(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１個のプロドラッグ活性化酵素に結合している抗原結合領域を含む化合物であって、抗原結合領域が腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に結合しかつ単一のポリペプチド鎖から成る化合物。
【請求項２】
化合物が共有結合的に結合した炭水化物を有する、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
抗原結合領域が重鎖抗体の可変ドメインと軽鎖抗体の可変ドメイン（ｓＦｖフラグメント）とを有する、請求項１または２に記載の化合物。
【請求項４】
ＴＡＡがＮ−ＣＡＭ、ＰＥＭ、ＥＧＦ−Ｒ、Ｓｉａｌｙｌ−Ｌｅａ、Ｓｉａｌｙｌ−Ｌｅｘ、ＴＦβ、ＧＩＣＡ、ＧＤ３、ＧＤ２、ＴＡＧ７２、ＣＡ１２５、ＭＡｂＬ６によって画定される２４〜２５ｋＤａの糖タンパク質またはＣＥＡ、好ましくはＣＥＡである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項５】
酵素が、ラクタマーゼ、好ましくはBacillus cereus IIβ−ラクタマーゼ、ピログルタメートアミノペプチダーゼ、Ｄ−アミノペプチダーゼ、オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、ホスファターゼ、ヒドロキシニトリルリアーゼ、プロテアーゼ、エステラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、好ましくはシュードモナス由来のカルボキシペプチダーゼＧ２、またはグリコシダーゼである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項６】
酵素が、β−グルクロニダーゼ、好ましくはE.coli、Kobayasia nipponica 、Secale cerealeまたはヒトβ−グルクロニダーゼである、請求項５に記載の化合物。
【請求項７】
抗原結合領域がペプチドリンカーを介して酵素に連結している、請求項１〜６のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項８】
化学的方法によってまたは適当な発現系を選択することによってグリコシル化を行う、請求項１〜７のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項９】
Saccharomyces cerevisiaeまたは、更に有利にはHansenula polymorpha で分泌発現を行う、請求項１〜８のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１０】
E. coli で発現し、次いで化学的にグリコシル化する、好ましくはガラクトシル化および／またはマンノシル化する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１１】
E. coli でペリプラズム発現を行ったｓＦｖ−β−ラクタマーゼ融合タンパク質を化学的にグリコシル化、好ましくはガラクトシル化および／またはマンノシル化する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１２】
ｓＦｖ−β−ラクタマーゼ融合タンパク質がSaccaromyces cerevisiae またはHansenula polymorphaで分泌発現を行う、請求項１〜８のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１３】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の化合物をコードする核酸。
【請求項１４】
ＣＥＡおよびヒトβ−グルクロニダーゼに対するヒト化ｓＦｖフラグメントをコードする、請求項１３に記載の核酸。
【請求項１５】
第１表に示される配列を有する請求項１３に記載の核酸。
【請求項１６】
請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の核酸を含むベクター。
【請求項１７】
請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の核酸または請求項１６に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１８】
ＢＨＫ、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、昆虫、タバコ植物、酵母またはE. coli 細胞である、請求項１７に記載の宿主細胞。
【請求項１９】
（ａ）  請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の核酸または請求項１６に記載のベクターを宿主細胞に導入し、
（ｂ）  この宿主細胞を培養し、
（ｃ）  化合物を単離する、
ことを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載の化合物の製造法。
