(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
活性成分として、5-{4-[2-(メチルピリド-2-イルアミノ)エトキシ]ベンジル}チアゾリジン-2,4-ジオン；3-{4-[2-(ベンゾオキサゾール-2-イルメチルアミノ)エトキシ]フェニル}-2-エトキシプロピオン酸；(+)-3-{4-[2-(ベンズオキサゾール-2-イルメチルアミノ)エトキシ]フェニル}-2-エトキシプロピオン酸；(-)-3-{4-[2-(ベンズオキサゾール-2-イルメチルアミノ)エトキシ]フェニル}-2-エトキシプロピオン酸；15-デオキシ-Δ１２，１４-プロスタグランジンＪ２（１５−ｄ ＰＧＪ２）から選択される、ＰＰＡＲ−γ型のレセプターの少なくとも一つのアクチベーターを含む、ケラチノサイトの分化の活性化剤。
【請求項２】
ＰＰＡＲ−γ型のレセプターのアクチベーターが、２００ｎＭ以下の、ＰＰＡＲ−γに関するＡＣ５０を有することを特徴とする請求項１記載の活性化剤。
【請求項３】
ＰＰＡＲ−γ型のレセプターのアクチベーターが、特異的であることを特徴とする請求項２記載の活性化剤。
【請求項４】
ＰＰＡＲ−γ型のレセプターのアクチベーターが、０．０５以下のＰＰＡＲαに関するＡＣ５０に対する、ＰＰＡＲ−γに関するＡＣ５０の比Ｒ１を有することを特徴とする請求項３記載の活性化剤。
【請求項５】
使用されるＰＰＡＲ−γ型のレセプターのアクチベーターが、１００ｎＭ以下の濃度で使用された場合、２０％以下のケラチノサイト増殖の阻害のパーセントを有することを特徴とする請求項１から４のいずれか一項記載の活性化剤。
【請求項６】
局所的経路を経た適用に適した形態で存在することを特徴とする請求項１から５のいずれか一項記載の活性化剤。
【請求項７】
ＰＰＡＲ−γ型のレセプターのアクチベーターが、該活性化剤の全重量に対して、一般的に０．００１から１０重量％の間の濃度で含まれていることを特徴とする請求項１から６のいずれか一項に記載の活性化剤。
【請求項８】
ＰＰＡＲ−γ型のレセプターのアクチベーターが、該活性化剤の全重量に対して、一般的に０．０１から１重量％の間の濃度で含まれていることを特徴とする請求項７に記載の活性化剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、製薬学的組成物の調製のためのＰＰＡＲ−γ型のレセプターの少なくとも一つのアクチベーターの使用に関し、該組成物は、表皮細胞の分化の異常に関する皮膚疾患を治療することを企図する。
【０００２】
【従来の技術】
表皮細胞の分化の異常に関する多くの皮膚疾患が存在する；例として、乾癬、湿疹、皮膚炎、一般的な挫瘡、魚鱗癬を含む角質症、及び皮膚ガンが挙げられる。表皮細胞の分化の異常は一般的に、表皮細胞の過剰増殖に伴って生じる。これらの疾患を治療するために、各種の製薬学的アプローチが考慮されている。しかしながら、現時点で完全に満足する治療は存在しない。かくして存在する治療を改良する必要性が存する。
【０００３】
ペルオキシソームは、ミトコンドリアに緊密に関連し、過酸化水素の代謝に特徴的である一連の酵素（カタラーゼ、ウレートオキシダーゼ、D-アミノ酸オキシダーゼ）、及び脂肪酸β−酸化酵素を含む小器官である。ペルオキシソーム増殖因子は、主にクロフィブレートのような低脂血症因子、除草剤、及びフタル酸エステルのような工業プラスチックを含む化学的産物の群である。これらのペルオキシソーム増殖因子は、ＰＰＡＲと称され、ステロイド核レセプタースーパーファミリーの一部であるレセプターを活性化する、非遺伝子毒性発ガン因子である。これらのレセプターは、ペルオキシソーム増殖因子によって活性化でき、また天然の脂肪酸によっても活性化でき、それ故ペルオキシソーム及びミトコンドリアのβ−酸化に関与する酵素をコードする、または代わりにＰ４５０−４Ａ６脂肪酸β−ヒドロキシラーゼをコードする遺伝子の発現を刺激する。
【０００４】
一連の参考文献は、脂質の代謝の調節及びホメオスタシスにおけるＰＰＡＲの役割を示唆する。
【０００５】
ＰＰＡＲレセプターは、レチノイドＸレセプター（ＲＸＲと称される）とのヘテロダイマーの形態において、ペルオキシソーム増殖因子応答エレメント（ＰＰＲＥ）と称されるＤＮＡ配列エレメントに対する結合によって転写を活性化する。
【０００６】
ヒトＰＰＡＲの３種のサブタイプが同定され記載されている：ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲγ及びＰＰＡＲδ（またはＮＵＣ１）。
【０００７】
特許出願WO 96/33724において、プロスタグランジンＪ２またはＤ２のようなＰＰＡＲγに対して選択的な化合物が、肥満症および糖尿病を治療するための潜在的な活性剤であることが記載されている。
【０００８】
さらに、特許出願WO 95/35108において、チアゾリジンジオン、とりわけシグリタゾン(ciglitazone)が、ケラチノサイトの増殖を阻害することによって乾癬の治療において活性を有することが記載されている。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本出願人は、ヒトケラチノサイトの分化が、高カルシウム濃度で誘導された場合、ＰＰＡＲ、とりわけＰＰＡＲγの発現のレベルが増大することを発見した。また本出願人は、乾癬病変皮膚において、ＰＰＡＲ、とりわけＰＰＡＲγの発現のレベルが、非病変皮膚のそれに対して顕著に減少することを観察した。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
