(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）
0003742435.tif 000016
で表されるコレステロールの式（II）
0003742435.tif 000017
（上式中、Ｒ1は水酸基であり、Ｒ2およびＲ3は、それぞれ水酸基および水素原子であるか、またはそれぞれ水素原子および水酸基である）
で表されるヒドロキシル化コレステロールへの生物学的変換方法による式（II）で表されるヒドロキシル化コレステロールの製造方法であって、
（Ａ）前記生物学的変換を行いうるものであり、かつアミコラータ（Ａｍｙｃｏｌａｔａ）属およびスフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）属に属する微生物から選ばれる菌株またはその培養菌体の調製物および酸素の存在下において式（Ｉ）で表されるコレステロールをインキュベーション処理する工程、および
（Ｂ）インキュベーション処理液から式（II）で表されるヒドロキシルコレステロールの少なくとも１種を採取する工程、
を含んでなる方法。
【請求項２】
前記アミコラータ属に属する微生物がアミコラータ  サツルネア（Ａｍｙｃｏｌａｔａ ｓａｔｕｒｎｅａ）またはアミコラータ  オートトロヒカ（Ａｍｙｃｏｌａｔａ ａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃａ）に属する微生物である請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記スフィンゴモナス属に属する微生物がスフィンゴモナス  マリー（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｍａｌｉ）、スフィンゴモナス  パウチモビリス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｐａｕｃｉｍｏｂｉｌｉｓ）、スフィンゴモナス  パラパウチモビリス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｐａｒａｐａｕｃｉｍｏｂｉｌｉｓ）、スフィンゴモナス  ヤノイクヤエ（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｙａｎｏｉｋｕｙａｅ）、スフィンゴモナス  アドハエシバ（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ａｄｈａｅｓｉｖａ）、スフィンゴモナス  カプスラータ（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｃａｐｓｕｌａｔａ）、スフィンゴモナス  サンギス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｓａｎｇｕｉｓ）、スフィンゴモナス  マクロゴルタビダス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｍａｃｒｏｇｏｌｔａｂｉｄｕｓ）およびスフィンゴモナス  テラーエ（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｔｅｒｒａｅ）からなる群より選ばれる請求項１記載の方法。
【請求項４】
工程（Ａ）におけるインキュベーション処理が、前記微生物の培養物中において式（Ｉ）で表されるコレステロールを処理するものである請求項１記載の方法。
【請求項５】
工程（Ａ）におけるインキュベーション処理が、さらにメチル化シクロデキストリン類の存在下で行われる請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
式（II−ａ）
0003742435.tif 000018
で表される２５−ヒドロキシコレステロールの式（II−ｂ）
0003742435.tif 000019
（上式中、Ｒ2およびＲ3は、それぞれ水酸基および水素原子であるか、またはそれぞれ水素原子および水酸基である）
で表されるジヒドロキシコレステロールへの生物学的変換方法による式（II−ｂ）で表されるジヒドロキシコレステロールの製造方法であって、
（Ａ）前記生物学的変換を行いうるものであり、かつアミコラータ（Ａｍｙｃｏｌａｔａ）属およびスフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）属に属する微生物から選ばれる菌株またはその培養菌体の調製物および酸素の存在下において式（II−ａ）で表される２５−ヒドロキシコレステロールをインキュベーション処理する工程、および
（Ｂ）インキュベーション処理液から式（II−ｂ）で表されるジヒドロキシルコレステロールの少なくとも１種を採取する工程、
を含んでなる方法。
【請求項７】
工程（Ａ）におけるインキュベーション処理が、さらにメチル化シクロデキストリン類の存在下で行われる請求項６記載の方法。
【請求項８】
式（II−ｂ−１）
0003742435.tif 000020
（上式中、Ｒ2およびＲ3は、それぞれ水酸基および水素原子である）で表されるジヒドロキシコレステロール。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、微生物の作用によるコレステロールのヒドロキシル化法、より具体的にはコレステロールからの２５−ヒドロキシコレステロール、１７，２５−ジヒドロキシコレステロールまたは２５，２６−ジヒドロキシコレステロールのいずれか１種または２種以上の製造方法に関する。また、前記の新規ジヒドロキシコレステロールにも関する。
背景技術
生物学的方法、特に微生物を用いるコレステロールを初めとするステロイド類のヒドロキシ誘導体の製造方法としては、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属微生物を用いてコレステロールから２５−ヒドロキシコレステロールに変換する方法が特開平７−１２３９９７号に開示されている。また、ステロイド類以外の化合物の生物学的変換で興味深いものとしては、ビタミンＤ類の微生物、例えば、ノカルディア  オウトトロヒカ（Ｎｏｃａｒｄｉａ ａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃａ）、ストレプトマイセス  ロゼオスポラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓ）、アミコラータ  サツルネア（Ａｍｙｃｏｌａｔａ ｓａｔｕｒｎｅａ）、アミコラータ  オウトトロヒカ（Ａｍｙｃｏｌａｔａ ａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃａ）、スフィンゴモナス  エスピー（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）を用いるヒドロキシル化による２５−ヒドロキシビタミンＤ類の製造方法が知られている（特開平４−１６６０９０号、特開平７−２４１１９７号）。
