(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ストレプトマイセス・ラベンドュラエ（Streptomyces lavendulae）の培養上清を酸性下で遠心沈澱する工程を特徴とする、トランスグルタミナーゼ阻害活性を有する画分の製造方法。
【請求項２】
ストレプトマイセス・ラベンドュラエ（Streptomyces lavendulae）の培養上清を酸性下で遠心沈殿して得られる画分を中性下で核酸切断酵素処理し、再び酸性下で遠心沈澱して得られる、トランスグルタミナーゼ阻害活性を有する画分の製造方法。
【請求項３】
請求項１又は２記載の製造方法で得られる画分を用いることを特徴とするトランスグルタミナーゼ活性の阻害方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はストレプトマイセス属の微生物、より詳細にはストレプトマイセス・ラベンドュラエ（Streptomyces lavendulae）によるトランスグルタミナーゼ阻害物質の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
トランスグルタミナーゼはペプチド、蛋白質中のグルタミン残基側鎖のγーカルボキシアミド基と一級アミンと間のアシル転移反応を触媒する酵素（特開平１ー２７４７１等参照）であり、食品、飼料及び医薬分野において幅広く利用されている酵素である。
例えば、蒲鉾等の水産練り製品の物性の改良（特開平２ー１００６５３、特開平２ー１８６９６１等参照）、肉小片を結着させることによる成形肉の調製（特公平６ー５５１１６等参照）、リジンやメチオニン等の必須アミノ酸の導入による栄養性改善（特開平６ー７０９１参照）、及び創傷治療への応用（特開平５ー８２０８３７参照）等にトランスグルタミナーゼの架橋反応を応用した利用技術が導入されている。
【０００３】
しかし、トランスグタミナーゼの利用に当たっては、架橋反応の制御が重要であり、過度の架橋形成はトランスグルタミナーゼを利用する製品の物性低下（劣化）や生体利用性の低下等を引き起こし、逆にその利用価値を消失させる。そこで、トランスグルタミナーゼ反応の制御法が待望されている。
【０００４】
さて、医薬分野において、各生体組織に分布するトランスグルタミナーゼが過度の活性上昇を起こすと幾つかの病気の発症と関連することが報告されている。
例えば、皮脂腺トランスグルタミナーゼ活性の過度の上昇とアクネ病変（acne lesions）との関連が指摘されている。また、皮膚病の一つの乾せんや視力障害をもたらす白内障と過度のトランスグルタミナーゼ活性との関連も報告されている。更には、切傷部位の正常な出血阻止のみを目的としている血漿トランスグルタミナーゼ（ファクターXIIIa）が、ある特定の場合にはきわめて所望されない状態を来すことが報告されている。
例えば、過度の血液凝固、すなわち血管内の血栓の形成は脳卒中、血栓症、各種狭心症、心筋症等の症状をもたらす。従って、トランスグルタミナーゼの過度の反応を制御することは不可欠である。
【０００５】
トランスグルタミナーゼには、活性発現にカルシウムを必要とするカルシウム依存性の酵素（特公平１ー５０３８２等参照）と、活性発現にカルシウムを必要としないカルシウム非依存性の酵素（特開平１ー２７４７１参照）が知られている。また、種々のトランスグルタミナーゼが既に知られているが、その何れの場合にも触媒活性発現に関与する部位はシステイン残基であり、チオール酵素と分類されている。
【０００６】
従って、トランスルタミナーゼの活性を制御するための反応停止法としては、加熱による酵素蛋白の熱変性が最も確実な方法と考えられる。また、触媒活性部位であるチオール基を重金属や化学修飾剤等で保護するか、あるいは、トランスグルタミナーゼの基質と拮抗する反応拮抗剤を添加することも有効であると考えられる。
更に、モルモット肝臓由来のトランスグルタミナーゼのようなカルシウム依存性のトランスグルタミナーゼの場合には、反応系内よりカルシウムを除去すれば活性は発現しなくなることから、カルシウムのキレート剤であるリン酸、ピロリン酸、エチレンジアミン四酢酸（ETDA）及びエチレングリコールビス（２ーアミノエチルエーテル）四酢酸（EGTA）等を添加することも有効である。
