(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）混合物を非誘導シリカ粒子に通してポリペプチドをシリカ粒子に吸着させ、
（ｂ）シリカ粒子を洗浄して夾雑物を除去し、
（ｃ）溶媒としてエタノールおよび塩として塩化ナトリウムを含む緩衝液でシリカ粒子からポリペプチドを溶離する、工程からなる、混合物中の疎水性の異なる成分から、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ結合蛋白質、血管内皮成長因子、またはＲＡＮＴＥＳからなるグループから選択される、目的とするポリペプチドを選択的に分離する方法。
【請求項２】
ポリペプチドがＩＧＦ−Ｉである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＩＧＦ−Ｉが完全長ＩＧＦ−Ｉである請求項２に記載の方法。
【請求項４】
シリカ粒子のポアサイズが約２２５Åである請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ＩＧＦ−Ｉが脳ＩＧＦ−Ｉである請求項２に記載の方法。
【請求項６】
粒子が工程（ｂ）においてリン酸緩衝液中のアルコール溶媒を用いて洗浄される請求項１に記載の方法。
【請求項７】
アルコール溶媒が、ｐＨ７のリン酸緩衝液中、約２０％（ｖ／ｖ）エタノールである請求項６に記載の方法。
【請求項８】
工程（ｃ）で用いる緩衝液がリン酸緩衝液である請求項１に記載の方法。
【請求項９】
シリカ粒子のポアサイズが約２００〜１０００Åである請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
塩化ナトリウムの濃度が約０．２〜３Ｍである請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
エタノールの濃度が約５〜４０％（ｖ／ｖ）である請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
溶離用緩衝液のｐＨが約５〜８である請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
（ａ）混合物を非誘導シリカ粒子のカラムにロードし、
（ｂ）カラムを緩衝液で洗浄して夾雑物を除去し、
（ｃ）溶媒として約５〜４０％（ｖ／ｖ）のエタノール、および塩として約０．２〜３Ｍの塩化ナトリウムを含むｐＨ約５〜８の緩衝液でカラムからＩＧＦ−Ｉを溶離する、工程からなる、混合物からＩＧＦ−Ｉを精製する方法。
【請求項１４】
カラムをリン酸緩衝液中のアルコール溶媒で洗浄する請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
アルコール溶媒が、ｐＨ７のリン酸緩衝液中、約２０％（ｖ／ｖ）エタノールである請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
エタノールの濃度が約１０〜３０％（ｖ／ｖ）である請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
塩化ナトリウムの濃度が約０．５〜２Ｍである請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
溶媒が、ｐＨ７のリン酸緩衝液中、約２０％（ｖ/ｖ）濃度のエタノールであり、塩が約１Ｍ濃度の塩化ナトリウムである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
ＩＧＦ−Ｉが完全長ＩＧＦ−Ｉである請求項１３に記載の方法。
【請求項２０】
ＩＧＦ−Ｉが脳ＩＧＦ−Ｉである請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
本発明は、一段階で、細胞培養液のような混合液から、中等度の疎水性を有するポリペプチドを実質的に均質になるまで精製するための一般的な方法に関する。
背景と関連技術の説明
蛋白の大規模で経済的な精製はバイオテクノロジー産業においてますます重要な問題となっている。一般的に蛋白は、目的とする蛋白を製造するためにその蛋白の遺伝子を含む組換えプラスミドを挿入された哺乳動物細胞系または細菌細胞系を用いて細胞培養から製造される。使用する細胞系は生きた有機体であるため、糖、アミノ酸、および通常、動物血清の調製物から供給される成長因子を含有する複雑な増殖培地を用いて培養する必要がある。目的とする蛋白を、ヒトの治療薬として使用するのに十分な純度で、細胞を培養した化合物混合物および細胞自身の副産物から分離することはきわめて困難な問題である。通常、精製手順は複数の段階からなり、高価な装置やクロマトグラフィー法が必要である。Ogezらの、Biotech.Adv.,7:467-488（1989）およびSoferの、Bio/Technology,4:712-715（1986）参照。
細胞屑から蛋白を精製する手順は、まず最初に蛋白の発現部位に依存する。ある蛋白は細胞から増殖培地中に直接分泌され、別の蛋白は細胞内に産生される。後者の蛋白の場合は、精製法の最初の工程に細胞の溶解が含まれるが、これは機械的振盪、浸透圧衝撃、または酵素処理を含む様々な方法によって行うことができる。そのような崩壊によって、細胞の全内容物がホモジネート中に放出され、さらに大きさが小さいために除去することが困難な、細胞より小さい断片が生じる。この断片は、通常、分画遠心や濾過によって除去される。小規模ではあるが、蛋白製造操作の過程で細胞が自然死することによって、直接蛋白が分泌される場合にも同様な問題が生じる。
目的の蛋白を含む、夾雑物を除去した溶液が得られたら、通常、種々のクロマトグラフィー技術の組み合わせによって、目的の蛋白を細胞が産生した他の蛋白と分離する。この技術では、蛋白の価電、疎水性の程度または大きさに基づいて蛋白の混合物が分けられる。これらの技術ごとにいくつかの異なるクロマトグラフィー樹脂を用いて、特定の蛋白の精製計画を正確に立てることができる。
蛋白によっては所望により、精製すべき蛋白と第二蛋白（特異抗体のような）の相互作用を利用するアフィニティークロマトグラフィーを行ってもよい。
これらの各分離法は本質的に、蛋白が長いカラム内を異なる速度で移動することにより、蛋白がカラム内を通過するにつれて蛋白の分離が促され、物理的な分離が達成されるか、または分離媒質に直接吸着し、次いでこれを異なる溶媒で分別溶離することができる。ある場合には、夾雑物がカラムに特異的に吸着し、目的とする蛋白が吸着しない（すなわち、目的の蛋白が「通過（フロースルー）液」中に存在する）ことにより、所望の蛋白が挟雑物から分離される。
これらの精製技術の１つとして、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を製造規模で行うことができる。この場合、極めて高価なカラムサイズと、より通常の条件下できわめて遅い分離工程を必要とする樹脂を用いて、高度の分離を行うことができる。しかしながら、この技術では、高価な装置と、高圧下で数百回ないし数千回精製を繰り返すことができる化学的および機械的安定性を有するクロマトグラフィーカラムとパッキングを用いる必要がある。
吸着クロマトグラフィーはしばしばステロイドのような低分子の精製に用いられており、現在では大規模な蛋白精製にも使用されることが多くなってきている。シリカ粒子が、高いキャパシティーと親和性により蛋白を吸着する能力を有することは以前から知られている。主たる進歩は、活性型の蛋白を高収量で脱着するための方法の決定である。
この方法の初期の使用において、ｐＨを変えるか（Edyらの、J.Gen.Virol.,33:517-521（1976））、カオトロピックな塩を用いて溶離が行われてきた（Whitmanらの、J.Interferon Res.,1:305-312（1981））。ChadhaおよびSulkowskiの、J.Interferon Res.,2:229-234（1982）は、アルキルアミンと有機溶媒を溶離剤に用い、インターフェロンを高率に回収した。彼らはガラス上での蛋白の結合および脱着に関するメカニズムの理論を提案している（ChadhaおよびSulkowskiらの、Prep.Biochem.,11:467-482（1981））。この理論は、蛋白がシリカに結合する際の極性力と非極性力の両方を考慮しており、良好な溶離剤は両タイプの結合を自在に切り離せる必要があることを報告している。
多くの実験が「多孔性制御」ガラスを用いて行われているが、普通のシリカ粒子のような他の多孔性ガラスでも数分の１のコストで同等の性能を得ることができる。非誘導シリカ粒子であるベアーシリカは、主として乾燥剤として販売されている。シリカは高価でなく、十分な化学的活性を有し、広範囲の置換基を加えることができるため、クロマトグラフィー媒質を製造するのによく用いられている骨格である（Anspachらの、J.Chromatog.,443:45-54（1988）参照）。この論文は蛋白の溶離において様々なサイズ排除クロマトグラフィーカラムを検討し、２つの異なるカラムで別々に蛋白の溶離量に影響を与えるように、リン酸緩衝液の塩（塩化ナトリウム）濃度を変えることによって溶離剤のイオン強度を変化させた。さらに、シリカ粒子は強固であり、誘導シリカカラムを精製に反復使用することができ、カラムにおける良好な溶媒の流れが得られる。非誘導シリカは細胞屑および疎水性の高い夾雑物を除去するためのフィルターとして用いられるが、一般的にクロマトグラフィーの媒質としては用いられない。
シリカ粒子は、粒子サイズおよび粒子内のポアサイズが種々異なる、様々な形のものを利用することができる。粒子サイズは主としてシリカのパッキング（充填）特性を決定し、これによってシリカをカラムとして用いるときの流速や逆圧が決定される。しかし、ポアサイズは孔の内部に出入りする蛋白のサイズを決定する。Kiselevら（Column Chromatography, 5th Int.Symposium（Lausanne,10月7-10日、1969）、124-125頁）は、ポアサイズ約５００Åが分子量１００００〜１０００００ダルトンの範囲のポリスチレン分子を分離するに最適であることを示した。
インターフェロン−γのような蛋白を吸着するためにシリカ粒子を使用することが知られている。例えば、Panらの、Eur.J.Biochem.,166:145-149（1987）は、０．５Ｍ ＴＭＡＣ／トリスＨＣｌ（ｐＨ８．０）を用いる溶離を開示している。Stankovicらの、Anal.Biochem.,184:100-103（1990）は、クロロホルム：メタノール（１：１）を用いるグラミシジンＡの溶離にシリカ粒子を用いている。Manningらの、J.Chromatog.,487:41-50（1989）はメタノールおよびイソ−プロパノールを用いるエラスチンペプチドの分配における誘導シリカの使用を報告している。Skogenらの、Clin.Chem.,33:401-404（1987）は、疎水結合相シリカ粒子を用い、メタノール／水で溶離するジゴキシン様免疫反応性因子の抽出を開示している。Byrneらの、Anal.Biochem.,148:163-173（1985）は、シリカ粒子を含む連続クロマトグラフィーによるガングリオシドの分離を開示している。Takagiらの、J.Chromatog.,208:201-208（1981）は、高速シリカ粒子クロマトグラフィーにおいて、ドデシル硫酸ナトリウムと蛋白ポリペプチド間に形成された複合体の溶離特性に対する塩濃度の影響について開示している。Hillarらの、Bas.Appl.Histochem.,31:299-313（1987）は、Ｃ１８シリカ粒子カラムにおいて０．１Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液中のメタノールグラジエントを用いるシリカ粒子法を用い、子ウシ肝臓から核ペプチドを溶離している。本溶媒とブタン−１−オール−プロパン−２−オール−酢酸−水を用いる精製に関しては、Hillarらの、Physiol.Chem.Phys.Med.NMR,17:325-343（1985）、およびHillarらの、Physiol.Chem.Phys.Med.NMR,17:307-323（1985）を参照。
