(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
１１乃至２０個のアミノ酸残基からなるペプチドであって、そのＮ−末端のリシンにモノ-又はジ-パルミチン酸が結合したペプチドであり、下記の化学式（１）で表されるアミノ酸配列を有するペプチド。
ＫＸ1Ｘ2Ｘ3ＰＸ4Ｘ5ＰＸ6ＰＸ7……（１）
（式中、ＫはＬｙｓであり、P はProであり、X1はGlu, Arg, Asp又はLysであり、X2は、Arg, Lys, Pro, Leu又はIleであり、X3, X4及びX5は各々独立的にPro, Met, Val, Trp, Phe, Ile又はLeuと同じであるか異なり、X6はAsn, Gln, Arg又はLysであり、X7はAsp, Glu, Arg及びLysよりなる群から選ばれる１つのアミノ酸であり、かつ、前記ペプチドがSH3ドメインに結合することによってSH3ドメインを含む蛋白質により媒介される細胞内信号伝達経路を妨害する。）
【請求項２】
配列番号１乃至５及び８乃至１２のペプチドの１つであることを特徴とする請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
アミノ酸残基がＬ-アミノ酸であることを特徴とする請求項１又は２に記載のペプチド。
【請求項４】
１つ以上のアミノ酸残基がＤ-アミノ酸で置換されていることを特徴とする請求項３に記載のペプチド。
【請求項５】
１つ以上のアミノ酸残基がヒドロキシプロリン、ヒドロキシリシン、システイン、チロキシン、ノルロイシン、ピログルタミン酸又はメチル化したアミノ酸で置換されされていることを特徴とする請求項１乃至４のいずれかに記載のペプチド。
【請求項６】
前記ペプチドのＣ−末端はアミド、カルボキシル又はエステル形態であることを特徴とする請求項１乃至５のいずれかに記載のペプチド。
【請求項７】
パルミトイル−パルミトイル−リシンと結合されており、Lys残基が化学式（１）中に存在するLysであることを特徴とする請求項１乃至６のいずれかに記載のペプチド。
【請求項８】
１１乃至２０個のアミノ酸残基からなるペプチドであって、そのＮ−末端のリシンにモノ-又はジ-パルミチン酸が結合し、配列番号６又は７で表されるアミノ酸配列を有し、前記ペプチドがSH3ドメインに結合することによってSH3ドメインを含む蛋白質により媒介される細胞内信号伝達経路を妨害することを特徴とするペプチド。
【請求項９】
有効成分として１つ以上の請求項１乃至８のいずれかに記載のペプチド及び薬剤学的に収容可能な担体を含む、癌又は免疫抑制関連疾患を予防するか治療するための薬剤学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、src系タンパク質キナーゼに結合するモチーフ(motif)から由来した合成ペプチドとそれを含有する癌治療用及び免疫抑制用の薬剤学的組成物に関するものである。
【０００２】
（背景技術）
細胞の生物学的、生理学的活性の大部分は、細胞内機作を刺激するか、又は抑制する外部信号(external signal)により調節される。このような外部信号が細胞内に伝達されて細胞内反応を誘導する機作を信号伝達(signal transduction)という。多様で且つ相違な形態の細胞外因子(例：ホルモン、吸着分子、サイトカイン等)の細胞外結合による細胞内信号伝達は、タンパク質キナーゼの活性により媒介される。これらの分子を活性化するため、初期に水溶体と標的との相互作用が必要である。前記相互作用は、細胞内に信号を伝達する多重経路に関連した他の分子間の相互作用を含む連鎖信号伝達体系(cascade)を刺激する。
【０００３】
現在、約400個の相違なタンパク質キナーゼが知られており、数年後タンパク質キナーゼの総数はその倍以上になるだろう(Hardie G et al, (1995) The protein kinase Facts Book. London : Academic)。信号伝達に関連したタンパク質キナーゼの殆どは、酵素活性ドメイン及び他の細胞タンパク質と結合するドメインを含む多数のドメイン(domains)から構成される。タンパク質キナーゼ間に一次配列類似性を有する主な領域は、酵素活性ドメイン(catalytic domain)であり、これをSH1(Src homology 1)という。タンパク質キナーゼのSH1ドメインは、酵素及び全てのタンパク質キナーゼが共有する11個のサブドメイン(subdomain)にさらに分類されることができる。次に最も共通的な機能性ドメインは、SH2(Src homology 2)(Sadowski et al. (1986) Mol. Cell. Biol. 6:4396-4408) 及び SH3(Src homology 3)である。SH2及びSH3ドメインは、細胞内の連鎖信号伝達体系においてタンパク質−タンパク質の相互作用を媒介し、src系以外にも多くのタンパク質で発見された。最近、信号伝達に関連したSH2及びSH3ドメインに対する広範囲な構造及び機能研究は、3次元的構造及び機能を詳しく記述しており、これらは前記ドメインがpTy−結合ドメイン(PTB)であることを明らかにしている(P Blaikie et al., (1994) J. Biol. Chem 269:32031: Zhou M et al., (1995) Nature 92, 7784-7788)。
【０００４】
約100個のアミノ酸から成るSH2ドメインは、タンパク質変形−依存タンパク質−タンパク質の相互作用を促進させるホスホチロシン−含有ペプチド配列に高い親和度で結合することができる(Pawson T et al., (1992) Cell. 70:694-704)。
【０００５】
SH2ドメインがリン酸化したチロシン残基に特異に結合できるという追後の発見が、Ras GTPase−活性化タンパク質(GAP)、ホスファチジルイノシトール3'−キナーゼ(PIK)及びホスホリパーゼC−γでもなされた(Cantley et al, (1991) Cell 64:281-320)。また、SH2ドメインは、活性化された水溶体によってこれらのタンパク質を位置化させ、酵素活性の調節に関与する(O'Brien et al, (1990) Mol. Cell. Biol 10:2855-2862: Roussel et al, (1991) Pro. Natl. Acad. Sci. USA 88:10696-10700: Bucker et al, (1992) EMBO J. 11:3469-3479)。
