(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１０又は１７に示されるアミノ酸配列からなるペプチド。
【請求項２】
配列番号１０又は１７に示されるアミノ酸配列からなるペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項３】
請求項１記載のペプチドと、マーカータンパク質及び／又はペプチドタグとを結合させた融合ペプチド。
【請求項４】
請求項１記載のペプチドに特異的に結合する抗体。
【請求項５】
抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項４記載の抗体。
【請求項６】
請求項１記載のペプチドを発現することができる発現系を含んでなる宿主細胞。
【請求項７】
被検物質と、請求項１記載のペプチドと、ＨＩＶ−１感受性細胞と、ＨＩＶ−１とを用い、該ＨＩＶ−１感受性細胞におけるＨＩＶ−１の細胞傷害活性を測定・評価することを特徴とするＨＩＶ−１感染抑制促進又は抑制阻害物質のスクリーニング方法。
【請求項８】
被検ペプチドを発現するベクターをトランスフェクトしたＨＩＶ−１感受性細胞と、請求項１記載のペプチドと、ＨＩＶ−１とを用い、該ＨＩＶ−１感受性細胞におけるＨＩＶ−１の細胞傷害活性を測定・評価することを特徴とするＨＩＶ−１感染抑制促進又は抑制阻害物質のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＨＩＶ−１（ヒト免疫不全ウイルス・タイプ１）感染抑制作用を有する新規アンチセンスペプチド、特にＨＩＶ−１のｇｐ４１におけるアミノ酸配列をもつ合成ペプチドＴ２０のアンチセンスペプチド及びかかるアンチセンスペプチドを有効成分として含有するＨＩＶ−１感染抑制剤等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ペプチドは、二重ラセン構造をとる二本鎖ＤＮＡのうちの一方のセンスＤＮＡから読み取られるが、それと相補的に対になっている方のＤＮＡをアンチセンスＤＮＡと呼び、それによってコ−ドされるペプチドはアンチセンスペプチドと呼ばれている。Blalock とSmith は、アンチセンスＤＮＡによりコ−ドされるペプチドの疎水性パタ−ンと本来のペプチド（センスペプチド）のそれとの間に、相互に逆の値を示す逆相関があることを報告している（BBRC 121: 203-207, 1984、Trends.Biothech. 6: 140-144, 1991）。アミノ酸の遺伝情報は、３個の塩基からなるコドンに暗号化され、そのコドンと相補的関係にあるアンチコドンでコ−ドされるアミノ酸（アンチセンスアミノ酸）をアミノ酸（センスアミノ酸）と比較すると、親水性のアミノ酸に対するアンチセンスアミノ酸は疎水性のアミノ酸となり、わずかに親水性のアミノ酸に対するアンチセンスアミノ酸はわずかに疎水性である。アンチセンスコドンからのアミノ酸への翻訳を５′側から読む代わりに３′側から読んでも、アンチセンスアミノ酸の性格はほとんど変らない。このことが、センスペプチドとアンチセンスペプチドの疎水性パタ−ンが逆になる理由とされている。各アミノ酸と対応するアンチセンスアミノ酸を表１に示す。
【０００３】
【表１】
0003819226.tif 000002
【０００４】
センスペプチドとアンチセンスペプチドが相互作用をする現象がしばしば観察されている。ペプチドの立体構造が溶媒の水に対して逆になると理解すると、立体構造が相補的になると考えることができる。このセンスペプチドとアンチセンスペプチドによる相互反応性を基盤とした「分子認識理論」がBlalock らによつて提唱されたが、この相互作用における分子レベルの機序はいまだに不明な点が多い。近年、タンパク質の生理活性等を解析するために、タンパク質分子内や、リガンドとそのレセプタ−等の対応関係にあるタンパク質間において、かかるセンス−アンチセンスの関係にあるＤＮＡ配列を検索することが行われている。しかしながら、アミノ酸をコ−ドするＤＮＡのコドンは３つの核酸塩基から構成され、一つのアミノ酸をコ−ドするコドンは複数あるため、アンチセンスアミノ酸としては複数のアミノ酸があることになる。従って検索の際、アミノ酸レベルで比較すればアンチセンスアミノ酸に該当する場合でも核酸レベルで比較した場合にはアンチセンス部分であると判断されない場合が多い。
【０００５】
本発明者らは、センスペプチド・アンチセンスペプチドの関係は塩基配列レベルでの相補性は必要条件ではなく、アミノ酸レベルでの対応があれば蛋白質レベルでのペプチド相互反応には十分であると考え、先にアミノ酸レベルにおけるタンパク質分子内センス−アンチセンス関係領域の検索方法を提供した。そして、この方法が、あるタンパク質に対して特異的に作用する生理活性ペプチドを設計するのに有力な手段になりうることを明らかにした（特開平９−２４１２９７号公報）。
【０００６】