かくして、本発明の主題は、製薬学的組成物の調製のためのＰＰＡＲ−γ型のレセプターの少なくとも一つのアクチベーターの使用であり、該組成物は、表皮細胞の分化の異常に関する皮膚疾患を治療することを企図する。
【００１１】
【発明の実施の形態】
製薬学的組成物は、好ましくは皮膚科学的組成物である。
【００１２】
本発明に従って、「ＰＰＡＲ−γ型のレセプターのアクチベーター」は、Kliewer等, Nature 358, 771-774, 1992に記載されたトランス活性化試験において、１μＭ以下のＰＰＡＲ−γに関するＡＣ５０を有するいずれかの化合物を意味するように企図される。
【００１３】
好ましくは、ＰＰＡＲ−γ型のレセプターのアクチベーターは、２００ｎＭ以下、有利には５０ｎＭ以下のＰＰＡＲ−γに関するＡＣ５０を有する。
【００１４】
好ましくは、ＰＰＡＲ−γ型のレセプターのアクチベーターは特異的である、即ち、１０-1以下である、ＰＰＡＲαに関するＡＣ５０に対するＰＰＡＲ−γに関するＡＣ５０の比Ｒ１を有する。好ましくは、Ｒ１は０．０５以下であり、より有利には０．０２以下である。
【００１５】
ＡＣ５０は、ＰＰＡＲレセプターの一つ、とりわけＰＰＡＲ−αまたはＰＰＡＲ−γ型を介した「アクチベーター」化合物による活性化のレポーターである酵素活性（ルシフェラーゼ）の５０％を与えるのに必要な「アクチベーター」化合物の濃度である。
【００１６】
本発明においてとり分け使用される化合物は、以下のものである：
5-{4-[2-(メチルピリド-2-イルアミノ)エトキシ]ベンジル}チアゾリジン-2,4-ジオン；
3-{4-[2-(ベンゾオキサゾール-2-イルメチルアミノ)エトキシ]フェニル}-2-エトキシプロピオン酸；
(+)-3-{4-[2-(ベンズオキサゾール-2-イルメチルアミノ)エトキシ]フェニル}-2-エトキシプロピオン酸；
(-)-3-{4-[2-(ベンズオキサゾール-2-イルメチルアミノ)エトキシ]フェニル}-2-エトキシプロピオン酸；
15-デオキシ-Δ12,14-プロスタグランジンＪ２（１５−ｄ ＰＧＪ２）。
【００１７】
5-{4-[2-メチルリピド-2-イルアミノ)エトキシ]ベンジル}チアゾリジン-2,4-ジオン、及び１５−ｄ ＰＧＪ２のような本発明において使用される化合物のいくつかは、ケラチノサイトの増殖に対する弱い阻害活性を有する、または全くその阻害活性を有さないので、本発明において使用される化合物が、この型の皮膚疾患を治療することは、全くより驚くべきことである。
【００１８】
好ましくは、使用されるＰＰＡＲ−γ型のレセプターのアクチベーターは、１００ｎＭ以下の濃度で使用される場合、２０％以下のケラチノサイト増殖の阻害のパーセントを有する（以下の実施例参照）。
【００１９】
本発明に従った製薬学的組成物は、生理学的に許容可能な媒体を含む。
【００２０】
本発明の他の特徴、態様、主題及び利点は、以下に続く記載、並びにそれを説明することを企図した非制限的である各種の具体的な実施例を読むことで、より明らかとなるであろう。
【００２１】
表皮細胞、とりわけケラチノサイトの分化の異常に関連した疾患としては、とりわけ乾癬、湿疹、扁平苔癬、狼瘡と関連する皮膚病変、アトピー性、脂漏性または日光皮膚炎のような皮膚炎、脂漏性角化症、老年性、化学線性、光誘発性または小胞性角化症のような角化症、一般的な挫瘡、ケロイド、母斑、いぼ、魚鱗癬及び皮膚ガンが挙げられる。
【００２２】
表皮細胞の分化の異常に関連した疾患としては、アトピー性皮膚炎、湿疹及び乾癬のような障壁機能の異常が好ましくは挙げられる。
【００２３】
本発明に従った組成物の投与は、腸内の、全身的なまたは局所的な経路を経て実施できる。好ましくは、製薬学的組成物は、局所的な経路を経た適用に適した形態で実装される。
【００２４】
腸内経路を経て、該組成物、とりわけ製薬学的組成物は、錠剤、ゼラチンカプセル、糖衣錠、シロップ、懸濁液、溶液、パウダー、顆粒、エマルション、ミクロスフェア若しくはナノスフェア、または制御された放出が可能である脂質性若しくはポリマー状ベシクルの形態で存在し得る。全身経路を経て、該組成物は、点滴または注射のための溶液または懸濁液の形態で存在し得る。
【００２５】
本発明に従って使用される化合物は一般的に、約０．００１ｍｇ／体重のｋｇから１００ｍｇ／体重のｋｇの一日の投与量で、１から３回の投与の取り込みで投与される。
【００２６】
局所的経路を経て、本発明に従った製薬学的組成物は、とりわけ皮膚及び粘膜の治療のために企図され、ペースト状軟膏、クリーム、乳液、クリーム状軟膏、パウダー、しみ込ませたパッド、溶液、ゲル、スプレー、ローションまたは懸濁液の形態で存在し得る。それはまた、制御された放出を可能にするミクロスフェア、若しくはノナスフェア、または脂質性若しくはポリマー状ベシクルまたはポリマー状パッチ及びヒドロゲルの形態で存在し得る。この局所的経路組成物は、無水形態または水性形態の何れでも存在し得る。
