(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ユビキチンリガーゼ（E3）としてのパーキンタンパク質（Parkin）の使用。
【請求項２】
ユビキチンリガーゼが、ユビキチン結合酵素（E2）と結合し、ユビキチンを標的タンパク質に結合させる活性を有する酵素である、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
パーキン遺伝子（parkin）中の若年性パーキンソニズムに関連する変異を検出する方法であって、
パーキンタンパク質（Parkin）が神経細胞においてユビキチンを標的タンパク質に結合させる活性に影響を及ぼす変異、および／またはパーキンタンパク質（Parkin）とユビキチン結合酵素（E2）との相互作用に影響を及ぼす変異であって、パーキン遺伝子（parkin）のユビキチン様ドメイン（Ub1）および／またはRING-ボックスもしくはその近傍のアミノ酸配列をコードする領域の塩基の変異または欠失を検出することを含む、前記方法。
【請求項４】
神経細胞においてユビキチンを標的タンパク質に結合させる活性に影響を及ぼす変異が、パーキン遺伝子（parkin）のユビキチン様ドメイン（Ub1）および／またはRING-ボックスもしくはその近傍のアミノ酸配列をコードする領域の塩基の変異または欠失である、請求項３記載の方法。
【請求項５】
パーキンタンパク質（Parkin）とユビキチン結合酵素（E2）との相互作用に影響を及ぼす変異が、パーキン遺伝子（parkin）のRING-ボックスまたはその近傍のアミノ酸配列をコードする領域の塩基の変異または欠失である、請求項３または４に記載の方法。
【請求項６】
ユビキチン結合酵素（E2）がUbcH7またはUbcH8である、請求項３〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
患者由来のパーキンタンパク質（Parkin）が保持する、神経細胞においてユビキチンを標的タンパク質に結合させる活性を測定することを含む、パーキン遺伝子（parkin）中の若年性パーキンソニズムに関連する変異を検出する方法。
【請求項８】
患者由来のパーキンタンパク質（Parkin）とユビキチン結合酵素（E2）との相互作用を測定することを含む、パーキン遺伝子（parkin）中の若年性パーキンソニズムに関連する変異を検出する方法。
【請求項９】
ユビキチン結合酵素（E2）UbcH7またはUbcH8である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
（１）若年性パーキンソニズム患者由来のパーキン遺伝子（parkin）を含む発現ベクターを保持する細胞を提供する工程；
（２）該細胞と候補化合物とを接触させる工程；および
（３）パーキンタンパク質（Parkin）が保持する、ユビキチンを標的タンパク質に結合させる活性、および／またはパーキンタンパク質（Parkin）とユビキチン結合酵素（E2）との相互作用を測定する工程：を含む、若年性パーキンソニズムの治療および/または予防のための医薬のスクリーニング方法。
【請求項１１】
細胞が神経細胞由来である、請求項１０に記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術】
本発明は、パーキンタンパク質（本明細書中、Parkinとも称する）の新規な用途、より具体的には、ユビキチンリガーゼ（E3）としてのParkinの使用に関する。本発明はまた、Parkinのユビキチンリガーゼ（E3）機能に着目した若年性パーキンソニズムの診断方法、より具体的には、パーキン遺伝子（本明細書中、parkinとも称する）の変異を検出することによる若年性パーキンソニズムの診断方法にも関する。本発明はさらに、若年性パーキンソニズムの治療及び／又は予防のための医薬のスクリーニング方法にも関する。
【０００２】
【従来の技術】
ユビキチン経路は、細胞内のタンパク質量の調節に関与する細胞内タンパク質分解において中心的役割を担うことが知られている（Hershko,A他、Annu.Rev.Biochem.  67,425-479(1998)；及びHochstrasser,M、Annu.Rev.Genet. 30, 405-439(1996)）。ユビキチンはユビキチンのＣ末端Ｇｌｙと標的タンパク質のＬｙｓ残基のε−ＮＨ2基との間のイソペプチド結合を介して該標的タンパク質と共有結合する。タンパク質のユビキチン化は、E1（ユビキチン活性化酵素）、E2（ユビキチン結合酵素）およびE3（ユビキチンリガーゼ）と命名される３種類の酵素のカスケードの触媒によって行われ、この一連の反応によって形成されたポリユビキチン鎖は、真核生物のATP-依存性プロテアーゼ複合体である26Sプロテアソームによるタンパク質分解攻撃のための分解シグナルとして機能する（Coux,O他、Annu.Rev.Biochem. 65, 801-847(1996)；及びBaumeister,W.,他、Cell 92,367-380(1998)）。E2（ユビキチン結合酵素）およびE3（ユビキチンリガーゼ）の多様性により細胞内においてタンパク質分解の複数の経路が獲得される（Hershko,A他、Annu.Rev.Biochem. 