(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
コリネ型細菌由来の１６ＳリボソームＲＮＡの３’末端の１〜１２番目の塩基配列と少なくとも６塩基が相補的である６〜１２塩基のｒＲＮＡ相補的塩基配列を有し、該ｒＲＮＡ相補的塩基配列の上流側に連結された、配列表の配列番号１０の第１０〜３４位の塩基配列および配列番号１２の第１０〜３５位の塩基配列から選ばれる２０塩基以上の配列をさらに有することを特徴とする、コリネ型細菌内で蛋白質を効率よく翻訳させるための組換えＤＮＡ。
【請求項２】
前記ｒＲＮＡ相補的塩基配列が、配列表の配列番号２９に示される塩基配列である、請求項１に記載のＤＮＡ。
【請求項３】
配列表の配列番号１０の第１０〜３４位の塩基配列および配列番号１２の第１０〜３５位の塩基配列から選ばれる２０塩基以上の配列が、配列表の配列番号３７に示される塩基配列である請求項１または２に記載のＤＮＡ。
【請求項４】
前記コリネ型細菌がブレビバクテリウム・フラバム (Brevibacterium flavum)ＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７）である請求項１〜３のいずれか一項に記載のＤＮＡ。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のＤＮＡを含み、前記相補的塩基配列が、発現されるべき蛋白質の翻訳開始コドンの４〜１６塩基上流に置かれているコリネ型細菌内で複製可能なプラスミド。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のＤＮＡを含み、前記相補的塩基配列に含まれるSD配列が、発現されるべき蛋白質の翻訳開始コドンの１２塩基上流に置かれているコリネ型細菌内で複製可能なプラスミド。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のＤＮＡが、発現されるべき蛋白質の翻訳開始コドンの上流に置かれていることを特徴とするコリネ型細菌内で複製可能なプラスミドを用いて、コリネ型細菌内で蛋白質を発現させる方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、コリネ型細菌において、蛋白質の翻訳を効率よく行わせるＤＮＡ配列に関する。さらに詳しくは、細胞の中でｍＲＮＡが転写された後、リボソームが結合し、蛋白質の翻訳が開始されるが、このリボソームの認識、結合をより効率的に行わせ、その結果、蛋白質の発現量を増大させるＤＮＡ配列に関するものである。また、該ＤＮＡ配列を有するプラスミドにも関する。
【０００２】
【従来の技術】
これまで、種々の有用蛋白質が微生物を用いて生産されてきており、その一般的手法については既に確立されている。しかし、個々の微生物（属）における、特定の蛋白質の効率的生産方法については改良の余地が残されている。
【０００３】
組み換えＤＮＡ技術を用いて、有用蛋白質を生産させる場合、様々の要因が、その生産性に影響を及ばす。中でも、有用蛋白質をコードする遺伝子の転写促進に関与するプロモーターと、ｍＲＮＡの、１６ＳリボソームＲＮＡの３’末端配列と相補的に結合して翻訳促進に関与するＳＤ配列が大きな要因となる。
【０００４】
蛋白質の翻訳においては、翻訳開始コドンの上流に存在するＳＤ配列と１６ＳリボソームＲＮＡの３’末端との相補性［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 71, p1342 (1974), Nucleic Acid Research, 22, p1287 (1994)］、ＳＤ配列と翻訳開始コドンとの距離［Molecular Microbiology, 6, p1219 (1992), Nucleic Acid Research, 22, p4953 (1994)］、ＳＤ配列上流の配列［Nucleic Acid Research, 14, p5481 (1986), GENE, 73, p227 (1988)］、及び、翻訳開始コドン下流の配列［EMBO J., 6, p2489 (1987)］が影響を与えることが知られている。
【０００５】
しかしながら、産業上重要なコリネ型細菌における、蛋白質の効率的な翻訳に関する配列については、本発明者等の知る限り従来の報告例はない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
上記のように、有用蛋白質を細胞内で効率的に翻訳させ、大量に発現させるためには、翻訳開始コドン周辺の配列、特に、ＳＤ配列の塩基配列、ＳＤ配列と翻訳開始コドンとの距離、ＳＤ上流の塩基配列が重要である。ところが、コリネ型細菌についての知見はなく、工業的に重要なコリネ型細菌での検討はされていない。
【０００７】
本発明は、コリネ型細菌内において、有用蛋白質の翻訳を効率的に行わせ、該蛋白質を細胞内で大量に発現させるために必要な配列の提供を目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決すべく、鋭意研究を重ねた結果、コリネ型細菌内で蛋白質の翻訳を効率的に行わせる配列を見いだした。すなわち、ＳＤ配列の改変、ＳＤ配列上流配列の改変、ＳＤ配列と翻訳開始コドンとの距離の改変により、蛋白質の翻訳を効率的に行わせる配列を見い出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、コリネ型細菌由来の１６ＳリボソームＲＮＡの３’末端の１〜１２番目の塩基配列と少なくとも６塩基が相補的である６〜１２塩基のｒＲＮＡ相補的塩基配列を有する、コリネ型細菌内で蛋白質を効率よく翻訳させるための組換えＤＮＡ（以下、本発明ＤＮＡともいう）を提供する。
【００１０】
好ましくは、本発明ＤＮＡは前記ｒＲＮＡ相補的塩基配列の上流側に連結されたＡＴ含量が７５％以上である１〜３０塩基の高ＡＴ含量塩基配列をさらに有する。高ＡＴ含量塩基配列としては、配列番号３７に示される塩基配列が挙げられる。
【００１１】
また、好ましくは、本発明ＤＮＡは、以下の工程から成る測定法で測定したときのベータガラクトシダーゼ活性が、配列番号３４に示す塩基配列のＤＮＡと同等またはそれ以上である。
