(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号１４に示されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、フォスファチジルセリンを加水分解するフォスフォリパーゼＡ1 活性を有するポリペプチド。
【請求項２】
配列表の配列番号１４に示されるアミノ酸配列を有する請求項１記載のポリペプチド。
【請求項３】
請求項１記載のポリペプチドをコードする核酸。
【請求項４】
請求項２記載のポリペプチドをコードする核酸。
【請求項５】
配列表の配列番号１４に示される塩基配列のうち、３２ｎｔのＡから１３９９ｎｔのＧまでの領域の塩基配列、又は該塩基配列と８５％以上の相同性を有する塩基配列を有する請求項３記載の核酸。
【請求項６】
配列表の配列番号１４に示される塩基配列のうち、３２ｎｔのＡから１３９９ｎｔのＧまでの領域の塩基配列を有する請求項４記載の核酸。
【請求項７】
配列表の配列番号１１に示される塩基配列のうち、１４ｎｔのＡから１３８１ｎｔのＧまでの領域の塩基配列を有する核酸。
【請求項８】
請求項３ないし７のいずれか１項に記載の核酸を含み、宿主細胞中でフォスファチジルセリンを加水分解するフォスフォリパーゼＡ1 活性を有するポリペプチドを産生することができる組換えベクター。
【請求項９】
請求項８記載の組換えベクターで形質転換された細胞。
【請求項１０】
請求項９記載の細胞を培養することからなる、請求項１又は２記載のポリペプチドの生産方法。
【請求項１１】
請求項３記載の核酸又はその相補鎖の連続する１５〜５０塩基の領域と相補的な、請求項３記載の核酸又はその相補鎖を増幅するためのプライマー。
【請求項１２】
配列表の配列番号１２又は１３で示される塩基配列を有する請求項１１記載のプライマー。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規なフォスフォリパーゼＡ1 （以下、「ＰＬＡ１」ということがある）、それをコードする核酸、該核酸を含む組換えベクター、該組換えベクターにより形質転換された細胞及び該細胞を用いたＰＬＡ１の生産方法並びに前記核酸を検出又は測定するためのオリゴヌクレオチドに関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＰＬＡ１は、リン脂質のグリセロールの１位（リン酸エステルが結合している部位を３位とした場合）における脂肪酸とのエステル結合を特異的に加水分解する酵素である。ＰＬＡ１は、マスト細胞におけるヒスタミン放出を促進するので、ＰＬＡ１に対する中和抗体は、アレルギーなどヒスタミンが関与する疾患の症状の軽減に有効であると考えられる。また、ＰＬＡ１でリン脂質を加水分解することにより、生理活性リゾリン脂質が生成されるので、ＰＬＡ１は生理活性リゾリン脂質の生産に用いることができる。
【０００３】
従来より、ＰＬＡ１は公知であるが、ヒト由来でフォスファチジルセリン又はリゾフォスファチジルセリンを特異的に加水分解するＰＬＡ１は知られていない。また、ＰＬＡ１をコードするＤＮＡの塩基配列は全く知られておらず、遺伝子工学的手法によりＰＬＡ１を生産することはできない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、フォスファチジルセリンを加水分解する新規なＰＬＡ１を提供することである。また、本発明の目的は、フォスファチジルセリンを加水分解するＰＬＡ１をコードする核酸及びこれを利用して遺伝子工学的手法により前記ＰＬＡ１を生産する手段を提供することである。
【０００５】
すなわち、本発明は、配列表の配列番号１４に示されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、フォスファチジルセリンを加水分解するフォスフォリパーゼＡ1 活性を有するポリペプチドを提供する。また、本発明は、該ポリペプチドをコードする核酸を提供する。さらに、本発明は、上記本発明の核酸を含み、宿主細胞中で、フォスファチジルセリンを加水分解するフォスフォリパーゼＡ1 活性を有するポリペプチドを産生することができる組換えベクターを提供する。また、本発明は、上記本発明の細胞を培養することからなる、上記本発明のポリペプチドの生産方法を提供する。また、本発明は、前記本発明の核酸又はその相補鎖の連続する１５〜５０塩基の領域と相補的な、前記本発明の核酸又はその相補鎖を増幅するためのプライマーを提供する。