【００２７】
該組成物は、該組成物の全重量に対して、一般的に０．００１から１０重量％の間、好ましくは０．０１から１重量％の間の濃度で局所的経路を経て使用される。
【００２８】
上述の組成物は、もちろん不活性な若しくは薬力学的に活性な添加剤、またはこれらの添加剤の組み合わせをも含むことができ、上記添加剤は特に、湿潤剤；ヒドロキノン、アゼライン酸、コーヒー酸またはコウジ酸のような脱色素剤；皮膚軟化剤；グリセリン、ＰＥＧ−４００、チアモルホリノン及びそれらの誘導体、または代わりに尿素のような水和剤；S-カルボキシメチルシステイン及びS-ベンジルシスタミン及びそれらの塩若しくは誘導体、または過酸化ベンゾイルのような抗脂漏剤または抗挫瘡剤；ケトコナゾールまたはポリ-4,5-メチレン-3-イソチアゾリドンのような抗真菌剤；抗細菌剤、カロテノイド及び特にβ−カロチン；アントラリン及びその誘導体のような抗乾癬剤；エイコサ-5,8,11,14-テトライン酸及びエイコサ-5,8,11-トリイン酸、それらのエステル及びアミド、並びに最後にレチノイドである。
【００２９】
これらの組成物はまた、芳香剤、パラ-ヒドロキシ安息香酸エステルのような防腐剤、安定剤、保湿剤、ｐＨ調節剤、浸透圧調節剤、乳化剤、ＵＶ−Ａ及びＵＶ−Ｂスクリーン剤、並びにα-トコフェロール、ブチルヒドロキシアニゾールまたはブチルヒドロキシトルエンのような抗酸化剤を含むことができる。
【００３０】
もちろん、当業者は、本発明に固有に備わった有利な特性が、考慮される添加剤によって改変されない、または実質的に改変されないように、これらの組成物に加えられる最適な化合物を選択するのに注意を払うであろう。
【００３１】
本発明を説明することを企図し、制限するものではないいくつかの実施例が与えられるであろう。
【００３２】
【実施例】
実施例１
上述のＰＰＡＲγ活性化産物のＡＣ５０及びＲ１
ＡＣ５０を測定するために使用した方法は、Kliewer等, Nature 358, 771-774, 1992に記載されたものである。かくして、ＨｅＬａ細胞を、これらのレセプターをコードする発現ベクター、及びＳＶ４０ウイルスプロモーターとルシフェラーゼ遺伝子の断片の上流にクローン化されたＰＰＲＥ応答エレメントを含むレポータープラスミドを使用して共存トランスフェクションするトランス活性化試験によって、ＰＰＡＲγまたはＰＰＡＲαを経た分子の活性化力を評価できる。共存トランスフェクションされた細胞を、試験分子で２４時間処理し、ルシフェラーゼ活性をルミネッセンスによって測定する。
【００３３】
表１は、その結果を集積する。各分子について、結果はＡＣ５０値によってｎＭで表され、それは最大の活性の５０％を与える試験分子の濃度を表す。
【表１】
0003773790.tif 000002
化合物Ａ：5-{4-[2-(メチルピリド-2-イルアミノ)エトキシ]ベンジル}チアゾリジン-2,4-ジオン；
化合物Ｂ：3-{4-[2-(ベンゾオキサゾール-2-イルメチルアミノ)エトキシ]フェニル}-2-エトキシプロピオン酸；
化合物Ｃ：(+)-3-{4-[2-(ベンズオキサゾール-2-イルメチルアミノ)エトキシ]フェニル}-2-エトキシプロピオン酸；
化合物Ｄ：(-)-3-{4-[2-(ベンズオキサゾール-2-イルメチルアミノ)エトキシ]フェニル}-2-エトキシプロピオン酸；
化合物Ｅ：15-デオキシ-Δ12,14-プロスタグランジンＪ２（１５−ｄ ＰＧＪ２）。
【００３４】
実施例２
ケラチノサイト増殖の測定
使用されるケラチノサイトは、整形外科手術で生じた皮膚標本から得た。それらは第二節で使用される。
【００３５】
１０％胎児ウシ血清（ＦＣＳ）、０．４μｇ／ｍｌのヒドロコルチゾン、１０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ、及び１０-9Ｍのコレラ毒素を含むＭＥＭ培地において、ミトシン(mitocyne)で処理された３Ｔ３フィブロブラストの存在下で、Rheinwald及びGreenの方法に従って湿潤環境（５％ＣＯ2）中で３７℃で、ケラチノサイトを培養する。ケラチノサイトを蒔く２４時間前に、１０ｃｍ2クラスターウェル中にｃｍ2当たり１５，０００細胞の割合で３Ｔ３細胞を蒔く。次いでケラチノサイトを、ｃｍ2当たり４０００細胞の割合で蒔く。
【００３６】
該細胞を、ＤＭＳＯで希釈した産物で、蒔いたケラチノサイト当たり４時間処理する。培養培地中のＤＭＳＯの最終濃度は、０．２％（ｖ／ｖ）を越えない。培養の３日後、１／１００に希釈した5-ブロモ-2'-デオキシウリジン（ＢｒｄＵ、Boehringer ref 1 674629から得た細胞増殖キット）の溶液を、培養培地に加える。
【００３７】
ＤＮＡの変性後、抗ＢｒｄＵ−ＰＯＤ（ペルオキシダーゼ）抗体を、製造者の説明書に従って加える。インキュベーションの１時間後、基質溶液を加え、光学密度の読み取りをＥＬＩＳＡリーダーにおいて３７０ｎＭで実施する。
【００３８】
かくして、実施例１で記載された化合物Ａ及びＥは、１００ｎＭ以下の濃度で使用された場合、２０％以下のケラチノサイト増殖の阻害の％を示す。
【００３９】
実施例３
材料及び方法
細胞培養条件
