(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体媒体中で、前記液体媒体中でそれぞれ遊離状態にある複数の異なる核酸配位子を同時にハイブリダイズするための方法であって、前記配位子は、前記液体媒体中で遊離状態にある同じ成分またはいくつかの成分に属し、
ａ）相互に分離した複数の固定化部位を配置している、複数のハイブリダイゼーション用の同じ支持体を準備する工程；
ｂ）前記支持体を温度調節し、少なくとも前記支持体の一つの参照方向で、前記固定化部位にそれぞれ異なる局所温度値を有させる工程；
ｃ）核酸配位子とそれぞれ特異的にハイブリダイズ可能な複数の異なる核酸対配位子を準備する工程；
ｄ）前記各対配位子について、対応する配位子／対配位子複合体が安定化する最適温度値を測定する工程；
ｅ）前記異なる固定化部位に前記対配位子を配置して固定化し、前記配位子／対配位子複合体の安定性が直接的または間接的に依存する外因性パラメーターとして、前記最適温度値に前記局所温度値を合わせる工程；
ｆ）前記液体媒体を、複数の前記対配位子を固定化させた前記支持体と接触させる工程；
ｇ）前記固定化対配位子と対応する液体媒体中の配位子との間で形成される複数の異なる複合体の存在及び／または量を感知する工程
を含む方法。
【請求項２】
（ｆ）に記載の接触工程が、全ての固定化部位に同じ最小温度値を適用することによって実施され、前記最小温度値は、全ての配位子を対配位子と実際にハイブリダイズさせるのに十分なものであり、次いでそれぞれ異なる所定の局所温度値を異なる固定化部位に適用することにより支持体を洗浄する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（ｆ）に記載の接触工程が、それぞれ異なる所定の第一の局所温度値を異なる固定化部位に適用することにより実施され、次いでそれぞれ異なる第二の局所温度値を異なる固定化部位で維持することにより支持体を洗浄し、第一の値は前記局所温度のそれぞれの第二の値と同一または異なる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
（ｆ）に記載の接触工程が、それぞれ異なる所定の局所温度値を異なる固定化部位に適用することにより実施され、相対的に冷たい一定温度で洗浄液でハイブリダイズした支持体を洗浄する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
局所温度値の空間的勾配を、前記支持体の少なくとも一つの参照方向で支持体に確立する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
液体媒体の成分のラベリング、及び支持体に固定化された異なる配位子／対配位子複合体のラベリングの少なくとも一つを使用して、異なる配位子／対配位子複合体を感知する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
分析される一つ以上の異なる構成要素を含む試料から液体媒体が得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
試料が生物学的試料である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
一つ以上の異なる構成要素のそれぞれに等しいか、前記構成要素のそれぞれから直接由来し、前記一つ以上の構成要素を表す、液体媒体中の一つ以上の成分を得るために、試料が少なくとも一つの予備試料操作に供される、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
異なる配位子が固定化されている支持体を少なくとも一つのその後の操作に供し、結合していない成分を前記支持体から分離し、及び／または異なるリガンドを段階的にまたは別の態様で溶出または放出する請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
液体媒体が、それぞれ異なる核酸配位子を含むいくつかの異なる成分を含み、それによって前記異なる成分がハイブリダイズし、支持体上で互いに分離されている、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記異なる成分の同定、定量、分離、及び分画化からなる群から選択される少なくとも一つの応用で実施される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
液体媒体が液体媒体中に単一の成分を含み、前記単一の成分がそれぞれ異なるいくつかの核酸配位子を含みまたは示し、それによって単一の成分が異なる対配位子とそれぞれハイブリダイズする、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
単一の成分が核酸であり、対配位子のプローブヌクレオチド配列に対してそれぞれ相補的である目標のヌクレオチド配列に従って、少なくとも一つの鎖の一連のヌクレオチドが、複数のハイブリダイゼーション領域、それ故複数の配位子を決定する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
液体媒体の核酸成分のハイブリダイゼーションによる配列決定、核酸成分の再配列決定、核酸材料または試料の分析及び同定、並びに核酸材料の分類からなる群から選択される少なくとも一つの応用で実施される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
一種の同一のフラグメントまたは数種の異なる核酸フラグメントを含む核酸試料から、液体媒体が得られる、請求項７に記載の方法。
【請求項１７】
変性、クローン化及び増幅からなる群から選択される少なくとも一つの予備操作に、核酸試料が供される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
温度調節をした後に液体媒体を前記支持体と接触させる、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
液体媒体中で、前記液体媒体中でそれぞれ遊離状態にある複数の異なる核酸配位子を同時にハイブリダイズするための装置であって、前記配位子は、前記液体媒体中で遊離状態にある同じ成分またはいくつかの成分に属し、
ａ）相互に分離した複数の固定化部位を配置している、複数のハイブリダイゼーション用の同じ支持体；
ｂ）少なくとも前記支持体の一つの参照方向で、前記固定化部位にそれぞれ異なる局所温度値を作動条件において有させる前記支持体のための温度調節手段；
ｃ）核酸配位子とそれぞれ特異的にハイブリダイズ可能な複数の異なる核酸対配位子であって、前記対配位子は、前記異なる固定化部位に配置されて固定化されており、対応する配位子／対配位子複合体が安定である異なる最適温度値と、前記固定化部位における異なる局所温度値を作動条件において実質的に合わせるための、複数の異なる核酸対配位子；
ｄ）前記液体媒体を前記支持体と接触させるための手段；
ｅ）前記固定化対配位子と対応する接触液体媒体中の配位子との間で形成される異なる複合体の検出のための手段
を含む装置。
【発明の詳細な説明】
