(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物由来のＳ−アデノシルメチオニン脱炭酸酵素遺伝子のプロモーター領域を有するＤＮＡ断片であって、以下の(a)または(b)のＤＮＡを含む植物プロモーターとして作用する能力を有するＤＮＡ断片：
(a)配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡ；
(b)配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなるＤＮＡ。
【請求項２】
植物由来のスペルミジン合成酵素遺伝子のプロモーター領域を有するＤＮＡ断片であって、以下の(a)または(b)のＤＮＡを含む植物プロモーターとして作用する能力を有するＤＮＡ断片：
(a)配列番号１３の塩基配列からなるＤＮＡ；
(b)配列番号１３の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなるＤＮＡ。
【請求項３】
植物由来のアルギニン脱炭酸酵素遺伝子のプロモーター領域を有するＤＮＡ断片であって、以下の(a)または(b)のＤＮＡを含む植物プロモーターとして作用する能力を有するＤＮＡ断片：
(a)配列番号２５の塩基配列からなるＤＮＡ；
(b)配列番号２５の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなるＤＮＡ。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のＤＮＡ断片を含むベクター。
【請求項５】
異種遺伝子が該ＤＮＡ断片の転写制御下にある請求項４記載のベクター。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、クロダネカボチャのＳ−アデノシルメチオニン脱炭酸酵素遺伝子のプロモーター、スペルミジン合成酵素遺伝子のプロモーターおよびアルギニン脱炭酸酵素遺伝子のプロモーターに関するものであり、該プロモーターは遺伝子組み換えを利用した植物の新品種の開発や有用物質を生産させる植物の改変に利用される。
【０００２】
【従来の技術】
植物遺伝子工学は、多大な時間とコストを要する交配によらず、所望の特性を持った植物を作出することができる極めて有用な技術である。よって、植物細胞への遺伝子導入法の開発によって、様々な形質転換植物の作出が可能になってきた。現在このような遺伝子工学を用いて様々な形質転換植物の開発が盛んに行われており、欧米を始め、日本国内でも実用化されている。
【０００３】
植物の遺伝子工学を利用した品種改良は、主に農作物の分野であり、アンチセンス技術を利用した日持ちのよいトマトや除草剤耐性のダイズやナタネ、耐虫性のバレイショやトウモロコシがあり、このような主要な食物に対する遺伝子組み換え技術の適用は、食糧問題を解決する上で計り知れない役割を果たしている。さらに、近年は、農作物以外の植物に遺伝子工学的手法を用いて、物質生産や、環境修復を植物に行わせることも積極的に試みられている。それらは、今後、エネルギー問題や環境問題へ大きく寄与することが予想されている。
【０００４】
形質転換体植物を作成する上での重要な問題は、植物細胞内へ導入した遺伝子を効率よく発現させることがあげられる。プロモーター配列は植物細胞内での遺伝子の転写レベルを決定する主要な因子であり、一般に転写活性の強いプロモーター配列を用いることにより、目的遺伝子の発現レベルを向上させることが可能である。しかし、プロモーター配列には、植物種や、器官、組織や細胞または環境条件ごとに存在するRNAポリメラーゼの違いに基づく特異性が存在することが知られており、従って、植物細胞での遺伝子発現を行おうとする場合には、目的の条件で機能するプロモーター配列を用いる必要がある。現在、実用レベルで利用可能なプロモーターは限られており、一般的には、カリフラワーモザイクウイルス由来の３５Ｓプロモーターがよく用いられている。
【０００５】
ところで、クロダネカボチャは、低温、高塩濃度、乾燥などのストレスを受けるとその体内にポリアミン合成酵素群の遺伝子を発現し、ポリアミンを蓄積することが知られている。ポリアミンとは第１級アミノ基を２つ以上もつ脂肪族炭化水素の総称で生体内に普遍的に存在する天然物であり、２０種類以上のポリアミンが見出されている。代表的なポリアミンとしてはプトレシン、スペルミジン、スペルミンがある。ポリアミンの主な生理作用としては、▲１▼核酸との相互作用による核酸の安定化と構造変化、▲２▼種々の核酸合成系への促進作用、▲３▼タンパク質合成系の活性化、▲４▼細胞膜の安定化や物質の膜透過性抗性の強化などが知られている。
【０００６】
植物におけるポリアミンの役割としては細胞増殖や分裂時に核酸、タンパク質生合成の促進効果や細胞保護が報告されており、環境ストレスに対しては塩ストレス、酸ストレス（Plant cell physiol., 38(10), 156-1166, 1997）、低温ストレス（Plant Science, 122, 111-117, 1997  、Plant Science, 126, 1-10, 1997、Japan Jour. Crop Sci., 50(3), 411-412, 1981）との関わりが主に報告されている。
【０００７】
植物のポリアミン生合成に関わるポリアミン代謝関連酵素としてはアルギニン脱炭酸酵素（ＡＤＣ）、オルニチン脱炭酸酵素（ＯＤＣ）、Ｓ−アデノシルメチオニン脱炭酸酵素（ＳＡＭＤＣ）、スペルミジン合成酵素（ＳＰＤＳ）、スペルミン合成酵素（ＳＰＭＳ）等が知られている。これらのポリアミン代謝関連酵素をコードする遺伝子については植物から既に幾つかが単離されている。
【０００８】
ＡＤＣ遺伝子はエンバク（Mol. Gen. Genet., 224, 431-436, 1990）、トマト（Plant Physiol., 103, 829-834, 1993）、シロイヌナズナ（plant physiol., 111, 1077-1083, 1996）、エンドウ（Plant Mol. Biol., 28, 997-1009, 1995）、ＯＤＣ遺伝子はチョウセンアサガオ（Datura）（Biocem. J., 314, 241-248, 1996）、ＳＡＭＤＣ遺伝子はジャガイモ（Plant Mol. Biol., 26, 327-338, 1994）、ホウレンソウ（Plant Physiol., 107, 1461-1462, 1995）、タバコ、ＳＰＤＳ遺伝子はシロイヌナズナ（Plant cell Physiol., 39(1), 73-79, 1998）等から単離されている。しかしながら、これらの植物由来のポリアミン代謝関連酵素遺伝子プロモーターについては全く報告されていない。
【０００９】
【発明が解決しようする課題】
本発明の目的の１つは、植物における遺伝子工学的手法を用いて、品種改良などを行うために必要な遺伝子の制御を行うことができるプロモーターを提供することである。さらには、温度の制御により、目的遺伝子を制御することが可能なプロモーターを提供することである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、本発明の植物プロモーターを得るために、すでに、クロダネカボチャの生理学の知見による遺伝子レベルでの解明をめざし、鋭意研究して、クロダネカボチャよりいくつかのcDNAを単離した（特開2001-46079）。これらの単離したcDNAを調査し、さらに、特にＳ−アデノシルメチオニン脱炭酸酵素遺伝子、スペルミジン合成酵素遺伝子およびアルギニン脱炭酸酵素遺伝子の上流配列をクローニングし、解析した結果、モデル植物のタバコで発現するプロモーターを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
本発明は、以下の項１〜項２２に関する。
項１、植物由来Ｓ−アデノシルメチオニン脱炭酸酵素遺伝子のプロモーター領域を含むDNA断片。
項２、以下の（a）または（b）のDNAを含むDNA断片。
（a）配列番号１の塩基配列からなるDNA
（b）（a）の塩基配列において１もしくは複数の塩基配列が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなり、かつ植物プロモーターとして作用する能力を有するDNA
項３、以下の（a）または（b）のDNAを含む請求項１記載のDNA断片。
（a）配列番号１の塩基配列からなるDNA
（b）（a）の塩基配列において１もしくは複数の塩基配列が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなり、かつ植物プロモーターとして作用する能力を有するDNA
項４、請求項２または３の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ植物プロモーターとして作用する能力を有するDNA断片。
項５、温度により制御可能な請求項１から４のいずれか１項に記載のDNA断片。
項６、請求項１から５のいずれか１項に記載のDNA断片を含むベクター。
項７、異種遺伝子が該DNA断片の転写制御下にある請求項６記載のベクター。
項８、請求項６または７記載のベクターを宿主植物細胞に導入した形質転換植物。
項９、請求項８記載の形質転換植物から得られた種子及びその子孫。
項１０、植物由来のスペルミジン合成酵素遺伝子のプロモーター活性を有するDNA断片。
項１１、以下の（a）または（b）のDNAを含むDNA断片。
（a）配列番号１３の塩基配列からなるDNA
（b）（a）の塩基配列において１もしくは複数の塩基配列が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなり、かつ植物プロモーターとして作用する能力を有するDNA
項１２、以下の（a）または（b）のDNAを含む請求項１０に記載のDNA断片。
（a）配列番号１３の塩基配列からなるDNA
（b）（a）の塩基配列において１もしくは複数の塩基配列が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなり、かつ植物プロモーターとして作用する能力を有するDNA
項１３、請求項１１または１２の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ植物プロモーターとして作用する能力を有するDNA断片。
項１４、請求項１０から１３のいずれか１項に記載のDNA断片を含むベクター。
項１５、異種遺伝子が該DNA断片の転写制御下にある請求項１４記載のベクター。
項１６、請求項１４または１５に記載のベクターを宿主植物細胞に導入した形質転換植物。
項１７、請求項１６記載の形質転換植物から得られた種子及びその子孫。
項１８、植物由来のアルギニン脱炭酸酵素遺伝子のプロモーター活性を有するDNA断片。
項１９、以下の（a）または（b）のDNAを含むDNA断片。
（a）配列番号２５の塩基配列からなるDNA
（b）（a）の塩基配列において１もしくは複数の塩基配列が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなり、かつ植物プロモーターとして作用する能力を有するDNA
項２０、以下の（a）または（b）のDNAを含む請求項１８に記載のDNA断片。
（a）配列番号２５の塩基配列からなるDNA
（b）（a）の塩基配列において１もしくは複数の塩基配列が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなり、かつ植物プロモーターとして作用する能力を有するDNA断片。
項２１、請求項１９または２０に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ植物プロモーターとして作用する能力を有するDNA。
