(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
クリーニング組成物であって、
（ａ）  下記およびそれらの混合物から選択されるズブチリシン変種であるプロテアーゼ酵素、
Ｎ７６Ｄ／Ｓ９９Ｄ
Ｎ７６Ｄ／Ｓ１０１Ｒ
Ｎ７６Ｄ／Ｓ１０３Ａ
Ｎ７６Ｄ／Ｖ１０４Ｉ
Ｎ７６Ｄ／Ｉ１０７Ｖ
Ｎ７６Ｄ／Ｓ９９Ｄ／Ｓ１０１Ｒ
Ｎ７６Ｄ／Ｓ９９Ｄ／Ｓ１０３Ａ
Ｎ７６Ｄ／Ｓ９９Ｄ／Ｖ１０４Ｉ
Ｎ７６Ｄ／Ｓ１０１Ｒ／Ｓ１０３Ａ
Ｎ７６Ｄ／Ｓ１０１Ｒ／Ｖ１０４Ｉ
Ｎ７６Ｄ／Ｖ１０４Ｉ／Ｉ１０７Ｖ
Ｎ７６Ｄ／Ｖ１０４Ｙ／Ｉ１０７Ｖ
Ｎ７６Ｄ／Ｖ１０４Ｉ／Ｎ１２３Ｓ
Ｎ７６Ｄ／Ｉ１０７Ｖ／Ｎ１２３Ｓ
Ｎ７６Ｄ／Ｓ９９Ｄ／Ｓ１０１Ｒ／Ｓ１０３Ａ
Ｎ７６Ｄ／Ｓ９９Ｄ／Ｓ１０１Ｒ／Ｖ１０４Ｉ
Ｎ７６Ｄ／Ｓ９９Ｄ／Ｓ１０３Ａ／Ｖ１０４Ｉ
Ｎ７６Ｄ／Ｓ１０１Ｒ／Ｓ１０３Ａ／Ｖ１０４Ｉ
Ｎ７６Ｄ／Ｓ１０３Ａ／Ｖ１０４Ｉ／Ｎ１２３Ｓ
Ｎ７６Ｄ／Ｖ１０４Ｉ／Ｉ１０７Ｖ／Ｎ１２３Ｓ
Ｎ７６Ｄ／Ｓ９９Ｄ／Ｓ１０１Ｒ／Ｓ１０３Ａ／Ｖ１０４Ｉ
Ｎ７６Ｄ／Ｓ９９Ｄ／Ｓ１０１Ｒ／Ｓ１０３Ａ／Ｖ１０４Ｉ／Ｎ１２３Ｓ
Ｎ７６Ｄ／Ｓ１０３Ａ／Ｖ１０４Ｉ／Ｌ１２６Ｆ
Ｎ７６Ｄ／Ｓ１０３Ａ／Ｖ１０４Ｉ／Ｓ１２８Ｇ
Ｎ７６Ｄ／Ｓ１０３Ａ／Ｖ１０４Ｉ／Ｓ１２８Ｌ
Ｎ７６Ｄ／Ｓ１０３Ａ／Ｖ１０４Ｉ／Ｐ２１０Ｉ
Ｎ７６Ｄ／Ｓ１０３Ａ／Ｖ１０４Ｉ／Ｌ１２６Ｆ／Ｓ２６５Ｎ
Ｋ２７Ｒ／Ｎ７６Ｄ／Ｖ１０４Ｙ／Ｎ１２３Ｓ／Ｑ２０６Ｌ／Ｎ２１８Ｓ、および
（ｂ）前記プロテアーゼ酵素と適合する１種以上のクリーニング組成物物質と
を含んでなることを特徴とする、クリーニング組成物。
【請求項２】
クリーニング組成物物質が、界面活性剤、溶媒、緩衝剤、酵素、汚れ放出剤、土汚れ除去剤、分散剤、増白剤、起泡抑制剤、布帛柔軟剤、起泡増強剤、酵素安定剤、ビルダー、漂白剤、色素、香料およびそれらの混合物からなる群より選択されるものである、請求項１に記載のクリーニング組成物。
【請求項３】
クリーニング組成物物質が組成物の少くとも１重量％の界面活性剤を含み、前記界面活性剤がアルキルベンゼンスルホネート、一級アルキルサルフェート、二級アルキルサルフェート、アルキルアルコキシサルフェート、アルキルアルコキシカルボキシレート、アルキルポリグリコシドおよびそれらの対応サルフェート化ポリグリコシド、α‐スルホネート化脂肪酸エステル、アルキルおよびアルキルフェノールアルコキシレート、ベタインおよびスルホベタイン、アミンオキシド、Ｎ‐メチルグルカミド、ノニオン系一級アルコールエトキシレート、ノニオン系一級アルコール混合エトキシ／プロポキシとそれらの混合物からなる群より選択される物質からなる、請求項１に記載のクリーニング組成物。
【請求項４】
ゼオライト、ポリカルボキシレート、積層シリケート、ホスフェートおよびそれらの混合物からなる群より選択される少くとも５％のビルダーを更に含んでなる、請求項３に記載のクリーニング組成物。
【請求項５】
クリーニング組成物物質が、少くとも１種の漂白剤を含んでなる、請求項１に記載のクリーニング組成物。
【請求項６】
漂白剤が、ペルカーボネート、ペルボレートおよびそれらの混合物からなる群より選択され、場合により少くとも１種のブリーチ活性剤を更に含んでなる、請求項５に記載のクリーニング組成物。
【請求項７】
クリーニング組成物物質が、セルラーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ、ペルオキシダーゼおよびそれらの混合物からなる群より選択される少くとも１種の酵素を含んでなる、請求項１に記載のクリーニング組成物。
【請求項８】
クリーニング組成物物質が少くとも１種の布帛柔軟剤を含んでなる、請求項１に記載のクリーニング組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はカルボニルヒドロラーゼ変種である新規プロテアーゼ酵素を含んでなる様々なクリーニング組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
酵素は最大クラスの天然タンパク質である。各種の酵素は通常異なる種類の化学反応を触媒する（すなわち、消費されずに反応を促進する）。プロテアーゼとして知られる酵素は、他のタンパク質を加水分解する（開裂される化学結合のいずれかの側における水分子のＨおよびＯＨ部分の取込みで化合物を２以上のより簡単な化合物に分解する）ものとして知られている。タンパク質を加水分解するこの能力は、天然タンパク質工学処理プロテアーゼを洗濯洗剤製品への添加剤として配合することにより利用されてきた。衣類上の多くの汚れはタンパク質性であり、広い特異性を有するプロテアーゼはこのような汚れの除去性を実質的に改善するものである。
【０００３】
残念ながら、これらタンパク質の天然細菌環境下における効力レベルは比較的に非天然の洗浄環境中にしばしば移行されていない。特に、熱安定性、ｐＨ安定性、酸化安定性および基質特異性のようなプロテアーゼの特徴は、酵素の天然環境外での利用のためには必ずしも最適化されていない。
【０００４】
プロテアーゼ酵素のアミノ酸配列がプロテアーゼの特徴を決定している。プロテアーゼのアミノ酸配列の変化は、酵素の性質を様々な程度に変えたり、あるいはアミノ酸配列における変化の位置、性質および／または大きさに応じて酵素を不活化させることさえある。洗浄環境下のようなクリーニング用途でプロテアーゼの効力を増加させることを目標として、それらの性質を改善する試みに際し、プロテアーゼのアミノ酸配列を変えるいくつかの試みが行われてきた。これらの試みには、全く多様な条件下で熱安定性を高めて酸化安定性を改善するために、アミノ酸配列を変えることも含まれる。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
当業界で記載された様々な試みにもかかわらず、様々な表面をクリーニングする上で有用なプロテアーゼの新たに有効な変種に関する必要性が依然として存在している。したがって、改善されたタンパク質分解活性、基質特異性、安定性および／または高性能特徴を有したカルボニルヒドロラーゼ変種であるプロテアーゼ酵素を含有するクリーニング組成物を提供することが本発明の目的である。これらのおよび他の目的は、以下の詳細な記載から容易に明らかとなるであろう。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明は
（ａ）有効量のプロテアーゼ酵素（ここで、このプロテアーゼ酵素は、天然でみられないアミノ酸配列を有するカルボニルヒドロラーゼ変種であり、異なるアミノ酸により前駆カルボニルヒドロラーゼの複数アミノ酸残基を置換して誘導されたものであり、前駆酵素で置換された上記複数のアミノ酸残基は＋７６位と、以下の残基：＋９９、＋１０１、＋１０３、＋１０４、＋１０７、＋１２３、＋２７、＋１０５、＋１０９、＋１２６、＋１２８、＋１３５、＋１５６、＋１６６、＋１９５、＋１９７、＋２０４、＋２０６、＋２１０、＋２１６、＋２１７、＋２１８、＋２２２、＋２６０、＋２６５および／または＋２７４のうち１以上とに相当し、その番号位置はBacillus amyloliquefaciensの天然ズブチリシンあるいは他のカルボニルヒドロラーゼまたはズブチリシン（例えば、Bacillus lentus ズブチリシン）の相当アミノ酸残基に対応する）、および（ｂ）プロテアーゼ酵素と適合する１種以上のクリーニング組成物物質を含んでなるクリーニング組成物に関する。
【０００７】
本発明は、本明細書に記載されたカルボニルヒドロラーゼ変種であるプロテアーゼ酵素と物品を接触させることからなる、クリーニングの必要な物品のクリーニング方法にも関する。したがって、本発明には、好ましくは撹拌下で上記布帛を上記プロテアーゼ酵素含有水性液と接触させることからなる、布帛クリーニング方法も含んでなる。その方法は約６０℃以下の温度で行えるが、もちろん沸騰までの洗濯温度でればかなり有効である。本発明は、クリーニングの必要な皿を本明細書に記載されたようなプロテアーゼ酵素と接触させることからなる、皿のクリーニング方法にも関する。本発明の方法には身体の洗浄方法も含まれ、その方法はクリーニングの必要なヒトまたはそれより下等の動物身体の部分を本明細書に記載されたようなプロテアーゼ酵素と接触させることからなる。
【０００８】
【発明の実施の形態】
１．プロテアーゼ酵素：
本発明には、非天然カルボニルヒドロラーゼ変種であるプロテアーゼ酵素が含まれ、この酵素はそれが誘導される前駆カルボニルヒドロラーゼと比較して、異なるタンパク質分解活性、安定性、基質特異性、ｐＨプロフィルおよび／または性能特徴を有する。前駆カルボニルヒドロラーゼは天然カルボニルヒドロラーゼでもまたは組換えヒドロラーゼであってもよい。このカルボニルヒドロラーゼ変種は天然でみられないアミノ酸配列を有しており、異なるアミノ酸による前駆カルボニルヒドロラーゼの「複数アミノ酸残基」の置換により誘導されている。前駆酵素の「複数アミノ酸残基」は＋７６位と、以下の残基：＋９９、＋１０１、＋１０３、＋１０４、＋１０７、＋１２３、＋２７、＋１０５、＋１０９、＋１２６、＋１２８、＋１３５、＋１５６、＋１６６、＋１９５、＋１９７、＋２０４、＋２０６、＋２１０、＋２１６、＋２１７、＋２１８、＋２２２、＋２６０、＋２６５および／または＋２７４のうち１以上とに相当し、その番号位置はBacillus amyloliquefaciensの天然ズブチリシンあるいは他のカルボニルヒドロラーゼまたはズブチリシン、例えばBacillus lentus ズブチリシンの相当アミノ酸残基に対応する。
【０００９】
本発明による組成物で有用なプロテアーゼ酵素であるカルボニルヒドロラーゼ変種は、アミノ酸残基＋７６位の置換を、一以上の追加修飾と共に有する。好ましくは、本発明において有用な変種プロテアーゼ酵素は下記組合せ：76/99; 76/101; 76/103; 76/104; 76/107; 76/123; 76/99/101; 76/99/103; 76/99/104; 76/101/103; 76/101/104; 76/103/104; 76/104/107; 76/104/123; 76/107/123; 76/99/101/103; 76/99/101/104; 76/99/103/104; 76/101/103/104; 76/103/104/
123; 76/104/107/123; 76/99/101/103/104; 76/99/103/104/123; 76/99/101/103/104/123; 76/103/104/128; 76/103/104/260; 76/103/104/265; 76/103/104/197；76/103/104/105; 76/103/104/135; 76/103/104/126; 76/103/104/107; 76/103/ 104/210; 76/103/104/126/265 および／または 76/103/104/222 においてアミノ酸残基の置換、欠失または挿入を有する。最も好ましくは、本発明において有用な変種酵素は残基の下記組合せ：Ｂ．amyloliquefaciens ズブチリシンの76/99;76/104; 76/99/104; 76/103/104; 76/104/107; 76/101/103/104; 76/99/101/103/104および 76/101/104 においてアミノ酸残基の置換、欠失または挿入を有する。
【００１０】
このようなカルボニルヒドロラーゼまたはズブチリシン変種をコードする変種ＤＮＡ配列は、天然または組換え前駆酵素をコードする前駆ＤＮＡ配列から誘導される。変種ＤＮＡ配列は、Bacillus amyloliquefaciensにおいて７６、９９、１０１、１０３、１０４、１０７、１２３、２７、１０５、１０９、１２６、１２８、１３５、１５６、１６６、１９５、１９７、２０４、２０６、２１０、２１６、２１７、２１８、２２２、２６０、２６５および／または２７４位あるいはそのいずれかの組合せに相当する前駆ＤＮＡ配列によりコードされる１以上の特定アミノ酸残基の置換についてコードするように前駆ＤＮＡ配列を修飾することにより誘導される。ここで修飾について特定されたアミノ酸残基は（すべてのズブチリシンで残基位置を特定する上で常法になった）Ｂ．amyloliquefaciens に適用しうる番号付けに従い特定されているが、本発明において有用な好ましい前駆ＤＮＡ配列は図１０〜１２で示されたようなBacillus lentus のＤＮＡ配列である（Seq.ID No.11）。
【００１１】
