(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アスコルビン酸類、金属塩、多孔質担体、アルカリ土類金属水酸化物および水からなり、アスコルビン酸類1モル当たり、アルカリ土類金属水酸化物が１.６〜２.５モルの割合であるガス濃度調節剤と試験材料とを密閉性容器内に収納して密封することにより、密閉系内の酸素濃度を１％以下かつ炭酸ガス濃度を３〜７％に調節することを特徴とする低酸素濃度環境の調節方法。
【請求項２】
密閉系内の酸素濃度を３０分以内に５％以下、１時間以内に１％以下とし、かつ炭酸ガス濃度を、少なくとも１５分後から３時間後の間、３〜７％の範囲に保持する請求項１記載の低酸素濃度環境の調節方法。
【請求項３】
該試験材料が培養細胞であり、低酸素濃度環境が虚血性環境である請求項１又は２記載の低酸素濃度環境の調節方法。
【請求項４】
該ガス濃度調節剤が、アスコルビン酸類1モル当たり、アルカリ土類金属水酸化物が１.８〜２.２モルの割合である請求項１、２又は３記載の低酸素濃度環境の調節方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はガス濃度調節剤及び低酸素濃度環境の調節方法に関する。詳しくは、酸素濃度１％以下かつ炭酸ガス濃度３〜７％である低酸素濃度環境、例えば、手術、心臓停止、臓器移植といった、臓器や器官に血液の循環が足りなくなる虚血状態時における個々の臓器や器官の損傷を細胞レベルで調査するための基礎研究に必要な虚血性環境を、簡便に実現するためのガス濃度調節剤並びにこれを用いた低酸素濃度環境の調節方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、虚血性環境で培養細胞を試験するための低酸素濃度環境を作るには、培養容器に密閉性耐圧容器を用い、この容器に真空ポンプと炭酸ガス濃度を調節した窒素─炭酸ガスの混合ガスを充填したボンベとをつなぎ、密閉容器内のガス吸引と混合ガスの供給を繰り返して、容器内を炭酸ガスを含む窒素に置換するという方法が主に行われてきた。また、培養雰囲気調整剤を用いる方法も行われ、培養雰囲気調整剤として、嫌気性細菌の培養に用いる嫌気培養剤、例えば、「ガスパック」（ＢＢＬ社製）、「アネロパック」（三菱ガス化学製）等が用いられることがあった。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、前記の密閉性耐圧容器を用い強制的にガス置換する方法は、大がかりな装置を必要とし、取扱いが面倒で手間がかかり、装置の維持管理が必要となるなどの欠点があった。特に培養細胞の状態変化を経時的にとらえるような試験の場合には、幾つもの容器をガス置換しなければならず、そのために時間がかかり、試験条件を一様に揃えることが困難であった。また、前記嫌気培養剤などの培養雰囲気調整剤を用いる方法にも、次のように色々と問題があった。例えば、「ガスパック」の場合、まず使用に際して水の添加、触媒の準備などが必要であり、また脱酸素速度にばらつきがあって、均一条件での培養が困難であった。また「アネロパック」の場合は、培養環境の炭酸ガス濃度が高くなるために、培地中に溶け込む炭酸ガスの影響で培地のｐＨが下がり、細胞の培養に影響を及ぼす欠点があった。
