(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表における配列番号６乃至９のいずれかに示すアミノ酸配列を含んでなるＬ−アスパラギナーゼ活性を有するヒトＬ−アスパラギナーゼ変異体ポリペプチド、又は、当該活性を実質的に喪失させることなく、当該変異体ポリペプチドのアミノ酸の１個又は２個以上を他のアミノ酸に置換したヒトＬ−アスパラギナーゼ変異体ポリペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載のポリペプチドを有効成分として含んでなる感受性疾患剤。
【請求項３】
悪性腫瘍、白血病又はリンパ腫治療剤としての請求項２に記載の感受性疾患剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明はＬ−アスパラギナーゼ活性を有する新規なポリペプチド、詳細には、Ｌ−アスパラギナーゼ活性を有する哺乳類由来のポリペプチドに関する。
【０００２】
【従来の技術】
Ｌ−アスパラギナーゼ（ＥＣ３．５．１．１）は、Ｌ−アスパラギンを加水分解してＬ−アスパラギン酸とアンモニアを生ずる反応を触媒する酵素である。Ｌ−アスパラギナーゼの抗腫瘍剤としての研究は、ジェー・ジー・キッズが『ジャーナル・オブ・エキスペリメンタル・メディスン』、第９８巻、５６５乃至５８２頁（１９５３年）において、モルモットの血清にリンパ腫に対する抗腫瘍作用が認められることを報告したことに端を発する。その後、ジェー・ディー・ブルームは『ネイチャー』、第１９１巻、１１１４乃至１１１５頁（１９６１年）において、この抗腫瘍作用の実体がＬ−アスパラギナーゼであることを明らかにした。現在、その作用機作は次のように説明されている。即ち、急性リンパ性白血病細胞等の腫瘍細胞は、Ｌ−アスパラギンシンテターゼを欠損しているため、生体内のＬ−アスパラギンが必須栄養素となることから、生体内にＬ−アスパラギンが不足するか存在しない条件下では増殖できないので、生き続けることができない。ところがＬ−アスパラギンは正常細胞にとっては必須栄養素ではないので、悪性腫瘍患者においては、Ｌ−アスパラギナーゼにより生体内のＬ−アスパラギンを加水分解すれば、腫瘍細胞のみを選択的に死滅させ、悪性腫瘍を治療することができるというものである。以来、Ｌ−アスパラギナーゼの抗腫瘍剤としての実用化を目指して精力的な研究が続けられ、その結果、現在では、大腸菌由来のＬ−アスパラギナーゼは白血病及びリンパ腫の治療剤として用いられるようになった。
【０００３】
しかしながら、大腸菌由来のＬ−アスパラギナーゼは、人体からみれば、所詮、異種蛋白質であり、これを配合使用する従来の治療剤は、患者に投与すると、アナフィラキシーショック、蕁麻疹、浮腫、喘鳴、呼吸困難などの過敏反応を始めとする深刻な副作用を頻発させることとなった。斯くして、従来の治療剤は用量及び投与頻度を大幅に制限せざるを得ない状況にあり、そのため、斯かる副作用を軽減乃至解消するための提案が幾つかなされてきた。
【０００４】
その第一は、特開昭５４−１１９０８２号公報に見られるように、２−Ｏ−置換ポリエチレングリコール−４，６−ジクロロ−Ｓ−トリアジンにより大腸菌由来のＬ−アスパラギナーゼにおけるアミノ基の６５％以上を封鎖し、Ｌ−アスパラギナーゼそのものを化学的に修飾しようというものである。第二は、特開平４−３２０６８４号公報又は特開昭５５−１９０１８号公報に見られるように、ある種のヒト細胞株の培養物又は人尿から、ヒトのＬ−アスパラギナーゼを採取しようというものである。第一の提案には、大量に入手の容易な大腸菌のＬ−アスパラギナーゼを利用できる利点はあるものの、修飾反応の制御が困難なうえに、副作用を完全に解消するまでには到らないという問題がある。第二の提案によるヒトのＬ−アスパラギナーゼは、大腸菌が産生するものと違って、患者に投与しても抗体を産生し難い利点はあるものの、特開平４−３２０６８４号公報に開示されたヒト細胞はＬ−アスパラギナーゼ産生能が充分高いとは言えず、Ｌ−アスパラギナーゼを量産しようとすると、細胞を大量に培養しなければならない問題があり、また特開昭５５−１９０１８号公報で開示された方法においても、工業的規模で継続して新鮮な人尿を得ることが困難であるという問題がある。
【０００５】
ところで、昨今の組換えＤＮＡ技術の進歩には目覚しいものがある。今日では、目的とするポリペプチドをコードするＤＮＡを単離することができれば、そのＤＮＡと自律複製可能なベクターから組換えＤＮＡを作製し、これを微生物や動植物の細胞に導入して得られる形質転換体を培養することにより、所望量のポリペプチドが容易に取得できるようになった。しかしながら今日に至るまで、Ｌ−アスパラギナーゼをコードする哺乳類由来のＤＮＡは未だ単離されておらず、
当然のことながら、組換えＤＮＡ技術により、哺乳類由来のＬ−アスパラギナーゼが製造されてもいない。
【０００６】
斯かる状況に鑑み、斯界においては、一刻も早く活性なＬ−アスパラギナーゼをコードする哺乳類由来のＤＮＡが単離され、その単離されたＤＮＡに組換えＤＮＡ技術を適用することにより、Ｌ−アスパラギナーゼ活性を有する哺乳類由来のポリペプチドを大量生産する技術の確立が待ち望まれている。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
この発明の第一の課題は、Ｌ−アスパラギナーゼ活性を有する哺乳類由来のポリペプチドを提供することにある。
【０００８】
この発明の第二の課題は、斯かるポリペプチドをコードするＤＮＡを提供することにある。
【０００９】
この発明の第三の課題は、斯かるポリペプチドをコードするＤＮＡと自律複製可能なベクターを含んでなる組換えＤＮＡを提供することにある。
【００１０】
この発明の第四の課題は、斯かる組換えＤＮＡを適宜宿主に導入してなる形質転換体を提供することにある。
【００１１】
この発明の第五の課題は、斯かる形質転換体を用いる上記ポリペプチドの製造法を提供することにある。
【００１２】
この発明の第六の課題は、斯かるポリペプチドを有効成分として含んでなる感受性疾患剤を提供することにある。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
この発明は、上記第一の課題をＬ−アスパラギナーゼ活性を有する哺乳類由来のポリペプチドにより解決するもである。
【００１４】
またこの発明は、上記第二の課題をＬ−アスパラギナーゼ活性を有する哺乳類由来のポリペプチドをコードするＤＮＡにより解決するものである。
【００１５】
またこの発明は、上記第三の課題をＬ−アスパラギナーゼ活性を有する哺乳類由来のポリペプチドをコードするＤＮＡと自律複製可能なベクターを含んでなる組換えＤＮＡにより解決するものである。
【００１６】
またこの発明は、上記第四の課題を、Ｌ−アスパラギナーゼ活性を有する哺乳類由来のポリペプチドをコードするＤＮＡを適宜宿主に導入してなる形質転換体により解決するものである。
【００１７】
またこの発明は、上記第五の課題を、Ｌ−アスパラギナーゼ活性を有する哺乳類由来のポリペプチドをコードするＤＮＡを適宜宿主に導入してなる形質転換体を培養し、産生したポリペプチドを培養物から採取してなるポリペプチドの製造方法により解決するものである。
【００１８】
またこの発明は、上記第六の課題を、Ｌ−アスパラギナーゼ活性を有する哺乳類由来のポリペプチドを有効成分として含んでなる感受性疾患剤により解決するものである。
【００１９】
【作用】
哺乳類由来のこの発明のポリペプチドは、Ｌ−アスパラギンに作用し、Ｌ−アスパラギン酸とアンモニアを生成する。
【００２０】
この発明のＤＮＡは、自律複製可能な適宜ベクターに挿入して組換えＤＮＡとし、この組換えＤＮＡを、通常当該ポリペプチドを産生しないけれども、容易に増殖させることのできる適宜宿主に導入して形質転換体とすることにより、当該ポリペプチドの産生を発現する。
【００２１】
この発明の複製可能な組換えＤＮＡは、通常、当該ポリペプチドを産生しないけれども、容易に増殖させることのできる適宜宿主に導入して形質転換体とすることにより、当該ポリペプチドの産生を発現する。
【００２２】
この発明の形質転換体は、培養すると、当該ポリペプチドの産生を発現する。
【００２３】
この発明の製造方法に従ってこの形質転換体を培養すれば、所望量のポリペプチドが容易に得られる。
【００２４】
この発明の感受性疾患剤は、ヒトに投与すると重篤な副作用なく、顕著な治療・予防効果を発揮する。
【００２５】
本発明者は、Ｌ−アスパラギナーゼをコードするモルモット及びヒト由来のＤＮＡを世界で初めて単離し、その塩基配列を解明するのに成功した。すなわち、モルモット由来のＤＮＡは、配列表における配列番号１５に示す塩基配列を、また、ヒト由来のＤＮＡは、配列表における配列番号１６に示す塩基配列を有していることを明らかにした。この知見は、同じ出願人による特開平８−２１４８８５号公報に開示されている。本発明はこれら知見に基づくものであって、Ｌ−アスパラギナーゼ活性を有する哺乳類由来のポリペプチドを世界で初めて提供するものである。
【００２６】
【発明の実施の形態】
この発明のポリペプチドは、それが哺乳類に由来するものであって、かつ、Ｌ−アスパラギナーゼ活性を有する限りその出所・由来は問わない。この発明のポリペプチドは哺乳類由来の遺伝子を発現させることにより得ることができ、通常、配列表における配列番号１、２及び３に示すアミノ酸配列を含んでいる。ただし、その配列番号３に示すアミノ酸配列において、符号「Ｘａａ」を付して示したアミノ酸はグルタミン又はアルギニンを表すものとする。個々のポリペプチドとしては、例えば、配列表における配列番号４乃至９に示すいずれかのアミノ酸配列のポリペプチドが挙げられる。ただし、斯界の技術水準に鑑み、その配列番号４乃至９に示すアミノ酸配列に対して、Ｌ−アスパラギナーゼ活性を実質的に喪失させることなく、そのアミノ酸の１個又は２個以上を他のアミノ酸で置換することは比較的容易である。一方、同じＤＮＡに由来するポリペプチドであっても、それを導入する際に用いるベクターの種類や、それを導入する宿主の種類又はそのＤＮＡを含む形質転換体の培養に使用する培地の成分・組成や培養温度・ｐＨなどによっては、宿主内酵素によるＤＮＡ発現後の修飾や精製の過程で、所期の活性は保持しているものの、Ｎ末端及び／又はＣ末端におけるアミノ酸が１個又は２個以上欠失するか、Ｎ末端及び／又はＣ末端に１個又は２個以上のアミノ酸が付加したり、産生したポリペプチドに糖鎖の付加が生じることがある。斯かる状況に鑑み、配列表における配列番号４乃至９に示すいずれかのアミノ酸配列をそっくりそのまま有するポリペプチドは言うに及ばず、Ｌ−アスパラギナーゼ活性を有する限り、それらの相同体も、当然この発明に包含される。なお、この発明のポリペプチドは、通常多量体の形態、望ましくは、４量体の形態をとるときにＬ−アスパラギナーゼ活性を有する。
