(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
個々の赤血球のヘモグロビン濃度を決定するための方法であって、
（ａ）血液サンプルの赤血球を、電解質液中の、間隔をあけた、個々の赤血球の流れにのせるステップと、
（ｂ）孔を通して流れる赤血球の各々の通過により生ずる電気抵抗の変化を測定すること、及び該孔を通る赤血球の通過により生ずる電気抵抗の変化を代表する大きさを有する各々の赤血球についての対応する第１のパルスシグナルを誘導することを含む、前記孔内の電解質液の低周波電気抵抗を測定するステップと、
（ｃ）孔を通して流れる赤血球の各々の通過により生ずる高周波抵抗の変化を測定すること、及び該孔を通る各々の赤血球の通過により生ずる高周波抵抗の変化を代表する大きさを有する各々の赤血球についての対応する第２のパルスシグナルを誘導することを含む、前記孔内の電解質液の高周波（RF）抵抗を測定するステップと、
（ｄ）各々の赤血球について形状を決定するステップと、
（ｅ）前記対応する第１のパルスシグナルに対する第２のパルスシグナルの比及び赤血球の形状から、流れる各々の赤血球の各々のヘモグロビン濃度を計算するステップと、
を特徴とする方法。
【請求項２】
前記形状の決定が、赤血球を球状化する化学試薬と赤血球を混合することを特徴とすることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記形状の決定が、赤血球の直接的測定を特徴とすることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記赤血球の直接的測定が、赤血球を光学的に像形成することを特徴とすることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記形状の決定が、赤血球について一定形状を仮定することを特徴とすることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記孔が、非フォーカスフロー孔を特徴とすることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記孔が、フォーカスフロー孔を特徴とし、そして前記赤血球が前記電解質液でおおわれることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項８】
各々の赤血球の容量を決定することを更に特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項９】
各々の赤血球ヘモグロビン濃度の決定に基づく赤血球の副次集団の同定を更に特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
赤血球の副次集団が、正色素性赤血球、高色素性赤血球及び低色素性赤血球を特徴とすることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
個々の赤血球のヘモグロビン濃度を測定するための装置であって、
（ａ）血液サンプルの赤血球を、電解質液中の、間隔をあけた、個々の赤血球の流れにのせるための手段と、
（ｂ）孔を通して流れる赤血球の各々の通過により生ずる電気抵抗の変化を測定すること、及び該孔を通る各々の赤血球の通過により生ずる電気抵抗の変化を代表する大きさを有する各々の赤血球についての対応する第１のパルスシグナルを誘導することを含む、前記孔内の電解質液の低周波電気抵抗を測定するための抵抗測定手段と、
（ｃ）孔を通して流れる赤血球の各々の通過により生ずる高周波抵抗の変化を測定すること、及び該孔を通る各々の赤血球の通過により生ずる高周波抵抗の変化を代表する大きさを有する各々の赤血球についての対応する第２のパルスシグナルを誘導することを含む、前記孔内の電解質液の高周波（RF）抵抗を測定するための高周波測定手段と、
（ｄ）各々の赤血球について形状を決定するための手段と、
（ｅ）前記対応する第１のパルスシグナルに対する第２のパルスシグナルの比及び赤血球の形状から、流れる各々の赤血球のヘモグロビン濃度を計算するための手段と、
を特徴とする装置。
【請求項１２】
前記形状を決定するための手段が、赤血球を球状化する化学試薬と、赤血球を混合するための手段を特徴とすることを特徴とする請求項11に記載の装置。
【請求項１３】
前記形状を決定するための手段が、赤血球の直接的測定を行うための手段を特徴とすることを特徴とする請求項11に記載の装置。
【請求項１４】
前記赤血球の直接的測定が、赤血球を光学的に像形成することを特徴とすることを特徴とする請求項13に記載の装置。
【請求項１５】
前記形状を決定するための手段が、赤血球について一定形状を仮定するための手段を特徴とすることを特徴とする請求項11に記載の装置。
【請求項１６】
前記孔が、非フォーカスフロー孔を特徴とすることを特徴とする請求項11に記載の装置。
【請求項１７】