項２２、温度により制御可能な請求項18から21のいずれか１項に記載のDNA断片。
項２３、請求項１８から２２のいずれか１項に記載のDNA断片を含むベクター。
項２４、異種遺伝子が該DNA断片の転写制御下にある請求項２３記載のベクター。
項２５、請求項２３または２４に記載のベクターを宿主植物細胞に導入した形質転換植物。
項２６、請求項２５記載の形質転換植物から得られた種子及びその子孫。
【００１２】
【発明の実施の態様】
本発明の「植物プロモーター」とは、植物においてプロモーターとして、作用する能力（プロモーター機能）を有するDNA断片のことである。「プロモーター」とは、DNAを鋳型としてmRNA合成酵素（転写）を開始するDNA上の特定塩基配列を意味し、塩基の共通配列を有し、これを認識してmRNAを合成する酵素（RNAポリメラーゼ）がmRNAを合成する。ここで、「プロモーター機能」とは、RNAポリメラーゼがDNA上の特異な領域に結合し、転写開始する作用をいう。具体的には、S-アデノシルメチオニン脱炭酸酵素遺伝子、スペルミジン合成酵素遺伝子またはアルギニン脱炭酸酵素遺伝子のプロモーターであり、または以下の（a）、（b）または（c）のDNAを含むDNA断片を含む。
（a）配列番号１、１３または２５の塩基配列からなるDNA
（b）（a）の塩基配列において１もしくは複数の塩基配列が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなり、かつ植物プロモーターとして作用する能力を有するDNA
（c）（a）又は（ｂ）の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ植物プロモーターとして作用する能力を有するDNA。
【００１３】
本発明の植物プロモーターは、配列番号１、１３または２５記載の塩基配列からなるDNAにおいて、１もしくは複数のDNAが欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなり、かつ、植物プロモーターとして作用する能力を有するDNAである。本発明の植物プロモーターには、配列番号１、１３または２５記載の塩基配列の３‘または５’末端に、翻訳効率を上げる塩基配列などを付加したものや、３‘または５’末端をプロモーター活性が有る限り、欠失したものが含まれる。
【００１４】
本発明の「ベクター」とは、上記プロモーターをベクターに導入したものであり、ベクターとしては、大腸菌由来のベクター、例えば、pBluescriptベクター、β−グルクロニダーゼ遺伝子（ＧＵＳ）を含むプラスミド、ｐＢＩ１０１−ＨｍB、シャトルベクター、ヘルパープラスミド、ｐＲＫ２０１３などが挙げられる。また、植物ウイルス、例えばカリフラワーモザイクウイルスを利用することもできる。ベクターはそれぞれの宿主細胞に応じて選択する。植物プロモーターをベクターに導入する方法は、通常の遺伝子をベクターに導入する方法に従う。
【００１５】
本発明の「形質転換植物」とは、上記ベクターを宿主植物細胞に導入した形質転換植物である。宿主植物細胞としては、シロイヌナズナWassilewskija 株、トマト、タバコ、ペチュニア、コムギ、イネ、トウモロコシ、カボチャ、キュウリ、ワタなどが挙げられる。植物発現ベクターを宿主植物細胞に導入する形質転換法としては、エレクトロポレーション法、プロトプラスト融合法、マイクロインジェクション法、ポリエチレングリコール法あるいはパーティクルガン法などを挙げることができる。さらに、遺伝子を導入した細胞から再生された形質転換植物体である。再生方法としては、カルス状の形質転換細胞をホルモンの種類、濃度を変えた培地へ移して培養し、不定胚を形成させ、完全な植物体を得る方法がある。使用する培地としては、ワタではＭＳＩＣ培地（MS塩、0.75% MgCl2, 1.9g/l KNO3, 30g/l グルコース、2.0g/l  ジェランガム、 pH5.8） 、ニンジンでは Kamada & Harada培地などが例示される。
【００１６】
本発明の具体的な工程例としては、下記工程が例示される。
(1) Ｓ−アデノシルメチオニン脱炭酸酵素遺伝子（SAMDC）、スペルミジン合成酵素遺伝子（SPDS）あるいはアルギニン脱炭酸酵素遺伝子（ＡＤＣ）の上流領域のクローニング
(2) β−グルクロニダーゼ遺伝子（ＧＵＳ遺伝子）との融合
(3) プラスミドのアグロバクテリウムへの導入
(4) 無菌タバコの栽培
(5) アグロバクテリウムの感染
(6) 除菌
(7) 形質転換植物の選択
(8) 形質転換植物の再生
(9) 形質転換体の確認
(10) GUS活性の測定
〈１〉SAMDC遺伝子、SPDS遺伝子およびＡＤＣ遺伝子のプロモーター領域の単離
クロダネカボチャから得られた遺伝子、Ｓ−アデノシルメチオニン脱炭酸酵素遺伝子SAMDC（特開2001-46079）、 スペルミジン合成酵素遺伝子SAMDC（特開2001-46079）、アルギニン脱炭酸酵素遺伝子ADC（特開2001-46079）の塩基配列より、合成オリゴヌクレオチドを作製し、インバースＰＣＲ法を行う。クロダネカボチャよりゲノムＤＮＡを抽出した後、EcoRIなど数種の制限酵素で切断し、セルフライゲーションさせた後、ＰＣＲの鋳型として使用する。第１プライマー群を用いて、ＰＣＲを行った後、反応産物をさらに第２プライマー群を用いてＰＣＲを行い、上流領域をクローニングする。アガロースゲル電気泳動で目的の長さのクローンを得た後、ＴＡクローニングベクターにサブクローニングして、オートシークエンサーを用いて配列決定を行う。得られたＰＣＲ断片の配列の一部がSAMDC、SPDS、ADCの配列と完全に一致したことから、各々SAMDC、SPDS、ADCの上流（植物プロモーター）と判断する。
〈２〉SAMDC遺伝子、SPDS遺伝子、ADC遺伝子のプロモーター領域の利用
上記方法により得た植物プロモーターを、モデル植物のタバコにおいて、キメラ遺伝子コンストラクトをつくり、タンパク質の発現制御に利用することができる。さらに、本プロモーターは温度により制御可能であることから、低温などのストレス耐性遺伝子と接続すると、低温耐性をはじめとしたストレス耐性等を付与した新規植物の育種にも応用できる。
〈３〉植物プロモーターのベクターへの導入と宿主植物細胞の形質転換
植物細胞の形質転換方法としては、プロトプラストに電気パルス処理してプラスミドを植物細胞へ導入するエレクトロポレーション法や、小細胞、細胞、リソソーム等とプロトプラストとの融合法、マイクロインジェクション法、ポリエチレングリコール法、あるいは、パーティクルガン法等の方法を挙げることができる。また、植物ウイルスをベクターとして利用することによって、該目的遺伝子を植物体に導入することができる。利用する植物ウイルスとしては、例えばカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）を用いることができる。すなわち、まず、ウイルスゲノムを一旦、大腸菌由来のベクターなどに挿入して組換え体を調製した後、ウイルスのゲノム中にこれらの目的遺伝子を挿入する。このようにして修飾されたウイルスゲノムを制限酵素により該組換え体から切り出し、植物体に接種することによって、これらの目的遺伝子を植物体に挿入することができる〔ホーン（Hohn）ら、モレキュラー・バイオロジー・オブ・プラント・チューモアーズ（Molecular Biology of Plant Tumors）、アカデミック・プレス、ニューヨーク（Academic Press、New York）、第549〜560頁(1982)、米国特許第4,407,956号〕。
【００１７】
さらに、アグロバクテリウムのＴｉプラスミドを利用する方法がある、アグロバクテリウム属に属する細菌が植物に感染すると、それが持っているプラスミドＤＮＡの一部を植物ゲノム中に移行させるという性質を利用して、これらの目的遺伝子を植物体に導入することもできる。アグロバクテリウム属に属する細菌のうち、アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens) は植物に感染してクラウンゴールと呼ばれる腫瘍を、アグロバクテリウム・リゾゲネス(Agrobacterium rhizogenes) は植物に感染して毛状根を引き起こすが、これらは感染の際にＴｉプラスミドまたはＲｉプラスミドと呼ばれる、それぞれの細菌中に存在するプラスミド上のＴ−ＤＮＡ領域(Transferred DNA)と呼ばれる領域が植物中に移行し、植物のゲノム中に組み込まれることに起因する。さらに、ＴｉまたはＲｉプラスミド上にはＴ−ＤＮＡ領域が植物中に移行し、植物のゲノム中に組み込まれるために必須であるｖｉｒ領域と言われる領域がある。ｖｉｒ領域自身は、植物中に移行されることはなく、またこのｖｉｒ領域はＴ−ＤＮＡ領域が存在するのと異なったプラスミド上にあっても機能しうる〔Nature,303,179,(1983)〕。
【００１８】
ＴｉまたはＲｉプラスミド上のＴ−ＤＮＡ領域中に、植物ゲノム中に組込みたいＤＮＡを挿入しておけば、アグロバクテリウム属の細菌が植物体に感染する際に目的とするＤＮＡを植物ゲノム中に組込むことができる。ここで、ＴｉまたはＲｉプラスミドのＴ−ＤＮＡ中のクラウンゴール、又は毛状根を引き起こす部分を、目的とする移行機能を損なうことなく取り除き、得られたものをベクターとして使用することもできる。本発明においてはこのような種々のベクターを用いることができる。例えば、バイナリーベクターと呼ばれるｐＢＩ１０１（クロンテック社）等のベクターに、本発明のプロモーターに繊維形成および伸長に関与する遺伝子をセンスまたはアンチセンス方向で接続したものを挿入して、これらを植物細胞に導入することができる。なお、これらのベクターは前出のｖｉｒ領域を有しておらず、該ベクターを導入して用いるアグロバクテリウム属の細菌は、ｖｉｒ領域を有している他のプラスミドを含有している必要がある。
【００１９】
また、これらのベクターはアグロバクテリウム属の細菌だけではなく、大腸菌中でも増幅することができるシャトルベクターであり、したがって、Ｔｉプラスミドの組換え操作は、大腸菌を用いて行うことができる。更に、これらのベクターは、抗生物質耐性遺伝子を含んでおり、大腸菌、アグロバクテリウム属の細菌または植物細胞等を形質転換する際に、形質転換体を容易に選別することができる。また、これらのベクターにはカリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶの３５Ｓプロモーターが存在しており、これらのベクターに挿入された遺伝子を植物ゲノム中に組み込んだ後、非調節的に発現させることが可能となる。
〈４〉形質転換植物細胞から植物体の再生
以下に、タバコにおける、アグロバクテリウムによる目的遺伝子の導入および形質転換細胞の植物体への再生法を詳述する。タバコの種子を常法に従って、ＭＳプレートに播種し、無菌的に栽培する。本発明の植物プロモーターに目的遺伝子を接続し、カナマイシン及びハイグロマイシン耐性遺伝子を有するプラスミドにより形質転換したアグロバクテリウムを培養し、希釈したものをチューブに分注し、１cm角に切断したタバコの葉を浸し、数日間、液体MS培地中で共存培養する。アグロバクテリウムが肉眼で観察できるまで十分に増殖したら、除菌操作を行ない、MSプレート上で数日間、培養を行う。これらの葉片を最終的に発芽に必要なホルモンを含むMSプレート上で培養し、１週間ごとに新しいプレートに移植を繰り返す。形質転換した葉片は増殖を続け、シュートが現れてくる。完全なシュートの形状を示すようになったら、シュートの根元のカルス部分を含まないようにメスで切り取り、発根に必要なホルモンを含むMSプレートに移植し、発根が確認されるまで無菌培養を行い、形質転換体を得る。この形質転換体より、常法に従ってＤＮＡを抽出し、プロモーター部分およびGUS遺伝子部分にプライマーを設計し、PCRを行い、形質転換の有無を確認することができる。
