(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｄ−グルクロン酸（GlcA）をＬ−イズロン酸（IdoA）に変換し得る、ヒトを含む哺乳類のグルクロニルC5−エピメラーゼまたはその機能的誘導体をコードし、配列表に示す１〜1404ヌクレオチド残基からなるヌクレオチド配列により構成される、単離もしくは組換えDNA。
【請求項２】
配列表に示す73〜1404ヌクレオチド残基からなるヌクレオチド残基により構成される請求項１記載のDNA。
【請求項３】
請求項１または２に記載のDNA、転写プロモーターおよびポリアデニル化配列からなる転写単位を含有する組換え発現ベクター。
【請求項４】
ベクターがバキュロウイルスであることを特徴とする請求項３記載の組換え発現ベクター。
【請求項５】
請求項３または４記載の組換え発現ベクターを用いて形質変換した宿主細胞。
【請求項６】
請求項３または４記載の組換え発現ベクターを用いて形質転換した宿主細胞を栄養培地中で培養して、グルクロニルC5−エピメラーゼを発現および分泌させることからなる、Ｄ−グルクロン酸（GlcA）をＬ−イズロン酸（IdoA）に変換し得るグルクロニルC5−エピメラーゼの製造方法。
【請求項７】
請求項６に記載の方法により調製されるグルクロニルC5−エピメラーゼ。
【発明の詳細な説明】
本発明は、Ｄ−グルクロン酸をＬ−イズロン酸に変換し得るグルクロニルC5−エピメラーゼをコードする単離もしくは組換えDNA配列に関する。本発明はまた、そのようなエピメラーゼの製造方法に関する。
発明の背景
ヘパリンおよびヘパラン硫酸は、交互のグルコサミンとヘキスロン酸残基で構成される硫酸化グルコサミングリカンの複合体である。２つの多糖類は構造的に関連するが、ヘパリンがより濃密に硫酸化され、Ｌ−イズロン酸（IdoA）／Ｄ−グルクロン酸（GlcA）単位のより高い比を示すように、組成において異なる。
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ヘパリンは主に、結合組織型肥満細胞により産生されるが、ヘパラン硫酸は偏在的分布を有し、ほとんどのタイプの細胞により発現される。ヘパリンおよびヘパラン硫酸の生物学的役割は、おそらく主には、酵素、酵素阻害剤、細胞外基質タンパク質、成長因子／サイトカインおよびその他などの多糖類のタンパク質との相互作用である（Salmivirta,M.,Lidholt,K.and Lindahl,U(1996)The FASEB Journal 10,1270-1279）。相互作用は、おおよそ糖質の構造に関して選択的／特異的であり、従って種々の硫酸基およびヘキスロン酸単位の量および分布に依存する。特に、IdoA単位は、それらの残基の著しい構造的柔軟性のために、一般的にヘパリンおよびヘパラン硫酸鎖のタンパク質への結合を促進していると考えられている（Casu,B.,Petitou,M.,Provasoli,M.and Sinay,P.(1988)Trends in Biochemical Sciences 13,221-225）。
ヘパリンおよびヘパラン硫酸は、プロテオグリカンとして合成される。方法は、ペプチドのコア構造と共有結合する交互のGlcAとＮ−アセチルグルコサミン（GlcNAc）単位で構成される糖配列を生成するグリコシル化反応により開始される。生じた（GlcAβ1,4-GlcNAcal,4-）n二糖類の繰り返しは、おそらく鎖の伸長と共に、一連の酵素反応によって修飾され、これはGlcNAc単位のＮ−デアセチル化およびＮ−硫酸化により開始され、GlcAのIdoA残基へのC5−エピマー化に続き、様々な位置でのＯ−硫酸基の付加によって終結する。Ｎ−デアセチル化／Ｎ−硫酸化段階は、種々のスルホトランスフェラーゼと同様にGlcA C5−エピメラーゼが全て基質の認識についてＮ−硫酸基の存在に左右されるために、ポリマー鎖の修飾の全体の程度を決定するにあたって重要な役割を持っている。GlcNAcのＮ−デアセチル化およびＮ−硫酸化反応の双方が同一のタンパク質によって触媒されるが、異なる組織源からのＮ−デアセチラーゼ／Ｎ−スルホトランスフェラーゼのモレキュラー・クローニングは酵素の２つの別個の形態を包含する。２つの酵素のタイプは反応速度特性について相違し、このことは、これらが別個にヘパリンおよびヘパラン硫酸の生合成に包含されることを示唆している。
発明の要旨
