(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の被検物質に対する特異的結合物質が固定されて該特異的結合物質により部分的に被覆された面、すなわち特異的結合物質により被覆されていない部分と被覆されている部分を併せ持つ面を有する担体の該面に、試料と、被検物質に対する特異的結合物質であって前記担体に固定された特異的結合物質と同一又は異なる特異的結合物質が固定された磁性粒子とを接触させる工程、及び前記磁性粒子が前記面の特異的結合物質により被覆されていない部分から被覆されている部分に移動するように磁石を作用させる工程を含んでなり、前記面の特異的結合物質により被覆されていない部分と被覆されている部分における磁性粒子の分布状態から被検物質の有無を判定することを特徴とする、試料中の被検物質の測定方法。
【請求項２】
試料中の被検物質に対する特異的結合物質が固定されて該特異的結合物質により部分的に被覆された面、すなわち特異的結合物質により被覆されていない部分と被覆されている部分を併せ持つ面を有する担体の該面に、被検物質及び／又はその類縁体を接触させて前記面に固定された特異的結合物質に該被検物質及び／又はその類縁体を結合させる工程、前記面に試料と、被検物質に対する特異的結合物質であって前記担体に固定された特異的結合物質と同一又は異なる特異的結合物質が固定された磁性粒子とを接触させる工程、及び前記磁性粒子が前記面の特異的結合物質により被覆されていない部分から被覆されている部分に移動するように磁石を作用させる工程を含んでなり、前記面の特異的結合物質により被覆されていない部分と被覆されている部分における磁性粒子の分布状態から被検物質の有無を判定することを特徴とする、試料中の被検物質の測定方法。
【請求項３】
担体が平底面を有する凹部を少なくとも一つ備えた容器であって、該平底面が特異的結合物質により部分的に被覆されている、請求項１又は２に記載の試料中の被検物質の測定方法。
【請求項４】
担体が板状体であって、その表面が特異的結合物質により部分的に被覆されている、請求項１又は２に記載の試料中の被検物質の測定方法。
【請求項５】
前記被検物質が抗原であり、前記特異的結合物質が抗体である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の試料中の被検物質の測定方法。
【請求項６】
前記被検物質が抗体であり、前記特異的結合物質が抗原である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の試料中の被検物質の測定方法。
【請求項７】
試料中の被検物質の測定に用いる担体が平底面を有する凹部を少なくとも一つ備えた容器であり、該被検物質に対する特異的結合物質が固定されて部分的に該特異的結合物質により被覆されている平底面を有する担体と、被検物質に対する特異的結合物質であって前記担体に固定された特異的結合物質と同一又は異なる特異的結合物質が固定された磁性粒子とを含む、試料中の被検物質の測定器具。
【請求項８】
試料中の被検物質の測定に用いる担体が板状体であり、該被検物質に対する特異的結合物質が固定されて部分的に該特異的結合物質により被覆されている表面を有する担体と、被検物質に対する特異的結合物質であって前記担体に固定された特異的結合物質と同一又は異なる特異的結合物質が固定された磁性粒子とを含む、試料中の被検物質の測定器具。
【請求項９】
試料中の被検物質の測定に用いる担体が平底面を有する凹部を少なくとも一つ備えた容器であり、該被検物質に対する特異的結合物質が固定されて部分的に該特異的結合物質により被覆されている平底面を有する担体と、被検物質及び／又はその類縁体と、被検物質に対する特異的結合物質であって前記担体に固定された特異的結合物質と同一又は異なる特異的結合物質が固定された磁性粒子とを含む、試料中の被検物質の測定器具。
【請求項１０】
試料中の被検物質の測定に用いる担体が板状体であり、該被検物質に対する特異的結合物質が固定されて部分的に該特異的結合物質により被覆されている表面を有する担体と、被検物質及び／又はその類縁体と、被検物質に対する特異的結合物質であって前記担体に固定された特異的結合物質と同一又は異なる特異的結合物質が固定された磁性粒子とを含む、試料中の被検物質の測定器具。
【請求項１１】
前記被検物質が抗原であり、前記特異的結合物質が抗体である、請求項７〜１０のいずれか一項に記載の試料中の被検物質の測定器具。
【請求項１２】
前記被検物質が抗体であり、前記特異的結合物質が抗原である、請求項７〜１０のいずれか一項に記載の試料中の被検物質の測定器具。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、被検物質に対する特異的結合物質を固定した磁性粒子を用いて試料中の被検物質を測定する方法及び該方法に使用する測定器具に関し、特に試料中に含まれる微量の被検物質までも妨害物質の影響を受けずに短時間且つ簡便に測定を行うことが可能な被検物質測定方法及び該方法に使用する測定器具に関する。本発明は、臨床検査分野等の生命科学分野において有用である。
【０００２】
【従来の技術】
抗原と抗体、糖とレクチン、ヌクレオチド鎖とそれに相補的なヌクレオチド鎖、リガンドとレセプター等の特異的な親和性を有する物質間の反応を利用した試料中に含まれる微量の被検物質の測定方法又は測定器具は種々のものが知られている。
【０００３】
中でも、抗原と抗体の間の抗原抗体反応（免疫反応）を利用した免疫学的測定方法は広く実施されている。この免疫学的測定方法のうち間接凝集反応測定法は簡易かつ安価な方法であることから汎用されている。
【０００４】
この間接凝集反応測定法は、被検物質に対する抗体（被検物質が抗体の場合は抗原を使用することも可能）を結合した粒子（ラテックス粒子若しくはゼラチン粒子等の高分子粒子又は赤血球等）と被検物質を含むと推定される試料を、マイクロタイタープレート等の底面がＵ字状又はＶ字状になった測定容器内で混合し、反応させて、生じた被検物質を介した粒子間の凝集像を観察することにより、試料中の被検物質の存在の有無を判定するものである。
【０００５】
図９は、この間接凝集反応測定法により試料中の被検物質の測定を行なった場合の凝集像を示したものである。試料中に被検物質が存在しない（陰性）場合、抗体（又は抗原）を結合した粒子は凝集を起こさないので重力によりそのまま沈降し、Ｕ字状又はＶ字状等の測定容器の内壁面に沿って転がり落ちて（滑り落ちて）測定容器の底面中央部に集まる。従って、陰性の場合、測定容器の上方から見ると、測定容器の底面中央部に粒子が収束した像が観察される（図９のＡ）。
一方、試料中に被検物質が存在する（陽性）場合、抗体（又は抗原）が結合した粒子は被検物質を介して三次元的な凝集を起こして凝集塊を生成する。この凝集塊は、凝集を起こしていない粒子に比べると測定容器の内壁面上を転がり難く（滑り落ち難く）、転がり速度（滑り落ち速度）が小さいので、測定容器の内壁面に広がった状態で止まる。従って、陽性の場合、測定容器の上方から見ると、粒子が測定容器底面に広がった状態、即ち「ボタン」状の凝集像が観察でき（図９のＢ）、試料中に被検物質が存在することが確認できる。
【０００６】
しかしながら、この間接凝集反応測定法は、試料中の被検物質の存在の有無、つまり陽性又は陰性かを測定容器底面の粒子による円形の像の大小によって判定するものである。
したがって、被検物質の濃度が低い試料の場合、測定容器底面中央部には被検物質を介して凝集した粒子と被検物質とは結合していない粒子の両方が混在していて、且つ凝集像の円が小さいので、陰性の場合との判別が困難であった。
