(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
α−アミラーゼをコード化したポリヌクレオチドを含んでいるベクターをグラム陰性細菌細胞内へ転移させ、そしてその細胞を受容能導入方法で処理して受容能を持つ細胞を生産させることからなる、＿受容能を持つグラム陰性細菌細胞を製造する方法。
【請求項２】
該細胞が大腸菌である第１項の方法。
【請求項３】
α−アミラーゼをコード化したポリヌクレオチドが好熱性細菌から単離されたものである第１項の方法。
【請求項４】
該受容能導入方法が酢酸カリウム、ＫＣｌ、ＭｎＣｌ2、ＣａＣｌ2、グリセロール及びヘキサミン塩化コバルトから成る緩衝液で細胞を洗浄する工程を用いる標準的な高度の受容能導入方法である第１項の方法。
【請求項５】
該大腸菌細胞が次の遺伝子型をもつ細胞から成る群から選ばれる第２項の方法。
［ｅ１４-（ｍｃｒＡ）、Δ（ｍｃｒＣＢ−ｈｓｄＳＭＲ−ｍｒｒ）１７１、ＳｂｃＣ、ｒｅｃＢ、ｒｅｃＪ、ｕｍｕＣ：：Ｔｎ５（Ｋａｎr）、ＵｖｒＣ、ｓｕｐＥ４４、ｌａｃ、ｇｙｒＡ９６、ｒｅｌＡ１、ｔｈｉ−１、ｅｎｄＡ１［Ｆ’ｐｒｏＡＢ、ｌａｃＩQＺΔＭ１５、Ｔｎ１０、（ｔｅｔr）］］
［ｒｅｃＡ１、ｅｎｄＡ１、ｇｙｒＡ９６、ｔｈｉ−１、ｈｓｄＲ１７、ｓｕｐＥ４４、ｒｅｌＡ１、ｌａｃ、［Ｆ’ｐｒｏＡＢ、ｌａｃＩQＺΔＭ１５、Ｔｎ１０（ｔｅｔr）］］及び
［Δ（ｍｃｒＡ）１８３、Δ（ｍｃｒＣＢ−ｈｓｄＳＭＲ−ｍｒｒ）１７３、ｅｎｄＡ１、ｓｕｐＥ４４、ｔｈｉ−１、ｒｅｃＡ、ｇｙｒＡ９６、ｒｅｌＡ１、Ｌａｃ、［Ｆ’ｐｒｏＡＢ、ｌａｃＩQＺΔＭ１５、Ｔｎ１０（ｔｅｔr）］］
【請求項６】
該方法が更に受容能を持つ細胞を凍結する工程を含む第１項の方法。
【請求項７】
α−アミラーゼをコード化したポリヌクレオチドの発現のための遺伝子的構築を含んでいる受容能を持つグラム陰性細菌細胞＿。
【請求項８】
大腸菌である、第７項の受容能を持つ細胞。
【請求項９】
α−アミラーゼをコード化したポリヌクレオチドが好熱性細菌から単離されたものである第７項の受容能を持つ細胞。
【請求項１０】
該細胞が酢酸カリウム、ＫＣｌ、ＭｎＣｌ2、ＣａＣｌ2、グリセロール及びヘキサミン塩化コバルトから成る緩衝液で細胞を洗浄する工程を用いる標準的な高度の受容能導入方法で作られる第７項の受容能を持つ細胞。
【請求項１１】
該細胞が凍結されたものである第７項の受容能を持つ細胞。
【請求項１２】
第１項の方法で作成された受容能を持つ細胞。
【請求項１３】
第６項の方法で作成された受容能を持つ細胞。
【請求項１４】
＿ＡＴＣＣ番号＃６９４８０、ＡＴＣＣ番号＃６９４８１及びＡＴＣＣ番号＃６９４８２よりなる群から選ばれる大腸菌細胞株。
【発明の詳細な説明】
［技術分野］
この発明は一般に遺伝子工学の分野に関するものである。さらに具体的にはこの発明は高度に形質転換可能な細菌細胞およびそのような細胞を生産する方法に関するものである。
［発明の背景］
組換えＤＮＡ構築の生体内生成と遺伝子ライブラリーの生産における重要な工程は、他の遺伝子工学技術と同様に、ＤＮＡ（及びその他の類似のポリヌクレオチド）の宿主細胞への挿入プロセスである。宿主細胞へポリヌクレオチドを導入するプロセスは形質転換とよばれる。細菌細胞が種々の遺伝子工学実験の宿主細胞としてしばしば用いられる。遺伝子工学実験のために最もしばしば用いられる細菌種のなかに大腸菌Escherichia coli（E. coli）がある。大腸菌は外因性ＤＮＡを細胞内へ自然には取り入れない。大腸菌を、外因性ＤＮＡの摂取が出来るようにするプロセス、すなわち受容能を導入する工程に付すことが必要である。他の細菌細胞と同様に、外因的に付加されたＤＮＡを摂取できるようにした大腸菌は受容能を持つ細胞（コンピテント細胞）とよばれる。
