(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
固体支持体上に生体高分子類または生体モノマー類を合成する方法において、改良が有機高分子の表面に吸着された求核試薬を含む有機高分子の使用を含んでなり、前記高分子がシートの形態の二軸配向ポリプロピレンである方法。
【請求項２】
前記求核試薬がアミン、ヒドロキシル、チオール、カルボキシレートおよび少なくとも前記の１つを含む置換基からなる群から選択される請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記生体高分子または生体モノマーが、核酸類、オリゴヌクレオチド類、アミノ酸類、タンパク質類、ペプチド類、ホルモン類、オリゴ糖類、脂質類、糖脂質類、リポ多糖類、リン脂質類、逆方向ヌクレオチド類、ペプチド核酸類、メタ−ＤＮＡ、アビジン、ビオチン、抗体類、前記の類似体、および前記の少なくとも２つの組み合わせからなる群から選択される請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記高分子の表面がアミンを含む請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記高分子の表面がヒドロキシルを含む請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記高分子の表面がチオールを含む請求項１記載の方法。
【請求項７】
前記生体高分子がオリゴヌクレオチド類、ペプチド類およびオリゴ糖類からなる群から選択される請求項１記載の方法。
【請求項８】
固体支持体上に生体高分子類または生体モノマー類を合成する方法において、改良がアミン化ポリプロピレン、ヒドロキシル化ポリプロピレンおよびチオール化ポリプロピレンからなる群から選択された固体支持体の使用を含んでなり、前記固体支持体が二軸配向ポリプロピレンシートである方法。
【請求項９】
前記生体高分子がオリゴヌクレオチド類、ペプチド類およびオリゴ糖類からなる群から選択される請求項８記載の方法。
【請求項１０】
タンパク質またはペプチドの連続的分析方法において、改良が有機高分子表面に吸着された求核試薬に前記タンパク質またはペプチドを結合させることを含んでなり、前記高分子が二軸配向ポリプロピレンである方法。
【請求項１１】
前記求核試薬がアミン、ヒドロキシル、チオール、カルボキシレートおよび前記の少なくとも１つを含む置換基からなる群から選択される請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
その表面上に吸着された求核試薬を含んでなる有機高分子を結合したデバイスであって、所定の配列を有する少なくとも１つのオリゴヌクレオチドが前記求核試薬として前記高分子に共有結合的に付着されており、前記高分子が二軸配向ポリプロピレンであるデバイス。
【請求項１３】
前記求核試薬が、アミン、ヒドロキシル、チオール、カルボキシレートおよび前記の少なくとも１つを含む置換基からなる群から選択される請求項１２記載のデバイス。
【請求項１４】
前記高分子が、ヒドロキシル化ポリプロピレン、チオール化ポリプロピレンおよびアミン化ポリプロピレンからなる群から選択される請求項１２記載のデバイス。
【請求項１５】
前記オリゴヌクレオチドの長さがヌクレオチド約２５０個である請求項１２記載のデバイス。
【請求項１６】
前記オリゴヌクレオチドが関心の遺伝子の配列に相補性である請求項１２記載のデバイス。
【請求項１７】
関心の遺伝子を分析する方法であって、ａ．関心の遺伝子を含む試料を得、ｂ．前記試料を請求項１２記載のデバイスに導入し、そしてｃ．前記遺伝子が請求項１２記載のデバイスのオリゴヌクレオチドに相補的な方法でハイブリッド形成しているかどうかを測定する各工程を含んでなる方法。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本出願は、１９９２年１０月２９日出願の出願番号第０７／９７１，１００号の一部継続出願である。
本発明は、表面が活性化された有機高分子上への生体高分子もしくは生体モノマーの合成、並びに前記高分子上への前もって合成した生体高分子の結合に関する。本発明は、核酸、ペプチド類、タンパク質類の合成、ならびに、ハイブリッド形成による配列決定、ペプチド／タンパク質配列決定、および遺伝レベルにおける診断評価において、特に有用性がある。
発明の背景
本特許開示に記載の論文および刊行物は、それに含まれる情報の故に示した；この情報のいずれも、法的”先行技術”とはみなされず、我々は、上記情報のすべてに関して先行発明の要件を設定する権利を保有する。
デオキシリボ核酸（”ＤＮＡ”）およびリボ核酸（”ＲＮＡ”）は、長い、糸状巨大分子であり、ＤＮＡは、デオキシリボヌクレオチドの鎖を含み、ＲＮＡは、リボヌクレオチドの鎖を含む。ヌクレオチドは、１個のヌクレオシドおよび１個以上のホスフェート基からなり；ヌクレオシドは、五炭糖に結合した窒素性塩基からなる。通常、前記ホスフェート基は、五炭糖の５番目の炭素（”Ｃ−５”）ヒドロキシル基（”ＯＨ”）に結合している；しかし、それはまた、３番目の炭素ヒドロキシル基（”Ｃ−３  ＯＨ”）に結合することもできる。ＤＮＡ分子中において、五炭糖は、デオキシリボースであるのに対して、ＲＮＡ分子中においては、五炭糖はリボースである。ＤＮＡ中における窒素性塩基は、アデニン（”Ａ”）、シトシン（”Ｃ”）、グアニン（”Ｇ”）およびチミン（”Ｔ”）である。これらの塩基は、ウラシル（”Ｕ”）がチミンに置き換わっている以外は、ＲＮＡについても同様である。したがって、ＤＮＡの主要ヌクレオシドは総称して”デオキシヌクレオシド”と称され、下記のようである；デオキシアデニン（”ｄＡ”）、デオキシシトシン（”ｄＣ”）、デオキシグアニン（”ｄＧ”）およびチミジン（”Ｔ”）である。対応するリボヌクレオチドは、”Ａ”、”Ｃ”、”Ｇ”および”Ｕ”と定義される。（都合上、および対応するチミジンリボヌクレオシドがないので、デオキシチミジンは、通常、”Ｔ”と定義される；しかし、一貫したものとする目的のためには、この開示全文において、チミジンを”ｄＴ”と定義するであろう）。
ＤＮＡまたはＲＮＡ分子の窒素性塩基の配列が前記分子中に含まれる遺伝情報をコードするＤＮＡまたはＲＮＡ分子の糖およびホスフェート基は、前記分子の骨格を形成し、構造的役割を担っている。具体的には、あるヌクレオチドの五炭糖の３’ヒドロキシルが隣接するヌクレオチドの五炭糖の５’ヒドロキシルに結合するように、各ヌクレオチドの糖部分が隣接するヌクレオチドの糖部分に結合している。前記２個の五炭糖の結合は通常ホスホジエステル結合によっている。この結合プロトコールに基づいて、ヌクレオチド鎖の一端（”末端”）は５’末端（例  ヒドロキシル、ホスフェート、ホスフェート類等）を有しており、他端は例えば３’ヒドロキシルまたはホスフェート基を有している。都合上、ヌクレオチド鎖の塩基配列は５’から３’方向に、すなわち、５’−ＡＴＣＧ−３’、または、単にＡＴＣＧと記載される。
ＤＮＡおよびＲＮＡは、生きている動物によって内部で産生される；しかし、ＤＮＡおよびＲＮＡは、ＤＮＡおよびＲＮＡの合成鎖が迅速かつ効率的に産生できるように化学的に合成することもできる。これらの鎖は、通常、”合成オリゴヌクレオチド”または”オリゴヌクレオチド”と称されている。オリゴヌクレオチド合成のために広く利用されている化学操作は、”ホスホルアミダイト法”と称されている。たとえば、米国特許第４，４１５，７３２号；ＭｃＢｒｉｄｅ、Ｌ．およびＣａｒｕｔｈｅｒｓ、Ｍ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、２４：２４５−２４８（１９８３）；およびＳｉｎｈａ、Ｎ．ら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１２：４５３９−４５５７（１９８４）を参照；これらはすべて、本文中に参考として取り込まれた。ホスホルアミダイト法に基づいた市販のオリゴヌクレオチドシンセサイザーとして、例えば、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  ＯＬＩＧＯ  １０００；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ８７５０TM；およびＡＢＩ  ３８０TM、３９２TMおよび３９４TM  ＤＮＡシンセサイザーが挙げられる。プロトコールまたは機器にかかわらず、ほとんどの通常の合成オリゴヌクレオチドは、通常”固体支持体”と称されている支持材料上で”成長”する。固体支持体は、さまざまであり周知である；固体支持体に関する詳細は、下記に詳しく記載される。
化学合成オリゴヌクレオチドの重要性は、主に、オリゴヌクレオチド類が関連しうる極めてさまざまな用途に由来する。たとえば、オリゴヌクレオチドは、遺伝子工学、組み換えＤＮＡ法、アンチセンスＤＮＡ、ゲノムＤＮＡの検出、種々の系からのＤＮＡおよびＲＮＡのプローブ、タンパク質−ＤＮＡ複合体の検出、部位特異的変異の検出、ＤＮＡおよびＲＮＡ合成のプライマー、ポリメラーゼ連鎖反応、リガーゼ連鎖反応等のような増幅法プライマー、テンプレート、リンカー、および分子相互作用研究を必要とする生物研究で利用可能である。オリゴヌクレオチド合成領域において最近注目されているのは、Ｅｄｗｉｎ  Ｓｏｕｔｈｅｒｎ（欧州特許出願ＷＯ８９／１０９７７、”Ａｎａｌｙｚｉｎｇ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ”参照）によって最初に開示されたハイブリッド形成による配列決定（”ＳＢＨ”）と一般に称される操作である。
ＤＮＡおよびＲＮＡの主要構造は、下記のヌクレオシドとして図示できる；
0003733413.tif 000002
核酸合成において鍵となる段階は、１個のヌクレオチドの５’水酸基と別のヌクレオチドの３’水酸基との間のヌクレオチド間ホスフェート結合の特異的かつ順次の形成である。したがって、オリゴヌクレオチドの典型的合成において、”入ってくる”ヌクレオチドのホスファイト基が別のヌクレオチドの５’水酸基と結合する（すなわち、この５’水酸基が”リン酸化される”かまたは”亜リン酸化”される）。これらの基は、オリゴヌクレオチドの合成に積極的に関与可能でなければならない。したがって、５’水酸基は、研究者が上記２個のヌクレオチドを反応チェンバー中に導入しその中の条件を前記２個のヌクレオチドが適切に結合できるように調整できるように、修飾されている（通常、ジメチルトリチル（”ＤＭＴ”）によって）；上記添加を連続させることによって、所定の配列を有する成長するオリゴヌクレオチドが正確に産生できる。
タンパク質およびペプチドは、すべての生細胞にとって必須の要素である。それらは、細胞壁および細胞膜、酵素、免疫グロブリン、抗体、輸送分子並びにほとんどのホルモンの構造要素である。タンパク質およびペプチドの構築単位は、２０種の天然のアミノ酸である。各アミノ酸は、”コドン”と称される３個のヌクレオチドの連続的グループによって”コード”される。４種の異なるヌクレオチドがありかつアミノ酸１個のコードに３個のヌクレオチドが必要であるので、可能なコドンが６４個（４3）ある。したがって、数種のコドンが同一のアミノ酸をコードできる；たとえば、コドンＧＣＧ、ＧＣＡ、ＧＣＴおよびＧＣＣはすべてアミノ酸、アラニンをコードする。
アミド結合によって正確に結合されたアミノ酸群がタンパク質鎖を形成し、このようなタンパク質鎖（”一次構造”）のアミノ酸配列がタンパク質の生物学的機能に関与する極めて複雑な二次およびテリトリ（ｔｅｒｒｉｔｏｒｙ）構造を決定する。
各アミノ酸は、タンパク質およびペプチドがアミノ（”Ｎ−”）およびカルボキシル（”Ｃ−”）末端を有するように、アミノおよびカルボキシル末端を有している。アミノ酸の一般的構造は、下記のように図示できる；
0003733413.tif 000003
式中、Ｒは、少なくとも２０種の異なる側鎖（例えば、アラニンの側鎖は、ＣＨ3基である）である。”ＮＨ2”基は、アミノ基であり、”ＣＯＯＨ”基は、カルボキシル基である。
核酸の場合と同様に、合成直鎖または分岐鎖アミノ酸は、化学的に合成できる。直鎖アミノ酸の合成で特に周知の操作は”固相ペプチド合成”と称されており、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｄによって１９６３年に紹介された。一般に、Ｂａｒａｎｙ、Ｇ．およびＭｅｒｒｉｆｉｅｄ、Ｒ．Ｂ．（１９８０）、Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ、２：１−２８４、Ｇｒｏｓｓ、Ｅ．およびＭｅｉｅｎｈｏｆｅｒ、Ｊ．編著、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照。固相ペプチド合成プロトコールを利用する自動ペプチド合成機として、例えば、ＡＢＩ  ４３０TMおよび４３１TM、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ９０５０  Ｐｌｕｓ  ＰｅｐＳｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒTM、およびＭｉｌｌｉｇｅｎ  ９５００TMおよび９６００TMが挙げられる。通常、第１番目のアミノ酸のＣ末端が反応基を含む固体支持体（すなわち、結合部位）に結合され、一方、第１番目のアミノ酸のＮ末端は化学変化を起こしやすい保護基（すなわち、容易に除去可能な基）によって保護されている。アミノ酸上の側鎖官能基は、”一時的”保護基によって保護されていなければならない。適切な条件下において、同様に保護されたアミノ酸が、化学変化を起こしやすい保護基が既に除去されている不溶化された第１のアミノ酸に付加される。連続的添加を繰り返すことによって、アミノ酸鎖が合成でき、最終段階は、通常、固体支持体からの前記鎖の開裂と各アミノ酸側鎖からの一時的保護基の除去となる。これによって、生物学的に活性なタンパク質またはペプチドが生じる。
オリゴ糖は、糖ペプチドおよび糖脂質の構築単位である；糖ペプチドおよび糖脂質は、細胞膜表面との相互作用によって、生物学的活性の重要な媒介者となることができる。したがって、合成オリゴ糖は、特に、特定の細胞膜を標的にするためにまたは糖ペプチドおよび糖脂質の細胞膜表面に対する天然の結合を妨害するために、利用できる。合成オリゴ糖は、最近、特定の薬物に特定の組織を標的とさせるそれらの能力の故に不評である。オリゴ糖の固相合成は、固体支持体としてポリ（エチレングリコール）モノメチルエーテルを用いて報告されている。Ｄｏｕｇｌａｓ、Ｓ．Ｐ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１３：５０９５−５０９７（１９９１）参照。また、Ｒｕｄｅｍａｃｈｅｒ、Ｔ．Ｗ．ら、”Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ”、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５７：７８５−８３８（１９８８）参照。
特に核酸、タンパク質／ペプチド、およびオリゴ糖合成に利用される固体支持体は、さまざまである。核酸合成に関して、広く利用されている固体支持体は、制御多孔性ガラス（”ＣＰＧ”）である。たとえば、米国特許第４，４５８，０６６号を参照。他の材料として、ナイロン、ポリスチレン、ポリアクリルアミドおよびセルロースが挙げられる。テフロンTMファイバー支持体は、オリゴヌクレオチド合成の基質として記載されている。Ｌｏｈｒｍａｎｎ、Ｒ．Ａ．およびＲｕｔｈ、Ｊ．（１９８４）ＤＮＡ  ３：１２２；ＰＣＴ公開公報ＷＯ８５／０１０５１（１９８５年３月１４日公開）；およびＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、Ｏｘｉｄｉｚａｂｌｅ  Ｓｏｌｉｄ  Ｓｕｐｐｏｒｔｓ（酸化可能固体支持体）（Ｃａｔ．Ｎｏ．ＯＳＳ−０１およびＯＳＳ−０２）参照。タンパク質／ペプチド合成に関して、上記材料として、例えば、架橋ポリスチレン、セルロースおよびポリアミド樹脂が挙げられる。米国特許第４，９２３，９０１号は、それにオリゴヌクレオチドおよびペプチドを結合させた修飾膜を記載している。記載してあるように、ポリ（エチレングリコール）モノメチルエーテルは、オリゴ糖合成のための支持体として使用されてきた。