そして、この被検物質の濃度が低い試料の場合の判定の困難さゆえ、低濃度の被検物質を測定することができず、また時間をかけて凝集像を十分形成させてから判定しようとするため測定に要する時間が長くなり、通常測定時間は１時間以上であった。
【０００７】
また、間接凝集反応測定法では、被検物質以外の試料中の成分を介して、抗体（又は抗原）を結合した粒子が凝集したり、或いは抗体（又は抗原）を結合した粒子が測定容器の内壁面に結合して、試料中に被検物質が存在しない（陰性）にもかかわらずあたかも被検物質が存在する（陽性）ような凝集像を示す場合があった（非特異的凝集反応）。このように陰性の試料を陽性と誤って判定する可能性があるということは、臨床検査による疾病の診断においては重大な問題となっていた。
【０００８】
これに対し、特開昭64-69954号公報には、検体試料中の被検物質である抗原又は抗体に対応する抗体又は抗原を内壁に固定させた測定容器に検体試料を加え、同時に又は次いでこの検体試料を洗浄することなく測定容器に固定させたものと同一の抗体又は抗原或いは特異的結合の類縁体を固定させた不溶性担体粒子を測定容器に加え、発現する凝集反応の有無により検体試料中の被検物質である抗原又は抗体の有無を判定する免疫学的測定方法が開示されている。この測定方法において検体試料中に被検物質である抗原（又は抗体）が存在しない（陰性）場合の測定容器内の状態を上方から見ると、図９のＡに示した凝集像と同様の像が観察される。また、検体試料中に被検物質である抗原（又は抗体）が存在する（陽性）場合に測定容器内の状態を上方から見ると、図９のＢに示した凝集像と同様の像が観察される。
【０００９】
上記特開昭64-69954号公報に記載の測定方法は、低濃度の被検物質を測定することができ、地帯現象を抑制でき、かつ短時間で明瞭な凝集像が得られる方法であるが、試料中の被検物質の存在の有無を測定容器底面の粒子による円形の像の大小によって判定するものであるので、被検物質の濃度が著しく低い試料の場合には陰性の場合との判別が困難であるとの問題は避け得ないものであった。
【００１０】
また、特開平2-124464号公報には、被測定物質（被検物質）に特異的に結合するか又はこれと競合する物質（抗体又は抗原等）を磁性粒子に固定化した磁性マーカー粒子とサンプル溶液（試料）とを混合し、この反応溶液に対し測定容器の所定の壁面領域の外側に配置した磁石を作用させ、これにより所定の壁面領域に集められた磁性マーカー粒子の分布状態に基づいてサンプル中の被測定物質を測定する免疫学的測定方法が開示されている。この測定方法においてサンプル中に被測定物質が存在しない（陰性）場合に測定容器内の状態を上方から見ると、図９のＡに示した凝集像と同様の像が観察され、サンプル中に被測定物質が存在する（陽性）場合に測定容器内の状態を上方から見ると図９のＢに示した凝集像と同様の像が観察される。
【００１１】
この特開平2-124464号公報に記載の測定方法によれば、磁性粒子を磁石により測定容器底面に引き寄せて磁性粒子の沈降速度を増大させることにより、測定容器底面の凝集像の形成を短時間で行わせ、判定に要する時間を短縮することができる。しかし、やはり試料中の被検物質の存在の有無を測定容器底面の粒子による円形の像の大小によって判定するものであるので、被検物質の濃度が低い試料の場合には陰性の場合との判別が困難であるとの点では変わりのないものであった。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の課題は、特異的結合反応を利用して試料中の被検物質を目視又は機器を用いて測定する際に、試料中の被検物質の濃度の大小にかかわらず短時間に被検物質の存在の有無の判定を行うことが可能であり、しかもその判定の信頼性が高い測定方法並びに該方法に使用する担体及び測定器具を提供することである。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明は、試料中の被検物質に対する特異的結合物質が固定されて該特異的結合物質により部分的に被覆された面、すなわち特異的結合物質により被覆されていない部分と被覆されている部分を併せ持つ面を有する担体の該面に、試料と、被検物質に対する特異的結合物質であって前記担体に固定された特異的結合物質と同一又は異なる特異的結合物質が固定された磁性粒子とを接触させる工程、及び前記磁性粒子が前記面の特異的結合物質により被覆されていない部分から被覆されている部分に移動するように磁石を作用させる工程を含んでなり、前記面の特異的結合物質により被覆されていない部分と被覆されている部分における磁性粒子の分布状態から被検物質の有無を判定することを特徴とする、試料中の被検物質の測定方法（第１の測定方法）である。また、本発明は、試料中の被検物質に対する特異的結合物質が固定されて該特異的結合物質により部分的に被覆された面、すなわち特異的結合物質により被覆されていない部分と被覆されている部分を併せ持つ面を有する担体の該面に、被検物質及び／又はその類縁体を接触させて前記面に固定された特異的結合物質に該被検物質及び／又はその類縁体を結合させる工程、前記面に試料と、被検物質に対する特異的結合物質であって前記担体に固定された特異的結合物質と同一又は異なる特異的結合物質が固定された磁性粒子とを接触させる工程、及び前記磁性粒子が前記面の特異的結合物質により被覆されていない部分から被覆されている部分に移動するように磁石を作用させる工程を含んでなり、前記面の特異的結合物質により被覆されていない部分と被覆されている部分における磁性粒子の分布状態から被検物質の有無を判定することを特徴とする、試料中の被検物質の測定方法（第２の測定方法）である。
更に、本発明は、試料中の被検物質の測定に用いる担体が平底面を有する凹部を少なくとも一つ備えた容器であり、該被検物質に対する特異的結合物質が固定されて部分的に該特異的結合物質により被覆されている平底面を有する担体と、被検物質に対する特異的結合物質であって前記担体に固定された特異的結合物質と同一又は異なる特異的結合物質が固定された磁性粒子とを含む、試料中の被検物質の測定器具である。
また、本発明は、試料中の被検物質の測定に用いる担体が板状体であり、該被検物質に対する特異的結合物質が固定されて部分的に該特異的結合物質により被覆されている表面を有する担体と、被検物質に対する特異的結合物質であって前記担体に固定された特異的結合物質と同一又は異なる特異的結合物質が固定された磁性粒子とを含む、試料中の被検物質の測定器具である。
更に、本発明は、試料中の被検物質の測定に用いる担体が平底面を有する凹部を少なくとも一つ備えた容器であり、該被検物質に対する特異的結合物質が固定されて部分的に該特異的結合物質により被覆されている平底面を有する担体と、被検物質及び／又はその類縁体と、被検物質に対する特異的結合物質であって前記担体に固定された特異的結合物質と同一又は異なる特異的結合物質が固定された磁性粒子とを含む、試料中の被検物質の測定器具である。
また、本発明は、試料中の被検物質の測定に用いる担体が板状体であり、該被検物質に対する特異的結合物質が固定されて部分的に該特異的結合物質により被覆されている表面を有する担体と、被検物質及び／又はその類縁体と、被検物質に対する特異的結合物質であって前記担体に固定された特異的結合物質と同一又は異なる特異的結合物質が固定された磁性粒子とを含む、試料中の被検物質の測定器具である。
【００１４】
【発明の実施の形態】
