(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に記載の配列からなる核酸分子。
【請求項２】
前記核酸分子が、前記配列中の１または数個のヌクレオチドが置換、付加または欠失した変異を有し、かつ、低温における発酵力の調節が変異前と同等または向上された遺伝子である、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項３】
請求項１から２のいずれかの項に記載の核酸分子を有する、低温で発酵力が調節される酵母。
【請求項４】
請求項１から２のいずれかの項に記載の核酸分子を有する、プラスミド。
【請求項５】
請求項４に記載のプラスミドを含有する、低温で発酵力が調節される酵母。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は低温において酵母の発酵力を調節する遺伝子、該遺伝子を含有するプラスミド、該プラスミドを有する酵母、該酵母を育種する方法、該酵母を含有するパン生地および該パン生地の製造方法に関する。さらに詳しくは製パン、とりわけリタード工程を含むデニッシュやクロワッサンなどのペストリー、さらに全ての種類のパンにおける冷蔵および冷凍生地に適した酵母、並びにその育種方法、およびこの酵母を含有するパン生地、および該パン生地の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
最近の製パン業界においては、省力化によるパン製造工程の合理化と、その反面、多様な消費者ニーズに応えるため、冷凍生地法が盛んに行われるようになってきた。しかし、冷凍生地法においては生地の冷凍、輪送、保存、解凍等にコストがかかるだけでなく、さらに冷凍に耐え得る酵母の取得、生地の劣化等の問題点がある。たとえば、生地ミキシング後、冷凍過程において若干の発酵（いわゆる冷凍前発酵）が起こり、エチルアルコールが生地中に生成することによって酵母の冷凍耐性が低下する、または、流通過程における冷凍庫の開閉あるいは保管条件の不良による温度上昇のためせっかく冷凍した生地でも昇温による一部解凍が起こり品質が低下する、などの問題があった。
【０００３】
これを解決するために、冷凍生地の製造において、冷凍前発酵を抑えるためにミキシング温度を極端に抑えるべく冷蔵庫のような低温下でミキシングを行い、かつ、急速冷凍をするためにスパイラル急速冷凍機を使用するなどの方法が採られている。しかし、この方法は、膨大なエネルギーを必要とする等の欠点がある。  これらの問題点の解決のために、パン生地を冷凍させないで冷蔵状態で保管すると同時に生地の熟成をはかるいわゆる冷蔵生地法が検討されている。
【０００４】
しかし、従来から使用されているパン酵母を用いて生地を低温で冷蔵保存しても、発酵速度は常温より遅くはなるものの発酵が進むため、せいぜい、一日程度しか冷蔵保存できないという問題点がある。このため、一部は実用化されているものの、広く応用されるまでは至っていないのが実状である。
【０００５】
さらに、デニッシュやクロワッサンなどのペストリーの製造では、ロールインマーガリンをきれいに層状に折り込むため生地を低温処理するいわゆる「リタード法」がとりいれられている。しかしながら、このリタード工程における若干の生地発酵のために、ロールインマーガリンがきれいに折り込まれず、できたパンの層がきれいにならなかったり、生地の冷蔵保管が事実上できないため、成形残生地が活用できず、製パン工程の歩留まりの低下を招いている。
【０００６】
そこで、パン生地の冷蔵保存、あるいはリタード工程に使用し得る、低温状態で発酵力が弱い低温感受性の酵母が求められている。もちろん、通常の発酵温度では発酵力がなければならないことはパン製造上不可欠であることはいうまでもない。低温で発酵が抑制され、休眠するか、または増殖しないが、通常の培養温度では正常に分裂、増殖する、いわゆる低温感受性酵母としては、リボソームサブユニットに関する低温感受性酵母（A.P.Surguchovら、Biochim.Biophys.Acta vo1. 654 149‐155(1981)、M.Moritzら、Mol. Cell. Bio1. vol.11 5681‐5692 (1991)）、ＧＴＲ１遺伝子に関する変異株（M. Bun-yaら、Mol. Cell. Biol. vol.12 2958-2966 (1992)）等が知られている。低温感受性酵母の取得法としては、トリチウム自殺法を用いた低温感受性株の取得方法（B.S.Littlewoodら、Mutat. Res. vol. 17 315‐322 (1973)）等が知られている。しかし、これらの報告されている酵母は日常使用されているパン酵母ではなく、いずれもパン酵母に比べて発酵力が著しく低く、さらに、パンに求められる独特の風味等において劣るため、製パン用酵母として利用することがむずかしい酵母である。
【０００７】
低温で発酵力が抑制されるパン酵母の取得あるいは育種方法は、特開昭６１−１９５６３７、特開平４−２３４９３９、特開平５−７６３４８、特開平５−２８４８９６、特開平５−３３６８７２、あるいは特表平７−５００００６などに報告されている。しかし、いずれの育種方法も複雑で手間がかかり、効率的かつ効果的な育種が困難であるか、あるいは低温での発酵力が抑制される程度が低く実用性に乏しいという問題がある。
【０００８】
なお、本願明細書において、「遺伝子産物」とは、遺伝子がコードするポリペプチド、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ等をいう。また「低温感受性」あるいは「低温において酵母の発酵力を調節する」とは、２０℃以下において野生型パン酵母に比べて発酵力（炭酸ガス発生）が抑制される性質を言う。
【０００９】
低温感受性酵母に関する多くの開示から、低温感受性酵母が遺伝的背景に依存してその性質を示すことは明白な事実である。M. Bun-yaら、Mol. Cell. Biol. vol.12 2958-2966 (1992)）はＧＴＲ１の欠失が酵母を低温感受性にすることを報告している。また特表平７−５００００６公報ではｌｔｓ１〜８が開示されているように、低温感受性に関する遺伝子（以下、低温感受性遺伝子）は複数存在し、また該低温感受性については、その感受性レベルにおいて差がある。このような事実は、パン酵母として最適な低温感受性遺伝子の選択が重要な課題の一つであることを示している。
【００１０】
このように酵母を低温感受性にする原因は、特定遺伝子の破壊（失活）あるいは遺伝子産物の性質の変化が考えられるが、最適な低温感受性遺伝子の選択のためには、これら遺伝子の同定がなされる必要がある。後者の場合（遺伝子産物の性質が変化する場合）においては、例えば、低温感受性に関する酵素の活性等を指標に、低温感受性を評価をすることにより最適化が可能になる。また、低温感受性遺伝子にin vitroで変異を導入し、酵母、大腸菌等を用いて発現させ、それらの酵素活性等を指標に低温感受性を評価することにより、低温感受性パン酵母の変異が良好なものかどうかを評価できる。
【００１１】
しかるに、現在取得されあるいは使用されている低温感受性のパン酵母は、いずれも突然変異によって偶然に得られた低温感受性株を育種しているにすぎず、その最も重要な低温感受性という性質が最適化されていない。むしろ、より複雑で手間のかかる育種方法で、低温感受性以外の性質を改善することにより、パン酵母に適した性質を有するように低温感受性株を育種しているのが実状である。またそのような育種すら行わず、単に低温感受性遺伝子を有するという理由のみでパン酵母として利用している場合もある（特表平7−500006）が、必ずしも、最適な低温感受性酵母とはいえない。
【００１２】
優れた低温感受性パン酵母を育種するためには、前述した最適な低温感受性遺伝子の選択に加えて、低温感受性遺伝子の組み合わせによる低温感受性の向上が重要である。例えば、酵母は多くの代謝システムを有しているが、少なくとも酵母の代謝システムに関わる遺伝子の一つが低温感受性になることによって低温感受性の形質を示すようになると考えられる。しかし、各代謝システムによってその効果には当然差が生じる。同一代謝系に関連する低温感受性遺伝子を複数組み合わせる、あるいは異なる代謝系に関連する低温感受性遺伝子を複数組み合わせること等は優れた育種方法といえるが、一般的に行われている交雑、胞子形成、あるいは突然変異等の育種技術では困難なのが実状である。このように、低温感受性パン酵母の開発には、低温感受性を付与する遺伝子産物の評価を可能にし、効率的な育種方法が望まれている。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記問題点を解決するためになされたものである。
【００１４】
本発明の目的は、低温において酵母の発酵力を調節する遺伝子をクローニングし、その遺伝子を同定することにある。また、この遺伝子産物をin vitroで評価することにより、優良な低温感受性パン酵母を育種し、さらに、複数の低温感受性遺伝子を有する株を育種するという従来の技術では非常に困難であった育種方法を容易に可能とする方法をも提供する。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
本発明は、低温において酵母の発酵力を調節する遺伝子に関する。
【００１６】
好適な実施態様においては、前記遺伝子が、エネルギー獲得系あるいは糖の膜透過系に関連する遺伝子である。
【００１７】
好適な実施態様においては、前記遺伝子が、酵母の２番染色体右腕テロメアから約１３０ｋｂに存在しているＸｂａＩ-Ｓａｕ３ＡＩ／ＢａｍＨＩの約２．１ｋｂ断片であり、以下に示す制限酵素地図を有する遺伝子である。
【００１８】
【化３】
0003748619.tif 000002
【００１９】
好適な実施態様においては、前記遺伝子は、配列番号１に示される配列を有する。
【００２０】
好適な実施態様においては、前記遺伝子が、Ｓａｕ３ＡＩ部分分解処理によって得られる約９．６ｋｂの断片であり、以下の制限地図に示す断片に存在する。
【００２１】
【化４】
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【００２２】
好適な実施態様においては、前記遺伝子が、配列番号２で示される塩基配列を含む遺伝子である。
【００２３】
好適な実施態様においては、前記遺伝子が、該遺伝子中の１または２以上のヌクレオチドが置換、付加または欠失した変異を有し、かつ、発酵力の調節が変異前と同等または向上された遺伝子である。
