(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＴＲＡＦ５遺伝子機能が欠損したマウスから得られるＴ細胞をＣＤ７０と抗ＣＤ３モノクローナル抗体で共刺激する系に被検物質を存在させ、Ｔ細胞の細胞増殖の程度を野生型のマウスの場合と比較評価することを特徴とするＴＲＡＦ５様メディエイター物質のスクリーニング方法。
【請求項２】
ＴＲＡＦ５遺伝子機能が欠損したマウスから得られるＢ細胞を抗ＣＤ４０モノクローナル抗体で刺激する系に被検物質を存在させ、Ｂ細胞の細胞増殖の程度を野生型のマウスの場合と比較評価することを特徴とするＴＲＡＦ５様メディエイター物質のスクリーニング方法。
【請求項３】
ＴＲＡＦ５遺伝子機能が欠損したマウスをＴ細胞依存性抗原で免疫する体液性応答系に被検物質を存在させ、免疫グロブリンの産生の程度を野生型のマウスの場合と比較評価することを特徴とするＴＲＡＦ５様メディエイター物質のスクリーニング方法。
【請求項４】
野生型のマウスが、ＴＲＡＦ５遺伝子機能が欠損したマウスと同腹の野生型のマウスであることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載のＴＲＡＦ５様メディエイター物質のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＴＲＡＦ５遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物や、これを用いたＴＲＡＦ５様メディエイター物質のスクリーニング方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
腫瘍壊死因子（以下「ＴＮＦ」という）スーパーファミリーに属するサイトカインは、種々の細胞の活性化、増殖、分化、細胞死（アポトーシス）、細胞増殖及び炎症を調節・生起することが知られている。また、これらのサイトカインは三量体を形成する蛋白質であることも知られている（Corr. Top. Microbiol. Immunol. 198, 175-218, 1995）、（Adv. Immunol. 61, 1-55, 1996）。上記ＴＮＦは、ＢＣＧをあらかじめ投与したマウスにリポ多糖（以下「ＬＰＳ」という）を注射したとき、血清中に出現する癌細胞傷害因子として知られており、また、悪液質を誘導するＴＮＦ−α（カケクチン）と、このＴＮＦ−αと同様の作用を示すＴＮＦ−β（リンフォトキシン：以下「ＬＴ」という）の２種類のＴＮＦが知られている。
【０００３】
上記ＴＮＦ−αは、活性化されたマクロファージ、未熟なマクロファージ、ナチュラルキラー細胞、クッパー細胞、Ｔ及びＢリンパ球、好中球、リンホカイン活性化キラー細胞、線維芽細胞、肥満細胞、アストロサイト及びケラチノサイト等から産生されることが知られており、また、細菌及びウイルス等の感染やサイトカイン刺激、癌細胞、マイトジェン及びホルボールエステル等の刺激によりＴＮＦ−αの産生が誘導されることが知られている。一方、ＬＴは活性化リンパ球から産生され、マイトジェンやホルボールエステル等の刺激によりＬＴの産生が誘導されていることが知られている。このＴＮＦ−αとＬＴは、共通のリガンドとしてＴＮＦレセプター（以下「ＴＮＦＲ」という）スーパーファミリーに結合する因子であることが知られている。
【０００４】
ＴＮＦＲスーパーファミリーは、各種細胞中において、細胞増殖、細胞分化及びアポトーシス（細胞死）を調節するシグナルを伝達することが知られており（Science 264, 667-668, 1994)、（Ann. Rev. Med. 45, 491-503, 1994）、細胞膜上に存在し、細胞膜を１回貫通する構造を持つレセプター蛋白質であり、これらのレセプターにＴＮＦ−αやＬＴが結合するとレセプターを凝集させ、細胞内にシグナルを導入すると考えられている（J. Biol. Chem. 267, 2119-2122, 1992）、（Cell 73, 431-445, 1993）。このスーパーファミリーに属するレセプターとして、Ｆａｓ、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、ＣＤ４０、ＣＤ３０、ＣＤ２７、ＬＴ−βＲ等が知られており、これらＴＮＦＲスーパーファミリーと会合する分子が、レセプターを介するシグナル伝達系に重要な役割を果たしていると考えられている。
【０００５】
