(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペルオキシダーゼ活性を有する免疫活性化合物の７．０に近いかまたはこれより低いｐＨを有する溶液における安定化法であって、
置換されていないか、またはアルキル、置換アルキル、アリール、ヒドロキシルによる置換を除く置換アリール、エーテル、アミン、置換アミン、アゾ、アミド、ハロゲン、ニトロ、チオール、チオール誘導体、アルデヒド、酸、酸塩、エステル、スルホネート、ホスホネート、およびトリメチルシリルよりなる群から選択される１つまたはそれ以上の置換基で置換された、少なくとも１種のアリールボロン酸化合物を、当該免疫活性化合物を安定化するのに有効な量で、ペルオキシダーゼ活性を有する化合物に添加することを特徴とし、ここで当該アリールボロン酸化合物による当該免疫活性化合物の安定化が、当該アリールボロン酸化合物のプロテアーゼ阻害によらないものである、上記方法。
【請求項２】
前記アリールボロン酸が４−ブロモフェニルボロン酸である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記アリールボロン酸が３−アセトアミドフェニルボロン酸である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記免疫活性化合物がミオグロビンである、請求項１〜３までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記免疫活性化合物がペルオキシダーゼである、請求項１〜３までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記ペルオキシダーゼが西洋ワサビペルオキシダーゼである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ペルオキシダーゼが活性分子に結合している、請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
前記活性分子が、抗体もしくはその断片；抗原；ハプテン；タンパク質；糖タンパク質；タンパク質ミメティック；核酸配列；ステロイド；ホルモン；または前記いずれかの誘導体、よりなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記アリールボロン酸化合物およびペルオキシダーゼ活性を有する免疫活性化合物が一緒に水溶液中に存在する、請求項１〜８までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記アリールボロン酸化合物の添加量が０．０１％〜０．５％（質量／体積）である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ペルオキシダーゼ活性を有する免疫活性化合物と、置換されていないか、またはアルキル、置換アルキル、アリール、ヒドロキシルによる置換を除く置換アリール、エーテル、アミン、置換アミン、アゾ、アミド、ハロゲン、ニトロ、チオール、チオール誘導体、アルデヒド、酸、酸塩、エステル、スルホネート、ホスホネート、およびトリメチルシリルよりなる群から選択される１つまたはそれ以上の置換基で置換された、少なくとも１種のアリールボロン酸化合物とを含んでなる、７．０に近いかまたはこれより低いｐＨを有する溶液において安定な安定化試薬であって、ここで当該アリールボロン酸化合物による当該免疫活性化合物の安定化が、当該アリールボロン酸化合物のプロテアーゼ阻害によらないものである、上記安定化試薬。
【請求項１２】
前記アリールボロン酸化合物が４−ブロモフェニルボロン酸である、請求項１１に記載の安定化試薬。
【請求項１３】
前記アリールボロン酸化合物が３−アセトアミドフェニルボロン酸である、請求項１１に記載の安定化試薬。
【請求項１４】
前記試薬がさらに保存剤を含む、請求項１１〜１３までのいずれか１項に記載の安定化試薬。
【請求項１５】
前記免疫活性化合物がミオグロビンである、請求項１１〜１４までのいずれか１項に記載の安定化試薬。
【請求項１６】
前記免疫活性化合物がペルオキシダーゼである、請求項１１〜１４までのいずれか１項に記載の安定化試薬。
【請求項１７】
前記ペルオキシダーゼが西洋ワサビペルオキシダーゼである、請求項１６に記載の安定化試薬。
【請求項１８】
前記ペルオキシダーゼが活性分子に結合した、請求項１６または１７に記載の安定化試薬。
【請求項１９】
前記活性分子が、抗体もしくはその断片；抗原；ハプテン；タンパク質；糖タンパク質；タンパク質ミメティック；核酸配列；ステロイド；ホルモン；または前記いずれかの誘導体、よりなる群から選択される、請求項１８に記載の安定化試薬。
