(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗ＩｇＥ抗体の治療的有効量を含む、住血吸虫(Schistosoma)感染症患者を治療するための医薬組成物。
【請求項２】
抗ＩｇＥ抗体の量が治療経過中の患者のＩｇＥレベルを検出されないようにするのに有効な量である請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
抗ＩｇＥ抗体がＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、またはＩｇＭクラスである請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
抗ＩｇＥ抗体がヒト化されている請求項１〜３のいずれかに記載の組成物。
【請求項５】
抗ＩｇＥ抗体の治療的有効量を含む、住血吸虫感染症患者における成虫数または卵数を減少させるための＿医薬組成物。
【請求項６】
抗ＩｇＥ抗体の量が治療経過中の患者のＩｇＥレベルを検出されないようにするのに有効な量である請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
抗ＩｇＥ抗体がＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、またはＩｇＭクラスである請求項５または６に記載の組成物。
【請求項８】
抗ＩｇＥ抗体がヒト化されている請求項５〜７のいずれかに記載の組成物。
【請求項９】
抗ＩｇＥ抗体の治療的有効量を含む、住血吸虫感染症患者の肝脾腫大を減少させるための＿医薬組成物。
【請求項１０】
抗ＩｇＥ抗体の量が治療経過中の患者のＩｇＥレベルを検出されないようにするのに有効な量である請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
抗ＩｇＥ抗体がＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、またはＩｇＭクラスである請求項９または１０に記載の組成物。
【請求項１２】
抗ＩｇＥ抗体がヒト化されている請求項９〜１１のいずれかに記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
発明の分野
本発明は寄生虫感染症を予防または治療する方法に関する。詳細には、本発明に従って、ＩｇＥアンタゴニストを寄生虫感染症患者や寄生虫感染症のリスクを有する患者に投与することによって、感染経過中の患者のＩｇＥレベルを除去するか、検出されないようにする。
背景と関連技術分野の説明
ＩｇＥ抗体産生の上昇はSchistosoma mansoniを含む寄生性ぜん虫による感染症の顕緒な特徴である（Finkelman,F.D.らの、Immun.Today 12:462-466(1991)）。通常、このＩｇＥ反応は、後生動物の寄生虫に対する宿主の防御における最も重要な構成要素であると考えられる（Capron,A.らの、Nature 253:474-475(1975)、Capron,A.らの、Prog.Allergy 31:234-267(1982)、およびJoseph,M.らのNature 303:810-812(1983)）。この仮説は多くの研究によって裏づけられている：Ｂ細胞が枯渇すると免疫の発達が妨げられる（Bazin,H.らの、J.Immun.124:2373-2377(1980)）、ＩｇＥ抗体によって有効な免疫を養子移入することができる（Capron,A.らの、Ann.Rev.Immun.3:455-476(1985)およびVignali,D.A.A.らの、Immun.Today 10:410-416(1989)）、およびＩｇＥは好塩基球、マクロファージ、および血小板介在細胞毒性を介する抵抗性に直接に介在し得る（Joseph,M.らの、Nature 303:810-812(1983);Capron,M.らの、J.Immun.132:462-468(1984)；およびAuriault,C.らの、Eur.J.Immun.14:132-138(1984)）。さらに、最近の疫学研究報告は、住血吸虫特異的ＩｇＥ抗体レベルが高いことと再感染に対する抵抗性との間に相関があることを明らかにしている（Hagan,P.らの、Nature 349:243-2445(1991);Rihet,P.らの、Eur.J.Immun.21:2679-2686(1991);およびDunne,D.W.らの、Eur.J.Immun.22:1483-1494(1992)）。寄生虫免疫におけるＩｇＥの役割を検討するために行われた研究のほとんどは、遺伝的突然変異の結果としてか、多能性リンホカインＩＬ−４を除去することによってＩｇＥが欠損している系を用いてきた。
驚くべきことに、本発明者らは、ＩｇＥアンタゴニストを用いてＩｇＥを除去することによって（ＥＬＩＳＡアッセイでＩｇＥが検出されないレベルまで低下することによって測定）、ネズミの住血吸虫症における寄生虫負荷が減少し、卵産生が減少し、肝脾腫大が減少することをみいだした。
受容体、抗IgE抗体、結合因子、またはそれらの断片の形のＩｇＥアンタゴニストは当該分野で開示されている。米国特許第４９６２０３５号は肥満細胞のＩｇＥ受容体のα−サブユニットまたはそのＩｇＥ結合断片をコードするＤＮＡを開示している。Ｈｏｏｋら（Federation Proceedings Vol.40,No.3,Abstract#4177）は、１タイプが抗イデオタイプであり、２つ目のタイプが共通ＩｇＥ決定基と結合し、３つ目のタイプがＩｇＥが好塩基球表面上にある場合に隠れた決定基に対するものである、モノクローナル抗体を開示している。
