(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
３−キヌクリジノンからＲ−３−キヌクリジノールを生成する能力を有するアルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、フィロバシディウム（Ｆｉｌｏｂａｓｉｄｉｕｍ）属、オーレオバシディウム（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）属、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属に属する微生物の菌体及び／または該菌体処理物の存在下、水性媒体中で３−キヌクリジノンを光学選択的に還元させて該水性媒体中にＲ−３−キヌクリジノールを生成蓄積せしめ、ついで該水性媒体からＲ−３−キヌクリジノールを採取することを特徴とするＲ−３−キヌクリジノールの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、微生物の菌体及び／または該菌体処理物の存在下３−キヌクリジノンに、該化合物のカルボニルを光学選択的に還元してＲ−３−キヌクリジノールを製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
Ｒ−３−キヌクリジノールは生理活性又は薬理活性成分（医薬品、農薬など）の中間原料として有用な化合物である。この光学活性Ｒ−３−キヌクリジノールの化学的製造法においては、３−キヌクリジノンと光学活性フェネチルアミンから調製したイミンを原料とし、ソディウムボロハイトレイトで還元して製造する方法｛（Ｓｙｎｔｈ．Ｃｏｍｍｕｎ．２２（１３），ｐｐ１８９５−１９１１（１９９２）｝、ラセミのアセチル体を酒石酸で分割し加水分解して製造する方法｛Ａｃｔａ  Ｐｈａｒｍ．Ｓｕｅｃ．１６（４），ｐｐ２８１−２８３（１９７９）｝が知られている。また、生物学的製造法として、ブチルエステルのラセミ体を原料として、馬血清のエステラーゼで光学分割して製造する方法｛ＬｉｆｅＳｃｉ．，２１（９），ｐｐ１２９３−１３０２（１９７７）｝、ラセミ体を原料とし、ズブチリシンプロテアーゼを用いるアシル化反応によって光学分割して製造する方法（米国特許第５２１５９１８号公報）、ラセミ体を原料としてビニル酪酸とズブチリシンプロテアーゼの存在下にＳ体をキヌクリジニル酪酸に変換させてＲ体を得る方法（独国公開特許第１９７１５４６５号公報）、ラセミ体３−キヌクリジノールエステルにＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属に属する微生物由来のエステル分解酵素を作用させてＲ体を取得する方法（特開平１０−２１０９９７号公報）などが知られている。しかしながらこれらの方法は、いずれもＲ−３−キヌクリジノールを経済的に有利に製造する方法とはいいがたい。また、３−キヌクリジノンに微生物を作用させる方法（特開平１０−２４３７９５号公報）が提案されたが、本法において例示されているＲ−３−キヌクリジノール生成例は、ナカザワエ（Ｎａｋａｚａｗａｅ）属、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属に属する微生物を用いた方法であるが、生成収率、光学純度とも工業的に充分とは言い難い。
【０００３】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、経済的に優れ、簡便にＲ−３−キヌクリジノールを製造する方法を提供することを鋭意検討した結果、ある種の微生物を３−キヌクリジノンに作用させることにより、Ｒ−３−キヌクリジノールが高収率、高光学純度で得られることを見い出し、本発明を完成した。
【０００４】
すなわち本発明は、３−キヌクリジノンからＲ−３−キヌクリジノールを生成する能力を有するアルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、アースロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属、フィロバシディウム（Ｆｉｌｏｂａｓｉｄｉｕｍ）属、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属、オウレオバシディウム（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）属、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属に属する微生物の菌体及び／または該菌体処理物の存在下、水性媒体中で３−キヌクリジノンを光学選択的に還元させて該水性媒体中にＲ−３−キヌクリジノールを生成蓄積せしめ、ついで該水性媒体からＲ−３−キヌクリジノールを採取することを特徴とするＲ−３−キヌクリジノールの製造方法を提供するものである。
