(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルタミン酸塩レセプター制御の細胞である中枢神経系中のニユーロンまたはグリア細胞に対するグルタミン酸塩の作用を阻止するための薬剤を製造するためにグルタミン酸塩レセプターにおけるペプチド拮抗物質である（１−５）ＧｎＲＨ，（１−３７）ＧＲＦまたはインシユリンのＣ−ペプチドを使用するペプチド拮抗物質の使用方法。
【請求項２】
ＮＭＤＡレセプター制御の細胞である中枢神経系中のニューロン又はグリア細胞におけるＧｎＲＨの分泌を抑制するための薬剤を製造するためにＮＭＤＡレセプターにおけるペプチド拮抗物質である（１−５）ＧｎＲＨ，（１−３７）ＧＲＦまたはインシユリンのＣ−ペプチドを使用するペプチドを使用するペプチド拮抗物質の使用方法。
【請求項３】
薬剤がＮＭＤＡ−レセプター媒介の刺激作用を阻止するためのものである請求項２に記載のペプチド拮抗物質の使用方法。
【請求項４】
ＮＭＤＡ−レセプター媒介の刺激作用が神経伝達物質またはペプチドの解放または細胞傷害または細胞死滅を生じる毒性作用である請求項３に記載のペプチド拮抗物質の使用方法。
【請求項５】
薬剤が低酸素性脳疾患、虚血性脳疾患、または代謝性脳疾患の治療用である請求項１ないし２のいずれか１項に記載のペプチド拮抗物質の使用方法。
【請求項６】
薬剤が脳卒中または低血糖症の治療用である請求項１ないし２のいずれか１項に記載のペプチド拮抗物質の使用方法。
【請求項７】
薬剤が脳損傷の治療用である請求項１ないし２のいずれか１項に記載のペプチド拮抗物質の使用方法。
【請求項８】
薬剤が分娩前後の期間中の胎児の治療用および幼年期の幼児の治療用である請求項１、２及び５ないし７のいずれか１項に記載のペプチド拮抗物質の使用方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は中枢神経系におけるニユーロンまたはグリア細胞のごとき、グルタミン酸塩レセプターおよびＮＭＤＡレセプター制御の細胞に影響を及ぼすための薬剤を製造するためにグルタミン酸塩レセプターおよび特殊型のグルタミン酸塩レセプター（ＮＭＤＡ（Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸塩））における新規な型のペプチド拮抗物質を使用するペプチド拮抗物質の使用方法に関する。その薬剤は、（１−５）ＧｎＲＨ，（１−３）ＩＧＦ−Ｉ，（１−３７）ＧＲＦおよびインシユリンのＣ−ペプチドのごとき、グルタミン酸末端ペプチドからなる。本薬剤は、脳卒中、低血糖症、脳損傷、放射線誘発脳障害、または炎症性脳障害、ならびに成人または小児科患者の脳の慢性の変性状態のごとき、中枢神経系の低酸素性脳疾患、虚血性脳疾患および代謝性脳疾患の治療に使用され得る。
発明の背景
神経興奮性アミノ酸、グルタミン酸塩に対するレセプター、特にＮ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸塩（ＮＭＤＡ）に対する特殊型レセプターがニユーロンの発育、作用および死滅に重大な役割を演ずることが知られている（マクドナルド・ジエイダブリユー氏等著、脳研究評論、１９９０年、第１５巻、第４１頁乃至第７０頁およびチヨイ・ダブリユー氏著、ニユーロン、１９８８年、第１巻、第６２３頁乃至第６３４頁「Mc Ronald JW et al., Brain Research Reviews,1990,15:41-70 and Choi W,Neuron 1988,1:1623-34」）。
また、神経ペプチドＧｎＲＨ（ゴナドトロピン解放ホルモン）の分泌がＮＭＤＡレセプターの活性に依存することも知られている。それゆえ、ＧｎＲＨ神経分泌系はＮＭＤＡレセプター活性および抑制の一種の生物学的検定を提供することができる。この件については別紙の参照文献（１−３）を参照可能である。
インシユリン様成長因子−Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）はニユーロンおよびグリア細胞発育および作用の考え得る調節体としてかなりの関心が生じた（４）。しかしながら、脳中のそのパラクリン作用のメカニズムは完全には解明されていない。加えて、ＩＧＦ−Ｉの末梢血清濃度の年齢関連の増加から多分生じる脳についての内分泌作用（５）はまだ憶測である。胎児の脳において、サラ氏等はＩＧＦ−ＩのＮ−末端−切り詰め形状および生物学的活性形状の存在を示した（６）。これはこれらの著者に、脳ＩＧＦ−ＩがＩＧＦ−Ｉ生物学的活性（７）を保持する（４−７０）ＩＧＦ−Ｉ、および（１−３）ＩＧＦ−Ｉ、Ｎ−末端トリペプチドに減成され得るという仮説を設けた。
最近、サラ氏等は（１−３）ＩＧＦ−Ｉが未知のメカニズムにより皮質薄片からのアセチルコリン解放を調節することができることを示唆した。加えて、これらの著者は（１−３）ＩＧＦ−Ｉが線条体薄片からのドーパミン解放に伴われるＮＭＤＡレセプターにおける作用物質として作用し得ることを示唆した。彼らはＩＧＦ−Ｉが内因性ＮＭＤＡレセプター作用物質の前駆物質であり得ることを示唆した。ＮＭＤＡレセプターが年齢および思春期に関連した変化によるＧｎＲＨ分泌のメカニズムに含まれることを以前に開示した文献（１，２）があり、本発明は異なる年齢でのラツト視床下部の移植からのＧｎＲＨについてのＩＧＦ−Ｉの考え得る作用およびその副生成物を研究することを目途とした。加えて、本発明はこれらの生体内ペプチドの系統的投与の効果をそれらの生体外局部使用後に得られた副生成物と比較した。
