(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト好中球エラスターゼを阻害する非天然タンパク質であって、少なくとも非天然のクニッツドメインのコア配列を含んでなり、該非天然クニッツドメイン中のウシ膵臓トリプシンインヒビター（ＢＰＴＩ）の１５位に相当する位置のアミノ酸がIle，ValまたはAlaであり、１８位に相当する位置の残基がＰｈｅであって、ＢＰＴＩの３９−４２位に相当する位置の残基が非荷電アミノ酸であることを特徴とするタンパク質、ここでクニッツドメインとはＢＰＴＩの５、３０、５１、５５位に相当する位置にＣｙｓを、ＢＰＴＩの１２位に相当する位置にＧｌｙを、ＢＰＴＩの４３位に相当する位置にＡｓｎを、ＢＰＴＩの３３位に相当する位置にＰｈｅを有する（ただしＢＰＴＩの１４位と３８位に相当する位置がＣｙｓである場合はＢＰＴＩの３７位に相当する位置はＧｌｙである）ドメインを指し、コア配列とはＢＰＴＩの５-５５位に相当する位置の残基を指すものである。
【請求項２】
ＢＰＴＩの１-５８位に相当する位置の残基からなる、請求項１記載のタンパク質。
【請求項３】
ＢＰＴＩの１４,３８位に相当する位置の残基がＣｙｓであり、３７位に相当する位置の残基がＧｌｙであることを特徴とする、請求項１または２に記載のタンパク質。
【請求項４】
ＢＰＴＩの４５位に相当する位置の残基がＰｈｅで、４３位に相当する位置の残基がＡｓｎであることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載のタンパク質。
【請求項５】
ＢＰＴＩの１５位に相当する位置の残基がＶａｌであることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載のタンパク質。
【請求項６】
ＢＰＴＩの１５位に相当する位置の残基がＩｌｅであることを特徴とする、請求項１−３に記載のタンパク質。
【請求項７】
BPTIの１５位に相当する位置の残基がAlaであることを特徴とする、請求項１から３に記載のタンパク質。
【請求項８】
ＢＰＴＩの１６位に相当する位置の残基がＡｌａまたはＧｌｙであることを特徴とする、請求項１〜７のいずれかに記載のタンパク質。
【請求項９】
ＢＰＴＩの１７位に相当する位置の残基がＭｅｔ，Ｐｈｅ，ＩｌｅまたはＬｅｕであることを特徴とする、請求項１〜８のいずれかに記載のタンパク質。
【請求項１０】
ＢＰＴＩの１９位に相当する位置の残基がＰｒｏ，Ｓｅｒ、ＬｙｓまたはＧｌｎであることを特徴とする、請求項１〜９のいずれかに記載のタンパク質。
【請求項１１】
ＢＰＴＩの１６位に相当する位置の残基がＡｌａであることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれかに記載のタンパク質。
【請求項１２】
ＢＰＴＩの１７位に相当する位置の残基がＰｈｅであることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれかに記載のタンパク質。
【請求項１３】
ＢＰＴＩの１９位に相当する位置の残基がＰｒｏであることを特徴とする、請求項１〜１２のいずれかに記載のタンパク質。
【請求項１４】
ＢＰＴＩの３９位に相当する位置の残基がＭｅｔであることを特徴とする、請求項１〜１３のいずれかに記載のタンパク質。
【請求項１５】
ＢＰＴＩの４０位に相当する位置の残基がＧｌｙ，Ａｌａ，Ｓｅｒ，Ａｓｎ，ＴｈｒまたはＰｒｏであることを特徴とする、請求項１〜１４のいずれかに記載のタンパク質。
【請求項１６】
ＢＰＴＩの４０位に相当する位置の残基がＧｌｙまたはＡｌａであることを特徴とする、請求項１〜１５のいずれかに記載のタンパク質。
【請求項１７】
ＢＰＴＩの４０位に相当する位置の残基がＧｌｙであることを特徴とする、請求項１〜１６のいずれかに記載のタンパク質。
【請求項１８】
ＢＰＴＩの４１位に相当する位置の残基がＡｓｎ，Ｇｌｎ，Ｓｅｒ，ＴｈｒまたはＡｌａであることを特徴とする、請求項１〜１７のいずれかに記載のタンパク質。
【請求項１９】
ＢＰＴＩの４１位に相当する位置の残基がＡｓｎであることを特徴とする、請求項１〜１８のいずれかに記載のタンパク質。
【請求項２０】
ＢＰＴＩの４２位に相当する位置の残基がＧｌｙであることを特徴とする、請求項１〜１９のいずれかに記載のタンパク質。
【請求項２１】
ＢＰＴＩの４０位に相当する位置の残基がＧｌｙであり、４２位に相当する位置の残基に相当する位置の残基がＧｌｙであることを特徴とする、請求項１〜２０のいずれかに記載のタンパク質。
【請求項２２】
ＢＰＴＩの４０位に相当する位置の残基がＧｌｙであり、４１位がＡｓｎであり、４２位がＧｌｙであることを特徴とする、請求項１〜２１のいずれかに記載のタンパク質。
【請求項２３】
ＢＰＴＩの３９位に相当する位置の残基がＭｅｔであり、４０位がＧｌｙであり、４１位がＡｓｎであり、４２位がＧｌｙであることを特徴とする、請求項１〜２２のいずれかに記載のタンパク質。
【請求項２４】
ＢＰＴＩの３１位に相当する位置の残基がＧｌｎであることを特徴とする、請求項１〜２３のいずれかに記載のタンパク質。
【請求項２５】
ＢＰＴＩの３４位に相当する位置の残基がＰｒｏであることを特徴とする、請求項１〜２４のいずれかに記載のタンパク質。
【請求項２６】
ＢＰＴＩの３４位に相当する位置の残基がＶａｌであることを特徴とする、請求項１〜２４のいずれかに記載のタンパク質。
【請求項２７】
ＢＰＴＩの１位に相当する位置の残基がＡｒｇであることを特徴とする、請求項１〜２６のいずれかに記載のタンパク質。
【請求項２８】
ＢＰＴＩの２位に相当する位置の残基がＰｒｏであることを特徴とする、請求項１〜２７のいずれかに記載のタンパク質。
【請求項２９】
ＢＰＴＩの３位に相当する位置の残基がＡｓｐであることを特徴とする、請求項１〜２８のいずれかに記載のタンパク質。
【請求項３０】
ＢＰＴＩの４位に相当する位置の残基がＰｈｅであることを特徴とする、請求項１〜２９のいずれかに記載のタンパク質。
【請求項３１】
当該請求項において特定されていない位置に対応する各アミノ酸残基がヒトＩＴＩの軽鎖のクニッツドメインの１つと同じであることを特徴とする、請求項１〜３０のいずれかに記載のタンパク質。
【請求項３２】
当該請求項において特定されていない位置に対応する各アミノ酸残基がＢＰＴＩまたはヒトＩＴＩの軽鎖の第１のクニッツドメイン（ヒトＩＴＩ−Ｄ１）と同じであることを特徴とする請求項１〜３１のいずれかに記載のタンパク質。
【請求項３３】
該ドメインが配列番号1，4，5，12-26，29-35に対するよりも配列番号27，28に対して同一性が高いことを特徴とする、請求項１〜３２のいずれかに記載のタンパク質。
【請求項３４】
該非天然クニッツドメインのコアアミノ酸配列が、ＢＰＴＩのコアアミノ酸配列に対してよりもヒトＩＴＩ−Ｄ１のそれに対して同一性が高いことを特徴とする、請求項１〜３３のいずれかに記載のタンパク質。
【請求項３５】
該ドメインのコア配列がＢＰＴＩの１３−２１位に相当する位置の残基に配列番号４１−４９からなる群から選択される配列を含み
なおかつ、ＢＰＴＩの１３−２１位に相当する位置以外の残基に相当する配列が、
ＢＰＴＩの１位に相当する位置に、いずれのアミノ酸でも，
ＢＰＴＩの２位に相当する位置に、いずれのアミノ酸でも，
ＢＰＴＩの３位に相当する位置に、いずれのアミノ酸でも，
ＢＰＴＩの４位に相当する位置に、Ｙ、
ＢＰＴＩの６位に相当する位置に、Ｐ以外のいずれのアミノ酸でも
ＢＰＴＩの７位に相当する位置に、L，S，T，D，N，KまたはR、
ＢＰＴＩの８位に相当する位置に、いずれのアミノ酸でも，
ＢＰＴＩの９位に相当する位置に、いずれのアミノ酸でも，
ＢＰＴＩの１０位に相当する位置に、Ｐ以外のいずれのアミノ酸でも，
ＢＰＴＩの２２位に相当する位置に、Ｐ以外のいずれのアミノ酸でも，
ＢＰＴＩの２３位に相当する位置に、YまたはF，
ＢＰＴＩの２４位に相当する位置に、Ｐ以外のいずれのアミノ酸でも，
ＢＰＴＩの２５位に相当する位置に、いずれのアミノ酸でも，
ＢＰＴＩの２６位に相当する位置に、いずれのアミノ酸でも，
ＢＰＴＩの２７位に相当する位置に、いずれのアミノ酸でも，
ＢＰＴＩの２８位に相当する位置に、Ｐ以外のいずれのアミノ酸でも，
ＢＰＴＩの２９位に相当する位置に、Ｐ以外のいずれのアミノ酸でも，
ＢＰＴＩの３１位に相当する位置に、Ｐ以外のいずれのアミノ酸でも，
ＢＰＴＩの３２位に相当する位置に、Ｐ以外のいずれのアミノ酸でも，
ＢＰＴＩの３５位に相当する位置に、Ｙ，ＷまたはＦ，
ＢＰＴＩの４４位に相当する位置に、S，K，R，T，Q，DまたはE，
ＢＰＴＩの４５位に相当する位置に、Y，
ＢＰＴＩの４６位に相当する位置に、Ｐ以外のいずれのアミノ酸でも，
ＢＰＴＩの４７位に相当する位置に、T，N，AまたはG，
ＢＰＴＩの４８位に相当する位置に、いずれのアミノ酸でも，
ＢＰＴＩの４９位に相当する位置に、いずれのアミノ酸でも，
ＢＰＴＩの５０位に相当する位置に、いずれのアミノ酸でも，
ＢＰＴＩの５２位に相当する位置に、いずれのアミノ酸でも，
ＢＰＴＩの５３位に相当する位置に、いずれのアミノ酸でも，
ＢＰＴＩの５４位に相当する位置に、いずれのアミノ酸でも，
ＢＰＴＩの５６位に相当する位置に、いずれのアミノ酸でも，
ＢＰＴＩの５７位に相当する位置に、いずれのアミノ酸でも，
または、ＢＰＴＩの５８位に相当する位置に、いずれのアミノ酸でも，
からなる群から選択される１以上の置換を有する請求項１〜３４のいずれかに記載のタンパク質。
【請求項３６】
該ドメインのコア配列がＢＰＴＩの１３−２１位に相当する位置の残基に配列番号４１−４９からなる群から選択される配列を含み
なおかつ、ＢＰＴＩの１３−２１位に相当する位置以外の残基に相当する配列が
ＢＰＴＩの１位に相当する位置に、いずれのアミノ酸でも，
ＢＰＴＩの２位に相当する位置に、いずれのアミノ酸でも，
ＢＰＴＩの３位に相当する位置に、いずれのアミノ酸でも，
ＢＰＴＩの６位に相当する位置に、Ｐ以外のいずれのアミノ酸でも
ＢＰＴＩの７位に相当する位置に、L，S，T，D，N，KまたはR、
ＢＰＴＩの８位に相当する位置に、いずれのアミノ酸でも，
ＢＰＴＩの９位に相当する位置に、いずれのアミノ酸でも，
ＢＰＴＩの２４位に相当する位置に、Ｐ以外のいずれのアミノ酸でも，
ＢＰＴＩの２５位に相当する位置に、いずれのアミノ酸でも，
ＢＰＴＩの２６位に相当する位置に、いずれのアミノ酸でも，
ＢＰＴＩの２７位に相当する位置に、いずれのアミノ酸でも，
ＢＰＴＩの２８位に相当する位置に、Ｐ以外のいずれのアミノ酸でも，
ＢＰＴＩの２９位に相当する位置に、Ｐ以外のいずれのアミノ酸でも，
ＢＰＴＩの４９位に相当する位置に、いずれのアミノ酸でも，
ＢＰＴＩの５０位に相当する位置に、いずれのアミノ酸でも，
ＢＰＴＩの５２位に相当する位置に、いずれのアミノ酸でも，
ＢＰＴＩの５３位に相当する位置に、いずれのアミノ酸でも，
ＢＰＴＩの５４位に相当する位置に、いずれのアミノ酸でも，
ＢＰＴＩの５６位に相当する位置に、いずれのアミノ酸でも，
ＢＰＴＩの５７位に相当する位置に、いずれのアミノ酸でも，
または、ＢＰＴＩの５８位に相当する位置に、いずれのアミノ酸でも，
からなる群から選択される１以上の置換を有する請求項１〜３４のいずれかに記載のタンパク質。
【請求項３７】
該ドメインのコア配列が、ＢＰＴＩの１３−２１位に相当する位置の残基に、配列番号４１−４９からなる群から選択されるタンパク質のコア配列のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を有する、請求項１または２に記載のタンパク質。
【請求項３８】
ＢＰＴＩの１３−２１位に相当する位置に配列番号４１−４９からなる群から選択される配列を有する請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３９】
該ドメインのコア配列が、配列番号51，53，54，55，56，57，59，60及び61からなる群から選択されるタンパク質のコア配列のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を有する、請求項１または２に記載のタンパク質。
【請求項４０】
配列番号51，53，54，55，56，57，59，60及び61からなる群から選択される、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項４１】
配列番号51，53，54，55，56，57，59，60及び61からなる群から選択される参照インヒビターのコア配列とは
ＢＰＴＩの１位に相当する位置に、いずれのアミノ酸でも，
ＢＰＴＩの２位に相当する位置に、いずれのアミノ酸でも，
ＢＰＴＩの３位に相当する位置に、いずれのアミノ酸でも，
ＢＰＴＩの６位に相当する位置に、Ｐ以外のいずれのアミノ酸でも
ＢＰＴＩの７位に相当する位置に、L，S，T，D，N，KまたはR、
ＢＰＴＩの８位に相当する位置に、いずれのアミノ酸でも，
ＢＰＴＩの９位に相当する位置に、いずれのアミノ酸でも，
ＢＰＴＩの２４位に相当する位置に、Ｐ以外のいずれのアミノ酸でも，
ＢＰＴＩの２５位に相当する位置に、いずれのアミノ酸でも，
ＢＰＴＩの２６位に相当する位置に、いずれのアミノ酸でも，
ＢＰＴＩの２７位に相当する位置に、いずれのアミノ酸でも，
ＢＰＴＩの２８位に相当する位置に、Ｐ以外のいずれのアミノ酸でも，
ＢＰＴＩの２９位に相当する位置に、Ｐ以外のいずれのアミノ酸でも，
ＢＰＴＩの４９位に相当する位置に、いずれのアミノ酸でも，
ＢＰＴＩの５０位に相当する位置に、いずれのアミノ酸でも，
ＢＰＴＩの５２位に相当する位置に、いずれのアミノ酸でも，
ＢＰＴＩの５３位に相当する位置に、いずれのアミノ酸でも，
ＢＰＴＩの５４位に相当する位置に、いずれのアミノ酸でも，
ＢＰＴＩの５６位に相当する位置に、いずれのアミノ酸でも，
ＢＰＴＩの５７位に相当する位置に、いずれのアミノ酸でも，
または、ＢＰＴＩの５８位に相当する位置に、いずれのアミノ酸でも，
からなる群から選択される置換が１つ以上ある点が違うだけであるアミノ酸配列を含んでなる、請求項１〜４０のいずれかに記載のタンパク質。
【請求項４２】
配列番号51，53，54，55，56，57，59，60及び61からなる群から選択される参照インヒビターのコア配列とは
ＢＰＴＩの１位に相当する位置に、いずれのアミノ酸でも，
ＢＰＴＩの２位に相当する位置に、いずれのアミノ酸でも，
ＢＰＴＩの３位に相当する位置に、いずれのアミノ酸でも，
ＢＰＴＩの４位に相当する位置に、Ｙ、
ＢＰＴＩの６位に相当する位置に、Ｐ以外のいずれのアミノ酸でも
ＢＰＴＩの７位に相当する位置に、L，S，T，D，N，KまたはR、
ＢＰＴＩの８位に相当する位置に、いずれのアミノ酸でも，
ＢＰＴＩの９位に相当する位置に、いずれのアミノ酸でも，
ＢＰＴＩの１０位に相当する位置に、Ｐ以外のいずれのアミノ酸でも，
ＢＰＴＩの２２位に相当する位置に、Ｐ以外のいずれのアミノ酸でも，
ＢＰＴＩの２３位に相当する位置に、YまたはF，
ＢＰＴＩの２４位に相当する位置に、Ｐ以外のいずれのアミノ酸でも，
ＢＰＴＩの２５位に相当する位置に、いずれのアミノ酸でも，
ＢＰＴＩの２６位に相当する位置に、いずれのアミノ酸でも，
ＢＰＴＩの２７位に相当する位置に、いずれのアミノ酸でも，
ＢＰＴＩの２８位に相当する位置に、Ｐ以外のいずれのアミノ酸でも，
ＢＰＴＩの２９位に相当する位置に、Ｐ以外のいずれのアミノ酸でも，
ＢＰＴＩの３１位に相当する位置に、Ｐ以外のいずれのアミノ酸でも，
ＢＰＴＩの３２位に相当する位置に、Ｐ以外のいずれのアミノ酸でも，
ＢＰＴＩの３５位に相当する位置に、Ｙ，ＷまたはＦ，
ＢＰＴＩの４４位に相当する位置に、S，K，R，T，Q，DまたはE，
ＢＰＴＩの４５位に相当する位置に、Y，
ＢＰＴＩの４６位に相当する位置に、Ｐ以外のいずれのアミノ酸でも，
ＢＰＴＩの４７位に相当する位置に、T，N，AまたはG，
ＢＰＴＩの４８位に相当する位置に、いずれのアミノ酸でも，
ＢＰＴＩの４９位に相当する位置に、いずれのアミノ酸でも，
ＢＰＴＩの５０位に相当する位置に、いずれのアミノ酸でも，
ＢＰＴＩの５２位に相当する位置に、いずれのアミノ酸でも，
ＢＰＴＩの５３位に相当する位置に、いずれのアミノ酸でも，
ＢＰＴＩの５４位に相当する位置に、いずれのアミノ酸でも，
ＢＰＴＩの５６位に相当する位置に、いずれのアミノ酸でも，
ＢＰＴＩの５７位に相当する位置に、いずれのアミノ酸でも，
または、ＢＰＴＩの５８位に相当する位置に、いずれのアミノ酸でも，
からなる群から選択される置換が１つ以上ある点が違うだけであるアミノ酸配列を含んでなる、請求項１〜４０のいずれかに記載のタンパク質。
【請求項４３】
（a）BPTIの１５位に相当する位置の残基がValまたはIleであり、及び／または（ｂ）BPTIの１７位に相当する位置の残基がPheであることを特徴とする、請求項１のタンパク質。
【請求項４４】
