(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
硫酸化キチンオリゴ糖及び／又はその塩を有効成分として含有することを特徴とする抗炎症剤。
【請求項２】
キチンオリゴ糖の重合度が２〜１０である請求項１記載の抗炎症剤。
【請求項３】
形態が、粉剤、錠剤、カプセル剤、軟膏、スプレー剤又は注射剤である請求項１又は２記載の抗炎症剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、新しい作用機作に基いて炎症性疾患を治療する抗炎症剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、肺炎、肝炎、腎炎等の炎症性疾患の治療薬としては、副腎皮質ホルモンであるグルココルチコイド又は各種の非ステロイド系抗炎症剤が用いられていた。これらは、例えばホスホリパーゼＡ2 阻害、リポキシゲネース阻害、シクロオキシゲネース阻害等の抗プロスタグランジン作用に基づいて開発されたものであって、炎症反応を抑制または遮断し、炎症による合併症を防ぐ目的で使用されていた。
【０００３】
一方、近年、炎症の誘発は、白血球と血管内皮細胞間の接着を促進する分子に起因し、この反応には特定の接着分子が深く関わることが明らかとなってきた。すなわち、白血球上、及び炎症部位から遊離されるインターロイキン１やＴＮＦ（腫瘍壊死因子）により活性化された活性化血管内皮細胞上に、それぞれ特定の接着分子が存在し、それらの接着分子の相互作用により、白血球、特に好中球と、血管内皮細胞とが接着して、炎症局所へ、白血球の浸潤が開始されることが明らかとなってきた。
【０００４】
これらの接着分子は、白血球及び血管内皮細胞の双方から発現されるが、セレクチンファミリー、インテグリンファミリーが代表的なものである。なお、セレクチンファミリーは、白血球が血管内皮細胞へ結合する初期段階に接着を起こさせ、インテグリンファミリーは、主としてその後に起こるよりしっかりした結合に関わる。
【０００５】
これらのうち、セレクチンファミリーは、糖鎖をそのリガンドとすることが明らかとなってきた。セレクチンファミリーには血管内皮細胞に存在するＥーセレクチン（Bevilacqua, M.P. et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84, 9238-9243)、活性化血小板に発現されるＰ−セレクチン(Geng, J.G. et al. (1990) Nature, 343, 757-760) 、白血球に存在するＬ−セレクチン(Ley, K. et al. (1991) Blood, 77, 2553-2555 ）の３種が存在するが、これらの糖鎖リガンドは、シアリルLex あるいはシアリルLea(Lowe, J.B. et al. (1991) cELL, 53, 475-484; Philipis, et. al. (1990) Science, 250, 1130-1132; Magnani, J.L. 81991) Glycobiology, 1, 318-320)であると同定されている。
【０００６】
そこで、近年明らかになりつつある炎症の誘発機作に関する知見を基に、白血球の血管内皮細胞からの浸潤を阻害することにより、炎症を抑制することが考えられる。すなわち、白血球と血管内皮細胞とのセレクチンを介した接着を阻害するために、セレクチンのリガンドであるシアリルLex やシアリルLea を直接体内へ投与して炎症を抑制しようとする試みがなされている。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、グルココルチコイドは強い抗炎症作用を示すものの、若年層に投薬すると、満月様顔貌、めまい、頭痛、嘔吐など、更に重篤な場合には感染症、消化管出血、代謝異常、骨粗症、血栓症の誘発などの副作用を伴うために連続投与は困難であるという問題があった。
【０００８】
また、非ステロイド系抗炎症剤は一般的に効力が弱いという問題があった。
【０００９】
更に、セレクチンのリガンドであるシアリルLex やシアリルLea を直接体内へ投与する方法は、その問題点は明らかでないが、未だ認可されていない。なお、シアリルLex は、シアル酸転移酵素を用いて酵素的に合成されるが、合成が困難である。また、シアリルLex は、主にＥ−セレクチンと結合し、Ｌ−セレクチンやＰ−セレクチンとはあまり強く結合しない。
