(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の理化学的性質を有する1,5-アンヒドログルシトール脱水素酵素。
(1) 作用：
電子キャリアー非存在下において、1,5-アンヒドログルシトールに特異的に作用して２位の水酸基を酸化するとともに直接還元性発色剤を還元する反応を触媒する作用を有する。
(2) 基質特異性：
1,5-アンヒドログルシトールに強く作用し、L-ソルボースに弱く作用する。また、D-グルコースに若干作用する。
(3) 至適pH：
至適pHは8.0〜9.0付近にある。
(4) pH安定性：
pH7.0〜9.0にて安定である。
(5) 至適温度：
至適温度は35〜40℃付近にある。
(6) 温度安定性：
40℃付近まで90％以上安定である。
(7) 電子受容体：
2,6-ジクロロフェノールインドフェノール、フェリシアン化合物等のほか、還元性発色剤も利用できる。またNAD、NADP等の補酵素や溶存酵素は利用できない。
(8) 分子量：
ドデシル硫酸−ポリアクリルアミド電気泳動法による分子量は、約55,000である。
【請求項２】
アグロバクテリウム属に属し、1,5-アンヒドログルシトール脱水素酵素生産能を有する微生物により生産されるものである請求項１記載の1,5-アンヒドログルシトール脱水素酵素。
【請求項３】
アグロバクテリウム属に属し、1,5-アンヒドログルシトール脱水素酵素生産能を有する微生物を栄養培地に培養し、膜画分中に請求項１記載の1,5-アンヒドログルシトール脱水素酵素を生成蓄積せしめ、これを採取することを特徴とする1,5-アンヒドログルシトール脱水素酵素の製造法。
【請求項４】
アグロバクテリウム属に属し、1,5-アンヒドログルシトール脱水素酵素生産能を有する微生物が、アグロバクテリウム・ツメファシエンスである請求項３記載の製造法。
【請求項５】
還元性発色剤の存在下、1,5-アンヒドログルシトールを含む試料に請求項１又は２記載の1,5-アンヒドログルシトール脱水素酵素を作用せしめ、生成する還元された発色物質を測定することを特徴とする1,5-アンヒドログルシトールの定量法。
【請求項６】
還元性発色剤が、テトラゾリウム又はその塩類である請求項５記載の定量法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規な1,5-アンヒドログルシトール脱水素酵素及びその製造法、並びに当該酵素を用いた、簡便かつ高精度で糖尿病等の診断に有用な、1,5-アンヒドログルシトールの定量法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
1,5-アンヒドログルシトール（以下、「1,5-AG」という）は、ある種の疾患、特に糖尿病において、血清、血漿、尿等の体液中の量が大きく変動することから、有用な診断指標として近年臨床において重要な検査項目となりつつある。この1,5-AGの定量法としては、ピラノースオキシダーゼを作用させて、生成する過酸化水素をパーオキシダーゼ発色系にて比色定量する方法（特公平5-41238号公報）が主流となり、近年、汎用の自動分析装置に応用されている。他の方法としては、1,5-AG酸化能を有する酸化酵素を作用させ、酸素の消費量や電子受容体の還元体もしくは酸化された1,5-AG反応生成物を測定する方法などが挙げられる。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、ヒト由来の被検体、例えば血清中の1,5-AGの濃度レベルは低く、糖尿病患者においては更に低値化することから、ピラノースオキシダーゼを用いたパーオキシダーゼ発色系では、感度の面で十分なものとはいい難い。また、電子受容体を利用する酸化還元酵素を用いて、その還元体を測定する方法においても、電子受容体である2,6-ジクロロフェノールインドフェノール、フェリシアン化合物等の還元体自身が不安定であることや、感度の面で十分なものとはいえず、多数検体処理のための汎用の自動分析装置への応用が困難であることなどの問題点がある。
【０００４】
従って、1,5-AGを簡便に精度よく測定でき、かつ汎用の自動分析装置への応用も容易な1,5-AGの定量方法の開発が望まれていた。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
