(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
次のアミノ酸配列（１）
PyrGlu-Phe-Thr-Asp-Val-Lys-Cys-Thr-Gly-Ser-Lys-Gln-Cys-Trp-Pro-Val-Cys-Lys-Gln-Met-Phe-Gly-Lys-Pro-Asn-Gly-Lys-Cys-Met-Asn-Gly-Lys-Cys-Arg-Cys-Tyr-Ser-OH  （１）
（式中、 PyrGlu-はピログルタミン酸残基を表す）で表されるペプチド。
【請求項２】
分子内ジスルフィド結合を有する請求項１記載のペプチド。
【請求項３】
３個の分子内ジスルフィド結合を有する請求項１または２記載のペプチド。
【請求項４】
中国産サソリ(Buthus martensi) から抽出するか、もしくはアミノ酸配列（１）を有する合成ペプチドを空気酸化することにより得られる請求項３記載のペプチド。
【請求項５】
次のアミノ酸配列（２）：
PyrGlu-Phe-Thr-Asn-Val-Ser-Cys-Ser-Ala-Ser-Ser-Gln-Cys-Trp-Pro-Val-Cys-Lys-Lys-Leu-Phe-Gly-Thr-Tyr-Arg-Gly-Lys-Cys-Met-Asn-Ser-Lys-Cys-Arg-Cys-Tyr-Ser-OH  （２）
（式中、 PyrGlu-はピログルタミン酸残基を表す）で表されるペプチド。
【請求項６】
分子内ジスルフィド結合を有する請求項５記載のペプチド。
【請求項７】
３個の分子内ジスルフィド結合を有する請求項５または６記載のペプチド。
【請求項８】
中国産サソリ(Buthus martensi) から抽出するか、もしくはアミノ酸配列（２）を有する合成ペプチドを空気酸化することにより得られる請求項７記載のペプチド。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は新規なペプチド性毒素に関し、さらに詳細には、中国産サソリ（Ｂｕｔｈｕｓ  ｍａｒｔｅｎｓｉ）の毒腺から得られるペプチド性毒素に関する。
【０００２】
【従来の技術】
サソリは蛛形綱サソリ目に属する節足動物の総称であり、全世界に約６００種が生息する。サソリは一般に猛毒な生物であると考えられているが、実際には致命的な毒素を持つサソリは種類が限られており、例えば、アフリカの砂漠に生息するＢｕｔｈｕｓ  ｕｓｔｒａｌｉｓ，メキシコ産のＣｅｎｔｒｕｒｏｉｄｅｓｅｘｉｌｉｃａｕｄａや，南ヨーロッパ産のＢ．ｏｃｃｉｔａｕｄａ等、数種にすぎない。サソリの仲間のもつ毒素は一般に神経毒であるが、なかにはそれほど強くない毒素も多く、それらの生理活性を医薬あるいは生化学研究に利用するため、現在までに種々のサソリ毒素が単離されている（Ｄｒｅｙｅｒ．Ｆ．  Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１５巻  ９４−１２８頁  １９９０年）。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
現在までに単離され、構造決定されたサソリ毒素の例としては、Ｃｈａｒｙｂｄｏｔｏｘｉｎ１（ＣｈＴＸ，Ｍｉｌｌｅｒ，Ｃ．ら  Ｎａｔｕｒｅ，３１３巻３１６−３１８頁，１９８５年），Ｉｂｅｒｉｏｔｏｘｉｎ（ＩｂＴＸ，Ｇａｌｖｅｚ．Ａ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５巻  １９号  １１０８３−１１０９０頁，  １９９０年），Ｋａｌｉｏｔｏｘｉｎ（ＫＴＸ，Ｒｏｍｉ．Ｒ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８巻  ３５号  ２６３０２−２６３０９頁，  １９９３年）およびＭａｒｇａｔｏｘｉｎ（ＭｇＴＸ，Ｂｅｎｄｎａｒｒｅｋ．Ｍ．ら，ＢＢＲＣ，１９８巻  ６１９頁  １９９４年）等が知られており、これらの毒素の生理作用として、特にＫ+ チャンネルに対する作用が注目されている。