これらの変種ＤＮＡ配列は、１以上の追加修飾と共にアミノ酸残基７６の挿入または置換についてコードしている。好ましくは、変種ＤＮＡ配列は下記組合せ：76/99; 76/101; 76/103; 76/104; 76/107; 76/123; 76/99/101; 76/99/103; 76/99/104; 76/101/103; 76/101/104; 76/103/104; 76/104/107; 76/104/123; 76/107/123; 76/99/101/103; 76/99/101/104; 76/99/103/104; 76/101/103/104; 76/103/104/123; 76/104/107/123; 76/99/101/103/104; 76/99/103/104/123; 76/99/101/103/104/123; 76/103/104/128; 76/103/104/260; 76/103/104/265; 76/103/104/197; 76/103/104/105; 76/103/104/135; 76/103/104/126; 76/103/104/107; 76/103/104/210; 76/103/104/126/265および／または 76/103/104/222 でアミノ酸残基の置換または挿入についてコードしている。最も好ましくは、変種ＤＮＡ配列は残基の下記組合せ：76/99; 76/104; 76/99/104; 76/103/104; 76/104/107; 76/101/103/104; 76/99/101/103/104 および 76/101/104 の修飾についてコードしている。これらの組換えＤＮＡ配列は、一般的に前駆カルボニルヒドロラーゼＤＮＡ配列によりコードされる酵素の同性質とは実質的に異なる少くとも１つの性質と、新規アミノ酸配列を有する、カルボニルヒドロラーゼ変種についてコードしている。このような性質にはタンパク質分解活性、基質特異性、安定性、変化したｐＨプロフィルおよび／または向上した性能特徴が含まれる。
【００１２】
ここで有用なプロテアーゼ酵素は、表示されたアミノ酸残基位置で１９種天然Ｌ‐アミノ酸のうちいずれかの置換を有している。このような置換はいかなる前駆ズブチリシン（原核、真核、哺乳動物など）においても行える。この出願全般にわたり、共通１および３文字コードで様々なアミノ酸を表している。このようなコードはDale,J.W.(1989),Molecular Genetics of Bacteria,John Wiley & Sons,Ltd.,Appendix Bと同じである。
【００１３】
好ましくは、特定アミノ酸残基位置の各々で行われる置換には、７６位におけるＤ、Ｈ、Ｅ、Ｇ、Ｆ、Ｋ、ＰおよびＮを含めた置換；９９位におけるＤ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、ＧおよびＳを含めた置換；１０１位におけるＧ、Ｄ、Ｋ、Ｌ、Ａ、Ｅ、ＳおよびＲを含めた置換；１０３位におけるＱ、Ｔ、Ｄ、Ｅ、Ｙ、Ｋ、Ｇ、Ｒ、ＳおよびＡを含めた置換；１０４位における全１９種天然アミノ酸を含めた置換；１２３位におけるＮ、Ｔ、Ｉ、Ｇ、Ａ、ＣおよびＳを含めた置換；２７位におけるＫ、Ｎ、Ｃ、ＶおよびＴを含めた置換；１０５位におけるＡ、Ｄ、Ｇ、ＲおよびＮを含めた置換；１０７位におけるＡ、Ｌ、Ｖ、Ｙ、Ｇ、Ｆ、Ｔ、ＳおよびＡを含めた置換；１０９位におけるＳ、Ｋ、Ｒ、Ａ、ＮおよびＤを含めた置換；１２６位におけるＡ、Ｆ、Ｉ、ＶおよびＧを含めた置換；１２８位におけるＧ、ＬおよびＡを含めた置換；１３５位におけるＡ、Ｆ、Ｉ、ＳおよびＶを含めた置換；１５６位におけるＤ、Ｅ、Ａ、Ｇ、ＱおよびＫを含めた置換；１６６位における全１９種天然アミノ酸を含めた置換；１９５位におけるＥを含めた置換；１９７位におけるＥを含めた置換；２０４位におけるＡ、Ｇ、Ｃ、ＳおよびＤを含めた置換；２０６位におけるＬ、Ｙ、Ｎ、ＤおよびＥを含めた置換；２１０位におけるＬ、Ｉ、Ｓ、ＣおよびＦを含めた置換；２１６位におけるＶ、Ｅ、ＴおよびＫを含めた置換；２１７位における全１９種天然アミノ酸を含めた置換；２１８位におけるＳ、Ａ、Ｇ、ＴおよびＶを含めた置換；２２２位における全１９種天然アミノ酸を含めた置換；２６０位におけるＰ、Ｎ、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｃ、ＫおよびＤを含めた置換；２６５位におけるＮ、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｃ、Ｋ、ＹおよびＨを含めた置換；２７４位におけるＡおよびＳを含めた置換があるが、これらに制限されない。このような各位置で置換される特に好ましいアミノ酸は下記表Ｉで表示されている。特定のアミノ酸が表Ｉで示されているが、いかなるアミノ酸も特定残基で置き換わっていてよいことが理解されるべきである。
【００１４】
0003776244.tif 000002
【００１５】
Bacillus amyloliquefaciensズブチリシンの＋７６に相当するアミノ酸残基においてＢ．lentusズブチリシンでインビトロ変異を有するこれらのプロテアーゼ酵素は、前駆ズブチリシンにはない変化した安定性（例えば、修正された自己タンパク質分解安定性）を示すズブチリシン変種を生じる（表IVおよびVI参照）。
【００１６】
しかも、Bacillus amyloliquefaciensズブチリシンにおいて＋９９、＋１０１、＋１０３、＋１０４、＋１０７、＋１２３、＋２７、＋１０５、＋１０９、＋１２６、＋１２８、＋１３５、＋１５６、＋１６６、＋１９５、＋１９７、＋２０４、＋２０６、＋２１０、＋２１６、＋２１７、＋２１８、＋２２２、＋２６０、＋２６５および／または＋２７４に相当する残基のインビトロ変異は、単独でまたは互いの組合せで、＋７６変異と一緒になって、変化したタンパク質分解活性、変化した熱安定性、変化したｐＨプロフィル、変化した基質特異性および／または変化した性能特徴を示すズブチリシン変種を生じる。
【００１７】
カルボニルヒドロラーゼは、Ｃ（Ｏ）‐Ｘ結合（Ｘは酸素または窒素である）を有した化合物を加水分解するプロテアーゼ酵素である。それらには天然カルボニルヒドロラーゼおよび組換えカルボニルヒドロラーゼがある。天然カルボニルヒドロラーゼには主としてヒドロラーゼ、例えばズブチリシンまたはメタロプロテアーゼのようなペプチドヒドロラーゼがある。ペプチドヒドロラーゼとしてはα‐アミノアシルペプチドヒドロラーゼ、ペプチジルアミノ酸ヒドロラーゼ、アシルアミノヒドロラーゼ、セリンカルボキシペプチダーゼ、メタロカルボキシペプチダーゼ、チオールプロテイナーゼ、カルボキシルプロテイナーゼおよびメタロプロテイナーゼがある。セリン、メタロ、チオールおよび酸プロテアーゼと、エンドおよびエキソプロテアーゼが含まれる。
【００１８】
“組換えカルボニルヒドロラーゼ”とは、天然カルボニルヒドロラーゼをコードするＤＮＡ配列が、カルボニルヒドロラーゼアミノ酸配列において１以上のアミノ酸の置換、挿入または欠失についてコードする変異ＤＮＡ配列を生じるように修飾されてなる、カルボニルヒドロラーゼを意味する。適切な修飾法は本明細書、ならびに米国特許第４，７６０，０２５号（ＲＥ３４，６０６）、米国特許第５，２０４，０１５号および米国特許第５，１８５，２５８号明細書に開示されており、それらの開示は引用することにより本明細書の開示の一部とされる。
【００１９】
ズブチリシンは、タンパク質またはペプチドのペプチド結合を開裂するように通常作用する細菌または真菌カルボニルヒドロラーゼである。ここで用いられる“ズブチリシン”とは天然ズブチリシンまたは組換えズブチリシンを意味する。天然ズブチリシンのシリーズは様々な微生物種により産生されて、しばしば分泌されることが知られている。このシリーズのメンバーのアミノ酸配列は完全に相同的ではない。しかしながら、このシリーズのズブチリシンは同一または類似タイプのタンパク質分解活性を示す。この種のセリンプロテアーゼは、それらとキモトリプシン関連のセリンプロテアーゼとを区別する触媒三残基(catalytic triad)を規定する共通アミノ酸配列を有している。ズブチリシンおよびキモトリプシン関連セリンプロテアーゼの双方はアスパラギン酸、ヒスチジンおよびセリンからなる触媒三残基を有している。ズブチリシン関連プロテアーゼにおいて、これらアミノ酸の相対順序は、アミノからカルボキシ末端にかけて読取ると、アスパラギン酸‐ヒスチジン‐セリンである。しかしながら、キモトリプシン関連プロテアーゼでは、相対順序がヒスチジン‐アスパラギン酸‐セリンである。このため、本ズブチリシンはズブチリシン関連プロテアーゼの触媒三残基を有するセリンプロテアーゼに関する。例には本図６、７で特定されたズブチリシンがあるが、それに限定されない。
【００２０】
“組換えズブチリシン”とは、ズブチリシンをコードするＤＮＡ配列が天然ズブチリシンアミノ酸配列で１以上のアミノ酸の置換、欠失または挿入についてコードする変種（または変異）ＤＮＡ配列を生じるように修飾されたズブチリシンを意味する。このような修飾を生じて、本明細書において開示されたものと組み合わせてもよい適切な方法には、米国特許第４，７６０，０２５号（ＲＥ３４，６０６）、米国特許第５，２０４，０１５号および米国特許第５，１８５，２５８号明細書に開示されものがある。
【００２１】
“非ヒトカルボニルヒドロラーゼ”およびそれらをコードするＤＮＡは、多くの原核および真核生物から得られる。原核生物の適切な例には、E.coliまたはPseudomonas のようなグラム陰性生物と、Micrococcus またはBacillusのようなグラム陽性細菌がある。カルボニルヒドロラーゼおよびそれらの遺伝子が得られる真核生物の例には、Saccharomyces cerevisiaeのような酵母、Aspergillus sp．のような真菌と、非ヒト哺乳動物源、例えばカルボニルヒドロラーゼキモシンついてコードする遺伝子が得られるウシsp. がある。ズブチリシンの場合のように、カルボニルヒドロラーゼシリーズは、そのシリーズのメンバー間で完全に相同的ではないアミノ酸配列を有するが、それでもなお同一または類似タイプの生物活性を示す、様々な関連種から得られる。このため、ここで用いられるような非ヒトカルボニルヒドロラーゼは、原核および真核源と直接または間接的に関連したカルボニルヒドロラーゼに関する機能的規定を有する。
【００２２】
“カルボニルヒドロラーゼ変種”は、“前駆カルボニルヒドロラーゼ”のアミノ酸配列から誘導されたアミノ酸配列を有する。前駆カルボニルヒドロラーゼ（例えばズブチリシン）には天然カルボニルヒドロラーゼ（ズブチリシン）および組換えカルボニルヒドロラーゼ（ズブチリシン）がある。カルボニルヒドロラーゼ変種のアミノ酸配列は、前駆アミノ酸配列の１以上のアミノ酸の置換、欠失または挿入により、前駆ヒドロラーゼアミノ酸配列から“誘導”される。このような修飾は、前駆カルボニルヒドロラーゼ（ズブチリシン）酵素自体の操作よりもむしろ、前駆カルボニルヒドロラーゼ（ズブチリシン）のアミノ酸配列をコードする“前駆ＤＮＡ配列”においてなされるものである。前駆ＤＮＡ配列のこのような操作に適した方法には本明細書において開示された方法と、当業者に公知の方法がある（例えば、ＥＰ  Ｏ  ３２８２９９、ＷＯ８９／０６２７９とそこで既に参照された米国特許および出願参照）。
【００２３】
Bacillus amyloliquefaciensズブチリシンの下記位置：＋９９、＋１０１、＋１０３、＋１０４、＋１０７、＋１２３、＋２７、＋１０５、＋１０９、＋１２６、＋１２８、＋１３５、＋１５６、＋１６６、＋１９５、＋１９７、＋２０４、＋２０６、＋２１０、＋２１６、＋２１７、＋２１８、＋２２２、＋２６０、＋２６５および／または＋２７４のうち１以上と共に＋７６位に相当する特定残基が本発明においては変異のために特定されている。好ましくは、修飾される残基は下記組合せ76/99; 76/101; 76/103; 76/104; 76/107; 76/123;76/99/101; 76/99/103; 76/99/104; 76/101/103; 76/101/104; 76/103/104;76/104/107; 76/104/123; 76/107/123; 76/99/101/103; 76/99/101/104; 76/99/103/104; 76/101/103/104; 76/103/104/123; 76/104/107/123; 76/99/101/103/104; 76/99/103/104/123; 76/99/101/103/104/123; 76/103/104/128; 76/103/104/260；76/103/104/265; 76/103/104/197; 76/103/104/105; 76/103/104/135; 76/103/ 104/126; 76/103/104/107; 76/103/104/210; 76/103/104/126/265 および／または 76/103/104/222 、最も好ましくは76/99; 76/104; 76/99/104; 76/103/104; 76/104/107; 76/101/103/104; 76/99/101/103/104 および 76/101/104 から選択される。これらのアミノ酸位置番号は、図１〜図４で表された成熟Bacillus amyloliquefaciensズブチリシン配列に当てはめられた場合に関する。しかしながら、本発明において有用なプロテアーゼ酵素はこの具体的ズブチリシンの変異に制限されず、Bacillus amyloliquefaciensズブチリシンの具体的な特定残基に“相当”する位置でアミノ酸残基を有する前駆カルボニルヒドロラーゼにもおよぶ。好ましくは、前駆ズブチリシンはBacillus lentus ズブチリシンであり、置換、欠失または挿入は上記場合に対応するＢ．lentusの相当アミノ酸残基において行われる。
【００２４】
前駆カルボニルヒドロラーゼの残基（アミノ酸）は、それが相同的である（即ち、一次または三次構造の位置に対応する）ならばBacillus amyloliquefaciensズブチリシンの残基に対応するか、あるいはBacillus amyloliquefaciensズブチリシンにおける特定残基またはその残基の一部と類似している（即ち、化学的に化合、反応または相互作用する上で同一または類似した機能的能力を有する）。
【００２５】
