(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
上皮細胞増殖因子レセプターに対するモノクローナル抗体とスペーサーとからなる結合体であって、
前記スペーサーがポリカチオンであることを特徴とする結合体。
【請求項２】
前記ポリカチオンがポリリジンであることを特徴とする請求項１に記載の結合体。
【請求項３】
上皮細胞増殖因子レセプターに対するモノクローナル抗体と、ＤＮＡフラグメントとが、スペーサーを介して結合して形成している複合体であって、
前記スペーサーがポリカチオンであることを特徴とする複合体。
【請求項４】
前記ポリカチオンがポリリジンであることを特徴とする請求項３に記載の複合体。
【請求項５】
前記ＤＮＡフラグメントが遺伝子をコードしていることを特徴とする請求項３または４に記載の複合体。
【請求項６】
前記遺伝子が癌遺伝子または癌抑制遺伝子であることを特徴とする請求項３〜５のいずれかに記載の複合体。
【請求項７】
上皮細胞増殖因子レセプターに対するモノクローナル抗体と、ＤＮＡフラグメントとが、スペーサーを介して結合して形成している複合体を含み、前記ＤＮＡフラグメントを細胞に導入するためのＤＮＡデリバリーシステムであって、
前記スペーサーがポリカチオンであることを特徴とするＤＮＡデリバリーシステム。
【請求項８】
前記ポリカチオンがポリリジンであることを特徴とする請求項７に記載のＤＮＡデリバリーシステム。
【請求項９】
前記ＤＮＡフラグメントが遺伝子をコードしていることを特徴とする請求項７または８に記載のＤＮＡデリバリーシステム。
【請求項１０】
前記遺伝子が癌遺伝子または癌抑制遺伝子であることを特徴とする請求項９に記載のＤＮＡデリバリーシステム。
【請求項１１】
前記細胞が癌細胞であることを特徴とする請求項７〜１０のいずれかに記載のＤＮＡデリバリーシステム。
【請求項１２】
上皮細胞増殖因子レセプターに対するモノクローナル抗体と、ＤＮＡフラグメントとが、スペーサーを介して結合して形成している複合体を、前記上皮細胞増殖因子レセプターを発現する培養細胞に投与することにより、前記培養細胞に前記ＤＮＡフラグメントを導入するＤＮＡ導入法であって、
前記スペーサーがポリカチオンであることを特徴とするＤＮＡ導入法。
【請求項１３】
前記ポリカチオンがポリリジンであることを特徴とする請求項１２に記載のＤＮＡ導入法。
【請求項１４】
前記ＤＮＡフラグメントが遺伝子をコードすることを特徴とする請求項１２または１３に記載のＤＮＡ導入法。
【請求項１５】
前記遺伝子が癌遺伝子または癌抑制遺伝子であることを特徴とする請求項１４に記載のＤＮＡ導入法。
【請求項１６】
前記培養細胞が癌細胞であることを特徴とする請求項１２〜１５のいずれかに記載のＤＮＡ導入法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、上皮細胞増殖因子レセプターに対するモノクローナル抗体の結合体ならびにその複合体およびその細胞への嵌入方法に関するものであり、さらに詳細には、上皮細胞増殖因子レセプターに対するモノクローナル抗体と、スペーサーとからなる結合体またはそれと遺伝子との複合体および上皮細胞増殖因子レセプターを介したエンドサイトーシスを利用した新規なジーンデリバリーシステムに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）については、その生理学的役割が、歯の発育、胃、肺の発達などにおいて広範に研究されている。この研究の結果、その上皮細胞増殖因子レセプター（ＥＧＦＲ）が上皮細胞の表面に局在していることが判明した。
上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）は、特異的な細胞表面のレセプターと相互作用して、生体内および生体外において、種々の細胞の発育を刺激する。この研究の結果、その上皮細胞増殖因子レセプターが上皮細胞の表面に局在していることが判明した。