【０００６】
SH2ドメインに基づいた合成リン酸化ペプチドは、ホスファチジルイノシトール3−キナーゼが血小板−誘導成長因子(platelet-derived growth factor)水溶体に結合することを防止すると判明された(Bscobedo et al, (1991) Mol. Cell. Biol. 11:1125-1132 : Fanll et al, (1992) Nature 352:726-730)。また、Ras GTPase−活性化タンパク質(GAP)、ホスファチジルイノシトール3−キナーゼ(PIK)及びPLC−γのSH2ドメインが、PDGF水溶体内のリン酸化ペプチド配列を確実に認識できるということを突然変異研究を通じて明らかにした(Bantl et al, (1992) Cell 69:413-423 : Kazlauskas et al, (1990) Science 247:1578-1581 : (1992) Mol. Cell. Biol. 12:2534-2544)。
【０００７】
タンパク質キナーゼの他の共通的な特徴は、SH3(Src homology 3)ドメインである。約60個の残基の長さから構成され、プロリンに豊かなペプチド配列に結合するSH3ドメインは、左回転ポリプロリン系IIヘリックス構造(left handed polyproline type II helix structure)を有するコンセンサスPXXP(ここで、XはIle、Leu、Pro、Met、Phe、Tyrのような疎水性アミノ酸である)を有する(Feng et al, (1994) Science 266:1241-1247)。また、SH3とポリプロリンヘリックスの結合は、タンパク質−タンパク質の相互作用を促進させ、特定の細胞内場所(subcellular site)で機能性オリゴマー複合体(functional oligomeric complexes)を(他のモジューラードメインと連合されて)形成する(Pawson et al, (1995) Nature 373:573)。タンパク質は、多数のSH3ドメインを有することができ、いろいろな他のリガンドと複合体を成すことができ、プロリンに豊かなリガンドに隣接したセリン又はトレオニン・リン酸化は、SH3ドメイン相互作用に影響を及ぼすことができる(Chem et al, (1996) J. Biol. Chem 271:6328)。ある場合には、SH3−リガンドの相互作用を、保存されたチロシンのリン酸化によって陰性的に調節することができる(Park et al, (1996) Immunity 4:515-525: Broome et al, (1996) J. Biol. Chem. 271:16, 798-806)。
【０００８】
Shc及びインシュリン水溶体基質−1(IRS-1)タンパク質のpTyr−結合(PTB)ドメインは、β−turn(一般に、コンセンサスNPXpY配列)を形成した残基の前にpTyrが存在するリン酸化ペプチドモチーフを認識する(Blankie et al, (1994) J. Biol. Chem. 269:32031)。pTyrが結合されたNH2−末端の5〜8残基にある疏水性アミノ酸によって特異性が付与されるので(Trub et al, (1995) J. Biol. Chem. 270:18205)、SH2ドメインを形成することと異なる方式でリガンドを認識する(Zhou et al, (1995) Nature 378:584)。PTBドメインは、活性化された水溶体付近の追加的な信号タンパク質を補充するドッキングタンパク質(docking proteins)としての役割が先に発見されたので、SH2と異なる役割を果たすことができる。X11、FE65及びNumbのようなタンパク質のPTBドメインは、リン酸化していないペプチドモチーフと結合することができ、これはpTyr認識役割を果たすSH2ドメインとは異なり、PTBドメインが主にペプチド認識要素(peptide recognition elements)であることを示す。
【０００９】
治療的標的として関心を引くタンパク質−タンパク質の相互作用は、免疫反応水溶体とのカップリングに必須的なSykキナーゼのSH2ドメイン、水溶体と下流効果機(downstream effectors)とのカップリングに関連したsrc系キナーゼのSH2及びSH3ドメイン、及びShc機能に必須的なPTBドメインを含む。これらのドメインの抑制剤を開発するためには、各々のタンパク質に相当の特異性を有し、膜通過性及び高親和性を示し、適切な薬物動態と安定性を有する化合物を製造することが必要である。
【００１０】
タンパク質−タンパク質の相互作用は、細胞内信号伝達の各々の全段階に関わっている。従って、細胞膜において、信号が開始されて水溶体により細胞質内に他の細胞タンパク質の活性強化が生じ；細胞質において、信号がいろいろの細胞位置に伝達され；核において、信号が複合体から転写調節と関連した他のタンパク質に伝達され、特定遺伝子の転写を調節する。
【００１１】
Src系タンパク質は、共通の調節メカニズムを有するが、細胞発現及び位置化においては異なる。9個のsrc系チロシンキナーゼが同定された(Src、Lck、Hck、Fyn、Fgr、Yes、Blk、Lyn及びYrk) (Brown M (1996) Biochem Biophys Acta 1287, 121-149)。非常に良く保存されたsrc系タンパク質の調節方式は、Src homology、つまりドメインSH1及びSH2の２つのペプチド結合モジュールから構成される。これらのモジュールは、ホスホチロシン及びポリプロリン系IIへリックスの各々を含む標的に結合し、信号伝達過程中にタンパク質−タンパク質複合体の形成を媒介する。蓄積された研究結果は、チロシンリン酸化場所及びポリプロリンの多い位置周辺の所定の配列が、各々SH2ドメイン及び SH3ドメインを含むタンパク質によって認識され、タンパク質−タンパク質の相互作用が、タンパク質複合体の機能及び／又は解離(dissolution)を媒介することにより、細胞内信号を増幅させることを示唆する。SH2ドメインによるリン酸化タンパク質の認識及びSH3によるポリプロリンの認識は、周りのアミノ酸配列及びドメインの特性の存在によって特異性が付与される。
