(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
イヌリンに室温下で水を加え、必要に応じて等張化の薬剤を加えた後、６０〜１１０℃まで１０分以上をかけて昇温して溶解することを特徴とするイヌリン含有製剤の製造方法。
【請求項２】
昇温してイヌリンを溶解後、該溶液を２０〜７０℃まで冷却し、冷却した溶液を容器に充填し、更に５〜−４０℃まで冷却する請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
イヌリン又はこれに必要に応じて等張化の薬剤を加えた混合物に６０〜１００℃の熱水を加えて溶解した後、５〜−４０℃まで冷却することを特徴とするイヌリン含有製剤の製造方法。
【請求項４】
熱水を加えて溶解後、該溶液を２０〜７０℃に冷却して容器に充填し、更に５〜−４０℃まで冷却する請求項３記載の製造方法。
【請求項５】
容器が、バイアル又はアンプルである請求項２又は４記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、糸球体濾過量の測定に用いる診断薬として有用なイヌリン含有製剤の製造方法に関する。また、該製剤を用いた、正確性、簡便性及び迅速性に優れたイヌリンクリアランスを求める方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
透析患者及び糖尿病からの腎疾患患者の増加に警告が発せられて久しい。腎疾患は全身的でかつ多岐に亙った重篤な疾患を誘発する原因的な疾患に発展し易いことから、腎臓に疾患を有する患者は定期的な病状の進行確認が必須であり、そのための方法として、腎血漿流量の測定、ＰＳＰ排泄試験、インジゴカルミン試験等の試験や、糸球体濾過量の測定が行われている。
機能検査に重要で、実態を把握できる試験である糸球体濾過量の測定に用いられる物質としては、糸球体で自由に濾過されるが、尿細管では分泌も再吸収もされず、更に代謝されない、腎臓に蓄積されない、有毒でない、糸球体濾過に影響しない、血液中および尿中の濃度が容易に測定できる等の要件が必要とされるため、多くの物質が適用され得るものではなく、従来使用又は検討されてきた物質としても、イヌリンの他、チオ硫酸ナトリウム、クレアチニン、イオヘキソース、イオタラム酸、ＥＤＴＡ、ＤＴＰＡがあるにすぎない。これらのうち、イオタラム酸以下はラジオアイソトープラベルの物質であり、諸外国では用いられているが、我国では放射性物質の使用に制限が多いため使用されていない。イオヘキソースはＨＰＬＣでの測定が試みられているが、評価は決定していない。クレアチニンは我国で使用されているが、尿細管での分泌、クリアランス値が安定でない等の問題がある。
【０００３】
イヌリンは糸球体濾過量の測定に好ましい物質であるが、我国においては医薬品としての使用は認められておらず、低カロリー食品の補助材料として使用されているに過ぎない。イヌリンを始めとする糖類の脱色・精製方法としては、主に蔗糖の精製技術として開発されたマグネシウム系吸着剤（特公昭60-34882号）、リン酸及び石灰等（特公昭61-49960号）、クリストバル石（特公平2-61320号）、ダイナミック膜（特公平5-10078号）、粉末陰イオン交換樹脂等（特公平7-96082号）、モノビニル芳香族モノマー等（特開平2-503634号）、天然粘土鉱物のコロイド溶液（特開平4-248999号）、両性イオン交換樹脂等（特公昭54-25513号）、キチン粉末（特公昭56-13499号）、タンニン酸とキトサン（特公昭58-20275号）、ヨウ素等（特公昭59-26280号）、各種の活性炭（特開昭52-36887号、同60-211000号、特開平5-91900号、同212208号、特公昭54-25513号）などを用いる方法が知られており、また、イヌリンに含まれる発熱物質であるエンドトキシンの除去方法としては、カブトガニ血球由来ペプチド（特開平6-116298号）、非イオン系界面活性剤（特開平8-252301号）、低分子キトサン（特公平6-41479号）、陽イオン交換体等（特許第2908455号）、ヒアルロン酸等（特開昭54-67024号）、四級アンモニウム塩（特開平5-345116号）などを用いる方法が知られている。しかし、我国では、イヌリンは医薬品として認められていないため、実際に医薬品としての純度まで追求したものは皆無であった。
【０００４】