【０００６】
【発明の実施の形態】
上記のように、本発明のポリペプチドは、配列表の配列番号１４に示すアミノ酸配列又は該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、フォスファチジルセリンを加水分解するフォスフォリパーゼＡ1 活性を有する。配列表の配列番号１４に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドは、ヒト由来の新規なＰＬＡ１であり、セリンリン脂質（フォスファチジルセリン及びリゾフォスファチジルセリン）のグリセロールの１位にエステル結合を特異的に加水分解するものである（以下、この活性を持つ酵素を「ＰＳ−ＰＬＡ１」と呼ぶことがある）。ヒト由来のこのような性質を有するＰＬＡ１は初めて見出された。
【０００７】
配列表の配列番号１４に示すアミノ酸配列と８５％以上、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有し、かつ、フォスファチジルセリンを加水分解するフォスフォリパーゼＡ1 活性を有するポリペプチドも本発明の範囲に含まれる。特に、配列番号１４に示すアミノ酸配列のうち、１又は数個のアミノ酸が置換され、欠失され、付加され又は挿入され、かつ、フォスファチジルセリンを加水分解するフォスフォリパーゼＡ1 活性を有するポリペプチドも本発明の範囲に含まれる。このようなポリペプチドは、それをコードするＤＮＡに常法である部位特異的変異法等により変異を導入することにより容易に調製することができる。また、得られたポリペプチドがフォスファチジルセリンを加水分解するフォスフォリパーゼＡ1 活性を有するか否かは、下記実施例に記載する方法により、フォスファチジルセリンを基質としてＰＬＡ１活性があるか否かを調べることにより容易に知ることができる。また、細胞内で生産されたポリペプチドは、しばしばそのＮ末端領域の数個ないし数十個のアミノ酸が切断されて成熟タンパク質になることが知られている。後述の配列番号１１に示されるアミノ酸配列を有するラットＰＬＡ１では、成熟タンパク質においては配列番号１１で示されるアミノ酸配列における２５番目のグリシンがＮ末端になっている。従って、配列番号１４に示されるアミノ酸配列のうち、Ｎ末端から１〜３０個程度が欠失しているポリペプチドも当然ＰＬＡ１活性を有すると考えられ、このようなポリペプチドも当然ながら本発明の範囲内に含まれる。特に、配列番号１４に示されるヒトＰＬＡ１では、成熟タンパク質のＮ末端は第２０番目のセリンないし第２７番目のアラニンであると考えられるので、このような成熟タンパク質も当然本発明の範囲内に含まれる。
【０００８】
本発明はまた、上記本発明のポリペプチドをコードする核酸を提供する。核酸はＤＮＡでもＲＮＡでもよいが、多くの場合、熱安定性に優れたＤＮＡが好ましい。配列番号１４に示される塩基配列のうち、第３２番目の塩基（以下、第〜番目の塩基を「〜ｎｔ」のように記載する）であるＡから１３９９ｎｔのＧまでの領域がコード領域であるから、配列番号１４に示される塩基配列のうち、３２ｎｔのＡから１３９９ｎｔのＧまでの領域の塩基配列を有する核酸は本発明の核酸である。本発明の核酸は、これに限定されるものではなく、上記した本発明のポリペプチドをコードする核酸はいずれも本発明の範囲に含まれる。特に、配列番号１４に示される塩基配列と８５％以上、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有する塩基配列を有し、かつ、フォスファチジルセリンを加水分解するフォスフォリパーゼＡ1 活性を有するポリペプチドをコードする核酸は本発明の範囲に含まれる。また、配列番号１１に示される塩基配列のうち、１４ｎｔのＡから１３８１ｎｔのＧまでの領域の塩基配列を有する核酸は、ラット由来のセリンリン脂質特異的ＰＬＡ１をコードする核酸であり、この核酸も新規なものであって本発明の範囲に含まれる。
【０００９】
本発明の核酸は、その塩基配列が明らかになっているから、ヒトｃＤＮＡライブラリー（配列番号１１に示す塩基配列を有するＤＮＡはラットｃＤＮＡライブラリー）を鋳型としたＰＣＲにより、又は本発明のＰＬＡ１を発現している細胞のｍＲＮＡを鋳型としたＲＴ−ＰＣＲにより容易に調製することができる。