67,425-479(1998)；及びHochstrasser,M., Annu.Rev.Genet. 30, 405-439(1996)）。基質認識に最も密接に関連するE3の分子的基礎は詳細には解明されていない。現在、多数のRING-フィンガープロテインが、タンパク質のユビキチン化においてE3として関与していることが示唆されている（Harper,J.W.他、Nature Cell Biol. 1, E5-E7 (1999); Zachariae,W.他、Genes & Dev. 13, 2039-2058 (1999); Xie, Y.他、EMBO J. 18, 6832-6844(1999); Joazeiro, C.A.P.他、Science 286, 309-312 (1999); Lorick,K.L.他、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96, 11364-11369 (1999); Moynihan, T.P.他、J.Biol.Chem. 274, 30963-30968 (1999);及びMartinez-Noel,G他、FEBS Leters 454, 257-261(1999)）
【０００３】
以下、E1、E2およびE3について簡単に説明する。
E1（ユビキチン活性化酵素）は、ユビキチン分子と高エネルギー性チオエステル結合を最初に形成する酵素である。ユビキチン分子との高エネルギー性チオエステル結合を形成する際にはATPを消費する。E1は活性化されたユビキチンを以下のE2（ユビキチン結合酵素）へと転移する。
E2は、E1から活性化されたユビキチンを受け取り、新たなチオエステル中間体を形成する。E2の多くはE3（ユビキチンリガーゼ）と選択的に相互作用しているが、いくつかのE2は直接に基質タンパク質をユビキチン化することが判明している。E2は遺伝子ファミリーを形成しており、出芽酵母では１３個の遺伝子が同定された。ヒトなどの高等動物ではより多くの遺伝子が存在することが明らかになりつつある。
【０００４】
E3（ユビキチンリガーゼ）は、直接または間接的に基質タンパク質（標的タンパク質）と相互作用して、ユビキチンを基質またはその基質に既に形成されたユビキチン鎖に転移する反応を触媒する。E3はユビキチンシステムの基質特異性を決定する上で最も重要な機能分子である。現在までに報告されているE3酵素の数は少なく、その機能もほとんど解明されていない。現在、E3酵素は以下のHECTタイプとRINGフィンガータイプの２つに分類されており、E3酵素の異常と疾患との関連性が示唆されている。
【０００５】
（１）HECTタイプ：Ｃ末端側にE6-AP（E6−associated protein）とホモロジーのあるHECT（homologous to E6-AP C-terminus）ドメインをもつファミリー；
（２）RINGフィンガータイプとしてはこれまでに６つ知られており、これらを以下に示す。
（２−１）基質（標的）のＮ末端を認識するE3α（酵母のUBR1のホモログ）とE3β；
（２−２）細胞分裂期に主に働く分子量約１，５００ＫＤａのAPC（anaphase promoting complex）のコンポーネントAPC11；及び
（２−３）Ｇ１期に主に働くSCF［SkpI/Cullin1(Cdc53)/F-box protein］複合体の結合因子であるROC1：
（２−４）p53のユビキチン化に関するMDM2
（２−５）レセプターチロシンキナーゼのアダプタータンパク質c-Cbl
（２−６）乳癌の原因遺伝子産物BRCA1
【０００６】
近年、遺伝性神経変性疾患の原因遺伝子が幾つか同定され、原因遺伝子から作られる異常タンパク質の動態が明らかにされつつある。その結果、多くの異常タンパク質が、疾患で傷害を受ける脳・神経に凝集・沈着していることが見出された。従って、神経変性には異常タンパク質の沈着によって引き起こされる共通分子機構が想定され、それを解明することにより新たな治療法を開発する試みが始まろうとしている。
【０００７】
パーキンソン病は錐体外路症状を主特徴とする代表的な神経変性疾患であり、病理学的には黒質ドーパミン作動性ニューロンや他の脳幹神経細胞が変性脱落するとともに、残存ニューロンの細胞体内にレビー小体が出現することを特徴としている。近年、患者の神経細胞のレビー小体にα−シヌクレイン（synuclein）タンパク質とユビキチンが蓄積していることが判明した。α−シヌクレイン遺伝子のミスセンス変異も見出されており、その異常な細胞内蓄積の原因になることが示唆されている。
【０００８】