【請求項２０】
前記アリールボロン酸化合物およびペルオキシダーゼ活性を有する免疫活性化合物が一緒に水溶液中に存在する、請求項１１〜１９までのいずれか１項に記載の安定化試薬。
【請求項２１】
前記アリールボロン酸化合物が０．０１％〜０．５％（質量／体積）の量で存在する、請求項２０に記載の安定化試薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、分析法で使用するための、ペルオキシダーゼ、および生物活性分子のような他の分子に結合したペルオキシダーゼを安定化するための方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ペルオキシダーゼ特に西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）は、免疫測定法を含む分析法で一般的に使用される酵素である。多くのフォーマットが知られており、抗原、抗体、ハプテン、および他のアナライトの測定のために広く使用されている。いくつかの例は競合法及び免疫測定法である。競合的免疫測定法の場合、標識アナライトは、固定化されたアナライト結合分子種への結合について試料中のアナライトと競合する。すなわち試料中のアナライトの濃度を増加させると、固定化される標識アナライトが減少する。免疫測定法の場合、標識アナライト結合物質は、試料中のアナライトおよび固定化アナライト結合物質と複合体を形成する。このタイプの測定法では、試料中のアナライトの濃度を上昇させると、固定化される標識アナライト結合物質が増加する。どちらのタイプの免疫測定法でも、固定化標識アナライトを非結合標識アナライトから分離し、固定化または非結合ＨＲＰ活性を測定する。
【０００３】
分析法（例えば、免疫測定法）で使用される試薬は、製造、出荷、および保存期間後活性を維持しなければならない。この期間、これらは、活性に影響を与える比較的高温度または低温度にさらされることがある。従ってペルオキシダーゼ標識物質または他の活性な生物学的成分を含有する安定な試薬を提供することは商業的に有利である。
これは、多くの生物学的物質では容易には達成されない。例えば酵素標識分子および他の複雑な生物学的分子は、免疫測定法に広く使用されており、酵素または活性分子の活性（特に、免疫測定法で使用される低濃度では）は時間とともに低下することがある。保存温度が上昇すると、生物活性は一層急速に低下することがわかっている。酵素または活性分子に結合した酵素の活性の低下を遅らせるか防止する１つの方法は、安定化を達成するのに充分な量で溶液中の酵素に安定剤を添加することである。
【０００４】
ペルオキシダーゼまたはＨＲＰの安定化法には、ポリエチレングリコールおよびカルシウム塩の添加（米国特許第４，７２８，０２３号）；８−アニリノ−ｌ−ナフタレンスルホン酸の添加（ＦＲＧ特許第３，１００，０７６号）；フェノールおよびＣ1 −Ｃ3 低級アルキル、塩素および臭素からの１つまたはそれ以上の置換基を有する置換フェノールの添加（米国特許第４，７６４，４６８号）；４−アミノアンチピリンの添加（ヨーロッパ特許第０７０，９９２号）；III 族およびIV族の多価イオンの添加（米国特許第４，１６９，０１２号）および４−ヒドロキシまたは４−アルコキシアリールアセトアミドの添加（米国特許第５，３７２，９３２号）がある。ＨＲＰおよび他の生物学的分子の両方の安定化は、少なくとも１つのヒドロキシル基およびハメット（Hammett ）シグマ値（σｐ）−０．２０≦ｘ≧＋０．２４の基またはアミドで置換されたベンゼン環を有する化合物の添加（米国特許第５，５１６，６７２号）により達成される。
【０００５】
現在公知の添加物は、ペルオキシダーゼおよび他の生物学的分子の安定性を改良するが、さらなる改良に対するニーズがある。特に試薬の輸送の間に遭遇する室温および高温での安定性が改良された試薬調製物が好ましい。既知の添加物のあるものは、分析試薬調製物でしばしば使用され、かつ免疫測定法で使用される免疫反応に影響を与えることがあるタンパク質および他の成分と相互作用し得る。調製物の活性成分を安定化し、他の成分に対して有害な作用を有さない添加物もまた好ましい。
【０００６】