正常なヒトケラチノサイト（ＮＨＫ）を、整形外科手術の後に得られたヒト皮膚から単離し、Rheinwald及びGreenの方法によって培養した(Rheinwald J.G.及びGreen, H. Serial cultivation of strains of human epidermal keratinocytes : the formation of keratinizing colonies from single cells. Cell, 1975, 6, 331-343)。該細胞を、０．５ｍＭのＣａＣｌ2を含む完全培地（ＭＣＤＢ１５３）で培養した。ＭＣＤＢ１５３完全培地は、０．４％（ｖ／ｖ）ウシ脳下垂体抽出物、５μｇ／ｍｌのインスリン、及び１０ｎｇ／ｍｌの上皮増殖因子（ＥＧＦ）を加えた基底培地（ＫＢＭ、Clonetics, San Diego, CA)より成る。細胞が約６０％の集合体に到達したときに（０日目）、培地を０．１５ｍＭ ＣａＣｌ2（低カルシウム培地）または１．１５ｍＭ ＣａＣｌ2（高カルシウム培地）のそれぞれを含むＭＣＤＢ１５３完全培地に交換する。該培地は二日おきに交換する。
【００４０】
１型コラーゲンの皮膚等量物上で再構成した表皮
整形外科手術の後に得られたヒト乳の皮膚から単離された成人内部小胞(interfollicular)表皮細胞を増幅し(Rheinwald J.G. 及びGreen, H. Serial cultivation of strains of human epidermal keratinocytes : the formation of keratinizing colonies from single cells. Cell, 1975, 6, 331-343)、 液体窒素中で貯蔵した。細胞を解凍し、１型コラーゲンの皮膚等量物上に蒔いた(Asselineau, D., Bernard, B.D.及びDarmon, M. Three-dimensional culture of human keratinocytes on a dermal equivalent. A model to study epidermal morphogenesis and differentiation in vitro. In: Maibach, H., Lowe, N. (編） Models in Dermatology. Karger, Basle, 1987, 1987, 1-7)。培養物は、まず最初に、一層の集合体を得るために一週間培養培地中で漬けられ（０日目）、次いで層状化し角質化した表皮を生産するために、気体−液体界面に配置された。培養培地は、１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清、ＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）、ヒドロコルチゾン（０．４μｇ／ｍｌ）及びコレラ毒素（１０-9Ｍ）を加えた最小必須培地（ＭＥＭ）より成った。培地を一週間に三回交換した。
【００４１】
再構成された皮膚の形態を、ヘマラン−フロキシン−サフロン(hemalum-phloxin-saffron)で垂直方向のパラフィン切片を染色することによって評価した。
【００４２】
生体組織片
生体組織片を、患者の同意の後に、関与した及び関与していない乾癬皮膚から得た。生体組織片を、ＲＮＡ抽出溶液（４Ｍ グアニジンチオシアン酸）に迅速に浸した。次いでそれを液体窒素で凍結し、使用まで−８０℃で維持した。
【００４３】
ＲＮＡの単離
培養物中のケラチノサイト、または再構成された皮膚から生じた全てのＲＮＡを、製造者の方法に従ってTrizol(Gibco BRL)法を使用して単離し、使用まで−８０℃で保存した。皮膚生体組織片から生じた全てのＲＮＡを、Chomczynski及びSaachiによって記載されたように調製した(Chromczynski, P.及びSaachi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal. Biochem., 1987, 162, 156-159)。
【００４４】
ＲＴ−ＰＣＲ及び半定量的ＰＣＲ
ＰＣＲオリゴヌクレオチドをGibco BRL(France)によって合成し、それらは以下に記載の配列を有する：
ＧＡＰＤＨセンスオリゴヌクレオチド(5'-AATCCCATCACCATCTTCCA-3')及びアンチセンスオリゴヌクレオチド(5'-GTCATCATATTTGGCAGGTT-3')；ＰＰＡＲαに対するセンスオリゴヌクレオチド(5'-TCATCAAGAAGACGGAGTCG-3')及びアンチセンスオリゴヌクレオチド(5'-CGGTTACCTACAGCTCAGAC-3')；ＰＰＡＲγに対するセンスオリゴヌクレオチド(5'-ATGACAGCGAACTTGGCAATA-3')及びアンチセンスオリゴヌクレオチド(5'-CGAACTGGAAGAAGGGAAAT-3')；ケラチン１に対するセンスオリゴヌクレオチド(5'-AGTTCCAGCGTGAGGTTTGT-3')及びアンチセンスオリゴヌクレオチド(5'-GGGACTGAGATTGCCACTGA-3')；ロリクリン(loricrin)に対するセンスオリゴヌクレオチド(5'-ACCACGGAGGCCGAAGGAGTT-3')及びアンチセンスオリゴヌクレオチド(5'-CTGGGGTTGGGAGGAGGTAGTTG-3')；トランスグルタミナーゼタイプＩ（ＴＧＩ）に対するセンスオリゴヌクレオチド(5'-GCGGCAGGAGTATGTTCTTA-3')及びアンチセンスオリゴヌクレオチド(5'-AGGGATGTGTCTGTGTCGTG-3')。増幅された生成物は、ＧＡＰＤＨについて５５８ｂｐ、ＰＰＡＲα、δ及びγについてそれぞれ２１１，２８７及び３４１ｂｐ；ケラチン１について２５０ｂｐ；ロリクリンについて１８９ｂｐ；及びＴＧＩについて４４４ｂｐに等しい。
