(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
コラン酸またはコラン酸塩と、リン脂質と、中性脂質とを含んでなり、アポリポタンパク質を含まない、内毒素血症に罹ったヒトまたは動物の治療または予防に用いられる医薬組成物。
【請求項２】
中性脂質が８０重量％までの量で含まれる、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
中性脂質が７０重量％までの量で含まれる、請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
中性脂質が５０重量％までの量で含まれる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項５】
組成物中の脂質総重量に対して３％〜５０％の中性脂質を含んでなる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項６】
コラン酸またはコラン酸塩と、リン脂質と、中性脂質とを含んでなり、中性脂質が脂肪総量に対して３重量％〜５０重量％の量で存在している、静脈内投与用である、アポリポタンパク質を含まない、内毒素血症の治療用若しくは予防用医薬組成物。
【請求項７】
コラン酸またはコラン酸塩が胆汁酸または胆汁酸塩である、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
胆汁酸または胆汁酸塩と、リン脂質と、中性脂質とを含んでなる、アポリポタンパク質を含まない内毒素血症の治療用若しくは予防用医薬組成物であって、該組成物が５重量％〜３０重量％の胆汁酸または胆汁酸塩と、３重量％〜５０重量％の中性脂質と、１０重量％〜９５重量％のリン脂質とを含んでなり、該組成物がエマルジョンであることを特徴とする医薬組成物。
【請求項９】
組成物が１０重量％〜１５重量％の胆汁酸または胆汁酸塩と、５重量％〜１０重量％の中性脂質とを含んでなり、組成物の残部がリン脂質であることを特徴とする請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
静脈内投与用である請求項８または９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
リン脂質がホスファチジルコリンである、請求項６〜１０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
リン脂質がスフィンゴ脂質である、請求項６〜１０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
中性脂質がトリグリセリドである、請求項６〜１２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
中性脂質がコレステロールエステルである、請求項６〜１２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
胆汁酸塩がコール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、およびケノデオキシコール酸ナトリウムから選択される、請求項７〜１４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
胆汁酸塩がコール酸ナトリウムである、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
ホスファチジルコリンと、トリグリセリドと、コール酸ナトリウムとを含んでなる請求項６〜１１、１３、および１６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
ホスファチジルコリンとトリグリセリドとを９３：７の重量比で含んでなる、請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
コール酸ナトリウムと、ホスファチジルコリンと、トリグリセリドとを１３．１：８１．２：５．７の重量比で含んでなる、請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
内毒素血症に罹ったヒトまたは動物の治療または予防に用いられる、請求項６〜１９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、内毒素に関連した内毒素血症の治療に関する。更に具体的には、本発明は、生体由来の内毒素を中和しおよび／または除去する作用を有する各種組成物を投与することによる中毒の治療、ならびにこれらの組成物を用いる予防に関する。
【０００２】
背景技術
正常な血清は、密度によって特定される多数のリポタンパク質、すなわちキロミクロン、ＶＬＤＬ、ＬＤＬおよびＨＤＬを含んでいる。それらは、遊離およびエステル化されたコレステロール、トリグリセリド、リン脂質、数種類の他の微量指質成分およびタンパク質から構成されている。密度が極めて低いリポタンパク質（ＶＬＤＬ）は、トリグリセリドの形態でエネルギーを体細胞に輸送して、保存および使用する。トリグリセリドが放出されると、ＶＬＤＬは低密度のリポタンパク質（ＬＤＬ）に転換される。低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）は、コレステロールおよび他の脂溶性物質を体内の細胞へ輸送し、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）は、過剰のまたは使用できない脂溶性物質を肝臓へ輸送して除去する。正常な状態では、これらのリポタンパク質は釣り合いがとれており、脂溶性物質の適正な放出と除去が行なわれるようになっている。異常な状態では、ＨＤＬが低濃度であることにより、多くの病的状態を引き起こしたり、他の物質で二次的複合体を構成することがある。
【０００３】
