(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
エンド-β-Ｎ-アセチルグルコサミニダーゼ（ＥＣ３．２．１．９６）の存在下、糖鎖供与体である複合糖質の糖鎖を糖鎖受容体である下記式（化１）で示されるＮ-アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）残基を有する合成基質に転移させることにより非天然型の複合糖ペプチドを製造する方法。
【化１】
0003776952.tif 000003
（式中、Ｒ1はＨ、アミノ保護基、アミノ酸、ペプチドあるいはＮ末端アミノ酸のαアミノ基を保護したペプチドを示す。Ｒ2はＯＨ、カルボキシル保護基、アミノ酸、ペプチドあるいはＣ末端アミノ酸のカルボキシル基を保護したペプチドを示す。ｎは２である。）
【請求項２】
Ｎ末端アミノ酸のαアミノ基の保護基が９-フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基、第３ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）基、３-ニトロ-２-ピリジンスルフェニル（Ｎｐｙｓ）基、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）基あるいはダンシル（ＤＮＳ）基である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｃ末端アミノ酸のカルボキシル基の保護基が第３ブチル（Ｂｕt ）、ベンジル（Ｂｚｌ）あるいはメチル（Ｍｅ）基である請求項１または２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ペプチドの合成反応と酵素による糖鎖転移反応を組み合わせた生理活性複合糖ペプチドの製造方法に関する。本発明は医薬分野に応用される。
【０００２】
【従来の技術】
糖質および複合糖質は生物の細胞、体液等に存在し、細胞の基質認識や細胞-細胞間の認識等に深く関わっている。また糖質は生体内物質の吸収分解等の代謝の速度に関係している。タンパク質には糖鎖を持つものが知られ、例えばエリスロポエチンやティシュープラスミノーゲンアクチベーターがあり、動物細胞を用い遺伝子工学的に作られたこれら糖タンパク質が医薬として利用されている。またペプチドホルモンの中にも糖鎖を持つものが知られ、例えばヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）等がある。これら糖タンパク質あるいは糖ペプチドでは糖鎖がＮ結合型糖鎖として、ペプチド鎖のＡｓｎにＧｌｃＮＡｃを介して結合している。
【０００３】
タンパク質あるいは生理活性ペプチド等に糖鎖を付けたり、あるいは今ある糖鎖を別の糖鎖に換えることにより、生理機能の強化や生理活性の改変に役立つことが期待される。糖鎖を酵素的に改変する方法としては、１）転移酵素あるいはエキソグリコシダーゼによる方法と、２）エンドグリコシダーゼによる方法が考えられる。
【０００４】
１）の方法としては、例えばＤ．Ｈ．ジョジアッセ（D. H. Joziasse）ら［ヨーロピアン ジャーナル オブ バイオケミストリー（Eur. J. Biochem.)、 第１９１巻、第７５-８３頁（１９９０）］の報告があるが、これは糖鎖の非還元末端からの逐次反応である。また、最近、Ｍ．シャスター（M. Schuster）ら［ジャーナル オブ アメリカン ケミカル ソサエテイ（J. Amer. Chem. Soc.）、第１１６巻、第１１３５-１１３６頁（１９９４）］は数種のグリコシルトランスフェラーゼを組み合わせた糖鎖の固相合成法を報告している。
