(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ロイコノストック・ラクティス(Leuconostoc lactis)ＳＨＯ４７株（生命研菌寄第１３９７０号）、または、ロイコノストック・ラクティス(Leuconostoc lactis)ＳＨＯ５４株（生命研菌寄第１３９７１号）が生産するＤ−乳酸脱水素酵素であって、以下の理化学的性質を有するＤ−乳酸脱水素酵素。
（１）作用：下記反応式の反応を触媒する。
【化１】
0003773283.tif 000008
（２）安定性：１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中、グリセリン、または、牛血清アルブミン存在下、室温で１カ月放置後、９０％以上の残存活性を有する。
（３）比活性：ピルビン酸還元反応において、２０００Ｕ／ｍｇ protein以上（測定温度３０℃）
（４）分子量：約８万〜８．５万（セファデックスＧ−１００ゲル濾過クロマトグラフィー法）
（５）至適ｐＨ範囲（ピルビン酸還元反応）：７〜８
（６）安定ｐＨ領域：５〜１１
（７）作用適温の範囲：２０℃から５０℃までの範囲（リン酸緩衝液ｐＨ７．５）
【請求項２】
請求項１記載のＤ−乳酸脱水素酵素の生産能を有するロイコノストック・ラクティス(Leuconostoc lactis)ＳＨＯ４７株（生命研菌寄第１３９７０号）、または、ロイコノストック・ラクティス(Leuconostoc lactis)ＳＨＯ５４株（生命研菌寄第１３９７１号）を培養し、培養物からＤ−乳酸脱水素酵素を採取することを特徴とする請求項１のＤ−乳酸脱水素酵素の製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
この発明は、Ｄ−乳酸脱水素酵素（以下、Ｄ−ＬＤＨと略記する）とその製造法に関するものである。さらに詳しくは、この発明は、臨床検査などの分野で各種物質の定量分析に有用な、安定性に優れ、かつ比活性の高いＤ−ＬＤＨとその製造法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術とその課題】
近年、酵素は、その反応の安定性、基質との特異的結合性、および光学的定量化の容易性などの優れた特異性が注目され、医療分野や食品の成分分析などに広く触媒として利用されている。
これらの酵素の一つであるＤ−ＬＤＨは、臨床検査などの分野で各種物質の定量分析に用いられている。具体的には、血清や尿中のピルビン酸の定量、グルタミン酸・ピルビン酸トランスアミナーゼ（以下ＧＰＴと略記する。）などピルビン酸が生成される反応や、ピルビン酸キナーゼの酵素活性測定等に用いられている。また、Ｄ−乳酸の工業的製造にも有用である。
【０００３】
そして従来は、上記の各種の測定法やＤ−乳酸の製造には、ラクトバチラス属(Lactobacillus) 、ロイコノストック属(Leuconostoc) 、スタフィロコッカス属(Staphylococcus)等の微生物（マイクロバイオロジカル・レビューズ(Microbiological Reviews) 、４４巻、１０６〜１３９頁（１９８０年））を由来とするＤ−ＬＤＨが用いられてきた。
【０００４】
しかしながら、この従来のＤ−ＬＤＨは、安定性に欠けており、臨床検査試薬中に組込む際に種々の安定化剤を添加しなければならない等の問題があった。
また、従来のＤ−ＬＤＨは、比活性も高いもので数百〜１５００Ｕ／ｍｇ protein程度であり、臨床検査試薬中に組込む場合、充分量の活性を得るためには添加する蛋白質が多くなるという問題があった。その結果、酵素中に含まれる他の夾雑蛋白が試薬中に多く添加されることになり、こうした夾雑蛋白の影響を受ける可能性があった。
【０００５】
この発明は、以上の通りの事情を鑑みてなされたものであり、従来のＤ−ＬＤＨの欠点を解消し、安定性に優れ、かつ比活性の高いＤ−ＬＤＨとその製造方法を提供することを目的としている。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
この発明は、上記の課題を解決するものとして、以下の理化学的性質を有するＤ−乳酸脱水素酵素、すなわちＤ−ＬＤＨと、このＤ−ＬＤＨ生産能を有する菌株を培養し、培養物からＤ−ＬＤＨを採取することを特徴とするＤ−ＬＤＨの製造法を提供する。