糸球体濾過量測定に用いるイヌリン製剤は、アメリカにおいてはUSPXX Supplement 2に、イギリスにおいてはBP 1968  Addendum 1969に収載され、製造及び使用が公的に承認されている。しかして、イヌリンは常温で１ｇを完全に溶解させるのに水10000mL以上を要し、等張液である生理的食塩水への溶解性は更に極めて低い。また、イヌリン製剤にはその性格上、溶解補助剤等の添加剤が一切使用できないことから、固体が存在する製剤として製造し、これを用時に加温の上、短時間で強く振って溶解させて適用する必要があり、取り扱いが難しく煩雑である。このため、イヌリン製剤は、有用であることが認識されているに拘わらず、我国でも現在まで開発する企業がなく、医薬品として登録されている国でも殆ど使用されていないのが現状である。
【０００５】
ところで、イヌリンを用いて糸球体濾過値（イヌリンクリアランス）を測定する際には、イヌリンを被験者の静脈に投与し、その前後で経時的に単回又は複数回採取した被験者の血漿及び／又は尿について、イヌリン濃度を測定する。イヌリン濃度は、通常、キャリブレータを使用してキャリブレーションを行って測定される。また、測定上の誤差を調整するため、精度管理用試料を用い、数検体ごとに精度管理を行う。
【０００６】
従来、イヌリンの測定方法には、前処理としてイヌリンを強酸で加熱して加水分解し、産生するフルフラールをアンスロン等と反応させて発色させる方法が多用されてきた。しかし、強酸での加熱操作が煩雑で危険性が高く、また自動分析機等への適用が困難で、迅速性、安全性に欠けるという問題があった。また、反応が非特異的で、グルコース等の他の糖類の影響を受けるため、正確性に欠けるという問題もあり、クリアランスに好適な物質としてのイヌリンの長所を損なうことになる。
【０００７】
このため、イヌリンを簡便により正確に測定する方法として、種々の酵素法が開発されてきた。これらは、イヌリンを一般にイヌリナーゼとよばれる酵素を用いて単糖に分解し、生じたフルクトースを種々の方法で測定するものである。
【０００８】
例えば、特開昭62-205799号には、フルクトースをヘキソキナーゼ・ホスホグルコイソメラーゼ・グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼと共役反応させ、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）の上昇を測定する方法が；臨床化学、第１０巻第６４〜６９頁（１９８１）には、フルクトースをソルビトールデヒドロゲナーゼと共役反応させ、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）の減少をレート法で測定する方法が；臨床化学、第２３巻第１６４〜１６９頁（１９９４）には、フルクトースをフルクトキナーゼ・ホスホグルコイソメラーゼ・グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼを用いる方法と共役反応させてＮＡＤＰＨの上昇を測定する方法が；特公昭59-35592号には、フルクトースを酸素の存在下でフルクトースデヒドロゲナーゼを用いて電子受容体と反応させ、生成する５−ケト−Ｄ−フルクトース又は還元型電子受容体の増加、又は酸化型電子受容体若しくは酸素の減少を測定する方法が、それぞれ開示されている。
【０００９】
これらの酵素法では、内因性グルコースの影響を受けずに測定することができ、また、反応時間を２０分以上に設定可能な特定の自動分析機への適用が可能となり（臨床化学、第２３巻第１６４〜１６９頁（１９９４））、正確性、簡便性の向上が確認されている。
しかしながら、これらの方法においても、反応時間は予備加温時間を含めて２６分を要する。これは、主に、イヌリナーゼの酵素活性が、イヌリンを短時間で完全に単糖に分解するには不十分であるためと考えられる。
【００１０】
ところで、イヌリンは、チコリ等の塊茎に含まれるグルコースをターミナル（末端）として、フラクトースがｎ＝２〜６０で直鎖に結合した多糖類である。また、イヌリンは熱又は溶解液のｐＨ等の影響により加水分解されやすい物質である（生化学実験講座４、糖質の化学（上）第１０９〜１１１頁（東京化学同人））。このため、製法の違いにより、イヌリンの平均分子量、分子量分布、純度等は異なるものとなる。
【００１１】
これに対し、イヌリンを分解するイヌリナーゼは、末端から１単糖ずつ分解していくエキソ型と糖鎖の真中を切断するエンド型の２タイプに大別されるが、これらの分解反応速度は、イヌリンを短時間で完全に単糖に分解するには、いずれも不十分である。前記の測定法では、イヌリナーゼの反応時間を長くしてこれらの問題を回避することができるが、近年主流の汎用自動分析機では、反応時間を最長でも２０分以上に延ばすことはできない。
【００１２】
