(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
粒子内に、第１成分としてエネルギーのドナーを、第２成分としてエネルギーのアクセプターを、互いがエネルギー交換距離にある位置に含有しており、該第２成分が６００ｎｍ以上の励起波長と６５０ｎｍ以上の放射波長を有し、該２つの成分が５０ｎｍ以上のストークスシフトを有し、該粒子の表面に上にタンパク質、ポリペプチド、核酸、ヌクレオチド、またはリガンドアナログを含有するタンパク質が結合している粒子。
【請求項２】
粒子内に、第１成分としてエネルギーのドナーを、第２成分として蛍光色素を、互いがエネルギー交換距離にある位置に含有しており、該第１成分がフタロシアニンであり、該第２成分が６００ｎｍ以上の励起波長と６５０ｎｍ以上の放射波長を有し、該２つの成分が５０ｎｍ以上のストークスシフトを有している粒子。
【請求項３】
粒子内に、第１成分としてエネルギーのドナーを、第２成分として蛍光色素を、互いがエネルギー交換距離にある位置に含有しており、該第２成分がフタロシアニンであり、該第２成分が６００ｎｍ以上の励起波長と６５０ｎｍ以上の放射波長を有し、該２つの成分が５０ｎｍ以上のストークスシフトを有している粒子。
【請求項４】
粒子内に、第１成分としてエネルギーのドナーを、第２成分として蛍光色素を、互いの距離がエネルギー交換距離にある位置に含有しており、該第１成分がナフタロシアニンであり、該２つの成分が５０ｎｍ以上のストークスシフトを有している粒子。
【請求項５】
粒子内に、第１成分としてエネルギーのドナーを、第２成分として蛍光色素を、互いがエネルギー交換距離にある位置に含有しており、該第２成分がナフタロシアニンであり、該２つの成分が５０ｎｍ以上のストークスシフトを有している粒子。
【請求項６】
粒子内に、第１成分としてエネルギーのドナーを、第２成分として蛍光色素を、互いがエネルギー交換距離にある位置に含有しており、第１成分がフタロシアニンであり、第２成分がナフタロシアニンであり、該２つの成分が５０ｎｍ以上のストークスシフトを有している粒子。
【請求項７】
粒子内に、第１成分としてエネルギーのドナーを、第２成分として蛍光色素を、互いがエネルギー交換距離にある位置に含有しており、第１成分がスチリルであり、第２成分がナフタロシアニンであり、該２つの成分が５０ｎｍ以上のストークスシフトを有している粒子。
【請求項８】
粒子内に、第１成分としてエネルギーのドナーを、第２成分として蛍光色素を、互いがエネルギー交換距離にある位置に含有しており、第１成分がフェニルブタジエニルであり、第２成分がナフタロシアニンであり、該２つの成分が５０ｎｍ以上のストークスシフトを有している粒子。
【請求項９】
粒子内に、第１成分としてエネルギーのドナーを、第２成分として蛍光色素を、互いがエネルギー交換距離にある位置に含有しており、第１成分がフェニルヘキサトリエニルであり、第２成分がナフタロシアニンであり、該２つの成分が５０ｎｍ以上のストークスシフトを有している粒子。
【請求項１０】
粒子内に、第１成分としてエネルギーのドナーを、第２成分として蛍光色素を、互いがエネルギー交換距離にある位置に含有しており、第１成分がポルフィンであり、第２成分がナフタロシアニンであり、該２つの成分が５０ｎｍ以上のストークスシフトを有している粒子。
【請求項１１】
粒子内に、第１成分としてエネルギーのドナーを、第２成分として蛍光色素を、互いがエネルギー交換距離にある位置に含有しており、第１成分がカルボシアニン色素であり、第２成分がナフタロシアニンであり、該２つの成分が５０ｎｍ以上のストークスシフトを有している粒子。
【請求項１２】
粒子内に、第１成分としてエネルギーのドナーを有し、さらに互いがエネルギー交換距離にある位置に２種類の蛍光色素を有する粒子であって、該第１成分がトランス-４-［４-（ジブチルアミノ）スチリル］-１-メチルピリジンであり、該２種類の色素がシリコンフタロシアニンビス（ジメチルペンタフルオロフェニルシリルオキシド）およびシリコンフタロシアニンビス（ジメチルビニルシリルオキシド）からなる群から抽出され、該エネルギーのドナーと２種類の色素のストークスシフトが５０ｎｍ以上である粒子。
【請求項１３】
粒子内に、第１成分としてエネルギーのドナーを有し、さらに互いがエネルギー交換距離にある位置に３種類の蛍光色素を有する粒子であって、該第１成分がトランス-４-［４-（ジブチルアミノ）スチリル］-１-メチルピリジンであり、該３種類の色素がシリコンフタロシアニンビス（ジメチルペンタフルオロフェニルシリルオキシド）、シリコンフタロシアニンビス（ジメチルビニルシリルオキシド）およびシリコンフタロシアニンビス（ジメチルビニルシリルオキシド）からなる群から抽出され、該エネルギーのドナーと３種類の色素のストークスシフトが５０ｎｍ以上である粒子。
【請求項１４】
粒子内に、第１成分としてエネルギーのドナーを、第２成分として２種類の蛍光色素を、互いがエネルギー交換距離にある位置に含有しており、第１成分が１，１’-ジヘキシル-３，３，３’，３’-テトラメチルインドジカルボシアニンであり、該２種類の色素はシリコン２，３-ナフタロシアニンビス（ジメチルビニルシリルオキシド）およびシリコンナフタロシアニンビス（ジメチルエチルマレイミドシリルオキシド）からなる群から抽出され、該エネルギードナーと２種類の蛍光色素のストークスシフトが５０ｎｍ以上である粒子。
【請求項１５】
粒子内に、第１成分としてエネルギーのドナーを、第２成分として２種の蛍光色素を、互いがエネルギー交換距離にある位置に含有しており、該第１成分が１，１’-ジヘキシル-３，３，３’，３’-テトラメチルインドジカルボシアニンの塩であり、該２種の色素がシリコン２，３-ナフタロシアニンビス（ジメチルビニルシリルオキシド）およびシリコンフタロシアニンビス（ジメチルエチルマレイミドシリルオキシド）からなる群から抽出され、該エネルギーのドナーと２種類の色素のストークスシフトが５０ｎｍ以上である粒子。
【請求項１６】
粒子内に、第１成分としてエネルギーのドナーを、第２成分として蛍光色素を、互いがエネルギー交換距離にある位置に含有しており、該第１成分が（Ｅ，Ｅ）-３，５-ビス-（４-フェニル-１，３-ブタジエニル）-４，４-ジフルオロ-４-ボラ-３ａ，４ａ-ジアゾ-ｓ-インダセンであり、該第２成分がシリコン２，３-ナフタロシアニンビス（ジメチルヘキシルビニルシリルオキシド）であり、該２つの成分が５０ｎｍ以上のストークスシフトを有している粒子。
【請求項１７】
粒子内に、第１成分としてエネルギーのドナーを、第２成分として蛍光色素を、互いがエネルギー交換距離にある位置に含有しており、該第１成分が（Ｅ，Ｅ）-３，５-ビス-（４-フェニル-１，３-ブタジエニル）-４，４-ジフルオロ-４-ボラ-３ａ，４ａ-ジアゾ-ｓ-インダセンであり、該第２成分がシリコン２，３-ナフタロシアニンビス（ジメチルビニルシリルオキシド）であり、該２つの成分が５０ｎｍ以上のストークスシフトを有している粒子。
【請求項１８】
粒子内に、第１成分としてエネルギーのドナーを、第２成分として蛍光色素を、互いがエネルギー交換距離にある位置に含有しており、該第１成分がシリコンフタロシアニンビス（マレイミド-フルオロセイン）であり、該第２成分がシリコンフタロシアニンビス（マレイミド-フルオロセイン）および該２つの成分が５０ｎｍ以上のストークスシフトを有している粒子。
【請求項１９】
粒子内に、第１成分としてエネルギーのドナーを、第２成分として蛍光色素を、互いがエネルギー交換距離にある位置に含有しており、該第１成分が（Ｅ，Ｅ）-３，５-ビス-（４-フェニル-１，３-ブタジエニル）-４，４-ジフルオロ-４-ボラ-３ａ，４ａ-ジアゾ-ｓ-インダセンであり、該第２成分がシリコン２，３-ナフタロシアニンビス（ジメチルヘキシルビニルシリルオキシド）であり、該２つの成分が５０ｎｍ以上のストークスシフトを有している粒子。
【請求項２０】
粒子内に、第１成分としてエネルギーのドナーを、第２成分として２種類の蛍光色素を、互いがエネルギー交換距離にある位置に含有しており、該第１成分が（Ｅ，Ｅ）-３，５-ビス-（４-フェニル-１，３-ブタジエニル）-４，４-ジフルオロ-４-ボラ-３ａ，４ａ-ジアゾ-ｓ-インダセンであり、該第２成分の２種の色素がシリコン２，３-ナフタロシアニンビス（ジメチルヘキシルビニルシリルオキシド）およびシリコンオクタエトキシ２，３-ナフタロシアニンビス（ジメチルヘキシルビニルシリルオキシド）からなる群から抽出され、該エネルギードナーと２種類の色素のストークスシフトが５０ｎｍ以上である粒子。
【請求項２１】
粒子内に、第１成分としてエネルギーのドナーを、第２成分として２種類の蛍光色素を、互いがエネルギー交換距離にある位置に含有しており、該第１成分が（Ｅ，Ｅ）-３，５-ビス-（４-フェニル-１，３-ブタジエニル）-４，４-ジフルオロ-４-ボラ-３ａ，４ａ-ジアゾ-ｓ-インダセンであり、該第２成分の２種の色素がシリコン２，３-ナフタロシアニンビス（ジメチルヘキシルビニルシリルオキシド）および５，５’-ジクロロ-１，１’-ジフェニルアミノ-３，３’-ジエチル-１０，１２-エチレンチアトリカルボシアニンの塩からなる群から抽出され、該エネルギードナーと２種類の色素のストークスシフトが５０ｎｍ以上である粒子。
【請求項２２】
粒子内に、第１成分としてエネルギーのドナーを、第２成分として２種類の蛍光色素を、互いがエネルギー交換距離にある位置に含有しており、該第１成分が（Ｅ，Ｅ）-３，５-ビス-（４-フェニル-１，３-ブタジエニル）-４，４-ジフルオロ-４-ボラ-３ａ，４ａ-ジアゾ-ｓ-インダセンであり、該第２成分の２種の色素がシリコン２，３-ナフタロシアニンビス（ジメチルヘキシルビニルシリルオキシド）およびシリコン２，３-ナフタロシアニンビス（ジメチルペンタフルオロフェニルシリルオキシド）からなる群から抽出され、該エネルギーのドナーと２種類の色素が５０ｎｍ以上のストークスシフトを有している粒子。
【請求項２３】
粒子がラテックス粒子である請求項１〜２２いずれかに記載の粒子。
【請求項２４】
請求項１〜２２のいずれかに記載の粒子であって、粒子内に、ほぼ同一の励起波長と放射波長を有する２またはそれ以上の色素分子を添加し、これによって蛍光消光が減少され、蛍光強度が該色素分子の組み合わせにより増加されるよう改良された改良粒子。
【請求項２５】
粒子内において第２成分とほぼ同じ励起および放射波長を示す少なくとも１種類の蛍光色素を第３成分としてさらに含有し、これによって消光が減少され、該第２および第３の追加成分の組み合わせによって蛍光強度が増加される、請求項１〜１１または１６〜１９のいずれかに記載の粒子。
【請求項２６】
少なくとも１のさらなる蛍光色素を第４成分として含有し、該第４成分が粒子内で該２つのアクセプター色素とほぼ同じ励起および放射波長を示し、これによって消光が減少され、該２種類の色素および該追加成分の組み合わせによって蛍光強度が増強される、請求項１２、１４、１５、２０、２１または２２記載の粒子。
【請求項２７】
少なくとも１のさらなる蛍光色素を第３成分として含有し、該第３成分が粒子内で該第２成分とほぼ同じ励起および放射波長を示し、これによって消光が減少し、該第２成分と該追加成分の組み合わせにより蛍光強度が増強される、請求項１〜１１、１３または１６〜１９いずれかに記載のラテックス粒子。
【請求項２８】
少なくとも１のさらなる蛍光色素を第４成分として含有し、該第４成分が粒子内で該２種のアクセプター色素とほぼ同じ励起および放射波長を示し、これによって消光が減少され、蛍光強度が該２種のアクセプター色素と該追加成分の組み合わせにより増強される、請求項１２、１４、１５、２０、２１または２２記載のラテックス粒子。
【請求項２９】
請求項１〜２２いずれかに記載の粒子を用いて反応混合物内の標的リガンドを検出する検出アッセイ。
【請求項３０】
請求項１〜２２のいずれかに記載の粒子であって、ａ）少なくとも１の所望の励起ピークを有する出発ドナー色素および少なくとも１の所望の放射ピークを有する最終アクセプター色素を含有する一連の色素を、該一連の色素中の各色素のスペクトルが、励起エネルギーを最終のアクセプター色素へ伝達する有意なエネルギー伝達が可能であるよう重複し、該微粒子の励起波長が６００ナノメートル以上であり、ストークスシフトが５０ナノメートル以上となるように選択する；そしてｂ）該一連の色素を微粒子内へランダムに取り込ませる：工程を含む方法により製造される、蛍光微粒子。
【請求項３１】
６２０ｎｍから７５０ｎｍの間に励起ピークを有し、６５０ｎｍから８５０ｎｍの間に放射ピークを有する請求項３０記載の微粒子。
【請求項３２】
６５０ｎｍから９００ｎｍの間に励起ピークを有し、８００ｎｍから１０００ｎｍの間に放射ピークを有する請求項３０記載の微粒子。
【請求項３３】
ラテックス、シリカ、アルミナ、リポソーム及びコロイドからなる群から選択される、請求項３１記載の微粒子。
【請求項３４】
ラテックス、シリカ、アルミナ、リポソーム及びコロイドからなる群から選択される、請求項３２記載の微粒子。
【請求項３５】
請求項１〜２２のいずれかに記載の粒子であって、Ａ）（１）該第１成分として所望の励起ピークを有する少なくとも１のドナーサブユニットを；および（２）該第２成分として、所望の放射ピークを有する少なくとも１のアクセプターサブユニットを有し、該ドナーサブユニットからアクセプターサブユニットへの分子内エネルギー伝達が可能である；少なくとも１のハイブリッドフタロシアニン誘導体を選択する、Ｂ）該ハイブリッドフタロシアニン誘導体を微粒子内へランダムに取り込ませる：工程を含む方法にて作成される微粒子。
【請求項３６】
ラテックス、シリカ、アルミナ、リポソーム及びコロイドからなる群から選択される、請求項３５記載の微粒子。
【請求項３７】
請求項１〜２２のいずれかに記載の粒子であって、Ａ）（１）該第１成分として所望の励起ピークを有する少なくとも１のドナーサブユニットを；（２）該第２成分として所望の放射ピークを有する少なくとも１のアクセプターサブユニット；および（３）少なくとも１の電子伝達サブユニットを有し、該ドナーサブユニットからアクセプターサブユニットへの分子内エネルギー伝達が可能である；少なくとも１のハイブリッドフタロシアニン誘導体を選択する、Ｂ）該ハイブリッドフタロシアニン誘導体を微粒子内へランダムに取り込ませる：工程を含む方法にて作成される微粒子。
【請求項３８】
ラテックス、シリカ、アルミナ、リポソームおよびコロイドからなる群から選択される、請求項３７記載の微粒子。
【請求項３９】
請求項１〜２２のいずれかに記載の粒子であって、Ａ）（１）該第１成分として所望の励起ピークを有する少なくとも１のドナーサブユニットを；（２）該第２成分として所望の放射ピークを有する少なくとも１のアクセプターサブユニット；および（３）ハイブリッドフタロシアニン内の金属に共有結合している少なくとも１の軸性配位子を有し、該ドナーサブユニットからアクセプターサブユニットへの分子内エネルギー伝達が可能である；少なくとも１の金属含有ハイブリッドフタロシアニン誘導体を選択する、Ｂ）該ハイブリッドフタロシアニン誘導体を微粒子内へ取り込ませる：工程を含む方法にて作成される微粒子。
【請求項４０】
ラテックス、シリカ、アルミナ、リポソームおよびコロイドからなる群から選択される、請求項３９記載の微粒子。
【請求項４１】
請求項１〜２２のいずれかに記載の粒子であって、Ａ）ハイブリッドフタロシアニン内の金属に共有結合している少なくとも１の軸性配位子を有する、少なくとも１の金属含有ハイブリッドフタロシアニン誘導体を選択する；Ｂ）該ハイブリッドフタロシアニン誘導体を微粒子内へ取り込ませる；工程を含む方法にて作成される微粒子。
【請求項４２】
ラテックス、シリカ、アルミナ、リポソームおよびコロイドからなる群から選択される、請求項４１記載の微粒子。
【請求項４３】
請求項１〜２２のいずれかに記載の粒子であって、Ａ）（１）該第１成分として所望の励起ピークを有する少なくとも１のドナーサブユニットを；（２）該第２成分として所望の放射ピークを有する少なくとも１のアクセプターサブユニット；（３）少なくとも１の電子伝達サブユニット；および（４）ハイブリッドフタロシアニン内の金属に共有結合している少なくとも１の軸性配位子を有し、該ドナーサブユニットからアクセプターサブユニットへの分子内エネルギー伝達が可能である；少なくとも１の金属含有ハイブリッドフタロシアニン誘導体を選択する、Ｂ）該フタロシアニン誘導体を微粒子内へ取り込ませる：工程を含む方法にて作成される微粒子。
【請求項４４】
ラテックス、シリカ、アルミナ、リポソームおよびコロイドからなる群から選択される、請求項４３記載の微粒子。
【請求項４５】
請求項１〜２２のいずれかに記載の粒子であって、フタロシアニン誘導体内の金属に共有結合している少なくとも１の軸性リガンドを含有する、金属含有フタロシアニン誘導体を含む微粒子。
【請求項４６】
請求項１〜２２のいずれかに記載の粒子であって、ハイブリッドフタロシアニン誘導体内の金属に共有結合している少なくとも１の軸性リガンドを含有する、金属含有ハイブリッドフタロシアニン誘導体を含む微粒子。
【請求項４７】
請求項１〜２２のいずれかに記載の粒子であって、Ａ）色素系中に、所望の励起ピークを有する少なくとも１の出発のドナーサブユニット、および所望の、互いに同一もしくは近接している放射ピークを有する２またはそれ以上の最終アクセプター色素を含有し、該色素系の各色素が励起エネルギーを最終のアクセプター色素へ伝達する有意なエネルギー伝達を十分行えるようなスペクトルの重複を有するように、一連の色素系を選択する；そしてＢ）該一連の色素系を微粒子内へランダムに取り込ませて最小の蛍光消光と最大の蛍光強度を示す改良された粒子となるようにする：工程を含む製法にて製造される、改良された蛍光微粒子。
【請求項４８】
該放射ピークが互いに１０ｎｍの範囲内にある、請求項４７記載の改良された微粒子。
【請求項４９】
該一連の色素系に５個までの異なる色素を含有する請求項４７記載の改良された微粒子。
【請求項５０】
該一連の色素系に１０個までの異なる色素を含有する請求項４７記載の改良された微粒子。
【請求項５１】
請求項１〜２２のいずれかに記載の粒子であって、ａ）カルボシアニン色素およびエテニル置換ジピロロメテンボロンジフルオロ色素からなる群から選択され、所望の励起ピークを有する少なくとも１の出発ドナー色素、および、フタロシアニン類からなる群から選択され、所望の放射ピークを有する少なくとも１の最終アクセプター色素を含有し、色素系中の各色素が励起エネルギーを最終アクセプター色素へ伝達するのに十分なスペクトルの重複を有しており、ストークスシフトが５０ナノメートル以上である色素系を選択し；ｂ）該一連の色素系を微粒子内にランダムに取り込ませる：工程を含む方法で製造される蛍光微粒子。
【請求項５２】