水溶液中の有機ホウ素化合物は、多くの分子と強く相互作用する。多くの異なる機構による相互作用は、種々の物質の精製に使用されている。例えば固体支持体に結合した３−アミノフェニルボロン酸は、糖タンパク質の分画で使用される。有機ホウ酸塩は、多くの酵素を阻害し、動物の代謝に影響を与えることがあり、そして認識された静菌剤である（総合的な総説については、生物学的分離におけるボロン酸塩リガンド（Boronate Ligands in Biochemical Separations ）、アミコン・コーポレーション（Amicon Corporation）、Danvers 、刊行物５０７、１９８１、を参照されたい）。有機ホウ素化合物はまた、単独でまたはフェノール性もしくは芳香族アミンエンハンサー（ＰＣＴ公報ＷＯ９３／２３０６０）と組合せたＨＲＰ（ＰＣＴ公報ＷＯ９３／１６１９５）により触媒される化学発光反応からの光の出力を増加させることもわかっている。
【０００７】
有機ホウ素化合物はまた、電子移動電極で使用されている（ＰＣＴ公報ＷＯ８５／０２８６１）。
アリールボロン酸は、有機ホウ素群内の化合物のファミリーである。アリールボロン酸は、タンパク質分解酵素を含有する液体界面活性剤の調製物で使用されている（ＰＣＴ公報ＷＯ９２／１９７０７）。高濃度のアリールボロン酸では、タンパク質分解酵素は、界面活性剤調製物の他のタンパク質成分を分解することが妨害される。洗浄水での以後の希釈において、タンパク質分解酵素は再度活性になる。
【０００８】
驚くべきことに我々は、アリールボロン酸化合物は、免疫測定法で使用するための、ペルオキシダーゼ、または別の分子に結合したペルオキシダーゼ（以後ペルオキシダーゼ標識結合体または結合体と呼ぶ）、特にＨＲＰまたはＨＲＰ−結合体の活性の低下を遅らせるかまたは防止する安定剤として添加することができることを発見した。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の目的は、少なくとも１種のアリールボロン酸化合物を含む安定なペルオキシダーゼ組成物を提供することである。本発明の第２の目的は、ペルオキシダーゼ（特にＨＲＰ）に少なくとも１種のアリールボロン酸化合物を添加することを含む、ペルオキシダーゼ（特にＨＲＰ）の安定化法を提供することである。本発明の第３の目的は、結合体試薬に少なくとも１種のアリールボロン酸化合物を添加することによりペルオキシダーゼ標識結合体の安定化法を提供することである。安定化組成物は、分析法で有用である。これらは、酵素免疫測定法で特に有用である。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明の１つの実施態様は、ペルオキシダーゼと、置換されていないか、またはアルキル、置換アルキル、アリール、ヒドロキシルによる置換を除く置換アリール、エーテル、アミン、置換アミン、アゾ、アミド、ハロゲン、ニトロ、チオール、チオール誘導体、アルデヒド、酸、酸塩、エステル、スルホネート、ホスホネート、トリメチルシリルよりなる群から選択される１つまたはそれ以上の置換基で置換された、少なくとも１種のアリールボロン酸化合物とを含んでなる、安定化ペルオキシダーゼ試薬である。
本発明の別の実施態様は、ペルオキシダーゼに、置換されていないか、またはアルキル、置換アルキル、アリール、ヒドロキシルによる置換を除く置換アリール、エーテル、アミン、置換アミン、アゾ、アミド、ハロゲン、ニトロ、チオール、チオール誘導体、アルデヒド、酸、酸塩、エステル、スルホネート、ホスホネート、およびトリメチルシリルよりなる群から選択される１つまたはそれ以上の置換基で置換された、少なくとも１種のアリールボロン酸化合物を、ペルオキシダーゼを安定化するのに有効な量で添加することを特徴とする、ペルオキシダーゼ活性の安定化法である。
好適な実施態様は、ペルオキシダーゼが西洋ワサビペルオキシダーゼである上記組成物または方法である。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明は、ＨＲＰの安定剤としてのアリールボロン酸化合物の使用に関する。安定剤は、式ＡｒＢ（ＯＨ）2 （式中、Ａｒはフェニルまたはナフチルである）のアリールボロン酸である。
アリール構造は、置換されていないか、またはアルキル、置換アルキル、アリール、ヒドロキシルによる置換を除く置換アリール、エーテル、アミン、置換アミン、アゾ、アミド、ハロゲン、ニトロ、チオール、チオール誘導体、アルデヒド、酸、酸塩、エステル、スルホネート、ホスホネート、およびトリメチルシリルよりなる群から選択される１つまたはそれ以上の置換基で置換されてよい。置換または非置換化合物のいくつかの例を以下に示す。
【００１２】
【化１】
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フェニルボロン酸
【００１３】
【化２】
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４−ブロモフェニルボロン酸
【００１４】
【化３】
0003742258.tif 000004
