(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式１の合成ハプテンを用いて得られたハイブリドーマ３Ｄ１１、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２９３により産生されるモノクローナル抗体と式２の合成ハプテンを用いて得られた受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２９２のハイブリドーマ１０Ｃ９により産生されるモノクローナル抗体とを組み合わせたものからなることを特徴とする請求項２に記載のシガトキシン類検出サンドイッチ測定キット。
【化１】
0003820519.tif 000013
【化２】
0003820519.tif 000014
ＲはＨまたメチル基である。
【請求項２】
組み合わせるモノクローナル抗体の一方のモノクローナル抗体が標識化したものであることを特徴とする請求項１に記載のシガトキシン類検出サンドイッチ測定キット。
【請求項３】
標識化合物が酵素標識体であることを特徴とする請求項２に記載のサンドイッチ測定キット。
【請求項４】
前記請求項１に記載の式１で表される新規化合物。
【請求項５】
前記式１で表される新規化合物のシガトキシン類を認識するモノクローナル抗体を産生させるハイブリドーマを得るための合成ハプテンとしての使用。
【請求項６】
式３で表される合成ハプテンとキャリヤータンパクとの反応生成物で免疫して得られるシガトキシン類と特異的に反応するモノクローナル抗体。
【化３】
0003820519.tif 000015
式３中、ｎは１以上の整数である
【請求項７】
合成ハプテンとキャリヤータンパクとの反応生成物におけるキャリヤータンパクが牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、キーホールリムペットヘモシアニン（keyhole limpet hemocyanine,ＫＬＭ）またはオボアルブミン（egg albumin、ＯＶＡ）であることを特徴とする請求項６のモノクローナル抗体。
【請求項８】
受託番号ＦＥＲＭ  ＰＢ−８２９３として受託されたシガトキシン類と特異的に反応するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ３Ｄ１１。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、被検出非タンパク高分子化合物を構成する分子内の部分構造から誘導される複数の合成ハプテンを利用して得られる前記被検出非タンパク高分子化合物に特異的に結合する複数のモノクローナル抗体、特にシガトキシン類と特異的に反応するモノクローナル抗体、に標識化合物、例えば酵素標識化合物を結合した標識モノクローナル抗体とシガトキシン類と特異的に反応する前記モノクローナル抗体とは別のモノクローナル抗体である非標識モノクローナル抗体とを組み合わせたシガトキシン類、特にシガトキシンＣＴＸ３Ｃの検出に有用なサンドイッチ測定キットに関する。また、前記標識モノクローナル抗体を得るモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ、該ハイブリドーマを作製するのに用いられる合成ハプテンおよび当該合成ハプテンとキャリヤータンパク質とから得られた当該ハイブリドーマを作製するのに用いられる免疫用化合物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
免疫的手法を用いて、海毒、特にシガトキシン類（ＣＴＸ）を調査する研究は、ラジオイムノアッセイの発展に伴って１９７７年頃から始まった。
シガテラ毒は、天然からごく微量しか採集されず（８５０匹、４ｔの毒ウツボから毒本体のシガトキシンは僅か０．３５ｍｇ）、培養による生産も困難なことが抗体調製の障害となっている。ハワイ大学ホカマらは、貴重な毒本体シガトキシン（１μｇ）をヒト血清アルブミンにカルボジイミド法で連結したコンジュゲートを作製、これを抗原としてマウスに免疫、モノクローナル抗体を調製した（Ｔｏｘｉｃｏｎ 第１５巻、(1977 年)、第317頁）。この抗体は、シガトキシンに結合するが、オカダ酸とも強い交差活性を示し、その親和性の差は５倍程度しかない（Journal of Clinical Laboratory Analysis第6巻、(1992 年)、第54頁）。また、ブレベトキシン、マイトトキシン、パリトキシン等にも交差活性を示すことが分かっているが（Journal of AOAC International第81巻、(1998 年)、第727頁）、詳しいデータは発表されていない。このホカマらの抗体を用いて、シガトキシン類に汚染された魚類を免疫的手法により検出するため試薬、キット(Cigua Check TM)などが開発されている。
【０００３】
本発明者らは、初期にはシガトキシンの左側ＡＢＣ環部を化学合成し、これを合成ハプテンとしたタンパクコンジュゲートを用いて、三種のモノクローナル抗体を調製しているが、これらはいずれもシガトキシンに非常に弱いアフィニティーしか示さなかった（Synthesis (1999年)、第1431頁） 。また、他のグループも、合成ハプテン（ＪＫＬＭ環部）のコンジュゲートの免疫を試みているが、モノクローナル抗体の調製には至っていないようである〔Toxicon第38巻(2000年) 第６６９頁〕。このような状況の中で、本発明者らは、更に、シガトキシン類の右末端の部分構造であるＩＪＫＬＭ環部を含む合成ハプテンを設計、合成し、この合成ハプテンのタンパクコンジュゲートでマウスを免疫する工程を含む方法により前記受託番号ＦＥＲＭ  ＰＢ−８２９３のハイブリドーマを作りだし、当該ハイブリドーマを用いてシガトキシン類に特異性の高いモノクローナル抗体を調製することに成功した。そして、該モノクローナル抗体を３Ｄ１１（独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターの受託日、平成１４年３月５日、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１８７５０。平成１５年２月１３日に前記原寄託よりブタペスト条約に基づく寄託への移管申請により受託番号ＦＥＲＭ  ＰＢ−８２９３として受託された。）と命名した。該モノクローナル抗体のシガトキシンＣＴＸ３Ｃに対しての結合解離定数(Ｋｄ)は、１２２ｎＭであった。また、シガトキシンに構造の類似した海産ポリエーテル系毒素と前記抗体の交差活性を測定したところ、赤潮毒ブレベトキシン類と交差活性が確認されたが、この交差活性は、シガトキシン類との結合と比べると３５０分の１以下の非常に弱いものであることを見出した。