【０００５】
【発明の実施の形態】
本発明に用いられる微生物は、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、アースロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属、フィロバシディウム（Ｆｉｌｏｂａｓｉｄｉｕｍ）属、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属、オーレオバシディウム（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）属、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属に属する微生物であって３−キヌクリジノンからＲ−３−キヌクリジノールを生成する能力を有する微生物である。具体的な種としては、例えばアルカリゲネス  ユウトロフス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｅｕｔｒｏｐｈｓ）、アルカリゲネス  エポキシリティカス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｅｐｏｘｙｌｙｔｉｃｕｓ）、アルカリゲネス  マルガリタエ（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｍａｒｇａｒｉｔａｅ）、コリネバクテリウム  メディオラナム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｍｅｄｉｏｌａｎｕｍ）、フィロバシディウム  カプシュリゲナム（Ｆｉｌｏｂａｓｉｄｉｕｍ  ｃａｐｓｕｌｉｇｅｎｕｍ）、ロドトルラ  アウランティアカ（Ｒｈｏｄｏｔｒｕｌａ  ａｕｒａｎｔｉａｃａ）、ヤロビア  リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、アウレオバシディウム  マンソニー（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ  ｍａｎｓｏｎｉｉ）が挙げられる。
【０００６】
これら微生物の中で、好適に用いられる具体的菌株としては、例えばアルカリゲネス  ユウトロフス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｅｕｔｒｏｐｈｓ）ＡＴＣＣ１７６９９、コリネバクテリウム  メディオラナム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｄｉｏｌａｎｕｍ）ＡＴＣＣ  １４００４、フィロバシディウムカプシュリゲナム（Ｆｉｌｏｂａｓｉｄｉｕｍ  ｃａｐｓｕｌｉｇｅｎｕｍ）ＩＦＯ  １１１９、ロドトルラ  アウランティアカ（Ｒｈｏｄｏｔｒｕｌａ  ａｕｒａｎｔｉａｃａ）ＩＦＯ  ０７５４、ヤロビア  リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＩＦＯ  １５４８、オウレオバシディウム  マンソニー（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ  ｍａｎｓｏｎｉｉ）ＩＦＯ  ６４２１が挙げられる。
【０００７】
これらの菌株のうち、ＩＦＯ番号の付されているものは大阪発酵研究所、またＡＴＣＣ番号の付されているものはＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｅｃｔｉｏｎに保管されている菌株であり、いずれも容易に入手可能である。