本発明において測定を行う被検物質としては、タンパク質、糖質、脂質、核酸のような有機物質、無機物質等の生体関連物質であればいずれのものでもよい。
具体的には、ＨＢｓ抗原、抗ＨＢｓ抗体、ＨＢｅ抗原、抗ＨＢｅ抗体、抗ＨＢｃ抗体、抗ＨＣＶ抗体、抗ＨＩＶ抗体、抗ＡＴＬＶ抗体等のウイルス関連の抗原又は抗体；抗トレポネーマ・パリダム（ＴＰ）抗体、抗マイコプラズマ抗体、抗ストレプトリジンＯ抗体（ＡＳＯ）等の細菌関連の抗原又は抗体；免疫グロブリンＧ(IgG）、免疫グロブリンＡ(IgA) 、免疫グロブリンＭ(IgM) 、若しくは免疫グロブリンＥ(IgE) 等の免疫グロブリン；Ｃ反応性タンパク質（CRP)、α1-酸性糖タンパク質、ハプトグロビン、補体Ｃ3 、補体Ｃ4 、リウマトイド因子等の炎症マーカー；α−フェトプロテイン、ＣＥＡ、ＣＡ19-9等の腫瘍マーカー；ヒト胎盤絨毛性ゴナドトロピン等のホルモン；アレルゲン、アレルゲン特異IgE 抗体等のアレルギー関連の抗原又は抗体；抗トロンビン   (AT  ) 等の血液凝固系関連物質；フィブリン体分解物(FDP) 、Ｄダイマー等の線溶系関連物質；ＡＢＯ式血液型抗体、不規則抗体等の血液型関連の抗原又は抗体；ウイルスのＤＮＡ又はＲＮＡ；細菌のＤＮＡ又はＲＮＡ；ヒト等の動物若しくは植物のＤＮＡ又はＲＮＡ；リポタンパク質(a) 等の他の疾病に関連した物質又は薬物等を例示することができる。
【００１５】
本発明において、試料とは、前記の被検物質が存在する可能性があり、且つその被検物質の存在の有無の確認又は場合によっては定量を行おうとする液状のものをいう。
例えば、ヒト又は動物の血液、血清、血漿、尿、精液、髄液、唾液、汗、涙、腹水、羊水等の体液；ヒト又は動物の脳等の臓器、毛髪、皮膚、爪、筋肉、神経組織等の抽出液；ヒト又は動物の糞便の抽出液；細胞或いは菌体の抽出液；植物の抽出液等が挙げられる。
【００１６】
本発明において、被検物質に対する特異的結合物質（以下、単に特異的結合物質という。）とは被検物質に対し親和性を有する物質をいい、被検物質との特異的な相互作用により該被検物質に非共有結合的に安定に結合する物質をいう。
例えば、特異的結合物質は、被検物質が抗原の場合にはその抗体であり、被検物質が抗体の場合にはその抗原であり、被検物質がヌクレオチド鎖の場合にはそれと相補的なヌクレオチド鎖である。
また、被検物質がリガンドの場合にはそのレセプターである。
磁性粒子に固定する特異的結合物質と、担体に固定する特異的結合物質は、被検物質を介しての結合が可能であれば、それぞれ同一でも異なってもよい。
【００１７】
本発明において、磁性粒子とは、少なくとも外部から磁石を作用させている間は磁化する粒子であればよい。この磁性粒子としては、例えば、鉄、コバルト、ニッケル等の強磁性金属、これらの強磁性金属を含む合金、非磁性体中に強磁性金属又は強磁性金属を含む合金を含有するもの、強磁性金属中又は強磁性金属を含む合金中に非磁性体を含有するもの等の強磁性体を単独で粒子状に成形した粒子、強磁性体を核としてその表面をポリスチレン、シリカゲル、ゼラチン、ポリアクリルアミド等の高分子物質で被覆した粒子、ポリスチレン、シリカゲル、ゼラチン、アクリルアミド等の高分子物質の粒子を核として強磁性体を被覆した粒子、赤血球、リポソーム又はマイクロカプセル等の閉じた袋状の物質に強磁性体を封入した粒子等を挙げることができる。
また、この磁性粒子は、外部から磁石を作用させている間は磁化し、外部からの磁石の遮断により速やかに減磁する性質を持つものであることが特に好ましく、そのような磁性粒子としては、例えば、強磁性体である酸化鉄(III) (Fe2O3) を粒子内に分散させた磁性粒子である、Dynabeads M-450 uncoated（商品名、ダイナル社製）が挙げられる。
更に、磁性粒子としては、色素を被覆するか又は色素を粒子中に分散若しくは封入させることにより着色したものを使用してもよい。
【００１８】
磁性粒子の粒子径は、好ましくは0.01〜100 μｍであり、特に好ましくは 0.5〜10μｍである。また、磁性粒子は、比重が１〜10のものが好ましい。
【００１９】
尚、本発明における磁性粒子としては、前記したものであれば、ＥＩＡ、ＲＩＡ、ＦＩＡ、化学発光免疫測定法等で既に免疫磁気分離用担体として使用されている粒子又は細胞磁気分離用担体として使用されている粒子等を何ら制限なく用いることができる。
【００２０】
本発明においては、特異的結合物質を固定した磁性粒子を用いるが、特異的結合物質を磁性粒子に固定するには、特異的結合物質を前記の磁性粒子の表面に疎水結合、親水吸着等の物理的吸着法、共有結合等の化学的結合法又はこれらの方法の併用などにより行うことができる。
【００２１】
特異的結合物質の磁性粒子への固定を物理的吸着法により行う場合は、公知の方法に従って、該特異的結合物質と磁性粒子とを緩衝液等の溶液中で混合し接触させることにより行うことができる。
例えば、特異的結合物質と磁性粒子を緩衝液等の溶液中で混合し撹拌することにより接触させ、約２℃〜約40℃で約10分〜約１日間吸着反応を行わせた後、得られた磁性粒子を緩衝液等で洗浄すればよい。
【００２２】
また、特異的結合物質の磁性粒子への固定を架橋試薬による化学的結合法によって行う場合は、日本臨床病理学会編「臨床病理臨時増刊特集第53号  臨床検査のためのイムノアッセイ−技術と応用−」, 臨床病理刊行会, 1983年、日本生化学会編「新生化学実験講座１  タンパク質IV」, 東京化学同人, 1991年等に記載の公知の方法に従い、特異的結合物質と磁性粒子をグルタルアルデヒド、カルボジイミド、イミドエステル、マレイミド等の二価性の架橋試薬と混合、接触させ、特異的結合物質と磁性粒子のそれぞれのアミノ基、カルボキシル基、チオール基、アルデヒド基、水酸基等の官能基を架橋試薬と反応させることにより固定することができる。
例えば、磁性粒子を含む緩衝液等にグルタルアルデヒド、カルボジイミド、イミドエステル、マレイミド等の二価性の架橋試薬を加え、撹拌し反応させる。次にこれに特異的結合物質を加え、撹拌して反応させる。場合によっては、その後これに透析、ゲルろ過などの処理により架橋試薬を除くか若しくは架橋反応の反応停止剤を添加すること等により反応を停止させる。そして、得られた磁性粒子を緩衝液等で洗浄すればよい。
【００２３】
また、特異的結合物質の磁性粒子への固定量を変更することにより、試料中の被検物質の濃度の高低に応じて容易に感度を変更することができる。
例えば、磁性粒子に特異的結合物質を固定する際に、高濃度の特異的結合物質を用いれば固定量が多くなって感度を高めることができる。
【００２４】
必要があれば非特異的反応を抑制するため、ウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミン、カゼイン又はその塩などの各種タンパク質、脱脂粉乳等を特異的結合物質を固定した磁性粒子に接触させること等の公知の方法により、該磁性粒子をマスキングしてもよい。
例えば、マスキングは特異的結合物質を固定した磁性粒子をウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミン、カゼイン又はその塩などの各種タンパク質などを含む緩衝液等に加え静置し、該磁性粒子の表面を各種タンパク質等でコーティングすることにより行うことができる。
【００２５】