【００２４】
本発明は、また、上記の遺伝子を有する、低温で発酵力が調節される酵母に関する。
【００２５】
本発明は、さらに、上記に記載の低温で発酵力が調節される遺伝子を有するプラスミドに関する。
【００２６】
また、本発明は、上記プラスミドを含有する、低温で発酵力が調節される酵母に関する。
【００２７】
好適な実施態様においては、前記プラスミドが、それぞれ異なる２以上の発酵力を調節する遺伝子を含むプラスミドを含む、低温で発酵力が調節される酵母である。
【００２８】
さらに、本発明は、低温で発酵力が調節される遺伝子、あるいは低温で発酵力が調節される遺伝子を有するプラスミドを有し、低温で発酵力が調節される酵母を含有するパン生地に関する。
【００２９】
好適な実施態様においては、パン生地が冷蔵生地である。
【００３０】
さらに、本発明は、前記酵母を含有するパン生地の製造方法に関する。
【００３１】
さらに、本発明は、それぞれ異なる低温において酵母の発酵力を調節する遺伝子を複数含有する酵母の育種方法を提供する。この方法は、以下の工程：
低温において酵母の発酵力を調節する複数の遺伝子を単離する工程；
低温において酵母の発酵力を調節する遺伝子を有する胞子株と、他の低温において酵母の発酵力を調節する遺伝子を有する胞子株とを接合させて、二倍体酵母を作成する工程；
該二倍体酵母に胞子を形成させ、胞子株を取得する工程；
低温において酵母の発酵力を調節する遺伝子を複数有する胞子株を、該単離した遺伝子をプローブとしてハイブリダイゼーションにより単離する工程；および、  該複数の遺伝子を有する胞子株どうしを接合させる工程；
を包含する。
【００３２】
好適な実施態様においては、２つの低温において酵母の発酵力を調節する遺伝子を有する酵母の育種方法である。この方法は、低温において酵母の発酵力を調節する遺伝子を１つ有する胞子株と、他の低温において酵母の発酵力を調節する遺伝子を１つ有する胞子株とを接合させて、２つの低温において酵母の発酵力を調節する遺伝子を有する胞子株を単離して、酵母を育種する方法である。
【００３３】
別の好適な実施態様においては、２つの低温において酵母の発酵力を調節する遺伝子を有する胞子株と、他の低温において酵母の発酵力を調節する遺伝子を有する胞子株とを接合させて、３つ以上の改善された遺伝子を有する酵母を育種する方法である。
【００３４】
これらの発明により、上記目的が達成される。
【００３５】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００３６】
本発明の遺伝子は、以下に記載する方法で、容易にクローニングされ得る。本発明の遺伝子の１例は、図３の制限酵素地図を有している、ＸｂａＩ-Ｓａｕ３ＡＩ／ＢａｍＨＩの約２．１ｋｂ断片であり、酵母の２番染色体右腕テロメアから約１３０ｋｂに存在している。
【００３７】
また、別の遺伝子としては、図１５で示される、Ｓａｕ３ＡＩ部分分解処理によって得られる約９．６ｋｂの断片である。
【００３８】
以下、本願発明の遺伝子を取得（クローニング）する方法について述べる。
【００３９】
一般に、遺伝子のクローニングは、その変異が優性か劣性かによって方法が異なる。変異が優性であるか劣性であるかは、交雑株の遺伝解析によって、遺伝学的に決めることができる。変異が優性の場合には、野生型の宿主親株が低温感受性に変化することを指標にすればよい。変異が劣性の場合には、低温感受性の親株が、形質転換によって野生型に復帰することを指標にすればよい。
【００４０】
本願発明の低温で酵母の発酵力を調節する遺伝子（以下、低温感受性遺伝子という場合がある）は、劣性と考えられるので、遺伝子のクローニングは、低温感受性宿主が野生型に復帰することを指標にして行い得る。
【００４１】
従って、まず、低温感受性の酵母を取得し、その酵母を宿主として、野生型に復帰させる遺伝子をスクリーニングすることにより、目的の遺伝子が取得され得る。
【００４２】
発酵力を調節する遺伝子としては、解糖系の代謝に関与する酵素、あるいは間接的に解糖系に影響を与える、例えばtRNA、rRNA、あるいは糖の膜透過系に関するポリペプチド、または脂肪酸の合成系の酵素のように間接的に糖の膜透過に影響する酵素に関連した遺伝子が考えられる。これらの酵素あるいはポリペプチドをコードする遺伝子をクローニングすることにより、同定され得る。また未同定のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列も見いだされ得る。これらの解析の結果、本願発明の低温で発酵力を調節する遺伝子、さらに該遺伝子を有する酵母が新規であるかどうかが明らかにされ得る。
【００４３】
以下、まず、低温感受性の酵母の取得、およびその低温感受性酵母を形質転換するために好適な宿主を創製することを説明し、次に、目的の遺伝子を有する染色体ＤＮＡ（遺伝子）ライブラリーの作成、およびそのＤＮＡライブラリーを用いて育種した宿主を形質転換し、目的の遺伝子をクローニングする方法を説明する。
【００４４】
（低温感受性酵母の取得）
本願発明の遺伝子を取得するための低温感受性酵母は、自然界からのスクリーニング、ニトロソグアニジン、エチルメタンスルホネート、紫外線照射等の変異処理、交雑や細胞融合などによる育種操作によって得られる。ここでは、変異処理を行って、目的とする酵母を取得する方法を開示するが、この方法に限られないことは言うまでもない。また、１段階の変異処理だけでは、不十分な場合は、変異処理を繰り返す方法、胞子を取得して戻し交雑する方法、細胞融合させる方法などを併用し得る。
【００４５】
（Ａ）酵母の変異
ここでは、エチルメタンスルフォネート（以下、ＥＭＳと記す）による変異法を説明する。使用する培地は以下の通りである。
【００４６】
0003748619.tif 000004
まず、親株のスラントから、１白金耳、ＹＰＤ培地 ５ｍｌに植菌し、３０℃、１６時間振盪培養する。培養終了後、3000rpm、10分で遠心分離して集菌し、0.1M、pH7.0のリン酸バッファーで１回洗浄する。菌体を同じリン酸バッファー５ｍｌに懸濁し、ＥＭＳを０．１５ｍｌ添加し、３０℃、２時間、時々攪拌しながら処理し、３０００ｒｐｍ、１０分の遠心分離で集菌し、リン酸バッファーで洗浄後、20% Na2S2O3を5ml加えて３０℃、１０分静置してＥＭＳを分解する。20% Na2S2O3処理を２回行い、生理食塩水５ｍｌで３回洗浄し、生理食塩水５ｍｌに懸濁し、上記組成のＹＰＤ寒天プレートに適宜希釈して菌を塗布する。
【００４７】
（Ｂ）低温感受性酵母のスクリーニング
B-1.１次スクリーニング：マイクロプレート法
ブロムクレゾールパープル（BCP）を用い、高ｐＨでは青紫色、低ｐＨでは黄色になるBCPの性質を利用して発酵力をスクリーニングする方法である。
【００４８】
ＹＰＤ寒天プレートで生育した株を、１白金耳、ＹＰＤ培地200μlが入ったマイクロプレートに植菌し、３０℃、１６時間静置培養する。マイクロプレートの各ウエルにＢＣＰ含有ＹＰＤ培地（上記ＹＰＤ培地にブロムクレゾールパープル(BCP)30mg加えたもの）200μlを注入し、このマイクロプレート各2枚に、この培養ブロスを20μｌずつそれぞれ移植し、それぞれ１０℃、および３０℃で５時間静置培養する。３０℃培養区で生育が良く菌量が多く、よく発酵するためブロスのｐＨが下がり色が黄変し、かつ１０℃培養区で生育は良いが発酵が抑制されるためブロスのｐＨが下がらず色が黄変していない株を選択する。
【００４９】
B-2.２次スクリーニング：マイセル法：
２次スクリーニングはマイセル発酵の前後の重量差が大きい株を選択する方法である。使用する培地は以下の通りである。
【００５０】
0003748619.tif 000005
１次スクリーニングで得られた株を糖蜜培地５ｍｌに１白金耳植菌して、３０℃、２４時間振盪培養する。この培養液５ｍｌを糖蜜培地５０ｍｌに移植し、さらに３０℃、２４時間振盪培養する。培養後、2本のフラスコから、培養液を併せて８０ｍｌとり、３０００ｒｐｍ、１０分遠心分離して集菌し、滅菌水で１回洗浄する。100mlのマイセル液に懸濁し、それぞれ５０ｍｌを、１０℃で１５時間、および３０℃で５時間培養した。マイセル発酵の前後の重量差をもってマイセル発酵力とし、３０℃で良く発酵しており、かつ１０℃で発酵力が低い株を選択する。
【００５１】
なお、低温下で発酵力が抑制される酵母を取得する観点からは、変異処理した酵母を、増殖する酵母を死滅させる薬剤を含有するＹＰＤ培地に接種し、低温下で嫌気状態で培養する工程を加えることが、より効果的である。低温で増殖する菌体が死滅するので、スクリーニングの効率はさらに向上するからである。増殖する酵母を死滅させる薬剤としては、例えば、ナイスタチン、アンホテリシンＢ、シクロヘキシミドなどが挙げられるが、比較的低濃度で増殖細胞死滅効果のある薬剤であればいずれでもよい。薬剤の培地中の濃度は、ナイスタチンの場合１０μｇ／ｍｌ〜５０μｇ／ｍｌ、アンホテリシンＢの場合、１００μｇ／ｍｌ〜５００μｇ／ｍｌ、シクロヘキシミドの場合、１０００μｇ／ｍｌ〜５０００μｇ／ｍｌが適当である。
【００５２】
以上のようにして、低温感受性酵母が取得され得る。
【００５３】
（形質転換用低温感受性酵母の育種）
一般的に実用酵母では外来のプラスミドＤＮＡなどを受け入れる、いわゆる形質転換能力は極端に低い場合が多く、また外来遺伝子導入の際に指標として利用されるマーカーもないのが普通である。低温感受性パン酵母に高い形質転換能力と遺伝子マーカーを付与するためには、高形質転換能と遺伝子マーカーを有する実験室株との交雑による育種が効果的である。もちろん突然変異、細胞融合等の技術を利用することによっても育種が実施できるのはいうまでもない。
【００５４】
低温感受性パン酵母としては、交雑による育種を実施するために、一倍体株を利用するのが望ましい。二倍体以上の株では一倍体を作製して用いることができる。高い形質転換能力を示す実験室株とは、例えば、プラスミドYCp50（8kb）による形質転換において形質転換能力が、例えば約1000/μgDNA以上を示すものが好適である。しかし外来ＤＮＡを受け取る能力がわずかでもあれば、基本的には本研究に用いることができる。なお形質転換方法によって形質転換効率は大きく影響を受けるが、一例としてBIO 101社製のALKALI CATI0N YEAST TRANSF0RMATI0N KIT等が使用できる。ただし形質転換法がこの方法に限定されないのはいうまでもない。遺伝子マーカーとしては、例えば、ura3、leu2、trp１、his3（Methods in Enzymology vol.101  202‐211 R.Wu編  Academic Press)等の栄養要求、セルレニン耐性(N.Nakazawaら、J．Ferment. Bio1. vol.76 60‐63(1993)) G‐418耐性(T.D.Webster Gene vo1.26 243‐252(1983)）等の薬剤耐性が利用し得る。その他、外来プラスミドの形質転換が確認できるマーカーであればどのようなものでも利用し得る。
