(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
血球細胞を含有するサンプルを細胞含有部分と細胞喪失部分とに分離する方法であって、
該サンプルを容器内に入れること、ここにおいて、該容器は複数の境界壁内に該サンプルを保持し、該境界壁の少なくとも一つは柔軟である、
添加物および磁性粒子を準備すること、ここにおいて、該添加物は該細胞および該磁性粒子に結合し、該磁性粒子は該細胞および該添加物に結合する、
該サンプル、該添加物および該磁性粒子を一緒にして、細胞含有網状構造体を得ること、
第１および第２の力を加えることにより、前記複数の境界壁内で該網状構造体を該細胞喪失部分から分離すること、ここにおいて、前記の第１の力は磁力であり、前記の第２の力は、該境界壁の少なくとも１つを介して伝達される自動的機械的力である、を含んでなる方法。
【請求項２】
該容器内に入れられたサンプルが３ｍｌ以上の容積を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該容器内に入れられたサンプルが１ｍｌ未満の容積を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
該機械的力が、前記少なくとも１つの柔軟な境界壁に加えられる圧力を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
該磁性粒子のそれぞれが５×１０−２４ｍ３から５×１０−６ｍ３の平均体積を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
該粒子がコーティングでコートされている、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
該コーティングが抗リガンドを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
該コーティングが抗体を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
該コーティングがポリカチオン重合体を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
該添加物の結合が、抗リガンドを含む添加物から生じる、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
該磁性粒子が一次抗体を含み、該添加物が二次抗体を含み、該一次抗体が該細胞の表面成分に結合し、該二次抗体が該一次抗体に結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
該細胞が主に赤血球を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
該血球細胞が白血球および血小板を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
サンプルの細胞喪失部分中の前立腺特異抗原のレベルを測定することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
サンプルの細胞喪失部分中のクレアチニンのレベルを測定することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明の分野は、臨床的診断およびバイオテクノロジーである。
【０００２】
（発明の背景）
疾患を同定し治療するためのインビトロ診断試験は、病院、家庭および医院において一般的な手段となっている。血液、尿、脳脊髄液（これは時には血液を含有しうる）などの生物学的流体は、そのような試験に最も頻繁に利用される生物学的サンプルである。
【０００３】
血液は、異なる多数の成分を含有し、それらのいくつかは、サンプルによって著しく異なる濃度で存在する。例えば、全血中の赤血球および白血球の両方の割合は正常個体間で、更には同一個体においても時間経過によって、そして特に病理学的条件下においては様々となりうる。保存条件、凝固、赤血球の脆弱性などの他の要因に関連したこの大きなばらつきは、血液含有サンプルの診断を実施する際に、深刻な技術的問題を引き起こす。
【０００４】
全血は、通常、試験前に種々の画分に分離される。とりわけ、画分への分離は、ヘマトクリット値における相違を有利に補い、その他の点においては、上流または下流の生化学的アッセイにおける潜在的な妨害を減少しうる。しばしば利用される画分としては、血清、血漿、白血球、赤血球および血小板が挙げられる。「血漿」および「血清」なる語は、本発明においては、細胞成分の実質的部分が除去された全血由来の任意の流体を意味するものとして用いられる。凝固剤の存在または不存在は決定的因子ではないため、本発明においては、血漿および血清は互換的に用いられる。
【０００５】