該クニッツドメインのアミノ酸配列が配列番号１から４０のアミノ酸配列のいずれとも同一ではない、請求項１から４３のいずれかに記載のタンパク質。
【請求項４５】
該変異クニッツドメインを少なくとも２つ含んでなる、請求項１から３７、３９、４１から４４のいずれかに記載のタンパク質。
【請求項４６】
ヒト好中球エラスターゼに対し、強い（１０-9＞Kd＞１０-11M）あるいはきわめて強い（Kd＜１０-11M）結合親和性を有する、請求項１から４５のいずれかに記載のタンパク質。
【請求項４７】
キメラファージタンパクであることを特徴とする、請求項１から４６のいずれかに記載のタンパク質。
【請求項４８】
PEG化された形態であることを特徴とする、請求項１から４７のいずれかに記載のタンパク質。
【請求項４９】
ヒト好中球エラスターゼを結合するために使用される請求項１から４７のいずれかに記載のタンパク質。
【請求項５０】
ヒト好中球エラスターゼ活性を阻害するために使用される、請求項１から４７のいずれかに記載のタンパク質。
【請求項５１】
有害なヒト好中球エラスターゼ活性を阻害するために使用される、請求項４１から４７のいずれかに記載のタンパク質。
【請求項５２】
過剰なヒト好中球エラスターゼ活性を阻害するために使用される、請求項１から４７のいずれかに記載のタンパク質。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
発明分野
この発明は新しいプロテアーゼ抑制因子、特に人体の好中球エラスターゼ（hNE）を抑制する小さな蛋白質と人体カテプシンG（hCG）を抑制する蛋白質とに関連するものである。
背景となる技術の説明
好中球エラスターゼとカテプシンG。セリン・プロテアーゼの活性部位は非常に類似している。トリプシン、キモトリプシン、好中球エラスターゼ、カテプシンGその他のプロテアーゼは非常に強い連続した相同性を持っている。いわゆる触媒性三価元素（標準キモトリプシン番号）は、アスパラギン酸102、ヒスチジン57、セリン195から成り立っている。触媒性三価元素に近い残留物（残基、以下同じ）は、特定の酵素の基質を決定する。（CRE184，p366〜7参照）
消化酵素トリプシン、ひ臓エラスターゼ、キモトリプシンの構造と機能については好中球エラスターゼよりも詳しく研究されている。基質を合わせたhNEのレントゲン構造が解明されてhNEの活性部位とトリプシンのそれとの類似性が非常に強いことが判明している。hNEの特殊性はトリプシンより高い、ファクターXよりも低い。
セリン・プロテアーゼは生体組織に遍在し、次のような過程で大切な役割を果たす。消化、血液凝固、繊維素溶解、免疫反応、受精、ペプチド・ホルモンの並進運動後のプロセスなど。こうした酵素が果たす役割は重要とはいえ、制御されない不適切な蛋白質融解活動は非常に有害である。幾つかのセリン・プロテアーゼは深刻な疾患の直接原因となっている。
人体の好中球エラスターゼ（hNE、またはHLE、EC3.4.21.11）は、細胞外マトリックス・コンポーネント（CAMP82、CAMP88、MCWH89、その他照合）に対する幅広い範囲の活動を行なう29Kd血清プロテアーゼである。
この酵素は、ポリモルフ核白血球の好アズール性か粒の主要な中性プロテアーゼのひとつで、病原体排除と接続組織の再構築（TRAV88）に関わるものである。循環アルファ1抗プロテアーゼ抑制因子（α1-PI）、hNEの生理学的抑制因子（HEID86）の遺伝性減少や、α1-PIの酸化による非活性化（喫煙者の気腫）においては、肺組織の広範な破壊はhNE（CANT89、BEIT86、HUBB86、HUBB89a,b、HUTC87、SOMM90、WEWE87）のエラスチン分解活動の不制御が原因であることがある。嚢包性繊維症や気腫など人体に見られる気管系統の疾患の幾つかは、肺臓の上皮表面の好中球（SNID91、MCEL91、GOLD86）への負担が増加することに特徴が見られ、好中球からのhNE放出はこれらの疾患の進行と関係している。（MCEL91、WEIS89）hNEは嚢包性繊維症に見られる次の悪循環の主要な成分である。（CF）（NADE90）
（好中球によるプロテアーゼの過剰分泌）
（炎症）
（好中球の補充）
hNEの不適当な活動は非常に有害で、気腫の進行を止めたり、CFの症状を緩和させるには、親和性の非常に高い抑制因子が必要とされる。抑制因子は他の有益なセリン・プロテアーゼやエステラーゼを抑制しないように、hNEに特定のものでなければならない。ナデル（NADE90）は過剰分泌の開始は10-10M  hNEにより始まり、したがって、抑制因子は自由hNEの濃度をこのレベルよりもずっと低く押さえなければならない。したがって、hNEは優れた抑制因子を必要とする酵素である。
プロテナーゼ3（p29やPRー3としても知られる）は非常に重要で、hNEよりもさらに重要であると示唆する報告もある。NILE89、ARNA90、KAOR88、CAMP90、GUPT90を参照。カテプシンGは好中球が生産する別のプロテアーゼで、過剰に分泌されると疾患の原因となり得る。
FERR90、PETE89、SALV87、SOMM90を参照。
カテプシンGはhNEより不安定で、試験管内で検査するのはより難しい。パワーとハーパー（POWE86）は、カテプシンGは炎症、気腫、成年の気管系統疾患、類リューマチ性関節炎に関与していると述べている。
蛋白セリウム・セリン・プロテアーゼ抑制因子。多数の蛋白質は、敵対する酵素に対して限定して蛋白融解基質を制限することによって、セリン・プロテアーゼ抑制因子として作用する。多くの場合、反応部位ペプチド結合（小片結合（易切断性結合、以下同様））は、少なくともひとつの2硫酸塩ループに取り囲まれている。これにより、新生の抑制因子が修正抑制因子に変換する再にふたつのペプチド鎖が分断されないようになっている。
抑制因子の活性部位を説明するために特殊な命名法が発達した。小片結合のアミノ面の残留物から始まり、結合を離れた残余物はP1、P2、P3というように命名される。（sche67）小片結合に従っていく残留物はP1'、P2'、P3'というように命名される。全体的に見て構造に大きな違いがある蛋白質抑制因子の主鎖はP3とP3'までの範囲でで非常に酷似しており、特にP2とP2'、P1とP1'でも類似性は非常に高い。（LASK80とその他本書で引用されるもの）各セリン・プロテアーゼには部位S1、S2、などがあり、基質や抑制因子のP1、P2などの残留物のサイドグループを受け取ることと、部位S1'、S2'などがあり、基質や抑制因子からP1'やP2'のサイドグループを受け取ることは一般に認められている。（SCHE67）これはS部位と、プロテアーゼに関して基質や抑制因子に関するプロテアーゼ特殊性を与えるPサイドグループとの相互作用である。
セリン・プロテアーゼ抑制因子は順序類似性と、活性部位と二硫酸塩ループの位相関係の両方にしたがって科にグループ分けされる。科には牛のひ臓トリプシン抑制因子（クニッツ）、ひ臓分泌トリプシン抑制因子（カザル）、ボウマン-カーク抑制因子、大豆トリプシン抑制因子（クニッツ）科がある。
抑制因子には、単一のポリペプチド鎖に幾つかの反応部位を持つものもあり、これらの個々のドメインは順序や特殊性、ひいては位相においてさえ違いを持つことがある。
これらの抑制因子のさらに変わった特徴に、P1残余物交換後もある程度の抑制機能を維持することが挙げられる。P5からP5'の域、特にP3からP3>の域において、置換アミノ酸が抑制因子の特殊性に大きな影響を及ぼすことが発見されている。LASK80は、BPTI（クニッツ）科において、P1LysとArgを持つ抑制因子はトリプシンを抑制する傾向があり、P1=Tyr、Phe、Trp、Leu、Metを持つものはキモトリプシンを抑制し、PI=AlaまたはSerを持つ抑制因子はエラステーゼを抑制する傾向があると示している。またさらに続けて、カザル抑制因子の中では、p1=LeuまたはMetを持つものはエラステーゼの強力な抑制因子であり、ボウマン-カーク科のエラステーゼはP1Alaにより抑制されるが、P1Leuでは抑制されないと述べている。
次に蛋白セリウム抗エラステーゼと抗カテプシンG抑制因子について話を進めていきたい。HNEとガテプシンG抑制因子として知られているものに、クニッツ科抑制因子UTI（GEBH6）、エグリン／大麦科抑制因子エグリン（SCHN86b）、そしてセルピン科抑制因子アルファ-抗キモトリプシンとアルファ抗トリプシン（BARR86）がある。
α1-プロテナーゼ抑制因子（α1-抗トリプシン）。hNEレベル過剰による疾患の治療法として論理的なアプローチは、内因性で不可逆性の抑制因子、α1-PIを処置することである。STON90はhNEによる損害からハムスターの肺を守るためのα1-P1の効能についての研究を報告している。これによると、α1-P1は実験測定により推定されるように生体内においては約16％だけが活性であると結論された。それにもかかわらず、α1-P1は治療効果を示している。嚢法性繊維症の患者にα1-P1をエアゾール塗布したところ、こうした治療は気管組織と損傷防止と抗マイクロビアル防御の増加の両方に効果があることが示された。（MCEL91）
しかし、肺用抗エラスチン分解剤として定期的に使用するには実際面で幾つかの問題があった。それには、分子が比較的大きいこと（残留物394、51Kd）、分子間を安定させる2硫酸塩ブリッジ、そして3つの部位でのグリコサイレーション（glycosylation）による蛋白質の並進後の修正の欠如が含まれる。HEIM91は、プロテアーゼ抑制因子によるPMN白血球仲介内皮細胞薄離の抑制を報告している。これは、白血球プロテアーゼ抑制因子分泌（SLPI）、α1-プロテアーゼ抑制因子（α1-PI）、クロロメチルケトン抑制因子（CMK）を比較している。SLPIとCMKはhNE仲介細胞薄離を抑制するが、α1-PIは抑制しない。著者は、その大きさのためα1-PIはhNEが活動する場所に浸透できないのではないかと提案している。この発明で公開される抑制因子はSLPIよりも小さく、細胞外の隙間を自由に通過できるものと私たちは考えている。
さらに、分割されるα1-PIとα1-PI／hNE複合体（BAND88a、b）は両方とも好中球化学誘因子になりえる。好中球の過剰数が肺に流出し、hNEを放出し、hNEがα1-PIと反応してより多くの好中球を肺に送るというサイクルを遮断しようとする者にとって、これは非常に不利なことである。したがって、小さくて安定して、無害で、hNEの抑制因子となり得るものが治療において優れた価値を持つ。
人体ひ臓分泌トリプシン抑制因子。これはカザル科抑制因子である。この科の抑制因子は酵素原粒子に保存され、ひ臓液の酵素原とともに分泌される。一般には、自然な状態ではカザル抑制因子はトリプシンを抑制するものである。しかし例外もあり、卵類粘液質や卵抑制因子などのように、キモトリプシン、サブティリシン、エラスターゼを抑制するものもある。
野性のタイプのhPSTIはhNEに対してはまったく無活動であるが、コリンズ他（COLL90）は、人体ひ臓分泌トリプシン抑制因子（hPSTI）で設計された変種ではhNEに対して優れた効能を持つものもあると報告している。hNE10pM以下、7.3pMでのPSTI-5D36、7pMでのPSTI-4A40、5.2pMでのPSTI-4F21に対するKiを持つ3変種が報告されている。
ウリ種抑制因子。ウリ種抑制因子は、さらにもう一種のセリンプロテアーゼ抑制因子である。これまでに報告されたものは、P1残基にあるリシン又はアルギニンであり、トリプシンを抑制するもので、hNEに対しては完全に不活性であった。マックワーターその他（1989年）はスックオッシュ種の抑制因子であるCMTI-IIIの同族体数個を合成した。CMTI-IIIは約1.5・10-12MのトリプシンのKiがある。マックワーターその他（1989年）は、HLE（hNEと同じ）の特性を共有する、P1における「比較的かさのある疏水性物質のグループ」を置き換えることを勧めている。カテプシンGに関してはかさのある（特に芳香族の）サイドグループが強く好まれることを期待していた。彼らはPHE、LEU、MET、及びALAがその基準どおり機能することが分かった。TRP、TYR、及びHISはテストしなかった。（ALAが利用できる二番目に小さいサイドグループであることに注意）。彼らは更に代用残基のより広範に及ぶグループ（VAL、ILE、LEU、ALA、PHE、MET、及びGLY）がHLEに探知可能な結合をしていることを発見した。特に、hNEと比較してCMTI-III（VAL5）はKi＝9nMである。
「クニッツ」ドメイン・タンパク質抑制因子。ウシ膵臓・トリプシン抑制因子（BPTI、a.k.a.アプロトニン）は、BPTI（Kunitz）ドメイン（KuDom）グループに属する58a.a.セリンタンパク質抑制因子である。TRASYLOLという商標のもとで、これは膵臓の間に分泌されるトリプシンの影響を抑えるために使われる。58アミノ酸の配列が知られているだけでなく、BPTIの三次元構造がX線の回折（HUBE77、MARQ83、WLOD84、WLOD87a、WLOD87b）、ニュートロン回折（WLOD84）、及びNMR（WAGN87）によって高解像に求められている。X線の構造の一つはブルックヘーブン・プロテイン・データバンクに「6PTI」［sic］として預けられている。多様なBPTIの同族（EIGE90、HYNE90）の三次元構造も知られている。少なくとも60個の同族が報告されており、39個の同族の配列が表13に示されている。更に各位置に現れるアミノ酸の種類が表15に示されている。ヒトに見られるタンパク質の同族には、リポプロテイン関係凝固抑制因子（LACI）（WUNT88、GIRA89）、インターαトリプシン抑制因子（ALBR83a、ALBR83b、DIAR90、ENGH89、TRIB86、GEBH86、GEBH90、KAUM86、ODOM90、SALI90）、及びアルツハイマー・ベータ・アミロイド・プレカーサー・タンパク質がある。円形BPTI及び円形に変えられたBPTIは、BPTIに類似した結合要素を持つ。BPTIと同族のタンパク質の中にはどちらかの末端により多くの、又はより少ない残基を持つものがある。
BPTIにおいて、P1残基は15の位置にある。Tschescheその他（TSCH87）はいくつかのBPTI P1の派生物の、多様なプロテアーゼに対する結合について報告している。
0003819931.tif 000002
Tschescheその他の報告から、我々は“＋”と印つけられた分子のペアに、Kd≧3.5・10-6Mがあり、更に“−”と印つけられた分子のペアにはKd＞＞3.5・10-6Mがあると推論する。野性型BPTIがhNEに対し僅かな親和性しか持たないことは明らかである。しかしより高い親和性を持つBPTIの突然変異体があることも知られている。表には示されていないが、BPTIはhCGに対して目立った結合はしない。だがバークマン及びTschesche（BRIN90）は、hCGが5.0x10-7MであるKiを持つ、BPTIの三つの突然変異体（viz.K15F、R17F、M52E）を作成した。
BPTI及びその相同体に関する研究には次のものがある。
0003819931.tif 000003
インターαトリプシン抑制因子（ITI）は大きい（Mr ca 240,000）循環プロテアーゼ抑制因子であり、多くの哺乳類のプラズマ内に見られる（ODOM90、SALI90、GEBH90、GEBH86参照）。hNEに対する親和性定数は60〜150nMである。カテプシンGに対するそれは20〜6000nMである。
未ださわられていない抑制因子は糖タンパク質であるが、これは強いグリコサミノグリカン結合を通じて相互作用する3つのグリコサイレート（glycosylate）するサブユニットから成ると現在では考えられている（ODOM90，SALI90，ENGH89，SELL87）。ITIの抗トリプシン活性は最も小さいサブユニット（ITIのL鎖、非グリコサイレートMr ca15,000）に位置しており、このサブユニットは尿（UTI）と血清（STI）に見られる酸安定抑制因子に対するアミノ酸の順序とまったく同様である（GRBH86，GEBH90）。成熟したL鎖は21残基N末端配列をなし、SER10でグリコサイレートされ、二つのタンデムKuDomが続いており、そのうち最初のものはASN45でグリコサイレートされている。
（ODOM90）人体蛋白質では2番目のクドム（KuDom）（ITI-D2またはHI-BT）が、トリプシン、キモトリプシン、プラズミンに対する抑制を示している。（ALBR83a、ALBR83b、SELL87、SWAI88）最初のドメイン（ITI-D1またはHI-8e、GEBH86の図1に示されるUTI順序の残留物22-76から成る）にはこうした活動が欠如しているが（ALBR83a,n、SWAI88）、白血球エラステーゼ（10-6＞Ki＞10-9）を抑制することは報告されている。（ALBR83a,b、ODOM90）ただしその効能は直接使用するには弱すぎる。