【請求項２０】
（ａ）  請求項１７または１８に記載の宿主細胞を培養し、
（ｂ）  化合物を単離する、
ことを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の化合物の製造法。
【請求項２１】
医薬または診断助剤を製造するための、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の化合物の使用。
【請求項２２】
癌の治療のための医薬を製造するための、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の化合物の使用。
【請求項２３】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の化合物を含む医薬。
【請求項２４】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の化合物を含む診断助剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、ほとんどまたはまったく細胞毒性を持たない化合物（プロドラッグ）を細胞毒性化合物（薬物）に代謝することができる少なくとも１種類の酵素に結合する抗原結合領域を含む化合物であって、この抗原結合領域が単一のポリペプチド鎖から成ることを特徴とする化合物に関する。共有結合によって結合した炭水化物がポリペプチド鎖上に存在することが有利である。
【０００２】
【従来の技術】
治療用組成物として用いられるプロドラッグと抗体−酵素抱合体との組み合わせは、既に専門家の文献に記載されている。このことにより、特定の組織に向けられており且つプロドラッグ開裂酵素が結合する抗体が生体中に注入され、続いてこの酵素で活性化することができるプロドラッグ化合物を投与することができることになる。標的組織に結合した抗体−酵素抱合体の作用は、プロドラッグ化合物を結合した組織に対して細胞毒性作用を示す化合物へと転換しようとするものである。しかしながら、抗体−酵素抱合体についての研究では、これらの化学的抱合体は好ましくない薬物動態を示し、プロドラッグの不適切な部位特異的な腫瘍選択的開裂しかないことが判っている。幾人かの著者は、この明らかな欠点を、抗酵素抗体を追加注入して血漿から抗体−酵素抱合体を速やかに除去しようとすることによって、除去しようとしている（Sharmaら、Brit. J. Cancer, 61, 659, 1990) 。抗体−酵素抱合体のもう一つの問題点は、再現性が高く且つ均質に多量を調製する可能性が限定されていることである。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、工業的規模で調製することができ且つその薬物動態および薬理特性により治療目的に好適な融合タンパク質を見出すことであった。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
これに関連して、単一ポリペプチド鎖から成る抗原結合領域を有する化合物は炭水化物が有利に結合する融合タンパク質の調製とプロドラッグの活性化に使用するのに予想外に有利であることを見出した。
それ故、本発明は少なくとも１個の酵素に結合する抗原結合領域を有する化合物であって、その抗原結合領域が単一のポリペプチド鎖から成り、炭水化物が融合タンパク質に有利に結合している化合物に関する。
抗原結合領域とは、本発明の目的に対しては、抗体の少なくとも２個の可変ドメイン、好ましくは重鎖抗体の１個の可変ドメインと軽鎖抗体（ｓＦｖフラグメント）の１個の可変ドメインとを含む領域を意味する。しかしながら、抗原結合領域は、二価または多価構造、すなわち、例えばＥＰ−Ａ−０  ４０４  ０９７号明細書に記載されているように２個以上の結合領域を有することもできる。しかしながら、ヒトのまたはヒト化ｓＦｖフラグメントが特に好ましく、中でもヒト化ｓＦｖフラグメントが好ましい。
【０００５】
抗原結合領域は、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に結合するのが好ましく、下記のＴＡＡが特に好ましい。
神経細胞接着分子（Ｎ−ＣＡＭ）、
多形上皮ムチン（ＰＥＭ）、表皮成長因子レセプター（ＥＧＦ−Ｒ）、
トムセン・フリーデンライヒ抗原β（ＴＦβ）、
消化管癌抗原（ＧＩＣＡ）、
ガングリオシドＧＤ３（ＧＤ３）、
ガングリオシドＧＤ２（ＧＤ２）、
Ｓｉａｌｙｌ−Ｌｅａ、Ｓｉａｌｙｌ−Ｌｅｘ、
ＴＡＧ７２、
ＭＡｂ  Ｌ６によって画定される２４〜２５ｋＤａの糖タンパク質、
ＣＡ１２５、及び特に癌胎児性抗原（ＣＥＡ）。
【０００６】
