(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるフルクトシルアミノ酸オキシダーゼをコードするＤＮＡ。
【請求項２】
配列番号１に記載の塩基配列からなる、請求項１に記載のＤＮＡ。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のＤＮＡを含有する発現ベクター。
【請求項４】
プラスミドｐＮＦＬ８である請求項３記載の発現ベクター。
【請求項５】
請求項３又は４に記載の発現ベクターで形質転換された形質転換体。
【請求項６】
酵母である請求項５記載の形質転換体。
【請求項７】
メタノール酵母である請求項６記載の形質転換体。
【請求項８】
請求項５〜７のいずれかに記載の形質転換体を培地に培養し、培養物からフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを回収することを特徴とする組換えフルクトシルアミノ酸オキシダーゼの製造方法。
【請求項９】
培地が、メタノール０．１〜５．０％、及び０．１〜５．０％のＮＨ４Ｃｌ及び／又は０．１〜５．０％の酵母エキスを含有するものである請求項８記載の方法。
【請求項１０】
アマドリ化合物を含有する試料と、請求項５〜７のいずれかに記載の宿主細胞の培養物又はその処理物を接触させ、酸素の消費量又は過酸化水素の発生量を測定することを特徴とする、試料中のアマドリ化合物の分析法。
【請求項１１】
試料が生体成分であり、アマドリ化合物の分析が、該生体成分中の糖化タンパクの量及び／又は糖化率の測定、あるいはフルクトサミンの定量によりなされることを特徴とする請求項１０記載の分析法。
【請求項１２】
請求項５〜７のいずれかに記載の宿主細胞の培養物またはその処理物を含有するアマドリ化合物の分析のための試薬又はキット。
【請求項１３】
生体成分中の糖化タンパクの量及び／又は糖化率の測定、あるいはフルクトサミンの定量のために用いられることを特徴とする請求項１２記載の試薬又はキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＤＮＡ組換え技術によるフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（以下、ＦＡＯＤ−Ｌと称する）の真核細胞による製造に関し、より詳しくは、アスペルギルス属（Aspergillus）由来のＦＡＯＤ−Ｌをコードする遺伝子を含有し、真核細胞内で機能的な発現ベクター、該発現ベクターにより形質転換された真核細胞、得られた形質転換体を培養することによる組換えＦＡＯＤ−Ｌの製造、そのようにして得られる組換えＦＡＯＤ−Ｌ、該組換えＦＡＯＤ−Ｌを用いるアマドリ化合物の分析法及び該分析法に有用な試薬に関する。
【０００２】
【従来技術】
アマドリ化合物は、タンパク質、ペプチド及びアミノ酸のようなアミノ基を有する物質と、アルドースのような還元性の糖が共存する場合、アミノ基とアルデヒド基が非酵素的かつ非可逆的に結合し、アマドリ転移することにより生成される物質であり、醤油等の食品、及び血液等の体液に含有されている。その生成速度は、反応性物質の濃度、接触時間、温度などの関数であることから、生成量を測定することにより、それら反応性物質を含有する物質に関する様々な情報を得ることができる。
例えば、生体内では、グルコースとアミノ酸が結合したアマドリ化合物であるフルクトシルアミン誘導体が生成しており、血液中のヘモグロビンが糖化されたフルクトシルアミン誘導体はグリコヘモグロビン、アルブミンが糖化された誘導体はグリコアルブミン、血液中のタンパクが糖化された誘導体はフルクトサミンと呼ばれる。これらの血中濃度は、過去の一定期間の平均血糖値を反映しており、その測定値は、糖尿病の症状の重要な指標となり得るために、測定手段の確立は臨床上、極めて有用である。また、食品中のアマドリ化合物を定量することにより、その食品の製造後の保存状況や期間を知ることができ、品質管理に役立つと考えられる。
このように、アマドリ化合物の定量分析は医学及び食品を含む広範な分野で有用である。
【０００３】
従来、アマドリ化合物を含有する試料に酸化還元酵素を作用させ、酸素の消費量又は過酸化水素の発生量を測定することにより、定量する分析法が提案されている（例えば、特公平５−３３９９７号公報、特開昭６１ー２６８１７８号公報、特開平２−１９５９００号公報、特開平３−１５５７８０号公報）。さらに、糖尿病の診断のための糖化タンパクの定量法も開示されている（特開平２−１９５８９９号公報、特開平２−１９５９００号公報）。
【０００４】
アマドリ化合物の酸化還元酵素による分解反応は下記の一般式で表すことができる。
【化１】
Ｒ1−ＣＯ−ＣＨ2−ＮＨ−Ｒ2  ＋  Ｏ2  ＋  Ｈ2Ｏ→
Ｒ1−ＣＯ−ＣＨＯ  ＋  Ｒ2−ＮＨ2  ＋  Ｈ2Ｏ2
（式中、Ｒ1はアルドース残基、Ｒ2はアミノ酸、タンパク質又はペプチド残基を表す）
本出願人は、上記の目的に適う酵素として、フサリウム属（Fusarium）由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（ＦＡＯＤ−Ｌ及びＦＡＯＤ−Ｓ）を精製し、その有用性を明らかにした（特開平８−１５４６７２、特開平７−２８９２５３）。また、アスペルギルス属（Ａspergillus）が、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（ＦＡＯＤ−Ｌ）を生産することも明らかにした。
【０００５】
【発明が解決すべき課題】
しかしながら、微生物を培養し、培地から該酵素を抽出して製造する方法は、多くの労力と時間を必要とし、非効率的である。また、精製法で得られる酵素には、フサリウム属又はアスペルギルス属の菌株固有のタンパク質等の不純物が付随する確立が高く、そのような不純物には、ＦＡＯＤ−Ｌ活性に悪影響を及ぼす物質が混在する可能性があり、測定の信頼性が十分に確保できない恐れがあった。
従って、フサリウム属またはアスペルギルス属の菌に由来する不純物を伴わないＦＡＯＤ−Ｌを効率よく製造する方法の開発が求められていた。そのためには、フサリウム属又はアスペルギルス属由来のＦＡＯＤ−ＬをコードするＤＮＡをクローニングし、該ＤＮＡを含有する適当な発現ベクターを構築し、該発現ベクターで宿主細胞を形質転換し、該形質転換体を適当な培地で培養することにより、解決することができる。しかしながら、フサリウム属またはアスペルギルス属由来のＦＡＯＤ−ＬをコードするＤＮＡがクローニングされた例はなく、まず、そのようなＤＮＡのクローニングが必要であった。
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、アスペルギルス・テレウス  ＧＰ１（Ａspergillus terreus ＧＰ１：ＦＥＲＭ−１５６６４）が産生するＦＡＯＤ−ＬをコードするＤＮＡをクローニングし、該ＤＮＡを含有する発現ベクターを構築し、該発現ベクターで大腸菌を形質転換し、得られた大腸菌形質転換体（Ｅ．coli ＳＯＬＲ／ｐＦＡＬ２及びＥ．coli ＪＭ１０９／ｐＦＡＬ２）を培養することにより、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ活性を有する組換えＦＡＯＤ−Ｌを製造した。
【０００７】
しかしながら、本来、真核生物であるアスペルギルス・テレウス  ＧＰ１（Ａspergillus terreus ＧＰ１：ＦＥＲＭ−１５６６４）が生産していたＦＡＯＤ−Ｌを原核生物に生産させると、インクルージョンボディ（封入体）を形成し、効率的な酵素の生産を確保できない恐れがある。このような現象は当業者に公知であり、多くの文献に記載されている（例、ラボマニュアル遺伝子工学増補版、丸善株式会社、１８７頁参照）。
