(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
感染性物質に対して全身性及び分泌性免疫応答を誘発可能な抗原または前記感染性物質に対する防御を付与する抗体の発現ベクターであって、前記抗原または抗体は前記発現ベクターを含む組み換え発現系で処置した動物の消化管および気道に出現し、前記発現ベクターは、
ａ）３′および５′末端に局在するＴＧＥＶレプリカーゼ認識シグナルおよび少なくとも１個のプロモータを含むブタ伝染性胃腸炎ウイルス（ＴＧＥＶ）由来欠陥ウイルスゲノムまたはその対応する相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、および、
ｂ）（ｉ）感染性物質に対して全身性及び分泌性免疫応答を誘発可能な抗原、および（ｉｉ）前記感染性物質に対する防御能力を付与する抗体から構成される群から選択された産物をコードする少なくとも１個のＤＮＡ配列であって、ＴＧＥＶ由来前記欠陥ウイルスゲノム中に存在する少なくとも１個のプロモータに操作によって連結されているＤＮＡ配列、を含む。
【請求項２】
ＴＥＧＶ由来前記欠陥ウイルスゲノムまたはその対応するｃＤＮＡは、さらに、ＴＧＥＶレプリカーゼをコードする完全配列を含む請求項１記載のベクター。
【請求項３】
感染性物質に対して全身性及び分泌性免疫応答を誘発可能な異なる抗原をコードする１個を越えるＤＮＡ配列を含む請求項１記載のベクター。
【請求項４】
感染性物質に対する防御能力を付与する異なる抗体をコードする１個を超えるＤＮＡ配列を含む請求項１記載のベクター。
【請求項５】
感染性物質に対して全身性及び分泌性免疫応答を誘発可能な抗原または前記感染性物質に対する防御能力を付与する抗体を発現させるための組み換え発現系であって、前記抗原または抗体は前記組み換え発現系で処置した動物の消化管および気道に出現し、前記組み換え発現系は、
ａ）請求項１乃至４のいずれか1項に記載の発現ベクター；および
ｂ）ヘルパーウイルス、
を含む。
【請求項６】
前記ヘルパーウイルスがＴＧＥＶ由来欠陥ゲノムの複製およびキャプシド形成のための機能的および構造的タンパク質を提供する請求項５に記載の前記組み換え発現系。
【請求項７】
前記ヘルパーウイルスがＴＧＥＶ由来欠陥ゲノムのキャプシド形成のための構造的タンパク質を提供する請求項５に記載の前記組み換え発現系。
【請求項８】
薬学的に許容可能な賦形剤とともに請求項５乃至７のいずれか１項に記載の組み換え発現系を含む、感染性物質に対して動物を防御するためのワクチン。
【請求項９】
ブタをブタ感染性物質から防御するための請求項８記載のワクチンで、このワクチンは、
ａ）
（ｉ）ブタ病原体の抗原をコードする少なくとも１個のＤＮＡ配列を含有する少なくとも１個の発現ベクターを含む組み換え発現系；
（ｉｉ）互いに異なったブタ病原体の抗原をコードする１個を超えるＤＮＡ配列を含有する発現ベクターを含む組み換え発現系；および
（ｉｉｉ）ブタ病原体の抗原をコードする少なくとも１個のＤＮＡ配列を含有する請求項１乃至４のいずれかに記載の異なる発現ベクターを含む組み換え発現系、
から構成される群から選択された組み換え発現系；および
ｂ）ヘルパーウイルスとしてのブタコロナウイルス、
を含む。
【請求項１０】
前記ブタ病原体が、アクチノバシラス  スウス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｉｓ）、アクチノバシラス  プルロニューモニアエ（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ヘモフイラス  パラスウス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｐａｒａｓｕｉｓ）、ポルシン  パルボウイルス（Ｐｏｒｃｉｎｅ  ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）、エシェリシア  コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、エリシペロスリックス  リュシオパチアエ（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）、パステウレラ  ムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、ボルデテラ  ブロンキセプチカ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）、クロストリジウム種（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．）、セルプリナ  ヒヨダイセンテリアエ（Ｓｅｒｐｕｌｉｎａ  ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）、マイコプラズマ  ヒヨニューモニアエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ブタ伝染性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）、ブタ呼吸器コロナウイルス、ロタウイルス、およびブタ繁殖器および呼吸器症候群、オージエスツキー（Ａｕｊｅｓｚｋｙ）病（仮性狂犬病）、ブタインフルエンザまたは伝染性胃腸炎および萎縮性鼻炎および増殖性回腸炎の病因物質から構成される群から選択される請求項９記載のワクチン。
【請求項１１】
イヌをイヌ感染性物質から防御するための請求項８記載のワクチンで、このワクチンは、
ａ）
（ｉ）イヌ病原体の抗原をコードする少なくとも１個のＤＮＡ配列を含有する少なくとも１個の発現ベクターを含む組み換え発現系；
（ｉｉ）互いに異なったイヌ病原体の抗原をコードする１個を超えるＤＮＡ配列を含有する発現ベクターを含む組み換え発現系；および
（ｉｉｉ）イヌ病原体の抗原をコードする少なくとも１個のＤＮＡ配列を含有する請求項１乃至４のいずれかに記載の異なる発現ベクターを含む組み換え発現系、
から構成される群から選択された組み換え発現系；および
ｂ）イヌコロナウイルス
を含む。
【請求項１２】
前記イヌ病原体が、イヌヘルペスウイルス、イヌアデノウイルス１および２型、イヌパルボウイルス１および２型、イヌレオウイルス、イヌロタウイルス、イヌコロナウイルス、イヌパラインフルエンザウイルス、イヌインフルエンザウイルス、デイステンバーウイルス、狂犬病ウイルス、レトロウイルスおよびイヌカリシウイルスから構成される群から選択される請求項１１記載のワクチン。
【請求項１３】
ネコをネコ感染性物質から防御するための請求項８記載のワクチンで、このワクチンは、
ａ）
（ｉ）ネコ病原体の抗原をコードする少なくとも１個のＤＮＡ配列を含有する少なくとも１個の発現ベクターを含む組み換え発現系；
（ｉｉ）互いに異なったネコ病原体の抗原をコードする１個を超えるＤＮＡ配列を含有する発現ベクターを含む組み換え発現系；および
（ｉｉｉ）ネコ病原体の抗原をコードする少なくとも１個のＤＮＡ配列を含有する請求項１乃至４のいずれかに記載の異なる発現ベクターを含む組み換え発現系、
から構成される群から選択された組み換え発現系；および
ｂ）ネココロナウイルス
を含む。
【請求項１４】
前記ネコ病原体が、ネコカリシウイルス、ネコ免疫不全ウイルス、ネコヘルペスウイルス、ネコ汎白血球減少症ウイルス、ネコレオウイルス、ネコロタウイルス、ネココロナウイルス、ネコ感染性腸膜炎ウイルス、狂犬病ウイルス、ネコオウム病クラミジア、およびネコ白血病ウイルスから構成される群から選択される請求項１３記載のワクチン。
【請求項１５】
ブタをブタ伝染性胃腸炎ウイルス（ＴＧＥＶ）から防御するための請求項８記載のワクチンで、前記組み換え発現系が、下記に記載の少なくとも１個の発現ベクターを含む。
0003769300.tif 000032
【発明の詳細な説明】
本発明のベクターは、全身性及び分泌性免疫応答の誘発に適する少なくとも１つの抗原を発現する組換え欠陥ウイルスゲノムを含んでいる。本発明の欠陥ウイルスゲノムは、３'及び５'末端に配置されたウイルスレプリカーゼ認識シグナルを有しそして更に内部欠失を有する親ウイルスゲノムを含んでおり、そしてこの欠陥ウイルスゲノムはその複製をヘルパーウイルスに依存している。これらのベクターは、（ａ）上記の発現ベクターと（ｂ）欠陥ゲノムの複製及びキャプシド化用の機能及び構造タンパク質を提供するヘルパーウイルス、を含んでいる組換え系の形成に適している。この系は種々の動物種、特にブタ、イヌ及びネコの感染作用物に対する単価及び多価ワクチンの製造に適している。
発明の分野
本発明は、粘膜感染を予防するために全身性及び分泌性免疫応答を誘発するのに適する抗原を発現する組換え欠陥ウイルスゲノムに基づく多数のベクターに関するものであり、そしてワクチン目的でこれらベクターを適当なヘルパーウイルスと一緒に使用することに関するものである。
発明の背景
発現ベクターを使用して組換えタンパク質を達成することは周知の事実である。一般的に、原核生物及び酵母の発現系は非常に有効でありそして使用し易いが、優れた真核細胞を含有する使用された発現系はタンパク質産生値の低さや宿主範囲の制限に関して多数の欠点を示している。優れた真核細胞の現存する発現系のうちで、バクロウイルスに基づくベクターはタンパク質産生に関して最も有効である。しかし乍らこれらは、知られているように、動物細胞とは異なる方法でタンパク質をグリコシル化する昆虫細胞でしか使用できない。加えて、組換えウイルスの構築は同種組換えによって行われるが、これは、特に多数の遺伝子変異体を分析しなければならないとき、骨の折れる技術である。
他方、異種遺伝子発現に適するＤＮＡウイルスに基づくベクターが知られている。しかし乍ら、ＤＮＡに基づくベクターの使用では、これらが宿主細胞の核で複製しそしてゲノムに組込まれる可能性があるので信頼性がないため多数の欠点が示されている。反対に、ＲＮＡに基づくベクターを使用すると、これらは宿主細胞のゲノムではなくて細胞質中で複製し、複製がＤＮＡではなくてＲＮＡによって行われそしてゲノムへの組込みの可能性が非常に低いため、これらのＲＮＡウイルスに基づくベクターが一層確実なものになるので、ＤＮＡウイルスの使用に関連した欠点が克服される。
ビリオンキャプシドを含有する欠陥干渉粒子（ＤＩ）や欠陥ゲノムも良く知られており、そしてこれらは殆どが複製エラーによって感染性ウイルスゲノムから産生される欠失サブゲノム突然変異体である。一般的に、用語「ＤＩ粒子」はＲＮＡ又はＤＮＡゲノムの或る領域を欠き、ウイルスのタンパク質及び抗原を含有し、複製には感染性親ウイルス（ヘルパーウイルス）の同時感染を必要とする欠陥ウイルスを言い、そしてこれら欠陥ウイルスは同種ヘルパーウイルスを犠牲にして複製するので同種ヘルパーウイルスと特異的に干渉する［Ｈuang及びＢaltimore、Ｎature、226、325〜327（1970年）］。ＤＩゲノムは、１つのＲＮＡ鋳型から別のＲＮＡ鋳型に又はＲＮＡ鋳型の１つの断片から同じ分子の別の断片にＲＮＡポリメラーゼがシフトした結果として、ゲノム再編成から生じる。これらのＤＩゲノムは一度生成すると、親ゲノム又は複製及びキャプシド化に関与するタンパク質をコードする増幅ウイルスを犠牲にして自己増幅し、そして親ウイルス又は増幅ウイルスはこのような生成物について欠陥ゲノムと競合しなければならない。
