(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
リポソームの製造方法であって、
ａ）臨界、超臨界またはほぼ臨界の流体中のリン脂質および水性相の溶液または混合物を形成すること；
ｂ）溶液または混合物の圧力を減じて臨界、超臨界またはほぼ臨界の流体をリン脂質および水性相から分離し、該リン脂質および水性相が１つ以上のリポソームを形成すること
を含んで成る前記の方法。
【請求項２】
前記リポソームが治療薬を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記治療薬がペプチドである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記水性相が治療薬を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記リン脂質が治療薬を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
さらに、治療薬を前記リポソームに入れる工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記臨界、超臨界またはほぼ臨界の流体が、二酸化炭素、亜酸化窒素、プロパン、エチレンおよびエタンを含んで成る臨界流体を形成しうる組成物の群から選ばれる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記混合物または溶液がノズルを出るとき、混合物または溶液が減圧される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ノズルが直径約０．５-０．６ミクロンの１つ以上の開口を有する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記臨界、超臨界またはほぼ臨界の流体が共留剤を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記共留剤がメタノール、エタノールおよびアセトンよりなる組成物の群から選ばれる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
リポソームの製造方法であって、
ａ）リン脂質と臨界、超臨界またはほぼ臨界の流体との溶液または混合物を形成すること；
ｂ）前記溶液または混合物を水性相に注入して１つ以上のリポソームを形成すること
を含んで成る、前記の方法。
【請求項１３】
前記溶液または混合物が注入されるとき、溶液または混合物を減圧する工程をさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記リポソームが治療薬を有する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記治療薬がペプチドである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記水性相が治療薬を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記リン脂質が治療薬を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
治療薬を、形成されたリポソームに入れる工程をさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１９】
前記溶液または混合物がノズルを通して前記水性相に注入される、請求項１２に記載の方法。
【請求項２０】
前記ノズルが直径約０．５-０．６ミクロンの少なくとも１つの開口を有する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記臨界、超臨界またはほぼ臨界の流体が、二酸化炭素、亜酸化窒素、ハロ−炭化水素、プロパン、エチレンおよびエタンよりなる臨界流体を形成しうる組成物の群から選ばれる、請求項１２に記載の方法。
【請求項２２】
前記臨界、超臨界またはほぼ臨界の流体がさらに共留剤を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項２３】
前記共留剤がメタノール、エタノールおよびアセトンよりなる組成物から選ばれる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】
リポソームの製造方法であって、
ａ）多重ラメラ小胞と臨界、超臨界またはほぼ臨界の流体との混合物を形成すること；
ｂ）混合物の圧を減じて前記の臨界、超臨界またはほぼ臨界の流体を取り出し、前記多重ラメラ小胞が１つ以上のリポソームを形成すること
を含んで成る、前記の方法。
【請求項２５】
リン脂質を水性相中で水和することによって前記多重ラメラ小胞を形成する工程をさらに含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記多重ラメラ小胞が治療薬を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記治療薬がペプチドである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
さらに、治療薬を前記リポソームに入れる工程を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】
減圧速度を制御して予め決定されたサイズのリポソームを形成する工程を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項３０】
ａ）リン脂質、水性相および多重ラメラ小胞、並びに臨界、超臨界またはほぼ臨界の流体；の内の１種以上のものの溶液または混合物を形成するための第１容器：
ｂ）前記溶液または混合物を収容し、そしてこの溶液または混合物の圧を減じて臨界、超臨界またはほぼ臨界の流体をリン脂質、水性相および多重ラメラ小胞から分離するための、前記第１容器と流体が通じている減圧手段
を含んで成り、前記リン脂質、水性相および多重ラメラ小胞が１つ以上のリポソームを形成する、リポソーム製造装置。
【請求項３１】
減圧中または後に、前記リン脂質、水性相または多重ラメラ小胞を収容するための第２容器をさらに含む、請求項３０に記載の装置。
【請求項３２】
前記減圧手段がノズルを含む、請求項３０に記載の装置。
【請求項３３】
前記装置が、前記第１容器と通じているリン脂質と臨界、超臨界またはほぼ臨界の流体との混合回路を含み、この混合回路はリン脂質と臨界、超臨界またはほぼ臨界の流体とを受け入れ、このリン脂質と臨界、超臨界またはほぼ臨界の流体とを混合し、そしてこの混合物を前記第１容器に送る、請求項３０に記載の装置。