【０００４】
また、シガトキシン類のモノクローナル抗体を得ることを目的とする合成ハプテンとして、シガトキシンのＡＢＣ環部のＣ16位にカルボン酸リンカーを導入した誘導体とキャリヤープロテインであるＢＳＡまたはＫＬＨとからコンジュゲート化合物を合成し、これをＲＩＢＩアジュパント中に乳化し、５匹のＢａｌｂ／ｃマウスに３週間間隔で４回注射して免疫し、該マウスから脾臓を取り出し、該脾臓細胞をミエローマ細胞（Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３）と融合し、前記抗体を得、前記抗体の前記合成ハプテンに対する反応特異性を評価している〔Synthesis 1999,No.SI.1431-1436 ISSN 0039-7881,〕。すなわち、シガトキシン類、特にシガトキシンＣＴＸ３Ｃの部分構造を用いて、免疫化学的な手法でシガトキシン類（ＣＴＸ）を調査するのに有用なモノクローナル抗体を製造するのに有用な合成シガトキシン類の環部の一部を用いた合成ハプテンの検討がなされている。
【０００５】
本発明者らは、前記検討に対し更にシガトキシン類に対しての親和性を更に向上させたモノクローナル抗体を得ることができる合成ハプテンを設計してシガトキシンＣＴＸ３Ｃの左末端の部分構造であるＡＢＣＤＥ環部を含む化合物をハプテンとして設計、合成し、この合成ハプテンのタンパクコンジュゲートでマウスを免疫する工程を含む方法により前記受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２９２のハイブリドーマ１０Ｃ９（独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターの受託日、平成１４年３月５日、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１８７４９。平成１５年２月１３日に前記原寄託よりブタペスト条約に基づく寄託への移管申請により受託番号ＦＥＲＭ  ＰＢ−８２９２として受託された。）を作りだし、当該ハイブリドーマを用いてシガトキシン類に特異性の高いモノクローナル抗体を調製することに成功した。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、基本的には、前記本発明者らが開発した前記２つのモノクローナル抗体を組み合わせて、検出特性をより改善したサンドイッチ法によりシガトキシン類を検出するキットを提供することである。
また、前記キットを得るためのモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ、該ハイブリドーマを得るために有用な合成ハプテン、該合成ハプテンとキャリヤータンパクとを結合させた前記モノクローナル抗体を産生させるハイブリドーマを得るのに有用な合成ハプテン−タンパクコンジュゲートを提供することである。
特に、前記２つのモノクローナル抗体の一方にサンドイッチ法に有用な標識体を結合して有用なサンドイッチ法キットを得るべく検討し、シガトキシンＣＴＸ３Ｃを構成するＩＪＫＬＭ環を持つ合成ハプテンを用いて得られたモノクローナル抗体に酵素標識体を結合することによりサンドイッチ法に有用なキットが得られることを発見し、前記課題を解決することができた。
更に、前記検討の中で、被検出化合物を、該被検出化合物構成する分子内の部分構造から誘導される複数の合成ハプテンを利用して得られる前記被検出非タンパク化合物に特異的に結合する複数のモノクローナル抗体を組み合わせたサンドイッチ測定キットとすることにより、擬陽性を顕著に減少できることを確認し、前記サンドイッチ測定キットの技術思想を確立するに至った。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明の第１は、（１）請求項１に記載の式１の合成ハプテンを用いて得られた受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２９３のハイブリドーマ３Ｄ１１により産生されるモノクローナル抗体と請求項１に記載の式２の合成ハプテンを用いて得られた受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２９２のハイブリドーマ１０Ｃ９により産生されるモノクローナル抗体とを組み合わせたものからなることを特徴とするシガトキシン類検出サンドイッチ測定キットである。好ましくは、（２）前記組み合わせるモノクローナル抗体の一方のモノクローナル抗体が標識化したものであることを特徴とするシガトキシン類検出サンドイッチ測定キットであり、より好ましくは、（３）標識化合物が酵素標識体であることを特徴とする前記サンドイッチ測定キットである。また、非標識モノクローナル抗体がプレートに吸着されていることを特徴とする前記サンドイッチ測定キットである。
【０００８】