血液分離技術は、概念上、遠心分離、濾過および固相分離の３つの範疇に分類することができる。
【０００６】
遠心分離
血液分離は、通常、遠心分離により達成される。（１）遠心分離は、一般には、９５％を超える効率で血清または血漿から細胞成分を分離し、（２）遠心機の運転には高度の熟練者を必要とせず、（３）遠心分離は、１５分以内に複数のサンプルの同時処理を可能にするため、一般には、遠心分離が望ましい。しかし、血液の遠心分離にも問題がある。例えば、遠心機は高価であり、複数の工程を含み、例えばベッドサイドなどでの看護の際、学校、家庭では使用できず、通常、運転には電力を要する。
【０００７】
濾過
血液から種々の成分を分離するための多数の濾過技術が公知である。例えば、Ａｌｌｅｎらの米国特許第４，９８７，０８５号は、ガラス繊維膜とセルロース膜との組合せを用いた次第に減少する孔径を有する濾過系を記載している。Ｈｉｌｌｍａｎらの米国特許第４，７５３，７７６号は、細胞の流動を遅らせるために毛管力を用いたガラス精密濾過フィルターを開示している。Ｋｏｎｄｏらの米国特許第４，２５６，６９３号は、紙、不織布、粉末を含むシート様フィルター物質または繊維（例えば、人工繊維またはガラス繊維）から選ばれる少なくとも１つの成分から構成されるフィルター層を有する多層化学分析要素を開示している。米国特許第３，６６３，３７４号および第４，２４６，６９３号は、全血から血漿を分離するためのメンブランフィルターを開示しており、米国特許第３，０９２，４６５号、第３，６３０，９５７号、第３，６６３，３７４号、第４，２４６，６９３号、第４，２４６，１０７号、第２，３３０，４１０号は、更なる濾過系（それらのうちのいくつかは細孔膜を利用するものである）を開示している。
【０００８】
公知濾過技術は、一般には、必要な血液の容積を僅か数滴にまで減少させる。したがって、多数の濾過試験は、僅か約２５〜７５μｌの全血の使用を意図している。全血を僅か約５〜５０μｌしか必要としないいくつかの濾過技術が開発されている。ほとんどの適用においては、濾過は、濾過表面が試験片の反応域上に位置する該試験片上で直接生じる。また、これらの形式の濾過は、遠心機に関連した利用上の問題を減少または排除する。
【０００９】
しかし、これらの進歩は、しばしば、全く新たな問題を引き起こす。例えば、フィルターは有意な量の血漿を保持する傾向があり、低濃度で存在する被検体を、小容積の血液に由来する血清中で検出することは困難な場合が多い。また、既存のフィルターは詰まりやすく、望ましくない遅い流速を有する。詰まりを減少させ流速を改善するために、しばしば、全血に凝集剤を混合するが（米国特許第５，２６２，０６７号、第５，７６６，５５２号、第５，６６０，７９８号および第５，６５２，１４８号）、これらの問題は解決されていない。
【００１０】
フィルターに対して用いる力を改変することにより流速を改善する努力がなされている。しかし、この場合の選択肢はかなり限定される。フィルターの製造および使用は比較的簡単だが、フィルターは赤血球の過剰の溶血を引き起こす傾向がある。また、毛管作用（すなわち、液体中の分子の、お互いに対する及び毛管壁に対する引力により、水または液体が正常液体レベルより上に上昇する現象）を用いることができる。しかし、毛管作用は、一般に、大容積の迅速な分離をもたらすには弱すぎる（例えば、米国特許第５，６６０，７９８号、第５，６５２，１４８号および第５，２６２，０６７号を参照されたい）。さらに、毛管作用による血漿の分離では、ウィッキング膜または採集膜内に比較的大量の流体が保持される傾向がある。このため今度は、該ウィッキング膜または採集膜またはそれらの両方の試験あるいは該膜からの該保持物質の溶出が必要となりうる。
【００１１】
固相分離
固相分離には、典型的には、標的の結合をもたらす表面、すなわち、該標的を固定化しそれをサンプルから取り出すように作用する表面が関与する。典型的な固相分離技術としては、結合クロマトグラフィー、ビーズを使用する結合分離、および中空糸分離が挙げられる。
【００１２】
特に有利な固相分離型の１つとして、磁気分離が挙げられる。この分離においては、磁気的に誘引可能な（常磁性）ビーズにより標的が捕捉される。濾過分離の場合のような物的障壁が存在しないため、磁気分離は比較的穏やかな傾向にある。例えば、Ｌａｎｓｄｒｏｐの米国特許第５，５１４，３４０号およびＣａｒｅｗの米国特許第５，１２３，９０１号においては、流体から磁性粒子を分離するためにバッチ法において磁気ワイヤが使用されている。Ｋｅｌｌａｎｄらの米国特許第４，６６３，０２９号およびＷａｎｇの米国特許第５，７９５，４７０号においては、連続フロー法において流体から磁性粒子が分離されている。例えばＭｏｕｂａｙｅｄの米国特許第５，５３６，４７５号において公開されている更に他の方法は、流体から磁性粒子を分離するために複数の磁石および揺れ分離チャンバーを使用するものである。
【００１３】