発明の概要
本発明はグルタミン酸塩レセプター制御の細胞およびＮＭＤＡ−レセプター制御の細胞、好ましくは中枢神経系中のニユーロンまたはグリア細胞に影響を及ぼすための薬剤を製造するためにグルタミン酸塩レセプターおよびＮＭＤＡレセプター（グルタミン酸塩レセプターの特殊型）におけるペプチド拮抗物質を使用するペプチド拮抗物質の使用方法に関する。本薬剤は神経伝達物質またはペプチドの放出のごときＮＭＤＡレセプター媒介の興奮作用および大量のカルシウム流入に追随している細胞の傷害または細胞の死滅を生じさせる毒性作用を阻止する。
かくして本発明はグルタミン酸塩（ＮＭＤＡ）−レセプタ制御の細胞の分泌、作用および死滅に治療的に影響を及ぼすための方法に関する。
本薬剤は（１−５）ＧｎＲＨ，（１−３）ＩＧＦ−Ｉ，（１−３７）ＧＲＦおよびインシユリンのＣ−ペプチドの中から好適に選ばれたグルタミン酸−末端ペプチドからなる。好ましくは本薬剤は（１−３）ＩＧＦ−Ｉからなる。
本薬剤はＮＭＤＡレセプター拮抗作用によりＧｎＲＨ分泌に影響を及ぼすことが示された。
本薬剤は中枢神経系の急性または慢性疾患、脳卒中および低血糖症、脳損傷、放射線誘発脳障害または炎症性脳障害および慢性変性状態を含む低酸素性脳疾患、虚血性脳疾患および代謝性脳疾患のごときＮＭＤＡレセプターの過剰活性を伴う疾患の治療に使用され得る。ＮＭＤＡレセプターと低酸素性脳疾患、虚血性脳疾患および代謝性脳疾患との間の関係は例えば、サイモン・アールピー氏等著、サイエンス  １９８４年、第２２６巻、第８５０頁乃至第８５２頁、ヴイーロツホト氏著、サイエンス  １９８５年、第２３０巻、第６８１頁乃至第６８３頁、マクドナルド・ジエイダブリユー氏等著、脳研究評論、１９９０年、第１５巻、第４１頁乃至第７０頁、チヨイ・ダブリュー氏著、ニユーロン  １９８８年、第１巻、第６２３頁乃至第６３４頁（Simon RP et al., Sience 1984,226:85-52,Wielocht,Sience 1985,230:681-83, Mc Donald JW et al., Brain Research reviews,1990,15:41-70,choi W,Neuron 1988,1:623-34）に開示されている。分娩前後の期間中の胎児および幼児期の期間中の幼児の治療はニユーロン発育に関連して重要である。
本薬剤は系統的にまたは局部的に投与され得る。
本薬剤は治療投与量において付与されるべきである。
好適な投与量は１μｇ〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲であり好ましくは（１−３）ＩＧＦ−１が系統的に付与されるとき５〜５０μｇ／ｋｇにすることが可能である。（１−３）ＩＧＦ−Ｉが局部的に付与されるときその投与量は０．１μｇないし１ｍｇ／ｋｇにすることができる。
本発明はまた特許請求の範囲に特定されたような治療に用いるものである。
以下に付与されるデータは、例えば、
ａ）（１−３）ＩＧＦ−ＩがＮＭＤＡ−レセプター拮抗物質として作用し
ｂ）この作用が生物学的活性の副生成物に内因性の処理を示す前駆ペプチドＩＧＦ−Ｉにより得られることができ、
ｃ）このメカニズムが生体内投与後作用し
ｄ）（１−３）ＩＧＦ−Ｉ，ＧｎＲＨおよび（１−５）ＧｎＲＨに関する例がペプチドのｇｌｕ−末端副生成物を含むより一般的な方法のプロトタイプであることを示す。
発明を実施するための最良の形態
本発明はＩＧＦ−Ｉと異なるペプチド系に属するグルタミン酸末端生成物が同様にＮＭＤＡレセプターにおける拮抗物質として作用するという仮説を試験した。本発明は視床下部においてＧｎＲＨの減成から生じるＮ−末端グルタミン酸を有する（１−５）ＧｎＲＨペプチド（１０）を研究した。かかるペプチドは我々が以前に説明した調整方法（１１）のＧｎＲＨの抑制自動フイードバツクに包含し得る。成長ホルモン解放因子（ＧＲＦ）はＧＨ分泌（１２）についてＮＭＤＡの刺激作用により示唆されるようなＮＭＤＡレセプターの制御下における他の視床下部ペプチドである。本発明はここでヒト血漿またはある組織中で識別されたＣ−末端グルタミン酸を有する生理学的形状の（１−３７）ＧＲＦ（１３）を研究した。脳の外面のペプチド系を研究するために、本発明はＣ−末端グルタミン酸を有するインシユリンの副生成物インシユリンのＣ−ペプチドの作用を評価した。グルタミン酸塩レセプターのＮＭＤＡ特殊型はこれまで膵臓に局在されていなかつたが、グルタミン酸デカルボキシラーゼが膵臓島からの主要な抗原として最近特徴付けられたことは注目すべきである（１４）。ＡＭＰＡ特殊型のグルタミン酸塩レセプターは同様に膵臓に局在されていた（ベルトランド氏等著、英国雑誌薬物学、１９９２年、第１０１巻、第３５４頁乃至第３５９頁「Bertrand et al., Br.J.Pharmacol.,1992,101:354-9」）。
