(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程：
(a)  水界からウイルス粒子を分離する工程、
(b)  工程(a)において得られたウイルス粒子をゲルに包埋する工程、及び
(c)  工程(b)において得られた包埋物をタンパク質分解酵素及び／又は界面活性剤で処理する工程、
を包含するウイルス遺伝子の分離方法。
【請求項２】
以下の工程：
(a)  水界からウイルス粒子を分離する工程、
(b)  工程(a)において得られたウイルス粒子をゲルに包埋する工程、
(c)  工程(b)において得られた包埋物をタンパク質分解酵素及び／又は界面活性剤で処理する工程、及び
(d)  工程(c)において得られたタンパク質分解酵素処理及び／又は界面活性剤処理物を電気泳動する工程、
を包含するウイルス遺伝子の分画方法。
【請求項３】
以下の工程：
(a)  水界からウイルス粒子を分離する工程、
(b)  工程(a)において得られたウイルス粒子をゲルに包埋する工程、
(c)  工程(b)において得られた包埋物をタンパク質分解酵素及び／又は界面活性剤で処理する工程、
(d)  工程(c)において得られたタンパク質分解酵素処理及び／又は界面活性剤処理物を電気泳動する工程、及び
(e)  工程(d)において得られた電気泳動ゲルを分析する工程、
を包含するウイルス遺伝子の解析方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、水界中のウイルスからインタクトな状態で遺伝子を分離する方法、該方法により分離した遺伝子を分画する方法、該方法により分画した遺伝子を解析する方法に関する。
背景技術
1989年、バーらは、電子顕微鏡による観察によって、湖水や海水等の水界中には膨大な数のウイルス様粒子が存在することを報告した[Bergh et al. :Nature 340:467-468(1989)]。一般に、電子顕微鏡によるウイルスの観察では、形態が互いに類似しているウイルス同志を判別することは困難である。そこで、ウイルスを界面活性剤やタンパク質分解酵素を用いてウイルス外皮を破壊し、遊離した遺伝子を分析する方法が知られている。しかし、溶液中に遊離した遺伝子は機械的せん断力などにより遺伝子鎖が切断されてしまうことが多く、インタクトな状態のまま分離することは困難である。遺伝子の分析を行う場合でも、原核生物や真核生物のように共通の遺伝子配列が知られていないことから、全ウイルスを対象とした解析を行うことは困難である。また、通常のポリエチレングリコールによる濃縮分離法では、その濃度により沈降するウイルスに違いが生じることから、水界中の全ウイルスを対象とするには限界がある。
発明の開示
本発明は、水界中のウイルスからインタクトな状態で遺伝子を分離する方法、該方法により分離した遺伝子を分画する方法、該方法により分画した遺伝子を解析する方法を提供することを目的とする。
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、水界試料中のウイルス粒子を超遠心分離により濃縮し、ウイルス粒子をゲル中に包埋後、タンパク質分解酵素及び／又は界面活性剤で処理することにより、ウイルスDNAをインタクトな形で分離することができることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、以下の工程：
(a)  水界からウイルス粒子を分離する工程、
(b)  工程(a)において得られたウイルス粒子をゲルに包埋する工程、及び
(c)  工程(b)において得られた包埋物をタンパク質分解酵素及び／又は界面活性剤で処理する工程、
を包含するウイルス遺伝子の分離方法である。
さらに、本発明は、以下の工程：
(a)  水界からウイルス粒子を分離する工程、
(b)  工程(a)において得られたウイルス粒子をゲルに包埋する工程、
(c)  工程(b)において得られた包埋物をタンパク質分解酵素及び／又は界面活性剤で処理する工程、及び
(d)  工程(c)において得られたタンパク質分解酵素処理及び／又は界面活性剤処理物を電気泳動する工程、
を包含するウイルス遺伝子の分画方法である。
さらに、本発明は、以下の工程：
(a)  水界からウイルス粒子を分離する工程、
(b)  工程(a)において得られたウイルス粒子をゲルに包埋する工程、
