(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
コラーゲン刺激血小板凝集の阻害能およびコラーゲンとフォン・ビルブラント因子（ｖＷＦ）との間の相互作用の阻止能を有し、
医用ヒルＨｉｒｕｄｏ  ｍｅｄｉｃｉｎａｌｉｓの唾液から取得可能である、
１４〜１５．５ｋＤの分子量を有する、単離されたタンパク質。
【請求項２】
該単離タンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動分析において、１４．５〜１５．０ｋＤの分子量を示すことを特徴とする、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
コラーゲン刺激血小板凝集の阻害能およびコラーゲンとフォン・ビルブラント因子（ｖＷＦ）との間の相互作用の阻止能を有し、
１４〜１５．５ｋＤの分子量を有する、単離されたタンパク質の製造方法であって、
該タンパク質を、医用ヒルＨｉｒｕｄｏ  ｍｅｄｉｃｉｎａｌｉｓの唾液から分離・精製する工程は、
陽イオン交換カラム・クロマトグラフィーを用いて、粗唾液から、該タンパク質を分離し、
次いで、ゲル浸透クロマトグラフィーを用いて、精製を行うことを特徴とする、製造方法。
【請求項４】
コラーゲンとフォン・ビルブラント因子（ｖＷＦ）との間の相互作用の阻止によって、その予防または治療効果がもたらされる、血栓栓塞性疾患、動静脈シャント、あるいは冠状バイパス手術を受けている患者、ならびに自己免疫疾患のいずれかに対する予防または治療用途に使用可能な薬剤調製物であって、
該調製物は、
請求項１又は２に記載される、単離タンパク質を、活性成分として、
薬理学的に許容される、担体、賦形剤、または希釈剤を一つまたはそれ以上とともに、含んでなることを特徴とする、薬剤調製物。
【請求項５】
前記担体は、
医用装置の、その使用に先立ち、被覆する用途に適する、ゲル基剤またはクリームを含んでなること特徴とする、請求項４に記載の薬剤調製物。
【請求項６】
体液と接触させて使用される、インプラント用または体外用医用装置であって、
該装置表面を、生体適合性ならびに坑血栓性とする目的で、固定化された請求項１また２に記載のタンパク質による被覆がなされていることを特徴とする、医用装置。
【請求項７】
インビトロ、ならびに、インビボにおける血小板凝集の阻止用医薬、あるいは、体外治療用医薬の製造のために、請求項１また２に記載のタンパク質を使用する方法。
【請求項８】
インビトロ、ならびに、インビボにおけるフォン・ビルブラント因子（ｖＷＦ）のコラーゲンへの結合の阻止用医薬、あるいは、体外治療用医薬の製造のために、請求項１また２に記載のタンパク質を使用する方法。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
本発明は、コラーゲン刺激血小板活性化および凝集の強力な阻害剤として作用し、コラーゲンとフォンビルブラント因子との間の相互作用の阻止能を有する新規のタンパク質に関する。
ヒトにおける正常な止血は、細胞性および体液性の双方の生化学的成分の関与する複雑な一連の相関するメカニズムによって調節される。生化学的経路には、無傷の内皮細胞の傷害、血小板の刺激および凝血メカニズムの活性化が関与する。血管壁が傷害を受けた場合、最初に起きることのひとつは、血液への内皮下層の露出である。内皮下層のコラーゲンは、血小板粘着をもたらすまず最初の刺激のひとつと考えられており、この後に、形状変化、凝集および血栓形成が続く。
したがって、血小板粘着および／または血小板凝集のレベルでの治療的処理は、ほとんどの血栓形成性障害の予防または治療に有用である。
ヒル唾液が血小板凝集の阻害能を有する種々の作用物質を含むことは公知である。
例えば、ヒルジンは広く公知の化合物である（メルクインデックス、１９８３、Ｎｏ．４６１３；ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．、１６５、１８０、１９８４）。ヒルジンは、１：１の化学量論的複合体のかたちでトロンビンに結合することによってトロンビン誘導性血小板凝集を阻害する。これは、ひき続いてフィブリノーゲンからフィブリンへのトロンビン触媒による変換を阻止する。