【００２７】
この発明のポリペプチドは、通常、組換えＤＮＡ技術により製造される。すなわち、この発明のポリペプチドは、通常、それをコードするＤＮＡを含む形質転換体を培養し、産生したポリペプチドを培養物から採取することにより製造することができる。斯かる形質転換体は、例えば、配列表における配列番号１０乃至１５に示すいずれかの塩基配列を含んでいる組換えＤＮＡを適宜宿主に導入することにより得ることができる。なお上記の塩基配列は、遺伝子コードの縮重を利用して、コードするアミノ酸配列を変えることなく、塩基の１個又は２個以上を他の塩基で置き換えても良い。また、ＤＮＡの宿主中での当該ポリペプチドの産生を促すために、当該ポリペプチド又はその相同体をコードする塩基配列における、塩基の１個又は２個以上を他の塩基で適宜置換し得ることは云うまでもない。さらには、当該ポリペプチド又はその相同体をコードする塩基配列における塩基の５′末端及び／又は３′末端に１個又は２個以上のアミノ酸をコードする配列及び／又はアミノ酸をコードしない配列を付加し得ることも云うまでもない。
【００２８】
この発明のポリペプチドをコードするＤＮＡは、その発現産物たるポリペプチドがＬ−アスパラギナーゼ活性を有している限り、それが天然から得られたものであっても、人為的に合成されたものであってもかまわないし、また天然から得られたものと配列の一致する野生型ＤＮＡであっても、野生型ＤＮＡに対するＤＮＡ相同体であっても構わない。この発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの天然の給源としては、例えば、モルモットの肝臓が挙げられ、そこからは常法により、例えば、配列番号１５に示す塩基配列を含んでいる野生型ＤＮＡが得られる。すなわち、同じ出願人による特開平８−２１４８８５号公報に開示されているように、先ず、モルモット肝臓より精製したポリ（Ａ）付加ＲＮＡを材料として、常法によりｃＤＮＡライブラリーを作製する。ここに、モルモット血清より精製したＬ−アスパラギナーゼの部分アミノ酸配列に基づき化学合成したオリゴヌクレオチドをプローブとして用いて、プラークハイブリダイゼーション法を適用し、この発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを含むファージクローンを採取する。斯くして得られたファージクローンを通常一般の方法により処理すれば、当該ＤＮＡが得られる。また、配列表における配列番号１５に基づいてＤＮＡを化学合成することも可能である。野生型ＤＮＡに対する相同体の例としては、例えば、配列表における配列番号１０乃至１４に示す塩基配列を含む個々のＤＮＡが挙げられる。配列表における配列番号１０に示す塩基配列を含むＤＮＡは、配列表における配列番号１５に示す、上述のようにして得られる野生型ＤＮＡに、斯界において慣用の方法、例えば、ＰＣＲ法や点突然変異導入法を、配列表における配列番号１０の塩基配列に基づいて適用することにより得ることができる。配列表における配列番号１１乃至１４に示す塩基配列を含むＤＮＡは、いずれも以下のようにして得ることができる。すなわち、先ず、同じ出願人による特開平８−２１４８８５号公報に開示されたような、ヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング等により、配列表における配列番号１６に示す塩基配列を含む野生型ＤＮＡを得る。そして次に、この野生型ＤＮＡに、斯界において慣用のＰＣＲ法や点突然変異導入法などを、配列表における配列番号１１乃至１４の塩基配列に基づき適用すればよい。また、配列表における配列番号１０乃至１４に示す塩基配列に基づいてＤＮＡを化学合成することも可能である。
【００２９】
斯かるＤＮＡは、通常、組換えＤＮＡの形態で宿主に導入される。組換えＤＮＡは、通常ＤＮＡと自律複製可能なベクターを含んでなり、ＤＮＡが入手できれば、通常一般の組換えＤＮＡ技術により比較的容易に調製することができる。斯かるベクターの例としては、例えば、ｐＫＫ２２３−３、ｐＧＥＸ−２Ｔ、ｐＲＬ−λ、ｐＢＴｒｐ２  ＤＮＡ、ｐＵＢ１１０、ＹＥｐ１３、Ｔｉプラスミド、Ｒｉプラスミド、ｐＢＩ１２１、ｐＣＤＭ８、ｐＢＰＶ、ＢＣＭＧＳｎｅｏ等のプラスミドベクターが挙げられ、このうち、この発明のＤＮＡを大腸菌、枯草菌等の原核細胞で発現させるにはｐＫＫ２２３−３、ｐＧＥＸ−２Ｔ、ｐＲＬ−λ、ｐＢＴｒｐ２  ＤＮＡおよびｐＵＢ１１０が、また酵母或いは動植物由来の細胞すなわち、真核細胞で発現させるにはＹＥｐ１３、Ｔｉプラスミド、Ｒｉプラスミド、ｐＢＩ１２１、ｐＣＤＭ８、ｐＢＰＶ及びＢＣＭＧＳｎｅｏが好適である。
【００３０】
斯かるベクターにこの発明のＤＮＡを挿入するには、斯界において通常一般の方法が採用される。具体的には、例えば、先ず、自律複製可能なベクターを制限酵素により切断する。次にＰＣＲ法を応用して、この発明のＤＮＡの５′末端及び３′末端に、先にベクターの切断に用いたのと同一の制限酵素切断部位を導入し二本鎖とした後、同制限酵素で切断する。次に、該ベクターと該ＤＮＡ断片の混合液に、ＤＮＡリガーゼを作用させて連結する。斯くして得られた組換えＤＮＡは、適宜宿主に導入して形質転換体とし、これを培養することにより無限に複製可能である。
【００３１】
この発明による組換えＤＮＡは、大腸菌、枯草菌、放線菌、酵母、植物細胞、動物細胞を始めとする適宜の宿主に導入することができる。宿主が大腸菌の場合には、例えば、宿主を組換えＤＮＡとカルシウムイオンの存在下で培養すればよく、一方宿主が枯草菌の場合には、例えば、コンピテントセル法やプロトプラスト法を適用すればよい。また宿主が動物細胞の場合には、例えば、ＤＥＡＥ−デキストラン法やエレクトロポレーション法によればよい。形質転換体をクローニングするには、ハイブリダイゼーション法を適用するか、培地で培養し、Ｌ−アスパラギナーゼを産生するものを選択すればよい。
【００３２】
斯くして得られる形質転換体は、培地で培養すると、菌体内外又は細胞内外に当該ポリペプチドを産生する。培地には、通常、炭素源、窒素源、ミネラルさらには必要に応じてアミノ酸やビタミンなどの微量栄養素を補足した通常一般の液体培地が使用され、ここの炭素源としては、澱粉、澱粉加水分解物、グルコース、果糖、蔗糖などの糖質が、また窒素源としては、例えばアンモニア乃至アンモニウム塩、尿素、硝酸塩、ペプトン、酵母エキス、脱脂大豆、コーンスティープリカー、肉エキスなどの含窒素無機乃至有機物が挙げられる。形質転換体を斯かる培地に接種し、栄養培地を温度２５乃至６５℃、ｐＨ５乃至８に保ちつつ、通気攪拌などによる好気的条件下で約１乃至１０日間培養すれば、当該ポリペプチドを含む培養物が得られる。この培養物は、感受性疾患剤としてそのまま使用可能なこともあるが、通常は、例えば、使用に先立ち必要に応じて、超音波や細胞壁溶解酵素により菌体又は細胞を破砕した後、濾過、遠心分離などにより当該ポリペプチドを菌体破砕物又は細胞破砕物から分離し、精製する。又例えば、培養物から菌体又は細胞を濾過、遠心分離などにより除去した培養上清を回収し、精製する。精製には、菌体又は細胞破砕物由来の不溶性成分を除去した上澄液や、培養上清に、例えば、塩析、透析、濾過、濃縮、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、等電点電気泳動及びゲル電気泳動などの、蛋白質を精製するための斯界における通常一般の方法が採用でき、必要に応じて、これら方法を適宜組み合わせればよい。そして、最終使用形態に応じて、精製したポリペプチドを濃縮・凍結乾燥して液状又は固状にすればよい。
【００３３】
以下、実験例に基づき説明するが、ここで用いられる方法は斯界において慣用のものであり、例えば、ジェイ・サムブルックら、『モレキュラー・クローニング・ア・ラボラトリー・マニュアル』（１９８９年）、コールド・スプリング・ハーバー発行や、松村正実、『ラボマニュアル遺伝子工学』（１９８８年）、丸善発行などにも詳述されている。
【００３４】
【実験例１】
〈モルモット及びヒト由来の野生型ＤＮＡの発現〉
【００３５】
【実験例１−１】
〈モルモット由来の野生型ＤＮＡの発現〉
【００３６】
【実験例１−１（ａ）】
〈モルモット由来の野生型ＤＮＡの調製〉
モルモット由来のＬ−アスパラギナーゼをコードする野生型ＤＮＡは、同じ出願人による特開平８−２１４８８５号公報に開示された方法に準じて調製した。このＤＮＡは、配列表における配列番号１５に示す塩基配列を有していた。以後、その配列番号１５に示す塩基配列において、ポリペプチドをコードする領域すなわち、当該塩基配列における第２０乃至第１７１４の塩基よりなる配列を有するＤＮＡを『ＧＰＡ／ＷＴ  ＤＮＡ』と呼ぶ。また、ＧＰＡ／ＷＴ  ＤＮＡの発現産物たる、配列表における配列番号１５に並記したアミノ酸配列を有するポリペプチドを、以後『モルモット野生型Ｌ−アスパラギナーゼ』と呼ぶ。なお、配列表における配列番号１７には、ＧＰＡ／ＷＴ  ＤＮＡの塩基配列とともに、そのコードするアミノ酸配列が併記されている。
【００３７】
【実験例１−１（ｂ）】
〈組換えＤＮＡの調製〉