【００５５】
低温感受性パン酵母を宿主とする場合に、適当なマーカーを付与する方法について述べる。低温感受性の一倍体パン酵母と、形質転換能約5000/μｇＤＮＡを有し、ura3、leu2、trp1等の遺伝子マーカーを有する一倍体実験室株とを交雑し、二倍体を作製する。その後、胞子形成培地（Methods in yeast Genetics, A Laboratory Course Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press）を用いて胞子形成を行い、胞子嚢からマニピュレーション法にて胞子を分離する。得られた胞子株の低温感受性を、前述の方法で調べる。更に栄養要求性を分析し、そして、YCp50等の栄養要求マーカーを有するプラスミドあるいはpYI13Gなどの薬剤耐性マーカーを有するプラスミドを用いて、形質転換能を調べる。このようにして、低温感受性であり、形質転換能が高く、かつura3、leu2、trp1等のマーカーを一種あるいは複数種有する低温感受性酵母の宿主が育成され得る。
【００５６】
（染色体ＤＮＡライブラリーの作成）
酵母染色体ライブラリーの作製は酵母染色体ＤＮＡとYCp50、YEp13等のプラスミドを用いて、Maniatis等の方法(Mo1ecular Cloning、T.Maniatisら、Co1d Spring Harbor Laboratory Press）によって作製できる。酵母染色体ＤＮＡはHereford法(L.Herefordら、Cell vol.18 1261‐1271(1979)）や酢酸カリウム法（Current Protocols in Molecular Biology F. M. Ausubel等編 John Wiley & Sons、New York(1989)）を用いて抽出でき、ＤＮＡ供与酵母は低温感受性遺伝子を含まなければどのような株でも用い得る。また、市販の遺伝子ライブラリー、例えばATCC37415、ATCC37323が利用され得る。ATCC37415あるいはATCC37323から調製されたライブラリーＤＮＡを用いて形質転換を行い、選択マーカーによって形質転換株を選択する。形質転換株は、１０００〜ｌ０,０００株程度取得すればよい。上記ライブラリーはそれぞれＹＣｐタイプ、ＹＥｐタイプのプラスミドのライブラリーであり、これらのプラスミドは酵母内で、存在様式が相違していることが知られている。
【００５７】
（形質転換）
上記宿主への形質転換はプロトプラスト法（S.Harashimaら、Mol.Cell.Biol.vo1.4 771‐778(1984)）、酢酸リチウム法（H.Itoら、J. Bacteriol. vol. 153 163‐168 (1983)）、エレクトロポレーション法、エレクトロインジェクション法（酵母による遺伝子実験法、バイオマニュアルシリーズ、山本正幸編、羊土社）等によって行い得る。またBIO 101社製のALKALI  CATI0N  YEAST  TRANSF0RMATI0N  KIT等を用いても実施し得る。
【００５８】
ATCC37415を用いて形質転換を行う場合は、選択培地としては、ウラシルを含まない最少培地であればどのような培地でもよく、好適には以下の組成の培地：
Yeast nitrogen base with amino acids    0.67%
Glucose                                 2.0%
Casamino acids                          0.4%
Agar                                    2.0%
が用いられ得る。
【００５９】
ATCC37323を用いて形質転換を行う場合は、選択培地としては、ロイシンを含まない最少培地であればどのような培地でもよい。好適には以下の組成の培地：
Yeast nitrogen base without amino acids  0.67%
Glucose                                  2.0%
L-leucine drop‐out mix*                 0.2%
Agar                                     2.0%
*drop-out mixは、Methods in Yeast Genetics, A Laboratory Course Manual (H.D. Rose et al. Cold Spring Harbor Laboratory Press）に記載されているが用いられ得る。
【００６０】
（低温で酵母の発酵力を調節する遺伝子のクローニング）
目的の遺伝子のスクリーニングは、低温感受性宿主が野生型に復帰することを指標にして行い得る。その一例を述べると、形質転換株をYPGA培地にレプリカし、３０℃で２〜３日間培養後、約４５℃に保温した色素寒天培地を重層し、直ちに５℃にて一夜保温する。低温感受性酵母は低温で発酵力が著しく抑制されるため、ＢＣＰの色調は青紫色であるが、低温感受性が解除された株はＢＣＰの色調は黄色に変化する。このようにして、低温感受性の形質を解除する遺伝子を含有するプラスミドで形質転換された株（陽性クローン）が多数選択され得る。
【００６１】
また、上記方法とは異なる選択方法も用いられ得る。低温で発酵が著しく抑制される株は、低温でエネルギー獲得系が著しく抑制される株であり、このような株の低温における生育は、野生株に比べて著しく抑制される。形質転換した株を一夜ＹＰＤ培地で培養後、ＹＰＤ寒天培地にプレートする。形質転換株のうち５℃で約２カ月間培養後、野生株と同様にコロニーを作る株を多数分離できる。このようにして、複数の陽性クローンが取得され得る。
【００６２】
（プラスミドの回収と制限酵素地図）
形質転換株からのプラスミドの抽出はHereford法や、酢酸カリウム法等によって行う。その後、常法に従って、抽出したプラスミドをJM109あるいはHB101等の大腸菌に形質転換する。得られた形質転換株を培養し、プラスミドを抽出精製することによってプラスミドが回収され得る。プラスミド中に挿入された目的の遺伝子のマッピング（制限酵素地図の作成）は、市販の各種制限酵素を用いて行われ得る。このようにして、複数の陽性クローンの、それぞれのプラスミドのマッピングを行うと挿入されたＤＮＡ断片の共通部分が見いだされ得る。この共通部分に、低温において発酵力を調節する遺伝子が存在すると考えられる。
【００６３】
（ＤＮＡ塩基配列の決定）
低温で発酵力を調節する遺伝子断片の精製には、アガロースゲル電気泳動等が利用され得る。得られた遺伝子断片を、例えば、制限酵素Sau3AあるいはTthHB81等の４塩基を認識する酵素で切断し、マルチクローニングサイトを有するM13ファージ、例えばM13mp18あるいはM13mp19にサブクローニングして、ＤＮＡの塩基配列の決定を行う。またM13ファージの代わりにpUC18あるいはpUC19等のプラスミドベクター、pUC118あるいはpTV119Nなどを利用してＤＮＡ塩基配列の決定が行われ得る。
【００６４】
ＤＮＡ塩基配列の決定は、Sanger法あるいはMaxamーGilbert法（Molecular Cloning、T.Maniatisら、Cold Spring Harbor Laboratory Press）を用いて行われ得る。さらに、（株）パーキンエルマー ジャパンのTaq DyeDeoxyTM Terminator cycle sequencing Kitを用い、ABI373A DNAシーケンサーによって行うこともできる。得られたＤＮＡ配列と種々のデーターベースとを比較することによって、ＤＮＡ配列中の遺伝子が同定され得る。国立遺伝学研究所ＤＮＡデータベースDDBJ（DNA Data Bank of Japan）等が利用され得る。
【００６５】
（低温感受性遺伝子の性質の同定）
酵母の発酵力は、各菌株の遺伝的背景の違いによって大きく影響を受けることが知られている。低温感受性遺伝子のクローニングによって同遺伝子の発酵力に与える効果を定量的に判定することが可能となる。低温感受性遺伝子が挿入されたベクター、またはベクターのみをそれぞれ同一に宿主に導入し、当該遺伝子以外は同一の遺伝的背景を持つ菌株を作製する。発酵力は前述したマイセル法を改良し、砂糖やグルコース等を含む培地で発酵を行い、経時的に重量変化を測定することによって定量し得る。このようにして常温と低温における発酵力を比較することによって低温感受性遺伝子の機能を知ることができ、最適な低温感受性遺伝子を選択し得る。
【００６６】
ａ）既知遺伝子の場合
前項におけるＤＮＡデータベース検索によって、低温感受性遺伝子のコードする酵素等が明らかになった場合、活性が比較的容易に測定できる遺伝子、例えば、解糖系の酵素群をコードする遺伝子の低温感受性の程度は、以下のようにして測定され得る。まず、目的の遺伝子産物の無細胞抽出液を調製し（山本正幸編、バイオマニュアルシリーズ１０  酵母による遺伝子実験法、羊土社）、次に、in vitroで活性を測定することにより、各酵素の低温感受性が測定され得る。同種類の調節遺伝子を有する低温感受性酵母では、該遺伝子産物の低温における活性を測定することにより、低温感受性が高い株が選択され得る。他方、調節遺伝子が異種である低温感受性酵母間では、それぞれ野生型に対する遺伝子産物の低温における活性の減少の割合を相互に比較することにより、低温感受性が高い株が選択され得る。
【００６７】
ｂ）未同定遺伝子の場合
低温感受性遺伝子が未同定の場合、ＤＮＡ配列の既知機能領域とのホモロジー検索や遺伝的手法、例えば、遺伝子破壊や遺伝子置換等とそれに続く四分子解析等の手法を用いることによって、当該遺伝子の機能を明らかにすることができる。また当該遺伝子のサプレッサーの単離等も有効な手段となり得る。
【００６８】
（変異部位の解析）