本発明において、担体としては、特異的結合物質を固定することにより該特異的結合物質により部分的に被覆された面、すなわち特異的結合物質により被覆されていない部分と被覆されている部分を併せ持つ面を有する担体を使用する。担体としては特異的結合物質により部分的に被覆された面を有しており、該面に試料等の溶液を接触させることができる限りいずれの形状、構造でもよく、例えば、容器や、板状体などが挙げられる。担体として容器を用いる場合、溶液収納部分である凹部の形状は半球状、円筒形状、直方体形状等いずれの形状でもよく、その凹部の内壁面を特異的結合物質により部分的に被覆すればよい。凹部の形状が円筒形状、直方体形状等の平底面を有する形状である場合には、その平底面を特異的結合物質により部分的に被覆するのが好ましい。容器は凹部が複数存在していてもよい。容器としては、平底面を有する凹部を少なくとも一つ備えた容器であって、その平底面が特異的結合物質により部分的に被覆されているのが好ましい。平底面を有する凹部を少なくとも一つ備えた容器としては、例えば、平底マイクロプレート、トレイ等が挙げられる。担体として板状体を使用する場合、板状体の表面形状は円形、長方形、正方形等いずれの形状であってもよく、その表面を特異的結合物質により部分的に被覆すればよい。また、板状体の表面に溝を作って該溝に試料等の溶液を導入することにより溶液が表面から流れ落ちるのを防ぐこともできる。
【００２６】
担体の材質は、特異的結合物質を物理的又は化学的に固定できるものであれば何ら制限されず、例えば、ガラス、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリアクリレート、ポリプロピレン、ナイロン、ポリエチレン、ポリカーボネート、ポリメタクリレート等が挙げられる。
【００２７】
本発明においては、担体の面に特異的結合物質を固定する場合、該面が部分的に該特異的結合物質により被覆されるように固定する。これは、試料中に特異的結合物質が存在する場合、即ち陽性の場合に特異的結合物質で被覆した部分と被覆していない部分の像の比較によって陽性であることの判断がより明確となり、陽性と陰性の判別、つまり試料中の被検物質の有無の判別が容易になるからである。ここで、「部分的」とは、特異的結合物質が偏在しており、面全体にわたって特異的結合物質により被覆されていないことをいう。特異的結合物質により被覆された部分の形状及び面積は、試料中の被検物質の存在の有無を判定することができる限り特に制限はない。部分的被覆の例としては、担体の面の片側半分を被覆したり、担体の面に帯状に被覆したりする場合が挙げられる。
【００２８】
また、担体の面の特異的結合物質による被覆部分は複数存在していてもよく、例えば、試料中の複数の被検物質を測定するために、担体の面にそれぞれの被検物質に対する特異的結合物質による被覆部分を設けることができる。
【００２９】
図１は、本発明において担体として用いる平底マイクロプレートであって、各ウェルの平底面の片側半分が特異的結合物質により被覆されているものを示したものである。
図１のＡは平底マイクロプレートの斜視図であり（斜線部は前記特異的結合物質により被覆された部分である。）、図１のＢは平底マイクロプレートの平面図である（斜線部は前記特異的結合物質により被覆された部分である。）。
【００３０】
図２は、底面が長方形の直方体型透明容器であって、特異的結合物質により帯状に被覆されている部分（以下、帯状被覆部分という。）を有する底面を有するものを示したものである。
図２のＡは該容器の斜視図であり（斜線部は前記特異的結合物質により被覆された部分である。）、図２のＢは該容器の平面図である（斜線部は前記特異的結合物質により被覆された部分である。）。
【００３１】
図３は、表面形状が長方形の板状体であって、異なる２種類の特異的結合物質による帯状被覆部分を有する表面を有するものを示したものである。
図３のＡは、該板状体の斜視図（斜線部は、それぞれ異なる特異的結合物質により被覆された部分である。）であり、図３のＢは該板状体の平面図である（斜線部は、それぞれ異なる特異的結合物質により被覆された部分である。）。
【００３２】
図４は、表面形状が長方形の板状体であって該表面に断面形状が矩形の溝が設けられており、該溝の底面に異なる２種類の特異的結合物質による帯状被覆部分を形成したものを示したものである。
図４のＡは、そのような板状体の斜視図（斜線部は、それぞれ異なる特異的結合物質により被覆された部分である。）であり、図４のＢはそのような板状体の平面図である（斜線部は、それぞれ異なる特異的結合物質により被覆された部分である。）。
また、溝の帯状被覆部分側に板を載せること等によりカバーすると（図４のＡ参照）、カバーされていない側の溝に滴下された試料は毛細管現象で帯状被覆部分の方向に移動するので好ましい。
【００３３】
特異的結合物質の担体の面への固定化は、物理的吸着法又は架橋試薬による化学的結合法によって行うことができる。
物理的吸着法による場合は、公知の方法に従い、緩衝液等に溶解した特異的結合物質と担体の面とを接触させることにより行うことができる。
例えば、担体が容器の場合、緩衝液等に溶解した特異的結合物質を該容器の凹部に入れて静置することにより接触させ、約２℃〜約40℃で約10分〜約１日間吸着反応を行わせた後、凹部の液を吸引除去し、緩衝液等で洗浄すればよい。
【００３４】
また、架橋試薬による化学的結合法により行う場合は、日本臨床病理学会編「臨床病理臨時増刊特集第53号  臨床検査のためのイムノアッセイ−技術と応用−」, 臨床病理刊行会, 1983年、日本生化学会編「新生化学実験講座１  タンパク質IV」, 東京化学同人, 1991年等に記載の公知の方法に従い、被検物質に対する特異的結合物質と担体をグルタルアルデヒド、カルボジイミド、イミドエステル、マレイミド等の二価性の架橋試薬と混合、接触させ、特異的結合物質と担体のそれぞれのアミノ基、カルボキシル基、チオール基、アルデヒド基、水酸基等と反応させることにより固定することができる。
例えば、担体が容器の場合、該容器の凹部にグルタルアルデヒド、カルボジイミド、イミドエステル、マレイミド等の二価性の架橋試薬を加え、静置して反応させる。次いでこれに特異的結合物質を加えて静置することにより反応させる。場合によっては、その後これに架橋反応の反応停止剤を添加すること等により反応を停止させる。そして、緩衝液等で洗浄を行う。
【００３５】
また、本発明において、担体の面を部分的に被覆する方法としては、例えば、面の特異的結合物質により被覆したい部分にのみ特異的結合物質及び／又は架橋試薬を滴下して上記方法により固定化を行なう方法、面の特異的結合物質により被覆したい部分の周囲をプラスチック板等で囲ってこの囲まれた部分に特異的結合物質及び／又は架橋試薬を滴下して上記固定化を行なう方法、或いはスポンジ等の吸収体に特異的結合物質及び／又は架橋試薬を吸収させ、面の特異的結合物質により被覆したい部分に置いて接触させたり又は塗布して上記固定化を行なう方法などが挙げられる。
【００３６】
また、特異的結合物質の担体の面への固定量を変更することにより、試料中の被検物質の濃度の高低に応じて容易に感度を変更することができる。
例えば、担体に特異的結合物質を固定する際に、高濃度の特異的結合物質を用いれば固定量が多くなって感度を高めることができる。
【００３７】
更に、必要があれば非特異的反応を抑制するため、ウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミン、カゼイン若しくはその塩などの各種タンパク質、脱脂粉乳等を特異的結合物質を固定した担体に接触させること等の公知の方法により、特異的結合物質を固定した担体をマスキングしてもよい。
