(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｔ細胞由来の誘導性因子をコードする単離された核酸分子であって、その相補的配列は、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：２９、配列番号：２４または配列番号：２５の少なくとも１つとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子。
【請求項２】
前記単離された核酸分子が配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：２９、配列番号：２４または配列番号：２５によりコードされたタンパク質のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項３】
前記分子がｃＤＮＡである請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項４】
前記分子がゲノムＤＮＡである請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項５】
請求項２に記載の単離された核酸分子であって、そのヌクレオチド配列が配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：２９、配列番号：２４または配列番号：２５のヌクレオチド配列からなる核酸分子。
【請求項６】
配列番号：２５のヌクレオチド配列を有する請求項４に記載の単離された核酸分子。
【請求項７】
請求項１に記載の単離された核酸分子によりコードされたタンパク質をコードする単離された核酸分子。
【請求項８】
プロモーターに操作可能に連結された請求項１に記載の単離された核酸分子を含有する発現ベクター。
【請求項９】
プロモーターに操作可能に連結された請求項２に記載の単離された核酸分子を含有する発現ベクター。
【請求項１０】
プロモーターに操作可能に連結された請求項３に記載の単離された核酸分子を含有する発現ベクター。
【請求項１１】
プロモーターに操作可能に連結された請求項４に記載の単離された核酸分子を含有する発現ベクター。
【請求項１２】
プロモーターに操作可能に連結された請求項５に記載の単離された核酸分子を含有する発現ベクター。
【請求項１３】
プロモーターに操作可能に連結された請求項６に記載の単離された核酸分子を含有する発現ベクター。
【請求項１４】
請求項１に記載の単離された核酸分子を含有する組換え細胞。
【請求項１５】
請求項２に記載の単離された核酸分子を含有する組換え細胞。
【請求項１６】
請求項８に記載の発現ベクターを含有する組換え細胞。
【請求項１７】
請求項９に記載の発現ベクターを含有する組換え細胞。
【請求項１８】
請求項１０に記載の発現ベクターを含有する組換え細胞。
【請求項１９】
請求項１１に記載の発現ベクターを含有する組換え細胞。
【請求項２０】
請求項１に記載の単離された核酸分子によりコードされた単離されたタンパク質。
【請求項２１】
核酸分子によりコードされた単離されたタンパク質であって、少なくとも１２０アミノ酸を含有し、前記核酸分子の相補的配列は、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：２９、配列番号：２４または配列番号：２５の少なくとも１つとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、Ｔ細胞由来の誘導性因子である単離されたタンパク質。
【請求項２２】
配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：２９、配列番号：２４または配列番号：２５によりコードされた、４０個のＮ末端アミノ酸を除くすべてを少なくとも含有する請求項２１に記載の単離されたタンパク質。
【請求項２３】
配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：２９、配列番号：２４または配列番号：２５によりコードされた、２０個のＮ末端アミノ酸を除くすべてを少なくとも含有する請求項２２に記載の単離されたタンパク質。
【請求項２４】
請求項２０に記載の単離されたタンパク質に特異的に結合する抗体。
【請求項２５】
前記抗体がモノクローナル抗体である請求項２４に記載の抗体。
【請求項２６】
（ｉ）配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：２９、配列番号：２４または配列番号：２５のヌクレオチド配列によりコードされたアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列のタンパク質をコードする単離された核酸分子、および
（ii) 配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：２９、配列番号：２４または配列番号：２５のヌクレオチド配列によりコードされたアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列のタンパク質、
