(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記水溶性ペプチド：
インターフェロンアルファ類、インターフェロンベータ類、インターフェロンガンマー類、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子、マクロファージコロニー刺激因子、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、神経成長因子、ニューロトロピックファクター、脳神経細胞に作用を持つペプチド類、上皮細胞成長因子、インスリン様成長因子類、成長ホルモン、肝細胞成長因子、繊維芽細胞増殖因子、副甲状腺ホルモン、エンドセリン、糖鎖を有する該ペプチド、糖鎖構造の異なる活性を持つ該ペプチド因子、糖鎖を含まない該ペプチド因子、およびこれらのミューテイン、およびこれらの誘導体、類縁体、およびこれらの活性フラグメント、糖鎖があっても無くてもよい血小板増殖作用を持つ生理活性ペプチド；
トランスフォーミンググロースファクター、インスリン、リンホトキシン、血小板由来細胞成長因子、アンジオテンシンＩ、アンジオテンシンII、アンジオテンシンIII、アンジオテンシンＩインヒビター、ブラジキニン、ダイノルフィン、キョートルフィン、エンドルフィン、エンケファリン、セクレチン、成長ホルモン放出因子、黄体形成ホルモン放出ホルモンおよびその誘導体、ニューロテンシン、オキシトシン、バソプレシン、バソプレシン誘導体デスモプレシン、ヒルジンおよびその誘導体、グルカゴン、ガストリン、カルシトニン、カルシトニン遺伝子関連ペプチド、プロラクチン、副腎皮質刺激ホルモン、メラノサイト刺激ホルモン、甲状腺ホルモン放出ホルモンおよびその塩およびその誘導体、甲状腺刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、卵胞刺激ホルモン、パンクレオザイミン、コレシストキニン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、タフトシン、サイモシン、サイモスチムリン、モチリン、ボンベシン、セルレイン、ブラディキニン、カリクレイン、サブスタンスＰ、腫瘍壊死因子ならびにこれらのミューテイン、誘導体、類縁体、活性フラグメント、心房性ナトリウム利尿ホルモンおよびこれの類縁ペプチド、
ウロキナーゼ、スーパーオキサイドディスムターゼ、ティッシュータイププラスミノーゲンアクチベーター、アスパラギナーゼ、リゾティーム、糖鎖が有っても無くてもよい該酵素、糖鎖構造の異なる該酵素、これらのミューテイン、誘導体、および活性フラグメントからなる群より選ばれる水溶性ペプチドと常温でワックス様固体の平均分子量２０００〜６０００のポリエチレングリコールを配合してなる水溶性注射用医薬組成物。
【請求項２】
下記水溶性ペプチド：
インターフェロンアルファ類、インターフェロンベータ類、インターフェロンガンマー類、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子、マクロファージコロニー刺激因子、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、神経成長因子、ニューロトロピックファクター、脳神経細胞に作用を持つペプチド類、上皮細胞成長因子、インスリン様成長因子類、成長ホルモン、肝細胞成長因子、繊維芽細胞増殖因子、副甲状腺ホルモン、エンドセリン、血小板増殖作用を持つ生理活性ペプチド；
トランスフォーミンググロースファクター、インスリン、リンホトキシン、血小板由来細胞成長因子、アンジオテンシンＩ、アンジオテンシンII、アンジオテンシンIII、アンジオテンシンＩインヒビター、ブラジキニン、ダイノルフィン、キョートルフィン、エンドルフィン、エンケファリン、セクレチン、成長ホルモン放出因子、黄体形成ホルモン放出ホルモンおよびその誘導体、ニューロテンシン、オキシトシン、バソプレシン、バソプレシン誘導体デスモプレシン、ヒルジンおよびその誘導体、グルカゴン、ガストリン、カルシトニン、カルシトニン遺伝子関連ペプチド、プロラクチン、副腎皮質刺激ホルモン、メラノサイト刺激ホルモン、甲状腺ホルモン放出ホルモンおよびその塩およびその誘導体、甲状腺刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、卵胞刺激ホルモン、パンクレオザイミン、コレシストキニン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、タフトシン、サイモシン、サイモスチムリン、モチリン、ボンベシン、セルレイン、ブラディキニン、カリクレイン、サブスタンスＰ、腫瘍壊死因子、心房性ナトリウム利尿ホルモン、
ウロキナーゼ、スーパーオキサイドディスムターゼ、ティッシュータイププラスミノーゲンアクチベーター、アスパラギナーゼ、リゾティーム、
からなる群より選ばれる水溶性ペプチドと常温でワックス様固体の平均分子量２０００〜６０００のポリエチレングリコールを配合してなる水溶性注射用医薬組成物。
【請求項３】
さらに、生体内に注入可能な実質的に薬理活性を持たない水溶性蛋白を配合してなる請求項１または２記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、代謝や排泄の速いペプチドの生体内における薬理作用を持続させる製剤として有用な注射用医薬組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ペプチドは薬理効果が強いにもかかわらず体液内に投与された後の分解、排泄が速やかであるために注射などによる頻回投与が必要な場合が多い。従ってこれらの物質の持続性製剤の開発は注射回数を減らせることにより患者の苦痛を軽減し、また体液中濃度を持続的に一定有効濃度範囲に保つことにより有効性を高め、あるいは体液中濃度の急激な変動による副作用を軽減することが必要である。
このような持続性製剤を製造する目的で、ポリエチレングリコールを用いる試みがなされているが、未だ充分ではない。
【０００３】
たとえば、イギリス特許第１３８５９１４号公報には、カゼイン、コラーゲン、ケラチンなどの加水分解物をアシル化（パルミトイル化、ラウロイル化、ステアロイル化など）することにより脂溶性をあげたものを、ポリオキシエチレングリコールなどの両親媒性溶媒に溶解させることにより、皮下組織へ有効に浸透させうる皮膚外用剤の技術が開示されているが、水溶性ペプチドを製剤化することについては全く示されておらず、しかも、注射剤として使用することも全く示されていない。
ＰＣＴ国際出願公開第ＷＯ８９／０９６１０号公報においては腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）同士の会合、凝集を減少せしめる目的でポリエチレングリコールなどを配合する水分含有量の低い凍結乾燥製剤の技術が開示されている。しかしながら、ポリエチレングリコールの分子量、配合割合については具体的に示されていない。また、生体に投与後の腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）の生体内動態に及ぼす配合されたポリエチレングリコールの影響についても示されていない。
【０００４】
ＰＣＴ国際出願公開第ＷＯ８９／０５１５８号公報においては分子量９００〜１６００、より好ましくは分子量１９０〜４２０、特に好ましくは分子量２８５〜３１５（通常ポリエチレングリコール３００と称される）の非電解物質であるポリエチレングリコールを５％〜５０％（ｖ／ｖ）、特に好ましくは２５％（ｖ／ｖ）という高濃度に安定化剤または可溶化剤として含むインターフェロンベータ（ＩＦＮ−β）蛋白質注射剤の技術が開示されている。該公報においては常温で液状のポリエチレングリコールが使用されているため、ペプチド、蛋白質を安定に保存できる製剤として通常採用される真空乾燥あるいは凍結乾燥の手法は応用することはできない。即ち、該出願において使用されるポリエチレングリコールの濃度、分子量の組み合わせでは凍結乾燥は不可能であると記載されている。また、生体に投与後のインターフェロンベータ蛋白質の生体内動態へのポリエチレングリコールの影響については示されていない。ポリエチレングリコールの分子量が小さいほど刺激性が強いので、分子量の低いポリエチレングリコールを高濃度に含む製剤は避けるのがよいと考えられる。
特開昭６１−９７２２９号公報にはポリエチレングリコールなどを配合してなる安定なエリスロポエチン製剤の技術が開示されている。しかしながら、ここでは単にポリエチレングリコール４０００を０.２５％あるいは０.５％含む製剤が示されているものの、使用するポリエチレングリコールの分子量、最終製剤中の濃度など、有効な製剤の調整法については開示されていない。
特開昭６３−１２２６２８号公報にはインターリューキン２とポリエチレングリコールモノステアレート化合物とを、ＰＣＴ国際出願公開第ＷＯ８９／０２７５０号公報にはインターフェロンベータとポリエチレングリコールモノステアレート化合物とをそれぞれ安定化剤、可溶化剤として配合する技術が開示されている。すなわち、ここではポリエチレングリコールが非イオン性界面作用を有する誘導体として用いられている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
