(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下に示す（１）〜（８）のいずれか、またはこれらの２以上の混合物を有効成分とする水生動物の白点病及び／又はグルギア症の予防および治療剤、
（１）ラクトフェリン、
（２）ラクトフェリンをペプシンにより加水分解して得られるペプチド混合物、
（３）前記（２）のペプチド混合物から分離した、配列番号２６のアミノ酸配列からなるペプチド、
（４）前記（２）のペプチド混合物から分離した、配列番号２８のアミノ酸配列からなるペプチド、
（５）前記（２）のペプチド混合物から分離した、配列番号１０のアミノ酸配列からなるペプチド、
（６）配列番号２６のアミノ酸配列からなる合成ペプチド、
（７）配列番号２８のアミノ酸配列からなる合成ペプチド、
（８）配列番号１０のアミノ酸配列からなる合成ペプチド。
【請求項２】
有効成分が、少なくとも０．００１％（重量）の割合で含有されている請求項１の水生動物の白点病及び／又はグルギア症の予防および治療剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
この発明は、水生動物の寄生生物性疾患予防および治療剤に関するものである。さらに詳しくは、この発明は、養殖魚介類、観賞用魚類等の水生動物に寄生する生物によってそれらの水生生物に発生する各種疾病を予防および治療する薬剤に関するものである。
【０００２】
なお、以下の説明において、抗菌活性という用語は、細菌、ウイルス等の微生物を静菌または殺菌する作用を意味する。また、寄生生物とは、細菌、ウイルス等の微生物以外の、水生動物に寄生する生物を指す。
【０００３】
【従来の技術】
水生動物は、本来広い水域に生息しているが、観賞魚類、養殖魚類、養殖甲殻類等は、その経済性の観点から、狭い範囲の水域において高密度で飼育されている。このような環境下では、いったん伝染性の寄生生物が発生した場合、飼育群全体に蔓延し、水生動物が全滅にするほどの致命的な被害を招来する場合もある。
【０００４】
更に、近年普及してきた飼育水の循環方式を採用している飼育池においては、被害が全ての池に蔓延し、その根絶が極めて困難な状態となっている。特に、稚魚は感染に対する防御力が脆弱なため、その飼育環境における伝染性の寄生生物の発生には細心の注意が必要とされている。
従来、病原性細菌による水生動物の感染症に対しては、種々の抗生物質が使用されているが、抗生物質は、食品衛生法の規定によりその使用が制限され、魚体内の残留が許可されないので、出荷前に一定の休薬期間を設ける等の処置を採用せざるを得ない。
【０００５】
これに対して、原虫、寄生虫等の寄生による水生動物の感染症の治療には、従来より、次のような技術が知られている。
▲１▼淡水浴法および濃塩水浴法（引用文献１）
▲２▼ホルマリン、氷酢酸等による薬浴法（引用文献２）
▲３▼過酸化水素による浴治療法（引用文献３）
▲４▼塩過酸化物による浴治療法（引用文献４および５）
▲５▼トリフェニルメタンの誘導体、アクリジンの誘導体等の殺生物性または防腐性の活性染料による浴治療法（引用文献６の「従来の技術」欄に開示）
▲６▼サルファ剤（引用文献７）
▲７▼ニトロフラゾン製剤（引用文献７）
▲８▼有機リン製剤（引用文献７）
▲９▼キノリン誘導体、第４級アンモニウム塩、銀の塩、銅の塩、金属コロイド、ニトロフラゾン類、ニトロチアゾール類等の抗寄生生物活性物質による浴治療法（引用文献６の「従来の技術」欄に開示）
一方、哺乳動物の乳汁に含有されているラクトフェリンには、抗菌活性があり、各種微生物に対して静菌作用、殺菌作用を呈することが公知であって、飲食品、医薬品、化粧品、飼料等に利用されており（引用文献８〜１６）、養殖水生動物の病原菌感染予防および治療にも使用されている（引用文献１７）。
【０００６】
また、各種の生理的効果を有するペプチドが知られており、微生物に対する抗菌作用を有するペプチドも、多数報告されている。（引用文献１８〜３５）。
この発明の発明者等も、ラクトフェリンを蛋白分解酵素で加水分解物した分解物、この分解物から単離したペプチド、およびこれらのペプチドと同一のアミノ酸配列を有する合成されたペプチドが、各種微生物に対する抗菌活性を有することを見出し、既に特許出願している（引用文献３６〜４０）。特に、引用文献３８は、抗菌性ペプチドを極微量［０．００００４２％（重量）］含有する養鰻用飼料を開示している（引用文献３８の実施例１３）。ただし、このような飼料の場合にも、その有効性は細菌、ウイルス等の微生物に限られたものであり、ラクトフェリン、その加水分解物、その加水分解物から分離されたペプチド、およびそれらのペプチドと同一のアミノ酸配列を有する合成ペプチド、またはそれらを含有する飼料等が、寄生生物による水生動物の感染症に有効であることは従来知られておらず、またそのような事実を記載した刊行物も皆無である。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
