(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛍光標識されたＤＮＡを付着させた蛍光ビーズ又は蛍光ドットを１次元もしくは２次元状に配列した試料に励起光を照射し、該励起光の照射により前記試料から発生する蛍光を検出して該検出した蛍光の情報に基づいて前記蛍光標識されたＤＮＡを検査する方法であって、前記試料を一方向に連続的に移動させ、複数のスポット状励起光をそれぞれ前記連続的に移動している試料の複数の蛍光ビーズ又は蛍光ドットに照射し、前記試料が前記配列の１ピッチ分移動する間前記複数のスポット状励起光がそれぞれ前記試料の複数の蛍光ビーズ又は蛍光ドットを照射し続けるように光偏向器で前記複数のスポット状励起光を追尾駆動し、前記試料が前記配列の１ピッチ分移動したときに前記複数のスポット状励起光を前記光偏向器で前記一方向と反対の方向に前記一方向への移動よりも速い速度で走査して前記複数のスポット状励起光を前記試料上で前記配列の１ピッチずれた位置の複数の蛍光ビーズ又は蛍光ドットに照射することにより、前記試料が前記配列の１ピッチ分の相対走査に要する時間の半分以上の時間で前記複数のスポット状励起光を前記試料の複数の蛍光ビーズ又は蛍光ドットに順次照射することを特徴とするＤＮＡ検査方法。
【請求項２】
蛍光標識されたＤＮＡを付着させた蛍光ビーズ又は蛍光ドットを１次元もしくは２次元状に配列した試料に励起光を照射し、該励起光の照射により前記試料から発生する蛍光を検出して該検出した蛍光の情報に基づいて前記蛍光標識されたＤＮＡを検査する方法であって、前記試料を一方向に１ピッチずつステップ的に移動させ、該試料が１ピッチ分ステップ的に移動して停止した状態のときに複数のスポット状の励起光をそれぞれ前記試料の複数の蛍光ビーズ又は蛍光ドットに照射し、該照射により前記試料の複数の蛍光ビーズ又は蛍光ドットから発生する蛍光の一部を前記試料からの正反射光を遮光して４分割受光素子で検出し、該４分割受光素子で検出した結果に基づいて前記複数のスポット状の励起光が照射する位置が前記試料の複数の蛍光ビーズ又は蛍光ドットの位置からずれている場合には前記複数のスポット状の励起光が照射する位置を光偏向器で調整し、前記複数のスポット状の励起光が照射する位置が前記試料の複数の蛍光ビーズ又は蛍光ドットの位置とあった状態で前記複数のスポット状の励起光で照射された前記試料の複数の蛍光ビーズ又は蛍光ドットから発生した蛍光を検出し、該検出した蛍光の情報を予め記憶しておいたデータと比較することにより前記蛍光標識されたＤＮＡを検査することを特徴とするＤＮＡ検査方法。
【請求項３】
前記光偏向器による前記複数のスポット状の励起光の追尾駆動を、前記試料の一方向への連続的な移動に同期して行うことを特徴とする請求項１記載のＤＮＡ検査方法。
【請求項４】
前記複数のスポット状の励起光を前記試料の蛍光ビーズ又は蛍光ドットの前記配列の１ピッチ分を照射する時間内で前記複数のスポット状の励起光の強度を前記光偏向器により段階的に変化させ、各段階での蛍光を分離して検出することを特徴とする請求項１又は２記載のＤＮＡ検査方法。
【請求項５】
前記複数のスポット状の励起光を照射することにより前記試料の複数の蛍光ビーズ又は蛍光ドットから発生した蛍光をピンホールアレイを介して共焦点検出することを特徴とする請求項１又は２記載のＤＮＡ検査方法。
【請求項６】
励起光源と、該励起光源から発射した励起光から複数のスポット状励起光を形成する複数スポット状励起光形成手段と、蛍光標識されたＤＮＡを付着させた蛍光ビーズ又は蛍光ドットを１次元もしくは２次元状に配列した試料を載置して少なくとも一方向に移動可能なテーブル手段と、該テーブル手段に載置された前記試料の複数の蛍光ビーズ又は蛍光ドットに前記複数スポット状励起光形成手段で形成した複数のスポット状励起光を照射する励起光照射手段と、前記テーブル手段の前記一方向への連続的な移動に伴って移動する前記試料の移動に合わせて前記複数の蛍光ビーズ又は蛍光ドットに照射した複数のスポット状励起光を光偏向器で追尾駆動し前記試料が前記配列の１ピッチ分移動したときに前記光偏向器で前記複数のスポット状励起光を前記一方向と反対の方向に前記一方向への移動よりも速い速度で走査して前記複数のスポット状励起光を前記試料上で前記配列の１ピッチずれた位置の複数の蛍光ビーズ又は蛍光ドットに照射させる追尾駆動手段と、該追尾駆動手段で追尾駆動された複数のスポット励起光が照射された前記複数の蛍光ビーズまたは蛍光ドットから発生した蛍光を検出して該検出した蛍光に応じた信号を出力する蛍光検出手段と、前記複数スポット状励起光形成手段と前記テーブル手段と前記励起光照射手段と前記追尾駆動手段と前記蛍光検出手段とを制御すると共に前記蛍光検出手段からの出力信号を受けて前記蛍光標識されたＤＮＡを検査する制御手段とを備えたことを特徴とするＤＮＡ検査装置。
【請求項７】
励起光源と、該励起光源から発射した励起光から複数のスポット状励起光を形成する複数スポット状励起光形成手段と、蛍光標識されたＤＮＡを付着させた蛍光ビーズ又は蛍光ドットを１次元もしくは２次元状に配列した試料を載置して少なくとも一方向に１ピッチずつステップ的に移動可能なテーブル手段と、該テーブル手段が一方向に１ピッチ分ステップ移動して停止した状態で前記複数スポット状励起光形成手段で形成した複数のスポット状の励起光をそれぞれ前記試料の複数の蛍光ビーズ又は蛍光ドットに照射する励起光照射手段と、該励起光照射手段で複数のスポット状の励起光をそれぞれ前記試料の複数の蛍光ビーズ又は蛍光ドットに照射したときの該照射位置をモニタする照射位置モニタ手段と、該照射位置モニタ手段で前記照射位置をモニタして検出した前記複数のスポット状の励起光の照射位置のずれを補正する照射位置ずれ補正手段と、該照射位置ずれ補正手段で照射位置が補正された状態で前記複数のスポット状の励起光で照射された前記試料の複数の蛍光ビーズ又は蛍光ドットから発生した蛍光を検出する蛍光検出手段と、該蛍光検出手段で検出した蛍光の情報に基づいて前記蛍光標識されたＤＮＡを検査する検査手段とを備えたことを特徴とするＤＮＡ検査装置。
【請求項８】
前記追尾駆動手段は、前記光偏向器による前記複数のスポット状の励起光の追尾駆動を、前記テーブル手段の一方向への連続的な移動に同期して行うことを特徴とする請求項６記載のＤＮＡ検査装置。
【請求項９】
前記追尾駆動手段の光偏向器は前記励起光照射手段で前記試料の蛍光ビーズ又は蛍光ドットに照射する前記複数のスポット状の励起光の強度を制御し、該複数のスポット状の励起光で前記試料の蛍光ビーズ又は蛍光ドットの前記配列の１ピッチ分を照射する時間内で前記複数のスポット状の励起光の強度を段階的に変化させることを特徴とする請求項６又は７記載のＤＮＡ検査装置。
【請求項１０】
前記蛍光検出手段は、前記励起光照射手段で前記複数のスポット状の励起光を照射することにより前記試料の複数の蛍光ビーズ又は蛍光ドットから発生した蛍光をピンホールアレイを介して共焦点検出することを特徴とする請求項６又は７記載のＤＮＡ検査装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はそれ自体が蛍光を発するもの又は蛍光標識されたもの、特に蛍光標識されたＤＮＡを検出あるいは検査する方法及び装置に関する。特に、ビーズ又はドットアレー状に配列した蛍光を高感度・広ダイナミックレンジ・高速に検出、検査する方法及び装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
蛍光物体又は蛍光標識されたＤＮＡがビーズまたはドットアレー状に配列したサンプルを検出する方法として従来励起レーザ光を１スポット状にし、これをサンプルと励起レーザスポットを相対走査させて、得られる蛍光を検出していた。またサンプルの広い領域に励起光を面照射して、得られる蛍光を２次元ＣＣＤ等で蛍光検出していた。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