米国特許第４９４０７８２号は、ＩｇＥが肥満細胞と結合していないときにＩｇＥと反応することによってＩｇＥが肥満細胞と結合するのを阻害し、ＩｇＥがＢ細胞のＦｃＥ受容体と結合しているときはＩｇＥと反応するが、ＩｇＥが肥満細胞のＦｃＥ受容体と結合しているときはＩｇＥと結合せず、ＩｇＥのＢ細胞受容体への結合もブロックしないモノクローナル抗体を開示している。
米国特許第４９４６７８８号は、精製ＩｇＥ結合因子とその断片、およびＩｇＥ結合因子ならびにリンパ球の細胞性ＩｇＥ受容体と反応するモノクローナル抗体およびその誘導体を開示している。
米国特許第５０９１３１３号は、免疫グロブリンをＢ細胞膜に固定するドメインの細胞外断片と関連する抗原決定基を開示している。認識された抗原決定基はＩｇＥ保有Ｂ細胞上に存在するが、好塩基球上やＩｇＥの分泌可溶性形中には存在しない。米国特許第５２５２４６７号はそのような抗原決定基に特異的な抗体の生産法を開示している。米国特許第５２３１０２６号はそのような抗原決定基に特異的なネズミ−ヒト抗体をコードするＤＮＡを開示している。
ＷＯ８９／０６１３８は、ＩｇＥ保有Ｂ細胞上に存在するがＩｇＥ保有細胞上には存在しないＩｇＥの独特な抗原決定基を開示している。これらの抗原決定基のあるクラスは、ＩｇＥのＦｃεＲ結合部位またはその近くにあるが、他のクラスは、ＩｇＥをβ細胞膜に固定するε鎖のドメインの細胞外断片と関連している。
米国特許第４７１４７５９号は、アレルギーを治療するための、毒素と結合した抗体または抗体断片の形のイムノトキシンを開示している。
Prestaら（J.Immunol.151:2623-2632(1993)）は、遊離ＩｇＥのＦｃεＲＩとの結合を防げるがＦｃεＲＩ結合ＩｇＥとは結合しないヒト化抗ＩｇＥを開示している。同時係属中のＷＯ９３／０４１７３は高親和性ＩｇＥ受容体および低親和性ＩｇＥ受容体と別々に結合するポリペプチドを開示している。
Flores-Romoら（Science 261:1038-1041(1993)）は、in vivoの抗原特異的ＩｇＥ反応がＣＤ２３に対する抗体によって阻害されることを開示している。
すなわち、本発明の目的は、患者にＩｇＥアンタゴニストを投与することによって寄生虫感染症を予防または治療する方法を提供することである。
発明の要約
本発明の目的は、患者にＩｇＥアンタゴニストの治療的有効量を投与することを特徴とする寄生虫感染患者を治療するための方法である。
本発明の別の目的は、患者にＩｇＥアンタゴニストの治療的有効量を投与することを特徴とする寄生虫感染患者における卵または成虫の数を減少させるための方法である。
本発明の別の目的は、患者にＩｇＥアンタゴニストの治療的有効量を投与することを特徴とする寄生虫感染患者の肝脾腫大を減少させるための方法である。
図の簡単な説明
図１は血清ＩｇＥレベルに対する抗ＩｇＥモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の効果を示すグラフである。外来ウイルスがいないことが業者によって示されたＢＡＬＢ／ｃマウスを、隔離室中、マイクロアイソレーターキャップ下に収容した。施設に馴致したら、６〜８週齢のマウスを、１００μｇの抗ＩｇＥ ｍＡｂ（Ｒ３５−９２、ラットＩｇＧ１、Pharmingen）またはアイソタイプをマッチさせた対照抗体（ラットＩｇＧ1K、Pharmingen）を静脈内（ｉｖ）投与した。翌日、感染Biomphalaria glabrata巻貝から流出したS.mansoniのセルカリア９０匹で体表をばく露することによってマウスを感染させた。１週間間隔でマウスから採血し、次いでin vivoで、１、２、３、４、ならびに５週にｍＡｂ２０μｇで、また６ならびに７週にｍＡｂ１００μｇ（抗ＩｇＥ ｍＡｂの総量４００μｇ）かまたはｍＡｂ２０μｇ（抗ＩｇＥ ｍＡｂの総量２４０μｇ）で再処理した。総血清ＩｇＥ量はＥＬＩＳＡで測定した。ポリクローナルウサギ抗マウスＩｇＥ（Genentech,Inc.）を、０．０５Ｍ Ｎａ2ＣＯ3緩衝液（ｐＨ９．６）で２μｇ／ｍＬに希釈し、平底マイクロタイタープレートをコートした。抗マウスＩｇＥに結合しているネズミＩｇＥの量はビオチニル化ＩｇＥ受容体Ｉ−ＩｇＧイムノアドヘシンを用いて測定された（Haak-Frendscho,M.らの、J.Immun.151:351-358(1993)）。アッセイはストレプトアビジンン結合西洋ワサビパーオキシダーゼ（Zymed）を用いて行った。
図２Ａおよび２Ｂは、脾臓重量（２Ａ）および肝臓重量（２Ｂ）に対する抗ＩｇＥの効果を示すグラフである。細胞浸潤と炎症の大まかな目安として、脾臓および肝臓重量を、図１の説明の記載に従ってセルカリアに感染させた後８週で測定した。結果は平均（ｎ＝７〜１２／群）湿重量±標準偏差で表している。
図３（Ａ−Ｄ）は、感染マウスから得た肝臓と脾臓の組織病変を示す写真である。高用量の抗ＩｇＥまたは対照ＩｇＧで処理したマウスの脾臓と肝臓を、図１の説明の記載に従ってセルカリアに感染させた後８週で取り出し、組織病理所見の評価を行った。臓器を１０％緩衝ホルマリンで固定し、パラフィン包埋し、薄切し、次いでヘマトキシリンとエオジンで染色した。対照マウスの肝臓は、主にマクロファージと好中球からなる肉芽腫の多数の大きな集合病巣を含んでいた（Ａ）。抗ＩｇＥ ｍＡｂ処理動物の肝臓では卵の数がより少ないため肉芽腫も少なかった（Ｂ）。組織学的特徴、特にマクロファージと多数の好塩基球の存在は両群で同様であった。しかし、抗ＩｇＥ処理群の肉芽腫（Ｄ）は対照マウスのもの（Ｃ）より線維形成が少ないようであった。