正常な状態では、天然のＨＤＬは固形粒子であって、その表面はリン脂質単層によって覆われ、疎水性コアが包まれている。アポリポタンパク質Ａ−ＩおよびＡ−ＩＩは、その表面にそれらのアルファ螺旋ドメインの疎水性面の相互作用によって結合している。粒子は、その初期のまたは新たに分泌された形態では、ディスク状をしており、その二重層中に遊離コレステロールを受け入れる。コレステロールはレシチン：コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）の作用によってエステル化されて、ディスクの中央へと移動する。中央へのコレステロールエステルの移動は、二重層内部の空隙と溶解度とが限定されている結果である。ＨＤＬ粒子は、コレステロールがエステルされて中央へ移動すればするほど、「膨脹」して回転楕円体状粒子となる。ＨＤＬの「膨脹したコア」に集まるコレステロールと他の水不溶性の脂質とは、肝臓で浄化される。
【０００４】
Segrestら，Meth. Enzymol., 128:627-647 (1986)においてAnantharamaiahは、ペプチド中のアミノ酸相互の相互作用の結果として、「螺旋ホイール」（helical wheels)を形成する一連のペプチドを記載している。このような螺旋ホイールは、それらの配置に無極性面と極性面とを有している。この文献は、総体的にペプチドはこれらの粒子においてアポタンパク質（aproproteins）を置換することができることを示している。
【０００５】
Jonasら，Meth. Enzym., 128A:553-582(1986)は、ＨＤＬに類似した多種多様の再構成粒子を製造した。この手法は、標準的方法（Hatchら，Adv. Lip. Res., 6:1-68(1968)；Scanuら，Anal. Biochem., 44:576-588(1971)）によりＨＤＬを単離して脱脂質化を行ない、アポ−ＨＤＬタンパク質を得ることを含んでいる。これらのアポタンパク質を分画して、界面活性剤透析を用いて、リン脂質と、コレステロールとで、又は無しで再構成する。
【０００６】
Matzら，J. Biol. Chem., 257(8):4535-4540 (1982)は、ホスファチジルコリンとアポリポタンパク質Ａ−Ｉとのミセルを記載している。これら２成分の各種比率が記載されており、記載されている方法を用いて他のミセルを作成することができることが示唆されている。また、これらのミセルを酵素基質としてまたはＨＤＬ分子のモデルとして使用することも示唆されている。しかしながら、この文献では、コレステロールの除去へのミセルの適用は記載されておらず、また診断または治療上の使用については全く示唆されていない。
【０００７】
Williamsら，Biochem. & Biophys. Acta, 875:183-194 (1986)は、血漿に導入されるリン脂質リポソームであってアポタンパク質およびコレステロールを採取するものを教示している。リポソームは、イン・ビボでアポタンパク質ならびにコレステロールを採取するものであることが開示されており、コレステロールの取り込みは、アポタンパク質と相互作用してこれを採取したリン脂質リポソームで増進されると思われる。
【０００８】
Williamsら，Pers. Biol. & Med., 27(3):417-431 (1984)には、コレステロールを除去するものとしてレシチンリポソームが記載されている。この文献には初期の研究がまとめられており、アポタンパク質を含むリポソームはイン・ビトロではこれを含まないリポソームより効果的に細胞からコレステロールを除去することが示されている。この文献には、リポソームまたはミセルを含むアポタンパク質のイン・ビボでの使用およびリポソームを用いるイン・ビボでの研究における注意事項は記載されていない。
【０００９】
本発明の粒子と先行技術に記載のリポソームおよびミセルとの間には明確かつ著しい差異がある点に留意することが肝要である。後者では、内部の水性コア空隙を取り巻いている脂質を含む分子の二重層構造が関与している。リポソームの構造では、内部空隙を脂溶性成分で満たすことは除外されているが、脂溶性成分の分子取り込みはこれら２種類の脂質層の間に画定された空隙に限定されている。その結果、コレステロールや他の脂溶性物質のような物質の取り込みおよび排出に利用できる容積は本発明の粒子より著しく少なく、本発明の粒子は風船のように膨脹し、特定の物質で内部空隙が満たされるのである。
【００１０】
内毒素ショックは、ほとんどのグラム陰性菌（例えば、Escherichia coli; Salmonellatymphimurium）の外膜からリポ多糖（ＬＰＳ）が放出されることによって誘発される命に関わることの多い疾病である。細菌性ＬＰＳの構造はかなり詳しく解明されており、脂質Ａと呼ばれる独特な分子が脂質Ａ分子のグルコサミン主鎖を介してアシル鎖に結合している。これに関しては、Raetz, Ann. Rev. Biochem., 59: 129-170 (1990)を参照されたい。
【００１１】
脂質Ａ分子はリポ多糖構造（「ＬＰＳ」）の膜アンカーとして働き、内毒素の発生に関与しているものはＬＰＳである。ＬＰＳ分子は、脂質Ａ型構造と多糖部分とを特徴とする点に留意すべきである。この後者の残基は、ＬＰＳ分子が異なれば分子の細部が変化することがあるが、内毒素の一般的な構造上の特色は保持される。ＬＰＳ分子はどの細菌でも同一であるということは妥当でないと思われる（Raetz，上記引用を参照されたい）。当該技術分野では、様々なＬＰＳ分子を「内毒素」と呼ぶことは普通に行なわれていることであり、この用語は以後ＬＰＳ分子を集合的に表すのに用いることにする。
【００１２】
米国特許第５，１２８，３１８号明細書（この特許明細書の内容は、その開示の一部として本明細書に引用される）では、ＨＤＬ関連アポリポタンパク質および内毒素に結合してそれを不活性化することができる脂質を両方共含んでいる再構成粒子は、内毒素によって引き起こされる毒性を緩和するのに有効な物質として用いることができることが教示されている。
【００１３】
その内容がその開示の一部として本明細書に引用される原出願およびその原出願では、各種の他の物質を用いて内毒素によって引き起こされる毒性を処理することができることが開示されていた。具体的には、再構成粒子ではアポリポタンパク質は必要でなく、また再構成粒子はペプチドと脂質とを含み、このペプチドはアポリポタンパク質ではないことが見いだされた。
【００１４】
本発明者らは、内毒素によって引き起こされた毒性はアポリポタンパク質またはペプチドの後に脂質を順次投与することによって処理することができることも見いだした。逐次投与の後に、これらの成分は再構成粒子として会合し、続いて内毒素を除去する作用を行なう。