上記の１スポットを照射し、相対走査して検出する場合、ビーズ又はドットアレーサンプルを全面隈なく走査するため下記に示すように実際に蛍光検出に有効に使われる時間の比率が非常に小さくなる。即ち、ビーズ又はドットの径をＤとし、ビーズ又はドットのピッチをＰとすると、アレーが正方碁盤目状であるとすると走査時間中蛍光検出に有効に使われる比率はπＤ２／４Ｐ２となる。例えばＤとＰの比を１：２とすると、この値は１９．６％、１：１．５としても３４．９％となる。このように半分以上の時間が検出に有効に使われないことに成る。
【０００４】
また１スポット光を照射して検出するため、サンプルが多数のビーズやドットからなる場合蛍光検出に多大な時間を要することに成り、高速検出が難しい。さらに高感度・広ダイナミックレンジで検出しようとすると、１ビーズ又は１ドットを励起する時間はある程度必要になり、高速検出を実現しようとすると感度とダイナミックレンジを犠牲にしなければならない
上記の第２の面照射し、２次元的に検出する場合も、上記の無駄な時間は同じであり、高感度・広ダイナミックレンジについても、困難と成る。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明は上記の課題を解決するため以下に示す手段を用いている。
【０００６】
蛍光物質が付着したビーズ又はドットアレーの直径に概ね等しいビーム径のスポット状の励起光を照射する。このビーズ又はドットアレーとこのスポット状励起光を相対的に走査して得られる蛍光を励起光から分離、検出する。この際、ビーズ配列の１ピッチ分の相対走査に要する時間内で概ね常時スポット励起光がビーズ又はドットアレーに照射するようにスポット励起光を追尾駆動する。この用にすることにより、従来問題となっていた、走査時間内のほとんどの時間を蛍光検出に利用することが可能になる。
【０００７】
また同様の効果を得る手段として、ビーズ又はドットアレーとスポット状励起光の相対走査により蛍光検出する際、１ピッチ分の相対走査に要する平均時間内で概ねスポット励起光がビーズ又はドットアレーを照射するように蛍光ビーズ又はドットアレー試料を１ピッチステップずつステップ移動させる。
【０００８】
さらに上記スポット励起光はマルチスポットとする。これにより同時に多数のビーズ又はドットを同時に検出することが可能になる。この結果、１ビーズ又はドットの検出にかけられる時間が更に長くなり、高感度・広ダイナミックレンジ・高速検出が実現できる。
【０００９】
上記のような検出を確実に行うため本発明ではスポット励起光がビーズ又はドットで反射もしくは回折した光分布の走査方向の偏りを検出し、この検出信号に基づいて、スポット励起光とサンプルの位置を補正する。
【００１０】
更に、スポット励起光がビーズ又はドットで反射もしくは回折した光分布のトラッキング方向の偏りを検出する。この検出信号に基づいてビーズ又はドットアレーの配列方向と直交する方向にスポット励起光の位置もしくは蛍光ビーズ又はドットアレー試料位置を補正する。このようにすることにより確実にほぼ常時励起光がビーズ又はドットを照射することになる。
【００１１】
また上記蛍光を検出する方法としてフォトンカウント検出法を用いる。これにより、上記の検出時間の長時間化の効果とあいまって蛍光が微弱なビーズ又はドットでも検出が可能になる。
【００１２】
更に上記ビーズ配列の１ピッチ分の相対走査に要する時間内で上記励起光の強度を段階的に変化させ、各段階での蛍光を分離検出する。このようにすることにより、サンプル内に蛍光が大きなものと微弱なものが混ざっていても、双方を精度良く検出することが可能になり、広ダイナミックレンジ検出が実現できる。
【００１３】
【発明の実施の形態】
以下本発明の実施形態例を用いて詳細に説明する。
【００１４】