【００２０】
また、形質転換体や非形質転換体より、常法に従ってＲＮＡを抽出し、キメラ遺伝子のセンスまたはアンチセンス配列を有するプローブを作成し、これらのプローブを用いてノザンハイブリザイゼーションを行ない、目的遺伝子の発現の状態を調べることができる。
エレメント決定方法
本発明のプロモーター上にあるエレメント部位を決定する方法としては、例えばJoseph Sambrook,David W. Russell  Molecular Cloning 第３版のChapter13に書かれているデリーション法やPCRを用いて長さを調節したプロモーターを作製し、植物細胞等に形質転換後、目的の条件でのプロモーター活性をレポーター遺伝子を用いて調査する方法がある。さらに詳細にエレメント配列を決定する場合は、Joseph Sambrook,David W. Russell  Molecular Cloning 第３版のChapter13に書かれているようにプロモーター上にDNA変異を導入して、またはPCR法を利用した変異の変異の導入により、上記と同様に、植物細胞等に形質転換後、プロモーター活性を調査し、もっとも重要なエレメント配列を決定する方法がある。具体例としては、アラビドプシスDREエレメントの決定（The Plant Cell 6:251-264(1994) ）などが参考になる。
【００２１】
The plant journal (1996) 9(2) 14-158は、公知の35SプロモーターにSAMDC遺伝子を接続したものでは、形質転換体ができず、誘導性のプロモーターに変更することで形質転換体が可能になったことを報告しており、本発明のプロモーターは、35Sプロモーターよりも形質転換体を得るのに有利である。
た。
【００２２】
本発明のプロモーターの改変は、プロモーターのエレメントをタンデムに接続したり、タバコモザイクウイルスのΩ配列を接続するなどの種々の方法により活性が変化したプロモーターを得ることができる（Plant cell physiol  37(1):49-59(1996)、Efficient Promoter Cassettes for Enhanced Expression of Foreign Genes in Dicotyledonous and Monocotyledonous Plant、特開  2000-166577）。
【００２３】
本発明のプロモ−ターに接続することが好ましい遺伝子として、下記のものが例示される。
(i)Genes encoding enzymes that synthesize osmoprotectants
【００２４】
【表１】
0003772974.tif 000002
【００２５】
(ii)Late embryogenesis abundant (LEA)- related genes
【００２６】
【表２】
0003772974.tif 000003
【００２７】
(iii)Regulatory genes
【００２８】
【表３】
0003772974.tif 000004
【００２９】
(iv)Oxidative stress related genes
【００３０】
【表４】
0003772974.tif 000005
【００３１】
(v) Genes encoding for molecular chaperones
【００３２】
【表５】
0003772974.tif 000006
【００３３】
参考文献
・Alia HH, Chen THH, and Murata N (1998) Transformation with a gene for choline oxidase enhances the cold tolerance of Arabidopsis during germination and early growth. Plant Cell Envir 21: 232-239.
・Bowler C, Slooten L, Vandenbranden S, Rycke RD, Botterman J, Sybesma C, Van MM, and Inze D (1991) Manganese superoxide dismutase can reduce cellular damage mediated by oxygen radicals in transgenic plants. EMBO J 10: 1723-1732
・Capell T, Escobar C, Liu H, Burtin D, Lepri O, and Christou P (1998) Overexpression of the oat arginine decarboxylase cDNA in transgenic rice (Oryza sativa L.) affects normal development patterns in vitro and results in putrescine accumulation in transgenic plants. Theor Appl Genet 97: 246-254
・De Ronde JA, Spreeth MH, and Cress WA (2000) Effect of antisense L-Delta(1)-pyrroline-5-carboxylate redutase transgenic soybean plants subjected to osmotic and drought stress. Plant Growth Regul 32: 13-26
・Deak M, Horvath GV, Davletova S, Torok K, Sass L, Vass I, Barna B, Kiraly Z, and Dudits D (1999) Plants ectopically expressing the iron-binding protein ferritin, are tolerant to oxidative damages and pathogens. Nature Biotechnol 17: 192-196
・Espinosa-Ruiz A, Belles JM, Serrano R, and Culianez-Macia FA (1999) Arabidopsis thaliana AtHAL3: a flavoprotein related to salt and osmotic tolerance and plant growth. Plant J 20: 529-539
・Ezaki B, Gardner RC, Ezaki Y, and Matsumoto H (2000) Expression of aluminum-induced genes in transgenic arabidopsis plants can ameliorate aluminum stress and/or oxidative stress. Plant Physiol 122: 657-665
・Grichko VP, and Glick BR (2001) Flooding tolerance of transgenic tomato plants expressing the bacterial enzyme ACC deaminase controlled by the 35S, ro1D or PRB-1b promoter. Plant Cell Physiol 42: 245-249
・Gupta AS, Heinen JL, Holaday AS, Burke JJ, and Allen RD (1993) Increased resistance to oxidative stress in transgenic plants that overexpress chloroplastic Cu/Zn superoxide dismutase. Proc Natl Acad Sci USA 90: 1629-1633
・Hayashi HA, Mustardy L, Deshnium P, Ida M, and Murata N (1997) Transformation of Arabidopsis thaliana with the codA gene for choline oxidase: accumulation of glycine betaine and enhanced tolerance to salt and cold stress. Plant J 12: 133-142
・Hirano HY, and Sano Y (1998) Enhancement of Wx gene expression and the accumulation of amylose in response to cool temperatures during seed development in rice. Plant Cell Physiol 39(8): 807-812
・Hong Suk-Whan and Vierling E. (2000) Mutants of Arabidopsis thaliana defective in the acquisition of tolerance to high temperature stress. Proc.Natl.Acad.Sci.97:4392-4397.
・Hoshida H, Tanaka Y, Hibino T, Hayashi Y, Tanaka A, and Takabe T (2000) Enhanced tolerance to salt stress in transgenic rice that overexpresses chloroplast glutamine synthetase. Plant Mol Biol 43: 103-111
・Huang J, Hirji R, Adam L, Rozwadowski KL, Hammerlindi JK, Keller WA, and Selvaraj G (2000) Genetic engineering of glycine betaine production toward enhancing stress tolerance in plants: metabolic limitations. Plant Physiol 122: 747-756
・Jaglo-Ottosen KR, Gilmour SJ, Zarka DG, Schabenberger O, and Thomashow MF (1998) Arabidopsis CBF1 overexpression induces COR genes and enhances freezing tolerance. Science 280: 104-106
・Kasuga M, Liu Q, Miura S, Yamaguchi-Shinozaki K, and Shinozaki K (1999) Improving plant drought, salt and freezing tolerance by gene transfer of a single stress-inducible transcription factor. Nature Biotechnol 17: 287-291.
・Karakas B., Oziasakins P., Stushnoff C., Suefferheld M. and Rieger M. (1997). Salinity and drought tolerance of mannitol-accumulating transgenic tobacco. Plant Cell Environ. 20:609-616.