大腸菌を受容化させるには多くの確立された方法がある。これらの方法はMandel and Higa（J. of Mol. Biol. 53:159（1970））のＣａＣｌ2培養法や多くのそのよく知られた変法を含む。Hanahanは大腸菌細胞の形質転換の効率に影響する因子の詳細な研究を行い（J. Mol. Biol. 166:557-580（1983））、そこで彼は高度に受容能を持つ大腸菌の最良の生産方法として一般に認められているところの、酢酸カリウム、ＫＣｌ、ＭｎＣｌ2、ＣａＣｌ2及びヘキサミン塩化コバルトから成る緩衝液内で大腸菌細胞を洗浄する工程から成る高度に受容能を持つ大腸菌細胞の生産方法を記載している。受容能を持つ大腸菌細胞を生産する他の方法はJesse他によって記載されている（アメリカ特許４，９８１，７９７号）。Jesse他は、受容能導入プロセスの一部として１８℃から３２℃の温度範囲で大腸菌細胞を生育させることによって高度のレベルの受容能が誘導され得ることを示している。
大腸菌細胞が受容能を持つようにする種々の技術は、形質転換効率が広範に変化するコンピテント大腸菌細胞の組成物を生産する。ＤＮＡがコンピテント大腸菌に入る機構は完全には理解されていない。コンピテント大腸菌細胞の一つの組成物が、他のコンピテント大腸菌細胞組成物のそれと形質転換効率において相違する理由もまた完全には理解されていない。HanahanはEscherichia Coli and Salmonella Thyphimurium: Celluar and Molecular Biology, editor F. C. Neidhardt, American Society of Microbiology, Washington, D. C.（1987）に於いて、大腸菌形質転換について知られていることの総説を提供している。コンピテント大腸菌細胞、すなわち形質転換される能力のある細胞の高い百分率の製造における細胞の１分画のみがＤＮＡ摂取に必要的な受容能をもつ。すなわちコンピテント大腸菌細胞組成物を生成する若干の優れた方法は、ＤＮＡ摂取の個々の高い速度レベルまたはＤＮＡの大きな断片を摂取する能力を示す大腸菌細胞を含有するものとは逆に、コンピテント大腸菌細胞の高い百分率を含有するコンピテント大腸菌組成物の形成のみをもたらすであろう。または、コンピテント細胞を生成する他の方法は、高い形質転換効率を「個々に」もつコンピテント大腸菌細胞の形成をもたらすであろう。HanahanはJ. Mol. Bio. 166:557-580（1983）において、コンピテント大腸菌細胞は細胞エンベロープを横切ってのＤＮＡの輸送のチャンネルを含んでいること、また大腸菌細胞の形質転換の受容性を決定する限定された工程は細胞が興味あるＤＮＡを摂取した後に細胞におこる事項すなわち樹立工程であることを推測した。コンピテント大腸菌細胞組成物の形質転換効率に影響する他の因子は細胞の遺伝子型である。大腸菌のある株は、同様な受容能導入方法にふしたときに大腸菌の他の株よりも高度に形質転換的なコンピテント細胞組成物を生じることが知られている。Hanahan（アメリカ特許４，８５１，３４８号）は、種々の受容能導入方法を用いて高度に形質転換可能な大腸菌細胞組成物を生産するためには如何にしてE. coli deoR変種が用い得るかを記載している。
大腸菌を形質転換に受容的にできることが示されて以来、出来るだけ最も受容性の大腸菌細胞を生産することが興味あることであった。J. Mol. Bio. 166:557-580（1987）に記載の酢酸カリウム、ＫＣｌ、ＭｎＣｌ2、ＣａＣｌ2、グリセロール及びヘミサミン塩化コバルトから成る緩衝液中で細胞を洗浄する工程を用いるHanahanの方法を用いて得られた最大級のレベルの形質転換効率は、スーパーコイル化されたｐＵＣ１８プラスミドＤＮＡの１マイクログラムあたり約１ｘ１０9の形質転換体である。細胞１個あたりではこれは、現実に形質転換された数でいえば、３０個のうち約１個の細胞に相当する。しかし、優れた形質転換性を示す大腸菌の新株と同様に、優れた形質転換性のコンピテント大腸菌を生産する新規な改良方法の必要性は依然として存在している。そのような方法や株は、所望の結果を得るに要する形質転換の数を最小にするような遺伝子工学分野のほとんどの研究者にとって広範な興味があろう。すなわち例えば大きな遺伝子ライブラリーは、複合組換え分子の構築がより容易に得られるのと同様に、より容易に築かれ得るであろう。
［発明の要約］
