(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Iで表される(2R,3S)-1-ハロ-2-ヒドロキシ-3-(保護)アミノ-4-置換ブタン類の立体選択的製造方法であって、
【化１】
0003843255.tif 000013
（式中、Halはハロゲン、Rはアルキル、置換アルキル、アリール、及び置換アリールからなる群から選択され、並びにR1はアミノ官能基の保護基である）、
式IIで表される(3S)-1-ハロ-2-オキソ-3-(保護)アミノ-4-置換ブタンを、
【化２】
0003843255.tif 000014
（式中、Hal、R及びR1は上記で定義したとおりである）
式IIの化合物の立体選択的還元を触媒し得る微生物（前記微生物はRhodococcus erythropolis ATCC 4277、Rhodococcus erythropolis DSM 6971及びRhodcoccus sp. ATCC 21227、Rhodococcus erythropolis ATCC 27854及びBrevibacterium sp. ATCC 19653からなる群より選択される微生物である）と前記還元に効果のある条件下に接触させ、式Iで表される化合物を回収することを含む、上記方法。
【請求項２】
Halがクロロであり、Rがフェニルであり、R1がt-ブトキシカルボニルである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
微生物がRhodococcus erythropolis ATCC 4277である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
微生物がRhodococcus erythropolis DSM 6971である、請求項１記載の方法。
【請求項５】
微生物がRhodococcus species ATCC 21227である、請求項１記載の方法。
【請求項６】
微生物がRhodococcus species ATCC 27854である、請求項１記載の方法。
【請求項７】
微生物がRhodococcus sp. ATCC 19653である、請求項１記載の方法。
【請求項８】
一段階発酵で行われる、請求項１記載の方法。
【請求項９】
二段階発酵で行われる、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
誘導剤存在下に行われる、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
誘導剤が式Iで表される化合物であり、それを微生物が生育する間に添加する、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
式Iで表される化合物が少なくとも７０％の収率で得られ、かつ少なくとも９３％のジアステレマー純度で得られる、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
式Iで表される化合物が少なくとも９５％の収率で得られ、かつ少なくとも９９％のジアステレマー純度で得られる、請求項１０記載の方法。
【請求項１４】
下記式で表されるエポキシ化合物を製造する方法であって、
【化３】
0003843255.tif 000015
(式中、Rはアルキル、置換アルキル、アリール、及び置換アリールからなる群から選択され、並びにR1はアミノ官能基の保護基である)
下記式で表されるアリールエステルを、
【化４】
0003843255.tif 000016
（式中、R及びR1は上記で定義したとおりであり、R2は水素またはニトロであり、及びフェニル環のオルトまたはパラ位で置換されていてもよい）
下記式で表される官能基を有するイオウイリド化合物と反応させ、
【化５】
0003843255.tif 000017
（式中、R3及びR4は、アルキル、置換アルキル及びアリールからなる群より選択される）
下記式で表される中間体ケトイリド化合物を製造し、
【化６】
0003843255.tif 000018
（式中、R、R1、R3及びR4は上記で定義したとおりである）
式IIIで表される前記化合物を、塩素源及び有機酸を用いて処理して、下記式で表される1-置換-2-アミノ-3-オキソ-4-クロロブタンを形成し、
【化７】
0003843255.tif 000019
（式中、R及びR1は上記で定義したとおりである）
前記化合物を還元して、下記式で表される1-クロロ-2-ヒドロキシ-3-アミノ-4-置換ブタン化合物を形成し、
【化８】