本発明の目的は、上記従来の方法の問題点を解決し、細胞培養の低酸素障害試験などのための虚血性環境に代表されるような低酸素濃度環境を簡便に作ることができる、取扱の簡単なガス濃度調節剤並びにこれを用いた低酸素濃度環境の調節方法を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、従来技術の問題点に鑑み鋭意研究を重ねた結果、酸素吸収能および炭酸ガス発生能を併せもつアスコルビン酸系酸素吸収剤と炭酸ガス吸収剤を組み合わせてなるガス濃度調節剤を用い、密閉容器内の雰囲気を酸素濃度１％以下、炭酸ガス濃度３〜７％に調節することにより、虚血状態のモデル実験系として理想的な低酸素濃度環境が容易に得られることを見いだし、本発明を完成した。
【０００５】
すなわち、本発明は、アスコルビン酸類、金属塩、多孔質担体、アルカリ土類金属水酸化物および水からなる組成物であり、該組成物を密封系内に収納することにより系内の酸素を吸収して酸素濃度を１時間以内に１％以下としかつ炭酸ガス濃度を３〜７％に調節することを特徴とするガス濃度調節剤を提供する。
また上記本発明のガス濃度調節剤は、密封系内の酸素濃度を３０分以内に５％以下、１時間以内に１％以下とし、かつ炭酸ガス濃度を、少なくとも１５分後から３時間後の間、３〜７％の範囲に保持することを特徴とするものである。
本発明のガス濃度調節剤は、酸素吸収反応の主剤としてアスコルビン酸類を含みかつ炭酸ガス吸収剤としてアルカリ土類金属水酸化物を含むものであり、上記本発明のガス濃度調節剤にあっては、アスコルビン酸類は、アスコルビン酸、エリソルビン酸またはその塩、もしくはこれらの混合物であってもよい。
また上記本発明のガス濃度調節剤にあっては、前記金属塩は硫酸第一鉄７水和物が好ましい。また前記多孔質担体は活性炭が好ましい。
【０００６】
さらに本発明は、上記本発明のガス濃度調節剤を用い、該調節剤と試験材料とを密閉性容器内に収納して密封することにより、密閉系内の酸素濃度を１％以下かつ炭酸ガス濃度を３〜７％に調節することを特徴とする低酸素濃度環境の調節方法を提供する。
また本発明の調節方法は、上記の方法において、密閉系内の酸素濃度を３０分以内に５％以下、１時間以内に１％以下とし、かつ炭酸ガス濃度を、少なくとも１５分後から３時間後の間、３〜７％の範囲に保持することを特徴とする方法である。
また本発明の調節方法は、上記の方法において、試験材料が培養細胞であり低酸素濃度環境が虚血性環境であることを特徴とする方法である。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明のガス濃度調節剤及びこれを用いた低酸素濃度環境の調節方法は、培養細胞の低酸素障害試験等、虚血性環境、つまり低酸素濃度環境下の試験におけるガス雰囲気の調整に適用される。すなわち、本発明においては、ガス濃度調節剤と試験材料の培養細胞とを密閉性容器内に収納し密封することにより、密閉系内の酸素濃度が１％以下かつ炭酸ガス濃度が３〜７％に、より具体的には、密閉系内の酸素濃度が３０分以内に５％以下、１時間以内に１％以下、かつ炭酸ガス濃度が、少なくとも１５分後から３時間後の間、３〜７％の範囲に保持される。
また本発明においては、試験材料は必ずしも培養細胞に限定されず、本発明の方法を適用することによって目的を達成できるものであれば、試験材料はどのような物であってもよい。
【０００８】
本発明のガス濃度調節剤には、酸素吸収反応の主剤として酸素吸収能並びに炭酸ガス発生能を併せもつアスコルビン酸類が有効であり、これに組み合わせる炭酸ガス吸収剤としてアルカリ土類金属水酸化物が有効であり、ガス濃度調節剤として、アスコルビン酸類、金属塩、多孔質担体、アルカリ土類金属水酸化物および水からなる組成物が用いられる。本発明ではガス濃度調節剤は前記組成物を通気性包材で包装した包装体として用いられる。
【０００９】