ここに述べる発明は、広範な種類の受容能導入方法に適合できる大腸菌のような高度に形質転換し得るグラム陰性細菌の製法を提供する。本発明の方法は、好ましくは澱粉分解活性のような炭水化物分解活性をもつ酵素をコード化し（そして発現可能な）ポリヌクレオチド配列を含む遺伝子的構造の導入を含む。この酵素は好ましくは細胞の周辺腔の中に位置している。しかし本発明の実施は発現炭水化物分解酵素の細胞位置についてのいかなる特定の理論にも依存しない。酵素の発現のための炭水化物分解活性との遺伝子的構築を含むコンピテント大腸菌細胞は、そのような遺伝子的構築を欠いている類似の大腸菌細胞よりも外因性ＤＮＡでより容易に形質転換することが示されている。
ここに提供される発明は、形質転換に受容性とされた炭水化物分解活性で酵素をコード化するポリヌクレオチド配列を含有する大腸菌を含む。興味のある炭水化物分解酵素はα−アミラーゼ、特に好熱性の細菌から単離されたα−アミラーゼを含む。本発明のコンピテント細胞は長期の貯蔵のために凍結してもよい。
本発明の他の観点は、例えば形質転換に受容性のある大腸菌細胞のようなグラム陰性細菌を得る方法を含む。これらの方法は炭水化物分解活性のある酵素を大腸菌の中へコード化するポリヌクレオチド配列を転移させ、次いでHanahan（J. Mol. Bio. 166:557-580（1983）に記載のように酢酸カリウム、ＭｎＣｌ2、ＣａＣｌ2、グリセロール及びヘキサミン塩化コバルトから成る緩衝液で細胞を洗浄する工程から成る標準的な高度の受容能導入方法を含む種々の受容能導入方法を用いての細胞受容能を得させることから成る。
［特定の実施態様の説明］
ここに述べる発明は、遺伝子的構築を欠く類似の大腸菌細胞と比べ受容能導入方法を行ったあと増大した形質転換効率を持たせるように遺伝子的に変化させた大腸菌細胞のようなグラム陰性細菌を含む。本発明の細胞は、好ましくはα−アミラーゼのような澱粉分解酵素の如き炭水化物分解酵素の発現のために遺伝子的構築の付加により修飾されている。大腸菌細胞への炭水化物分解酵素の発現のための遺伝子的構築は、受容能導入方法で受容能を持つようにしたあと増大した形質転換効率をもつ大腸菌細胞を与える。本発明はまた、炭水化物分解酵素の発現のための遺伝子的構築を含むコンピテント大腸菌細胞の組成物；そのような細胞の凍結物；およびコンピテント細胞の製法も含む。
ここで使った「澱粉分解酵素」という用語は、炭水化物分子の構成モノサッカライド単位の間に存在する少なくとも１種の結合を加水分解する能力のある酵素を意味する。ここで使った「澱粉分解酵素」という用語は、炭水化物分子の構成モノサッカライド単位の間に存在する少なくとも１種の結合を加水分解する能力のある酵素を意味する。ここで使った「α−アミラーゼ」という用語は、澱粉やグリコーゲンのようなグリコシド結合を含むポリサッカライドのα−１→４グルコシド結合の加水分解を触媒する能力のある酵素を意味する。好ましい炭水化物分解酵素は澱粉分解酵素である。好ましい澱粉分解酵素はα−アミラーゼである。本発明で用いる特に好ましい澱粉分解酵素は、好熱性細菌から単離されたα−アミラーゼ、特に最近単離された無特性の好熱性細菌からのα−アミラーゼである。無特性の好熱性細菌からのこのα−アミラーゼをコード化するポリヌクレオチド配列は、ＡＴＣＣ番号６９４８０、６９４８１及び６９４８２号をもつ大腸菌株に存在するＦＡＭＹプラスミドに見いだされる。
本発明に用いる炭水化物分解酵素をコード化するポリヌクレオチド配列を含む遺伝子的構築は、炭水化物分解酵素の発現を与えるようにデザインされる。炭水化物分解酵素の発現は構築的であっても導入的であってもよい。大腸菌やその他のグラム陰性細菌中の興味ある遺伝子の発現方法は公知である。そのような技術の例としてはGene Expression Technology: Methods and Enzymology, Vol.185, Goeddel, Editor, Academic Press, Incorporated, San Diego, California（1991）を参照せよ。興味ある炭水化物分解酵素をコード化するポリヌクレオチドを含む遺伝子的構築は、細菌細胞中で独立して複製するか又は細菌細胞のゲノムの中へ取り入れるようにデザインされる。炭水化物分解酵素をコード化するポリヌクレオチド配列に加えてこの遺伝子的構築は、例えばプラスミド、ファージ、ファージミド等のような多くの通常の遺伝子的ベクターの如何なるものから成っていても良い。炭水化物分解酵素をコード化するポリヌクレオチドを含む遺伝子的構築は、例えば形質転換、接合、エレクトロポレーション等の種々の形質転換技術の如何なるものによっても大腸菌細胞の中へ導入できる。