のうちの少なくとも一つに特異的な作用剤を細胞と接触させる工程、ならびに
前記細胞でのインターロイキン−９の効果の決定としての前記作用剤と（ｉ）もしくは（ii) との相互作用を決定する工程
を含む、細胞におけるインターロイキン−９の効果を決定する方法。
【請求項２７】
前記作用剤が（ii) に特異的に結合する抗体である請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記作用剤が前記（ｉ）に特異的である請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
試料をＴＩＦまたはＴＩＦをコードする核酸分子に結合する作用剤と接触させること、および前記試料中のＴＩＦの決定としての前記結合を決定することを含む、試料中のＴＩＦの存在を決定する方法。
【請求項３０】
前記作用剤が抗体である請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記作用剤が核酸分子である請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
ＩＬ−９の存在下でＴＩＦ産生細胞の試料に物質を加えること、およびＴＩＦの産生を決定することを含む、前記物質がＩＬ−９活性に影響するかどうかを決定するためのスクリーニング方法であって、前記物質ではなくＩＬ−９の存在下での前記細胞によるＴＩＦの産生と比較して、前記細胞によるＴＩＦの産生における差は、前記物質がＩＬ−９活性に影響することを示唆する方法。
【請求項３３】
前記物質がＩＬ−９阻害剤またはアンタゴニストであり、前記方法が前記物質の非存在下と比べて存在下での前記細胞による低レベルのＴＩＦの産生を決定することをさらに含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記物質がＩＬ−９活性化剤であり、前記方法が前記物質の非存在下と比べて存在下での前記細胞による高レベルのＴＩＦの産生を決定することをさらに含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
喘息またはアレルギーを緩和するのに十分な量のＴＩＦムテインを含有する、喘息またはアレルギーに罹っている患者を治療するための医薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（関連出願）
本出願は特許出願第０９／３５４，２４３号（１９９９年７月１６日出願）の一部継続出願であり、これは特許出願第０９／１７８，９７３号（１９９８年１０月２６日出願）の一部継続出願である。これらの出願はともに、その全体が参考として援用される。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、新たに単離された核酸分子およびその使用に関する。本発明の核酸分子は、サイトカインのインターロイキン−９（「ＩＬ−９」）によってアップレギュレーションされることが明らかにされている。本発明の核酸分子によってコードされるタンパク質もまた開示される。それらはＴ細胞由来誘導性因子（「ＴＩＦ」）として記載される。このような核酸分子は、ＳＴＡＴの活性化を細胞内で誘導するタンパク質をコードする。そのようなタンパク質は、例えば、標的化組織の再生を刺激する際に使用することができる。さらに、その阻害剤またはアンタゴニストを使用して、他の組織の分化を遅らせ、妨げ、または阻害することができる。
【０００３】
（背景技術）
この１０年間に、免疫系およびその調節の知識が目覚ましく拡大していることが認められる。特に注目される１つの領域は、免疫系を調節するタンパク質および糖タンパク質に対する研究の領域である。このような分子の最もよく知られている１つのファミリーがサイトカインである。サイトカインは、細胞間の「情報伝達」に関与している分子である。サイトカインファミリーの個々のメンバーが、ガンおよびアレルギーなどの広範囲の病理学的状態に関わっていることが見出されている。サイトカインがそのような状態の病理学に関わっているとしても、サイトカインはまた、治療的に有用であるとして知られている。
【０００４】
インターロイキンはサイトカインの１つのタイプである。インターロイキンに関する文献は膨大である。この領域における特許の例示的ではあるが、決して完全ではない列挙には、米国特許第４，７７８，８７９号（Ｍｅｒｔｅｌｓｍａｎｎら）；米国特許第４，４９０，２８９号（Ｓｔｅｒｎ）；米国特許第４，５１８，５８４号（Ｍａｒｋら）；および米国特許第４，８５１，５１２号（Ｍｉｙａｊｉら）が含まれる（これらはすべて、インターロイキン−２、すなわち「ＩＬ−２」を含む）。インターロイキン−１（「ＩＬ−１」）に関するさらなる特許が発行されている（米国特許第４，８０８，６１１号（Ｃｏｓｍａｎ）など）。これらのすべての特許の開示は、参考として本明細書中に援用される。