(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホストへの移植に適した上皮細胞のキメラシートを産生する方法であって、
ホストにとり自系である上皮細胞を、ホストにとり同種異系である上皮細胞とともに、in vitroにおいて混合し、
該上皮細胞の混合物を、in vitroにおいて、上皮細胞の集密成長を促進するのに適した条件下で、ホストへの移植に適した上皮細胞のキメラシートへ培養する工程を含んでなる、方法。
【請求項２】
前記上皮細胞が表皮細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記表皮細胞がケラチノサイトである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
上皮細胞のキメラシートが皮膚移植に適したものである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ホストにとり自系である上皮細胞と、ホストにとり同種異系である上皮細胞との混合物を含んでなる、請求項１に記載の方法によってin vitroにおいて産生される上皮細胞のキメラシート。
【請求項６】
ホストにとり自系である上皮細胞と、ホストにとり同種異系である上皮細胞との混合物を含んでなる、請求項２に記載の方法によってin vitroにおいて産生される上皮細胞のキメラシート。
【請求項７】
ホストにとり自系である上皮細胞と、ホストにとり同種異系である上皮細胞との混合物を含んでなる、請求項３に記載の方法によってin vitroにおいて産生される上皮細胞のキメラシート。
【請求項８】
ホストにとり自系である上皮細胞と、ホストにとり同種異系である上皮細胞との混合物を含んでなる、請求項４に記載の方法によってin vitroにおいて産生される上皮細胞のキメラシート。
【請求項９】
ホストにとり自系である上皮細胞と、ホストにとり同種異系である上皮細胞との培養混合物を含んでなる、ホストへの移植に適した上皮細胞のキメラシート。
【請求項１０】
前記上皮細胞が表皮細胞である、請求項５に記載の上皮細胞のキメラシート。
【請求項１１】
前記表皮細胞がケラチノサイトである、請求項１０に記載の上皮細胞のキメラシート。
【請求項１２】
上皮細胞のキメラシートが皮膚移植に適したものである、請求項１１に記載の上皮細胞のキメラシート。
【請求項１３】
ホストへの移植に適した上皮細胞のキメラシートを産生する方法であって、
ホストにとり自系である上皮細胞を、ホストにとり同種異系である上皮細胞とともに、in vitroにおいて混合し、このとき、前記自系である上皮細胞は培養物中における上皮細胞の５０％であって、かつ前記同種異系である上皮細胞は培養物中における上皮細胞の５０％であり、
該上皮細胞を、in vitroにおいて、上皮細胞の集密成長を促進するのに適した条件下で、自系のホストへの移植に適した上皮細胞のキメラシートへ培養する
工程を含んでなる、方法。
【請求項１４】
前記上皮細胞が表皮細胞である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記表皮細胞がケラチノサイトである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
上皮細胞のキメラシートが皮膚移植に適したものである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ホストへの移植に適した上皮細胞のキメラシートを産生する方法であって、
ホストにとり自系である上皮細胞を、ホストにとり同種異系である上皮細胞とともに、in vitroにおいて混合し、このとき、前記自系である上皮細胞は培養物中における上皮細胞の２５％であって、かつ前記同種異系である上皮細胞は培養物中における上皮細胞の７５％であり、
該上皮細胞を、in vitroにおいて、上皮細胞の集密成長を促進するのに適した条件下で、自系のホストへの移植に適した上皮細胞のキメラシートへ培養する