これらの種類の材料の合成に有用な固体支持体に対する需要が引き続き存在している。これは、これまで利用されてきた材料が関連する欠点を有していることによる。たとえば、ある支持体は、実際にアミノ酸またはタンパク質／ペプチドを固体支持体に結合させるために”スペーサーアーム”すなわちリンカーの使用を必要としている；通常、上記リンカーが利用されると、生体モノマーおよび生体高分子の支持体上の”非リンカー”部位に非特異的に結合するのを減少させるかまたは防止するために、リンカーが存在していない膜上の部位をブロックすることがしばしば必要となる。たとえば、Ｚｈｕｎｇ、Ｙ．ら、”Ｓｉｎｇｌｅ−ｂａｓｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｄｉｓｅａｓｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｂｏｕｎｄ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ”、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１９（１４）：３９２７−３９３３（１９９１）（ナイロン）を参照。他の材料は、支持体表面上に適当な材料をグラフトさせるために表面修飾の使用を必要とし、それは、次に生体モノマーおよび生体高分子を結合できる。たとえば、米国特許第４，９２３，９０１号（ポリプロピレン）参照。さらにその他の材料は、例えば、支持体の化学修飾を必要とし、支持体と生体モノマーおよび生体高分子の間の必要な結合を提供する。たとえば、米国特許第４，４５８，０６６号（無機高分子）参照。明らかなように、これらの付加工程はエラーの可能性を付与し、それゆえに、正の分析結果に否定的影響を及ぼし、ならびに、支持体コストを著しく上昇させる。
必要とされているものおよび従って当技術水準に寄与するものは、材料が迅速、効率的および経済的に調製できるために上記の付加的プロトコールを必要とせずオリゴヌクレオチドおよびタンパク質／ペプチドの合成に利用できる材料である。適切な固体支持体法によって、オリゴヌクレオチドは、それの上に合成でき、特異的遺伝的変異の存在または不在を決定するために患者試料ＤＮＡの分析に生成した産物を利用できる。
発明の要約
本発明は、生体高分子合成に有用な有機高分子を提供することによってこれらの需要を満たし、前記有機高分子は、外部化学種（ｅｘｔｅｒｎａｌ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｓｐｅｃｉｅｓ）によって修飾され、前記修飾は、マイクロウェーブまたはラジオ周波数域のエネルギーを外部化学種存在下において有機高分子に適用することによって達成される。特に好適な態様において、関心の遺伝子領域に相補性のオリゴヌクレオチドは、上記高分子上に合成され、これらは、次に、特定の遺伝的変異（類）の存在または不在のための患者試料の分析のために利用される。
好適には、前記高分子は、生体高分子合成に適した条件下において化学的に不活性であり、限定されはしないが水素、炭素、酸素、フッ素、塩素、臭素、硫黄および窒素を含む種々の化学元素の置換基を含む炭素骨格を含んでいる。限定されはしないが、代表的高分子として、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリイソブチレン、ポリブタジエン、ポリイソプレン、ポリビニルピロリドン、ポリテトラフルオロエチレン、二フッ化ポリビニリデン、ポリフルオロエチレンプロピレン、ポリエチレンビニルアルコール、ポリメチルペンテン、ポリクロロトリフルオロエチレン、ポリスルホン、およびそれらの共重合体の混合物が挙げられる。ポリプロピレンは、特に好適な高分子である。特定の最終目的のため、最適であるのは、二軸配合ポリプロピレンフィルムである。
好適には、外部化学種は、（１）高分子表面に先に吸着されていない化学種であり；そして（２）高分子表面に吸着されると、好適にはエネルギー上昇状態によって求核試薬となる。最も好適には、前記エネルギー上昇状態はラジオ周波数プラズマ放電、マイクロウェーブ周波数プラズマ放電またはコロナ放電である。
好適には、限定されはしないが、生体高分子として、核酸、タンパク質、ペプチド、ホルモン、オリゴ糖、脂質または逆方向ヌクレオチド（Ｏｒｔｉｇａｏ、Ｊ．ら、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．２：１２９（１９９２））、ペプチド核酸（Ｅｇｈｏｌｍ、Ｍ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：１８９５（１９９２））およびＭｅｔａ−ＤＮＡ（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ、Ｈ．＆Ｓｗｉｔｚｅｒ、Ｃ．、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：６２５５（１９９２））のようなこれらの合成類似体、および上記の組み合わせが挙げられる。生体高分子合成は、好適には、有機、無機または生化学的手段、およびその組み合わせによって達成される。最も好適には、前記高分子上にオリゴヌクレオチドが合成され、記載のように、これらを用いてＤＮＡを含む患者試料を分析する。
本発明の特に好適な態様において、有機高分子はポリプロピレンであり、外部化学種は窒素および水素（アンモニアガスの形態で）であり、求核試薬はアミンであり、前記エネルギー上昇状態はラジオ周波数プラズマ放電によって達成される。したがって、特に好適な表面活性化有機分子は、ラジオ周波数プラズマ放電によってアミン化されたポリプロピレン材料である；このような材料は、スペーサーアームまたはリンカーを要せずして、それに対してヌクレオチドおよび／またはアミノ酸を”インプレース（ｉｎ−ｐｌａｃｅ）”または”インサイチュー（ｉｎ−ｓｉｔｕ）”結合させるために利用され、従って、オリゴヌクレオチドおよび／またはペプチドの合成に特に極めて適している。活性化有機高分子上のアミン基は、それに導入されたヌクレオチドおよび／またはアミノ酸が高分子表面上に共有結合的に付着するように、ヌクレオチドと反応性である。いくつかの用途では、ポリプロピレンは、二軸配向フィルムの形態で最も好適である。
上記の表面活性化有機高分子は、例えば、オリゴヌクレオチド、ペプチド、オリゴ糖、および脂質合成の領域で、特定の用途を見いだす。たとえば、上記高分子上に合成されたオリゴヌクレオチドに関して、これらの材料はたとえばハイブリッド形成による配列決定（”ＳＢＨ”）および医学および診断評価目的のための遺伝分析領域で特定の用途を見いだす。ポリプロピレンは”化学的に不活性”であるので、非特異的結合に関係した問題は、検出感度が極めて改善されるように、実質的に回避される。
【図面の簡単な説明】
第１図は、アミン化ポリプロピレン上に先に直接合成された開裂１７−ｍｅｒオリゴヌクレオチド（５’−ＤＭＴ保護基を有する）の高速液体クロマトグラフィ分析の結果である。
第２図は、分析に先立ちＤＭＴ保護基を除去した第１図の１７−ｍｅｒオリゴヌクレオチドの毛細管ゲル電気泳動分析の結果である。
第３図は、アミン化ポリプロピレン上に直接合成された所定のターゲットオリゴヌクレオチドからの、３個のオリゴヌクレオチドプローブの脱ハイブリッド形成分析の集積であり、前記プローブのそれぞれは、前記ターゲットに相補性であるかまたは非相補性の種々の配列を有している。
第４図は、ＣＴＦＲ  Ｅｘｏｎ  １０、Ｎｏｒｍａｌに相補性のターゲットオリゴヌクレオチドに対するＣＴＦＲ  Ｅｘｏｎ  １０、ＮｏｒｍａｌおよびＣＴＦＲ  Ｅｘｏｎ  １０、△Ｆ５０８由来のアンプリコンの脱ハイブリッド形成分析の集積であり、前記ターゲットオリゴヌクレオチドは、アミン化ポリプロピレン上に直接合成されている。そして
第５図は、蛍光標識プローブとアミン化ポリプロピレンに直接合成されたターゲットとの間のハイブリッド形成のレーザープリンター複製であり、ＣＣＤカメラによって前記標識を検出したものである。
好適な態様の詳細な説明
生体高分子（オリゴヌクレオチド、ペプチド、オリゴ糖、脂質等）の固相合成は、定義上、固体支持体を必要とし、最初の出発原料を結合させかつ生体高分子合成を開始させる。先にも述べたように、”固相合成の独自の特徴として固体支持体自体が挙げられ、本合成法の将来の改良はおそらく、より優れた支持体が見つけられることによるであろう”。Ｗａｌｌａｃｅ、Ｒ．Ｂ．およびＩｔａｋｕｒａ、Ｋ．”Ｓｏｌｉｄ  ｐｈａｓｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｐｏｌｙｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ”Ｃｈｐｔ．１３，Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｓｃｏｕｔｅｎ，Ｗ．Ｈ．編著、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９８３）。当業者には明らかであろうが、この意見が正しいことが証明された。生体高分子合成に関連する化学の進歩に伴い；上記生体高分子、特にオリゴヌクレオチドおよびペプチドの必要性が高まるに伴い；そして上記生体高分子の適用領域が拡大されるに伴い、”より優れた支持体”に対する必要性が現実に高まっている。
基本的に、これまでの固体支持体手段に関連していた利点はまた、通常、その使用によって生ずる問題の種類および数に直接関連している。これは、上記材料が支持体材料それ自体と生体高分子の化学的相互作用を伝達する程度に応じて、それと同程度に材料がその他の材料と非特異的に相互作用できることに起因している。たとえば、ナイロン基材のフィルター類はＤＮＡ分析領域で広範囲の適用を見いだしており、それによって、オリゴヌクレオチドは前記ナイロンに直接架橋される。しかし、必須ではないにしても研究者がそれに”非特異的”材料を結合させることを望まないナイロン上のすべての部位を化学的にブロックする必要があるほど、ナイロンは他の材料と極めて反応性である。上記参考のＺｈｕｎｇ論文で記載されているように、アミノリンカー結合オリゴヌクレオチドプローブが存在していないナイロン膜上の部位に試料ＤＮＡを非特異的に結合することを防止しようとする試みにおいて、これらの極めて反応性の部位をブロックしてそれに対する非特異的結合を回避することが必要であった。このプロトコールは、固体支持体とオリゴヌクレオチドの間にリンカーとしてポリ−Ｔテイルを用いる過去の操作を改良する努力において検討された。Ｓａｉｋｉ，Ｒ．Ｋ．ら（１９８９）、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ ８６：６２３０−６２３４参照。これらの操作において、前記オリゴヌクレオチドは、”オフライン”合成されその後支持体にアミノリンカーまたはポリＴテイルによって結合されるとして記載されている。
”オンライン”（インサイチュ）合成の場合、利用可能な固体支持体とともに利用することが必要な化学操作の種類は、驚くほどである。たとえば、ＣＰＧ、シリカ、ガラス等のような無機固体支持体の場合、これらの材料の化学構造が、生体高分子合成を制約すると考えられる”剛性”を生ずる。したがって、特にＣＰＧの場合、通常、化学リンカーをそれと関連させて利用することが必要である。基本的に、これらのリンカーは、それらの化学的組成または長さにかかわらず、支持体の一端に結合されかつ成長する生体高分子に結合可能な化学的に”可撓性”の部分を供することによって合成における”自由”度を提供することを意図している。リンカーなしでも理論的には生体高分子を合成可能であるが、総収率、合成の迅速性等が乱される。リンカーを利用する無機材料の使用例としてさらに、欧州特許出願ＷＯ８９／１０９７７は、その上でのオリゴヌクレオチドのインサイチュ合成における用途のために、脂肪族リンカーを結合させたガラス板の使用を開示している。
当業者には明らかでであろうが、リンカーは極めて予測不可能である。再度述べるが、ある一定の支持体材料に対して、リンカーのどのタイプおよびどの長さが最適であるかは必ずしも明らかではない。したがって、通常、リンカーを必要とする特定のすべての固体支持体について、一定のリンカーの条件、組成および長さを最適化する必要がある。
他の支持体は、実際には、生体高分子合成の目的のためには支持体として利用されていない。むしろ、これらの材料は、他の材料と化学的に反応し、次に、上記合成を伝達する能力の故に利用されている。たとえば、Ｋｈｒａｐｋｏ、Ｋ．Ｒ．ら、”Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｂｙ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｍｉｘｔｕｒｅ”ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−Ｊ．ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ａｎｄ  Ｍａｐｐｉｎｇ １：３７５−３８８（１９９１）は、先に合成されたオリゴヌクレオチドが無機材料上ではなくポリアクリルアミドゲル層に共有結合で連結できるように、それにポリアクリルアミドゲルを重層させた無機材料（ガラス）の使用を記載している。したがって、前記ガラスは、明らかに、主に実際の合成支持体のための形態支持体として機能する。同様に、米国特許第４，９２３，９０１号において、ポリプロピレンおよびポリエチレンのような化学的不活性のポリマーは、適用可能な官能基を有する高分子単量体がその表面上にグラフト重合されると、核酸およびペプチド合成に有用であると記載されている。
基本的に、当技術の現在の状況は、極めて反応性の（ナイロンのような）材料から、基本的に単なるリンカーの単体として作用する材料（すなわちガラス板）までの全範囲に及んでいる。
生体高分子合成の全体としての目的という観点から、有意量のエネルギーおよび資源が、ある材料を別の材料に結合させるより効率的リンカーまたはメカニズムの開発に向けられてきた。たとえば、Ｍａｓｋｏｓ、Ｕ．＆Ｓｏｕｔｈｅｒｎ、Ｅ．Ｍ．”Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎｓ  ｏｎ  ｇｌａｓｓ  ｓｕｐｐｏｒｔｓ；ａ  ｎｏｖｅｌ  ｌｉｎｋｅｒ  ｆｏｒ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｈｕｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ  ｉｎ  ｓｉｔｕ”、Ｎｕｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０（７）：１０７９−１６８４（１９９２）参照。
ＷａｌｌａｃｅおよびＩｔａｋｕｒａが”より優れた支持体”へ注目したことの正当性を認識し、我々は、全く異なる手法に着手し、全体に（ｉｎ  ｔｏｔｏ）支持体材料に注目した。我々は、そうする際に、生体高分子および生化学合成における用途に真に優れた固体支持体は、下記のような、リンカーが利用できるが支持体と関連させて使用する必要がないように無機材料の化学構造的な剛性を有しておらず；活性化されると支持体表面がそれに対して共有結合的に生体高分子を結合可能であるように表面活性化を受け、かつ第１の基準と関連して生体高分子のインサイチュ合成を受け；生体高分子合成の結論において、生体高分子が占有していない支持体上の領域が非特異的結合を受けず、または上記非特異的結合が実際に起こると生体高分子を排除することなくこれらの材料が容易に表面から除去されるように化学的に不活性であり；そして、材料を種々の異なる範疇で利用可能であるように取り扱いおよび操作が容易である、材料が最も好適であることを確認した。
