(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
膵臓島細胞内におけるホルモン遺伝子表現を制御するプロモータに結合する能力を有していて、ＳＥＱ  ＩＤ  NO：２に示されているアミノ酸配列を有するホメオボックスタイプ転写因子蛋白質をコードする分離された核酸。
【請求項２】
核酸が、ＳＥＱ  ＩＤ  NO：１に示されるヌクレオチド331−1182を含むものである請求項１記載の核酸。
【請求項３】
核酸がｃＤＮＡである請求項１記載の核酸。
【請求項４】
請求項１記載の核酸を含むベクター。
【請求項５】
請求項４記載のベクターでトランスフェクト又は形質転換された宿主細胞。
【請求項６】
請求項１記載の核酸でトランスフェクト又は形質転換された宿主細胞。
【請求項７】
ホメオボックス−タイプの膵臓島ホルモン転写因子を発現する方法であって、該方法が請求項６記載の宿主細胞を該転写因子の発現に適した条件の下で培養するステップを含む方法。
【請求項８】
ホメオボックス−タイプの膵臓島ホルモン転写因子を生産する方法であって、該方法が請求項６記載の宿主細胞を該転写因子の発現に適した条件の下で培養し、該転写因子を回収するステップを含む方法。
【請求項９】
請求項１記載の核酸によってコードされる、分離されたホメオボックス−タイプ膵臓島ホルモン転写因子蛋白質。
【請求項１０】
該蛋白質がＳＥＱ  ＩＤ  NO：３、ＳＥＱ  ＩＤ  NO：４、ＳＥＱ  ＩＤ  NO：８及びＳＥＱ  ＩＤ  NO：９で構成された群から選択される核酸配列を有する組織特異性プロモータ要素（ＴＳＥ）と結合する請求項９記載の転写因子蛋白質。
【請求項１１】
新しい哺乳動物膵臓島ホルモン転写因子蛋白質をコードする核酸配列のライブラリーをプローブするため用いられるＳＥＱ  ＩＤ  NO：１の少なくとも５０個の連続したヌクレオチドを含む分離された核酸プローブ。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は核酸と、それによってコード表現されるレセプター蛋白質に関するものである。本発明による核酸は新しい組織固有膵臓ホルモン因子蛋白質をコード表現する。本発明はまた、そうした転写因子をつくる方法と、インビボとインビトロの両方で、膵臓島ホルモン遺伝子プロモータからのホルモン遺伝子表現を調節するためにその転写因子蛋白質を用いる方法に関するものである。
発明の背景
内分泌性器官である膵臓は、主にペプチドホルモングルカゴン（Ａ−細胞）、インシュリン（Ｂ−細胞）、ソマトスタチン（Ｄ−細胞）、および膵臓ポリペプチド（Ｆ−細胞）を合成し、分泌する。小腸から発生学的手法で取り出したこれらの膵臓島細胞は、同じペプチドホルモン遺伝子の表現を指令する腸を出発点とする調節経路を有している可能性がある。形成初期の内分泌性膵臓には、ソマトスタチン、インシュリン、およびグルカゴンを共表現する多機能（pluripotent）細胞が存在している。これらの基幹細胞が成長すると、その内分泌性ホルモンレセプターが単一の遺伝子からの表現に拘束されてしまう傾向が観察され、このことは、一般の転写因子が当初３つの遺伝子すべてを規制できるのに対して、個々の核酸転写遺伝子蛋白質は、後で、個々の成熟島細胞タイプにおいてグルカゴン組織固有ペプチド生産を指定しなければならないことを示唆している。
グルカゴンおよびインシュリンの表現に比べて、ソマトスタチンの表現の開始はやや遅い。マウスでは、ソマトスタチンの表現はインシュリン遺伝子を共表現する細胞における発生学的発展の17日目に開始され、その後、成長したソマトスタチン生産Ｄ−細胞において抑制される。また、インシュリンおよびソマトスタチン遺伝子の両方を共表現する細胞の別のサブセットでは、膵臓ポリペプチド遺伝子は活性化され、その後、インシュリン遺伝子とソマトスタチン遺伝子の両方が抑制される。この発展調節のパターンはインシュリンおよびソマトスタチン遺伝子の表現はポジティブ制御メカニズムとネガティブ制御メカニズムの両方の影響を受けていることを示している。
ラットの膵臓島細胞系Ｔu−６のソマトスタチン遺伝子の表現は、cＡＭＰ反応要素（ＣＲＥ）と共同して高度の構成的活性をつくりだす組織固有プロモータ要素（ＴＳＥ）を必要とすることが観察されている。ＴＳＥ状の配列はソマトスタチンプロモータの500塩基対領域で３度繰り返されており、−300および−100に位置しているプロモータ近接ＴＳＥが最も高い活性を示す。ソマトスタチンＴＳＥは通常ホメオボックス−タイプの蛋白質によって識別される正統ＴＡＡＴモチーフを含んでいる。ホメオボックス因子ＩＳＬ−１は、例えば、ＴＳＥに結合して、ラットインシュリノーマ細胞系ＲＩＮ  ５ＡＨ内のソマトスタチン表現を調節することができる。しかしながら、ＩＳＬ−１はソマトスタチン生産ＴＵ−６細胞の抽出物内のＴＳＥ結合活性のほとんど無視し得る程度の部分だけを含んでいるように思われる。膵臓島細胞に加えて、ソマトスタチン遺伝子はニューロン、甲状腺のＣ−細胞、それに消化腺のＤ−細胞でも表現される。
膵臓における個々の遺伝子のキー調節因子として、多数のホメオボックス−タイプ因子が提案されているが、それらの構造、細胞分布およびそれらが豊富に含まれている部位に関してはまだ解明されていない問題が多数存在している。
膵臓ホルモンの重要な機能はグルコースの血管流体レベルを制御することである。グルカゴンはランゲルハンス島のＡ−細胞によって合成され、低血液グルコースレベルに反応して放出される。グルカゴンは主として肝臓細胞に影響を与え、アデニレートシクラーゼおよびcＡＭＰカスケードを誘発し、グリコーゲンの劣化と血中グルコースの増大をもたらす。代謝にグルコースがどの程度使えるかどうかは、体循環内のインシュリンおよびグルカゴン濃度の調節によって、（食事後の）過剰時期と（急激な活動後の）欠乏時期の両方に調節される。
食事後に、血中グルコースが100mlあたり80〜90mgという正常レベル以上に上昇すると、インシュリンが膵臓のランゲンルハンス島のＢ−細胞内の分泌小胞からの血液に放出される。島細胞自体はグルコースまたはアミノ酸レベルの上昇に反応して血液中にインシュリンを放出し、血液がそれを身体中に分配する。細胞表面レセプターに結合することによって、インシュリンは血液からのグルコースを取り除かせ、それをグリコーゲンとして蓄積させる。グルコースが100mlあたり80mg以下に低下すると、その島のＡ−細胞がグルカゴンの分泌を開始する。グルカゴンは肝臓細胞のグルカゴンレセプターと結合し、アデニレートシスラーゼおよびcＡＭＰカスケードを活性化させる（エピネフィリンの反応に類似した反応）。その結果。グリコーゲンの劣化と循環中へのグルコースの放出をもたらす。
糖尿病は体内のインシュリン作用の不十分さによって起こされ、インシュリンレベルの調整に関与する種々の欠陥から発生する場合がある。例えば、インシュリンレセプターの機能あるいは調節における異常は、糖尿病を持つ一部の人々において観察されている。この病気は、構造的に異常なインシュリンの生産、またはプロインシュリンのインシュリンへの転換の不良によって、正常なインシュリン合成が行われないことによっても発生する。幼児期、あるいは早い時期の糖尿病は膵臓島のＢ−細胞による不十分な、あるいは異常なインシュリン合成によって引き起こされる。こうした状況のほとんどでは、インシュリンの注射によって問題を克服することができる。したがって、特定のタイプの糖尿病を持った患者を措置するためには、糖尿病患者の体内でのインシュリンレベルを増大させる方法の開発が望ましい。
発明の簡単な説明
本発明によれば、新しいホメオボックス−タイプの転写因子蛋白質が提供される。本発明による蛋白質は膵臓島細胞から抽出され、インビボとインビトロの両方でのホルモン遺伝子の調節に有益な役割を果たす。加えて、これらの蛋白質、あるいはそれらの断片は、抗転写因子抗体をつくりだす免疫源としても有益である。
上述の膵臓島転写因子蛋白質をコード表現する分離された核酸分子、およびそうした分子を含んだ組換え細胞も提供される。ここで述べた分子は当業者には公知の種々の表現システムに組み込むことができる。加えて、本発明による核酸分子は任意のサンプル内での膵臓島転写因子遺伝子またはmＲＮＡトランスクリプトが存在しているかどうか、そして、存在している場合の量に関するアッセイのプローブとしても有用である。上に述べた核酸分子、およびそれらの断片は、膵臓島転写因子をコード表現する遺伝子の増強のためのＰＣＲ反応におけるプライマーおよび／またはテンプレートとしても有用である。
本発明による膵臓島ホルモン転写因子蛋白質と免疫反応性のある抗体も提供される。これらの抗体は任意のサンプル、例えば組織サンプルやウェスターンブロットなどに存在する膵臓島転写因子蛋白質のレベルを判定するための診断アッセイにおいて有用である。これらの抗体は、膵臓島転写因子蛋白質を生成するためにも用いることができる。
内分泌性ホルモン遺伝子を制御するプロモータからの転写を形成するための方法も提供される。また、哺乳動物におけるインシュリンのレベルを調節し、グルコースが存在している場合の哺乳動物における糖尿病を措置する方法も提供してくれる。
発明の詳細な説明
本発明によれば、分離された哺乳動物のホメオボックス−タイプの転写因子蛋白質が提供される。“ホメオボックス−タイプの転写因子蛋白質”あるいは“転写因子蛋白質”という表現は膵臓島ホルモン遺伝子の天然のプロモータ領域に結合して、mＲＮＡ転写を調節することができる蛋白質を意味している。