請求項１〜２２のいずれかに記載の粒子であって、Ａ）所望の励起ピークを有する少なくとも１の出発ドナー色素、および所望の放射ピークを有する少なくとも１の最終アクセプター色素を含有し、色素系中の各色素のスペクトルが励起エネルギーを最終アクセプター色素へ伝達するのに十分であるよう重複しており、該微粒子の励起波長が、試料の吸収が入射光の約１０％以下である領域内であり、試料の蛍光の寄与が、バックグラウンド信号の約１０％以下であるような一連の色素系を選択し、Ｂ）該色素系をランダムに微粒子内に取り込ませる：工程を含む方法で製造される、少なくとも１のアナライトを、該アナライトを含有することが予測される試料内から検出するための蛍光微粒子。
【請求項５３】
試料が生の血清、生の尿及び生の血漿からなる群から選択される、請求項５２記載の微粒子。
【請求項５４】
請求項１〜２２のいずれかに記載の粒子であって、Ａ）励起波長が、試料の吸収が入射光の約１０％以下であり、放射が試料の蛍光バックグラウンド信号に対して１０％以下となる領域であるよう選択された所望の励起ピークおよび放射ピークを有する、ハイブリッドフタロシアニン誘導体を選択し；Ｂ）該一連の色素を微粒子内にランダムに取り込ませる工程を含む方法で製造される、試料中の少なくとも１のアナライトを検出するための蛍光微粒子。
【請求項５５】
該試料が生の血清、生の尿および生の血漿からなる群から選択される、請求項５４記載の微粒子。
【請求項５６】
ハイブッドフタロシアニン誘導体が、シリコン［ジ（１，６−ジフェニルナフタロシアニン）］ジフタロシアニンビス（ジメチルヘキシルビニルシリルオキシド）である、請求項３５〜４４のいずれかに記載の微粒子。
【請求項５７】
ハイブッドフタロシアニン誘導体が、シリコン［ジ（１，６−ジフェニルナフタロシアニン）］テトラフルオロフタロシアニンフタロシアニンビス（ジメチルヘキシルビニルシリルオキシド））である、請求項３５〜４４のいずれかに記載の微粒子。
【請求項５８】
ハイブッドフタロシアニン誘導体が、シリコン［ジ（１，６−ジフェニルナフタロシアニン）］テトラフルオロフタロシアニンフタロシアニンビス（ジメチルペンタフルオロフェニルシリルオキシド））である、請求項３５〜４４のいずれかに記載の微粒子。
【請求項５９】
ハイブッドフタロシアニン誘導体が、シリコン［ジ（１，６−ジフェニルナフタロシアニン）］ジフタロシアニンビス（ジメチルペンタフルオロフェニルシリルオキシド））である、請求項３５〜４４のいずれかに記載の微粒子。
【請求項６０】
ハイブッドフタロシアニン誘導体が、シリコン［ジ（１，６−ジフェニルナフタロシアニン）］ジ（第３ブチル−フタロシアニン）ビス（ジメチルヘキシルビニルシリルオキシド））である、請求項３５〜４４のいずれかに記載の微粒子。
【発明の詳細な説明】
本発明は、１９９４年６月１２日に出願された米国特許出願第０８／２７４，５３５号の一部継続出願であり、１９９３年１０月１８日に出願された米国特許出願第０８／１３８，７０８号、１９９３年９月２４日に出願された米国特許出願第０８／１２６，３６７号に優先権主張をしている。上記全ての出願は、本明細書に参考として含まれる。
発明の分野
本発明は一般に、新規な色素と標識、および検出物の検索もしくは可視化に関する。さらに詳細には本発明は蛍光エネルギー伝達および分子内エネルギー伝達をイムノアッセイまたは核酸アッセイにおけるアナライトの検出のために利用すべく、蛍光色素を含有する蛍光ラテックス粒子を提供する。
発明の背景
細胞または細胞内の分子を可視化するため、および流体中のアナライトの濃度を測定するために様々な方法が使用される。蛍光顕微鏡を使用する場合には蛍光色素、一般には抗体のごとき特定のプローブに結合している蛍光色素を、細胞内のタンパク質および複合体の局在を調べるために用いる。アナライトの濃度の測定には最近４０年間で、抗体のアナライトもしくは標的リガンドに対する優れた特異性からイムノアッセイが一般的となっている。ラジオイムノアッセイは、放射線標識化したヌクライドのアナライトに対する高い特異的活性に基づいて開発され、これによって低濃度のアナライトの測定が可能となった。しかしながら、環境およびヒトの健康への影響が考慮され、イムノアッセイにおける放射性物質の使用は一般的ではなくなってきつつある。イムノアッセイの信号を増幅するために酵素を使用することは、酵素が環境またはヒトの健康に対して害を及ぼさない、もしくはその危険性が無いという点において、イムノアッセイの分野における重要な進歩であった。酵素を使用するイムノアッセイはしかしながら、酵素の活性が温度依存性であり、酵素もしくは基質の不安定性によって標的リガンドの定量が不正確となるという問題を抱えている。イムノアッセイにおいてその他の方法としては、酵素の存在下もしくは非存在下で、蛍光をアナライトの濃度の測定のための信号としてモニターすることが行われている。
生物流体内のアナライトの濃度を定量する際に、蛍光色素の性質は非常に重要である。例えば、生物流体が血液、血清もしくは血漿である場合、流体固有の蛍光により、多くの色素が使用できなくなる。生物流体を、２００ｎｍ以上の様々な波長において励起すると一般には６００ｎｍまでの蛍光放射を示す。蛍光は色素を適当な波長によって励起させることによって発光する。蛍光信号は、特定の波長で蛍光分子を励起させ、そして他の波長における蛍光の放射を測定するように調整された蛍光計測器を用いて測定する。励起波長と放射波長の相違は、ストークスシフト（Stokes shift）として認識される。最も感受性の高い測定を行うためには、試料の放射波長が色素の放射と干渉するものであってはならない。さらに、ストークスシフトを可能な限り大きくして、励起光がバックグラウンド信号として検出器に検出されることのないようにする必要がある。ストークスシフトが大きくない場合には、蛍光メーター内のフィルターもしくはモノクロメーターを、放射波長近辺の光を除くために使用してもよい；しかしながら、フィルターを使用すると、検出器へ届く光量が減少する。この光のロスという問題を回避する方法のひとつとして、一般的な高明度の光源を用いるという方法がある。小さなストークスシフトおよび生物流体の固有放射に近い値の放射を示す色素に関する問題を除くため、一般に精巧な装置が構築されている。病院における、患者近傍での診断の出現に伴い、診断に使用する装置はより小型化され、そしてより使用が簡単なものとする傾向がある。従って、生物試料中のアナライトを検出するイムノアッセイにおいて、蛍光の発光を評価し得る、小型で単純な蛍光計の開発が所望されている。
固有の蛍光を有する、流体中のアナライトのアッセイもしくは細胞成分の可視化において生じる他の問題は、標識として用いられる色素の選択である。色素は一般に、その明るさ（蛍光量子収量の生成および吸光係数）によって選択される、というのは、一定の感受性がアッセイもしくは可視化操作において必要とされるからである。しかしながら、試料が固有の蛍光を有する場合には装置が試料の蛍光を色素からの蛍光と区別できないおそれがあるため、標識として使用する色素の選択が制限される。
本発明は、特定の励起および放射波長に調整し得る増幅された蛍光標識系を開発する方法を提供する。さらに、本方法は色素を粒子中に取り込ませて、蛍光の消光を最小限に抑制し、粒子中の色素分子の蛍光強度を最大にする改良方法を提供する。本発明の新規な色素系は、流体内のアナライトの量、および特に生物流体内のアナライトの量を測定するのに有用である。本発明の新規色素系は、特定の励起および放射波長に調整することができ、これによって例えば光放射ダイオードおよびレーザーダイオードのごとき低電流の光源およびホトダイオードやその類似物のごとき検出器を用いた、例えば患者近傍での診断に供するイムノアッセイに用いるためのバッテリー電流で小型の蛍光計を作成し得る。
発明の概要
本発明は、新規な蛍光粒子に関する。この新規な粒子は、特定の励起および放射波長に調整して広く様々なアッセイまたは可視化系に用い得る。他の点において、本発明の提供する方法論は、色素分子の粒子内部における蛍光の消光を最小限にし、蛍光強度を最大限とするために、励起波長および放射波長が同じもしくは非常に近似している別個の色素分子を使用して色素を粒子内へ取り込ませる、改良方法をも開示する。
新規なフタロシアニン誘導体およびハイブリッドフタロシアニン誘導体を開示し、これらの化合物に関して特許を請求している。少なくとも１つのハイブリッドフタロシアニン誘導体を有する微粒子であって、該誘導体は（１）所望の励起ピークを有する少なくとも１つのドナーサブユニット；および（２）所望の放射ピークを有する少なくとも１つのアクセプターサブユニットを有しており、該誘導体は該ドナーサブユニットから該アクセプターサブユニットへの分子内エネルギー伝達を行うことができるという態様を開示する。かかる誘導体はまた、電子伝達サブユニットを含有していてもよい。軸性配位子がハイブリッドフタロシアニン誘導体に含有されている金属に共有結合していてもよい。分子内エネルギー伝達が可能である多くの化合物を、蛍光エネルギー伝達が可能である化合物と同様に特許請求の範囲としている。
図面の説明
図１はフタロシアニン、ナフタロシアニンおよびアントラニロシアニンの構造を示す。
図２はシリコンフタロシアニン、シリコンナフタロシアニンおよびシリコンアントラニロシアニンの構造を示す。
図３はシリコンフタロシアニンジヒドロキシドのスペクトル図および２，３−ナフタロシアニンジヒドロキシドのスペクトル図である。
図４はエテニル置換ジピロロメテンボロンジフルオロ色素の一般的構造の図である。
図５は波長増加に対するバックグラウンド信号の減少を示す図である。本データは本出願人が１９９２年５月２１日に出願した米国特許出願第０７／８８７，５２６号の「試薬の移動を膜無しで制御する診断装置」に記載の測定装置にて測定したものである。なお、該出願の全体は本明細書に参考として含まれる。
図６は近赤外に放射を示すナフタロシアニン誘導体である。
図７は蛍光エネルギー伝達ナフタロシアニン化合物の一般式を示す。
図８はヒト血清の２００ｎｍから１０００ｎｍの吸収スペクトルを示す。
図９は新規ハイブリッドフタロシアニン誘導体である、シリコン［ジ（１，６−ジフェニル−ナフタロシアニン）］ジフタロ−シアニンビス（ジメチルヘキシルビニルシリルオキシド）を示す。
詳細な説明
本発明は新規蛍光粒子および新規蛍光分子およびこれらを用いた診断方法を提供する。蛍光色素を利用した細胞成分もしくは細胞の可視化、または蛍光色素を用いるアッセイおよび試料中のアナライトを定量するアッセイの開発には蛍光計の使用が必要である。蛍光標識、試料および装置は、正確な測定のためにお互いに許容性であることが必要である。試料および装置に応じた、蛍光標識をするためのいくつかの基準を以下に示す。第１に、色素の吸収もしくは励起および放射波長は、標本または試料に一致してはいけない。第２に、色素のストークスのシフトは励起波長からのバックグラウンド値を最小にするために、可能な限り大きくすべきである。第３に、色素は可視化させる相またはアッセイの流体相と相溶性でなくてはならない；すなわち、色素は可視化もしくはアッセイ条件に応じて水溶性または水不溶性であるべきである。第４に、色素は所望の感受性を達成するために必要な明るさを有すべきである。明るさは色素の吸光係数および蛍光量子収量により決まる。第５に、蛍光信号を検出するための装置は一般に、色素の特異性および可視化もしくはアッセイしようとする標本もしくは試料の特異性に合わせてデザインする。
これらの点をより詳しく説明し、さらに蛍光可視化手法または蛍光色素を用いたアッセイ法を開発する際の問題点にも言及する。一つは、色素としてはすでに合成されているか、または上記基準に合致させるために合成したものに限定されることである。当業者は、広い範囲の励起および放射波長を有する色素分子のデザインおよび合成が非常に長期間かかり、一般には非常に限定された範囲の励起および放射波長のみを目的とした分子のデザインがされていることを認識するであろう。本発明の開示するところは、多くの励起および放射波長に調整し得、大きなストークスシフトを得ることのできる蛍光標識を製造することを可能にするものである。すなわち、色素に対応する装置をデザインするのではなく、色素系を試料もしくは標本および装置の特性にあわせてデザインすることが可能である。色素系を試料および装置の特性に適応させるように調整することにより、可視化操作またはアッセイの成功の機会が多いに増やされる。
色素の励起および放射波長はアッセイもしくは可視化しようとする試料と一致すべきではない、というのは一致させれば試料が蛍光信号の測定を干渉するからである。試料の吸収または放射波長が色素と同じであれば、実際には、例えば血清または血液試料を希釈して試料による干渉を減少させるか、または干渉している試料を検出領域から洗浄、排除することになる。実際、現在の市場には、生の生物流体内のアナライトの測定、特に生の血液または血清の測定を行う蛍光アッセイ系は販売されていない。生の試料内のアナライトを検出するための蛍光アッセイ系が無い理由は、上記に述べた全ての問題を解決する色素が、特に生物試料の蛍光測定法においては無いことによるものである。励起波長において、試料が有意な吸収をする場合、試料を励起する光量は、試料の性質の相違によって影響を受ける。例えば、異なる個人から血清、血漿または血液試料を採取した場合、各試料は励起光に対する比吸収が異なり、この相違は蛍光標識を励起するのに用いた励起光の強度の相違へと翻訳される。色素の蛍光放射は、直接入射光の強度に比例し、試料が入射光の一部を吸収する場合には、蛍光信号はそれによって変化する。これによって、不正確なもしくは影響を受けた蛍光放射を測定するという結果となる。さらに、色素の放射波長は試料の放射もしくは吸収と一致してはいけない、というのは、試料が色素の蛍光によって測定される蛍光を増加させ、そしてその結果、不正確もしくは影響を受けた蛍光放射が得られることになるからである。これらの問題は、試料が励起および放射波長に対して不可視である場合には除くことができる。
図８には２００ｎｍから１０００ｎｍのヒト血清のスペクトラムを示す。６００ｎｍ以上の波長の吸収は２００ｎｍから６００ｎｍの間の吸収よりかなり少ない。従って、入射光の吸収および色素の蛍光に及ぼす影響は６００ｎｍ以上で励起すれば減少できる。尿、血液、血清もしくは血漿を含む生物流体に対して好ましい励起波長は６００ｎｍまたはそれ以上である、特に好ましい６００ｎｍ以上の励起波長は、レーザーダイオードおよび光放射ダイオードの最高放射波長に一致する。好ましい放射波長は６００ｎｍ以上から選択する。試料固有の蛍光は色素および試料の放射波長が重複する場合に高いバックグラウンド信号となり得る。加えて、励起源の散乱光もまた、バックグラウンド信号となり得る。散乱光のバックグラウンドに対する寄与は、例えば図５から認められる。一般に、散乱の大きさは測定された波長の４乗に対する逆関数となる。このことは、所望の放射波長はスペクトルの近赤外または赤外領域にあることを意味する。本明細書では６００ｎｍ以上の波長で励起し、６５０ｎｍ以上の放射および、より好ましくは７３０ｎｍ以上で放射する色素および色素系を開示する。
励起源からのバックグラウンド値を最小にして、感度の限界におけるバックグラウンドに対する信号の割合が最大となるべく、色素のストークスシフトは可能な限り大きくすべきである。大きなストークスシフトはしかしながら、蛍光の測定効率を最大とするだけで、常に蛍光測定の正確さに結び付くわけではない。例えば、表３は４２０ｎｍから６７０ｎｍの波長で励起された、バッファー中または希釈していないヒト血清中におけるいくつかの色素系のデータを示す。血清中の第１の色素系を４７５ｎｍで励起した場合の蛍光強度（表１、１行）は、ストークスシフトが２０５ｎｍであってもバッファー中の色素の場合のたった７．６％である。４２０ｎｍで励起した第２の色素系（表１、４行）は、ストークスシフトが２６０ｎｍで、バッファー中の場合の２８％である。第３および第４の色素系（表１、６０行および５９行）は、６７０ｎｍと６５０ｎｍで励起した場合に、それぞれ１１０ｎｍと１３０ｎｍのストークスシフトを示し、蛍光強度はバッファー内および血清内においてほぼ同等であった。第５の色素系は、ハイブリッドフタロシアニン誘導体であり（表１、１行）、６４６ｎｍで励起した場合に、ストークスシフトが１１４ｎｍで、バッファー内と血清内ではほぼ同等の蛍光強度を示した。励起波長が測定を行った試料の吸収範囲である場合に、蛍光強度が大きな影響を受けることをデータは示している。データはまた、ストークスシフトが測定の正確さには影響を及ぼさないことも示している。これらのデータは、試料の吸収のある範囲内の波長で励起される他の色素および色素系にもあてはまる。減少した蛍光放射の効果は放射光の波長（すなわち、６８０ｎｍまたは７８０ｎｍ）によるものではない、というのは、血清およびバッファー溶液の６８０ｎｍおよび７８０ｎｍにおける吸収が最小であるからである。当業者は、本明細書に記載した発明の開示、すなわち、色素系の励起および放射のための波長は、大きなストークスシフトを有する色素系を選択するだけより、試料の吸収および放射の性質に拘わるものであるということを認識するであろう。１００ｎｍ以上のストークスシフトを示す色素の入手可能性は限られており、特に励起波長が６００ｎｍ以上のものの入手は非常に困難である。大きなストークスシフトを示すほとんどの色素が水不溶性であるため、色素の水性試料への溶解性がさらに入手可能な色素であってもその利用性が問題となる。
小さなストークスシフトを有する色素の問題は、モノクロメーターまたは、励起源からの光を透過させる高価な光学製品を用いることによる蛍光メーターの機械的な操作により通常、克服し得る。しかしながら、フィルターに起因する光の強度の減少に対応するために、例えばより強力な光源の使用が必要となる。光源は熱を発生し、これは熱溝もしくは熱ファン等の装置を使用して消散させる必要がある。光学的および機械的観点からの蛍光測定装置の複雑さは、色素系の不十分さに大きな影響を及ぼす。病院および救急分野における患者近傍での試験の出現によって、イムノアッセイにおける蛍光を測定する装置はより小型で、そして技術者に対してより難しくないものにする必要がある。すなわち、例えばイムノアッセイに用いられる蛍光メーターを製造する業界では、将来的にはさらに単純で小型の装置が必要とされるのである。高出力光源および高価な光学製品が現在は蛍光メーターに搭載されているが、これは小さく、小型な装置という要求にはそぐわない。本発明は、大きなストークスシフトを有し、両方の波長が励起源および放射検出器の両方に適合するように調整されている色素であって、試料、例えば血液、血清、血漿、尿、地下水およびこれらの類似物の吸収および放射波長と共存し得る色素を開示する。新規蛍光粒子の励起および放射波長は一般に、お互いにそれぞれ独立して変化させ得る。
色素はアッセイの流体相と相溶性でなくてはならない、または換言すれば、色素は可視化操作もしくはアッセイの方法に応じて水溶性または水不溶性でなくてはならない。多くの蛍光色素は水不溶性であるかまたはほとんど水に溶けない。従ってこれらの色素は分子、タンパク質、核酸または細胞の標識には不向きである。当業者は、水不溶性色素がラテックス粒子の中へ導入し得ることを、米国特許第４，３２６，００８号、第４，６０９，６８９号および第５，１５４，８８７号の記載から認識するであろう。これらの特許は本明細書に参考として含有する。即ち水不溶性色素をラテックス粒子の内部に取り込ませることによって、様々なアッセイ方法における可視化用ラテックスとして有用とすることができる。
色素は、所望の感受性を得るのに必要な程度に明るいことが必要である。色素の励起係数と蛍光量子収量、および測定する標的の濃度がわかれば、色素が所望の感受性を達するのに十分明るいか否かを判断することができる。ラテックス粒子内への色素の取り込みまたは蛍光基質の産生を触媒する酵素の利用は、当業者が増幅系として用いる技術の例である。
蛍光信号を検出するために用いられる装置は一般に、色素および可視化またはアッセイしようとする標本もしくは試料の特性に応じてデザインされる、というのは限られた数の色素しか良好な使用ができないからである。上記のように、装置の構成成分は特定の色素系に応じて選択される、というのは、有用な装置は励起源からの光を除くように高度に調節されている必要があるからである。
上記に記載した各条件を共に考慮すると、ピコモル以下の濃度の試料の分析、特に生物流体試料の分析に用い得る色素系の開発の幅が非常に狭まることがわかる。蛍光を測定する装置のデザイン上の制約からも、かかる制限は発生する。本発明の開示する新しい事項によれば、一般的にはほとんどすべての装置のデザインに適合する色素系をデザイン、合成および調節することができる。
本発明の開示する事項のうちのいくつかは、色素の励起および放射波長を、この励起および放射が、蛍光を測定する試料のマトリックスに対して許容性であるように、および蛍光を定量する装置に対して許容性であるように調節するための方法に関することである。ひとつの開示は、対となって蛍光エネルギーの伝達が生じる少なくとも２種類の色素を粒子内部もしくは粒子表面上へ取り込みまたは吸収のいずれかをさせることである。使用し得る粒子は、粒子の表面もしくは内部に色素を吸収したものである。他の開示は、お互いに共有結合しており、溶液内および粒子内の両方において蛍光エネルギー伝達を生じる色素を取り込ませることである。その他の開示はハイブリッドフタロシアニン類、ハイブリッドナフタロシアニン類、ハイブリッドアントラニロシアニン類およびこれらのクラスの化合物の誘導体を取り込ませることである。
粒子内に取り込ませるための色素対の選択は、ドナー色素の適当な励起波長におけるエネルギー伝達を示す能力（シングレット−シングレットエネルギー伝達）およびアクセプター色素の放射波長に基づいて行う。２つの分子の蛍光エネルギー伝達は、当業者には良く知られており、エネルギー伝達の速度はフォースターによってアン・フィジック（Ann. Physik.）（１９８４）２、５５−７５に報告されている。蛍光エネルギー伝達は、タンパク質、ＲＮＡおよびペプチド内でのおよその関係を知るための分光学上の基準として用いられ（アニュアル・レビュー・オブ・バイオケミストリー（１９７８）、４７、８１９−８４６）、その他粒子内の幾何学的な詳細を探索するのにも用いられる（フィジカル・レビュー・レターズ（１９８８）６１、６４１−６４４）。米国特許第５，３２６，６９２号は、制御可能な強化されたストークスシフトを有する蛍光粒子を開示する。米国特許第４，５４２，１０４号および第４，６６６，８６２号は、フィコビリタンパク質（phycobiliproteins）内の蛍光エネルギー伝達を開示する。これらの色素複合体はイムノアッセイにおける標識として使用するよう、開示されている；しかしながら、フィコビリタンパク質の制限された利用性および天然タンパク質複合体が高価であるため、これらのタンパク質は商業的規模で利用するのに好ましいとは言えない。非対称またはハイブリッドフタロシアニン類は例えば、ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサエティー１９９０、１１２、９６４０−９６４１；ケミストリー・レターズ１９９２、２０３１−２０３４およびインオーガニック・ケミストリー１９９４、３３、１３７５−１７４０に記載されているがしかし、本発明は好ましい蛍光強度を達成し、所望の励起および放射性質を有する、免疫診断において用いるために合成される強力な化合物を開示する。本発明はさらに、様々なジイミノイソインジリンまたはジカルボニトリルの前駆体の比率およびハイブリッドのフタロシアニン類、ナフタロシアニン類およびアントラニロシアニン類を合成する際における該前駆体の電子供与性基もしくは電子吸引性基による置換の比率が、化合物の吸収スペクトルおよび励起および放射波長に影響を及ぼすことを開示する。
ある点から言えば、本発明の粒子はその内部もしくは外部上にエネルギー交換距離にて存在する少なくとも２種の色素を有する新規な蛍光粒子である。当業者は、ラテックス、シリカ、アルミナ、リポソーム類、様々なコロイドおよびこれらの類似物等の様々な粒子が本発明に利用し得ることを認識するであろう。特に好ましい粒子はラテックス粒子である。粒子中に取り込ませるための色素分子の選択は、使用する粒子、分析しようとする試料および蛍光を測定する装置によって定まる。例えば、血清や細胞抽出物のごとき生物媒体中のアナライトを測定するアッセイを開発する際には、試料の固有の吸収および蛍光を考慮しなくてはならない。血清および細胞構成成分の吸収は、６００ｎｍ周辺までの可視スペクトル内と同様、紫外線スペクトルにも存在し、固有の蛍光は大まかには６００ｎｍ近くである。さらに、小さな粒子、例えば地下水中の土粒子、血清もしくは血液中のリポタンパク質、細胞および細胞の粒子と構成成分、を含有する試料では励起光が散乱され、その結果、より高いバックグラウンド値が生ずることとなる。理想的な色素の組は、６００ｎｍ以上で励起されもしくは吸収し、そしてアクセプター色素が吸収する波長を放射するドナー色素と、６００ｎｍ以上の波長で放射するアクセプター色素からなる。単一の色素系でも、例えばハイブリッドフタロシアニン誘導体を使用した場合は励起および放射波長は両方、６００ｎｍ以上であるべきである。例えば血清である試料は、このようにすればアクセプター色素の蛍光に影響を及ぼさなくなる、というのは、試料はドナー色素の吸収領域においてほとんど吸収を示さず、そしてアクセプター色素が試料が蛍光を有さない領域の波長にて放射するからである。
粒子の内部もしくは外部に取り込まれた蛍光色素分子は、各色素がお互いに非常に近接しており、および粒子のマトリックスに対しても非常に近接しているため、蛍光消光を示す。粒子の内部および外部に色素を取り込ませる際に、色素の濃度は消光を考慮に入れて定めるべきである。複数の色素は、連続的にあるいは同時に取り込ませればよい。消光の程度は、バッファー溶液、緩衝タンパク質溶液または水中に希釈（約０．００１から０．１％の固形量）した粒子懸濁液の蛍光放射を測定し、その後色素を遊離させる溶剤にて上記と同濃度となるように粒子を溶解した溶液の蛍光を測定して、定量する。蛍光強度の比率（１−［取り込まれた色素の蛍光強度／遊離された色素の蛍光強度］）は、粒子内における消光の程度を示すものである。実際には、様々な濃度で色素を取り込ませ、取り込まれた色素およびこれから遊離された色素の蛍光強度を測定して粒子の蛍光強度を最適化し、一方で粒子内の蛍光の消光を最小にする。１以上のアクセプター色素を蛍光消光を最小にし、蛍光強度を最大にするために使用する状況下においては、お互いの放射ピークが約１０ｎｍの範囲内にある別個のアクセプター色素を選べばよい。他の考慮すべき重要な点は、蛍光エネルギー伝達の効率である。実際には、エネルギー伝達効率は１００％に近いものではなく、エネルギー伝達の後にもドナー色素の蛍光が観察される。この結果放射されるドナー色素からの蛍光は、粒子の「有効ストークスシフト（effective Stokes shift）（すなわち、蛍光系における、規定されたアクセプター分子の放射波長と光源波長の波長の相違の最小値）」がドナーとアクセプター色素の、それぞれ励起波長と放射波長の相違ではなく、ドナーの放射波長とアクセプターの放射波長の間の相違となってしまう。効果的なエネルギー伝達が得られず、蛍光メーターにて使用するフィルターの選択が困難な場合にはドナーとアクセプターの放射波長は、お互いに部分的に重複していても良い。エネルギー伝達効率の減少はまた、直接アクセプター色素の放射の減少につながり、粒子が効果的なエネルギー伝達を有する粒子ほどには明るくない粒子となる。さらに、非効果的エネルギー伝達条件下においては、試料または溶液の条件、例えばpＨ、イオン強度および類似の条件のわずかな変化が、エネルギー伝達効率の強度に影響を及ぼし、このため蛍光信号の強度が影響を受ける。
蛍光エネルギー伝達のための色素の対を選択するにあたって、ドナーの放射波長およびアクセプターの励起波長の重複を研究する。各色素は粒子内においてお互いエネルギー交換距離に保持してシングレット−シングレットエネルギー伝達が可能なようにする。受入れ可能な励起および放射波長の重複を示す色素の特定の組（例えば、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユーエスエー１９６９、６３、２３〜３０参照）であっても、これらが粒子内で蛍光エネルギー伝達を示さず、または最適以下（８０％未満）のエネルギー伝達効率しか有さないものかもしれない。２またはそれ以上の色素が効果的なエネルギー伝達を示すかどうかは、適当なスペクトルの重複基準が満たされた後に実験によって判断する。蛍光エネルギー伝達の効率は、ドナー色素単独の粒子の蛍光強度を測定し、さらに２またはそれ以上の色素を取り込んだ粒子（すなわち、蛍光エネルギー伝達粒子である）の、ドナー色素の放射波長における蛍光放射を測定して評価するが、その際、両方の粒子は同じドナー色素および粒子の濃度が等しくなるようにする。ドナー色素放射波長において測定されたエネルギー伝達粒子からの蛍光を、ドナー粒子からの蛍光で除したものが蛍光エネルギー伝達の効率である。有効ストークスシフトがドナー色素の放射により減少されぬよう、理想的には該粒子のドナー色素からの放射は検出不可能であるかまたはほとんど検出できないものであるべきである。好ましい蛍光エネルギー伝達効率は８０％またはそれ以上であり、特に好ましい蛍光エネルギー伝達効率は９０％またはそれ以上である。
本発明は消光が減少し、蛍光強度が改善された粒子を提供する。蛍光分子の大部分は芳香族性を有する。すなわち４ｎ＋２ｐｉ電子を有する。芳香族性に起因して分子の積層、特に水溶液中の水不溶性分子もしくは水溶液中の粒子内の分子の積層が促進され、これによって蛍光消光が促進される。本発明に記載した新規蛍光粒子は、色素分子の立体的干渉によって、最小となった粒子内積層を有する。他の観点からすれば、本発明では色素分子の蛍光消光を、ほぼ同じ励起波長および放射波長を有する別個の色素を用いることによって最小とする。すなわち、別個の色素の最大励起および／または放射の波長はお互いに約１０ｎｍの範囲内にあり、このため、実質的にこれらのピークが重なる。当業者は、様々な色素系の励起および放射スペクトルの幅を変えることができることを認識するであろう。別個の色素は基本的に、同一色素の場合のように同じ角度に組織された方向に互いに積層されることはない。この積層原理の類型としては、不純物によって純粋化合物の融点が下落することが挙げられる。固形化合物に不純物が含まれるとその不純物が純粋化合物の結晶構造を破壊することによって、融点が下がることは、物理化学者には良く知られていることである。色素を粒子の内部もしくは表面上に有機溶媒用いて取り込ませ、その後に溶媒を飛ばして色素を粒子内に析出もしくは結晶化させる。粒子中の色素分子の結晶格子の崩壊によって分子の積層が変化し、これによって消光が減少する。こうして、同じ励起および放射スペクトルを有する、同一でない色素分子が分子間の消光相互作用を減少して粒子の蛍光強度を改善するのである。
他の観点からは、本発明において粒子内で蛍光エネルギー伝達を示す別個の色素を粒子に取り込ませることは、他の結晶格子の形成をも崩壊させる。すなわち、蛍光エネルギー伝達を示す粒子の蛍光強度は、同一色素の積層が、同一でない色素により崩壊させられることによる粒子内の消光の減少によって増強される。
本発明のさらに他の観点においては、フタロシアニン誘導体および、軸性配位子を有するハイブリッドフタロシアニン誘導体の合成が、芳香族環系の積層を減少し、分子間の相互作用を最小として、蛍光強度を最大にすることを示す。
当業者は、蛍光エネルギー伝達を示す１以上の色素の対を粒子内部もしくは表面に取り込ませると、様々な波長において蛍光を発する粒子が得られることを認識するであろう。さらに、本発明の教示によれば、吸収体であるドナーから中間体ドナーへ、そしてアクセプター（これが蛍光を発する）へのエネルギー伝達カスケードを生じる３またはそれ以上の色素を同時に粒子内に取り込ませると、非常に長いストークスシフトの生成物が得られ、励起および放射の性質の多様性においてほぼ限りない粒子を得ることが可能となることを認識するであろう。
図１はフタロシアニン類、ナフタロシアニン類およびアントラニロシアニン類誘導体である好ましいアクセプター色素を示す。図２は特に好ましいアクセプター色素である、シリコンフタロシアニン類、ナフタロシアニン類およびアントラニロシアニン類の誘導体を示し、式中のＲは水素または０〜２０のヘテロ原子（Ｎ，Ｏ，Ｓ）を有し、０または１のシロキシド基を有する１〜２０炭素原子の飽和もしくは未飽和アルキル炭素鎖を示す。最も好ましい化合物の態様は、Ｒが
Ｓｉ(ＣＨ3)2Ｃ6Ｆ5
Ｓｉ(Ｃ6Ｈ13)3
Ｓｉ(ＣＨ3)2(ＣＨ2)3ＣＮ
Ｓｉ(ＣＨ3)2(ＣＨ2)10ＣＯＯＣＨ3
Ｓｉ(ＣＨ3)2ＣＨ＝ＣＨ2
Ｓｉ(ＣＨ3)2(ＣＨ2)10ＣＯＯＨ
Ｓｉ(ＣＨ3)2(ＣＨ2)4Ｃｌ、および
Ｓｉ(ＣＨ3)2(ＣＨ2)6ＣＨ＝ＣＨ2
であるものである。フタロシアニン類およびナフタロシアニン類の親化合物は、ラテックス粒子内におけるその放射波長がそれぞれ６８０ｎｍおよび７８０ｎｍであることから好ましい。好ましい親化合物としては、８５０から９００ｎｍ付近の放射を示すアントラニロシアニン類もある。これらの親化合物の３つの種類は総合して「フタロシアニン誘導体」と呼ばれ、金属を含有していてもしていなくてもよく、そして軸性配位子を有していてもいなくてもよい。フタロシアニン誘導体の放射波長は特に生物試料中の蛍光を定量する際に、そしてバックグラウンドの散乱光強度を最小とする際に有用である。当業者は例えばフェニル、ナフチルまたはアントラニル環に様々な置換基を付した別個の分子ではあるがフタロシアニン類の誘導体である化合物を合成し得、これがさらに本発明の範囲内であることを認識するであろう。テトラアザポルフィンの誘導体もまた、本発明の誘導体の範囲内である。芳香族骨格を誘導体とすると、励起もしくは放射波長が赤または青側にシフトする。フタロシアニン誘導体色素を励起させるためのドナー色素の選択は、フタロシアニン誘導体の適当な範囲の吸収波長に対応する放射波長をドナー色素が有するようにして行う。図３はシリコンジヒドロキシフタロシアニンおよびシリコンジヒドロキシナフタロシアニンのジメチルホルムアミド溶液の、吸収スペクトルを示す。これらのアクセプター色素が、ドナー色素によって強く励起される範囲はそれぞれ、およそ５５０ｎｍと６７０ｎｍおよび６００ｎｍと７６０ｎｍの間である。当業者は、多くの色素がドナー色素の候補となり得ることを認識するであろう、というのは、アクセプター色素を励起させ得るのに有用な波長範囲が広いのためである。アクセプターの選択は上記に概略を示した基準に基づいて行わなくてはならない。いくつかの実施例はこの新規なアプローチの可転性を説明するものである。装置を構築すると仮定すると、最大強度が４８０ｎｍである励起源と、６００から７００ｎｍの間で良好な量子効率を示す検出器を有するものとなる。ドナー色素は従って、４８０ｎｍにて励起され、さらにフタロシアニン誘導体が６８０ｎｍの放射に対するアクセプター色素であると仮定すればドナーは５５０から６７０ｎｍの放射を示さなくてはならない。
本発明において好ましい色素の種類は、スチリル、フェニルブタジエニルおよびフェニルヘキサトリエニル色素である。スチリル色素は、以下の構造を有する：
0003773949.tif 000002
フェニルブタジエニル色素は、以下の構造を有する：
0003773949.tif 000003
フェニルヘキサトリエニル色素は以下の構造を有する：
0003773949.tif 000004
（式中Ｒ1、Ｒ2およびＲ3は同一でも異なっていてもよく、Ｒ1、Ｒ2およびＲ3は水素または０から１０のヘテロ原子を有する、飽和もしくは未飽和の１〜２０炭素原子のアルキル炭素鎖を示す。）
一般的に、これらの種類の色素は、およそ約４７０と５３０ｎｍの間の励起波長と、およそ６００から７８０ｎｍの間の放射波長を有する（リチャード・ピー・ホーグランド著、モレキュラー・プローブス・ハンドブック・オブ・フルオレセント・プローブス・アンド・リサーチ・ケミカルズ  １９９２−１９９４、第１５６頁参照）。特に好ましいスチリル色素は、トランス−４−［４−ジブチルアミノ）スチリル］−１−メチルピリジニウムヨーダイド（アルドリッヒ・ケミカル社）であり、これはジメチルホルムアミド溶液とした際に４８６ｎｍにおいて最大吸収を示し、そして放射が６００ｎｍである化合物である。当業者は、これらの種類の色素のアニリン窒素およびピリジン窒素以外の置換基は、水不溶性を維持するために疎水性基であることが必要であることを認識するであろう。
本発明の新たな技術の他の適応においては、装置は最大強度が４２０ｎｍである光源と上記例にて述べた検出器を有するよう組み立てる。色素系にはフタロシアニンアクセプターを含有してもよい；しかしながら、異なったドナーを選択すべきである。本適用において好ましいドナーは、メソ−テトラ−２−アミノフェニルポルフィン（ポリフィリン・プロダクツ・インコーポレイテッド、米国ユタ州ローガン）である。この化合物のジメチルスルホキシド溶液は、励起波長４１８ｎｍに対して最大吸収を有し、６５５ｎｍ付近で放射を示す。このポルフィリンはラテックス粒子中のフタロシアニン誘導体を励起させ、そしてこの色素系は６８０ｎｍを放射する。
他の特に好ましい適用は、イムノアッセイを生の血液もしくは血清または様々な生物試料内で行えるようにする装置系を構築することである。励起源としては最大強度が６５０ｎｍ付近であるＬＥＤまたはレーザーダイオードを使用して、血液または血清試料による光の吸収を排除する。検出器は７００から８００ｎｍの間で良好な量子効率を有しており、従って好ましいアクセプター色素は約７８０ｎｍの放射波長を有するナフタロシアニン誘導体である。この放射波長は血液もしくは血清または生物試料中には通常は認められない。ナフタロシアニンアクセプターに対するドナー色素は光源と一致するよう６５０ｎｍ付近で吸収し、およそ６６０ｎｍから７６０ｎｍの間で放射するべきである。このドナーとして適用するのに好ましい色素は、カルボシアニン色素およびエテニル置換ジピロロメテンボロンジフルオロ色素の種類であり、これらは米国特許第５，１８７，２８８号、５，２４８，７８２号および５，２７４，１１３号に記載されている。