図１は、蛍光標識されたＤＮＡがビーズ７１の表面に付着し、このビーズが蜂の巣状に２次元平面上に最密充填配列（但しＰ＞Ｄ）したＤＮＡビーズアレーサンプル７を励起光ビーム３０１，３０２，３０３……で照射し、蛍光検出している図である。ビーズ７１１１，７１２１，７１３１……には励起光ビーム３０１，３０２，３０３……がサンプル上の各ビーズ中心付近である３００１，３００２，３００３……を照射している。ＤＮＡビーズアレーサンプル７は図示しないｘステージにより太い矢印で示すようにｘ方向に連続一様速度Ｖｓで走査されている。
【００１５】
このため、図２の（Ａ）に示すように、図１の状態が時間（時刻）ｔ１とすると、ビーズ７１１１はΔｔ（＝ｔｎ+１−ｔｎ）時間後の時刻ｔ２ではビーズの配列ピッチＰ離れた図１の７１１２の位置に来ている。そこで励起光ビーム３０１，３０２，３０３……をｘ方向に太い矢印で示すようにｘ方向に速度Ｖｂで走査する。この時ほぼＶｂ＝Ｖｓとなるように走査する。７１１２の近くの位置までビームを走査したら図２の（Ｂ）に示すようにもとの位置即ち図１の３０１，３０２，３０３、……迄戻し、時刻ｔ２では再び速度Ｖｂでビームを走査する。
【００１６】
この動作をビーズの配列ピッチＰ進む毎に繰り返し、ｘ方向に配列する最後のビーズまで到達したら図示しないｙステージを用いてＤＮＡサンプル７を-ｙ方向に√３Ｐ／２だけ移動することにより、今まで検出していた図１のライン７１Ａ１，７１Ａ２，７１Ａ３……の隣のライン７１Ｂ１，７１Ｂ２……を上記の方法で検出することが出来る。Ｂのラインが検出終了すればマルチスポットの数をＮとすると-ｙ方向に√３Ｐ（Ｎ-１／２）移動し、上記の検出を繰り返す。このようにしてサンプル全面のビーズを検出する。
【００１７】
以上の説明で明らかなようにビーズの配列の１ピッチ分を走査する時間内のほとんどで励起光がビーズを照射している。このためこの時間内で蛍光検出を行うことが可能になる。即ち従来のようにサンプルの面全面を走査する場合には走査速度Ｖｓが同じとすると、ビームがビーズを過ぎる時間Ｄ／Ｖｓしか検出時間がなかったが、上記の方法を採用することにより、ほぼＰ／Ｖｓの時間検出に使える。更に従来の全面走査の場合には隣接ビーズの間も走査するためｙ方向のステップ移動の数を本方式に比べ、√３Ｐ／２Ｄ倍多くなり、この全サンプルを検出する時間が長くなる。
【００１８】
このように本方式を採用することにより、１ビーズを検出する時間が長くなり、従って蛍光が微弱でフォトンカウント法で蛍光強度を検出する場合には多くのフォトンが検出器に入り、高感度化される。また全面検出の時間が早くなり、高速検出が可能になる。
【００１９】
図３は本発明の蛍光ビーズ検出装置あるいは蛍光ビーズを用いるＤＮＡ検査装置の実施形態図である。１１及び１２は励起レーザ光源であり、１１は波長４８８ｎｍのレーザ、１２は波長５３２ｎｍのレーザである。それぞれのレーザビームは必要に応じて、本図では１２０１，１２０２で示すビーズ整形光学系により所望のビーム径にされる。所望のビーム径になった各レーザビームは１１１及び１２１のＡＯ偏向変調器(acoustic-optic deflector & modulator)に入射する。ＡＯ偏向変調器はこの中に実装されている水晶の超音波振動子に入力する高周波信号の周波数を変えることにより出射するレーザビームの回折角を変え、また入力高周波信号の振幅を変えることにより出射するレーザビームの強度を変える。
【００２０】
両レーザビームの光軸は紙面に垂直な方向に僅かにずれているので、４８８ｎｍと５３２ｎｍのレーザビームはミラー１１２と１２１により-ｚ方向（下方）に僅かに位置ずれし、また角度も平行から僅かにずれて進む。両光は凸レンズ１０１に入射し他の知平行に進み２つの穴が開いたピンホール板に入射する。それぞれのピンホールを通過した両光は偏光ビームスプリッタ２１を通過し、それぞれのビームが間隔Ｗから成る２つのビームになる。各波長の２つのビームは互いに直交する直線偏光になっているが、１／４波長板２２を通過することにより右及び左回りの円偏光になり、台形張り合われプリズム２３に入射する。この台形貼り合わせプリズムの貼り合わせ部分は偏光ビームスプリッタになっており、２つの台形の高さは僅かに違っているため１／４波長板２４に入射するときには各波長のビームは間隔が１／２Ｗで交互に直交する直線偏光の４本のビームになっている。