【００１５】
少なくとも幾つかの個体は正常濃度より高いアポリポタンパク質（apoliprotein）を固有の濃度として有し、アポリポタンパク質またはペプチドを含まないが開示の脂質を含む再構成粒子を投与することによって効果的な内毒素血症の治療を行なうことができることも見いだした。
【００１６】
また、これらの出願に開示されている発明には、本明細書に記載の再構成粒子および成分を使用して、内毒素によって引き起こされる毒性の予防を必要とする被験者に予防上有効量を投与することによって予防することも包含されている。このような被験者としては、感染症に罹患しているまたは外科手術から回復しつつある患者が挙げられる。これらの患者は、血漿中のＨＤＬ濃度が極めて低いことがあり、時には正常水準の２０％程度であることもある。これらの場合には、ＨＤＬを用いて早期に予防して、これらの降下を補償するようにするのが極めて望ましい。
【００１７】
極めて意外なことには、リン脂質を単独でまたは中性脂質、コール酸塩などの付加物質と組合わせて有効な薬剤として用いて、内毒素血症を緩和および／または予防することができることを見いだした。ホスファチジルコリン（以後、「ＰＣ」とする）を単独でまたはスフィンゴ脂質のような他のリン脂質と組合わせて、アポリポタンパク質またはそれから誘導されるペプチドのようなペプチドおよびタンパク質を本質的に含まない組成物で用いるのが特に好ましい。モノ−、ジ−およびトリグリセリドのような中性脂質は、組成物を静脈内ボーラスの形態で用いるときに中性脂質の総量が所定の重量パーセント以下である限り、リン脂質と組み合わせることができる。例えば、連続輸液による静脈内への投与の他の形態に用いるときには、これらの重量パーセントはさほど決定的ではないが望ましい。
【００１８】
本発明の特に好ましい態様としては、胆汁酸または胆汁酸塩をリン脂質および中世脂質と一緒に用いているエマルジョンが挙げられる。コール酸塩である胆汁酸および胆汁酸塩の内毒素血症の治療における効果を、本明細書で示す。これらの胆汁酸は、単独で、またはホスファチジルコリンおよび／またはトリグリセリドのような１種類以上のリン脂質および／または中性脂質と組合わせて用いることができる。
【００１９】
本発明を、下記の開示内容において更に詳細に説明する。
【００２０】
図面の簡単な説明
第１図は、アポ−Ａ−Ｉ、リン脂質およびコール酸塩を含む再構成粒子の形成法を示す。
第２図は、再構成粒子によるＬＰＳ分子の受容を示す。
第３図は、マウスモデルでの内毒素によって引き起こされた毒性の減少を検討するのに用いた実験を示す。
第４図の分類した（labelled）先行技術は、各種のペプチドによる螺旋ホイールの形成を示す。Anantharamaiah，上記引用を参照されたい。
第５Ａおよび５Ｂ図は、ヒト全血モデルにおけるＴＮＦ放出を決定することによって内毒素の中和を決定したモデルで各種の組成物を試験したときに得られる結果を示す。第５Ａ図はタンパク質の役割を示し、第５Ｂ図はリン脂質の役割を示す。試験した組成物しては、天然のリポタンパク質（ＶＬＤＬ、ＬＤＬ、ＨＤＬ）、再構成ＨＤＬ（「Ｒ−ＨＤＬ」）、およびINTRALIPID（登録商標）組成物ならびにリン脂質およびタンパク質を含むエマルジョンが挙げられる。
第６Ａおよび６Ｂ図では、同じモデルでのトリグリセリド（中性脂質）、およびリン脂質であるホスファチジルコリンの役割を比較している。
第７図は、E. coli LPSを投与したときの５５％致死モデルを用いて、マウスモデルでの各種ＰＣおよびＰＣ／ＴＧ組成物の投与に関連した毒性についての情報を示している。
第８図は、上記引用したヒト全血分析法を、トリグリセリドの代わりにリン脂質とエステル化されていないコレステロール、スフィンゴミエリン、または両者の混合物とを用いて行なったものに共通するデーターを示す。
第９Ａおよび９Ｂ図は、これらの新たな図において、リン脂質、エステル化されていないコレステロールおよび／またはスフィンゴミエリンを中性脂質としてのトリグリセリドまたはエステル化されたコレステロールと混合することを除き第５Ａおよび５Ｂ図に示したものに共通する結果を示している。
第１０図は、イン・ビボでのマウスモデルにおけるコレステロールエステルおよびトリグリセリドを含むエマルジョンから得られる結果を比較している。
第１１図は、各種のＴＧを含む組成物を投与した後に血中に放出されるトリグリセリドの理論量を毒性閾値と共にグラフに示したものである。「ＴＰＮ」は「総非経口栄養」を表し、「ＲＩ」は本発明による組成物を表す。
【００２１】
実施例１
S. tymphimurium内毒素で行なったマウスの生存率を決定する目的で、検討を行なった。異系交配した雄Swiss-Websterマウスに、塩水（２０匹のマウス）再構成ＨＤＬ粒子（４０匹のマウス）、または再構成ペプチド１８Ａ（２０匹のマウス）に尾静脈から注射により投与した。注射材料の詳細は、下記の通りである。
【００２２】
ａ．ＨＤＬ粒子
粒子は、Matzら，J. Biol.Chem., 257: 4535-4540 (1982)および米国特許第５，１２８，３１８号明細書に準じて界面活性剤透析を用い、純度９５％の卵ホスファチジルコリン（２：１重量／重量）で再構成したａｐｏ−Ｈｕ−ＨＤＬ（８５％−ＡＩ；１５％Ａ−IIおよびアポＣ）から調製した。上記文献および特許明細書の内容は、その開示の一部として本明細書に引用される。
【００２３】
ｂ．ペプチド粒子
ペプチド１８Ａは下記のアミノ酸配列を有する。
Asp-Trp-Leu-Lys-Ala-Phe-Tyr-Asp-Lys-Val-Ala-Gly-Lys-Leu-Lys-Glu-Ala-Phe
【００２４】
また、ペプチドの試料を、界面活性剤透析を用いてMatzら，上記引用（２：１重量／重量）および米国特許第５，１２８，３１８号明細書に従って重ど９５％の卵ホスファチジルコリンと混合して再構成した。生成する粒子は、Matzおよび特許文献のａｐｏ−ＨＤＬではなくペプチド成分が含まれていることを除き、米国特許第５，１２８，３１８号明細書に開示されたものと同一であった。
【００２５】
再構成物質の投与から１５分以内に、マウスにSalmonella LPS１０ｍｇ／ｋｇ体重を腹腔内に投与した。評価基準は、生存数であった。第３図にこれらの結果を示しており、塩水コントロールと比較してほぼ４倍優れている。合成ペプチドは、再構成アポ−ＨＤＬを含む粒子とほぼ同程度の効果を有する。