図４は血清ＩＬ−４に対する抗ＩｇＥの影響を示すグラフである。血清ＩＬ−４は０．０５Ｍ Ｎａ2ＣＯ3（ｐＨ９．６）中の１μｇ／ｍＬの抗マウスＩＬ−４ ｍＡｂ（ＢＶＤ４−１Ｄ１１、ラットＩｇＧ2b、Pharmingen）をコートした平底マイクロタイタープレートを用いるＥＬＩＳＡによって測定した。ＩＬ−４はビオチン結合抗マウスＩＬ−４（ＢＶＤ６−２４Ｇ２、ラットＩｇＧ1、Pharmingen）を用いて検出し、西洋ワサビパーオキシダーゼ−ストレプトアビジン（Zymed）を用いて処理する。
図５は、Ｂ細胞上のＣＤ２３発現を示すグラフである。S.mansoniに感染させて８週後に、抗ＩｇＥ ｍＡｂおよび対照抗体処理マウスから脾臓を取り出した。細胞をすりガラススライドで分散させ、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と０．０１％アジ化ナトリウムを含むリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）で洗浄し、次いでＣＤ４５ＲおよびＣＤ２３を認識するモノクローナル抗体（それぞれ、ＲＡ３−６Ｂ２、Ｒｅｄ６ １３−結合ラットＩｇＧ2a（GIBCO）およびＢ３Ｂ４、ＦＩＴＣ−結合ラットＩｇＧ2a（Pharmingen））の適切な希釈物で染色した。細胞の分析は、ＦＡＣＳｃａｎを用い、リンパ球のポピュレーションにゲートをかけて行った。非感染マウスの脾細胞を、ＣＤ２３（ａ）のＢ細胞における発現の参考として用いた。対照抗体で処理したマウスの細胞では住血吸虫(Schistosoma)感染に応じてＣＤ２３（ｂ）発現の顕著なアップレギュレーションを示した。これに対して、脾細胞におけるＣＤ２３（ｃ）の発現は抗ＩｇＥ ｍＡｂ処理によって減少した。
好ましい態様の詳細な説明
Ａ．定義
本明細書中で用いている用語「ＩｇＥアンタゴニスト」は、ＩｇＥの生物活性を阻害する物質を表す。そのようなアンタゴニストには抗ＩｇＥ抗体、ＩｇＥ受容体、抗ＩｇＥ受容体抗体、ＩｇＥ抗体の変異体、ＩｇＥ受容体のリガンド、およびそれらの断片が含まれるが、これらに限定されるものではない。抗体アンタゴニストはＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、またはＩｇＭクラスであってもよい。本発明のある態様において、抗体アンタゴニストは、二特異的（すなわち、寄生虫感染の始まりまたは進行に関与する標的と結合することができるアミノ酸配列および抗原結合部位を含む）であってもよい。変異体のＩｇＥ抗体には通常、１個またはそれ以上のアミノ酸残基にアミノ酸の置換や欠失がみられる。ＩｇＥ受容体のリガンドには、ＩｇＥ、抗受容体抗体、およびそれらの、アミノ酸置換変異体ならびに欠失変異体および環状化変異体を含むＩｇＥ受容体と結合することができる断片が含まれるが、これらに限定されるものではない。
一般に本発明のある態様において、ＩｇＥアンタゴニストは、ＩｇＥ分子上の結合部位をブロックするか、またはＩｇＥ受容体をブロックすることによって、Ｂ細胞、肥満細胞、または好塩基球上のＩｇＥ受容体に対するＩｇＥの結合をブロックすることによって作用する。さらに、本発明のある態様において、ＩｇＥアンタゴニストは可溶性ＩｇＥと結合することによって循環中からＩｇＥを除去することによって作用する。本発明のＩｇＥアンタゴニストはＩｇＥ産生を阻害することによっても作用することもできる。好ましくは、本発明のＩｇＥアンタゴニストは肥満細胞や抗塩基球からのヒスタミンの放出をもたらさない。
本明細書中で用いている用語「治療量」とは、疾患の症状を予防または改善するか、病的な生理学的状態に反応する量をいう。
本明細書中で用いている「ポリペプチド」は、一般に少なくとも約２個のアミノ酸を有するペプチドおよび蛋白を表す。
Ｂ．一般的方法
本発明のＩｇＥアンタゴニストは、線虫、吸虫、ならびに条虫を含む寄生性ぜん虫、およびＩｇＥレベルの上昇に関連する他の寄生虫による感染症を治療するのに使用することができる。
ＩｇＥアンタゴニストとその設計法および生成法は当該分野でよく知られている（背景と関連技術分野の説明の項参照）。ＩｇＥアンタゴニストが抗体である場合は、ＩｇＥアンタゴニストはＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、およびＩｇＥのようなあらゆるタイプの免疫グロブリンであってよく、これにはそのような抗体のポリクローナルおよびモノクローナル形が含まれる。
ＩｇＥに対するポリクローナル抗体は一般に、ＩｇＥとアジュバントを複数回にわたって動物に皮下（ｓｃ）注射するか、腹腔内（ｉｐ）注射することにより動物中で上昇する。ＩｇＥまたはＩｇＥのＦｃ領域からの標的アミノ酸配列を含む断片を、免疫する動物種に対して免疫原性の蛋白、例えば、キーポールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、またはダイズトリプシンインヒビターと、二機能性剤または誘導化剤、例えばマレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基を介して結合）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リジン残基を介する）、グルタルアルデヒド、蓚酸無水物、ＳＯＣｌ2、またはＲとＲ1が別のアルキル基であるＲ1Ｎ＝Ｃ＝ＮＲを用いて結合させることは有用であろう。
