(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含み、あるいは、（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも、アグリカナーゼ活性を示すポリペプチド。
【請求項２】
配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【請求項３】
請求項１〜２のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項３に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項５】
請求項４に記載の発現ベクターでトランスフェクションされた細胞。
【請求項６】
（１）請求項１〜２のいずれか一項に記載のポリペプチドと、（２）アグリカナーゼにより切断可能な基質用ポリペプチドと、（３）試験化合物とを接触させる工程、及び
前記基質用ポリペプチドの切断を分析する工程
を含む、試験化合物が前記ポリペプチドのアグリカナーゼ活性を阻害するか否かを検出する方法。
【請求項７】
請求項６に記載の方法による検出工程、及び
アグリカナーゼ活性を阻害する物質を選択する工程
を含む、請求項１〜２のいずれか一項に記載のポリペプチドのアグリカナーゼ活性を阻害する物質をスクリーニングする方法。
【請求項８】
請求項１〜２のいずれか一項に記載のポリペプチドに結合する抗体又はその断片。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、新規なアグリカナーゼに関する。
背景技術
関節疾患は、関節軟骨の損傷及び変性を主病変とする疾患である。関節疾患の中で最も患者数の多い疾患は、変形性関節症（ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ；以下、ＯＡと略称することがある）である（Ｅｌｄｅｒｓ  Ｍ．Ｊ．，Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．，２７，Ｓｕｐｐｌ．，６０，６−８，２０００）。しかし、現行の治療法においては、鎮痛消炎剤やヒアルロン酸製剤が軟骨変性や軟骨下骨破壊に伴う痛みを軽減する目的で対症療法的に用いられているに過ぎず、充分な治療効果を上げているとは言えない状況にある（Ｄｉｅｐｐｅ  Ｐ．，Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．，２９，２７９−２８１，２０００）。
関節軟骨は、主にＩＩ型コラーゲンと軟骨特異的プロテオグリカンであるアグリカンとから構成される組織であり、関節疾患では両者の分解及び変性が観察されている。そのため、古くより、これら細胞外マトリクス成分の分解及び変性の制御が関節疾患の治療に繋がると考えられており、分解に関与するプロテアーゼ（コラゲナーゼ又はアグリカナーゼ）の同定、そして、それらに対する阻害剤の探索及び医薬品としての開発の試みが精力的に行われてきた。
コラゲナーゼ活性を有するプロテアーゼとしては、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ１、ＭＭＰ８、ＭＭＰ１３、又はＭＭＰ１４等）が同定され、それぞれの選択的阻害剤が発見されていた。しかしながら、多数のコラゲナーゼ阻害活性を有するＭＭＰ阻害剤を、ＯＡ及びリューマチ性関節炎（ＲＡ）を含む関節疾患治療薬として開発する動きがあったにもかかわらず、これらの疾患を適応症とするＭＭＰ阻害剤は上市されていなかった（Ｇｒｅｅｎｗａｌｄ  Ｒ．Ａ．Ａｎｎ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８７８，４１３−４１９，１９９９）。このような状況下、関節軟骨のもう一つの主要構成成分であるアグリカンを選択的に分解するアグリカナーゼが注目された。
ヒト関節疾患患者の滑液中に検出される主要なアグリカン分解断片が、いずれもアグリカナーゼ切断部位での切断により生じているとの各種報告（Ｓａｎｄｙ  Ｊ．Ｄ．ら，Ｊ  Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，８９，１５１２−１５１６，１９９２；及びＬｏｈｍａｎｄｅｒ  Ｌ．Ｓ．らＡｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．，３６，１２１４−１２２２，１９９３）から、アグリカンの第３７３番目のグルタミン酸残基と第３７４番目のアラニン残基との間（Ｇｌｕ３７３−Ａｌａ３７４の間）を切断する酵素アグリカナーゼが、関節疾患に関与することが明らかにされていた。一方、関節軟骨の体外移植培養系において、ＩＬ−１誘導により、まずアグリカンの分解が起こり、続いてＩＩ型コラーゲンの分解が亢進することが知られていた（Ｄｉｎｇｌｅ  Ｌ．Ｔ．ら，Ａｎｎ．Ｒｈｅｕｍ．Ｄｉｓ．，３４，３０３−３１１，１９７５；Ｃａｗｓｔｏｎ  Ｔ．Ｅ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，２１５，３７７−３８５，１９９５；及びＫｏｚａｃｉ  Ｌ．Ｄ．ら，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．，４０，１６４−１７４，１９９７）。マウス関節炎モデルにおいても、アグリカン分解がＩＩ型コラーゲン分解に先行することが報告されていた（ｖａｎ  Ｍｅｕｒｓ  Ｊ．Ｂ．ら，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．，４２，１１２８−１１３９，１９９９）。これらの報告は、先行するアグリカン分解を阻害することにより、ＩＩ型コラーゲン分解をも制御しうる可能性を示唆していた。
ところが、金属プロテアーゼであること、細胞外に存在すること、基質認識に糖鎖の関与があること、ＩＬ−１、ＴＮＦ、又はレチノイン酸で活性が誘導されること等の生化学的性質が分かっていたにも拘わらず、関節疾患の原因となるアグリカナーゼの本体は長い間不明のままであった。最近になり、ＡＤＡＭＴＳ４（ａｇｇｒｅｃａｎａｓｅ−１；Ｔｏｒｔｏｒｅｌｌａ  Ｍ．Ｄ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８４，１６６４−１６６６，１９９９）及びＡＤＡＭＴＳ１１（ａｇｇｒｅｃａｎａｓｅ−２；Ａｂｂａｓｚａｄｅ  Ｉ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４，２３４４３−２３４５０，１９９９）が、前記のアグリカナーゼ活性を有するプロテアーゼとして報告された。しかし、これらのプロテアーゼはヒトＯＡ軟骨で遺伝子発現増強されておらず、しかも、ヒト膝関節軟骨の体外移植培養系においてアグリカナーゼ活性を誘導することが知られているＩＬ−１、ＴＮＦ、又はレチノイン酸で遺伝子発現誘導されないことから、関節疾患に関する別のプロテアーゼの存在が示唆されていた（Ｆｌａｎｎｅｒｙ  Ｃ．Ｒ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２６０，３１８−３２２，１９９９）。
更に、近年、ＯＡになりやすい家系やＯＡ患者の遺伝学的調査により、その部分にＯＡとの関連性を示す遺伝的要因があるとされた染色体上の領域（ＯＡ感受性領域）が特定されてきている。例えば、１１ｑ（Ｃｈａｐｍａｎ  Ｋ．ら，Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．，６５，１６７−１７４，１９９９）、４ｑ１２−４ｑ２１．２、６ｑ２１．１−６ｑ２２．１、１６ｐ１３．１−１６ｑ１２．１、及び１６ｑ２１−１６ｑ２３（Ｌｏｕｇｈｌｉｎ  Ｊ．ら，Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．，６５，１７９５−１７９８，１９９９）がＯＡ感受性領域として報告されている。
発明の開示
本発明の課題は、関節疾患治療剤のスクリーニングツールとして有用な、関節疾患の原因となる新規のアグリカナーゼ、及びそれをコードする新規のポリヌクレオチドを提供し、関節疾患治療剤として有用な物質を得るための簡便なスクリーニング系を提供することにある。
本発明者は前記課題を解決するために鋭意研究を行なった結果、関節疾患の原因となるアグリカナーゼ［具体的には、ＭＤＴＳ８（Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅ  ａｎｄ  Ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ  ｗｉｔｈ  Ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ  ｔｙｐｅ−１  ｒｅｐｅａｔｓ  ８）］をコードする遺伝子を取得し、前記アグリカナーゼタンパク質を発現させた。次いで、前記タンパク質が、アグリカナーゼ活性を示すこと、軟骨細胞分化に伴い発現が誘導されること、及び、ＭＤＴＳ８の染色体座が関節疾患であるＯＡ感受性領域として特定されている領域に存在することを示し、本発明のポリペプチドが、関節疾患の原因となるアグリカナーゼであり、関節疾患治療剤のスクリーニングツールとして有用であることを確認した。また、前記タンパク質を用い、試験化合物が関節疾患の原因となるアグリカナーゼ活性を阻害するか否かを検出する方法、及び、前記検出方法を用いた関節疾患治療剤のスクリーニング方法を確立した。更に、前記検出工程を含む、関節疾患治療用医薬組成物の製造法を確立し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、
［１］（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含み、あるいは、（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも、アグリカナーゼ活性を示すポリペプチド；
［２］配列番号２で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、アグリカナーゼ活性を示す、［１］記載のポリペプチド；
［３］配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入されたアミノ酸配列であり、且つ軟骨細胞に分化することによりその発現が誘導されるアミノ酸配列を含み、しかも、アグリカナーゼ活性を示すポリペプチド；
［４］配列番号２で表されるアミノ酸配列との相同性が９０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも、アグリカナーゼ活性を示すポリペプチド；
［５］配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
［６］［１］〜［５］記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
［７］［６］記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター；
［８］［７］記載の発現ベクターでトランスフェクションされた細胞；
［９］（１）［１］〜［５］記載のポリペプチドと、（２）アグリカナーゼにより切断可能な基質用ポリペプチドと、（３）試験化合物とを接触させる工程、及び前記基質用ポリペプチドの切断を分析する工程を含む、試験化合物が前記ポリペプチドのアグリカナーゼ活性を阻害するか否かを検出する方法；