ＴＮＦＲと会合する分子はＴＲＡＦ（ＴＮＦ receptor-associated factor）ファミリーと呼ばれ、ＴＮＦＲスーパーファミリーの下流のシグナル伝達分子として知られている（Genes Dev. 12, 2821-2830, 1998）。現在、ＴＲＡＦファミリーには６つの因子が知られており（Cell 78, 681-692, 1994）、（Science 267, 1494-1498, 1995）、（J. Biol. Chem. 269, 30069-30072, 1995）、（Cell80, 389-399, 1995）、（J. Biol. Chem. 270, 25715-25721, 1995）、（J. Biol. Chem. 271, 14661-14664, 1996）、（Nature 383, 443-446, 1996），（J. Biol. Chem. 271, 28745-28748, 1996），（Proc. Nattl. Acad. Sci. USA 93, 9437-9442, 1996）、それらはＴＲＡＦ１，ＴＲＡＦ２，ＴＲＡＦ３，ＴＲＡＦ４，ＴＲＡＦ５，ＴＲＡＦ６と呼ばれて、これらＴＲＡＦファミリーのヒトＴＲＡＦのアミノ酸配列やドメイン構造についても知られている（細胞工学、Vol.16,No.7, 1997）。
【０００６】
ＴＲＡＦ１以外のＴＲＡＦファミリーは、Ｎ末端よりＲＩＮＧフィンガー、Ｚｎフィンガー、コイルドコイル、ＴＲＡＦドメインから構成され、また、ＴＲＦＡ４を除く他のＴＲＡＦファミリーは、デスドメイン（death domain）を欠失したＴＮＦＲスーパーファミリーのいくつかと直接相互作用することが知られている（Genes Dev. 12, 2821-2830, 1998)。他方、ＴＮＦＲスーパーファミリーのＴＮＦＲ１やＦａｓのデスドメインに会合するアダプター分子として、ＴＲＡＤＤ（ＴＮＦＲ１-associated death domain），ＦＡＤＤ（Ｆａｓ-associating protein with a novel death domain）及びＲＩＰ（receptor interacting protein）があり、ＴＲＡＦ２は、これらアダプター分子を経由して、レセプターのデスドメインと間接的に相互作用することが知られている（Science 281, 1305-1308, 1998）。また、デスドメインを有するレセプターは、これらのアダプター分子を介してアポトーシスを誘導し、ＮＦ（nuclear factor）−κＢを活性化することも知られている（Science 281, 1305-1308, 1998）。
【０００７】
過剰発現したＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ５及びＴＲＡＦ６は、ＴＮＦＲレセプターを介してＮＦ−κＢを活性化し、ドミナント・ネガティブ抑制因子として作用するＺｎ結合ドメインを欠失したＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ５及びＴＲＡＦ６を過剰発現させると、これらのレセプターを介するＮＦ−κＢの活性化がブロックされる（J. Biol. Chem. 271, 14661-14664, 1996）、（Nature 383, 443-446, 1996）、（Science 269, 1424-1427, 1995）ことから、ＴＮＦＲスーパーファミリーによるＮＦ−κＢの活性化をメディエイトするシグナル伝達分子は、ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ５及びＴＲＡＦ６であることと考えられている。
【０００８】
ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ５及びＴＲＡＦ６の下流には、ＮＦ−κＢの活性化に共通のメディエイターであるＮＦ−κＢ誘導キナーゼ（ＮＩＫ）が存在すること（Nature 385, 540-544, 1997）、ＮＦ−κＢの活性化にはＮＦ−κＢのインヒビターであるＩκＢとよばれるタンパク質のＮ末端に存在するセリンのリン酸化が必要であり、かかるリン酸化を担うＩκＢキナーゼ（ＩＫＫ）が存在すること（Cell 91, 299-302, 1997）、ＩＫＫはＮＩＫやＭＡＰキナーゼキナーゼキナーゼ（ＭＡＰＫＫＫ）ファミリーに属するＭＡＰキナーゼ／ＥＲＫキナーゼキナーゼ（ＭＥＫＫ）１によって活性化されること（Proc. Nattl. Acad. Sci. USA 95,3537-3542, 1998）が知られており、これらのことからＴＮＦＲファミリーを介するＮＦ−κＢの活性化にはＴＲＡＦ−ＮＩＫ−ＩＫＫの経路が主に働いていると考えられている。
【０００９】