【００２６】
実施例２
血漿タンパク質と血液の細胞成分との相互作用の完全性を保存しながら、ＴＮＦ−αのＬＰＳによって媒介される刺激に影響を与える因子は、イン・ビトロでのヒト全血系で適当に検討することができる。このような系を用いて、リポタンパク質の成分のいずれがＬＰＳを中和するのに重要であるかを決定した。
【００２７】
試験を行なった材料は、再構成高密度リポタンパク質（Ｒ−ＨＤＬ）、天然の血漿リポタンパク質（ＶＬＤＬ、ＬＤＳ、ＨＤＬ）、リポタンパク質欠損血清、およびトリグリセリド含量の多いエマルジョンである２０％INTRALIPID（登録商標）（トリグリセリドおよびリン脂質）であった。
【００２８】
血液をヘパリン処理したチューブに集めて、Hank′s Balanced Salt Solution(以後「ＨＢＳＳ」とする)または試験を行なう材料をＨＢＳＳに溶解したもので希釈した。生成する材料をStarstedtチューブに移した（２５０μｌ／チューブ）。ＬＰＳを、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳを含むパイロジェン不含塩水に溶解し、（２．５μｌを）最終濃度１０ｎｇ／ｍｌとなるように加えた。３７℃で４時間インキュベーションした後、チューブを４℃まで冷却し、１０，０００×ｇで５分間遠心分離した。上清を集めて、市販のＥＬＩＳＡを用いてＴＮＦ−αを測定した。
【００２９】
下記の表１では、試験を行なった材料の組成を比較している。第５Ａおよび５Ｂ図にその結果を示す。データーは、添加したタンパク質（第５Ａ図）およびリン脂質（第５Ｂ図）の濃度に対してプロットした生成したＴＮＦ−αの量としてプロットしている。対数尺度を用いて、使用した濃度を広範囲に示すようにし、１０°を１ｍｇ／ｍｌとした。総ての全血インキュベーションはE. coli 0111: B4 LPS１０ｎｇ／ｍｌを含んでおり、第５Ａおよび５Ｂ図のキーが示すように、組成物の一つを補足していた。
【００３０】
タンパク質含量をプロットすると（第５Ａ図）、材料の効果が異なり、リン脂質含量をプロットすると（第５Ｂ図）極めて類似していることから、リン脂質は重要な成分であると思われる。これは、タンパク質を含まない脂質エマルジョンが天然のＨＤＬより有効であるが、Ｒ−ＨＤＬより効果が低いことによって確かめられる。タンパク質は、中和には重要ではないと思われる。
【００３１】
【表１】
0003818660.tif 000002
【００３２】
実施例３
次の段階として、様々な量の中性脂質を含むタンパク質不含脂質エマルジョンを、ヒト全血で試験した。実施例２に記載したのと同じイン・ビトロでのヒト全血分析法を用いた。
【００３３】
本明細書に記載の総ての粒子は、同じプロトコールによって作成し、これはリン脂質、スフィンゴミエリン、またはホスファチジルコリン、トリオレインおよび／またはエステル化されていないコレステロールエステルを混合し、クロロホルムに溶解して、これをフラスコに秤り取ることを含んでいた。ビタミンＥ（０．０２％、重量／容量）を酸化防止剤として加えた。次に、乾燥脂質フィルムを、試料上に窒素またはアルゴンガスを吹き付けることによって調製した。次いで、非パイロジェン塩水の一定容量をフラスコに加えた後、渦流ミキサーで混合して総ての脂質を懸濁させた。次に、溶液を高圧ホモゲナイザーでホモゲナイズした。ホスファチジルコリンをトリオレインと共にまたはトリオレインなしで含む試料を、２０，０００ｐｓｉで１０回ホモゲナイザー中を循環させた。コレステロールを１種類以上の他の脂質と共に含む試料を、３０，０００ｐｓｉで１５〜２０回循環させた。ホモゲナイズした溶液を０．４５μｍシリンジ・フィルターで濾過し、濾液を使用するまで（３日以内）室温で保存した。第６Ａおよび６Ｂ図にこれらの結果を示す。これらの検討では、ＬＰＳによって変化するＴＮＦ−α産生を添加したトリグリセリド（第６Ａ図）またはリン脂質（第６Ｂ図）の濃度に対してプロットした。キーによって示される組成物は、（重量で）７％トリグリセリド（「ＴＧ」）、４５％ＴＧ、８９％ＴＧ、９４％ＴＧ、Ｒ−ＨＤＬまたはＴＧを含まないリン脂質（第６Ｂ図だけに示される）を含んでいた。８９％ＴＧ組成物は１０％INTRALIPID（登録商標）処方物であり、９４％ＴＧは２０％INTRALIPIDに相当する。総ての他の試験では、卵ホスファチジルコリン（ＰＣ）およびトリオレインを用いた。
【００３４】
これらの結果は、タンパク質を含まない組成物は、トリグリセリド含量によって比較すると、非常に異なっていることを示している。それらは、リン脂質（ＰＣ）含量によって試験すると、極めて類似している。これにより、特にリン脂質のみが有効であるが、４５％までのＴＧを含むエマルジョンより効果が低いので、リン脂質の役割が立証される。
【００３５】
実施例４
次に、マウスモデルでのイン・ビボでの実験について検討を行なうが、これはヒトでの効果を予測するための信頼性のある系として認められている。
【００３６】
これらの実験では、リン脂質投与量（２００ｍｇ／ｋｇまたは４００ｍｇ／ｋｇ）を与える十分な量の実施例３に記載の処方物並びに他のもの（純ホスファチジルコリン、７％ＴＧ、２５％ＴＧ、４５％ＴＧ、７１％ＴＧ、８１％ＴＧ、８９％ＴＧ、９４％ＴＧ）または塩水コントロールを、E. coli 0111:B4 LPS２５ｍｇ／ｋｇと共にボーラス形態でマウスに注射した。コントロール群には、エマルジョンの容積に匹敵する十分な容積の生理食塩水を静脈内投与した。７２時間後の生存数を、第７図に示す。コントロール群中の３４４匹の動物の内、１５５匹が生存した。
【００３７】
ＰＣ単独では、保護効果はあまり高くなく、９５％信頼水準では統計上有意ではなかったが、７％、４５％および７１％ＴＧ組成物では、生存数が有意に改良された。８０％および８９％ＴＧ組成物では、効果は閾値ぎりぎりであり、９４％ＴＧでは生存数が減少した。
【００３８】
投与量を増加してＰＣ４００ｍｇ／ｋｇを供給したところ、８９％および９４％ＴＧエマルジョンでは生存時間が減少したが、これは上記に説明したように、ＴＧ中毒によるものと思われる。
【００３９】
実施例５