一次構造とのホモロジーを確立するために、前駆カルボニルヒドロラーゼのアミノ酸配列はBacillus amyloliquefaciensズブチリシン一次配列、特に配列が公知であるズブチリシンにおいて非変種であることが知られた残基セットと直接比較される。図５は amyloliquefaciensズブチリシンとＢ．lentusズブチリシンとの間における保存残基について示している。保存残基を並べて、並びを維持する（即ち、予定にない欠失および挿入による保存残基の除去を避ける）ために必要な挿入および欠失を行った後、Bacillus amyloliquefaciensズブチリシンの一次配列にある特定アミノ酸に相当する残基が明らかにされる。保存残基の並びは、好ましくはこのような残基の１００％を保存しているべきである。しかしながら、保存残基の７５％以上または５０％もの少ない並びでも、相当残基を明らかにする上で十分である。触媒三残基Ａｓｐ３２／Ｈｉｓ６４／Ｓｅｒ２２１の保存は維持されているべきである。
【００２６】
例えば、図６および図７において、Bacillus amyloliquefaciens、Bacillus subtillis、Bacillus licheniformis(carisbergensis)およびBacillus lentus のズブチリシンのアミノ酸配列はアミノ酸配列間で最大のホモロジー量を与えるように並べられている。これら配列の比較では、各配列に多くの保存残基が含まれていることを示している。これらの保存残基（ＢＰＮ′およびＢ．lentus間）は図５で特定されている。
【００２７】
このため、これらの保存残基は、Bacillus lentus のズブチリシン（１９８９年７月１３日付で公開されたＰＣＴ公開Ｎｏ．ＷＯ８９／０６２７９）、ここで好ましいズブチリシン前駆酵素、または好ましいBacillus lentus ズブチリシンと高度に相同的であるＰＢ９２として称されるズブチリシン（ＥＰＯ  ３２８２９９）のような他のカルボニルヒドロラーゼで、Bacillus amyloliquefaciensズブチリシンの対応する相当アミノ酸残基を明らかにするために用いられる。これらズブチリシンのうちあるもののアミノ酸配列が、保存残基の最大ホモロジーを生じるBacillus amyloliquefaciensズブチリシンの配列と共に、図６および図７において並べられている。この図にみられるように、Bacillus amyloliquefaciensズブチリシンと比較してBacillus lentus の配列にいくつかの欠失がある。このため、例えば、他のズブチリシンにおいてBacillus amyloliquefaciensズブチリシンのＶａｌ１６５に相当するアミノ酸は、Ｂ．lentusおよびＢ．licheniformis の場合にイソロイシンである。
【００２８】
このため、例えば、＋７６位のアミノ酸はＢ．amyloliquefaciens およびＢ．lentusズブチリシン双方でアスパラギン（Ｎ）である。しかしながら、本発明において有用な好ましいズブチリシン変種において、Bacillus amyloliquefaciensズブチリシンで＋７６に相当するアミノ酸はアスパラギン酸（Ｄ）で置換されている。ここで置換について特定されたすべてのアミノ酸残基 vs.このような各位置で好ましい置換の比較は、説明目的で表IIに示されている。
【００２９】
0003776244.tif 000003
相当残基は、三次構造がＸ線結晶学で決定された前駆カルボニルヒドロラーゼの三次構造レベルでホモロジーを調べることにより明らかにしてもよい。相当残基は、前駆カルボニルヒドロラーゼおよびBacillus amyloliquefaciensズブチリシンの特定アミノ酸残基の２以上の主鎖原子（ＮとＮ、ＣＡとＣＡ、ＣとＣ、およびＯとＯ）の原子座標が並べた後に０．１３ｎｍ、好ましくは０．１ｎｍ以内である場合として明らかにされる。ベストモデルがBacillus amyloliquefaciensズブチリシンに対して問題のカルボニルヒドロラーゼの非水素タンパク質原子の原子座標の最大オーバーラップを与えるように配向および配置された後で、並びが実現される。ベストモデルは利用できる最高解像能で実験回折データについて最低Ｒ因子を与える結晶学モデルである。
【００３０】
0003776244.tif 000004
【００３１】  Bacillus amyloliquefaciensズブチリシンの特定残基と機能的に類似した相当残基とは、それらがBacillus amyloliquefaciensズブチリシンの特定残基に限られかつ属するやり方でタンパク質構造、基質結合性または触媒作用を変更、修飾またはそれに寄与するようなコンホメーションをとる前駆カルボニルヒドロラーゼのアミノ酸として規定される。更に、それらは、所定残基の主鎖原子が相同位置を占めることに基づく一致性の基準を満たさないが、残基の側鎖原子の少くとも２つの原子座標がBacillus amyloliquefaciensズブチリシンの対応側鎖原子の０．１３ｎｍ内に存在する程度まで類似した位置を占める（三次構造がＸ線結晶学で得られた）前駆カルボニルヒドロラーゼの残基である。Bacillus amyloliquefaciensズブチリシンの三次元構造の座標はＥＰＯ公開Ｎｏ．０  ２５１  ４４６（米国特許出願第０８／２１２，２９１号に相当する、その開示は引用することにより本明細書の開示の一部とされる）に示され、三次構造のレベルで相当残基を決めるために上記のように使用できる。
【００３２】
置換、挿入または欠失について特定された残基の一部は保存残基であるが、その他はそうではない。保存されていない残基の場合、１以上のアミノ酸の置換は天然でみられるものに相当しないアミノ酸配列を有する変種を生じる置換に限定される。保存残基の場合、このような置換は天然配列で起こらないはずである。本発明において有用なカルボニルヒドロラーゼ変種には、カルボニルヒドロラーゼ変種の成熟形とこのようなヒドロラーゼ変種のプロおよびプレプロ形がある。プレプロ形は、これがカルボニルヒドロラーゼ変種の発現、分泌および成熟を促進することから、好ましい構造である。
【００３３】
“プロ配列”とは、除去されたときにカルボニルヒドロラーゼの“成熟”形を出現させる、カルボニルヒドロラーゼの成熟形のＮ末端部分に結合されたアミノ酸の配列に関する。多くのタンパク質分解酵素が翻訳プロ酵素産物として天然でみられ、翻訳後プロセッシングがないとこのまま発現される。カルボニルヒドロラーゼ変種、特にズブチリシン変種を生じる好ましいプロ配列はBacillus amyloliquefaciensズブチリシンの推定プロ配列であるが、他のズブチリシンプロ配列も用いてよい。例では、Bacillus lentus （ＡＴＣＣ  ２１５３６）のズブチリシンの推定プロ配列が用いられる。
【００３４】
“シグナル配列”または“プロ配列”とは、カルボニルヒドロラーゼのＮ末端部分、あるいはヒドロラーゼの成熟またはプロ形の分泌に関与するプロヒドロラーゼのＮ末端部分に結合されたアミノ酸の配列に関する。シグナル配列のこの定義は機能的なもので、天然条件下でズブチリシンまたは他のカルボニルヒドロラーゼの分泌の実施に関与するズブチリシン遺伝子または他の分泌性カルボニルヒドロラーゼのＮ末端部分によりコードされるすべてのアミノ酸配列を含めた意味である。本発明で有用なプロテアーゼ酵素は、ここで記載されたカルボニルヒドロラーゼ変種の分泌を行うためにこのような配列を利用する。例で用いられる好ましいシグナル配列は、Bacillus lentus （ＡＴＣＣ  ２１５３６）ズブチリシンのシグナル配列の残部に融合されたBacillus amyloliquefaciensズブチリシンからのシグナル配列の初めの７アミノ酸残基を含んでなる。
【００３５】
カルボニルヒドロラーゼ変種の“プレプロ”形は、ヒドロラーゼのアミノ末端に作動的に結合されたプロ配列と、プロ配列のアミノ末端に作動的に結合された“プレ”または“シグナル”配列とを有する、ヒドロラーゼの成熟形からなる。
【００３６】
“発現ベクター”とは、適切な宿主でＤＮＡの発現を行える適切な制御配列に作動的に結合されたＤＮＡ配列を含むＤＮＡ組立体に関する。このような制御配列には、転写を行うプロモーター、このような転写を制御する任意オペレーター配列、適切なｍＲＮＡリボソーム結合部位についてコードする配列と、転写および翻訳の終結を制御する配列を含んでいる。ベクターはプラスミド、ファージ粒子または単純に可能なゲノムインサートである。適切な宿主に形質転換されると、ベクターは宿主ゲノムから独立して複製および機能するか、あるいは一部の場合にはゲノム自体の中に組み込まれる。本明細書において、“プラスミド”および“ベクター”は時々互換的に用いられるが、プラスミドが現在最も常用される形のベクターである。しかしながら、相当する機能を発揮して、当業界で知られるかまたは知られるようになった、このような他の形の発現ベクターもここに含まれる。
【００３７】
本発明で用いられる“宿主細胞”は、通常それらを酵素的に活性なエンドプロテアーゼを分泌しないように操作された、好ましくは米国特許第４，７６０，０２５号（ＲＥ３４，６０６）で開示された方法により操作された、原核または真核宿主である。ズブチリシンを発現させる上で好ましい宿主細胞は、酵素的に活性な天然プロテアーゼおよびアルカリプロテアーゼ（ズブチリシン）を欠くBacillus株ＢＧ２０３６である。株ＢＧ２０３６の作成は米国特許第５，２６４，３６６号明細書で詳細に記載されている。ズブチリシンを発現させる上で他の宿主細胞には、Bacillus subtilis １１６８（米国特許第４，７６０，０２５号（ＲＥ３４，６０６）および米国特許第５，２６４，３６６号明細書でも記載されており、それらの開示は引用することにより本明細書の開示の一部とされる）とＢ．licheniformis 、Ｂ．lentusなどのようないずれか適切なBacillus株がある。
【００３８】
宿主細胞は組換えＤＮＡ技術を用いて作成されたベクターで形質転換またはトランスフェクトされる。このような形質転換された宿主細胞は、カルボニルヒドロラーゼ変種をコードするかまたは望ましいカルボニルヒドロラーゼ変種を発現するベクターを複製することができる。カルボニルヒドロラーゼ変種のプレおよびプレプロ形についてコードするベクターの場合、このような変種は発現されると、典型的には宿主細胞から宿主細胞媒体中に分泌される。
【００３９】
“作動的に結合された”とは、２つのＤＮＡ領域間の関係について表すとき、それらが互いに機能的に関連していることを単純に意味する。例えば、プレ配列は、それがシグナル配列として機能して、タンパク質の成熟形の分泌に関与し、おそらくシグナル配列を開裂させるならば、ペプチドに作動的に結合されている。プロモーターはそれが配列の転写を制御するならばコード配列に作動的に結合されており、リボソーム結合部位はそれが翻訳を行えるように配置されているならばコード配列に作動的に結合されている。
【００４０】
天然前駆カルボニルヒドロラーゼをコードする遺伝子は、当業者に知られる一般的方法に従い得られる。その方法では通常目的のヒドロラーゼの領域をコードする推定配列を有した標識プローブを合成し、ヒドロラーゼを発現する生物からゲノムライブラリーを作り、プローブとのハイブリッド形成により目的とする遺伝子についてライブラリーをスクリーニングする。次いで、陽性ハイブリッド形成クローンの酵素地図が作成され、配列決定される。例で用いられるＢ．lentus遺伝子は米国特許第５，１８５，２５８号明細書の例１で記載されたようにクローニングされ、その開示は引用することにより本明細書の開示の一部とされる。例で用いられるＢＰＮ′遺伝子はＲＥ３４，６０６明細書の例１で記載されたようにクローニングされ、その開示は引用することにより本明細書の開示の一部とされる。
【００４１】
次いで、クローン化カルボニルヒドロラーゼが宿主細胞を形質転換してヒドロラーゼを発現させるために用いられる。次いでヒドロラーゼ遺伝子は高コピー数プラスミドに結合される。このプラスミドは、それがプラスミド複製に必要な周知要素：即ち問題の遺伝子に作動的に結合されたプロモーター（それが宿主により認識、即ち転写されるならば、遺伝子自体の相同的プロモーターとして供給される）、外来性であるかまたはヒドロラーゼ遺伝子の内在ターミネーター領域により供給される（ある真核宿主細胞のヒドロラーゼ遺伝子から宿主で転写されたｍＲＮＡの安定性にとり必要な）転写終結およびポリアデニル化領域と、望ましくは抗生物質含有培地中の増殖でプラスミド感染宿主細胞の連続培養維持を行える抗生物質耐性遺伝子のような選択遺伝子を含んでいるという意味で、宿主で複製される。高コピー数プラスミドは宿主用の複製起点も含み、それにより染色体制限なしに細胞質で多数のプラスミドを生成させることができる。しかしながら、ヒドロラーゼ遺伝子の多数コピーを宿主ゲノム中に組込むこともこの本範囲に含まれる。これは、特に相同的組換えを受けやすい原核および真核生物で容易化される。
【００４２】
本例で用いられる遺伝子は天然Ｂ．lentus遺伝子および天然Ｂ．amyloliquefaciens 遺伝子である。一方、天然または変異前駆カルボニルヒドロラーゼ（ズブチリシン）についてコードする合成遺伝子も作成してよい。このようなアプローチで、前駆ヒドロラーゼ（ズブチリシン）のＤＮＡおよび／またはアミノ酸配列が決定される。その後多数の重複合成一本鎖ＤＮＡ断片が合成され、ハイブリッド形成および結合により前駆ヒドロラーゼについてコードする合成ＤＮＡを生じる。合成遺伝子作成例は米国特許第５，２０４，０１５号明細書の例３で示され、その開示は引用することにより本明細書の開示の一部とされる。
