(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
キシロオリゴ糖分子中にウロン酸残基を有する酸性キシロオリゴ糖を含有することを特徴とするメラニン生成抑制剤。
【請求項２】
該酸性キシロオリゴ糖はキシロースの重合度が異なるオリゴ糖の混合組成物であり、キシロースの平均重合度が2.0〜3.0であることを特徴とする請求項１に記載のメラニン生成抑制剤。
【請求項３】
前記酸性キシロオリゴ糖が、「リグノセルロース材料を酵素的及び／又は物理化学的に処理してキシロオリゴ糖成分とリグニン成分の複合体を得、次いで該複合体を酸加水分解処理してキシロオリゴ糖混合物を得、得られるキシロオリゴ糖混合物から、１分子中に少なくとも１つ以上のウロン酸残基を側鎖として有するキシロオリゴ糖を分離して得たもの」であること特徴とする請求項１または請求項２に記載のメラニン生成抑制剤。
【請求項４】
ウロン酸がグルクロン酸もしくは4-O-メチル−グルクロン酸であることを特徴とする請求項１〜請求項３のいずれかに記載のメラニン生成抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、化粧品及び医薬部外品分野に於いて使用される新規なメラニン生成抑制剤に関する。より詳細には、優れた生理活性を有し、しかも安全性の高いメラニン生成抑制剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
しみ・そばかす及び日焼け後の肌への色素沈着は、加齢に伴い発生、増加、或いは消失しにくくなり、中高年齢層にとって悩みとなっている。これらの色素沈着症の発生機構は未だ解明されていないが、太陽光線、特に紫外線やメラノサイト刺激ホルモン等の作用により表皮メラノサイトのメラニン合成機構が亢進する為と考えられている。
【０００３】
また、表皮角化細胞（ケラチノサイト）の加齢に伴う角化遅延もメラニンの表皮外への排泄速度を遅延させ、メラニン合成能の亢進と合わせて、表皮内のメラニン顆粒密度の増加、即ち臨床的に色素沈着が増加する症状を発現させるものと考えられている。更に、それらの色素沈着部は局部的に存在し、周囲の正常皮膚部と明らかな差異を生ずることもある。
【０００４】
この為、上記の後天的な色素沈着部を正常な皮膚色にまで回復させる薬剤や、色素沈着を予防する薬剤（美白剤）が強く望まれており、これまでにもアスコルビン酸、グルタチオン、コロイドイオウ等が開発され、美白剤の有効成分として商品化されてきた。また、種々の薬用植物抽出物や海草抽出物、植物由来の没食子酸、ゲラニイン等を用いた例もある。近年は、コウジ酸やグルコピラノシド誘導体であるアルブチン等も美白剤成分として使用されている。かかる美白剤成分としては、メラニン生成を触媒するチロシナーゼの活性を阻害するチロシナーゼ活性阻害剤、チロシンからドーパ、ドーパキノン、ドーパクロムを経てメラニンを生成する過程の一部又は全部を阻害するメラニン生合成阻害剤、メラニンの代謝を正常化するメラニン排泄促進剤等が知られている。
【０００５】
しかしながら、アスコルビン酸は酸化されやすく不安定であり、グルタチオンやコロイドイオウは特有の異臭や沈殿を生じるという欠点がある。また、従来の薬用植物抽出物や海草抽出物は効果が不十分であったり、品質が一定しないという問題点があった。更に、コウジ酸等に於いても高濃度では安全性に問題があり、また、その安定性の維持等にも配慮しなければならなかった。その他にも、運用により副作用を生じるものもあった。
【０００６】