【００４５】
培養細胞、再構成された皮膚、または皮膚生体組織片から抽出された５μｇのＲＮＡを使用して、ＲＴ−ＰＣＲを実施した。７０℃で１０分間のピロカルボン酸ジエチル処理された水における変性の後、４２℃で５０分、２０μｌの全緩衝液容量に対して(２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．４，５０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍ＝ｍＭ ＭｇＣｌ2，１ｍＭ ｄＮＴＰ、１０ｍＭ ＤＴＴ及び２０ユニットのＲＮアーゼインヒビター）、「SuperScript II ＲＮアーゼＨ−逆転写キット」（１０ユニット／反応, Gibco BRL)及びプライマーとして０．５μｇのオリゴ（ｄＴ）を使用して、ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した。該混合物を７０℃で１５分不活性化し、３７℃で２０分ＲＮアーゼＨで処理した。各場合において、逆転写酵素を含まないサンプル（陰性対照）を含んだ。９４℃で１分間の変性後、以下の条件の下で、ＰＣＲ増幅をＰＴＣ２２５機(MJ Research)を使用して実施した；９４℃で３０秒の変性、５５℃で３０秒のアニーリング、及び７２℃で３０秒の伸長、全部で３０サイクル。
【００４６】
反応混合物は、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．４、５０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．１μＭ オリゴヌクレオチドプライマー、１００μＭ ｄＮＴＰ、０．５ユニットのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼＰ及び１／１００に希釈された５μｌのｃＤＮＡ混合物を含む。最終生成物を、７２℃で３分加熱した。各場合において、ＲＴに対する陽性対照（ＰＰＡＲをコードするｃＤＮＡを含む）及びＰＣＲ陰性対照（ＤＮＡを含まない）を含んだ。ＰＣＲ生成物を、１μｇ／ｍｌの臭化エチジウムを含む２％アガロースゲル上での電気泳動によって分離し、写真を撮り、それらの同一性をサザンブロットによって確認した。
【００４７】
ｄＮＴＰの濃度が、１００μＭのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、１０μＭのｄＣＴＰ、０．５μＣｉの[３２Ｐ]ｄＣＴＰである点を除いて、上記記載のように半定量的ＰＣＲを実施した。次いでＰＣＲ生成物を、６％（重量／ｖ）のアクリルアミドゲルを使用して分離した。各バンドの放射性活性を、ホスホルイメージング法によって定量した。スクリーンを、FUJI BAS 2000を使用してスキャンし、シグナルを、イメージ分析プログラム(Tina)を使用してＰＳＴ（光刺激ルミネッセンス）単位において定量した。その結果を、ＧＡＰＤＨのそれとバンドの強度を比較して各サンプルについて分析した。ＰＣＲサイクルの最適な数は、直線状増幅領域において決定された。ｃＤＮＡ混合物の１０倍の連続的な希釈物を、放射性活性シグナルの強度と、ＤＮＡの初期量の間の直線的相関関係を制御するために作製した。
【００４８】
結果
培養物におけるＮＨＫから生じた全ＲＮＡのノーザンブロット分析を使用する第一の実験は、ＰＰＡＲδが未分化および分化したケラチノサイトにおいてほぼ等量で存在する一方で、ＰＰＡＲα及びγは検出されないことを示した。
【００４９】
ＰＰＡＲの発現を分析するために、ＰＰＡＲサブタイプに特異的であるオリゴヌクレオチドを使用してＲＴ−ＰＣＲを実施した。ＰＰＡＲα、δ及びγに相当するそれぞれ２１１ｂｐ、２８７ｂｐ及び３４１ｂｐのＰＣＲ生産物が、電気泳動の後得られた。ＰＣＲ生産物の特異性は、ＰＰＡＲをコードするｃＤＮＡを含むプラスミドを使用して変化した。さらに、ＰＣＲ生産物を同定するためにサザンブロット分析を実施した。３種のＰＰＡＲサブタイプは、低カルシウム培地において６０％の集合体で得られた未分化ＮＨＫにおいても、高カルシウム培地において４日間の培養の後得られた分化したＮＨＫにおいても検出された。
【００５０】