生の血液または血清を用いるイムノアッセイに対して、さらに他の特に好ましい適用は、励起源が７９０ｎｍ近辺であり、放射波長が９００ｎｍ近辺とする条件である。単一色素系に好ましい色素はシリコン１、６−オクタエトキシナフタロシアニンビス（ジメチルヘキシルビニルシリルオキシド）であり、これは７９０ｎｍにて励起され約９００ｎｍにて放射する。
ナフタロシアニン色素およびナフタロシアニン誘導体色素に対するドナー色素として好適に用いられる色素はカルボシアニン類およびエテニル−置換ジピロロメテンボロンジフルオロ色素である。これらは米国特許第５，１８７，２８８号、第５，２４８，７８２号および５，２７４，１１３号に記載されているように、７９０ｎｍまでの励起波長および６７０ｎｍから８００ｎｍまでの放出波長を有する。
好ましいカルボシアニン色素は一般に５００ｎｍから７５０ｎｍで励起され（モレキュラー・プローブス・ハンドブック参照）、以下の一般式で表わされる化合物である：
0003773949.tif 000005
（式中、ｎは１もしくは２；または３である；式中、Ｒ1とＲ2はＳ、ＮまたはＯである；そして式中Ｒ3はＨまたは、飽和もしくは不飽和であって０〜１０のヘテロ原子（Ｎ、Ｏ、Ｓ）を有する、１〜２０炭素のアルキル炭素鎖である。）
その他の好ましいカルボシアニン色素は、以下の一般式で表される化合物である：
0003773949.tif 000006
（式中、ｎは１もしくは２、または３である、Ｒ1〜Ｒ6はＨまたは、飽和もしくは不飽和であって０〜１０のヘテロ原子（Ｎ、Ｏ、Ｓ）を有する、１〜２０炭素のアルキル炭素鎖である。）
好ましいドナー色素としては、エテニル置換ジピロロメテンボロンジフルオロ色素も挙げられ、これは一般に５００ｎｍ以上（モレキュラー・プローブス・ハンドブック参照）で励起され、図４に示した一般式を有するが、式中のＲ1〜Ｒ7は米国特許第５，１８７，２８８号、第５，２４８，７８２号および第５，２７４，１１３号に記載されている置換基を含む。
特に好ましいドナー色素は１，１−ジヘキシル−３，３，３’，３’−テトラメチルインドジカルボシアニンヨーダイドおよび（Ｅ，Ｅ）−３，５−ビス−（４−フェニル−１，３−ブタジエニル）−４，４−ジフルオロ−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアゾ−５−インダセン（モレキュラー・プローブス・インコーポレイテッド、アメリカ合衆国オレゴン州ユージーン、より購入）であり、これらのジメチルホルムアミド溶液は、最大吸収がそれぞれ６４２ｎｍ、６４５ｎｍおよび６５０ｎｍであって、最大放射が６７５ｎｍ、６６５ｎｍおよび６７０ｎｍである。これらの特に好ましい色素とナフタロシアニン誘導体を取り込んでいる粒子は、６５０ｎｍの光源で励起され、そしておよそ７８０ｎｍから８７０ｎｍで放射する。当業者はいずれの色素の励起および放射スペクトルも正規分布を示し、このため強い蛍光を得るために励起源はドナー色素の最大励起波長に正確に一致する必要が無いことを認識するであろう。同様に、有効エネルギー伝達に到達するためにドナーの放射波長もアクセプター色素の最大励起波長と正確に一致する必要は無い。当業者はカルボシアニン類の１および３位における置換基およびジピロロメテンボロンジフルオロ色素のＲ1およびＲ7位の置換基、および環状構造の間の結合は変化させ得、この変化させた化合物もまた粒子の蛍光スペクトルを調節するのに有用であることを認識するであろう。
約８００ｎｍから１０００ｎｍまでの放射波長もまた、蛍光粒子には好ましい。この近赤外領域では光源の散乱光成分が実質的に減少して蛍光測定のバックグラウンド値が下がるからである。加えて、生物試料は８００ｎｍから１０００ｎｍの間では実質的に吸収も発光もしない。試料中の特定の物質、例えば血清中のリポタンパク質、地下水中の粒子、生物試料中の細胞残渣および類似物は、散乱光を増加させてバックグラウンド値を増加させるが、散乱光の測定は８００ｎｍから１０００ｎｍの範囲において最小となる。例えば、図５は許可された出願である米国特許願第０７／８８７，５２６号（この出願の内容は参考として本明細書に含まれる）に記載された、生のヒト血清を含有するまたはしないイムノアッセイ装置内において、測定された光の波長が７３０ｎｍから９００ｎｍへ増加するにつれてバックグラウンドの減衰を示す図である。この図は、光源が１ミリワット（ｍＷ）の６７０ｎｍレーザーダイオードである場合に、９００ｎｍで測定した場合を７９０ｎｍでの測定と比べるとバックグラウンド信号が５倍も減少していたことを示す。さらに、生の血清の６７０ｎｍにおける励起では７３０ｎｍから９００ｎｍの間に有意に測定可能な蛍光は認められなかった。したがって、例えば９００ｎｍ付近で放射する色素の蛍光を測定する際の、信号のバックグラウンドに対する比率は、７９０ｎｍ付近で放射する色素と比較すると５倍改善されるのである。７８０ｎｍで放射を測定した場合の信号のバックグラウンドに対する比は、７３０ｎｍで測定した場合の３０倍改善される（図５参照）。信号の対バックグラウンド比を最大にすることは、分析化学の分野では一般的に要求されることである、というのは測定の感度が改善されるからである。好ましい色素は、例えばジャーナル・オブ・ケミカル・ソサエティー・パーキン・トランスレーション１、（１９８８）、２４５３−２４５８に記載されている、７８０ｎｍ以上で放射する化合物であり、ナフタロシアニンおよびアントラニロシアニン類の誘導体（図１）を含み、およびナフタロシアニン類は図６に記載した一般式（式中、ＭはＳｉ、Ｇｅ、Ａｌ、Ｓｎ、Ｔｉのごとき金属であり、Ｒは軸性配位子、シリコンを有するまたは有さないアルキルまたはアリール基（好ましい軸性部分はアルキルまたはアリールシリルクロライドから合成される）、およびＸは同一でも異なっていてもよい電子供与性基であってアミノ、ヒドロキシル、アルコキシ、アリールオキシ、フェニル、アルキルおよびこれらの類似物を含む。１または複数のＸ基の電子供与性が放射波長を、通常のナフタロシアニン化合物より赤方向へシフトさせるのである（図１）。例えば実施例２６、２７および２８に記載した化合物は放射波長が８５０ｎｍ付近の色素の例である。これらの好ましい色素は、７８０ｎｍにて放射する色素と比較して改善された、信号の対バックグラウンド比を有する（図５参照）。ハロゲン、ニトロ、シアノ、スルフェート、カルボニルおよびカルボキシアルキルおよびこれらの類似物のごとき、励起もしくは放射波長の青方向へのシフトを生じる電子吸引性基もまたＸ基として用い得る。この種類の近赤外放射色素に対して好ましいドナー色素は、アクセプター色素の吸収性に対応する放射波長を有するものである。この態様に好ましい色素は、米国特許第５，１８７，２８８号、第５，２４８，７８２号および第５，２７４，１１３号に記載のエテニル置換ジピロロメテンボロンジフルオライド色素である。
ラテックス粒子中の、ドナーのアクセプターに対する好ましいモル比は約２０：１から約１：２０の間であり、より好ましくは約１：１から約６：１の間である。所望の蛍光強度は、ドナー色素とアクセプター色素をさまざまな比率で、様々な色素濃度にて粒子内に取り込ませ、粒子の蛍光放出を測定する実験を通して得なくてはならない。
ドナー色素とアクセプター色素の幾何学的な方向は、これらの間のエネルギー伝達に影響を及ぼすであろう。ドナー色素およびアクセプター色素は、溶液中で効率的な蛍光エネルギー伝達（ＦＥＴ）を示す最適な結合構造の化合物であるように合成し得る。最適化されたＦＥＴ化合物はその後、粒子内に取り込ませてもよい。フタロシアニン誘導体類をこの態様においてアクセプター部分として用いることができ、フタロシアニン誘導体は電子供与性または電子吸引性基（上述）にて置換して、所望の励起および放射波長を与えるようにしてもよい。例えば、この態様に好ましいナフタロシアニン化合物は図７に記載したものである（式中、Ｘは水素またはアミノ、ヒドロキシル、アルコキシ、アリールオキシ、フェニル、アルキルおよびこれらの類似物である電子供与基であり、Ｄはナフタロシアニン誘導体と、ドナーとアクセプター間のエネルギー伝達が可能な距離で共有結合しているドナー色素である。本発明の教示することから、当業者はすべてのフタロシアニン誘導体がドナーまたはアクセプター色素として機能し得ることを認識するであろう。例えば、シリコンオルソオクタエトキシ（フタロシアニン）誘導体は約７５０ｎｍから７８０ｎｍで放射し、これはシリコンナフタロシアニン誘導体と類似している。一般に、ドナーとアクセプター間の距離は約５オングストロームから６０オングストロームであり、好ましくは５オングストロームから１５オングストロームである。さらに、必要とされるＦＥＴ化合物の適用に応じて、各ナフタロシアニン誘導体に１〜４個のドナー色素が結合していてもよい。適当なドナー色素はアクセプター色素の吸収範囲において放射するものである。実施例２９は蛍光発光性シリコンフタロシアニンＦＥＴ化合物の合成を示す。表１の５６番は、この化合物のラテックス粒子中の蛍光性質を示す。当業者は本発明の教示することから、多くのＦＥＴ化合物を特別な励起および放射波長が要求される、様々な特定の適用のために合成し得ることを認識するであろう。
近赤外スペクトルに対して高度に可視であるという、所望のおよび予期可能な蛍光性を有する粒子を開発するための他のアプローチは、非対称またはハイブリッドフタロシアニン類、ナフタロシアニン類またはアントラニロシアニン類およびこれらの誘導体を合成することである。「ハイブリッドフタロシアニン誘導体」という語は本明細書においてはすべての種類のフタロシアニン類、ナフタロシアニン類またはアントラニロシアニン類およびこれらの誘導体の、金属および軸性配位子を含むもしくは含まない混成物（ハイブリッド）であって、テトラアザポルフィン類およびその誘導体を含む。本発明の開示する新規ハイブリッド分子は、分子内エネルギー伝達を示す。ジイミノイソインドリンまたはそのジイミノイソインドリン類の誘導体から合成したものに金属を取り込み、軸性配位子で仕上げてハイブリッドフタロシアニン誘導体を合成し得る、またはベンゼン、ナフタレンまたはアントラセン化合物それぞれのジカルボニトリル誘導体から合成したものに、様々な金属の取り込みおよび軸性配位子による仕上げを通してフタロシアニン誘導体を合成し得る。ハイブリッド分子はインオーガニック・ケミストリー（１９９４）、３３、１３７５〜１７４０に記載されたテトラアザポルフィンの誘導体を含有していてもよく、これもまた本発明のハイブリッドフタロシアニン誘導体の範囲内に含まれる。２つの別個のサブユニットからなるハイブリッドフタロシアニン誘導体の合成戦略は例えばジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサエティー（１９９０）、１１２、９６４０〜９６４１、インオーガニック・ケミストリー（１９９４）、３３、１７３５〜１７４０、ケミストリー・レターズ、（１９９２）、７６３〜７６６、ケミストリー・レターズ、（１９９２）、１５６７〜１５７０およびケミストリー・レターズ、（１９９２）、２０３１〜２０３４に記載されている。これらの文献は、亜鉛金属を含むまたは金属を含まない、軸性配位子を含まないハイブリッド分子の合成に言及している。ここに記載した合成アプローチを、本発明の教示することへの適用は、ジイミノイソインドリンおよびその誘導体の性質が分子の励起および放射性質を支配し、さらに軸性配位子による仕上げが粒子内の積層を減少させて消光を最小にして蛍光強度を最大とすると言うことに基づいて行う。ハイブリッドフタロシアニン誘導体上の軸性配位子は、水溶性化合物においても好ましい、というのは軸性配位子がハイブリッド分子と、例えばハイブリッド分子に共有結合していてもいなくてもよいタンパク質、抗体および核酸等との相互作用を最小とするからである。
本発明は３または４の別個のサブユニットを有し、大きなストークスシフトを示す新規なハイブリッドフタロシアニン誘導体を開示する。基本的には、励起は最も高いエネルギーまたは最も短い波長の吸収を示すサブユニットで起こり、放射は最も低いエネルギーのサブユニットで起こる。
ハイブリッドフタロシアニン誘導体に所望される励起および放射波長によって、ハイブリッドフタロシアニンの合成に使用されるジイミノイソインドリン誘導体およびジカルボニトリル誘導体前駆体の種類が規定される。所望される励起および放射波長は一般に試料、蛍光測定の種類および装置によって決まる。ジイミノイソインドリン誘導体前駆体とジカルボニトリル誘導体前駆体の様々な組み合わせは、赤へシフトしたまたは青へシフトした励起および／または放射波長のパターンを有するハイブリッドフタロシアニン誘導体を作成するために結合し得る。一般に、ジイミノイソインドリン前駆体またはジカルボニトリル前駆体上の電子供与性置換基、特にフタロシアニン構造のオルソ位（すなわち、図６にＸとして示した、テトラアザポルフィン構造に対してオルソ位）にあるアミノ、ヒドロキシル、アルコキシ、アリールオキシ、フェニル、アルキルおよび類似物のごとき置換基は、励起および／または放射波長を赤へシフトさせる。反対に、電子吸引性置換基、特にオルソ位にあるハロゲン、ニトロ、シアノ、スルフェート、カルボキシルおよびカルボキシアルキルおよびこれらの類似物のごとき置換基は、励起または放射波長を青へシフトさせる。さらに、オルソ位以外のサブユニットの位置もまたハイブリッドフタロシアニン誘導体の励起および放射性を変化させる。一般にジイミノイソインドリン前駆体またはジカルボニトリル前駆体のいずれをハイブリッドフタロシアニンの合成のために選択するかは、所望されているのが金属の存在か非存在のいずれであるか、およびハイブリッド分子内の金属の種類によって決まる。例えば、ジイミノイソインドリン前駆体を合成に使用する場合には、シリコン金属をフタロシアニン誘導体構造を形成するテトラメライゼーション反応の間に導入することができる。シリコンはさらにシリコンジヒドロキシフタロシアニン誘導体分子へと修飾されて軸性配位子が例えば様々なシリルクロライド試薬によって処理して添わせるようにすればよい。消光を減少させ、蛍光強度を上昇させるための軸性配位子の重要性は、フタロシアニン／ナフタロシアニン分子およびハイブリッドフタロシアニン誘導体の両方に対して明白である（実施例３１参照）。軸性配位子はまた、例えば他の蛍光分子と結合させる、タンパク質、ポリペプチドもしくは核酸へ結合させる、または分子の溶解性を変化させ得るスルフェート、カルボン酸もしくはアミノ置換基を用いて分子の荷電を変化させるごとき、分子をさらに修飾する際にも有用である。ジカルボニトリル前駆体を使用する場合、フタロシアニン誘導体は金属無しで合成されるが、Ｇｅ、Ａｌ、Ｓｎ、Ｔｉおよびこれらに類似する様々な金属をその後に取り込ませることができる。これらの金属はまた、金属の原子価に応じて軸性配位子と共に用いても良い。
ハイブリッドフタロシアニン誘導体の蛍光消光特性は、フタロシアニン誘導体よりも特に好ましいものである。実施例３２はシリコン２，３−ナフタロシアニンビス（ジメチルヘキシルビニルシリルオキシド）のラテックス粒子とシリコン［ジ（１，６−ジフェニルナフタロシアニン）］ジフタロシアニンンビス（ジメチルヘキシルビニルシリルオキシド）を含有するラテックス粒子の消光特性を比較した代表的な例である。ハイブリッドフタロシアニン誘導体は本質的には消光を示さず、表に示したさまざまな色素充填濃度に対して、ナフタロシアニン誘導体の消光の５０％までの消光しか示されない。ハイブリッドフタロシアニン誘導体を含有するラテックスの蛍光強度はフタロシアニン誘導体よりかなり強い。これは、ハイブリッドフタロシアニン誘導体の特別の性質を説明するものである。
ハイブリッドフタロシアニン誘導体を合成するためのジイミノイソインンドリン前駆体またはジカルボニトリル前駆体のテトラメリゼーション反応において、対向するサブユニットが同じとなるように制御し得る。この制御は例えば前駆体の置換基として嵩高な置換基を用いてテトラメリゼーション反応において、同様の嵩高い置換基を有するサブユニットが立体障害のために隣接し得ないようにすることによって行い得る。嵩高なフェニル置換基がジカルボニトリル前駆体において、該前駆体のテトラメリゼーションがにおいてサブユニットが対向するようにするために用いられることは、インオーガニック・ケミストリー（１９９４）、３３、１７３５〜１７４０、ケミストリー・レターズ（１９９２）、２０３１〜２０３４およびケミストリー・レターズ（１９９２）、１５６７〜１５７０に記載されている。これらの文献はしかしながら、本発明に開示されている新規フタロシアニン誘導体をジイミノイソインンドリン前駆体から軸性配位子と共にまたは該リガンドなしで合成する方法は提供していない。
好ましいハイブリッドフタロシアニン誘導体は、２種類の別個のサブユニットを有し、同一サブユニットが対向している構造を有する。特に好ましいハイブリッドフタロシアニン誘導体は、対向同一サブユニットを一つの軸に有し、別個の対向サブユニットを他の軸に有する化合物である。特に好ましい分子は、赤又は青にシフトした励起または放射波長、およびより長いストークスシフトを有するという性質を、テトラメリゼーション反応に用いる前駆体分子の選択の結果として得る。特に好ましいハイブリッドフタロシアニン誘導体は、例えば「ドナー」ジフェニルジイミノイソインドリン前駆体またはジイミノイソインドリン前駆体は、ハイブリッド分子の６５０ｎｍの吸収に寄与し、これによってハイブリッド分子が励起される。ジフェニルフェニルジイミノイソインドリン前駆体またはフェニルジイミノイソインドリンは、ジアルキルまたはアリールオキシフェニルジイミノイソインドリン前駆体である「アクセプターサブユニット」への「電子伝達サブユニット」として働き、これによってアクセプターサブユニットによる最低エネルギーにおける放射が、約８５０ｎｍにて測定できる。「電子伝達サブユニット」の性質は、このサブユニットが放射すれば、アクセプターサブユニットの所望の放射が得られなくなるため、かかる放射が望ましくないということから、重要である。従って、電子伝達サブユニットのＨＯＭＯおよびＬＵＭＯ性はドナーとアクセプターサブユニット分子に基づいてデザインされるべきである。ＨＯＭＯおよびＬＵＭＯエネルギーの関係は、励起と放射に関係することが、パリザーらの、ジャーナル・オブ・ケミカル・フィジックス（Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．）（１９５３）、２１、７６７〜７７６、ポープルの、トランス・ファラディー・ソク（Trans. Faraday Soc.）（１９５３）、４９、１３７５〜１３８５、マックヒューら、セオレティカ・キミカ・アクタ（ベルリン）（１９７２）、２４、３４６〜３７０およびコバヤシら、インオーガニック・ケミストリー（１９９４）、３３、１７３５〜１７４０、ケミストリー・レターズ（１９９２）、２０３１〜２０４１、コナミら、モレキュラー・フィジックス（１９９３）、８０、１５３〜１６０に開示されている。