好ましい酵素は、ほとんどまたは全く細胞毒性を持たない化合物を細胞毒性化合物に代謝することができる酵素である。例には、ＥＰ−Ａ２−０  ３８２  ４１１号明細書またはＥＰ−Ａ２−０  ３９２  ７４５号明細書などに記載されているβ−ラクタマーゼ、ピログルタメートアミノペプチダーゼ、ガラクトシダーゼまたはＤ−アミノペプチダーゼ；例えばＷＯ９１／００１０８号明細書に記載されているオキシダーゼ、例えば、エタノールオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼまたはα−グリセリル−ホスフェートオキシダーゼ；例えばＥＰ−Ａ２−０  ３６１  ９０８号明細書に記載されているペルオキシダーゼ；例えばＥＰ−Ａ１−０  ３０２  ４７３号明細書に記載されているホスファターゼ；例えばＷＯ９１／１１２０１号明細書に開示されているヒドロキシニトリルリアーゼまたはグルコシダーゼ；カルボキシペプチダーゼ、例えばカルボキシペプチダーゼＧ２（ＷＯ８８／０７３７８号明細書）；アミダーゼ、例えばペニシリン５−アミダーゼ（Kerr, D.E.ら、Cancer Immunol. Immunther., 1990, 31) ；及びプロテアーゼ、エステラーゼまたはグリコシダーゼ、例えばＷＯ９１／０８７７０号明細書に記載の例えばガラクトシダーゼ、グルコシダーゼまたはグルクロニダーゼである。
【０００７】
β−グルクロニダーゼが好ましく、Kobayasia nipponica またはSecale cereale由来のものが好ましく、大腸菌またはヒトβ−グルクロニダーゼ由来が更に好ましい。個々の酵素の基質も前記の特許明細書で指摘されており、本願明細書の開示内容の一部を構成するものである。β−グルクロニダーゼの好ましい基質はＮ−（Ｄ−グリコピラノシル）ベンジルオキシカルボニルアントラサイクリン、特にＮ−（４−ヒドロキシ−３−ニトロベンジルオキシカルボニル）ドクソルビシン及びダウノルビシン＝β−Ｄ−グルクロニドである（J.C. Florentら、(1992) Int. Carbohydr. Symp. Paris, A262, 297 またはS. Andrianomenjanaharyら、(1992) Int. Carbohydr. Symp. Paris, A264, 299 ）。
【０００８】
本発明は、本発明による化合物をコードする核酸にも関する。特に好ましいものは、核酸並びにその変体（variant ）及び変異体（mutant）であって、ヒトのβ−グルクロニダーゼに連結したＣＥＡ（癌胎児性抗原）に対するヒト化ｓＦｖフラグメントをコードするものであり、好ましくは第１表に示す配列を有するものである（ｓＦｖ−ｈｕβ−Ｇｌｕｃ）。
【０００９】
本発明による化合物は、通常は当業者に普通に知られている遺伝子操作の方法によって調製し、抗原結合領域を１種類以上の酵素に、直接またはリンカー、好ましくはペプチドリンカーを介して、結合させることができる。用いることができるペプチドリンカーは、例えば抗体のヒンジ領域またはヒンジ様アミノ酸配列である。この場合には、酵素は好ましくはＮ末端で抗原結合領域に直接またはペプチドリンカーを介して結合している。しかしながら、酵素または複数の酵素は、例えばＷＯ９１／００１０８号明細書に記載されているように抗原結合領域に化学的に結合することもできる。
【００１０】
本発明の化合物のアミノ酸配列をコードする核酸は、通常は発現ベクターにクローニングされ、ＢＨＫ、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、昆虫、タバコ植物、酵母または大腸菌細胞などの原核または真核宿主細胞に導入され、発現される。この方法で調製された化合物は、次に単離して、診断助剤または治療剤として用いることができる。本発明による化合物のもう一つの一般に知られている調製法は、ヒト以外のトランスジェニック哺乳類、好ましくはトランスジェニックヤギでコードする核酸を発現させることである。
【００１１】
本発明による核酸でトランスフェクションしたＢＨＫ細胞は、ＣＥＡに対して特異的であるだけでなく、完全なβ−グルクロニダーゼ活性も有した融合タンパク質（ｓＦｖ−ｈｕβ−Ｇｌｕｃ）を発現する（例５を参照されたい）。
この融合タンパク質は、ＥＰ０５０１２１５Ａ２号明細書（例Ｍ）に記載の方法によって抗−イディオタイプアフィニティークロマトグラフィによって精製した。この方法で精製した融合タンパク質の分子量は還元条件下でのＳＤＳ  ＰＡＧＥでは１００ｋＤａであるが、１００及び２００ｋＤａの分子はそれぞれ非還元条件下で現れる。
【００１２】
本来の条件下でのゲルクロマトグラフィ（ＴＳＫ−３０００ゲルクロマトグラフィ）では、１個のタンパク質ピーク（例６、図１）を示し、これは特異性酵素活性試験において活性ピークと相関する（ＥＰ０５０１２１５Ａ２号明細書）。標準的な分子量マーカーと比較することによるピークの位置は、分子量が約２００ｋＤａであることを示している。この知見は、ＳＤＳ  ＰＡＧＥからのデーターと一緒になって、機能的な酵素学的に活性なｓＦｖ−ｈｕβ−Ｇｌｕｃ融合タンパク質は「二価分子」の形態をしており、すなわち２個の結合領域と２個の酵素分子を有する。本明細書には記載されていない実験から、融合タンパク質はある種の培養条件では４個の結合領域と４個の酵素分子を有する四量体（テトラマー）の形態をとることができる。ｓＦｖ−ｈｕβ−Ｇｌｕｃ融合タンパク質を精製して、イン・ビトロで機能の特性決定を行った後、融合タンパク質の薬物動態と腫瘍局在化をヒト胃癌を有するヌードマウスで決定した。機能的に活性な融合タンパク質の量を、器官を適宜処理した後様々な時間に器官及び腫瘍中で（例７）決定し、免疫学的測定法（３決定基試験、例８）によって決定した。代表的な実験の結果を、第４表に纏める。
【００１３】
