(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
変異型にマッチする第１のプライマーと野生型にマッチする第２のプライマーとの混合物を遺伝子検査プローブとして用いＤＮＡ配列の検査部位に対して相補鎖伸長反応を行い、該伸長反応に際して蛍光標識を取り込み、蛍光標識ＤＮＡ鎖を得、さらに当該蛍光標識ＤＮＡ鎖を電気泳動により分離する工程を含み、第１のプライマーと第２のプライマーとの間で検査部位における少なくとも１つの核酸が異なり、第１のプライマーまたは第２のプライマーは電気泳動における泳動速度を変えるために付加的な他の配列を有し、第１のプライマーおよび第２のプライマーはいずれも前記検査部位における核酸および付加的な他の配列以外は同一の塩基配列を有し、蛍光標識ＤＮＡ鎖中の蛍光標識は同じ色素である遺伝子検査方法。
【請求項２】
第１のプライマーと第２のプライマーとの間で検査部位における複数の塩基が異なり、第１のプライマーおよび第２のプライマーの伸長した鎖の長さが異なるものである請求項１記載の遺伝子検査方法。
【請求項３】
相補鎖伸長反応の際に蛍光標識デオキシヌクレオチド３リン酸（ｄＮＴＰ）またはジデオキシヌクレオチド３リン酸（ｄｄＮＴＰ）が取り込まれ、相補鎖伸長の生成物が蛍光検出により検出される請求項１記載の遺伝子検査方法。
【請求項４】
電気泳動がマイクロチップ電気泳動であり、泳動路が溝を切ることによりまたはキャピラリーを設けることにより形成され、それぞれの泳動路長が１０ｃｍ未満である請求項１に記載の遺伝子検査方法。
【請求項５】
第１のプライマーおよび第２のプライマーの３’末端または３’末端領域はターゲットにマッチさせるに際し検査すべき変異部位とハイブリダイズするよう設計され、相補鎖伸長反応に際して蛍光標識ｄｄＮＴＰまたは蛍光標識ｄＮＴＰが取り込まれる請求項１に記載の遺伝子検査方法。
【請求項６】
相補鎖伸長反応により蛍光標識核酸基質とともに取り込まれたＤＮＡ鎖が電気泳動に際して蛍光標識核酸基質より早く泳動する請求項１に記載の遺伝子検査方法。
【請求項７】
ゲルあるいは流動性ポリマーを用いた電気泳動による遺伝子検査方法であり、一組のプライマーを用いて１塩基あるいは数塩基の相補鎖伸長反応を行い、さらに蛍光標識の取り込み後に電気泳動分離で見られるＤＮＡバンドの電気泳動パターンのピーク形状を観測する工程を含み、当該プライマーは少なくとも検査部位における核酸および付加的な他の配列以外は同一の塩基配列を有し、蛍光標識ＤＮＡ鎖中の蛍光標識は同じ色素であり、前記ピーク形状は各ターゲット部位の種類によって異なるものであることを特徴とする遺伝子検査方法。
【請求項８】
第１のプライマーと第２のプライマーの伸長鎖の長さが異なる請求項７に記載の遺伝子検査方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はＤＮＡ検出、遺伝子診断、一塩基変異検出などＤＮＡの検出、遺伝子のタイピングなどの方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヒトゲノム配列解析の完了にともない、遺伝子情報を診断など医療分野に活用しようとする動きが活発化している。ＤＮＡの代表的な分析技術はゲル電気泳動であり、特にキャピラリーアレーゲル電気泳動装置は高速高スループットＤＮＡ分析システムとして広く用いられ、ゲノム解析にも用いられている。ゲノム配列解析に続いて注目されているのは遺伝子発現プロフィール分析や遺伝子中の１塩基置換（ＳＮＰｓ：ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ）の分析である。種々条件下で発現している遺伝子を調べたり、種々固体の遺伝子変異を調べたりすることで遺伝子の機能や遺伝子と病気あるいは医薬品感受性との関連が調べられている。また、これらの蓄積された遺伝子に関する知識を用いて病気の診断などが行われつつある。
【０００３】
病気の診断では未知の遺伝子の解析と異なり、既に知られた遺伝子やその変異の有無が検査対象である。これには安いコストで検査できることが望ましく、種々の方法が発達してきている。医療診断では単一の遺伝子による病気の診断から種々遺伝子と環境が影響して起こる病気や医薬品に対する感受性に関連した複数の遺伝子の検査が重要になりつつある。此処では何種類もの遺伝子を同時に検査することが重要である。従って一つの遺伝子や変異を検査するのでなく複数の遺伝子を検査する必要があるが、遺伝子の検査部位の増幅プロセスを含めて安価にＳＮＰｓなどを測定するシステムが求められている。このため、ゲノム解析に用いられたキャピラリーゲル電気泳動とは異なった簡便な方法が望まれている。ＳＮＰｓ分析や遺伝子のプローブ検査に使用できるシステムとしては、Ｉｎｖａｄｅｒ  ａｓｓａｙ，Ｔａｑｍａｎ  ａｓｓａｙ，ＤＮＡ  ｃｈｉｐ，ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８１，  ３６３（１９９８））などが報告されている。前３者は蛍光標識を用いた検出方法であり、励起レーザー光源と光検出システムを持つ。Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇは段階的相補鎖合成と化学発光を用いたシステムで、微量の核酸基質を順次注入するシステムと光検出システムを持つ。