これらの基準は、生体高分子合成を受ける条件下で好適には化学的に不活性である表面活性化、有機高分子を用いることによって達成される。
本文で使用したように、用語”有機高分子”および”高分子”は、生体高分子合成に適した条件下で最も好適には化学的に不活性であり、限定されはしないが水素、炭素、酸素、フッ素、塩素、臭素、硫黄および窒素を含む種々の化学元素の置換基を含む炭素骨格を含む支持体材料を意味する。限定されはしないが、代表的高分子として、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリイソブチレン、ポリブタジエン、ポリイソプレン、ポリビニルピロリドン、ポリテトラフルオロエチレン、二フッ化ポリビニリデン、ポリフルオロエチレンプロピレン、ポリエチレンビニルアルコール、ポリメチルペンテン、ポリクロロトリフルオロエチレン、ポリスルオン、およびその共重合体の混合物類が挙げられる。ポリプロピレンは、特に好適な高分子である。
本文で使用したように、用語”表面活性化”を高分子と連関させて使用した際には、外部化学種が高分子表面に吸着されそれによって化学種が高分子表面に生体高分子および生体モノマーを化学的に連結可能となるように高分子を修飾するプロセスを意味している。
本文で使用したように、用語”媒体”を用語”高分子”と連関させて使用した際には、高分子の物理的、構造的形態を意味する；従って、”媒体”は、一般的に、高分子フィルム（すなわち、実質的に非多孔性の表面を有する高分子）；高分子膜（例  多孔性表面を有する高分子）；高分子フィラメント（例  メッシュおよび布）；ポリマービーズ；ポリマーフォーム；ポリマーフリット；およびポリマー糸として定義できる。最も好適には、高分子媒体は、糸または膜またはフィルムである。
本文で使用したように、用語”デバイス−媒体”を用語”高分子”と関連させて使用する際には、マイクロタイタープレート、試験管、無機シート、ディップスティック等のような高分子媒体を結合できるすべてのデバイスを意味する。たとえば、高分子媒体がポリプロピレン糸であると、１本以上のポリプロピレン糸がプラスティックディップスティックタイプデバイスに結合できるか、または、ポリプロピレン膜がガラススライドに結合できる。特定のデバイスは、それ自体、重要でない−−−必要であるのは、高分子媒体が高分子またはそれに吸着されたあらゆる生体高分子の機能的挙動に影響を及ぼすことなくそれに対して結合できることおよびデバイスインテントがデバイスを導入したあらゆる材料（例  臨床試験等）内部で安定であることである。
本文で使用したように、用語”吸着された”とは、化学および生化学技術で通常それに帰属する意味を有する。再度述べると、別の材料に吸着された第１の材料は実際に、第１の材料が他の材料表面から容易には除去できないようにその材料の”一部”となる。たとえば、表面活性化高分子は、その表面に求核試薬を含む；適切な条件下では、たとえば、前記求核試薬と反応する生体モノマーはこのような求核試薬によって生体高分子表面に共有結合で結合されそれによって吸着される。
本文で使用したように、用語”表面”とは、好適には約１０〜約１０００オングストロームである約５０００オングストローム以下の深さを意味する。
本文で使用したように、用語”求核試薬”とは、電子欠失種と結合可能な１対の電子を含む化学種である。好適には、外部化学種は、高分子表面に吸着されると求核試薬となる。”外部化学種”とは、高分子表面に先に吸着されていない化学種である。再度述べると、外部化学種は、高分子表面に吸着されると、求核試薬となる。好適には、外部化学種は、プラズマ放電を受ける。通常、プラズマプロセスは、外部化学種のイオン化された形態及びラジカル形態を生み出すであろう。好適には、外部化学種は、窒素；酸素；硫黄；炭素；水素；アルゴン；ヘリウム；および前記の少なくとも１つを含む組み合わせからなる群から選択される。これらの外部化学種の求核形態として、例えば、アミン；ヒドロキシル；チオール；カルボキシレート；および少なくとも前記１つを含む置換基が挙げられる。外部化学種が適切な条件下でプラズマに供されると、この外部化学種のイオン化され及びラジカルの形態（群）が生ずる。当業者には明らかであるように、適当な条件下で前記イオン化され及びラジカルの形態（群）は、高分子と”化学的に”相互作用し、一方、その非イオン化及び非ラジカルの形態（群）は、高分子と化学結合を形成する傾向を有していない。
本文で使用したように、用語”生体高分子”とは、生物または化学部分の単位を意味する。限定されはしないが、代表的生体高分子として、核酸、オリゴヌクレオチド、アミノ酸、タンパク質、ペプチド、ホルモン、オリゴ糖、脂質、糖脂質、リポ多糖、リン脂質、限定されないが逆方向ヌクレオチド、ペプチド核酸、Ｍｅｔａ−ＤＮＡ、および上記の組み合わせを含む前記の合成類似体が挙げられる。”生体高分子合成”とは、生体高分子の有機および無機の両者の合成方法を包含する。生体高分子の単一単位または生体高分子の部分でない単一単位を意味する”生体モノマー”は、生体高分子に関連している。したがって、例えば、ヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド生体高分子内で生体モノマーであり、アミノ酸は、タンパク質およびペプチド生体高分子内で生体モノマーである；例えば、アビジン、ビオチン、抗体、抗体断片等は、同様に生体モノマーである。さらに、本文で使用したように、用語”開始生体モノマー”または”イニシエーター生体モノマー”とは、反応性求核試薬によって高分子表面に共有結合で結合された第１の生体モノマー、または、生体高分子に結合されたリンカーまたはスペーサーアームに結合される第１の生体モノマーであり、前記リンカーまたはスペーサーアームは、反応性求核試薬を介して高分子に結合されている。
本文で使用したように、”類似体”または”合成類似体”が生体モノマーまたは生体高分子と関連させて使用されると、特定生体モノマーまたは生体高分子の天然または非天然変種を称する。たとえば、”抗体類似体”として、キメラ抗体、モノクローナル抗体、および抗体断片が挙げられる；”アミノ酸類似体”として、ベータ・アラニンが挙げられる；ヌクレオチド類自体として、イノシンおよびデオキシヌクレオチドが挙げられる。上述は、排他的なものではなくむしろ代表的なものである。
本文で使用したように、用語”逆方向ドットブロット”とは、生体高分子を固体支持体に結合させるプロトコールを意味し、試料材料中の成分の存在（または不在）をその適用によって、およびその後の試料の生体高分子との相互作用（または非相互作用）によって検出する。本文で使用したように、用語”ドットブロット”とは、試料材料中または由来の成分を固体支持体に結合させ生体高分子または生体モノマープローブをそれに適用するプロトコールを意味する。
本文で使用したように、用語”マスク”または”マスキング”とは、生物、化学または物理的反応の起こることを選択的に阻害する材料またはプロセスを意味する。例示の手段として、高分子を表面活性化技術に供した後にスクリーニングメカニズムによってマスクされまたは被覆された高分子領域が実質的に表面非活性であり、それによってマスクされなかった領域のみが実質的に例えば生体高分子合成に参画できるような、表面活性化以前に有機高分子の最上部で行われるスクリーニングメカニズムがマスクとして挙げられる。用語”マスク”または”マスキング”は排他的に静的なものを意味しておらず、ダイナミックマスキング、すなわち、１連のマスキング段階を用いて同一の活性化された有機高分子上に種々の異なる生体高分子を選択的に合成することも、同様に、本定義の範囲に属するとみなされる。
本文で使用したように、用語”認識ドメイン（領域）”とは、細胞表面上でレセプターによって認識されるアミノ酸の配列を意味する。
本文で使用したように、用語”生体反応性ペプチド”とは、細胞から反応を惹起可能なペプチドを意味しており；たとえば、細胞表面の認識部位に結合するペプチドは生体反応性ペプチドである。
本文で使用したように用語”シード”は、生体反応性ペプチドに結合しかつそれに他の同様の細胞が結合する細胞を意味する。
本開示の残りは、都合上、高分子ポリプロピレン、化学種アンモニア、プラズマプロトコールおよびオリゴヌクレオチドおよびペプチド合成に用途に焦点を絞る。他の高分子類、化学種、エネルギー励起方法、および生体高分子も本文に開示の発明を受けることを理解されたい。
ポリプロピレンは、化学的に極めて不活性でかつ疎水性である；したがって、ポリプロピレンは、極めて腐食性の環境においても利用できる。たとえば、ポリプロピレンは、種々の鉱酸（例  塩酸）、有機酸（例  ギ酸、酢酸）、塩基類（例  塩化アンモニウム、水酸化カリウム）、塩類（例  塩化ナトリウム）、酸化剤（例  過酢酸、ヨウ素溶液）、および有機溶媒（例  アセトン、エチルアルコール、アセトニトリル）に対して良好な化学耐性を有している。さらに、ポリプロピレンは、低蛍光バックグランドを供する。ポリプロピレンは、下記の化学構造を有している：
0003733413.tif 000004
この構造は、生体高分子合成に対して機能的ではない；すなわち、それ自体として、支持体材料としてポリプロピレンを用いてオリゴヌクレオチドを合成することはできない。したがって、ポリプロピレンが生体高分子合成に有用となるためには、その表面を例えばアミノ基を表面に導入することによって修飾しなければならない。効率的、迅速かつ経済的なポリプロピレン媒体表面上への上記アミノ基の導入方法は、アンモニアまたは有機アミン含有ガス中でプラズマ放電を使用することになる。
”プラズマ”は、最も好適には電磁場から十分なイオン化エネルギーを得えるイオン化ガスである。それは、長飛程の電磁力を示し電気の伝導体となる。プラズマは、電子、原子、陽および陰イオンおよび中性フリーラジカルの混合物からなる。プラズマの総電荷は、中性である。限定されはしないが、プラズマエネルギー源として、直流、交流、ラジオ周波数、マイクロウェーブ、ショックウェーブおよびレーザーが挙げられる。低温プラズマ処理として、ラジオ周波数プラズマ放電（”ＲＦＰＤ”）、マイクロウェーブプラズマ放電（”ＭＦＰＤ”）およびコロナ放電（”ＣＤ”）が挙げられる；上記処理はすべて、通常、約１０００オングストローム以下の深さまで固体材料表面のみに影響を及ぼし、材料の残りは未修飾のまま残す。
プラズマによる表面相互作用は、通常、３種の一般的な反応可能性の群に分類される；（１）高分子表面の化学種が表面から除去できる；（２）外部化学種が高分子表面に付加できる；または（３）結合再配置が高分子自体の表面内部で起こりうる。これらの反応の１種を越えるものが同時に起こることもあり得る。プラズマ放電と熱の表面修飾法（イオン化、または、通常高分子全体に深く浸透してその全体としての特徴に大きく影響を及ぼすアルファまたはベータ照射）の主な違いは、反応ガスまたは反応種を産生して種々の表面状態をつくりうる混合物の選択および望ましくない副次的影響を起こしうる第２の反応種の欠如という観点から、実現可能な高い化学可撓性である。
ポリプロピレンは、アンモニアガス中または限定されはしないが１級、２級または３級であってよいＣ1−Ｃ12脂肪族または環状アミン類を含むその他の適切なアミンを導入したものの中で、ＲＦＰＤ、ＭＦＰＤまたはＣＤを用いて、それに対してアミノ基を導入することによって、表面活性化される。炭化水素鎖は、直鎖、分枝鎖、飽和または非飽和であることができ、１個以上のアミノ基が炭化水素鎖に結合できる。メチルアミン、アルキルアミン、エチレンジアミン、ジアミノシクロヘキサンは、上記アミン類の例である。アンモニアは、最も好適である。
ＲＦＰＤ、ＭＦＰＤまたはＣＤの存在下において、最も好適なアミノ基の媒体への結合メカニズムは、下記のようである：
0003733413.tif 000005
酸素ラジカル存在下において、生成した表面活性化ポリプロピレンは、下記の活性化表面を含む：
0003733413.tif 000006
硫黄ラジカル存在下において、生成した表面活性化ポリプロピレンは、下記の活性化表面を含む：
0003733413.tif 000007
したがって、例えば、周知の核酸合成法を用いて、下記の吸着開始ヌクレオチド類をうることができる：
ホスホルアミデート                  ホスフェート
式中、Ａは、保護基であり、および、Ｂは、前記４個の塩基の１つを示す。化学リンカーは高分子への生体モノマーの結合を必要としないので、開始生体モノマーが吸着され、すなわち、実際に高分子自体の”一部”となる。
ＭＦＰＤ、ＲＦＰＤおよびＣＤは、高分子媒体の必要とする部分のみが活性化されるように、効率的に制御できるのは有益である。したがって、表面の一部のみを活性化することによって、その残りは化学的に不活性であり続け、その中に本発明の利点が存在する。高分子媒体の表面の（好適には）１部位の部分のみを活性化することによって、例えばインサイチュオリゴヌクレオチド合成の結論として、実質的に表面の残部のすべてが化学的に不活性であるように、活性化された領域のみが生体高分子合成を受けるようになるであろう。したがって、もしこのようなオリゴヌクレオチドを遺伝的追跡のためにプローブとして用いるならば、核酸巨大分子の表面への非特異的結合に関連した問題が回避される。
好適には、高分子媒体表面の１平方センチメーターあたり約５０ナノモル（”ナノモル／ｃｍ2”）未満、さらに好適には約５〜１５ナノモル／ｃｍ2の活性化化学種を含む。これらの値は高分子材料の高さ×幅表面面積に関している；したがって、高分子材料が多孔性表面を含む状況では、先の値は、孔に属する表面積が示されると、高さ×幅表面積よりも極めて大きい総表面積には適用されない。これとは別に、高分子媒体約１５％未満、さらに好適には約１０％未満および最も好適には約５％が活性化学種を含む。この面積は”小さい”ように見えまたは前記百分率は”低い”ように思われるが、これらは相対的値である。たとえば、１００％活性化化学種表面を有する高分子媒体を使用することもできるであろう。しかし、これは、活性化種のすべてが開始生体モノマーによって占有されないかもしれないことしたがって非特異的結合の可能性が高まるという点において、問題が生ずるであろう。しかし、表面活性化百分率が低下するに伴い、表面の各活性化部分が開始生体モノマーによって確実に占有される可能性が実質的に増加する（特に、周辺領域が化学的に不活性であるので）。
プラズマ発生装置は市販されており、本発明に適用可能である。特に好適なプラズマジェネレーターは、Ｐｌａｓｍａ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ（Ｍｏｄｅｌ  Ｎｏ．ＰＳ０１５０Ｅ  ラジオ周波数）から入手可能である。このようなデバイスは、ガス導入条件、出力、プラズマ放電時間等が容易に選択され、変化させられ、最適化できかつ制御できるので、好適である。これらのパラメーターは、ほとんど実験せずに最適化できるが、それは主に、高分子媒体の物理的条件が、もし例えば出力（通常ワット単位）が高すぎるかまたはプラズマ放電時間が長すぎると、悪影響を受けることになる−−−−このような悪影響は、通常、”もろい”高分子媒体を生成することによって現れる。したがって、必要度に応じて、および本文に開示したパラメーターと矛盾しないように、当業者は、高分子媒体の効率的表面活性化の条件を最適化する能力を付与されている。