本発明は、Ｄ−グルクロン酸（GlcA）をＬ−イズロン酸（IdoA）に変換し得る、ヒトを含む哺乳類のグルクロニルC5−エピメラーゼまたはその機能的誘導体をコードする単離もしくは組換えDNA配列を提供する。
本発明はまた、上記のDNA配列、転写プロモーターおよびポリアデニル化シグナルからなる転写単位を含有する組換え発現ベクターを提供する。
本発明はまた、上記の組換え発現ベクターを用いて形質転換した宿主細胞を培養液中で培養して、グルクロニルC5−エピメラーゼまたはその機能的誘導体を発現および分泌させることからなる、Ｄ−グルクロン酸（GlcA）をＬ−イズロン酸（IdoA）に変換し得るグルクロニルC5−エピメラーゼまたはその機能的誘導体の製造方法を提供する。
本発明による特異的なDNA配列は、請求項２、３および４において規定している。
更に、本発明は、そのような組換え発現ベクターを用いて形質転換した宿主細胞を提供する。
最後に、本発明は、前文で概説した方法により調製されるグルクロニルC5−エピメラーゼまたはその機能的誘導体を包含する。
添付の図面および配列表の簡単な説明
配列表：C5−エピメラーゼのヌクレオチド配列および決定されたアミノ酸配列
決定されたアミノ酸配列をヌクレオチド配列の下に示す。右側の数字は各々の配列におけるヌクレオチド残基およびアミノ酸残基を示す。５個のシーケンスしたペプチドを太字で表す。精製したペプチドのＮ−末端配列を太字と斜体で示す。潜在的Ｎ−グルコシル化部位を★印で示す。潜在的膜貫通領域に下線を引く。
図１：インビトロ転写−翻訳
エピメラーゼcDNAをpcDNA３発現ベクターに挿入し、XbaＩを用いて3′末端において線状にした。次いで『実験的手法』に記載しているように、ウサギ網状赤血球溶解物系において［35S］メチオニンの存在下でインビトロ転写−翻訳をさせた。エピメラーゼcDNAの転写産物（Epi）は、LMWタンパク質標準と比較することにより、〜50kDaの分子量を有している。同じ系で発現させたβ−ガラクトシダーゼの118kDa対照試料（Ｃ）を比較のために示す。
図２：Ｎ−デアセチル化、Ｎ−硫酸化したE.coli K5の莢膜多糖類における発現させたC5−エピメラーゼの作用
代謝的に3H−標識したK5多糖類をＮ−デアセチル化、そしてＮ−硫酸化して、次いで（Ａ）組換えC5−エピメラーゼでトランスフェクションしたSf9細胞の溶解物；（Ｂ）組換えC5−β−ガラクトシダーゼでトランスフェクションしたSf9細胞の溶解物と共にインキュベートした。インキュベート産物をHNO2／NaBH4で処理し、生じたヘキスロニルアンヒドロマンニトール二糖類を回収してペーパークロマトグラフィーで分離した。矢印は、グルクロノシル−アンヒドロマンニトール（GM）とイズロノシル−マンニトール（IM）の二糖類標準を示す。さらなる情報については『実験的手法』を参照。
図３：ウシの肺および肥満細胞腫細胞において発現しているC5−エピメラーゼmRNAのノーザン分析
各組織／細胞株からの全mRNAをアガローズゲル電気泳動によって分離した。ブロットを調製し、エピメラーゼcDNAの32P−標識した2460bp断片でプローブし、そして最後にＸ−線フィルム（Kodak,Amercham）に感光させた。矢印は分子量標準の位置を示す。さらなる情報については『実験的手法』を参照。
発明の詳細な説明
本発明は、哺乳類のグルクロニルC5−エピメラーゼまたはその機能的誘導体をコードするDNA配列に関し、そのようなエピメラーゼまたは誘導体はＤ−グルクロン酸（GlcA）をＬ−イズロン酸（IdoA）に変換することができる。用語『哺乳類』は、ヒトへ変種の該酵素をも包含することを意図するものである。
ここで用いる『グルクロニルC5−エピメラーゼまたはその機能的誘導体』の定義は、Ｄ−グルクロン酸をＬ−イズロン酸に変換する能力を有する酵素を指すものとする。従って、その定義は、機能的断片、突然変異誘発または他の組換え技術により生じた突然変異体のような機能的変異体を含む、そのような能力を有する全てのエピメラーゼを包含する。更に、その定義は、哺乳類のグルコシル化または未グルコシル化のグルクロニルC5−エピメラーゼ、その酵素の多形またはアレル変異体および他のアイソフォームを包含することを意図するものである。酵素の『機能的誘導体』は、機能的断片、機能的融合タンパク質または機能的突然変異タンパク質を包含し得る。本発明に包含されるそのようなエピメラーゼは１つまたはそれ以上のアミノ酸の欠失を有し得るが、そのような欠失はＮ−末端、Ｃ−末端または内部欠失である。ここで示した変換能を有する限りは、トランケート型もまた企図されている。