本発明のコンピテント大腸菌細胞は、発現のためのポリヌクレオチド配列をコード化する炭水化物分解酵素を含む大腸菌細胞を受容能導入方法にふすることによって製造される。「受容能導入方法」という用語は、大腸菌細胞を外因性ＤＮＡによる形質転換に受容的にするのに用いるあらゆる方法を意味する。「形質転換効率」という用語は、与えられたコンピテント細胞組成物の受容的レベルの尺度である。形質転換効率は、コンピテント細胞組成物へ付加される外因性ＤＮＡの各マイクログラム（又はほかの量）を得る形質転換体の数で表される。与えられた形質転換プロトコールを用いて測定したところの与えられたコンピテント細胞組成物の形質転換効率が形質転換に用いた特定の外因性ＤＮＡに応じて変化することは当業者に好まれるであろう。外因性ＤＮＡのトポロジーやサイズのような因子は、測定された形質転換効率に影響し得る。大腸菌（及びその他のグラム陰性細菌）に受容能を導入する方法は、分子生物学の領域の平均的当業者によく知られている。受容能導入技術はそれぞれかなり異なっているが、殆どすべての受容能導入技術は細胞を多価カチオンと約０℃で接触させることから成っている。本発明で用いられる受容能導入技術は次のものを含むが但しこれらに限定されない。すなわちMandel and Higa（J. Mol. Bio., 53:159（1970）のＣａＣｌ2培養法；酢酸カリウム、ＫＣｌ、ＭｎＣｌ2、ＣａＣｌ2、グリセロール及びヘキサミン塩化コバルトから成る緩衝液中で細胞を洗浄する工程を用いるHanahan, J. Mol. Bio., 166:557-580（1983）の方法。Hanahanの方法は本発明で用いるのに特に好ましい。Hanahan: J. Mol. Bio. 166:557-580（1983）の他に、酢酸カリウム、ＫＣｌ、ＭｎＣｌ2、ＣａＣｌ2、グリセロール及びヘキサミン塩化コバルトから成る緩衝液中で細胞を洗浄する工程を用いる標準的な高度効率の受容能導入方法を実施するための詳細なプロトコールはこれ以外に例えばアメリカ特許４，９８１，７９７号やSambrook et al., Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Press（1989）に見られる。本発明のコンピテント細胞は、最もよく知られている形質転換方法、典型的には外因性ＤＮＡの存在下にコンピテント細胞を熱パルスに露出する工程を含む方法を用いて形質転換することができる。そのような形質転換方法の例はMandel and Higa, J. of Mol. Bio. 53:159（1970）およびHanahan, J. Mol. Bio. 166:557-580（1983）に見られる。
受容能導入方法で大腸菌が受容能を持つようにしたあと、細胞を凍結してその受容能を解凍後も保持させることができる。凍結したコンピテント細胞は本発明の特に有用な実施態様である。何故ならばそれらは長時間貯蔵ができ、新しいコンピテント細胞製剤をつねに製造する必要がなくなるからである。凍結コンピテント細胞製造のプロトコールは当業者に公知である。そのようなプロトコールの一例はHanahan, J. Mol. Bio. 166:557-580（1983）に見られる。
炭水化物分解酵素の大腸菌中への発現のために遺伝子構築の導入は、多くの大腸菌の変種株に受容的とした大腸菌細胞組成物の形質転換効率を増大させるために役立つ。炭水化物分解酵素の発現のために遺伝子的構築を含む大腸菌細胞株の遺伝子型は、与えられた遺伝子工学実験に特に有用なように選択される。例えばＬａｃＺαフラグメント相補性の故にスクリーン可能なクローニングベクターは、ＬａｃＺ遺伝子の中に特定の突然変異を含有できる。同様に細胞は、形質転換ＤＮＡによる相補性を提供するために色んな他の欠失や突然変異を含むことができる。宿主細胞は、クローニングをはかどらせるための限定修飾を所有しても欠如していてもよい。宿主細胞はまた、例えばＲｅｃＡやＲｅｃＢＣのような一つまたはそれより多い組換え系統を欠如していてもよい。本発明で用いられる好ましい大腸菌株は、アメリカ特許４，８５１，３４８号でHanahanが述べているようなｄｅｏＲ遺伝子中に突然変異を含む細胞である。