また、我々は最近、プライマーの３’末端近傍をターゲットのＳＮＰｓ部位にハイブリダイズさせ相補鎖合成を進行させて得られるピロリン酸をＡＴＰに変えて化学発光させてＳＮＰｓを検出する方法を報告している。此処では３’末端のプライマーがターゲットにしっかりとハイブリダイズしたときにだけ相補鎖合成が起きる特性を利用して野生種のターゲットと変異種のターゲットを見分けている（生物物理化学  ２００１，  ４５：  ２１９−２２５）。一方、ゲル電気泳動を用いたＳＮＰｓ分析方法も普及してきている。もっとも簡便なのが４種類の蛍光標識ターミネーターを用いて１塩基相補鎖伸長を行いゲル電気泳動により、蛍光標識ターミネーターと蛍光標識ＤＮＡを分離して計測する（Ｂｉｏ  Ｗａｖｅ  １７，  ２−５（２００１））。この方法は本発明に一番近いので詳しく説明する。ＰＣＲなどでコピー数を増幅したターゲットとなるＤＮＡを用意する。解析に用いるのは２本鎖ＤＮＡでも１本鎖ＤＮＡでも良いが此処では話しを簡単にするために１本鎖ＤＮＡをターゲットとする。ターゲットの変位を観測しようとする部位の手前に３’末端が来るように設計されたプライマーをハイブリダイズして１塩基相補鎖合成する。この時相補鎖合成基質として４種の蛍光標識ターミネーターを加えておく。どの核酸基質（此処ではターミネーター）が取り込まれてもこれ以上相補鎖伸長はしない。相補鎖伸長したプライマーにはどれか一つだけ蛍光標識ターミネーターが取り込まれる。複数の蛍光体がプライマーに結合し合成相補鎖をつくることはない。生成した相補鎖伸長鎖はターゲットＤＮＡに変位した塩基が合っても無くても同じ長さであり、変位の有無により標識蛍光体の種類が異なる。反応液中には未反応のたくさんの蛍光標識ｄｄＮＴＰがあるのでこのままでは蛍光検出できず、ゲル電気泳動により蛍光標識ｄｄＮＴＰと伸長した蛍光標識ＤＮＡ鎖を分離し、色分解蛍光計測により変位（ＳＮ��ｓ）の種類を決定する。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
医療診断のためのＤＮＡ検査方法としては（１）装置および試薬などのコストが安いこと、（２）高速高スループットの検出ができること、（３）同時に複数のＤＮＡ部位の診断をおこなえること、（４）１塩基の変異を識別検出できること、などが重要である。種々の方法の中で１塩基相補鎖伸長による方法は産物を質量分析したりキャピラリーゲル電気泳動により分析したりするもので広く普及している。しかし、質量分析装置は高価であり、また、計測自体は短時間で終わるものの測定にかけるための試料の準備に手間がかかるなどの難点があった。一方、キャピラリーゲル電気泳動を用いた方法ではＤＮＡシーケンシングに用いている装置を使用しているため、泳動路長が長く検出に３０−６０分を必要とする。さらに、４種のターミネーター（ｄｄＮＴＰ）をそれぞれ異なる蛍光体で標識したものを相補鎖合成基質として用いており、色分離機能を持った高価な計測装置が必要であった。これらは短時間で簡便にＳＮＰｓ計測をしたり、高スループット分析をするには適しているとはいえず、新しいＳＮＰｓ分析手法が求められている。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
これらの課題を解決するために、用いる蛍光体を一種類とし、検査用のプライマーをターゲットにハイブリダイズさせ相補鎖合成して得られるＤＮＡ鎖の長さがターゲットＤＮＡに変位が有るが否かで変化する様にした。さらに、高速泳動を実現する為にゲル電気泳動路長の短いキャピラリーゲル電気泳動あるいはチップ上に設けたゲル電気泳動路を活用して１―２分以内に計測結果が得られる方法を提示する。
【０００６】
まず発明の基本となっている方法について説明する。ここで用いる検出用のプローブ（プライマー）は変異種のターゲットと相補的な変異種用のプライマーと野生種のターゲットに相補的な野生種用のプライマーを混合したものである。野生種用のプライマーには１０マーからなるポリＴ配列（他の配列でも良い）がついており、変異種用のプライマーよりも時間がかかって泳動する。すなわち電気泳動でこれらは分離検出できる。ターゲットとなるＤＮＡにプローブ（プライマー）をハイブリダイズさせ、ＤＮＡポリメラーゼと反応基質ｄＮＴＰ（デオキシヌクレオチド３リン酸）および蛍光標識ターミネーター（ｄｄＮＴＰ−ｆ）を加えてＤＮＡ相補鎖合成をおこなう（ｄＮＴＰは必ずしも必要でない）。プライマーの末端部分の変異部位に相補的な部分がマッチすれば蛍光標識ｄｄＮＴＰ−ｆが取り込まれてプライマーは蛍光標識される。しかし、ターゲットの変異部位に相補的なプライマーの部分がマッチしていないと相補鎖合成は起こらず蛍光標識は取り込まれない。末端の変異部位に隣接するか、２塩基離れた部位の塩基をターゲットと相補的でない様にしておくと変異部のマッチミスマッチによる相補鎖合成のスイッチングをより確実に行うことができる。プライマーのターゲットにハイブリダイズする長さは２０マー前後を用いた。野生型と変異型が含まれるヘテロタイプのターゲットでは２本の強度の等しいピークが現れる。一方、野生型だけあるいは変異型だけのホモタイプのターゲットでは１本のピークしか現れないのでどちらのピークか判定するために内部標準となる蛍光標識ＤＮＡ鎖を少量加えておく必要がある。相補鎖合成しただけの反応産物をそのまま電気泳動すると蛍光標識核酸基質（ｄＮＴＰ−ｆ）によるピークがスペクトル中に現れるのでこれを内部標準にしても良い。以下発明の詳細を開示する。