(c)  工程(b)において得られた包埋物をタンパク質分解酵素及び／又は界面活性剤で処理する工程、
(d)  工程(c)において得られたタンパク質分解酵素処理及び／又は界面活性剤処理物を電気泳動する工程、及び
(e)  工程(d)において得られた電気泳動ゲルから遺伝子を抽出し分析する工程、
を包含するウイルス遺伝子の解析方法である。
以下、本発明を詳細に説明する。
水界に存在するウイルスの遺伝子を分離、分画及び解析する本発明の方法の一例を示すと図１のようになる。まず、水界から得たサンプル水に含まれるウイルス粒子を分離する（工程Ａ）。次いで、得られたウイルス粒子をゲルに包埋する（工程Ｂ）。得られた包埋物をプロティナーゼＫ、SDS等で処理することによってウイルス外皮等を分解後（工程Ｃ）、ウイルス遺伝子を分画する（工程Ｄ）。最後に分画した遺伝子をサザンブロット解析やノザンブロット解析によって解析する（工程Ｅ）。このようなウイルス遺伝子のインタクトな分離は、より具体的には以下のようにして行うことができる。
１．水界からのウイルス粒子の分離
(1) 水界からのウイルス粒子含有サンプル水の採取
水界とは、自然の水性環境及び人為的な水性環境などのウイルス粒子を含有し得るあらゆる水性環境をいう。例えば、自然の水性環境としては、海、湖、河川などが挙げられ、また、人為的な水性環境としては、培養液、活性汚泥、下水、血液などが挙げられるが、これらに限定されない。そして、ウイルス粒子含有サンプル水は、上記水界由来のものが挙げられる。例えば、海及び湖からのサンプル水の採取は、ニスキン採水器やバンドン採水器等を用いて、所望の水深より水試料を採取し、船上又は陸上に回収することにより行うことができる。
(2) ウイルス粒子含有サンプルからの夾雑物の除去
一般に、海水、湖水、河川水中には、図２に示すような、様々な生物等が存在している。本発明の方法においては、上記水界中に存在するウイルス粒子が対象となる。
サンプル水からウイルス粒子を分離するために、まず上記(1)において得られたサンプル水から夾雑物を除去する。夾雑物の除去は、低速遠心分離や濾過などによって行うことができる。ここで、夾雑物とは、土壌粒子、粘土鉱物、動植物組織断片、動植物プランクトン、その他デトライタスなど、比較的大きなサンプル水混入物をいう。また、低速遠心分離は、約6,000×ｇ、10〜15分間で行うことが好ましい。低速遠心に用いることができる遠心分離機としては、ベックマン社製HP-30型や日立社製CR26H型などを挙げることができる。さらに、サンプル液を濾過することによって、夾雑物を除去する場合には、濾紙（例えば、ワットマン社製No.3）を用いることができる。また、サンプル水が清澄な場合には、この低速遠心分離の工程は省略することもできる。
(3) ウイルス粒子の精製
上記(2)において得られた夾雑物除去液からのウイルス粒子の精製は、濾過によって行うことができる。ここで、ウイルスの精製に用いることができる濾過膜としては、孔径0.1μm〜0.45μm、好ましくは孔径0.20μm〜0.22μmの小孔を有するものなどが挙げられる。例えば、0.22μmの孔径を有する親水性ポリビニリデンジフロライド膜（ミリポア社製GVWP型）を用いることができる。小孔の孔径は、濾過により除去する生物等の大きさに応じて、例えば、図３を参考に、適宜選択することができる。通常、孔径0.20μm〜0.22μmのフィルターを用いることにより、水界に生息するほとんどの細菌類を除去することができる。また、濾過膜の素材としては、低タンパク質吸着性の親水性ポリビニリデンジフロライド（PVDF）、親水性ポリテトラフルオロエチレン（PTFE）、ポリカーボネートなどが挙げられる。濾過をより迅速に行うために、濾過に際しては圧力を負荷することが好ましい、例えば、濾過圧力は100mmHg以下、好ましくは30mmHg以下とすることができる。
(4) ウイルス粒子の分離
上記(3)において得られた濾液からのウイルス粒子の分離は、超遠心分離によってウイルス粒子を沈殿させることにより行うことができる。ここで、超遠心分離は、100,000〜130,000×ｇ、３〜16時間で行うことが好ましい。超遠心に用いることができる遠心分離機としては、日立社製CP90αやベックマン社製OptimaXL-100Kなどを挙げることができる。
(5)ヌクアーゼ処理