クリアランスの大きい（すなわち、生体内における薬理作用の持続時間が短い）水溶性ペプチドの生体内における薬理作用の持続時間を長くすることができれば、注射による投与回数を減らすことにより患者の苦痛が軽減され、また体液中の薬物濃度が持続的に一定有効濃度範囲に保たれるために薬物の有効性が高まる。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記の問題点を解決するため鋭意研究をおこなった結果、常温でワックス様固体の平均分子量２０００〜６０００のポリエチレングリコールを配合することにより、ラットにおけるクリアランスが体重１キログラムあたり３０ミリリットル／時間以上である水溶性医薬活性ペプチドの薬理活性を損なわないことはもちろんのこと、低粘度下でその薬理作用を持続させうる凍結乾燥可能な水溶性持続性注射製剤が得られることを見いだし、これに基づきさらに鋭意研究をおこなった結果本発明を完成するに至った。
本発明は、(１)、ラットにおけるクリアランスが体重１キログラムあたり３０ミリリットル／時間以上である水溶性ペプチドと常温でワックス様固体の平均分子量２０００〜６０００のポリエチレングリコールを配合してなる水溶性注射用医薬組成物，(２)、さらに、生体内に注入可能な実質的に薬理活性を持たない水溶性蛋白を配合してなる上記(１)の医薬組成物、および(３)さらに、酸性ムコ多糖類を配合してなる上記(１)または(２)の医薬組成物である。
【０００７】
本発明の組成物において、主薬としては、ラットにおけるクリアランスが体重１キログラムあたり３０ミリリットル／時間以上である水溶性ペプチドが用いられる。
上記でいう水溶性の程度としては、オクタノール／水分配比が０.１以下であ ることが挙げられる。
本発明でいう水溶性ポリペプチドはラットにおけるクリアランスが体重１キログラムあたり３０ミリリットル／時間以上で生理活性を有するペプチドであれば特に限定されない。たとえば、抗生物質、増血剤、感染症治療剤、抗痴呆剤、抗ウィルス剤、抗腫瘍剤、解熱剤、鎮痛剤、消炎剤、抗潰瘍剤、抗アレルギー剤、抗欝剤、向精神薬、強心剤、不整脈治療剤、血管拡張剤、降圧利尿剤などの降圧剤、糖尿病治療剤、抗凝血剤、コレステロール低下剤、骨粗しょう症治療剤、ホルモン剤、ワクチンなどとして用いられるものであって、上記のクリアランスで特定されるものが挙げられる。
【０００８】
本発明で用いられる該ペプチドとしては、２個以上のアミノ酸から構成される医薬活性を持つペプチドおよびその誘導体が用いられ、分子量約２００〜２０００００のものが好ましい。また、これらペプチドの作用機作としてアンタゴニスト、アゴニスト、またはこれらの可溶性リセプターおよびそれらの誘導体も挙げられる。また、糖鎖を有するものについては糖鎖構造の異なるものも含まれる。また、ポリエチレングリコールなどの合成ポリマーあるいはヒアルロン酸などの天然ポリマーで修飾されていてもよいし、任意の糖あるいは非ペプチド性化合物で修飾されていてもよい。該修飾において付加される物質が任意のレセプター、抗体などへ結合しうるものでもよい。また、本来の薬理活性を発現するのに必要なアミノ酸構造に加えて例えば任意のレセプター、抗体などへ結合しうるペプチドを付加したハイブリッドペプチドも含まれる。
該ペプチドとしては天然物由来あるいは遺伝子組換えにより製造されたインターフェロン類（例えばインターフェロンアルファ類、インターフェロンベータ類、インターフェロンガンマー類など）、造血因子、例えば顆粒球コロニー刺激因子、（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、インターリューキン類（例えばＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１）などが挙げられる。また、該ペプチドとしては天然物由来あるいは遺伝子組換えにより製造された成長因子類、例えば神経成長因子（ＮＧＦ）、ニューロトロピックファクター（ＮＴＦ）、脳神経細胞に作用を持つペプチド類、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、インスリン様成長因子類（ＩＧＦ）、成長ホルモン（ＧＨ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）などが挙げられる。また、該ペプチドとしては副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、エンドセリンなどが挙げられる。また、該ペプチドとしては糖鎖を有するもの、糖鎖構造の異なる活性を持つこれらの因子、または糖鎖を含まないこれらの因子、またはこれらのミューテイン、またはこれらの誘導体、類縁体、またはこれらの活性フラグメントが挙げられる。
また、該ペプチドは血小板増殖作用を持つ生理活性ペプチドで、糖鎖があっても無くてもよい。
【０００９】
さらに、該ペプチドとしては、トランスフォーミンググロースファクター（ＴＧＦ）、インスリン、リンホトキシン、血小板由来細胞成長因子（ＰＤＧＦ），アンジオテンシンＩ、アンジオテンシンII、アンジオテンシンIII、アンジオテ ンシンＩイ ンヒビター、ブラジキニン、ダイノルフィン、キョートルフィン、 エンドルフィン、エンケファリン、セクレチン、バソプレシン、成長ホルモン放出因子（ＧＲＦ）、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）またはその誘導体、ニューロテンシン、オキシトシン、バソプレシン、バソプレシン誘導体｛デスモプレシン（日本内分泌学会雑誌、第５４巻第５号第６７６−６９１頁（１９７８））参照｝、ヒルジンまたはその誘導体、グルカゴン、ガストリン、カルシトニン、カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）、プロラクチン、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、メラノサイト刺激ホルモン（ＭＳＨ），甲状腺ホルモン放出ホルモン（ＴＲＨ）その塩およびその誘導体（特開昭５０−１２１２７３号、特開昭５２−１１６４６５号公報参照）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、パンクレオザイミン、コレシストキニン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）、タフトシン、サイモシン、サイモスチムリン、モチリン、ボンベシン、セルレイン、ブラディキニン、カリクレイン、サブスタンスＰ、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）またはこれらのミューテイン、誘導体、類縁体、活性フラグメントが挙げられる。
また、該ペプチドとしては心房性ナトリウム利尿ホルモン（ＡＮＰ）またはこれの類縁ペプチドなどが挙げられる。
また、該ペプチドは天然物由来あるいは遺伝子組換えにより製造された酵素でもよく、糖鎖が有っても無くてもよく、また糖鎖構造の異なるものでもよく、またこれらのミューテイン、または誘導体、または活性フラグメントでもよく、例えばウロキナーゼ、スーパーオキサイドディスムターゼ（ＳＯＤ）、ティッシュータイププラスミノーゲンアクチベーター（ＴＰＡ）、アスパラギナーゼ、リゾティームなどが挙げられるが、これらに限定される訳ではなく、また他の投与可能な酵素類も含まれる。
【００１０】
ワクチンは抗原となる天然物由来あるいは合成あるいは遺伝子組換えにより製造されたペプチド、蛋白質、あるいは天然物由来の非ペプチド性抗原物質、あるいはこれらの混合物があげられ、これら単独あるいはハプテンに結合、あるいはアジュヴァントとともに注射剤として投与されるものであり、例えば杉花粉、ぶたくさ花粉などが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００１１】
なお、ヒトおよび他の温血動物における薬物の代謝、排泄能力の指標であるクリアランスが小さいペプチド、例えばヒトにおけるクリアランスが体重１キログラムあたり約１５ミリリットル／時間以下のペプチドはもともと身体からの排出が遅く、持続は充分得られている。また、副作用の発現が懸念されたり、薬理効果が非常に強く、過剰量の投与が患者に不利益をもたらすようなペプチドは患者の経過観察を行ないながら慎重に投与する必要がある。このため、これら二つの条件にあてはまるペプチドにおいては持続性製剤は必要ではない。例えば遺伝子組換えヒトエリスロポエチンのヒトにおける通常薬用量である１０マイクログラム（１８００国際単位）、あるいは２０マイクログラムをヒトに静脈内投与した場合の血清中エリスロポエチン濃度を用いて計算されたクリアランスの平均値はそれぞれ７５８ミリリットル／時間、あるいは７３９ミリリットル／時間と報告されている（宇治康明ら、診療と新薬、２６巻、１ページ〜、１９８９年）。それぞれの群の平均体重は６５.８キログラム、あるいは６９.３キログラムであるので、体重１キログラムあたりのクリアランスはそれぞれ１１.５ミリリットル ／時間、あるいは１０.７ミリリットル／時間と計算される。該論文においては 投与量を２マイクログラムおよび０.２マイクログラムにまで下げてヒトに静脈 内投与されているが、血清中濃度下面積（ＡＵＣ）は投与量に比例しており、薬物動態は線形性が保たれていたことが報告されており、エリスロポエチンのクリアランスは０.２マイクログラムから２０マイクログラムの投与量の範囲内では 投与量依存性は無いことが報告されている。ちなみに、該エリスロポエチンのヒトに静脈内投与した後の半減期（投与後２時間から８時間まで）の平均値は１０マイクログラム投与群では３.３時間、２０マイクログラム投与群では５.２時間と非常に長く、投与後４８時間目においても血清中に数ピコグラム／ミリリットルから数十ピコグラム／ミリリットル残存していた。これらのことから、臨床に供されているエリスロポエチン製剤は週１〜３回程度の頻度での投与でよいとされている。