［１０］［９］記載の方法による検出工程、及びアグリカナーゼ活性を阻害する物質を選択する工程を含む、［１］〜［５］記載のポリペプチドのアグリカナーゼ活性を阻害する物質をスクリーニングする方法；
［１１］［１０］記載の方法により、関節疾患治療用物質をスクリーニングする方法；
［１２］［９］記載の方法による検出工程、及び製剤化工程を含む、関節疾患治療用医薬組成物の製造方法；並びに
［１３］［１］〜［５］記載のポリペプチドに結合する抗体又はその断片
に関する。
本明細書において「アグリカン」とは、関節軟骨の細胞外マトリックスに存在し、Ｎ末端の２個の球状ドメイン（Ｇ１及びＧ２）、グリコサミノグリカン結合領域、及びＣ末端の球状ドメイン（Ｇ３）からなるコアタンパク質と、このコアタンパク質を修飾するコンドロイチン硫酸及びケラタン硫酸グリコサミノグリカンとからなるプロテオグリカンを意味する。
また、本明細書において「アグリカナーゼ活性」とは、関節軟骨に存在するヒトアグリカンを、第３７３番目のグルタミン酸残基と第３７４番目のアラニン残基との間（以下、「Ｇｌｕ３７３−Ａｌａ３７４の間」と称する）で選択的に切断する活性を意味する。
更に、本明細書において「アグリカナーゼ」とは、前記アグリカナーゼ活性を有する金属プロテアーゼを意味する。前記アグリカナーゼは、通常、亜鉛配位コンセンサス配列［すなわち、Ｈｉｓ−Ｇｌｕ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｈｉｓ（Ｘａａは任意のアミノ酸を意味する；配列番号２４で表される配列）］を有する。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を詳細に説明する。
［１］本発明のポリペプチド
本発明のポリペプチドには、
（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、アグリカナーゼ活性を示すポリペプチド；
（３）配列番号２で表されるアミノ酸配列の１又は複数の箇所において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも、アグリカナーゼ活性を示すポリペプチド（以下、機能的等価改変体と称する）；並びに
（４）配列番号２で表されるアミノ酸配列との相同性が９０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも、アグリカナーゼ活性を示すポリペプチド（以下、相同ポリペプチドと称する）
が含まれる。
本発明のポリペプチドである前記ポリペプチド（１）〜（４）の内、軟骨細胞に分化することによりその発現が誘導されるアミノ酸配列を含むポリペプチドが好ましい。
（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
本発明のポリペプチドとしては、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドが最も好ましい。配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、アグリカナーゼ活性を示し、１２２１個のアミノ酸残基からなるヒト由来の新規アグリカナーゼである。後述の実施例５に示すように、軟骨細胞に分化することによりその発現が誘導される。また、その遺伝子が、後述の実施例６に示すように、変形性関節症（ＯＡ）に関連する染色体の位置に存在することから、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、関節疾患の原因となるアグリカナーゼであると考えられる。
（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、アグリカナーゼ活性を示すポリペプチド
本発明のポリペプチドである「配列番号２で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、アグリカナーゼ活性を示すポリペプチド」としては、例えば、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、あるいは、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドのＮ末端及び／又はＣ末端に、適当なマーカー配列等を付加したポリペプチド（すなわち、配列番号２で表されるアミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端に、適当なマーカー配列等が付加されたアミノ酸配列を有し、しかも、アグリカナーゼ活性を示す融合ポリペプチド）が含まれる。
前記マーカー配列としては、例えば、ポリペプチドの発現の確認、細胞内局在の確認、あるいは、精製等を容易に行なうための配列を用いることができ、例えば、ＦＬＡＧタグ、ヘキサ−ヒスチジン・タグ（Ｈｉｓタグとも称する）、ヘマグルチニン・タグ、又はｍｙｃエピトープなどを挙げることができる。
本明細書において、或るポリペプチドが「アグリカナーゼ活性を示す」か否かを判定する方法（以下、「アグリカナーゼ活性の判定方法」と称することがある）は、特に限定されるものではないが、例えば、前記の試験ポリペプチド（例えば、試験ポリペプチドを含む細胞、組織培養液、若しくは組織抽出液、又は試験ポリペプチドの部分精製若しくは精製標品など）と、アグリカナーゼの基質（例えば、ヒトアグリカン）とを適当な緩衝液［例えば、５０ｍｍｏｌ／Ｌトリス塩酸（ｐＨ７．４）］中で接触させ、前記基質がその切断部位（例えば、ヒトアグリカンにおけるＧｌｕ３７３−Ａｌａ３７４の間）で切断されたか否かを分析することにより確認することができ、好ましくは、後述の実施例４に記載の方法により確認することができる。
前記のアグリカナーゼの基質としては、アグリカナーゼにより切断可能なポリペプチド（以下、基質用ポリペプチドと称する）である限り、特に限定されるものではなく、例えば、ヒト又は他の動物由来のアグリカン、前記アグリカンの断片（但し、アグリカナーゼにより切断可能な断片）、あるいは、前記アグリカン又はその断片と適当なマーカー配列（例えば、ＦＬＡＧタグ、Ｈｉｓタグ、ヘマグルチニン・タグ、又はｍｙｃエピトープなど、好ましくは、ＦＬＡＧタグ又はＨｉｓタグ）との融合ポリペプチド（但し、アグリカナーゼにより切断可能な融合ポリペプチド）を挙げることができる。より具体的には、例えば、ヒト又は他の動物の軟骨組織より精製したアグリカン、遺伝子組換えアグリカン（例えば、アグリカン又はその断片のＮ末端にＦＬＡＧタグを付加し、且つＣ末端にＨｉｓタグを付加した組換えアグリカン）、市販のアグリカン（生化学工業製）、あるいは、それらの部分ポリペプチドを用いることができる。
基質用ポリペプチドがアグリカナーゼ活性に基づいて切断されたか否かを分析する方法としては、例えば、基質用ポリペプチドが試験ポリペプチドで切断されることによって生じるポリペプチド断片を分析（例えば、ポリペプチド断片の有無を検出、あるいは、ポリペプチド断片の生成量を測定）する方法、あるいは、前記切断によって減少する基質用ポリペプチドを分析（例えば、基質用ポリペプチドの有無を検出、あるいは、基質用ポリペプチドの減少量を測定）する方法を挙げることができる。
例えば、基質用ポリペプチドとしてヒトアグリカンを用いる場合には、Ｇｌｕ３７３−Ａｌａ３７４の間で切断されることによって生じるポリペプチド断片の分析方法として、特に限定されるものではないが、例えば、常法に従って分解断片のＮ末端配列又はＣ末端配列を決定する手法、あるいは、より簡便に、Ｇｌｕ３７３−Ａｌａ３７４の間で切断されることにより生じるＣ末端のＡｓｎ３６９−Ｉｌｅ３７０−Ｔｈｒ３７１−Ｇｌｙ３７２−Ｇｌｕ３７３配列（配列番号２５で表される配列）、又はＮ末端のＡｌａ３７４−Ａｒｇ３７５−Ｇｌｙ３７６−Ｓｅｒ３７７−Ｖａｌ３７８配列（配列番号２６で表される配列）を特異的に認識する抗ネオエピトープ抗体（Ｈｕｇｈｅｓ  Ｃ．Ｅ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，３０５，７９９−８０４，１９９５）を用いるＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｓｏｌｖｅｎｔ  Ａｓｓａｙ）又はウエスタンブロッティング等の免疫学的手法を用いることができる。なお、ＥＬＩＳＡ又はウエスタンブロッティング等の免疫学的手法は、例えば、右田俊介・紺田進・本庶佑・濱岡利之編、「免疫実験操作法Ｉ・ＩＩ」、南江堂（１９９５年）に従って行なうことができる。
また、基質用ポリペプチドとしてヒトアグリカンを用いる場合には、Ｇｌｕ３７３−Ａｌａ３７４の間で切断されることによって減少するヒトアグリカンの分析方法として、特に限定されるものではないが、例えば、抗ヒトアグリカン抗体を用いるウエスタンブロッティングを用いることができる。
更に、基質用ポリペプチドとして、アグリカン又はその断片のＮ末端にＦＬＡＧタグを付加し、且つＣ末端にＨｉｓタグを付加した組換えアグリカンを用いる場合には、Ｇｌｕ３７３−Ａｌａ３７４の間で切断されることによって減少する前記組換えアグリカンの分析方法として、抗ＦＬＡＧタグ抗体及び／又は抗Ｈｉｓタグ抗体を用いるＥＬＩＳＡ又はウエスタンブロッティングを用いることができる。
（３）機能的等価改変体
本発明の機能的等価改変体は、配列番号２で表されるアミノ酸配列の１又は複数の箇所において、１又は複数個（好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜７個、更に好ましくは１〜５個）、例えば、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも、アグリカナーゼ活性を示す（より好ましくは、更に、軟骨細胞に分化することによりその発現が誘導されるアミノ酸配列を含む）ポリペプチドである限り、特に限定されるものではなく、その起源もヒトに限定されない。。
例えば、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドのヒトにおける変異体が含まれるだけでなく、ヒト以外の生物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、又はイヌ）由来の機能的等価改変体が含まれる。更には、それらの天然ポリペプチド（すなわち、ヒト由来の変異体、あるいは、ヒト以外の生物由来の機能的等価改変体）を元にして、あるいは、配列番号２で表されるアミノ酸配列で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを元にして、遺伝子工学的に人為的に改変したポリペプチドなどが含まれる。なお、本明細書において「変異体」（ｖａｒｉａｔｉｏｎ）とは、同一種内の同一ポリペプチドにみられる個体差、あるいは、数種間の相同ポリペプチドにみられる差異を意味する。
配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのヒトにおける変異体、あるいは、ヒト以外の生物由来の機能的等価改変体は、当業者であれば、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列（例えば、配列番号１で表される塩基配列）の情報を基にして、取得することができる。なお、遺伝子組換え技術については、特に断りがない場合、公知の方法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら，”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ，１９８９）に従って実施することが可能である。