実施可能な断片、突然変異またはトランケート型を、スクリーニングによって、適切に特定することができる。これは、段階的方法における、例えばＮ−末端、Ｃ−末端または内部領域の欠失により可能とされ、生じた誘導体をそのＤ−グルクロン酸のＬ−イズロン酸への所望の変換能について分析することができる。問題の誘導体がこの能力を働かせる場合、エピメラーゼの機能的誘導体を構成するものが適当であると考えられる。
有用なエピメラーゼの例は、配列表に示されるまたは実質的に示される配列を有するタンパク質またはその機能的誘導体である。
実験的方法
ペプチド精製およびシーケンシング−ウシの肝臓の界面活性剤抽出物から、Ｏ−脱硫酸化ヘパリン−セファロース、Red−セファロース、フェニル−セファロースおよびコンカナバリンＡ−セファロースのクロマトグラフィーによって精製した、52kDaエピメラーゼタンパク質（〜１μg）
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を、オンライン120フェニルチオヒダントインアナライザーを備えたモデル470Aタンパク質シークェネーター（Applied Biosystems）装置を使用して直接Ｎ−末端の配列を決定した（Tempst,P.,and Riviere,L.(1989)Anal Biochem.183,290-300）。他の試料（〜１μg）を分離SDS-PAGE（12％）にかけ、次いでPVDF膜にトランスファーした。膜をコマシーブルーで染色した後、酵素のバンドを切り出した。材料の半分を直接Ｎ−末端配列分析して、残りを１％RTX-100／10％アセトニトリル／100mM Tris-HCl、pH8.0の存在下にLys-C（0.0075U；Waco）で消化した。生成したペプチドを逆相C4カラムで分離し、６mlの0.1％トリフルオロ酢酸中における10〜70％アセトニトリル勾配を用いて100μl／分の流速で溶出して、990Watersダイオード・アレイ検出器で検出した。次に選択したペプチドを上記のように配列分析にかけた。
スクリーニング用プローブ---全RNAをSambrook等（1989年）の手法に従ってウシ肝臓から抽出した。〜５μgのウシ肝臓全RNA（65℃３分で変性）を10mM Tris-HCl、pH8.3の緩衝液中において１単位RNAse阻害剤（Perkin-Elmer Corp.）、１mMの各dNTP、５μMランダムヌクレオチドヘキサマーおよび1.25単位の白血病ウィルスの逆転写酵素（Perkin-Elmer Corp.）を含有する反応混合物とインキュベートすることにより、一本鎖cDNAを合成した。混合物を42℃で45分、次に95℃で５分保持した。縮重オリゴヌクレオチドプライマーを、精製したエピメラーゼから得た内部ペプチドの１つについて決定したアミノ酸配列に基つき設計した（表１）。ウシ肝臓の一本鎖cDNAを、10mM Tris-HCl、pH9.0の緩衝液中の１μlの10％トゥイーン20、６mM MgCl2、１mMの各dNTPおよび2.5単位のTaqポリメラーゼ（Pharmacia Biotech）を含有する100μlの全量において、100ピコモルのプライマー１（センス）およびプライマー３（アンチセンス）と共にPCRに供した。反応生成物を、12％ポリアクリルアミドゲル上で分離した。〜100bpのバンドをゲルから切り出し、同じPCR条件で再度増幅させた。付加的なポリアミドゲル電気泳動の後、生成物を単離し、次いでシーケンスして108bp配列を得た。PCR生成物をpUC119プラスミド中にサブクローン化した。プラスミドから切り取ったDNA断片を、ランダムプライマーDNA標準化キット（Boehringer Mannhem）を用いて［32P］dCTP（DuPont NEN）で標識した。
cDNAライブラリーのスクリーニング---λgt10ベクター（Clontech）中において構築されたウシの肺cDNAライブラリーを、ハイブリダイズのプローブとして108bpのPCR断片を用いてスクリーニングした。ライブラリーのプラークのニトロセルロース複製物を６×SSC、0.1％SDSおよび0.1mg／ml変性サケDNAを含有する５×Denhart's溶液中で２時間、65℃で予備ハイブリダイズした。ハイブリダイゼーションを、32P標識プローブを含有する同じ溶液中において42℃で16〜18時間実施した。フィルターを、同じ温度で２×SSC、0.5％SDSで２回、次いで0.5×SSC、１％SDSで２回洗浄した。ライブラリーを同じ温度条件下で繰り返し２回スクリーニングした。最後に、全cDNAファージライブラリーを、λgt10フォワードおよびリバースプライマー（Clontech）を用いてエピメラーゼcDNA特異的プライマー（5′-GCTGATTCTTTTCTGTC-3′）でPCR増幅させた。