公知磁気分離を血液の分離に適用する際の大きな制約の１つは、種々のタイプの細胞および細胞下粒子のすべてを取り出すために複数の抗リガンドが必要なことである。例えば赤血球、リンパ球、単球および血小板は、異なる表面抗原を有し、いずれか１つの抗体に特異的に結合するというものではない。さらに、細胞の生活環または病理学的状態、遺伝病または遺伝子変異による該細胞上のリガンドの欠如または不存在は、一般に、抗リガンドが標的細胞に結合する効率を減少させる。
【００１４】
公知磁気分離装置に伴う問題は、サンプル容積が増加するにつれて（特に、１ミリリットルを超えるサンプル容積の場合に）悪化する。多数の診断用途は、複数の試験または一連の試験の要件を満足するためには１ミリリットルまでの血清容積を要するため、磁気分離は特に有用というわけではない。さらに、グルコースまたはヘモグロビン試験などのアッセイは、サンプル中の生物学的物質または化学物質（タンパク質、ビリルビンおよび薬物を含む）による妨害に対して非常に感受性である。
【００１５】
したがって、血液をその構成成分に分離するための（特に、全血から血漿または血清を分離するための）改良された方法および装置を提供することが、依然として必要とされている。
【００１６】
（発明の概要）
本発明においては、サンプルを添加物と粒子との両方と混合して細胞含有網状構造体を得、磁力を使用して該網状構造体を残りの実質的に細胞が喪失した部分から分離することにより、細胞含有サンプルを細胞含有部分と実質的に細胞が喪失した部分とに分離する。
【００１７】
好ましい実施形態の１つの態様においては、該容器は複数の境界壁（ｃｏｎｆｉｎｉｎｇ  ｗａｌｌｓ）を有し、該境界壁の少なくとも１つは柔軟である。該サンプルは該境界壁内に保持され、好ましくは全血を含み、該細胞含有部分は相互連結赤血球の網状構造体を主に含む。特に好ましいリンカーには、抗リガンド、例えば、赤血球膜上または赤血球膜中のリガンドまたは抗原に結合する一次抗体、および該一次抗体に結合する二次抗体が含まれる。好ましい実施形態のもう１つの態様においては、該一次抗体を該サンプルに直接加え、該二次抗体を常磁性ビーズの表面に結合させる。
【００１８】
好ましい実施形態のもう１つの態様においては、高分子物質、例えば、Ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ（登録商標）、陽イオン性（カチオニック）リポソーム、陽イオン性脂質およびポリデンドロマー（ｐｏｌｙｄｅｎｄｒｏｍｅｒ）を、抗リガンドおよび磁気分離と組合せて又は抗リガンドおよび濾過と組合せて用いることができる。アプタマーを、単独で又は陽イオン性重合体、陽イオン性リポソームおよびデンドロマーと組合せて使用することができる。
【００１９】
好ましい実施形態の更にもう１つの態様においては、該分離が該境界壁内で生じ、いくつかの実施形態においては、該分離において、少なくとも部分的に、磁力を用い、一方、他の実施形態においては、少なくとも２つの力を用いて、実質的に細胞が喪失した部分から該網状構造体を分離する。分離に２つの力を用いる場合、一方の力は磁力であり、もう一方の力は、少なくとも１つの境界壁を介して伝達される電気機械的な力である（この場合の「電気機械的」、「自動的」、「水圧」および「空気圧」なる語は、本発明においては互換的に用いられる）。
【００２０】
本発明の種々の目的、特徴、態様および利点は、添付図面（図面中の同じ数字は、同じ成分を表す）および本発明の好ましい実施形態の以下の詳細な記載から更に明らかとなるであろう。
【００２１】
（図面の簡単な記載）
図１Ａは、血液サンプルに分離剤が加えられている好ましい実施形態の概要図である。
図１Ｂは、赤血球の分離後の図１Ａの実施形態の概要図である。
図２Ａは、もう１つの実施形態の概要図である。
図２Ｂは、図２Ａの実施形態において存在すると考えられる結合相互作用の概要図である。
図３は、さらにもう１つの実施形態の概要図である。
【００２２】
（特定の実施形態の詳細な記載）
図１Ａの一般化された好ましい実施形態においては、血液分離装置１０は、容器２０および磁石５０を含む。容器２０は、赤血球に実質的に結合する一次抗体４２と、一次抗体４２に実質的に結合する二次抗体でコートされた粒子４０とが加えられている血液３０を含有する。
【００２３】
容器２０は、好ましくは、通常の試験管または試験管状の容器（例えば、バキュテーナーまたはファルコン管）である。そのような管の容積は、好ましくは、約１０ｍｌ未満であるが、適当な容器は、より大きな又はより小さな容積のサンプル腔を定めうる。
【００２４】