従って、ＦＡＯＤ−Ｌをコードする遺伝子（又はＤＮＡ）を含有し、真核細胞を形質転換することが可能な発現ベクターを構築し、該発現ベクターで真核細胞を形質転換し、得られた形質転換体を培養して酵素を生産させる方法の開発が必要であった。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、ＦＡＯＤ−Ｌをコードする遺伝子（又はＤＮＡ）を適当な発現ベクターに挿入し、得られたベクターを用いて真核細胞を形質転換し、ＦＡＯＤ−Ｌを生産させることに成功した。
すなわち、本発明はアスペルギルス属（Ａspergillus）の菌に由来するＦＡＯＤ−Ｌをコードする異種遺伝子を導入された真核細胞により生産されたことを特徴とするＦＡＯＤ−Ｌを提供するものである。
異種遺伝子としては、アスペルギルス属（Ａspergillus）の菌に由来するＦＡＯＤ−Ｌをコードする遺伝子であることが好ましく、アスペルギルス・テレウスＧＰ１（Ａspergillus terreus ＧＰ１：ＦＥＲＭ−１５６６４）由来のＦＡＯＤ−Ｌをコードする遺伝子がより好ましい。
本発明のＦＡＯＤ−Ｌは、例えば、後述する実施例に記載のごとく原核性宿主を形質転換して得られる形質転換体（例、Ｅ．coli ＳＯＬＲ／ｐＦＡＬ２又はＥ．coli ＪＭ１０９／ｐＦＡＬ２）から得られるＦＡＯＤ−ＬをコードするＤＮＡ断片を真核細胞に発現させることによって得ることができる。
【０００９】
さらに、本発明は、上記のＦＡＯＤ−Ｌをコードする異種遺伝子を含有し、真核細胞内で機能的な発現ベクターを提供するものである。
該遺伝子は、好ましくはアスペルギルス属（Ａspergillus）の菌、より好ましくはアスペルギルス・テレウス  ＧＰ１（Ａspergillus terreus ＧＰ１：ＦＥＲＭ−１５６６４）由来のＦＡＯＤ−Ｌをコードする遺伝子である。
そのような発現ベクターには、実施例に記載の原核性形質転換体であるＥ．coli ＳＯＬＲ／ｐＦＡＬ２又はＥ．coli ＪＭ１０９／ｐＦＡＬ２から得られるＦＡＯＤ−ＬをコードするＤＮＡ断片を含有させてもよい。
最も好ましい発現ベクターはプラスミドｐＮＦＬ８である。
本明細書中、発現ベクターが真核細胞内で「機能的」であるとは、該ベクターを真核細胞に導入したとき、得られた形質転換体が適当な培地で増殖し、該ベクターに含有されている異種のＦＡＯＤ−Ｌを生産しうることを意味する。
「異種遺伝子」とは、ＦＡＯＤ−Ｌを生産する真核細胞固有の遺伝子以外の外来性遺伝子であることを意味する。
なお、本明細書中、「遺伝子」及び「ＤＮＡ」なる語句は、起源に関係なく、目的のＦＡＯＤ−Ｌ活性を有するペプチドをコードすることを条件として、相互変換可能に用いられる。
【００１０】
本発明はまた、上記発現ベクターで真核細胞を形質転換して得られる形質転換体を提供するものである。
真核細胞は、好ましくは酵母、より好ましくはメタノール酵母である（メチロトロフ酵母またはメタノール資化性酵母）。
さらに、本発明は、これらの形質転換体を培地に培養し、培養物からフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを回収することを特徴とするフルクトシルアミノ酸オキシダーゼの製造方法を提供するものである。
また、本発明は、アマドリ化合物を含有する試料と、これら形質転換体の培養物又はその処理物を接触させ、酸素の消費量又は過酸化水素の発生量を測定することを特徴とする、試料中のアマドリ化合物の分析法を提供するものである。
本発明の分析法は、アマドリ化合物を含有する試料の全てに適用可能であるが、生体成分であることが好ましい。また、その場合、該生体成分中の糖化タンパクの量及び／又は糖化率の測定、あるいはフルクトサミンの定量により行うことが好ましい。
本発明はまた、上記の形質転換体の培養物又はその処理物を含有するアマドリ化合物の分析のための試薬又はキットを提供するものである。
該試薬及びキットは、好ましくは生体成分中の糖化タンパクの量及び／又は糖化率の測定、あるいはフルクトサミンの定量のために用いられるものである。
【００１１】
本発明のＦＡＯＤ−Ｌは、以下の特性：
（１）酸素の存在下でアマドリ化合物を酸化して、α−ケトアルデヒド、アミン誘導体及び過酸化水素を生成する反応を触媒する酵素活性を有し；
（２）ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定したとき、分子量約４８,０００ダルトンの同一サブユニット２個より成り；
（３）そのＮ末端に配列表の配列番号２で示されるアミノ酸配列を、また、中間に配列番号３で示されるアミノ酸配列を有し；かつ
（４）アスペルギルス属（Ａspergillus）の菌由来の他のタンパク質を実質上含有しない；を有するペプチド又はその酵素活性を有するフラグメントである。
本発明のＦＡＯＤ−Ｌ又はそのフラグメントは、配列番号１記載のアミノ酸配列又はその部分配列を含有することが好ましい。
また、本発明の発現ベクターは、１つの実施態様として、配列番号１記載の塩基配列又はその部分配列を含有する。
【００１２】
本明細書中、培養物の「処理物」とは培養物から得られる物質であって、上記式(Ｉ)で示される反応を触媒する酵素活性を高め、及び／又は酵素活性の利用をより容易にするために、当該技術分野で通常の方法により処理された物質を指す。
ＦＡＯＤ−Ｌ活性が形質転換体細胞内に止まっている場合、処理物の例として以下のものを挙げることができる。
（１）生の細胞：ろ過又は遠心等の通常の方法で培養物から分離された細胞。
（２）乾燥細胞：（１）の生細胞を凍結乾燥又は真空乾燥したもの。
（３）細胞抽出物：（１）又は（２）の細胞を通常の方法（例えば有機溶媒中での自己溶菌、アルミナや海砂と混合しての摩砕、又は超音波処理）して得られる。
（４）酵素溶液：細胞抽出物を常法通り精製するか部分精製することにより得られる。
（５）精製酵素：（４）に記載の酵素溶液をさらに精製し、不純物を含まないもの。
（６）酵素活性を有するフラグメント；精製酵素等を適当な方法で断片化処理することにより得られるペプチドフラグメント。
（７）固定化細胞又は酵素：細胞又は酵素を通常の方法で固定化（例えばポリアクリルアミド、ガラスビーズ、イオン交換樹脂等に固定化）したもの。
培地に分泌される場合は、培養物そのもの及びそれから精製される酵素（溶液、凍結乾燥品、断片化したフラグメント等）及び固定化酵素が培養物又は処理物の例として挙げられる。
本発明の目的には、酵素活性を有するフラグメントも有用であり、そのような「酵素活性を有するフラグメント」は、（６）に記載のごとく、ＦＡＯＤ−Ｌ活性を有し、本発明の目的に有用なペプチドフラグメントを指す。それは、例えば、上記（５）の精製酵素を、適当な方法で断片化処理することにより得ることができ、培養物の処理物の１つである。
なお、本明細書で、単にＦＡＯＤ−Ｌというときにも、上記の培養物の処理物の１つを表す場合がある。
【００１３】
【発明の実施の形態】
ＦＡＯＤ−Ｌの真核細胞での生産のための発現ベクターの構築、形質転換及び形質転換体の培養は、当該技術分野で既知の方法に従って行うことができる。
本発明のＦＡＯＤ−Ｌの生産に適した真核細胞としては、酵母、特にＳaccharomyces属に属する株（例えば、Ｓ．cerevisiae）やＣandida属に属する株（例えば、Ｃ．boidinii）、動物細胞又は培養植物細胞、例えば、マウスＬ９２９細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などが例示される。
通常、発現には菌体内発現と分泌発現の２種類があるが、各々について適当な発現系が存在する。例えば、酵母形質転換体に、発現産物を細胞外に分泌させる必要があれば、ＦＡＯＤ−ＬをコードするＤＮＡのＮ末端に宿主酵母由来の分泌蛋白質のシグナル配列の遺伝子を連結させて、発現産物をペリプラスムに分泌させるよう、発現系を構築する。