cDNA挿入物のサブクローニングおよびシーケンシング---組換えバクテリオファージDNAのEcoRＩ制限切断後に分離アガロースゲル電気泳動（Sambrook等，1989）によって単離したcDNA挿入物をpUC119プラスミド中にサブクローン化した。完全なヌクレオチド配列を、［35S］dATPおよび修飾T7DNAポリメラーゼ（Sequenase version 2.0 DNA sequencing kit;U.S.Biochemical Corp.）またはALFTMシステム（Pharmacia Biotech）のいずれかを用いるジデオキシ鎖終止反応にて、両方の鎖について別個に決定した。DNA配列をコンパイルし、DNASTARTMプログラム（Lasergene）を使用して分析した。
ポリクローナル抗体および免疫検出---推定エピメラーゼアミノ酸配列の77〜97残基に対応するペプチドを化学的に合成し
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次にグルタルアルデヒドを用いてオボアルブミンと複合させた（Harlow,E.and Lane,D.(1989)in Antibodies:A Laboratory Manual,pp78-79,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY）。ウサギを、Freund'sアジュバンドと共にペプチド複合体を用いて免疫化した。６追加免疫後（各々240μgの複合ペプチドを用いた）、血液を採取し、血清を回収した。抗体画分をプロテインＡ−セファロースカラム（Pharmacia Biotech）上で更に精製し、イムノブロットに使用した。
GlcA C5−エピメラーゼの試料を、12％SDS-PAGEにより変性条件下で分離し、次にニトロセルロース膜（HybondTMECL）にトランスファーした。ECLイムノブロットを、製品のプロトコール（Amersham）に従って実施した。簡潔には、膜を最初にブロック剤で処理し、次に生成した抗体とインキュベートし、そして最後にペルオキシダーゼ標識抗ウサギ抗体とインキュベートした。ECL剤を添加後、化学反応により放たれる光をHyperfilmTMECLに30〜60秒感光させることにより検出した。
ノーザンブロットハイブリダイゼーション---ウシの肝臓および肺の全RNAをSambrook,J.,Fritsch,E.F.and Maniatis,T,（(1989)in Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY）に従って調製し、Chomczynski and Sacci(1987)に記載されるように、マウス脂肪腫（MCT）全RNAを腫瘍細胞株から抽出した（Montgomery,R.I.,Lidholt,K.,Flay,N.W.,Liang,J.,Verter,B.,Lindahl,U.and Esko,J.D.(1992)PNAS 89,11327-113331）。各組織からの全RNA（〜20μg試料）を50％（v/v）ホルムアミド中、５％ホルムアルデヒド、20mM Mops緩衝液、pH7.0において65℃５分間で変性させた。変性RNAを５％（v/v）ホルムアルデヒドを含有する1.2％アガロースゲルにおける電気泳動によって分離し、次にHybond N+ナイロン膜（Amersham）にトランスファーした。RNAブロットを、Express Hybハイブリダイゼーション溶液（Clontech）中で65℃で１時間予備ハイブリダイズし、続いて［32P］dCTP標識DNAプローブ（cDNAクローンの5′−末端を包含する2460bp断片）を含む同じ溶液中でハイブリダイズした。膜を、同じ温度で２×SSC、0.5％SDS中で２回15分間、次いで0.5×SSC、0.5％SDS中で２回15分間洗浄した。膜をKodak Ｘ−線フィルムに−70℃で24時間感光させた。