本発明はかくしてグルタミン酸塩レセプターにおけるペプチド拮抗物質の内因性系が存在するということにある。グルタミン酸塩レセプターの下位区分を示すＮＭＤＡレセプターはその治療的使用を検討するための基礎を提供し得る。それにより３つの要因が考慮されるべきである。
１．異なるペプチドが他のペプチドの副生成物であり得るアミノ酸のグルタミン酸末端配列として身体中に存在する。４つのペプチド系（ＧｎＲＨ，ＩＧＦ−Ｉ，ＧＲＦ、プロインシユリン）を検討すると、本発明においてＮＭＤＡレセプターにおける拮抗物質として活性があることを示す生理学的副生成物、すなわち、（１−５）ＧｎＲＨ，（１−３）ＩＧＦ−Ｉ，（１−３７）ＧＲＦおよびインシユリンのＣ−ペプチドが存在する。
２．考慮すべき第２の要因はそのようなグルタミン酸塩末端ペプチドの生成である。ＩＧＦ−Ｉおよび（１−３）ＩＧＦ−Ｉを使用するとき、内因性拮抗物質がどのような年齢においても生成され得ないことが証明される。これは治療に使用のために、特に予定前にまたは月満ちて生まれた新生児のような若い被験者において、前駆物質ペプチドまたは拮抗物質それ自体との間で選ぶことにおいて重要である。本発明の実験データを基にして、新生児が少なくともＩＧＦ−Ｉに関してそのようなペプチド拮抗物質を作るための能力が少ないかまたは無いということである。
３．第３の要因は脳へのかかる拮抗物質の考え得る内分泌供給である。これは生理学的パラクリン系が内分泌の作用メカニズムによる治療使用の基礎として提案される。ここで（１−３）ＩＧＦ−Ｉが証明のために再度使用される。
多数のペプチド系による内因性ＮＭＤＡレセプター拮抗物質の製造は新規であり、そして（１−３）ＩＧＦ−Ｉを使用するデータは発育態様および内分泌の作用メカニズムの用途として使用され得る。
材料および方法
雄のウイスターラツトの視床下部移植が以前に説明された文献（１−３，９）の静的培養装置を使用して個々に研究された。各室の全体培養量（０．５ｍｌ）がサンプリングされかつ７．５分毎に更新された。これらの断片を使用して、ＧｎＲＨの放射免疫検定が以前に詳述された文献（１，２）のごとく実施された。ＧｎＲＨの分泌はいずれかの分泌促進剤の不存在においてまたはＮａ＋チヤンネルを開放する脱分極化剤であるベラトリジン（Veratridine）の５．１０-5Ｍまたはグルタミン酸塩レセプターの別個の特殊型の作用物質であるカイネート（Kainate）の５．１０-2ＭまたはＮ−メチル−Ｄ，Ｌ−アスパラギン酸塩（ＮＭＡ）に対する７．５分の露出中に研究された。これらのすべての生成物はミズーリ州セントルイスに所在のシグマからもたらされた。２５および５０日で、ベラトリジンが３７．５分間隔で繰り返して使用された。１５日でベラトリジンが５２．５分間隔で、すなわちＧｎＲＨの抑制自動フイードバツクにより発生される無反応の期間を越えて使用された（１１）。ＧｎＲＨの分泌応答は分泌促進剤に対する露出直前と露出中に測定された濃度間の差異として計算された。
本発明は組み換えｈＩＧＦ−Ｉ（スエーデン国、ストツクホルムに所在のカビ−フアーマシア）またはその２つの副生成物である（１−３）ＩＧＦ−Ｉ（イギリス国、マージサイドに所在のペニンスラ）および（４−７０）ＩＧＦ−Ｉ（オーストラリア国、アデレードに所在のグロペツプ）の濃度増加に対する生体外露出の作用を研究した。本発明は他のペプチドの作用も研究した。ＧｎＲＨ断片および類似物は（１−５）ＧｎＲＨ（ベルギー国、ブリユツセルに所在のＵＣＢ）、（２−１０）ＧｎＲＨ（アメリカ合衆国、ミズーリ州セントルイスに所在のシグマ）および（１−９）ＧｎＲＨａ（Ｄ−ＴＲＰ6−ＰＲＯ3−Ｎ−エチルアミドＧｎＲＨ）を包含した。ＧｎＲＨ作用物質がドクター、ジエイ・リビエル氏（アメリカ合衆国、カリフオルニア州に所在のザ・ソーク・インステイチユート）により快く提供された。牛プロインシユリンおよびその副生成物がインシユリンのＣ−ペプチドおよびインシユリンそれ自体を包含した（デンマーク国、コペンハーゲンに所在のノボ−ノルデイスク）。最後に、ＧＲＦ−関連ペプチドは（１−４３）ラツトＧＲＦ（スイス国、ブーベンドルフに所在のベーヘム）、（１−３７）ヒトＧＲＦ（イギリス国、マージサイドに所在のペニンスラ）および（１−２９）ヒトＧＲＦ（スエーデン国、ストツクホルムに所在のカビ・フアーマシア）を包含した。ＡＰ−５（ＤＬ−２−アミノ−５−フオスフオノ吉草酸、シグマ）と、ＮＭＤＡレセプターおよびＤＮＱＸ（６，７−ジニトロ−キノサリン−２，３−ジオン、トクリス・ノイラミン、イギリス国バツクハースト・ヒル）における選択的な拮抗物質と、カイナートレセプターにおける選択的な拮抗物質とが同様に使用された。種々のペプチドまたは拮抗物質が１５分間、すなわちベラトリジンに対する露出前または露出中の７．５分の分割で使用された。本発明はまた生後１５日または５０日のラツトにおけるＩＧＦ−Ｉまたはその副生成物の１回の注入の作用も研究した。その後、動物は犠牲にされそして視床下部外植片が注入後２５分研究され、この間隔はたんぱく質代謝に影響を及ぼすのに十分なＩＧＦ−Ｉの血漿濃度を得るのに要求されている（エー・スコツトナー、パーソナル・コミユニケーシヨン）。その時点で、漿液が他の文献に記載された方法（１５）を使用してＩＧＦ−Ｉの評価分析のために集められ、そしてテストステロンが標準ＲＩＡ（ソリン・バイオメデイア）を使用して同様に測定された。ＧｎＲＨ分泌応答（ＩＣ50）の５０％抑制を生じる研究された物質の濃度が以前に記載された文献（３，９）により計算され、そしてデータが共分散分析により比較された。顕著なＧｎＲＨ分泌パルスの発生がパルサー・プログラム（２，３）を使用して決定された。