【請求項３４】
前記混合回路が静的ミキサー、リン脂質容器およびポンプ手段を含み、前記ポンプ手段は、静的ミキサーおよびリン脂質容器と通じており、前記ポンプ手段は臨界、超臨界またはほぼ臨界の流体を収容し、そして臨界、超臨界またはほぼ臨界の流体を前記リン脂質容器へ送り、前記リン脂質容器はポンプ手段および静的ミキサーと通じており、前記リン脂質容器はリン脂質を含んでおり、臨界、超臨界またはほぼ臨界の流体を収容し、そしてリン脂質および臨界、超臨界またはほぼ臨界の流体を前記静的ミキサーに送り、前記静的ミキサーは前記リン脂質容器および前記第１容器と通じており、臨界、超臨界またはほぼ臨界の流体およびリン脂質を収容して混合物を形成し、この混合物は前記第１容器に送られる、請求項３３に記載の装置。
【請求項３５】
前記減圧手段が背圧調節器を含む、請求項３１に記載の装置。
【請求項３６】
さらに、トラップアセンブリーを含み、このトラップアセンブリーはリポソームを収容するための前記第２容器と通じている、請求項３１に記載の装置。
【請求項３７】
前記トラップアセンブリーが、リポソームを収容するための前記第２容器と通じている少なくとも１つのトラップ容器を含む、請求項３５に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は一般にリポソームを製造するための方法および装置に関する。これらの方法および装置では臨界、超臨界またはほぼ臨界の流体を特徴とする。
発明の背景
リポソームは、それらの水性コア内に親水性化合物を取り込むことができる単一または多重リン脂質二重層よりなる顕微鏡的小胞である。数十オングストロームの小さなサイズから数ミクロンもの大きなサイズのリポソームが形成されてきた。たいていのリポソームは哺乳類の膜の分子特性を有するので、それらは非毒性、非抗原性および生分解性である。
リポソームは薬剤のキャリヤーとして使用される。リポソームは、薬剤の有効性を高め；薬剤の毒性を減じ；そして薬剤の治療効果を持続することができる様々な特徴を有するものをつくることができる。
多重二重層のリポソームは多重ラメラ小胞（multilamellar vesicles：ＭＬＶｓ）として知られている。層の間に取り込まれた液はそれぞれの膜が壊れたときにのみ放出されるので、ＭＬＶｓは時間限定放出薬剤用に非常に有望である。単一二重層のリポソームは単ラメラ（unilamellar）小胞（ＵＶ）として知られている。ＵＶは極めて小さく（ＳＵＶｓ）または大きく（ＬＵＶｓ）つくってもよい。
リポソームは音波処理、洗浄剤透析、エタノール注射、フレンチプレス押し出し、エーテル注入および逆相蒸発によって実験室で製造される。これらの方法は最終リポソームと共に洗浄剤または有機物質のような残留物をしばしば残す。製造の観点からは、有機溶媒はその後除去しなければならないので、有機溶媒を使用しない方法を用いるのが好ましいことは明らかである。
方法によっては、リン脂質原料および封入薬剤の変性を生じる苛酷なまたは激しい条件が強いられる。これらの方法をリポソームの大量生産に用いるのは容易ではない。
有機溶媒を使用しないでＭＬＶ、ＬＵＶおよびＳＵＶを製造するいくつかの方法がある。有機溶媒なしのＭＬＶは通常、水の存在下で脂質を撹拌することによって製造される。次に、水溶性薬剤の捕捉効率を高めるためにＭＬＶの凍結−融解を数サイクル行う。ＭＬＶはまたＬＵＶおよびＳＵＶ製造用の出発材料としても使用される。
ＬＵＶを有機溶媒なしで製造する１つの方法では、調整された細孔サイズのポリカーボネートフルターを通してＭＬＶを高圧で押し出すものである。ＳＵＶは音波処理、フレンチプレスまたは高圧均質化法によってＭＬＶから製造することができる。高圧均質化にはある種の制限がある。高圧均質化はＳＵＶの形成にのみ有効である。さらに、高圧均質化はかなりの高温を生じうる。極度に高い温度は装置の破損を伴う。高圧均質化は最終生成物が無菌であることを保証しない。高圧均質化はバルブで栓をしたり、溶液の再循環が不十分であるので、操作適性に乏しい。
リポソームを治療薬の放出および調整放出に用いる場合、生体使用に適したリポソームを比較的大量に供給する必要がある。Ｏｓｔｒｏ，Ｍ．Ｊ．およびＣｕｌｌｉｓ，Ｐ．Ｒ．の”Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ａｓ  Ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ”、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、４６；１５７６−１５８７（１９８９）。現在の実験室規模の方法は封入薬剤の量および質、脂質含有量および結合性、並びにリポソームのサイズ分布および取り込み容積の点で再現性に乏しい。薬剤およびリポソームの多寸法特性、並びに原材料のばらつきは再現性に影響する。
本発明のリポソーム生成物は安定ではない。室温または冷蔵温度で６カ月ないし２年の間、安定である最終配合物が望ましい。安定性要件はリポソーム脱水技術によってゆるめられてきた。脱水リポソームは薬剤なしで病院に配られ、使用直前に病院の薬剤師によって薬剤と混合することができる。しかしながら、薬剤師による薬剤含有リポソームの調合は治療コストを高め、そしてさらに調合ミスの可能性もある。
現在のリポソーム製品は殺菌が難しい。無菌状態は、成分（脂質、緩衝剤、薬剤および水）を個々にオートクレーブまたは濾過により殺菌し、次いで殺菌環境中で混合することによって一般に得られる。この殺菌プロセスは難しく、いくつかの処理段階の後、生成物を指示通りに殺菌しなければならないので、時間を要し、かつ経費がかかる。
リポソームの加熱はリポソームに取り返しのつかない損傷を加えるので、最終生成物の熱による殺菌は不可能である。０．２２ミクロンフィルターを通す濾過も、多重層リポソームの特性を変えてしまうかもしれない。製薬工業界では一般に用いられないガンマ線処理はリポソーム膜を壊してしまう。ピコセカンドのレーザー殺菌はまだ実験段階であり、商業的な薬剤殺菌には応用されていない。
リポソーム薬剤放出および調整放出ビヒクルに対して増大している市場の需要を満たすことができる大規模でコスト的にも有効なリポソームの製造方法が求められている。その方法および装置は取り込まれなかった薬剤、脂質および溶媒を再循環するものでなければならない。その方法および装置は均質なリポソーム生成物を生成するものでなければならない。連続操作が可能であるとその方法はさらに有利である。
発明の概要
本発明はリポソームを製造するための方法および装置を特徴とする。これらの方法および装置は、予め決められた大きさの殺菌されたかつ実質的に有機溶媒を含まない薬剤グレードリポソームの大規模製造に適している。