本明細書および特許請求の範囲における、ＤＮＡ，ＲＮＡ、ポリペプチド、または蛋白質の形容詞として“分離された”または“精製された”という用語が使用されている場合、そのように限定されたＤＮＡ，ＲＮＡ、ポリペプチド、または蛋白質が人の手によって生産され、したがって、インビボ細胞環境におけるその天然の状態からは分離されていることを意味している、こうした人為的操作の結果として、本発明による組換えＤＮＡ，ＲＮＡ、ポリペプチド、および蛋白質は、天然のままのＤＮＡ，ＲＮＡ、ポリペプチド、および蛋白質では果たすことができない役割を果たすことができる。
ここで用いられている“哺乳動物の”という用語は、例えば、ヒト、ラット、マウス、ウサギ、サル、ヒヒ、ニワトリ、ブタ、ヒツジ類、イヌ類、ネコ類など、そこから本発明による転写因子蛋白質が抽出される種々の種を意味している。
ここで用いられている“ホメオボックス”という用語は任意のプロモータ領域内の特定のヌクレオチド配列に結合する本発明による転写因子内部の約60〜65のアミノ酸によって構成される領域を意味している。ホメオボックス領域に関する一般的な検討については、Gehring, W., ＴＩＢＳ, 17：277−280（August/1992）参照。本発明によるホメオボックス領域は、好ましくは、それそれＴＳＥ−ＩおよびＴＳＥ−IIに対応したＳＥＱ  ＩＤ  NO：３およびNO：４に規定される“組織固有要素”のいずれか、あるいは両方に結合する。典型的なホメオボックス領域は、ＳＥＱ  ＩＤ  NO：２のアミノ酸146〜205と同じアミノ酸配列を有している。
ホメオボックス領域内に、“認識ヘリックス”と呼ばれるＤＮＡ−結合特性に関与するα−ヘリックスが存在している。この認識ヘリックスは、通常、本発明による蛋白質ホメオボックス領域の約42〜52アミノ酸で発生する（例えばＳＥＱ  ＩＤ  NO：２のアミノ酸187〜197）。好ましい実施例においては、本発明による転写因子蛋白質はホメオボックス領域の位置44、例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  NO：２のアミノ酸位置189にヒスチジンアミノ酸残基を含んでいる。
“プロモータに結合する”という表現、あるいはそれが文法的に変化した表現は、ＤＮＡ−結合転写因子（例えば、クロレセプター、ラムダレセプターなど）の核酸の特定の領域との、ＲＮＡ転写を調節するための結合を意味している〔例えば、Freifelder, D., Molecular Biology, 188−194（第２版、1987）参照〕。本発明による転写因子は少なくとも、哺乳動物のインシュリンまたはソマトスタチン遺伝子から選択されたプロモータ領域に結合する。典型的な組織固有要素としては、ラットインシュリン“Ｐ−ボックス”（ＳＥＱ  ＩＤ  NO：８）（例えば、OhlssonおよびEdlund, 1986, Cell, 45：35−44、本明細書に引例）に述べられているラットインシュリン遺伝子の−82から−64のヌクレオチド位置）；ラットインシュリン−１“ＦＬＡＴ”または“Ｅ２”応答要素（ＳＥＱ  ＩＤ  NO：９）（例えば、上述のOhlssonおよびEdlundに述べられているラットインシュリンの−222から−208ヌクレオチド位置）；ＴＳＥ−Ｉ（ＳＥＱ  ＩＤ  NO：３）；ＴＳＥ−II（ＳＥＱ  ＩＤ  NO：４）などがある。特に好ましい実施例においては、本発明による転写因子は上に述べた応答要素のそれぞれを結合させる能力を有している。
“膵臓島ホルモン遺伝子”という表現は内分泌性膵臓島細胞にとって内発性のホルモンをコード表現する遺伝子を示している。“膵臓島”という用語は内分泌性膵臓島細胞に対して内発性の、ホルモンコード表現遺伝子を示している。“膵臓島”とは、哺乳動物の内分泌性膵臓（島細胞）から取り出した細胞のグループを意味している。こうした細胞はペプチドホルモングルアカゴン（膵臓Ａ−細胞）、インシュリン（膵臓Ｂ−細胞）、ソマトスタチン（膵臓Ｄ−細胞）、および膵臓ポリペプチド（膵臓Ｆ−細胞）を合成し、分泌する。
本発明による転写因子は、膵臓島細胞におけるホルモン遺伝子表現を制御する複数のプロモータに結合する能力（つまり、２つ以上のホルモン遺伝子プロモータに結合する能力）を有していることを特徴とする。好ましくは、本発明による転写因子は少なくともインシュリンおよびソマトスタチン遺伝子からのＲＮＡ転写を調節する。本発明による転写因子はトランス活性化、またはトランス抑制ＲＮＡ転写のいずれかで転写を調節する。
特殊な実施例においては、本発明による転写因子はさらに膵臓ホルモン遺伝子をトランス活性化する能力、例えば、膵臓および小腸内部でのインシュリン、グルカゴン、およびソマトスタチンの表現を活性化する能力を有していることを特徴とする。“トランス活性化”という表現、またはそれが文法的に変化した表現は、それがホルモン遺伝子表現に関する場合、膵臓島ホルモン遺伝子のプロモータ領域への結合とmＲＮＡ転写開始における共同作業における本発明による転写因子の作用を示している。
別の実施例で、本発明による転写因子は、さらに、膵臓ホルモン遺伝子表現をトランス抑制する能力、例えば、膵臓および小腸内部でのインシュリン、グルカゴン、およびソマトスタチンの表現を抑制する能力を有していることを特徴としている。“トランス抑制”という表現、またはその文法的に変化した表現は、それがホルモン遺伝子表現に関する場合、膵臓島ホルモン遺伝子のプロモータ領域への結合と、mＲＮＡ転写の開始（つまり、プロモータからのＲＮＡ転写活性の除去）の開始の抑止における本発明による転写因子、またはそのポリペプチド断片の作用によるものである。
別の側面で、本発明による転写因子は、特に小腸および膵臓における、インシュリンおよびソマトスタチン転写の組織固有レギュレータである。自然に発生する本発明による蛋白質の表現はそれがインシュリンおよびソマトスタチンプロモータ上での機能的に重要なcis要素での主要な結合活性を構成している膵臓および小腸内部での内分泌細胞タイプに高度に限定されている。本発明による蛋白質は、同じcis要素を通じてインビトロとインビボの両方で転写を刺激（つまり、トランス活性化）することが認められている。
顕著な点は、本発明による転写因子はインシュリンおよびソマトスタチン生産膵臓島細胞からの核酸抽出物における圧倒的なＴＳＥ結合活性の原因となっており、この蛋白質がペプチドホルモン表現の調節と成長中の腸組織内の内分泌性細胞の指定において重要な役割を果たしているという仮説を裏づけるものである。
ＣＲＥＢは、Ｔu−６細胞におけるＣＲＥ結合活性の主要な役割を果たしているので、インビボで観察される共作用性はＣＲＥＢと本発明による膵臓転写因子との間の相互作用から生じているかもしれないと考えられている。ホルモン性刺激がない場合、ＣＲＥＢ活性はcＡＭＰ調節ＰＫ−Ａ部位から発生するものではなく、Ｑ２と呼ばれるグルタミンを豊富に含んだ領域から発生しているように思われる。したがって、ＣＲＥＢは本発明による細胞固有転写因子と相乗作用してインシュリンおよびソマトスタチン遺伝子などの膵臓ホルモン遺伝子の高レベル表現を提供する役割を果たすホスホリル化依存または構成的活性化領域を交互に採用することによっていくつかの機能を副次的に果たしているのかもしれない。
本発明のさらに別の実施例において、本発明による転写因子は、内分泌性膵臓のＢ−細胞とＤ−細胞では均一に表現されるのに外分泌性細胞では表現されないことを特徴としている。
ここで用いられている“均一に表現される”という表現は本発明による転写因子をコード表現する自然発生的なＲＮＡがインシュリンおよびソマトスタチンをつくりだす膵臓島細胞タイプのそれぞれに検出することができることを意味している。好ましくは、表現のレベルはこれらの膵臓島細胞タイプのそれぞれにおいて基本的には均等である。
別の側面で、本発明による転写因子蛋白質は、さらに、グルコース濃度の変動に反応を示すことを特徴としている。ここで用いられている“グルコース濃度の変動に反応を示す”という表現は、本発明による転写因子の表現が存在しているグルコース濃度に対応して変動することを意味している。例えば、本発明による蛋白質をコード表現するmＲＮＡのレベルは、膵臓島細胞が20mM程度のグルコースにおいて培養された場合、膵臓島細胞が２mM程度のグルコース内部で培養する場合よりかなり高い。
現在の段階で好ましい本発明による膵臓島ホルモン転写因子蛋白質は、ＳＥＱ  ＩＤ  NO：２に示されている蛋白質配列と基本的には同じアミノ酸配列、および、アクセス番号69385に基づいてＡＴＣＣに寄託されたプラスミドpＩＴＦ−１および生物学的な活性を有し、その修正された形態の転写因子コード表現部分によってコード表現されるアミノ酸配列と基本的には同じアミノ酸配列を有している。当業者なら、結果としてもたらされるレセプター種の生物学的活性を変えずに、上に述べた配列の多数の残基を他の、化学的、立体構造的および／または電子的に同様の残基と取り替えることができることが分かるであろう。
大腸菌ＸＬ１−ブルー細胞（ストラタジーン）内で形質変換されたプラスミドpＩＴＦ−１は、本条約によって布告された規制を目的とする微生物の寄託の国際識別に関するブタペスト条約の条件に基づいて、12301 Parklawn  Drive, Rockville, Maryland, U. S. A. 20852のAmerican Type Culture Collection（ＡＴＣＣ）に、1993年８月12日に寄託された。寄託された素材のサンプルは工業所有権事務局あるいは条約および規制の諸条件、あるいは米国および他のすべての国、あるいは本出願、または本出願の優先性を主張する出願が申請されている、あるいは該出願に基づくいずれかの特許が認められている国際的の特許法やその他の規制に基づいてそれらを受けとる資格を持った個人に対して使用が認められているし、将来においても使用が認められる。特に、本出願に基づいた、あるいは本願に対する優先性を主張する、あるいは参照によってそれを組み込んだすべての出願に基づく米国特許が発行された場合、寄託された素材の利用可能性に関するすべての制限は撤廃され、その制限解除は撤回されない。