【００１２】
細胞増殖に生物学的又は生理学的に関連した信号伝達現象は、小さい調節ドメインに作用するペプチドを使用して、タンパク質−タンパク質の相互作用を抑制することで調節することができる。例えば、細胞増殖及び分化に関連した遺伝子の発現を誘導する細胞内又は細胞外の信号が核に伝達されることを防止することにより、細胞増殖の終結を導き、細胞死滅をもたらす。
【００１３】
従って、水溶体とのカップリング及び下流効果器への伝達に関連したタンパク質のSH3ドメインの潜在的抑制剤は、各々のタンパク質に対して特異性及び親和性が高くなければならなく、適切な薬物動態と安定性プロフィルを持たなければならない。
【００１４】
本発明者は、SH3ドメインに親和性が高くて、信号伝達経路内にタンパク質−タンパク質の相互作用を抑制する新規なペプチドを供給するため、多くの研究を重ねた結果、アミノ酸配列(１)を含む合成ペプチドが、SH3ドメインに親和性が高く、且つパルミチン酸がペプチドのN−末端にカップリングされる場合、ペプチドが細胞内への透過性が増加されることを発見した。前記ペプチド及びN−パルミトイルペプチドは、癌及び免疫抑制関連疾患を治療するのに有用に使用されることができる。
【００１５】
（発明の開示）
従って、本発明は、SH3ドメインに親和性が高く、適切な薬物動態と安定性プロフィルを示しながら、SH3を含むタンパク質により媒介される細胞内の信号伝達経路を妨害するか、抑制することができる新規な抑制ペプチドを提供する。
【００１６】
また、本発明は癌又は免疫抑制関連疾患の治療剤として前記ペプチドの用途を提供する。
また、本発明は本発明によるペプチドを含有する癌又は免疫抑制関連疾患を治療するための薬剤学的組成物を提供する。
【００１７】
（発明の詳細な説明）
Src系のキナーゼなどのような特定タンパク質に結合するモチーフ(motif)から由来する本発明の合成ペプチド(以下、簡単に「ペプチド」又は「抑制ペプチド」という)は、下記の化学式（１）のアミノ酸配列の一部または全てを含む。
ＫＸ1Ｘ2Ｘ3ＰＸ4Ｘ5ＰＸ6ＰＸ7……（１）
【００１８】
式中、KはLysであり；PはProであり；X1はGlu、Arg、Asp又はLysであり；X2はArg、Lys、Pro、Leu又はIleであり；X3、X4 、及びX5は各々独立的にPro、Met、Val、Trp、Phe、Ile又はLeuと同じであるか異なり；X6はAsn、Gln、Arg又はLysであり；X7はAsp、Glu、Arg及びLysのうち選ばれる１つのアミノ酸である。ここで、これらのアミノ酸残基のうち１つが、１つまたは４つのアミノ酸と追加的に連結されることができ、この際、追加されるアミノ酸が１つの場合、アミノ酸はTyrまたはpTyrであり；４つの場合には、1番目のアミノ酸はTyrまたはpTyrであり、2番目及び3番目はAsp又はGluであり、4番目はIle、Leu、Val、Metのような疎水性アミノ酸である。
【００１９】
前記化学式（１）で表される配列の全部又は一部を含む本発明のペプチドは、配列目録に記載された配列番号1〜12を含むことができる。
本発明のペプチドと細胞内の標的タンパク質との結合は、SH3を発現するGST−融合タンパク質を使用する試験管内の結合性検査(in vitro binding assay)により測定され、src系キナーゼを発現する癌細胞などの特定細胞を退化させる。
【００２０】
本発明のペプチドと、欠失、置換、付加などのような変形によるそれらの変異体及び誘導体は、化学的に合成されるか、または遺伝子再組合により製造されることができる。ペプチドの長さは、4〜20個のアミノ酸からなることが好ましい。
【００２１】
抑制ペプチドを含有する薬剤学的組成物は、溶液、ミセル(micelles)、リポソーム又は適切なアジュバント(adjuvant)への懸濁液の形態で使用されることができる。抑制ペプチドは、細胞への輸送及び癌細胞に対する標的化を強化するため、脂質と連結された形態で使用することができる。好ましい実施例によると、ペプチドはN−末端リシンに１つ又は２つのパルミチン酸を連結することが好ましい。
【００２２】
本発明による薬剤学的組成物は、非経口的又は局所経路を通じて、好ましくは、液相運搬剤による溶液又は懸濁液の形態に投与することが好ましい。
抑制ペプチドは、肝細胞癌腫及びSH3ドメインを発現する他の癌に対する抗腫瘍治療剤としてだけでなく、癌患者に臨床的手術後、癌細胞の転移を抑制する抗腫瘍治療剤として使用されることができる。
【００２３】
〔用語の定義〕
明細書及び特許請求の範囲にわたって使用される用語は、次のような意味を有する。
【００２４】
「ペプチド」とは、本明細書において「オリゴペプチド」と互いに互換的に使用されることができ、通常、アルファ−アミノと隣接したアミノ酸のカルボニル基間のペプチド結合により連結された一連の残基を意味する。オリゴペプチドの長さは、正確な配列が維持される限り、本発明においてあまり重要ではない。ペプチドは、繰り返し結合された形態(例：SH2-SH2-SH2----n, SH3-SH3-SH3----n)以外には、通常、約50残基以下の長さが好ましく、一般に約4〜20残基、好ましくは、約13又は約16残基から構成されることが好ましい。
【００２５】
「抑制ペプチド」は、SH2及びSH3結合ドメインを含み、これらのドメインを含有した細胞内のタンパク質と結合することにより、細胞信号伝達経路を遮断するか、又は妨害することができるペプチドである。従って、多様な癌細胞において、前記抑制ペプチドは、細胞増殖及び分化の信号伝達経路に関連したタンパク質キナーゼ及び信号伝達タンパク質のような適切な細胞内のタンパク質に結合することができる。
【００２６】
用語「パルミトイル化ペプチド」は、脂質(パルミチン酸)が連結された抑制ペプチドの形態に関するものである。パルミトイル化(palmitoylation)は、生体内において抑制ペプチドの細胞への移動及び癌細胞の標的化を強化するためのものである。
【００２７】
「癌」は、SH2、SH3及びPTBドメインを含有した細胞内タンパク質を発現する多様なヒト／動物の癌を含む。
また、３文字コードは、WIPO Standard ST.25(1998), Appendix 2, Table 3によるアミノ酸残基を示すように使用した。
【００２８】
