(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の式（Ｉ）
【化１】
0003863579.tif 000012
のインシュリンを得る方法であって、
Ａ）  次の式（II）
Ｒ2−Ｒ1−Ｂ２−Ｂ29−Ｙ−Ｘ−Ｇｌｙ−Ａ２−Ａ20−Ｒ3    （II）
の蛋白質を水性媒質１リットル当たり０.０５〜０.３ｇの式（II）の蛋白質濃度で、水性媒質中でpH１０〜１１において少なくとも１つのカオトロピック助剤の存在下に、式（II）の蛋白質のシステイン残基当たり２〜１０個のメルカプタンの−ＳＨ基を産生する量のメルカプタンと反応させ、そして
Ｂ）  正しく連結されたシスチン架橋を有する得られるプロインシュリンをトリプシン、トリプシン様の酵素及び場合によっては追加的にカルボキシペプチダーゼＢ、または前述した酵素の混合物と反応させて、正しく連結されたシスチン架橋を有する式（Ｉ）のインシュリンを製造し、
Ｃ）  このようにして得られた反応生成物を水性媒質１リットル当たり３〜５０ｇの疎水性吸着樹脂であって、架橋結合したポリスチレン、ポリアクリレートおよびポリスチレンとジビニルベンゼンとの共重合体から成る群より選択されるものとpH４〜７において処理し、
Ｄ）  式（Ｉ）の吸着されたインシュリンを含有する吸着樹脂を分離し、そして
Ｅ）  該吸着樹脂から式（Ｉ）のインシュリンを脱着すること
よりなる上記式（Ｉ）のインシュリンを得る方法。
ここで、上記した式（Ｉ）及び式（II）において、
Ｘはａ) Ｌｙｓ及びＡｒｇからなる群からのアミノ酸残基、または
ｂ) ペプチドのＮ−末端及びカルボキシル末端にアミノ酸残基ＡｒｇまたはＬｙｓを含有する２〜３５個のアミノ酸残基を有するペプチドであり、
Ｙは遺伝子的にコード可能なアミノ酸残基であり、
Ｚはａ) Ｌｙｓ及びＡｒｇよりなる群からのアミノ酸残基、
ｂ) ペプチドのカルボキシル末端にアミノ酸残基ＡｒｇまたはＬｙｓを含有する２〜３個のアミノ酸残基を有するペプチド、または
ｃ) ＯＨであり
Ｒ1はフェニルアラニン残基または共有結合であり、
Ｒ2はａ) 水素原子、
ｂ) ＬｙｓおよびＡｒｇからなる群からのアミノ酸残基、または
ｃ) ペプチドのカルボキシル末端にアミノ酸残基ＡｒｇまたはＬｙｓを含有する２〜４５個のアミノ酸残基を有するペプチドであり、
Ｒ3は遺伝子的コード可能なアミノ酸残基であり、
残基Ａ２−Ａ２０は、ヒトインシュリン、動物インシュリンまたはインシュリン誘導体のＡ鎖のアミノ酸配列に対応し、そして残基Ｂ２−Ｂ２９は、ヒトインシュリン、動物インシュリンまたはインシュリン誘導体のＢ鎖のアミノ酸配列に対応する。
【請求項２】
式（II）の蛋白質を用いる請求項１の方法。
ここで式（II）の式中、
Ｘはアミノ酸残基ＡｒｇまたはヒトインシュリンのＣ鎖のアミノ酸配列を有するペプチドであり、
ＹはＡｌａ、ＴｈｒおよびＳｅｒからなる群からのアミノ酸残基であり、
Ｒ1はアミノ酸残基Ｐｈｅであり、
Ｒ2はａ) 水素原子、または
ｂ) ペプチドのカルボキシル末端にＡｒｇを含有する２〜２５アミノ酸残基を有するペプチドであり、
Ｒ3はＡｓｎ、ＳｅｒおよびＧｌｙからなる群からなるアミノ酸残基であり、残基Ａ２−Ａ20およびＢ２−Ｂ29は、ヒトインシュリンのＡ鎖およびＢ鎖のアミノ酸配列にそれぞれ対応し、そして
得られる正しく連結されたシスチン架橋を有する式（Ｉ）のインシュリンは式中のＹ、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ａ２−Ａ20およびＢ２−Ｂ29が前述の定義を有するものであり、そして
Ｚはアミノ酸残基Ａｒｇ、ペプチド残基Ａｒｇ−ＡｒｇまたはＯＨであるものとする。
【請求項３】
式（II）の蛋白質を用いる請求項１の方法。
ここで式（II）の式中、
Ｘはアミノ酸残基Ａｒｇ、またはペプチドのＮ−末端及びカルボキシル末端にアミノ酸残基Ａｒｇおよび／またはＬｙｓを含有する２〜３５個のアミノ酸残基を有するペプチドであり、
Ｙはアミノ酸残基Ｔｈｒであり、
Ｒ1はアミノ酸残基Ｐｈｅであり、
Ｒ2はａ) 水素原子、または
ｂ) カルボキシル末端がアミノ酸残基Ａｒｇである２〜１５個のアミノ酸残基を有するペプチドであり、
Ｒ3はアミノ酸残基ＧｌｙまたはＡｓｎであり、