上記(4)において得られたウイルス粒子沈殿物中には、他の生物由来の裸の核酸や無機粒子やデトライタスに吸着・保持された核酸等が多量に含まれている場合がある。これらの核酸は、ヌクレアーゼ処理することによって除去することができる。ここで、DNAの分解にはDNaseを、RNAの分解にはRNaseを用いる。すなわち、上記(4)において得られたウイルス沈殿物をTMバッファー、TEバッファー等に懸濁し、適当量のDNase又はRNaseを添加しインキュベーションする。反応の停止は、EDTA溶液、RNasin溶液などを添加することによって行うことができる。このようにして、裸の核酸が混入していないウイルス粒子懸濁液を得ることができる。
２．ゲルへのウイルス粒子の包埋
ウイルス粒子から遺伝子を分離する場合、ウイルス粒子を液体に懸濁した状態のままタンパク質分解酵素や界面活性剤で処理すると、処理過程での物理的せん断力によって遺伝子が切断されてしまうことが多い。そこでウイルス粒子をゲル中に包埋することによって固定化し、固定化されたウイルス粒子をタンパク質分解酵素や界面活性剤で処理することによって、遺伝子の切断を防ぐことができる。ウイルス粒子のゲル中への包埋は、ウイルス懸濁液にゲル化剤、例えば低融点アガロースを添加することにより行うことができる。すなわち、上記１において得られたヌクレアーゼ処理ウイルス懸濁液を低融点アガロースが固化しない程度の温度（例えば、55℃）に加温し、ゲル化剤、例えば低融点アガロースを添加した後、十分混合して冷却固化させる。アガロースの終濃度は１％前後が好ましい。
３．ウイルス外皮の分解処理
上記２においてゲル中に包埋されたウイルス粒子の外皮は、タンパク質分解酵素及び／又は界面活性剤等を含むウイルス外皮分解処理液で、ゲル包埋物を処理することによって分解除去することができる。用いることができるタンパク質分解酵素としては、プロティナーゼＫ（ニッポンジーン社製）など、界面活性剤としては、硫酸ドデシルナトリウム（SDS）などが挙げられる。ここで、上記ウイルス外皮の分解は、タンパク質分解酵素及び／又は界面活性剤がゲル中に十分浸透することによって達成される。
４．電気泳動によるウイルス遺伝子の分画と検出
上記３において得られたウイルス外皮分解処理物は、電気泳動（例えばパルスフィールドゲル電気泳動）によって、該処理物中に含まれるヌクレオチドをサイズごとに分画することができる。すなわち、ウイルス外皮の分解処理を行ったゲルをウエルに入る程度の大きさにスライスし、アガロースなどを支持体とする電気泳動のゲルにアプライする。次いで、分画サイズ範囲に対応するパルスフィールドゲル電気泳動条件下で、ウイルス遺伝子をサイズごとに分画することができる。分画したウイルス遺伝子は、核酸染色剤等を用いて検出することができる。また、ウイルスの分離とその遺伝子の精製、分画操作を定量的に行うことで、各サイズの存在量比を調べることが可能である。
５．ウイルス遺伝子の解析
上記４において分画されたウイルス遺伝子は、サザンブロット解析、ウエスタンブロット解析等によって分析することができる。分画した遺伝子のサイズが大きい場合には、ブロッティング操作を行う前に、ヌクレオチド鎖をある程度切断しておくことによりブロッティング効率を高めることができる。ヌクレオチド鎖の切断は、分画後のゲルを紫外線処理することや塩酸処理することにより行うことができる。また、ブロッティングした遺伝子は、常法に従い、標識プローブによるハイブリダイゼーションによって特定の遺伝子の存否、存在量などについて解析することができる。例えば、有害赤潮が発生しやすい海域から採取したサンプル水由来のウイルス遺伝子について解析する場合、赤潮の原因プランクトンの消長に関連しているウイルス（例えばシャトネラウイルス）の遺伝子の塩基配列に基づいて合成したプローブを用いることによって、該ウイルスの存否、存在量等について調べることができる。
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明のウイルス遺伝子の分離方法を示した図である。
図２は、湖水や海水中に含まれている微生物等の形態を示した図である。
図３は、濾過膜の孔径と除去することができる微生物との関係を示した図である。
図４は、水界からのウイルスの分離方法を示した図である。
図５は、本発明の方法を用いて、海水及び湖水から分離したウイルス遺伝子のパルスフィールドゲル電気泳動写真を示す図である。
