(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ハイビスカス自体又はその有機溶媒及び／又は水による抽出物を含有することを特徴とする線維芽細胞増殖剤。
【請求項２】
ハイビスカス自体又はその有機溶媒及び／又は水による抽出物を含有することを特徴とする皮膚コラーゲン産生促進剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、皮膚線維芽細胞の増殖を活性化し、細胞外マトリックス産生を増加させることにより、皮膚のはり・しわを改善する皮膚老化防止効果に優れた老化防止化粧料に関する。
【０００２】
【従来の技術および課題】
近年、健康で美しい肌を保つことが、老若男女を問わず、重大な関心事になっている。ところが、肌は、加齢などの内的因子や紫外線、活性酸素などの外的因子によって、皮膚が本来維持している収縮性、柔軟性、保湿性などの機能が衰え、様々なトラブルを発生する。
これらのトラブルのひとつであるしわは、真皮の細胞外マトリックスを産生する細胞数の減少、分裂速度の衰えなどの細胞機能の老化や、コラーゲン線維の減少および変性、皮下脂肪組織の減少などにより、皮膚の弛緩および弾力性の損失が起こることが原因となって発生する。
従来、皮膚老化への対処法としては、老化によって失われるコラーゲン、ヒアルロン酸などの物質を皮膚に塗布し補う組成物や、紫外線や活性酸素から皮膚を守るための防御物質を配合した間接的な老化防止剤が主流であった。
【０００３】
【発明者が解決しようとする課題】
しかしながらこれらの方法は満足のいく効果を奏するものではなかった。また、老化を根本的に改善しようとする試みとしてはレチノイン酸などがあるが、安全性に問題があり、長期使用に耐え得るものではなかった。
従って、皮膚の老化を改善し、しかも皮膚に弊害がなく、安全に使用できる老化防止化粧料の開発が望まれている。
【０００４】
【問題を解決する手段】
そこで本発明者らは、かかる実情に鑑み鋭意検討した結果、ハイビスカス自体又はその有機溶媒及び／又は水による抽出物が、皮膚線維芽細胞の細胞増殖を活性化し、細胞外マトリックスの産生を増加させることにより、皮膚のはり・しわの改善に顕著な作用を示すことを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００５】
すなわち、本発明は、ハイビスカス自体又はその有機溶媒及び／又は水による抽出物を含有することを特徴とする老化防止化粧料を提供するものである。
【０００６】
本発明で使用されるハイビスカス（学名：Hibiscus sabdariffa L.）は通常、各種溶剤で抽出し、抽出物（エキス）として使用するが、抽出液をそのまま使用してもよいし、乾燥粉体として使用してもよい。また、ハイビスカスをそのまま小片に裁断して小片状で使用しても、或いは乾燥後、粉砕して粉末状で使用してもよい。
【０００７】
ここで前記抽出物を得る方法としては公知の方法が利用できる。
植物抽出物は上記ハイビスカス、好ましくは乾燥末化したものを水もしくは有機溶媒（ヘキサン、エーテル、酢酸エチル、ブタノール、アセトン、プロパノール、エタノール、メタノール、プロピレングリコール、1,3ブチレングリコール）あるいはそれらを一定の比率で混合した溶媒、たとえば水性アルコールを用い、通常4℃〜100℃で抽出して得られる。こうして得られた抽出物は、必要に応じて活性炭又は活性白土等により精製する。
一般的には配合量は目的に応じ、0.001〜100重量％を任意に配合、使用する。
【０００８】
【実施例】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【０００９】
（ハイビスカス抽出物  製造例）  原材料として、ハイビスカスの乾燥物を300g使用した。前記原材料300gにイオン交換水450mlを加え、60℃で3時間加熱抽出した後No.2濾紙にて濾過する。全ての濾液を合わせ、HP-20（三菱化成社製：φ=50mm,h=500mm）カラムクロマトグラフィーに付し、HP-20未吸着画分を、ロータリーエバポレーターにて減圧濃縮、凍結乾燥し、ハイビスカス抽出物120gを得た（収量40%）。
【００１０】
＜実験例１＞皮膚線維芽細胞増殖試験
（１）試験溶液調製
前記ハイビスカス抽出物をCa2+,Mg2+不含有PBS（phosphate buffered saline。蒸留水１lあたり、NaCl 8.0g, KCl 0.2g, KH2PO4 0.2g, Na2HPO4・12H20 2.9g ）に0.1（w/v）％になるように溶解後、0.2μmメンブランフィルターにて濾過滅菌し、適宜希釈したものを、試験溶液とした。