例えば、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列の情報を基にして適当なプライマー又はプローブを設計し、前記プライマー又はプローブと、目的とする生物［例えば、哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、又はイヌ）］由来の試料（例えば、総ＲＮＡ若しくはｍＲＮＡ画分、ｃＤＮＡライブラリー、又はファージライブラリー）とを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法（Ｓａｉｋｉ，Ｒ．Ｋ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９，４８７−４９１，１９８８）又はハイブリダイゼーション法を実施することにより、ポリペプチドコードするポリヌクレオチドを取得し、そのポリヌクレオチドを適当な発現系を用いて発現させ、発現したポリペプチドが、例えば、実施例４に記載の方法により、アグリカナーゼ活性を示すことを確認することにより、所望のポリペプチドを取得することができる。
また、前記の遺伝子工学的に人為的に改変したポリペプチドは、常法、例えば、部位特異的突然変異誘発法（ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ；Ｍａｒｋ，Ｄ．Ｆ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１，５６６２−５６６６，１９８４）により、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを取得し、そのポリヌクレオチドを適当な発現系を用いて発現させ、発現したポリペプチドが、例えば、実施例４に記載の方法により、アグリカナーゼ活性を示すことを確認することにより、所望のポリペプチドを取得することができる。
また、本発明の機能的等価改変体には、配列番号２で表されるアミノ酸配列の１又は複数の箇所において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入され、更に、そのＮ末端及び／又はＣ末端に適当なマーカー配列等が付加されたアミノ酸配列を有し、しかも、アグリカナーゼ活性を示す融合ポリペプチドが含まれる。
更に、本発明の機能的等価改変体としては、配列番号２で表されるアミノ酸配列の１又は複数の箇所において、１又は複数個（好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜７個、更に好ましくは１〜５個）、例えば、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、しかも、アグリカナーゼ活性を示すポリペプチドであることが好ましく、更に、軟骨細胞に分化することによりその発現が誘導されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであることがより好ましい。
（４）相同ポリペプチド
本発明の相同ポリペプチドは、配列番号２で表されるアミノ酸配列との相同性が９０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも、アグリカナーゼ活性を示すポリペプチドである限り、特に限定されるものではないが、配列番号２で表されるアミノ酸配列に関して、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、更に好ましくは９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むことができる。また、本発明の相同ポリペプチドとしては、配列番号２で表されるアミノ酸配列との相同性が９０％以上（より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上）であるアミノ酸配列からなり、しかも、アグリカナーゼ活性を示すポリペプチドが好ましい。
更に、本発明の相同ポリペプチドとしては、アグリカナーゼ活性を示し、しかも、軟骨細胞に分化することによりその発現が誘導されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであることがより好ましい。
なお、本明細書における前記「相同性」とは、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  ｌｏｃａｌ  ａｌｉｎｇｍｅｎｔ  ｓｅａｒｃｈ  ｔｏｏｌ；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３−４１０，１９９０）検索により得られた値を意味し、アミノ酸配列の相同性は、ＢＬＡＳＴ検索アルゴリズムを用いて決定することができる。具体的には、ＢＬＡＳＴパッケージ（ｓｇｉ３２ｂｉｔ版，バージョン２．０．１２；ＮＣＢＩより入手）のｂｌ２ｓｅｑプログラム（Ｔａｔｉａｎａ  Ａ．Ｔａｔｕｓｏｖａ及びＴｈｏｍａｓ  Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，１７４，２４７−２５０，１９９９）を用い、デフォルトパラメーターに従って算出することができる。ペアワイズ・アラインメント・パラメーターとして、プログラム名「ｂｌａｓｔｐ」を使用し、Ｇａｐ挿入Ｃｏｓｔ値を「０」で、Ｇａｐ伸長Ｃｏｓｔ値を「０」で、Ｑｕｅｒｙ配列のフィルターとして「ＳＥＧ」を、Ｍａｔｒｉｘとして「ＢＬＯＳＵＭ６２」をそれぞれ使用する。
［２］本発明のポリヌクレオチド
本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである限り、特に限定されるものではなく、例えば、配列番号１で表される塩基配列を含むポリヌクレオチドを挙げることができ、配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドが特に好ましい。なお、本明細書における用語「ポリヌクレオチド」には、ＤＮＡ及びＲＮＡの両方が含まれる。
本発明のポリヌクレオチドの製造方法は、特に限定されるものではないが、例えば、（１）ＰＣＲを用いた方法、（２）常法の遺伝子工学的手法（すなわち、ｃＤＮＡライブラリーで形質転換した形質転換株から、所望のｃＤＮＡを含む形質転換株を選択する方法）を用いる方法、又は（３）化学合成法などを挙げることができる。以下、各製造方法について、順次、説明する。
前記（１）のＰＣＲを用いた方法では、例えば、以下の手順により、本発明のポリヌクレオチドを製造することができる。
すなわち、本発明のポリペプチドを産生する能力を有するヒト細胞又は組織からｍＲＮＡを抽出する。次いで、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列に基づいて、本発明のポリペプチドに相当するｍＲＮＡの全長を挟むことのできる２個１組のプライマーセット、あるいは、その一部のｍＲＮＡ領域を挟むことのできる２個１組のプライマーセットを作成する。抽出した前記ｍＲＮＡを鋳型とする逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を行なうことにより、本発明のポリペプチドの全長ｃＤＮＡ又はその一部を得ることができる。
より詳細には、まず、本発明のポリペプチドの産生能力を有する細胞又は組織から、本発明のポリペプチドをコードするｍＲＮＡを含む総ＲＮＡを既知の方法により抽出する。抽出法としては、例えば、グアニジン・チオシアネート・ホット・フェノール法、グアニジン・チオシアネート−グアニジン・塩酸法、又はグアニジン・チオシアネート塩化セシウム法等を挙げることができるが、グアニジン・チオシアネート塩化セシウム法を用いることが好ましい。本発明のポリペプチドの産生能力を有する細胞又は組織は、例えば、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド又はその一部を用いたノーザンブロッティング法、あるいは、本発明のポリペプチドに特異的な抗体を用いたウエスタンブロッティング法などにより特定することができる。
続いて、抽出したｍＲＮＡを精製する。ｍＲＮＡの精製は常法に従えばよく、例えば、ｍＲＮＡをオリゴ（ｄＴ）セルロースカラムに吸着後、溶出させることにより精製することができる。所望により、ショ糖密度勾配遠心法等によりｍＲＮＡを更に分画することもできる。また、ｍＲＮＡを抽出しなくても、市販されている抽出精製済みのｍＲＮＡを用いることもできる。
次に、精製されたｍＲＮＡを、例えば、ランダムプライマー、オリゴｄＴプライマー、及び／又はカスタム合成したプライマーの存在下で、逆転写酵素反応を行ない、第１鎖ｃＤＮＡを合成する。この合成は、常法によって行なうことができる。得られた第１鎖ｃＤＮＡを用い、目的ポリヌクレオチドの全長又は一部の領域を挟んだ２種類のプライマーを用いてＰＣＲを実施し、目的とするｃＤＮＡを増幅することができる。得られたＤＮＡをアガロースゲル電気泳動等により分画する。所望により、前記ＤＮＡを制限酵素等で切断し、接続することによって目的とするＤＮＡ断片を得ることもできる。
前記（２）の常法の遺伝子工学的手法を用いる方法では、例えば、以下の手順により、本発明のポリヌクレオチドを製造することができる。
まず、前記のＰＣＲを用いた方法で調製したｍＲＮＡを鋳型として、逆転写酵素を用いて１本鎖ｃＤＮＡを合成した後、この１本鎖ｃＤＮＡから２本鎖ｃＤＮＡを合成する。その方法としては、例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ法（Ｅｆｓｔｒａｔｉａｄｉｓ，Ａ．ら，Ｃｅｌｌ，７，２７９−２８８，１９７６）、Ｌａｎｄ法（Ｌａｎｄ，Ｈ．ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，９，２２５１−２２６６，１９８１）、Ｏ．Ｊｏｏｎ  Ｙｏｏ法（Ｙｏｏ，Ｏ．Ｊ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９，１０４９−１０５３，１９８３）、又はＯｋａｙａｍａ−Ｂｅｒｇ法（Ｏｋａｙａｍａ，Ｈ．及びＢｅｒｇ，Ｐ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，２，１６１−１７０，１９８２）などを挙げることができる。
次に、前記２本鎖ｃＤＮＡを含む組換えプラスミドを作製した後、大腸菌（例えば、ＤＨ５α株、ＨＢ１０１株、又はＪＭ１０９株）に導入して形質転換させ、例えば、テトラサイクリン、アンピシリン、又はカナマイシン等に対する薬剤耐性を指標として、組換体を選択する。宿主細胞の形質転換は、例えば、宿主細胞が大腸菌の場合には、Ｈａｎａｈａｎの方法（Ｈａｎａｈａｎ，Ｄ．Ｊ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６６，５５７−５８０，１９８３）、すなわち、ＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２、又はＲｂＣｌを共存させて調製したコンピテント細胞に、前記組換えＤＮＡ体を加える方法により実施することができる。なお、ベクターとしては、プラスミド以外にもラムダ系などのファージベクターを用いることもできる。