本発明は、臨界、超臨界またはほぼ臨界の流体を使用するリポソームのいくつかの異なる方法を特徴とする。
ここで使用する語”リン脂質”とは、分子のアルコール部分に必須部分としてホスフェート基が含まれる脂肪酸のエステルである組成物を意味する。リン脂質はグリセロールを含むグリセロホスファチドおよびスフィンゴシンを含むスフィンゴミエリンを包含する。
物理化学の分野では、”臨界流体”という用語は臨界温度および臨界圧における気体を意味する。”超臨界流体”という用語は臨界温度より上の温度および臨界圧より上の圧における気体を意味する。超臨界流体は本出願では”ＳＣＦ”と略記することがある。”ほぼ臨界”という用語は臨界に近いという意味で使用する。これに限定されないが、ほぼ臨界の流体の１つの例は、その臨界温度より下の温度および臨界圧以上の圧力の気体である。そのような気体は超臨界または臨界流体の気体に近い性質、特に溶媒和特性を有する。
臨界、越臨界およびほぼ臨界の流体を使用する工業的設定では、特に溶媒の特性を用いる場合、”臨界”という用語が超臨界、臨界およびほぼ臨界の流体を意味することは一般的である。本出願では”ＳＣｏＣｏＮＣ流体”という用語を用いて、超臨界、臨界またはほぼ臨界の流体を表す。リポソームおよびリポソーム配合物に関して”臨界”という語を使用することは、超臨界流体およびほぼ臨界の流体並びに臨界流体を用いて形成されたリポソームを意味する。流体は、超臨界、臨界またはほぼ臨界であっても、ときには実施例において便宜上、”臨界”とすることがある。
ＳＣｏＣｏＮＣ流体の溶媒和特性は補助溶媒および共留剤によって影響を受ける。補助溶媒および共留剤という用語は入れ換えて使用することができ、ＳＣｏＣｏＮＣに溶解し、そしてこれらを加えるＳＣｏＣｏＮＣにリン脂質および水性相に関して望ましい溶解性を付与する組成物を示す。非極性補助溶媒とは、約０．０−０．１デバイの双極子モーメントをほとんどまたは全く持たない組成物を指す。極性補助溶媒とは、約０．１−１．７デバイの双極子モーメントを有する組成物を指す。
ここで使用する”水性相”という用語は、全部がまたは一部が水よりなる組成物を意味する。
ＳＣｏＣｏＮＣ流体は二酸化炭素；亜酸化窒素；ハロ−炭化水素、例えばフレオン（登録商標）；アルカン、例えばプロパンおよびエタン；そしてアルケン、例えばエチレンよりなる臨界流体を形成することができる組成物の群から選ばれるのが好ましい。
本方法では、減圧速度が形成されるリポソームのサイズに影響を及ぼす。
１つの方法はリン脂質、水性相および臨界、超臨界またはほぼ臨界の流体の溶液または混合物を形成する段階を含む。溶液または混合物は減圧されると、臨界、超臨界またはほぼ臨界の流体をリン脂質および水性媒質から分離して、１つ以上のリポソームを形成する。
いくつかの態様では、水性相は治療薬を含む。ここで使用する”治療薬”という用語は個々の患者に望ましい反応をもたらすことができる化学物質または薬剤を意味する。本発明のこの態様は剪断に敏感でない治療薬に非常に適している。
好ましくは、水性相およびＳＣｏＣｏＮＣ流体中のリン脂質の溶液の混合物は第１容器のチャンバー内に保持する。その後、溶液または混合物は第２チャンバーまたは第２容器を通過するとき減圧される。第２チャンバーではＳＣｏＣｏＮＣ流体が形成されたリポソーム組成物から除去することができる。
好ましくは、ＳＣｏＣｏＮＣ流体は再循環される。リン脂質および水性相がＳＣｏＣｏＮＣ流体と共に運ばれる程度まで、そのような成分を再循環してもよい。便宜上、ＳＣｏＣｏＮＣ流体で形成されたリポソームは”臨界流体リポソーム”または”ＣＦＬ”と呼ぶ。
本発明の１つの態様はリポソーム形成装置を特徴とする。装置はリン脂質、水性相およびＳＣｏＣｏＮＣ流体を混合して混合物または溶液を形成する第１容器を含む。装置はさらに、第１容器と通じている第２容器を含む。装置はさらに溶液または混合物の圧力を減じることができる減圧手段を含む。減圧手段は第１容器と第２容器との間に挟さんでも、または第２容器と一体になっていてもよい。第２容器は、減圧時にリポソームを形成するリン脂質および水性相の溶液または混合物を収容する。
好ましくは、ＳＣｏＣｏＮＣ流体を減圧手段および／または第２容器から取り出し、再循環させる。
本発明の１つの態様は、リン脂質およびＳＣｏＣｏＮＣの溶液または混合物を形成する段階を含む。次に、溶液または混合物をチップまたはオリフィスに通して減圧して水性相に送り、１つ以上のリポソームを形成する。減圧の結果、ＳＣｏＣｏＮＣ流体はリン脂質および水性相から分離される。放たれたＳＣｏＣｏＮＣ流体は出口を与えるか、または再循環させてリン脂質の溶液または混合物を形成する。
本発明の別の態様は、リン脂質およびＳＣｏＣｏＮＣ流体の溶液または混合物を形成する段階を含むリポソームの製造方法を特徴とする。溶液または混合物を水性相に注入すると、リン脂質およびＳＣｏＣｏＮＣ流体が減圧されるときに１つ以上のリポソームが形成する。
好ましくは、水性相またはリン脂質はリポソームに封入する治療薬を含有する。本方法の態様はタンパク質およびペプチドのような剪断に敏感な治療薬に非常に適している。本方法の態様はタンパク質およびペプチドに極端な剪断力または温度を加えない。
本方法の態様は単ラメラリポソームの形成に非常に適している。リポソームの大きさは減圧速度によって決まる。
好ましい方法では二酸化炭素；亜酸化窒素；ハロ−炭化水素、例えばフレオン；アルカン、例えばプロパンおよびエタン；そしてアルケン、例えばエチレンよりなる臨界流体を形成することができる組成物の群から選ばれるＳＣｏＣｏＮＣ流体を使用する。
本方法の１つの態様はリポソームを形成するための装置を特徴とする。装置はリン脂質およびＳＣｏＣｏＮＣ流体の溶液または混合物を収容するための第１容器を含む。装置はさらに水性相を収容するための第２容器を含む。第１容器および第２容器は、リン脂質およびＳＣｏＣｏＮＣ流体混合物を水性相に注入するための注入手段によって通じている。水性相へ注入すると、リポソームが形成される。
好ましくは、水性相は、リポソーム内に封入する治療薬を含んでいる。
ＳＣｏＣｏＮＣ流体は注入および減圧時にリン脂質から水性相に放たれる。ＳＣｏＣｏＮＣ流体は第１容器に再循環させて、さらにリン脂質およびＳＣｏＣｏＮＣ流体の溶液または混合物を形成するのが好ましい。
本発明の別の態様では、リン脂質および治療薬の溶液および混合物をまずＳＣｏＣｏＮＣ流体中で製造し、減圧し、そして水性緩衝液または相に注入する。リン脂質および治療薬は個々にまたは共にＳＣｏＣｏＮＣ流体に混合することができることに注目すべきである。