ここで使われている“基本的には同じアミノ酸配列”という表現は、基準となるアミノ酸配列に対して少なくとも70％程度の同一性を有しており、そして、基準アミノ酸配列によって定義される蛋白質と同様の機能的、および生物学的特性を保持しているアミノ酸配列を示している。好ましくは、“基本的に同じアミノ酸配列”を有している蛋白質は、基準アミノ酸配列に対して少なくとも80％、より好ましくは90％のアミノ酸同一性を有している。そして、95％以上のアミノ酸同一性を有するものが最も好ましい。
“生物学的な活性を有する”または“機能的”という用語は、本明細書中で本発明による転写因子蛋白質、またはそのポリペプチド断片の形容詞として用いられた場合、ここで述べられているホメオボックス−タイプの転写因子のいずれかと類似した機能的特性を示すポリペプチドを意味している。例えば、ひとつの実施例において、生物学的な活性を有する蛋白質はＴＳＥ−Ｉ，ＴＳＥ−II，“Ｐ−ＢＯＸ”，“ＦＬＡＴ”のいずれかと結合してそれらからのＲＮＡの転写を調節するものである。こうした活性は、ゲルシフトおよび実施例５に述べるＤＮＡse  Ｉ保護アッセイなど、当業者に公知のいずれの方法によってでも評価することができる。
本発明による転写因子蛋白質は、実施例１〜３に述べられている方法、以下に述べる組換え表現システムなど、当業者に公知の種々の方法で分離することができる。
本発明の別の実施例によれば、本発明による転写因子蛋白質をコード表現する分離された核酸が提供される。ここに述べられている核酸分子は、こうした核酸を当業者に公知の種々の蛋白質表現システムに組み込んだ場合、本発明による転写因子蛋白質をつくりだすのに有益である。加えて、こうした核酸分子またはその断片を簡単に検出可能な置換基とラベルすることができ、任意のサンプルにおける膵臓ホルモン転写因子遺伝子またはmＲＮＡ転写の存在および／またはその量の評価のためのハイブリダイゼーションプローブとして用いることができる。ここに述べられる核酸分子、およびその断片は、ここで述べられている本発明による転写因子蛋白質をコード表現する遺伝子を増幅するためのＰＣＲ反応においてプライマーおよび／またはテンプレートとしても有益である。
内分泌性転写因子をコード表現する典型的な核酸は以下のものから選択することができる。
(ａ)  ＳＥＱ  ＩＤ  NO：２に示されるアミノ酸配列をコード表現するＤＮＡ、または、アクセス番号69385に基づいてＡＴＣＣに寄託された、プラスミドpＩＴＦ−１の転写因子コード表現部分、
(ｂ)  やや厳格な条件下で(ａ)のＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡにおいて、該ＤＮＡが生物学的な活性を有する内分泌性転写因子をコード表現することを特徴とするＤＮＡ、
(ｃ)  (ａ)か(ｂ)のＤＮＡで変性したもの、該ＤＮＡが生物学的な活性を有する内分泌性ホルモン転写因子をコード表現するＤＮＡ。
ここで使われている“核酸”という用語は、リボ核酸（ＲＮＡ）またはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を意味している。ＤＮＡは相補ＤＮＡ（cＤＮＡ）であっても、内分泌性転写因子を表現する遺伝子など、ゲノム性ＤＮＡであっても、いずれでもよい。
ハイブリダイゼーションとは、染色体ＤＮＡにおいて自然に発生する結合と類似した水素結合を通じて核酸の相補ストランド（つまり、センス：アンチセンスストランド、またはプローブ：標的−ＤＮＡ）が相互に結合することを意味している。任意のプローブを標的−ＤＮＡとハイブリダイズさせるのに用いられる厳しさのレベルは当業者なら容易に変更できるであろう。
“厳格なハイブリダイゼーション”という用語は、ここでは、ポリ核酸ハイブリッドが安定的に存在できる状態を意味している。当業者にはよく知られているように、ハイブリッドの選択性はそのハイブリッドの溶解温度（Ｔm）に関連している。一般的に、ハイブリッドの安定性はナトリウムイオン濃度および温度の関数である。通常、ハイブリダイゼーション反応は厳格さがより低い条件下で行われ、その後厳格さを変えて、より高い厳格さで洗浄する。ハイブリダイゼーションの厳格さとは、その洗浄条件に関連している。
ここで用いられている“やや厳格なハイブリダイゼーション”とは、標的−ＤＮＡが、その標的−ＤＮＡに対して60％程度、好ましくは75％程度、そしてより好ましくは85％程度、そして最も好ましくは90％以上の相同性を有する相補核酸に結合できるようにする状態を意味している。好ましくは、やや厳格な条件とは50％ホルムアミド、５Ｘデンハート溶液、５Ｘ  ＳＳＰＥ，0.2％ＳＤＳ内で42℃の温度下でハイブリダイゼーションを行い、その後、65℃の温度下で0.2Ｘ  ＳＳＰＥ，0.2％ＳＤＳで洗浄する場合と同等の条件である。
“高厳格なハイブリダイゼーション”とは、その核酸配列が65℃で0.018Ｍ  ＮａＣｌで安定にハイブリッドする許容条件である（即ち、もしハイブリッドが65℃で0.018Ｍ  ＮａＣｌで不安定であれば、ここでいう、高厳格な条件下で安定ではない）。高厳格な条件は例えば、42℃で50％ホルムアミド、５Ｘデンハート溶液、５Ｘ  ＳＳＰＥ，0.2％ＳＤＳ内でハイブリダイゼーションし、後65℃で0.1Ｘ  ＳＳＰＥおよび0.1％ＳＤＳ洗浄する条件である。
“低厳格度ハイブリダイゼーション”という表現は、10％ホルムアミド、５Ｘデンハート溶液、６Ｘ  ＳＳＰＥ，0.2％ＳＤＳ内で42℃の温度下でハイブリダイゼーションを行い、その後、１Ｘ  ＳＳＰＥ，0.2％ＳＤＳ内で50℃の温度下で洗浄を行う場合と同様の条件を意味する。デンハート溶液およびＳＳＰＥ（Sambrookら、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor  Laboratory Press, 1989）は、他の適切なハイブリダイゼーション緩衝液と同様、当業者にはよく知られている。
ここで用いられている“変性したもの”とは、少なくともひとつのヌクレオチドが基準核酸、例えばＳＥＱ  ＩＤ  NO：１と違っているが、基準アミノ酸と同じアミノ酸をコード表現するコドンを意味している。例えば、“ＵＣＵ”，“ＵＣＣ”，“ＵＣＡ”および“ＵＣＧ”などの３文字で示されるコドンは、これら４つのコドンがすべてアミノ酸セリンをコード表現するので、変性物である。
好ましい実施例においては、ここで開示されている内分泌性ホルモン低蛋白質をコード表現するcＤＮＡは、ＳＥＱ  ＩＤ  NO：１のヌクレオチド331−1182、あるいはアクセス番号69385に基づいてＡＴＣＣに寄託されたプラスミドpＩＴＦ−１の転写因子コード表現部分と基本的には同じヌクレオチド配列を有している。内分泌性ホルモン転写因子蛋白質をコード表現する現在の段階で最も好ましいcＤＮＡは、ＳＥＱ  ＩＤ  NO：１のヌクレオチド331−1182、またはアクセス番号69385に基づいてＡＴＣＣに寄託されたプラスミドpＩＴＦ−１の転写因子コード表現部分と同じヌクレオチド配列を有している。
ここで用いられている“基本的に同じヌクレオチド配列”という用語は、基準ポリヌクレオチドに対して十分な相同性を有しており、やや厳格なハイブリダイゼーション条件に基づいてハイブリダイズするＤＮＡを意味している。ひとつの実施例において、基準となるヌクレオチド配列と同じヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  NO：２に指定されているのと基本的に同じアミノ酸配列をコード表現する。別の実施例で、基準ヌクレオチド配列と“基本的に同じヌクレオチド配列”を有しているＤＮＡは、基準となるヌクレオチド配列に対して少なくとも60％の相同性を有している。基準ヌクレオチド配列に対して少なくとも70％、好ましくは90％、そして、より好ましくは95％以上の相同性を有するＤＮＡが好ましい。
本発明による核酸は、例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  NO：１などの種々の領域からのオリゴヌクレオチドプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行う実施例１および２に述べられている方法など、先行技術において公知の種々の方法によってつくることができる。
本発明のさらに別の実施例によれば、任意にラベルされた転写因子コード表現cＤＮＡあるいはその断片を用いて新しい哺乳動物の膵臓島ホルモン転写因子をコード表現するさらに別の核酸配列のライブラリー（例えば、cＤＮＡ、ゲノム性など）をプローブすることができる。実施例１および２に述べられているように、哺乳動物の膵臓島cＤＮＡライブラリー、好ましくはヒトの膵臓島cＤＮＡライブラリーの構造は先行技術において公知である。こうしたcＤＮＡライブラリーのスクリーニングは、当初、約42℃以下の温度、約50％以下のホルムアミド濃度、そして、低塩分濃度を内容とする厳格さの低い条件で行われる。
現在の段階で好ましいプローブに基づいたスクリーニング条件は約37℃の温度、約20％のホルムアミド濃度、そして５Ｘ標準くえん酸食塩水（ＳＳＣ：20Ｘ  ＳＳＣは３Ｍ塩化ナトリウム、0.3Ｍくさん酸ナトリウム、pH7.0を含んでいる）を内容としている。こうした条件は、完全な相同性がなくても、プローブ配列とかなりの程度の類似性を有する配列を確認できるようにしてくれる。“かなりの類似性”という表現は少なくとも50％の相同性を有している配列を意味している。好ましくは、プローブと少なくとも70％の相同性を有する配列が可能となり、プローブとより低い相同性を有する配列を区別できるようにするハイブリダイゼーション条件が指定される。その結果、ＳＥＱ  ＩＤ  NO：１のヌクレオチド331−1182と基本的には同じヌクレオチド配列が得られる。