【０００７】
【発明の実施の形態】
＜実施例１＞
第一の実施例は検査用プライマーの３’末端をターゲットの変異部位に一致させ、相補鎖合成により蛍光標識ターミネーター（ｄＮＴＰ−ｆ）をプライマーに取り込み、流動性ポリマーを分離媒体として用いるチップ電気泳動あるいはキャピラリー電気泳動によるＳＮＰｓタイピングの例である。短時間でＳＮＰｓタイピングをするには泳動路長の短いゲル電気泳動を用いることが必要である。２０マー程度の蛍光標識ＤＮＡを２−３分以内に分析するには泳動路長は３−１０ｃｍ程度が良い。ガラスやプラスティックの表面に作製した溝を電気泳動路として用いるチップ電気泳動は安価な装置と短時間で泳動結果が得られる手段として使われており、日立電子エンジニアリングあるいはアジレントテクノロジーから装置が市販されている。現在はほとんどＰＣＲ産物の長さチェックなどの目的に使われる。ＤＮＡを蛍光標識したり、２本差ＤＮＡの間に入るインターカレーター色素を用いてＤＮＡを染色したりしてレーザー誘起蛍光法で測定する。レーザーとして安価な赤色レーザーが便利であり、このレーザーで励起できるＣｙ−５などの色素でＤＮＡを標識して計測が行われる。簡便な装置では計測できる蛍光の種類は一つである。チップ電気泳動では泳動路長が短いこともあり、１塩基の鎖長差のＤＮＡを識別することは難しい。そこでターゲットが野生型かあるいは変異型化によって、できるだけ鎖長に変化がでるように試料調製し計測すると短い泳動路のゲル電気泳動でＳＮＰｓのタイピングができる。本発明はこれを可能にする方法を提供するものである。
【０００８】
１０ｃｍ以下の短い電気泳動路でも分離できるように野生型にマッチするプライマーと変異型にマッチするプライマーとでは長さが変化するようにした。すなわち野生型のプライマーにはポリＴからなるオリゴヌクレオチドを５’末端に付加し、電気泳動速度が変異型のプライマーより遅くなるようにした。両者の違いはこのポリＴ配列と変位部分の核酸の種類が野生型に相補的（野生型プライマー）か、あるいは変異型に相補的（変異型プライマー）かだけである。図１は本発明の原理説明図である。野生型プライマーと変異型プライマーを等しい濃度で含む検査用プライマーを用意する。野生型プライマーは５’末端に１０マーから成るポリＴ配列を持つ。配列番号１〜８に例として用いたプライマーの配列と、配列番号９〜１２にターゲットＤＮＡの配列を示した。ターゲットＤＮＡの注目する変異部の隣の塩基種に相補的なターミネーター（ｄＮＴＰ−ｆ）、この例ではｄＴＴＰ−ｆ、とＤＮＡポリメラーゼを加えて相補鎖合成を行う。プライマーの３’末端がターゲットと相補的である場合にはプライマーを起点として相補鎖が伸びる。相補的でない場合には相補鎖伸長は起こらないので蛍光標識は取り込まれない。この場合には１塩基伸長であるがｄＮＴＰ（ターミネーターの塩基種を除く）と蛍光標識ターミネーターを加えて数塩基伸長して蛍光標識ターミネーターを取り込むようにしても良い。いずれの場合にも伸長する塩基長は野生型及び変異型で同じであるがターゲットがどちらであるかによって相補鎖伸長従って蛍光標識が取り込まれるか否かが決定される。ＤＮＡポリメラーゼとしてはＴｈｅｒｍｏ  Ｓｅｑｅｎａｓｅ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）やＳｅｑｅｎａｓｅ  Ｖｅｒ．２  Ｔ７  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、Ａｍｂｉｏｎ製のＥｘｏ−Ｋｌｅｎｏｗが使用できる。これらの酵素はいずれも遺伝子工学的に５’→３’エキソヌクレアーゼ活性と３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を無くしたものである。特に本発明に使用できる酵素の条件としては、プライマーの３’末端を削るエクソヌクレアーゼ活性（３’→５’エキソヌクレアーゼ活性）の無いことが重要である。これは、プライマーの３’末端とターゲットＤＮＡがミスマッチの状態においてエクソヌクレアーゼによりプライマーの３’末端が削られると、野生型のプライマーと変異型のプライマーとで３’末端の構造に関係なく相補鎖伸長が可能となるためである。本発明の実施例では、プライマーの高次構造の影響で相補鎖伸長反応が起きづらくなる影響を除去する目的、２本鎖ＤＮＡでも野生型及び変異型の測定を可能とするために、耐熱性酵素であるＴｈｅｒｍｏ  Ｓｅｑｅｎａｓｅ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いる。蛍光標識はＣｙ−５を用い、ｄｄＮＴＰ−Ｃｙ５はアマシャムバイオサイエンスのＴｈｅｒｍｏ  Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ  Ｃｙ５  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｋｉｔ（各々、ｄｄＡＴＰ−Ｃｙ５：８．８μＭ、ｄｄＣＴＰ−Ｃｙ５：７．０μＭ、ｄｄＧＴＰ−Ｃｙ５：１７．６μＭ、ｄｄＴＴＰ−Ｃｙ５：１４．３μＭのストック）を用いた。