本発明の第２は、（４）請求項１に記載の式１で表される新規化合物である。本発明の第３は、（５）請求項１に記載の式１で表される新規化合物のシガトキシン類を認識するモノクローナル抗体を産生させるハイブリドーマを得るための合成ハプテンとしての使用である。
【０００９】
本発明の第４は、（６）請求項６に記載の式３の合成ハプテンとキャリヤータンパクとの反応生成物で免疫して得られるシガトキシン類と特異的に反応するモノクローナル抗体であり、好ましくは、（７）前記合成ハプテンとキャリヤータンパクとの反応生成物におけるキャリヤータンパクが牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、キーホールリムペットヘモシアニン（keyhole limpet hemocyanine,ＫＬＭ）またはオボアルブミン（egg albumin、ＯＶＡ）であることを特徴とする前記モノクローナル抗体である。
【００１０】
本発明の第５は、（８）受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２９３として受託されたシガトキシン類と特異的に反応する前記各モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマである。
【００１１】
【本発明の実施の態様】
本発明をより詳細に説明する。
Ａ．環境、食物などに微量に存在化合物の検出、特に精度の良い検出手法の確立は安全な社会生活に強く要求されている。本発明の被検出非タンパク化合物を構成する分子内の部分構造から誘導される複数の合成ハプテンを利用して得られる前記被検出非タンパク化合物に特異的に結合する複数のモノクローナル抗体を組み合わせて前記被検出非タンパク化合物検出するサンドイッチ測定方法の確立は、高精度の検出を提供するものである点で革新的な技術である。
Ｂ．本発明の請求項１に記載の式１の合成ハプテンに含まれる化合物３、３’（反応式１に記載。）は下記の反応式１によって得られる。反応式１の出発化合物１は公知である〔文献；Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．２００１，３８１−３８２．〕。化合物２は、２０ｍＬナス型フラスコに化合物１（７．８ｍｇ、１１μｍｏｌ）、酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）（１００μＬ）、メタノール（３００μＬ）、Ｐｄ（ＯＨ）２(２０％、カーボン上: １．１ｍｇ、１１μｍｏｌ) を加えた。水素雰囲気下（肉厚風船を使用）、室温で ３時間攪拌した。酢酸エチルで希釈してから、セライトで濾過した。濾液を濃縮し、化合物２（６．２ｍｇ，１３μｍｏｌ）を定量的に得た。
【００１２】
化合物３および３‘の混合物は、２０ｍＬナス型フラスコに化合物２(4.2 mg, 9.0 μmol),ＣＨ2Ｃｌ2(300 μＬ), （ＭｅＯ）2ＣＨＣＨ2ＣＯ2Ｍｅ(25 μＬ, 180 μmol), ＴｓＯＨ・Ｈ2Ｏ(0.5 mg, 3 μmol) を加えた。室温で１．５時間攪拌した後、トルエン(1 ｍＬ) を加えて、ロータリーエバポレーターで減圧（120 mbar/hPa）し、1時間後に大気圧に戻した。酢酸エチルで希釈してから、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、水、飽和食塩水で洗い、無水硫酸マグネシウムで乾燥、ろ過、濃縮した。シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して、アセタール位に関してのジアステレオマー混合物 (３：３’＝３：１) を(4.7 mg, 8.5 μmol, 94%)得た。化合物３および３’混合物の物性を表１に示す。
【００１３】
【表１】
0003820519.tif 000002
【００１４】
【化４】
0003820519.tif 000003
【００１５】
Ｃ、タンパク質コンジュゲートの調製までを反応式２に示す。
化合物３，３’〜化合物４，４’の合成；
２０ｍＬナス型フラスコに化合物３，３’(4.7 mg, 8.5 μmol)、ｔ−ＢｕＯＨ(0.5 mL)、水 (125μL)、ＬｉＯＨ・Ｈ2Ｏ(2.8 mg, 68 μmol) を加えて、室温で1時間撹拌した。ＫＨＳＯ4(18.6 mg, 136 μmol) を加え、溶液のｐＨ（3-４程度）を確認した後、酢酸エチル (10 mL) で希釈した。無水硫酸マグネシウムで乾燥、ろ過、濃縮し、粗化合物４，４’を得た。これにＤＭＦ(200 μL)、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド (9.7 mg, 85μmol)、 ＥＤＣ・ＨＣｌ(8.1 mg, 43 μmol) を加えて、室温で１２時間攪拌した。反応溶液を酢酸エチル(10 ml)で希釈し、有機層を水で３回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥、濃縮し、活性化エステルである化合物６，６’を得た。これにＤＭＦ(100 μL) を加えた溶液を作製し、コンジュゲートの調製に使用した。
【００１６】
ＫＬＨコンジュゲートの調製
ＫＬＨ(7.0  mg)のPBS buffer 溶液 (2.0 ml)に活性化エステルである化合物６，６’(約4.2 μmol) のＤＭＦ溶液(50 μL) を加えて１０分間撹拌した。一日静置した後、４℃で透析した。この後、１４、１９時間後にＰＢＳバッファー(700 mL) を交換し、２８時間後に透析膜からエッペンドルフチューブに移し換えて、−７８℃で保存した。
【００１７】
ＢＳＡコンジュゲートの調製
ＢＳＡ (7.0 mg) のＰＢＳバッファー溶液 (2.0 mL) に活性化エステルである化合物６，６’(約4.2 μmol) のＤＭＦ溶液(50 μL)を加えて１０分間撹拌した。一日静置した後、４℃で透析した。この後、１４、１９時間後にＰＢＳバッファー(700 mL) を交換し、２８時間後に透析膜からエッペンドルフチューブに移し換えて、−７８℃で保存した。