なお、酸性キシロオリゴ糖の生理効果に関しては、水耕栽培に於けるスギ挿穂の発根促進効果の記載（セルラーゼ研究会報第16巻2001年）があるのみで、メラニン生成抑制剤に関する開示はなされていない。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明に於いては、メラニン生成抑制効果に優れ、かつ安全性及び安定性の高いメラニン生成抑制剤及び美白剤を提供することを目的とした。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
前記課題を解決する為、培養メラニン産生細胞に於けるメラニン生成を指標として、メラニン生成抑制剤のスクリーニングを行った。その結果、ウロン酸残基が付加した酸性キシロオリゴ糖が優れたメラニン生成抑制効果を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
本発明は前記課題を解決するため、以下の構成を採用する。即ち、本発明の第１は、「キシロオリゴ糖分子中にウロン酸残基を有する酸性キシロオリゴ糖を含有することを特徴とするメラニン生成抑制剤」である。
【００１０】
本発明の第２は、前記第１発明において、該酸性キシロオリゴ糖はキシロースの重合度が異なるオリゴ糖の混合組成物であり、キシロースの平均重合度が2.0〜3.0であることを特徴とするメラニン生成抑制剤である。
【００１１】
本発明の第３は、前記第１または第２の発明において、前記酸性キシロオリゴ糖が、「リグノセルロース材料を酵素的及び／又は物理化学的に処理してキシロオリゴ糖成分とリグニン成分の複合体を得、次いで該複合体を酸加水分解処理してキシロオリゴ糖混合物を得、得られるキシロオリゴ糖混合物から、１分子中に少なくとも１つ以上のウロン酸残基を側鎖として有するキシロオリゴ糖を分離して得たもの」であること特徴とするメラニン生成抑制剤である。
【００１２】
本発明の第４は、前記第１〜第３のいずれかの発明において、ウロン酸がグルクロン酸もしくは4-O-メチル−グルクロン酸であることを特徴とするメラニン生成抑制剤である。
【００１３】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の構成について詳述する。キシロオリゴ糖とは、キシロースの２量体であるキシロビオース、３量体であるキシロトリオース、あるいは４量体〜20量体程度のキシロースの重合体を言う。本発明で使用する酸性キシロオリゴ糖とは、キシロオリゴ糖１分子中に少なくとも１つ以上のウロン酸残基を有するものを言う。
また、キシロースの重合度が異なるオリゴ糖の混合組成物であっても良い。一般的には、天然物から製造するために、このような組成物として得られることが多く、以下、主として酸性キシロオリゴ糖組成物について説明する。
該組成物は、平均重合度で示す数値は正規分布をとる酸性キシロオリゴ糖のキシロース鎖長の平均値で、2〜11が好ましく、2.0〜3.0がより好ましい。キシロース鎖長の上限と下限との差は20以下が好ましく、10以下がより好ましい。ウロン酸は天然では、ペクチン、ペクチン酸、アルギン酸、ヒアルロン酸、ヘパリン、コンドロイチン硫酸、デルタマン硫酸等の種々の生理活性を持つ多糖の構成成分として知られている。本発明におけるウロン酸としては特に限定されないが、グルクロン酸もしくは4-O-メチル−グルクロン酸が好ましい。
【００１４】
上記のような酸性キシロオリゴ糖組成物を得ることが出来れば、その製法は特に限定されないが、（１）木材からキシランを抽出し、それを酵素的に分解する方法（セルラーゼ研究会報第16巻、2001年6月14日発行、P17-26）と、（２）リグノセルロース材料を酵素的及び／又は物理化学的に処理してキシロオリゴ糖成分とリグニン成分の複合体を得、次いで該複合体を酸加水分解処理してキシロオリゴ糖混合物を得、得られるキシロオリゴ糖混合物から、１分子中に少なくとも１つ以上のウロン酸残基を側鎖として有するキシロオリゴ糖を分離する方法が挙げられる。