【０００３】
このレセプターは、内的タンパクチロシンキナーゼ活性をもつ１１８６個のアミノ酸からなる１７００００ダルトンの膜貫通グリコプロテインである。ＥＧＦレセプターの発現は、一般には増殖中の細胞に限定され、その発現は細胞が分化し、増殖を停止したときに終了する。またＥＧＦの発現は、増殖中の細胞が腺細胞に分化した後に起こる。
細胞ならびに組織のＥＧＦレセプターのレベルをラジオレセプターアッセイまたは免疫組織化学的染色法によって測定したところ、小細胞肺癌はＥＧＦ結合活性を持ってなく、腺癌は中程度のＥＧＦ結合活性であるが、通常の組織レベルに比べると明らかに上昇した活性を示すのに対して、偏平上皮癌は腺癌などを含む他の肺癌よりも実質的に高いＥＧＦ結合活性を示すことが判明している。この結果、ＥＧＦレセプターが高いレベルにあることは、肺偏平上皮癌ばかりでなく、腺癌の発達にも関与しているものと考えられる。
更に、ＥＧＦレセプターは、全ての癌細胞の細胞膜上に局在していて、ＥＧＦレセプターの数は腫瘍の中心部に向かうにつれて徐々に減少している。また、腫瘍の中心部の末梢細胞では、ＤＮＡ合成が盛んに行なわれていて、その細胞が急激に増殖している。従って、ＥＧＦレセプターの発現と悪性腫瘍細胞の生育とは直接的な因果関係があるといえる。
【０００４】
多くの腫瘍細胞は、ポリペプチド成長因子を産生し、放出しているが、しばしばこれらの因子に対する機能的レセプターをも保有している。かかる因子の１つとして、オートクリン成長因子であるＴＧＦ−αがあり、このＴＧＦ−αはＥＧＦに構造が類似している。またＥＧＦレセプターはＴＧＦ−αの機能的レセプターと推定されている。しかしながら、小細胞肺癌細胞はＥＧＦに拮抗するＴＧＦ−α様因子を産生も放出もしていないことが明白である。このように小細胞肺癌セルラインや新鮮な小細胞肺癌組織にしばしば見られるようなＥＧＦレセプターが欠如することは、いろんな種類の肺癌の中の小細胞肺癌に特徴的であって、特殊なマーカーとして使用することができるものと思われる。
【０００５】
一方、最近では、正確に標的を捕えることができる癌化学療法が強く要望されている。今日では、トランスフェリンレセプター、神経成長因子レセプターなどのレセプターばかりでなく、乳癌細胞、胸癌細胞、前立腺癌細胞など種々の癌細胞に対するモノクローナル抗体も、種々のタンパクトキシンに結合されるイムノトキシンとして使用されている。偏平上皮癌は上皮細胞増殖因子レセプターを過剰に産生し、ＥＧＦレセプターを過剰に産生する細胞の生体内での成長を促進し、また細胞表面のＥＧＦレセプターは抗体と結合して嵌入されることが知られているので、ＥＧＦレセプターは偏平上皮癌に対する療法のための優れた標的と考えられる。
【０００６】
ＥＧＦレセプターに対するモノクローナル抗体（以下、「抗ＥＧＦレセプターモノクローナル抗体」ともいう）は、主に、ＥＧＦレセプターを過剰産生する偏平上皮癌の細胞において過剰産生される低親和性のＥＧＦレセプターと免疫反応をする。
ＥＧＦレセプターに対するモノクローナル抗体を、６０Ｓリボゾーム不活化タンパクであるゲロニンに結合させたものが既に知られている（ＨｉｒｏｔａＮ．，  ｅｔ  ａｌ．；ＣＡＮＣＥＲ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ  ４９，７１０６−７１０９，Ｄｅｃ．１５，１９８９）。  このモノクローナル抗体−ゲロニン結合体は、ＥＧＦレセプターの数に比例して細胞表面に結合し、ＥＧＦレセプターに結合するために上記モノクローナル抗体を拮抗する。この結合体は、タンパク合成を阻害し、ＥＧＦレセプターを過剰産生する癌細胞を死滅させることができる。更に、この結合体は、通常のヒト繊維芽細胞に対して僅かに細胞毒性を示すが、ＥＧＦレセプターが欠失している小細胞肺癌細胞とマウス繊維芽細胞を死滅させることはない。これに対して、遊離のゲロニンおよびこれらの混合物では、ＥＧＦレセプターを過剰産生する細胞を死滅させることはなかった。これらの結果から、このモノクローナル抗体−ゲロニン結合体は、ＥＧＦレセプターを過剰産生する偏平上皮癌と対する標的療法に使用できることが示唆されている。