【００４３】
天然または合成前駆カルボニルヒドロラーゼ遺伝子がクローニングされると、いくつかの修飾が天然前駆カルボニルヒドロラーゼの合成以外にも遺伝子の使用を高めるために行われる。このような修飾には、米国特許第４，７６０，０２５号（ＲＥ３４，６０６）およびＥＰＯ公開第０  ２５１  ４４６号明細書で開示されたような組換えカルボニルヒドロラーゼの生産と、ここで記載されたカルボニルヒドロラーゼ変種の生産がある。
【００４４】
下記カセット変異誘発法も本発明で有用なカルボニルヒドロラーゼ変種の作成および同定を容易にするために用いられるが、部位特異的変異誘発を含めた他の方法も用いてよい。最初に、ヒドロラーゼについてコードする天然遺伝子が得られ、全部または一部が配列決定される。次いで配列がコードされた酵素で１以上のアミノ酸の変異（欠失、挿入または置換）を行うことが望まれる箇所について走査される。この箇所に隣接する配列は、発現されたときに様々な変異体についてコードするオリゴヌクレオチドプールで遺伝子の短いセグメントを置換するための制限部位の存在について評価される。このような制限部位は、好ましくは遺伝子セグメントの置換を容易にするためにヒドロラーゼ遺伝子内で独特な部位である。しかしながら、ヒドロラーゼ遺伝子で過度に重複していない好都合な制限部位はいずれも用いうるが、但し制限切断で作られた遺伝子断片は適正な配列で再アセンブリーできねばならない。制限部位が選択された箇所から好都合な距離内の位置（１０〜１５ヌクレオチド）に存在しないならば、このような部位は読取枠だけでなくコードされたアミノ酸も最終作成で変わらないように遺伝子でヌクレオチドを置換させることにより作成される。その配列を変えて望ましい配列にするための遺伝子の変異は、通常知られる方法に従いＭ１３プライマー伸長により行われる。適切な隣接領域を配置して、２つの好都合な制限部位配列にするために必要な変化を評価する作業は、遺伝子コードの重複性、遺伝子の制限酵素地図および多数の異なる制限酵素によりルーチン化される。好都合な隣接制限部位が利用しうるならば、上記方法は部位を含まない隣接領域だけと併用される必要があることに留意すべきである。
【００４５】
天然ＤＮＡまたは合成ＤＮＡがクローニングされると、変異される位置に隣接した制限部位は同族制限酵素で切断され、複数の末端相補オリゴヌクレオチドカセットがその遺伝子に結合される。変異誘発は、すべてのオリゴヌクレオチドが同様の制限部位を有するように合成できて、合成リンカーが制限部位を作成する上で不要であるため、この方法により簡易化される。
【００４６】
ここで用いられるタンパク質分解活性は、活性酵素ｍｇ当たりのペプチド結合の加水分解速度として規定される。多くの周知操作がタンパク質分解活性を測定するために存在する（K.M.Kalisz,"Microbial Proteinases",Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology,A.Fiechter ed.,1988）。修正タンパク質分解活性に加えてまたは代えて、本発明の変種酵素はＫｍ、Ｋｃａｔ、Ｋｃａｔ／Ｋｍ比および／または修正基質特異性および／または修正ｐＨ活性プロフィルのような他の修正された性質を有していてもよい。これらの酵素は、例えば洗濯用途のような加水分解プロセスで存在することが予想される特定基質用に作ることができる。
【００４７】
１つの目的は前駆カルボニルヒドロラーゼと比較して変化したタンパク質分解活性を有する変種カルボニルヒドロラーゼを得ることであり、そうすればこのような活性を（数値的に大きく）増加させて標的基質で更に効率的に作用するように酵素を使用できるようになるからである。前駆体と比較して変化した熱安定性および／または変化した基質特異性を有する変種酵素にも興味ある。好ましくは、変異されるカルボニルヒドロラーゼはズブチリシンである。Bacillus amyloliquefaciensズブチリシンの＋７６、＋９９、＋１０１、＋１０３、＋１０４、＋１０７、＋１２３、＋２７、＋１０５、＋１０９、＋１２６、＋１２８、＋１３５、＋１５６、＋１６６、＋１９５、＋１９７、＋２０４、＋２０６、＋２１０、＋２１６、＋２１７、＋２１８、＋２２２、＋２６０、＋２６５および／または＋２７４あるいはそれらいずれかの組合せに相当する残基においてズブチリシンタイプカルボニルヒドロラーゼでこのような結果を得るために有用な特定のアミノ酸が以下の実施例において示されている。一部の場合には、低いタンパク質分解活性が望ましい。逆に、一部の場合には、前駆体よりも変種酵素のタンパク質分解活性を増加させることが望まれる。加えて、アルカリまたは熱安定性であろうと、変種の安定性の増加または減少（変更）が望まれる。Ｋｃａｔ、ＫｍまたはＫｃａｔ／Ｋｍの増加または減少は、これらの動力学的パラメーターを決定するために用いられる基質に特異的である。
【００４８】
しかも、ズブチリシンでいくつか他の修飾と共に＋７６位に相当する残基は酵素の全体的安定性および／またはタンパク質分解活性を調節する上で重要なことがわかった。このため、例で示されたように、相当する＋７６位におけるBacillus lentus ズブチリシンのアスパラギン（Ｎ）は、得られる変異酵素で高い安定性および／または高い活性を生じるように、下記アミノ酸残基＋９９、＋１０１、＋１０３、＋１０４、＋１０７、＋１２３、＋２７、＋１０５、＋１０９、＋１２６、＋１２８、＋１３５、＋１５６、＋１６６、＋１９５、＋１９７、＋２０４、＋２０６、＋２１０、＋２１６、＋２１７、＋２１８、＋２２２、＋２６０、＋２６５および／または＋２７４のうち１以上の修飾と共に、好ましいプロテアーゼ酵素でアスパラギン酸（Ｄ）により置換することができる。
【００４９】
本発明で有用な最も好ましいプロテアーゼ酵素は例で示されている。これらには置換残基の下記特定組合せ：N76D/S99D 、N76D/V104I、N76D/S99D/V104I 、N76D/S103A/V1041、N76D/V1041/I107V、N76D/V104Y/I107VおよびN76D/S101R/S103A/V104Iがある。これらの置換は好ましくはBacillus lentus （組換えまたは天然型）ズブチリシンで行われるが、置換はいかなるBacillusズブチリシンで行ってもよい。
【００５０】
このおよび他の変種ズブチリシンで得られた結果に基づくと、Bacillus amyloliquefaciensの＋７６、＋９９、＋１０１、＋１０３、＋１０４、＋１０７、＋１２３、＋２７、＋１０５、＋１０９、＋１２６、＋１２８、＋１３５、＋１５６、＋１６６、＋１９５、＋１９７、＋２０４、＋２０６、＋２１０、＋２１６、＋２１７、＋２１８、＋２２２、＋２６０、＋２６５および／または＋２７４位に相当するカルボニルヒドロラーゼ（好ましくは、ズブチリシン）の残基が、これら酵素のタンパク質分解活性、性能および／または安定性と、このような変種酵素のクリーニングまたは洗浄性能にとり、重要であることは明らかである。
【００５１】
以下は本発明組成物で有用なプロテアーゼ酵素の製造例により示されている。
プロテアーゼ製造例
Ｂ．subtilisでＧＧ３６遺伝子発現用の作成
Ｂ．lentusからのズブチリシン遺伝子の発現のためのクローニングおよび作成は、米国特許第５，１８５，２５８号明細書で記載された場合と本質的に同様に行う。プラスミドＧＧＡ２７４（図８に記載）が図９で示されたように下記のやり方で更に修飾される。ＧＧＡ２７４プラスミドの作成時に導入されたＰｓｔＩ部位は、下記配列：５′ＧＡＡＧＣＴＧＣＡＡＣＴＣＧＴＴＡＡＡ３′（Seq.ID No.1 ）を有するオリゴヌクレオチドで、下記のオリゴヌクレオチド特異的変異誘発により除去される。下線“Ａ”残基は制限酵素ＰｓｔＩの認識配列を除いて、２７４位でアラニンからトレオニンに対応アミノ酸残基を変える。２７４位のトレオニンはクローン化Ｂ．lentusズブチリシン遺伝子配列で本来みられる野生型残基である。ズブチリシンについてコードするＤＮＡセグメントは、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ切断でプラスミドＧＧＡ２７４またはその誘導体（図９で示されたＧＧＴ２７４）から切り出される。ＤＮＡ断片は、変異誘発のために、ＭＰ１９のようなバクテリオファージＭ１３ベースベクター中に逆サブクローニングされる。変異誘発後、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄIII 切断、その後クローニングが、変異ズブチリシンタンパク質の発現および回収のために、ＧＧＡ２７４のような発現プラスミド中に変異ズブチリシン遺伝子を逆移動させる上で行われる。
【００５２】
オリゴヌクレオチド特異的変異誘発
オリゴヌクレオチド特異的変異誘発はZoller,M.et al.(1983),Methods Enzymol.,100:468-500で記載されたように行われる。例として、配列５′ＧＣＴＧＣＴＣＴＡＧＡＣＡＡＴＴＣＧ３′（Seq.ID No.2 ）の合成オリゴヌクレオチドが７６位のアミノ酸残基をアスパラギン（Ｎ）からアスパラギン酸（Ｄ）、即ちＮ７６Ｄに変えるために用いられる。下線“Ｇ”および“Ｃ”残基は野生型遺伝子配列からの変化を表す。ＣＡは＋７５位でロイシンを保ち、Ｘｂａｌ制限酵素のＸｂａｌ認識部位（ＴＣＴＡＧＡ）を導入するようにアミノ酸配列を変化させ、一方ＧＡＣの変化は＋７６のアスパラギンをアスパラギン酸に変化させる。
【００５３】
９９、１０１、１０３および１０４位の変異誘発には、異なるオリゴヌクレオチドが望ましい変異の組合せに応じて使用できる。例えば、配列５′ＧＴＡＴＴＡＧＧＧＧＣＧＧＡＣＧＧＴＣＧＡＧＧＣＧＣＣＡＴＣＡＧＣＴＣＧＡＴＴ３′（Seq.ID No.3 ）のオリゴヌクレオチドが単一ズブチリシン分子で下記変化：Ｓ９９Ｄ、Ｓ１０１Ｒ、Ｓ１０３ＡおよびＶ１０４Ｉを同時に行うために用いられる。同様に、配列５′ＴＣＡＧＧＴＴＣＧＧＴＣＴＣＧＡＧＣＧＴＴＧＣＣＣＡＡＧＧＡＴＴＧ３′（Seq.ID No.4 ）および５′ＣＡＣＧＴＴＧＣＴＡＧＣＴＴＧＡＧＴＴＴＡＧ３′（Seq.ID No.5 ）のオリゴヌクレオチドがＩ１０７ＶおよびＮ１２３Ｓを各々作るために利用される。同じく、下線残基はアミノ酸配列または制限酵素認識配列で望ましい変化を生じさせる野生型配列からの変化を表す。
【００５４】
ズブチリシン変種のタンパク質分解活性
前記オリゴヌクレオチド特異的変異誘発の方法に従い、表III で掲載された変種が作られる。これらズブチリシン変種の各々のタンパク質分解活性は表III で示されている。動力学的パラメーターｋｃａｔ、Ｋｍおよびｋｃａｔ／Ｋｍは、P.Bonneau et al.(1991) J.Am.Chem.Soc.,Vol.113,No.3,p.1030 に記載された方法を用いて、合成ペプチド基質サクシニル‐Ｌ‐Ａｌａ‐Ｌ‐Ａｌａ‐Ｌ‐Ｐｒｏ‐Ｌ‐Ｐｈｅ‐ｐ‐ニトロアニリドの加水分解に関して測定される。簡単にいえば、少量のズブチリシン変種ストック溶液がｐＨ８．６の０．１Ｍ Tris-ＨＣｌ緩衝液に溶解された基質を含む１ｃｍキュベットに加えられ、２５℃で恒温される。反応の進行は４１０ｎｍで反応生成物ｐ‐ニトロアニリンの吸光度をモニターすることにより分光測定で追跡される。動力学的パラメーターは、非直線回帰アルゴリズムを用いて各反応毎に反応速度および生成物濃度をMichaelis-Menten式に当てはめることにより得られる。
【００５５】
0003776244.tif 000005
0003776244.tif 000006
【００５６】
表III に掲載された結果は、試験されたズブチリシン変種のすべてがタンパク質分解活性を留めていることを示している。更に、データの詳しい分析では、タンパク質分解活性がBacillus amyloliquefaciensで７６、９９、１０１、１０３、１０４、１０７および１２３位に相当するアミノ酸残基において置換の様々な組合せによりBacillus lentus ズブチリシンで有意に変わっていることを示している。
【００５７】
ズブチリシン変種の熱安定性
前記オリゴヌクレオチド特異的変異誘発のプロセスにより作られた本発明のBacillus lentus ズブチリシンおよび変種で観察される熱安定性の比較は表IVで示されている。５０ｍＭ  ＣａＣｌ２含有または非含有０．１Ｍグリシン、０．０１％Tween-80ｐＨ１０．０中の精製酵素１５μg/mlを小さな管中に入れ、１０℃で５分間、１０〜６０℃で１分間および６０℃で２０分間インキュベートする。次いで管を氷上に１０分間おく。管からの一部は、２５℃に恒温された０．１Ｍ tris-ＨＣｌ緩衝液ｐＨ８．６に溶解された１．２ｍＭの合成ペプチド基質サクシニル‐Ｌ‐Ａｌａ‐Ｌ‐Ａｌａ‐Ｌ‐Ｐｒｏ‐Ｌ‐Ｐｈｅ‐ｐ‐ニトロアニリドを含有する１ｃｍキュベットへの添加により、酵素活性について調べる。初期の直線的反応速度は、時間の関数として４１０ｎｍで反応生成物ｐ‐ニトロアニリンの吸光度をモニターすることにより分光測定で追跡する。データは加熱前に対する活性％として表示される。表IVに掲載された結果は、大多数の変種（２６例中２４）が５０ｍＭ  ＣａＣｌ２添加試験条件下でBacillus lentus ズブチリシンに匹敵する熱安定性を発揮することを示している。５０ｍＭ  ＣａＣｌ２非添加試験条件下でも、大多数の変種（２６例中１９）がBacillus lentus ズブチリシンよりも有意に安定である。更に、変種N76D/S99D 、N76D/V104I、N76D/S99D/V104I 、N76D/S103A/V1041、N76D/V1041/I107V、N76D/V104Y/I107VおよびN76D/S101R/S103A/V104Iは５０ｍＭ  ＣａＣｌ２非添加試験条件下で単一置換変種Ｎ７６Ｄよりも有意に安定である。