Mordarskiらの、Archivum Immunologiae et Therapiae Exper.,25:273（1977）は、ベンゼン中の１０％アセトン、次いでメタノールを用いるシリカ粒子による抗体精製を開示している。JentschおよびMueckeの、Int.J.Pept.Protein Res.,9:78-79（1977）は、ブタノール−１−ピリジン−酢酸−水で平衡化したシリカ粒子クロマトグラフィーによるハチ毒ペプチドの精製を開示している。Flouretらは、Int.J.Pept.Protein Res.,13:137-141（1979）でメタノールとクロロホルムの混合物を用いてシリカ粒子カラム吸着クロマトグラフィーによりオキシトシンを精製している。Stoffelらは、Poppe-Seyler's Z,Physiol.Chem.,364:1455-1466（1983）で、９０％蟻酸を溶媒に用いるシリカ粒子排除クロマトグラフィーによってプロテオリピッド アポ蛋白を精製している。Hemmasiらは、Hoppe-Seyler's Z.Physiol.Chem.,365:485-492（1984）で、クロロホルム：メタノールエチルアセテート／酢酸中、シリカ粒子およびセファデックスＬＨ−２０によるペプチドＩＩＩ（ウシインスリンＢ鎖のデコサペプチド）の精製を開示している。TrucksessとStoloffは、J.Assoc.Off.Anal.Chem.,62:1080-1082（1979）で、シリカ粒子カラム（クロロホルムで洗浄し、クロロホルム−メタノールで溶離する）によるアフラトキシンＢ１およびＭ１の精製を開示している。
Visserらの、Neth.Milk Dairy J.,29:319-334（1975）;Loginovaらの、Prikl.Biokhim.Mikrobiol.,14:715-718（1978）;Schmidtらの、Anal.Chem.,52:177-182（1980）.Luらの、Shengwu Huazue Yu Shengwu Wuli Jinzhan,48:46-48（1982）;Wangらの、Gaodeng Xuexiao Huaxue Xuebao,6:557-561（1985）;Duhamelらの、Tetrahedron Lett.,26:6065-6066（1985）;PickartおよびThalerの、Prep.Biochem.,5:397-412（1975）;PillotおよびPetitの、Mol.Immunol.,21:53-60（1984）;Moriseらの、Jpn Circ J.,52:1309-1316（1988）;Wangらの、Biochemistry,19:5111-5117（1980）;Adachiらの、J.Chromatogr.,428:247-254（1988）;Singhalらの、Cancer Res.,47:5566-5571;Taoらの、Biol.Chem.Hoppe Seyler,368:187-194（1987）;Mountらの、Arch.Biochem.Biophys.,240:33-42（1985）;およびHuennekensおよびHendersonの、Chemistry and Biology of Pteridines、Pfleiderer編（Berlin,de Gruyter,1975）も参照のこと。
多孔性ガラスによる蛋白精製の総説としては、Mizutaniの、J.Lig.Chromatog.,8:925-983（1985）がある。その９４７頁でMizutaniは、緩衝液中にエタノール５〜１０％を添加すると、蛋白の溶離力が増大するであろうと述べているが、裏付けとなるデータやそれ以上の情報は示していない。Bockらは、Science,191:380-383（1976）で、カオトロピック緩衝液を用いる多孔性制御ガラス吸着クロマトグラフィーによる蛋白精製を開示している。Mizutaniの総説に示された他の参考文献としては、Mizutaniの、J.Pharm.Sci.,69:279-282（1980）（溶離時に０．１％ＳＤＳを使用）、MizutaniおよびMizutaniの、J.Chrom.,168:143-150（1979）（標準蛋白を用い、多孔性制御ガラスとＣＭ−セルロースでの溶離を比較）、Mizutaniの、J.Pharm.Sci.69:1226-1227（1980）（０．２Ｍグリシン（ｐＨ８〜９）および０．１％グリシンを用い、多孔性制御ガラスから抗体を溶離）、およびYipらの、Proc.Natl.Acad.sci.USA,78:1601-1605（1981）（リン酸緩衝液中、塩化ナトリウムとエチレングリコールの混合物を用いてインターフェロン−γを溶離）が挙げられる。
さらに、米国特許文献において、シリカ粒子吸着剤を用いる蛋白および他の分子の精製が、米国特許番号４９０８４３２号（１９９０年３月１３日発行）、第５０５７４２６号（１９９１年１０月１５日発行）、第４７７７２４２号（１９８８年１０月１１日発行）（シリカガラスビーズに腫瘍壊死因子を吸着させ、緩衝溶液で洗浄し、ｐＨ８〜１１で低級アルカノール、ポリオール、アミン、またはアミノアルコールで溶離した）、第５００４６８８号（１９９１年４月２日発行）、第４８４９４３４号（１９８９年７月１８日発行）、第５０７１９５９号（１９９１年１２月１０日発行）、第４６５２５２９号（１９８７年３月２４日発行）、第４７３８９２６号（１９８８年４月１９日発行）、第４８９４３３０号（１９９０年１月１６日発行）、第４１９９４５０号（１９８０年４月２２日発行）、第３８６９４８２号（１９７５年３月４日発行）、第３９０４７５１号（１９７５年９月９日発行）、第４７２５６７３号（１９８８年２月１６日発行）、第３８７６７７５号（１９７５年４月８日発行）、に記載されている。
本主題に関する外国公開特許文献としては、日本国特許出願第１０５１０９７号（１９８９年２月２７日公開）、日本国特許出願第５９１５９７５３号（１９８４年９月１０日公開）、ドイツ国特許出願第２０９１８７号（１９８４年４月２５日公開）、欧州特許第４３１６７９号（１９９１年６月１２日公開）、欧州特許出願第３３７４９２号（１９８９年１０月１８日公開）、ドイツ国特許出願第２８６７２１号（１９９１年２月７日公開）、日本国特許出願第９０２３４６９２号（１９９０年９月１７日公開）、ドイツ国特許出願第２８０１７４号（１９９０年６月２７日公開）、日本国特許出願第５１１１８８１０号（１９７６年１０月１９日公開）、日本国特許出願第７３００８４８２号（１９７０年７月２０日に日本国特許出願第７０６３１３８号として出願）、日本国特許出願第５０１１６６９１号（１９７５年９月１２日公開）、日本国特許出願第７３０１９３１８号（１９７０年４月１７日に日本国特許出願第７０３３３５５号として発行）、ドイツ国特許出願第２１７８２３号（１９８５年１月２３日公開）、ドイツ国特許出願第２９８２７５号（１９９２年２月１３日公開）、ＦＲ第２６５３０３４号（１９９１年４月１９日公開）、ＳＵ第５６０６１４号（１９７７年７月２０日公開）、ＳＵ第１２７２２２７号（１９８６年１１月２３日公開）、ＣＳ第１８７８１５号（１９８１年１２月１５日公開）、ＣＳ第２４３３３６号（１９８７年５月１５日公開）、ＦＲ第２６００３４１号（１９８７年１２月２４日発行）、ＫＲ第９２０６４０１号（１９９２年８月６日公開）、ＷＯ第９３／００３６１号（１９９３年１月７日公開）、およびＫＲ第９０００７４８号（１９９０年２月１５日公開）などが挙げられる。
ChadhaとSulkowski（Prep.Biochem.（前述））は、テトラメチルアンモニウムクロリド（ＴＭＡＣ）を用いて、多孔性制御ガラスから蛋白、具体的にはインターフェロン−γを溶離した先駆者である。彼らは５０〜７５％エチレングリコール、１Ｍ塩化アンモニウム、または１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌを用いて部分的にインターフェロン−αを回収したことを開示した。しかし、これらの試薬では他の蛋白も溶離されるため、ＴＭＡＣほど選択的ではなかった。Panら（前述）も参照のこと。ＴＭＡＣを用いる溶離にもいくらかの欠点がある。例えば、ＴＭＡＣは、蛋白であるインスリン様成長因子（ＩＧＦ−Ｉ）に比べて比較的疎水性であり、後の工程でＩＧＦ−Ｉから除去することが困難な他のいくつかの蛋白を溶離する。ＩＧＦ−Ｉはゲル濾過、次いでスルホプロピル置換カチオン交換カラムでのイオン交換、次いで緩衝液交換、および第二ゲル濾過工程による分画化によって精製されている。次に、プレパラティブ等電点フォーカシングによりさらに同様の等電点を持つ夾雑物からＩＧＦ−Ｉを分離し、次いで２つの逆相クロマトグラフィー工程を経て純粋なＩＧＦ−Ｉを得た（Cornellらの、Prep.Biochem.,14:123（1984））。多くの工程が関与するため、このプロトコールがあまり効率的ではないことは明白である。
これに代わるＩＧＦ−Ｉ精製プロトコールでは、リンカーによってプロテインＡとＩＧＦ−Ｉを融合させる必要がある。この方法によれば、培養上清をアガロースに結合させたＩｇＧからなるアフィニティーカラムを通過させる。夾雑物はカラムを通過するのに対し、ＩＧＦ−Ｉ融合産物はカラムと結合し、この結合した物質を溶離し、処理してリンカーを除去し、次いでＩｇＧ−アガロースを通過させて遊離のプロテインＡを除去する。Moksらの、Bio/Technology,5:379-382（1987）、およびSoferの、Bio/Technology,4:712-715（1986）を参照。
ＩＧＦ−Ｉは、カチオン交換吸着剤と疎水性相互作用吸着剤を組み合わせて用いる一連の吸着−脱着工程によっても精製されてきた。米国特許第５２３１１７８号（１９９３年７月２７日発行）も参照のこと。別のＩＧＦ−Ｉ精製法には、ヒトＩＧＦ−Ｉ含有培養ブロスを遠心し、上清を蒸留水で希釈し、得られる溶液をｐＨ５．６に調節し、この溶液を弱陰イオン交換樹脂と１０ｍＭリン酸緩衝溶液（ｐＨ５．６）に通し、ヒトＩＧＦ−Ｉ分画を１５０〜２００ｍＭ ＮａＣｌ溶液に溶解させ、次いでこの分画をＤＥ陽イオン交換樹脂と１０ｍＭ トリス緩衝溶液に通して最終産物を得ることが含まれる。ＫＲ第９２０８３７７号（１９９２年９月２６日公開）参照。さらに、ＫＲ第９２０８３７８号（１９９２年９月２６日公開）は、ＩＧＦ−Ｉ含有培養ブロスを陰イオン交換樹脂カラムに通し、このカラムをリン酸緩衝液で洗浄し、次いで塩化ナトリウム含有炭酸ナトリウム溶液に溶解させてＩＧＦ−Ｉ分画を得、この分画を陽イオン交換樹脂カラムに通し、濃縮し、次いでこの濃縮溶液をゲル濾過カラムに通して最終産物を得ることによるＩＧＦ−Ｉの精製法を開示している。
本発明の目的は、高価でない非誘導シリカ粒子のみを用いて疎水性夾雑物からポリペプチドを精製する一般的な方法を提供することである。
本発明の別の目的は、シリカ粒子を破壊しないイオン性溶媒および有機溶媒を組み合わせて用い、非誘導シリカ粒子からポリペプチドを選択的に溶離させる方法を提供することである。
本発明の具体的な目的は発酵液からＩＧＦ−Ｉを精製する方法を提供することである。
これらおよび他の目的は、当業者には明らかになるであろう。
本発明の要約
したがって、本発明の１つの目的は、
（ａ）混合物を非誘導シリカ粒子に通してポリペプチドをシリカ粒子に吸着させ、
（ｂ）シリカ粒子を洗浄して夾雑物を除去し、
（ｃ）アルコール溶媒または極性非プロトン性溶媒、およびアルカリ土類塩、アルカリ金属塩または無機アンモニウム塩を含む緩衝液を用いてシリカ粒子からポリペプチドを溶離する、工程からなる混合物中の疎水性の異なる成分から目的とするポリペプチドを選択的に分離する方法を提供することである。
別の目的として、本発明は、
（ａ）混合物を非誘導シリカ粒子のカラムに通し、
（ｂ）カラムを緩衝液で洗浄して夾雑物を除去し、