残基Ａ２−Ａ20およびＢ２−Ｂ29は、ヒトインシュリンのＡ鎖およびＢ鎖のアミノ酸配列にそれぞれ対応し、そして
得られる正しく連結されたシスチン架橋を有する式（Ｉ）のインシュリンは、式中Ｙ、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ａ２−Ａ20およびＢ２−Ｂ29が前述の定義を有するものであり、そして
Ｚはアミノ酸残基Ａｒｇ、ペプチド残基Ａｒｇ−ＡｒｇまたはＬｙｓ−ＬｙｓまたはＯＨであるものとする。
【請求項４】
システインまたは塩酸システイン水和物がメルカプタンとして用いられる請求項１ないし３のいずれか１つに記載の方法。
【請求項５】
式（Ｉ）のインシュリンをイソプロパノールまたはｎ−プロパノールを使用して吸着樹脂から脱着する請求項１ないし４のいずれか１つに記載の方法。
【請求項６】
０.０１〜０.１Ｍの塩が製造段階Ｃ）において加えられる請求項１ないし５のいずれか１つに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
ヒトインシュリンは全部で５１個のアミノ酸残基を含む２個のアミノ酸鎖を有する蛋白質である。６個のシステイン残基は２個のアミノ酸鎖に存在しており、各々２個のシステイン残基はジスルフィド架橋を通じて互いに連結している。生物学的に活性なヒトインシュリンでは、Ａ及びＢ鎖は２個のシスチン架橋を通じて互いに連結され、そして更なるシスチン架橋がＡ鎖に存在する。統計的にみれば、ヒトインシュリン分子内のジスルフィド架橋形成には１５の可能性がある。この１５の可能性内の唯一つのものが生物学的活性ヒトインシュリン中に起こっている。以下のシステイン残基は、お互いにヒトインシュリン中で連結している：
Ａ６−Ａ１１
Ａ７−Ｂ７
Ａ２０−Ｂ１９
文字Ａ及びＢは特定のインシュリンアミノ酸鎖を表し、アミノ酸残基の位置の数字は特定のアミノ酸鎖のアミノ末端よりカルボキシ末端に数えられたものである。ジスルフィド架橋は２個のヒトインシュリン分子間にも形成され得るので無限の多くの異なるジスルフィド架橋が容易に形成され得る。
【０００２】
ヒトインシュリン製造の既知の方法はヒトプロインシュリンを使用することに基づいている。ヒトプロインシュリンは８６個のアミノ酸残基の線状のアミノ酸鎖を有する蛋白質であり、ヒトインシュリンのＢ及びＡ鎖は３５個のアミノ酸残基を有するＣペプチドを介して互いに連結されている。ヒトインシュリン中に起こるジスルフィド架橋の形成は中間体を通じて形成され、ヒトインシュリンのシステイン残基は、例えばＳ−スルホネート（−Ｓ−ＳＯ3-）基（EP 0 037 255）のような硫黄保護基を具備する。正しく連結されたシステイン架橋を有するプロインシュリンを得る方法もまた知られており（Biochemistry, 60, 1968, 622〜629頁）、それはシステイン残基がチオール残基（−ＳＨ）として存在する豚の膵臓より得られるプロインシュリンを出発材料とするものである。“正しく連結されたシスチン架橋”の言葉は哺乳動物からの生物学的に活性なインシュリン中に見い出されるジスルフィド架橋を意味するものと解釈される。
【０００３】
遺伝子工学の複数の方法がヒトインシュリンと異なるアミノ酸配列および／またはアミノ酸鎖長を有するヒトプロインシュリンまたはプロインシュリンを微生物中で製造することを可能にしている。遺伝子工学により改変された大腸菌細胞から製造されたプロインシュリンが全て正しく連結されたシスチン架橋を持っているものではない。大腸菌（EP 0 055 945）を用いてヒトインシュリンを得る方法は以下の製造段階を基礎としている：
微生物の発酵−細胞分裂−融合蛋白の単離−融合蛋白の臭化シアン切断−プロインシュリン配列を含有する切断生成物の単離−S-スルホネート基によるプロインシュリンのシステイン残基の保護−正しく連結されたシスチン架橋の形成−亜硫酸分解−プロインシュリンの脱塩−正しく連結されたシスチン架橋を含有するプロインシュリンのクロマトグラフィーによる精製−プロインシュリン溶液の濃縮−濃縮プロインシュリン溶液のクロマトグラフィーによる精製−プロインシュリンの酵素切断によるヒトインシュリンの取得−得られたヒトインシュリンのクロマトグラフィー精製。
【０００４】