通常、細胞または免疫原性のコンジュゲートや誘導体による動物の免疫は、ＩｇＥ １ｍｇまたは１μｇとフロインドの完全アジュバントを混合し、この溶液を多くの部位に皮内注射することによって行う。１カ月後、最初の量の１／５〜１／１０のフロインド完全アジュバント中のコンジュゲートを複数の部位に皮下注射することにより動物にブースターをかける。７〜１４日後、動物から採血し、血清中の抗ＩｇＥ価をアッセイする。この価がプラトーに達するまで動物にブースターをかける。好ましくは、異なる蛋白と結合し、および／または異なる架橋剤を介した同じＩｇＥコンジュゲートを用いて動物にブースターをかける。コンジュゲートは組換え細胞培養中で蛋白融合物として形成させることもできる。アラム（アルミニウムアジュバント）のような凝集剤を用いて免疫反応を増強することもできる。
モノクローナル抗体の作製は、免疫動物から脾細胞を回収し、通常の方法（例えば、ミエローマ細胞との融合、またはEpstein-Barr(EB)ウイルスによる形質転換）によって細胞を不死化し、次いで所望の抗体を発現しているクローンをスクリーニングすることによって行った。ハイブリドーマ技術はKoehlerとMilsteinらの、Eur.J.Immunol.,6:511(1976)に最初に記載され、Hammerlingらの、Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas中、Elsevier,N.Y.、563-681頁(1981)にも記載されており、多くの特異抗原に対する高レベルのモノクローナル抗体を分泌するハイブリッド細胞系を作出するために広く用いられてきた。
ハイブリッド細胞系は細胞培養用の培地中、in vitroで維持することができる。抗体を産生する細胞系は、ヒポキサンチン−アミノプテリンチミジン（ＨＡＴ）培地中の連続細胞系を含む組成物中で選択および／または維持することができる。実際に、ハイブリドーマ細胞系が樹立されると、種々の栄養的に適切な培地でこの細胞系を維持することができる。さらに、ハイブリッド細胞系は、凍結および液体窒素による保存を含むあらゆる種々の通常の方法で保存し、保管することができる。凍結細胞系を解凍して蘇生させることによって、モノクローナル抗体の合成および分泌を再開させ連続的に培養することができる。
組織培養上清からの、分泌された抗体の回収は、沈澱法、イオン交換クロマトグラフィーやアフィニティクロマトグラフィーなどのような通常の方法によって行われる。本明細書に記載されている抗体は、通常のＩｇＧまたはＩｇＭの精製法（以前はプールした血漿からこれらの免疫グロブリンを精製するために使われてきた、例えば、エタノールまたはポリエチレングリコール沈澱法）によってハイブリドーマ細胞培養から回収することもできる。
日常的にマウスモノクローナル抗体が用いられるが、本発明はこれに限定されるものではなく、実際にヒト抗体を用いることができる。そのような抗体は、例えば、ヒトのハイブリドーマを用いて得ることができる（Coteらの、Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R.Liss、77頁(1985)）。実際に、本発明に従って、動物抗原と結合する可変ドメインをヒトの定常ドメインと結合させることによってキメラ抗体を産生するために開発された技術を用いることができ（Cabillyらの、米国特許第４８１６５６７号；Morrisonらの、Proc.Natl.Acad.Sci.,81:6851(1984);Boulianneらの、Nature,312:643-646(1984);Neubergerらの、Nature,312:604(1984);Neubergerらの、Nature,314:268-270(1985);Takedaらの、Nature,314:452(1985);ＥＰ１８４１８７；ＥＰ１７１４９６；ＥＰ１７３４９４；ＰＣＴ ＷＯ８６／０１５３３;Shawらの、J.Nat.Canc.Inst.,80:1553-1559(1988);Morrisonの、Science,229:1202-1207(1985);Oiらの、BioTechniques,4:214(1986)）、そのような抗体は本発明の範囲内である。本明細書において、用語「キメラ」抗体は、別の蛋白の少なくとも一部（通常、免疫グロブリンの定常ドメイン）と結合した抗体分子の少なくとも抗原結合部を含むポリペプチドを表すために用いられる。
ある態様において、そのようなキメラ抗体は約１／３にげっ歯類（または他の非ヒト種）配列を含むため、ヒトにおいて有意な抗グロブリン反応を誘発することができる。例えば、ネズミ抗ＣＤ３抗体であるＯＫＴ３の場合は、生じる抗グロブリン反応の多くか定常領域よりむしろ可変領域に対するものである（Jaffersらの、Transplantation,41:572-578(1986)）。