ＤＩ粒子は或る種のコロナウイルス、例えば、ネズミ肝炎ウイルス（ＭＨＶ）、感染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）及びウシコロナウイルス（ＢＣＶ）から得られそして特徴が決定されているが、ブタ伝染性胃腸炎ウイルス（ＴＧＥＶ）から誘導されるＤＩ粒子は記載されていない。ＭＨＶ天然ＤＩ粒子の１つは、外来遺伝子が内部プロモーター転写配列の制御下に挿入されている発現ベクターを開発する基礎として使用されてきた［Ｌin及びＬai、Ｊ．Ｖirol．、6110〜6118、10月（1993年）］。
一般的に、ＤＩ粒子に基づく既知の異種遺伝子発現ベクターはそれらの種及び標的器官特異性に関連して幾つかの欠点を有しており、そしてクローニング能力が制限されているので、基礎的な研究とワクチンを含む治療目的でこのようなベクターの開発に適用される研究の両方でこれらの使用可能性が制限されている。
従って、上記した欠点を成功裏に克服できる異種遺伝子発現ベクターの需要が依然として存在する。詳細には、安全性やクローニング能力の値が高くそして種特異性や向性を容易に制御できるように設計できる幾つかの異種遺伝子発現ベクターを利用できることが非常に有利であろう。
本発明はこの課題に対する解決を提供し、そしてこの解決は種々の動物種における免疫応答の誘発及び種々の感染作用物によって生じる感染の予防に適する抗原を発現する組換え欠陥ウイルスゲノムに基づくベクターを含んでいる。本発明によって提供される異種遺伝子発現ベクター（又はＤＮＡ配列）は高い安全性値並びに高いクローニング能力を有しているので、これらの種特異性及び向性を容易に制御できるように設計して、種々の動物種において種々の感染作用物によって生じる感染に対して保護を与え得るワクチン製剤に適するベクターを作成することができる。
それ故、本発明の目的は、免疫応答−詳細には、種々の動物種における感染作用物に対する全身性及び分泌性免疫応答−又は感染作用物に対して保護を提供し高い安全性値やクローニング能力値を備えた抗体の誘発に適する少なくとも１つの抗原を発現する組換え欠陥ウイルスゲノムに基づくベクターであり、そしてこれは種特異性や向性を容易に制御できるように設計することができる。
上記ベクターを構築する基礎として役立つ欠陥ウイルスゲノムも本発明の更なる目的である。
本発明のもう１つの目的は、（ａ）上記したベクター及び（ｂ）組換え欠陥ウイルスゲノムの複製及びキャプシド化に関与するタンパク質を提供するヘルパーウイルス、を含んでいる異種タンパク質の組換え発現系である。
本発明の更にもう１つの目的は、種々の動物種において種々の感染作用物によって生じる感染に対して保護を誘発し得るワクチンであり、そしてこれは製薬的に許容可能な賦形剤と一緒に、上記した組換え系を含んでいる。これらのベクターは、組換え系中に存在する発現ベクターが１つ若しくはそれより多い感染作用物に対して免疫応答を誘発し得る１つ若しくはそれより多い抗原を発現するのか、又は１つ若しくはそれより多い感染作用物に対して保護を提供する１つ若しくはそれより多い抗体を発現するのかに依存して単価又は多価であることができる。
本発明によって提供される他の目的には動物の免疫感作方法が含まれ、そしてこれは上記組換え系又はワクチンの投与並びに新生動物種に感染する感染作用物から新生動物を保護する方法からなっている。
【図面の簡単な説明】
図１はＴＧＥＶの構造を示す。ビリオンは、内部が28.5キロベース（kb）の正の極性の一本鎖ＲＮＡ分子である脂質エンベロープからなる球形粒子である。このＲＮＡはヌクレオキャプシドを形成するＮタンパク質に関係している。Ｍ及びｓＭ構造タンパク質は膜内に含まれている。タンパク質Ｓは三量体の一員であり、そしてペプロマーを形成しているエンベロープの外部に固定されている。
図２は、配列が決定された４つのコロナウイルス：ＭＨＶ、ＩＢＶ、ＨＣＶ229Ｅ（ヒトコロナウイルス229Ｅ）及びＴＧＥＶのゲノム構成を示す。各タンパク質をコードする読取り枠は目盛りに対して示されている。各ゲノムにおいて、各ウイルスを発現するＲＮＡの開始点は矢印で示されている。ウイルスＭＨＶ又はＴＧＥＶによって発現されるメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の数はウイルス株に依存して変動する可能性がある。この略図では、ＴＧＥＶの矢印は株ＴＨＥＲ-１によって発現されるｍＲＮＡに対応する。これらのｍＲＮＡは３'が共通末端であり、そして大きいものから順に番号付けされている。
図３は、ＴＧＥＶゲノム、株ＴＨＥＲ-１の発現を示す。このゲノムの読取り枠（ＯＲＦ）の配置が示されている：Ｐol、ポリメラーゼ；Ｓ、ｓＭ、Ｍ及びＮ、構造タンパク質；nsp ３a、３b及び７、非構造タンパク質（タンパク質３bはこのウイルスでは産生されない）。このゲノムは、同じ長さであるが、７つのｍＲＮＡ（１〜７）を合成する鋳型として役立つ負の極性（−）のＲＮＡ中で転写される。各ｍＲＮＡでは、５'末端の共通配列、リーダー（四角）、３'末端のポリアデニン部分及びこれらの各々で転写される領域（太線）が示されている。
図４は、ＳＴ細胞中高い感染多重度（m.o.i.）での継代数に伴うＴＧＥＶのＴＨＥＲ-１（Ａ）及びＰＵＲ46-mar1ＣＣ12（Ｂ）単離物の力価の進展を示す。
図５は、高いm.o.i.で46回継代したＴＨＥＲ-１ウイルスを用いて感染させたＳＴ細胞中で産生されたＲＮＡの電気泳動分析の結果を示す。継代数は各レーンの上部に示し、そして左側のスケールは、kbで表される分子量マーカー（ＴＧＥＶ及びＧibcoＢＲＬマーカーのゲノムＲＮＡ）の位置を示す。右側のスケールはＴＧＥＶ ｍＲＮＡ及び欠陥干渉（ＤＩ）ＲＮＡを示す。ＮＩ、感染なし。
図６は、ＴＨＥＲ-１ｐ35ウイルスで感染させたＳＴ細胞のＲＮＡのノーザンブロットアッセイの結果を示す。
図７は、ＳＴ細胞中におけるＴＨＥＲ-1-ＳＴｐ41ウイルスの希釈継代物から進めるＲＮＡのノーザンブロットアッセイの結果を示す。
図８は、欠陥ＲＮＡ Ａ、Ｂ及びＣの増殖に与える細胞系統変動の影響を示す。ウイルスＴＨＥＲ-1-ＳＴｐ46はＩＰＥＣ（ブタ腸上皮細胞）中希釈しないで10回継代し、そしてＰＭ（ブタマクロファージ）細胞中で５回継代した。図８Ａ及び８Ｂ：それぞれＩＰＥＣ及びＰＭ中での継代数に伴うウイルス力価の進展。図８Ｃ：ＩＰＥＣ（32Ｐiによる代謝物標識によって）中での継代数１及び10又はＰＭ細胞（リーダーＲＮＡに相補的な１個のオリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成によって）中での継代数１及び５のウイルスで感染させたＳＴ細胞のＲＮＡの分析。
図９は、欠陥ゲノムＡ、Ｂ及びＣのキャプシド化を示す。図９Ａは、臭化エチジウムで染色したアガロースゲルを示し、ここでは継代数１及び継代数41の精製ビリオンから抽出されたＲＮＡは、15％のスクロースクッション（ｗ／ｖ）による遠心によって分析されている。継代数41のレーンでは、親ゲノムのみならずＲＮＡ Ａ、Ｂ及びＣを観察することができる。左側のスケールは移動マーカーをkbで示している。図９Ｂは、リーダーＲＮＡと相補的なオリゴヌクレオチドを用いるノーザンブロットアッセイによって、スクロースクッション又は連続傾斜による遠心で精製した継代数41のビリオンのＲＮＡの分析結果を示す。市販のＧibcoＢＲＬのＲＮＡ及び継代数１のビリオンのＲＮＡ（レーンａ）をマーカーとして使用した。レーンｂ及びｃ、それぞれ31％及び15％のスクロースクッション（ｗ／ｖ）で沈殿させたビリオンから抽出したＲＮＡ。レーンｄ及びｅ、連続スクロースクッションで精製したウイルスから抽出したＲＮＡ、それぞれ1.20及び1.15ｇ／mlのフラクション。
図10は、欠陥ＲＮＡのＤＩ-Ｂ及びＤＩ-Ｃのクローニング方法を示しており、この図では、鋳型として全長ゲノムＲＮＡ（Ａ）、ＤＩ-Ｂ（Ｂ）及びＤＩ-Ｃ（Ｃ）を使用し、ＲＴ-ＰＣＲで得られた相補的なＤＮＡフラグメント（ｃＤＮＡ）の概略図を見ることができる。点線は、サイズが大きいため予想されたフラグメントの不存在を示している。欠陥ＲＮＡは線で示した４つの重複フラグメント（ａ、ｂ、ｃ及びｄ）にクローン化された；これらの線の下の数字はアガロースゲル中で決定されたフラグメントの大きさを示す。プライマーとして使用したオリゴヌクレオチドとそれらの極性は矢印と数字で示す。オリゴヌクレオチドの配列は表２に示す。（Ａ）中の縞模様又は白い箱はウイルス遺伝子の相対的位置を示している：pol、ポリメラーゼ；Ｓ、Ｍ及びＮ、構造遺伝子；３a、３b、ｓＭ及び７、小さいＯＲＦ。陰影を付けた細い箱はリーダー配列を示す。
図11は、欠陥ＲＮＡの増幅で得られたＰＣＲ生成物の電気泳動分析の結果を示す。オリゴヌクレオチド１及び２（ａ）、３及び４（ｂ）、５及び６（ｃ）又は７及び８（ｄ）とのＲＴ-ＰＣＲ反応では精製ビリオンＴＨＥＲ-１ｐ1又はＴＨＥＲ-１ｐ41のＲＮＡが鋳型として使用され、そして親ゲノムにおけるこれらオリゴヌクレオチドの配列と位置は表２に示す。継代数１（親ゲノムＲＮＡ）又は継代数41（親ＲＮＡ、ＤＩ-Ａ、ＤＩ-Ｂ及びＤＩ-Ｃ）のＲＮＡ鋳型に対応するレーン、及びＤＮＡ移動性マーカー（Ｍ、ＧibcoＢＲＬ）のレーンが各々の場合に示されている。肉太タイプの数字は、欠陥ＲＮＡに特異的な増幅生成物の大きさをkbで示している。ＲＮＡ Ｂ＋Ｃ、即ちＢとＣのＲＮＡ：ＴＨＥＲ-１ ＳＴｐ41ウイルスのＲＮＡをゲルで分画する実験で精製されたバンド。ＢとＣのＲＮＡは非常に近接して移動したので、単一バンドとして切断された。
図12は、ａ、ｂ、ｃ及びｄクローニングの重複フラグメントの配列決定によって得られた完全なＲＮＡ ＤＩ-Ｃ ｃＤＮＡ配列（配列識別番号24参照）を示す。ＲＮＡ ＤＩ-Ｃは４つの不連続親ゲノム領域：I、II、III及びIＶを保持している。これらの領域のフランキング部位は矢印で示されている。ゲノムＤＩ-Ｃ中に存在する３つのＯＲＦ：相中の不連続領域ＩとIIの融合から生じる6.7kbのキメラＯＲＦ；相中の上記ＯＲＦに先行するアミノ酸３個のミニ-ＯＲＦ、及び遺伝子ＳのＡＵＧで始まるＯＲＦ、の翻訳が示されている。高度に同種の領域−これらはポリメラーゼ及びヘリカーゼ活性に関与しているので、他のコロナウイルスで記載されたタンパク質ドメイン及び金属イオン結合部位を有する−には陰影が付けられている。ＣＴＡＡＡＣ転写プロモーター配列には陰影が付けられている。ＯＲＦ１ａと１ｂの間の重複部分（41個のヌクレオチド）には陰影が付けられており、リボソームのスリッパリィ（slippery）配列には下線が引かれており、そしてＯＲＦ1a終結コドンは箱で囲まれている。637、6397及び6485位では、親ゲノムに関して特異的な変化が示されている。親ゲノムのこれらの位置に存在するヌクレオチドが示されている。
図13は、ＲＮＡ ＤＩ-Ｃ構造の略図である。総ゲノム長は箱の右に見られる。ＲＮＡ ＤＩ-Ｃは４つの不連続ＴＧＥＶゲノム領域（Ｉ、II、III及びIＶ）を含んでいる。これらの領域は2.1kbのゲノム５'末端、ＯＲＦ１ａと１ｂ間の重複領域を含むほぼ完全なＯＲＦ１ｂ、遺伝子Ｓの開始部、不完全なＯＲＦ7及び非翻訳領域３'を含んでいる。親ゲノムの箱の上部の文字と数字はウイルス遺伝子を示している。箱の下部の数字は、ＴＧＥＶ ＰＵＲ46-ＰＡＲ単離物の配列を参照して、不連続領域のフランキングヌクレオチドの親ゲノム中の位置を示している。ＲＮＡ ＤＩ-Ｃに対応する箱には４つの不連続領域の長さをヌクレオチドで示している。３番目の箱では、ＯＲＦ１ａと１ｂの43個のヌクレオチドが親ゲノム中で互いに重なっていることを考慮に入れて、各ウイルス遺伝子から誘導されるヌクレオチドの数を示している。コンピューター分析で予測されたＯＲＦは矢印又は簇で示している。Ｐnt、プソイドノット；Ｐol、ポリメラーゼ；Ｍib、金属イオン結合部；Ｈel、ヘリカーゼ；Ｃd、保持ドメイン。