【００１４】
真核性宿主に使用するのに適した発現ベクターは既知であり、それらから任意に選択することができるが、酵母でのＦＡＯＤ−Ｌの発現のための発現ベクターとしては、ＧＡＬプロモーターやＡＯＤプロモーター等のプロモーターを含有するものが好ましい。又、哺乳動物細胞でのＦＡＯＤ−Ｌ発現のための発現ベクターとしては、ＳＶ４０プロモーター等のプロモーターを有するものが挙げられる。
また、発現効率を高めるために、当該技術分野で既知の多コピー型プラスミドを用いて、多コピー型発現ベクターを構築することもできる。
ＦＡＯＤ−Ｌ発現ベクターの構築は、適当な方法で得られるＦＡＯＤ−Ｌをコードする遺伝子又はＤＮＡ、例えばｍＲＮＡの逆転写によって得られるｃＤＮＡ、既にクローン化されたＤＮＡ、あるいは合成ＤＮＡ等を、適当な発現ベクターに挿入することにより行うことができ、そのような方法は当該技術分野で既知である。
【００１５】
以下に、酵母での発現に適した発現ベクターの構築方法を示すが、これは１例にすぎず、本発明は以下の発現ベクターに限定されるものではない。
酵母でのＦＡＯＤ−Ｌ遺伝子の発現のために、Ｃ．boidiniiの染色体挿入型発現ベクターであるプラスミドpＮＯＴel（特開平５−３４４８９５）を用い、ＦＡＯＤ−Ｌ発現ベクターを構築する。このプラスミドpＮＯＴelは、ＡＯＤプロモーターとＵＲＡ３遺伝子を含んでおり、該プラスミドで形質転換された形質転換体を、Ｕｒａ要求を指標として選抜する手段を与えることができる。
まず、クローン化ＦＡＯＤ−ＬｃＤＮＡを含む大腸菌発現ベクターｐＦＡＬ２を、実施例の記載に従って得られるＥ．coli ＳＯＬＲ／ｐＦＡＬ２又はＥ．coli ＪＭ１０９／ｐＦＡＬ２から得、これを鋳型としてＦＡＯＤ−ＬのＮ末端とＣ末端に相当する２種のプライマー（配列番号４及び５）を用いてＰＣＲを行い、約１.３ｋｂのＦＡＯＤ−ＬｃＤＮＡ断片を得、精製した。他方、プラスミドpＮＯＴelを制限酵素ＮotIにより消化した後、ウシ腸ホスファターゼを用いて脱リン酸化処理し、上記の、ＦＡＯＤ−ＬｃＤＮＡ断片と共にＤＮＡ Blunting Kit（宝酒造株式会社）を用いて平滑化した。これらをＤＮＡ ligation Kit（宝酒造株式会社）を用いて連結し、プラスミドｐＮＦＬを得た。これを大腸菌にＨanahan法（Ｈanahan，Ｄ，Ｔechniques for Ｔransformation of Ｅ.coli. Ｉn：ＤＮＡ Ｃloning, vol Ｉ, Ｇlover, Ｄ.Ｍ.(ed), pp109-136, ＩＲＬ Ｐress, 1985）で形質転換し、得られた形質転換体から任意に８４株を選択してプラスミドを調製した。プラスミドを制限酵素ＨindIIIで処理して挿入片の方向性を確認し、ＦＡＯＤ−ＬｃＤＮＡ断片がＡＯＤプロモーターの下流に挿入されているプラスミドｐＮＦＬ８を得た。該プラスミドｐＮＦＬ８の制限地図は図５に示されている。
【００１６】
上記のプラスミドｐＮＦＬ８を用い、Ｕｒａ要求性のＣ．boidiniiTK62株を形質転換し、形質転換体をＵｒａを含まないＹＮＢ培地で培養した。ＵＲＡ+型形質転換体から任意に１４株を選び、これらの株をメタノール含有基本培地で培養すると、その１１株が後述の表１に示すように、ＦＡＯＤ−Ｌを生産した。形質転換体のサザン解析の結果、大多数の形質転換体がシングルコピーを有していることがわかった。
【００１７】
発現ベクターによる宿主細胞の形質転換は既知であり、Ｍolecular Ｃloning：A LABOLATORY MANUAL, Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｌaboratory Ｐressに記載の方法で行うことができる。真核性宿主の場合は、コンピテントセル作製法、エレクトロポレーション法、リチウム改変法、哺乳動物細胞の場合はトランスフェクション法、エレクトロポレーション法により行うことができる。
形質転換体の培養に用いる培地は、炭素源（例えばグルコース、メタノール、ガラクトース、フルクトース等）及び無機また有機窒素源（例えば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸ナトリウム、ペプトン、カザミノ酸等）を含有していてよい。所望により、培地に他の栄養源（例えば無機塩類（塩化ナトリウム、塩化カリウム）、ビタミン類（例えばビタミンＢ1）、抗生物質（例えばアンピシリン、テトラサイクリン、カナマイシン等)）を加えてもよい。哺乳動物細胞の培養には、イーグル培地が適当である。
本発明のＦＡＯＤ−Ｌの製造に適した培地は、０.１〜５.０％、好ましくは０.５〜２.０％のＮＨ4Ｃｌ及び／又は０.１〜５.０％、好ましくは１％の酵母エキスを含有する、メタノール０.１〜５.０％、好ましくは１.５％を含有する基本培地である。例えば、後述の表２及び３には、宿主細胞がメタノール酵母である場合の培地条件の比較が示されている。表から、１.５％メタノール含有基本培地でも十分にＦＡＯＤ−Ｌが生産されるが、窒素源としてＮＨ4Ｃｌを含有することが好ましく、酵母エキスの濃度が約１％であることが好ましいことが分る。
【００１８】
形質転換体の培養は、通常、pＨ５.０〜８.０、好ましくはpＨ５.５〜６.０、２５〜４０℃（好ましくは２８℃）で１６〜９６時間行えばよい。
生産されたＦＡＯＤ−Ｌが培養溶液、培養濾液（上澄み）中に存在しているときは、培養物を濾過又は遠心分離する。培養濾液から、ＦＡＯＤ−Ｌを天然又は合成のタンパク質の精製、単離に一般的に用いられる常法（例えば透析、ゲル濾過、抗ＦＡＯＤ−Ｌモノクロナール抗体を用いてのアフィニティカラムクロマトグラフィー、適当な吸着剤を用いてのカラムクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等）によって精製できる。生産されたＦＡＯＤ−Ｌが培養形質転換体のペリプラズム及び細胞質中に存在するときは、濾過や遠心分離によって細胞を集め、それらの細胞壁及び／又は細胞膜を、たとえば超音波及び／又はリゾチーム処理によって、破壊して、デブリス（細胞破砕物）を得る。デブリスを適当な水溶液（例えばトリス−塩酸緩衝液）に溶解させる。この溶液から、常法によって、ＦＡＯＤ−Ｌを精製することができる。
【００１９】
形質転換体中で生産されたＦＡＯＤ−Ｌを再生（リフォールディング）する必要があるときは、これを常法によって行なうことができる。
本発明方法で得られる形質転換体を適当な培地で培養して得られる培養物はＦＡＯＤ−Ｌ活性を示すが、このものを上記のごとく当業者既知の通常の方法でさらに処理して酵素溶液等の処理物を調製することができる。また、所望により精製してもよい。例えば、培養物を遠心してＦＡＯＤ−Ｌ産生−形質転換体を収穫し、りん酸緩衝液に懸濁し、音波処理等によって細胞を破壊する。次いで、上清を遠心分離することにより、酵素標品を得る。さらに、上清を透折し、クロマトグラフィー等でさらに精製すれば精製酵素が得られる。次いで、制限酵素処理やエキソヌクレアーゼ処理等により、酵素活性を有するフラグメントを得ることができる。
【００２０】
上記の培養物、その処理物（精製酵素標品及び酵素活性を有するフラグメントを含む）は、ＦＡＯＤ−Ｌ酵素活性を有し、アマドリ化合物の定量分析に適しており、例えば、糖尿病の診断に有用である。
既述のごとく、本発明の形質転換体を培養して得られる培養物及びその処理物は以下の反応式：
【化２】
Ｒ1−ＣＯ−ＣＨ2−ＮＨ−Ｒ2  ＋  Ｏ2  ＋  Ｈ2Ｏ→
Ｒ1−ＣＯ−ＣＨＯ  ＋  Ｒ2−ＮＨ2  ＋  Ｈ2Ｏ2
（式中、Ｒ1はアルドース残基、Ｒ2はアミノ酸、タンパク質又はペプチド残基を表す）
