(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
液中に存在する微粒子に、微粒子の吸収帯の中から選択される波長の光を照射して吸収させ、当該微粒子の当該波長における吸光度の相違による光泳動速度の差を利用して、液中の微粒子を分離、又は計測する方法。
【請求項２】
微粒子が色素を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
色素がモリブデンブルーである請求項２に記載の方法。
【請求項４】
照射される光の波長が微粒子に添加される色素の吸収帯の波長から選択される請求項３に記載の方法。
【請求項５】
光がレーザー光である請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
さらに微粒子の粒径を調節して微粒子の泳動速度を変化させることを含む、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、液中の微粒子の分離手法に関し、光エネルギーを用いた新しい手法を提供するものである。より詳細には、本発明は、液中の吸光度の異なる微粒子に光を照射して、光の吸収により泳動速度が相違する微粒子を検出、分離、選別又は計測する方法、そのための装置、及び光泳動独度を増加させるための光泳動速度増進剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
液中の微粒子の分離およびキャラクタリゼーションは、現代の分析化学の重要なテーマの一つである。微粒子の分散液は生体系や水圏、工業製品やその製造過程など、身の回りの至る所に存在し、生物学、生体工学、医学、生態学、環境科学、工業化学といった分野の研究対象となっているからである。
これまで、ラテックス、エマルション液滴、ミセル、ベシクル、半導体などの液中の微粒子に対して様々な泳動分析法が適用され、泳動による分離やキャラクタリゼーションが行なわれてきた。このような泳動法として、電気泳動法、沈降法、誘電泳動法や電磁泳動法などが開発されてきた。
【０００３】
これらの泳動分析法のうち、既に泳動機構が解明されて広く応用されているものは電気泳動法と沈降法の２つである。しかしながら、電気泳動法は電荷を持った微粒子を主な適用対象にしていること、媒体の選択が経験的で予備的実験を必要とするケースが多いこと、沈降法は微粒子が媒体と密度差を持つ必要があることなどの短所も合わせ持っているため、これらは万能な泳動法といえるものではなかった。また、上記の泳動分析法に加えて新たな泳動場、泳動駆動力を用いた分析法を開発していくことによって、分離が困難だった微粒子の簡便な分離法や、微粒子の挙動についての新たな情報を得ることが可能となる。
【０００４】
近年、流体中の３種類の粒径の異なるポリスチレンラテックスを、レーザーの輻射圧を利用してサイズ分離したという報告が出された（Imasaka,et al., Anal.Chem. 1995, 67, 1763-1765.）。２０世紀初期に光が物体に力を及ぼす現象が発見されたが、物体が動く原因を光そのものよりも光によって生じる温度勾配に求めたこともあってか、物体を動かす目的で光を用いるまでに半世紀を費やした。レーザーの出現とその性能の向上を背景に、物理学の分野において１９７０年、レーザー照射によって水中のポリスチレンラテックスが光に押されるように動く現象をA. Ashkin.が発見し、これを報告した（Ashkin, A. Phys. Rev. Lett. 1970, 24, 156-159.）。その後、媒体よりも高い屈折率を持つ微粒子にTEM００ modeのレーザーを照射すると、照射条件によって２つの異なる現象が観測されることが知られるようになった。１つは、レーザーが焦点距離の短いレンズで強く集光された場合に観測され、微粒子は光の輻射圧の勾配力によって焦点にトラップされる（Ashkin, A., et al., S. Opt. Lett. 1986, 11, 288-290.；Ashkin, A, et al., Science 1987, 235, 1517-1520.；Misawa, H., et al., Chem.Lett. 1990, 8, 1479-1482.；Ashkin, A., Biophys. J. 1992, 61, 569-582.）。