この発明は、一般に、一種または多種の成分を含む液体媒体の複合化により前記液体媒体中の遊離状態の複数または多様な種々の配位子の存在を決定する処理に関する。
この説明及び特許請求範囲において、次の定義が採用される。
「配位子」は、一つまたは複数の非共有結合によって「対配位子」と呼ばれる他の構成要素または分子に特異な様式で結合できる化学的、生化学的または生物学的性質のある構成要素または分子を意味すると定義する。
この定義から特に含まれるものに、相互に及び相補的様式で複合体を形成できる異なる生物学的または生化学的構成要素、特にバイオポリマーがある。
−それらは、例えば、それらはポリペプチド、特にエピトープまたは抗原（対配位子）に特種な様式で結合できる抗体（配位子）といったポリペプチド、またはその反対の、ポリペプチドであり、
−またはそれらには、以下の説明に例示されるように、一重鎖形でオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドに相補的様式で結合できるある核酸または核構成材が含まれる。
配位子が対配位子と結合または一対化、即ち複合体の形成を行う化学的特質の反応または平衡を、以後「複合化」（complexing）用語で呼ぶことにする。この反応または平衡の生成物を、以後「複合体」（complex）の用語で呼ぶことにする。核構成材料またはマクロ分子の場合には、この複合体を以後「複式体」（duplex）の用語で呼ぶことにする。
「核構成材料」または「核酸」は、改質等が行われているヌクレオチドの少なくとも一つの非分枝で線形の鎖を含むあるマクロ分子を意味すると理解される。この定義に含まれるものに、明らかに、デオキシリボ核酸、その修正体、その他、及びリボ核酸、その修正体、その他が挙げられる。このようなマクロ分子は一重鎖または二重鎖でもよいし、他のある第二次または第三次の分子構造を有していてもよい。実際には以後の説明及び実例においては、この核構成材料は配位子を含有し、直接この処理を受けるものかまたはそこから液体媒体が得られるものであり、次にこの発明に従い処理される。
「オリゴヌクレオチド」は、天然の核酸またはその構成成分、即ち糖、窒素質塩基または燐酸基の少なくとも一つが改質された核酸から成る少なくとも５個のモノマー、好ましくは少なくとも７個、例えば８個のモノマーを含有するポリヌクレオチドを意味する。
「支持体」は、直接または間接に、共有結合的及び非共有結合的にその表面に対配位子が永久的に固定化または付着されたある基板を意味する。
基板は、例えば不活性で透明の材質のシートのような自己支持性か、例えばガラススライド上のアクリルアミドの層のような剛性なベースでそれ自体が支持されている。
「表面」は、固体基板であれ、見かけ表面より真の表面が大きい多孔性基板であれ、対配位子に接近可能の基板の表面を意味すると理解される。以後の説明及び実例では、オリゴヌクレオチドは上記定義の対配位子を構成している。
一方の核構成材料または核酸と他方の相補的オリゴヌクレオチドとの間の複合化反応を、以後は「混成（hybiridization）」の用語で呼ぶ。
文書、ＷＯ−９２／１０５５８及びＷＯ−９３２２６８０、並びにいわゆる「可逆的ドットブロット」生物検定様式によれば、一またはそれ以上の核酸成分を含む核酸試料の場合に液体媒体の複合化、即ち混成によりこの液体媒体中の遊離状態の複数の異なる核酸の断片、分節または連鎖（配位子）の存在を決定する処理方法とその装置が記載されている。この処理では。主に、文書（６）と（７）に開示された周知の原理と方法による混成による核酸試料の順序付けに適用される。
この方法によれば、
ａ）核酸フラグメントに相補的なヌクレオチド配列とそれぞれに複合化が可能であり、それぞれが異なる複数のオリゴヌクレオチド（対配位子）がその中に固定化され、相互に分離した複数の離散型カップリングサイトまたはゾーンがその表面に分布した多複合化用のバイオチップ型の支持体を用意する。
ｂ）一つのカップリング位置から他の位置にかけて、等温条件下で、液体媒体、即ち核酸試料とこの複合化支持体とを接触させ、それにより遊離ヌクレオチド配列は固定されたオリゴヌクレオチドとそれぞれ一対となり、結果としてこの複数複合化の支持体に付着する。
ｃ）元の液体媒体中の異なるヌクレオチド配列の存在及び／または量を表現する信号及び／または情報を発生するように、得られた異なる複合体即ち混成体の存在及び／または量を表現するパラメーターを多複合化支持体の異なるカップリングサイトで観察する。好ましくは、これら複合体は、核酸試料の成分の標識化、または形成し、支持体に付着した異なる混成体の標識化を利用して観察される。
上記のように、このプロセスは完全に等温条件下で行われる。即ち、液体媒体を多複合化支持体に接触させる時及び／または混成の後のこの支持体を洗浄する時に一つのカップリングサイトから他のサイトにかけて同じ混成温度を設けて行う。
文書、ＥＰ−０，５３５，２４２によれば、同様な方法が記載され、同じく等温条件下で操作することが提案されている。これによれば、各カップリングサイトにおけるこのサイトに特定のオリゴヌクレオチドの濃度は作用温度の関数として選択され、相補的なヌクレオチド配列により得られた対応する複合体の安定性を促進する。
この文書によれば、この濃度は、その温度が変動する洗浄液体により実施され、熱勾配洗浄と不正確に称している洗浄段階の間に、各カップリングサイトで溶出した相補的なヌクレオチド配列のパーセンテージを観察することで選択される。
上記の解決法は文書、ＷＯ−９２／１０５８８で確認された技術的困難を免れず、これはまだ解決していない。実際、先決した混成温度とオリゴヌクレオチド（対配位子）の配列の所定の長さでは、核酸プローブのそのターゲットの相補的配列との混成で得られる複合体の安定性はこの配列によって変動する。つまり、相互にヌクレオチドの一つのみ異なる、即ちある場合はＴで他の場合はＧ、二つのオリゴヌクレオチドは、同じ長さで類似配列であるのに、同じ安定性ではそれぞれの相補的核酸を混成を行わない。換言すれば、得られる複合体の安定性は温度に依存するので、形成が可能の複合体の最低の安定に充分な冷温度で、核酸試料は多複合化支持体に担持したオリゴヌクレオチドプローブと混成すべきであり、そうでないと混成後に虚偽のネガティブ、即ちオリゴヌクレオチドプローブがその相補的配列が試料中に存在するのに混成信号を発生しない、が得られることになる。しかし、この手法で工程を遂行することで、オリゴヌクレオチドプローブ完全には相補的でない配列と充分に安定な複合体を形成する場合がある。このような場合には、虚偽のポジティブ、即ちオリゴヌクレオチドプローブがその相補的配列が核酸試料中に存在しないのに混成信号を発生する、が得られることになる。
その結果、これら虚偽のネガティブおよび虚偽のポジティブは核酸試料の分析、特に混成になる配列化のための分析に誤差を導入するので、上記した技術的解決法を度々利用できなくする。
従って、この発明の目的は上記のような複合化による処理、特に混成における信頼性を向上させることである。
この発明の出発点は、各配位子／対配位子複合体の安定性または信頼性が、以後参照パラメーターと呼称し、多複合化支持体の条件を設定する少なくとも一つの外因性パラメーターに直接的または間接的に依存することの観察である。
「外因性パラメーター」は、配位子及び／または対配位子に対して非本質的な、即ちそれらからは独立したパラメーターまたは条件を意味すると理解される。
