(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）トロンボモジュリンを添加している被検血漿とトロンボモジュリンを添加していない被検血漿のそれぞれに凝固誘発物質を添加し、生成されたトロンビン量を指標とするプロトロンビンエース活性を測定する工程、
（２）トロンボモジュリンによるプロトロンビンエース活性の阻害率を算出する工程、
（３）その阻害率を血液抗凝固能の指標として使用する工程、
を含むことを特徴とする被検血液の血液抗凝固能の測定方法。
【請求項２】
トロンボモジュリンを添加している被検血漿とトロンボモジュリンを添加していない被検血漿に、少なくともカルシウムイオンおよびリン脂質を添加することを特徴とする請求項１に記載の測定方法。
【請求項３】
トロンボモジュリンを添加している被検血漿とトロンボモジュリンを添加していない被検血漿において、さらにプロトロンビンを添加することを特徴とする請求項１または２に記載の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、血液の抗凝固能および血液中のトロンボモジュリン活性を測定するための新規な方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、血液中に存在する種々の抗凝固因子、例えばアンチトロンビンIII 、プロテインＣ、プロテインＳなどを、各々生化学的に定量する方法は知られていたが、複数の血液抗凝固因子が協同して作りだす血液全体の有する包括的な抗凝固能（血液抗凝固能）を、生理的状況下で測定できる方法は存在しなかった。一方、血液凝固能を測定する方法としてはＡＰＴＴ（Activated Partial Thromboplastin Time)など凝固時間を測定する方法が存在しているため、ＡＰＴＴによって対立概念の血液抗凝固能を測定できるとも考えられるが、実際には不可能であった。例えば、プロテインＣあるいはプロテインＳ欠損血漿では、血液抗凝固能が低下し、凝固時間が短縮するはずであるが、ＡＰＴＴではこの変化を検知することはできなかった。これは、ＡＰＴＴが血液凝固因子の作用を測定する方法であるためであり、プロテインＣやプロテインＳのような血液抗凝固能に関与する因子の作用については、十分に評価できないのである。このように、血液抗凝固能の変化は、必ずしも血液凝固能の変化によってのみ把握できるものではないため、ＡＰＴＴに相当する血液抗凝固能の測定方法が望まれていた。また、従来血液中のトロンボモンジュリン測定法として、酵素免疫的な方法は知られていたが、この方法によれば失活したトロンボモンジュリンをも検知してしまう難点があった。そこで、血液中のトロンボモンジュリンの生理的活性を簡便に測定する方法が望まれていた。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、血液抗凝固能を生理的状況下で簡便に測定する方法ならびに血液中のトロンボモジュリン活性を生理的状況下で簡便に測定する方法を提供する。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、血液抗凝固能の測定方法について鋭意検討した結果、トロンボモジュリン添加によるプロトロンビンエース活性の阻害の程度が、血液抗凝固能と強く相関することを見出し、本発明を完成するに到った。すなわち本発明は、（１）トロンボモジュリンを添加している被検血漿とトロンボモジュリンを添加していない被検血漿のそれぞれに凝固誘発物質を添加し、生成されたトロンビン量を指標とするプロトロンビンエース活性を測定する工程、（２）トロンボモジュリンによるプロトロンビンエース活性の阻害率を算出する工程、（３）その阻害率を血液抗凝固能の指標として使用する工程、を含むことを特徴とする被検血液の血液凝固能の測定方法である。また、上記の方法において、トロンボモジュリンを添加している被検血漿とトロンボモジュリンを添加していない被検血漿に、少なくともカルシウムイオンおよびリン脂質を添加すること、あるいはプロトロビンを添加することを特徴とする被検血液の血液抗凝固能の測定方法、さらにはプロトロンビンエース活性を指標とする血液中のトロンボモジュリン活性の測定方法に関する。
【０００５】
以下に本発明を詳述する。被検血漿にトロンボモジュリンおよび凝固誘発物質を添加した後、プロトロンビンを添加する。一定時間反応させた後、トロンビンを定量し、１分間に発生するトロンビン量を以てプロトロンビンエース活性とする。このプロトロンビンエース活性のトロンボモジュリンによる阻害の程度が血液抗凝固能と強く相関し、その指標として有効であった。また、このプロトロンビンエース活性の阻害の程度が、トロンボモジュリン濃度に依存することから、プロトロンビンエース活性の阻害の程度を評価することにより、血液中のトロンボモジュリン活性を測定できることを確認した。