驚くべきことには、腫瘍／血漿比はたった４８時間後で５／１に達する。更に時間が経てば、この比率は更に好ましくなり、＞２００／１の値に達する（５日目）。ｓＦｖ−ｈｕβ−Ｇｌｕｃ融合タンパク質がこのような好ましい薬物動態を示す理由は、腫瘍に結合していない融合タンパク質が主としてマンノース６−ホスフェート及びガラクトースのレセプターによるインターナリゼーションによって血漿及び正常な組織から除去されるからである。（この現象の証拠は、例えば肝臓で分子内β−グルクロニダーゼ濃度が増加することである）。
【００１４】
第５表に示されるように、ｓＦｖ−ｈｕβ−Ｇｌｕｃは比較的多量のガラクトース、特に特定のレセプターへの結合に主に重要なマンノースを含んでいる。生成し融合タンパク質の炭水化物残基を介して結合している融合タンパク質／レセプター複合体を次に、インターナリゼーションによって細胞外区画から除去する。
主としてガラクトースとマンノースとによって媒介されるこの迅速インターナリゼーション機構は、本発明による融合タンパク質の有利な薬物動態と緊密に関連している。ガラクトース及び特にマンノースが結合する融合タンパク質のこれらの有利な薬物動態により、細胞外分布を行う親水性のプロドラッグを非特異的なプロドラッグ活性化を誘導することなく比較的初期に静脈内に投与することができる。この場合には、Sharmaら（Brit. J. Cancer, 61, 659, 1990）によって記載された除去工程は必要ない。第４表のデーターに基づけば、適当なプロドラッグの注入(S. Adrianomenjanahariら、1992, Int. Carbohydrate Symp., Parts A264, 299) を、ｓＦｖ−ｈｕβ−Ｇｌｕｃ融合タンパク質の注射から３日後には重大な副作用を起こすことなく行うことが可能である（データーは示されていない）。
【００１５】
同様に炭水化物の融合タンパク質への有利な結合は、例えばSaccharomyces cerevisiaeまたはHansenula polymorphaのような特定の酵母株でのｓＦｖ−ｈｕβ−Ｇｌｕｃ融合タンパク質の分泌発現によって行うこともできる。これらの生物は、適当なＮ−グリコシル化部位を有する融合タンパク質を極めて効果的にマンノシル化することができる（Goochee ら、Biotechnology, 9, 1347-1354, 1991 ）。酵母細胞で分泌発現を行ったこのような融合タンパク質は、ＢＨＫ細胞で発現したｓＦｖ−ｈｕβ−Ｇｌｕｃ融合タンパク質に匹敵するほどの高度のマンノシル化及び好ましい薬物動態を示す（データーは示されていない）。この場合には、ガラクトースがないことは、融合タンパク質の極めて高度のマンノシル化によって補償される（第６表）。前記のｓＦｖ−ｈｕβ−Ｇｌｕｃ融合タンパク質を遺伝子操作によって構築して、例９に詳細に記載するように、酵母中で発現させた。
【００１６】
しかしながら、ヒトβ−グルクロニダーゼの代わりに、有利な特性を有する他のグルクロニダーゼを用いることも可能である。例えば、大腸菌のβ−グルクロニダーゼは、ｐＨ７．４におけるその触媒活性はヒトβ−グルクロニダーゼの活性より著しく高いといった特別な利点を有する。例１０において、ｓＦｖ−大腸菌β−Ｇｌｕｃ構築物を遺伝子操作の方法によって調製し、Saccharomyces cerevisiaeにおいて機能的に活性なマンノシル化した融合タンパク質として分泌発現を行った。薬物動態データーは、酵母またはＢＨＫ細胞で発現したｓＦｖ−ｈｕβ−Ｇｌｕｃ分子のものに匹敵する（第４表）。
【００１７】
菌類（fungus）Kobayasia nipponica 及び植物Secale cereale由来のグルクロニダーゼは、例えば、それらが単量体（モノマー）として活性であるという利点を有する。例１１では、遺伝子操作の方法を用いて、Saccharomyces cerevisiaeでの発現の後にｓＦｖ−B. cereus β−ラクタマーゼＩＩ融合タンパク質をマンノシル化した形態で優先的に放出する構築物を調製した。
この融合タンパク質も本発明による融合タンパク質と同様に、プロドラッグの活性化に好ましいβ−グルクロニダーゼ薬物動態に基づいている（第４表）。
【００１８】
更に、本発明による化合物をプロドラッグと組合せで用いるだけでなく、グルクロニドとして代謝されて不活性化する細胞増殖抑制剤を、投与した化合物によって毒性のある形態に転換することができる従来の化学療法の構成に用いることもできる。
【００１９】
下記の例により、ｓＦｖ−β−Ｇｌｕｃ融合タンパク質の遺伝子操作による合成と、機能性の論証を行う。
出発材料はプラスミドｐＡＢｓｔｏｐ４３１／２６ｈｕｍＶＨ及びｐＡＢｓｔｏｐ４３１／２６ｈｕｍＶＨＬを含んでいた。これらのプラスミドは、抗−ＣＥＡ  ＭＡｂ  ＢＷ４３１／２６のＶＨ遺伝子とＶＬ遺伝子のヒト化したものを含む（Guessow とSeemann, 1991, Meth. Enzymology, 203, 99-121）。その他の出発材料は、プラスミドｐＡＢｓｔｏｐ４３１／２６ＶＨ−ｈｕβ−Ｇｌｕｃ１Ｈ（ＥＰ−Ａ２−０５０１２１５号明細書）であって、ＶＨに固有のシグナル配列を含むＶＨエキソンと、続いてＣＨ１エキソン、ヒトＩｇＧ３ｃ遺伝子のヒンジエキソン及びヒトβ−グルクロニダーゼの完全なｃＤＮＡを含むものから成っていた。