かかる実情において、本発明者らは、1,5-AGの分析に利用できる反応系について検討すると共に、それらに利用できる酵素について探索を行った。その結果、アグロバクテリウム（Agrobacterium）属に属する微生物の膜画分中に、1,5-AGを特異的に酸化する新規な酵素（以下「1,5-AG脱水素酵素」という）が存在することを見出した。そして、この1,5-AG脱水素酵素を1,5-AGに作用させると、1,5-AGの２位の水酸基を酸化すると共に2,6-ジクロロフェノールインドフェノールなどの電子受容体を還元させる反応を触媒すること、及び当該反応を還元性発色剤を用いて行うと電子キャリアーの非存在下においても1,5-AGの２位水酸基を酸化すると共に直接還元性発色剤を還元し発色物質を生成させることを見出し、本発明を完成した。
【０００６】
すなわち本発明は、次の理化学的性質を有する1,5-AG脱水素酵素を提供するものである。
【０００７】
(1) 作用：
電子キャリアー非存在下において、1,5-アンヒドログルシトールに特異的に作用して２位の水酸基を酸化するとともに直接還元性発色剤を還元する反応を触媒する作用を有する。
【０００８】
(2) 基質特異性：
1,5-アンヒドログルシトールに強く作用し、L-ソルボースに弱く作用する。また、D-グルコースに若干作用する。
【０００９】
(3) 至適pH：
至適pHは8.0〜9.0付近にある。
【００１０】
(4) pH安定性：
pH7.0〜9.0にて安定である。
【００１１】
(5) 至適温度：
至適温度は35〜40℃付近にある。
【００１２】
(6) 温度安定性：
40℃付近まで90％以上安定である。
【００１３】
(7) 電子受容体：
2,6-ジクロロフェノールインドフェノール、フェリシアン化合物等のほか、還元性発色剤も利用できる。またNAD、NADP等の補酵素や溶存酵素は利用できない。
【００１４】
(8) 分子量：
ドデシル硫酸−ポリアクリルアミド電気泳動法による分子量は、約55,000である。
【００１５】
また、本発明は、アグロバクテリウム属に属し、1,5-AG脱水素酵素生産能を有する微生物を栄養培地に培養し、膜画分中に上記1,5-AG脱水素酵素を生成蓄積せしめ、これを採取することを特徴とする1,5-AG脱水素酵素の製造法を提供するものである。
【００１６】
更に本発明は、還元性発色剤の存在下、1,5-アンヒドログルシトールを含む試料に上記1,5-AG脱水素酵素を作用せしめ、生成する還元された発色物質を測定することを特徴とする1,5-AGの定量法を提供するものである。
【００１７】
【発明の実施の形態】
従来、アグロバクテリウム属に属する微生物中からは、Hayanoら（ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー，242巻，3665-3672，1967年）によって細胞質画分中にグルコシド-3-デヒドロゲナーゼの存在が確認され、別に、Takeuchiら（ジャーナル・オブ・バイオケミストリー，100巻，1049-1055，1986年）によって1,5-AGがグルコシド-3-デヒドロゲナーゼの基質となり得ることが報告されている。また、シュードモナス属に属する菌株からは、NAKAMURAら（ジャーナル・オブ・バイオケミストリー，99巻，607-613，1986年）によって膜画分に電子受容体の存在下の場合のみ、1,5-AGを1,5-アンヒドロ-D-フルクトースに変換するとともに酸素を消費する酸化活性をもつ酵素が報告されている。
【００１８】
しかしながら、1,5-AGに特異的で、電子キャリアー非存在下で1,5-AGを酸化し直接還元性発色剤を還元する代謝酵素の存在は未だ報告されていない。すなわち、本発明酵素の作用を式に示すと次のとおりであるが、このような作用を示す酵素は未だ知られておらず新規なものである。
【００１９】
【数１】
0003819094.tif 000002
【００２０】
本発明の酵素の生産に用いられる微生物としては、アグロバクテリウム属に属し、1,5-AG脱水素酵素を生産するものであればいずれの菌株でもよいが、好適な例としては、財団法人発酵研究所に寄託され、分譲可能な公知菌株であるアグロバクテリウム・ツメファシエンスIFO13532、アグロバクテリウム・ツメファシエンスIFO13533等が挙げられる。
【００２１】
上記菌体を培養する培地としては、炭素源、無機窒素源及び無機塩を含む培地が用いられる。炭素源としては基本的に糖類を利用し、L-ソルボース、グルコース等を酵素誘導するものであればいずれも使用できる。無機窒素源としては硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等が、無機塩としてはナトリウム、カリウム、マグネシウム、鉄、マンガン等の塩類が使用できる。