【０００６】
本測定法に用いる被検血漿は、測定系に影響を与えないＣａキレート剤を添加した血漿、好ましくはクエン酸添加血漿が使用できる。血漿からフィブリノーゲンを除去せずに測定を行うことも可能であるが、測定時にピペットなどがフィブリンにより閉塞してしまうなどの不便があるため、フィブリノーゲン除去操作を行うことが好ましい。フィブリノーゲン除去剤としては、レプチラーゼなどのフィブリノーゲンをゲル化除去するものが使用可能である。レプチラーゼは、フィブリノーゲンをほぼ完全に除去することのできる量を用いる。好ましくは、血漿中濃度として０．１〜１００Ｕ／ｍｌ程度が適当である。また、熱処理による除去も可能であるが、測定系への影響を考えれば、除去剤の使用が好ましい。
【０００７】
凝固誘発物質として、カルシウムイオンの単独使用が可能である。使用するカルシウムイオンの濃度は、凝固反応、抗凝固反応が進行しうる濃度であればよい。好ましくは、最終濃度として３〜４０ｍＭ程度が適当である。測定の感度および再現性を上げるためには、血液凝固第Ｘ因子の活性を増大する物質をカルシウムイオンに加えて併用するのがよい。血液凝固第Ｘ因子活性を増大する物質として、例えば、血液凝固第ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩ、ＸＩＩ因子、組織因子、高分子キニノーゲン、カオリンやエラジン酸などの接触因子などが挙げられる。なお、使用量は充分な感度および再現性を得られるように選択する。
【０００８】
プロトロンビンエースの構成成分として、あるいは活性化プロテインＣの効果を発揮させるためにリン脂質を添加してもよい。血中に残存するリン脂質で十分な場合もあるが、感度および再現性を良くするためにはリン脂質を適量添加するほうが好ましい。リン脂質としては、ホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、カルジオリピンなどを適当な割合で混合したものを用いることができる。あるいは、洗浄血小板や血小板リン脂質などの生体膜構成成分も使用可能である。添加するプロトロンビンとしては、プロトロンビンエースにより活性化されトロンビンを生じるものであれば使用できる。例えば、ヒト、サル、ラット、マウス、ウサギ、ウシなどのプロトロンビンが使用可能である。使用するプロトロンビン濃度は、通常の方法にて検出できる量のトロンビンを発生させる濃度でよい。好ましくは、最終濃度として０．１〜１０ｎＭが適当である。
【０００９】
添加するトロンボモジュリンは、トロンビンと結合してプロテインＣを活性化するものであれば使用でき、ヒト、サル、ラット、マウス、ウサギ、ウシなどの肺や胎盤から抽出した膜貫通型トロンボモジュリン、尿などの体液から抽出した可溶型トロンボモジュリン、遺伝子操作により作出される組み換え型トロンボモジュリンなどが使用できる。使用するトロンボモンジュリン濃度は、プロトロンビンエースを有為に減少させる濃度であればよい。トロンビン濃度の測定方法としては、Ｓ−２３６６、Ｓ−２２３８（カビ社製）などの合成発色基質を用いる方法や、凝固時間測定法などが可能である。
【００１０】
トロンボモジュリンの代わりに活性化プロテインＣを用いることもできるが、プロテインＣそのものの異常を検知することができない。また、プロテインＣ活性化剤（プロタックなどの蛇毒、トロンボモジュリン−トロンビン複合体など）を用いる方法も可能であるが、プロテインＣ活性化に関する因子、例えば好酸球由来塩基性蛋白などの異常を検知する場合には不向きである。
【００１１】
さらにプロトロンビンエース活性の測定に変えて、プロトロンビンを添加せずに、活性化第Ｖ因子量や凝固誘発物質を添加後に発生するトロンビン量の測定で代替することも可能であるが、再現性や簡便性において劣るため、プロトロンビンエース活性を指標とすることが好ましい。本発明の測定法原理は、以下の通りである。
【００１２】