多複合化支持体を条件設定するかまたは条件設定ができるそのような外因性の参照パラメーターは例えば、
−温度のような支持体に応用できる物性パラメーターまたは条件、
−実質的に全ての対配位子と一対化が可能の抗−対配位子の表面積のような前記支持体の表面に存在するまたはその表面で利用可能な化学的、生化学的または生物学的パラメーターまたは条件、
−選択的には、液体媒体に対するその湿潤性または表面張力のような支持体の表面に確立した物理化学的パラメーター。
更なる例として、核酸タイプの配位子及びオリゴヌクレオチドタイプの対配位子の場合における外因性パラメーターは、核酸及び／またはオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列には帰属せず、例えば基本的な窒素質核酸塩基のどれか一つにおいてそれぞれの存在頻度に差異があるパラメーターまたは特性を意味すると理解される。
この発明は次に、以下の二つの特性を組み合わせることで特色が現れる。
−一方では、全ての支持体において、例えばその全表面で、結合部位は外因性参照パラメーターの関数として区別され、そのパラメーターは異なる結合部位においてはそれぞれ異なる値を有す。
−特に異なる配位子／対配位子複合体の安定性を決定する外因性参照パラメーターの先決した最適値の関数として、対配位子はそれぞれ異なる結合部位の間に分布している。
従ってこの発明によれば、対応する対配位子が固定化された多複合化の支持体上の各結合部位は、対応する配位子／対配位子複合体の安定性に関する外因性参照パラメーターの最適値で機能し、この最適値が少なくとも一つの直接に隣接する結合部位の最適値とは相違させることが可能である。
この発明の利点により、複数複合化の特に信頼性が高く、正確であり、敏感である様式が達成され、これは解像度も優れている。
「カップリング」は支持体の表面に対配位子を永久に固定化できる共有結合またはその他のいずれかの結合を意味する。
この発明は、例えば直接複合化または競合複合化による異なる生物検定形式に従って実行される。
この発明は、任意に「サンドイッチ」形式により実行される。この形式によれば配位子は固定された対配位子及び液体媒体中の遊離状態にある試料と一対化が可能である。
好ましい実施例の方法によれば、三つの異なる実用性のある様式が選択される。
−第一の様式によれば、外因性参照パラメーターの同一の最小値を適用して液体媒体を複合化支持体に接触させる。この最小値は実質的には全ての配位子と対配位子を複合化するのに十分な値である。次に支持体を、異なる結合部位にそれぞれ異なり先決しておいた外因性参照パラメーター値を適用することで洗浄する。これをこの洗浄段階の間、適用する。
−第二の様式相によれば、支持体と液体媒体との同じ接触を、異なる結合部位にそれぞれ異なり先決しておいた第一の外因性参照パラメーター値を適用することで遂行する。次に支持体を、外因性参照パラメーターのそれぞれ異なる第二の先決した値に異なる結合部位に維持して洗浄する。第一の値は、それぞれ外因性参照パラメーターの第二の値と同一または異なる。
−第三の様式によれば、支持体を、異なる結合部位にそれぞれ異なり先決しておいた外因性参照パラメーター値を適用することで液体媒体と接触させる。これを単一複合化または混成の間に適用する。混成された支持体を次に比較的冷たい一定の温度で洗浄液体により洗浄する。
いわゆる均質型検出様式では、当然のことながら洗浄は本質的なものではない。
上記定義の第一の様式は、各結合部位において、対配位子の量または濃度は、一方では考慮する配位子に実際に相補的である全ての配位子と、他方では同時にまたは寄生的にこの対配位子と一対となり得る全ての配位子と複合体を形成するに十分であることを仮定している。
好ましくは、特に平坦姿勢の多複合化支持体には、支持体の少なくとも一基準方向、例えば長方形支持体の場合のその幅に、外因性参照パラメーターの勾配のような空間階調が確立されている。次いでこの空間階調は、異なる結合部位間にそれぞれ対配位子を分布して、異なる結合部位の位置と配置を固定する。
この発明の変形または付加項目として、多複合化支持体上の結合部位は、このカップリング位置において異なる値を持つ他の一つの外因性参照パラメーターの関数として区別され、加えて対配位子は、配位子／対配位子複合体の安定性もまたそれぞれ決定する他の外因性参照パラメーターの予め定められた最適値の関数としてこのカップリング位置間に分布される。
好ましくは、異なる配位子／対配位子複合体類の安定性がそれに依存する他の一つの外因性パラメーターは、異なる配位子／対配位子複合体類の安定性にそれぞれ要求される前記の他のパラメーターの値の平均値に設定される。実例では、この他の外因性パラメーターは、多複合化支持体と接触される液体媒体のｐＨまたはイオン強度であり、このパラメーターは混成バッファーの組成で決まる。
その異なる結合部位に関して、この発明により設計され条件設定される多複合化支持体は、配位子の検出及び／または定量化に好ましく使用される。
この目的のために幾つかの様式が考えられる。
−異なる配位子／対配位子複合体類の存在及び／または量を表す変数を、特に異なる結合部位で走査することで観察し、元の液体媒体中の異なる配位子の存在及び／または量を表す信号及び／または情報を取得する。
−好ましくは、異なる配位子／対配位子複合体は、それ自体は周知である次の操作の少なくともいずれか一つを用いて観察する。即ち、液体媒体の成分の標識化及び支持体に付着した異なる配位子／対配位子複合体の標識化。
一般的には、支持体に接触させる液体媒体は一種または複数種の異なる構成要素を含有し、生物学的試料または試材等の試料から得られ、分析されが、これは二つの様式に従う。
−試料を上記方法に従い、直接に処理、特に多複合化支持体と直接に接触させる。
−または試料が、それぞれ異なる構成要素に同一またはそれから直接誘導され、構成要素の代表物である、処理された液体媒体中の一種または多種の成分を得るために選択された少なくとも一つの予備的操作を受ける。
更に一般的には、異なる配位子が付着する複合化支持体を任意に、この支持体から複合化されなかった成分または不安定な形態で対配位子と複合化した成分を分離するために及び／または異なる配位子を差動的にまたは他の方法で溶出または放出ために選択した洗浄等の少なくとも一つの継続操作を受ける。
この発明の応用の好ましいが独占的ではない分野は、核酸生成物または化合物の処理と分析に関するもの。この場合、配位子は、特に一重鎖形にある遊離ターゲットヌクレオチド配列から成る核酸であり、この核酸は、対応する対配位子から成り、他の固定または付着された相補的プローブヌクレオチド配列と混成が容易である。
更に好ましくは、核構成材料としての液体媒体は、それぞれ異なる数種の配位子、即ち混成用の数種の領域またはセグメントを含むかまたは表現する単一成分、即ち一つの核酸から成り、それによりこの同一成分は異なる対配位子、即ちオリゴヌクレオチドとそれぞれに一対化する。従ってこの場合は、少なくとも一つの核酸鎖のヌクレオチドの連続が、対配位子のプローブヌクレオチド配列に対してそれぞれ相補的であるターゲットヌクレオチド配列に従って、複数の混成領域、それ故に複数の配位子を決定する。