特に、（２）の方法が好ましく、以下にその概要を示す。
【００１５】
酸性オリゴ糖組成物は、化学パルプ由来のリグノセルロース材料を原料とし、加水分解工程、濃縮工程、希酸処理工程、精製工程を経て得ることができる。加水分解工程では、希酸処理、高温高圧の水蒸気（蒸煮・爆砕）処理もしくは、ヘミセルラーゼによってリグノセルロース中のキシランを選択的に加水分解し、キシロオリゴ糖とリグニンからなる高分子量の複合体を中間体として得る。濃縮工程では逆浸透膜等により、キシロオリゴ糖−リグニン様物質複合体が濃縮され、低重合度のオリゴ糖や低分子の夾雑物などを除去することができる。濃縮工程は逆浸透膜を用いることが好ましいが、限外濾過膜、塩析、透析などでも可能である。得られた濃縮液の希酸処理工程により、複合体からリグニン様物質が遊離し、酸性キシロオリゴ糖と中性キシロオリゴ糖を含む希酸処理液を得ることができる。この時、複合体から切り離されたリグニン様物質は酸性下で縮合し沈殿するのでセラミックフィルターや濾紙などを用いたろ過等により除去することができる。希酸処理工程では、酸による加水分解を用いることが好ましいが、リグニン分解酵素などを用いた酵素分解などでも可能である。
【００１６】
精製工程は、限外濾過工程、脱色工程、吸着工程からなる。一部のリグニン様物質は可溶性高分子として溶液中に残存するが、限外濾過工程で除去され、着色物質等の夾雑物は活性炭を用いた脱色工程によってそのほとんどが取り除かれる。限外濾過工程は限外濾過膜を用いることが好ましいが、逆浸透膜、塩析、透析などでも可能である。こうして得られた糖液中には酸性キシロオリゴ糖と中性キシロオリゴ糖が溶解している。以下のようなイオン交換樹脂を用いた吸着工程により、この糖液から酸性キシロオリゴ糖のみを取り出すことができる。
糖液をまず強陽イオン交換樹脂にて処理し、糖液中の金属イオンを除去する。ついで強陰イオン交換樹脂を用いて糖液中の硫酸イオンなどを除去する。この工程では、硫酸イオンの除去と同時に弱酸である有機酸の一部と着色成分の除去も同時に行っている。強陰イオン交換樹脂で処理された糖液はもう一度強陽イオン交換樹脂で処理し更に金属イオンを除去する。最後に弱陰イオン交換樹脂で処理し、酸性キシロオリゴ糖を樹脂に吸着させる。
【００１７】
樹脂に吸着した酸性オリゴ糖を、低濃度の塩（NaCl、CaCl2、KCl、MgCl2など）によって溶出させることにより、夾雑物を含まない酸性キシロオリゴ糖溶液を得ることができる。この溶液を、例えば、スプレードライや凍結乾燥処理により、白色の酸性キシロオリゴ糖組成物の粉末を得ることができる。
【００１８】
化学パルプ由来のリグノセルロースを原料とし、キシロオリゴ糖とリグニンからなる高分子量の複合体を中間体とした酸性キシロオリゴ糖組成物の上記製造法のメリットは、経済性とキシロースの平均重合度の高い酸性キシロオリゴ糖組成物が容易に得られる点にある。平均重合度は、例えば、希酸処理条件を調節するか、再度ヘミセルラーゼで処理することによって変えることが可能である。また、弱陰イオン交換樹脂溶出時に用いる溶出液の塩濃度を変化させることによって、１分子あたりに結合するウロン酸残基の数が異なる酸性キシロオリゴ糖組成物を得ることもできる。さらに、適当なキシラナーゼ、ヘミセルラーゼを作用させることによってウロン酸結合部位が末端に限定された酸性キシロオリゴ糖組成物を得ることも可能である。
【００１９】
このようにして得られた酸性キシロオリゴ糖組成物は、エタノール、プロパノール及びイソプロパノール等の低級アルコール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、1,3-ブチレングリコール及びグリセリン等の多価アルコール、希酸、希アルカリの水溶液等に溶解して美白剤基材に含有させる。或いは、アルコール、エステル等を含有する基材成分に直接添加、溶解して含有させることもできる。また、マイクロカプセル化やリポソームに内含させて添加してもよい。