被検血液に凝固誘発物質を添加することで凝固反応が開始されると、活性化第Ｘ因子、活性化第Ｖ因子、カルシウムイオン、リン脂質からなるプロトロンビンエースが形成され、本酵素の作用によりトロンビンが生成する。反応系内にトロンボモジュリンが存在すると、トロンビン−トロンボモジュリン複合体が形成され、該複合体がプロテインＣを活性化する。活性化プロテインＣはプロテインＳの存在下、活性化第Ｖ因子を分解することでプロトロンビンエースを阻害する。つまり、トロンボモジュリンの有無により、プロトロンビンエース阻害の程度に差異が生じる。この阻害の程度は、プロテインＣ、プロテインＳ、トロンビン、さらにはこれらの因子に影響する血液因子、例えば第Ｖ因子、第ＶＩＩＩ因子、リン脂質およびこれらに対する阻害因子、プロテインＣインヒビター、α１−アンチトリプシン、α２−マクログロブリン、補体Ｃ４ｂ結合蛋白、アンチトロンビンＩＩＩ、ヘパリンコファクターＩＩ、ルーパスアンチコアギュラント等の自己抗体、ティッシュファクターパスウェイインヒビター、ヘモシステイン、好酸球由来塩基性蛋白質、アネキシン類などの生理的な活性を反映する。従って、本測定法によれば、これらの因子に起因する包括的な血液抗凝固能を生理的条件下で測定できる。なお、阻害の程度は、プロトロンビンエース活性を５０％阻害するトロンボモジュリンの濃度などで表すことができる。また、この血液抗凝固能の測定原理を応用すれば、プロトロンビンエース活性を指標として血液中のトロンボモジュリン活性を測定することも可能である。
【００１３】
本発明の測定法は、従来法にはない利点を有するため、様々な分野で利用されるものと期待される。例えば、血液や血液製剤の抗凝固能検査（輸血時の検査、血液製剤の品質管理など）あるいは様々な疾患の診断などである。特にプロテインＣ欠損血漿、ルーパスアンチコアギュラント血漿、クマリン系薬剤使用患者の血漿などの場合には、正常人に認められる血液抗凝固能が、以下の実施例に示すように全く認められないか、認められても微弱であることを確認しており、正常人の場合と区別することが可能な本測定法は、臨床現場で強く待ち望まれている。
【００１４】
【実施例】
【００１５】
【実施例１】
本測定系が実用的な方法であるかを確かめる為に、正常人６人分のプールクエン酸加血漿を用いて検討を行った。プールクエン酸加血漿１ｍｌに対し５０μｌの２００Ｕ／ｍｌのレプチラーゼ（ペンタファーム社）を加え混合し、１０分間室温で放置後、遠心分離しデフィブリノーゲン血漿（以後ｄＰＰＰと略す）を得た。この１００μｌのｄＰＰＰに１０μｌの緩衝液（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ、１１２５ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０６２５％ＢＳＡ）あるいは緩衝液に溶解した５、１０、２５、５０、１００、５００、１０００単位／ｍｌのトロンボモジュリンを加えた。３７℃で１分間加温したのち緩衝液で７５００倍に希釈したウサギ脳ティッシュファクター（組織トロンボプラスチン、国際試薬）、０．３３ｍｇ／ｍｌのリポソーム化したリン脂質（ホスファチジルコリン：ホスファチジルセリン＝１：１、Ｓｉｇｍａ）および６６．７ｍＭの塩化カルシウムを含む緩衝液を１５μｌ加え凝固反応を開始した。この時の反応液中のトロンボモジュリン濃度は０．４、０．８、２、４、８、４０、８０単位／ｍｌであり、ウサギ脳ティッシュファクター、リン脂質および塩化カルシウムの濃度はそれぞれ６２５００倍希釈、０．０４ｍｇ／ｍｌおよび８ｍＭである。反応開始１０分後、反応液内に２５μｌの１０μＭのプロトロンビンを加え１分間反応させたのち、反応液を５μｌ採取し２００μｌの１ｍＭのＳ−２３６６溶液に加え１０分間反応させた。反応を２００μｌの５０％酢酸を加えることにより中断し、４０５ｎｍの吸光度を測定した。得られた吸光度を別途作成したトロンビンの検量線により換算し、１分間に発生したトロンビンの量をプロトロンビンエース活性とした。加えたトロンボモジュリンの濃度に依存してプロトロンビンエース活性の阻害が観測され、その５０％阻害濃度は１．４４単位／ｍｌと読取る事が出来た（図１）。このことから正常人では５０％阻害濃度で１．４４単位／ｍｌと血液抗凝固能を評価することができ、本法は実用的に血液抗凝固能を測定し得る手段となることが確認できた。
【００１６】
また、血液中のトロンボモジュリン濃度に依存して、プロトロンビンエース活性の阻害が認められ、図１に示すように検量線が作成できることから、プロトロンビンエース活性の阻害の程度から、血液中のトロンボモジュリンの活性を測定できることを確認した。
【００１７】
【実施例２】