一方、ＭＥＫＫ１とアポトーシスシグナル調整キナーゼ（ＡＳＫ）１の２つのキナーゼによって介されるｃ−ＪｕｎプロテインＮ−末端キナーゼ（ＪＮＫ）／ストレス活性化プロテインキナーゼ（ＳＡＰＫ）の活性化においてもＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ５及びＴＲＡＦ６は関与している（Proc. Nattl. Acad. Sci. USA 94, 9792-9796, 1997）、（Molecular Cell 2, 389-395, 1998）。これらのことから、ＴＲＡＦのシグナル伝達経路の下流には、ＮＦ−κＢを活性化する経路とＪＮＫ／ＳＡＰＫを活性化する経路の２つの経路が存在すると考えられている。
【００１０】
また、ＴＲＡＦ２及びＴＲＡＦ５はともに、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＯＸ４０、リンホトキシンβレセプター（ＬＴ−βＲ）、ＨＶＥＭ及びＲＡＮＫに直接結合するが、ＴＲＡＦ２はＴＲＡＤＤとよばれるデスドメインを有するアダプター分子を介して、デスドメインを有するＴＮＦＲ６０、ＤＲ３、ＤＲ４、ＤＲ５と会合することが知られている（Science,281:1305-1308,1998）。
【００１１】
ＴＲＡＦ２遺伝子欠損マウス及びＴＲＡＦ２のドミナント・ネガティブフォーム（ＴＲＡＦ２−ＤＮ）を発現するトランスジェニックマウスが最近になって作製されたことから、ＴＲＡＦ２はＪＮＫ／ＳＡＰＫの活性化に必須であるが、ＴＮＦによるＮＦ−κＢの活性化には必須ではないことが報告されている（Immunity 7, 715-725, 1997）、（Immunity 7, 703-713, 1997）。また、ＴＲＡＦ２欠損マウス及びＴＲＡＦ３欠損マウスは早死にし（Immunity 7, 715-725, 1997）、（Immunity 5, 407-415, 1996）、ＴＲＡＦ３欠損マウスは、Ｔ依存性免疫応答が損なわれていることも報告されている（Immunity 5, 407-415, 1996）。
【００１２】
ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、ＬＴ−α、Ｆａｓ、ＣＤ４０及びＣＤ４０Ｌ（ＣＤ４０リガンド）等のノックアウトマウス は既に作製されており、また、ＴＲＡＦ２及びＴＲＡＦ３ノックアウトマウス においても上記のように既に作製され、個体レベルにて解析されている。しかし、ＴＲＡＦ５ノックアウトマウス は知られておらず、また、個体レベルにおけるＴＲＡＦ５の機能的な役割についても解析されていなかった。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、ＴＲＡＦ５ノックアウトマウス等のＴＲＡＦ５遺伝子が欠損した非ヒト動物や、これを用いたＴＲＡＦ５様メディエイター物質のスクリーニング方法を提供することにある。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究し、ＴＲＡＦ５ノックアウトマウスを作製し、このＴＲＡＦ５ノックアウトマウスが生後２４週間は明らかな異常を示さず、ＴＲＡＦ５がタンパク質レベルで欠損していることを確認し、また、このＴＲＡＦ５ノックアウトマウス と該ノックアウトマウス と同腹の野生型マウスを用いて、これらのＴ細胞をＣＤ７０と抗ＣＤ３モノクローナル抗体で共刺激する場合及びこれらのＢ細胞を抗ＣＤ４０モノクローナル抗体で刺激する場合、両者間にＴ細胞やＢ細胞の細胞増殖の程度が異なること、及び両者をＴ細胞依存性抗原で免疫すると体液性応答に差異が存在することを見い出し、本発明を完成するに至った。
【００１５】
すなわち本発明は、ＴＲＡＦ５遺伝子機能が欠損したマウスから得られるＴ細胞をＣＤ７０と抗ＣＤ３モノクローナル抗体で共刺激する系に被検物質を存在させ、Ｔ細胞の細胞増殖の程度を野生型のマウスの場合と比較評価することを特徴とするＴＲＡＦ５様メディエイター物質のスクリーニング方法や、ＴＲＡＦ５遺伝子機能が欠損したマウスから得られるＢ細胞を抗ＣＤ４０モノクローナル抗体で刺激する系に被検物質を存在させ、Ｂ細胞の細胞増殖の程度を野生型のマウスの場合と比較評価することを特徴とするＴＲＡＦ５様メディエイター物質のスクリーニング方法や、ＴＲＡＦ５遺伝子機能が欠損したマウスをＴ細胞依存性抗原で免疫する体液性応答系に被検物質を存在させ、免疫グロブリンの産生の程度を野生型のマウスの場合と比較評価することを特徴とするＴＲＡＦ５様メディエイター物質のスクリーニング方法や、野生型のマウスとしてＴＲＡＦ５遺伝子機能が欠損したマウスと同腹の野生型のマウスを用いる上記スクリーニング方法に関する。
【００１６】
【発明の実施の形態】