（ｃ）アルコール溶媒または極性非プロトン性溶媒約５〜４０％（ｖ/ｖ）、および約０．２〜３Ｍのアルカリ土類塩、アルカリ金属塩または無機アンモニウム塩を含む緩衝液（約ｐＨ５〜８）を用いてカラムからＩＧＦ−Ｉを溶離する、工程からなるＩＧＦ−Ｉを含む混合物からＩＧＦ−Ｉを精製する方法を提供するものである。
図の簡単な説明
図１は、シリカ上で０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７）中のＴＭＡＣを段階的に増量させて得られた分画のＲＰ−ＨＰＬＣ分析結果を示す。クロマトグラムは上からリン酸塩、０．１Ｍ ＴＭＡＣ、０．３Ｍ ＴＭＡＣ、０．６Ｍ ＴＭＡＣ、０．９Ｍ ＴＭＡＣ、１．２Ｍ ＴＭＡＣ、１．５Ｍ ＴＭＡＣ、および２．０Ｍ ＴＭＡＣの順である。０．３Ｍ ＴＭＡＣのクロマトグラムの矢印はミス−ホールディングされたモノマーとＩＧＦモノマー（左から右に向かって）を表す。
図２は、シリカ上で０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７）中のＮａＣｌ、次いでＴＭＡＣを段階的に増量させて得られた分画のＲＰ−ＨＰＬＣ分析結果を示す。クロマトグラムは上からリン酸塩、０．１Ｍ ＮａＣｌ、１．２Ｍ ＮａＣｌ、１．５Ｍ ＮａＣｌ、２．０Ｍ ＮａＣｌ，０．１Ｍ ＴＭＡＣ、０．３Ｍ ＴＭＡＣ、０．６Ｍ ＴＭＡＣ、および０．９Ｍ ＴＭＡＣの順である。０．１Ｍ ＴＭＡＣのクロマトグラムの矢印はミス−ホールディングされたモノマーとＩＧＦモノマー（左から右に向かって）を表す。
図３はシリカからのＩＧＦ−Ｉの溶離に対する溶媒の影響を示す。幅の狭い斜線はイソプロピルアルコール、格子はアセトニトリル、点はメタノール、黒はエタノール、および幅広の斜線はエチレングリコールである。
図４はシリカからのＩＧＦ−Ｉの溶離に対するエタノールとＮａＣｌの影響を示す。斜線は０．１Ｍ ＮａＣｌ、格子は０．６Ｍ ＮａＣｌ、および点は１．５Ｍ ＮａＣｌである。
図５はシリカからのＩＧＦ−Ｉの溶離に対するエタノールとＮａＣｌの様々な濃度の影響を示す。斜線は棒線の黒部分はＴＭＡＣであり、斜線部分はエタノールとＮａＣｌである。棒線Ａは１０％エタノールと１．５Ｍ ＮａＣｌ、棒線Ｂは２０％エタノールと０．５Ｍ ＮａＣｌ、棒線Ｃは２０％エタノールおよび１．０Ｍ ＮａＣｌ、および棒線Ｄは２０％エタノールおよび１．５Ｍ ＮａＣｌである。
図６はＴＭＡＣグラジエントを用いて結合したＩＧＦ−Ｉを溶離するシリカクロマトグラムを示す。実線は吸光度（２８０ｎｍ）で、破線は伝導度である。矢印（左から右に向かって）は、カラムローディング、ローディング後のリン酸塩による洗浄およびＴＭＡＣグラジエントの開始を示す。溶離中に分画を回収し、ＲＰ−ＨＰＬＣアッセイによってＩＧＦ−Ｉのアッセイを行った。ＩＧＦ−Ｉを含む分画をプールした（４．４時間から５．２時間までのＴＭＡＣプール）。約５．２時間から６．５時間までの示した０．７〜１Ｍ ＴＭＡＣの分画をプールした。
図７は２０％エタノールで洗浄して夾雑物を除去し、エタノールとＮａＣｌを組み合わせて結合ＩＧＦ−Ｉを溶離するシリカクロマトグラムを示す。実線は吸光度（２８０ｎｍ）で、破線は伝導度である。矢印（左から右に）は、カラムローディング、ローディング後のリン酸塩による洗浄、２０％エタノール洗浄、２０％エタノールと１Ｍ ＮａＣｌによる洗浄、リン酸塩による洗浄およびＴＭＡＣによる再生を示す。溶離中に分画を回収し、ＲＰ−ＨＰＬＣアッセイによってＩＧＦ−Ｉのアッセイを行った。ＩＧＦ−Ｉモノマーを含む分画をプールした（ＥｔＯＨ／ＮａＣｌプール；左から２本目の４．７〜５．４時間の水平ライン）。他のプールはクロマトグラムの吸光ピークに基づいて行い、２０％エタノールプール（一番左側の水平ライン）およびＴＭＡＣプール（左から３本目の水平ライン）が含まれる。
図８はシリカからＩＧＦ−Ｉを溶離するためにＴＭＡＣグラジエントまたはエタノール／ＮａＣｌの組み合せのいずれかを用いて得られた分画のＲＰ−ＨＰＬＣ分析の結果を示す。クロマトグラムは上から下に順に、ローディング、フロースルー、リン酸塩洗浄、０．１〜０．７Ｍ ＴＭＡＣ、０．７〜１．０Ｍ ＴＭＡＣ、２０％エタノール、２０％エタノール／１Ｍ ＮａＣｌ、およびＴＭＡＣによる再生である。一番上のクロマトグラムの矢印はＩＧＦモノマーである。
図９はシリカからのＩＧＦ−Ｉの溶離に対するエタノール／ＮａＣｌの組み合せを用いるＴＭＡＣグラジエントの影響を比較するＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す。レーンは左から右に順に、分子量標準品、ローディング、フロースルー、リン酸塩洗浄、ＴＭＡＣプール、ＴＭＡＣ後、２０％エタノール、エタノール／ＮａＣｌ、ＴＭＡＣ再生、およびＩＧＦ−Ｉである。
図１０はシリカからＩＧＦ結合蛋白−３（ＩＧＦＢＰ−３）を溶離するために２０ｍＭリン酸塩（ｐＨ７）中のエタノールとＮａＣｌの組み合せを用いて得られた分画のＲＰ−ＨＰＬＣ分析の結果を示す。上から一番目のクロマトグラムは２０％エタノール／１Ｍ ＮａＣｌ（矢印はＩＧＦＢＰ−３を示す）、二番目のクロマトグラムは２０％エタノール、三番目のクロマトグラムはフロースルー、および一番下のクロマトグラムはロードである。
好ましい態様の詳細な説明
Ａ．定義
本明細書中で用いている「目的とするポリペプチド」とは、一般にアミノ酸約１０個以上のペプチドおよび蛋白をいう。このポリペプチドは宿主細胞とホモロガスであってもよいし、好ましくはエクソジェナス（ポリペプチドがチャイニーズハムスター卵巣細胞もしくは細菌細胞によって産生されるヒト蛋白や、異なる酵母細胞、細菌細胞もしくは哺乳動物細胞によって産生される酵母ポリペプチドのような用いられている宿主細胞とヘトロロガスであること、すなわち、外来性であることを意味する）であってもよい。哺乳動物ポリペプチド（本来哺乳動物から得られたポリペプチド）を用いることが好ましく、それらが培地中に直接分泌されることがより好ましい。
細菌ポリペプチドの例には、例えば、アルカリホスファターゼおよびβ−ラクタマーゼが含まれる。哺乳動物ポリペプチドの例には、例えばレニン、ヒト成長ホルモンを含む成長ホルモン、ウシ成長ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン、上皮小体ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、リポプロテイン、α−１−抗トリプシン、インスリンＡ鎖、インスリンＢ鎖、プロインスリン、卵胞刺激ホルモン、カルシトニン、黄体形成ホルモン、グルカゴン、第ＶＩＩＩＣ因子、第ＩＸ因子、組織因子、およびフォンヴィルブランド因子のような凝集因子、プロテインＣのような抗凝固因子、心房ナチュリエティック（naturietic）因子、肺サーファクタント（surfactant）、ウロキナーゼもしくはヒト尿プラスミノーゲン活性化因子、組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）のようなプラスミノーゲン活性化因子、ボンベシン、トロンビン、造血成長因子、腫瘍壊死因子−αおよび−β、エンケファリナーゼ、ＲＡＮＴＥＳ（発現および分泌Ｔ細胞の正常な活性化を制御）、ヒトマクロファージ炎症蛋白（ＭＩＰ−１−α）、ヒト血清アルブミンのような血清アルブミン、ミューラー（mullerian）阻害物質、レラキシンＡ鎖、レラキシンＢ鎖、プロレラキシン、マウスゴナドトロピン関連ペプチド、β−ラクタマーゼの様な細菌蛋白、ＤＮアーゼ、インヒビン、アクチビン、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、ホルモンもしくは成長因子の受容体、インテグリン、プロテインＡもしくはＤ、リウマチ因子、骨由来神経向性因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロピン−３、−４、−５、または−６（ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＮＴ−５、またはＮＴ−６）もしくはＮＧＦ−βのような神経成長因子のような神経向性因子、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、ａＦＧＦおよびｂＦＧＦのような線維芽細胞成長因子、上皮成長因子（ＥＧＦ）、ＴＧＦ−α、およびＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦ−β４、もしくはＴＧＦ−β５を含むＴＧＦ−βのような形質転換成長因子（ＴＧＦ）、インスリン様成長因子−Ｉおよび−ＩＩ（ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ）、デス（１−３）−ＩＧＦ−Ｉ（脳ＩＧＦ−Ｉ）、インスリン様成長因子結合蛋白、ＣＤ−３、ＣＤ−４、ＣＤ−８、およびＣＤ−１９のようなＣＤ蛋白、エリスロポイエチン、骨誘導因子、イムノトキシン、骨形態形成蛋白（ＢＭＰ）、インターフェロン−α、−βおよび−γのようなインターフェロン、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えばＭ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦならびにＧ−ＣＳＦ、インターロイキン（ＩＬ）、例えばＩＬ−１〜ＩＬ−１０、スーパーオキサイドジスムターゼ、Ｔ細胞受容体、表面膜蛋白、崩壊促進因子、例えばエイズエンベロープの一部の様なウイルス抗原、輸送蛋白、ホーミング受容体、アドレシン、制御蛋白、抗体、および上記ポリペプチドの断片が含まれる。
好ましい目的とするポリペプチドは、最小限度の蛋白分解によって細胞中で容易に産生され、それらの意図する用途のためにグリコシル化する必要のないポリペプチドである。このような哺乳動物ポリペプチドの例には、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、脳ＩＧＦ−Ｉ、成長ホルモン、レラキシン鎖、成長ホルモン放出因子、インスリン鎖もしくはプロインスリン、ウロキナーゼ、イムノトキシン、ＮＧＦ、ＮＴ−５、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１−α、血管内皮細胞成長因子、ＩＧＦ−Ｉ結合蛋白、ＧＨ結合蛋白、および抗原が含まれる。特に好ましい哺乳動物ポリペプチドには、ＩＧＦ−Ｉ、脳ＩＧＦ−Ｉ、成長ホルモン、ＮＧＦ、ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＮＴ−５、ならびにＮＴ−５を含むＮＴ−６のようなニューロトロピン、ＩＧＦ−Ｉ結合蛋白、血管内皮成長細胞因子、またはＲＡＮＴＥＳが含まれる。
本明細書中で用いている「ＩＧＦ−Ｉ」とは、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、および好ましくはヒトを含むあらゆる種由来の、天然配列の、または（デス−１−３−ＩＧＦ−Ｉまたは脳ＩＧＦ−Ｉのような）変異体型および組換え型のインスリン様成長因子−Ｉを表す。ＩＧＦ−Ｉを製造するための方法がＥＰ１２８７３３（１９８４年１２月１９日公開）に開示されている。
本明細書中で用いている「疎水性を異にする成分」とは、目的とするポリペプチドを含有する混合物中に含まれる成分をいい、この成分から目的とするポリペプチドが選択的に分離される。これらの成分は目的とするポリペプチドと疎水性が異なる。
本明細書中で用いている「非誘導シリカ粒子」とは、吸着ベッドのような吸着法に使用するシリカゲルとしても知られているはだかのシリカビーズをいう。はだかのシリカは、遊離のヒドロキシル基を持つ、すなわち、ヒドロキシル基と他の成分との化学的結合または反応を含むいかなる方法によっても誘導化または修飾されていないシリカである。
本明細書中で用いている「緩衝液」とは、酸−塩基結合成分の作用によるｐＨの変化に抵抗する緩衝溶液をいう。