【０００７】
しかし、トラングルタミナーゼ反応の停止のために加熱処理を行うことは、食品や飼料の一部に対し有効であるが、中には加熱により品質が低下したり、物性が損傷したりして加熱が好ましくない食品や飼料があり、加熱によるトランスグルタミナーゼの活性制御はその応用範囲は広くない。
また、医薬分野においては、病症状が現れた生体に加熱処理を施すことは、生体の死あるいは組織の損傷を招く恐れがあり、極めて有効ではない。
更に、物理的な制限により加熱処理が不可能な食品や飼料及び生体試料もあり、加熱処理は有効でないケースも多々存在する。
【０００８】
一方、チオール基を保護する重金属や化学修飾剤の添加によるトランスグルタミナーゼ活性の制御は規制上、食品への応用は不可能である。また、飼料における応用も食品の場合に準ずると考えられ基本的に困難である。更に、医薬分野においても、病症状の現れた生体に重金属や化学修飾剤を投与することは、その影響に特異性が無いことから極めて危険である。
【０００９】
カルシウム依存性トランスグルタミナーゼについては、カルシウムキレート剤であるリン酸、ピロリン酸、EDTA、EGTA等を使用することで活性阻止が可能であるが、リン酸、ピロリン酸、EDTAは食品添加物であり、食品中に存在する内在性のトランスルグタミナーゼの活性阻止に応用可能である。一方、医薬分野への応用については、EDTAは生体活動に必須なカルシウムまでもキレートする可能性があり、その使用には制限がある。
【００１０】
以上記述してきたように、カルシウム依存性及び非依存性の両トランンスグルタミナーゼに共通な有効な活性阻止方法がないのが現状である。
【００１１】
【発明が解決しようする課題】
本発明者等は、カルシウム依存性／非依存性のいずれのトランスグルタミナーゼに対しても有効な阻害物質の提供を目的とする。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は上記課題を解決するために鋭意検討した結果、ストレプトマイセス属の微生物が生産する高分子化合物がカルシウム依存性／非依存性を問わずトランスグルタミナーゼ活性を阻害することを見いだし、本発明を完成した。
すなわち、本発明はストレプトマイセス属の微生物を培地中で培養することによりトランスグルタミナーゼ活性を阻害する高分子化合物を生産させ、当該高分子化合物を培地中から採取することを特徴とするトランスグルタミナーゼ活性阻害物質の製造方法である。以下に、本発明を詳細に説明する。
【００１３】
目的とする高分子化合物を生産する微生物としてはストレプトマイセス属に属する微生物が用いられる。ストレプトマイセス属の中でも、取り分けストレプトマイセス・ラベンドュラエ（Streptomyces lavendulae）を用いるのが好ましい。ストレプトマイセス・ラベンドュラエ（Streptomyces lavendulae）の一例として、ストレプトマイセス・ラベンドュラエ  ＡＪ９５４１を通商産業省・工業技術院・生命工学工業技術研究所（以下、生命研と略する）に寄託した。尚、寄託番号はＦＥＲＭ  Ｐー１５４２５である。
【００１４】
目的とする高分子化合物を生産する為に、ストレプトマイセス  ラベンドュラエを通常２０〜３５℃の温度範囲で、１２時間から８日間、好ましくは１から４日間培養すると培地中に目的とする物質が分泌生産される。
尚、培地は通常、放線菌等の培養に用いられる培地を用いればよい。
【００１５】
次に、このように培地中に分泌生産された目的の高分子化合物を、以下の操作に従って培地中から採取する。
すなわち、酸性下で培養上清を遠心し沈澱してくる画分を集める。次に、この画分を中性（ｐＨ約７）に戻して透析後、DNase処理を施し、再び酸性（ｐＨ約２.５〜約３.５）に戻して遠心沈澱し、得られる画分を集める。次に、この画分を中性（pH７）で透析して得られる画分が目的とするトランスグルタミナーゼ活性を阻害する画分である。この方法での活性回収率は約６５ー８０％である。
【００１６】