ヒト化抗体を用いることによって、ヒトのあらゆる抗グロブリン免疫反応を減少させるか除去することができる。実際的には、ヒト化抗体は、通常、相補性決定領域（ＣＤＲ）由来のアミノ酸残基、すなわち、抗原結合部位の形成に直接関与する可変ドメイン中の超可変領域由来のアミノ酸、およびおそらく、枠組み領域（ＦＲ）のアミノ酸、すなわち、可変ドメイン内にある程度保存されている配列の領域が、げっ歯類の抗体中の類似部位由来の残基によって置換されている。ヒト化抗体の構築はRiechmannらの、Nature,332:323-327(1988);Queenらの、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86:10029-10033(1989);Coらの、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:2869-2873(1991);Gormanらの、Proc.Natl.Acad.Sci.,88:4181-4185(1991);Daughertyらの、Nucleic Acids Res.,19:2471-2476(1991);Brownらの、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:2663-2667(1991);Junghansらの、Cancer Res.,50:1495-1502(1990);Fendlyらの、Cancer Res.,50:1550-1558(1990);およびＰＣＴ特許出願ＷＯ８９／０６６９２ならびにＷＯ９２／２２９５３に記載されている。
ある場合には、ヒトの枠組み中のヒトＣＤＲをげっ歯類の抗体由来のＣＤＲで置換することによって十分に高い抗原結合親和性が伝達されるが（Jonesらの、Nature,321:522-525(1986);およびVerhoeyenらの、Science,239:1534-1536(1988)）、他の場合ではさらに１個の（Riechmannら、既述）またはいくつかの（Queenら、既述）ＦＲ残基を置換する必要がある（Coら、既述も参照のこと）。
本発明にはトランスジェニック動物によって産生されるヒト抗体を使用することも含まれる。本システムでは、目的の抗体をコードするＤＮＡを分離し、動物宿主のジャームライン中に安定して取り込ませる。この動物中で抗体を産生し、この抗体を動物の血液または他の体液から回収する。あるいはまた、所望の抗体を発現している細胞系を動物宿主から分離し、これを用いてin vitroで抗体を産生し、次いでこの抗体を細胞培養から標準的方法によって回収することができる。
抗ＩｇＥ抗体断片を本発明の方法に使用することもできる。ＩｇＥとＩｇＥ受容体との相互作用をブロックするか混乱させることができる抗ＩｇＥ抗体のあらゆる断片が本発明で使用するのに適している。
適切な抗ＩｇＥ断片は、組み合せ可変ドメインライブラリーから、所望の抗体断片を発現することができるＤＮＡをスクリーニングすることによって得ることができる。モノクローナル抗体の産生を回避して抗体分子の抗原結合領域（Ｆ（aｂ）断片として知られている）の組換えＤＮＡ変異体を作出するためのこれらの技術は本発明の実施範囲内に含まれる。通常、当業者は免疫動物から得た免疫系細胞から抗体特異的メッセンジャーＲＮＡ分子を抽出し、これを相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）内に転写し、このｃＤＮＡを最近発現系中にクローンする。当業者は、数多くの機能的Ｆ（ａｂ）断片を速やかに作出してスクリーニングすることにより所望の抗原と結合する該断片を得ることができる。具体的には、そのようなＩｇＥ結合分子（ＩｇＥ蛋白に対する特異性を有するＦ（ａｂ）断片）は、本明細書中で定義し、論じ、特許請求した用語「抗体」中に含まれる。
本発明のさらなる態様において、可溶性ＩｇＥ受容体をＩｇＥアンタゴニストとして用いることができる。本発明に用いるのに適した可溶性受容体には、例えば、ＦｃεＲＩα鎖の細胞外ドメイン（エクソドメイン）中のＩｇＥ結合部位を含む分子が含まれる。ＦｃεＲＩのα鎖を遺伝的に修飾することによって、Blankらの、J.Boil.Chem.,266:2639-2646(1991)またはQuらの、J.Exp.Med.,167:1195に記載の方法に従って組換え発現系中でエキソドメインを可溶性蛋白として分泌させることができる。
本発明には、抗ＩｇＥ抗体および可溶性受容体に加えてＩｇＥ結合ペプチドを使用することも含まれる。ＩｇＥとＩｇＥ受容体との相互作用を混乱させるかブロックすることができるあらゆるＩｇＥ結合ペプチドが本発明で使用するのに適している。
上記の抗ＩｇＥ抗体、その断片、可溶性ＩｇＥ受容体、および他のＩｇＥ結合ペプチドのようなＩｇＥと結合してＩｇＥ／受容体相互作用に干渉するＩｇＥアンタゴニストに加えて、本発明には、ＩｇＥとＩｇＥ受容体との結合に競合することによって利用可能なＩｇＥ受容体を低下させ、それによってＩｇＥ／受容体相互作用を混乱させるＩｇＥアンタゴニストを用いることが含まれる。
ＩｇＥ変異体は、本発明の方法において使用するのに適した受容体結合競合物質の例である。ＩｇＥ変異体は、１個または複数のアミノ酸が置換および／または欠失しているような一部が変化したＩｇＥの形であり、この一部が変化したＩｇＥ分枝はＩｇＥ受容体との結合においてＩｇＥと競合することができる。
ＩｇＥ変異体の断片も本発明で使用するのに適している。ＩｇＥ受容体との結合において、ＩｇＥと競合することができるＩｇＥ変異体のあらゆる断片が、本発明に記載の方法に使用可能である。