0003843255.tif 000020
（式中、R及びR1は上記で定義したとおりである）
前記ヒドロキシ化合物を塩基と反応させて前記エポキシ化合物を形成することを含み、前記1-クロロ-2-オキソ-3-アミノ-4-置換ブタン化合物の還元を請求項１に記載の方法で行い、それにより前記1-クロロ-2-ヒドロキシ-3-アミノ-4-置換ブタン化合物を少なくとも７０％の収率で、かつ少なくとも９３％のジアステレオマー純度で得ることを特徴とする上記方法。
【請求項１５】
式Iで表される化合物が少なくとも９５％の収率で得られ、かつ少なくとも９９％のジアステレマー純度で得られる、請求項１４記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は(2R,3S)-1-ハロ-2-ヒドロキシ-3-(保護)アミノ-4-置換ブタン類を、相当するオキソ化合物を立体選択的に還元することにより製造する新規な方法に関する。本発明の方法により製造された置換ブタン類は、アンジオテンシン変換酵素、レニンおよびHIV-プロテアーゼの阻害剤として治療学的に有用な多数の分子に存在する、ヒドロキシエチルアミン生物学的等価体サブユニットの前駆体である。
【０００２】
発明の背景
Bing-nan Zhou et al. J. Am. Chem. Soc., 105, pages 5926-5928, 1983には、ヒトの代謝及び長鎖脂肪酸の輸送において重要な役割を果たすL-カルニチンの化学微生物学的合成について記載されている。特にこの文献には、ベイカー酵素、すなわちSaccharomyces cerevisiae により、エチルK-クロロアセトアセテートをエチル(S)-4-クロロ-3-ヒドロキシブタノエートへ還元することについて記載されている。
【０００３】
Kazutoshi Ushio et al. Tetrahedron Letters, Vol. 27, No. 23, pages 2657-2660, 1986, にはベータ-ケトエステルのメタノール生育酵素による還元について記載されている。この文献は、目的の反応においてD-異性体が増える方向に劇的にシフトしたエナンチオマー過剰の生成物が生じることを教示している。この現象は、メタノール中で生育する酵素を使用して反応を行った場合に生じるが、これはそのような媒体中で生育する酵素の性質によるものである。
【０００４】
Markus Christen et al. J. Chem. Soc. Chem. Commun. pages 264-266, 1988,には、メチル-6-(p-クロロフェニルチオ)-3,4-ジヒドロヘキサノエートの４種類の立体異性体の合成について開示されており、そのキーでありキラリティーの導入は、適する酵素還元により行われる。前記文献には、酵素によるベータ-ケトエステルの還元はかなり研究されているが、生成物の絶対立体配置がどちらであるか予測することは依然として困難であり、特に達成しえるエナンチオマー過剰については困難である。
【０００５】
Antonio Trincone et al., Biotechnology and Bioengineering, Vol. 35, pages 559-564, 1990にはSulfolobus solfataricusの静止細胞によるケトンの非対称還元について記載されている。この微生物の静止細胞の還元能は、細胞生育のフェーズ（phase）に強く依存している。
【０００６】
Ramesh Patel et al., Enzyme Microb. Technol., Vol. 13, pages 906-912, 1991には4,5-ジヒドロ-4-(4-メトキシフェニル)-6-(トリフルオロメチル-1H-1)-ベンズアゼピン-2-オンの立体特異的微生物学的還元について記載されている。特に、キー中間体である(3R-cis)-1,3,4,5-テトラヒドロ-3-ヒドロキシ-4-(4-メトキシフェニル)-6-(トリフルオロメチル)-2H-1-ベンズアゼピン-2-オンを親ケトンの立体選択的微生物学的還元により製造したことを記載している。特定の条件を選択することにより、4種類の既知の可能性から単一の異性体を得ることが可能であることを述べている。
【０００７】
Ramesh Patel et al., Enzyme Microb. Technol., Vol. 15, pages 1014-1021, 1993, にはジケト化合物3,5-ジオキソ-6-(ベンジルオキシ)ヘキサン酸メチルエステルの、得られたジヒドロキシ化合物の単一エナンチオマーへの立体選択的還元を記載している。
