(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
炭化水素を資化する微細藻類であるPrototheca zopfii RND-16 (FERM P-18543)。
【請求項２】
炭化水素による汚染物にPrototheca zopfii RND-16 (FERM P-18543)を接触させる工程を有することを特徴とするバイオレメディエーション方法。
【請求項３】
汚染物が、炭化水素を含有する排水である請求項２のバイオレメディエーション方法。
【請求項４】
汚染物が、炭化水素を含有する土壌とである請求項２のバイオレメディエーション方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この出願の発明は、炭化水素を資化できる微細藻類とそれを用いた排水の浄化方法に関するものである。さらに詳しくは、この出願の発明は高温度、高塩濃度を含む広い塩濃度範囲、さらには広いｐＨ範囲において、炭化水素を資化できる微細藻類と、それを用いたバイオレメディエーション方法に関するものである。
【０００２】
【従来技術とその課題】
近年大きな社会問題となっている海洋汚染では、その発生源として、有害化学物質、油類、放射性物質、廃棄物の投棄、富栄養価物などが知られている。
【０００３】
中でも、油類による汚染は、原油生産地域のみならず、油脂を使用あるいは生産する工場、たとえば食品加工場等の周辺においても問題となっている。また、油田から原油を搬送する際にタンカーの事故が起これば、広い海域に渡り水質汚染が起こり、海鳥、哺乳動物、魚介類等の周辺環境に甚大な被害をもたらす。例えば、海鳥や海洋性の哺乳動物は、羽毛や皮膚表面に疎水性物質を有し、海水との直接接触を防止して体温を維持しているが、油が付着すると、この疎水性物質が失われるため体温が低下し、生存できなくなる。また、これらの動物は海水から余分な塩分を排出しながら水分を補給するが、油の付着によりこの機能も失われるため、脱水症状を起こす。さらに、海草や魚介類は、表面に油が付着することにより光合成や呼吸ができなくなり、死滅する。
【０００４】
従来、タンカーや油田の事故により一過的に水域に流出した原油や石油は、オイルフェンスによりその広がりを防止し、界面活性剤や有機溶剤からなる油処理剤を散布することにより、油が水と混合するようにして処理していた。しかし、油処理剤を使用する方法では、流出した油類は、小さな油滴となり、水と混合され、やがて海洋中に希釈されてその被害の規模を縮小できるものの、根本的な解決にはならない。また、工業排水等に少量含まれる油類の処理には適用できるものではなかった。
【０００５】
そこで、光や熱により油を分解する方法や、活性炭や薬剤を用いた物理化学的吸着等の方法も提案され、一部で使用されている。しかし、これらの方法は、光や熱、あるいは大量の試薬を用いる上、浄化のための機械設備等を必要とするため、コストが高い、タンカー事故等の遠洋における油の処理には適用しにくい、広範に渡る汚染には対応できないなどの問題があった。
【０００６】
そこで、近年、環境適応性の高い方法として、バイオレメディエーションが注目されている。バイオレメディエーションは、浄化機能を有する各種の微生物を用いて、環境汚染の著しい水域や土壌における油等の炭化水素や富栄養価物等を乳化、分解、資化する方法であり、常温・常圧で行うためにエネルギーをほとんど必要としない。したがって、コストが低い、汚染の現場で直接的に処理を行うことができる、油田や工場の操業中であっても浄化処理を行うことができる、広範囲に渡る汚染を浄化することができる、などの利点を有する。
【０００７】
このようなバイオレメディエーションで用いられる微生物としては、各種のものが知られている。たとえば、Agrobacterium属やRodococcas属の油分解性バクテリアが、高い炭化水素分解性を示すものとして報告されている（Biosci.Biotechnol.Biochem., 59, 11, 2159-2161 (1995)）。また、石油分解酵母（Candida maltosa）は、低いｐＨ領域においても高い活性を示すものとして報告されている（Wolf, K., ed, Non-conventional Yeast in Biotechnology, pp.426-430 (1996)）。しかし、これらのバクテリアは、低いｐＨにおける分解能が低く、酵母は、３０℃以上の高温およびｐＨ６．５以上では活性が著しく低下するため、高温地域では使用できないという問題があった。
【０００８】