ここで用いられている核酸“プローブ”とは単一鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ、あるいはその断片で、ＳＥＱ  ＩＤ  NO：１のいずれか、好ましくはヌクレオチド331−1182に示されているいずれか14またはそれ以上と同じ（あるいはそれと相補的な）少なくとも14、好ましくは20、より好ましくは50の継続的な塩基を含んだヌクレオチドの配列を有している。それからプローブを構成する好ましい領域はＳＥＱ  ＩＤ  NO：１の５′および／または３′コーディング領域を含んでいる。さらに、本発明の転写因子蛋白質のcＤＮＡコード表現領域全体をプローブとして用いることもできる。プローブは、以下に述べるような先行技術において公知の方法でラベルすることができ、種々の診断キットで用いることができる。
ここで述べられている、種々の文法的形態における“ラベル”または“表示手段”とは、検出可能な信号をつくりだすのに直接または間接的に関与する単一の原子または分子を示している。いずれのラベルまたは表示手段も本発明の核酸プローブ、表現された蛋白質、ポリペプチド断片、あるいは抗体分子に結合させることができる。これらの原子または分子は単独でも、または別の試薬との組み合わせでも用いることができる。こうしたラベルは臨床診断化学において良く知られている。
このラベル手段は変性しないで抗体または抗原と化学的に結合して有益な免疫蛍光トレーサであるフルオロクローム（染料）を形成する蛍光ラベリング試薬などであってよい。適切な蛍光ラベリング試薬は、フルオレセインイソシアネート（ＦＩＣ）、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、５−ジメチルアミン−１−ナフタレンスルホニルクロライド（ＤＡＮＳＣ）、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、リスアミン、ローダミン8200スルホニルクロライド（ＲＢ−200−ＳＣ）などである。免疫蛍光分析法の説明は、DeLuca, “Immunofluorescence Analysis”, in Antibody As a Tool, Marchalonisら、eds., John Wiley & Sons, Ltd., pp.189−231（1982）に開示されている。この資料は本明細書に引例として組み込まれている。
ひとつの実施例では、その指示グループはホースラディッシュペロキシダーゼ（ＨＲＰ）、グルコースオキシダーゼなどの酵素である。主要指示グループが酵素である場合、目に見える信号をつくりだすために別の試薬が必要となる。ＨＲＰのためのそうした追加試薬としては過酸化水素、ジアミノベンジジンなどの酸化染料前駆体などである。グルコースオキシダーゼを用いて有用な追加試薬は２，２′−アジノ−ジ−（３−エチル−ベンズチアゾリン−Ｇ−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）である。
別の実施例では、放射性元素がラベリング用試薬として用いられる。典型的な放射ラベル用試薬はガンマ線放射を発生する放射性元素である。124Ｉ，125Ｉ，126Ｉ，131Ｉおよび51Ｃrなどガンマ線を放出する元素は、ひとつのタイプの放射性元素指示グループを代表するものである。特に好ましいのは125Ｉである。別のグループの有用なラベルする手段は陽電子を放出する11Ｃ，18Ｆ，15Ｏおよび13Ｎなどの元素である。このように放出された陽電子は動物体内に存在する電子と衝突するとガンマ線を発生する。32Ｐ，111インジウムまたは3Ｈなどのデータ線放出元素も有用である。
核酸、抗体、ポリペプチド、および蛋白質のラベリングなど、基質へのラベルの結合は先行技術において良く知られている。例えば、本発明による抗体は培養媒体で提供される放射ラベルされたアミノ酸の代謝による取り込みによってラベルすることができる。例えば、Galfreら、Meth, Enxymol., 73：３−46（1981）参照。活性化された機能基による蛋白質接合、あるいは結合の従来の手段は特に利用性が高い。例えば、Aurameasら、Scand. J. Immunol., Vol. ８, Suppl. ７：７−23（1978），Rodwellら、Biotech., ３：889−894（1984）、および米国特許第4,493,795号参照。
本発明のさらに別の実施例においては、適切な宿主細胞内に上に述べた核酸配列を表現させることによって本発明による転写因子を遺伝子組換えでつくるための方法が提供される。ここで述べられている膵臓転写因子をつくりだすのに適した組換えＤＮＡ表現システムは先行技術において良く知られている。例えば、上に述べたヌクレオチド配列をさらに操作するためにベクターに組み込むことができる。ここに用いられているベクター（またはプラスミド）という用語は、その表現または複製を目的としてヘテロロガスＤＮＡを細胞に導入するために用いられる個々の要素を意味している。
適切な表現ベクターには、そうしたＤＮＡの表現を規制することができるプロモータ領域など、調節配列に操作的に結合されるＤＮＡを表現することができるベクターなどがある。したがって、表現ベクターとは、プラスミド、ファージ、遺伝子組換えウィルス、あるいはその他の、適切な宿主細胞に導入すると挿入されたＤＮＡの表現をもたらすベクターなど、遺伝子組換えＤＮＡまたはＲＮＡ構成を示している。適切な表現ベクターは当業者にはよく知られており、真核細胞そして／または原核細胞内で複製することができるもの、そしてエピゾーム性のままでいるもの、そして宿主細胞のゲノムに組み込まれるなどを含む。
ここで用いられているプロモータ領域という用語はそれが操作によって結合されるＤＮＡの転写を制御するＤＮＡのセグメントを意味している。プロモータ領域としては、ポリメラーゼ認識、結合、および転写を開始させるのに十分な特定の配列を含んでいる。さらに、プロモータ領域には、ＲＮＡポリメラーゼの認識、結合、および転写の開始を調節する配列を含んでいる。これらの配列はcisアクティングであってもよいし、トランスアクティング因子に反応性のあるものでもよい。プロモータは、調節に応じて、構成的である場合もあり、また、規制的であってもよい。本発明の実施での使用が考えられる典型的なプロモータには、ＳＶ40アーリープロモータ、サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）プロモータ、マウス乳腺腫瘍ウィルス（ＭＭＴＶ）ステロイド誘発性プロモータ、マックロニーマウスロイケニアウィルス（ＭＭＬＶ）プロモータなどを含んでいる。
ここで用いられている“操作的に結合される”という用語は、ＤＮＡとプロモータ、エンハンサ、転写または翻訳停止サイト、および他の信号配列など、調節およびエフェクタヌクレオチド配列との機能的な関係を示している。例えば、ＤＮＡのプロモータへの操作的結合とは、ＤＮＡとプロモータとの間の、そのＤＮＡの転写が、特にそのＤＮＡを識別し、そのＤＮＡに結合し、そしてそれを転写するＲＮＡポリメラーゼによって、そのプロモータから開始されるような物理的、機能的関係を意味している。表現、そして／またはインビトロでの転写を最適化するためには、余分な、不適切な別の翻訳の開始（スタート）コドン、あるいは転写または翻訳のレベルのいずれかで表現に干渉したり、あるいはそれを低下させてしまう他の配列を除去するために、それらクローンの５′未翻訳部分を取り除いたり、加えたり、あるいは変更したりすることが必要な場合もある。また、コンセンサスリボゾーム結合部位〔例えば、Kozak（1991）J. Biol. Chem. 266：19867−19870参照〕を５′のスタートコドンに直接挿入することもできるし、表現を増幅してもよい。こうした修正が望ましいこと（あるいはその必要性）は経験的に判断できる。
ここで用いられている表現という用語は、ポリ核酸がmＲＮＡに転写されて、ペプチド、ポリペプチド、または蛋白質に翻訳されるプロセスを意味している。ポリ核酸がゲノム性ＤＮＡから取り出される場合、その表現には、適切な真核宿主細胞または生物が選ばれた場合、スプライシングまたはmＲＮＡが含まれる。
原核形質変換ベクターは先行技術においてよく知られており、ｐブルースクリプト、およびファージ／ラムダＺＡＰベクター（Stratagene, La Jolla, CA）などを含んでいる。他の適切なベクターおよびプロモータは、1989年１月17日の米国特許第4,798,885号に詳しく開示されており、その開示全体は本明細書に引例として組み込まれる。さらに、lac ｚ遺伝子（オペレータ、プロモータ、転写スタート部位、シャイン−デリガーノ配列、および翻訳開始信号を含む）の５′領域、トリプトファン遺伝子（trpオペレータ、プロモータ、リボゾーム結合部位および翻訳イニシエータ）からの調節領域、そして、tap−lacまたは一般的にＴacプロモータと呼ばれる２つのプロモータを含んでいる融合遺伝子などの配列を含む表現カセットを用いて、それらの配列にそれらカセットが選ばれたクローニングベクターに挿入される前に、合成ＤＮＡを挿入しても差し支えない。
大腸菌細胞を形質変換させるための他の適切なベクターには、ｐＥＴ表現ベクター（Novagen，米国特許第4,952,496号参照）、例えば、Ｔ７プロモータ、Ｔ７ターミネータ、誘発性大腸菌lacオペレータ、そしてlacレセプター遺伝子およびＴ７ターミネータを含むpＥＴ12ａ−ｃ、およびＴ７ターミネータ、および大腸菌ompＴ分泌信号などを含む。別の適切なベクターは、lppプロモータ、lacＵＶ５プロモータオペレータ、ompＡ分泌信号、およびlacレセプター遺伝子を含むpＩＮ−III  opmＡ２（Duffaudら、Meth. in Enzymology, 153：492−507, 1987）である。好ましい表現ベクターは実施例３に述べるＰＧＥＸ−２Ｔベクター（Pharmacia）である。