インビトロ翻訳---pcDNA3発現ベクター（Invitrogen）に挿入した３kbGlcA C5−エピメラーゼクローンを制限酵素XbaＩにより3′−末端で線状化した。インビトロ翻訳を、連結T7転写−翻訳システム（Amersham）を用いて、製造業者の指示に従って実施した。T7ポリメラーゼ転写ミックス（全量10μl；30℃；15分間）を用いた0.5μg線状化プラスミドDNAのインキュベーションにより生成する対応するmRNAを、50μCi［35S］メチオニンを含有する至適ウサギ網状赤血球溶解物（全量50μl）と混合し、次に30℃で１時間インキュベートした。生成物の試料（５μl）を12％SDS-PAGEに供した。ゲルを直接Kodak Ｘ−線フィルムに感光させた。感光後、適用したタンパク質分子量標準（LMW Molecular Calibration Kit,Pharmacia Biotech）をコマシーブルーでゲルを染色することにより可視化させた。
GlcA C5−エピメラーゼの発現---GlcA C5−エピメラーゼを、BacPakTMバキュロウィルス発現システム（Clontech）を用いて、製造業者による指示に従って発現させた。２つのオリゴヌクレオチド、１つはcDNAクローンの5′−末端（１〜17bp，センス）、他方はコード領域の3′−末端（1387〜1404bp，アンチセンス）を、C5−エピメラーゼcDNAクローンのPCR増幅に用いた。生じた断片を、BacPAK8ベクター中にクローン化した。10％ウシ胎児血清およびペニシリン／ストレプトマイシンを補充したGrace's昆虫培地（GibcoBRL）中で維持されているSf9昆虫細胞を、次いでウィルスDNAと共にC5−エピメラーゼ構築物により同時にトランスフェクションした。対照のトランスフェクションを、発現キットに包含されているβ−グクロニダーゼcDNAおよびヘパリン生合成に関与するGlcNac Ｎ−デアセチラーゼ／Ｎ−スルホトランスフェラーゼ
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をコードするマウスcDNAの構築物を用いて実施した。各同時にトランスフェクションした組換え体の単一のプラークを拾い上げ、増殖させた。Sf9細胞の２つのペトリ皿（60mm）を各組換えウィルスストックに感染させ、27℃で５日間インキュベートした。１つの皿からの細胞を全RNA抽出に使用し、上述のようにノーザン分析を実施した。他方の皿からの細胞は、１mM PMSFおよび10μg／mlペプスタチンＡを含有する、100mM KCl、15mM EDTA、１％トリトンＸ−100、50mM HEPS、pH7.4の緩衝液中で溶解させた。細胞溶解物の上澄みをならし培地と同様にエピメラーゼ活性について分析した。細胞溶解物のタンパク質含量は、Bradford（1976）の方法またはBCA試薬法（Smith,P.K.,Krohn,R.I.,Hermanson,G.T.,Mallia,A.K.,Gartner,F.H.,Provenzano,M.D.,Fujimoto,E.K.,Goeke,N.M.,Olson,B.J.,and Klenk,D.C.,(1985)Anal,biochem.150,76-85）によって見積もった。
GlcA C5−エピメラーゼ活性の証明---エピメラーゼ活性は、上記のCampbell等（1994）に本質的に記載されているように、二相液体シンチレーションカウント法を用いて分析した。反応混合物は、全量55μlで、25μlの細胞溶解物または培地、25μlの２×エピメラーゼ活性培地（20mM HEPES,30mM EDTA,0.02％Triton X-100,200mM KCl,pH7.4）および５μlの基質（10,000cpm 3H）を含有する。基質は、Ｄ−［５−3H］グルコースをＤ−［１−3H］グルコース置換したことを除き、Campbell等（1994）の方法に従ってE.coli K5から得た化学的にＮ−アセチル化およびＮ−硫酸化した多糖類である。
Ｄ−グルクロン酸のＬ−イズロン酸への酵素的変換は、代謝的に１−3H−標識した基質（E.coli K5から得たＮ−アセチル化およびＮ−硫酸化莢膜多糖類）およびCampbell等（1994）に記載の分析法を用いて証明した。修飾したポリマーの試料（〜20μg；200,000cpmの3H）を、全量300μlのエピメラーゼ活性緩衝液中の250μlの細胞溶解物と共に37℃で６時間インキュベートした。インキュベーションを100℃で５分間加熱することにより終止させた。試料を、50μgのキャリヤーヘパリンと混合し、pH1.5の亜硝酸と反応させ（Shively,J.and Conred,H.E.(1976)Biochemistry 15,3932-3942）、次いでNaBH4で生成物を還元した。生じたヘキスロニル−アンヒドロマンニトール二糖類を0.2Ｍ NH4HCO3中のセファデックスＧ−15のカラム（１×200cm）のゲルクロマトグラフィーによって回収し、酢酸エチル／酢酸／水（３：３：１）中のWhatman No.３ペーパーにおけるペーパークロマトグラフィーに供した。