従来のイヌリン製剤は、イヌリナーゼによる分解反応が遅いため、汎用の自動分析機に適用される反応時間内に生成するフルクトースの量が少なくかつ変動するので、これを感度良く正確に測定することはできない。また、従来のイヌリンの分解反応は、イヌリナーゼのエキソ型及びエンド型の比率に影響されるため、比率の異なるイヌリナーゼを用いる場合には、一定時間内に生成するフルクトースの量が異なるという問題もあった。フルクトース測定用の試薬等への不純物や、測定対象である血液や尿に由来する種々の化学物質が、イヌリナーゼのエキソ型、エンド型の活性比率に影響を与える場合には、反応性差が拡大する要因になりうる。さらに、イヌリナーゼのエキソ型、エンド型比率にロット間差があると、反応性差がより大きくなると考えられる。以上のように、酵素法によっても、従来のイヌリン製剤をそのまま用いると、汎用自動分析機への適用を考えた場合、迅速性と正確性を両立させることは困難であった。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の目的は、再溶解性に優れ、安定で、取り扱い易いイヌリン製剤の製造方法を提供することにある。また、本発明の目的は、正確性、簡便性及び迅速性に優れたイヌリンクリアランスを求める方法を提供することにある。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
かかる実情において、本発明者らは鋭意研究を行なった結果、イヌリンに水を加え、特定の温度まで徐々に昇温して溶解するか；イヌリンに熱水を加えて溶解した後に、特定の温度まで冷却するか；又はイヌリンに熱水を加えて溶解した後に、凍結乾燥することにより、再溶解性に優れ、安定で、取り扱い易いイヌリン含有製剤が得られることを見出した。
また、当該イヌリン含有製剤を用いて酵素法によりイヌリンを測定すれば、正確、簡便かつ迅速にイヌリンクリアランスを求めることができることを見出し、本発明を完成した。
【００１５】
すなわち、本発明は、イヌリンに室温下で水を加え、必要に応じて等張化の薬剤を加えた後、６０〜１１０℃まで１０分以上をかけて昇温して溶解することを特徴とするイヌリン含有製剤の製造方法を提供するものである。
また、本発明は、イヌリン又はこれに必要に応じて等張化の薬剤を加えた混合物に６０〜１００℃の熱水を加えて溶解した後、５〜−４０℃まで冷却することを特徴とするイヌリン含有製剤の製造方法を提供するものである。
また、本発明は、イヌリンに６０〜１００℃の熱水を加えて溶解した後、該溶液を２０〜７０℃に冷却して容器に充填し、凍結乾燥することを特徴とするイヌリン含有製剤の製造方法を提供するものである。
【００１６】
【発明の実施の形態】
本発明で用いるイヌリンとしては、現在イヌリンを医薬品として認めている国がごく少数であり、医薬品原料としてのイヌリンが入手困難であるため、食品用として市販されているイヌリン又はこれを精製して用いることができる。食品用イヌリンは、通常、平均分子量３０００〜７０００であり、このいずれをも使用することができる。イヌリンとしては、再溶解性の点から、特に平均分子量約４０００のものが好ましい。
また、イヌリンとしては、発熱物質を含有しないものが好ましいが、発熱物質を含有するイヌリンを用いた場合には、イヌリンを加温して溶解した溶液を熱時パイロジェンフリーの活性炭で処理して発熱物質を除去して使用することもできる。
【００１７】
精製イヌリンは、例えば食品用イヌリンを温湯に溶解し、熱時に活性炭及びメンブランフィルターで処理して冷却した後、濾液から採取することができる。
ここで、温湯の温度はイヌリンを効率よく溶解できればよいが、６０〜９０℃の範囲が好ましい。また、用いる温湯の量は、温度、攪拌の強さ等の条件により異なるが、イヌリンの約３〜１０重量倍、特に３〜５重量倍が好ましい。また、活性炭としては、パイロジェンフリーの活性炭が好ましく、日本薬局方第２部収載の薬用炭を使用できる。活性炭の種類は特に限定されないが、発熱物質のほか、着色性物質除去の能力を有する注射用グレードの活性炭を、イヌリンに対して１〜２０重量％用いるのが好ましい。次いで、メンブランフィルターで濾過滅菌して得られる濾液から、通常、平均分子量約５０００のイヌリンが得られる。本発明においては、この濾液にアセトンを加えて攪拌し、生じた沈澱を濾取して得られる平均分子量約４０００のイヌリンを用いるのが好ましい。アセトンは、濾液に対して５〜２０重量倍、好ましくは５〜１０重量倍添加するのが好ましい。なお、平均分子量はＧＰＣクロマトグラフィーを用いて既知標準品プルランとの比較から求めた値である。
【００１８】
本発明で用いる水は、基本的に精製水でよいが、医薬品注射製剤に用いるものについては、注射用水又は蒸留水の使用が必要である。
【００１９】
本発明の第１の方法においては、イヌリンに室温下で水を加え、６０〜１１０℃まで１０分以上をかけて徐々に昇温して溶解して、イヌリン含有製剤を製造する。ここで用いられる水の量は、イヌリンに対して５〜２００重量倍であるのが好ましい。このとき、必要に応じて等張化の薬剤を加えることもできる。等張化の薬剤としては、糖類以外の無機塩類及び有機酸類等が挙げられ、特に塩化ナトリウムが好ましい。塩化ナトリウムを用いる場合、その濃度は０〜５重量％であるのが好ましく、特に、製剤を直接人体に適用する場合には、体液の浸透圧比に近い０．９重量％が好ましい。また、室温とは、１〜３０℃の温度をいう。