ＰＡＦ−acetherなどの凝集剤によって誘導される血小板凝集に対する阻害活性を有するHirudinidaeの唾液に由来する低分子量のレセプター介在血小板活性化因子拮抗物質が、ＥＰ−Ａ−０３４８２０８に開示されている。
コラーゲン分子のヘリックス領域のペプチド結合の加水分解的切断によってコラーゲンを特異的に分解するコラゲナーゼは、ＷＯ８７／００８６０に開示されている。
医用ヒル（Hirudo medicinalis）は噛傷における血栓形成を阻止するためにヒルジンのみを利用するのではない。このヒルの噛傷における最も顕著な特徴は、ヒルジンが１５〜３０分間で傷部から洗い落とされるようであるのに、１０時間から２４時間という長時間の出血時間の延長が認められることである。したがって、ヒルジン以外の他の要因がこの作用に関与していることが考えられる。
最近、分子量６５ｋＤを有し、コラーゲン刺激血小板凝集阻止能を有する「カリン（Calin）」と称されるHirudo medicinalisからのタンパク質について記述があった（ＷＯ９２／０７００５）。
ＬＡＰＰと称される別の低分子量（１６ｋＤ）のコラーゲン誘導血小板凝集インヒビターがHaementeria officinalisに見出だされた（ＥＰ−Ａ−０４８０６５１）。
これらのタンパク質のいずれについても、フォンビルブラント因子（ｖＷＦ）介在の血小板粘着の重要な性質に影響することは示されていない。
この因子は、血小板機能において必須の役割を果たす複合成分性糖タンパク質である。これは露出された内皮下層への正常の血小板粘着のためおよび血管傷害部における正常の血小板栓塞形成のために要求される。ｖＷＦの機能は、高壁剪断率（high wall shear rate）の条件がそろっている小直径の血管においてとくに重要である。ｖＷＦ機能の基本となるメカニズムは内皮下層の成分との相互作用および血小板膜上の特異的レセプターとの相互作用からなることが現在認められている（Ｒｕｇｇｅｒｉら、１９９２、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．２１５、２６３−２７５）。
したがって、対応するタンパク質のｖＷＦとの干渉作用は、治療的使用において追加の利点を提供する。
ここで、約１５ｋＤの分子量を有する新規のタンパク質がコラーゲン刺激血小板凝集および粘着の強力なインヒビターとして作用すること、とくに、コラーゲンとｖＷＦとの間の相互作用を阻止することが見出された。
したがって、本発明の目的は、コラーゲン刺激血小板凝集の阻害能およびコラーゲンとｖＷＦとの間の相互作用の阻止能を有し、医用ヒルHirudo medicinalisの唾液から得ることができる実質的に純粋のタンパク質を提供することにある。
本発明による新規のタンパク質は、分子量１４〜１５．５ｋＤ、好ましくは１４．５〜１５．０ｋＤ（使用する方法によって異なる）を有し、コラーゲンとｖＷＦとの間の相互作用を阻止する。これらの結果に対し、公知のＬＡＰＰは分子量１６ｋＤを有し、Haementeria officinalisから分離された。ＬＡＰＰのｖＷＦへの影響は、今日まで示され得なかった。他の重要な点は、ＬＡＰＰと本発明のタンパク質（ブランジニン）のアミノ酸配列は異なるということである。
これらの相違および以下にあげる相違は、本発明によるタンパク質が血小板凝集阻害活性を示す他のタンパク質とは異なることを示している。
本発明のタンパク質には、単離されたタンパク質の活性を維持している開示された精製タンパク質の変異体が含まれ、これにはフラグメント、サブユニット、天然の突然変異体および無作為に生じた人為的突然変異体も含まれる。さらにまた、開示されたタンパク質に由来する融合タンパク質などのハイブリッドタンパク質も含まれる。