図14は、ＲＮＡ ＤＩ-Ｂの構造を示す。ＲＮＡ ＤＩ-ＢはＴＧＥＶゲノムの３つの不連続領域（Ｉ、II及びIII）を含有しており、そしてこれらは2.1kbのゲノム５'末端、ＯＲＦ１ａと１ｂ間の重複領域を含む完全なＯＲＦ１ｂ、遺伝子Ｓの開始部、ＯＲＦ7の終結部及び３'末端の非翻訳領域を含んでいる。親ゲノムの箱の上部の文字と数字はウイルス遺伝子を示している。箱の下の数字は、ＴＧＥＶ ＰＵＲ46-ＰＡＲ単離物の配列を参照して、不連続領域のフランキングヌクレオチドの親ゲノム中の位置を示している。不連続領域IIとIIIの間に生じている欠失の大きさが不均一性であるためＤＩ-Ｂゲノム集団が実際に存在している。２番目と３番目の箱では、それぞれ最大及び最小の大きさのゲノムについて３つの不連続領域のヌクレオチドの長さを示している。３番目の箱では、ＯＲＦ１ａと１ｂの43個のヌクレオチドが親ゲノム中で互いに重なっていることを考慮に入れて、各ウイルス遺伝子から誘導されるヌクレオチドの数を示している。コンピューター分析で予測されたＯＲＦは矢印又は簇で示している。Ｐnt、プソイドノット；Ｐol、ポリメラーゼ；Ｍib、金属イオン結合部；Ｈel、ヘリカーゼ；Ｃd、保持ドメイン。
図15は、ＲＮＡ ＤＩ-Ｃ中のＯＲＦ１ａと１ｂ間の重複領域のＲＮＡの二次及び三次構造を示す。（Ａ）はプソイドノット（ヌクレオチド2354〜2358）を構成するノットのヌクレオチドに相補性を示すフォーク様構造に最も近接した領域を考慮したとき予測された構造。スリッパリィ配列ＵＵＵＡＡＡＣには下線が引かれている。ＯＲＦ１ａ終結コドンが箱で示されている。（Ｂ）は２つの配列相補性部分（幹：Ｓ1及びＳ2）を含んでいる上記プソイドノットの概略図。スリッパリィ配列は箱で示されている。（Ｃ）はプソイドノットの折り畳み中のヌクレオチド2489から2493の配列を考慮に入れた別のモデル。この構造は更なる相補性配列（幹）部分を含んでいる。（Ｄ）は３つの幹に印を付けたプソイドノットの概略図：Ｓ1、Ｓ2及びＳ3。
図16は、ノーザンブロットアッセイでウイルスに特異的なオリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成によるＲＮＡ ＤＩのマップ作成を示す。ＴＨＥＲ-1-ＳＴｐ41ウイルスのＲＮＡは、親ゲノムＲＮＡ並びにＤＩ Ａ、Ｂ及びＣが明白に分離されるまでアガロースゲルで分画した。ＲＮＡをナイロンフィルターに移し、そしてこれは32Ｐiで標識した数個のオリゴヌクレオチドとハイブリッドを形成し、親ゲノムとハイブリッドを形成し（＋）そして欠陥ゲノムとハイブリッドを形成し（＋）又は形成しなかった（−）。親ゲノムのオリゴヌクレオチドと相補的な配列の凡その位置は矢印で示されている。これらの正確な配列と位置は表３に示す。これらのオリゴヌクレオチドは全て親ゲノムとハイブリッドを形成し、そしてＲＮＡ Ｂ及びＣと予想される結果を示した。
図17は、ＲＮＡ ＤＩ-Ｃで感染させた細胞のトランスフェクションによってワクチン用ウイルスを取得する方法の概略を示す。元の欠陥粒子中に存在する５'及び３'末端を維持し乍ら、インビトロ転写によってＤＩ-Ｃ ＲＮＡの産生を可能にした構築に関する標準的な概略を示す。Ｔ7プロモーター［ＰrＴ7］の配列及び肝炎デルタウイルス（ＨＤＶ）の自己触媒リボザイム［Ｒz ＨＤＶ］の配列をＤＩ-Ｃ ＲＮＡ配列のフランキングにクローン化した。リボザイムで導入された自己触媒開裂位置は配列の上部に印が付けられている。矢印はＲＮＡ ＤＩ-Ｃ中の天然形態で維持された内部転写プロモーター配列の位置を示す。Ｌ、リーダー。Ｔ7φ、Ｔ7バクテリオファージ転写終結シグナル。異種遺伝子がクローン化されている欠陥ゲノムとヘルパーウイルスの両方がキャプシド内に入っているビリオンは、インビトロで転写されたＲＮＡを対応するヘルパーウイルスで感染させたＳＴ細胞中にトランスフェクションしたときに回収された。
図18は、元の欠陥粒子中に存在する３'及び５'末端を維持し乍ら、インビトロ転写によってｐＤＩＡ-６Ａ．Ｃ３の産生を可能にした構築の標準的な概略を示す。バクテリオファージＴ7プロモーター［ＰrＴ7］の配列及び肝炎デルタウイルス（ＨＤＶ）の自己触媒リボザイム［ＲzＨＤＶ］の存在は、自己複製ＲＮＡをコードするｃＤＮＡ配列のフランキングにクローン化した。プラスミドｐＤＩＡ-６Ａ．Ｃ３は、ＴＧＥＶを無効化するモノクローナル抗体６Ａ．Ｃ３をコードする遺伝子を含有している［実施例４参照］。異種遺伝子のクローニングは、Ｓ遺伝子開始コドン（ＡＵＧ）に続くＯＲＦ１ｂの後にそしてこの遺伝子の読取り相内に実施した（ＩＧＳ：遺伝子間配列；Ｌ：リーダー配列；Ｄ：多様性領域；Ｊ：結合領域；ＶＨ：免疫グロブリンＨ鎖の可変モジュール；ＣＨ：免疫グロブリンＨ鎖の定常モジュール；ＶＫ：免疫グロブリンＬ鎖の可変モジュール；ＣＫ：免疫グロブリンＬ鎖の定常モジュール；ポリＡ：ポリＡ配列；Ｔ7φ：Ｔ7転写ターミネーター）。
発明の詳細な説明
本発明は、種々の動物種の種々の感染作用物に対する免疫応答の誘発に適する少なくとも１つの抗原、又は感染作用物に対して保護を与え、高い安全性とクローニング能力を有する抗体を発現する組換え欠陥ウイルスゲノムに基づいて異種ＤＮＡベクターを提供し、そしてこれらベクターはそれらの種特異性及び向性を容易に制御できるように設計することができる。
本明細書で使用される意味における用語「感染作用物」には、動物を感染させそして病理学を生じさせ得るウイルス、細菌又は寄生虫感染作用物が含まれる。
用語「動物種」には、任意の種の動物、通常は哺乳動物、そして特にブタ、イヌ又はネコが含まれる。
本発明の特別な具体化では、全身性及び分泌性免疫応答の誘発、粘膜感染の予防に適する抗原を発現する組換え欠陥ウイルスゲノムに基づいて、種特異性や腸又は呼吸器粘膜の感染に対する向性を容易に制御できるように設計され、そしてそれによって、腸管の感染に対する新生動物の保護に特に有益な粘膜及び乳腺刺激性免疫の誘発に完全に適合されている発現ベクターが得られる。本発明のもう１つの特別な具体化では、感染作用物に対する保護を提供する少なくとも１つの抗体を発現する組換え欠陥ウイルスゲノムに基づく発現ベクターが提供される。
本発明によって取得される発現ベクターは、ウイルス、好ましくはＲＮＡゲノムと正の極性を有するウイルスから誘導され、親ウイルスの３'及び５'末端を維持し、内部欠失を有しそしてその複製をヘルパーウイルスに依存する欠陥ウイルスゲノムを含んでいる。それ故、本発明は３'及び５'末端に位置するウイルスレプリカーゼ認識シグナルを有する親ウイルスのゲノムを追加的に含んでおり、更に内部欠失も含んでいる欠陥ウイルスゲノムを提供し、そしてこの欠陥ウイルスゲノムは組換え欠陥ウイルスゲノムの複製及びキャプシド化用の機能及び構造タンパク質を供給するヘルパーウイルスに依存している。特別な具体化では、欠陥ウイルスゲノムは、追加的に、親ウイルスレプリカーゼをコードする完全な配列を含んでいる。この場合には、希望する場合、ヘルパーウイルスは組換え欠陥ウイルスゲノムのキャプシド化に必要な構造タンパク質だけを提供するか、又はそうではなくて組換え欠陥ウイルスゲノムの複製及びキャプシド化用の機能及び構造タンパク質を提供することができる。組換え欠陥ゲノムが由来するウイルスがＲＮＡゲノムを有するウイルスであるとき、発現ベクターは上記した欠陥ＲＮＡと相補的なｃＤＮＡ又は上記した欠陥ＲＮＡと実質的に相補的なｃＤＮＡを含んでいる。
本発明によって提供されるベクターは高いクローニング能力−少なくとも18kb−を有しており、これはＲＮＡ真核ウイルスに基づくベクターで記載された最大のクローニング能力である。更に、これらのベクターは、（ａ）欠陥ゲノムに基づいており、（ｂ）ＲＮＡゲノムを含んでおり且つ複製中間体としてＤＮＡを使用しておらず、そしてｃ）感染細胞の細胞質中で増殖するウイルスに基づいており、これらａ）〜ｃ）は全て欠陥ゲノムと細胞染色体との組換えを妨げるので、安全性レベルが高い。
本発明の特別な具体化では、コロナウイルスから、特にＴＧＥＶから誘導される欠陥ＲＮＡゲノムの取得を記載する。これらのゲノムは非常に低いＴＧＥＶ組換え頻度（＜１×109）という更なる利点を有しており、そしてこれによって欠陥ゲノムとヘルパーウイルスゲノムとの容易な組換えが妨げられる。しかし乍ら、たとえこの組換えが実際に生起したとしても、本発明は弱毒ウイルスをヘルパーウイルスとして且つ欠陥ゲノム取得用の出発材料として使用することの便宜性を意図しているので、弱毒ウイルスが得られよう。
このようなベクターの基礎を構成する欠陥ゲノムは、これらが誘導されるウイルスの非希釈連続継代によって種々の細胞系で得ることができる。ＤＩ粒子の産生頻度は種々のウイルス−細胞系で非常に変動する可能性がある；この理由のため、適当な単離物及び細胞系統を選択するという目的で種々の細胞系統中で種々のウイルス単離物を用いて継代物を作ることが推奨される。或る継代数後に、ウイルスを単離し、そしてその後、これを使用してどのウイルスｍＲＮＡにも対応しないバンドの出現の可能性を観察する目的で、感染で産生された細胞内ＲＮＡを分析し、そして上記のバンドが出現した場合には、これらの新しいＲＮＡの性質−サブゲノムかそれとも欠陥か−を分析するために、親ウイルスを用いた非希釈連続継代を継続する。数回の継代の後に、連続継代中のＲＮＡパターンの進展を分析し、そしてこの目的で、適当な細胞系の細胞を種々の継代物から生じるウイルスで感染させ、そして産生されたＲＮＡは慣用の技術、例えば、３２Ｐｉによる代謝物標識又は適当なオリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成によって分析する。ＴＧＥＶから誘導される幾つかの欠陥ＲＮＡの取得及び特徴決定に関する詳細な説明は実施例１で行う。
欠陥ＲＮＡでは、逆転写（ＲＴ）反応及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅（以下、ＲＴ-ＰＣＲ）によって上記欠陥ＲＮＡに−相補的な又は実質的に相補的な−対応するｃＤＮＡを取得することができる。この後ｃＤＮＡを有効なプロモーターの制御下で適当なプラスミド、例えばブルースクリプト（Ｂluescript）IIにクローン化することができる。得られたプラスミドは、複製の調節及び制御用並びに転写及び翻訳の開始及び終結用のシグナルを含有する幾つかの調節要素で制御される欠陥ウイルスゲノムを含有している。それ故、これらのプラスミドはポリＡ配列、自己触媒切断配列又は異種ＤＮＡの挿入を可能にする制限酵素認識配列、並びに対応する調節、制御及び終結シグナルを含有することができる。
このようにして得られ、欠陥ゲノム又は対応するｃＤＮＡを含有するプラスミドは、欠陥ゲノム中に存在する遺伝子のプロモーター若しくは該欠陥ゲノムが由来するウイルスの他の任意のプロモーター又はこれらプロモーターの改変体と、得られた発現ベクター中に含まれる調節配列の制御下で特定の活性をコードする少なくとも１つの異種ＤＮＡ配列を高い効率でクローン化するために、慣用の遺伝子工学技術で操作することができる。実施例２は、種々のウイルスに対して保護を誘発する抗原をコードする発現ベクターの産生を記載している。
本発明で得られる発現ベクターは１つ若しくはそれより多い活性、例えば、種々の感染作用物に対して免疫応答を誘発し得る１つ若しくはそれより多い抗原、又は１つ若しくはそれより多い感染作用物に対して保護を提供する１つ若しくはそれより多い抗体を発現することができる。１つの特別で且つ好ましい具体化では、これらのベクターは、呼吸器又は腸粘膜で増殖する種々の感染作用物に対して全身性免疫応答又は粘膜性免疫応答を誘発し得る少なくとも１つの抗原を発現する。もう１つの特別で且つ好ましい具体化では、上記発現ベクターは、感染作用物に対して保護を与える任意のイソタイプ（例えば：ＩgＧ１、ＩgＡ等）の抗体のＨ及びＬ鎖をコードする少なくとも１つの遺伝子を発現する。特別の場合には、発現される抗体はＴＧＥＶを無効化する６Ａ．Ｃ３として同定されるモノクローナル抗体であり（実施例４参照）、そしてこれは免疫グロブリンの定常部分がブタ起源であるイソタイプＩgＧ１又はＩgＡと共に発現される。