本発明で用いられる特に好ましい大腸菌株は、それぞれＡＴＣＣ番号６９４８０、６９４８１及び６９４８２号をもち、好熱性細菌から単離されたα−アミラーゼの発現のために遺伝子構築の付加で修飾されたＸＬ１−ＢｌｕｅTM株（Stratagene, La Jolla, California）、ＸＬ１−ＢｌｕｅＭＲ株およびＳＵＲＥTM（Stratagene, La Jolla, California）である。ＡＴＣＣ番号６９４８０、６９４８１及び６９４８２号の大腸菌株中にα−アミラーゼを含有するプラスミドは、平均的な当業者に公知の技術を用いて他の細菌株へ容易に転移できる。同様に平均的な当業者は、６９４８０、６９４８１及び６９４８２号の大腸菌株中べプラスミドからのα−アミラーゼ遺伝子を切りとり、そして遺伝子の新規細菌株への転移に先だってα−アミラーゼ遺伝子の新規遺伝子的構築へ転移することができる。
大腸菌について参照がなされたけれど、他のグラム陰性細菌細胞も更に受容的とすることができる。例えばPseudomonas, Rhizobium, Agrobacterium, Salmonella, Proteus, Shigella, Klebsiella等の属からの細胞である。
上記の本発明は次の実施例への参照によってさらに理解され得る。これらの実施例は本発明の説明の目的のために提供されたもので、本発明を限定するものとして解釈してはならない。
［実施例］
実施例１  高度に受容能を持つ大腸菌株の創製とテスト
（背景）
最近に単離された無特性の好熱性細菌からのα−アミラーゼ遺伝子をまず独立に複製したプラスミドＤＮＡエレメント上に挿入し、次いで接合によりいくつかの大腸菌株中へ導入した。このα−アミラーゼ遺伝子は、ＡＴＣＣ番号６９４８０、６９４８１及び６９４８２号の大腸菌株中に存在するプラスミド中に見いだされた。ここに得られたα−アミラーゼ遺伝子を含む株および対応する親株は、Hanahan（J. Mol. Biol.（1983））の方法を用いて受容能を持つようにした。株を含むα−アミラーゼ遺伝子の形質転換効率を、α−アミラーゼ遺伝子を欠いている類似の株の形質転換と比較した。
（材料と方法）
この作業に用いた大腸菌株はＸＬ１−Ｂｌｕｅ、ＳＵＲＥTM、ＸＬ１−ＭＲ、ＳＣＳ−１、ＮＭ５２２及びＢＢ４株であった。これら細胞の遺伝子型は次のようである。ＳＵＲＥTM［ｅ１４-（ｍｃｒＡ）、Δ（ｍｃｒＣＢ−ｈｓｄＳＭＲ−ｍｒｒ）１７１、ｓｂｃＣ、ｒｅｃＢ、ｒｅｃＪ、ｕｍｕＣ：：Ｔｎ５（Ｋａｎr）、ｕｖｒＣ、ｓｕｐＥ４４、ｌａｃ、ｇｙｒＡ９６、ｒｅｌＡ１、ｔｈｉ−１、ｅｎｄＡ１［Ｆ’ｐｒｏＡＢ、ｌａｃＩQＺΔＭ１５、Ｔｎ１０、（ｔｅｔr）］］；ＮＭ５２２［ｓｕｐＥ，ｔｈｉ−１、Δ（ｌａｃ−ｐｒｏＡＢ）、Δ（ｈｓｄＳＭＲ−ｍｃｒＢ）５（ｒk−ｍk）、［Ｆ’ｐｒｏＡＢ，ｌａｃＩQＺΔＭ１５］］；ＸＬ１−Ｂｌｕｅ［ｒｅｃＡ１、ｅｎｄＡ１、ｇｙｒＡ９６、ｔｈｉ−１、ｈｓｄＲ１７、ｓｕｐＥ４４、ｒｅｌＡ１、ｌａｃ、［Ｆ’ｐｒｏＡＢ、ｌａｃＩQＺΔＭ１５、Ｔｎ１０（ｔｅｔr）］］；ｘＬ１−ＢｌｕｅＭＲＦ’［Δ（ｍｃｒＡ）１８３、Δ（ｍｃｒＣＢ−ｈｓｄＳＭＲ−ｍｒｒ）１７３、ｅｎｄＡ１、ｓｕｐＥ４４、ｔｈｉ−１、ｒｅｃＡ１、ｇｙｒＡ９６、ｒｅｌＡ１、ｌａｃ、［Ｆ’ｐｒｏＡＢ、ｌａｃＩQＺΔＭ１５、Ｔｎ１０（ｔｅｔr）］］；ＤＨ５α［ｓｕｐＥ４４、ΔｌａｃＵ１６９（Φ８０ｌａｃＺΔＭ１５）ｈｓｄＲ１７、ｒｅｃＡ１、ｅｎｄＡ１、ｇｙｒＡ９６、ｔｈｉ−１、ｒｅｌＡ１］；ＳＣＳ１：ｒｅｃΔ１、ｇｙｒＡ９６、ｅｎｄＡ１，ｔｈｉ−１，ｈｓｄＲ１７、ｓｕｐＥ４４、ｒｅｌＡ１；ＢＢ４：ｅ１４-（ΔｍｃｒＡ）、ｈｓｄＲ５１４、ｓｕｐＥ４４、ｓｕｐＦ５８、ｌａｃＹ１又は（ｌａｃＩＺＹ）6、ｇａｌＫ２、ｇａｌＴ２２、ｍｅｔＢ１、ｔｒｐＲ５５、Δ（ａｒｇＦ−ｌａｃ）ｕ１６９、Ｆ’［ｌａｃＩQＺΔＭ１５ｐｒｏＡＢｎ１０（ｔｅｔr）］。これらの株の遺伝子型はまた他の場所と共にStratagene（La Jolla, California）1993のカタログの付録の中に見いだされ得る。