低温において発酵を調節する遺伝子が変異を受けている場合、その変異部位の解析には、野生型酵母と低温感受性となった変異型酵母との、それぞれの遺伝子の塩基配列を決定し、比較することが必要である。
【００６９】
低温感受性酵母の親株である野生型酵母のＤＮＡライブラリーを作成し、これを用いて、低温において発酵を調節する遺伝子をクローニングした場合には、そのクローニングした遺伝子に対応する低温感受性酵母の遺伝子断片を取得し、配列を比較することにより、変異部位が決定され得る。
【００７０】
他方、親株のＤＮＡライブラリーを使用せず、市販のＤＮＡライブラリーを使用する場合には、クローニングした遺伝子断片に対応する、親株およびその変異株である低温感受性株の遺伝子断片の配列を比較する必要がある。
【００７１】
クローニングしたＤＮＡに対応するＤＮＡ（遺伝子）断片が親株あるいは低温感受性酵母に存在するか否かはサザンハイブリダイゼーションによって調べ得る（Molecular Cloning, T. Maniatis ら、Cold Spring Harbor Laboratory Press）。
【００７２】
酵母からの染色体ＤＮＡの抽出は、Hereford法や酢酸リチウム法等を用いて行われる。抽出したＤＮＡは、前述した制限酵素地図をもとに種々の制限酵素で切断してアガロースゲル電気泳動を行いナイロンフィルターあるいはニトロセルロースフィルターにブロッティングする。プローブとして前記クローニングＤＮＡ断片の一部または全部を用い、アイソトープラベルあるいは蛍光ラベルを付し、サザンハイブリダイゼーションに使用する。蛍光ラベルとしては、アマシャムジャパン（株）製のFluorescein Gene ImagesTM randam prime module等が利用され得る。また、蛍光ラベルの代わりに32Ｐラベルも当然に用いられ得る。
【００７３】
サザンハイブリダイゼーションの結果から、親株および低温感受性株とも前記クローニングＤＮＡ断片と同じ制限酵素マップを有するかどうかが明らかにされる。この情報をもとに親株、低温感受性株の染色体ＤＮＡを適切な制限酵素で切断し、目的ＤＮＡ断片の存在する領域をアガロース電気泳動等にて精製を行う。このようにして得られたＤＮＡを、例えば、pUC18あるいはpUC19等のプラスミドベクターの適切な制限酵素部位に挿入する。プラスミドベクターの代わりにλファージ等のファージベクターも使用され得る。サザンハイブリダイゼーションに使用するプローブを用いて、コロニーハイブリダイゼーション（Molecular Cloning, T. Maniatisら、Cold Spring Harbor Laboratory Press）を行えば、目的のＤＮＡ断片を有するクローンをスクリーニングできる。ファージベクターの場合はプラークハイブリダイゼーション法が用いられ得る。
【００７４】
上記の方法によって、低温で発酵力を調節する遺伝子の野生型、変異型の両ＤＮＡ断片をクローニングすることができる。これらの両ＤＮＡ断片の塩基配列を決定し、比較することで、該ＤＮＡがコードしている遺伝子の変異部位が明らかとなる。
【００７５】
（変異の最適化：目的遺伝子への変異の導入）
本願発明の遺伝子は、低温で発酵力を調節する遺伝子をさらに最適化させることにより、優良な低温感受性株が育種され得る。
【００７６】
低温で発酵力を調節する遺伝子が、得られる変異のうち最適であるかどうかが検討され得る。野生型遺伝子に人為的に変異を導入し、例えば、大腸菌を用いた発現システムを用いることで多数の変異遺伝子産物を得ることができる。発現システムとしては大腸菌のほか、酵母、枯草菌、動物細胞等のシステムが用いられ得る。遺伝子に人為的に変異を導入する方法としては、化学的または酵素的に変異をおこさせる方法がある。また変異の導入方法としては、ランダムに変異を導入する方法と部位特異的に変異を導入する方法がある。
【００７７】
ランダムに変異を導入する方法として、薬剤を用いて化学的にＤＮＡを変異させる方法がある。このような薬剤として、塩酸ヒドロキシルアミン、亜硝酸ナトリウム、ギ酸、ヒドラジンなどが用いられ得る。例えば、塩酸ヒドロキシルアミンを用いた変異では、まず、M13ファージ、例えば、M13mp19の二本鎖ＤＮＡに、低温で発酵力を調節する遺伝子のＤＮＡ断片を連結させる。連結されたＤＮＡをE.coli JM109などに感染させて培養する。培養後、ファージ粒子を調製して、得られたファージ粒子に変異反応を行う。変異反応は塩酸ヒドロキシルアミシを用いて行われ得る。塩酸ヒドロキシルアミンとしては、0.１Mから2M、好ましくは0.25M、pHが6.0から8.0、好ましくは6.0のものが用いられ得る。反応は３７℃で、１時間から２４時間行い得る。この変異反応を行ったファージ粒子を、E.coli JM109などに感染させ、変異が導入された二本鎖組換えＤＮＡを回収する。回収された変異遺伝子は、プラスミドに移すことにより、調製され得る。
【００７８】
亜硝酸ナトリウム、ギ酸、ヒドラジンなどを用いる変異方法は、基本的には、Myers  K.Wらの示す方法（Science vol.229 242‐247(1985)）が用いられ得る。この方法は、調節遺伝子を組み込んだ組換えM13ファージから一本鎖ＤＮＡを調製し、これを変異処理することによって行い得る。
【００７９】
亜硝酸ナトリウムを用いる場合、０．５Ｍから２Ｍ、好ましくは１Ｍの濃度で行い、pHが酸性側、好ましくはｐＨ４．３、４℃から３７℃、好ましくは２５℃の反応温度で、１分から５時間、好ましくは３０分間反応させることにより行なわれ得る。
【００８０】
ギ酸を用いる場合、１２Ｍの濃度で、４℃から３７℃、好ましくは１５℃で、２分から１０分間反応させることにより行われ得る。
【００８１】
ヒドラジンを用いる場合、２５℃で３分から１０分処理することによって行なわれ得る。
【００８２】
これらの反応で変異された一本鎖ＤＮＡは、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼのクレノー（Ｋｌｅｎｏｗ）フラグメントあるいはSequenaseRなどを用いて二本鎖化し、プラスミドに組み込むことによって、変異遺伝子を調製することができる。
【００８３】
また、酵素反応を用いるランダム変異の方法としては、ＰＣＲ反応（ポリメラーゼ連鎖反応）を用いる方法（D. W. Leun等、Journal of Methods in Cell and Molecular Biology vol.1 11‐15(1989)）が挙げられる。これはTaq DNAポリメラーゼを用い、遺伝子の両端の配列を持つ合成ＤＮＡ（ＤＮＡプライマー）からそれぞれ遺伝子を合成させるものであり、この際の反応条件、例えば、通常の反応よりMgCl2濃度や基質（ｄＮＴＰｓ）の濃度を上げたり、４種の基質のうち１種類のみの濃度を極端に低下させるなどの反応条件を用いて、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼによる遺伝子合成に誤りを起こさせることにより、変異を有する遺伝子を調製することができる。
【００８４】
遺伝子の変異を部位特異的に導入する方法としては、オリゴヌクレオチドを用いるin vitro部位特異的変異導入法、変異部位のカセット置換法、ＰＣＲ反応を用いる方法などを挙げることができる。オリゴヌクレオチドを用いるin vitro部位特異的に変異を導入する方法は、遺伝子を挿入したM13組換えファージから一本鎖ＤＮＡを調製し、変異させたい部分の変異後の配列を含む合成ＤＮＡプライマーを用いて、ＤＮＡポリメラーゼクレノー断片のような酵素を用いて二本鎖化する方法である。二本鎖化されたＤＮＡを、E.coliに導入することによって、変異が導入された遺伝子が調製され得る。このin vitro部位特異的変異導入は、市販のキット、例えば宝酒造（株）の「MutanTM-K」あるいは「MutanTM-G」、アマシャム・ジャパン（株）の「オリゴヌクレオチドを用いた部位特異的in vitro変異体作製システムversion 2.0」を用いて、簡単に行い得る。
【００８５】
変異部位のカセット置換法は、変異させたい部位を含む制限酵素断片を、変異を含む合成ＤＮＡでそっくり置換することによって行い得る。
【００８６】
ＰＣＲ反応を用いる変異導入は、Itoら（W. Itoら、Gene vol.102, 67‐70(1991)）の方法等に従って行ない得る。この方法は、変異させたい部位を含む合成ＤＮＡプライマーと遺伝子末端の合成ＤＮＡとを用いてＰＣＲ反応を行ない、２種の合成されたＤＮＡをハイブリダイズさせた後、酵素により伸長させて、変異させたい部位を含む遺伝子全長を合成するＰＣＲ反応を再び行う方法である。
【００８７】
このようにして変異を導入した遺伝子を、大腸菌の発現ベクター、例えば、pKK233‐2、pKK233‐3（ファルマシアバイオテック社）に組み込み、JM105等の大腸菌に導入する。これらの株を培養し、IPTG等の形質発現誘導剤を添加することによって所望のポリペプチドが発現され得る。発現されたポリペプチドの性質に従って抽出、精製が行われ得る。精製された遺伝子産物（ポリペプチド）を用いてそれぞれ高温（例えば３０℃）、低温（例えば０℃〜２０℃，好ましくは５℃〜１５℃）で活性を測定し、温度による活性の差を求める。このうち高温では通常レベルかそれ以上の活性を示し、低温では野生型より著しく活性を減じる遺伝子産物が選択され得る。
【００８８】
人為的に変異を導入した遺伝子の産物（ポリペプチド）の温度感受性を比較すると、突然変異等によって取得した低温で発酵力を調節する遺伝子がさらに低温感受性に関して向上できるかどうかを知ることができる。このため、この遺伝子産物の機能の向上が期待できる場合には、さらに多くの突然変異株のスクリーニングを実施し、優れた低温感受性を示す遺伝子を含有する酵母を選択することができる。このように遺伝子への人為的な変異導入は低温感受性を示す酵母のスクリーニングに有益な情報をもたらし、遺伝子のクローニングがそれを可能とする唯一の手段を提供する。
【００８９】
また、この技術の応用例として、変異が導入された最良の遺伝子を選択し、その遺伝子を、野生型パン酵母の遺伝子と置換し、優良菌株を育種し得る。一般的に、酵母ではin vivoにおける遺伝子の相同組換えを利用した遺伝子置換は比較的容易に実施できる。このように本願発明は、遺伝子組換え技術を利用した低温感受性パン酵母の育種をも可能としている。
【００９０】
（プラスミド）