他方、抗ＨＩＶ−１活性を有する多くのペプチド抑制剤が既に報告されている（Cell 89: 263-273, 1997、Cell 93: 681-684, 1998、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 95: 15613-15617, 1998、Cell 99: 103-115, 1999、Nat.Med. 4: 1302-1307, 1998、J.Virol. 72: 9763-9770, 1998、Cell 99: 243-246, 1999）。しかし、本発明のＨＩＶ−１感染抑制作用を有するアンチセンスペプチドは知られていなかった。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、ＨＩＶ−１感染抑制作用を有する新規アンチセンスペプチド、特にＨＩＶ−１のｇｐ４１におけるアミノ酸配列をもつ合成ペプチドＴ２０ペプチドのアンチセンスペプチド及び該アンチセンスペプチドを有効成分とするＨＩＶ感染抑制剤等を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために、ＨＩＶ−１のエンベロープグリコプロテインｇｐ１６０分子内でセンス−アンチセンスペプチドの関係にあるペプチドを幅広く検索し、１００をはるかに超える候補アンチセンスペプチドを見い出し、そのすべてについて合成ペプチドを作製し、作製したすべての合成ペプチドについて実際にＨＩＶ感染抑制作用の有無を調べたが、有意にＨＴＬＶ−ＩＩＩＢ系統（ＨＩＶ−１IIIB）感染抑制作用を示すものは見い出すことができなかった。そこで、候補アンチセンスペプチドの中でも、ＨＩＶ−１のｇｐ４１におけるアミノ酸配列を持つ合成ペプチドであり、ＨＩＶ−１感染に対して強力な抑制機能を持つことが示されているＴ２０領域内のアミノ酸配列に対するアンチセンスペプチドのＮ末端及びＣ末端にフランキングアミノ酸配列を付加修飾したペプチドを種々合成し、それら修飾ペプチドについて実際にＨＩＶ感染抑制作用の有無を調べた結果、１０μｇ／ｍｌでＨＩＶ−１IIIB感染抑制作用を有する修飾ペプチドが存在することを見い出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち本発明は、配列番号１０又は１７に示されるアミノ酸配列からなるペプチド（請求項１）や、配列番号１０又は１７に示されるアミノ酸配列からなるペプチドをコードするＤＮＡ（請求項２）や、請求項１記載のペプチドと、マーカータンパク質及び／又はペプチドタグとを結合させた融合ペプチド（請求項３）や、請求項１記載のペプチドに特異的に結合する抗体（請求項４）や、抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項４記載の抗体（請求項５）や、請求項１記載のペプチドを発現することができる発現系を含んでなる宿主細胞（請求項６）や、被検物質と、請求項１記載のペプチドと、ＨＩＶ−１感受性細胞と、ＨＩＶ−１とを用い、該ＨＩＶ−１感受性細胞におけるＨＩＶ−１の細胞傷害活性を測定・評価することを特徴とするＨＩＶ−１感染抑制促進又は抑制阻害物質のスクリーニング方法（請求項７）や、被検ペプチドを発現するベクターをトランスフェクトしたＨＩＶ−１感受性細胞と、請求項１記載のペプチドと、ＨＩＶ−１とを用い、該ＨＩＶ−１感受性細胞におけるＨＩＶ−１の細胞傷害活性を測定・評価することを特徴とするＨＩＶ−１感染抑制促進又は抑制阻害物質のスクリーニング方法（請求項８）に関する。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明の対象となるペプチドとしては、ＨＩＶ−１のｇｐ１６０内のアミノ酸配列、例えばＨＩＶ−１のｇｐ１６０内のｇｐ４１内のＴ２０領域内のアミノ酸配列に対してアンチセンスペプチドとなる分子内ペプチド配列を、所定数のアミノ酸をペプチドフレ−ムの長さとしてセットし、アンチセンスアミノ酸として所定割合以上のマッチングのペプチドとして検索することにより得られるＨＩＶ−１感染抑制作用を有するペプチド、例えば、８アミノ酸をペプチドフレ−ムの長さとしてセットし、アンチセンスアミノ酸として７５％以上のマッチングのペプチドとして検索することにより得られるＨＩＶ−１感染抑制作用を有するペプチドや、上記検索して得られるペプチドをさらに修飾することにより得られるＨＩＶ−１感染抑制作用を有するペプチドを例示することができる。ここで、検索することにより得られるＨＩＶ−１感染抑制作用を有するペプチドとは、検索することにより直接得られる候補アンチセンスペプチドであって、かつＨＩＶ−１感染抑制作用を有するペプチドをいい、また、検索して得られるペプチドをさらに修飾することにより得られるＨＩＶ−１感染抑制作用を有するペプチドとは、検索することにより直接得られる候補アンチセンスペプチドを構成するアミノ酸配列に欠失、置換、付加等の修飾を施した修飾ペプチドであって、かつＨＩＶ−１感染抑制作用を有するペプチドをいう。かかる修飾としては、候補アンチセンスペプチドを構成するアミノ酸配列のＮ末側及び／又はＣ末側に１〜１０個、好ましくは３〜５個、より好ましくは４個のフランキングアミノ酸配列を付加する付加修飾を好適に例示することができ、ここで、フランキングアミノ酸配列とは、例えば配列番号１又は９に示されるアミノ酸配列のＮ末側及び／又はＣ末側に隣接して存在するアミノ酸配列をいう。また、上記ＨＩＶ−１感染抑制作用とは、ＨＩＶ−１感受性細胞、すなわち、Ｔ細胞株等の通常ＨＩＶ−１が感染することができる細胞に対するＨＩＶ−１の感染を抑制・阻害する作用をいう。