他の適用においては、ハイブリッド分子は一方がおよそ６５０ｎｍで地方がおよそ６８０ｎｍの２つの励起波長を有することが要求されるが、このとき両方の波長に対する放射は約７６０ｎｍである。すなわち、励起に関係する前駆体を６５０ｎｍのジイミノイソインドリンおよび６８０ｎｍテトラフルオロジイミノイソインドリンとすればよい。テトラメリゼーション反応を制御して放射サブユニットが分子内で対向するようにするために用い得る放射サブユニットとしては、ジフェニルフェニルジイミノイソインドリンが挙げられる。得られるハイブリッドフタロシアニン誘導体の励起および放射波長は従って、個々のジイミノイソインドリンを代表する波長である。
その他の適用では、約６５０ｎｍの励起波長と約７５０ｎｍの放射波長が要求される。励起および放射に寄与する前駆体はそれぞれ、ジイミノイソインドリンおよびジフェニルフェニルジイミノイソインドリンである。後者の前駆体は放射サブユニットが対向するように制御するのにも用い得る。
他の適用においては、励起波長における大きな吸光係数が、約６５０ｎｍにおける励起のために必要とされる。放射波長は約８５０ｎｍ付近であるべきである。励起に関与する前駆体はジフェニルジイミノイソインドリンとすればよく、この前駆体はこれらのサブユニットが対向するように制御し、このために二つのサブユニットは所望の吸光係数を与えるのに寄与する。フェニルジイミノイソインドリン誘導体前駆体は電子伝達サブユニットとして働くことができ、アルコキシフェニルジイミノイソインドリン前駆体は特性放射を８５０ｎｍ付近に有するアクセプターとして働くことができる。
他の適用においては、単一波長で励起した際に、一つの化合物が２つの放射波長を有することが所望される。所望される励起は６５０ｎｍ付近であり、放射は７６０ｎｍ付近および８１０ｎｍ付近である。励起に寄与する前駆体は、テトラフルオロジイミノイソインドリンまたはテトラフルオロベンゼン−１，２−ジカルボニトリルとすればよい。放射に寄与する前駆体はそれぞれ、ジブトキシフェニルジイミノイソインドリンまたは３，４−ジブトキシナフタレン−１，２−ジカルボニトリルとすればよい。
得られる化合物を、その後粒子内へ取り込ませて約６００ｎｍ以上の波長で励起を示し、約６５０ｎｍで放射を示す粒子を得る。当業者は水溶性ハイブリッドフタロシアニン誘導体はタンパク質、ポリペプチド、ヌクレオチド、核酸およびこれらの類似物を結合させて、これらの物質の生物流体中における存在の検出、またはＤＮＡプローブもしくはイムノアッセイを行うのにも用い得ることを認識するであろう。
好ましい粒径は約０．１ｎｍから５０００ｎｍであり、好ましくは約１ｎｍから１０００ｎｍである。粒径の選択は標識の特定の機能に基づいて行うべきである。粒径は、適用の種類に応じて変化させてよい。例えば、イムノアッセイにおいて、非常に低い濃度のアナライトを測定するために標識がより強い蛍光を必要とする場合には、より大きな粒子を選択すればよい。というのはより大きな粒子はより多くの色素分子を取り込むことができるからである。小さな粒径（０．１〜１ｎｍ）の粒子を、米国特許第４，４２０，５６８、第４，４７６，２２９号および第４，５１０，２５１号に記載されたごとく蛍光偏向アッセイに用いてもよく、細胞成分のインビトロにおける可視化またはインビボ結像技術に用いてもよい。
適当な励起および放射性質を示す得られた蛍光色素粒子にさらに、特定の目的に必要とされるさまざまな核酸、ヌクレオチド、タンパク質またはペプチドおよびこれらの類似物へ吸収または化学的に反応させる。マクロ分子を粒子内へ吸収するには、特にラテックス粒子内へ吸収するには当業者にはよく知られており、一般的である巨大分子の５℃から５０℃の温度で、分子のｐＩより低いｐＨにおいて吸収させる方法を含む方法を用いればよい。例えば、蛍光エネルギー伝達を示す蛍光粒子は、アッセイの反応混合物内の、非競争的イムノアッセイに用いるための抗体または競争的イムノアッセイに用いるためのリガンドアナログのいずれかに含有されていてもよい。非競争的アッセイの場合、反応混合物には少なくとも１つの標的リガンドおよび、少なくとも１つの該標的リガンドに特異的なレセプターが結合している少なくとも１種類の蛍光粒子を含んで抗体（蛍光）共役物を形成しているものを含む。競合的アッセイの場合、反応混合物は少なくとも１の標的リガンド、少なくとも１の該標的リガンドに特異的なレセプターおよび少なくとも１つのリガンドアナログが結合してリガンドアナログ（蛍光）共役物を形成している少なくとも１種類の蛍光粒子を含む。非競争的反応混合物内において標的リガンド結合した抗体共役物、および競争的反応混合物内で標的リガンドに対する特異的レセプターで結合されていないリガンドアナログ共役物は、標的リガンド−抗体共役複合体の標的リガンドの他のエピトープに特異的なレセプター及び、リガンドアナログ共役物のリガンドアナログに特異的なレセプターからなる固相へそれぞれ結合させることができる。固相で結合されていない蛍光共役物を除き、結合された蛍光を測定する。測定された蛍光は標的リガンド濃度に比例する。上述のさまざまな試薬をラテックス粒子に共有結合させることが可能である。例えば、抗体またはリガンドアナログをそのアミンまたはカルボン酸を、粒子の表面上のカルボン酸またはアミンと結合させて安定なアミド結合を形成してもよい。
試料中の核酸の定量をする場合にも、本発明に開示した新規化合物はその明るさのため、およびその近赤外放射性のために有用である。一般に、核酸のアッセイを行う際には定量しようとする核酸に対して相補的なプローブを選択する。このプローブ分子を、信号発生基と、一般には共有結合によって結合させる。信号発生基は水溶性フタロシアニン誘導体もしくはハイブリッドフタロシアニン誘導体、または蛍光エネルギー伝達を示すかもしくはハイブリッドフタロシアニン誘導体である、またはこれらの化合物の組み合わせである適当な色素系の粒子とすればよい。標識されたプローブ分子をその後、標的核酸を含有すると考えられる生物試料へ導入し、標識されたプローブ配列を標的核酸と結合させる。標識されたプローブ／標的核酸をその後、標的核酸に相補的である他の核酸が固定化された表面上に固定化する。反対に、生物試料を固定化した相補的核酸を有する表面へ導入して標的核酸を固定化してもよい。標識したプローブをその後固定化した標的分子へ結合するために、この系へ導入する。過剰の標識されたプローブをその後洗い流し、得られる蛍光強度を標準曲線に対応させて試料中の核酸濃度を測定すればよい。
当業者はイムノアッセイおよび核酸アッセイの多くのバリエーションを行うことができること、および本発明の教示する新規色素系を現在の技術に新規に適応し得ることが認識するであろう。
当業者は、本明細書に記載した新規蛍光粒子がイムノアッセイ、蛍光顕微鏡、インビボ結像、インビトロガン治療、核酸アッセイ、細胞ソーターおよびこれら類似の技術に応用できることを認識するであろう。
実験セクション
約７８０ｎｍまで放射する色素用パーキンエルマー（Perkin-Elmer）型ＬＳ５０Ｂルミネサンス分光光度計で蛍光測定を行った。場合によっては、８００ｎｍ以上放射する色素を実施例１８に従って測定した。蛍光度を補正しなかった。吸光測定を、ヒューレット・パッカード（Hewlett Packard）８４５２Ａ二極管配列（Diode Array）分光光度計で行った。
実施例１
シリコンフタロシアニンジヒドロキシドＳｉＰｃ（ＯＨ）2の製造
ピリジン（５０ｍＬ）および水（５０ｍＬ）中のシリコンフタロシアニンジクロリドの懸濁物（１．８３ｇ、３．０ミリモル）を１２０℃で１８時間油浴で撹拌しながら還流した。冷却後、濃い青色の固体状の生成物を濾過し、残渣を水（１０ｍＬ）、アセトン（５ｍＬ）で洗浄し、ついで真空下で乾燥し、標題化合物１．７１ｇを得た。
実施例２
シリコンフタロシアニンビス（トリヘキシルシリルオキシド）（以下でしばしばＰｃＳｉトリヘキシルと称する）の製造
クロロトリヘキシルシラン（７３３μＬ、２．０ミリモル）を含む無水ピリジン（１１ｍＬ）中のシリコンフタロシアニンジヒドロキシド（１１５ｍｇ、０．２ミリモル）の懸濁物を１３０℃で５時間油浴で還流した。生成した紫色の溶液を放置して冷却し、蒸発させた。生成したスラリーを氷冷したヘキサン（２ｍＬ）で処理し、濃い青色の固体状生成物を濾過し、氷冷したヘキサン（２ｍＬ）で洗浄し、真空下で乾燥し、粗製生成物２４９ｍｇを得た。クロロホルム中の粗製生成物をヘキサン中で平衡化したアルミナカラム（活性１）で精製し、生成物を鮮明な青色のバンドとしてヘキサン／トルエン（２／１、容量／容量）で溶出した。生成物を含む溶媒を蒸発させ、融点１７１℃（ｌｉｔ融点１７５℃）を有する標題化合物６９ｍｇを得た。
実施例３
シリコンフタロシアニンビス［（１０−カルボメトキシデシル）ジメチルシリルオキシド］（以下でしばしばＰｃＳｉメチルエステルと称する）
無水ピリジン（１１ｍＬ）中のシリコンフタロシアニンジヒドロキシド（１１５ｍｇ、０．２ミリモル）の懸濁物に、（１０−カルボメトキシデシル）ジメチルクロロシラン（５８６ｍｇ、２ミリモル）を加え、その混合物を１３０℃５時間油浴で撹拌しながら還流した。濃い青色の溶液を放置して冷却し、溶媒を蒸発させた。ヘキサン中で平衡化したシリカゲル６０Åカラム上で残渣を精製し、生成物をトルエンで青色のバンドとしてゆっくりと溶出した。生成物を含むトルエン画分を蒸発させ、ヘキサン（１０ｍＬ）を残渣に加え、青色の生成物を濾過し、ヘキサンで洗浄し、乾燥し、標題化合物１０５ｍｇを得た。
実施例４
シリコンフタロシアニンビス（ジメチルビニルシリルオキシド）（以下でしばしばＰｃＳｉビニルと称する）の製造
無水ピリジン（１１ｍＬ）中のシリコンフタロシアニンジヒドロキシド（１１５ｍｇ、０．２ミリモル）の懸濁物に、クロロジメチルビニルシラン（２７６μＬ、２．０ミリモル）を加え、混合物を１３０℃５時間油浴で撹拌しながら還流した。暗色の溶液を放置して冷却し、蒸発させた。ヘキサンで平衡化したシリカゲル６０Åカラムで残渣を精製し、生成物を青色バンドとしてトルエンで溶出した。生成物を含む溶出物を蒸発させ、残渣をヘキサンで処理し、暗青色の固体状生成物を濾過し、ヘキサンで洗浄し、真空下で乾燥し、標題化合物７．５ｍｇを得た。
実施例５
シリコンフタロシアニンビス［（３−シアノプロピル）ジメチルシリルオキシド］（以下でしばしばＰｃＳｉシアノと称する）の製造
無水ピリジン（１１ｍＬ）中のシリコンフタロシアニンジヒドロキシド（１１５ｍｇ、０．２ミリモル）の懸濁液に、クロロ（３−シアノプロピル）−ジメチルシラン（３２８μＬ、２．０ミリモル）を加え、混合物を１３０℃で５時間油浴で撹拌しながら還流した。紫色の溶液を冷却し、蒸発させた。ヘキサンで平衡化したシリカゲル６０Åカラムで残渣を精製した。カラムをトルエンで洗浄し、生成物をトルエン／イソプロピルアルコール（９０／１０、容量／容量）で鮮明な青色のバンドとして溶出した。生成物を含む溶出物を真空下で蒸発させ、２６０℃以上の融点を有する標題化合物１０１ｍｇを得た。
実施例６
シリコンフタロシアニンビス（ジメチルペンタフルオロ−フェニルシリルオキシド）（以下でしばしばＰｃＳｉペンタフルオロと称する）の製造
無水ピリジン（１１ｍＬ）中のシリコンフタロシアニンジヒドロキシド（１１５ｍｇ、０．２ミリモル）の懸濁液に、クロロジメチルペンタフルオロフェニルシラン（３７６μＬ、２．０ミリモル）を加え、混合物を１３０℃で５時間油浴で撹拌しながら還流した。暗緑色の溶液を放置して冷却し、蒸発させた。ヘキサンで平衡化したシリカゲル６０Åカラムで残渣を精製した。生成物を暗青色のバンドとして溶出した。生成物を含む溶出物を真空下で蒸発させ、残渣をヘキサン（１０ｍＬ）で処理し、暗青色の固体状生成物を濾過し、ヘキサンで洗浄し、真空下で乾燥し、標題化合物７３ｍｇを得た。
実施例７
シリコン２，３−ナフタロシアニンジヒドロキシド（以下でしばしば水酸化ＮａＰｃＳｉと称する）の製造
ピリジン（１０ｍＬ）および水（１０ｍＬ）中のシリコン２，３−ナフタロシアニンジクロリド（２８０ｍｇ、０．３４ミリモル）の懸濁液を１３０℃で２４時間油浴で撹拌しながら還流した。室温に冷却後に、暗緑色の固体状生成物を濾過し、残渣を洗浄し、逐次、水（５ｍＬ）およびアセトン（２ｍＬ）で洗浄した。生成物を真空下で乾燥し、標題化合物２１７ｍｇを得た。
実施例８
シリコン２，３−ナフタロシアニンビス（ジメチルビニルシリルオキシド）（以下でしばしばＮａＰｃＳｉビニルと称する）の製造
無水ジメチルホルムアミド（１ｍＬ）中のシリコン２，３−ナフタロシアニンジヒドロキシド（８７ｍｇ、０．１１ミリモル）の懸濁液にクロロジメチルビニルシラン（０．０４２ｍＬ、０．３ミリモル）、ついでイミダゾール（１４ｍｇ、０．２ミリモル）を加えた。混合物を２４時間室温でアルゴン下で撹拌した。溶媒を蒸発させ、ヘキサンで平衡化したシリカゲル６０Åカラムで残渣を精製した。生成物を緑色のバンドとしてトルエンで溶出した。生成物を含むトルエン画分を蒸発させ、残渣をヘキサンで処理した。暗緑色の固体を濾過し、ヘキサンで洗浄し、真空下で乾燥し、標題化合物２６ｍｇを得た。
実施例９
シリコン２，３−ナフタロシアニンビス（ジメチルペンタフルオロフェニルシリルオキシド）（以下でしばしばＮａＰｃＳｉペンタフルオロと称する）の製造
無水ピリジン（５ｍＬ）中の２，３−ナフタロシアニンジヒドロキシド（８７ｍｇ、０．１１ミリモル）の懸濁液にクロロジメチルペンタフルオロフェニルシラン（０．１８８ｍＬ、１ミリモル）を加えた。混合物を５時間１３０℃で油浴で撹拌しながら還流した。冷却後に、溶媒を蒸発させ、ヘキサンで平衡化したシリカゲル６０Åカラムで残渣を精製した。生成物を緑色のバンドとしてトルエンで溶出した。生成物を含むトルエン画分を蒸発させ、残渣をヘキサンで処理した。暗緑色の固体を濾過し、ヘキサンで洗浄し、真空下で乾燥し、標題化合物２３ｍｇを得た。
実施例１０
種々のサイズであり、色素を配合されたラテックス粒子の一般製造法
種々の色素を以下に概要を示した一般法により種々のサイズとしたラテックス粒子へ配合した。２種の方法を記載し、色素溶液の添加前にテトラヒドロフランまたはジメチルホルムアミドのいずれかの水溶液でラテックス粒子を膨張させることを含む。使用されたラテックス粒子サイズは６７ｎｍ〜７８３ｎｍの範囲であり、当技術の熟練者はより小さいおよびより大きい粒子を使用できることを認識している。粒子を膨張するために使用される有機溶媒の選択は、いずれかの溶媒中で種々の色素の溶解性に主に依存する。下記の実施例１５の表１および表２は、選択された数の色素の各々の色素対またはハイブリッドフタロシアニン誘導体を粒子へ配合するための水性有機溶媒および最適色素濃度を示している。当業者は、程度の異なる蛍光強度を消失を示す粒子を製造するため、より多いまたはより少ない量の色素を粒子へ配合することまたは各色素対の他に対する比を変えることによってこれらの方法を様々に変化させ得ることを認識するであろう。当業者は同様の技術は、例えば、米国特許第４，１９９，３６３号および同第４，３６８，２５８号に記載のようにラテックス粒子への導入に有用であることも認識している。
サイズが６７ｎｍ〜７８３ｎｍの範囲である界面活性剤不含有ポリスチレンスルフェートラテックス粒子および２００ｎｍ〜４００ｎｍ粒子の範囲であるカルボキシル修飾ラテックス（「ＣＭＬ」）粒子をインターフェイシャル・ダイナミックス社（ポートランド、オレゴン州）から市販のものを使用した。
テトラヒドロフランを使用する方法１
テトラヒドロフラン（０．３６ｍＬ）を固形分２．５％のラテックス粒子の溶液１．６ｍＬに撹拌しながら室温で５分間かけて滴下して加えた。ラテックス懸濁物を更に３０分間室温で撹拌し、ラテックスを膨張した。テトラヒドロフラン中適当な濃度で１種またはそれ以上の色素からなる色素溶液（０．０４ｍＬ）を撹拌したラテックス溶液に５分間かけて滴下して加え、表１に示されるような配合する色素の濃度（２ｍＬ容量中）を得た。ラテックス−色素溶液を暗室で室温で３０分間撹拌した。ついで、ラテックス溶液を透析管（スペクトラポール（Ｓｐｅｃｔｒａｐｏｒ）、分子量１２−１４，０００カットオフ、スペクトラム社（ヒューストン、テキサス州）製）に移し、色素−ラテックス溶液を４℃で１２〜１５時間水に対して透析した。色素−ラテックス溶液を透析から取り出し、溶液中の固形分のパーセントを透析後の最終容量および開始時の固形分濃度から算出した。
ジメチルホルムアミドを使用する方法２
ジメチルホルムアミド（１．３３ｍＬ）を、固形分６．７％のラテックス粒子の溶液０．６ｍＬに撹拌しながら室温で５分間かけて滴下して加えた。ラテックスの懸濁物を更に３０分間室温で撹拌し、ラテックスを膨張した。ジメチルホルムアミド中適当な濃度で１種またはそれ以上の色素からなる色素溶液（０．０７ｍｌ）を、ラテックス溶液を撹拌しながらそこに５分間かけて滴下して加え、表１に示されるように配合色素濃度（容積２ｍＬ中）を得た。ラテックス−色素溶液を暗下にて室温で３０分間かけて撹拌した。ついで、ラテックス溶液を透析管（スペクトラポール、１２−１４，０００分子量切断、スペクトラム社（ヒューストン、テキサス州）製）に移し、色素−ラテックス溶液を４℃で１２〜１５時間水に対して透析した。色素−ラテックス溶液を透析から取り出し、溶液中の固形分のパーセントを透析後の最終容量および開始時の固形分濃度から算出した。
実施例１
蛍光強度における色素配合濃度の変更の効果およびラテックス粒子の蛍光強度の最適化
ラテックス粒子への色素の混合は、最大蛍光強度を得るためにおよび色素分子の蛍光消光率を最小にするために最適化しなければならない。粒子中の色素分子が非常に近接しているために、蛍光の消光は顕著であり得る。ＰｃＳｉビニルを、以下の表に示される種々の濃度で方法１（実施例１０）を使用して６７ｎｍラテックス粒子（インターフェイシャル・ダイナミックス社製（ＩＤＣ）、（ポートランド、オレゴン州）から市販の硫酸ポリスチレン）へ加えた。色素ラテックス粒子を水またはテトラヒドロフランのいずれか中に各々色素濃度で固形分を０．００１９％に希釈した。溶液を３５０ｎｍで励起し、６８０ｎｍでの放射を測定した。粒子中で消光するパーセントは（１−［水中の蛍光強度÷有機溶媒中の強度］）×１００である。以下の表は、各々条件での色素配合濃度および消光の関数として蛍光強度を示す。
0003773949.tif 000007
これらの結果は最適配合色素濃度より最高の蛍光強度および最低の消光が得られることを示している。この場合では、配合溶液中の色素濃度０．０２５〜０．０５ｍｇ／ｍＬにより最良の強度および最少の消光が得られる。色素間の間隔が著しく増加するために、色素が０．０２５ｍｇ／ｍＬ以下であれば、強度および消光がいっそう少なくなり、粒子中で色素がより密着するために色素が０．０５ｍｇ／ｍＬ以上であれば、強度がより少なくなり、消光が増大する。この種の実験は蛍光強度を最適にし、消光を最小にする方法を示している。
実施例１２
ラテックス粒子中の蛍光エネルギー伝達の証明