異なるインターロイキンに関するより最近の特許には、米国特許第５，６９４，２３４号（ＩＬ−１３）；同第５，６５０，４９２号（ＩＬ−１２）；同第５，７００，６６４号、同第５，３７１，１９３号および同第５，２１５，８９５号（ＩＬ−１１）；同第５，７２８，３７７号、同第５，７１０，２５１号、同第５，３２８，９８９号（ＩＬ−１０）；同第５，５８０，７５３号、同第５，５８７，３０２号、同第５，１５７，１１２号、同第５，２０８，２１８号（ＩＬ−９）；同第５，１９４，３７５号、同第４，９６５，１９５号（ＩＬ−７）；同第５，７２３，１２０号、同第５，１７８，８５６号（ＩＬ−６）、および同第５，０１７，６９１号（ＩＬ−４）が含まれる。このような特許文献の通り一遍の総説でさえ、インターロイキンファミリーのメンバーの性質が多様であることを示している。これより大きなサイトカインファミリーはさらに大きな多様性を示すと考えられ得る。例えば、Ａｇｇａｒｗａｌら編、Ｈｕｍａｎ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ：Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｆｏｒ  Ｂａｓｉｃ  Ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、１９９２年）、Ｐａｕｌ編、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ、１９９３年）、７６３頁〜８３６頁、「Ｔ細胞由来サイトカインおよびそのレセプター」および「前炎症性サイトカインおよび免疫性」を参照のこと。引用されたすべての参考文献は参考として援用される。
【０００５】
様々なサイトカイン間の関係は複雑である。本明細書中に引用されている参考文献から理解されるように、特定のサイトカインのレベルが増大または低下すると、これにより、被験体によって産生される他の分子のレベルが直接的または間接的のいずれかで影響を受けることがある。影響を受ける分子の中には、他のサイトカインが含まれる。
【０００６】
以前には「Ｐ４０」と呼ばれていたリンホカインＩＬ−９は、抗原非依存的なＴ４細胞株の永久成長を持続させる因子として最初に同定されたＴ細胞由来の分子である。例えば、Ｕｙｔｔｅｎｈｏｖｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：６９３４（１９８８）、およびＶａｎ  Ｓｎｉｃｋら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６９：３６３（１９８９）を参照のこと。これらの開示は、Ｓｉｍｐｓｏｎら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８３：７１５（１９８９）の開示と同様に参考として援用される。
【０００７】
ＩＬ−９の活性は、ＣＴＬまたは新しく単離されたＴ細胞に対する活性を示すことができない制限されたＴ４細胞株に対して最初に発見された。例えば、Ｕｙｔｔｅｎｈｏｖｅら（上記）、およびＳｃｈｍｉｔｔら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９：２１６７（１９８９）を参照のこと。この活性範囲は、ＩＬ−９およびＴ細胞成長因子III （「ＴＣＧＦIII 」）と示される分子が、骨髄由来肥満細胞のＩＬ−３に対する増殖応答を高める因子であるＭＥＡ（肥満細胞成長増強活性）と同一であることが実験により示されたときに広がった。このことは、Ｈｕｌｔｎｅｒら（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．）および米国特許出願第４９８，１８２号（１９９０年３月２３日出願）に記載されている（両方の開示は参考として本明細書中に援用される）。ヒト型のＩＬ−９が巨核芽球白血病の増殖を刺激することもまた見出された。Ｙａｎｇら、Ｂｌｏｏｄ、７４：１８８０（１９８９）を参照のこと。ＩＬ−９に関する最近の研究により、ＩＬ−９はまた、赤芽球コロニー形成を支持すること（Ｄｏｎａｈｕｅら、Ｂｌｏｏｄ、７５（１２）：２２７１〜２２７５（６−１５−９０））；骨髄性赤芽球バースト形成の増殖を促進すること（Ｗｉｌｌｉａｍｓら、Ｂｌｏｏｄ、７６：３０６〜３１１（９−１−９０））；および成人起源または胎児起源のＢＦＵ−Ｅのクローン成熟を支持すること（Ｈｏｌｂｒｏｏｋら、Ｂｌｏｏｄ、７７（１０）：２１２９〜２１３４（５−１５−９１））も明らかにされている。ＩＬ−９の発現は、また、ホジキンス病および大細胞未分化リンパ腫における関わりも示されている（Ｍｅｒｚら、Ｂｌｏｏｄ、７８（８）：１３１１〜１３１７（９−１−９０））。気管支過敏性の発症に対する感受性または耐性を有するマウスの遺伝子分析により、ＩＬ−９遺伝子との連鎖、ならびにこのモデルにおけるＩＬ−９産生と感受性との相関が解明されている（Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９４、１３１７５〜１３１８０、１９９７）。ヒトの遺伝子研究もまた、喘息の原因と考えられるものとしてＩＬ−９およびＩＬ−９Ｒ遺伝子を指摘している（Ｄｏｕｌｌら、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．