結果
各図の説明、結果および解説
図１は１５日、２５日および５０日での視床下部外植片によるＧｎＲＨ分泌についてのＩＧＦ−Ｉ関連のペプチドの生体外作用を示す。
脱分極化症状の発現に対するＧｎＲＨ分泌応答（７．５分間ベラトリジン５０μＭ）が１５日において５２．５分または２５日および５０日において３７．５分の間隔で繰り返し研究された。かかる研究は制御条件においてまたはＩＧＦ−Ｉおよび副生成物、（４−７０）ＩＧＦ−Ｉおよび（１−３）ＩＧＦ−Ｉ、ならびにＡＰ−５、ＮＭＤＡレセプターにおける競争的な拮抗物質の増加する濃度の存在において行われた。各実験が進められかつそれに制御条件においてベラトリジン攻撃が続いた。
１５日、２５日または５０日で得られた視床下部外植片を使用して制御条件においてベラトリジンに対する繰り返しの露出により誘発されたＧｎＲＨの分泌は実験中に変化しない（図１）。
外植片がＩＧＦ−Ｉの存在において培養されるとき、ＧｎＲＨの分泌は１５日で影響を及ぼされず、一方投与関連の抑制が２５および５０日で観察されている。この抑制作用に対する感度はそれぞれ２．１０-13および８〜１０-10Ｍ、（ｐ＜０．００１）であるＩＧＦ−ＩのＩＣ50により示されるように２５日でより５０日でのほうが大きい。研究された３つの年代で、（４−７０）ＩＧＦ−ＩはＧｎＲＨ分泌にどのような作用も生じない。これに反して、（１−３）ＩＧＦ−Ｉを有する外植片の培養はＧｎＲＨ分泌の投与関連の抑制を生じる。２５日および５０日で、（１−３）ＩＧＦ−Ｉ（それぞれ４．１０-9および３．１０-13Ｍ）のＩＣ50はＩＧＦ−Ｉを使用して得られたものと同様である。１５日で、外植片は（１−３）ＩＧＦ−Ｉ（ＩＣ50：１．１０-13Ｍ）の抑制作用に非常に感応するが、しかしそれらはＩＧＦ−Ｉによっては影響を及ぼされない。１５日、２５日および５０日で、ＡＰ−５は（１−３）ＩＧＦ−Ｉの抑制作用に近似するＧｎＲＨ分泌（それぞれ、ＩＣ50：１２．１０-13，１．１０-9および１．１０-11Ｍ）の投与関連の抑制を生じる。
表１に示したように、生後５０日の外植片を使用して、（１−３）ＩＧＦ−Ｉ（１０-10ないし１０-6Ｍ）はカイネートにより誘発されたＧｎＲＨの分泌を変化させないが、しかしＮＭＡにより誘発されたＧｎＲＨ分泌の投与関連の抑制が観察されている。ＮＭＤＡレセプターにおける拮抗作用の競争的な性質のために、（１−３）ＩＧＦ−Ｉの１０-6ＭがＧｎＲＨのＮＭＡ誘発分泌を抑制することを顕著に要求するが、一方トリペプチドの１０-10がベラトリジンにより誘発されたＧｎＲＨの分泌を抑制するに十分である。（１−３）ＩＧＦ−Ｉのこの１０-10Ｍ濃度はそれ自体作用を有しない濃度（５．１０-4Ｍ）におけるＮＭＡの存在において研究されたとき、ベラトリジンに対するＧｎＲＨ分泌応答の部分抑制のみを生じさせることができる（表１）。
0003819932.tif 000002
データは対照の％であり、平均±ＳＥＭ（ｎ＝６）である。
ｂ対ａはｐ＜０．００１であり、ｃ対ａはｐ＜０．００１である。
図２は５０日でのラツトの視床下部外植片によるＧｎＲＨ分泌についてのＩＧＦ−Ｉ関連ペプチドの生体外作用を示す。
ベラトリジン（７．５分間、ベラトリジン５．１０-5Ｍ）により誘発されたＧｎＲＨ分泌の平均±ＳＥＭ増加が３０分の間隔で繰り返し研究された。生後５０日の雄のラツト（各グループにおいてｎ＝６）の視床下部外植片の研究は生理塩水（賦形剤）またはＩＧＦ−Ｉの種々の投与量、または０．１ｍｇ／ｋｇの（４−７０）ＩＧＦ−Ｉまたは０．００４ｍｇ／ｋｇの（１−３）ＩＧＦ−Ｉの生体内分泌成分注入後２５分で始まった。
生後５０日の動物中に０．５ｍｇ／ｋｇのＩＧＦ−Ｉの単一の分泌成分注入後にベラトリジンに応答してＧｎＲＨの生体外分泌が１６７．５分まで著しく抑制された（図２）。０．０５〜０．２ｍｇ／ｋｇのＩＧＦ−Ｉ濃度は使用されたＩＧＦ−Ｉの投与に直接関連している４７．５〜１０７．５分の期間に関してベラトリジンのＧｎＲＨ分泌応答の抑制を生じる。その後、ＧｎＲＨの分泌応答は漸次回復される。ＩＧＦ−Ｉの０，０．０５，０．１，０．２および０．５ｍｇ／ｋｇの注入後２５分で得られたＩＧＦ−Ｉの平均（±ＳＥＭ）漿液濃度はそれぞれ７９９±８７，９４８±７６，１０５４±１１５，１２１５±５０および１７４０±２８ｎｇ／ｍｌである。かくして、ＩＧＦ−Ｉ注入はそれぞれ漿液ＩＧＦ−Ｉ濃度中の１９，３２，５２および１１８％の増加の説明となる。平均漿液テストステロン濃度は賦形剤（２．５±１．５ｎｇ／ｍｌ）または０．１ｍｇ／ｋｇのＩＧＦ−Ｉ（２．６±１．７ｎｇ／ｍｌ）により注入されたラツトにおいて顕著には異ならない。０．１ｍｇ／ｋｇの（４−７０）ＩＧＦ−Ｉの注入後効果は観察されなかつたが、０．００４ｍｇ／ｋｇの（１−３）ＩＧＦ−Ｉはベラトリジンに対するＧｎＲＨ応答の抑制を生じる（図２）。この抑制は０．１ｍｇ／ｋｇのＩＧＦ−Ｉ、モル基礎についての等価投与量を使用して見られる抑制と同様である。加えて、生後５０日のラツトの視床下部外植片からのＧｎＲＨの自発的な拍動性の分泌は０．１ｍｇ／ｋｇのＩＧＦ−Ｉ（データは図示していない）の分泌成分注入後２時間で完全に破壊されている。この抑制期間はベラトリジンにより誘発された分泌についての同一投与の作用と一致する。