最近になって、ヒトにおいて劣性遺伝形式を示して若年で発症する常染色体劣性遺伝性若年性パーキンソン病（AR-JP）の原因遺伝子が連鎖解析を経て同定され、パーキン（parkin）と名付けられた（Kitada,T他、Nature 392, 605-608(1998)）。parkinはヒト６番染色体ｑ２５．２−２７に由来する新規遺伝子であった。parkinによりコードされるタンパク質（Parkin）は、Ｎ末端部位にユビキチンと相同性を有する部位（ユビキチン様（Ubl）ドメイン）を有しており、Parkinがユビキチン同様にタンパク質分解に関与すると仮定した場合、その機能喪失が何らかのタンパク質の蓄積（分解異常）をもたらしニューロンを傷害することが推測される。また、ParkinはＣ末端部位に２つのRINGフィンガードメインとその間にあるIBR（in between RING）からなるRING-ボックスを有していた。しかしながら、Parkinがユビキチン経路に関与していることを示す証拠はこれまで報告されておらず、Parkinの細胞内での機能は未だ十分には解明されていなかった。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、Parkinがユビキチン経路に関与するかどうかを調べることによりParkinの新規な機能を見出し、それに基づいて若年性パーキンソニズムの新たな診断方法を提供することを解決すべき課題とした。本発明はまた、ユビキチン経路における機能が変化したParkinを利用してパーキンソン病の予防及び／又は治療のための医薬をスクリーニングする方法を提供することを解決すべき課題とした。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、Parkinが、ユビキチン経路において標的タンパク質へのユビキチンの転移反応に関与していることを実証し、本発明を完成するに至った。
本発明によれば、ユビキチンリガーゼ（E3）としてのパーキンタンパク質（Parkin）の使用が提供される。本発明の一態様では、ユビキチンリガーゼは、ユビキチン結合酵素（E2）と結合し、ユビキチンを標的タンパク質に結合させる活性を有する酵素である。
【００１１】
本発明の別の側面によれば、パーキン遺伝子（parkin）中の変異であって、パーキンタンパク質（Parkin）が神経細胞においてユビキチンを標的タンパク質に結合させる活性に影響を及ぼす変異、および／またはパーキンタンパク質（Parkin）とユビキチン結合酵素（E2）との相互作用に影響を及ぼす変異を検出することを含む、若年性パーキンソニズムの診断方法が提供される。
好ましくは、神経細胞においてユビキチンを標的タンパク質に結合させる活性に影響を及ぼす変異は、パーキン遺伝子（parkin）のユビキチン様（Ubl）ドメインおよび／またはRING-ボックスまたはその近傍の変異または欠失である。
好ましくは、ユビキチン結合酵素（E2）との相互作用に影響を及ぼす変異は、パーキン遺伝子（parkin）のRING-ボックスまたはその近傍の変異または欠失である。
好ましくは、ユビキチン結合酵素（E2）はUbcH7またはUbcH8である。
【００１２】
本発明のさらに別の側面によれば、患者由来のパーキンタンパク質（Parkin）が保持する、神経細胞においてユビキチンを標的タンパク質に結合させる活性を測定することを含む、若年性パーキンソニズムの診断方法、並びに患者由来のパーキンタンパク質（Parkin）とユビキチン結合酵素（E2）との相互作用を測定することを含む、若年性パーキンソニズムの診断方法が提供される。
好ましくは、ユビキチン結合酵素（E2）はUbcH7またはUbcH8である。
【００１３】
本発明のさらに別の側面によれば、（１）若年性パーキンソニズム患者由来のパーキン遺伝子（parkin）を含む発現ベクターを保持する細胞を提供する工程；（２）該細胞と候補化合物とを接触させる工程；および
（３）パーキンタンパク質（Parkin）が保持する、ユビキチンを標的タンパク質に結合させる活性、および／またはパーキンタンパク質（Parkin）とユビキチン結合酵素（E2）との相互作用を測定する工程：
を含む、若年性パーキンソニズムの治療及び／又は予防のための医薬のスクリーニング方法が提供される。
好ましくは、細胞は神経由来細胞である。
【００１４】
本発明のさらに別の側面によれば、上記した本発明のスクリーニング方法により同定される、若年性パーキンソニズムの治療及び／又は予防のための医薬が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、上記した本発明のスクリーニング方法に用いるための、若年性パーキンソニズム患者由来のパーキン遺伝子（parkin）を含む発現ベクターを保持する細胞が提供される。
【００１５】
【発明の実施の形態】
本発明は、ユビキチンリガーゼ（E3）としてのパーキンタンパク質（Parkin）の使用に関する。本明細書で「使用」という場合、その態様は、Parkinがユビキチンリガーゼ（E3）として作用する態様であれば特に限定されず、例えば、パーキンソン病、特には若年性パーキンソニズムの診断のために使用する方法、あるいはパーキンソン病、特には若年性パーキンソニズムの診断、予防及び／又は治療のための医薬のスクリーニングのために使用する方法などが挙げられる。
【００１６】
ユビキチンリガーゼ（E3）は、直接または間接的に標的タンパク質に相互作用して、ユビキチンを標的タンパク質に転移させる反応を触媒する酵素である。なお、標的タンパク質には既にユビキチン鎖が形成されている場合もあり、その場合にはその形成されたユビキチン鎖にユビキチンを転移する反応を触媒する。本明細書において「ユビキチンを標的タンパク質に結合（転移）させる」という場合には、ユビキチン化されていない標的タンパク質自体にユビキチンを転移する場合と、既にユビキチン化された標的タンパク質の該ユビキチン鎖にユビキチンを転移する場合の両方を包含する。