【００１０】
本発明はさらに、前記本発明の核酸を含み、宿主細胞中でフォスファチジルセリンを加水分解するフォスフォリパーゼＡ1 活性を有するポリペプチドを産生することができる組換えベクター及び該組換えベクターで形質転換された細胞を提供する。宿主細胞中での外来遺伝子発現のためのベクターはこの分野において周知であり、各種宿主細胞用のベクターが市販されてもいる。このような市販のベクターを用いてもよい。また、宿主細胞及び形質転換方法もこの分野において周知であり、宿主細胞も昆虫細胞、大腸菌や枯草菌のようなバクテリア、酵母、哺乳動物細胞等の各種のものが市販されている。このような市販の宿主細胞を用いてもよい。
【００１１】
本発明のポリペプチドは、上記本発明の形質転換細胞を培養し、該細胞又は培養液から常法により回収することにより得ることができる。なお、培養液からの回収は、通常のタンパク質の回収方法と同様にして行なうことができ、例えば、下記実施例において血小板からＰＬＡ１を精製した方法等を適用することができる。
【００１２】
ＰＬＡ１は、マスト細胞におけるヒスタミン放出を促進するので、本発明のポリペプチドに対する中和抗体は、アレルギーなどヒスタミンが関与する疾患の症状の軽減に有効であると考えられる。従って、本発明のポリペプチドは、アレルギーなどヒスタミンが関与する疾患の症状の軽減に有効な抗体を生産するための免疫原としての用途を有する。また、ＰＬＡ１でリン脂質を加水分解することにより、生理活性リゾリン脂質が生成されるので、本発明のポリペプチドは、生理活性リゾリン脂質の生産に用いることができる。
【００１３】
さらに、炎症部分にはセリンリン脂質が多く存在することが知られており、セリンリン脂質に対して特異性を有する本発明のＰＬＡ１は炎症部分に多く存在するものと考えられる。従って、上記本発明の核酸（この場合は、細胞中に存在するＲＮＡ）を検出又は測定することにより、炎症の診断が可能になる。検出又ははプライマーを用いたＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲを包含する）により高感度に行なうことができる。従って、本発明はまた、上記本発明の核酸又はその相補鎖の連続する１５〜５０塩基、好ましくは１５〜３０塩基の領域と相補的な、本発明の核酸又はその相補鎖を増幅するためのプライマーを提供する。このようなプライマーは、本発明の核酸を調製するための道具としても用いられる。この場合には、配列番号１４に示す塩基配列のうち、両端部分にある非コード領域又はこれを含む領域にそれぞれ相補的なプライマーが好ましい。
【００１４】
【実施例】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００１５】
実施例１
(1)   精製操作を通じて酵素活性の検出にはリゾフォスファチジルセリンを基質とし、リゾフォスフォリパーゼ活性を測定した。タンパク質濃度は２８０nmの吸光度でモニターした。酵素活性の測定は公知の方法（Higashi, S. et al. J. Biochem. 103, 442-447 (1988)、Yokoyama, K. et al. J. Biochem. 117, 1280-1287 (1995) ）に従った。基質とする1-[1-14C] オレオイル-sn-グリセロ-3- フォスフォセリンは公知の方法（Horigome, K.et al. J. Biochem. 101, 53-61 (1987)）に従って調製した。０．４ｍＭ塩化カルシウムを含む１００mMトリス塩酸緩衝液（pH7.5)に４０mMの基質と酵素を加え３７℃で適当な時間反応させた後、Doleの溶液（Dole, V. P. and Meinertz, H. J. Biol. Chem. 235, 2595-2599 (1960) ）を加えて反応を停止、遊離された脂肪酸を抽出した後、放射能を測定した。
【００１６】