３−アセトアミドフェニルボロン酸
【００１５】
【化４】
0003742258.tif 000005
１−ナフチルボロン酸
【００１６】
本発明で使用される好適な化合物は、上記の４−ブロモフェニルボロン酸、３−アセトアミドフェニルボロン酸、およびフェニルボロン酸である。本発明の好適な実施態様は、ブロモフェニルボロン酸を含む安定化ＨＲＰ組成物、またはブロモフェニルボロン酸を使用するＨＲＰの安定化法である。特に４−ブロモフェニルボロン酸は、好ましい溶解度と適切な安定化作用を示した。しかし特定の状況に適したアリールボロン酸化合物の選択法は、当業者に公知であろう。
【００１７】
アリールボロン酸安定剤は、任意の所望の時点でペルオキシダーゼまたはペルオキシダーゼ結合体に添加することができる。試薬成分、安定剤自体およびペルオキシダーゼまたはペルオキシダーゼ結合体、ならびに種々の他の部分の測定試薬は、固体型または溶解型で存在してもよい。安定剤は、安定化を達成するのに充分な量で添加すべきである。好ましくは安定剤は、０．０１％〜０．５％、好ましくは約０．１％（質量／体積）（％w/v ）である量で添加される。
【００１８】
本発明の１つの実施態様において、安定剤のより均一な分布および従って有効範囲の下限に近い添加の場合により良好な作用が達成されるため、安定剤は、以後乾燥される液体試薬に加えることができる。例えばアリールボロン酸化合物は、凍結乾燥する前かまたは凍結乾燥物質を水性溶媒で復元後に、ペルオキシダーゼまたは結合体溶液に添加することができる。後者の場合は、もちろん溶媒はまず安定剤と混合し次に凍結乾燥物質に添加してそれを溶解することができる。例えばもしペルオキシダーゼまたはペルオキシダーゼ結合体が、乾式分析測定要素（例えば薄膜またはスライド要素）の成分であるなら、被覆プロセスの前に安定剤を被覆溶液に加えることが好ましいであろう。しかし被覆プロセスの完了後に安定剤を加えることも企図される。例えば、噴霧することにより。
【００１９】
ペルオキシダーゼは、生物活性を有するかまたは免疫学的に有効な別の分子に結合してもよい。そのような分子は本明細書において、「活性分子」と呼ぶ。活性分子は、分析法で使用することができる分子である。好ましくは該活性分子は、抗体もしくはその断片、抗原またはハプテン、タンパク質、糖タンパク質、ペプチド、タンパク質ミメティック、核酸配列、ステロイド、ホルモン、または前記いずれかの誘導体、または前記の２つ以上または組合せから作成される化合物であろう。
【００２０】
本発明の実施において、保存剤も加えることも好ましいことがある。一般的な保存剤には、例えば２−ヒドロキシピリジン−Ｎ−オキシド、クロロアセトアミド、Ｎ，Ｎ−メチレン−ビス−（Ｎ−１−ヒドロキシルメチル）−２，５−ジオキソ−４−イミダゾリジニル）−尿素、５ブロモ−５−ニトロ−１，３−ジオキサンがある。
７．０に近いかまたはこれより低いｐＨを有する溶液において、ボロン酸塩は荷電しておらず、疎水性相互作用および電荷移動相互作用は、多くの分子（特にタンパク質）に対して強い結合を引き起こす。驚くべきことに我々は、この相互作用が生物活性分子に安定化作用を与えることを見いだした。
【００２１】
アリールボロン酸が、ペルオキシダーゼ標識物を含有する試薬に添加されるいくつかの測定法が行われた。標識リガンドを形成するためにリガンドに結合されるか、または標識リガンド結合物質を形成するためにリガンド結合物質に結合されることができる酵素標識物を使用して、測定を行うことができる。ペルオキシダーゼ（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ））のような酵素は好適な標識物である。好適な実施態様では、酵素はペルオキシダーゼである。この酵素には多様な型がある。ＨＲＰは最も好適な型であり、容易に入手できる。
特定の酵素標識物に適した基質を決定するのは、当業者の技術の範囲内である。基質は、酵素標識物により直接作用を受ける物質または標識物の酵素反応が関与する一連の反応に関与する物質であってよい。
本発明の有効性と利点は、以下の例により例示される。
【００２２】
【実施例】
実施例１：ＨＲＰ−抗体結合体の安定化