【０００９】
ターゲットＤＮＡは通常の方法に従って血液からＤＮＡを抽出して、注目する部位をＰＣＲ増幅して用いた。すなわち、全血２ｍｌに５０ｍＭのＮａＣｌ溶液１８ｍｌを添加して赤血球を溶血させる。４℃の条件で３５００ｒｐｍで１５分間遠心して沈殿を得る。得られた沈殿を５０ｍＭのＮａＣｌ溶液で洗浄し、白血球分画を得る。ＤＮＡｚｏｌ（ＧＢＣＯ  ＢＲＬ）１ｍｌ添加し、細胞壁を溶解する。１８Ｇの注射針付きのシリンジで溶液を出し入れしてゲノムＤＮＡを短く切断する。遠心して不要物を除く。エタノール０．５ｍｌと添加し攪拌後、遠心してゲノムＤＮＡを回収する。７０％エタノールでリンス後、４００μｌの水を添加し６５℃で溶解する。１０ｍｇ／ｍｌのＲｎａｓｅ  Ａを８μｌ添加し３７℃２時間インキュベートしてＲＮＡを分解する。フェノール・クロロホルム・アミルアルコール混合液を４００μｌ添加し、酵素を失活させる。プロパノ−ル沈殿操作によりゲノムＤＮＡを回収する。０．５×ＴＥ（ｐＨ８．０）２００μｌに溶解する。この操作でほぼ１００μｇ／ｍｌのゲノムＤＮＡ溶液を得る。一本鎖ＤＮＡを得るために、ＰＣＲプライマーの片方にビオチンをつけておき、アビジンを表面に固定した磁気ビーズでＰＣＲ産物を釣りだし、熱変性などで一本鎖にしてターゲットＤＮＡとして用いた。すなわち、上記で調製したゲノムＤＮＡ試料１μｌにキアゲン社のＨｏｔＳｔａｒＴａｑ添付の１０×ＰＣＲ緩衝液５μｌ、５ｍＭのｄＮＴＰを２μｌ、ＰＣＲ用の２種のプライマー（１ｐｍｏｌ／μｌ）５μｌ、水３７μｌ、ＨｏｔＳｔａｒＴａｑ  ０．２５μｌを添加し、９５℃１０分間加熱後、９４℃で３０秒間、５７℃で３０秒間、７２℃で６０秒間のステップを３０回繰り返し、特定ＤＮＡ領域を増幅する。ＰＣＲ産物にはフリーのプライマーが混在し、後の時期ビーズを用いた１本鎖ＤＮＡ調製の収率を低下させるため、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  （ＱＩＡＧＥＮ）を用いて取り除く。
【００１０】
ＰＣＲ産物（２００〜５００ｆｍｏｌ）に磁気ビーズであるＤｙｎａｂｅａｄｅｓ  （Ｍ２８０）  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  （Ｄｙｎａｌ，  ６．７×１０8  ｂｅａｄｓ／ｍｌ）１μｌと２Ｍ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０２％ＮＰ−４０、１０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ  （ｐＨ  ７．５）の溶液２５μｌを添加し、２５℃で３０分間攪拌する。マグネットでＰＣＲ産物の結合した磁気ビーズを回収し、０．１  Ｍ  ＮａＯＨ  １００μｌに懸濁して５分間放置後、水洗し、ビーズに固定した１本鎖ＤＮＡあるいはＮａＯＨ溶液中に遊離した１本鎖ＤＮＡを得る。ビーズに固定した１本鎖ＤＮＡ  は１０μｌの水に懸濁して試料として用いる。ＮａＯＨ溶液中に遊離した１本鎖ＤＮＡの場合は、直ちに３Ｍ酢酸で中和し、エタノール沈殿して１０μｌの水に溶解して試料として用いる。、各々にプライマー（１０ｐｍｏｌ）を添加し、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｅｑｕｅｎａｓｅの系で伸長反応を行わせ、Ｃｙ５ｄｄＮＴＰを取りこませ、電気泳動計測する。具体的には、１０μｌ反応体積で、上記１本鎖ＤＮＡ（０．４〜１ｐｍｏｌがベスト）に野生型と変異型用のプライマーを各々１０ｐｍｏｌとターゲットＤＮＡに対応する２０〜４０ｐｍｏｌのｄｄＮＴＰ−Ｃｙ５  酵素に添付されている１０×緩衝液１μｌとＴｈｅｒｍｏ  Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ  ２ユニットを氷上で添加し、直ちに９４℃３０秒間、５４℃３０秒間、７２℃３０秒間のサイクルを３０回行った後に、さらに７２℃で２分間伸長反応を行う。伸長反応終了液５μｌに１ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ８）を含むホルムアミド５μｌを加え、８０℃で３分間熱変成した後、氷冷する。全量を以下の電気泳動装置で電気泳動分離分析する。
【００１１】
電気泳動分離は日立電子エンジニアリング製の電気泳動装置「コスモアイ」を用い、電気泳動部は日立化成製の「Ｉ−チップ」を用いた。これは流動性ポリマーを分離媒体に用いた電気泳動チップである。電気泳動路の長さは約４ｃｍであり、数塩基の鎖長の差を分析するのは難しいが、１０塩基鎖長の差があると分離分析可能である。図２は配列番号１のポリＴ部分の長さを変え、蛍光標識ターミネーターを３’末端に相補鎖合成で導入したＤＮＡ鎖の電気泳動スペクトルである。２１は配列番号２に示した変異型プライマーで２１マー、２２は配列番号１記載の野生型プライマーのポリＴの長さが２のもの、２３は配列番号１記載の野生型プライマーのポリＴの長さが５のもの、２４は配列番号１記載の野生型プライマーのポリＴの長さが９のものである。ポリＴの長さが５塩基以上では変異型プライマーと野生型プライマーとを良く識別できる事が分かる。ゲル電気泳動に要する時間は１−２分である。ポリＴの長さを２０マー以上に長くすると電気泳動時間は長くなり、ｄｄＮＴＰ−ｆの信号と重なる事が在り望ましくない。蛍光標識されたプライマーの現れる位置は背景蛍光も無く精度の高い測定が行える。