工程を含んでなる、方法。
【請求項１８】
前記上皮細胞が表皮細胞である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記表皮細胞がケラチノサイトである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
上皮細胞のキメラシートが皮膚移植に適したものである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
請求項１３に記載の方法によってin vitroにおいて産生される上皮細胞のキメラシート。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、キメラ細胞培養物の生産に関する。詳細には、本発明は、皮膚移植に用いるキメラ表皮細胞培養物の生産に関する。
発明の背景
身体の損傷のない組織や器官は、様々な細胞の種類、ならびに細胞、組織および器官の機能に影響を与える細胞外マトリックスから成り立っている。細胞や組織に対して非先天的に損傷を与えると創傷が生じ、身体のあらゆる部位で創傷を治癒する共同機構が開始する（Robbins SL, et al.監修「疾病の病理学的基礎（Pathological Basis of Diseases）」、第２版、Philadelphia : WB Saunders, 1979: 55-106）。創傷閉鎖の必須要素としては、安全な外胚葉由来の組織（上皮または内皮）および隣接する中胚葉由来の組織における均一な血管供給系の修復が挙げられる。閉鎖を最適にするには、外傷性の損傷または選択的な手術によって生じた損傷が、感染のない状態で正常な組織の解剖学的構造を速やかに修復する必要がある（Bucknall TE, et al.監修「外科医のための創傷の治癒(Wound healing for surgeons）」Philadelphia: Bailliere Tindall: 42-74）。
この１０年間において、ヒトの上皮細胞のin vitroでの培養における技術的成果によって、その治療への応用が大きく注目を集めている。最も重要な実際に応用されたものとしては、広範囲に亙って外皮を喪失した患者への自己移植片として、in vitroで培養した上皮のシートを使用し、成功したことが挙げられることは明らかである（Green H. et al., 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 5665; Gllico G. et al., 1984, N. Eng. J. Med., 31: 448）。
１〜２ｃｍ２の生験標本をin vitroで培養すると、表面積を１０，０００倍まで拡大できることが明らかにされている。
全層性熱傷を初期に切除した後、自系の整合させた皮膚(meshed skin)を移植することにより、熱傷の大きな創傷を負った患者の死亡率は減少した（Heimbach DM., M.D., 1987, Surg. Clin. North. Am., 67: 93）。しかしながら、全体表面の５０％以上に及ぶ熱傷では、死亡率が非常に高くなり、これは上皮の剥がれた厚みのある整合した移植片のドナー部位の利用可能性が限定されていることと直接関係している。in vitroで再構成したヒトの上皮は、１９８１年以来重度の熱傷の治療に用いられ成功を納めてきた（O′Connor et al, 1981, Lancet, January 10, 75）。この方法は、全体表面の５０％を越える創傷を負った熱傷の患者に対して高水準の成功を納めている。しかしながら、細胞の成長と移植可能なシートの産生には長時間（３〜５週間）掛るのであり、その間に患者の症状が次第に悪化して行くことがあり、この技法の主要な不利な点である。本発明の目的の一つは、皮膚の外傷の迅速で安全な治療法を提供することである。この重要な目的は、下記の発明によって達成することができる。