実施例２〜４に記載した研究により、リン脂質は内毒素血症の抑制に有用な活性薬剤であることが明らかになった。トリグリセリド以外の無極性脂質はＰＣ以外の鱗翅室とエマルジョンを形成することができることから、他のものを試みることもできると思われた。典型的な物はスフィンゴミエリン（もう一つのリン脂質）およびエステル化されていないコレステロール（極性の中性脂質）、およびこれらの混合物である。従って、エステル化されたコレステロール（無極性エステル）、スクワレン（炭化水素）、およびビタミンＥ（無極性の酸化防止剤）を用いることもできる。一連の実験を、上記の実施例２のヒト全血分析法および実施例４のマウス生存数分析法を用いてこれらを試験する目的で設計した。
【００４０】
エマルジョンは、上記と同様にして、純ホスファチジルコリン、ホスファチジルコリンと、１０％（重量／重量）のエステル化されていないコレステロール、１０％（重量／重量）のスフィンゴミエリン、または両者の混合物を総量で１０％とを用いて調製した。エマルジョンを、ＰＣについては１００ｍｇ／ｄｌの濃度で、ＬＰＳは１０ｎｇ／ｍｌで、全血に加えた。混合物をインキュベーションして、ＴＮＦ−αの放出を測定した。
【００４１】
結果を第８図に示す。ＴＮＦ−αの産生は、ＰＣ単独では実質的に減少した。エステル化されていないコレステロール、スフィンゴミエリンまたは両者の混合物を含むエマルジョンも、ＴＮＦ−αの放出を抑制した。
【００４２】
実施例６
また、全血分析法を用いて、中性脂質を含むエマルジョンに対するエステル化されていないコレステロールおよび／またはスフィンゴミエリンの効果を測定した。再度、エマルジョンをＰＣ１００ｍｇ／ｄｌで加えた。各種組成（重量／重量）を表２に示す。
【００４３】
【表２】
0003818660.tif 000003
【００４４】
第９Ａおよび９Ｂ図に結果を示す。中性脂質で作成したＰＣエマルジョンは、極性脂質を加えてもまたは加えなくとも、抑制を示した。また、ＬＰＳ濃度は１０ｎｇ／ｍｌであり、これは内毒素の臨床的に相当する濃度である。コレステロールを含むエマルジョンはＴＧを含むエマルジョンより効果が低く、エステル化されていないコレステロールを含むエマルジョンは、それを含まないエマルジョンと同様にＴＮＦ−αを抑制しなかった。スフィンゴミエリンをエマルジョンに添加すると、ＴＮＦ−α産生の抑制が向上すると思われた。
【００４５】
実施例７
コレステロールエステルを含むエマルジョンを、致死投与量の内毒素を用いてイン・ビボモデル（すなわち、実施例４で用いたもの）で試験した。エマルジョンはＰＣおよびＴＧ、またはＰＣおよびコレステロールエステル（ＣＥ）を用いて調製し、ＰＣ２００ｍｇ／ｋｇをE. coli 0111:B4 LPS ２５ｍｇ／ｋｇ（致死投与量）と共に単回ボーラス投与量を提供するため尾静脈から投与した。コントロール群には、生理食塩水をエマルジョンの容量に相当する容量で静脈内投与した。
【００４６】
第１０図では、これらのデーターでＣＥおよびＴＧを含むエマルジョン空の結果を比較する。それぞれのエマルジョンを、総数が１６以上の動物を用いて、最低２回の実験で試験した。
【００４７】
図示されているように、７％または４５％ＣＥ（重量％）を含むエマルジョンでは、生存数が有意に向上した。実施例６のものを用いて得たこれらの結果は、ＣＥをＴＧの代わりに用いて内毒素を中和するエマルジョンを生成させることができることを示している。
【００４８】
実施例８
リン脂質とトリグリセリドとのタンパク質を含まないエマルジョンはＬＰＳで刺激した全血においてＴＮＦ−αの産生を遮断する。理論的には、これらのエマルジョンは、血漿中でリン脂質の保護濃度を提供する投与量で安全に投与することができれば、イン・ビボでも有効である可能性がある。本発明者らのＲ−ＨＤＬを用いた前の実験では、リン脂質の最低投与量は約２００ｍｇ／ｋｇであることが示唆されている。この投与量と体重の４．５％の血漿容積を用いれば、トリグリセリド含量の増加する一連のエマルジョンを投与した後に血漿中で予想されるトリグリセリドの濃度を計算することができる。この結果を、第１１図において重量％ＴＧの増加と共に上向きの滑らかな線として示す。血漿ＴＧ濃度は、脂肪の多い食事の後でも健康な成人では１０００ｍｇ／ｄｌを上回ることはほとんどない。膵臓炎は、血漿ＴＧが２０００ｍｇ／ｄｌを上回る患者で報告されている（Farmerら，Amer. J. Med., 54:161-164(1973);Krauseら，Amer. J. Med., 62: 144-149(1977);Glueckら，J. Lab. Clin. Med., 123:59-61）。血漿ＴＧが４０００ｍｇ／ｄｌを上回ることは極めてまれであり、重大な問題を引き起こす。これらの２つの閾値は、上記の図にて、水平線で示される。２００ｍｇ／ｋｇのリン脂質を供給する投与量で１０％または２０％INTROLIPID（登録商標）を投与すると、安全限界を大きく上回る血漿ＴＧ濃度（２個の白抜き丸を参照されたい）を生じることが予想される。対照的に、７％、４５％、７１％または７８％を含むエマルジョン（左から右へ黒塗り四角形）を投与すると、血漿ＴＧはそれぞれ１３６、４７７、１３００または２０００ｍｇ／ｄｌに上昇する。ＴＧ含量が約５０％までのエマルジョンは、ＴＧからの毒性がないことが予想される。
【００４９】
実施例９
リン脂質と胆汁酸、すなわちコール酸ナトリウムとの組合わせの効果を、前実施例で記載したのと同じ種類の実験で試験した。
【００５０】
しかしながら、試験動物に投与した処方物を調製した手順は異なっていた。
【００５１】
この実施例およびこれ以後の実施例では、処方物は、Microfluidizer高圧ホモゲナイザーを用いて調製した。この装置は、スケールアップが容易である。
【００５２】
液状トリオレインまたは液状の大豆トリグリセリドのいずれかを適当な量の水、または水にコール酸ナトリウム９ｍＭ、１８ｍＭまたは３６ｍＭを加えたものに秤取った。固形の顆粒状ホスファチジルコリンを秤紙上に秤取った後、攪拌しながら徐々に溶液に加えた。脂質を分散させるには凡そ３〜５分かかる。分散の後、材料を微小流動化装置に投入した。この装置は水圧を用いてポンプを作動し、次にこれが２個の互いに対向している試料のジェットを指示する。圧力は、平方インチ当たり２５，０００ポンド程度であることができる。衝突により、ジェットがプラス印の形状のオリフィスに押しやられることによって、試料をホモゲナイズする。