〔配列目録内の＜223＞〕
配列番号1〜12：高親和度をもってSH3ドメインに特異に結合し、細胞内の信号伝達を抑制するペプチド。
配列番号13：比較例のペプチド。
【００２９】
以下、本発明をより詳しく説明する。
本発明は、癌細胞の信号伝達経路を抑制することができるペプチドを提供する。抑制ペプチドのサブドメインは、src系キナーゼのような特定のタンパク質に結合するタンパク質の複数のドメインから由来し、SH3ドメインに親和性が高いので、SH3ドメインにより媒介される細胞内信号伝達経路を抑制し、癌細胞を退化させるか、拒否させるのに使用されることができる。
【００３０】
本発明のペプチドは、合成的に又はDNA再組合技術により製造されることができる。好ましくは、本発明のペプチドが含有するドメインは、宿主細胞及びリンパ球や多様な癌細胞のような癌細胞、その他の宿主細胞、それらのタンパク質及びその断片等、自然的に存在する物質を含有しないものであるが、一部の実施例によると、ペプチドは、自然的に存在する粒子の断片に結合された合成ペプチドから製造されることができる。ペプチドは、ペプチドをコーディングするDNA配列を有するDNAが導入された発現ベクトルを使用するDNA再組合技術により製造されることができる。前記ベクトルは、癌誘導位置に移動されるか、適切な宿主細胞に形質感染されるように製作され、公知された方法(Sambrook et al. Molecular Cloning, 1989, Cold Spring Harbor, Cold Spring Harbor Laboratory Press)により適当な状態下で発現されるようにできる。また、前記ペプチドは本発明の１つ以上のペプチド断片を含む融合タンパク質から製造されることができる。
【００３１】
本発明の所望の長さのペプチドに対するコーディング配列は、化学的技術、例えば、リン酸トリエステル法(Matteueei et al., (1981) J. Am. Chem. Soc. 103:3185)により合成されることができるので、本来のペプチド配列をコーディングするものを適切な塩基に置換して簡単に変形することができる。従って、コーディング配列を適切な連結子(linkers)に提供し、通常の技術を利用して発現ベクトルに連結(ligation)し、前記ベクトルを適当な宿主細胞を使用して所望の融合タンパク質を生産することができる。現在、多くのベクトル及び適当な宿主系が利用されることができる。融合タンパク質又はポリペプチドの発現において、コーディング配列は、開始及び終了コドン、プロモーター及び終了領域(terminator region)と作動可能に連結され、細胞性宿主細胞での発現のための発現ベクトルを提供する複製システムを提供する。
【００３２】
前記ポリペプチド又はペプチドは、多様な長さとなることができ、中性(電気的に中性)の形態、または塩の形態である。それらは、何の変形もしないものであるか、生物学的活性が維持される限り、糖化(glycosylation)、側鎖酸化(side chain oxidation)又はリン酸化により変形することができる。前記ペプチドは、約50アミノ酸残基以下の長さ、好ましくは、4〜20アミノ酸残基、より好ましくは、8〜16アミノ酸残基を有する。
【００３３】
細胞内の連鎖信号反応に関連したドメインを含む本発明のペプチドの生体内活性は、脂質化(lipidation)、糖化又は他のペプチドとの結合などのような変形により増加させることができる。例えば、ペプチドへのパルミチン酸結合のような脂質鎖の共有結合は、脂質に対する親和性により細胞内への輸送及び癌標的化を増加させる。また、本発明の形態によりコーディングされた癌細胞又は特異な器官標的化ベクトル／ウィルスベクトルに同様の目的で使用されることができる。細胞膜脂質に対する親和性を増加させることにより、細胞へのペプチド輸送を増加させるため、本発明のペプチドに結合させることができる脂質は、C18飽和脂肪酸、C16又はC18不飽和脂肪酸を含むことができる。
【００３４】
また、ペプチドは、そのアミノ酸残基の数を増加させるか減少させることにより、例えば、アミノ酸の付加又は欠失により変形させることができる。また、本発明のペプチドは、ペプチド活性に影響を及ぼさない限り、ある残基の順序または組成を変化させることにより変形させることができる。必須的接触位置で保存残基のような生物学的抑制活性に必須的なアミノ酸残基(「必須的アミノ酸」)は、それらの抑制活性を維持するため、変形できないという点は当業者が容易に認識することができる。必須的でないアミノ酸は、タンパク質のうち天然アミノ酸(例：L-α‐アミノ酸)に限られなく、β、γ、δアミノ酸、及び多くのL-α‐アミノ酸誘導体などもある。
【００３５】
通常、単一アミノ酸置換を有する一連のペプチドは、結合力に対する電荷(electric charge)、疎水性などの効果を測定するため使用される。例えば、ペプチドのアミノ酸を順次に一連の正電荷のアミノ酸(Lys、Arg)又は負電荷のアミノ酸(Glu)に置換すると、信号伝達モジュールSH2又はSH3を含む細胞内キナーゼ／アダプタタンパク質に対して他の形態の感作性を示すようになる。置換されるか付加される残基の数及び形態は、必須接触地点及び要求される機能的特性(例：疎水性対親水性)間に要求される間隔調節により異なる。本発明の本来のペプチドの親和度と比較して、信号伝達経路に関連した適当な細胞内標的タンパク質に対する結合親和度は、前記置換により増加されることができる。この際、結合を抑制する立体妨害及び負荷妨害を避けるため、選定されたアミノ酸残基又は他の分子断片を前記置換に使用しなければならない。
【００３６】
通常、１つの残基のみをアミノ酸置換する。置換、欠失、挿入又はそれらの組合せは、最終ペプチドの活性化により異なる。置換変形体は、ペプチドのうち少なくとも１つの残基が除去され、その箇所に他の残基が挿入されたものである。一般に、ペプチドの特性の細部的な調節が要求される場合、下記の表１により置換する。
【００３７】
【表１】
0003819712.tif 000002
【００３８】