本発明には、ＩｇＥ変異体とその断片に加えてＩｇＥ受容体結合ペプチドを使用することも含まれる。ＩｇＥとＩｇＥ受容体の相互作用を混乱させるかブロックすることができるあらゆるＩｇＥ受容体結合ペプチドが、本発明での使用に適している。
本発明を実施するにあたっては、ペプチド性ＩｇＥアンタゴニストを使用することに限定されない。ＩｇＥアンタゴニストとして機能し得るあらゆる化合物が、本発明の方法に使用するのに適しており、これには非蛋白低分子化合物が含まれる。
治療において使用すべき患者に投与するＩｇＥアンタゴニストの量は、治療すべき疾患、個々の患者の状態、投与部位、投与方法、および当業者に知られた他の要因を考慮した適当な医療業務にかなう方法で製剤化され、用量が確定するであろう。同時に、投与するＩｇＥアンタゴニストの用量は、用いるＩｇＥアンタゴニストの特性、例えば、その結合活性とin vivoでの血漿中の半減期、製剤中のＩｇＥアンタゴニストの濃度、投与経路と投与部位ならびに投与率、患者の臨床的トレランス、および患者の病状などに応じて変更されるが、これは十分に医師の技術範囲内である。
通常、ＩｇＥアンタゴニストは、約２カ月間、約１週間に一回、約２〜３ｍｇ／ｋｇの量で、皮下または静脈内に投与される。通常、抗ＩｇＥ抗体を用いる場合は、その濃度を血清ＩｇＥレベルの約２倍とするのに十分な抗体が投与される。本発明のアンタゴニストは静脈内、肺内、腹腔内、皮下または他の適切な経路によって投与される。
注射（筋肉内または皮下）は本発明のＩｇＥアンタゴニストを治療的に投与するための最初の経路であると予想されるが、静脈内投与やカテーテルによる投与、または他の外科的挿管を介した投与も用いられる。これにかわる経路には、経口投与のための懸濁剤、錠剤、およびカプセル剤など、液体製剤のための市販の噴霧器、凍結乾燥するかエアロゾル化したマイクロカプセルの吸入剤、および直腸投与や膣投与のための座剤が含まれる。液体製剤は粉末製剤を溶解させて液状にして利用することができる。
さらなる医薬的方法を用いて、本発明のアンタゴニストの作用の持続時間を調節してもよい。アンタゴニストは、コロイド状薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、ミクロエマルジョン、ナノ粒子、およびナノカプセル）、またはマクロエマルジョン中で、例えば、コアセルベーション技術かまたは界面重合（例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン−ミクロカプセルおよびポリ（メチルメタクリレート）ミクロカプセル）によって製造されたミクロカプセル中に取り込ませてもよい。そのような技術はRemington's Pharmacertical Sciences、第16版、Osol,A.編、1980に記載されている。
一般に、対象発明の製剤は、安定した剤形の製造を損なうことのない量の、および有効で安全な医薬的投与に適した量の他の成分を含むことができる。例えば、当業者によく知られた他の医薬的に許容される賦形剤は対象組成物の一部を形成することができる。これには、例えば、塩、種々の増量剤、さらなる緩衝剤、キレート剤、抗酸化剤、および共溶媒などが含まれ、これらの具体的な例にはトリス−（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩（「トリス緩衝液」）や２ナトリウムエデテートが含まれる。
通常、ＩｇＥレベルは当該技術分野でよく知られた標準的ＥＬＩＳＡ技術によってアッセイされる。通常、この技術では約３ｎｇ／ｍＬ以下のＩｇＥレベルを検出できない。
本発明の範囲をさらに定義している以下の実施例によって、本発明をさらに詳細に知ることができる。本明細書中に引用した全ての参考文献は本明細書の一部を構成する。
Ｃ．実施例
本研究において、ナイーブな（特定の処置を受けていない）マウスの住血吸虫症におけるＩｇＥ抗体産生の役割を検討した。抗ＩｇＥ ｍＡｂ処理は、感染の経過を通して血清中のＩｇＥレベルを検出されなくなるまで低下させ、成虫数と生じる卵の数をともに有意に減少させた。さらに、これらの抗ＩｇＥ ｍＡｂ処理マウスは肝脾腫大の減少も示した。さらに、これらの知見は、ナイーブなマウスのS.mansoni感染後のＩｇＥ産生が防御的な免疫反応というより宿主−寄生虫相互作用の免疫病理学的結果であることを示している。
１．血清ＩｇＥレベル
これらの試験では、モノクローナル抗ＩｇＥ抗体を用いて直接ＩｇＥを除去した。正常ＢＡＬＢ／ｃマウスをSchistosoma mansoniのセルカリアに感染させ、総量４００μｇの抗ＩｇＥ ｍＡｂで１週間に１回処置した。この高用量の処置により、８週間の感染経過中の血清ＩｇＥレベルは検出されなくなるまで低下した（図１）。低用量の抗ＩｇＥ ｍＡｂで１週間に１回（総抗ＩｇＥ ｍＡｂ量は２４０μｇ）処置した第２グループのマウスにおける感染の最後の２週間のＩｇＥ反応は測定可能であった（５０μｇ／ｍＬ以下）。これらのレベルは、感染の第８週だけ典型的な高血清ＩｇＥレベル（２４０μｇ／ｍＬ）を示した、アイソタイプ対照抗体（Ａｂ）で処置した感染マウスに比べて著しく低かった。
以前の報告（Sher,A.らの、J.Immun.145:3911-3916(1990)）と一致して、血清ＩｇＥレベルの、検出されなくなるまでの低下ではないが有意な低下は、寄生虫負荷や寄生虫の生殖能力にほとんど影響はなかった（表１）。これに反して、「高用量」の抗ＩｇＥ ｍＡｂで処置したことによってＩｇＥレベルが検出されなくなった感染動物では、対照群に比べて、成虫数と生じる卵の数が有意に減少していた。