０．５ｍｌ容反応管に１０×ＰＣＲ緩衝液を１０μｌ、２５ｍＭ  ｄＮＴＰミックスを１μｌ、鋳型として、実験例１−１（ａ）で得たモルモット由来のＬ−アスパラギナーゼをコードする野生型ＤＮＡを１ｎｇとり、配列表の配列番号１５に並記したアミノ酸配列におけるＮ末端及びＣ末端付近の配列に基づき化学合成したオリゴヌクレオチドをセンスプライマー及びアンチセンスプライマーとして適量加え、滅菌蒸留水で９９．５μｌとした後、２．５単位／μｌアンプリタックＤＮＡポリメラーゼを０．５μｌ加えた。センスプライマーは、配列が５′−ＡＡＴＣＴＣＧＡＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＧＣＧＣＧＣＡＴＣＡ−３′であり、配列表における配列番号１５に併記したアミノ酸配列のＮ末端をコードする部分の上流に、エム・コザックが『ニュークレイック・アシッド・リサーチ』、第１５巻、８１２５乃至８１４８頁（１９８７年）に示した動物細胞における共通配列を付加し、さらにその上流に制限酵素Ｘｈｏ  Ｉ切断部位を付加したものである。アンチセンスプライマーは、配列が５′−ＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＴＣＡＧＡＴＧＧＣＡＧＧＣＧＧＣＡＣ−３′であり、配列表における配列番号１５に併記したアミノ酸配列のＣ末端をコードする部分の下流に２個の終始コドンを付加し、さらにその下流に制限酵素Ｎｏｔ  Ｉ切断部位を付加した配列に相補的な配列のものである。常法により、上記混合物を９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で３分間の順序でインキュベートするサイクルを４０回繰り返すことによりＰＣＲを行いＤＮＡを増幅させ、ＧＰＡ／ＷＴ  ＤＮＡを含むＤＮＡを得た。このＤＮＡを制限酵素Ｘｈｏ  Ｉ及びＮｏｔ  Ｉで切断することにより得られる約１．７ｋｂｐのＤＮＡ断片を２５ｎｇとり、これに予め制限酵素ＸｈｏＩ及びＮｏｔ  Ｉで切断しておいたインビトロジェン社製プラスミドベクター『ｐＣＤＭ８』を１０ｎｇを加え、さらに宝酒造製ライゲーション・キット・バージョン２の溶液Ｉを先のＤＮＡ混合溶液と同容量加えた後、１６℃で２時間インキュベートして、複製可能な組換えＤＮＡ『ｐＣＧＰＡ／ＷＴ』を得た。
【００３８】
組換えＤＮＡ  ｐＣＧＰＡ／ＷＴをコンピテントセル法によりインビトロジェン社製大腸菌ＭＣ１０６１／Ｐ３株に導入し、得られた形質転換体を２０μｇ／ｍｌのアンピシリン及び１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含むＬブロス培地（ｐＨ７．２）に接種し、３７℃で１８時間振とう培養した。培養物を遠心分離して形質転換体を採取し、通常のアルカリ−ＳＤＳ法を適用して組換えＤＮＡ  ｐＣＧＰＡ／ＷＴを抽出した。蛍光光度計を使用する自動シーケンサにより分析したところｐＣＧＰＡ／ＷＴは、その３′末端に終止コドンが連結されたＧＰＡ／ＷＴ  ＤＮＡを含んでおり、またＧＰＡ／ＷＴ  ＤＮＡは、ＣＭＶプロモーター下流に５′末端から３′末端方向に連結されていることが確認された。
【００３９】
実験例１乃び後述する実験例２でのＤＮＡの発現には、いずれもサル腎臓由来の細胞株であるＣＯＳ−１細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６５０）を宿主とした系を用いた。この系は一過性発現系であるため、形質転換体内では導入されたＤＮＡが安定して、すなわち数日を超えて保持されず、形質転換体を用いて繰り返し目的とするペプチドを産生できないという欠点がある。しかし、該細胞に先述のプラスミドベクター『ｐＣＤＭ８』のようなＳＶ４０ウイルス複製起点を有するベクターを導入した場合には、その細胞あたりのコピー数が一次的に １０5個程度に上昇することが知られており、このために目的とするＤＮＡの発現産物の解析が極めて容易であるという利点がある。
【００４０】
【実験例１−１（ｃ）】
〈組換えＤＮＡのＣＯＳ−１細胞への導入と発現〉
実施例１−１（ｂ）で調製した組換えＤＮＡ  ｐＣＧＰＡ／ＷＴを、フレデリック・エム・オースベルらが『カレント・プロトコール・イン・モレキュラー・バイオロジー』（１９８７年）、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ・インク発行、チャプター９．２．１乃至９．２．３及び、チャプター９．２．５乃至９．２．６で紹介しているＤＥＡＥ−デキストラン法に準じてＣＯＳ−１細胞に導入し、発現させた。詳細には、先ず口径３．５ｃｍのベクトン・ディッキンソン・ラブウェア製６穴マルチウエルプレート『３０４６』の１穴に２．５ｍｌの１０％（ｖ／ｖ）牛胎児血清を含むＤＭＥ培地を入れ、１．８×１０5 個のＣＯＳ−１細胞を接種し、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ2 インキュベーター内で３７℃で培養した。翌日、培養上清をアスピレーターで除去し、５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．４）を含むＤＭＥ培地で細胞を洗浄後、２．８μｇ／ｍｌのｐＣＧＰＡ／ＷＴ、５０ｍＭのトリス−塩酸（ｐＨ７．４）、０．４ｍｇ／ｍｌのＤＥＡＥ−デキストラン、０．１ｍＭのクロロキンを含むＤＭＥ培地を、１穴あたり２．５ｍｌずつ加え、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ2 インキュベーター内で３７℃で４時間静置した。その後上清を除去し１０（ｖ／ｖ）％ＤＭＳＯを含む１０ｍＭリン酸食塩緩衝液（以後ＰＢＳという）を１穴当たり２．５ｍｌ添加して室温で２分間静置し、上清を除去して５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．４）を含むＤＭＥ培地で細胞を洗浄し、２．５ｍｌのコスモバイオ社製ＣＯＳ培地を加え、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ2 インキュベーター内で３７℃で３日間培養し、目的ＤＮＡを発現させた。なお、対照区としてプラスミドベクターｐＣＤＭ８を用いてこれと同一の実験をも行った。
【００４１】
３日間培養した後の、先述の培養器を−８０℃で静置して凍結させた後、室温で融解させる操作を３回繰り返して細胞を破砕させた。その後全培養物を遠沈管に移し取り、遠心分離により不溶性成分を沈澱として除去し、全可溶性画分を得た。そしてこれを膜濃縮し、１穴由来の全可溶性画分を０．５ｍｌに調整して、以降の分析に用いた。
【００４２】
【実験例１−１（ｄ）】
〈Ｌ−アスパラギナーゼ活性の測定〉
Ｌ−アスパラギナーゼ活性は、次のようにして測定した活性値（単位）で表示した。すなわち、１．５ｍｌ反応管に被検試料を５０μｌずつ分注する一方、Ｌ−アスパラギンを１．４ｍｇ／ｍｌになるように５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、溶液を１反応管あたり２００μｌずつ加え反応混合液とした。同反応管を３７℃で０、１、２、４、６及び１６時間静置した後、反応混合液中のＬ−アスパラギン酸をアミノ酸分析機により測定した。これと並行して、１．０、０．５又は０．２５単位／ｍｌに希釈した大腸菌由来のＬ−アスパラギナーゼ標品を用いる系を設け、３７℃で０及び１時間静置した後、Ｌ−アスパラギン酸測定結果から求めたＬ−アスパラギン酸の増加量に基づき検量線を作成した。被検試料の系で測定されたＬ−アスパラギン酸の増加量をこの検量線に内挿し、被検試料の活性値を推定した。活性の低い被検試料は反応時間を２時間以上にのばした系での測定結果から活性値を推定した。なお、Ｌ−アスパラギナーゼ１単位は、上記条件下で反応させたとき、１分間にＬ−アスパラギンからアンモニアを１μｍｏｌ遊離する量と定義した。
【００４３】
実験例１−１（ｃ）で得た全可溶性画分それぞれにこの処理を施し、３．６×１０5 個のＣＯＳ−１細胞由来の全可溶性画分中に検出されたＬ−アスパラギナーゼ活性の総量として表示した。その結果、モルモット野生型Ｌ−アスパラギナーゼの活性は０．０８３単位であった。対照区では、検出されなかった。
【００４４】
【実験例１−１（ｅ）】
〈ウエスタン・ブロッティング〉
先ず以下の方法により、抗Ｌ−アスパラギナーゼ抗体を調製した。すなわち、常法に従って化学合成した、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｃｙｓにより表される配列のオリゴペプチドのＣ末端にキーホール・リンペット・ヘモシアニンを結合させ、精製した後、常法に従いウサギに免疫した。２週間間隔で６回免疫した後、全採血し５０％（ｗ／ｖ）硫安塩析にて精製し、抗Ｌ−アスパラギナーゼ・ウサギ抗血清を得た。次に、ユー・ケー・レムリが『ネイチャー』、第２２７巻、６８０乃至６８５頁（１９７０年）に報告した方法に準じて、実験例１−１（ｃ）で得た、全可溶性画分のうち０．２ｍｌを、還元剤存在下で１２．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（以後ＳＤＳ−ＰＡＧＥという）に供し、泳動された全ポリペプチドをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルからニトロセルロース膜に転写した後、先の抗Ｌ−アスパラギナーゼ・ウサギ抗血清を用いて、エイチ・トービンが『プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ユー・エス・エー』、第７６巻、４３５０乃至４３５４頁（１９７９年）に報告した方法に準じてウエスタン・ブロッティングを行った。発色はアルカリフォスファターゼ発色系によった。対照と比較して、試料で特異的に染色されたバンドを確認するとともに、染色されたバンドを分子量マーカーと比較してＬ−アスパラギナーゼのサブユニットあたりの分子量を求めた。用いた分子量マーカーは、ウシ血清アルブミン（６７ｋＤａ）、オボアルブミン（４５ｋＤａ）、大豆トリプシンインヒビター（２０．１ｋＤａ）及びα−ラクトアルブミン（１４．４ｋＤａ）であり、これらはアミドブラックにて染色した。実験例１−１（ｃ）で得た全可溶性画分は明瞭なバンドは示さなかった。