【００５３】
試料はマイクロフルイダイザー中を再循環し、「１回通過」が、総ての試料を装置中に送液するのに要する時間の量として画定した。試料を循環させて２０回通過させ、ホモゲナイズした試料を生成した。デキストロースを、最終濃度５％まで加えた。
【００５４】
E. coli 0111:B4から精製した内毒素（４０ｍｇ／ｋｇ）と上記のエマルジョン（２００ｍｇホスファチジルコリン／ｋｇ）を室温で混合し、直ちにC57BL6/Jマウス（体重１９〜３０ｇ）に尾静脈から静脈内注射により投与した。コール酸塩のみを投与されたマウスは、コール酸塩／ＥＭＬ（エマルジョン）製剤に等しい体積のコール酸ナトリウムを同じコール酸塩濃度で与えられた。コントロールマウスには、同体積の５％デキストロースを投与して血漿の重量オスモル濃度に相当するようにした。
【００５５】
結果を、直ぐ下の表３に示す。エマルジョンは、前実施例に記載されているホスファチジルコリン／７％トリグリセリドェマルジョンである。コール酸ナトリウムを用いるときには、これを所定の濃度で原材料に加えた後、材料を乳化した。
【００５６】
【表３】
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【００５７】
便宜上、エマルジョンの重量パーセントは、次の通りである。９ｍＭのコール酸塩を用いるときには、エマルジョンに対する重量パーセントは７％コール酸塩、６．１％トリグリセリド、および８６．９％ホスファチジルコリンである。１８ｍＭコール酸塩では、重量パーセントは１３．１％コール酸塩、５．７％トリグリセリド、および８１．２％ホスファチジルコリンである。３６ｍＭコール酸塩では、相対値は２３．２％コール酸塩、５％トリグリセリド、および７１．８％ホスファチジルコリンである。
【００５８】
これらの実験で投与されるＬＰＳの量（４０ｍｇ／ｋｇ）は前の実験で死亡率の検討に用いた量よりもはるかに多い点に留意すべきである。これらの高投与量を用いる意図は、ホスファチジルコリンおよび／またはトリグリセリドに起因すると考えられる総ての保護効果を圧倒することである。従って、これらの実験の後に得られる結論は、胆汁酸塩であるコール酸ナトリウムに起因する保護効果があることである。
【００５９】
ここに示されていないものは、他の胆汁酸塩およびタウリンを含む胆汁塩を用いて行なった検討である。胆汁酸の追加例としては、アロデオキシコール酸、リトコール酸、ヒオデオキシコール酸、ヒオコール酸、α、βおよびω−ムリコール酸、ムロデオキシコール酸、ウルソデオキシコール酸、ウルソコール酸、およびこれらの塩の総て、例えばナトリウム塩、またはタウリンまたはグリシン抱合体が挙げられる。Hoffmann、上記引用を参照されたい。
【００６０】
実施例１０
次いで、更に検討を行なったが、その第一は被験動物としてマウスを用いる生存数の検討であった。
【００６１】
生存数の検討では、被験動物を４群に分けた。第一の群には５％デキストロース溶液を投与し、コントロールとして用いた。第二の群には、上記のようにして調製した９３％（重量）ホスファチジルコリンおよび７％（重量）トリグリセリドのエマルジョンを投与した。エマルジョンは、５％デキストロース、および脂質の約５０ｍｇ／ｍｌでの大豆リン脂質を含んでいた。
第三および第四の群では、動物は第二群に投与したのと同様のエマルジョンに１８ｍＭコール酸ナトリウムまたは１８ｍＭデオキシコール酸ナトリウムを補足したものを投与された。この実験では、用いたプロトコールは実施例９に記載したものと同一であった。
【００６２】
生存数を投与から７２時間後に測定し、下の表４にまとめた。
【００６３】
【表４】
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【００６４】
群の生存数の比較の統計的有意性を、コンピュータープログラムを用いて一般化したWilcox法によって検定した点に留意されたい。群１のコントロールに対する比較を「１」の下に示し、群２の７％エマルジョンで処理した動物に対する比較を「２」の下に示し、群３のエマルジョンとコール酸ナトリウムとで処理した動物に対する比較を「３」の下に示す。
【００６５】
生存率および統計分析のいずれも、胆汁酸塩を含む処方物が明らかに予想外に優れていることを示している。
【００６６】
実施例１１
実験の第二の組では、ウサギモデルを用いた。このモデルでは、ＴＮＦ（腫瘍壊死因子）−αの放出を測定した。
【００６７】
ウサギを３群に分け、５％デキストロース溶液、上記のリン脂質とトリグリセリドとのエマルジョン（９３％／７％）、または１８ｍＭコール酸をも含む９３％／７％エマルジョンを投与した。総てのエマルジョンは、実施例１０と同様に５％デキストロースに調整した。ウサギにエマルジョンのプライミング・ボーラス（priming bolus）を投与し、２時間後にE. coli 0111:B4 LPS １００μｇを作用させた。プライミング・ボーラスの後に、処方物を投与して、体重１ｋｇ当たり１時間当たり脂質５０ｍｇを静脈内投与により連続保持輸液を行なった。静脈内投与は、作用の後３時間継続した。
【００６８】
血液を、ベースラインにおいて最初のボーラスの投与から３０分後、および投与から５時間に亙り１時間毎にウサギから採取した。
【００６９】
下記の表５に、ピークＴＮＦ−α値を示す。これらは、内毒素の投与から２時間後に起きた。
【００７０】
周知のStudent検定を用いて、統計的有意性を決定した。表に示されるように、ＴＮＦ−α値は１８ｍＭコール酸を投与した後有意に減少した。
【００７１】
【表５】
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【００７２】
上記の実施例は、一つの態様では、内毒素が会合するリン脂質の有効量を投与することにより被験者における内毒素血症の緩和または予防を包含する本発明を詳細に説明したものである。次に、リン脂質と内毒素との会合（結合）を、リポタンパク質粒子を除去することによる方法に習熟している者には周知の標準的な生物学的方法によって被験者から除去する。内毒素がリン脂質と会合（associate）することにより、これが不活性化される。
【００７３】