で示されるアマドリ化合物の酸化還元反応を触媒する。上記式において、Ｒ1が−ＯＨ、−（ＣＨ2）n−、又は−［ＣＨ（ＯＨ)］n−ＣＨ2ＯＨ（式中、ｎは０−６の整数）であり、Ｒ2が−ＣＨＲ3−［ＣＯＮＨＲ3］mＣＯＯＨ（式中、Ｒ3はα−アミノ酸側鎖残基、ｍは１−４８０の整数を表す）で示されるアマドリ化合物が基質として好ましい。中でも、Ｒ3がリジン、ポリリジン、バリン、アスパラギンなどから選択されるアミノ酸の側鎖残基であり、またｎが５〜６、ｍが５５以下である化合物が好ましい。
【００２１】
本発明の分析法を行うには、アマドリ化合物を含有すると考えられる試料と本発明のＦＡＯＤ−Ｌを発現する形質転換体の培養物又はその処理物を、水又は緩衝液中で接触させ、酸素の消費量又は過酸化水素の発生量を測定することにより、試料中のアマドリ化合物を分析する。本発明の分析法は、生体成分中の、糖化タンパクの量及び／又は糖化率の測定、あるいはフルクトサミンの定量に基づいて行われる。
例えばアマドリ化合物を含有する緩衝液中の試料に、培養物又はその処理物の水又は緩衝液中懸濁液（溶液）を加える。pＨ、温度及び反応時間等の反応条件は特に限定されるものでなく、同様の酵素反応に通常用いられる条件から適宜選択するとよい。しかしながら、約ｐＨ４.０〜１２.０、好ましくはｐＨ７.０〜９.０であり、より好ましくはｐＨ約８.０、温度２５〜５０℃、好ましくは２５〜４０℃、より好ましくは３５℃で反応させる。
【００２２】
本発明方法に用いる被検液としては、アマドリ化合物を含有する任意の試料溶液を用いることができ、例えば、血液（全血、血漿又は血清）、尿等の生体由来の試料の外、醤油等の食品が挙げられる。
緩衝液としてはトリス−塩酸緩衝液等を用いる。ＦＡＯＤ−Ｌ、ＦＡＯＤ−Ｌを発現する形質転換体の培養物又はその処理物の使用量は、終点分析法においては通常、０.１単位／ml以上、好ましくは１〜１００単位／mlである。
本発明の分析法では、下記のいずれかのアマドリ化合物の定量法を用いる。
（１）過酸化水素発生量に基づく方法
当該技術分野で既知の過酸化水素の定量法、例えば、発色法、過酸化水素電極を用いる方法等で測定し、過酸化水素及びアマドリ化合物の量に関して作成した標準曲線と比較することにより、試料中のアマドリ化合物を定量する。具体的には、後述の力価の測定法に準じる。ただし、ＦＡＯＤ−Ｌ量は１ユニット／ｍｌとし適当に希釈した試料を添加し、生成する過酸化水素量を測定する。過酸化水素発色系としては、４−アミノアンチピリン／フェノール系のかわりに４−アミノアンチピリン／Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−トルイジン，４−アミノアンチピリン／Ｎ,Ｎ−ジメチルアニリン，４−アミノアンチピリン／Ｎ,Ｎ−ジエチルアニリン，ＭＢＴＨ／Ｎ,Ｎ−ジメチルアニリン，４−アミノアンチピリン／２，４−ジクロロフェノール等の組み合わせが可能である。
【００２３】
（２）酸素の消費量に基づく方法
反応開始時の酸素量から反応終了時の酸素量を差し引いた値（酸素消費量）を測定し、酸素消費量とアマドリ化合物の量に関して作成した標準曲線と比較することにより、試料中のアマドリ化合物を定量する。具合的には、後述の力価の測定法に準じて行う。但し用いるＦＡＯＤ−Ｌ量は１ユニット／mlとし、適当に希釈した試料を添加し吸収される酸素量を求める。
【００２４】
本発明方法は試料溶液をそのまま用いて行うこともできるが、対象によっては、あらかじめ糖が結合したリジン残基を遊離させてから行うことが好ましい。
そのような目的には、タンパク質分解酵素を用いる場合（酵素法）と、塩酸等の化学物質を用いる場合（化学法）があるが、前者が好ましい。本発明方法に用いることができるタンパク質分解酵素は、当業者に既知であり、トリプシン、カルボキシペプチダーゼＢ、パパイン、アミノペプチダーゼ、キモトリプシン、サーモリシン、ズブシリシン、プロティナーゼＫ、プロナーゼ等を挙げることができる。酵素処理の方法も既知であり、例えばプロテアーゼ処理は、下記実施例に記載の方法で行うことができる。
【００２５】
上記のごとく、本発明のＦＡＯＤ−Ｌを発現する形質転換体の培養物又はその処理物は、糖化タンパクに含まれるフルクトシルリジンに高い基質特異性を有するものであることから、血液試料中の糖化タンパクを測定することを含む、糖尿病の診断などに有用である。また、フルクトシルバリンにも特異性を有することから、糖化ヘモグロビンの測定にも有用である。
なお、検体として血液試料（全血、血漿又は血清）を用いる場合、採血した試料をそのまま、あるいは透折等の処理をした後用いる。
さらに、本発明方法に用いるＦＡＯＤ−Ｌを発現する形質転換体の培養物又はその処理物、あるいはパーオキシダーゼ等の酵素は、溶液状態で用いてもよいが、適当な固体支持体に固定化してもよい。例えば、ビーズに固定化した酵素をカラムに充填し、自動化装置に組み込むことにより、臨床検査など、多数の検体の日常的な分析を効率的に行うことができる。しかも、固定化酵素は再使用が可能であることから、経済効率の点でも好ましい。
さらには、酵素と発色色素とを適宜組み合わせ、臨床分析のみならず、食品分析にも有用なアマドリ化合物の分析のためのキットを得ることができる。
【００２６】
酵素の固定化は当該技術分野で既知の方法により行うことができる。例えば、担体結合法、架橋化法、包括法、複合法等によって行う。担体としては、高分子ゲル、マイクロカプセル、アガロース、アルギン酸、カラギーナンなどがある。結合は共有結合、イオン結合、物理吸着法、生化学的親和力を利用し、当業者既知の方法で行う。
固定化酵素を用いる場合、分析はカラム又はバッチ方式のいずれでもよい。上記のごとく、固定化酵素は、血液試料中の糖化タンパクの日常的な分析（臨床検査）に特に有用である。臨床検査が糖尿病診断を目的とする場合、診断の基準としては、結果を糖化タンパク濃度として表すか、試料中の全タンパク質濃度に対する糖化タンパク質の濃度の比率で表される。全タンパク質濃度は、通常の方法（２８０nmの吸光度、Lowry法あるいは、アルブミンの自然蛍光など）で測定することができる。
【００２７】
本発明のアマドリ化合物の定量のための試薬は、本発明のＦＡＯＤ−Ｌを発現する形質転換体の培養物又はその処理物、及び好ましくはｐＨ７.０〜９.０、より好ましくはｐＨ８.０の緩衝液からなる。該培養物又はその処理物が固定化されている場合、固体支持体は高分子ゲルなどから選択され、好ましくはアルギン酸である。
試薬中の培養物又はその処理物の量は、終点分析を行う場合、試料あたり、通常１〜１００単位／ml、バッファーはトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８.０）が好ましい。
過酸化水素の生成量に基づいてアマドリ化合物を定量する場合、発色系としては、上記の各種の組み合わせを利用することが可能である。
本発明のアマドリ化合物の分析試薬と、適当な発色剤ならびに比較のための色基準あるいは標準物質を組み合わせてキットとすることもできる。そのようなキットは、予備的な診断、検査に有用であると考えられる。
【００２８】
【実施例】
次下に実施例を挙げて本発明を詳しく説明するが、これらは本発明を制限するものではない。以下の実施例において用いたプラスミド類、様々な制限酵素等の酵素類は、市販品から入手し、供給者の指示に従って使用するか、文献記載の方法で製造することができる。また、プラスミドの構築、宿主の形質転換、形質転換体の培養及び培養物からの酵素の回収は、当業者既知の方法、あるいは文献記載の方法に準じて行なった。また、酵素活性は以下の力価の測定法に従って測定した。
力価測定法
（１）生成する過酸化水素を比色法により測定する方法。
Ａ.速度法