【００１２】
上記の他種々のＳＮＰｓについてタイピングを行った。この結果、十分な精度で１−２分以内にタイピングできる事が確認された。電気泳動の場合、電気泳動時間は条件により変化する事があり、単独のピークが観測された場合にこれが変異型なのか野生型なのか判断しにくい難点がある。しかし、この場合には残存する蛍光標識ｄｄＮＴＰ−ｆが現れるのでこれを基準にして判別できる利点がある。また、ｄｄＮＴＰ−ｆはプライマーによる信号より後にでるので相補鎖合成サンプルを精製処理すること無しに計測試料とすることができる便利さがある。
【００１３】
このようにして調製したゲノムＤＮＡから本発明のＳＮＰ検出ができることを確認しているが、以下の実施例では本発明に直結する部分を説明するために、テンプレートとしては配列番号９−１２に示した配列のＤＮＡを化学合成したものをモデルとして用いた。
サンプル１：５’−ＣＣＧＡＧ  ＧＣＡＴＡＧＴＡＧＡ  Ｃ／Ｔ  ＧＡＣＴＧＧＡＴＡＴ  ＡＧＧＧＡＣＣＴＡＣ−３’（配列番号９）
サンプル２：５’−ＡＡＡＡＴ  ＡＴＡＡＡＡＴＡＡＡ  Ｇ／Ｃ  ＡＴＧＧＴＡＣＴＡＴ  ＡＴＴＧＧＴＡＡＧＡ−３’（配列番号１０）
サンプル３：５’−ＧＧＡＧＧ  ＣＴＧＡＧＧＴＧＧＧ  Ｔ／Ｃ  ＧＧＡＴＣＡＣＧＡＧ  ＧＴＴＡＧＧＡＧＴＴ−３’（配列番号１１）
サンプル４：５’−ＴＴＧＧＴ  ＣＣＣＴＧＴＣＣＴＡ  Ｇ／Ｔ  ＴＧＧＴＣＧＡＧＧＡ  ＡＴＴＣＴＡＡＴＧＣ−３’（配列番号１２）
【００１４】
サンプル１ではプライマーとして野生型  ３’−ＧｃＡｇａｃｃｔａｔａｔｃｃｃｔｇｇａｔｇｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔ−５’（配列番号１）を用いる。一方、変異型プライマーには３’−ＡｃＡｇａｃｃｔａｔａｔｃｃｃｔｇｇａｔｇ−５（配列番号２）を用いる。これらを１：１の割合で混合したものが検査用のプライマーである。これはターゲットサンプルの変異位置より３’末端側にハイブリダイズする。プライマーの３’末端は変異部位に来るように設計されている。プライマーの３’末端から３塩基目にはターゲットとミスマッチするように塩基種を選んでいる。これは、変異部位の塩基種のミスマッチによりプライマーの３’末端が非常にはがれ安くなり、相補鎖合成が完全にブロックされる様にするためである。このような人工的なミスマッチ塩基種をプライマーに入れないときには３’末端だけのミスマッチでは相補鎖合成が部分的に進行して精度の高いタイピングができない事が在るためである。加える蛍光標識ターミネーターはｄｄＴＴＰ−ｆである。
【００１５】
サンプル２，３，４に対応した野生型及び変異型プライマーと蛍光標識ターミネーターは以下の通りである。
サンプル２：
野生型プライマー  ３’−ＣｔＴｃｃａｔｇａｔａｔａａｃｃａｔｔｃｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔ−５’（配列番号３）、
変異型プライマー  ３’−ＧｔＴｃｃａｔｇａｔａｔａａｃｃａｔｔｃｔ−５’（配列番号４）、
ターミネーター  ｄｄＴＴＰ−ｆ
サンプル３：
野生型プライマー  ３’−ＡｃＧｔａｇｔｇｃｔｃｃａａｔｃｃｔｃａａｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔ−５’（配列番号５）、
変異型プライマー  ３’−ＧｃＧｔａｇｔｇｃｔｃｃａａｔｃｃｔｃａａ−５’（配列番号６）、
ターミネーター  ｄｄＣＴＰ−ｆ
サンプル４：
野生型プライマー  ３’−ＣａＧｃａｇｃｔｃｃｔｔａａｇａｔｔａｃｇｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔ−５’（配列番号７）、
変異型プライマー  ３’−ＡａＧｃａｇｃｔｃｃｔｔａａｇａｔｔａｃｇ−５’（配列番号８）
ターミネーター  ｄｄＴＴＰ−ｆ
である。
【００１６】
ここでは一種類のターミネーターだけを用いたが、ターミネーターに加えて残り３種の核酸基質ｄＮＴＰを加えた試薬キットを用意しておけば全てのＳＮＰｓに対応できる。この場合、相補鎖合成の長さはターゲットにより変化し、数塩基伸びてからターミネーターが取り込まれて相補鎖合成が停止する場合もあるがこの場合でも変異種と野生型の鎖長の差は１０塩基である。
【００１７】
＜実施例２＞
第２の実施例はプライマーとして変異部分の数塩基先に３’末端が来るものを用いた例である。サンプル１を例にプライマー末端の構造を説明する。プライマーの末端から３塩基目がターゲットの変異部位に一致する様にプライマーを作る。サンプル１の場合には
野生型プライマー  ３’−ｃｔＧＧｔｇａｃｃｔａｔａｔｃｃｃｔｇｇｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔ−５’（配列番号１３）
変異型プライマー  ３’−ｃｔＡＧｔｇａｃｃｔａｔａｔｃｃｃｔｇｇ−５’（配列番号１４）