【０００７】
他方、上皮細胞増殖因子レセプターを認識するモノクローナル抗体と、偏平上皮癌に対する抗癌剤であるペプロマイシン（ＰＥＰ）とを結合させた結合体も知られている（Ｏｓａｋｕ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．；ＡＮＴＩＣＡＮＣＥＲ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ  １１：１９５１−１９５６（１９９１））。この結合体は、ＰＥＰ単独よりも低濃度で、ＥＧＦレセプターを過剰産生する偏平上皮癌のＡ４３１細胞を死滅させるとのが報告されている。また、この結合体は、ＥＧＦレセプターが偏平上皮癌における多くの症例で発見されることから、ＥＧＦレセプターを利用する処置において有用な武器となりうるであろうとも報告されている。
【０００８】
上述したように、抗ＥＧＦレセプターモノクローナル抗体との結合体が知られていて、ある程度の効果は期待されるけれども、癌という病気の多様性等を考慮すると、多様な抗癌剤や癌療法を開発することが強く望まれているのが現状である。
【０００９】
また、最近では、治療のために、外部の遺伝子を標的とする細胞中にデリバリーするシステムに強い関心が寄せられている。これらのジーンデリバリーシステムは主にレトロビールスやアデノビールスベクターを使用し、それらの感染力を介して行なわれている。
癌の遺伝子療法としては、潰瘍壊死因子（ＴＮＦ）遺伝子を潰瘍浸潤骨髄細胞中に導入して黒色腫の治療を行なった症例が知られている（Ｈｗｕ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．；Ｊ．Ｎｅｖｒｏ−ｓｕｒｇ．７９，１０４−１１０（１９９３））。この症例では、患者から単離した骨髄細胞をカルシウムーリン酸沈殿法ならびにエレクトロポレーションによってＤＮＡを用いて生体外で処理した後、患者の血液中に戻すことによって治療が行なわれた。しかしながら、この方法は、遺伝子を特定の標的細胞に直接導入するものではない。従って、遺伝子を特定の標的細胞に直接導入できるジーンデリバリーシステムが開発されれば、癌療法にとって極めて有用であろう。
【００１０】
【発明の解決しようとする課題】
したがって、本発明は、前述した課題を解決することを目的として、上皮細胞増殖因子レセプターに対するモノクローナル抗体と、スペーサーとが結合していることを特徴とする上皮細胞増殖因子レセプターに対するモノクローナル抗体の結合体を提供することを目的としている。
【００１１】
また、本発明は、上皮細胞増殖因子レセプターに対するモノクローナル抗体と、遺伝子とが、スペーサーを介しまたは介さずに結合して複合体を形成していることを特徴とする上皮細胞増殖因子レセプターに対するモノクローナル抗体の複合体を提供することを目的としている。
【００１２】
更に、本発明は、上皮細胞増殖因子レセプターに対するモノクローナル抗体の複合体を用いて、上皮細胞増殖因子レセプターを介して、エンドサイトーシスを利用した細胞中に導入する新規なジーンデリバリーシステムを提供することを目的としている。
【００１３】
加えて、本発明は、上皮細胞増殖因子レセプターに対するモノクローナル抗体の結合体または複合体を作製する結合体または複合体を作製する製法を提供することをも目的としている。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、前述した目的を達成するために、鋭意研究ならびに検討を重ねた結果、ＩｇＧクラス２に属するマウスモノクローナル抗体がＥＧＦレセプターのタンパク部分に特異的に結合することおよびこのモノクローナル抗体がＥＧＦレセプターを介して細胞中に嵌入する特殊なエンドサイトーシス機能を利用して、ＥＧＦレセプターを過剰産生する癌細胞を標的とするモノクローナル抗体の複合体を構築すると共に、この複合体を介してヒト細胞中に遺伝子となるタンパクを導入することを見出して、本発明を完成するに至った。