原虫、寄生虫等の寄生による水生動物感染症を治療するための前記従来技術には、次のような問題があった。
a)前記▲１▼について：処理水の塩濃度が飼育している水と異なり、魚の生態に望ましくない影響がある。
b)前記▲２▼について：持続時間が短く、薬剤使用量の許容範囲が狭く、かつ使用する薬剤に毒性がある。
c)前記▲３▼および▲４▼について：飼育水がアルカリ性を呈し、海水に難溶性であり、使用時危険である。
d)前記▲５▼について：皮膚中および内部の寄生虫に無効であり、多量の物質が必要であり、水が着色する。
e)前記▲６▼および▲７▼について：観賞魚類にのみ適用でき、大規模な養殖には適用ででない。
f)前記▲８▼について：劇薬であり、他の物質との併用を避ける必要がある。
g)前記▲９▼について：皮膚中及び内部の寄生虫に無効であり、多量の物質が必要である。
【０００８】
このような従来技術の現状から、水生動物への寄生生物の寄生による感染症を効果的に予防すること、または水生動物に寄生した寄生生物による感染症を有効に治療することは、水産業界およびペット業界にとって極めて重要であり、それらのために必要な物質が、待望されていた。
この発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであり、水生動物への寄生生物の寄生による感染症に対して安全かつ有効な予防剤および治療剤を提供することを目的としている。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
この発明の発明者等は、ラクトフェリンおよび既に特許出願した各種ペプチドの用途について鋭意研究を行っていたが、これらの物質が、寄生生物による水生動物の感染症の予防および治療に極めて有効であることを見出し、この発明を完成した。
【００１０】
すなわち、この発明は、上記の課題を解決するものとして、以下に示す（１）〜（８）のいずれか、またはこれらの２以上の混合物を有効成分とする水生動物の白点病及び／又はグルギア症の予防および治療剤を提供する。
（１）ラクトフェリン、
（２）ラクトフェリンをペプシンにより加水分解して得られるペプチド混合物、
（３）前記（２）のペプチド混合物から分離した、配列番号２６のアミノ酸配列からなるペプチド、
（４）前記（２）のペプチド混合物から分離した、配列番号２８のアミノ酸配列からなるペプチド、
（５）前記（２）のペプチド混合物から分離した、配列番号１０のアミノ酸配列からなるペプチド、
（６）配列番号２６のアミノ酸配列からなる合成ペプチド、
（７）配列番号２８のアミノ酸配列からなる合成ペプチド、
（８）配列番号１０のアミノ酸配列からなる合成ペプチド。
【００１１】
また、この発明の予防および治療剤においては、上記有効成分が、少なくとも０．００１％（重量）の割合で含有されていることを好ましい態様としてもいる。
【００１２】
次にこの発明について詳しく説明する。
なお、以下の説明において、百分率は特に断りのない限り重量による値である。  この発明の予防および治療剤を適用することのできる水生動物は、たとえばウナギ、フナ、ブリ（ハマチ）、マダイ、クロダイ、ヒラメ、ギンザケ、ニジマス、コイ、アユ、マアジ、シマアジ、フグ、カンパチ、ティラピア、スズキ、アマゴ、ヤマメ、イワナ、ドジョウ、カワハギ等の養殖魚類、エビ、カニ等の甲殻類、錦鯉、金魚、熱帯魚等の観賞魚類等である。
【００１３】
また、この発明の予防および治療剤が有効に作用する寄生生物は、たとえばコスティア、クリプトリア、トリコディナ等の鞭毛虫類、キロドネラ、エピスティルス、白点等の繊毛虫類、エクソボルス、グルギア等の胞子虫類、ギロダクチルス、ダクチロギルス等の吸虫類等である。
なお、この発明の予防および治療剤は、水生動物用の薬品であってもよく、あるいは水生動物用の飼料に添加したものであってもよい。
【００１４】