である。３’末端から３塩基目はターゲットを認識して相補鎖合成を行うか否か判別する塩基である。此処では４塩基目にミスマッチ塩基種Ｇ（本来Ｃ）を入れて、３塩決めがミスマッチの時には３’末端がはがれて相補鎖合成が起こらない様にした。この人工的なミスマッチは２塩基目に入れても良い。注目する変異部位がプライマーの塩基とターゲットの塩基種とで相補的か否かで末端のハイブリダイゼーションの安定度が変化して相補鎖合成能力がコントロールできれば良いので、いろいろな変形が採用できる。相補鎖合成基質としてｄｄＴＴＰ−ｆを入れておけば１塩基伸長して反応は停止するので生成物は野生型の場合３’−Ｔ（−ｆ）ｃｔＧＧｔｇａｃｃｔａｔａｔｃｃｃｔｇｇｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔ−５’であり、変異型の場合  ３’−Ｔ（−ｆ）ｃｔＡＧｔｇａｃｃｔａｔａｔｃｃｃｔｇｇ−５’である。此処で（−ｆ）は核酸塩基Ｔに蛍光体が付いていることを示す。相補鎖合成基質としてｄＮＴＰとｄｄＮＴＰの混合物たとえばｄｄＣＴＰ−ｆ，  ｄＴＴＰを用いることもできる。この場合、ｄＴＴＰおよびｄｄＣＴＰ−ｆが一つずつ取り込まれて２塩基伸長し、生成する蛍光標識断片は野生型の場合３’−Ｃ（−ｆ）ｔｃｔＧＧｔｇａｃｃｔａｔａｔｃｃｃｔｇｇｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔ−５’、変異型の場合  ３’−Ｃ（−ｆ）ｔｃｔＡＧｔｇａｃｃｔａｔａｔｃｃｃｔｇｇ−５’である。これらはいずれもｄｄＣＴＰ−ｆよりも早く電気泳動し、２分以内に結果を知ることができる。蛍光体がＣｙ５やＣｙ５．５やＴｅｘａｓＲｅｄでは、ｄｄＮＴＰ−ｆが蛍光標識断片より遅く泳動される条件を作ることができる。これは、蛍光体のチャージに強く依存しており、フルオレッセインのようなマイナスチャージを持つ蛍光体ではｄｄＮＴＰ−ｆが早く泳動するのでこれは成立しない。
【００１８】
＜実施例３＞
第３の実施例はＳＮＰｓの頻度解析の例である。個人のＳＮＰｓ解析の場合には現れるスペクトルパターンは野生型ホモ、変異型ホモおよびヘテロの３種である。此処では変異種が何％入っているかなどの詳しい定量分析は不要である。測定対象がこれら３つのいずれに属するか決めることをＳＮＰタイピングと言っている。ＳＮＰｓと医薬品感受性あるいは病気に関する感受性との関連を調べるには数万人にもなる非常に多くの患者のＳＮＰｓを調べてこれら感受性との相関関係を調べる必要がある。ＳＮＰｓのかずは数百万と言われているのでひとつ筒これを調べると大変な労力が必要である。そこで、患者サンプルを症状毎にあるいは医薬品応答のタイプ毎に混合してＳＮＰｓを測定して病気や医薬品に対する応答とＳＮＰｓの関連を調べることが良いスクリーニング方法として考えられている。これには変異ターゲットと野生型ターゲットを鋳型として同時に同じ条件で相補鎖合成して得られる産物を分離して精度良く検出する必要がある。相補鎖合成とゲル電気泳動を用いるＳＮＰｓタイピング方法として使われている４種の蛍光標識ｄｄＮＴＰを用いて相補鎖合成して１塩基伸長する方法では野生型から得られる相補鎖も変異型から得られる相補鎖も同じ塩基長であり電気泳動分離したときに得られるピークが重なる。これらを色分離検出して相対的な存在比を計算するが誤差が大きい難点がある。本発明では同じ色素で同じ条件下で相補鎖合成して電気泳動分離して同じ検出器で検出するので定量的な評価にはより適した方法である。短時間で電気泳動を完了するチップ電気泳動を用いてもＤＮＡ鎖長が１０塩基以上離れるとピークは完全に分離できるので定量検討に適している。図３は変異型プライマーの信号強度（Ｉｍ）および野生型プライマーの信号強度（Ｉｗ）の和（Ｉｗ＋Ｉｍ）を母数にして変異型の信号強度（Ｉｍ）割合を表した検量線３１である。３２のポイントが変異型１％のプロットである。この結果より１％以下の精度で分析できる事がわかる。変異株の存在量と信号強度が比例関係にあることから、本方法が変異株の存在比を調べるのに有効である事が分かる。このような分析はプールサンプル分析として特に重要視されているが良い方法がなく新たな方法が望まれていたものである。存在量の少ないＳＮＰｓの頻度解析には野生型プライマーに対して変異型プライマーを相対的に多く入れて測定することも有効である。これにより、変異型のプライマーに蛍光標識が導入された相補鎖伸長産物が多く生成して少ない頻度で現れる変異型をより簡単に計測できる。
【００１９】
＜実施例４＞
本実施例は複数のサンプルを同時にタイピングする例である。この場合、複数の変異部位に対応した信号を分離検出してピークの同定をする必要がある。電気泳動スペクトルの横軸すなわち電気泳動時間は条件によって変化するので、その都度標準物質を同時に電気泳動するなどしてピークの同定をする必要がある。より簡単に観測された信号が変異種のターゲットによるのか、野生型のターゲットによるのか同定するのに都合の良い方法を開示する。
【００２０】
通常電気泳動スペクトルに現れるパターンは１本のピークである。ピークの形状を変えて識別できるようにすれば標準物質などを用いなくても、また、野生型に起因するピークと変異型に起因するピークの間隔を短くしても識別検出できる。本実施例では、野生型のプライマーを２つの異なる長さのポリＴを付加したプライマー（異なる泳動速度のプライマーであればよい）から構成し、スペクトル上でピークに特徴ある形を作るようにした。より具体的にサンプル１に対する野生型のプライマーで示すと