（２）細胞培養
正常ヒト２倍体線維芽細胞HFSKF-II（理化学研究所製）を、Ham-F12（大日本製薬社製）に15（v/v）％の牛胎児血清を添加したもので培養した。前記培地にて１×105cell/mlに調整した細胞を、内径16mmの滅菌プラスチック24穴プレートに0.5mlずつ接種し、24時間培養後、試験溶液を10（v/v）％含む培地に交換し、その後48時間培養した。
（３）細胞数測定
前記のように培養後、24穴プレートの培地を捨て、Ca2+,Mg2+不含有PBSで細胞を洗浄後、トリプシンを用いて細胞を剥離し、細胞数を測定し、細胞増殖作用を検討した。これらの結果を第１表に示す。なお、ネガティブコントロールとしてはCa2+,Mg2+不含有PBSを用いた。
【００１１】
【表１】
皮膚線維芽細胞増殖試験結果
0003748941.tif 000002
【００１２】
表１の結果より、前記ハイビスカス抽出物は皮膚線維芽細胞の増殖効果を有することが見いだされた。
【００１３】
＜実験例２＞皮膚線維芽細胞賦活試験
MTT（3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルーテトラゾリウムブロマイド）は生細胞中に取り込まれるとミトコンドリア中の酵素の作用を間接的に受けてTetrazolium環が還元的に開裂し、青色のFormazanを形成する。細胞中で生成されるFormazan量は細胞のミトコンドリアのエネルギー代謝（呼吸酵素活性）と良好な相関があるため、MTT還元法によって細胞賦活効果を評価できる。
（１）試験溶液調製
前記ハイビスカス抽出物をCa2+,Mg2+不含有PBSで希釈し、0.2μmメンブランフィルターにて濾過滅菌したものを、試験溶液とした。
（２）MTTストック溶液の調製
MTT（3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルーテトラゾリウムブロマイド）5mgをCa2+,Mg2+不含有PBS 1mlに溶解した溶液をフィルターで濾過後、滅菌してMTTストック溶液を調製した。
（３）細胞培養
正常ヒト２倍体線維芽細胞HFSKF-IIを、Ham-F12（大日本製薬社製）に15（v/v）％の牛胎児血清を添加したもので培養した。前記培地にて１×105cell/mlに調整した細胞を、内径16mmの滅菌プラスチック24穴プレートに0.5mlずつ接種し、24時間培養後、試験溶液を10（v/v）％含む培地に交換し、その後48時間培養した。24穴プレートの培地を捨て、Ca2+,Mg2+不含有PBSで細胞を洗浄後、前記MTTストック溶液を10mlMTTストック/100μl培地となるように加え、4時間培養した。培地を除去し、酸性イソプロパノール（特級塩酸を0.04Nになるようイソプロパノールに添加した溶液）を各ウェルに600μl添加、攪拌後、波長570nmで吸光度を測定し、波長650nmで測定した濁度の吸光度を差し引いてFormazanの生成量として評価した。これらの結果を表２に示す。なお、ネガティブコントロールとしてはCa2+,Mg2+不含有PBSを用いた。
【００１４】
【表２】
皮膚線維芽細胞賦活試験結果
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【００１５】
表２の結果より、前記ハイビスカス抽出物は線維芽細胞賦活効果を有することが見いだされた。
【００１６】
＜実験例３＞皮膚線維芽細胞コラーゲン合成促進試験
（１）試験溶液調製
前記ハイビスカス抽出物をCa2+,Mg2+不含有PBSで希釈し、0.2μmメンブランフィルターにて濾過滅菌したものを、試験溶液とした。
（２）細胞培養
正常ヒト２倍体線維芽細胞HFSKF-IIを、Ham-F12（大日本製薬社製）に15（v/v）％の牛胎児血清を添加したもので培養した。前記培地にて１×105cell/mlに調整した細胞を、内径32mmの滅菌プラスチック12穴プレートに1.0mlずつ接種し、120時間培養後、試験溶液を10（v/v）％含む無血清線維芽細胞増殖培地F-GM（クラボウ社製）に交換し、その後48時間培養を行った。
（３）細胞数の測定
前記のように培養後、12穴シャーレの培地を捨て、Ca2+,Mg2+不含有PBSで細胞を洗浄し、トリプシンを用いて細胞を剥離し、細胞数を測定した。試験溶液のネガティブコントロールとしてはCa2+,Mg2+不含有PBSを使用した。
（４）培地内コラーゲン量の測定