・Kavi Kishor PB, Hong Z, Miao G-H, Hu C-AA, and Verma DPS (1995) Overexpression of pyrroline-5-carboxylate synthetase increases proline production and confers osmotolerance in transgenic plants. Plant Physiol 108: 1387-1394
・Kim JC, Lee SH, Cheng YH, Yoo CM, Lee SI, Chun HJ, Yun DJ, Hong JC, Lee SY, Lim CO, and Cho MJ (2001) A novel cold-inducible zinc finger protein from soybean, SCOF-1, enhances cold tolerance in transgenic plants. Plant J 25: 247-259
・Kim SA, Kwak JM, Jae SK, Wang MH, and Nam HG (2001) Overexpression of the AtGluR2 gene encoding an aradopsis homolog of mammalian glutamate receptors impairs calcium utilization and sensitivity to ionic stress in transgenic plants. Plant Cell Physiol 42: 74-84
・Lee JH, and Schoffl F (1996) An Hsp70 antisense gene affects the expression of HSP70/HSc70, the regulation of HSF, and the acquisition of thermotolerance in transgenic Arabidopsis thaliana. Mol Gen Genet 252: 11-19
・Lee JH, Hubel A, and Schoffl F (1995) Depression of the activity of genetically engineered heat shock factor causes constitutive synthesis of heat shock proteins and increased thermotolerance in transgenic Arabidopsis. Plant J 8: 603-612
・Lilius G, holmberg N, and Bulow L (1996) Enhanced NaCL stress tolerance in transgenic tobacco expressing bacterial choline dehydrogenase. Bio/technology 14:177-180
・Malik MK, Slovin Jp, Hwang CH, and Zimmerman JL (1999) Modified expression of a carrot small heat shock protein gene, Hsp17.7, results in increased or decreased thermotolerance. Plant J 20: 89-99
・McKaersie BD (2001) Stress tolerance of transgenic plants overexpressing superoxide dismutase ( Abstract Socity for Experimental Biology  Annual Meeting). J Exptl Bot 52 (supplement): p8
・McKaersie BD, Bowley SR, and Jones KS (1999) Winter survival of transgenic alfalfa overexpressing superoxide dismutase. Plant Physiol 199: 839-847
・McKaersie BD, Bowley SR, Harjanto SR, and Leprince O (1996) Water deficit tolerance and field performance of transgenic alfalfa overexpressing superoxide dismutase. Plant Physiol 111: 1177-1181
・McKaersie BD, Chen Y, Debens M, Bowley SR, Bowler C, Inze D, D'Halluin K, and Botterman J (1993) Superoxide dismutase enhance tolerance of freezing stress in transgenic alfalfa (Medicago sativa L.). Plant Physiol 103: 1155-1163
・Medina J, Catala R, and Salinas J (2001) Developmental and stress regulation of RC12A and RC12B, two cold-inducible genes of Arabidopsis encoding highly conserved hydrophobic proteins. Plant Physiol 125: 1655-1666
・Moghaieb REA, Tanaka N, Saneoka H, Hussein HA, Yousef SS, Ewada MAF, Aly MAM, and Fujita K (2000) Expression of betaine aldehyde dehydrogenase gene in transgenic tomato hairy roots leads to the accumulation of glycine betaine and contributes to the maintenance of the osmotic potential under salt stress. Soil Sci Plant Nutr 46: 873-883
・MsPRP2 gene in alfalfa and improve salinity tolerance of the plants. Plant Physiol 120: 473-480
・Park JM, Park c-J, Lee S-B, Ham B-K, Shin R, and Paek K-H (2001) Overexpression of the tobacco Tsi1 gene encoding an EREBP/AP2-type transcription factor enhances resistance against pathogen attack and osmotic stress in tobacco. Plant Cell 13: 1035-1046
・Pilon-Smits EAH, Ebskamp MJM, Paul MJ, Jeuken MJW, Weisbeek PJ, and Smeekens SCM (1995) Improved performance of transgenic fructan-accumulating tobacco under drought stress. Plant physiol 107: 125-130
・Queitsch C, Hong S-W, Vierling E, and Lindquist S (2000) Heat shock protein 101 plays a crucial thermotolerance in Arabidopsis. Plant Cell 12: 479-492
・Quimio CA, Torrizo LB, Setter TL, Ellis M, Grover A, Abrigo EM, Oliva NP, Ella ES, Carpena AL, Ito O, Peacock WJ, Dennis E, Datta SK (2000) Enhancement of submergence tolerance in transgenic rice overproducing pyruvate decarboxylase. J Plant Physiol 156: 516-521
・Roxas VP, Lodhi SA, Garrett DK, Mahan JR, and Allen RD (2000) Stress tolerance in transgenic tobacco seedlings that overexpress glutathione S-transferase/glutathione peroxidase. Plant Cell Physiol 41: 1229-1234
・Roxas VP, Smith RK Jr, Allen ER, and Allen RD (1997) Overexpression of glutathione-S-transferase/glutathione peroxidase enhances the growth of transgenic tobacco seedlings during stress. Nature Biotechnol 15: 988-991
・Saijo Y, Hata S, Kyozuka j, Shimamoto K, and Izui K (2000) Over-expression of a single Ca2+ dependent protein kinase confers both cold and salt/drought tolerance on rice plants. Plant J 23: 319-327
・Sakamoto A, Alia HH, and Murata N (1998) Metabolic engineering of rice leading to biosynthesis of glycine betaine and tolerance to salt and cold. Plant Mol. Biol. 38: 1011-1019
・Sheveleva E, Chmara W, Bohert HJ, and Jensen RG (1997) Increased salt and drought tolerance by D-ononitol production in transgenic Nicotiana tabacum L. Plant Physiol. 115: 1211-1219
・Sivamani E, bahieldin A, Wraith JM, Al-Niemi T, Dyer WE, Ho THD, and QU RD (2000) Improved biomass productivity and water use efficiency under water deficit conditions in transgenic wheat constitutively expressing the barley HVA1 gene. Plant Sci 155: 1-9
・Soderman E, Hjellstrom M, Fahleson J, and Engstrom P (1999) The HD-Zip gene ATHB6 in Arabisopsis is expressed in developing leaves, roots and carpels and up-regulated by water deficit conditions. Plant Mol Biol 40: 1073-1083