本測定法で評価される血液抗凝固能が、正常人においてどの程度ばらつくのかを検討し、正常人における血液抗凝固能の正常範囲を決定した。健康な男女それぞれ５人、計１０人の血液抗凝固能の測定を行った。実施例１と同様にクエン酸加血漿１ｍｌに対し、５０μｌの割合で２００Ｕ／ｍｌのレプチラーゼ（ペンタファーム社）を加え、ｄＰＰＰを得た。この５０μｌのｄＰＰＰに５μｌの緩衝液あるいは緩衝液に溶解したトロンボモジュリンを、反応液中濃度が０．８、２、４、８、２０単位／ｍｌになるように加えた。３７℃で１分間加温したのち緩衝液で７５００倍に希釈したウサギ脳ティッシュファクター、０．３３ｍｇ／ｍｌのリポソーム化したリン脂質および６６．７ｍＭの塩化カルシウムを含む緩衝液を７．５μｌ加え凝固反応を開始した。反応開始１０分後、反応液内に１２．５μｌの１０μＭのプロトロンビンを加え１分間反応させたのち、反応液を５μｌ採取し２００μｌの１ｍＭのＳ−２３６６溶液に加え１０分間反応させた。反応を２００μｌの５０％酢酸を加えることにより停止し、４０５ｎｍの吸光度を測定し、別途作成したトロンビンの検量線によりプロトロンビンエース活性に変換した。健康な男女１０人の血液抗凝固能は、トロンボモジュリンによるプロトロンビンエース５０％阻害平均濃度では２．０±１．２単位／ｍｌであり、その内訳は男子２．４±１．５単位／ｍｌ、女子１．７±０．８単位／ｍｌであった。またトロンボモジュリン８単位／ｍｌによる平均プロトロンビンエース阻害率では男子７４．２±５．６％、女子７８．６±４．８％であり平均７６．４±５．５％であった。正常人の血液抗凝固能は、以上の範囲の値をとることが明らかになった。
【００１８】
【実施例３】
血液凝固系が異常な血液を本法で測定することにより、血液抗凝固能の低下を検出し得るかどうかを病態モデル血漿を用いて検討した。プロテインＣ欠損症、欠乏症のモデル血漿としてプロテインＣ欠乏血漿、ワーファリン使用者、播種性凝固亢進症候群、肝臓機能低下患者、プロテインＣ、Ｓ複合的欠損症のモデル血漿としてクマリン系薬剤投与者血漿（クマジン血漿）、ルーパスアンチコアギュラント血症患者のモデル血漿としてルーパスアンチコアギュラント血漿、およびそのコントロール血漿（抗凝固能は正常）としてルーパス血漿（いずれもジョージキング社）を用いた。実施例１と同様に、これらの病態クエン酸加血漿１ｍｌに対し、５０μｌの割合で２００Ｕ／ｍｌのレプチラーゼ（ペンタファーム社）を加え、ｄＰＰＰを得た。この５０μｌのｄＰＰＰに５μｌの緩衝液あるいは緩衝液に溶解したトロンボモジュリンを、反応液中濃度が０．８、２、４、８、２４、８０単位／ｍｌになるように加えた。３７℃で１分間加温したのち緩衝液で７５００倍に希釈したウサギ脳ティッシュファクター、０．３３ｍｇ／ｍｌのリポソーム化したリン脂質および６６．７ｍＭの塩化カルシウムを含む緩衝液を７．５μｌ加え凝固反応を開始した。反応開始１０分後、反応液内に１２．５μｌの１０μＭのプロトロンビンを加え１分間反応させたのち、反応液を５μｌあるいはプロテインＣ欠乏血漿の場合は３μｌを採取し、２００μｌの１ｍＭのＳ−２３６６溶液に加え５あるいは１０分間反応させた。反応を２００μｌの５０％酢酸を加えることにより中断し、４０５ｎｍの吸光度を測定し、別途作成したトロンビンの検量線によりプロトロンビンエース活性に変換した。その結果、プロテインＣ欠乏血漿においてはプロトロンビンエース活性阻害が全く認められず、このプロテインＣ欠損血漿にプロテインＣを加えたところ正常値に戻ったことから、この反応がプロテインＣに依存していることが明らかとなった。またクマリン系薬剤投与血漿、ルーパス血漿およびルーパスアンチコアギュラント血漿に対する５０％阻害濃度はそれぞれ２３．４、１．５、１７．３単位／ｍｌであった。またトロンボモジュリン８単位／ｍｌによる平均プロトロンビンエース阻害率はそれぞれ３．６、７９．６、９．２％であった。このようにクマリン投与者血漿においては実施例２の正常人における値に比べ阻害率は低下しており、明らかな抗凝固能低下が認められた。また、ルーパス血漿においてはトロンボモジュリン−プロテインＣ／プロテインＳ系の抗凝固能が正常人と変わらないのに対し、ルーパスアンチコアギュラント血漿においては抗凝固能の著しい低下が認められた。以上の結果から本法が血液抗凝固能を正しく反映する包括的な測定であることが明らかとなった。
【００１９】
【発明の効果】
本発明の測定法によれば、複数の血液抗凝固因子が協同して作りだす包括的血液抗凝固能ならびに血液中のトロンボモジュリン活性を、生理的状況下で簡便に測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】正常人におけるトロンボモジュリンのプロトロンビンエース阻害効果
【図１】
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