また、必要以上の増血とならないように週１回あるいは２週間に１回ヘモグロビン濃度あるいはヘマトクリット値を測定し、必要以上の増血を認めた場合には休薬することが求められている。このため、エリスロポエチンの持続性製剤を開発しても必要以上の増血が起きた場合にはコントロールすることができず、患者の利益にはならない。また、ラットを実験動物として用いた場合のエリスロポエチンのクリアランスは体重１キログラムあたり１９.４ミリリットル／ 時間と報告されており（投与量は体重１キログラムあたり５００国際単位）ヒトにおけると同様に代謝、排泄が遅い（奥村一夫他、薬理と治療、第１８巻、追補、１４１ページ〜１６２ページ（１９９０年））。ラット、ヒトなどの温血動物のクリアランスは体重の関数として表すことができることが報告されており（ボクセンバウムら、ジャーナル  オブ  ファルマコキネティックス  アンド  バイオフォーマシューティックス、第１０巻、２０１ページ〜２２７ページ（１９８２年）が代表的な文献として挙げられる）、エリスロポエチンにおけるラットとヒ��の体重１キログラムあたりのクリアランスの関係は、他のペプチドにおいてもほぼ成立することは明らかである。つまり、ラットにおけるクリアランスが小さいペプチドはヒトにおけるクリアランスも小さいことがほぼ確実に推定できる。本発明におけるクリアランスとは身体全体が薬物を処理する速度をその時の循環血液中濃度で除したものと定義され、単位時間あたりに身体が薬物を処理できる体液の容積を表し、この値が大きいほど身体の薬物処理能力が高い（ジー、アール、ウイルキンソン、ファーマコロジーレビュー、３９巻、１ページ〜、１９８７年。花野学ら、ファーマコキネティックス応用編（南山堂）、１９８９年）。血漿中（血清中）薬物濃度を基準にした場合にはＣＬＰ、全血中薬物濃度を基準にした場合にはＣＬＢと表記される。本発明におけるクリアランスは総クリアランス（ＣＬＴＯＴ）と称される場合もあるが、血漿中（血清中）あるいは全血中のいづれを基準にするかによりＣＬＰあるいはＣＬＢと読み換えられる。通常、これらの値は静脈内投与投与された薬物量を血漿中（血清中）あるいは全血中の薬物濃度下面積（ＡＵＣ）でを除したものとして表される。また、クリアランスはファーマコキネティックスの分野で用いられる他の公知の学術用語で定義されることもあるが、その意味するところは同一である。
【００１２】
本発明にあっては、ポリエチレングリコールは、常温でワックス様固体であって、平均分子量２０００〜６０００のものが用いられる。
本発明でいう常温とは日本薬局方で規定されている温度範囲であり、具体的には１５℃〜２５℃をいう。
ワックス様固体としては、液体ではなく白色のワックスに外観が類似する固体が挙げられる。
本発明においては平均分子量２０００から６０００までのポリエチレングリコールが用いられる。より好ましくは平均分子量が２０００〜５０００である。さらに好ましくは平均分子量が２０００〜４５００である。また、異なる分子量のものを混合して用いてもよい。本発明でいう分子量とは、日本薬局方に記載されているマクロゴール４００の平均分子量決定試験により求められる分子量をいう。
該ポリエチレングリコールの例としては、たとえば平均分子量２０００のもの，平均分子量３０００のもの，平均分子量４０００のものなどが挙げられる。
【００１３】
ペプチド製剤の保存は常温での取り扱いが簡便であるが、水溶液の状態では低温保存に比較して分解が促進されることが多く、また、ペプチドなどにおいては液体状態で振動などの物理的刺激を受けることにより薬理活性を失うものがあることが知られている。そこでペプチドの製剤特に注射用製剤としては真空乾燥、特に凍結乾燥による製剤化が好まれ、通常常温で流通、保存される。本発明の水溶性医薬用組成物の水溶液を真空乾燥あるいは凍結乾燥で製剤化をおこなう場合に常温で液体のポリエチレングリコールを使用すると凍結乾燥後に常温で液体が残存することになり特にペプチドなどの薬理活性を損ねる可能性が高い。一方、常温で固体のポリエチレングリコールを使用すると凍結乾燥後にも常温で固体で存在するためにペプチド特にペプチドの薬理活性を損ねないために保存性に優れている。パーキンエルマー社示差走査カロリメーター（ＤＳＣ７）を用いて常温で固体のポリエチレングリコールの融点を測定したところ（昇温速度は１０℃／分）、ポリエチレングリコール１０００（和光一級、平均分子量１０００）は２６.７８℃および３６.５８℃に熱移動のピークがみられた。ポリエチレングリコール１５４０（和光一級、平均分子量１５００）の熱移動のピークは４７.３２ ℃であったが、３０℃近辺から有意な熱移動が起きていることが確認された。日本薬局方において室温は１℃〜３０℃と規定されており、また日本国内においても盛夏時には３０℃以上に気温が上昇することは周知のことである。かかる条件下での冷所保存でない医薬製剤の流通、保存においては３０℃あるいはそれ以上の温度に該医薬製剤が暴露される機会は十分にある。従って、ポリエチレングリコール１０００あるいは１５４０を使用することにより、例えば凍結乾燥製剤中でこれらのポリエチレングリコールの融解が起きることが予想されるため、これらの使用は好ましくない。一方、ポリエチレングリコール２０００（和光一級、 平均分子量２０００）においては熱移動のピークは５２.３９℃であり、有意な熱移動は４０℃近辺から起こっていた。また、ポリエチレングリコール４００ ０（和光一級、平均分子量３０００）の熱移動のピークは５８.９４℃、ポリエ チ レングリコール６０００（和光一級、平均分子量７５００）の熱移動のピー クは６３.５６℃であった。これらの結果より、平均分子量１５４０以下のポリ エチ レングリコールは真空乾燥あるいは凍結乾燥による製剤化をおこなう医薬 組成物に使用する場合には不適である。一方、平均分子量２０００あるいはそれ以上の平均分子量で本発明において用いられている示差走査カロリメーターによる融点測定において４０℃近辺から有為な熱移動が起きるようなポリエチレングリコールを使用することで常温あるいは室温での流通、保存中のポリエチレングリコールの融解は防止できる。
【００１４】
本発明における体液内に注入しうる実質的に薬理活性を持たない水溶性蛋白質としては血清アルブミン、ポリクローナルあるいはモノクローナルの免疫グロブリンあるいはこれのフラグメント、コラーゲンあるいはゼラチンなどが挙げられるが、好ましくは血清アルブミンである。
ペプチドの配合割合としては該物質の活性および治療上の必要量に応じて一概には決定できないが単位投与組成物中に通常薬用量が配合される。
ペプチド対ポリエチレングリコールの重量比は好ましくは０.００００１：１ 〜１００：１である。さらに好ましくは０.０００１：１〜１０：１である。水 溶性蛋白の配合割合も同様に一概には決定できないが、注射用医薬組成物に通常添加される量が添加可能であり、ペプチド対水溶性蛋白の重量比は０.００００ １：１〜１００：１が好ましい。さらに好ましくは０.０００１〜１０：１であ る。本発明の医薬組成物水溶液におけるポリエチレングリコールの濃度は好ましくは２０％（Ｗ／Ｖ）以下、０.０１％（Ｗ／Ｖ）以上、さらに好ましくは１０ ％（Ｗ／Ｖ）以下、０.０５％（Ｗ／Ｖ）以上、特に好ましくは５％（Ｗ／Ｖ） 以下、０.１％（Ｗ／Ｖ）以上である。
【００１５】
本発明の組成物にさらに配合しうる酸性ムコ多糖類としてカルボキシル基によって高い負電荷を持つヒアルロン酸、あるいは硫酸基を有する酸性ムコ多糖類としてコンドロイチン−４−硫酸、デルマタン硫酸、コンドロイチン−６−硫酸、ケラタン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸などが挙げられる。また、硫酸基を有する天然型酸性ムコ多糖類の脱硫酸化物も挙げられる。
また、上記の酸性ムコ多糖類としてアミノ糖とウロン酸との二糖単位の繰り返し構造からなる長い直鎖状の複合多糖類であってもよい。これらはウロン酸の一部でガラクトースに置き換わったものも含み、硫酸基またはカルボキシル基によって高い負電荷を持つポリアニオンである。アミノ糖残基のアミノ基は通常アセチル化されているが、アセチル基の代わりに硫酸基が該アミノ基に結合したものでもよい。または、これらの誘導体でもよい。
【００１６】
上記の酸性ムコ多糖類は軟骨などの生体組織から抽出されたものでもよく、微生物から生産されたものでもよい。また、これらの誘導体でもよい。
その分子量としてはヒアルロン酸の場合１万〜３００万、好ましくは５０万〜２５０万、さらに好ましくは１００万〜２５０万程度のものが挙げられる。硫酸基を有するムコ多糖類の分子量としては１０００〜１００万、好ましくは１０００〜３０万、さらに好ましくは１０００〜１０万程度のものが挙げられる。
上記硫酸基を有するムコ多糖類としてはその硫酸基の数が、二糖単位あたり約０.０１〜４.０個のものが挙げられ、二糖単位あたり約０.１〜３.０個のものが好ましく用いられる。
硫酸基を有する天然型酸性ムコ多糖類は脱硫酸化してもよく、その方法としては、酸性メタノール溶液で脱硫酸する方法（シュバート、メソッヅインカーボハイドレートケミストリー、５巻、１０９頁、１９６５年）が挙げられる。脱硫酸化された本発明のムコ多糖類における硫酸基の数は、二糖単位あたり約０〜０. １個が挙げられ、好ましくは約０〜０.０５個が挙げられる。
【００１７】
本発明において用いられる硫酸基を有する天然型酸性ムコ多糖類の脱硫酸化物としてはコンドロイチン、脱硫酸化ヘパリン、ヘパランが具体例として挙げられる。なかでもコンドロイチン、ヘパランが好ましい。