このようにして得られる形質転換株から、目的のｃＤＮＡを有する形質転換株を選択する方法としては、例えば、以下に示す（ｉ）合成オリゴヌクレオチドプローブを用いる形質転換株スクリーニング法、（ｉｉ）ＰＣＲにより作製したプローブを用いる形質転換株スクリーニング法、（ｉｉｉ）本発明のポリペプチドに対する抗体を用いる形質転換株スクリーニング法、又は（ｉｖ）セレクティブ・ハイブリダイゼーション・トランスレーション系を用いる形質転換株スクリーニング法を採用することができる。
前記（ｉ）の合成オリゴヌクレオチドプローブを用いる形質転換株スクリーニング法では、例えば、以下の手順により、目的のｃＤＮＡを有する形質転換株を選択することができる。
すなわち、本発明のポリペプチドの全部又は一部に対応するオリゴヌクレオチドを合成し、これをプローブ（３２Ｐ又は３３Ｐで標識する）として、形質転換株のＤＮＡを変性固定したニトロセルロースフィルター又はポリアミドフィルターとハイブリダイズさせ、得られた陽性株を検索して、これを選択する。なお、プローブ用のオリゴヌクレオチドを合成する場合には、コドン使用頻度を用いて導いたヌクレオチド配列とすることもできるし、あるいは、考えられるヌクレオチド配列を組合せた複数個のヌクレオチド配列とすることもできる。後者の場合には、イノシンを含ませてその種類を減らすことができる。
前記（ｉｉ）のＰＣＲにより作製したプローブを用いる形質転換株スクリーニング法では、例えば、以下の手順により、目的のｃＤＮＡを有する形質転換株を選択することができる。
すなわち、本発明のポリペプチドの一部に対応するセンスプライマー及びアンチセンスプライマーの各オリゴヌクレオチドを合成し、これらを組合せてＰＣＲを行ない、目的ポリペプチドの全部又は一部をコードするＤＮＡ断片を増幅する。ここで用いる鋳型ＤＮＡとしては、本発明のポリペプチドを産生する細胞のｍＲＮＡより逆転写反応にて合成したｃＤＮＡ、又はゲノムＤＮＡを用いることができる。このようにして調製したＤＮＡ断片を、例えば、３２Ｐ又は３３Ｐで標識し、これをプローブとして用いてコロニーハイブリダイゼーション又はプラークハイブリダイゼーションを行なうことにより、目的のｃＤＮＡを有する形質転換株を選択する。
前記（ｉｉｉ）の本発明のポリペプチドに対する抗体を用いる形質転換株スクリーニング法では、例えば、以下の手順により、目的のｃＤＮＡを有する形質転換株を選択することができる。
すなわち、予め、ｃＤＮＡを発現ベクターに組込み、形質転換株の培養上清、細胞内、又は細胞表面にポリペプチドを産生させ、本発明のポリペプチドに対する抗体及び前記抗体に対する２次抗体を用いて、所望のポリペプチド産生株を検出し、目的のｃＤＮＡを有する形質転換株を選択する。
前記（ｉｖ）のセレクティブ・ハイブリダイゼーション・トランスレーション系を用いる形質転換株スクリーニング法では、例えば、以下の手順により、目的のｃＤＮＡを有する形質転換株を選択することができる。
すなわち、形質転換株から得られるｃＤＮＡを、ニトロセルロースフィルター等にブロットし、本発明のポリペプチドの産生能力を有する細胞から別途調製したｍＲＮＡをハイブリダイズさせた後、ｃＤＮＡに結合したｍＲＮＡを解離させ、回収する。回収されたｍＲＮＡを適当なポリペプチド翻訳系、例えば、アフリカツメガエルの卵母細胞へ注入したり、あるいは、ウサギ網状赤血球ライゼート又は小麦胚芽等の無細胞系を用いて、ポリペプチドに翻訳させる。本発明のポリペプチドに対する抗体を用いて検出して、目的のｃＤＮＡを有する形質転換株を選択する。
得られた目的の形質転換株より本発明のポリヌクレオチドを採取する方法は、公知の方法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら，”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ，１９８９）に従って実施することができる。例えば、細胞よりプラスミドＤＮＡに相当する画分を分離し、得られたプラスミドＤＮＡからｃＤＮＡ領域を切り出すことにより行なうことができる。
前記（３）の化学合成法を用いた方法では、例えば、化学合成法によって製造したＤＮＡ断片を結合することによって、本発明のポリヌクレオチドを製造することができる。各ＤＮＡは、ＤＮＡ合成機［例えば、Ｏｌｉｇｏ  １０００Ｍ  ＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ社製）、又は３９４  ＤＮＡ／ＲＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）など］を用いて合成することができる。
また、本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドの情報に基づいて、例えば、ホスファイト・トリエステル法（Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ，Ｍ．ら，Ｎａｔｕｒｅ，１０，１０５−１１１，１９８４）等の常法に従い、核酸の化学合成により製造することもできる。なお、所望アミノ酸に対するコドンは、それ自体公知であり、その選択も任意でよく、例えば、利用する宿主のコドン使用頻度を考慮して、常法に従って決定することができる（Ｃｒａｎｔｈａｍ，Ｒ．ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，９，ｒ４３−ｒ７４，１９８１）。更に、これら塩基配列のコドンの一部改変は、常法に従い、所望の改変をコードする合成オリゴヌクレオチドからなるプライマーを利用した部位特異的突然変異誘発法（ｓｉｔｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（Ｍａｒｋ，Ｄ．Ｆ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１，５６６２−５６６６，１９８４）等により実施することができる。
これまで述べた種々の方法により得られるＤＮＡの配列決定は、例えば、マキサム−ギルバートの化学修飾法（Ｍａｘａｍ，Ａ．Ｍ．及びＧｉｌｂｅｒｔ，Ｗ．，“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，６５，４９９−５５９，１９８０）やジデオキシヌクレオチド鎖終結法（Ｍｅｓｓｉｎｇ，Ｊ．及びＶｉｅｉｒａ，Ｊ．，Ｇｅｎｅ，１９，２６９−２７６，１９８２）等により行なうことができる。
［３］本発明の発現ベクター及び細胞
単離された本発明のポリヌクレオチドを、適当なベクターＤＮＡに再び組込むことにより、真核生物又は原核生物の宿主細胞をトランスフェクションすることができる。また、これらのベクターに適当なプロモーター及び形質発現にかかわる配列を導入することにより、それぞれの宿主細胞においてポリヌクレオチドを発現させることが可能である。
本発明の発現ベクターは、本発明のポリヌクレオチドを含む限り、特に限定されるものではなく、例えば、用いる宿主細胞に応じて適宜選択した公知の発現ベクターに、本発明のポリヌクレオチドを挿入することにより得られる発現ベクターを挙げることができる。
また、本発明の細胞も、本発明の前記発現ベクターでトランスフェクションされ、本発明のポリヌクレオチドを含む限り、特に限定されるものではなく、例えば、本発明のポリヌクレオチドが、宿主細胞の染色体に組み込まれた細胞であることもできるし、あるいは、本発明によるポリヌクレオチドを含む発現ベクターの形で含有する細胞であることもできる。また、本発明のポリペプチドを発現している細胞であることもできるし、あるいは、本発明のポリペプチドを発現していない細胞であることもできる。本発明の細胞は、例えば、本発明の発現ベクターにより、所望の宿主細胞をトランスフェクションすることにより得ることができる。
例えば、真核生物の宿主細胞には、脊椎動物、昆虫、及び酵母等の細胞が含まれ、脊椎動物細胞としては、例えば、サルの細胞であるＣＯＳ細胞（Ｇｌｕｚｍａｎ，Ｙ．，Ｃｅｌｌ，２３，１７５−１８２，１９８１）、チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）のジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損株（Ｕｒｌａｕｂ，Ｇ．及びＣｈａｓｉｎ，Ｌ．Ａ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７，４２１６−４２２０，１９８０）、ヒト胎児腎臓由来ＨＥＫ２９３細胞、及び前記ＨＥＫ２９３細胞にエプスタイン・バーウイルスのＥＢＮＡ−１遺伝子を導入した２９３−ＥＢＮＡ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）等を挙げることができる。
脊椎動物細胞の発現ベクターとしては、通常発現しようとする遺伝子の上流に位置するプロモーター、ＲＮＡのスプライス部位、ポリアデニル化部位、及び転写終結配列等を有するものを使用することができ、更に必要により、複製起点を有していることができる。前記発現ベクターの例としては、例えば、ＳＶ４０の初期プロモーターを有するｐＳＶ２ｄｈｆｒ（Ｓｕｂｒａｍａｎｉ，Ｓ．ら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１，８５４−８６４，１９８１）、ヒトの延長因子プロモーターを有するｐＥＦ−ＢＯＳ（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ，Ｓ．及びＮａｇａｔａ，Ｓ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１８，５３２２，１９９０）、又はサイトメガロウイルスプロモーターを有するｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）等を挙げることができる。
宿主細胞として２９３−ＥＢＮＡ細胞を用いる場合には、発現ベクターとして、エプスタイン・バーウイルスの複製起点を有し、２９３−ＥＢＮＡ細胞で自己増殖が可能なｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）などを用いることができる。
また、宿主細胞としてＣＯＳ細胞を用いる場合には、発現ベクターとして、ＳＶ４０複製起点を有し、ＣＯＳ細胞において自律増殖が可能であり、更に、転写プロモーター、転写終結シグナル、及びＲＮＡスプライス部位を備えたものを用いることができ、例えば、ｐＭＥ１８Ｓ（Ｍａｒｕｙａｍａ，Ｋ．及びＴａｋｅｂｅ，Ｙ．，Ｍｅｄ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０，２７−３２，１９９０）、ｐＥＦ−ＢＯＳ（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ，Ｓ．及びＮａｇａｔａ，Ｓ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１８，５３２２，１９９０）、又はｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ，Ｂ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２９，８４０−８４２，１９８７）等を挙げることができる。