【０００４】
これらのペプチド毒素は、構造に高い相同性を示すものの、Ｋ+ チャンネルに対して全く正反対の作用を示すものもあり、これらのペプチド毒素を医薬等に応用するには、より多くのペプチド毒素を単離し、構造活性相関を研究する必要がある。このような現状に鑑み、本発明は、新たなサソリペプチド毒素を提供し、サソリ毒素の医薬等に対する応用に寄与することを課題とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、中国産サソリ（Ｂｕｔｈｕｓ  ｍａｒｔｅｎｓｉ）の毒腺から、マウスに対する致死活性を指標に、新たなサソリ毒素を単離すべく鋭意研究を行い、配列番号１および配列番号２で表されるペプチドを単離・精製し、その構造を推定した。また、この配列番号１および配列番号２に従ってペプチドを合成し、この構造を確認して本発明を完成した。すなわち、本発明によれば、配列番号１および配列番号２で表されるペプチドをペプチド毒素として提供することができる。以下、配列番号１で表されるペプチドをＳＶ１と呼び、配列番号２で表されるペプチドをＳＶ２と呼ぶ場合がある。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明のペプチドは、例えば、中国産サソリ（Ｂ．ｍａｒｔｅｎｓｉ）から毒腺を摘出し、これを例えば０．５Ｍ程度の酢酸でペプチドを抽出して粗抽出物を得る。この粗抽出物から、通常、ペプチド精製に用いられるイオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー等を用いて、マウスに対する致死活性を指標に分離・精製することにより得ることができる。
【０００７】
また本発明のペプチドは、分子内に３箇所までのジスルフィド結合を有しうるオリゴペプチドであるため、通常のペプチド合成機（例えばパーキン・エルマー社製ペプチド合成機４３１Ａ型）を用いた固相法により、ジスルフィド結合を含まないペプチドを合成し、所望により、これを酸化反応に付して、分子内にジスルフィド結合を導入した後、Ｃ−１８逆相高速液体クロマトグラフィー等に付して精製することにより、製造することもできる。
【０００８】
本発明のペプチドにおいて、分子内に３箇所のジスルフィド結合が存在しうることは、（１）一次構造に６個のＣｙｓ残基が存在すること、および（２）サソリ（Ｂ．ｍａｒｔｅｎｓｉ）から抽出したペプチドの質量分析のデータによれば、ペプチドは単量体で存在し、分子内に３箇所のジスルフィド結合が存在することを示している、という二つの事実から明らかである。
【０００９】
サソリ（Ｂ．ｍａｒｔｅｎｓｉ）から抽出した天然型の本発明のペプチドにおける３箇所のジスルフィド結合については、前記の既に知られているサソリ毒素であるＣｈＴＸおよびＩｂＴＸにおける、３箇所のジスルフィド結合の位置から類推して、７−２８番目，１３−３３番目および１７−３５番目のＣｙｓ残基間に存在すると推定されるが、その存在箇所は未だ同定されていない。しかし、天然型のペプチドを合成法で得るには、例えば、固相法でジスルフィド結合を含まないペプチドを合成した後、酸化反応により、無作為に３箇所のジスルフィド結合を導入して、例えばＣ−１８ＨＰＬＣで天然品と同じ保持時間を有する画分を単離して生理活性を測定すれば得ることができる。
【００１０】
さらに、天然型以外の様式のジスルフィド結合を有するペプチドであっても、本発明のペプチドと同様の生理活性を有する限りにおいて、本発明に使用することができる。