【００２２】
培養は、振とう、通気撹拌等の方法による好気的条件下で行うのががよく、pH６〜８、25〜35℃で行うのが好ましい。培養期間は１〜７日間、通常は２〜４日間で完了する。上記方法で培養することにより、主に菌体の膜画分中に1,5-AG脱水素酵素が生成蓄積される。
【００２３】
培養後、微生物中から本発明酵素を取得するには、適当な緩衝液中で菌体をダイノミル、超音波処理等により破壊し、その処理液から膜画分を超遠心等により分離する。次いでトリトンX-100等の非イオン界面活性剤により膜画分から酵素を遊離させ、不溶分を遠心分離により除去すると、1,5-AG脱水素酵素含有抽出液を得ることができる。精製酵素は、この抽出液を、疎水クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイト、ゲル濾過等の酵素の精製に一般的に使われている技術を適宜組み合せて精製することにより得られる。
【００２４】
次に、微生物としてアグロバクテリウム・ツメファシエンスIFO13533を用いて得られた本発明の1,5-AG脱水素酵素の性質を示す。なお、以下における1,5-AG脱水素酵素の活性は、次の方法で測定した。
【００２５】
〈酵素活性測定法〉
0.2Mリン酸カリウム緩衝液（pH8.0）1.5ml、0.25重量％ニトロテトラゾリウムブルー 0.3ml、２重量％トリトンX-100 0.3ml、50mM 1,5-AG水溶液0.3ml、水0.45ml、及び酵素溶液0.15mlより成る全量3.0mlの酵素含有液を37℃で反応させ、540nmにおける吸光度変化（ΔmOD/min）を測定する。この条件下で生成するホルマザン色素の分子吸光係数を16.7×103とし、１分間に１μmolのホルマザンを生成する酵素量を１単位（unit）として、1,5-AG脱水素酵素の活性を次式に従って求めた。
【００２６】
【数２】
0003819094.tif 000003
【００２７】
〈理化学的性質〉
(1) 作用：
１mM 2,6-ジクロロフェノールインドフェノール及び2.5mM 1,5-AGを含有する100mMトリス・塩酸緩衝液（pH9.0）に本発明酵素を添加し、37℃で反応させ経時的に反応液中の生成物と反応のモルバランスを表１に示す条件でHPLCにて分析した。
【００２８】
【表１】
0003819094.tif 000004
【００２９】
その結果、反応の進行とともにリテンションタイム10.0分の1,5-AGのピークが減少し、新たにリテンションタイム9.6分の位置に反応物のピークが現れた。この反応のモルバランスは一致していた。また、1,5-AGの３位の水酸基を酸化する作用を持つグルコシド-3-デヒドロゲナーゼ（EC 1.1.99.13）を同様の条件で反応させ、HPLCで分析した結果、1,5-AGのピーク減少とともに、新たにリテンションタイム10.8分の位置に反応物のピークが現れた。一方、1,5-AGの２位の水酸基を酸化する作用を持つピラノースオキシダーゼ（EC 1.1.3.10）を、2.5mM 1,5-AGを含有する40mMホウ酸緩衝液（pH7.5）に添加し、37℃で反応させた結果、1,5-AGのピーク減少とともに、新たにリテンションタイム9.6分の位置に反応物のピークが現れた。これらの結果において、1,5-AGに本発明酵素を作用させた場合の反応生成物とピラノースオキシダーゼを作用させた場合の反応生成物のリテンションタイムが一致していることから、本発明酵素による1,5-AGの酸化部位は２位の水酸基であることが分かる。
【００３０】
(2) 基質特異性：
前述の酵素活性測定法において、1,5-AGの代わりに各種糖溶液（いずれも終濃度５mM）を用いた場合の相対反応性（基質特異性）を表２に示す。本発明酵素は1,5-AGに対して強く、L-ソルボースに対しては弱く作用し、D-グルコースに若干作用した。
【００３１】
【表２】
0003819094.tif 000005
【００３２】
(3) 至適pH：
本発明酵素を用いて、前述の酵素活性測定法中における緩衝液の代わりに、種々のpHを有するクエン酸緩衝液、リン酸カリウム緩衝液、トリス−塩酸緩衝液及びグリシン緩衝液を用いた場合の酵素活性を測定した。この結果を図１に示す。図１より、本発明酵素の至適pHは8.0〜9.0付近にあることが分かる。
【００３３】
(4) pH安定性：