【００１８】
【化５】
0003820519.tif 000004
【００１９】
（Ｐｒはキャリヤータンパク。ｎは１以上の整数）
【００２０】
ハプテン価の解析
透析して得た ＢＳＡコンジュゲートを、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳで質量分析した。ＢＳＡコンジュゲートの平均分子量は約７１８００であった（ＢＳＡの分子量約６６４００）。ハプテンの分子量が (５４０) であるので、ＢＳＡコンジュゲートには平均１０個（化合物６．６’においてｎの平均値）のハプテンが連結されていることが分かった。
【００２１】
Ｄ、モノクローナル抗体調製；
前項で得たＩＪＫＬＭ−ＫＬＨ（100μg）にＲＩＢＩアジュバンド（ＲＩＢＩ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Res. Inst.社製）を加え、良く攪拌してエマルジョンとしたのち、これをＢａｌｂ／ｃマウス（５匹）に二週間毎に三回、腹腔内投与した。初回免疫から３５日目にマウスの血清を採取し、ＩＪＫＬＭ−ＢＳＡ（式４）を用い、ＥＬＩＳＡ法で血清の抗体価を滴定した。
【００２２】
【化６】
0003820519.tif 000005
【００２３】
E、ＥＬＩＳＡ法による抗体価の測定；
９６ウエルＥＬＩＳＡ用プレート（ファルコン社製、3910）の各ウエルに50 μＬの ＩＪＫＬＭ−ＢＳＡ溶液を入れ、室温で２時間放置後、４℃で一晩放置して、プレートにコンジュゲートを吸着させた。プレートをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ〔PBS バッファー に５％ Ｔｗｅｅｎ ２０(和光純薬製 ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート（Sorbitan Monolaurate）、ICI社、商標Tween 20 相当品 No. 167-11515、を含むもの〕で３回洗浄後、ＭＩＬＬＩ−Ｑ水で一度洗浄し、吸着しなかったコンジュゲートを除去した。ハイブリドーマ培養上清（もしくは抗血清、精製抗体溶液）を加え、室温で１時間放置後、PBS-Tweenと、ＭＩＬＬＩ−Ｑ水で順次洗浄した。50μＬの 酵素標識二次抗体（ヤギ抗マウスIgG−西洋わさびペルオキシダーゼ：ＨＲＰ）（ＺＹＭＥＤ社製、62-6520  1000倍希釈）を各ウエルに入れ、室温で１時間放置後、PBS-Tweenと、ＭＩＬＬＩ−Ｑ水で順次洗浄した。100μＬの基質溶液〔基質溶液の組成: １，２−フェニレンジアミン（1,2-phenylenediamine）4.0 mg、過酸化水素水 10 μＬ、0.1Ｍ クエン酸バッファー (pH 5.0) 10 ml〕を加え、５分間呈色反応を進行させた後、２規定 硫酸（50 μＬ）で反応を停止した。マイクロプレート吸光度測定装置（ＢＩＯ−ＲＡＤ, Benchmark 170-6850）を用いて、４５０ｎｍの吸光度を測定し、陽性のクローンを判別した。
【００２４】
血清中の抗体価の測定；
ＩＪＫＬＭ−ＢＳＡ溶液を吸着した９６ウエルＥＬＩＳＡ用プレートの最上段に、５０μＬのＰＢＳバッファーを入れた。２００倍に希釈したマウスの抗血清(50 μＬ) を最上段のウエル(Ａ１)に加え、この溶液を順次２倍希釈した（縦列Ａ１−Ａ８に４００倍から５１，２００倍の希釈系列を作製）。プレートを室温で１時間放置後、上述の方法で４５０ｎｍの吸光度を測定した。血清希釈率の対数（横軸）と吸光度をプロット（ＯＤ、縦軸）すると、シグモイド状の滴定曲線となり、血清濃度依存的に、血清中の抗体がＩＪＫＬＭ−ＢＳＡコンジュゲートと結合することが分かった。また、ＡＢＣ−ＢＳＡとはほとんど結合しないことを確認した。
【００２５】
５匹の中で、最も高い抗体価を示したマウスに、腹腔内にＩＪＫＬＭ−ＫＬＨ（100 μg）を追加免疫し、３日後に脾臓を摘出した。脾臓に付着している組織や臓器の断片をピンセットで取り除いた後、基本培地〔RPMI Medium 1640 (GIBCO 社製、一袋)、炭酸水素ナトリウム2 g, ペニシリン-ストレプトマイシン（GIBCO 社製）20 mg, 200 mM-グルタミン２０mLを蒸留水に溶かして１０００mＬとしてｐＨを７．２に調製したもの〕入りのシャーレに移し、ピンセットで脾臓内の細胞を浮遊させた。脾細胞浮遊液を濾過後、５０mL遠心管に移した。さらに、基本培地１５ｍＬを加え、良くピペッティングして濾過し、全量を３０ｍＬとした。８００回転／分で５分間、室温で遠心分離し、上清を除去、タッピングした。ＨＴ・ＢＣ培地［牛胎児血清（ＦＣＳ）200 ｍＬ, ＨＴ（コスモバイオ社製ＨＴ液（５０倍濃縮）２０ｍＬ,ＢＣ（Bioresearch island社製 BriClone）５０ｍＬ, 基本培地７３０ ｍＬを混合したもの）を３０ｍＬ加え、細胞を浮遊させた。
【００２６】
ハイブリドーマの調製；
冷凍庫から（−１３０℃）からミエローマ細胞〔Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８．５６３（大日本製薬社製）〕の凍結したチューブを取り出し、３７℃恒温槽中で速やかに解凍した。チューブをアルコール綿でよく消毒したのち、チューブ内の細胞浮遊液を基本培地３０ｍＬに移した。８００回転／分で５分間、室温で遠心分離し、上清を除去した。タッピング後、１０ＦＣＳ培地(基本培地に１０％のＦＣＳを添加)を１０ｍＬ加え、細胞を浮遊させ、５０ｍＬ培養フラスコに移した。フラスコの栓をゆるめ、炭酸ガス培養装置にいれた。１?２日毎に継代し、２５０ｍＬフラスコ２本分（９０-１００ｍＬ）にした。
【００２７】