本発明におけるＴＲＡＦ５遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物とは、ＴＲＡＦ５をコードする非ヒト動物の内在性遺伝子が破壊・欠損・置換等により不活性化され、ＴＲＡＦ５を発現する機能を失った非ヒト動物をいい、また非ヒト動物とは、マウス、ラット等の齧歯目動物を具体的に挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
【００１７】
本発明における野生型の非ヒト動物とは、上記ＴＲＡＦ５遺伝子機能が欠損した非ヒト動物と同種の動物を意味し、同腹の動物が好ましい。そして、ＴＲＡＦ５遺伝子機能が欠損した非ヒト動物としては、メンデルの法則に従い出生してくるものが、ＴＲＡＦ５欠損型と同腹の野生型を得ることができ、これらを用いて正確な比較実験をすることができる点で好ましい。そして、ＴＲＡＦ５ノックアウトマウス を、野生型マウスとしては該ノックアウトマウス と同腹の野生型マウスを、それぞれ具体的に挙げることができる。以下、非ヒト動物がマウスの場合を例にとって説明する。
【００１８】
ＴＲＡＦ５ノックアウトマウス の作製法としては、ＴＲＡＦ５を発現する機能を失ったノックアウトマウス を作製することができるものであればどのような作製法でもよいが、例えば、ＴＲＡＦ５のＲＩＮＧフィンガードメインをコードするｃＤＮＡをプローブとして、マウスのゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、ゲノムＤＮＡのＴＲＡＦ５遺伝子を単離し、Ｃ末端のＲＩＮＧフィンガードメインの半分をコードするエキソン部分とその周囲のイントロンを、例えばｐＭＣ１ネオ遺伝子等マーカー遺伝子に置換してターゲットベクターを作製し、作製されたターゲットベクターをエレクトロポレーション法によってＥＳ細胞に導入し、相同的組換えを起こしたＥＳ細胞を選択し、このＥＳ細胞系を用いて生殖系列のキメラマウスを作製し、野生型マウスとを交配させることによって得られるヘテロ接合体マウス（Ｆ１：雑種第一代）同士を交配させることによって、メンデルの法則に従い産生するＴＲＡＦ５ノックアウトマウス と同腹の野生型マウスを作製することができる。
【００１９】
本発明のＴＲＡＦ５様メディエイター物質のスクリーニング方法におけるＴＲＡＦ５様メディエイター物質とは、ＴＮＦＲスーパーファミリーからＮＦ−κＢやＪＮＫ／ＳＡＰＫを活性化するシグナル伝達分子としてＴＲＡＦ５と同様な作用活性を有する物質を挙げることができるが、これらに限定されるものではなく、ＴＲＡＦ５様メディエイター物質は、ＴＲＡＦ５ノックアウトマウス から得られるＴ細胞をＣＤ７０と抗ＣＤ３モノクローナル抗体で共刺激する系に被検物質を存在させ、Ｔ細胞の細胞増殖の程度を同腹の野生型マウスの場合と比較評価することにより、ＴＲＡＦ５ノックアウトマウス から得られるＢ細胞を抗ＣＤ４０モノクローナル抗体で刺激する系に被検物質を存在させ、Ｂ細胞の細胞増殖の程度を同腹の野生型マウスの場合と比較評価することにより、あるいは、ＴＲＡＦ５ノックアウトマウス をＴ細胞依存性抗原で免疫する体液性応答系に被検物質を存在させ、体液性応答（免疫グロブリンの産生）の程度を同腹の野生型マウスの場合と比較評価することによりスクリーニングすることができる。
【００２０】
以下に、実施例を挙げてこの発明を更に具体的に説明するが、この発明の技術的範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１（ＴＲＡＦ５ノックアウトマウス の作製）
ＴＲＡＦ５のＲＩＮＧフィンガードメインをコードするマウスｃＤＮＡをプローブとして、１２９／Ｓｖ／Ｊ系統由来のマウスのゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによって、ＴＲＡＦ５遺伝子のゲノムＤＮＡのクローンを単離した。ＴＲＡＦ５のＲＩＮＧフィンガードメインをコードするｃＤＮＡは、エキソンI及びエキソンIIと命名した２つの独立したエキソンを含んでおり、そのターゲティング構築物（Ｔ５−ＫＯ）は、ｐＭＣ１ネオ遺伝子カセット（ストラトジーン社製）により、ＲＩＮＧフィンガードメインのＣ末端側の半分をコードするエキソンIIとその周囲のイントロンが含まれた０．７ｋｂのフラグメントを、内在性のＴＲＡＦ５遺伝子に対して逆方向に置換することによって作製した（図１参照）。
【００２１】
この線状化したＴ５−ＫＯを、エレクトロポレーション法によってＥＳ細胞（Ｒ１細胞）に導入した。文献（In Gene targeting: A practical approach, 33-61, 1993）記載の方法に準じて、ネオマイシン耐性ＥＳクローンをＧ４１８及びＧＡＮＣ(ガンシクロビア)によって選択し、サザンブロット法によって相同的組換え体を同定した。その同定された相同的組換え体から単離されたゲノムＤＮＡをＥｃｏＲ１又はＢａｍＨ１でダイジェストし、図１に示す３′フランキングプローブ（プローブＡ）及びネオマイシン耐性遺伝子に特異的なプローブ（プローブＢ）に対して、サザンブロット法によりハイブリダイズして、１．２ｋｂのフラグメントからなるｐＭＣ１ネオ遺伝子カセットを含むターゲットされた対立遺伝子の存在を確認した。