・Steponkus Pl, Uemura M, Joseph RA, Gilmour S, and Thomashow MF (1998) Mode of action of the COR15a gene on the freezing tolerance of Arabidopsis thaliana. Proc Natl Acad Sci USA 95: 14570-14575
・Tamminen I, Makela P, Heino P, and Palva ET (2001) Ectopic expression of AB13 gene enhances freezing tolerance in response to abscisic acid and low temperature in Arabidopsis thaliana. The Plant J 25: 1-8
・Tarczynski MC, Jensen RG, and Bohert HJ (1993) Stress protection of transgenic tobacco by production of the osmolyte mannitol. Science 259: 508-510
・Tepperman JM, and Dunsmuir P (1990) Transformed plants with elevated levels of chloroplasts SOD are not more resistant to superoxide toxicity. Plant Mol Biol 14: 501-511
・Thomas JC, Sepahi M, Arendall B, and Bohert HJ (1995) Enhancement of seed germination in high salinity by engineering mannitol expression in Arabidopsis thaliana. Plant Cell  Envir 18: 801-806
・Van Camp W, Capiau K, Van Montagu M, Inze D, and Slooten L (1996) Enhancement of oxidative stress tolerance in transgenic tobacco plants overproducing Fe-superoxide dismutase in chloroplasts. Plant Physiol 112: 1703-1714
・Wang J, Zhang H, and Allen RD (1999) Overexpression of an Arabidopsis peroxisomal ascorbate peroxidase gene in tobacco increases protection against oxidative stress. Plant Cell Physiol 40: 725-732
・Winicov I, and Bastola DR (1999) Transgenic overexpression of the transcription factor Alfin1enhances expression of the endogenous
・Xu D, Duan X, Wang B, Hong B, Ho TD, and Wu R (1996) Expression of a late embryogensis abundant protein gene, HVA1, from barley confers tolerance to water deficit and salt stress in transgenic rice. Plant Physiol 110: 249-257
・Yu Q, Osborne LD, and Rengel Z (1999) Increased tolerance to Mn deficiency in transgenic tobacco overproducing superoxide dismutase. Annals Bot 84: 543-547
・Zhu B, Su J, Chang MC, Verma DPS, Fan YL, and Wu Ray (1998) Overexpression of a pyrroline-5-carboxylate synthetase gene and analysis of tolerance to water and salt stress in transgenic rice. Plant Sci 139: 41-48
【００３４】
【発明の効果】
本発明では、レポーター遺伝子として広く植物で使われているＧＵＳ遺伝子を本発明のプロモーターの３’末端に連結して使用すると、ＧＵＳ活性を調べることで、簡単にプロモーターの強さを評価できる。レポーター遺伝子としては、ＧＵＳ遺伝子に限らず、ルシフェラーゼ、グリーンフルオレセイントプロテインも使用することができる。SAMDC遺伝子、SPDS遺伝子およびADC遺伝子は、ポリアミン合成遺伝子酵素群の一つの遺伝子であり、まだ、未知の機能を持っているポリアミンの発現の時期、発現の組織などを本発明のプロモーターを利用して同定し、ポリアミンの機能を明らかにするためにも有用である。
【００３５】
本発明のプロモーターは、SAMDC遺伝子、SPDS遺伝子およびADC遺伝子、すなわちポリアミン合成酵素群に関与するプロモーターであり、植物のポリアミン合成シグナル経路を解明するためのシス因子やトランス因子の単離に利用することができ、かつ、温度による遺伝子制御が可能であることから、既知の温度による遺伝子制御可能なプロモーターと比較研究し、植物のストレス応答システムを研究する技術分野においてもきわめて有用である。
【００３６】
さらに、低温などのストレス耐性に関与するタンパクをコードしている塩基配列と、本発明の植物プロモーターを結合したキメラ遺伝子を作製して、特定の環境条件の時のみに目的の遺伝子の発現を行うことができ、植物に負担が少ないストレス耐性形質転換植物を作製することが出来る。また、一般にカリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーターを用いることによって、植物の器官全体に生活環の全過程を通して形態変化をもたらすことができるが、本発明プロモーターを用いれば、生育環境に応じて、その形態が変化しうる植物体を作製することができる。
【００３７】
【実施例】
以下に、本発明を実施例により具体的に説明する。
実施例１  SAMDCの上流領域を持つ形質転換タバコの作製
(1) Ｓ−アデノシルメチオニン脱炭酸酵素遺伝子、SAMDCの上流領域 (SAMDCpro)のクローニング
クロダネカボチャ(Cucurbita ficifolia Bouche)の播種後、1ヶ月育成した幼植物体を用いて、Plant  DNAZOL(GIBCO BRL社)を用いてゲノムＤＮＡを抽出し、インバース(inverse) ＰＣＲ法でゲノムＤＮＡのクローニングを行った。すなわち、制限酵素NcoI、BamHI、SphI、DraI、AIW44I で１μｇのゲノムＤＮＡを切断した後、Ligation high（東洋紡社）でセルフライゲーションさせた。ライゲーションしたＤＮＡ 300ngを鋳型にしてＰＣＲ試薬キット(LA-PCR キット、宝酒造)を用いて、SAMDCの５‘上流域を増幅させた。該反応は、配列番号２および３に示した核酸配列を有する第１プライマー群を用い、９４℃、１５秒間および６５℃、１２分間を２８サイクル実施した。次に、このＰＣＲ産物を用いて、配列番号４および５に示した塩基配列を有する第２プライマー群を用いて、同様の条件でＰＣＲを行った。このＰＣＲ産物を電気泳動で量および長さを確認し、得られたＤＮA断片をAdvanTAge PCR Cloning Kit（Clontech社）を用いて、ベクターｐＴAdvに導入し、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換して、クローニングした。その後、ABI PRISM 310 Genetic Analyzer（ABI社）を用いて、SAMDCの５‘上流域塩基配列を決定した。該塩基配列はプライマーの配列よりｃＤＮＡと全て一致し、ｃＤＮＡに対応するゲノム領域であることが確認できた。さらに、転写阿開始点から約1000bpになるように、両端に制限酵素サイト（XbaI、BamHI）を付加した配列番号６および７のプライマーを設計し、pBluescriptのMCSへ挿入し、pSAMDC1000proと名付けた。この塩基配列を配列番号１に示す。さらに同様に転写阿開始点から500bpになるものも配列番号８および９により作製し、pSAMDC500proと名付けた。この塩基配列を配列番号10に示す。
(2) β−グルクロニダーゼ遺伝子（ＧＵＳ遺伝子）との融合
β−グルクロニダーゼ遺伝子（ＧＵＳ）を含むプラスミド、pBI221（Clontech社）を制限酵素、BamHIおよびEcoRIで切断した後、アガロースゲル電気泳動を行って、該プラスミド中のＧＵＳ遺伝子を取り出した。このＧＵＳ遺伝子をプラスミド、上記のベクターpSAMDC1000proとpSAMDC500proのpBluescript上の制限酵素、BamHIおよびEcoRIサイトに挿入して、プラスミド、ｐSAMDCpro1000:ＧＵＳとｐSAMDCpro500:ＧＵＳを得た。
【００３８】
また、pSAMDC1000proとpSAMDC500proを制限酵素、XbaI およびBamHIで切断し、電気泳動後、XbaI-BamHI断片をプラスミド、ｐＢＩ１０１−ＨｍB（奈良先端大学、新名淳彦教授から入手）の制限酵素、XbaIおよびBamHIサイトに挿入して、新規なプラスミド、ｐＢＩ101-SAMDCpro1000：ＧＵＳとpBI101-SAMDCpro500:GUSを得た。次いで、該プラスミド、pBI101-1000：ＧＵＳとpBI101-500:GUSで大腸菌ＪＭ１０９を形質転換して、Escherichia coli JM109/pBI101-SAMpro1000:GUSおよびEscherichia coli JM109/pBI101-SAMpro500:GUSを得た。この工程を図１に示す。
(3) プラスミドのアグロバクテリウムへの導入
（2）で得られた大腸菌、Escherichia coli JM109/pBI101-SAMDCpro1000:GUSおよびEscherichia coli JM109/pBI101-SAMDCpro500:GUSを、それぞれ５９ｍｇ／Lのカナマイシンを含むＬＢ培地で、３７℃で一晩、培養し、それぞれの大腸菌からプラスミドを抽出した。抽出したプラスミド2μｌとELECTOROMAX A.tumefaciens LBA4404cell（GIBCO BRL社）50μlを混ぜ、ジーンパルサーIIエレクトロポレーションシステム（BIO-RAD社）により、Cuvett Gap 0.2cm、Voltage 2.5KV、Field strength 12.5KV/cm、Capacity 25μF、Resistor200Ωの条件でエレクトロポレーションを行った。その後、SOC培地で２時間、28℃で培養を行い、５０ｍｇ／ｌカナマイシンYEP培地上に塗布した。２８℃で２日間培養した後、単一コロニーを選択した。得られた形質転換体をLBA4404/pBI101-SAMDCpro1000:GUS、LBA4404/pBI101-SAMDCpro500:GUSと命名した。
(4) 無菌タバコの栽培
タバコの種子（奈良先端大学、新名惇彦教授から入手）数１０粒を１．５ｍｌチューブに入れ、７０％エタノール１ｍｌを加え、３分間放置した。続いて、滅菌液(5％次亜塩素酸ナトリウム、0.02％TritonX-100)に３分間浸し、滅菌水で５回洗浄した後に、MSプレート(1リットルあたりでムラシゲ−スクーグ無機塩類4.3g、ショ糖30g 、ミオイノシトール0.1g、ジェランガム2.5g、pH5.7)に置床した。このプレートを25℃の植物インキュベーター（サンヨー製、MLR-350HT）中で、約２週間培養した。発芽後、上記と同様のMS培地を含む植物培養用ポットに移植し、約１ヶ月育成した。