本発明の特別な具体化では、誘導された欠陥ＲＮＡの１つのｃＤＮＡを含有するプラスミド中の異種遺伝子のクローニングは、Ｓ遺伝子開始コドン（ＡＵＧ）に続くＯＲＦ１ｂの後にそしてこの遺伝子の読取り枠内に行われた（実施例２）。或いは、異種ＤＮＡ配列はこのゲノムの他の領域、例えば、ＴＧＥＶのＯＲＦ１、２又は３に対応する領域にクローン化することができる。得られたプラスミドから、適当なポリメラーゼを使用してＲＮＡを発現させ、そしてこれで適当な細胞−弱毒ヘルパーウイルスで前以て感染させた−を形質転換し、ヘルパーウイルスゲノムを含有するビリオン及び欠陥ゲノムを有する他のビリオンを回収することができた（図17）。
或いは、本発明の発現ベクターは、上記方策を使用して１つ又は幾つかの遺伝子を発現させることができる。この目的のために、１つ若しくは幾つかのプロモーター又は１つのプロモーターと幾つかの内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、或いは幾つかのプロモーターと１つの内部リボソーム侵入部位を使用することができる。
本発明は、（ａ）上記したベクター及び（ｂ）組換え欠陥ウイルスゲノムの複製及びキャプシド化に関与するタンパク質を助けるヘルパーウイルスを含んでいる異種タンパク質を発現する組換え系も提供する。それ故、異種タンパク質発現用の組換え系が、少なくとも１つの特定の活性を有するタンパク質を発現する組換え欠陥ウイルスゲノムに基づいて提供され、該系は：
ａ）ｃＤＮＡが得られている場合には、慣用の遺伝子工学によって操作することができる欠陥ウイルスゲノムを含有し、３'及び５'末端に位置するウイルスレプリカーゼ認識シグナルを含有し、追加的に内部欠失や１つの活性、例えば全身性及び粘膜性免疫を与え得る抗原；若しくは感染作用物に対して保護を与える抗体をコードする少なくとも１つの内部ＤＮＡ配列を含んでいる組換えベクター；並びに
ｂ）欠陥ゲノムの複製及びキャプシド化用の機能及び構造タンパク質を提供するヘルパーウイルス、
を含んでいる。
或いは、上記の異種タンパク質発現用組換え系は、親ウイルスレプリカーゼをコードする完全な配列を含んでいる上記したタイプの発現ベクター、及び欠陥ゲノムのキャプシド化用の構造タンパク質と、任意に、欠陥ウイルスゲノムの複製用の機能タンパク質（レプリカーゼ）を提供するヘルパー親ウイルスを含んでいる。
これらの系によって、感染作用物に対して免疫応答を誘発し得る抗原か又は保護を与える抗体のどちらかを発現することができ、そしてこのため、これらの系はワクチン目的でそして感染に対する保護のために使用するのに適している。
本発明はまた、種々の動物種において種々の感染作用物によって生じる感染に対して保護を誘発し得るワクチンも提供し、そしてこれらのワクチンは（ｉ）（ａ）異種ＤＮＡ配列がクローン化されている欠陥ウイルスゲノムに基づく発現ベクターと（ｂ）欠陥ゲノムの複製に一緒になって協力するヘルパーウイルスからなる上記組換え系、任意に、（ii）製薬的に許容可能な賦形剤を含んでいる。それ故、本発明で提供されるワクチンは種々の動物種に影響を与える種々の感染作用物に対して免疫を与えるのに適している。
本明細書で使用した意味においては「免疫を与えること」は、上記した組換え系によって適当なメカニズム、例えば抗原提供細胞、Ｂ及びＴリンパ球、抗体、細胞の免疫応答を高める物質（インターロイキン、インターフェロン等）、細胞壊死因子並びに病原性作用物によって生じた感染に対して動物に保護をもたらす類似物質がレセプター生物（治療される動物）で開始することを意味すると理解すべきである。
本発明で提供されるワクチンは、組換え系に存在する発現ベクターが１つ又はそれより多い感染作用物に対して免疫応答を誘発し得る１つ又はそれより多い抗原を発現するかどうかに依存して、単価又は多価であることができる。発現ベクターは、１つ又はそれより多い感染作用物に対して保護を与える１つ又はそれより多い抗体を発現するかどうかに依存して、単価又は多価であることができる。
種特異性は、ヘルパーウイルスが対応する種の細胞レセプターによる認識に適しているエンベロープタンパク質を発現するような方法で制御される。本発明で得られるワクチンの特別の群はコロナウイルス、好ましくはブタ、イヌ又はネココロナウイルスをヘルパーウイルスとして含んでいる。
これらのワクチンは、特にブタ、イヌ及びネコ種に影響を与えるか、粘膜に感染するか又は侵入経路として粘膜を経由する感染作用物に対して処方される。
本発明の特別な具体化によって、種々のブタ、イヌ及びネコの感染作用物に対してブタ、イヌ及びネコを保護し得る単価ワクチンが提供され、そして向性はコロナウイルスのＳ糖タンパク質を発現することによって制御される。
ブタ感染作用物に対する単価ワクチンは、以下のブタ病原体：アクチノバシラス  プルロニューモニエ（pleuropneumoniae）、アクチノバシラス  スイス（suis）、ヘモフィルス  パラスイス（parasuis）、ブタ  パーボウイルス、レプトスピラ、大腸菌、エリジペロトリックス  ルシオパシエ（rhusiopathiae）、パスツレラ  マルトサイダ、気管支敗血症菌、クロストリジウム種、セルプリナ  ヒオジセンテリエ（hyodisenteriae）、マイコプラズマ  ヒオニューモニエ（hyopneumoniae）、ブタ流行性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）、ブタ呼吸器コロナウイルス、ロタウイルス、又はブタ繁殖性及び呼吸器症候群、アウジェスキー病（偽性狂犬病）、ブタインフルエンザ、伝染性胃腸炎を引き起こす病原体並びに萎縮性鼻炎及び増殖性回腸炎の病因学的物質の抗原から本質的になる群から選択される抗原を発現する発現ベクターを含有することができる。
イヌ感染作用物に対する単価ワクチンは、以下のイヌ病原体：イヌ  ヘルペスウイルス、イヌ  アデノウイルス１及び２型、イヌ  パーボウイルス１及び２型、イヌ  レオウイルス、イヌ  ロタウイルス、イヌ  コロナウイルス、イヌ  パラインフルエンザウイルス、イヌ  インフルエンザウイルス、ジステンパーウイルス、狂犬病ウイルス、レトロウイルス及びイヌ  カリチウイルスの抗原から本質的に構成される群から選択される抗原を発現する発現ベクターを含有することができる。
ネコ感染作用物に対する単価ワクチンは、以下のネコ病原体：ネコ  カリチウイルス、ネコ  免疫欠損症ウイルス、ネコ  ヘルペスウイルス、ネコ汎白血球減少症ウイルス、ネコ  レオウイルス、ネコ  ロタウイルス、ネコ  コロナウイルス、ネコ感染性腹膜炎ウイルス、狂犬病ウイルス、ネコオウム病クラミジア及びネコ白血病ウイルスの抗原から本質的に構成される群から選択される抗原を発現する発現ベクターを含有することができる。
これらのベクターは感染作用物、例えば、上記したようなブタ、イヌ又はネコ感染作用物に対して保護を与える抗体を発現することができる。特別な具体例では、ＶＧＰＴを無効化する６Ａ．Ｃ３として同定される組換えモノクローナル抗体を発現する幾つかのベクターが産生された。
本発明で得られるワクチンは乳腺刺激性免疫を誘発することによって子ブタを保護することができ、そしてこれは腸管の感染に対して新生子ブタを保護するのに特に有益である。
一般的に、本発明で得られるワクチンは、免疫化すべき動物に少なくとも108プラーク形成単位（pfu）の力価のヘルパーウイルスを導入し得る抗原量を含有する。
賦形剤として、生理学的食塩血清又は他の類似する食塩溶液のような希釈剤を使用することができる。同様に、これらのワクチンは、ワクチン製剤で通常使用されるようなアジュバント：水性物（水酸化アルミニウム、ＱuilＡ、アルミナゲル懸濁物等）又は油性物［鉱物油、グリセリド及び脂肪酸副生成物並びにこれらの混合物に基づく、例えば、Ｍarcol 52（ＥＳＳＯ Ｅspa ola Ｓ．Ａ．）、Ｓimulsol 5100（ＳＥＰＩＣ）及びＭontanide 888（ＳＥＰＩＣ）］を含有しても良い。
これらのワクチンは、細胞応答増強物質（ＣＲＰ）、即ちＴヘルパー細胞（Ｔh１及びＴh２）サブ集団増強物質、例えばインターロイキン１（ＩＬ-１）、ＩＬ-２、ＩＬ-４、ＩＬ-５、ＩＬ-６、ＩＬ-12、ｇ-ＩＦＮ（ガンマインターフェロン）、細胞壊死因子及びワクチンを接種した動物で理論的に細胞免疫を誘発し得る同様な物質を含有することもできる。これらのＣＲＰ物質は水性又は油性アジュバントを有するワクチン製剤中で使用することができよう。細胞応答を調節しそして免疫を刺激する他のタイプのアジュバント、例えばＭＤＰ（ムラミルジペプチド）、ＩＳＣＯＭ（免疫刺激剤コンプレックス）又はリポソームを使用することもできる。
本発明は、動物を種々の感染から予防しそして保護し得る多価ワクチンを提供する。これらの多価ワクチンは、対応する抗原をコードする種々の配列が同じ組換えベクターに挿入されている発現ベクターからか又はヘルパーウイルスと一緒に同時接種するためにその後混合される別個の組換えベクターを構築することによって製造することができる。それ故、これらの多価ワクチンは、発現ベクター自体が、１つより多い感染作用物をコードする１つより多いＤＮＡ配列を含有している組換え系を含んでいるか、又はそうではなくて、ワクチンの製造で使用される組換え系が、各々少なくとも１つの異なる抗原を発現する種々の発現ベクターを含有することができる。このタイプの多価ワクチンにおける実際上の制限は、上記した発現ベクターが同一の動物種の感染作用物の抗原を発現しなければならないということ及びヘルパーウイルスが上記の特定の種に対して適するものでなければならないということである。同様に、多価ベクターを含んでいる多価ワクチンは、抗原をコードする配列の代わりに感染作用物に対して保護を与える抗体をコードする配列を使用して製造することができる。これらのベクターは、１つより多い抗体をコードする１つより多いＤＮＡ配列を含有する発現ベクターか又は各々が少なくとも１つの異なる抗体を発現する種々の発現ベクターかのどちらかを含んでいる組換え系を含有し得る。
本発明の特別な具体化によって、それぞれ種々のブタ、イヌ及びネコ感染作用物に対してブタ、イヌ及びネコを保護し得るワクチンが提供される。この目的のために、ワクチンの組換え系に含有される発現ベクターは上記したブタ、イヌ又はネコ病原体の種々の抗原を発現しなければならない。
本発明のワクチンは液体又は凍結乾燥形態で提供することができ、そして組換え系を賦形剤中に懸濁して製造することができる。上記の系が凍結乾燥形態の場合、賦形剤自体は希釈剤であることができる。
或いは、本発明によって達成されワクチンは、一部としてか又は希釈剤としてか又は他の慣用若しくは組換えワクチンのどちらかで希釈される凍結乾燥フラクションとして、他の慣用のワクチンと組み合わせて使用することができる。
本発明で提供されるワクチンは経口、経鼻、皮下、皮内、腹腔内若しくは筋肉内経路によってエアゾールで動物に投与することができる。
本発明はまた、動物、特にブタ、イヌ及びネコを種々の感染作用物に対して同時に免疫化する方法−本発明で提供される免疫学的に有効な量の組換え系を含有するワクチンを、経口、経鼻、皮下、皮内、腹腔内若しくは筋肉内経路によってか又はエアゾールで（又はこれらを組合せた形態で）投与することを含んでいる−も提供する。