この方法の不利な点は多数の製造段階よりなっていることと、精製段階での損失があることで、これらがインシュリンの低収率をもたらしている。この多段階製法ゆえに多大なる損失が危惧されねばならない。分離された融合蛋白の段階から、臭化ジシアン切断、亜硫酸分解及びプロインシュリンの精製の段階（EP 0 055 945）を通じ、４０％迄のプロインシュリン損失を見込まなければならない。同様に最終生成物に至るまでの以下の精製段階の間で大きな損失が生じる。
遺伝子工学的方法により、もし必要とする製造段階が相当減らせるならば、ヒトインシュリン又はインシュリン誘導体製造における収率増加が達成できる。
本発明の目的は、製造段階がより少なく、そして全体としての精製損失がより少ない、インシュリンアミノ酸鎖中で正しく連結されたシスチン架橋を有するインシュリンを得るための方法を開発するにある。
【０００５】
本発明によれば、次の一般式（Ｉ）
【化２】
0003863579.tif 000002
のインシュリンの製造方法が見出されたのである。そしてこの方法は
【０００６】
Ａ）  次の式（II）
Ｒ2−Ｒ1−Ｂ２−Ｂ29−Ｙ−Ｘ−Ｇｌｙ−Ａ２−Ａ20−Ｒ3    （II）
の蛋白質を水性媒質１リットル当たり０.０５〜０.３ｇの式（II）の蛋白質濃度で、水性媒質中でpH１０〜１１において、少なくとも１つのカオトロピック助剤（chaotropic auxiliary）の存在下に、式（II）の蛋白質のシステイン残基当たり２〜１０個のメルカプタンの−ＳＨ基を産生する量のメルカプタンと反応させ、そして
Ｂ）  正しく連結されたシスチン架橋を有する得られたプロインシュリンとトリプシン、トリプシン様の酵素及び場合によっては追加的にカルボキシペプチダーゼＢまたは前述した酵素の混合物と反応させて、正しく連結されたシスチン架橋を有する式（Ｉ）のインシュリンを製造し、
Ｃ）  このようにして得られた反応生成物を水性媒質１リットル当たり疎水性吸着樹脂３〜５０ｇとpH４〜７において処理し、
Ｄ）  式（Ｉ）の吸着されたインシュリンを含有する吸着樹脂を分離し、そして
Ｅ）  この吸着樹脂から式（Ｉ）のインシュリンを脱着すること
よりなるものである。ここで、上記した式（Ｉ）及び式（II）において、
【０００７】
Ｘはａ) Ｌｙｓ及びＡｒｇよりなる群のアミノ酸残基、または
ｂ) ペプチドのＮ−末端及びカルボキシル末端にアミノ酸残基ＡｒｇまたはＬｙｓを含有する２〜３５個のアミノ酸残基を有するペプチドであり、
Ｙは遺伝子的にコード可能なアミノ酸残基であり、
Ｚはａ) Ａｒｇ及びＬｙｓよりなる群のアミノ酸残基、
ｂ) ペプチドのカルボキシ末端にアミノ酸残基ＡｒｇまたはＬｙｓを含有する２〜３個のアミノ酸残基を有するペプチド、または
ｃ) ＯＨであり
Ｒ1はフェニルアラニン残基または共有結合であり、
Ｒ2はａ) 水素原子、
ｂ) ＬｙｓおよびＡｒｇよりなる群のアミノ酸残基、または
ｃ) ペプチドのカルボキシ末端にアミノ酸残基Ｌｙｓ又はＡｒｇを含有する２〜４５個のアミノ酸残基を有するペプチドであり、
Ｒ3は遺伝子的にコード可能なアミノ酸残基、
ヒトインシュリン、動物インシュリンまたはインシュリン誘導体のＡ鎖のアミノ酸配列に対応する残基Ａ２−Ａ２０、およびヒトインシュリン、動物インシュリンまたはインシュリン誘導体のＢ鎖のアミノ酸配列に対応する残基Ｂ２−Ｂ２９であるものとする。
【０００８】
好ましく用いられる式（II）の蛋白質は、式中、
Ｘがアミノ酸残基ＡｒｇまたはヒトインシュリンのＣ鎖のアミノ酸配列を有するペプチドであり、
ＹがＡｌａ、ＴｈｒおよびＳｅｒよりなる群のアミノ酸残基であり、
Ｒ1がアミノ酸残基Ｐｈｅであり、
Ｒ2がａ) 水素原子、または
ｂ) カルボキシル末端にＡｒｇを含有する２〜２５個のアミノ酸残基を有するペプチドであり、
Ｒ3がＡｓｎ、ＳｅｒおよびＧｌｙからなる群のアミノ酸残基、および
ヒトインシュリンのＡ鎖およびＢ鎖のアミノ酸配列に対応する残基Ａ２−Ａ２０およびＢ２−Ｂ２９であり、そして
得られる正しく連結されたシスチン架橋を有する式（Ｉ）のインシュリンは、式中、Ｙ、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ａ２−Ａ２０およびＢ２−Ｂ２９が前述の定義を有するものであり、そして
Ｚがアミノ酸残基Ａｒｇ、ペプチド残基Ａｒｇ−ＡｒｇまたはＯＨであるものである。