なお、ユビキチンリガーゼ（E3）が、ユビキチンを標的タンパク質に結合させる活性を発揮するには、ユビキチン結合酵素（E2）と結合することが必要な場合がある。
【００１７】
本発明はまた、若年性パーキンソニズムの診断方法にも関する。本発明の診断方法では、Parkinが神経細胞においてユビキチンを標的タンパク質に結合させる活性に影響を及ぼす変異、および／またはParkinとユビキチン結合酵素（E2）との相互作用に影響を及ぼす変異が検出される。
ParkinはKitada,T他、Nature 392, 605-608(1998)に報告されているタンパク質である。parkinは１２個のエクソンから成り、４６５アミノ酸をコードする遺伝子であり、Ｎ末端にはユビキチン様ドメイン（アミノ酸番号１〜７６）を、Ｃ末端にはRING1ドメイン（アミノ酸番号２３８−２９３）、IBRドメイン（アミノ酸番号３１４−３７７）およびRING2ドメイン（アミノ酸番号４１８−４４９）を有する。日本人患者やトルコ人患者を用いてparkinの遺伝子変異解析が行われており、若年性パーキンソニズムでは特定のエクソンを欠失している頻度が高いことが判明しつつある。本明細書で言うRINGボックスとはアミノ酸番号２３８〜４４９のアミノ酸配列を意味し、その近傍とは、その前後１０〜２０アミノ酸残基程度の範囲を意味する。
【００１８】
ParkinのmRNAはノザンブロットでは普遍的に発現していることが検出されるが、特に脳における発現は高い。本明細書の以下の実施例で示されるように、Parkinはヒトドーパミン作動性ニューロブラストーマSH-SY5Y細胞において、標的タンパク質をユビキチン化する活性を有している。Parkinによるユビキチン結合反応を触媒する活性は、神経細胞を含むある一定の細胞において保持されていると考えられることから、本発明の診断方法では、例えば、ヒトドーパミン作動性ニューロブラストーマSH-SY5Y細胞のような神経細胞を用いて行うことが好ましい。
【００１９】
ユビキチンを標的タンパク質に結合させる活性に影響を及ぼす変異とは、ユビキチンを標的タンパク質に結合させる活性を低下または増加させる変異の両方を含む。本発明は以下の理論に拘束されることはないが、一般的には、ユビキチンの標的タンパク質への結合が低下すると、標的タンパク質の分解効率が低下し、その結果としてタンパク質の蓄積が誘導されると考えられることから、ユビキチン結合活性の低下を測定することにより若年性パーキンソニズムの診断を行うことができる。
Parkinが神経細胞においてユビキチンを標的タンパク質に結合させる活性に影響を及ぼす変異は、parkinのユビキチン様ドメイン、RING1ドメイン、IBRドメインおよびRING2ドメインの何れか１つ以上の部位における塩基の変異又は欠失である。このような変異は患者から採取したDNAの塩基配列を直接決定して調べてもよいし、あるいは既に既知の変異の有無を調べる場合にはPCR等を用いて簡単に検出することができる。
【００２０】
本発明で言う「ユビキチン結合酵素（E2）」とは、E1から活性化されたユビキチンを受け取り、新たなチオエステル中間体を形成する酵素であり、好ましくは、UbcH7またはUbcH8であり、特に好ましくはUbcH7である。
UbcH7は、１５４個のアミノ酸からなる分子量１７８６１Ｄａのタンパク質である（Ulrike Nubert et al., J.Biol.Chem., 271, 2795-2800, 1996）。また、UbcH8は１５３個のアミノ酸からなる分子量１７７６８Ｄａのタンパク質である（Sushant Kumar et al., J.Biol.Chem., 272, 13548-13554, 1997）。
パピローマウイルス１６型と１８型由来のＥ６依存性P53のユビキチン化はヘクトドメインを有するE6-AP（１００ｋＤａ）がリガーゼとして機能する。この際のユビキチン結合酵素（E2）がUbcH5とUbcH7とUbcH8であることが報告されている（Sushant Kumar et al., J.Biol.Chem., 272, 13548-13554, 1997）。
UbcH7とUbcH8のホモロジーは約４６％である。
【００２１】
本発明の診断方法では、Parkinが神経細胞においてユビキチンを標的タンパク質に結合させる活性、および／またはParkinとユビキチン結合酵素（E2）との相互作用が測定される。
【００２２】
Parkinが神経細胞においてユビキチンを標的タンパク質に結合させる活性は任意の方法で測定できる。例えば、Myc等で標識したparkinを含む発現ベクターおよびFLAG等で標識したユビキチン発現ベクターをSH-SY5Y細胞等の神経細胞に同時トランスフェクションする。細胞を２群に分け、一群はMG132などのプロテアソーム阻害剤で処理しておく。トランスフェクションから一定時間経過後に、細胞を回収する。Parkinの標識に使用した物質に対する抗体（例えば、抗Myc抗体）によって調製した免疫沈降物を、ユビキチンの標識に使用した物質に対する抗体（例えば、抗FLAG抗体）を用いたイムノブロット法によりユビキチン結合タンパク質を検出する。これにより高分子量のユビキチン化タンパク質が検出された場合には、ユビキチンが標的タンパク質に結合していることが示される。また、この高分子量のユビキチン化タンパク質に対応するバンドが、プロテアソーム阻害剤の処理を行わなかった細胞では検出されなかった場合には、この高分子量のユビキチン化タンパク質がプロテアソームで分解されていることが示され、Parkinによるタンパク質分解への関与を調べることができる。
