 %,EPA9.2%）を得た。このカツオ油エチル1.5gを原料として、ラウリルアルコール10.5g を加え（モル比1:10）、セラミックス担体（日本ガイシ（株）、SM-10）で固定化したリゾプス・デレマー（Rhizopus delemar）のリパーゼ（田辺製薬（株）製、タリパーゼ原末120,000 U/g））0.5gおよび蒸留水0.1mlを加えて、140振とう／分（振幅6cm）で往復振とうしながら、30℃で24時間アルコリシス反応を行った。このときのアルコール交換率を実施例１と同様にして算出した結果、61.7%であった。未反応の脂肪酸エチルエステル画分中の脂肪酸組成はDHA53.4%、EPA16.3%であり、DHAの回収率は90.1%であった。反応混液中の酸価を測定したところ2.4であり、加水分解反応はほとんど起こらなかった。
【００３８】
〔実施例１１〕
カツオ油を、ナトリウムエチラートを触媒としてエタノール中でエチルエステル化反応させてカツオ油エチルを得、さらに尿素付加による方法および分子蒸留機を用いた方法により、DHAおよびEPAを粗濃縮した高度不飽和脂肪酸エチル（DHA61.1%,EPA8.3%）を得た。この高度不飽和脂肪酸エチル875gを原料として、ラウリルアルコール1225g を加え（モル比1:2）、リゾムコール・ミーハイ（Rhizomucor miehei）の固定化リパーゼ（ノボノルディスク（株）製、Lipozyme IM ）80gを加えて、140rpmで撹拌しながら30℃で実施例１のスケールアップ実験を行った。
【００３９】
反応混液を経時的にサンプリングして、アルコール交換率、未反応の脂肪酸エチルエステル画分中のDHAおよびEPA含量、DHAの回収率をキャピラリーガスクロマトグラフィーにより分析して下記の通り算出した（表１）。
【００４０】
【表１】
0003773315.tif 000003
【００４１】
各サンプルの反応混液中の酸価を測定したところ3.0以下であり、加水分解反応はほとんど起こらなかった。
【００４２】
〔実施例１２〕
カツオ油を、ナトリウムエチラートを触媒としてエタノール中でエチルエステル化反応させてカツオ油エチルを得、さらに尿素付加による方法および分子蒸留機を用いた方法により、DHAおよびEPAを粗濃縮した高度不飽和脂肪酸エチル（DHA61.1%,EPA8.3%）を得た。この高度不飽和脂肪酸エチル875gを原料として、ラウリルアルコール1225g を加えて、リゾムコール・ミーハイ（Rhizomucor miehei）の固定化リパーゼ（ノボノルディスク（株）製、Lipozyme IM ）80gを加えて、140rpmで撹拌しながら、30℃で15時間アルコリシス反応を行った。この反応を30回まで繰り返して行ったときのアルコール交換率、未反応の脂肪酸エチルエステル画分中のDHAおよびEPA含量並びにDHAの回収率をキャピラリーガスクロマトグラフィーにより分析して算出した（表２）。
【００４３】
【表２】
0003773315.tif 000004
【００４４】
各サンプルの反応混液中の酸価を測定したところ3.0以下であり、加水分解反応はほとんど起こらなかった。
〔実施例１３〕
実施例10の繰り返し反応で得られたアルコリシス反応混液10.0kgについて、真空精留装置（日本真空技術（株）、形式;FJ2900）を用いて反応混液中のラウリルアルコール（エタノールも含む）、ワックスエステルおよび脂肪酸エチルエステル画分の分離実験を行った。
【００４５】
固定化リパーゼを除去した反応混液を1torrに保った真空タンクに仕込み、十分に脱ガスを行ってから、0.1torrの真空に保った薄膜式蒸留タンクに20L/hrの割合で供給した。蒸留タンク内の蒸発面の温度は115〜118℃とし、5.1kgの初留分を得た。
【００４６】