ピアス・アンド・ワリナー（Pierce and Warriner ）（チェスター、英国）から得られたスクシニミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）とＮ−スクシニミジルＳ−アセチルチオアセテート（ＳＡＴＡ）を使用して、モノクローナル抗体（ヒト卵胞刺激ホルモンに対して作成した）をＨＲＰに結合した。次にＢＩＯＴＩＮ−ＸＸ−ＮＨＳ（カルビオケム（Calbiochem）、ビーストン（Beeston ）、英国）を使用して、ＨＲＰ−抗体結合体をビオチン化した。ビオチン化ＨＲＰ−抗体を、溶出緩衝液として３００mM塩化ナトリウムを含有する１００mMリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）を使用して、製造業者のプロトコールに従って、ＰＤ−１０カラム（ファルマシアバイオテク（Pharmacia ）、セントアルバンス（St. Albans）、英国）で脱塩した。結合体をＵＶ吸収で定量し、種々の添加物で試験試薬を希釈し、次に２〜８℃または３７℃で保存した。次に試薬中の結合体の活性を、ＶＩＴＲＯＳ  ＥＣｉストレプトアビジン被覆マイクロウェル（オーソクリニカルダイアグノスティクス（Ortho-Clinical Diagnostics）、英国）中の試薬１００μｌを、３７℃で１５分インキュベートして試験した。インキュベーション中に、ビオチン化ＨＲＰ−抗体結合体は、ビオチンとストレプトアビジンとの反応によりマイクロウェルの表面に固定化された。マイクロウェルを洗浄後、固定化ＨＲＰ−抗体複合体の活性を、増強発光反応（米国特許第５，３７２，９３１号）を使用して測定した。発光性基質（ルミノール誘導体と過酸塩）と電子移動物質を含有するＶＩＴＲＯＳ  ＥＣｉシグナル試薬を、マイクロウェルに加えた。結合した結合体中のＨＲＰは、ルミノール誘導体の酸化を触媒して光を放出する。電子移動物質（置換アセトアニリド）は産生される光のレベルを増加させ、その発光を延長させる。マイクロウェルからの光シグナルを、ＡＭＥＲＬＩＴＥアナライザー（オーソクリニカルダイアグノスティクス（Ortho-Clinical Diagnostics）、英国）を使用して測定した。
【００２３】
前述のビオチン化ＨＲＰ−抗体結合体を０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で希釈して、１０ng/ml の濃度を得た。マグネシウム欠乏ＫＡＴＨＯＮ（ロームアンドハース（Rohm and Haas ）、英国）を保存剤（１％w/v ）として添加し、マイクロウェルの表面への結合体の非特異吸着を防ぐためにウシ血清アルブミン（１％w/v ）を加えた。各アリールボロン酸安定剤を、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）で２００mg/ml 溶液として調製し、結合体溶液に加えて安定剤の所望のモル濃度を得た。結合体溶液を２〜８℃または３７℃で２時間、２４時間、９６時間、および９週間保存した。結合体中のＨＲＰの活性を前記のように測定した。結果を表１に示す。
【００２４】
【表１】
0003742258.tif 000006
【００２５】
ＨＲＰ活性は、対照光の出力（添加物無し  −  ２〜８℃で２時間保存）のパーセントとして表される光の出力である。
表１から、安定剤の非存在下では３７℃で保存後にＨＲＰの活性は顕著に低下したことがわかる。ＨＲＰ活性は、２〜８℃でまたはアリールボロン酸化合物の存在下で保存すると保持される。安定剤の存在下では３７℃で９週間保存後でも、ＨＲＰ活性は初期活性の５０％を超えている。
【００２６】
実施例２：ＨＲＰ−テストステロン結合体の安定化
ジシクロヘキシルカルボジイミドとＮ−ヒドロキシスクシンイミド（アルドリッチケミカル社（Aldrich Chemical Co.）、ギリンガム（Gillingham）、英国）とを反応させて、ＨＲＰをテストステロン−３−カルボキシメチルオキシムに化学結合させた。精製結合体を、１．３％塩化ナトリウム、２％ショ糖、０．５％マグネシウム欠乏ＫＡＴＨＯＮ、０．２％ウシ血清アルブミン、およびステロイド放出剤としての６００μg/l のＤＡＮＡＺＯＬを含有する５０mMリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中６０ng/ml の濃度に希釈した。結合体溶液を、２５℃で種々の濃度の４−ブロモフェニルボロン酸の存在下で保存し、次にＨＲＰ結合体活性を競合的免疫測定法で測定した。
【００２７】