形質転換および受容能導入方法は本質的には、Hanahan, J. Mol. Bil. 166:557-580（1983）に記載の標準的な高度受容能導入法による。接合細胞交配は、興味ある供与体と受容体をそれらの指数的成長期のあいだ等モルで混合し、ゆるやかに撹拌しながら３７℃に６０分培養し、そして１０-3から１０-4希釈で適当な選択プレート上でプレート培養して行われた。
制限酵素消化や連結反応のような全てのＤＮＡ操作は、Stratagene（La Jolla, California）から入手した酵素を用いメーカーの勧める条件に従って行われた。（ＲＳＦ１０１０誘導体ｐＡＬ２０５へのα−アミラーゼ遺伝子のクローニング）好熱細菌からのアミラーゼ遺伝子を含有するｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔTMＩＩベクター誘導体であるｐＭＢ１００をＸｂａＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、そして適切なＤＮＡフラグメントを単離しこれらの同じ２つの酵素で消化したｐＡＬ２０５に連結した。連結混合物をＳＣＳ１へ形質転換させ、ＴｅｔRＣａｍRコロニーを選択した。これら形質転換体からのプラスミドＤＮＡを単離し、制限酵素分析にふしてアミラーゼ遺伝子の存在を確認した。
（相同組換えによるＦＡＭＹの生成）
大腸菌株ＢＢ４（Ｒｅｃ+、ＮａｌＳ、ＦｌａｃｌqＺＭ１５、ｐｒｏＡＢ、Ｔｎ１０（ｔｅｔＲ））をｐＡＬ２０５ＡＭＹＤＮＡで形質転換させ、ＣａｍRコロニーを選択した。次にｐＡＬ２０５ＡＭＹをもつＢＢ４細胞をＸＬ１ＭＲ細胞（ＮａｌR、Ｆ’、ＴｅｔS、ＣａｍS）と接合的に交配させ、そしてＮａｌR、ＴｅｔR、ＣａｍR相互接合体を選択した。ｐＡＬ２０５ＡＭＹは自己伝達性の能力がないので、ＣａｍR相互接合体を得るもっとも良い手段は、交配前にＢＢ４（Ｒｅｃ+）宿主中の両方のプラスミド上の相同的ＴｅｔR遺伝子の間の相同的組換え現象によるものであった。コインテグレートプラスミドの存在は、ここに得た株であるＸＬ１−ＭＲＦＡＭＹをＮＭ５２２（Ｆ’）と交配させて確認した。この「逆」交配からの全ての相互接合体は同時にＴｅｔRとＣａｍRであった。加えて、アミラーゼ特異性プライマーを用いたＡＬ１ＭＲＦＡＭＹのＰＣＲ増幅は、ｐＢＭ１００とｐＡＬ２０５ＡＭＹから増幅したフラグメントでアガロースゲル上で共泳動した増幅生産物を与えた。
（形質転換プロトコール）
Hanahanの方法で製造した冷凍コンピテント細胞を氷の上で解凍した。解凍中、この細胞を緩やかに手で混ぜた。細胞１００μｌを別の予め冷却した１５ｍｌのＦａｌｃｏｎ２０５９ポリプロピレン管の中へ入れた。β−メルカプトエタノールの１．７μｌ（貯蔵した１４．４Ｍのβ−メルカプトエタノールを高純度の水で１：１０に希釈したもの）を細菌１００μｌに加えて最終濃度を２５ｍＭとした。管の内容物をゆるやかに渦巻かせた。次に細胞を２分ごとにゆるやかに渦巻かせながら１０分間氷の上で培養した。１０または１００μｇのスーパーコイルしたｐＵＣ１８ＤＮＡをゆるやかに渦巻かせながら細胞に加えた。次に管を氷の上で３０分間培養した。次いで管を３０秒のあいだ４２℃の水浴中で熱パスルにふした。ここで用いた熱パルスの時間は、最大の形質転換効率を得るために重要である。次に管を２分間氷上で培養した。予め加熱（４２℃）したＳＯＣ培地０．９ｍｌを加え、２２５−２５０ｒｐｍで振盪しながら１時間３７℃で培養させた。形質転換混合物を適当な培地を服務プレートに移し、抗生物質をプレートの表面上にひろげた。
（培地と溶液）
ＳＯＢ培地（リットルあたり）
トリプトン  ２０．０ｇ
酵母エキス  ５．０ｇ
食塩  ０．５ｇ
オートクレーブ
使用前にＳＯＢ培地１リットルあたり１ＭのＭｇＣｌ2１０ｍｌと１ＭのＭｇＳＯ4を添加
濾過滅菌
ＳＯＣ培地（リットルあたり）
ＳＯＢ培地
使用前に２Ｍの濾過滅菌したグルコース溶液１ｍｌ又は２０％（ｗ／ｖ）グルコース溶液２ｍｌを添加
濾過滅菌
ＮＺＹ修飾培地（リットルあたり）
食塩５ｇ
ＮｇＳＯ4．７Ｈ2Ｏ  ６ｇ
酵母エキス  ５ｇ
Ｎ・Ｚアミン  １０ｇ
オートクレーブ
ＬＢプレート溶液（リットルあたり）
トリプトン  １０ｇ
酵母エキス  ５ｇ
食塩  １０ｇ
寒天  １５ｇ
オートクレーブ
ＴＹ培地（リットルあたり）
トリプトン  ８ｇ
食塩  ５ｇ
酵母エキス  ５ｇ
ＮａＯＨでｐＨを７．２−７．４に調整
オートクレーブ