この方法は、これらに限定されないがタキソール、カンプトテシン、シスプラチン、ドキソルビシン等の特定の抗ガン化合物のような疎水性薬剤のリポソーム封入に特に適している。
本発明の別の態様は、多重ラメラ小胞およびＳＣｏＣｏＮＣ流体の混合物を形成することを含むリポソームの製造方法を特徴とする。混合物を減圧するとＳＣｏＣｏＮＣ流体が除かれて１つ以上のリポソームが形成する。
好ましくは、多重ラメラ小胞は水性相中でリン脂質を水和することによって製造される。水性相またはリン脂質は治療薬を含んでいるのが好ましい。
リポソームの大きさを減圧速度によって調節すると、あらかじめ決められた大きさのリポソームを形成することができる。
本発明の１つの態様はリポソームを形成するための装置を特徴とする。装置は多重ラメラ小胞およびＳＣｏＣｏＮＣ流体の混合物を収容するための第１容器を含む。第１容器は第２容器と通じており、第２容器は混合物を減圧してＳＣｏＣｏＮＣ流体を取り出すことができる。減圧中、１つ以上のリポソームが形成される。
本発明の１つの態様はさらに、水性相中でリン脂質を水和することによって多重ラメラ小胞を形成するための第３容器を含む。リポソームに特別の性質を付与するために水性相またはリン脂質は治療薬を含んでいてもよい。
本発明の態様はさらに、減圧速度を決定するための調節手段を特徴とする。減圧速度はリポソームの大きさを決める。
好ましくは、減圧容器中のリポソーム配合物から取り出されたＳＣｏＣｏＮＣ流体は第１容器に再循環して、多重ラメラ小胞およびＳＣｏＣｏＮＣ流体の混合物を形成する。
ＳＣｏＣｏＮＣ流体との接触は、特に急速な減圧時に細胞構造の破壊を引き起こす。従って本発明の態様はほとんど自己殺菌性のものである。
本発明の方法および装置は、治療薬を運ぶリポソームを形成することができるものである。治療薬はリポソームの形成に用いる成分に混合しても、あるいは当業界で公知の方法でリポソームを形成した後、リポソームに治療薬を入れてもよい。
本発明の態様は最終リポソーム生成物に封入されない原料、脂質および溶媒の回収を可能にするものである。本発明の態様は効率的な薬剤の取り込みおよび非封入薬剤回収を特徴とする。装置および方法の操作パラメーターは他の工業的に用いられるプロセスと一致する。方法および装置は連続的に操作することができる。
これらのおよび他の利点は以下の図面および詳細な説明から当業者には明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明の特徴を示す装置の略図である。
図２は、ノズルアセンブリーの分解図である。
図３（ａ）および（ｂ）は、（ａ）０．５ｍｍおよび（ｂ）０．０６ｍｍの２つのノズルサイズを用いてＳＣｏＣｏＮＣ流体二酸化炭素で形成したリポソームの粒子サイズ分析をグラフで示したものである。
図４（ａ）および（ｂ）は、（ａ）６．０ｍｍおよび（ｂ）０．２２ｍｍの２つのノズルサイズを用いてＳＣｏＣｏＮＣ流体亜酸化窒素およびエタノールで形成したリポソームの粒子サイズ分析をグラフで示したものである。
図５は、圧力のリポソームサイズへの影響を示す棒グラフである。
図６は、臨界流体の種類のリポソームサイズへの影響を示す棒グラフである。
発明の詳細な説明
本発明をリポソームを形成するための方法および装置として詳しく説明する。本方法および装置は薬剤放出、医薬品、化粧品および食品加工に用いられる。
本発明の１つの態様を図１で説明する。数字１１で一般的に示されるリポソームを製造する装置は、次の主要構成部品からなる：第１容器１５；第２容器１７；数字１９で一般的に示されるＳＣｏＣｏＮＣ流体源；および数字２１で一般的に示される低圧トラップアセンブリー。
第１容器１５は１種以上の次の物品または組成物の供給物を収容するようにしてある；リン脂質、多重ラメラ小胞（ＭＬＶ）、水性相、ＳＣｏＣｏＮＣ流体および治療薬。
１つの態様では、第１容器１５はリン脂質および水性相を収容することができる。第１容器１５はＳＣｏＣｏＮＣ流体源１９と通じていて、導管２５によりＳＣｏＣｏＮＣ流体を収容する。”通じている”という用語は、液体が容器、導管等へまたはこれらから移動することができるように接続あるいは接触しているという意味で用いる。
導管２５は圧縮機２７および貯蔵容器２９と通じている。貯蔵容器２９はＳＣｏＣｏＮＣ流体を含み、この流体は圧縮機２７によって導管２５に通す。導管２５を通るＳＣｏＣｏＮＣ流体の流れはバルブ２５ａおよび２５ｂによって制御される。導管２５内の圧力は圧力バルブ３１によってモニターされる。
第１容器１５は導管２５からＳＣｏＣｏＮＣ流体を受け取り、ＳＣｏＣｏＮＣ流体はリン脂質および水性相と混合物を形成する。第１容器１５は導管３３により第２容器１７と通じている。
背圧調節器３３ａは導管３３内の圧力を制御する。背圧調節器３３ａは導管３３を通って流れる混合物の圧力を減じ、これらは第２容器１７に収容される。１つの態様では、導管３３は第２容器１７内のノズル３３ｂで終わる。
第２容器１７は出口導管３５と通じている。バルブ３５ａは導管３５を通る流体の流れを制御する。
バルブ３７ａは導管３７の流体の流れを制御する。第２容器１７に集まったリポソームは出口導管３５を通って取り出される。
第２容器１７はトラップアセンブリー２１と通じている。トラップアセンブリー２１は２つの主要構成部品からなる：第１トラップ容器４１および第２トラップ容器４３。第１トラップ容器４１は導管４５によって第２容器１７と通じている。
背圧調節器４５ａは導管４５内の圧力を制御する。導管４５を通る流れはバルブ４５ａによって制御される。導管４５内の圧力は圧力メーター４７によってモニターされる。
第１トラップ容器４１はＳＣｏＣｏＮＣ流体、並びに第２容器１７からの取り込まれたリン脂質、水性相およびリポソームを収容する。リポソーム、リン脂質および水性相は導管４９により第１トラップ容器４１から取り出される。バルブ４９ａは導管４９を通る流体の動きを制御する。
分路５１は導管４９および導管４５と通じる。分路５１は殺菌および洗浄試薬を導管４９を通してポンプで送りそしてトラップ容器４１内でバックフラッシュすることを可能にする。バルブ５１ａは導管５１の流体の流れを制御する。
第１トラップ容器４１は導管５５により第２トラップ容器４３と通じる。第２トラップ容器４３はＳＣｏＣｏＮＣ流体、並びに取り込まれたリポソーム、リン脂質および水性相を、減圧中に第２チャンバー１７および第１トラップ容器４１から流れ出る混合物として収容する第２容器となる。
第２トラップ容器４３は氷浴容器５７中に維持する。氷浴容器５７は氷が詰められており第２トラップ容器４３内の温度を制御および維持する。
第２トラップ容器４３と通じている導管５９からはリポソームおよび封入されなかったリン脂質および水性相を取り出すことができる。バルブ５９ａは導管５９の流体の流れを制御する。