次に、低カルシウム培地または高カルシウム培地において培養されたＮＨＫにおけるＰＰＡＲサブタイプの発現のレベルを比較するために、半定量的ＰＣＲ分析を実施した。ＰＰＡＲα遺伝子の発現は、低カルシウム培地（１．７倍）及び高カルシウム培地（２．６倍）において、０日目から４日目でゆっくりと増大する。４日後、ＰＰＡＲδ遺伝子の発現は、低カルシウム及び高カルシウム培地の両者において増大した（それぞれ４．５及び５．８倍）。ＰＰＡＲγ遺伝子の発現のレベルは、低カルシウム培地において４日間で変化しないままである一方で、該細胞を高カルシウム培地で培養した後、３日目及び４日目の間で驚くべきことに増大する（４．５倍）。
【００５１】
ケラチノサイト分化は、浸した培養条件の下で不完全であるために、我々は、ＰＰＡＲの発現を研究するために、表皮のより完全な層状化及び角質化を示す再構成した皮膚をin vitroで使用した。出現の２日後、わずかに２または３層のケラチノサイトが存在する；２日後、ケラチノサイトは薄い複数の層の上皮を構成し、一方で７日後、表皮は正常なヒトの表皮のように見える上皮より成る。免疫学的蛍光による研究により、インボルクリン、フィラグリン及びＴＧＩ（トランスグルタミナーゼＩ）のような分化マーカーが、Asselineau, D., Bernard, B.D., 及びDarmon, M. Three-dimensional culture of human keratinocytes on a dermal equivalent. A model to study epidermal morphogenesis and differentiation in vitro. In: Maibach, H., Lowe, N. (編） Models in Dermatology. Karger, Basle, 1987, 1-7に記載されているように発現し位置することが示された。
【００５２】
上皮の再構成の間の３種のＰＰＡＲサブタイプの発現のレベルは、以下のようなものである：
ＰＰＡＲα ＲＮＡは、出現の７日後でわずかに増大する（２倍）。ＰＰＡＲδのレベルは、０日目から７日目で一定に維持される。これに対して、ＰＰＡＲγの発現は、０日目と７日目の間で７倍に増大する。
【００５３】
皮膚の再構成の間のＰＰＡＲサブタイプの発現の態様を、ケラチノサイト分化マーカーのそれと比較した。ケラチン１，ロリクリン、及びＴＧＩの最大の発現は、出現の７日後に観察された。
【００５４】
ヒト皮膚におけるＰＰＡＲサブタイプの発現を分析するために、全ＲＮＡを、非病変または病変乾癬表皮から調製し、ＲＴ−ＰＣＲ半定量的分析にかけた。ＰＰＡＲαの発現は、病変皮膚においてわずかにのみ減少する一方で、ＰＰＡＲγの発現は、顕著に減少する（約３．５倍）。しかしながら、ＰＰＡＲδの発現は、非病変表皮に対して病変表皮において増大する。
【００５５】
議論
３種のＰＰＡＲサブタイプは、両生類、齧歯類及びヒトにおいて記載されている。(Issemann, I. 及びGreen, S. Activation of a member of the steroid hormone receptor superfamily by peroxisome proliferators. 1990, Nature, 347, 647-650 - Sher, T., Yi, H.-F., McBride, O.W.及びGonsalez, F.J. cDNA cloning, chromosomal mapping, and functional characterization of the human peroxisome proliferator activated receptor. Biochemistry, 1993, 32, 5598-5604 - Zhu, Y., Alvares, K., Huang, Q., Rao, H.S. 及びReddy, J.K. Cloning of a new member of the peroxisome proliferator-activated receptor gene family from mouse liver. J. Biol. Chem., 1993, 268, 26817-26820 - Greene, M.E., Blumberg, B. McBride, O.W., Yi, H.F., Kronquist, K., Kwan, K., Hsieh, L., Greene, G. 及びNimer, S.D. Isolation of the human peroxisome proliferator activated receptor gamma cDNA : expression in hematopoietic cells and chromosomal mapping. Gene Expression, 1995, 4, 281-299 - Elbrecht, A., Chen, Y., Cullinan, C.A., Hayes, N., Leibowitz, M.D., Moller, D.E., 及びBerger, J. Molecular cloning, expression and characterization of human 1 and γ2. Biochem. Biophys. Res. Comm., 1996, 224, 431-437 - Lambe, K.G.