マウスから取り出した脾細胞（２ｘ１０8個）とミエローマ細胞（5ｘ１０7個）を混合し、遠心（８００回転／分、５分間、室温）し、上清を除去、タッピングした。この後、ＥＣＦバッファー〔マンニトール 45.5 g, 10 mＭ 塩化カルシウム（10 mＬ）, 10 mＭ 塩化マグネシウム（10 mL）, 20 mＭ トリスバッファー〔トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン〕 ｐＨ７．２を蒸留水で溶かして、1000 mlにしたもの〕 を３０ｍＬを加え、遠心（８００回転／分、５分間、室温）、上清除去、タッピングする操作を２回繰り返した後、ＥＣＦバッファー(4.8 mＬ) を加えた。これを６ウエルプレート（ＳＵＭＩＲＯＮ製）に、１．２ｍＬずつ分注し、島津社製 ＳＳＨ−１０細胞融合装置を用い、以下の条件で細胞融合した〔電極間距離:1.0 mm; 交流周波数: 1 MHz; 交流初期印加電圧: 80 V; 交流初期印加時間: 10 s; パルス幅: 40 μｓ; パルス電圧: 920 V; パルス電界強度: 2.30 kV/cm; 交流２次印加電圧: 80 V; パルス印加間隔: 1.0 s; 印加パルス数: 1; パルス電圧変化: +0 V; 交流最終印加時間: 10 s; 交流電圧減衰率: 0%; 接触強化: off〕。
【００２８】
前記調製したハイブリドーマ細胞を、各ウエルにＨＡＴ培地（選択培地）〔基本培地110 ml, FCS 30 ml, BC 7.5 ml, HAT（コスモバイオ社製 HAT液（50 倍濃縮）を混合したもの）100μＬを加えた９６ウエルプレート１０枚に移した。２週間後、ハプテンとしたＩＪＫＬＭ環部に結合する抗体を産生するハイブリドーマをＩＪＫＬＭ−ＢＳＡを用い、ＥＬＩＳＡ法でスクリーニングした。陽性のウエルを選択し、２回クローニング後に、再度ＥＬＩＳＡ陽性となった抗体を産生するクローンを順次培養し、それぞれ約２００ mＬまで増殖させた。この結果、ＩＪＫＬＭ−ＫＬＭを免疫原として、３種のモノクローナル抗体、すなわち、IＭ（ＩからＭの環を持つことを意味する）−３Ｄ１１（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１８７５０として独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに受託され、平成１５年２月１３日に前記原寄託よりブタペスト条約に基づく寄託への移管申請により受託番号ＦＥＲＭ  ＰＢ−８２９３として受託されたハイブリドーマにより産生された抗体。抗体名を前記受託ハイブリドーマを識別する表示と同一にした。）、ＩＭ−２Ｃ７およびＩＭ−８Ｂ１２を調製することができた。得られたモノクローナル抗体の結合試験をＥＬＩＳＡ法で検討した。抗原として、シガトキシン類の部分構造、すなわちＡＢＣ、ＡＢＣＤ、Ａ＊ＢＣ(Ａ環部がシガトキシン型のものを意味する)、およびＩＪＫＬＭ環構造を連結したＢＳＡコンジュゲートを用いた。その結果、ＩＪＫＬＭ 環部親和性の高い抗体として、ＩｇＧ抗体ＩＭ−３Ｄ１１を選別した。ＩＪＫＬＭに対する解離定数Ｋｄは８．６ｎＭであった（測定法については後述する。）。
【００２９】
抗体の精製及びサブクラスの決定
上清を抗マウスＩｇＧ、ＩｇＭアフィニティーカラム（ＮＧＦ Industries, Ltd.社製）で精製した（結合用リン酸バッファー（pH 7.0）、溶出用バッファー（0.2 M Glycine-HCl, pH 2.5）。精製した抗体をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウムーポリアクリルアミドゲル電気泳動）で分析し、＞９５％の純度であることを確認した。ＰＩＥＲＣＥ社製タイピングキット（37501）を用いて、それそれの抗体のサブクラスを決定した。
【００３０】
抗体の親和性解析（競争阻害実験）
次に、前記選別した３種のモノクローナル抗体を精製し、ハプテンとの解離定数(Ｋｄ)を求めた。ＥＬＩＳＡ用プレート（Ａ１からＡ１２ウエル）に順次２倍希釈した競合阻害剤（ＰＢＳ溶液 各30 μＬ）の溶液を調製した。これに抗体溶液(30 μＬ)を加え、室温で２時間放置した。抗体と阻害剤の混合溶液５０μＬを、ハプテン−ＢＳＡ溶液を吸着した９６ウエルＥＬＩＳＡ用プレート（抗体の親和性解析参照）に加え、室温で２０分間放置した。プレートを洗浄後、吸光度を測定し、滴定曲線を得た。Ｆｒｉｇｕｅｔらの方法［Journal of Immunological Method, 第77巻（1985年）, 第305 頁］を参考に、Ｋｌｏｔｚプロットして得られた直線の傾きから阻害剤のＫｄ値を求めた。この結果、IＭ−３Ｄ１１はＩＪＫＬＭ 環部（ＩＭ）（式５）にかなり高い親和性（Ｋｄ＝ 8.6 nM）を示すことが分かった。
【００３１】
【化７】
0003820519.tif 000006
【００３２】
この結果をふまえ、上述の競争阻害の実験系を利用して毒本体ＣＴＸ３Ｃとの結合試験を検討した。ＩＭ−３Ｄ１１はＣＴＸ３Ｃに強く結合した（Ｋｄ＝１２２ｎＭ）。さらに、ＩＭ−３Ｄ１１については、構造の類似した海産ポリエーテル毒素との結合試験を検討したところ、オカダ酸や、マイトトキシンとはほとんど結合しなかった。赤潮毒ブレベトキシン類とは交差活性を検出したが、ＣＴＸ３Ｃとの親和性と比べると、３５０分の１程度（ＢＴＸＡ:Ｋｄ＝４３μＭ）の非常に弱いものであることが分かった。
【００３３】
３Ｄ１１抗体の酵素標識法〔3D11-ＨＲＰ（西洋わさびペルオキシダーゼ）；の合成〕（サンドイッチ法用）
３Ｄ１１抗体のＨＲＰ標識はPierce社のEZ-Link（商標名）Plus Activated Peroxidase and Kitを用い、Pierce社説明書に従って行った。３Ｄ１１抗体(1mg) のcarbonate-bicarbonate buffer溶液 (1 mL)に1mgのEZ-Link Plus Activated Peroxidaseの水溶液(100 μL)を加え、室温で1時間反応させた。10 μLのReductant solution（ＮａＢＨ3ＣＮが主成分）を反応混合液へ加え、１５分間室温で反応させた。２０ mLのクエンチバッファー（Quench Buffer）を加え、得られた溶液を室温で１５分間静置した。反応液は１ＬＰＢＳで３回透析後、１ｍＬのグリセロールを加え、−２０℃で保存した。