一般的な方法（Horigome, K. et al. J. Biochem. 101, 53-61 (1987) 、Higashi,S. et al. J. Biochem. 103, 442-447 (1988) ）に従ってWistarラットから多血小板血漿を調製した。得られた多血小板血漿を２mM塩化カルシウム、２units/mlトロンビン存在下に３７℃で２０分間保温した後、１５００ｘｇ、４℃にて１０分間遠心分離し上清を分取した。３００匹分の上清をプールし精製原液とした。精製原液を１００mM塩化ナトリウムを含む１０mMトリス塩酸緩衝液（pH7.4 ）で平衡化したＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂ（商品名）カラム（３０ｍｌ）にかけ、フロースルー分画を集めた。フロースルー分画にリゾフォスフォリパーゼ活性が回収された。次に、得られたフロースルー分画を１００mM塩化ナトリウムを含む１０mMトリス塩酸緩衝液（pH7.4 ）で平衡化したヘパリンセファロースＣＬ−６Ｂ（商品名）カラム（１０ｍｌ）にかけ、平衡化に用いた緩衝液でカラムを洗浄した後、0.1 から１M の塩化ナトリウムの濃度勾配によりタンパク質を溶出した。各溶出分画のリゾフォスフォリパーゼ活性を測定し、酵素活性を含む分画をプールした。酵素活性は２５０mM塩化ナトリウム濃度の付近に溶出されていた。プールした溶液をブルーセファロースＣＬ−６Ｂ（商品名）カラム（２ｍｌ）にかけ、カラムを５００mM塩化ナトリウムを含む１０mMトリス塩酸緩衝液（pH7.4 ）で洗浄した後、タンパク質を１M 塩化ナトリウムを含む５０mMトリス塩酸緩衝液（pH9.0 ）を用いて溶出した。各精製工程での物質収支を表１にまとめた。
【００１７】
ブルーセファロースＣＬ６Ｂ（商品名）カラムの各溶出分画のリゾフォスフォリパーゼ活性を測定するとともに含まれるタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分析したところ、リゾフォスフォリパーゼ活性の高い分画には５５kDa のタンパク質が主成分として多く溶出されていることが分かった。同様の結果がヘパリンセファロースＣＬ−６Ｂカラムの溶出分画の分析からも得られた。これの結果は５５kDa のタンパク質がリゾフォスフォリパーゼ活性を持つタンパク質であることを示唆している。
【００１８】
【表１】
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【００１９】
(2)   ＳＤＳ−ＰＡＧＥで５５kDa の位置に泳動されるタンパク質が酵素活性を持つタンパク質であることを確認するために、公知の方法（Hattori,M. et al. J. Biol. Chem. 268, 18748-18753 (1993)）に準じて1,3-[3H]ジイソプロピルフルオロフォスフェート（3 Ｈ−ＤＦＰ）によるラベル化を試みた。リゾフォスフォリパーゼ活性を含むカラムの種々の溶出分画と 3Ｈ−ＤＦＰ（５μＣｉ、DuPont NEN）を混合し室温で１５分間放置した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行いタンパク質を分離した。次に、フルオログラフィーを行いラベル化されたタンパク質を検出した。その結果、５５kDa のタンパク質がラベル化されることを確認した。この結果は、５５kDa のタンパク質がセリンエステラーゼに特徴的な活性部位のセリン残基を有することを示している。なお、他にもラベル化されるタンパク質が見いだされたが、その含量とリゾフォスフォリパーゼ活性には相関が認められなかった。以上の事実は５５kDa のタンパク質がリゾフォスフォリパーゼ活性を持つ酵素タンパク質であることを示唆している。
【００２０】
(3)   ５５kDa のタンパク質を主成分とするブルーセファロースＣＬ−６Ｂ（商品名）カラムからの溶出分画を濃縮、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりタンパク質を分離した。次に、ゲル中のタンパク質をポリビニリデンジフルオライド（PVDF）膜（Millipore ）にトランスファーした後、クマシーブルー染色により５５kDa のタンパク質の位置を同定、そのバンドを切り出した。得られた膜断片を材料に、自動エドマン分解−ＰＴＨアミノ酸誘導体の合成・同定を行うアミノ酸配列決定装置（ABI model 477A protein sequencer connected on-line to ABI model 120A phenylthiohydantoin analyzer 、Perkin-Elmer）を用いてＮ末端のアミノ酸配列を決定したところ、配列番号１に示す配列が得られた。