容器２０は、典型的な試験管の形状を有するものとして記載されているが、異なる形状を有する別の容器も意図される。したがって、適当な容器は、実質的に赤血球が喪失した部分の回収を容易にするための狭い頭部を有しうる。また、別の容器は、異なる形状の底（例えば、Ｖ字状または平らな底）を有しうる。さらにもう１つの具体例においては、個々の容器は、多ウェルマイクロタイタープレートの場合のようなアレイの一部として形成されうる。適当な容器の更なる具体例には、中空糸、毛管のアレイ、ビーカー、小袋、ディッシュおよびシリンダー、一般には、境界壁内に流体を保持させ少なくとも１つの開口を与えうる任意の装置が含まれる。適当な容器には、ガラスまたはプラスチック上にエッチングされたマイクロチャネルを有する顕微鏡スライド、あるいは単純なプラスチックホイルまたはフィルムなどの「壁のある開いた」構造体も含まれると意図される。
【００２５】
本発明における教示に関して使用する容器は複数の境界壁内にサンプルを保持すること、および該境界壁の少なくとも１つは柔軟であることが、特に意図される。本発明で用いる「柔軟」な境界壁なる語は、該境界壁を破壊したり損傷することなく、適度な（すなわち、０．５ｐｓｉ未満の）圧力により実質的に変形されうる壁を意味する。例えば、プラスチックホイルまたは薄いラテックスシートは柔軟であるとみなされる。これとは対照的に、典型的な薄い（２ｍｍ）ポリカーボネートプレートは、この定義の範囲においては、柔軟であるとはみなされない。なぜなら、ポリカーボネートプレートは、典型的には、破壊されることなく実質的に変形されることはないからである。したがって、特に意図される容器は、１つの比較的強固な壁と、その上に配置された少なくとも１つの他の柔軟な境界壁（例えば、ヒートシールによる薄いプラスチックシート）とを有しうる。更に特に意図される容器においては、該境界壁のすべてが柔軟でありうる。そのような容器は封筒の形状を有することが可能であり、意図される容器の具体例は、参照により本明細書に組み入れる米国特許出願第０９／２７２，２３４号に記載されている。
【００２６】
容器は、ガラス、合成高分子、セラミックス、金属またはそれらの混合物を含む適当な任意の材料から構成されうると意図される。そのような容器は、有色または透明、半透明または非半透明でありうる。あるいは、該容器は目盛り又は他のマーキングを有する又は有しないことがある。
【００２７】
図１Ａにおいては、分離されているサンプルは全血である。そのような血液は、一般には、新鮮なヒト全血であると意図され、そのうちの数ミリリットルは、好ましくは、静脈穿刺により得られる。もう１つの具体例は、毛細血管血であり、これは、ランセットを使用して１０μＬ未満〜数百μＬの範囲の容積で得ることができる。
【００２８】
該血液は、添加物の添加または成分の除去などにより前処理することができる。意図される添加物には、バッファー、水または等張溶液、抗凝固剤、抗体および試験溶液が含まれる。除去されうる意図される物質または成分には、抗体、グロブリン、アルブミンおよび細胞画分、例えば、血小板、白血球などが含まれる。
【００２９】
また、該血液は、非ヒト由来（脊椎または無脊椎動物由来など）でありうる。また、本明細書に記載のとおりに使用する血液は、任意のタイプの保存状態から得られることが可能であり、それ自体、冷却された血液、凍結された血液または保存剤を含有する血液でありうる。
【００３０】
好ましい実施形態においては、一次抗体４２は、ヒト赤血球に対するマウス由来モノクローナル抗体（これは、当分野においては、しばしば、ｈＲＢＣに対するモノクローナルＡｂと称される）である。二次抗体４４は、好ましくは、ヒツジ、ロバ、ヤギまたはマウス由来の抗マウスＩｇＧ抗体である。
【００３１】
該抗体を産生させるための技術はよく知られている。例えば、該一次および二次抗体は、ヤギ、ヒツジ、ウマまたは組換え起源を含む適当な任意の起源に由来しうる。また、適当な抗体は、ＩｇＧおよびＩｇＭおよびサブクラスを含む多数のクラスおよびサブクラスから選択されうる。さらに、抗体は、タンパク質分解フラグメントまたは操作されたフラグメント、例えば、Ｆａｂもしくは（Ｆａｂ）２またはキメラ抗体を含む多数の分子変種から選択されうる。抗体の組合せが特に意図される。
【００３２】
もちろん、一次抗体および二次抗体の両方が、それらのそれぞれの標的に実質的に結合することが好都合である。該一次抗体は、好ましくは、赤血球に実質的に結合し、特に、該赤血球の表面上に存在する少なくとも１つのリガンドまたは成分に実質的に結合する。該二次抗体は、好ましくは、該一次抗体の少なくともいくつかの成分に結合する。
【００３３】
二次抗体４４は、好ましくは、コート化粒子４０のコーティング内に含まれる。そのような粒子は、磁力により誘引可能であり、好ましくは、合成高分子またはセルロース内に包埋された常磁性組成物を含む。常磁性粒子が好ましいが、該コート化粒子は、それに加えて又はその代わりに、強磁性またはクロム物質またはその混合物を含みうる。さらに別の変形においては、適当な粒子は、天然または合成高分子、アガロースなどを含む多数の他の物質でコートされうる。好ましい粒径は０．１〜１００μｍの範囲であるが、１０〜１００ｎｍまたは１００μｍより大きな他の粒径も意図される。もう１つの観点から考えると、約５×１０−２４ｍ３〜約５×１０−６ｍ３の平均体積を有する粒子を用いることが意図される。赤血球を標的とする場合には、該赤血球の直径が該コート化粒子の直径の約５倍であると好都合でありうる。