【００２１】
１／４波長板２４を通過すると各波長で４本のビームは交互に右および左回りの円偏光になり、第２の台形貼り合わせプリズム２５に入射する。このプリズムは２３と同じ構造であるが２個ある台形の高さの差が２３のそれの半分になっている。このためこのプリズムを通過したビームは各波長で間隔が１／８Ｗの８本のビームに成っており、１／４波長板２６を通過することにより、右と左の円偏光ビームが交互に並ぶ。
【００２２】
各波長で８本のビームがｘ方向の前後に平行に-ｚ方向に進み、波長分離ビームスプリッタ３０を通過し、チューブレンズ３１と対物レンズ３５により、ＤＮＡビーズサンプル７の８個のビーズアレーを図１に示すように同時に照射する。２波長のそれぞれ８個のビームはサンプル７上で図１に示すようにｙ方向に並び、図１には図示していないｘ方向のｍＰ（ｍは整数）離れたビーズの列を他方の波長のマルチビームが照射する。チューブレンズ３１と対物レンズ３５はピンホール１０２の像をサンプル７に１／Ｍの倍率で縮小結像するので、図１に示すようにビーズ７１の径Ｄとほぼ同程度かやや大きいスポット径になるようにピンホール径と倍率１／Ｍが設定されている。
【００２３】
制御回路８は既に図１と２を用いて説明したようにｘｙステージ６を図２の（Ａ）に示すようにｘ方向に走査し、サンプル上のビーズの端まで行くとｙ方向にステップ移動すると共に、ＡＯ偏向変調器を駆動し、図２の（Ｂ）に示すように２色のマルチビームをビーズの移動に合わせて同時に走査する。１ピッチ移動のほとんどの時間ビームがビーズを照射しているので、各ビーズにある蛍光標識からはこの間蛍光が発生している。発生した蛍光は対物レンズ３５とチューブレンズ３１を透過し、波長選択ビームスプリッタ３０で反射し、蛍光検出光学系５の窓５１を通りレンズ５２、開口付き遮光板５３レンズ５４を通過しマルチチャンネルフォトマル５０１と５０２に照射ビーズの蛍光像を結像する。５５は波長選択ビームスプリッタであり、４８８ｎｍで励起され５１０ｎｍ近傍の蛍光を透過し、５０１のマルチチャンネルフォトマルに導き、５３２ｎｍで励起され５７０ｎｍ近傍の蛍光を反射し、５０２のマルチチャンネルフォトマルに導く。
【００２４】
各マルチチャンネルフォトマル５０１及び５０２の前には上記の傾向波長整分のみを透過する干渉フィルタが設置されており、余分なノイズ光をこのフィルタでカットする。またこのフィルタとフォトマルの間に８個の蛍光スポットのみを通過させるピンホールアレーを設置することにより、図以外の場所から発生する蛍光灯のノイズ光をフォトマルの各チャンネルに入れないようにし、共焦点検出を行うことにより、更にＳＮの高い検出を行うことが出来る。
【００２５】
窓５１は蛍光波長から離れた波長の光をカットする色フィルタにすると、外部のノイズとなる迷光を遮光することになる。さらにチューブレンズと対物レンズから成るレンズ系は両テレセントリックにしてあるので、各ビーズから得られる蛍光の主光線は平行になっている。このため凸レンズ５２の焦点位置に遮光板５３を配置することにより、例え色フィルタからなる窓５１から外部の明光が入射してもほとんど遮光されることになる。
【００２６】
また図３の５５は上記の説明では１枚の一様な波長選択ビームスプリッタとしているが、これをｘ方向の前後で丁度２つの蛍光ビームの中間の位置を境にする２枚の特性の異なる波長選択ビームスプリッタにしても良い。即ちこのビーズの結像位置に近い部分では、両方の蛍光の像は完全に分離しているので、それぞれの蛍光色に最適な波長選択ビームスプリッタを２枚前後に置くことが可能になる。
【００２７】
各蛍光波長の８個のビーズ像はマルチチャンネルフォトマルの各チャンネルで検出される。１個のビーズの検出時間はほぼＰ／Ｖｓ（＝Δｔ）であるのでこの時間の間に来るフォトンの数を制御回路８で計数する。計数されたフォトン数はビーズの番地毎に又蛍光の色毎に制御回路のメモリに保存される。