前記孔が、フォーカスフロー孔を特徴とし、そして前記赤血球が前記電解質液でおおわれることを特徴とする請求項11に記載の装置。
【請求項１８】
各々の赤血球の容量を決定するための手段を更に特徴とする請求項11に記載の装置。
【請求項１９】
各々の赤血球ヘモグロビン濃度の決定に基づく赤血球の副次集団の同定のための手段を更に特徴とする請求項18に記載の装置。
【請求項２０】
前記赤血球の副次集団の同定のための手段が、正色素性赤血球、高色素性赤血球及び低色素性赤血球の決定を可能にすることを特徴とする請求項19に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、完全な血液サンプル中の個々の赤血球のヘモグロビン濃度の測定に関する。より詳しくは、本発明は、このような測定を行うための方法並びに統計的特徴を決定し、及び前記サンプルの副次集団を同定するための方法に関する。
発明の背景
個々の赤血球の特性の評価は、個体の健康状態の評価の標準的な一部分であり、特定の病気の診断及び治療の監視に用いられる。慣用的に報告される赤血球の特性は、血液の単位容量当りの赤血球の数（“赤血球数”又は“RBC”）、完全な血液中の赤血球の容量％（“充填赤血球量”又はPCV）、完全な血液の単位容量当りのヘモグロビンの量（ヘモグロビン濃度又は〔Hgb〕）、赤血球の平均サイズ（平均細胞容量又はMCV）及び赤血球サイズの分布（赤血球分布幅又はRDW）、各々の赤血球中のヘモグロビンの平均量（平均細胞ヘモグロビン又はMCH）並びに赤血球内のヘモグロビンの平均濃度（平均細胞ヘモグロビン濃度又はMCHC）を含む。これらの報告されるパラメータのうち、ほとんどの血液学分析者は、次の３つ：赤血球（RBC）、ヘモグロビン濃度（〔Hgb〕）、及び平均細胞容量数（MCV）のみを測定する。他のパラメータは以下の関数に従って計算される。
1.  PCV＝RBC×MCV
2.  MCH＝〔Hgb〕／RBC
3.  MCHC＝〔Hgb〕／PCV
4.  RDW＝容量／MCVの標準偏差
報告された赤血球パラメータは、患者の血液サンプルの状態を記述するのに用いられ、貧血の分類及び診断に関連する。例えば、MCVを用いて貧血のサブ分類が可能である。小球性貧血、例えば鉄分欠損又はサラセミアにおいてMCVの減少が見られる。Ｂ12／葉酸欠損又は再生不良性貧血の大球性貧血ではMCVの増加がおこる。正球性貧血（正常なMCV）は、免疫溶血性貧血又は遺伝性球状赤血球症を含む。他のパラメータ、例えばMCHC又はMCHの付加により、分類を狭くすることが可能である。小球性貧血について、鉄欠損はMCVとMCHCとの両方における減少を示すが、サラセミアにおいてはMCVのみが減少する。更に、赤血球集団内での値の分布は情報を増加させる。例えば、小球性貧血では、RDWは鉄欠損において増加するが、サラセミアでは増加しない。
他の分析的因子は特定の患者の血液サンプルを十分に評価するのに役立ち、潜在的に、病気の早期診断及び治療を許容する。集団内の個々の細胞ヘモグロビン濃度の分布の分析は、赤血球の流動特性に関する重大な情報を与える。個々の赤血球ヘモグロビン濃度の分布は、おおよそ、それら細胞の色の顕微鏡スライド上での手作業での評価に等しい。ヘモグロビン濃度の減少した赤血球は低色素性と呼ばれ、他方、ヘモグロビン濃度の増加した赤血球は血色素増加性と呼ばれる。ヘモグロビン濃度の増加した分布の集団は、多染性細胞として分類される。血色素増加性赤血球は流動特性を変え、鎌状赤血球貧血のような病気において溶血の発症の細胞的原因として示唆されている。
それらの現在の形態において、平均細胞ヘモグロビン及び平均細胞ヘモグロビン濃度の測定に関連したいくつかの問題及び制限がある。第１に、これらの測定は通常、全体の細胞集団についての平均測定として行われる。これにより、その集団内のこれらの測定の分布を得ること又は多重集団又は副次集団を同定することが不可能である。第２に、平均細胞ヘモグロビン及び平均細胞ヘモグロビン濃度の測定は、直接、決定されず、むしろ先の等式に記述されるように２又はそれ超の測定から計算されるので、これらの多重の測定による潜在的な誤差が存在する。
標準の方法において、MCHCは、ヘモグロビン含有量を充填赤血球量で割ることにより決定される。自動化血液分析機の場合、充填赤血球量は直接、決定されず、細胞数×平均細胞容量として決定される。多くの自動化システムにおいて、異常なヘモグロビン濃度を伴うサンプルについての容量測定の周知の不正確さがある。これにより、この容量における誤差は、平均細胞ヘモグロビン濃度の測定結果に広がる。