一方、コレステロールは、例えば、各種ビタミンＤ類の化学合成上の中間体となりうることが知られており（有機合成化学３７，８０９−８２９（１９７９）、予めコレステロールの１以上の特定部位をヒドロキシル化した化合物は、各種ヒドロキシル化ビタミンＤ類の合成中間体としての使用が期待できる。たしかに、上記特開平７−１２３９９７号公報に記載された微生物を用いる変換方法によれば、活性型ビタミンＤとの関連において好ましいコレステロールの２５位を選択的にヒドロキシル化できることが公表されている。
しかしながら、該公報に記載の方法によれば、ヒドロキシル化効率は必ずしも満足できるものでない。また、コレステロールから誘導される最終化合物、例えばビタミンＤ類の水溶性を改善するとの観点に立てば、モノ−ヒドロキシル化コレステロールだけでなく、さらなるヒドロキシル化の進んだ、例えばジヒドロキシル化コレステロールの提供も望まれるであろう。
従って本発明の目的は、モノ−ヒドロキシル化コレステロール、特に２５−ヒドロキシコレステロールの効率のよい製造方法、ならびにさらなるヒドロキシル化の進んだジヒドロキシコレステロールの製造方法および新規なジヒドロキシコレステロールそれ自体を提供することにある。
発明の開示
本発明者らは、上記目的を達成するために鋭意研究を進めてきたところ、上記特開平７−１２３９９７号公報に記載されたストレプトマイセス属以外の属の微生物が、コレステロールの２５位だけでなく、１７位または２６位もヒドロキシル化することを見い出した。
従って、上記目的は、本発明に従う、式（Ｉ）
0003742435.tif 000002
で表されるコレステロールの式（II）
0003742435.tif 000003
（上式中、Ｒ1は水酸基であり、Ｒ2およびＲ3は、それぞれ水酸基および水素原子であるか、またはそれぞれ水素原子および水酸基である）
で表されるヒドロキシル化コレステロールへの生物学的変換方法による式（II）で表されるヒドロキシル化コレステロールの製造方法であって、
（Ａ）前記生物学的変換を行いうるものであって、かつアミコラータ（Ａｍｙｃｏｌａｔａ）属およびスフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）属に属する微生物から選ばれる微生物またはその培養菌体の調製物および酸素の存在下で式（Ｉ）で表されるコレステロールをインキュベーション処理する工程、および
（Ｂ）インキュベーション処理液から式（II）で表されるヒドロキシルコレステロールの少なくとも１種を採取する工程、
を含んでなる方法、を提供することによって達成できる。
また、式（II）で表されるヒドロキシル化コレステロールのうち、式（II−ｂ）
0003742435.tif 000004
（式中、Ｒ2およびＲ3は、それぞれ水酸基および水素原子であるか、またはそれぞれ水素原子および水酸基である）
で表わされるジヒドロキシコレステロールは、上記方法における出発原料のコレステロールを２５−ヒドロキシコレステロールに代えて用いる別法によっても製造できる。
さらに、上記式（II−ｂ）で表されるジヒドロキシコレステロール、すなわち、１７，２５−ジヒドロキシコレステロールおよび２５，２６−ジヒドロキシコレステロールは、従来技術文献未載の化合物である。従って、本発明によれば、式（II−ｂ）で表される新規化合物ジヒドロキシコレステロールも提供される。
発明の詳細な記述
本発明の生物学的変換では、アミコラータ（Ａｍｙｃｏｌａｔａ）属およびスフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）属に属する微生物であって、前記式（Ｉ）のコレステロールから式（II）のヒドロキシル化コレステロールへ変換する能力を有する微生物、ならびにそれらの培養菌体調製物であれば、種および株の種類を問うことなく使用できる。好ましい微生物としては、上記変換能を有するアミコラータ  サツルネア（Ａｍｙｃｏｌａｔａ ｓａｔｕｒｎｅａ）、特に受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−５５４４およびＦＥＲＭ  ＢＰ−２３０７の下に日本国通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている微生物、ならびにアミコラータ  オートトロヒカ（Ａｍｙｃｏｌａｔａ ａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃａ）、特に受託番号ＡＴＣＣ ３３７９６の下にアメリカ合衆国アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託されている菌株を挙げることができる。
また、上記アミコラータ属に属する微生物の変換能に比べて、変換能が劣るものの、スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）属に属す種、マリー（ｍａｌｉ）ＩＦＯ  １５５００、パウチモビリス（ｐａｕｃｉｍｏｂｉｌｉｓ）ＩＦＯ  １３９３５、パラパウチモビリス（ｐａｒａｐａｕｃｉｍｏｂｉｌｉｓ）ＩＦＯ  １５１００、ヤノイクヤエ（ｙａｎｏｉｋｕｙａｅ）ＩＦＯ  １５１０２、アドハエシバ（ａｄｈａｅｓｉｖａ）ＩＦＯ  １５０９９、カプスラータ（ｃａｐｓｕｌａｔａ）ＩＦＯ  １２５３３、サンギス（ｓａｎｇｕｉｓ）ＩＦＯ  １３９３７、マクロゴルタビダス（ｍａｃｒｏｇｏｌｔａｂｉｄｕｓ）ＩＦＯ  １５０３３およびテラーエ（ｔｅｒｒａｅ）ＩＦＯ  １５０９８も使用することができる。なお、ＩＦＯは、日本国  発酵研究所（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ）における寄託番号である。
本発明によれば、これらのいずれかの菌株またはその培養菌体および酸素の存在下で、出発原料（または基質）であるコレステロール（式（Ｉ）の化合物）および／または２５−ヒドロキシコレステロール（式（II−ａ）の化合物）がインキュベーション処理される。この処理は、前記菌株を好気的条件下で培養する際に、その培養液中に基質を添加して行うかあるいは、場合により前記菌株の培養菌体を、例えばそのままもしくはホモジェナイズした調製物の懸濁液中に基質を添加し、酸素、例えば空気を通気しながらインキュベーションして行うこともできる。培養液への基質の添加は、培養前または培養後一定期間経過したときのいずれで行ってもよい。上記菌体は、上記いずれかの菌株を栄養源含有培地に接種し、好気的に培養することにより製造できる。