【０００８】
Ramesh Patel et al., Enzyme Microb. Technol., Vol. 14, pages 731-738, 1992にはベータ-ケトエステルの還元から得られるヒドロキシ生成物の光学的純度を改良する熱処理Geotrichum candidumのプロセスが記載されている。
【０００９】
Kometani et al,, Journal of Fermentation and Bioengineering, Vol. 80, No. 2, pages 208-210, 1995, には、エタノールをエネルギー源として使用する酵素媒介生物学的還元について記載されている。ベイカーズ酵素におけるエタノールの消費速度とプロキラルケトン還元速度の関係について研究され、プロキラルケトン類からキラルアルコール類の大量製造にエタノールを適用できると結論された。
【００１０】
Ramesh Patel et al., U.S. Patent No. 5,391,495（1995年2月21日発行）には、還元を触媒し得る微生物または酵素を用いた、特定のケト含有スルホンアミド化合物の立体選択的還元により相当するヒドロキシ基含有化合物を形成することが記載されている。命名された酵素は、オキシド還元酵素またはデヒドロゲナーゼであり、微生物は好ましくはHansenula、Rhodococcus、及びNorcardia種から選択される。
【００１１】
発明の要約
本発明は、特定の種のRhodococcus及びBrevibacteriumによる、相当するケト基含有化合物の還元による(2R,3S)-1-ハロ-2-ヒドロキシ-3-(保護)アミノ-4-置換ブタン類製造の新規な立体選択的方法に関する。生成物は高収率かつ良好なジアステレオマー純度で得られる。
【００１２】
発明の詳細な説明
本発明は、以下の式で表される(2R,3S)-1-ハロ-2-ヒドロキシ-3-(保護)アミノ-4-置換ブタン類の有利な合成方法を提供する。
【００１３】
【化９】
0003843255.tif 000002
式中、Halはハロゲン、好ましくは塩素であり、Rはアルキル、置換アルキル、アリール、及び置換アリールからなる群から選択され、並びにR1はアミノ官能基の保護基である。
【００１４】
式Ｉで表される置換ブタン類は、ACE、レニン及びHIVプロテアーゼの阻害剤である分子の合成における中間体として有用である。HIVプロテアーゼに対するそのような分子の活性は、AIDSのようなレトロウイウス感染の治療に非常に有効である。そのような化合物及びその使用については、例えば米国特許第5,849,911号明細書に記載されており、これらの記載は本明細書に組み込まれるものとする。米国特許第5,849,911号明細書に記載される特に重要なAIDS化合物は[3S-(3R*,8R*,9R*,12R*)]-3,12-ビス(1,1-ジメチルエチル)-8-ヒドロキシ-4,11-ジオキソ-9-(フェニルメチル)-6{[4-(2-ピリジニル)フェニル]メチル}-2,3,6,10,13-ペンタアザレテトラデカン二酸ジメチルエステルである。この化合物は、式Iの(2R,3S)-1-ハロ-2-ヒドロキシ-3-(保護)アミノ-4-置換ブタン類から直接合成してもよい。本発明の方法により非常に高収率に式Iで表される置換ブタン類のトランス(2R,3S)エナンチオマーを製造できるという事実は、上記治療学的化合物の有用な合成に非常に重要である。
【００１５】
本明細書において以下の用語は下記の定義を有する。用語"アルキル"は１〜７炭素原子、好ましくは１〜４炭素原子を有する、任意に置換された直鎖または分岐鎖の飽和炭化水素である。"低級アルキル"という表現は、任意に置換された１〜４炭素原子を有する置換アルキル基を表す。
【００１６】
用語"置換アルキル"は、例えば１〜４の置換基（例、ハロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、ヒドロキシ、アルコキシ、シクロアルコキシ、ヘテロシクロオキシ、オキソ、アルカノイル、アリール、アリールオキシ、アラルキル、アルカノイルオキシ、アミノ、アルキルアミノ、アリールアミノ、アラルキルアミノ、シクロアルキルアミノ、ヘテロシクロアミノ及び二置換アミノ）により置換されたアルキル基を意味する。ここでアルキル及び置換アルキルに与えられた定義は、アルコキシ基のアルキル部分についても適用される。
【００１７】
用語"アリール"は、環部分に６〜１２炭素原子を有する単環または二環の芳香族炭化水素基であり、たとえば、フェニル、ナフチル、ビフェニル及びジフェニル基が挙げられ、各々は置換されていてもよい。