例えば、担体が容器である場合には、特異的結合物質を固定した該容器の凹部にウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミン、カゼイン又はその塩などの各種タンパク質などを含む緩衝液等を加えて静置し、特異的結合物質を固定した容器の凹部の表面を各種タンパク質等でコーティングした後、凹部の液を吸引除去することにより行うことができる。
【００３８】
本発明による第１の測定方法においては、まず、上記のように特異的結合物質を固定して該特異的結合物質により部分的に被覆した面、すなわち特異的結合物質により被覆されていない部分と被覆されている部分を併せ持つ面を有する担体の該面に、被検物質の存在が疑われる試料と、特異的結合物質を固定した磁性粒子を接触させる。尚、試料中の複数の被検物質を測定する場合には、それぞれの被検物質に対する特異的結合物質を固定した磁性粒子を接触させる。試料は、例えば希釈液により希釈して担体に接触させることができる。また、磁性粒子は、例えば適当な分散媒に分散して担体に接触させることができる。上記使用の希釈液及び磁性粒子の分散媒としては、それぞれ、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水等の各種緩衝液又は生理食塩水等を用いることができる。尚、この緩衝液のｐＨについては、ｐＨ４〜１２の範囲内にあることが好ましい。
【００３９】
また、試料の希釈液及び磁性粒子の分散媒には、ウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミン、カゼイン、又はその塩などの各種タンパク質、塩化ナトリウムなどの各種塩類、各種糖類、脱脂粉乳、正常ウサギ血清などの各種動物血清、アジ化ナトリウムなどの各種防腐剤、非イオン性界面活性剤、両イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤などの各種界面活性剤等の添加剤を適宜加えて用いることができる。
そして、これらの添加剤を加える際の濃度は特に限定されるものではないが、0.001 〜10％(w/v) が好ましく、特に0.01〜５％(w/v) が好ましい。
また、界面活性剤としては、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、デカグリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンフィトステロール、フィトスタノール、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンヒマシ油、硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレンラノリン等の非イオン性界面活性剤、酢酸ベタインなどの両性界面活性剤又はポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩若しくはポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸塩などの陰イオン性界面活性剤等を挙げることができる。
【００４０】
担体が例えば上記したような容器の場合には、該容器の凹部に試料及び磁性粒子を添加することにより容器の内壁面と試料及び磁性粒子とを接触させることができる。
この場合、容器の凹部には、試料を添加した後磁性粒子を添加してもよく、逆に磁性粒子を添加した後試料を添加してもよい。
更に、試料と磁性粒子とを予め混合した後その混合物を容器の凹部に添加してもよい。
また、担体が例えば上記したような板状体の場合には、該板状体の表面に磁性粒子を分散させた後試料を滴下したり、また、試料を滴下した後磁性粒子を分散させたり、試料と磁性粒子を予め混合した後その混合物を滴下したりすることにより接触させればよい。
【００４１】
上記のように、担体の面に試料と磁性粒子とを接触させた後、磁性粒子が特異的結合物質により部分的に被覆された面に沿って移動するように磁石を作用させる。尚、担体の面上の磁性粒子の分布状態により陽性又は陰性の判定を行なうことができる限り、担体の面に試料と磁性粒子とを接触させる前又は接触させている間に磁石を作用させていてもよい。また、担体の面が部分的に特異的結合物質により被覆されている場合には、磁性粒子を移動させたい方向に移動させることができる位置であればどこに磁石を配置してもよく、例えば、移動させたい方向やその周辺に配置すればよい。より具体的には、例えば、面の片側半分を特異的結合物質により被覆した担体を用いた場合、面の特異的結合物質により被覆されていない部分から被覆されている部分（図１の矢印方向）に磁性粒子が移動するように磁石を配置するのが好ましい。また、面が特異的結合物質により帯状に被覆されている担体を用いた場合は、面の特異的結合物質により被覆されていない部分からその帯状被覆部分を通って特異的結合物質により被覆されていない部分（図２〜４の矢印方向）に磁性粒子が移動するように磁石を配置するのが好ましい。
【００４２】
磁石としては、磁場を発生して磁性粒子を磁化するものであればいずれのものでもよく、永久磁石、電磁石等を用いればよい。
また、磁束密度は、用いる磁性粒子と担体の面との相互作用に依存するが、通常、５〜100 ガウスである。
【００４３】
試料に被検物質が存在する場合、該被検物質は磁性粒子に固定された特異的結合物質に結合する。
この場合にその被検物質が結合した磁性粒子に磁石を作用させると、該磁性粒子は磁石に吸引されて担体の面に沿って該磁石の方向に移動するが、その過程で面に固定された特異的結合物質に出会うと、該磁性粒子は被検物質を介してその面に固定された特異的結合物質に結合して移動を停止するか又は移動が著しく遅くなる。
面の特異的結合物質が固定されていない領域では、磁性粒子の移動は該粒子と面との相互作用及び磁場の強さに依存して磁石の方向にすみやかに移動する。
一方、面の特異的結合物質が固定されている領域では、該磁性粒子に被検物質が結合している場合と結合していない場合とではその磁性粒子の移動速度に大きな差を生じる。
即ち、試料中に被検物質が存在しない場合、磁性粒子は被検物質を結合しないので、面に固定された特異的結合物質とは親和性を示さず、特異的結合物質が固定されていない領域と同様にすみやかに磁石の方向に移動する。従って、試料中に被検物質が存在しない場合、磁性粒子は磁石に近い位置、即ち担体の面の端部に集まる。
一方、試料中に被検物質が存在する場合、磁性粒子は被検物質を結合するので、該磁性粒子は面に固定された特異的結合物質と被検物質を介して結合して移動が停止又は著しく遅くなる。従って、試料中に被検物質が存在する場合、磁性粒子はその面の特異的結合物質で被覆された部分に集まる。
【００４４】
担体の面上の磁性粒子の分布状態、即ち像は、容易に肉眼により、あるいは吸光度測定やパターン認識によるマイクロプレートリーダー等の光学的読み取り装置により確認することができる。
【００４５】
図１のＣは、平底マイクロプレートを用いて被検物質が存在する試料（陽性の試料）について測定を行なった場合のウェルを上方からみた図であり、図１のＤは、平底マイクロプレートを用いて被検物質が存在しない試料（陰性の試料）について測定を行なった場合のウェルを上方からみた図である。
陽性の場合、ウェルの平底面の特異的結合物質で被覆されていない部分から移動してきた磁性粒子は特異的結合物質被覆部分にトラップされる。
【００４６】
図２のＣは、底面が長方形の直方体型の透明容器を用いて被検物質が存在する試料（陽性の試料）について測定を行なった場合の該容器を上方からみた図であり、図２のＤは、底面が長方形の直方体型の透明容器を用いて被検物質が存在しない試料（陰性の試料）について測定を行なった場合の該容器を上方からみた図である。