【００２０】
例１
ＭＡｂ  ｈｕｍ４３１／２６のＶＨ及びＶＬ遺伝子の増幅
オリゴヌクレオチドｐＡＢ−Ｂａｃｋ及びリンカー−アンチ（第２表）を用いて、ｐＡＢｓｔｏｐ４３１ＶＨｈｕｍ（ＶＨ４３１／２６）由来のＶＨ遺伝子に固有のシグナル配列を有するＶＨ遺伝子を増幅した（Guessow とSeemann, 1991, Meth. Enzymology, 203, 99-121）。オリゴヌクレオチドリンカー−センスとＶＬ（Ｍｕｔ）−Ｆｏｒ（第３表）を用いてｐＡＢｓｔｏｐ４３１ＶＬｈｕｍ（ＶＬ４３１／２６）を増幅した。
【００２１】
例２
ＶＨ４３１／２６及びＶＬ４３１／２６遺伝子フラグメントの結合
オリゴヌクレオチドリンカー−アンチ及びリンカー−センスは互いに部分的に相補性であり、ＶＨドメインとＶＬドメインとを結合してｓＦｖフラグメントを得るためのポリペプチドリンカーをコードする。増幅したＶＨフラグメントとＶＬフラグメントを融合するために、これらを精製して、下記のような１０サイクル反応に用いる。
Ｈ２Ｏ                                                    ３７．５μｌ
ｄＮＴＰ（２．５ｍＭ）                                      ５．０μｌ
ＰＣＲ緩衝液（１０×）                                      ５．０μｌ
Ｔａｑポリメラーゼ（Perkin-Elmer Corp., エメリービル、
カリフォルニア）（２．５Ｕ／μｌ）                          ０．５μｌ
ＶＬフラグメントの０．５μｇ／μｌＤＮＡ                    １．０μｌ
ＶＨフラグメントの０．５μｇ／μｌＤＮＡ                    １．０μｌ
ＰＣＲ緩衝液（１０×）：  １００ｍＭトリス、ｐＨ８．３、５００ｍＭ  ＫＣｌ、１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１％（ｗ／ｖ）ゼラチン。
反応混合物の表面をパラフィンで密封した後、９４℃で１分、５５℃で１分、７２℃で２分プログラムしたＰＣＲ装置で１０−サイクル反応を行い、フランキングプライマーｐＡＢ−Ｂａｃｋ及びＶＬ（Ｍｕｔ）−Ｆｏｒを加え、更に２０サイクルの反応を行う。生成するＰＣＲフラグメントは、リンカーを介してＶＬ遺伝子に結合しているＶＨ遺伝子から成る。ＶＨ遺伝子に固有のシグナル配列もＶＨ遺伝子の前にある。オリゴヌクレオチドＶＬ（Ｍｕｔ）−ＦｏｒもＶＬ遺伝子の最後のヌクレオチド塩基となり、ＣはＧに置き代わっている。このＰＣＲフラグメントはヒト化した一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ４３１／２６）をコードする。
【００２２】
例３
ｈｕβ−グルクロニダーゼ遺伝子を含む発現ベクター中へのｓＦｖ４３１／２６フラグメントのクローニング
（２）からのｓＦｖフラグメントをＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩで切断し、ＨｉｎｄＩＩＩで完全に開裂させＢｇｌＩＩで部分的に開裂したベクターｐＡＢ４３１ＶＨｈｕｍ／ＣＨ１＋１ｈ／β−Ｇｌｃに連結する。ベクターｐＡＢｓｔｏｐ４３１／２６ＶＨｈｕβ−Ｇｌｕｃ１Ｈは、ＶＨに固有のシグナル配列を有するＶＨエキソン、ＣＨ１エキソン、ヒトＩｇＧ３Ｃ遺伝子のヒンジエキソン及びヒトβ−グルクロニダーゼの完全なｃＤＮＡを含む。ヒト化したｓＦｖ４３１／２６、ヒンジエキソン及びヒトβ−グルクロニダーゼの遺伝子を含むプラスミドクローンｐＭＣＧ−Ｅ１を単離する（ｐＭＣＧ−Ｅ１）。
【００２３】
例４
ＢＨＫ細胞でのｓＦｖ−ｈｕβ−Ｇｌｕｃ融合タンパク質の発現
クローンｐＭＣＧ−Ｅ１を、ネオマイシン耐性遺伝子を有するプラスミドｐＲＭＨ１４０と、メトトレキセート耐性遺伝子を有するプラスミドｐＳＶ２とで、ＢＨＫ細胞中にトランスフェクションする。ＢＨＫ細胞は、次いで、ＭＡｂ  ＢＷ４３１／２６ｈｕｍの抗原結合特性とヒトβ−グルクロニダーゼの酵素活性を両方とも有する融合タンパク質を発現する。
【００２４】
例５
ｓＦｖ−ｈｕβ−Ｇｌｕｃ融合タンパク質の抗原結合特性及び酵素活性の証明
ｓＦｖ−ｈｕβ−Ｇｌｕｃ融合タンパク質が４３１／２６によって画定されたＣＥＡエピトープに特異的に結合することができ、同時にヒトβ−グルクロニダーゼの酵素活性を示すことができることを、特異性酵素活性試験（ＥＰ−Ａ２−０５０１２１５号明細書）で示した。この試験は、融合タンパク質がｓＦｖ部分を介して抗原に結合した後に融合タンパク質のβ−グルクロニダーゼ部分によって４−メチルウンベリフェリルβ−グルクロニドから４−メチルウンベリフェロンの放出を測定する。測定した螢光値を相対的螢光単位（ＦＵ）として記録する。この試験では、ＣＥＡをコーティングしたプレートで融合タンパク質によるメチル−ウンベリフェロンの有意な放出を示す。対照的に、融合タンパク質は、ＰＥＭ（多形性上皮ムチン）をコーティングしたコントロールプレートではメチルウンベリフェロンが全く放出されない。
【００２５】