【００５８】
0003776244.tif 000007
0003776244.tif 000008
【００５９】
ファージミドから作られた一本鎖ＤＮＡ鋳型による
オリゴヌクレオチド特異的変異誘発
Ａ．Ｂ．lentus変種の作成
変異誘発プロトコールはオリゴヌクレオチド特異的変異誘発で前記された場合と本質的に同様である。一本鎖ＤＮＡ鋳型はファージミド法で作る。一本鎖ＤＮＡ鋳型作成用のファージミドベクターを作成するために、我々はベクターｐＢＣＤＡＩＣＡＴを最初に作成した。ベクター作成のフローチャートは図１６、１７で示されている。初めに、ｐＣ１９４プラスミド（Horinouchi,S.and Weisblum,B.,J.Bacteriol.,150: 8-15,1982）のＣＡＴ遺伝子についてコードするＣ１ａＩ‐Ｃ１ａＩ断片をｐＵＣ１９（New England BioLabs,Beverly,MA）のポリリンカー領域のＡｃｃＩ部位中にクローニングしてプラスミドｐＵＣＣＨＬを作り、ＧＧ３６ＤＡＩコードＤＮＡの５′末端からのＥｃｏＲＩ‐ＤｒａＩ  ０．６ＫＢ断片をｐＢＳＫＳプラスミド（Stratagene,Inc.,San Diego,CA）のＥｃｏＲＩおよびＥｃｏＲＶ部位中にクローニングしてｐＢＣ２ＳＫ５を作る。プラスミドｐＢＣ２ＳＫ５の単一ＥｃｏＲＩ部位をＥｃｏＲＩ切断により除去し、その後Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ触媒で補充し、再結合させて、ＥｃｏＲＩ部位を有しないプラスミドｐＢＣ２ＳＫ‐５Ｒを作る。ｐＢＣＳＫ‐５Ｒ中にクローニングされたＥｃｏＲＩ‐ＤｒａＩ断片をＰｓｔＩ‐ＨｉｎｄIII 断片として単離し、ｐＵＣＣＨＬのＰｓｔＩ‐ＨｉｎｄIII 部位（ｐＵＣ１９のポリリンカーの一部）中にクローニングしてプラスミドｐＵＣＣＨＬ５Ｒを作る。ＧＧ３６ＤＡＩ遺伝子のコード配列をＥｃｏＲＩ‐ＢａｍＨＩ断片として切出し、ｐＵＣＣＨＬ５ＲのＥｃｏＲＩ‐ＢａｍＨＩ部位中にクローニングしてｐＵＣＣＡＴを作る。次いでｐＵＣＣＡＴの大きなＥｃｏＲＩ‐ＨｉｎｄIII 断片をＢＳ２ＫＳ＋のＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄIII 部位中にクローニングしてプラスミドｐＢＣＤＡＩＣＡＴを作る。
【００６０】
一本鎖ＤＮＡを作るために、ｐＢＣＤＡＩＣＡＴを含むE.coliをRessel,M.,Kidd,S.and Kelley,M.R.,GENE,45: 333-338,1986に記載されたプロトコールに従いファージＲ４０８（Stratagene,Inc.,San Diego,CAから得た）で感染させる。一本鎖ＤＮＡ鋳型が入手できたら、オリゴヌクレオチド特異的変異誘発で前記されたような標準変異誘発方法を実施する。ある変異体の作成は説明目的で以下に詳述されている。
【００６１】
Ｂ．lentus（ＧＧ３６）N76D/S103A/V104I/L217Hの作成では、ＧＧ３６  N76D/S103A/V104IについてコードするＥｃｏＲＩ‐ＢａｍＨＩ  ＤＮＡ断片をｐＵＣＣＡＴの作成（図１６、１７参照）に用いて、プラスミドｐＢＣＤＡＩＣＡＴを作る。一本鎖ＤＮＡ鋳型を前記プロトコールに従い作った後、下記配列の変異誘発プライマー
ｘＣ１ａｌ
５′  ＴＡＴ  ＧＣＣ  ＡＧＣ  ＣＡＣ  ＡＡＣ  ＧＧＴ  ＡＣＴ  ＴＣＧ
ＡＴＧ  ＧＣＴ  ３′(Seq.ID No.13)
を用いて、Ｌ２１７Ｈを作る。前記のように、下線残基は行われたヌクレオチド変化を表し、ｘＣ１ａＩは存在するＣ１ａＩ部位が変異誘発後に除去されたことを示す。変異誘発プロトコールは前記オリゴヌクレオチド特異的変異誘発で記載されたとおりである。変異誘発後、プラスミドＤＮＡを初めにＣ１ａＩ部位の除去についてスクリーニングし、Ｃ１ａＩ部位を欠いたクローンをＤＮＡ配列分析に付して、２１７位アミノ酸残基でＬからＨに変化したＤＮＡ配列について確認する。
【００６２】
Ｂ．ＢＰＮ′変種の作成およびＢ．subtilisでのそれらの発現
Ｂ．amyloliquefaciens （ＢＰＮ′）N76D/Q103A/Y104I/Y217Lの作成を２つの連続工程のほかは同様の方式で行う。Ｎ７６Ｄを最初にＢＰＮ′Ｙ２１７Ｌ中に導入してＢＰＮ′N76D/Y217Lを作り、第二の変異誘発を行ってＢＰＮ′N76D/Y217LをＢＰＮ′N76D/Q103A/Y104I/Y217Lに変換する。第一変異誘発用の一本鎖ＤＮＡ鋳型を作るために、ＢＰＮ′Ｙ２１７ＬズブチリシンについてコードするＥｃｏＲＩ‐ＢａｍＨＩ断片（Wells,J.,et al.,PNAS,84,5167,1087 で記載されたＹ２１７Ｌプラスミドから誘導される）を用いて、プラスミドｐＵＣＣＡＴＦＮＡを作る（図１８、１９参照）。ＢＰＮ′Ｙ２１７Ｌを含むｐＵＣＣＡＴＦＮＡプラスミドを用いて、ｐＢＣＦＮＡＣＡＴプラスミドを作成する（図１８、１９）。一本鎖ＤＮＡを前記のように作る。ＢＰＮ′N76D/Y217Lを作るために、下記配列のオリゴヌクレオチドプライマー
Ｘbal
５′  Ｃ  ＡＣＡ  ＧＴＴ  ＧＣＧ  ＧＣＴ  ＣＴＡ ＧＡＴ  ＡＡＣ
ＴＣＡ  ＡＴＣ  ＧＧＴ  Ｇ  ３′(Seq.ID No.14 ）を用いて、変化Ｎ７６Ｄを作る。次いで一本鎖ＤＮＡをＢＰＮ′N76D/Y217L保有ｐＢＣＦＮＡＣＡＴプラスミド（Ｎ７６Ｄ変異誘発後のｐＢＣＦＮＡＣＡＴプラスミド）から作り、下記配列のもう１つのオリゴヌクレオチド
ｘＰvull
５′  ＧＣＴ  ＧＡＣ  ＧＧＴ  ＴＣＣ  ＧＧＣ  ＧＣＴ ＡＴＴ  ＡＧＴ
ＴＧＧ  ＡＴＣ  ＡＴＴ  ３′  (Seq.ID No.15 ）で変異誘発させて、ＢＰＮ′N76D/Q103A/Y104I/Y217Lを得る。クローニング、一本鎖ＤＮＡ作成、変異誘発および変異体のスクリーニングに関係するすべての工程は前記のように実施する。ＢＰＮ′遺伝子およびその変種の発現は、ＲＥ３４，６０６に記載されたようなBacillus subtilis のプロテアーゼ欠失株中に直接プラスミドＤＮＡ（異なる変種のＢＰＮ′遺伝子を含むｐＢＣＦＮＡＣＡＴ）を組込むことにより行う。
【００６３】
多数の変種をこれらのプロテアーゼ製造例の開示どおりに作る。動力学的データおよび安定性データはこのような変種について作る。動力学的データは前記方法を用いて作り、表Ｖで示されている。安定性データはここで詳述されたように作成した。結果は表VIで示されている。
【００６４】
熱安定性アッセイ操作
精製酵素は、緩衝液で平衡化されたSephadex G-25 からなるカラムに酵素を適用し、同緩衝液を用いてカラムから酵素を溶出させることにより、０．１ＭグリシンｐＨ１０．０、０．０１％Tween-80中に緩衝液交換する。
【００６５】
６０℃に恒温された０．１Ｍグリシン、０．０１％Tween-80ｐＨ１０．０を含有する管に緩衝液交換された酵素を加えて、１５μg/mlの最終酵素濃度にする。
【００６６】
一部を様々な時間に６０℃インキュベートから取出し、２５℃に恒温された０．１Ｍ tris-ＨＣｌ緩衝液ｐＨ８．６に溶解された１．２ｍＭの合成ペプチド基質サクシニル‐Ｌ‐Ａｌａ‐Ｌ‐Ａｌａ‐Ｌ‐Ｐｒｏ‐Ｌ‐Ｐｈｅ‐ｐ‐ニトロアニリドを含有する１ｃｍキュベットへの添加により、酵素活性について直ちに調べる。初期の直線的反応速度は、時間の関数として４１０ｎｍで反応生成物ｐ‐ニトロアニリンの吸光度をモニターすることにより分光測定で追跡する。
【００６７】
５０％酵素不活化に要する時間の長さである半減期は、６０℃でインキュベート時間の関数として反応速度の一次プロットから決める。
【００６８】
データは同一条件下でBacillus lentus ズブチリシン（ＧＧ３６）について決められた半減期の％として表VIに掲載されている。
【００６９】
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0003776244.tif 000010
0003776244.tif 000011
【００７０】
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0003776244.tif 000013
0003776244.tif 000014
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【００７１】
２．クリーニング組成物物質：
本発明のクリーニング組成物は、前記プロテアーゼ酵素に加えて、プロテアーゼ酵素と適合する１種以上のクリーニング組成物物質も含んでいる。ここで用いられる“クリーニング組成物物質”という用語は、望まれるクリーニング組成物の具体的タイプおよび製品の形（例えば、液体、顆粒、スプレー組成物）について選択されるあらゆる液体、固体または気体物質を意味し、しかもその物質は組成物で用いられるプロテアーゼ酵素と適合している。クリーニング組成物物質の具体的選択は、クリーニングされる表面、物品または布帛と使用中（例えば、洗浄洗剤使用中）のクリーニング条件にとり組成物の望ましい形について考慮することにより容易に行われる。ここで用いられる“適合する”という用語は、プロテアーゼが通常の使用状況中に望んでいるほど有効でなくなる程度までにはクリーニング組成物物質がプロテアーゼ酵素のタンパク質分解活性を減少させないことを意味する。具体的なクリーニング組成物物質は以下で詳細に例示されている。
【００７２】
１種以上の前記プロテアーゼ酵素の有効量がタンパク質汚れ除去の必要な様々な表面をクリーニングする上で有用な組成物中に含有される。このようなクリーニング組成物には、形態上制限されない（例えば、液体及び顆粒）、硬質表面をクリーニングするための洗剤組成物；形態上制限されない（例えば、顆粒、液体及び固形処方）、布帛をクリーニングするための洗剤組成物；皿洗い組成物（形態上制限されない）；形態上制限されない（例えば、歯磨剤、練歯磨剤及び洗口液処方）オーラルクリーニング組成物；形態上制限されない（例えば、液体、錠剤）義歯クリーニング組成物がある。ここで記載される“プロテアーゼ酵素の有効量”とは、特定のクリーニング組成物で必要な酵素活性を出すために必要な前記プロテアーゼ酵素の量に関する。このような有効量は当業者により容易に確認でき、用いられる具体的酵素変種、クリーニング適用例、クリーニング組成物の具体的組成と、液体または乾燥（例えば、顆粒、固形）組成物が必要かどうかなどのような多くのファクターに基づいている。
【００７３】
好ましくは、本発明のクリーニング組成物は約０．０００１〜約１０％、更に好ましくは約０．００１〜約１％、更に一層好ましくは約０．００１〜約０．１％の１種以上のプロテアーゼ酵素を含んでいる。プロテアーゼ酵素が用いられた様々なクリーニング組成物のいくつかの例が、以下で更に詳細に記載されている。ここで用いられるすべての部、パーセンテージ及び比率は、他で指摘されないかぎり重量による。
【００７４】
ここで用いられる“非布帛クリーニング組成物”には、硬質表面クリーニング組成物、皿洗い組成物、口内洗浄組成物、義歯クリーニング組成物及び身体洗浄組成物がある。
【００７５】
Ａ．硬質表面、皿及び布帛用のクリーニング組成物
プロテアーゼ酵素は、高い起泡性および／または良好な不溶性基質除去性が望まれるあらゆる洗剤組成物で用いることができる。このため、プロテアーゼ酵素は、完全に処方された硬質表面クリーナー、皿洗い組成物、布帛洗濯組成物などを提供するために、様々な慣用成分と共に用いることができる。このような組成物は液体、顆粒、固形物などの形をとることができる。このような組成物は３０〜６０重量％もの界面活性剤を含有した最新の“濃縮”洗剤として処方してもよい。
【００７６】
本クリーニング組成物は、場合により、好ましくは、様々なアニオン系、ノニオン系、双極性などの界面活性剤を含有することができる。このような界面活性剤は、典型的には組成物の約０．１〜約６０％、好ましくは約１〜約３５％のレベルで存在する。
【００７７】
ここで有用な界面活性剤の非制限例には、慣用的なＣ11‐Ｃ18アルキルベンゼンスルホネートと一級およびランダムアルキルサルフェート、式ＣＨ３（ＣＨ２）ｘ（ＣＨＯＳＯ３−Ｍ＋）ＣＨ３およびＣＨ３（ＣＨ２）ｙ（ＣＨＯＳＯ３−Ｍ＋）ＣＨ２ＣＨ３のＣ10‐Ｃ18二級（２，３）アルキルサルフェート（式中ｘおよび（ｙ＋１）は少くとも約７、好ましくは少くとも約９の整数であり、Ｍは水溶性カチオン、特にナトリウムである）、Ｃ10‐Ｃ18アルキルアルコキシサルフェート（特に、ＥＯ１〜７エトキシサルフェート）、Ｃ10‐Ｃ18アルキルアルコキシカルボキシレート（特に、ＥＯ１〜７エトキシカルボキシレート）、Ｃ10‐Ｃ18アルキルポリグリコシドおよびそれらの対応サルフェート化ポリグリコシド、Ｃ12‐Ｃ18α‐スルホネート化脂肪酸エステル、Ｃ12‐Ｃ18アルキルおよびアルキルフェノールアルコキシレート（特に、エトキシレートおよび混合エトキシ／プロポキシ）、Ｃ12‐Ｃ18ベタインおよびスルホベタイン（“スルタイン”）、Ｃ10‐Ｃ18アミンオキシド、Ｃ８‐Ｃ24サルコシネート（特にオレオイルサルコシネート）などがある。アルキルアルコキシサルフェート（ＡＥＳ）およびアルキルアルコキシカルボキシレート（ＡＥＣ）がここでは好ましい（このような界面活性剤と前記アミンオキシドおよび／またはベタインまたはスルタイン界面活性剤との併用も、処方者の希望に応じて好ましい）。他の慣用的で有用な界面活性剤は標準テキストに掲載されている。特に有用な界面活性剤には、引用することにより本明細書の開示の一部とされる１９９３年３月１６日付で発行されたConnorらの米国特許第５，１９４，６３９号明細書で開示されたＣ10‐Ｃ18Ｎ‐メチルグルカミドがある。