【００２３】
本発明の診断方法では、Parkinとユビキチン結合酵素（E2）との相互作用が測定される。この相互作用は任意の方法で測定することできる。例えば、Myc等で標識したparkinを含む発現ベクターを、FLAG、HisまたはＨＡ等で標識したユビキチン結合酵素をコードする遺伝子を含む発現と一緒に好適な細胞内に同時トランスフェクションする。トランスフェクションの一定時間後に、細胞抽出物を調製し、Parkinの標識に用いた標識に対する抗体（例えば、抗Myc抗体）を用いた免疫沈降を行う。免疫沈降物と、ユビキチン結合酵素の標識に用いた標識に対する抗体とを用いたイムノブロットによりParkinとユビキチン結合酵素（E2）との相互作用を検出することができる。
【００２４】
本発明はさらに、若年性パーキンソニズムの治療及び／又は予防のための医薬のスクリーニング方法を提供する。本発明のスクリーニング方法は、（１）若年性パーキンソニズム患者由来のparkinを含む発現ベクターを保持する細胞を提供する工程；
（２）該細胞と候補化合物とを接触させる工程；および
（３）Parkinが保持する、ユビキチンを標的タンパク質に結合させる活性、および／またはParkinとユビキチン結合酵素（E2）との相互作用を測定する工程：
を含む。
【００２５】
本発明で用いる発現ベクターとしては、好ましくは動物細胞、特に好ましくはヒト神経細胞で挿入遺伝子を発現することができるベクターである。発現ベクターとしては、宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組込みが可能で、挿入遺伝子を転写できる位置にプロモーターを含有しているものが好ましい。発現ベクターの種類は特に制限されず、例えば、pcDNA3.1(+)ベクター（Invitrogen）、p-Tet-Onベクター（Clontech）、pSI Mammalian Expression Vector（Promega）、pSVK3 expressionベクター（Amersham Pharmacia Biotech）等が使用できる。
【００２６】
本発明で用いる細胞の種類は、Parkinがユビキチン経路でユビキチンリガーゼとしての機能を発揮できる細胞であれば特に制限されないが、好ましくは動物細胞、特には神経細胞であり、より好ましくはヒト由来神経細胞であり、例えば、ヒトドーパミン作動性ニューロブラストーマである。
【００２７】
上記スクリーニング方法で候補化合物が、Parkinがユビキチンを標的タンパク質に結合させる活性を高めたり、Parkinとユビキチン結合酵素（E2）との相互作用を高めたりした場合には、当該候補化合物は、若年性パーキンソニズムの治療及び／又は予防のための医薬の候補として選択することができ、こうして選択された医薬は、更なる試験に付して薬効を確認することができる。
【００２８】
候補化合物の種類の種類は特に限定されないが、例えば、サイトカイン類、小分子医薬、ホルモン、特異性抗体、ペプチド模倣物、アンチセンスオリゴヌクレオチド、および細胞機能またはタンパク質発現を改変する他の医薬のような任意の医薬などを挙げることができる。
以下の実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の範囲は実施例によって制限されることはない。
【００２９】
【実施例】
実験操作：
（１）発現プラスミドとトランスフェクション
pcDNA3.1(+)MycおよびpcDNA3.1(+)FLAGベクターを作製するために、Ｎ末端MycおよびFLAGエピトープをコードするオリゴDNAをpcDNA3.1(+)（Invitrogen）のKpnI/BamHI部位にライゲートした。parkinの野生型又はＮ末端欠失変異体、Ubc2(HHR6B)、UbcH8およびユビキチンのcDNAを適切なプライマーを使用してPCRにより増幅し、ベクターのBamHI部位にライゲートした。parkinのＣ末端欠失変異体およびミスセンス変異体は、QuikChange部位特異的変異誘発キット（Stratagene）を使用説明書に従って使用してpcDNA3.1(+)Myc-Parkinに変異を導入することによって作製した。pCAGGS-Ubc3は既に報告されている（Iwai,K他、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96, 12436-12441  (1999)）。
【００３０】