(5) アグロバクテリウムの感染
前記(4) で１ヶ月培養したタバコの葉を、メスで約１．０ｃｍ程度に切りそろえ、液体ＭＳ培地上に浮遊させ、上記(3)にて得た形質転換体、LBA4404/ pBI101-SAMDCpro1000:GUSとLBA4404/ pBI101-SAMDCpro500:GUSを28℃、２日間培養した培養液50μLを添加し、それぞれ別のシャーレ中で2日間、２5℃、暗黒化で共存培養を行った。
(6) 除菌
共存培養後の葉片を、滅菌水で数回洗浄した。
(7) 形質転換植物の選択
除菌済みのタバコ葉片をカナマイシン（100mg/L）、ハイグロマイシン（20mg/L）、カルベニシリン（250mg/L）、ナフタレン酢酸（0.02mg/L）、ベンジルアミノプリン（1mg/L）を含むMS培地に静置し、光強度４０００ルクスで培養した。以後、１週間毎に新しいＭＳプレートに移植した。形質転換した葉片は増殖を続け、ドーム状に盛り上がったカルス状のものから、約１カ月後、シュートが形成された。
(8) 形質転換植物の再生
シュートとなった植物体の根元を、カルス部分を含まないように剃刃もしくはメスで切り取り、MS培地を含む植物培養用ポットに軽く乗せるように挿して、25℃、16時間の光照射、8時間の暗黒化の条件で育成した。
(9) 形質転換体の確認
前記（８）で育成した植物体から、１枚の葉を切り出し、Plant  DNAZOL(GIBCO BRL社)を用いてでゲノムＤＮＡを抽出し、配列番号11および12のプライマーを用いてPCRを行うことにより、目的のDNA断片が含まれることを確認した。
実施例２：CaMV35Sプロモーターを持つ形質転換タバコの作製
(１) β−グルクロニダーゼ遺伝子（ＧＵＳ遺伝子）との融合
CaMV35Sプロモーター（35Ｓ）を含むプラスミド、pBI221（Clontech社）を制限酵素、XbaIおよびHindIIIで切断した後、アガロースゲル電気泳動を行って、該プラスミド中の35Sプロモーターを取り出した。この35Sプロモーターをプラスミド、ｐＢＩ１０１−ＨｍB（奈良先端大学、新名淳彦教授から入手）の制限酵素、XbaIおよびHindIIIサイトに挿入して、新規なプラスミド、ｐＢＩ35S：ＧＵＳを得た。次いで、該プラスミド、ｐＢＩ35S：ＧＵＳで大腸菌ＪＭ１０９を形質転換して、Escherichia coli JM109/pBI101-35S:GUSを得た。この工程を図１に示す。
(２) プラスミドのアグロバクテリウムへの導入
（１）で得られた大腸菌、Escherichia coli JM109/pBI101-35S:GUSを、それぞれ５９ｍｇ／Lのカナマイシンを含むＬＢ培地で、３７℃で一晩、培養し、それぞれの大腸菌からプラスミドを抽出した。抽出したプラスミド2μｌとELECTOROMAX A.tumefaciens LBA4404cell（GIBCO BRL社）50μlを混ぜ、ジーンパルサーIIエレクトロポレーションシステム（BIO-RAD社）により、Cuvett Gap 0.2cm、Voltage 2.5KV、Field strength 12.5KV/cm、Capacity 25μF、Resistor200Ωの条件でエレクトロポレーションを行った。その後、SOC培地で２時間、28℃で培養を行い、５０ｍｇ／ｌカナマイシンYEP培地上に塗布した。２８℃で２日間培養した後、単一コロニーを選択した。得られた形質転換体をLBA4404/pBI101-35S:GUSと命名した。
(３) 無菌タバコの栽培
タバコの種子（奈良先端大学、新名惇彦教授から入手）数１０粒を１．５ｍｌチューブに入れ、７０％エタノール１ｍｌを加え、３分間放置した。続いて、滅菌液(5％次亜塩素酸ナトリウム、0.02％TritonX-100)に３分間浸し、滅菌水で５回洗浄した後に、MSプレート(1リットルあたりでムラシゲ−スクーグ無機塩類4.3g、ショ糖30g 、ミオイノシトール0.1g、ジェランガム2.5g、pH5.7)に置床した。このプレートを25℃の植物インキュベーター（サンヨー製、MLR-350HT）中で、約２週間培養した。発芽後、上記と同様のMS培地を含む植物培養用ポットに移植し、約１ヶ月育成した。
(４) アグロバクテリウムの感染
前記(4) で１ヶ月培養したタバコの葉を、メスで約１．０ｃｍ程度に切りそろえ、液体ＭＳ培地上に浮遊させ、上記(3)にて得た形質転換体、LBA4404/pBI35S:GUSを28℃、２日間培養した培養液50μLを添加し、それぞれ別のシャーレ中で2日間、２5℃、暗黒化で共存培養を行った。
(５) 除菌
共存培養後の葉片を、滅菌水で数回洗浄した。
(６) 形質転換植物の選択
除菌済みのタバコ葉片をカナマイシン（100mg/L）、ハイグロマイシン（20mg/L）、カルベニシリン（250mg/L）、ナフタレン酢酸（0.02mg/L）、ベンジルアミノプリン（1mg/L）を含むMS培地に静置し、光強度４０００ルクスで培養した。以後、１週間毎に新しいＭＳプレートに移植した。形質転換した葉片は増殖を続け、ドーム状に盛り上がったカルス状のものから、約１カ月後、シュートが形成された。
(７) 形質転換植物の再生
シュートとなった植物体の根元を、カルス部分を含まないように剃刃もしくはメスで切り取り、MS培地を含む植物培養用ポットに軽く乗せるように挿して、25℃、16時間の光照射、8時間の暗黒化の条件で育成した。
(８) 形質転換体の確認
前記（８）で育成した植物体から、１枚の葉を切り出し、Plant  DNAZOL(GIBCO BRL社)を用いてでゲノムＤＮＡを抽出し、配列番号11および12のプライマーを用いてPCRを行うことにより、目的のDNA断片が含まれることを確認した。
実施例３：GUS活性の測定
（１）パーティクルガンによるプロモーター活性の評価
前記実施例１（２）で得られたpSAMDCpro1000:ＧＵＳとpBI221を野生型タバコの葉を用いて、パーティクルガン（Bio-Rad社）による一過性発現での、GUS活性を観察した。植物サンプルの準備として、タバコの葉を、0.25%のゲランガムを含む培地状に並べた。撃ち込む粒子は、金粒子60mgを計量し、1mlの70%エタノールを加え、ボルテックスで５分間撹拌した。15分静置後、10000rpm５秒間遠心し、上清を除去後、以下の作業を３回繰り返す。1mlの滅菌水を加え、１分間ボルテックス、１分間静置、10000rpm２秒間遠心、上清除去。繰り返した後、1mlの滅菌水を加え、50μlづつ分注し、−20℃で保存し、金粒子を５分間ボルテックスを行った。ボルテックスをしながら、５μl DNA (1mg/1ml )、50μl 2.5M CaCl2 、20μl 0.1M spermidineを加え、さらに３分間ボルテックスを行い、１分間静置し、微粒子を沈殿させた。10000rpm,10秒間遠心し、上清を除去し、ペレットを乱さないように250μlの100%エタノールを加え、ボルテックスでしっかりと撹拌させた後、遠心を行い上清を除去した。30μl  100%エタノールを添加し、ボルテックスでしっかりと撹拌して、金粒子へｐSAMDCpro1000:ＧＵＳとPBI221を吸着させた。その後、キャリアーディスクを１枚づつ70%エタノール中で洗浄し、十分に乾燥させ、そのキャリアーの中心部分に上記で準備した金粒子を５マイクロμlづつ添加し、乾燥させることにより、パーティクルガンの準備を行った。
【００３９】
パーティクルガンの条件は、金粒子0.1μｍ圧力1350psi、発射口から距離3段でそれぞれ２回ずつ撃ち込んだ。染色は、ＧＵＳ染色液(50mM リン酸バッファー、0.5Mフェリシアン化カリウム、0.5Mフェロシアン化カリウム、1mM X-Gluc)に浸し、真空装置で吸引して溶液を試料内部までよく染み込ませ、３７℃で一晩インキュベートして、GUSのスポットを確認した。（図２，３）
（２）形質転換タバコの染色によるプロモーター活性の確認
前記実施例１（９）および実施例２（８）で得られたLBA4404/pBI101-SAMDCpro1000:GUSとLBA4404/pBI101-SAMDCpro500:GUSとLBA4404/pBI101-35S:GUSによる形質転換タバコを、４℃、暗黒化、４日間の低温処理に続き、25℃、暗黒化、１日間の処理を行ったあと、ＧＵＳ染色液(50mM リン酸バッファー、0.5Mフェリシアン化カリウム、0.5Mフェロシアン化カリウム、1mM X-Gluc)に浸し、真空装置で吸引して溶液を試料内部までよく染み込ませ、３７℃で一晩インキュベートして、クロロフィルを除くため、５０％エタノールに１０分間、１００％エタノールに１０時間浸した。特にLBA4404/pBISAMpro1000:GUSとLBA4404/pBI35S:GUSにおいて、GUSよる染色が見られた (図４，６)。また、LBA4404/pBISAMpro500:GUSでは、GUSによる染色が見られなかった。（図５）。
（３）形質転換タバコの定量的GUS活性の測定
前記実施例１（９）および実施例２（８）で得られたLBA4404/pBI101-SAMDCpro1000:GUSとLBA4404/pBI101-SAMDCpro500:GUSとLBA4404/pBI35S:GUSによる形質転換タバコを、４℃、暗黒化、４日間の低温処理に続き、25℃、暗黒化、１日間の処理を行ったものと、25℃、暗黒化、同期間の処理を行ったものを準備した。GUS 活性は、４−メチルウンベリフェリルグルクロナイド（4-MUG ）を分解して、４ーメチルウンベリフェロン（4-MU）を生成する反応を指標として測定した。処理を行った葉、約１００ｍｇを500μｌの緩衝液（50mM  リン酸ナトリウム(pH 7.0), 10mM EDTA, 0.1% Triton X-100,  0.1% サルコシル）中で、乳鉢と乳棒を用いて磨砕し、磨砕液を遠心分離し、上清を得た。このうち10μｌに90μｌの1ｍＭの４−メチルウンベリフェリルグルクロナイド（4-MUG ）を加え、３７℃で反応を行い、１時間後に、900μｌの０．２Ｍ炭酸ナトリウムを加え反応を停止した。その反応液中に生じた４−メチルアンベリフェロン（4-MU）の蛍光（３６５nm励起、４５５nm発光）を測定し、GUS-活性を算出した。
また、得られた抽出液のタンパク質濃度の定量は、Protein assay reagent （BIO-RAD社）を用いた方法で行った。それぞれの形質転換タバコについて、GUS 活性を測定した結果を下記表１に示す。数字は、1mgの抽出液のタンパク質量あたり、１分間に生成する4-MUの量として示してある。特にLBA4404/pBI101-35Ｓ:GUSでは、温度処理に関係なく、常に強いプロモーター活性が見られた。LBA4404/pBI101-SAMDC1000:GUSでは、低温処理を与えたものに特に強いプロモーター活性が見られた。また、LBA4404/pBI101-SAMDCpro500:GUSでは、プロモーター活性がほとんど見られなかった。（図７、８）
これらの結果より、本発明のＤＮＡは、温度により、キメラ遺伝子を約５〜10倍多く発現させるように制御できることが分かった。
実施例４  SPDSの上流領域を持つ形質転換タバコの作製