【００７８】
５〜１７、好ましくは６〜１４、更に好ましくは７〜１２範囲内の平均親水性‐親油性バランス（ＨＬＢ）を有する界面活性剤を与えるエチレンオキシドと疎水性部分との縮合物であるノニオン系界面活性剤のクラスが特に有用である。疎水性（親油性）部分は性質上脂肪族でもまたは芳香族でもよく、いずれか特定の疎水基と縮合されたポリエチレン基の長さは親水性および疎水性要素間で望ましいバランス度を有する水溶性化合物を生じるように容易に調整できる。アルコール１モル当たりエチレンオキシド３〜８モルを含むＣ９‐Ｃ15一級アルコールエトキシレート（または混合エトキシ／プロポキシ）、特にアルコール１モル当たりエチレンオキシド６〜８モルを含むＣ14‐Ｃ15一級アルコール、アルコール１モル当たりエチレンオキシド３〜５モルを含むＣ12‐Ｃ15一級アルコールおよびそれらの混合物が特に好ましい。
【００７９】
他の活性成分、キャリヤ、ヒドロトロピー剤、加工助剤、色素または顔料、液体処方用溶媒などを含めて、洗剤クリーニング組成物で有用な様々な他の成分を本組成物に含有させることができる。起泡性の一層の増加が望まれるならば、
Ｃ10‐Ｃ16アルコールアミドのような起泡増進剤が典型的には約１〜約１０％レベルで組成物中に配合できる。Ｃ10‐Ｃ14モノエタノールおよびジエタノールアミドがこのような起泡増進剤の典型的クラスである。このような起泡増進剤と前記のアミンオキシド、ベタインおよびスルタインのような高起泡性補助界面活性剤との併用も有利である。所望であれば、ＭｇＣｌ２、ＭｇＳＯ４などのような可溶性マグネシウム塩が、更に起泡性を出すために、典型的には約０．１〜約２％のレベルで添加できる。
【００８０】
本液体洗剤組成物は、キャリヤとして水および他の溶媒を含有することができる。メタノール、エタノール、プロパノールおよびイソプロパノールで例示される低分子量一級または二級アルコールが適切である。一価アルコールが界面活性剤を溶解させる上で好ましいが、約２〜約６の炭素原子と約２〜約６のヒドロキシ基を含んだようなポリオール（例えば、１，３‐プロパンジオール、エチレングリコール、グリセリンおよび１，２‐プロパンジオール）も使用できる。組成物は約５〜約９０％、典型的には約１０〜約５０％のこのようなキャリヤを含有する。
【００８１】
本洗剤組成物は、水性クリーニング操作で使用中に、洗浄水が約６．８〜約１１．０のｐＨを有するように処方されることが好ましい。このため、最終製品は典型的にはこの範囲で処方される。推奨される使用量レベルでｐＨをコントロールするための技術には緩衝剤、アルカリ、酸などの使用があり、これは当業者に周知である。
【００８２】
本発明の硬質表面クリーニング組成物および布帛クリーニング組成物を処方する場合、処方者は約５〜約５０重量％のレベルで様々なビルダーを用いようとするであろう。典型的ビルダーには１〜１０ミクロンゼオライト、ポリカルボキシレート、例えばシトレートおよびオキシジサクシネート、積層シリケート、ホスフェートなどがある。他の慣用的ビルダーは標準処方集に掲載されている。
【００８３】
同様に、処方者はこのような組成物中にセルラーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、ペルオキシダーゼおよびプロテアーゼのような様々な追加酵素を、典型的には約０．００１〜約１重量％のレベルで用いようとするであろう。様々な洗浄および布帛ケア酵素が洗濯洗剤業界で周知である。
【００８４】
ペルカーボネート、ペルボレートなどのような様々な漂白化合物が、典型的には約１〜約１５重量％のレベルでこのような組成物中で使用できる。所望であれば、このような組成物はテトラアセチルエチレンジアミン、ノナノイルオキシベンゼンスルホネートなどのようなブリーチ活性剤も含有することができ、これらも当業界で知られている。使用量レベルは、典型的には約１〜約１０重量％の範囲である。
【００８５】
様々な汚れ放出剤、特にアニオン系オリゴエステルタイプ、様々なキレート化剤、特にアミノホスホネートおよびエチレンジアミンジサクシネート、様々な土汚れ除去剤、特にエトキシル化テトラエチレンペンタミン、様々な分散剤、特にポリアクリレートおよびポリアルパラテート、様々な増白剤、特にアニオン系増白剤、様々な色素移動阻止剤、例えばポリビニルピロリドン、様々な起泡抑制剤、特にシリコーンおよび二級アルコール、様々な布帛柔軟剤、特にスメクタイト土および土凝集ポリマー（例えば、ポリ（オキシエチレン））などはすべて約１〜約３５重量％範囲のレベルでこのような組成物に使用できる。標準処方集と公開特許では、このような慣用物質の多数の詳細な記載を含んでいる。
【００８６】
酵素安定剤も本発明のクリーニング組成物で用いてよい。このような酵素安定剤にはプロピレングリコール（好ましくは、約１〜約１０％）、ギ酸ナトリウム（好ましくは、約０．１〜約１％）およびギ酸カルシウム（好ましくは、約０．１〜約１％）がある。
【００８７】
１．硬質表面クリーニング組成物
ここで用いられる“硬質表面クリーニング組成物”とは、床、壁、浴室タイルなどのような硬質表面をクリーニングするための液体および顆粒洗剤組成物に関する。本発明の硬質表面クリーニング組成物は、有効量の１種以上のプロテアーゼ酵素、好ましくは組成物の約０．０００１〜約１０重量％、更に好ましくは約０．００１〜約５％、更に一層好ましくは約０．００１〜約１％の活性プロテアーゼ酵素を含有する。１種以上のプロテアーゼ酵素を含有することに加えて、このような硬質表面クリーニング組成物は典型的には界面活性剤と水溶性金属イオン封鎖ビルダーを含有する。しかしながら、スプレーウィンドークリーナーのようなある特殊製品では界面活性剤が時々用いられないが、その理由はそれらがガラス表面で薄膜状／すじ状残留物を形成するかもしれないからである。
【００８８】
界面活性剤成分は存在するとき本組成物の０．１％と少ないが、典型的には組成物は約０．２５〜約１０％、更に好ましくは約１〜約５％の界面活性剤を含有する。
【００８９】
典型的には、組成物は約０．５〜約５０％、好ましくは約１〜約１０％の洗浄ビルダーを含有する。好ましくは、ｐＨは約８〜１２の範囲にあるべきである。水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウムまたは塩酸のような慣用的ｐＨ調整剤が、調整が必要ならば使用できる。
【００９０】
溶媒も組成物に含有させてよい。有用な溶媒にはグリコールエーテル、例えばジエチレングリコールモノヘキシルエーテル、ジエチレングリコールモノブチルエーテル、エチレングリコールモノブチルエーテル、エチレングリコールモノヘキシルエーテル、プロピレングリコールモノブチルエーテル、ジプロピレングリコールモノブチルエーテルと、ジオール、例えば２，２，４‐トリメチル‐１，３‐ペンタンジオールおよび２‐エチル‐１，３‐ヘキサンジオールがあるが、それらに限定されない。用いられる場合、このような溶媒は典型的には約０．５〜約１５％、好ましくは約３〜約１１％のレベルで存在する。
【００９１】
加えて、イソプロパノールまたはエタノールのような高揮発性溶媒は、表面への組成物の“フルストレンクス”適用後に表面が洗い落とされないとき、表面から組成物の速い蒸発を促進するために、本組成物で用いることができる。用いられる場合、揮発性溶媒は典型的には組成物中に約２〜約１２％のレベルで存在する。
【００９２】
【実施例】
本発明の硬質表面クリーニング組成物態様は、下記非制限例で説明される（下記例において、例中の“プロテアーゼ＃”は前記表III で該当番号を有する本発明組成物で有用な変種に関するものである）。
【００９３】
0003776244.tif 000016
【００９４】
例１〜４において、表III で列挙されたプロテアーゼ＃１〜１１および１３〜２５は、特に表ＶおよびVIで記載された本発明で有用な追加プロテアーゼを含めて、実質上同様の結果でプロテアーゼ＃１２に置き代わる。
【００９５】
例５および６において、特に表III 、ＶおよびVIで列挙された本発明で有用なプロテアーゼ酵素のいずれの組合せも、実質上同様の結果でプロテアーゼ＃１２およびプロテアーゼ＃４に置き代わる。
【００９６】
0003776244.tif 000017
【００９７】
例７〜１０において、表III で列挙されたプロテアーゼ＃１〜１１および１３〜２５は、特に表ＶおよびVIで記載された本発明で有用な追加プロテアーゼを含めて、実質上同様の結果でプロテアーゼ＃１２に置き代わる。
【００９８】
例１１および１２において、特に表III 、ＶおよびVIで列挙された本発明で有用なプロテアーゼ酵素のいずれの組合せも、実質上同様の結果でプロテアーゼ＃１２およびプロテアーゼ＃４に置き代わる。
【００９９】
２．皿洗い組成物
本発明のもう１つの態様において、皿洗い組成物は１種以上のプロテアーゼ酵素を含んでいる。ここで用いられる“皿洗い組成物”とは、限定されないが顆粒および液体形を含めて、皿をクリーニングするためのすべての形態の組成物に関する。本発明の皿洗い組成物態様は下記例で説明される。
【０１００】
0003776244.tif 000018
0003776244.tif 000019
【０１０１】
例１３〜１６において、表III で列挙されたプロテアーゼ＃１〜１１および１３〜２５は、特に表ＶおよびVIで記載された本発明で有用な追加プロテアーゼを含めて、実質上同様の結果でプロテアーゼ＃１２に置き代わる。
【０１０２】
例１７および１８において、特に表III 、ＶおよびVIで列挙された本発明で有用なプロテアーゼ酵素のいずれの組合せも、実質上同様の結果でプロテアーゼ＃１２およびプロテアーゼ＃４に置き代わる。
【０１０３】
0003776244.tif 000020
【０１０４】
例１９Ａ〜Ｃにおいて、表III で列挙されたプロテアーゼ＃１〜１１および１３〜２５は、特に表ＶおよびVIで記載された本発明で有用な追加プロテアーゼを含めて、実質上同様の結果でプロテアーゼ＃１２に置き代わる。しかも例１９Ａ〜Ｃにおいて、特に表III 、ＶおよびVIで列挙された本発明で有用なプロテアーゼのいずれの組合せも、実質上同様の結果でプロテアーゼ＃１２に置き代わる。
【０１０５】
３．布帛クリーニング組成物
本発明のもう１つの態様において、布帛クリーニング組成物は１種以上のプロテアーゼ酵素を含んでいる。ここで用いられる“布帛クリーニング組成物”とは、限定されないが顆粒、液体および固形を含めて、布帛をクリーニングするためのすべての形態の洗剤組成物に関する。
【０１０６】
ａ．顆粒布帛クリーニング組成物
本発明の顆粒布帛クリーニング組成物は、有効量の１種以上のプロテアーゼ酵素、好ましくは組成物の約０．００１〜約１０重量％、更に好ましくは約０．００５〜約５％、更に好ましくは約０．０１〜約１％の活性プロテアーゼ酵素を含有する。１種以上のプロテアーゼ酵素に加えて、顆粒布帛クリーニング組成物は典型的には少くとも１種の界面活性剤、１種以上のビルダーと、一部の場合には漂白剤を含む。
【０１０７】
本発明の顆粒布帛クリーニング組成物態様は下記例で説明される。
【０１０８】
0003776244.tif 000021
【０１０９】
例２０〜２１において、表III で列挙されたプロテアーゼ＃１〜１１および１３〜２５は、特に表ＶおよびVIで記載された本発明で有用な追加プロテアーゼを含めて、実質上同様の結果でプロテアーゼ＃１２に置き代わる。
【０１１０】
例２２および２３において、特に表III 、ＶおよびVIで列挙された本発明で有用なプロテアーゼ酵素のいずれの組合せも、実質上同様の結果でプロテアーゼ＃１２およびプロテアーゼ＃４に置き代わる。
【０１１１】
0003776244.tif 000022
【０１１２】
例２４および２５において、表III で列挙されたプロテアーゼ＃１〜１１および１３〜２５は、特に表ＶおよびVIで記載された本発明で有用な追加プロテアーゼを含めて、実質上同様の結果でプロテアーゼ＃１２に置き代わる。
【０１１３】
例２６および２７において、特に表III 、ＶおよびVIで列挙された本発明で有用なプロテアーゼ酵素のいずれの組合せも、実質上同様の結果でプロテアーゼ＃１２およびプロテアーゼ＃４に置き代わる。
【０１１４】
0003776244.tif 000023
【０１１５】
0003776244.tif 000024
【０１１６】
0003776244.tif 000025
【０１１７】
0003776244.tif 000026
【０１１８】
0003776244.tif 000027
【０１１９】
例２８〜３４の各々において、表III で列挙されたプロテアーゼ＃１〜１１および１３〜２５は、特に表ＶおよびVIで記載された本発明で有用な追加プロテアーゼを含めて、実質上同様の結果でプロテアーゼ＃１２に置き代わる。しかも、例２８〜３４において、特に表III 、ＶおよびVIで列挙された本発明で有用なプロテアーゼのいずれの組合せも、実質上同様の結果でプロテアーゼ＃１２に置き代わる。
【０１２０】
ｂ．液体布帛クリーニング組成物