【０００９】
特に好ましく用いられる式（II）の蛋白質は、式中、
Ｘがアミノ酸残基Ａｒｇ、または２〜３５個のアミノ酸残基を有し、２個の塩基性アミノ酸残基、特にＡｒｇおよび／またはＬｙｓがペプチドの初めと末端に存在するペプチドであり、
Ｙがアミノ酸残基Ｔｈｒであり、
Ｒ1がアミノ酸残基Ｐｈｅであり、
Ｒ2がａ) 水素原子、または
ｂ) カルボキシ末端がアミノ酸残基Ａｒｇである２〜１５個のアミノ酸残基を有するペプチドであり、
Ｒ3がアミノ酸残基ＧｌｙまたはＡｓｎ、および
ヒトインシュリンのＡ鎖およびＢ鎖のアミノ酸配列に対応する残基Ａ２−Ａ２０およびＢ２−Ｂ２９であり、また
得られる正しく連結されたシスチン架橋を有する式（Ｉ）のインシュリンは、式中、Ｙ、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ａ２−Ａ２０およびＢ２−Ｂ２９が上述の定義を有するものであり、そして
Ｚがアミノ酸残基Ａｒｇ、ペプチド残基Ａｒｇ−ＡｒｇまたはＬｙｓ−ＬｙｓまたはＯＨであるものである。
【００１０】
驚くべきことに、式（II）の蛋白質は慣習的に“再生(refolding)”（R. Jaenicke, R. Rudolph, 1989, Folding Proteins, in Protein Structure, a practical Approach; Ed. Creighton, T.E., 191-224頁, JRL Press Oxford; EP 0 219 874）に先立つ反応段階で完全に還元される必要のないことが見出されているが、前述の方法においては異質蛋白質の割合が高い（５０〜９０％）にも拘わらず、−ＳＨ保護基を含有する適切に精製されたプロインシュリンの折りたたみに比肩しうる水準で折りたたみ収率が達成されていることである。
さらに驚くべきことに、正しく連結されたシスチン架橋を有する式（Ｉ）のインシュリンを産するために正しく折りたたまれたプロインシュリンの酵素的反応が５０〜９０％の異質蛋白質の存在下に、高収率で可能であることも見出され、式（Ｉ）のインシュリンは疎水性吸着樹脂と選択的によく結合することが判った。
【００１１】
既知の方法と比較し、本発明の方法は尚一層高収率で、かなり速い製造を可能にする。その理由は亜硫酸分解の回避と、場合によっては臭化シアン切断方法段階及び以前には未知のプロインシュリンを限定量のカオトロピック塩の存在下で、その変性した状態から正しく結合されたシスチン架橋を有するプロインシュリンに変換し、そして次にそのプロインシュリンを酵素的に変換して、それ以上の精製を必要とせず式（Ｉ）のインシュリンにするからである。こうして吸着により折りたたみ溶液から式（Ｉ）のインシュリンを分離することが可能となる。脱着後、中間的分離又は精製をすることなく吸着剤より式（Ｉ）のインシュリンをこのように得ることが出来る。本発明による方法は、既知の方法に比し、立ち上がり時間が短いために実質的に短時間製法であり、そして損失が避けられるため既知の方法に較べて２５〜１００％の収率増加を可能にする。
【００１２】
ペプチドと蛋白質のアミノ酸配列は、アミノ酸鎖Ｎ−末端から指定される。式（Ｉ）の括弧内に与えられた情報、つまりＡ６、Ａ２０、Ｂ１、Ｂ７又はＢ１９はインシュリンのＡ鎖又はＢ鎖中のアミノ酸残基の位置に対応する。
アミノ酸Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｐｒｏ及びセレノシステインは、“遺伝子的にコード可能なアミノ酸基”という意味を表す。
動物インシュリンの“残基Ａ２〜Ａ２０”及び“残基Ｂ２〜Ｂ２９”という言葉は、例えば牛、豚又は雌鳥のアミノ酸配列という意味に理解される。インシュリン誘導体のＡ２〜Ａ２０及びＢ２〜Ｂ２９基という言葉は、他の遺伝子的にコード可能なアミノ酸によりアミノ酸を置換して形成された対応するヒトインシュリンのアミノ酸配列を表す。
【００１３】
残基Ｚは常にＸのアミノ酸配列の一部であり、トリプシン、トリプシン様の酵素又はカルボキシペプチダーゼＢのようなプロテアーゼ活性により形成される。残基Ｒ3はインシュリンのＡ鎖の位置Ａ２１のアミノ酸残基である。残基ＹはインシュリンのＢ鎖の位置Ｂ３０のアミノ酸残基である。
トリプシン又はトリプシン様酵素はアルギニン又はリジンでアミノ酸鎖を切断するプロテアーゼである。