Gly Asn Val Pro Pro Xaa Thr Gln Pro Lys Cys Thr Asp Phe Gln Ser Ala Asn Leu Leu Arg Gly Xaa Xaa Xaa Lys Val Gln Phe （配列番号：１）
【００２１】
上記のカラムからの溶出分画を濃縮して得たタンパク質を還元カルボキシルメチル化した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、クマシーブルー染色を行い、５５kDa のタンパク質に相当するバンドを切り出した。次に、ゲル中のタンパク質を公知の方法（p80-83, 「遺伝子クローニングのためのタンパク質構造解析」平野久著（1993）東京化学同人）に従って臭化シアンまたはリジルエンドペプチダーゼ処理し、断片化した。得られたペプチド断片を逆相ＨＰＬＣを用いて0.1 ％トリフルオロ酢酸を含む０から６４％のアセトニトリルの濃度勾配を用いて分離した。得られたペプチド断片のアミノ酸配列は前述のようにアミノ酸配列決定装置を用いて決定した。また場合によってはペプチド断片を１０から２４％の濃度勾配ゲルを用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離、PVDF膜にトランスファーした後、アミノ酸配列決定した。これらの方法で配列番号２から７のアミノ酸配列が得られた。
Ile Thr Ile Pro Lys （配列番号：２）
Phe His Ile Ser Ser Arg Xaa Xaa Arg Lys （配列番号：３）
Ala Phe Leu Ala Gly Asp Xaa Leu Xaa Xaa Phe Asn Pro （配列番号：４）
Leu Ser Leu Glu Ile Ser Arg Phe Leu Xaa Lys （配列番号：５）
Ala Phe Pro Cys Ala Ser Tyr Lys Ala Phe Leu Ala Gly Asp Ser Leu Asp Ser Phe Asn Pro Phe Leu Leu （配列番号：６）
Val Gly His Phe Tyr Lys Gly Gln Leu Gly Arg Ile Thr Gly Leu Asp Pro Ala Gly Pro （配列番号：７）
【００２２】
(4)   配列番号１および３に含まれるアミノ酸配列を参考に配列番号８、９のＤＮＡオリゴマーを作成しプライマーとして用いた。
GTICCICCICCIACNCARCC（配列番号：８）
ACICGIGADATRTGGAA （配列番号：９）
【００２３】
ラット巨核球のλｇｔ１１ｃＤＮＡライブラリー（大阪大学薬学部土井先生から入手）をテンプレートとし、配列番号８、９のＤＮＡオリゴマーをプライマーとしてＰＣＲを行った。増幅されたＤＮＡ断片をpT7Blue T-vector（Novagen ）にサブクローニングし塩基配列を決定した。解析の結果、配列番号２から７のアミノ酸配列を暗号化し得るＤＮＡ断片を選択し以後の実験に用いた。次に、このＤＮＡ断片をプローブにラット巨核球λｇｔ１１ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、プラークハイブリダイゼーションにて陽性を示すファージを２クローン選別した。得られたファージクローンに挿入されているｃＤＮＡ断片をEcoRI 処理により切り出し、pBluescript IISKファージミドベクター(Stratagene)にサブクローン後、塩基配列を決定した。塩基配列を解析したところ、タンパク質のＮ末端部分を暗号化する部分がかけていると考えられた。そこで、ｃＤＮＡの５’部分を得るためにラット血小板のトータルＲＮＡをテンプレートにMarathon cDNA amplification kit （Clontech）を用いて5'-RACE を行い、得られたＤＮＡ断片の塩基配列を決定した。このときプライマーとしては、ファージクローンの塩基配列解析結果にもとづいて設計した配列番号１０に示すＤＮＡオリゴマーを用いた。
TTCCGGATGTCACTGTCCTC（配列番号：１０）
【００２４】