第２トラップ容器４３は導管６３によって大気と通じている。導管６３を通る流れはバルブ６３ａによって制御される。導管６３を通る流れは流量計６５によってモニターされる。
第１容器１５は数字６７で一般的に示されるリン脂質混合アセンブリーと通じている。リン脂質混合アセンブリー６７は次の主要構成部品からなる：固形分容器６９、循環ポンプ７１、静的（static）インラインミキサー７３および三方バルブ７５。固形分容器６９は、リン脂質を固体状で受け入れてＳＣｏＣｏＮＣ流体によって可溶化するようにしてある。固形分容器６９は導管７７からＳＣｏＣｏＮＣ流体を受け取る。導管７７は循環ポンプ７１と通じている。循環ポンプ７１は導管７９により三方バルブ７５と通じている。バルブ７９ａは導管７９の流体の動きを制御する。
三方バルブ７５は導管８１により静的インラインミキサー７３と通じる。静的インラインミキサー７３は導管８８により固形分容器６９と通じる。
リン脂質混合アセンブリー６７の固形分容器６９、循環ポンプ７１、静的インラインミキサー７３および三方バルブ７５は流体回路をなす。リン脂質混合アセンブリー６７は導管２５によりＳＣｏＣｏＮＣ流体貯蔵容器２９と通じており、これは導管８１を三方バルブ７５と静的インラインミキサー７３との間に結合して流体が第１チャンバー１５およびリン脂質混合アセンブリー６７に配送されるのを可能にしている。
リン脂質混合アセンブリー６７はベント８９を有する。バルブ８９ａはベント８９の流体の動きを制御する。
リン脂質混合アセンブリー６７は導管７７と通じる排出口９１を有する。バルブ９１ａは排出口９１を通る流体の動きを制御する。
リン脂質混合アセンブリー６７は三方バルブ７５と通じる注入口９３を有する。注入口９３は材料を導管１１２により第１容器１５へおよびリン脂質混合アセンブリー６７へ注入することを可能にする。
リン脂質混合アセンブリー６７は導管８３と通じる圧力計９５を有する。圧力計９５で導管８３の圧力をモニターすることができる。
第１容器１５、第２容器１７、低圧トラップアセンブリー２１およびリン脂質混合アセンブリー６７は数字９７で一般的に示される洗浄アセンブリーと通じている。洗浄アセンブリー９７は次の主要構成部品からなる：空気源９９、水源１０１、水酸化ナトリウム源１０３、次亜塩素酸塩溶液源１０５およびメタノール源１０７。導管１０９は導管枝管１１１ａ−ｅにより各源と通じている。導管１０９は導管２５と通じていて、洗浄試薬が第１容器１５、第２容器１７、低圧トラップアセンブリー２１およびリン脂質混合アセンブリー６７に入るのを可能にする。
洗浄試薬、例えば水、水酸化ナトリウム溶液、メタノールおよび次亜塩素酸塩溶液はポンプ１１３によって導管１０９を通して送る。洗浄アセンブリー９７の流体の流れはバルブ１１５ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｊおよびｈによって制御される。
第１チャンバー１５、第２チャンバー１７、リン脂質混合アセンブリー６７、低圧アセンブリー２１の第１トラップ容器４１および接続導管はボックス１１７に入れる。ボックス１１７はヒーター１１９によって加熱される。ヒーター１１９は導管８９内にある温度センサー１２１ｂによって制御される。温度はまたそれぞれ第１チャンバー１５の外側および第２チャンバー１７の外側にある温度制御器１２１ａおよび１２１ｃによっても検知される。
操作の際、洗浄溶媒をポンプ１１３によって供給する。ポンプ１１３は６８９，４８０Ｐａヘッドに対して６，０００ｍｌ／分のクローズカップルドギヤーポンプである。容器１０１、１０３、１０５および１０７の洗浄溶媒には０．１Ｎ  ＮａＯＨ、１０容量％の次亜塩素酸塩溶媒並びに９５％メタノールおよび脱イオン水が含まれる。脱イオン水は１，２００ｍｌ／分の速度のフラッシュ溶媒として提供される。容器９９の機器圧縮空気（１００ＳＣＦＭ＠７９０，８３０Ｐａ）を置換および乾燥溶媒として用いる。
システムは、それぞれ５システム容量の次亜塩素酸塩溶液を循環することによって周期的に洗浄して、存在する微生物を不活性化する；脱イオン水、フラッシュとして；苛性アルカリ、タンパク質除去のため；脱イオン水、フラッシュとして；メタノール、脂質の可溶化のため；および脱イオン水、フラッシュとして。システムは圧縮空気で送風乾燥する。装置は操作と操作の間に、装置１１中にメタノールを再循環させ、排出し、第２チャンバー１７および低圧トラップアセンブリー２１を水ですすぎ、そして圧縮空気で乾燥することによって洗浄する。
洗浄後、装置１１を乾燥し、操作温度にする。全てのバルブを閉じた位置にする。その標準操作モードにおいて、固形分容器６９をまず装置から取り出し、既知量のホスファチジルコリン（ＰＣ）／ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）混合物を入れ、そしてリン脂質混合アセンブリー６９にオンラインで戻す。三方バルブ７５を回して注入口９３が導管７９と通じるようにする。バルブ７９ａおよびベントバルブ８９ａを開く。
次に、任意の体積の補助溶媒または共留剤、例えばエタノールを皮下注射器（図示せず）によって注入口９３を経て導入する。そして三方バルブ９５を回してリン脂質混合アセンブリー６７が第１容器１５と通じるようにし、ベントバルブ８９ａを閉じる。バルブ２５ａを開き、ＳＣｏＣｏＮＣ流体溶媒を圧縮機２７に供給する。圧縮機２７を作動させ、その直後にバルブ２５ｂを開き、ＳＣｏＣｏＮＣ流体を第１容器１５およびリン脂質混合アセンブリー６７に導入する。操作圧に達したとき、圧縮機２７の作動を停止し、バルブ２５ｂを閉じる。
システムが安定化した後、ポンプ７１を作動させ、その速度を調整する。バルブ７９ａを開いた状態で、ポンプ７１は第１容器１５の底から補助溶媒そして第１容器１５の頂部からＳＣｏＣｏＮＣ流体相を吸引する。次に、混合物を時計の針と反対方向にポンプで送り、静的インラインミキサー７３によって混合し、そして三方バルブ７５によって第１容器１５に送る。
たいていの場合、治療用のタンパク質を含有する水性相（脱イオン蒸留水またはｐＨ＝７．０の１５０ｍＭリン酸塩含有生理食塩水のような緩衝塩含有溶液）は、皮下注射器によって試料口３５およびバルブ３５ａを経て第２容器１７へ導入される。
代わりに、水性相を第１容器１５に導入して、水性相およびＳＣｏＣｏＮＣ流体に溶解したリン脂質の混合物を形成してもよい。さらに代替として、ＭＬＶを第１容器１５に導入して、ＳＣｏＣｏＮＣおよびＭＬＶの混合物を形成する。溶液および混合物は減圧を行う前に十分なリードタイムをとって導入して、溶液または混合物を第１容器１５およびリン脂質混合アセンブリー６７と同じ温度にする。