【００１１】
【作用】
本発明のペプチドは、後記評価例に示すように、Ｃ５７／Ｂ１６雄性マウスに対して、すでに報告されている毒素と同程度の神経毒活性を示した。このことは、本発明のペプチドが新たな一次構造を有するサソリ毒素ペプチドであることを示すものである。サソリ毒素ペプチドの神経毒活性は、Ｋ+ チャンネルの開口、遮断に関与するためと考えられている。そのため、本発明のペプチドは、神経生理学における生化学試薬として有用であるばかりか、医薬、動物薬への応用も考えられる。例えば、脳血管平滑筋のＫ+ チャンネルとクモ膜下出血後の脳血管の攣縮に関する研究から、Ｋ+ チャンネルオープナーは有望な治療薬であると考えられている（Ｈ．Ｚｈａｎｇ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｃｏｏｋ，Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ＆  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ，７５巻  ３２７−３３６頁  １９９４年）。
【実施例】
【００１２】
次に実施例によって本発明をさらに説明するが、本発明の範囲はこれらのみに限定されるものではない。
【００１３】
実施例１．中国産サソリからＳＶ１の精製
ａ．粗抽出
中国産サソリの毒腺の凍結乾燥物３００ｍｇを約１５ｍｌの０．５Ｍ酢酸でホモジナイズし、３，０００×ｇで２０分間遠心分離した。沈殿は同様にホモジナイズ後遠心分離する操作を３回繰り返し、得られた上清を孔径０．４５μｍのフィルターで濾過して、粗抽出液を得た。
【００１４】
ｂ．逆相カラムクロマトグラフィー（１）
ａ．で得られた粗抽出液の原料換算６０ｍｇ分を１バッチとして、Ｃａｐｃｅｌｌ  ｐａｋ  Ｃ１８  ＳＧ−１２０（資生堂，φ１０×２５０ｍｍ）を用いたＣ−１８逆相高速液体カラムクロマトグラフィーに付し、流速３ｍｌ／ｍｉｎで、０．１％ＴＦＡ（ｐＨ２．２）中、１０２分間で０％から４５％のアセトニトリルの直線濃度勾配で溶出した。２３０ｎｍのＵＶ吸収でモニターしながら、ピークを示す画分を３６フラクションを分画し、Ｃ５７／Ｂｌ６雄性マウスを用いる生物検定により、保持時間４７分および５０分に溶出される２個の活性画分を得た。
【００１５】
ｃ．陽イオン交換カラムクロマトグラフィー
ｂ．で得られた保持時間４７分の画分を、をＴＳＫ−ｇｅｌ  ＳＰ−５ＰＷ（東ソー，φ７．５×７５ｍｍ）を用いた陽イオン交換カラムクロマトグラフィーに付し、流速０．５ｍｌ／ｍｉｎで、１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８）中、８０分間で０Ｍから０．８ＭのＮａＣｌの直線濃度勾配で溶出した。２３０ｎｍのＵＶ吸収でモニターしながら分画し、生物検定により、ＮａＣｌ濃度５８０ｍＭで溶出される活性画分を得た。
【００１６】
ｄ．逆相カラムクロマトグラフィー（２）
ｃ．で得られた活性画分を、１００Ａ  Ｃ１８逆相ＨＰＬＣカラム（メルク，φ４×１２５ｍｍ）を用いるＣ−１８逆相高速液体カラムクロマトグラフィーに付し、流速１．０ｍｌ／ｍｉｎで、０．１％ＴＦＡ（ｐＨ２．２）中、４０分間で０％から４０％のアセトニトリルの直線濃度勾配で、２３０ｎｍのＵＶ吸収でモニターしながら溶出した。ＳＶ１は保持時間２７．３分の箇所にシングルピークとして溶出された。この分画を集めて凍結乾燥し、１ｍｇのＳＶ１を得た。
【００１７】
実施例２．中国産サソリからＳＶ２の精製