シンハ他．（SINH91）は、P1サイト（残留物13）でバリンがアルギニンに取って替わっているときに、アルツハイマーのβ-アミロイド前段階蛋白質の、Ki＝800pMを持つhNE抑制因子への変換を報告している。彼らは3つの突然変異（viz.R13V（P1）、A14S（P1'）、M151（P2'））を持つ第2の蛋白質を作成している。P1'とP2’での変化は、α1-PIの活動部位に見られるアミノ酸と一致している。この蛋白質はhNEに対しては完全に不活性である。したがって、機械的に無関係である抑制因子内の変異発生部位特定の補外法を使用する際には注意が必要であると、彼らは述べている。またこれに続けて、彼らのキモトリプシンとカリクレインの実験が示すように、クドム科の中でさえ予想外の結果が生じていると述べている。
非蛋白セリウム・エラステーゼ抑制因子。化合物、ICI200,335（SOMM91）とICI200,880はトリプシンなどの他のプロテアーゼよりもHNEを強く好むことを示している。これらの複合体は小片結合の窒素アミドがCF3グループに交換しているときにおけるペプチドの類似物である。
これらの化合物はそれぞれ、P1位置でイソプロピル・グループを持ち（バリンのように）P2でプロリル残留物を持つ。どちらの化合物もP1′への拡大はない。インペリアリとアベレス（IMPE86）は、プロテアーゼ抑制因子は、アセチル・ペプチディル・メチル・ケトンから成り、ターミナル・メチル・グループはフッ素原子を1つから3つ持つと説明している。PEET90（並びに本書で引用されている他の研究）は、ペプチディル・フッ素メチル・ケトンとペプチディル・αケト・エステルの合成と、これらの化合物の豚のひ臓エラステーゼ（PPE）、HNE、ねずみのカテプシンG、人体カテプシンGに関する抑制特性について報告している。これらの複合体はP1’に拡大しない。メーディ他（MEHD90）は、ペプチディルαケト・カルボキシル酸のメチル・エステルによるHNEと人体カテプシンGの抑制について報告している。これらの複合物はどれもP1′残留物を持たない。アンジェラストロ他（ANGE90）は、ジケト・グループを持つプロテアーゼ抑制因子について報告している。これらの化合物のどれもP1以上には拡大しない。
ゴブハーダンとアベレス（GOVH90）は、アミド-NH-が-CF2-CH2-に交換され、αアミノ連結アミノ酸メチル・エステルがそれに続き、したがってP1残留物を提供する化合物について説明している。
インペリアリとアベレス（IMPR87）は、P3'まで拡大するキモトリプシンの抑制因子を説明している。これらの著者によって引用される研究は、抑制因子定数K1はそれに一致するS1'、S2'、S3’…プロテアーゼの結合部位、によって大きく低下できることを示している。これらの著者はHNEの抑制については触れていない。さらに、彼らが扱っている抑制因子は効能の優れた蛋白質プロテアーゼ抑制因子から取られたものではなく、P1'、P2'、P3’でのサイドグループは試行錯誤の結果判定されている。これに加えて、彼らは残留物の残りがEpiNE蛋白質に見られるものと著しく類似した形態を取るように、P1とP2’の間に-CO-CF2-CH-を-CO-NH-の替りに挿入している。
これ以外のクラスのプロテアーゼ抑制因子としては、小片ペプチドがボロンに交換されたカルボニル炭素内のものがある。これらの複合体はセリン・プロテアーゼを抑制するが、あまり具体的ではない。
エラステーゼ抑制因子の別のクラスに、ロバート他により説明されているクロロメチルケトンがある。（US4,664,053）これらの化合物はケト・グループに隣接する塩素原子を持つ。プロテアーゼの活性部位セリンは求核子として働き、塩化物を分離し、不可逆的に不活性のコバレント（covalent）酵素抑制因子不可物を生成する。アンジ他．（FEBS  Lett,234（2）367-373（1988））は、ペプチディル・クロロメチル・ケトンを持つHNEのレントゲンによる結晶構造について説明している。ツダ（Tsuda）他（Chem Pharm Bull,35（9）3576-84（1987））は、ペプチド・クロロメチル・ケトンの合成と、HNEを含むプロテアーゼに対するその活動を説明している。ガヌとショー（Thrombosis  Reserch、45:1-6（1987））は、改善されたペプチディル・クロロメチル・ケトン・プラズミン抑制因子について説明している。クロロメチル・ケトンは不可逆性付加物を形成するので、薬品としては理想的ではない。不可逆性化合物を形成するその他のクラスの抑制因子には、a）ペプチド・エノール・ラクトン（J.Biol Chem 266（1）13-21（1991）及びBiochemistry 29:4305-11（1990））、イソクマリン（クランツ他.US4.980287）、そしてペプチディル（α-アミノアルキル）ホスホネート・ジフェニル・エステル（Biochemistry 30:485-93（1991））がある。
化合物のクラスは、クロロメチル・ケトンに関連し、ペプチディル・メチル・ケトンから成るある程度の特殊性を持って、プロテアーゼと不可逆的に結合する。ピーターズとフィッツコー（Biomed  Biochim  Acta  49（4）173-178（1990）及び本書に引用される他の研究）は、ペチディル・メチル・ケトンはセリン・プロテアーゼ及びシステイン・プロテアーゼと不可逆的に結合し、この結合はペプチディル・グループの順序に従うと報告している。ペプチディル・メチル・ケトンがアミノ酸がメチル・グループに交換されるカルボニル・グループ内のペプチド相似体と見なされるなら、ピーターズとフィッツコーは、アミノ終点へ拡大する化合物に限って説明している。したがって、彼等はP1、P2などについては扱っているが、P1、P2’などは扱っていないことになる。
エラステーゼ抑制因子についてのその他の情報。PADR91は、エラスチン（すべてのエラステーゼの恒久的な基質）は、決定される効能を小さな溶性の人工基質と比べたときに、様々な可逆性及び不可逆性hNE抑制因子の効能を大きく減少させることができると報告している。
彼らは、どちらのクラスの抑制因子も20倍から100倍以上も効能が減っていることを発見した。彼らはエラスチンがその原因となっていると提案しているが、この現象についてこれ以上の説明はしていない。ひとつの可能性としては、合成抑制因子（すべてやや疎水性）がエラスチン（これも疎水性）と結合することが考えられる。彼らはひとつの逆性蛋白質抑制因子、K1＝エラスチンなしで30nM、エラスチンありで900nMの粘膜プロテアーゼ抑制因子のテストを行なった。抑制因子は30倍近く効能を失っても、自由hNEを10-10M以下に減少させることができた。
ここで引用した研究がすべて適切な事前研究であると認定するものではない。またここに挙げた日付は参考文献にあるもので、実際の出版月日と必ずしも一致するものではない。ここに引用した参考文献はすべて引用文献欄に記載されている。
発明の概要
この発明は、エラステーゼに大きな親和性を持つBPTIやITI-D1のようなクニッツ・ドメイン・セリン・プロテアーゼ抑制因子の突然変異に関するものである.これらの変異体は、野性のタイプのドメインに比べて少なくともマグニチュードひとつ、場合によってはマグニチュード3つ（1000倍）ほど、エラステーゼに対して高い親和性を持つと推定される。
運動性の抑制データは蛋白質のあるものについて、結合親和性が1.0x10-12Mから3.0x10-12の範囲にあることを示している。その他の蛋白質は融合ファージに顕示され、またhNEあるいはhCGへの親和性は不動化活性プロテアーゼ（hNEまたはhCG）からのpH溶出プロフィールから推定されている。幾つもの蛋白質がイースト内の選択蛋白質として有益な量で生産されている。
この発明はまた、人体好中求エラステーゼと／あるいはカテプシンGと特殊結合をするアプロトニンとそれに関連するポリペプチドの線形あるいは円形オリゴペプチド相似体に関するものである。特にここで公開される新しいエラステーゼ結合ポリペプチド（EpiNe）とカテプシンG結合ポリペプチドの相似体に関連するものである。
これらの相似体はアプロトニンとその同族抑制因子とは様々な面で異なる。まず、これらはより小さな分子で、むしろ1,500ダルトン分子質量より軽く、P5-P5"残留物（またはその相似体）だけかそのサブセットだけを含む。次に、P1とP1'残留物間の小片ペプチド（-CO-NH-）結合はこれらふたつの残留物のアルファ炭素の距離を著しく保つ非加水分解質結合である。
図の簡単な説明
図1
hNE球のミニPEPIライブラリの分割を示す。横軸はバッファのpHを示す。
縦軸は与えられたpHで得られるファージの量（投入ファージの分屑（フラクション、以下同様）を示す。
縦軸の目盛りは103。
図2
nHEのMYMUT PEPIライブラリの分屑を示す。横軸はバッファのpHを示す。
縦軸は与えられたpHで得られるファージの量（投入ファージの分屑）を示す。
縦軸の目盛りは103。
図3
EpiNEクローン1、3と7の溶出プロフィールを示す。各プロフィールは曲線の形をわかりやすくするためにピークが1.0になるよう目盛りが打たれている。
図4
カテプシンG球のBPTI-IIIMKとEpiNE1の結合のプロフィールを示す。横軸はバッファのpHを示す。縦軸は与えられたpHで得られるファージの量（入力ファージの分割として）を示す。縦軸の目盛りは103。
図5
カテプシンG球のMYMUTライブラリの分屑を示す。横軸はバッファのpHを示す。
縦軸は与えられたpHで得られるファージの量（投入ファージの分屑）を示す。
縦軸の目盛りは103。
図6
カテプシンGのMYMUTライブラリの第2分別を示す。
図7
カタプシンGとの結合に選択されたファージの不動化カタプシンGの溶出プロフィールを示す。
図8
優先されるHNE抑制因子の1グループの形成を示す。この抑制因子は以後クラスI抑制因子と呼ぶ。7,8,9,10とマークされた炭素はチラルセンター（chiral centers）である。
図9
優先されるHNE抑制因子の第2グループの形成を示す。この抑制因子は以後クラスII抑制因子と呼ぶ。7,8,9,10とマークされた炭素はチラルセンター（chiral centers）である。
図10
結合素としての2カルボキシメチル6アミノメチル・アントラキノンを示したものである。これと類似した大きさの比較的堅固な他の分子を使うこともできる。
図11
クラスIまたはII抑制因子溶に-CF2-、CH2-、または-CHF-で置き換えられた-NH-を持つVAL-ALAジペプチドの類似物準備に関わる複合体IからXVIIIを示す。
図12
優先HNE抑制因子の第3グループを示す。以後クラスIII抑制因子と呼ぶ。8,9,10とマークされた炭素はチラルセンター（chiral centers）である。
図13
クラスIとII抑制因子で使用されるボロン含有ジペプチド類似物の合成に関与する複合体XXXIからXXXVを示す。
図14
図5に示される分子の一部の合成に関与する複合体XLIからXLIVを示す。
好ましい実施態様の詳細な説明
エラステーゼまたはカテプシンGに対する高い親和性を持つ小さな蛋白質
この発明は、エラステーゼとカテプシンGに高い親和性を持つ、BPTI、ITI-D1、そしてその他のクニッツ・ドメインタイプ抑制因子の変異体に関するものである。ここで説明される幾つかの抑制因子はBPTIとある種のITI-D1から取り出されたものである。ただし、認識される変異体の雑種や他のクニッツ・ドメインタイプの抑制因子を構築することもできる。
数多くの異なるタイプのBPITとITI-D1変異子の親和性を同時に評価するために、BPTIやITI-DIをコード化したDNA順序がバクテリオファージM13のゲノムに組み込まれた。
クドム（KuDom）は遺伝子III外膜蛋白質を持つアミノ終点融解（融合、以下同様）として、M13の表面に顕示される。クドムアミノ酸順序（配列、以下同様）の改造が紹介される。特定のクドムを顕示しているファージの純粋な集団はそれぞれ不動化hNEまたはhCGとの相互作用に関連して特徴化される。特定のプロテアーゼに対して知られている親和性を持つ他のクドムを顕示しているファージのpH溶出プロフィールとの比較に基づいて、ターゲットとするプロテアーゼに対して高い親和性を持った突然変異クドムが明らかにされた。続いて、これらの突然変異クドムの順序が決定された。（一般的には対応するDNA順序による）
アプロトニンのようなプロテアーゼ抑制因子の幾つかは、HNE（1012／Mと高い親和性があることを示していた。これら58のアミノ酸ポリペプチドは、様々な合成により生成されたアプロティニン突然変異種から生物学的に選択された。P1、P1′、P2'、P3′、P4′の位置は様々である。P1では、VALとILEだけが選択されているが、LEU、PHE、METも合成条件により許可されている。（ライブラリでは探索されていないが、セリン・プロテアーゼの多くのカザル科抑制因子はP1′でグルタミン酸やアスパラギン酸を有する）選択された蛋白質はすべてP2′でPHEかMETを含んでいる。LEU、ILE、VAL、これらは分岐脂肪族サイドグループのアミノ酸であるが、ライブラリ内には存在するが明らかにHNEへの結合を妨げている。驚くことに、HNEに高親和性があるために選択された蛋白質はすべてP3’位置にフェニアラニンを持っている。HNEに関する特殊性を判断するためにはP3′位置が重要だと指摘した者は今までにない。P4′ではSER、PRO、THR、LYS、GLNが許可されている。THR以外はすべてが見られた。PROとSERは最も高い親和性を持つ誘導体の中に発見されている。
前述したように、BPTIは58のアミノ酸から成る蛋白質である。BPTIの順序は表13の最初に示されている。相同体では活性アミノ酸の数に多少の違いがあるので、この発明は58のアミノ酸を持つ蛋白質に限定されるものではない。
野性のタイプのBPTIはhNEの抑制因子としては良くない。K15L突然変異をひとつ持つBPTIはHNEに対してやや親和性を示している。（Kd＝2.9・10-9M）（BECK88b）しかし、牛のインターαトリプシン抑制因子の軽鎖のアミノ終点クニッツ・ドメイン（BI-8e）が蛋白質分解により生成されており、これはHNEの抑制因子となり得る可能性を示している。（Kd＝4.4・10-11M）（ALBR83）
P1残留物はBPTIのような分子の主要な決定因子であることが今までに提案されてきた。
（SINH91、BEDK88b、LASK80と本書で引用されている他の研究）BI-8eとBPTI（K15L）の両者ともそれぞれのP1位置でLEUを有するが、HNEに対するこれらの分子の親和性には66倍もの違いがある。したがって私たちはHNEに対するBPTIOのような分子の親和性には他の構造的特徴が影響しているのではないかという仮説を立てた。
BI-8eとBPTI（K15L）の構造の比較により、BPTIには位置39、41、42でプラスに電荷された3つの残留物の存在が明らかになった。これはBI-8eには見られない。BPTIのこうした親水性でかなり電荷された残留物はP1残留物を含むループの基礎となるループの上に顕示されており、二硫酸塩のブリッジで接続されている。基礎になるループ内の残留物（特に残留物39）はBPTIとトリプシンの表面との相互作用に関与しており（BLOW72）、BPTIとトリプシンとの堅固な結合に著しく寄与しているのではないかと考えられる。ただし、これらの親水性残留物はBPTI変種がHNEとドッキングするのを妨げているのかもしれない。この仮説を支持して、BI-8eはHNEに対して高い親和性を示しており、残留物39-42において電荷残留物はいっさい持っていない。よって、野性のタイプのBPTIの残留物39から42は人体のBI-8e同族種の残留物と交換された。予想したように、MGNG39-42置換物を含むBPTI（K15L）の誘導体は、突然変異置換物をひとつだけ含むBPTI（K15L）よりも、HNEに対して高い親和性を示した。位置39にMetを持ったBPTIの突然変異は知られているが、位置40-42は同時には変異していない。
表207と208はhNEに高い親和性を持つ新たなBPTI突然変異体の追加分が示されている。
私たちは、これらの突然変異がBPTI（K15V、R17L）よりマグニチュードひとつ分は多くhNEに対する親和性を持っているものと確信している。これらの突然変異体はすべて表に示されている活性部位突然変異の他に、位置39-42にMGNG突然変異を持っている。
同様に、表209はカテプシンGに対する高い親和性を持つ新たなBPTI突然変異の順序を示している。EpiC突然変異内のP1残留物はただひとつの例外としてPHEがあるが、あとは圧倒的にMETが占めている。ところがBPTIのP1はLYSで、EpiNE変種のP1はVALかILEである。EpiC突然変異では、P1'（残留物16）は圧倒的にALAが多数で僅かにGLYが一例あるだけである。P2'（残留物17）ではPHE、ILE、LEUとなっている。興味深いことに、残留物16と17は、少なくともこの小さなサンプルで見る限り大きさを補足することで組となるように見受けられる。小さなGLY残留物は大型のPHEと組になっており、比較的大型のALAはそれほど大型ではないLEUやILEと組になっている。あるいは、こうした組み合わせは、P1'での柔軟性によるものかもしれない。P1'がアラニンのときには駄目でもP1'がグリシンであればフェニールアラニンのサイドグループが可能になることがある。P1'がアラニンのときは、ロイシンやイソロイシンが最適のように思われる。