用語"アラルキル"はアルキル基を介してより大きな部分（larger entity）に結合したアルキル基を意味し、例えばベンジル基が挙げられる。
【００１８】
用語"置換アリール"は、例えば、１〜４の置換基(例、アルキル、置換アルキル、ハロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、ヒドロキシ、アルコキシ、シクロアルキルオキシ、ヘテロシクロオキシ、アルカノイル、アルカノイルオキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アラルキルアミノ、シクロアルキルアミノ、ヘテロシクロアミノ、アルカノイルアミノ、チオール、アルキルチオ、シクロアルキルチオ、ヘテロシクロチオ、ウレイド、ニトロ、シアノ、カルボキシ、カルボキシアルキル、カルバミル、アルコキシカルボニル、アルキルチオノ、アリールチオノ、アルキルスルホニル、スルホンアミド、アリールオキシ等)により置換されたアリール基を意味する。置換基はさらに、一つ以上の、ハロ、ヒドロキシ、アルキル、アルコキシ、アリール、置換アルキル、置換アリール及びアラルキルからなる群から選択される基により置換されていてもよい。
用語"ハロゲン"または"Hal"は、塩素、臭素、フッ素及びヨウ素を意味し、塩素が好ましい。
【００１９】
用語"アミノ官能基上の保護基"は、アミノ基が、結合した分子上のいずれかで起こる反応に関与しないように保護するそのアミノ基に結合し得る当業者が認識する基を意味する。そのような基の中で好ましいのはt-ブトキシカルボニル（BOC）であるが、当業者が認識するアミノ官能基保護基、一般にアルコキシカルボニル基〔例ベンジルオキシカルボニル〕を同様に使用することができる。
式Iで表される(2R,3S)-1-ハロ-2-ヒドロキシ-3-(保護)アミノ-4-置換ブタン類を製造する本発明の方法の出発物質は、下記式で表される相当するケト基含有化合物である。
【００２０】
【化１０】
0003843255.tif 000003
式中、Hal、R及びR1は上記で定義したとおりである。式IIで表される化合物を、文献できさいされ、また当業者に既知の方法により製造することができる。式IIで表される化合物を形成する好ましい方法は、同時継続特許出願Docket GY55に開示されており、その記載を本明細書に組み入れるものとする。この方法において、下記式で表されるアリールエステル；
【００２１】
【化１１】
0003843255.tif 000004
（式中、R及びR1は上記で定義したとおりであり、R2は水素またはニトロであり、フェニル基のオルトまたはパラ位で置換されていてもよい）を、イオウイリド、すなわち、下記式で表される官能基を有する化合物と反応し；
【００２２】
【化１２】
0003843255.tif 000005
下記式で表される中間体ケトイリドを生成させる；
【００２３】
【化１３】
0003843255.tif 000006
式中、R及びR1は上記で定義したとおりであり、R3及びR4は、アルキル、置換アルキル及びアリールからなる群より選択される。上記式で表されるケトイリド化合物を次に、塩素源、好ましくは塩基性の塩素源、最も好ましくは塩化リチウム及び有機酸(例えばメタンスルホン酸)と反応させることにより、式IIで表されるケト基含有化合物に変換する。
【００２４】
上記式Iで表される(2R,3S)-1-ハロ-2-ヒドロキシ-3-(保護)アミノ-4-置換ブタン類は、ACE、レニン及びHIVプロテアーゼの阻害剤である分子の合成における重要な中間体である。HIVプロテアーゼに対するそのような分子の活性は、AIDSのようなレトロウイルスの治療において非常に有用である。特に、式Iで表される(2R,3S)-1-ハロ-2-ヒドロキシ-3-(保護)アミノ-4-置換ブタン類は適する塩基と処理して、下記式で示される相当するエポキシド類に変換する。
【００２５】
【化１４】
0003843255.tif 000007
【００２６】
上記式で表されるエポキシド化合物は、米国特許第5,849,911号明細書に記載される特に重要なAIDS化合物、[3S-(3R*,8R*,9R*,12R*)]-3,12-ビス(1,1-ジメチルエチル)-8-ヒドロキシ-4,11-ジオキソ-9-(フェニルメチル)-6{[4-(2-ピリジニル)フェニル]メチル}-2,3,6,10,13-ペンタアザレテトラデカン二酸ジメチルエステルに変換することができ、前記明細書の記載は本明細書に組み入れるものとする。
【００２７】