【００１３】
上記候補アンチセンスペプチドの検索対象となるＨＩＶ−１系統は特に制限されるものでなく、ＢＨ１０（IIIＢ）株、ＭＮ株、１ＢＲ株、ＡＲＶ／ＳＦ２株、ＢＨ８株、ＢＲＵ株、ＣＤＣ−４５１株、ＥＬＩ株、ＨＸＢ２株、ＨＸＢ３株、ＪＨ３株、ＪＲＣＦＳ株、ＫＢ−１株、ＬＷ１２．３株、ＭＡＬ株、ＭＦＡ株、ＮＤＫ株、ＯＹＩ株、ＰＶ２２株、ＲＦ／ＨＡＴ株、ＳＣ株、ＳＦ１６２株、ＳＦ３３株、ＷＭＪ１株、ＷＭＪ２株、ＹＵ−２株、Ｚ−８４株、Ｚ２／ＣＤＣ−Ｚ３４株、Ｚａｉｒｅ  ６株、Ｚａｉｒｅ  ＨＺ３２１株等を例示することができる。そして、特定のＨＩＶ−１株に見い出されたアンチセンスペプチド領域に相当する他のＨＩＶ−１株の領域を候補アンチセンスペプチド領域とすることもできる。
【００１４】
本発明の対象となるペプチドの具体例としては、ＨＩＶ−１系統としてＨＩＶ−１IIIBを検索対象としたときに見い出された、配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるペプチド（ＴＡ−１）にアミノ酸付加修飾した配列表の配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなるペプチド（ＴＡ−１Ｌ）や、同じく配列表の配列番号９に示されるアミノ酸配列からなるペプチド（ＴＡ−９）にアミノ酸付加修飾した配列表の配列番号１６に示されるアミノ酸配列からなるペプチド（ＴＡ−９Ｌ）を挙げることができる。上記アミノ酸付加修飾は、具体的には、配列番号１又は９に示されるアミノ酸配列の両側に各４個のアミノ酸残基からなるフランキングアミノ酸配列を付加することにより行われたものである。
【００１５】
また、本発明の対象となるペプチドとして、上記配列番号１０又は１６に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＨＩＶ−１感染抑制作用を有するペプチドを例示することができ、具体的には配列番号１０に示されるアミノ酸配列の２番目のアミノ酸であるバリン（Val）がグルタミン酸（Glu）に置換した配列番号１７に示されるアミノ酸配列からなるＨＩＶ−１MN由来のペプチド（ＴＡ−１ＬMN）を例示することができる。なお、これら本発明の対象となるペプチドを総称して、以下「本件アンチセンスペプチド」という場合がある。
【００１６】
本件アンチセンスペプチドは、前記のように、ＨＩＶ−１のｇｐ１６０内のアミノ酸配列、例えばＨＩＶ−１のｇｐ４１におけるＴ２０（配列番号１８）内の部分アミノ酸配列に対しアンチセンスペプチドとなる分子内ペプチド配列を、４〜２０アミノ酸、好ましくは６〜１０アミノ酸、より好ましくは８アミノ酸をペプチドフレ−ムの長さとしてセットし、ＨＩＶ−１のｇｐ１６０（GenBank ACCESSION M15654）分子内のアミノ酸配列について、アンチセンスアミノ酸として６０％以上、好ましくは７５％以上のマッチングの候補アンチセンスペプチドを検索し、かかる候補アンチセンスペプチドにおけるＨＩＶ−１感染抑制作用を確認することにより得ることができる。かかる検索には、例えば、本発明者らにより既に報告されている（Nat.Med. 1, 1995, 894-901、J.Immunol. 157, 1996, 4591-4601、Peptides. 19, 1998, 211-223）タンパク質間及びタンパク質内において可能なすべてのセンス−アンチセンスアミノ酸ペアを見い出すことができるように設計されたコンピュータープログラム「ＡＮＴＩＳ」を用いることができる。
【００１７】
上記「ＡＮＴＩＳ」を用いた検索方法についてより具体的に説明する。比較解析すべき２種類のタンパク質１とタンパク質２をセットし（タンパク質分子内でのアンチセンスペプチドを検索するときには２番目の蛋白質も１番目のものと同一のものをセットし）、タンパク質１のＮ末端の任意の数（例えば６〜１０個）のアミノ酸から成るペプチドフレ−ムについて、これをタンパク質２のペプチドフレ−ムにＮ末端から始めてフレ−ムをアミノ酸１個ずつずらしながら順次対応させていく。その各フレ−ムについて、対応するアミノ酸のペアについてセンスアミノ酸−アンチセンスアミノ酸の関係（表１参照）にあるか否かを識別し、各フレ−ムを構成するアミノ酸のうちで定められた数以上（例えば、１０個のアミノ酸のうちで６〜８個以上）のアンチセンスアミノ酸を含むものをアンチセンスペプチドフレ−ムとして取り上げていく。更に、タンパク質２のペプチドフレ−ムをＣ末（カルボキシル末端）から逆に並べた場合についても同様に検索を行う。次いで、タンパク質１のペプチドフレ−ムのアミノ酸を１個分ずらして同様のすべての検索を行い、順次、タンパク質１のフレ−ムを移動させてすべてのセンス・アンチセンスペプチドの組み合わせを拾い上げる（特開平９−２４１２９７号公報参照）。このようにして候補アンチセンスペプチドをスクリーニングすることができる。