pCGN-Ubc4および他のpcDNA3.1(+)FLAG−Ubcは各々、PCRを用いてヒト肝臓cDNAライブラリーから一般的方法に従って調製した。使用したＵｂｃは全てヒト由来のものである。ヒト胎児腎臓293（HEK293）細胞およびヒトドーパミン作動性ニューロブラストーマSH-SY5Y細胞は、１０％胎児ウシ血清、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、及び１００Ｕ／ｍｌペニシリンを添加したDMEMで培養した。トランスフェクションは、FuGENE6トランスフェクション試薬を製造業者（Boehringer-Mannheim）の取扱説明書に従って使用して行った。細胞は最終濃度５０μＭのMG132（Cbz-Leu-Leu-Leu-アルデヒド）（Peptide Institute, Inc., Osaka, Japan）で処理した。
【００３１】
（１）免疫学的分析
免疫沈降は、ウサギポリクローナル抗Myc抗体（A-14）（Santa Cruz Biotechnology）を使用して既報の通り行った（Suzuki,H他、Biochem.Biophys. Res. Commun. 256, 127-132(1999)）。イムノブロットは、ビオチン結合マウスモノクローナル抗FLAG（M2）抗体（SIGMA）、マウスモノクローナル抗Myc抗体（9E10）（Santa Cruz Biotechnology）、マウスモノクローナル抗HA抗体（HA.11）（Berkeley Antibody Company）、またはマウスモノクローナル抗His抗体（RGS.His）（QIAGEN）を用いて行った。ビオチン結合抗FLAG（M2）抗体を検出するために、ストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体（Amersham Pharmacia Biotech）を使用した。
【００３２】
実施例１：ParkinとE2酵素との相互作用
Parkinがユビキチン経路に関与しているかどうかを以下の方法により試験した。即ち、Parkinと各種E2酵素が相互作用するかどうかを試験するために、Myc標識したparkinを各種のFLAG、HAまたはHisで標識したE2酵素と一緒にHEK293細胞内で異なる部位で発現させ、それらの相互作用を、抗Myc抗体を用いた免疫沈降により検出した。結果を図１に示す。
【００３３】
具体的には先ず、pcDNA3.1(+)Myc-Parkin（１０μｇ）を、図１の括弧内に表示した量（μｇ）のFLAG−、His−またはHA−Ｕｂｃをコードする各種の発現ベクターと一緒にHEK293細胞内に同時トランスフェクションした。トランスフェクションの４８時間後、細胞抽出物を調製し、抗Myc抗体を用いた免疫沈降（IP）を行った。細胞抽出物（図１の上段パネル）および免疫沈降物（図１の中段及び下段パネル）を、図１に表示した各種抗体を用いたイムノブロットにより分析した。ParkinとUbcH8の会合は通常の条件下では検出されなかったが、大量のUbcH8を発現させ、イムノブロットフィルムをECL反応のために長時間露光した場合には、その会合が検出された（＃のレーンを参照）。星印（＊）はIgGの軽鎖を含む非特異的バンドを示す。
図１に示す通り、UbcH7、並びに弱いながらもUbcH8はParkinと一緒に免疫沈降したが、試験した他のE2酵素（例えば、Ubc2、Ubc3、Ubc4、UbcH5A-CおよびUbcH6など）は何れも検出可能な結合を示さなかった。
【００３４】
実施例２：
UbcH7と相互作用することができるParkinのドメイン構造を分析した。Parkinは３つの領域、即ち、Ｎ末端のユビキチン様ドメイン、Ｃ末端のRING-ボックス、並びに上記２つのセグメントを連結するリンカー領域がある。Ｃ末端RING-ボックス領域は図２ａに示すように、RING1、RING2、およびIBR（in-between-RING）（Morett,E.他、Trends Biochem,Sci.24, 229-231(1999)）から構成されることが知られている。実施例２で用いたParkinの人工又は天然の変異体の構造を図２ａに模式的に示す。図２ａではアミノ酸の一文字表記を使用している。若年性パーキンソニズム（AR-JP）患者に見られたParkinのナンセンス及びミスセンス変異体を各々、ParkinQ311stop及びParkinT240R／ParkinR42Pとして示す。ParkinQ311stopは、第２１１番目のグルタミンが停止コドンに置換された変異体であり、ParkinT240R／ParkinR42Pは、第２４０番目のトレオニンがアルギニンに、第４２番目のアルギニンがプロリンに置換された変異体である。
【００３５】
これら変異Parkinを使用して実施例と同様の操作で変異ParkinとUbcH7との相互作用を分析した。但し、各種変異Parkinは図２ｂの括弧内に示した量（μｇ）で使用し、pcDNA3.1(+)FLAG−UbcH7（７μｇ）を使用した。抗FLAG抗体を用いるイムノブロットは粗抽出物について行った（図２ｂの上段のパネル）。抗Myc抗体（図２ｂの中段のパネル）または抗FLAG抗体（図２ｂの下段のパネル）を用いたイムノブロットは抗Myc抗体によって得られた免疫沈降物について行った。星印（＊）はＩｇＧの重鎖および軽鎖を示す。
【００３６】
