(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト血液凝固第XIII因子を有効成分とする火傷の局部治療のためのスプレー用外用剤（ただし、血液凝固第XIII因子およびトロンビンの組合せは除く）。
【請求項２】
さらにアプロチニンを含む請求項１の外用剤。
【請求項３】
ヒト血液凝固第XIII因子がヒト血漿由来である請求項１又は２に記載の外用剤。
【請求項４】
ヒト血液凝固第XIII因子がヒト胎盤由来である請求項１又は２に記載の外用剤。
【請求項５】
ヒト血液凝固第XIII因子が組換え遺伝子技術で製造された組換え蛋白質である請求項１又は２に記載の外用剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、ヒト血液凝固第XIII因子を有効成分とする皮膚創傷治療用外用剤に関するものである。
【０００２】
【従来の技術および問題点】
従来、ヒト血液凝固第XIII因子は皮膚創傷の治療剤として知られており、静脈内投与されていた。しかしながら、この投与方法では薬物の患部への移行性に問題があり、また投与に医師の手を煩わす必要があった。
【０００３】
そこで本発明はこのような欠点のない皮膚治療用ヒト血液凝固第XIII因子製剤を提供することを目的とする。
【０００４】
【問題点を解決するための手段】
本発明はヒト血液凝固第XIII因子を有効成分とする皮膚創傷治療用外用剤からなる。本発明の外用剤はさらにアプロチニンを含むのが好ましい。本発明の外用剤は特に火傷の局部治療に適している。ヒト血液凝固第XIII因子はヒトの血漿または胎盤由来のものが好適に使用され、組み換え遺伝子技術で製造されたものも使用し得る。
【０００５】
ヒト血液凝固第XIII因子（以下、第XIII因子という）は、血漿または胎盤等に広く存在し、トロンビンおよびＣａ2+によって活性化され、ε−（γ−グルタミル）リジン結合を種々の蛋白質間に形成し、分子同士を架橋結合させる。活性型第XIII因子によるフィブリンγ鎖同士の二量体化、α鎖の多量体化反応はフィブリンに強度と弾性を与え、止血機構に作用する。さらに、活性型第XIII因子は、フィブロネクチンのフィブリンα鎖、またはコラーゲンへの架橋結合を触媒し、創傷治癒の過程で重要な役割を果たしている（文献：松田、昭和５２年、日本血液学会雑誌、第４０巻第６号、p.995〜1002）。
【０００６】
第XIII因子製剤は、前述したように、主として創傷治癒障害の治療のために静脈内投与されているが、本発明者らは、種々検討の結果、第XIII因子が創傷した皮膚を経皮透過し、治療に必要な充分量が患部皮膚中に浸透することを見出し、第XIII因子が外用剤としても有効であることを明らかにして本発明を完成した。
【０００７】
第XIII因子製剤は、国内外における１万例以上の静脈内投与の使用経験および下記の急性毒性試験の結果からみて、通常２０〜５０単位／kg／人／日での使用量では副作用・毒性等の心配は全くない。
【０００８】
外用剤としては、損傷部位の障害の程度及び損傷の範囲に応じて１〜１０００単位／投与部位／人／日の投与ができる。ここで、第XIII因子の１単位とは、正常人の血漿１ml中に含まれる第XIII因子の量を示し、通常１５μg／ml程度である。
【０００９】
第XIII因子の急性毒性試験の結果を表１に示す。
【００１０】
【表１】
0003769035.tif 000002
本発明の外用剤は、切傷、刺創、割創、挫創、裂創、火傷等各種の皮膚創傷の治療に適用されるが、特に火傷の局部治療に有用である。
【００１１】
第XIII因子製剤は、従来よく知られている方法でヒト胎盤もしくは血漿を原料として血漿の分画精製法によって製造される。血漿の分画精製法によって製造されたものは、肝炎ウイルスやエイズウイルス等を含む可能性があるので、加熱処理等によりこれらのウイルスを不活性化することが望ましい。加熱処理は、第XIII因子をＥＤＴＡを含む塩化ナトリウム溶液に溶解し、約６０℃にて１０時間程度加熱することによりおこなわれる。
【００１２】
また、この第XIII因子は、遺伝子工学的手法によっても製造可能である。本発明で用いる第XIII因子は、分画精製法のみならず、遺伝子工学的手法等を含むあらゆる方法によって製造されたものが含まれる。
【００１３】
本発明の外用剤の態様としては、水溶性軟膏、油脂性軟膏、ローション、スプレー、オイル、ゲル剤等が挙げられる。水溶性軟膏用としてはマクロゴール基剤、油脂性軟膏用としてはワセリン基剤、オイル用としてはオリーブ油、ゴマ油、ツバキ油等の植物油、ゲル剤用としてはカルボキシビニルポリマー、ポリアクリル酸ナトリウム等が代表的な基剤として挙げられる。
【００１４】