【００１８】
本発明の対象となるＤＮＡとしては、配列番号１０又は１６に示されるアミノ酸配列からなるペプチドをコードする各ＤＮＡ、配列番号１０又は１６に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＨＩＶ−１感染抑制作用を有するペプチドをコードするＤＮＡ、配列番号１９又は２０に示される塩基配列又はその相補的配列並びにこれらの配列の一部又は全部を含むＤＮＡを例示することができる。
【００１９】
また、配列番号１９又は２０に示される塩基配列又はその相補的配列並びにこれらの配列の一部又は全部をプローブとして、各種ＨＩＶ−１由来のＤＮＡライブラリーに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションを行ない、該プローブにハイブリダイズするＤＮＡを単離することにより、本件アンチセンスペプチドと同効な目的とするＨＩＶ−１感染抑制作用を有するペプチドをコードするＤＮＡを得ることもできる。かかるＤＮＡを取得するためのハイブリダイゼーションの条件としては、例えば、４２℃でのハイブリダイゼーション、及び１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳを含む緩衝液による４２℃での洗浄処理を挙げることができ、６５℃でのハイブリダイゼーション、及び０．１×ＳＳＣ，０．１％のＳＤＳを含む緩衝液による６５℃での洗浄処理をより好ましく挙げることができる。なお、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を与える要素としては、上記温度条件以外に種々の要素があり、当業者であれば、種々の要素を適宜組み合わせて、上記例示したハイブリダイゼーションのストリンジェンシーと同等のストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００２０】
本発明の融合ペプチドとしては、本件アンチセンスペプチドとマーカータンパク質及び／又はペプチドタグとが結合しているものであればどのようなものでもよく、マーカータンパク質としては、従来知られているマーカータンパク質であれば特に制限されるものではなく、例えば、アルカリフォスファターゼ、抗体のＦｃ領域、ＨＲＰ、ＧＦＰなどを具体的に挙げることができ、また本発明におけるペプチドタグとしては、Ｍｙｃタグ、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、ＧＳＴタグなどの従来知られているペプチドタグを具体的に例示することができる。かかる融合ペプチドは、常法により作製することができ、Ｎｉ−ＮＴＡとＨｉｓタグの親和性を利用した本件アンチセンスペプチドの精製や、本件アンチセンスペプチドと相互作用するタンパク質やペプチドの検出や、本件アンチセンスペプチド等に対する抗体の定量などに用いることができる他、当該分野の研究用試薬としても有用である。
【００２１】
本発明の本件アンチセンスペプチドに特異的に結合する抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体等の免疫特異的な抗体を具体的に挙げることができ、これらは本件アンチセンスペプチド又は本件アンチセンスペプチドと担体との結合物を抗原として用いて常法により作製することができるが、その中でもモノクローナル抗体がその特異性の点で好ましく、かかるモノクローナル抗体等の抗体は、例えば、ＨＩＶ−１感染症の診断、ミサイル療法等の治療に使用しうる可能性があり、またＨＩＶ−１の感染機構を明らかにする上で有用である。
【００２２】
本発明はまた、上記本件アンチセンスペプチドを発現することができる発現系を含んでなる宿主細胞に関する。かかる本件アンチセンスペプチドをコードする遺伝子の宿主細胞への導入は、Davisら（BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, 1986）及びSambrookら（MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989）などの多くの標準的な実験室マニュアルに記載される方法、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、トランスベクション(transvection)、マイクロインジェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレープローディング (scrape loading)、弾丸導入(ballistic introduction)、感染等により行うことができる。