また、上記微生物の変異株、あるいは細胞融合もしくは遺伝子組換え法などの遺伝学的手法により誘導される組換え株などのいずれの株であっても３−キヌクリジンからＲ−３−キヌクリジノールを生成する能力を有するかぎり本発明で用いられる微生物に包含される。
【０００８】
本発明の製造方法においては、上記微生物の１種あるいは２種以上が菌体及び／または菌体処理物として用いられる。具体的には、上記微生物を培養して得られた菌体をそのまま、あるいは培養して得られた菌体を公知の手法で処理したもの、即ち、アセトン処理したもの（アセトン処理物）、凍結乾燥処理したもの（凍結乾燥処理物）、菌体を物理的または酵素的に破砕したもの等を用いることができる。また、菌体、アセトン処理物又は凍結乾燥処理物から、３−キヌクリジノンに作用しＲ−３−キヌクリジノールに変換する能力を有する酵素画分を粗製物あるいは精製物として取り出して用いることも可能である。さらには、このようにして得られた菌体又は菌体処理物を通常の固定化技術を用いて、すなわち、ポリアクリルアミド、カラギーナンゲル等の担体に固定化したもの等を用いることも可能である。
【０００９】
本明細書において、「菌体及び／または該菌体処理物」の用語は、上述の菌体、アセトン処理物、凍結乾燥処理物、酵素画分、及びそれらの固定化物全てを包含する。
次に、本発明の製造方法について具体的に説明する。
本発明においては、原料として３−キヌクリジノンを用い、これに前述した微生物の菌体及び／又は該菌体処理物を作用させて、Ｒ−３−キヌクリジノールを製造する。本発明の製造方法において微生物は、通常、培養して用いられるが、この培養については定法通り行うことができる。本微生物の培養の為に用いられる培地には本微生物が資化しうる炭素源、窒素源、及び無機イオン等が含まれる。炭素源としては、グルコース、フルクトース、サッカロース等の炭水化物、グリセロール、マンニトール、キシリトール、リビトール等のポリアルコール類、有機酸その他が適宜使用される。窒素源としては、ＮＺアミン、トリプトース、酵母エキス、ポリペプトン、肉エキス、大豆抽出物などの有機窒素源、あるいは硫酸アンモニウム塩、硝酸アンモニウム塩などの無機窒素源、その他などが適宜使用される。無機イオンとしては、リン酸イオン、マグネシウムイオン、鉄イオン、マンガンイオン、モリブデンイオンその他が必要に応じ適宜使用される。更に、培地にキヌクリジノールを添加して馴化培養することも有効である。培養は好気的条件下に、ｐＨ約５〜９、好ましくはｐＨ６〜８、温度４〜５０℃、好ましくは２５〜４０℃の適当な範囲に制御しつつ１〜１００時間行う。
【００１０】
Ｒ−３−キヌクリジノールを製造する方法として、本微生物を培養し、得られた菌体及び／または該菌体処理物に３−キヌクリジノンを添加し、反応させ３−キヌクリジノールを得る方法、培地に３−キヌクリジノンを添加し培養と反応を同時に行う方法、あるいは培養終了後該培養液に３−キヌクリジノンを添加して更に反応を行う方法等を適宜用いることができる。
【００１１】
反応は温度４〜７０℃、好ましくは２０〜５０℃の範囲で行い、ｐＨは４〜１０、好ましくは６〜９の範囲で行う。３−キヌクリジノンの濃度は０．０００１〜５０％、好ましくは０．０１〜５％の範囲が望ましく、必要に応じて反応の間、３−キヌクリジノンは追補添加される。
培養及び反応で得られたＲ−３−キヌクリジノールの採取方法としては、常法通り微生物などの固形分を遠心分離、フィルタープレス、限外濾過などの通常の分離装置により除去した後に反応液を有機溶媒による抽出、晶析、カラムクロマトグラフィー、濃縮、蒸留などの分離精製手段に供することにより分離することができ、分離精製手段は単独でまたは複数の手段を組み合わせて利用できる。前記有機溶媒としては、例えばブタノールなどのアルコール類、ヘキサン、シクロヘキサン、トルエン等の炭化水素類、クロロホルム、塩化メチレンなどのハロゲン化炭化水素類、酢酸エチル、酢酸メチルなどのエステル類、ケトン類、エーテル類、これらの混合溶媒などが利用できる。
【００１２】
【実施例】
以下に実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１