陽性の場合、底面の特異的結合物質で被覆されていない部分から移動してきた磁性粒子は帯状被覆部分にトラップされる。
【００４７】
図３のＣは、長方形の板状体を用いて２種類の被検物質が存在する試料（それぞれの被検物質が陽性の試料）について測定を行なった場合の該板状体を上方からみた図であり、図３のＤは、長方形の板状体を用いて被検物質が存在しない試料（陰性の試料）について測定を行なった場合の該板状体を上方からみた図である。
陽性の場合、表面の特異的結合物質で被覆されていない部分から移動してきた磁性粒子はそれぞれの被検物質に対応する帯状被覆部分にトラップされる。
【００４８】
図４のＣは、表面に溝が設けられた長方形の板状体を用いて２種類の被検物質が存在する試料（陽性の試料）について測定を行なった場合の該板状体を上方からみた図であり、図４のＤは、かかる板状体を用いて被検物質が存在しない試料（陰性の試料）について測定を行なった場合の該板状体を上方からみた図である。
陽性の場合、溝の底面の特異的結合物質で被覆されていない部分から移動してきた磁性粒子はそれぞれの被検物質に対応する帯状被覆部分にトラップされる。
【００４９】
また、担体として容器を使用した場合、試料と混合された磁性粒子はその比重により容器の凹部の下方に沈降する。この際、容器の上部から底面方向に磁石を作用させることにより磁性粒子の沈降を促進してもよい。
【００５０】
担体の特異的結合物質被覆面に沿って移動するように磁性粒子に磁石を作用させる場合、被検物質が結合していない磁性粒子と該面との相互作用は弱く、その移動速度はほぼ磁石に依存する。従って、大きな移動速度を必要とする場合、すなわち短時間で測定結果を求めるときには強い磁場を発生する磁石を使用すればよい。また、電磁石を用いて磁場の強さを調節しながら測定を行うことも可能である。
【００５１】
本発明による第２の測定方法においては、特異的結合物質を固定して該特異的結合物質により部分的に被覆した面、すなわち特異的結合物質により被覆されていない部分と被覆されている部分を併せ持つ面を有する担体の該面に、被検物質の存在が疑われる試料及び特異的結合物質を固定した磁性粒子を接触させる前に、被検物質及び／又はその類縁体を接触させて面に固定された特異的結合物質に被検物質及び／又はその類縁体を予め結合しておく。この第２の測定方法によれば、試料中に被検物質が存在しない、即ち陰性の場合においては、磁性粒子は被検物質を結合しないので、面に固定された特異的結合物質に予め固定されていた被検物質及び／又はその類縁体を介して面に固定された特異的結合物質と結合して移動が停止又は著しく遅くなり、磁性粒子はその面の特異的結合物質で被覆された部分に集まることとなる。一方、試料中に被検物質が存在する、即ち陽性の場合においては、磁性粒子は試料中の被検物質と結合するので、磁性粒子は面に固定された特異的結合物質に予め結合した被検物質の影響を受けずにすみやかに磁石の方向に移動して磁石に近い位置、即ち担体の面の端部に集まることとなる。従って、この第２の測定方法によれば、第１の測定方法により得られる陽性又は陰性の磁性粒子の分布状態と逆の結果が得られる。
【００５２】
ここで、被検物質の類縁体とは、被検物質の一部分、被検物質に別の物質が結合したもの、被検物質の構造の一部分が置換されたもの等であって被検物質の特異的結合物質と結合する部分の構造を有し、特異的結合物質に結合することができる物質のことである。
例えば、被検物質が抗原の場合、この抗原の抗原決定基を含む物質をこの被検物質の類縁体として挙げることができる。
【００５３】
担体の面に固定された特異的結合物質に被検物質及び／又はその類縁体を結合するには、被検物質及び／又はその類縁体をトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水等の各種緩衝液又は生理食塩水等に分散ないし溶解して該面に接触させればよい。尚、この緩衝液のpHについては、pH４〜12の範囲内にあることが好ましい。
【００５４】
また、試料が血液（全血試料）である場合、その血液試料中の被検物質の測定を行なうと、その試料中に含まれる赤血球により遮られて磁性粒子の分布状態が確認できず、陽性、陰性の判定が困難になる。
これに対し、担体の面における特異的結合物質による被覆部分上の試料及び磁性粒子を含む液の高さを小さくすると、その被覆部分上の赤血球の数が減るため赤血球に遮られずに磁性粒子の分布状態を確認することができる。
【００５５】
試料として血液を用いる場合、担体の面における特異的結合物質による被覆部分上の試料及び磁性粒子を含む液の高さは、１mm以下であるのが好ましい。
担体の面における特異的結合物質による被覆部分上の試料及び磁性粒子を含む液の高さを小さくするには、例えば、図１又は図２に示したような容器を担体として用いた場合にはその深さを小さくすればよく、図４に示したような表面に溝が設けられた板状体を担体として用いた場合にはその溝の深さを小さくすればよい。
【００５６】
試料中の被検物質の濃度が低い場合、試料を多量に用いる必要がある。それは、被検物質が一定数以上存在しないと測定において像が形成されないからである。
従って、血液試料中の被検物質の濃度が低い場合には、担体として、特異的結合物質による被覆部分上の高さは十分小さいが収容できる液の容量は大きい担体を用いるのが好ましい。
特異的結合物質による被覆部分上の高さは十分小さいが収容できる液の容量は大きい担体とするには、例えば、特異的結合物質により被覆されていない部分を被覆されている部分よりも高さを高くしたり、また、高さとは別に幅、奥行きを大きくしたりしてもよい。
具体的には、これらに限定されるものでないが、図５〜８に例示したような担体が被検物質の濃度が低い血液試料中の該被検物質の測定を行なう場合に適している。
図５及び図６は、それぞれ特異的結合物質による被覆部分上の高さが小さく、且つ特異的結合物質により被覆されていない部分の高さは前記被覆部分上の高さよりも大きい容器の斜視図である。
また、図７は、特異的結合物質による被覆部分上の高さが小さく、且つ特異的結合物質により被覆されていない部分の高さは小さいがその幅及び奥行きが大きい容器の斜視図である。
更に、図８は、特異的結合物質による被覆部分上の高さが小さく、且つ特異的結合物質により被覆されていない部分の高さは小さいがその幅及び奥行きが大きい溝が表面に設けられた板状体の斜視図である。
【００５７】
尚、このように、担体として、特異的結合物質による被覆部分上の高さは十分小さいが収容できる液の容量は大きい担体を用いる場合、該部分上の被検物質の数も赤血球と同様に減るが、被検物質は磁性粒子に結合して磁石の作用により他の部分から上記被覆部分に移動してくるので測定に支障はない。
【００５８】
【実施例】
以下、本発明を実施例により説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〕
（ＨＢｓ抗原の測定）
(1) 抗ＨＢｓ抗体固定マイクロプレートの作製
図１に示すように、平底マイクロプレート（ヌンク社製、ウェルの直径：７mm、ウェルの深さ：８mm）のウェルの平底面の片側半分に、抗ＨＢｓ抗体溶液（シノテスト社製、５μｇ／mlの濃度でpH７の10mMリン酸緩衝液に溶解したもの）25μl をピペットを用いて載せて接触させ、37℃で３時間静置した。次いで、ウェル内の溶液を吸引除去後、 0.5％(w/v) カゼインを含むトリス緩衝液（pH7.5 、50mM）（以下、これを希釈液Ａという。）を 0.3ml加えて、４℃で一晩放置し、これを吸引除去した。このようにして、抗ＨＢｓ抗体をウェルの平底面の左半分に固定したマイクロプレートを作製した。