【００４５】
【実験例１−１（ｆ）】
〈ゲル濾過による分子量の測定〉
次に実験例１−１（ｃ）で得た、ＣＯＳ−１細胞由来の全可溶性画分のうち２ｍｌを、ＰＢＳで平衡化したファルマシア製『ハイロード・スーパーデックス・２００・カラム』（内径１６ｍｍ×６０ｃｍ）を用いてゲル濾過カラムクロマトグラフィーに供し、溶出フラクションのＬ−アスパラギナーゼ活性を調べることにより、モルモット野生型Ｌ−アスパラギナーゼのネイティブな分子量を調べた。分子量マーカーとして、チログロブリン（６６９ｋＤａ）、フェリチン（４４０ｋＤａ）、カタラーゼ（２３２ｋＤａ）、アルドラーゼ（１５８ｋＤａ）、ウシ血清アルブミン（６７ｋＤａ）及びオボアルブミン（４３ｋＤａ）を用た。その結果、溶出画分のＬ−アスパラギナーゼ活性のピークは分子量約３００ｋＤａに相当する位置に認められた。
【００４６】
ウエスタン・ブロッティングでは明瞭なバンドを示さなかったため、モルモット野生型Ｌ−アスパラギナーゼの解離した状態での分子量は測定できなかった。そのネイティブな状態での分子量は、ゲル濾過の結果から、約３００ｋＤａと見積もられた。これに対して、モルモット血清Ｌ−アスパラギナーゼを精製し、ネイティブな状態での分子量をゲル濾過により分子量を求めると、約１９０ｋＤａと見積もられる。因みに、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解離した状態での分子量を求めると約４３ｋＤａと見積もられる。一方、同じ出願人による特開平８−２１４８８５号公報に開示されたモルモット血清Ｌ−アスパラギナーゼの３個の部分アミノ酸配列は、モルモット野生型Ｌ−アスパラギナーゼのアミノ酸配列における、第１０乃至第２３６のアミノ酸残基よりなる領域内に認められる。また、イー・ハームズらが『フェブス・レター』、第２８５巻、５５乃至５８頁（１９９１年）で大腸菌由来のＬ−アスパラギナーゼ等を用いた実験結果から提唱した、Ｌ−アスパラギナーゼ活性に必須な２つの共通配列すなわち、配列表における配列番号１及び２に示すアミノ酸配列は、モルモット野生型Ｌ−アスパラギナーゼのアミノ酸配列上ではそれぞれ、第１６乃至第１９のアミノ酸残基及び第１１４乃至第１１８のアミノ酸残基よりなる配列と一致する。これらのことと実験例１−１に示した結果から本発明者は、モルモット野生型Ｌ−アスパラギナーゼにとって、当該アミノ酸配列における第１乃至第４００のアミノ酸残基又はその前後のアミノ酸残基よりなる部分が、その活性発現に必須であろうと推測した。そこで、実験例２−１ではモルモット由来のＬ−アスパラギナーゼ相同体であるＣ末端欠失変異体の活性を調べるべく、モルモット由来のＤＮＡ相同体の発現産物の性質・性状について試験する。
【００４７】
【実験例１−２】
〈ヒト由来の野生型ＤＮＡの発現〉
ヒト由来のＬ−アスパラギナーゼをコードする野生型ＤＮＡは、同じ出願人による特開平８−２１４８８５号公報に開示された方法に準じて調製した。このＤＮＡは配列表における配列番号１６に示す塩基配列を有していた。以後、その配列番号１６に示す塩基配列においてポリペプチドをコードする領域すなわち、当該塩基配列における第９３乃至第１８１１の塩基よりなる配列を有するＤＮＡを『ＨＡ／ＷＴ  ＤＮＡ』と呼ぶ。また、ＨＡ／ＷＴ  ＤＮＡの発現産物たる配列番号１６に並記したアミノ酸配列を有するポリペプチドを、以後『ヒト野生型Ｌ−アスパラギナーゼ』と呼ぶこともある。なお、配列表における配列番号１８には、ＨＡ／ＷＴ  ＤＮＡの塩基配列とともに、そのコードするアミノ酸配列が併記されている。
【００４８】
鋳型、センスプライマー及びアンチセンスプライマー以外は実験例１−１（ｂ）と同一の条件でＰＣＲを行った。鋳型は、この実験例１−２で得たヒト由来のＬ−アスパラギナーゼをコードする野生型ＤＮＡ、センスプライマーは配列が５′−ＡＡＴＣＴＣＧＡＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＧＣＧＣＧＣＧＧＴＧ−３′であるオリゴヌクレオチド、アンチセンスプライマーは配列が５′−ＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＴＣＡＧＡＣＡＣＣＡＧＧＣＡＧＣＡＣ−３′であるオリゴヌクレオチドであった。この結果増幅されたＤＮＡを引き続き実験例１−１（ｂ）と同じ方法で処理し、組換えＤＮＡ『ｐＣＨＡ／ＷＴ』を調製した。同様に配列を確認した後、ＣＯＳ−１細胞に導入し、発現させて、実験例１−１と同様に分析した。
【００４９】
モルモット野生型Ｌ−アスパラギナーゼとは対照的に、ヒト野生型Ｌ−アスパラギナーゼは、本実験系においては活性が検出できなかった。この原因のひとつとして、例えば、ヒト野生型Ｌ−アスパラギナーゼはモルモット野生型Ｌ−アスパラギナーゼに比べ、比活性が低いことが考えられた。そこで、次の実験例２−２においては、ヒト由来のＤＮＡ相同体の発現産物の性質・性状について試験する。
【００５０】
【実験例２】
〈モルモット及びヒト由来のＤＮＡ相同体の発現〉
【００５１】
【実験例２−１】
〈モルモット由来のＤＮＡ相同体の発現〉
モルモット由来の野生型ＤＮＡの、特定の位置の塩基配列が終止コドンに置換されたＤＮＡ相同体を次のように調製した。すなわち、配列表の配列番号１７に示す塩基配列における、第１０９０乃至第１０９２の塩基よりなる配列を終止コドンに置換したＤＮＡ、及び第１０１２乃至第１０１４の塩基よりなる配列を終止コドンに置換したＤＮＡを、ＰＣＲ法を適用して調製した。アンチセンスプライマーの配列以外は、全て実験例１−１（ｂ）と同一の条件でＰＣＲを行った。それぞれのＤＮＡ調製のために使用したアンチセンスプライマーの配列は、５′−ＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＴＣＡＴＧＣＣＧＴＧＧＧＣＡＧＴＧＴ−３′及び５′−ＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＴＣＡＧＣＣＣＡＡＣＡＣＧＴＡＧＧＡ−３′であった。この結果増幅されたＤＮＡを引き続き実験例１−１（ｂ）と同様に処理し、組換えＤＮＡ『ｐＣＧＰＡ／Ｄ３６４ｓｔｐ』及び『ｐＣＧＰＡ／Ｌ３３８ｓｔｐ』を調製した。同様に配列を確認したところ、ｐＣＧＰＡ／Ｄ３６４ｓｔｐ及びｐＣＧＰＡ／Ｌ３３８ｓｔｐは、それぞれモルモット野生型Ｌ−アスパラギナーゼにおける、第１乃至第３６３のアミノ酸残基及び第１乃至第３３７のアミノ酸残基よりなる配列をコードするＤＮＡと、それぞれの３′末端側に介在配列なく存在する終止コドンを含むものでった。以後これらのポリペプチドをコードする部分のＤＮＡを、それぞれ『ＧＰＡ／Ｄ３６４ｓｔｐ  ＤＮＡ』及び『ＧＰＡ／Ｌ３３８ｓｔｐ  ＤＮＡ』と呼ぶ。ＧＰＡ／Ｄ３６４ｓｔｐ  ＤＮＡ及びＧＰＡ／Ｌ３３８ｓｔｐ  ＤＮＡはＣＭＶプロモーター下流に、５′末端から３′末端方向に連結されていた。以後これらのＤＮＡの発現産物を『モルモットＬ−アスパラギナーゼ相同体』と呼ぶこともある。
【００５２】
これら組換えＤＮＡを、実験例１−１に従ってＣＯＳ−１細胞に導入した後、同様に試験した。対照区として、実験例１−１（ｂ）で調製した組換えＤＮＡ  ｐＣＧＰＡ／ＷＴ及びｐＣＤＭ８を同様に処理し試験した。結果を表１に示す。
【００５３】
【表１】
0003819540.tif 000002
【００５４】
表１に示したように、上記のモルモットに由来する野生型ＤＮＡ及びその相同体のうち、ＧＰＡ／ＷＴ  ＤＮＡ及びＧＰＡ／Ｄ３６４ｓｔｐ  ＤＮＡの発現産物では活性が認められたが、ＧＰＡ／Ｌ３３８ｓｔｐ  ＤＮＡ発現産物では活性は検出されなかった。このことは、モルモット由来のＬ−アスパラギナーゼが十分な活性を示すためには、野生型Ｌ−アスパラギナーゼのアミノ酸配列上、第１乃至第３６３のアミノ酸残基よりなる領域があれば十分であることを示唆している。この第１乃至第３６３のアミノ酸残基よりなる配列は、配列表における配列番号４に示したものである。これをコードするＤＮＡの塩基配列は、配列表における配列番号１０に示したものである。またモルモット野生型Ｌ−アスパラギナーゼのアミノ酸配列は、配列表における配列番号５に示されている。
【００５５】
【実験例２−２】
〈ヒト由来のＤＮＡ相同体の発現〉
ヒト由来の野生型ＤＮＡの特定の位置の塩基配列を終止コドン又は他のアミノ酸に対するコドンに置換したＤＮＡ相同体を調製した。先ず、配列表の配列番号１８に示す塩基配列における第１０９６乃至第１０９８の塩基よりなる配列を終止コドンに置換したＤＮＡ相同体を、ＰＣＲ法を適用して調製した。すなわち、鋳型、センスプライマー及びアンチセンスプライマー以外は、全て実験例１−１（ｂ）と同一の条件でＰＣＲを行った。鋳型は、実験例１−２で得たヒト由来のＬ−アスパラギナーゼをコードする野生型ＤＮＡ、センスプライマーは配列が５′−ＡＡＴＣＴＣＧＡＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＧＣＧＣＧＣＧＧＴＧ−３′であるオリゴヌクレオチド、アンチセンスプライマーは配列が、５′−ＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＴＴＡＣＡＣＣＧＡＧＧＧＴＧＧＣＧＴ−３′であるオリゴヌクレオチドであった。この結果増幅されたＤＮＡを実験例１−１に従って処理し、組換えＤＮＡ『ｐＣＨＡ／Ｅ３６６ｓｔｐ』を調製し、配列を確認した。ｐＣＨＡ／Ｅ３６６ｓｔｐは、配列表の配列番号１６に併記したアミノ酸配列における第１乃至第３６５のアミノ酸残基よりなる配列をコードするＤＮＡと、その３′末端に介在配列なく存在する終止コドンを含むものであった。以後このコード部分のＤＮＡを『ＨＡ／Ｅ３６６ｓｔｐ  ＤＮＡ』と呼ぶ。ＨＡ／Ｅ３６６ｓｔｐＤＮＡは、ＣＭＶプロモーターの下流に５′末端から３′末端方向に連結されていた。
【００５６】