テストステロンに対するモノクローナル抗体を、ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（ピアス・アンド・ワリナー（Pierce and Warriner ）、チェスター、英国）を使用してビオチン化し、１．３％塩化ナトリウム、７０mM  ＥＤＴＡ、０．５％マグネシウム欠乏ＫＡＴＨＯＮ、１％ヒト血漿、０．０５％正常マウス血清および６００μg/l のＤＡＮＡＺＯＬを含有する５０mMリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．３）で１０mg/Lに希釈した。チャコールストリップしたヒト血漿（２５μｌ）を、ＶＩＴＲＯＳ  ＥＣｉストレプトアビジン被覆マイクロウェル（オーソクリニカルダイアグノスティクス（Ortho-Clinical Diagnostics）、英国）中の５０μｌのＨＲＰ−テストステロン結合体溶液と１００μｌのビオチン化抗体溶液とともに、３７℃で３０分インキュベートした。インキュベーションの間、ＨＲＰ−テストステロン結合体はビオチン化抗体に結合し、複合体は、ビオチンとストレプトアビジンとの反応により、ストレプトアビジン被覆マイクロウェルの表面に固定化された。マイクロウェルを洗浄後、ＨＲＰ活性を、ＶＩＴＲＯＳ  ＥＣｉシグナル試薬を使用してＶＩＴＲＯＳ  ＥＣｉアナライザーで測定した。結果を表２に示す。
【００２８】
【表２】
0003742258.tif 000007
【００２９】
ＨＲＰ活性は、０日保存の光の出力のパーセントとして表される光の出力である。
安定剤の非存在下では、ＨＲＰ−テストステロン結合体の活性は、２５℃で２１日間保存後に８３．４％まで低下していた。ブロモフェニルボロン酸量の増加とともに、結合体はより安定になった。安定剤の非存在下で２６〜２８日間保存後、ＨＲＰ−テストステロン結合体の活性は７７．１％まで低下していた。再度ブロモフェニルボロン酸量の増加とともに、結合体はより安定になった。
【００３０】
実施例３：ＨＲＰ−抗体／抗原複合体の安定化
スクシニミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）とＮ−スクシニミジルＳ−アセチルチオアセテート（ＳＡＴＡ）を使用して、Ｂ型肝炎コア抗原（ＨＢｃ）に対するモノクローナル抗体にＨＲＰを化学的に結合した。精製ＨＲＰ結合体を、２．０％塩化ナトリウム、２．０％マグネシウム欠乏ＫＡＴＨＯＮ、２．０％ウシ血清アルブミン、および０．０６５μg/ml組換えＨＢｃ（カイロンコーポレーション（Chiron Corporation）、エメリービル（Emeryville）、カリホルニア州、米国）を含有する２０mMリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．２）で０．０５７μg/mlの濃度に希釈した。ＨＲＰ標識抗ＨＢｃ抗体はＨＢｃ抗原と結合して、ＨＲＰ標識抗体／抗原複合体を形成する。溶液を、２５℃または３７℃で４−ブロモフェニルボロン酸の存在下または非存在下で保存し、次にＨＲＰ抗体／抗原複合体活性を免疫測定法を使用して測定した。
【００３１】
ヒトＩｇＭに対するモノクローナル抗体をＢＩＯＴＩＮ−ＸＸ−ＮＨＳ（カルビオケム（Calbiochem）、ビーストン（Beeston ）、英国）を使用してビオチン化し、０．５％ウシ血清アルブミンと０．９６％マグネシウム欠乏ＫＡＴＨＯＮを含有する２５mMリン酸カリウム／１５mMテトラホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．２）で０．７５mg/lに希釈した。ＨＢｃに対するＩｇＭ抗体を含有するヒト血漿を、０．９％塩化ナトリウム、５％ウシ血清アルブミンおよび１％ＢＲＯＮＩＤＯＸ（ヘンケル・ケー・ジー（Henkel K. G.）、ドイツ）を含有する１００mMリン酸カリウム緩衝液で１／２０に希釈した。２５μｌの希釈血漿を、ＶＩＴＲＯＳ  ＥＣｉストレプトアビジン被覆マイクロウェル（オーソクリニカルダイアグノスティクス（Ortho-Clinical Diagnostics）、英国）中のビオチン化抗ＩｇＭ抗体溶液１４５μｌで３７℃で１５分インキュベートした。インキュベーション中に、血漿中のＩｇＭ抗体は、ビオチン化ＩｇＭとの反応およびビオチンとストレプトアビジンとの反応により、ストレプトアビジン被覆マイクロウェルの表面に固定化される。マイクロウェルを洗浄後、１００μｌのＨＲＰ標識抗体／抗原複合体溶液をマイクロウェルに加え、３７℃でさらに１５分インキュベートする。この反応中に、複合体中のＨＢｃは、マイクロウェル上に固定化されたＨＢｃに対する抗体と反応する。マイクロウェルを洗浄後、マイクロウェルの表面に結合したＨＲＰの活性を、ＶＩＴＲＯＳ  ＥＣｉシグナル試薬を使用してＶＩＴＲＯＳ  ＥＣｉアナライザーで測定した。結果を表３に示す。
【００３２】
【表３】
0003742258.tif 000008
【００３３】
ＨＲＰ活性は、０日保存の光の出力のパーセントとして表される光の出力である。
安定剤の非存在下では、ＨＲＰ結合体の活性は１週間保存後に１％未満まで低下していた。０．０１％ブロモフェニルボロン酸では、結合体は２５℃で１週間保存後にその活性の３８％を保持し、０．１％ブロモフェニルボロン酸では、２５℃で１５週間保存後に活性の４５％そして３７℃で１週間保存後に活性の１５％を保持した。