かかる培養菌体の調製物を用意するための菌株の培養または基質が添加された状態で行われる菌株の培養は、原則的には一般微生物の培養方法に準じて行うことができるが、通常は液体培養による振盪培養、通気撹拌培養などの好気的条件下で実地するのが好ましい。
培養に用いられる培地としては、アミコラータ（Ａｍｙｃｏｌａｔａ）属およびスフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）属に属する微生物が利用できる栄養源を含有する培地であればよく、各種の合成、半合成培地、天然培地などいずれも利用可能である。培地組成としては炭素源としてのグルコース、マルトース、キシロース、フルクトース、シュークロース等を単独または組み合わせて用いることができる。窒素源としては、ペプトン、肉エキス、大豆粉、カゼイン、アミノ酸、酵母エキス、尿素等の有機窒素源、硝酸ナトリウム、硫酸アンモニウム等の無機窒素源を、単独または組み合わせて用いることができる。その他、例えば塩化ナトリウム、塩化カリウム、炭酸カルシウム、硫酸マグネシウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、塩化コバルト等の塩類、重金属類塩、ビタミン類も必要に応じ添加使用することができる。なお、培養中発泡が著しい場合には、公知の各種消泡剤を適宜培地中に添加することもできる。
培養条件は、該菌株が良好に生育し得る範囲内で適宜選択することができる。通常、ｐＨ６〜７．５、２８〜３０℃で２〜８日程度培養する。上述した各種の培養条件は、使用微生物の種類や特性、外部条件等に応じて適宜変更でき、当業者であれば容易に最適条件を選択できるであろう。
また、培養菌体調製物は、培養終了後、遠心分離または濾過により分離した菌体またはホモジェナイズした菌体を適当な溶液に懸濁して調製する。菌体の懸濁に使用できる溶液は、前記した培地であるか、あるいはトリス−酢酸、トリス−塩酸、コハク酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウムなどの緩衝液を単独または混合したものである。緩衝液のｐＨは、好ましくは６．０〜９．０、さらに好ましくは７．０〜８．５を挙げることができる。
基質は、粉末のままか、あるいは水溶性有機溶媒、例えばエタノールなどに溶解して培養液または菌体の懸濁液に添加することができ、その添加量は、例えば、培養液の場合、その１ｍｌ当り０．１５〜０．６０ｍｇが好ましい。添加量を０．６０ｍｇ／ｍｌより多くすると、変換速度が遅くなり好ましくない。基質添加後は、２７〜３１℃で１〜３日間、好ましくは約１日間、振とうあるいは通気撹拌などの操作を行い、好気的条件下で反応を進行させることにより基質を目的のヒドロキシル化コレステロールに変換することができる。かかる変換反応に際し、反応溶液中に基質とメチル化シクロデキストリン類を共存させることにより、基質から目的のヒドロキシル化コレステロールへの変換率を飛躍的に増大できる。
従って、本発明の好ましい態様では、上記インキュベーション処理が、さらにメチル化シクロデキストリン類の存在下で行われる。
本発明で使用するメチル化シクロデキストリン類とは、シクロデキストリンの２，３または６位の水酸基の水素原子がメチル基で置換された化合物をいい、２および６位が完全にメチル化されたα−シクロデキストリン由来のヘキサキス−（２，６−Ｏ−ジメチル）−α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン由来のヘプタキス−（２，６−Ｏ−ジメチル）−β−シクロデキストリンおよびγ−シクロデキストリン由来のオクタキス−（２，６−Ｏ−ジメチル）−γ−シクロデキストリン、あるいは２，３および６位が完全にメチル化されたα−シクロデキストリン由来のヘキサキス−（２，３，６−Ｏ−トリメチル）−α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン由来のヘプタキス−（２，３，６−Ｏ−トリメチル）−β−シクロデキストリンおよびγ−シクロデキストリン由来のオクタキス−（２，３，６−Ｏ−トリメチル）−γ−シクロデキストリン、あるいは２，３，６位の各６個、７個もしくは８個の水酸基が部分的にメチル化された部分メチル化シクロデキストリンを挙げることができる。本発明においては、上記メチル化シクロデキストリン類の中から任意の一種または二種以上が選択されて用いられるが、特にβ−シクロデキストリン由来の部分メチル化シクロデキストリンが好適に用いられる。
メチル化シクロデキストリン類の添加量は、反応溶液１ｍｌ当り０．５ｍｇ以上、好ましくは０．５〜１５ｍｇ、より好ましくは１〜１０ｍｇである。メチル化シクロデキストリン類の添加量が反応溶液１ｍｌ当り０．５ｍｇ未満の場合は、目的とするヒドロキシル化コレステロールへの変換率の増大が無添加のものに比べて有意なものとならない場合があり、１５ｍｇ付近の添加量では、場合によって発泡が起こり、消泡剤等を併用する必要が生じることもある。
また本発明の方法では、上記変換率を低下させない範囲で、非イオン界面活性剤を反応液に添加してもよい。このような界面活性剤としては、ポリオキシエチレン・ソルビタン脂肪酸エステル（例えばＴｗｅｅｎ８０（シグマ社製））、ソルビタン脂肪酸エステル（例えばＳｐａｎ８５（シグマ社製））、ポリオキシエチレンエーテル（例えばＢｒｉｊ９６（ジグマ社製））やＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（シグマ社製）、ノニルフェノール（例えばノニポール４５（三洋化成工業（株）製）、酸化エチレン−酸化プロピレンのブロック共重合物（例えばＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｌ−６１（旭電化工業（株）製）、および陰イオン性界面活性剤としてダイレックス（日本油脂（株）製）、トラックス（日本油脂（株）製）などが挙げられる。
こうして生成した目的のヒドロキシル化コレステロールを反応混合物から単離するには、種々の既知精製手段を選択、組み合わせて行うことができる。例えば、疎水性吸着樹脂への吸着、溶出、酢酸エチル、ｎ−ブタノール等を用いた溶媒抽出、シリカゲル等によるカラム法あるいは薄層クロマトグラフィー、逆相カラムを用いた分取用高速液体クロマトグラフィー等を、単独あるいは適宜組み合わせ、場合により反復使用することにより分離精製することができる。
なお、上記生物学的変換反応で、特に有利に使用できる菌株の一つであるアミコラータサツルネア（Ａｍｙｃｏｌａｔａ ｓａｔｕｒｎｅａ）ＦＥＲＭ  ＢＰ−５５４４菌株は、本発明者らが土壌中より分離し、Ａ−１２４６株と命名したものであって、下記のとおり新規な菌株であり、以下の菌学的性状を示す。