孔を通して一度に実質的に１の細胞が通過する時の個々の血液細胞での電気抵抗又は光学測定を行うための自動化された手段はサイトメトリーの技術で公知である。将来性のある特許（Wallace H. Coulter、米国特許第2,656,508号、1953年10月）は、それらが孔を通過する時の個々の細胞の直流（DC）抵抗を測定するための方法を記載する。次に、細胞の容量及び形状に対するこの低周波の測定の関係が十分に記載される。Coulter及びItoggによる特許（米国特許第3,502,974号、1970年３月）において、このような孔を通しての通過の間の高周波抵抗性の測定が教授される。RF抵抗測定が細胞の大きさ、形状、及び内部伝導度により影響を受けることが等しく公知である。細胞の“不透過度（opacity）”と呼ばれる比率であるDC抵抗性に対するRF抵抗性の比率を決定することにより、細胞の大きさの影響を排除し、細胞の内部伝導度及びその形状にのみ依存する測定を行うことができる。特定の白血球型の同定のため又は赤血球からの血小板の区別のためのような、より大きな集団内で血液細胞の副次集団を区別するためのいくつかの適用において、不透過度測定が用いられている。この区別は、一つの集団対他方の集団の相対的基準に基づき、観察された測定結果の原因である特定の細胞の特性の定量を含まない。
Leifら（“Two-dimensional Impedance Studies of BSA Buoyant Density Separated Human Erythrocytes,”Cytometry, 6:13 〜21, 1985）は、種々の密度の赤血球間を区別するための不透過度測定の使用を記載する。しかしながら、彼らは、細胞のヘモグロビン濃度の測定のための不透過度測定の使用を認めなかった。不透過度測定を用いる個々の赤血球のヘモグロビン濃度の定量は以前には記載されておらず、又は実施されていない。
他の文献において、Grovesら（英国特許出願GB 2,064,133号）は、穴を通る赤血球の流れを流体力学的にフォーカシングするための装置及び方法であって、低周波電流が穴を通過して電気的な第１のインピーダンスシグナル測定を行い、そして光学シグナル発生装置により流体力学的にフォーカシングして各々の赤血球の長さの測定値を得て赤血球形状の情報を得るための装置及び方法を教授する。更なる実施形態において、更なる高周波電流が穴を通過して電気的な第２のインピーダンスシグナル測定を行い、各々の赤血球の赤血球内部抵抗を得る。その文献は、個々の赤血球ヘモグロビン濃度の決定を教授せず、又は包含しない。
更なる文献において、Brittrenhamら（欧州特許出願0335001号）は、各々の血液細胞の検出に応答して形成された個々のパルスからのパルス幅に対するパルス高の比である区別パラメータを用いることによる血液細胞の粒子分析を教授する。区別パラメータの分布はパルス高及びパルス幅の分布上にプロットされ、そしてパルス高、幅及び区別パラメータの３次元表示が赤血球を分析するのに用いられる。その文献は、個々の赤血球ヘモグロビン濃度をいかに得るかを教授せず、又は包含しない。
血液及び他の細胞の特定の構成物の特性を問うための電気的手段の使用は20世紀の初めから実施されている。異なる周波数での一連の測定を行うことによる血液及び他の生物学的流体の電気特性の研究は、“交流分光法”と呼ばれている。この文献の報告は、Schwan, “Electrical Properties of Blood and Its Constituents : Alternating Current Spectroscopy,” Blut, 46:185〜197, 1983により供される。多数の研究者らは、DCからマイクロ波までの周波数域にわたる白血球の抵抗及び誘電特性を研究した。低周波数電流及びRF電流について白血球の電気伝導度は異なること、並びに低周波数電流に対する細胞膜の抵抗がこの差についての主な原因であることが、この期間の初期に認められた。これにより、赤血球集団の細胞質の平均電気伝導度を決定することが、この交流分光法の技術で可能である。しかしながら、この技術は、個々の細胞の内部伝導度の測定を許容せず、また個々の赤血球のヘモグロビン濃度を決定するために記載される手段でもない。
Pilwat及びZimmermann（“Determination of Intracellular Conductivity from Electrical Breakdown Measurements”, Biochimica et Biophysica Acta, 820:305〜314, 1985）は、細胞膜を破壊し、これによりその細胞内に電流を流す高強度電場の使用によるフローサイトメトリーの孔内の細胞の平均内部伝導度の測定を記載する。次にこの技術は、破壊された細胞集団についての電気抵抗を、細胞を破壊しないより低い場の強度で行った測定と比較する。この技術では、交流分光法のように、細胞集団の内部伝導度についての平均基準を決定することができる。この技術は、個々の細胞での全ての測定を行うのよりむしろ孔を通る集団の多重の通過を要求するので、フローサイトメトリーの孔において行うことができるが、それは、全体の集団についての平均測定を行うことができるだけである。また、この電気的技術では個々の細胞ヘモグロビン濃度の測定は行うことができない。