図３は１５日および５０日でのラツトの視床下部外植片によるＧｎＲＨ分泌についてのＩＧＦ−Ｉ関連のペプチドの生体外作用を示す。
ベラトリジン（７．５分間５．１０-5Ｍ）により誘発されたＧｎＲＨ分泌の平均±ＳＥＭ増加が１５日および５０日において得られた外植片を使用して繰り返し研究された。実験プロトコルは図２と同一である。生後５０日の雄のラツト（各グループにおいてｎ＝６）の視床下部外植片の研究が生理塩水（賦形剤）または異なる投与量のＩＧＦ−Ｉまたは（１−３）ＩＧＦ−Ｉの生体内分泌成分注入後２５分で始まった。１５日で得られたデータはＩＧＦ−Ｉが１５日において高い投与量の使用にもかかわらず５０日においてのみ有効であることを示すように５０日において得られたデータに対向させてある。これに反して、（１−３）ＩＧＦ−Ｉは両方の年代において有効である。５０日のデータは図２に見られ得るが、ここでそれらは１５日において得られたデータと比較して示されている。
図４は１５日および５０日での視床下部外植片によるＧｎＲＨ分泌についてのＩＧＦ−Ｉ生体外作用を示す。
実験手順は図１におけると同一である。生後１５日および５０日のラツトの外植片が使用された。図は１０-4Ｍおよび１０-3Ｍに達するＩＧＦ−Ｉの非常に高い濃度を使用して、１５日においてＧｎＲＨ分泌の抑制を得ることが最後に可能であることを示す。これは１５日において（１−３）ＩＧＦ−Ｉ中にＩＧＦ−Ｉの減成を制限するメカニズムが存在することを示唆する。図はＩＧＦ−Ｉが十分に高い濃度が使用されない限り、未成熟なラツトにおいて、１５日においてＮＭＤＡレセプター拮抗作用を生じないという事実を示す。データは未成熟な動物においてＮＭＤＡ拮抗物質として（１−３）ＩＧＦ−Ｉを使用するような必要を確認する。
図５はペプチド抑制体の存在において視床下部外植片によるＧｎＲＨ分泌についてのＩＧＦ−Ｉおよび（１−３）ＩＧＦ−Ｉの生体外作用を示す。
実験手順は図１におけると同一である。３つの異なる抑制体が使用された。単独で使用されるとき、それらはベラトリジンに対するＧｎＲＨ分泌応答を行わない。（１−３）ＩＧＦ−Ｉ（１０-10Ｍ）がＧｎＲＨ分泌の抑制を生じる一方、作用はＩＧＦ−Ｉが抑制作用を生じるべく減成される必要があることを示すペプチダーゼ抑制体により阻止される。ＧｎＲＨ分泌についての（１−３）ＩＧＦ−Ｉの抑制作用はペプチダーゼ抑制体により阻止されない。かくして、ＩＧＦ−Ｉの抑制作用は（１−３）ＩＧＦ−ＩによるＧｎＲＨ分泌の抑制を行わない３つの異なるペプチダーゼ抑制体により阻止され得る。そこでＧｎＲＨ分泌の抑制を発生するためにＩＧＦ−Ｉが（１−３）ＩＧＦ−Ｉに減成されるべき必要性を示している。
図６は１５および５０日での視床下部外植片によるＧｎＲＨの分泌についてのＧｎＲＨ関連のペプチドの生体外作用を示す。
左側のグラフは生後５０日の雄のラツトの個々の外植片によるＧｎＲＨ分泌の代表的な輪郭を示す。制御条件において、ベラトリジンを使用する脱分極化は３７．５分毎に行われている。実験条件において、これは競争できるＮＭＤＡレセプター拮抗物質ＡＰ−５、副生成物（１−５）および（２−１０）ＧｎＲＨおよび超作用物質（１−９）ＧｎＲＨａを包含する異なる物質の存在において繰り返されている。（１−９）ＧｎＲＨ作用物質に使用される濃度が大きいことに注目しなければならない。
右側のグラフはＧｎＲＨ関連ペプチドまたは拮抗物質ＡＰ−５の種々の濃度に関連してベラトリジンに対するＧｎＲＨ分泌応答（６個の個々の外植片の平均データ）を示す。ここで、データは制御条件において得られた初期のＧｎＲＨ分泌応答のパーセンテージとして表されている。図６に示されるように、ＧｎＲＨのベラトリジン誘発の分泌はＡＰ−５の作用と同じである投与関連の方法において（１−５）ＧｎＲＨにより抑制されている。（１−２）ＧｎＲＨおよび（１−６）ＧｎＲＨのようなＧｎＲＨの他のグルタミン酸端末断片を使用して、同様な抑制作用が得られる（データは図示されない）。ＧｎＲＨの超作用物質をである（１−９）ＧｎＲＨａを使用して、ＧｎＲＨ分泌はＩＣ50（２×１０-10Ｍ）が（１−５）ＧｎＲＨ（５×１０-13Ｍ）を使用して観察されたものより著しく高いけれども、同様に抑制されている。この差異は超作用物質の比較的低減された減成率対天然のデカペプチドＧｎＲＨに関連され得る。
図７は視床下部外植片によるＧｎＲＨの分泌についてのＩＧＦ−Ｉ，ＧＲＦおよびインシユリン関連ペプチドの生体外作用を示す。