5'-RACE の結果得られたＤＮＡ断片と前記の２つのファージクローンから得られたＤＮＡ断片とをあわせて、配列番号１１に示す塩基配列を持つｃＤＮＡが得られた。このｃＤＮＡは４５６アミノ酸からなるタンパク質を暗号化できる１３６８塩基からなるオープンリーディングフレームを含んでいることが分かった。暗号化されると予想されるタンパク質は、精製した５５kDa のタンパク質から決定した配列番号１から７のアミノ酸配列を全て含んでいた。また、Ｎ末端にシグナル配列と考えられる２４アミノ酸残基からなる疎水性領域を含んでいた。２５残基目のグリシンから始まるアミノ酸配列は、精製した５５kDa タンパク質のＮ末端アミノ酸配列（配列番号１）と一致した。さらに、暗号化されると予想されるタンパク質はセリンエステラーゼの活性中心に特徴的なアミノ酸配列モチーフ Gly Xaa Ser Xaa Glyを含んでいた。また３カ所のＮ−リンク糖鎖付加可能部位、１６のシステイン残基を含んでいた。
【００２５】
BLASTNプログラムを用いて、暗号化されると予想されるタンパク質と相同性のあるタンパク質を検索したところ、ラットの肝臓型リパーゼ、膵臓型リパーゼ、リポプロテインリパーゼと約３０％のアミノ酸相同性を示した。対応するヒトおよびマウスの酵素も有意な相同性を示した。しかしそれらより高い相同性を示すタンパク質は見出されなかった。
【００２６】
(5)   (4) で得られた各ｃＤＮＡ断片をSpeIを利用して完全長のｃＤＮＡに組み換えた。次に、得られたｃＤＮＡ（１ｎｔから１７４３ｎｔ）をバキュロウイルストランスファーベクター pVL1393（PharMingen）のSmaI-EcoRI部位に挿入した後、組み換えウイルスをバキュロゴールドトランスフェクションキット（PharMingen）を利用し、仕様書の方法に従って調製した。次に、メーカー（PharMingen）の仕様書の方法に従ってウイルスをＳｆ９細胞に感染させた。６ｘ１０5cells/ml のＳｆ９昆虫細胞（PharMingen）と組み換えウイルスまたは野生型バキュロウイルスＤＮＡ（AcNPV 、PharMingen）をmoi ＝10で混合し、２７℃で９６時間培養した。それぞれの感染細胞の培養上清を回収し酵素活性を測定したところ、組み換えウイルスでトランスフェクションした細胞の培養上清のみにリゾフォスフォリパーゼ活性とフォスファチジルセリンを加水分解するフォスフォリパーゼＡ１活性を認めた。なお、リゾフォスフォリパーゼ活性は(1) に示す方法で測定した。また、フォスフォリパーゼＡ１活性は公知の方法（Horigome, K. et al. J. Biochem. 101, 53-61 (1987) ）に従って調製した1-[1-14C] パルミトイル-2- アシル-sn-グリセロ-3- フォスフォセリン基質として同様の方法にて測定した。
【００２７】
この結果は、得られたｃＤＮＡの暗号化するタンパク質が血小板から精製した酵素と同じリゾフォスフォリパーゼ活性を有することを示すだけでなく、フォスファチジルセリンを加水分解するフォスフォリパーゼＡ１活性も同時に担っていることを示している。すなわち、得られたｃＤＮＡがＰＳ−ＰＬＡ１を暗号化することが明らかとなった。
【００２８】
(6)   (5) で得た組み換えウイルスで感染した細胞を培養し、培養上清５００mlから(1) に示す方法で約１６０μｇのＰＳ−ＰＬＡ１酵素を精製した。得られた酵素の分子量をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定したところ、５０ｋＤａと血小板から精製したもの（５５ｋＤａ、(1) ）に比べ小さめの分子量を示した。次に、ＰＳ−ＰＬＡ１の種々のリン脂質に対する基質特異性を検討した。特異性検討のための基質としては1-パルミトイル-2-[14C]アラキドノイル-sn-グリセロ-3- フォスフォエタノールアミン、1-パルミトイル-2-[14C]アラキドノイル-sn-グリセロ-3- フォスフォイノシトール、1-パルミトイル-2-[14C]アラキドノイル-sn-グリセロ-3- フォスフォコリン、1-パルミトイル-2-[14C]アラキドノイル-sn-グリセロ-3- フォスフォセリン、1-パルミトイル-2-[14C]アラキドノイル-sn-グリセロ-3- フォスファチジン酸を用いた。前３種はDuPont NENより購入し、後２種は公知の方法（Horigome, K. et al. J. Biochem. 101, 53-61 (1987) ）に従って調製した。