上記の方法で得られた、目的とする低温において発酵力を調節し得る遺伝子は、適当なプラスミドに組み込まれ得、酵母に形質転換され得る。プラスミドとしては、酵母の中で維持されるものであれば、いずれをも使用し得る。例えば、YIp、YEp、あるいはYCpに代表される酵母のプラスミドが使用され得る。好適には、YIp１、YIp５、YCp50、YEp13等のプラスミドが用いられ得る。
【００９１】
このようにして取得された低温において発酵力を調節し得る遺伝子を有するプラスミドをパン酵母に形質転換し、形質転換された酵母が取得され得る。
【００９２】
プラスミドには、それぞれ異なる２以上の発酵力を調節する遺伝子が含まれていてもよい。また、それぞれ異なる遺伝子を有するプラスミドを複数個、酵母に形質転換してもよい。
【００９３】
（育種）
前述の方法によって低温で発酵力を調節する遺伝子を含有する酵母を多数取得できる。酵母の遺伝子間の異同は遺伝学的な方法を用いて判定し得る。ただし、遺伝子内部の変異の違いを明らかにするのは、困難な場合が多い。
【００９４】
交雑等の育種技術を用いて、低温で発酵力を調節する遺伝子を一種類含有する酵母から、複数の異なる調節遺伝子を含有する酵母を育種することは優れた低温感受性酵母を提供する方法である。
【００９５】
遺伝学的手法を用いた方法では、交雑等を含め、詳細な四分子解析を行うことが必要である。一般的に胞子株では、生育の悪い株あるいは全く発芽しない株が出現する場合があり、特に実用的なパン酵母においてこの傾向が強い。このため、四分子解析が困難になり、複数の、それぞれ異なる低温で発酵力を調節する遺伝子を含有する一倍体株の選別を容易に行うことができない場合が多い。このように、遺伝学的手法を用いた方法では、多大な労力と時間を要するのが実情である。
【００９６】
本発明においては、実用的な酵母（例えばパン酵母）などの四分子解析の適用が困難な酵母を育種する方法が提供される。また、複数の低温で発酵力を調節する遺伝子を含有する酵母を容易に育種する方法も提供する。
【００９７】
本願発明のような遺伝子は、栄養要求性等の明確なマーカーとは異なり、容易かつ正確に評価することができない。従って、遺伝子発現の程度をいちいち検討する必要がある。従って、従来から用いられている四分子解析のような方法では、形成された胞子すべての発酵力を検討しなければならないので効率的ではない。そこで、いったん、目的の遺伝子を単離した場合に、それを実用酵母に育種する方法が提供される。
【００９８】
以下、複数の低温で発酵力を調節する遺伝子を含有する酵母を育種する方法を説明する。
【００９９】
まず、低温において酵母の発酵力を調節する複数の遺伝子を単離する。遺伝子の取得は、上記の方法で単離され得る。この遺伝子は、育種の際のプローブに使用される。
【０１００】
低温感受性酵母に胞子を形成させ、低温において酵母の発酵力を調節する遺伝子を有する胞子株を単離する。異なる調節する遺伝子を有し、かつ接合型の異なる胞子株を接合させて、二倍体酵母を作成する。この二倍体酵母に胞子を形成させ、胞子株を取得する。上記遺伝子をプローブとして、低温において酵母の発酵力を調節する遺伝子を複数有する胞子株を検出し、単離する。このようにして選択される、複数の発酵力を調節する遺伝子を有し、かつ接合型が異なる胞子株を接合して、目的の酵母が育種される。
【０１０１】
好適には、２つの低温において酵母の発酵力を調節する遺伝子を有する酵母が育種され得る。この方法は、低温において酵母の発酵力を調節する遺伝子を１つ有する胞子株と、他の低温において酵母の発酵力を調節する遺伝子を１つ有する胞子株とを接合させて、２つの低温において酵母の発酵力を調節する遺伝子を有する胞子株を単離して、酵母を育種する方法である。
【０１０２】
さらに、３つ以上の、酵母の発酵力を調節する遺伝子を有する酵母を育種し得る。２つの低温において酵母の発酵力を調節する遺伝子を有する胞子株と、他の低温において酵母の発酵力を調節する遺伝子を有する胞子株とを接合させて、３つ以上の発酵力を調節する遺伝子を有する酵母を育種し得る。
【０１０３】
別の好適な実施態様においては、２つの改善された遺伝子を有する胞子株と、他の改善された遺伝子を有する胞子株とを接合して、３つ以上の改善された遺伝子を有する酵母を育種する方法である。
【０１０４】
より具体的に２つの遺伝子を導入する場合を説明する。互いに異なる、低温において酵母の発酵力を調節する遺伝子を含有し、接合型が互いに異なる一倍体酵母を用いて二倍体の株を作成する。二倍体化は交雑のみではなく、細胞融合等によっても行い得る。得られた二倍体栄養細胞を胞子形成培地に塗付することによって胞子形成を行ない、マニピュレーションやランダム胞子分離によって胞子を分離する。通常二倍体株から一倍体胞子が４つ分離される。得られた胞子は両親の染色体を混合した形で染色体を受け継ぎ、その中には両親の相同染色体間で組み換えを起こしている染色体を含む場合もある。分離した胞子の中から２種類の低温において酵母の発酵力を調節する遺伝子を含有する株を選別するためには、M. D. Roseらの方法(Methods in Yeast Genetics, A Laboratory Course Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press）を用いたコロニーハイブリダイゼーションを実施するのが好適である。プローブとしては、例えば、遺伝子の変異部位の前後をコードするＤＮＡ配列に従って、変異塩基を中心に５’側、および３’側それぞれ１０ヌクレオチドからなる２１ヌクレオチドのプローブが好適に使用され得る。プローブの配列および鎖長は、野生型と変異型合成ＤＮＡとが、コロニーハイブリダイゼーションにおいて、解離条件として検出できるような差があれば、どのようなものでも使用し得る。γ-32PーATPあるいは蛍光試薬にてＤＮＡの末端をラベルし、プロ一ブとして用いられ得る。２種類のプローブについて変異型ＤＮＡにはハイブリダイズするが、野生型ＤＮＡにはハイブリダイズしない洗浄条件をそれぞれ決定する。
【０１０５】
上記の胞子株から、変異型プローブにハイブリダイズするが、野生型プローブにはハイブリダイズしない胞子株が選択され得る。選択した株のうち、互いに接合型が異なる株を接合させ、二倍体株が作製される。こうして育種した株のほとんどは、親株が示す低温感受性よりも向上した低温感受性を有している。
【０１０６】
このようにして、目的の低温感受性の酵母が育種され得る。
【０１０７】
このようにして得られた酵母は、低温で発酵力が抑制されているため、製パンに使用される。
【０１０８】
【実施例】
以下に、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、これらの実施例は本発明を制限するものではない。
【０１０９】
なお、本発明において使用される主な培地は下記のとおりである。
【０１１０】
ＹＰＤＡ培地
Bacto-yeast extract              1%
Bactoーpeptone                    2%
Glucose                          2%
Adenine hydorochloride           0.04%
ＹＰＤＡ寒天培地は、このＹＰＤＡ培地に2%の寒天を加えた培地である。
【０１１１】
（糖蜜培地）
糖蜜（糖として）  3%
硫安              0.5%
燐安              0.3%
尿素              0.2%
（ＹＰＧＡ培地）
Bacto-yeast extract       1%
Bact-polypeptone          2%
Glycerol                  3%
Adenine hydrochloride  0.04%
Bacto‐agar               2%
（カザミノ酸培地）
Yeast nitrogen base with amino acids    0.67%
Glucose                                 2.0%
Casamino acids                          0.4%
Bacto-agar                              2.0%
（マイセル液）
Glucose                               3%
Diammonium hydrogen phosphate         0.5%
Potassium Dihydrogen phoshate         0.5%
（色素寒天培地）
Bacto‐yeast extract          0.5%
Bacto‐polypeptone            1%
Sucrose                       10%
2%BCP/Et0H                    1%
Bacto‐agar                   0.8%
（最少培地）
Yeast nitrogen base without amino acids        0.67%
Glucose                                        2.0%
drop‐out mix*                                 0.2
Bacto‐agar                                    2.0%
*drop‐out mixは、Methods in Yeast Genetics, A Laboratory Course Manual(H.D.Rose et al.Cold Spring Harbor Laboratory Press)に記載されている。
【０１１２】
また、実施例に用いたプラスミド、ファージ、ＤＮＡ、種々の酵素、大腸菌、酵母などを扱う詳しい種々の操作は、以下の雑誌、成書に記載されている。
１．蛋白質核酸酵素、26(4)、(1981)  臨時増刊「遺伝子操作」（共立出版）。
【０１１３】
２．蛋白質核酸酵素、35(14),(1990)臨時増刊「遺伝子操作1990」（共立出版）。
【０１１４】
３．バイオマニュアルシリーズ１０「酵母による遺伝子実験法」山本正幸編集  羊土社。
４．Methods in Yeast Genetics, A Laboratory Course Manua1 H.D.Roseら、
Cold Spring Harbor Laboratory Press Cold Spring Harbor,New York