ヌクレオチドまたは核酸の生成物並びに化合物に応用されるこの発明による処理は、例えば次の応用の少なくともいずれかの一つ、即ち液体媒体の核酸成分の混成による配列化、この核酸成分の再配列化、核構成材料のマッピング、核構成材料または試料の分析と同定、核構成材料の分類、核構成材料のスクリーニング、遺伝子分析（例えば、参考文献８を参照）、バクテリアまたはウイルス病原性剤の検出に使用される。
この発明の応用の一つは、混成、特に核酸材料の重なり配列の決定による核酸材料の順序付けである。この順序付けの原理及びその様式は刊行物（６）と（７）に記載されており、この説明の必要の箇所にはその内容が参照として組み込まれている。核構成材料のヌクレオチド配列を再構築するためにこのようにして得られた情報の分析と処理については、刊行文献（９）と（１０）に記載されている。
この発明の他の応用は、配列の強制的再構築を行わずに混成プロフィルを決定することで微生物または微生物に関連する遺伝子を同定することである。
これらの全ての応用のために、液体媒体は一つの同じ核酸フラグメントまたは数種の異なる核酸フラグメントを含む核酸試料から得られる。この核酸試料に、次ぎの操作から選択した少なくとも一つの予備的操作を任意に実施してもよい。即ち、変性、溶解、フラグメンテーション、クローン化及び増幅。
この発明による処理の二つの異なるケースを念頭に入れておくべきである。
−第一のケースでは、液体媒体それぞれ異なる配位子から成る数種の異なる成分を含む。そこでは、この異なる成分は付着し、相互に分離しており、言わば多複合化支持体上で分解される。この様式は次の応用の少なくとも一つで遂行される。即ち、この異なる成分の同定、定量化、分離及び分別。
−他方のケースでは、液体媒体は、それ自体がそれぞれ異なる配位子から成るまたは表現する単一成分を含む。そこで、この成分は異なる配位子類とそれぞれに一対となる。
この発明による処理のための装置は以下から成る。
−その上に例えばマトリクス状に相互に分離した複数のカップリンサイトが配置または分布している多複合化支持体。カップリンサイトにはそれぞれ異なり、前記配位子とそれぞれ複合化が可能の複数の対配位子が固定化されている。
−前記配位子と前記対配位子とをそれぞれ一対とし、前記支持体にそれらを付着させるように設計された液体媒体を支持体に接触させる手段。
この装置は、一方では外因性参照パラメーターの関数として、前記サイトにおいてそれぞれ異なる前記パラメーターの値によって支持体上のカップリンサイトを区別する手段を更に含み、他方では支持体上の対配位子が、外因性参照パラメーターの予め定められた最適値の関数として異なる配位子／対配位子複合体の安定性をそれぞれ決定する異なるカップリンサイトの間に分布していることを特徴にする。
独占的ではないが好ましくは、選択される外因性参照パラメーターは温度であり、区別手段は少なくとも一つ基準方向に従って温度に温度勾配のような階調が生じるように設計されている。この場合好ましくは、装置は冷源と熱源を含み、その間を前記支持体が基準方向に伸びている。
一例として、このような装置は、それぞれ支持体の異なるカップリン位置と連結し、各カップリンサイトでの配位子／対配位子複合体の存在及び／または量を表す少なくとも一つの観察された変数を検出し、一または複数の測定信号または対応する情報を伝達する一または複数のセンサーを含む。
一例として、この装置は、例えばＣＤＤカメラのようなそれ自体多重の基本センサー類から成る単一センサー、または多複合化支持体の表面を走査する単一センサーを含む。
例えば、核構成材料の分析または順序付けには、この同じ装置は、前に定めておいた数学的及び／または論理的操作に基ずいて、異なるセンサー類により伝達された信号を処理し、液体媒体中の成分を特定する情報を得るユニットを含むまたはそれに連結している。
一例として、配位子／対配位子複合体の存在及び／または量を表す観察された変数は、発光または再発光（例えば、蛍光または冷光）の吸光度または強度、イオン化照射の強度、または光回析、核磁気共鳴、接触角変化、電気伝導率、ボルタンメトリー、電流測定、インピーダンス測定のような異なる配位子／対配位子複合体の他の物理的、光学的、電気的即ち誘電的または電気化学的の特性である。
実施態様の例として、多複合化支持体は次の不活性材質の一つから成る。ガラス、ガラス質材料、多孔性の無機または非晶質材料及びプラスチック材。
バイオチップが使用される時は、支持体と結合部位は伝統的の光リソグラフィ技術により得られる（刊行書Ｎｏ１１を参照）。
実例としてこの発明を、以下に詳細に記す実験プロトコールに従いまた添付した図を参照して、核酸または核酸材料の処理に関して述べる。
−図の１ａから１ｄは、ｘ−軸上に簡略に記した同定されたオリゴヌクレオチド及び核酸フラグメントための、それぞれ４℃、１０℃、２０℃及び２５℃における等温混成の結果を表す。観察された変数、即ち得られた異なる複合体の蛍光により再放射された光の相対値がｙ−軸にプロットされている。中実棒は完全な一対化を表し、オープン棒は外部不整合を表す。
−図２は、この発明による処理用の装置の断面を図示している。
−図３は図２に示した装置の上面図を図示している。
−図４は図２と３に示した装置の処理キャビティの拡大スケールの図を表す。
−図５は図２と３に示した装置の、手段としての処理及び測定キャビティに限定した上面図を図示している。
−図６は、この図の右に並べた記号説明で同定された異なる核酸フラグメント／オリゴヌクレオチド複合体の温度の関数とした観察した変数（蛍光）の変化を示す。
−図７は、図２と３による、更に特には図４に示した装置のキャビティに適合する多複合化支持板のための、選択したオリゴヌクレオチドの関数として、この板の幅または高さだけでなく長さに沿った結合部位の配置を表す。
−図の１ａから１ｄに類似した様式で、図８は、ｘ−軸上の同定された核酸フラグメントとオリゴヌクレオチド及びこの発明による多複合化支持体から得られた混成を、前記各図と同じ規則で、表したものである。
実験プロトコール
実験プロトコールは以下の計画による。
Ｉ−この発明の基礎を成す問題点の論証
１．１  オリゴヌクレオチド（対配位子）の選択
１．２  オリゴヌクレオチドの合成
１．３  オリゴヌクレオチドをグラフト化する方法
１．４  混成と複合体の蛍光の視覚化
１．５  等温での混成の結果
II−熱勾配に基ずいてそのカップリング位置が区別された多複合化支持体の助力による問題点の解決
２．１  熱勾配の応用を可能とするこの発明による装置の説明
２．２  それらの予め定められた最適混成温度におけるオリゴヌクレオチドの位置決め
２．３  発明による熱勾配下の混成の結果
２．４  包括的なオリゴヌクレオチドへの「バイオチップ」の操作の外挿
Ｉ−この発明の基礎を成す問題点の論証
１．１  オリゴヌクレオチド（対配位子）の選択
固体支持体の表面に固定化したオリゴヌクレオチドによる核酸（配位子）の伝統的混成で遭遇する困難を示すために、このタイプの分析の代表であるオリゴヌクレオチドのモデルを選定した。
選定したオリゴヌクレオチドの長さは８塩基であり、それは混成による順序付けが関与するタイプの応用には通常受容されている長さである（参考文献１と２）。