次に、これを６０〜１１０℃まで、好ましくは７０〜８０℃まで１０分以上、好ましくは２０分以上をかけて徐々に昇温する。昇温速度は、前記の範囲になれば特に制限されないが、１〜４℃／分、特に１〜３℃／分であるのが好ましい。本発明においては、このように徐々に昇温してイヌリンを溶解することが必要であり、それにより、再溶解性に優れたイヌリン含有製剤を得ることができる。
【００２０】
昇温してイヌリンを溶解した後、該溶液は、２０〜７０℃、特に２０〜６０℃に冷却するのが好ましい。
また、冷却した溶液は、必要に応じて濃度及びｐＨの調整、滅菌処理を行なった後、容器に充填し、更に５〜−４０℃まで、特に−５〜−４０℃に冷却するのが好ましい。滅菌処理は、通常の方法により行なうことができ、例えばメンブランフィルターにより濾過すればよい。滅菌後、溶液を１時間以上放置してイヌリンを析出させて懸濁液とした後、容器に充填することもできる。容器としては、バイアル、アンプル等が挙げられ、充填後、常法により打栓又は熔閉すればよい。冷却速度は、−０．５〜−４℃／分、特に−０．５〜−２℃／分で、目的温度まで０．５〜１時間であるのが好ましい。冷却後の温度で、１０時間程度、特に１〜２時間程度保持するのが好ましい。
【００２１】
本発明の第２の方法においては、まずイヌリン又はイヌリンに必要に応じて等張化の薬剤を加えた混合物に６０〜１００℃の熱水を加えて攪拌溶解する。熱水は、イヌリンに対して５〜２００重量倍であるのが好ましい。等張化の薬剤としては、前記と同様のものを同様にして用いることができる。
溶解後の溶液は、５〜−４０℃、好ましくは−５〜−４０℃に冷却する。冷却速度は、−０．５〜−４℃／分、特に−０．５〜−２℃／分で、目的温度まで０．５〜１時間であるのが好ましい。冷却後の温度で、１０時間程度、特に１〜２時間程度保持するのが好ましい。
また、イヌリンに熱水を加えて溶解した後に、該溶液を２０〜７０℃に冷却し、必要に応じて濃度及びｐＨの調整、滅菌処理を行ない、容器に充填した後、５〜−４０℃に冷却することもできる。滅菌処理、容器への充填は、前記と同様に行なうことができる。
【００２２】
本発明の第３の方法においては、まずイヌリンに６０〜１００℃の熱水を加えて攪拌溶解する。熱水は、イヌリンに対して５〜２００重量倍であるのが好ましい。また、イヌリンとともに、必要に応じて等張化の薬剤を溶解することもできる。等張化の薬剤としては、前記と同様のものを同様にして用いることができる。
イヌリンを溶解した溶液は、２０〜７０℃に冷却し、必要に応じて濃度及びｐＨの調整、滅菌処理を行ない、容器に充填した後、凍結乾燥する。滅菌処理、容器への充填は、前記と同様に行なうことができる。凍結乾燥は、常法により行なえばよく、例えばイヌリンを溶解した溶液を充填した容器を、−１０℃以下に冷却して溶液を凍結させた後、０．２mbar以下の減圧条件下で徐々に加温し、内容水分を昇華させて乾燥することにより、凍結乾燥製剤を得ることができる。
【００２３】
このようにして得られる本発明のイヌリン含有製剤は、腎機能を把握するための、糸球体濾過量の測定（イヌリンクリアランス）に用いる診断薬として有用である。
【００２４】
本発明において、イヌリンクリアランスは、前記の方法で調製したイヌリン含有製剤を用いて調製した注射剤を、静脈内投与した後、投与前後で採取した尿及び／又は血液中のイヌリン量を、イヌリン分解酵素を用いて測定することにより求める。
静脈投与の際、前記イヌリン含有製剤は注射剤として用いることができ、当該イヌリン含有製剤中のイヌリンが結晶化している場合には、必要に応じて、加温溶解し放冷の後、生理食塩水で希釈して、静脈内に投与することができる。
【００２５】
採取した尿及び／又は血液中のイヌリン量の測定には、まず、イヌリン分解酵素を用いてイヌリンを単糖に分解する。イヌリン分解酵素としては、イヌリンを単糖に分解する能力を有するものであれば特に制限されないが、例えばエキソイヌリナーゼ（ＥＣ３．２．１．８０）、エンドイヌリナーゼ（ＥＣ３．２．１．７）等が挙げられる。これらのイヌリナーゼは、例えばアスペルギルス（Aspergillus）属、キリベロマイセス（Klyberomyces）属等の微生物などにより得ることができ、また、これらの遺伝子組換え微生物より製造されたものや、遺伝子的に性質を改変されたものを用いることもできる。
これらのイヌリナーゼは、単独又は２種以上を組み合わせて用いることができ、例えばエキソイヌリナーゼとエンドイヌリナーゼを組み合わせて用いると、イヌリンの分解速度を高めることができる。