ポリプロピレンのアミン化に関して、前記ガスが下記の範囲の下記の成分を含むことが好適である：アンモニア（約９９％〜約１００％）および酸素（約０〜約１％）。好適には、出力電源のワットは、約１０〜約５００ワット、さらに好適には約１００〜約４００ワット、およびさらに好適には約２００ワットである。好適には、ポリプロピレンおよびガスは、約１０分未満、さらに好適には約１〜約５分の間、最も好適には約２分のプラズマ放電に供される。プラズマ放電の種類に関しては、ラジオ周波数波が利用されるのが好適である；好適には、これらは、約１ＭＨｚから約２０ＭＨｚの範囲、および最も好適には約１３ＭＨｚである。マイクロウェーブプラズマ放電に関して、前記マイクロウェーブが約１，０００ＭＨｚ〜約３，０００ＭＨｚの範囲、および最も好適には約２，０００ＭＨｚである。コロナ放電に関して、適用処理出力は、約１０〜約２５０ワット、さらに好適には約１０，０００〜２０，０００ボルトの電極にある。
高分子媒体は、研究者の要請に従い変化させることができる。高分子媒体が生体高分子合成の後に切除を受けることが望ましい；しかし、これが望ましいのは、主に、その上に合成された生体高分子の目的とした用途に基づいている。たとえば、遺伝レベルにおける核酸分析の領域では、試験機器が品質管理操作に容易に供されることが絶対的に必要であると考えれている。例として、薬物製造領域では、いったん製造されると、薬物の大規模ロットの一部分（または部分類）を分離することが実質的に容易である；もしこの部分が必要な品質保証および品質管理（ＱＡ／ＱＣ）パラメータに適合するならば、その際には、統計的見地から、全ロットが同一品質となる；一方、もしこの部分（類）が必要なＱＡ／ＱＣコントロールパラメータに適合しないならば、全ロットが疑わしい。この手法にある主な想定は、このロット製造に関連した全パラメータが、１試料のいかなる部分も全ロットを代表するとして同一であるとしている。遺伝分析の領域が拡大しかつ利用が増加するに伴い、同様の保証が要求され必要とされるであろう。
生体高分子合成後に開裂を受ける高分子媒体が望まれていることを上述に関して記憶されたい。
このような特徴が、高分子媒体上に合成された生体高分子のＱＡ／ＱＣを可能とする。たとえば、膜の場合、その一部分または部分類を、詳細かつ厳密な分析手法がそれに対して容易に適用できるように、切除可能である−もし、このような分析がたとえば特定のオリゴヌクレオチド配列が存在していることを示したならば、その際には、統計的見地から、全膜がその配列を有している。
高分子媒体の切除によって、同様に、それぞれが所定の生体高分子を含む複数の媒体の産生が可能となる。これらを次に切除して、各媒体からの１切片を単一のデバイス−媒体に結合できる。したがって、たとえば、多数の（ｐｌｅｔｈｏｒａ）ディップスティック（ｄｉｐｓｔｉｃｋ）が容易に産生でき、各ディップスティックは特定の生体高分子を含む数種の異なる高分子媒体部分を含んでいる；したがって、あらゆる特定の生体高分子合成条件は、同一でありかつこのような生体高分子はＱＡ／ＱＣプロトコールを受ける。
研究者の必要が切除能力に関連する特定のパラメータを決定するであろうが、膜の場合、厚さ約８０〜約１００μｍの厚さを有するポリプロピレンを利用することが好ましく、糸の場合、直径約０．００１インチを有するポリプロピレンを利用することが好ましい。膜の場合、切除は、いかなる開裂機器（例  はさみ）によっても容易に達成できる。糸の場合、開裂部位で末端を”密封”できる機器で開裂するのが望ましく、すなわち、これらは、レーザー、超音波機器、またはホットナイフである；これが望ましいのは、実用的見地から予測され、糸を開裂すると線維が互いにほどくことができるようにからみあったファイバーで構成されていることでわかる。（前記ファイバー自体は、もちろん、直接利用できるが、しかし、糸は、操作がやや容易であることから望ましい；しかし、これは、同様に、研究者の希望に応じている。）
本発明の特に好適な態様によれば、二軸配向ポリプロピレンフィルム（ＢＯＰＰ）は、オリゴヌクレオチド合成を支持するための固相活性化基質として使用される。前記基質は、適切には、アレイすなわち配列グリッドを含み、そのうえにオリゴヌクレオチド合成に必要な試薬が手動でまたは機械のいずれかで適用される。試薬の自動化機械的適用のため、試薬運搬のために低デッドボリューム、非交差夾雑構造を達成する単離弁を含む試薬分配手段を使用することが現在望ましい。上記試薬分配手段は、例えば、本発明の譲受人に共通して譲受された同時係属米国特許出願番号第０７／９３６，９７６号および第０７／９０９，２３２号に開示されている。これとは別に、その他の自動化合成機器を改造して、本文に記載したようにポリプロピレンフィルム基質の試薬分配を達成することもできる。
ラジオ周波数プラズマアミン化ポリプロピレン膜およびフィルムは、アレイ形態のオリゴヌクレオチド合成に機械的試薬分配手段を用いるための適切な基質であると提案された。しかし、微多孔性の膜基質を用いて上記配列を合成しようとする試みの結果、試薬分配チャンネル間の化学的漏出、物理的耐性の欠如および蛍光バックグランドの上昇の故に、不満足な結果となった。微多孔性膜基質は、また、極めて脆弱すぎることも証明された；それらは、それらを機械的試薬分配手段から除去しようとして簡単に壊れ、繰り返し使用の後にはばらばらになった。化学合成の後、膜は、同様に、蛍光バックグランド増強を示したようだった。
この特に好適な本発明の態様によれば、ＢＯＰＰフィルムは、例えば、機械的試薬分配手段を用いたオリゴヌクレオチド合成における使用において膜に置き換わった。ＢＯＰＰフィルムは耐久性でかつ使用した後でも破壊の兆候は全く見られず機械的試薬分配手段から容易に除去される。ＢＯＰＰフィルムは、また、低蛍光基質材料の必要性を満たす。最後になるが、ＢＯＰＰフィルムは、機械的試薬分配手段のチャンネル壁の間のシールを形成する非多孔性基質に対する必要性を満たし、従って、化学物質の隣接するチャンネルからの漏出を防止する。
例えばオリゴヌクレオチド合成における用途のための二軸配向ポリプロピレンフィルム基質は、市販されている；さらに、適切なフィルムは、当技術で周知のように容易に調製できる。適切なフィルムとして、Ｃａｔａｌｉｎａ  Ｐｌａｓｔｉｃｓ、Ｃａｌａｂａｓａｓ、ＣＡ、またはＭｏｂｉｌｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｆｉｌｍｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、Ｐｉｔｔｓｆｏｒｄ、ＮＹから、登録商標Ｂｉｃｏｒ  ＢおよびＢｉｃｏｒ  １００ＬＢＷとして入手可能なものが挙げられる。これらのフィルムは、一般に、高透明性、半透明性の公式の厚さが約０．６５から約２ミルズのフィルムとして特徴づけられる。典型的フィルムは、ＡＳＴＭ  Ｄ８８２によって下記の特性を有するものとして報告されている：引っ張り強度約１９，０００〜約２１，３００  ｌｂ／ｓｑ（ＭＤ）および約２９，０００〜約３８，７００  ｌｂ／ｓｑ（ＴＤ）；および破断伸び約１５０〜約１６２％（ＭＤ）および約４５〜約６０（ＴＤ）。フィルム、または、ＡＳＴＭ  Ｄ２４５７によって約９０のオーダーのＧａｒｄｎｅｒ  ＧｌｏｓｓおよびＡＳＴＭ  Ｄ１００３によって、約１．３〜約２．５のオーダーのＧａｒｄｎｅｒ  Ｈａｚｅを有している。例示的フィルムの特性分析に関するさらに詳細は、例えば、Ｍｏｂｉｌ  Ｃｏｍｐａｎｙから入手可能な小冊子”Ｂｉｃｏｒ  １００ＬＢＷ配向ポリプロピレンフィルム、開発典型値（１２／１／９１）”および”Ｂｉｃｏｒ  Ｂ  二軸配向ポリプロピレンフィルム、典型値（１９８７年８月１日）”に見られ、両者ともに本文に参考として取り込んだ。当然、これらの値は、適切なフィルムの特徴の例示を示しており、本発明にとって重大であるとみなすべきではない；当業者は、本発明による用途に適したその他のフィルムを容易に確認できるであろう。
全てのポリプロピレンフィルムは、本発明のプロセスによって有意にアミン化される。鋳造、溶融吹出しおよびＢＯＰＰフィルムについて機械的試薬分配手段を用いるオリゴヌクレオチド合成の基質として役立つそれらの能力を比較すると、しかしながら、ＢＯＰＰフィルムのみがハイブリッド形成可能なオリゴヌクレオチド合成のための完全に適切な支持体であることが見いだされた。鋳造および吹出しフィルムがこの適用において作用できない原因として、この時点で完全に評価されていないことがある。すべての鋳造および吹出しフィルムが乳白色となりまたはアンモニア（２８％）中で７０℃において加熱するかまたは蒸留水中で加熱すると曇ったので、溶媒浸透は１つの重大な要因である疑いがある。ＢＯＰＰフィルム以外のフィルムと室温で迅速脱保護試薬を使用することも同様に成功しなかった。
二軸配向ポリプロピレン（ＢＯＰＰ）フィルムは、微多孔性膜よりもより耐久性に優れており、低蛍光バックグランドを供する。ＢＯＰＰフィルムはまた、優れた溶媒耐性を供し、鋳造または溶融吹出しポリプロピレンフィルムよりも工学的に透明である。結果として、ＢＯＰＰフィルムは、特に機械的試薬分配手段を用いる際に、オリゴヌクレオチド合成の支持体として特に最も望ましい。
オリゴヌクレオチド合成における用途可能性のためのフィルム特性を特性分析するため、ナイロン、ＰＶＤＦおよびポリプロピレンから製造された数種のフィルムを試験した。最も優れた結果は、透明、非多孔性二軸配向ポリプロピレンフィルムによって得られた。多孔性ポリプロピレン膜ならびにその他の多孔性膜は、高いバックグランド信号を示し、このバックグランドの少なくとも有意部分はＤＮＡシークエンサー中の光学系では十分にろ過しきれない散乱効果によるらしい。
ドットブロットハイブリッド形成分析のためのバージンフィルムの評価は、低蛍光検出のための適用においてその適切性を示唆した。バックグラウンドおよび検出感度についての予備的研究において、赤外標識オリゴヌクレオチドの希釈系列をフィルムにスポットし乾燥させた。赤外蛍光色素で標識したオリゴヌクレオチド（ｌａｃＺ２００）の１：２希釈系列を透明、非多孔性二軸配向ポリプロピレンフィルムにスポットし風乾させた。通常、配列決定ゲルを固定するガラスプレートサンドイッチの間にこのシートを固定した。信号は、ＬＩ−ＣＯＲ  Ｍｏｄｅｌ  ４０００Ｌ  ＤＮＡシークエンサーを用いて検出した。１６００ｆｍｏｌから０．１ｆｍｏｌまでを含有する１μｌスポット由来の信号は、明らかに可視化できた。シグナルゲインは８００に設定し、シグナルオフセットは５０に設定した。アクリルアミドゲルに対する通常のオフセット設定は２００−２５０である；このことは明らかに、基質と有意に低いバックグランド蛍光を示している。
プライマー１００アットモル（ａｔｔｏｍｏｌｅ）に対応するスポットは、上記の配置で明確に見えた。異なる設定で、はるかに低い濃度のドットからのシグナルも同様に見えることができるが、ただし、その際には高濃度のいくつかのドットがアラインメントからはみ出す。１００アットモルが絶対的限度でないことは明らかである。たとえば、２次元スキャンシステムは、全スポット領域におけるシグナル積分を可能とし、シグナル／ノイズ比の信頼できる決定を可能とする。
ターゲットとして一重鎖Ｍ１３ｍｐ１８  ＤＮＡを用いるハイブリッド形成実験において、ヌクレオチド２００から２１７のｌａｃＺ−遺伝子に対応する１８−ｍｅｒオリゴヌクレオチドをプローブとして用いた。一重鎖Ｍ１３ｍｐ１８  ＤＮＡの１：２希釈系列を透明のポリプロピレンフィルムにスポットし、風乾させ、ＵＶ架橋させた。赤外標識プローブによるＳＤＳ緩衝液中３７℃におけるハイブリッド形成（Ｃｈｕｒｃｈ＆Ｋｉｅｆｆｅｒ−Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４０：１８５（１９８８））および洗浄の後、フィルムをＬＩ−ＣＯＲ  Ｍｏｄｅｌ  ４０００Ｌ  ＤＮＡシークエンサーでスキャンした。１００ｆｍｏｌ〜０．０５ｆｍｏｌのＭ１３ターゲットＤＮＡ由来の陽性ハイブリッドシグナルが明確に見られた。陰性コントロールは、１０ｆｍｏｌ  ｐｌｅ×Ｂ６  プラスミドＤＮＡを含有していた；それは、極めてかすかなシグナルを示し、ハイブリッド形成および洗浄手段が理想的ではなかったことを示唆している。シグナルゲインおよびオフセットは、それぞれ、８００および１５０であった。
５０アットモルほどのわずかのターゲットＤＮＡが明確に検出された；これは、ｌａｃＺ−ＤＮＡの（５×１０-7モル×１０10ｇ／モル＝）０．５μｇに対応している。この場合、プローブは、５’標識されており、従って、たった１個のフルオロクロームしか有していなかった。ｃＤＮＡマッピングのため、３００−１５００ｂｐのプローブが通常使用されるであろう；これらは、ＤＮＡ分子あたり１０−１０ｃ色素分子を有しており、従って、高感度が得られるであろう。
開示された高分子は、例えば、オリゴヌクレオチドおよびペプチドをその上に直接合成するために特に極めて適している。Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  ＯＬＩＧＯ  １０００を含めて種々の市販の核酸シンセサイザーが利用可能であるのは有益である。アミン化ポリプロピレン膜または糸に注目すると、アミン化プロセスの直後に（または保存から取り出した後に）、材料を直接核酸シンセサイザーの反応チェンバー中に入れることができる；上記材料の融通性の故に、それらは、チェンバー内部で容易に操作でき、すなわち、膜の場合緩く”巻き上げ”または糸の場合緩く挿入される。オリゴヌクレオチド合成がアミン化ポリプロピレン上で直接進行させることができるのは有益であり、アミノ基の”活性化”性質の故に、これらのオリゴヌクレオチドは、ポリプロピレンに直接共有結合で結合できる（もちろん、”開裂可能”結合またはスペーサーアームは、オリゴヌクレオチドが除去できるように利用できる；コハク酸ヌクレオシドの活性エステルはこれらがアンモニアによる”開裂”を受けるので好適である）。
上記由来のオリゴヌクレオチドは、遺伝スクリーニング分析における利用に理想的に適している。すなわち、オリゴヌクレオチドが関心の遺伝子の野生型または変異（類）配列に相補性であるオリゴヌクレオチドを含むアミン化プロピレンを利用することによって、調製患者試料について、問題の配列の存在または不在をスクリーニングできる。上記遺伝分析における用途のために化学的に合成したオリゴヌクレオチドの長さは、長さ約２５０塩基まで、好適には約５〜約１００塩基；さらに好適には約８〜約３０塩基、および最も好適には約１６塩基とするのが望ましい。これらの長さは、遺伝分析を実施する条件に相対して考えられるべきである。たとえば、室温では（我々はこの温度で分析を実施することを望む）、最も好適な長さが１６塩基であり；より低温では、短い（すなわち、８−ｍｅｒ）のが利用できる。
当業者は、患者からゲノム試料を分析用に調製する方法を容易に理解できる。試料ＤＮＡは、例えば、臨床試料（すなわち、涙、精液、膣分泌物、全血、血清、血漿、皮膚かきとり物）から容易に得られ、当業者が利用可能な種々の方法によって調製できる。通常、これらの方法の第１の目的は、問題の核酸の最終的増幅（例  ポリメラーゼチェーンリアクションによって）をそうでなければ妨害するような外来性物質が除去できる程度まで、核酸を精製することである。血清を試料として用いて、核酸の調製は、通常、下記の段階を含む；血清を７０℃で１時間、２５ｍＭ  ＭＯＰＳ（ｐＨ６．５）、２．５ｍＭ  ＥＤＴＡおよび０．５％ＳＤＳ中２．５ｍｇ／ｍｌのプロテナーゼＫ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）とともにインキュベーションする。この後に、下記の抽出を行う；フェノール抽出およびエーテル抽出である。この後にエタノール沈殿が続く。たとえば、Ａ．Ｌａｒｚｕｌら、Ｊ．Ｈｅｐｔｏｌ．５：１９９−２０４（１９８７）参照。述べたように、その他のプロトコールおよび方法もこのような精製のために容易に使用可能である。
上記精製の後、（通常）問題の特定のゲノム領域を増幅する必要がある。これは、ポリメラーゼチェーンリアクション（”ＰＣＲ”）のような方法および問題の特定領域に対するプライマーを用いて容易に達成できる。当業者は、ゲノム試料に対して上記増幅法を適用することならびにそれに必要なパラメータ（遺伝子領域または遺伝子を含む核酸配列領域の増幅を実質的に確実にするプライマーの選択）を把握しかつ理解する能力を付与されている。