【０００７】
（１）作用：下記反応式の反応を触媒する。
【０００８】
【化２】
0003773283.tif 000002
【０００９】
（２）安定性：１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中、グリセリン、または牛血清アルブミン存在下、室温で１カ月放置後、９０％以上の残存活性を有する。
（３）比活性：ピルビン酸還元反応において、２０００Ｕ／ｍｇ protein以上（測定温度３０℃）
（４）分子量：約８万〜８．５万（セファデックスＧ−１００ゲル濾過クロマトグラフィー法）
（５）至適ｐＨ範囲（ピルビン酸還元反応）：７〜８
（６）安定ｐＨ領域：５〜１１
（７）作用適温の範囲：２０℃から５０℃までの範囲（リン酸緩衝液ｐＨ７．５）
この発明に用いる微生物は、上記性質を有するＤ−ＬＤＨを産生し得るものであって、その種類には特に限定はないが、より具体的には乳酸菌があげられ、その中でも好適な例として、次の表１、表２、表３および表４に示した菌学的性質を有するロイコノストック・ラクティス(Leuconostoc Lactis)ＳＨＯ４７株、ロイコノストック・ラクティス(Leuconostoc Lactis)ＳＨＯ５４株が例示される。
【００１０】
【表１】
0003773283.tif 000003
【００１１】
【表２】
0003773283.tif 000004
【００１２】
【表３】
0003773283.tif 000005
【００１３】
【表４】
0003773283.tif 000006
【００１４】
この表１、表２、表３および表４に示した菌学的性質から、バージィのマニュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジー(Bergey's Mannual of systematic Bacteriology) およびメソッズ・イン・マイクロバイオロジー(METHODS IN MICROBIOLOGY) １６巻、１４７〜１７８頁(Separation of Species of the Genus Leuconostoc and Differentiation of the Leuconostoc from other Lactic acid Bacteria) に基づいて検索した結果、ＳＨＯ４７株、ＳＨＯ５４株は、共にロイコノストック・ラクティス(Leuconostoc lactis)に属する細菌と判明したが、生理的性質において既存菌株とは異なるものがあり、新菌株と判断できるので、それぞれロイコノストック・ラクティス(Leuconostoc lactis)ＳＨＯ４７株、ロイコノストック・ラクティス(Leuconostoc lactis)ＳＨＯ５４株と命名し、平成５年１１月１７日に通産省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託した。その寄託番号はそれぞれ、生命研菌寄第１３９７０号、生命研菌寄第１３９７１号である。
【００１５】
この発明における微生物を培養する際に用いられる栄養培地において、炭素源として、グルコース、シュークロース、マルトース等が使用でき、窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、ペプトン、肉エキス、酵母エキス等の無機または有機物が使用できる。さらに、無機塩類としては、カリウム、ナトリウム、亜鉛、鉄、マグネシウム、マンガン等の各塩類、必要に応じて微量金属塩、ビタミン類などを使用してもよい。
【００１６】
培養は通常、嫌気的あるいは微好気的な条件下で行う。培養温度は２０℃から４０℃、好ましくは３０℃から４０℃、最適には３５℃から４０℃で行う。このような条件下で３〜３０時間、好ましくは６から１０時間培養することにより、菌体内にＤ−ＬＤＨが生成、蓄積される。