本発明に用いられるアスコルビン酸類は、アスコルビン酸、エリソルビン酸またはその塩であり、またこれらの混合物であってもよい。なお、アスコルビン酸またはエリソルビン酸はナトリウム塩またはカリウム塩として用いられ、結局、本発明では、主剤のアスコルビン酸類は、アスコルビン酸またはエリソルビン酸のナトリウム塩またはカリウム塩の水溶液として用いられる。
主剤のアスコルビン酸類の水溶液濃度は、塩濃度で４０〜５５Wt％の範囲が好ましい。主剤の濃度が上記範囲を外れて低くなると酸素吸収速度が遅くなり、また濃くなると調節剤の調製が難しくなるので、いずれにしても望ましくない。
【００１０】
金属塩は、主剤の酸素吸収反応の触媒として用いられ、金属塩としては、鉄塩または銅塩が好ましく、硫酸第一鉄７水和物が、溶解性の点から好適に用いられる。金属塩の配合割合は、主剤１００重量部当たり５〜１５重量部が好ましい。金属塩は前記主剤の水溶液に溶解して用いられる。
以下、アスコルビン酸類を主剤といいい、主剤と金属塩を溶解した水溶液を単に主剤溶液ということがある。
【００１１】
多孔質担体は、主剤溶液を含浸、担持させるために用いられ、多孔質担体として、例えば、活性炭、ケイソウ土、シリカゲル、ゼオライト、軽石、アルミナ等の粉粒体、または吸水性紙、吸水性樹脂等、公知の担体物質が挙げられる。しかし、本発明では、特に活性炭が、吸水量が多い点、酸素吸収反応の発熱を奪うことが少なく反応を促進させるという点などから好ましく、粒状活性炭がより好ましい。
多孔質担体は主剤溶液１００重量部当たり３０〜１００重量部の範囲で用いられるが、多孔質担体の配合量は、主剤溶液を含浸させた多孔質担体とアルカリ土類金属水酸化物粉末と混合した際に、主剤溶液でアルカリ土類金属水酸化物粉末が湿潤するように、上記の範囲内で適切に選ぶ必要がある。
【００１２】
本発明では炭酸ガス吸収剤として、水に微溶解性を示すアルカリ土類金属水酸化物が好ましく、水酸化マグネシウムまたは水酸化カルシウムの粉末が好適に使用される。アルカリ土類金属水酸化物の配合は、主剤のアスコルビン酸類１モル当たり、アルカリ土類金属水酸化物１．６〜２．５モル、好ましくは１．８〜２．２モルの割合で用いられる。アルカリ土類金属水酸化物の配合量が少ないと炭酸ガス所定濃度に下がらず、また配合量が多すぎると炭酸ガス濃度が低くなりすぎるばかりでなく、酸素吸収速度の低下につながりガス濃度調節剤を多量に要することになるので、上記の範囲を超えることは好ましくない。
【００１３】
主剤のアスコルビン酸類は、理論的には、１モル当たり酸素１モルを吸収して炭酸ガス１モルを発生する。ここで容器内の空気中の酸素を吸収して酸素濃度１％以下とし炭酸ガス濃度３〜７％に保つためには、発生炭酸ガス量の約９０〜７０％を吸収してしまう必要があり、化学量論的には、主剤１モルの消費当たり、炭酸ガス約０．９〜０．７モルを吸収する必要がある。アルカリ土類金属水酸化物１モルの炭酸ガス吸収は、化学量論的には３／４モルであり、このため、炭酸ガス濃度３〜７％に保つためには、主剤１モルの消費当たり、アルカリ土類金属水酸化物１．２〜０．９モルと計算される。このようにアルカリ土類金属水酸化物の必要量は、主剤１モルの消費当たり、化学量論的には多くとも１．２モルにすぎないのに、アルカリ土類金属水酸化物の配合は実際には多くを要し、ガス濃度調節剤の使用量、酸素吸収速度等を考慮して、前記した配合比の範囲内で適切に選定する必要がある。
【００１４】
ガス濃度調節剤の製造方法は必ずしも限定されないが、ガス濃度調節剤は上記成分を混合した組成物であり、例えば、主剤のアスコルビン酸類と金属塩の水溶液（主剤溶液）と粒状担体とを混合して含浸させ、さらに粉末アルカリ土類金属水酸化物を混合して表面に分散、被覆させる方法がとられる。