発明を実施するための最良の形態
以下に、本発明を実施例を示して具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。
〔実施例１〕海水及び湖水からのウイルス粒子の分離
図４に示した手順に従って、東京湾及び霞ケ浦から採取したサンプル水からウイルス粒子を分離した。すなわち、まずサンプル水500mlを、アングルローターを備えた遠心機（クボタ社製KR200A型）を用い、6,000×ｇで10分間遠心分離することにより夾雑物を沈殿除去した。次いで、得られた上清を孔径0.22μmのPVDF膜フィルター（イワキ社製）を用いて吸引濾過した。得られた濾液を、遠心機（日立社製CP90α型）を用い、125,000×ｇで３時間超遠心分離した。そして、得られた沈殿物を、TMバッファー（10mM Tris-10mM MgCl2(pH7.5)）0.5〜1.0mlに溶解し、ウイルス溶液とした。得られた溶液450μlにDNaseを終濃度25μg/mlとなるように添加し、37℃で30分間インキュベートすることにより裸のDNAを消化した後、500mM EDTA(pH8.2)50μlを加え、DNase反応を終了させた。
〔実施例２〕ウイルス遺伝子の分離
実施例１において得られたウイルス粒子から遺伝子を分離した。すなわち、55℃に加熱したウイルス粒子含有液に、加熱溶解した55℃の２％の低融点アガロース（ニッポンジーン社製AgaroseGB）を等容量加え、型に注ぎ固化させた。固化させたウイルス包埋物を滅菌チューブに移し、55℃で15〜18時間、ウイルス外皮分解処理液（1mg/mlプロティナーゼＫ、１％SDS、0.5M EDTA(pH8.2)）で処理した。得られたウイルス包埋物をTEバッファー（10mM Tris-HCl、１mM EDTA(pH8.0)）でリンスした後、TEバッファー中に浸すことにより４℃で保存した。
〔実施例３〕ウイルスDNAのパルスフィールドゲル電気泳動
ウイルスDNAを、CHEF Mapper System（バイオラッド社製）を用いて、パルスフィールドゲル電気泳動によって分画した。すなわち、実施例２において得られたウイルス包埋物を細かくスライスし、各々の湿重量を測定し、予め調製した１％アガロースゲルにアプライした。次いで、初期スイッチングタイム0.06秒、最終スイッチングタイム17.33秒、電圧６V/cm、泳動時間７時間53分で電気泳動を行った。泳動後、SYBR（サイバーグリーン）で60〜120分間染色した。
染色後のゲルを図５に示した。図５において、レーン１、７、12はいずれもDNAのサイズマーカーを泳動したものである。その他のレーンについては、レーン２は1997年9月24日に東京湾から採取したサンプル水、レーン３〜６は1998年3月18日に東京湾から採取したサンプル水を用いた場合を示している。そのうちレーン３は採水地点Ｔ１の海水面、レーン４は採水地点Ｔ１の海水面下15ｍの深度の場所、レーン５は採水地点Ｔ２の海水面、レーン６は採水地点Ｔ２の海水面下20ｍの深度の場所から採取したものを用いた場合を示している。また、レーン８〜11は、1998年8月19日に東京湾から採取したサンプル水を用いた場合を示している。そのうちレーン８は採水地点Ｔ１の海水面、レーン９は採水地点Ｔ１の海水面下15mの深度の場所、レーン10は採水地点Ｔ２の海水面、レーン11は採水地点Ｔ２の海水面下20ｍの深度の場所から採取したものを用いた場合を示している。さらに、レーン13〜15は、霞ケ浦から採取したサンプル水を用いた場合を示している。そのうちレーン13は1998年５月19日、レーン14は1998年６月17日、レーン15は1998年７月14日に採取したものを用いた場合を示している。図５から明らかなように、インタクトなウイルス遺伝子を含むと考えられる30kbpを超える分子サイズのDNAが分画されていることが示された。
産業上の利用可能性
本発明により、水界中のウイルス遺伝子をインタクトな状態で分離、分画、解析する方法が提供される。本発明は、水界中に存在するウイルスの種類の識別と存在量比の推定に有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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