BPTIは副作用がほとんどなく人体に用いられてきたが、クドムは人体クドムに非常に類似しているので、免疫反応を起こす危険がさらに低い。したがって、私たちはEpiNE7に見られる活性部位変化をインターαトリプシン抑制因子の最初のクドムに移した。（例IV）このアプリケーションの目的として、ITI軽鎖遺伝子の核酸順序の番号付けはTRAB86に示されているもの、UTIのアミノ酸順序はGEBH86の図1に示されているものとなっている。ITI-DIに必要なコード順序は、TRAB86に提示されているcDNA順序の位置750と917間の168ベースである。人体ITI-DIのアミノ酸順序はアミノ酸56の長さで、完全なITI軽鎖順序のLys-22からArg77に渡る。ITI-DIのP1部位はMet-36である。表220-221にはある種のITI突然変異体が示されている。残留物は、P1残留物15というように、BPTIの同族クニッツ・ドメインに従って番号付けられていることに留意されたい。ITI-DIのアミノ終点を短縮すること、少なくともBPTIと同族の第1残留物までの短縮は、たぶん容認されているであろうことも言及されるべきである。
ITI-DIのEpiNE7を起因とする突然変異（BPTI15-19域）はhNEに対するその親和性を著しく高めた。私たちは分子の異なる部位（BPTI1-4域）の突然変異も同じように親和性を高めていることを発見した。これらの突然変異のパターンが組み合わされると、親和性に相乗的な増加が見られた。さらに近接するアミノ酸（BPTI26、31、34）の突然変異は親和性をより高めた。
ここで描かれるITI-DIのエラステーゼ結合変異体は野性のタイプのドメインとは次の位置（BPTIにつき番号付け）がひとつふたつ異なっている。1,2,3,4,15,16,18,19,31,34。さらに、次の突然変異にもひとつふたつ違いがあろう。Lysl->Arg; Glu2->Pro; Ser4->Phe*; Met15->Val*, Ile; Gly16->Ala; THr18->Phe*; Ser19->Pro; Thr26->Ala; Glu31->Gln; Gln34->Val* ＊印の付いた突然変異のひとつかふたつを導入することが特に望ましい。より良い具体化としては少なくとも＊印の付いた突然変異はすべて存在している。
普通の実験技術を持つ人々によって認められるだろうが、確認されたHNEとHCG抑制因子は、変化により親和性が大きく損なわれないように、特に抑制因子の安定性が失われないように、修正することができる。ここで提案される変化は様々なベースで評価できる。第1に、特定のアミノ酸が与えられた場所でクドムの枠組に収まるかどうか。枠組を壊すような変化は結合を損ない特殊性を低めることがほとんどである。アミノ酸がクドムの枠組に収まるかどうかは幾つかの方法で判断できる。1）そのアミノ酸は既知のクドムのどれかに現れているかどうか。2）クドムの構造モデルはその構造と提案される置換との間に互換性を示しているかどうか。3）力学的算出モデルは提案される突然変異が安定したものであると示しているか。自然に発生するクドムの順序の変異性は、ある種のアミノ酸がある場所で収まることを証明している。例がないからといってアミノ酸が収まらないということにはならない。
提案される変化が構造的に容認されれば、次に、ターゲットやその他の物質への結合にどのような影響が出るかという質問が起きる。一般に、クドムとターゲットの間の界面に変化した残留物を持つ突然変異した蛋白質にはテストが必要で、普通は突然変異蛋白質を顕示するファージの結合テストによってこれが行なわれる。結合界面のほとんどの変化は結合を弱めるが、中には親和性を高めるものもある。結合界面から遠く離れた残留物での変化は、蛋白質が不安定になっていない限りは結合を弱めないのが普通である。
表61は39の自然発生したクドムの変異を示している。これらの蛋白質はすべてC5からC55の域で51の残留物を持つ。蛋白質がその終点で持つ残留物の数が若干異なることから、残留物の合計数には多少違いがある。表62は表61に含まれる蛋白質の名前のリストである。表64はこれらの順序が記録されている研究の引用例で、表63は、特定の変異性に対する変異性を示す軌跡が幾つあるかを示したヒストグラムである。「コア（core）」は5から55の残留物で、コア以外の残留物に比べて順序と構造に大きな類似性を示している。
10の位置で、単一アミノ酸タイプが42ケースのすべてで観察されている。これらはC5,G12,C30,F33,G37,C38,N43,C51,C55である。また、これらの位置それぞれは構造を完全に失うことなく代替することが可能であるという報告がある。G12,C14,G37,C38だけが結合界面に十分近く変化を起こすに足りるものがある。G12はグリシンだけが取ることのできる形態で、この残留物はこのままにしておくのが最善である。マーク（Mark）他（Mark87）はC14とC38の両方をふたつのアラナインもしくはふたつのスレオニンと交換した。マークたちが取り除いたC14/C38のシステイン・ブリッジはBPTIの小片結合と非常に近いところにあったにもかかわらず、驚いたことには、どちらの突然変異分子もトリプシン抑制因子として機能した。BPTI（C14A,C38A）とBPTI（C14T,C38T）はどちらも安定していてトリプシンを抑制した。これらの残留物を交替することにより、有益な抑制因子が有益な安定性を維持するチャンスを高めるかもしれない。そして14または38の変更を具体化する突然変異を得てテストするには、斑紋状集団のファージ顕示が最善の方法である。
C14/C15二硫酸塩が取り除かれるときに限り、G37の堅固な保存が取り除かれる。
7つの位置（すなわち23、35、35、40、41、45、47）で、ふたつのアミノ酸タイプしか発見されなかった。位置23ではYとFだけが観察された。フェニル環のパラ位置は溶媒が入り込めるところで結合部位からは遠く離れている。ここでの変化は結合には僅かな影響しか与えず、斑入りに対してはそれほど大切なものではない。同様に、35にも原子残留物YとWしかなく、フェニールアラニンはたぶんここでも良く機能しないだろう。36ではグリシンがほとんどを示める他はセリンが見られた。この他のアミノ酸、特に｛N.D.A.R｝は可能なはずで、たぶん結合特性に影響を与えるはずである。位置40にはGとAしかない。構造モデルは他のアミノ酸も耐え得ることを示している。特に｛S,D,M,N,E,K,R,L,M,Q,T｝のセットが考えられる。位置40は結合部位に十分近く、ここでの変更は結合に影響を与える可能性がある。41ではNとKだけが見られたが、プロリン以外の他のアミノ酸も可能なはずである。
サイドグループでは、親水性のサイドグループが好まれる。特に｛D,S,T,E,R,Q,A,｝。この残留物は結合部位からはかなり離れているので、この変化が結合に大きな影響を与えることは考えられない。45では、Fはかなり好まれるが、Yが一度観察されている。フェニール環の一端が1回露出されたが、他の芳香族の代用｛WかH｝は分子に同じような構造を生み出す確率が高い。ただし安定性にどのような影響が出るかを予測するのは難しい。ロイシンやメチオニンのような脂肪族（分岐Cβsを持たない）もここで作用するかもしれない。47ではSとTだけが見られたが、他のアミノ酸、特に｛N,D,G,A｝も蛋白質に安定性を与えるはずである。
ひとつの位置（44）では3つのアミノ酸タイプしか観察されなかった。ここでは、アスパラギンが多数を示め、内部に水素結合を形成しているようであった。その他のアミノ酸もおそらくプロリン以外は可能なはずである。
これ以外の残りの40の位置については、4つ以上のアミノ酸が観察されている。
28の位置で、8以上のアミノ酸タイプが見られている。位置25は13の異なるタイプを示し、5つの位置（1、6、17、26、34）では12タイプを示している。プロリン（最も堅固なアミノ酸）が次の14の位置で観察されている。1,2,8,9,11,13,19,25,32,34,39,49,57,58。BPTIのφψ角度（CREI84、表6-3、p.222）は、プロリンが次の位置で可能であることを示している。
1,2,3,7,9,11,13,16,19,23,25,26,32,34,36,40,42,45,48,49,50,52,53,54,56,48。プロリンは4つの位置（34,39,57,58）で発生し、ここではBPTIのφψ角度がそれを容認できないことを示している。私たちはこれらのケースでは主鎖がローカルに再配置するという結論を出した。
これらのデータに基き、6つのシステインを除外して、私たちはクドム構造は表65に示されているこれらの置換を許容するものと推定した。クラスは次の置換を示している。
A）置換がhNE、hCGに実質的に同じように結合する安定した蛋白質を与える可能性が非常に強い。あるいは、親順序としてその他のセリン・プロテアーゼを与える。
B）親と類似した結合を与えるようである。あるいは
C）置換はクドム構造を維持する蛋白質を与えるが、結合に影響しやすい。
クラスCの突然変異は親和性をテストすることが必要である。これは、WO/02809にあるような顕示ファージシステムを使って比較的簡単に行なうことができる。hNEとhCG抑制因子の親和性は、BPTIの次の位置での置換に最も敏感である。15,16,17,18,34,39,19,13,11,20,36。抑制因子がITI-DIの突然変異の場合は、BPTIとITI-DIのシステインを揃えることによりこれらの位置をITI-DIの位置に直さなければならない。
私たちが扱っているhNE抑制因子のあるものは、PR-3抑制因子として有益である。私たちは自分たちの抑制因子のhNEとの相互作用をBPTI-トリプシン化合物への照合によりモデル化した。まずBPTIに接するトリプシンの残留物をリストした。次にhNEとPR-3からの残留物の対応するセットを考慮した。これらのセットは11の残留物で異なる。これらの違いでひとつだけがS1特殊性のポケットで発生した。それはhNEのV190とPR3のI190である。これにより、私たちが扱っているhNE抑制因子はPR-3抑制因子でもあるだろうという結論が出された。
特に、P1でバリンを持つ抑制因子はPR3を抑制するであろうと思われる。PR3はこの域にメチルをひとつ余計に持ち、メチルがひとつ少ない抑制因子は堅固なた結合を行なうだろうと思われる。
BPTIはかなり小さい。もしこれが、循環から急激に排除されてしまうなどの薬学的な問題の原因となるとすれば、BPTIにより取り出されたドメインをふたつ以上結合子で組み合わせることができる。この結合子はアミノ酸ひとつまたはふたつの順序が好ましい。好ましい結合子は人体蛋白質に繰り返されるドメイン間に見られるものである。特に、人体BPTI同族に見られる結合子で、それらのひとつはふたつのドメインを持ち（BALD85、ALBR83b）もうひとつは3つのドメインを持つ（WUNT88）。ペプチド結合子は蛋白質全体が再結合されたDNA技術で表されるという長所を持つ。免疫遺伝子の共役を形成するときに一般に使われるような非ペプチド結合子を使うこともできる。たとえば、ポリエチレングリコールに対するBPTIのようなクドム、いわゆるPEGylationと呼ばれるものがある。（DAVI79）▲注▼PEGylationはderivatization with PEGと同義。
この他に考えられる薬学的問題に、免疫遺伝性がある。BPTIは人体においてほとんど副作用なく使用されてきた。シークマン（Siekmann）他（SIEK89）は、BPTIとその相同体の幾つかの免疫学的特徴の研究を行なった。さらに、人体蛋白質から始めて免疫反応の可能性を抑えることもできる。このように、不可欠ではない残留物を変えることにより、その蛋白質をより人体蛋白質に近いものに変えることができる。この他の修正、たとえばPEGylationなども免疫反応を抑制することが観察されている。（DAVI79）
エラスターゼあるいはカテプシンGと結合する誘導されたペプチド
この発明はエラスターゼあるいはカテプシンGと結合する誘導されたある種のペプチドとも関連している。これに続く説明は特にEpiNEタイプのhNE抑制因子の誘導化に関するものであるが、必要な変更を加えて、EpiCタイプのカテプシンG抑制因子とITIDIタイプのhNE抑制因子に適用することもできる。ひとつの具体化はクラスIの抑制因子から成り（図8に示される）それらは次のものを含む。1）ペプチド残留物の最初のセグメント、2）HNEのS1ポケットと結合するが加水分解できないアミノ酸相似体、3）ペプチド残留物の第2セグメント。これらのクラスI抑制因子は図8に描写される構造を持つ。
ペプチドの第1と第2セグメントとP1アミノ酸相似体のサイドグループがHNEへの親和性と他のプロテアーゼへの特殊性を高めるために選ばれた。第1セグメントと第2セグメントを結ぶグループが次のために選ばれた。1）分割を防ぐ  2）HNEの活性部位との可逆性結合を可能にするため  3）ペプチドグループの形と電荷配分をまねるため。
発明の次の具体化は図9に示される円形化合物であるクラスII抑制因子からなる。これらの化合物は次のものから成る。1）連結するペプチドの最初のセグメント、2）HNEのS1ポケットと結合するが加水分解できないアミノ酸相似体、3）ペプチド残留物の第2セグメント、4）ペプチドの第2セグメントのカルボキシ基の末端と第1セグメントのアミノ末端をつなぐ比較的堅固なセグメント。この4番目のセグメントはセグメント1-3がHNEと結合する形態で存在できるようデザインされている。セグメント1-3に対する考慮はどちらのクラスの化合物でも同じである。
クラスIIの抑制因子は図9に描かれているように、R1で比較的堅固な2作用を行なう結合子を持つ。たとえば、三環式芳香族環システムでまさに反対の作用を行なうものがある。ひとつはアミノグループがC7に接続させ、もうひとつはカルボニル炭素レベルC11との結合を可能にする。例：2カルボキシメチル-6アミノメチルアントラキノン（図10）
置換物R2,X,R3,R4,R5,R7はクラスIに設定されたものと同じ可能性を持つ。
発明の3つめの具体化は、図12に示されるクラスIIIの抑制因子で、残留物P1',P2',P3'と（オプションの）P4',（そしてP5'）に対応するペプチド相似体あるいは非ペプチド相似体を持つものから成る。硼酸グループあるいは硼酸エステルが酵素の活性部位に収まるように配置される。
これらの化合物を合成する方法は実験技術を持つ者には知られている。
EPiNE1,3,7は質量約＝6kdの分子を持つ。EpiNE1,3,7よりもずっと小さい化合物やHENにより高い親和性を持つ化合物を提供することは可能である。またP5-P4...P4'-P5'のEpiNEの成分は特殊性の決定因子であるばかりでなく、この成分、またはそれに続くものは、HNEにしっかりと結合することが予想される。誘導体において小片ペプチドは加水分解されないように修正されるが、この誘導体はたいへん効果的なHNE抑制因子であろうと考えられる。
この発明内の多くの相似体は次の公式で定義される。
PN-P1-P1'-P2'-P3'-P3'-PC
ここでPNは
T-P5-P4-P3-P2-
T-P4-P3-P2
T-P3-P2
T-P2または
T-;
ここでPCは
-P4'-P5'-T,
-P4'-T,
-T;
P5,P4,P3,P2とP2',P3',P4',P5'はアミノ酸で、自然発生するアミノ酸を含むがそれだけに限定されるものではない。これはEpiNEポリペプチドの活性部位アミノ酸と対応する。Tはペプチド合成物と互換性を持つ停止機能グループで、ペプチドのエラステーゼの抑制活動
を逆行させない（ふたつのTは同じものでも異なるものでも良く、三環式を形成するために組み合わされても良い。）
（1）P1は一般分子式-NH-CHR-XC-を持つアミノ酸相似体の残留物である。P1'は一般分子式-XN-CHR-CO-を持つアミノ酸相似体の残留物である。P1とP1'は共に-XC-XN-を形成し、これは非加水分解性結合を含む
（2）P1とP1'は共にジペプチドの非加水分解性の硼素含有相似体を形成する。どちらの場合も、P1とP1'はEpiNEポリペプチドの対応するアミノ酸と同じように作用する。
他の研究者は、ペプチドと非常に大きさは類似しているが、加水分解できない数々の結合について説明している。ほとんどは可逆性あるいは不可逆性でプロテアーゼと結合できるようにP5-P4...P1と修正P1だけを与えている。彼らのアプローチは幾つかの面で欠陥がある。まず、P1'-P3'残留物の重要性を理解していないこと。次に、アプロトニンの小片結合の寸法を保存していないことである。