上記の酸性ムコ多糖類は、塩類、例えばアルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩であってもよい。該アルカリ金属塩としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩などが挙げられる。好ましくはナトリウム塩である。該アルカリ土類金属塩としては、マグネシウム塩、カルシウム塩などが挙げられ、本発明においてはヒアルロン酸ナトリウム塩が有利に使用される。
酸性ムコ多糖類の配合割合は、例えばムコ多糖類対ポリエチレングリコールの重量比が約０.０００１：１〜１００：１であり、好ましくは約０.００１：１〜１０：１、最も好ましくは約０.０１〜１：１である。
【００１８】
本発明の持続性注射用医薬組成物は、水溶性ペプチドおよびポリエチレングリコール、必要に応じ製剤用添加物あるいはさらに水溶性蛋白を含むものであるが、その調整に際してはアンプルまたはバイアル中に滅菌水または滅菌生理食塩水に溶解または懸濁してこれらを存在させてもよいし、目的に応じて真空乾燥または凍結乾燥したものでもよい。また、ペプチドと、必要に応じ添加物、水溶性蛋白等が混在する水溶液、またはこれの真空乾燥または凍結乾燥粉末に滅菌水または滅菌生理食塩水を加え再溶解したものと、ポリエチレングリコールあるいはこれに製剤用添加物を添加したものに滅菌水または滅菌生理食塩水を加え溶解させたものを混合してもよい。またこれらに限定されず他の調製法を採用してもよく、要はペプチドの活性を損なわない方法であればよい。
【００１９】
また、水溶性ペプチドあるいはこれに安定化剤として血清アルブミンを加えたものに、さらに製剤添加物として例えばヒアルロン酸ナトリウム塩を加え、注射用蒸留水あるいは注射用生理食塩水を添加し静かに混和することにより得られる溶液あるいは懸濁液（I）にポリエチレングリコールの注射用蒸留水あるいは注 射用生理食塩水溶液（II）を混合し、真空乾燥あるいは凍結乾燥による製剤化をおこなってもよい。また（I）を真空乾燥あるいは凍結乾燥したものを（II）に 分散し、速やかに真空乾燥あるいは凍結乾燥することによる製剤化をおこなってもよい。また、（I）を主とし、（II）を副とするそれぞれ別な二流体ノズルか ら加熱された気流中に噴霧することにより成型脱水（スプレードライイング）する製剤化をおこなってもよい。
【００２０】
この場合、水溶性ペプチドあるいはこれに血清アルブミンを加えたものとヒアルロン酸ナトリウム塩の複合体（III）がポリエチレングリコール中に分散され た状態のもの、あるいは（III）の表面にポリエチレングリコールがコーティン グされたものが得られる。また、ポリエチレングリコールを加熱溶融（融点よりわずかに高い温度）させたものに（I）あるいはこれを真空乾燥あるいは凍結乾 燥した粉末を分散させ、冷溶媒中に撹拌下滴下もしくは注入後すみやかに得られた微粒子を回収するか、または速やかに気相中に噴霧冷却（スプレーチリング）あるいは二流体ノズルから加熱された気流中に噴霧することにより成型脱水（スプレードライイング）する製剤化をおこなってもよい。また、公知の方法に従い、固体のポリエチレングリコール中に水溶性ペプチドあるいはこれに血清アルブミンを加えたものとヒアルロン酸ナトリウム塩の複合体が分散された注射投与可能な微粒子を成型する製剤化をおこなってもよい。また、得られた該微粒子はさらに真空乾燥などをおこなうことにより脱水操作を加えられてもよい。また、該微粒子製造時には微粒子同志の凝集を防止する目的でポリビニールアルコール、マンニトール、あるいは燐酸塩などの無機塩を微粒子表面に付着させてもよい。このようにして得られた該微粒子は通常注射用溶媒として許容される物質で構成される溶媒に投与直前に分散され速やかに投与される。
【００２１】
本発明の医薬組成物には核酸（ＲＮＡ、ＤＮＡ）を含んでもよく、該核酸はアンチセンスとして使用されるものでもよい（ミンウイチアングら、ジャーナル  オブ  ビオロジカル  ケミストリー、第２６６巻、１９１６２ページ〜１８７１ページ（１９９１年）が代表的な文献として挙げられる）。このようにして得られる単位投与物には従来用いられている添加物を添加してもよい。例えばpＨ調 節剤としてアルギニン、水酸化ナトリウム、グリシン、塩酸、クエン酸、 局所 麻酔剤としてベンジルアルコール、等張化剤として食塩などの無機塩類、マンニトール、ソルビトールなどの炭水化物、吸着防止剤としてTween  ８０（などの 界面活性剤）、溶解補助剤としてシクロデキスト リン類、安定化剤として血清 アルブミン、あるいは還元剤としてグルタチオンなどが挙げられるがこれらに限定されない。
【００２２】
本発明はペプチドと常温でワックス様固体のポリエチレングリコールとを混合し、製剤を構成する上で許容される添加物を含有させてもよい医薬組成物であり、通常はこれらの物質が単位組成物中に存在するように調製される。さらには、この調製物に注射用溶剤を添加した溶液製剤、あるいはこの溶液の真空乾燥物あるいは凍結乾燥物、およびこれらの乾燥物を薬学的に許容される注射用溶剤で再溶解した製剤としてもよい。また、該ペプチドあるいはこれに製剤を構成する上で許容される添加物を添加した医薬組成物あるいはこれを注射用溶剤で溶解した溶液、あるいはこの溶液の凍結乾燥物、およびこの凍結乾燥物を薬学的に許容される注射用溶剤で再溶解したものに、常温でワックス様固体のポリエチレングリコールを注射用溶剤で溶解したものあるいはこれに薬学的に許容される添加物を添加したものあるいはこれの凍結乾燥物に注射用溶剤で再溶解したものを混合した持続性製剤である。さらに本持続性製剤に生体内に注入しうる実質的に薬理効果を持たない血清アルブミンなどの水溶性蛋白を配合することにより作用の増強が期待できる。
【００２３】
本発明の医薬組成物は、水溶性ペプチドあるいは水溶性ペプチドに血清アルブミンなどの水溶性蛋白および（または）ヒアルロン酸ナトリウム塩などの酸性ムコ多糖類を加えて均一化し、加温溶融した常温で固体のポリエチレングリコールに分散させてこれを溶媒中注入または気相中に噴霧して微粒子化し、投与時に注射用溶剤で分散して使用することもできる。
本発明の医薬組成物は真空あるいは凍結乾燥された状態で保存、流通されるのが望ましいが、溶液状態でも保存、流通は可能である。保存温度は常温でよいが、好ましくは冷所保存である。本発明における冷所とは１５℃以下を指す（日本薬局方）が、製剤によっては凍結を避けたほうが良い場合もある。
【００２４】
本発明の医薬組成物のpＨはペプチドの活性に大きな影響を与えず、生理的に 許容できる範囲内のpＨが用いられる。好ましくは約pＨ２〜pＨ１０である。さ らに好ましくは約pＨ３〜pＨ９である。特に好ましくはpＨ３.５〜pＨ８である。
該pＨの調整は、水溶性ペプチド，ポリエチレングリコール，各種添加物など が存在する状態で最終的なpＨが上記の範囲内に入るように、例えば塩酸あるい は水酸化ナトリウムなどを含む液を添加することによりおこなわれる。また、該ペプチドの存在中の安定性を確保するため、pＨ調整用の液を別容器とし、使用 直前に本操作を行ってもよい。
【００２５】
本発明の医薬組成物は、水溶性で持続性があり、その溶液の粘度が非常に低いのが一つの特徴であり、注射時の取り扱いは容易である。本発明における粘度とはＥ型粘度計（東京計器製）でコーンＬＤを用いて測定される粘度をいう。本発明の水溶性注射用組成物は、生体に投与する際の粘度として、通常２００センチポワーズ（ｃｐ）以下、好ましくは１００ｃｐ以下、さらに好ましくは７０ｃｐ以下となるように調製される。
該調整方法としては、例えば水溶性ペプチド、ポリエチレングリコール、あるいは各種添加物を上記の方法で混合し、必要に応じて滅菌生理食塩水などの注射用溶剤で稀釈することが行なわれる。
【００２６】
本発明の医薬組成物の投与方法としては、注射による投与が行われるが、特に皮下注射による投与が好ましく、用途によっては他の注射ルート、例えば筋肉内投与、静脈内投与、関節腔内投与、眼内投与、さらには組織内投与もおこなわれる。
本発明の組成物の投与量，投与対象，投与対象疾患などは、主薬である水溶性ペプチドのそれらを基準に定められる。
本発明は有機溶媒を使用しないため３次元構造が生理活性発現に重要なペプチドなどにも適応可能である。
本発明の医薬組成物は、投与された後にペプチドの薬理作用を持続させ得るが、溶液状態での投与が可能であるため薬用量の調節が容易であり、また細い注射針を使用できるため患者に与える苦痛は小さい。
また、本発明においては、常温で固体の平均分子量２０００から６０００という限られた範囲のポリエチレングリコールを使用することによりポリエチレングリコール共在下でのペプチドの真空乾燥または凍結乾燥による製剤化が可能になり、かつ薬理作用が持続する持続性製剤が得られる。このため医療従事者にとってはその取り扱いが容易になり、患者にとっては水溶性組成物であるため太い針を使用する必要がなく、また注射回数を減らせるために治療行為による苦痛が軽減される。
【００２７】
【実施例】
以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２８】
実施例１．インスリン持続性製剤
豚インスリン（２６.８ユニット／ミリグラム：ディオシンス社（オランダ），ラットにおけるクリアランス：１４１６ml／hr／kg）の１０ミリグラムを５ミリリットルの０.１規定塩酸で溶解した。この溶液０.７ミリリットルに平均分子量２０００のポリエチレングリコール２０００（和光純薬）を４.２ミリグラム溶 解させた注射用生理食塩水０.７ミリリットルを加え、混合した。
【００２９】
実施例２．インスリン持続性製剤
豚インスリン（２６.８ユニット／ミリグラム：ディオシンス社（オランダ））の１０ミリグラムを５ミリリットルの０.１規定塩酸で溶解した。この溶液０.７ミリリットルに平均分子量２０００のポリエチレングリコール２０００（和光純薬）を２％（Ｗ／Ｖ）の濃度で溶解させた注射用生理食塩水０.７ミリリットル を加え、混合した。さらに、これにクエン酸水和物１７ミリグラム、クエン酸ナトリウム１７ミリグラム、マンニトール２８ミリグラムを加えて溶解させた。本製剤の１ミリリットルをガラス製バイアルに移し、公知の凍結乾燥操作をおこなった（凍結乾燥装置：ライオバックＧＴ−３、リーボールド社）。