さらに当業者には明らかであるように、ＤＮＡ試料は定義上２個の相補性ＤＮＡ鎖を含んでいるので、ＰＣＲのような増幅方法は、何組かの相補性アンプリコン（”アンプリコン”とは、増幅産物の鎖の１組であり、すなわち、相補性”アンプリコン”は、ＰＣＲ増幅の生成産物である）を生成するであろう。アミン化ポリプロピレンに共有結合で結合されたオリゴヌクレオチドに対する試料結合を増強させる手法として提案されているのは、分析前にこれらの組の１つを反応混合物から除去することである；これは、互いに相補性アンプリコンのハイブリッド形成のための競合を低下させる効果がある。この手法のため、唯一１組のアンプリコンセットのみをアミン化ポリプロピレン−オリゴヌクレオチドデバイスによるスクリーニングに供する。たとえば、プライマー１セットをビオチン化し、他のセットを例えば検出のために標識する。したがって、増幅後、例えば、アビジン被覆ビーズを用いて試料からビオチン化アンプリコンを”除去”できる。これは、溶液中に実質的に標識されたアンプリコンのみを保持するという効果を有している。当然、この標識は、標識アンプリコンをアミン化ポリプロピレン−オリゴヌクレオチドデバイスによって”スクリーニング”した後に検出目的で利用できる。
上記増幅の後、試料材料を、前記標識アンプリコンに相補性の配列を有するオリゴヌクレオチドを含むアミン化ポリプロピレン−オリゴヌクレオチドデバイスに呈することができる。アミン化ポリプロピレン−オリゴヌクレオチドデバイスの好適な適用が遺伝的変異のためのゲノム試料のスクリーニングであるので、緊縮条件（すなわち、限定されはしないが温度、イオン強度、化学的条件、時間および配列の性質を含むハイブリッド形成および脱ハイブリッド形成を可能とする条件）が重要である。すなわち、核酸配列中１改変のみを含む変異のため（野生型に対して、または”正常”配列に対して）、変異配列スクリーニングにおいて、正常配列すらも相補オリゴヌクレオチドに容易にハイブリッド形成することが大いにあり得るであろう。したがって、このような”非特異的”ハイブリッド形成の除去が必須である。たとえば、これは、塩濃度低下による１連の洗浄を用いて達成でき、それは、特異的にハイブリッド形成した材料の実質的にすべてを除去する前に、非特異的にハイブリッド形成した実質的にすべての材料を必然的に除去する効果を有している。
相補配列のみを確実に検出することが重要であるので、経時的にかつ緊縮条件下でアミン化ポリプロピレン−オリゴヌクレオチドデバイスからの試料核酸配列の脱ハイブリッド形成を”追跡”できるように、”歴史的”脱ハイブリッド形成分析を実施することを現在我々は好適としている−−−それらがアミン化ポリプロピレン−オリゴヌクレオチドデバイスから除去されるに伴い、非相補性および相補性配列の脱ハイブリッド形成パターンを比較することによって、我々は、前記パターンが実質的に異なり”正確な”ハイブリッド形成を正しく評価できることを確認した。この歴史的分析を用いて、特定の遺伝分析のための”ｙｅｓ／ｎｏ”緊縮プロトコールを作ることができる。たとえば、もし特定の公知の変異が特定の公知の”歴史的”脱ハイブリッド形成パターンを供するならば、その後もしこのパターンが非公知の試料についても得られるならば、その試料はこの特定の変異を含んでいる。
基本的に、我々は、経時的にシグナル消失（脱ハイブリッド形成を示唆する）を連続的にモニタリングしながら高速液体クロマトグラフィ（”ＨＰＬＣ”）法を用いて塩低下勾配にハイブリッド形成した材料を供する。下記で詳細に述べるように、我々は、実験的に、所定の配列の存在または不在に関する正確な決定が行われるように上記脱ハイブリッド形成パターンにおける明白な差異が確認できることを決定した。例えばアミン化ポリプロピレン上に直接合成されたオリゴヌクレオチドを用いたゲノムＤＮＡの分析のため、上記分析を上記に示したように容易に実施できる。
通常、ゲノムＤＮＡは、遺伝子１個またはその部分を含む。本文で使用したように、用語”遺伝子”は、当業者が通常使用する定義に従う。ゲノム試料は、限定されはしないが植物、脊椎動物、無脊椎動物、ウイルス源等を含むすべての起源に由来することができる。
異なる配列を有するオリゴヌクレオチドは、Ｍａｋｏｓ、Ｕ．およびＳｏｕｔｈｅｒｎ、Ｅ．Ｍ．、”Ｐａｒａｌｌｅｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ”、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０（７）：１６７５−１６７８（１９９２）に記載されたもののような”種々の”マスキング”プロトコールを用いて、前記高分子媒体上に合成できる。たとえば、オリゴヌクレオチドの場合、高分子媒体の全表面に適用される開始生体モノマーは、アデノシンであり、一方、媒体の４分の１のみにおいて、ヌクレオチドシトシンが添加され、残りの４分の３をマスキングし、その後全媒体の半分にヌクレオチドチミジンを添加し、他の半分をマスキングし、全高分子媒体に対してヌクレオチドグアノシンを添加する。したがって、最初の４分の１において、テトラマーＡＣＴＧが存在する；第１の４分の１を除く半分にトライマーＡＴＧが含まれる；他の半分がダイマーＡＧを含む。このような材料を、種々の対立遺伝子を含む遺伝変異のゲノム分析または遺伝変異のスクリーニングのために利用できる。たとえば、疾患膿胞性線維症をコードする遺伝子を生成できる核酸配列が少なくとも９５個、異なるものがある。したがって、単一の高分子デバイス媒体は、そのうえに異なる配列を有する９５個の異なる生体高分子によって生成でき、生体高分子のそれぞれは、上述のマスキングプロトコールに従って生成される。
これとは別に、異なる高分子媒体上に異なる生体高分子を合成でき、これらを単一の高分子デバイス上で組み合わせることができる。たとえば、膜の場合、異なるオリゴヌクレオチドを含む異なる高分子媒体からの種々の切片を単一のデバイスに固定できる。この手法の利点は、この高分子媒体の一部を含むデバイスの品質が保証されるように、前記生体高分子を含む高分子媒体の一部をより容易に品質管理できることである。膿胞性線維症の場合、たとえば、９５個の異なるオリゴヌクレオチドを含む９５の別々の高分子媒体（またはその小集団）を利用でき、ぞれぞれは、開裂され、それぞれからの部分は品質管理操作に供される。その後、これら９５種の媒体を１つの（または数種の）単一デバイス媒体上に組み合わせることができる。
開示された高分子は、また、オリゴヌクレオチドの平行分析すなわちハイブリッド形成による配列決定（”ＳＢＨ”）のために利用できる。ＳＢＨの最も初期のかつ実用的手法の１つは、Ｅｄｗｉｎ  Ｍ．ＳｏｕｔｈｅｒｎのＰＣＴ公報ＷＯ  ８９−１０９７７、”Ａｎａｌｙｚｉｎｇ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ”によって開示されている。同様に、Ｍａｓｋｏｓ＆Ｓｏｕｔｈｅｒｎ、同上（以後”Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  ＳＢＨ”）を参照。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  ＳＢＨプロトコールによれば、多くの異なるオリゴヌクレオチドが固体支持体の表面上に合成され、その後、試料核酸配列とのハイブリッド形成を実施するために利用される；前記オリゴヌクレオチドは、インサイチュで合成され、オリゴヌクレオチドの収率の単一性を確保する。単一分析実験で同一表面上ですべての異なる配列に対するハイブリッド形成を実施することは、それぞれのオリゴヌクレオチドすべてに対する同一の実験条件を生むことになるのは有益である。本文で開示された表面活性化高分子媒体は、ＳＢＨプロトコールに直接適用可能である。表面活性化高分子媒体は同様に、光除去可能な保護基を用いる高分子調製にも適用可能である。ＰＣＴ公報、ＷＯ  ９０／１５０７０”Ｖｅｒｙ  ｌａｒｇｅ  ｓｃａｌｅ  ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”を参照。
開示された表面活性化高分子は、特に、”逆方向ドットブロット”プロトコールのためのインサイチュ生体高分子合成に適している。たとえば、上述のプロトコールのある部分で、異なる定義された配列を有する１連のオリゴヌクレオチドを表面活性化高分子上に直接合成する（または、”オフライン”で合成された高分子に結合される）。その後、前記オリゴヌクレオチドの１つに相補性の配列を有するポリヌクレオチドを含有する疑いのある試料を、それに対して適用する。検出は、分析前（直接標識）またはハイブリッド形成後（間接標識）ポリヌクレオチドの標識を行う標識法によって達成できる。研究者は高分子媒体上で異なるオリゴヌクレオチドの物理的位置を知っているので、特定位置における標識の存在は、アミン化ポリプロピレンオリゴヌクレオチドデバイスにハイブリッド形成した試料由来のいかなる物質の存在および配列の両者に関する情報を提供する。
さらに、開示された表面活性化高分子材料は、また、生体高分子合成のためにリンカーおよびスペーサーアームと連関させて使用することができる。これらは、高分子支持体からの合成生体高分子の非除去または除去のための非開裂または開裂プロトコールを受ける。生体高分子、特にオリゴヌクレオチドおよびペプチドの合成に適用されるリンカー類およびスペーサーアームは、周知でさまざまであり、本文で詳細には検討しない。したがって、開示された高分子材料は、例えば、オリゴヌクレオチドまたはペプチドの合成に使用でき、次に、それらは、支持体から開裂され、上述の種々の内容のいかなるものにおいても利用できる。
開示された表面活性化、有機高分子は、また、タンパク質／ペプチド配列決定に適用可能である。当業者には明らかであるように、タンパク質配列決定は、タンパク質合成と異なり、特定タンパク質のアミノ酸配列の決定に関している；特定タンパク質のアミノ酸配列は次に例えば、そのタンパク質の化学合成またはタンパク質のアミノ酸をコードするであろうコドンの一般的または最適核酸配列を決定するために利用できる。タンパク質配列決定のための周知の操作は、”Ｅｄｍａｎ分解”と称されている。Ｅｄｍａｎ，Ｐ．およびＨｅｎｓｃｈｅｎ、Ａ（１９７５）：Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，Ｓ．Ｂ．編著）、２３２−２７９頁、Ｓｐｒｉｎｇ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ、Ｈｅｉｄｅｒｂｅｒｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照。簡単に述べると、前記Ｅｄｍａｎ分解法は、一度に１個ずつアミノ酸残基をペプチドＮ末端から開裂すること、およびフェニルチオヒダントイン誘導体としてそれを確認することを必要としている。この操作は、これまでに十分に述べられており、本文で詳細には述べない。自動化タンパク質およびペプチドシークエンサーは、市販されている；例示として、Ｐｏｒｔｏｎ  ＬＦ  ３０００  プロテインシークエンサー（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社）が挙げられる。
配列決定されるタンパク質が、化学的に不活性の有機高分子に対して、例えば１，４  フェニレンジイソチオシアナート（”ＰＤＩＴＣ”）を用いて、共有結合できるのは有益である；しかし、高分子およびタンパク質表面に結合可能なすべての部分が利用可能である。結合反応は、下記のように進行させることができる：
0003733413.tif 000008
式中、”ＰＰ−Ｎｕ”は、その表面に吸着された求核試薬を含むポリプロピレンである。
前記高分子に共有結合で結合されたタンパク質はその後、例えばＥｄｍａｎ分解プロトコールを用いて、効率的に配列決定できる。
開示された表面活性化、化学的不活性化有機高分子の別の適用は、アビジン、アビジン誘導体、ビオチンおよびビオチン誘導体のような生体モノマーの共有結合による結合に関連している。上記材料は、多数の適用を有している−−−−特に望ましいのは、それぞれ、隔離するためにビオチン化したかまたはアビジンに連結させた巨大分子である。当業者には明らかであろうが、アビジンは、ビオチンに特異的な４個の結合部位を有する糖タンパク質である；ビオチンとアビジンの結合親和性は、極めて強固でありかつ非共有結合の両者である。たとえば、こうした高分子に結合させたアビジンの用途は、さまざまであり−−−−例として、上記材料を用いて、例えばＰＣＲを用いるポリヌクレオチド含有試料の増幅の結果としての配列反応を規格化できる。たとえば、ビオチン化プライマー（ターゲット配列の第１の領域に特異的）をそれに共有結合で結合したアビジンを有する高分子デバイス媒体に添加する；その後、第２の標識プライマー（前記ターゲットの第２の領域に特異的）、ポリメラーゼ酵素、およびヌクレオチド三リン酸エステルを結合プライマーに添加し、ＰＣＲ反応を開始させる。高分子に結合したアビジン量を制御することによって、ＰＣＲ反応の結果生成した伸張した標識鎖を規格化するようにビオチン化プライマーの量を”制御”し、これらはその後例えば従来のスラブゲル電気泳動法を用いて分析できる。
表面活性化、有機高分子はまた、細胞接着及び細胞増殖／繁殖のために、例えばほ乳類細胞培養のために使用される装置、人工皮膚移植片および組織および血液適合性を示す補綴装置において利用できる。たとえば、特異的細胞認識領域に関連する生体活性ペプチドは、開示された高分子上に合成でき、種々の細胞を含む試料をそれに適用でき、それによって、前記認識領域を含む細胞をそれに選択的に結合させることができる。Ｙａｍａｄａ、Ｋ．Ｍ．、”Ａｄｈｅｓｉｏｎ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ”、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６６：２０  １２８０９−１２８１２（１９９１）は、種々の生物学的活性ペプチドおよび上記領域に特異的な認識領域を含む細胞について記載している。たとえば、接着性の糖タンパク質フィブロネクチンは、種々の生物学的プロセス、特に細胞付着および細胞移動を媒介する点において関与している。フィブロネクチンは、数種の細胞表面受容体によって結合されている；上記受容体によって認識されるフィブロネクチンのペプチド配列は、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（”ＲＧＤ”）およびＬｅｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌ（”ＬＤＶ”）を含む。したがって、１個以上のＲＧＤペプチドを含む１連の生体高分子は、前記開示された生体高分子上に合成でき、例えば、それに対する細胞付着を媒介する。たとえば、ＰｉｅｒｓｃｈｂａｃｋｅｒおよびＲｕｏｓｌａｈｔｉ、Ｎａｔｕｒｅ  ３０９：３０−３３、１９８４（および参考文献）は、細胞付着領域を含むフィブロネクチンのペプチック消化断片を最初に単離しかつ特性分析した。細胞付着促進活性を有する３０個のアミノ酸の合成ペプチドを調製した。ＲＧＤＳテトラペプチドがタンパク質被覆プラスチックビーズに結合された時ではなく前記領域をさらに６個の炭素原子スペーサーアームを介してセファロースビーズに結合させた時に、ネズミ腎線維芽細胞の付着を促進するテトラペプチド（ＲＧＤＳ）に描写された。著者は、活性のこうした欠如は付着領域に対する細胞の接近低下によるかまたはタンパク質被覆プラスチック表面へ対しての結合効率の不良によるのであろうと示唆していた。この問題を解決するため、ＣａｐｐｅｌｌｏおよびＣｒｉｓｓｍａｎ、Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｐｒｅｐｒｉｎｔｓ  ３１：１９３−１９４、１９９０は、組み換え遺伝学を用いて、ＲＧＤ領域を含むフィブロネクチンの１０個のアミノ酸配列をＢｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ  シルクフィブロインタンパク質の結晶領域をコードするアミノ酸配列の１領域に入れた。ＲＧＤ組み換えペプチドの繰り返し配列を含む高分子量の共重合体ＳＬＰ−Ｆがニトロセルロースフィルター上に固定され、アフリカミドリザル腎上皮細胞の付着を促進した。本文に開示された支持体は、これらの種類の最終結果を達成するために効率的に利用できる。