【０００５】
この現象は光学ピンセットとして知られ、生物学や医学の分野で細胞や菌を非接触非破壊で扱う技術として実用化されている。もう１つはレーザーが焦点距離の長いレンズで弱く集光された場合、または全く集光されない場合に見られる現象で、微粒子は光の輻射圧の散乱力によって光の照射方向に動いていく。この現象は液中の微粒子の泳動分析法としての大きな可能性があるにもかかわらず、これまでほとんど顧みられてこなかった。
本発明者らは、先に水中の各種の有機液滴について、液滴の屈折率と粒径がレーザー光照射により、泳動速度がどの様に変化するか観察してきており、泳動速度が、粒子の屈折率と粒径に比例することを見出してきた（A.Hirai, H.Monjushiro, H.Watarai, Langmuir, vol 12, 5570-5575, 1996）。このような光泳動は粒子の屈折率と溶液のそれとの差により、照射された光の散乱により、粒子が移動する現象であり、微粒子をその屈折率と粒径に応じて分離することができる。
【０００６】
このような光泳動法による微粒子の分離法は、無電荷の微粒子であっても分離することができ、また、従来ＤＮＡ等の生体物質や環境物質の分離技術として広く活用されているキャピラリー電気泳動法などの電気泳動法のように調整や測定に熟練を必要とするものでもないという大きな特徴がある。しかしながら、従来の光泳動法は、微粒子の屈折率と粒径に応じて分離するものであり、他の要因によって分離することができず、また泳動速度も遅いという欠点があった。
したがって、光泳動法の新たな手法の開発が期待されてきている。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、新規な光泳動法を提供するものである。
本発明は、無電荷の微粒子や同じ表面電荷を有する微粒子であっても、これらを簡便な操作で分離することができる新規な光泳動法を提供する。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、光泳動法における液中の微粒子の分離やキャラクタリゼーションについて種々検討してきたところ、物質が本来持っている吸収スペクトルを利用して光泳動を起こさせることを見出した。
【０００９】
本発明は、液中の吸光度の異なる微粒子に光を照射して、光の吸収により泳動速度が相違する微粒子を検出、分離、選別又は計測する方法に関する。
また、本発明は、光照射装置、吸光度の異なる微粒子を含有する液状体からなる被検体を収納し得る透明容器、及び光の照射により光泳動された微粒子を検出、分離、選別又は計測し得る装置からなる、液中の吸光度の異なる微粒子に光を照射して、光の吸収により泳動速度が相違する微粒子を検出、分離、選別又は計測するための装置に関する。
さらに、本発明は、前記方法における照射する光の波長において吸光度を有する色素からなる、液中の吸光度の異なる微粒子に光を照射して、光の吸収による微粒子の光泳動速度増進剤に関する。
【００１０】
本発明者らは、先に水中の各種の有機液滴について、液滴の屈折率と粒径がレーザー光照射により、泳動速度が、粒子の屈折率と粒径に比例することを見出してきた（A.Hirai, H.Monjushiro, H.Watarai, Langmuir, vol 12, 5570-5575, 1996）。今回、本発明者らはレーザー波長に吸収をもつ水中の液滴微粒子にレーザー光を照射して、レーザー光泳動速度に及ぼす微粒子の光吸収の影響について検討したところ、光吸収を有する微粒子の光泳動速度が光吸収を持たない微粒子に比べて飛躍的に増大することを見出した。
【００１１】
本発明者らは、まず吸収スペクトルの測定によりモリブデンブルーを添加した２−ベンジルピリジンが、照射するレーザー光の波長１０６４ｎｍに吸収をもつことを調べた。結果を図１に示す。図１はモリブデンブルーを無添加（溶媒）の場合、モリブデンブルーを２．４×１０−２ｍｏｌ／ｄｍ３の濃度で添加した場合、及びモリブデンブルーを７．２×１０−２ｍｏｌ／ｄｍ３の濃度で添加した場合の各波長（ｎｍ）における吸光度（１ｍｍセル）を示したものである。図１における吸光度はベンゼンの吸光度を０．００とした場合の比で示されている。図１より実験に用いたレーザー光の波長である１０６４ｎｍにおける吸光度Ａをみると、モリブデンブルーを無添加の場合（２−ベンジルピリジン）には吸光度Ａがほぼ０であるのに対して、モリブデンブルーを２．４×１０−２ｍｏｌ／ｄｍ３の濃度で添加した場合の吸光度Ａは０．２５（２５％）であり、またモリブデンブルーを７．２×１０−２ｍｏｌ／ｄｍ３の濃度で添加した場合の吸光度Ａは０．７１（７１％）であることがわかった。