カルボキシペプチダーゼＢはアミノ酸鎖のカルボキシ末端にあるＡｒｇ又はＬｙｓのような塩基性アミノ酸残基を切断するエクソプロテアーゼである（Kemmler et al., J. Biol. Chem. 246, 6786〜6791頁）。
【００１４】
ヒトインシュリンのＡ鎖は以下の配列（配列番号１）を有する：Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｃｙｓ、Ｃｙｓ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｉｌｅ、Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、Ｔｙｒ、Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｔｙｒ、Ｃｙｓ、Ａｓｎ
ヒトインシュリンのＢ鎖は以下の配列（配列番号２）を有する：Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｃｙｓ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｃｙｓ、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｇｌｙ、Ｐｈｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ
ヒトインシュリンのＣ鎖は以下の配列（配列番号３）を有する：Ａｒｇ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、Ｌｅｕ、Ｇｌｙ、Ｇｌｙ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ
【００１５】
カオトロピツク助剤は例えば、硫酸アンモニウム、塩酸グアニジン、炭酸エチレン、チオシアネート、ジメチルスルホキシド及び尿素のような水性溶液中で水素結合を破る化合物である。
疎水性吸着樹脂という用語は例えば、ポリアクリレート又はポリスチレン又はスチレンとジビニルベンゼンの共重合体、殊に大きな表面積と多くの大きな空孔（large pores）を有する高分子吸着樹脂、例えば商業製品としてのローム アンド ハース社又は三菱化成株式会社のXAD16、XAD1600又はHP20のような非イオン性で疎水性の架橋された重合体及び／又は共重合体を表す。
メルカプタンという用語は、少なくとも１個の−ＳＨ基を有する化合物を意味するものと理解される。水溶性のメルカプタンが好ましい。これ等化合物の例としてはジチオトレイトール、ジチオエリトリトール、２−メルカプトエタノール、システイン、グルタチオン、メチルチオグリコレート、３−メルカプト−１,２−プロパンジオール及び３−メルカプトプロピオン酸がある。
【００１６】
式（II）の蛋白質は多くの遺伝子工学構築法の助けにより微生物中で形成出来る（EP 0 489 780、EP 0 347 781、EP 0 453 969）。遺伝子工学構築法は大腸菌又はストレプトマイセテスのような微生物を発酵させて発現できる。形成された蛋白質は微生物内に保持され（EP 0 489 780）又は発酵溶液に排出される。
本発明による方法では、式（II）の蛋白質は、細胞を破壊した直後であって発酵溶液及び微生物に由来する多数の蛋白質が夾雑したものが使用できる。式（II）の蛋白質は、しかしながら、例えば沈澱又はクロマトグラフィーによる精製後のように予め精製された形でも使用できる。
【００１７】
製造段階Ａ）の工程は次のとおりである。蛋白質をカオトロピツク助剤又は種々のカオトロピツク助剤の混合液に溶解する。好ましくは尿素又は塩酸グアニジンを水を溶媒として濃度６〜９Ｍ、好ましくは８Ｍで用いる。反応混合物のpHは８.５〜１０.８である。使用できる緩衝剤の例としてはリン酸塩、トリ（ヒドロキシメチル）アミノメタン（tris）、ホウ酸塩又はグリシン緩衝剤である。水性媒質中の緩衝剤物質の濃度は０.５Ｍまでであり、好ましくは０.００５Ｍ〜０.５Ｍ、特に好ましくは０.０５〜０.１Ｍである。蛋白質混合液は次に水性メルカプタン溶液と混合される。この手段により以下の濃度が反応液中（水に基づいて）で確立する。