本化合物の主成分の分子量は種々の限外濾過膜に対する透過性より約１０、０００〜約１００、０００の範囲にあると考えられる。
また、本化合物はpH２〜１０の広範囲で安定、かつその阻害活性は９５℃、３０分間の加熱処理でも保持される。更に、蛋白分解酵素であるトリプシンやプロナーゼ、及び核酸切断酵素DNaseで処理してもトランスグルタミナーゼ阻害活性は保持されることから、本高分子化合物は蛋白質、ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）以外の多糖類であると考えられる。この見解は本化合物の精製のためにゲル濾過クロマトグラフィーを行ったところ、トランスグルタミナーゼ阻害活性のピークとフェノールー硫酸法で検出される糖ピークとが一致することからも支持される。
【００１７】
本発明のストレプトマイセス・ラベンドュラエが生産する高分子化合物のトランスグルタミナーゼ阻害活性は、トランスグルタミナーゼ活性をベンジルオキシカルボニル−Ｌ−グルタミニル−グリシンとヒドロキルアミンを基質として反応を行い、生成したヒドロキサム酸をトリクロロ酢酸存在下で鉄錯体を形成させ、この鉄錯体の５２５nmでの吸収を測定する方法で測定した系（ハイドロキサメート法）にて、６．１ミリユニット（ｍＵ）のトランスグルタミナーゼ活性を５０％阻害する阻害物質量を１阻害活性（ＩＵ）と定義する。
【００１８】
本発明のストレプトマイセス・ラベンドュラエが生産する高分子化合物は、カルシウム依存性／非依存性トランスグルタミナーゼの区別なく、両トランスグルタミナーゼの活性を阻害する。尚、その詳細は実施例に記述した。
また、この高分子化合物は硫酸、塩酸等により部分加水分解に付しても、その活性は保持させる。このことから、トランスルグルタミナーゼ活性の阻害には本化合物の高次構造以外、例えばその構成成分（糖）等の大きな関与が示唆される。本化合物の成分分析から主成分としてグルコース、キシロース、マンノース、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−ガラクトサミン、ガラクトース、Ｎ−グルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン、フコース等の存在が確認されている。
【００１９】
尚、上述したように本発明の高分子化合物により活性阻害を受けるトラングルタミナーゼはカルシウム依存性及び非依存性を問わず、動物起源のものでも植物起源のものでもまたは微生物起源のものでも該当し、特にその起源が限定されるものではない。
【００２０】
また、トランスグルタミナーゼ活性は、ベンジルオシキカルボニル−Ｌ−グルタミニル−グリシンとヒドロキルアミンを基質として反応を行い、生成したヒドロキサム酸をトリクロロ酢酸存在下で鉄錯体を形成させ、この鉄錯体の５２５nmでの吸収を測定する方法（ハイドロキサメート法）、ヂメチルカゼインとトリチウムラベルしたヒスタミンを基質として反応を行い、ヂメチルカゼインへの放射能ラベルした低分子の取り込みを測定する方法（ラベルアミン法）、及びカゼイン同士の架橋反応を、ドデシル硫酸ーポリアクリルアミド電気泳動により、高分子物質の生成を測定する方法の三通りの測定法で調べた。
【００２１】
本発明の高分子化合物は、ストレプトマイセス・ラベンドュラエが培養液に分泌生産する物質であり、菌体破砕の必要性は無く、菌体内物質の混入は殆ど考えられない。また、その精製は簡便でかつ回収率も高いので、工業レベルの精製は技術的にもコスト的にも可能である。
更に、部分加水分解物にも同様の活性が認められ、その構成成分はグルコース、キシロース、マンノース、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−ガラクトサミン、ガラクトース、Ｎ−グルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン、フコース等といった一般の多糖類であり、その応用は食品、飼料等の広範囲に及ぶと考えられる。
【００２２】
医薬分野への応用では、上述のようにして得た本発明の高分子化合物を更に高純度に精製してから、注射液、製剤、軟膏薬、座薬等の医薬品として用いることもできる。また、本発明の高分子化合物を低分子化した成分にも同様の活性があることより、高純度に精製後、低分子化合物に分解して医薬品として用いることもできる。