前記発現ベクターは、例えば、ＤＥＡＥ−デキストラン法（Ｌｕｔｈｍａｎ，Ｈ．及びＭａｇｎｕｓｓｏｎ，Ｇ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１１，１２９５−１３０８，１９８３）、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈殿法（Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．及びｖａｎ  ｄｅｒ  Ｅｄ，Ａ．Ｊ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２，４５６−４５７，１９７３）、市販のトランスフェクション試薬（例えば、ＦｕＧＥＮＥＴＭ６  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ；Ｂｏｅｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ社製）を用いた方法、あるいは、電気パスル穿孔法（Ｎｅｕｍａｎｎ，Ｅ．ら，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１，８４１−８４５，１９８２）等により、ＣＯＳ細胞に取り込ませることができる。
更に、宿主細胞としてＣＨＯ細胞を用いる場合には、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターと共に、Ｇ４１８耐性マーカーとして機能するｎｅｏ遺伝子を発現することのできるベクター、例えば、ｐＲＳＶｎｅｏ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ，１９８９）又はｐＳＶ２−ｎｅｏ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｐ．Ｊ．及びＢｅｒｇ，Ｐ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．，１，３２７−３４１，１９８２）等をコ・トランスフェクトし、Ｇ４１８耐性のコロニーを選択することにより、本発明のポリペプチドを安定に産生するトランスフェクションされた細胞を得ることができる。
本発明の細胞は、常法（例えば、日本生化学会編，「新生化学実験講座１８細胞培養技術」，東京化学同人，１９９０）に従って培養することができ、前記培養により細胞外に本発明のポリペプチドが生産される。前記培養に用いることのできる培地としては、採用した宿主細胞に応じて慣用される各種の培地を適宜選択することができる。例えば、ＣＯＳ細胞の場合には、例えば、ＲＰＭＩ−１６４０培地又はダルベッコ修正イーグル最小必須培地（ＤＭＥＭ）等の培地に、必要に応じて牛胎仔血清（ＦＢＳ）等の血清成分を添加した培地を使用することができる。また、２９３−ＥＢＮＡ細胞の場合には、牛胎仔血清（ＦＢＳ）等の血清成分を添加したダルベッコ修正イーグル最小必須培地（ＤＭＥＭ）等の培地にＧ４１８を加えた培地を使用することができる。
本発明の細胞を培養することにより、前記細胞の細胞外に生産される本発明のポリペプチドは、前記ポリペプチドの物理的性質や生化学的性質等を利用した各種の公知の分離操作法（例えば、岡田雅人及び宮崎香編，「改訂タンパク質実験ノート上・下」，羊土社，１９９９）により、分離精製することができる。具体的には、本発明のポリペプチドを含む培養液を、例えば、通常のタンパク質沈殿剤による処理、限外濾過、各種液体クロマトグラフィー［例えば、分子ふるいクロマトグラフィー（ゲル濾過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換体クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、又は高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等］、若しくは透析法、又はこれらの組合せ等により、本発明のポリペプチドを精製することができる。
本発明のポリペプチドは、マーカー配列とインフレームで融合して発現させることにより、本発明のポリペプチドの発現の確認、又は精製等が容易になる。前記マーカー配列としては、例えば、ＦＬＡＧタグ、ヘキサ−ヒスチジン・タグ、ヘマグルチニン・タグ、又はｍｙｃエピトープなどを挙げることができる。また、マーカー配列と本発明のポリペプチドとの間に、プロテアーゼ（例えば、エンテロキナーゼ、ファクターＸａ、又はトロンビンなど）が認識する特異的なアミノ酸配列を挿入することにより、マーカー配列部分をこれらのプロテアーゼにより切断除去することが可能である。
［４］本発明の検出方法及びスクリーニング方法
本発明のポリペプチドを用いると、試験化合物が、本発明のポリペプチドのアグリカナーゼ活性を阻害するか否かを検出することができる。また、この本発明の検出方法を用いると、本発明のポリペプチドのアグリカナーゼ活性を阻害する物質をスクリーニングすることができる。本発明のポリペプチドは、後述の実施例５に示すように、軟骨細胞に分化することによりその発現が誘導されるタンパク質であり、しかも、その遺伝子は、後述の実施例６に示すように、変形性関節症（ＯＡ）に関連する染色体の位置に存在することから、関節疾患の原因となるアグリカナーゼであると考えられる。従って、本発明のポリペプチドのアグリカナーゼ活性を阻害する物質は、関節疾患治療用物質として有用であり、本発明のポリペプチドそれ自体を、本発明のポリペプチドのアグリカナーゼ活性を阻害する物質、あるいは、関節疾患治療用物質（特には、変形性関節症治療剤）のスクリーニングツールとして使用することができる。
本発明の検出方法又はスクリーニング方法にかけることのできる試験化合物としては、特に限定されるものではないが、例えば、ケミカルファイルに登録されている種々の公知化合物（ペプチドを含む）、コンビナトリアル・ケミストリー技術（Ｔｅｒｒｅｔｔ，Ｎ．Ｋ．ら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，５１，８１３５−８１３７，１９９５）又は通常の合成技術によって得られた化合物群、あるいは、ファージ・ディスプレイ法（Ｆｅｌｉｃｉ，Ｆ．ら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２，３０１−３１０，１９９１）などを応用して作成されたランダム・ペプチド群を用いることができる。前記公知化合物には、例えば、金属プロテアーゼ阻害活性を有することが知られているが、本発明のポリペプチドのアグリカナーゼ活性に対して阻害するか否かが不明な化合物（ペプチドを含む）が含まれる。また、微生物の培養上清、植物若しくは海洋生物由来の天然成分、又は動物組織抽出物などもスクリーニングの試験化合物として用いることができる。更には、本発明のスクリーニング方法により選択された化合物（ペプチドを含む）を、化学的又は生物学的に修飾した化合物（ペプチドを含む）を用いることができる。
本発明の検出方法においては、試験ポリペプチドと基質用ポリペプチドとを接触させる代わりに、本発明のポリペプチドと基質用ポリペプチドと試験化合物とを接触させること以外は、先述のアグリカナーゼ活性の判定方法と同様にして実施することができる。すなわち、本発明の検出方法では、本発明のポリペプチドと基質用ポリペプチドと試験化合物とを接触させ、前記試験化合物の存在下において、前記基質用ポリペプチドが、本発明のポリペプチドのアグリカナーゼ活性に基づいて切断されたか否か（あるいは、その切断の程度）を分析することにより、前記試験化合物が、本発明のポリペプチドのアグリカナーゼ活性を阻害するか否かを検出する。基質用ポリペプチドが、本発明のポリペプチドのアグリカナーゼ活性に基づいて切断されないか、あるいは、前記切断の程度が減少する場合には、前記試験化合物が、本発明のポリペプチドのアグリカナーゼ活性を阻害すると判断することができる。
本発明の検出方法に用いることのできる基質用ポリペプチドとしては、先述のアグリカナーゼ活性の判定方法で説明した基質用ポリペプチドを用いることができる。
また、本発明の検出方法において、基質用ポリペプチドが、本発明のポリペプチドのアグリカナーゼ活性に基づいて切断されたか否かを分析する方法としては、先述のアグリカナーゼ活性の判定方法で説明した方法を用いることができる。前記方法としては、例えば、基質用ポリペプチドが、本発明のポリペプチドのアグリカナーゼ活性に基づいて切断されることによって生じるポリペプチド断片を分析（例えば、ポリペプチド断片の有無を検出、あるいは、ポリペプチド断片の生成量を測定）する方法、あるいは、前記切断によって減少する基質用ポリペプチドを分析（例えば、基質用ポリペプチドの有無を検出、あるいは、基質用ポリペプチドの減少量を測定）する方法を挙げることができる。
本発明のスクリーニング方法では、本発明の検出方法により、試験化合物が、本発明のポリペプチドのアグリカナーゼ活性を阻害するか否かを検出し、その結果に基づいて、本発明のポリペプチドのアグリカナーゼ活性を阻害する物質、あるいは、関節疾患治療用物質を選択する。より具体的には、例えば、本発明のポリペプチドと基質用ポリペプチドと試験化合物とを接触させ、前記試験化合物の存在下における前記基質用ポリペプチドの切断の有無又は程度を指標として、本発明のポリペプチドのアグリカナーゼ活性を阻害する物質、あるいは、関節疾患治療用物質を選択することができる。基質用ポリペプチドが、本発明のポリペプチドのアグリカナーゼ活性に基づいて切断されないか、あるいは、前記切断の程度が減少する場合には、前記試験化合物が、本発明のポリペプチドのアグリカナーゼ活性を阻害する物質、あるいは、関節疾患治療用物質であると判定することができる。
［５］本発明の関節疾患治療用医薬組成物の製造方法
本発明には、本発明のスクリーニング方法により選択される、本発明のポリペプチドのアグリカナーゼ活性を阻害する物質を有効成分とする関節疾患治療用医薬組成物が包含される。
関節疾患治療用医薬組成物の品質規格の確認試験において、本発明の検出方法により、本発明のポリペプチドのアグリカナーゼ活性を阻害するか否かを検出する工程、及び製剤化工程を含む、関節疾患治療用医薬組成物の製造方法も本発明に含まれる。
また、前記検出工程を含む本発明のスクリーニング方法で得られた物質を製剤化することからなる、関節疾患治療用医薬組成物の製造方法も本発明に含まれる。
本発明のポリペプチドのアグリカナーゼ活性を阻害する物質を有効成分とする製剤は、前記有効成分のタイプに応じて、それらの製剤化に通常用いられる担体、賦形剤、及び／又はその他の添加剤を用いて調製することができる。
投与としては、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、又は経口用液剤などによる経口投与、あるいは、静注若しくは筋注などの注射剤、坐剤、経皮投与剤、又は経粘膜投与剤などによる非経口投与を挙げることができる。特に胃で消化されるペプチドにあっては、静注等の非経口投与又は消化を受けない製剤化手段、例えば、ＷＯ９５／２８９６３号パンフレットに記載の製剤化手段が好ましい。
経口投与のための固体組成物においては、１又はそれ以上の活性物質と、少なくとも一つの不活性な希釈剤、例えば、乳糖、マンニトール、ブドウ糖、微結晶セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、デンプン、ポリビニルピロリドン、又はメタケイ酸アルミン酸マグネシウムなどと混合することができる。前記組成物は、常法に従って、不活性な希釈剤以外の添加剤、例えば、滑沢剤、崩壊剤、安定化剤、又は溶解若しくは溶解補助剤などを含有することができる。錠剤又は丸剤は、必要により糖衣又は胃溶性若しくは腸溶性物質などのフィルムで被覆することができる。