例６
ＴＳＫ３０００ゲルクロマトグラフィ
２５μｌ中抗−イディオタイプアフィニティークロマトグラフィによって精製したｓＦｖ−ｈｕβ−Ｇｌｕｃ融合タンパク質２００ｎｇを、適当な移動相（ＰＢＳ、ｐＨ７．２、５ｇ／ｌマルトースと４．２ｇ／ｌアルギニンを含有）中、ＴＳＫゲルＧ３０００ＳＷ  ＸＬカラム（TOSO HAAS 品番３．５ＷｘＮ３２１１、７．８ｍｍ×３００ｍｍ）上で、０．５ｍｌ／分の流速でクロマトグラフィ処理を行った。Ｍｅｒｃｋ  Ｈｉｔａｃｈｉ  ＨＰＬＣ装置（Ｌ−４０００ＵＶ検出器、Ｌ−６２１０インテリジェントポンプ、Ｄ−２５００クロマト積分計）を約２０バールで操作し、溶出液の吸光度を２８０ｎｍで測定し、ＬＫＢ２１１１Ｍｕｔｉｓａｃフラクションコレクターを用いて０．５ｍｌ画分ずつを集めた後、特異性酵素活性試験（ＳＥＡＴ）（ＥＰ０５０１２１５Ａ２号明細書、例Ｊ）で分析した。この実験の結果を図１に示す。２８０ｎｍの吸光度の測定によって検出できるピークの位置は、溶出液の特異性及び酵素活性（ＳＥＡＴ）を決定するピークと一致することは明らかである。矢印で示される標準的タンパク質の分子量の位置に基づいて、機能的に活性なｓＦｖ−ｈｕβ−Ｇｌｕｃ融合タンパク質の分子量は本来の条件下では約２００ｋＤａであると結論することができる。
【００２６】
例７
融合タンパク質の決定のための器官／腫瘍の処理
下記の遂次的工程を行った。
皮下腫瘍を有し、融合タンパク質または抗体−酵素包合体で処理したヌードマウス（ＣＤＩ）で眼窩後部放血を行った後、屠殺し、
血液をただちにＬｉｑｕｅｍｉｎ２５０００（Ｈｏｆｆｍａｎ−ＬａＲｏｃｈｅ  ＡＧ製）１０μｌを予め入れておいたエッペンドルフ試験管に移し、
次に、遠心分離機（Ｍｅｇａｆｕｇｅ１．０、Ｈｅｒａｅｕｓ製）中で２５００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行い、
血漿が得られ、試験まで冷凍し、
器官または腫瘍を除去し、秤量した後、
これらをＰＢＳ、ｐＨ７．２中で１％ＢＳＡ２ｍｌで完全にホモジナイズし、腫瘍ホモジネートを０．１Ｎ  ＨＣｌでｐＨ４．２に調整し（β−グルクロニダーゼはｐＨ＜３．８では不活性化するので、試料には加え過ぎてはならない）、
総てのホモジネートを１６０００ｇで３０分間遠心分離し、
透明な上澄液を除去し、
腫瘍上澄液を０．１Ｎ  ＮａＯＨで中和すると、
上澄液と血漿を免疫学的試験で定量することができる。
【００２７】
例８
３決定基試験
試験を、下記のようにして行う。
マウス抗−ｈｕβ−Ｇｌｕｃ抗体（ＭＡｂ２１１８／１５７  Ｂｅｈｒｉｎｇｗｅｒｋｅ）をＰＢＳ、ｐＨ７．２中で２μｇ／ｍｌまで希釈したもの７５μｌを、マイクロタイタープレート（ポリスチレン、Ｕ字形、Ｂ型、Ｎｕｎｃ製、品番４−６０４４５）のそれぞれのウェルに入れ、
マイクロタイタープレートをカバーをして室温で一晩インキュベーションし、次いで、マイクロタイタープレートを０．０５Ｍトリス−クエン酸緩衝液、ｐＨ７．４のウェル当たり２５０μｌで３回洗浄し、
この方法でコーティングしたこれらのマイクロタイタープレートを遮断溶液（１％カゼイン／ＰＢＳ、ｐＨ７．２）２５０μｌを用いてそれぞれのウェルで室温で３０分間インキュベーションし（非特異的結合部位の遮断）（必要のないコーティングしたマイクロタイタープレートを室温で２４時間乾燥した後、長期保存のためにコーティングしたアルミニウムバッグに乾燥カートリッジと共に密封し、
遮断中に、未処理の９６ウェルのＵ字形マイクロタイタープレート（ポリスチレン、Ｒｅｎｎｅｒ製、品番１２０５８）中で、１０試料＋２陽性コントロール＋１陰性コントロールを１％カゼイン／ＰＢＳ、ｐＨ７．２で１：２に８段階で希釈し（試料１５０μｌから出発し、試料７５μｌを採取して、カゼイン溶液７５μｌに加える、など）、
遮断溶液を抗−ｈｕβ−Ｇｌｕｃ抗体をコーティングしたマイクロタイタープレートから吸引し、ウェル当たり希釈試料５０μｌを希釈プレートから試験プレートへ移し、室温で３０分間インキュベーションし、
試料のインキュベーション中に、ＡＢＣ−ＡＰ試薬（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ、品番ＡＫ−５０００）を作成し、試薬Ａ（Ａｖｉｄｉｎ  ＤＨ）２滴を１％カゼイン／ＰＢＳ、ｐＨ７．２、１０ｍｌ中で十分に混合し、試薬Ｂ（ビオチン化アルカリ性ホスファターゼ）２滴を加えて十分に混合し（ＡＢＣ−ＡＰ溶液は使用の少なくとも３０分前に作成しなければならない）、
試験プレートをＥＬＩＳＡ洗浄緩衝液（Ｂｅｈｒｉｎｇｗｅｒｋｅ、品番ＯＳＥＷ９６）で３回洗浄し、
ビオチン標識した検出用抗体混合物（マウス抗４３１／２６抗体（ＭＡｂ２０６４／３５３、Ｂｅｈｒｉｎｇｗｅｒｋｅ）及びマウス抗−ＣＥＡ抗体（ＭＡｂ２５０／１８３、Ｂｅｈｒｉｎｇｗｅｒｋｅ）との１＋１混合物を１％カゼイン／ＰＢＳ、ｐＨ７．２、で希釈して５μｇ／ｍｌの濃度としたもの、それぞれの抗体の最終濃度は２．５μｇ／ｍｌ）、５０μｌをそれぞれのウェルに入れ、
試験プレートをＥＬＩＳＡ洗浄緩衝液で３回洗浄し、
調整したＡＢＣ−ＡＰ溶液５０μｌをそれぞれのウェルに入れて、室温で３０分間インキュベーションし、