【００２８】
このメモリに保存したデータを別途記憶しておいたデータと比較することにより、蛍光検出したＤＮＡの状態を検査・評価することができる。
また、上記求めたフォトン数の情報を、試料上のビーズの番地情報と共に、図示していない画面上に表示して、オペレータに結果を閲覧できるようにしても良い。
更に、この求めたフォトン数の情報を、試料上のビーズの番地情報と共に、通信手段を介して解析装置や分析装置、他の検査装置などに送信して用いることもできる。
サンプル上のビーズの中には非常に多くの蛍光分子がついているものもある。このような場合にはΔtの時間にフォトンが多く来過ぎて、この数をＮｐとしたとき、フォトンパルスの時間幅Δｔｐに対し、Ｎｐ＞Δｔ／Δｔｐとなってしまうと、パルスが重なり、計数することが困難になる。このように微弱な蛍光から非常に強い蛍光までを含むサンプルに対しては制御回路からＡＯ偏向変調器に、送る信号を以下のように制御して、上記の問題を解決する。
【００２９】
即ち、１ビーズを検出する時間Δｔを２分し、例えば前半のΔｔ／２の時間にはほぼ１００％の励起光を照射し、後半のΔｔ／２の時間には数％の励起光を照射するようにＡＯ偏向変調器の高周波の振幅を変化させる。このようにして強弱２種の励起光での蛍光をそれぞれ分離して検出する。このようにすることにより、蛍光分子が非常に少ない領域から非常に多い領域のビーズまで広いダイナミックレンジで正確に蛍光検出を行うことが可能になる。しかも１回の走査で、２個の蛍光標識を広ダイナミックレンジで検出することが可能になる。
【００３０】
図３の３４は励起光を低い反射率で反射させるビームスプリッタである。このビームスプリッタで反射した励起光はレンズ４１に入射する。このレンズ４１は対物レンズの瞳を４分割ポジションセンサ４０のセンサ面に結像する。また４分割ポジションセンサ４０の前には図７に詳細を示すマスク４０がある。
【００３１】
前述したように８個のマルチスポットビームはチューブレンズの光軸に平行に入射し、対物レンズの瞳中心に各ビームが集まる。対物レンズを透過した８本のビームは図４の３００に示すように垂直にビーズを照射する。ビーズの表面で反射する光５０２はビーズの中心からずれ、入射角がθとなると、反射光は垂線から大きな角度２θで反射し、対物レンズには入射しなくなる。
【００３２】
他方ビーズの表面で屈折しビーズの中に入った励起光はビーズの下の面で反射しビーズの上面で屈折し、光軸に対しαの角度で上方に出てくる。この屈折する光は図５の３００１Ａに示すようにビーズの中心から大きく外れた光も対物レンズに戻る際光軸からの角度αが小さく、ほとんどが対物レンズに入射する。
【００３３】
対物レンズの瞳の位置でビーズからの戻り光の位置はビーズから出てくる光の光軸とのなす角度で決まり、対物レンズのＮＡに相当する角度θＮＡ（＝ｓｉｎ−１ＮＡ）より小さい角度は対物レンズを通過し、大きい光は通過しない。図６に示すようにこの瞳Ｃの内部で白い部分、即ち瞳の中心Ｏから放射状にＡまでと、ＢからＣまでを除いた、ＡからＢまでの領域に来る光のみを検出するようにする。この白い部分を通過する光は、ビーズの球面で反射するものは図５の円弧部３００２Ａに入射する光３００２であり、ビーズで屈折し戻ってくるものは図５の円弧部３００１Ａに入射する光３００１のみとなる。
【００３４】
ビーズで屈折して戻ってくる光５０１´は入射時に矢印Ｗ１で示した広い範囲からの光が図６の瞳内の白い部分に戻ってくるのに対し、表面で反射する光は入射時にＷ２で示した狭い範囲からの光しか図６の瞳内の白い部分に戻らない。しかも表面で反射する光は屈折して戻ってくる光とは瞳の逆側に戻ってくる。
【００３５】
以上の戻り光の瞳上での性質を用いて、図７に示すように瞳を結像する位置に置いた４分割ポジションセンサ４０の前に図６の瞳内の白い部分に相当する４４０１を透過部とし、他の部分を社高部とするマスク４４を図７のように設置する。このマスク４４の背面には図８に示すような４分割ポジションセンサ４０がある。４分割ポジションセンサ４０は４つの独立なセンサ４０１，４０２，４０３及び４０４がギャップ４００を隔てて配置されており、各センサから上下の端子Ａ１，Ａ２及び左右の端子Ｂ１，Ｂ２が対角状に出ている。