そして、上記宿主細胞としては、大腸菌、ストレプトミセス、枯草菌、ストレプトコッカス、スタフィロコッカス等の細菌原核細胞や、酵母、アスペルギルス等の真菌細胞や、ドロソフィラＳ２、スポドプテラＳｆ９等の昆虫細胞や、Ｌ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｃ１２７細胞、ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３細胞（ジヒドロ葉酸レダクターゼやチミジンキナーゼなどを欠損した変異株を含む）、ＢＨＫ２１細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ヒトＴ細胞株等の動物細胞や、植物細胞等を挙げることができる。
【００２３】
また、発現系としては、上記本件アンチセンスペプチドを宿主細胞内で発現させることができる発現系であればどのようなものでもよく、染色体、エピソーム及びウイルスに由来する発現系、例えば、細菌プラスミド由来、酵母プラスミド由来、ＳＶ４０のようなパポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、アデノアソシエーテッドウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、レトロウイルス由来のベクター、バクテリオファージ由来、トランスポゾン由来及びこれらの組合せに由来するベクター、例えば、コスミドやファージミドのようなプラスミドとバクテリオファージの遺伝的要素に由来するものを挙げることができる。この発現系は発現を起こさせるだけでなく発現を調節する制御配列を含んでいてもよい。
【００２４】
上記発現系を含んでなる宿主細胞やかかる細胞の細胞膜、またかかる細胞を培養して得られる本件アンチセンスペプチドは、後述するように本発明のスクリーニング方法に用いることができる。例えば、細胞膜を得る方法としては、F. Pietri-Rouxel（Eur. J. Biochem., 247, 1174-1179, 1997）らの方法などを用いることができ、また、かかる本件アンチセンスペプチドを細胞培養物等から回収し精製するには、硫酸アンモニウム又はエタノール沈殿、酸抽出、アニオン又はカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含めた公知の方法、好ましくは、高速液体クロマトグラフィーが用いられる。特に、アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、例えば、本件アンチセンスペプチドに対する抗体を結合させたカラムや、上記本件アンチセンスペプチドに通常のペプチドタグを付加した場合は、このペプチドタグに親和性のある物質を結合したカラムを用いることにより、本件アンチセンスペプチドを得ることができる。
【００２５】
また、上記本件アンチセンスペプチドをコードするＤＮＡ、本件アンチセンスペプチド、本件アンチセンスペプチドとマーカータンパク質及び／又はペプチドタグとを結合させた融合ペプチド、本件アンチセンスペプチドに対する抗体、本件アンチセンスペプチドを発現することができる発現系を含んでなる宿主細胞等は、ＨＩＶ−１感染症の予防・治療や診断に有用であり、ＨＩＶ−１感染抑制作用の促進又は抑制物質のスクリーニングに用いることができるばかりでなく、ＨＩＶ−１感染のメカニズムの解明にも使用することができる。
【００２６】
本発明のＨＩＶ−１感染抑制作用促進又は抑制物質のスクリーニング方法としては、被検物質と本件アンチセンスペプチドとＨＩＶ−１感受性細胞とＨＩＶ−１とを用い、該ＨＩＶ−１感受性細胞におけるＨＩＶ−１感染抑制作用を測定・評価する方法や、被検ペプチドを発現するベクターをトランスフェクトしたＨＩＶ−１感受性細胞と、本件アンチセンスペプチドとＨＩＶ−１とを用い、該ＨＩＶ−１感受性細胞におけるＨＩＶ−１感染抑制作用を測定・評価する方法等を挙げることができる。
【００２７】
上記被検物質と本件アンチセンスペプチドとＨＩＶ−１感受性細胞とＨＩＶ−１とを用いるスクリーニング方法としては、例えば、ヒトＴ細胞株等のＨＩＶ−１感受性細胞の存在下に被検物質と本件アンチセンスペプチドとを接触せしめ、次いでＨＩＶ−１を感染せしめ、該ＨＩＶ−１感受性細胞におけるＨＩＶ−１細胞死を測定し、被検物質が非存在下の対照の場合と比較・評価する方法を具体的に例示することができる。また、上記被検ペプチドを発現するベクターをトランスフェクトしたＨＩＶ−１感受性細胞と、本件アンチセンスペプチドとＨＩＶ−１とを用いるスクリーニング方法には、被検ペプチドを発現するベクターと本件アンチセンスペプチドを発現するベクターとをコトランスフェクトしたＨＩＶ−１感受性細胞とＨＩＶ−１とを用いる態様も含まれる。また、ＨＩＶ−１としては、ＨＩＶ−１陽性患者から得られた所定のウイルス価の血清や患者リンパ球の培養上清を用いてもよい。