実験手順は図６におけると同一である。生後５０日のラツトの外植片が使用された。種々のペプチドおよびそれらの副生成物が使用された。使用したＧＲＦの（１−３７）および（１−２９）副生成物はラツト配列と著しく異ならないヒト配列であつた。これに反して、完全な（１−４３）配列はヒトＧＲＦがＣ末端において非常に異なるためラツトＧＲＦであつた。牛プロインシユリン、インシユリンおよびインシユリンのＣ−ペプチドが同様に研究された。
（１−４３）ＧＲＦおよびグルタミン酸末端副生成物（１−３７）ＧＲＦはＧｎＲＨの分泌の投与関連抑制を生じる（図７）。この作用は（１−２９）ＧＲＦがＧｎＲＨ分泌に影響を及ぼさないので、それらのペプチドのＧＨ−解放活性に依存するものとは思われないが、そのペプチドはＧＨ−解放活性を保持した。プロインシユリンおよび末端グルタミン酸を有するインシユリンのＣ−ペプチドはまたＧｎＲＨの投与関連抑制を可能にする。これに反して、非常に生物学的活性のペプチドインシユリンは作用を有しない。ＩＧＦ−Ｉに関してすでに議論されたように、（１−４３）ＧＲＦおよびプロインシユリンの抑制作用がそれらのグルタミン酸末端副生成物に対するそれらのペプチドの内因性減成に依存することがある。
図８は視床下部外植片からＮＭＡおよびカイネート（Kainate）により誘発されるＧｎＲＨ分泌についてのグルタミン酸−末端ペプチドの生体外作用を示す。
ＮＭＡ（上方グラフ）およびカイネート（下方グラフ）に対する７．５分の露出により誘発されたＧｎＲＨ分泌応答が生後５０日の雄のラツトの外植片を使用して研究された。この研究は種々のペプチドのグルタミン酸末端副生成物の存在においてかつＮＭＤＡおよびカイネートレセプターにおけるそれぞれ選択的な拮抗物質であるＡＰ−５およびＤＮＱＸの存在において行われた。これらのすべての物質は１０-6Ｍ濃度において使用された。
図８に示されるように、研究された種々の系に属するグルタミン酸末端ペプチドはＮＭＡにより誘発されたＧｎＲＨの分泌の注目される抑制を生じ、それに反してＧｎＲＨのカイネート誘発分泌は影響を及ぼされない。カイネートレセプターではなくＮＭＤＡレセプターの掛かり合いが選択的な拮抗物質、ＡＰ−５およびＤＮＱＸを使用して得られた抑制作用によりさらに示されている（図８）。
図９は異なる化合物による視床下部薄膜からのトリチウム化されたグルタミン酸塩の移動を示す。
視床下部薄膜調合剤が異なる化合物の存在において結合するトリチウム化されたグルタミン酸塩の移動を研究するのに使用された。グルタミン酸塩は比較的低い１０-6ないし１０-8濃度において追跡子の結合を移動することが可能である。ＩＧＦ−Ｉ，（１−３）ＩＧＦ−Ｉおよび（１−５）ＩＧＦ−ＩＧｎＲＨは視床下部薄膜に結合するグルタミン酸塩の競争者として作用する。それらの化合物は高い濃度が要求される一方、同様にＮＭＡまたはＡＰ−５の高い濃度は結合するトリチウム化されたグルタミン酸塩の移動を得るのに必要とされることが顕著である。これはＮＭＤＡレセプター用のトリチウム化されたグルタミン酸塩の親和力がグルタミン酸塩レセプターの他の特殊型に関して少ないためである。
本発明はまた端末グルタミン酸塩を有するベンドルフインおよびＴＲＨの１０-12Ｍないし１０-9Ｍの作用を研究した。これら両方のペプチドはＧｎＲＨのベラトリジン誘発分泌の４０〜６０％の抑制作用を生じるが、しかしその作用はこの予備実験において投与量に関連するものとは認められなかつた。かくしてここで展開された概念は他のグルタミン酸末端ペプチドに及ぼされ得る。
脳の海馬のニユーロンのパツチ−クランプ研究を使用して得られた予備データはＮＭＤＡおよびカイネートを包含するグルタミン酸塩レセプターの種々の特殊型が（１−３）ＩＧＦ−Ｉにより拮抗され得ることを示す。
討論
本発明はかくしてＩＧＦ−ＩがＧｎＲＨの分泌についての抑制作用を有することを示した。この作用はＧｎＲＨの分泌が（４−７０）ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−Ｉレセプターにおける高い生物活性の作用物質により影響されることはないので、典型的なＩＧＦ−Ｉレセプターにより媒介されることはない（７）。それゆえ、Ｎ−末端トリペプチド、（１−３）ＩＧＦ−ＩがＧｎＲＨの分泌についてＩＧＦ−Ｉの抑制作用を媒介し得ると仮定されている。この仮説は２５日および５０日におけるＩＧＦ−Ｉおよび（１−３）ＩＧＦ−Ｉの抑制作用の等しい効力により支持されている。加えて、その（１−３）ＩＧＦ−Ｉ副生成物が１５日において顕著に抑制するが１５日におけるＩＧＦ−Ｉの非常に高い濃度の要求およびペプチダーゼ抑制体の作用はＩＧＦ−Ｉの抑制作用が１５日でまだ活動を開始され得ない（１−３）ＩＧＦ−Ｉメカニズムにその減成を必要とすることを示す。（１−３）ＩＧＦ−Ｉは生物合成の別の方法からよりもＩＧＦ−Ｉの酸素減成から生じる見込みがある。ＩＧＦ−Ｉの人間の胎児の脳ｃＤＮＡについての研究はアミノ末端切り詰めがペプチドの転移後の変更から生じることを示した（１６）。