フローサイトメーターで個々の細胞ヘモグロビン濃度の測定を行うために２つの手段が開示されている。Tyckoによる米国特許第4,735,504号（1988年４月）は、球状の赤血球の容量及びヘモグロビン濃度を測定するために、フローサイトメトリーの孔内のこれらの細胞についての２つの角の領域にわたっての散乱した光の収集を記載する。更に、Tychoによる米国特許第5,194,909号（1993年３月）は、細胞容量及びヘモグロビン濃度を同時に測定するために、球状の赤血球上での光散乱の１つの角の領域と一緒の直流抵抗の測定を記載する。両方の技術は、レーザー光源、光学的に純粋な材料から作製された光学測定に適したフローセル、並びにホトディテクター及びそれらに関連する電気部品の使用を要求する。これらの光学技術の使用はかなり高価になり、測定装置を複雑にする。更に、両方の技術は細胞の形状に極めてセンシティブであり、細胞が完全に球状である場合に正確な測定が行われるのみである。これにより、ネイティブ形状での赤血球での測定は可能でない。
従って、光学的照射及び検出の使用を要求しないフローサイトメトリーの孔の中で個々の赤血球のヘモグロビン濃度を測定するための手段についての必要性が存在する。本明細書に記載されるように、このような装置及び方法は、現在可能であるものよりも簡単な装置で低価格で、個々の細胞ヘモグロビン濃度を迅速かつ正確に測定する能力を有するであろう。
発明の概要
本発明は、個々の赤血球のヘモグロビン濃度を測定するための方法に関する。その方法は、電解質液内の間隔をあけた個々の赤血球の流れの中に、血液サンプルの赤血球をのせるステップと；孔を通る流れの赤血球の各々の通過により引きおこされる電気抵抗の変化を測定すること、及び孔を通る赤血球の通過により引きおこされる電気抵抗の変化の代表的な大きさを有する対応する第１のパルスシグナルを得ることを含む、孔内で電解質液の低周波数抵抗を測定するステップと；孔を通る流れの赤血球の各々の通過により引きおこされる高周波抵抗の変化を測定すること、及び孔を通る赤血球の通過により引きおこされる高周波抵抗の変化の代表的な大きさを有する対応する第２のパルスシグナルを得ることを含む、孔内で電解質液の高周波（RF）抵抗を測定するステップと；各々の赤血球についての形状を決定するステップと；そして、第１及び第２のパルス並びに赤血球の形状から、流れの赤血球の各々のヘモグロビン濃度を計算するステップと、を含む。更に、その方法は、非フォーカスフロー孔を有する装置及びフォーカスフロー孔を用いる装置に適用可能である。
赤血球形状の測定は、赤血球を球状にする（Sphering）こと、血液細胞の直接的測定及び赤血球についての一定の値を選択することを含む異なる方法によって行うことができる。
本発明は、更に、孔を通しての流れの赤血球の各々の通過により引きおこされる低周波電気抵抗の測定された変化を用いて赤血球の容量を測定することを更に含む方法に関する。
本発明の方法は、赤血球ヘモグロビン濃度の測定に基づく赤血球の副次集団の同定を可能にする。
更に、本発明は、個々の赤血球のヘモグロビン濃度を測定するための装置に関する。その装置は、電解質液中の間隔のあいた個々の赤血球の流れに血液サンプルの赤血球をのせるための手段と；孔を通る流れの赤血球の各々の通過により引きおこされる電気抵抗の変化を測定すること、及び孔を通る赤血球の通過により引きおこされる電気抵抗の変化の代表的な振幅を有する対応する第１のパルスシグナルを得ることを含む、孔内の電解質液の低周波電気抵抗を測定するための抵抗測定手段と；孔を通しての流れの赤血球の各々の通過により引きおこされる高周波抵抗の変化を測定すること、及び孔を通る赤血球の通過により引きおこされる高周波抵抗の変化の代表的な振幅を有する対応する第２のパルスシグナルを得ることを含む、孔内の電解質液の高周波（RF）抵抗を測定するための高周波測定手段と；各々の赤血球についての形状を測定するための手段と；対応する第１及び第２のパルス並びに赤血球の形状から、流れの赤血球の各々のヘモグロビン濃度を計算するための手段と、を含む。
更に、その装置は、非フォーカスフロー孔を含み得る装置に関する。あるいは、その装置は、フォーカスフロー孔を用いることができる。
なお更に、その装置は、赤血球の形状の測定を供することに関する。その装置の一実施形態において、その装置は、赤血球を球状にするための球状化剤と赤血球を混合するのに用いられる容器（不図示）を含む。第２の実施形態において、その装置は、血液細胞の直接的測定のための手段を含む。これは、赤血球の像を得るための像形成システム（不図示）を含む。
本発明は、孔を通る流れの赤血球の各々の通過により引きおこされる電気抵抗の測定された変化を用いる赤血球の容量を測定するための手段を更に含む装置に更に関する。
本装置は、赤血球容量及びヘモグロビン濃度の決定に基づく赤血球の副次集団の同定を可能にする。
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明で用いるための装置の概略図である。
図２は、緩衝された塩溶液の出発イオン含有量、ヘモグロビンの溶液の濃度と、生じた混合物の電気伝導度と、の間の関係の図である。
図３は、緩衝された塩溶液中のヘモグロビンの濃度と、ヘモグロビンの存在しない緩衝した塩溶液に対する溶液の電気伝導度と、の間の関係の図である。