【００２０】
本発明の酸性キシロオリゴ糖組成物の美白剤への配合量は、その効果から考え、0.001〜20％（以下全て質量％）の濃度範囲とすることが望ましい。配合量が0.001％未満であると十分な効果が得られない。また、20％を越えると美白剤の安定性等に影響を及ぼすことがある。
【００２１】
本発明の酸性キシロオリゴ糖組成物を配合した美白剤は、ローション、乳剤、クリーム、軟膏等の形態をとることが出来る。また更に、柔軟性化粧水、収れん性化粧品、洗浄用化粧水等の化粧水類、エモリエントクリーム、モイスチュアクリーム、クレンジングクリーム、メイクアップクリーム等のクリーム類、エモリエント乳液、モイスチュア乳液、ナリシング乳液、クレンジング乳液等の乳液類、ゼリー状パック、ピールオフパック、洗い流しパック、粉末パック等のパック類、美容液及び洗顔料といった種々の製剤形態の美白化粧料としても配合することが出来る。
【００２２】
本発明に於いては、更に、他の美白剤成分や、保湿剤、抗炎症剤、紫外線吸収剤等、他の有効成分を配合することも出来、日焼け止め化粧料、皮膚保護用化粧料、肌荒れ改善用化粧料等の薬用化粧料或いは医薬部外品等として提供することも出来る。
【００２３】
【実施例】
以下、本発明について実施例により詳説する。本発明はこれにより限定されるものではない。まず、各測定法の概要、本発明で有効成分として含有させた酸性キシロオリゴ糖組成物UX2の調製例１を示す。
【００２４】
＜測定法の概要＞
(1) 全糖量の定量：
全糖量は検量線をＤ−キシロース（和光純薬工業（株）製）を用いて作製し、フェノール硫酸法（還元糖の定量法、学会出版センター発行）にて定量した。
(2) 還元糖量の定量：
還元糖量は検量線をＤ−キシロース（和光純薬工業（株）製）を用いて作製、ソモジ−ネルソン法（還元糖の定量法、学会出版センター発行）にて定量した。
(3) ウロン酸量の定量：
ウロン酸は検量線をＤ−グルクロン酸（和光純薬工業（株）製）を用いて作製、カルバゾール硫酸法（還元糖の定量法、学会出版センター発行）にて定量した。
(4) 平均重合度の決定法：
サンプル糖液を50℃に保ち15000rpmにて15分遠心分離し不溶物を除去し上清液の全糖量を還元糖量（共にキシロース換算）で割って平均重合度を求めた。
(5) 酸性キシロオリゴ糖の分析方法：
オリゴ糖鎖の分布はイオンクロマトグラフ（ダイオネクス社製、分析用カラム：Ｃａｒｂｏ  Ｐａｃ  ＰＡ−１０）を用いて分析した。分離溶媒には100mMのNaOH溶液を用い、溶出溶媒には前述の分離溶媒に酢酸ナトリウムを500mMとなるように添加し、溶液比で、分離溶媒：溶出溶媒＝10：0〜4：6となるような直線勾配を組み分離した。得られたクロマトグラムより、キシロース鎖長の上限と下限との差を求めた。
(6) オリゴ糖１分子あたりのウロン酸残基数の決定法
サンプル糖液を50℃に保ち15000rpmにて15分遠心分離し不溶物を除去し上清液のウロン酸量（Ｄ−グルクロン酸換算）を還元糖量（キシロース換算）で割ってオリゴ糖１分子あたりのウロン酸残基数を求めた。
(7) 酵素力価の定義：
酵素として用いたキシラナーゼの活性測定にはカバキシラン（シグマ社製）を用いた。酵素力価の定義はキシラナーゼがキシランを分解することで得られる還元糖の還元力をＤＮＳ法（還元糖の定量法、学会出版センター発行）を用いて測定し、１分間に１マイクロモルのキシロースに相当する還元力を生成させる酵素量を１ユニットとした。
【００２５】
＜酸性キシロオリゴ糖組成物の調整例＞
＜調製例１＞