これらの３種類の試料を用いて以下の実験を行った。
【００１２】
これらの試料を超音波をかけながら水中に分散させて、粒径が０．５から３μｍの液滴微粒子が分散した水溶液を調製した。これらの液滴を含有する溶液をガラスマイクロセルに入れ、図２に示す装置によりこれらの溶液中の微粒子の光泳動を観察した。
図２は本発明の検出、分離、選別又は計測するための装置の例を示したものである。調製された試料をマイクロセル２に入れ、レーザー光源１よりレーザー光を照射し、これをレンズ３により集光してマイクロセル２に照射する。マイクロセル２中の微粒子の挙動を顕微鏡４を通してＣＣＤカメラ５で撮影し、撮影された画像をビデオシステム６で表示させた。
【００１３】
この実験においては、レーザー源としてＣＷ  Ｎｄ：ＹＡＧレーザー（ADLAS, DIODE LASER PUMPED Nd:YAG LASER, DPY 321）の１０６４ｎｍの波長を使用し、第２高調波である５３２ｎｍの緑色光が１０６４ｎｍ光の５％以下の強度だったため、コールドミラーは使用しなかった。
出射レーザーのビーム径は直径１．０ｍｍであり、そのまま照射すると、試料を入れたセル全体に光が入射する。これを防ぐため、集光レンズ３を用いてビーム径を絞り、試料位置での直径を７０μｍとなるように調整した。レーザー出力は３１０ｍＷであった。集光レンズ３は焦点距離が６．００ｃｍのものを使用し、その焦点に顕微鏡４（Nikon, Labophot YF Type 104）の対物レンズの焦点が合うように、各部品を配置した。
試料は、内部寸法が１００μｍ×１００μｍ×５０ｍｍのマイクロセル２（Vitro Dynamics Inc., Standard Glass Microcells）に入れて顕微鏡の焦点下のｘ−ｙステージ上に置いた。泳動挙動の観察はＣＣＤカメラ５（Sony, DXC-108を用いた）を接続した顕微鏡下で行ない、得られた画像はビデオシステム６で記録しながらモニター上に映した。
【００１４】
各試料の種々の粒径（μｍ）における光泳動速度の結果を図３に示す。図３の横軸は粒径（μｍ）を示し、縦軸は光泳動速度（μｍ／秒）を示す。図３中の三角印はモリブデンブルーを無添加の場合（Ａ＝約０）を示し、菱形印はモリブデンブルーを２．４×１０−２ｍｏｌ／ｄｍ３の濃度で添加した場合（Ａ＝０．２５）を示し、丸印はモリブデンブルーを７．２×１０−２ｍｏｌ／ｄｍ３の濃度で添加した場合（Ａ＝０．７１）を示す。
この結果からも明らかなように微粒子の吸光度Ａが大きくなると泳動速度が飛躍的に増大することがわかる。特に粒径が２μｍ以上の場合にその相違が顕著になることがわかる。
【００１５】
粒径が２μｍの場合における吸光度と光泳動速度との関係を図４に示す。図４の横軸は１０６４ｎｍにおける１ｍｍセルでの微粒子成分の吸光度を示し、縦軸は光泳動速度（μｍ／秒）を示す。吸光度が約０の場合には光泳動速度が約１５μｍ／秒であるが、吸光度が０．２５の場合には光泳動速度が約２５μｍ／秒に増加し、吸光度が０．７１の場合には６５μｍ／秒に増加する。
この結果は、同じ粒径でほぼ同じ屈折率であっても、吸光度の相違により光泳動速度が大きく異なってくることをはっきりと示している。そして、この光泳動速度の相違により、吸光度の異なる微粒子を光の照射により各微粒子の有する吸光度に応じて検出することができること、この光泳動速度の差を利用して微粒子混合物中から特定の吸光度を有する微粒子を分離又は選別することができること、さらにはこの光泳動速度の差を利用して微粒子混合物中から特定の吸光度を有する微粒子の数を計測することができることが示された。
【００１６】
以上のように、本発明は吸光度の異なる微粒子に光を照射することにより、当該微粒子をその吸光度、好ましくは吸光度と粒径により検出、分離、選別又は計測する方法及びそのための装置を提供するものである。