（１−３）ＩＧＦ−ＩはＮＭＤＡレセプターにおいて作用物質として作用することが以前に示唆された。これに反して本発明のデータはＮＭＤＡレセプターにおいて拮抗物質として（１−３）ＩＧＦ−Ｉの活性を支持する。ＮＭＤＡおよびカイネートレセプターの種々の作用物質および拮抗物質を使用する我々の従前の研究において、我々はＮＭＤＡレセプターの適切な活性が自発的にまたはベラトリジンに応答して発生するＧｎＲＨ分泌パルスに対する必要条件であることを示した（２，３，９）。本発明はＧｎＲＨのＮＭＡ喚起の分泌がＩＧＦ−Ｉにより影響を及ぼされる一方カイネート喚起の分泌が影響を及ぼされないことを示す。ＮＭＤＡレセプターにおけるＩＧＦ−Ｉの拮抗作用の競争的な性質は２５日でＩＧＦ−Ｉに対する比較的低い感度、ＧｎＲＨの分泌に伴われるＮＭＤＡレセプターのピーク活性により特徴付けられる時間により示唆されている（３，９）。また、ＩＧＦ−Ｉは培養媒体が作用物質ＮＭＡにより強化されるとき、抑制体として活性が少ない。そのうえ、ＩＧＦ−Ｉおよびその（１−３）副生成物はＡＰ−５、ＮＭＤＡレセプターでの特別な競争的な拮抗物質と同程度に強いＧｎＲＨ分泌の抑制体であると思われる。最後に、視床下部薄膜調合剤に結合するグルタミン酸塩が種々のペプチド拮抗物質により移動される。
本発明における我々の観察はＩＧＦ−Ｉが雄のラツトの中隆起外植片からのＧｎＲＨの分泌を刺激したことを報告するハイニー等（１７）の観察と食い違う。かかる差異は我々が生後３０日の雄のラツトの外植片からのＧｎＲＨ分泌がＩＧＦ−Ｉ（図示されないデータ）により抑制されたことを認めたので性別によっては説明され得ない。考え得る説明はナイニー等がカイネートレセプターが大きな役割を演ずるように示されたＧｎＲＨニユーロンの中隆起末端を使用した（１８）ことである。これに反して、弓形のニユーロンを包含する視床下部の大きい部片を使用して、我々はＮＭＤＡレセプターがＧｎＲＨ分泌のために重要である（１−３，９）ことを認めた。かくして、これらの観察の生理学的意味はＩＧＦ−Ｉが作用している解剖学上の部位に依存することができた。ＧｎＲＨ神経分泌に結合されるこれらのレセプターに対する脳によるＩＧＦ−Ｉのパラクリン供給はまだ推定である。それに代えて、視床下部が、内分泌メカニズムにより、ＩＧＦ−Ｉの血漿濃度の変化により影響を及ぼされることが考えられる。ＩＧＦ−Ｉの急激な内分泌作用についての我々のデータから、我々は血漿ＩＧＦ−Ｉ濃度の慢性変化がＣＮＳ機能を調節することを推論できない。ＧｎＲＨ分泌についてのＩＧＦ−Ｉの慢性抑制作用は雄の思春期発育が生後２５日および５０日間で発生する一方循環ＩＧＦ−Ｉが同一期間で重要な増加を示すのでき期待されない（５）。しかしながら、漿液ＩＧＦ−Ｉ濃度中の１９％のみの急激な増加がＧｎＲＨ分泌の一時的な抑制を生じることが著しい。かかる作用は漿液テストステロンレベルが変化しないためＩＧＦ−Ｉによる生殖腺ステロイドの増加した分泌の負のフイードバツク作用により説明され得ない。生体外ＧｎＲＨの自発的な拍動分泌がＩＧＦ−Ｉにより急激に抑制されるので、生体内ＬＨ（黄体を形成するホルモン）の拍動分泌が同様に抑制され得ることが可能である。これはＩＧＦ−Ｉの治療的使用に重要であり得るさらに他の研究に値する。
ＩＧＦ−Ｉが生後１５日であって、刺激性アミノ酸に対する高いレベルのレセプターにより特徴付けられる期間においてＮＭＤＡレセプターのどんな拮抗作用も発生しない（１９，２０）ことが顕著である。加えて、１５日および２５日間のＩＧＦ−Ｉ抑制作用の発生は数の減少およびそれらのレセプターの活性と一致する（１９，２０）。ＣＮＳ全体においてこれらのレセプターとＩＧＦ−Ｉとの間の相互作用のモデルとしてＧｎＲＨ神経分泌系および関連のＮＭＤＡレセプターを考察することが可能である。この設定において、ＮＭＤＡレセプターは神経毒性に重要な役割、即ち成人の動物におけるより早い出生後の寿命中の非常に厳しい過程を演ずることが知られている。この論文において提案された概念と一致して、最近、ＩＧＦ−Ｉが低酸素性脳疾患、虚血性脳疾患に対して保護することができるが（２２）、しかし（４−７０）ＩＧＦ−Ｉがかかる作用を生じない（２３）ことが報告された。かくして、ＩＧＦ−Ｉが（１−３）ＩＧＦ−Ｉの前駆物質として、即ちＮＭＤＡレセプターにおける考え得る内因性拮抗物質としてＣＮＳにおいて重要な役割を演ずることが示唆され得る。
グルタミン酸末端ペプチドによるＮＭＤＡレセプター拮抗作用の概念はＧｎＲＨ，ＧＲＦおよびプロインシユリンの副生成物が同様な作用を有するので、ＩＧＦ−Ｉと異なるペプチド系に広げられ得る。これは直接の生合成からまたは前駆物質ペプチドの減成から生じる末端グルタミン酸を有するペプチドがグルタミン酸塩レセプターの拮抗物質（ＮＭＤＡ特殊型）として作用し得ることを示唆する。生理学的条件において、これらのペプチドは多分生合成のそれらの部位でパラクリンまたはオートクリン作用に含まれている。それらはこの過程がＮＭＤＡレセプターの活性に依存するときそれらの分泌の抑制自動調節体として作用し得る。かかるメカニズムは我々が以前に記載した（１１）ＧｎＲＨの自動フイードバツクに伴われ得る。同様なメカニズムはＧＲＦ分泌の制御の役割を演ずることが可能である。すでに議論されたように、ＩＧＦ−Ｉ関連のペプチドの考え得る生理学的関連がこのペプチドの広範な分布および周辺血液中のその比較的高い濃度のために異なる。それゆえ（１−３）ＩＧＦ−Ｉはパラクリンまたはエンドクリン生成から由来するグルタミン酸塩レセプターにおける内因性拮抗物質として考えられる。最後に、ＣＮＳ中に良好に確立された役割を有するグルタミン酸塩レセプターはインシユリンのＣ−ペプチドがそれらのレセプターの内因性拮抗物質を提供し得る膵臓のごとき他の身体器官において幾つかの役割を演ずることが可能である。