発明の概要
本発明は、皮膚の外傷を治療するためin vitroでキメラ上皮を成長させ生成する方法に関する。本発明の新規な特徴は、移植可能な表皮シートの生産に同種異系の細胞を用いることである。これらの皮膚移植片は、各種の皮膚外傷、特に熱傷による創傷だけでなく、大きな先天性母斑、慢性潰瘍、難治性創傷（nonhealing wounds)、治療上皮膚交換を必要とすることがある他の種類の外傷性の皮膚喪失などの他の症状の治療にも用いることができる。実際、大きな火傷を負った患者にとっては、ドナーの皮膚の利用可能性が創傷の被覆率および助かるかどうかを決める要因となるのである。同種異系細胞を用いると、この同種異系細胞は皮膚バンクに保存することができるのでキメラ上皮のin vitroでの生産においてかなりの時間（５０％まで）が節約されるであろうと予想される。
従って、本発明は、ホスト（宿主）に移植するのに適したキメラ細胞培養物を生産する方法にであって、このホストにとって自系である細胞を、このホストにとって自系でない細胞と共に細胞の成長を促進するのに適した条件下で培養することを含んでなる方法を提供する。
本発明は、このホストにとって自系である細胞と、このホストにとって自系でない細胞との混合物を含んでなるホストに移植するのに適した移植可能なキメラ細胞培養物も提供する。好ましい態様では、これらの細胞の種類は両方ともに上皮細胞、特にケラチノサイトである。
本発明は、皮膚移植治療を必要とする患者に前記キメラ細胞培養物を移植することを含んでなる皮膚の移植方法も提供する。
【図面の簡単な説明】
第１図は、ケラチノサイトの各種培養物のフローサイトメトリー分析を表す。パネル(a)は、単純なＢａｌｂ／ｃケラチノサイト培養物中のＨ−２ｄ陽性細胞の割合を表す。パネル(b)は、単純なＣ３Ｈ／ＨｅＮケラチノサイト培養物中のＨ−２ｋ陽性細胞の割合を表す。パネル(c)は、キメラケラチノサイト培養物中のＨ−２ｄ陽性およびＨ−２ｋ陽性細胞の割合を表す。
第２図は、移植１４日後のＣ３Ｈ／ＨｅＮマウスでの(a)同系移植片、(b)同種異系、および(c)キメラ移植片の組織学的分析を表す。
第３図は、Ｃ３Ｈ／ＨｅＮでの移植３０日後のキメラ移植片および同系移植片の免疫蛍光染色を表す。パネル(a)は、Ｈ−２ｋで染色した同系移植片である。パネル(b)は、Ｈ−２ｋで染色したキメラ移植片である。パネル(c)は、Ｈ−２ｄで染色したキメラ移植片である。
好ましい態様の詳細な説明
下記の説明は、ネズミのキメラ表皮細胞培養物を調製して、ネズミのホストに移植する、本発明の一態様の例である。
表皮細胞の調製および培養
ネズミの表皮ケラチノサイトの一次培養物を、YuspaおよびHarrisの方法（Exp. Cell. Res., 1974, 86:95）に準じて、新生児Ｂａｌｂ／ＣおよびＣ３Ｈ／ＨｅＮネズミの皮膚から得た。簡単に説明すれば、新生児マウスを頸部脱臼により屠殺した後、７０％エタノール、冷プロビオジン、および７０％エタノールで、それぞれ３回洗浄した。四肢および尾を切断し、尾から口吻屁と縦切開を行ない、皮膚を鉗子を用いて除去した。リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）の０．２５％〜２０μｇ／ｍｌトリプシン−ＤＮアーゼ溶液上にこの皮膚を４℃で一晩浮遊させた後、表皮を真皮から分離した。剥ぎ採った表皮片を血清を含む媒質に無菌的に移し、残存する酵素の作用を阻害し、表皮細胞を機械的に放出した。単細胞懸濁液を２回洗浄し、ペレットを１０％ＦＣＳ培地５ｍｌに再懸濁した。表皮細胞懸濁液をLympholyte-Mグラディエント(Cedarlane Laboratories Limited、カナダ）に適用し、室温、３００ｇで３０分間遠心分離した。ケラチン性物質および他の破砕片を含む生成ペレットを廃棄した。凝集した表皮細胞を含む界面層を集めて、２回洗浄し、３：１の割合でＨａｍ′ｓＦ−１２と混合したＥｅａｇｌｅ培地のＤｕｌｂｅｃｃｏ−Ｖｏｇｔ改質培地（ＤＭＥ)(Flow Labs, Mississauga, Ontario,カナダ）に再懸濁した。