（１）形態
栄養菌糸は合成寒天培地および天然寒天培地においてよく発達し、不規則的に分岐する。また隔壁は認められない。胞子はグリセリン・アスパラギン寒天培地およびスターチ無機塩寒天培地などで良好に形成される。顕微鏡で観察すると、胞子形成菌糸の分岐方法は、単純分岐で胞子は直線状に形成される。胞子は通常３個以上の連鎖が認められ、培養の後期には長い鎖上を呈し、表面は平滑である。胞子の形状は円筒形で、その大きさは０．５〜０．８×２．５〜４．３μｍである。菌核、胞子のう、鞭毛胞子は観察されない。
（２）各種培地における生育状態（３０℃）
（２−１）シュークロース・硝酸塩寒天培地
培地上での生育状態は、中程度であり、コロニー裏面の色調は、淡褐色である。気菌糸の形成は中程度であり、クリーム色を呈する。可溶性色素は産生しない。
（２−２）グルコース・アスパラギン寒天培地
培地上での生育状態は、やや不良であり、コロニー裏面の色調は、クリーム色である。気菌糸の形成は中程度であり、白色を呈する。可溶性色素は産生しない。
（２−３）グリセリン・アスパラギン寒天培地
培地上での生育状態は、良好であり、コロニー裏面の色調は、淡黄色である。気菌糸の形成は良好であり、白色を呈する。可溶性色素は産生しない。
（２−４）スターチ・無機塩寒天培地
培地上での生育状態は、中程度であり、コロニー裏面の色調は、クリーム色である。気菌糸の形成は良好であり、白色を呈する。可溶性色素は産生しない。
（２−５）チロシン寒天培地
培地上での生育状態は、中程度であり、コロニー裏面の色調は、赤褐色である。気菌糸の形成は良好であり、クリーム色を呈する。淡赤褐色の可溶性色素を産生する。
（２−６）栄養寒天培地
培地上での生育状態は、良好であり、コロニー裏面の色調は、淡黄色である。気菌糸の形成は良好であり、白色を呈する。可溶性色素は産生しない。
（２−７）イースト・麦芽寒天培地
培地上での生育状態は、良好であり、コロニー裏面の色調は、淡黄色である。気菌糸の形成はやや不良であり、白色を呈する。可溶性色素は産生しない。
（２−８）オートミール寒天培地
培地上での生育状態は、中程度であり、コロニー裏面の色調は、クリーム色である。気菌糸の形成はやや不良であり、白色を呈する。可溶性色素は産生しない。
（２−９）ペプトン・イースト・鉄寒天培地
培地上での生育状態は、中程度であり、コロニー裏面の色調は、淡褐色である。気菌糸の形成は中程度であり、クリーム色を呈する。可溶性色素は産生しない。
（３）生理的性質
（３−１）生育温度範囲：栄養寒天培地を使用した場合、２０〜３０℃の温度範囲で良好な生育が認められる。１０℃以下および４０℃以上では生育しない。
（３−２）好気性・嫌気性の区別：好気性である。
（３−３）ゼラチンの液化：陽性である。
（３−３）スターチの加水分解：陰性である。
（３−４）脱脂牛乳の凝固、ペプトン化：いずれも陰性である。
（３−５）メラニン様色素の生成：陰性である。
（３−６）硝酸還元能：陰性である。
（４）各種炭素源の利用性：プリドハム・ゴトリーブ寒天培地上に各種の炭素源を加え、生育を見た場合、Ｄ−グルコース、シュークロース、Ｄ−キシロース、イノシトール、Ｄ−マンニット、Ｄ−フルクトースのいずれの炭素源も利用することができる。Ｌ−アラビノース、Ｌ−ラムノースおよびラフィノースは利用できない。
（５）細胞壁成分
細胞壁成分を全菌体の分解物を用いて調べた結果、ルシェバリエの分類（インターナショナル・ジャーナル・オブ・システマティック・バクテリオロジー（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）ｖｏｌ．２０，ｐ４３５〜４４３（１９７０））によるタイプIII細胞壁に属した。またミコール酸は含まれていない。
以上の菌学的性状から本菌株が放線菌に属することは明確であり、インターナショナル・ジャーナル・オブ・システマティック・バクテリオロジー（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）ｖｏｌ．３６，ｐ２９〜３７（１９８６）に報告されている既知微生物の性状と比較したところ、本菌株は、アミコラータ・サツルネア（Ａｍｙｃｏｌａｔａ  ｓａｔｕｒｎｅａ）とほぼ一致した。以上の結果から、本菌株はアミコラータ・サツルネア（Ａｍｙｃｏｌａｔａ  ｓａｔｕｒｎｅａ）に属するものと判断し、アミコラータ・サツルネア（Ａｍｙｃｏｌａｔａ  ｓａｔｕｒｎｅａ）Ａ−１２４６株と命名した。本菌株は、日本国工業技術院生命工学工業技術研究所に平成７年８月７日付けでＦＥＲＭ  Ｐ−１５０９８として寄託された後、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の規定の下、同研究所の国際寄託当局に移管され、前述の寄託番号（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５５４４）を得ているものである。
以下、本発明について具体例を挙げてより詳細に説明するが、本発明をこれらの例に限定することを意図するものでない。
なお、下記の例中の％は、特記しない限り重量％を意味する。
例１〜９：コレステロールから２５−ヒドロキシコレステロールへの変換
グルコース１．５％、バクトソイトン（ディフコ社製）１．５％、コーンスチープリカー０．５％、塩化ナトリウム０．４％、炭酸カルシウム０．２％（ｐＨ７．０）からなる種母用培地１００ｍｌを５００ｍｌ容三角フラスコに入れ、１２０℃、２０分間加熱滅菌した。これにアミコラータ・サツルネア（Ａｍｙｃｏｌａｔａ  ｓａｔｕｒｎｅａ）  Ａ−１２４６株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５５４４）の凍結種母２ｍｌを接種し、２８℃、２２０ｒｐｍで４８時間振とう培養し、種母培養液を調製した。
次にグルコース２．０％、酵母エキス０．２％、ペプトン０．５％、大豆粉１．０％、コーンスチープリカー０．５％、第二リン酸カリウム０．０４％、塩化ナトリウム０．０４％、炭酸カルシウム０．２％（ｐＨ７．４）からなる変換培養用培地５０ｍｌを２５０ｍｌ容三角フラスコに入れ、１２０℃、２０分間加熱滅菌した。これに先に調製した種母培養液１ｍｌを接種し、２８℃、２２０ｒｐｍで振とう培養し、４８時間後、基質であるコレステロール１５ｍｇおよび表１に示す各種の化合物を添加し、さらに７２時間培養を継続した。