実施例１のステップｂ．で得られた保持時間５０分の画分を、実施例１のステップｃ．と同様にＴＳＫ−ｇｅｌ  ＳＰ−５ＰＷ（東ソー，φ７．５×７５ｍｍ）を用いる陽イオン交換カラムクロマトグラフィーで精製し、ＮａＣｌ濃度６００ｍＭで溶出される活性画分を得た。この画分を、実施例１のステップｄ．と同様に１００Ａ  Ｃ１８逆相ＨＰＬＣカラム（メルク，φ４×１２５ｍｍ）を用いるＣ−１８逆相高速液体カラムクロマトグラフィーで精製し、保持時間２９．２分の箇所にシングルピークとして溶出された分画を集めて凍結乾燥して、０．８ｍｇのＳＶ２を得た。
【００１８】
実施例３．１次構造の同定
ａ．アミノ酸組成の測定
ＳＶ１およびＳＶ２をそれぞれ、減圧下封管中に定沸点６Ｎ−ＨＣｌを用いて１１０℃，２０時間処理して加水分解し、アミノ酸分析器によりアミノ酸組成を求めた。結果を〔表１〕に示す。
【００１９】
【表１】
0003776968.tif 000002
【００２０】
ｂ．アミノ酸組成の測定
常法に従って還元およびＳ−カルボキシメチル化したＳＶ１およびＳＶ２は、通常のエドマン分解に抵抗性であったので、ギムネ・ガレゴら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５巻  ３３２９−３３３３頁，１９８８年）の方法で、ピログルタミン酸アミノペプチダーゼ処理を行った。
得られたペプチドをアミノ酸シーケンサーにより分析し、ＳＶ−１からは、
【００２１】
Glu-Phe-Thr-Asp-Val-Lys-Cys-Thr-Gly-Ser-Lys-Gln-Cys-Trp-Pro-Val-Cys-Lys-Gln-Met-Phe-Gly-Lys-Pro-Asn-Gly-Lys-Cys-Met
【００２２】
のＮ末端側の配列が同定された（但し、配列中Ｃｙｓは、Ｓ−カルボキシメチル化Ｃｙｓとして同定した）。さらに、ＳＶ１からは、ロミらの方法（Ｊ．Ｂｉｏｌ．，Ｃｈｅｍ．，２６８巻  ３５号  ２６３０２−２６３０９頁，１９９３年）によりＣＮＢｒ分解することにより、
【００２３】
Phe-Gly-Lys-Pro-Asn-Gly-Lys-Cys-Met-Asn-Gly-Lys-Cys-Arg-Cys-Tyr-Ser  および
【００２４】
Asn-Gly-Lys-Cys-Arg-Cys-Tyr-Ser
【００２５】
のＣ末端部分の構造を確認した。また、ＳＶ１は、ＭＳ−ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによる質量値、４１６９．１Ｄａを示した。このことは、分子内に３箇所のジスルフィド結合を有するとして、アミノ酸配列から計算した質量値である４１８５．９Ｄａより１６Ｄａ少なく、ＳＶ１は配列番号１で示されるペプチドであることが判明した。また、同様にＳＶ２からは、同様の処理により、
【００２６】
Phe-Thr-Asn-Val-Ser-Cys-Ser-Ala-Ser-Ser-Gln-Cys-Trp-Pro-Val-Cys-Lys-Lys-Leu-Phe-Gly-Thr
【００２７】
のＮ末端側配列が同定された（但し、配列中Ｃｙｓは、Ｓ−カルボキシメチル化Ｃｙｓとして同定した）。さらに、ＳＶ２のＬｙｓ−Ｃプロテアーゼ（Achromobactor 由来）による分解では、
【００２８】
Leu-Phe-Gly-Thr-Tyr-Arg-Gly-Lys  の部分構造、
【００２９】
Cys-Met-Asn-Ser-Lys  の部分構造および、
【００３０】
Cys-Arg-Cys-Tyr-Ser
【００３１】
のＣ末端部分の構造を確認した。また、未処理のＳＶ２は、ＭＳ−ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによる質量値、４１７７．２Ｄａを示した。このことは、分子内に３箇所のジスルフィド結合を有するとして、アミノ酸配列から計算した質量値である４１９３．７Ｄａより１６Ｄａ少なく、ＳＶ２は配列番号２で示されるペプチドであることが判明した。