リン酸水素１カリウム０．１重量％、硫酸マグネシウム０．０５重量％、酵母エキス０．３重量％、ポリペプトン０．５重量％、硫酸アンモニウム０．２重量％、グルコース２重量％、肉エキス０．３重量％（ｐＨ７．０）の組成からなる培地５０ｍｌを仕込んだ５００ｍｌ容三角フラスコを１２０℃、１５分間滅菌処理後、アルカリゲネス  ユウトロフス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｅｕｔｒｏｐｈｓ）ＡＴＣＣ  １７６９９を１白金耳量接種し、３０℃で２４時間好気的に培養した。培養終了後、培養液（１０ｍｌ）を集め、遠心分離後、菌体に反応液（グルコース２重量％、３−キヌクリジノン・ＨＣｌ  ５０ｍＭ、ＮａＯＨでｐＨ７に調整）３ｍｌに懸濁し、炭酸カルシウム０．２ｇを加えて３０℃で７２ｈｒ振とう反応させた。反応終了後、遠心分離により菌体を除き、炭酸ナトリウムを飽和濃度に添加後、酢酸エチルで２ｍｌで２度抽出し、酢酸エチル層を集めて蒸発乾固させることによりＲ−３−キヌクリジノール粗結晶１６ｍｇを取得した。Ｒ−３−キヌクリジノールの定量は、ＴＬＣ（アセトン：クロロホルム：５Ｎアンモニア水＝８：１：１でシリカゲルプレートを展開後、ヨウ素で発色）並びにＨＰＬＣ（ダイセル社キラルパックＯＤ、移動相ｎ−ヘキサン：イソプロパノール＝９０：１０）にて行った。また、光学純度の検定は、以下の通りアセチル化した後、ＨＰＬＣ（ダイセル社キラルパックＯＤ−Ｈ、移動相ｎ−ヘキサン：イソプロパノール：トリエチルアミン＝９０：１０：０．１、移動相の流速は０．５ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度４０℃、示差屈折計により検出）にて分析した。アセチル化は以下の通り行った。酢酸エチル抽出後乾固させサンプルに、無水酢酸：ピリジン＝５：１液を加え６０℃で２０分処理し、しかる後に蒸発乾固させ、残査をイソプロパノールに溶解して分析に供した。本条件で、Ｒ−３−キヌクリジノール（関東化学製、製品番号２９３７３−１Ａ）は１６分後に溶出した。
生成したＲ−３−キヌクリジノールの濃度は５．７ｇ／ｌ（反応液１リットル換算）、変換率９０％、光学純度はＲ体９８％以上であった。
【００１３】
実施例２
菌株としてコリネバクテリウム  メディオラナム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｄｉｏｌａｎｕｍ）ＡＴＣＣ  １４００４を用いた以外は実施例１と同様の実験を行った。反応液中に生成したＲ−３−キヌクリジノールは５．３ｇ／ｌ、該反応液から採取したＲ−３−キヌクリジノール粗結晶は１５ｍｇであった。変換率８５％、光学純度は９２％であった。
【００１４】
実施例３
酵母エキス０．３重量％、ポリペプトン０．５重量％、麦芽エキス０．３重量％、グルコース２重量％（ｐＨ６．０）の組成からなる培地５０ｍｌを仕込んだ５００ｍｌ容三角フラスコを１２０℃、１５分間滅菌処理後、ロドトルラ  オウランティアカ（Ｒｈｏｄｏｔｒｕｌａ  ａｕｒａｎｔｉａｃａ）ＩＦＯ  ０７５４を１白金耳量接種し、３０℃で２４時間好気的に振とう培養した。反応および分析は、実施例１と同様に行った。生成したＲ−３−キヌクリジノールの濃度は５．３ｇ／ｌ（反応液１リットル換算）、該反応液から採取したＲ−３−キヌクリジノール粗結晶は１５ｍｇであった。変換率８５％、光学純度は９４％であった。
【００１５】
実施例４
菌株としてヤロウィア  リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｙｐｏｌｙｔｉｃａ）ＩＦＯ  １５４８を用いた以外は、実施例３と同様の実験を行った。Ｒ−３−キヌクリジノールの生成濃度は、５．４ｇ／ｌ（反応液１リットル換算）、採取した粗結晶は１５ｍｇであった。変換率８６％、光学純度は９４％であった。
【００１６】
実施例５
菌株としてオウレオバシディウム  マンソニー（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍｍａｎｓｏｎｉｉ）ＩＦＯ  ６４２１を用いた以外は、実施例３と同様の実験を行った。Ｒ−３−キヌクリジノールの生成濃度は、５．２ｇ／ｌ（反応液１リットル換算）、採取した粗結晶は、１４ｍｇであった。変換率８３％、光学純度は９３％であった。
【００１７】
実施例６
菌株としてフィロバシディウム  カプシュリゲナム（Ｆｉｌｏｂａｓｉｄｉｕｍ  ｃａｐｓｕｌｉｇｅｎｕｍ）ＩＦＯ  １１１９を用いた以外は、実施例３と同様の実験を行った。Ｒ−３−キヌクリジノールの生成濃度は、５．５ｇ／ｌ（反応液１リットル換算）、採取した粗結晶は、１５ｍｇであった。変換率８９％、光学純度は９３％であった。