ＤＮＡの特定の位置のコドンを他のアミノ酸に対するコドンへ置換するには、ロバート・エム・ホートンらが『メソッズ・イン・エンザイモロジー』、アカデミック・プレス発行、第２１７巻、２７０乃至２７９頁（１９９３年）で紹介しているオーバーラップ・エクステンション法に従って行った。その概要を図１に示すと共に以下に説明する。第１、変異を導入すべき位置の塩基を、目的とする別の塩基に置換した互いに相補な変異プライマーＡ及び変異プライマーＳを調製する。ここで、変異プライマーＡはアンチセンス鎖であり、変異プライマーＳはセンス鎖である。他方、目的とするＤＮＡの全域を増幅し得るプライマーのセット、すなわち、５′末端プライマー及び３′末端プライマーを調製する。ここで５′末端プライマーはセンス鎖であり、３′末端プライマーはアンチセンス鎖である。第２、基の塩基配列のＤＮＡを鋳型として、先の５′末端プライマーと変異プライマーＡを用いて通常のＰＣＲを行う。これと並行して、同じＤＮＡを鋳型として、先の３′末端プライマーと変異プライマーＳを用いて通常のＰＣＲを行う（第１段ＰＣＲ）。第３、第１段ＰＣＲにより増幅した２つのＤＮＡ、第１段ＰＣＲで使用した５′末端プライマー及び３′末端プライマーを、同一の反応管で混合し、ＰＣＲを行う（第２段ＰＣＲ）。第１段ＰＣＲで増幅された２つのＤＮＡ断片は、鋳型兼プライマーとして変異が導入されたＤＮＡの生成に用いられ、５′末端プライマー及び３′末端プライマーは変異が導入されたＤＮＡ増幅のためのプライマーとして用いられる。この方法により、７とおりの塩基置換を導入したＤＮＡすなわち、７種のＤＮＡ相同体を調製した。７とおりの塩基置換の内容と、それに伴うアミノ酸配列の変化の内容を表２にまとめて示した。この７種のＤＮＡ相同体の調製に用いた、鋳型ＤＮＡと変異プライマーＡ及び変異プライマーＳの配列を表３にまとめて示した。一方、７個のＤＮＡ相同体の調製に用いた、５′末端プライマー及び３′末端プライマーはそれぞれ、この実験例２−２で先に示したｐＣＨＡ／Ｅ３６６ｓｔｐの調製時に用いたセンスプライマー及びアンチセンスプライマーと同一である。
【００５７】
【表２】
0003819540.tif 000003
【００５８】
【表３】
0003819540.tif 000004
【００５９】
ここで得たヒト由来のＤＮＡ相同体を実験例１−１に従って処理し、組換えＤＮＡ『ｐＣＨＡ／ＭＵＴ１』、『ｐＣＨＡ／ＭＵＴ２』、『ｐＣＨＡ／ＭＵＴ３』、『ｐＣＨＡ／ＭＵＴ４』、『ｐＣＨＡ／ＭＵＴ５』、『ｐＣＨＡ／ＭＵＴ６』及び『ｐＣＨＡ／ＭＵＴ７』を得た。以後、この実験例２−２で得た、以上のＤＮＡ相同体の発現産物を、『ヒトＬ−アスパラギナーゼ相同体』と呼ぶこともある。同様に配列を確認した後、ＣＯＳ−１細胞へ導入し発現させ、試験した。対照区として、実験例１−２で得たｐＣＨＡ／ＷＴ及びｐＣＤＭ８を同様に処理・試験した。また、この実験例２−２では各発現産物の量的な比較のための参考としてウエスタン・ブロッティングで検出されたバンドのシグナル強度を、デンシトメトリーにより数値化した。以上の結果を表４に示した。
【００６０】
【表４】
0003819540.tif 000005
【００６１】
表４の結果は、ヒト由来のＬ−アスパラギナーゼは野生型でも、その相同体の一つであるＣ末端欠失変異体（ＨＡ／Ｅ３６６ｓｔｐ  ＤＮＡ発現産物）でもモルモット由来のそれらに比べ、比活性が低いことを示唆している。また、これに対し、ヒト由来の野生型Ｌ−アスパラギナーゼ本来のアミノ酸配列の内のいくつかを他のアミノ酸に置換した点突然変異体の中には、検出され得る程度に比活性が上昇するものがあることをも示している。発現産物が少なくとも検出され得る程度の活性を示すことが確認された、ヒト由来のＤＮＡ相同体  ＨＡ／ＭＵＴ１ＤＮＡ、ＨＡ／ＭＵＴ２  ＤＮＡ、ＨＡ／ＭＵＴ３  ＤＮＡ及びＨＡ／ＭＵＴ５  ＤＮＡは、それぞれ配列表における配列番号１１、１２、１３及び１４に示す塩基配列を有すものであり、そのコードするポリペプチドは、それぞれ配列表における配列番号６、７、８及び９に示すアミノ酸配列を有すものである。
【００６２】
以上の実験結果から、哺乳類に由来するポリペプチドが、少なくとも実験例１及び２で用いた発現系・活性測定系で検出され得る程度のＬ−アスパラギナーゼ活性を示すためには、従来公知の、配列表における配列番号１及び２に示すアミノ酸配列の他に、例えば、同じく配列番号３に示すアミノ酸配列を有する必要があることを見出した（ただし、符号「Ｘａａ」を付して示したアミノ酸はグルタミン又はアルギニンを表すものとする）。因みに、モルモット野生型Ｌ−アスパラギナーゼは、そのアミノ酸配列上第２９８乃至第３０２の残基よりなる部分にこの配列を有している。配列表における配列番号１乃至３に示すアミノ酸配列を全て有するポリペプチドとしては、例えば、モルモットに由来する、配列表における配列番号４乃び５に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドと、ヒトに由来する配列表における配列番号６乃至９に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドが挙げられる。
【００６３】
以上の知見に基づき、本発明者はＬ−アスパラギナーゼ活性を有する哺乳類由来のポリペプチドを発明するに至った。以下実施例に基づきこの発明を説明するが、ここで選択した方法はいずれも斯界において慣用のものである。当然ながら、この発明を実施するための方法は、これらに限定されるわけではない。
【００６４】
【実施例Ａ−１】
〈Ｌ−アスパラギナーゼ活性を有するモルモット由来の野生型ポリペプチド〉
【００６５】
【実施例Ａ−１（ａ）】
〈形質転換体の調製〉
０．５ｍｌ容反応管に１０×ＰＣＲ緩衝液を１０μｌ、２５ｍＭ  ｄＮＴＰミックスを１μｌ、鋳型として、実験例１−１で得た組換えＤＮＡ  ｐＣＧＰＡ／ＷＴを１ｎｇとり、ＧＰＡ／ＷＴ  ＤＮＡの５′末端及び３′末端の配列に基づき化学合成したオリゴヌクレオチドをセンスプライマー又はアンチセンスプライマーとして適量加え、滅菌蒸留水で９９．５μｌとした後、２．５単位／μｌアンプリタックＤＮＡポリメラーゼを０．５μｌ加えた。センスプライマーは、配列が５′−ＧＣＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＣＧＣＧＣＧＣＡＴＣＡ−３′であり、ＧＰＡ／ＷＴ  ＤＮＡの５′末端の上流に制限酵素Ｅｃｏ  ＲＩ切断部位を付加したものである。アンチセンスプライマーは、配列が５′−ＧＣＡＡＧＣＴＴＴＣＡＧＡＴＧＧＣＡＧＧＣＧＧＣＡＣ−３′であり、ＧＰＡ／ＷＴ  ＤＮＡの３′末端の下流に終始コドンを付加し、さらにその下流に制限酵素Ｈｉｎ  ｄＩＩＩ切断部位を付加した配列に相補的な配列のものである。常法により、上記混合物を９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で３分間の順序でインキュベートするサイクルを４０回繰り返すことによりＰＣＲを行い、ＤＮＡを増幅させた。このＤＮＡを制限酵素Ｅｃｏ  ＲＩ及びＨｉｎ  ｄＩＩＩで切断することにより約１．７ｋｂｐのＥｃｏ  ＲＩ−Ｈｉｎ  ｄＩＩＩ断片を得た。このＤＮＡ断片を２５ｎｇとり、これに予め制限酵素Ｅｃｏ  ＲＩ及びＨｉｎ  ｄＩＩＩで切断しておいたファルマシア製プラスミドベクター『ｐＫＫ２２３−３』を１０ｎｇを加え、さらに宝酒造製ライゲーションキット・バージョン２の溶液Ｉを先のＤＮＡ混合溶液と同体積加えた後、１６℃で２時間インキュベートすることにより、複製可能な組換えＤＮＡ『ｐＫＧＰＡ／ＷＴ』を得た。
【００６６】
組換えＤＮＡ  ｐＫＧＰＡ／ＷＴをコンピテントセル法によりファルマシア製大腸菌ＪＭ１０５株に導入し、ここで得られる形質転換体『Ｊ−ＧＰＡ／ＷＴ』を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬブロス培地（ｐＨ７．２）に接種し、３７℃で１８時間振とう培養した。培養物を遠心分離して形質転換体を採取し、通常のアルカリ−ＳＤＳ法を適用して組換えＤＮＡ  ｐＫＧＰＡ／ＷＴを抽出した。蛍光光度計を使用する自動シーケンサで分析することにより、このｐＫＧＰＡ／ＷＴにおいては、図２に示すごとく配列表における配列番号１７に示す塩基配列のＧＰＡ／ＷＴ  ＤＮＡがタックプロモーターの下流に５′末端から３′末端方向に連結されているのが確認された。また、ＧＰＡ／ＷＴ  ＤＮＡの３′末端側には、介在配列なく終止コドンが存在していることも確認された。
【００６７】
【実施例Ａ−１（ｂ）】
〈ポリペプチドの製造〉
形質転換体Ｊ−ＧＰＡ／ＷＴを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬブロス培地（ｐＨ７．２）に接種し、３７℃で１８時間振とう培養した。次に３０ｌ容ジャーファーメンタに新鮮なＬブロス培地を１８ｌとり、先に培養しておいた種培養物を１％（ｖ／ｖ）の割合で接種し、３７℃で通気攪拌培養した。培養物の一部を厚さ１ｃｍのキュベットにとり、波長６５０ｎｍにおける吸光度を測定しつつ培養し、吸光度が約１．５に達した時点でＩＰＴＧを終濃度０．１ｍＭとなるように添加し、さらに５時間培養した。その後、遠心分離により培養物から回収される菌体を、１３９ｍＭ塩化ナトリウム、７ｍＭリン酸水素二ナトリウム及び３ｍＭリン酸二水素ナトリウムを含む混液（ｐＨ７．２）に懸濁し常法により超音波処理して菌体を破砕し、菌体破砕物を遠心分離して上清を回収した。
【００６８】
この上清に氷冷下で硫酸アンモニウムを５０％（ｗ／ｖ）まで加え、均一に溶解し、暫時静置し遠心分離後、沈澱を採取した。この沈澱を２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解させ、同緩衝液に透析後、同緩衝液で平衡化したファルマシア製『キュー・セファロース・エフ・エフ・カラム』に負荷し、同緩衝液で充分に洗浄後、０から０．５Ｍの塩化ナトリウムの濃度勾配下、２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を通液した。塩化ナトリウム濃度が０．１乃至０．３Ｍ付近で溶出した画分を採取し、膜濃縮しながら１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に溶媒交換した。同緩衝液で平衡化したシグマ製『Ｌ−アスパラギン・アガロース』に負荷し、同緩衝液で洗浄後０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で溶出させた。溶出画分を膜濃縮し、１０％（ｖ／ｖ）グリセリンを含むトリス塩酸−塩緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化したファルマシア製『ハイロード・スーパーデックス・２００・カラム』に負荷し、約３００ｋＤａ付近の溶出画分を採取したところ、純度９０％以上の精製ポリペプチドが、培養液あたり約０．１ｍｇ／ｍｌの収量で得られた。