なお、基質などの添加方法は以下のとおりである。例１では、粉末状のコレステロール１５ｍｇを添加した。例２では、コレステロール１５０ｍｇをエタノール４ｍｌに懸濁し、超音波で分散させた懸濁液０．４ｍｌを添加した。例３では、コレステロール１５０ｍｇをＴｗｅｅｎ８０（界面活性剤：シグマ社製）１ｍｌとエタノール３ｍｌの混液に懸濁し、超音波で分散させた懸濁液０．４ｍｌを添加した。例４、５および６では、コレステロールを各１５ｍｇ、Ｔｗｅｅｎ８０を各１ｍｌおよびあらかじめ殺菌（１２１℃、２０分）しておいた１．５％の各シクロデキストリン水溶液をそれぞれ５．６ｍｌ添加した。例７、８および９では、コレステロールを各１５ｍｇ、Ｔｗｅｅｎ８０を各１ｍｌおよびあらかじめ殺菌（１２１℃、２０分）しておいた部分メチル化β−シクロデキストリン（メチル化率７４％：メルシャン（株）製）の１．５％水溶液をそれぞれ設定濃度に応じて添加した。
得られた培養液２ｍｌを共栓付き遠心沈殿管にとり、酢酸エチル０．５ｍｌを加え、３０分間撹拌し、さらに３０００ｒｐｍ、１５分間遠心分離し、酢酸エチル層を分取した。この５μｌをＴＬＣプレート（シリカゲル６０Ｆ254：メルク社製）にスポットし、クロロホルム：メタノール＝１０：１で展開し、これを硫酸により発色させた。標品（シグマ社製）と同じＲｆ値（約０．５）を示すスポットをクロマトスキャナー（ＣＳ−９２０：（株）島津製作所製）で読みとり、２５−ヒドロキシコレステロールを定量した。コレステロールから２５−ヒドロキシコレステロールへの変換率は表１にまとめて示す。
0003742435.tif 000005
例１０〜１９：コレステロールから２５−ヒドロキシコレステロールへの変換（反応時間の変動が及ぼす影響）
例１〜９に示した変換培養用培地５０ｍｌを２５０ｍｌ容三角フラスコに入れ、１２０℃、２０分間加熱滅菌した。これに例１〜９と同様に調製した種母培養液１ｍｌを接種し、２８℃、２２０ｒｐｍで４８時間振とう培養した。これに粉末状のコレステロールを１５ｍｇ、Ｔｗｅｅｎ８０を１ｍｌ添加し、さらにあらかじめ殺菌しておいた各種メチル化β−シクロデキストリンの１．５％水溶液を最終濃度０．１５％となるように添加し、培養を継続した。コレステロールを添加して１６時間、４０時間および６４時間経過した培養液中の２５−ヒドロキシコレステロールを例１〜９と同様の方法で定量した。コレステロールから２５−ヒドロキシコレステロールへの変換率を表２にまとめて示す。なお、例１７および１８は、２，６−ジ−Ｏ−メチル−β−シクロデキストリンおよび２，４，６−トリ−Ｏ−メチル−β−シクロデキストリンをそれぞれ２：１および１：２の比率で混合したものを使用した。
0003742435.tif 000006
例２０〜２３：コレステロールから２５−ヒドロキシコレステロールへの変換（コレステロールの添加濃度の変動が及ぼす影響）
例１〜９に示した変換培養用培地５０ｍｌを２５０ｍｌ容三角フラスコに入れ、１２０℃、２０分間加熱滅菌した。これに例１〜９と同様に調製した種母培養液１ｍｌを接種し、２８℃、２２０ｒｐｍで４８時間振とう培養した。これに粉末状のコレステロールとあらかじめ殺菌しておいた１．５％部分メチル化β−シクロデキストリン（メチル化率７４％：メルシャン（株）製）水溶液５．６ｍｌを添加し、さらに４０時間培養を継続した。得られた培養液中の２５−ヒドロキシコレステロールを例１〜９と同様の方法で定量した。コレステロールから２５−ヒドロキシコレステロールへの変換率を表３にまとめて示す。
0003742435.tif 000007
例２４〜２６：コレステロールから２５−ヒドロキシコレステロールへの変換（菌体調製物による）
例１〜９に示した変換培養用培地５０ｍｌを２５０ｍｌ容三角フラスコに入れ、１２０℃、２０分間加熱滅菌した。これに例１〜９と同様に調製した種母培養液１ｍｌを接種し、２８℃、２２０ｒｐｍで４８時間振とう培養した。得られた培養液を遠心分離（３０００ｒｐｍ、１０分）して菌体を集め、下記組成の各緩衝液５０ｍｌに懸濁した。
緩衝液Ａ（例２４）：トリス−酢酸５０ｍＭ、コハク酸ナトリウム２５ｍＭ、硫酸マグネシウム０．０５％、部分メチル化β−シクロデキストリン（メチル化率７４％：メルシャン（株）製）０．１５％、グルコース０．５％（ｐＨ８．０）
緩衝液Ｂ（例２５）：トリス−酢酸５０ｍＭ、コハク酸ナトリウム２５ｍＭ、硫酸マグネシウム０．０５％、部分メチル化β−シクロデキストリン（メチル化率７４％：メルシャン（株）製）０．１５％（ｐＨ８．０）
緩衝液Ｃ（例２６）：トリス−酢酸５０ｍＭ、コハク酸ナトリウム２５ｍＭ、硫酸マグネシウム０．０５％（ｐＨ８．０）
これに粉末状のコレステロールを各々１５ｍｇ添加し、２８℃、２２０ｒｐｍで２４時間振とうした。得られた溶液中の２５−ヒドロキシコレステロールを例１〜９と同様の方法で定量した。コレステロールから２５−ヒドロキシコレステロールへの変換率を表４に示す。
0003742435.tif 000008
例２７：コレステロールから２５−ヒドロキシコレステロールへの変換（スケールアップ）
グルコース１．５％、バクトソイトン（ディフコ社製）１．５％、コーンスチープリカー０．５％、塩化ナトリウム０．４％、炭酸カルシウム０．２％（ｐＨ７．０）からなる種母用培地１００ｍｌを５００ｍｌ容三角フラスコに入れ、１２０℃、２０分間加熱滅菌した。これにアミコラータ・サツルネア（Ａｍｙｃｏｌａｔａ  ｓａｔｕｒｎｅａ）  Ａ−１２４６株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５５４４）の凍結種母２ｍｌを接種し、２８℃、２２０ｒｐｍで４８時間振とう培養し、種母培養液を調製した。次にグルコース２．０％、酵母エキス０．２％、ペプトン０．５％、大豆粉１．０％、コーンスチープリカー０．５％、第二リン酸カリウム０．０４％、塩化ナトリウム０．０４％、炭酸カルシウム０．２％、シリコンＫＭ７５（消泡剤：信越化学（株）製）０．０５％（ｐＨ７．４）からなる変換培養用培地を３ｌ容ミニジャー５基に各々１．５ｌづつ入れ、１２０℃、２０分間加熱滅菌した。これに先に調製した種母培養液を３０ｍｌづつ接種し、温度２８℃、撹拌４００ｒｐｍ、通気１．０ｖｖｍの条件で４８時間培養した。これにコレステロール４５０ｍｇをエタノール１５ｍｌに溶解して添加し、さらにシリコンＫＭ７５（消泡剤）の１０％水溶液４ｍｌおよび部分メチル化β−シクロデキストリン（メチル化率７４％：メルシャン（株）製）の７．５％水溶液３０ｍｌを添加し、さらに７２時間培養を継続した。実施例１と同様の方法で２５−ヒドロキシコレステロールを定量したところ、コレステロールを添加して２４時間後に１１４μｇ／ｍｌ、４８時間後に６２μｇ／ｍｌ、７２時間後に４９μｇ／ｍｌであった。このようにして５基のミニジャーから合わせて５．６ｌの培養液が得られた。