そして、この発明によってＤ−ＬＤＨを製造するには、たとえば上記のごとく微生物を培養し、培養終了後、遠心分離や濾過などの操作で培養液から菌体を回収し、菌体から粗酵素液を抽出し、精製すればよい。抽出法には、自己消化、超音波破砕、フレンチプレス、界面活性剤処理、リゾチーム処理などいずれを用いてもよく、こうした処理後、遠心分離により細胞片を除去し、粗酵素液を得る。粗酵素液については、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー等のクロマトグラフィーを組み合わせることにより、本発明のＤ−ＬＤＨを単離、精製することができる。イオン交換樹脂としては、Ｑ−セファロースＦＦ（ファルマシア社製）、ＤＥＡＥ−セファロース（ファルマシア社製）など、アフィニティークロマト用樹脂としては、チバクロンブルーＨ−ＥＲＤ（ＩＣＩ製）、チバクロンイエローＨＥ−３Ｇ、ブルーセファロースＣＬ−６Ｂ（ファルマシア社製）など、疎水クロマト用樹脂としては、オクチル−セファロースＣＬ−４Ｂ（ファルマシア社製）など、ゲル濾過用担体または樹脂としては、セファデックスＧ−１００などが挙げられる。また、これらのカラムクロマトグラフィーに加え、硫酸ストレプトマイシンや硫酸プロタミン処理による除核酸、硫酸アンモニウム処理によるタンパク質の塩析を行ってもよい。
【００１７】
【作用】
この発明のＤ−ＬＤＨは、下記反応式の反応を触媒する。
【００１８】
【化３】
0003773283.tif 000007
【００１９】
そして、その安定性については、前記の通り、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中、グリセリン、または牛血清アルブミン存在下、室温で１カ月放置後、９０％以上の残存活性を有し、
比活性は、ピルビン酸還元反応において、２０００Ｕ／ｍｇ protein以上（測定温度３０℃）で、
分子量は、約８万〜８．５万（セファデックスＧ−１００ゲル濾過クロマトグラフィー法）、
至適ｐＨ範囲（ピルビン酸還元反応）は、７〜８、並びに
安定ｐＨ領域は、５〜１１であって、
作用適温の範囲は、２０℃から５０℃までの範囲（リン酸緩衝液ｐＨ７．５）である。
【００２０】
なお、活性の測定は４．０ｍＭのピルビン酸、０．２ｍＭのＮＡＤＨを含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に酵素溶液を加え、緩やかに混和した後、分光光度計で３４０ｎｍにおける吸光度変化を測定した。なお測定は、３０℃で行った。１分間に１マイクロモルのＮＡＤＨをＮＡＤ+ に変換する酵素量を１単位（Ｕ）とした。
【００２１】
以下、実施例を示してさらに詳しくＤ−乳酸脱水素酵素およびその製造法について説明する。
【００２２】
【実施例】
実施例１
グルコース３．０％（重量％を表す。以下同様）、酵母エキス１．０％、ペプトン０．５％、クエン酸三ナトリウム・二水和物０．５％、酢酸ナトリウム０．２％、硫酸マグネシウム・七水和物０．０２％、硫酸マンガン・四〜五水和物０．００５％、ツイン８０  ０．１％（容量％）、ｐＨ６．４よりなる培地２５リットルを３０リットル容のジャーファーメンターに仕込み、１２１℃で１５分間滅菌した後、ロイコノストック・ラクティス(Leuconostoc lactis)ＳＨＯ５４株（生命研菌寄第１３９７１号）を接種し、４０℃で１０時間、２００ｒｐｍで攪拌し、通気しない条件下、４ＮのＮａＯＨでｐＨを６．４に調整しながら培養した。遠心分離により菌体を採取して約１８０ｇの湿菌体を得た。得られた菌体を凍結状態で保存した。
【００２３】
次に、凍結菌体約１００ｇをＥＤＴＡおよび２−メルカプトエタノールを２ｍＭずつ含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１Ｌに懸濁し、これに Triton Ｘ−１００を０．０１％、リゾチームを０．２ｍｇ／ｍｌ、ＤＮase を０．２ｍｇ／ｍｌになるように添加し、２時間室温で攪拌後、遠心分離により細胞片を除去し、Ｄ−ＬＤＨを含む粗酵素液を得た。
【００２４】
この粗酵素液を酢酸を加えｐＨ５．８に調整し、予め２ｍＭのＭｇＣｌ2 を含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．８）で平衡化したチバクロンブルーＨ−ＥＲＤカラムに通じ、同緩衝液（ｐＨ５．８）で洗浄したところ、Ｄ−ＬＤＨはカラムに吸着せず素通りした。このＤ−ＬＤＨを含む溶液を、１０ｍＭのＭｇＣｌ2 を含む２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．３）で平衡化したチバクロンイエローＨＥ−３Ｇカラムに通じたところ、Ｄ−ＬＤＨは吸着した。１ｍＭのＥＤＴＡを含む２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．６）をカラムに通じ、Ｄ−ＬＤＨを溶出した。活性画分を集め濃縮した。このようにして得られたＤ−ＬＤＨは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動で単一なバンドを与え、精製酵素標品を得ることができた。また、活性の収率は約４０％で、酵素１ｍｇ当たり約２３００単位の比活性を示し、その精製度は粗酵素液を１とすると約２５倍であった。