１００ｍＭ ＦＺＬ溶液はあらかじめ得られたＦＺＬを蒸留水で溶解することによって調製した。４５mＭ ４−アミノアンチピリン、６０ユニット／ｍｌパーオキシダーゼ溶液、及び６０ｍＭ  フェノール溶液それぞれ１００μｌと、０.１Ｍ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８.０）１ｍｌ、及び酵素溶液５０μｌを混合し、全量を蒸留水で３.０ｍｌとする。３０℃で平衡化した後、１００ｍＭ ＦＺＬ溶液５０μｌを添加し、５０５ｎｍにおける吸光度を経時的に測定した。生成するキノン色素の分子吸光係数（５.１６×１０3Ｍ-1cm-1）から、１分間に生成する過酸化水素のマイクロモルを算出し、この数字を酵素活性単位とする。
【００２９】
Ｂ.終末法
上記Ａ法と同様に処理し、基質添加後、２０分間３０℃でインキュベートした後の５０５ｎｍにおける吸光度を測定し、別にあらかじめ標準過酸化水素溶液を用いて作成した検量線から生成した過酸化水素量を算出することにより、酵素活性を測定する。
（２）酵素反応による酸素吸収を測定する方法
０.１Ｍ トリス−塩酸緩衝液1ｍｌと酵素溶液５０μｌを混合し、蒸留水で全量を３.０ｍｌとし、ランク ブラザーズ社の酸素電極のセルに入れる。３０℃で攪拌し、溶存酸素と温度を平衡化した後、５０ｍＭ ＦＺＬ １００μｌを添加し、酸素吸収を記録計で連続的に計測し、初速度を得る。標準曲線から１分間に吸収された酸素量を求め、これを酵素単位とする。
【００３０】
実施例１  ＦＡＯＤ−ＬをコードするＤＮＡのクローニング
１．アスペルギルス・テレウスＧＰ１(Ａspergillus terreus ＧＰ１；ＦＥＲＭＰ−１５６６４）のＦＡＯＤ−Ｌの部分アミノ酸配列の決定
１）Ａ. terreus ＧＰ１の培養及びＦＡＯＤ−Ｌの精製
Ａspergillus terreus ＧＰ１；Ｐ−１５６６４）をＦＺＬ ０.５％、グルコース １.０％、リン酸二カリウム０.１％、リン酸一ナトリウム ０.１％、硫酸マグネシウム ０.０５％、塩化カルシウム ０.０１％, イーストエキス ０.２％を含有した培地（ｐＨ６.０)１０Ｌに植菌し、ジャーファーメンターを用いて通気量２Ｌ／分、攪拌速度４００ｒｐｍの条件で２８℃、２４時間攪拌培養した。培養物は瀘過して集めた。
菌糸体２５９ｇ（湿重量）を、２ｍＭのＤＴＴを含む、０.１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８.５)８００mlに懸濁し、ダイノ・ミルにより菌糸体を破砕した。破砕液を９,５００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、得られた液を粗酵素液とし、以下の方法で精製した。
【００３１】
粗酵素液に４０％飽和になるように硫酸アンモニウム（以下、硫安と略す）を加え、攪拌し、１２,０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。得られた上清に７５％飽和になるように硫安を加え、撹拌し、１２,０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。沈殿を２ｍＭのＤＴＴを含有する５０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８.５）（以下、緩衝液Ａと略す）に溶解した。その溶液に硫安４０％を含む緩衝液Ａを等量加え、次いで、約２００mlのブチル−トヨパール（butyl-ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ）樹脂を加え、穏やかに撹拌した。同緩衝液で洗浄後、緩衝液Ａを用い、バッチ法で溶出した。溶出液を硫安濃縮し、２５％飽和硫安を含む緩衝液Ａで平衡化したフェニル−トヨパール（phenyl-ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ）カラムに吸着した。同緩衝液にて洗浄した後、硫安濃度２５−０％飽和の直線勾配で溶出した。活性画分を集め、硫安濃縮後、４０％飽和硫安を緩衝液Ａで平衡化したブチル−トヨパールカラムに吸着した。同緩衝液にて洗浄した後、硫安濃度４０−０％飽和の直線濃度勾配にて溶出した。活性画分を統合し、緩衝液Ａで平衡化したＤＥＡＥ−トヨパールカラムに供した。活性画分は同緩衝液による洗浄画分に認められたので、これを集め、硫安濃縮した。続いて得られた酵素溶液を０.１Ｍ ＮａＣl、２mＭ ＤＴＴを含む０.１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８.５）にて平衡化したセファクリルＳ−３００カラムによりゲル瀘過を行い、７０〜１００ユニットの精製酵素を得た。
【００３２】
得られた精製酵素標品をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動）において、標準タンパクとしてホスホリラーゼＢ、牛血清アルブミン、オボアルブミン、カルボニックアンヒドラーゼ、大豆トリプシンインヒビターを用い、デービスの方法に従って分子量を測定した。即ち、１０％ゲルを用いて、４０ｍＡで３時間泳動し、クーマシーブリリアントブルーＧ−２５０でタンパク染色を行った。分子量既知の数種のタンパクについて同様に泳動し、検量線から分子量を求めた結果、サブユニットの分子量は約４８,０００ダルトンであることが示された（図６）。
また、スーパーデックス２００ｐｇによるゲルろ過による分子量測定では、図７の検量線図から明らかなように、約９４,０００ダルトンであった。
【００３３】
２）部分アミノ酸配列の決定
上記の方法で精製した酵素標品をＶ８プロテアーゼ（シグマ社製）により断片化し、クリーブランド法［D.W.Cleaveland, S.G.Fisher, M.W. Kirschner and U.K. Laemmli, J.Biol.Chem., 252, 1102 (1977)］によりさらに断片化した。次いで、ＰＶＤＦ（ポリビニリデン  フルオリド、ミリポア社製、商品名，イモピロン−ＰＳＱ）膜にトランスファー（１４Ｖで一晩（１２時間））し、プロテインシーケンサー４７６Ａ（アプライドバイオシステムズ社）を用い、エドマン分解法によりアミノ酸配列を決定した。その結果、Ｎ−末端及び内部ペプチドの２断片からそれぞれ、配列番号２及び３に示す１７及び１６残基のアミノ酸配列が決定された。
【００３４】
２．ＲＴ−ＰＣＲによる部分ｃＤＮＡ断片の増幅
１）オリゴヌクレオチドプライマーの調製
上記１．２）で得たアミノ酸配列から推定される塩基配列を基に、ＰＣＲ（ポリメラーゼチェーン反応）に用いるためのプライマーを、図１に示すように設計した。このプライマーの設計に際して、アスペルギルス属のコドン使用率を考慮に入れ、またサブクローニングを容易にするために、プライマーの端にＢamＨＩ認識配列を付加した。これらプライマー１及び２の塩基配列をそれぞれ、配列番号４及び５に示す。なお、プライマー２は、プライマー１が付着するＤＮＡに相補なＤＮＡに付着するよう、図１に記載の配列に基づき、そのＣ末端側から合成されている。
【００３５】
２）totalＲＮＡの調製
上記１．１）の方法で培養したＡ. terreus ＧＰ１株の菌糸体１ｇからグアニジン／フェノール／クロロホルム法(Chomczynski,P. and Sacchi,N. (1987) Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-PhOH-chloroform extraction, Anal. Biochem. 162, 156-159）に従って、totalＲＮＡ５mgを得た。
【００３６】
３）ＲＴ−ＰＣＲ
上記１．２）で設計したプライマーと、２．２）で調製したtotalＲＮＡを用い、以下の手順で逆転写ポリメラーゼチェーン反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を行った。ａ）totalＲＮＡ（５μg／μl）２μlに滅菌水３６μlを加え、６５℃、５分加温した後、氷上で急冷する。