置換変形は、キナーゼ又は信号関連分子に対する親和度などのタンパク質の機能に相当な変化を招く。置換はシート(sheet)または螺旋構造、標的位置の分子の電荷又は疎水性、側鎖体積などのようなペプチド骨格(backbone)構造に大きな影響を及ぼす。一般に、ペプチド特性に一番大きい影響を及ぼすと考えられる置換は、Serなどの親水性残基がLeu、Ile、Phe、Val、Alaなどの疎水性残基に置換されること；Lys、Arg又はHisなどの正電荷側鎖を有する残基がGluまたはAspなどの負電荷残基に置換されること；体積が大きい側鎖を有する残基がGlyなどの側鎖を有しない残基に置換されること等がある。
【００３９】
１つ以上のアミノ酸が、D−アミノ酸に、又はヒドロキシプロリン、ヒドロキシリシン、シスチン、チロキシン、ノルロイシン又はピログルタミン酸等のアミノ酸に、又はメチル化アミノ酸に置換された全てのペプチドは、本発明の範囲内に含まれる。また、C-末端がアミド、カルボキシルまたはエステルを有するペプチドも、それらが本発明の目的を達成するなら、本発明の範囲内に存在する。
また、本発明のペプチドは、２つ以上の残基のイソステレス(isosteres)を含むことができる。ここで、イソステレスの定義は、1番目の配列の立体構造の形状のため2番目の配列に置換されることができる２つ以上の残基の配列である。イソステレスの用語は、当業者に知られたペプチド骨格の変形を含む。このような変形は、アミド窒素、α‐炭素、アミドカルボニル、アミド結合の完全な置換、拡張、欠失又は骨格架橋などに対する変形を含む。
【００４０】
多様な非天然アミノ酸類似体によるペプチドの変形は、ペプチドの生体内安定性を増加させるのに特に有用である。安定性は、多様な方法により検査されることができる。例えば、ペプチダーゼ及びヒトの血漿と血清などの多様な生物学的培地は、安定性の測定に使用されている。
【００４１】
また、本発明は、本発明の１つ以上のペプチドを有効物質として含有する薬剤学的組成物を提供する。
【００４２】
幾つかの実施例によると、ペプチド−脂質化方法を使用して細胞内への輸送及び癌標的化を助ける少なくとも１つの構成要素を本発明の薬剤学的組成物内に含ませることが好ましい。脂質は細胞内への輸送及び部分的な癌標的化を助けることのできる製剤として同定された。例えば、パルミチン酸残基は、Lys残基のアルファ又はエプシロンアミノ基に結合され、Gly、Gly−Gly、Ser又はSer−Serなどの１つ以上の連結残基を介して連結される。脂質化されたペプチドは、ミセル(micelle)の形態に直接に注入されることもでき、リポソーム内に挿入されるか、または不完全なフロイントアジュバント等の補助剤内に乳化されることもできる。好ましい実施例によると、特別に効果的な輸送及び標的化は、Lysのアルファ又はエプシロンアミノ基にパルミチン酸を付着させたものを含む。本発明の抑制ペプチドは、例えばPal2K(パルミチル−パルミチル−Lys)又はPal3CK(パルミチル−パルミチル−パルミチル−Cys−Lys)等に結合されることができ、得られたリポペプチドは、癌成長を特異に抑制するため患者に投与されることができる。
【００４３】
癌細胞の標的化のため、ペプチドは標的癌細胞の細胞表面決定基に特異的な抗体又はその断片を含有したリポソーム内に挿入されることができる。
【００４４】
固形製剤として、薬剤学的に収容可能な従来の非毒性固形担体が使用されることができる。前記担体としては、マンニトール、ラクトース、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルカム、セルロース、グルコース、スクロース、炭化マグネシウム等を含むが、これらに限られるものではない。経口投与のため、有効成分として１つ以上の本発明のペプチドは、組成物の総重量に対して10〜95重量%、好ましくは、25〜75重量%が前記経口投与のための担体に含まれる。
【００４５】
本発明の薬剤学的組成物は、静脈内、皮下、皮内、筋肉内経路のような非経口又は局所的経路により患者に投与することができる。
【００４６】
エアゾール投与の場合、本発明のペプチドは、界面活性剤及び噴射剤により微分して供給することが好ましい。通常のペプチドの量は、製剤の総100重量部に対して、0.01〜20重量%、好ましくは1〜10重量%である。
【００４７】
投与される本発明の組成物の量は、一定範囲に限られず、患者の病症、状態、年齢及び体重により容易に当業者が決めることができる。しかしながら、一般に、約5〜100mg/kg/日、好ましくは、10〜50mg/kg/日、より好ましくは、30mg/kg/日である。
【００４８】
ペプチド又はこれを含む薬剤学的組成物は、生体内で生理活性を示し、前記生理活性は、ペプチド又は組成物が投与された患者の血液又は骨髄試料中で生体内で測定可能である。
【００４９】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明がこれらの実施例に限定されるものではない。
【００５０】
（実施例）
実施例１：ペプチドの合成
Applied Biosystems 430A合成器、本発明者により開発されたＦｍｏｃプログラム及びNovabiochem (Laufelfingen, Switzerland) から購入した側鎖保護基を有するFmoc L-アミノ酸 （すなわちLys (Boc), Arg (Mtr), Asp (OtBu), Tyr (tBu)）を使用して 、固体相ペプチド合成の方法で抑制ペプチド（配列番号１）を合成した。
【００５１】
Fmoc-Asp-OH (0.35 mmol) と Fmoc-Arg-OH (0.35 mmol)を含むp-ベンジルオキシベンジルアルコール−樹脂1gで各々の合成を開始し、次の合成サイクルを行った。
【００５２】
N-メチルプロリドン (1x2 min, 1x5 min)に溶解された55%のピペリジンでN(-除去(deprotection)する段階；
N-メチルプロリドン(6ml)に溶解されたFmoc-AA-OH (1.5 mmol) を、ジイソプロピルカルボジイミド(1.5 mmol) と1-ヒドロキシベンゾトリアゾール (1.5 mmol) を用いて活性化させ、1.5時間結合させる段階；
N-メチルピロリドンに５％濃度で溶解されているN-エチルモルホリンで洗浄し、上記活性化及び結合段階を繰り返す段階；
【００５３】
反応に参与しないアミノ基の保護は、N-メチルピロリドンに溶解された無水酢酸(2.5 mmol) とジイソプロピルエチルアミン(1.2 mmol)により行った。上記のように樹脂−結合ペプチドを合成した後、分析用ペプチドプローブをトリフルオロアセトリチック分解により除去し、その後、高性能の液体クロマトグラフィ(HPLC)とFAB質量分析によりアミノ酸の分析で確認した。