【００３０】
実施例３．インスリン持続性製剤
豚インスリン（２６.８ユニット／ミリグラム：ディオシンス社（オランダ））の１０ミリグラムを５ミリリットルの０.１規定塩酸で溶解した。この溶液０.７ミリリットルに平均分子量３０００のポリエチレングリコール４０００（和光純薬）を２％（Ｗ／Ｖ）の濃度で溶解させた注射用生理食塩水０.７ミリリットル を加え、混合した。さらに、これにクエン酸水和物１７ミリグラム、クエン酸ナトリウム１７ミリグラム、マンニトール２８ミリグラムを加えて溶解させた。本製剤の１ミリリットルをガラス製バイアルに移し、公知の凍結乾燥操作をおこなった（凍結乾燥装置：ライオバックＧＴ−３、リーボールド社）。
【００３１】
実施例４．インスリン持続性製剤
豚インスリン（２６.８ユニット／ミリグラム：ディオシンス社（オランダ））の１０ミリグラムを５ミリリットルの０.１規定塩酸で溶解した。この溶液０.７ミリリットルに平均分子量２０００のポリエチレングリコール２０００（和光純薬）を１０％（Ｗ／Ｖ）の濃度で溶解させた注射用生理食塩水０.７ミリリット ルを加え、混合した。さらに、これにクエン酸水和物１７ミリグラム、クエン酸ナトリウム１７ミリグラム、マンニトール２８ミリグラムを加えて溶解させた。本製剤の１ミリリットルをガラス製バイアルに移し、公知の凍結乾燥操作をおこなった（凍結乾燥装置：ライオバックＧＴ−３、リーボールド社）。
【００３２】
実施例５．インスリン持続性製剤
豚インスリン（２６.８ユニット／ミリグラム：ディオシンス社（オランダ））の１０ミリグラムを５ミリリットルの０.１規定塩酸で溶解した。この溶液０.７ミリリットルに平均分子量３０００のポリエチレングリコール４０００（和光純薬）を１０％（Ｗ／Ｖ）の濃度で溶解させた注射用生理食塩水０.７ミリリット ルを加え、混合した。さらに、これにクエン酸水和物１７ミリグラム、クエン酸ナトリウム１７ミリグラム、マンニトール２８ミリグラムを加えて溶解させた。本製剤の１ミリリットルをガラス製バイアルに移し、公知の凍結乾燥操作をおこなった（凍結乾燥装置：ライオバックＧＴ−３、リーボールド社）。
【００３３】
実施例６．インスリン持続性製剤
豚インスリン（２６.８ユニット／ミリグラム：ディオシンス社（オランダ））の１０ミリグラムを５ミリリットルの０.１規定塩酸で溶解した。この溶液０.７ミリリットルに平均分子量２０００のポリエチレングリコール２０００（和光純薬）を２０％（Ｗ／Ｖ）の濃度で溶解させた注射用生理食塩水０．７ミリリットルを加え、混合した。さらに、これにクエン酸水和物１７ミリグラム、クエン酸ナトリウム１７ミリグラム、マンニトール２８ミリグラムを加えて溶解させた。本製剤の１ミリリットルをガラス製バイアルに移し、公知の凍結乾燥操作をおこなった（凍結乾燥装置：ライオバックＧＴ−３、リーボールド社）。
【００３４】
実施例７．インスリン持続性製剤
豚インスリン（２６.８ユニット／ミリグラム：ディオシンス社（オランダ））の１０ミリグラムを５ミリリットルの０.１規定塩酸で溶解した。この溶液０.７ミリリットルに平均分子量３０００のポリエチレングリコール４０００（和光純薬）を２０％（Ｗ／Ｖ）の濃度で溶解させた注射用生理食塩水０.７ミリリッ トルを加え、混合した。さらに、これにクエン酸水和物１７ミリグラム、クエン酸ナトリウム１７ミリグラム、マンニトール２８ミリグラムを加えて溶解させた。本製剤の１ミリリットルをガラス製バイアルに移し、公知の凍結乾燥操作をおこなった（凍結乾燥装置：ライオバックＧＴ−３、リーボールド社）。
【００３５】
実施例８．インスリン持続性製剤
豚インスリン（２６.８ユニット／ミリグラム：ディオシンス社（オランダ））の１０ミリグラムを５ミリリットルの０.１規定塩酸で溶解した。この溶液０.７ミリリットルに平均分子量２０００のポリエチレングリコール２０００（和光純薬）を４.２ミリグラム溶解させた注射用生理食塩水０.７ミリリットルを加え、混合した。
【００３６】
実施例９．インスリン持続性製剤
豚インスリン（２６.８ユニット／ミリグラム：ディオシンス社（オランダ））の１２ミリグラムを１ミリリットルの０.１規定の塩酸に溶解し、さらに５ミリ リットル注射用生理食塩水を加えて希釈した。６０ミリグラム、３００ミリグラム、または６００ミリグラムの平均分子量２０００のポリエチレングリコール２０００（和光純薬）をそれぞれ３ミリリットルの注射用生理食塩水に溶解し２％（Ｗ／Ｖ）、１０％（Ｗ／Ｖ）、または２０％（Ｗ／Ｖ）のポリエチレングリコール溶液を調製した。それぞれの溶液１ミリリットルに前記のインスリン水溶液を１ミリリットルづつ加えてポリエチレングリコール濃度の異なる３種類のインスリン注射液を調製した。
【００３７】
実施例１０．インターフェロンアルファ持続性製剤
３００万国際単位のインターフェロンアルファと５ミリグラムのヒト血清アルブミンを含むインターフェロンアルファ製剤（武田薬品，ラットにおけるクリアランス：１２３ml／hr／kg）２バイアルにそれぞれ注射用蒸留水１ミリリットルを加え、合わせた。このうち１.２ミリリットルをとり、ポリエチレングリコー ル４０００（和光純薬一級、平均分子量３０００）を０.４５％（Ｗ／Ｖ）の濃 度になるように注射用生理食塩水（扶桑薬品）に溶解した溶液の０.６ミリリッ トルを加えて混合した。
【００３８】
実施例１１．インターフェロンアルファ持続性製剤
３００万国際単位のインターフェロンアルファと５ミリグラムのヒト血清アルブミンを含むインターフェロンアルファ製剤（武田薬品）２バイアルにそれぞれ注射用蒸留水１ミリリットルを加え、合わせた。このうち１.２ミリリットルを とり、ポリエチレングリコール２０００（和光純薬一級、平均分子量２０００）を２０％（Ｗ／Ｖ）の濃度になるように注射用生理食塩水（扶桑薬品）に溶解した溶液の０.３ミリリットルおよび注射用生理食塩水０.３ミリリットルを加えて混合した。
【００３９】
実施例１２．インターフェロンアルファ持続性製剤
３００万国際単位のインターフェロンアルファと５ミリグラムのヒト血清アルブミンを含むインターフェロンアルファ製剤（武田薬品）２バイアルにそれぞれ注射用蒸留水１ミリリットルを加え、合わせた。このうち１.２ミリリットルを とり、ポリエチレングリコール４０００（和光純薬一級、平均分子量３０００）を２０％（Ｗ／Ｖ）の濃度になるように注射用生理食塩水（扶桑薬品）に溶解した溶液の０.３ミリリットルおよび注射用生理食塩水０.３ミリリットルを加えて混合した。
【００４０】
実施例１３．インスリン持続性製剤
４００ミリグラムのポリエチレングリコール２０００または４０００（それぞれ和光一級）と５００ミリグラムのＤ−マンニトール（和光特級）を１０ミリリットルの注射用生理食塩水（扶桑薬品）に溶解し、これに２０％（Ｗ／Ｖ）のヒト血清アルブミンを含有するアルブミンニチヤク（日本製薬）を０.１ミリリッ ト ル添加し混合した。この溶液と豚インスリン（２６.８ユニット／ミリグラム： ディオシンス社（オランダ））の１０ミリグラムを２ミリリットルの０.１規定 塩酸で溶解したものを混合した。得られた２種類の溶液には沈殿は見られず、澄明な溶液が得られた。凍結乾燥装置ライオバックＧＴ−３（リーボールドヘラエウス社、ドイツ）を用いて自体公知の方法で２種の該混合物を凍結乾燥した。
【００４１】
実施例１４．インスリン持続性製剤
豚インスリン（２６.８ユニット／ミリグラム：ディオシンス社（オランダ））の４.５ミリグラムを０.５ミリリットルの０.１規定の塩酸に溶解し、さらに２.５ミリリットル注射用生理食塩水を加えて希釈した。６００ミリグラムの平均分子量２０００のポリエチレングリコール２０００（和光純薬）を３ミリリットルの注射用生理食塩水に溶解し２０％（Ｗ／Ｖ）のポリエチレングリコール溶液を調製した。豚インスリン溶液１ミリリットルにポリエチレングリコール溶液０. ５ミリリットル、注射用生理食塩水０.５ミリリットルを加えてインスリン注射 液を調製した。
【００４２】
実施例１５．Ｇ−ＣＳＦ持続性製剤
６００ミリグラムの平均分子量２０００のポリエチレングリコール２０００（和光純薬）を３ミリリットルの注射用生理食塩水に溶解し２０％（Ｗ／Ｖ）のポリエチレングリコール溶液を調製した。Ｇ−ＣＳＦを含む製剤であるフィルグラスティム（Filgrastim）（アムジェン社、アメリカ）の２３マイクロリットルに、注射用生理食塩水１.７２７ミリリットルとこのポリエチレングリコール溶液 ０.３５ミリリットルを加えてＧ−ＣＳＦ注射液を調製した。なお、Ｇ−ＣＳＦ のラットにおけるクリアランスは体重１キログラムあたり５３.１〜７９.８ミリリットル／時間と報告されている（タナカヒデジ他、ザ・ジャーナル・オブ・ファーマコロジー・アンド・エクスペリメンタル・セラピューティックス、第２５５巻、７２４ページ〜７２９ページ、１９９０年）。
【００４３】
実施例１６．ＳＯＤ持続性製剤
４００ユニット（２００マイクログラムに相当）のセラチア由来スーパーオキサイドディスミュターゼ（ＳＯＤ）（特開昭５７−２９２８５号および特開昭５８−１６６８５号公報）を含む０.７ミリリットルの生理食塩水にポリエチレン グリコール（平均分子量３０００のポリエチレングリコール４０００：和光純薬）の生理食塩水溶液（１０％(ｗ／ｖ)）０.７ミリリットルを加えて完全に混和 した。
【００４４】
実施例１７．ヒルジン持続性製剤