標識体としては、周知のものを使用できる。
【００３４】
シガトキシンのＡ〜Ｅ（ＡＥと略称する場合もある）の環構造をもつ前記標識モノクローナル抗体と組み合わせるモノクローナル抗体の調製（この技術は、本出願と同日付けにて特許出願した）の説明；
１．合成ハプテンとなる前記式２（請求項３）のジアステレオマー混合物の合成。
下記の工程１により得られる。
【００３５】
【化８】
0003820519.tif 000007
【００３６】
化合物７のＯＨをベンジル基（Ｂｎ）保護基で保護した化合物の合成方法は、M. Maruyama et al,Heterocycles,2001,54,93-99,に記載されている。化合物１は前記文献２に記載の化合物のＢｎをＤＤＱ（2,3-ジクロロ-5,6-ジシアノ-1,4-ベンゾキノン）を用いて脱保護することにより得られる。化合物１のアルコール(4.0 mg,6.0 μmol)をＴＨＦ（テトラヒドロフラン）(2 ｍＬ)に溶かし、室温でテトラブチルアンモニウムフルオリド (ＴＢＡＦ,１Ｍ ＴＨＦ溶液：１８μL,１８μmol)を加えた。３０分後、反応溶液を濃縮して、シリカゲルクロマトグラフィーで精製し、化合物８(2.5 mg, 5.9 μmol,９８％)を得た。
【００３７】
２０ｍＬナス型フラスコに化合物８(2.8 mg, 6.6 μmol),ＣＨ2Ｃｌ2(300 μL), （ＭｅＯ）2ＣＨＣＨ2ＣＯＯＭｅ(１０μl,７０ μmol), ＴｓＯＨ・Ｈ2Ｏ(0.5 mg, 3 μmol) を加えた。室温で１．５時間攪拌した後、トルエン(1 ｍＬ) を加えて、ロータリーエバポレーターで減圧（120 mbar/hPa）し、１時間後に大気圧に戻した。シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して、アセタール位に関してのジアステレオマー混合物 (式２の上の化合物：下の化合物＝２：１) を(1.9 mg, 3.8 μmol, 57%) 得た。式２の化合物の物性を表２に示す。
【００３８】
【表２】
0003820519.tif 000008
【００３９】
式１及び式２のＲをＨにした化合物９は、式２の化合物をＬｉＯＨで処理して得られる。工程においてＬがスクシンイミドの化合物４は工程２で得られる。
【００４０】
【化９】
0003820519.tif 000009
【００４１】
２０mLナシ型フラスコに式１及び式２の化合物(2.5 mg, 4.9 μmol)、ｔ−ＢｕＯＨ(0.5 mL)、水 (125 μL)、ＬｉＯＨ・Ｈ2Ｏ(2.8 mg, 68 μmol) を加えて、室温で１時間撹拌した。ＫＨＳＯ4(18.6 mg, 136 μmol) を加え、溶液のｐＨ（3-４程度）を確認した後、酢酸エチル (40 mL) で希釈した。無水硫酸マグネシウムで乾燥、ろ過、濃縮し、粗化合物８を得た。これにＤＭＦ(ＤＭＦ＝Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、２００μL)、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド (5.6 mg, 49 μmol)、ＥＤＣ−ＨＣｌ (ＥＤＣ＝1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド、4.8 mg, 25 μmol) を加えて、室温で１２時間攪拌した。反応溶液を酢酸エチル(40 mL)で希釈し、有機層を水で３回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥、濃縮し、活性化エステルである化合物９を得た。これにＤＭＦ(100 μL) を加えた溶液を作製し、コンジュゲートの調製に使用した。
【００４２】
２．タンパクコンジュケートの製造。
ＫＬＨコンジュゲートの調製；
ＫＬＨ(5.0  mg)のＰＢＳバッファー溶液 (1.0 mL)に活性化エステルである化合物９(約2.4 μmol) の ＤＭＦ溶液(50 μL) を加えて１０分間撹拌した。一日静置した後、４℃で透析した。この後、５．９時間後にＰＢＳバッファー(700 mL)を交換し、１２時間後に透析膜からエッペンドルフチューブに移し換えて、−７８℃で保存した。
【００４３】
ＢＳＡコンジュゲートの調製；
ＢＳＡ(7.0  ｍｇ) のＰＢＳバッファー溶液 (2.0 ｍＬ) に活性化エステルである化合物９(約2.4 μmol) のＤＭＦ溶液 (50 μL) を加えて１０分間撹拌した。一日静置した後、４℃で透析した。この後、５．９時間後にＰＢＳバッファー (700 ｍＬ) を交換し、１２時間後に透析膜からエッペンドルフチューブに移し換えて、−７８℃で保存した。
【００４４】
３．ハプテン価の解析
透析して得た ＢＳＡコンジュゲートを、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳで質量分析した。ＢＳＡコンジュゲートの平均分子量は約７０２００であった（ＢＳＡの分子量約66400）。ハプテン部分の分子量が（４７６）であるので、ＢＳＡコンジュゲートには平均８個のハプテンが連結されていることが分かった。
【００４５】
４．モノクローナル抗体（非標識抗体として用いる）の作製；
前項で得たＡＢＣＤＥ−ＫＬＨ(100μg）にＲＩＢＩアジュバンド（RIBI Immunol. Res. Inst.社製）を加え、良く攪拌してエマルジョンとしたのち、これをＢａｌｂ／ｃマウス（５匹）に二週間毎に３回、腹腔内投与した。初回免疫から３９日目にマウスの血清を採取し、ＡＢＣＤＥ−ＢＳＡを用い、ＥＬＩＳＡ法で血清の抗体価を滴定した。