更に、本発明は、妊娠期間前又は中に、経口、経鼻、皮下、皮内、腹腔内及び筋肉内経路によってか又はエアゾールで（又はこれらを組合せた形態で）母親に又はこれらの子孫に、本発明で提供される免疫学的に有効な量の組換え系を含有するワクチンを投与することからなる、新生動物に感染する感染作用物から新生動物を保護する方法も提供する。
本発明は、欠陥ウイルスゲノムの取得、これらの特徴決定、プラスミドの構築及び発現ベクターを取得する目的でのこれらの操作並びに種々の種の種々の感染作用物に対する無効化抗体の誘発を詳細に記載している以下の実施例によって説明される。
実施例１
ＴＧＥＶから誘導される欠陥粒子の生成
１．１  高い感染多重度（m.o.i.）でのＴＧＥＶ株の非希釈連続継代
欠陥粒子の生成又はウイルス集団中に少ない比率で既に存在している欠陥粒子の賦課を促進するために、種々の非希釈ＴＧＥＶ単離物の連続継代を種々の細胞系中で実施した。ＤＩ粒子が生成する頻度は種々のウイルス−細胞系で非常に変動し得るので、継代はＳＴ（ブタ精巣、ブタ精巣上皮細胞）細胞系統中で種々のＴＧＥＶ単離物（ＴＨＥＲ-１及びＰＵＲ46-mar 1ＣＣ12）を用いて実施した。
株ＴＨＥＲ-１（伝染性胃腸炎ヘルパー腸及び呼吸器コロナウイルス、株１）はＰＵＲ46-ＭＡＤ株［Ｓ nchez等、Ｖirology 174、410〜417（1990年）］から誘導されるＳＴ細胞培養物中で20回継代して弱毒化した変異株である。株ＰＵＲ46-mar 1ＣＣ12もサンチェス（Ｓ nchez）等（上述）によって記載されている。
各ＴＧＥＶ株をＳＴ細胞中希釈しないで35回継代した。３つの場合における各々の最初の継代のm.o.i.は１個の細胞当たり100pfuであった。明確な細胞変性効果が観察されたとき−通常は、上記効果によって細胞単層の半分以上に影響があったとき−、感染後20時間から48時間（h.p.i.）の間に各継代の上清液を集め、そしてこの上清液の半量を次の継代の感染で使用した。継代数に伴うウイルス力価の変動は図４に示す。ウイルスの力価は各ウイルスの連続継代をとおして２対数単位の間の範囲であった。株ＴＨＥＲ-１の場合には、継代数30〜46における力価は最初の30回継代したものより低かった。
ＳＴ細胞中で35回継代されていたウイルスを使用して、感染で生じた細胞内ＲＮＡを分析した。感染後６時間から９時間の間に３２Ｐ１で代謝的に標識したＲＮＡを分析した［Ｍaniatis等、Ｍolecular cloning：実験室マニュアル、Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｌaboratory（1982年）］。ＴＨＥＲ-1-ｐ35感染（ＴＨＥＲ-１株ウイルスを高いm.o.i.で35回継代した）では、どのウイルスｍＲＮＡにも対応しない３つの強いバンドが観察された。これらのバンドはゲノムＲＮＡとＳ遺伝子メッセンジャーの間に位置していた（図５）。これらの新しいサブゲノムＲＮＡの性質を分析するために、株ＴＨＥＲ-１を用いて非希釈連続継代を継続した。46回の継代後、連続継代中のＲＮＡパターンの進展を分析した。この目的のために、ＳＴ細胞を種々の継代から得られたウイルスで感染させ、そして代謝的に標識された生成したＲＮＡを変性アガロースゲルで分析した（図５）。最初の継代ではゲノムＲＮＡとサブゲノムウイルスメッセンジャーしか検出されなかったが、継代数30では、22、10.6及び9.7kbの３つの新しいＲＮＡ（それぞれ図５でＤＩ-Ａ、ＤＩ-Ｂ及びＤＩ-Ｃとして示されているＲＮＡ Ａ、Ｂ及びＣ）が検出された。これらのサブゲノムＲＮＡはその後の15回の継代をとおして安定な形態のままであり、ゲノムＲＮＡの複製及びヘルパーウイルスのｍＲＮＡの合成に顕著に干渉した（図５、レーン30〜45）。これらの結果は、非希釈連続継代で生成するか又は増幅された３つのＲＮＡが安定であること及びこれらのうちの少なくとも１つが干渉していることを示している。
１．２  サブゲノムＲＮＡの特徴決定
１．２．１  末端及び内部領域の分析
サブゲノムＲＮＡ Ａ、Ｂ及びＣがコロナウイルス欠陥ＲＮＡの標準的な構造を有しているかどうか、そして特に、これらが野生ゲノムの５'及び３'末端を保持しているかどうかそしてその小さいサイズが内部欠失によるものかどうかを決定するために、このウイルスに特異的なプローブを用いて幾つかのハイブリッド形成アッセイを実施した。この目的のために、ＴＨＥＲ-1-ＳＴｐ35ウイルス（ＳＴ細胞中で35回継代したＴＨＥＲ-１株ウイルス）で感染させた細胞からＲＮＡを抽出し、そしてそのハイブリッド形成は、リーダー及びウイルス３'末端配列と相補的なオリゴヌクレオチドを使用して、ノーザンブロットアッセイ（Ｍaniatis等、上述）で特定のウイルスプローブを用いて分析した。各々の場合に、ＴＨＥＲ-1-ｐ１ウイルス（ＳＴ細胞中で１回継代した株ＴＨＥＲ-１ウイルス）で感染させた細胞及び非感染ＳＴ細胞（ＮＩ）から得られたＲＮＡ（それぞれ、各フィルターのレーン１及び２）を対照として使用した。プローブとして使用したオリゴヌクレオチドはリーダーＲＮＡ（親ゲノムの５'末端の66〜91位）、３'末端の非翻訳領域（親ゲノムの５'末端のヌクレオチド28524〜28543）及び構造遺伝子Ｍ及びＮ（それぞれ、各遺伝子のプライマーＡＵＧから始まる97〜116及び5〜24位）と相補的である。
図６に示されるように、２つのオリゴヌクレオチドは全ての親ウイルスｍＲＮＡとハイブリッドを形成し、そしてこれらはＲＮＡ Ａ、Ｂ及びＣも検出したので、これらのＲＮＡには内部欠失がありそして末端は維持されていることが示された。これらのＲＮＡ中にどのゲノム配列が存在するのかに関する分析の最初の試みとして、感染細胞のＲＮＡを、構造ウイルスタンパク質Ｓ、Ｍ及びＮの遺伝子と相補的なオリゴヌクレオチドとハイブリッド形成させた。これらのどれも欠陥ＲＮＡとはハイブリッドを形成せず、構造タンパク質遺伝子が欠失されていることが示唆された。かくして、サブゲノムＲＮＡ Ａ、Ｂ及びＣは親ウイルス末端を維持しそして内部欠失を有している。
１．２．２  ＲＮＡ Ａ、Ｂ及びＣの増殖
ＲＮＡ Ａ、Ｂ及びＣが、培養中の増殖を親ウイルスに依存する欠陥ゲノムであることを証明するために、ＳＴ細胞を種々のm.o.i.：10、0.1、0.01及び0.001pfu／細胞のウイルスＴＨＥＲ-1-ＳＴｐ41（ＳＴ細胞中で41回継代したＴＨＥＲ-１株ウイルス）で感染させた。この継代から得られ、10h.p.i.で集めたウイルスを滴定し、そしてＳＴ細胞中で更に１回継代して増幅させ、そしてこれを順次使用して、細胞質ＲＮＡを抽出した（Ｍaniatis等、上述）新しい細胞を感染させた。ＲＮＡはリーダーＲＮＡと相補的なオリゴヌクレオチドを使用してノーザンブロットアッセイで分析した。図７は得られた結果を示す。m.o.i.は各レーン上に示す（10−３、10−２、10−１及び10pfu／細胞）。陰性対照として、ＴＨＥＲ-1-ｐ1ウイルスでＳＴ細胞を感染させて得られたＲＮＡが含まれており、そしてこれは10pfu／細胞のm.o.i.のサブゲノムＲＮＡを含有していない（第１レーン）。10pfu／細胞のm.o.i.のＴＨＥＲ-1-ＳＴｐ41ウイルスによる感染に対応するレーン、陽性対照では、ゲノムＲＮＡ（ｍＲＮＡ １）が標識されており、そして欠陥ＲＮＡ Ａ、Ｂ及びＣ（ＤＩ-Ａ、ＤＩ-Ｂ、ＤＩ-Ｃとして示されている）並びに対応するＳ遺伝子（ｍＲＮＡ ２）が標識されている。
最初の継代（これに続く継代が増幅継代であるのでこの実験における隘路）のm.o.i.が0.1pfu／細胞又はこれ未満であるとき、ウイルスのゲノムＲＮＡ及びｍＲＮＡが予想された割合で検出される条件下でＲＮＡ Ａ、Ｂ及びＣの消失が観察される（図７）。m.o.i.が10pfu／細胞であるとき、３つの欠陥ＲＮＡは維持されている。ＲＮＡ Ａ、Ｂ及びＣが、感染に使用したＴＨＥＲ-1-ｐ41ウイルス中のゲノムＲＮＡより高い割合で見い出されるので、これらの結果は、これらのＲＮＡの複製又は増殖には細胞が欠陥ウイルスによってそして更にはヘルパーウイルスによっても感染される必要があることを示している。かくして、ＲＮＡ Ａ、Ｂ及びＣには、トランスで提供されるヘルパーウイルスの機能が必要である。それ故、ＲＮＡ Ａ、Ｂ及びＣは、増殖をヘルパーウイルスに依存している欠陥ゲノムである。
１．２．３  別の細胞系統におけるＤＩ ＲＮＡのインビトロ産生、増幅、増殖及び干渉
ＲＮＡ ＤＩのインビトロ産生、増幅、増殖及び干渉は細胞系統に特異的であり、そしてこの理由により、細胞系統の変化が欠陥ＲＮＡに対して有する影響について試験した。この目的のために、ＴＨＥＲ-1-ＳＴｐ46ウイルス（ＳＴ細胞中、高m.o.i.で46回継代したＴＨＥＲ-１ウイルス）を、ブタ腸上皮細胞（ＩＰＥＣ）及びブタマクロファージ（ＰＭ）中で新しい一連の非希釈継代に付した。図８はＩＰＥＣ中10回までの継代（図８Ａ）とＰＭ中５回までの継代（図８Ｂ）での力価の変動と継代数を示す。両細胞系統でのウイルス収量はＳＴ細胞中で得られた収量より低く、そして各継代のm.o.i.は20から0.2pfu／細胞の間の範囲で変動したと推定される。
ＴＨＥＲ-1-ＳＴｐ46-ＩＰＥＣｐ1（ＩＰＥＣ細胞中で１回継代したＴＨＥＲ-1-ＳＴｐ46ウイルス）及びＴＨＥＲ-1-ＳＴｐ46-ＩＰＥＣｐ10（ＩＰＥＣ細胞中で10回継代したＴＨＥＲ-1-ＳＴｐ46ウイルス）を３２Ｐｉで標識しそして変性アガロースゲルで分析した（図８Ｃ）。
ＴＨＥＲ-1-ＳＴｐ46-ＰＭｐ1ウイルス（ＰＭ細胞中で１回継代したＴＨＥＲ-1-ＳＴｐ46ウイルス）及びＴＨＥＲ-1-ＳＴｐ46-ＰＭｐ5（ＰＭ細胞中で５回継代したＴＨＥＲ-1-ＳＴｐ46ウイルス）で感染させたＳＴ細胞のＲＮＡは、リーダーＲＮＡと相補的なオリゴヌクレオチドを用いてノーザンブロットアッセイで分析した（図８Ｃ）。
結果は図８Ｃに見られ、そしてこれは両細胞系統中で１回の継代では３つの欠陥ＲＮＡが残っていたが、ＰＭ中での少なくとも５回の継代とＩＰＥＣ中での少なくとも10回の継代ではＲＮＡ Ａしか残らなかったことを示している。両方の場合で、野生ゲノム（１）に対応するＲＮＡ、即ちＲＮＡ Ａ、Ｂ及びＣ（それぞれ、ＤＩ-Ａ、ＤＩ-Ｂ及びＤＩ-Ｃ）並びにｍＲＮＡ２（タンパク質Ｓ）の位置に印が付けられている。ＴＨＥＲ-1-ＳＴｐ46-ＰＭｐ5ウイルスＲＮＡに対応するレーンではゲノムＲＮＡの位置が示されている−オートラジオグラフの暴露期間が図８Ｃで示された期間の10倍であったときにだけ観察される。
１．３  欠陥ゲノムのキャプシド化
欠陥ＲＮＡがキャプシド化能力を有しているかどうかを試験するために、ウイルスＴＨＥＲ-1-ＳＴｐ1（ＳＴ細胞中で１回継代したＴＨＥＲ-１ウイルス）及びＴＨＥＲ-1-ＳＴｐ41（ＳＴ細胞中で41回継代したＴＨＥＲ-１ウイルス）に対する部分的な精製を、15重量／容量（ｗ／ｖ）％のスクロースクッションで遠心して同時に実施した。ＲＮＡを精製ビリオンから抽出し、そして臭化エチジウム染色によってアガロースゲルで分析した（図９Ａ）。継代数41のビリオンでは、ＲＮＡ Ａ、Ｂ及びＣがゲノムＲＮＡと同じ強度で検出されたので、これら３つの欠陥ＲＮＡが効率的にキャプシド化することを示していた。