【００２２】
相同的組換えの起こったＥＳクローンを用い、文献（Proc. Nattl. Acad. Sci. USA 90, 8424-8, 1993）記載の凝集方法に準じて、生殖系列のキメラマウスを作製した。作製されたオスのキメラマウスを野生型のＣ５７ＢＬ／６Ｊのメスマウスと交配させることによりヘテロ接合体マウス（Ｆ１：雑種第一代）を作出し、次いで、ホモ接合体マウスを得るために、このヘテロ接合体マウスをインタークロスさせ、メンデルの法則に従い産生（＋／＋：＋／−：−／−＝１１８：２０３：１２１）したＴＲＡＦ５欠損マウスを作製した。このようにして作製された本発明のＴＲＡＦ５ノックアウトマウス は健康に育ち、生まれてから２４週間は明らかに異常を示さなかった。また、リンパ節やバイエル板の発達上の欠陥もなかった。
【００２３】
（ＴＲＡＦ５ノックアウトマウス におけるＴＲＡＦ５発現の確認）次に、作製したマウスの組織内におけるＴＲＡＦ５蛋白質の発現について、以下の方法により確認した。同腹子から出生された野生型マウス（ｔｒａｆ５+/+）、キメラマウス（ｔｒａｆ５+/-）及び本発明のＴＲＡＦ５ノックアウトマウス （ｔｒａｆ５-/-）から得られた全肺細胞を、溶解緩衝液〔最終濃度で２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．５％のトリトン−Ｘ、２ｍＭのＥＤＴＡ、１μｇ／ｍｌのアプロチニン、１μｇ／ｍｌのロイペプチン、１ｍＭのＰＭＳＦ（フェニルメタンスルホニルフルオリド）、１μｇ／ｍｌのペプスタチン〕中で均質化することにより、それぞれの溶解物を調製した。
【００２４】
グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）又はヒトＬＴ−βＲの細胞質領域を含む融合蛋白質ＧＳＴ−ＬＴ−βＲをあらかじめ吸着させたグルタチオンセファロースゲル（ファルマシア製）に、上記全肺細胞溶解物を通すことによって、ＴＲＡＦ２やＴＲＡＦ５を親和的に結合させ、上記溶解緩衝液で３回洗浄した後、結合したＴＲＡＦ２及びＴＲＡＦ５を溶出した。この溶出物を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により分画し、ＰＶＤＦ膜（ミリポア社製）にブロットした。ＴＲＡＦ５のＮ末端ペプチド（ＴＲＡＦ５−Ｎ）、ＴＲＡＦ５のＣ末端ペプチド（ＴＲＡＦ５−Ｃ）に対するポリクローナル抗体（Santa Cruz Biotechnology Inc.社製）及びコントロールとしてD. V. Goeddel博士から提供されたＴＲＡＦ２のＮ末端ペプチドに対するポリクローナル抗体を用いて、ウェスタンブロット法で調べ、高度の化学ルミネッセンス装置（アマシャム社製）をプロトコルの指示に従い用いて、作製したマウスの組織内におけるＴＲＡＦ５蛋白質の発現を確認した。結果を図２に示す。図２R>２中のＰは、コントロールとしてのＴＲＡＦ５発現ベクターのトランスフェクタントにおける結果を示している。これらの結果から、本発明のＴＲＡＦ５ノックアウトマウス がＴＲＡＦ５蛋白質を発現しないことや、また、ＴＲＡＦ５遺伝子の欠損がＴＲＡＦ２の発現に影響しないことが明らかとなった。
【００２５】
実施例２（ＴＲＡＦ５ノックアウトマウス のＴ細胞内でのＣＤ２７を介する共刺激の障害）
文献（Int. Immunol. 10, 517-526, 1998）記載のマウスの肥満細胞腫Ｐ８１５、マウスのＣＤ７０をトランスフェクションされたＰ８１５（ＣＤ７０−Ｐ８１５）、及びマウスのＣＤ８０をトランスフェクションされたＰ１８５（ＣＤ８０−Ｐ８１５）を用いた。抗ＣＤ３モノクローナル抗体（１μｇ／ｍｌ）の存在下で、放射線が照射されたこれらＰ８１５、ＣＤ７０−Ｐ８１５又はＣＤ８０−Ｐ８１５（２×１０4／well）と、野生型マウス又はＴＲＡＦ５ノックアウトマウス の胸腺細胞（２×１０5／well）とを、１０％のＦＣＳ及び５０μＭの２−メルカプトエタノールをＲＰＭＩ１６４０に追加した９６ウエルラウンドボトルマイクロプレートで４０時間培養し、その後８時間０．５μＣｉ／wellの［3Ｈ］チミジン（アマシャム社製）で培養物を刺激した。細胞をガラスフィルターに採取して、マイクロβカウンター（Micro beta Plus; Wallac社製）で放射能を測定した。
【００２６】