結論
ここでは、ＩＧＦ−Ｉおよびその副生成物、（１−３）ＩＧＦ−Ｉおよび（４−７０）ＩＧＦ−Ｉが、単一の分泌成分注入として生体内に付与されるかまたは生体外で使用されて、視床下部外植片によるＧｎＲＨの分泌について研究された。研究された３つの期間（１５日、２５日および５０日）において（４−７０）ＩＧＦ−Ｉはどのような作用も示さない。５０日においてＩＧＦ−Ｉの生体内投与または生体外使用はベラトリジン、脱分極化剤により誘発されたＧｎＲＨ分泌の投与関連抑制を生じる。加えて、生体外ＧｎＲＨの自発的な拍動分泌がＩＧＦ−Ｉの生体内投与後遷移的に抑制される。（１−３）ＩＧＦ−ＩはＩＧＦ−１の抑制作用と同様な抑制作用を示す。２５日で、ＩＧＦ−Ｉおよび（１−３）ＩＧＦ−Ｉは高い濃度が要求されるけれども５０日におけると同一の作用を示す。１５日においてＩＧＦ−Ｉはどのような作用も示さないが、ｎＲＨ分泌の潜在的抑制は生体内または生体外で（１−３）ＩＧＦ−Ｉを使用して観察された。（１−５）ＧｎＲＨ，（１−３７）ＧＲＦおよびインシユリンのＣ−ペプチドのごとき他のペプチド系のグルタミン酸塩末端副生成物は（１−３）ＩＧＦ−Ｉの抑制作用と同様な抑制作用を生じる。これらの作用はＡＰ−５、ＮＭＤＡレセプターでの競争的な拮抗物質の作用に近似する。加えて、研究されたペプチドはカイネートにより誘発されたＧｎＲＨ分泌ではなくＮＭＡにより誘発されたＧｎＲＨ分泌を抑制しかつそれらは視床下部薄膜調合剤からトリチウム化されたグルタミン酸塩の移動を生じる。これらのデータは種々のペプチド系のグルタミン酸塩末端副生成物がＮＭＤＡレセプターにおいて拮抗物質としての役割を演ずることを示す。これは局部的なパラクリン作用から生じることができる。ＩＧＦ−Ｉの急激な系統的投与がＩＧＦ−Ｉ減成から生じる（１−３）ＩＧＦ−ＩによりＮＭＤＡレセプターでの競争的な拮抗作用により、ＧｎＲＨ分泌の抑制を生じるので、エンドクリン作用も可能である。この過程は生後１５日および２５日間で発育すると思われ、発育状況の重要性を示す。
参照文献
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２  ブルギニヨン・ジエイピー氏、ジエラルド・エー氏、マシユー・ジエイ氏、シモンズ・ジエイ氏、フランチモント・ピー氏著、視床下部外植片からのゴナドトロピン解放ホルモンの拍動解放がＮ−メチル−Ｄ，Ｌアスパラギン酸塩レセプターの遮断により抑制される。内分泌学  １９８９年、第１２５巻、第１０９０頁乃至第１０９６頁
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８  サラ・ヴイアール氏、カールソン−スクウイラツト・シー氏、バーグマン・テイー氏、ジエルンバル・エツチ氏、ロバーツ・ピージエイ氏、クロフオード・エム氏、ホーカンソン・エルエヌ氏、シバレロ・アイ氏、ノードバーグ・エー氏著、ｇｌｙ−ｐｒｏ−ｇｌｕ（ＧＰＥ）、新規な神経活性ペプチドとしての脳内で切り詰められるインシユリン状成長因子Ｉのアミノ末端トリペプチド。生化学生物物理学研究発表  １９８９年、第１６５巻、第７６６頁乃至第７７１頁
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【図面の簡単な説明】
図１は１５日、２５日および５０日での視床下部外植片によるＧｎＲＨの分泌についてのＩＧＦ−Ｉ関連のペプチドの生体外作用を示すグラフ図である。
図２は５０日での視床下部外植片によるＧｎＲＨの分泌についてのＩＧＦ−Ｉ関連のペプチドの生体外作用を示すグラフ図である。
図３は１５日および５０日での視床下部外植片によるＧｎＲＨの分泌についてのＩＧＦ−Ｉ関連のペプチドの生体外作用を示すグラフ図である。
図４は１５日および５０日での視床下部外植片によるＧｎＲＨの分泌についてのＩＧＦ−Ｉの生体外作用を示すグラフ図である。
図５はペプチダーゼ抑制体の存在における視床下部外植片によるＧｎＲＨの分泌についてのＩＧＦ−Ｉおよび（１−３）ＩＧＦ−Ｉの生体外作用を示すグラフ図である。
図６は視床下部外植片によるＧｎＲＨの分泌についてのＧｎＲＨ関連のペプチドの生体外作用を示すグラフ図である。
図７は視床下部外植片によるＧｎＲＨの分泌についてのＩＧＦ−Ｉ，ＧＲＦおよびインシユリン関連のペプチドの生体外作用を示すグラフ図である。
図８は視床下部外植片からＮＭＡおよびカイネートにより誘発されるＧｎＲＨの分泌についてのグルタミン酸−末端ペプチドの生体外作用を示すグラフ図である。
図９は異なる化合物による視床下部薄膜からのトリチウム化されたグルタミン酸塩の移動を示すグラフ図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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