混合ポンプ７１の作動を停止した後、バルブ４５ｂ、背圧調節器４５ａ、バルブ６３ａを完全に開く。背圧調節器３３ａを徐々に開いて、第１容器１５およびリン脂質混合アセンブリー６７を減圧する。生成物はそれぞれ導管３５、４９および５９を経て、第２容器１７、第１トラップ容器４１、第２トラップ容器４３から得られる。各収集試料の体積を測定し、記録する。一般に供給物質（水性および補助溶媒相）の９５％−１００％が第１トラップ容器４１に回収され、第２トラップ容器４３には回収されない。収集試料は４℃で貯蔵する。
本発明の方法および装置の他の特徴は次の実施例で説明する。
実施例１
ノズルサイズおよび設計がリポソームの臨界流体形成に及ぼす影響
臨界流体リポソームは、まず共留剤を用いて／用いずにリン脂質をＳＣｏＣｏＮＣ流体中で溶媒和して混合物を形成することにより製造される。混合物は水性相に入れて徐々に減圧する。形成される臨界流体リポソームの数、大きさおよび特性は減圧ノズルの大きさおよび設計、減圧力、臨界流体密度（温度および圧力）界面力、電荷分布、並びに封入生成物および緩衝溶液の特性のような多くのパラメーターによって決まる。蒸留脱イオン（ＤＤＩ）水中におけるリポソームの臨界流体形成に及ぼすノズルサイズの影響を表１、図３（ａ）および（ｂ）に示す。図３は、２つの異なるノズルを用いて、ＳＣｏＣｏＮＣ流体二酸化炭素によって形成したリポソームの粒径分布を示すグラフである。図３（ａ）は内径０．５０ｍｍのノズルを用いて形成したリポソームの分布を示し、図３（ｂ）は内径０．０６ｍｍのノズルを用いて形成したリポソームの分布を示す。
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ノズル直径０．５ｍｍで形成したリポソームは位相差顕微鏡によって容易に見ることができた。２７，６８１ｋＰａおよび６０℃にて超臨界流体二酸化炭素を用いて形成したリポソームの平均サイズは４７８ナノメーター（ｎｍ）であった。粒子サイズ分析はＣｏｕｌｔｅｒ  Ｎ４ＭＤレーザーに基づく装置のサイズ分布プロセッサー（ＳＤＰ）によって行った。ＳＤＰはマルチモーダルサイズ分析が可能であり、各個々のサイズクラスにおける粒子の相対割合を記録する。単一リポソーム母集団の標準偏差（Ｓ．Ｄ．）は１８０ｎｍであり、分散率（Ｃ．Ｖ．）は３７％であった。
０．０６ｍｍＩＤノズルで形成したリポソームはより小さく、より均一であり、平均粒子サイズは３２６ｎｍ（Ｓ．Ｄ．は１５０ｎｍ、Ｃ．Ｖ．は４４％）であった。表１のデータに基づくと、リポソーム半径は明らかにノズル半径の１／５乗によって決まる：
Ｒ′2＝Ｒ′1×（ｒ2／ｒ1）1/5    （１）
式中、Ｒ′は形成されたリポソームの半径であり、ｒは減圧ノズルの先端の内半径である。
ノズル半径の臨界流体リポソーム（ＣＦＬ）の大きさへの影響をさらに評価するために、ノズルの設計を０．２２ミクロン（μm）フィルターを組み込むように変更した。図２に戻ると、数字２１１で一般的に示されるフィルターノズルアセンブリーは次の主要構成部品からなる：雄体２１５および雌体２１７を含むハウジング２１３；およびフィルター膜２１９。フィルター膜は導管３３の末端で、ハウジング２１３内に保持した。雌体２１５および雄体２１７は互いに適合するねじ込み部分を共に操作することによって合わせて、１つのハウジング２１３を形成した。フィルター膜２１９は非常に均質でかつ曲がりくねっていない孔を有する無機膜であった（アルテック  アソシエーツ社、イリノイ州  ディアフィールド）。フィルター膜２１９は３１６ＳＳメッシュスクリーン２２１で支持し、テフロンＯ−リング２２３でシールした。
０．０６ｍｍの針先および０．２２ミクロン濾紙を通る超流体Ｎ2Ｏによって形成されたリポソームのサイズを表２および図４に示す。図４は、２つの異なるノズルサイズを用いて、ＳＣｏＣｏＮＣ流体亜酸化窒素およびエタノールで形成したリポソームの粒子サイズ分布をグラフで示したものである。図４（ａ）は０．０６ｍｍのノズルで形成したリポソームの分布を示し、図４（ｂ）は０．２２ミクロンのノズルで形成したリポソームの分布を示す。
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方程式１によると、ＬＩＰ−５３リポソームは３１２ｎｍからＬＩＰ−６９において１０２ｎｍの大きさに減じるはずであった。これらの２つの実験と方程式１との間の一致は少なくとも５０％であり、０．２２ミクロンフィルターは０．０６ｍｍ臨界流体リポソームを少なくとも５０％までを１０５ｎｍに減じた。
０．２２ミクロンフィルターは、隣接バブルをより大きなものに凝集することを可能にする多数のポイント出口を有するので、１００％のサイズ減少は不可能である。断りがなければ、ほとんどの残りの実験は０．０６ｍｍオリフィスで行った。
実施例２
圧力がリポソームの臨界流体形成に及ぼす影響
臨界流体圧が注入法によって形成されるリポソームのサイズに及ぼす影響を表３および図５の棒図表に示す。図５に示すように、各圧に対して、ラインが左下から右上に伸びている左の棒は中程度のサイズのリポソーム（１００−４００ｍｍ）を示す。ラインが右下から左上に伸びている右の棒は大きなサイズのリポソーム（４００ｍｍを越える）を示す。これらのＣＦＬは全て０．０６ｍｍ減圧ノズルで形成された。
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初期減圧に伴うリポソームの大きさの増加は、バブル成長形成圧の関係と一致する。しかしながら、この関係は臨界流体相に溶解したリン脂質の量および減圧速度によって複雑になっている。前者は重要である。というのは、最も均一なサイズのリポソーム（３５２ｎｍで１００％）は、レシチンを６０℃の超臨界流体二酸化炭素に可溶化するのに最適な圧である２０，７８６ｋＰａで得られるからである。
表３に示す実験は、臨界流体を６０分間循環し、次に記載の圧力から大気条件にゆっくりと減圧することによって行った。リポソームは従って、例えばＬＩＰ−３７では３４，５７６ｋＰａの初期圧から０ｋＰａの変動圧力で形成された。
様々な減圧の影響を評価するために、リポソームを特定の圧力間隔で形成する一連の実験を行った。これらの実験結果を以下の表４に示す。
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例えばＬＩＰ−６４では、２０，７８６ｋＰａおよび６０℃の極性補助溶媒含有ＳＣＦ  Ｎ2Ｏを、６０分間、鶏卵黄レシチンと接触させ、２０，７８６から１３，８９１ｋＰａに徐々に減圧してＤＤＩ水に入れ、リポソーム溶液を取り出し、新しいＤＤＩ水に代えた。
ＬＩＰ−６５では、残りの臨界流体混合物を１３，８９１ｋＰａから７，６８６ｋＰａに徐々に減圧することによって、さらに多くのリポソームが形成された。
最後に、ＬＩＰ−６６では、臨界流体混合物を７，６８６ｋＰａから大気条件に減圧する。