この発明に使用するラクトフェリン類は、市販のラクトフェリン、哺乳動物（例えば、ヒト、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ウマ等）の初乳、移行乳、常乳、末期乳等、またはこれらの乳の処理物である脱脂乳、ホエー等から常法（例えば、イオン交換クロマトグラフィー等）により分離したラクトフェリン、それらを塩酸、クエン酸等により脱鉄したアポラクトフェリン、それらを鉄、銅、亜鉛、マンガン等の金属でキレートさせた金属飽和ラクトフェリン、各種飽和度で金属を飽和したラクトフェリンまたはそれらの２種以上の任意の混合物（以下これらをまとめてラクトフェリン類と記載することがある）のいずれであってもよいが、牛乳から分離された市販のラクトフェリンが、最も安価に得られるので好適である。  この発明に使用するラクトフェリン類の加水分解物は、前記ラクトフェリン類を常法により酸または蛋白分解酵素により加水分解して得られるペプチド混合物であり、製造の態様を例示すれば、次のとおりである。
【００１５】
酸による加水分解は、ラクトフェリン類を０．１〜２０％、望ましくは５〜１５％の濃度で水または精製水等に溶解し、得られた溶液に塩酸、リン酸等の無機酸、またはクエン酸等の有機酸を添加し、溶液のｐＨを１〜４、望ましくは２〜３に調整する。次いで、このようにして得られた溶液を、調整されたｐＨに応じて適当な温度で所定時間加熱して加水分解する。例えば、ｐＨが１〜２に調整された場合には８０〜１３０℃、望ましくは９０〜１２０℃で、ｐＨ２〜４に調整された場合には１００〜１３０℃、望ましくは１００〜１２０℃で、それぞれ１〜１２０分間、望ましくは５〜６０分間加熱する。
【００１６】
酵素により加水分解する場合には、ラクトフェリン類を０．５〜２０％、望ましくは５〜１５％の濃度で水、精製水等に溶解し、得られた溶液を使用酵素の至適ｐＨに調整して加水分解する。使用する酵素には特に制限がなく、市販の酵素、例えばモルシンＦ（商標。盛進製薬社製。至適ｐＨ２．５〜３．０）、豚ペプシン（和光純薬社製。至適ｐＨ２〜３）スミチームＡＰ（商標。新日本化学社製。至適ｐＨ３．０）、アマノＭ（商標。アマノ製薬社製。至適ｐＨ３．０）、アマノＡ（商標、アマノ製薬社製。至適ｐＨ７．０）、トリプシン（ノボ社製。至適ｐＨ８．０）等を単用または任意に併用するが、特に豚ペプシン、スミチームＡＰが望ましい。前記の酵素の他に、例えば、市販のエキソペプチダーゼを含有する醤油酵素（田辺製薬社製）を組み合わせて使用することもできる。使用する酵素の量は、基質に対して０．１〜５．０％の範囲、特に、０．５〜３．０％が望ましい。
【００１７】
すなわち、この酵素による加水分解は、具体的には、ラクトフェリン類の溶液のｐＨを調整し、上記の酵素を適量添加した後、得られた溶液の温度を１５〜５５℃、望ましくは３０〜５０℃で３０〜６００分間、望ましくは６０〜３００分間保持してラクトフェリン類を加水分解する。次いで溶液をそのまま、または中和した後、酵素を常法により加熱失活する。
【００１８】
これらの酸または酵素を用いる方法によって得られた反応液を、常法により冷却し、必要に応じて中和、脱塩、脱色し、得られた溶液をそのまま、濃縮して液状の濃縮製品、または濃縮後乾燥して粉末製品とすることができる。
なお、以上の加水分解条件は厳密なものではなく、製造コスト、例えば、温度、時間、酸または酵素の種類および量、反応装置（加圧の有無）等を考慮して適宜設定できる。
【００１９】
以上の方法によって得られたラクトフェリン類の加水分解物は、種々の分子量を有するペプチドの混合物であり、加水分解の分解率は、ホルモール滴定法により測定した分解度が６〜２０％、特に７〜１５％の範囲が望ましい。
この発明に使用するラクトフェリン類の加水分解物から分離されたペプチド、およびそれらのペプチドと同一のアミノ酸配列を有する合成されたペプチド（以下これらをまとめてペプチド類と記載することがある）は、前記引用文献３６〜４０と同一の方法により製造することができる。その一例を示せば、次のとおりであり、同様の方法により配列表記載の各ペプチドを分離または合成することができる。
１）ラクトフェリン類加水分解物からの分離（以下分離例と記載することがある）  市販の牛ラクトフェリン（シグマ社製）５０ｍｇを精製水０．９ｍｌに溶解し、０．１規定の塩酸でｐＨを２．５に調整し、のち市販の豚ペプシン（シグマ社製）１ｍｇを添加し、３７℃で６時間加水分解した。次いで０．１規定の水酸化ナトリウムでｐＨを７．０に調整し、８０℃で１０分間加熱して酵素を失活させ、室温に冷却し、１５，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、透明な上清を得た。この上清１００μｌをＴＳＫゲルＯＤＳ−１２０Ｔ（東ソ−社製）を用いた高速液体クロマトグラフィ−にかけ、０．８ｍｌ／分の流速で試料注入後１０分間０．