図４は、赤血球のヘモグロビン濃度と細胞の不透過度測定値との間の関係の細胞の形状への依存性を示す図である。
図５は、ヘモグロビン濃度の関数としての球状化した及び変形可能な赤血球の不透過度を示す図である。その曲線は、この適用において開発された分析に基づいて予想される理論的投影を示す。
図６は、54の患者についての本発明の方法対標準方法により決定されたヘモグロビン濃度の比較である。
図７は、本発明により決定された血液サンプルのヘモグロビン濃度ヒストグラムである。図７（Ａ）は、通常の赤血球集団を示す。図７（Ｂ）は、低色素性赤血球である赤血球の大きな増加を示す。図７（Ｃ）は、血色素増加性赤血球である赤血球の大きな増加を示す。
好ましい実施形態の詳細な記載
図１に概略的に示すように、本発明の装置は希釈された赤血球細胞サンプルをフローセルに供する流体のシステム４につながったフローセル２からなる。そのフローセル２は、それを通して一度に実質的に１つ、赤血球が流れる測定孔６を含む。電極８は孔の各々の側面に位置する。その電極は、その孔を横切る直流場及び高周波交流場を確立することができる電気回路要素10につながる。電気回路要素は電極にも接続され、孔を通して赤血球の移動する時に生ずるDC及びRF電圧の変化を測定する。この回路要素の出力はデジタル化手段１６によりコンピュータ14に接続される。そのコンピュータは、孔を通過する各々の赤血球により生ずるDC電圧及びRF電圧の変化の大きさを記録する記録手段18を含む。次にコンピュータは、計算手段20を用いて分析を行い、本開示に従う孔を通過する個々の赤血球のヘモグロビン濃度を決定する。更に、好ましい実施形態において、各々の赤血球の容量が計算される。更に、そのデジタルコンピュータは、細胞ヘモグロビン濃度及び容量の平均の標準偏差及び変化の係数を含む赤血球集団についての統計的測定結果を集める。
個々の赤血球のヘモグロビン濃度を決定するために、赤血球のアリコートを周知の伝導度の等張溶液で希釈する。その希釈は、実質的に一度に１つの細胞が孔を通って流れることができるのを確実にするような比であるべきである。典型的な希釈は、意図した目的のために当業者に周知である。通常、希釈は、１に対して１超である。フォーカス・フロー孔システムを用いる装置について、電解質に対する赤血球の希釈は約2,500に対して１である。非フォーカスフロー孔システムについて、電解質に対する赤血球の希釈は約5000に対して１である。
等張溶液の伝導度の範囲は、重大であることは示されていない。広範囲の伝導度が本発明に役立つことが示されている。等張溶液は、典型的には、中性pHを有する塩化ナトリウムの緩衝された塩溶液である。適切な等張溶液の例は、pH7.4及び約290mOsmの浸透圧モル濃度の等張リン酸緩衝塩類溶液である。
細胞のヘモグロビン濃度は、細胞が測定孔を通って流れる時に測定される赤血球のDC及びRF抵抗を分析することから得られる。測定孔を通って流れる時に電気的に伝導性の流体内に懸濁された粒子又は細胞により引きおこされる電気抵抗は、粒子又は細胞の容量、その形状及び方向、並びに電流の特定の周波数についての懸濁流体に対する粒子又は細胞の電気伝導度により決定される。細胞又は粒子の形状、方向及び伝導度の全体的効果は、“形状因子”と呼ばれる。
電場に対して平行な長軸方向での回転だ円体である細胞又は粒子について、形状因子ｆsは、
0003828155.tif 000002
（式中、σcは特定周波数での細胞の伝導度であり、σeはその周波数での外部溶液の伝導度であり、ｍはだ円体の幅（小さい軸）に対するだ円体の長さ（大きい軸）の比であり、そしてｚは、
0003828155.tif 000003
で定義されるｍの関数である）に等しい。
等式１に現れる外部媒体の伝導度に対する細胞の伝導度の比
0003828155.tif 000004
は、相対伝導度と呼ばれる。
低周波測定（DCを含む）について、血液細胞は、この周波数での膜の非電気伝導性のため、電場に対する絶縁体として現れる。この状況において、細胞の伝導度σcは懸濁溶伝導度σeに対して極めて小さく、このため、比σc／σeは本質的に０である。この単純化を等式１に適用すると、直流ｆs,DCについての血液細胞の形状因子は次：
0003828155.tif 000005
のように記述することができる。
その電流の周波数が増加するにつれて、細胞膜の透電率又は絶縁能力は喪失する。高周波（RF）においては、膜は電場にほとんどかくれる。次に、細胞の伝導度は、その内部の伝導度により決定される。赤血球について、その内部は、通常、ヘモグロビンの溶液のみを含み、核又は他の内部構造を含まない。それゆえ、細胞質を作るヘモグロビン溶液の伝導度は、RF電流に対する細胞の伝導度を決定する全体的な原因となる。赤血球について、細胞質の電気伝導度は、その細胞が懸濁された外部の緩衝された塩溶液の伝導度と同じオーダーの大きさである。これにより、RF測定について、DC測定についての等式１に適用される単純化は適用することができず、そして形状因子ｆs,RFは等式１の全ての文字により記述される。