これにパーライト（濾過助剤：東興パーライト工業（株）製）を３％添加して濾過し、濾液を得た。酢酸エチル５ｌおよび塩化ナトリウム５００ｇを添加し、撹拌機で９０分撹拌し、さらにエタノール２００ｍｌを添加して１時間静置した。酢酸エチル層（約４．５ｌ）を分離し、およそ５０ｍｌまで減圧濃縮した後、さらに酢酸エチル５０ｍｌ、塩化ナトリウム５ｇおよびエタノール２ｍｌを添加し、有機層に抽出した。酢酸エチル層（約５０ｍｌ）を分離し、およそ４ｍｌまで減圧濃縮した後、イオン交換水５０ｍｌを加えた。得られた懸濁液をクロロホルム３０ｍｌで２回抽出した。クロロホルム層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、濃縮乾固して黄色粉末８００ｍｇを得た。
得られた粉末をクロロホルム−メタノール−水（７：１３：８）の下層に溶解し、この２層系を用いた遠心液液分配クロマトグラフィー（ＣＰＣモデルＮＭＦ，２５０Ｗ×１２：三鬼エンジニアリング（株）製）により精製した。すなわち、実施例１と同様の方法でＴＬＣ分析したときにＲｆ値約０．５にスポットが観測される部分を集めて濃縮乾固し、１６８．２ｍｇの白色粉末を得た。この粉末をさらにセファデックスＬＨ−２０（ファルマシア社製、展開溶媒：トルエン−メタノール（８５：１５））のカラムクロマトグラフィーに付し、上記ＴＬＣで分析して単一となった画分を集めて濃縮乾固し、白色粉末状の２５−ヒドロキシコレステロール１３３．５ｍｇを得た。
得られた粉末を０．１ｍｇ／ｍｌの濃度でメタノールに溶解し、下記の条件でＨＰＬＣ分析を行ったところ保持時間１７．９分の単一ピークが観測された。この保持時間は２５−ヒドロキシコレステロールの標品（シグマ社製）のものと一致した。
（ＨＰＬＣ条件）
カラム：ＹＭＣ  ｐａｃｋ  Ａ−３０２（φ４．６ｍｍ×１５０ｍｍ）
移動相：８５％メタノール
流  速：０．８ｍｌ／分
検  出：２１０ｎｍ
また、得られた粉末のマススペクトル、ＮＭＲスペクトルも標品のものと一致した。
（１）ＦＡＢマススペクトル（ポジティブイオン、マトリックスＮＢＡ）：ｍ／ｚ＝４０２（Ｍ+）
（２）1Ｈ−ＮＭＲスペクトル（ＣＤＣｌ3；内部標準ＴＭＳ）：０．６８（３Ｈ，ｓ），０．９３（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．２Ｈｚ），１．０１（３Ｈ，ｓ），１．２２（６Ｈ，ｓ），３．５３（１Ｈ，ｍ），５．３５（１Ｈ，ｍ）
例２８：コレステロールから１７，２５−ジヒドロキシコレステロールへの変換
例１〜９と同様に種母培養液を調製した。
次に、グルコース２．０％、酵母エキス０．２％、ペプトン０．５％、大豆粉１．０％、コーンスチープリカー０．５％、第二リン酸カリウム０．０４％、塩化ナトリウム０．０４％、炭酸カルシウム０．２％、シリコンＫＭ７５（消泡剤：信越化学（株）製）０．０５％（ｐＨ７．４）からなる変換用培地１．５ｌを３ｌ容ミニジャーに入れ、１２０℃、２０分間加熱滅菌した。これに先に調製した種母培養液を３０ｍｌ接種し、温度２８℃、撹拌４００ｒｐｍ、通気１．０ｖｖｍの条件で４８時間培養した。これにコレステロール４５０ｍｇをエタノール１５ｍｌに溶解して添加し、さらにシリコンＫＭ７５（消泡剤：信越化学（株）製）の１０％水溶液４ｍｌおよび部分メチル化β−シクロデキストリン（メチル化率７４％：メルシャン（株）製）の７．５％水溶液３０ｍｌを添加した後、９１時間培養を継続した。
このようにして得られた培養液にパーライト（濾過助剤：東興パーライト工業（株）製）を３％添加して濾過し、濾液１．２ｌを得た。これをアンバーライトＸＡＤ−８（ローム・アンド・ハース社製）１００ｍｌのカラムに通過させて生成物を吸着させた。このカラムを２０％メタノール水２００ｍｌで洗浄した後、９０％メタノール水５００ｍｌで生成物を溶出させた。溶出液を減圧濃縮してメタノールを留去した後、残った水層約１００ｍｌを酢酸エチル５０ｍｌで２回抽出した。得られた酢酸エチル層を無水硫酸アトリウムで乾燥した後、濃縮乾固した。
これを１００ｍｌのシリカゲル（商品名：シリカゲル６０、メルク社製）のカラムに付し、クロロホルム−メタノール（１００：１）４００ｍｌで溶出し、溶出液を減圧濃縮して溶媒を留去した後、さらに調製用薄層クロマトグラフィー（商品名：シリカゲル６０Ａｒｔ１１７９８、メルク社製）に付し、クロロホルム−メタノール（２０：１）で展開した。１７，２５−ジヒドロキシコレステロールに相当する部分（Ｒｆ＝０．３３）をかきとり、クロロホルム−メタノール（１：１）で抽出して濃縮乾固し、白色粉末状の１７，２５−ジヒドロキシコレステロール３．３ｍｇを得た。
以下に本発明により提供される１７，２５−ジヒドロキシコレステロールの理化学的性状を示す。
（１）外観：白色粉末
（２）分子式：Ｃ27Ｈ46Ｏ3
（３）ＦＡＢマススペクトル（ネガティブイオン、マトリックスＮＢＡ）：ｍ／ｚ＝４１７（Ｍ−１）-
（４）1Ｈ−ＮＭＲスペクトル（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3）：主要な吸収は、下記のとおりである。
δＴＭＳ（ｐｐｍ）：０．７８（３Ｈ，ｓ），０．９２（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．２Ｈｚ），１．００（３Ｈ，ｓ），１．２２（６Ｈ，ｓ），３．５３（１Ｈ，ｍ），５．３６（１Ｈ，ｍ）
（５）13Ｃ−ＮＭＲスペクトル（１００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3）：主要な吸収は、下記のとおりである。
δＴＭＳ（ｐｐｍ）：１４．０（ｑ），１４．４（ｑ），１９．４（ｑ），２０．９（ｔ），２２．６（ｔ），２３．７（ｔ），２９．３（ｑ×２），３１．７（ｔ），３１．９（ｔ），３２．２（ｄ），３２．３（ｔ），３２．７（ｔ），３６．５（ｓ），３７．３（ｔ），３８．１（ｔ），３９．７（ｄ），４２．３（ｔ），４４．２（ｔ），４７．３（ｓ），４９．７（ｄ），５１．２（ｄ），７１．０（ｓ），７１．８（ｄ），８６．５（ｓ），１２１．７（ｄ），１４０．７（ｓ）
例２９〜３７：１７，２５−ジヒドロキシコレステロールの製造（共存物の変動による変換率への影響）
グルコール１．５％、バクトソイトン（ディフコ社製）１．５％、コーンスチープリカー０．５％、塩化ナトリウム０．４％、炭酸カルシウム０．２％（ｐＨ７．０）からなる種母用培地１００ｍｌを５００ｍｌ容三角フラスコに入れ、１２０℃、２０分間加熱滅菌した。これにアミコラータ・サツルネア（Ａｍｙｃｏｌａｔａ  ｓａｔｕｒｎｅａ）Ａ−１２４６株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５５４４）の凍結種母２ｍｌを接種し、２８℃、２２０ｒｐｍで４８時間振とう培養し、種母培養液を調製した。