【００１５】
したがって、まず、本発明に使用することができる上皮細胞増殖因子レセプターに対するモノクローナル抗体としては、上皮細胞増殖因子レセプターを認識できるモノクローナル抗体であればいずれも使用することができる。
なお、多くの細胞には、リガンドに対する親和性に関して２つのクラスのＥＧＦレセプターがあると考えられる。現在のところ、これらのＥＧＦレセプターが異なる機能を有しているかどうかは明らかではないが、生理学的な条件ではこれら２つのＥＧＦレセプターが互いに互換的に作用していることは知られている。またＥＧＦが親和性の高いレセプターに結合することは細胞のマイトジェン応答に関連しているとの証拠もある。更に、高親和性レセプターについても、低親和性レセプターについても、その正確な組成もそれらを規制する機能も明らかではないが、本発明に使用するモノクローナル抗体は、特に低親和性クラスであるヒトＥＧＦレセプターのサブクラスと免疫反応するものであるが、何らこれに限定されるものではない。
なお、本明細書において単にモノクローナル抗体と称する場合は、特段の定めがないかぎり、本発明に使用することができる上皮細胞増殖因子レセプターに対するモノクローナル抗体を意味するものと理解すべきである。
【００１６】
本発明において、モノクローナル抗体は、まず、このモノクローナル抗体を他の物質に結合するためのスペーサーの役割を担うことができる物質（以下、単に「スペーサー」ということがある）と結合体が形成される。このモノクローナル抗体とスペーサーとは、ジスルフィド結合またはチオエーテル結合で結合するのが好ましい。従って、モノクローナル抗体は、スペーサーとの結合反応を円滑に進行させるために、例えば、Ｎ−サクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）などのジチオ基を有する化合物で修飾するのが好ましい。この目的のためには、モノクローナル抗体の性質や活性を損なうことなく、このモノクローナル抗体にジチオ基を付与することができる化合物であればいずれも使用することができる。
【００１７】
他方、かかるスペーサーとしては、例えば、モノクローナル抗体とジチオ結合ができると共に、モノクローナル抗体の複合体を形成する成分とも結合でき、かつ、この複合体が投与される生体に対して毒性を示したり、細胞への嵌入に悪影響を及ぼしたりしなければ、いずれの物質も使用することができる。かかる物質としては、特に、ポリリジンなどのアミノ酸、その他のポリカチオンなどが挙げられる。なお、これらのスペーサー自身がモノクローナル抗体とジチオ結合することができない場合には、スペーサーにジチオ基を付与することができる化合物、例えば、イミノチオランなどの硫黄含有物質で修飾して使用することもできる。
【００１８】
上記のようにして調製されたモノクローナル抗体と、スペーサー化合物とは、常法に従って反応させることによって、モノクローナル抗体の結合体を得ることができる。なお、この反応においては、残存する遊離のスルフヒドリル基を常法に従って保護するのが好ましい。
【００１９】
このようにして得られたモノクローナル抗体の結合体は、次いで、遺伝子と結合されて、モノクローナル抗体の複合体にされる。このモノクローナル抗体と遺伝子、つまりＤＮＡフラグメント、との結合は、例えば、親和性によるのが好ましい。例えば、モノクローナル抗体とポリリジンとの結合体に、ＤＮＡを加えて、適当な条件で保温することによって、所定のＤＮＡが結合されたモノクローナル抗体の複合体を得ることができる。
なお、モノクローナル抗体および／または遺伝子の種類によっては、つまり、モノクローナル抗体と遺伝子とがスペーサーを介在させることなく結合して複合体を作製することができる場合には、このモノクローナル抗体と遺伝子ＤＮＡとはかかるスペーサーを介さずに複合体を形成してもよい。