DC又はRF抵抗のようなその場の中の粒子の電気抵抗（Ｒ）は、粒子の容量（Ｖ）×形状因子×システム定数（ｋ）に等しく、又は
Ｒ＝Ｖ・ｆS・ｋ              （４）
である。
上述のように、不透過度は、RF抵抗をDC抵抗で割った値、又は
0003828155.tif 000006
で定義される。
細胞の容量はDC及びRF測定の両方について同じであり、そしてシステム定数ｋRF及びｋDCは、利得制御を調節すること又は他の手段により等しくセットすることができるので、不透過度は、形状因子の比率のみになるか又は
0003828155.tif 000007
である。
上述のように、ｆs,DCは等式３により記述され、そしてｆs,RFは等式１により記述される。それゆえ、細胞の不透過度は、
0003828155.tif 000008
として記述される。
この等式で見ることができるように、細胞の不透過度は、パラメータ“ｍ”により記述されるように細胞の形状に、及び外部媒体の伝導度に対する細胞の内部の伝導度の比（σc／σe）にのみ依存する。
不透過度により血液細胞中のヘモグロビン濃度を決定するために、赤血球の細胞質のヘモグロビン濃度と細胞質溶液の電気伝導度との間の関係を知らなければならない。小規模な赤血球それ自体の中でのこの関係を測定することの困難さのため、この関係を決定するために実験モデルが開発された。周知の量の緩衝した塩を周知の量の水に加えて周知の電気伝導度の溶液を作った。次に、特定量のヘモグロビンを塩溶液に加えて第１のヘモグロビン濃縮物を作った。この第１のヘモグロビン溶液の伝導度を測定した。次に、その第１のヘモグロビン溶液に更なる量のヘモグロビンを加えて第２のヘモグロビン濃縮物を作った。この第２の溶液の伝導度を測定した。この過程を、広範囲のヘモグロビン濃度でくり返した。緩衝した塩溶液の出発塩濃度に対するヘモグロビン溶液の伝導度の依存性は、緩衝された塩のいくつかの出発濃度においてこの実験をくり返すことによって見い出した。この一連の実験の結果を図２に示す。
図２の結果は、各々のヘモグロビン溶液の伝導度を、ヘモグロビン溶液の得られる出発塩溶液の伝導度で割ることによって単純化することができる。このスケールされた伝導度は、相対伝導度とも呼ばれる。このスケーリングの結果を図３に示す。これは、一本の曲線が出発塩濃度と独立した、ヘモグロビン溶液の相対伝導度を記述することを示す。この結果は、この図で示されるデータを次の一般式：
Relative_Conductivity＝（１−ｘ・Hb）y           （８）
の等式に回帰させることにより数学的に記述される。ここで、Hbはヘモグロビン濃度である。この回帰は、次の特定の等式：
Relative_Conductivity＝（１−.016・Hb）1.49      （９）
を供する。
本開示に記載されるような不透過度の測定による個々の赤血球のヘモグロビン濃度を決定するための方法において、細胞は、大量の塩溶液に希釈される。赤血球の膜は水の流動及びそれを通るイオン流動の両方を許容するが、赤血球は、その内部溶液を外部溶液イオン濃度にほぼ等しいイオン濃度に調節することにより、特定のイオン濃度の外部溶液の希釈に応答するであろう。これにより、上述の実験で決定され、等式９で記述される相対伝導度は、本明細書に記載され等式７で記述される不透過度により測定されるような相対伝導度に等しい。それゆえ、等式７及び９を組み合わせることにより、ヘモグロビン濃度と不透過度との間の関係が決定される。この結果は、等式10：
0003828155.tif 000009
で記述される。
このヘモグロビン濃度と不透過度との間の関係は、所定範囲の細胞形状パラメータ“ｍ”について図４にプロットされる。この図に見られるように、赤血球の変化による所定のヘモグロビン濃度についての不透過度測定における実質的な差が存在し得る。
これにより、不透過度測定からヘモグロビン濃度を正確に決定するために、細胞の形状を考慮する必要がある。細胞形状を説明するためのいくつかのかわりの手段がある。
１つのかわりの手段は、赤血球を等容量的に球状化することであろう。任意的実施形態において、その球状化細胞は、周知の細胞固定試薬で安定化することができる。赤血球を等容量的に球状化するための手段は当業者に公知である。典型的には、球状化試薬は、細胞膜の表面領域をできる限り小さくすることにより、赤血球をそれらの正常の両凹のディスク形状から球に変換させるのに用いることができる。球状化剤を用いる場合、好ましくは、赤血球容量はほぼ一定であり、球状化剤の使用により変化しないべきである。球状化赤血球を用いる場合、形状パラメータ“ｍ”は、全ての細胞について１に等しいであろう。そしてヘモグロビン濃度は等式10又は図４に従って決定することができる。
細胞形状を説明するための第２のかわりの手段は、各々の細胞の形状を測定することであろう。これを行うためのいくつかの方法は細胞測定の当業者に周知である。各々の細胞の形状を直接測定するための方法は、直接的イメージング法又はGrovesらにより教授されるスリットスキャニング法を含むであろう。
