(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ユーカリ属に属する木本植物の組織を組織培養して得られる芽又はこれより伸長したシュートを、温度０〜１２℃、かつ、光強度１μｍｏｌ／ｍ２／ｓ以下で、１０〜４０日間培養した後、通常の増殖条件で培養することを特徴とする、ユーカリ属に属する木本植物の組織培養によるシュート増殖方法
【請求項２】
ユーカリ属に属する木本植物の組織を組織培養して得られる芽として、多芽体より得られた芽を用いる、請求項１に記載のユーカリ属に属する木本植物の組織培養によるシュート増殖方法。
【請求項３】
ユーカリ属に属する木本植物の組織を組織培養して得られる芽又はこれより伸長したシュートを材料とし、少なくとも以下の過程（Ａ）及び（Ｂ）を経て行う、ユーカリ属に属する木本植物の組織培養による増殖方法。
（Ａ）：ユーカリ属に属する木本植物の組織を組織培養して得られる芽又はこれより伸長したシュートを、温度０〜１２℃、かつ、光強度１μｍｏｌ／ｍ２／ｓ以下で、１０〜４０日間培養した後、通常の増殖条件で培養することにより、シュートを増殖させる過程
（Ｂ）：（Ａ）にて増殖させたシュートを採取し、植物ホルモンとしてオーキシン類を含む植物組織培養用培地に移植して発根させ、苗を得る過程
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、農業、林業等に適用可能な、組織培養によるクローン苗の大量生産方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
植物組織を培養容器内で栄養繁殖、あるいは増殖させて植物体を再生し、大量のクローン苗を生産する組織培養技術は、現在、ラン等の花卉類や農作物を中心に適用され、生産品の均一化や収量の増加といった大きな効果をもたらしている。
【０００３】
一方、この技術は、木本植物、即ち樹木においても、クローン苗の生産・大量増殖にその適用が期待されている。しかし、ラン等の草本植物の大量増殖で確立された培養条件を木本植物に適用しても、同じ成果は得られない。植物の種類が異なれば、その植物にとって最適な培地や温度・光等の培養条件も異なるので、これは当然とも言えるが、更に、木本植物の場合は、これに含まれているポリフェノール類等の生長阻害物質が、組織の増殖に悪影響をもたらすからである。従って、木本植物の組織培養においては、単なる培養条件の最適化だけでは、草本植物に匹敵する程の増殖効率を得ることができない。特に、この問題は、優良な形質を備えた精英樹の大量増殖を目的とする場合には深刻となる。即ち、かかる場合には、その優良形質が発現し、見極められるだけの樹齢に達した成木を材料として組織培養を行なう必要があるが、樹齢が高くなればなるほど、その組織中のポリフェノール含量が高くなるため、培養組織の増殖効率は一層伸び悩むこととなる。
【０００４】
これまでにも、木本植物の組織培養における増殖効率の向上を目的として、培地組成の改変（例えば、無機塩類の濃度や組合せの変更、植物生長調節物質の濃度や種類・組合せの変更、新規成分の添加等）や培養環境の制御（例えば、光強度・光質の変更、空気中の炭酸ガス濃度の制御等）が様々に行なわれ、一定の成果を挙げてきた。しかしながら、上記した理由により、いまだに採算的に見合う増殖効率が得られず、実用化に至っていないケースが多い。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ユーカリ属に属する木本植物の組織培養におけるシュート増殖効率を大幅に向上させ、実用化可能な、即ち、効率的で安価なクローン苗の大量生産方法を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは鋭意研究の結果、ユーカリ属に属する木本植物の組織を組織培養して得られる芽又はこれより伸長したシュートを、通常は植物の生育に不適とされる低温で、しかも、弱光〜暗黒下で一定期間培養した後、通常の増殖条件で培養することにより、これが極めて活発に増殖することを見出し、本発明を完成した。