好適には、生体反応性ペプチドは、高分子表面から生体反応性ペプチドの空間的距離を保つためにスペーサーアームを用いて、合成できる。上記スペーサーアームは、好適には長さが原子約５０個であり、さらに好適には長さが原子約２０個であり、最も好適には原子約６個である。好適なスペーサーアームは親水性である。好適には、前記生体反応性ペプチド配列は、他の非生体反応性ペプチド配列を含む生体高分子に沿って繰り返される；これは、生体反応性ペプチド配列の数が増加すると、細胞の認識領域が生体反応性ペプチドに結合する確率が高くなるので、望ましい。好適には、生体反応性ペプチド配列は、少なくとも約３０回、生体高分子内部で繰り返され、さらに好適には生体高分子に沿って約１５回、および最も好適には約１０回繰り返される。あらゆる２個の生体反応性ペプチド配列の間の距離が少なくとも１個のアミノ酸残基、さらに好適には約３個および最も好適には約９個であるのが望ましい。
例
下記の例は限定することを全く意図しておらずまたは限定するものとしてみなされることを意図していないが、本発明の特に好適な態度に−−−−非適合配列すなわち変異の存在の示唆のための核酸配列を含む試料の分析に用いられるポリプロピレンのアミン化、その後の上への直接オリゴヌクレオチド合成；およびその上への直接ペプチド合成に関している。
Ｉ．材料、方法、機器類および特異オリゴヌクレオチド類
Ａ．試薬類
１）ＯＬＩＧＯ  １０００  ＤＮＡ  シンセサイザー
オリゴヌクレオチドの合成は、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社、ＢＩＮＡＲＹ−ＰＡＫTMホスホルアミダイド（ｄＡ（Ｂｚ）−パーツ番号第３３７７３７、ｄＣ（Ｂｚ）−パーツ番号第３３７７３８、ｄＧ（ｉＢｕ）−パーツ番号第３３７７３９、Ｔ−パーツ番号第３３７７４６）；ＤＮＡ合成試薬キット（Ｏｘｉｄｉｚｅ−−パーツ番号第３３７７３２、ＤＥｂｌｏｃｋ−パーツ番号第３３７７３３、Ｃａｐｌ−パーツ番号第３３７７３４、Ｃａｐ２−パーツ番号第３３７７３５）；ＡＣｔｉｖａｔｅ  試薬（パーツ番号第３３８２８４）および開裂および脱保護キット（パーツ番号第３３７７４２）を用いて達成した。
２）ハイブリッド形成緩衝液
すべての化学試薬は、少なくともＡＣＳ等級であった。ハイブリッド形成緩衝液は、６ＸＳＳＰＥ／０．０１％ドデシル硫酸ナトリウムからなった。６ＸＳＳＰＥは、ＺＯＸＳＳＰＥ（１リットルあたり；３Ｍ  ＮａＣｌ；０．２Ｍ  ＮａＨ2ＰＯ4；１０Ｎ  ＮａＯＨによってｐＨ７．４に調整した０．０２Ｍ  ＥＤＴＡ）を希釈し６Ｘを得て、その後、それに対して０．０１％ＳＤＳ（ｖ／ｖ）を添加し調製した。
３）Ｄ−ＨＡＳTM勾配緩衝液
Ｄ−ＨＡＳTM勾配緩衝液は、ＺＸＳＳＰＥ／０．０１％ＳＤＳ（すなわち、ＺＯＸＳＳＰＥストックを利用し、ＺＸＳＳＰＥに希釈し、０．０１％（ｖ／ｖ）ＳＤＳを添加した）から構成された。
４）ラジオ周波数プラズマ試薬
電子等級無水アンモニア（９９．９９５％純度）を、商標ＡＬＨＡＧＡＺTMとしてＬＩＱＵＩＤ  Ａｉｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｗａｌｎｕｔ  Ｃｒｅｅｋ，ＣＡ）から入手した。超高純度アルゴンガス（９９．９９９％）は、同様に同じ商標でＬｉｑｕｉｄ  Ａｉｒから入手した。
Ｂ．高分子デバイス媒体
ポリプロピレン膜フィルターシート（２１．５ｃｍ×２６．６ｃｍ、０．２μｍ孔径）は、商標ＭＥＴＲＩＣＥＬTMとしてＧｅｌｍａｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ、Ｍｉｃｈｉｇａｎから入手した。ポリプロピレン系（０．０１０インチ直径）は、Ｂｌｕｅ  Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｂｌｕｅ  Ｍｏｕｎｔａｉｎ、Ａｌａｂａｍａ（製品番号ＭＰ６９）から入手した。ポリプロピレンフィルム（１．２ミル）は、Ｃａｔａｌｉｎａ  Ｐｌａｓｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｃｏａｔｉｎｇ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｃａｌａｂａｓａｓ，ＣＡ）から入手した。
Ｃ．市販のプロトコール
１）ポリメラーゼチェーンリアクション（”ＰＣＲ”）
特定ＤＮＡ巨大分子の増幅は、ＡｍｐｌｉＴａｇTMを有するＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ  ＧｅｎｅＡｍｐTM  ＤＮＡ増幅試薬キット（パーツ番号第Ｎ８０１−００５５）を用いて、達成した。製造業者の指示に従った。
２）プライマービオチン化
ＰＣＲ増幅用５’−ビオチン化プライマーは、Ｂｉｏｔｉｏｎ−ＯＮTMホスホルアミダイト（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、Ｃａ．パーツ番号第５１９１）を用いて、作製した。ビオチン化プライマーは、使用に先立ち精製することはなかった。製造業者の指示に従った。
３）プライマー標識
ＰＣＲ増幅のためのプライマーは、ＵＳＢ  ＣＬｏｎｅｄ  Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ試薬類を用いて、γＰ32（Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）によって５’標識された。製造業者の指示に従った。
４）プローブ標識
６１５フルオレセインプローブは、５’末端においてフルオレセイン−ＯＮホスホルアミダイト（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ、Ｃａｔ．Ｎｏ．５２３５−１）によって標識した。製造業者の指示に従った。
５）スルホ−ＳＤＴＢ分析−アミン含量、定量的
ポリプロピレンデバイス媒体のアミン含量は、特に、Ｓｕｌｆｏ−ＳＤＴＢアッセイ（Ｐｉｅｒｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ；製品番号２８６１０Ｘ）を用いて、決定した。定量は、酸性水性条件下でデバイス媒体からのＤＭＴカチオンの放出を測定し、行った。生成したＤＭＴの量は、７０，０００ｃｍ-1Ｍ-1の４９８ｎｍにおける消滅係数からまたは標準曲線（△ＯＤ＝４９８ｎｍ対Ｓｕｌｆｏ−ＳＴＤＢ標準）から推定した。６Ｎ  ＨＣｌをＤＭＴカチオンを溶液中へ放出させるために使用したことを除いて、製造業者の指示に従った。
Ｄ．その他分析プロトコール
１）ニンヒドリン分析−アミン含量、定性的
アミン化ポリプロピレンの定性分析をニンヒドリン分析で実施した；ヘテロ環化合物であるニンヒドリンはアミン基と錯化し、および錯化時において、黄色から深い青への色変化が起こる。約１−３滴の下記溶液をそれぞれ、順次、推定アミン化プロプロピレン材料に添加した；Ａ−シアン化カリウム／ピリジン（０．０１Ｍ  ＫＣＮ／９８ｍｌ  ピリジン）；Ｂ−５００ｍｇ  ニンヒドリン／１０ｍｌ  ブタノール；Ｃ−８０ｍｇ  フェノール／２０ｍｌ  ブタノール。この後、材料を１１０℃で約２分間加熱し、その後、色を定性的に観察した。
２）ＤＭＴ分析−アミン含量、定量的
ポリプロピレンのアミン化の定量的決定は、Ｒｅｄｄｙ，Ｍ．Ｐ．ら、”Ａｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｓｏｌｉｄ  ｐｈａｓｅ  ｔｒｉｔｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ”、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２８／１：２３−２６（１９８７）に記載の操作を改変し用いて、達成した。アミン基は、ジクロロメタン中テトラ−ｎ−ブチルアンモニウム過塩素酸塩／２，４，６−コリジンの存在下においてジメトキシトリチル（ＤＭＴ）塩酸と反応させる；酸処理後、ＤＭＴカチオンが放出され、５０１ｎｍにおいて分光光度計で測定できる。結果は、アミン化ポリプロピレンのＯＤ単位／ｃｍ2として示すことができる。
プロトコールは下記のようであった：アミン化ポリプロピレンをジメトキシトリチル塩酸（Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）および２，４，６−コリジン含有乾燥ジクロロメタン中テトラ−ｎ−ブチルアンモニウム過塩素酸塩（Ｆｌｕｋａ、Ｃｉｔｙ，Ｓａｔａｔｅ）の等モル量の溶液（０．５Ｍ）中に懸濁した。反応を、約１５〜３０分の間に完了させた。アミン化ポリプロピレンを除去し、ジクロロメタンで完全に洗浄した。乾燥アミノ化ポリプロピレンは、その後、ジクロロメタン中２％（ｗ／ｖ）トリクロロ酢酸１０ｍｌ中に懸濁した；橙色の存在はＤＭＴカチオンの存在を示唆しており、これは、分光光度計で定量した（λｍａｘ−５０１ｎｍ、ε＝７６，０００）。
Ｅ．機器
１）ラジオ周波数ガスフロープラズマ放電
Ｐｌａｓｍａ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｍｏｄｅｌ  ０１５０Ｅを用いて、アンモニアガス存在下でラジオ周波数ガスフロー放電を生成させた。
アミン化プロセスは下記の段階から構成されていた；連続的真空吸引操作下において、各アミン化工程の開始およびその間にチェンバー内部において０．１トールの基準圧力を設定した。その後、無水アンモニアを４分間導入し、約０．２５トールのチェンバー圧力を得た。この後、無水アンモニアガス存在下において２分間、２００ワットのＲＦ−出力を適用した。ＲＦ−出力の断続後、チェンバーをさらに２分間同一圧力でアンモニアガス中に保持した。この後、約０．２５トールで１０分間、アルゴンガスをチェンバー中に導入した。最後に、チェンバーを、約１分間ゆっくりと排気しながら大気条件に戻した。
２）自動化ＤＮＡシンセサイザー
オリゴヌクレオチド合成は、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社（Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、ＣＡ）ＯＬＩＧＯ  １０００自動化ＤＮＡシンセサイザーで、ホルホルアミダイド基準化学プロトコールを用いて行った。アミン化ポリプロピレンは、固体支持体のために使用した。種々の長さのホモーおよびヘテロ−オリゴヌクレオチドは、製造業者の指示に従って合成した。
３）毛細管ゲル電気泳動
オリゴヌクレオチドの毛細管電気泳動分析は、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社、Ｐ／ＡＣＥTM２０００高速毛細管電気泳動システムを用いて行った。Ａ２７ｃｍ、１００μｍ、ｉ．ｄ．カラム（Ｐｏｌｙｍｉｃｒｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｌｏｇｉｅｓ社、Ｐｈｏｅｎｉｘ，ＡＺ）を利用した；重合ポリアクリルアミドゲルカラムは、１０％Ｔを用いて所内で調製した。試料は、電気動態注入法（７．５ｋＶ；３．０秒）によってカラム上にのせた；分離は、オリゴヌクレオチドの長さに応じて、３００Ｖ／ｃｍで１０−３０分間、実施した。トリスーヒドロキシメチルアミノメタン（”ＴＲＩＳ”）−ほう酸（ｐＨ８．３）は、溶出緩衝液として利用した。吸光度検出は、主にオリゴヌクレオチドの長さに応じて０．０１〜１．０  ＯＤ260nm／ｍｌの範囲であった。
４）高速液体クロマトグラフィ（”ＨＰＬＣ”）
オリゴヌクレオチドのＨＰＬＣ分析は、ダイオードアレイ検出器モジュール１６８およびオートサンプラー５０７（２０μｌ  インジェクターループ）付属Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社、Ｓｙｓｔｅｍ  ＧｏｌｄTM  ＨＰＬＣ  Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ  Ｓｏｌｖｅｎｔ  Ｍｏｄｕｌｅ  １２６で行った。Ｃ１８８８８ｔｒａｓｈｅｒｅTM  ＨＰＬＣ  カラム（Ｂｅｃｋｍａｎ、パーツ番号第２４４２５４号；３μ粒子ＯＤＳ、４．６ｍｍ×７．５ｃｍ）を利用した。ボトルＡは、０．１Ｍ酢酸アンモニウム、ＰＨ６．８を含有していた；ボトルＢは、ＨＰＬＣ等級アセトニトリルを含有していた。システムは、下記のような勾配モードで操作した（流速＝１ｍｌ／ｍｉｎ）；０−３分−１００％ボトルＡ、０％ボトルＢ；３−３３分−１００％ボトルＡから３０％ボトルＡ／０％ボトルＢから７０％ボトルＢまで。
５）Ｂｒｅａｄｂｏａｒｄ  Ｄｙｎａｍｉｃ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（Ｄ−ＨＡＳTM）Ｓｙｓｔｅｍ
経時的にプローブ−標的乖離の進行を分析するため、ブレッドボード  Ｄｙｎａｍｉｃ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（Ｄ−ＨＡＳTM）Ｓｙｓｔｅｍを構築した。ここで使用したＤ−ＨＡＳTMアナライザーのために、改良１７１放射性元素検出器付属Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社、Ｓｙｓｔｅｍ  ＧｏｌｄTM  ＨＰＬＣ  Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ  Ｓｏｌｖｅｎｔ  Ｍｏｄｕｌｅ  １２６を利用した；改良は、フローセルを１／８インチｏ．ｄ．／１／１６インチｉ．ｄ．の蛍光化エチレンプロピレン共重合体チューブに置換したことであった。このチューブは、それに対してハイブリッド形成させた問題の標識配列を有するアミン化ポリプロピレン−オリゴヌクレオチドのその中への挿入を可能とし、この材料は、次に、２ポリプロピレンスクリーンの間に”サンドイッチされた”。この並べ方は、改良フローセル中における乖離緩衝液の流動を可能とした−−−−したがって、アミン化ポリプロピレンオリゴヌクレオチドからの標識配列の乖離が起こるに伴い、放射性カウント数が減少し、従って、標的からのプローブの乖離を連続的に追跡できた。ボトルＡは、Ｄ−ＨＡＳTM  勾配緩衝液を含有し、およびボトルＢは、０．０１％ＳＤＳを含有していた。Ｄ−ＨＡＳTMＳｙｓｔｅｍは、下記のような勾配モードで操作した；０−２分−１００％ボトルＡ（１ｍｌ／ｍｉｎ）；２−２２分−０％−１００％ボトルＢ（２ｍｌ／ｍｉｎ）；２２−２４分−１００％ボトルＢ（２ｍｌ／ｍｉｎ）；２４−２６分−０％−１００％Ａ（２ｍｌ／ｍｉｎ）。
６）荷電結合素子（”ＣＣＤ”）カメラ
蛍光標識プローブの検出のため、Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ  Ｎｕ２００  Ｃａｍｅｒａ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｒｅｖ．２．０．を連結したＰｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ  Ｍｅｔａｃｈｒｏｍｅ  ２  ＣＣＤ  Ａｒｒａｙ  カメラ（Ｔｕｓｃｏｎ，ＡＺ）を利用した。レーザー源は、アルゴンイオンレーザー、４５７−５１４ｎＭ（ＯｍｎｉＣａｍｅｒａ、Ｃｈｉｎｏ、Ｃｏ．）であった。