【００２３】
【実施例】
以下に本発明を実施例に従って説明する。尚、本発明の技術的範囲は実施例に限定されるものではない。
【００２４】
（実施例１）
ストレプトマイセス・ラベンドュラエ（ＡＪ９５４１、ＦＥＲＭ  Ｐー１５４２５）の４日間培養した時の培養上清３７０ｍｌを１Ｎ塩酸でpH３に調整し、遠心（５５００ｇ、１５分間）で沈澱する画分（ペレット）を集め、２０ｍｌの１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（pH７）で溶解し、同トリス塩酸緩衝液に対し透析し、６１ｍｌの酸処理液を得た。
次いで、５Ｕ／ｍｌのDNaseを添加し２５℃、３時間反応させた。再び１Ｎ塩酸でpH３に調整し、遠心（５５００ｇ、１５分間）で得られる沈澱画分を集め、再度２０ｍｌの前出トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７）で溶解し、透析し、６７ｍｌのDNase処理液を得た。この活性回収率は７３％であった。尚、この６７ｍｌのDNase処理液を後述の実施例２及び３の試料とした。
【００２５】
（実施例２）
上述の実施例１で得たDNase処理液について、（１）動物起源トランスグルタミナーゼとしてモルモット肝臓トランスグルタミナーゼ、（２）胎盤トランスグルタミナーゼ（ファクターXIIIa）及び（３）微生物起源トランスグルタミナーゼとして味の素株式会社製の酵素（ストレプトベルチシリウム・モバラエンス  ＩＦＯ  １３８１９株由来のトランスグルタミナーゼ）を用いて、その阻害活性を調べた。
その結果、何れの起源のトランスグルタミナーゼについても、同様の濃度で阻害を示し（図１）、その阻害様式は何れも同じであることが明らかになった。
【００２６】
（実施例３）
上述の実施例１で得たDNase処理液について、トヨパールHW-65F樹脂を充填したゲル濾過カラム（２．５ｃｍ直径ｘ６０．５ｃｍ長さ）にチャージし、活性ピークの分画を行った（図２）。その結果、トランスグルタミナーゼ活性の阻害ピークとフェノールー硫酸法で検出した糖ピークとが一致した。
【００２７】
【発明の効果】
ストレプトマイセス属の微生物、例えばストレプトマイセス・ラベンドュラエを培養することにより、培地中に目的とする高分子化合物を効率よくかつ簡便に分泌生産させることができる。このようにして得られる高分子化合物又は当該高分子化合物を硫酸等で加水分解して得られる部分分解物はカルシウム依存性でも、カルシウム非依存性でも、また、動物起源のものでも、植物起源のものでも、又は微生物起源のものでも区別無く、全てのトランスルグルタミナーゼの活性を有効に阻害することができる。
この本高分子化合物はトランスグルタミナーゼ活性の制御に有効であることから、本発明の化合物は医薬、食品、飼料等に広範囲に利用され得る。
【図面の簡単な説明】
【図１】この図は、本発明の高分子化合物のトランスグルタミナーゼ活性の阻害活性を示す。ストレプトマイセス・ラベンドュラエ  ＡＪ９５４１（FERM  Pー15425）の培養液より調製したDNase処理液の添加量と各種トランスグルタミナーゼの残存活性を調べたものである。
●印はモルモット肝臓トランスグルタミナーゼ、▲印は胎盤トランスルグルタミナーゼ（ファクターXIIIa）、■印は味の素（株）製の微生物トランスルグルタミナーゼをそれぞれ示す。
【図２】この図は、本発明の高分子化合物のゲル濾過クロマトグラフィーにおけるトランスグルタミナーゼ阻害活性と糖の存在を示す。ストレプトマイセス  ラベンドュラエ  ＡＪ  ９５４１（FERM  Pー１５４２５）の培養液より調製した３ｍｌDNase処理液（１０８１ＩＵ、１５ｍｇグルコース換算量）のトランスグルタミナーゼ阻害活性と各フラクションの糖含量を調べたものである。
●印はトランスグルタミナーゼ阻害活性、○印はフェノールー硫酸法による糖量をそれぞれ示す。
【図１】
0003858296.tif 000002
【図２】
0003858296.tif 000003