【００１０】
本発明は上記問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、副作用がほとんどなく、充分な抗炎症作用を有し、製造が容易な抗炎症剤を提供することにある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記目的を達成するため鋭意研究し、ラットに、コブラ毒(Cobra venom factor、  以下ＣＶＦと略記) を静脈内投与することにより惹起される、好中球依存性及び酸素ラジカル介在性で、かつ、Ｐ−セレクチン及び／又はＬ−セレクチン依存性の炎症モデルにおいて、硫酸化キチンオリゴ糖及び／又はその塩が、肺の血管透過性の増大、炎症に伴う出血及びミエトペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）活性を有為に抑制することから、抗炎症剤として有用であることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１２】
すなわち、本発明の抗炎症剤は、硫酸化キチンオリゴ糖及び／又はその塩を有効成分として含有することを特徴とする。
【００１３】
以下、本発明について好ましい態様を挙げて詳細に説明する。
【００１４】
本発明において硫酸化キチンオリゴ糖は、キチンオリゴ糖を化学的に硫酸化して得られるものを用いるのが好ましい。キチンオリゴ糖は、カニ、エビ等の甲殻類の外皮から得られる天然多糖類であるキチンを、酸、アルカリ等で化学的に部分加水分解するか、微生物・酵素等により生物化学的に部分加水分解して得られるＮ−アセチルグルコサミン（GlcNAc）のオリゴマ−である。また、キチンオリゴ糖の重合度は、２〜10程度で、多糖であるキチンに比べて水に対する溶解性が高い。キチンオリゴ糖は良質の甘味を有することから、食品素材として従来より使用されており、したがって、人体に対する安全性は高いものであるといえる。
【００１５】
キチンオリゴ糖の硫酸化は、通常、一般的に行われている方法を採用することができるが、硫酸化剤として、硫酸・トリメチルアミン複合体を使用するのが好ましい。キチンオリゴ糖と硫酸化剤の使用割合は、目的とする硫酸化キチンオリゴ糖の硫酸化率（又は硫黄含有率）及び反応条件に応じて選ぶことができる。例えば、50〜60℃の温度下に、数十時間〜数日間にわたって反応させる場合には、キチンオリゴ糖の重量の２倍量の硫酸化剤を用いるのが好ましい。このような条件下に製造する場合、硫酸化率は、キチンオリゴ糖の総水酸基の約50〜60％となる。
【００１６】
また、硫酸化キチンオリゴ糖の精製は、通常、各種の修飾多糖類を精製する際に採用されている方法により行うことができる。具体的には、反応混合物を減圧濃縮後、蒸留水に対して透析することにより脱塩し、トリフルオロ酢酸処理によりトリメチルアミンを除去し、次いで凍結乾燥することにより、白色粉末を得ることができる。
【００１７】
硫酸化キチンオリゴ糖の一般式を化１に示す。
【００１８】
【化１】
0003769045.tif 000002
【００１９】
なお、本発明で用いる硫酸化キチンオリゴ糖は、キトサンオリゴ糖を同様の処理により硫酸化することによっても製造することができる。
【００２０】
また、本発明において硫酸化キチンオリゴ糖の塩は、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、二価鉄塩等を用いることができる。
【００２１】
本発明の抗炎症剤は、硫酸化キチンオリゴ糖及び／又はその塩を抗炎症物質として含有していればよく、その形態は、粉剤、錠剤、カプセル剤等の経口投与剤、軟膏、スプレー剤等の外用薬、静脈内、動脈内、筋肉内、皮下、皮内等への注射剤等いずれであってもよく、その形態に応じて、通常の医薬品の調製に使用される希釈剤、賦形剤等を配合するのが好ましい。なお、希釈剤、賦形剤は製造しようとする医薬品の形態に応じて、粉剤、溶剤、懸濁剤等が用いられるが、これらは、具体的には、例えば、粉剤としては、乳糖、セルロース等が用いられ、溶剤としては、水、エチルアルコール、プロピレングリコール等が用いられ、懸濁剤としては、ポリオキシエチレンソルビトール、ソルビタンエステル類等が用いられる。
【００２２】