０５％ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）を含む２０％アセトニトリルで溶出し、のち３０分間０．０５％ＴＦＡを含む２０〜６０％のアセトニトリルのグラジエントで溶出し、２４〜２５分の間に溶出する画分を集め、真空乾燥した。この乾燥物を２％（Ｗ／Ｖ）の濃度で精製水に溶解し、再度ＴＳＫゲルＯＤＳ−１２０Ｔ（東ソー社製）を用いた高速液体クロマトグラフィーにかけ、０．８ｍｌ／分の流速で試料注入後１０分間０．０５％ＴＦＡを含む２４％アセトニトリルで溶出し、のち３０分間０．０５％ＴＦＡを含む２４〜３２％のアセトニトリルのグラジエントで溶出し、３３．５〜３５．５分の間に溶出する画分を集めた。上記の操作を２５回反復し、真空乾燥し、ペプチド約１．５ｍｇを得た。
【００２０】
前記のペプチドを６Ｎ塩酸で加水分解し、アミノ酸分析計を用いて常法によりアミノ酸組成を分析した。同一の試料を気相シ−クェンサ−（アプライド・バイオシステムズ社製）を用いて２５回のエドマン分解を行ない、２５個のアミノ酸残基の配列を決定した。またＤＴＮＢ（５，５−ジチオ−ビス（２−ニトロベンゾイック・アシド））を用いたジスルフィド結合分析法（引用文献４１）によりジスルフィド結合が存在することを確認した。
【００２１】
その結果、このペプチドは、２５個のアミノ酸残基からなり、３番目と２０番目のシステイン残基がジスルフィド結合し、３番目のシステイン残基からＮ−末端側に２個のアミノ酸残基が、２０番目のシステイン残基からＣ−末端側に５個のアミノ酸が、それぞれ結合した、配列番号２６のアミノ酸配列を有していることが確認された。
【００２２】
なお、前記の分離方法において、採取する画分を変更することにより種々のペプチドを取得することができる。
２）ペプチド類の化学的合成（以下合成例と記載することがある）
ペプチド自動合成装置（ファルマシアＬＫＢバイオテクノロジ−社製。ＬＫＢＢｉｏｌｙｎｘ４１７０）を用い、シェパ−ド等（引用文献４２）による固相ペプチド合成法に基づいてペプチドを次のようにして合成した。
【００２３】
アミン官能基を９−フルオレニルメトキシカルボニル基で保護したアミノ酸に、Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイミドを添加して所望のアミノ酸の無水物を生成させ、このFmoc−アミノ酸無水物を合成に用いた。ペプチド鎖を製造するためにＣ−末端のアスパラギン残基に相当するFmoc−アスパラギン無水物を、そのカルボキシル基を介し、ジメチルアミノピリジンを触媒としてウルトロシンＡ樹脂（ファルマシアＬＫＢバイオテクノロジ−社製）に固定する。次いでこの樹脂をピペリジンを含むジメチルホルムアミドで洗浄し、Ｃ−末端アミノ酸のアミン官能基の保護基を除去する。のちアミノ酸配列のＣ−末端から２番目に相当するFmoc−アルギニン無水物を前記Ｃ−末端アミノ酸残基を介して樹脂に固定されたアルギニンの脱保護アミン官能基にカップリングさせた。以下同様にして順次グルタミン、トリプトファン、グルタミン、およびフェニルアラニンを固定した。全部のアミノ酸のカップリングが終了し、所望のアミノ酸配列のペプチド鎖が形成された後、９４％ＴＦＡ、５％フェノ−ル、および１％エタンジオ−ルからなる溶媒でアセトアミドメチル以外の保護基の除去およびペプチドの脱離を行ない、高速液体クロマトグラフイ−によりペプチドを精製し、この溶液を濃縮し、乾燥し、ペプチド粉末を得た。
【００２４】
前記のペプチドについてアミノ酸分析計を用いて常法によりアミノ酸組成を分析し、配列番号１０のアミノ酸配列を有することを確認した。
なお、前記の合成方法において、アミノ酸の種類および結合させるアミノ酸の数を変更することにより、種々のペプチドを化学的に合成することができる。
以上のようにして得られたラクトフェリン類の加水分解物およびペプチド類は、加水分解されていないラクトフェリンに比して、熱およびｐＨの変化に対して極めて安定であり、そのまま、賦形剤または他の薬剤と混合して使用することができる。
【００２５】
この発明においては、前記のラクトフェリン類、ラクトフェリン類の加水分解物、ペプチド類またはこれらの２種以上を任意に混合して使用することもでき、０．００１〜５．０％、望ましくは０．０１〜３．０％の濃度で含有させ、水生動物の寄生生物性疾患予防および治療用薬剤として、またはこの薬剤を飼料に添加し、水生動物の寄生生物性疾患予防および治療用飼料として使用することができる。
【００２６】