【０００７】
即ち、本発明は、ユーカリ属に属する木本植物の組織培養によるシュート増殖方法であって、ユーカリ属に属する木本植物の組織を組織培養して得られる芽又はこれより伸長したシュートを、温度０〜１２℃、かつ、光強度１μｍｏｌ／ｍ２／ｓ以下で、１０〜４０日間培養した後、通常の増殖条件で培養することを特徴とする。
また、本発明は、ユーカリ属に属する木本植物の組織培養による増殖方法であって、ユーカリ属に属する木本植物の組織を組織培養して得られる芽又はこれより伸長したシュートを材料とし、少なくとも以下の過程（Ａ）及び（Ｂ）を経て行うことをも特徴とする。
（Ａ）：ユーカリ属に属する木本植物の組織を組織培養して得られる芽又はこれより伸長したシュートを、温度０〜１２℃、かつ、光強度１μｍｏｌ／ｍ２／ｓ以下で、１０〜４０日間培養した後、通常の増殖条件で培養することにより、シュートを増殖させる過程
（Ｂ）：（Ａ）にて増殖させたシュートを採取し、植物ホルモンとしてオーキシン類を含む植物組織培養用培地に移植して発根させ、苗を得る過程
【０００８】
【発明の実施の形態】
以下に、本発明を詳細に説明する。
【０００９】
本発明は、ユーカリ属に属する木本植物の組織を組織培養して得られる芽又はこの芽から伸長するシュートを材料として用いる。
【００１０】
なお、ここで材料として用いる芽には、ユーカリ属に属する木本植物の組織を組織培養して得られる、定芽（頂芽や腋芽等）、不定芽、多芽体より採取される芽等が含まれる。多芽体とは、定芽や不定芽が適当な条件下で増殖して生じる、多数の芽を分化させた組織である。多芽体は非常に活発に増殖し、多数の芽を分化させるので、組織培養によって木本植物のクローン苗を大量生産する場合には、その木本植物の組織からいったん多芽体を誘導し、この多芽体を増殖させつつ、これから芽又はシュートを採取して、これらの芽やシュートを植物体の再生に用いるのが効率的である。
【００１１】
ユーカリ属に属する木本植物の組織からの多芽体の誘導は、概ね次の過程を経て行なわれる。まず、材料とする植物の組織から定芽や不定芽を採取し、有効塩素量０．５〜４％の次亜塩素酸ナトリウム水溶液に１０〜２０分間浸漬して表面を殺菌する。次いで、これらを滅菌水で洗浄し、固体培地に挿し付けて芽を開じょさせ、伸長してきたシュートを同じ組成の培地で継代培養することにより、多芽体が形成される。固体培地は、ショ糖１〜５ｗ／ｖ％、植物ホルモンとしてベンジルアミノプリン（以下、ＢＡＰと略す。）０．０２〜１．０ｍｇ／ｌ、ゲランガム０．２〜０．３ｗ／ｖ％もしくは寒天０．５〜１ｗ／ｖ％を含有するムラシゲスクーグ（以下、ＭＳと略す。）培地又はこのＭＳ培地の硝酸アンモニウム成分と硝酸カリウム成分とを半減させた改変ＭＳ培地を用いるのが好ましい。なお、このようにして誘導された多芽体は、適当に分割し、再び同組成の培地に置床して継代培養することにより、維持・増殖することができる。
【００１２】