培地内コラーゲン量は、前記（２）のように培養後、12穴プレートの各ウェルの培地を採取し、Ca2+,Mg2+不含有PBSにより細胞を洗浄した液を加えた溶液中に存在するヒドロキシプロリンの含量を定量することにより測定した。ヒドロキシプロリンはコラーゲンに特徴的なアミノ酸である。ヒドロキシプロリン量は、Inayama,Shibata,Ohtuki,Saitoの方法（藤本大三郎、永井裕(1985)、コラーゲン実験法、pp.51-56、講談社）に準じ、以下の方法により測定した。まず、培地に等容の12N-HClを加え、110℃、24時間加熱する。加水分解後、HClはロータリーエバポレーターで除去しておく。蒸留水2ml、KCl 1.5g、ホウ酸緩衝液（蒸留水1l当たり、ホウ酸 61.84g、KCl 225g、pH8.7）0.5mlを加え、室温で20分間静置する。クロラミンT溶液（p-トルエンスルホンクロロアミドナトリウム三水和物 1.41gを2ーメトキシエタノール25mlに溶解）0.5mlを加えて25分間適宜振とうし、さらに3.6Mチオ硫酸ナトリウム溶液 1.5mlを加え、密栓し、100℃で30分間加熱する。冷却した後、トルエンを2.5ml加え5分間振とう後、トルエン層を採取し、無水硫酸ナトリウムのカラム（6mm2×30mm）を通過させる。流出液1.0mlをとり、p-ジメチルアミノベンズアルデヒド溶液 0.5ml（p-ジメチルアミノベンズアルデヒド 120gをエタノール 200mlに溶解した液と、濃硫酸 27.4mlをエタノール 200mlに溶解した液を、氷冷下で混合）と混合し、室温で30分間放置後、560nmの吸光度を測定する。 コラーゲン量を前記（３）で測定した細胞数で割り、細胞数あたりの培地内コラーゲン量を算出する。試験溶液のネガティブコントロールとしてはCa2+,Mg2+不含有PBSを使用した。コラーゲン合成促進率は次式を用い、ネガティブコントロールのコラーゲン量を100%として計算を行った。
【００１７】
【数１】
培地内コラーゲン合成率(%)＝(Sx／Cx)× 100
Sx；試料溶液を添加したウェルにおける細胞数あたりの培地内コラーゲン量
Cx；Ca2+,Mg2+不含有PBSを添加したウェルにおける             細胞数あたりの培地内コラーゲン量
これらの結果を表３に示す。なお、ネガティブコントロールとしてはCa2+,Mg2+不含有PBSを用いた。
【００１８】
【表３】
皮膚線維芽細胞コラーゲン合成促進試験結果
0003748941.tif 000004
【００１９】
表３の結果より、前記ハイビスカス抽出物は皮膚線維芽細胞のコラーゲン合成促進効果を有することが見いだされた。
【実験例４】マウス皮膚塗布試験
実験動物としてICR系雌マウス（リタイア）を用い、バリカンにて剃毛した背部皮膚にハイビスカスエキスを10（v/v）％エタノールに溶解した溶液を１日１回0.2ml、５日/週、塗布した。４週間後、マウス背部から直径12mmの皮膚を採取した。採取した皮膚はを重量を測定後、アセトンにて脱水・脱脂後均質化し、実験例３（４）に示したInayama,Shibata,Ohtuki,Saitoの方法（藤本大三郎、永井裕(1985)、コラーゲン実験法、pp.51-56、講談社）に準じてコラーゲン量を算出した。これらの結果を表４に示す。なお、ネガティブコントロールとしては10（v/v）％エタノール溶液を用いた。
【００２０】
【表４】
マウス皮膚塗布試験結果
0003748941.tif 000005
【００２１】
表４の結果より、前記ハイビスカス抽出物はマウス皮膚のコラーゲン量を増加させる効果を有することが見いだされた。
【００２２】
【処方例】以下に本発明の処方例を挙げる。
【００２３】
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【００２４】
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【００２５】
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【００２６】
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【００２７】
0003748941.tif 000010
【００２８】
【発明の効果】
本発明によれば、ハイビスカス自体又はその有機溶媒及び／又は水による抽出物を含有した安全な老化防止化粧料が提供され、該老化防止化粧料は皮膚全体の老化を根本的に改善することができるため、いつまでもみずみずしくはりのある肌を保つことができる。