１００ＡＴＵ（約８マイクログラムに相当）のヒルジン（ペニンスララボラトリー社、米国）を含む溶液に注射用生理食塩水を加えて全量１ミリリットルとした。この溶液を含むガラス製バイアル瓶にポリエチレングリコール（平均分子量３０００のポリエチレングリコール４０００：和光純薬）の生理食塩水溶液（１０％(ｗ／ｖ)）１ミリリットルを加えて完全に混和した。
【００４５】
実施例１８．ＩＬ−２持続性製剤
１ミリリットルのインターリューキン２（ＩＬ−２；１０マイクログラムを含有）を（特開昭６１−７８７９９号公報記載）の製造法により製造し、特開昭６０−１１５５２８号公報）の精製法で精製した。Ｎ末端はメチオニンが付いているものといないもの混合物）に０.５ミリリットルの生理食塩水を添加した。こ の溶液の１ミリリットルを含むガラス精バイアル瓶にポリエチレングリコール（平均分子量３０００のポリエチレングリコール４０００：和光純薬）の生理食塩水溶液（１０％(ｗ／ｖ)）１ミリリットルを加えて完全に混和した。
【００４６】
実施例１９．酢酸リュープロレリン持続性製剤
７５０マイクログラムのＬＨ−ＲＨアナログである酢酸リュープロレリン（米国特許第４００８２０９号）を１.５ミリリットルの１／３０モルの燐酸緩衝液 （pＨ６）に溶解した。この溶液の１ミリリットルを含むガラス製バイアル瓶に ポリエチレングリコール（平均分子量３０００のポリエチレングリコール４０００：和光純薬）の生理食塩水溶液（１０％(ｗ／ｖ)）１ミリリットルを加えて完全に混和した。
【００４７】
実施例２０．ＰＴＨ持続性製剤
４５０マイクログラムの副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）（バッケム社、スイス）を１.５ミリリットルの注射用生理食塩水に溶解した。この溶液１ミリリットル を含むガラス製バイアル瓶にポリエチレングリコール（平均分子量３０００のポリエチレングリコール４０００：和光純薬）の生理食塩水溶液（１０％(ｗ／ｖ)）１ミリリットルを加えて完全に混和した。
【００４８】
実施例２１．ＴＲＨ持続性製剤
１.４６４ミリグラムの甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン（thyrotropin−releasing hormone：ＴＲＨ）酒石酸塩と５０ミリグラムのＤ−ソルビトールを含有 するヒルトニン注（武田薬品）の１ミリリットルをガラス製バイアル瓶（容量約５ミリリットル）に入れ、ポリエチレングリコール（平均分子量３０００のポリエチレングリコール４０００：和光純薬）の生理食塩水溶液（１０％(ｗ／ｖ)）１ミリリットルを加えて完全に混和した。
【００４９】
実施例２２．ＦＧＦムテイン持続性製剤
ＴＧＰ−５８０（リコンビナントヒト塩基性ＦＧＦムテインＣＳ２３：ＥＰ公開２８１、８２２号公報）溶液（０.９６ミリグラム蛋白質／ミリリットル）の ０.３６ミリリットルに注射用生理食塩水１.１４ミリリットル、ポリエチレングリコール（平均分子量３０００のポリエチレングリコール４０００：和光純薬）の生理食塩水溶液（１０％(ｗ／ｖ)）１.５ミリリットル、さらにヒト血清アル ブミンを２０％含有するアルブミンニチヤク（日本製薬）を６マイクロリットル加えて完全に混和した。
【００５０】
実施例２３．ＮＧＦ持続性製剤
神経細胞成長因子（ＮＧＦ）（バイオメディカルテクノロジー社、米国）１０マイクログラムを含む生理食塩水０.７ミリリットルにヒト血清アルブミンを２ ０％含有するアルブミンニチヤク（日本製薬）を４マイクロリットル添加し、さらに注射用生理食塩水１.４ミリリットル（扶桑薬品）を加え全量を２.１ミリリットルにした。また、この溶液にポリエチレングリコール（平均分子量３０００のポリエチレングリコール４０００：和光純薬）の生理食塩水溶液（１０％(ｗ ／ｖ)）２.１ミリリットルを加えて完全に混和した。
【００５１】
実施例２４．ＥＧＦ持続性製剤
上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）（ケミコンインターナショナル社、米国）１０マイクログラムを含む生理食塩水０.７ミリリットルにヒト血清アルブミンを２０ ％含有するアルブミンニチヤク（日本製薬）を４マイクロリットル添加し、さらに注射用生理食塩水１.４ミリリットル（扶桑薬品）を加え全量を２.１ミリリットルにした。また、この溶液にポリエチレングリコール（平均分子量３０００のポリエチレングリコール４０００：和光純薬）の生理食塩水溶液（１０％(ｗ／ ｖ)）２.１ミリリットルを加えて完全に混和した。
【００５２】
実施例２５．インターフェロンベータ持続性製剤
インターフェロンベータ（ペーゼル社、ドイツ）１０マイクログラムを含む生理食塩水０.７ミリリットルにヒト血清アルブミンを２０％含有するアルブミン ニチヤク（日本製薬）を４マイクロリットル添加し、さらに注射用生理食塩水１.４ミリリットル（扶桑薬品）を加え全量を２.１ミリリットルにした。また、この溶液にポリエチレングリコール（平均分子量３０００のポリエチレングリコール４０００：和光純薬）の生理食塩水溶液（１０％(ｗ／ｖ)）２.１ミリリット ルを加えて完全に混和した。
【００５３】
実施例２６．インターフェロンガンマ持続性製剤
インターフェロンガンマ（ジェンザイム社、米国）１０マイクログラムを含む生理食塩水０.７ミリリットルにヒト血清アルブミンを２０％含有するアルブミ ンニチヤク（日本製薬）を４マイクロリットル添加し、さらに注射用生理食塩水１.４ミリリットル（扶桑薬品）を加え全量を２.１ミリリットルにした。また、この溶液にポリエチレングリコール（平均分子量３０００のポリエチレングリコール４０００：和光純薬）の生理食塩水溶液（１０％(ｗ／ｖ)）２.１ミリリッ トルを加えて完全に混和した。
【００５４】
実施例２７．ＴＧＦ−β持続性製剤
形質転換成長因子（ＴＧＦ−β）（和光純薬工業(株)製）１マイクログラムを含む生理食塩水０.７ミリリットルにヒト血清アルブミンを２０％含有するアル ブミンニチヤク（日本製薬）を４マイクロリットル添加し、さらに注射用生理食塩水１.４ミリリットル（扶桑薬品）を加え全量を２.１ミリリットルにした。また、この溶液にポリエチレングリコール（平均分子量３０００のポリエチレングリコール４０００：和光純薬）の生理食塩水溶液（１０％(ｗ／ｖ)）２.１ミリ リットルを加えて完全に混和した。
【００５５】
実施例２８．副甲状腺ホルモン持続性製剤
副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）（バッケム社、スイス）１０マイクログラムを含む生理食塩水０.７ミリリットルにヒト血清アルブミンを２０％含有するアルブ ミンニチヤク（日本製薬）を４マイクロリットル添加し、さらに注射用生理食塩水１.４ミリリットル（扶桑薬品）を加え全量を２.１ミリリットルにした。また、この溶液にポリエチレングリコール（平均分子量３０００のポリエチレングリコール４０００：和光純薬）の生理食塩水溶液（１０％(ｗ／ｖ)）２.１ミリリ ットルを加えて完全に混和した。
【００５６】
実施例２９．ＴＮＦ−α持続性製剤
腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）（和光純薬工業(株)製）４００ユニットとヒト血清アルブミン０.１ミリグラムを含むpＨ７.４のりん酸緩衝液０.１ミリリットルに注射用生理食塩水０.６ミリリットル（扶桑薬品）を加えヒト血清アルブミン を２０％含有するアルブミンニチヤク（日本製薬）を４マイクロリットル添加し、さらに注射用生理食塩水１.４ミリリットル（扶桑薬品）を加え全量を２.１ミリリットルにした。また、この溶液にポリエチレングリコール（平均分子量３０００のポリエチレングリコール４０００：和光純薬）の生理食塩水溶液（１０％(ｗ／ｖ)）２.１ミリリットルを加えて完全に混和した。
【００５７】
実施例３０．成長ホルモン持続性製剤
成長ホルモン（ＵＣＢバイオプロダクッ社、ベルギー）１０マイクログラムを含む生理食塩水０.７ミリリットルにヒト血清アルブミンを２０％含有するアル ブミンニチヤク（日本製薬）を４マイクロリットル添加し、さらに注射用生理食塩水１.４ミリリットル（扶桑薬品）を加え全量を２.１ミリリットルにした。また、この溶液にポリエチレングリコール（平均分子量３０００のポリエチレングリコール４０００：和光純薬）の生理食塩水溶液（１０％(ｗ／ｖ)）２.１ミリ リットルを加えて完全に混和した。
【００５８】
実施例３１．カルシトニン持続性製剤
カルシトニン（ＵＣＢバイオプロダクッ社、ベルギー）１０マイクログラムを含む生理食塩水０.７ミリリットルにヒト血清アルブミンを２０％含有するアル ブミンニチヤク（日本製薬）を４マイクロリットル添加し、さらに注射用生理食塩水１.４ミリリットル（扶桑薬品）を加え全量を２.１ミリリットルにした。また、この溶液にポリエチレングリコール（平均分子量３０００のポリエチレングリコール４０００：和光純薬）の生理食塩水溶液（１０％(ｗ／ｖ)）２.１ミリ リットルを加えて完全に混和した。
【００５９】
実施例３２．ＴＰＡ持続性製剤
組織プラスミノーゲンアクチベーター（ＴＰＡ）（バイオスコット社、米国）１０マイクログラムを含む生理食塩水０.７ミリリットルにヒト血清アルブミン を２０％含有するアルブミンニチヤク（日本製薬）を４マイクロリットル添加し、さらに注射用生理食塩水１.４ミリリットル（扶桑薬品）を加え全量を２.１ミリリットルにした。また、この溶液にポリエチレングリコール（平均分子量３０００のポリエチレングリコール４０００：和光純薬）の生理食塩水溶液（１０％(ｗ／ｖ)）２.１ミリリットルを加えて完全に混和した。
【００６０】
実施例３３．ＩＬ−３持続性製剤