【００１５】
本発明のガス濃度調節剤は、前記組成物を少なくとも一部を通気性包材で包装した包装体として用いられ、使用の便宜上、酸素吸収能力と炭酸ガス発生能力を併せ持つガス濃度調節剤として１剤の包装体で提供することが望ましい。ただし、本発明のガス調節剤は、炭酸ガス発生型の酸素吸収剤組成物と炭酸ガス吸収組成物とを、それぞれ、別個の包装体として提供することができる。
【００１６】
ガス濃度調節剤の通気性包材は、酸素と炭酸ガスを通過するものであればよく、酸素透気度３００ml／Hr・m2以上かつ炭酸ガス透気度３００ml／Hr・m2以上の包材が好ましい。通気性包材としては、公知の通気性包材が使用でき、例えば、合成繊維からなる不織布、合成紙、マイクロポーラスフィルム、紙等、さらには補強材として開孔ポリエチレン、ワリフ等を貼り合わせた複合包材等が用いられる。
【００１７】
製造されたガス濃度調節剤は、ガスバリヤ性の容器や袋に保管されており、使用するにあたり、ガスバリヤ性容器や袋から取り出して用いられる。
ガス濃度調節剤は少なくとも、容器内に密閉された空気中の酸素を吸収することができる量が必要であり、主剤のアスコルビン酸類の酸素吸収量は、化学量論的には、主剤１モル当たり酸素１モルである。ガス濃度調節剤の使用量は、上記主剤の理論的必要量を目安として、好ましくは１．５倍以上、より好ましくは１．８〜２．５倍の範囲に選ばれ、酸素吸収速度や密閉容器のガスバリヤ性を考慮して決められる。
【００１８】
本発明に用いられる密封性容器は、ガスバリヤ性材料からなり、密封することによって実質的に気密性を保つことができるものであればよく、容器の気密性は外気侵入量で１日あたり容器内容積の３％以下、好ましくは２％以下のものが用いられる。
【００１９】
上記密封性容器は、少なくとも培養プレートと調節剤とを収容できる大きさがあればよく、その形状は特に限定されない。一般に細胞培養には、３５ｍｍ径のプラスチック製ペトリ皿が使われることが多いが、その枚数に合わせて適当な大きさの密封性容器を選択し、内部に生じる空間容積に対応してガス濃度調節剤の使用量を決める必要がある。
密封性容器としては従来の耐圧容器も使用できるが、ガスバリアー性のプラスチック容器、袋等が使用できる。例えば、容器本体と蓋との間にシール材はさみ留め具で締めつける簡単な密閉構造のプラスチック容器が軽量で取扱いも便利であり、好適に使用される。またポリ塩化ビニリデンコートしたプラスチックフィルム袋等も、袋の口部をヒートシールしたり、クリップで密封する等の方法をとるだけで容易に密封性容器として使用できる。
【００２０】
【実施例】
以下に実施例を挙げて説明する。
実施例１
５０％アスコルビン酸ソーダ水溶液１１３ｇに硫酸第一鉄７水和物７ｇを溶解した液を顆粒状活性炭４９ｇに含浸させた後、これに水酸化マグネシウム３６ｇを加えて均一に混ぜ合わせ、ガス濃度調節剤原料粉末を調製した。得られた原料粉末２２．７ｇを、内側に開孔ポリエチレンフィルムをラミネートした紙（酸素拡散速度；２００００ｍｌ／ｍ2 ・Ｈｒ）で作成した袋（サイズ；１００ｍｍ×１４０ｍｍ）に充填してヒートシールし、ガス濃度調節剤を作成した。
作成したガス濃度調節剤をポリ塩化ビニリデンコートされたナイロンフィルムの袋（サイズ；２５０ｍｍ×３５０ｍｍ）に空気１．６ｌと共に密封し、次いでこの密封袋を３７℃の恒温槽中に保持し、袋内のガス組成の変化を経時的に測定した。ガス濃度調節剤について上記実験を３回ずつ行った。結果を表１に示す。
【００２１】
比較例１