この培地に、インシュリン５μｇ／ｍｌ、コレラ毒素（Schwarz/Mann,クリーブランド、オハイオ、米国）１０-10Ｍ、アデニン２４．３μｇ／ｍｌ、ヒトトランスフェリン５μｇ／ｍｌ、３，３′，５′−トリヨード−Ｌ−サイロニン(Sigma Chemicals)２×１０-9Ｍ、ヒドロコルチゾン（Calbiochem, La Jolla,カリフォルニア、米国）０．４μＭ、ペニシリンＧ１００ＩＵ／ｍｌ、ゲンタマイシン(Schering Canada Inc.)２５μｇ／ｍｌ、表皮成長因子（ＥＧＦ，Chiron Corp., Emeryville,カリフォルニア、米国）１０ｎｇ／ｍｌ、およびウシ胎児血清（ＦＣＳ，Flow Lab)１０％を補足した。細胞成長力および表皮細胞懸濁液のカウント数は、トリパンブルー色素排除法によって確かめた。
細胞培養
Ｂａｌｂ／ｃケラチノサイト（ＢＫ）またはＣ３Ｈ（ＣＫ）を培養フラスコ中で個別に成育させ、または５０％ＢＫ−５０％ＣＫの割合で混合した。播種細胞濃度は、１０５細胞数／ｃｍ２であった。総ての培養物を、３７℃で５％ＣＯ２を含む加湿雰囲気中に２４時間置いた後、３１℃に移し、表皮成長因子（ＥＧＦ）を培地に加えた。この培地を２日毎に取り替えた。培地の最初の４８時間については、培地のＭｇ2+濃度を２ｍＭに調整した後、５ｍＭに増加した（Molloy C.J.およびLaskin J.D., 1988, Dfferentiation, 32:86)。
キメラ培養細胞懸濁液の免疫蛍光染色
集密した培養物を０．０１％−０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡ溶液で処理して、細胞懸濁液を調製した。次に、細胞を、抗−Ｈ−２ｋモノクローナル抗体（Ｃ３Ｈ／ＨｅＮ細胞に特異的）で４℃で４５分間処理した。１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および０．１％アジ化ナトリウム（Ａｚ）を含むＰＢＳで２回洗浄した後、細胞をヤギ抗−マウスＩｇＭ−ＩｇＧフルオレッセイン（ＦＩＴＣ）複合体（３００倍希釈）に４℃、暗所で４５分間暴露した。細胞を洗浄した後、フィコエリトリン（ＰＥ）とカップリングした抗−Ｈ−２ｄモノクローナル抗体（Ｂａｌｂ／ｃ細胞に特異的）で暗所にて４℃で４５分間処理した。このインキュベーションの後、細胞をＰＨＳ−１％ＢＳＡ−０．１％Ａｚで３回洗浄した。次いで、それぞれのペレットを１％パラホルムアルデヒド１ｍｌに再懸濁し、フローサイトメトリー(Becton Dickison, Montreal,ケベック、カナダ）によって分析した。コントロールとして、純粋なＢａｌｂ／ｃおよびＣ３Ｈ／ＨｅＮ集密ケラチノサイト培養物を酵素的に再懸濁した後、それぞれ抗−Ｈ−２ｄ−ＰＥ標識、およびＨ−２ｋとＩｇＭ−ＩｇＭ−ＦＩＴＣモノクローナル抗体で別々に染色した。
キメラシートの調製
ケラチノサイトの一次培養が集密に達した時点で、表皮シートを調製した。培養物を無菌のＰＢＳで２回洗浄した後、２．５ｍｇ／ｍｌのジスパーゼ(Sigma)５ｍｌをそれぞれのフラスコに加え、３７℃で２０〜３０分間インキュベーションを行ない、フラスコ表面からこれらのシートを取り出した。シートを２回洗浄し、ワセリンゲージ(Ethicon Ltd., Johnson and Johnson, Peterborough,オンタリオ、カナダ）ベルサル・サイド・アップ(basal side up)に移した後、Ｌｉｇａｃｌｉｐｓ(Sherwood Medical Industries Ltd., Markham,オンタリオ、カナダ）で固定した。これらのシートを、移植まで、適当な媒質に浸漬しておいた。
移植手続