(1) 大腸菌由来のベータガラクトシダーゼ遺伝子と、前記遺伝子に連結したｔａｃプロモーターと、前記ベータガラクトシダーゼ遺伝子の開始コドンとｔａｃプロモーターの間に配列番号３４に示す塩基配列のＤＮＡまたは測定対象のＤＮＡとを有するプラスミドを調製する。
(2) 前記プラスミドをブレビバクテリウム・フラバム(Brevibacterium flavum)ＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１４９７）に導入する。
(3) 導入されたブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３を培養する。
(4) 得られた培養液について、ベータガラクトシダーゼ活性を測定する。
【００１２】
このようなＤＮＡの例としては、配列番号２９〜３６及び３８〜４５に示される塩基配列が挙げられる。
本発明ＤＮＡを用いるのに好ましいコリネ型細菌は、ブレビバクテリウム・フラバム (Brevibacterium flavum)ＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１４９７）である。
【００１３】
また、本発明は、本発明ＤＮＡを含み、ｒＲＮＡ相補的塩基配列が、発現されるべき蛋白質の翻訳開始コドンの４〜１６塩基上流に置かれているコリネ型細菌内で複製可能なプラスミドを提供する。
【００１４】
かくして本発明によれば、コリネ型細菌内において、有用蛋白質の翻訳を効率的に行わせ、該蛋白質を大量に発現させるために必要なＤＮＡ及び該ＤＮＡを有するプラスミドが提供される。
【００１５】
【発明の実施の形態】
以下、本発明についてさらに詳細に説明する。
＜１＞本発明ＤＮＡ
本発明ＤＮＡは、コリネ型細菌由来の１６ＳリボソームＲＮＡの３’末端の１〜１２番目の塩基配列と少なくとも６塩基が相補的である６〜１２塩基のｒＲＮＡ相補的塩基配列を有する、コリネ型細菌内で蛋白質を効率よく翻訳させるための組換えＤＮＡである。本明細書において上記のｒＲＮＡ相補的塩基配列を有するＤＮＡとは、そのＤＮＡが転写されて生じたＲＮＡの塩基配列が１６ＳリボゾームＲＮＡの３’末端の塩基配列と相補的である塩基配列を有するＤＮＡを意味するものである。また、相補的な塩基は、その５つ以上が連続していることが好ましい。
【００１６】
ｒＲＮＡ相補的塩基配列の具体例としては、配列番号２９〜３６に示される塩基配列が挙げられる。
好ましくは、本発明ＤＮＡは前記ｒＲＮＡ相補的塩基配列の上流側に連結されたＡＴ含量が７５％以上、好ましくは８５％以上である１〜３０塩基、好ましくは２０〜３０塩基の高ＡＴ含量塩基配列をさらに有する。高ＡＴ含量塩基配列の具体例としては、配列番号３７に示される塩基配列が挙げられる。
【００１７】
本発明ＤＮＡは、配列が上記の条件を満たすように決定されれば、通常用いられるＤＮＡ合成装置、例えば、アプライド・バイオシステムズ(Applied Biosystems)社製３９４ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザーを用いて合成することができる。
【００１８】
あるいは、コリネ型細菌由来の１６ＳリボソームＲＮＡあるいは、細胞内で比較的発現量の多い種々の遺伝子上流、例えば、ｄｎａＫ、ｇｒｏＥＬ、ｄｎａＡ、ａｓｐａｒｔａｓｅ、ｓｅｃＡ等の遺伝子上流からクローニングすることもできる。その供給源となる微生物として、コリネ型細菌、例えば、ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavum) ＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１４９７）、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（Brevibacterium ammoniagenes）、ＡＴＣＣ６８７１、同ＡＴＣＣ１３７４５、同ＡＴＣＣ１３７４６、ブレビバクテリウム・デバリカタム（Brevibacterium devaricatum）ＡＴＣＣ１４０２０、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）ＡＴＣＣ１３８６９、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）ＡＴＣＣ３１８３１等を用いることができる。
【００１９】
これらの供給源微生物から本発明ＤＮＡを調製するための基本操作の一例を述べれば次のとおりである。
まず、ｄｎａＫ、ｇｒｏＥＬ、ｄｎａＡ、ａｓｐａｒｔａｓｅ、ｓｅｃＡ等の遺伝子を、上記コリネ型細菌、例えば、ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavum）ＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１４９７）株の染色体の中から、通常遺伝子を単離する方法、すなわち、ＰＣＲ、ハイブリダイゼーション、相補、等の方法で分離・取得し、目的遺伝子を含む断片を単離し、単離した断片の塩基配列を決定し、翻訳開始コドンを同定することにより、その翻訳開始コドンの上流の配列が判明する。この判明した配列に基づいて本発明ＤＮＡを合成するか、または、単離した断片から、適切な制限酵素を用いて本発明ＤＮＡを切り出すことができる。
【００２０】
本発明ＤＮＡは、発現されるべき蛋白質の翻訳開始コドンの所定塩基上流に置かれたとき、その蛋白質の翻訳を効率的に行わせる。すなわち、本発明ＤＮＡは、コリネ型細菌内で蛋白質を効率よく翻訳させる機能が高いものである。本発明ＤＮＡの機能の評価は、該ＤＮＡにより発現される下流に位置する蛋白質が活性等を有する場合には、その活性等を測定することにより行うことができる。
【００２１】
下流に位置する蛋白質としては、例えば、ベータガラクトシダーゼ遺伝子が挙げられ、該遺伝子をＡ断片の下流に連結することにより、ベータガラクトシダーゼ活性を指標にしてその翻訳効率を測定することができる。
【００２２】