酵素反応は、基質４０mM、塩化カルシウム０．４mMを含む１００mMトリス塩酸緩衝液（pH7.5 ）に、精製した酵素を加え３７℃で１５分間反応させることにより行った。生成物を薄層クロマトグラフィーにて分離し（展開溶媒：クロロホルム／メタノール／酢酸／水（２５／１５／４／２；ｖ／ｖ／ｖ／ｖ））、生成物の放射能をBAS2000 イメージアナライザー（富士写真フィルム）を用いて定量した。その結果、組み換え細胞から精製したＰＳ−ＰＬＡ１のホスファチジルセリンに対する比活性は 2.61 μmol/min/mgであるのに対し、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジン酸、ホスファチジルイノシトールに対する比活性は 0.1μmol/min/mg以下であった。同様の結果が血小板から精製した酵素でも得られた。この結果は、ＰＳ−ＰＬＡ１がホスファチジルセリン特異的であり、しかも血小板由来の酵素と組み換え細胞由来の酵素に違いがないことを示している。
【００２９】
(7)   次に、ＰＳ−ＰＬＡ１とリパーゼとの相同性が認められたことから、トリグリセリドを基質とする可能性について調べた。酵素活性の測定は次のようにして行った。酵素と２μM の1,2-di[14C]-オレオイル-sn-グリセロ-3- フォスフォセリン（[14C]PS 、公知の方法（Horigome, K. et al. J. Biochem. 101, 53-61 (1987) ）に従って調製）またはtri[14C]オレオイル−グリセロール（[14C]TG 、DuPont NEN）を３００μＭTritonX-100 （商品名）存在下に０．４mM塩化カルシウムを含む１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（pH7.5 ）中で３７℃、１５分間保温した。Bligh とDyerの方法（Bligh, E. G. and Dyer, W. J. Can. J. Biochem. 37,911-917 (1959) ）により生成物を抽出した後、(6) と同様にしてリゾホスファチジルセリンまたはジグリセリドの遊離を定量した。ジグリセリドの薄層クロマトグラフィーにおける展開溶媒はヘキサン／エーテル／酢酸（７０／３０／１；ｖ／ｖ／ｖ）を用いた。その結果、ＰＳ−ＰＬＡ１はこのTritonX-100 （商品名）ミセル系でホスファチジルセリンを基質とするがトリグリセリドは基質としないことが分かった。また、同じ系で２μＭの[14C]PS とラベル化していないTGを混合した場合、２μＭの[14C]TG とラベル化していないPSを混合した場合についても同様にして酵素活性を定量したところやはりトリグリセリドは基質とならないことが分かった。以上のことから、ＰＳ−ＰＬＡ１はリパーゼのアミノ酸配列との相同性が高いにも関わらずトリグリセリドを基質としないことが明らかとなった。
【００３０】
(8)   次に、ＰＳ−ＰＬＡ１がホスフォリパーゼＢ活性を持つ可能性を検討した。1-パルミトイル-2-[14C]アラキドノイル−ｓｎ−グリセロ−３−フォスフォセリンを基質として(6) に示す方法で酵素活性を測定した。薄層クロマトグラフィーでの展開パターンを解析したところ、遊離脂肪酸の位置には放射能が認められず、リゾホスファチジルセリンの位置に認められた。この結果は、ＰＳ−ＰＬＡ１がホスファチジルセリンのｓｎ−２位のアシル基の遊離を触媒しいなことを示している。一方、1,2-ジ[14C] オレオイル-sn-グリセロ-3- フォスフォセリンを基質とした場合には遊離脂肪酸とリゾホスファチジルセリンの両方の位置に放射能が認められた。この結果とこれまでの結果をあわせて考えると、ＰＳ−ＰＬＡ１はホスファチジルセリンまたはリゾホスファチジルセリンのｓｎ−１位のアシル基特異的に作用し、ホスフォリパーゼＢ活性を持たないことが分かった。
【００３１】
実施例２
(1)   次に、ラットＰＳ−ＰＬＡ１に対応するヒト酵素の有無を調べる目的で、ヒトEST bankからラットＰＳ−ＰＬＡ１ｃＤＮＡと相同性の高い配列を検索した。その結果、４３２塩基の相同性の高い配列が登録されていることが分かった（EST bank :human clone=120969、Genbank T96213）。このｃＤＮＡクローン（ＥＳＴクローンと呼ぶ）はヒト胎児の肝臓および脾臓のｍＲＮＡから得られたものであり、実際にタンパク質を暗号化する可能性は調べられていなかった。