【００３６】
Ａ１，Ａ２の方向は励起マルチスポットのアレー方向であり、Ｂ１，Ｂ２はアレーと直角な方向である。図４〜図６を用いて説明したようにビーズに対し励起スポット光がアレーの方向にずれていればＡ１，Ａ２の端子間で電圧変化を生じるので図１５ニ示すようにこの差（符号を含め）信号を増幅する。この励起スポットのアレー方向のずれ信号をＡＤ変換し、制御回路８に入力する。同様にＢ１，Ｂ２の電圧差を差動増幅し、ＡＤ変換したアレーと直交する方向のずれ信号を制御回路８に入力する。
【００３７】
この２方向のずれを検知したなら、図１５に示すようにアレーと直交する方向については図３のＡＯ偏向変調器１１１及び１２１に入力する高周波信号の周波数をずれが少なくなるように制御回路により変化させ、アレーの方向に付いてはｘｙステージ６のｙステージを制御回路８により制御し、ずれを補正する。
【００３８】
図９は本発明の蛍光標識ドットアレー検査装置の実施形態図である。７２はスポッタあるいはインクジェット等で打点されたＤＮＡのドットである。ドット径は数十ミクロンでありこれがドット径の数倍のピッチＰで正方状に配列している。このドットを同時に複数照射する励起光学系は図１と概ね同じであるが、ドット系が大きい分照射ビーム径が数十ミクロンに成るような設計がされている。図１０は上記のマルチ励起スポット形成光学系を省略した光学系が示されている。マルチスポット励起光３は図１同様３１のチューブレンズと３５の対物レンズによりサンプル７上のドットアレーを同時照射している。励起光により生じた蛍光は図１と同様にして蛍光検出系５により２波長励起光に対する２波長の蛍光を検出する。
【００３９】
以下に本実施例におけるサンプルと励起マルチスポットの位置関係について図１７を用いて説明する。なお後に説明する図１６に示すビーズアレーの検出においても同様な位置関係の動作になる。
【００４０】
図１７（Ａ）はビーズアレーまたはドットアレーサンプルの位置の時間変化を表し、（Ｂ）は励起光の位置を表す。ステージはビーズ又はドットアレーの配列ピッチＰ相当の距離をステップ的に移動し、ｔｎ+１-ｔｎ＝Δｔより若干短い時間内で検出を行う。従って基本的には励起光は図１７（Ｂ）のように静止している。
【００４１】
図１６のビーズ検出の場合には先に図１で説明したビーズからの反射光を対物レンズの瞳と協約な位置に設置した４分割ポジションセンサでビーズの中心と励起光スポットが一致していることを検出し、ずれている場合には制御する。
【００４２】
図９のドットアレーの場合には図１０に示す光学系を用いて、励起光とドットの位置ずれを検出して、このずれを補正する。以下図１０を用いて詳細に説明する。図１０のハーフミラー３４はサンプルのドットから反射した励起光の一部を反射し、レンズ４１１に導く。４４０は図１１に詳細図を示す０次光カットフィルタであり、サンプルから反射した光の０次光を図１１の４４０２で遮光する。即ちレンズ４１１による対物レンズ３５の瞳の結像位置にこの０次光フィルタが設置されており、サンプルで反射した励起光の正反射光が、このフィルタの４４０２で遮光され、回折した光のみがこのフィルタの４４０１を通過してくる。
【００４３】
ドットアレーの各ドットはプローブＤＮＡと溶媒等を含んだ液体をスポッタ又はインクジェット機構により打点された後、蛍光標識されたターゲットＤＮＡをハイブリダイゼションさせたものである。従ってドットの部分はその周囲のガラス基板に比べ盛り上がっている。このため個々のレーザ光が照射されると、この盛り上がり部で光が屈折し、反射した光は０次光とは異なる方向に回折する。この結果この回折光のみ０次光カットフィルタ４４０の４４０１を通過することに成る。
【００４４】