次にグルコース２．０％、酵母エキス０．２％、ペプトン０．５％、大豆粉１．０％、コーンスチープリカー０．５％、第二リン酸カリウム０．０４％、塩化ナトリウム０．０４％、炭酸カルシウム０．２％（ｐＨ７．４）からなる変換培養用培地５０ｍｌを２５０ｍｌ容三角フラスコに入れ、１２０℃、２０分間加熱滅菌した。これに先に調製した種母培養液１ｍｌを接種し、２８℃、２２０ｒｐｍで振とう培養し、４８時間後、基質であるコレステロール１５ｍｇおよび表５に示す各種の化合物を添加し、さらに７２時間培養を継続した。
なお、基質などの添加方法は以下のとおりである。例２９では、粉末状のコレステロール１５ｍｇを添加した。例３０では、コレステロール１５０ｍｇをエタノール４ｍｌに懸濁し、超音波で分散させた懸濁液０．４ｍｌを添加した。例３１では、コレステロール１５０ｍｇをＴｗｅｅｎ８０（界面活性剤：シグマ社製）１ｍｌとエタノール３ｍｌの混液に懸濁し、超音波で分散させた懸濁液０．４ｍｌを添加した。例３２、３３および３４では、コレステロールを各１５ｍｇ、Ｔｗｅｅｎ８０を各１ｍｌおよびあらかじめ殺菌（１２１℃、２０分）しておいた１．５％の各シクロデキストリン水溶液をそれぞれ５．６ｍｌ添加した。例３５、３６および３７では、コレステロールを各１５ｍｇ、Ｔｗｅｅｎ８０を各１ｍｌおよびあらかじめ殺菌（１２１℃、２０分）しておいた部分メチル化β−シクロデキストリン（メチル化率７４％：メルシャン（株）製）の１．５％水溶液をそれぞれ設定濃度に応じて添加した。
得られた培養液２ｍｌを共栓付き遠心沈殿管にとり、酢酸エチル０．５ｍｌを加え、３０分間撹拌し、さらに３０００ｒｐｍ、１５分間遠心分離し、酢酸エチル層を分取した。この５μｌをＴＬＣプレート（シリカゲル６０Ｆ254：メルク社製）にスポットし、クロロホルム：メタノール＝１０：１で展開し、これを硫酸により発色させた。実施例１で得た標品と同じＲｆ値（０．３３）を示すスポットをクロマトスキャナー（ＣＳ−９２０：（株）島津製作所製）で読みとり、１７，２５−ジヒドロキシコレステロールを定量した。コレステロールから１７，２５−ジヒドロキシコレステロールへの変換率を表５にまとめて示す。
0003742435.tif 000009
例３８〜４７：１７，２５−ジヒドロキシコレステロールの製造（反応時間の変動）
例２９〜３７に示した変換培養用培地５０ｍｌを２５０ｍｌ容三角フラスコに入れ、１２０℃、２０分間加熱滅菌した。これに実施例２と同様に調製した種母培養液１ｍｌを接種し、２８℃、２２０ｒｐｍで４８時間振とう培養した。これに粉末状のコレステロールを１５ｍｇ、Ｔｗｅｅｎ８０を１ｍｌ添加し、さらにあらかじめ殺菌しておいた各種メチル化β−シクロデキストリンの１．５％水溶液を最終濃度０．１５％となるように添加し、培養を継続した。コレステロールを添加して１６時間、４０時間および６４時間経過した培養液中の１７，２５−ジヒドロキシコレステロールを例２９〜３７と同様の方法で定量した。コレステロールから１７，２５−ジヒドロキシコレステロールへの変換率を表６にまとめて示す。なお、例４５および例４６は、２，６−ジ−Ｏ−メチル−β−シクロデキストリンおよび２，４，６−トリ−Ｏ−メチル−β−シクロデキストリンをそれぞれ２：１および１：２の比率で混合したものを使用した。
0003742435.tif 000010
例４８〜５１：１７，２５−ジヒドロキシコレステロールの製造（基質濃度の変動）
例２９〜３７に示した変換培養用培地５０ｍｌを２５０ｍｌ容三角フラスコに入れ、１２０℃、２０分間加熱滅菌した。これに例２９〜３７と同様に調製した種母培養液１ｍｌを接種し、２８℃、２２０ｒｐｍで４８時間振とう培養した。これに粉末状のコレステロールとあらかじめ殺菌しておいた１．５％部分メチル化β−シクロデキストリン（メチル化率７４％：メルシャン（株）製）水溶液５．６ｍｌを添加し、さらに４０時間培養を継続した。得られた培養液中の１７，２５−ジヒドロキシコレステロールを例２９〜３７と同様の方法で定量した。コレステロールから１７，２５−ジヒドロキシコレステロールへの変換率を表７にまとめて示す。
0003742435.tif 000011
例５２：２５，２６−ジヒドロキシコレステロールの製造
例１〜９と同様に種母培養液を調製した。
次に、グルコース２．０％、酵母エキス０．２％、ペプトン０．５％、大豆粉１．０％、コーンスチープリカー０．５％、第二リン酸カリウム０．０４％、塩化ナトリウム０．０４％、炭酸カルシウム０．２％、シリコンＫＭ７５（消泡剤：信越化学（株）製）０．０５％（ｐＨ７．４）からなる変換用培地１．５ｌを３ｌ容ミニジャーに入れ、１２０℃、２０分間加熱滅菌した。これに先に調製した種母培養液３０ｍｌ接種し、温度２８℃、撹拌４００ｒｐｍ、通気１．０ｖｖｍの条件で４８時間培養した。これにコレステロール４５０ｍｇをエタノール１５ｍｌに溶解して添加し、さらにシリコンＫＭ７５（消泡剤：信越化学（株）製）の１０％水溶液４ｍｌおよび部分メチル化β−シクロデキストリン（メチル化率７４％：メルシャン（株）製）の７．５％水溶液３０ｍｌを添加した後、９１時間培養を継続した。
このようにして得られた培養液にパーライト（濾過助剤：東興パーライト工業（株）製）を３％添加して濾過し、濾液１．２ｌを得た。これをアンバーライトＸＡＤ−８（ローム・アンド・ハース社製）１００ｍｌのカラムに通過させて生成物を吸着させた。このカラムを２０％メタノール水２００ｍｌで洗浄した後、９０％メタノール水５００ｍｌで生成物を溶出させた。溶出液を減圧濃縮してメタノールを留去した後、残った水層約１００ｍｌを酢酸エチル５０ｍｌで２回抽出した。得られた酢酸エチル層を無水硫酸アトリウムで乾燥した後、濃縮乾固した。
これを１００ｍｌのシリカゲル（商品名：シリカゲル６０、メルク社製）のカラムに付し、クロロホルム−メタノール（１００：１）４００ｍｌで溶出し、溶出液を減圧濃縮して溶媒を留去した後、さらに調製用薄層クロマトグラフィー（商品名：シリカゲル６０Ａｒｔ１１７９８、メルク社製）に付し、クロロホルム−メタノール（２０：１）で展開した。２５，２６−ジヒドロキシコレステロールに相当する部分（Ｒｆ＝０．２６）をかきとり、クロロホルム−メタノール（１：１）で抽出して濃縮乾固し、白色粉末状の２５，２６−ジヒドロキシコレステロール１０．２ｍｇを得た。
以下に本発明により提供される２５，２６−ジヒドロキシコレステロールの理化学的性状を示す。
（１）外観：白色粉末
（２）融点：１８５〜１９１℃
（３）分子式：Ｃ27Ｈ46Ｏ3
（４）ＦＡＢマススペクトル（ネガティブイオン、マトリックスＮＢＡ）：ｍ／ｚ＝４１７（Ｍ−１）-
（５）1Ｈ−ＮＭＲスペクトル（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3）：主要な吸収は、下記のとおりである。