さらに、本発明は新規のタンパク質を自体公知の標準法を用いて調製する方法に関する。
すなわち、本発明の目的は、コラーゲン刺激血小板凝集阻害能およびコラーゲンとフォンビルブラント因子との間の相互作用の阻止能を有し、分子量１４〜１５．５ｋＤを有する実質的に純粋のタンパク質の製造法を提供することにあり、これはタンパク質を調製用電気泳動によるワンステップ精製によって医用ヒルHirudo medicinalisの唾液から適宜分離精製することを特徴とする。
本発明による典型的な方法には、Hirudo medicinalisの凍結乾燥粗唾液をｐＨ７．５〜８．５の通常の緩衝液中で戻すことおよび少なくともひとつの従来のクロマトグラフィー処理、好ましくはゲル浸透クロマトグラフィーによる精製が含まれる。
加えて、本発明は薬剤調製物および医用装置に関する。
すなわち、本発明のさらなる目的は、活性成分として上記および請求の範囲に定義したタンパク質、それにひとつまたはそれ以上の薬剤学的に容認し得る担体、賦形剤または希釈剤を含んでなる薬剤調製物を提供することにある。
本発明による薬剤調製物は、適宜、ヒルジンまたはヘパリンなどの坑凝血剤またはプラスミノーゲン活性化因子またはヘメンチンなどの血栓溶解剤などの追加の活性成分を含むことができる。
本発明の新規のタンパク質および薬剤調製物はそれぞれ、静脈血栓症、末梢動脈血栓症、脳血栓症および心筋梗塞を含む種々の血栓栓塞性疾患の治療、それに動静脈シャントの患者または冠状バイパス手術を受けている患者のために使用することができる。調製物はまた、紅斑性狼瘡、リウマチ様関節炎および多発性関節炎結節などの自己免疫疾患の治療に用いることができる。本発明の調製物はまた、ヒルに噛まれた後に経験される出血時間延長のシミュレーションに有用であり、したがって、ヒル療法で現在用いられるこれらの適用において全部または一部をヒルの代替として用いることも可能である。
本発明による新規のタンパク質は、任意の無毒性の有機または無機酸と薬剤学的に容認し得る塩を形成することができる。無機酸は例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸または燐酸およびオルト硫酸一水素ナトリウムおよび硫酸水素カリウムなどの酸金属塩などである。有機酸の例としては、モノ、ジおよびトリカルボン酸、例えば酢酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、安息香酸、ヒドロキシ安息香酸、フェニル酢酸、桂皮酸、サリチル酸、およびメタンスルホン酸などのスルホン酸がある。カルボキシ末端アミノ酸部の塩には、任意の適当なな無機または有機塩基とで形成された非毒性カルボン酸塩が含まれる。これらの塩には例えば、ナトリウムおよびカリウムなどのアルカリ金属、カルシウムおよびマグネシウムなどのアルカリ土類金属、アルミニウムを含むＩＩＩＡ群の軽金属、および有機一級、二級およびトリアルキルアミンなどの三級アミン、例えばトリエチルアミン、プロカイン、ジベンジルアミン、１−エチレンアミン、Ｎ、Ｎ′−ジベンジルエチレンジアミン、ジヒドロアビエチルアミンおよびＮ−アルキルピペリジンなどが含まれる。
本発明による調製物は、従来の無毒性の薬剤学的に容認し得る担体、希釈剤、アジュバントおよび非経腸投与に典型的な基剤を含む単位用量として投与することができる。ここでいう「非経腸」には、皮下、静脈内、関節内および気管内注射および注入点滴などが含まれる。
本発明による単位用量は、本発明のタンパク質の一日必要量、または必要総量を複数分割したものを用いることができる。任意の対象（ヒトを含む哺乳動物）への治療的に容認し得る最適投薬量は、種々の因子、例えば用いる特定の有効成分の活性、年齢、体重、一般的健康状態、性別、食餌、投与時間およびルート、クリアランス回数などによって異なる。したがって、コラーゲンによる血小板凝集の刺激を阻害するために必要な血液濃度は、好ましくは０．１〜５０ｍｇ／リットルの範囲である。