野生型プライマー  ３’−ｃｔＧＧｔｇａｃｃｔａｔａｔｃｃｃｔｇｇｔｔｔｔｔｔ−５’（配列番号１５）
および            ３’−ｃｔＧＧｔｇａｃｃｔａｔａｔｃｃｃｔｇｇｔｔｔ−５’（配列番号１６）
であり、比率を２：１の５  ｐｍｏｌと２．５  ｐｍｏｌ（５０μｌスケール）とした。一方、変異型プライマーは３’−ｃｔＡＧｔｇａｃｃｔａｔａｔｃｃｃｔｇｇ−５’  （５  ｐｍｏｌ）（配列番号１４）である。ここで、野生型プライマーに付けるポリＴの長さは３塩基及び６塩基であり前の実施例より短くしてある。得られるスペクトルパターンは図４に示したように形から変異種と野生型を容易に識別できる。調べようとするＳＮＰｓが複数ある場合には、まず、ゲノムから前期と同様に目的とする領域を複数ＤＮＡ断片同時ＰＣＲなどで増やした後、前期と同様にターゲットのＤＮＡ鎖を１本鎖として取り出す。各ＳＮＰｓに対応する検査用プライマーをサンプルと混合しハイブリダイゼーションを行う。Ｃｙ−５（異なる蛍光体を用いても良い）で標識された４種のｄＮＴＰ−ｆを加えて相補鎖合成する。もちろん、ｄｄＮＴＰ−ｆとｄＮＴＰあるいはｄＮＴＰ−ｆとｄｄＮＴＰの組み合わせでも良い。検査用のプライマーはＳＮＰｓの種類ごとに異なる位置に蛍光標識された相補鎖合成産物が現れるようにプライマーの長さや泳動速度を調製しておく。図５は複数（３種）のサンプルを測定した例である。５１、５４、５７が変異型のピーク、５２と５３の組、５５と５６の組、５８と５９の組が５１、５４、５７に対応する野生形のピークである。どのＳＮＰｓについても必ず野生型か変位型のピークが観測される。場合によっては両方の信号が観測される。ピーク形状の違いに注目するとヘテロタイプのサンプルでは真ん中が低く、量端が高い３本のピークで並んでいることになる。ホモの場合にはいずれかの高いピークが消失する（変異型では低いピークも消失）ので容易にＳＮＰｓのタイプを判別でき、全てのＳＮＰｓが同定できる。
【００２１】
＜実施例５＞
ここではＳＮＰｓタイピングを中心に有効性を述べたが、一般の遺伝子タイピング（検査対象のＤＮＡ中に目的とする配列を持ったものがあるか否かを調べること）にも応用可能である。検査しようとする部位にハイブリダイズする種々長さのプローブを用意する。電気泳動パターンとして現れたときにどのピークが何に相当するかわかるように、いくつかのプローブについてはターゲットにハイブリダイズする部分の配列は同じで５’末端にＴやＡを１−２塩基付加したプローブ（プライマー）を一定の比率で混合しておく。スペクトルパターン中にはこの混合比を反映したピーク型が現れるので種々のピークが同時に現れても、また、電気泳動速度が変化して単純に泳動時間からピークの同定が困難な場合でも、形状からピークの同定が容易である。複数のＤＮＡプローブが一度に電気泳動すると分離能などの点で問題となる場合もあるが、この場合、グループ分けしたサンプルを時系列的に電気泳動分離して連続して分離解析することもできる。特に電気泳動時間が短いので繰り返し測定してもあまり多くの時間を必要としない利点がある。
【００２２】
【発明の効果】
以上説明したように本発明では一つのターゲットＤＮＡ配列部位に対して長さの異なる二つのプライマー（プローブ）を同時に用いてターゲットにハイブリダイズし、ハイブリダイズしたものについて相補鎖合成可能な条件のものについて同じ塩基数だけ相補鎖合成すると共に蛍光標識を取り込み、短い電気泳動、早い電気泳動で短時間に分離検出ことで、簡便、高スループット、低価格機器の使用などを実現するものである。ＳＮＰｓ分析の場合について言うと、２つのプライマーすなわち野生型ターゲットＤＮＡにマッチする野生型プライマーと変異型ターゲットにマッチする変異型プライマーを混合したものを検査用のプライマーとして用いて相補鎖合成により蛍光標識核酸をプライマーの末端に導入する。この時ターゲットにマッチしたプライマーにだけ蛍光標識核酸は導入される。変異型プライマーと野生型プライマーとでは長さが異なるように作られており、短いゲル電気泳動で短時間に分離検出する事ができる。相補鎖合成はターゲットにマッチしたプライマーにだけ起こるが、この場合に伸びる塩基数は野生型と変異型で同じである。そこで長さの違いから容易にどちらのプライマーか区別することができる。此処では野生型プライマーの５’末端にポリＴをつけたが、ＤＮＡ以外の原子団をつけて電気泳動速度を変化させても良く、いずれの場合も短時間で電気泳動分離できるものである必要がある。この結果１―２分で変異の有無を調べる事を可能とした。泳動路を１００本持った装置を使用し、測定サイクルを長めに見て３分とすると１時間で２０００の変異測定が可能である。また、一日１０時間稼働すると２万のＳＮＰｓタイピングを可能とする高スループットＳＮＰｓタイピングを可能とする。さらに、ＳＮＰｓと医薬品感受性の関連研究で重要となる変異ＤＮＡの存在比計測にも活用できる方法であり、ＤＮＡ検出分野に大きく貢献する方法である。
【００２３】
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> HITACHI, LTD.