エネルギー伝達用の種々の色素が取り込まれているラテックス粒子を、水、およびテトラヒドロフランまたはジメチルホルムアミドのいずれか中で固形分０．０６％〜０．００１％に希釈し、および固形分の濃度が等しい溶液を、ドナー色素のほぼ励起最大値に相当する波長で励起した。ラテックスから色素を遊離するために、粒子を有機溶媒に希釈し、これによって、粒子中の色素間のいずれのエネルギー伝達工程も崩壊した。アクセプター色素の放射最大において水および有機溶媒中の溶液の蛍光を記録し、比較した。アクセプターの蛍光強度が有機溶媒中より水中ですくなくとも５倍高いとき、蛍光エネルギー伝達が有意であると定義した。
実施例１３
粒子の蛍光強度におけるラテックス粒子中のアクセプター色素濃度に対するドナー色素濃度の変更の効果
メソ−テトラ−２−ジメチルアミノフェニルポルフィリンを以下のように製造した。テトラヒドロフラン（２．５ｍＬ）中のメソ−テトラ−２−アミノフェニルポルフィリン（１００ｍｇ、０．１５ミリモル）および３７％ホルムアミド（５００μＬ、６．０ミリモル）の水溶液を撹拌しながら、水素化ホウ素シアノナトリウム（１１４ｍｇ、１．８ミリモル）を加えた。ついで、混合物を１０分間かけて氷酢酸（６０μＬ）で処理し、室温で３時間撹拌した。更に氷酢酸（６０μＬ）を加え、混合物を更に１時間室温で撹拌した。混合物を蒸発させ、残渣をトルエンで平衡化したシリカゲル６０Åカラムで精製した。生成物を暗茶色のバンドとしてトルエン／１％イソプロパノールで溶出した。生成物を含む画分を蒸発させ、インク−ブルー色の固体状残渣を真空下で乾燥し、標題化合物８５ｍｇを得た。
メソ−テトラ−２−ジメチルアミノフェニルポルフィリン（ポルフィリン社（ローガン、ユタ州）から市販のメソ−テトラ−２−アミノフェニルポルフィリンから製造したＴｄａｐ）およびＰｃＳｉビニル（実施例４）を、実施例１０のテトラヒドロフラン方法１を使用して６７ｎｍラテックス粒子（インターフェイシャル・ダイナミックス社（ポートランド、オレゴン州）製の硫酸ポリスチレンラテックス）へ取り込ませた。Ｔｄａｐ対ＰｃＳｉビニルのモル比をラテックス配合溶液中１／１〜２／１〜６／１へと変更し、一方、各々の溶液中でＰｃＳｉビニル質量（０．１ｍｇ／ｍＬ）を一定に維持した。透析した粒子を水中で固形分０．００１９％に希釈し、ＰｃＳｉビニルの６８０ｎｍにおける蛍光強度を３５０ｎｍ〜４７０ｎｍの励起波長の関数として測定した。Ｔｄａｐの最大励起波長は４３０ｎｍであり、ＰｃＳｉビニルの最大励起波長は３５０ｎｍである。Ｔｄａｐの最大放射波長は６５０ｎｍである。以下の表は結果を示す。
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ラテックス粒子中のドナー対アクセプターのモル比が１／１から６／１に増加すれば、エネルギー伝達がアクセプター色素の蛍光強度により測定されるように、著しく効率的になるということをこれらの結果は示している。６５０ｎｍの最大放射波長で粒子中のＴｄａｐ色素の放射が観察できなかったことは、エネルギー伝達が効率的であるということを示唆する。データはエネルギー伝達経路から得られるラテックス粒子の蛍光強度は、ドナー色素の「光採集（ｌｉｇｈｔ  ｇａｔｈｅｒｉｎｇ）」許容性により影響をうけることを示す。従って、ラテックス粒子の蛍光強度の最適化にはドナー対アクセプターのモル比の変更を含む。
実施例１４
ラテックス粒子の消光および蛍光強度における異なるの色素の混合効果
実施例２〜６に記載のように製造された５種のシリコンフタロシアニン類を以下の方法により色素１、３または５種類の色素を一式として６７ｎｍの界面活性剤不含有ポリスチレンラテックス粒子（インターフェイシャル・ダイナミックス社（ポートランド、オレゴン州）製）へ取り込ませた。各々シリコンフタロシアニン誘導体は各々３５０ｎｍおよび６８０ｎｍに最大励起および放射波長を有した。各々色素−ラテックスの製造後、各々の懸濁物を水またはテトラヒドロフランいずれかに固形分０．０５７％に希釈した。色素−ラテックス溶液を３５０ｎｍで励起し、６８０ｎｍで蛍光強度を測定した。水中の蛍光強度÷テトラヒドロフラン中の蛍光強度−１はラテックス粒子中の色素の消光度である。
ラテックス中の１種のフタロシアニン色素の製造
テトラヒドロフラン（０．１ｍＬ）中のＰｃＳｉペンタフルオロ色素（０．０２ｍｇ）の溶液を、ラテックス粒子（１．０ｍＬ）の２％固形分溶液を撹拌して、そこに５分かけて滴下して加えた。ラテックス懸濁物を６時間室温で撹拌し、ついで透析管（スペクトラポール（Ｓｐｅｃｔｒａｐｏｒ））、分子量１２〜１４，０００カットオフ（スペクトラム社（ヒューストン、テキサス州）製）に移し、色素−ラテックス溶液を４℃で１２〜１５時間水に対して透析した。色素−ラテックス溶液を透析から除去し、固体濃度を１．６％に調整した。
ラテックス中の３種のフタロシアニン色素の製造
テトラヒドロフラン（０．１ｍＬ）中の全色素０．０２ｍｇに等モル量のＰｃＳｉペンタフルオロ、ＰｃＳｉトリヘキシルおよびＰｃＳｉシアノ色素を含む溶液を、ラテックス粒子（１．０ｍＬ）の固形分２％の溶液を撹拌し、そこに５分間かけて滴下した加えた。ラテックス懸濁物を室温で６時間撹拌し、ついで透析管（スペクトラポール、分子量１２〜１４，０００カットオフ）（スペクトラム社（ヒューストン、テキサス州）製）に移し、色素−ラテックス溶液を４℃で１２〜１５時間かけて水に対して透析した。色素−ラテックス溶液を透析から除去し、固形分濃度を１．６％に調整した。
ラテックス中の５種のフタロシアニン色素の製造
テトラヒドロフラン（０．１ｍＬ）中に等モル量のＰｃＳｉペンタフルオロ、ＰｃＳｉトリヘキシル、ＰｃＳｉシアノ、ＰｃＳｉビニルおよびＰｃＳｉメチルエステル色素を合計で０．０２ｍｇ含む溶液を、ラテックス粒子溶液（１．０ｍＬ）の固形分２％の溶液を撹拌して、そこに５分かけて滴下して加えた。ラテックス懸濁物を室温で６時間撹拌し、ついで透析管（スペクトラポール、分子量１２〜１４，０００分子量カットオフ（スペクトラム社（ヒューストン、テキサス州）製））に移し、色素−ラテックス溶液を４℃で１２〜１５時間かけて水に対して透析した。色素−ラテックス溶液を透析から取り出し、固形分濃度％を１．６％に調整した。
以下の表は蛍光実験の結果を詳細に説明するものである。
0003773949.tif 000009
データーはラテックス中へ取り込まれた異種の色素の数が１〜３〜５と進むにつれ、粒子中の消光が減少するために蛍光強度が増加することを示す。
実施例１５
蛍光エネルギー伝達色素ラテックス（表１）およびハイブリッドフタロシアニン誘導体類を取り込んだ蛍光ラテックス（表２）の製造および分析
種々の蛍光エネルギー伝達ラテックスを種々のドナーおよびアクセプター色素分子で製造した。表１は各々ドナーおよびアクセプター色素の配合濃度、ドナーおよびアクセプター色素のモル比、実施例１０に記載の溶媒系配合色素、および特定固形分濃度で各々粒子サイズの励起および放射波長および蛍光強度を示している。いくつかのエネルギー伝達ラテックスは、同一の色素対を異なる直径のラテックスへ取り込ませた。記載したラテックスの蛍光エネルギー伝達効率は８０％より大きい。第５６番に示した色素系は蛍光エネルギー伝達化合物（ＦＥＴ化合物）であるので、ドナーおよびアクセプター対はラテックスへ取り込ませる以前に分子中に存在する。
表２は、実施例１０に記載のハイブリッドフタロシアニン誘導体を取り込んだラテックス粒子の特徴および特定固形分濃度における蛍光強度を示す。
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実施例１６
ラテックス粒子への抗ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）抗体の吸収
実施例１０の記載と同様に製造された染色されたラテックス粒子に対する抗体、および染色されていないラテックス粒子に対する抗体の補体の吸収の具体例は共に以下に概要を示す、ｈＣＧのサンドウィッチアッセイに使用できる。当業者によって種々の技術はラテックス粒子へのプロテイン、ペプチド、リガンドアナログヌクレオチドおよび核酸の吸収または共有結合に利用され得ることが認識されている。２０ｍＭ硼酸ナトリウム／１５０ｎｍ塩化ナトリウム（ｐＨ８．２）中の抗−βｈＣＧモノクローナル抗体（０．２ｍＬ、６．６ｍｇ／ｍＬ；アプライド・バイオテック社(サンディエゴ、カリフォルニア州)製）の溶液にボルテックス（ｖｏｒｔｅｘ）をかけながら、色素ラテックス（０．１ｍＬ、固形分２％、４１２ｎｍ；エントリ（ｅｎｔｒｙ）１０、表１）の溶液を素早く加えた。室温で抗体ラテックス溶液にボルテックスをかけながら、０．１Ｍクエン酸カリウム溶液（ｐＨ３）（０．０４ｍＬ）を素早く加え、生成した溶液のｐＨを３．５にした。溶液を室温で５時間インキュベートし、ついで、２Ｍ硼酸カリウム溶液（ｐＨ９．７）（０．０２５ｍＬ）を素早く加え、ボルテックスをかけて、ｐＨを約８．５にした。このラテックス抗体抱合体を２０ｍＭホウ酸ナトリウム／１５０ｍＭ塩化ナトリウム（ｐＨ８．２）各々２Ｌを４回交換して４℃で４日間透析（スペクトラポール透析管、分子量３００，０００カットオフ（スペクトラム社（ヒューストン、テキサス州）製））した。ついで、透析したラテックス抱合体を透析管から取り出し、固体濃度を０．４％になるように算出した。この抱合体は血清中ｈＣＧのイムノアッセイに使用できる。ラテックスは、励起および放射波長各々、６５０ｎｍおよび７８０ｎｍを有する。
２０ｍＭ硼酸ナトリウム／１５０ｍＭ塩化ナトリウム（ｐＨ８．２）および０．１Ｍクエン酸カリウム（ｐＨ３）（０．６ｍＬ）中に抗−αｈＣＧモノクローナル抗体（０．１２ｍＬ、１０．３ｍｇ／ｍＬ；アプライド・バイオテック社（サンディエゴ、カリフォルニア州）製）を含む溶液にボルテックスをかけながら、硫酸ポリスチレンラテックス溶液（０．０３６ｍＬ、固形分８．４％、１０００ｎｍ；インターフェイシャル・ダイナミックス社（ポートランド（オレゴン州）製）を室温で素早く加えた。溶液を５時間室温でインキュベートし、エペンドルフ（Eppendorf）遠心機(５分間2000×g)中で遠心分離にかけた。上清を除去し、ペレットを０．１Ｍリン酸カリウム（ｐＨ７）（１．５ｍＬ）で再懸濁し、懸濁物を上記のように遠心分離にかけた。この方法を２回繰り返し、最終遠心分離で、固形分を１％にするために、ペレットを０．１Ｍリン酸カリウム（ｐＨ７）（０．３ｍＬ）で再懸濁した。この抗体ラテックスを膜のような固相上で使用し、ｈＣＧのイムノアッセイにおける反応混合物中の色素抗体ラテックス抱合体複合体を捕獲するのに用いられる。
実施例１７
ｈＣＧのイムノアッセイ
固相抗−αｈＣＧラテックス溶液（０．００５ｍＬ、固形分１％；実施例１６）は、非特異的結合相互作用を低くするために２％コンデンスミルク溶液で処理されている０．４５ミクロンナイロン製膜（ミリポア社（ボストン、マサチューセッツ州）製）の２ｃｍ2片に適用してもよい。その膜をその上でｈＣＧ色素ラテックス接合複合体を捕獲する固相として使用できる。すなわち、ｈＣＧアッセイは、色素ラテックス抱合体（０．０２５ｍＬ、実施例１６）を、ｈＣＧを含有していることが予測される１ｍＬの血清試料および既知の濃度のｈＣＧ（１０、１００、３００、５００および１０００ｍＩＵ／ｍＬ）を含有する１ｍＬの血清試料へ添加することによって行うことができる。血清試料を約１０分間インキュベートし、ついでその試料を固相膜ラテックスを含む固相膜に適用する。色素ラテックス抱合体を含む血清試料が固相ラテックススポットを通って流れるよう、膜を吸収剤の上に置くべきである。血清溶液が膜を通した後、色素ラテックス抱合体を含まない血清（０．５ｍＬ）を結合されていない色素ラテックス抱合体を除去するために適用する。ついで、膜上のラテックススポットを蛍光計内の前面蛍光付属品内に置き、該スポットを６５０ｎｍで励起し、各々膜上のスポットの蛍光強度を７８０ｎｍで測定する。既知の試料のｈＣＧ濃度の関数として蛍光強度をプロットする。グラフから未知のｈＣＧ血清の蛍光強度を既知のｈＣＧ濃度と比較できる。
実施例１８
近赤外線放射色素の測定用の蛍光計
色素試料（１０ｍｍ×１０ｍｍ石英製キュベット中２ｍＬ試料容量）を低波長透過遮断フィルター（コリオン社製ＬＳ７００、７００ｎｍ以下の波長を透過する）を通したダイオードレーザー（サンレーザーＳＬ−６；１＝６７０＋／−１０ｎｍ、０．９５ｍＷ）により励起した。蛍光放射をダイオードレーザー入射束に対して９０°にて検知した。放射された光を集め、２個の非球面レンズ（メレ・グリオ、Ｃａｔ＃０１ＬＡＧ１１９）からなるコンデンサーによりシリコンホトダイオード（メレ・グリオ、Ｃａｔ＃０１ＬＡＧ１１９）に焦点を合わせた。シリコンホトダイオードの前の高波長透過遮断フィルター（スコットグラスＲＧ７１５）は６７０ｎｍで散乱レーザー光を遮断したが、７１５ｎｍ以上の波長の放射光は透過した。シリコンホトダイオードからの光電流を常用の電流増幅器（メレ・グリオＣａｔ＃１３ＡＭＰ００３）により増幅し、ナノアンペア（「ｎＡ」）が表示した。場合によっては、１２ｍｍ幅のフィルターを７３０ｎｍ、７９０ｎｍ、８５０ｎｍおよび９００ｎｍの中心波長を有するシリコンホトダイオードの前に置いた。
実施例１９
シリコン２，３−ナフタロシアニンビス（ジフェニルビニルシリルオキシド）の製造
ジフェニルビニルクロロシラン（２８μＬ、０．１２５ミリモル）およびイミダゾール（７ｍｇ、０．１ミリモル）を含むジメチルホルムアミド（０．５ｍＬ）中のシリコン２，３−ナフタロシアニンジヒドロキシド（３９ｍｇ、０．０５ミリモル）懸濁物をアルゴン下で１８時間室温で撹拌した。反応混合物を蒸発させ、残渣をヘキサンで平衡したシリカカラム精製し、長い緑色のバンドとしてトルエンで生成物を溶出した。生成物を含むトルエン画分を蒸発させ、緑色の固体を５ｍｇ得た。
実施例２０
シリコン２，３−ナフタロシアニンビス（トリフェニルシリルオキシド）の製造
トリフェニルクロロシラン（３７ｍｇ、０．１２５ミリモル）およびイミダゾール（７ｍｇ、０．１ミリモル）を含むジメチルホルムアミド（１ｍＬ）中シリコン２，３−ナフタロシアニンジヒドロキシドの懸濁物を、アルゴン下で室温で１８時間撹拌した。反応混合物を蒸発させ、残渣をヘキサンで平衡化したシリカカラムで精製し、緑色のバンドとしてトルエンで生成物を溶出した。生成物を含むトルエン画分を蒸発させ、緑色の固体２．５ｍｇを得た。
実施例２１
シリコン２，３−ナフタロシアニンビス（ジメチルマレイミドエトキシシリルオキシド）の製造
ジクロロジメチルシラン（１３．５μＬ、０．１１ミリモル）およびイミダゾール（１４ｍｇ、０．２ミリモル）を含むジメチルホルムアミド（１ｍＬ）中シリコン２，３−ナフタシアニンジヒドロキシド（３９ｍｇ、０．０５ミリモル）の懸濁物をアルゴン下で室温で１８時間撹拌した。ついで、反応混合物をＮ−（２−ヒドロキシエチル）マレイミド（３５ｍｇ、０．２５ミリモル）で処理し、更に１０時間撹拌した。反応混合物を蒸発させ、残渣をヘキサン、ついで、トルエンで平衡化したカラムで精製し、緑色のバンドとしてトルエン／１０％イソプロパノールで生成物を溶出した。生成物を含む溶出物を蒸発させ、緑色の固体３．５ｍｇを得た。
実施例２２
シリコン２，３−ナフタロシアニンビス（ジメチルシリルオキシドトランススチルベン）の製造
ジクロロジメチルシラン（１３．５μＬ、０．１１ミリモル）およびイミダゾール（１４ｍｇ、０．２ミリモル）を含むジメチルホルムアミド（１ｍＬ）中シリコン２，３−ナフタロシアニンジヒドロキシド（３９ｍｇ、０．０５ミリモル）の懸濁物をアルゴン下で室温で２時間撹拌した。ついで、反応混合物をトランス−４−ヒドロキシスチルベン（４９ｍｇ、０．２５ミリモル）で処理し、更に５時間撹拌した。反応混合物を蒸発させ、残渣をヘキサンで平衡化したシリカカラムで精製し、長い緑色のバンドとしてトルエンで溶出した。生成物を含むトルエン画分を蒸発させ、緑色の固体４ｍｇを得た。
実施例２３
シリコン２，３−ナフタロシアニンビス（ジメチルヘキシルビニルシリルオキシド）の製造
７−オクタ−１−エニルジメチルクロロシラン（３２μＬ、０．１２５ミリモル）およびイミダゾール（７ｍｇ、０．１ミリモル）を含むジメチルホルムアミド（１ｍＬ）中のシリコン２，３−ナフタロシアニンジヒドロキシド（３９ｍｇ、０．０５ミリモル）の懸濁物をアルゴン下で室温で１８時間撹拌した。反応混合物を蒸発させ、残渣をヘキサンで平衡化したシリカカラムで精製し、生成物を緑色のバンドとしてトルエンで溶出した。生成物を含むトルエン画分を蒸発させ、残渣をヘキサンで処理し、暗緑色の固体および薄い緑色の上清を得た。混合物を遠心分離し、上清を除去し、固体をさらにヘキサンで処理し、遠心分離した。上清を再び除去し、固体を真空下で乾燥し、生成物７．３ｍｇを得た。
実施例２４
シリコン２，３−ナフタロシアニンビス（トリデカフルオロ−１，１，−２，２−テトラヒドロオクチル−１−ジメチルシリルオキシド）の製造
（トリデカフルオロ−１，１，２，２−テトラヒドロオクチル）−１−ジメチルクロロシラン（３７μＬ、０．１ミリモル）およびイミダゾール（７ｍｇ、０．１ミリモル）を含むジメチルホルムアミド（１ｍＬ）中シリコン２，３−ナフタロシアニンジヒドロキシド（３９ｍｇ、０．０５ミリモル）の懸濁液をアルゴン下室温で２時間撹拌した。反応混合物を蒸発させ、残渣をヘキサンで平衡化したシリカカラムで精製し、ヘキサン／２０％トルエン、ついでヘキサン／４０％トルエンで溶出し、緑色のバンドとして生成物を得た。生成物溶出液を蒸発させ、残渣をヘキサンで処理し、緑色の固体を得た。混合物を遠心分離し、上清を除去し、固体を更にヘキサンで処理し、再遠心分離した。上清を再びを除去し、緑色の固体を真空下で乾燥し、生成物７．５ｍｇを得た。
実施例２５
シリコン２，３−ナフタロシアニンビス（ジメチルレチノール）の製造
ジクロロジメチルシラン（１３．５μＬ、０．１１ミリモル）およびイミダゾール（１４ｍｇ、０．２ミリモル）を含むジメチルホルムアミド（１ｍＬ）中シリコン２，３−ナフタロシアニンジヒドロキシド（３９ｍｇ、０．０５ミリモル）の懸濁物をアルゴン下で室温で撹拌した。２０分後、反応混合物を全トランス−レチノール（７２ｍｇ、０．２５ミリモル）で処理し、更に１時間撹拌した。反応混合物を蒸発させ、ついで、残渣をヘキサンで平衡化したシリカカラムで精製し、緑色の長いバンドとしてトルエンで生成物を溶出した。生成物を含むトルエン画分を蒸発させ、残渣をヘキサンで処理し、暗緑色固体および薄い緑色の上清を得た。混合物を遠心分離し、ヘキサンを除去し、固体を真空下で乾燥し、最終生成物１０ｍｇを得た。
実施例２６
シリコンオクタエトキシ−２，３−ナフタロシアニンジクロリドの製造
４，９−ジエトキシ−１，３−ジイミノベンズ［ｆ］イソインドリン（０．６ｇ）を、蒸発したばかりのキノリン（１２ｍＬ）にアルゴン下で加えた。１０分間撹拌した後、シリコンテトラクロリド（４．０ｍＬ）を加え、反応混合物を１９０℃で１時間加熱した。反応混合物を室温に冷却し、水（１２０ｍＬ）をゆっくりと加え、未反応のシリコンテトラクロリドを加水分解した。濃いあい色の沈殿物を濾取し、メタノールおよびアセトンで洗浄した。