図8はクラスI抑制因子を示すが、これはEPiNEポリペプチドの線形ペプチド相似体である。R1（P2）,R2（P1）,X.R3（P1'）,R4（P2'）,R5（P3'）,R6（R4'）に好まれる選択は次の通り。
R1：
Lプロリル-、L、Lシスチニル-、Lバリル-、L-メチオニル-、アセチルのようなH-、アセチル-、疎水性成分・R1はアプロトニンがP2残留物であるサイドグループであることに注意。抑制因子にはオプションでアプロトニンのP3、P3-P4、またはP3-P5残留物とその相似体を含むことがある。これにはEpiNEポリペプチドが含まれる。
R2：
アルキルまたは2-4炭素原子。例、エチル、n-プロピル、イソプロピル、ｎーブチル、イソブチルまたはtertブチル。2プロピル（C7がLバリンのCαに類似するように）、2ブチル（C7がLイソロイシンのCαに類似するように）が好まれる。
X：
エラステーゼ抑制活動を干渉しない非加水分解性連結。
この結合子はできればペプチド（-CO-NH-）グループと類似した長さを持つ。この結合子が-XN-KC-と見なされる場合には、-XN-は、-CO-,-SO-,または-B（OR7）-であり、-XC-は、チオエーテル（-S-）またはメチレン基でこれは置換されない（-CH2-）、またはmono-（例：-CHF）やdi-（例-CF2-）置換となるだろう。この置換物には、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、塩素またはフッ素が考えられるが、ハロゲンはふたつ以上にならないことが望ましい。適する結合子には、-CO-CH2-、-CO-CH2-、-CO-CF2-、-CO-CHF-、-CO-CO-、-B（OH）-CH2-、-SO-CH2-、-CO-S-が含まれる。
典型的な-CO-NH-ペプチディル結合子によって接続されるCアルファ（「α炭素原子」と同義）炭素間の距離は約3.8オングストロームである。この発明で好まれる非ペプチディル、非水解性結合子は、アルファからアルファの距離を4.5オングストローム以上に伸ばすものではない。
ただし、より長い結合子、たとえば、-CO-CFH-CH2-や、-CO-CF2-CH2-などが使われることもある。これらの結合子ではアルファからアルファの距離は約5-6オングストロームに伸びる。
結合子の主要原子と結合されるCアルファ炭素が、通常のペプチド結合に見られるように実質上同じ面に横たわることはできれば望ましいが、不可欠ではない。
R3：
-H、または小さなアルキルやアルコキシ基グループなど、1-10の炭素と0-3のN,O,S,CI,F原子を含む脂肪族グループ。作用性-H,CH3,-CH2-SOOH,-CH2-CH-COOH。これによりC8がグリシン、L-アナリン、L-アスパラギン酸、またはL-グルタミン酸のCアルファにそれぞれ類似できるので望ましい。他の可能性としては、エチル、イソプロピル、n-プロピル、ヒドロキシメチル基（形成セリンなど）、またはヒドロキシエチル基（形成ホモレリンなど）。
R4：
4-7の炭素を持つ非分岐脂肪族グループまたはアリルアルキルグループ、ここではアルキル成分は1-3の炭素でアリル成分は単環式または二環式で、異種原子（N,O,S）やハロゲン（CI,F）置換物を含むこともある。作用性-CH2-フェニールと-CH2-CH2-S-CH3。これによりC9がL-フェニールアラニンまたはL-メチオニンのカルファに類似するので望ましい。
R5：
上記のR4の項で説明されているようにアリルアルキルグループ。より望ましいのは、アリルメチルグループ、特に-CH2-フェニールグループ（L-フェニールアラニンなど）である。
R6：
-NH2,-OH,-AA。ここでAAは、セリン、プロリン、リジン、または短いペプチドのようなアミノ酸残留物である。このアミノ酸はEpiNE抑制因子を含むBPTI（クニッツ）科抑制因子のP4′位置で見つかるどのアミノ酸でもよい。短いペプチドはこのような抑制因子のP4′-P5′のジペプチド順序であることが望ましい。
R7：
小さなアルキルグループ（1-4の炭素原子）、-CH3、-CH2-CH3、-CH（CH3）2など。
R1では、溶解度を高めるためにブロックされていないアミノグループを持つことが望ましい。アミノ酸は疎水性のものが好ましい。というのは、Epi分子では、この位置に半分のシスティンがあり、二硫酸塩（-S-S-）結合が疎水性だからである。
R2では、2-プロピルグループが特に好まれる。これは、EpiNE1結合は誘導体p1でILEを持つ誘導体に対してよりもHNEに対してより堅固だからである。R2が2-ブチルで、β炭素での偏光力が自然状態で見られるL-ILE内と同じであることが好まれる。図1でC7とマークされている炭素がL-バリンと同じ偏光力を持つことが好ましい。C7とC8で不特定の偏光力を持つ化合物を使うこともできる。C9とC10での偏光力がLアミノ酸と同じであることが好ましい。R2はまた、-CH3,-CF3,-SH2-CH3でもよい。
R3では-CH3が好まれる。-H,-CH2-COOH,または-CH2OHも使われることがある。
R4＝-CH2-フェニルであることが特に好まれ、またR4＝-CH2-CH2-S-CH3であることも好まれる。
R5＝-CH2フェニルが特に好まれる。他にモノメチルフェニルやジメチルフェニル、ナフチル基（αまたはβ）、ヒドロキシフェニル（o,m,またはp）、メトキシフェニル基などの中性アリルグループも-CH2ーグループに付帯することができる。
R6は特殊性と融解度によって選ばれる。-OH,-NH2,L-セリン、L-プロリン、L-リジンなどが好まれる。
パーフルオル基化合物の合成は、水素やフッ素を幾つか持つ化合物の合成よりも簡単なことがしばしばある。よって、X=［-CO-CF2-］、R3＝-Fまたは-CF3、そしてH8をFで置換することにより、好まれる化合物ができる。
図9はクラスIIの抑制因子を示し、これらはEpiNE化合物の環式ペプチド相似体である。
R2,X,R3,R4,R5に対する好ましい選択はクラスI抑制因子と同様である。（R6はない）
R1はP1残留物のアミドとP3′残留物のカルボニルの間にブリッジを形成する。これは比較的堅固なグループで、C11とラベルされたカルボニル炭素がR1の一端と結合し、同時にR1の第2の機能グループがアミノグループN7と結合できるという複数の機能グループを持つ。機能グループは希望する堅固さを加えるためにひとつあるいはそれ以上の環を含む。
R1はまた望ましいスパンを持つ。これにより、R1が適切な形態でC7,C8,C9,C10を保持できる。BPTI内ではCα-15とC-18は10オングストローム離れている。したがって、RIは同様に約10オングストロームの間隔を与えるはずである。
たとえば、2、6ジメチルアントラセン内では、メチル炭素の間隔は約9オングストロームある。ジメチルアントラセンは、Cα-15とC-18間で望ましい間隔よりも短いので、ひとつのメチルグループにカルボキシル酸を付け、他のグループにはアミノグループをひとつ付けた。これにより結合子を約2オングストローム延長した。
メチレン基グループやアミノ酸及び／あるいはカルボキシル酸グループの挿入や除去は、特定の結合子により与えられる間隔を最適にするのに望ましい方法であると考えられる。
アントラセンは疎水性が高い。よって、アントラキノンなどのように、より溶解度が高く、より簡単に退行できる誘導体のほうがより適切であろう。アントラセン核の誘導に加えて、環システム内にひとつまたはそれ以上の異質原子を配置することは融解度を高め毒性を下げるために有益であろう。より簡単にイオン化できるグループ（例-SO3-または-CH2-NH3+）をひとつまたはそれ以上原子核に付着させることも有益であろう。-CH2OHなどの中性溶解グループも有益である。HNEに結合する高い親和性を持つEpiNEsは正の電荷を持ち、溶解グループとしてアミングループを好む。
適切なフレームワークとして適切なものにはこの他次のものが含まれる。テトラサイクリン（特に2,10誘導体）（The Pharmacological Basis of Therapeutics, Eighth Edithion, Editors Gilman, Rall, Nies, Taylor, Permagon Press, 1990, ISBN0-08-040296-8（以後GOOD-8）,p.1117），フェノサイアジン（p.396,GOOD-8），マルプロティリン（p.407,GOOD-8），カルバマゼピン（p.447,GOOD-8），アポモルフィン（p.473,GOOD-8）。結合子をデザインするときには、フレームワークに付着している望ましくない不要な薬学的特性を生ずるようなグループを除去する。
ブリッジ構造として適切な例をさらに挙げると、それはPro-Pro-Proである。
図12はクラスIII抑制因子の形を示している。これらの分子はクラスIの抑制因子と同じように線形である。硼酸グループがHNEの活性部位に収まるように位置しているのを例外として、P5...P1が欠如している。硼素原子は、普通P1ミノ酸のカルボニル炭素のように親電子性で、それと同じように活動する。硼酸グループは自由（D1=D2=-OH）あるいはエステル化されることもある。硼酸エステルは血清内でいつでも水解できる。-B（OH）-CH2が小片結合と置換することに留意されたい。
R3,R4,R5,R6に対する選択はクラスI抑制因子と同様である。
生体で使用するときには抑制因子は吸収、摂取、吸入、注入などの方法で投与することができる。注入する場合は、静脈、筋肉、皮下などに注射する、また錠剤、カプセル、塗布薬、シロップ、エリキシルなど、どのような形をとってもかまわない。これらについては最新版のRemington's Pharmaceutical Sciencesを参照されたい。適量を判断するには、非常に小量から始めて、臨まれる抑制効果が観察されるまで増加させていく方法を取るか薬学効果を得るために知られているその他の方法を取る。抑制因子は好中級エラステーゼの過剰活動に悩まされている哺乳類、特に人類に投与することができる。
この研究によるペプチドと蛋白質抑制因子は、実験で検証されているどのような方法をもっても生成することができ、次のような方法がある。対応する遺伝子やホスト細胞の分割溶解蛋白質にコードされている遺伝子の圧出（発現、以下同様）（Sambrook他を参照）、関連する蛋白質に基づいた半合成（Tschescheの研究を参照）、または直接の有機合成などがある。ペプチド結合はFmoc、tBocまたはその他のペプチド合成化学を使って生成することができる。SOLID PHASE PEPTIDE SYNTHESIS: A Practica Approach（E. Atherton and R.C.Sheppard, IRL Press at Oxford University, Oxford, England, 1989, ISBN0-19-963067-4）、THE PRACTICE OF PEPTIDE SYNTHESIS（M.Bodanszky and A. Bodanszky, Springer-Verlag, New York, 1984, ISBN0-387-13471-9），PRINCIPLES OF PEPTIDE SYNTHESIS（M. Bodanszky, Springer-Verlag, New York, 1984）を参照のこと。
これらの小さな蛋白質とエラステーゼやガテプシンGと結合する誘導されたペプチドは、抑制活動にもかかわらず、酵素の純化に使えることがある。ただし、好まれる化合物は試験管内でも生体内でも人体の好中球エラステーゼやカテプシンGの抑制因子としても有益なものである。
参考例
親和性の測定
蛋白質の他の分子に対する親和性を測定する方法は数多くある。Scatchard（Ann NY Acad Sci（1949）51:660-669）は蛋白質の結合に適用される結合の測定や解析方法についての伝統的な方法を示している。この方法は比較的純粋な蛋白質と結合蛋白質と非結合蛋白質との識別を必要とする。
抑制因子の酵素に対する親和性を測定するのに適切な第2の方法は、酵素の活動を低下させる抑制因子の能力を測定するものである。この方法は酵素が基質を分割する速さとクロム遺伝子またはフッ素遺伝子の能力にもよるが、数十マイクログラムからミリグラムの比較的純粋な抑制因子を必要とする。
蛋白質の第2の物質に対する親和性を測定する第3の方法は、M13のような遺伝パッケージにその蛋白質を顕示し、固定された「第2の物質」に付着する蛋白質の能力を測定する。この方法は遺伝パッケージが増幅できるのでたいへん感度が高い。これはまったく新しい方法ではない。Makela, O, H Sarvasと私Seppala（"Immunological Methods Based on Antigen-Coupled Bacteriophages.",J Immunol Methods（1980）, 37:213-223）はバクテリオファージに化学的に接合しているハプタンを使って、ハプタンに親和性を持つ抗体の相度を測定する方法について論議している。さらに、私たちはpHステップ傾斜度を使って結合定子に対して少なくとも準定量分析の値を得ることができた。固定プロテアーゼに対して既知の親和性を持つ抑制因子を使って、ファージ顕示される抑制因子を判断するための標準プロフィールが設定された。表203はBPTIファージとBPTI（K15L）ファージのプロフィールが示されている。この場合、これらのファージは固定hNEから容出されている。固定プロテアーゼの各バッチ（組）によって期間その他が異なるために、こうしたプロフィールは、バッチによって変わってくる。それにもかかわらず、プロフィールの相対的な形状により上位抑制因子を認識することができるのである。
Ascenzi他（ASCE90）はBPTIの人体と牛の凝血因子Xへの結合における熱力学を研究している。
彼らは、pHが9から5に下がるにつれKAが30倍以上低下することを発見した。pH値とともに変化するKAは、活性部位で発見されたヒスチジンにより、セリン・プロテアーゼのクドム（及びその他の抑制因子）への結合では一般的に見られることではないかと思われる。これらの変化が発生したときのpH値は特定のプロテアーゼと抑制因子に特有のものである。抑制因子が結合し電荷を埋蔵しエネルギー的に好ましくない状態になると、ヒスチジンの活性部位をプロトン化することが見られている。この相反効果は非常に堅固に結合した抑制因子がイミダゾールのPKaを効果的にプロトン化のために低下させることである。
この発表の実験仕様全体を通じてラブクエーク（Labquake）の撹拌培養が使われた。
固定人体好中球エラステーゼの準備
1mlの反応ジェル（Reacti-Gal）6xアセトン内（200μlパックビーズ（beads／球体））のCDI活性化アガローズ（agarose）（Pierce Chemical社）が、空のSelect-Dスピンコラム（5プライム-3プライム）に入れられた。アセトンは排出され、ビーズは氷水の温度の1.0mlの冷水と同じく氷水の温度の100mMの硼酸1.0ml、pH8.5、0.9％NaClで素早く2回洗浄された。硼酸塩バッファ内の200μlの2.0mg/ml人体好中球エラスターゼ（hNE）（カリフォルニア州サンディエゴCalBiochem社）がビーズに加えられた。コラムは封印されラブクエーカー撹拌器を使って4℃で36時間撹拌された。hNE溶液が排出sre，ビーズは氷水の温度の2.0M  Trisで洗浄された。pH8.0、4℃で2時間以上、残りの反応グループをブロックした。TBS/BSA内のビーズの50％スラリーが準備された。これに同量の滅菌した100％グリセロールが加えられ、ビーズは25％スラリーとして-20℃で保存された。使用に先駆けて、ビーズはTBS/BSAで3回洗浄され、TBS/BSAのスラリーが準備された。
例I
ファージのクロン的純正集団の特徴化と分別、各々単一キメタ・アプロティニン相似体／M13III蛋白質を顕示する。
この例では、ターゲット結合ドメインを示すキメラファージ蛋白質が固定ターゲットからpHを下げることにより圧出できることと、蛋白質が圧出されるときのpHがターゲッドに対するドメインの親和性を示していることを説明するものである。
標準的な手順
特に記されていない限り、すべての操作は室温で行なわれた。また特に記されていない限り、すべての細胞はXL1-Blue（TM）（カリフォルニア州ラホーヤ、Stratagene社）である。
1）活性トリプシン・ビーズへのBPTI-III  MKの結合の論証
私たちはBPTI-III顕示ファージの固定活性トリプシンとの結合を論証した。顕示ファージの固定活性プロテアーゼとの結合とそれに続く感染ファージを固有のpH容出プロフィールで論証することは、何十マイクログラムもの突然変異蛋白質を生成し純化しなくてすむので、特定の突然変異についての評価を容易にするものである。