【００４６】
ＥＬＩＳＡ法；
９６ウエルＥＬＩＳＡ用プレート（ファルコン社製、3910）の各ウエルに５０ μＬの ABCDE−ＢＳＡ溶液を入れ、室温で２時間放置後、４℃で一晩放置して、プレートにコンジュゲートを吸着させた。プレートをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ〔ＰＢＳバッファーに５％Ｔｗｅｅｎ ２０〔和光純薬製 ポリオキシエチレン（polyoxyethylene） (２０) ソルビタン モノラウレート（Sorbitan Monolaurate）ＩＣＩ社  商標Ｔｗｅｅｎ−２０ 相当品 No. 167-11515〕〕を含むもの〕で３回洗浄後、ＭＩＬＬＩ-Ｑ水（Millipore 社製の複数段階の樹脂やフィルターを用いて、精製水を脱イオン化もの）で一度洗浄し、吸着しなかったコンジュゲートを除去した。ハイブリドーマ培養上清（もしくは抗血清、精製抗体溶液）を加え、室温で１時間放置後、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎと、ＭＩＬＬＩ-Ｑ水で順次洗浄した。５０μＬの 酵素標識二次抗体（ヤギ抗マウスＩｇＧ−西洋わさびペルオキシダーゼ）（ＺＹＭＥＤ社製、62-6520  1000倍希釈）を各ウエルに入れ、室温で１時間放置後、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎと、ＭＩＬＬＩ-Ｑ水で順次洗浄した。１００μＬの基質溶液 〔基質溶液の組成: 1,2-phenylenediamine 4.0 mg、過酸化水素水 10 μＬ、０．１Ｍ クエン酸 バッファー(pH 5.0) 10 ml〕を加え、５分間呈色反応を進行させた後、２規定 硫酸（50 μl）で反応を停止した。マイクロプレート吸光度測定装置（ＢＩＯ−ＲＡＤ,Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ 170-6850）を用いて、４５０ｎｍの吸光度を測定し、陽性のクローンを判別した。
【００４７】
血清中の抗体価の測定
ハプテン（ＡＢＣＤＥあるいはＩＪＫＬＭ）−ＢＳＡ溶液を吸着した９６ウエルＥＬＩＳＡ用プレートの最上段に、５０μＬのＰＢＳバッファーを入れた。２００倍に希釈したマウスの抗血清(５０μl) を最上段のウエル(Ａ１)に加え、この溶液を順次２倍希釈した（縦列Ａ１−Ａ８に４００倍から５１，０００倍の希釈系列を作製）。プレートを室温で１時間放置後、上述の方法で４５０ｎｍの吸光度を測定した（図２参照）。血清希釈率の対数と吸光度をプロットすると、血清濃度依存的に、血清中の抗体が ＡＢＣＤＥ−ＢＳＡコンジュゲートと結合することが分かった。
【００４８】
５．抗体価の高いマウスからの脾臓の摘出、培養
５匹の中で、最も高い抗体価を示したマウスに、腹腔内にＡＢＣＤＥ−ＫＬＨ（100 μg）を追加免疫し、３日後に脾臓を摘出した。脾臓に付着している組織や臓器の断片をピンセットで取り除いた後、基本培地〔ＲＰＭＩ Ｍｅｄｉｕｍ 1640 (GIBCO 社製、一袋、炭酸水素ナトリウム２g, ペニシリン-ストレプトマイシン（GIBCO 社製）20 mg, 200 mM-グルタミン２０ｍＬを蒸留水に溶かして1000ｍＬとしてｐＨを7.2に調製したもの〕入りのシャーレに移し、ピンセットで脾臓内の細胞を浮遊させた。脾細胞浮遊液を濾過後、５０ｍＬ遠心管に移した。さらに、基本培地１５ｍＬを加え、良くピペッティングして濾過し、全量を３０ｍＬとした。８００回転／分で５分間、室温で遠心分離し、上清を除去、タッピングした。ＨＴ・ＢＣ培地〔牛胎児血清（FCS）200 ml,ＨＴコスモバイオ社製ＨＴ液（５０倍濃縮）２０ｍＬ、ＢＣ（Bioresearch island社製 BriClone）５０ｍＬ,
基本培地 ７３０ｍＬを混合したもの〕を３０mＬ加え、細胞を浮遊させた。
【００４９】
冷凍庫から（−１３０℃）からミエローマ細胞Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３（大日本製薬社製）を凍結したチューブを取り出し、３７℃恒温槽中で速やかに解凍した。チューブをアルコール綿でよく消毒したのち、チューブ内の細胞浮遊液を基本培地３０ｍＬに移した。８００ｒｐｍ（回転／分）で５分間、室温で遠心分離し、上清を除去した。タッピング後、１０％ＦＣＳ(基本培地に１０％のFCSを添加)を１０ｍＬ加え、細胞を浮遊させ、５０ｍＬ培養フラスコに移した。フラスコの栓をゆるめ、炭酸ガス培養装置にいれた。１−２日毎に継代し、２５０ｍＬフラスコ２本分（９０−１００ｍＬ）にした。
【００５０】
マウスから取り出した脾細胞（２ｘ１０8個）とミエローマ細胞（5ｘ１０7個）を混合し、遠心（８００回転／分、５分間、室温）し、上清を除去、タッピングした。この後、ＥＣＦバッファー〔マンニトール 45.5 g, 10 mM 塩化カルシウム（10 ｍＬ）、１０ｍＭ塩化マグネシウム（１０ｍＬ）、２０ｍＭ ＴｒｉｓバッファーｐＨ7.2を蒸留水で溶かして、1000ｍＬにしたもの〕 を３０ｍＬを加え、遠心（８００回転／分、５分間、室温）、上清除去、タッピングする操作を２回繰り返した後、ＥＣＦバッファー(4.8ｍＬ) を加えた。これを６ウエルプレート（ＳＵＭＩＲＯＮ製）に、１．２ｍＬずつ分注し、島津社製ＳＳＨ−１０細胞融合装置を用い、以下の条件で細胞融合した〔［電極間距離:１．０ｍｍ; 交流周波数: 1 ＭＨｚ; 交流初期印加電圧: ８０Ｖ; 交流初期印加時間:１０秒（s）; パルス幅:４０（マイクロ秒（μｓ）; パルス電圧:９２０Ｖ; パルス電界強度:２．３０ｋＶ／ｃｍ; 交流２次印加電圧:８０Ｖ; パルス印加間隔:１．０秒;印加パルス数: １; パルス電圧変化:＋０Ｖ; 交流最終印加時間:１０秒; 交流電圧減衰率:０％; 接触強化:ｏｆｆ〕。