【００１８】
式（II）の蛋白質濃度は０.０５〜０.６ｇ／リットルで、好ましくは０.１〜０.３ｇ／リットルである。メルカプタンの量は式(II）の蛋白質のシステイン残基当たり２〜１０のメルカプタンの−ＳＨ残基であり、好ましくは６〜９である。溶液のpHは１０〜１１で、好ましくは１０.８である。上述の緩衝液成分が用いられる。正確なpHは水酸化ナトリウム溶液を加えることにより確立する。緩衝液成分の濃度は０.００５〜０.５Ｍで、好ましくは０.０５〜０.１Ｍである。
メルカプタンを含有する反応混合液中のカオトロピツク助剤の濃度は１Ｍ以下で、好ましくは０.１〜０.８Ｍ、特に好ましくは０.３〜０.６Ｍである。使用するメルカプタンは好ましくはシステイン又は２−メルカプトエタノールの単独又は混合物である。
製造段階Ａ）における折りたたみ中の温度は０℃〜５０℃で、好ましくは２℃〜３０℃、特には４℃〜１０℃である。反応時間は３〜１２時間で、好ましくは４〜８時間、特には５時間である。
製造段階Ａ）の結果として正しく連結されたシスチン架橋を含有するプロインシュリンが得られる。
【００１９】
製造段階Ｂ）においては、製造段階Ａ）からの反応溶液はpHを６.５〜９.０、好ましくは８〜９に調整する。これにトリプシン又はトリプシン様酵素を正しく連結されたシスチン架橋を有するプロインシュリン３ｇに対し１〜３mgの量を加える。これに場合により、カルボキシペプチダーゼＢを式（Ｉ）のインシュリン１ｇに対し、３〜８単位の量で加える。トリプシン及びカルボキシダーゼＢの混合液もまた加えてもよい。得られた溶液を次に４℃〜１５℃で４〜１６時間撹拌する。製造段階Ｂ）の結果として正しく連結されたシスチン架橋を含有する式Ｉのインシュリンが得られる。
製造段階Ｃ）においては、製造段階Ｂ）の反応液を塩酸又は硫酸のような酸を用いてpH２.５〜４.５に調整する。もし溶液に濁りが生じるなら場合によりそれを濾過又は遠心分離により除去する。残っている溶液を疎水性吸着樹脂で処理する。ＸＡＤ又はＨＰ２０タイプの樹脂が適切である。樹脂量は反応液１リットル当たり３〜５０ｇで、好ましくは２０〜４０ｇ／リットルである。
【００２０】
得られた懸濁液を０.１Ｍの濃度までの塩化ナトリウムのような塩で処理し、次に３〜４時間撹拌する。樹脂の式Ｉのインシュリンの吸着はサンプリングし、高速液体クロマトグラフィー分析（ＨＰＬＣ分析）によりチェックする。溶液中にインシュリンが残っていないのを確認後、即座に吸着樹脂を水性反応溶液かせ分離する（製造段階Ｄ）。これは例えば、すでに知られている方法により濾過又は遠心分離により行われる。式（Ｉ）の吸着されたインシュリンを含有する樹脂を純水性又は水性溶液を含む緩衝液で洗浄する。特に、洗浄溶液中の伝導性が０.４mS／cmになるまで洗浄する。
【００２１】
式（Ｉ）のインシュリンの脱着（製造段階Ｅ）は使用される疎水性吸着樹脂の如何に応じた既知の方法により行われる。脱着がＸＡＤ又はＨＰ２０吸着樹脂を用いた場合には、例えば（Ｃ1〜Ｃ6）アルカノールのような水混和性で非イオン有機溶剤を２０〜６５％含有する水性溶液により行われる。好ましくはイソプロパノール又はｎ−プロパノールの３５％が溶媒の水中で使用される。式（Ｉ）のインシュリンの脱着は、例えばイソプロパノール溶剤で洗浄することにより行われる。この洗浄はイソプロパノール溶液と混合しながら撹拌圧力フィルター上で洗浄するか又はカラム中でクロマトグラフィーにより行われる。樹脂／イソプロパノールの量比は１：１〜１：１０であり、好ましくは１：１１〜１：２である。洗浄段階は１〜５回好ましくは２回繰り返される。一緒にしたイソプロパノール画分は直接又は水で希釈後、更にクロマトグラフィーによる精製に用いられる。次の実施例中で本発明の方法を詳述する。百分率のデータは別に記載しない場合は重量によるものである。
【００２２】
実施例１
遺伝子工学により変性した大腸菌（EP 0 489 780）の発酵によって次のアミノ酸配列を有する融合蛋白質を調製した。
プロインシュリン配列１（配列番号４）：
Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg Phe Val Asn Gln His
Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu
Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu
Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu
Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu
Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys
Gly
【００２３】
プロインシュリン配列１は式（II）に対応するもので、式中、
Ｘは、ヒトインシュリン由来のＣペプチドであり、
Ｙは、Ｔｈｒ(Ｂ３０)であり、
Ｒ1は、Ｐｈｅ(Ｂ１)であり、
Ｒ2は、アミノ酸残基１１個を有するペプチドであり、
Ｒ3は、Ｇｌｙ(Ａ２１)であり、そして
Ａ２−Ａ２０はヒトインシュリンのＡ鎖（アミノ酸残基２〜２０）のアミノ酸配列であり、そしてＢ２−Ｂ２９はヒトインシュリンのＢ鎖（アミノ酸残基２〜２９）のアミノ酸配列である。
【００２４】
発現されたプロインシュリン配列１を有する融合蛋白質を大腸菌細胞中で集め、そして封入体を作成する。発酵完了後、大腸菌細胞を遠心分離により除去し、そして慣用の高圧ホモジナイゼイションにより破砕する。遊離された融合蛋白質封入体を遠心分離する。
プロインシュリン配列１を有する分離された融合蛋白質封入体２６００ｇ（冷凍乾燥後の乾燥重量）をpH１０.８の８Ｍ塩酸グアニジン溶液２００リットルに溶解する。場合により少量の懸濁物質を遠心分離後、清澄溶液をpH１０.８の水性システイン溶液（塩酸システイン水和物２５０ｇ）１８００リットルに４℃で撹拌注入する。インシュリン含有融合蛋白質の比率はＳＤＳ電気泳動走査（U.K. Laemmli, Nature, 227巻, 680〜685頁, 1970）により測定され、それは４５％であった。折りたたみ反応終結後、反応混合液中の正しく連結されたシスチン架橋を有するプロインシュリン配列１の含有量がＨＰＬＣ分析により測定され７６０ｇであった。
【００２５】
この溶液の２０００リットルを６Ｎ塩酸を用いてpH８.５に調整した。次にトリプシン５００mgを加えた。ＨＰＬＣ測定によればインシュリン２が３５０mg形成されていた。インシュリン２は式（Ｉ）に対応するもので、式中、
Ｙは、Ｔｈｒ(Ｂ３０)であり、
Ｚは、Ａｒｇ−Ａｒｇであり、
Ｒ1は、Ｐｈｅ(Ｂ１)であり、
Ｒ3は、Ｇｌｙ(Ａ２１)であり、そして
Ａ２−Ａ２０はヒトインシュリンのＡ鎖（アミノ酸残基２〜２０）のアミノ酸配列であり、そしてＢ２−Ｂ２９はヒトインシュリンのＢ鎖（アミノ酸残基２〜２９）のアミノ酸配列である。
【００２６】
インシュリン２は配列表の配列番号６及び９よりなり、正しく結合されたシスチン架橋を通じて互いに連結されたものである。
この溶液を６Ｎ塩酸を用いてpH３.５に調整し、そして伝導度の値を飽和塩化ナトリウム溶液を用いて約１０mS／cmに調整した。僅かな濁りを遠心分離により除去した。ＨＰ２０（三菱化成社製、ドイツ−デュッセルドルフ）７５kgを澄んだ溶液に加えた。インシュリン２が上清中に検出されなくなるまで懸濁液を徐々に４℃で１６時間撹拌した。吸入フィルターによる濾過で樹脂を除去し、そして洗浄液中の伝導度が０.４mS／cm以下になるまで水で洗浄した。生成物を５０％濃度の水性イソプロパノール溶液７５リットル中で樹脂を懸濁させて脱着した。濾過及びイソプロパノールでのインキュベーションを２回反復する。６０分後、樹脂を濾過しそして次に３５％濃度のイソプロパノール溶液中でインキュベーションを数回反復し、そして濾過した。インシュリン２の収量は２８８ｇであった。
インシュリン２を含有する溶出液は水で希釈及びpH調整後に直ちにクロマトグラフィーカラム上で更に精製し得る。
【００２７】
ＨＰＬＣ分析
蛋白質０.５ｇを６Ｍ塩酸グアニジン、５０mM tris、pH８.５、５mMエチレンジアミンテトラアセテート（ＥＤＴＡ）、１％ ２−メルカプトエタノール及び１０mMジチオトレイレールの溶液４０mlに９５℃で２分間溶解し、そして次に１４０００ｇで２０分間遠心分離した。澄んだ上清０.０２mlを高速液体クロマトグラフィーカラムに付した。
カラム：ニュークリオゲル(RNucleogel）RP 300-5/46（マカリー ＆ ネルゲル社製，アーヘン，ドイツ）