経口のための液体組成物は、例えば、乳濁剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤、又はエリキシル剤を含むことができ、一般的に用いられる不活性な希釈剤、例えば、精製水又はエタノールを含むことができる。前記組成物は、不活性な希釈剤以外の添加剤、例えば、湿潤剤、懸濁剤、甘味剤、芳香剤、又は防腐剤を含有することができる。
非経口のための注射剤としては、無菌の水性若しくは非水性の溶液剤、懸濁剤、又は乳濁剤を含むことができる。水溶性の溶液剤又は懸濁剤には、希釈剤として、例えば、注射用蒸留水又は生理用食塩水などを含むことができる。非水溶性の溶液剤又は懸濁剤の希釈剤としては、例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油（例えば、オリーブ油）、アルコール類（例えば、エタノール）、又はポリソルベート８０等を含むことができる。前記組成物は、更に湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定化剤、溶解若しくは溶解補助剤、又は防腐剤などを含むことができる。前記組成物は、例えば、バクテリア保留フィルターを通す濾過、殺菌剤の配合、又は照射によって無菌化することができる。また、無菌の固体組成物を製造し、使用の際に、無菌水又はその他の無菌用注射用媒体に溶解し、使用することもできる。
投与量は、前記スクリーニング法により選択された有効成分の活性の強さ、症状、投与対象の年齢、又は性別等を考慮して適宜決定することができる。
例えば、経口投与の場合、その投与量は、通常、成人（体重６０ｋｇとして）において、１日につき約０．０１〜１０００ｍｇ、好ましくは０．０１〜１００ｍｇである。また、非経口投与の場合、注射剤の形では、１日につき０．０１〜１０００ｍｇ、好ましくは０．０１〜１００ｍｇである。
［６］本発明の抗体又はその断片
本発明のポリペプチドに反応する抗体（例えば、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体）は、各種動物に、本発明のポリペプチド、又はその断片を直接投与することで得ることができる。また、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを導入したプラスミドを用いて、ＤＮＡワクチン法（Ｒａｚ，Ｅ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１，９５１９−９５２３，１９９４；又はＤｏｎｎｅｌｌｙ，Ｊ．Ｊ．ら，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１７３，３１４−３２０，１９９６）によっても得ることができる。
ポリクローナル抗体は、例えば、本発明のポリペプチド又はその断片を適当なアジュバント（例えば、フロイント完全アジュバントなど）に乳濁した乳濁液を、腹腔、皮下、又は静脈等に免疫して感作した動物（例えば、ウサギ、ラット、ヤギ、又はニワトリ等）の血清又は卵から製造することができる。このように製造された血清又は卵から、常法のポリペプチド単離精製法によりポリクローナル抗体を分離精製することができる。そのような分離精製方法としては、例えば、遠心分離、透析、硫酸アンモニウムによる塩析、又はＤＥＡＥ−セルロース、ハイドロキシアパタイト、若しくはプロテインＡアガロース等によるクロマトグラフィー法を挙げることができる。
モノクローナル抗体は、例えば、ケーラーとミルスタインの細胞融合法（Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．及びＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５−４９７，１９７５）により、当業者が容易に製造することが可能である。
すなわち、本発明のポリペプチド又はその断片を適当なアジュバント（例えば、フロイント完全アジュバントなど）に乳濁した乳濁液を、数週間おきにマウスの腹腔、皮下、又は静脈に数回繰り返し接種することにより免疫する。最終免疫後、脾臓細胞を取り出し、ミエローマ細胞と融合してハイブリドーマを作製する。
ハイブリドーマを得るためのミエローマ細胞としては、例えば、ヒポキサンチン−グアニン−ホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損又はチミジンキナーゼ欠損のようなマーカーを有するミエローマ細胞（例えば、マウスミエローマ細胞株Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．Ｕ１）を利用することができる。また、融合剤としては、例えば、ポリエチレングリーコールを利用することができる。更には、ハイブリドーマ作製における培地として、例えば、イーグル氏最小必須培地、ダルベッコ氏変法最小必須培地、又はＲＰＭＩ−１６４０などの通常よく用いられている培地に、１０〜３０％のウシ胎仔血清を適宜加えて用いることができる。融合株は、ＨＡＴ選択法により選択することができる。ハイブリドーマのスクリーニングは培養上清を用い、ＥＬＩＳＡ法又は免疫組織染色法などの周知の方法により行ない、目的の抗体を分泌しているハイブリドーマのクローンを選択することができる。また、限界希釈法によってサブクローニングを繰り返すことにより、ハイブリドーマの単クローン性を保証することができる。このようにして得られるハイブリドーマは、培地中で２〜４日間、あるいは、プリスタンで前処理したＢＡＬＢ／ｃ系マウスの腹腔内で１０〜２０日間培養することで、精製可能な量の抗体を産生することができる。
このように製造されたモノクローナル抗体は、培養上清又は腹水から常法のポリペプチド単離精製法により分離精製することができる。そのような分離精製方法としては、例えば、遠心分離、透析、硫酸アンモニウムによる塩析、又はＤＥＡＥ−セルロース、ハイドロキシアパタイト、若しくはプロテインＡアガロース等によるクロマトグラフィー法を挙げることができる。
また、モノクローナル抗体又はその一部分を含む抗体断片は、前記モノクローナル抗体をコードする遺伝子の全部又は一部を発現ベクターに組み込み、適当な宿主細胞（例えば、大腸菌、酵母、又は動物細胞）に導入して生産させることもできる。
以上のように分離精製された抗体（ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を含む）について、常法により、ポリペプチド分解酵素（例えば、ペプシン又はパパイン等）によって消化を行ない、引き続き、常法のポリペプチド単離精製法により分離精製することで、活性のある抗体の一部分を含む抗体断片、例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はＦｖを得ることができる。
更には、本発明のポリペプチドに反応する抗体を、クラクソンらの方法又はゼベデらの方法（Ｃｌａｃｋｓｏｎ，Ｔ．ら，Ｎａｔｕｒｅ，３５２，６２４−６２８，１９９１；又はＺｅｂｅｄｅｅ，Ｓ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，３１７５−３１７９，１９９２）により、一本鎖（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ）Ｆｖ又はＦａｂとして得ることも可能である。また、マウスの抗体遺伝子をヒト抗体遺伝子に置き換えたトランスジェニックマウス（Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．ら，Ｎａｔｕｒｅ，３６８，８５６−８５９，１９９４）に免疫することで、ヒト抗体を得ることも可能である。
実施例
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。なお、特に断らない限り、公知の方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら，”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ，１９８９）に従って実施した。
実施例１：Ｃ末ＦＬＡＧ付加型発現ベクターの作製
プラスミドｐＣＥＰ４（インビトロジェン社製）を、制限酵素ＣｌａＩ及びＮｓｉＩで切断し、平滑末端化した後、自己連結反応を行なうことにより、エプスタイン・バーウイルス由来のＥＢＮＡ１発現ユニットを除去した発現ベクターｐＣＥＰ４ｄを作製した。得られた発現ベクターｐＣＥＰ４ｄを、制限酵素ＮｈｅＩ及びＢａｍＨＩで切断した後、アガロースゲル抽出することにより得られた約７．７ｋｂｐのＤＮＡ断片に、配列番号７で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号８で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとをアニールさせて得られた二重鎖オリゴヌクレオチドを挿入することにより、発現ベクターｐＣＥＰ４ｄ−ＦＬＡＧを作成した。なお、得られた発現ベクターが目的の配列を有することは、塩基配列により確認した。
得られた発現ベクターｐＣＥＰ４ｄ−ＦＬＡＧを鋳型とし、配列番号９で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号１０で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとの組み合わせをプライマーとして、パイロベスト（ＰｙｒｏＢｅｓｔＴＭ）ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）を用いてＰＣＲを行なった。前記ＰＣＲでは、最初に９４℃（２分間）で熱変性を行なった後、９４℃（３０秒間）と５５℃（３０秒間）と７２℃（３０秒間）とからなるサイクルを１５回繰り返し、最後に７２℃（７分間）の伸長反応を行なった。
前記ＰＣＲにより生じた約０．４ｋｂｐのＤＮＡ断片を制限酵素ＳｐｅＩで切断した後、このＤＮＡ断片を、制限酵素ＸｂａＩで切断したｐＣＥＰ４ｄ−ＦＬＡＧ（約７．７Ｋｂｐ）に挿入することにより、発現ベクターｐＣＥＰ４ｄＥ２−ＦＬＡＧを作成した。得られた発現ベクターｐＣＥＰ４ｄＥ２−ＦＬＡＧにおいては、プロモーターから下流に向かって、クローニングサイトであるＸｂａＩ認識配列、ＮｈｅＩ認識配列、ＮｏｔＩ認識配列、及びＢａｍＨＩ認識配列、並びにＦＬＡＧタグがこの順に配列されている。
実施例２：新規アグリカナーゼ遺伝子ＭＤＴＳ８の全長ＯＲＦ遺伝子のクローニング
配列番号３で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（５’側にＸｂａＩ認識配列及びＫｏｚａｋ配列が付加してある）と配列番号４で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（５’側にＮｏｔＩ認識配列が付加してある）との組み合わせをプライマーとし、ヒト胎盤ｃＤＮＡ（Ｍａｒａｔｈｏｎ−ＲｅａｄｙＴＭ  ｃＤＮＡ；クロンテック社製）を鋳型として、ＤＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ  ＬＡ  ＴａｑＴＭ；宝酒造社製）を用いてＰＣＲを行なった。前記ＰＣＲでは、最初に９４℃（２分間）で熱変性を行なった後、９８℃（１０秒間）と６８℃（３分間）とからなるサイクルを４５回繰り返し、最後に６８℃（７分間）の伸長反応を行なった。