【００３２】
このＥＳＴクローンを入手し全塩基配列を決定したところ、ラットＰＳ−ＰＬＡ１と約８０％の相同性があることが分かった。ただし、ラットｃＤＮＡのオープンリーディングフレームに相当する部分の前から約４／５の位置に４残基のヌクレオチド挿入があり、そのためそこに終止コドンが生じていることが分かった。そのため暗号化されると予想されるタンパク質はラットＰＳ−ＰＬＡ１よりも小さいことが示唆された。
【００３３】
このＥＳＴクローンがＰＳ−ＰＬＡ１を暗号化する可能性を検討するために、実施例１−(5) と同様の手法にてそのｃＤＮＡをバキュロウイルストランスファーベクターに組み込みＳｆ９細胞に感染させた。実施例１−(5) と同様にして培養上清の酵素活性を測定したがＰＳ−ＰＬＡ１に関連する活性は認められなかった。この事実は登録されていたＥＳＴクローンがヒトのＰＳ−ＰＬＡ１を暗号化するものではないことを示している。
【００３４】
(2)   実施例２−(1) のように登録されていたＥＳＴクローンはヒトＰＳ−ＰＬＡ１を暗号化していなかった。しかしながら、ラットＰＳ−ＰＬＡ１ｃＤＮＡと高い塩基配列相同性があったことから、このＥＳＴクローンの非翻訳領域と考えられる部分の塩基配列を参考に配列番号１２、１３のＤＮＡオリゴマーを作製しヒト肝臓由来のｍＲＮＡ（Clonetech ）をテンプレートにＲＴ−ＰＣＲを行った。
CACGAGGATTTCCAGCTCAG（配列番号：１２）
CCCTGTACATGTTTCTATTG（配列番号：１３）
【００３５】
得られたｃＤＮＡ断片の塩基配列を決定したところ、配列番号１４の塩基配列が得られた。この配列は、ラットＰＳ−ＰＬＡ１と同じ４５６アミノ酸からなるタンパク質を暗号化しうるオープンリーディングフレームを含んでいた。さらに暗号化されると予想されるタンパク質の特徴もラットのもの（実施例１−(4) 参照）と一致した。なお、登録されていたＥＳＴクローンで見られた４残基のヌクレオチド挿入は、得られたｃＤＮＡには見られなかった。またそれ以外にもアミノ酸置換を伴う塩基置換が一カ所、アミノ酸置換を伴わない塩基置換が数カ所認められた。
【００３６】
(3)   実施例２−(2) で得られたｃＤＮＡ断片を実施例１−(5) と同様の手法にてバキュロウイルストランスファーベクターに組み込みＳｆ９細胞に感染させた。実施例１−(5) と同様にして培養上清の酵素活性を測定したところ、ラットＰＳ−ＰＬＡ１の場合（実施例１−(5) ）と同様にリゾフォスフォリパーゼ活性とフォスファチジルセリンを加水分解するフォスフォリパーゼＡ１活性を認めた。以上の結果は、実施例２−(2) で得られたｃＤＮＡがヒトＰＳ−ＰＬＡ１を暗号化することを示している。
【００３７】
【発明の効果】
本発明により、セリンリン脂質に対し基質特異性を有するヒトＰＬＡ１が初めて提供された。また、それをコードするＤＮＡをはじめ、遺伝子工学的に該ＰＬＡ１を生産する手段が提供された。
【００３８】
【配列表】
0003733677.tif 000003
【００３９】
0003733677.tif 000004
【００４０】
0003733677.tif 000005
【００４１】
0003733677.tif 000006
【００４２】
0003733677.tif 000007
【００４３】
0003733677.tif 000008
【００４４】
0003733677.tif 000009
【００４５】
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【００４６】
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【００４７】
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【００４８】
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【００４９】
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0003733677.tif 000019
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