(1) スペルミジン合成酵素遺伝子、SPDSの上流領域 (SPDS pro)のクローニングクロダネカボチャ(Cucurbita ficifolia Bouche)の播種後、1ヶ月育成した幼植物体を用いて、Plant  DNAZOL(GIBCO BRL社)を用いてでゲノムＤＮＡを抽出し、インバース(inverse) ＰＣＲ法でゲノムＤＮＡのクローニングを行った。すなわち、制限酵素NcoI、BamHI、SphI、DraI、AIW44I で１μｇのゲノムＤＮＡを切断した後、Ligation high（東洋紡社）でセルフライゲーションさせた。ライゲーションしたＤＮＡ 300ngを鋳型にしてＰＣＲ試薬キット(LA-PCR キット、宝酒造)を用いて、SPDSの５‘上流域を増幅させた。該反応は、配列番号１４および１５に示した核酸配列を有する第１プライマー群を用い、９４℃、１５秒間および６５℃、１２分間を２８サイクル実施した。次に、このＰＣＲ産物を用いて、配列番号１６および１７に示した塩基配列を有する第２プライマー群を用いて、同様の条件でＰＣＲを行った。このＰＣＲ産物を電気泳動で量および長さを確認し、得られたＤＮA断片をAdvanTAge PCR Cloning Kit（Clontech社）を用いて、ベクターｐＴAdvに導入し、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換して、クローニングした。その後、ABI PRISM 310 Genetic Analyzer（ABI社）を用いて、SPDSの５‘上流域塩基配列を決定した。該塩基配列はプライマーの配列よりｃＤＮＡと全て一致し、ｃＤＮＡに対応するゲノム領域であることが確認できた。さらに、転写阿開始点から約1000bpになるように、両端に制限酵素サイト（XbaI、BamHI）を付加した配列番号１８および１９のプライマーを設計し、pBluescriptのMCSへ挿入し、p SPDS 1000proと名付けた。この塩基配列を配列番号１３に示す。さらに同様に転写阿開始点から500bpになるものも配列番号２０および２１により作製し、pSPDS500proと名付けた。この塩基配列を配列番号２２に示す。
(2) β−グルクロニダーゼ遺伝子（ＧＵＳ遺伝子）との融合
β−グルクロニダーゼ遺伝子（ＧＵＳ）を含むプラスミド、pBI221（Clontech社）を制限酵素、BamHIおよびEcoRIで切断した後、アガロースゲル電気泳動を行って、該プラスミド中のＧＵＳ遺伝子を取り出した。このＧＵＳ遺伝子をプラスミド、上記のベクターp SPDS 1000proとp SPDS 500proのpBluescript上の制限酵素、BamHIおよびEcoRIサイトに挿入して、プラスミド、ｐSPDSpro1000:ＧＵＳとｐSPDSCpro500:ＧＵＳを得た。この工程を図９に示す。
また、p SPDS 1000proとp SPDS 500proを制限酵素、XbaI およびBamHIで切断し、電気泳動後、XbaI-BamHI断片をプラスミド、ｐＢＩ１０１−ＨｍB（奈良先端大学、新名淳彦教授から入手）の制限酵素、XbaIおよびBamHIサイトに挿入して、新規なプラスミド、ｐＢＩ101- SPDS pro1000：ＧＵＳとpBI101- SPDS pro500:GUSを得た。次いで、該プラスミド、pBI101-SPDS1000：ＧＵＳとpBI101-SPDS500:GUSで大腸菌ＪＭ１０９を形質転換して、Escherichia coli JM109/pBI101-SPpro1000:GUSおよびEscherichia coli JM109/pBI101-SPpro500:GUSを得た。この工程を図14に示す。
(3) プラスミドのアグロバクテリウムへの導入
（2）で得られた大腸菌、Escherichia coli JM109/pBI101-SPDSpro1000:GUSおよびEscherichia coli JM109/pBI101-SPDSpro500:GUSを、それぞれ５９ｍｇ／Lのカナマイシンを含むＬＢ培地で、３７℃で一晩、培養し、それぞれの大腸菌からプラスミドを抽出した。抽出したプラスミド2μｌとELECTOROMAX A.tumefaciens LBA4404cell（GIBCO BRL社）50μlを混ぜ、ジーンパルサーIIエレクトロポレーションシステム（BIO-RAD社）により、Cuvett Gap 0.2cm、Voltage 2.5KV、Field strength 12.5KV/cm、Capacity 25μF、Resistor200Ωの条件でエレクトロポレーションを行った。その後、SOC培地で２時間、28℃で培養を行い、５０ｍｇ／ｌカナマイシンYEP培地上に塗布した。２８℃で２日間培養した後、単一コロニーを選択した。得られた形質転換体をLBA4404/pBI101- SPDS pro1000:GUS、LBA4404/pBI101- SPDS pro500:GUSと命名した。
(4) 無菌タバコの栽培
タバコの種子（奈良先端大学、新名惇彦教授から入手）数１０粒を１．５ｍｌチューブに入れ、７０％エタノール１ｍｌを加え、３分間放置した。続いて、滅菌液(5％次亜塩素酸ナトリウム、0.02％TritonX-100)に３分間浸し、滅菌水で５回洗浄した後に、MSプレート(1リットルあたりでムラシゲ−スクーグ無機塩類4.3g、ショ糖30g 、ミオイノシトール0.1g、ジェランガム2.5g、pH5.7)に置床した。このプレートを25℃の植物インキュベーター（サンヨー製、MLR-350HT）中で、約２週間培養した。発芽後、上記と同様のMS培地を含む植物培養用ポットに移植し、約１ヶ月育成した。
(5) アグロバクテリウムの感染
前記(4) で１ヶ月培養したタバコの葉を、メスで約１．０ｃｍ程度に切りそろえ、液体ＭＳ培地上に浮遊させ、上記(3)にて得た形質転換体、LBA4404/ pBI101- SPDS pro1000:GUSとLBA4404/ pBI101- SPDS pro500:GUSを28℃、２日間培養した培養液50μLを添加し、それぞれ別のシャーレ中で2日間、２5℃、暗黒化で共存培養を行った。
(6) 除菌
共存培養後の葉片を、滅菌水で数回洗浄した。
(7) 形質転換植物の選択
除菌済みのタバコ葉片をカナマイシン（100mg/L）、ハイグロマイシン（20mg/L）、カルベニシリン（250mg/L）、ナフタレン酢酸（0.02mg/L）、ベンジルアミノプリン（1mg/L）を含むMS培地に静置し、光強度４０００ルクスで培養した。以後、１週間毎に新しいＭＳプレートに移植した。形質転換した葉片は増殖を続け、ドーム状に盛り上がったカルス状のものから、約１カ月後、シュートが形成された。
(8) 形質転換植物の再生
シュートとなった植物体の根元を、カルス部分を含まないように剃刃もしくはメスで切り取り、MS培地を含む植物培養用ポットに軽く乗せるように挿して、25℃、16時間の光照射、8時間の暗黒化の条件で育成した。
(9) 形質転換体の確認
前記（８）で育成した植物体から、１枚の葉を切り出し、Plant  DNAZOL(GIBCO BRL社)を用いてでゲノムＤＮＡを抽出し、配列番号２３および２４のプライマーを用いてPCRを行うことにより、目的のDNA断片が含まれることを確認した。
実施例５：GUS活性の測定
（１）パーティクルガンによるプロモーター活性の評価
前記実施例４（２）で得られたpSPDS pro1000:ＧＵＳとpBI221を野生型タバコの葉を用いて、パーティクルガン（Bio-Rad社）による一過性発現での、GUS活性を観察した。植物サンプルの準備として、タバコの葉を、0.25%のゲランガムを含む培地状に並べた。撃ち込む粒子は、金粒子60mgを計量し、1mlの70%エタノールを加え、ボルテックスで５分間撹拌した。15分静置後、10000rpm５秒間遠心し、上清を除去後、以下の作業を３回繰り返す。1mlの滅菌水を加え、１分間ボルテックス、１分間静置、10000rpm２秒間遠心、上清除去。繰り返した後、1mlの滅菌水を加え、50μlづつ分注し、−20℃で保存し、金粒子を５分間ボルテックスを行った。ボルテックスをしながら、５μl DNA (1mg/1ml )、50μl 2.5M CaCl2 、20μl 0.1M spermidineを加え、さらに３分間ボルテックスを行い、１分間静置し、微粒子を沈殿させた。10000rpm,10秒間遠心し、上清を除去し、ペレットを乱さないように250μlの100%エタノールを加え、ボルテックスでしっかりと撹拌させた後、遠心を行い上清を除去した。30μl  100%エタノールを添加し、ボルテックスでしっかりと撹拌して、金粒子へｐSPDSpro1000:ＧＵＳとPBI221を吸着させた。その後、キャリアーディスクを１枚づつ70%エタノール中で洗浄し、十分に乾燥させ、そのキャリアーの中心部分に上記で準備した金粒子を５マイクロμlづつ添加し、乾燥させることにより、パーティクルガンの準備を行った。
【００４０】
パーティクルガンの条件は、金粒子0.1μｍ圧力1350psi、発射口から距離3段でそれぞれ２回ずつ撃ち込んだ。染色は、ＧＵＳ染色液(50mM リン酸バッファー、0.5Mフェリシアン化カリウム、0.5Mフェロシアン化カリウム、1mM X-Gluc)に浸し、真空装置で吸引して溶液を試料内部までよく染み込ませ、３７℃で一晩インキュベートして、GUSのスポットを確認した。（図１０，１１）
（２）形質転換タバコの染色によるプロモーター活性の確認
前記実施例４（９）で得られたLBA4404/pBI101-SPDSpro1000:GUSによる形質転換タバコを、４℃、暗黒化、４日間の低温処理に続き、25℃、暗黒化、１日間の処理を行ったあと、ＧＵＳ染色液(50mM リン酸バッファー、0.5Mフェリシアン化カリウム、0.5Mフェロシアン化カリウム、1mM X-Gluc)に浸し、真空装置で吸引して溶液を試料内部までよく染み込ませ、３７℃で一晩インキュベートして、クロロフィルを除くため、５０％エタノールに１０分間、１００％エタノールに１０時間浸した。LBA4404/pBISPDSpro1000:GUSにおいて、GUSよる染色が見られた (図１２)。
実施例６  アルギニン脱炭酸酵素の上流領域を持つ形質転換タバコの作製
(1) アルギニン脱炭酸酵素遺伝子、ADCの上流領域 (ADCCpro)のクローニング
クロダネカボチャ(Cucurbita ficifolia Bouche)の播種後、1ヶ月育成した幼植物体を用いて、Plant  DNAZOL(GIBCO BRL社)を用いてでゲノムＤＮＡを抽出し、インバース(inverse) ＰＣＲ法でゲノムＤＮＡのクローニングを行った。すなわち、制限酵素EcoRV、SacI、SphI、で１μｇのゲノムＤＮＡを切断した後、Ligation high（東洋紡社）でセルフライゲーションさせた。ライゲーションしたＤＮＡ 300ngを鋳型にしてＰＣＲ試薬キット(LA-PCR キット、宝酒造)を用いて、ADCの５‘上流域を増幅させた。該反応は、配列番号27および28に示した核酸配列を有する第１プライマー群を用い、９４℃、１５秒間および６５℃、１２分間を２８サイクル実施した。次に、このＰＣＲ産物を用いて、配列番号26および29に示した塩基配列を有する第２プライマー群を用いて、同様の条件でＰＣＲを行った。このＰＣＲ産物を電気泳動で量および長さを確認し、得られたＤＮA断片をAdvanTAge PCR Cloning Kit（Clontech社）を用いて、ベクターｐＴAdvに導入し、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換して、クローニングした。その後、ABI PRISM 310 Genetic Analyzer（ABI社）を用いて、ADCの５‘上流域塩基配列を決定した。該塩基配列はプライマーの配列よりｃＤＮＡと全て一致し、ｃＤＮＡに対応するゲノム領域であることが確認できた。さらに、転写阿開始点から約1000bpになるように、両端に制限酵素サイト（XbaI、BamHI）を付加した配列番号30および31のプライマーを設計し、PCRにより増幅し、TAKARA BKL Kitを用いてPUC118のMCSへ挿入し、pADC1000proと名付けた。この塩基配列を配列番号25に示す。
(2) β−グルクロニダーゼ遺伝子（ＧＵＳ遺伝子）との融合
β−グルクロニダーゼ遺伝子（ＧＵＳ）を含むプラスミド、pBI221（Clontech社）を制限酵素、で切断した後、アガロースゲル電気泳動を行って、該プラスミド中のＧＵＳ遺伝子を取り出した。このＧＵＳ遺伝子をプラスミド、上記のベクターpADC1000proのpBluescript上の制限酵素、BamHIおよびEcoRIサイトに挿入して、プラスミド、ｐADCpro1000:ＧＵＳを得た。この工程を図13に示す。
また、pADC1000proを制限酵素、XbaI およびBamHIで切断し、電気泳動後、XbaI-BamHI断片をプラスミド、ｐＢＩ１０１−ＨｍB（奈良先端大学、新名淳彦教授から入手）の制限酵素、XbaIおよびBamHIサイトに挿入して、新規なプラスミド、ｐＢＩ101-ADCpro1000：ＧＵＳを得た。次いで、該プラスミド、pBI101-ADC1000：ＧＵＳで大腸菌ＪＭ１０９を形質転換して、Escherichia coli JM109/pBI101-ADCpro1000:GUSを得た。この工程を図14に示す。