種々のpHを有するクエン酸緩衝液、リン酸カリウム緩衝液、トリス−塩酸緩衝液及びグリシン緩衝液（各緩衝液とも200mM）に本発明酵素を添加し、37℃で60分間処理後、残存酵素活性を測定した。この結果を図２に示す。図２より、本発明酵素の安定pH範囲は7.0〜9.0であることが分かる。
【００３４】
(5) 至適温度：
本発明酵素を用いて、前述の酵素活性測定法における組成で、種々の温度で10分間反応させた。この結果を図３に示す。図３より、本発明酵素の至適温度は35〜40℃付近であることが分かる。
【００３５】
(6) 温度安定性：
本発明酵素を20mMリン酸カリウム緩衝液に添加し、種々の温度で10分間処理後、残存酵素活性を測定した。この結果を図４に示す。図４より、本発明酵素は40℃付近まで90％以上安定であることが分かる。
【００３６】
(7) 電子受容体：
100mMリン酸カリウム緩衝液（pH8.0）中に、本発明酵素とともに種々の電子受容体を共存させた場合の、各電子受容体での活性を相対活性で表した。表３より、2,6-ジクロロフェノールインドフェノール及びフェリシアン化合物が電子受容体としての活性が高いが、ニトロテトラゾリウムブルーについては電子キャリアー非存在下においても電子受容体となり得ることが分かる。
【００３７】
【表３】
0003819094.tif 000006
【００３８】
(8) 分子量：
ドデシル硫酸−ポリアクリルアミド電気泳動法により求めた本発明酵素の分子量は、約55,000であった。
【００３９】
(9) 等電点：
クロマトフォーカシングカラム（ファルマシア社製）を用いた本発明酵素の等電点は、約4.0であった。
【００４０】
(10) Km値：
ラインウイバーバーク（Lineweaver-Burk）プロットにより、本発明酵素の1,5-AGに対するKm値を求めた結果、約1.0mMであった。
【００４１】
本発明の1,5-AGの定量法は、上記本発明の1,5-AG脱水素酵素を用い、次の如くして行われる。すなわち、被検体を還元性発色剤の存在下、1,5-AG脱水素酵素又はこれを含有する酵素製剤とともにインキュベートし、2-ケト-1,5-AG及び還元された発色物質を生成せしめ、生成した発色物質量を測定することにより、被検体中の1,5-AG量を定量することができる。
【００４２】
本発明の定量法に使用できる緩衝液としてはpH６〜10のリン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、グッド緩衝液、ホウ酸緩衝液等、通常使用されるものであればいずれも使用可能である。
【００４３】
還元性発色剤としては、テトラゾリウム又はその塩が挙げられるが、具体的には、ニトロテトラゾリウムブルー（以下NTBと略す）、2-(4-ヨードフェニル)-3-(4-ニトロフェニル)-5-フェニル-2Hテトラゾリウムクロライド、3-(4,5-ジメチル-2-チアゾリル)-2,5-ジフェニル-2Hテトラゾリウムブロマイド、2-(4-ヨードフェニル)-3-(4-ニトロフェニル)-5-(2,4-ジスルホフェニル)-2Hテトラゾリウム塩（以下WST-1と略す）等が利用でき、その使用濃度は、50〜2000μmol/l、特に100〜1000μmol/lの範囲が好ましい。
【００４４】
本発明の定量法においては、1,5-AG脱水素酵素は20〜10,000単位／リットル、特に200〜2,000単位／リットルの範囲で使用するのが好ましい。
【００４５】
本発明の定量法が適用できる試料としては、1,5-アンヒドログルシトールを含む血清、血漿、尿等の生体由来の試料が挙げられる。
【００４６】
反応液中の還元された発色性物質の測定は、上記の如くして反応せしめた後、発色物質特有の吸収波長において、一定時間後の吸光度あるいは一定時間内の吸光度変化を測定することにより行うことができる。
【００４７】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００４８】
実施例１  〔アグロバクテリウム・ツメファシエンスIFO13533由来1,5-AG脱水素酵素の取得〕
リン酸二カリウム２％、リン酸一カリウム0.5％、塩化カリウム0.75％、塩化ナトリウム2.5％、塩化アンモニウム1.25％、硫酸ナトリウム0.025％、硫酸マグネシウム0.005％及びL-ソルボース0.1％より成る培地（pH7.0）50mlを200ml容の培養フラスコに添加し、120℃で15分間殺菌後冷却し、アグロバクテリウム・ツメファシエンスIFO13533を１白金耳接種し、30℃で３日間振とう培養して種培養液とした。得られた種培養液10mlを、２リットル培養フラスコ中、上記と同じ組成の液体培地1000mlに接種し、30℃で３日間振とう培養した。