勾配：緩衝液Ａ：０.１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）
緩衝液Ｂ：アセトニトリル中０.０９％ＴＦＡ
温度：５５℃
合計溶出時間：４０分間
勾配は溶出時間後の下記の緩衝液Ｂの量を特徴とする。
１０分間２５％、１２分間６０％、１３分間９０％、１５分間１００％
流速：１ml／分
検出：２１５nm
インシュリンの保持時間：約１９分間
【００２８】
実施例２
遺伝子工学により変性した大腸菌（EP 0 347 781）の発酵によって次のアミノ酸配列を有する融合蛋白質を調製した。
融合蛋白質３（配列番号５）：
Met Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu
His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr
Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Ile Glu Gly Arg Phe Val Asn Gln
His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly
Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Gly Ile Val Glu Gln
Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
【００２９】
この融合蛋白質はプロインシュリン３のアミノ酸配列を含有している。発現された融合蛋白質３を大腸菌細胞内で集め、そして封入体を作成する。細胞の破砕を実施例１のように行った。このようにして得られた融合蛋白質３を臭化シアン開裂に付し、プロインシュリンを作成した（配列番号：８）。プロインシュリン３は式IIに対応するもので、式中、
Ｘは、Ａｒｇであり、
Ｙは、Ｔｈｒ(Ｂ３０)であり、
Ｒ1は、Ｐｈｅ(Ｂ１)であり、
Ｒ2は、４個のアミノ酸残基を有するペプチドであり、
Ｒ3は、Ａｓｎ(Ａ２１)であり、そして
Ａ２−Ａ２０及びＢ２−Ｂ２９はヒトインシュリンのＡ及びＢ鎖のアミノ酸配列に対応するものである。
【００３０】
臭化シアン開裂の後、プロインシュリン３の含量を９.２％インシュリン含有蛋白質を含む冷凍乾燥試料中でＳＤＳ電気泳動により定量分析した。実施例１のようにプロインシュリン３の２０００ｇを塩化システイン水和物と共にインキュベートする。次に正しく連結されたシスチン架橋を有するプロインシュリン３の１２６０ｇの含量をＨＰＬＣ分析により全反応混合液中で測定した。この生成物を実施例１のようにトリプシン５００mgで処理した。
インシュリン４が作成された。このインシュリン４は式Ｉに対応するもので、式中、
Ｙは、Ｔｈｒ(Ｂ３０)であり、
Ｚは、Ａｒｇであり、
Ｒ1は、Ｐｈｅ(Ｂ１)であり、
Ｒ3は、Ａｓｎ(Ａ２１)であり、そして
Ａ２−Ａ２０及びＢ２−Ｂ２９はヒトインシュリンのＡ及びＢ鎖のアミノ酸配列に対応するものである。
【００３１】
インシュリン４は配列表の配列番号：１及び７よりなり、そり等は正しく結合されたシスチン架橋により互いに連結されていた。
得られた溶液（２m3）はインシュリン誘導体８００ｇを含有し、それを実施例１のようにＨＰ２０ ７５kgで処理した。吸着及び脱着後合体した溶出液はインシュリン４を７０３ｇ含有していた（収率８８％）。
【００３２】
【配列表】
0003863579.tif 000003
【００３３】
0003863579.tif 000004
【００３４】
0003863579.tif 000005
【００３５】
0003863579.tif 000006
【００３６】
0003863579.tif 000007
【００３７】
0003863579.tif 000008
【００３８】
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【００３９】
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【００４０】
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