Ｂ、Ｄ及びＪで示す３つの塩基を選択した。これらは、対応する二重鎖ＤＮＡｃの安定性の相違を特徴とする。ＡとＴのヌクレオチドがリッチである配列Ｂは、その相補的配列と相対的に不安定な複式体を形成しよう。一方、ＣとＧのヌクレオチドがリッチである配列Ｊは、その相補的配列と相対的に安定な複式体を形成しよう。ＣとＧのヌクレオチドと同じ数のＡとＴのヌクレオチドを含有する配列Ｄは、その相補的配列と中間の安定性の複式体を形成しよう。Ｂｒｅｓｌａｕｅｒ等の最近接モデル（参照文献３参照）を用いて二重鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドの相対的安定性を粗くではあるが予測することが可能である。このモデルにより、ある温度における各複式体のためのその配列の関数とした自由結合エネルギィを計算することができる。
これら三つ塩基配列（Ｂ、Ｄ及びＪで示す。以下を参照）から、Ｂ、Ｄ及びＪの配列の単変動に相当する他の七つの配列を決定した。
固体の多複合化支持体に固定化したのはこれら１０のオリゴヌクレオチドである。これらは、その５’端部にこれらの固体化に必要なビオチン基を含有する（下の１．３を参照）。以下の表においては、三つの塩基配列を太字で記す。注欄の添え字”ｃ”は相補的配列を意味する。
0003843134.tif 000002
６種の蛍光性オリゴヌクレオチド（標識化された配位子）をこれらの固定化したオリゴヌクレオチドにより混成した。これらは、この３つの塩基配列及び末端ヌクレオチドが異なるそれらの変形体に相補的なオリゴヌクレオチドである。これらはその５’端部にフルオレセインを含有する。
0003843134.tif 000003
１．２  オリゴヌクレオチドの合成
活性化ビオチン及びフルオレセイン誘導体を５’位にアーム−（ＣＨ2）6−ＮＨ2−を含有するアミンで機能化したオリゴヌクレオチド配列と結合して、ビオチンとフルオレセインで標識化したオリゴヌクレオチドを得た。
１．２．１  オリゴヌクレオチドの合成
アミン含有オリゴヌクレオチド類を、製造者提供のプロトコールを用いたホスホアミダイト法に従い、ＡＢＩ  ３９４装置（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｒｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）で合成した。アミン含有アームのホスホアミダイト前駆体を含む全ての試剤はＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから提供された。支持体からの開裂と脱保護化の後、酢酸ソーダ溶液（３Ｍ）と冷エタノール（−２０℃）を添加してオリゴヌクレオチド配列が上記される（原文に誤り）。
１．２．２  オリゴヌクレオチド−５’ビオチン接合体の合成
このアミン含有オリゴヌクレオチドを乾燥した後、０．１５ＭのＮａＣｌを含有する０．２Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．８）に溶解した。次に、ＤＭＦ中のビオチン溶液（ビオチノイルアミドカプロン酸Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドエステル、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）（５ｍｇ／ｌ）を添加する。３７℃で２時間加温放置した後、塩化アンモニウム溶液（１Ｍ）の１０ミクロリッターを添加して反応を停止する。次いで、ビオチン化したオリゴヌクレオチドを−８０℃でエタノールと酢酸ナトリウム（３Ｍ）中に沈降させ、純水に溶解し、逆相ＨＰＬＣにより精製する。その濃度を２６０ｎｍのＵＶ測定により求めた。
１．２．３  オリゴヌクレオチド−５’フルオレセイン接合体の合成
アミン含有オリゴヌクレオチドを乾燥した後、０．１５ＭのＮａＣｌを含有する０．２Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．８）に溶解する。次に、ＤＭＦ中のフルオレセインイソチオシアナート（Ａｌｄｒｉｃｈ）の溶液（１２．５ｍｇ／ｌ）を添加する。５５℃で２時間加温放置した後、塩化アンモニウム溶液（１Ｍ）の２５ミクロリッターを添加して反応を停止する。次いで、この蛍光性オリゴヌクレオチドを上記のように沈降させ、精製する。その濃度を２６０ｎｍのＵＶ測定ににより求めた。
これら種々接合体の純度を逆相ＨＰＬＣにより調べる。
１．３  オリゴヌクレオチド（対配位子）をグラフト化（固定化）する方法
実験用に選択した固体支持体は顕微鏡スライドである。これは、このタイプの分析には共通の支持体である。使用したスライドの寸法は７５×２５×１ｍｍである。使用するオリゴヌクレオチドを固定化する方法は、ガラス表面誘導化及び分子生物学で共通に使用する技術から構成される。
第一のステップは、アミン基をシラン化の手法によりガラス表面にグラフト化することから成る。第二のステップにおいては、アミンと強力に反応するカップリング剤により表面を活性化する。第三のステップにおいては、アビジンを、そのアミノ酸の一級アミンとカップリング剤との反応により活性化した表面に共有結合的にグラフト化する。最後に、最終ステップにおいて、ビオチン化したオリゴヌクレオチドを、アビジンによるビオチンの強力結合により、この表面に固定化する。
この方法は、オリゴヌクレオチドのそれらの５’端部でのガラス表面への付着を保証する。
詳細なプロトコール
１．  ガラススライドを十分の一に希釈したスルホクロム酸（Ｐｒｏｌａｂｏ）で洗浄し、水洗し、８０℃で１５分間乾燥する。
２．  ３−アミノプロピルジメチルエトキシシラン（ＡＢＣＲ社）の１％を含有するトルエン溶液（ｖｏｌ／ｖｏｌ）にスライドを浸す。室温で２０分間静置させる。
３．  スライドをエタノールで二回洗い、８０℃で１５分間乾燥する。
４．  スライドを、ピリジンの１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）と１，４−フェニレンジイソチオシアナート（Ａｌｄｒｉｃｈ）の０．２％（ｗ／ｖｏｌ）を含有するジメチルフォルムアミドに浸す。室温で１時間静置させる。
５．  スライドをメタノール、次いでアセトン中で洗い、８０℃で１５分間乾燥する。
６．  溶液状のアビジンの液滴の２μｌを所望の箇所に置く。アビジン溶液はｐＨ８の１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、アビジン１ｍｇ／ｍｌ（Ｓｉｇｍａ）から成る。室温に２０から３０分間静置させる。
７．  ピペットでアビジンの液滴を吸い上げる。
８．  １ＭのＮａＣｌ溶液でアビジン沈積物を洗い、再度２μｌ液滴を沈積させ、ピペットでそれを吹い上げる。
９．  ビオチン化したオリゴヌクレオチド（５μＭ）の液滴２μｌを同じ箇所に沈積させる。室温で３０分間静置する。ピペットで液滴を除く。このオリゴヌクレオチドは、ｐＨ８の１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＮａＣｌに希釈されている。
１０．  スライドを、１％水酸化アンモン（ｖｏｌ／ｖｏｌ）と１ＭのＮａＣｌを含有する溶液に浸す。これを室温で１０分間放置する。
１１．  スライドを水洗し、大気中で乾燥する。
スライドは混成、即ち複合化に備える。
カップリング位置を決定し、ガラススライド上に正確にオリゴヌクレオチドの位置を定めるため、６から９のステップはＧｉｌｓｏｎロボット、モデル２２２により自動化した。このロボットは、希釈器に連結した針を備えた直角座標ロボットアームから構成されている。このアセンブリーにより、正確で再現性ある様式で液滴の沈積と吸い上げが可能となる。