【００５９】
(2) 抗ＨＢｓ抗体固定磁性粒子の作製
磁性粒子（Dynabeads M-450 uncoated、ダイナル社製、粒径：4.5 μｍ、３％(w/v) ）１mlと抗ＨＢｓ抗体溶液（シノテスト社製、pH7.0 の10mMリン酸緩衝液に濃度 0.1mg／mlで溶解したもの）１mlを混合し、37℃で30分間反応させた。ここに希釈液Ａを約20倍量加えてマスキングを行なった。次いで、得られた磁性粒子を希釈液Ａにて洗浄し、磁性粒子を濃度が約 0.1％(w/v) となるように希釈液Ａに再分散させた。このようにして、抗ＨＢｓ抗体固定磁性粒子分散液を調製した。
【００６０】
(3) ＨＢｓ抗原の測定
▲１▼  上記(1) で作製した抗ＨＢｓ抗体固定マイクロプレートのウェルに、試料であるＨＢｓ抗原陽性血清25μl を加え、次いで上記(2) で作製した抗ＨＢｓ抗体固定磁性粒子分散液25μl を加えて１分間撹拌した。これを静置し、マイクロプレートの側面方向に磁石を設置することによりウェルの平底面の抗ＨＢｓ抗体が固定されていない部分から平底面の抗ＨＢｓ抗体が固定されている部分方向（図１の矢印方向）に磁束密度40〜60ガウスの磁場を発生させた。磁場を発生させてから２分間以内に図１のＣに示すような磁性粒子の像が認められた。
▲２▼  上記(1) で作製した抗ＨＢｓ抗体固定マイクロプレートの各ウェルに、試料である各種濃度のＨＢｓ抗原液（明治乳業社製、 0.5％(w/v) カゼイン及び 0.1Ｍ塩化ナトリウムを含む50mMトリス塩酸緩衝液(pH8.0) にそれぞれ０、１、２、10、100 、1000ng／mlの濃度で溶解したもの）をそれぞれ25μl ずつ加え、更に上記(2) で作製した抗ＨＢｓ抗体固定磁性粒子分散液をそれぞれ25μl 加えて１分間撹拌した。これを静置し、マイクロプレートの側面方向に磁石を設置することによりウェルの平底面の抗ＨＢｓ抗体が固定されていない部分から平底面の抗ＨＢｓ抗体が固定されている部分方向（図１の矢印方向）に磁束密度40〜60ガウスの磁場を発生させた。３分間以内に抗原濃度０ng／mlのもの以外の全てについて図１のＣに示すような磁性粒子の像が認められた。
【００６１】
〔実施例２〕
（抗ＨＢｓ抗体の測定）
(1) ＨＢｓ抗原固定マイクロプレートの作製
図１に示すように、平底マイクロプレート（ヌンク社製、ウェルの直径：７mm、ウェルの深さ：８mm）のウェルの平底面の片側半分に、ＨＢｓ抗原溶液（明治乳業社製、５μｇ／mlの濃度でpH７の10mMリン酸緩衝液に溶解したもの）25μl をピペットを用いて載せて接触させ、37℃で３時間静置した。次いで、ウェル内の溶液を吸引除去後、前記の希釈液Ａを 0.3ml加えて、４℃で一晩放置し、これを吸引除去した。このようにして、ＨＢｓ抗原をウェルの平底面の左半分に固定したマイクロプレートを作製した。
【００６２】
(2) ＨＢｓ抗原固定磁性粒子の作製
磁性粒子(Dynabeads M-450 uncoated 、ダイナル社製、粒径：4.5 μｍ、３％(w/v) ）１mlとＨＢｓ抗原溶液（明治乳業社製、pH7.2 の10mMリン酸緩衝液に40μｇ／mlの濃度で溶解したもの）１mlを混合し、37℃で30分間反応させた。ここに希釈液Ａを加えてマスキングを行なった。次いで、得られた磁性粒子を希釈液Ａにて洗浄し、磁性粒子を濃度が約 0.1％(w/v) となるように希釈液Ａに再分散させた。このようにして、ＨＢｓ抗原固定磁性粒子分散液を調製した。
【００６３】
(3) 抗ＨＢｓ抗体の測定
上記(1) で作製したＨＢｓ抗原固定マイクロプレートのウェルに、試料である抗ＨＢｓ抗体を含む血清を25μl 加え、次いで上記(2) で作製したＨＢｓ抗原固定磁性粒子分散液を25μl 加えて１分間撹拌した。これを静置し、マイクロプレートの側面方向に磁石を設置することによりウェルの平底面のＨＢｓ抗原が固定されていない部分から平底面のＨＢｓ抗原が固定されている部分方向（図１の矢印方向）に磁束密度40〜60ガウスの磁場を発生させた。磁場を発生させてから２分間以内に図１のＣに示すような磁性粒子の像が認められた。
【００６４】
〔実施例３〕
（抗ＨＢｃ抗体の測定）
(1) ＨＢｃ抗原固定マイクロプレートの作製
図１に示すように、平底マイクロプレート（ヌンク社製、ウェルの直径：７mm、ウェルの深さ：８mm）のウェルの平底面の片側半分に、ＨＢｃ抗原溶液（明治乳業社製、５μｇ／mlの濃度でpH７の10mMリン酸緩衝液に溶解したもの）25μl をピペットを用いて載せて接触させ、37℃で３時間静置した。次いで、ウェル内の溶液を吸引除去後、 0.5％(w/v) カゼインを含むグリシン緩衝液（pH９、100mM ）（以下、これを希釈液Ｂという。）を 0.3ml加えて、37℃で一晩放置し、これを吸引除去した。このようにして、ＨＢｃ抗原をウェルの平底面の左半分に固定したマイクロプレートを作製した。
【００６５】
(2) ＨＢｃ抗原固定磁性粒子の作製
磁性粒子(Dynabeads M-450 uncoated 、ダイナル社製、粒径：4.5 μｍ、３％(w/v) ）１mlとＨＢｃ抗原溶液（明治乳業社製、pH7.2 の10mMリン酸緩衝液に40μｇ／mlの濃度で溶解したもの）１mlを混合し、37℃で30分間反応させた。ここに希釈液Ｂを加えて37℃で３日間マスキングを行なった。次いで、得られた磁性粒子を希釈液Ｂにて洗浄し、磁性粒子を濃度が約 0.1％(w/v) となるように希釈液Ｂに再分散させた。このようにして、ＨＢｃ抗原固定磁性粒子分散液を調製した。
【００６６】
(3) 抗ＨＢｃ抗体の測定
上記(1) で作製したＨＢｃ抗原固定マイクロプレートのウェルに、上記(2) で作製したＨＢｃ抗原固定磁性粒子分散液を37.5μl 加え、次いで試料である抗ＨＢｃ抗体を含む血清を12.5μl 加えて１分間撹拌した。これを静置し、マイクロプレートの側面方向に磁石を設置することによりウェルの平底面のＨＢｃ抗原が固定されていない部分から平底面のＨＢｃ抗原が固定されている部分方向（図１の矢印方向）に磁束密度40〜60ガウスの磁場を発生させた。磁場を発生させてから２分間以内に図１のＣに示すような磁性粒子の像が認められた。
【００６７】
〔実施例４〕
（ＨＢｓ抗原及びヘモグロビンの同時測定）
(1) 抗ＨＢｓ抗体・抗ヘモグロビン抗体固定板状体の作製
アクリル押し出し板（幅２５ｍｍ、奥行き４０ｍｍ、厚さ１ｍｍ）〔アクリルサンデー社製〕の上に２枚のアクリル押し出し板（幅１０ｍｍ、奥行き４０ｍｍ、厚さ０．５ｍｍ）〔アクリルサンデー社製〕を５ｍｍの間隔をおいて溶剤で貼り合わせて、図４に示された表面に溝（幅５ｍｍ、奥行き４０ｍｍ、高さ０．５ｍｍ）が設けられた板状体を作製した。
この板状体の溝の底面の左端から５ｍｍより１０ｍｍの部分に抗ＨＢｓ抗体溶液（シノテスト社製、５μｇ／mlの濃度でpH７の10mMリン酸緩衝液に溶解したもの）20μl をピペットを用いて載せて接触させた。更に、この板状体の溝の底面の左端から１５ｍｍより２０ｍｍの部分に抗ヘモグロビン抗体溶液（日本バイオテスト研究所社製、５μｇ／mlの濃度でpH７の10mMリン酸緩衝液に溶解したもの）20μl をピペットを用いて載せて接触させて、37℃で３時間静置した。
次いで、これらの溶液を吸引除去後、前記の希釈液Ａ 0.3mlをここに加えて、４℃で一晩放置し、これを吸引除去した。
そして、この板状体の左端の上にアクリル押し出し板（幅２５ｍｍ、奥行き２５ｍｍ、厚さ１ｍｍ）〔アクリルサンデー社製〕を溶剤で貼り合わせることにより、図４に示したように板状体にカバーをした。