本明細書中で用いている「溶媒」とは、アルコールおよび極性非プロトン性溶媒をいう。アルコールは、アルコールが用語として一般に用いられている意味を表し、好ましくは炭素原子１〜１０個のアルコール、より好ましくはメタノール、エタノール、イソ−プロパノール、ｎ−プロパノール、ｔ−ブタノール、およびエチレングリコールならびにポリエチレングリコール、および最も好ましくはエタノールまたはイソ−プロパノールである。このようなアルコールは、水溶液に加えると、溶液の極性を低下させることによって溶液の疎水性を増大させる溶媒である。極性非プロトン性溶媒には、例えばジメチルスルホオキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジオキサン、アセトニトリルなどのような分子が含まれ、これらをアルコールの代わりにか、またはアルコールに加えて用いることができる。この中で好ましい溶媒は、メタノール、エタノール、イソ−プロパノール、ｎ−プロパノール、またはアセトニトリルであり、最も好ましくはエタノールである。プロピレングリコールとグリセロールはこの定義から除外される。
本明細書中で用いている用語「アルカリ土類塩、アルカリ金属塩、または無機アンモニウム塩」とは、アルカリ土類元素もしくはアルカリ金属元素のカチオン、またはアンモニウムカチオンを有し、このカチオンがアルカリ土類カチオンもしくはアルカリ金属カチオンである場合は無機または有機（炭化水素主体）アニオンを有し、またカチオンがアンモニウムカチオン、例えばＴＭＡＣの場合の様に、アンモニウムがアニオンと共有結合していない場合は無機アニオンを有する塩をいう。このような塩の例には、塩化ナトリウム、塩化アンモニウム、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、リン酸ナトリウム、リン酸カルシウム、リン酸アンモニウム、リン酸マグネシウム、リン酸カリウム、リン酸カリウム、硫酸ナトリウム、硫酸アンモニウム、硫酸カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸カルシウムなどが含まれる。この内好ましい塩はクロリドまたはサルフェートである。この内最も好ましい塩は塩化ナトリウムである。
Ｂ．本発明の実施方法
混合物中のポリペプチドを他の成分と分けるための本発明の方法には、３つの基本的な工程がある。最初に、混合物を非誘導シリカ粒子に通し、ポリペプチドをシリカ粒子に吸着させる。これによりポリペプチドはシリカに吸着する。シリカはいかなる適切なポアサイズ（平均直径）であってもよいが、一般的なポアサイズの範囲は約２００〜１５００Å、好ましくは約２００〜１０００Å、より好ましくは約２２５Åである。シリカの粒子サイズは、一般に約３０〜１３０ミクロンの範囲である。目的とするポリペプチドは保持される。したがって、夾雑物（通常夾雑蛋白または夾雑ポリペプチド）である混合物の他の成分は簡単に洗浄除去することができる。
シリカ粒子上へのポリペプチドの吸着はクロマトグラフィーによるか、または非クロマトグラフィー的なバッチ法によって行うことができる。クロマトグラフィーによる吸着は混合物をカラムクロマトグラフィー装置中のシリカ粒子ベッドに通すことによって行われる。典型的には、混合物約１Ｌを、シリカ粒子約５０ｍＬ（乾燥重量約２０ｇ）を含むカラム装置に流速約２０カラム容積（ＣＶ）／時で流す。
通常、シリカへの非クロマトグラフィー的吸着は、混合物を適切な容器、例えば密封できるガラス容器中でシリカ粒子と混合することによって行われる。好ましい方法は、カラス瓶中の混合物約１Ｌにシリカ粒子約３００ｍＬを加え、一定速度で混合しながらインキュベーションする。種々の時間と温度が適用可能であるが、好ましくは吸着を約４〜８℃で約１．５時間続ける。
本方法の第二工程では、シリカ粒子を洗浄して夾雑物を除去する。未吸着物質を含まないシリカの洗浄はクロマトグラフィーを行わずに行うか、またはシリカを既述のごとくカラム装置に注入してクロマトグラフィー的に吸着させることができる。バッチ法的洗浄は混合物をシリカから排出させ、シリカに吸着した目的とするポリペプチドを放出させない緩衝液の数倍量を加えて行われる。好ましい緩衝液はｐＨ約５〜８であり、より好ましくはリン酸緩衝液であり、また洗浄を行うための好ましい溶媒は、上記の定義のごとくアルコールであり、より好ましくはエタノールである。最も好ましい洗浄用溶媒はｐＨ７のリン酸緩衝液中の約２０％（ｖ／ｖ）エタノールである。
ポリペプチドが吸着したシリカのクロマトグラフィーによる洗浄は、洗浄が完結するまで約１０〜２０ＣＶ／時の流速でシリカに緩衝液を含む溶媒を通すことによって行う。なお、洗浄の完結は通常の方法で測定することができる。
第三工程では、目的とするポリペプチドを、洗浄したシリカから緩衝溶液を用いて溶離する。緩衝液の第一に重要な成分は、例えばポリペプチドおよび溶媒の種類によって、溶液中の濃度が約５〜４０％（ｖ／ｖ）、好ましくは１０〜３０％（ｖ／ｖ）のアルコール溶媒または極性非プロトン性溶媒である。
本緩衝液の次に重要な成分は、アルカリ土類塩、アルカリ金属塩、または無機アンモニウム塩であり、これらは主として使用する溶媒濃度とアルカリ土類塩、アルカリ金属塩、または無機アンモニウム塩の種類に応じて、約０．２〜３Ｍ、好ましくは０．５〜２Ｍの濃度で存在する。例えば、カチオンがナトリウム、カリウム、またはアンモニウムの場合は濃度は約０．５〜３Ｍであるが、カチオンがマグネシウムの場合は濃度は約０．２〜１Ｍである。好ましくは、緩衝液はｐＨが約５〜８であり、最も好ましくはｐＨ７のリン酸緩衝液である。最も好ましくは、溶媒は約２０％（ｖ／ｖ）の濃度のエタノールであり、塩はｐＨ７のリン酸緩衝液中の約１Ｍの濃度の塩化ナトリウムである。
目的とするポリペプチドの脱着は広範囲にわたって上昇させた温度で促進することができる。おおよそ室温で脱着することが好ましい。
通常、溶離したポリペプチドを濃縮するのが望ましい。好ましい方法では、適切なサイズの分子量を除去する限外濾過システムを用いて溶出液を濃縮する。限外濾過後の残留液は所望によりミクロフィルトレーションまたは他の方法によって滅菌することができる。
ポリペプチドが組換えによって作られている場合は、所望のポリペプチドをコードするＤＮＡを発現させるのに適した宿主細胞は、前核生物細胞、酵母細胞、またはより高等な真核生物細胞である。この目的に適した前核生物には、始原細菌およびユーバクテリアのような細菌が含まれる。好ましい細菌は、例えばEscherichia（例えばE.coli）、Enterobacter、Erwinia、Klebsiella、Proteus、Salmonella（例えばSalmonella typhimurium）、ならびにSerratia（例えばSerratia marcescans）のようなEnterobacteriaceae、B.sutilisならびにB.licheniformis（例えば、DD266710（１９８９年４月１２日公開）に開示されているB.licheniformis 41P）のようなBacillus、P.aeruginosaのようなPseudomonas、Streptomyces、Azotobactor、Rhizobia、Vitreoscilla、およびParacoccusのようなグラム陰性菌またはグラム陽性菌のようなユーバクテリアである。適切なE.coli宿主にはE.coli W3110（ATCC 27325）、E.coli 294（ATCC 31446）、E.coli B、およびE.coli X1776（ATCC 31537）が含まれる。これらの例は例示的なものであって制限を与えるものではない。
上記の細菌のいかなる突然変異細胞も使用することができる。もちろん、細菌細胞内のレプリコンの複製能を考慮して適切な細菌を選択する必要がある。例えば、レプリコンを提供するのにpBR322、pBR325、pACYA177、またはpKN410のようなよく知られたプラスミドを用いる場合は、E.coli、Serratia、またはSalmonella種を適切に使用することができる。
E.coli W3110株は、組換えＤＮＡ産物発酵における共通の宿主株であるため、好ましい宿主または親宿主である。好ましくは、宿主細胞は最小量の蛋白分解酵素を分泌する。例えば、W3110株を修飾することにより、宿主内在性の蛋白をコードする遺伝子中に遺伝的突然変異を起こすことができるが、そのような宿主の例には完全遺伝型tonAΔを持つE.coli W3110 1A2株、完全遺伝型tonAΔ ptr3を持つE.coli W3110 9E4株、完全遺伝型tonAΔ ptr3 phoAΔE15 Δ（argF-lac）169ΔdegP ΔompT kanrを持つE.coli W3110 27C7株（ATCC 55244）、完全遺伝型tonA ptr3 phoAΔE15 Δ（argF-lac）169 ΔdegP ΔompT Δrbs7 ilvG kanrを持つE.coli W3110 37D6株、非カナマイシン耐性degP欠失突然変異を持つ37D6株であるE.coli W3110 40B4株、および米国特許第４９４６７８３号（１９９０年８月７日発行）に開示されている突然変異体ペリプラスミックプロテアーゼを持つE.coli株が含まれる。
前核生物に加え、糸状菌または酵母のような真核生物微生物は、ポリペプチドをコードするベクターの適切な発現宿主である。Saccharomyces cerevisiae、すなわち通常のパン酵母が、低級な真核生物宿主微生物の中で最も一般的に用いられる。しかし、Schizoasccharomyces pombe（BeachおよびNurseの、Nature,290:140（1981）、EP139383（1985年５月２日公開）、例えばK.lactis（MW98-8C、CBS683、CBS4574、Louvencourtらの、J.Bacteriol.,737（1983））、K.fragilis（ATCC 12424）、K.bulgaricus（ATCC 16045）、K.wickeramii（ATCC 24178）、K.waltii（ATCC 56500）、K.drosophilarum（ATCC 36906、Van den Bergらの、Bio/Technology,8:135（1990）、K.thermotolerans、ならびにK.marxianusのようなKluyveromyces宿主（米国特許第4943529号、Fleerらの、Bio/Technology,9:968-975（1991）、yarrowia（EP402226）、Pichia pastoris（EP183070、Sreekrishnaらの、J.Basic Microbiol.,28:265-278（1988）、Candida、Trichoderma reesia（EP244234）、Neurospora crassa（Caseらの、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,76:5259-5263（1979））、Schwanniomyces occidentalis（EP 394538（1990年8月31日公開））のようなSchwanniomyces、例えばNeurospora、Penicillium、Tolypocladium（WO 91/00357、1991年1月10日公開）、ならびにA.nidulans（Ballanceらの、Biochem.Biophys.Res.Commun.,112:284-289（1983））、Tilburnらの、Gene,26:205-221（1983）、Yeltonらの、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:1470-1474（1984））、ならびにA.niger（KellyおよびHynesの、EMBO J.,4:475-479（1985））のようなAspergillus宿主といった糸状菌のような他の多くの属、種、および株が一般に利用でき、本発明において有用である。