本発明の液体布帛クリーニング組成物は、有効量の１種以上のプロテアーゼ酵素、好ましくは組成物の約０．０００１〜約１０重量％、更に好ましくは約０．００１〜約１％、最も好ましくは約０．００１〜約０．１％の活性プロテアーゼ酵素を含有する。このような液体布帛クリーニング組成物は、典型的にはアニオン系界面活性剤、脂肪酸、水溶性洗浄ビルダーと水を更に含んでいる。
【０１２１】
本発明の液体布帛クリーニング組成物態様は下記例で説明される。
【０１２２】
0003776244.tif 000028
【０１２３】
例３５〜３７において、表III で列挙されたプロテアーゼ＃１〜１１および１３〜２５は、特に表ＶおよびVIで記載された本発明で有用な追加プロテアーゼを含めて、実質上同様の結果でプロテアーゼ＃１２に置き代わる。
【０１２４】
例３８および３９において、特に表III 、ＶおよびVIで列挙された本発明で有用なプロテアーゼ酵素のいずれの組合せも、実質上同様の結果でプロテアーゼ＃１２およびプロテアーゼ＃４に置き代わる。
【０１２５】
ｃ．固形布帛クリーニング組成物
手洗い汚れ布帛用に適した本発明の固形布帛クリーニング組成物は、有効量の１種以上のプロテアーゼ酵素を、好ましくは組成物の約０．００１〜約１０重量％、更に好ましくは約０．０１〜約１％で含有する。
【０１２６】
本発明の固形布帛クリーニング組成物態様は下記例で説明される。
【０１２７】
0003776244.tif 000029
【０１２８】
例４２および４３において、表III で列挙されたプロテアーゼ＃１〜１１および１３〜２５は、特に表ＶおよびVIで記載された本発明で有用な追加プロテアーゼを含めて、実質上同様の結果でプロテアーゼ＃１２に置き代わる。
【０１２９】
例４４および４５において、特に表III 、ＶおよびVIで列挙された本発明で有用なプロテアーゼ酵素のいずれの組合せも、実質上同様の結果でプロテアーゼ＃１２およびプロテアーゼ＃４に置き代わる。
【０１３０】
Ｂ．追加クリーニング組成物
前記の硬質表面クリーニング、皿洗いおよび布帛クリーニング組成物に加えて、１種以上のプロテアーゼ酵素も不溶性基質の加水分解が望まれる様々な他のクリーニング組成物中に配合してよい。このような追加クリーニング組成物にはオーラルクリーニング組成物、義歯クリーニング組成物およびコンタクトレンズクリーニング組成物があるが、それらに限定されない。
【０１３１】
１．口内洗浄組成物
本発明のもう１つの態様において、薬学上許容される量の１種以上のプロテアーゼ酵素が歯または義歯からタンパク質汚れを除去する上で有用な組成物中に含有される。ここで用いられる“口内洗浄組成物”とは、歯磨剤、練歯磨剤、歯磨ゲル、歯磨粉、洗口液、マウススプレー、マウスゲル、チューインガム、ロゼンジ、小袋、錠剤、バイオゲル、予防ペースト、歯処理溶液などに関する。好ましくは、本発明の口内洗浄組成物は組成物の約０．０００１〜約２０重量％、更に好ましくは約０．００１〜約１０％、更に一層好ましくは約０．０１〜約５％の１種以上のプロテアーゼ酵素と、薬学上許容されるキャリヤを含む。ここで用いられる“薬学上許容される”とは、その用語が表す薬物、薬剤または不活性成分が妥当な利益／危険比で釣り合って過度の毒性、不適合性、不安定性、刺激、アレルギー反応などなくヒトおよびそれより下等の動物の組織と接触する使用に適していることを意味する。
【０１３２】
典型的には、口内洗浄組成物の口内洗浄成分の薬学上許容される口内洗浄キャリヤ成分は、通常組成物の約５０〜約９９．９９重量％、好ましくは約６５〜約９９．９９％、更に好ましくは約６５〜約９９％である。
【０１３３】
本発明の口内洗浄組成物に含有させてもよい薬学上許容されるキャリヤ成分と任意成分は当業者に周知である。口内洗浄組成物で有用な様々な組成タイプ、キャリヤ成分と任意成分は、１９９２年３月１７日付で発行されたSeibelの米国特許第５，０９６，７００号；１９９１年７月２日付で発行されたSampathkumarの米国特許第５，０２８，４１４号；１９９１年７月２日付で発行されたBenedict,Bush およびSunberg の米国特許第５，０２８，４１５号明細書に開示されており、それらすべてが引用することにより本明細書の開示の一部とされる。
【０１３４】
本発明の口内洗浄組成物態様は下記例で説明される。
【０１３５】
0003776244.tif 000030
【０１３６】
例４６〜４９において、表III で列挙されたプロテアーゼ＃１〜１１および１３〜２５は、特に表ＶおよびVIで記載された本発明で有用な追加プロテアーゼを含めて、実質上同様の結果でプロテアーゼ＃１２に置き代わる。しかも、例４６〜４９において、特に表III 、ＶおよびVIで列挙された本発明で有用なプロテアーゼ酵素のいずれの組合せも、実質上同様の結果でプロテアーゼ＃１２に置き代わる。
【０１３７】
0003776244.tif 000031
【０１３８】
例５０〜５３において、表III で列挙されたプロテアーゼ＃１〜１１および１３〜２５は、特に表ＶおよびVIで記載された本発明で有用な追加プロテアーゼを含めて、実質上同様の結果でプロテアーゼ＃１２に置き代わる。しかも、例５０〜５３において、特に表III 、ＶおよびVIで列挙された本発明で有用なプロテアーゼ酵素のいずれの組合せも、実質上同様の結果でプロテアーゼ＃１２に置き代わる。
【０１３９】
0003776244.tif 000032
【０１４０】
例５４〜５７において、表III で列挙されたプロテアーゼ＃１〜１１および１３〜２５は、特に表ＶおよびVIで記載された本発明で有用な追加プロテアーゼを含めて、実質上同様の結果でプロテアーゼ＃１２に置き代わる。しかも、例５４〜５７において、特に表III 、ＶおよびVIで列挙された本発明で有用なプロテアーゼ酵素のいずれの組合せも、実質上同様の結果でプロテアーゼ＃１２に置き代わる。
【０１４１】
0003776244.tif 000033
【０１４２】
例５８〜６１において、表III で列挙されたプロテアーゼ＃１〜１１および１３〜２５は、特に表ＶおよびVIで記載された本発明で有用な追加プロテアーゼを含めて、実質上同様の結果でプロテアーゼ＃１２に置き代わる。しかも、例５８〜６１において、特に表III 、ＶおよびVIで列挙された本発明で有用なプロテアーゼ酵素のいずれの組合せも、実質上同様の結果でプロテアーゼ＃１２に置き代わる。
【０１４３】
２．義歯クリーニング組成物
本発明のもう１つの態様において、口腔外で義歯をクリーニングするための義歯クリーニング組成物は１種以上のプロテアーゼ酵素を含有する。このような義歯クリーニング組成物は、有効量の、好ましくは組成物の約０．０００１〜約５０重量％、更に好ましくは約０．００１〜約３５％、更に一層好ましくは約０．０１〜約２０％の１種以上のプロテアーゼ酵素と、義歯クリーニングキャリアを含んでいる。発泡錠などのような様々な義歯クリーニング組成物フォーマットが当業界で周知であり（例えば、引用することにより本明細書の開示の一部とされるYoung の米国特許第５，０５５，３０５号明細書参照）、義歯からタンパク質汚れを除去する上で１種以上のプロテアーゼ酵素の配合用に通常適している。
【０１４４】
本発明の義歯クリーニング組成物態様は下記例で説明される。
【０１４５】
0003776244.tif 000034
【０１４６】
例６２〜６６において、表III で列挙されたプロテアーゼ＃１〜１１および１３〜２５は、特に表ＶおよびVIで記載された本発明で有用な追加プロテアーゼを含めて、実質上同様の結果でプロテアーゼ＃１２に置き代わる。しかも、例６２〜６５において、特に表III 、ＶおよびVIで列挙された本発明で有用なプロテアーゼ酵素のいずれの組合せも、実質上同様の結果でプロテアーゼ＃１２に置き代わる。
【０１４７】
３．身体洗浄組成物
本発明のもう１つの態様において、（液体および固形で）皮膚をクリーニングするためのパーソナルクレンジング組成物は１種以上のプロテアーゼ酵素を含有している。このような組成物は、典型的には組成物の約０．００１〜約５重量％、好ましくは約０．００５〜約２％、最も好ましくは約０．０１〜約０．８％のプロテアーゼ酵素を含有する。ここで記載されたようなプロテアーゼ酵素を含有できる好ましいパーソナルクレンジング組成物は、１９９３年９月１４日付で出願された双方ともVisscherらによる米国特許出願第０８／１２１，６２３号および第０８／１２１，６２４号明細書で示され、それらの開示は引用することにより本明細書の開示の一部とされる。このような組成物は下記例で説明される。
【０１４８】
0003776244.tif 000035
【０１４９】
0003776244.tif 000036
【０１５０】
例６６〜６７において、表III で列挙されたプロテアーゼ＃１〜１１および１３〜２５は、特に表ＶおよびVIで記載された本発明で有用な追加プロテアーゼを含めて、実質上同様の結果でプロテアーゼ＃１２に置き代わる。しかも、例６６〜６７において、特に表III 、ＶおよびVIで列挙された本発明で有用なプロテアーゼ酵素のいずれの組合せも、実質上同様の結果でプロテアーゼ＃１２に置き代わる。
【０１５１】
例６８
洗浄性能試験
本発明組成物で有用な変種の洗浄性能は、ＥＭＰＡ１１６（コットン上に血液／ミルク／カーボンブラック）衣切れ（Testfabrics,Inc.,Middlesex,NJ 07030 ）から汚れの除去を調べることにより評価する。
【０１５２】
ギザギザ端のある３×４-1/2インチに切断された６枚のＥＭＰＡ１１６布切れを、水１０００ｍｌ、硬度１５ｇｐｇ（Ｃａ++：Ｍｇ++３：１ｗ：ｗ）、洗剤７ｇおよび適宜に酵素を含有したモデル７２４３Ｓ  Terg-O-Tometer（United States Testing Co.,Inc.,Hoboken,NJ ）の各ポットに入れる。洗剤ベースはwfk-Testgewebe GmbH,Adlerstrasse 42,Postfach 13 07 62,D-47759 Krefeld,Germany のＷＦＫ１洗剤である：
【０１５３】
成分                                                  最終処方の％
ゼオライトＡ                                            ２５％
硫酸ナトリウム                                          ２５％
ソーダ灰                                                １０％
直鎖アルキルベンゼンスルホネート                          ８．８％
アルコールエトキシレート（７‐８ＥＯ）                    ４．５％
ナトリウム石鹸                                            ３％
ケイ酸ナトリウム（ＳｉＯ２：Ｎａ２Ｏ  ３：３：１）        ３％
このベース洗剤に下記添加を行う：
【０１５４】
成分                                                  最終処方の％
過ホウ酸ナトリウム一水和物                              １３％
コポリマー（Sokalan CP5 ）                                ４％
ＴＡＥＤ（Mykon ATC Green ）                              ３％
酵素                                                      ０．５％
増白剤（Tinopal AMS-GX）                                  ０．２％
【０１５５】
過ホウ酸ナトリウム一水和物はDegussa Corporation,Ridgefield-Park,NJ 07660から得る。Sokalan CP5 はBASF Corporation,Parsippany,NJ 07054から得る。Mykon ATC Green （ＴＡＥＤ，テトラアセチルエチレンジアミン）はWarwick International,Limited,Mostyn,Holywell,Clwyd CH8 9HE,England から得る。Tinopal AMS GXはCiba-Geigy Corporation,Greensboro,NC 27419から得る。
【０１５６】
６枚のＥＭＰＡ１１６布切れを６０℃で３０分間酵素入り洗剤で洗浄し、その後各回毎に水１０００ｍｌで５分間にわたり２回すすぎ洗いする。酵素を標準曲線では０．０５〜１ｐｐｍ、ルーチン分析では０．２５ｐｐｍの最終濃度で加える。布切れを乾燥し、プレスし、布切れの反射率をMinolta Chroma Meter,Model CR-200(Minolta Corporation,Ramsey,NJ 07446)のＬ＊ａ＊ｂ＊スケールでＬ値を用いて測定する。性能はB.Lentus（ＧＧ３６）プロテアーゼの性能の％として報告し、同様の汚れ除去性能を示すために必要な変種プロテアーゼの量でB.Lentus（ＧＧ３６）プロテアーゼの量を割り１００を掛けることにより計算する。データは表VII で示されている。
【０１５７】
表VII 
酵素                                                洗浄性能
B.Lentusズブチリシン                                  100
N76D                                                  310