(3) プラスミドのアグロバクテリウムへの導入
（2）で得られた大腸菌、Escherichia coli JM109/pBI101-ADCpro1000:GUSを、それぞれ５９ｍｇ／Lのカナマイシンを含むＬＢ培地で、３７℃で一晩、培養し、それぞれの大腸菌からプラスミドを抽出した。抽出したプラスミド2μｌとELECTOROMAX A.tumefaciens LBA4404cell（GIBCO BRL社）50μlを混ぜ、ジーンパルサーIIエレクトロポレーションシステム（BIO-RAD社）により、Cuvett Gap 0.2cm、Voltage 2.5KV、Field strength 12.5KV/cm、Capacity 25μF、Resistor200Ωの条件でエレクトロポレーションを行った。その後、SOC培地で２時間、28℃で培養を行い、５０ｍｇ／ｌカナマイシンYEP培地上に塗布した。２８℃で２日間培養した後、単一コロニーを選択した。得られた形質転換体をLBA4404/pBI101-ADCpro1000:GUSと命名した。
(4) 無菌タバコの栽培
タバコの種子（奈良先端大学、新名惇彦教授から入手）数１０粒を１．５ｍｌチューブに入れ、７０％エタノール１ｍｌを加え、３分間放置した。続いて、滅菌液(5％次亜塩素酸ナトリウム、0.02％TritonX-100)に３分間浸し、滅菌水で５回洗浄した後に、MSプレート(1リットルあたりでムラシゲ−スクーグ無機塩類4.3g、ショ糖30g 、ミオイノシトール0.1g、ジェランガム2.5g、pH5.7)に置床した。このプレートを25℃の植物インキュベーター（サンヨー製、MLR-350HT）中で、約２週間培養した。発芽後、上記と同様のMS培地を含む植物培養用ポットに移植し、約１ヶ月育成した。
(5) アグロバクテリウムの感染
前記(4) で１ヶ月培養したタバコの葉を、メスで約１．０ｃｍ程度に切りそろえ、液体ＭＳ培地上に浮遊させ、上記(3)にて得た形質転換体、LBA4404/ pBI101-ADCpro1000:GUSを28℃、２日間培養した培養液50μLを添加し、それぞれ別のシャーレ中で2日間、２5℃、暗黒化で共存培養を行った。
(6) 除菌
共存培養後の葉片を、滅菌水で数回洗浄した。
(7) 形質転換植物の選択
除菌済みのタバコ葉片をカナマイシン（100mg/L）、ハイグロマイシン（20mg/L）、カルベニシリン（250mg/L）、ナフタレン酢酸（0.02mg/L）、ベンジルアミノプリン（1mg/L）を含むMS培地に静置し、光強度４０００ルクスで培養した。以後、１週間毎に新しいＭＳプレートに移植した。形質転換した葉片は増殖を続け、ドーム状に盛り上がったカルス状のものから、約１カ月後、シュートが形成された。
(8) 形質転換植物の再生
シュートとなった植物体の根元を、カルス部分を含まないように剃刃もしくはメスで切り取り、MS培地を含む植物培養用ポットに軽く乗せるように挿して、25℃、16時間の光照射、8時間の暗黒化の条件で育成した。
(9) 形質転換体の確認
前記（８）で育成した植物体から、１枚の葉を切り出し、Plant  DNAZOL(GIBCO BRL社)を用いてでゲノムＤＮＡを抽出し、配列番号23および24のプライマーを用いてPCRを行うことにより、目的のDNA断片が含まれることを確認した。
実施例７  GUS活性の測定
（１）パーティクルガンによるプロモーター活性の評価
前記実施例６（２）で得られたpADCpro1000:ＧＵＳとpBI221を野生型タバコの葉を用いて、パーティクルガン（Bio-Rad社）による一過性発現での、GUS活性を観察した。植物サンプルの準備として、タバコの葉を、0.25%のゲランガムを含む培地状に並べた。撃ち込む粒子は、金粒子60mgを計量し、1mlの70%エタノールを加え、ボルテックスで５分間撹拌した。15分静置後、10000rpm５秒間遠心し、上清を除去後、以下の作業を３回繰り返す。1mlの滅菌水を加え、１分間ボルテックス、１分間静置、10000rpm２秒間遠心、上清除去。繰り返した後、1mlの滅菌水を加え、50μlづつ分注し、−20℃で保存し、金粒子を５分間ボルテックスを行った。ボルテックスをしながら、５μl DNA (1mg/1ml )、50μl 2.5M CaCl2、20μl 0.1M spermidineを加え、さらに３分間ボルテックスを行い、１分間静置し、微粒子を沈殿させた。10000rpm,10秒間遠心し、上清を除去し、ペレットを乱さないように250μlの100%エタノールを加え、ボルテックスでしっかりと撹拌させた後、遠心を行い上清を除去した。30μl  100%エタノールを添加し、ボルテックスでしっかりと撹拌して、金粒子へｐSAMDCpro1000:ＧＵＳとPBI221を吸着させた。その後、キャリアーディスクを１枚づつ70%エタノール中で洗浄し、十分に乾燥させ、そのキャリアーの中心部分に上記で準備した金粒子を５マイクロμlづつ添加し、乾燥させることにより、パーティクルガンの準備を行った。
【００４１】
パーティクルガンの条件は、金粒子0.1μｍ圧力1350psi、発射口から距離3段でそれぞれ２回ずつ撃ち込んだ。染色は、ＧＵＳ染色液(50mM リン酸バッファー、0.5Mフェリシアン化カリウム、0.5Mフェロシアン化カリウム、1mM X-Gluc)に浸し、真空装置で吸引して溶液を試料内部までよく染み込ませ、３７℃で一晩インキュベートして、GUSのスポットを確認した。
（２）形質転換タバコの定量的GUS活性の測定
前記実施例６（９）および実施例２（８）で得られたLBA4404/pBI101-ADCpro1000:GUSとLBA4404/pBI35S:GUSによる形質転換タバコを、４℃、暗黒下、5日間の低温処理に続き、25℃、暗黒下、１日間の処理を行ったものと、25℃、暗黒下、同期間の処理を行ったものと、４℃、光あり、5日間の低温処理に続き、25℃、光あり、１日間の処理を行ったものと、25℃、光有り、同期間の処理を行ったものを準備した。GUS 活性は、４−メチルウンベリフェリルグルクロナイド（4-MUG ）を分解して、４ーメチルウンベリフェロン（4-MU）を生成する反応を指標として測定した。
処理を行った葉、約１００ｍｇを500μｌの緩衝液（50mM  リン酸ナトリウム(pH 7.0), 10mM EDTA, 0.1% Triton X-100,  0.1% サルコシル）中で、乳鉢と乳棒を用いて磨砕し、磨砕液を遠心分離し、上清を得た。このうち10μｌに90μｌの1ｍＭの４−メチルウンベリフェリルグルクロナイド（4-MUG ）を加え、３７℃で反応を行い、１時間後に、900μｌの０．２Ｍ炭酸ナトリウムを加え反応を停止した。その反応液中に生じた４−メチルアンベリフェロン（4-MU）の蛍光（３６５nm励起、４５５nm発光）を測定し、GUS-活性を算出した。
また、得られた抽出液のタンパク質濃度の定量は、Protein assay reagent （BIO-RAD社）を用いた方法で行った。それぞれの形質転換タバコについて、GUS 活性を測定した結果を下記表１に示す。数字は、1mgの抽出液のタンパク質量あたり、１分間に生成する4-MUの量として示してある。特にLBA4404/pBI101-35Ｓ:GUSでは、温度処理に関係なく、常に強いプロモーター活性が見られた。LBA4404/pBI101-ADC1000:GUSでは、低温処理を与えたものに特に強いプロモーター活性が見られた。（図１５,１６）
これらの結果より、本発明のＤＮＡは、光にほとんど左右されることなく、温度により、キメラ遺伝子を約2〜４倍多く発現させるように制御できることが分かった。
【００４２】
【配列表】
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0003772974.tif 000008
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【図面の簡単な説明】
【図１】本発明プロモーターを含有するpSAMDCpro1000:GUS、pSAMDCpro500:GUS およびpBI101-SAMDCpro1000:GUS、 pBI101-SAMDCpro1000:GUS 、pBI101-35S:GUS
の構築工程を表す図である。
【図２】pSAMDCpro1000:ＧＵＳを用いて、タバコの葉で一過性発現を確認した図である。
【図３】pBI221を用いて、タバコの葉で一過性発現を確認した図である。
【図４】LBA4404/pBI101-SAMDCpro1000:GUSによる形質転換タバコをGUS染色した図である。
【図５】LBA4404/pBI101-SAMDCpro500:GUSによる形質転換タバコをGUS染色した図である。
【図６】LBA4404/pBI101-SAMDCpro1000:GUSによる形質転換タバコをGUS染色した図である。
【図７】本発明プロモーターを含有する形質転換タバコのGUS酵素の発現量を定量的に測定し、25℃の活性を1.0とした場合の４℃の活性を相対的に表した図である。前記実施例に記載のLBA4404/pBI101-SAMDCpro1000:GUSとSAMDCpro1000が対応し、LBA4404/pBI101-SAMDCpro500:GUSとSAMDCpro500が対応し、LBA4404/pBI101-35S:GUSと35Sが対応する。それぞれ独立の２ラインを反復数２回で行い、その平均値を表している。
【図８】本発明プロモーターを含有する形質転換タバコのGUS酵素の発現量を定量的に測定した。前記実施例に記載のLBA4404/pBI101-SAMDCpro1000:GUSとSAMDCpro1000が対応し、LBA4404/pBI101-SAMDCpro500:GUSとSAMDCpro500が対応し、LBA4404/pBI101-35S:GUSと35Sが対応する。それぞれ独立の２ラインを反復数２回で行い、その平均値を表している。
【図９】本発明プロモーターを含有するpSPDSpro1000:GUS、pSPDSpro500:GUSの構築工程を表す図である。
【図１０】pSPDS pro1000:ＧＵＳを用いて、タバコの葉で一過性発現を確認した図である。
【図１１】pBI221を用いて、タバコの葉で一過性発現を確認した図である。
【図１２】LBA4404/pBI101-SPDSpro1000:GUSによる形質転換タバコをGUS染色した図である。
【図１３】pBI101-SPDSpro1000:GUSと pBI101-ADCpro1000:GUSの構築工程を表す図である。
【図１４】pBI101-SPDSpro1000:GUS、pBI101-SPDSpro500と pBI101-ADCpro1000:GUSの構築工程を表す図である。
【図１５】本発明プロモーターを含有する形質転換タバコのGUS酵素の発現量を定量的に測定し、25℃の活性を1.0とした場合の４℃の活性を相対的に表した図である。前記実施例に記載のLBA4404/pBI101-ADCpro1000:GUSとSAMDCpro1000が対応し、LBA4404/pBI101-35S:GUSと35Sが対応する。darkは暗黒下で処理を行ったサンプル、lightは光がある条件で処理を行ったサンプルである。それぞれ独立の２ラインを反復数２回で行い、その平均値を表している。
【図１６】本発明プロモーターを含有する形質転換タバコのGUS酵素の発現量を定量的に測定した。前記実施例に記載のLBA4404/pBI101-ADCpro1000:GUSとSAMDCpro1000が対応し、LBA4404/pBI101-35S:GUSと35Sが対応する。darkは暗黒下で処理を行ったサンプル、lightは光がある条件で処理を行ったサンプルである。それぞれ独立の２ラインを反復数２回で行い、その平均値を表している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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