ＹＴトップ寒天（リットルあたり）
寒天６ｇを加えたＴＹ培地
オートクレーブ
５５℃に冷却
滅菌したＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏを最終濃度が１０ｍＭとなるように添加
ＴＹプレート（リットルあたり）
１５ｇ添加のＹＴ培地
オートクレーブ
５５℃に冷却
滅菌したＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏを最終濃度が１０ｍＭとなるように添加
ＬＢ−アンピシリンプレート（リットルあたり）
上記のようにしてＬＢプレートを作成
５５℃に冷却
アンピシリン溶液を最終濃度が５０μｇ／ｍｌ（２００μｇ／ｍｌ）となるまで添加
ＴＯＰＰ５株に対してアンピシリン５０ｍｇ，１ＭのＭｇＳＯ4１０ｍｌ
ＬＢ−アンピシリン−メチシリンプレート（リットルあたり）
上記のようにしてＬＢプレート溶液を作成
５５℃に冷却
２０ｍｇのアンピシリンと８０μｇのメチシリンを添加
ＬＢ−テトラサイクリンプレート（リットルあたり）
上記のようにしてＬＢプレート溶液を作成
５５℃に冷却
テトラサイクリン溶液を添加
テトラサイクリン  １２−２０μｇ
水  １０ｍｌ
この溶液は光に感受性なのでＬＢプレート溶液の冷却を待つあいだは溶液を冷暗所に貯蔵
もし長時間室温に放置するときは光からプレートを保護するために箔でプレートを覆う
ＬＢ−カナマイシンプレート（リットルあたり）
上記のようにしてＬＢプレート溶液を作成
５５℃に冷却
カナマイシン溶液を添加
カナマイシン  ７５μｇ、１ＭのＭｇＳＯ4  １０ｍｌ
プレートを４℃で保存
（結果）
α−アミラーゼ遺伝子の大腸菌ゲノムへの取り入れは、ＡＬ１−Ｂｌｕｅ、ＳＵＲＥ及びＸＬ１−ＢｌｕｅＭＲＦ株の中に存在するＦ性因子の上へ遺伝子を挿入することにより達成された。この方法は、染色体の上へα−アミラーゼ遺伝子を挿入するよりも優れていた。何故ならばＦエピソームの上のα−アミラーゼ遺伝子の存在は、興味あるどんな大腸菌株への遺伝子の接合的交配をも可能とするからである。最初にｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔTMベクター中へクローンしたα−アミラーゼ遺伝子は制限酵素消化で単離され、そしてｐＡＬ２０５と呼ばれるＲＳＦ１０１０プラスミド（Bagdasarian et al., Gene 16:237-247（1981））誘導体の上へ再クローン化された。プラスミドｐＡＬ２０５は次の２つの修飾を除きGreener et al., Genetics 130:27-36（1992）に記載のプラスミドｐＡＬ４００と同等であった。すなわち（１）ルシフェラーゼ遺伝子は、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＢｇｌＩＩ制限エンドヌクレアーゼを用いたクロランフェニコール耐性遺伝子で置き換えられていた；（２）Pseudomonas aeruginosaからのプロモータエレメントはＢａｍＨＩクローニング部位の中へクローンされていた。このプラスミドは、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ及びＳＵＲＥ株にあるＦエピトームに担持されたテトラサクリン耐性遺伝子と相同のテトラサイクリン耐性遺伝子をもっている。Ｆエピトームへのアミラーゼ遺伝子の挿入は、大腸菌株ＢＢ４の中のこれらの２つのエピソームの間の相同性組換えにより生体内で達成された。ＦＡＭＹと呼ばれるこの新しいエピソームは次にＸＬ１−Ｂｌｕｅ、ＸＬ１−ＭＲ及びＳＵＲＥTM株の中へ接合的に交配させて超コンピテント細胞誘導体を製造した。
ＸＬ１−ＭＲＦＡＭＹ、ＳＵＲＥＦＡＭＹ、ＸＬ１−ＭＲ、ＳＵＲＥ及びＤＨ５アルファ（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬから購入）に対する形質転換効率を、表１に要約した標準的方法で測定した。Hanahan（J. Mo. Bio. 166:557-580（1983））の方法を受容能の指標方法として用いた。データは、ＳＬ１−ＭＲＦ及びＳＵＲＥのＦＡＭＹ誘導体は、当量のＤＮＡ濃度では標準的なＸＬ１−Ｂｌｕｅ、ＳＵＲＥ及びＤＨ５アルファよりも４〜５倍大きい形質転換効率をもっていることを示した。
