(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２で示されるアミノ酸配列で表される蛋白質、又は配列番号２で示されるアミノ酸配列の幾つかのアミノ酸残基について欠失、置換、付加の変化が生じた配列で表され接着特性を有する蛋白質、をコードするフジツボ第３接着蛋白質遺伝子。
【請求項２】
配列番号１で示される塩基配列からなるフジツボ第３接着蛋白質遺伝子。
【請求項３】
配列番号２で示されるアミノ酸配列で表される蛋白質、又は配列番号２で示されるアミノ酸配列の幾つかのアミノ酸残基について欠失、置換、付加の変化が生じた配列で表され接着特性を有する蛋白質である、フジツボ第３接着蛋白質。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、水中や湿潤な環境で使用できる接着剤の原料となるペプチドを組み換えＤＮＡ技術を用いて製造するために用いるＤＮＡに関する。接着蛋白質をコードするＤＮＡを組み込んだ組み換え体ＤＮＡを含む微生物や培養細胞を培養液中で培養し、該培養物中に蓄積される該ポリペプチドを採集することにより、得られる該ペプチドは、接着剤の原料や細胞培養の基質として広い用途で利用されることが期待される。
【０００２】
【従来の技術】
乾燥条件下で強い接着力を示す接着剤は様々な種類のものが開発されている。それらの多くのものは、一旦乾燥条件下で接着してしまえば湿潤環境におかれてもその強度を維持できる。しかし、湿潤な条件下や水中で接着を開始した場合、有効な強度に達することができる接着剤は存在しなかった。
【０００３】
フジツボは、セメントと呼ばれる蛋白質を主成分とする物質を基盤に分泌して、海水中で強く付着することができる。この蛋白質のアミノ酸組成は調べられており、一般的な不溶性の蛋白質とは異なることが示唆されていた（G.Walker, J.mar. biol. Ass. U.K.(1972)52, 429-7435) 。
【０００４】
セメントの不溶性画分を構成する第１接着蛋白質、及びセメントの可溶性画分に含まれ、分子量が約60kDa の第２接着蛋白質については、既に本発明者によりその遺伝子がクローニングされ、構造も決定されている（特開平7-265081号公報、特願平7-203250号明細書）。しかし、セメント中に含まれる第１及び第２接着蛋白質以外の蛋白質については、未だにその遺伝子のクローニング等に成功した例は知られていない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
上記のように、セメント中に含まれる蛋白質の一部については、その遺伝子のクローニングに成功している。しかし、セメント中にはこれら以外にも多くの蛋白質が含まれており、そのような蛋白質も第１接着蛋白質及び第２接着蛋白質と同様に接着剤等に利用できるものと考えられる。本発明は、そのような蛋白質を遺伝子工学的手法を用いて大量に生産すべく、その生産のもととなる遺伝子を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題を解決するため、鋭意検討を重ねた結果、セメント中に含まれる分子量約20kDa の可溶性蛋白質（以下、「第３接着蛋白質」という。）をコードするｃＤＮＡを単離することに成功し、本発明を完成した。
即ち、本発明は、配列番号２で示されるアミノ酸配列、又は配列番号２で示されるアミノ酸配列と実質的に同一なアミノ酸配列をコードするフジツボ第３接着蛋白質遺伝子である。
【０００７】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のフジツボ第３接着蛋白質遺伝子は、配列番号２で示されるアミノ酸配列、又は配列番号２で表されるアミノ酸配列と実質的に同一なアミノ酸配列をコードする。ここで、「配列番号２で示されるアミノ酸配列と実質的に同一なアミノ酸配列」とは、配列番号２で示されるアミノ酸配列の幾つかのアミノ酸残基について、欠失、置換、付加等の変化が生じた配列であって、前記配列と同様の接着特性を有するアミノ酸配列をいう。幾つかのアミノ酸残基について欠失、置換、付加等の変化を起こさせることは、本願の出願時において常用されている技術、例えば、部位特異的変異誘発法（Nucleic Acid Research, Vol.10, No.20, p6487-6500(1982)）により行うことができる。
【０００８】
本発明遺伝子は以下の手順で得ることができる。
まず、第３接着蛋白質を単離し、その部分アミノ酸配列を決定する。第３接着蛋白質の単離は、可溶性の蛋白質を単離するのに常用される方法に従って行うことができ、例えば、フジツボの底殻より分泌されるセメントを集め、70％ギ酸等により可溶化される画分を遠心により上清として回収し、この可溶化画分を逆相ＨＰＬＣによって分離し、最初に溶出されるメジャーピークを分取することにより、単離できる。部分アミノ酸配列は、市販のプロテインシークエンサーにより決定することができる。
【０００９】
次に、フジツボの全ＲＮＡを単離し、それからポリアデニル酸鎖を有するＲＮＡ（ポリＡ−ＲＮＡ）を調製する。全ＲＮＡの単離は、常法に従って行うことができ、例えば、フジツボ全組織をチオシアン酸グアニディン等により可溶化し、フェノール／クロロホルムによる抽出を行い、イソプロパノールにより沈殿させることにより得られる。全ＲＮＡを得る方法はこの方法に限定されるものではなく、LiCl沈殿法や塩化セシウム溶液に重層して遠心することによっても得られる。全ＲＮＡからポリＡ−ＲＮＡの調製は、例えば、オリゴdTセルロースカラムを用いて行うことができる。
【００１０】