【００２０】
この発明によれば、この結合体によって細胞中に嵌入（エンドサイトーシス）できる遺伝子については、特に限定されるものではなく、使用目的に応じて、いずれの遺伝子をも本発明の複合体に結合して、所望の細胞に遺伝子を抗体として嵌入することができる。
【００２１】
従って、本発明の目的に最も沿うものの１つとして、本発明は、ＥＧＦレセプターを過剰に発現する偏平上皮癌細胞などの癌細胞に応用することができる。この種の癌細胞には、例えば、ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子を効率よく導入した後に、ガンシクロビルを投与すれば、癌細胞を選択的に死滅させることができる。
その他の癌細胞には、癌抑制遺伝子を導入することができる。かかる癌抑制遺伝子としては、例えば、ウイルムス腫瘍にはＷＴ−１、網膜芽細胞腫にはＲｂなどが挙げられる。
【００２２】
更には、癌遺伝子（オンコジン）が過剰発現しているものには、既に発明者らによって発表されたアンチセンス発現ベクターなどを導入して、抑制することもできる。
更にまた、本発明にかかる複合体ならびにエンドサイトーシスを適用することができるその他の癌としては、例えば、Ｂｅｃｋｗｉｔｈ−Ｗｉｅｄｅｍａｎｎ症候群（例えば、ヘパトプラストーマ、横紋筋肉腫、ウイルムス腫瘍など）、膀胱癌、Ｅｗｉｎｇ肉種などが挙げられる。
つまり、本発明は、当該遺伝子を結合させて癌細胞に導入して、所謂遺伝子の治療に応用することができる。
【００２３】
以下、本発明を実施例によって説明する。
実施例
ヒトＥＧＦレセプターに対するモノクローナル抗体
低アフィニテイー（親和）型ＥＧＦレセプターと免疫反応するＩｇＧ２型マウスモノクローナル抗体をハイブリドーマセルラインによって作製した（Ｂｅｈｚａｄｉａｎ  Ｍ．Ａ．ａｎｄ  Ｓｈｉｍｉｚｕ，Ｎ．：Ｃｅｌｌ  Ｓｔｒｕｃｔｕｅ  Ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ；１０，２１９−２３２（１９８５））。つまり、ヒト類表皮腫細胞で免疫したＢＡＬＢｃマウスの脾臓細胞をマウス骨髄腫細胞と融合した。細胞融合は、文献記載の方法（Ｏｉ，Ｖ．Ｔ．＆  Ｈｅｒｚｅｎｂｅｒｇ，Ｌ．Ａ．：  Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ｅｄｓ．Ｂ．Ｂ．ＭＩＳＨＥＬＬ  ａｎｄ  Ｓ．Ｍ．ＳＨＩＩＧＩ，  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｆｒｅｅｍａｎ，ｐｐ．３５１−３７２，１９８０）を改良して行なった。つまり、マウス脾臓細胞とマウス骨髄腫細胞とをダルベッコ改良イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ））で２度洗浄した後、５対１の割合で混合してペレットにした。このペレットを柔かくして、これに４５％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と５％ジメチルスルホキシドＤＭＥＭ溶液からなるＰＥＧ０．６ｍｌを室温で１分間掛けて滴下した。続いて、６ｍｌのＤＭＥＭを６−７分間掛けて徐々に添加した後、２０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ１０ｍｌを添加した。得られた細胞を７分間７００ｒｐｍで遠心分離をしてペレットにした後、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を含有するＨｙ培地に懸濁し、各穴に一滴（８０μｌ）づつ９６穴マイクロタイタープレートに分配した。次の日、ｍｌ当たり１−２ｘ１０５個のマウス腹膜細胞を含むＨＡＴ−Ｈｙ培地を１滴づつ各穴に添加した。７日目に、培地の半分を、ＨＴだけを含有する新鮮なＨｙ培地に入れ替えた。１２−１５日目に、８０μｌの培地を１７０個の生育しているコロニーから取り出して１２５Ｉ−プロテインＡ結合アッセイに使用した。次いで、Ｈｙ培地を追加して、３日後にＩ−プロテインＡ結合アッセイを繰り返した。この時点で、３６個のＩｇＧ産生コロニーを２４穴培養プレートに移した。これらのコロニーを培養した培地をＥＧＦ結合を阻害するかどうかのアッセイをした。このうちで阻害活性を示した２個のコロニーを限界希釈培養法でサブクローンした後、液体窒素中に凍結して保存した。