１．４  混成と複合体の蛍光の視覚化（複合体の存在及び／または量を特性化する変数）
蛍光性オリゴヌクレオチドを、次ぎの緩衝液中の１０-7の濃度で、固定化したオリゴヌクレオチドを担持する表面上で混成した。ｐＨ８の５０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ；４．５ＭのＴＭＡＣ１；２ｍＭのＥＤＴＡ；０．０１％のサルコシン。この緩衝液は参照文献４から得られる。
混成容積は１５０μｌである。この容積は、２４×５０ｍｍのガラスのカバースリップを使用する時、約０．１ｍｍ厚さの液膜に相当する。
混成の時間は１ｈである。
等温混成を、所定の温度を提供するタンクまたは水浴内で、スライドとガラスのカバースリップの間で実施した。
熱勾配（以下を参照）によるこの発明による混成のために、混成溶液（液体媒体）を傾斜して支持する金属のブロックに直接沈積させ、オリゴヌクレオチドを担持するスライドを、泡が形成しないように注意してその上に当てた。
混成（複合化）の視覚化、即ち観察を、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ社（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）のＦｌｕｏｒＩｍａｇｅｒ（蛍光画像）装置を用いた蛍光によって行った。この装置は、アルゴンレーザ光（４８８ｎｍで励起）によって箇所ごとに及び結合部位ごとに照射することで観察対象の表面を走査し、光学繊維の束によって再放射され観察され検出された光を集める。５１５ｎｍの高ｂａｕｔ（ｓｉｃ、原文の間違い）フィルターが、非交換様式でこの装置に内蔵されている。更にフィルターを加えて、集光、観察された光を波長に関してより良好に選択することが可能である。
観察のために、５３０±３０ｎｍの干渉フィルターを付設し、装置内の光増幅器を９２０ボトルに設定した。生じた画像のピクセルのサイズは、２００×２００μｍ平方である。カップリング位置は、直径が約２ｍｍのディスクから成り、これは約１０ピクセルのオーダーの各サイトの最終画像を表らわしている。
オリゴヌクレオチド（対配位子）の長さは短く、室温でもＤＮＡ複式体の迅速な解離が最低安定性を持つ配列（配列Ａ及びＢ）に起こる。従って、混成を高い信頼性で観察するために以下の方法を開発した。
１．  スライドを−２０℃に冷却した混成緩衝液に迅速に浸す。撹き混ぜる。
２．  スライドを−９℃に冷却した２０Ｘ  ＳＳＣ（Ａｍｂｅｓｃｏ社，Ｓｏｌｏｎ，Ｏｈｉｏ，ＵＳＡの市販標準液）に迅速に浸す。撹き混ぜる。
これらの二つのステップは最大１０ないし１５秒内に行うべきである。
３．  スライドを−２０℃に冷却した混成緩衝液に迅速に浸す。この温度でこの緩衝液では複式体（複合体）の解離は生じない。この緩衝液は脱ガスする必要がある。
４．  ターゲット（配位子）のオリゴヌクレオチドを含む溶液からスライドを取り出す。前もって冷却したガラスのカバースリップを上に置く。スライドの底を迅速に拭う。
５．  直ちに、蛍光画像装置により視覚し観察する。
混成の定量化は、この蛍光画像装置とＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ社が提供したＩｍａｇｅＱｕａｎｔ（登録商標）ソフトウエアによって遂行した。
上記プロトコールは、同じスライドで実施した繰り返しで、２５％の混合信号の変動係数を保証する。
１．５  等温での混成の結果
１０のオリゴヌクレオチド（対配位子）、ｂＡ、ｂＢ、ｂＣ、ｂＤ、ｂＥ、ｂＦ、ｂＧ、ｂＨ、ｂＩ、ｂＪを担持するスライドを作製し、４℃で三種の蛍光オリゴヌクレオチド（配位子）、ｆＢｃ、ｆＤｃ及びｆＪｃの混合物により混成化を行った。それぞれの初期濃度は１０−7Ｍである。
これら混成の定量的結果は表１にまとめた。
これは、反復した実験の平均値であり、混成信号は複式体信号、ｂＪ：ＦＪｃの関数として表示した。
表１の値から、強い混成信号と極めて弱いそれとの強度の差は約１５倍である。検出できない混成は、強い混成より少なくとも２０倍弱い。
予測したように、オリゴヌクレオチド、ｂＢ、ｂＤ及びｂＪから得られた混成は、溶液中の遊離オリゴヌクレオチドはそれぞれの相補的鎖であったので強い。
ｂＣ、ｂＥ、ｂＦ及びｂＨから得られた混成は極めて弱く検出が可能ではないが、このことは、内部不整合は完全な一対化と容易に区別されることを意味している。
他方、外部不整合では同じことが真とは言えない。実際、ｂＡが相対的弱い混成信号を発生する一方で、完全な一対化の信号に匹敵する強い混成信号を発生するｂＧとｂＩでは、同じことが真ではない。従って、複式体ｂＡ：ｆＤｃにより形成する外部不整合は正確に区別されるが、複式体ｂＧ：ｆＤｃ及びｂＩ：ｆＪｃが形成する外部不整合はそうではない。
この実験条件下では、それ故に未知の試料（液体媒体）を微細に分析することは可能ではない。未知の試料で上記混成を実施すると、オリゴヌクレオチド、ｂＢ、ｂＤ、ｂＧ、ｂＩ及びｂＪは試料との混成化として決定されようが、これは４０％の虚偽のポジティブレベルであることを示す。
外部不整合の識別を改良するのに、混成温度をの上昇を考えることができる。これを解決法を開拓するために、六種のオリゴヌクレオチド、ｂＡ、ｂＢ、ｂＤ、ｂＧ、ｂＩ及びｂＪをスライド上に固定化し、異なる温度、４、１０、２０、２５、３０及び３７℃でオリゴヌクレオチド、ｆＢｃ、ｆＤｃ及びｆＪｃと混成を行った。図１は、４から２５℃の温度で得られた混成の結果を表す。これらは１６ないし４２の測定で得られた平均値である。結果は、その複式体が最も安定と見なされるので、混成、ｂＪ：ｆＪｃの相対的光強度で表現している。この複式体の混成信号の絶対強度は、もちろん温度が上昇すると減少している。
図１は、１０℃の混成のプロフィルが４℃の混成で得られたそれに類似することを示している。他方、２０及び２５℃ではある変化が生じている。その外部不整合、ｂＧ−ｆＤｃは、完全一対化ｂＩ：ｆＪｃより著しく弱くなる。同様に、外部不整合、ｂＩ：ｆＪｃは、単一混成の間その差異が完全な識別にはやや低いが、完全な一対化、ｂＪ：ｆＪｃより顕著に弱くなっているる。しかし、完全な一対化、ｂＢ：ｆＢｃも強度を減少し、不整合の複式体、ｂＩ：ｆＪｃの信号より弱い信号を発生する。従って、完全に一対化した複式体を不整合の複式体から誤差なく分離する混成強度しきい値を選択するのは可能ではない。例えば、０．５のしきい値で２５℃で混成するように選択すると、オリゴヌクレオチド、ｂＢはネガティブ、オリゴヌクレオチド、ｂＩはポジティブと断定されよう。従って、最終結果は虚偽のポジティブと虚偽のネガティブから成ることになろう。次に、０．４のしきい値で２０℃の混成が選択されれば、実験の変動により、オリゴヌクレオチド、ｂＢが実際にポジティブと断定るばかりでなく、オリゴヌクレオチド、ｂＩ、時にはオリゴヌクレオチド、ｂＧも同様に断定される。
II  熱勾配を与えた本発明による解決法
２．１  熱勾配の応用を可能とするアセンブリーの説明
上に開示した外部不整合間の識別の問題を解決するために、固定化オリゴヌクレオチドを担持するガラススライドの表面に熱勾配を確立でき、多複合化支持体を構成できる処理装置を設計し、開発した。
この装置は次の仕様に合致する。