図２ｂの結果から分かるように、ユビキチン様ドメインおよびリンカー領域の欠失はUbcH7との結合に影響を及ぼさず、RING-ボックスを含有するＣ末端の半分があればUbcH7の捕捉には十分であった。対照的に、RING1またはRING2ドメインの何れかを欠くRING-ボックス変異体は、UbcH7と結合することができなかった。さらに、若年性パーキンソニズム（AR-JP）患者に見られる２つのミスセンス変異体を試験した場合は、RING1ドメインにおいてThrがArgに変異しているParkinT240R（HAttori,N他、Biochem.Biophys.Res.Commun. 249, 754-758 (1998)）はUbcH7と相互作用しなかったが、ユビキチン様ドメイン変異体であるParkinR42PはUbcH7と結合することができた。以上の結果から、リンカー領域およびユビキチン様ドメインなどの他の領域ではなく、RING-ボックスドメインがユビキチン結合酵素であるUbcH7との会合に必要であることが判明した。
【００３７】
実施例３：
Parkinのユビキチン経路における役割を解明するために、複数の他の異なるクラスのE3で報告されているように（ZacHAriae,W.他、Genes & Dev. 13, 2039-2058 (1999); Xie, Y.他、EMBO J. 18, 6832-6844(1999); Joazeiro, C.A.P.他、Science 286, 309-312 (1999); Lorick,K.L.他、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96, 11364-11369 (1999)）、Parkinが標的タンパク質を捕捉してそれをユビキチン化できるかどうかを試験した。
【００３８】
先ず、pcDNA3.1(+)Myc−parkinおよびpcDNA3.1(+)FLAG−ユビキチンベクター（各１０μｇ）をSH-SY5Y細胞に同時トランスフェクションした。トランスフェクションの４８時間後、全細胞を回収した。ある実験では、細胞を回収する前の３、８または２４時間の時点でMG132（５０μＭ）で処理しておいた。抗Myc抗体によって調製した免疫沈降物を、抗FLAG抗体（図３の上段パネル）および抗Myc抗体（図３の下段パネル）を用いたイムノブロットのために使用した。図３において、星印（＊）は、Parkinの位置を示す。高分子量のユビキチン化されたタンパク質を右側に（Ｕｂ）ｎとして示す。
【００３９】
図３の結果から分かるように、Myc−parkinおよびFLAG−ユビキチンをヒトドーパミン作動性ニューロブラストーマSH-SY5Y細胞で同時発現した場合、高分子量のユビキチン化タンパク質を含めて複数のユビキチン化されたバンドが、プロテアソーム阻害剤MG132（Cbz-Leu-Leu-Leu-アルデヒド）で処理しておいた細胞の粗抽出物からの抗Myc免疫沈降物で検出された（Rock,K.L.他、Cell 78, 761-771(1994)）。一方、阻害剤の処理を行わない場合にはユビキチン化されたバンドは測定されなかった。ポリユビキチン標識タンパク質とParkinとの会合は、MG132の処理後に時間に依存した様式で生じ、ユビキチン化されたタンパク質のあるものはParkinより小さかった。これらの結果は、Parkinが細胞タンパク質をユビキチン化のために捕捉することができること、そしてユビキチンタンパク質リガーゼとして機能することを示している。
【００４０】
なお、HEK293胎児腎臓細胞抽出物を用いた同様の分析では、Parkinに結合したユビキチン化されたバンドは観察されなかった（データは示さず）。この結果より、Parkinの標的タンパク質はHEK293細胞では欠いているか、あるいはまた、Parkinと標的タンパク質との結合またはParkinのE3活性に影響を及ぼす別の必須因子がHEK293細胞では欠けていること、またはユビキチン化抑制タンパク質がHEK293細胞に存在することが示唆される。
【００４１】
実施例４：
SH-SY5Y神経細胞におけるParkinとE2との結合とユビキチン化活性との間の機能的関連の解明を試みた。
実験条件は実施例３と同様とした。但し、各種の変異体Myc−Parkinの発現ベクターは図４の括弧内に示した量（μｇ）で使用し、細胞を回収する前に２４時間MG132（５０μＭ）で処理した。トランスフェクションの４８時間後、抗Myc抗体によって調製した免疫沈降物を、抗FLAG抗体（図４の上段パネル）および抗Myc抗体（図４の下段パネル）を用いたイムノブロットのために使用した。変異体Parkinの詳細については図２ａに示す。図４において、星印（＊）は、図２ｂと同様に、ＩｇＧの重鎖および軽鎖のバンドを示す。ＩｇＧの重鎖に対するバンドは野生型Parkinおよびミスセンス変異Parkinの位置と重複する。
【００４２】
図４に示すように、UbcH7の捕捉を不可能にするRING-ボックスにおける欠失またはミスセンス変異があった場合はいずれも、MG132で処理する同一条件下において、Parkinと会合したユビキチン化タンパク質のバンドは検出できなかった。この結果は、UbcH7の捕捉がParkinの機能に必要であることが示される。ユビキチン様ドメインを欠くParkin変異体および患者由来の変異したParkinR42Pはユビキチン化タンパク質との会合をほぼ完全に喪失した（図４）。しかしながら、これらの変異ParkinはUbcH7に結合することができたことから（図２ｂ）、ユビキチン様ドメインは標的認識に必要なドメインであることが示唆される。これらの結果は、Parkinのユビキチン化活性の損失がAR-JPの原因であることを示している。