細胞形状を説明するための第３のかわりの手段は、細胞の形状を仮定することであろう。赤血球の正常な集団は一定かつ周知の形状及び変形性を有するので、この方法が可能である。この方法を用いることが器具を最も簡単にするであろうが、特に正常な挙動に従わない赤血球のサンプルについて潜在的な不正確さを有する。
上述の分析の実験的確認は、モデルシステム及び患者の血液サンプルの両方で行われた。そのモデルシステムは、せまく規定したヘモグロビン濃度で赤血球の集団を形成するために、Clarkら（“Study on the Dehydrating Effect of the Red Cell Na+ /k+ -Pump in Nystatin-treated Cells with Varying Na + and Water Contents, ”Biochimica et Biophysica Acta, 646:422〜432, 1981）の技術を利用する。この技術で、約20ｇ／dl〜50ｇ／dlのヘモグロビン濃度の集団を形成することができる。この範囲は正常及び異常な人々の両方に見られるヘモグロビン濃度の範囲を超える。
図５は、特定濃度のヘモグロビンで細胞のサンプルを作るためにこの技術で処理した細胞での結果を示す。細胞は、球状化の後及び正常な状態の両方で測定する。この図の連続線は、球形状で固定化した細胞及び正常な変形性を保持する細胞の両方についての、本開示により記載されるような、所定のヘモグロビン濃度についての不透過度の予測測定結果を示す。両方の細胞集団について密接な一致点が見られる。細胞の正常な変形性は他の因子の中でもヘモグロビン濃度で変化すること、及び高ヘモグロビン濃度の細胞は球状化細胞と同様にふるまうことに注意すべきである。
球として細胞を固定化した後に測定した54の患者サンプルのグループについての本明細書に記載される不透過度法によるヘモグロビン濃度測定の結果は図６に見られる。不透過度法により決定したヘモグロビン測定値は、標準比色法により測定したヘモグロビンと比較される。これらの２つの測定の間の等量の線もプロットされる。このデータセットについて、本明細書に記載される不透過度技術により測定したヘモグロビン濃度と標準比色法により決定したヘモグロビン濃度との間の標準偏差は1.09ｇ／dlである。
ヘモグロビン濃度分布を検出する本発明の能力を図７に示す。図７（Ａ）は、ヘモグロビン濃度29ｇ／dl〜41ｇ／dlの大部分の細胞を有する正常な赤血球集団を示す。この赤血球副次集団は、正色素性であるとして記述される。図７（Ｂ）は、赤血球の大きな低色素性副次集団を示す患者からのヘモグロビン分布である。図７（Ｃ）は、赤血球の大きな血色素増加性副次集団を示す異なる患者からのヘモグロビン分布である。実施例３の方法を、これらの測定結果を得るために用いた。
以下の実施例は、詳説するのみである個々の赤血球のヘモグロビン濃度の測定のための方法及び製剤を供することが認められるはずである。この開示に従って、他の試薬及び／又は技術を用いることができる。
実施例１
完全な血液２μｌのサンプルを290mOsmに調節した140mM塩化ナトリウムを含むpH7.4の10mMリン酸ナトリウム緩衝液５mlに希釈する。そのサンプルを、流体力学フォーカシングを用い、約50ミクロンの直径×70ミクロンの長さの寸法の円柱状測定孔を含むフローセルを備えた血液分析機に吸引する。そのフローセルは、孔を横切る直流（DC）抵抗及び23MHzの周波数の高周波（RF）抵抗の測定を許容するように適切な電気回路要素に接続された、孔の各々の側面上にある２つの電極を含む。典型的には99％超の赤血球を含む、血液の希釈サンプルを、血液サンプルの希釈率及び孔の容量により決定されるように、一度に本質的に１つの細胞を、測定孔を通して流す。第２の流体の流れでの細胞のサンプルを含む流体の流れの流体力学的フォーカシングは、約４倍の更なる希釈の原因となる。流れの速度は測定孔内で秒当り約５メーターにセットする。赤血球は、流れる間にそれらに与えられる流動力に応じて変形する。DC及びRF抵抗の測定結果は約32,000の細胞の各々について記録される。各々の細胞のヘモグロビン濃度は、各々の細胞が測定の間、４対１の長さ対幅の形状を有すると仮定して、本明細書に記載されるように不透過度測定から決定される。ヘモグロビン濃度の平均、並びに標準偏差の統計的基準及び集団の変化の係数は、個々のヘモグロビン濃度測定からコンピュータ処理される。集団のヘモグロビン濃度のヒストグラムも形成され、低色素性及び血色素増加性集団が同定される。
実施例２