ここでいう「薬剤学的に容認し得る担体」とは、活性化合物または患者との間で望ましくない反応を起こさない不活性、無毒性固体または液体の充填剤、希釈剤またはカプセル用材料を意味する。適当な、好ましくは液体の担体は、当業者に広く公知のもので、例えば滅菌水、生理的食塩水、液体デキストロース、糖溶液、エタノール、グリコールおよび石油、動物油、植物油または合成油などのオイル、例えばピーナツ油、大豆油および鉱油などがある。
本発明による担体はまた、通常プラスチック材料または合成繊維から作られる医用装置を使用前に被覆するために適する薬剤学的に容認し得るゲルまたはクリームである（以下を参照されたい）。
さらにまた、本発明の目的は、装置表面を実質的に耐血栓性にするために上記および請求の範囲に定義した固定化タンパク質で被覆した、体液と接触して使用するインプラント用または体外用の医用装置を提供することである。本発明のポリペプチドを医用装置に固定化してその表面を生物適合性および耐血栓性にする。そのような装置は時に、血小板凝集を概して引き起こしがちな陰性に帯電した濡れ性（wettable）表面を有し、これは血液や他の体液と接触して使用するインプラント用および体外用装置において不都合である。そのような装置の例としては、義肢、義眼、人工臓器、縫糸、人工脈管節、カテーテル、透析器、血液輸送用チューブおよび容器がある。
医用装置の被覆およびタンパク質の固定化は、標準法（例えば、ＵＳ  ４．８８５．２０７）によって行う。
最後に、本発明は上記および請求の範囲に定義されたタンパク質の、インビトロおよびインビボにおけるコラーゲン刺激血小板凝集およびコラーゲンへのｖＷＦの結合を阻止するためおよび体外的治療のための医薬物の製造のための使用に関する。
【図面の簡単な説明】
第１図は、ヒル唾液からのブランジニンのゲル浸透クロマトグラフィーによる精製の説明図である。詳細は実施例２に示す。斜線領域は活性画分を示す。曲線下の番号（３〜１４）は画分を示す。
第２図は、ＳＤＳゲル電気泳動によるブランジニンの精製を示す説明図である。詳細は実施例４に示す。画分番号（８〜１２）およびマーカー（Ｍ）を示す。画分１０および１１は、実施例１によるアッセイにおいて陽性を示す。
第３図は、Ａｚｏｃｏｌｌ（登録商標）によって測定されたコラーゲン分解活性の標準曲線を示す説明図である。詳細は実施例４に示す。縦軸：５６０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ）。横軸：コラゲナーゼ活性（ｍＵ／アッセイ）。
第４ａ図は、コラーゲン刺激血小板凝集の用量依存性阻害作用を示す説明図である。詳細は実施例５に示す。縦軸：凝集％。横軸：ブランジニン濃度（ｎＭ）。
第４ｂ図は、血小板凝集阻害のコラーゲン特異性を示す説明図である。詳細は実施例５に示す。縦軸：凝集％。横軸：１＝対照、２＝コラーゲン、３＝ＡＤＰ。
第５図は、コラーゲンへのｖＷＦ結合の用量依存性阻害作用を示す説明図である。詳細は実施例６に示す。縦軸：４０５ｎｍにおける吸光度（ＯＤ）。横軸：精製タンパク質の濃度（ｎＭ）。三角：精製タンパク質。丸：対照（タンパク質無し）。
本発明はさらに以下の実施例によってより詳細に説明される。
［実施例１］
Hirudo medicinalisからのタンパク質のコラーゲン刺激血小板凝集阻害剤としてのインビトロ活性
Hirudo medicinalisの粗唾液において、血小板に富む血漿（ＰＲＰ）中でコラーゲンの存在によって引き起こされる血小板凝集に対する用量依存性阻害活性を検出することができる。
血液を最終濃度０．３８％のクエン酸ナトリウムを用いてボランティアから採取した。血小板に富むまたは血小板に乏しい血漿を、分画遠心分離によって調製した。
血小板凝集を異なる濃度のコラーゲンｈｏｒｍ（登録商標、Hormonchemie社）を加えることによってアグレゴメータ（aggregometer）ＰＡＰ−４（Biodata社）中で行った。パラメーターはコラーゲン添加後の最大吸光度であった。抗血栓剤は値を低下させる。
上記のアッセイを、本発明による以下のタンパク質精製および精製タンパク質の特徴付けに用いた。