インターリューキン３（ＩＬ−３；Ｒ＆Ｄシステムズ社、米国）１０００ユニットを含む生理食塩水０.７ミリリットルにヒト血清アルブミンを２０％含有す るアルブミンニチヤク（日本製薬）を４マイクロリットル添加し、さらに注射用生理食塩水１.４ミリリットル（扶桑薬品）を加え全量を２.１ミリリットルにした。また、この溶液にポリエチレングリコール（平均分子量３０００のポリエチレングリコール４０００：和光純薬）の生理食塩水溶液（１０％(ｗ／ｖ)）２. １ミリリットルを加えて完全に混和した。
【００６１】
実施例３４．インターフェロンアルファ持続性製剤
３００万国際単位のインターフェロンアルファと５ミリグラムのヒト血清アルブミンを含むインターフェロンアルファ製剤（武田薬品、ラットにおけるクリアランス：１２３ml／hr／kg）１０バイアルにそれぞれ注射用蒸留水１ミリリットルを加えた。
これに分子量１８０万のヒアルロン酸ナトリウム塩（ジェンザイム社、米国）を１.２％(ｗ／ｖ)になるように注射用生理食塩水に溶解した溶液１０ミリリッ トルを加え、静かに混和した。この溶液に常法に従い凍結乾燥し、得られた粉末を５５℃に加熱溶融したポリエチレングリコール４００（平均分子量３０００：和光一級）の１０グラム中に添加して素早く分散した。５℃に冷却した２００ミリリットルの蒸留水中にホモジナイザー（ポリトロン：キネマティカ社）で高速撹拌しながら溶液を滴下することにより微粒子を作製した。続いて速やかに篩過することにより微粒子を回収し、凍結乾燥操作をおこなった。
【００６２】
実施例３５．インターフェロンアルファ持続性製剤
３００万国際単位のインターフェロンアルファと５ミリグラムのヒト血清アルブミンを含むインターフェロンアルファ製剤（武田薬品、ラットにおけるクリアランス：１２３ml／hr／kg）１０バイアルにそれぞれ注射用蒸留水１ミリリットルを加えた。
これに分子量１８０万のヒアルロン酸ナトリウム塩（ジェンザイム社、米国）を１.２％(ｗ／ｖ)になるように注射用生理食塩水に溶解した溶液１０ミリリッ トルを加え、静かに混和した。この溶液に常法に従い凍結乾燥し、得られた粉末を５５℃に加熱溶融したポリエチレングリコール４００（平均分子量３０００：和光一級）の１０グラム中に添加して素早く分散した。続いてスプレードライヤー（ＧＳ−３１：ヤマト科学）を用いてこの溶液から微粒子を作製し、さらに凍結乾燥操作をおこなった。
【００６３】
実験例１
下記配合割合にて注射剤を調製し、実験に使用した。
比較製剤１：豚インスリン（２６．８ユニット／ミリグラム：ディオシンス社(オランダ))の１０ミリグラムを５ミリリットルの０.１規定塩酸で溶解した。この溶液０.７ミリリットルに注射用生理食塩水０.７ミリリットルを加えた。
比較製剤２：注射用生理食塩水  ２  ミリリットル
８週齢の雄性ＳＤ系ラット背部皮下に、２００マイクログラム／ラットの薬用量で実施例１の製剤または比較製剤１の注射液を投与した。対照として比較製剤２の生理食塩水注射液を同様に投与した。投与前および一定時間毎に約０.４ミ リリットルづつ採血し血清を分離採取した。血清中のグルコース濃度をグルコースＣテストワコー（和光純薬）定量した。
〔図１〕に血清中グルコース濃度の時間推移を示す。比較製剤２の生理食塩水注射液投与群では血清中グルコース濃度はほとんど変動しなかった。比較製剤１のインスリン溶液投与群では血清中グルコース濃度は投与後３０分から低下しているが、投与後１２０分目から上昇を始めていた。一方、実施例１の製剤のポリエチレングリコール２０００を添加したインスリン溶液投与群では投与後３０分目から血清中グルコース濃度は低下し投与後６時間目でもほぼ同じ低い値であった。なお、インスリンのラットにおける体重１キログラムあたりのクリアランスは１４１６ミリリットル／時間と報告されている（ハルバン他、メタボリズム、第２８巻、１０９７ページ〜１１０４ページ（１９７９年））。
【００６４】
実験例２
比較製剤３：豚インスリン(２６.８ユニット／ミリグラム：ディオシンス社(オランダ))の１０ミリグラムを５ミリリットルの０.１規定塩酸で溶解した。この 溶液０.７ミリリットルと平均分子量４００のポリエチレングリコール４００（和光純薬）を１０％（Ｗ／Ｖ）の濃度で溶解させた注射用生理食塩水０.７ミリリ ットルを加え、混合した。さらに、これにクエン酸水和物１７ミリグラム、クエン酸ナトリウム１７ミリグラム、マンニトール２８ミリグラムを加えて溶解させた。本製剤の１ミリリットルをガラス製バイアルに移し、公知の凍結乾燥操作を行なった（凍結乾燥装置：ライオバックＧＴ−３、リーボールド社）。
実施例２から実施例７で得られた平均分子量２０００あるいは３０００のポリエチレングリコールを配合したインスリン持続性製剤ではスポンジケーキ状の一様な凍結乾燥物が得られたのに比較して、比較製剤３のポリエチレングリコール４００を配合したインスリン製剤では常温で液体のポリエチレングリコール４００のために凍結乾燥物に濡れが見られた。このことは不安定なペプチドの製剤化の方法として汎用される凍結乾燥をおこなう際には配合剤として平均分子量２０００あるいは３０００のポリエチレングリコールがポリエチレングリコール４００よりも優れていることを示している。
【００６５】
実験例３
比較製剤４：豚インスリン（２６.８ユニット／ミリグラム：ディオシンス社 （オランダ））の１０ミリグラムを５ミリリットルの０.１規定塩酸で溶解した。この溶液０.７ミリリットルに平均分子量４００のポリエチレングリコール４０ ０（和光純薬）を４.２ミリグラム溶解させた注射用生理食塩水０.７ミリリットルを加え、混合した。
比較製剤５：豚インスリン(２６.８ユニット／ミリグラム：ディオシンス社(オランダ))の１０ミリグラムを５ミリリットルの０.１規定塩酸で溶解した。この 溶液０.７ミリリットルに注射用生理食塩水０.７ミリリットルを加えた。
比較製剤６：  注射用生理食塩水  ２  ミリリットル
８週齢の雄性ＳＤ系ラット背部皮下に、２００マイクログラム／ラットの薬用量で実施例８の製剤，比較製剤４または比較製剤５の注射液を投与した。対照として比較製剤６の生理食塩水注射液を同様に投与した。投与前および一定時間毎に約０.４ミリリットルづつ採血し血清を分離採取した。血清中のグルコース濃 度をグルコースＣテストワコー（和光純薬）で定量した。
〔図２〕に血清中グルコース濃度の時間推移を示す。比較製剤６の生理食塩水注射液投与群では血清中グルコース濃度はほとんど変動しなかった。比較製剤５のインスリン溶液投与群では血清中グルコース濃度は投与後３０分から低下しているが、投与後１２０分目から上昇を始めていた。比較製剤４のポリエチレングリコール４００を含むインスリン溶液投与群では血清中グルコース濃度は投与後３０分から低下しているが、投与後２４０分目から上昇を始めていた。一方、実施例８の製剤のポリエチレングリコール２０００を添加したインスリン溶液投与群では投与後３０分目から血清中グルコース濃度は低下し投与後６時間目でもほぼ同じ低い値であった。このことから添加するポリエチレングリコールの分子量は大きいもののほうがより持続効果が得られることが判明した。
【００６６】
実験例４
比較製剤７：豚インスリン（２６.８ユニット／ミリグラム：ディオシンス社 （オランダ））の１２ミリグラムを１ミリリットルの０.１規定の塩酸に溶解し、さらに５ミリリットル注射用生理食塩水を加えて希釈した。このインスリン水溶液１ミリリットルに注射用生理食塩水１ミリリットルを加えインスリン注射液を調製した。
８週齢の雄性ＳＤ系ラット背部皮下に、２００マイクログラム／ラットの薬用量で実施例９の製剤および比較製剤７の注射液を投与した。投与前および一定時間毎に約０.４ミリリットルづつ採血し血清を分離採取した。血清中のグルコー ス濃度をグルコースＣテストワコー（和光純薬）定量した。
〔図３〕に血清中グルコース濃度の時間推移を示す。比較製剤７のポリエチレングリコール２０００を含まないインスリン溶液投与群では血清中グルコース濃度は一旦低下しているが、投与後１８０分目から上昇を始め３６０分目ではほぼ正常値に復していた。一方、ポリエチレングリコール２０００を含むインスリン溶液投与群では血清中グルコース濃度は一旦低下しているが、ポリエチレングリコールの濃度が高くなるほど血糖値の回復が遅れる傾向があり、２％（Ｗ／Ｖ）のポリエチレングリコール水溶液で２倍希釈したインスリン注射液投与群では投与後２４０分目から血糖値が回復し始めていた。濃度１０％（Ｗ／Ｖ）のポリエチレングリコール２０００水溶液で２倍希釈したインスリン注射液投与群ではさらに血糖値が低下しており、投与後２４０分目からの血糖値の回復も弱かった。しかし、使用したポリエチレングリコール２０００の濃度を２０％（Ｗ／Ｖ）に上げても大きな薬効増強はみられなかった。このことから高くても約５％（Ｗ／Ｖ）のポリエチレングリコールが共存することによりインスリンの持続効果が得られることが判明した。
【００６７】
実験例５
比較製剤８：３００万国際単位のインターフェロンアルファと５ミリグラムのヒト血清アルブミンを含むインターフェロンアルファ製剤（武田薬品）２バイアルにそれぞれ注射用蒸留水１ミリリットルを加え、合わせた。このうち１.２ミ リリットルをとり、注射用生理食塩水（扶桑薬品）０.６ミリリットルを加えて 混合した。
８週齢の雄性ＳＤ系ラット背部皮下に、０.３ミリリットル／ラットの薬用量 で実施例１０の製剤または比較製剤８の注射液を投与した。投与後、一定時間毎に約０.４ミリリットルづつ採血し血清を分離採取した。血清中のインターフェ ロンアルファ濃度は ELISA 法で定量した。〔図４〕にその結果を示す。インタ ーフェロンアルファを単独で投与した群では投与後１時間目から、急速に血液中濃度が減少していた。一方、平均分子量３０００のポリエチレングリコールと混合して投与した群では投与後１時間目および２時間目ではインターフェロンアルファ単独投与群よりも低い血液中濃度であったが、投与後４時間目および６時間目ではインターフェロンアルファ単独投与群に比較して高い血液中濃度を維持していた。このことはインターフェロンアルファと平均分子量３０００のポリエチレングリコールを混合して投与することにより、血液中濃度のピークを低くして望ましくない副作用の発現を抑制しながら、高い血液中濃度を持続させることが可能なことを示している。なお、インターフェロンアルファのラットにおける体重１キログラムあたりのクリアランスは１２３ミリリットル／時間であった。