−１ｃｍ長さの有用または作用ゾーン中での１０℃の温度勾配
−０．１℃以内の全ての箇所でのスライド基板の温度の知見
−試験ごとのスライド基板の温度の再現性：０．１ｍｍ以内で０．１℃。２０から２５℃の室温が自由に変えるられねばならない。
−オリゴヌクレオチドを担持するガラススライドの設置及び除去の容易さ。
基板の表面に熱勾配を確立する最も簡単な方法は、この基板の各端部にそれぞれ冷源３と熱源４をそれぞれ連結する方法である。二つの源の間に熱勾配は確立される。基板が一定の厚さであるならば、温度勾配は一定、即ち温度は基板に沿った距離の関数として基板上を線形的に変化する。
実用上の見地から、オリゴヌクレオチドをその上に固定化するガラススライド２は試験ごと容易に置き換え可能であり、異なる試験間で熱交換に差異がないことが必要である。これが、熱勾配がガラススライド内に直接には確立されず、表面に小さいキャビティ１ａが掘られた金属ブロック１内に確立された理由である。ガラススライド２はこのキャビティに置かれ、固定化したオリゴヌクレオチドを担持するその側面は下方に向いている。くさび１１により支持された金属ブロック１とガラススライド２の間に、混成溶液５（図４を参照）即ち液体媒体がくる。
図４において、ガラススライド２の位置を設定するストップ６が示されている。実際はスライドはこれらのストップと接触して設置される。スライド上でオリゴヌクレオチドを固定化する間、熱勾配下のオリゴヌクレオチドの位置は、このようにストップと接触しているスライドの縁部２ａから決定される。金属ブロック１は、例えば熱伝導率が１０から５０Ｗ／ｍ．Ｋのステンレススチール３０４１から構成されている。これは、例えば０．０６Ｗ／ｍ．Ｋ以下の固有伝導率を有し、例えばポリウレタンから構成される覆い７により絶縁にされている。
この装置の端部は、冷気及び熱源の循環ができ、製造所（cryothermostat minister Huber,−２５／＋１２０℃）の推奨値によれば熱変動率は±０．０２℃で安定である水浴に連結している。
装置の温度は、図５に記載されているクロメル−アルメル熱電対（タイプＫ）により制御された。混成溶液中では、熱電対ＴＣＩ（ｓｉｃ、原文に間違い）及びＴＣ４はスライド２のいずれかの側面に位置しており、一方、そのワイヤの全直径が０．０８ｍｍである熱電対ＴＣ２及びＴＣ３はガラススライドの下に位置している。これら熱電対は直接にこのスチールに電気的に溶接した。それらの位置（熱電対の二つワイヤの中央値）は、マイクロメーターテーブルｘ，ｙの上にかかる双眼鏡レンズによって０．０２ｍｍ以内に決められている。これらは、氷冷の純水浴に浸した冷接合点を備え、差動的に載置されている。その差動電圧は、高精度マルティメーター（Ｋｅｉｔｈｌｅｙ，モデル２０００、精度：０．１μＶ）により測定され、これら熱電対用の標準表により温度に変換される。
上記した処理装置の寸法は、図２に文字入りマークで示されており、ＡＡ：４０ｍｍ、ＢＢ：４０ｍｍ、ＣＣ：２０ｍｍ、ＤＤ：１５ｍｍ、ＪＪ：１２０ｍｍ、ＥＥ：１０ｍｍ、ＦＦ：１０ｍｍ、ＧＧ：２０ｍｍ、ＨＨ：４０ｍｍ、ＩＩ：１２ｍｍである。
数値シミュレーションから予測される熱勾配の直線性を、このアセンブリの基礎となる熱電対によって実験的にチェックした。勾配は線形であり、スライド２の有用なゾーンのある箇所の温度は、熱電対ＴＣ２とＴＣ３が提供する温度から簡単に計算できる。
熱及び冷源の数点の温度のために異なる時間で行った温度測定は、試験ごとの温度分布は０．１℃以内まで再現性があることを示している。
ここに報告する実験の多くでは、冷水浴を−９℃に、熱水浴を＋６１℃に調節した。冷源３の液体はグリコール含有水（２５％グリコール）であり、熱源２のそれは純水であった。確立された勾配は１．０８５℃／ｍｍであった。２５ｍｍ離れたガラススライドの両縁部では、それぞれ１３．２及び４０．３℃であった。
２．２  それらの予め定められた最適混成温度におけるオリゴヌクレオチドの位置決め
等温混成の結果は、各オリゴヌクレオチドの混成温度は、外部不整合間の正確な識別のためには十分に高いことが必要であることを示している。しかし、この温度は、混成信号を検出可能とするには同時に十分に低い温度にとどめるべきである。上記装置では、混成温度は混成信号温度が４℃で得られる混成信号の２５％に等しくなるように設定されたが、この温度は固定化したオリゴヌクレオチドの飽和度に相当する。ガラススライド２（平板支持体）の位置と分布は、このように粗く決められることになる。
勾配下にあるオリゴヌクレオチドのそれぞれの位置を正確にするために、勾配の方向にオリゴヌクレオチドを担持する五個一組になったスライドを作製した。五個一組体の５つの結合部位は、それぞれスライド２の冷縁部２ａから５、８．８、１２．６、１６．４及び２０．２ｍｍである。次にこれらスライドを、相補的な蛍光性のオリゴヌクレオチドの各種組合せにより混成した。図６は、オリゴヌクレオチド、ｆＢｃ，ｆＤｃ及びｆＪｃによるそのような混成の結果である。この実験では、熱勾配用の水浴を−９と＋７０℃に設定した。
この種の幾つかの実験の終了時に、異なるオリゴヌクレオチドの結合部位の位置をそれぞれ明らかにした。
ｂＡ：２３．５℃  ；ｂＢ：２３℃  ；ｂＤ：２６．５℃  ；ｂＧ：２７．５℃；  ｂＩ：２７．５℃；  ｂＪ：２９℃
２．３  発明による熱勾配下の混成の結果
この実験のために、オリゴヌクレオチド、ｂＡ、ｂＢ、ｂＤ、ｂＧ、ｂＩ及びｂＪを、スライド２の冷縁部２ａからそれぞれ９．５、９、１２．２、１３．２、１３．２及び１４．６ｍｍの各ガラススライド上に固定化した。冷気及び熱源の水浴は−９と＋６１℃に設定した。これらの位置は上記に明かにした温度に対応する。図７のダイアグラムに従って、オリゴヌクレオチドの沈着を重複行った。次に各スライド（２）を、等温熱混成で前に使用したｆＢｃ、ｆＤｃ及びｆＪｃの同じ混合物により熱勾配下に混成を実施した。
得られた混成結果を図８に集約する。これらは５回測定の平均値である。この結果を、図１ａから１ｄに提示した結果と同様に、混成、ｂＪ：ｆＪｃの相対強度として表してある。
三つの完全一対化が遜色ない強度の混成信号（０．８４から１）を発生するのが注目でき、それに対して外部不整合の信号は顕著により弱い。等温熱混成で得た結果と異なり、ここでは完全一対化を不整合から分離する強度しきい値を、例えば０．７のしきい値のように定めることが可能である。
上記装置の正確な操作をチェックするために、同一のスライドを蛍光性オリゴヌクレオチド、ｆＡｃ、ｆＢｃ、ｆＤｃ、ｆＧｃ、ｆＩｃ及びｆＪｃの他の組合せにより混成化した。これらの組合せはオリゴヌクレオチド、ｆＢｃを体系的に含有する。加えて、これらはｆＩｃまたはｆＪｃ及びｆＡｃまたはｆＤｃ、またはｆＧｃを含む。この様式で、各組合せの三つの蛍光性オリゴヌクレオチドは、それらが同じ固定したオリゴヌクレオチドとは一対化しないので、それらの混成において干渉を生じなかった。ｆＡｃ、ｆＧｃ及びｆＩｃを含む組合せも使用した。実際に、配列ＡとＧの間の交差混成は極めて低い（下の結果を参照）。
表２にこれら混成の結果を報告する。これらは、複式体、ｂＢ：ｆＢｃの混成信号の強度に相対して表した。更に、非整合用に、結果は対応する完全一対化の混成信号に相対して表した。