例えば、本発明ＤＮＡは、以下の工程から成る測定法で測定したときのベータガラクトシダーゼ活性が、配列番号３４に示す塩基配列のＤＮＡと同等またはそれ以上となるものである。
(1) 大腸菌由来のベータガラクトシダーゼ遺伝子と、前記遺伝子に連結したｔａｃプロモーターと、前記ベータガラクトシダーゼ遺伝子の開始コドンとｔａｃプロモーターの間に配列番号３４に示す塩基配列のＤＮＡまたは測定対象のＤＮＡとを有するプラスミドを調製する。
(2) 前記プラスミドをブレビバクテリウム・フラバム(Brevibacterium flavum)ＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１４９７）に導入する。
(3) 導入されたブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３を培養する。
(4) 得られた培養液について、ベータガラクトシダーゼ活性を測定する。
【００２３】
より具体的には、本発明ＤＮＡは、以下の工程から成る測定法で測定したときに、ベータガラクトシダーゼ活性が３５０Ｕ以上となるものである。
(1) 大腸菌由来のベータガラクトシダーゼ遺伝子、前記遺伝子に連結したｔａｃプロモーター、及び、プラスミドｐｇａｌの前記ベータガラクトシダーゼ遺伝子の開始コドンとｔａｃプロモーターの間であって、開始コドンから１０塩基上流に上記ＤＮＡを有するプラスミドを調製する。
(2) 調製したプラスミドをブレビバクテリウム・フラバム(Brevibacterium flavum)ＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１４９７）に導入する。
(3) 導入されたブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３を、１０ｍｌの半合成培地〔組成：尿素２ｇ、（ＮＨ4）2ＳＯ4 ７ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4 ０. ５ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 ０．５ｇ、ＭｇＳＯ4 ０．５ｇ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ６ｍｇ、ＭｎＳＯ4・４〜６Ｈ2Ｏ ６ｍｇ、酵母エキス２. ５ｇ、カザミノ酸５ｇ、ビオチン２００μｇ、塩酸チアミン２００μｇ、及び、グルコース２０ｇを蒸留水１Ｌに溶解した〕に植菌し、３０〜３３℃で１２〜１６時間前培養を行い、この前培養の培養液を同半合成培地に２％植菌して３１℃で５時間培養する。
(4) この培養液について、ベータガラクトシダーゼ活性を、Experiments in Molecular Genetics, ed. by J.H. Miller (1977), chapter 48, p. 352-355に記載の方法により測定する。すなわち、培養液のＯＤを波長６００ｎｍで測定した後、培養液を１０〜１００μｌサンプリングし、ベータガラクトシダーゼ活性測定用バッファ〔６０ｍＭリン酸水素二ナトリウム、４０ｍＭリン酸二水素ナトリウム、１０ｍＭ塩化カリウム、１ｍＭ硫酸マグネシウム、５０ｍＭベータメルカプトエタノール、ｐＨ７．０〕を添加し、全体を１ｍｌにする。トルエンを０．１％添加し、３０秒間激しく攪拌した後、３７℃で４５分間放置し、トルエンを蒸発させる。次いで、２８℃の恒温槽に移し、５分間放置することにより、液温を反応温度に合わせる。基質であるＯＮＰＧ〔オルトニトロフェノールベータガラクトシド）溶液（ＯＮＰＧ４ｍｇを１ｍｌの１００ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．０）に溶解させたもの〕を０．２ｍｌ添加し、反応を開始させる。１〜１０分経過し、反応液に着色が認められたら、０．５ｍｌの１Ｍ炭酸ナトリウム溶液を添加し、反応を終了させる。吸光度計にて波長４２０ｎｍおよび５５０ｎｍのおける吸光度（ＯＤ）を測定し、活性を下記式により算出する。
【００２４】
【数１】
活性（Ｕ）＝（ＯＤ420−１．７５×ＯＤ550）／（測定時間（分）×ＯＤ600）×１０００
【００２５】
このようなＤＮＡの例としては、配列番号２９〜３６及び３８〜４５に示される塩基配列が挙げられる。
なお、本発明ＤＮＡは、蛋白質を効率よく翻訳すなわち発現させるために、染色体上の発現されるべき蛋白質の翻訳開始コドンの所定塩基上流に置いてもよいし、また、プラスミド上の発現されるべき蛋白質の翻訳開始コドンの所定塩基上流に置いてもよい。本発明ＤＮＡを所定位置に置くことすなわち組み込むことは、ＤＮＡ断片を染色体またはプラスミドの所望の位置に組み込むための公知の方法によって行うことができる。
【００２６】
本発明ＤＮＡは、特に、ブレビバクテリウム・フラバム (Brevibacterium flavum)ＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１４９７）において、蛋白質を効率よく翻訳させることができる。
【００２７】
本発明ＤＮＡは、二本鎖および一本鎖のいずれの形態であってもよい。
【００２８】
＜２＞本発明プラスミド
また、本発明は、本発明ＤＮＡを含み、ｒＲＮＡ相補的塩基配列が、発現されるべき蛋白質の翻訳開始コドンの４〜１６塩基上流に置かれているコリネ型細菌内で複製可能なプラスミドを提供する。なお、４〜１６塩基上流とは、本発明ＤＮＡのｒＲＮＡ相補的配列と翻訳開始コドンの間に４〜１６塩基のスペーサー塩基配列があることを意味する。
【００２９】
ＤＮＡ断片をプラスミドの所望の位置に組み込む方法は公知であり、公知の方法に従って、コリネ型細菌内で複製可能なプラスミドに、発現されるべき蛋白質の翻訳開始コドンの所定塩基対上流に本発明ＤＮＡを組み込むことによって本発明プラスミドを得ることができる。
【００３０】