［実施例２］
タンパク質の分離およびクロマトグラフィー精製
本発明によるタンパク質は、Hirudo medicinalisの粗唾液から分離することができた。凍結乾燥した唾液を、２０ｍＭトリスＨＣｌ、１０ｍＭ塩化カルシウム（ｐＨ８．０、ＴＣ−緩衝液）に２０ｍｇ／ｍｌの濃度に戻した。唾液をＣＭ−フラクトゲル（Fraktogel、登録商標）カラム（Ｅ．Ｍｅｒｃｋ社、ダルムシュタット、ドイツ）に載せて、同じ緩衝液中のＮａＣｌ−勾配を用いて溶出した。実施例１に記述の血小板阻害アッセイで活性であるカラム画分は、もはやヒルジン活性部を含まなかった。最終精製を、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１０ｍＭ塩化カルシウム、２００ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ８．０、ＴＣＮ−緩衝液）を用いるジオール修飾シリカカラム上でのゲル浸透クロマトグラフィーによって行った。本精製ステップの典型例を第１図に示す。粗唾液のタンパク質量に対する精製タンパク質の収量は５％であった。他の実験における収量は２〜７％であった。
［実施例３］
調製用電気泳動によるタンパク質のワンステップ精製
別の方法として、タンパク質は調製用電気泳動によって一行程で巧く分離することができた。「プレプ−セル（Prep-cell、登録商標）」装置（バイオラド社、ミュンヘン、ドイツ）中に、通常１０％のアクリルアミドを用いて円柱状ポリアクリルアミドゲルを説明書にしたがって重合化させた。サンプルを電気泳動緩衝液中に加えた。電気泳動中、泳動方向に直角の緩衝液流が溶出されるタンパク質をフラクションコレクターへ移動させた。画分を分析用ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動によって分析して、分子量１５．０ｋＤにしたがって集めた。他の確認実験において分子量値を１４．５ｋＤと決定した。
［実施例４］
タンパク質の特徴付け
実施例１による活性を有する精製タンパク質は、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて約１５０００Ｄの分子量を示した。第２図は、実施例２に記述の典型的なゲル浸透クロマトグラフィーからの活性画分を示す。ゲル上のタンパク質バンドは銀染色によって可視化した。
精製されたタンパク質には、以下に示す好ましいアッセイ法を用いてのいかなるタンパク質分解活性も検出されなかった。レゾルフィン（resorufin、登録商標、ベーリンガー社、マンハイム、ドイツ）によって共有結合で修飾されたカゼインを基質として、プロテナーゼＫを陽性対照として用いた。５０μｌのレゾルフィン標識した０．４％カゼイン溶液に、５０μｌの２００ｍＭトリス、２０ｍＭ塩化カルシウム（ｐＨ７．８）および１００μｌのサンプル溶液を加えた。３７℃で２４時間インキュベートした後、４５０μｌの５％トリクロル酢酸溶液を加えて反応を止めた。反応混合物を遠心分離して、４００μｌの上清を６００μｌの５００ｍＭトリス（ｐＨ８．８）を含むキュベットに移した。直ちに５７４ｎｍで吸光度を読んだ。２４時間のインキュベーションで有意のタンパク質分解活性が粗唾液中に認められたが、精製タンパク質の場合は、吸光度値はバックグラウンドレベルを僅かに下回った（以下の表１を参照されたい）。
上記のタンパク質分解活性の他に、粗唾液はコラーゲン分解活性をも有する。この活性を測定するための好ましい方法は、非特異性色原性コラゲナーゼ基質のアゾコール（azocoll、登録商標、Calbiochem社）を使用して次のようにして行う。アゾコールを５０ｍＭトリス、２００ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ブリジ３５、０．０１％ＮａＮ3（ｐＨ８．０、緩衝液Ａ）中に２０ｍｇ／ｍｌの濃度で懸濁して、遠心分離、吸引および再懸濁によって２回洗浄した。１００μｌのサンプルまたは対照緩衝液を、９６ウェルマイクロタイタープレートのウェルにピペットで入れて緩衝液Ａによる連続希釈列をつくって、これに１００μｌのアゾコール懸濁液を加えた。この混合物を３７℃で典型として１８時間インキュベートした。反応を止めるために、未分解の基質をを１０００×ｇで１０分間遠心分離して沈澱させた。上清を新しいマイクロタイタープレートに移して、５６０ｎｍで吸光度を読んだ。クロストリジウム・ヒストリチカムからのコラゲナーゼ（シグマ社）を用いて標準曲線を作成した（第３図）。