【００４３】
実施例の考察：
Parkinは、黒質の神経変性を引き起こす早期発症型パーンキンソン症候群に関与することが示されている（Kitada,T他、Nature 392, 605-608(1998); Mizuno,Y他、J.Neurochem. 71, 893-902(1998)）。上記実施例１から４の結果から、ParkinはUbcH7（E2酵素）を用いてユビキチンを標的タンパク質に結合させるリガーゼ（E3酵素）として機能し、標的タンパク質のユビキチン化を媒介していることが示唆される。この機構の模式図を図５に示す。Parkinは２つの機能的に異なるドメイン、即ち、（１）特異的E2酵素であるUbcH7を捕捉するＣ末端のRING-ボックス、並びに（２）ユビキチン化のための標的タンパク質の認識に必要なＮ末端のユビキチン様ドメインから構成される。多くのAR-JP患者は、Parkinの欠失変異を有しており、一部の患者はRING-ボックスまたはユビキチン様ドメインにミスセンス変異を有している（Hattori,N他、Biochem.  Biophys.  Res.  Commun. 249, 754-758 (1998); Hattori,N.他、Ann.Neurol. 44, 935-941(1998)）。これまで試験したこの領域に変異を有するかこの領域を欠失しているParkin構築物は全て、E3活性を欠いていたことから、Parkinによって媒介されるユビキチン化経路は、タンパク質の量を調節することによって黒質のニューロンの恒常性の維持において中枢的役割を担っていることが示される。
【００４４】
しかしながら、Parkinの機能不全が高度に選択的な神経細胞死を誘導する機構は不明である。ユビキチン化されたタンパク質が神経のSH-SY5Y細胞でParkinと同時に免疫沈降するが、胎児腎臓のHEK293細胞では免疫沈降しないという今回の知見によって、Parkinは神経細胞において選択的にタンパク質分解に関与していることが示唆される。Parkinをユビキチンリガーゼとみなす場合、標的タンパク質（図５では“Ｘ”と記載されている）及び／又はParkinによる基質認識に必須な因子が、ドーパミン作動性ニューロンにのみ存在している可能性がある。これにより、AR-JP患者の黒質細胞における“Ｘ”の異常な蓄積が特異的な神経細胞死を誘導している可能性がある。これは、Parkinがユビキチン化に関与していて、多分ユビキチンタンパク質リガーゼとして作用するという今回の知見によって説明できる可能性がある。
【００４５】
ユビキチン化タンパク質の異常な蓄積は多様な神経変性疾患においてよく生じることを示す証拠はますます増えている（Lowe,J.,他、Brain Pathol. 3, 55-65(1993); Mayer,R.他(1998), In "Ubiquitin and the Biology of the Cell" pp.429-462, Plenum Press, New York）。これらの知見は、ユビキチン／プロテアソーム経路によって仲介されるタンパク質の量の調節が多くの非分裂神経細胞において重要な役割を担っていることを示している。
本発明において、AR-JPのparkinの変異がユビキチン化の異常に関連することが初めて示された。
【００４６】
【発明の効果】
本発明により、parkinの機能の一部が解明され、若年性パーキンソニズムの新たな診断方法が提供されることになった。また、本発明によりパーキンソン病の予防及び／又は治療に有用な医薬のスクリーニング系の開発が可能になった。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ヒト胎児腎臓293細胞におけるParkinとUbcH7との会合を示すイムノブロットの結果を示す写真である。
【図２】図２ａは、Parkinの構造と実施例２で用いたParkinの人工又は天然の変異体の構造の模式図である。図２ｂは、UbcH7と各種変異Parkinとの会合を示すイムノブロットの結果を示す写真である。
【図３】図３は、ヒトドーパミン性ニューロブラストーマSH-SY5Y細胞中でMG132で処理した後における、ユビキチン化された細胞タンパク質とParkinとの会合を示すイムノブロットの結果を示す写真である。
【図４】図４は、ユビキチン化タンパク質との結合に必要なParkinのドメイン分析の結果を示すイムノブロットの結果を示す写真である。
【図５】図５は、Parkinが関与するユビキチン化経路のモデルの模式図を示す。図５において、Ubはユビキチンを示し、E1はユビキチン活性化酵素を示し、E2はユビキチン結合酵素を示し、Ublはユビキチン様ドメインを示す。“Ｘ”はユビキチン化のためにParkinのユビキチン様ドメインにより認識されると推定される標的タンパク質である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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