コリネ型細菌内で複製可能なプラスミドには、特に制限はなく、公知のもの（例えばｐＢＹ５０１（特開昭６０−２４８１８２号公報）、ｐＢＹ５０３（特開昭６２−２５２３７９号公報）、ｐＢＬ１００（特開昭６０−１２０９９２号公報）、ｐＡＭ３３０（特開昭５８−６７６９９号公報）、ｐＢＬ１（J. Gen. Microbiol., 1984, 130, p. 2237-2246）等）を使用してもよいし、任意のプラスミドにコリネ型細菌内でのプラスミドの安定化及び複製に必要な配列を組み込むことにより作製してもよい。
【００３１】
本発明プラスミドは、コリネ型細菌に導入され、コリネ型細菌内において蛋白質が効率的に翻訳される。
【００３２】
【実施例】
以下に、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
【００３３】
【実施例１】
評価用プラスミドの作製
（Ａ）シャトルベクターの構築
米国特許５，１８５，２６２号明細書記載のプラスミドｐＣＲＹ３１内に存在する、コリネ型細菌内でのプラスミドの安定化に必要な領域の配列をもとに、下記の１対のプライマーを、アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）社製「３９４ ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザー（synthesizer ）」を用いて合成した。
【００３４】
【化１】
0003819512.tif 000002
【００３５】
実際のＰＣＲは、パーキンエルマーシータス社製の「ＤＮＡサーマルサイクラー」を用い、反応試薬として、レコンビナント・タックＤＮＡ・ポリメラーゼ・タカラ・タック（Recombinant TaqDNA Polymerase TaKaRa Taq）（宝酒造製）を用いて下記の条件で行った。
【００３６】
【表１】
反応液：
（１０×）ＰＣＲ緩衝液              １０μｌ
１．２５ｍＭ  ｄＮＴＰ混合液        １６μｌ
鋳型ＤＮＡ  ＭｇＣｌ2               １０μｌ（DNA含有量１μＭ以下）
上記記載のａ−１，ｂ−１プライマー  各々１μｌ（最終濃度０．２５μＭ）
レコンビナント・タックＤＮＡ・ポリメラーゼ  ０．５μｌ
滅菌蒸留水                          ６２．５μｌ
以上を混合し、この１００μｌの反応液をＰＣＲにかけた。
ＰＣＲサイクル：
デナチュレーション過程：９４℃    ６０秒
アニーリング過程      ：５２℃    ６０秒
エクステンション過程  ：７２℃  １２０秒
以上を１サイクルとし、２５サイクル行った。
【００３７】
上記で生成した反応液１０μｌを０．８％アガロースゲルにより電気泳動を行い、約１．１ｋｂのＤＮＡ断片が検出できた。
上記で増幅産物を確認できた反応終了液１０μｌ、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ＋ １μｌを各々制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩで完全に切断し、７０℃で１０分間処理することにより制限酵素を失活させた後、両者を混合し、これに、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ（１０×）緩衝液１μｌ、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ１Ｕの各成分を添加し、滅菌蒸留水で１０μｌにして、１５℃で３時間反応させ、結合させた。
【００３８】
得られたプラスミド混液を用い、塩化カルシウム法〔Journal of Molecular  Biology，５３，１５９（１９７０）〕によりエシェリヒア・コリＪＭ１０９（宝酒造製）を形質転換し、アンピシリン５０ｍｇを含む培地〔トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ及び寒天１６ｇを蒸留水１Ｌに溶解〕に塗抹した。
【００３９】
この培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドを抽出し、該プラスミドを制限酵素（ＥｃｏＲＩ，ＸｈｏＩ）により切断し、挿入断片を確認した。この結果、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ＋の長さ３．０ｋｂのＤＮＡ断片に加え、長さ１．１ｋｂの挿入ＤＮＡ断片が認められた。本プラスミドをｐＢＳｐａｒと命名した。
【００４０】
さらに、米国特許５，１８５，２６２号明細書記載のプラスミドｐＣＲＹ３１内に存在する、コリネ型細菌内でのプラスミドの複製に必要な領域の配列をもとに、下記の１対のプライマーを、アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）社製「３９４ ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザー（synthesizer）」を用いて合成した。
【００４１】
【化２】
0003819512.tif 000003
【００４２】
実際のＰＣＲは、パーキンエルマーシータス社製の「ＤＮＡサーマルサイクラー」を用い、反応試薬として、レコンビナント・タックＤＮＡ・ポリメラーゼ・タカラ・タック（Recombinant TaqDNA Polymerase TaKaRa Taq）（宝酒造製）を用いて下記の条件で行った。
【００４３】
【表２】
反応液：
（１０×）ＰＣＲ緩衝液              １０μｌ
１．２５ｍＭ  ｄＮＴＰ混合液        １６μｌ
鋳型ＤＮＡ  ＭｇＣｌ2               １０μｌ（DNA 含有量１μＭ以下）
上記記載のａ−２，ｂ−２プライマー  各々１μｌ（最終濃度０．２５μＭ）
レコンビナント・タックＤＮＡ・ポリメラーゼ    ０．５μｌ
滅菌蒸留水                          ６２．５μｌ
以上を混合し、この１００μｌの反応液をＰＣＲにかけた。
ＰＣＲサイクル：
デナチュレーション過程：９４℃    ６０秒
アニーリング過程      ：５２℃    ６０秒
エクステンション過程  ：７２℃  １２０秒
以上を１サイクルとし、２５サイクル行った。
【００４４】