結果を図３に示す。ＣＤ８０−Ｐ８１５と抗ＣＤ３モノクローナル抗体で共刺激した場合、野生型マウス及びＴＲＡＦ５ノックアウトマウス の胸腺細胞は共によく増殖したが両者に有意差はなかった。一方、ＣＤ７０−Ｐ８１５と抗ＣＤ３モノクローナル抗体で共刺激した場合は、野生型マウスの胸腺細胞（黒）に比べてＴＲＡＦ５ノックアウトマウス の胸腺細胞（斜線）の方が一貫して低い応答を示した。これらの結果から、ＣＤ７０をリガンドとするＣＤ２７を介する共刺激は、ＴＲＡＦ５ノックアウトマウス の胸腺細胞において特異的に障害されることが確認できた。したがって、ＴＲＡＦ５ノックアウトマウス から得られるＴ細胞をＣＤ７０と抗ＣＤ３モノクローナル抗体で共刺激する系に被検物質を存在させ、Ｔ細胞の細胞増殖の程度を野生型マウスの場合と比較評価することによりＴＲＡＦ５様メディエイター物質をスクリーニングすることができる。
【００２７】
（参考例１）ＣＤ２７がメディエイトするＮＦ−κＢ及びＪＮＫ／ＳＡＰＫの活性化が、ＴＲＡＦ５ノックアウトマウス の胸腺細胞で障害されるかどうかを以下の方法により調べた。３０分間氷上で野生型マウス又はＴＲＡＦ５ノックアウトマウス の胸腺細胞（５×１０6）をＣＤ２７のアゴニストである抗ＣＤ２７モノクローナル抗体（１０μｇ／ｍｌ；ファーミンジェン社製）と共にインキュベートすることによって刺激し、それらの刺激した胸腺細胞を、あらかじめ氷で冷やしたリン酸緩衝生理食塩水で洗浄した。その後、洗浄した胸腺細胞をあらかじめ暖めておいたヤギ抗ハムスター免疫グロブリン（１００μｇ／ｍｌ；カッペル社製）とを用い、３７℃で１５分間クロスリンクすることで凝集した。これらの凝集した細胞から抽出した核（５μｇ）を６％のゲルにのせ、電気泳動移動度シフト分析を行い、Fuji BAS 2000イメージアナライザーによりバンドを確認することで、ＮＦ−κＢの活性化を調べたところ、野生型マウスとＴＲＡＦ５ノックアウトマウス の両者間に有意な差は認められなかった。
【００２８】
また、１ｍＭのＮａＦと０．１ｍＭのＮａ3ＶＯ4とを含む溶解液で上記の凝集した細胞を溶解した。その溶解液をウサギのポリクローナル抗体である抗ＪＮＫ抗体（Santa Curz社製）とインキュベートして、プロテインＧ−セファロースビーズ（ファルマシア社製）で免疫沈降させた。京都大学の西田博士から提供されたＧＳＴ−ｃ−Ｊｕｎ（１−７９）を基質として、これらの免疫沈降物のインビトロでキナーゼ分析を行い、Laemmliサンプル緩衝液により反応を停止させて、リン酸化された蛋白質を得た。このリン酸化された蛋白質を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により蛋白質を分離させ、Fuji BAS 2000イメージアナライザーで分析し、バンドを同定することで、ＪＮＫ／ＳＡＰＫの活性化を調べたところ、野生型マウスとＴＲＡＦ５ノックアウトマウス の両者間に有意な差は認められなかった。
【００２９】
実施例３（Ｂ細胞表面分子のＣＤ４０仲介刺激の障害）
文献（Int. Immunol. 10, 517-526, 1998）記載の方法によって、脾細胞から調製した小型休止期Ｂ細胞（１×１０5細胞）を１０μｇ／ｍｌの抗ＣＤ４０モノクローナル抗体（ＨＭ４０−３；ファーミンジェン社製）の存在又は不存在下に、１０％のＦＣＳ及び５０μＭの２−メルカプトエタノールを加えたＲＰＭＩ１６４０の９６ウェルフラットボトル組織培養プレート（コーニング社製）内で４８時間培養することで小型休止期Ｂ細胞を刺激した。次いで、フルオレセインイソシアネート（ＦＩＴＣ）又はホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）を用いて蛍光標識した抗ＣＤ２３モノクローナル抗体、抗ＣＤ５４モノクローナル抗体、抗ＣＤ８０モノクローナル抗体、抗ＣＤ８６モノクローナル抗体又は抗Ｆａｓモノクローナル抗体（PharMingen社製）のそれぞれを、刺激された小型休止期Ｂ細胞の受容体に結合させ、フローサイトメトリーによって受容体の発現を分析した。また、対照として、抗ＣＤ４０モノクローナル抗体に代えて５μｇ／ｍｌのリポ多糖（ＬＰＳ；シグマ社製）を用いた。
【００３０】
結果を図４に示す。これらの結果から、抗ＣＤ４０モノクローナル抗体の存在下、野生型マウス（図４中の太い実線）においては、Ｂ細胞におけるレセプターであるＣＤ２３、ＣＤ５４、ＣＤ８０、ＣＤ８６及びＦａｓの発現を向上させたが、ＴＲＡＦ５ノックアウトマウス （図４中の細い実線）においては、これらレセプターの発現は、野生型マウスのＢ細胞と比較して、明らかに減少していた。一方、ＬＰＳの存在下では、ＴＲＡＦ５ノックアウトマウス のＢ細胞における上記各レセプターの発現は、野生型マウスの結果と同様であった。なお、抗ＣＤ４０モノクローナル抗体やＬＰＳの不存在下における結果は、図４中の細い点線で示されている。