混合広葉樹チップ（国内産広葉樹70％、ユーカリ30％）を原料として、クラフト蒸解及び酸素脱リグニン工程により、酸素脱リグニンパルプスラリー（カッパー価9.6、パルプ粘度25.1cps）を得た。スラリーからパルプをろ別、洗浄した後、パルプ濃度10％、ｐＨ８に調製したパルプスラリーを用いて以下のキシラナーゼによる酵素処理を行った。
【００２６】
バチルスsp.S-2113株（独立行政法人産業技術総合研究所特許微生物寄託センター、寄託菌株FERM BP-5264）の生産するキシラナーゼを１単位／パルプｇとなるように添加した後、60℃で120分間処理した。その後、ろ過によりパルプ残渣を除去し、酵素処理液1050Lを得た。
【００２７】
次に、得られた酵素処理液を濃縮工程、希酸処理工程、精製工程の順に供した。
濃縮工程では、逆浸透膜（日東電工（株）製、RO NTR-7410）を用いて濃縮液（40倍濃縮）を調製した。希酸処理工程では、得られた濃縮液のｐＨを3.5に調整した後、121℃で60分間加熱処理し、リグニンなどの高分子夾雑物の沈殿を形成させた。さらに、この沈殿をセラミックフィルターろ過で取り除くことにより、希酸処理溶液を得た。
【００２８】
精製工程では、限外濾過・脱色工程、吸着工程の順に供した。限外濾過・脱色工程では、希酸処理溶液を限外ろ過膜（オスモニクス社製、分画分子量8000）を通過させた後、活性炭（和光純薬（株）製）770gの添加及びセラミックフィルター濾過により脱色処理液を得た。吸着工程では、脱色処理液を強陽イオン交換樹脂（三菱化学（株）製PK218）、強陰イオン交換樹脂（三菱化学（株）製PA408）、強陽イオン交換樹脂（三菱化学（株）製PK218）各100kgを充填したカラムに順次通過させた後、弱陰イオン交換樹脂（三菱化学（株）製WA30）100kgを充填したカラムに供した。この弱陰イオン交換樹脂充填カラムから75mMのNaCl溶液によって溶出した溶液をスプレードライ処理することによって、酸性キシロオリゴ糖組成物の粉末（全糖量353g、回収率13.1％）を得た。以下、この酸性キシロオリゴ糖組成物をUX10とする。前述の測定方法により、UX10は平均重合度10.3、キシロース鎖長の上限と下限との差は10、酸性キシロオリゴ糖１分子あたりウロン酸残基を１つ含む糖組成化合物であった。
【００２９】
得られたUX10の１０％水溶液100mlに、スミチームＸ50mgを添加し、60℃、20時間反応後、弱アニオン交換樹脂（WA30）10ｇを充填したカラムに供した。カラムを水洗した後、75mMのNaCl溶液によって溶出した溶液を凍結乾燥することによって、酸性キシロオリゴ糖組成物粉末（全糖量2.1g、回収率21％）を得た。以下、この酸性キシロオリゴ糖組成物をUX2とする。前述の測定方法により、UX2は平均重合度2.3、キシロース鎖長の上限と下限との差は2、酸性キシロオリゴ糖１分子あたりウロン酸残基を１つ含む糖組成化合物であった。
【００３０】
次に、得られた酸性キシロオリゴ糖組成物を用いて行ったメラニン生成抑制試験の概要と結果を実施例１に、安全性試験及び安定性試験の概要と結果を実施例２に示す。また、酸性キシロオリゴ糖組成物を含有する美白化粧品（化粧水及び軟膏）の処方と製造法を実施例３及び実施例４に示す。
【００３１】
＜実施例１＞