典型的な真核形質変換ベクターには、クローンされた仔ウシパピローマウィルスゲノム、マウスレトロウィルスのクローンされたゲノム、および〔MulliganおよびBerg, Nature Vol.277：108−114（1979）〕に述べられているpＳＶ−２  gptシステム、オカヤマ−ベルグクローニングシステム〔Mol. Cell. Biol. Vol.２：161−170（1982）〕、およびGenetics Institute〔Science Vol. 228：810−815（1985）〕に述べられている表現クローニングベクターなどが含まれており、形質変換された真核細胞系において関心の対象となる蛋白質を少なくとも一定程度確実に表現してくれる。
哺乳動物の細胞のトランスフェクションのために本発明による転写因子コード表現ＤＮＡに結合することができる調節要素を含んでいる特に好ましいベースベクターはpcＤＮＡ１などのサイトメガロウィルス（ＣＭＶ）プロモータに基づくベクター（Invitrogen, San Diego, CA），pＭＡＭＮeo（Clontech, Palo Alto, CA）、pＭＳＧ（Pharmacia, Piscataway, NJ）などのＭＭＴＶプロモータに基づくベクター、およびpＳＶβ（Clontech, Palo Alto, CA）などのＳＶ40プロモータに基づくベクターである。
本発明の別の実施例によれば、本発明の核酸分子（つまり、ＤＮＡまたはmＲＮＡ）を含む“組換え細胞”が提供される。適切な宿主細胞、好ましくはバクテリア細胞、より好ましくは大腸菌細胞を形質変換する方法、およびヘテロロガス蛋白質をコード表現する遺伝子を含む該細胞を培養するために適用可能な方法は、先行技術においてよく知られている。例えば、Sambrookら、Molecular  Cloning：A Laboratory Manual（２ed）, Cold Spring Harbor, Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, USA（1989）参照。
形質変換を行うための典型的な方法は、例えば、プラスミド、ウィルス性またはバクテリア性ファージベクターを用いた形質転換、トランスフェクション、エレクトロポレーション、リポフェクションなどである。ヘテロロガスＤＮＡは、そのエクストラクロモゾーマルメンテナンスを可能にする配列を任意に含み、該ヘテロロガスＤＮＡは（宿主内で安定して保持されるようにさせるための別の手段として）宿主のゲノムに組入させることができる。
本発明の実施において使用が考えられる宿主生物としては、その内部においてヘテロロガス蛋白質の遺伝子組換えによる生産が行われている生物を含んでいる。こうした宿主生物の例としては、バクテリア（例えば、大腸菌）、イースト菌（サッカロミセスセレビシアエ、カンジダトロピカリス、ハンセヌラポリモルフィア、およびＰ．パストリスなど；米国特許第4,882,279号、第4,837,148号、第4,929,555号および第4,855,231号参照）、哺乳動物細胞（例えば、ＨＥＫ293，ＣＨＯおよびＬtk細胞）、昆虫細胞などである。現在の段階で好ましい宿主生物はバクテリアである。最も好ましいバクテリアは大腸菌である。
本発明の別の実施例によれば、本発明による膵臓転写因子に対して発生する抗体が提供される。こうした抗体は、本発明による蛋白質、その断片を抗体生産のための抗原として用いることによって、当業者によく知られている標準的な手法を用いてつくることができる（例えば、実施例６参照）。本発明による抗体は、通常、本発明による転写因子蛋白質、またはその断片を含むインカラムで哺乳動物を免疫化し、それによって、免疫化試薬のための免疫特性を有する抗体分子の生産を誘発することによってつくりだされる。
例えば、本発明による蛋白質の合成ペプチド断片に対してウサギ内に発生される抗体は、合成ペプチドおよび等モルベースの対応する本発明による転写因子蛋白質を識別し、好ましくは、天然の蛋白質の活性を抑制する能力を有している。本発明に対する抗体は、例えば、４℃で２時間の反応によるビスジアゾ化ベンジジン（ＢＤＢ）リンケージによるＢＳＡにそれを抗原として結合させるために、Ｃ−端末にＴyrが加えられた適切な合成断片によって、雄および雌の生後３か月のニュージーランド白ウサギを免疫化することによって得ることができる。低分子量物質を除去するためにこの反応混合体を透析され、得られた物質を液体窒素内で凍結され、−20℃で保存される。動物はBenoitら、P. N. A. S. USA, 79, 917−921（1982）の手順によって、１mg当量のペプチド抗原で免疫化される。４週間の間隔を置いて、これらの動物を200μgの抗原を注射することによってブーストし、その後、10日から14日間飼育する。３回目のブースト後、クロラミン−Ｔ法によってつくられた放射沃素化抗原ペプチドを結合する能力について抗血清を調べ、ＣＭＣ−イオン交換カラムクロマトグラフィーによって精製される。次に、抗体分子を哺乳動物から集めて、例えば、ＩｇＧフラクションを得るためにＤＥＡＥセファデックスを用いるなどの、公知の方法において望ましい程度にまで分離される。
この抗体の特異性をさらに強化するために、これらの抗体を固体相添加免疫化ポリペプチドを用いた免疫親和性クロマトグラフィーによって精製することができる。抗体は抗体分子と免疫反応して固体相免疫複合体を形成するのに十分な時間、固体相転写因子ペプチドと接触される。結合した抗体は、次に、標準的な手法で複合体から分離される。ＳＥＱ  ＩＤ  NO：２のアミノ酸196−214と免疫反応性がある典型的な抗膵臓ホルモン抗体については、実施例６に述べる。
このようにしてつくられた抗体は、なかんずく、組織または血管流体などの哺乳動物、好ましくはヒトの体サンプルに存在している膵臓島転写因子蛋白質のレベルを検出するための診断方法およびシステムにおいて用いることができる。こうした抗体は、また、本発明による転写因子蛋白質の免疫親和性または親和性クロマトグラフィーによる精製のために用いることができる。
本発明のさらに別の実施例においては、膵臓ホルモン遺伝子を制御する転写を調節する方法が提供され、この方法は：
該プロモータを本発明による転写因子蛋白質と接触させるステップで構成されている。
ここで用いられいる“接触させる”という用語は、（例えば、適切な緩衝液、または生理学的条件など）適切な環境条件の下で、本発明による転写因子、あるいはＤＮＡに結合するその断片を、膵臓ホルモン遺伝子プロモータからの組織特異性プロモータ要素、好ましくはインシュリン遺伝子プロモータと結合させるのに十分な時間だけ提供することを意味している。こうした接触は細胞を含まないインビトロシステムか、生物学的に活性を有するインシュリン蛋白質をコード表現する遺伝子を含んだ細胞の内部で、インビトロまたはインビボで培養された細胞のいずれかで行われる。
本発明のさらに別の実施例においては、哺乳動物におけるインシュリンのレベルを調整する方法が提供され、該方法は：
グルコースの存在下で、生物学的に活性を有するインシュリン蛋白質をコード表現する遺伝子を本発明による転写因子蛋白質、またはそのＤＮＡ結合断片と接触させるステップを含んでいる。
“グルコースの存在下で”という表現は、本発明による転写因子蛋白質のグルコースに応答した表現が発生するのに十分な濃度でグルコースが存在していることを意味している。例えば、グルコースレベルが80〜90mg/ml血管流体の正常範囲より慢性的に高い患者においては、本発明による転写因子蛋白質のグルコース応答反応が起きる。
本治療法を実施するためには、膵臓転写因子蛋白質をコード表現する本発明による核酸を膵臓島Ｂ−細胞などの生物学的に活性のあるインシュリンを表現することができる適切な細胞に導入する。本発明によるホメオボックス−タイプの転写因子はインシュリン遺伝子の表現をトランスアクティベートすることは分かっているので、本発明による転写因子蛋白質の表現を発生させると、インシュリン遺伝子を含んだ任意の細胞のインシュリンの表現を発生させると考えられる。加えて、本発明による転写因子蛋白質の表現レベルは種々の濃度のグルコースと反応することが分かっているので、本発明による方法は、インシュリンのグルコース応答表現のための手段を提供してくれる。
本発明による核酸はインビボでそうした細胞に導入することもできるし、あるいは、インビトロでそれら細胞をそうしたことを必要とする患者の体内に移植する前にインビトロで培養された細胞に導入することもできる。本発明による核酸は、インビトロで上に述べた組換え細胞をつくるためのいずれかの方法を用いて適切な内分泌性細胞に導入することができる。
膵臓細胞を移植するための方法は先行技術においてよく知られている。例えば、ヒトへの挿入に適した成長可能な細胞、好ましくは膵臓島細胞を含んでいる移植可能な合成組織マトリックス構造について開示している米国特許第4,997,443号および第4,902,295号参照。移植される細胞を宿主の免疫応答から保護するための細胞カプセル化移植法は先行技術においてよく知られている（例えば、米国特許第4,353,888号および第4,696,286号参照）。したがって、インシュリンをプロセスできるどのヒト細胞、好ましくは内分泌性細胞を、ここで述べられている治療法での使用の対象として考えることができる。