【００３１】
次に、様々な刺激によるＢ細胞の細胞増殖応答について調べた。１０μｇ／ｍｌの抗ＣＤ４０モノクローナル抗体、１０μｇ／ｍｌのアフィニティー精製のヤギ抗マウス免疫グロブリンＭ（ジャクソンイムノリサーチラボラトリー社製）、２０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−４（Ｒ＆Ｄシステム社製）、又は１０μｇ／ｍｌの抗ＣＤ４０モノクローナル抗体と１０μｇ／ｍｌのヤギの抗免疫グロブリンモノクローナル抗体をそれぞれ用いてＢ細胞を刺激した。結果を図５に示す。抗ＣＤ４０モノクローナル抗体又は免疫グロブリンＭを加えた抗ＣＤ４０モノクローナル抗体によるレセプターの刺激では、ＴＲＡＦ５ノックアウトマウス のＢ細胞増殖的応答（斜線）は、野生型マウスのＢ細胞増殖的応答（黒）と比較して、明らかに減少した。一方、免疫グロブリンＭ又はＩＬ−４に対するＴＲＡＦ５ノックアウトマウス のＢ細胞増殖的応答は、野生型マウスのＢ細胞増殖的応答に匹敵した。
【００３２】
以上のことから、ＴＲＡＦ５ノックアウトマウス では、ＣＤ４０を介するＢ細胞の活性化において特異的な欠損を有することがわかった。したがって、ＴＲＡＦ５ノックアウトマウス から得られるＢ細胞を抗ＣＤ４０モノクローナル抗体で刺激する系に被検物質を存在させ、Ｂ細胞の細胞増殖の程度を同腹の野生型マウスの場合と比較評価することことにより、ＴＲＡＦ５様メディエイター物質をスクリーニングすることができる。
【００３３】
（参考例２）ＣＤ４０を介する活性化のメカニズムにおいて、ＴＲＡＦ２−ＤＮのトランスジェニックマウスでは、ＮＦ−κＢではなくＪＮＫ／ＳＡＰＫの活性化が、このマウスのＢ細胞内でブロックされたことから（Immunity 7, 703-713, 1997）、ＴＲＡＦ５ノックアウトマウスのＢ細胞においても同様な結果が得られるかどうかを以下の方法により調べた。上記実施例３と同様に、野生型マウス及びＴＲＡＦ５ノックアウトマウス の脾細胞から調製されたＢ細胞（５×１０6）を、抗ＣＤ４０モノクローナル抗体（１０μｇ／ｍｌ）と共に３７℃で１５分間、又はＬＰＳ（５μｇ／ｍｌ）と共に３７℃で３０分間それぞれ刺激した。その後、それらのＢ細胞から抽出された核（１０μｇ）を６％のゲルにのせ、電気泳動移動度シフト分析を行い、Fuji BAS 2000イメージアナライザーによりバンドを確認することで、ＮＦ−κＢの活性化を調べた。
【００３４】
また、上記の調製されたＢ細胞（５×１０6）を、抗ＣＤ４０モノクローナル抗体（１０μｇ／ｍｌ）と共に３７℃で１５分間刺激し、刺激したＢ細胞を１ｍＭのＮａＦと０．１ｍＭのＮａ3ＶＯ4とを含む溶解液で溶解した。その溶解液を抗ＪＮＫ抗体といっしょにインキュベートして、プロテインＧ−セファロースビーズで免疫沈降させた。ＧＳＴ−ｃ−Ｊｕｎ（１−７９）を基質として、インビトロでこれらの免疫沈降物のキナーゼ分析を行い、Laemmliサンプル緩衝液により反応を停止させて、リン酸化された蛋白質を得た。このリン酸化された蛋白質を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により蛋白質を分離させ、Fuji BAS 2000イメージアナライザーで分析し、バンドを同定することで、ＪＮＫ／ＳＡＰＫの活性化を調べた。
【００３５】
これらの結果からは、野生型マウスとＴＲＡＦ５ノックアウトマウスとの間に有意な差を見い出すことができず、ＴＲＡＦ５ノックアウトマウスのＢ細胞では、ＮＦ−κＢの活性化又はＪＮＫ／ＳＡＰＫの活性化の障害はないと考えられる。
【００３６】
実施例４（ＴＲＡＦ５ノックアウトマウス における体液性応答）
レセプターＣＤ４０とそのリガンドであるＣＤ４０Ｌとの相互作用は、クラススイッチング及び胚中心形成に対して、Ｔ細胞依存性抗原に対する体液性応答に重要な役割を果たすことが知られており（Immunity 1, 167-178, 423-431,1994)、また前述のように、ＴＲＡＦ５ノックアウトマウスのＢ細胞におけるＣＤ４０を介する活性化の欠失がインビトロにおいて観察されたことから、ＴＲＡＦ５ノックアウトマウス において体液性応答が障害されるかどうかを、水酸化アルミニウムゲルに吸着させた４−ヒドロキシ−３−ニトロフェノール−アセチール（ＮＰ）−ハプテン担体ニワトリγグロブリン（モル率２２：１、ＮＰ22−ＣＧ）を用いて調べた。
【００３７】