欠陥ゲノムが完全なゲノムと一緒にキャプシド化するのか、それとも反対に欠陥ゲノムが独立してキャプシド化するのかを決定するために、ＴＨＥＲ-1-ＳＴｐ41ウイルスを、スクロースクッションの密度を変えるか又は連続スクロース傾斜で遠心して精製した。各々の場合における精製ビリオンのＲＮＡを、リーダーＲＮＡと相補的なオリゴヌクレオチドを用いてノーザンブロットアッセイで分析した（図９Ｂ）。31％（ｗ／ｖ）のスクロースクッション（ｄ＝1.19ｇ／ml）で遠心を実施したとき、沈殿したビリオン中では野生ゲノムしか検出されなかった。しかし乍ら、15％（ｗ／ｖ）のより低い密度（ｄ＝1.11ｇ／ml）のスクロースクッションを使用したとき、完全なゲノムに加えて３つの欠陥ＲＮＡが検出された。連続スクロースクッション（15〜42％、ｗ／ｖ）では、図９Ｂのレーンｄ及びｅで示されるように、この傾斜の上部フラクション（1.15ｇ／mlに近い密度）に欠陥ビリオンを、そして下部フラクション（1.20ｇ／mlに近い密度）に標準的なビリオンを豊富化することができた。各レーンの上部バンドは野生型ゲノムと欠陥ゲノムＡ（ＤＩ-Ａ）に相当しそして下部バンドは欠陥ゲノムＢとＣ（ＤＩ-ＢとＤＩ-Ｃ）に相当する。これらの結果は、標準的なビリオンより軽い欠陥ビリオンでは、ＲＮＡ Ａ、Ｂ及びＣは効率的にキャプシド化し、そしてゲノムＤＩ-Ｂ及びＤＩ-Ｃ（10.6及び9.7kb）は野生型ゲノムとは別個にキャプシド化することを示している。
１．４  欠陥ＲＮＡ Ｂ及びＣのクローニング及び配列決定。これらの一次構造の決定。
１．４．１  相補的ＤＮＡの合成及びＲＮＡ Ｂ及びＣの増幅
欠陥ＲＮＡ Ｂ及びＣの大きさは、電気泳動ゲルにおける移動性に基づいて、それぞれ10.6及び9.7kbと推定されていた。これらの大きさが大きいため、ゲノム末端と相補的なプライマーを使用して単一の逆転写酵素及びポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ-ＰＣＲ）で上記欠陥ＲＮＡを増幅することはできなかった。この制限を克服するために、４つの重複フラグメントが全ての場合にゲノム全長をカバーできるようにするプライマー対を使用して、欠陥ゲノムを４つの別々の反応で増幅させた。５'末端から３'末端に並べたこれらの重複フラグメントはａ、ｂ、ｃ及びｄと称した（図10）。精製ビリオンから抽出したＴＨＥＲ-1-ＳＴｐ41ウイルスＲＮＡを鋳型として使用した。このＲＮＡは、親ゲノムに加えて、３つの欠陥ＲＮＡ Ａ、Ｂ及びＣを含有していた。対照として、ＴＨＥＲ-１野生ウイルスのゲノムＲＮＡの増幅を同時に実施した。
ＲＴ-ＰＣＲ反応でプライマーとして使用したオリゴヌクレオチドの配列と位置を表２に示す。
0003769300.tif 000002
プライマー１及び２を用いてＲＴ-ＰＣＲでＴＨＥＲ-1-ＳＴｐ41ウイルスＲＮＡと親ウイルスＴＨＥＲ ＲＮＡを増幅すると1.9kbのＰＣＲ生成物が主として生じた（図11、フラグメントａ）。小さいバンドが２つのレーンに見られるので、この反応で観察されたこれらの小さいバンドは非特異的なハイブリッド形成によるものである。同じＲＴ-ＰＣＲ反応を、ゲル精製物から抽出したＤＩ-Ｂ及びＤＩ-Ｃ ＲＮＡのプールを含有するアガロースフラクションから出発して実施したが、結果は同じであった。これは、フラグメントａが全てのＲＮＡ ＤＩに共通でありそして野生ＴＧＥＶゲノムの５'末端の1.9kb領域に相当することを示している。
ＴＨＥＲ-1-ＳＴｐ41ウイルスＲＮＡから出発し、オリゴヌクレオチド３及び４を用いて増幅すると2.8kbの特有のＰＣＲ生成物が生じた（図11、フラグメントｂ）。予想される生成物の大きさが12kbであるようなＰＣＲ生成物はＴＨＥＲ-１対照ウイルスＲＮＡからは得られなかった。これらのデータに基づいて、少なくとも１つの欠陥ゲノムは2.8kbの１つのｂフラグメントを有しており、そしてその他の欠陥ゲノムは同じフラグメント又はより大きいフラグメントを有しているが、これは大きさが大きいためＰＣＲ反応では検出可能でないと推論することができる。
親ゲノム中4.6kbで分離されたオリゴヌクレオチド５及び６は、ＴＨＥＲ-1-ＳＴｐ41ウイルスＲＮＡから得られる3.5及び4.6kbの２つの異なる生成物を生じさせた（図11、フラグメントｃ）。4.6kbの生成物は対照として使用した野生ウイルスＲＮＡからも得られた。これらの結果は、少なくとも１つの欠陥ゲノム中（多分、最も豊富な欠陥ゲノムであるＤＩ−Ｃ中）ではフラグメントｃが１つの欠失を含有しており、ＰＣＲによって3.5kbのフラグメントを生じさせたことを示唆している。4.6kbのフラグメントは、ＴＨＥＲ-1-ＳＴｐ41ウイルスＲＮＡ集団中に存在する親ゲノムとこのゲノム領域を維持している欠陥ゲノムに由来している。
親ウイルスゲノムＲＮＡのプライマー７及び８を用いたＲＴ−ＰＣＲによる増幅では、これらのオリゴヌクレオチド間の分離が完全ゲノムでは9.5kbである（図10）ので、バンドは生じなかった（図11、フラグメントｄ）。対照的に、ＴＨＥＲ-1-ＳＴｐ41ウイルスＲＮＡを鋳型として使用したとき、1.9及び2.1kbの２つの非常に強いバンドが観察された。これらのバンドは多分1.9kbバンド周辺のより小さいバンド群と一緒に移動するのでフラグメントｄに相当する幅広い連続バンドとして現れ、ゲルでの解像が妨げられる（図11）。異種混交性は、クローニングフラグメントｄの大きさで観察された（以下参照）。
１．４．２  増幅生成物（ａ、ｂ、ｃ及びｄ）の種々の欠陥ＲＮＡへの割当て
大きさが1.9から2.1kbの間で変動するｄフラグメントを種々の欠陥ゲノムに割り当てるために、鋳型として使用したＴＨＥＲ-1-ＳＴｐ41ウイルスＲＮＡを、野生ゲノム、ＤＩ-Ａ、ＤＩ-Ｂ及びＤＩ-ＣのＲＮＡに対応するバンドが明確に分離されるまでアガロースゲルで分画した。これら４つのＲＮＡの各々に対応するバンドを別々に切り取り、そしてオリゴヌクレオチド８及び９を用いたＲＴ-ＰＣＲの増幅反応で鋳型として使用した。精製したゲノムバンドＲＮＡから出発しても、ＰＣＲ生成物は全く得られなかった。ＲＮＡ ＤＩ-Ｂから主として1.9kbのＰＣＲ生成物が得られたが、大きさが1.9kb近くで変動するＤＮＡも少し得られ、この領域における或る種の異種混交性が示される。ＲＮＡ ＤＩ-Ｃの増幅によって2.1kbのＰＣＲ生成物が主として生じた。これらの結果から、1.9kbのフラグメントは欠陥ＲＮＡ Ｂに、そして2.1kbのフラグメントはＲＮＡ ＤＩ-Ｃに割り当てることができた。
ｄフラグメントが割り当てられると、プライマー５及び６で得られた3.5及び4.6kbのｃフラグメントはそれぞれ欠陥ＲＮＡ Ｃ及びＢに割り当てられた。何となれば、この割当てから生じるフラグメントａ〜ｄは全て、各々の場合に移動性で推定されたＲＮＡ Ｂ及びＣの大きさと一致したからである。
ゲノムＢ及びＣの完全な配列が決定されると、フラグメントの割当ては、特定の欠失の側部に位置するオリゴヌクレオチドを使用して、各精製バンドのＲＮＡの増幅によって証明された。フラグメントの割当てはまた、ＤＩ-Ｃには存在しないＤＩ-Ｂ領域とＤＩ-Ｂには存在しないＤＩ-Ｃ領域をマップ化したオリゴヌクレオチドを使用して、ノーザンブロットアッセイでも確認された。
１．４．３  重複フラグメントａ、ｂ、ｃ及びｄのクローニング及び配列決定
ＲＮＡ Ｃと相補的な４つの重複ＤＮＡフラグメントａ（1.9kb）、ｂ（2.8kb）、ｃ（3.5kb）及びｄ（2.1kb）をブルースクリプト（Ｂluescript）ＳＫ−にクローン化した。別々のＲＴ-ＰＣＲ反応から誘導された少なくとも２つのクローンの配列が決定された。種々のクローン中で一致しなかった位置の配列（多分Ｔaqポリメラーゼのエラー）は、対応する非クローン化ＰＣＲ生成物から直接決定した。この手順後に、ＲＮＡ ＤＩ-Ｃコンセンサス配列が決定された。Ｔaqポリメラーゼの１エラーの平均は各コピーの1.2kbであった。ＤＩ-Ｃゲノムの完全な配列は図12に示す。
このようにして得られた完全なＲＮＡ ＤＩ-Ｃ配列は、ＰＵＲ46-ＰＡＲウイルスのＯＲＦ１ａ及び１ｂ配列［Ｅleouet等、Ｖirology 206、817〜822（1995年）］や他のＴＨＥＲ-１ウイルスのＯＲＦについて我々の研究室で決定した配列と比較した。完全なＲＮＡ ＤＩ-Ｃ配列では、株ＰＵＲ46-ＰＡＲの配列の比較で14個ヌクレオチドの差異が見い出された。ゲノム欠陥ＲＮＡ ＤＩ-Ｃの特異的な変化を特定するために、株ＴＨＥＲ-１、即ち欠陥ゲノムの親ウイルス中のこれらの位置の配列を決定した。ＤＩ-Ｃ ＲＮＡ配列は、対応する親ウイルスの配列と比較して僅か３つのヌクレオチドの差異と、ＯＲＦに何も影響を与えない9189位での１個の挿入しか示さなかった（図12）。
１．４．４  ＤＩ-Ｃ及びＤＩ-Ｂゲノムの一次構造
配列データによって、ＤＩ-Ｃゲノムは４つの不連続親ゲノム領域から構成され（図13）、そしてこれらの領域は：ａ）このゲノムの５'末端の2144個ヌクレオチド；ｂ）ＯＲＦ１ａと１ｂ間の重複領域及びＯＲＦ 1bの５'の凡そ半分を含んでいる親ゲノムの12195位から16734位間の領域に対応する4540個ヌクレオチド；ｃ）野生ゲノムの17843〜20372位に対応しそしてＯＲＦ1bの３'の半分と第８遺伝子Ｓヌクレオチドを含んでいる2531個ヌクレオチドの領域；及びｄ）３'末端の493個ヌクレオチドを含んでいることが示された。
ＤＩ-Ｂゲノムの一次構造はクローン化したフラグメントａ及びｂ（ゲノムＤＩ-Ｃに共通）、ｃ（親ゲノムに類似）及びｄ（ゲノムＤＩ-Ｂに特異的）の配列決定によって決定した。ゲノムＤＩ-Ｂはこのゲノムの３つの不連続領域：ａ）全てのＤＩ-Ｂクローンに共通でありそしてＲＮＡ ＤＩ-Ｃの領域Ｉと同一のゲノムの５'末端の2144個ヌクレオチド；ｂ）親ゲノムの12195〜20369位から20436位に対応し、そして遺伝子１の２つのＯＲＦ間の重複領域、完全なＯＲＦ1b及び遺伝子Ｓの最初のヌクレオチドを含んでいる8178〜8243個ヌクレオチドの大きさが変動する領域；及びｃ）このゲノムの３'領域のヌクレオチドの278乃至303個から構成されている（図14）。
ゲノムＤＩ-Ｂと称される集団を構成するクローンは領域IIからIIIの間に生じた欠失の大きさが異なっており、そしてこの欠失は遺伝子Ｓ（ヌクレオチド６から73の間）の開始点で始まりそして遺伝子７（ヌクレオチド195から233の間）の終了点で終わっている。
親ＲＮＡ ＴＨＥＲ-１の５'末端配列はＲＮＡの直接配列決定で決定され、そしてこれは５'-ＮＣＵＵＵＵＡＡＡＧ-３'である。この配列の最初の「Ｎ」ヌクレオチドの性質は決定されていない。これまでのところ、３つのＴＧＥＶ単離物、ＰＵＲ46-ＰＡＲ、ＰＵＲ46-ＢＲＩ及びＦＳ772/70の５'末端の配列が記載されており［Ｅleouet等、上述；Ｐage等、Ｖirus Ｇenes 4、289〜301（1990年）；Ｓethna等、Ｊ．Ｖirol．65、320〜325（1991年）］、そしてこれらは全て最初のヌクレオチドが異なっている。コロナウイルス感染で生起するリーダーの交換からみて、欠陥ＲＮＡのリーダー配列は親ウイルスのリーダー配列と同一でなければならない［Ｍakino等、Ｊ．Ｖirol．57、729〜737（1986年）］。
これら３つの欠陥ＲＮＡは、これら自体がオリゴｄＴカラムに結合する（結果は示していない）ので、ポリＡを含有している。
１．４．５  ＲＮＡ Ｂ及びＣはＯＲＦ１ａと１ｂ間に重複領域を保持しており、そしてこの領域にはリボソームの転位（−１）の原因となるモチーフが含まれている。
ゲノムＤＩ-ＣとＤＩ-Ｂに割り当てられた配列によれば、6370及び10003個ヌクレオチドのＯＲＦがそれぞれ、このゲノムの５'末端から数えてヌクレオチド315で開始していると予測することができる。ＲＮＡ ＤＩ-ＣのＯＲＦは、ＤＩ-Ｃゲノムの6685位のＯＲＦ 1bに内部欠失が生起していた不連続領域IIとIIIの結合部位で生じた終結コドンで終わる。ＤＩ-ＢゲノムのＯＲＦはＯＲＦ1bの天然の終結コドンで終わる。
２つの欠陥ＲＮＡはＯＲＦ１ａと１ｂ間の重複領域を保持しており、そしてこの領域はこの領域のリボソームの転位（−１）の原因となるスライディング配列及び三次構造モチーフ、プソイドノット（Ｅleouet等、上述）を含んでいる。図15はこの領域のＲＮＡの考えられる二次及び三次構造を示す。この領域のプソイドノットについてエリューエット（Ｅleouet）等が提案した構造はＣ及びＤで示された構造である；しかし乍ら、他の構造も考えられる（Ａ及びＢで示されるような）が、どれが正しい構造かは分かっていない。