５０％アスコルビン酸ソーダ水溶液１０５ｇに硫酸第一鉄７水和物６．５ｇを溶解した液を顆粒状活性炭４９ｇに含浸させた後、これに水酸化マグネシウム２０ｇを加えて均一に混ぜ合わせ、ガス濃度調節剤原料粉末を調製した。得られた原料粉末２０ｇを、実施例１と同様に、紙／開孔ポリエチレンフィルム製の袋に充填し、ガス濃度調節剤を作成した。
作成したガス濃度調節剤について実施例１と同様、ナイロンフィルムの袋に空気１．６ｌと共に密封し、次いでこの密封袋を３７℃の恒温槽中に保持し、袋内のガス組成の変化を経時的に測定した。結果を表１に示す。
【００２２】
【表１】
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【００２３】
実施例２および比較例２
実施例１および比較例１に作成したガス濃度調節剤を、各々ウィリアムズメディウムＥ培地（ＧｉｂｃｏＢＲＬ社製）２．０ｍｌを入れた３５ｍｍ径のプラスチック製ペトリ皿と共に、三菱ガス化学製角型ジャー（内容積１．６ｌ）に密封し、次いでこのジャーを３７℃の恒温槽中に保持しておき、経時的に培地のｐＨの変化を調べた。結果を表２に示す。
表２に示すように、実施例１のガス濃度調節剤を用いた実施例２の場合には、培地のｐＨは７．４と、元の培地のｐＨが維持されていた。これに対して、比較例１のガス濃度調節剤を用いた比較例２の場合には、ｐＨ７．２と培地のｐＨの低下が認められたが、ｐＨ７．２は、一般的に人体内ではアシドーシスの症状に相当する。結局、培地のｐＨの低下の認められなかったことは、実施例１のガス濃度調節剤が、虚血状態の培養環境調節剤として好ましいことを示す。
【００２４】
【表２】
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【００２５】
実施例３
Wister雄性ラットの肝臓を、カルシウムキレート剤およびコラゲナーゼを潅流させた後、平衡塩溶液中でメスおよびピペットを用いて機械的に分散し、その浮遊液より遠心分離により肝細胞のみを採取し、３５ｍｍ径プラスチックディッシュで１．５ｍｌのウィリアムズメディウムＥ培地にて培養し、初代培養肝細胞を作成した。
作成した初代培養肝細胞を用い低酸素障害試験を次のように行った。
角型ジャー（三菱ガス化学製、１．６Ｌ容）に初代培養肝細胞を培養したプラスチックディッシュと実施例１に作成したガス濃度調節剤とを入れて密封し、この密封した角型ジャーを３７℃の恒温槽中に所定時間保持したのち、ジャーの蓋を開けて開放状態を保持した。密封状態の保持時間を、それぞれ、２時間、３時間および４時間と変えて試験を行った。
本試験では、ジャーが密封状態にある間のジャー内の初代培養肝細胞は、生体肝における虚血状態を反映する低酸素状態となり、ジャーの蓋を開けることにより、生体肝における血行再開通状態を反映する再酸素化状態となる。
【００２６】
本実施例では、複数の角型ジャーを準備しておき、低酸素状態を、それぞれ、２時間、３時間および４時間の実験群に分けて低酸素障害試験を行った。
それぞれの実験群について、（１）細胞膜障害の指標として培養液中に漏洩した乳酸脱水素酵素活性（ＬＤＨ）、（２）肝ミトコンドリアで酸素呼吸を行う酸化的リン酸化能の指標としてＮＡＤ+ ／ＮＡＤＨ比と平衡関係にある培養液中ケトン体比（ＫＢＲ：アセト酢酸／3-ヒドロキシ酪酸比）、（３）肝ミトコンドリア内の酵素機能の指標として培養液中に産生されたケトン体濃度（アセト酢酸＋3ーヒドロキシ酪酸）、を経時的に測定し、低酸素状態および再酸素化状態における各指標の変化と低酸素時間の長さとの比較を行った。なお、低酸素状態を設けない実験を同様に行い対照群とした。各指標の測定結果を、図１、図２および図３に示す。
【００２７】