イヌリナーゼを用いてイヌリンを分解する反応は、水溶液、緩衝液中で行われ、該緩衝液はｐＨ３〜８．５、特にｐＨ４〜７に調製されるのが好ましい。また、反応温度は１０〜７０℃、特に２５〜４０℃が好ましく、汎用自動分析機では３７℃で行われる。イヌリナーゼの濃度は、試料中のイヌリン濃度やイヌリナーゼの起源等によって異なるが、通常１〜１００Ｕ／mLの範囲であるのが好ましい。反応溶液中には、イヌリナーゼの反応に特に悪い影響を及ぼさない範囲で、測定試薬に用いる追随酵素、色原体、界面活性剤、防腐剤等を添加することもできる。
【００２６】
イヌリンを単糖に分解した後、当該単糖を測定する。かかる単糖測定方法としては特に制限されないが、例えば特開昭62-205799号、臨床化学  第10巻第64〜69頁（1981）、臨床化学  第23巻第164〜169頁（1994）、特公昭59-35592号等に記載の方法により、行うことができる。具体的には、以下の（１）〜（４）の方法が挙げられる。
【００２７】
（１）イヌリン分解により生成した単糖を、ヘキソキナーゼ、ホスホグルコイソメラーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼを用いてグルコネート−６−ホスフェートとする反応と、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸の還元反応との共役反応により生じた還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸を測定する方法。
（２）イヌリン分解により生成した単糖を、ソルビトールデヒドロゲナーゼを用いてソルビトールとする反応と、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの酸化反応との共役反応により減少する還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを測定する方法。
（３）イヌリン分解により生成した単糖を、フルクトキナーゼ、ホスホグルコイソメラーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼを用いてグルコネート−６−ホスフェートとする反応と、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸の還元反応との共役反応により生じた還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸を測定する方法。
（４）イヌリン分解により生成した単糖を、酸素の存在下、フルクトースデヒドロゲナーゼを用いて電子受容体を作用させ、生成する５−ケト−Ｄ−フルクトース又は還元型電子受容体の増加、又は酸化型電子受容体若しくは酸素の減少を測定する方法。
【００２８】
上記（４）の方法においては、例えば１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムメチルスルフェート（１−メトキシ−ＰＭＳ）が電子受容体であった場合、これを介して酸素との反応により生成する過酸化水素の増加をエンドポイント法及び／又はレート法で測定することができる。
過酸化水素の増加は、４−アミノアンチピリンとアニリン系トリンダー試薬がペルオキシダーゼで触媒され、カップリングして生成するキノン色素の増加等で測定することができる。アニリン系トリンダー試薬としては特に制限されないが、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン（ＴＯＯＳ）が、酸化縮合したときのモル吸光係数感度が高く、呈色が安定しているなどの点から好ましい。
また、テトラゾリウム塩が電子受容体であった場合、反応により生成するホルマザン色素の増加を、エンドポイント法及び／又はレート法で測定することができる。
【００２９】
イヌリン測定の際には、さらに他の添加剤を共存せしめることもできる。かかる添加剤としては、特に制限されないが、例えばＮ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホニックアシッド（ＴＥＳ）等のグッド緩衝液、酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液等の各種緩衝液；ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル等の界面活性剤；塩化ナトリウム等の塩類；アルブミン、ポリエチレングリコール等の高分子化合物；アミノ酸類、糖類、シクロデキストリン類等の安定化剤；抗生物質、アジ化ナトリウム等の防腐剤；ＥＤＴＡ又はその塩等のキレート剤などが挙げられる。
【００３０】