所望のポリペプチドをコードするＤＮＡを発現させるのに適した適切な宿主細胞は、多細胞生物からも誘導することができる。そのような宿主細胞は複雑なプロセッシング活性とグリコシル化活性を示し得る。原則として、脊椎生物培養でも無脊椎生物培養でも、いかなる高等真核生物細胞培養も適切である。無脊椎生物細胞の例には植物細胞および昆虫細胞が含まれる。多くのバクロウイルス株と変種、およびそれに対応するSpodoptera frugiperda（毛虫）、Aedes aegypti（蚊）、Aedes albopictus（蚊）、Drosophila melanogaster（ショウジョウバエ）、およびBombyx moriのような宿主由来の複製可能な昆虫宿主細胞が確認されている。例えば、Luckowらの、Bio/Techonlogy,6:47-55（1988）、Millerらの、Genetic Engineering（Setlow J.K.ら編）、８巻（Plenum Publishing,1986）,277-279頁、およびMaedaらの、Nature,315:592-594（1985）参照。トランスフェクションには様々なウイルス株例えば、Autographa californica NPVのＬ−１変種およびBombyx mori NPVのBm-5株が公に利用可能であり、そのようなウイルスは本発明において、特にSpodoptera frugiperda細胞をトランスフェクションするためのウイルスとして使用してもよい。
綿、トウモロコシ、ジャガイモ、大豆、ペチュニア、トマト、およびタバコの植物細胞培養を宿主として利用できる。典型的には、植物細胞は、所望のポリペプチドをコードするＤＮＡを得るために予め操作された細菌のAgrobacterium tumefaciensのある株とインキュベーションすることによってトランスフェクションされる。植物細胞培養とA.tumefaciensとのインキュベーション中に所望のポリペプチドをコードするＤＮＡは植物細胞宿主に伝達され、植物細胞宿主はトランスフェクションされ、適切な条件下で所望のポリペプチドをコードするＤＮＡを発現する。さらに、ノパリン合成酵素プロモーターおよびポリアデニル化シグナル配列のような植物細胞と互換性のある制御配列およびシグナル配列も利用できる（Depickerらの、J.Mol.Appl.Gen.,1:561（1982））。さらに、Ｔ−ＤＮＡ ７８０遺伝子の上流領域から分離されたＤＮＡ部分は組換えＤＮＡを含む植物組織中の植物で発現し得る遺伝子を活性化するか、またはその遺伝子の転写レベルを増大させることができる（EP 321196、１９８９年６月２１日公開）。
有用な哺乳動物宿主細胞系の例としては、ＳＶ−４０（COS-7、ATCC CRL 1651）で形質転換されたサル腎ＣＶ１系、ヒト胎児腎系（293すなわち浮遊細胞中で増殖するサブクローンの293細胞）、乳飲みハムスター腎細胞（BHK ATCC CCL 10）、チャイニーズハムスター卵巣細胞／-DHFR（CHO）、マウスセリトリー細胞（TM4）、サル腎細胞（CV1、ATCC CCL 70）、アフリカミドリザル腎細胞（VERO-76、ATCC CRL-1587）、ヒト子宮頚癌細胞（HELA、ATCC CCL 2）、イヌ腎細胞（MDCK、ATCC CCL 34）、バッファローラット肝細胞（BRL 3A、ATCC CRL 1442）、ヒト肺細胞（W138、ATCC CCL 75）、ヒト肝細胞（Hep G2、HB 8065）、マウス乳癌細胞（MMT 060562、ATCC CCL51）、TRI細胞（Matherらの、Annals N.Y.Acad.Sci.,383:44-68（1982）、ＭＲＣ ５細胞、ＦＳ４細胞、およびヒト肝細胞癌系（Hep G2）がある。
宿主細胞を、本発明の上記の発現ベクターか、またはクローニングベクターでトランスフェクションし、好ましくは形質転換し、次いでプロモーターを誘発させるか、形質転換体を選択するか、または所望の配列をコードする遺伝子を増幅させるのに適するように改良した通常の栄養培地中で培養する。
トランスフェクションとは、実際に何等かのコード配列が発現されているいないに関わらず、宿主細胞が発現ベクターを取り込むことをいう。多くのトランスフェクション法、例えばＣａＰＯ4およびエレクトロポーレーションが当業者に知られている。一般に、このベクターのオペレーションの証が宿主細胞中が見られたらトランスフェクションの成功が確認される。
形質転換とは、ＤＮＡを生体内に導入し、ＤＮＡを染色体外要素としてか、染色体要素によって複製可能にすることをいう。使用する宿主細胞に応じて、形質転換はそのような細胞に適切な標準技術を用いて行われる。Sambrookらの、Molecular Cloning: A Laboratory Manual（New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press、1989）の1.82項に記載の塩化カルシウムを用いるカルシウム処理、またはエレクトロポーレーションは、一般的に、前核生物または実質的な細胞壁バリアーを含む他の細胞において用いられる。Agrobacterium tumefaciensによる感染は、Shawらの、Gene,23:315（1983）およびWO 89/05859（1989年６月29日公開）に記載のある植物細胞を形質転換するために用いられる。さらに、植物はWO 91/00358（1991年１月10日公開）に記載の超音波処理を用いて形質転換することができる。
そのような細胞壁を持たない哺乳動物細胞では、GrahamおよびVan der EbのVirology,52:456-457（1978）のリン酸カルシウム沈澱法が好ましい。哺乳動物細胞宿主系形質転換の一般的態様は、Axelが米国特許第４３９９２１６号（1983年８月16日発行）で開示している。典型的には、酵母中への形質転換はVan Solingenらの、J.Bact.,130:946（1977）およびHsiaoらの、Proc.Natl.Acad.Sci（USA）,76:3829（1979）に記載の方法に従って行われる。しかし、核マイクロインジェクション、エレクトロポーレーション、完全細胞との細菌のプロトプラスト融合、またはポリカチオン、例えばポリブレンおよびポリオルニチンなど、によるような細胞中にＤＮＡを導入するための他の方法も用いることができる。哺乳動物細胞を形質転換するための様々な技術については、Keownらの、Methods in Enzymology（1990）,Vol.185,527-537頁、およびMansourらの、Nature,336:348-352（1988）を参照。
前核細胞を用い、本発明の方法に従って目的とするポリペプチドを産生する場合は、前核細胞を、プロモーターが構成的にまたは人工的に誘導され得る適切な培地で培養する。これについては、例えば、Sambrookらの、Molecular Cloning: A Laboratory Manual（Cold Spring Harbor Laboratory Press,NY,1989）に総括的に記載されている。適切な培地の例は、下記の実施例の項で示す。
炭素、窒素、および無機リン酸塩源のほかにいかなる必要な添加物も、適切な濃度で、単独でか、複合窒素源のような他の添加物質や培地との混合物として含まれていてもよい。
哺乳動物宿主細胞を用いて本発明のポリペプチドを産生する場合は、哺乳動物宿主細胞を様々な培地中で培養することができる。HamのF10（Sigma）、最小基礎培地（（MEM）、Sigma）、RPMI-1640（Sigma）、Dulbeccoの改良Eagle培地（DMEM）、Sigma）のような市販の培地が宿主細胞の培養に適している。さらに、HamおよびWallaceの、Meth.Enz.,58:44（1979）、BarnesおよびSatoの、Anal.Biochem.,102:255（1980）、米国特許第4767704、4657866、4927762、5122469、または4560655号、WO 90/03430、WO 87/00195、または米国再発行特許第30985号に記載のいかなる培地も宿主細胞の培地として使用できる。これらの培地のいずれにも必要に応じてホルモンおよび/または他の成長因子（インスリン、トランスフェリンまたは上皮成長因子など）、塩（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、およびリン酸塩など）、緩衝液（HEPESなど）、ヌクレオシド（アデノシンおよびチミジンなど）、抗体（GentamycinTM薬など）、微量元素（通常ミリモルの範囲の最終濃度で存在する無機化合物をいう）、およびグルコースまたは同等のエネルギー源を添加してもよい。いかなる他の必要な添加物も当業者に知られた適切な濃度で含むことができる。温度およびｐＨなどのような培養条件は、発現のために選ばれた宿主細胞に既に用いられている以前の条件であり、当業者には明らかであろう。
in vitroでの哺乳動物細胞培養の生産性を最大にするための原理、プロトコールおよび実用的技術は、Mammalian Cell Biotechnology:A Practical Approach,M.Butler編（Oxford Univesity PressでIRL Press、Oxford,1991）に総括的に記載されている。
上記方法は、ポリペプチドが細胞内にか、ペリプラスミック空間中にか、または培地中に直接分泌されるいずれの場合にも用いることができる。ポリペプチドを分離するための本明細書中に示した好ましい条件は、培地中に直接分泌される条件である。
以下に、本発明のシリカ工程後に、更に高純度を得るための適切な精製法を例示する：イムノアフィニティまたはイオン交換カラムによる分画化、エタノール沈澱、逆相ＰＨＬＣ、疎水性相互作用クロマトグラフィー、S-セファロースおよびDEAEのようなイオン交換樹脂によるクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、SDS-PAGE、硫酸アンモニウム沈澱、および例えばセファデックスG-75を用いるゲル濾過。
本発明は以下の実施例の内容によってさらに完全に理解できよう。ただし、これらは単に本発明の例示であって、本発明の範囲を制限するものではない。すべての文献および特許文献は本明細書の一部を構成する。
実施例Ｉ
発酵ブロスからのＩＧＦ−Ｉの回収
Ａ．カラム調製
乾燥シリカ包装物（W.R. GraceのDavison Chemical Divisionから得たgrade 653）の１容量を水５〜１０容量に懸濁し（２回）、微細物を除去する。水２容量に対し樹脂約１容量のスラリーを適切な大きさのガラスカラムに移した。ベッドの長さが一定になるまで水でベッドを平衡化する。次に、上端のフローアダプターを充填したベッドの上に置き、カラムに水を流速２０〜４０ＣＶ／時で流して平衡化した。適切なベースラインに達したら、カラムは使用準備完了とした。一般的には、水を合計３ＣＶ用い、均一に充填されたベッドを作製した。カラム直径は１×１２．８ｃｍ（ベッドボリューム１０ｍＬ）であった。特に示さない限り、以下の工程はすべて室温で行った。
Ｂ．試料調製およびローディング
本実施例に記載の発酵物中の組換えヒトＩＧＦ−Ｉを製造するのに使用した宿主は、E.coli W3110の誘導株である27C7であった。27C7の完全な遺伝型は、WO 93/11240（１９９３年６月１０日公開）に記載のごとくtonA ptr3 phoAΔE15 Δ（argF-lac）169ΔdegP ΔompT kanrである。27C7株はAmerican Type Culture CollectionにATCC 55244として寄託された。
本実施例で用いた分泌プラスミドｐＬＳ３２ＴｓｃはＩＧＦ−Ｉ遺伝子を含んでいる。
E.coli中のＩＧＦ−Ｉ遺伝子の発現に必要な転写配列および翻訳配列は、アルカリホスファターゼプロモーターおよびｔｒｐ シャイン−ダルガーノ配列によって与えられる。Δｔ0転写ターミネーターはＩＧＦ−Ｉ終止コドンの近傍に位置している。細胞質からの蛋白分泌は1amBシグナル配列か、またはSTIIシグナル配列によって導かれる。ＩＧＦ−Ｉの大部分は細胞のペリプラスミック空間に認められる。プラスミドpLS32TSCは形質転換宿主にテトラサイクリン耐性をもたらす。