これら結果は、全ての完全一対化は類似した強度信号を発生することを示している。しかし、一対化ｂＧ：ｆＧｃは、６回の測定の標準偏差が０．２２であり、０．７９の信号であるので僅かであるが弱い信号を発生する。実験の変動を除いた真の信号がＩより事実上小さい確率は、従って、約９７％と高い。それ故に、このことは熱勾配におけるＧの位置がこの実験では若干熱く、Ｇは冷源に向け再位置決めができることを示している。
その上これら結果は、外部不整合は完全複式体ｂＢ：ｆＢｃまたはそれらの各完全類縁体よりもかなり弱い信号発生することも示している。組合せ、ｆＢｃ＋ｆＤｃ＋ｆＪｃによる混成の特異の場合におけるように、完全参照複式体に比較できる０．７のしきい値は、外部不整合から完全一対化を識別することを可能とする。
次に、オリゴヌクレオチド、ｂＧを２６．８℃の位置に設定し、（スライド２の冷縁部２ａから１２．５ｍｍ）、他のオリゴヌクレオチドの位置を不変のままにしたスライドについて新規実験を実施した。これらスライドを、蛍光性オリゴヌクレオチドの組合せ、ｆＢｃ＋ｆＧｃ＋ｆＩｃ及びｆＢｃ＋ｆＧｃ＋ｆＪｃにより混成した。複式体、ｂＢ：ｆＢｃと比較した複式体、ｂＧ：ｆＧｃの混成信号の平均は、７回測定で１．０８で標準偏差は０．３２であった。次に、不整合ｂＧ：ｆＤｃとｂＧ：ｆＡｃの信号を、ｂＧ用の新しい温度まで、以前の値を採用し、それらに１．０８：０．７９＝１．３６７の比率を掛けることで外挿した。同様に、それらの対応する完全類縁体、ｂＧ：ｆＧｃと比較される不整合ｂＤ：ｆＧｃとｂＡ：ｆＧｃの信号を、先行値を１．３６７で割ることで先行値から推論した。全てのこれら結果と計算は表３に記されている。
予想通りに、これらの新しい結果は先行結果を確認し、改良している。全ての完全一対化が１に近似する混成信号を発生する一方で、信号が僅かに０．５より多きいｂＩ：ｆＪｃを除外して、末端不整合は０．５以下の信号を発生する。０．７のしきい値は、外部不整合から完全一対化の明確な区別を可能とする。
２．４  一般的オリゴヌクレオチド  バイオチップの操作への応用
例えば全ての”６５  ５３６の可能性のあるオクタマー”を担持するオリゴヌクレオチド  バイオチップを使用する間に、信号がポジティブがネガティブかを決定するために強度しきい値を単純に応用するのは極めて有効とは言えない。実際、最も安定な不整合の信号は完全一対化の信号の二倍の弱さにすぎず、実験上の変動によりある数の完全一対化をネガティブとして検出し、同様にある数の外部不整合をポジティブとして決定すこともある。例えば、表３に集約した全データについて言うと、報告した３９の内に０．７のしきい値以下の完全一対化の信号が２あり（５．１％）、０．７のしきい値以上である外部不整合は５６回の測定の内で２（３．６％）である。これは複式体ｂＪ：ｆＩｃの値であり、複式体ｂＪ：ｆＩｃの値である。これら二つの複式体は、遂行した実験の内、三種の最も安定な不整合の複式体の部分を形成する。
処理のより有効な手法は、同じグループ中の末端ヌクレオチドのみ相違する全てのオリゴヌクレオチド（全ての可能性のあるオクトマーを担持するバイオチップ用には１６オクトマー）を結合し、各グループごとに最も強い信号を決定する手法である。その時は、ポジティブグループをネガティブグループから識別することは、これが完全一対化と内部不整合とを識別すすことを含むので、容易である。例えば、０．４のしきい値を最も強い信号に関して適用する。
次に、オリゴヌクレオチドの各グループに対して、０．７のしきい値を最も強い信号に関して適用することが可能である。
表３に報告した全ての実験についてこの様式で処理を実行すれば、完全一対化は全て実験の最も強い信号に関する０．４のしきい値を大きく越えるので、ネガティブであると決定される完全一対化はない。他方で、ポジティブであると誤って決定された二つの値は誤ってポジティブのままである。
従ってこれらのデータを応用すれば、この様式で作用するオリゴヌクレオチドバイオチップは、虚偽のネガティブ割合が０％、内部不整合の虚偽のポジティブ割合が０％、そして実際上、３０から４０％の外部不整合に対し約１０％の虚偽のポジティブ割合に相当するｅｘｔｅｍｅｓ（原文に誤り）不整合の虚偽のポジティブ割合が３から４％を持つことになる。このような虚偽のポジティブと虚偽のネガティブの割合は、等温混成による従来処理の状態をかなり改善していることを表している。この割合は、混成による順序付けによって核酸試料の配列の再構築を可能にするのに十分な低い割合である。実際には、残存する混成誤差は、混成の冗長性を利用した適当なデータ処理ソフトウエアにより修正できる（５）。
更に結果の質を改善するためには、試料ごとに一つではなく二つの混成を実行することが可能である。その時、虚偽のポジティブ割合は、外部不整合の３０から４０％に対し１％のオーダーになるはずである。
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この説明に含めた必要な参考文献
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（３）Ｋ．Ｊ．Ｂｒｅｓｌａｕｅｒ，Ｒ．Ｆｒａｎｋ，Ｈ．Ｂｌ  ｃｋｅｒ，Ｌ．Ａ．Ｍａｒｙ；塩基配列からＤＮＡ複式体ｓｔａｂｉｌｉｔ（原文間違い）の予測；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ；１９９６：８３;３７４６−３７５０
（４）Ｕ．Ｍａｓｋｏｓ，Ｅ．Ｍ．Ｓｏｕｔｈｅｒｎ；ガラス支持体上で合成したオリゴヌクレオチドの大きい配列を利用したオリゴヌクレオチド再会合の研究；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ；１９９３；２１；４６６３−４６６９
（５）Ｚ．Ｓｔｒｅｚｏｓｋａ，Ｔ．Ｐａｕｎｅｓｋｕ，Ｄ．Ｒａｄｏｓａｖｌｊｅｖｉｃ，Ｉ．Ｌａｂａｔ，Ｒ．Ｄｒｍａｎａｃ，Ｒ．Ｃｒｋｖｅｎｊａｋ−ｏｖ；混成によるＤＮＡ順序付け：非ゲルに基ずく方法により読まれた１００塩基；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ；１９９１；８８；１００８９−１００９３
（６）Ｅ．Ｍ．Ｓｏｕｔｈｅｒｎ等（１９９２）；オリゴヌクレオチドの配列に対する混成による核酸配列の分析と比較：実験モデルを用いた評価；Ｇｅｎｏｍｉｃｓ１３，１００８−１０１７
（７）Ｒ．Ｄｒｍａｎａｃ等；ｈｙｂｒｉｉｚａｔｉｏｎ（原文に間違い）によるＤＮＡ配列決定：有効な大スケール順序付けの戦略；Ｓｃｉｅｎｃｅ２６０；１６４９−１６５２
（８）Ｃａｒｒａｎｏ等（１９８９）；ＤＮＡ指紋化用の高解像蛍光に基ずく半自動化法；Ｇｅｎｏｍｉｃ４；１２９−１３６
（９）Ｌｙｓｏｖ，Ｙｕ等（１９８８）；Ｄｏｋｌａｄｙ  ａｋａｄｅｍｉ，Ｎａｕｋ，ＳＳＲ３０３；１５０８−１５１１
（１０）Ｄｒｍａｎａｃ．Ｒ等（１９８９）；Ｇｅｎｏｍｉｃｓ４；１１４−１２８；
（１１）Ｓｚｅ  ＶＬＳＩ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；ＭｃＧｒａｗ  Ｈｉｌｌ；１９８３
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図１ｄ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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