この発明の水生動物の寄生生物性疾患予防および治療剤は、充填剤および増量剤（例えば、糖、でんぷん等）、結合剤（例えば、カルボキシメチルセルロース、ゼラチン等）、含湿剤（例えば、グリセロール等）、膨化剤（例えば、寒天、炭酸カルシウム等）、溶解遅延剤（例えば、パラフィン等）、吸収促進剤（例えば、４級アンモニウム化合物等）、表面活性剤（例えば、グリセロールモノステアレート、アセチルアルコール等）、吸着剤（例えば、カオリン等）、潤滑剤（例えば、ステアリン酸カルシウム等）等の薬学的組成物に通常使用される希釈剤とともに、ラクトフェリン類、その加水分解物および／またはペプチド類を公知の方法によりゲル剤、ペースト剤、乳剤、シロップ剤、粒剤、粉剤等に製剤化される。また、ラクトフェリン類、その加水分解物および／またはペプチド類を、他の薬効のある公知の薬剤と併用することも可能である。
【００２７】
この発明の水生動物の寄生生物性疾患予防および治療のために使用される飼料は、ラクトフェリン類、その加水分解物および／またはペプチド類を、通常水生動物の飼料として用いられる各種成分とともに、ペレット飼料、顆粒飼料、粉末飼料、錠剤化飼料、粉砕飼料、押出飼料、膨脹飼料、ペースト状飼料、懸濁液状飼料、ゲル状飼料、フィルム状飼料、微粒子飼料、フロック飼料、アスピック飼料等の各種の形態に、常法により加工される。なお、ラクトフェリン類は、加熱により変性するので、加熱工程後に混合するようにする。ラクトフェリン類の加水分解物およびペプチド類は、加熱変性がないので、いずれの工程でも使用することができる。
【００２８】
次に試験例を示してこの発明をさらに詳しく説明する。
試験例１
この試験は、マダイの白点病に対するラクトフェリンの予防および治療効果を調べるために行った。
１）試験対象
マダイ１才魚（魚体重４０〜７０ｇ）１００尾を用いた。
２）試験方法
前記マダイを５０尾ずつ２群に分け、一方に対照飼料を、他方に試験飼料を、乾燥重量でそれぞれ１日当たり魚体重の０．４％の割合で給餌し、毎年白点病が多発する池において水温約２４℃で１か月間飼育し、飼育開始後１５日、２０日、２５日および３０日に各群の白点病による斃死尾数を計数して試験した。対照飼料および試験飼料は、次のとおりである。
対照飼料：市販のウナギ養殖用飼料（中部飼料社製）
試験飼料：市販のウナギ養殖用飼料（中部飼料社製）に１．０％の割合で市販の
ラクトフェリン（森永乳業社製）を添加。
３）試験結果
この試験の結果は、表１に示したとおりである。表１から明らかなように、斃死尾数が、対照群では２５日から急増し、３０日では全部が斃死したのに対して、試験群ではいずれの飼育日数においても２尾であり、顕著に斃死尾数が少なかった。この結果は、ラクトフェリンが、マダイの白点病の予防および治療に有効であることを立証している。なお、他のラクトフェリン類の加水分解物およびペプチド類についてもほぼ同様な結果が得られた。
【００２９】
【表１】
0003819445.tif 000002
【００３０】
試験例２
この試験は、水生動物感染症の治療に有効なラクトフェリン量を決定するために行った。
１）試験対象
マダイ１才魚（魚体重３０〜７０ｇ）５５０尾を用いた。
２）試験方法
前記マダイを５０尾ずつ１１群に分け、各群にそれぞれマーカーを付した白点病感染魚数尾を加えて白点病に感染させるとともに、次の飼料を、乾燥重量でそれぞれ１日当たり魚体重の１．０％の割合で給餌し、水温約２４℃で１か月間飼育し、飼育開始後５日、１０日、１５日および２０日に各群の斃死尾数を計数して試験した。なお、この試験に使用した市販のウナギ養殖用飼料およびラクトフェリンは、試験例１と同一のものである。
第１群（対照群）：市販飼料
第２群：市販飼料に０．０００５％の割合でラクトフェリンを添加。
第３群：市販飼料に０．００１％の割合でラクトフェリンを添加。
第４群：市販飼料に０．０１％の割合でラクトフェリンを添加。
第５群：市販飼料に０．１％の割合でラクトフェリンを添加。
第６群：市販飼料に１．０％の割合でラクトフェリンを添加。
第７群：市販飼料に２．０％の割合でラクトフェリンを添加。
第８群：市販飼料に３．０％の割合でラクトフェリンを添加。
第９群：市販飼料に４．０％の割合でラクトフェリンを添加。
第１０群：市販飼料に５．０％の割合でラクトフェリンを添加。
第１１群：市販飼料に６．０％の割合でラクトフェリンを添加。
３）試験結果
この試験の結果は、表２に示したとおりである。表２から明らかなように、飼育２０日後の斃死尾数が、第１群では５０尾であるのに対して第２群では４５尾であり、対照である第１群とほぼ同等であった。これに対して第４群〜第８群における飼育２０日後の斃死尾数は、顕著に減少し、第３群、第９群および第１０群における飼育２０日後の斃死尾数は、第４群〜第８群のそれらよりも若干多いが、第１群および第２群のそれらよりも斃死尾数が顕著に少なかった。また、第１１群における飼育２０日後の斃死尾数は、第１０群のそれとほぼ同等であり、ラクトフェリン添加量の増加による斃死尾数の減少は認められなかった。