【００６８】
実験例６
比較製剤９：３００万国際単位のインターフェロンアルファと５ミリグラムのヒト血清アルブミンを含むインターフェロンアルファ製剤（武田薬品）２バイアルにそれぞれ注射用蒸留水１ミリリットルを加え、合わせた。このうち１.２ミ リリットルをとり、注射用生理食塩水（扶桑薬品）０.６ミリリットルを加えて 混合した。
８週齢の雄性ＳＤ系ラット背部皮下に、０.３ミリリットル／ラットの薬用量 で実施例１１の製剤、実施例１２の製剤または比較製剤９の注射液をそれぞれ投与した。投与後、一定時間毎に約０.４ミリリットルづつ採血し血清を分離採取 した。血清中のインターフェロンアルファ濃度はＥＬＩＳＡ法で定量した。〔図５〕にその結果を示す。インターフェロンアルファを単独で投与した群では投与後１時間目から、急速に血液中濃度が減少していた。一方、平均分子量２０００または３０００のポリエチレングリコールと混合して投与した群では投与後１時間目および２時間目ではインターフェロンアルファ単独投与群よりも低いかあるいはほぼ同じ血液中濃度であったが、投与後４時間目および６時間目ではインターフェロンアルファ単独投与群に比較して高い血液中濃度を維持していた。このことはインターフェロンアルファと平均分子量２０００または３０００のポリエチレングリコールを混合して投与することにより、血液中濃度のピークを低くして望ましくない副作用の発現を抑制しながら、高い血液中濃度を持続させることが可能なことを示している。
【００６９】
実験例７
比較製剤１０：４００ミリグラムのポリエチレングリコール６０００（和光一級  平均分子量７５００）と５００ミリグラムのＤ−マンニトール（和光特級）を１０ミリリットルの注射用生理食塩水（扶桑薬品）に溶解し、これに２０％（Ｗ／Ｖ）のヒト血清アルブミンを含有するアルブミンニチヤク（日本製薬）を０.１ミリリットル添加 し混合した。この溶液と豚インスリン（２６.８ユニット ／ミリグラム：ディオ シンス社（オランダ））の１０ミリグラムを２ミリリッ トルの０.１規定塩酸で 溶解したものを混合した。得られた溶液には沈殿は見られず、澄明な溶液が得られた。凍結乾燥装置ライオバックＧＴ−３（リーボールドヘラエウス社、ドイツ）を用いて自体公知な方法で該混合物を凍結乾燥した。実施例１３で得られた２種の凍結乾燥物あるいは比較製剤１０にそれぞれ１０ミリリットルの注射用蒸留水（扶桑薬品）と２ミリリットルの０.１規定塩酸の 混液を加え溶解したところ、ポリエ チレングリコール６０００を用いた群にお いてのみ、乳白色の白濁がみられた。このことからポリエチレングリコール６０００以上の平均分子量のポリエチレングリコールはペプチドに変性をきたすため、凍結乾燥可能な注射用医薬組成物として本発明において使用することはできない。
【００７０】
実験例８
比較製剤１１：豚インスリン（２６.８ユニット／ミリグラム：ディオシンス 社（オランダ））の４.５ミリグラムを０.５ミリリットルの０.１規定の塩酸に 溶解し、さらに２.５ミリリットル注射用生理食塩水を加えて希釈した。６００ ミリグラムの平均分子量１５００のポリエチレングリコール１５４０（和光純薬）を３ミリリットルの注射用生理食塩水に溶解し２０％（Ｗ／Ｖ）のポリエチレングリコール溶液を調製した。豚インスリン溶液１ミリリットルにポリエチレングリコール溶液０.５ミリリットル、注射用生理食塩水０.５ミリリットルを加えてインスリン注射液を調製した。
比較製剤１２：豚インスリン（２６.８ユニット／ミリグラム：ディオシンス 社（オランダ））の４.５ミリグラムを０.５ミリリットルの０.１規定の塩酸に 溶解し、さらに２.５ミリリットル注射用生理食塩水を加えて希釈した。このイ ンスリン溶液１ミリリットルに注射用生理食塩水１ミリリットルを加えてインスリン注射液を調製した。
１１〜１２週齢の雄性ＳＤ系ラット背部皮下に、１５０マイクログラム／ラットの薬用量で実施例１４の製剤または比較製剤１１の注射液を投与した。対照として比較製剤１２の注射液を投与した。投与前および一定時間毎に約０.４ミリ リットルづつ採血し血清を分離採取した。血清中のグルコース濃度をグルコースＣテストワコー（和光純薬）で定量した。
〔図６〕に血清中グルコース濃度の時間推移を示す。比較製剤１２のインスリン溶液投与群では血清中グルコース濃度は投与後２時間目まで低下しているが、その後上昇し、投与後５時間目にはほぼ投与前の値に復していた。比較製剤１１のポリエチレングリコール１５４０を含むインスリン溶液投与群では血清中グルコース濃度は比較製剤１２投与群とほぼ同じ血糖値の経時変化を示し、差はみられなかった。一方、実施例１４の製剤のポリエチレングリコール２０００を添加したインスリン溶液投与群では投与後３時間目まで血清中グルコース濃度の低下が持続し、投与後５時間目でも比較製剤１１または比較製剤１２投与群の血糖値の約半分の低い値であった。このことから添加するポリエチレングリコールの平均分子量が１５００のポリエチレングリコール１５４０では持続効果が得られず、平均分子量２０００のポリエチレングリコール２０００では充分な持続効果が得られることが判明した。
【００７１】
実験例９
比較製剤１３：Ｇ−ＣＳＦを含む製剤であるフィルグラスティム（Filgrastim）（アムジェン社、アメリカ）の２３マイクロリットルに、注射用生理食塩水２.０７７ミリリットルを加えてＧ−ＣＳＦ注射液を調製した。
比較製剤１４：６００ミリグラムの平均分子量２０００のポリエチレングリコール２０００（和光純薬）を３ミリリットルの注射用生理食塩水に溶解し２０％（Ｗ／Ｖ）のポリエチレングリコール溶液を調製した。注射用生理食塩水１.７ ５ミリリットルとこのポリエチレングリコール溶液０.３５ミリリットルを加え て注射液を調製した。
８週齢の雄性ＳＤ系ラット背部皮下にヒトＧ−ＣＳＦを含む実施例１５の製剤、比較製剤１３、比較製剤１４の各注射液を０.３ミリリットルづつそれぞれ投 与した。投与後７時間目に約０.４ミリリットルづつ採血し（抗凝固剤としてＥ ＤＴＡ  ２Ｎa を使用）、末梢白血球数、赤血球数、血小板数はミクロセルカウンターＣＣ−１８０Ａ型（東亜医用電子）を用いて測定した。末梢好中球数、リンパ球数、単球数、好酸球数はギムザ染色を施した血液塗抹標本を鏡検することにより白血球２００個を分類し、それぞれの細胞の出現頻度を白血球数に乗じて算出した。結果は以下に示す（各群４匹のラットの平均値）：
0003730667.tif 000002
この結果より、ラットにおけるクリアランスが体重１キログラム当たり５３. ０〜７９.８ミリリットル／時間であるＧ−ＣＳＦに平均分子量２０００のポリエチレングリコールを添加することにより、薬理効果が増強されていることが 判明した。一旦、増加した末梢好中球は通常の生理的メカニズムにより末梢血から消失していくことが知られており、ポリエチレングリコール添加による末梢好中球数増加効果が持続することは明らかである。
【００７２】
【発明の効果】
本発明の注射用組成物は、主薬である水溶性ペプチドの生体内における薬理作用を持続させる。
そのため、注射による投与回数を減らすことが可能になる。このことは、医療行為による患者の苦痛を軽減し、かつ医療従事者の負担をも軽減できるという特徴がある。
【００７３】
【図面の簡単な説明】
【図１】は、実験例１で得られた、実施例１の製剤（△）、比較製剤１（○）または比較製剤２（○を黒く塗りつぶした印）を投与後の血清中グルコース濃度の時間推移を示したものである。
【図２】は、実験例３で得られた、実施例８の製剤（○）、比較製剤４（□）、比較製剤５（○を黒く塗りつぶした印）または比較製剤６（△）を投与後の血清中グルコース濃度の時間推移を示したものである。
【図３】は、実験例４で得られた、実施例９のインスリン溶液をポリエチレングリコール２０００の濃度が２％（Ｗ／Ｖ）の溶液で２倍希釈したもの（○を黒く塗りつぶしたもの）、１０％（Ｗ／Ｖ）の溶液で２倍希釈したしたもの（□）または２０％（Ｗ／Ｖ）の溶液で２倍希釈したもの（△）を投与後の血清中グルコース濃度の時間推移を示したものである。
【図４】は、実験例５で得られた、比較製剤８（○を黒く塗りつぶした印）または実施例１０の製剤（○）を投与後の血清中インターフェロンアルファ濃度の時間推移を示したものである。
【図５】は、実験例６で得られた、比較製剤９（○を黒く塗りつぶした印）、実施例１１の製剤（○）または実施例１２の製剤（□）を投与後の血清中インターフェロンアルファ濃度の時間推移を示したものである。
【図６】は、実験例８で得られた、実施例１４の製剤（○）、比較製剤１１（○を黒く塗りつぶした印）または比較製剤１２（□）を投与後の血清中グルコース濃度の時間推移を示したものである。
【図１】
0003730667.tif 000003
【図２】
0003730667.tif 000004
【図３】
0003730667.tif 000005
【図４】
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【図５】
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【図６】
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