図１２はマルチスポット励起光３がサンプルのドットアレー７２をずれた状態で照射しているところを示している。このようにずれた状態で照射すると反射し、０次カットフィルタを通過した光は図１０のレンズ４１２により撮像センサ４３０の面上に図１３に示すように、ドットのエッジ部が明るくその他の場所は暗く結像する。そこで撮像センサとして例えば図１４に示すように４分割センサをドットの０次カットフィルタ透過像７２１のアレーピッチと等しいピッチで配列しておく。またこの４分割センサの中心は、もし励起光とドットが一致していれば像の中心と一致するように配置されている。
【００４５】
このため図１２のようにずれていると図１４のように０次カットフィルタ透過像７２１は４分割センサの中心からずれて結像する。この結果４分割センサの４３３、４３１の順に検出強度が強く、４３２，４３４にはほとんど光が来ないようになる。この結果先に説明した図１５の差動増幅器を用いることにより、ずれの２次元的な方向が分かり、制御回路８を介してステージ６を微動制御することにより、ずれを補正し正しい位置に励起光が照射するように出来る。
【００４６】
【発明の効果】
以上詳細に説明したように本発明により、ビーズ又はドットアレーから成る蛍光物体あるいは蛍光標識を付着したＤＮＡサンプルを検出したい部分のみに励起光を照射し、蛍光検出できるようになり、高感度・広ダイナミックレンジ・高速に検出することが可能になった。この結果、今後の医療検査等で大量サンプルを扱う領域での高精度、高速検査に非常に有効である。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明による蛍光ビーズアレー検出の状態を説明するビーズアレーサンプルの斜視図である。
【図２】（Ａ）ビーズアレーの位置変化を示すグラフ、（Ｂ）マルチスポット励起光の位置変化を示すグラフである。
【図３】本発明による蛍光ビーズアレー検出装置の概略構成を示す正面図である。
【図４】ビーズに照射する励起光と反射光の関係を説明するビーズの断面図である。
【図５】ビーズに照射する励起光と反射光の関係を説明するビーズの断面図である。
【図６】対物レンズの瞳上でのビーズ反射光の状態を示す平面図である。
【図７】ビーズ反射光を検出する４分割センサの平面図である。
【図８】ビーズ反射光を検出する４分割センサの平面図である。
【図９】本発明による蛍光ドットアレー検出の状態を説明するビーズアレーサンプルの斜視図である。
【図１０】本発明による蛍光ドットアレー検出装置の概略構成を示す正面図である。
【図１１】０次光カットフィルタの平面図である。
【図１２】マルチスポット励起光がずれた状態で照射されたビーズアレーサンプルの正面の断面図である。
【図１３】マルチスポット励起光がずれた状態で照射されたビーズアレーサンプルの平面図である。
【図１４】  4分割センサ上に投影された励起光の０次カットフィルタ透過像の状態を示す4分割センサアレイの平面図である。
【図１５】４分割センサの信号を処理する回路のブロック図である。
【図１６】本発明による蛍光ビーズアレー検出の状態を説明するビーズアレーサンプルの斜視図である。
【図１７】（Ａ）ビーズアレーの位置変化を示すグラフ、（Ｂ）マルチスポット励起光の位置変化を示すグラフである。
【符号の説明】
５・・・蛍光検出光学系    ６・・・ＸＹステージ    ７・・・ＤＮＡビーズアレーサンプル    ８・・・制御回路    １１，１２・・・励起レーザ光源    ３０・・・波長分離ビームスプリッタ    ３１・・・チューブレンズ    ３５・・・対物レンズ    ４０・・・4分割ポジションセンサ    ５５・・・波長選択ビームスプリッタ        ７１・・・ビーズ    ３０１，３０２，３０３・・・励起光ビーム        １１１，１２１・・・ＡＯ偏向変調器    ５０１，５０２・・・マルチチャンネルフォトマル
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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