同様の方法で配列番号２乃至１２のペプチドを合成した。
【００５４】
実施例２：脂質との合成
ペプチド−結合樹脂及びパルミチン酸をベンゾトリアゾール-１-イル−オキシ−トリス−ピロリジノ−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート/Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール/Ｎ−メチルモルホリンが２：１：２の比率で混合された溶液で結合させ、上記ペプチド樹脂を５倍程度過量で添加した。３時間反応させた後、メタノール(３×)でリポペプチド樹脂を洗浄した後、ニンヒドリンテストを経た結果、約９９％の結合が生じたことを確認できた。脂質があまり結合されていないペプチドは、ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−ピロリジノ−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート／Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール／Ｎ−メチルモルホリンが２：１：２の比率で混合された溶液を５倍の過量で添加した後、約１４時間反応させて、二重結合された形態で得られた。上記リポペプチドは、チオアニソール（２５０μｌ）及びエタンジチオール（１５０μｌ）を含むトリフルオロ酢酸（４ｍｌ）を用いて、４時間内に樹脂から分離した。ろ過液は、蒸発により残基に付いている酢酸を除去し、冷たいエテールに加えた後、攪拌した。沈殿されたリポペプチドは、エテールで３回洗浄した。冷却されたアセトン（２０ｍｌ）を含むトリフルオロエタノール／クロロホルム（１：３、３ｍｌ）溶液で沈殿させ、ここに数滴の水を添加することで、さらに精製した。製造されたリポペプチドは、ｔ−ブタノール／水（３：１）溶液で凍結乾燥した。アミノ酸分析及びＦＡＢ質量分析により、Ｎ−末端リシンにパルミトイル−パルミトイルが連結された配列番号１乃至１２のペプチドのリポペプチド各々を確認した。
【００５５】
参考例：ＧＳＴ融合蛋白質の製造
ペプチドの抑制活性を測定するため、特定のペプチドモチーフとＳＨ３ドメインの相互作用を抑制する抑制ペプチドの活性を測定した。多様なＳＨ２及びＳＨ３ドメインは、ｐＧＥＸベクトルシステム(Pharmacia製)を用いてサブクローンした。得られたｐＧＥＸ−Ｅ２は、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ／ＳＨ２）及びグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）／ＳＨ３融合蛋白質をコーディングするように製作した。上記で製作されたｐＧＥＸは、Ｅ．ｃｏｌｉに導入して形質転換させ、形質転換体をＩＰＴＧが存在する液状培地（ＬＢ）で成長させた。ＧＳＴ／Ｅ２融合蛋白質は、標準プロトコール(Current Protocols in Molecular Bionlogy, eds. Ausubel et. al., (NY:John Wiley and Sons, 1991)により精製した。簡単に説明すると、細胞をペレット化し、緩衝液A (50 mM TRIS (pH7.5), 2 mM EDTA, 250 mM NaCl, 5% グリセロール (V/V), 1% Tween (V/V), 1% Triton X-100 (V/V)で再懸濁した後、ここに、2 mM PMSF 及び15 mM 2-メルカプトエタノールをさらに添加した。バクテリアは、超音波粉砕機又はマイクロフルイダイザにより力学的に破壊させ、分解物の溶液層の分画は、緩衝液Ａで再水和させたグルタチオン−アガロースビーズに吸収させた。ビーズが揺動により懸濁液に維持されるまで、吸収を４℃で３０分〜１４時間行った。その後、ビーズを冷たい緩衝液Ａで３回洗浄し、50 mM Tris(pH 8.0)で５回さらに洗浄した。
【００５６】
実験例１：ペプチドとＳＨ３ドメインとの結合測定
実施例１及び実施例２で製造されたペプチドがＳＨ３に結合する能力を測定するため、配列番号１のペプチド（Ｐ１）及びそのリポペプチド（ＬＰ１）をアミノメチルクマリン酢酸塩（aminomethyl coumarine acetate 、以下AMCAという）に結合させた。
【００５７】
各々のペプチド５ｍｇとＡＭＣＡを５０ｍＭ濃度の重炭酸ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ８．５）１ｍｌに溶解し、反応を開始する直前に、５ｍｇ/ｍｌジメチルスルホキシド（ＤＭＦ）を添加した。ペプチドを攪拌しつつ、徐々に５０〜１００μｌのＡＭＣＡ溶液を添加した後、続いて攪拌しつつ４℃で１日間反応を行った。反応後、ＡＭＣＡが結合されたペプチドとＡＭＣＡが結合されないペプチドを、ゲルろ過により分離した。
【００５８】
次いで、ＡＭＣＡ結合されたペプチド複合体（０．０７５〜１．４μＭ）を３．１２μＭＧＳＴ/ＳＨ３融合蛋白質と反応させた後、反応混合物を常温で１分間放置した。共鳴エネルギー転移方法（resonance energy transfer method）及び二重レーザー分光蛍光計（double laser spectrofluorometry 、PTL-3965, 日本国)を用いて、ＧＳＴ/ＳＨ３融合蛋白質のＳＨ３ドメインとＡＭＣＡが結合されたペプチド複合体の結合親和度を測定した。上記方法は、ＡＭＣＡ結合されたペプチドが３５０〜４５０ｎｍで蛍光放出する現象を利用したものである。相対的転移効率は、次のような方法で計算した。
【００５９】
すなわち、２８０ｎｍ照射波長によりＧＳＴ−ＳＨ３融合蛋白質内のトリプトファンが励起されるように、ＧＳＴ/ＳＨ３融合蛋白質及びペプチド−ＡＭＣＡ複合体を含有する試料に、２８０ｎｍ波長を照射し、ＡＭＣＡ−ペプチド複合体は、３５０ｎｍ照射波長により励起され、４５０ｎｍの蛍光を放出するようにした。
【００６０】