移植実験に用いた受容マウスは、Ｂａｌｂ／ｃおよびＣ３Ｈ／ＨｅＮマウスであった。それぞれの品種は、移植片を受入れるマウスにとって(a)同系、(b)同種異系、または(c)キメラである表皮シートの移植片を受けた。例えば、Ｂａｌｂ／ｃマウスには、(a)Ｂａｌｂ／ｃマウス由来の表皮シート（同種移植片または同系移植片）、(b)Ｃ３Ｈ／ＨｅＮマウス（同種異系移植片）、または(c)両種のＢａｌｂ／ｃおよびＣ３Ｈ／ＨｅＮマウス（キメラ移植片）由来の表皮シートを移植した。
Ｂａｌｂ／ｃおよびＣ３Ｈ／ＨｅＮマウスのような近交系品種のマウスは、均質な個体群であり、一品種の総ての構成部員は同一の遺伝学的組成からなっているものを表す。それ故、同系移植片は自己移植片と実験的には同等であると考えることができると理解され、いずれの場合にも受容動物および移植片も共に同じ遺伝学的組成であるからである。本実験の目的のために、自己移植片の代わりに同系移植片を用いた。それは表皮シートを調製したマウスは、表皮細胞を単世する際に屠殺するからである。
受容マウスは、ケタミンキシラジン０．０５ｍｌ／１０ｇ体重の量で筋肉内注射によって麻酔した。マウスの背部を、剃毛して、その部分をプロビオジンおよび７０％エタノールで洗浄することによって移植用に調製した。全層厚みの皮膚を筋肉まで切開した。Ｆｕｓｅｎｉｇ移植チャンバー（Fusenig N.E. et al., 1980「医学研究における組織培養(Tissue Culture in Medical Research)」第２巻、Richard R.C.およびRayan K.監修、オックスフォード、Pergamon、８７頁）を設け、均質またはキメラシートを筋肉に付着させた。次に、ワセリンゲージを、静かに取り外した。移植チャンバーの最上部は、４個の皮膚縫合（絹、４〜０、Ethicon Ltd.製、Peterborough,オンタリオ）によって設置し、４日間固定した後、取り除いた。移植から１４日および３０日後、組織学および免疫組織化学分析の目的で生験を行なった。
組織学的研究
移植から１４日後に、同系移植片ならびに同種異系およびキメラ移植片から生験試料を採取し、Ｂｏｕｉｎ溶液中で固定して、パラフィンに埋設した。次いで、４〜５μｍの切片ヘマトキシリンフロキシンおよびサフロンで染色市、光学顕微鏡（Nikon Optiphot,日本）下で観察した。
間接的免疫蛍光のために、移植から３０日後に同系移植片およびキメラ移植片から完全な生験試料を集め、ＯＣＴ化合物（Miles, Elkhart,インディアナ）に埋設し、液体窒素中で冷凍し、必要になるまで−７０℃で保存した。それぞれの生験試料から４μｍのクリオスタット切片を調製し、９５％加湿チャンバー中、室温で４５分間抗−Ｈ−２ｄまたは抗−Ｈ−２ｋモノクローナル抗体で染色し、ＰＢＳ−ＢＳＡ−Ａｚで十分洗浄した後、ＦＩＴＣ複合ヤギ抗−マウスＩｇＭ−ＩｇＧを暗所で前記のように４５分間オーバーレイした。更にＰＢＳ−ＢＳＡ−Ａｚで洗浄した後切片を３０％グリセロール−２％グリシン−ＰＢＳ溶液に置き、カバースリップをオーバーレイし、蛍光顕微鏡(Nikon Optiphot)を用いて検討し、Ｋｏｄａｋ  Ｔｍａｘ  ４００ＡＳＡフィルムを用いて写真を採った。
結果
本発明者らは、ネズミモデルを用いて、２種類の異なるケラチノサイトからなるキメラ性の移植可能なシートを生産する新規な表皮培養法を開発した。これらの移植可能なシートは、熱傷治療を行ない且つ促進し、他の皮膚外傷の治療に用いられる。
Ｂａｌｂ／ｃおよびＣ３Ｈ／ＨｅＮケラチノサイトの５０：５０混合物を含んでなるキメラ培養物を、集密まで同時培養した。集密培養物は、(i)特異的な抗Ｈ−２ｄ（Ｂａｌｂ／ｃおよび／または抗−Ｈ−２ｋ（Ｃ３Ｈ／ＨｅＮ）モノクローナル抗体を用いてこれらの移植可能なキメラシート上でのそれぞれの細胞の種類の割合を評価する目的で染色し、または(ii)集密培養物からジスパーゼ処理によって表皮を得て、受容動物のＢａｌｂ／ｃまたはＣ３Ｈ／ＨｅＮマウス６〜８週齢に移植した。第１図は、組み合わせて用いた抗−Ｈ−２ｄおよび抗−Ｈ−２ｋモノクローナル抗体または個別に用いたそれぞれの抗体を用いて評価したところ、キメラ培養物が培養の３日後にはそれぞれの細胞の種類をほぼ同じ割合で含むことを示している。