ＡＢＣ−ＡＰインキュベーション中に、基質を作成し（それぞれの試験に対して新鮮な基質：１ｍＭ  ４−メチルウンベリフェリルホスフェート、品番Ｍ−８８４３、Ｓｉｇｍａ製、０．５Ｍトリス＋０．０１％ＭｇＣｌ２、ｐＨ９．６）、
試験プレートをＥＬＩＳＡ洗浄緩衝液で７回洗浄し、
基質５０μｌをそれぞれのウェルに入れ、試験プレートをカバーして３７℃で２時間インキュベーションした後、
停止溶液（０．２Ｍグリシン＋０．２％ＳＤＳ、ｐＨ１１．７）１５０μｌをそれぞれのウェルに加え、
螢光分析法による評価をＦｌｕｏｒｏｓｃａｎＩＩ（ＩＣＮ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、カタログ番号７８−６１１−００）中で、励起波長３５５ｎｍで発光波長４６０ｎｍで行い、
試料中の融合タンパク質の未知濃度を同一実験に含まれる陽性コントロールについての螢光値（精製したｓＦｖ−ｈｕβ−Ｇｌｕｃを較正プロットとしてＣＥＡ５μｇ／ｍｌと混合したものを有する希釈系）に基づいて測定する。
【００２８】
例９
酵母中のｓＦｖ−ｈｕβ−Ｇｌｕｃ融合タンパク質の発現
例２からの一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）をオリゴ２５７７及び２５６１（第７表）で増幅し、ＸｂａＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化したベクターｐＵＣ１９中にクローニングする（図２）。
ヒトβ−グルクロニダーゼ遺伝子をプラスミドｐＡＢ４３１／２６ＶＨｈｕｍ／ＣＨ１＋１Ｈ／β−Ｇｌｕｃ（例３）からのオリゴ２５６２及び２５４０で増幅し、ＢｇｌＩＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ（図３）で切断したｐＵＣ１９（図２）中のプラスミドｓＦｖ４３１／２６に連結する。
ＫｐｎＩ／ＮｃｏＩフラグメントをｓＦｖ４３１／２６由来のオリゴ２５８７及び２６２７（第９表）で増幅し、ＫｐｎＩ／ＮｃｏＩ（図４）で消化した酵母発現ベクターｐＩＸＹ中にクローニングする。
ｐＵＣ１９（図３）のプラスミドｓＦｖ４３１／２６ｈｕβ−Ｇｌｕｃ由来のＢｓｔＥＩＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを、ＶＨ遺伝子、リンカー及びＶＬ遺伝子の一部を有し（ＶＨ／ｌｉｎｋ／ＶＫｐａｒｔ．、ｐＩＸＹ１２０中）、ＢｓｔＥＩＩで消化し、部分的にＨｉｎｄＩＩＩで消化したベクターｐＩＸＹ１２０中に連結する（図５）。
ｐＩＸＹ１２０中で得られるプラスミドｓＦｖ４３１／２６ｈｕβ−ＧｌｕｃをSaccharomyces cerevisiae中に形質転換し、融合タンパク質を発現させる。
【００２９】
例１０
酵母中でのｓＦｖ−大腸菌−β−グルクロニダーゼ融合タンパク質の発現
大腸菌グルクロニダーゼ遺伝子をオリゴ２６３８及び２６３９（第１０表）でｐＲＡＪ２７５（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ，８３：８４４７−８４５１，１９８６）から増幅し、ＢｇｌＩＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ（図６）で切断したｐＵＣ１９中（例９、図２）でｓＦｖ４３１／２６中に連結する。
ｐＵＣ１９中のｓＦｖ４３１／２６大腸菌β−ＧｌｕｃからのＢｓｔＥＩＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを、ＢｓｔＥＩＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ（図７）で部分的に消化したｐＩＸＹ１２０（例９、図４）におけるベクターＶＨ／ｌｉｎｋ／ＶＫｐａｒｔ中にクローニングする。
ｐＩＸＹ１２０中のプラスミドｓＦｖ４３１／２６大腸菌β−ＧｌｕｃをSaccharomyces cerevisiae中に形質転換し、融合タンパク質を発現させる。
【００３０】
例１１
酵母中におけるｓＦｖ−β−ラクタマーゼ融合タンパク質の発現
例２からの一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）をオリゴ２５８７及び２６６９（第１１表）で増幅し、ＫｐｎＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＵＣ１９ベクターに連結する（図８）。
β−ラクタマーゼＩＩ遺伝子（Ｈｕｓｓａｉｎら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６４：２２３−２２９，１９８５）をBacellus cereus の完全なＤＮＡからのオリゴ２６７３及び２６７４で増幅し、ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＵＣ１９ベクターに連結する（図９）。β−ラクタマーゼ遺伝子のＢｃｌＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを、ＢｇｌＩＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで切断したｐＵＣ１９中のｓＦｖ４３１／２６に連結する（図１０）。