【００２４】
ＩｇＧの精製
上記のようにして凍結保存しておいたハイブリドーマサブクローンを１８％ＦＢＳを含有する多量のＨｙ培地でｍｌ当たり１ｘ１０６個の細胞密度になるまで生育させた。得られた細胞は、血清フリーのＤＭＥＭで洗浄した後、血清フリーのＨｙ培地にｍｌ当たり５ｘ１０６個の細胞密度になるように懸濁させてＣＯ２を含む培養器中に３０時間放置した。その細胞から得られたＩｇＧを常法の硫酸アンモニウム沈殿法ならびにＤＥＡＥセルロースカラムクロマトグラフィーによって精製した。
【００２５】
モノクローナル抗体の確認
このようにして得られた精製モノクローナル抗体は、二重免疫拡散法によるウサギの抗マウスＩｇＧ抗体との沈殿によってＩｇＧであることを確認した。このモノクローナル抗体は、ポリアクリルアミドゲル上でＭｒ＝１６０００の１本だけのタンパクバンドを示し、また還元剤を適用するとＭｒ＝５２０００と２４０００の２本のバンドに解離した。これらのプロフィールは、イムノグロブリンＧの分子構造と一致しており、得られたモノクローナル抗体が均質であることを確認した。
【００２６】
プラスミドの調製
ｐＳＶ２ＣＡＴプラスミドＤＮＡを大腸菌で生育し、単離した後、文献記載の方法で精製した（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ，Ｈ．Ｃ．＆  Ｄｏｌｙ，Ｊ：Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，７，１５１３−１５１８（１９７９））。この精製したプラスミドを１％アガロースゲルで電気泳動して細菌由来のＤＮＡが存在してないことを確認した。
【００２７】
モノクローナル抗体の修飾
ＥＤＴＡ（０．５ｍＭ）を含有する１００ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ８．０）に溶解したモノクローナル抗体（１ｍｇ／ｍｌ）を、１７倍モル過剰量のＮ−サクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）のエタノール溶液（１０ｍＭ）と混合した後、３７℃で３０分間培養した。この反応を、ＥＤＴＡ（０．５ｍＭ）を含む２００ｍＭのＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．９）で平衡にしたセファデックスＧ２５カラムを用いて４℃でゲルろ過することによって終了させた。得られたモノクローナル抗体を、文献記載の方法で測定したところ、抗体１分子当たり約３個のジチオピリジル基が導入されていることが判明した（Ｏｚａｗａ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ：Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，４３，１５２−１５７，（１９８９）；Ｌａｍｂｅｒｔ，Ｊ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６０，１２０３５−１２０４１（１９８５））。次いで、得られた反応生成物を、１０倍量のＨＢＳバッファー（ＨＥＰＥＳ２０ｍＭ（ｐＨ７．３）、ＮａＣ１１５０ｍＭ）で４℃で希釈し、限界ろ過をした後、メンブレンでろ過した。
【００２８】
ポリリジンの修飾