【００３４】
「コート（化）」なる語は、任意の露出表面の完全または部分的な任意の被覆を意味するものとして本発明で用いられる。図１においては、粒子４０は、二次抗体を固定化する物質でコートされている。そのような固定化は一時的または永久的であることが可能であり、共有結合または非共有結合を含みうる。例えば、非共有結合は、抗体を該ビーズまたは他の固相と共にインキュベートすることを伴いうる。もう１つの具体例として挙げられる、固相への抗体の共有結合は、抗体のアミノ基を、該固相上のアルデヒドまたは該固相上の活性化カルボキシル基と反応させて、共有結合を得ることを伴いうる。
【００３５】
さらに他の実施形態においては、該一次抗体および二次抗体の一方または両方を、所望の結合および少なくとも最低限の許容される特異性を有する代替的組成物で置換または補足されうる。抗リガンドは、そのような代替的組成物の一般的クラスであり、本発明においては、適当なリガンドに非共有的に結合する任意の分子と定義される。抗リガンドおよびリガンドの具体例には、それぞれ、抗体および抗原、核酸におけるセンスおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドが含まれるが、これらに限定されるものではない。ヌクレオチドに加えて他の重合体も意図される。さらなる具体例としては、リガンドに実質的に結合するアプタマーおよびレクチンが挙げられる。
【００３６】
「細胞含有網状構造体」なる語は、本発明においては、除去する細胞を細胞溶解しなければ個々の細胞を容易には機械的に除去することができない少なくとも２以上の細胞の凝集体を意味する。通常、凝固した血液が細胞含有網状構造体の一例であるが、疎水性、親水性、静電的、ファンデルワールス、イオン相互作用または他の分子相互作用などの分子相互作用により媒介される任意の組合せにより実質的に形成された凝集体も意図される。したがって、細胞含有網状構造体の他の具体例としては、該細胞に実質的に結合する抗体または他の連結剤との組合せにより形成された赤血球、白血球または他の細胞の凝集体が挙げられる。そのような網状構造体にはビーズなどの固体支持体が含まれうることが、特に意図される。
【００３７】
赤血球と２つの異なる抗体との混合物を用い、該一次抗体が該赤血球に結合し該二次抗体が該一次抗体に結合する場合に異種凝集体が形成されうることが、特に意図される。該抗体の２つの結合部分の１つだけがそのような結合に関与する場合には、以下の凝集体が形成されうる：（ａ）赤血球に結合した一次抗体、（ｂ）該一次抗体に結合した二次抗体、および（ｃ）赤血球または血液もしくは体液中の何らかの他の細胞型に一次抗体に結合した二次抗体。該抗体の２つの結合部分の両方が結合に関与する場合には、凝集体（ａ）、（ｂ）、（ｃ）の任意の組合せが形成され、それにより凝集体の潜在的に巨大な網状構造体が生じうる。
【００３８】
該サンプル、抗体または他の抗リガンド、およびビーズまたは他の粒子を、任意の順序で該容器内で一緒にすることができる。例えば、実施形態の１つのクラスにおいては（示されていない）、容器は、磁気的に誘引可能なビーズで予めローディングされると意図される。適当なそのような容器はＭｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ（商標）からＭｉｎｉＭＡＣＳ（商標）分離カラムとして商業的に入手可能であり、該カラムには分離促進装置も備えられている。該標準的プロトコールは、例えば、該ビーズを適当な抗リガンドで予めコートすることにより及び適当な抗リガンドを該サンプルに加えることにより、本明細書中の教示に適合するよう改変される必要があるであろう。
【００３９】
磁石５０は、一般には、円形磁石であるが、別の実施形態においては、該磁石はまた、異なる形状およびデザインを有しうる。意図される別の磁石には、棒磁石、馬蹄形磁石、環状磁石が含まれ、それらは、四重極、六重極および八重極などを含む適当な任意の多重極構造を有しうる。磁石は、永久磁石、電磁石、または更には超伝導磁石であることが可能であり、強磁石または希土類磁石でありうる。さらに、該磁石は単一の磁石である必要はなく、複数の磁石を含むことが好都合でありうる。好ましい磁石は、永久磁石では０〜２テスラ、電磁石では０〜１００テスラの強度を有しうる。特に好ましい磁石においては、０〜１テスラの磁界の強さの永久磁石を使用する。
【００４０】