前記ＰＣＲにより生成した約２．３ｋｂｐのＤＮＡ断片（５’側にＸｂａＩ認識配列及びＫｏｚａｋ配列が付加され、３’側にＮｏｔＩ認識配列が付加されている）を、プラスミドＰＣＲ２．１（インビトロジェン社製）にサブクローンすることにより、クローンｐＭＤＴＳ８Ｃｙｓを得た。
得られたプラスミドｐＭＤＴＳ８Ｃｙｓを制限酵素ＸｂａＩ及びＮｏｔＩで切断し、得られた約２．３ｋｂｐのＤＮＡ断片を、前記実施例１で作製したプラスミドｐＣＥＰ４ｄＥ２−ＦＬＡＧのＸｂａＩ及びＮｏｔＩ部位に挿入することにより、プラスミドｐＣＥＰｄＥ２−ＭＤＴＳ８Ｃｙｓ−ＦＬＡＧを得た。
得られたプラスミドｐＣＥＰｄＥ２−ＭＤＴＳ８Ｃｙｓ−ＦＬＡＧを制限酵素ＫｐｎＩ及びＮｏｔＩで切断し、約８．３ｋｂｐのＤＮＡ断片（以下、ＤＮＡ断片Ａと称する）を得た。また、前記プラスミドｐＣＥＰｄＥ２−ＭＤＴＳ８Ｃｙｓ−ＦＬＡＧを制限酵素ＫｐｎＩ及びＳｐｅＩで切断し、約１．５ｋｂｐのＤＮＡ断片（以下、ＤＮＡ断片Ｂと称する）を得た。
配列番号３で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号４で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとの組み合わせの代わりに、配列番号５で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号６で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（５’側にＮｏｔＩ認識配列が付加してある）との組み合わせをプライマーとして用いること以外は、前記ＰＣＲと同じ条件でＰＣＲを実施した。前記ＰＣＲにより生じた約１．５ｋｂｐのＤＮＡ断片（３’側にＮｏｔＩ認識配列が付加されている）を、プラスミドＰＣＲ２．１（インビトロジェン社製）にサブクローンすることにより、クローンｐＭＤＴＳ８−３Ｈを得た。得られたクローンｐＭＤＴＳ８−３Ｈを、制限酵素ＳｐｅＩ及びＮｏｔＩで切断し、約１．５ｋｂｐのＤＮＡ断片（以下、ＤＮＡ断片Ｃと称する）を得た。
前記ＤＮＡ断片Ａ、前記ＤＮＡ断片Ｂ、及び前記ＤＮＡ断片Ｃを連結することにより、プラスミドｐＣＥＰｄＥ２−ＭＤＴＳ８Ｆｕｌｌ−ＦＬＡＧを作製した。このプラスミドｐＣＥＰｄＥ２−ＭＤＴＳ８Ｆｕｌｌ−ＦＬＡＧは、新規アグリカナーゼ遺伝子ＭＤＴＳ８の配列番号１で表される塩基配列における第１番〜第３６６３番の塩基からなる遺伝子を含有し、配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１番〜第１２２１番のアミノ酸からなる配列のＣ末端に、配列番号２３で表されるアミノ酸配列が付加したポリペプチドを、動物細胞を宿主として、発現することができる。
実施例３：ＭＤＴＳ８全長タンパク質（ＭＤＴＳ８Ｆｕｌｌ）の発現
前記実施例２で作製したプラスミドｐＣＥＰｄＥ２−ＭＤＴＳ８Ｆｕｌｌ−ＦＬＡＧ（あるいは、コントロールとして、前記実施例１で作製したプラスミドｐＣＥＰｄＥ２−ＦＬＡＧ）を、市販のトランスフェクション試薬（ＦｕＧＥＮＥＴＭ６  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ；ベーリンガー・マンハイム社製）を用いて、添付指示書に従い、ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞（インビトロジェン社製）に導入した。
プラスミド導入後、１〜２日間培養して得た培養上清中に、目的タンパク質が存在することを、Ｃ末端に付加したＦＬＡＧタグに対する抗体（マウス抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体Ｍ２；シグマ社製）を用いたウエスタンブロッティングで確認した。すなわち、前記培養上清を、ＳＤＳ／１０％〜２０％アクリルアミドゲル（第一化学薬品社製）を用いて電気泳動した後、ブロッティング装置を用いてポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜に転写した。転写後のＰＶＤＦ膜に、ブロッキング剤（ブロックエース；大日本製薬社製）を添加してブロッキングした後、前記マウス抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体Ｍ２と、西洋わさびパーオキシダーゼ標識ウサギ抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体（ザイメッド社製又はタゴ社製）とを、順次反応させた。あるいは、前記ブロッキングに続いて、ビオチン化Ｍ２抗体（シグマ社製）と、西洋わさびパーオキシダーゼ標識ストレプトアビジン（アマシャムファルマシアバイオテク社製）とを、順次反応させた。反応後、市販のウエスタンブロッティング検出システム（ＥＣＬウエスタンブロッティング検出システム；アマシャムファルマシアバイオテク社製）を用いて、目的タンパク質の発現を確認した。検出されたタンパク質のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）における見かけ上の分子質量は、約１２０〜１４０ＫＤａであった。
実施例４：ＭＤＴＳ８全長タンパク質のアグリカナーゼ活性の確認
（１）組換えアグリカンＧ１Ｇ２の調製
公知のヒトアグリカンの遺伝子配列（Ｄｏｅｇｅ  Ｋ．，ら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．，１８，２００−２０２，１９９０）に基づいて合成した配列番号１１で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号１２で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとの組み合わせをプライマーとし、ヒト胎盤ｃＤＮＡ（Ｍａｒａｔｈｏｎ−ＲｅａｄｙＴＭ  ｃＤＮＡ；クロンテック社製）を鋳型とし、パイロベスト（ＰｙｒｏＢｅｓｔＴＭ）ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）を用いてＰＣＲを行なった。前記ＰＣＲでは、最初に９４℃（１分間）で熱変性を行なった後、９８℃（１０秒間）と６８℃（２分間）とからなるサイクルを４０回繰り返し、最後に６８℃（７分間）の伸長反応を行なった。
前記ＰＣＲにより生成したＤＮＡ断片を制限酵素ＢａｍＨＩで切断し、プラスミドｐＣＥＰ−ＳｉｇＦｌａのＢａｍＨＩ部位に導入することにより、ヒトアグリカンの球状ドメイン１（Ｇ１）−球状ドメイン２（Ｇ２）のＮ末にＦＬＡＧタグを、そして、Ｃ末にＨｉｓタグを付加したタンパク質（以下、組換えアグリカンＧ１Ｇ２と称する）を発現するために用いる発現プラスミドｐＣＥＰ−ｒＡｇｇを作製した。なお、前記プラスミドｐＣＥＰ−ＳｉｇＦｌａは、前記実施例１で作製したプラスミドｐＣＥＰ４ｄのＨｉｎｄＩＩＩ部位及びＸｈｏＩ部位に、配列番号１３で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号１４で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとをアニールさせて得られた二重鎖オリゴヌクレオチドを導入することにより得られた発現ベクターである。プラスミドｐＣＥＰ−ＳｉｇＦｌａでは、プロモーターから下流に向かって、インフルエンザウィルスのヘマグルチニン（ｈｅｍａｇｌｕｔｉｎｉｎ）由来の分泌シグナル配列（Ｇｕａｎ  Ｘ−Ｍ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７，２１９９５−２１９９８，１９９２）、ＦＬＡＧタグ配列、そして、ＢａｍＨＩ認識配列がこの順に配列されている。
得られた発現プラスミドｐＣＥＰ−ｒＡｇｇを、ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞に導入し、３〜７日間培養して目的タンパク質（すなわち、組換えアグリカンＧ１Ｇ２）を発現させた。培養上清からの目的タンパク質の精製は、Ｎ末端にＦＬＡＧタグが付加していることを利用して、アフィニィティクロマトグラフィーにより精製した。すなわち、培養上清を、カラムに詰めたＭ２−アガロース（シグマ社製）にアプライし、２０ｍｍｏｌ／Ｌトリス塩酸（ｐＨ７．４）／１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム（以下、ＴＢＳと称する）で洗浄した後、０．１ｍｏｌ／Ｌグリンシン塩酸（ｐＨ３．０）で溶出することにより分画し、直ちに１ｍｏｌ／Ｌトリス塩酸（ｐＨ８．０）で中和した。
（２）アグリカナーゼ活性の検出
前記実施例３と同様にして、前記実施例２で作製したプラスミドｐＣＥＰｄＥ２−ＭＤＴＳ８Ｆｕｌｌ−ＦＬＡＧ（あるいは、コントロールとして、前記実施例１で作製したプラスミドｐＣＥＰｄＥ２−ＦＬＡＧ）を、ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞（インビトロジェン社製）に導入した。前記プラスミド導入から１６時間した経過したところで、培地を無血清培地に置換し、更に３４時間培養を継続した後、培養上清を回収した。
得られた各培養上清と、前記実施例４（１）で調製した組換えアグリカンＧ１Ｇ２とを混合し、３７℃で１夜反応させた後、前記実施例３に記載した手順に従って、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＰＶＤＦ膜への転写、及びブロッキングを実施した。続いて、前記ＰＶＤＦ膜に、アグリカナーゼネオエピトープを認識するマウスモノクローナル抗体ＢＣ−３（Ｈｕｇｈｅｓ  Ｃ．Ｅ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｊ．，３０５，７９９−８０４，１９９５）と、パーオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体（タゴ社製）とを、順次反応させた後、市販のウエスタンブロッティング検出システム（ＥＣＬウエスタンブロッティング検出システム；アマシャムファルマシア社製）を用いて検出した。
その結果、プラスミドｐＣＥＰｄＥ２−ＦＬＡＧ（コントロール）でトランスフェクションしたＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞の培養上清と、組換えアグリカンＧ１Ｇ２とを反応させても、抗アグリカナーゼネオエピトープ抗体と反応する分解物が認められなかったのに対して、プラスミドｐＣＥＰｄＥ２−ＭＤＴＳ８Ｆｕｌｌ−ＦＬＡＧでトランスフェクションしたＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞の培養上清と、組換えアグリカンＧ１Ｇ２とを反応させると、前記分解物が生成することが判明した。
本実施例により、ＭＤＴＳ８がアグリカナーゼ活性を有することが明らかになった。
実施例５：軟骨細胞分化に伴うＭＤＴＳ８のｍＲＮＡの発現誘導
（１）間葉系幹細胞の軟骨細胞への分化誘導
ヒト間葉系幹細胞は、ＴＧＦ−β３等の刺激下でスフェロイド培養することにより、軟骨細胞に分化することが知られている（Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒ  Ｍ．Ｆ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８４，１４３−１４７，１９９９）。