また、本発明のイヌリン含有製剤は、イヌリン測定の際のキャリブレーションに用いるキャリブレータ、精度管理に用いる精度管理用試料として好適に使用することができる。
キャリブレータ及び精度管理用試料は、イヌリンの分子量分布等の差異による測定誤差を回避する等の観点から、注射剤と同様の方法で製造したイヌリン含有製剤を使用するのが好ましい。
【００３１】
キャリブレータ及び精度管理用試料は、本発明のイヌリン含有製剤を、精製水に、必要に応じて緩衝液、界面活性剤等の溶解補助剤を溶解して水性溶液として用いることもできるし、血清溶液、尿溶液、又はＢＳＡ、ポリエチレングリコール、各種塩類等を用いて作製された血清様物質若しくは尿様物質として用いることもできる。
キャリブレータ及び精度管理用試料のイヌリン濃度は特に制限されないが、測定試薬の定量性を考慮して設定され、１〜１０００mg／dLの範囲であるのが好ましい。このようにして調製されたキャリブレータ及び精度管理用試料は、通常、水溶液としては、精製水溶解で低温〜室温保存の広い範囲で長期間流通使用に耐え得る。また、血清溶液、尿溶液、血清様物質、尿様物質としては、液状凍結品又は凍結乾燥品として長期間流通することができ、用時に融解、溶解し、その後数週間は使用することができる。
【００３２】
これらのキャリブレータ及び精度管理用試料を用いたキャリブレーション及び精度管理は、通常の方法により行うことができる。
キャリブレーションは、例えば被検体の測定前、同時又は測定後に、本発明のキャリブレータ及び精製水を測定し、次の計算式を用いて行うことができる。
【００３３】
【数１】
0003816403.tif 000002
【００３４】
また、精度管理は、例えば被検体の測定前、同時又は測定後に、本発明の精度管理用試料を被検体と同様に測定し、その測定値を管理図を用いて評価するか、表示値又は実績値を対照にあらかじめ定められた許容範囲で管理することができる。
【００３５】
【実施例】
以下、実施例によって本発明を詳述するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００３６】
参考例１（精製イヌリンの製造）
食品用イヌリン（平均分子量５０００；オラフティー社製）１００ｇに８０℃の温湯５００mLを加えて１０分間攪拌し、溶解を確認後、熱時にパイロジェンフリーの活性炭（白鷺Ｐ、武田薬品工業社製）１０ｇを投入し、更に液温を保持して１０分間攪拌を継続した。この溶液を熱時に０．２〜０．５μｍのメンブランフィルター（米国ミリポア社製）により濾過滅菌した後、４０℃に冷却し、濾液に１０重量倍のアセトンを加えて攪拌した。生じた沈殿を濾取し、風乾後４０℃で減圧乾燥して、９０ｇの精製イヌリンを得た。
得られた精製イヌリンは平均分子量約４０００、白色の結晶性粉末で無味無臭、パイロジェン試験に陰性であった。
【００３７】
参考例２（精製イヌリンの製造）
アセトンを添加しない以外は参考例１と同様に操作して、沈殿物８５ｇを得た。得られた精製イヌリンはパイロジェンフリーであったが、平均分子量は約５０００であった。
【００３８】
参考例３（精製イヌリンの製造）
食品用イヌリン（平均分子量５０００；オラフティー社製）１００ｇに８０℃の温湯５００mLを加えて１０分間攪拌し、溶解を確認後、熱時にパイロジェンフリーの活性炭１０ｇを投入して、更に液温を保持して１０分間攪拌を継続した。この溶液を熱時に０．２〜０．５μｍのメンブランフィルターにより濾過後、熱時、スプレードライヤーにより乾燥した。  得られた精製イヌリンはパイロジェンフリーであったが、平均分子量は約５０００であった。
【００３９】
実施例１
参考例１で製造した精製イヌリン１０ｇに、室温下、注射用水７０mL及び塩化ナトリウム０．９ｇを加え、３０分で８０℃まで徐々に加温して溶液とした。溶解を確認後、溶液を６０℃に冷却し、０．０１mol／Lの水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ６．５に調整した後、注射用水を加えて１００mLとした。これを、０．８及び０．２２μｍのメンブランフィルターで濾過滅菌した後、その２０mLをバイアルに充填し、打栓してイヌリン２ｇを含有する製剤を得た。
【００４０】
実施例２
参考例１で製造した精製イヌリン１０ｇに、８０℃に加熱した注射用水９０mLを加えて溶解し、これに塩化ナトリウム０．９ｇを加えて更に撹拌溶解した。溶液を６０℃に冷却し、０．０１mol／Lの水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ６．５に調整した後、注射用水を加えて１００mLとした。これを、０．２２μｍのメンブランフィルターで濾過滅菌した後、その２０mLをバイアルに充填し、ゴム打栓、アルミ締めによりバイアルを密封した。このバイアルを直ちに冷却機により−１０℃／１０分の速度で−１０℃まで冷却し、その温度に１時間保持後、１０℃／１０分の速度で２０℃まで加温して、イヌリン２ｇを含有する製剤を得た。