薄膜式蒸留の凝縮液を精留塔の塔底部に導入し、精留塔内の真空度が0.1torr、塔底温度が150〜153℃になるように操作した。精留塔の理論段数は３段とし、塔頂部分を還流比1:2で還流し、主留分として1.9kgの脂肪酸エチルエステル画分を得た。また、塔底部から2.9kgの凝縮液を取り出した。
【００４７】
それぞれの画分をイヤトロスキャンおよびキャピラリーガスクロマトグラフィーにより分析したところ、初留中のラウリルアルコール純度は98.1%であり、主留中のエチルエステル（脂肪酸組成中、DHA84.8%, EPA3.9% であった。）は97.8%であった。なお、主留中の2.2%の不純物はワックスエステルであった。また、凝縮液はワックスエステルが99.1%であった。
このように、真空精留装置を用いることにより、反応混液から未反応のエチルエステル画分を効率的に分離することができた。このとき、初発エチルエステル原料中のDHA含量に対するのDHA回収率は62.4%であった。
【００４８】
〔実施例１４〕
カツオ油を、ナトリウムエチラートを触媒としてエタノール中でエチルエステル化反応させてカツオ油エチルを得、さらに尿素付加による方法および分子蒸留機を用いた方法により、DHAおよびEPAを粗濃縮した高度不飽和脂肪酸エチル（DHA61.1%,EPA8.3%）を得た。これにラウリルアルコールを３倍モル量になるように加えた混合物200gを原料として、30℃の条件下で、ガラスカラム（26mm×100mm）にリゾムコール・ミーハイ（Rhizomucor miehei）の固定化リパーゼ（ノボノルディスク（株）製、Lipozyme IM ）8gを充填した連続リアクター（ベットボリューム26mm×45mm）を下記の流速で運転した。
それぞれ反応混液中のアルコール交換率、未反応の脂肪酸エチルエステル画分中のDHAおよびEPA含量、DHAの回収率をキャピラリーガスクロマトグラフィーにより分析して下記の通り算出した（表３）。
【００４９】
【表３】
0003773315.tif 000005
【００５０】
各サンプルの反応混液中の酸価を測定したところ3.0以下であり、加水分解反応はほとんど起こらなかった。
【００５１】
〔実施例１５〕
カツオ油を、ナトリウムエチラートを触媒としてエタノール中でエチルエステル化反応させてカツオ油エチルを得、さらに尿素付加による方法および分子蒸留機を用いた方法により、DHAおよびEPAを粗濃縮した高度不飽和脂肪酸エチル（DHA61.1%,EPA8.3%）を得た。これにラウリルアルコールを３倍モル量になるように加えた混合物を原料として、30℃の条件下で、ガラスカラム（26mm×100mm）にリゾムコール・ミーハイ（Rhizomucor miehei）の固定化リパーゼ（ノボノルディスク（株）製、Lipozyme IM ）8gを充填した連続リアクター（ベットボリューム26mm×45mm）を8.9ml/hの流速で90日間連続運転した。
【００５２】
この反応の反応混液を経時的にサンプリングして、アルコール交換率、未反応の脂肪酸エチルエステル画分中のDHAおよびEPA含量並びにDHAの回収率をキャピラリーガスクロマトグラフィーにより分析し、下記の通り算出した（表４）。
【００５３】
【表４】
0003773315.tif 000006
【００５４】
各サンプルの反応混液中の酸価を測定したところ3.0以下であり、加水分解反応はほとんど起こらなかった。
本実施例に示した通り、カラム式の連続リアクターを用いてもバッチ式反応で行ったものとほぼ同様な値が得られた。連続運転を90日間行っても酵素に顕著な失活は見られず、連続リアクター法でも十分に効率的なアルコリシス反応が行えることがわかった。
【００５５】
【発明の効果】
本発明により、ω−３系高度不飽和脂肪酸エステルの精製方法が提供される。本発明は、ω−３系高度不飽和脂肪酸エステルを収率よく高純度に精製できるため、医薬品、生化学試薬の創薬等に有用である。