結果
プローブの産生およびcDNAライブラリーのスクリーニング−〜52kDaタンパク質のアミノ酸配列データは、高度に精製したエピメラーゼをリジン特異的プロテアーゼで消化し、生成したペプチドを逆相カラムで分離することにより得られた。５つの最も重要なペプチドを単離し、アミノ酸シーケンシングに供した（表Ｉ）。ペプチドの１つ（ペプチド１）は、天然のタンパク質のＮ−末端配列と一致していた。得られた最も大きいペプチド（表Ｉにおけるペプチド５）の配列は、表Ｉに示しているように、２つのセンスおよび１つのアンチセンスオリゴヌクレオチドプライマーの設計に使用された。DNAプローブは、テンプレートとしてウシの肝臓のcDNAを用いてプライマー１および３を使用するPCRにより生成された。生じた〜100bpのDNA断片は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動で精製し、同じプライマーを使用して再度増幅させ、最終的に電気泳動によって単離した。生成物の同一性は、プライマー２および３を使用し、予想される〜60bp断片が得られる『縮小』PCRにより確かめた（データは示さない）。更に、大きいDNA断片（108bp）のシーケンシングは、単離したペプチドと一致する予測されたアミノ酸配列を与えた（表Ｉ）。
108bp PCR断片を、［32P］dCTPで標識し、ウシの肺のlgt10ライブラリーのスクリーニングに使用した。１つのハイブリダイズするクローンは、３kbの挿入物を有すると同定された。同じライブラリーの繰り返しのスクリーニングは２つの追加の陽性クローンをもたらし、２つともよりサイズの小さいクローンであった。後のシーケンシングは、後者の２つのクローンが3.0kbのもの中に含まれることを示した（データは示さない）。３kbクローンは両方の鎖についてシーケンスし、共に3073bpを含むことが見出され；追加の12bpの配列は、ファージライブラリーのPCR増幅により得られた分離クローンの特徴化において5′−末端に添加されたものである（『実験的手法』を参照）。
cDNAおよび予想されるタンパク質構造の特徴付け−全3085bpの特定した全cDNA配列は、444アミノ酸残基のオープンリーディングフレームを含有する（配列表）。特に、コード領域（1332bp）は、利用できるcDNAの5′−末端側にひどく位置を変えており、より大きい非コード領域（1681bp）によって3′−末端側が空けられている。予測されるアミノ酸配列は、49,905ダルトンのポリペプチドと一致していた。エンドペプチダーゼ消化後に単離された５つのポリペプチドの全て（表Ｉ）は、cDNAから予測される一次構造（配列表）において認識された。これらのペプチドの１つ（ペプチド１）は、単離された肝臓のタンパク質のＮ−末端と一致していた。このタンパク質は、予測されるポリペプチド配列の74〜86残基と一致することが見出された。従って、ウシの肝臓から単離された酵素は、天然のタンパク質のトランケート型であることが示される。
３kb cDNAクローンを挿入した発現ベクターからのmRNAの産生、その後の［35S］メチオニンの存在下におけるウサギ網状赤血球溶解物との生成物のインキュベーションは、〜50kDaと見積もられるMrを有する別の標識されたタンパク質の精製をもたらす（図１）。この生成物は、予測されるアミノ酸配列の77〜97残基（配列表を参照）に対応する合成ペプチドに対して生じたポリクローナル抗体によりイムノブロットされることが認められた（データは示さない）。同じ抗体はまた、単離された〜52kDaのウシ肝臓のタンパク質と反応した（データは示さない）。これらの知見は、３bk cDNAは、単離された〜52kDaのウシ肝臓のタンパク質をコードする転写物に由来することが確かめられる。
cDNA構造は、３つの潜在的Ｎ−グリコシル化部位の存在を示唆する（配列表）。細菌中で発現したタンパク質（合成ペプチドに対して生じたポリクローナル抗体について非常に強いウェスタンシグナルを与える；データは示さない）が酵素活性を欠失しているため、糖置換体は酵素の折り畳みおよび触媒活性に重要である。潜在的膜貫通領域は、配列表において下線で示している。予測されるタンパク質は、２つにシステイン残基を含み、単離された（トランケート）タンパク質においては１つだけである。NEMはエピメラーゼ活性を阻害するため（データは示さない）、この単一のシステイン単位は、触媒機構に必須でありうる。