【０００５】
一方、２）のエンドグリコシダーゼを用いた糖転移反応としては、Ｒ．Ｂ．トリムブル（R. B. Trimble）ら［ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー（J. Biol. Chem.）、第２６１巻、第１２０００-１２００５頁（１９８６）］のフラボバクテリウム メニンゴセプチカム（Flavobacterium meningosepticum）由来のエンド-β-Ｎ-アセチルグルコサミニダーゼ（エンド-Ｆ）に関するもの、Ｒ．Ｍ．バーデールス（R. M. Bardales）ら［ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー（J. Biol. Chem.）、第２６４巻、第１９８９３-１９８９７頁（１９８９）］のディプロコッカス ニューモニエ（Diprococcuspneumoniae）由来のエンド-α-Ｎ-アセチルガラクトサミニダーゼに関するものがあり、前者はグリセロールが受容体に、また後者はグリセロール、ｐ-ニトロフェノール、セリン、スレオニン等が受容体になるという報告である。その後、竹川ら［特開平５-６４５９４号（１９９３）］およびＫ．タケガワ（K. Takegawa）ら［ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー（J. Biol. Chem.）、第２７０巻、第３０９４-３０９９頁（１９９５）］がアルスロバクタープロトホルミエ（Arthrobacter protophormiae）由来のエンド-β-Ｎ-アセチルグルコサミニダーゼ（エンド-Ａ）による糖質への糖鎖転移反応を、また、Ｋ．ヤマモト（K. Yamamoto）ら［バイオケミカル バイオフィジカル リサーチ コミュニケーション（Biochem. Biophys. Res. Commun.）、第２０３巻、第２４４-２５２頁（１９９４）］はムコール ヒエマリス（Mucor hiemalis）由来のエンド-Ｍによる糖質への糖鎖転移反応を報告した。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
複合糖質は糖鎖部分と糖鎖が付加する側のタンパク質、ペプチドあるいはセラミド部分等から構成されている。糖質に糖鎖を新たに付与したりあるいは他の糖鎖と入れ換えたりする、いわゆる糖鎖の改変（リモデリング）により複合糖質の生体内での安定性や生物活性が天然の複合糖質に比べて増強されたり天然にない生物機能が付加されれば医薬品に応用した場合に有用である。また、複合糖質における糖鎖のもつ生理的機能は今まで糖鎖改変の有効な手段がなかったために、十分には解明されていないが、その役割の解析のための重要な手段を提供する。
【０００７】
糖質あるいは複合糖質に糖鎖を新たに付加あるいは改変する方法としては、エキソグリコシダーゼまたはグリコシルトランスフェラーゼを用いた糖残基を一つ一つ逐次的に付加する酵素法が考えられる。また、エンド-Ａやエンド-Ｍ等のエンドグリコシダーゼによる方法は複合糖鎖をブロックとして糖質や複合糖質に転移させる、より効率的な方法を提供する。
【０００８】
天然の糖タンパク質あるいは糖ペプチドの糖鎖は、通常Ｎ結合型糖鎖として、Ａｓｎ-Ｘ-Ｓｅｒ（Ｔｈｒ）［Ｘは任意のアミノ酸、Ｓｅｒ（Ｔｈｒ）はセリンまたはスレオニンを示す］のアミノ酸配列のペプチド鎖のＡｓｎのアミド基に結合したＧｌｃＮＡｃを介して結合している。即ちこのアミノ酸配列のＡｓｎに、末端にＧｌｃＮＡｃ残基を有する糖鎖が付加され更に修飾を受けてＮ結合型複合糖鎖は生合成される。従って、天然にはこのアミノ酸配列のＡｓｎに結合した糖鎖以外のＮ結合型糖鎖は見出されていない。