プラスミドｐＬＳ３２Ｔｓｃは、プラスミドｐＬＳ３２、ｐＡＰｌａｍＢ、ｐＬＳ３２１ａｍＢ、ｐＬＳ３３１ａｍＢ、およびｐＬＳ３３Ｔｓｃを中間体に用いるいくつかの工程を経て構築された（前述のWO 93/11240に詳細に開示）。形質転換体は標準的形質転換技術によって得られ、テトラサイクリン２０ｍｇ／Ｌを含むＬＢプレート上で選別し、純化した。この培地の組成は以下の通りである：Bacto-Trypton１０ｇ／Ｌ、酵母エキス５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１０ｇ／Ｌ、テトラサイクリン−ＨＣｌ ２０ｍｇ／Ｌ、および寒天１５ｇ／Ｌ。
E.coli 27C7/pLS32Tscを用いる直接分泌法によってＩＧＦ−Ｉを製造するための発酵法は１０〜約１０００Ｌの範囲のバッチ中で行った。テトラサイクリン２０ｍｇ／Ｌを含む無菌ＬＢブロスに新たに解凍した保存培養を接種することによって振盪フラスコを調製した。この振盪フラスコを３５〜３９℃、５０〜２５０ｒｐｍで７〜１２時間インキュベーションした。この振盪フラスコを用いて、生産培地を用いて１０Ｌ培養器内で増殖させる二次接種物培地に接種した。この二次培養は５５０ｎｍの吸光度が２０〜３５に達するまで３５〜３９℃で培養した。次に、この培養物を用いて１０００Ｌ生産ブロスに接種した。すべての接種物の量は培地の初期量の０．１％〜１０％であった。
培地の組成は以下の通りである。すべての培地成分は加熱処理または濾過によって滅菌された。
成分 量／Ｌ
グルコース*                                     １０〜３００ｇ
硫酸アンモニウム                                ２〜６ｇ
リン酸ナトリウム、１塩基２水和物                １〜５ｇ
リン酸カリウム、２塩基                          １〜５ｇ
クエン酸ナトリウム、２水和物                    ０．５〜５ｇ
塩化カリウム                                    ０．５〜５ｇ
硫酸マグネシウム、７水和物                      ０．５〜５ｇ
Pluronic Polyol、L61                            ０．１〜２ｍＬ
塩化第二鉄、７水和物                            １０〜１００ｍｇ
硫酸亜鉛、７水和物                              ０．１〜１０ｍｇ
塩化コバルト、７水和物                          ０．１〜１０ｍｇ
モリブデン酸ナトリウム、２水和物                ０．１〜１０ｍｇ
硫酸第二銅、５水和物                            ０．１〜１０ｍｇ
ホウ酸                                          ０．１〜１０ｍｇ
硫酸マンガン、１水和物                          ０．１〜１０ｍｇ
テトラサイクリン                                ５〜３０ｍｇ
酵母エキス**                                    ５〜１５ｇ
ＮＺアミンＡＳ**                                ５〜１５ｇ
メチオニン**                                    ０〜５ｇ
水酸化アンモニウム                              ｐＨ調節に必要な量
硫酸                                            ｐＨ調節に必要な量
*グルコースの一部を最初に培地に加え、残りを発酵中を通して供給した。
**これらの成分は発酵中を通して供給することができる。
発酵方法は、３５〜３９℃およびｐＨ７．０〜７．８で行った。かくはん速度は２００〜８００ｒｐｍに調節し、通気速度は１分間に培養１容あたり空気０．５〜２．０容であった。培地中のリン酸塩が枯渇したとき、ＩＧＦ−Ｉの産生が起きた。発酵を２５〜３５時間続けた後、培養を冷却し、回収を行った。培養物の不活化は、連続フロー装置を用い、６０〜７０℃および流速１５〜２５Ｌ／分で加熱処理するか、または６０〜７０℃で５〜１５分間タンク内で加熱不活化（１０Ｌ規模）することによって行った。加熱不活化した培養物をAX Alpha-lavel遠心器またはそれと同等の遠心器を用いて遠心し、次いで上清を深いフィルターを通して浄化した。浄化した発酵ブロスをさらにプロセッシングするために保存し、細胞は捨てた。
浄化したブロスを流速２０〜４０ＣＶ／時で、シリカカラムに直接いれた（ロード）。ロードした総量は４０ＣＶであった。ローディング中にブロス中に存在する着色した物質のほとんどが、視覚観察においてカラムを素通りした。ＨＰＬＣまたはＳＤＳ−ＰＡＧＥによってカラムからの流出物を分析したところ、ローディング中にＩＧＦ−Ｉの損失がないことが示された。
Ｃ．ＴＭＡＣによる洗浄と溶離
試料をローディングした後、ＵＶトレースがベースラインに戻るまでカラムを０．０１Ｍリン酸塩（ｐＨ７）４ＣＶで洗浄した。この時点で、充填したベッドはまだ暗褐色であり、まだかなりの量の発酵成分がカラムに結合していることが示された。次に、０．１Ｍリン酸塩（ｐＨ７）中のＴＭＡＣを段階的に増量してカラムの溶出を行った。リン酸塩による洗浄およびそれに続くすべての洗浄の速度は、約５ＣＶ／時であった。各ＴＭＡＣ洗浄物の部分標本を０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）中の２９％アセトニトリルで平衡化した０．４６×２５ｃｍ  Ｖｙｄａｃ  Ｃ−１８（５μ／３００Å）ＲＰ−ＨＰＬＣカラムで分析した。０．１％ＴＦＡ中の２９〜３０％アセトニトリルの直線グラジエントを用い、３０分間かけてＩＧＦ−Ｉを溶離した。次に、０．１％ＴＦＡ中の６０％アセトニトリルで５分間カラムを再生した後、再平衡化した。これらの分析では０．５ｍＬ／分の一定流速とし、インジェクション間の合計時間は４５分であった。このアッセイにおいて約３１分に溶離するＩＧＦ−Ｉモノマー（図１）は０．３Ｍ  ＴＭＡＣで溶離し始めた。すべてのＩＧＦ−Ｉは０．９Ｍ ＴＭＡＣ工程後に溶離した。
残念なことに、ＴＭＡＣ溶離工程も、続くＩＧＦ−Ｉの精製を妨げる望ましくない夾雑蛋白をかなりの量含んでいた。グラジエント溶離も試みたが、夾雑蛋白に対するＩＧＦ−Ｉの純度は改善しなかった。したがって、シリカ溶離プールの純度を改善する為に、ＴＭＡＣ緩衝液で溶離する前の種々の洗浄工程の効果を試験した。
実施例ＩＩ
シリカ溶離に対するＮａＣｌの影響
シリカカラムとロード条件は実施例Ｉに記載の通りであった。０．１Ｍリン酸緩衝液で洗浄した後、カラムを０．１Ｍリン酸塩（ｐＨ７）中の０．１〜２Ｍ ＮａＣｌを含む緩衝液を４−ＣＶに増量して洗浄した。次に、０．１Ｍリン酸塩（ｐＨ７）中のＴＭＡＣを段階的に増量してカラムを溶出した。実施例Ｉの記載に従ったこれらの分画のＨＰＬＣ分析結果は図２を示す。ＮａＣｌを増量してもＩＧＦ−Ｉの溶離、またはＴＭＡＣによる溶離前の夾雑物の除去に対する効果はなかった。２Ｍ ＮａＣｌ緩衝液の伝導度は１Ｍ ＴＭＡＣより高いため、２Ｍ ＮａＣｌでもいかなるＩＧＦ−Ｉまたは夾雑蛋白の除去にも効果がなかったことに注目することは重要である。したがって、ＴＭＡＣを、シリカに結合した蛋白の有効な溶離剤たらしめているのは単にイオン強度だけではない。ＴＭＡＣの溶離力はそのイオン特性と溶媒特性によるので、ＴＭＡＣの溶離能力はイオン強度と溶媒強度の相互作用に依存するはずである。
実施例ＩＩＩ
シリカ溶離における溶媒の影響
シリカからのＩＧＦ−Ｉの溶離における様々な溶媒の影響について検討した。これらの実験では、実施例Ｉに記載のごとくＩＧＦ−Ｉを含む発酵ブロスをシリカカラムにロードした。０．１Ｍリン酸塩（ｐＨ７）４ＣＶで洗浄した後、０．１Ｍリン酸塩（ｐＨ７）中の溶媒を５、１０、２０、または３０％（ｖ／ｖ）に増加させて５ベッド容量でカラムを洗浄した。次に、３０％溶媒＋１Ｍ ＮａＣｌで洗浄を行い、ＮａＣｌを含むことがＩＧＦ−Ｉを溶離するのに遊離であるかについて検討した。最後に、０．１Ｍリン酸塩（ｐＨ７）中の１Ｍ ＴＭＡＣを含む緩衝液を用いて、溶媒で洗浄した後にまだカラムに疎水性蛋白が残留しているかについて検討した。試験した溶媒には、イソプロパノール、エチレングリコール、メタノール、エタノール、アセトニトリル、プロピレングリコール、およびグリセロールが含まれる。すべての試料は、実施例Ｉに記載のＲＰ−ＨＰＬＣアッセイによるＩＧＦ−Ｉの分析を行った。この試験の結果は図３にまとめている。
一般的に、プロピレングリコールとグリセロールを除くすべての溶媒がシリカに結合したＩＧＦ−Ｉを溶離するのに有効であった。これら２種類の溶媒で洗浄してもＩＧＦ−Ｉは回収されなかった。プロピレングリコールとグリセロールから得られるＨＰＬＣクロマトグラムは、これらの溶媒がＩＧＦ−Ｉと相互作用することによって、カラムの再生工程中に溶離される、より疎水性の高い蛋白としての挙動を示すことを示唆した。したがって、プロピレングリコールとグリセロールはもはやシリカからＩＧＦ−Ｉを溶離するのに適した溶媒とは考えられなかった。
他の溶媒の溶離力は２つのグループに分けることができた。イソプロパノールとアセトニトリルは強力な溶離剤と思われたが、有意な量のＩＧＦ−Ｉを回収するにはなお３０％の溶媒が必要であった。エチレングリコール、メタノール、およびエタノールは、結合ＩＧＦ−Ｉを溶離するために３０％溶媒に１Ｍ ＮａＣｌを添加することが必要な弱い溶離剤であった。ＮａＣｌを添加することにより、強い溶媒であるイソプロパノールおよびアセトニトリルによるＩＧＦ−Ｉの溶離も促進された。他の溶媒に対するエタノールの相対的なコスト、有用性、および安全性の点から、シリカからのＩＧＦ−Ｉの溶離において好ましい効果を示すエタノールと塩の組み合せについてさらに検討を行った。
実施例ＩＶ
シリカ溶離に対するエタノールとＮａＣｌの影響
エタノールとＮａＣｌの組み合せは、各成分を別々に増量したものについて検討した。実施例Ｉの記載のごとく３本のシリカカラムを調製し、ロードした。ローディング後、各カラムを０．１Ｍリン酸塩（ｐＨ７）４ＣＶで洗浄した。次に、カラムを０．１、０．６、または１．５Ｍ ＮａＣｌ＋０〜３０％エタノール（５％ずつ増量）のいずれかを含むリン酸緩衝液４ＣＶで洗浄した。３０％エタノール＋ＮａＣｌ工程の終了時に、カラムを０．１Ｍリン酸塩（ｐＨ７）中の１Ｍ ＴＭＡＣ ４ＣＶで再生し、すべてのＩＧＦ−Ｉが溶離されたことを確認した。
これらの溶離液のＨＰＬＣ分析の結果を図４に示す。各カラムで見られる傾向は同様である。ＩＧＦ−Ｉを完全に除去するために、低濃度のＮａＣｌでは、高濃度のエタノールが必要であった。事実、０．１Ｍ ＮａＣｌと３０％エタノールによってかなりの量のＩＧＦ−Ｉが溶離された。しかし、エタノール濃度を上昇させることによって、ＩＧＦ−Ｉ溶離プロフィールはより低い塩濃度で溶離が高まるようにシフトした。カラムをＴＭＡＣで再生してもさらにＩＧＦ−Ｉが除去されなかったことから、ＮａＣｌとエタノールのこれら濃度は樹脂からＩＧＦ−Ｉをすべて除去するのに有効であった。各処理におけるＩＧＦ−Ｉの回収率は各カラムに流した全量の＞９７％であった。エタノール量を３本のカラムで一定（１０、２０、または３０％）とし、０〜２Ｍ ＮａＣｌの増量を検討した他の実験において同様の傾向が得られた。
実施例Ｖ
ＩＧＦ−Ｉの溶離における好ましいエタノールおよびＮａＣｌ濃度の検討
充填したベッドが５ｍＬである以外は実施例Ｉの記載に従って４本のシリカカラムを調製した。ＩＧＦ−Ｉモノマー約１０ｍｇを含む浄化した発酵ブロスを各カラムに流した。０．１Ｍリン酸塩（ｐＨ７）４ＣＶで洗浄した後、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７）中の以下の成分約４ＣＶでカラムを洗浄し、溶離した。この再生工程における溶媒とＮａＣｌの影響を減少させるために、ＴＭＡＣ処理前に各カラムを０．１Ｍリン酸塩（ｐＨ７）４ＣＶで洗浄した。