生まれてから８週から１２週間目の野生型マウス及びＴＲＡＦ５ノックアウトマウスの腹腔内に、５０μｇ（高投与プロトコル）又は５μｇ（低投与プロトコル）の水酸化アルミニウムゲルに吸着させた上記ＮＰ22−ＣＧを注入することによって一次免疫化し、一次免疫後２１日の各マウスに対して、新たに５μｇのＮＰ22−ＣＧを注入して二次免疫化を行った。一次免疫をした後、７日目、１４日目、２１日目及び２８日目に各マウスの血清を採取し、これらの血清中に含まれるＮＰに特異的な全ＩｇＭ及び全ＩｇＧ1並びに高アフィニティーＩｇＧ1をＥＬＩＳＡにより測定した。すなわち、高密度ＮＰ−ハプテン担体ウシ血清アルブミン（ＮＰ22−ＢＳＡ）又は低密度ＮＰ−ハプテン担体ウシ血清アルブミン（ＮＰ2−ＢＳＡ）に覆われたＥＬＩＳＡプレート（Immulon社製）中で一次抗体反応をさせ、これに酵素標識二次抗体であるビオチン結合アイソタイプ特異的抗体（ファーミンジェン社製）を反応させ、次いでアジビン−ビオチン結合ペルオキシダーゼ複合体（ベクター社製）を二次抗体に結合させ、この複合体のペルオキシダーゼ活性をＤＡＢ（３，３´−ジアミノベンジジン）反応で染色した。
【００３８】
上記ＥＬＩＳＡの結果に基づき、免疫グロブリンＧ1に対してはＮＰに特異的な抗Ｃ６モノクローナル抗体を標準として、ＩｇＭに対しては標準免疫血清を標準として、ＮＰに特異的な抗体のユニット数を計算により求めた。また、低アフィニティー及び高アフィニティーＩｇＧ1抗体の合計のユニット数に対する高アフィニティーＩｇＧ1抗体のユニット数の割合を求めた。結果を図６に示す。なお、図６のそれぞれの図に示されている「−」は、各実験において測定された４匹のマウスの平均値を算出し示したものである。
【００３９】
これらのことから、高投与プロトコルにおける全ＩｇＭ及び全ＩｇＧ1の滴定量で顕著な差異は、野生型マウス及びＴＲＡＦ５ノックアウトマウス の間で観察されなかった。また、高アフィニティーＩｇＧ1の滴定量でも、顕著な差異は両者間で観察されなかった。しかし、低投与プロトコルにおいて、一次免疫した後のＴＲＡＦ５ノックアウトマウス （○）は、野生型マウス（●）よりも多くの抗ＮＰＩｇＭを産生した（図６Ａ参照）。また、抗ＮＰＩｇＧ1のトータル量は、ＴＲＡＦ５ノックアウトマウス では、野生型マウスに比べ減少したが（図６Ｂ参照）、高アフィニティー抗ＮＰＩｇＧ1抗体においては、ＴＲＡＦ５ノックアウトマウス は野生型マウスよりも、その産生量が一貫して低く、実質的に低いアフィニティーの割合を示した（図６Ｃ及び図６Ｄ参照）。一方、Ｔ細胞非依存抗原であるＮＰ−Ficoll（フィコール）に対する体液性応答は、ＴＲＡＦ５ノックアウトマウス における応答と野生型マウスにおける応答を比べるとほぼ匹敵する結果が得られていることから、ＴＲＡＦ５ノックアウトマウス は、Ｔ細胞依存性抗原に対する体液性応答において、欠損を示すことがわかった。したがって、ＴＲＡＦ５ノックアウトマウス をＴ細胞依存性抗原で免疫する体液性応答系に被検物質を存在させ、体液性応答の程度を同腹の野生型マウスの場合と比較評価することにより、ＴＲＡＦ５様メディエイター物質をスクリーニングすることができる。
【００４０】
【発明の効果】
本発明のＴＲＡＦ５ノックアウトマウス は、Ｔ細胞及びＢ細胞に対する細胞増殖的不応答性であり、またＴ細胞依存抗原に対する体液性応答において欠損があることから、本発明のＴＲＡＦ５ノックアウトマウス を用いることによって、被検物質のＣＤ２７抗原活性、ＣＤ４０抗原活性及びＴ細胞依存抗原に対する体液性応答を評価することが可能となり、ＴＲＡＦ５分子機能の更なる解明とＴＲＡＦ５に関与するレセプターを介するシグナル伝達経路の更なる解明に有用であるばかりでなく、抗原及び抗体等に起因する疾病に対する薬剤の開発に有用な情報を得ることができる。また、長期間生存が可能な本発明のＴＲＡＦ５ノックアウトマウス と野生型マウスを用いることによりＴＲＡＦ５様メディエイター物質をスクリーニングすることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のＴＲＡＦ５ノックアウトマウス の遺伝子地図を示す図である。
【図２】本発明のＴＲＡＦ５ノックアウトマウス がＴＲＡＦ５を発現しないことを示す図である。
【図３】本発明のＴＲＡＦ５ノックアウトマウス と野生型マウスにおけるＣＤ２７を介するＴ細胞の細胞増殖に関する結果を示す図である。
【図４】本発明のＴＲＡＦ５ノックアウトマウス と野生型マウスにおけるＣＤ４０を介するＢ細胞の細胞増殖に関する結果を示す図である。
【図５】本発明のＴＲＡＦ５ノックアウトマウス と野生型マウスにおけるＣＤ４０を介するＢ細胞の細胞増殖に関する結果を示す図である。
【図６】本発明のＴＲＡＦ５ノックアウトマウス における特異的体液性応答の結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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