その結果、ＡＭＣＡと結合されたペプチドがＧＳＴ融合蛋白質のＳＨ３ドメインと結合するので、２８０ｎｍによるＧＳＴ融合蛋白質のトリプトファンの３５０ｎｍでの蛍光放出度が減少すると同時に、ペプチドに結合されたＡＭＣＡが４５０ｎｍで蛍光放出度が増加することがわかる（図１参照）。このような現象は、複合体中のペプチドがＧＳＴ/ＳＨ３融合蛋白質と結合することにより、ＧＳＴ−ＳＨ３蛋白質内のトリプトファンにより形成された３５０ｎｍの蛍光放出波長を吸収して、複合体中のペプチドが４５０ｎｍ波長の蛍光を放出できるからである。
【００６１】
複合体中のペプチドの量に応じてＡＭＣＡの４５０ｎｍ蛍光放出が増加すると、トリプトファンの３５０ｎｍ蛍光放出は、比例的に減少する反面、ＧＳＴ/ＳＨ３融合蛋白質の４５０ｎｍ蛍光放出は、そのような相関関係が示さない。結果的に、実施例１及び２のペプチドは、ＳＨ３に高い親和力を有することがわかる。
【００６２】
実験例２：細胞内へのパルミトイル化抑制ペプチドの移動の蛍光顕微鏡による検出
上記パルミトイル化抑制ペプチドの細胞内への移動を確認するために、癌細胞がこれらのペプチドで処理された。
結果として、図２に示すように、癌細胞中の特定領域で蛍光が観察された。
実験例３：細胞内へのパルミトイル化抑制ペプチドの分布を示す共焦点顕微鏡測定
癌細胞中の特定領域へのパルミトイル化抑制ペプチドの移動は証明されたが（図２参照）、細胞中でのこれらペプチドの正確な分布は確認されていない。そこで、癌細胞がパルミトイル化抑制ペプチドで処理された。
結果として、図３に示すように、癌細胞内でのパルミトイル化抑制ペプチドは細胞質を超えて核の近くまで分配された。
実験例４：細胞内蛋白質のリン酸化に対する抑制効果の測定
パルミトイル化したペプチドが細胞内信号経路を変化できるかを検査するため、Ｔ細胞収容体（ＴＣＲ）により媒介される信号経路に対して、効果を測定した。ＴＣＲ−媒介信号経路は、ＬｃｋのようなＳｒｃキナーゼによるＣＤ３及びζＩＴＡＭ（免疫収容体チロシン活性化モチーフ）のリン酸化により活性化され、リン酸化したＣＤ３及びζＩＴＡＭは、ＺＡＰ−７０と反応してＺＡＰ−７０のチロシンをリン酸化する。
【００６３】
ジュルカト(Jurkat)細胞及び本発明のペプチド（配列番号１のパルミトイル化したペプチド；ＬＰ１）の混合物、パルミトイル化した（ＬＰｃ）又はパルミトイル化しない（Ｐｃ）比較ペプチド（配列番号１３）を、３７℃で１２時間培養した。細胞分解物は、ホスホチロシンに対する抗体を用いてブロットを行った。
【００６４】
図４から明らかなように、ＬＰ１処理されたグループにおいて、１００μｌ/ｍｌ又は４００μｌ/ｍｌのＬＰ１（図４Ｂのｂ、ｃ列）では、細胞内チロシンのリン酸化が大幅に減少する反面、ＬＰｃ−及びＰｃ−処理されたグループでは、基本的な水準のリン酸化だけが示された。図４Ａは、ＬＰ１の濃度を２μｌ/ｍｌから２００μｌ/ｍｌに多様にして６時間培養した時の結果を示す図である。チロシンリン酸化は、５０μｌ/ｍｌ〜１００μｌ/ｍｌの濃度（図４Ａのｃ、ｄ列）で減少し、約２００μｌ/ｍｌの濃度では大幅に減少する。
【００６５】
このような結果は、本発明のペプチドがチロシンリン酸化により開始される信号伝達の初期過程を有効に抑制できることを証明する。これに加えて、図示していないが、パルミトイル化したペプチド（ＬＰ１）は、パルミトイル化しないペプチドよりチロシンリン酸化に一層高い抑制効果を示し、これは、パルミトイル化が細胞へのペプチド移送効率を増加できることを示唆する。
【００６６】
実験例５：ペプチドが信号伝達機構の構成成分のリン酸化に及ぼす影響分析
上記実験例２の結果から明らかなように、本発明のパルミトイル化したペプチドは、細胞質内ホスホチロシンにより誘導される初期信号伝達段階の関連分子を抑制すると考えられる。ジュルカトのようなＴ細胞の信号伝達経路の多様な初期現象のうち、チロシンのリン酸化は、Ｌｃｋ、ＦｙｎのようなＳｒｃ系列キナーゼにより調節される反面、脱リン酸化は、蛋白質チロシンホスファターゼにより調節される。次いで、Ｔ細胞でＴＣＲとの結合及びＳｒｃキナーゼによるＣＤ３のリン酸化が生じ、リン酸化したＣＤ３は、ＺＡＰ−７０を補充する。ＺＡＰ−７０は、ＣＤ−３鎖とＺｅｔａ鎖内のリン酸化したＩＴＡＭｓに結合することにより、リン酸化したゼタ鎖の蓄積を促進し、チロシンホスファターゼによる脱リン酸化を阻止する。従って、ＬＰ１によるゼタ鎖のリン酸化の抑制は、直接的にＬｃｋの作用を防ぐか、又は間接的にＺＡＰ−７０がリン酸化したＩＴＡＭｓに結合することを防ぐことにより行われる。従って、ＬＰ１又はＰｃの作用は、Ｌｃｋ、ＺＡＰ−７０、ＣＤ３又はゼタのリン酸化程度を測定することにより決定することができる。
【００６７】
ジュルカト細胞を50 (g/ml又は300 (g/ml濃度のパルミトイル化ペプチドで６時間処理し、その後ルペプチン(leupeptin), アプロチニン(aprotinin), ホスファターゼ抑制剤(2 mM sodium orthovanadate, 0.4 mM EDTA, 10 mM sodium fluride and 10 mM sodium pyrophsphate), 50 mM トリス-塩酸(pH 8.0), 300 mM 塩化ナトリウム及び0.5% トリトンX-100を含有する緩衝溶液で再懸濁した。細胞溶解物をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで電気泳動(4-20% SDS-PAGE) した後、ニトロセルロース膜に移した。
【００６８】
ニトロセルロース膜を、５％脱脂牛乳を含有したＰＢＳ緩衝溶液で処理し、下記の抗体を使用して免疫ブロットを行うことにより、蛋白質水準での発現程度を調査した。抗体として、クローン4G10 抗−ホスホチロシン抗体(Upstate), 抗−ZAP−70抗体(Transduction Laboratories), 抗−Lck抗体(Santa Cruz)及び抗−Zeta(() 鎖抗体(Santa Cruz)を、各々1:1000, 1:1000, 1:1000及び1:500に希釈して使用し、HRPO結合された二次抗体(Amersham)は、1:2000に希釈して使用した。
【００６９】
その結果、ＬＰ１によりＬｃｋキナーゼ活性は著しく低下するが、ＬＰｃ又はＰｃによっては低下しなかった（図５参照）。図５において、ＬＰ１、ＬＰｃ及びＰｃは、図４と関連して説明したものと同様の意味を有し、Ｃは、対照群を意味する。また、ＣＤ３ゼタのリン酸化は、ＬＰ１により非常に低減され、これは、ＣＤ３ゼタのリン酸化がＬｃｋキナーゼ活性の減少に否定的に影響することを意味する。
【００７０】