【０００９】
上述の酵素による糖鎖の付加あるいは改変には糖鎖受容体であるタンパク質あるいはペプチドにＧｌｃＮＡｃ残基があることが必要であり、糖鎖の付加あるいは改変は、従来、天然の糖タンパク質あるいは糖ペプチドの糖鎖をエンドグリコシダーゼあるいはエキソグリコシダーゼによりＧｌｃＮＡｃ残基を残して切り取った後に別の糖タンパク質から調製した糖鎖を付け換えるものに限られていた。
【００１０】
タンパク質やペプチドの中にはＡｓｎ-Ｘ-Ｓｅｒ（Ｔｈｒ）の配列があっても糖鎖の付かないものも多く、例えばカルシトニンなどはその一例である。またＡｓｎがあってもこの配列が無ければ生合成段階での糖鎖の付加はできない。無論、グルタミン(Gln)に糖鎖を生合成的に付加することは遺伝子工学手法をもってしても不可能である。
【００１１】
Ａｓｎ残基にＧｌｃＮＡｃを結合した糖ペプチド（ＧｌｃＮＡｃ-Ａｓｎ-ペプチド）を化学的に合成できれば、上述の酵素法によりＡｓｎに結合したＧｌｃＮＡｃ残基に糖鎖を付加した新しい複合糖ペプチドを合成できる。この場合、ペプチド側にはＡｓｎ-Ｘ-Ｓｅｒ（Ｔｈｒ）の配列は必ずしも必要とせずＡｓｎのみあればよい。また、Ａｓｎに類縁のアミノ酸であるグルタミン（Ｇｌｎ）にＧｌｃＮＡｃ残基を付けた糖ペプチドを合成すれば、同様の複合糖ペプチドの合成が期待できる。
【００１２】
ペプチドの合成は固相合成法による残基数が数十個のものまでの合成が工業的に実用化されている。
【００１３】
本発明は、糖を結合したグルタミン(Gln)を少なくとも１個含むペプチド即ち合成基質を化学的に合成し、この足がかりの糖残基へ糖あるいは糖鎖を酵素的に転移させれば新しい複合糖ペプチドが合成できるとの考えに基づき開発されたものである。エンド-β-Ｎ-アセチルグルコサミニダーゼが、Asnよりも側鎖メチレン鎖に１個長いGlnに結合したGlcNAcにも糖鎖を転移付加させることができるという本発明者らの発見に基づく。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
本発明を概説すれば、本発明は１）糖鎖受容体となるＧｌｃＮＡｃ残基を有する合成基質の合成と、２）ＧｌｃＮＡｃ残基を有する合成基質への酵素による糖鎖の転移反応の２つの構成からなる。
【００１５】
本発明にいうＧｌｃＮＡｃ残基を有する合成基質とは、下記式（化１）
【化２】
0003776952.tif 000002
（式中、Ｒ1はＨ、アミノ保護基、アミノ酸、ペプチドあるいはＮ末端アミノ酸のαアミノ基を保護したペプチドを示す。Ｒ2はＯＨ、カルボキシル保護基、アミノ酸、ペプチドあるいはＣ末端アミノ酸のカルボキシル基を保護したペプチドを示す。ｎは２である。）で示される化合物である。
【００１６】
（化１）に示すＧｌｃＮＡｃ残基を有する合成基質の合成は如何なる方法によってもよいが、例えばＴ．イナヅ（T. Inazu）ら［ペプチド ケミストリー １９９３（Peptide Chemistry 1993）、第１０１-１０４頁（１９９４）］の報告した方法に準じて合成される。
【００１７】
ＧｌｃＮＡｃがアミド基に結合したグルタミン（ＧｌｃＮＡｃ-Ｇｌｎ）をＧｌｎに代えて用いることによりＧｌｃＮＡｃがＧｌｎに結合したペプチド（ＧｌｃＮＡｃ-Ｇｌｎ-ペプチド）が合成される。（化１）のｎが２の化合物がこれに当たる。
【００１８】
（化１）のＲ1にある末端アミノ酸のαアミノ基の保護基としては、例えば、９-フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基、第３ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）基、３-ニトロ-２-ピリジンスルフェニル（Ｎｐｙｓ）基、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）基あるいはダンシル（ＤＮＳ）基等が用いられる。