ｂ）ａ）の溶液に以下の溶液を加える。
５×buffer                          ２０μl
ｄＮＴＰmix（各２０mＭ）              ５μl
ＲＮase inhibitor（１１５Ｕ／ml）     ２μl
Ｏligo dt （０.４２μg／μl）       ２４μl
ＲＴase (ＭＬＶ）（２００Ｕ／μl）    １μl
ＤＴＴ（０.１Ｍ）                    １０μl
ｃ）ａ）＋ｂ）の溶液を２５℃、１０分放置した後、４２℃で一夜反応させる。そして、９５℃で５分加熱した後、氷上で急冷するとｃＤＮＡが得られる。
ｄ）ｃ）で合成したｃＤＮＡ２μlに以下の溶液を加える。
１０×ＰＣＲ  buffer                    ２.５μl
ｄＮＴＰ  ｍｉｘ                        １.８μｌ
プライマー１                            １   μｌ
プライマー２                            １   μｌ
減菌水                                １６.５７５μｌ
ｅ）ｄ）の溶液を９５℃で５分加熱した後、氷上で急冷した後、Ｔaq ＤＮＡ Ｐolymerase（５Ｕ／ｍｌ）を０．１２５μｌ加える。
ｆ）ｅ）にミネラルオイルを重層して以下の条件でＰＣＲ反応を行う。
（９４℃，１分；６０℃，２分；７２℃，２分）からなる一連の処理を３０サイクル行った後、７２℃で３分処理する。
ｇ）次いで、アガロースゲル電気泳動にかける。
その結果、プライマー１と２を用いたとき、図３に示すように約４００bpの断片の増幅が確認できた。図３は、アガロース電気泳動の結果を示す模写図である。図中、レーン１はφＸ１７４／ＨincII（マーカー）、レーン２はプライマー１及び２を用いた電気泳動パターンである。マーカーはＰＣＲにより増幅した断片のサイズを判断するために泳動を行った。
【００３７】
３．ＰＣＲ断片のサブクローニング
上記２．で得た約４００bpのＰＣＲ断片をアガロースゲルから切り出し、ＤＮＡ回収用フィルター付遠心チューブ（孔径０.２２μｍ、宝酒造社製Ｃode Ｎo.９０４０）を用いて、１０,０００ｒｐｍ．４℃、１時間の遠心の後、エタノール沈殿を行うことで精製した。
次いで、ＰＣＲ断片（１μl）、Ｋ buffer（１μl）、ＢamＨＩ（１μl）及び減菌水（７μl）を混合し、３７℃で４時間の消化を行った。得られたＢamＨＩ消化断片を、同じくＢamＨＩで消化したpBluescreipt II SK+（STRATAGENE社製：ｌａｃプロモータ−を有する大腸菌用発現ベクター）に、ライゲーション（１６℃・３０分）し、得られたライゲーション混合物を用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。形質転換は、ＴａＫａＲａ Ｌigation Ｋit Ｖer. ２.０（宝酒造）を使用し、Ｈanahan法（Ｈanahan，Ｄ，Ｔechniques for Ｔransformation of Ｅ.coli. Ｉn：ＤＮＡ Ｃloning, vol Ｉ, Ｇlover, Ｄ.Ｍ.(ed), pp109-136, ＩＲＬ Ｐress, 1985）に従って行った。
その結果、図４に示すように、約４００bpのＰＣＲ断片がpBluescreipt II SK+のＢamＨＩサイトに挿入されたプラスミドｐＦＬＰを得た。図４において、レーン１はλ／ＥcoＴ１４１（マーカー）を、レーン２はｐＦＬＰ／ＢamＨＩを表す。その塩基配列をジデオキシ法により決定したところ、ＦＡＯＤ−ＬのｃＤＮＡの部分配列であることが確認された。
【００３８】
４．ｃＤＮＡライブラリーの作成及びプラークハイブリダイゼーション
上記の２．２）の方法で得たtotal ＲＮＡからｍＲＮＡ Ｐurification Ｋit（ファルマシア社）を用いてｍＲＮＡを得た。該ｍＲＮＡ ５μgから、ＺＡＰ-cＤＮＡ Ｓynthesis Ｋit（STRATAGENE社製）を用いてｃＤＮＡライブラリーを作成した。即ちｍＲＮＡ５μgから逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを合成し、λＺＡＰ ＩＩベクター（STRATAGENE社製）に連結し、Gigapack III Gold（STRATAGENE社製）を用いてインビトロでパッケージングしてｃＤＮＡライブラリーを得た。（条件等はマニュアルに従った。）
次いで、ｃＤＮＡのタイターを測定した結果、１.０×１０5pfu/μgベクターであった。
このファージライブラリーを大腸菌ＸＬＩ−Ｂlue  ＭＲＦ株に感染させ、３７℃で１２時間培養することによりプラークを形成させた。次いで、３.でサブクローニングしたＰＣＲ断片を32Ｐで標識してプローブとして用い、プラークハイブリダイゼーションによりスクリーニングした。即ち、得られたプラークをニトロセルロースフィルターに転写し、アルカリ変性後、４２℃で32Ｐで標識したプローブと１２時間ハイブリダイズさせた。洗浄後、Ｘ線フィルムに１２時間露光させた。その結果、約２０,０００プラークから７つの陽性プラークを得た。
【００３９】
５.  ＦＡＯＤ−ＬをコードするＤＮＡのサブクローニング
ＦＡＯＤ−ＬをコードするＤＮＡのプラスミドへのサブクローニングはインビトロ切除法で行った。７個の陽性プラークからExAssistヘルパーファージ（STRATAGENE社製）を用いて添付のマニュアルに従い、大腸菌ＪＭ１０９（Ｅ.coli ＪＭ１０９ Ｃompetent Ｃell．宝酒造株式会社）に形質転換した。得られた形質転換体からプラスミドを抽出し塩基配列を決定した。その結果、ＦＡＯＤ−ＬのＮ末端アミノ酸配列に相当する塩基配列を有する約１.５ｋｂのＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドｐＦＡＬ２を保持するクローンを１株得た（大腸菌形質転換体（Ｅ.coli ＪＭ１０９／ｐＦＡＬ２))。このｐＦＡＬ２の制限地図を図２に示す。該クローンの塩基配列及び推定のアミノ酸配列を配列番号１に示す。
又、該プラスミドｐＦＡＬ２を用いて大腸菌ＳＯＬＲ（STRATAGENE社）を形質転換して大腸菌形質転換体（Ｅ.coli ＳＯＬＲ／ｐＦＡＬ２)を得た。
【００４０】
実施例２  酵母でのＦＡＯＤ−Ｌの発現
（１）ＦＡＯＤ−Ｌ発現ベクターの構築
アスペルギルス・テレウス  ＧＰ１（Ａspergillus terreus ＧＰ１：ＦＥＲＭ−１５６６４）由来のクローン化ｃＤＮＡを含む大腸菌発現ベクターｐＦＡＬ２を、Ｅ.coli ＪＭ１０９／ｐＦＡＬ２（実施例１）から得た。
得られたｐＦＡＬ２を鋳型としてＦＡＯＤ−ＬのＮ末端とＣ末端に相当する２種のプライマー（配列番号６及び７）を用いて以下の条件でＰＣＲを行って約１.３ｋｂのＦＡＯＤ−ＬｃＤＮＡ断片を得た。ＰＣＲ条件：［９４℃,１分；６０℃,１分；７２℃,３分］を３０サイクル＋７２℃,５分を１回。
アガロース電気泳動後、断片を常法通り精製し、ＦＡＯＤ−ＬｃＤＮＡ断片を得た。
【００４１】
プラスミドpＮＯＴel（特開平５−３４４８９５）を制限酵素ＮotＩにより消化した後、ウシ腸ホスファターゼ（ベーリンガーマンハイム社）を用いて脱リン酸化処理し、上記の、ＦＡＯＤ−ＬｃＤＮＡ断片と共にＤＮＡ Blunting Kit（宝酒造株式会社）を用いて平滑化した。これらをＤＮＡ ligation Kit（宝酒造株式会社）を用いて連結し、プラスミドｐＮＦＬを得た。
次いで、プラスミドｐＮＦＬを用い、Hanahan法（前掲）でＥ．coli JM109株を形質転換した。得られた形質転換体から任意に８４株を選択してプラスミドを調製した。プラスミドを制限酵素ＨindIIIで処理して挿入片の方向性を確認し、ＦＡＯＤ−ＬｃＤＮＡ断片がＡＯＤプロモーターの下流に挿入されているプラスミドｐＮＦＬ８を得た。該プラスミドｐＮＦＬ８の制限地図を図５に示す。