0003825798.tif 000002
ＰＢＳ０．２５ｍＬ中のヘパリン３０単位およびバルビタールナトリウム１５ｍｇの腹腔内注射によりマウスを屠殺した。門脈系を潅流して成虫を回収した（Amiri,P.らの、Nature 356:604-607(1992)）。報告した数は平均虫数／マウス（ｎ＝７〜１２／グループ）±標準偏差である。肝臓中の寄生虫卵を定量するために、肝臓を、ＰＢＳ中の１％トリプシン２５ｍＬ中で２０〜３０秒間ホモゲナイズした。混合物を室温で３〜４時間インキュベーションし、再懸濁し、次いで試料２０μＬを取り出し、顕微鏡的に評価した。結果は肝臓当りの独立して計数した１０試料の平均総卵数±標準偏差で示している。
＊は分散分析で決定したｐ＜０．０５で有意であることを示し、比較はStudent-Newman-Keul Testを用いて行った。
２．脾臓と肝臓に対する影響
高用量（４００μｇ）ｍＡｂ処置ラットにおいて、脾臓（図２Ａ）および肝臓（図２Ｂ）重量の増加によって測定した全体の細胞性炎症反応は、ＩｇＥ処理した対照マウスに比べて約５０％低下した。これはおそらく卵生産の減少によるものである。興味深いことに、感染の最後の２週間にのみＩｇＥを産生したマウス（２４０μｇ（低用量））は、ＩｇＥ処理動物と同等の卵数および同等の臓器重量の増加を示した。この知見は、卵生産に応じたＩｇＥ合成と次いで起こる脾臓および肝臓中への細胞浸潤との関連を暗示している。同様に、遺伝的にＩｇＥが欠損しているＳＪＡ／９マウスでは、S.japonium卵に対する肉芽腫反応の低下を示し、このことはＩｇＥが肉芽腫形成を増強するように作用することを示唆している（Owhashi,M.らの、Int.Arch.Allergy.Appl.Immunol.90:310-12(1989)）。
３．卵生産に対する影響
住血吸虫症における鍵となる病理学的変化は、肝臓の門脈細静脈に捕捉された住血吸虫卵の周囲の肉芽腫形成を特徴とする慢性的炎症である（Cheever,A.W.らの、Am.J.Trop.Med.Hyg.40:60-71(1989);Olds,G.R.らの、J.Infect.Dis.159:798-901(1989);およびPrakash,S.らの、J.Immun.144:317-322(1990)）。感染動物の組織病理学的検査の結果、臓器サイズは組織の炎症反応と相関することが明らかとなった（図３Ａ）。卵数の減少によって、高用量の抗ＩｇＥ ｍＡｂで処置したマウスの肝臓中の肉芽腫数の顕著な減少がみられた（図３Ｂ）。全体として、肉芽腫の細胞性には認め得るほどの変化はみられなかった。抗ＩｇＥ処理した感染マウスとＩｇＧ処理対照のいずれにおいても、多数のマクロファージと好塩基球を含むよく発達した肉芽腫が観察されたが、高用量処置群では肉芽腫関連線維症の減少がみられた（図３Ｃ、Ｄ）。
４．血清ＩＬ−４に対する影響
住血吸虫卵は、強い炎症反応を惹起するのに加え、ＣＤ４+Ｔ細胞のＴH2サブクラスのクローンの増加と活性化に対する強力な刺激因子である（Pearce,E.J.らの、J.Exp.Med.173:159-166(1992);およびGrzych,J.M.らの、Immun.146:1322-1327(1991)）。ＴH2細胞は、ＩｇＥとＩｇＧのスイッチ因子として作用する（Stavnezer,J.らの、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:7704-7708(1988)）、インターロイキン４（ＩＬ−４）を含む特異的なサイトカインを放出する（Mosmann,T.F.らの、Ann.Rev.Immun.7:145-173(1989)）。これらの実験では、対照抗体で処理したマウスの感染第７週と第８週において、卵生産が生じると共に、血清ＩＬ−４が検出可能なレベルに上昇した（図４）（Vella,A.T.らの、J.Immun.148:2283-2290(1992)）。しかし、抗ＩｇＥ ｍＡｂで処理した感染マウスの血清では、ＩＬ−４の同様なスパイク（spike）はみられず（図４）、このことは、ＩｇＥを完全に抑制することによって、ＩＬ−４産生によって測定したＴH2活性の低下が生じることを示唆した。いかなる特定の理論に制限されることなく、これらの知見は、ＩＬ−４がＩｇＥ合成を律するのに加えて、ＩｇＥがＩＬ−４の分泌を増幅するフィードバックにより、それ自身の産生を調節することができることを示唆している。
抗寄生虫エフェクター機能におけるＩＬ−４の関与は、ワクチン接種したマウスモデルで抗ＩＬ−４抗体を用いて検討されてきた（Sher,A.らの、J.Immun.145:3911-3916(1990)）。この処理によって血清ＩｇＥはＩＬ−４と共に減少したが、このマウスのSchistosoma mansoniに対する免疫性には変化がみられなかった。これに対し、ここに示した実験は、予期しないことに、ＩＬ−４と共に血清ＩｇＥを、部分的というよりむしろ完全に（ＩｇＥレベルが検出されなくなるまで低下することによって示す）除去することによって、ナイーブなネズミ宿主の寄生虫に対する免疫に対して好ましい効果が得られることを示している。それでもやはり、いかなる特定の理論にも制限されることなく、Ｔ細胞の増殖（Kurt-Jones,E.T.らの、J.Exp.Med.166:1774-1787(1987);およびFernandez-Botran,R.らの、J.Exp.Med.168:543-558(1988)）と成長（Tepper,R.I.らの、Cell 62:457-467(1990)）を助長する、局所的に産生されたＩＬ−４は寄生虫負荷と寄生虫の生殖能を減少させるのに寄与した可能性がある。