上記で生成した反応液１０μｌを０．８％アガロースゲルにより電気泳動を行い、約１．８ｋｂのＤＮＡ断片が検出できた。
上記で増幅産物を確認できた反応終了液１０μｌ、プラスミドｐＢＳｐａｒ  １μｌを各々制限酵素ＸｈｏＩ及びＫｐｎＩで完全に切断し、７０℃で１０分処理することにより制限酵素を失活させた後、両者を混合し、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ(１０×）緩衝液１μｌ、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ１Ｕの各成分を添加し、滅菌蒸留水で１０μｌにして、１５℃で３時間反応させ、結合させた。
【００４５】
得られたプラスミド混液を用い、塩化カルシウム法〔Journal of Molecular  Biology，５３，１５９（１９７０）〕によりエシェリヒア・コリＪＭ１０９（宝酒造製）を形質転換し、アンピシリン５０ｍｇを含む培地〔トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ及び寒天１６ｇを蒸留水１Ｌに溶解〕に塗抹した。
【００４６】
この培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドを抽出し、該プラスミドを制限酵素（ＸｈｏＩ，ＫｐｎＩ）により切断し、挿入断片を確認した。この結果、プラスミドｐＢＳｐａｒの長さ４．１ｋｂのＤＮＡ断片に加え、長さ１．８ｋｂの挿入ＤＮＡ断片が認められた。本プラスミドをｐＢＳｐａｒ−ｒｅｐと命名した。
【００４７】
上記で作製したプラスミドｐＢＳｐａｒ−ｒｅｐ １μｌ、ｐＨＳＧ２９８（宝酒造社製）１μｌを各々制限酵素ＫｐｎＩ及びＥｃｏＲＩで完全に切断し、７０℃で１０分処理させることにより制限酵素を失活させた後、両者を混合し、これに、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ１０×緩衝液１μｌ、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ１Ｕの各成分を添加し、滅菌蒸留水で１０μｌにして、１５℃で３時間反応させ、結合させた。
【００４８】
得られたプラスミド混液を用い、塩化カルシウム法〔Journal of Molecular  Biology，５３，１５９（１９７０）〕によりエシェリヒア・コリＪＭ１０９（宝酒造製）を形質転換し、カナマイシン５０ｍｇを含む培地〔トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ及び寒天１６ｇを蒸留水１Ｌに溶解〕に塗抹した。
【００４９】
この培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドを抽出し、該プラスミドを制限酵素により切断し、挿入断片を確認した。この結果、プラスミドｐＨＳＧ２９８の長さ２．６ｋｂのＤＮＡ断片に加え、長さ２．９ｋｂの挿入ＤＮＡ断片が認められた。本プラスミドをｐＨＳＧ２９８ｐａｒ−ｒｅｐと命名した。
【００５０】
（Ｂ）ｔａｃプロモーターの挿入
ｔａｃプロモーターを含有するプラスミドｐＴｒｃ９９Ａ（ファルマシア社製）を鋳型としたＰＣＲ法により、ｔａｃプロモーター断片を増幅させるべく、下記の１対のプライマーを、アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）社製「３９４ ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザー（synthesizer）」を用いて合成した。
【００５１】
【化３】
0003819512.tif 000004
【００５２】
実際のＰＣＲは、パーキンエルマーシータス社製の「ＤＮＡサーマルサイクラー」を用い、反応試薬として、レコンビナント・タックＤＮＡ・ポリメラーゼ・タカラ・タック（Recombinant TaqDNA Polymerase TaKaRa Taq）（宝酒造製）を用いて下記の条件で行った。
【００５３】
【表３】
反応液：
（１０×）ＰＣＲ緩衝液              １０μｌ
１．２５ｍＭ  ｄＮＴＰ混合液        １６μｌ
鋳型ＤＮＡ  ＭｇＣｌ2               １０μｌ（DNA含有量１μＭ以下）
上記記載のａ−３，ｂ−３プライマー  各々１μｌ（最終濃度０．２５μＭ）
レコンビナント・タックＤＮＡ・ポリメラーゼ    ０．５μｌ
滅菌蒸留水                          ６２．５μｌ
以上を混合し、この１００μｌの反応液をＰＣＲにかけた。
ＰＣＲサイクル：
デナチュレーション過程：９４℃    ６０秒
アニーリング過程      ：５２℃    ６０秒
エクステンション過程  ：７２℃  １２０秒
以上を１サイクルとし、２５サイクル行った。
【００５４】
上記で生成した反応液１０μｌを３％アガロースゲルにより電気泳動を行い、約１００ｂｐのＤＮＡ断片が検出できた。
上記で増幅産物を確認できた反応液１０μｌ、上記（Ａ）で作製したプラスミドｐＨＳＧ２９８ｐａｒ−ｒｅｐ ５μｌを各々制限酵素ＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩで完全に切断し、７０℃で１０分処理することにより制限酵素を失活させた後、両者を混合し、これに、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ１０×緩衝液１μｌ、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ１Ｕの各成分を添加し、滅菌蒸留水で１０μｌにして、１５℃で３時間反応させ、結合させた。
【００５５】
得られたプラスミド混液を用い、塩化カルシウム法〔Journal of Molecular  Biology，５３，１５９（１９７０）〕によりエシェリヒア・コリＪＭ１０９（宝酒造製）を形質転換し、カナマイシン５０ｍｇを含む培地〔トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ及び寒天１６ｇを蒸留水１Ｌに溶解〕に塗抹した。
【００５６】