本発明では、こうした定芽、不定芽、そして多芽体より得られる芽又はこれより伸長したシュート等を適当なタイミングで、例えば、定芽や不定芽の採取直後に、多芽体の誘導直後に、多芽体の維持・増殖を繰返している過程のいずれかの時点で、あるいは、幼植物体の再生過程に移行する直前の段階で、いったん、温度０〜１２℃、かつ、薄暗闇程度の弱光〜暗黒下、即ち、光強度１μｍｏｌ／ｍ2／ｓ以下にて培養する。温度が０℃よりも低いと、培養組織が凍結して破壊される等の低温障害を被り、温度が１２℃よりも高いと、その後、通常の増殖条件下で培養しても培養組織の活発な増殖は望めなくなる。更に、１μｍｏｌ／ｍ2／ｓよりも強い光で培養すると、その培養組織中にポリフェノール類が生成されて、増殖を妨げるようになるため好ましくない。
【００１３】
このとき、培地としては、例えば、ＭＳ培地やガンボーグＢ５培地等の一般的な植物組織培養用の基本培地に、ショ糖等の炭素源を０．１〜２ｗ／ｖ％及びＢＡＰもしくはカイネチン（以下、Ｋｉｎと略す。）等のサイトカイニンを単独で０．０１〜１．０ｍｇ／ｌ添加した液体培地、又は、これに、更にゲランガム０．２〜０．３ｗ／ｖ％もしくは寒天０．５〜１ｗ／ｖ％を添加した固体培地を用いることができる。液体培地を用いる場合には、培養組織をこの培地中に浸漬して静置培養を行なえばよく、固体培地を用いる場合には、培養組織をこの培地上に置床して、又は突刺して（培養組織がシュートの形状をしている場合。）培養を行なえばよい。
【００１４】
こうした低温・弱光〜暗黒下での培養は１０〜４０日間行なう。培養期間が１０日より短くても、４０日より長くても、その後の増殖条件下での培養で、活発なシュート増殖は望めない。
【００１５】
低温・弱光〜暗黒下での培養後の組織は、その組織に通常適用される増殖条件で培養する。例えば、ＭＳ培地やガンボーグＢ５培地等の一般的な植物組織培養用の基本培地に、ショ糖を１〜５ｗ／ｖ％、ＢＡＰ又はＫｉｎを単独で０．０１〜１．０ｍｇ／ｌ、及び、ゲランガムを０．２〜０．３ｗ／ｖ％又は寒天を０．５〜１ｗ／ｖ％添加した固体培地を用い、温度２０〜３０℃、光強度２０〜５０μｍｏｌ／ｍ２／ｓで低温・弱光〜暗黒培養後の芽又はそのシュートを培養すると、３〜４週間後には、培養している組織の基部よりシュートが多数発生し、速やかに多芽体が形成され、増殖する。多芽体は遺伝的変異も起こり難く、前記したように非常に活発に増殖し、多数の芽を分化させるので、ユーカリ属に属する木本植物のクローン苗を大量生産する場合には、ここでも多芽体を誘導して行なう方が有利である。
【００１６】
最終的に、植物個体を再生するには、弱光〜暗黒培養後、増殖条件で増殖させたシュートを採取し、これをショ糖等の炭素源、植物ホルモンとしてインドール酢酸、インドール酪酸、ナフタレン酢酸、ジクロロ酢酸等のオーキシン類を含む、適当な植物組織培養用培地にて培養し、発根させればよい。また、炭素源としてショ糖等を用いる代わりに、炭酸ガスを培養環境中に供給してもよい。例えばユーカリ属に属する木本植物においては、炭酸ガスを環境中に供給しつつ、オーキシン類０．０１〜２．０ｍｇ／ｌを含むＭＳ培地にて培養することで、多芽体より得られたシュートを発根させることができる。ＭＳ培地は４倍程度まで希釈して用いても構わない。培地は、液体でも固体でも用いることができる。液体培地を用いる場合には、フェノール樹脂やロックウール等を材料とする適当な空隙を有する支持体を、その液体培地で湿潤させ、これに多芽体等より採取したシュートを挿し付ければよい。
【００１７】
なお、本発明の低温・弱光〜暗黒培養は、ユーカリ属に属する木本植物を組織培養により増殖する過程において、幼植物体の再生に到るまでの間、１回以上適用することができる。
【００１８】
【作用】