転位がＴＧＥＶでは20％の効率で生じ（Ｅleouet等、上述）そしてこの転位によって遺伝子１の連続翻訳が可能になることを示す説明がなされている。ＤＩ-ＢとＤＩ-ＣのＲＮＡ（そして多分ＤＩ-Ａ ＲＮＡ）が親ゲノムのこの領域を保持しているという事実は、ＲＮＡの複製又はゲノムの増殖にはこの領域が必要である可能性を示唆している。
欠陥ゲノムＤＩ-ＣとＤＩ-Ｂには他の２つの小さなＯＲＦが存在している。その１つ、即ち、長い読取り枠に先行するＯＲＦは３個のアミノ酸のペプチドをコードしており、そしてこのペプチドは野生型のゲノムにも見られるがその機能は知られていない。もう一方のＯＲＦは両方の場合に遺伝子ＳのＡＵＧで開始し、そしてＤＩ-Ｃでは16個のアミノ酸のペプチドを、そしてＤＩ-Ｂでは大きさが変動するペプチドをコードしている。これらのＯＲＦが機能的であるかどうかは知られていない。保持されているウイルスの２つの転写プロモーターコンセンサス配列（ＣＵＡＡＡＣ）だけが、欠陥ＲＮＡ Ｂ及びＣにおいて遺伝子１及び遺伝子Ｓに正しく先行するものである。これらの配列には図12中で印が付けられている。
図16は、ノーザンブロットアッセイでウイルスに特異的なオリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成によるＲＮＡ Ａ、Ｂ及びＣのマップ作成を示している。親ゲノム並びにＤＩ Ａ、Ｂ及びＣから得られるＲＮＡが明確に分離されるまでＴＨＥＲ-1-ＳＴｐ41ウイルスのＲＮＡをアガロースゲルで分画した。このＲＮＡを、３２Ｐｉで印を付けた種々のオリゴヌクレオチドとハイブリッドを形成するナイロンフィルターに移し、親ゲノムとハイブリッドを形成した（＋）、そして欠陥ゲノムとハイブリッドを形成した（＋）か又はハイブリッドを形成しなかった（−）。親ゲノム中のオリゴヌクレオチドと相補的な配列の凡その位置には矢印で印を付けた。これらの正確な配列と位置は表３に見られる。オリゴヌクレオチドは全て親ゲノムとハイブリッドを形成し、そしてＲＮＡ Ｂ及びＣで予想された結果が得られた。
0003769300.tif 000003
実施例２
発現ベクターの生成
ＲＮＡ ＤＩ-ＣをコードするｃＤＮＡをファージＴ7プロモーターの制御下でブルースクリプトIIプラスミドにクローン化した。このｃＤＮＡはポリＡ配列、肝炎デルタウイルス（ＨＤＶ）リボザイム及びファージＴ7終結シグナルを含んでいる。図17に構築が示されているこれらプラスミドの１つはｐＤＩＣ-１と命名されている。これらのプラスミドを操作して、異種遺伝子を欠陥ゲノム中に存在する遺伝子Ｓプロモーター若しくは別のＴＧＥＶプロモーター又は有効性を高めたこれらの改変体の制御下で上記プラスミドにクローン化することができる。
これら異種遺伝子のクローニングは、Ｓ遺伝子の開始コドン（ＡＵＧ）に続くＯＲＦ1bの後にそしてこの遺伝子に関する読取り相内に実施した。
これらのｃＤＮＡから、ファージＴ7ポリメラーゼを使用してＲＮＡを発現させ、そしてこれで、弱毒ヘルパーウイルスＴＨＥＲ-１で前以て感染させたＳＴ細胞を形質転換して、ヘルパーウイルスゲノムを含有するビリオンや対応する欠陥ゲノムを含有する他のビリオンが回収できた。２％のウシ胎児血清の存在下で凍結乾燥した上記ウイルスを、ブタ、イヌ及びウサギの胃腸管及び気道に感染する作用物に対して特異的な抗体を誘発するワクチンとして使用した。
ベクターの向性は適当な弱毒ヘルパーウイルスを使用してブタ、イヌ又はネコ種に特異的に標的化した。
実施例３
無効化抗体の誘発
３．１  ブタ流行性下痢コロナウイルス（ＰＥＤＶ）に対する保護の誘発
ヘルパーウイルス（ＴＨＥＲ-１）及びＰＥＤＶ糖タンパク質Ｓ遺伝子がクローン化されているｐＤＩＣ-１プラスミドからなる組換え系を使用してブタを免疫化した。
免疫化は、子ブタ１匹当たり109pfuを経口経路で投与して実施した。
無効化抗体の存在は、免疫化後15、30、45及び60日目のワクチン接種動物の血清でアッセイした；そしてＰＥＤＶに特異的な抗体の存在はラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）（Ｍaniatis等、上述）を使用して測定した。
免疫化後45日目に集めた血清では、これらの血清を経口投与前にＰＥＤＶ（株ＳＥＧ86-1）の有毒ウイルスと共に予めインキュベートしていたとき、このウイルスによる感染に対して10日齢の子ブタで完全な保護がもたらされた。
３．２  イヌコロナウイルスに対する保護の誘発
ヘルパーウイルス（イヌコロナウイルス株Ｆort Ｄodge）と、イヌコロナウイルス糖タンパク質Ｓ遺伝子がクローン化されていたｐＤＩＣ-１プラスミド（株Ｆort Ｄodge）からなる組換え系を使用してイヌを免疫化した。
免疫化は、イヌ１匹当たり10９pfuを経口経路で投与して実施した。
免疫化後15、30、45及び60日目のワクチン接種動物の血清中の無効化抗体の存在をアッセイし、そしてイヌコロナウイルスに特異的な抗体の存在はＲＩＡを使用して測定した。
免疫化後45日目に集めた血清では、これらの血清を経口投与前にイヌコロナウイルス（株Ｆort Ｄodge）の有毒ウイルスと共に予めインキュベートしたとき、このウイルスによる感染に対して10日齢の子イヌで完全な保護が与えられた。
３．３  アルテリウイルス（arterivirus）ＰＲＲＳＶによって引き起こされる感染に対する保護の誘発
ヘルパーウイルス（ＴＨＥＲ-１）と、アルテリウイルスＰＲＲＳＶ ＯＲＦ３及びＯＲＦ５（株Ｆort Ｄodge）がクローン化されていたｐＤＩＣ-１プラスミドからなる組換え系を使用してブタを免疫化した。
免疫化は、子ブタ１匹当たり10９pfuを経口経路で投与して実施した。
無効化抗体の存在は免疫化後15、30、45及び60日目のワクチン接種動物の血清でアッセイし、そしてＰＲＲＳＶに特異的な抗体の存在はＲＩＡによって測定した。
免疫化後45日目に集めた血清では、これらの血清を経口経路で投与する前にＰＲＲＳＶ（株Ｆort Ｄodge）の有毒ウイルスと共に予めインキュベートしていたとき、このウイルスによる感染に対して10日齢の子ブタで完全な保護がもたらされた。
実施例４
発現ベクターの生成
実施例２に記載した方法に類似する方法に従って、自己複製ＲＮＡをコードしているｃＤＮＡを、ファージＴ7プロモーターの制御下ブルースクリプトIIプラスミドにクローン化した。このｃＤＮＡはポリＡ配列、肝炎デルタウイルス（ＨＤＶ）のリボザイム及びファージＴ7終結シグナルを含んでいる。図18に構築が示されているこれらプラスミドの１つは、ｐＤＩＡ-６Ａ．Ｃ３と命名されている。このプラスミドは、ＴＧＥＶを無効化するモノクローナル抗体６Ａ．Ｃ３をコードする遺伝子を含有している。モノクローナル抗体６Ａ．Ｃ３の特徴及びその構築はドクター  ジョアクイン  カスチラ  カリオン（Ｄr．Ｊoaquin Ｃastilla Ｃarri n）の博士論文、表題「コロナウイルスの無効化抗体を分泌するトランスジェニック動物の構築」、マドリッドのオートノーマ（Ａut noma）大学、理学部、1996年12月、43〜52頁、65〜79頁中に記載されている。
この異種遺伝子のクローニングは、遺伝子Ｓ開始コドン（ＡＵＧ）に続くＯＲＦ1bの後にそしてこの遺伝子に関する読取り枠内に実施した。
このｃＤＮＡから開始して、ファージＴ7ポリメラーゼを使用してＲＮＡを発現させ、そしてこれで、弱毒ヘルパーウイルスＴＨＥＲ-１で前以て感染させたＳＴ細胞を形質転換し、その結果ヘルパーウイルスゲノムを含有するビリオン及び対応する欠陥ゲノムを有する他のビリオンが回収された。２％のウシ胎児血清の存在下で凍結乾燥した上記ウイルスを、組換え６Ａ．Ｃ３モノクローナル抗体を発現するベクターとして使用することができる。これらベクターの向性は、適当な弱毒ヘルパーウイルスを使用してブタ種に特異的となった。
実施例５
無効化抗体の発現
ヘルパーウイルス（ＴＨＥＲ-１）と、ＴＧＥＶを無効化する組換えモノクローナル抗体６Ａ．Ｃ３をコードする配列を含有するｐＤＩＡ-６Ａ．Ｃ３プラスミド（実施例４）から構成される組換え系を使用してブタを免疫化した。
免疫化は、経口経路で子ブタ１匹当たり10９pfuを投与して実施した。
無効化６Ａ．Ｃ３抗体の存在は、免疫化後15、30、45及び60日目のワクチン接種動物の血清中でＲＩＡ［Ｍaniatis等、上述］を使用してアッセイした。組換え抗体は10３倍より高い力価を有していたので、10４倍以上の感染性ウイルスの力価を低下させることができる。
微生物の寄託
大腸菌から誘導されたＤＨ-５細菌中に導入されたｐＤＩＣ-１と命名されたプラスミド、［ＤＨ５／ＰＤＩＣ-１］は、ヨーロッパ動物細胞培養物収集所（ＥＣＡＣＣ）、英国ＳＰ4 ＯＪＧウィルトシャー、サリスベリー、ポートンダウンに、対応する受理番号Ｐ96030641で1996年3月6日に寄託された。
更に、ＴＨＥＲ-１と命名された弱毒ヘルパーウイルスはＥＣＡＣＣに、対応する受理番号Ｖ96030642で1996年3月6日に寄託された。
配列リスト
（1）一般情報：
（i）出願人：
（Ａ）名称：シアナミド  イベリカ、エス．エー．（Ｃyanamid Iberica，Ｓ．Ａ．）
（Ｂ）住所：クリストーバル  ボルジュ（Ｃristobal Ｂordiu）、35
（Ｃ）都市：マドリッド
（Ｅ）国：スペイン
（Ｆ）郵便番号：28003
（Ｇ）電話：34 1 663 91 21
（Ｈ）ファクシミリ：34 1 663 94 01
（ii）発明の名称：
組換え欠陥ウイルスゲノムに基づくベクター及びワクチン製剤におけるそれらの使用
（iii）配列の数：24
（iv）コンピュータによる読取りフォーム：
（Ａ）媒体：ディスク
（Ｂ）コンピュータ：ＩＢＭ ＰＣ−互換性
（Ｃ）操作システム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ
（Ｄ）ソフトウェア：パテントインリリース  1.0、バージョン  1.30（ＥＰＯ）
（2）配列識別番号［ＩＤ．ＳＥＱ．ＮＯ．］：１に関する情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ：27塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）位相幾何学：鎖状
（ii）分子のタイプ：ＤＮＡ
（iii）仮説：無し
（iｖ）アンチセンス：無し
（xi）配列の記載：配列識別番号：１：
0003769300.tif 000004
（2）配列識別番号２に関する情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ：21塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）位相幾何学：鎖状
（ii）分子のタイプ：ＤＮＡ
（iii）仮説：無し
（iｖ）アンチセンス：無し
（xi）配列の記載：配列識別番号：２：
0003769300.tif 000005
（2）配列識別番号３に関する情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ：32塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）位相幾何学：鎖状
（ii）分子のタイプ：ＤＮＡ
（iii）仮説：無し
（iｖ）アンチセンス：無し
（xi）配列の記載：配列識別番号：３：
0003769300.tif 000006