この培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドを抽出し、該プラスミドを制限酵素により切断し、挿入断片を確認した。この結果、上記（Ａ）で作製したプラスミドの長さ５．５ｋｂのＤＮＡ断片に加え、長さ０．１ｋｂの挿入ＤＮＡ断片が認められた。このプラスミドをｐＨＳＧ２９８ｔａｃと命名した。
【００５７】
（Ｃ）ベータガラクトシダーゼ遺伝子の挿入
大腸菌由来のベータガラクトシダーゼ遺伝子（lacZ）の配列は決定されており［EMBO Journal, 2, 593 (1983)］、この遺伝子部分をＰＣＲ法により増幅させ、上記（Ｂ）で作製したプラスミドｐＨＳＧ２９８ｔａｃに挿入し、評価用プラスミドを作製した。
【００５８】
下記の１対のプライマーを、アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）社製「３９４  ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザー（synthesizer ）」を用いて合成した。
【００５９】
【化４】
0003819512.tif 000005
【００６０】
実際のＰＣＲは、パーキンエルマーシータス社製の「ＤＮＡサーマルサイクラー」を用い、反応試薬として、レコンビナント・タックＤＮＡ・ポリメラーゼ・タカラ・タック（Recombinant TaqDNA Polymerase TaKaRa Taq）（宝酒造製）を用いて下記の条件で行った。
【００６１】
【表４】
反応液：
（１０×）ＰＣＲ緩衝液              １０μｌ
１．２５ｍＭ  ｄＮＴＰ混合液        １６μｌ
鋳型ＤＮＡ  ＭｇＣｌ2               １０μｌ（DNA 含有量１μＭ以下）
上記記載のａ−４，ｂ−４プライマー  各々１μｌ（最終濃度０．２５μＭ）
レコンビナント・タックＤＮＡ・ポリメラーゼ    ０．５μｌ
滅菌蒸留水                          ６２．５μｌ
以上を混合し、この１００μｌの反応液をＰＣＲにかけた。
ＰＣＲサイクル：
デナチュレーション過程：９４℃    ６０秒
アニーリング過程      ：５２℃    ６０秒
エクステンション過程  ：７２℃  １２０秒
以上を１サイクルとし、２５サイクル行った。
【００６２】
上記で生成した反応液１０μｌを０．８％アガロースゲルにより電気泳動を行い、約３．１ｋｂのＤＮＡ断片が検出できた。
上記で増幅産物を確認できた反応終了液１０μｌ、上記（Ｂ）で作製したプラスミド溶液５μｌを各々制限酵素ＰａｃＩ及びＢａｍＨＩで完全に切断し、７０℃で１０分処理することにより制限酵素を失活させた後、両者を混合し、これに、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ１０×緩衝液１μｌ、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ１Ｕの各成分を添加し、滅菌蒸留水で１０μｌにして、１５℃で３時間反応させ、結合させた。
【００６３】
得られたプラスミド混液を用い、塩化カルシウム法〔Journal of Molecular  Biology、５３、１５９（１９７０）〕によりエシェリヒア・コリＪＭ１０９（宝酒造製）を形質転換し、カナマイシン５０ｍｇを含む培地〔トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ及び寒天１６ｇを蒸留水１Ｌに溶解〕に塗抹した。
【００６４】
この培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドを抽出し、該プラスミドを制限酵素（ＰａｃＩ，ＢａｍＨＩ）により切断し、挿入断片を確認した。この結果、上記（Ｂ）で作製したプラスミドの長さ５．６ｋｂのＤＮＡ断片に加え、長さ３．１ｋｂの挿入ＤＮＡ断片が認められた。
【００６５】
このプラスミドをｐｇａｌと命名した。
【００６６】
【実施例２】
Ａ断片の評価
（Ａ）ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３由来のＡ断片の単離
微生物細胞内含量の多い蛋白質、または多いと考えられる蛋白質をコードする遺伝子を単離することにより、コリネ型細菌内で蛋白質を効率よく翻訳させるために必要なＤＮＡ（Ａ断片）を単離することができる。
【００６７】
特開平５−３０９７７号公報、特開平７−１０７９８１号公報等に記載の方法に従い、変異株を用いた相補、ＰＣＲ法、ハイブリダイゼーション法等により、ａｓｐＡ、ｓｅｃＡ等の遺伝子を単離し、目的の遺伝子のＯＲＦの配列を決定した。さらに、該ＯＲＦの上流の配列を決定することにより、Ａ断片の配列を決定した。配列決定した配列を配列番号２９〜３７に記載する。
【００６８】
（Ｂ）  Ａ断片の合成
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３から単離したＡ断片の配列に基づき、アプライド・バイオシステムズ(Applied Biosystems)社製３９４ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザーを用いて合成した。
【００６９】
また、人工的にデザインしたＡ断片、すなわち、単離した以外の配列のＳＤ配列、ＳＤ配列と翻訳開始コドンとの距離を変化させた配列、ＳＤ配列上流を改変した配列を種々合成した。
【００７０】
合成した配列は以下の（あ）〜（う）の通りである（配列番号１〜２０）。
（あ）単離した遺伝子上流の配列に基づいて合成した配列
【００７１】
【化５】
0003819512.tif 000006
【００７２】
（い）ＳＤ配列上流に新しい配列を付加して合成した配列
【００７３】
【化６】
0003819512.tif 000007
【００７４】
（う）ＳＤ配列と翻訳開始コドンとの距離を変化させて合成した配列
【００７５】
【化７】
0003819512.tif 000008
【００７６】
（Ｃ）  Ａ断片のｐｇａｌへの挿入
合成した、配列番号１〜２０の配列と相補的なＤＮＡをさらに合成し、各々アニーリングを行い２本鎖ＤＮＡを作製した。