木本植物の芽又はそのシュートは、その親植物の種類にもよるが、通常は、温度２０〜３０℃、光強度２０〜４０μｍｏｌ／ｍ２／ｓにおいて、もっとも活発な増殖を示す。しかるに、本発明者らは、ユーカリ属に属する木本植物の組織を組織培養して得られる芽又はこれより伸長したシュートを、いったん、温度０〜１２℃、かつ、光強度１μｍｏｌ／ｍ２／ｓ以下という、植物組織の増殖には全く不適な低温・弱光〜暗黒下で培養した後、改めて増殖に最適な条件で培養すると、ただ単に、同じ増殖最適条件でその培養を続けるよりも、これらのシュートが極めて活発に増殖することを見出した。
【００１９】
この理由はまだ明らかではない。しかし、芽又はそのシュートを一定期間、低温・弱光〜暗黒下に置けば、その組織中の内生ホルモン含量が変化し、ポリフェノール類の含量は減少する。その結果、組織の若返り（幼若化）が起き、改めて増殖条件でこれを培養することにより、ユーカリ属に属する木本植物においては、活発なシュート増殖を示すようになるのではないかと考えられる。
【００２１】
【実施例】
以下に、本発明を実施例に基づいて説明する。
【００２２】
［実施例１］
１０年生ユーカリプタス・ニテンス（Eucalyptus nitens：以下、Ｅ．ニテンスという。）の当年生枝を材料とし、ショ糖２ｗ／ｖ％、ＢＡＰ０．１ｍｇ／ｌ及びゲランガム０．２４ｗ／ｖ％を含むＭＳ培地を用いて誘導した多芽体からシュートを切出し、このシュートについて以下の実験を行なった。
【００２３】
まず、葉のついたままのシュートを、ショ糖１ｗ／ｖ％、ＢＡＰ０．１ｍｇ／ｌを含むＭＳ液体培地中で、光強度０．１μｍｏｌ／ｍ2／ｓ（肉眼では、殆ど暗黒と感じた。）、温度０、５、１０又は１５℃にて７、１４、３５又は７０日間、静置培養した。次いで、これらのシュートを１節ごとに切り分け、通常の増殖条件、即ち、多芽体の誘導に用いたと同様の固体培地で、光強度３０μｍｏｌ／ｍ2／ｓ、温度２４℃で培養を行ない、４週間後、発生したシュート数を調査した。
【００２４】
結果を表１に示す。表中、発生シュート数とは、置床したシュート１０節から新たに発生したシュートの総数を示している。
【００２５】
［比較例１］
多芽体から切出された葉のついたままのシュートを、多芽体の誘導に用いたのと同じ固体培地にそのまま移植し、光強度３０μｍｏｌ／ｍ2／ｓ、温度２４℃で培養を行った他は、実施例１と同様にして、このシュートから新たに発生したシュート数を調査した。
【００２６】
【表１】
表１．Ｅ．ニテンスにおける弱光〜暗黒培養の効果
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【００２７】
表１より明らかなように、低温・弱光〜暗黒培養時の温度は低いほど、その後の増殖条件下での増殖効率が高く、温度０、５又は１０℃で１４又は３５日間低温・弱光〜暗黒培養を行ったシュートからは、その後、これを通常の増殖条件で培養することにより、多数のシュートが新たに発生した。特に、温度０又は５℃で低温・弱光〜暗黒培養を行なったシュートの場合には、通常の増殖条件で培養を続けたシュートと比べ、新たに発生したシュートの数が２倍以上に達した。一方、温度１５℃で低温・弱光〜暗黒培養を行なったシュートの場合には、通常の増殖条件で培養を続けたシュートと比べ、むしろ新たなシュートの発生が阻害される傾向が見られた。
【００２８】
なお、低温・弱光〜暗黒培養の期間を７日間とした場合には、その効果は認めらなかった。また、これを７０日間とした場合には、その後の増殖条件下での培養において、やはり、シュート発生が阻害される傾向が見られた。
【００２９】
【発明の効果】
本発明によれば、ユーカリ属に属する木本植物の組織培養におけるシュート増殖効率を大幅に、しかも簡易に向上することができる。
【００３０】
従って、本発明によれば、ユーカリ属に属する木本植物の効率的で安価なクローン苗の大量生産が可能となり、その実用化への道を開くことができる。