【００１９】
Ｎ末端アミノ酸の保護基は糖鎖転移反応後に常法により外すか、あるいは予め保護基を外した後に糖鎖転移反応に供してもよい。
【００２０】
（化１）のＲ2にあるカルボキシル基の保護基としては、第３ブチル（Ｂｕt）基、ベンジル（Ｂｚｌ）基あるいはメチル（Ｍｅ）基等であるが、水への溶解性を上げるために保護基を外し、遊離型で用いることが多い。
【００２１】
本発明の第２の構成は、糖鎖受容体である合成基質への糖鎖供与体からの糖鎖の転移反応による付加である。
【００２２】
エンドグリコシダーゼの存在下、下記式（式１）：
Ｘ-ＧｌｃＮＡｃ-Ｙ ＋ Ｚ → Ｘ-ＧｌｃＮＡｃ-Ｚ ＋ Ｙ （式１）
［式中、Ｘは複合糖鎖、Ｙは糖質あるいは複合糖質、Ｚは（化１）に示した合成基質］
で表される転移反応を行うことを特徴とする。
【００２３】
本発明に用いるエンドグリコシダーゼとしては、エンド-β-Ｎ-アセチルグルコサミニダーゼ（ＥＣ３．２．１．９６）であり、例えば、エンド-Ａやエンド-Ｍ等が用いられる。該酵素は下記式（式２）：
Ｒ-ＧｌｃＮＡｃ-ＧｌｃＮＡｃ-Ａｓｎ-（ペプチドまたはタンパク質）（式２）
（式中Ｒは複合糖鎖を示す）
のアスパラギン（Ａｓｎ）結合型糖鎖のキトビオース部分（ＧｌｃＮＡｃ-ＧｌｃＮＡｃ）の間を加水分解するが、この時に適当な糖鎖受容体があると、受容体に糖鎖（Ｒ-ＧｌｃＮＡｃ）部分が転移する。（式１）の反応はそれを利用したものである。
【００２４】
エンドグリコシダーゼによる糖鎖転移反応の糖鎖受容体となるのは、通常、Ａｓｎ-Ｘ-Ｓｅｒ（Ｔｈｒ）配列を含むペプチドのＡｓｎに結合したＧｌｃＮＡｃ残基である。
【００２５】
驚くべきことに、天然には存在しないグルタミン（Ｇｌｎ）に結合したＧｌｃＮＡｃ残基を含むペプチド（ＧｌｃＮＡｃ-Ｇｌｎ-ペプチド）のＧｌｃＮＡｃ残基にもＡｓｎの場合と同様に糖鎖の転移反応が起きることが分かった。
【００２６】
（化１）に示すＧｌｃＮＡｃ残基を有する合成基質はかかる知見に基づき調製されたものであり、この合成基質への酵素による糖鎖の転移反応を行う本発明を完成させた。
【００２７】
酵素の糖鎖供与体の基質特異性については、エンド-Ａは高マンノース型糖鎖のみに作用するが、エンド-Ｍは高マンノース型のみならず複合型糖鎖や混成型糖鎖にも作用する。
【００２８】
これらの酵素の本来の機能は加水分解であり、（式１）のＺの代わりに水が入り加水分解反応が転移反応とともに副反応として進行する。また、（式１）で生成した転移反応生成物（Ｘ-ＧｌｃＮＡｃ-Ｚ）は加水分解反応の基質となり再分解を受ける。
【００２９】
糖鎖転移反応を効率よく行わせるには加水分解反応を抑えて（式１）の反応を優先的に行わせることが必要である。与酵素量を減らし、基質である糖鎖供与体（Ｘ-ＧｌｃＮＡｃ-Ｙ）と糖鎖受容体（Ｚ）の仕込濃度を、そのモル比を１近くにしつつ高濃度にすることにより反応の場（酵素の活性中心）における水の影響を排して転移反応を効率よく進行させることができる。
【００３０】
反応系で重要な点は、反応を酵素律速条件下で行うことである。即ち糖鎖供与体から受容体への糖鎖転移反応の速度が与酵素量に依存し、その速度を最大にするに必要な最少量の酵素量になるように酵素の添加量を制限して反応する。例えばエンド-Ｍの場合、糖鎖供与体に対して５００ユニット（Ｕ）／モル（供与体）以下、望ましくは８０-４００Ｕ／モル（供与体）程度の酵素量を加える。なおここで、酵素の１ユニット（Ｕ）は、ヒトトランスフェリン由来のアシアロ複合型糖鎖のダンシル化（ＤＮＳ）誘導体を加水分解して、３７℃、１分間に１マイクロモル（μｍｏｌ）のＮ-アセチルグルコサミニル-アスパラギンのＤＮＳ誘導体（ＧｌｃＮＡｃ-Ａｓｎ-ＤＮＳ）を生成させるに必要な酵素量である。