【００３１】
この結果から、０．００１〜５．０％の割合でラクトフェリンを含む飼料が、マダイの白点病の治療に有効であることが明らかになった。なお、他のラクトフェリン類の加水分解物およびペプチド類についてもほぼ同様な結果が得られた。
【００３２】
【表２】
0003819445.tif 000003
【００３３】
試験例３
この試験は、ラクトフェリン加水分解物およびペプチド類の水生動物感染症に対する治療効果を調べるために行った。
１）試験対象
高橋らの方法（引用文献４３）によりグルギア症に感染させたアユ当才魚（魚体重２０〜４０ｇ）２５０尾を用いた。
２）試験方法
前記アユを５０尾ずつ５群に分け、次の飼料を、それぞれ１日当たり魚体重の１．０％の割合で給餌し、水温約２０℃で１か月間飼育し、試験開始後１５日、２０日、２５日および３０日に各群から任意に１０尾を取出し、高橋らの方法（引用文献４３）により、開腹してグルギア・シストの形成を肉眼で観察し、各群の全試験数に対するグルギア・シスト形成尾数の百分率を算出し、感染率を試験した。なお、使用した市販飼料はアユ用クランブル飼料（日本水産社製）であり、ラクトフェリンは、試験例１と同一のものである。
第１群（対照群）：市販飼料
第２群：市販飼料に１．０％の割合で配列番号２６のペプチド（前記分離例と同一の方法によりラクトフェリン加水分解物から分離した）を添加。
第３群：市販飼料に１．０％の割合で配列番号２８のペプチド（前記分離例と同一の方法によりラクトフェリン加水分解物から分離した）を添加。
第４群：市販飼料に１．０％の割合で配列番号１０のペプチド（前記合成例と同一の方法により合成した）を添加。
第５群：市販飼料に１．０％の割合でラクトフェリン加水分解物（前記と同様の方法によりラクトフェリンを加水分解物した）を添加。
３）試験結果
この試験の結果は、表３に示したとおりである。表３から明らかなように、飼育後３０日の感染率が、第１群では１００％であるのに対して、第２群〜第５群のそれは０％であり、顕著に感染率が低下した。この結果から、ラクトフェリンの加水分解物およびペプチド類がアユのグルギア症の治療に有効であることが明らかになった。なお、他のラクトフェリン類の加水分解物およびペプチド類、並びに他の寄生生物についてもほぼ同様な結果が得られた。
【００３４】
【表３】
0003819445.tif 000004
【００３５】
次に実施例を示してこの発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、この発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００３６】
【実施例】
実施例１
ラクトフェリン（森永乳業社製）５ｇ、ウナギ用粉末飼料（中部飼料社製）１ｋｇおよびミンチした冷凍魚１ｋｇを均一に混合し、グランイダー（三菱電機社製）を用いて造粒し、混合型モイストペレット飼料約２ｋｇを得た。
実施例２
次の方法により得たアポラクトフェリンを用いたことを除き、実施例１と同一の方法により混合型モイストペレット飼料約２ｋｇを得た。
【００３７】
ラクトフェリン（森永乳業社製）１００ｇを２リットルの脱イオン水に溶解し、透析チューブに入れ、４０リットルの０．１Ｍクエン酸溶液（ｐＨ２．２）に対して、４℃で３６時間透析し、更にクエン酸を除去するため、２０倍量の脱イオン水に対して、４℃で２４時間透析（途中、２回脱イオン水を交換）し、透析内液を凍結乾燥し、アポラクトフェリン約９７ｇを得た。
実施例３
ウナギ用粉末飼料（中部飼料社製）２ｋｇに、ラクトフェリン（森永乳業社製）８ｇを添加し、０．２リットルの水を加えて均一に混練し、ラクトフェリン添加ウナギ用飼料約２．２ｋｇを得た。
実施例４
前記分離例と同一の方法により製造したラクトフェリン分解物（森永乳業社製）を用いたことを除き、実施例３と同一の方法によりラクトフェリン分解物添加ウナギ用飼料を得た。
実施例５
前記分離例と同一の方法により分離した配列番号２６のペプチド０．１ｇ、鶏卵５０ｇ、アサリエキス（理研ビタミン社製）１０ｇ、アミエキス（理研ビタミン社製）５ｇ、グルコース（昭和産業社製）５ｇ、デキストリン（昭和産業社製）１０ｇ、スケトウタラ肝油（理研ビタミン社製）５ｇ、アミノ酸混合物（味の素社製）５ｇ、ミネラル混合物（和光純薬工業社製）５ｇおよびビタミン混合物（理研ビタミン社製）５ｇを均一に混合し、この混合物を、１０％の濃度でゼイン（和光純薬工業社製）を含む６０％エタノール０．０１リットルと均一に混合し、常法により凍結乾燥し、粉砕微粉化し、マイクロカプセル化微粒子飼料約０．１ｋｇを得た。