【００４１】
実施例３
参考例１で製造した精製イヌリン１０ｇに、室温下、注射用水９０mL及び塩化ナトリウム０．９ｇを加え、３０分で７０℃まで徐々に加温して溶液とした。溶解を確認後、溶液を５０℃に冷却し、０．０１mol／Lの水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ６．５に調整した後、注射用水を加えて１００mLとした。これを、０．２２μｍのメンブランフィルターで濾過滅菌した後、その２０mLをバイアルに充填し、ゴム打栓、アルミ締めによりバイアルを密封した。このバイアルを直ちに冷凍機を用いて−１０℃／１０分の速度で−２０℃まで冷却し、その温度に２時間保持後、１０℃／１０分の速度で室温まで加温して、イヌリン２ｇを含有する製剤を得た。
【００４２】
実施例４
参考例１で製造した精製イヌリン１０ｇに、６０℃の注射用水９０mLを加えて溶解し、この溶液を４０℃に冷却後、０．０１mol／Lの水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ６．５に調整し、注射用水を加えて１００mLとした。これを、０．２２μｍのメンブランフィルターで濾過滅菌した後、その２０mLをバイアルに充填し、常法により凍結乾燥し、ゴム打栓、アルミ締めを行い、イヌリン２ｇを含有する凍結乾燥製剤を得た。
【００４３】
実施例５
食品用イヌリン（平均分子量５０００；オラフティー社製）１０ｇに、室温下、注射用水９０mL及び塩化ナトリウム０．９ｇを加え、３０分で７０℃まで徐々に加温して溶液とした。溶解を確認後、溶液を６０℃に冷却し、０．０１mol／Lの水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ６．５に調整した後、注射用水を加えて１００mLとした。これを、０．２２μｍのメンブランフィルターで濾過滅菌した後、その１０mLをバイアルに充填し、打栓して、イヌリン１ｇを含有する製剤を得た。得られた製剤はパイロジェン試験で陽性であったが、加温して溶解した溶液に熱時パイロジェンフリーの活性炭２ｇで処理することにより、実施例１と同様の製剤を得た。
【００４４】
実施例６
参考例１で製造した精製イヌリン１０ｇに、室温下、注射用水９０mLを加え、３０分で８０℃まで徐々に加温して溶液とした。溶解を確認後、溶液を４０℃に冷却し、０．０１mol／Lの水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ６．５に調整した後、注射用水を加えて１００mLとした。０．２２μｍのメンブランフィルターで濾過滅菌した後、６時間室温放置して懸濁液とし、その１０mLを各バイアルに充填し、打栓して、イヌリン１ｇを含有する懸濁液の製剤を得た。
【００４５】
実施例７
参考例１で製造した精製イヌリン１００ｇに、室温下、注射用水８９０mL及び塩化ナトリウム９ｇを加え、２５分で７０℃まで徐々に加温して溶液とした。溶解を確認後、溶液を５０℃に冷却し、０．０１mol／Lの水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ６．５に調整した後、注射用水を加えて１０００mLとした。０．８μｍ及び０．２２μmのメンブランフィルターで濾過滅菌した後、５時間冷却放置してイヌリンを析出させ、均一懸濁液とした。その１０mLをバイアルに充填し、打栓して、イヌリン１ｇを含有する懸濁液製剤を得た。
【００４６】
実施例８
参考例３で製造した精製イヌリン１０ｇに、８０℃の注射用水９０ｍLを加えて溶解し、これに塩化ナトリウム２ｇを加えて更に攪拌溶解した。溶液を６０℃に冷却し、０．０１mol／Lの水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ６．５に調整した後、注射用水を加えて１００mLとした。これを、０．２２μｍのメンブランフィルターで濾過滅菌した後、その１０mLをバイアルに充填し、ゴム打栓、アルミ締めによりバイアルを密封した。このバイアルを直ちに冷却機により−１０℃／１０分の速度で−１０℃まで冷却し、その温度に２時間保持後、１０℃／１０分の速度で室温まで戻して、イヌリン１ｇを含有する製剤を得た。
【００４７】
実施例９
参考例１で製造した精製イヌリン１０ｇに、室温下、注射用水９０mL及び塩化ナトリウム０．９ｇを加え、３０分かけて７０℃まで徐々に加温して溶液とした。溶解を確認後、溶液を４０℃に冷却し、０．０１mol／Lの水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ６．５に調整した後、注射用水を加えて１００mLとした。これを、０．８μｍのメンブランフィルターで濾過滅菌した後、その２０mLをアンプルに注入し、熔閉して、イヌリンを２ｇを含有するアンプル製剤を得た。