【００３４】
実施例４：乾式薄膜フォーマットで使用されるＨＲＰ結合体
前記したように上記実施例以外に、本発明は乾式免疫測定分析要素において有用であることが企図される。従って以下の例は、本発明の有利な性質を有する酵素結合体を与える本発明の実施態様を記載する。
アナライト（例えば、特に限定されないが、グルコース、トリグリセリド、リパーゼ、グリセロール、コレステロール、コレステロールエステル）の存在または量を測定するためのＨＲＰを含む乾式分析要素は公知である。ＨＲＰ−結合体を含む乾式免疫測定分析要素は公知であり、例えばＣ−反応性タンパク質（ＣＲＰ）、ジゴキシン、フェニトインを測定するための免疫測定要素がある。
【００３５】
安定剤は、展開層、下塗層、および／または試薬層を含む任意の層またはゾーンに、公知の方法（例えば、ホッパーおよびグラビア被覆法）を使用して要素内に導入してもよい。好適な要素では、ＨＲＰと安定剤は一緒に存在する。
コレステロール測定のための、同じ層中にＨＲＰとアリールボロン酸安定剤を含む分析要素は、以下の組成およびフォーマットを有するであろう：
【００３６】
【表４】
0003742258.tif 000009
【００３７】
要素はスライドにマウントし、ストリップまたは他の適当な型で維持し、試験すべき条件下で保存することができる。対照要素（例えば、新鮮な要素）を使用してコレステロール標準物質で得られた、反射分光計を使用して測定される反射密度は、試験条件下で保存した要素と比較することができる。当業者に公知のように、要素中の安定剤の位置および安定剤の量は所望の安定性が得られるまで容易に変更することができる。
【００３８】
実施例５：フェニトインの検出のための乾式免疫測定要素
フェニトイン測定のための、同じ層中にフェニトイン−ＨＲＰ結合体とアリールボロン酸安定剤を含む免疫測定分析要素は、以下の組成およびフォーマットを有するであろう：
【００３９】
【表５】
0003742258.tif 000010
【００４０】
上記のように要素はスライドにマウントし、ストリップまたは他の適当な型で維持し、試験すべき条件下で保存することができる。対照要素（例えば、新鮮な要素）を使用してフェニトイン標準物質で得られた反射密度は、試験条件下で保存された要素と比較することができる。当業者に公知のように、要素中の安定剤の位置および安定剤の量は、所望の安定性が得られるまで容易に変更することができる。
アリールボロン酸化合物は、上記コレステロール要素以外にアナライトに対するＨＲＰを含む乾式分析要素を安定化し、フェニトインについて上記したもの以外に免疫測定法に対するＨＲＰ−結合体を含む乾式免疫測定分析要素を安定化するのに作用するであろう。
【００４１】
実施例６−ミオグロビンの安定化
ミオグロビン、ヘモグロビンおよびサイトクロームＣは、ペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質である。これらのタンパク質の酵素活性は、免疫測定法で使用されており、これらはルミノールと過酸化物との酵素触媒発光反応により検出されている（ＧＢ特許第２，０６３，４６９号）。
ミオグロビンは、急性心筋梗塞の有用なマーカーであることが証明されている（米国特許第５，７４４，３５８号）。ミオグロビンの標準的参照溶液は、免疫反応によりこのアナライトの測定において使用され、これらの溶液の安定性はアリールボロン酸化合物の添加により改良することができる。
【００４２】
ミオグロビンの免疫測定法
ミオグロビンに対する２つのマウスモノクローナル抗体は、ビオスパシフィック・ユーエスエー（BiosPacific, USA）から得られた。ＨＲＰは、ピアス・アンド・ワリナー（Pierce and Warriner ）（チェスター、英国）から得られたスクシニミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）とＮ−スクシニミジルＳ−アセチルチオアセテート（ＳＡＴＡ）を使用して、ミオグロビンモノクローナル抗体の１つに化学的に結合させた。精製したＨＲＰ結合体を、１．０％マグネシウム欠乏ＫＡＴＨＯＮおよび０．５％ウシ血清アルブミンを含有する１００mMリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）に３μg/mlで希釈した。
【００４３】