また、本発明は、前記してきたように、色素などの光吸収剤を光泳動法における光泳動速度を増加させるために使用することができることから、光泳動法における照射する光の波長において吸光度を有する光吸収剤、例えばモリブデンブルーなどの色素からなる、液中の吸光度の異なる微粒子に光を照射して、光の吸収による微粒子の光泳動速度を増加させるための使用、又は光泳動速度増進剤を提供するものである。
【発明の実施の形態】
【００１７】
本発明の方法において検出、分離、選別又は計測される微粒子は、それ自体が固有の吸光度を有するものであってもよいが、前記したように微粒子に色素などの照射する光の波長において当該光を吸収する光吸収剤を添加して、微粒子の吸光度を変化させたものであってもよい。本発明の方法において使用される光吸収剤としては、照射する光の波長において当該光を吸収するものであって、微粒子成分に悪影響を与えないものであれば特に制限はない。光の吸収の程度は使用する光吸収剤の最大吸収である必要はなく、図１に例示されているように微粒子に光吸収剤を添加した場合に、微粒子の吸光度を変化させることができるものであればよい。本発明の光吸収剤としては、照射する光が可視領域またはその近傍である場合には色素、例えばモリブデンブルーなどであってよいが、必ずしも着色されるものである必要ない。
また、微粒子に吸光度の差を付するために、異なる光吸収剤を用いて吸光度の差をつけることもできるが、同じ光吸収剤を用いてその濃度差により吸光度の差を付することもできる。
【００１８】
本発明の方法は、液中における微粒子の挙動に関するものであり、当該「液」としては、溶媒として使用し得るもので照射する光の波長において吸収が顕著でないものであれば特に制限はないが、通常は水が好ましい。水は純水であってもよいが、生理的食塩水などの水溶液であってもよい。
本発明の方法における照射する光の波長は、微粒子を泳動し得る波長であればよいが、検出、分離、選別又は計測される微粒子の吸収帯の中から選択されるのが好ましく、より好ましくは微粒子の吸光度の差が明確な波長である。微粒子自体が吸光度において差が余りない場合には光吸収剤、例えば色素などの吸収帯の中から選択されるのが好ましい。
光源としては種々のものを使用することができるが、単一波長のレーザー光が好ましい。
【００１９】
本発明の方法は、微粒子の吸光度の差により微粒子を検出、分離、選別又は計測するものであるが、微粒子の吸光度の差に加えてさらに微粒子の粒径により微粒子の混合物中から特定の粒径及び吸収を有する微粒子を検出、分離、選別又は計測することもできることは、図３に示す結果からもわかる。したがって、本発明は、液中に存在する吸光度の異なる微粒子に光を照射して、光の吸収及び微粒子の粒径により泳動速度が相違する微粒子を検出、分離、選別又は計測する方法を提供するものでもある。
【００２０】
さらに本発明は、前記した本発明の方法を実施するための装置を提供する。本発明の装置は、基本的には光照射装置、吸光度の異なる微粒子を含有する液状体からなる被検体を収納し得る透明容器、及び光の照射により光泳動された微粒子を検出、分離、選別又は計測し得る装置からなるものであり、必要に応じて検出、分離、選別又は計測などのための特別の装置を設けることもできる。例えば、泳動を記録するために検出、分離、選別又は計測し得る装置にＣＣＤカメラを設けることができる。さらに、当該ＣＣＤカメラで得られた画像を画像処理するための処理装置及びそれをモニターするためのモニター装置を設けることもできる。
【００２１】
【実施例】
以下に、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。
【００２２】
実施例１  モリブデンブルー含有２−ベンジルピリジンの調製
１２−モリブドリン酸（Ｈ３ＰＭｏ１２Ｏ１４・ｘＨ２Ｏ）の水溶液に、ｐＨ１でアスコルビン酸を添加して、モリブデンブルーの水溶液を得た。
得られたモリブデンブルー水溶液を２−ベンジルピリジン（ｄ＝１．０６７、ｎ＝１．５８）で抽出して、洗浄、乾燥してモリブデンブルー含有２−ベンジルピリジン溶液を調製した。