ＬＰ１の抑制効果は、ＺＡＰ−７０に対して一層強い。ＺＡＰ−７０リン酸化の抑制は、リン酸化の力動的な変化を誘導し、特にＬｃｋ−誘導ＺＡＰ−７０リン酸化に対する抑制作用は、ＬＰ１の濃度が２００μｇ/ｍｌ以上の場合、最も強い。従って、ＬＰ１がＳｒｃキナーゼを抑制してジュルカト細胞の初期信号伝達を遮断し、１×１０6細胞当たり２００μｇ/ｍｌ以上に処理される時、最も強い抑制効果を示す。
【００７１】
実験例６：ペプチドが細胞内カルシウムイオンの移動に及ぼす影響分析
上記実験例３から明らかなように、本発明のペプチドは、Ｌｃｋ及び関連蛋白質のリン酸化を抑制し、これは、究極的に細胞内カルシウムイオンの移動のように信号伝達の後半部に生ずる現象にも影響を及ぼす。
【００７２】
本発明のペプチドが信号伝達の後期現象を抑制するかを調べるため、ジュルカト細胞をLP1 (100 (g/ml) 、他のペプチド（図６Ｂ）又は緩衝液のみ（図６Ａ）で37oCで１時間処理した。処理された細胞は、３ｍＭのＦｌｕｏ−３ＡＭを添加したＲＰＭＩ１６４０培地で5 ( 106 cells/mlとなるように再懸濁し、３７℃で３０分間培養した。その後、細胞を、氷に冷却されたＬＯＣＫＳ緩衝溶液（１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭ硫酸マグネシウム、５ｍＭ塩化カリウム、１０ｍＭグリシン、１５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４）で洗浄し、同じ緩衝溶液で最終濃度が1 ( 106 cells/mlとなるように再懸濁した。上記処理された細胞を、使用前まで光を遮断した状態で氷に保管した。流動細胞測光分析(flow cytometric analysis)のため、細胞を３７℃で５分間培養し、抗−ＣＤ３抗体（ＯＫＴ３）を添加する前後の細胞内カルシウムイオンの濃度をFACScalibur (Becton-Dickinson, San Jose, CA)で測定した（図６参照）
【００７３】
その結果、ＬＰ１を処理した場合には、ＯＫＴ３のＴＣＲ刺激によるカルシウムイオンの流出が生じないが、イオノマイシンにより誘導されるカルシウムイオンの流入には影響を及ぼさなかった。このような事実は、本発明のペプチドがＴＣＲ−媒介信号伝達過程中に細胞内カルシウム濃度増加などの信号伝達の下位事件に影響を及ぼすことを示す。
【００７４】
実験例７：抗癌効果の測定：ＭＴＳ分析による細胞増殖の測定
生体の抗癌効果を検査するため、ヒトの肝細胞癌腫細胞(Hepatocellular;SNU-398)を韓国細胞株銀行から分譲された。肝細胞癌腫細胞をＲＰＭＩ−１６４０（シグマ）培地（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）及び５×１０-5Ｍ ２−メルカプトエタノール（シグマ）を用いた培養液で保管した。
【００７５】
SNU-398細胞(5 x 105細胞/ウェル)を９６−ウェルプレートに接種した。検査培地は、10% FBS (Gibco BRL), 4 mM L-グルタミン(シグマ), ゲンタマイシン(Gibo BRL)及び5 x 10-5 M 2-メルカプトエタノール（シグマ）を含有するＲＰＭＩ１６４０（シグマ）から構成される。パルミトイル化抑制ペプチド（ＬＰ１及びＬＰ２）を多様な濃度で処理した後、３７℃のＣＯ2培養器で２４時間培養した。その後、20 (l/ウェルの濃度でCellTiter 96R AQueous 試薬溶液(Promega)を添加した。37oC、5% CO2のCO2培養器で１〜２時間培養した後、ＥＬＩＳＡプレート判読機(Bio-Rad)を用いて４９０ｎｍでの吸光度を測定した。各々の結果は、実験を３回繰り返した後、平均±Ｓ．Ｄ．で表示したものである。０細胞/ウェルで示された背景吸光度は、これらの結果値から差し引かれた。
【００７６】
比較のため、比較ペプチド（Ｐｃ、配列番号１３）及びパルミトイル化Ｐｃ（ＬＰｃ）を用いていろいろの実験を行った。
ＬＰ１を処理した場合、癌細胞の増殖が著しく減少し、特に３０μｇから抑制効果が示し始め、１６０μｇから癌細胞が元より1/4以下の水準に急激に減少した（図７参照）。図８は、ペプチド処理による細胞成長変化を顕微鏡で分析した結果であって、ＬＰ１（図８Ａ）処理は、癌細胞の密度及び癌細胞の形態学的変化を非常に減少させる反面、対照群（図８Ａ）、Ｐｃ処理群（図８Ｂ）及びＬＰｃ処理群（図８ｃ）は、そのような変化がないか、有意でない変化が示されるだけである。ＬＰ１処理された癌細胞は、細胞サイズが減少し、培地に対する固着力がなくなった。
【００７７】
（産業上利用可能性）
以上説明したように、本発明の抑制ペプチドは、Ｌｃｋ等が関連する信号伝達だけでなく、体細胞分裂に関する信号伝達に含まれたＳＨ３ドメインを有する蛋白質に対する有効な抑制効果を有する。従って、本発明のペプチドは、効果的な抗癌剤として使用することかできる。
【００７８】
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【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  図1は、本発明の抑制ペプチドとＳＨ３−ＧＳＴ融合蛋白質の結合親和度を示すグラフである。
【図２】  図２は、パルミトイル化した抑制ペプチドが細胞内に運搬された状態を確認した蛍光顕微鏡写真である。
【図３】  図３は、パルミトイル化した抑制ペプチドの細胞内での分布度を確認した共焦点顕微鏡写真である。
【図４】  図４は、パルミトイル化した抑制ペプチドがチロシンのリン酸化に及ぼす影響を示す電気永動写真である。
【図５】  図５は、パルミトイル化した抑制ペプチドが信号伝達経路構成成分のリン酸化に及ぼす影響を示す電気永動写真である。
【図６】  図６は、抑制ペプチドが細胞内カルシウムイオン濃度に及ぼす影響を示す流動細胞測光の写真である。
【図７】  図７は、ＭＴＳ分析により抑制ペプチドが癌細胞の増殖に及ぼす影響を示すグラフである。
【図８】  図８は、本発明の抑制ペプチドを処理した癌細胞の数及び形態の変化を示す顕微鏡写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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