同容量の水性相を減圧の３段階それぞれに使用したことに注目すべきである。粒子サイズ分析から、リポソームのユニモードの（unimodal）比較的小さな分布が、７，２７２ｋＰａであるＮ2Ｏの臨界圧より上の圧力で形成されたことが分かる。より大きなリポソームの大部分は６，９９６ｋＰａから大気条件への減圧で形成される。エチレン／エタノールおよびプロパン／エタノール混合物についてのより小さい分別減圧のリポソームサイズへの影響を表４に示す。
一連の部分亜酸化窒素／エタノール減圧は、鶏卵黄レシチンおよび０．０６ｍｍ減圧ノズルを用いて行ったことに留意すべきである；表４の一連の残りの減圧は０．５ｍｍ減圧ノズルを用いてエタノール中の純粋なホスファチジルコリンで行った。臨界流体密度は臨界圧より下で急速に変化するので、分別減圧の最終段階においてより大きなリポソームが形成されるのであろう。
操作上は、ＤＤＩ水および水性緩衝溶液を減圧チャンバーに保持するため、また気体の排出体積が劇的に増加するため、減圧は臨界圧付近およびそれ以下でずっと長く行う。気体の膨張によるジュール・トンプソン冷却効果のためのこの気体体積の急速な増加が、おそらくより大きなバブルおよびリポソームを形成するのであうろ。表４に示すＬＩＰ−１１２試料は実際、プロパン／エタノール部分減圧の第３段階後に凍結した。
実施例３
臨界流体の種類がリポソームの臨界流体形成に及ぼす影響
いくつかの臨界流体によって形成されたリポソームを、表５の粒子サイズ分布で特徴づけ、図６の棒図表によって比較する。図６に示すように、各臨界流体に対して、ラインが左下から右上に伸びている左の棒は小さいサイズないし中程度のサイズのリポソームを示す。ラインが右下から左上に伸びている右の棒は大きなリポソームを示す。これらの実験は全て、２０，７８６ｋＰａおよび６０℃で６０分間、鶏卵黄レシチンを臨界流体相（補助溶媒なし）と接触させ、次に０．０６ｍｍ減圧ノズルを通して徐々に減圧することによって行った。
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ＬＩＰ−６３の超臨界エチレンは、広いがユニモードのリポゾームの分布（平均粒子サイズ３２０ｎｍおよびＳ．Ｄ．３００ｎｍ）をつくる。臨界圧より下での減圧は、試験を行った残りの臨界流体の場合、バイモードの（bimodal）分布となった。
実施例４
極性共留剤または補助溶媒がリポソームの臨界流体形成に及ぼす影響
一般に、極性共留剤は以下の表６に示すように臨界流体リポソームのサイズおよび均一性を制御する。
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極性補助溶媒を使用しないＬＩＰ−５１、ＳＣＦ  Ｎ2Ｏにおけるミクロンサイズのリポソーム母集団は、おそらく亜酸化窒素の臨界点より下の減圧の際に形成されたのであろう。ＬＩＰ−５３における２容量％のエタノールの添加で、平均サイズが３１２ｎｍ、標準偏差が５４ｎｍおよび分散率が１７％のリポソームの狭いユニモードの分布が得られる。同様に、ＬＩＰ−５２２における２容量％のメタノールおよびＬＩＰ−５４における２容量％のアセトンの添加で、ミクロンサイズのリポソーム母集団がなくなる。しかしながら、これらの２つの添加剤は、平均サイズが約１００ｎｍおよび３００ｎｍの分布を形成する。これらの２つの極性補助溶媒を用いたＳＣＦ  Ｎ2Ｏの場合、両分布は比較的狭い。加えた極性共留剤は、亜酸化窒素と水との間の界面張力を下げる（水中の５％エタノールは表面張力を２５℃での７２ダイン／ｃｍから５３ダイン／ｃｍに下げ；水中の５％アセトンは表面張力を５６ダイン／ｃｍに下げる）ことによって亜酸化窒素ＣＦＬのサイズを調節するようである。低くてより均一な界面張力は形成されるバブルおよびリポソームのサイズを制御するであろう。極性共留剤を含有するＳＣＦ  Ｎ2Ｏ中のレシチンの溶解度を上げると、ＣＦＬのサイズおよび分布を確実に減じることができる。
極性共留剤は表７に示すように、ほぼ臨界のプロパンによって形成されたＣＦＬに同様な影響を及ぼす。２容量％のエタノール補助溶媒を加えると、ほぼ臨界のプロパンで形成されたミクロンサイズのリポソーム母集団はなくなり、平均サイズが１９６ｎｍおよび標準偏差が３００ｎｍの単一リポソーム母集団を形成する。この消失およびサイズの減少はおそらく、レシチンがほぼ臨界のプロパンにそれのみで非常に可溶性であるため、プロパン−水界面特性が変わることによって生じるのであろう。ＣＦＬのサイズはまた使用する緩衝剤および封入するタンパク質でも変わる。アセトンはプロパンＣＦＬに非常に大きな影響を持ち、リポソームを平均サイズ８５ｎｍおよび標準偏差８３ｎｍの単一母集団にする。ＬＩＰ−７６において塩が存在する（０．０９Ｍ  ＮａＣｌ）ためにメタノールが同様な作用をしなかったことは大いにありうることである。
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表８に示すようにクロロジフルオロメタンによって形成されたリポソームへの極性補助溶媒の影響は明らかにほとんどまたは全くない。しかしながら、これらの３つの実験は異なる圧力で（ＬＩＰ−６０は２０，７８６ｋＰａで、ＬＩＰ−７３は２７，６８１ｋＰａでそしてＬＩＰ−７５は３４，５７６ｋＰａで）行ったことに留意すべきである。初期圧はリポソームのサイズおよび分布に有意な影響を及ぼしうる。
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実施例５
操作モードがリポソームの臨界流体形成に及ぼす影響
臨界流体注入および減圧法によって形成されたリポソームのサイズ分布を比較し、表９に示す。
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表９の両実験は、１ｍｇ／ｍｌのチトクローム−Ｃおよび９．１ｍｇ／ｍｌの鶏卵黄レシチンを含有する１５０ｍＭリン酸塩緩衝剤含有生理食塩水で行った。また、両実験の間、約６，８９５ｋＰａ／分のゆっくりした減圧速度を０．０６ｍｍノズル先端を通して維持した。表９のデータは、臨界流体減圧では臨界流体注入法よりも小さな粒子サイズ分布となることを示している。
臨界流体減圧法によって形成されたリポソームのサイズ分布への減圧速度の影響は表１０で比較する。両実験は０．５０ｍｍノズル先端を用いて、リン酸塩緩衝剤含有生理食塩水中のタンパク質およびレシチンの濃度を同じにして行った。データは、急速な減圧（約６，８９５ｋＰａ／秒）はリポソームのサイズに有意に影響しないことを示している；実際のところ、ゆっくりした減圧（約６，８９５ｋＰａ／分）で制御がうまく行われるようであり、小さな（平均サイズ９２ｎｍ）ユニモードの分布がＬＩＰ−１００において得られる。