これらの実施例は、胆汁酸または胆汁酸塩のようなコラン酸またはコラン酸塩の群の１つの投与を用いて、リン脂質と同じ目的を達成する、すなわち内毒素血症の緩和または予防することもできることも示している。従って、胆汁酸／胆汁酸塩およびリン脂質の一方または両方を含むペプチドおよびタンパク質を含まない組成物を、内毒素血症の治療に用いることができる。コラン酸は、例えばHofmann, Hepatology, 4(5):4S-14S(1984)に記載されており、この文献の内容は、その開示の一部として本明細書に引用される。特に、コラン酸に特徴的な構造を示している５Ｓ頁、第１および２図が注目され、これらの内容は、その開示の一部として本明細書に引用される。
【００７４】
治療を行なう被験動物はヒトであることが好ましいが、本発明の実施はヒト以外の動物にも同様に適用できる。
【００７５】
ここで用いられる「緩和」とは、グラム陰性菌（S. tymphimurium, E. coliなど）によって産生される各種の内毒素のいずれかによって引き起こされる内毒素血症の苦しみを軽減する治療を表す。予防は、被験者が、内毒素へ暴露されることによって生じる症状にあるかまたはこの症状を引き起こしそうな時点で薬剤を投与することによって行なうことができる。従って、外科処置を受けようとする被験者に、この処置の前に活性成分を投与することができる。
【００７６】
この被験者の治療に要するリン脂質と胆汁酸との配合物の有効量は、変化することがある。一般に、被験者の体重１ｋｇ当たりリン脂質を総量で約２００ｍｇ〜約８００ｍｇまでの投与量が好ましいが、この量は内毒素血症の重篤度または予防の状況における危険性の程度によって増減することができる。胆汁酸およびそれらの塩のようなコラン酸および塩については、約１０ｍｇ〜約３００ｍｇ／ｋｇ体重、更に好ましくは１５ｍｇ〜約２７５ｍｇ／ｋｇ体重の投与量が用いられる。
【００７７】
中性脂質を含まないリン脂質のエマルジョンも想像されるように、胆汁酸／胆汁酸塩およびリン脂質を、中性脂質をも含む組成物中で投与するのが望ましいが、これは必要ではない。リン脂質を組合わせて投与することが望ましいことは、中性脂質とリン脂質とは会合してリポタンパク質に類似した粒子となるが、それらは、当然のことであるが常にリポタンパク質に含まれているペプチド成分のタンパク質を含まないという点でリポタンパク質とは異なっていることに起因している。
【００７８】
治療の特に望ましい形態は、リン脂質が卵黄ホスファチジルコリン、大豆を基剤としたホスファチジルコリンまたはスフィンゴ脂質のようなホスファチジルコリンである。胆汁酸／胆汁酸塩については、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウムおよびケノデオキシコール酸ナトリウムのようなコール酸および／またはその塩が好ましい。
【００７９】
中性脂質に関しては、コレステロールエステルまたはトリグリセリドを用いるのが好ましいが、スクワレンまたは他の炭化水素油、ジ−およびモノ−グリセリドのような他の中性脂質、およびビタミンＥのような酸化防止剤も用いることができる。
【００８０】
組成物を投与することができる形態は変化することができ、ボーラスまたは他の静脈内形態が特に好ましい。ボーラス形態を用い、組成物がトリグリセリドなどを含むときには、投与に幾分注意しなければならない。トリグリセリドは多量に投与しすぎると、毒性を有することはかなり広く知られていることである。しかしながら、通常の技術を有する技術者であれば、トリグリセリド中毒の危険性を減少させまたは除くようにした組成物を容易に処方することができる。一般に、ボーラス形態を用いるときには、組成物はトリグリセリドまたは他の中性脂質を重量で約８０重量％だけ、好ましくは７０重量％だけを含むべきである。最も好ましくは、組成物は、ボーラスを投与するときには、中性脂質を約５０重量％含むにすぎないようにすべきである。
【００８１】
しかしながら、他の静脈内形態のような非ボーラス形態を用いるときには、中毒の危険性は減少する。それでもなお、上記範囲が静脈内または他の投与形態に好ましいが、それらは必須とされるものではないことを理解しなければならない。胆汁酸および胆汁酸塩については、投与量は、約２５ｍｇ／ｋｇ体重〜約５００ｍｇ／ｋｇ体重が好ましく、約５０ｍｇ／ｋｇ体重〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重が特に好ましい。リン脂質については、約１００ｍｇ／ｋｇ体重〜約１０００ｍｇ／ｋｇ体重の投与量が好ましい。しかしながら、投与量は一般的なものであり、被験者および投与の様式によって変化する。
【００８２】
上記のように、タンパク質およびペプチドを含まない処方物は、少なくとも１種類のリン脂質または胆汁酸／胆汁酸塩が含まれていることが必要である。リン脂質については、トリグリセリド、ジグリセリドまたはモノグリセリドのような少なくとも１種類の中性脂質が含まれていることが好ましい。組成物は、ステロール（例えば、コレステロール、β−シトステロール）、エステル化下またはエステル化されていない脂質（例えば、コレステロールエステルまたはエステル化されていないコレステロール）、スクワレンのような炭化水素油、ビタミンＥのような酸化防止剤などの追加材料を含むことができるが、これらは必須とされるものではない。２種類以上のリン脂質および／または２種類以上の中性脂質をこれらの如何なる処方物に用いることもできることは勿論である。中性脂質とリン脂質との配合物を用いるときは、中性脂質は組成物の脂質の総量に対して約３重量％〜約５０重量％で含まれるべきである。
【００８３】
胆汁酸／胆汁酸塩の場合には、これらは、リン脂質、中性脂質、または両者を単独にまたは組合わせて用いることができる。これらの追加材料（例えば、リン脂質および中性脂質）に関しては、好ましいものは上記に記載し、述べたものである。任意の追加成分としては、上記の者が挙げられる。
【００８４】
また、内毒素血症の治療に用いられる組成物も、本発明の一部である。本発明のこの特徴の一つの態様は、胆汁酸／胆汁酸塩、リン脂質および中性脂質のそれぞれの少なくとも一つを含む組成物であって、全体として内毒素血症を緩和する量の活性成分を含む組成物である。この組成物は、重量パーセントで、胆汁酸／胆汁酸塩約５重量％〜約３０重量％、中性脂質約３重量％〜約５０重量％、およびリン脂質約１０重量％〜約９５重量％を含むのが好ましい。特に好ましいものは、胆汁酸／胆汁酸塩約１０〜１５重量％、中性脂質約５重量％〜約１０重量％を含む組成物であって、組成物の残部がリン脂質であるものである。