δＴＭＳ（ｐｐｍ）：０．６９（３Ｈ，ｓ），０．９３（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），１．０１（３Ｈ，ｓ），１．１４（３Ｈ，ｓ），３．３７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．０Ｈｚ），３．４３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．０Ｈｚ），３．５０（１Ｈ，ｍ），５，３４（１Ｈ，ｍ）
（６）13Ｃ−ＮＭＲスペクトル（１００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3）：吸収は、下記のとおりである。
δＴＭＳ（ｐｐｍ）：１１．９（ｑ），１８．７（ｑ），１９．４（ｑ），２０．２（ｔ），２１．１（ｔ），２３．３（ｑ），２４．３（ｔ），２８．２（ｔ），３１．７（ｔ），３１．９（ｔ＋ｄ），３５．７（ｄ），３６．５（ｓ＋ｔ），３７．３（ｔ），３９．２（ｔ），３９．８（ｔ），４２．３（ｔ），４２．３（ｔ），５０．１（ｄ），５６．１（ｄ），５６．８（ｄ），７０．０（ｔ），７１．８（ｄ），７３．０（ｓ），１２１．７（ｄ），１４０．８（ｓ）
例５３〜６１：２５，２６−ジヒドロキシコレステロールの製造（添加剤の影響）
例１〜９と同様に種母培養液を調製した。
次に、グルコース２．０％、酵母エキス０．２％、ペプトン０．５％、大豆粉１．０％、コーンスチープリカー０．５％、第二リン酸カリウム０．０４％、塩化ナトリウム０．０４％、炭酸カルシウム０．２％（ｐＨ７．４）からなる変換培養用培地５０ｍｌを２５０ｍｌ容三角フラスコに入れ、１２０℃、２０分間加熱滅菌した。これに先に調製した種母培養液１ｍｌを接種し、２８℃、２２０ｒｐｍで振とう培養し、４８時間後、基質であるコレステロール１５ｍｇおよび表８に示す各種の化合物を添加し、さらに７２時間培養を継続した。
なお、基質などの添加方法は以下のとおりである。例５３では、粉末状のコレステロール１５ｍｇを添加した。例５４では、コレステロール１５０ｍｇをエタノール４ｍｌに懸濁し、超音波で分散させた懸濁液０．４ｍｌを添加した。例５５では、コレステロール１５０ｍｇをＴｗｅｅｎ８０（界面活性剤：シグマ社製）１ｍｌとエタノール３ｍｌの混液に懸濁し、超音波で分散させた懸濁液０．４ｍｌを添加した。例５６、５７および５８では、コレステロールを各１５ｍｇ、Ｔｗｅｅｎ８０を各１ｍｌおよびあらかじめ殺菌（１２１℃、２０分）しておいた１．５％の各シクロデキストリン水溶液をそれぞれ５．６ｍｌ添加した。例５９、６０および６１では、コレステロールを各１５ｍｇ、Ｔｗｅｅｎ８０を各１ｍｌおよびあらかじめ殺菌（１２１℃、２０分）しておいた部分メチル化β−シクロデキストリン（メチル化率７４％：メルシャン（株）製）の１．５％水溶液をそれぞれ設定濃度に応じて添加した。
得られた培養液２ｍｌを共栓付き遠心沈殿管にとり、酢酸エチル０．５ｍｌを加え、３０分間撹拌し、さらに３０００ｒｐｍ、１５分間遠心分離し、酢酸エチル層を分取した。この５μｌをＴＬＣプレート（シリカゲル６０Ｆ254：メルク社製）にスポットし、クロロホルム：メタノール＝１０：１で展開し、これを硫酸により発色させた。実施例１で得た標品と同じＲｆ値（０．２６）を示すスポットをクロマトスキャナー（ＣＳ−９２０：（株）島津製作所製）で読みとり、２５，２６−ジヒドロキシコレステロールを定量した。コレステロールから２５，２６−ジヒドロキシコレステロールへの変換率を表８にまとめて示す。
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例６２〜７１：２５，２６−ジヒドロキシコレステロールの製造（反応時間の影響）
例５３〜６１に示した変換培養用培地５０ｍｌを２５０ｍｌ容三角フラスコに入れ、１２０℃、２０分間加熱滅菌した。これに例５３〜６１と同様に調製した種母培養液１ｍｌを接種し、２８℃、２２０ｒｐｍで４８時間振とう培養した。これに粉末状のコレステロールを１５ｍｇ、Ｔｗｅｅｎ８０を１ｍｌ添加し、さらにあらかじめ殺菌しておいた各種メチル化β−シクロデキストリンの１．５％水溶液を最終濃度０．１５％となるように添加し、培養を継続した。コレステロールを添加して１６時間、４０時間および６４時間経過した培養液中の２５，２６−ジヒドロキシコレステロールを例５３〜６１と同様の方法で定量した。コレステロールから２５，２６−ジヒドロキシコレステロールへの変換率を表９にまとめて示す。なお、例６９および７０は、２，６−ジ−Ｏ−メチル−β−シクロデキストリンおよび２，４，６−トリ−Ｏ−メチル−β−シクロデキストリンをそれぞれ２：１および１：２の比率で混合したものを使用した。
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例７２〜７５：２５，２６−ジヒドロキシコレステロールの製造（基質濃度の影響）
例５３〜６１に示した変換培養用培地５０ｍｌを２５０ｍｌ容三角フラスコに入れ、１２０℃、２０分間加熱滅菌した。これに例５３〜６１と同様に調製した種母培養液１ｍｌを接種し、２８℃、２２０ｒｐｍで４８時間振とう培養した。これに粉末状のコレステロールとあらかじめ殺菌しておいた１．５％部分メチル化β−シクロデキストリン（メチル化率７４％：メルシャン（株）製）水溶液５．６ｍｌを添加し、さらに４０時間培養を継続した。得られた培養液中の２５，２６−ジヒドロキシコレステロールを例５３〜６１と同様の方法で定量した。コレステロールから２５，２６−ジヒドロキシコレステロールへの変換率を表１０にまとめて示す。
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例７６〜８８
使用菌株を表１１に示す各種菌株で置き換えた他、例１〜９と同様に種母培養液および変換培養用培地を調製し、部分メチル化β−シクロデキストリンを最終濃度が１．０％となるように添加した。
添加コレステロール濃度を３００μｇ／ｍｌとし、下記表１１に示されるｐＨおよび反応時間、培養した。基質コレステロールおよび得られたヒドロキシ化コレステロールの測定は、上記各例に従って行った。結果を表１１にまとめて示す。
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表中、
ＣＨＯ：コレステロール
２５（ＯＨ）−ＣＨＯ：２５−ヒドロキシコレステロール
１７，２５（ＯＨ）−ＣＨＯ：１７，２５−ジヒドロキシコレステロール
２５，２６（ＯＨ）−ＣＨＯ：２５，２６−ジヒドロキシコレステロール
産業上の利用可能性
本発明によれば、２５−ヒドロキシコレステロールを初めとするヒドロキシル化コレステロールが効率よく製造できるとともに、新規なヒドロキシル化コレステロールとして１７，２５−ジヒドロキシコレステロールおよび２５，２６−ジヒドロキシコレステロールが提供される。これらの化合物は、例えば、ビタミンＤ類の製造用中間体として有用であり、医薬品製造業において利用可能であろう。