【００４８】
試験例１
本発明のイヌリン製剤と従来のイヌリン製剤について、８０℃及び沸騰水浴中での再溶解性を評価した。結果を表１に示す。
イヌリン２ｇを含有する０．９％生理食塩水溶液２０mLの製剤を各被験体とした。実施例４の製剤については、バイアルに２０mLとなるように注射用水を注入して、試験に供した。対照製剤として用いた従来のイヌリン製剤は、ＵＳＰ適合である米国クエストコア社のイヌリン製剤を用いた。
再溶解性は、温度制御可能な薬液溶解バス（坂口電熱社製）又は実験用ウォーターバスにより、再溶解時間を測定した。
【００４９】
【表１】
0003816403.tif 000003
【００５０】
実施例１０（各種イヌリンの測定）
実施例１と同様の方法により、イヌリン含有製剤Ａ、Ｂ及びＣ（３ロット）を製造した。このイヌリン含有製剤をそれぞれ精製水で３０mg／dLとなるように調製し、下記の試薬及び測定法によりイヌリン濃度を測定し、測定感度の相対％を求めた。比較として、市販のイヌリンを用いて同様に測定した。結果を表２に示す。
【００５１】
（試薬の調製）
(1)組成１：
Ｒ１（濃度はＲ１中）
酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）  ０．０５mol／Ｌ
イヌリナーゼ（東洋紡績社製）  ５０Ｕ／mL
フルクトースデヒドロゲナーゼ（東洋紡績社製）  ５０Ｕ／mL
１−メトキシ−ＰＭＳ  １００mg／Ｌ
Ｒ２（濃度はＲ２中）
ＴＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）  ０．０５mol／Ｌ
ペルオキシダーゼ（東洋紡績社製）  １０Ｕ／mL
４−アミノアンチピリン  ０．１ｇ／Ｌ
アニリン系トリンダー試薬（ＴＯＯＳ）  １ｇ／Ｌ
(2)組成２：
組成１において、イヌリナーゼを１２０Ｕ／mLに増量したもの。
【００５２】
（測定）
試料２．７μＬにＲ１を１８０μＬ添加し、３７℃にて５分間インキュベーションし、第１反応とした。その後、Ｒ２を１８０μＬ添加して５分間インキュベーションし、第２反応とした。第１反応及び第２反応の吸光度を液量補正した各吸光度の差をとる２ポイントエンド法で５４６nmにおける吸光度を測定した。測定には日立７１７０形自動分析機を用いた。
【００５３】
【表２】
0003816403.tif 000004
【００５４】
表２の結果より、本発明品はいずれも、測定感度の差はほとんど見られないが、比較品では、いずれも測定感度が低く、また、イヌリナーゼの添加量で測定感度が変動することがわかる。
【００５５】
実施例１１（イヌリンキャリブレータの測定）
実施例１０のイヌリン含有製剤を、それぞれ精製水で、イヌリン２０mg／dL水溶液とし、キャリブレータとした。次に、実施例１０で用いた試薬組成１及び方法でイヌリン濃度を測定し、測定感度を求めた。調製後、１０℃保存で１３ヶ月後まで安定性を確認した。結果を表３に示す。
【００５６】
【表３】
0003816403.tif 000005
【００５７】
表３の結果より、いずれのキャリブレータも、安定性に優れていた。
【００５８】
実施例１２（イヌリン精度管理用試料の測定）
実施例１のイヌリン含有製剤を、プール血清、プール尿に溶解し、血清で４、２０、４０mg／dL、尿で１６、８０、３２０mg／dLの精度管理用試料を作製した。これらについて、実施例１０で用いた試薬組成１及び方法でイヌリン濃度を測定し、試料として精製水、キャリブレータ、精度管理用試料を同時に測定した。各精度管理用試料のイヌリン濃度は、精製水、キャリブレータの感度換算により求めた。調製後、４℃及び−２０℃で保存したときの安定性を、４℃保存で７日間、−２０℃保存で１３ヶ月まで確認した。−２０℃保存については、凍結融解を３回まで繰り返した後の安定性も確認した。結果を表４〜６に示す。
【００５９】
【表４】
0003816403.tif 000006
【００６０】
【表５】
0003816403.tif 000007
【００６１】
【表６】
0003816403.tif 000008
【００６２】
表４〜６の結果より、本発明のイヌリン含有製剤は、血清又は尿に溶解した後も、４℃及び−２０℃において安定性が良好であることが確認された。また、凍結融解に対しても安定性は良好であった。
【００６３】
【発明の効果】
本発明によれば、再溶解性に優れ、安定で、取り扱い易いイヌリン製剤を得ることができ、腎機能の把握に用いられる糸球体濾過量の測定に有用である。
すなわち、当該イヌリン製剤を用いれば、酵素反応によりイヌリンを迅速かつ正確に測定することができ、汎用自動分析機への適用も可能となり、正確、簡便かつ迅速にイヌリンクリアランスを求めることができる。