培養終了後、遠心分離して菌体を回収した。得られた菌体量は培養液１リットル当たり約２ｇであった。得られた菌体を１ｇ当たり2.5mlの20mMリン酸カリウム緩衝液（pH7.2）に懸濁させ、超音波ホモジナイザーにより、菌体を細断した。得られた破砕液を10,000ｇで遠心分離し、その上清を更に100,000ｇで遠心分離して膜画分を得た。膜画分１ｇ当たり10mlの１％トリトンX-100含有20mMリン酸カリウム緩衝液（pH7.2）で懸濁させ、撹拌しながら一晩膜画分から酵素の可溶化を行った。得られた可溶化液を再度100,000ｇで遠心分離して膜残渣を除き、粗酵素液を得た。この粗酵素液の酵素活性を前述の測定法に基づいて測定したところ、菌体１ｇ当たり0.5単位の活性が得られた。
【００４９】
実施例２  〔1,5-AG脱水素酵素の精製〕
実施例１で得られた可溶化液を、予め１％トリトンX-100含有20mMリン酸カリウム緩衝液（pH7.2）で平衡化したハイドロキシアパタイトカラムに通して酵素を吸着させ、同組成の緩衝液で洗浄後、１％トリトンX-100含有20mMリン酸カリウム緩衝液（pH7.2）の直線グラジエントで溶出し、酵素の活性画分を集めた。更に比活性を上げるため、再度ハイドロキシアパタイトカラムに通して上記同様の操作を行い、活性画分を集め限外濾過により濃縮し、比活性が12単位/mg蛋白質である精製酵素を得た。該精製標品は、ポリアクリルアミド電気泳動において単一バンドを示した。
【００５０】
実施例３  〔NTBを利用した1,5-AGの定量〕
0.35mM NTB及び１％トリトンX-100を含む350mMリン酸カリウム緩衝液（pH8.0）2.55mlに、各種濃度の1,5-AG溶液0.15ml及び実施例２により得られた1,5-AG脱水素酵素溶液0.3ml（0.54単位）を加えた全量3.0mlの反応液を、37℃で10分間反応させ、540nmの吸光度を測定して検量線を作成した。図５にこの結果を示した。検量線は、０〜50μg/mlまで直線となり、還元性発色剤としてNTBを用いた1,5-AGの定量が可能であることが分かる。
【００５１】
実施例４  〔WST-1を利用した1,5-AGの定量〕
実施例３の還元性発色剤に代えてWST-1を用い、吸光度の測定波長を450nmとした以外は、上記と同様の操作にて測定を行い検量線を作成した。図６にこの結果を示した。検量線は、０〜50μｇ／mlまで直線となり、還元性発色剤としてWST-1を用いた1,5-AGの定量が可能であることが分かる。
【００５２】
【発明の効果】
以上のように、本発明の1,5-AG脱水素酵素は、電子キャリアー非存在下において1,5-AGに特異的に作用し直接還元性発色剤を還元する作用を有する。従って、これを用いた本発明の1,5-AGの定量法は、特異酵素の作用により直接生成される還元された発色物質を測定するものであるため、試料中の1,5-AGを簡便かつ精度良く測定することができ、特に糖尿病等の診断に極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】アグロバクテリウム・ツメファシエンスIFO13533を培養して得られた本発明の1,5-AG脱水素酵素の最適pHを示すグラフである。
【図２】アグロバクテリウム・ツメファシエンスIFO13533を培養して得られた本発明の1,5-AG脱水素酵素のpH安定性を示すグラフである。
【図３】アグロバクテリウム・ツメファシエンスIFO13533を培養して得られた本発明の1,5-AG脱水素酵素の最適温度を示すグラフである。
【図４】アグロバクテリウム・ツメファシエンスIFO13533を培養して得られた本発明の1,5-AG脱水素酵素の温度安定性を示すグラフである。
【図５】アグロバクテリウム・ツメファシエンスIFO13533を培養して得られた本発明の1,5-AG脱水素酵素及び還元性発色剤としてNTBを用いた1,5-AG測定の検量線である。
【図６】アグロバクテリウム・ツメファシエンスIFO13533を培養して得られた本発明の1,5-AG脱水素酵素及び還元性発色剤としてWST-1を用いた1,5-AG測定の検量線である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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