ポリリジン水溶液（１ｍｇ／ｍｌ）を、それぞれが６０ｍＭと１ｍＭの最終濃度になるようにトリエタノールアミン／ＨＣｌバッファー０．５Ｍ（ｐＨ８．０）とＥＤＴＡ０．１Ｍとを混合した。この混合物から脱気をし、０℃で窒素中に放置した後、０℃で窒素中において２−イミノチオラン（１ｍＭ）を用いて２時間処理した。過剰の試薬を除去した後、１／１０量の０．５ｍＭトリエタノールアミン／ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）を添加して、ポリリジンのｐＨを７．０に上げた。
【００２９】
修飾モノクローナル抗体と修飾ポリリジンとの結合体の調製
修飾モノクローナル抗体のＨＢＳバッファー溶液を等量（約５倍モル過剰量）の修飾ポリリジンと混合した。この混合物を４℃で２０時間窒素条件下で放置した。次いで、２ｍＭヨードアセタミドを添加して残存する遊離のスルフヒドリル基をブロックして、２５℃で更に１時間培養を続けた。
【００３０】
修飾モノクローナル抗体と修飾ポリリジンとの結合体の精製
得られた修飾モノクローナル抗体と修飾ポリリジンとの結合体を、モノＳ  ＨＲ５／Ｓカラム（ファルマシア社製）でのカチオン交換クロマトグラフィーによってＡバッファー８０％／Ｂバッファー２０％からＢバッファー１００％までの傾斜法によって単離した。ここでＡバッファーは５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．９）からなり、ＢバッファーはＡバッファーと３ＭＮａＣｌとの混合液からなっている。１．６５Ｍ２Ｍとの食塩の間で溶離することによって得られた生成物分画をＨＢＳで塩析した後、メンブレンでろ過することによって、使用した結合体に沈殿物が何ら含まれていないことを確認した。
【００３１】
結合体／ＤＮＡ複合体の調製およびＤＮＡデリバリーのためのアッセイ
上記において修飾モノクローナル抗体と修飾ポリリジンとの結合体とＤＮＡとの複合体は、文献記載の方法に従って作製した（Ｃｕｒｉｅｌ，Ｄ．Ｔ．，ｅｔ  ａｌ：Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，３，１４７−１５４（１９９２））。つまり、上記結合体とｐＳＶ２ＣＡＴプラスミドＤＮＡとを室温で３０分間培養した後、得られた複合体を１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ中で３７℃で５％ＣＯ２の存在下で生育させたＮＡ細胞を５ｘ１０５個含む組織培養皿に入れた。この細胞を３７℃で２４時間培養して、１０％ＦＣＳ／ＤＭＥＭで洗浄した後、６０時間放置した。図１に示すように、得られた複合体は、アガロース電気泳動により、ＤＮＡ自体とは別個の泳動パターンを示していることが分かる。得られたＤＮＡ／結合体の複合体は、ＤＮＡ濃度に比例して作製された。
【００３２】
レポータージーン発現を評価するために、細胞ライゼート（溶菌液）を文献記載の方法で作製し（Ｗｕ，Ｇ．Ｙ．ｅｔ  ａｌ：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６２，４４２９−４４３２（１９８７））、そのクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）活性を測定するために文献記載の方法でアッセイした（Ｇｏｒｍａｎ，Ｃ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ：Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，２，１０４４−１０５１（１９８２））。つまり、細胞抽出物を、［１４Ｃ］クロラムフェニコールを４ｍＭアセチルコエンザイムＡ添加の０．２５Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）に溶解して、３７℃で６０分間培養した。その薄層クロマトグラフィープレートをイメージングプレートを用いて室温で２時間オートラジオグラフに掛けて分析した。