上記式IIで表される(3S)-1-ハロ-2-オキソ-3-(保護)アミノ-4-置換ブタン類の立体選択的還元による式Iで表される(2R,3S)-1-ハロ-2-ヒドロキシ-3-(保護)アミノ-4-置換ブタン類の形成を、本発明に従い、酸化還元酵素との反応により、または好ましくは、式IIで表されるケトンの酵素的還元を触媒することができる酸化還元酵素を供給する微生物との反応により、行うことができる。微生物の細胞は、無傷の湿潤細胞または凍結乾燥、スプレー乾燥または熱乾燥細胞のような乾燥細胞の形態であってもよく、あるいは破裂細胞または細胞抽出物のような処理細胞物質のような形態であってもよい。多数の様々な微生物が、いくつかの形態の酸化還元酵素を供給することが知られているが、本発明において、Rhodococcus及びBrevibacteriumの選択された種のみが、式IIにより表される化合物を触媒して目的の(2R,3S)-1-ハロ-2-ヒドロキシ-3-(保護)アミノ-4-置換ブタン類を高定量的にかつ高いエナンチオマー収率で生成することが見出された。これらの種は、Rhodococcus erythropolis ATCC 4277、Rhodococcus erythropolis DSM 6971及びRhodococcus sp. ATCC 21227、Rhodococcus erythropolis ATCC 27854及びBrevibacterium sp. ATCC 19653である。本明細書において用語"ATCC"は、個々の微生物の寄託番号、すなわちAmerican Type Culture Collection 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852の番号である。用語"DSM"は、the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures, Branschweig, Germanyを意味する。
【００２８】
本発明の酵素的還元法は、使用する微生物の発酵の次に行ってもよい。すなわち、二段階の発酵及び還元としてもよい。または同時に、すなわち一段階でまたはインシツ発酵及び還元で行ってもよい。後者において、微生物を適当な媒体中、特に窒素及び炭素源を含む媒体（medium、培地、培養液）中で、十分な生育が認められるまで生育させてもよく、次に式IIの化合物から選択される化合物をそれに添加してもよい。式IIで表される化合物の実質的に完全な変更が得られるまで酵素的還元をその後継続する。
【００２９】
二段階法において、微生物を上述した媒体中で、所定の酵素活性レベルを示すまで生育し、そのレベルにおいて細胞を従来の分離技術により収穫し、及び適するバッファー剤等を含有する微生物細胞懸濁液をそれから製造する。適するバッファー剤としては、ホスフェートバッファー類、特にカリウムホスフェートバッファー、トリス−HCl、酢酸ナトリウム等である。また、水を用いて微生物細胞の懸濁液を製造してもよい。式IIで表される化合物を次にそれに添加して、酵素的還元を、変換が実質的に完了するまで継続する。いずれの例においても、適する生育媒体は、既に述べたように、炭素及び窒素源及び微量元素を含む。誘導剤をまた添加してもよい。当業者が認識するように、誘導剤という用語は、細胞内での目的の酵素的活性、すなわち酸化還元酵素活性を開始するか若しくは増強するいずれかの化合物を意味する。式IIで表される(3S)-1-ハロ-2-オキソ-3-(保護)アミノ-4-置換ブタン類は、特に微生物の生育中に少量添加した場合に誘導剤であると考えられる。
【００３０】
媒体のための適する炭素源としては、マルトース、ラクトース、グルコース、フルクトース、グリセロール、ソルビトール、スクロース、スターチ、マンニトール、プロピレングリコール等の糖類、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム等の有機酸及びその塩、グルタミン酸ナトリウム等のアミノ酸及びその塩、及びエタノール、プロパノール等のアルコール類が挙げられる。適する窒素源としては、N-ZアミンA、トウモロコシスティープ（steep）リカー、大豆ミール、ビーフ抽出物、酵素抽出物、糖蜜、ベイカーズ酵素、トリプトン、（nutrisoy）、ペプトン、イースタミン（yeastamin）、硝酸ナトリウム、硫酸アンモニウム等が挙げられる。適する微量元素としては、ホスフェート類、及びマグネシウム、マンガン、カルシウム、コバルト、ニッケル、鉄、ナトリウム及びカリウム塩を添加してもよい。本発明において使用される適する媒体は、これらのカテゴリーから選択される複数の成分を含んでいてもよい。代表的な好ましい媒体は、これらに限定する意図ではないが、以下を（質量％）含む水性媒体である。