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表２は、このアッセイを用いての典型的測定の結果を示す。アゾコールアッセイにおいて活性を示した粗唾液およびカリン（Calin、ＷＯ９２／０７００５）と呼ばれる他のチスイビルのタンパク質とは対照的に、本発明による精製タンパク質はバックグラウンドレベル以上の有意のコラーゲン分解活性を有しないことが驚いたことに見出だされた。
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［実施例５］
精製タンパク質による血小板凝集の用量依存性阻害作用
血小板に富む血漿を、試験化合物とともに３７℃で２分間インキュベートして、最終濃度１．２５μｇ／ｍｌになるようにコラーゲンを加えることによって凝集させた。本発明のタンパク質（ブランジニン）は、約１５ｎＭのＩＣ50を示した。さらなる実験では、０．５〜１００ｎＭという結果が得られた。唾液の粗抽出物は、コラーゲン刺激さらにＡＤＰ刺激血小板凝集の阻害作用を示した。これに対して、ブランジニンは可能な最高濃度において無効であった。詳細は第４ａおよび４ｂ図から明かである。
［実施例６］
インビトロにおけるコラーゲンへのｖＷＦ結合の精製タンパク質による阻害作用
血小板のコラーゲンとの直接の相互作用を阻害する以外に、本発明による精製タンパク質は、ｖＷＦの結合を阻害するという意外な追加の能力を有する。
これは、５μｇ／ウェルのウマ腱からのコラーゲンタイプＩで９６ウェルマイクロタイタープレートを被覆することによって示された。コラーゲンを０．１Ｍの酢酸に溶解して、ｐＨ７．２の燐酸塩緩衝液に対して１８時間透析した。３７℃で１時間インキュベートした後、ウェルを２５０μｌの１０ｍｇ／ｍｌのＢＳＡのＰＢＳ緩衝液溶液によってブロックして、ＢＳＡを含まないＰＢＳ緩衝液で３回洗浄した。本発明によるタンパク質を含む２５μｌのサンプルを加えて、次いで５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１ＢＳＡ、０．００１％ツイーン８０を含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で１：８０に希釈した７５μｌのヒト血漿を加えて、３７℃で２時間インキュベートした。再洗浄の後、結合したｖＷＦを、ホースラディッシュペルオキシダーゼに抱合した１００μｌの１／４０００希釈したポリクローナルウサギ抗ｖＷＦ抗血清によって検出した。抗血清を３７℃で１時間インキュベートした。発色をＡＢＴＳを用いて３７℃で３０分間行って、４０５ｎｍで測定した。ある実験ではヒト血漿の代わりに精製ｖＷＦ因子（セルビオ社、Remagen、ドイツ）を用いたが、血漿測定と較べてきわめて似た結果が得られた。
血漿からのおよび精製されたｖＷＦの双方の結合を、本発明による精製タンパク質であるブランジニンによって用量依存的に阻止することができた。標準条件下での５０％阻害が約４０ｎＭ（０．５ｎＭ〜１００ｎＭの範囲）で認められた（第５図）。
コラーゲンに結合することによって、ブランジニンは血小板のコラーゲンとの相互反応の阻害のみならず、フォンビルブラント因子のこの内皮下層マトリックス成分との結合にも関与する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５】
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