例えば、本発明による転写因子蛋白質のグルコース応答表現を確実に行わせ、それによってインシュリンのグルコース応答表現を起こさせるようにするために、哺乳動物のプライマリー発生時島細胞、好ましくはヒトのものを、本発明による転写因子をコード表現する核酸および／または生物学的に活性を有するインシュリン蛋白質をコード表現するひとつ、または複数の適切なベクターと共に分離または形質導入してもよい。さらに、上皮細胞を島細胞内に区別させる方法について述べた米国特許第4,935,000号および生物学的な活性を有するインシュリンをつくりだすことができるランゲルハンスの島をつくりだす方法について述べている米国特許第4,868,121号参照。
ひとつの実施例において、本発明による転写因子蛋白質をコード表現する核酸を哺乳動物の細胞、好ましくは膵臓島細胞に、適切な先行技術においてよく知られているウィルス性ベクターを用いて、インビボまたはインビトロのいずれかで伝達することができる。特にインビボでの“遺伝子治療”方法のために設計された適切なレトロウィルス性ベクターは、例えば、ＷＩＰＯの刊行物ＷＯ 9205266およびＷＯ 9214829に述べられており、これらの資料は核酸をインビボでヒトの細胞に効率的に導入する方法について述べている。さらに、本発明による転写因子のインビボでの表現を制限あるいは低下させることが望ましい場合、本発明による核酸のアンチセンスストランドを導入することが考えられる。
ここで望まれている“生物学的に活性を有するインシュリン蛋白質をコード表現する遺伝子”とは、イン−ビボで表現された場合に、その蛋白質が生理学的に正常な方法でグルコースの濃度を調整できるように、インシュリン蛋白質をコード表現する遺伝子を指している。
本発明のさらに別の実施例においては、哺乳動物の糖尿病を措置するための方法が提供され、該方法は：
グルコースの存在下で、生物学的に活性を有するインシュリン蛋白質をコード表現する遺伝子を含んだ細胞内で、本発明の核酸ベクターを表現するステップを含んでいる。
以下の非限定的実施例を参照して、本発明についてさらに詳しく説明する。ここで触れられているすべての米国特許および刊行物はその全体が引例として組み込まれる。
特に他の記述がないかぎり、本発明は、例えば、Maniatisら、Molecular Cloning：A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, USA（1982）；Sambrookら、Molecular Cloning：A Laboratory Manual（２ed）, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, USA（1989）；Davisら、Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing, Inc., New York, USA（1986）；またはMethods in Enzymology：Guide to Molecular Cloning Technique：Vol.152, S. L. BergerおよびA. R. Kimmerl Eds., Academic Press Inc., San Diego, USA（1987）などの資料に述べられている。
Ｔu６細胞系は膵臓腫瘍から得られたものである（Madsenら、1986, J. Cell Biol., 103：2025−2034参照）。本発明によるcＤＮＡは、先行技術においてよく知られている方法を用いていずれかの膵臓島細胞源から得ることができる。すべての場合に、共トランスフェクトされたＲＳＶ−ルシフェラーゼレセプタープラスミドの活性に正常化した後、ＣＡＴ活性が測定された。ＣＭＶ−ＩＴＦ−１表現プラスミドは標準クローニング手順を用いて、ペアレントプラスミドを含んだＣＭＶプロモータ（例えば、Stratagene, La Joll, CAから商業的に入手できるpＯＧ44など）にＩＴＦ−１  cＤＮＡを挿入することによって構成された。“−ＴＳＥ”および“４Ｘ  ＴＳＥ”ソマトスタチンプラスミドがLeonardら、（1992）ＰＮＡＳ，89：6247−6251に述べられている手順で作成された。
実施例１
Ｔu６  cＤＮＡライブラリー構成
Ｔu６  cＤＮＡは、タイムセーバーcＤＮＡ合成キット（Pharmacia）を用いて５μgのＴu６細胞誘導ポリ（Ａ）指定ＲＮＡから合成された。Ｅco ＲＩオーバーハングを有するＮot  Ｉ/Ｅco ＲＩアダプタがcＤＮＡ端に結紮され、組み込まれなかったリンカーはＣＬ−４Ｂセファロースカラム（Pharmacia）によるクロマトグラフィーによってcＤＮＡから分離した。1.5〜４kbのcＤＮＡがアガロースゲル電気泳動によってサイズ指定され、λgt−11ファージアームに結紮された。Gigapack II  Gold（Stratagene）でパッケージングした後、このライブラリーは４×１０6pfuを含んでおり、これは青／白色選択で判定して再結紮されたファージアームの２％以下であった。
実施例２
ホメオボックス−タイプ転写因子蛋白質をコード表現するcＤＮＡの分離
ホメオボックス配列はアミノ酸ＬＥＫＥＦ（センス方向、aa.ホメオドメインの17−21）およびＩＷＦＱＮ（アンチセンス方向、aa.48−52）をコード表現する変性オリゴヌクレオチドプライマーによってＰＣＲ増幅を行うことによってファージＴu−６  cＤＮＡライブラリーから分離された。用いられた合成プライマーは５′−GGCGGATCCCTXRARARRGART（Ａ/Ｔ）Ｃ−３′（ＳＥＱ  ＩＤ  NO：５）および５′GGCGGATCCC（Ｇ/Ｔ）RTTYTGRSAACCA−３′（ＳＥＱ  ＩＤ  NO：６）で、ここでＲ＝Ａ/ＧおよびＹ＝Ｃ/Ｔである。ＰＣＲは各プライマーおよび１ng  Ｔu６  cＤＮＡを20pmol用いて行われた。アニーリング温度が45℃で３サイクル行われ、その後55℃の温度で35サイクル行われた。予想された129bpのＰＣＲ生成物をアガロースゲル電気泳動で溶かし、ゲルから取り出して、ブルースクリプトＳＫ IIにサブクローンし、そして、二重鎖ＤＮＡ配列決定によって分析された。予想されたサイズの６つの増幅されたＤＮＡ断片が得られ、ブルースクリプトＳＫ  IIにサブクローンされた。分析の対象となった６つの組換えクローンのうち、５つは同じホメオドメイン断片に対応していた。
全長ＩＴＦ−１  cＤＮＡクローンを得るために、ＩＴＦ−１  ＰＣＲ断片をランダムプライマーラベリングで高度の特異活性にラベルした。Ｔｕ−６ λgtllライブラリーから106程度のプラークがＩＴＦ−１断面プローブへのハイブリダイゼーションによってスクリーンされた。30のボジティブプラークが精製され、そのうちのいくつかはブルースクリプトＳＫ IIにサブクローンされ、両方の鎖の上で配列された。283個のアミノ酸によって構成される新しい蛋白質をコード表現する全長1.6kpのcＤＮＡクローンが得られ、これはインシュリン転写因子−１またはＩＴＦ−１（ＳＥＱ  ＩＤ  NO：１）と命名された。
実施例３
大腸菌内でのホメオボックス−タイプ転写因子蛋白質の表現
上の実施例２に述べられた1.6kb ＩＴＦ−１のcＤＮＡ配列をフレームで、バクテリア性表現ベクターpＧＥＸ−２Ｔ（Pharmacia）に挿入した。その結果得られた表現プラスミドを“pＩＴＦ−１”にラベルして、大腸菌鎖ＢＬ21に導入した。ＬＢ培養液（Sambrookら、supra参照）＋30μg/mlのアンピシリンを0.6のＯＤ  Ａ600に加えたもの１リットル内で培養された。0.25g  ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピアノシド）で３時間刺激を与えた後、遠心分離にかけ、プロテアーゼ抑制因子（１mM  ＰＭＳＦ、トラシロル、および100Ｕ/mlレウペプチン）を含んでいるＨＤＢ緩衝液（140mM ＮａＣｌ，５mM ＫＣｌ，0.7mM Ｎａ2ＨＰＯ4，25mMヘペスpH7.4）に再懸濁させた。氷上で30分間リソザイム（１mg/ml）によって措置することによって細胞を溶解した。その後、抽出物が１％トリトンＸ−100、５mM ＥＤＴＡ，１mM ＤＴＴ，１Ｍ ＮａＣｌの最終濃度を持つように、細胞溶解液を加えた。次に細胞溶解物を40kgで30分間遠心分離にかけ、上澄液を１％トリトン、プロテアーゼ抑制因子、およびＤＴＴを含んだＨＤＢ緩衝液内で１mMで２時間平衡透析した。その溶解物をさらに500μlグルタチオン−アガロースビーズと４℃の温度下で20分間混合した。このビーズを７回洗浄し、分離したところ、このビーズを７ユニットのトロンビンと室温で１時間培養することによって、組換えＩＴＦ−１蛋白質が溶出した。
実施例４
ＲＮＡse保護およびインサイ（in situ）ハイブリダイゼーション分析
本発明による転写因子蛋白質の生産がインシュリンおよびソマトスタチン生産に関連する内分泌性細胞タイプにだけ限定されているかどうかを判定するために、ＲＮＡse保護アッセイを種々の細胞系および組織から得たＲＮＡに関して行った。ＲＮＡは、11種類のラットの細胞株と、11匹の成熟したラットの視床株、大脳、中脳、脳幹、小腸、皮質、膵臓、心臓、腎臓、肝臓、および脾臓から得た組織を用いて、標準酸／グアジニジウム／フェノール方法（上述Sambrook参照）で作成された。ＲＮＡse保護分析を行うために、ＳＥＱ  ＩＤ  NO：１のアミノ酸60〜165に対応するＩＴＦ−１  cＤＮＡの318bp断片を含むHind III直線化プラスミドリボプローブが用いられた。このリボプローブを総量30μgのＲＮＡにアニールして、上のLeanordらに述べられているように処理した。Ｔu−６およびＲＩＮ５  ＡＨ膵臓島細胞系の両方でＩＴＦ−１ＲＮＡが観察されたが、ＰＣ12，ＪＥＧ−３，ＣＯＳ，ＨＴ22，Helaその他を含む非内分泌性細胞株では検出できる程のＩＴＦ−１  ＲＮＡは観察されなかった。検査された11種類のラット組織のうち、膵臓および小腸だけがＩＴＦ−１  ＲＮＡを含んでおり、対応する本発明による転写因子蛋白質が小腸および膵臓の内分泌性細胞だけに高度に限定されていることを示している。