【００７７】
２本鎖ＤＮＡ溶液１０μｌ、上記実施例２（Ｃ）で作製したプラスミドｐｇａｌの溶液５μｌを各々制限酵素ＰａｃＩ及びＢｇｌＩＩで完全に切断し、７０℃で１０分処理することにより制限酵素を失活させた後、両者を混合し、これに、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ１０×緩衝液１μｌ、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ１Ｕの各成分を添加し、滅菌蒸留水で１０μｌにして、１５℃で３時間反応させ、結合させた。
【００７８】
得られたプラスミド混液を用い、塩化カルシウム法〔Journal of Molecular  Biology，５３，１５９（１９７０）〕によりエシェリヒア・コリＪＭ１０９（宝酒造製）を形質転換し、カナマイシン５０ｍｇを含む培地〔トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ及び寒天１６ｇを蒸留水１Ｌに溶解〕に塗抹した。
【００７９】
この培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドを抽出し、通常の方法に従い、ベータガラクトシダーゼ遺伝子上流の配列を確認することにより、挿入断片を確認した。
【００８０】
これらのプラスミドを順次ｐｇａｌ−１〜ｐｇａｌ−２０と命名した。
【００８１】
（Ｄ）  Ａ断片の評価
実施例２（Ｃ）で作製したプラスミドを米国特許５，１８５，２６２号明細書に記載の方法に従って、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ
ＢＰ−１４９７）に導入した。
【００８２】
形質転換されたブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３菌体を、白金耳にて１０ｍｌの半合成培地のＡ培地〔組成：尿素２ｇ、（ＮＨ4）2ＳＯ4 ７ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4 ０. ５ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 ０．５ｇ、ＭｇＳＯ4 ０．５ｇ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ６ｍｇ、ＭｎＳＯ4・４〜６Ｈ2Ｏ ６ｍｇ、酵母エキス２. ５ｇ、カザミノ酸５ｇ、ビオチン２００μｇ、塩酸チアミン２００μｇ、及び、グルコース２０ｇを蒸留水１Ｌに溶解した〕に植菌し、３０〜３３℃で１２〜１６時間振とう培養（前培養）した。次にＡ培地１００ｍｌに前培養液を２％植菌し、３１℃で５時間振とうして対数増殖期中期まで培養した。この培養液を用いて、ベータガラクトシダーゼ活性の測定を行った。
【００８３】
ベータガラクトシダーゼ活性の測定は通常の方法［Experiments in Molecular Genetics, ed. by Jeffrey H. Miller (1977), chapter 48, Assay of β-galactosidase］に従って行った。具体的には、以下のようにして行った。
【００８４】
培養液のＯＤを波長６００ｎｍで測定した後、培養液を１０〜１００μｌサンプリングし、ベータガラクトシダーゼ活性測定用バッファ〔６０ｍＭリン酸水素二ナトリウム、４０ｍＭリン酸二水素ナトリウム、１０ｍＭ塩化カリウム、１ｍＭ硫酸マグネシウム、５０ｍＭベータメルカプトエタノール、ｐＨ７．０〕を添加し、全体を１ｍｌにした。
【００８５】
トルエンを０．１％添加し、３０秒間激しく攪拌した後、３７℃で４５分間放置し、トルエンを蒸発させた。次いで、２８℃の恒温槽に移し、５分間放置することにより、液温を反応温度に合わせた。
【００８６】
基質であるＯＮＰＧ（オルトニトロフェノールベータガラクトシド）溶液〔ＯＮＰＧ４ｍｇを１ｍｌの１００ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．０）に溶解させたもの〕を０．２ｍｌ添加し、反応を開始させた。１〜１０分経過し、反応液に着色が認められた後、０．５ｍｌの１Ｍ炭酸ナトリウム溶液を添加し、反応を終了させた。
【００８７】
吸光度計にて波長４２０ｎｍおよび５５０ｎｍのおける吸光度（ＯＤ）を測定し、活性を下記式により算出した。
【００８８】
【数２】
活性（Ｕ）＝（ＯＤ420−１．７５×ＯＤ550）／（測定時間（分）×ＯＤ600）×１０００
【００８９】
下記表５に示したとおり、１６ＳリボソームＲＮＡの３’末端と相補的な配列に相当する領域の評価を行ったところ、その中心部分ＧＧＡＧＧの保存性が高いものは、配列番号９に比較して、活性の高いことが判明した。
【００９０】
【表５】
表５  ベータガラクトシダーゼ活性
────────────────────────────────────
プラスミド          評価に用いた配列        ガラクトシダーゼ活性（Ｕ）
────────────────────────────────────
ｐｇａｌ−１            配列番号１                    １１００
ｐｇａｌ−２            配列番号２                      ４５０
ｐｇａｌ−３            配列番号３                      ５００
ｐｇａｌ−４            配列番号４                      ５００
ｐｇａｌ−５            配列番号５                      ４００
ｐｇａｌ−６            配列番号６                      ３５０
ｐｇａｌ−７            配列番号７                      ６５０
ｐｇａｌ−８            配列番号８                      ６００
ｐｇａｌ−９            配列番号９                        ３０