Ａ．１０％エタノール、１０％エタノール＋１．５Ｍ ＮａＣｌ、１Ｍ ＴＭＡＣ
Ｂ．０．５Ｍ ＮａＣｌ、２０％エタノール＋０．５Ｍ ＮａＣｌ、１Ｍ ＴＭＡＣ
Ｃ．２０％エタノール、２０％エタノール＋１．０Ｍ ＮａＣｌ、１Ｍ ＴＭＡＣ
Ｄ．１．５Ｍ ＮａＣｌ、２０％エタノール＋１．５Ｍ ＮａＣｌ、１Ｍ ＴＭＡＣ
エタノールとＮａＣｌの各組み合せの終了時にＴＭＡＣ洗浄を行い、溶離緩衝液処理後にシリカに結合したＩＧＦ−Ｉを除去した。ＩＧＦ−Ｉの除去に加えて、ＴＭＡＣはシリカに結合している多くの疎水性蛋白を非特異的に溶離した。したがって、ＴＭＡＣによる溶離ではエタノールとＮａＣｌの組み合せを用いる場合に比べて有意に純度が低かった。この試験の結果は図５にまとめている。それぞれの場合において、これらのすべての条件から得られるＩＧＦ−Ｉの回収量は同様であった（１０〜１０．５ｍｇ）。しかし、ＩＧＦ−Ｉの最も特異的な溶離は、２０％エタノールと１または１．５Ｍ ＮａＣｌ（条件ＣまたはＤ）を用いて得られた。これらの条件を用いてＩＧＦ−Ｉ約９５％が得られた。ＮａＣｌ濃度が０．５Ｍ（Ｂ）に低下するとＩＧＦ−Ｉの溶離は不完全となった（８０％回収）。しかし、エタノールが減少し、ＮａＣｌが増加するとＩＧＦ−Ｉの回収により激烈な影響がみられた（Ａ）。溶離前の洗浄工程はＩＧＦ−Ｉを除去しなかったが、様々な量の疎水性夾雑物を除去した。したがって、２０％エタノールと１Ｍ ＮａＣｌからの溶離物プールは１．５Ｍ ＮａＣｌ／２０％エタノールから得られるものよりわずかに純度が高かった。これらの研究の目的はシリカから最高の回収率で最高純度のＩＧＦ−Ｉを得ることであるから、最も強力な溶離条件は２０％エタノール／１Ｍ ＮａＣｌの組み合せであった。この特定の組み合せは、シリカに結合したＩＧＦ−Ｉを溶離するための約５％エタノールと０．５Ｍ ＮａＣｌの緩衝液調製物のセイフティウインドゥとなるので、この条件を選択した。
実施例ＶＩ
ＴＭＡＣ対ＥｔＯＨ／ＮａＣｌ溶離の比較
実施例Ｉの記載にしたがって２本のシリカカラムを調製した。ＩＧＦ−Ｉ約２０ｍｇを含む浄化した発酵ブロスを各カラムにロードした。ＴＭＡＣグラジエント溶離を示すクロマトグラムは図６に示す。２０ｍＭリン酸塩（ｐＨ７）４ＣＶで洗浄した後、１本のカラムを２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）中の０〜１ＭＴＡＣの直線グラジエントで溶離した。全グラジエントは１０ＣＶで流速は約５ＣＶ／時であった。グラジエントの終了時にカラムを緩衝液中の１Ｍ ＴＭＡＣ ５ＣＶでさらに洗浄し、さらに蛋白が溶離しないことを確認した。エタノールとＮａＣｌの組み合せを用いるシリカクロマトグラムを図７に示す。上記のごとくこのカラムにロードし、洗浄した後、２本目のカラムを以下の成分を含む２０ｍＭリン酸緩衝液５ＣＶを用い５ＣＶ／時の速度で溶離した。
Ａ．２０％エタノール
Ｂ．２０％エタノール＋１．０Ｍ ＮａＣｌ
Ｃ．添加せず
Ｄ．１Ｍ ＴＭＡＣ
ＴＭＡＣカラム再生に対するエタノールと塩の影響を最小限にするため工程Ｃに洗浄を含めた。分画約５ｍＬを、両カラムの溶離プロフィールにしたがって回収した。ＩＧＦ−Ｉを含む分画を各カラムから一緒にプールした。他のプールは各カラムのクロマトグラムに基づいて行った。
図８はこれらのカラムからプールした分画のＲＰ−ＨＰＬＣ分析結果を示す。０．１％ＴＦＡ緩衝液中の２９％アセトニトリルで平衡化した０．４６×２５ｃｍ Ｖｙｄａｃ Ｃ−１８（５μ／３００Å）ＲＰ−ＨＰＬＣカラムを用いて試料の分析を行った。蛋白の溶離は、０．１％ＴＦＡ緩衝液中の２９−３０％アセトニトリルの直線グラジエントで１０分間、次いで３０−４０％アセトニトリルのグラジエントで５分間行った。再生する前に、カラムを０．１％ＴＦＡ中の６０％アセトニトリルで再生した。インジェクション間の総時間は２０分間で、分析を通して流速は２ｍＬ／分とした。
両方の場合とも、シリカプール中に定量できる量のＩＧＦ−Ｉモノマーが得られたが、これらの２つの方法によって得られたＩＧＦ−Ｉプールの純度は異なっていた。ＴＭＡＣグラジエントの間に、ＩＧＦ−Ｉは約０．１〜０．７Ｍ ＴＭＡＣで溶離した。さらにＴＭＡＣを加えてもＩＧＦ−Ｉは溶離しなかったが、主としてＩＧＦ−Ｉより疎水性の他の蛋白が溶離し、ＲＰ−ＨＰＬＣ分析で１１．５分後に溶離した（ＩＧＦ−Ｉモノマーはこのアッセイで約７．３分で溶離した）。ＴＭＡＣはグラジエントモードで用いた場合でも、シリカに結合したＩＧＦ−Ｉを特異的に除去するのに有益でなかったことは注目に値する。
他方、リン酸緩衝液（ｐＨ７）中の２０％エタノールによる洗浄によって有意な量の夾雑蛋白が除去された。エタノール洗浄後、エタノールと塩の組み合せによって、より特異的にＩＧＦ−Ｉが溶離された。総蛋白に対するＩＧＦ−Ｉモノマーの比は、エタノール／ＮａＣｌプールにおいて、約２０％大きかった（表Ｉ）。
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ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるこれらの試料の分析結果もＴＭＡＣプールに比べてエタノール／ＮａＣｌプールにおける純度が有意に改善されていることを示した（図９）。試料（各０．６ｍＬ）を５０％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）と混合し、ＴＣＡの最終濃度が２０％となるようにした。氷上で２０分間インキュベーションし、次いで試料を１００００×ｇで遠心して上清を除去した。ペレットを９５％氷冷アセトン０．５ｍＬで２回洗浄し、遠心して上清を上記のごとく除去した。ペレットを約５分間風乾した後、ペレットを、１％β−メルカプトエタノールを含むLaemmli試料緩衝液で最初の試料の容量に再懸濁し、１００℃で３〜５分間加熱した。ＩＧＦ−Ｉ約１０μｇを含む対照もＴＣＡ試料処理に含めた。各試料１０μＬをプレキャスト１０−２０％アクリルアミドグラジエントゲル（Daiichi）にロードし、Ｔｒｉｓ−Ｔｒｉｃｉｎｅ泳動緩衝液を用い、３０ｍＡで約１．５時間泳動した（SchaggerおよびVon Jagowの、Anal.Biochem.,166:368（1987））。次に、４０％メタノールおよび１０％酢酸中の０．１％クーマシーブリリアントブルーＲ−２５０を用いて約１．５時間ゲルを染色した。４０％メタノールおよび１０％酢酸を数回交換しながら脱色した。レシプロシェーカーを用いてゲルの染色と脱色を促進した。
レーン中の主要な蛋白バンドはＩＧＦ−Ｉ参照標準品と共に移動したが、ＲＰ−ＨＰＬＣ分析結果（図８）から、ＴＭＡＣプールとＥｔＯＨ／ＮａＣｌプールのみがＩＧＦ−ＩモノマーまたはミスホルーディングされたＩＧＦ−Ｉを含んでいた。如何なる理論にも制限されることなく、このことは多くのより疎水性の蛋白（ＲＰ−ＨＰＬＣアッセイで１１．５分後に溶離）は、還元されると本物のＩＧＦ−Ｉモノマーと一緒に移動するＩＧＦ−Ｉ凝集物であることを示唆している。ＴＭＡＣプールとＥｔＯＨ／ＮａＣｌプールとの比較から、ＥｔＯＨ／ＮａＣｌプールの純度が改善されることがわかる。エタノール／ＮａＣｌで溶離したカラムをＴＭＡＣで再生することによって、ＴＭＡＣグラジエントプールに存在する多くの蛋白が除去された（図８および９）。
実施例ＶＩＩ
シリカからのＩＧＦ−Ｉの特異的溶離（１０００Ｌ規模）
Ａ．カラム調製
乾燥シリカ包装物（W.R. GraceのDavison Chemical Divisionから得たgrade 653）の１容を水５〜１０容に懸濁し（２回）、微細物を除去した。水２に対し樹脂約１のスラリーを適切な大きさのガラスカラムに移した。ベッドの長さが一定になるまで水でベッドを平衡化する。次に、上端のフローアダプターを充填したベッドの上に置き、カラムに水を流速２０ＣＶ／時で流して平衡化した。適切なベースラインに達したら、カラムは使用準備完了とした。一般に水を合計３ＣＶ用い、一様に充填されたベッドを作製した。直径３５ｃｍのカラム中の高さ約２０ｃｍの充電ベッドを常に使用した（ベッド容積約２０Ｌ）。
Ｂ．試料調製およびローディング
実施例Ｉに記載のE.coli発酵ブロス約１０００Ｌを６５度で３０秒間インライン加熱殺菌し、次いでAlpha Lava AX遠心器（１０ＬＰＭ）で遠心することにより細胞屑のない浄化した上清を得た。浄化したブロスを流速約１０ＣＶ／時で、シリカカラムに直接ロードし、ロードした総量は５０ＣＶであった。ローディング中にブロス中に存在する着色した物質のほとんどが、視覚観察においてカラムを素通りした。ＨＰＬＣまたはＳＤＳ−ＰＡＧＥによるカラムからの流出物を分析したところ、ローディング中にＩＧＦ−Ｉの損失がないことが示された。
Ｃ．洗浄と溶離
試料を流した後、吸光度（２８０ｎｍ）がベースラインに戻るまでカラムを２０ｍＭリン酸塩（ｐＨ７）４ＣＶで洗浄した。リン酸塩による洗浄速度およびそれ以降の全ての洗浄速度は約３ＣＶ／時であった。この時点で、充填したベッドはまだ暗褐色であり、まだかなりの量の発酵成分がカラムに結合していることを示した。次に、２０ｍＭリン酸塩（ｐＨ７）中の２０％エタノール４ＣＶをカラムにロードした。これによりこの工程で損失するＩＧＦ−Ｉが少量（約５〜１０％）であったのに比べて有意な量の夾雑蛋白が除去された。カラムに結合したＩＧＦ−Ｉのバルクは２０ｍＭリン酸塩（ｐＨ７）中に２０％エタノールおよび１Ｍ ＮａＣｌを含む緩衝液によって優先的に溶離された。
ＩＧＦ−Ｉ溶離プールは一般に４〜５ＣＶであり、浄化した発酵ブロスからは８５〜９０％の正しくホールディングされたＩＧＦ−Ｉモノマーが常に回収された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥから、シリカプール中で検出された主要な蛋白はＩＧＦ−Ｉであった。ＨＰＬＣ分析によるこのプール中のＩＧＦ−Ｉの分布は一般的に１５〜２５％がミスホールディングされたモノマー、２〜５％が酸化されたモノマーであり、３０〜４０％が正しくホールディングされたモノマーであった。残りの部分は主にＩＧＦ−Ｉの凝集物であった。溶離後、シリカカラムがまだ非常に暗褐色を呈したことに注目すべきである。エタノールとＮａＣｌの組み合せによってＩＧＦ−Ｉを溶離した後のカラムの樹脂は１回使用後に捨てられた。
実施例ＶＩＩＩ
シリカからの脳ＩＧＦ−Ｉの特異的溶離
脳ＩＧＦ−Ｉは、脳型が３個のＮ−末端アミノ酸（ｇｌｙ−ｐｒｏ−ｇｌｕ）を欠いている他は完全長ＩＧＦ−Ｉと同様である。脳ＩＧＦ−Ｉを生産するのに使用した宿主は実施例Ｉに記載の２７Ｃ７であった。この実施例で使用した分泌プラスミドｐＬＳ３３Ｔｓｃは脳ＩＧＦ−Ｉのコード配列を持っている。プラスミドｐＬＳ３３Ｔｓｃは、前述のWO 93/11240に詳細に開示された数工程を経て構築された。形質転換体はテトラサイクリン２０ｍｇ／Ｌを含むＬＢプレート上で選別し、純化した。この培地の組成は以下の通りである：Bacto-Trypton １０ｇ／Ｌ、酵母エキス５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１０ｇ／Ｌ、テトラサイクリン−ＨＣｌ ２０ｍｇ／Ｌ、および寒天１５ｇ／Ｌ。
E.coli 27C7／pLS32Tscを用いる脳ＩＧＦ−Ｉを製造するための発酵法は１０〜約４０Ｌの範囲のバッチ中で行った。テトラサイクリン５ｍｇ／Ｌを含む無菌ＬＢブロス５００〜３０００ｍＬに新たに解凍した保存培養１〜２ｍＬを接種することによって振盪フラスコ接種物を調製した。この振盪フラスコを３５〜３９℃、５０〜２００ｒｐｍで７〜１２時間インキュベーションした。振盪フラスコ接種物を用いて生産培地を含む１０〜５０Ｌ培養器に接種した。生産培養は５５０ｎｍの吸光度が７０〜９０に達するまで３５〜３９℃で、３０℃に温度を変えるかまたは変えずに培養した。