ファージMKは遺伝子間域にkanR遺伝子を挿入することにより、M13から取り出された。BPTI-III  MKファージは遺伝子IIIを、信号間隔を指定するコドン、成熟蛋白質を指定するコドン、そしてDNAコード化BPTIの間に挿入することによって取り出された。ファージMAはampR遺伝子を遺伝子間域に挿入することによりM13から取り出された。ファージBPTI-III  MAは信号ペプチドと成熟IIIコード化域の間でpbtiをIIIに挿入することにより、ファージMAから取り出された。ファージBPTI-IIIMAは信号ペプチドと成熟IIIコード化域の間でpbtiをIIに挿入することにより、ファージMAから取り出された。BPTI-IIIMKとBPTI-IIIMAは遺伝子III蛋白質のアミノ終点まで融解したBPTIを示す。ビリオン（VIRION）につき約5コピー。
50mMTris、pH7.5、150mM  NaCl、1.0mg/mlBSA（TBS/BSA）バッファ、あるいは50mMクエン酸ナトリウム、pH6.5、150mM  NaCl、1.0mg/mlBSA（CBS/BSA）バッファ内のどちらかの50μlのBPTI-IIIMKファージ（3.7・1011pfu/ml）が10μlの固定トリプシン25％スラリー（イリノイ州ロックフォード、Pierce Chmical社）と、TBS/BSAあるいはCBS/BSAに追加された。制御用に、50μlMKファージ（9.3・1012pfu/ml）が、TBS/BSAまたはCBS/BSA内の10μlの固定トリプシン25％スラリーに加えられた。
BPTI-IIIMKファージの感染性はMKファージの25倍ほど低くなっている。よって、上記で選択された条件はファージ粒子のほぼ等しい数がトリプシンのビーズに加えられることを確かにする。ラブクエーク撹拌器（カリフォルニア州バークレー、Labindustries社）で3時間撹拌された後、それが適切な場合には、TBS/BSAあるいはCBS/BSAの0.5mlがサンプルに加えられた。ビーズはその後5分間洗浄され、遠心器に30分かけられて回収された。上澄み液が取り除かれて、0.5mlのTBS/0.1％Tween-20が追加された。ビーズは撹拌器で5分間撹拌され遠心器で回収された。上澄み液が取り除かれて、ビーズは上記のTBS/0.1％
Tween-20でさらに5回洗浄された。最後にビーズは0.5mlの容出バッファ（1.0mg/mlBSAを含みグリシンでpH2.2に調節されている0.1M  HCL）の中に入れられ、5分間撹拌されて遠心器で回収された。上澄みの一部は取り除かれて、130μLの1MTris、pH8で中和された。中和された容出の部分標本はLB液で希釈され、斑形成ユニット用に力価が測定された。
表201は投入されたBPTI-IIIMKファージが著しい割合で固定トリプシンに結合したことと、容出バッファによる洗浄で回収されたことを示す。ビーズに結合した融解ファージの量はTBSバッファ（pH7.5）のほうがCBSバッファ（pH6.5）よりも多かった。これはBPTIのトリプシンに対する親和性がpH7.5のほうがpH6.5よりも高かったという観察と一致している。（VINC72、VINC74）MK制御用ファージ（BPTI顕示なし）では固定トリプシンへの結合はずっと低い割合になっており、この結合はpHとは無関係である。pH6.5ではBPTI-IIIMKファージのほうがMKファージよりも1675倍多くトリプシンと結合しているが、pH7.5では、2103倍の違いが観察された。よって、BPTIを顕示する融解ファージは活性トリプシンのビーズへの付着し、感染ファージとしての回収できる。
BPTIのP1突然変異の生成
BPTI-III融解ファージと固定セリン・プロテアーゼの相互作用の特殊性を論証するために、単一アミノ酸置換がBPTI-III融解蛋白質のP1位置に導入された。（BPTIの残留物15）
K15L変更が望まれたのは、BPTI（K15L）が人体好中球エラステーゼ（HNE）（Kd＝2.9・10-9M）に対してはわりと良い抑制因子であるが、トリプシンに対しては良くないからである。BPTI（K15L）を顕示する融解ファージは固定HNEとは結合するが、固定トリプシンとは結合しない。BPTI-IIIMK融解ファージは反対の表現型を顕示している（トリプシンに結合し、HNEに結合しない）。これらの観察はBPTI-III融解ファージの固定セリン・プロテアーゼに対する結合の特殊性を示している。
BPTI-IIIMKとBPTI（K15L）-IIIMAファージの固定トリプシンと人体好中球エラステーゼに対する親和性の特徴化
TBS/BSA（1.7・1011pfm/ml）内のBPTI-IIIMKファージ30μlが固定人体好中球エラスターゼあるいは固定トリプシン（Pierce Chemical社）に加えられた。またTBS/BSAにも加えられた。同様にTBS/BSA（3.2・1010pfm/ml）内のBPTI（K15L）-IIIMAファージ30μlが固定HNEあるいは固定トリプシン（Pierce Chemical社）に加えられた。サンプルはラブクエーク撹拌器で3時間撹拌され、ビーズは0.5mlのTBS/BSAで5分間洗浄され遠心器で回収された。上澄み液が取り除かれて、ビーズは0.5mlのTBS/0.1％Tweenで5回洗浄された。最後にビーズは0.5mlの容出バッファ（1.0mg/mlBSAを含みグリシンでpH2.2に調節されている0.1M  HCL）の中に入れられ、5分間撹拌されて遠心器で回収された。上澄みの一部は取り除かれて、130μLの1MTris、pH8.0で中和されLB液で希釈され、斑形成ユニット用に力価が測定された。
結合されたBPTI-IIIMKとBPTI（K15L）-IIIMAファージの固定好中球からの解離にpHの与える影響
与えられた融解ファージの固定セリン・プロテアーゼに対する親和性は、pH7.0からpH約約2.2にまで及ぶ1ないし0.5pHを単位とするステップ傾斜度を使った洗浄によりビーズから容出する結合融解ファージの量に基づいて特徴化することができる。上述のBPTI変種のHNEに対する親和性は高くないので（Kd>1・10-9M）、これらの変種を顕示している融解ファージはpH2.2以上ではHNEから解離するのではないかと予想された。
さらに、融解ファージはBPTI変種それぞれに固有のpH値で解離するのではないだろうか。HNEに高い親和性を持つBPTI変種を顕示している融解ファージには厳しい洗浄条件を与える低pHバッファが必要だが、HNEに対して低い親和性を持つBPTI変種を顕示している融解バッファでは融解ファージを解離させるには中性のpH条件で十分かもしれない。
BPTI（K15L）-IIIMAファージ30μl（TBS/BSA内で1.7・1010pfm/ml）がTBS/BSA内のHNEビーズ50％スラリー5μlに加えられた。同様にBPTI-IIIMAファージ30μl（TBS/BSA内で8.6・1010pfm/ml）がTBS/BSA内のHNEビーズ5μlに加えられた。したがって、ほとんど同じ数のファージ粒子がビーズに加えられたことになる。サンプルは3時間撹拌されながら培養された。その後ビーズはTBS/BSA0.5mlで洗浄され、遠心器で回収された。ビーズは0.5mlのTBS/0.1％Tween-20で5分間洗浄され、遠心器で回収された。その後さらに4回、TBS/0.1％Tween-20での洗浄が行なわれた。ビーズは100mMクエン酸ナトリウム0.5ml、pH7.0、1.0mg/mlBSA含有で洗浄された。遠心器で回収されて上澄み液が取り除かれた。HNEビーズは続いて100mMクエン酸ナトリウム0.5ml、1.0mg/mlBSA含有、pHは6.0、5.0、4.0、3.0、そして最後は2.2の容出バッファで洗浄された。pHで洗浄された後は、1MTris、pH8.0をLB液で希釈したもので中和され、斑形成ユニット用に力価が測定された。
表203は投入されたBPTI-IIIMK融解ファージのHNEビーズに対する付着の割合が低いことと、回収されたものはpH7.0と6.0で洗浄されたものが圧倒的に多かったことを示している。著しく高い割合でBPTI（K15L）-IIIMAハージがHNEビーズに結合しており、pH5.0と4.0での洗浄で多くが回収されている。よって、BPTI（K15L）-IIIMAをHNEから解離するにはBPTI-MKファージを解離するよりも低いpH条件（すなわちより厳しい条件）が必要とされる。
BPTI（K15L）の親和性はBPTIのHNEに対する親和性よりも1000倍以上大きかった（報告されたKd値を使って（BECK88b））。よって、これはHNEに対して高い親和性を持つBAPI変種を顕示するファージを解離するにはより低いpH条件が必要とされることを提案している。
固定HNEに対する親和性において、BPTI（K15L）の残留物39-42の突然変異の影響
BPTI（K15L、MGNG）-IIIMAファージ（TBS/BSA内で9.2・109pfu/ml）30μlが、TBS/BSA内の固定HNEの50％スラリー5μLに加えられた。同様に固定HNEに30μLのBPTI（K15L）-IIIMAファージ（TBS／BSA内で1.2・1010pfu/ml）が加えられた。サンプルは3時間撹拌しながら培養された。ビーズは0.5mlのTBS/BSAで5分間洗浄された後で回転にかけられた。ビーズは0.5mlのTBS/0.1％Tween-20で5分間洗浄された。最後に、ビーズは引続き100mMクエン酸ナトリウム・バッファの次の各pHで洗浄された。pH7.0、6.0、5.0、4.75、4.5、4.25、4.0、3.5。pHで洗浄された後は中和されてLB液で希釈され、斑形成ユニットの力価が測定された。
表204はBPTI（K15L、MGNG）-IIIのほうがHNEビーズに結合しているBPTI（K15L）-IIIMAファージよりも2倍以上になっていることを示している。どちらの場合も、pH4.75部分が回収ファージの最も大きな割合を占めているおり、これは野性タイプのBPTIの残留物39-42をBI-8eのM39GNGで置き換えることにより、BPTI（K15L）変種のHNEに対する結合を強めたことを確証している。
BPTI（K15V、R17L）-IIIMAの構築
BPTI（K15V、R17L）は今までに説明されているすべてのBPTI変種の中でもHNEに対して最も高い親和性を示している。（Kd＝6・10-11M）（AUER89）。溶出システムをテストするために、このBPTI（K15V、R17L）を顕示しているファージが生成され、自由HNEへの既知の親和性を持つBPTI変種を顕示している融解ファージの固定HNEへの親和性を特徴化するための参考用ファージとして使われた。
固定HNEに対するBPTI（K15V、R17L）-IIIMAファージの親和性
BPTI（K15L、R17L）-IIIMAファージ（TBS/BSA内で9.8・1010pfu/ml）40μlが、TBS/BSA内の固定HNEの50％スラリー10μLに加えられた。同様に固定HNEに40μLのBPTI（K15L、MGNG）-IIIMAファージ（5.13・109pfu/ml）が加えられた。サンプルは1.5時間撹拌された。ビーズは0.5mlのTBS/BSAで1回5分間洗浄された後で、0.5mlのTBS/0.1％Tween-20で5回洗浄された。その後、ビーズは引続き150mM  NaCl、1.0mg.mlBSAを含有するクエン酸ナトリウム・バッファの次の各pHで洗浄された。pH7.0、6.0、5,0、4.5、4.0、3.75、3.5、3.0。BPTI（K15L、MGNG）-IIIMAではpH3.75と3.5での洗浄は省略された。それぞれのpH値で2回づつ洗浄が行なわれ、上澄み液が集められた。1MTris  pH8中和されてLB液で希釈され、斑形成ユニットの力価が測定された。
表206は、pH4.5と4.0部分が最も多くの回収BPTI（K15V、R17L）-IIIMAファージを含んでいることを示している。BPTI（K15L、MGNG）-IIIMAファージは、BPTI（K15L）-IIIMAファージのように、pH5.0から4.5の部分で最も多く回収されている。BPTI（K15V、R17L）の親和性はBPTI（K15L）のHNEに対する親和性よりも48倍高い（Kd値使用、BPTI（K15V、R17L）にはAUER89、BPTI（K15L）にはBECK88b）。BPTI（K15V、R17L）-IIIMAファージのpH溶出プリフィールはpH4.0でピークを示しているが、BPTI（K15L）-IIIMAファージはpH4.5がピークで、これは自由HNEに対する高い親和性を示すBPTI変種を顕示する融解ファージを固定HNEから解離するには、より低いpH条件が必要であるという推定を裏付けるものである。
例II
hNEに高い親和性を持つBPTI誘導体
私たちは、BPTI突然変異がM13から取り出される顕示ファージの表面に、遺伝子III蛋白質（gIIIp）へのアミノ終点融解として現れるようにした。M13はビリオン（VIRION）につき約5つのgIIIpコピーを持つ。
私たちのファージ・ライブラリ理論には位置15と17でPHE,LEU,ILE,VAL,METを、位置16でGLYまたはALAを、位置18でPHE,SER,THER,ILEを、位置19でSER,PRO,THR,LYS,あるいはGLNを持つ1728のBPTI突然変異が含まれていて、BPTI遺伝子の圧出の結果として（前述のMGNG突然変異のコード化）、ランダムにコントロールされる変異遺伝子により、固定hNEで突然変異を持つファージを培養し、より酸性のバッファで積極的にファージを溶出することにより、hNE結合活動をスクリーンする。20の突然変異（表207-208のクロン識別子を参照）が順序付けのために選択され、8つのユニークな順序が示された。表207と208は、hNEに高い親和性を持つBPTI誘導体の9つ（8に事前調査で識別されたもうひとつを加え）の順序が示されている。これらは、pH3.5で溶出されたEpiNE1,EpiNE3,EpiNE5,EpiNE6,EpiNE7と、pH3.5-4で溶出されたEpiNE2,EpiNE4,EpiNE8である。
EpiNE1,EpiNE3,EpiNE7を持つファージを固定HNEから溶出するのにpH4.0以下の条件が必要であったことは、これらがBPTI（K15V、R17L）よりもHNEに対して高い親和性を持つBPTI変種を顕示していることを提案している。
EpiNE1,EpiNE3,EpiNE7は溶性蛋白質として圧出され、そのHNE抑制活動がカスティロ他の蛍光計評価で測定されている（CAST79）。データはグリーン及びワークの方法で解析されている（GREE53）。EpiNE1,EpiNE3,EpiNE7は自由蛋白質として、E.coliとイーストの両方で生成される。これらの淡泊質がhNEを抑制する能力は、フッ素基質の分割にしたがって測定される。これらの化合物のK1は、1pM、2pM、3pMである。EpiNe1を顕示するファージは、ファージに顕示される他のクドム抑制因子をすばやく特徴化するための参考用pH溶出プロフィルを設定するために使われる。ここに挙げられたEpiNEはすべてBPRI（K15V、R17L）よりも低いKdを持つ（60pM）。
EpiNEクローンの順序の調査は哲蒙的である。P1位置（残留物15）で、VALまたはILEが強く好まれることは、14から6でVALがILEよりも好まれることを示している。スクリーンされたライブラリでは理論的にP1でこれらのアミノ酸を持つ突然変異があるはずだが、実際にはP1位置でのLEU、PHE、またはMETの例は観察されていない。
これはLYS15のアミノ酸置換物LEU、PHE、またはMETをひとつ持ったBPTI変種が、VALまたはLIEを含む相対物と比べて、HNEに対する親和性が著しく低いという観察と一致している（BECK88b）。
PHEは位置17で強く好まれ、20のクローンのうち12に現れている。METはこの位置で次に優勢な残留物であるが、位置15にVALがあるときにだけ現れる。位置18では、ライブラリではこの位置で他の残留物も含むべきにもかかわらず、PHEが順序付けられたクローン20のすべてに現れている。この結果は非常に驚くべきもので、今までのBPTIの突然変異解析からは予想できぬものである。私たちは、位置18でのPHEの存在がそれぞれのEpiNEのHNEへの結合力を著しく高めるものと推定する。最後に、位置19で、PROが20のコドンのうち10に現れている。2番目に優勢な残留物SERは20のコドンのうち6つにしか現れていない。この研究で変異遺伝子にターゲットを当てている残留物のうち、残留物19はHNEの抑制因子の相互作用表面の端に一番近い。それにもかかわらず、PROの優勢が観察されるのは、位置19でのPROは、位置18でのPHEのように、これらの蛋白質のHNEへの結合力を高める役割を果していることを示しているのだろう。興味深いことに、EpiNE5はただ一度だけ現れ、EpiNE1と異なるのは位置19だけである。同様に、EpiNE6がEpiNE3と異なるのは位置19だけである。これらの変更はこれらの蛋白質がHNEと相互作用するのにわずかな影響だけしか与えないのであろう。これは、EpiNE5とEpiNE6のpH溶出プロフィールが、EpiNE1とEpiNE3のそれとそれぞれ非常に類似していることによって裏付けられる。