完全な血液２μｌのサンプルを290mOsmに調節した140mM塩化ナトリウムを含むpH7.4の10mMリン酸ナトリウム緩衝液５mlに希釈する。そのサンプルを、流体力学フォーカシングを用い、約50ミクロンの×50ミクロンの断面及び70ミクロンの長さの寸法の方形測定孔を含むフローセルを備えた血液分析機に吸引する。そのフローセルは、孔を横切る直流（DC）抵抗及び23MHzの周波数の高周波（RF）抵抗の測定を許容するように適切な電気回路要素に接続された、孔の各々の側面上にある２つの電極を含む。孔を通って流れる時に個々の細胞の像が記録されるように、イメージングシステムも孔に備え付けられる。典型的には99％超の赤血球を含む、血液の希釈サンプルを、血液サンプルの希釈率及び孔の容量により決定されるように、一度に本質的に１つの細胞を、測定孔を通して流す。第２の流体の流れでの細胞のサンプルを含む流体の流れの流体力学的フォーカシングは、約４倍の更なる希釈の原因となる。流れの速度は測定孔内で秒当り約５メーターにセットする。赤血球は、流れる間にそれらに与えられる流動力に応じて変形する。DC及びRF抵抗の測定結果は約32,000の細胞の各々について記録される。測定孔内での各々の細胞の形状の像がDC及びRF測定と一緒に得られる。その幅に対する長さの比により記述される各々の細胞の形状がその像から得られる。各々の細胞のヘモグロビン濃度は、本明細書に記載される分析により、不透過度測定及び形状測定から決定される。ヘモグロビン濃度の平均、並びに標準偏差の統計的基準及び集団の変化の係数は、個々のヘモグロビン濃度測定からコンピュータ処理される。集団のヘモグロビン濃度のヒストグラムも形成され、低色素性及び血色素増加性集団が同定される。
実施例３
完全な血液２μｌのサンプルを、290mOsmの、74mMのKCl、71mMのNaCl、100μｇ／dlの界面活性剤ｎ−ドデシル−ｎ，ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート（DDAPS）及び0.1％グルタルアルデヒドを含む7.0mMクエン酸ナトリウム緩衝液pH7.4の５mlに希釈する。その溶液への赤血球の希釈は、各々の細胞を等容量で球状化し、及び流れる間変形を防ぐために細胞の固定化を行う。そのサンプルを、流体力学フォーカシングを用い、約50ミクロンの直径×70ミクロンの長さの寸法の円柱状測定孔を含むフローセルを備えた血液分析機に吸引する。そのフローセルは、孔を横切る直流（DC）抵抗及び23MHzの周波数の高周波（RF）抵抗の測定を許容するように適切な電気回路要素に接続された、孔の各々の側面上にある２つの電極を含む。典型的には99％超の赤血球を含む、血液の希釈サンプルを、血液サンプルの希釈率及び孔の容量により決定されるように、一度に本質的に１つの細胞を、測定孔を通して流す。第２の流体の流れでの細胞のサンプルを含む流体の流れの流体力学的フォーカシングは、約４倍の更なる希釈の原因となる。DC及びRF抵抗の測定結果は約32,000の細胞の各々について記録される。各々の細胞のヘモグロビン濃度は、各々の細胞が測定の間、球形状を有するという知見のもと、本明細書に記載されるように不透過度測定から決定される。ヘモグロビン濃度の平均、並びに標準偏差の統計的基準及び集団の変化の係数は、個々のヘモグロビン濃度測定からコンピュータ処理される。集団のヘモグロビン濃度のヒストグラムも形成され、低色素性及び血色素増加性集団が同定される。
実施例４
完全な血液１μｌのサンプルを、290mOsmの、74mMのKCl、71mMのNaCl、100μｇ／dlの界面活性剤ｎ−ドデシル−ｎ，ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート（DDAPS）及び0.1％グルタルアルデヒドを含む7.0mMクエン酸ナトリウム緩衝液pH7.4の10mlに希釈する。その溶液の希釈は、各々の細胞を等容量で球状化し、及び流れる間変形を防ぐために細胞の固定化を行う。そのサンプルを、流体力学フォーカシングを用いず、約50ミクロンの直径×70ミクロンの長さの寸法の円柱状測定孔を含むフローセルを備えた血液分析機に吸引する。そのフローセルは、孔を横切る直流（DC）抵抗及び23MHzの周波数の高周波（RF）抵抗の測定を許容するように適切な電気回路要素に接続された、孔の各々の側面上にある２つの電極を含む。典型的には99％超の赤血球を含む、血液の希釈サンプルを、血液サンプルの希釈率及び孔の容量により決定されるように、一度に本質的に１つの細胞を、測定孔を通して流す。DC及びRF抵抗の測定結果は約32,000の細胞の各々について記録される。各々の細胞のヘモグロビン濃度は、各々の細胞が測定の間、球形状を有するという知見のもと、本明細書に記載されるように不透過度測定から決定される。ヘモグロビン濃度の平均、並びに標準偏差の統計的基準及び集団の変化の係数は、個々のヘモグロビン濃度測定からコンピュータ処理される。集団のヘモグロビン濃度のヒストグラムも形成され、低色素性及び血色素増加性集団が同定される。
本明細書において、詳説目的のため、本発明の詳細な記載がなされるが、本発明の要旨及び範囲から離れることなく、本明細書の詳細における多くのバリエーションが当業者により行われ得る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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