紫外−可視（塩化メチレン）（λmaxｎｍ）：７６８，８６９．
実施例２７
シリコンオクタエトキシ−２，３−ナフタロシアニンジヒドロキシドの製造
水（１５ｍＬ）を含むピリジン（１５ｍＬ）中のシリコンオクタエトキシ−２，３−ナフタレンジクロリド（１．９６ｇ）の懸濁物を１８時間還流した。懸濁液を冷却し、黒色の沈殿物を濾過し、水（１０ｍＬ）で洗浄した。沈殿物を真空下で乾燥し、重量（１．３７ｇ、紫色の粉末）を測定した。
紫外−可視（塩化メチレン）（λmax（ｎｍ））：７６６，８６７。
実施例２８
シリコンオクタエトキシ−２，３−ナフタロシアニンビス（ジメチルヘキシルビニルシリルオキシド）の製造
７−オクタ−１−エニルジメチルクロロシラン（０．６ｍＬ）およびイミダゾール（１４０ｍｇ）を含むジメチルホルムアミド（２０ｍＬ）中のシリコンオクタエトキシ−２，３−ナフタレンジヒドロキシド（１．０ｇ）の懸濁物をアルゴン下で室温でアルゴン下で２４時間撹拌した。反応混合物を回転蒸発機で蒸発させ、クロマトグラフ（シリカゲル７０〜２３０メッシュ、６０Å、２×５０ｃｍ、ヘキサン−トルエン（１：１））にかけ、真空乾燥し、重量（４６ｍｇ）を測定した。
紫外−可視（テトラヒドロフラン）（λmax（ｎｍ）、ε（Ｍ-1ｃｍ-1））：８５５，３７００００。
赤外スペクトル（ＫＢｒ）：３０７４，２９５８，２９２４，２８５４，１５８９，１４１７，１３７３，１３４８，１２６２，１２３８，１１９４，１１６１，１１１１，１０４４，１０２５，９３３，９０９，８４４，７９９，７６０ｃｍ-1。
1Ｈ−ＮＭＲ（５００ＨＭｚ、ＣＤＣｌ3）：δ９．０（ｍ，２，５−Ｎｃ），７．９（ｍ，３，４−Ｎｃ），５．３（ｍ，−ＣＨ2），４．６（ｍ，ビニル，−ＣＨ2），３．５（ｍ，ビニル  ＣＨ）１．８（ｍ，−ＣＨ3），１．３（ｍ，ε  −ＣＨ3），０．５（ｍ，δ  −ＣＨ2），０．１（ｍ，γ  −ＣＨ2），−０．８（ｍ，β  −ＣＨ2），−１．７（ｍ，α  −ＣＨ2），−２．３（ｓ，−ＣＨ3）。
実施例２９
シリコンフタルロシアニンビス（ジメチルマレイミドフルオレセイン）の製造
フルオレセインＡＴＰ（０．５ｍｇ，１．０５マイクロモル）を８０％メタノール溶液（５２μＬ）中で０．１２Ｍ炭酸カリウムの溶液で処理した。５分後、加水分解溶液を１Ｎ塩酸（１０μＬ）中０．５Ｍリン酸カリウム／０．１Ｍホウ酸カリウム（ｐＨ７．０）を加えることにより冷却した。冷却した加水分解溶液を蒸発乾固し、ジメチルホルムアミド（１００μＬ）に再溶解し、生成した溶液を１．０ｍＬ血清バイアル中シリコンフタロシアニンビス（ジメチルマレイミドシリルオキシド）に加えた。ついで、反応混合物を室温で１時間撹拌した。ついで、粗製生成物を、トルエン／２０％ジメチルホルムアミドを使用して２枚の３”×３”シリカ板上でクロマトグラフにかけた。溶出後、平板を真空下で乾燥し、よりよく分離するために再度クロマトグラフにかけた。生成物のバンドをかきとり、ジメチルホルムアミド（５ｍＬ）で処理し、３０秒間ボルテックスし、シリカから濾過した。濾液を蒸発させ、緑がかった蛍光色の固体０．５５ｍｇを得た。
実施例３０
スズ（ＩＶ）オクタブトキシ−２，３−ナフタロシアニンビス（トリエチルシリルオキシド）の製造
トリエチルシラノール（７７μＬ）、ナトリウム（３．５ｍｇ）およびキシレン（５ｍＬ）の混合物をアルゴン下で１時間還流し、僅かに冷却した。キシレン（５ｍＬ）中のスズ（ＩＶ）オクタブトキシ−２，３−ナフタロシアニンジクロリド（７４ｍｇ）溶液を生成した溶液に加え、混合物を２０分間還流した。生成物を水（１回２５ｍＬ）で２回洗浄し、乾燥（ＭｇＳＯ4）し、回転蒸発機で蒸発させて暗赤色の固体を得た。この固体をクロマトグラフィー（シリカゲル、７０〜２３０メッシュ、６０Å、２×５０ｃｍ、トルエン−イソプロパノール）にかけ、真空乾燥し、重量（１７ｍｇ）を測定した。
紫外−可視（テトラヒドロフラン）（λmax（ｎｍ）、ε（Ｍ-1ｃｍ-1））：９００、１７４０００。
実施例３１
スズ（ＩＶ）２，３−ナフタロシアニンビス（トリエチルシリルオキシド）の製造
トリエチルシラノール（７７μＬ）、ナトリウム（３．５ｍｇ）およびキシレン（８ｍＬ）の混合物をアルゴン下で１時間還流し、わずかに冷却した。スズ（ＩＶ）２，３−ナフタロシアニンジクロリド（４５ｍｇ）を生成した溶液に加え、混合物を５日間還流した。懸濁物を濾過し、固体を洗浄（キシレンおよび水）し、真空乾燥し、重量（４１ｍｇ）を測定した。固体をクロマトグラフィー（シリカゲル７０〜２３０メッシュ、６０Å、２×５０ｃｍ、塩化メチレン−テトラヒドロフラン）にかけ、真空乾燥し、重量（２６ｍｇ）を測定した。
紫外−可視（テトラヒドロフラン）（λmax（ｎｍ）、ε（Ｍ-1ｃｍ-1））：７００、７４６；７８６、２５３０００。
蛍光（テトラヒドロフラン）（λmax（ｎｍ））：８２０。
実施例３２
スズ（ＩＶ）２，３−ナフタロシアニンビス（ジメチルヘキシルビニルシリルオキシド）の製造
７−オクタ−１−エニルジメチルシラノール（１８６ｍｇ）、ナトリウム（７ｍｇ）、およびキシレン（１０ｍＬ）の混合物をアルゴン下で４時間還流し、わずかに冷却した。スズ（ＩＶ）２，３−ナフタロシアニンジクロリド（９０ｍｇ）を生成した溶液に加え、混合物を４時間還流した。懸濁物を濾過し、固体をキシレン（５ｍＬ）および水（５ｍＬ）で洗浄した。濾液の有機相を分離し、乾燥（ＭｇＳＯ4）し、および回転蒸発機で蒸発させた。残渣をヘキサン（１回２ｍＬ）で２回粉砕し、明緑色の固体を得、真空乾燥し、重量（８．５ｍｇ）を測定した。
紫外−可視（テトラヒドロフラン）（λmax（ｎｍ）、ε（Ｍ-1ｃｍ-1））：６７０，７２００；７３２，６９００；７８６，８４９００。
実施例３３
スズ（ＩＶ）オクタブトキシ−２，３−ナフタロシアニンジクロリドの製造
アルゴン雰囲気下で四塩化スズ（２３４μＬ）を乾燥ジメチルホルムアミド（１５ｍＬ）中オクチルブトキシ−２，３−ナフタロシアニン（３１０ｍｇ）の混合物に加え、混合物を６時間撹拌しながら還流した。生成物を冷却し、懸濁物を濾過し、暗赤色固体をジメチルホルムアミド（５ｍＬ）および水（５ｍＬ）で洗浄し、真空乾燥し、重量（２８８ｍｇ）を測定した。
実施例３４
スズ（ＩＶ）オクタブトキシ−２，３−ナフタロシアニンビス（ジメチルヘキシルビニルシリルオキシド）の製造
７−オクタ−１−エニルジメチルシラノール（１８６ｍｇ）、ナトリウム（７ｍｇ）およびキシレン（１０ｍＬ）の混合物をアルゴン下で５時間還流し、わずかに冷却した。スズ（ＩＶ）オクタブチル−２，３−ナフタロシアニンジクロリド（３７ｍｇ）を生成した溶液に加え、混合物を２日間還流した。生成物を水（１０ｍＬ）で洗浄し、乾燥（ＭｇＳＯ4）し、回転蒸発機で蒸発させ、暗赤色の固体を得た。この固体をクロマトグラフ（シリカゲル  ７０〜２３０メッシュ、６０Å、２×５０ｃｍ、トルエン−イソプロパノール）にかけ、真空乾燥し、重量（１７ｍｇ）を測定した。
紫外−可視（テトラヒドロフラン）（λmax（ｎｍ））：７８５；８９３，２２７０００。
蛍光（テトラヒドロフラン）（λmax（ｎｍ））：７８９。
実施例３５
７−オクタ−１−エニルジメチルシラノールの製造
トリエチルアミン（１．５ｍＬ）、水（０．１８ｍＬ）およびエーテル（１５ｍＬ）の混合物を氷／水浴中で撹拌しながら、そこにエーテル（２ｍＬ）中７−オクタ−１−エニルジメチルクロロシラン（２．５６ｍＬ）の溶液を１時間滴下して加えた。生成物を氷／水浴中でさらに１時間撹拌し、濾過し、エーテル（１０ｍｌ）で濾過した固体を洗浄した。濾液を回転蒸発機で蒸発させ、残渣をヘキサン（３０ｍＬ）と水（３０ｍＬ）の間に分配した。有機相を分離し、乾燥（ＭｇＳＯ4）し、シリカゲル（７０〜２３０メッシュ、６０Å）を通して濾過し、ヘキサン（１００ｍＬ）で洗浄した。濾液を回転蒸発機で蒸発させ、無色の油を得、真空乾燥し、重量（１．０６ｇ）を測定した。
実施例３６
テトラブロモテトラブトキシ−２，３−ナフタロシアニンの製造
１，４−ブトキシナフタレン−２，３−ジカルボニトリル（１６１ｍｇ）および２，３−ジブロモ−６，７−ジシアノナフタレン（１６８ｍｇ）を、アルゴン雰囲気下で１−ブタノール（２ｍＬ）中のリチウム金属（３５ｍｇ）の溶液を還流し、そこに加えた。反応溶液を２時間還流で維持し、冷却し、氷酢酸（１０ｍＬ）中へ撹拌した。３０分後、溶媒を回転蒸発機で蒸発させ、残渣を塩化メチレン（１０ｍＬ）中に溶解した。溶液を１Ｎ塩酸（１回１０ｍＬ）で２回、水（１０ｍＬ）で洗浄し、乾燥（ＭｇＳＯ4）し、回転蒸発機で蒸発させた。残渣をクロマトグラフィー（シリカゲル７０〜２３０メッシュ、６０Å、２×５０ｃｍ、ヘキサン−トルエン）にかけ、固体状生成物をヘキサン（２ｍＬ）で粉砕し、真空乾燥し、重量（８ｍｇ）を測定した。
紫外−可視（テトラヒドロフラン）（λmax（ｎｍ））：７４３、８３９。
蛍光（テトラヒドロフラン）（λmax（ｎｍ））：７８９。
実施例３７
ジ（１，６−ジブトキシ−２，３−ナフタロシアニン）ジ（テトラフルオロフタロシアニン）の製造
１，４−ジブトキシナフタレン−２，３−ジカルボニトリル（１６１ｍｇ）およびテトラフルオロフタロニトリル（１００ｍｇ）を、アルゴン雰囲気下で１−ブタノール（２ｍＬ）中のリチウム金属（３５ｍｇ）の溶液を還流して、そこに加えた。反応溶液を１時間還流で維持し、冷却し、氷酢酸（１０ｍＬ）へ撹拌した。３０分後、溶媒を回転蒸発機で蒸発させ、残渣を塩化メチレン（１０ｍＬ）中で溶解した。溶液を１Ｎ塩酸（１回１０ｍＬ）で２回、水（１０ｍＬ）で洗浄し、乾燥（ＭｇＳＯ4）し、回転蒸発機で乾燥させた。残渣を２回クロマトグラフ（シリカゲル７０〜２３０メッシュ、６０Å、２×５０ｃｍ、ヘキサン−トルエン）にかけ、明緑色の画分を真空乾燥し、重量（１０ｍｇ）を測定した。
紫外−可視（テトラヒドロフラン）（λmax（ｎｍ）、ε（Ｍ-1ｃｍ-1））：６７９，２５８００；７５２、８８２００；７８９；７６５００。
蛍光（テトラヒドロフラン）（λmax（ｎｍ））：８１５。
実施例３８
ジ（１，６−ジフェニル−２，３−ナフタロシアニン）ジ（テトラフルオロフタロシアニン）の製造
１，４−ジフェニルナフタレン−２，３−ジカルボニトリル（１６５ｍｇ）およびテトラフルオロフタロニトリル（１００ｍｇ）を、アルゴン下で１−ブタノール（２ｍＬ）中のリチウム金属（３５ｍｇ）の溶液を還流し、そこに加えた。反応溶液を１．５時間還流で維持し、冷却し、および氷酢酸（１０ｍＬ）へ撹拌した。３０分後、溶媒を回転蒸発機で蒸発させ、残渣を塩化メチレン（１０ｍＬ）中に溶解した。溶液を１Ｎ塩酸（１回１０ｍＬ）で２回、水（１０ｍＬ）で洗浄し、乾燥（ＭｇＳＯ4）し、回転蒸発機で蒸発させた。残渣をクロマトグラフ（シリカゲル７０〜２３０メッシュ、６０Å、２×５０ｃｍ、ヘキサン−トルエン）にかけ、明緑色の画分を真空乾燥し、重量（７ｍｇ）を測定した。
紫外−可視（テトラヒドロフラン）（λmax（ｎｍ）、ε（Ｍ-1ｃｍ-1））：７４７，８６８００。
蛍光（テトラヒドロフラン）（λmax（ｎｍ））：７６０。
実施例３９
ジブトキシ−１，３−ジイミノベンズ［ｆ］イソインドリンの製造
１，４−ジブトキシナフタレン−２，３−ジカルボニル（１．６１ｇ）、メタノール（１．１４ｍＬ）中の２５％ナトリウムメトキシドおよび乾燥１−ブタノール（１０ｍＬ）の混合物を撹拌し、ここへ無水アンモニアを３０分間ゆっくりと吹き込んだ。アンモニアを引き続いて入れながら、混合物を３０分間還流した。
生成物を冷却後、回転蒸発機で真空下で溶媒を除去した。残渣をクロマトグラフ（シリカゲル  ７０〜２３０メッシュ、６０Å、ヘキサン−トルエン−イソプロパノール）にかけ、黄色の生成物をエーテル（１０ｍＬ）で処理し、濾過により補集し、エーテル（１０ｍＬ）で洗浄し、真空乾燥し、重量（５１７ｍｇ）を測定した。
1Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3）δ  ８．２２（ｍ，５，８  −Ｈ），７．６５（ｍ，６，７  −Ｈ），４．２３（ｍ，γ  −ＣＨ2），１．９７（ｍ，β  −ＣＨ2），１．６１（ｍ，α  −ＣＨ2），１．０４（ｔ，−ＣＨ3）。
実施例４０
ジエトキシ−１，３−ジイミノベンズ［ｆ］イソインドリンの製造
１，４−ジエトキシナフタレン−２，３−ジカルボニトリル（１．３３ｇ）、メタノール（１．１４ｍＬ）中２５％ナトリウムメトキシドおよび乾燥エタノール（１０ｍＬ）の混合物と撹拌し、ここへ無水アンモニアを２０分間ゆっくりと吹き込んだ。引き続いてアンモニアを入れながら、混合物を２時間還流した。生成物を冷却後、溶媒を回転蒸発機で真空下で除去した。残渣を塩化メチレン（１０ｍＬ）で処理し、生成物を濾過により補集し、水（５ｍＬ）、塩化メチレン（５ｍＬ）で洗浄し、真空乾燥し、重量（７６６ｍｇ）を測定した。
実施例４１
シリコン［ジ（１，６−ジフェニル−２，３−ナフタロシアニン）］ジフタロシアニンジヒドロキシドの製造
四塩化ケイ素（２３１μＬ）をアルゴン雰囲気下で新たに蒸留したキノリン（５ｍＬ）中のジフェニル−１，３−ジイミノベンズ［ｆ］イソインドリン（４７０ｍｇ）および１，３−ジイミノイソイドリン（９７ｍｇ）の混合物に加え、混合物を２００℃で４０分間撹拌しながら加熱した。生成物を僅かに冷却し、水（５ｍＬ）で処理し、５分間還流した。混合物を冷却し、エーテル（３０ｍＬ）で処理し、濾過し、エーテル（１０ｍＬ）および水（１０ｍＬ）で固体を洗浄した。濾液（暗緑色）の有機相を分離し、水（１５ｍＬ）で洗浄し、乾燥（ＭｇＳＯ4）し、回転蒸発機で蒸発させた。残渣を３回クロマトグラフ（シリカゲル７０〜２３０メッシュ、６０Å、２×５０ｃｍ、ヘキサン−塩化メチレン）にかけ、真空乾燥し、重量（５５．５ｍｇ）を測定した。
紫外−可視（テトラヒドロフラン）（λmax（ｎｍ）、ε（Ｍ-1ｃｍ-1））：６４０；６８０；７１４，６７９００；７４２。
蛍光（テトラヒドロフラン）（λmax（ｎｍ））：７５０。
実施例４２
シリコン［ジ（１，６−ジエトキシ−２，３−ナフタロシアニン）ジフタロシアニンジヒドロキシドの製造
四塩化ケイ素（１３７μＬ）を、アルゴン雰囲気下で新たに蒸留したキノリン（３ｍＬ）中ジエトキシ−１，３−ジイミノベンズ［ｆ］イソインドリン（２２７ｍｇ）および１，３−ジイミノイソインドリン（５８ｍｇ）の混合物に加え、混合物を２時間２００℃で撹拌しながら加熱した。生成物をわずかに冷却し、水（３ｍＬ）で処理し、５分間還流した。混合物を冷却し、エーテル（１０ｍＬ）で処理し、暗青色固体状生成物を濾取し、エーテル（１０ｍＬ）および水（１０ｍＬ）で洗浄し、真空下で重量（１７５ｍｇ）を測定した。
紫外−可視（テトラヒドロフラン）（λmax（ｎｍ）：６００，６３２，６６６，７００，７２４，７８８。
実施例４３
シリコン［ジ（１，６−ジエトキシ−２，３−ナフタロシアニン）］ジフタロシアニンビス（ジメチルヘキシルビニルシリルオキシド）の製造
シリコン［ジ（１，６−ジエトキシ−２，３−ナフタロシアニン）］ジフタロシアニンジヒドロキシド（８５ｍｇ）、７−オクタ−１−エニルジメチルクロロシラン（２５６μＬ）、イミダゾール（６８ｍｇ）およびジメチルホルムアミド（２ｍＬ）の混合物を２４時間室温で撹拌した。生成物を回転蒸発機で真空下で濃縮した。残渣をクロマトグラフ（シリカゲル  ７０〜２３０メッシュ、６０Å、２×５０ｃｍ、ヘキサン−トルエン−イソプロパノール）にかけ、真空乾燥し、重量（３２ｍｇ）を測定した。
紫外−可視（テトラヒドロフラン）（λmax（ｎｍ）：６０１，６３３，６６７，７０２，７３１，８２２，９０４。
実施例４４
シリコン［ジ（１，６−ジフェニル−２，３−ナフタロシアニン）］ジフタロシアニンビス（ジメチルヘキシルビニルシリルオキシド）の製造（図９）
シリコン［ジ（１，６−ジフェニル−２，３−ナフタロシアニン）］ジフタロシアニンジヒドロキシド（３０ｍｇ）、７−オクタ−１−エニルジメチルクロロシラン（１１５μＬ）、イミダゾール（３０ｍｇ）およびジメチルホルムアミド（６５０μＬの混合物を室温で３０分間撹拌した。生成物を回転蒸発機で真空下で濃縮した。残渣をクロマトグラフ（シリカゲル  ７０〜２３０メッシュ、６０Å、２×５０ｃｍ、ヘキサン−トルエン）にかけ、真空乾燥および重量（３８ｍｇ）を測定した。
1Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3）δ８．３１，８．２５（ｍ，２，５−Ｎｃ，１０，１３−Ｎｃ），７．９４（ｍ，Ａｒ−Ｎｃ），７．９５，７．７４（３，４−Ｎｃ，１１，１２−Ｐｃ），０．６８（ｍ，ε  −ＣＨ2），０．２１（ｍ，δ  −ＣＨ2），−０．１１（ｍ，γ  −ＣＨ2）、−１．２２（ｍ，β  −ＣＨ2），−２．１４（ｍ，α  −ＣＨ2）、−２．７６（ｓ，−ＣＨ3）。
紫外−可視（テトラヒドロフラン）（λmax（ｎｍ），ε（Ｍ-1ｃｍ-1））：６４４；６８４；７１８，８１１００；７４８。
蛍光（テトラヒドロフラン）（λmax（ｎｍ））：７５４。
実施例４５
テトラフルオロ−１，３−ジイミドベンズ［ｆ］イソインドリンの製造
テトラフルオロフタロニトリル（２．０ｇ）、メタノール（２．３ｍＬ）中２５％ナトリウムメトキシドおよび乾燥ブタノール（１０ｍＬ）の混合物を撹拌し、ここへ無水アンモニアを２０分間ゆっくりと吹き込んだ。引き続いてアンモニアを入れながら、混合物を１時間還流した。生成物を冷却後、溶媒を回転蒸発機で真空下で除去した。残渣をエーテル（５０ｍＬ）で処理し、生成物を濾過により補集し、水（１０ｍＬ）、エーテル（１０ｍＬ）で洗浄し、真空乾燥し、重量（０．４５ｇ）を測定した。
実施例４６
ジフェニル−１，３−ジイミノベンズ［ｆ］イソインドリンの製造
１，４−ジフェニルナフタレン−２，３−ジカルボニトリル（４．３ｇ）、メタノール（３．０ｍＬ）中２５％ナトリウムメトキシドおよび乾燥１−ブタノール（２５ｍＬ）の混合物を撹拌し、ここへ無水アンモニアを３０分間ゆっくりと吹き込んだ。引き続いてアンモニアを入れながら、混合物を１．５時間還流した。生成物を冷却後、溶媒を回転蒸発機で真空下で除去した。残渣を塩化メチレン（５０ｍＬ）で処理し、生成物を濾過により補集し、水（１０ｍＬ）、塩化メチレン（１０ｍＬ）で洗浄し、真空乾燥し、重量（３．６８ｇ）を測定した。
実施例４７
シリコン［ジ（１，６−ジフェニル−２，３−ナフタロシアニン）］ジ（テトラフルオロフタロシアニン）ジヒドロキシドの製造
四塩化ケイ素（８６μＬ）を、アルゴン雰囲気下で新たに蒸留したキノリン（１ｍＬ）中ジフェニル−１，３−ジイミノベンズ［ｆ］イソインドリン（１７４ｍｇ）およびテトラフルオロ−１，３−ジイミノイソインドリン（５４ｍｇ）の混合物に加え、混合物を２００℃１時間撹拌しながら加熱した。生成物をわずかに冷却し、水（１ｍＬ）で処理し、５分間還流した。混合物を冷却し、エーテル（１０ｍＬ）で処理し、濾過し、水（２ｍＬ）およびエーテル（５ｍＬ）で固体を洗浄した。濾液の有機相を分離し、水（５ｍＬ）で洗浄し、回転蒸発機で蒸発させた。残渣をクロマトグラフィー（シリカゲル  ７０〜２３０メッシュ、６０Å、２×５０ｃｍ、塩化メチレン）にかけ、真空乾燥および重量（１８ｍｇ）を測定した。