これに代わる理論では、ＩｇＥは有効な抗寄生虫反応から寄生虫を保護する役割を演じ得る。ＩｇＥの除去はＩＬ−４の強い抑制をももたらすことから、この免疫グロブリンのアイソタイプは、住血吸虫卵に対するＴHの反応を歪め得る可能性がある。以前の報告において、成虫対ＴH2刺激および卵誘発免疫学的病変に対するＴH1刺激と防御の関連は確立されている（Scott,P.らの、Immun.Rev.112:161-182(1989)）。さらに、マウスにおいて、住血吸虫卵に対するＴH2の反応はＴH1反応のダウンレギュレーションと免疫病原性の両方をもたらすことが示唆されている（Vella,A.らの、J.Immun.148:2283-2290(1192)）。すなわち、抗ＩｇＥ  ｍＡｂ処理によるＩｇＥの除去は、ＴH2反応からＴH1反応に向かって、バランスを単に変化させるだけかも知れない。これらのＴH1細胞によって産生されるメディエーターおよびサイトカインは寄生虫感染症の制御においてより効果的かも知れない（James S.L.らの、Curr.Top.Microbiology Immunol.21:31-39(1990)）。
５．血清ＩＦＮ−αに対する効果
この系におけるＴH1およびＴH2誘導サイトカインの相対的な関与についてさらに検討するために、S.mansoniに対する防御免疫を与えることがわかっている、ＴH1産物であるＩＦＮ−αについても血清をアッセイした（Pancre,V.H.らの、Cell.Immunol.125:58-64(1990)）。用いたＥＬＩＳＡは１５ｐｇ／ｍＬまで感度があったが、循環中のＩＦＮ−αはSchistosoma感染の８週間の経過中に回収した血清試料のいずれにも検出されなかった（データ示さず）。しかし、抗ＩｇＥ抗体または対照抗体で処理した非感染マウスおよび感染マウスから得たコンカナバリンＡ刺激脾細胞の上清中のＩＦＮ−αレベルは測定可能であった。公表された知見（Sher,A.R.らの、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:616-65(1990)）と同じく、この培養中のＩＦＮ−αレベルは、感染後８週間強く抑制された（非感染マウス５６０ｎｇ／ｍＬに対して感染マウス１８ｎｇ／ｍＬ）。興味深いことに、抗ＩｇＥ抗体による処理は部分的にこの抑制を回復させ、感染マウスからの脾臓細胞の上清中のＩＦＮ−αを６７ｎｇ／ｍＬに上昇させた。これらの結果は、ＩＦＮ−αの検出から判断して、ＴH1細胞は抗体処理後においてより豊富であり、寄生虫に対する免疫反応の改善に部分的に寄与し得ることを示唆している。
６．ＣＤ２３の発現に対する影響
Schictosoma感染マウスの抗ＩｇＥ処理に関連する他の結果を確認する努力の中で、脾リンパ球細胞におけるセルカリア感染後８週間の異なる表面マーカーの発現について評価した。ＩＬ−４はＩｇＥに対する低親和性受容体（ＦｃεＲＩＩ）であるＣＤ２３の細胞表面における発現を増大させることが知られている（Kikutani,H.らの、Cell 47:657-665(1986)）。脾臓ＣＤ４５Ｒ+Ｂ細胞におけるＣＤ２３発現試験の結果は、ＣＤ２３発現はSchistosoma感染に応じて増大したが、抗ＩｇＥ ｍＡｂ処理後に、非感染マウスでみられた発現レベルまで抑制されて戻ったことを示した（図５）。抗ＩｇＥ処理マウスにおいてＣＤ２３発現の増強がみられなかったことは、ＩＬ−４レベルが検出限界未満であったことと一致している。さらに、ＦｃεＲＩＩはＩｇＥに関連した抗原の捕捉と提示にかなり効率的に作用することができ（Kehry,M.R.らの、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86:7556-7569(1989)）、ＩｇＥ（ＴH2）反応に対して優先的に抗原を発現することができる。ある寄生虫抗原の提示はＴH1細胞発現か、ＴH2細胞発現のいずれかに関連しているので、ＩｇＥフィードバックメカニズムの１つは、ＴH2細胞発現を刺激するＩｇＥ結合抗原の提示と関連しているかも知れない。in vitroにおけるＩｇＥ／ＦｃεＲＩＩ相互作用は免疫グロブリンのアイソタイプの選択をもたらし、Ｂ細胞の増殖を刺激することが示されている（Scott,P.らの、Immun.Rev.112:161-182(1989)）。ある特定の理論に制限されるものではないが、ＩｇＥとＣＤ２３保有Ｂ細胞の相互作用をブロックすることによるＩｇＥ合成への干渉は、この寄生虫によって正常に刺激された非常に高いＩｇＥレベル（２４０μｇ／ｍＬ）を全体的に除去する比較的低濃度（１００μｇ／週）の抗ＩｇＥ抗体の能力を説明するであろう。
【図１】
0003825798.tif 000003
【図２Ａ】
0003825798.tif 000004
【図２Ｂ】
0003825798.tif 000005
【図３Ａ】
0003825798.tif 000006
【図３Ｂ】
0003825798.tif 000007
【図３Ｃ】
0003825798.tif 000008
【図３Ｄ】
0003825798.tif 000009
【図４】
0003825798.tif 000010
【図５】
0003825798.tif 000011