【００３１】
糖鎖供与体と受容体の仕込濃度を著しく高めることも重要である。与酵素量を制限しつつ両基質を高濃度に仕込むことにより、糖鎖転移反応が促進され副反応が抑えられて反応収率は飛躍的に向上する。その濃度は、糖鎖供与体が１０ｍＭ以上、望ましくは１５-７５ｍＭがよい。また糖鎖受容体は２．５ｍＭ以上、望ましくは７．５-３５ｍＭ程度がよい。糖鎖受容体の濃度は高い方が望ましいが、合成基質の溶解度が低い場合には２．５ｍＭ程度の濃度でも用いられる。
【００３２】
本発明に用いる糖鎖供与体としては、高マンノース型、複合型、混成型いずれの糖鎖も用いられる。高マンノース型糖鎖は例えば卵白アルブミン等から、またシアル酸を含有する複合型糖鎖は例えばヒトトランスフェリンや牛フェツイン等から調製され、シアリダーゼ処理等によりシアル酸を外せばアシアロ複合型糖鎖が調製される。酵素的あるいは化学的に修飾された糖鎖、あるいは化学合成された糖鎖も用いることができる。
【００３３】
本発明の反応は、基質の糖鎖供与体、糖鎖受容体および酵素のエンドグリコシダーゼを緩衝溶液中で混合することにより行われる。先述のごとく、糖鎖供与体の濃度を１０ｍＭ以上、望ましくは１５-７５ｍＭ、糖鎖受容体の濃度を２．５ｍＭ以上、望ましくは７．５-３５ｍＭになるように加える。酵素量は５００Ｕ／モル（供与体）以下、望ましくは８０-４００Ｕ／モル（供与体）程度に制限し、例えば、エンド-Ｍの場合、２-１０ｍＵ／ｍｌ程度の量で用いる。緩衝液としては、ｐＨ５-８程度、濃度２５-２００ｍＭ、望ましくは５０-１００ｍＭの適当な緩衝液が用いられる。エンド-Ｍの場合、通常ｐＨ５．５-６．５、濃度５０-１００ｍＭの酢酸あるいはリン酸緩衝液中で反応が行われる。基本的な反応液組成の一例は、糖鎖供与体２５ｍＭ、糖鎖受容体１０ｍＭ、エンド-Ｍ４ｍＵ／ｍｌおよび６０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．２５）である。
【００３４】
反応温度は通常、室温-５０℃程度、好ましくは３０-４０℃で行われ、反応時間は１-２４時間である。例えば、エンド-Ｍ酵素の場合、通常、３７℃で３-１８時間程度反応が行われる。
【００３５】
生成した複合糖質は公知の手段に従って反応終了液から容易に分離精製することが出来る。例えば、ゲルろ過カラムクロマトグラフィー、イオン交換樹脂カラムクロマトグラフィー、レクチンカラムクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等により反応終了液から反応生成物の複合糖質を分離し、更に濃縮、脱塩、凍結乾燥等を行えばよい。
【００３６】
【実施例】
以下に実施例をあげて本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例1】
高マンノース型糖鎖のＧｌｃＮＡｃ-Ｇｌｎ-Ｆｍｏｃへの糖鎖転移反応：
糖鎖受容体のＧｌｃＮＡｃ-Ｇｌｎ-Ｆｍｏｃ（分子量５７２）はＡｓｎの代わりにＧｌｎ（グルタミン）が入った化合物としてＧｌｃＮＡｃ-Ａｓｎ-Ｆｍｏｃの合成法に準じて合成した。酵素反応にはナトリウム塩にして用いた。糖鎖供与体として、卵白アルブミンをプロナーゼ処理、セファデックスＧ-２５ゲルろ過更にＤｏｗｅｘ５０イオン交換クロマトにより分離精製して得た高マンノース型糖鎖（Ｍａｎ）6-（ＧｌｃＮＡｃ）2-Ａｓｎ（分子量１６５１）を１μｍｏｌ（終濃度２５ｍＭ）、糖鎖受容体としてＧｌｃＮＡｃ-Ｇｌｎ-Ｆｍｏｃ（分子量５７２）を２００ｎｍｏｌ（同５ｍＭ）、エンド-Ｍを１６０μＵ（同４ｍＵ／ｍｌ）加え、６０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．