本発明の抗炎症剤の成人１人当たりの投与量は、硫酸化キチンオリゴ糖として、経口の場合0.1 〜1.0 ｇ、静脈内の場合10〜100 mg、筋肉内の場合50〜300 mg、皮下、皮内の場合30〜150 mgを、１日１回又は数回に分割して投与するのが好ましい。また、外用薬としては、例えば、軟膏として外皮局所に塗布し、又はスプレー剤の形で外皮、咽喉、鼻腔等に適用し、あるいは点眼液として使用することができる。この場合、外用剤中の硫酸化キチンオリゴ糖の濃度は、剤形や適用部位によって異なるが、0.1 〜１重量％とするのが好ましい。
【００２３】
【作用】
本発明の抗炎症剤は、硫酸化キチンオリゴ糖及び／又はその塩を有効成分として含有するが、ラットに、ＣＶＦを静脈内投与することにより惹起される、好中球依存性及び酸素ラジカル介在性で、かつ、Ｐ−セレクチン及び／又はＬ−セレクチン依存性の炎症モデルに、硫酸化キチンオリゴ糖及び／又はその塩を投与すると、肺の血管透過性の増大、炎症に伴う出血及びミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）活性を有意に抑制することから、優れた抗炎症作用を有するものであるといえる。
【００２４】
これは、硫酸化キチンオリゴ糖及び／又はその塩が、セレクチンのリガンドとして作用し、炎症の誘発となる白血球と血管内皮細胞とのセレクチンを介した接着を阻害するためと考えられる。
【００２５】
すなわち、上記実験動物モデルを用いてスクリーニングされる物質は、セレクチンが介在する白血球の血管内皮細胞への接着による組織浸潤を抑制するので、広く炎症一般、例えば成人性呼吸切迫症候群(adult respiratory distress syndrome: ARDS) 等の予防または治療に有効であると期待され、したがって、硫酸化キチンオリゴ糖及び／又はその塩は、種々の炎症に対して有効であることが期待される。
【００２６】
また、キチンオリゴ糖は良質の甘味を有することから、食品素材として従来より使用されており、したがって、人体に対する安全性は高いものであるといえる。
【００２７】
更に、硫酸化キチンオリゴ糖及び／又はその塩は、安価に、大量生産することが可能であり、経済的にも有利である。
【００２８】
【実施例】
以下に、本発明の抗炎症剤の有効成分である硫酸化キチンオリゴ糖の効果を明らかにするため、実施例を挙げて説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２９】
実施例１
キチンオリゴ糖であるキトテトラオ−ス（[GlcNAc]4 ）200 mgと、硫酸・トリメチルアミン複合体（アルドリッチ社製）400 mgとを、ジメチルホルムアミド６mlに溶解し、50〜60℃の油浴中で、１週間攪拌した。
【００３０】
得られた反応液を真空ポンプで減圧濃縮した後、残査を水に溶解し、脱イオン水に対して15時間透析し、次いで凍結乾燥した。得られた乾固物を、水２mlに溶解し、キトテトラオ−スの水酸基総数の1.5 倍モル相当量のトリフルオロ酢酸を加えて、室温下に、１時間攪拌した。続いて、反応液を透析した後、凍結乾燥して、硫酸化率（硫黄含有率）が7.2 ％の硫酸化キチンオリゴ糖（[GlcNAc]4-SO3H）190 mgを得た。
【００３１】
実施例２
実施例１において、キチンオリゴ糖であるキトテトラオ−スを、キトペンタオ−ス（[GlcNAc]5 ）に代え、あとは実施例１と同様にして、硫酸化率（硫黄含有率）が13.5％の硫酸化キチンオリゴ糖（[GlcNAc]5-SO3H）200 mgを得た。
【００３２】
試験例（抗炎症作用の評価試験）
（１）肺炎症の評価法及び肺炎症モデル動物の作成
実施例１、２で得られた[GlcNAc]4-SO3H、[GlcNAc]5-SO3Hの２種の硫酸化キチンオリゴ糖の抗炎症作用を評価するために、硫酸化する前の[GlcNAc]4 と、[GlcNAc]5 とを、それぞれ比較例１、比較例２として用いた。これらを被検物質とする。
【００３３】
それぞれの被検物質を、１mg/kg 濃度で、１mgウシ血清アルブミン／ml生理食塩水溶液に溶かし、１分間超音波処理して、被検物質溶液とした。
【００３４】
また、コブラ (Naja naja)粗毒素から、Tillらの方法(J. Clin. Invest., 69,
1126-1135 (1982）) により、ＣＶＦを精製単離した。
【００３５】
ラット( 雄性、Long Evans、250-350g) に、被検物質溶液を、0.3ml/匹静脈内投与した後、体重１kg当たり20ＵのＣＶＦを、125I- ウシ血清アルブミン（ 0.5μＣｉ）及び51Cr標識ラット赤血球とともに静脈内投与した。なお、ラットは、ＣＶＦの投与により肺炎症をおこす。