ＸＬ１−ＢｌｕｅＦＡＭＹ及びＳＵＲＥＦＡＭＹに存在する他の性質が混乱されてないことの確認のために、細胞をＭ１３ファージ（Ｆの存在を示す）及びファージλで感染可能性の試験をした。ＦＡＭＹ誘導体はもとの親と同等であった。加えて、プラスミドのミニプレプス（minipreps）（何れも標準的なアルカリ性溶菌とStratagene's Clear Cut miniprep systemによる）は成功的に行われ、ミニプレプスの収量は親株と差がないようであった。更に、ミニプレスＤＮＡを配列させたが得られた結果は優れていた。
基質としての連結ＤＮＡとのＦＡＭＹ誘導体の相対的形質転換効率を試験した。その結果を表２に示す。
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（コンピテント細胞及び形質転換プロトコールはHanahan, J. Mol. Bio. 166:557-580（1983）の方法で行った。スーパーコイルしたｐＵＣ１８ＤＮＡの１００または１０ピコグラムを細胞のアリコットの１００マイクロリットルに加え、そして１００マイクログラム／ｍｌアンピシリンを含有するＬＢプレート上でプレート培養した。）
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（ＸＬ１−Ｂｌｕｅ及びその誘導体についての相対的形質転換効率。基質ＤＮＡプラスミド、９７０−３、８．７８ｋｂのＭ１３誘導体をＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼで消化し、形質転換の前にＴ−４リガーゼで一晩培養した。ａとｂは、二つの別個の形質転換実験で得られた結果を示す。）
実施例２  大腸菌の株を含有するプラナーゼ遺伝子の形質転換
澱粉分解酵素のプララナーゼをコードした高好熱性細菌ＥＳ１から単離したＤＮＡセグメントをＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミドベクター（Stratagene, La Jolla, California）中へクローンした。このプラスミドをＫＣ１−Ｂｌｕｅ細胞（Stratagene, La Jolla, California）中へ移し次いでそれを、３７℃でのプララナーゼ発現が細胞の形質転換効率を増大しているか否かを調べるために、クロラムフェニコール耐性のＲＳＦ１０１０プラスミド誘導体での形質転換で調べた。プラナーゼ遺伝子のための非最適条件下で得た予備的な結果は、形質転換効率の再現性ある改良を示すには非結論的であった。しかし異なる生育条件下、たとえば３７℃より高い温度では可能であり（何故ならばプララナーゼは超好熱性生物から得られたものであるので）プラナーゼ遺伝子を含有する株の形質転換効率は対照株よりも有意に高くあり得る。
（生物学的寄託）
１９９３年１１月９日に本出願人はAmerican Type Culture Collection, Rockville, Md., U. S. A.（ATCC）にＸＬ１−ＢｌｕｅＦＡＭＹ（ＡＴＣＣ番号＃６９４８０）、ＸＬ１−ＢｌｕｅＭＲＦＡＭＹ（ＡＴＣＣ番号＃６９４８１）及びＳＵＲＥTM（ＡＴＣＣ番号＃６９４８２）株を寄託した。これらの寄託は特許手続きのための微生物寄託の国際承認に関するブタペスト協定およびその規則の規定（ブタペスト協定）にもとづいて行われた。これは寄託日から３０年間生きた培養の保持を保証する。生物はブタペスト協定の条項のもとに、そして適切なアメリカ特許が発行されれば無拘束の入手を保証するところの出願人とＡＴＣＣとの間の取り決めに従ってＡＴＣＣから入手可能である。寄託株の入手は、その特許法によるいかなる政府の権限で与えられた権利に反して実施の許諾であると解釈してはならない。
（等価物）
上記の明細書に記載のすべての出版物や特許は参照によってここに取り入れられる。前述の書面による明細書は、当業者が本発明を実施するのに十分であると考えられる。実際に、分子生物学分野または関連分野の当業者に明白な発明の実施の上述の態様の種々の変更は、以下の請求の範囲の範囲内にあると意図されている。
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