【００２８】
上記のスクリーニング方法におけるＨＩＶ−１の感染の程度を測定・評価する方法としては、ＨＩＶ−１の感染によるＨＩＶ−１感受性細胞における細胞死やＨＩＶ−１感受性細胞におけるＨＩＶ−１関連抗原の発現あるいはＨＩＶ−１遺伝子の測定・評価を具体的に例示することができる。細胞死の検出や測定方法としては、例えばあらかじめ放射性物質をＨＩＶ−１感受性細胞に取り込ませておき、細胞死により細胞外に放出される放射性物質量を測定する方法を挙げることができ、ＨＩＶ−１関連抗原の検出や測定方法としては、免疫蛍光染色法を挙げることができ、ＨＩＶ−１遺伝子の検出や測定方法としては、例えばＲＮＡ抽出キット（日本ジーン社製「IsogenLS」など）を用いて、ＨＩＶ−１感受性細胞内のＲＮＡ画分を調製し、逆転写酵素（GIBCO-BRL社製「Superscript II」など）を用いて逆転写を行い、得られるｃＤＮＡをＰＣＲにより増幅するＲＴ−ＰＣＲ法を挙げることができる。
【００２９】
また本発明は、上記スクリーニング方法により得られるＨＩＶ−１感染抑制促進物質やＨＩＶ−１感染抑制阻害物質に関する。これらＨＩＶ−１感染抑制促進物質やＨＩＶ−１感染抑制阻害物質は、ＨＩＶ−１感染メカニズムを解明する上で有用であり、特にＨＩＶ−１感染抑制促進物質はＨＩＶ−１感染抑制作用の促進を必要としている患者の予防・治療剤としての可能性がある。本発明はまた、本件アンチセンスペプチドを有効成分として含有するＨＩＶ−１感染抑制・阻害剤に関する。また、本件アンチセンスペプチドをコードするＤＮＡやＲＮＡ、及びかかるＤＮＡ又はＲＮＡのアンチセンス鎖の全部又は一部は、ＨＩＶ−１感染メカニズムを解明する上で有用である。
【００３０】
【実施例】
以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はかかる実施例により何ら制限されるものではない。
実施例Ａ［材料及び方法］
Ａ−１（アンチセンスペプチド検索）
アンチセンスペプチドの検索には、タンパク質間において可能なすべてのセンス−アンチセンスアミノ酸ペアを発見するように本発明者らが設計したコンピュ−タ−プログラム（「ＡＮＴＩＳ］）を使用した。
【００３１】
Ａ−２（ヒト細胞ライン及びＨＩＶ系統）
成人Ｔ細胞白血病（ＡＴＬ）患者からの白血球を、脊髄血白血球（ＣＢＬ）とともに共培養することにより樹立したＭＴ−４細胞ラインを用いた（Science. 229: 563-566, 1985、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 78: 6476-6480, 1981）。ＭＴ−４細胞を、１０％ＦＣＳ、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、及びストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地で成長させた。使用したＨＩＶ−１は、ＨＴＬＶ−ＩＩＩＢ系統（ＨＩＶ−１IIIB）（Nature. 313: 277-284, 1985）及びＭＮ系統（ＨＩＶ−１MN）（Virology. 164: 531-536, 1988）で、これらＨＩＶはヒト単核白血球細胞ラインＵ９３７において増殖させた。
【００３２】
Ａ−３（ペプチド合成）
ペプチドを、Ｆ−ｍｏｃケミストリ−とともにソリッド・フェイズ・メソッドにより、ペプチドシンセサイザ−ＡＭＳ４２２（ＡＢＩＭＥＤ製、ドイツ）を使用して合成した。ペプチドを、サイドチェ−ン・プロテクティング・グル−プのコンコミタント除去とともに、トリフルオロ酢酸（ＴＥＡ；８０％）、チオアニソ−ル（１２％）、１、２−エタンジチオール（ＥＤＴ；６％）及びｍ−クレゾ−ル（２％）での処理により樹脂から得た。その後、これらのペプチドを、０．１％ＴＥＡ／水−アセトニトリルと共に、リバ−スドフェイズＣ１８カラム上で高性能リキッドクロマトグラフィ−により精製した。全てのペプチドは、ＫＯＭＰＡＣＴ  ＭＡＬＤＩ  ＩＩ（Kratos- シミズ製、日本）フライト・マス・スペクトロメ−タ−の時間により確認された。
【００３３】
Ａ−４（ＭＴＴアッセイ）