上記で得られたポリＡ−ＲＮＡを鋳型として逆転写酵素を用いて２本鎖ｃＤＮＡを調製し、これを適当なベクターに挿入し、このベクターを適当な宿主に導入して増幅させ、ｃＤＮＡライブラリーを作製する。２本鎖ｃＤＮＡの合成は、Ｓ１ヌクレアーゼ法やオカヤマ−バーグ法により行ないえるが、市販のｃＤＮＡ合成キットを用いて合成することも可能である。ベクターは、λファージ由来の各種ベクター、例えば、λgt10やλZapII など、あるいはpBR322等のプラスミドベクターを用いることができる。
【００１１】
ライブラリーから目的クローンの選択は、上記で決定した第３接着蛋白質の部分アミノ酸配列を基に、オリゴヌクレオチドを合成し、これに強く結合するクローンを選択すればよい。配列の決定はサンガー法やマキサム−ギルバート法等の一般的な方法によって決定できる。以上の手順により翻訳開始コドンから終始コドン、さらにポリアデニル酸鎖付加シグナルを含む第３接着蛋白質ｃＤＮＡの全長を単離することができる。
【００１２】
単離したｃＤＮＡは適当な発現ベクターに挿入し、微生物や培養細胞に導入して発現させることにより、当該ペプチドを大量調製することが可能である。この際、当該ＤＮＡはシグナル部分を含むため、当該ペプチドを宿主細胞外に分泌させることができる。また、シグナル部分を除去して適当なベクターに組み込んで用いることにより細胞内で生産させることも可能である。
【００１３】
【発明の実施の形態】
【００１４】
【実施例】
〔実施例１〕アカフジツボの第３接着蛋白質の部分アミノ酸配列の決定
岩手県宮古市宮古湾で採取したアカフジツボの底殻より分泌されるセメントを集め、70％ギ酸水溶液に懸濁した。ギ酸濃度を10％に希釈後、200000×ｇで１時間遠心し、得られた上清を逆相のＨＰＬＣによって分離し、最初に溶出されるメジャーピークを回収し、第３接着蛋白質を単離した。
単離した第３接着蛋白質の部分アミノ酸配列を、プロテインシークエンサー473A（アップライドバイオシステムズ社）により決定した。
【００１５】
〔実施例２〕アカフジツボのｃＤＮＡライブラリーの作製
岩手県宮古市宮古湾で採取した底殻直径４−５cmのアカフジツボ10個体をチオシアン酸グアニディン、クエン酸ナトリウム、Ｎ−ラウリルザルコシン酸ナトリウム、２−メルカプトエタノール等の溶液中で組織を機械的に破砕し、フェノール及びクロロホルムによる抽出を行なって、蛋白質などを除去した後、イソプロパノールを加えて沈殿させることにより全ＲＮＡを抽出し、オリゴdTセルロースカラムに導通してポリＡ−ＲＮＡを調製した。この操作により約２μg のポリＡ−ＲＮＡが得られた。
【００１６】
次に、このポリＡ−ＲＮＡを鋳型として逆転写酵素を用いて２本鎖ｃＤＮＡを調製した。この操作はアマシャム社のｃＤＮＡ合成キットを用いて添付のプロトコールに従って行なった。得られた２本鎖ＤＮＡにEcoRＩ−Notl−BamHＩアダプターを付加し、ファージベクターλZapII に挿入した。この操作は、アマシャム社のｃＤＮＡ合成システムを用いて添付のプロトコールに従って行なった。挿入の完了したファージベクターは同キットに添付のインビトロパッケージング溶液を用いて組み換えＤＮＡをファージ内に封入させた。封入の完了した組み換えファージは、大腸菌XL-I blueに感染させ、増幅した。
【００１７】
〔実施例３〕第３接着蛋白質ｃＤＮＡを含む組み換えファージの選択
実施例２で得られた組み換えファージを増幅させ、得られた５万個のプラークをナイロンメンブレン  ハイボンド（Amersham社）上に固定した。次いで、実施例１で決定した部分アミノ酸配列の相補鎖に相当するオリゴヌクレオチドプローブCA(A,G,T,C)AC(A,G,T,C)CC(A,G)TC(T,C)TC(A,G)TG をミリジェンサイクロンＤＮＡ合成機により合成し、α32Ｐ−ＡＴＰによる末端ラベルにより標識して、プラークハイブリダイゼーションを行なった。その結果、５万クローンより、プローブと結合する30個以上のプラークが得られた。これらのうち10個のプラークを任意に選び、挿入されているｃＤＮＡの長さをアガロース電気泳動により調べて、最も長い挿入断片を持つものについてファージベクターからEXASSIST system (Stratagene社）を用いてプラスミドベクターを切り出した。このプラスミドベクターを大腸菌SF1-20K に導入した。大腸菌SF1-20K は、工業技術院生命工学工業技術研究所（日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号）にFERM P-15620号として寄託されている（寄託日：平成８年5 月15日）。
【００１８】
〔実施例４〕第３接着蛋白質遺伝子の配列決定
実施例３で得られた挿入断片の配列をアプライドバイオシステムズ社製 373Ａ−ＤＮＡシーケンサー及びシーケンシングキッドを用いて配列を決定した。その結果、この挿入断片が第３接着蛋白質の成熟体の全長を含む配列であることが判明した。得られた第３接着蛋白質遺伝子は配列番号１に示した通り、成熟体のＮ末端アミノ酸から翻訳終了コドンまで 183アミノ酸配列をコードする全長 881bpの配列であり、最上流から19残基はシグナルペプチドにあたる。下流側の非翻訳領域にはポリアデニル酸鎖付加シグナルAATAAAが存在し、そのさらに下流にポリアデニル酸鎖が存在した。
【００１９】
【発明の効果】
本発明はフジツボ第３接着蛋白質遺伝子を提供する。本発明の遺伝子から作られる蛋白質は、接着剤の原料として極めて有用である。
【００２０】
【配列表】
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0003752309.tif 000003
【００２１】
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