さらに、酵母様の形態を示す真核微生物であるPrototheca属、中でもPrototheca hydrocarboneaやPrototheca zopfii等の緑藻が石油分解性を有することが報告されているが、これらの育成及び分解の条件は、ｐＨ３〜９、塩化ナトリウム濃度０．８〜２．４重量％、２５℃以下であり、限られた環境下においてのみ、活性を示す。とくに３０℃以上を超える温度では、生育及び油成分の分解は不可能とされていた（Appl.Environ.Microb., p.333-336 (1983); System.Appl.Microbiol.5, 119-123 (1984)）。一般的に海水の塩濃度は約３．５重量％であるため、従来報告されているPrototheca属の藻類は、海水からの油成分の分解・浄化には使用できない。また土壌汚染に対しては、使用できる温度と塩濃度の範囲が限定されているため、沿岸地域や気温の高い地域では使用できなかったのが実情である。
【０００９】
したがって、この出願の発明は、以上のとおりの問題点を解決し、広範囲なｐＨ、温度および塩濃度の土壌や河川、湖沼、海洋等において実施できるバイオレメディエーションの方法と、それに適用するための微生物として、高温度、高塩濃度を含む広い塩濃度範囲、あるいは広いｐＨ範囲においても炭化水素を資化できる微生物を提供することを課題としている。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
この出願の発明は、以上のとおりの課題を解決するものとして、まず、第１には、炭化水素を資化する微細藻類であって、３０〜４０℃の温度領域において炭化水素を資化できることを特徴とする微細藻類を提供する。
【００１１】
この出願の発明は、第２には、０〜２Ｍの塩濃度範囲で炭化水素を資化できる前記の微細藻類を、第３には、ｐＨ３〜９の範囲で炭化水素を資化できる前記いずれかの微細藻類を、第４には、バイオサーファクタント能を有する前記いずれかの微細藻類を提供する。
【００１２】
この出願の発明は、また、第５には、前記の微細藻類がPrototheca属の微細藻類であること、および、第６には、前記のPrototheca属に属する微細藻類がPrototheca zopfii RND-16（Ferm P-18543）であることをその態様として提供する。
【００１３】
さらに、第７には、この出願の発明は、少なくとも前記いずれかの微細藻類を用いることを特徴とするバイオレメディエーション方法を提供する。
【００１４】
そして、この出願の発明は、第８には、炭化水素を含有する排水を浄化する方法であって、少なくとも、排水に前記いずれかの微細藻類を接触させる工程を有することを特徴とするバイオレメディエーション方法を、第９には、炭化水素によって汚染された土壌を浄化する方法であって、少なくとも、汚染土壌に前記いずれかの微細藻類を接触させる工程を有することを特徴とするバイオレメディエーション方法をも提供する。
【００１５】
【発明の実施の形態】
この出願の発明者らは、鋭意研究により、静岡県伊豆蓮台寺温泉の４０℃および３５．５℃の排水中から分離した酵母様微生物１２株の中に、広範囲なｐＨ領域および塩濃度において炭素水素を資化する微細藻類を見出し、本願発明に至ったものである。具体的には、本願発明の微細藻類は、３０〜４０℃の温度範囲、ｐＨ３〜９の範囲、０〜２Ｍの塩濃度範囲で炭化水素を資化できるものである。
【００１６】
また、後述の実施例からも明らかなように、本願発明の微細藻類は、炭化水素を資化する際に、界面活性剤成分を分泌し、石油等の炭化水素成分を乳化して油滴を形成した後、その油滴に入り込み増殖する。すなわち、この発明の微細藻類は、バイオサーファクタント能を有するものでもある。
【００１７】
本発明者らは、この微細藻類についてさらに研究を進め、18SrDNAの塩基配列による系統解析からこの微細藻類がPrototheca zopfii var. hydrocaroneaに属することを明らかにした。また、この微細藻類は、Prototheca zopfiiと１００％の確率で単系統を形成すると同時に、同じ従属栄養のPrototheca属であるPrototheca wickerhamiiよりも独立栄養のクロレラであるAuxenochlorella protothecoidesに近縁であることも明らかにされている。
【００１８】
さらに、この出願の発明の微細藻類は、従来報告されているPrototheca zopfiiには見られない次のような特徴を有するものである。
【００１９】
（ａ）炭化水素を資化してエタノールとする
（ｂ）一般培地で、４０℃以上の高い温度範囲で増殖する
（ｃ）炭化水素を炭素源とする培地で、４０℃までの高い温度範囲で増殖する
（ｄ）静置培養における炭化水素の最大資化速度が従来公知の菌株の２倍以上である
そして、本願の発明者らは、以上のとおりの特性を有する微細藻類を特許寄託している（受託番号：FERM P-18543）。