────────────────────────────────────
【００９１】
次に、１６ＳリボソームＲＮＡの３’末端と相補的な配列上流の配列の影響を調べたところ、表６に示したとおり、ＡＴに富む配列を付加した場合に、活性が上昇することが判明した。
【００９２】
【表６】
表６  ベータガラクトシダーゼ活性
────────────────────────────────────
プラスミド          評価に用いた配列        ガラクトシダーゼ活性（Ｕ）
────────────────────────────────────
ｐｇａｌ−１            配列番号１                    １１００
ｐｇａｌ−２            配列番号２                      ４５０
ｐｇａｌ−１０          配列番号１０                  １７００
ｐｇａｌ−１１          配列番号１１                  １０００
ｐｇａｌ−１２          配列番号１２                  ２０００
ｐｇａｌ−１３          配列番号１３                  １３００
────────────────────────────────────
【００９３】
１６ＳリボソームＲＮＡの３'末端と相補的な配列に含まれるSD配列と翻訳開始コドンとの距離を変化させたところ、表７に示したとおり、８ｂｐから１４ｂｐの場合、特に１２ｂｐの場合、活性の上昇が観察できた。
【００９４】
【表７】
表７  ベータガラクトシダーゼ活性
────────────────────────────────────
プラスミド          評価に用いた配列        ガラクトシダーゼ活性（Ｕ）
────────────────────────────────────
ｐｇａｌ−１４          配列番号１４                  １１００
ｐｇａｌ−１３          配列番号１３                  １３００
ｐｇａｌ−１５          配列番号１５                  １８００
ｐｇａｌ−１６          配列番号１６                    ９００
ｐｇａｌ−１７          配列番号１７                    ４００
ｐｇａｌ−１８          配列番号１８                  １８００
ｐｇａｌ−１２          配列番号１２                  ２０００
ｐｇａｌ−１９          配列番号１９                  ２５００
ｐｇａｌ−２０          配列番号２０                  １６００
────────────────────────────────────
【００９５】
【発明の効果】
本発明によれば、ＳＤ配列の改良、ＳＤ配列上流配列の改良、ＳＤ配列と翻訳開始コドンとの距離の改良により、蛋白質の翻訳を効率的に行わせ、細胞内で大量に発現させることが可能になる。
【００９６】
【配列表】
0003819512.tif 000009
【００９７】
0003819512.tif 000010
【００９８】
0003819512.tif 000011
【００９９】
0003819512.tif 000012
【０１００】
0003819512.tif 000013
【０１０１】
0003819512.tif 000014
【０１０２】
0003819512.tif 000015
【０１０３】
0003819512.tif 000016
【０１０４】
0003819512.tif 000017
【０１０５】
0003819512.tif 000018
【０１０６】
0003819512.tif 000019
【０１０７】
0003819512.tif 000020
【０１０８】
0003819512.tif 000021
【０１０９】
0003819512.tif 000022
【０１１０】
0003819512.tif 000023
【０１１１】
0003819512.tif 000024
【０１１２】
0003819512.tif 000025
【０１１３】
0003819512.tif 000026
【０１１４】
0003819512.tif 000027
【０１１５】
0003819512.tif 000028
【０１１６】
0003819512.tif 000029
【０１１７】
0003819512.tif 000030
【０１１８】
0003819512.tif 000031
【０１１９】
0003819512.tif 000032
【０１２０】
0003819512.tif 000033
【０１２１】
0003819512.tif 000034
【０１２２】
0003819512.tif 000035
【０１２３】
0003819512.tif 000036
【０１２４】
0003819512.tif 000037
【０１２５】
0003819512.tif 000038
【０１２６】
0003819512.tif 000039
【０１２７】
0003819512.tif 000040
【０１２８】
0003819512.tif 000041
【０１２９】
0003819512.tif 000042
【０１３０】
0003819512.tif 000043
【０１３１】
0003819512.tif 000044
【０１３２】
0003819512.tif 000045
【０１３３】
0003819512.tif 000046
【０１３４】
0003819512.tif 000047
【０１３５】
0003819512.tif 000048
【０１３６】
0003819512.tif 000049
【０１３７】
0003819512.tif 000050
【０１３８】
0003819512.tif 000051
【０１３９】
0003819512.tif 000052
【０１４０】
0003819512.tif 000053