【００３２】
実施例４．固相法によるペプチドの合成
ペプチドの合成は、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）樹脂（パーキン・エルマー社製）を担体とし、パーキン・エルマー・ジャパン社の全自動ペプチド合成機４３３Ａ型を用いて、ＦａｓｔＭｏｃTM（パーキン・エルマー・ジャパン社）の固相法により合成した。（但し、ｔＢｕ＝ｔ−Ｂｕｔｙｌを示す。）
【００３３】
ペプチド樹脂からのペプチドの切り放しと粗ペプチドの脱保護は、ＴＦＡ／チオアニソール／１，２−エタンジオール（９０／５／５，ｖ／ｖ）混合液を、ペプチド樹脂１ｍｇ当たり１０ｍｌ加えた後、室温で２．５時間処理することにより行った。反応液を濾過し、濾液にエーテルを加えてペプチドを沈澱させた後、沈澱をエーテルで３回洗浄した。次いで得られた沈殿をＴＦＡに再溶解し、再びエーテルで沈澱させて粗ペプチドを得た。
【００３４】
得られた粗ペプチドは、蒸留水に１．７ｍＭの濃度に溶解し、室温で４８時間空気酸化して、分子内にジスルフィド結合を導入した後、ＳＶ１については実施例１のステップｄ．，ＳＶ２については実施例２の最終ステップのＣ−１８ＨＰＬＣと同様の方法で精製し、合成ペプチドを得た。
【００３５】
合成ペプチドは、上記Ｃ−１８ＨＰＬＣで、天然品と同一の保持時間を示し、天然品と同一のアミノ酸組成および分子量を示した。また、合成ペプチドと天然品との混合物は、上記Ｃ−１８ＨＰＬＣで、天然品と同一の保持時間の箇所にシングルピークを与えた。さらに、合成ペプチドは、天然品と同一の生理活性を示した。これらのことから、ＳＶ１およびＳＶ２はそれぞれ配列表１および２に示すアミノ酸配列を有するペプチドであることが明らかである。
【００３６】
評価例１．ネズミに対する毒性試験
本発明のペプチドのネズミに対する毒性試験は、Ｍａｒｔｉｎら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２巻  ４４５２−４４５９頁  １９８７年）の方法に準じて実施した。すなわち、体重２０±３ｇのＣ５７／Ｂ１６雄性マウスを用い、０．１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む、種々の濃度の試料溶液を５μｌ／マウスを大脳脳室内に投与し、神経興奮により惹起される神経毒の症状を観察した。マウスの致死率から計算したＳＶ１およびＳＶ２のＬＤ50は、２０〜５０ｎｇ／マウスであり、この値は、モロッコ産サソリから単離されたＫＴＸ（Ｒ．Ｒｏｍｉら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．文献前出）の値とほぼ同様であった。
このＫＴＸについては、本発明者らによって、Ｋ+ チャンネル  ブロッカー活性を有することが確認されており（文献前出）、本発明のペプチドであるＳＶ１およびＳＶ２も、投与時の神経毒の症状およびＬＤ50値から、Ｋ+ チャンネルに対して、何らかの作用を有すると考えられる。
【００３７】
【発明の効果】
本発明によれば、配列番号１および配列番号２で示されるペプチドを、サソリ毒素ペプチドとして提供することができる。これらのペプチドは、評価例に示すように、Ｃ５７／Ｂ１６雄性マウスに対して、すでに報告されている毒素と同程度の活性を示し、新たな一次構造を有するサソリ毒素ペプチドである。従って、本発明のペプチドは、神経生理学における生化学試薬として有用であるばかりか、サソリ毒素ペプチドの医薬、動物薬としての応用に繋がるものである。
【００３８】
【配列表】
【００３９】
0003776968.tif 000003
【００４０】
0003776968.tif 000004