【００２５】
実施例１で得られたＤ−ＬＤＨは、セファデックスＧ−１００（ファルマシア社製）ゲル濾過クロマトグラフィーにより分子量を測定したところ、約８万〜８．５万であった。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動においては分子量約４万の位置に単一のバンドを与えた。また、ｐＨ５〜１１で安定で、ｐＨ７．５で最大の活性を示した。
実施例２
グルコース３．０％（重量％を表す。以下同様）、酵母エキス１．０％、ペプトン０．５％、クエン酸三ナトリウム・二水和物０．５％、酢酸ナトリウム０．２％、硫酸マグネシウム・七水和物０．０２％、硫酸マンガン・四〜五水和物０．００５％、ツイン８０  ０．１％（容量％）、ｐＨ６．４よりなる培地２５リットルを３０リットル容のジャーファーメンターに仕込み、１２１℃で１５分間滅菌した後、ロイコノストック・ラクティス(Leuconostoc lactis)ＳＨＯ４７株（生命研菌寄第１３９７０号）を接種し、４０℃で７時間、１００ｒｐｍで攪拌し、通気しない条件下、４ＮのＮａＯＨでｐＨを６．４に調整しながら培養した。遠心分離により菌体を採取して約１６０ｇの湿菌体を得た。得られた菌体を凍結状態で保存した。
【００２６】
この粗酵素液を酢酸を加えｐＨ５．８に調整し、予め２ｍＭのＭｇＣｌ2 を含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．８）で平衡化したチバクロンブルーＨ−ＥＲＤカラムに通じ、同緩衝液（ｐＨ５．８）で洗浄したところ、Ｄ−ＬＤＨはカラムに吸着せず素通りした。このＤ−ＬＤＨを含む溶液を、１０ｍＭのＭｇＣｌ2 を含む２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．３）で平衡化したチバクロンイエローＨＥ−３Ｇカラムに通じたところ、Ｄ−ＬＤＨは吸着した。１ｍＭのＥＤＴＡを含む２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．６）をカラムに通じ、Ｄ−ＬＤＨを溶出した。活性画分を集め濃縮した。このようにして得られたＤ−ＬＤＨは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動で単一なバンドを与え、精製酵素標品を得ることができた。また、活性の収率は約４５％で、酵素１ｍｇ当たり約２４００単位の比活性を示し、その精製度は粗酵素液を１とすると約４０倍であった。
実施例３
ＳＨＯ５４株から精製したＤ−ＬＤＨの保存安定性を調べた。Ｄ−ＬＤＨを、２５％グリセロールまたは０．５％牛血清アルブミンを含む１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で希釈することにより、１０Ｕ／ｍｌの濃度のＤ−ＬＤＨ液を調製した。この酵素液を０．５ｍｌずつ１．５ｍｌ容のエッペンドルフチューブに分注し、３０℃の恒温槽で保存した。
【００２７】
適当な時間保存した後の残存酵素活性を測定した。
添付した図面の図１は、保存開始時の酵素活性を１００％として、各保存時間活性をプロットしたものである。
図１に示したように、この発明のＤ−ＬＤＨは、保存開始から３０日後においても、９０％以上の残存活性を示すことが確認された。
【００２８】
【発明の効果】
この発明により、以上詳しく説明したとおり、安定性に優れかつ高い比活性を有するＤ−ＬＤＨが生成され、このＤ−ＬＤＨによって生成ピルビン酸または存在するピルビン酸を測定する各種測定用試薬や、Ｄ−乳酸生産への利用が容易となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】この発明のＤ−ＬＤＨの保存安定性試験における安定性曲線を示した図である。
【図１】
0003773283.tif 000009