ＩＴＦ−１  ＲＮＡ生産の部位はインサイ（in situ）ハイブリダイゼーションでも確認された。インサイハイブリダイゼーションを行うために、膵臓および小腸を低温保持装置上で切開して、スライド上に載せ、ＩＴＦ−１アンチセンスリボプローブとハイブリダイズさせた（例えば、Leeら、（1990）Mol. and Cellular Neuroscience, １：168−177参照）。35ＳでラベルしたＩＴＦ−１アンチセンスリボプローブを用いて、ＴＩＦ−１  ＲＮＡが島に観察されたが、周辺の外分泌性腺房細胞では観察されなかった。島内部では、ハイブリダイゼーション信号はすべての細胞に均等に分散されていた。島細胞のわずか10〜20％だけがソマトスタチンをつくりだすので、β−細胞を含んでいるインシュリンなどの他の細胞タイプもこの因子をつくりだすものと考えられる。ＩＴＦ−１  ＲＮＡは小腸のほとんどの上皮細胞に存在しているが、これらのうちの少数のみがソマトスタチンをつくりだすことが分かっている。したがって、両方の組織で、ソマトスタチンをつくりだす細胞はＩＴＦ−１を表現する細胞のうちの小部分だけであるように思われる。
実施例５
ゲル流動性変動およびＤＮＡse Ｉ保護分析
ラットのインシュリンプロモータ内部では、“Ｐ−Ｂox”（ＳＥＱ  ＩＤ  NO：８）および“ＦＬＡＴ”または“Ｅ２”（ＳＥＱ  ＩＤ  NO：９）と呼ばれる２つの組織特異性要素は、膵臓島細胞内のインシュリン表現のプロモートに関与している。ソマトスタチンプロモータの内部では、ＴＳＥ Ｉ（ＳＥＱ  ＩＤ  NO：３）およびＴＳＥ II（ＳＥＱ  ＩＤ  NO：４）と呼ばれる２つの相互に関連した組織特異性要素が膵臓島Ｔu−６細胞内でのソマトスタチン表現をプロモートする。ＩＴＦ−１がこれら機能的に定義された要素に結合できるかどうかを判定するために、組換えＩＴＦ−１蛋白質を原核ＧＳＴ−ＩＴＦ−１表現プラスミド（実施例３に説明）を用いて形質変換した大腸菌から作成した。グルタチオン−アガロースビーズ上で精製した後、ＧＳＴ−ＩＴＦ−１融合蛋白質をスロンビンで切断してアミノ酸から伸びた161アミノ酸ＩＴＦ−１ポリペプチド断片の検索を可能にした。ＳＥＱ  ＩＤ  NO：12の124−283。
ソマトスタチンプロモータによるＤＮＡse Ｉ保護に関する研究それぞれ−104から−86まで（５′−TTGCGAGGCTAATGGTGCG−３、ＳＥＱ  ＩＤ  NO：３）および−303から−281（５′GATCTCAGTAATAATCATGCAG−３′，ＳＥＱ  ＩＤ  NO：４）に広がっている二重鎖スマトスタチンＴＳＥ ＩおよびＴＳＥ IIオリゴ糖を用いて行われた（ヤマモトら、1990，Cell, 60：611−617参照）。ミュータントＴＳＥ Ｉは上述のleonardらに述べられている方法にしたがって作成され、ＴＳＥ IIオリゴは５′−GATCTCAGGCCGGCCGCATGCAC−３′（ＳＥＱ  ＩＤ  NO：７）の配列を含んでいた。ＴＳＥ ＩおよびＴＳＥ II部位の両方にわたって個別のフットプリントが観察された。両方の部位での保護は粗Ｔu−６核抽出物を用いて得られたフットプリンティングパターンと一致していた。ＴＳＥ II部位は更に低い濃度のＩＴＦ−１で完全に保護されたが、このことはこの部位がＴＳＥ Ｉ部位より高い親和性でこの蛋白質と結合するのかもしれないことを示している。
同様のＤＮＡse保護アッセイがラットインシュリンＩ組織−特異性プロモータ断片“Ｐ−Ｂox”（ＳＥＱ  ＩＤ  NO：８）および“ＦＬＡＴ”（ＳＥＱ  ＩＤ  NO：９）（上述のOhlssonおよびEdlund参照）に対応する二重鎖オリゴヌクレオチドを用いて行われた。ソマトスタチンプロモータ断片のために得られた結果と同様、組換えＩＴＦ−１蛋白質を用いて行われたアッセイで、インシュリンプロモータ“Ｐ−Ｂox”および“ＦＬＡＴ”部位の両方に広がる個別フットプリントが観察された。
ラベルされたＴＳＥ ＩおよびＴＳＥ IIオリゴを用いたゲル流動性変動アッセイ（例えば、上述のYamamotoら参照）が、ＩＴＦ−１のＤＮＡ結合特性を評価するために行われた。その結果はいずれの部位に対する組換えＩＴＦ−１蛋白質の結合もラベルされていない野生タイプのＴＳＥ ＩまたはＴＳＥ IIコンペティタＤＮＡによって簡単に取って代わられることを示している。しかしながら、ＴＡＡＴ認識モチーフに置換基を有したＴＳＥ ＩおよびＴＳＥ IIのミュータントバージョン（Version）はＩＴＦ−１結合に対して同様の能力を示すことはできなかった。フットプリンティングに関する研究の場合と同様、ＩＴＦ−１蛋白質のＴＳＥ II蛋白質に対する親和性はＴＳＥ Ｉに対する親和性より高いように思われる。
同様のゲル流動性変動アッセイがラットインシュリンＩ組織特異性プロモータ断片“Ｐ−Ｂox”および“ＦＬＡＴ”（上述の、OhlssonおよびEdlund参照）に対する二重鎖オリゴヌクレオチド類を用いて行われた。その結果は、いずれの部位に対する組換えＩＴＦ−１蛋白質の結合もラベルされない野生タイプのＰ−ＢoxまたはＦＬＡＴコンペティタＤＮＡによって簡単に取って代わられることを示している。しかしながら、Ｐ−ＢoxおよびＦＬＡＴのミュータントバージョンがＩＴＦ−１結合に関して同様の力を発揮することはできなかった。
ソマトスタチン表現細胞における他のＤＮＡ−結合活性に対してＩＴＦ−１  ＤＮＡ−結合が相対的にどれ程強力かについてのアッセイがＴu−６核抽出物を用いた変動実験で行われた。高親和性ＴＳＥ IIプローブを用いて、Ｃ１，Ｃ２，Ｃ３と命名された３つの複合体がそれぞれの流動性に基づいて観察された。複合体Ｃ１とＣ３は抽出物の量が少なくても現れたのに、複合体Ｃ２は抽出物の濃度を高くした場合にだけ現れた。Ｃ１とＣ２は、両方とも野生タイプに取って代わられたのに対して、ミュータントＴＳＥ ＩおよびＴＳＥ IIオリゴによっては取って代わられなかったので、高い親和性複合体を示しているように思われる。Ｃ１とＣ２のいずれも、Helaなどの非内分泌性細胞抽出物では観察されなかったので、これらの複合体も組織特異性であるように思われる。
実施例６
抗体およびウェスターンブロット分析
（実施例５に述べられた）Ｃ１，Ｃ２およびＣ３複合体がＩＴＦ−１に関連した因子を持っているかどうかを判定するために、ＳＥＱ  ＩＤ  NO：２のアミノ酸196−214から延びている合成ＩＴＦ−１ペプチドに対して、ウサギのモノクローナル抗血清（抗ＩＴＦ−１）が形成された。この抗ＩＴＦ−１抗血清は、ウェスターンブロット分析で組換えＩＴＦ−１蛋白質を特異的に識別する。ＩＴＦ−１抗血清によるウェスターンブロット分析は細胞質および核Ｔu−６抽出物（例えば、上述Leonardら参照）で行われた。
Ｔu−６抽出物において、ＩＴＦ−１抗血清は核および細胞質抽出物の49kD蛋白質を特異的に識別した。この帯域の分子量は予想されたＩＴＦ−１の質量（31kD）とはまったく異なっており、この49kD免疫反応性生成物がＩＴＦ−１  ＲＮＡによってプログラムされるレチクロサイト細胞溶解物からのインビトロ翻訳生成物とコミグレートする。
核および細胞質フラクションの両方でのＩＴＦ−１蛋白質を示しているウェスターンブロットデータから予想されるように、複合体Ｃ１は両方の抽出物（細胞質と核）で観察され、この蛋白質が抽出物調製中に漏出する可能性を示唆している。Ｔu−６核抽出物によって予備培養した場合、ＩＴＦ−１抗血清はＣ１およびＣ２複合体を完全に破壊したが、Ｃ３に対してはまったく影響を示さなかった。免疫前血清はこれら複合体のいずれに対してもまったく影響を示さなかったので、我々が得た結果は、ＩＴＦ−１蛋白質がＴu−６細胞内のＴＳＥ結合活性の大部分を担っていることを示唆している。
さらに、複合体Ｃ１は全長組換えＩＴＦ−１蛋白質−ＴＳＥ複合体と同じ相対流動性を示しているおり、これはＣ１がＩＴＦ−１を含んでいることを示している。Ｔu−６核抽出物の濃度を増大させるとＣ２が出現するという事実は、この複合体がＩＴＦ−１の２量体形態に基づくものかもしれない可能性を示唆している。実際に、ＴＳＥ II部位はこの部位上の２つのホメオドメインモノマー間の協同的結合を促進する可能性のある２ＴＡＡＴモチーフを含んでいる。
ゲル流動性変動アッセイのテストでは、ＩＴＦ抗血清は組換えＩＴＦ−１のＴＳＥプローブへの結合を特異的に抑制したが、ＩＳＬ−１蛋白質の結合は抑制しなかった。
実施例７
インビトロ転写
インシュリンおよびソマトスタチンプロモータからの転写に対する組換えＩＴＦ−１の影響は、ＰＣ12抽出物の代わりにHeLa核抽出物が用いられたことを除けば、前に述べたのと同様の方法で（例えば、Gonzalesら、（1991）Mol. & Cell. Biol., 11（３）：1306−1312参照）行われた。ＩＴＦ−１およびＣＲＥＢ蛋白質は個別と組み合わせの両方で評価が行われた。Hela核抽出物は検出可能なレベルのＩＴＦ−１蛋白質を含んでおらず、内発性の蛋白質の干渉を受けずにこの因子のテストを行うことが可能であった。
簡単に言うと、10mM ＨＥＰＥＳ pH7.9，60mM ＫＣｌ，0.2mM ＥＤＴＡ，５mM ＭｇＣｌ2，５％グリセロール、２％ポリビニルアルコール、２mM ＤＴＴ，100ng  pＵＣα１（コントロールＤＮＡテンプレート）、200ngソマトスタチンプロモータテンプレート、83ｇ核酸抽出物、および組換え転写アクチベータ“−ＴＳＥ”および“４Ｘ  ＴＳＥ”を含んだ最終体積50ｌ内で反応が行われた。“−ＴＳＥ”プラスミドはＣＲＥ部位は含んでいるが、ＴＳＥ部位は含んでいない最小ソマトスタチンプロモータ構成物を含んでいる。“４Ｘ  ＴＳＥ”プラスミドはＣＲＥ部位の上流に配置された４つのＴＳＥ Ｉ部位を含むソマトスタチンプロモータベクターである。中間コントロールとして、ヒトα−グロブリンテンプレートが用いられた。