正常ヒト間葉系幹細胞（バイオ・ホイタッカー社製）を、ヒト間葉系幹細胞増殖培地キット（バイオ・ホイタッカー社製）で培養して５×１０５個の細胞を得た。続いて、２．５×１０５個の細胞を、不完全軟骨分化誘導培地［ＤＭＥＭ−ｈｉｇｈ  ｇｌｕｃｏｓｅ（ライフテクノロジー社製）、１ｍｍｏｌ／Ｌピルビン酸ナトリウム（ライフテクノロジー社製）、０．３５ｍｍｏｌ／Ｌプロリン（ライフテクノロジー社製）、０．１μｍｏｌ／Ｌデキサメタゾン（シグマ社製）、０．１７ｍｍｏｌ／Ｌアスコルビン酸−２−リン酸（シグマ社製）、及びＩＴＳ＋１  Ｃｕｉｔｕｒｅ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（シグマ社製）］で洗浄した後、完全軟骨分化誘導培地［０．０１μｇ／ｍＬのＴＧＦ−β３（シグマ社製）を含む不完全軟骨分化誘導培地］５００μＬに細胞を懸濁し、ポリプロピレンチューブを用いて１５０×ｇで５分間遠心分離することにより細胞ペレットを得た。得られた細胞ペレットを、そのまま細胞培養装置中で培養して、３〜４日に一度、完全軟骨分化誘導培地に培地交換しながら、２週間培養を継続した。
（２）軟骨細胞への分化の確認
未分化ヒト間葉系幹細胞及び分化誘導した細胞から、それぞれ、市販の総ＲＮＡ精製試薬（ＩＳＯＧＥＮ；日本ジーン社製）を用いて総ＲＮＡを調製した。得られた総ＲＮＡをＤＮアーゼ（日本ジーン社製）を用いて、３７℃で１５分間反応させた。ＤＮアーゼ処理した総ＲＮＡ０．５μｇをスーパースクリプト・ファーストストランドシステム（ＲＴ−ＰＣＲ用）（ギブコ・ＢＲＬ社製）を用いてｃＤＮＡに変換した。
前記実施例５（１）の分化誘導処理により、ヒト間葉系幹細胞が軟骨細胞に分化したことは、軟骨細胞に特異的に発現しているＩＩ型コラーゲン及びＩＸ型コラーゲンのｍＲＮＡが分化誘導に伴い、著しく発現上昇していることで確認した。具体的には、シークエンスディテクター（Ｐｒｉｓｍ７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ；アプライド・バイオシステムズ社製）を用いた定量ＰＣＲにより存在量を測定し、比較した。なお、プライマーセットとしては、ＩＩ型コラーゲンについては、配列番号１５で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号１６で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとの組み合わせを、ＩＸ型コラーゲンについては、配列番号１７で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号１８で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとの組み合わせを、それぞれ使用した。また、ＰＣＲは、市販のＰＣＲ試薬（ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  ｃｏｒｅ  ｒｅａｇｅｎｔ；アプライド・バイオシステムズ社製）を用い、９５℃（１０分間）の初期変性反応を実施した後、９４℃（１５秒間）と６０℃（３０秒間）と７２℃（６０秒間）とからなるサイクル反応を４５回繰り返すことにより実施した。
また、ｍＲＮＡ発現量算出の標準曲線を得るために、ヒト染色体ＤＮＡを鋳型として、前記プライマーセットを用いて同条件のＰＣＲを行なった。更に、内部標準としてヒトグリセルアルデヒド３−リン酸脱水素酵素（Ｇ３ＰＤＨ）の発現量を算出するために、前記ｃＤＮＡ及びヒト染色体ＤＮＡをそれぞれ鋳型として、配列番号２１で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号２２で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとの組み合わせをプライマーセットとして、同条件のＰＣＲを行なった。このＧ３ＰＤＨの測定値により、ＩＩ型コラーゲン又はＩＸ型コラーゲンの各ｍＲＮＡの存在量を補正した。
（３）軟骨細胞でのＭＤＴＳ８遺伝子の発現
新規アグリカナーゼ遺伝子ＭＤＴＳ８のｍＲＮＡ量を測定するのに用いるプライマーセットとして、配列番号１で表される塩基配列に基づいて、配列番号１９で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号２０で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとを設計した。これらのオリゴヌクレオチドの組み合わせをプライマーセットとし、前記実施例５（２）で調製したｃＤＮＡ（総ＲＮＡ換算で５ｎｇ相当）を鋳型とし、ＤＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ  ＬＡ  ＴａｑＴＭ；宝酒造社製）を用いてＰＣＲを行なった。前記ＰＣＲでは、最初に９４℃（２分間）で熱変性を行なった後、９８℃（１０秒間）と６０℃（３０秒間）と７２℃（１分間）とからなるサイクルを４０回繰り返した。
また、Ｇ３ＰＤＨ遺伝子の発現をモニターするために、配列番号２１で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号２２で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとの組み合わせをプライマーセットとして用い、前記実施例５（２）で調製したｃＤＮＡ（総ＲＮＡ換算で５ｎｇ相当）を鋳型とし、ＤＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ  ＬＡ  ＴａｑＴＭ；宝酒造社製）を用いてＰＣＲを行なった。前記ＰＣＲでは、最初に９４℃（２分間）で熱変性を行なった後、９８℃（１０秒間）と６０℃（３０秒間）と７２℃（１分間）とからなるサイクルを３０回繰り返した。
その結果、軟骨細胞分化に伴ったＧ３ＰＤＨ遺伝子の大きな発現変動は認められなかったのに対して、本発明の新規アグリカナーゼ遺伝子ＭＤＴＳ８のｍＲＮＡは、分化前のヒト間葉系幹細胞では検出されず、軟骨細胞では約０．３３ｋｂｐのバンドとして検出された。すなわち、本発明の新規アグリカナーゼ遺伝子ＭＤＴＳ８のｍＲＮＡが軟骨細胞で遺伝子発現することが示された。
実施例６：新規アグリカナーゼ遺伝子ＭＤＴＳ８の染色体座の決定
配列番号１で表される塩基配列からなる新規アグリカナーゼ遺伝子ＭＤＴＳ８の全長ＯＲＦの遺伝子配列を問い合わせ配列として、ＧｅｎＢａｎｋをＢＬＡＳＴ検索したところ、ＭＤＴＳ８の部分配列を含有するＢＡＣクローンＡＣ０２６４９８、ＡＣ０２５２８４、ＡＣ０１０５４８、及びＡＣ００９１３９が発見された。なお、いずれのクローンにも、最小で２４個あるエクソンの一部しか存在しなかった。
続いて、東大医科学研究所及び理化学研究所により構築され、ウェブ上に公開されている公開データベース（Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  ＲＥｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  Ｐｒｏｊｅｃｔ；ｈｔｔｐ：／／ｈｇｒｅｐ．ｉｍｓ．ｕ−ｔｏｋｙｏ．ａｃ．ｊｐ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＨＴＧ＿ｔｏｏｌ／ｖｉｅｗ．ｃｇｉ？ｌａｙｅｒ＝ｔｏｐ）を利用し、これらのクローン４種が染色体１６ｑに存在することを確認した。また、この検索により、前記クローン４種には、１６ｑ番染色体に存在する遺伝子座マーカーＷＩ−２２５３３、ｓｔＳＧ３０６９、ＳＧＣ３２９５２、及びｓｔＳＧ６２７３２が含まれていることが確認された。
続いて、１６ｑ番染色体に存在する前記マーカーＷＩ−２２５３３、ｓｔＳＧ３０６９、ＳＧＣ３２９５２、及びｓｔＳＧ６２７３２を用い、より詳細な遺伝子座を決定した。具体的には、別の公開データベース（Ｔｈｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｄｂ．ｏｒｇ／）を用いて、前記の４つの遺伝マーカーを検索し、それらがいずれも染色体の物理地図上の１６ｑ２２．３−２３．１にあることから、ＭＤＴＳ８が染色体１６ｑ２２．３−２３．１にあることが判明した。これにより、ＭＤＴＳ８の染色体座が、関節疾患であるＯＡ感受性領域として特定されている領域に存在することが明らかとなった。
産業上の利用可能性
本発明のポリペプチドは、関節疾患（特にＯＡ）の原因となる新規アグリカナーゼであるので、本発明のポリペプチドのアグリカナーゼ活性を阻害する物質は、関節疾患治療用物質として有用である。
また、本発明のポリペプチドによれば、関節疾患治療剤の簡便なスクリーニング系を提供することができる。すなわち、本発明のポリペプチドを利用する本発明の検出方法を用いることにより、本発明のポリペプチドのアグリカナーゼ活性を阻害する物質を選択し、関節疾患治療用物質をスクリーニングすることができる。
また、前記スクリーニング方法で選択された物質を有効成分とし、担体、賦形剤、及び／又はその他の添加剤を用いて製剤化することにより、関節疾患治療用医薬組成物を製造することができる。
本発明の検出方法は、関節疾患治療用物質をスクリーニングする為のみでなく、関節疾患治療用医薬組成物の品質規格の確認試験において、用いることも可能である。すなわち、本発明の検出方法を用いて、試験化合物が本発明のポリペプチドのアグリカナーゼ活性を阻害するか否かを検出し、次いで、前記アグリカナーゼ活性阻害物質を製剤化することにより、関節疾患治療用医薬組成物を製造することができる。
更に、本発明のポリヌクレオチド、発現ベクター、細胞、及び抗体は、本発明のポリペプチドを製造するのに有用である。
配列表フリーテキスト
以下の配列表の数字見出し＜２２３＞には、「Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ」の説明を記載する。具体的には、配列表の配列番号３〜６、及び９〜１２の配列で表される各塩基配列は、人工的に合成したプライマー配列である。また、配列表の配列番号７、８、１３、及び１４の配列で表される各塩基配列は、人工的に合成したリンカー配列である。更に、配列表の配列番号２３の配列で表される塩基配列は、制限酵素ＮｏｔＩ認識配列及びＦＬＡＧタグ配列を含む人工的に合成した配列である。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。
【配列表】
0003800175.tif 000002
0003800175.tif 000003
0003800175.tif 000004
0003800175.tif 000005
0003800175.tif 000006
0003800175.tif 000007
0003800175.tif 000008
0003800175.tif 000009
0003800175.tif 000010
0003800175.tif 000011
0003800175.tif 000012
0003800175.tif 000013
0003800175.tif 000014
0003800175.tif 000015
0003800175.tif 000016
0003800175.tif 000017
0003800175.tif 000018