【００４２】
（２）形質転換
上記のプラスミドｐＮＦＬ８を、制限酵素ＢamＨＩにより直鎖状にした後、リチウム改変法を用いてＣ．boidiniiTK62株に形質転換した。このＴＫ６２株はＵｒａ要求性であり、プラスミドpNOTelにはＵＲＡ３遺伝子が含まれているので、Ｕｒａ要求を指標に形質転換体を選抜することができる。
形質転換体をＵｒａを含まないＹＮＢ培地に塗布することにより得られたＵＲＡ+型の形質転換体から任意に１４株を選び、１.５％メタノール含有基本培地に接種し、２８℃で３日間震盪培養した。集菌後、菌体内のＦＡＯＤ−Ｌ活性を上記の力価測定法のＡ．速度法により測定し、表１の結果を得た。なお、以下の実施例におけるＦＡＯＤ−Ｌの力価測定は同様の方法で行った。
【００４３】
表１  ｐＮＦＬ８により形質転換されたＣ．boidiniiのＦＡＯＤ−Ｌ活性
【表１】
0003819969.tif 000002
注：１，検出されず
２，pＮＯＴelで形質転換したＣ．boidiniiTK62株
表１から明らかに、１１株にＦＡＯＤ−Ｌ活性が認められ、その内、ＦＬＣ１４株が最大の活性を示した。
【００４４】
（３）形質転換体のサザン解析
Ｃ．boidiniiTK62株の染色体ＤＮＡに挿入されたプラスミドのコピー数を決定するためにサザン解析を行った。活性の異なる形質転換体３株より染色体ＤＮＡを抽出し、制限酵素ＥcoＲＩで消化した後、アガロースゲル電気泳動に供し、常法通りサザンブロッティングした。プローブとしてＵＲＡ３遺伝子を用い、プローブの標識はＤＩＧ−ＥＬＩＳＡ法により行った。結果は図８に示すように、強い活性を示すＣ．boidinii TK62/pNEL14株のみにおいて８.８ｋｂの断片が認められたので、２コピー以上のＦＡＯＤ−ＬｃＤＮＡ断片が染色体ＤＮＡに挿入されていることが予想された。それ以外のものは全てシングルコピーであった。
これは、挿入されているコピーが１つの時はＥｃｏＲＩ処理により、C.boidiniiのＥｃｏＲＩ認識部位とｐＮＦＬ８のＥｃｏＲＩ認識部位から９.１ｋｂの断片が切り出されるだけであるのに対して、２つ以上のコピーが挿入されていれば、２カ所のｐＮＦＬ８のＥｃｏＲＩ認識部位から切り出される断片が生じ、この断片のサイズが８.８ｋｂであることによるものである。
【００４５】
（４）ＦＡＯＤ−Ｌ活性を有する形質転換体の培養条件の検討
上記（３）で最も高活性を示した形質転換体Ｃ．boidinii TK62/pNEP14株を用い、好適な培養条件を検討した。１.５％メタノールを含有する基本培地を用い、無機窒素源を種々変えて培養しＦＡＯＤ−Ｌ活性を測定した。その結果を表２に示す。
表２ Ｃ．boidinii TK62/pNEP14株によるＦＡＯＤ−Ｌ生産に対する窒素源の影響
【表２】
0003819969.tif 000003
表２から、窒素源としてＮＨ4Ｃｌが好ましいことが分かる。その培地中の含有量は、０.１〜５.０％、より好ましくは０.５〜２.０％である。
【００４６】
次いで、酵母エキス濃度を種々変化させて検討した結果、下記の表３に示すように、酵母エキス濃度が高いほど、ＦＡＯＤ−Ｌ活性が上昇する。好ましい酵母エキス濃度は０.１〜５.０％、より好ましくは約１％である。
表３ Ｃ．boidinii TK62/pNEP14株によるＦＡＯＤ−Ｌ生産に対する酵母エキス濃度の影響
【表３】
0003819969.tif 000004
【００４７】
さらに、炭素源として１.５％メタノール、１.５％メタノール＋３％グリセロール、３％グリセロールのいずれかを含有する培地でＣ．boidinii ＴＫ６２／ｐＮＥＰ１４株を培養しＦＡＯＤ−Ｌ生産のタイムコースをとったところ、図９に示すように、メタノール培地でのみ、顕著な生産が認められ、培養４０時間で最大の生産性を示した。以上の実験の結果から、ＦＡＯＤ−Ｌ生産能力を有する形質転換体の培養に適した培地は、メタノール０.１〜５.０％、好ましくは１.５％を含有する基本培地に、０.１〜５.０％、より好ましくは０.５〜２.０％のＮＨ4Ｃｌ及び／又は０.１〜５.０％、より好ましくは１％の酵母エキスを含有するものであることが分かる。
【００４８】
（５）Ｃ．boidinii TK62/pNEP14株のジャーファーメンターを用いた大量培養C.boidinii TK62/pNEP14株を１５Ｌ容のジャーファーメンターを用い、１Ｌの培地中で培養することにより、ＦＡＯＤ−Ｌの大量生産を行った。培地は以下の方法で調整した。１Ｌ中に（ＮＨ4Ｃｌ：５ｇ，Ｋ2ＨＰＯ4：１ｇ，ＮａＨ2ＰＯ4：１ｇ，ＭｇＳＯ4・２Ｈ2０：０.５ｇ，ＣａＣｌ2・２Ｈ2０：０.１ｇ，酵母エキス：１０ｇ）を含有する混合物を、ｐＨ６.０に調整し、１２０℃，２０分オートクレイブ処理した後、１.５％になるようにメタノールを加える。その結果、図１０に示すように、培養４０時間でＦＡＯＤ−Ｌの生産は最大になり、４０時間を過ぎると生産性の減少が認められた。
次いで、得られた培養物を、遠心分離（１０,０００ｒｐｍ、４℃、１分）により集菌し、ペレットを０.８５％ＫＣｌで洗浄し、０.１Ｍ トリス−塩酸緩衝液 (pH 8.0)に懸濁した。MINI-BEAT BEATER（ジャパンラムダ社）で菌体を３,８００ｒｐｍ、３０秒で氷冷をはさみながら６回ビーズ破砕し、遠心分離（１,４００ｒｐｍ、４℃、５分）して無細胞抽出液を調製した。このものを以後、酵素液として用いた。
【００４９】
実施例３  糖化ヒト血清アルブミン濃度の測定
糖化ヒト血清アルブミン（シグマ社）を０.９％塩化ナトリウム水溶液で溶解させ、０〜１.０％の範囲で濃度の異なる糖化ヒト血清アルブミン溶液を調製した。
これらの溶液を用いて以下の操作を行った。
１）プロテアーゼ処理
糖化アルブミン溶液                                            ６０μl
１２.５mg/ml  プロテアーゼXIV（シグマ社）溶液                 ６０μl
この混合液を３７℃で３０分間インキュベートし、その後、約９０℃で５分間、加熱して反応を停止させた。
【００５０】
２）活性測定
ＦＡＯＤ反応液は以下のようにして調製した。
４５mＭ  ４−アミノアンチピリン溶液                          ３０μｌ
６０mＭ  Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−
３−スルホプロピル）−m−トルイジン溶液                      ３０μｌ
６０ユニット／ml  パーオキシダーゼ溶液                       ３０μｌ
０.１Ｍ  トリス−塩酸緩衝液（pＨ８.０）                    ３００μｌ
６ユニット／ml  ＦＡＯＤ−Ｌ溶液                             ５０μｌ
蒸留水で全量を１mlとした。
６ユニット／ml  ＦＡＯＤ−Ｌ溶液は、実施例１の方法で得たＦＡＯＤ−Ｌを６ユニット／mlになるよう、０.１Ｍトリス−塩酸緩衝液（pＨ８.０）で希釈して調製した。
ＦＡＯＤ反応液を３０℃で２分間インキュベートした後、上記の各プロテアーゼ処理溶液を１００μl加え、３０分後の５５５nmにおける吸光度を測定した。この方法で得られる糖化アルブミンの濃度と吸光度との関係を図１１に示す。図中の縦軸は５５５nmの吸光度（過酸化水素の量に対応）、横軸は糖化アルブミンの濃度を表す。図は、糖化アルブミンの濃度と過酸化水素発生量が相関関係にあることを示している。
【００５１】
実施例４  ヒト血清アルブミンの糖化率の測定