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実施例６
リポソームの封入特性
封入方法は一般に”受動的”であり、小胞形成中にリポソームがある水性容積を取り込む能力にかかっている。その結果、取り込み効率は小さな単ラメラ小胞（ＳＵＶ）の場合の１％未満から、いくつかの多重ラメラ小胞（ＭＬＶ）の場合の８８％もの高さまで大きく変化することになる。取り込み効率はサイズおよび方法の特徴（そして従ってリポソーム製造方法）によって変わる。
リポソームはまた、膜を横切る（transmembrane）イオン勾配に応じて特定の薬剤を隔離する能力によって薬剤を取り込むこともできる。間接的な取り込み（remote loading）とも呼ばれるこの”活性な”方法は、膜を横切るｐＨ勾配（含まれる薬剤がイオン性であるときリポソーマ内のｐＨは低い）またはカリウムイオンのような外因性イオン透過担体（ionophores）による、膜を横切る電位勾配を有する予備形成リポソームに、帯電した両親媒性薬剤を取り込むことも含まれる。例えば、９８％の取り込み効率および１：２．２（重量／重量）もの高さの薬剤：脂質比は、ＬＵＶシステム中の塩酸ドキソルビシンの場合に容易にうることができる（マイヤー等、１９８５）。”受動的”方法とは異なり、取り込み効率は脂質濃度に関係しない。膜を横切るイオン勾配は効率的な薬剤封入を行うことができるばかりでなく、小胞からの薬剤流出速度を３０倍も遅らせる。
高い取り込み効率および高い薬剤：脂質比を得る別の方法は、疎水性基（例えば、脂肪酸またはリン脂質）を薬剤に化学的に結合することである；これによってリポソーム膜に非常に可溶性の分子がつくられる。ＳＣｏＣｏＮＣ流体で製造されたリポソームには、望ましい組成物を、一般的な方法によって製造されたリポソームに用いられるどのような方法で取り込んでもよい。音波処理および臨界流体によって形成されたリポソームへのチトクローム−Ｃの取り込みを表１１にまとめた。取り込みは、チトクローム−Ｃがリポソーム形成の際に水性相中に存在するという意味で受動的である。
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実施例７
臨界流体リポソームの安定性
臨界流体リポソームの安定性および一般的なリポソームの安定性は様々なパラメーター、例えば原料組成、純度および酸素による影響の受けやすさ、並びに生成物の殺菌性、封入薬剤とリポソーム材料との間の混和性、水性相ｐＨおよびイオン強度および組成、並びに製造方法によって決まる。安定性の不足はリポソームサイズおよび薬剤保持能力に影響する。薬剤に用いる場合、リポソーム配合物は４℃で６−２４カ月の貯蔵寿命を有するのが望ましい。
リポソームは一般的な凍結−乾燥および再水和の際にひどい融解および漏れを生じる。脂質膜の各側を等モル濃度のグルコースのような糖で被覆することによって、リポソームのサイズの変化なしに、９０％以上の取り込み材料を維持するさらさらした粉末状のリポソーム調剤を形成することができる（クロウ等、１９８５）。安定性の問題はまた、使用時に予備形成リポソームを”間接取り込み”することによって避けることができる（バリー等、１９８５）。間接取り込みは、膜を横切るｐＨ勾配をつくるために、必要な投与量の治療薬を加える前に予備形成リポソーム調剤のｐＨを変えることによって容易に行うことができる。薬剤の再現性のあるかつ完全な取り込みは５分以内に達成され、注射用リポソーム製剤が得られる（オストロ等、１９８９）。リポソーム製剤の安定性はまた、合成飽和脂質を使用することにより、またはアルファ−トコフェロールおよびベータ−ヒドロキシトルエンのような酸化防止剤を加えてリン脂質の分解を防止することによって増すことができる。
臨界流体のリポソーム製剤の安定性の増減を評価するために、臨界流体リポソームの安定性を試験した。この試験は、粒子サイズ分布を時間の関数として測定することによって行った。特別の予防処置、例えば不活性ガス下での臨界流体リポソームの製造、酸化防止剤の使用、または無菌処理および収集処理は臨界流体リポソームの製造に用いなかった。臨界流体リポソーム製剤の時間安定性を表１２に示す。
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超臨界二酸化炭素リポソームは表１２中のデータによって示されるように、６カ月の間、４℃の貯蔵温度で良好ないし優秀な安定性を示す。
０．０６ｍｍノズルによって形成されたより小さい直径のリポソームは、０．５０ｍｍノズルによって形成されたより大きいリポソームよりも明らかに安定である。
臨界流体リポソームについての比較の第２のポイントとして、音波エネルギーによって形成されたリポソームの相対安定性を表１３から推定することができる。
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脱イオン蒸留（ＤＤＩ）水中で音波エネルギーによって形成されたリポソームは、４℃の貯蔵の２３日後に少しの凝集を示す。
４カ月間にわたる他の臨界流体によって形成されたリポソームの安定性を表１４に示す。データから、最も有効な臨界流体は安定性が減少する順序で：（１）プロパン；（２）クロロジフルオロメタン；（３）亜酸化窒素；（４）エタン；（５）トリフルオロメタン；および（６）エチレンであることが分かった。
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一般に、極性助触媒は臨界流体リポソームの安定性を改良した。この改良は表１５に例示されており、この表から臨界亜酸化窒素リポソームの安定性は添加剤としてメタノールを使用したときによりすぐれており；エタノールおよびアセトン添加剤はないよりはよく、Ｎ2Ｏ臨界流体リポソームの安定性に類似の影響を及ぼす。
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本発明の態様では最終リポソーム生成物に組み込まれない原料、脂質および溶媒を回収することができる。本発明の具体例は、効率的な薬剤の取り込みおよび封入されなかった薬剤の回収を特徴とする。本発明の装置および方法の操作パラメーターは他の工業的に用いられるプロセスと一致する。本発明の装置および方法は連続操作が可能である。
本発明の好ましい具体例について説明してきたが、本発明の変更は可能であり、本発明は上記の詳細に限定されるものではなく、請求の範囲内で変更することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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