<120> A method for testing a gene
<130> H200747
<160> 16
<210>1
<211>31
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>DNA primer which hybridize with a DNA template represented by SEQ ID NO: 9 and be complementary extend to the DNA template represented by SEQ ID NO: 9
<400>1
cttccatgat ataaccattc tttttttttt t                        31
<210>2
<211>21
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>DNA primer which hybridize with a DNA template represented by SEQ ID NO: 9 and be complementary extend to the DNA template represented by SEQ ID NO: 9
<400>2
acagacctat atccctggat g                                  21
<210>3
<211>31
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>DNA primer which hybridize with a DNA template represented by SEQ ID NO: 10 and be complementary extend to the DNA template represented by SEQ ID NO: 10
<400>3
cttccatgat ataaccattc tttttttttt t                        31
<210>4
<211>21
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>DNA primer which hybridize with a DNA template represented by SEQ ID NO: 10 and be complementary extend to the DNA template represented by SEQ ID NO: 9
<400>4
gttccatgat ataaccattc t                                  21
<210>5
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<213>Artificial Sequence
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<223>DNA primer which hybridize with a DNA template represented by SEQ ID NO: 11 and be complementary extend to the DNA template represented by SEQ ID NO: 11
<400>5
acgtagtgct ccaatcctca attttttttt t                        31
<210>6
<211>21
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
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<223>DNA primer which hybridize with a DNA template represented by SEQ ID NO: 11 and be complementary extend to the DNA template represented by SEQ ID NO: 11
<400>6
gcgtagtgct ccaatcctca a                                  21
<210>7
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<213>Artificial Sequence
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<400>7
cagcagctcc ttaagattac gttttttttt t                        31
<210>8
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<212>DNA
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<223>DNA primer which hybridize with a DNA template represented by SEQ ID NO: 12 and be complementary extend to the DNA template represented by SEQ ID NO: 12
<400>8
aagcagctcc ttaagattac g                                  21
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ccgaggcata gtagaygact ggatataggg acctac                36
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<213>Artificial Sequence
<220>
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aaaatataaa ataaasatgg tactatattg gtaaga                36
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<400>11
ggaggctgag gtgggyggat cacgaggtta ggagtt                36
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<213>Artificial Sequence
<220>
<223>DNA template
<400>12
ttggtccctg tcctaktggt cgaggaattc taatgc                36
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<212>DNA
<213>Artificial Sequence
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<223>DNA primer which hybridize with a DNA template represented by SEQ ID NO: 9 and be complementary extend to the DNA template represented by SEQ ID NO: 9
<400>13
ctggtgacct atatccctgg tttttttttt                          30
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<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>DNA primer which hybridize with a DNA template represented by SEQ ID NO: 9 and be complementary extend to the DNA template represented by SEQ ID NO: 9
<400>14
ctagtgacct atatccctgg                                    20
<210>15
<211>26
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>DNA primer which hybridize with a DNA template represented by SEQ ID NO: 9 and be complementary extend to the DNA template represented by SEQ ID NO: 9
<400>15
ctggtgacct atatccctgg tttttt                              26
<210>16
<211>23
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>DNA primer which hybridize with a DNA template represented by SEQ ID NO: 9 and be complementary extend to the DNA template represented by SEQ ID NO: 9
<400>16
ctggtgacct atatccctgg ttt                                23
【００２４】
【配列表フリーテキスト】
配列番号１：配列番号９に示すDNA鋳型とハイブリダイズし、配列番号９に示すDNA鋳型と相補的に伸長させるDNAプライマー
配列番号２：配列番号９に示すDNA鋳型とハイブリダイズし、配列番号９に示すDNA鋳型と相補的に伸長させるDNAプライマー
配列番号３：配列番号１０に示すDNA鋳型とハイブリダイズし、配列番号１０に示すDNA鋳型と相補的に伸長させるDNAプライマー
配列番号４：配列番号１０に示すDNA鋳型とハイブリダイズし、配列番号１０に示すDNA鋳型と相補的に伸長させるDNAプライマー
配列番号５：配列番号１１に示すDNA鋳型とハイブリダイズし、配列番号１１に示すDNA鋳型と相補的に伸長させるDNAプライマー
配列番号６：配列番号１１に示すDNA鋳型とハイブリダイズし、配列番号１１に示すDNA鋳型と相補的に伸長させるDNAプライマー
配列番号７：配列番号１２に示すDNA鋳型とハイブリダイズし、配列番号１２に示すDNA鋳型と相補的に伸長させるDNAプライマー
配列番号８：配列番号１２に示すDNA鋳型とハイブリダイズし、配列番号１２に示すDNA鋳型と相補的に伸長させるDNAプライマー
配列番号９：DNA鋳型
配列番号１０：DNA鋳型
配列番号１１：DNA鋳型
配列番号１２：DNA鋳型
配列番号１３：配列番号９に示すDNA鋳型とハイブリダイズし、配列番号９に示すDNA鋳型と相補的に伸長させるDNAプライマー
配列番号１４：配列番号９に示すDNA鋳型とハイブリダイズし、配列番号９に示すDNA鋳型と相補的に伸長させるDNAプライマー
配列番号１５：配列番号９に示すDNA鋳型とハイブリダイズし、配列番号９に示すDNA鋳型と相補的に伸長させるDNAプライマー
配列番号１６：配列番号９に示すDNA鋳型とハイブリダイズし、配列番号９に示すDNA鋳型と相補的に伸長させるDNAプライマー
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の原理説明図である。
【図２】種々ポリＴを用いて分離能を調べた図である。
【図３】ＳＮＰｓの定量分析のための検量線を示す。
【図４】スペクトルパターンでピークを識別する結果を示した図である。
【図５】混合分析の模式図である。
【符号の説明】
１１；検査プライマーのターゲットと相補的な部分
１２；プライマーがハイブリダイズするターゲットの配列部分
１３；蛍光標識
１４；ポリＴの付いてない変異型ターゲットを調べるための変異型プライマーに蛍光標識核酸が付加したオリゴマーによるピーク
１５；ポリＴの付いている野生型ターゲットを調べるための変異型プライマーに蛍光標識核酸が付加したオリゴマーによるピーク
２１；変異型プライマーから得た蛍光標識１塩基伸長産物
２２；ＴＴＴを付加した野生型プライマーから得た蛍光標識１塩基伸長産物
２３；ＴＴＴＴＴＴを付加した野生型プライマーから得た蛍光標識１塩基伸長産物
２４；ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴを付加した野生型プライマーから得た蛍光標識１塩基伸長産物
２５；Ｔ２０（Ｔが２０つながったもの）を付加した野生型プライマーから得た蛍光標識１塩基伸長産物
４１；一種の変異プライマーを用いて得られるピークパターン
４２；２−３マーの異なるポリＴを持つ野生型プライマーを混合して得られるピークパターン
５１；ヘテロタイプのＳＮＰｓ検査部位１から得られるパターン
５２；変異型のＳＮＰｓ検査部位２から得られるパターン
５３；野生型のＳＮＰｓ検査部位３から得られるパターン
【図１】
0003752466.tif 000002
【図２】
0003752466.tif 000003
【図３】
0003752466.tif 000004
【図４】
0003752466.tif 000005
【図５】
0003752466.tif 000006