実施例６
前記合成例と同一の方法により合成した配列番号１０のペプチド０．１ｇを用いたことを除き、実施例５と同一の方法により、マイクロカプセル化微粒子飼料約０．１ｋｇを得た。
実施例７
ラクトフェリン（森永乳業社製）５０ｍｇおよび実施例５と同一の配列番号２６のペプチド１０ｍｇを精製水１０ｍｌに溶解し、アユ用クランブル飼料（日本水産社製）１ｋｇに均一に噴霧し、風乾して吸着させ、アユ用飼料約１ｋｇを得た。
実施例８
実施例２と同一の方法により得たアポラクトフェリン５０ｍｇおよび実施例６と同一の配列番号１０のペプチド１０ｍｇを用いたことを除き、実施例７と同一の方法により、アユ用飼料１ｋｇを得た。
実施例９
精製水１０リットルに、実施例６と同一の配列番号１０のペプチド５０ｇを溶解し、除菌フィルター（日本ミリポア工業社製）で瀘過し、１００ｍｌずつ無菌的に容器に充填し、水生動物用の寄生生物性感染症治療剤を得た。
実施例１０
精製水１０リットルに、実施例６と同一の配列番号１０のペプチド２５ｇおよび実施例５と同一の配列番号２６のペプチド２５ｇを溶解し、８０℃で１５分間加熱殺菌し、１００ｍｌずつ無菌的に容器に充填し、水生動物用の寄生生物性感染症治療剤を得た。
【００３８】
【発明の効果】
以上詳しく説明したとおり、この発明によって以下の効果が奏せられる。
１）寄生生物による水生動物の感染症を効果的に予防および治療することができる。
２）長期間給与しても水生動物およびその棲息環境に悪影響を与えない。
３）特別な設備、繁雑な操作を必要とせず、通常の飼料と同様に給与できる。
４）水生動物を飼育する人に無害である。
５）休薬期間を設ける必要がなく、何時でも任意に給与できる。
【００３９】
【配列表】
0003819445.tif 000005
0003819445.tif 000006
【００４０】
0003819445.tif 000007
【００４１】
0003819445.tif 000008
【００４２】
0003819445.tif 000009
【００４３】
0003819445.tif 000010
【００４４】
0003819445.tif 000011
【００４５】
配列：
Arg Xaa Xaa Xaa Lys
1               5
配列番号：１０
配列の長さ：６
配列の型：アミノ酸
トポロジ−：直鎖状
配列の種類：ペプチド。
【００４６】
0003819445.tif 000012
【００４７】
0003819445.tif 000013
【００４８】
0003819445.tif 000014
【００４９】
0003819445.tif 000015
【００５０】
0003819445.tif 000016
【００５１】
0003819445.tif 000017
【００５２】
0003819445.tif 000018
【００５３】
0003819445.tif 000019
【００５４】
0003819445.tif 000020
【００５５】
0003819445.tif 000021
【００５６】
0003819445.tif 000022
【００５７】
0003819445.tif 000023
【００５８】
0003819445.tif 000024
【００５９】
0003819445.tif 000025
【００６０】
0003819445.tif 000026
【００６１】
配列：
Lys Cys* Phe Gln Trp Gln Arg Asn Met Arg Lys Val Arg Gly Pro
1                5                   10                  15
Pro Val Ser Cys* Ile
20
配列番号：２６
配列の長さ：２５
配列の型：アミノ酸
トポロジ−：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列の特徴：下記配列において、３番のCysと２０番のCysがジスルフィド結合している。
【００６２】
0003819445.tif 000027
【００６３】
配列：
Lys Thr Arg Arg Trp Gln Trp Arg Met Lys Lys
1               5                   10
配列番号：２８
配列の長さ：３８
配列の型：アミノ酸