（2）配列識別番号４に関する情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ：32塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）位相幾何学：鎖状
（ii）分子のタイプ：ＤＮＡ
（iii）仮説：無し
（iｖ）アンチセンス：無し
（xi）配列の記載：配列識別番号：４：
0003769300.tif 000007
（2）配列識別番号５に関する情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ：26塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）位相幾何学：鎖状
（ii）分子のタイプ：ＤＮＡ
（iii）仮説：無し
（iｖ）アンチセンス：無し
（xi）配列の記載：配列識別番号：５：
0003769300.tif 000008
（2）配列識別番号６に関する情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ：25塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）位相幾何学：鎖状
（ii）分子のタイプ：ＤＮＡ
（iii）仮説：無し
（iｖ）アンチセンス：無し
（xi）配列の記載：配列識別番号：６：
0003769300.tif 000009
（2）配列識別番号７に関する情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ：20塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）位相幾何学：鎖状
（ii）分子のタイプ：ＤＮＡ
（iii）仮説：無し
（iｖ）アンチセンス：無し
（xi）配列の記載：配列識別番号：７：
0003769300.tif 000010
（2）配列識別番号８に関する情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ：23塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）位相幾何学：鎖状
（ii）分子のタイプ：ＤＮＡ
（iii）仮説：無し
（iｖ）アンチセンス：無し
（xi）配列の記載：配列識別番号：８：
0003769300.tif 000011
（2）配列識別番号９に関する情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ：20塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）位相幾何学：鎖状
（ii）分子のタイプ：ＤＮＡ
（iii）仮説：無し
（iｖ）アンチセンス：無し
（xi）配列の記載：配列識別番号：９：
0003769300.tif 000012
（2）配列識別番号１０に関する情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ：26塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）位相幾何学：鎖状
（ii）分子のタイプ：ＤＮＡ
（iii）仮説：無し
（iｖ）アンチセンス：無し
（xi）配列の記載：配列識別番号：１０：
0003769300.tif 000013
（2）配列識別番号１１に関する情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ：20塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）位相幾何学：鎖状
（ii）分子のタイプ：ＤＮＡ
（iii）仮説：無し
（iｖ）アンチセンス：無し
（xi）配列の記載：配列識別番号：１１：
0003769300.tif 000014
（2）配列識別番号１２に関する情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ：20塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）位相幾何学：鎖状
（ii）分子のタイプ：ＤＮＡ
（iii）仮説：無し
（iｖ）アンチセンス：無し
（xi）配列の記載：配列識別番号：１２：
0003769300.tif 000015
（2）配列識別番号１３に関する情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ：20塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）位相幾何学：鎖状
（ii）分子のタイプ：ＤＮＡ
（iii）仮説：無し
（iｖ）アンチセンス：無し
（xi）配列の記載：配列識別番号：１３：
0003769300.tif 000016
（2）配列識別番号１４に関する情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ：20塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）位相幾何学：鎖状
（ii）分子のタイプ：ＤＮＡ
（iii）仮説：無し
（iｖ）アンチセンス：無し
（xi）配列の記載：配列識別番号：１４：
0003769300.tif 000017
（2）配列識別番号１５に関する情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ：20塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）位相幾何学：鎖状
（ii）分子のタイプ：ＤＮＡ
（iii）仮説：無し
（iｖ）アンチセンス：無し
（xi）配列の記載：配列識別番号：１５：
0003769300.tif 000018
（2）配列識別番号１６に関する情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ：19塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）位相幾何学：鎖状
（ii）分子のタイプ：ＤＮＡ
（iii）仮説：無し
（iｖ）アンチセンス：無し
（xi）配列の記載：配列識別番号：１６：
0003769300.tif 000019
（2）配列識別番号１７に関する情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ：20塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）位相幾何学：鎖状
（ii）分子のタイプ：ＤＮＡ
（iii）仮説：無し
（iｖ）アンチセンス：無し
（xi）配列の記載：配列識別番号：１７：
0003769300.tif 000020
（2）配列識別番号１８に関する情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ：20塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）位相幾何学：鎖状
（ii）分子のタイプ：ＤＮＡ
（iii）仮説：無し
（iｖ）アンチセンス：無し
（xi）配列の記載：配列識別番号：１８：
0003769300.tif 000021
（2）配列識別番号１９に関する情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ：20塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）位相幾何学：鎖状
（ii）分子のタイプ：ＤＮＡ
（iii）仮説：無し
（iｖ）アンチセンス：無し
（xi）配列の記載：配列識別番号：１９：
0003769300.tif 000022
（2）配列識別番号２０に関する情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ：20塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）位相幾何学：鎖状
（ii）分子のタイプ：ＤＮＡ
（iii）仮説：無し
（iｖ）アンチセンス：無し
（xi）配列の記載：配列識別番号：２０：
0003769300.tif 000023
（2）配列識別番号２１に関する情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ：20塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）位相幾何学：鎖状
（ii）分子のタイプ：ＤＮＡ
（iii）仮説：無し
（iｖ）アンチセンス：無し
（xi）配列の記載：配列識別番号：２１：
0003769300.tif 000024
（2）配列識別番号２２に関する情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ：20塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）位相幾何学：鎖状
（ii）分子のタイプ：ＤＮＡ
（iii）仮説：無し
（iｖ）アンチセンス：無し
（xi）配列の記載：配列識別番号：２２：
0003769300.tif 000025
（2）配列識別番号２３に関する情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ：20塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）位相幾何学：鎖状
（ii）分子のタイプ：ＤＮＡ
（iii）仮説：無し
（iｖ）アンチセンス：無し
（xi）配列の記載：配列識別番号：２３：
0003769300.tif 000026
（2）配列識別番号２４に関する情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ：9714塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）位相幾何学：環状
（ii）分子のタイプ：ｃＤＮＡ
（iii）仮説：無し
（iｖ）アンチセンス：無し
（ｖi）供給源：
（Ａ）生物：ブタ伝染性胃腸炎ウイルス（ＴＧＥＶ）
（Ｂ）株：ＴＨＥＲ-１
（Ｃ）個々の単離物：ＤＩ-Ｃ
（xi）配列の記載：配列識別番号：２４：
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0003769300.tif 000031
【図１】
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【図２】
0003769300.tif 000034
【図３】
0003769300.tif 000035
【図４】
0003769300.tif 000036
【図５】
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【図６】
0003769300.tif 000038
【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
0003769300.tif 000055
【図１５】
0003769300.tif 000056
【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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