【００３１】
0003843255.tif 000008
【００３２】
上述した媒体のpHは滅菌後のものである。滅菌前にｐHは約６〜８に調整することが好ましく、最も好ましくは約６．５に調整することが好ましい。媒体を次に、例えば約１２０℃で３０分間加熱することにより、滅菌する。滅菌後、媒体のpHを６．５〜７．５に調整し、最も好ましくは約７．０に調整する。微生物の生育及び還元プロセスの間、pHは約４．０〜９．０、好ましくは約６．０〜８．０の間に維持される。上述した成分から適する塩基または酸性塩をpHの調整のために使用することができる。
【００３３】
反応混合物の温度は、還元プロセスに用いることができる熱エネルギーの基準であり、この理由から、適する温度を維持してプロセスが完了するのに用いられる十分なエネルギーを保証するようにしなければならない。本発明の方法に適する温度範囲は、約１５℃〜約６０℃、好ましくは約２５℃〜約４０℃である。圧力は、本発明の方法の実行において決定的な条件ではないことがわかっており、簡便のためには、典型的にほぼ大気圧を維持する。
【００３４】
本発明の方法は好ましくは有酸素条件で行う。反応混合物の攪拌及び通気はまた本発明の方法に有用であり、生体内変換に利用できる酸素量に影響する。本発明の方法は、例えば振盪フラスコ培養または発酵タンク中で、微生物が生育する間、一段階または二段階法で上述したように行うことが有利である。約５０〜１０００RPMの範囲の攪拌が好ましく、約５０〜５００RPMの範囲が最も好ましい。媒体体積あたり、かつ1分あたり約０．１〜１０体積の空気（ｖ／Ｖｔ．）を通気するのが好ましく、媒体体積あたり、かつ1分あたり約５体積の空気（ｖ／Ｖｔ．）を通気するのが特に好ましい。
【００３５】
式IIで表される化合物の完全な変換には、式IIの化合物を媒体に添加した時間から測定して、例えば、約４〜４８時間、典型的には約４〜２４時間必要である。媒体は水性ベースであることが好ましいが、有機液体または混和性または非混和性、すなわち二相の有機／水性液体混合物も同様に使用してもよい。
本発明の立体選択的酵素還元方法は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NADH）のような補助因子を、特に単離酵素を用いる場合に、使用して行ってもよい。NADHは例えば、その後再生して再利用してもよい。ホルメートデヒドロゲナーゼやグルコースデヒドロゲナーゼのようなin situでNADHを再生する更なる酵素を用いてもよい。適する水素ドナーとしては、分子水素、ホルメート（例、アルカリ金属またはアンモニウムホルメート）、グルコース、ハイポホスファイト（次亜燐酸塩）、またはメチルビオロゲンを例とするビオロゲン存在下の電気化学的還元が挙げられる。また例えばエタノールまたはホルメートを用いて、更なる酵素を用いずにNADHを再生することもできる。
【００３６】
式IIの化合物を、出発原料と媒体の混合重量に対して約０．２〜５質量％となるように反応媒体に添加することもさらに好ましい。出発原料に対する微生物の接種量は、上述した時間で式IIの化合物の酵素的還元を行うのに十分な量であり、一般的に約５〜３０質量％の細胞濃度である。所定の微生物に上述した好ましい反応パラメータを用いることにより、反応収率は７０％より多くなり、最適には９９％を超え、また驚くべきことに、ジアステレオマー純度は９３％より高くなり、最適には、式Iの化合物の目的のエナンチオマーが９９％を超える。本発明の還元方法の生成物、すなわち式Iの化合物は、適するいずれの単離および／または精製方法、例えば抽出、蒸留、結晶化、カラムクロマトグラフィー等の方法、によって回収してもよい。
【００３７】
本発明の実行において、上述した本発明の観点から遊離することなく、様々な実施態様及び変更が当業者に明らかであり、また当業者により容易に行われることが理解される。従って、請求の範囲の観点は、上述した記載そのものに限定されることなく、むしろ、当業者に等価なものとして取り扱われる全ての特性及び態様を含み、本発明に存在する特許性のある新規な性質の全てを包含するように請求の範囲は構成される。以下の実施例を参照して本発明をさらに説明する。
【００３８】
実施例１
立体選択的酵素的還元:全細胞の使用−一段階法