EpiNE2とEpiNE8だけが、他の選択クローンと異なるpHプロフィールを示している。どちらのクローンも位置19でLYSを含み、それがBPTIとHNEとの相互作用を制限するのかもしれない。ただし、EpiNE2とEpiNE8（それぞれ、R15LとY21S）内の他の変更がHNEに対する親和性に影響を与えている可能性を排除することはできない。
位置18は特定のセリン・プロテアーゼに対するアプロティニン相似体や誘導体の特殊性や親和性を決定するのに重要な位置であるとは、今まで認識されていなかった。今までに、位置18のフェニルアラニンがHNEへの特殊性や高親和性に寄与すると報告したり提案した者はいない。
例III
hCGに高い親和性を持つBPTI誘導体
BPTI突然変異を有するファージの同じライブラリが、カテプシンGの結合活動についてスクリーンされる。図7には個々のカテプシンG結合クローンの結合とpHプロフィールが示されている（EpiC変種に割り当てられる）。クローンはすべて小さなピークを示しており、Ph5（クローン1、8、10、11）の溶出とpH4.5（クローン7）において、結合したファージが徐々に低下していくのと重なっている。表209はカテプシンGビーズの結合を示すクローンを報告している。
EpiC変種とカテプシンG、またhNEに対するEpiNEのpHプロフィールを比べると、EpiNE変種はhNEに対して高い親和性を持っているが、EpiC変種はカテプシンGに対してほどほどの親和性しか持っていない。
EpiC突然変異のP1残留物は圧倒的にMETでひとつPHE例があるだけだが、BPTIではLYSで、EpiC変種ではVALまたはLEUのどちらかである。EpiCの突然変異では残留物16はほとんどALAでひとつだけGLYの例がある。残留物17はPHE、ILE、またはLEUである。おもしろいことに、少なくともこの小さなサンプルで見る限り、残留物16と17は大きさを補足しながらペアになるようである。小さなGLY残留物は大きなPHEと組になり、比較的大きなALAはそれよりも小さいLEUやILEとペアになっている。位置18と19が使えるMYMUTライブラリにある残留物の大部分は、EpiC変種に代表されている。
例IV
ITI：hNEに対する高い親和性を持つ誘導体
顕示ベクトルの構築
私たちはTRAB86にあるITI軽鎖遺伝子の核酸番号付け方法と、GEBH86の図1のUTIに示されているアミノ酸番号付け方法を使用している。またSAMB89とAUSU87で標準方法とされているものに従ってDNAの操作を行なっている。
人体ITI-DIの蛋白質順序は56のアミノ酸残留物から成り、完全なITI軽鎖順序のLYS22からARG77までに渡っている。この順序は、TRAB86に示されているcDNA順序の位置750から917の間の168の基部によりエンコード（encode）されている。このアミノ酸順序をエンコードしているDNAは標準の方法で、M13遺伝子iiiに導入されている。含有するITI-DI-III溶解遺伝子を隔離するファージはMA-ITIと呼ばれ、ampR遺伝子を保有する。ITI-DI::III融解蛋白質の圧出と、ファージ表面へのその顕示は、ウエスタン（Western）の兎の抗（hITI）血清を使った分析とファージ力価中和実験により論証されていた。
アガローズ固定プロテアーゼ・ビーズに結合されるMA-ITIファージの分別
ITI-DI-III融解蛋白質を顕示しているファージがプロテアーゼ人体好中球エラステーゼ（hNE）あるいはカテプシンGと強力に相互作用しているかどうかテストするために、顕示ファージの部分標本がアガローゼ固定hNEまたはカテプシンGのビーズ（hNEビーズまたはカテプシンGビーズ）とともに培養された。ビーズは洗浄され、pH分別により溶出されたファージと結合された。pH低下の行列は次の通りである。：pH7.0、6.0、5.5、5.0、4.5、4.0、3.5、3.0、2.5、2.0。溶出と中和に続き、様々な投入や洗浄、そしてpH溶出部分の力価測定が行なわれた。
幾つかの分別の結果は表212（hNEビーズに結合するEpiNE-7またはMA-ITIファージ）、表213（カテプシンGに結合するEpiC-10またはMA-ITIファージ）にまとめられている。2種類のビーズ（hNEまたはカテプシンG）に対して、コントロール顕示ファージ（EpiNE-7またはEpiC-10）を使って得られたpH溶出プロフィールは以前に見られたものと類似していた。hNEビーズに適用されたEpiNE-7顕示ファージの約0.3％が分別手順の間に溶出され、溶出プロフィールはpH4.0あたりで溶出の最高値を示していた。カテプシンGビーズに適用されたEpiC-10の微量、0.02％が溶出され、溶出プロフィールはpH5.5近くで最高値を示していた。
MA-ITIファージはアガローズ・ビーズにおいて、hNEとカテプシンGのどちらにも大きな親和性は示していない。
hNEビーズまたはガテプシンGビーズに結合するMA-ITIファージのpH溶出プロフィールは、低下pHによるファージ回収において実質的に単調な減少を示している。さらに、分別処理の間に回収されたビーズに適用されたファージの分屑の合計はかなり低い。hNEビーズからは0.0002％、カテプシンGからは0.0003％であった。
完全な大型（Mr＝240,000）ITI蛋白質による好中球抑制の公表値K1は60から150nMの範囲であり、ITIによるカテプシンG抑制の値は20から6000nMまでが報告されている。（SWAI88、ODOM90）私たちが行なったhNEビーズに結合された顕示ファージのpH分屑測定は、hNEへの親和性が低い（>μM）淡泊質を顕示しているファージはビーズにより結合されないが、高い親和性（nM）を持つ淡泊質を顕示しているファージはビーズに結合しpH5ぐらいで溶出していることを示す。ITI軽鎖の最初のKuDomがITIのhNEに対する抑制活動に全責任を負うとしたら、そしてまた、このドメインがMA-ITIファージに正確に顕示されているとしたら、顕示ファージのhNEビーズへの結合や分別を可能にする、抑制因子のhNEに対する親和性は最低でも50から100nMであろう。
ITI-DIのP1域の変更
ITI-DIとEpiNE-7が溶液でBPTIと同じ構成を取るとすると、これらふたつのポリペプチドは第1第2結合ループの両方で同一のアミノ酸順序を持つことになる。例外はP1位置あたりと位置11と34の4つの残留物である。ITI-DIでは位置15から20の順序は次のようになる。（ITI-DIの位置15は、GEBH86内のUTI順序の位置36と対応する。）
0003819931.tif 000004
これらふたつの蛋白質はhNEに対する親和性に大きな違いがある。ITI-DIのhNEに対する親和性を高めるために、位置15から20でカセット突然変異遺伝子によりEpiNE-7順序がITI-DI順序に組み込まれた。
P1位置付近でEpiNE-7変化があるITI-DI-III融解遺伝子を含むファージはMA-ITI-E7と呼ばれる。
MA-ITI-E7ファージの分別
ITI-D1-III融解蛋白質の位置15、16、18、19での変化が顕示ファージのhNEビーズへの結合に影響を与えるかどうかをテストするために、短縮pH溶出プロフィールが測定された。EpiNE-7、MA-ITI、MA-ITI-E7顕示ファージの部分標本がhNEビーズとともに室温で3時間培養された。ビーズは洗浄され、ファージが上述のように溶出された。ただし、pH溶出は次の3つ、pH7.0、3.5、2.0だけが行なわれた。これら3つの溶出の結果は表214に示される。
EpiNE-7とMA-ITI顕示ファージの結合と溶出は次のように説明される。投入されたファージの分屑合計は、EpiNE-7ファージでは高く（0.4％）、MA-ITIファージでは低かった（0.0001％）。さらにEpiNE-7ファージはpH3.5で溶出が最高となったが、MA-ITIファージは上記に見られるように、pH低下にともなって単調な減少が見られるだけであった。
MA-ITI-E7ファージはMA-ITIファージに比べてhNEビーズへの結合レベルの向上を示している。投入されたファージのビーズから溶出された分屑の合計は、MA-ITI-E7ファージ族ははどちらもMA-ITIファージ族よりも10倍程多くなっている（ただしEpiNE-7ファージよりはまだ40倍程低い）。さらに、MA-ITI-E7ファージ族のpH溶出プロフィールはEpiNE-7ファージと同じように、pH3.5で最高値を示している。
MA-ITI-E7ファージの結合特性をさらに定義するために、前述の延長pH分別手法がhNEビーズへのファージ結合を使って表215に示されるように行なわれた。EpiNE-7顕示ファージのpH溶出プロフィールはすでに説明されている。このより明解なpH溶出プロフィールでは、MA-ITI-E7ファージはpH5を中心に幅広く溶出最高値を示している。hNEビーズからpH溶出で得られたMA-ITI-E7ファージの分屑合計は、やはりEpiNE-7顕示ファージを使って得られたものよりも40倍ほど少なかった。
hNEビーズに結合するMA-ITI-E7のpH溶出状態はBPTI［K15L］-III-MAファージを使ったときに見られるものと類似している。K15L突然変異を持つBPTIのhNEに対する親和性は3.・10-9Mである。これ以外はすべて同様であると仮定すると、MA-ITI-E7のpH溶出プロフィールは、自由ITI-D1-E7ドメインのhNEに対する親和性はnM範囲にあると示される。よって、P1域のあたりでITI-DI順序の替りにEpiNE-7順序が置き換えられると、明らかにhNEに対する親和子得が20倍から50倍増加する（ITI-DIでK1＝60から150nMと仮定）。
もしEpiNE-7とITI-DI-E7が同じ溶解構造を持っているとすると、これらの蛋白質は相互作用表面についてhNEに対して同一のアミノ酸順序を示す。この類似性にもかかわらず、EpiNE-7はITI-DI-E7に比べて約1000倍ほど高い親和性をhNEに示している。この観察は、相互作用を調整する上で、非接触第2残留物の重要性を協調している。
ITI軽鎖はSER10とASN45でグリコサイレートされる。（GEBH86）グリコサミノグリカン鎖の除去は抑制因子のhNEに対する親和性を約5倍ほど低下させることが示されている。（SELL87）。この他にEpiNE-7とITI-D1-E7との違いで重要となる可能性を持つものに、正味電荷がある。BPTIは電荷＋6を持つが、EpiNE-7は＋1、ITI-D1は-1である。さらに、これらのふたつの分子間の電荷の違いは結合表面に近接する分子の中心部分の違いとなる。EpiNE-7の位置26はLYSでITI-D-E7ではTHRであるが、位置31の残留物はそれぞれGLNとGLUである。これらの順序変化は正味分子電荷を変えるのみならず、ITI-DI-E7の相互作用表面近くに負の電荷を与えている。位置31における負の電荷発生（ここで説明されている他のどのhNE抑制因子にも見られない）が抑制因子とプロテアーゼとの相互作用を不安定にさせるのかもしれない。
BITI-E7ファージの準備
ITI-D1のK1EDSをEpiNE7からのR1RDFと交換して、ファージMA-BITI-E7を作った。BPTIのPhe4はその蛋白質の疎水コアの一部である。セリンとの交換はITI-E7の安定性や力学的特徴を不利な方向で変えることになるかもしれない。ITI-E7は位置2でGluを負に電荷しているが、EpiNE7はProを持つ。
ファージMA-ITIにより顕示されるITI-III融解蛋白質の推定アミノ終点で同様の変更が行なわれた。これらのファージはMA-BITIと呼ばれる。
ファージMA-ITIとMA-BITIにより顕示されるITI-III融解蛋白質の特性をウエスタン分析を使って比較した。どちらの顕示ファージ族によって生成された融解蛋白質にも大きさや量において著しい違いは見られなかった。よって、ファージに顕示されるどちらの融解蛋白質でプロセスされたフォームには大きな違いはなかった。さらに、MA-ITI-E7とMA-EpiNE7により顕示される遺伝子III融解蛋白質のプロセスフォームにも大きな違いはなかった。プロセスに大きな変更があって蛋白質の形成に大きな変化があるということが、MA-ITI-E7とMA-IpiNE7顕示ファージが示すhNEビーズへの結合の大きな違いの原因であるということは、したがってほとんど考えられない。
MA-BITIとMA-BIIT-E7顕示ファージのhNEビーズへの結合特性を、前述の延長pH分別手順を使って特徴付けた。表216を参照。hNEビーズに結合するMA-IpiNE7顕示ファージのpH溶出プロフィールはすでに説明したものと類似している。MA-BITIとMA-BITI-E7のpH溶出プロフィールは、MA-ITIとMA-ITI-E7によって示されるものとは著しく異なる。（表212と215を参照）どちらの場合も、顕示された融解蛋白質の推定アミノ終点での変更はhNEビーズから溶出される顕示ファージの分屑を数倍に高めた。
顕示ファージへのhNEビーズの結合力は、ビーズの準備状態や準備された個々のビーズの年齢（age）によって異なる。したがって、ビーズから得られるプロフィールの形状を比較するにあたっては、同じ組（batch）からの同じ年齢（age）のビーズを使うべきである。例をあげれば、hNEビーズから回収されたMA-EpiNE7顕示ファージの分屑は、表212、215、216に示されるそれぞれの実験間、またこの発明内での実験仕様で与えられた結果と約2倍ほど差位がある。
ただし、pH溶出プロフィールの形はほとんど同じである。顕示ファージ生成量を、同時に行なわれた溶出のビーズから回収されたMA-EpnNE7の生成量に標準化することによって、hNEビーズの結合力のバラツキを修正することができる。表212、215、216が標準化されると顕示ファージの回収は、回収されたMA-EpiNE7と比べて次のようになる。
顕示ファージ族    標準化分屑
MA-ITI            0.0067
MA-BITI           0.027
MA-ITI-E7      0.027
MA-BITI-E7      0.13
よって、顕示された融解蛋白質のアミノ終点順序の変更は、hNEビーズから溶出されるファージの分屑を3倍から5倍増加させる。MA-ITI-E7はpH5.0を中心に幅広いpH最高値を示しているが、MA-BITI-E7ではpH最高値はpH4.75から4.5あたりになっている。
MA-BITI-E7顕示ファージのpH溶出の最高値は、前に説明されているように、BPTI（K15L）とBPTI（K15V、R17L）顕示ファージの最高値の間に位置する（それぞれ、pH4.75、pH4.5、pH4.0）。（例III）顕示ファージが示すpH最大値から、溶液内で自由なBITI-E7蛋白質がhNEに対して持つ親和性は10-10範囲にあると推定された。これは上記のITI-E7に対する推定量よりも10倍程hNEに対する親和性が増加していることを表す。
上で説明されているように、ファージ蛋白質のウエスタン分析は、アミノ終点順序変更に関して遺伝子IIIにおいては大きな変化はないことを示している。したがって、顕示ファージのhNEビーズに対する親和性の変化が、アミノ終点の突然変異の融解蛋白質の変更（訂正）プロセスの結果からなる蛋白質の大きな変更に帰することはない。
結合力が増加したのは、一部には、1）位置2でGLUがPROに変わったために生じた蛋白質の正味負電荷の減少（-1から0）、または2）蛋白質の疎水性コアの残留物4でSERがPHEに変わったために蛋白質がより安定した、または3）これら両方の置換の共同効果が考えられる。
MA-BITI-E7-1222とMA-BITI-E7-141の生成と特性
仮定されたKuDom：hNE相互作用においては、BITI-E7とEpiNE7はふたつの位置、11と34においてのみ異なる。EpiNE7ではこれらの残留物はそれぞれTHRとVALである。BITI-E7ではこれらはALAとGLNである。加えて、BITI-E7は31にGLUを持つが、EpiNE7はGLNを持つ。この残留物は直接界面にはないが、この負の電荷が結合に影響を与えている可能性もある。オリゴヌクレオチドによる突然変異遺伝子を使って、位置11、31、34の置換がプロテアーゼ：抑制因子相互作用に与える影響を調べた。
ファージMA-BITI-E7-1222は突然変異体を持つBITI-E7と同じある。ファージMA-BITI-E7-141は突然変異体E31QとQ34Vを持つBITI-E7と同じである。
MA-BITI-E7-1222とMA-BITI-E7-141顕示ファージのhNEビーズへの結合特性を、表217（MA-BITI-E7とMA-BITI-E7-1222）と表218（MA-EpiNE7とMA-BITI-E7-141）に示される延長pH分別方法を使って判定した。