そのＣＡＴ活性測定の結果、この複合体で処理されたＮＡ細胞では、著しいＣＡＴ活性が発現したのに対して、ＤＮＡのみおよび抗体と、ポリリジンと、ＤＮＡとの混合物で処理したＮＡ細胞にはかかる活性は発現していなかった（図３）。また、このＣＡＴ活性は、図４に示すように、トランスフェクションのために２倍のＤＮＡを複合させた結合体を使用したときに増加した。
つまり、ＣＡＴジーンＤＮＡは、ＥＧＦレセプターを介してモノクローナル抗体によって細胞中に導入されて、トランスフェクションされた細胞中で発現した。
【００３３】
結合アッセイおよび競合阻害アッセイ
モノクローナル抗体を、ヨードビーズを用いて１２５Ｉで標識した。得られた結合体を文献記載の方法でアッセイした（Ｓｈｉｍｉｚｕ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７，３６００−３６０４（１９８０））。２４穴プラスチック皿で密集細胞培養された細胞を、氷上で冷却しながら、氷冷ＥＢＳＳ１ｍｌで２度洗浄した後、１２５Ｉ（約３００００ｃｐｍ）で標識したモノクローナル抗体と共に、標識していないモノクローナル抗体、モノクローナル抗体とポリリジンとの結合体、ならびにモノクローナル抗体−ポリリジン結合体／ＤＮＡ複合体を種々の濃度にＥＢＳＳバッファー１ｍｌに溶解した溶液で２時間処理した。次いで、細胞をＥＢＳＳ１ｍｌで２度洗浄して、１ＮＮａＯＨ中に可溶化した。細胞の放射能強度をガンマコウンターで測定した。
得られたモノクローナル抗体−ポリリジン結合体／ＤＮＡ複合体は、１２５Ｉ−モノクローナル抗体の細胞への結合を阻害するから、ＥＧＦレセプターに結合していることは明白である（図２）。
【００３４】
【発明の効果】
本発明に係る結合体および複合体は、その成分であるモノクローナル抗体として、ＥＧＦレセプターに対して特異的であって、種々の型の細胞のうちでも、ＥＧＦレセプターを過剰に産生する細胞だけを標的として認識することができる。
また本発明に係る結合体に使用されているポリリジンなどの
は、アフィニテイーによる結合によってその成分である遺伝子を複合体に導入することができるので、本発明に係る方法を応用すれば、いかなる遺伝子をも細胞中に導入することができ、極めて有用なものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、モノクローナル抗体−ポリリジン／ＤＮＡ複合体のアガロースゲル電気泳動のパターンを示す泳動図
モノクローナル抗体−ポリリジンの結合体（０．２μｇ）を、ｐＳＶ２ＣＡＴプラスミドＤＮＡ（０．２、１または２μｇ）と混合して、アガロースゲルを用いて電気泳動を行なった。ＤＮＡの存在はＵＶ発色下でエチジウムブロマイドで可視することができた。ＤＮＡマーカーはＢｓｔＰＩで消化されたλＤＮＡである。
【図２】図２は、モノクローナル抗体−ポリリジン／ＤＮＡ複合体による１２５Ｉ−モノクローナル抗体結合の競合阻害を示すグラフ。
１２５Ｉ−モノクローナル抗体のＡ５４９細胞への結合は、モノクローナル抗体−ポリリジン結合体またはそのＤＮＡ複合体の量を増加しながら測定した。
【図３】図３は、モノクローナル抗体−ポリリジン／ＤＮＡ複合体によるＣＡＴジーントランスフェクションを示す図であって、複合体形成によるＣＡＴジーンの導入を示している。
ＮＡ細胞を、ＤＮＡだけ、モノクローナル抗体と、ポリリジンと、ＤＮＡとの混合物、およびモノクローナル抗体−ポリリジン／ＤＮＡ複合体と共に、培養した。ＣＡＴ活性は、３−ＡｃＣＭの産生として検出した。
【図４】図４は、モノクローナル抗体−ポリリジン／ＤＮＡ複合体によるＣＡＴジーントランスフェクションを示す図であって、用量依存性発現を示している。
ＮＡ細胞を、モノクローナル抗体−ポリリジン結合体（１０μｇ）と、
ｐＳＶ２ＣＡＴプラスミドＤＮＡ（１０または２０μｇ）との複合体で処理した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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