紫外−可視（テトラヒドロフラン）（λmax（ｎｍ），ε（Ｍ-1ｃｍ-1））：７２７，７５９，８０９，８３５。
蛍光（テトラヒドロフラン）（λmax（ｎｍ））：６８５，７６０，８４０。
実施例４８
シリコン［ジ（１，６−ジフェニル−２，３−ナフタロシアニン）］（１，６−ジエトキシフタロシアニン）フタロシアニンジヒドロキシドの製造
四塩化ケイ素（１７２μＬ）を、アルゴン雰囲気下で新たに蒸留したキノリン（２ｍＬ）中ジフェニル−１，３−ジイミノベンズ［ｆ］イソインドリン（３４７ｍｇ）、ジエトキシ−１，３−ジイミノベンズ［ｆ］イソインドリン（７１ｍｇ）および１，３−ジイミノイソインドリン（３６ｍｇ）の混合物に加え、混合物を２００℃１時間撹拌しながら加熱した。生成物をわずかに冷却し、水（２ｍＬ）で処理し、５分間還流した。混合物を冷却し、エーテル（１０ｍＬ）で処理し、濾過し、水（５ｍＬ）およびエーテル（５ｍＬ）で固体を洗浄した。濾液の有機相を分離し、水（１０ｍＬ）で洗浄し、乾燥（ＭｇＳＯ4）し、回転蒸発機で蒸発させた。残渣をクロマトグラフィー（シリカゲル  ７０〜２３０メッシュ、６０Å、２×５０ｃｍ、塩化メチレン）にかけ、真空乾燥および重量（６ｍｇ）を測定した。
紫外−可視（塩化メチレン）（λmax（ｎｍ））：６４９，６９３，７２４，７５８，８２７。
蛍光（テトラヒドロフラン）（λmax（ｎｍ））：７５０。
実施例４９
シリコン［ジ（１，６−ジフェニル−２，３−ナフタロシアニン）］（テトラフルオロフタロシアニン）フタロシアニンジヒドロキシドの製造
四塩化ケイ素（１７２μＬ）を、アルゴン雰囲気下で新たに蒸留したキノリン（２ｍＬ）中ジフェニル−１，３−ジイミノベンズ［ｆ］イソインドリン（３４７ｍｇ）、テトラフルオロ−１，３−ジイミノベンズ［ｆ］イソインドリン（５４ｍｇ）および１，３−ジイミノイソインドリン（３６ｍｇ）の混合物に加え、混合物を２００℃１時間撹拌しながら加熱した。生成物をわずかに冷却し、水（２ｍＬ）で処理し、５分間還流した。混合物を冷却し、エーテル（１０ｍＬ）で処理し、濾過し、水（５ｍＬ）およびエーテル（５ｍＬ）で固体を洗浄した。濾液の有機相を分離し、水（１０ｍＬ）で洗浄し、乾燥（ＭｇＳＯ4）し、回転蒸発機で蒸発させた。残渣をクロマトグラフィー（シリカゲル  ７０〜２３０メッシュ、６０Å、２×５０ｃｍ、塩化メチレン）にかけ、真空乾燥および重量（２１ｍｇ）を測定した。
紫外−可視（テトラヒドロフラン）（λmax（ｎｍ））：６４６，６８９，７２０，７５３、７９０。
蛍光（テトラヒドロフラン）（λmax（ｎｍ））：７６０。
実施例５０
シリコン［ジ（１，６−ジフェニル−２，３−ナフタロシアニン）］（テトラフルオロフタロシアニン）フタロシアニンビス（ジメチルヘキシルビニルシリルオキシド）の製造
シリコン［ジ（１，６−ジフェニル−２，３−ナフタロシアニン）］（テトラフルオロフタロシアニン）フタロシアニンジヒドロキシド（１０．５ｍｇ）、７−オクト−１−エニルジメチルクロロシラン（３８μＬ）、イミダゾール（１０ｍｇ）およびジメチルホルムアミド（２００μＬ）の混合物を室温で３０分間撹拌した。生成物を回転蒸発機で真空下濃縮した。残渣をクロマトグラフィー（シリカゲル  ７０〜２３０メッシュ、６０Å、２×５０ｃｍ、ヘキサン−トルエン）にかけ、真空乾燥し、重量（４ｍｇ）を測定した。
紫外−可視（テトラヒドロフラン）（λmax（ｎｍ））：７３２，７５７，７９４，８１６。
蛍光（テトラヒドロフラン）（λmax）：７６３、８３０。
実施例５１
シリコン［ジ（１，６−ジフェニル−２，３−ナフタロシアニン）］（テトラフルオロフタロシアニン）フタロシアニンビス（ジメチルペンタフルオロフェニルシリルオキシド）の製造
シリコン［ジ（１，６−ジフェニル−２，３−ナフタロシアニン）］（テトラフルオロフタロシアニン）フタロシアニンジヒドロキシド（１０．５ｍｇ）、クロロジメチルペンタフルオロフェニルシラン（２８μＬ）、イミダゾール（１０ｍｇ）およびジメチルホルムアミド（２００μＬ）を室温で３０分間撹拌した。生成物を回転蒸発機で真空下で濃縮した。残渣をクロマトグラフィー（シリカゲル  ７０〜２３０メッシュ、６０Å、２×５０ｃｍ、ヘキサン−トルエン）にかけ、２種生成物画分ＡおよびＢを得、真空乾燥し、重量（各々２．８ｍｇおよび５．５ｍｇ）を測定した。
Ａ．紫外−可視（テトラヒドロフラン）（λmax（ｎｍ））：６５０，７２６，７６２，７９６，８２４。
蛍光（テトラヒドロフラン）（λmax）：７７０。
Ｂ．紫外−可視（テトラヒドロフラン）（λmax（ｎｍ））：６５１，７２６，７６３，７９６，８２４。
蛍光（テトラヒドロフラン）（λmax）：７７０。
実施例５２
シリコン［ジ（１，６−ジフェニル−２，３−ナフタロシアニン）］ジフタロシアニンビス（ジメチルペンタフルオロフェニルシリルオキシド）の製造
シリコン［ジ（１，６−ジフェニル−２，３−ナフタロシアニン）］ジフタロシアニンジヒドロキシド（２０ｍｇ）、クロロジメチルペンタフルオロフェニルシラン（５８μＬ）、イミダゾール（２０ｍｇ）およびジメチルホルムアミド（４５０μＬ）の混合物を室温で１時間撹拌した。生成物を回転蒸発機で真空下で濃縮した。残渣をヘキサン（５ｍＬ）で処理し、緑色の固体状生成物を濾過により補集し、ヘキサン（２ｍＬ）で洗浄し、真空乾燥し、重量（２６ｍｇ）を測定した。
紫外−可視（テトラヒドロフラン）（λmax（ｎｍ））：６４８，６９１，７２４，７５９．
蛍光（テトラヒドロフラン）（λmax（ｎｍ））：７６８．
実施例５３
ジ（１，６−ジフェニルナフタロシアニン）ジ（ｔ−ブチルフタロシアニン）の製造
１，４−ジフェニルナフタレンジカルボニトリル（４９５ｍｇ）、４−ｔ−ブチルフタロニトリル（９２ｍｇ）、およびリチウムブトキシド（４．０ｍＬ）の混合物を油浴で１．５時間還流し、冷却した。冷氷酢酸（２０ｍＬ）を生成した懸濁物に加え、真空乾燥した。緑色の残渣をジクロロメタン中に再懸濁し、溶液を３０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。上清を１Ｎ塩酸（２×２０ｍＬ）、ついで水（１×１０ｍＬ）で洗浄した。有機相を真空下で乾燥した。粗製生成物をクロマトグラフ（シリカゲル７０〜２３０メッシュ、６０Å、２×５０ｃｍ、ヘキサン−トルエン）にかけ、真空乾燥し、重量（４．２ｍｇ）を測定した。
紫外−可視（テトラヒドロフラン）（λmax（ｎｍ），ε（Ｍ-1ｃｍ-1））：６６８，４３２９７；６８８，８６９１４；７２６，９２７１５；７５８，６４３２９。
蛍光（テトラヒドロフラン）（λmax（ｎｍ））：７３２。
実施例５４
５−ｔ−ブチル−１，３−ジイミノイソリンドリンの製造
無水アンモニアを、４−ｔ−ブチルフタロニトリル（１．８ｇ）、メタノール（２．３ｍＬ）中の２５％ナトリウムメトキシド、および乾燥１−ペンタノール（２０ｍＬ）の撹拌した混合物を内へ、ゆっくりと３０分間吹き込んだ。引き続いてアンモニアを入れながら、混合物を１．５時間還流した。生成物を冷却した後、溶媒を回転蒸発機により除去した。残渣を塩化メチレン（２０ｍＬ）で処理し、生成物を濾過により捕集し、塩化メチレン（１回１０ｍＬ）で２回、エーテル（１０ｍＬ）で洗浄し、真空乾燥し、重量（０．４ｇ）を測定した。
実施例５５
６，７−ジブロモ−１，３−ジイミノベンズ［ｆ］イソインドリンの製造
無水アンモニアを、６，７−ジブロモナフタレン−２，３−ジカルボニトリル（０．５ｇ）、メタノール（０．３ｍＬ）中の２５％ナトリウムメトキシド、および乾燥１−ペンタノール（１０ｍＬ）の撹拌した混合物内へ５０分間ゆっくりと吹き込んだ。引き続いてアンモニアを入れながら、混合物を２．５時間還流した。生成物を冷却した後、オレンジ−黄色の固体を濾過により捕集し、エーテル（２０ｍＬ）で洗浄し、真空乾燥し、重量（０．６ｇ）を測定した。
実施例５６
シリコン［ジ（１，６−ジフェニル−２，３−ナフタロシアニン）ジ−ｔ−ブチルフタロシアニン］ジヒドロキシドの製造
アルゴン雰囲気下で新たに蒸留したキノリン（１ｍＬ）中ジフェニル−１，３−ジイミノベンズ［ｆ］イソインドリン（１７２ｍｇ）および５−ｔ−ブチル−１，３−ジイミノイソインドリン（５０ｍｇ）の混合物に、四塩化ケイ素（５７μＬ）を加え、混合物を撹拌しながら２１０℃で１時間加熱した。生成物を僅かに冷却し、水（２ｍＬ）で処理し、５分間還流した。混合物を冷却し、エーテル（１０ｍＬ）で処理し、濾過し、エーテル（３０ｍＬ）で固体を洗浄した。濾液の有機相を分離し、水（１回２０ｍＬ）で２回洗浄し、エーテルを回転蒸発機で蒸発させた。残渣をクロマトグラフ（シリカゲル  ７０〜２３０メッシュ、６０Å、２×５０ｃｍ、塩化メチレン）にかけ、真空乾燥し、重量（１１ｇ、緑色の固体）を測定した。
紫外−可視（塩化メチレン）（λmax（ｎｍ））：６５６，６７０，６９４，７３０，７５８。
蛍光（塩化メチレン）（λmax（ｎｍ））：７６７。
実施例５７
シリコン［ジ（１，６−ジフェニル−２，３−ナフタロシアニン）］ジ−ｔ−ブチルフタロシアニンビス（ジメチルヘキシルビニルシリルオキシド）の製造
シリコン［ジ（１，６−ジフェニル−２，３−ナフタロシアニン）］ジ（ｔ−ブチルフタロシアニン）ジヒドロキシド（３２０ｍｇ）、７−オクチル−１−エニルジメチルクロロシラン（２００μＬ）、イミダゾール（１３６ｍｇ）およびジメチルホルムアミド（６ｍＬ）の混合物を室温で１２時間撹拌した。生成物を回転蒸発機で真空下で濃縮した。残渣をクロマトグラフ（シリカゲル  ７０〜２３０メッシュ、６０Å、２×５０ｃｍ、ヘキサン）にかけた。青色の画分を捕集し、溶媒を回転蒸発機で蒸発させ、重量（１５０ｍｇ）を測定した。
紫外−可視（塩化メチレン）（λmax（ｎｍ））：６３２，６７６，７０２，７５０．
蛍光（塩化メチレン）（λmax（ｎｍ））：７１６．
実施例５８
シリコンオクタブロモ−２，３−ナフタロシアニンジヒドロキシドの製造
アルゴン雰囲気下で新たに蒸留したキノリン（２ｍＬ）中６，７−ジブロモ−１，３−ジイミノベンズ［ｆ］イソインドリン（４３３ｍｇ）および５−ｔ−ブチル−１，３−ジイミノイソインドリン（１００ｍｇ）の混合物に、アルゴン雰囲気下で四塩化ケイ素（１１４μＬ）を加え、混合物を撹拌しながら２１０℃で１時間加熱した。生成物を僅かに冷却し、水（２ｍＬ）で処理し、１５分間還流した。混合物を冷却し、エーテル（４ｍＬ）で処理し、濾過し、２回エーテル（１回２ｍＬ）で固体を洗浄した。固体を真空乾燥し、重量（０．５７ｇ、暗緑色固体）を測定した。
実施例５９
シリコンオクタブロモ−２，３−ナフタロシアニンビス（ジメチルヘキシルビニルシリルオキシド）の製造
シリコン［オクタブロモ−２，３−ナフタロシアニンジヒドロキシド（５００ｍｇ）、７−オクタ−１−エニルジメチルクロロシラン（２５６μＬ）、イミダゾール（６８ｍｇ）およびジメチルホルムアミド（５ｍＬ）の混合物を室温で１２時間撹拌した。生成物を回転蒸発機で真空下で濃縮した。残渣をクロマトグラフ（シリカゲル７０〜２３０メッシュ、６０Å、２×５０ｃｍ、ヘキサン）にかけ、青緑色画分を捕集し、真空乾燥し、および重量（３００ｍｇ）を測定した。
紫外−可視（テトラヒドロフラン）（λmax（ｎｍ））：６９４．
蛍光（テトラヒドロフン）（λmax（ｎｍ））：７０６．
実施例６０
シリコンオクタエトキシフタロシアニンジクロリドの製造
アルゴン雰囲気下で新たに蒸留したキノリン（１０ｍＬ）中４，７−ジエトキシ−１，３−ジイミノイソインドリン（１．０ｇ）の混合物に、四塩化ケイ素（６００μＬ）を加え、混合物を撹拌しながら２００℃で１．５時間加熱した。生成物を冷却し、水（１０ｍＬ）および塩化メチレン（１０ｍＬ）で処理した。有機相を分離し、回転蒸発機で蒸発させた。黒色残渣をエーテル（５ｍＬ）で処理し、濾過した。濾液を乾燥（Ｎａ2ＳＯ4）し、溶媒を回転蒸発機で蒸発させ、真空乾燥し、重量（３００ｍｇ、暗緑色の固体）を測定した。
紫外−可視（テトラヒドロフラン）（λmax（ｎｍ））：７４２．
紫外−可視（塩化メチレン）（λmax（ｎｍ））：７６４．
赤外スペクトル（ＫＢｒ）：３４３５，３０６０，２９８３，２９３２，２２２８，１７２７，１６０３，１５０４，１３１７，１２５６，１２１８，１０６８，８１０ｃｍ-1．
実施例６１
ジエトキシ−１，３−ジイミノイソインドリンの製造
１，４−ジエトキシ−２，３−フタロニトリル（１．０ｇ）、メタノール（１．２ｍＬ）中２５％ナトリウムメトキシド、および乾燥１−ペンタノール（２０ｍＬ）の撹拌した混合物内へゆっくりと４５分間吹き込んだ。引き続いてアンモニアを入れながら、混合物を３時間還流した。生成物を冷却後に、溶媒を回転蒸発機にて除去した。残渣を真空下で乾燥し、重量（１．４ｇ、緑色の固体）を測定した。
実施例６２
オクタメトキシ−２，３−ナフタロシアニンの製造
メタノール（７ｍＬ）中２５％ナトリウムメトキシドに懸濁した１，４−ジメトキシナフタレン−２，３−ジカルボニトリル（８２０ｍｇ）を１．５時間還流し、冷却し、氷酢酸（５０ｍＬ）へ撹拌した。３０分後に、溶媒を回転蒸発機で蒸発させ、残渣を塩化メチレン（１００ｍＬ）中に溶解した。溶液を１０％塩酸（１００ｍＬ）、ブライン（１００ｍＬ）で洗浄し、回転蒸発機で蒸発させた。残渣をクロマトグラフィー（シリカゲル７０〜２３０メッシュ、６０Å、２×５０ｃｍ、トルエン）にかけ、真空乾燥し、重量（５２ｍｇ、赤茶色の固体）を測定した。
紫外−可視（テトラヒドロフラン）（λmax（ｎｍ））：８３７．
実施例６３
ゲルマニウムテトラ−ｔ−ブチルフタロシアニンジクロリドの製造
四塩化ゲルマニウム（１．５ｍＬ）をアルゴン雰囲気下で１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン（７ｍＬ）中５−ｔ−ブチル−１，３−ジイミノイソインドリン（５００ｍｇ）およびトリブチルアミン（３．４ｍＬ）の混合物に加え、混合物を３．５時間還流した。生成物を冷却し、水（２０ｍＬ）および塩化メチレン（２０ｍＬ）で処理した。有機相を分離し、水（１０ｍＬ）で洗浄し、乾燥（ＭｇＳＯ4）し、回転蒸発機で蒸発させた。残渣をクロマトグラフィー（シリカゲル７０〜２３０メッシュ、６０Å、２×５０ｃｍ、トルエン：イソプロパノール（９：１））にかけ、緑色の画分を捕集し、真空乾燥し、重量（３１０ｍｇ）を測定した。
紫外−可視（テトラヒドロフラン）（λmax（ｎｍ））：６８０．
蛍光（テトラヒドロフラン）（λmax（ｎｍ））：７１８，７５０．
実施例６４
異なるストークスシフトを有するラテックス中種々の色素系の蛍光強度および励起および放射波長に対するヒト血清の影響
表３に掲げるドナーおよびアクセプター色素対またはハイブリッドフタロシアニン誘導体をテトラヒドロフラン溶媒法を使用して０．２ミクロンのラテックス（ＩＤＣ社（オーランド、オレゴン州）製のＣＭＬ）内に取り込ませた。ラテックス粒子を、５０ｍＭリン酸カリウム、１０ｍＭホウ酸カリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウムおよびウシ血清アルブミン（ｐＨ７）１０ｍｇ／ｍＬを含む緩衝液または生ヒト血清のいずれかへ表に掲げた種々の固形分濃度に希釈した。励起および放射波長および相当するストークシフトは表に掲げられる。
結果は励起波長がヒト血清に吸収される領域にあるとき、生ヒト血清で測定された蛍光強度に非常に影響を及ぼすということを示している。逆に、励起波長が血清がほとんど吸収しない領域にあるとき、ヒト血清で測定されるラテックスの蛍光強度に影響はない。
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実施例６５
シリコン［ジ（１，６）−ジフェニルナフタロシアニン）］ジフタロシアニンの消光への軸性配位子の効果
シリコン［ジ（１，６−ジフェニルナフタロシアニン）］ジフタロシアニンジヒドロキシドおよびシリコン［ジ（１，６−ジフェニルナフタロシアニン）］ジフタロシアニンビス［ジメチルヘキシルビニルシリルオキシド］を、ＴＨＦ溶媒系を使用して以下の表に示されるように種々色素濃度で０．２ミクロンＣＭＬラテックス（ＩＤＣ社製（ポートランド、オレゴン州））へ入れた。蛍光ラテックスを５ｍＭリン酸カリウム、１ｍＭホウ酸カリウム緩衝液（ｐＨ７）またはテトラヒドロフラン中のいずれかで０．０００５７％固形分に希釈した。蛍光強度を６４６ｎｍで励起により測定した。放射を７６０ｎｍにセットした。結果を以下の表４に表す。
結果は軸性配位子を有さないジヒドロキシハイブリッド誘導体が０．１ｍｇ／ｍＬ配合濃度でさえ高程度の消光を示し、一方ではビスジメチルヘキシルビニルシリルオキシドハイブリッド誘導体（軸性配位子を有する）はほとんど消光しないことを示している。結果は軸性配位子がハイブリッドフタロシアニン誘導体では特に最大蛍光強度を達成することが重要であることが示されている。
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実施例６６
相方共に軸性配位子を有するハイブリッドフタロシアニン誘導体およびナフタロシアニン誘導体のラテックス中の消光
シリコン［ジ（１，６−ジフェニルナフタロシアニン）］ジフタロシアニンビス［ジメチルヘキシルビニルシリルオキシド］（ハイブリッドフタロシアニン誘導体）およびシリコン２，３−ナフタロシアニンビス［ジメチルヘキシルビニルシリルオキシド］（ナフタロシアニン誘導体）を、テトラヒドロフラン溶媒系を使用して以下の表に示すように種々の色素濃度で０．２ミクロンＣＭＬラテックス（ＩＤＣ社製（ポートランド、オレゴン州））へ入れた。蛍光ラテックスを５ｍＭリン酸カリウム、１ｍＭホウ酸カリウム緩衝液（ｐＨ７）またはテトラヒドロフラン中のいずれかで０．０００５７％固形分に希釈した。蛍光強度を以下の表に示した励起および放射波長で測定した。
結果はハイブリッドフタロシアニン誘導体がナフタロシアニン誘導体より消光に対する耐性がより強いといことを示す。結果はラテックス中において改良された蛍光強度を達成するというハイブリッドフタロシアニン誘導体の特性を示す。
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【図１】
0003773949.tif 000033
【図２】
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【図３Ａ】
0003773949.tif 000035
【図３Ｂ】
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【図４】
0003773949.tif 000037
【図９】
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【図５】
0003773949.tif 000039
【図８】
0003773949.tif 000040
【図６】
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【図７】
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