顕示ITI誘導体の位置11でのTHRからANAの置換は、顕示ファージのhNEビーズへの結合力には明らかな影響は与えていない。
対照的に、位置31と34での変化は顕示ファージのhNE結合特性に深い影響を与えている。（表218）MA-BITI-E7-141の溶出プロフィールpH最大は、親MA-BITI-E7と比べて低pHに移動している。さらに、最大位置（pH4.5とpH4.0の間）はこの実験でMA-EpiNE7ファージによって示されたものと同一だった。最後に、MA-BITI-E7-141ファージは親MA-BITI-E7に比べてhNEビーズから溶出された投入ファージ分屑合計が10倍増加している（0.3％に対して0.03％）。
実際、hNEビーズから溶出されたMA-BITI-E7-141の分屑合計は、MA-EpiNE7のほとんど2倍だった。
上述の結果は、hNEビーズへのMA-BITI-E7-141顕示ファージによる結合がMA-EpiNE7によるものと類似するものであることを示している。よって、BITI-E7-141はKd<1pMを持つかもしれない。このような親和性は親（BITI-E7）に対して上記で推定されたものよりも100倍程高く、完全なITI蛋白質について報告されている親和性に比べて105から106倍高いものである。
BITI-E7-141の突然変異遺伝子
BITI-E7-141は9つの位置でITI-D1と異なる（1、2、4、15、16、18、19、31、34）。hNEに対する高い親和性を維持しながらITI-D1から変化が最も少ない蛋白質を得るために、位置1、2、4、16、19、31、34での変化を逆行させたときの影響を調べた。BITI-E7-141に導入された変化の図式を下記に示す。
0003819931.tif 000005
ITI-D1残留物は太字で、ITI-D1にもBITI-E7-141にも見られない残留物は太字の下に下線を引いて顕示してあります。MUT1619はITI-D1残留物を位置16と19で回復する。
17のMETと18のPHEが高親和性を持つhNE結合に最適のようであるが、F17F18もまた効果的である。16のGLYと19のSERは、hNEに対するBPTI変種のライブラリの分別から得られるBPTI変種とhNEとの高親和結合でしばしば発生する。（ROBE91）よって、hNEへの高親和性を維持しながらこれらの位置でITI-D1順序を回復することが可能なようだ。MUT200に指定された順序は仮定であるが、hNEに対して高親和性を持つ可能性は非常に高い。
BITI顕示ファージはEpiNE7のR1TDFをITIファージのK1EDSで置き換えることによって生成された。
BITI-E7に次のふたつの変化を導入してBITI-E7-141が生成された。位置31でGLUをGLNに、位置34でGLNをVALに変更。
BITI-E7-141蛋白質順序アSN24-GLY25-THR26は成熟核細胞（真核細胞、以下同様）有機体内のN結合のグリコサイレーションで一般的に認められる順序ASN-X-THR/SERとマッチする。人体血清から隔離された完全ITI内では、この部位で軽鎖ポリペプチドがグリコサイレートされる。（ASN45、ODOM90）もしBITI-E7-141蛋白質が成熟核細胞圧出により生成されるなら、ASN24もグリコサイレートされる可能性が高い。このようなグリコサイレーションは長期治療に使われると、蛋白質が同種性と免疫遺伝性を持つように純化することを困難にする。KuDomsのこの位置でしばしばアラニンが発見されるので、T26とAを交換した。
変異誘発化MA-BITI-E7-141顕示ファージのhNE結合特性
個々のファージ集団のhNEビーズへの結合特性は、既に説明された短縮及び延長pH溶出方法を使って判定される。これらの研究の結果は表219に示されている。
表219はhNEビーズから溶出された様々な顕示ファージのpH溶出データを示すものである。ビーズに適用されたpfuの合計は2番目のコラムに示されている。短縮pH溶出方法（pH7.0、pH3.5、pH2.0）の各pH分屑から回収された投入pfuの分屑は次の3つのコラムに示されている。
ここで得られたデータには、延長pH溶出プロトコル、pH3.5リストは、pH6.0、pH5.5、pH5.0、pH4.5、pH4.0、pH3.5溶出サンプルで回収された投入物の分屑の合計を表している。
同様に、pH2.0リストはpH3.0、pH2.5、pH2.0溶出サンプルで回収された投入物の分屑の合計である。pH溶出方法全体を通じて得られた投入pfuの分屑の合計は表219の第6コラムに記載されている。表の最後のコラムは回収された投入pfuの分屑合計をMA-BITI-E7-141顕示ファージで得られた値に標準化した数字をリストしている。
表219に示されるデータを比較する際には、ふたつの要素を考慮する必要がある。第1に、hNEビーズから放出されたファージの運動性と延長pH方法に関わる時間延長により、pH3.5で回収された投入pfuの分屑は延長pH溶出方法のpH2.0分屑により、短縮方法で得られる値よりも高められる。この影響の大きさは、両方の方法を使ってMA-BITI-E7-141顕示ファージをhNEビーズから溶出したときに見られる。第2の要素は、表219に挙げられている投入pfu範囲では、投入pfuが回収に影響を与えることだ。投入pfuが大きければ溶出により回収される投入物の分屑合計も大きくなる。この効果は、投入pfuが3から4ほど違うときに明らかとなる。これは、より高い力価で適用されたファージからのデータがより低い力価で適用されたファージからのデータと比較されるときに、顕示ファージのhNEビーズに対する親和性を高く見積りすぎてしまうことにつながる。
これらの点に注意しながら表219を見てみよう。hNEビーズの顕示ファージ結合上のMA-BITI-E7-141顕示ファージ（親）に導入された突然変異体の効果は次の3つのカテゴリーに分類できる。効果がほとんどないもの、ある程度（2、3倍）の効果があるもの、大きな（5倍以上）効果があるもの。
MUTT26AとMUTQE変化はhNEビーズへの顕示ファージの結合にほとんど効果がないように見られる。pfuの回収合計で見ると、顕示ファージはこれらの変更結合も親のhNEビーズへの結合と同じように含んでいる。
実際、親側から得られたpH溶出プロフィールと延長pH溶出方法で得られたMAUU26A顕示ファージは区別がつかない。MUTQE顕示ファージの結合は親側に比べると幾らか減少しているようで、適用されるpfuを考慮するとこの結合はやや過大評価されすぎているようだ。
MUTP1とMUT1619オリゴヌクレオチドにより導入された順序変更は、顕示ファージのhNEビーズへの結合を2倍から3倍弱めるようだ。投入力価と様々な溶出分屑から回収されたpfuを考慮すると、1）これらの顕示ファージはどちらもMA-EpiNE7顕示ファージよりもhNEビーズに対する親和性が低い、また2）MUT1619顕示ファージはMUTP1顕示ファージよりもhNEビーズに対する親和性が高いようである。
BITI-E7-141のアミノ終点での順序変更は、顕示ファージによるhNEビーズへの結合を少なくとも10倍程減少させるようである。AMINO2変化はAMINO1の変化よりも実質的にずっと多く顕示ファージの結合を減少させると思われる。
表219のデータを上のように判読すると、次の結論に達する。
1）
ITI-DIの位置26でのALAとTHRの置換とその誘導体は抑制因子とhNEの相互作用にいっさい影響を与えない。よって、成熟核細胞培地で生成された抑制因子の蛋白質のASN24でのグリコサイレーションの可能性は、hNEへの親和性を減少せずに避けることができる。
2）
位置31でのGLUからGLNの変化と位置34でのGLNからVALへの変化により生み出されたhNEビーズに対する顕示ファージの親和性増加は、主に位置34でのVAL置換によるものである。
3）
ITI-D1のアミノ終点域で導入された3つの変化（位置1、2、4）はすべて、hNEビーズに結合している顕示ファージに何らかの影響を与える。位置4での変化（SERからPHE）は、位置2での変化よりも大きな影響を与えるようである。
位置1での変化はほとんど影響しない。
4）
BITI-E7-141のP1域近く（位置15）での変化は、顕示ファージのhNEへの結合に影響する。位置16でのALAからGLYの変化と、19でのPROからSERへの変化は抑制因子の親和性を幾らか（約3倍ほど）減少させる。位置15でのILEからVALへの置換はさらに結合を減少させる。
BITI-E7-141は9つの位置でITI-D1と異なる。上記の論議によれば、ITI-D1に基づく高親和性を持つhNE抑制因子はITI-D1順序を4、5箇所の位置で変えるだけで構築できる。これらの変更は次の通り。位置4のPHE、位置15のVAL、位置18のPHE、位置34のVAL、位置26のALA。ASN24のグリコサイレーションを考慮しなければ、THRをそのまま26の位置に置いておくこともできる。
10．まとめ：hNEに対する隔離ITI-D1誘導体に推定される親和性
hNEビーズへの顕示ファージ結合と溶出から考えるに、ITI-D1の様々な誘導体が自由に溶液の中にあるようなhNEに対して親和性を推定することが可能である。これらの推定は表220以下にまとめられている。
例5
図11はR2＝2プロピル、X＝［-CO-CF2-］、R3＝-CH3を組み入れる数々の初期中期の化合物である。化合物Iはグリセルアルデヒドで、この中ではヒドロキシルがメチルチオメチル（MTM）グループにより保護される。（p.680 in ADVANCED ORGANIC CHMISTRY, Third Edition, Part B: Reactions and Synthesis, F.A Carey and R.J.Sundberg, Plenum Press, New York, 1990, ISBN0-306-43456-3（以後CARE90）並びにここで引用される他の研究も含む）
化合物Iはグリニヤール試薬に反応し、二塩化プロピルによりイールドIIを形成する。
IIIではC3のヒドロキシルがテトラヒドロピラニあるいは（THP）グループにより保護される（p.679、CARE90）。MTMグループはAg+またはHg++の水溶性溶液内で非酸条件のもとで選択的に取り除かれる（p.680、CARE90）。C2のヒドロキシルは化合物IVに与えられるために、選択的にN-ブロモ琥珀酸イミドでケトンに酸化される。（p1059 in ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY, Reactions. Mehanisms, and Structure Third Edition, Jerry March, John Wiley & Sons, New York, 1985,ISBN0-417-88841-9（以後MARC85）and Filler, Chem Rev, 63:21-43（1963）（FILL63）
化合物IVのC1ヒドロキシルはMTMでブロックされ、C2でのケト・グループはLiAlH4でアルコールに還元される。（p.809、MARC85）C2ヒドロキシルはβメトキシエトキシメチル・グループでブロックされ（p.679、CARE90）、MTMグループは化合物Vを生成するために取り除かれる。化合物VはN-クロロ琥珀酸イミドでアルデヒドに酸化される（p.1059、MARC85及びFILL63）。化合物VIはグリニヤード試薬に転化され、Vに反応し、アルコールVIIを生成する。C3をケトンに転化するのにN-クロロ琥珀イミドが使われる。ケトンはジエチルアミノ硫酸三フッ化物（DAST）またはMARC85の809ページに記載されているその他の試薬のひとつを使ってgemジフロライド（化合物VIII）に転化される。
C5でヒドロキシルを保護しているTHPグループが穏やかな酸性の水溶性水解で取り除かれる（p.689、CARE90）。ヒドロキシルはPC15またはその他適切な試薬（MARC85の383ページに記載されているものなど）で塩化物に転化され化合物IXを生成する。MEMグループは非水溶性臭化亜鉛で取り除かれ（MARC85、p.1059とp.1084）化合物Xを生成する。化合物Xのメチルエステルは、ジアゾメタン（CARE90、p.134）の反応と、フタルイシドカリウムに反応して（CARE90、p132）化合物XIを生成する（ヒドラジンで処理されメチルエステルの水解の後）。化合物XIはFmocやtBocを使ってペプチド合成物を組み入れるのに適している。
化合物XIの合成はC2あるいはC5での明確な偏光力を確立しない。XIは、固定蛋白質などの偏光マトリックスとクロマトグラフィーを使って4つのコンポーネントに解像することができる。化合物XIを異なる偏光力のコンポーネントに解像することが好まれる。
合成を行なうときには替りに次の方法を用いてもよい。
a）
最初の反応において二プロピル塩化グリニエール試薬の替りに、二ブチル塩化グリニエール試薬を使う。これにより、ILE-ALA相似体が合成でき、その中で結合する-NH-が-CF2-に置換される。二プロピル塩化物の替りにその他のアルキル塩化物を使うことができる。これにより他のジペプチド相似体が生成され、その中で最初のアミノ酸が置換される。
b）
VIをVIIIで置き換える。これによりVAL-GLYまたはILE-GLYの相似体が合成される。VIの替りに他の1（O-MEM）-2-クロロ化合物を使うことにより、第2のアミノ酸がALAとは異なるジペプチド相似体が生成される。
c）
化合物VとVIの替りにXIVとXVを使うことによって、F置換のないXVIを生成することができる。
d）
CH3-CO2Fを使うことによって、-FとCH3-COO-を追加し二重結合で交差できるようになる（p.181、CARE90及びここに引用されている他の参考文献）XVIIはXIVとXVのグリニエール付加物を脱水することにより得ることができる。
e）
化学的に近いものを使って、XIのC2とC3の間に-CH2-を追加することができる。
例6
図13はカルボニル炭素の替りに硼素を含むジペプチド相似体の仮定的合成に関与する化合物を示す。これらの相似体はクラスIとクラスIIの抑制因子に使われる。
化合物XXXIはマテソン（Matteson）他により報告されている（Organometallics 3:1284ff（1984）（MATT84）.XXXIはイソプロプリエステルXXXIIを与えるためにトランスエステル化される。XXXIIIはMOMにより保護される1ヒトロキシ-2-メチル-3-クロロプロパンの誘導体である。XXXIIIはリチウムに反応し、リチウム誘導体はXXXIIと反応しXXXIVを与える。MOMグループが取り除かれ、自由アルコールはN-クロロ琥珀酸イミドでアルデヒドに酸化された後で、Cr03でカルボキシル酸に酸化される。自由ジペプチド相似体はXXXVとして示される。
例7
図14は硼酸グループを含有する分子の仮定的合成に関与する化合物を示す。硼酸グループは、R3がS1部位を占有するとそれがP1残留物のカルボニル炭素の部位を占有するように配置される。化合物XLIはR3が-H、-CH3、エチルその他のときに容易に生成できる。マテソン他（MATT84）がXLII使用を報告している。XLIIはXXXIに特定の偏光力を負わせる（図13）。XLIIとXLIの反応はXLIIIを生成する。この生成物はC2でひとつの偏光力を持つ可能性が圧倒的に高い。偏光力が図14に示されているようになるか逆になるかは知られていない。XLIVはMOMグループを取り除きC1の主要ヒドロキシルをカルボキシル酸に酸化することによって得られる。XLIVはN,N'-ジサイクロヘキシルカルボジイミド（DCC）を使って自由アミンと連結することができる。XLIVはアミノグループを持たないので、XLIVが鎖の終点となる。
クラスII抑制因子に使用されるR1結合子はCARE90、MARC85その他に記載されている標準方法で合成することができる。
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BPTI-III MKファージの投入合計は
0.030ml X（8.6・1010pfu/ml）=2.6・109
BPTI（k15l）-III MAファージの投入合計は
0.030ml X（1.7・1010pfu/ml）=5.2・108
BPTI（k15l）-III MAファージの感染性がBPTI（k151）-III MAファージのそれよりも5倍低いとすれば、上記のファージ投入は固定HNEに同数のファージ粒子が加えられることを確実にする。
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【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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