ＭＴ−４細胞は、特にＨＩＶ−１感染が誘発する細胞死滅に敏感であるので、本発明者らは、ＭＴ−４細胞におけるＨＩＶ−１誘発細胞死滅を、ＨＩＶ−１感染の指標とした（J.Virol.Methods. 20: 309-321, 1988、J.Virol.Methods. 33: 61-71, 1991）。アンチセンスペプチドの存在化及び非存在化におけるＨＩＶ−１の細胞傷害を確認するため、３倍で総量２００μｌの９６ウエルの平底の培養プレ−トで、ＭＴＴアッセイを行った。インビトロで合成したペプチドの抗ＨＩＶ−１活性を、ウイルス誘発細胞死滅の抑制により確認した。アンチセンスペプチドのストック溶液からの希釈液２μｌを、９６ウエルの平底の培養プレ−トのウエルに加えた。ＲＰＭＩ１６４０培地のＨＩＶ−１IIIB溶液を、９８μｌ量、マイクロタイタ−・トレ−・ウエルに加えた。コントロ−ル・ウエルをＲＰＭＩ１６４０培地で模擬感染させた。マイクロタイタ−トレ−を、連続的に３７℃、１時間でインキュベ−トした。１×１０5細胞／ｍｌのＭＴ−４細胞懸濁液１００μｌをウエルに加えた。ＣＯ2インキュベ−タ−における３７℃での５日間のインキュベ−ション後、細胞生存力を、３−（４，５−ジメチルチアゾ−ル−２−ｙｌ）−臭化２，５−ジフェニルテトラゾリウムを用いるＭＴＴアッセイにより確認した。プレ−トリ−ダ−において２波長（５４０及び６９０ｎｍ）で吸収度を確認した。全デ−タは、少なくとも３以上のウエルの平均値を表す。ＨＩＶ−１誘発細胞傷害における候補アンチセンスペプチドの抑制割合は、下式により計算した。式中、（ＯＤpeptide）HIVは被検ペプチドの所定の濃度によりテストされたＨＩＶ感染細胞の光学密度を示し、（ＯＤC）HIVは未処理のＨＩＶ感染細胞の光学密度を示し、（ＯＤC）mockは未処理の模擬感染細胞の光学密度を示す。
【００３４】
【数１】
0003819226.tif 000003
【００３５】
実施例Ｂ［結果］
Ｂ−１（ＨＩＶ−１IIIBｇｐ１６０におけるＴ２０領域内のアミノ酸配列に対するアンチセンスペプチドの検索）
ＨＩＶ−１IIIBのｇｐ１６０におけるＴ２０領域内のアミノ酸配列に対するアンチセンスペプチド配列を、８アミノ酸をペプチドフレ−ムの長さとしてセットし、アンチセンスアミノ酸として７５％以上のマッチング（８アミノ酸中６以上のマッチング）のペプチドを探索した。その結果、Ｔ２０内の７領域に対する９つの候補アンチセンスペプチドを見い出した。図１には、矢印で示されたＴ２０内の７領域と矢印で示された９つの候補アンチセンスペプチド領域が線で結ばれている。これら候補アンチセンスペプチドについて前記実施例Ａ−３記載の方法で合成ペプチドを作製し、これら合成候補アンチセンスペプチドについて、前記実施例Ａ−４記載のＭＴＴアッセイを行った。また、上記９つの候補アンチセンスペプチドの略称、アミノ酸配列（ｇｐ１６０における位置）及びＴ２０領域内における対応するペプチド（Ｔ２０における位置）を表２に示す。
【００３６】
【表２】
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【００３７】
例えば、表２にＴＡ−１として示されるアンチセンスペプチドの連続６アミノ酸配列（NVTENF：配列番号）は、Ｔ２０領域内のアミノ酸番号５〜１０に示される各アミノ酸残基に対するアンチセンスアミノ酸からなり、ＴＡ−２（ITQACPKV：配列番号２）、ＴＡ−３（QACPKVSF：配列番号３）、ＴＡ−４（ACPKVSFE：配列番号４）、ＴＡ−５（NKTFNGTG：配列番号５）、ＴＡ−６（GGGDMRDN：配列番号６）、ＴＡ−７（IEAQQHLL：配列番号７）、ＴＡ−８（KDQQLLGI：配列番号８）、ＴＡ−９（RLRDLLLI：配列番号９）として示される他のアンチセンスペプチドは８アミノ酸により構成されている。本発明者らにより既に報告されているように（Nat.Med 1: 894-901, 1995）、フランキングアミノ酸配列の付加が特にアンチセンスペプチドの効果を増大させる場合もあるので、上記のアンチセンスペプチドにの両側フランキング領域の各４アミノ酸残基を付加した７つのアンチセンスペプチドを新たに合成した。フランキングアミノ酸配列を有するこれらのアンチセンスペプチドを表３に示し、表２に示されたそれぞれのアンチセンスペプチド名にＬを加えることにより略称とした。
【００３８】
【表３】
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【００３９】
配列番号１０〜１６でそれぞれ示される、新たに合成した７つのアンチセンスペプチド、すなわちＴＡ−１Ｌ（VVLVNVTENFNMWK）、ＴＡ−２−４Ｌ（NTSVITQACPKVSFEPIPI）、ＴＡ−５Ｌ（LKCNNKTFNGTGPCTN）、ＴＡ−６Ｌ（IFRPGGGDMRDNWRSE）、ＴＡ−７Ｌ（LLRAIEAQQHLLQLTV）、ＴＡ−８Ｌ（ERYLKDQQLLGIWGCS）、ＴＡ−９Ｌ（FSYHRLRDLLLIVTRI）の内、ＴＡ−２−４Ｌは、ＴＡ−２、ＴＡ−３、ＴＡ−４の５アミノ酸が、互いに重なり合っているので、３つのペプチドを組み合わせたペプチド（ITQACPKVSFE）の両側フランキング領域に各４個のアミノ酸残基を付加したものである。また、ＨＩＶ−１IIIB系統のｇｐ１６０におけるＴ２０も、ポジティブコントロ−ルとして使用するため合成した
【００４０】
実施例Ｂ−２（ＭＴ−４細胞におけるＨＩＶ−１IIIB感染抑制効果）