このようにして、溝の底面に異なる２種類の特異的結合物質（抗ＨＢｓ抗体及び抗ヘモグロビン抗体）による帯状被覆部分が形成された板状体を作製した。
【００６８】
(2) 抗ヘモグロビン抗体固定磁性粒子の作製
磁性粒子（Dynabeads M-450 uncoated、ダイナル社製、粒径：4.5 μｍ、３％(w/v) ）１mlと抗ヘモグロビン抗体溶液（日本バイオテスト研究所社製、pH7.0 の10mMリン酸緩衝液に濃度 0.1mg／mlで溶解したもの）１mlを混合し、37℃で30分間反応させた。ここに希釈液Ａを約20倍量加えてマスキングを行なった。
次いで、得られた磁性粒子を希釈液Ａにて洗浄し、磁性粒子を濃度が約 0.1％(w/v) となるように希釈液Ａに再分散させた。このようにして、抗ヘモグロビン抗体固定磁性粒子分散液を調製した。
【００６９】
(3) ＨＢｓ抗原及びヘモグロビンの同時測定
試料であるＨＢｓ抗原溶液（明治乳業社製、pH7.2 の10mMリン酸緩衝液に100ｎｇ／ml の濃度で溶解したもの）50μl と１μｇ／mlのヒトヘモグロビン（シノテスト社製）50μl を試験管中にて混合攪拌し、次いで上記(2) で作製した抗ヘモグロビン抗体固定磁性粒子分散液50μl 及び実施例１の(2) で作製した抗ＨＢｓ抗体固定磁性粒子分散液50μl をここに加えて撹拌した。
この混合液の150μl を上記(1) で作製した抗ＨＢｓ抗体・抗ヘモグロビン抗体固定板状体の溝のカバーされた部分とカバーされていない部分の境目付近にピペットを用いて載せて帯状被覆部分に接触させた。
これを静置し、板状体の帯状被覆部分が形成された側面方向に磁石を設置することにより、板状体の溝の底面の抗ＨＢｓ抗体及び抗ヘモグロビン抗体が固定されていない部分から溝の底面の抗ＨＢｓ抗体及び抗ヘモグロビン抗体が固定されている部分方向（図４の矢印方向）に磁束密度40〜60ガウスの磁場を発生させた。磁場を発生させてから３分間以内に図４のＣに示すような２本の磁性粒子の像が認められた。
【００７０】
〔実施例５〕
（血液中のＨＢｓ抗原の測定）
実施例１の(1) で作製した抗ＨＢｓ抗体固定平底マイクロプレートに、ＨＢｓ抗原陽性血液を10μl 加え、次いで 0.5％(w/v) カゼイン及び 0.1Ｍ塩化ナトリウムを含む50mMトリス塩酸緩衝液(pH8.0) を５μl 加え、更に実施例１の(2) で作製した抗ＨＢｓ抗体固定磁性粒子分散液を25μl 加えて１分間撹拌した後、静置した。
このマイクロプレートのウェルに、直径５mmのガラス棒を底面から１mm浮かせるように入れて、特異的結合物質（抗ＨＢｓ抗体）による被覆部分上の試料及び磁性粒子を含む液の高さを１mmとした。
マイクロプレートの側面方向に磁石を設置することによりウェルの平底面の抗ＨＢｓ抗体が固定されていない部分から平底面の抗ＨＢｓ抗体が固定されている部分方向（図１の矢印方向）に磁束密度40〜60ガウスの磁場を発生させた。
磁場を発生させてから２分間以内に図１のＣに示すような磁性粒子の像が赤血球に遮られることなく認められた。
陰性血液を用いた場合には磁性粒子の像は認められなかった。
【００７１】
〔実施例６〕
（血液中の抗ＨＢｓ抗体の測定）
実施例２の(1) で作製したＨＢｓ抗原固定平底マイクロプレートに、抗ＨＢｓ抗体陽性血液を10μl 加え、次いで 0.5％(w/v) カゼイン及び 0.1Ｍ塩化ナトリウムを含む50mMトリス塩酸緩衝液(pH8.0) ５μl を加え、更に実施例２の(2)で作製したＨＢｓ抗原固定磁性粒子分散液を25μl 加えて１分間撹拌した後、静置した。
このマイクロプレートのウェルに、直径５mmのガラス棒を底面から１mm浮かせるように入れて、特異的結合物質（ＨＢｓ抗原）による被覆部分上の試料及び磁性粒子を含む液の高さを１mmとした。
マイクロプレートの側面方向に磁石を設置することによりウェルの平底面のＨＢｓ抗原が固定されていない部分から平底面のＨＢｓ抗原が固定されている部分方向（図１の矢印方向）に磁束密度40〜60ガウスの磁場を発生させた。
磁場を発生させてから２分間以内に図１のＣに示すような磁性粒子の像が赤血球に遮られることなく認められた。
陰性血液を用いた場合には磁性粒子の像は認められなかった。
【００７２】
【発明の効果】
本発明の第１の測定方法及び第２の測定方法によれば、試料中の被検物質の有無を、従来のように容器底面に集まった粒子の円形の像の大小ではなく、磁性粒子が磁石に近い位置、即ち面の端部に集まるか或いは担体の面の特異的結合物質で被覆された部分に集まるかにより判定することから判定が容易であり、被検物質濃度が低い場合であってもその判定が容易である。したがって高感度で試料中の被検物質の測定をすることができる。しかも非特異的凝集反応が生じた場合においても誤った判定を与えることはない。
また、本発明の第１の測定方法によれば、磁性粒子及び／又は担体の面への特異的結合物質の固定量を変更することにより感度を容易に変更することができるので効率がよい。従って、被検物質の濃度が低い場合においても被検物質の有無を容易に判定することができる。
更に、本発明の第１の測定方法及び第２の測定方法によれば、短時間で、具体的には被検物質の種類にもよるが、通常、20秒〜10分程度で試料中の被検物質の有無の判定を行なうことができ、例えば、ＨＢｓ抗原の場合、１ng／ml程度の濃度であっても３分間以内で測定が可能である。
更に、本発明によれば、試料中の複数の被検物質の測定を同時に行なうことができる。
また、本発明による第１の測定器具及び第２の測定器具は、それぞれ第１の測定方法及び第２の測定方法に好適に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】各ウェルの平底面の片側半分が特異的結合物質により被覆された平底マイクロプレートを示す図である。
【図２】底面が特異的結合物質により帯状に被覆されている直方体型の透明容器を示す図である。
【図３】表面が特異的結合物質により帯状に被覆されている板状体を示す図である。
【図４】表面に溝が設けられ、該溝の底面が特異的結合物質により帯状に被覆されている板状体を示す図である。
【図５】特異的結合物質による被覆部分上の高さが小さく、且つ特異的結合物質により被覆されていない部分の高さは前記被覆部分上の高さよりも大きい容器の斜視図である。
【図６】特異的結合物質による被覆部分上の高さが小さく、且つ特異的結合物質により被覆されていない部分の高さは前記被覆部分上の高さよりも大きい容器の斜視図である。
【図７】特異的結合物質による被覆部分上は高さが小さく、且つ特異的結合物質により被覆されていない部分の高さは小さいがその幅及び奥行きが大きい容器の斜視図である。
【図８】特異的結合物質による被覆部分上の高さが小さく、且つ特異的結合物質により被覆されていない部分の高さは小さいがその幅及び奥行きが大きい溝が表面に設けられた板状体の斜視図である。
【図９】間接凝集反応測定法により試料中の被検物質の測定を行なった場合の凝集像を示す図である。
【図１】
0003749959.tif 000002
【図２】
0003749959.tif 000003
【図３】
0003749959.tif 000004
【図４】
0003749959.tif 000005
【図５】
0003749959.tif 000006
【図６】
0003749959.tif 000007
【図７】
0003749959.tif 000008
【図８】
0003749959.tif 000009
【図９】
0003749959.tif 000010