【００８５】
これらの重量百分率は、３成分からなる組成物に対するものである点に留意すべきである。この３成分系を、例えばキャリヤー、アジュバント、上記のような任意成分と組み合わせると、総組成物に対する重量百分率は降下する。このような治療組成物は、常にタンパク質を含まずかつペプチドを含まないことに留意すべきである。
【００８６】
胆汁酸または胆汁酸塩を含まない組成物の場合には、このようなタンパク質を含まず、ペプチドを含まない組成物は、中性脂質を少なくとも約３重量％から中性脂質を約５０重量％まで含み、残部は少なくとも１種類のリン脂質であるのが好ましい。好ましくは、中性脂質はトリグリセリドであるが、上記下追加の中性脂質のいずれであることもできる。また、リン脂質は、ホスファチジルコリンであるのが好ましい。
【００８７】
本発明の他の態様は当業者には明らかになるであろうし、ここでは繰り返し記載する必要はない。
【００８８】
詳細な説明および実施例は例示のためのものであり、本発明の制限のためのものではなく、本発明の精神および範囲内の他の態様は当業者に理解されることが分かるであろう。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】アポ−Ａ−Ｉ、リン脂質およびコール酸塩を含む再構成粒子の形成法を示す図。
【図２】再構成粒子によるＬＰＳ分子の受容を示す図。
【図３】マウスモデルでの内毒素によって引き起こされた毒性の減少を検討するのに用いた実験を示す図。
【図４Ａ】分類した（labelled）先行技術は、各種のペプチドによる螺旋ホイールの形成を示す図であり、Anantharamaiah，の上記引用を参照。
【図４Ｂ】分類した（labelled）先行技術は、各種のペプチドによる螺旋ホイールの形成を示す図であり、Anantharamaiah，の上記引用を参照。
【図４Ｃ】分類した（labelled）先行技術は、各種のペプチドによる螺旋ホイールの形成を示す図であり、Anantharamaiah，の上記引用を参照。
【図４Ｄ】分類した（labelled）先行技術は、各種のペプチドによる螺旋ホイールの形成を示す図であり、Anantharamaiah，の上記引用を参照。
【図４Ｅ】分類した（labelled）先行技術は、各種のペプチドによる螺旋ホイールの形成を示す図であり、Anantharamaiah，の上記引用を参照。
【図４Ｆ】分類した（labened）先行技術は、各種のペプチドによる螺旋ホイールの形成を示す図であり、Anantharamaiah，の上記引用を参照。
【図４Ｇ】分類した（labelled）先行技術は、各種のペプチドによる螺旋ホイールの形成を示す図であり、Anantharamaiah，の上記引用を参照。
【図４Ｈ】分類した（labelled）先行技術は、各種のペプチドによる螺旋ホイールの形成を示す図であり、Anantharamaiah，の上記引用を参照。
【図４Ｉ】分類した（labelled）先行技術は、各種のペプチドによる螺旋ホイールの形成を示す図であり、Anantharamaiah，の上記引用を参照。
【図５Ａ】ヒト全血モデルにおけるＴＮＦ放出を決定することによって内毒素の中和を決定したモデルで各種の組成物を試験したときに得られる結果を示す図であり、タンパク質の役割を示す。試験した組成物しては、天然のリポタンパク質（ＶＬＤＬ、ＬＤＬ、ＨＤＬ）、再構成ＨＤＬ（「Ｒ−ＨＤＬ」）、およびINTRALIPID（登録商標）組成物ならびにリン脂質およびタンパク質を含むエマルジョンが挙げられる。
【図５Ｂ】ヒト全血モデルにおけるＴＮＦ放出を決定することによって内毒素の中和を決定したモデルで各種の組成物を試験したときに得られる結果を示す図であり、リン脂質の役割を示す。試験した組成物しては、天然のリポタンパク質（ＶＬＤＬ、ＬＤＬ、ＨＤＬ）、再構成ＨＤＬ（「Ｒ−ＨＤＬ」）、およびINTRALIPID（登録商標）組成物ならびにリン脂質およびタンパク質を含むエマルジョンが挙げられる。
【図６Ａ】同じモデルでのトリグリセリド（中性脂質）、およびリン脂質であるホスファチジルコリンの役割を比較した図。
【図６Ｂ】同じモデルでのトリグリセリド（中性脂質）、およびリン脂質であるホスファチジルコリンの役割を比較した図。
【図７】E. coli LPSを投与したときの５５％致死モデルを用いて、マウスモデルでの各種ＰＣおよびＰＣ／ＴＧ組成物の投与に関連した毒性についての情報を示す図。
【図８】上記引用したヒト全血分析法を、トリグリセリドの代わりにリン脂質とエステル化されていないコレステロール、スフィンゴミエリン、または両者の混合物とを用いて行なったものに共通するデーターを示す図。
【図９Ａ】リン脂質、エステル化されていないコレステロールおよび／またはスフィンゴミエリンを中性脂質としてのトリグリセリドまたはエステル化されたコレステロールと混合することを除き図５Ａおよび図５Ｂに示したものに共通する結果を示す図。
【図９Ｂ】リン脂質、エステル化されていないコレステロールおよび／またはスフィンゴミエリンを中性脂質としてのトリグリセリドまたはエステル化されたコレステロールと混合することを除き第５Ａおよび５Ｂ図に示したものに共通する結果を示す図。
【図１０】イン・ビボでのマウスモデルにおけるコレステロールエステルおよびトリグリセリドを含むエマルジョンから得られる結果を比較した図。
【図１１】各種のＴＧを含む組成物を投与した後に血中に放出されるトリグリセリドの理論量を毒性閾値と共に示したグラフであり、「ＴＰＮ」は「総非経口栄養」を表し、「ＲＩ」は本発明による組成物を表す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図４Ｇ】
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【図４Ｈ】
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【図４Ｉ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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