及びTugwood, J.D. A human peroxisome-proliferator-activated receptor-γ is activated by inducers of adipogenesis, including thiasolidinedione drugs, Eur. J. Biochem., 1996, 239, 1-7 - Schmidt, A., Endo, N., Rutledge, S.J., Vogel, R., Shinar, D.及びRodan, G.A. Identification of a new member of a steroid hormone receptor superfamily that is activated by a peroxisome proliferator and fatty acids. Mol. Endocrinol., 1992, 6, 1634-1641 - Kliewer, S.A., Forman, B.M., Blumberg, B., Ong, E.S., Borgmeyer, U., Mangelsdorf, D.J., Umesoto, K.及びEvans, R.M. Differential expression and activation of a family of murine peroxisome proliferator-activated receptor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994, 91, 7355-7359 - Amri, E.-Z, Bonino F., Ailhaud, G., Abumrad, N.A.及びGrimaldi, P.A. Cloning of a protein that mediated transcriptional effects of fatty acids in preadipocytes. J. Biol. Chem., 1995, 270, 2367-2671 - Dreyer, C., Krey, G., Keller, H., Givel, F., Helftenbein, G., 及びWahli, W. Control of the peroxisomal beta-oxidation pathway by a novel family of nuclear hormone receptors. Cell, 1992, 68, 879-887)。ＰＰＡＲαは、肝臓、心臓、腎臓、及び腸のような脂肪酸酸化及びペルオキシソーム代謝の高いレベルを示す組織で強力に発現される。ＰＰＡＲδは、豊富に且つ遍在的な態様で発現される一方、ＰＰＡＲγの発現は、白色脂肪組織のような活発な脂質生成を有する組織で著しいが、免疫系の細胞においても見出される(Issemann, I.及びGreen, S. Activation of a member of the steroid hormone receptor superfamily by peroxisome proliferators. 1990, Nature, 347, 647-650 - Kliewer, S.A., Forman, B.M., Blumberg, B., Ong, E.S., Borgmeyer, U., Mangelsdorf, D.J., Umesoto, K.及びEvans, R.M. Differential expression and activation of a family of murine peroxisome proliferator-activated receptor. Proc. Natl. Sci. USA. 1994, 91, 7355-7359 - Lehmann, J.M., Moore, L.B., Smih-Oliver, T.A., Wilkinson, W.O., Wilson, T.M.及びKliewer, S.A. An antidiabetic thiasolidinedione is a high affinity ligand for peroxisome proliferator activated receptors γ (PPARγ) J. Biol. Chem., 1995, 270, 12953-13956 - Braissant, O., Foufelle, F., Scotto, C., Dauca, M.及びWahli, W. Differential expression of proxisome proliferator-activated receptor (PPARs) : tissue distribution of PPAR-α, -β and -γ in the adult rat, Endocrinology, 1996, 137, 354-366 - Tontonoz, P., Hu, E., Graves, R.A., Budavari, A.I. 及びSpiegelman, B.M. mPPARγ2n tissue-specific regulator of an adipocyte enhancer. Genes Dev., 1994, 8, 1224-1234)。３種のＰＰＡＲサブタイプの組織特異的配置は、それらの異なる生理学的機能を説明するであろう。ＰＰＡＲα及びＰＰＡＲγは、脂質ホメオスタシスの二つの部門、即ちそれぞれ脂肪酸代謝及び脂質生成を調節するようである。一方でＰＰＡＲδの遍在的な発現は、一般的であるが未だ未知の生物学的機能を示唆する。