５．Molecular Cloning a Laboratory Manual Maniatisら、
Cold Spring Harbor Laboratory Press Cold  Spring  Harbor,New York
６．Methods in Enzymology, L.Grossmanら編、29巻 Academic Press
７．Methods in Enzymology, R.Wuら編  65巻  Academic Press
８．Methods in Enzymology. R.Wuら編  101巻  Academic Press
９．Methods in Enzymology, B.Kimmel編 152巻 Academic Press
１０．Methods in Enzymology, C.Fink編 194巻 Academic Press
（実施例１）
商品名カネカレッドイースト（鐘淵化学工業株式会社製）の菌株をFowell胞子形成プレート（酢酸ナトリウム0.4%、寒天2%、pH6.7）に塗布し、28℃、３〜４日間培養して胞子を形成させて得られた胞子株R-6R株を親株として用い、前記（Ａ）のＥＭＳ法による変異を行い、前記（Ｂ）のスクリーニングを行った。その結果、３２３０‐１および９１９５と命名した２株の低温感受性の一倍体酵母を得た。これらの株について、５℃低糖生地発酵力、３０℃低糖生地発酵力を測定した。  低糖生地での発酵力は、イースト工業会で定められた低糖生地発酵力に準じて、以下の原料配合：
小麦粉        100g
酵母            2g
庶糖            5g
食塩            2g
水             62g
により、生地を捏上温度が２０±１℃になるようにミキシングを行い、生地をシリンダーにいれて、あらかじめスタート時の生地量を測定した。５℃、２４時間発酵させた後の生地量とスタート時の生地量との差を５℃低糖生地発酵力とした。
【０１１５】
また、上記原料配合により、生地を捏上温度が３０±１℃になるようにミキシングを行い、生地をシリンダーに入れてあらかじめスタート時の生地量を測定した。３０℃、８０分発酵させた後の生地量とスタート時の生地量との差を３０℃低糖生地発酵力とした。結果を表１に示す。
【０１１６】
【表１】
0003748619.tif 000006
【０１１７】
変異株の５℃低糖生地発酵力は、対照のＲ−６Ｒ、カネカレッドイーストに比べて非常に低く、３０℃低糖生地発酵力は、対照とほぼ同等の値を示した。
【０１１８】
（実施例２）
親株Ｒ−６Ｒおよびこの株に由来する実施例１で取得した２株の低温感受性酵母の形質転換能力を調べた。プラスミドとしてＬｅｕ２、Ｇ‐４１８耐性マーカーを有するｐＹＥ１３Ｇ（ＡＴＣＣ３７２７６）を０．１〜ｌ０μｇ使用し、BIO 101社製ALKALI CATI0N YEAST TRANSF0RMATI0N KITを用いて形質転換を行った。Ｇ‐４１８（２５０μｇ／ｍ１）を含有するＹＰＤＡ培地にて３０℃３日間培養後、出現したコロニーをカウントした。対照としてＳＨ２６７５株（接合型α：ｕｒａ３‐５２、ｌｅｕ２‐３，１１２，ｔｒｐｌ，ｐｈｏ３‐１，ｐｈｏ５‐１）を用いた。結果を表２に示す。
【０１１９】
【表２】
0003748619.tif 000007
【０１２０】
（実施例３）
低温感受性菌３２３０‐１と９１９５の形質転換能を向上させ、かつ選択マーカーを付与するために形質転換能の高い実験室株と交雑した。ＳＨ２６７５株（接合型α：ｕｒａ３‐５２，ｌｅｕ２‐３，１１２，ｔｒｐ１，ｐｈｏ３‐１，ｐｈｏ５‐１）を交雑の片親として用いた。
【０１２１】
実施例２で示した方法を用いて、ｐＹＥ１３ＧをＳＨ２６７５に形質転換し、ＳＨ２６７５（ｐＹＥ１３Ｇ）を作製した。
【０１２２】
３２３０‐１（接合型ａ）、９１９５（接合型ａ）、ＳＨ２６７５（ｐＹＥ１３Ｇ）をそれぞれＹＰＤＡ寒天培地にストリークし、３０℃、２日間培養した。ＹＰＤＡ寒天培地に３２３０‐１とＳＨ２６７５（ｐＹＥ１３Ｇ）、９１９５とＳＨ２６７５（ｐＹＥ１３Ｇ）を十字にレプリカし、３０℃、１日培養した。その後、２５０μｇ／ｍ１のＧ‐４１８含有する最少培地にレプリカし、更に３０℃、３日間培養した。生育してきたコロニーを単離し、Ｆｏｗｅｌｌ胞子形成培地にストリークし、３０℃にて胞子を形成させた。胞子形成が認められた株を交雑株とした。各交雑株をＹＰＤＡ培地にて数世代継植しプラスミドを脱落させた。プラスミドの脱落の確認は、Ｇ‐４１８感受性の復帰を指標として行った。
【０１２３】
交雑株３２３０‐１／ＳＨ２６７５の胞子をマニピュレーションによって分離した。低温感受性でかつウラシル要求株のうち、６株についてＹＣｐ５０を用いて形質転換効率を調べた。６株の形質転換効率は１００〜１０００／μｇＤＮＡを示したが、生育が悪い、あるいは低温感受性の色素プレートによる判定が明確でなかった。そこで、更に交雑を行って、生育がよく、かつ低温感受性の判定が明確となる株を選択した。４２Ｃ（接合型ａ：ｕｒａ３‐５２，ｌｅｕ２‐３，ｌ１２，ｌｔｓ（低温感受性の遺伝子型））とＳＨ２６７５（ｐＹＥ１３Ｇ）株の交雑を行ない、同様にして胞子株を分離した。低温感受性でかつウラシル要求株の形質転換効率をＹＣｐ５０を用いて測定した。結果を表３に示す。
【０１２４】
【表３】
0003748619.tif 000008
【０１２５】
また、交雑株９１９５／ＳＨ２６７５から同様にして胞子株を分離した。低温感受性でかつウラシル要求株のうち２株についてＹＣｐ５０を用いて形質転換効率を測定した。結果を表４に示す。
【０１２６】
【表４】
0003748619.tif 000009
【０１２７】
（実施例４）
９１９５／ＳＨ３８Ａ（接合型ａ；ｕｒａ３‐５２，ｌｔｓ）（以下３８Ａと略す）の低温感受性を野生型に解除する遺伝子のクローニングを行った。野生株の遺伝子ライブラリーとしてM.Roseによって作製され、ATCCを通して分譲されているATCCNo.37415（Name of Library:CEN BANK A）を使用した。BIO 101社製ALKALI CATI0N YEAST TRANSF0RMATI0N KITを用い、同キットのプロトコールに従って、３８ＡをCEN BANKのＤＮＡを用いて形質転換した。形質転換株はカザミノ酸寒天培地にて３０℃、２日間培養することによって得られた。
【０１２８】
形質転換株をＹＰＧＡ培地と、マスタープレートとしてカザミノ酸寒天培地とにレプリカし、３０℃、２〜３日間培養した。ＹＰＧＡ培地で生育したコロニー上に色素寒天培地１０ｍ１を重層し、５℃で、一夜培養した後、黄色のハローを形成しているコロニーをスクリーニングした。低温感受性株は、ＢＣＰの青紫色の色調を変化させなかった。約１１、０００株の形質転換株をスクリーニングした結果、８株の陽性株が得られた。これらの株をＲＴＳ２０１〜２０８とそれぞれ命名した。
【０１２９】
得られた陽性株８株からプラスミドを脱落させるために、5-フルオロオロチン酸を含む寒天培地（Methods in Enzymology, G.Fink編vol.194 302‐319）にそれぞれの株をストリークした。３０℃で培養した結果、プラスミドの脱落した株がそれぞれ取得された。これらの株を再びＹＰＧＡ培地にレプリカし、低温感受性の有無を色素寒天培地で調べた結果、８株のうち６株か低温感受性を示し、２株（ＲＴＳ２０２、２０７）は低温感受性を示さなかった。８株の陽性株からプラスミドの回収を行なった。８株からHereford法によりＤＮＡを抽出精製し、E.coli HB101に形質転換し、プラスミドを回収した。それぞれのプラスミドをｐＲＢＡ、ｐＲＢＢ、ｐＲＢＣ、ｐＲＢＤ、ｐＲＢＥ、ｐＲＢＦ、ｐＲＢＧ、およびｐＲＢＨと命名した。各プラスミドを用いて、３８Ａを宿主として、再度形質転換を行ない、それぞれ形質転換株を得た。各株について低温感受性の有無を色素寒天培地にて調べた結果、６種類（ｐＲＢＡ、ｐＲＢＣ、ｐＲＢＤ、ｐＲＢＥ、ｐＲＢＦおよびｐＲＢＨ）が低温感受性を解除されていたが、残り２種類（ｐＲＢＢ，ｐＲＢＧ）は低温感受性のままであったことがわかった。
【０１３０】
以上の結果から、ＲＴＳ２０１、２０３、２０４、２０５、２０６および２０８株がそれぞれ保持するプラスミドｐＲＢＡ、ｐＲＢＣ、ｐＲＢＤ、ｐＲＢＥ、ｐＲＢＦおよびｐＲＢＨには、３８Ａの低温感受性を野生型に解除するＤＮＡ断片がクローニングされていることが判明した。図１に、これらのプラスミドの制限酵素地図を示した。
【０１３１】
（実施例５）
実施例４で得られたプラスミドｐＲＢＡとｐＲＢＣとは、図１からわかるように共通の約６．５ｋｂＤＮＡ断片を有する。この共通の断片に低温感受性を解除する遺伝子が存在することが予想される。そこで、低温感受性を解除する遺伝子領域を特定するための実験を行った。
【０１３２】
プラスミドｐＲＢＡをＳａｌＩで切断し、DNA Ligation Kit ver.2を用いてライゲーションを行なった。E.coli HB101を形質転換し、得られた形質転換株からプラスミドを抽出した。抽出したプラスミドをＳａｌＩなどの種々の制限酵素で切断し、解析を行ない、酵母染色体ＤＮＡ内のＳａｌＩ部位からＹＣｐ５０のＳａｌＩ部位まで欠失したプラスミドｐＲＢＡ１を選択した。
【０１３３】
プラスミドｐＲＢＣをＳａｌＩで切断し、DNA Ligation kit ver.2を用いてライゲーションを行なった。E.coli HB101を形質転換し、得られた形質転換株からプラスミドを抽出した。抽出したプラスミドをＳａｌＩなどの種々の制限酵素で切断し、解析を行なって、酵母染色体ＤＮＡ内のＳａｌＩ部位からＹＣｐ５０のＳａｌＩ部位まで欠失したプラスミドｐＲＢＣ１を選択した。このプラスミドｐＲＢＣ１は、E.coli HB101に形質転換され、工業技術院生命工学工業技術研究所に、E.coli HB101(pRBC1) (FERM P-14888)として寄託されている。
【０１３４】
このプラスミドｐＲＢＣ１をＨｉｎｄIIIで切断し、DNA Ligation kit ver.2を用いてライゲーションを行なった。E.coli HB101を形質転換し、得られた形質転換株からプラスミドを抽出した。プラスミドをＨｉｎｄIIIなどの種々の制限酵素で切断し、解析を行ない、酵母染色体ＤＮＡ内のＨｉｎｄIII部位からＹＣｐ５０のＨｉｎｄIII部位までが欠失したプラスミドｐＲＢＣ２を選択した。
【０１３５】