メラニン生成抑制試験は、マウス由来のメラニン産生細胞であるB16メラノーマ細胞（大日本製薬（株）製）を用いて実施した。以下にその概要を示す。まず、Ｂ１６メラノーマ細胞を培地（ＦＢＳ（大日本製薬（株）製）10％を含むＭＥＭダルベッコ培地（大日本製薬（株）製）、以下培地と略す）5mlを入れたフラスコに播種し、前培養（CO2濃度：5％、37℃、以下培養と略す）した。5日後、常法に従い、トリプシン処理及び遠心分離により細胞を集めた。次に、得られた細胞を、96ウエルマイクロプレートに1×103個／培地100μｌ／１ウエルになるように播種した。24時間培養後、サンプルを培地に添加し、培養を継続した。更に4日後、培養上清の420nmに於ける吸光度を測定し、下記の計算式によりメラニン生成抑制率及びＳＤ（標準偏差）を算出した。なお、各サンプルについて同試験を6ウエルずつ実施し、対照としてはコウジ酸（陽性、和光純薬工業（株）製）及び培地（陰性）を用いた。
【００３２】
メラニン生成抑制率（％）＝〔（ａ−ｂ)／ａ〕×100
ａ：サンプル無添加培養に於ける吸光度、ｂ：サンプル添加培養に於ける吸光度
【００３３】
また、上記の各ウエルを洗浄、培地交換（100μｌ）後、アラマーブルー（旭テクノグラス（株）製）を用いた常法に従って、蛍光強度を測定（励起波長：544nm、検出波長：590nm）し、下記の計算式により細胞増殖阻害率を算出した。なお、細胞増殖阻害率は細胞毒性に相当する。
【００３４】
細胞増殖阻害率（％）＝〔（ｃ−ｄ)／ｃ〕×100
ｃ：試料無添加培養における蛍光強度、ｄ：試料添加培養における蛍光強度
【００３５】
酸性キシロオリゴ糖組成物UX2のメラニン生成抑制試験の結果を表１に示す。
【表１】
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【００３６】
表１より明らかなように、酸性キシロオリゴ糖組成物UX2には顕著なメラニン生成抑制効果が認められた。また、何れの濃度でもUX2には細胞毒性はなかったが、コウジ酸の場合は0.1％以上の濃度で強い細胞毒性が認められた。細胞毒性のない濃度範囲に於けるメラニン生成抑制効果を比較すると、UX2（1％）はコウジ酸（0.05％）と同等以上の効果があると言える。
【００３７】
＜実施例２＞
安全性試験及び安定性試験は以下のように実施した。酸性キシロオリゴ糖組成物UX2の2％溶液（50％エタノール）100μｌをＣ３Ｈマウス（雄、６週齢、日本チャールズリバー（株）製）の背皮に約１ヶ月間連日塗布した結果、背皮の炎症等の副作用は観察されなかった。また、１ヶ月後の上記UX2溶液のイオンクロマトグラムに於ける変化は認められなかった。これらのことは、酸性キシロオリゴ糖組成物の高い安全性と安定性を示す。
【００３８】
＜実施例３＞
酸性キシロオリゴ糖組成物UX2を用いて、メラニン生成抑制作用を付与した下記組成の化粧水を常法にて製造した。
処方：（１）1，3−ブチレングリコール、3.0％  （２）ソルビトール、2.0％  （３）エタノール、10.0％  （４）カルボキシビニルポリマー１％水溶液、10.0％  （５）UX2、1.0％  （６）パラオキシ安息香酸メチル、0.1％  （７）香料、0.1％  （８）精製水、73.8％
製造法：（６）（７）を（３）に溶解して（８）に加え、（１）（２）（５）を順次添加して混合した後、（４）を加え、混合し、均一化した。
【００３９】
＜実施例４＞
酸性キシロオリゴ糖組成物ＵＸ２を用いて、メラニン生成抑制作用を付与した下記組成の軟膏を常法にて製造した。
処方：（１）白色ワセリン、25.0％  （２）ステアリルアルコール、15.0％  （３）ラウリル硫酸ナトリウム、1.0％  （４）パラオキシ安息香酸ブチル、0.1％（５）UX2、1.0％  （６）精製水、57.9％
製造法：（１）〜（４）の油相成分を混合し、75℃に加熱して、溶解、均一化する。７５℃に加熱した（６）に油相成分を添加して乳化し、冷却後40℃にて（５）を順次添加、混合、均一化する。
【００４０】
【発明の効果】
本発明で得られる酸性キシロオリゴ糖組成物を含有したメラニン生成抑制剤は、強い薬理活性を有しており、化粧品及び医薬部外品の成分として、肌を白くする効果が期待でき、美白剤として有用である。