【００５６】
表皮のケラチノサイトの分化の工程は、表皮の障壁機能の形成に関与する特異的な脂質の蓄積を伴う。しかしながら、表皮におけるＰＰＡＲサブタイプの発現のレベルまたは役割については、ほとんど未知である。最近の研究により、マウスの表皮の基底上の細胞におけるＰＡＲαのドミナントネガティブ突然変異体の構成的な発現が、皮膚の減少した障壁機能を引き起こすことが示されている(Imakado, S., Bickenbach, J.R., Bundman, D.S., Rothnagel, J.A., Attar, P.S., Wany, X.-J., Walczak, V.R., Wisniewski, S., Pote,J., Gordon, J.S., Heyman, R.A., Evans, R.M.,及びRoop, D.R., Targeting expression of a dominant-negative retinoic acid receptor mutant in the epidermis of trangenic mice results in loss of barrier fuction. Genes Dev., 1995, 9, 317-329)。突然変異ＰＡＲαは、ＲＸＲを引き離すことが可能であり、それはＰＰＡＲ−ＲＸＲヘテロダイマーの形成に必要である(Keller, H., Dreyer, C., Medin, J., Mahfoudi, A., Ozato, K.及びWahli, W. Fatty acids and retinoids control lipid metabolism through activation of peroxisome proliferator-activated receptor - retinoid X receptor heterodimers. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993; 90; 2160-2164 - Issemann, I., Prince, R.A. Tugwood, J.D.及びGreen, S. The retinoid X receptor enhances the function of the peroxisome proliferator activated receptor. Biochimie, 1993, 75, 251-256)。これは、ＰＰＡＲαの不活性化が、トランスジェニックマウスにおける表皮の障壁機能の損失に部分的に関与していることを示す。
【００５７】
かくして我々は、３種のＰＰＡＲサブタイプが、ヒトケラチノサイトにおいて発現されることをここで示す。ＰＰＡＲδは最も高いレベルの発現を示す一方で、ＰＰＡＲα及びＰＰＡＲγは低レベルで発現される。ラットの内部小胞ケラチノサイトで報告されているＰＰＡＲ遺伝子の発現の存在しないこと(Braissant, O., Foufelle, F., Scott, C., Dauca, M. 及びWahli, W. Differential expression of proxisome profirator-activated receptor (PPARs) : tissue distribution of PPAR-α, -β and -γ in the adult rat, Endocrinology, 1996, 137, 354-366)は、ハイブリダイゼーション法の不十分な感受性、及び／または研究された種における差異のためであろう。
【００５８】
我々の研究は、ＰＰＡＲγの発現、及びある程度のＰＰＡＲαの発現が、ケラチノサイトの分化に関与することを示す。高カルシウム培地において４日間培養されたＮＨＫにおけるＰＰＡＲγの発現は、著しく増大する。
【００５９】
この観察は、ＰＰＡＲγの発現が表皮の層状化及び角質化の間で増大する再構成された皮膚のモデルを使用して確認された。ＰＰＡＲの発現を、正常な表皮の基底上の区画において通常発現される各種のマーカー（ケラチン１，ＴＧＩ及びロリシン）における増大と比較した。これは、ＰＰＡＲ−γの発現が、ヒト表皮の基底上の層で生じ、ＮＨＫの分化と関連することを強力に示唆する。
【００６０】
ＰＰＡＲサブタイプの発現をまた、病変及び非病変乾癬表皮において測定した。ＰＰＡＲα及びＰＰＡＲγのレベルの減少が、過剰増殖病変表皮において観察され、２種のサブタイプの発現が、表皮の分化状態に依存することをもう一度示す。ＰＰＡＲδの発現は、病変表皮において増大し、このことは、このサブタイプの発現が、ケラチノサイト増殖と関連するであろうという示唆を導く。
【００６１】
結論として、しみ込ませたまたは空気にさらした培養物を使用して、ＰＰＡＲα及び−γ遺伝子の発現が、ケラチノサイト分化の間で増大する一方で、ＰＰＡＲδの発現は、改変されないことを、我々は示した。過剰増殖乾癬表皮において、ＰＰＡＲ−γの発現は減少し、それはこのタイプが、ケラチノサイト分化に関与することを示す。