【００６９】
【実施例Ａ−１（ｃ）】
〈理化学的性質〉
精製ポリペプチドを次のように分析し、その理化学的性質を明らかにした。精製ポリペプチドのネイティブな分子量は、実験例１−１（ｅ）に準じてゲル濾過により求めた。その結果、溶出画分のＬ−アスパラギナーゼ活性のピークは分子量約３００ｋＤａに相当する位置に認められた。精製ポリペプチドの、解離した状態での分子量は、実験例１−１（ｅ）中に示したＳＤＳ−ＰＡＧＥにより求めた。その結果、分子量５０±１０ｋＤａの位置に、主たるバンドが認められた。この結果は、精製ポリペプチドは、ネイティブな状態では多量体を形成していることを示している。２種類の方法の測定誤差及び、大腸菌を始めとする哺乳類以外の従来公知のＬ−アスパラギナーゼのネイティブな状態での形態が全て４量体であることを考慮に入れると、この結果は精製ポリペプチドが４量体を形成していることを示していると考えられる。またこの精製ポリペプチドを、実験例１−１（ｄ）に示した方法に供した結果、Ｌ−アスパラギナーゼ活性を有していることが確認された。
【００７０】
【実施例Ａ−２】
〈Ｌ−アスパラギナーゼ活性を有するモルモット由来の野生型ポリペプチド〉
【００７１】
【実施例Ａ−２（ａ）】
〈形質転換体の調製〉
概要を図３に示す。先ず始めに、センスプライマー及びアンチセンスプライマーの配列以外は、全て実施例Ａ−１（ａ）と同一の条件でＰＣＲを行った。センスプライマーの配列は、５′−ＧＴＧＡＡＴＴＣＧＧＡＧＧＴＴＣＡＧＡＴＧＧＣＧＣＧＣＧＣＡＴＣＡ−３′であり、アンチセンスプライマーの配列は、５′−ＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＧＡＴＧＧＣＡＧＧＣＧＧＣＡＣ−３′であった。ここで増幅されたＤＮＡを制限酵素Ｅｃｏ  ＲＩ及びＮｏｔ  Ｉで切断し、約１．７ｋｂｐのＥｃｏ  ＲＩ−Ｎｏｔ  Ｉ断片を得た。このＤＮＡ断片７０ｎｇと、予め制限酵素Ｘｈｏ  Ｉ及びＮｏｔ  Ｉで切断しておいたファルマシア製プラスミドベクター『ｐＢＰＶ』５０ｎｇ及び、リンカーとして次の塩基配列よりなる４種のオリゴヌクレオチドを、それぞれ２５ｎｇずつ混合した。第１のオリゴヌクレオチドの配列は、５′−ＴＣＧＡＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＡＧＴＧＴＴＣＧＴＧＧＧＴＴＡＴＴ−３′、第２のそれは、５′−ＴＴＣＴＴＣＣＴＧＡＴＧＧＣＣＧＴＡＧＴＧＡＣＡＧＧＡＧＴＧ−３′、第３のそれは、５′−ＡＡＴＴＣＡＣＴＣＣＴＧＴＣＡＣＴＡＣＧＧＣＣＡＴＣＡＧＧＡ−３′であり、第４のそれは、５′−ＡＧＡＡＡＡＴＡＡＣＣＣＡＣＧＡＡＣＡＣＴＴＣＡＴＧＧＴＧＧＣ−３′である。なおリンカーとして用いたオリゴヌクレオチドは、いずれも常法に従い合成後、ファルマシア製Ｔ４ポリヌクレオチド・キナーゼを作用させた後、エタノール沈澱により精製したものを用いた。このＤＮＡ混合溶液に、等容の宝酒造製ライゲーション・キット・バージョン２の溶液Ｉを加え、１６℃で２時間保持することにより複製可能な組換えＤＮＡ『ｐＢＩｇＧＰＡ／ＷＴ』を得た。
【００７２】
組換えＤＮＡ  ｐＢＩｇＧＰＡ／ＷＴをコンピテントセル法により大腸菌ＨＢ１０１株に導入し、得られる形質転換体を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬブロス培地（ｐＨ７．２）に接種し、３７℃で１８時間振とう培養した。培養物を遠心分離して菌体を回収し、通常のアルカリ−ＳＤＳ法を適用して組換ＤＮＡ  ｐＢＩｇＧＰＡ／ＷＴを抽出した。自動シーケンサで配列を分析すると、このｐＢＩｇＧＰＡ／ＷＴは図４に示すような構造をしていることが確認された。すなわち、モロニー・マウス肉腫ウイルスのロング・ターミナル・リピート由来のエンハンサー（Ｅｍｓｖ）とマウス・メタロチオネインＩ遺伝子由来のプロモーター（Ｐｍｔｉ）からなる転写調節域の下流に、ディー・エフ・スターンが『サイエンス』、第２３５巻、３２１乃至３２４頁（１９８７年）で紹介しているイムノグロブリンの分泌シグナル配列を含むペプチド部分をコードするＤＮＡ、Ｉｇ  ｓｅｃ  ＤＮＡ  が連結されており、さらにその下流に同じ読み枠で、ＧＰＡ／ＷＴ  ＤＮＡが５′末端から３′末端方向に連結されていた。また、ＧＰＡ／ＷＴ  ＤＮＡの３′末端には介在配列なく終止コドンが存在していることも確認した。
【００７３】
この組換えＤＮＡ  ｐＢＩｇＧＰＡ／ＷＴを、ライフ・テクノロジーズ製リポフェクチン試薬を用い、添付のプロトコールに従って、マウス由来細胞株Ｃ１２７（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６１６）に導入した。該組換えＤＮＡが導入された形質転換体は、第一段階として、増殖の制御能力の喪失すなわちフォーカス形成能によって選択した。第二段階として、フォーカスを含む近傍の細胞を滅菌濾紙にて回収し、目的とする形質転換体を通常の限界希釈法により、Ｌ−アスパラギナーゼ活性の産生能に基づき単細胞化した。斯くして形質転換体『Ｃ−ＧＰＡ／ＷＴ』を得た。
【００７４】
【実施例Ａ−２（ｂ）】
〈ポリペプチドの製造〉
形質転換体Ｃ−ＧＰＡ／ＷＴを、先ず種培養として２．５ｍｌの１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を含むＤＭＥ培地を添加した口径３．５ｃｍのベクトン・ディッキンソン・ラブウェア製６穴マルチウエルプレート『３０４６』の１穴に接種し、コンフルエントにまで培養した。ここから細胞をトリプシン処理することにより剥離させ、その一部を種細胞として、同培地を添加した別の新たな６穴プラスチックプレートの６穴に接種し培養した。同様の操作を順次培養器を拡張させながら繰り返し、細胞数を増加させて、１５０ｃｍ2 培養フラスコ５０本を用いて、該形質転換体を通常の連続培養に供した。最終的に培養上清１００ｌを回収し、実施例Ａ−１（ｂ）の菌体破砕物の上清の処理方法と同様に、硫酸アンモニウム沈澱、沈澱溶解液のキュー・セファロース・エフエフ・カラムを用いたクロマトグラフィー、その溶出画分のＬ−アスパラギン・アガロース・を用いたクロマトグラフィー及びその溶出画分のハイロード・スーパーデックス・２００・カラムを用いたクロマトグラフィーの順で処理した。その結果、純度９０％以上の精製ポリペプチドが、培養液あたり約１μｇ／ｍｌの収量で得られた。
【００７５】
【実施例Ａ−２（ｃ）】
〈理化学的性質〉
得られた精製ポリペプチドの理化学的性質を、実施例Ａ−１（ｃ）と同様に調べると、実施例Ａ−１（ｂ）で得た精製ポリペプチドと同等の性質を示すものであることが確認された。
【００７６】
【実施例Ａ−３】
〈Ｌ−アスパラギナーゼ活性を有するヒト及びモルモット由来のポリペプチド相同体〉
【００７７】
【実施例Ａ−３（ａ）】
〈形質転換体の調製〉
鋳型、センスプライマー及びアンチセンスプライマー以外は実施例Ａ−１（ａ）に示した方法と同一条件でＰＣＲを行い、得られたＤＮＡを実施例Ａ−１（ａ）と同様に処理することにより組換えＤＮＡ『ｐＫＧＰＡ／Ｄ３６４ｓｔｐ』、『ｐＫＨＡ／ＭＵＴ１』、『ｐＫＨＡ／ＭＵＴ２』、『ｐＫＨＡ／ＭＵＴ３』及び『ｐＫＨＡ／ＭＵＴ５』を得た。それぞれの組換えＤＮＡの調製のために用いた鋳型ＤＮＡの名称、センスプライマー及びアンチセンスプライマーの塩基配列を表５にまとめて示す。実施例Ａ−１（ａ）と同様に塩基配列を分析し、これらの組換えＤＮＡの構造を確認した。これらの組換えＤＮＡの構造は、図５乃至９に示している。
【００７８】
【表５】
0003819540.tif 000006
【００７９】
ここで得た、組換えＤＮＡを同様に実施例Ａ−１（ａ）に従って処理し、形質転換体『Ｊ−ＧＰＡ／Ｄ３６４ｓｔｐ』、『Ｊ−ＨＡ／ＭＵＴ１』、『Ｊ−ＨＡ／ＭＵＴ２』、『Ｊ−ＨＡ／ＭＵＴ３』及び『Ｊ−ＨＡ／ＭＵＴ５』を得た。
【００８０】
【実施例Ａ−３（ｂ）】
〈ポリペプチドの製造〉
これら５種類の形質転換体を実施例Ａ−１（ｂ）と同様に培養、菌体の破砕、菌体破砕物の硫酸アンモニウム沈澱、沈澱溶解液のキュー・セファロース・エフエフ・カラムを用いたクロマトグラフィー、及びその溶出画分のＬ−アスパラギン・アガロースを用いたクロマトグラフィーの順で処理した。この結果得られた溶出画分は実施例Ａ−１（ｂ）と同様に膜濃縮した後、ハイロード・スーパーデックス・２００・カラムを用いたクロマトグラフィーに供し、約１４０ｋＤａ付近の溶出画分を採取したところ、いずれも純度９０％以上の精製ポリペプチドが培養液あたり約０．１ｍｇ／ｍｌの収量で得られた。これらの精製ポリペプチドを実施例Ａ−１（ｃ）の方法により分析し、理化学的性質を明らかにした。実施例Ａ−１で得た結果とあわせて表６に示した。
【００８１】
【表６】
0003819540.tif 000007
【００８２】
表６に示す結果は、大腸菌を宿主として発現させ精製された、それぞれの野生型ポリペプチド或いはポリペプチド相同体は、いずれもＬ−アスパラギナーゼ活性を示すことが分かる。またこれらのポリペプチドは４量体を形成していることが示されている。
【００８３】
【実施例Ａ−４】
〈Ｌ−アスパラギナーゼ活性を有するヒト及びモルモット由来のポリペプチド相同体〉
【００８４】
【実施例Ａ−４（ａ）】
〈形質転換体の調製〉