培地の組成は以下の通りである。すべての培地成分は加熱処理または濾過によって滅菌された。
成分 量／Ｌ
グルコース*                                     １０〜３００ｇ
硫酸アンモニウム                                ２〜６ｇ
リン酸ナトリウム、１塩基２水和物                １〜５ｇ
リン酸カリウム、２塩基                          １〜５ｇ
クエン酸ナトリウム、２水和物                    ０．５〜５ｇ
塩化カリウム                                    ０．５〜５ｇ
硫酸マグネシウム、７水和物                      ０．５〜５ｇ
Pluronic Polyol、L61                            ０．１〜２ｍＬ
塩化第二鉄、７水和物                            １０〜１００ｍｇ
硫酸亜鉛、７水和物                              ０．１〜１０ｍｇ
塩化コバルト、７水和物                          ０．１〜１０ｍｇ
モリブデン酸ナトリウム、２水和物                ０．１〜１０ｍｇ
硫酸第二銅、５水和物                            ０．１〜１０ｍｇ
ホウ酸                                          ０．１〜１０ｍｇ
硫酸マンガン、１水和物                          ０．１〜１０ｍｇ
テトラサイクリン                                ５〜３０ｍｇ
酵母エキス**                                    ５〜１５ｇ
ＮＺアミンＡＳ**                                ５〜１５ｇ
イソロイシン**                                  ０〜１ｇ
水酸化アンモニウム                              ｐＨ調節に必要な量
硫酸                                            ｐＨ調節に必要な量
*グルコースの一部を最初に培地に加え、残りを発酵中を通して供給した。
**これらの成分は発酵中を通して供給することができる。
発酵を３５〜４０時間続けた後、培養を冷却し、回収を行った。培養の不活化は、連続フロー装置を用い、６０〜７０℃および流速１５〜２５Ｌ／分で加熱処理するか、または６０〜７０℃で５〜１５分間タンク内で加熱不活化（１０Ｌ規模）することに行った。培養物をAX Alpha-lavel遠心器またはそれと同等の遠心器を用いて遠心し、次いで上清を深いフィルターを通して浄化した。次に、浄化した発酵ブロスをプロセッシングに用い、細胞を捨てた。
浄化した発酵ブロス約１２Ｌを、実施例Ｉに記載のごとく水を用いて充填し、平衡化した５００ｍＬシリカカラムに直接ロードした。流す速度を約１０ＣＶ／時とし、カラムからの流出液を２８０ｎｍでモニターした。ローディングを通じて、流出液は２０ＡＵＦＳ（吸光度単位全スケール）以上であり、ロードした物質の色のほとんどがカラムに結合しなかったことを示した。ローディング後、カラムを２０ｍＭリン酸塩（ｐＨ７）４ＣＶを用い、５ＣＶ／時の速度で洗浄し、吸光トレースをベースラインに戻した。疎水性夾雑蛋白を２０ｍＭリン酸塩（ｐＨ７）中の２０％エタノール４ＣＶを用い５ＣＶ／時の速度で洗浄して除去した。分画を実施例ＶＩに記載のＶｙｄａｃ  ＲＰ−ＨＰＬＣ分析によって分析した。いずれの洗浄分画においても脳ＩＧＦモノマーの損失はなかった。脳ＩＧＦ−Ｉは２０ｍＭリン酸塩（ｐＨ７）中の２０％エタノール／１Ｍ ＮａＣｌによって溶離された。
２０％エタノール、１Ｍ ＮａＣｌ、０．１Ｍリン酸塩（ｐＨ７）溶離液中の様々な形の脳ＩＧＦ−Ｉの分布は、ミスホールディングされたモノマーが約５〜１５％、酸化モノマーが２〜６％、および正しくホールディングされたモノマーが３０〜４０％であった。残りのものは還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて脳ＩＧＦ−Ｉモノマーと同じ移動パターンを示したことから、凝集した脳ＩＧＦ−Ｉであった。シリカプール中の脳ＩＧＦ−Ｉの回収率は約９５％であった。
実施例ＩＸ
シリカからのＩＧＦ−Ｉ結合蛋白の溶離
ＩＧＦ−Ｉ結合蛋白の１つ（ＩＧＦＢＰ−３）を、回収した脂肪培養液からシリカで精製した。ベッドボリューム５０ｍＬのシリカカラムを実施例Ｉの記載に従って調製した。ＩＧＦＢＰ−３は、米国特許第５２５８２８７号（１９９３年１１月２日発行）、およびMukkuらの、Insulin-like Growth Factor Binding Proteins、S.L.S.DropおよびR.L.Hintz編、65-70頁、1989の記載に従ってヒト腎細胞系（２９３ｓ）中で製造された。
無血清培養液を遠心（４０００ｒｐｍ、１０分間）して得、濾過滅菌した。ＩＧＦＢＰ−３ １８．４ｍｇを含む回収した細胞培養液約０．９Ｌを、流速約２０ＣＶ／時でシリカカラム（ベッドボリューム５０ｍＬ）にロードした。ローディング終了時に、ＵＶトレース（Ａ２８０）がベースラインに戻るまで、カラムを０．１Ｍリン酸塩（ｐＨ７）約４ＣＶで洗浄した。この流速およびこれに続くすべての洗浄の流速は約５ＣＶ／時であった。
リン酸塩洗浄の終了時に、シリカカラムの色はローディング開始時と実質的に同じであった。分画はPolymer Labs PLRP-Sカラム（８μ／４０００Å）を用いるＲＰ−ＨＰＬＣによって分析した。カラムは０．１％ＴＦＡ中の２０％アセトニトリルで平衡化した。０．１％ＴＦＡ中の２０〜５０％アセトニトリルのグラジエントで、９分間かけて結合蛋白を溶離した。次に、カラムを０．１％ＴＦＡ中の９０％アセトニトリルで再生し、次いで再平衡化した。インジェクション間の総時間は１３分間であった。ＨＰＬＣによるフロースルー試料と洗浄試料の分析結果は、これらの分画中にＩＧＦＢＰ−３が約５％存在したことを示す。次に、カラムを０．１Ｍリン酸塩（ｐＨ７）中の２０％エタノール３ＣＶで洗浄し、全ＩＧＦＢＰ−３の１０％を含む小さなピークを得た。
０．１Ｍリン酸塩（ｐＨ７）で洗浄して残るエタノールを除去した後、カラムを０．１Ｍリン酸塩（ｐＨ７）中の１Ｍ ＮａＣｌ ３ＣＶで洗浄したところ、蛋白の溶離はみられなかった。まだカラムに結合しているＩＧＦＢＰ−３のバルク（１３．７ｍｇまたは７５％）は０．１Ｍリン酸塩（ｐＨ７）中の２０％エタノールおよび１Ｍ ＮａＣｌの組み合せを含む緩衝液４ＣＶを用いて溶離した。２０％エタノール＋１Ｍ ＮａＣｌ溶離物の純度は８０％ＩＧＦＢＰ−３より大きかった（図１０）。この溶離後、カラムを０．１Ｍリン酸塩（ｐＨ７）中の２Ｍ ＴＭＡＣ ３ＣＶで再生した。ＴＭＡＣ工程はＩＧＦＢＰ−３約７．５％を除去した。全分画中のＩＧＦＢＰ−３の全回収率は９８％であった。
実施例Ｘ
シリカからのＶＥＧＦの溶離
血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）もシリカに結合し、エタノールとＮａＣｌの組み合せによって溶離することができる。ＶＥＧＦは、ヒト胎児腎細胞（２９３ｓ）のかわりにＣＨＯ細胞を用いる他は、Wo 90/13649（1990年11月15日公開）、およびLeungらの、Science、246:1306-1309（1989）の記載に従って製造された。当該分野でよく知られたＣＨＯ細胞に適したプロモーターを使用している同様のベクターを使用した。２４時間後、細胞を無血清培地に移しさらに４８時間培養した。この無血清培地を０．６５μｍ膜によるマイクロフィルトレーションによって回収し、濾過滅菌した。この濾液を、実施例Ｉの記載に従って水を用いて充填し、平衡化した５ｍＬシリカカラムにかけた。１０ＣＶ／時の一定流速を、ローディングおよびそれに続くすべての工程で使用した。
ローディング後、カラムを２０ｍＭリン酸塩（ｐＨ７）４ＣＶで洗浄することによって、カラム流出物の吸光度をベースラインに戻した。次に、カラムを２０ｍＭリン酸塩（ｐＨ７）中の１Ｍ ＮａＣｌ ４ＣＶで洗浄した。これによって夾雑蛋白はいくらか除去されたが、ＶＥＧＦは除去されなかった。１Ｍ ＮａＣｌ緩衝液で洗浄した後、ＶＥＧＦは２０ｍＭリン酸塩（ＰＨ７）中の１．５ＮａＣｌと２０％エタノールの組み合せによって溶離された。エタノールとＮａＣｌの組み合せによって、シリカに結合しているＶＥＧＦの約９０％が除去された。残りの結合ＶＥＧＦは２０ｍＭリン酸塩（ｐＨ７）中の２Ｍ ＴＭＡＣによって除去された。
実施例ＸＩ
シリカからのＲＡＮＴＥＳの溶離
組換えヒトＲＡＮＴＥＳは、Schallらの、J.EXp.Med.,177:1821-1825（1993）の記載に従って発現プラスミド中で完全長ペプチドのｃＤＮＡと細菌ＳＴＩＩプロモーターを結合することによってE.coli中で生産された。発酵ブロスを、Beckman RC3B遠心器を用いて２０℃、４５００ｒｐｍで遠心して細胞を除去した。次に、ブロスを深いフィルターを通して浄化し、２０ｍＭリン酸塩（ｐＨ７）４ＣＶで平衡化する以外は実施例Ｉの記載に従って５００ｍＬシリカカラムに直接ロードした。流速２０ＣＶ／時でカラムを平衡化し、ロードした。
浄化した発酵ブロス６．６Ｌをロードした後、カラムを、平衡緩衝液２ＣＶ、次いで２０ｍＭリン酸塩（ｐＨ７）中の２０％エタノール２ＣＶで洗浄した。ＲＡＮＴＥＳは２０ｍＭリン酸塩（ｐＨ７）中の２０％エタノールおよび１Ｍ ＮａＣｌの組み合せで溶離した。
実施例ＸＩＩ
シリカからのヒトＭＩＰ−１−αの溶離
組換えヒトマクロファージ炎症蛋白（ｈｕＭＩＰ）−１αは、Schallらの、J.Exp.Med.,177:1821-1825（1993）に記載の発現ベクター中に完全長ペプチドのｃＤＮＡと細菌ＳＴＩＩプロモーターを結合させることにより、E.coli中で生産された。１２Ｎ ＨＣｌを加えて、浄化した上清ブロス約２００ｍＬをｐＨ３に調節した。５分間かくはんした後、ｐＨを補正したブロスを４０００ｒｐｍで１５分間遠心した。ＮａＯＨを加えて遠心上清をｐＨ５に補正した。
この物質約１００ｍＬを、実施例Ｉの記載に従って水で充填した５ｍＬシリカカラムにロードした。ローディング後、１０ｍＭクエン酸塩（ｐＨ５）４ＣＶでカラムを洗浄した。次に、カラムを１０ｍＭクエン酸塩および１５％エタノール（ｐＨ５）４ＣＶで洗浄して夾雑物を除去した。生成物を１０ｍＭクエン酸塩、１５％エタノール、および１Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ５）で溶離した。１０ｍＭクエン酸塩（ｐＨ５）中の２Ｍ ＴＭＡＣによってシリカカラムを再生したところ、さらにｈｕＭＩＰが除去されることはなかったが、夾雑蛋白はさらに除去された。
種々の洗浄分画および溶離分画の分析クロマトグラフィーはPolymer Labs PLRP-Sカラム（８μ／４０００Å）を用い、５０℃で行われた。カラムは０．１％ＴＦＡ中の２０％アセトニトリルで平衡化した。０．１％ＴＦＡ中の１０〜６０％アセトニトリルのグラジエントで、９分間かけて結合蛋白を溶離した。次に、カラムを０．１％ＴＦＡ中の９０％アセトニトリルで再生し、次いで再平衡化した。インジェクション間の総時間は１３分間であった。ＨＰＬＣで分析したところ、カラム素通り液におけるｈｕＭＩＰの損失は全ｈｕＭＩＰの５％未満であった。エタノール洗浄によって結合ｈｕＭＩＰの約１０％が除去されたが、かなりの量の夾雑蛋白も除去された。１５％エタノールと１Ｍ塩化ナトリウムの組み合せによって結合ｈｕＭＩＰの約８５％が溶離した。エタノール／ＮａＣｌプールはＲＰ−ＨＰＬＣによる分析で純度約９０％と判定された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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