ＨＩＶ−１IIIBｇｐ１６０におけるＴ２０に対するアンチセンスペプチドを、ＨＩＶ−１誘発細胞傷害の効果を評価するため、ＨＩＶ−１IIIB及びＭＴ−４細胞の混合物に加えて、実施例Ａ−４に記載のＭＴＴアッセイを実施した。Ｔ２０をポジティブコントロ−ルとした結果を図２に示す。１６種の候補アンチセンスペプチドの内、ＴＡ−１Ｌは１０μｇ／で細胞傷害を８０％抑制し、同濃度のＴＡ−９Ｌは１６％近く抑制したが、他の候補アンチセンスペプチドは抑制効果を示さなかった（図２ａ及びｂ参照）。また、ＴＡ−１Ｌは、ＭＴ−４細胞のＨＩＶ−１誘発細胞傷害を用量依存的に抑制した（図２ｃ参照）。
【００４１】
実施例Ｂ−３（ＴＡ−１Ｌ及びＴＡ−１ＬMNのＨＩＶ−１感染抑制効果）
Swiss-Plot に登録されているＨＩＶ−１系統のＨＩＶ−１IIIB以外の他の２９株のＴＡ−１Ｌに関連する配列を表４に示す。表４からもわかるように、ＴＡ−１領域（NVTENF）及びＣ末端フランキングアミノ酸領域（NMWK）はＨＩＶ−１系統間で充分に維持されている。それぞれのＨＩＶ−１系統株のＴＡ−１領域が、対応するそれぞれのＴ２０に対するアンチセンスペプチド（ＡＳＰ）であるかどうかを分析したところ、ＨＩＶ−１IIIBも含めた３０種のＨＩＶ−１系統のうち、１８種がＴＡ−１領域とＴ２０領域間にセンス−アンチセンスペプチド関係をもっていた（表４参照）。ＨＩＶ−１MNは、ＴＡ−１領域とＴ２０領域間にセンス−アンチセンスペプチド関係をもたない系統の１つであるが、ＨＩＶ−１IIIBにおけるＴＡ−１Ｌに相当するＭＮ系統の配列も合成し（ＨＩＶ−１MNのｇｐ１６０におけるアミノ酸番号８３〜９６）、そのペプチドをＴＡ−１ＬMNと名付けた。ＴＡ−１Ｌ及びＴＡ−１ＬMN間の違いは、２番目のアミノ酸がバリンとグルタミン酸との１つのアミノ酸の相違である。ＭＴＴアッセイにおいて、ＴＡ−１Ｌ及びＴＡ−１ＬMNは、共にＭＴ−４細胞のＨＩＶ−１IIIB細胞傷害を強く抑制したが、ＨＩＶ−１MNにより誘発された細胞傷害は弱く抑制するにすぎなかった（図３ａ及び３ｂ参照）。
【００４２】
【表４】
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【００４３】
上記図３ｂに示されるように、ＴＡ−１Ｌは、ＨＩＶ−１MN感染を弱いながらも抑制し、また、ＴＡ−１ＬMNは、ＴＡ−１Ｌ同様に、ＨＩＶ−１IIIB感染とＨＩＶ−１MN感染を抑制した 。ＴＡ−１ＬのＨＩＶ−１MNに対する弱い抑制作用により、ＴＡ−１ＬがＨＩＶ−１MNのＴ２０領域と相互作用するのではなく、分子内で、あるいはＣＤ４のようないくつかのターゲット分子とともに、他の領域と相互作用する可能性が示唆されたので、ＨＩＶ−１IIIBｇｐ１６０及びＣＤ４の間で分子内アンチセンスペプチドを探索したところ、ヒトＣＤ４においてＴＡ−１Ｌ領域に対するアンチセンスペプチド配列を見い出した。表５におけるアミノ酸間のドットはセンス−アンチセンスアミノ酸ペアを示している。このことは、ＴＡ−１ＬによるＨＩＶ−１感染抑制作用は、ＴＡ−１Ｌ領域とＴ２０領域間の相互作用効果に加えて、ｇｐ１２０のＣＤ４への結合阻害が関連していることを示唆している。また、ＨＩＶ−１IIIBｇｐ１６０におけるＴＡ−１Ｌ領域（８４〜９７）に相当する配列は、ｇｐ１２０／ｇｐ４１会合において重要であるとされているｇｐ１２０のＣｌドメイン（Virus Genes 14: 211-223, 1997、J.Virol. 71: 9722-9731, 1997）に含まれる。これらのことは、ＴＡ１Ｌ領域とＴ２０領域間の相互作用に加えて、ＴＡ−１Ｌが、ｇｐ１２０及びＣＤ４間の相互作用を阻害するかもしれないという解釈を支持している。さらに、ＴＡ−１Ｌ領域（８４〜９７）は、モノクローナル抗体に対する抗原性エピトープとして報告されているαヘリックス領域（９１〜１１５）と重複し（FASEB J. 11: 147-153, 1997）、その欠失は、ｇｐ１２０のＣＤ４への結合力を消滅させる（J.Virol. 72: 7280-7288, 1998）。
【００４４】
【表５】
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【００４５】
【発明の効果】
本発明のアンチセンスペプチドは、ＨＩＶ−１に対して、強い感染抑制活性を有し、ＨＩＶ−１に対する感染抑制剤としての治療薬に応用できるものである。また、本発明のアンチセンスペプチドは、ＨＩＶ−１感染メカニズムを解明する上で有用である。
【００４６】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ＨＩＶ−１のｇｐ１６０内における、Ｔ２０領域内のアミノ酸配列に対するアンチセンスペプチドを示す図である。
【図２】ＭＴＴアッセイでのＨＩＶ−１IIIB感染におけるアンチセンスペプチドの効果を示す図である。
【図３】ＭＴＴアッセイでのＨＩＶ−１IIIB又はＨＩＶ−１MN感染におけるアンチセンスペプチドの効果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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