鋳型、センスプライマー又はアンチセンスプライマー以外は実施例Ａ−１（ａ）に示した方法と同一条件でＰＣＲを行った。得られたＤＮＡを実施例Ａ−２（ａ）で用いたのと同一のリンカーを用い、同一の条件で連結することにより、組換えＤＮＡ『ｐＢＩｇＧＰＡ／Ｄ３６４ｓｔｐ』、『ｐＢＩｇＨＡ／ＭＵＴ１』、『ｐＢＩｇＨＡ／ＭＵＴ２』、『ｐＢＩｇＨＡ／ＭＵＴ３』及び『ｐＢＩｇＨＡ／ＭＵＴ５』を得た。それぞれの組換えＤＮＡの調製のためのＰＣＲに用いた鋳型ＤＮＡの名称、センスプライマー及びアンチセンスプライマーの塩基配列を表７にまとめて示す。実施例Ａ−１（ａ）と同様に塩基配列を分析し、これらの組換えＤＮＡの構造を確認した。これらの組換えＤＮＡの構造は、図１０乃至１４に示している。
【００８５】
【表７】
0003819540.tif 000008
【００８６】
ここで得た、組換えＤＮＡを同様に実施例Ａ−２（ａ）と同様に処理することにより、それぞれ形質転換体『Ｃ−ＧＰＡ／Ｄ３６４ｓｔｐ』、『Ｃ−ＨＡ／ＭＵＴ１』、『Ｃ−ＨＡ／ＭＵＴ２』、『Ｃ−ＨＡ／ＭＵＴ３』及び『Ｃ−ＨＡ／ＭＵＴ５』を得た。
【００８７】
【実施例Ａ−４（ｂ）】
〈ポリペプチドの製造〉
【００８８】
これら５種類の形質転換体を実施例Ａ−２（ｂ）と同様に培養し、培養上清を実施例Ａ−１（ｂ）の菌体破砕の処理方法と同様に硫酸アンモニウム沈澱、沈澱溶解液のキュー・セファロース・エフ・エフ・カラムを用いたクロマトグラフィー及びその溶出画分のＬ−アスパラギン・アガロース・ゲルを用いたクロマトグラフィーの順で処理した。この結果得られた溶出画分は実施例Ａ−１（ｂ）と同様に膜濃縮した後、ハイロード・スーパーデックス・２００・カラムを用いたクロマトグラフィーに供し、約１４０ｋＤａ付近の溶出画分を採取したところ、純度９０％以上の精製ポリペプチドが培養液あたり約１μｇ／ｍｌの収量で得られた。これらの精製ポリペプチドを実施例Ａ−１（ｃ）の方法により分析し、理化学的性質を明らかにした。実施例Ａ−３で得た結果とあわせて表８に示した。
【００８９】
【表８】
0003819540.tif 000009
【００９０】
表８に示す結果は、動物細胞を宿主として発現させ精製された、それぞれの野生型ポリペプチド或いは、ポリペプチド相同体は、いずれもＬ−アスパラギナーゼ活性を示すことが分かる。またこれらのポリペプチドは４量体を形成していることが示される。
【００９１】
以上実施例Ａに示すごとく、この発明のポリペプチドは、いずれもＬ−アスパラギナーゼ活性を示す。したがって、この発明の感受性疾患剤は、ヒトに投与すると、体内のＬ−アスパラギンを加水分解し、Ｌ−アスパラギナーゼ感受性疾患の治療・予防に効果を発揮する。この発明でいう感受性疾患とは、Ｌ−アスパラギン依存性腫瘍細胞の存在に起因する疾患全般を意味するものとし、具体的には、例えば、急性白血病・急性転化した慢性白血病・Ｔ細胞白血病等の白血病、非ホジキン病・ホジキン病等の悪性リンパ腫を挙げることができる。斯くしてこの発明の感受性疾患剤は、上記のごとき感受性疾患を治療・予防するための抗腫瘍剤としての用途を有することとなる。剤型並びに感受性疾患の種類及び性状にもよるが、この発明の感受性疾患剤は、通常、液状、ペースト状又は固状に調製され、当該ポリペプチドを０．０００００１乃至１００％（ｗ／ｗ）、望ましくは、０．０００１乃至１００％（ｗ／ｗ）含んでいる。
【００９２】
この発明の感受性疾患剤は当該ポリペプチド単独の形態はもとより、当該ポリペプチドとそれ以外の生理的に許容される、例えば、基剤、賦形剤、可溶剤、緩衝剤、安定剤、さらには必要に応じて、他の生理活性物質乃至は他の薬剤のうちから選ばれる１種又は２種以上との組成物としての形態をも包含する。基剤、賦形剤、可溶剤、緩衝剤及び安定剤としては具体的には、例えば、日本医薬品添加剤協会編集、『医薬品添加物辞典』（１９９４年）、薬事日報社発行や、日本医薬品添加剤協会編集、『医薬品添加物辞典追補  １９９５』（１９９５年）、薬事日報社発行などに記載のものが挙げられる。他の生理活性物質乃至他の薬剤としては具体的には、例えば、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、インターロイキン１、インターロイキン２、インターロイキン３、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＧＭ−ＣＳＦ、カルボコン、シクロフォスファミド、アクラルビシン、チオテパ、ブスルファン、アンシタビン、シタラビン、フルオロウラシル、テトラヒドロフリルフルオロウラシル、メトトレキサート、アクチノマイシンＤ、クロモマイシンＡ３、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、メルカプトプリン、プレドニゾロン、マイトマイシンＣ、ビンクリスチン、ビンブラスチン、金コロイド、クレスチン、ピシバニール、レンチナン及び丸山ワクチンなどが挙げられる。
【００９３】
さらに、この発明の感受性疾患剤は、投薬単位形態の薬剤をも包含し、その投薬単位形態の薬剤とは、当該ポリペプチドを、例えば、１回当たりの用量又はその正数倍（４倍まで）若しくはその約数（１／４０まで）に相当する量を含んでおり、投薬に適する物理的に分離した一体の剤型にある薬剤を意味する。この様な投薬形態の薬剤としては、注射剤、液剤、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、舌下剤、点眼剤、点鼻剤、座剤などが挙げられる。
【００９４】
この発明の感受性疾患剤は経口的に投与しても非経口的に投与しても、いずれの場合にも、感受性疾患の治療・予防に効果を発揮する。感受性疾患の種類や症状にもよるが、具体的には、患者の症状や投与後の経過を観察しながら、成人当たり約０．１μｇ乃至５００ｍｇ／回、望ましくは約０．１乃至１００ｍｇ／回のポリペプチドを１乃至４回／日又は１乃至７回／週の用量で１日乃至１年間にわたって経口投与するか、皮内、皮下、筋肉内又は静脈内に非経口投与すればよい。また、この発明の感受性疾患剤のその他の一形態としては、例えば、遺伝子治療を応用した形態が挙げられる。つまり、この発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを適宜宿主に導入してなる形質転換体を投与し、この発明のポリペプチドを感受性疾患患者の生体内で産生させることにより、上記の投与形態と同等の効果を発揮する。なお、遺伝子治療を実施するための一般的手順は、例えば、島田隆、斎藤泉、小澤敬也編集、『実験医学別冊バイオマニュアルＵＰシリーズ  遺伝子治療の基礎技術』（１９９６年）、羊土社発行に詳述されている。
【００９５】
次に、実験例３に基づき、この発明のポリペプチドの生物活性について、実験例４に基づき、この発明のポリペプチドの安全性について説明する。
【００９６】
【実験例３】
〈生物活性〉
【００９７】
【実験例３−１】
〈イン・ビトロにおける抗腫瘍細胞効果〉
【００９８】
ヒト組織球リンパ腫細胞株Ｕ９３７（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ−１５９３）及びヒトリンパ芽球由来細胞株Ｍｏｌｔ４（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ−１５８２）を、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地で予め継代培養しておいた。対数増殖期にあるそれぞれの細胞培養系から、細胞を遠心分離により回収し、同培地で２×１０５個／ｍｌの細胞濃度に調整し、該細胞懸濁液をベクトン・ディッキンソン・ラブウェア製２４穴マルチウエルプレート『３０４７』プレートに、１穴あたり１ｍｌで合計１３穴に接種した。ここに実施例Ａ−１乃至Ａ−４で調製した１２種類の精製ポリペプチドのＰＢＳによる希釈液をそれぞれ添加し、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２インキュベーター内で、３７℃で７２時間培養した。各精製ポリペプチドの終濃度は、Ｌ−アスパラギナーゼ活性として１単位／ｍｌであった。対照区として、ＰＢＳを等容添加して同じく培養する系を設けた。培養後細胞を回収し、トリパン・ブルーにより死細胞を染色して、精製ポリペプチド添加系の細胞生存率を対照区と比較した。その結果、いずれの精製ポリペプチドを添加した系も、細胞生存率は対照区と比較して有意に低い値を示した。このことは、実施例Ａ−１乃至Ａ−４で得られた精製ポリペプチドは、いずれもＵ９３７及びＭｏｌｔ４に対する細胞障害性を有することを示している。
【００９９】
【実験例３−２】
〈イン・ビボにおける抗腫瘍細胞効果〉
【０１００】
東北大学加齢医学研究所医用細胞資源センターに登録されているマウスリンパ腫細胞株６Ｃ３ＨＥＤを、常法により１×１０７個／匹で８日ごとにその脇腹に皮下注射することによって継代移植されているＣ３Ｈマウスをモデルマウスとして用いた。該細胞の移植後４日目から７日目までの毎日、該モデルマウスに実施例Ａ−１乃至Ａ−４で得られた精製ポリペプチドを、４００単位／匹で、静脈注射にて投与した。移植後４及び８日目の腫瘍の大きさを肉眼で観察した。なお精製ポリペプチドは、０．１５Ｍの塩化ナトリウム溶液で希釈した後、ミリポア製の孔径０．４５μｍのメンブランフィルターで濾過した後に投与した。対照区として、０．１５Ｍ塩化ナトリウム溶液を同様に処理した系を設けた。その結果、対照区では腫瘍の明らかな肥大が認められたのに対し、精製ポリペプチドを投与した系では腫瘍の明らかな退縮又は消失が認められた。このことは、実施例Ａ−１乃至Ａ−４で調製される精製ポリペプチドが、いずれもモデルマウスの腫瘍を治癒する能力があることを示している。
【０１０１】
【実験例４】
〈急性毒性試験〉
実施例Ａ−１乃至Ａ−４で調製された精製ポリペプチドをそれぞれ別個に、常法にしたがって８週齢のマウスに経皮、経口あるいは腹腔内に注射投与した。その結果、これらの精製ポリペプチドのＬＤ５０は、いずれの投与経路による場合も約１００ｍｇ／ｋｇ以上であった。このことは、この発明のポリペプチドがヒトへの投与を前提とする医薬品として安全であることを裏付けている。
【０１０２】