パネル(c)に示されるように、キメラ培養物のＢａｌｂ／ｃのケラチノサイトの割合は４０％であり、Ｃ３Ｈ／ＨｅＮのケラチノサイトの割合は４２％であった。この免疫染色では、Ｂａｌｂ／ｃのケラチノサイト（ＢＫ）の増殖はＣ３Ｈ／ＨｅＮケラチノサイト（ＣＫ）と同時培養したときに成長の阻害は見られず、またその逆の場合も同じであった。更に、移植の目的のために準備した表皮細胞は、培養の播種の開始時と本質的に同じ割合の２種類の細胞からなっていた。ネガティブコントロールは、第二の抗体である抗−マウス−ＩｇＧ−ＦＩＴＣにだけ染色した。
キメラシートを移植し、受容動物の背部に置いた。移植から１４日後に、組織学的分析の目的で、同系移植片および同種異系およびキメラ移植片から生験試料を採取した。ヘマトキシリンおよびフロキシン染色（第２図）では、良好に構成された表皮が見られ、爪角質層、有棘層および胚芽層も存在した。キメラ移植片および同系移植片では単球の浸潤は見られなかった。しかしながら、培養した表皮同種異系移植片では、表皮細胞の組織破壊と、移植拒絶の徴候である単球および多形核細胞の顕著な浸潤が見られた。キメラ移植片および同系移植片では、拒絶は起こらなかった。
キメラシート移植の後に表皮を構成するケラチノサイトの起源を決定するため、移植から３０日後に自系およびキメラ移植片から生験試料を採取し、ＯＣＴに埋設し、液体窒素中で冷凍した。それぞれの生験試料から薄い切片を調製し、抗−Ｈ−２ｄまたは抗−Ｈ−２ｋモノクローナル抗体で染色した。第３図に示されるように、Ｂａｌｂ／ｃ受容マウスに予め移植したキメラシートは、表皮は同系移植片の場合と同様にＢａｌｂ／ｃ（ＢＫ）の実を含むことを示した。Ｃ３Ｈ／ＨｅＮ（ＣＫ）細胞は、移植片には見られなかった。ＣＫ細胞は、全移植片の通常の拒絶なしに移植片から受動的に脱落した。同じ結果は、Ｃ３Ｈ／ＨｅＮ受容マウスでのキメラシートの移植の後にも得られた。
本発明者らは、キメラ培養物が同系細胞２５％および異系細胞７５％からなるときには、同じ結果が得られたことも示した。それ故、同系および異系表皮細胞懸濁液を用いるキメラ表皮の生成についての本発明は皮膚交替についての高品質の結果を示している。
ヒト治療についてのこの手法を用いれば、ほぼ５０％まで移植可能なシートを得るのに必要な時間の遅れを著しく少なくすることができることが予想される。実際、３Ｔ３線維芽腫のフィーダー層の存在下では、新たに単離したケラチノサイトは、細胞分裂の多くのサイクル中にコロニーに成長する（Rheinwald J.G.およびGreen H., 1975, Cell, 6: 331)。コロニーの大きさは、それらが融合して、連続した多層シートを約１０日で生じるまで経時的に増加する。この時点で、増殖は停止する
（Tenchini et al,. 1992, Burns, 18: 11s）。同時に、細胞バンクに保存されており、予めウイルス感染および他の疾患について試験した同種異系ケラチノサイトを解凍し、培養フラスコに接種して集密させることができる。細胞懸濁液は、自系および同種異系培養物のいずれから別々に作成することもできる。これらの種類の細胞を、次に、適当な割合で混合した後、新たなフラスコに接種して、インキュベーションし、移植可能なシートを生成することができる。この段階で、生成した表皮シートは火傷などの皮膚の外傷の治療に用いられる。標準的な培養法と比較して、キメラシートは、２回目または多くの場合３回目の経路を予想するよりは、むしろ最初の自系ケラチノサイトの培養経路で移植に用いることができた。この方法によれば、皮膚創傷の治療期間が著しく短縮される。
前記の説明はキメラ皮膚移植片に関するものであるが、このキメラ手法はキメラ血管器官、キメラ靭帯ならびに他のキメラ器官の調製に用いることもできる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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