第XIII因子は、例えばこれをグルコース、ヒト血清アルブミン等を含む塩化ナトリウム水溶液に溶解し、力価を調整した後、無菌濾過し、バイアルに分注し、凍結乾燥し、用時、注射用蒸留水に溶解し、そのまま水剤として、または噴射装置を備えた容器に充填してスプレー剤として使用される。
【００１５】
なお、第XIII因子の活性測定法としてはフィブリン形成法、トランスグルタミナーゼ活性測定法または免疫学的な抗原量の測定法等があるが、本発明の実施例では、感度が高く活性型第XIII因子量を測定することができる西田らのダンシルカダベリン（dansylcadaverine）法（文献：Nishida J.，et al．(1984)，Thromb．Res.，vol．36，p.123〜131）を用いた。ダンシルカダベリン（ヤトロン社より購入）は第XIII因子の基質となる蛍光アミンであり、第XIII因子の作用によりカゼインとダンシルカダベリン−カゼイン複合体を形成し、反応後、ゲル濾過で分取した当該複合体の蛍光強度を測定することで、第XIII因子の活性を測定できる。
【００１６】
【実施例】
以下に製造例、製剤例及び試験例により本発明をさらに具体的に説明する。
【００１７】
製造例１  ヒト胎盤からの第XIII因子の製造
胎盤を凍結後、微細に粉砕し、塩化ナトリウム溶液を加えて撹拌後、遠心して上清Ｉを集める。この上清Ｉについて酵素免疫測定法によりＨＢｓ抗原陰性であることを確認後、これにリバノール溶液を加えて第XIII因子を含む沈殿IIを洗浄後、ＥＤＴＡを含む塩化ナトリウム溶液を加えて撹拌する。未溶解物（沈殿III）を除いた上清IIIにＮ−セチル−塩化ピリジニウム溶液を加え、随伴蛋白質およびムコ多糖類を沈殿させた後、上清IVにリバノール溶液を加えて第XIII因子を含む沈殿Ｖを生成させる。この沈殿ＶにＥＤＴＡを含む塩化ナトリウム溶液を加えて撹拌後、未溶解物（沈殿VI）を除いた上清VIに硫酸アンモニウムを加えて第XIII因子を含む沈殿VIIを生成させる。沈殿VIIにＥＤＴＡ溶液を加え、これをＥＤＴＡ、アジ化ナトリウムを含むトリス塩酸緩衝液で透析する。pH調整後、生じた沈殿VIIIを除き、上清VIIIをゲルろ過して活性画分を集め、これに硫酸アンモニウムを加えて第XIII因子を含む沈殿IXを生成させる。この沈殿IXをＥＤＴＡを含むトリス塩酸緩衝液に溶解し、同緩衝液で透析後、pH調整して第XIII因子をオイグロブリンとして沈殿させる。このオイグロブリン沈殿をＥＤＴＡを含む塩化ナトリウム溶液に溶解後、アミノ酢酸およびショ糖を添加する。次に、硫酸アンモニウムを加えて第XIII因子を含む沈殿Ｘを生成させ、この沈殿ＸをＥＤＴＡを含む塩化ナトリウム溶液に溶解後、同溶液に透析し、次いでグルコースおよびヒト血清アルブミンを含む塩化ナトリウム溶液を用いて第XIII因子の力価を調整する。
【００１８】
製剤例１  第XIII因子の治療用外用製剤の調製１
上記の製造例１で製造した第XIII因子溶液を用いて外用製剤を調製した。即ち、第XIII因子を２４０単位／mlに力価調整し無菌濾過した後、ヒト血清アルブミン３２mg、グルコース２０mg及び塩化ナトリウム３４mgとともにガラス製バイアルに分注し、凍結乾燥した。使用時に、この凍結乾燥第XIII因子を投与時の第XIII因子の濃度が１２０単位／mlになるように注射用蒸留水で溶解し、この溶液をスプレー用溶液として使用する。
【００１９】
製剤例２  第XIII因子の治療用外用製剤の調製２
製剤例１と同様に凍結乾燥したものを、使用時に１０００単位／ml以上のアプロチニン溶液で第XIII因子の濃度が１２０単位／mlになるように溶解し、この溶液をスプレー用溶液として使用する。
【００２０】
試験例１  インビトロ（in vitro）皮膚透過実験
Sprague-Dawley系ラット（雄、９〜１０週齢、体重３００ｇ）の腹部皮膚を剃毛後、または剃毛後６０℃のウォーターバス中で、４５秒間加温して各々摘出し、約８ｃｍ2面積の経皮吸収測定用水平膜型セル（文献：John J．Windheuser，et al．(1982) J．of Pharmaceutical Sciences，vol．71，No．11，p.1211〜1213）に装着した。皮膚表面側に製剤例１又は製剤例２の製剤（濃度１２０単位／ml）を１ml塗布した。皮膚裏面側にはあらかじめ約４５ｍｌの0.05M Tris−HCl・0.15M NaCl（pH７.５）溶液を接した。セルは３７℃に保ち、８時間経皮吸収を観察した。その間、２時間ごとに２０μlサンプリングし、第XIII因子の活性を測定した。剃毛後摘出した皮膚を使用した結果を表２に、剃毛後熱処理した皮膚を使用した結果を皮膚表面側に塗布した全量を１００％として表３にそれぞれ示した。
【００２１】
【表２】
0003769035.tif 000003
（ｎ＝３）
【００２２】
【表３】
0003769035.tif 000004
（ｎ＝３）