【００５１】
調製したハイブリドーマ細胞を、各ウエルにＨＡＴ培地 [HAT-RPMI 1640, 20% FCS, 5% Briclone (BioResearch Ireland社製)含有] １００μＬを加えた９６ウエルプレート１０枚に移した。２週間後、ハプテンとしたＡＢＣＤＥ環部に結合する抗体を産生するハイブリドーマ１０Ｃ９（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１８７４９とて独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに受託された。受託日平成１４年３月５日。平成１５年２月１３日に前記原寄託よりブタペスト条約に基づく寄託への移管申請により受託番号ＦＥＲＭ  ＰＢ−８２９２として受託された。）をＡＢＣＤＥ−ＢＳＡを用い、ＥＬＩＳＡ法でスクリーニングした。陽性のウエルを選択し、２ 回クローニング後に、再度ＥＬＩＳＡ陽性となった抗体を産生するモノクローンを順次培養し、それぞれ約２００ｍＬまで増殖させた。この結果、６種のモノクローナル抗体を調製することができた。得られたモノクローナル抗体の結合試験をＥＬＩＳＡ法で検討した。抗原として、シガトキシン類の部分構造を連結したＢＳＡコンジュゲートを用いた。その結果（表３）、ＡＢＣＤＥ−ＫＬＨ環部を免疫して得られたＩｇＧ抗体は、ＡＢＣＤＥ−ＢＳＡ（化学式ＡＥ−ＢＳＡ）へ強く結合し、IＪＫＬＭ−ＢＳＡ（化合物１０）とは結合しないことがわかった。
【００５２】
【化１０】
0003820519.tif 000010
【００５３】
【表３】
0003820519.tif 000011
【００５４】
【化１１】
0003820519.tif 000012
【００５５】
サンドイッチ検定法
Ｃｏａｓｔｅｒ社ＥＬＩＳＡ Ｐｌａｔｅ（83590）に１０Ｃ９のＰＢＳ溶液 (4.3 μg/mL)を５０μＬ/ウエル入れ、４℃で一晩静置した。溶液を捨て、１％スキム  ミルク入りＰＢＳを加えて(400 μL/ウエル)室温で１時間静置した。溶液を廃棄後、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３回洗浄した後(200 μL/ウエル) 、ＣＴＸ３Ｃの希釈溶液を入れ(50 μL/ウエル)１時間静置した。溶液を廃棄後、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３回洗浄した(200 μL/ウエル)。３Ｄ１１−ＨＲＰのＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ溶液( 1 μg/mL, 50 μL/ウエル)を加え、室温で１時間静置した。溶液を廃棄して、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３回洗浄した(200 μL/ウエル)後、ＯＰＤ溶液(100 μL/ウエル、Sigma社FAST（商標名）ｏ−PHENYLENE DIAMINE DIHYDROCHLORIDE TABLET SETSを使用)を加えて、室温にて５−１０分発色させた。２規定硫酸水溶液(50μL/ウエル)を加えて反応を停止させ、吸光度(450ｎｍ)をBio-Rad社製Microplate Reader Benchmarkにて測定した。測定結果を図１に示す。
【００５６】
【発明の効果】
以上述べたように、本発明において設計した合成ハプテン(ＩＪＫＬＭ環部)、および合成ハプテン(ＡＢＣＤＥ環部)を用いて得られたモノクローナル抗体の組み合わせたサンドイッチＥＬＩＳＡ法を用いることにより、シガトキシンを高感度で検定できることを見出した。従来の、１種の抗体のサンプルへの結合を指標とするシガテラ毒検定キットにおいては、しばしば、陽性となっても夾雑物に結合し陽性となった擬陽性のケースを避けることができなかった。従来技術ではそのことの判別も不可能であったので、本発明の測定キットの提供は、社会生活の向上に資すること顕著である。被検出非タンパク化合物に対する２つの抗体を組み合わせたサンドイッチ式検定法は、本発明により初めて確立したものであり、特に、シガトキシンＣＴＸ３Ｃの特異性の高い検出方法を確立した点において優れた効果をもたらしたものである。
【００５７】
本明細書で使用の一部の略号表
BSA: bovine serum albumin
CTX: ciguatoxin
ELISA: enzyme linked immunosorbent assay
HRP: Horseradish Peroxidase (西洋わさびペルオキシダーゼ)
O.D.: Optical Density
OPD: o-Phenylene Diamine
PBS: Phosphate Buffered Saline
Bn: benzyl
DDQ: 2,3-dichloro-5,6-dicyano-1,4-benzoquinone
EDC；1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride
FCS: fetal calf serum
Ig: Immunoglobulin
KLH: keyhole limpet hemocyanine
TBAF: tetra-n-butylammonium fluoride
Ts: p-tolenesulfonyl
THF: tetrahydrofuran
OVA: ovalbumin
【図面の簡単な説明】
【図１】  本発明のサンドイッチ法によるＣＴＸ３Ｃの検出特性
【図２】  １−５はシガトキシンのＡ〜Ｅ環部を含むＢＳＡとのコンジュゲートＡＥ−ＢＳＡに対する抗体価、（１）−（５）はシガトキシンのＩ〜Ｍ環部を含むＢＳＡとのコンジュゲートＩＭ−ＢＳＡに対する抗体価
【図１】
0003820519.tif 000016
【図２】
0003820519.tif 000017