トポロジ−：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列の特徴：下記配列において、１６番のCysと３３番のCysとがジスルフィド結合している。
【００６４】
0003819445.tif 000028
【００６５】
0003819445.tif 000029
【００６６】
0003819445.tif 000030
【００６７】
0003819445.tif 000031
＜引  用  文  献＞
１）江草周三著、「魚の感染症」、第４６８ページ及び第４７２ページ、恒星
社厚生閣、昭和５９年
２）小華和忠ら編、「動物用医薬品・飼料添加物・新飼料の有用性評価法」、
第６０ページ、フジ・テクノシステム、昭和５２年
３）特開平１−３１７３４６号公報
４）小華和忠ら編、「動物用医薬品・飼料添加物・新飼料の有用性評価法」、
第５９ページ、フジ・テクノシステム、昭和５２年
５）魚病研究、第１巻、第２号、第４８ページ〜５３、１９６７年
６）特開平４−２３５９１２号公報
７）沢田実ら編、「１９９１年版  動物用医薬品用具要覧」、社団法人日本動
物薬事協会、１９９１年
８）特開平３−３３０１３０号公報
９）特開昭６１−８３１３１号公報
１０）ジャパンフードサイエンス、第２７巻、第１号、第２５ページ〜第３４ペ
ージ、１９８８年
１１）サイエンス(Science) 、第１９７巻、第２６３ページ〜第２６５ページ、
１９７７年
１２）エー・エフ・ウイリアムス及びジェー・ディー・バウム(A. F. Williams
& J. D. Baum) 編、ヒューマンミルク・バンキング」(Human Milk Bankin
g)、ネッスル・ニュートリション・ワークショップ・シリーズ、第５巻(N
estl Nutrition Workshop Series Volume 5)、第１３３ページ〜第１４３
ページ、レーベン・プレス・ブックス社(Reven Press Books Ltd.)、１９
８４年
１３）デイリー・サイエンス・アブストラクツ(Dairy Science Abstracts) 、第
３０巻、第９号、第５００ページ［３２１０］、１９６８年
１４）日本小児科学会雑誌、第８８巻、第７号、第１５８１ページ〜第１５８２
ページ、「Ａ−４３」、１９８４年
１５）ザ・ジャーナル・オブ・インフェクシャス・ディージス(The Journal of
Infectious Diseases)、第１５３巻、第２号、第２３２ページ〜第２３７
ページ、１９８６年
１６）フランス国特許第２，５９６，９８６号明細書、１９８７年
１７）特開平５−９２９２７号公報
１８）特開昭５７−１０６６８９号公報
１９）特開昭５８−１３５９４号公報
２０）特開昭５８−２１３７４４号公報
２１）特開昭５９−５１２４７号公報
２２）特開昭６０−１３０５９９号公報
２３）特開昭６０−１７２９９８号公報
２４）特開昭６１−２５１６９９号公報
２５）特開昭６３−４４５９８号公報
２６）特開昭６２−２２７９８号公報
２７）特開昭６２−５１６９７号公報
２８）特開昭６３−１７８９７号公報
２９）特開平２−５３７９９号公報
３０）特表平２−５０００８４号公報
３１）特開平３−２６１７１７号公報
３２）プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナルアカデミー・オブ・ザ・サイ
エンス・オブ・ユナイテッド・ステーツ・オブ・アメリカ(Proceedings
of the National Academy of the Science of United States of America
) 、第８４巻、第５４４９ページ〜第５４５３ページ、１９８７年
３３）フィミヤ・プリロードヌフ・ソエジェニェーニ(Khimiya Prirodnykh Soed
inenij) 、第１号、第１３０ページ〜第１３３ページ、１９７８年
３４）特開平２−５３７９９号公報
３５）特開平２−２３４６８４号公報
３６）特開平５−９２９９４号公報
３７）特開平５−７８３９２号公報
３８）特開平５−１４８２９５号公報
３９）特開平５−１４８２９６号公報
４０）特開平５−１４８２９７号公報
４１）アナリティカル・バイオケミストリー（Analytical Biochemistry)
第６７巻、第４９３ページ、１９７５年
４２）ジャーナル・オブ・ケミカル・ソサイエティ・パーキンＩ（Journal of
Chemical Society Parkin Ｉ）、第５３８ページ、１９８１年
４３）魚病研究、第１１巻、第２号、第８３ページ〜第８８ページ、１９７７年