以下、この発明の感受性疾患剤につき実施例を挙げて説明する。
【０１０３】
【実施例Ｂ】
〈感受性疾患剤〉
【０１０４】
【実施例Ｂ−１】
〈液剤〉
安定剤として１％（ｗ／ｖ）のヒト血清アルブミンを含む生理食塩水に実施例Ａ−１乃至Ａ−４で得た精製ポリペプチドをそれぞれ別個に０．１ｍｇ／ｍｌとなるように溶解させ、常法に従った精密濾過により滅菌して液剤を得た。
【０１０５】
いずれの製品も安定性に優れ、悪性腫瘍、急性白血病、悪性リンパ腫、慢性白血病の急性転化、Ｔ細胞白血病を含む感受性疾患を治療・予防するための注射剤、点眼剤、及び点鼻剤として有用である。
【０１０６】
【実施例Ｂ−２】
〈液剤〉
安定剤として１％（ｗ／ｖ）のグリセリンを含む生理食塩水に実施例Ａ−１乃至Ａ−４で得た精製ポリペプチドをそれぞれ別個に０．１ｍｇ／ｍｌとなるように溶解させ、常法に従った精密濾過により滅菌して液剤を得た。
【０１０７】
いずれの製品も安定性に優れた、悪性腫瘍、急性白血病、悪性リンパ腫、慢性白血病の急性転化、Ｔ細胞白血病を含む感受性疾患を治療・予防するための注射剤、点眼剤、及び点鼻剤として有用である。
【０１０８】
【実施例Ｂ−３】
〈乾燥注射剤〉
安定剤として、１％（ｗ／ｖ）の精製ゼラチンを含む生理食塩水に実施例Ａ−１乃至Ａ−４で得た精製ポリペプチドをそれぞれ別個に５０ｍｇ／ｍｌとなるように溶解させ、常法に従った精密濾過により滅菌して、バイアル瓶に１ｍｌずつ分注し、凍結乾燥後密栓した。
【０１０９】
いずれの製品も安定性に優れ、悪性腫瘍、急性白血病、悪性リンパ腫、慢性白血病の急性転化、Ｔ細胞白血病を含む感受性疾患を治療・予防するための乾燥注射剤として有用である。
【０１１０】
【実施例Ｂ−４】
〈軟膏剤〉
滅菌蒸留水に和光純薬工業製カルボキシビニルポリマー『ハイビスワコー１０４』と高純度トレハロースをそれぞれ濃度１．４％（ｗ／ｗ）及び２．０％（ｗ／ｗ）になるように溶解させ、実施例Ａ−１乃至Ａ−４で得た精製ポリペプチドをそれぞれ別個に均一に混合後、ｐＨ７．２に調整して１ｇ当たり該ポリペプチドを約１０ｍｇ含むペースト状物を得た。
【０１１１】
いずれの製品も延展性と安定性に優れ、悪性腫瘍、急性白血病、悪性リンパ腫、慢性白血病の急性転化、Ｔ細胞白血病を含む感受性疾患を治療・予防するための軟膏として有用である。
【０１１２】
【実施例Ｂ−５】
〈錠剤〉
林原製無水結晶α−マルトース粉末『ファイントース』に実施例Ａ−１乃至Ａ−４で得た精製ポリペプチドと細胞賦活剤としてのルミンを均一に混合し、得られる混合物を打錠機により打錠して製品１錠（約２００ｍｇ）当たり該ポリペプチド及びルミンをそれぞれ約５ｍｇ含む錠剤を得た。
【０１１３】
いずれの製品も摂取性と安定性に優れ、さらに細胞賦活作用も有し、悪性腫瘍、急性白血病、悪性リンパ腫、慢性白血病の急性転化、Ｔ細胞白血病を含む感受性疾患を治療・予防するための錠剤として有用である。
【０１１４】
【発明の効果】
この発明は、Ｌ−アスパラギナーゼ活性を有する哺乳類由来のポリペプチドの発見に基づくものである。この発明のポリペプチドは、いずれもアミノ酸配列まで解明されている物質であり、安定したＬ−アスパラギンを加水分解する活性を有する。これにより、この発明のポリペプチドは、Ｌ−アスパラギン依存性腫瘍細胞に起因する各種の疾患に対する治療剤・予防剤として威力を発揮する。
【０１１５】
この発明のポリペプチドは哺乳類由来であることから、ヒトに対する抗原性が低く、多量投与或いは継続投与しても重篤な副作用を惹起することがない。したがって、この発明のポリペプチドは、使用に際して患者の感受性に関して厳密な管理をしなくとも、所望の効果を発揮できる利点がある。
【０１１６】
かくも有用なるこの発明のポリペプチドは、これをコードするこの発明のＤＮＡを利用することにより、所望量を容易に製造することができる。
【０１１７】
この発明は、斯くも顕著な作用効果を発揮するものであり、斯界に貢献すること誠に多大な意義のある発明であるといえる。
【０１１８】
【配列表】
0003819540.tif 000010
【０１１９】
0003819540.tif 000011
【０１２０】
0003819540.tif 000012
【０１２１】
0003819540.tif 000013
0003819540.tif 000014
【０１２２】
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0003819540.tif 000017
【０１２３】
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0003819540.tif 000019
【０１２４】
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【０１２５】
0003819540.tif 000022
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【０１２６】
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【０１２７】
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【０１２８】
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【０１２９】
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【０１３０】
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【０１３１】
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【０１３２】
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【０１３３】
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【０１３４】
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【０１３５】
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【図面の簡単な説明】
【図１】オーバー・ラップ・エクステンション法の概要を示す図である。
【図２】組換えＤＮＡ  ｐＫＧＰＡ／ＷＴの制限酵素地図を示す図である。
【図３】組換えＤＮＡ  ｐＢＩｇＧＰＡ／ＷＴの調製法の概要を示す図である。
【図４】組換えＤＮＡ  ｐＢＩｇＧＰＡ／ＷＴの制限酵素地図を示す図である。
【図５】組換えＤＮＡ  ｐＫＧＰＡ／Ｄ３６４ｓｔｐの制限酵素地図を示す図である。
【図６】組換えＤＮＡ  ｐＫＨＡ／ＭＵＴ１の制限酵素地図を示す図である。
【図７】組換えＤＮＡ  ｐＫＨＡ／ＭＵＴ２の制限酵素地図を示す図である。
【図８】組換えＤＮＡ  ｐＫＨＡ／ＭＵＴ３の制限酵素地図を示す図である。
【図９】組換えＤＮＡ  ｐＫＨＡ／ＭＵＴ５の制限酵素地図を示す図である。
【図１０】組換えＤＮＡ  ｐＢＩｇＧＰＡ／Ｄ３６４ｓｔｐの制限酵素地図を示す図である。
【図１１】組換えＤＮＡ  ｐＢＩｇＨＡ／ＭＵＴ１の制限酵素地図を示す図である。
【図１２】組換えＤＮＡ  ｐＢＩｇＨＡ／ＭＵＴ２の制限酵素地図を示す図である。
【図１３】組換えＤＮＡ  ｐＢＩｇＨＡ／ＭＵＴ３の制限酵素地図を示す図である。
【図１４】組換えＤＮＡ  ｐＢＩｇＨＡ／ＭＵＴ５の制限酵素地図を示す図である。
【符号の説明】
Ｅｃｏ  ＲＩ                  Ｅｃｏ  ＲＩ切断部位
Ｈｉｎ  ｄＩＩＩ              Ｈｉｎ  ｄＩＩＩ切断部位
Ｎｏｔ  Ｉ                    Ｎｏｔ  Ｉ切断部位
Ｘｈｏ  Ｉ                    Ｘｈｏ  Ｉ切断部位
ＧＰＡ／ＷＴ                  モルモット野生型Ｌ−アスパラギナーゼをコードするＤＮＡ（ＧＰＡ／ＷＴ  ＤＮＡ）
Ｄ３６４ｓｔｐ                モルモットＬ−アスパラギナーゼ相同体をコードするＤＮＡ（ＧＰＡ／Ｄ３６４ｓｔｐＤＮＡ）
ＨＡ／ＭＵＴ１                ヒトＬ−アスパラギナーゼ相同体をコードするＤＮＡ（ＨＡ／ＭＵＴ１  ＤＮＡ）
ＨＡ／ＭＵＴ２                ヒトＬ−アスパラギナーゼ相同体をコードするＤＮＡ（ＨＡ／ＭＵＴ２  ＤＮＡ）
ＨＡ／ＭＵＴ３                ヒトＬ−アスパラギナーゼ相同体をコードするＤＮＡ（ＨＡ／ＭＵＴ３  ＤＮＡ）
ＨＡ／ＭＵＴ５                ヒトＬ−アスパラギナーゼ相同体をコードするＤＮＡ（ＨＡ／ＭＵＴ５  ＤＮＡ）
Ｐｔａｃ                      ｔａｃプロモーター
ｒｒｎＢＴ１Ｔ２              リボゾームＲＮＡオペロンの転写終領域
５Ｓ                          ５ＳリボゾームＲＮＡ遺伝子
ＡｍｐＲ                      アンピシリン耐性遺伝子
ｐＢＲ３２２ｏｒｉ            大腸菌における複製開始点
Ｉｇ  ｓｅｃ                  イムノグロブリンの分泌シグナル配列を含むペプチド部分をコードするＤＮＡ（Ｉｇ  ｓｅｃ  ＤＮＡ）
Ｅｍｓｖ                      モロニー・マウス肉腫ウイルスのロング・ターミナル・リピート由来のエンハンサー
Ｐｍｔｉ                      マウス・メタロチオネインＩ遺伝子由来のプロモーター
Ｐｏｌｙ（Ａ）                ＳＶ４０由来のポリ（Ａ）付加シグナル
ＢＰＶＩ                      ウシパピローマ・ウイルスのゲノム
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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