プラスミドｐＲＢＣ１をＢａｍＨＩで切断し、DNA Ligation Kit ver.2を用いてライゲーションを行なった。E.coli HB101を形質転換し、得られた形質転換株からプラスミドを抽出した。プラスミドをＢａｍＨＩなどの種々の制限酵素で切断し、解析を行ない、酵母染色体ＤＮＡ内のＢａｍＨＩ断片約１ｋｂが欠失しているプラスミドｐＲＢＣ４を選択した。
【０１３６】
ｐＲＢＣ１をＨｉｎｄIIIで切断し、酵母ＤＮＡとＹＣｐ５０の一部を含む約３ｋｂのＤＮＡ断片をアガロース電気泳動とGene clean（ＢＩＯ １０１社製）を用いて抽出精製を行った。ＹＣｐタイプクローニングベクターｐＲＳ３１６（R.S.Sikorsk1らGenetics vol. l22, l9-27(1989)）をＨｉｎｄIIIで切断し、上記約３ｋｂ断片と混合し、DNA Ligation Kit ver.2を用いてライゲーションを行った。E.coli GM33(F- λ- dam-)を形質転換し、得られた形質転換株からプラスミドを抽出した。プラスミドをＨｉｎｄIIIなどの種々の制限酵素で切断し、解析を行い、ｐＲＳ３１６への挿入方向が異なるｐＲＢＣ６およびｐＲＢＣ７を取得した。
【０１３７】
ｐＲＢＣ７をXbaIで切断し、DNA Ligation Kit ver.2を用いてライゲーションを行った。E.coli GM33を形質転換し、得られた形質転換株からプラスミドを抽出し、抽出したプラスミドをXbaI等種々の制限酵素で切断し解析を行った。酵母ＤＮＡとベクターとに存在するXbaI部位で欠失が生じたｐＲＢＣ１２が得られた。
【０１３８】
ｐＲＢＣ６およびｐＲＢＣ７をEcoRIで切断し、DNA Ligation Kit ver.2を用いてライゲーションを行った、E.coli HB101を形質転換し、得られた形質転換株からプラスミドを抽出した。プラスミドをEcoRI等種々の制限酵素で切断し、解析を行った。酵母DNAとベクターとに存在するEcoRI部位によって欠失が生じたプラスミドｐＲＢＣ８、ｐＲＢＣ９がそれぞれ得られた。上記得られた各プラスミド、ｐＲＢＣ１、ｐＲＢＣ２、ｐＲＢＣ４、ｐＲＢＣ６、ｐＲＢＣ７、ｐＲＢＣ８、ｐＲＢＣ９およびｐＲＢＣ１２のそれぞれのプラスミドの制限酵素地図を図２に示した。
【０１３９】
上記の方法で作製した、プラスミドｐＲＢＡ１、ｐＲＢＣ１、ｐＲＢＣ２、ｐＲＢＣ４、ｐＲＢＣ６、ｐＲＢＣ７、ｐＲＢＣ８、ｐＲＢＣ９およびｐＲＢＣ１２を前述した方法を用いてそれぞれ酵母宿主３８Ａに形質転換し、カザミノ酸培地で形質転換株を選択した。それぞれの形質転換株の低温感受性について色素寒天培地を用いて検討した。結果を表５に示した。
【０１４０】
【表５】
0003748619.tif 000010
【０１４１】
この結果から、ｐＲＢＣ１２のXbaI部分からクローニング部位Sau3AI/BamHIまでの約２．１ｋｂ ＤＮＡに３８Ａの低温感受性を解除する遺伝子が存在している可能性が高いことが明らかになった。またEcoRI部位が低温感受性に重要な役割を果たしていることが判った。
【０１４２】
（実施例６）
実施例５において決定した低温感受性を解除する遺伝子領域の塩基配列の決定を行なった。ｐＲＢＣ１のＨｉｎｄIII切断を行ない、３．０ｋｂのＤＮＡ断片をアガロース電気泳動によって分離し、Gene clean(ＢＩＯ  １０１社製）を用いて、同断片の抽出精製を行なった。次に３．０ｋｂＤＮＡ断片をＳａｕ３ＡＩで切断し、Ｍ１３ｍｐ１９にサブクローニングした。常法に従って一本鎖ファージを調製したあと、（株）パーキンエルマージャパン社製のTaq DyeDeoxyTM Terminator Cycle Sequencing Kitを用い、同キットのプロトコールに従って反応を行なった。同社製のＡＢ１３７３Ａ  ＤＮＡシークエンサーを用いて、ＤＮＡ塩基配列の決定を行なった。この塩基配列をべ一スにデータベースＤＤＢＪを用いてホモロジー検索を行なった。その結果、ＤＤＢＪエントリーネームＳＣＣＩＩ０ＲＦ（１９４８３ｂｐ）の一部であることが明らかになった。同ＤＮＡ断片は２番染色体右腕テロメアから約１３０ｋｂに存在している（F.Doignonら  Yeast vol.9 189‐199(1993)）。
【０１４３】
（実施例７）
ｐＲＢＣ４のＢａｍＨＩ‐Ｓａｕ３ＡＩ／ＢａｍＨＩ約２．７ｋｂ断片が、低温感受性酵母Ｒ‐６Ｒおよび９１９５に存在することを確認するためにサザンハイブリダイゼーションを行った。Ｒ‐６Ｒと９１９５の染色体ＤＮＡを種々の制限酵素で切断し、サザンハイブリダイゼーションに供した。プローブとしてＰｓｔＩ‐ＨｉｎｄIII１．１ｋｂ（図２参照）ＤＮＡ断片を使用した。（株）パーキンエルマージャパン社製のFluorescein Gene ImagesTM random prime moduleを使って蛍光ラベルを行ない、同キットを用いてサザンハイブリダイゼーションを行なった。結果を図４に示した。
【０１４４】
図２で示した制限酵素地図とＳＣＣＩＩ０ＲＦのＤＮＡ配列から、Ｒ‐６Ｒと９１９５にそれぞれ同２．７ｋｂ  ＤＮＡ断片を含むフラグメントが存在することが確認された。
【０１４５】
（実施例８）
低温感受性をガス発生量によって測定した。形質転換株３８Ａ（ｐＲＳ３１６）および３８Ａ（ｐＲＢＣ１２）をそれぞれ寒天を含まないカザミノ酸液体培地５ｍｌに植菌し、３０℃で一夜培養した。全量をそれぞれ同培地５０ｍｌに継植し、３０℃で一夜培養した。培養液のＯＤ600を測定し、菌体量をそろえ、遠心分離によって集菌した。ガス発生量の測定は次のように行った。発酵液はパン生地中の発酵パターンとよい相関が得られる下記Ｋ１０発酵液を用いた。
【０１４６】
【表６】
0003748619.tif 000011
【０１４７】
２．５ｍｌのＫ１０発酵液に菌体を懸濁し、アルミキャップをした試験管（１５×１３０mm)に移した。２２０ｒｐｍにて３０℃または５℃で培養し、経時的に重量を測定した。菌体の乾燥重量は１０５℃、５時間の乾燥処埋後測定した。
【０１４８】
結果を図５，６に示した。３０℃では３８Ａ（ｐＲＳ３１６）、３８Ａ（ｐＲＢＣ１２）共に同程度のガス発生量を示したが、５℃において３８Ａ（ｐＲＢＣ１２）は著しくガス発生量の増加を示し、低温感受性を解除した。
【０１４９】
（実施例９）
低温感受性を解除する約２．１kb領域の遺伝子破壊と４分子解析を行った。遺伝子破壊に用いたプラスミド作製の概略を図７に示した。まず、pBluescriptII ＫＳ＋（フナコシ株式会社）のHindIII部位にYEp24のＵＲＡ３断片（HindIII約１．２kb）が挿入されたプラスミドｐ５０５を調製した。次に、ｐＲＢＣ１のHindIII断片である約３kbの酵母ＤＮＡ（ＹＣｐ５０の一部を含む）をpUC19のHindIII部位に組み込み、ｐＭ０３０を作製した。
【０１５０】
ｐ５０５をKpnIとEcoRIとで切断し、ＵＲＡ３断片を調製した。他方、ｐＭ０３０をKpnIとEcoRIとで切断し、ベクターを含む約３kb断片と前記ＵＲＡ３断片をライゲーションしｐＭ０３１を作製した。
【０１５１】
次に、ｐＭ０３０をEcoRIで切断し、酵母ＤＮＡ約１．７kb断片を調製し、ｐＭ０３１のEcoRI部位に挿入し、プラスミドｐＭ０３２を得た。これにより、結果的にプラスミドｐＭ０３０中の酵母ＤＮＡ遺伝子のEcoRI-KpnI断片が削除され、ＵＲＡ３遺伝子が挿入され、遺伝子が破壊されている酵母遺伝子が得られた。
【０１５２】
宿主としてＳＨ２６７５とＳＨ２６７６（接合型ａ：ｕｒａ−５２，ｌｅｕ２−３，１１２，ｔｒｐ１，（ｈｉｓ１−２９），ｐｈｏ３−１，ｐｈｏ５−１）を交雑して得られた２倍体株ＳＨ２６７５／ＳＨ２６７６株を用いた。
【０１５３】
ｐＭ０３２をPvuIIで切断し、その約５０μｇを実施例２で示した方法を用いて形質転換を行った。カザミノ酸寒天培地にて３０℃で培養することによって形質転換株を得た。
【０１５４】
形質転換株からHereford法によって染色体ＤＮＡを調製し、ClaI，SacI，SpeI，XbaI等の制限酵素で切断し、実施例７に示した方法と同様にしてサザンハイブリダイゼーションによる解析を行った。プローブは次のように調製した。ｐＭ０３２をHindIIIで切断し０．８％アガロース電気泳動を行い０．３kb、１．２kb（ＵＲＡ３）、１．７kbのＤＮＡ断片を含むアガロースを切り出した。SUPRECTM-01を開いてそれぞれの断片を精製しプローブとして用いた。解析の結果、遺伝子破壊された株ＳＨ２６７５／ＳＨ２６７６（ＹＲＢ１７２３：：ＵＲＡ３)が得られたことを確認した。
【０１５５】
ＳＨ２６７５／ＳＨ２６７６（ＹＲＢ１７２３：：ＵＲＡ３）をFowell胞子形成培地で培養し、胞子を形成させた。マニピュレーションによって胞子を分離し、低温感受性に関して四分子解析を行った。分離した胞子が四分子ともに生育したことからこの低温感受性を解除する遺伝子は、栄養培地での増殖に対して必須遺伝子ではないことが判った。１０組の胞子について実施例４で示した色素寒天培地を用いて低温感受性を調べた。その結果を表７に示す。
【０１５６】
【表７】
0003748619.tif 000012
【０１５７】
また以下に示す２組の胞子株：
【０１５８】
【表８】
0003748619.tif 000013
【０１５９】
についてガス発生量による低温感受性試験を行った。
【０１６０】
菌体の培養にＹＰＤＡ培地を用いることを除いては、実施例８に示したガス発生量の定量方法に準じて、それぞれの株のガス発生量を測定した。発酵液として、Ｋ１０発酵液に、ヒスチジン、ロイシン、トリプトファン、ウラシルを加えたものを用いた。結果を図８〜１１に示した。当該遺伝子を破壊された株は低温感受性を示した。
【０１６１】
（実施例１０）
実施例７の結果をもとに、酵母Ｒ−６Ｒおよび９１９５由来の低温感受性遺伝子を有する酵母３８Ａから低温において発酵力を調節する遺伝子領域のクローニングを行った。
【０１６２】
酵母Ｒ６Ｒおよび３８Ａの染色体ＤＮＡをHereford法によって調製し、それぞれBamHIとClaIで切断し、低温感受性遺伝子の全領域を含む約３．５kbの断片を回収した（図１〜２参照）。PBlunescript ＫＳII＋のBamHI-ClaI部位にライゲーションしＪＭ１０９に形質転換しライブラリーを作製した。
【０１６３】
ｐＲＢＣ１２のPst1-HindIII １．１kb断片をプローブとしてコロニーハイブリダイゼーションを行った。Ｒ−６Ｒからは約４００株をスクリーニングした結果１株、３８Ａからは約５００株をスクリーニングした結果１株の陽性クローンを得た。それぞれの株より回収したプラスミドを種々の制限酵素を用いて解析した結果、ともに目的クローンであることが判った。効率の良い塩基配列の決定のために、更にそれぞれのプラスミドをEcoRIとHindIIIで切断し、ｐＵＣ１１８のEcoRI-HindIII部位に酵母ＤＮＡ（HindIII-EcoRI約１．３kb）をサブクローニングした。これら４種類のプラスミドをテンペレートとし、下記プライマー：