Rhodococcus erythropolis ATCC 4277細胞(1 mL)を、100 mLの媒体１に、500 mLフラスコ中で、接種し、振盪機上で28℃でかつ200 RPMで22時間インキュベートした。50細胞ブロスのpHは１Mリン酸カリウムバッファーで7.0に調整した。グルコースを細胞ブロスに25 mg/mLで添加し、50 mgの(1S)-[N-(1-ベンジル-2-オキソ-3-クロロ)プロピル]カルバミン酸t-ブチルエステル（基質）をそれに加えた。生体内変換(還元)を振盪機上で28℃でかつ200 RPMで行った。所定の時間に、反応混合物を60:40のt-ブチルメチルエーテル及びトルエンの混合物の2倍体積でクエンチし、0.2ミクロンフィルターを介して分離した有機相をろ過し、集めた。2 mLの有機相を窒素気流下蒸発させて乾燥し、残渣を1 mLのアセトニトリルにとり、ろ過して、(1S,2R)-[N-(1-ベンジル-2-ヒドロキシ-3-クロロ)プロピル]カルバミン酸t-ブチルエステル（生成物）についてHPLCにより分析した。結果を下記表１に要約した。
【００３９】
表１
0003843255.tif 000009
【００４０】
実施例２
全細胞使用:二段階法
本実施例における基質及び生成物は実施例１と同様である。Rhodococcus erythropolis ATCC 4277及びRhodococcus erythropolis DSM 6971(1 mL)の細胞をそれぞれ上述した100 mLの媒体１に500 mLフラスコ中で接種し、振盪機上で28℃でかつ280 RPMで48時間インキュベートした。100 mLの各培養物を、発酵槽中で混合した15 mLの媒体１に接種した。発酵槽中での生育を25℃、15 LPM(リットル／分)の通気及び500 RPMの攪拌の条件下36時間行った。細胞を発酵槽から収穫し、(1S)-[N-(1-ベンジル-2-オキソ-3-クロロ)プロピル]カルバミン酸t-ブチルエステル(基質)から(1S,2R)-[N-(1-ベンジル-2-ヒドロキシ-3-クロロ)プロピル]カルバミン酸t-ブチルエステル(生成物)への酵素的変換（生体内変換）に使用した。細胞懸濁液を、20グラムの細胞を100 mLの64 mMリン酸カリウムバッファー（pH7.0）中へ懸濁することにより製造した。各件濁液へ、25 mg/mLのグルコース及び所定の基質を添加した。基質から生成物への生体内変換を28℃で160 RPMで振盪機上にて行った。所定の時間において、反応混合物をクエンチし、生成物を得て、実施例１と同様に分析した。結果を下記の表２に要約した。
【００４１】
表２
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表１及び表２の結果は、目的の生成物が本発明の方法により高収率かつ非常に高いジアステレオマー純度で得られることを示している。
【００４２】
実施例３
生体内変換における種々の微生物種の使用：全細胞
実施例１に記載の方法に従った生体内変換を、一連の微生物を使用して行った。結果を表３に示す。
【００４３】
表３
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【００４４】
表３の結果は本発明の微生物が明らかに許容し得る収率（すなわち、７０％を超える）と許容し得るジアステレオマー純度（すなわち９０％を超える）で生成物を生成することを示す。
【００４５】
実施例４
細胞抽出物及び補助因子の使用
本実施例の方法における基質及び生成物は上述の実施例に記載したものである。Rhodococcus erythropolis ATCC 4277の細胞を上述したように媒体1上で生育させた。細胞（150グラム）を100 mLのpH7.0リン酸カリウムバッファー中に懸濁した。細胞懸濁液を4℃で、1300psi圧力においてマイクロフルイダイザー（microfluidizer）で崩壊させた。崩壊した細胞懸濁液を12000RPMで30分間遠心分離を行った。透明な上澄み（“細胞抽出物”）を、基質の生成物への生体内変換に使用した。
【００４６】
細胞抽出物の一部(10 mL)に10mgの基質、グルコースデヒドロゲナーゼ（35ユニット）、0.7 mM NAD+(ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド)及び200 mgのグルコースを追加した。反応をpH6.0において、150RPMの攪拌及び30℃で行った。試料を定期的に反応媒体から抜き出して分析した。生成物を95％収率でかつ>98％ジアステレオマー純度で得た。この実施例において、グルコースデヒドロゲナーゼ、NAD+及びグルコースを用いて、下記に示すようにNADH補助因子を再生した。
【００４７】
【化１５】
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