（１）培養液中に漏出したＬＤＨ量の経時変化は、図１に示すように、２時間の低酸素障害試験では、低酸素状態・再酸素化状態を通じてＬＤＨの漏洩は認められなかった。３時間の低酸素障害試験では、低酸素状態中はＬＤＨの漏洩は認められなかったが、再酸素化後ＬＤＨが若干の増加を認め、細胞膜障害が発生したことが示唆された。さらに４時間の低酸素障害試験では、低酸素状態開始後４時間目においてＬＤＨの増加が認められ、再酸素化後にはさらに上昇した。
（２）ＫＢＲの経時変化は、図２に示すように、低酸素状態においては、いずれの群も顕著に低下したが、再酸素化後、２時間の低酸素障害試験においてはＫＢＲは速やかに回復し前値に復したが、３時間の低酸素障害試験では再酸素化後もＫＢＲの回復は抑制され、４時間の群ではＫＢＲの回復はほとんど見られず、酸化的リン酸化能に障害が出ていることが認められた。
（３）培養液中へのケトン体の産生は、図３に示すように、低酸素状態中はいずれの群でもほぼ完全に停止し、再酸素化とともに産生は再開されたが、その産生量は低酸素時間が長いほど抑制されており、低酸素状態の長さにより肝ミトコンドリア内の酵素機能に障害がおきていることが認められた。
【００２８】
本実施例で行った初代培養肝細胞の低酸素障害試験では、低酸素状態および再酸素化状態ともに、生体肝における虚血状態および血行再開通状態における肝細胞の状態を機能的にも形態的にも良く反映しており、本発明の培養環境調節剤を用いた低酸素障害試験は、温阻血再潅流障害研究のモデル実験系として非常に有用である。
【００２９】
【発明の効果】
本発明のガス濃度調節剤およびガス濃度調節方法は、密封された容器内のガス環境を培養細胞の低酸素障害試験に適した環境とすることを実現したものであり、軽量で簡便な密封性容器および取扱いやすいガス濃度調節剤を用いた培養環境調節法を開発したことに特徴がある。
すなわち、本発明によれば、培養細胞の低酸素障害試験を行う環境を作り出すにあたり、高価で大型な装置を準備する必要がなく、通常の実験室にある孵卵器、恒温培養器等の中に細胞を接種した培地およびガス濃度調節剤を封入した密閉性容器を入れることで、細胞の低酸素障害試験を行なうことができる。また、多数の系を同時に開始させることが可能となり、研究効率の向上、作業時間の短縮を図ることができる。これにより、多くの医療研究機関において、培養細胞の低酸素障害試験、低酸素・虚血状態の研究を、簡便に、かつ安価に、効率的に行なうことが可能となる。
また本発明においては試験材料は必ずしも培養細胞に限定されず、本発明の方法を適用することによって目的を達成できるものであれば、試験材料は何であってもよく、本発明は脱酸素方法として広く応用できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  低酸素状態・再酸素化状態におけるＬＤＨの培地への漏洩の変化を示す。
【図２】  低酸素状態・再酸素化状態におけるＫＢＲの変化を示す。
【図３】  低酸素状態・再酸素化状態における培養液中のケトン体産生の経過を示す。
【符号の説明】
●  低酸素障害実験（２時間）群
▲  低酸素障害実験（３時間）群
■  低酸素障害実験（４時間）群
○  低酸素障害実験（２時間）の対照群（低酸素時間無し）
△  低酸素障害実験（３時間）の対照群（低酸素時間無し）
□  低酸素障害実験（４時間）の対照群（低酸素時間無し）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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