Ｄ．オリゴヌクレオチド配列
例全体で利用したオリゴヌクレオチドは、下記の配列を有していた（表示を容易とするため、例では、オリゴヌクレオチドを列挙した識別記号で示すであろう）。
１．ターゲットＡ（配列番号１）
0003733413.tif 000009
ターゲットＡの３’末端は、アミン化ポリプロピレンに直接合成した（すなわち、”リンカー”は全く利用しなかった）。
２．Ｐ２３（配列番号２）
0003733413.tif 000010
Ｐ２３は、ターゲットＡ（配列番号１）に対する標識相補体である。
３．Ｐ２４（配列番号３）
0003733413.tif 000011
Ｐ２４は、下線部塩基Ｇ（この塩基はＡであるはずである）を除いて、ターゲットＡに対する標識”相補”プローブである。
４．Ｐ３７（配列番号４）
0003733413.tif 000012
Ｐ３７は、ＧＣであるはずの塩基２個の欠失（”．．”）を除いて、ターゲットＡに対する標識”相補”プローブである。
５．ターゲットＡ６１（配列番号５）
0003733413.tif 000013
ターゲットＡ６１の３’末端は、アミン化ポリプロピレンに直接合成した。
６．ターゲットＡ７０（配列番号６）
0003733413.tif 000014
ターゲットＡ７０の３’末端は、アミン化ポリプロピレンに直接合成した。
７．ＣＦＴＲ  Ｅｘｏｎ  １０、Ｎｏｒｍａｌ（配列番号７）
0003733413.tif 000015
８．ＣＦＴＲ  Ｅｘｏｎ  １０、△Ｆ５０８（配列番号８）
0003733413.tif 000016
９．ＣＦＴＲ  Ｅｘｏｎ  １０  Ｐｒｉｍｅｒ，Ｓｅｎｓｅ（配列番号９）
0003733413.tif 000017
このプライマーは、５’末端においてビオチン化された。
１０．ＣＦＴＲ  Ｅｘｏｎ  １０  ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ（配列番号１０）
0003733413.tif 000018
このプライマーは、５’末端において標識された。
１１．開裂可能ターゲット１７−ｍｅｒ／定量的（配列番号１１）
0003733413.tif 000019
１２．ＳＡＭ１２５（配列番号１４）
0003733413.tif 000020
３’末端は、アミン化ポリプロピレンフィルムに直接合成された。
１３．６１５蛍光プローブ（配列番号１５）
0003733413.tif 000021
このプローブの５’末端は、フルオロセイン標識で標識された；このプローブの下線部は、ＳＡＭ１２５に相補性である。
例Ｉ
高分子デバイス媒体のアミン化
ポリプロピレン膜フィルターシートおよびフィルムは、上述のようにしてＲＦアミン化操作に供した。プラズマアミン化の後、前記シートおよびフィルムの約１ｃｍ×１ｃｍ端切片をニンヒドリン反応でアミン含量を定量的に分析した：非アミン化（”バージン”）ポリプロピレンコントロールシートおよびフィルムは、全く色の変化を示さなかった（すなわち、色が黄色のままであった）；アミン化ポリプロピレンシートは青色を呈し、ポリプロピレンシート上に存在するアミン基を示唆していた。シートおよびフィルムの残りを室温で（暗所に）電線インパルスヒートシーラーを用いて熱密封したポリエチレンバッグ中に保存した。オリゴヌクレオチド合成前に、シートおよびフィルムをＳｕｌｆｏ−ＳＤＴＢによってアミン含量を定量的に分析した：バージンポリプロピレンは約０〜１ナノモル／ｃｍ2を示した；ＲＦ処理に供したポリプロピレン膜は、約５〜３０ナノモル／ｃｍ2を含むと決定された。
ポリプロピレン糸を、上述のようにアミン化操作に供したが、２つ例外とした；実質的に直線的な糸は、ガラス板上に起き、その末端を接着テープでその場所に保持するか、または、糸をポリプロピレンオープンメッシュ材料の円筒状中心の回りにコイル状にし、その後この中心を接着テープを用いてガラス板に（その末端を介して）結合させた。およそ長さ６−１８ｃｍの糸をアミン化決定のために使用した。定量分析のため、バージンポリプロピレン糸は、ニンヒドリン試験プロトコールに供しても青色を呈せず、一方、ＲＦ処理に供したポリプロピレン糸は、所望の青色を呈した。定量試験（Ｓｕｌｆｏ−ＳＤＴＢによる）は、バージンポリプロピレン糸が約０〜２ナノモル／ｃｍ2のアミン表面含量を有していた；ＲＦ処理に供したポリプロピレン糸は、約５〜３０ナノモル／ｃｍ2のアミン表面含量を示した。
ポリプロピレンシート（２１．５ｃｍ×２６．６ｃｍ）のマスキングは、ＲＦ機器内部のガラス板状に上記シートを配置しこのシートに３０ｃｍ×３０ｃｍポリプロピレンメッシュフィルタースクリーン（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｍｅｓｈ  Ｌｏｓ  Ａｎｇｅｌｅｓ、ＣＡ，製品番号１４６４１０、１０００μｍ×１０００μｍ表示メッシュオープニング）を重層した。プラズマアミン化は、上述のように実施した。アミン”パターニング”（すなわち、表示メッシュオープニングに対応したアミン基の存在）の定性試験は、Ｓｕｌｆｏ−ＳＤＴＢ試薬を用いて実施し、蒸留水で洗浄し、シートを濃塩酸煙上にかざした。マスクされていない領域が橙色（アミン基の存在を示唆）を有し一方メッシュ部分（マスク領域）下の領域は白色（アミン基の不在を示唆）である”チェッカー”パターンが生成した。同一シートをその後蒸留水、メタノールおよびアセトンで洗浄し、風乾した。その後、このポリポロピレンシートに対して、３０ダイン−ｃｍ青色色素湿潤  Ｔｅｎｓｉｏｎ  Ｔｅｓｔ  Ｓｙｓｔｅｍ  キットＮｏ．５（Ｓｅｌｅｃｔ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｗａｋｕｓｈａ、ＷＩ）を適用し、この領域が疎水性であること（すなわち、アミン基がないこと）が示唆され、一方、マスクされていない領域が外観が白色のままであることから、この領域が親水性であること（すなわち、アミン基が存在すること）が示唆された。
例ＩＩ
アミン化ポリプロピレン上におけるオリゴヌクレオチド存在の決定
例Ｉのアミン化ポリプロピレン上へのオリゴヌクレオチド合成の効率決定は、前記材料上に合成されそれから開裂されたオリゴヌクレオチドのＨＰＬＣおよびＣＺＥ分析で予測した。
支持体材料がその表面上において実質的に同一の合成を可能とすることが重要である−−−すなわち、もし支持体材料の合成の変化を可能とするならば、異なる長さを有するオリゴヌクレオチドがその上に合成できる。
合成原料の品質決定のための効率的手段は、合成された原料のＨＰＬＣおよび／またＣＺＥ分析による。もし支持体材料が一貫した効率的合成を可能とするならば、その際には、その上に合成され、除去されかつＨＰＬＣおよび／または、ＣＧＥ分析に供された材料は単一ピークを生ずると予期される。すなわち、全くまたは実質的にわずかの”夾雑物”が存在しており、これらは、正確な配列長さおよび組成を有していないオリゴヌクレオチドを示唆している。
オリゴヌクレオチド合成前、および合成原料を分析する目的の故に、リンカー基をアミン化ポリプロピレンに添加した。特に、アミン化ポリプロピレンは、コハク酸ヌクレオシドの活性エステルで濃縮した；この後、その他のヌクレオシドを添加した。明らかであるように、コハク酸エステルの部分はアンモニアを用いた”開裂”を受ける。
１７−ｍｅｒオリゴヌクレオチド（配列番号１１）を、手で巻き上げかつＢｅｃｋｍａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  ＯＬＩＧＯ  １０００  ＤＮＡ  シンセサイザーのニードルチップ反応カラム中に緩く充填したアミン化ポリプロピレンシート（．５ｃｍ×１．５ｃｍ）上に直接合成した；アミン化ポリプロピレン糸（長さ約２０ｃｍ）を同様に利用した。１７−ｍｅｒオリゴヌクレオチド合成後このオリゴヌクレオチドを支持体から室温で１時間ＮＨ4ＯＨ（２８％）で開裂し、その後、８０℃で１時間、ＮＨ4ＯＨ（２８％）で脱保護した。放出されたオリゴヌクレオチドをその後ＨＰＬＣおよびＣＧＥ法で上述のパラメーターで分析した。ポリプロピレンシート上に合成されたオリゴヌクレオチドについての結果を第１図（ＨＰＬＣ）および第２図（ＣＧＥ）に示した（ポリプロピレン糸の結果は実質的に同様の結果を示した；これらの結果は、本文で示していない）。
第１図及び第２図から明らかなように、単一の明確なピークが示され、特にアミン化ポリプロピレンにおける合成効率が最適であることを示唆している（第１図の小さいピークは、合成ＤＮＡ鎖のベンゾイル保護基の除去によって形成されたベンズアミドに起因する）。
例ＩＩＩ
相補体および変異体の脱ハイブリッド形成の特徴
アミン化ポリプロピレンシ上に合成された標的配列に対するポリヌクレオチドのハイブリッド形成特徴を決定するため、完全な相補体（すなわち、”野生型”に類似する）である配列および完全な相補体でない配列（すなわち、”変異体”に類似する）を有するオリゴヌクレオチドを用いて一連の実験を実施した。記載したように、遺伝分析では、野生型および変異配列を識別することが重要である；この目標は、欠失変異の能力が単一塩基欠失／置換によるとみなされかつ上記変異配列が野生型相補プローブにハイブリッド形成する頻度によるとみなされると、悪影響を受ける。これらの要因の故に、標的からの脱ハイブリッド形成は、経時的にＤ−ＨＡＳTMシステムを用いて分析した。
これまでターゲットＡと称されたものを、上述のＤＮＡシンセサイザーを用いてアミン化ポリプロピレン膜上に直接合成した。その後、Ｐ２３（ターゲットＡに対する完全相補体）；Ｐ２４（単一塩基ミスマッチ）；およびＰ３７（２塩基欠失）は、下記のようにして別々にターゲットＡに導入した：それに共有結合的に結合させたターゲットＡを有するアミン化ポリプロピレンをハイブリッド形成緩衝液中で平衡化させた；その後、前記３個のプローブ（０．５ピコモル／５０μｌ  ハイブリッド形成緩衝液）のそれぞれをこれらの膜に添加し、２５℃で１時間インキュベーションした。ハイブリッド形成緩衝液をその後除去し、膜を２００μｌのハイブリッド形成緩衝液で一度洗浄した；その後、膜を開示のようにＤ−ＨＡＳTMシステムに添加した。標識プローブの存在低下分析を実施し、その結果をまとめて第３図に示した。
ターゲットＡに対する”完全”相補体と”不完全”相補体の間において、完全相補体が不完全相補体よりも同一条件下で長くターゲットＡにハイブリッド形成したままであることが予測されるであろう。第３図は、この予測の有効性を示している。Ｐ２３（相補体）およびＰ２４（単一塩基ミスマッチ）の脱ハイブリッド形成パターンの違いが極めて明らかであることに注目されたい；Ｐ２３およびＰ３７（塩基２個欠失）の脱ハイブリッド形成パターンの差異ははるかに大きい。
これらの結果は、特に、野生型標的および変異標的（類）がアミン化ポリプロピレンに直接合成可能であることおよびこれらを用いて遺伝スクリーニングが可能であることを示しており−−−野生型相補体および変異（またはその他）の存在の識別能力は明らかである。
例ＩＶ
膿胞性線維症  △Ｆ５０８  Ｅｘｏｎ  １０の分析
ＣＲＴＲ  Ｅｘｏｎ  １０、△Ｆ５０８患者試料（配列番号８）およびＣＦＴＲ  Ｅｘｏｎ  １０、正常患者試料（配列番号７）は、Ｃ．Ｔｈｏｍａｓ  Ｃａｓｋｅｙ教授（Ｂａｙｌｏｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｈｏｕｓｔｏｎ、ＴＸ）によって供与された。これらは、記載のセンスおよびアンチセンスプライマーを用いて増幅した；増幅後、実質的に標識アンプリコンのみが分析に利用されるように、ビオチン化アンプリコンを（アビジン被覆ビーズを用いて）除去した。
ＣＦＴＲ  Ｅｘｏｎ  １０に注目し、その配列（配列番号７）の下線部を、本文では”領域変異”、すなわち、△Ｆ５０８中において、ＡＴＣ  ＴＴＴがＡＴＴとして示されるように塩基ＣＴＴが欠失しているとして本文で称する。我々は、前記領域変異に対する標的を前記表面活性化有機高分子上に合成し構築するに際し、変異が存在すると可能なミスマッチ数を最大とするように、前記標的に沿った領域変異に対する相補体を位置するべきであると決定した。たとえば、もし領域変異がアミン化ポリプロピレンの遠位で標的に沿って位置すると、その際に、この例ではＥｘｏｎ  １０、△Ｆ５０８およびＥｘｏｎ  １０、Ｎｏｒｍａｌの対応するハイブリッド形成が下記のようになる；（下線部は、領域変異に対する相補体である）：
0003733413.tif 000022
したがって、Ｅｘｏｎ  １０、△Ｆ５０８がそれにハイブリッド形成した時の１６−ｍｅｒターゲットＡ７０に沿ったＥｘｏｎ  １０、△Ｆ５０８に注目すると、１３個の相補塩基とおよび３個のミスマッチがあるであろう（カッコに示した）。領域変異に対する相補体を高分子の方に移動すると、ミスマッチの数は増加する：
0003733413.tif 000023
この移動は、ターゲットＡ６１−Ｅｘｏｎ  １０、△Ｆ５０８ハイブリッド形成の相補塩基の数を１０まで減少させ、およびミスマッチの数を６まで増加させる。すなわち、ミスマッチが１００％増加する。
意図は、ミスマッチの数を最大とすることにある。これは、当然、領域変異の長さに依存するであろう。しかし、野生型相補標的と試料変異のミスマッチの好適な百分率は、少なくとも約２０％、さらに好適には約４０％、および最も好適には約５０％未満である（もしミスマッチ塩基の数が約５０％を越えると、緊縮条件が変異の標的への十分なハイブリッド形成を可能としないであろう）。しかし、これらの百分率は、標的上のミスマッチ部分およびミスマッチ種類に相対的である。たとえば、遠位（ｄｉｓｔａｌ）ミスマッチは、内部（ｉｎｔｅｒｎａｌ）ミスマッチほど望ましくないし、および相捕ハイブリッド形成に関連するＧ−Ｃ含量は通常Ａ−Ｔ含量よりも”大きい”。
Ｅｘｏｎ  １０、△Ｆ５０８およびＥｘｏｎ  １０、Ｎｏｒｍａｌアンプリコンの分析のため、ターゲットＡ６１を利用した；ターゲットＡ６１は、上述のようにしてアミン化ポリプロピレン上に直接合成した。ハイブリッド形成および脱ハイブリッド形成条件は、例ＩＩＩに記載の通りである。結果を第４図に示した。
第４図の結果が示唆するように、ＣＦＴＲ  Ｅｘｏｎ  １０、ＮｏｒｍａｌおよびＣＦＴＲ  Ｅｘｏｎ  １０、△Ｆ５０８の野生型相補ターゲットＡ６１との脱ハイブリッド形成における差異は驚くべきものであった−−−Ｅｘｏｎ  １０、△Ｆ５０８の脱ハイブリッド形成パターンは、バックグランドノイズのそれとほとんど同一であった。したがって、遺伝的変異の存在のための試料分析が容易に達成できる。
例Ｖ
ニワトリ−タマゴリゾチーム（”ＨＥＬ”）ペプチドの分析
下記のペプチドは、別々のアミン化ポリプロピレン膜上に直接合成した。これらのニワトリ−タマゴリゾチームペプチドは下記の配列を有していた：
ＨＥＬ  １１−２５（配列番号１２）：
0003733413.tif 000024
ＨＥＬ  １０６−１１６（配列番号１３）：
0003733413.tif 000025