N76D/S103A                                            230
N76D/V104I                                            130
N76D/I107V                                            160
N76D/S99D/S101R                                       370
N76D/S99D/S103A                                       290
N76D/S101R/S103A                                      130
N76D/S101R/V104I                                      300
N76D/S103A/V104I                                      320
N76D/S103G/V104I                                      160
N76D/S103A/V104F                                      210
N76D/S103A/V104N                                      110
N76D/S103A/V104T                                      170
N76D/V104I/I107V                                      210
N76D/S99D/S101R/S103A                                 220
N76D/S99D/S101R/V104I                                 140
N76D/S101G/S103A/V104I                                170
N76D/S101R/S103A/V104I                                150
N76D/S103A/V104I/S105A                                170
N76D/S103A/V104T/I107A                                120
N76D/S103A/V104T/I107L                                110
N76D/S103A/V104I/L126F                                110
N76D/S103A/V104I/L128G                                280
N76D/S103A/V104I/L135V                                160
N76D/S103A/V104I/D197E                                160
N76D/S103A/V104I/N204A                                170
N76D/S103A/V104I/N204G                                160
N76D/S103A/V104I/N204C                                150
N76D/S103A/V104I/P210I                                470
N76D/S103A/V104I/M222A                                100
N76D/S103A/V104I/T260P                                280
N76D/S103A/V104I/S265N                                190
【０１５８】
例６９
液体洗剤処方のプロテアーゼ安定性
液体洗剤処方で不活化に関するプロテアーゼ安定性の比較を、ここで記載された操作に従いBacillus Lentus ズブチリシンおよびその変種酵素N76D/S103A/V104Iについて行う。研究用の洗剤処方はThe Procter & Gamble CompanyによりＵＳＡで作られたTide Ultra液体洗濯洗剤の市販ボトルである。洗剤処方の熱処理はその場のプロテアーゼを不活化する上で必要である。これは４．５時間にわたり９６℃で洗剤をインキュベートすることにより行う。次いで酵素２０ｇ／ｌ範囲内のB.LentusズブチリシンおよびN76D/S103A/V104I変種の濃縮製品を洗剤処方中酵素０．３ｇ／ｌの最終濃度まで室温で熱処理Tide Ultraに加える。プロテアーゼ添加熱処理洗剤を５０℃に恒温された水浴中でインキュベートする。一部を０、２４、４６、７６および１１２時間間隔でインキュベート管から取出し、２５℃に恒温した０．１Ｍ Tris-ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．６に溶解された１．２ｍＭの合成ペプチド基質ｓｕｃ‐Ａｌａ‐Ａｌａ‐Ｐｒｏ‐Ｐｈｅ‐ｐ‐ニトロアニリドを含有した１ｃｍキュベットへの添加で酵素活性について調べる。初期の直線的反応速度は、時間の関数として４１０ｎｍで反応生成物ｐ‐ニトロアニリンの吸光度をモニターすることにより分光測定で追跡する。図２０で示されるように、N76D/S103A/V104I変種は天然B.Lentus酵素よりも不活化に関して有意に大きな安定性を有することが観察される。特定の試験条件下で２酵素についてTide Ultra洗剤処方中の不活化に関して評価された半減期は、B.Lentusズブチリシンで４５時間およびN76D/S103A/V104I変種で１２５時間である。
【０１５９】
本発明の具体的態様が記載されてきたが、本発明の様々な変更及び修正が本発明の精神及び範囲から逸脱せずに行えることは当業者にとり明らかであろう。本発明の範囲内に属するすべてのこのような修正を添付された請求の範囲ではカバーしていると考えられる。
【０１６０】
【配列表】
配  列  表
【表１】
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【０１６１】
【表２】
0003776244.tif 000038
【０１６２】
【表３】
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【０１６３】
【表４】
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【０１６４】
【表５】
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【０１６５】
【表６】
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【０１６６】
【表７】
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【０１６７】
【表８】
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【０１６８】
【表９】
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【０１６９】
【表１０】
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【０１７０】
【表１１】
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【０１７１】
【表１２】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  Bacillus amyloliquefaciensズブチリシンのＤＮＡおよびアミノ酸配列と、この遺伝子の部分制限地図について示す（Seq.ID No.6 ）。
【図２】  Bacillus amyloliquefaciensズブチリシンのＤＮＡおよびアミノ酸配列と、この遺伝子の部分制限地図について示す（Seq.ID No.6 ）。
【図３】  Bacillus amyloliquefaciensズブチリシンのＤＮＡおよびアミノ酸配列と、この遺伝子の部分制限地図について示す（Seq.ID No.6 ）。
【図４】  Bacillus amyloliquefaciensズブチリシンのＤＮＡおよびアミノ酸配列と、この遺伝子の部分制限地図について示す（Seq.ID No.6 ）。
【図５】  Bacillus amyloliquefaciens（ＢＰＮ）′およびBacillus lentus （野生型）のズブチリシンの中に保存されたアミノ酸残基について示す。
【図６】４種ズブチリシンのアミノ酸配列について示す。最上列はBacillus amyloliquefaciensのズブチリシン（ズブチリシンＢＰＮ′ともしばしば称される）のアミノ酸配列について表す（Seq.ID No.7 ）。第二列はBacillussubtillis のズブチリシンのアミノ酸配列について示す（Seq.ID No.8 ）。第三列はＢ．licheniformis のズブチリシンのアミノ酸配列について示す（Seq.IDNo.9）。第四列はBacillus lentus のズブチリシン（ＰＣＴ  ＷＯ８９／０６２７６ではズブチリシン３０９とも称されている）のアミノ酸配列について表す（Seq.ID No.10）。記号＊はズブチリシンＢＰＮ′と比較した特定アミノ酸残基の不存在について示す。
【図７】４種ズブチリシンのアミノ酸配列について示す。最上列はBacillus amyloliquefaciensのズブチリシン（ズブチリシンＢＰＮ′ともしばしば称される）のアミノ酸配列について表す（Seq.ID No.7 ）。第二列はBacillussubtillis のズブチリシンのアミノ酸配列について示す（Seq.ID No.8 ）。第三列はＢ．licheniformis のズブチリシンのアミノ酸配列について示す（Seq.IDNo.9）。第四列はBacillus lentus のズブチリシン（ＰＣＴ  ＷＯ８９／０６２７６ではズブチリシン３０９とも称されている）のアミノ酸配列について表す（Seq.ID No.10）。記号＊はズブチリシンＢＰＮ′と比較した特定アミノ酸残基の不存在について示す。
【図８】プラスミドＧＧＡ２７４の作成について示す。
【図９】この出願で用いられるある発現プラスミドへの中間体であるＧＧＴ２７４の作成について示す。
【図１０】  Bacillus lentus のズブチリシンのＤＮＡおよびアミノ酸配列について示す（Seq.ID No.11）。成熟ズブチリシンタンパク質はＡｌａに対応するコドンＧＣＧ（３３４‐３３６）で始まるコドンによりコードされている。
【図１１】  Bacillus lentus のズブチリシンのＤＮＡおよびアミノ酸配列について示す（Seq.ID No.11）。成熟ズブチリシンタンパク質はＡｌａに対応するコドンＧＣＧ（３３４‐３３６）で始まるコドンによりコードされている。
【図１２】  Bacillus lentus のズブチリシンのＤＮＡおよびアミノ酸配列について示す（Seq.ID No.11）。成熟ズブチリシンタンパク質はＡｌａに対応するコドンＧＣＧ（３３４‐３３６）で始まるコドンによりコードされている。
【図１３】本発明の好ましい態様のＤＮＡおよびアミノ酸配列について示す（N76D/S103A/V1041）（Seq.ID No.12）。この図面におけるＤＮＡは７６位でアスパラギン酸、１０３位でアラニンおよび１０４位でイソロイシンについてコードするように記載された方法で修飾されている。成熟ズブチリシン変種タンパク質はＡｌａに対応するコドンＧＣＧ（３３４‐３３６）で始まるコドンによりコードされている。
【図１４】本発明の好ましい態様のＤＮＡおよびアミノ酸配列について示す（N76D/S103A/V1041）（Seq.ID No.12）。この図面におけるＤＮＡは７６位でアスパラギン酸、１０３位でアラニンおよび１０４位でイソロイシンについてコードするように記載された方法で修飾されている。成熟ズブチリシン変種タンパク質はＡｌａに対応するコドンＧＣＧ（３３４‐３３６）で始まるコドンによりコードされている。
【図１５】本発明の好ましい態様のＤＮＡおよびアミノ酸配列について示す（N76D/S103A/V1041）（Seq.ID No.12）。この図面におけるＤＮＡは７６位でアスパラギン酸、１０３位でアラニンおよび１０４位でイソロイシンについてコードするように記載された方法で修飾されている。成熟ズブチリシン変種タンパク質はＡｌａに対応するコドンＧＣＧ（３３４‐３３６）で始まるコドンによりコードされている。
【図１６】ベクターｐＢＣＤＡＩＣＡＴの作成について示す。
【図１７】ベクターｐＢＣＤＡＩＣＡＴの作成について示す。
【図１８】ベクターｐＵＣＣＡＴＦＮＡの作成について示す。
【図１９】ベクターｐＵＣＣＡＴＦＮＡの作成について示す。
【図２０】液体洗剤処方中において野生型と比較した好ましい成熟酵素の安定性について示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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