０.９％塩化ナトリウム水溶液３mlに、糖化ヒト血清アルブミン（シグマ社）１５０mg、ヒト血清アルブミン（シグマ社）１５０mgをそれぞれ溶解した。これらの溶液を混合することにより、糖化率の異なる溶液を作製し、自動グリコアルブミン測定装置（京都第一科学）を用いて検定したところ、その糖化率は、２４.６％〜６１.１％であった。
これらの溶液を用いて以下の操作を行った。
１）プロテアーゼ処理
糖化アルブミン溶液                                            ６０μl
１２.５mg/ml  プロテアーゼXIV（シグマ社）溶液                 ６０μl
この溶液を３７℃で３０分間インキュベートし、その後、約９０℃で５分間加熱して反応を停止させた。
【００５２】
２）活性測定
ＦＡＯＤ反応液は以下のようにして調製した。
４５mＭ  ４−アミノアンチピリン溶液                          ３０μｌ
６０mＭ  Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−
３−スルホプロピル）−m−トルイジン溶液                      ３０μｌ
６０ユニット／ml  パーオキシダーゼ溶液                       ３０μｌ
０.１Ｍ  トリス−塩酸緩衝液（pＨ８.０）                    ３００μｌ
６ユニット／ml  ＦＡＯＤ−Ｌ溶液                             ５０μｌ
蒸留水で全量を１mlとした。
６ユニット／ml  ＦＡＯＤ−Ｌ溶液は、実施例１の方法で得たＦＡＯＤ−Ｌを６ユニット／mlになるよう、０.１Ｍトリス−塩酸緩衝液（pＨ８.０）で希釈して調製した。
ＦＡＯＤ反応液を３０℃で２分間インキュベートした後、上記の各プロテアーゼ処理溶液を１００μl加え、３０分後の５５５nmにおける吸光度を測定した。この方法で得られるアルブミンの糖化率と吸光度との関係を図１２に示す。図中の縦軸は５５５nmの吸光度（過酸化水素の量に対応）、横軸はアルブミンの糖化率を表す。図は、アルブミンの糖化率と過酸化水素発生量が相関関係にあることを示している。
【００５３】
実施例４  糖化ヘモグロビン濃度の測定
グリコヘモグロビンコントロール（シグマ社）を蒸留水で溶解させ、０〜３０％の範囲で濃度の異なる糖化ヘモグロビン溶液を調製した。
これらの溶液を用いて以下の操作を行った。
１）プロテアーゼ処理
糖化ヘモグロビン溶液                                          ２５μl
５００ユニット／ml  アミノペプチダーゼ溶液                      ５μl
０.１Ｍ  トリス−塩酸緩衝液（pＨ８.０）                       ２０μl
この混合液を３０℃で３０分間インキュベートした。その後、１０％トリクロロ酢酸を５０μl加えて撹拌し、０℃で３０分間静置した後１２０００回転で１０分間遠心分離を行った。得られた上清に２Ｍ  ＮaＯＨを約５０μl加え中性溶液にした。
【００５４】
２）活性測定
ＦＡＯＤ反応液は以下のようにして調製した。
３ｍＭ Ｎ−カルボメチルアミノ−２−フェニルアミン溶液         ３０μl
６０ユニット/ml  パーオキシダーゼ溶液                         ３０μl
０.１Ｍ  トリス−塩酸緩衝液（pＨ８.０）                     ３００μl
４ユニット/ml  ＦＡＯＤ−Ｌ溶液                               １０μl
蒸留水で全量を１mlとした。
４ユニット／ml  ＦＡＯＤ−Ｌ溶液は、実施例１の方法で得たＦＡＯＤ−Ｌを４ユニット／mlになるよう、０.１Ｍトリス−塩酸緩衝液（pＨ８.０）で希釈して調製した。
ＦＡＯＤ反応液を３０℃で２分間インキュベートした後、上記の各プロテアーゼ処理溶液を８０μl加え、３０分後の７２７nmにおける吸光度を測定した。この方法で得られる糖化ヘモグロビンの濃度と吸光度との関係を図１３に示す。図中の縦軸は７２７nmの吸光度（過酸化水素の量に対応）、横軸は糖化ヘモグロビンの濃度を表す。図は、糖化ヘモグロビンの濃度と過酸化水素発生量が相関関係にあることを示している。
【００５５】
【配列表】
【００５６】
0003819969.tif 000005
0003819969.tif 000006
0003819969.tif 000007
0003819969.tif 000008
【００５７】
0003819969.tif 000009
【００５８】
0003819969.tif 000010
【００５９】
0003819969.tif 000011
【００６０】
0003819969.tif 000012
【００６１】
0003819969.tif 000013
【００６２】
0003819969.tif 000014
【図面の簡単な説明】
【図１】  ＰＣＲに用いるためのプライマーの、ＦＡＯＤ−Ｌの部分アミノ酸配列との関係を示す説明図。
【図２】  ＦＡＯＤ−ＬをコードするＤＮＡを含むプラスミドｐＦＡＬ２の制限地図。
【図３】  ＲＴ−ＰＣＲにおけるアガロース電気泳動の結果を示す模写図であって、図中、レーン１はφＸ１７４／ＨincII；レーン２はプライマー１及び２を用いた電気泳動パターンを表す。
【図４】  図３の約４００bpのＰＣＲ断片のサブクローニングにおける電気泳動の結果を示す模写図であって、図中、レーン１はλ／ＥcoＴ１４１、レーン２はｐＦＬＰ／ＢamＨＩの泳動パターンを表す。
【図５】  ＦＡＯＤ−Ｌ発現ベクターｐＮＦＬ８の制限地図。
【図６】  アスペルギルス・テレウス  ＧＰ１（Ａspergillus terreus ＧＰ１；ＦＥＲＭ  Ｐ−１５６６４）由来の精製ＦＡＯＤ−ＬをＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動）にかけて得た移動パターンを示す写真。
【図７】  図６と同様のＦＡＯＤ−Ｌの、スーパーデックス２００pgを用いたゲルろ過による分子量測定の結果を示すグラフ。
【図８】  ｐＮＦＬ８により形質転換されたC.boidinii形質転換体の染色体ＤＮＡのサザン解析の結果を示すアガロース電気泳動パターンの模写図。
【図９】  C.boidinii TK62/pNEP14株の、１.５％メタノール、１.５％メタノール＋３％グリセロール又は３％グリセロールを含有する培地でのＦＡＯＤ−Ｌ活性産生のタイムコースを示すグラフ。
【図１０】  C.boidinii TK62/pNEP14株のジャーファーメンター培養におけるＦＡＯＤ−Ｌ活性産生のタイムコースを示すグラフ。
【図１１】  糖化ヒト血清アルブミンの濃度とＦＡＯＤ作用により生成された過酸化水素量との関係を示すグラフ。
【図１２】  ヒト血清アルブミンの糖化率とＦＡＯＤ作用により生成された過酸化水素量との関係を示すグラフ。
【図１３】  糖化ヘモグロビンの濃度とＦＡＯＤ作用により生成された過酸化水素量との関係を示すグラフ。
【図１】
0003819969.tif 000015
【図２】
0003819969.tif 000016
【図３】
0003819969.tif 000017
【図４】
0003819969.tif 000018
【図５】
0003819969.tif 000019
【図６】
0003819969.tif 000020
【図７】
0003819969.tif 000021
【図８】
0003819969.tif 000022
【図９】
0003819969.tif 000023
【図１０】
0003819969.tif 000024
【図１１】
0003819969.tif 000025
【図１２】
0003819969.tif 000026
【図１３】
0003819969.tif 000027