第２のミオグロビンモノクローナル抗体をビオチン−ＬＣ−ＮＨＳ（ピアス・アンド・ワリナー（Pierce and Warriner ）、チェスター、英国）を使用してビオチン化し、５．０％ウシ血清アルブミンと１．０％マグネシウム欠乏ＫＡＴＨＯＮを含有する１００mMリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）で３μg/mlに希釈した。
ビオスパシフィック・ユーエスエー（BiosPacific ）、エメリービル（Emeryville）, USA ）から得られたヒト心臓ミオグロビンの標準溶液を、１．０％マグネシウム欠乏ＫＡＴＨＯＮ、５．０％ウシ血清アルブミン、１０mM塩化ナトリウムおよび１mM  ＥＤＴＡを含有する１００mMリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で調製した。
【００４４】
１０μｌの標準ミオグロビン溶液を、ＶＩＴＲＯＳ  ＥＣｉストレプトアビジン被覆マイクロウェル（オーソクリニカルダイアグノスティクス（Ortho-Clinical Diagnostics）、英国）中で７０μｌのビオチン化モノクローナル抗体溶液および７０μｌのＨＲＰ標識モノクローナル抗体溶液とともに３７℃で８分間インキュベートした。インキュベーションの間に、ビオチン化抗体は、ビオチンとストレプトアビジンとの反応によりストレプトアビジン被覆マイクロウェルの表面に固定化される。同意に標準溶液中のミオグロビンはビオチン化抗体に固定化され、またＨＲＰ標識モノクローナル抗体に結合する。マイクロウェルを洗浄後、マイクロウェルの表面に結合したＨＲＰの活性を、ＶＩＴＲＯＳ  ＥＣｉアナラーザー中でＶＩＴＲＯＳ  ＥＣｉシグナル試薬を使用して測定した。アナライザー中の光出力として測定したマイクロウェルに結合したＨＲＰの活性は、測定中に加えたミオグロビンの免疫反応性に比例する。ミオグロビンの免疫反応性に対する光出力の応答曲線を、０〜１７５７ng/ml の範囲をカバーする一連の標準ミオグロビン溶液を使用して作製した。
【００４５】
ミオグロビンの安定性
ヒト心臓ミオグロビンを、１．０％マグネシウム欠乏ＫＡＴＨＯＮ、５．０％ウシ血清アルブミン、１０mM塩化ナトリウムおよび１mM  ＥＤＴＡを含有する１００mMリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で３５０ng/ml の濃度に溶解した。４−ブロモフェニルボロン酸と３−アセトアミドフェニルボロン酸を、それぞれエタノール中の１００mg/ml 溶液として調製し、ミオグロビン溶液に添加して安定剤の所望の濃度を得た。次にミオグロビン溶液を２５℃または３７℃で保存し、１週間および２週間後免疫反応性ミオグロビンの量を上記の免疫測定法を使用して測定した。ミオグロビン安定性に及ぼす４−ブロモフェニルボロン酸と３−アセトアミドフェニルボロン酸の影響を表４に示し、４−ブロモフェニルボロン酸の濃度を変化させることの影響を表５に示す。
【００４６】
【表６】
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【００４７】
ミオグロビンの免疫反応性は、０日保存時の免疫反応性のパーセントとして表される。
安定剤の非存在下では、ミオグロビンの免疫反応性は２５℃で２週間保存後に４９％に低下した。０．１２％４−ブロモフェニルボロン酸では、ミオグロビンの免疫反応性は２５℃で２週間保存後にその活性の７９％を保持し、０．１２％３−アセトアミドフェニルボロン酸では２５℃で２週間保存後に活性の８０％を保持した。
安定剤の非存在下では、ミオグロビンの免疫反応性は３７℃で２週間保存後に１２％に低下した。０．１２％４−ブロモフェニルボロン酸では、ミオグロビンの免疫反応性は３７℃で２週間保存後にその活性の２５％を保持し、０．１２％３−アセトアミドフェニルボロン酸では３７℃で２週間保存後に活性の４２％を保持した。
【００４８】
【表７】
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【００４９】
ミオグロビンの免疫反応性は、０日保存時の免疫反応性のパーセントとして表される。
安定剤の非存在下では、ミオグロビンの免疫反応性は２５℃で２週間保存後に４９％に低下し、３７℃で２週間保存後に１２％に低下した。４−ブロモフェニルボロン酸の量を増加させると、ミオグロビンはより安定であった。０．５％４−ブロモフェニルボロン酸の存在下では、２５℃で２週間保存後にミオグロビンの免疫反応性の７４％が保持され、３７℃で２週間保存後に２６％が保持された。
本明細書で引用したすべて材料は、参照することにより本明細書の一部とする。さらに本発明は、請求の範囲の範囲内のすべての修飾を包含することに注意されたい。本発明の範囲と目的を逸脱することなく多くの変更および修飾が可能であることを理解されたい。