GlcA C5−エピメラーゼの機能的発現−触媒的活性型のクローン化タンパク質を産生する試みについて種々の発現系を試験した。ウサギ網状赤血球溶解物系を使用するインビトロ翻訳により得られるタンパク質は、検出可能なエピメラーゼ活性を示さなかった（図１参照）。pcDNA3ベクター中に３kb cDNAを挿入することにより作られた構築物（Invitrogen）は、試験したいずれの細胞株（ヒト胚腎臓（293）、COS−１またはCHO細胞）においてmRNA生成（または翻訳）を誘導できなかった（データは示さない）。本発明者らは、細菌のpETシステム（Novagen）において酵素を発現させることを企てた。形質転換された細菌は、かなりの量の免疫反応性のあるタンパク質を生じさせたが、しかし、検出可能な酵素活性を欠いていた（データは示さない）。
Sf9昆虫細胞中にバキュロウィスルと共にエピメラーゼ組換え体を同時にトランスフェクションした結果、十分なGlcA C5−エピメラーゼ活性が生じた（表II）。２つの別個の実験において、同じエピメラーゼ組換え体ウィルスストックに感染した細胞からの溶解物は、対照の組換え体ウィスルストックに感染した細胞からの対応する画分より、タンパク質mg当たり、10倍より高い酵素活性を示した。エピメラーゼ組換え体に感染した細胞のならし培地は、対照のプラスミドウィルスに感染した細胞の対応する画分と比較して、20倍、30倍より高い酵素活性を示した。β−グルクロニダーゼ、またはヘパリン合成に関与するマウス脂肪腫のGlcNac Ｎ−デアセチラーゼ／Ｎ−スルホトランスフェラーゼ（Eriksson et.al.,1994）などの他の酵素をコードするcDNAを用いたトランスフェクションは、対照のレベルを超えるようなエピメラーゼ活性を顕著に増加させなかった。特に、熱−不活性発現酵素と比較して、対照について記録されたより高い3H2O放出は、昆虫細胞が本質的に内在性C5−エピメラーゼを産生することを示唆する。
エピメラーゼ活性の通例の分析に使用される多糖類基質は、［５−3H］グルコースの存在下において増殖させたE.coli K5の莢膜多糖類［(GlcAβ1,4-GlcNAca1,4)n］の化学的Ｎ−デアセチル化およびＮ−硫酸化により得られる。従って、表IIにおけるデータは、酵素の作用のために、修飾された多糖類の５−3H−標識GlcA単位からの3H2O放出を反映している
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GlcA残基のIdoA残基への現実の変換に対するより直接的な証拠は、［１−3H］グルコースを用いた細菌の次のインキュベーションにより得られる類似基質と共に発現した酵素をインキュベートすることにより得られる。この基質は、エピマー化反応を通じて標識が保持され、従って、IdoA含有二糖類単位の生成を示すために使用することができる。二糖類脱アミノ生成物のペーパークロマトグラフィーにより示されるように、組換えエピメラーゼを用いる次のインキュベーションでは、ヘキスロン酸の21％がIdoAに変換された（図２）。従って、インキュベートされた多糖類の組成は、予め決定されたIdoA／GlcAの等量比〜３／71)に達する。
ノーザン分析−ウシ肝臓、肺およびマウス脂肪腫からの全RNAを、エピメラーゼcDNAクローンからの2460bp DNA断片をプローブとして用いるハイブリダイゼーションによって分析した。ウシ肝臓および肺は共に、主に〜９kbおよび弱い〜５kbのバンドを有する、同じ転写パターンを与えた（図３）。これに対して、脂肪腫のRNAは〜５kbの転写物のみを示した。
本発明はここに記載したような発明の特定の態様に制限されないことに注目すべきである。当業者は同様な態様を認識するであろうし、そのような同様なものも添付の請求の範囲に包含される。
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配列表
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【図１】
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【図３】
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【図２】
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