本発明の更に別の態様においては、該サンプルは複数の境界壁内に保持され、該分離は、第１および第２の力によりその複数の境界壁内で生じる。第１の力は磁力を含み（前記を参照されたい）、一方、第２の力は、該境界壁の少なくとも１つを介して伝達される自動的機械的力を含む。本発明で用いる「自動的」機械的力なる語は、手動以外の方法で機械的力が加えられる方法に関して用いられる。特に意図される実施形態においては、該自動的機械的力は、柔軟な境界壁に加えられる圧力を含む。例えば、該境界壁のすべてが柔軟である容器においては、磁力は、該境界壁内に網状構造体を保持させうることが可能であり、機械的力（例えば、該容器を含む１以上のアクチュエータ）は、実質的に細胞が喪失した部分からの該網状構造体の分離を補助する。
【００４１】
図１Ｂにおいては、血球３２（詳細には示されていない）、抗体でコートされた常磁性粒子４０（詳細には示されていない）、および抗赤血球抗体４２（詳細には示されていない）から、いくつかの網状構造体４５が形成されている。網状構造体４５内の粒子４０は磁石５０により誘引され、それにより、実質的に細胞が喪失した血漿３４から細胞含有網状構造体４５が分離されている。
【００４２】
赤血球３２は、一般には、成熟した無核赤血球である。これらの血球は、通常、サンプル中に存在する赤血球の優勢な形態である。別の実施形態においては、赤血球はまた、α、β、γまたは胎児ヘモグロビンを含む任意のタイプのヘモグロビンを保持する赤血球でありうる。該赤血球はまた、健常な血球、または疾患（例えば、鎌状赤血球貧血またはサラセミア）を引き起こす赤血球でありうる。適当な赤血球はまた、多数の発達段階のもの、例えば、有核赤芽球または老化した無核赤血球でありうる。
【００４３】
本発明は、もちろん、成熟した無核赤血球に限定されるものではなく、特に、他の赤血球発達段階のものが意図され、他の細胞には、白血球、さらには、血小板を含む細胞断片が含まれる。したがって、例えば、該サンプルが尿を含む場合には、臨床家または他の個人は、細菌細胞または脱落した膀胱もしくは尿道細胞を分離するために本発明の方法および装置を用いることが可能であり、そのような場合には、図１Ｂの赤血球３２は非赤血球で置換されうる。
【００４４】
多種多様なサンプル上での操作に加えて、本明細書に記載の本発明の方法および装置は、多種多様な被検体を測定するために使用されうることも意図される。意図される被検体には、腫瘍マーカー、例えば前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、伝染病マーカー、内分泌マーカー、例えばテストステロン、エストロゲン、プロゲステロンおよび種々のサイトカイン、ならびに代謝マーカー、例えばクレアチニン、グルコースが含まれる。
【００４５】
図２Ａにおいて、血液分離装置１１０は、赤血球１３２（詳細には示されていない）、抗赤血球抗体１４２（詳細には示されていない）および抗マウス抗体１４４（詳細には示されていない）を含む白血球１３０から形成された網状構造体１４５を含有する、軟らかい壁の又は柔軟な容器１２０を有する。フィルター１６０は網状構造体１４５を濾過し、血漿１３４が収集領域に通過到達するのを可能にする。
【００４６】
フィルター１６０は、好ましくは、血液の細胞成分のサイズより小さな又は個々の細胞より大きいが該網状構造体よりは小さな孔径を有するガラス繊維フィルターである。別の実施形態においては、該フィルターは、クロマトグラフィー紙、天然または合成繊維、多孔性膜などを含む多数の材料から構成されうる。それらの別のフィルターの具体例としては、ナイロン繊維フィルター、サイズ排除膜、紙濾過器、織物フィルターが挙げられる。さらに、該フィルターは、例えば、溶血を減少させるための又は選択された画分もしくは分子を特異的に保持させるための物質でコートされている又はされていないことが可能である。適当なコーティングには、ポリビニルアルコール、ポリ酢酸ビニル、ポリカチオン重合体、レクチンまたは抗体が含まれる。
【００４７】
図２Ａにおいては、該サンプルの濾液部分は、引力により該フィルターを通過する。しかし、該サンプルをフィルター越えに移動させる原動力は、膜の両側の力または圧の差であることが可能であり、遠心分離、真空、圧縮ガスまたは磁石（本明細書に記載されている）を含む多数の方法で達成されうると認識される。濾過時間は非常に様々となりうるが、一般には、数秒〜３０分未満の範囲内であると考えられる。
【００４８】
図２Ｂは、赤血球１３２に結合した抗赤血球抗体１４２および抗赤血球抗体１４２に結合した抗マウス抗体１４４を含む網状構造体１４５の考えられうる部分の詳細を示す。単一の網状構造体は数百万個の細胞を含有しうると当業者に認識される。図２Ｂにおける種々の成分の配向および連結は、単なる典型例にすぎず、実際の網状構造体中に必ずしも存在する必要はないと理解されるべきである。とりわけ、実在の網状構造体は、示されている二次元図ではなく三次元のものであり、該抗体は、該図に示されているものよりはるかに小さい。図１Ｂの網状構造体４５は、図２Ｂに示されているものに対応した構造を有すると理解されるべきである。
【００４９】