Ｌｅｕ（ＨＥＬ  １１−２５）およびＬｙｓ（ＨＥＬ  １０６−１１６）のカルボキシル基をアミン化ポリプロピレンに直接接合させた（すなわち、ＬｅｕおよびＬｙｓはそれぞれ、開始生体モノマーである）。ペプチド合成は、Ｄ．Ｈｕｄｓｏｎ、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５３：６１７（１９８８）；Ｍｉｌｌｉｇｅｎ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｎｏｔｅ  ４−３０（１９８７）に記載された一般的プロトコールに従って実施した。Ｆｍｏｓ−保護アミノ酸は、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社から入手した。（Ｐｒｏｄ．Ｎｏｓ（製品番号）．Ｆｍｏｃ  Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）：２６６３６６；Ｆｍｏｃ  Ｌｙｓ（ＴＢｏｃ）：２６６３８７；Ｆｍｏｃ  Ａｓｎ：２６６３５１；Ｆｍｏｃ  Ｔｒｐ：２６６４０８；Ｆｍｏｃ  Ａｌａ：２６６３４２；Ｆｍｏｃ  Ｖａｌ：２６６４１４；Ｆｍｏｃ  Ｌｅｕ：２６６３８４；Ｆｍｏｃ  Ｓｅｒ（ＯＴＢｕ）：２６６４０２；Ｆｍｏｃ  Ｔｙｒ（ＯＴＢｕ）：２６６４１０；Ｆｍｏｃ  Ｇｌｙ：２６６３７５；Ｆｍｏｃ  Ａｓｐ（ＯＴＢｕ）：２６６３５４；Ｆｍｏｃ  Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）：２６６３７７；Ｆｍｏｃ  Ｍｅｔ：２６６３９０；Ｆｍｏｃ  Ａｒｇ（Ｍｔｒ）は、Ｍｉｌｌｉｇｅｎから入手した（製品番号９１１０１４）。結合剤（１，３−ジ−イソプロピルカルボジイミド）は、Ａｌｄｒｉｃｈから入手した（製品番号Ｄ１２，５４０−７）。結合剤（ハイドロキシベンゾトリアゾール）は、Ａｌｄｒｉｃｈから入手した（製品番号１５，７２６−０）。Ｆｍｏｓ脱保護基（ピペリジン）は、Ａｌｄｒｉｃｈから入手した（製品番号１０，４０９−４）。側鎖基は、１９ｍｌのトリフルオロ酢酸（９５％）（Ａｌｄｒｉｃｈ、製品番号２９，９５３−７）、０．５ｍｌアニソール（Ａｌｄｒｉｃｈ，製品番号１２，３２２−６）、および０．５ｍｌのエチルメチルスルフィド（Ａｌｄｒｉｃｈ、製品番号２３，８３１−７）を用いて除去し、それらは、混合物に添加し室温に６時間放置した後、エーテル洗浄した。
これらの特定ペプチド類の存在を証明するため、マウス抗ＨＥＬ−１１−２５モノクローナル抗体およびマウス抗ＨＥＬ−１０６−１１６モノクローナル抗体をＥＬＩＳＡフォーマットで用いた。抗体はＣｌｉｆｆｏｒｄ  Ｏｌｓｏｎ博士、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社から供与していただいた。これらの抗体はこれらのペプチドと交差反応しない。３つの条件を分析した：Ａ−その上に直接合成されたＨＥＬ−１１−２５ペプチドを含むアミン化ポリプロピレン；Ｂ−その上に直接合成されたＨＥＬ−１０６−１１６ペプチドを含むアミン化ポリプロピレン；Ｃ−コントロール（アミン化ポリプロピレン膜）。ＥＬＩＳＡ条件は下記のようであった；膜を９６穴タイタープレートの６個のそれぞれのウェルに入れた；２つのウェルは、膜／ＨＥＬ−１１−２５を含んでいた；２つのウェルは、膜／ＨＥＬ−１０６−１１６を含んでいた；および２つのウェルは膜を含んでいた。下記の条件を各ウェルについて用いた。１％ＢＳＡ溶液を各ウェルに添加し、室温で１時間インキュベーションした。この後、２５０μｌのリン酸塩で緩衝された生理食塩水（”ＰＢＳ”）による洗浄を３回行った。抗ＨＥＬ−１１−１６を各セットの１個のウェルに添加し、抗ＨＥＬ−１０６−１１６を残りのセットの１個のウェルに添加した。その後、アルカリホスファターゼ連結ヤギ抗マウス抗体（１：５０００希釈）（Ｈｉｇｈ  Ｃｌｏｎｅ，Ｕｔａｈ、Ｐａｒｔ＃ＥＡ１０５５−Ｘ）１００μｌを各ウェルに添加した。この後、室温で３０分インキュベーションした；その後２５０μｌのＰＢＳによる洗浄を３回行った。その後、ＮＢＴ−ＢＣＩＰ（ニトロブルーテトラゾリウム−Ｓｉｇｍａ  Ｎ６８７６；５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−フォスフェートＳｉｇｍａ，Ｂ６１４９、下記のように調製した：ＮＢＴストック（ジメチルホルムアミド１０ｍｌ中ＮＢＴ０．５ｇ）６６μｌおよびＢＣＩＰストック（７０％ジメチルホルムアミド１０ｍｌ中ＢＣＩＰ０．５ｇ）３３μｌをアルカリホスファターゼ緩衝液（１００ｍｍ  ＮａＣｌ；５ｍｍ  ＭｇＣｌ2；１００ｍｍ  トリス−ヒドロキシメチルアミノメタン、ｐＨ９．５）溶液１０ｍｌに添加した）溶液を各ウェルに添加した。発色（青）まで１０分、時間をとった。その後、ウェルを脱イオン水で洗浄した。洗浄後の青色の存在は、モノクローナル抗体に結合したヤギ抗マウスの存在を示唆していた（結果を示さず）。
それぞれの抗体は、特異的にそれらのそれぞれのペプチドに結合した。たとえば、青色は、抗ＨＥＬ−１０６−１１６を添加した膜／ＨＥＬ−１１−１６およびアミン化ポリプロピレンを含むウェルでは全く観察されなかった。アミン化ポリプロピレン中において色がないことは、いずれかの抗体の非特異的結合が起こらなかったことを示唆している。抗体の特定ペプチドへの特異的結合は、特に、ＨＥＬ−１１−２５およびＨＥＬ−１０６−１１６ペプチドが実際に正確にアミン化ポリプロピレン上に合成されたことを示唆している。
例ＶＩ
ディップスティックハイブリッド形成
それに共有結合で結合したＳＡＭ１２５を有するアミン化１．２ミル二軸配向ポリプロピレンフィルムを、ハイブリッド形成緩衝液中に１０分間、浸漬した。その後、９７μｌハイブリッド形成緩衝液中３μｌの６１５蛍光プローブ（１０ピコモル／１００μｌ）をそれに添加し、その後、９０分間インキュベーションした。この後、ハイブリッド形成緩衝液２００μｌで４回洗浄した。フィルムをその後除去し、ガラススライド上に置き、ＣＣＤカメラを用いて分析を行った；結果のレーザープリンター複製を第５図に示した。
第５図の結果は、ＳＡＭ１２５と６１５蛍光プローブとの間に強いハイブリッド形成が起きたことを示唆している。このディップスティック様式は、問題の遺伝的変異が存在するかまたは存在しないかを迅速分析できる；非放射性標識の使用は、放射性標識の使用によって起こる懸念を回避する。
前記にはかなり詳細にかつ好適な態様の観点から説明してきたが、これらは、開示または下記の請求の範囲の限定として解釈されるべきではない。当業者の範囲内の改良および変更は下記の請求の範囲の範囲内にあると意図される。
配列表
（１）一般的情報：
（ｉ）出願人：ベックマン  インスツルメンツ  インコーポレーテッド
（ｉｉ）発明の名称：表面が活性化された、有機高分子を用いる生体高分子の合成
（ｉｉｉ）配列の数：１５
（ｉｖ）通信住所：
（Ａ）受取人：ベックマン  インスツルメンツ  インコーポレーテッド内
（Ｂ）通り：ハーバー  ボルバード  ２５００
（Ｃ）市：フラートン
（Ｄ）州：カリフォルニア
（Ｅ）国：アメリカ合衆国
（Ｆ）郵便番号：９２６３４
（ｖ）コンピューター判読形態：
（Ａ）ミディウムタイプ：フロッピーディスク
（Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ  ＰＣ  コンパーチブル
（Ｃ）オペレーティングシステム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ
（Ｄ）ソフトウェア：パテントイン  リリース  ＃１．０，バージョン  ＃１．２５
（ｖｉ）現在の出願のデータ：
（Ａ）出願番号：
（Ｂ）出願日：１９９３年１０月２９日
（Ｃ）分類：
（ｖｉｉｉ）弁護士／弁理士情報：
（Ａ）氏名：ヘンリー，ジャニス  シー．
（Ｂ）登録番号：３４，３４７
（Ｃ）参照／名簿番号：１２９Ｄ−１１８７
（ｉｘ）電気通信情報：
（Ａ）電話：（７１４）７７３−６９７１
（Ｂ）ファックス：（７１４）７７３−７９３６
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：１６  塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：Ｎｏ
（ｉｖ）アンチセンス：Ｎｏ
（ｘｉ）配列：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１：
0003733413.tif 000026
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：２：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：１６  塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：Ｎｏ
（ｉｖ）アンチセンス：Ｎｏ
（ｘｉ）配列：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２：
0003733413.tif 000027
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：３：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：１６  塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：Ｎｏ
（ｉｖ）アンチセンス：Ｎｏ
（ｘｉ）配列：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３：
0003733413.tif 000028
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：４：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：１４  塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：Ｎｏ
（ｉｖ）アンチセンス：Ｎｏ
（ｘｉ）配列：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４：
0003733413.tif 000029
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：５：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：１６  塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：Ｎｏ
（ｉｖ）アンチセンス：Ｎｏ
（ｘｉ）配列：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５：
0003733413.tif 000030
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：６：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：１６  塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：Ｎｏ
（ｉｖ）アンチセンス：Ｎｏ
（ｘｉ）配列：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６：
0003733413.tif 000031
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＮ  ＮＯ）：７：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：９７  塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：Ｎｏ
（ｉｖ）アンチセンス：Ｎｏ
（ｘｉ）配列：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７：
0003733413.tif 000032
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：８：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：９５  塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：Ｎｏ
（ｉｖ）アンチセンス：Ｎｏ
（ｘｉ）配列：ＳＥＱ  ＩＤＮＯ：８：
0003733413.tif 000033
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：９：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：２４  塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：Ｎｏ
（ｉｖ）アンチセンス：Ｎｏ
（ｘｉ）配列：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９：
0003733413.tif 000034
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１０：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：２４  塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：Ｎｏ
（ｉｖ）アンチセンス：Ｙｅｓ
（ｘｉ）配列：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０：
0003733413.tif 000035
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１１：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：１７  塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：Ｎｏ
（ｉｖ）アンチセンス：Ｎｏ
（ｘｉ）配列：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１：
0003733413.tif 000036
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１２：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：１５  アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：Ｎｏ
（ｘｉ）配列：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２：
0003733413.tif 000037
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１３：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：１１  アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：Ｎｏ
（ｘｉ）配列：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３：
0003733413.tif 000038
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１４：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：１５  塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：Ｎｏ
（ｉｖ）アンチ−センス：Ｎｏ
（ｘｉ）配列：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４：
0003733413.tif 000039
（２）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１５：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：２４  塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：Ｎｏ
（ｉｖ）アンチ−センス：Ｎｏ
（ｘｉ）配列：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５：
0003733413.tif 000040