【０１６４】
【表９】
0003748619.tif 000014
【０１６５】
を用いてXbaI-Sau3AI/BamHIフラグメント２．１kbの塩基配列の決定を行った。塩基配列の決定は実施例６に準じて行った。結果を図１２〜１４に示した。
【０１６６】
（実施例１１）
３２３０−１／ＳＨ４２Ｃ／ＳＨ５Ｂ（接合型α；ｕｒａ３‐５２，ｌｅｕ２‐３，ｌ１２，ｌｔｓ）（以下５Ｂと略す）の低温感受性を野生型に解除する遺伝子のクローニングを行なった。野生株の遺伝子ライブラリ一としてS.Reedによって作製されATCCを通して分譲されているATCCNo.37323を使用した。５Ｂを同ライブラリーの遺伝子を用いて実施例４と同様に形質転換を行い、ロイシンを含有しない最少培地で、形質転換株が得られた。２７００株の形質転換株について、実施例４と同様にして低温感受性が解除された株をスクリーニングした結果、２株（ＲＴＳ１０１および１０２）の陽性株が得られた。Hereford法によりＤＮＡを抽出精製し、E.coli HB101に形質転換した。得られた形質転換株からプラスミドを回収した結果、ＲＴＳ１０１からは１種類（ｐＲＡＡ）、ＲＴＳ１０２からは２種類（ｐＲＡＢ１およびｐＲＡＢ２）が得られた。得られたプラスミドｐＲＡＡ、ｐＲＡＢ１およびｐＲＡＢ２を、５Ｂを宿主として、前述の方法を用いて再度形質転換し、それぞれの形質転換株について低温感受性の有無を色素寒天培地で調べた。その結果、プラスミドｐＲＡＡで形質転換された株では低温感受性のままであったが、プラスミドｐＲＡＢ１およびｐＲＡＢ２で形質転換された株では低温感受性が解除され、野生型を示した。ただし、プラスミドｐＲＡＢ１で形質転換された株の方がｐＲＡＢ２で形質転換された株より少し低温感受性の解除が弱かった。
【０１６７】
図１５にプラスミドｐＲＡＢ１およびｐＲＡＢ２の制限酵素地図を示した。この結果、プラスミドｐＲＡＢ１およびｐＲＡＢ２は、それぞれ、３．１ｋｂおよび約９．６ｋｂの酵母染色体がクローニングされていることが明らかになった。制限酵素地図から、ｐＲＡＢ１の酵母染色体部分は、ｐＲＡＢ２の酵母染色体ＤＮＡが一部欠失した結果生じたものと考えられる。
【０１６８】
プラスミドｐＲＡＢ１の酵母染色体遺伝子を含むＳａｌＩ‐ＨｉｎｄIII  ３．７ｋｂのＤＮＡ断片をＹＣｐ５０にサブクローニングした。プラスミドｐＲＡＢ１約１０μｇをＳａｌＩ、ＨｉｎｄIII、ＫｐｎＩの３種類の制限酵素で切断後、０．８％のアガロースゲル電気泳動を行ない、３．７ｋｂのＤＮＡ断片を含むアガロースを切り出した。ＳＵＰＲＥＣTM‐０１（宝酒造株式会社）を用いて、同フラグメントを抽出精製し、最終的に約５００ｎｇの３．７ｋｂＤＮＡ断片を得た。また、ＹＣｐ５０約２０μｇをＳａｌＩとＨｉｎｄIIIで切断し、アガロース電気泳動を行なった。同様にしてＳＵＰＲＥＣTM‐０１を用いて７．３ｋｂ  ＤＮＡ断片を抽出精製し、約１μｇを得た。
【０１６９】
プラスミドｐＲＡＢ１の３．７ｋｂＤＮＡ断片とＹＣｐ５０の７．３ｋｂＤＮＡ断片をそれぞれ１００ｎｇづつを混合し、DNA Ligation Kit ver.2（宝酒造株式会社）を用いて連結し、E.co1i HB101に形質転換した。形質転換株からプラスミドを抽出し、分析した結果、ＹＣｐ５０のＳａｌＩ‐ＨｉｎｄIII部位にｐＲＡＢ１のＳａｌＩ‐ＨｉｎｄIII  ３．７ｋｂの断片が挿入されたプラスミドｐＲＡＢ１２を得た。プラスミドｐＲＡＢ１２は、E.coli HB101に形質転換され、工業技術院生命工学工業技術研究所に、E.coli HB101(pRAB12) (FERM P-14889)として寄託されている。
【０１７０】
前述した方法を用いて、プラスミドｐＲＡＢ１２を宿主５Ｂに形質転換し、カザミノ酸培地で生育してきたコロニーについて、低温感受性の有無を色素寒天培地を用いて調べた。その結果、形質転換株は低温感受性の解除された野生型を示した。
【０１７１】
（実施例１２）
ｐＲＡＢ１の染色体ＤＮＡ部位の塩基配列を決定した。ＳａｌＩ‐ＨｉｎｄIII ３．７ｋｂ（実施例１１）の精製ＤＮＡ断片をＳａｕ３ＡＩで切断し、Ｍ１３ｍｐ１８のＢａｍＨＩ部位にサブクローニングした。実施例６と同様にして、ＳａｌＩ‐ＨｉｎｄIII３．７ｋｂ  ＤＮＡ断片の一部の塩基配列（M105)を決定した。図１６にＭ１３ファージクローンＭ１０５にサブクローニングされたＤＮＡ断片の塩基配列を示した。この塩基配列をべ一スにデータベースＤＤＢＪを用いてホモロジー検索を行なった。その結果、ｐＲＡＢ１にクローニングされている酵母染色体（約３ｋｂ）には、ＤＤＢＪエントリーネームＳＵＣＵＲＡ１０Ｇ（２１４８ｂｐ）を含み、ＵＲＡ１０、ｔＲＮＡ‐Ｇ１ｎ等の遺伝子がコードされていることが判った。
【０１７２】
（実施例１３）
プラスミドｐＲＡＢ２，ＹＥｐ１３を宿主５Ｂに形質転換し、ロイシンを含まない選択培地で選択し、それぞれ、形質転換株５Ｂ（ｐＲＡＢ２）および５Ｂ（ＹＥｐ１３）を得た。ウラシルを含む液体最少培地を用いて菌体を培養することを除いて、実施例８の方法に準じてガス発生量による低温感受性試験を行った。発酵液はウラシルを含むＫ１０発酵液を用いた。結果を図１７および１８に示した。形質転換株５Ｂ（ｐＲＡＢ２)の５℃ガス発生量は増加し、プラスミドｐＲＡＢ２に宿主５Ｂの発酵力を調節する遺伝子が存在することが明らかになった。
【０１７３】
【発明の効果】
本発明の、低温で酵母の発酵力を調節する遺伝子は、宿主のパン酵母に導入されて、宿主を低温感受性とする。従って、冷蔵パン生地に好適に用いられ得る。さらに、本発明の遺伝子を用いて、さらに優れた低温感受性が付与されるため、低温感受性酵母の育種に使用され得る。
【０１７４】
【配列表】
【０１７５】
【配列番号１】
0003748619.tif 000015
0003748619.tif 000016
【０１７６】
【配列番号２】
0003748619.tif 000017
【０１７７】
【配列番号３】
0003748619.tif 000018
【０１７８】
【配列番号４】
0003748619.tif 000019
【０１７９】
【配列番号５】
0003748619.tif 000020
【０１８０】
【配列番号６】
0003748619.tif 000021
【０１８１】
【配列番号７】
0003748619.tif 000022
【０１８２】
【配列番号８】
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【０１８３】
【配列番号９】
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【０１８４】
【配列番号１０】
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【０１８５】
【配列番号１１】
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【０１８６】
【配列番号１２】
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【０１８７】
【配列番号１３】
0003748619.tif 000028
【０１８８】
【配列番号１４】
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【０１８９】
【配列番号１５】
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【０１９０】
【配列番号１６】
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【０１９１】
【配列番号１７】
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【０１９２】
【配列番号１８】
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【０１９３】
【配列番号１９】
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【０１９４】
【配列番号２０】
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【０１９５】
【配列番号２１】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ｐＲＢＡ、ｐＲＢＢおよびｐＲＢＨとｐＲＢＣ、ｐＲＢＥおよびｐＲＢＦの挿入酵母染色体ＤＮＡの制限酵素地図を示す図である。
【図２】実施例５で得られたｐＲＢＡ１およびｐＲＢＣの各種欠失プラスミドの制限酵素地図を示す図である。
【図３】XbaI-Sau3AI/BamHI  2.1ｋｂ断片の制限酵素地図である。
【図４】ｐＲＢＣ４のBamHI-Sau3A約2.7KbDNAの一部の断片と、Ｒ‐６Ｒおよび９１９５株のＤＮＡとのサザンハイブリダイゼーションを示す図である。
【図５】３８Ａ（ｐＲＢＣ１２）の３０℃におけるガス発生量を示す図である。
【図６】３８Ａ（ｐＲＢＣ１２）の５℃におけるガス発生量を示す図である。
【図７】遺伝子破壊のためのプラスミド作成方法を示す図である。
【図８】遺伝子破壊株の３０℃におけるガス発生量を示す図である。
【図９】遺伝子破壊株の５℃におけるガス発生量を示す図である。
【図１０】遺伝子破壊株の３０℃におけるガス発生量を示す図である。
【図１１】遺伝子破壊株の５℃におけるガス発生量を示す図である。
【図１２】Ｒ−６Ｒ，３８ＡのXbaI-Sau3aI/BamHI 2.1kbの塩基配列を示す図である。
【図１３】第１２図の続きである。
【図１４】第１３図の続きである。
【図１５】ｐＲＡＢ１およびｐＲＡＢ２の比較を示す図である。
【図１６】ｐＲＡＢ１の制限酵素地図を示す図である。
【図１７】５Ｂ（ｐＲＡＢ２）の３０℃におけるガス発生量を示す図である。
【図１８】５Ｂ（ｐＲＡＢ２）の５℃におけるガス発生量を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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