得られたモリブデンブルー含有２−ベンジルピリジン溶液及び２−ベンジルピリジンの吸光度を光音響分光法（ＰＡＳ）より測定した。使用したセルは１ｍｍであった。この結果を図１に示す。また、波長１０６４ｎｍでは、約７１％と約２５％の吸収スペクトルが観察された。
【００２３】
実施例２  水中の微粒子の調製
２．０ｍＬの超純水を入れた秤量瓶に超音波をかけながら、２．０μＬの２−ベンジルピリジン又はモリブデンブルー含有２−ベンジルピリジン溶液をマイクロピペット（Eppendorf, 0.5μL〜10.0μL）を用いて加え、ｏ／ｗ（Oil in Water）エマルションを調製した。
得られた液滴微粒子の粒径は、概ね半径０．５μｍから３μｍであった。得られたエマルションは、界面活性剤を加えることなく数十分から数時間の間安定なエマルションを形成することが可能であった。
【００２４】
実施例３  光泳動の測定
図２に示す装置を用いて、実施例２で得られたエマルションの光泳動を観察した。
各試料を、内径１００×１００μｍ、外径２５０×２５０μｍの角形光学セル（Vitro Dynamics Inc.,Standard Glass Microcells）からなるマイクロセルに居れ、波長１０６４ｎｍ、出力３１０ｍｗ、照射スポット径７０μｍのレーザー光源（ｃｗ  Ｎｄ：ＹＡＧレーザー（CVI LASER Corp.又はADLAS DPY-321））からのレーザー光を照射した。泳動挙動の観察はＣＣＤカメラ（SONY DXC-108）を接続した顕微鏡（Nikon Labophoto）下で行ない、得られた画像はビデオで記録しながらモニター上に映した。モ二ター上の画像の上下左右は、光学セルを上から見たときの上下左右に対応させた。顕微鏡の対物レンズは、倍率×４０のものを用いた。
結果を図３及び図４に示す。光吸収を持たない時の泳動速度は約１５μｍ／ｓｅｃであるのに対し、吸光度が２５％で２８μｍ／ｓｅｃ、吸光度が７１％で６５μｍ／ｓｅｃを示た。
【００２５】
【発明の効果】
本発明は、吸光度による光泳動法という新規な泳動法を提供するものであり、従来の電気泳動法などでは分離や選別が困難であった無電荷の粒子や表面電荷が同じ粒子であっても本発明の方法により、吸光度の差により分離することができる。また、本発明の方法及び装置は比較的簡便なものであり、計測に当たって装置の煩雑な調整や測定に熟練を必要とせず、粒子の挙動をリアルタイムで測定することができる。さらに、光源のオン／オフにより粒子の動きを簡単に制御することもできる。
また、本発明は色素などの光を吸収する光吸収剤の、光の吸収による微粒子の光泳動速度を増加させるための使用、又は光泳動速度増進剤としての新たな用途を提供するものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、モリブデンブルーを無添加の場合、及び種々の濃度のモリブデンブルーを添加した場合の２−ベンジルピリジンの各波長（ｎｍ）における吸光度（１ｍｍセル）を示したものである。
【図２】図２は、本発明の検出、分離、選別又は計測するための装置の例を示したものである。
【図３】図３は、２−ベンジルピリジンを用いた各試料の種々の粒径（μｍ）における光泳動速度の結果を示したものである。図３の横軸は粒径（μｍ）を示し、縦軸は光泳動速度（μｍ／秒）を示す。図３中の三角印はモリブデンブルーを無添加の場合（Ａ＝約０）を示し、菱形印はモリブデンブルーを２．４×１０−２ｍｏｌ／ｄｍ３の濃度で添加した場合（Ａ＝０．２５）を示し、丸印はモリブデンブルーを７．２×１０−２ｍｏｌ／ｄｍ３の濃度で添加した場合（Ａ＝０．７１）を示す。
【図４】図４は、２−ベンジルピリジンにモリブデンブルーを７．２×１０−２ｍｏｌ／ｄｍ３の濃度で添加した場合の粒径が２μｍの場合における吸光度と光泳動速度との関係を示す。図４の横軸は１０６４ｎｍにおける１ｍｍセルでの微粒子成分の吸光度を示し、縦軸は光泳動速度（μｍ／秒）を示す。
【符号の説明】
１  レーザー光源
２  マイクロセル
３  レンズ
４  顕微鏡
５  ＣＣＤカメラ
６  ビデオシステム
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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