２５）４０μｌ中で３７℃、３時間反応させた。反応停止後、反応液を蒸留水で１ｍｌに希釈し反応生成物をＨＰＬＣで分析した。転移反応生成物が７．５％の収率で得られた。転移反応生成物をＨＰＬＣ分取し、質量分析したところ、分子量１７４８に相当するイオンピーク（ｍ／ｚ）が認められ、（Ｍａｎ）6-（ＧｌｃＮＡｃ）2-ＡｓｎからＧｌｃＮＡｃ-Ｇｌｎ-Ｆｍｏｃへの転移反応生成物、即ち（Ｍａｎ）6-（ＧｌｃＮＡｃ）2-Ｇｌｎ-Ｆｍｏｃであることが確認された。
【００３７】
【実施例２】
ヒトトランスフェリン由来複合型糖鎖のＧｌｃＮＡｃ-Ｇｌｎ-Ｆｍｏｃへの転移反応：
糖鎖供与体として、ヒトトランスフェリン（生化学工業）をプロナーゼ処理、セファデックスＧ-２５ゲルろ過を繰り返して得たＡｓｎ残基のみを有するシアロ糖ペプチド（ＴＦ-ＳＧＰ、分子量２３３８）、さらにシアリダーゼ処理してシアル酸を外したアシアロ糖ペプチド（ＴＦ-ＡＳＧＰ、分子量１７５６）を１μｍｏｌ（終濃度２５ｍＭ）とＧｌｃＮＡｃ-Ｇｌｎ-Ｆｍｏｃを２００ｎｍｏｌ（同５ｍＭ）を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．２５）２４μｌに溶解し、エンド-Ｍ １６０μＵを含む酵素溶液１６μｌを加え、３７℃で３時間反応した。反応停止後反応液を蒸留水で１ｍｌに希釈して、反応生成物をＨＰＬＣで分析した。転移反応生成物がＴＦ-ＳＧＰの場合５．０％、ＴＦ-ＡＳＧＰの場合１３．７％の収率で得られた。転移反応生成物をＨＰＬＣ分取により単離し、質量分析の結果、ＴＦ-ＳＧＰの転移反応生成物には分子量２５７４に相当するイオンピークが、またＴＦ-ＡＳＧＰの転移反応生成物には分子量１９９２に相当するイオンピーク（ｍ／ｚ［Ｍ-Ｈ］ １９９２）が観測され、各々ジシアロ２本鎖複合型糖鎖がＧｌｃＮＡｃ-Ｇｌｎ-Ｆｍｏｃに転移した化合物およびアシアロ２本鎖複合型糖鎖がＧｌｃＮＡｃ-Ｇｌｎ-Ｆｍｏｃに転移した化合物であることが確認された。
【００３８】
【実施例３】
ヒトトランスフェリン由来アシアロ糖鎖のＧｌｃＮＡｃ-Ｇｌｎ-ＤＮＳへの糖鎖転移反応：
糖鎖受容体としてＧｌｃＮＡｃ-Ｇｌｎのダンシル化（ＤＮＳ）誘導体（ＧｌｃＮＡｃ-Ｇｌｎ-ＤＮＳ）（分子量５８５）はＧｌｎのαアミノ基をＤＮＳ基で保護した化合物として合成した。糖鎖供与体としてアシアロ糖ペプチド（ＴＦ-ＡＳＧＰ）を用い、糖鎖供与体１μｍｏｌ（終濃度２５ｍＭ）と糖鎖受容体５００ｎｍｏｌ（同１２．５ｍＭ）を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．２５）２４μｌに溶解し、エンド-Ｍ １６０μＵを含む酵素溶液１６μｌを加え、３７℃で３時間反応させた。反応生成物をＨＰＬＣ分取し、質量分析したところ、分子量２００４に相当するイオンピーク（ｍ／ｚ）観察され、アシアロ２本鎖複合型糖鎖がＧｌｃＮＡｃ-Ｇｌｎ-ＤＮＳに転移した化合物であることが確認された。
【００３９】
【発明の効果】
本発明により、ＧｌｃＮＡｃ残基を有する合成基質に酵素的に糖鎖を付加して新規複合糖ペプチドを容易に合成することが可能となった。糖鎖受容体のペプチドはペプチド鎖のアミノ酸配列の中にグルタミン（Ｇｌｎ）があればＧｌｃＮＡｃ残基を介してＮ結合型糖鎖を付加することができ、天然には無い全く新しい複合糖ペプチドを合成できる。付加する糖鎖は高マンノース型、シアル酸を含む複合型糖鎖いずれでもよく、望み通りの複合糖ペプチドを合成できる。
本発明は、医薬への応用とともに複合糖質の糖鎖の果たしている生理的役割を解明するための研究手法を提供する。