【００３６】
ＣＶＦを投与してから30分間経過後に、ラットを、体重１kg当たり100 mgの塩酸ケタミンで麻酔して殺し、背部大動脈から採血した。
【００３７】
その後、30分間隔で、肺の血管系を、右心室を介して、ｐＨ7.4 のリン酸緩衝液10mlを用いて灌流した。次いで、肺を摘出し、滅菌生理食塩水10mlで、上記血管系を灌流し、次いで、組織内に残存する放射能量を、ガンマシンチレーションカウンターで測定した。
【００３８】
なお、陽性対照ラットは、被検物質を投与せず、あとは上記と同様に処理し、陰性対照ラットは、被検物質を投与せず、ＣＶＦの代わりにｐＨ7.4 のリン酸緩衝液を使用した以外上記と同様に処理した。
【００３９】
肺の炎症を、肺の血管透過性の増大と出血によって測定した。血管透過性の増大は、殺した時に得た静脈の血液１ml中に存在する放射能量に対する肺組織内に存在する125I- ウシ血清アルブミン放射能量の比を求めることにより測定した。また、出血は、殺した時に得た静脈の血液１ml中に存在する放射能量に対する肺組織内に存在する51Cr標識ラット赤血球の放射能により測定した。
【００４０】
それぞれ、被検物質及びＣＶＦ投与ラットの測定値を被検物質値、陽性対照ラットの測定値を陽性対照値、陰性対照ラットの測定値を陰性対照値として、肺炎症の阻害活性を下記の数１により算出した。
【００４１】
【数１】
肺炎症の阻害活性（％）＝100 ×[ （被検物質値−陰性対照値）／（陽性対照値−陰性対照値）]
【００４２】
（２）好中球浸潤の指標としての組織ミエロパーオキシダーゼ（以下ＭＰＯと略記）活性の測定法
炎症反応のもう一つの指標として好中球の血管から組織への浸潤を調べた。好中球にはマーカー酵素としてＭＰＯ活性が存在する。そこで、好中球浸潤の指標としてのＭＰＯ活性を測定した。
【００４３】
グリコーゲン刺激ラットの一定数の腹腔内好中球を正常ラットの肺に加え、組織をホモゲナイズし、次いで抽出した後、検量線を作成した（Warrenら、J. Clin. Invest., 84, 1873-1882, 1989)。
【００４４】
上記（１）で得られた肺標品を、緩衝液（50mMリン酸塩、ｐＨ6.0 ）６mlを用い、ホモゲナイザーとして「Polytron」（ Tokmar Co.,製、ダイアル４に設定）を使用して、40秒間ホモゲナイズした。次いで、４℃、3000xgの条件下で、30分間遠心分離した後、上澄液中のＭＰＯ活性を、O-ジアニジン存在下で、H2O2の消費からもたらされる460 nmの吸光度の変化を測定することにより評価した。
【００４５】
（３）結果
肺の血管透過性の増大、出血、ＭＰＯ活性の測定結果を表１に示す。
【００４６】
【表１】
0003769045.tif 000003
【００４７】
表１の結果から、実施例１、２の硫酸化キチンオリゴ糖は、比較例１、２の硫酸化しないキチンオリゴ糖と比較して、コブラ毒（ＣＶＦ）の投与による肺炎症において、肺の血管透過性の増大、炎症に伴う出血及びミエトペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）を有意に阻害することがわかる。したがって、実施例１、２の硫酸化キチンオリゴ糖は、抗炎症剤として利用できることがわかる。
【００４８】
（４）急性毒性の試験結果
実施例１、２で得られた硫酸化キチンオリゴ糖について、ラットにおける急性毒性を試験した。
【００４９】
その結果、ＬＤ50＞５ｇ／kgであった。
したがって、硫酸化キチンオリゴ糖は安全性が高いといえる。
【００５０】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明の抗炎症剤によれば、有効成分として含有する硫酸化キチンオリゴ糖及び／又はその塩が、セレクチンのリガンドとして作用することにより、炎症の誘因である白血球と血管内皮細胞とのセレクチンを介した接着を阻害し、炎症性疾患を治療することができる。したがって、従来の抗炎症剤とは全く異なる作用機序による抗炎症剤であるといえる。なお、キチンオリゴ糖は、食品素材として従来より使用されており、したがって、人体に対する安全性は高く、副作用もない。また、硫酸化キチンオリゴ糖及び／又はその塩は、安価に、容易に大量生産することができ、経済的にも有利である。