図３において、血液分離装置２１０は、血液サンプル２３０、抗赤血球抗体２６４でコートされた前置フィルター２６０、および抗赤血球抗体２７４でコートされた二次フィルター２７０を収容する容器２２０を有する。サンプル２３０の一部は前置フィルター２６０で濾過されて、部分的に細胞が喪失した流体２３３を与え、細胞が喪失した流体２３３の一部は二次フィルター２７０で濾過されて、実質的に細胞が喪失した流体２３４を与える。
【００５０】
この場合、容器２２０は、容器２０に関して既に記載した容器の範囲内に含まれる容器であると意図され、血液２３０および３０、赤血球２３２および３２、一次抗体２６４および４２、二次抗体２７４および４４ならびに血漿２３４および３４に関して、同様の対応が存在する。
【００５１】
好ましい前置フィルター材料は、ナイロン繊維の未圧縮層を含むナイロンウール２６０である。二次フィルター２７０は、好ましくは、マウス抗赤血球抗体２７４が結合しているガラス繊維ディスクである。別の実施形態においては、フィルター２６０および２７０の一方または両方は、繊維状フィルター材料、濾紙、多孔性膜などを含む他の任意の適当なフィルター材料で置換されうる。この具体例には、コート化または未コート化ガラス繊維、ミネラルウール、クロマトグラフィー紙などが含まれる。さらに、該フィルター材料は、例えば、溶血を減少させるために又は選択された画分もしくは分子を特異的に保持させるためにコートされている又はコートされていないことが可能である。適当なコーティングには、既に記載されているもの以外に、ポリビニルアルコール、ポリ酢酸ビニル、ポリカチオン重合体、レクチンまたは抗体が含まれる。
【００５２】
実験
血漿から赤血球を分離するための試験を行なった。その結果を以下に記載する。これらの試験は、前記の原理のいくつかを例示するものであるにすぎず、特許請求している発明の範囲を限定すると解釈されるものではない。
【００５３】
実験セット１
第１の一連の実験においては、マウス抗赤血球抗体と、ヤギ抗マウス抗体でコートされた常磁性ビーズと、０．５ｍｌの抗凝固全血とを使用して、赤血球を沈降させた。ヘパリン化、ＥＤＴＡまたはクエン酸添加全血を、１０μｌの未希釈マウス抗赤血球抗体溶液（Ｒｅｄ  Ｏｕｔ（商標），Ｒｏｂｂｉｎｓ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏｒｐ．）と２分間混合した。ついで、ヤギ抗マウス抗体でコートされた常磁性ビーズ（Ｃｏｒｔｅｘ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｉｎｃ．，ＭａｇａＣｅｌｌ（商標）またはＭａｇａＢｅａｄｓ（商標）；３０ｍｇ／ｍＬ；またはＰｉｅｒｃｅ  ＭａｇｎａＢｉｎｄ（商標））を含有する１０μｌの溶液（等張ＰＢＳ，ｐＨ７．４）を加え、穏やかに２分間混合した。該管の底を磁石（永久鉄磁石；約０．２テスラ）上に配置した。該細胞網状構造体の沈降は直ちに開始し、約２分後に実質的に終了した。該容器の頭部からの吸引により血漿を集めた。
【００５４】
重要なことに、本明細書に記載の方法および装置は、理論的に入手可能な細胞喪失部分の少なくとも７０容積％を比較的短い時間内に該網状構造体から分離することが判明している。多くの場合、そのような９０％の分離のための時間は３０分未満であり、他の場合には１０分未満であり、さらに他の場合には２分未満である。また、理論的に入手可能な細胞喪失部分の少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％および少なくとも９８％を該網状構造体から３０分未満に与える本明細書に記載の方法を用いた分離が行われている。
【００５５】
実験セット２
第２の一連の実験においては、全血と、マウス抗赤血球抗体と、ヤギ抗マウス抗体でコートされた常磁性ビーズとを使用して、顕微鏡スライド上で赤血球を沈降させた。０．２ｍｌの新鮮な全血に、５：ｌの抗赤血球抗体含有溶液（Ｒｅｄ  Ｏｕｔ（商標））を加え、混合し、室温で２分間インキュベートした。ついで、ヤギ抗マウス抗体でコートされた常磁性ビーズ（ＭａｇａＣｅｌｌ（商標）またはＭａｇａＢｅａｄｓ（商標）またはＭａｇａＢｉｎｄ（商標））を含有する５：Ｌの溶液を加え、混合し、さらに２時間後、該スライドの両側に２つの円形磁石を配置した。１．５分後、透明な血漿を含有する領域がそれらの２つの磁石の間に形成され、これは、横方向に固定された細胞含有網状構造体の破壊を伴うことなくピペットで回収された。
【００５６】
実験セット３