４つのリボヌクレオチドすべてを加えてそれぞれ400Ｍの最終濃度にするまえに、ＤＮＡテンプレート、核抽出物、およびアクチベータ蛋白質が30℃の温度下で、30分間、集合させられた。さらに30分間培養した後、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール［50：49：１］による抽出を行って反応を終わらせ、プライマー延長分析によって分析された（上述のGonzalesら参照）。α−グロブリンプロモータからの延長生成物は64ヌクレオチドであり、ソマトスタチンプロモータからの生成物は56および57ヌクレオチドの二重構造である。
精製ＩＴＦ−１蛋白質を追加した後にソマトスタチン転写が著しく誘発されることが、ソマトスタチンＣＲＥの上流に挿入された４ＴＳＥ Ｉ部位を用いて観察された。対照的に、ＩＴＦ−１は、テストされた蛋白質のどのようなレベルでも、ＴＳＥ部位（−ＴＳＥ）を欠いたα−グロブリン制御プライマーやソマトスタチンテンプレートには刺激性の影響を及ぼさなかった。対照的に、精製されたＣＲＥＢ蛋白質は−ＴＳＥと４Ｘ  ＴＳＥ Ｉテンプレートの両方から転写を開始させた。
ＩＴＦ−１がインビボでのソマトスタチン転写を刺激するかどうかを判定するために、ＩＴＦ−１  cＤＮＡが、標準的な方法を用いて、サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）表現ベクター（例えば、ＰＯＧ４，Stratagene）に挿入された。Hela細胞で調べた場合、ＣＭＶ−ＩＴＦ−１表現プラスミドはＴＳＥ ＩおよびＴＳＥ IIソマトスタチンレポータープラスミドの両方を12倍程度刺激したのに対して、これらの部位を含んでいない親のソマトスタチンプラスミドには軽微な影響が現れただけだった。ＣＭＶ−ＩＴＦ−１も、ＰＣ12細胞に共トランスフェクションするとＴＳＥ ＩおよびＴＳＥ IIレポーター活性を刺激したが、−ＴＳＥプラスミドは刺激性を示さなかった。これらの結果は、ＩＴＦ−１が細胞のタイプに依存して、ソマトスタチンプロモータからの転写を特異的に刺激することができることを示している。
組換えＴＩＦ−１のラットインシュリンプロモータへの影響を評価するために、同様のアッセイが行われた。この場合も、結果は、ＩＴＦ−１が細胞タイプに依存した形態でインシュリンプロモータからの転写を特異的に刺激することができることを示している。
実施例８
本発明によるホメオボックス−タイプ転写因子蛋白質の内発性遺伝子表現に対するグルコース濃度の影響
膵臓島細胞を０〜20mMの範囲の種々の濃度のグルコースの存在下で培養した。次に、ＲＮＡを島細胞の種々の培養物から分離して、ＳＥＱ  ＩＤ  NO：１から選んだcＤＮＡ断片でプローブした。
その結果は、グルコース濃度が高い場合（つまり、20mM程度）、ＩＴＦ−１  ＲＮＡの量に対してかなり高いレベルのＩＴＦ−１  ＲＮＡが検出された。したがって、本発明による膵臓転写因子の内発性表現はグルコースの濃度に対応した反応性を示す。
いくつかの好ましい実施例を参照にしつつ、上に本発明について説明してきたが、本明細書および特許請求の範囲に述べられている本発明の精神と範囲を逸脱せずに修正、変更が可能なことは分かるであろう。
配列の要約
配列ＩＤ  NO：１は本発明による内分泌性ホルモン転写因子（ＩＴＦ−１）をコード表現するcＤＮＡの核酸配列（および推測されるアミノ酸配列）である。
配列ＩＤ  NO：２は本発明による内分泌性転写因子（ＩＴＦ−１）の推測されるアミノ酸配列である。
配列ＩＤ  NO：３はＴＳＥ Ｉである。
配列ＩＤ  NO：４はＴＳＥ IIである。
配列ＩＤ  NO：５は実施例２に述べられている合成プライマーである。
配列ＩＤ  NO：６は実施例２に述べられている合成プライマーである。
配列ＩＤ  NO：７は実施例５に述べられているミュータントＴＳＥ IIである。
配列ＩＤ  NO：８はインシュリンプロモータ“Ｐ−Ｂox”領域である。
配列ＩＤ  NO：９はインシュリンプロモータ“ＦＬＡＴ”（Ｅ２）領域である。
配列のリスト
（１）  一般情報
（ｉ）  出願人：Montiny, Marc R.
Leonard, James N.
（ii）  発明の名称：膵臓島細胞におけるインシュリン表現を刺激する新しいホメオボックス因子
（iii）  配列の数：９
（iv）  対応する住所
（Ａ）  あて先：Pretty, Schroeder, Brueggemann & Clark
（Ｂ）  街路：444 South Flower Street, Suite 2000
（Ｃ）  都市：Los Angeles
（Ｄ）  州：CA
（Ｅ）  国：USA
（Ｆ）  郵便番号：90071
（ｖ）  コンピュータ読取方式：
（Ａ）  メディアタイプ：フロッピーディスク
（Ｂ）  コンピュータ：ＩＢＭ互換型  ＰＣ
（Ｃ）  オペレーティングシステム：PC−DOS/MS−DOS
（Ｄ）  ソフトウエア：リリース特許＃1.0
バージョン＃1.25
（vi）  現出願データ：
（Ａ）  出願番号：
（Ｂ）  出願日：
（Ｃ）  分類：
（viii）  弁理士／代理人に関する情報：
（Ａ）  氏名：Reiter, .Stephen E.
（Ｂ）  登録番号：31,192
（Ｃ）  参考／処理番号：Ｐ41 9422
（ix）  電信電話情報：
（Ａ）  電話：619-546-4737
（Ｂ）  ファックス：619-546-9392
（２）  ＳＥＱ  ＩＤ  NO：１の情報
（ｉ）  配列特徴：
（Ａ）  長さ：1614塩基対
（Ｂ）  タイプ：核酸
（Ｃ）  鎖：ボース（both）
（Ｄ）  トポロジー：ボース（both）
（ii）  分子タイプ：cＤＮＡ
（ix）  特徴：
（Ａ）  ＮＡＭＥ／ＫＥＹ：ＣＤＳ
（Ｂ）  部位：311..1182
（Ｃ）  他の情報：／生成物＝“ＩＴＦ−１  ホメオボックス−タイプ  トランスクリプション因子”
（xi）  配列図示：ＳＥＱ  ＩＤ  NO：１；
0003802051.tif 000002
0003802051.tif 000003
（２）  ＳＥＱ  ＩＤ  NO：２の情報
（ｉ）  配列特徴：
（Ａ）  長さ：283アミノ酸
（Ｂ）  タイプ：アミノ酸
（Ｄ）  トポロジー：直線
（ii）  分子タイプ：蛋白質
（xi）  配列図示：ＳＥＱ  ＩＤ  NO：２；
0003802051.tif 000004
（２）  ＳＥＱ  ＩＤ  NO：３の情報
（ｉ）  配列特徴：
（Ａ）  長さ：19塩基対
（Ｂ）  タイプ：核酸
（Ｃ）  鎖：二重
（Ｄ）  トポロジー：直線
（ii）  分子タイプ：ＤＮＡ（ゲノム性）
（ix）  特徴：
（Ａ）  ＮＡＭＥ／ＫＥＹ：プロモータ
（Ｂ）  部位：1.,22
（Ｄ）  他の情報：／因子＝“ソマトスタチンＴＳＥ−Ｉ領域”
（xi）  配列図示：ＳＥＱ  ＩＤ  NO：３；
0003802051.tif 000005
（２）  ＳＥＱ  ＩＤ  NO：４の情報
（ｉ）  配列特徴：
（Ａ）  長さ：22塩基対
（Ｂ）  タイプ：核酸
（Ｃ）  鎖：二重
（Ｄ）  トポロジー：直線
（ii）  分子タイプ：ＤＮＡ（ゲノム性）
（ix）  特徴：
（Ａ）  ＮＡＭＥ／ＫＥＹ：プロモータ
（Ｂ）  部位：1.,22
（Ｄ）  他の情報：／因子＝“ソマトスタチンＴＳＥ−II領域”
（xi）  配列図示：ＳＥＱ  ＩＤ  NO：４；
0003802051.tif 000006
（２）  ＳＥＱ  ＩＤ  NO：５の情報
（ｉ）  配列特徴：
（Ａ）  長さ：24塩基対
（Ｂ）  タイプ：核酸
（Ｃ）  鎖：単
（Ｄ）  トポロジー：直線
（ii）  分子タイプ：他の核酸；
（Ａ）  図示：オリゴヌクレオチド
（xi）  配列図示：ＳＥＱ  ＩＤ  NO：５；
0003802051.tif 000007
（２）  ＳＥＱ  ＩＤ  NO：６の情報
（ｉ）  配列特徴：
（Ａ）  長さ：23塩基対
（Ｂ）  タイプ：核酸
（Ｃ）  鎖：単
（Ｄ）  トポロジー：直線
（ii）  分子タイプ：他の核酸；
（Ａ）  図示：オリゴヌクレオチド
（xi）  配列図示：ＳＥＱ  ＩＤ  NO：６；
0003802051.tif 000008
（２）  ＳＥＱ  ＩＤ  NO：７の情報
（ｉ）  配列特徴：
（Ａ）  長さ：23塩基対
（Ｂ）  タイプ：核酸
（Ｃ）  鎖：二重
（Ｄ）  トポロジー：直線
（ii）  分子タイプ：ＤＮＡ（ゲノム性）
（xi）  配列図示：ＳＥＱ  ＩＤ  NO：７；
0003802051.tif 000009
（２）  ＳＥＱ  ＩＤ  NO：８の情報
（ｉ）  配列特徴：
（Ａ）  長さ：19塩基対
（Ｂ）  タイプ：核酸
（Ｃ）  鎖：二重
（Ｄ）  トポロジー：直線
（ii）  分子タイプ：ＤＮＡ（ゲノム性）
（ix）  特徴：
（Ａ）  ＮＡＭＥ／ＫＥＹ：プロモータ
（Ｂ）  部位：1.,19
（Ｄ）  他の情報：／因子＝“ラットインシュリン−Ｉ“Ｐ−ボックス”領域”
（xi）  配列図示：ＳＥＱ  ＩＤ  NO：８；
0003802051.tif 000010
（２）  ＳＥＱ  ＩＤ  NO：９の情報
（ｉ）  配列特徴：
（Ａ）  長さ：18塩基対
（Ｂ）  タイプ：核酸
（Ｃ）  鎖：二重
（Ｄ）  トポロジー：直線
（ii）  分子タイプ：ＤＮＡ（ゲノム性）
（ix）  特徴：
（Ａ）  ＮＡＭＥ／ＫＥＹ：プロモータ
（Ｂ）  部位：1.,18
（Ｄ）  他の情報：／因子＝“ラットインシュリン−Ｉ“Ｅ２”領域”
（xi）  配列図示：ＳＥＱ  ＩＤ  NO：９；
0003802051.tif 000011