【００２０】
したがって、この出願の発明の微細藻類を原油の流出した海洋や土壌、油等の炭化水素成分を含有する排水や土壌と接触させれば、迅速にかつ効率よく、炭化水素成分が分解され、浄化処理が行える。この出願の発明の排水および汚染土壌の浄化方法では、微細藻類と排水または土壌の接触方法はとくに限定されず、浄化対象の地域や水域に前記微細藻類を散布する方法や、排水や汚泥を該微細藻類を含有する浄化槽に導入する方法等のさまざまな方法が適用できる。もちろん、これらの浄化方法では、排水または土壌を微細藻類と接触させる工程以外に、洗浄、沈降、ろ過、攪拌、培養等の様々な工程を有していてもよい。
【００２１】
この出願の発明の微細藻類を用いるバイオレメディエーション方法は、従来公知の微生物を用いる方法に比べ、温度、塩濃度、ｐＨ等の浄化条件が広いため、海洋や高温地域、低ｐＨ土壌、沿岸地域等のあらゆる環境において適用できる。
【００２２】
なお、この出願の発明の微細藻類は、炭化水素を資化するだけでなく、グルコースからガスを発生する嫌気代謝を行うことも明らかになっている。そして、このようなガスの発生を伴う糖の発酵（エタノール発酵）は、従来のPrototheca属藻類においては知られていなかった性質である。
【００２３】
以下、実施例を示してこの出願の発明についてさらに詳細に説明する。もちろん、この出願の発明は、以下の実施例に限定されるものではないことはいうまでもない。
【００２４】
【実施例】
＜実施例１＞
静岡県の伊豆連光寺温泉の４０℃および３５．５℃の排水から分離した微細藻類Prototheca zopfii RND-16株（FERM P-18543）を４％（v/v）ｎ−ヘキサデカン（Ｃ16：和光純薬製、#080-03685）を含むＹＮＢ培地（Difco製、#291940）中に添加し、２５、３０、３５℃でそれぞれ２０日間培養した。
【００２５】
培養開始から微細藻類の数をトーマ血球計により数えた。
【００２６】
図１に各温度における増殖曲線を示した。
【００２７】
これより、本願の微細藻類がＮ−ヘキサデカンの存在下で３５℃においても良好な増殖を示し、その速度が２５℃よりも明らかに大きいことが確認された。
【００２８】
また、Ｎ−ヘキサデカンを活発に資化、分解している微細藻類を顕微鏡で観察し、写真を撮影した。図２に、微細藻類の顕微鏡写真を示した。
【００２９】
図２より、本願発明の微細藻類は、界面活性剤成分を分泌し、水中のｎ−ヘキサデカンを乳化して油滴を形成した後その油滴中に入り込み、ｎ−ヘキサデカンを分解、資化することが確認された。
＜実施例２＞
実施例１と同様に、微細藻類Prototheca zopfii RND-16株（FERM P-18543）をテトラデカン（Ｃ14）、ペンタデカン（Ｃ15）、ヘキサデカン（Ｃ16）、ヘプタデカン（Ｃ17）中にそれぞれ添加し（１％(v/v)）、３５℃で培養した。
【００３０】
培養液中に残存する各ｎ−アルカンの濃度をガスクロマトグラフにより分析した。図３（ａ）に培養前、図３（ｂ）に１０日間培養後の結果を示した。
【００３１】
図３より、培養１０日目で４種類のｎ−アルカンがほとんど分解されることが確認された。
【００３２】
以上の試験結果から、この出願の発明の微細藻が、従来知られているPrototheca zopfiiとは全く異なる性質を示す新規微生物であることが示された。また、この微細藻類は、高温度範囲でも炭化水素である各種ｎ−アルカンを迅速に、効率よく分解、浄化できることが確認された。
【００３３】
【発明の効果】
以上詳しく説明したとおり、この出願の発明により、新規な炭化水素資化微細藻類と、それを用いた炭化水素含有排水の浄化方法が提供される。この微細藻類は、広範囲なｐＨ、温度及び塩濃度において炭化水素成分を分解浄化できるものであり、油田や原油タンカーの事故等によって油が流出した海洋や土壌や、炭化水素成分を含有する工業排水等のバイオレメディエーションに適用できる微生物として有用性が高い。
【図面の簡単な説明】
【図１】この出願の発明の実施例において、本願発明の微細藻類をｎ−ヘキサデカン存在下、各温度で培養した際の増殖曲線を示した図である。
【図２】この出願の発明の微細藻類がヘキサデカンを資化、分解している様子の顕微鏡写真を示した図である。
【図３】この出願の発明の実施例において、本願発明の微細藻類を各種ｎ−アルカンの存在下に培養した際のガスクロマトグラフを示した図である。（ａ：培養前、ｂ：培養後）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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