透明なアセテートシート（例えば、３Ｍ  Ｉｎｃ．の製品３ＭＣＧ３４６０）もしくはプラスチックシートプロテクター（例えば、Ａｖｅｒｙ−Ｄｅｎｎｉｓｏｎ  ＰＶ１１９Ｅ）から、または小さな「ＺｉｐＬｏｃｋ」またはＩＴＷ  Ｉｎｃ．ＭｉｎｉＧｒｉｐ（商標）バッグ（２．５×３ｃｍ；２．０ｍｉｌ）から、４つの端のうちの３つにおいて密封された平らな封筒状物を調製した。０．５〜１ｍＬの抗凝固全血を該バッグ内に注入し、１０μＬのＲｅｄ  Ｏｕｔ（商標）（前記を参照されたい）を加え、該容器を穏やかに揺らすことにより血液と混合した。２分後、該抗マウスコート化磁性ビーズ（ＭａｇａＣｅｌｌ（商標））を加え、混合し、該バッグの開いた端を密封した。２分後、長方形の永久鉄磁石（約０．２テスラ）上に該バッグを水平に配置した。該磁性粒子および付着した細胞性網状構造体は該磁石の近くまで移動し、血漿の透明な層が上清として残った。ついで該バッグを、該磁石上に配置したままで垂直の位置に回転させ、開き、ピペットを使用して血漿を吸引した。また、封筒状物またはバッグ（抗ＲＢＣ抗体および抗マウスコート化常磁性ビーズで予め処理された血液を含有するもの）を、狭い間隔で離された２つの常磁石の間に通過させることが可能であることが見出された。該袋がそれらの磁石の間で上方に引かれるにつれて、該細胞網状構造体は該容器の底に引っ張られて、血漿の上層を与えた。
【００５７】
したがって、本実施例においては、容器は複数の柔軟な境界壁内にサンプルを保持し、該サンプル中に形成された細胞含有網状構造体は、それらの複数の境界壁内で分離される。あるいは、該封筒状物またはバッグを２つの磁石の間で通過させる代わりに、該容器に対して該細胞性網状構造体を移動させるために、アクチュエータまたは他の機械装置を使用して該バッグを圧縮させることが可能であった。この場合には、実質的に細胞が喪失した部分から該網状構造体を分離するために、該境界壁の少なくとも１つを介して伝達される第２の力（すなわち、自動的機械的力）を用いる。
【００５８】
実験セット４
１つの実験においては、血液および沈降試薬の添加前に、少量のスティールウール（ＰＢＳ中の５ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡで１２時間洗浄され処理されたもの）を該サンプル容器に加えた。ＲｅｄＯｕｔ（商標）およびＭａｇａＣｅｌｌ（商標）試薬の添加（それぞれ２分間）後、該管を磁石上に配置した。該細胞性網状構造体内に含有された常磁石ビーズを該スティールウールに固定化した。血球を実質的に含有しない血漿を吸引するために、ピペットチップを使用した。該スティールウールは、タンパク質または何らかの他の重合体子でコートされた場合には、２時間の間に該細胞ペレット中で溶血をほとんど引き起こさなかった。さらに、鉄ワイヤ、ウールまたはビーズも、デキストラン、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコールなどの他の非溶血性重合体でコートされた場合には、前記のとおりに加えることができると意図される。
【００５９】
もう１つの実験においては、１２ｍｍガラス管の外底部の１／３の周囲に１５個の鉄無頭釘をテープで留め、該管中、前記のとおりに、全血を、ヤギ抗マウス抗体でコート化された常磁性ビーズおよびマウス抗赤血球抗体と共にインキュベートした。該管を長方形の磁石上に配置すると、ほぼ即座に該管の底および側面上に析出が生じた。外部の無頭釘は、該磁気源を、該サンプル管に、より近くなるように配置させ、比較的均一な二次的横方向誘引を該サンプルカラム全体にもたらし、該細胞網状構造体が該管の側面に移動するにつれて、それは更に凝集する。
【００６０】
実験セット５
本明細書に記載の方法および装置により得られた試験結果を、表１に示す。これに関しては、遠心分離は全血からの細胞性物質の除去において少なくとも９９％有効（９９％の分離効率）であること、および本明細書に記載の方法および装置（該表中には「装置」として記載されている）はほぼ同等に有効であることに注目すべきである。特に、本明細書に記載の方法および装置は、少なくとも９０％、少なくとも９５％および少なくとも９８％の分離効率を有するものとして記載されうる。
【００６１】
【表１】
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【００６２】
このように、磁気分離の特定の実施形態および用途を開示した。しかし、本発明の概念から逸脱することなく、既に記載されているもの以外の多数の更なる修飾が可能であることが当業者に明らかなはずである。したがって、本発明は、特許請求の範囲の精神以外の何ものにも限定されるものではない。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】  図１Ａは、血液サンプルに分離剤が加えられている好ましい実施形態の概要図である。
【図１Ｂ】  図１Ｂは、赤血球の分離後の図１Ａの実施形態の概要図である。
【図２Ａ】  図２Ａは、もう１つの実施形態の概要図である。
【図２Ｂ】  図２Ｂは、図２Ａの実施形態において存在すると考えられる結合相互作用の概要図である。
【図３】  図３は、さらにもう１つの実施形態の概要図である。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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