ＫｐｎＩ／ＨｉｎｄＩＩＩｓＦｖ−β−ラクタマーゼフラグメントをＫｐｎＩで消化し、ＨｉｎｄＩＩＩで部分的に消化したｐＩＸＹ１２０に連結する（図１１）。プラスミドをSaccharomyces cerevisiae中で形質転換し、ＭＡｂ４３１／２６の抗原結合特性とBacillus cereus β−ラクタマーゼの酵素活性を両方とも有する融合タンパク質を発現させる。
【００３１】
【表１】
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【００３２】
【表２】
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【００３３】
【表３】
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【００３４】
【表４】
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【００３５】
【表５】
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【００３６】
【表６】
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【００３７】
【表７】
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【００３８】
【表８】
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精製したｓＦｖ−ｈｕβ−Ｇｌｕｃ融合タンパク質をその炭水化物含量について検討した。この結果、加水分解の後、下記の個々の成分は記載されたモル比（炭水化物のモル数／ｓＦｖ−ｈｕβ−Ｇｌｕｃのモル数）であることがわかった。
マンノース、グルコサミン及びガラクトースのモル比から、高マンノース型および／またはハイブリッド型構造（複合型構造の外に）が存在すると結論することができる。それ故、マンノース、ガラクトース、アセチルノイラミン酸或いはＮ−アセチルグルコサミンは末端に存在し、マンノースはマンノース６−ホスフェートとしても存在できる。
方法：
ノイラミン酸はＨｅｒｍｅｎｔｉｎとＳｅｉｄａｔ（１９９１）ＧＢＦ  Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｓ  １５巻、１８５〜１８８頁の方法（８０℃で０．１Ｎ硫酸の存在下にて３０分間加水分解した後、０．４Ｎ水酸化ナトリウム溶液で中和）によって、パルスアメロメトリー検出法による高ｐＨアニオン交換クロマトグラフィ（ＨＰＡＥ−ＰＡＤ）によって測定した。
単糖類成分も同様に、Ｈａｒｄｙら、（１９８８）Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１７０，５４−６２に記載の方法を基としたＨＰＡＥ−ＰＡＤ（１００℃で２Ｎトリフルオロ酢酸の存在下にて４時間加水分解した後、ＳｐｅｅｄＶａｃで蒸発乾固）によって測定した。
【００３９】
【表９】
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【００４０】
【表１０】
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【００４１】
【表１１】
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【００４２】
【表１２】
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【００４３】
【表１３】
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【００４４】
【表１４】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ＴＳＫ３０００ゲルクロマトグラフィ分析の結果を示す説明図。
【図２】ｐＵＣ１９中プラスミドｓＦｖ４３１／２６の構築を示す説明図。
【図３】ｐＵＣ１９中プラスミドｓＦｖ４３１／２６  ｈｕβ−Ｇｌｕｃの構築を示す説明図。
【図４】ｐＩＸＹ１２０中ベクターＶＨ／ｌｉｎｋ／ＶＫ  ｐａｒｔの構築を示す説明図。
【図５】ｐＩＸＹ１２０中ｓＦｖ４３１／２６  ｈｕβ−Ｇｌｕｃの構築を示す説明図。
【図６】ｐＵＣ１９中ｓＦｖ４３１／２６  Ｅ．Ｃｏｌｉ  β−Ｇｌｕｃの構築を示す説明図。
【図７】ｐＩＸＹ１２０中ｓＦｖ４３１／２６  Ｅ．Ｃｏｌｉ  β−Ｇｌｕｃの構築を示す説明図。
【図８】ｐＵＣ１９中ｓＦｖ４３１／２６の構築を示す説明図。
【図９】ｐＵＣ１９中β−ラクタマーゼ遺伝子の構築を示す説明図。
【図１０】ｐＵＣ１９中４３１／２６ｓＦｖ／β−ラクタマーゼ遺伝子の構築を示す説明図。
【図１１】ｐＩＸＹ１２０中４３１／２６ｓＦｖ／β−ラクタマーゼ遺伝子の構築を示す説明図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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