剃毛後摘出した皮膚を使用した時は、製剤例１及び製剤例２ともに第XIII因子はほとんど皮膚を透過しなかったが、熱処理して火傷状態にした皮膚を使用した時は、製剤例１及び製剤例２ともに第XIII因子は皮膚をよく透過し、特にアプロチニンを含む製剤例２では良好な透過を示した。
【００２３】
試験例２  ラット熱傷モデル投与実験
ネンブタール麻酔下にSprague-Dawley系ラット（雄、９〜１０週齢、体重３００ｇ）の背部皮膚を除毛し、８５℃に熱した金属棒（７０ｇ、直径１８mm）を２０秒間皮膚にあて、熱傷を作製した。熱傷は１匹の動物に脊髄を中心に両側２ヶ所作製した。製剤例２の製剤を１日、３０単位／０.２ml熱傷皮膚表面にスプレーした。２日後に約２cm2の面積の皮膚熱傷部を摘出し、生理食塩液で洗い、0.05M Tris−HCl・0.15M NaCl（pH７.５）溶液を加え、ホモジナイズし、遠心後、上清の第XIII因子の活性を測定した。対照例として、同様の製剤を１２０単位静脈内投与し、２日後に皮膚熱傷部と同面積の背部皮膚を摘出し、0.05M Tris−HCl・0.15M NaCl（pH７.５）溶液を加え、ホモジナイズし、遠心後、上清の第XIII因子の活性を測定した。その結果として、皮膚面積１cm2あたりの第XIII因子活性値を上記で定義した第XIII因子単位で表４に示した。
【００２４】
【表４】
0003769035.tif 000005
【００２５】
表４に示す結果より、スプレー投与は、静脈内投与に比べ総投与量が1／2であるが、皮膚中の第XIII因子活性は約２倍の値を得た。この結果は、第XIII因子製剤を、創傷治癒障害の治療として静脈内投与するよりも、外用剤として投与した方が有用であることが示唆された。
【００２６】
製造例２  組み換え第XIII因子の製造
組み換え第XIII因子のアミノ酸配列はグルンドマンら(Grundmann, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1986), vol.83, p.8024-8028）の第XIII因子の第３図に記載されたアミノ酸配列のうち１番目のＳｅｒから７３１番目のＭｅｔまでのアミノ酸配列を有し、かつ８８番目のＬｅｕがＰｈｅに置換されたものである。このアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を酵母用の発現ベクターであるpEMBLyex4 (J. K. Selton, Genetic Engineering (1987), Plenum Publishing Co., vol.9, p.135-154)のポリリンカーサイトのSstＩからHind IIIの間に挿入し、第XIII因子の生産用プラスミドとした。得られた生産用プラスミドにより、酵母宿主であるCL3ABYS86 (Offenlegungsshrift DE 3804890 A1)を形質転換し、酵母細胞内に組み換え第XIII因子を産生させ、酵母破壊上清より組み換え第XIII因子を精製した。
【００２７】
製剤例３  第XIII因子の治療用外用製剤の調製３
製造例２で製造された組み換え第XIII因子溶液を、さらに１.６％ヒト血清アルブミン、１％グルコース、及び１.７％塩化ナトリウムを含む溶液で希釈し、投与時の第XIII因子の濃度が１２０単位／mlになるようにした。この溶液をスプレー用溶液として使用する。
【００２８】
試験例３  第XIII因子のインビトロ（in vitro）皮膚透過実験
Sprague-Dawley系ラット（雄、９〜１０週齢、体重３００ｇ）の腹部皮膚を剃毛後、または、剃毛後60℃のウォーターバス中で、４５秒間加温して各々摘出し、直径が７mmの経皮吸収測定用水平膜型セル（前述）に装着した。皮膚表面側に製剤例１又は製剤例３の製剤（濃度１２０単位／ml）を０.１ml塗布した。皮膚裏面側にはあらかじめ４.７mlの0.05M Tris−HCl・0.15M NaCl (pH７.５)溶液を接した。セルは37℃に保ち、８時間経皮吸収を観察した。その間、２時間ごとに２０μlサンプリングし、第XIII因子の活性を測定した。剃毛後摘出した皮膚を使用した結果を表５に、剃毛後熱処理した皮膚を使用した結果を皮膚表面側に塗布した全量を１００％として表６にそれぞれ示した。
【００２９】
【表５】
0003769035.tif 000006
【００３０】
【表６】
0003769035.tif 000007
【００３１】
即ち、組み換え第XIII因子製剤においても胎盤由来の第XIII因子製剤と同様な良好な本剤の外用剤としての有用性を示唆する成績を得た。
【００３２】
【発明の効果】
本発明の、創傷治癒に直接関与するヒト血液凝固第XIII因子を有効成分として含有する皮膚創傷治療用外用剤は、標的部位への薬物移行性および患者のコンプライアンスを高めるため非常に有用である。