１５３、１２８０〜１２８４、１９９６；Ｈｏｌｒｏｙｄら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、５２、２３３〜２３５、１９９８）。次に、ＩＬ−９遺伝子導入マウスは、増大したＩＬ−９発現により、肺の肥満細胞過剰増殖、過好酸球増加症、気管支過敏性および高レベルのＩｇＥをもたらすことが明らかにした（Ｔｅｍａｎｎら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８、１３０７〜１３２０、１９９８；Ｇｏｄｆｒａｉｎｄら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０、３９８９〜３９９６、１９９８；ＭｃＬａｎｅら、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．１９：７１３〜７２０（１９９９））。まとめると、これらの結果は、ＩＬ−９がこれらの疾患において重要な役割を果たしていることを強く示唆している。さらなる研究により、喘息およびアレルギーにおけるＩＬ−９およびこのサイトカインのムテインの関わりが示されている。例えば、ＰＣＴ国際特許出願ＵＳ９６／１２７５７（Ｌｅｖｉｔｔら）およびＰＣＴ国際特許出願ＵＳ９７／２１９��２（Ｌｅｖｉｔｔら）を参照のこと（これらはともに参考として援用される）。
【０００８】
ＩＬ−９は、被験体における他の分子のレベルに影響を及ぼすことが知られている。Ｌｏｕａｈｅｄら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：５０６１〜５０７０  （１９９５）；Ｄｅｍｏｕｌｉｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１６：４７１０〜４７１６（１９９６）を参照のこと（これらはともに参考として援用される）。影響を受ける分子は生物学的システムにおいてそれ自身の機能を有していることが認識されている。例えば、Ｄｅｍｏｕｌｉｎらは、ＩＬ−９の知られている活性の多くがＳＴＡＴ転写因子の活性化により媒介されることを示している。そのため、その存在および／またはレベルがサイトカインなどの他の分子によって影響を受ける分子を同定しようとすることが引き続き注目されている。
【０００９】
下記の開示にはそのような分子が記載されている。本発明のタンパク質をコードする核酸分子は、ＩＬ−９の存在下で発現するが、その非存在下では発現しないことが見出された。従って、このような分子は、特に、被験体におけるＩＬ−９の発現または作用の「マーカー」である。そのような分子は、下記においてはＴ細胞由来誘導性因子または「ＴＩＦ」として示される。本発明のこれらの特徴および他の特徴は下記の開示において理解される。
【００１０】
（好適な実施態様の詳細な説明）
実施例１
ネズミのリンパ腫細胞株ＢＷ５１４７は、サイトカインをその培養培地に加えることを全く必要とすることなくインビトロで成長し得る細胞株としてよく知られている。ＩＬ−９によって誘導される遺伝子を同定するために、ＢＷ５１４７の試料を、ＩＬ−９の存在下（２００Ｕ／ｍｌ）または非存在下のいずれかで２４時間培養した。その後、全ＲＮＡを、イソチオシアン酸グアニジン溶解およびＣｓＣｌ勾配遠心分離を使用して単離した。これらの技術はこの分野ではよく知られている。この後、ポリアデニル化ＲＮＡを、オリゴ（ｄＴ）セルロースカラムを使用することによって全ＲＮＡから精製した。その後、単離されたポリＡ  ＲＮＡを使用して、二本鎖ｃＤＮＡを作製した。市販のオリゴ（ｄＴ）プライマーを使用した。３〜５μｇの任意の量のポリＡ  ＲＮＡを１μｇのオリゴｄＴとともに７０℃に１０分間加熱し、その後、５ｘ第一鎖緩衝液（２５０ｍＭのＨＣｌ（ｐＨ８．３）、３７５ｍＭのＫＣｌ、１５ｍＭのＭｇＣｌ2 ）、１０ｍＭジチオスレイトール、５００ｕＭの各デオキシヌクレオチド三リン酸、および８００Ｕの逆転写酵素とともにインキュベーションした。反応混合物の総容量は２０μｌであり、反応を３７℃で１時間行った。これにより、ｃＤＮＡの第一鎖が合成された。第二鎖の合成を、３０μｌの５第二鎖緩衝液（１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．９））、４５０ｍＭのＫＣｌ、２３ｍＭのＭｇＣｌ2 、０．７５ｍＭのβ−ＮＡＤ+ 、５０ｍＭの（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 を、６０Ｕの大腸菌由来ＤＮＡポリメラーゼＩ、２Ｕの大腸菌ＲＮａｓｅＨ、１０Ｕの大腸菌ＤＮＡリガーゼ、および２５０ｕＭの各デオキシヌクレオチド三リン酸とともに加え、１５０μｌの最終容量にすることによって行った。混合物を１６℃で２時間インキュベーションした。
【００１１】
生成物を、フェノール−クロロホルムを使用して抽出し、エタノールで沈殿させた。その後、この最終ｃＤＮＡ生成物を２００μｌのＴＥに再懸濁した。
【００１２】
これらの工程を、刺激されたＢＷ５１４７細胞（以降、「テスター」）、および並行して、未刺激のＢＷ５１４７細胞（以降、「ドライバー」）の両方について行った。
【００１３】
実施例２
次に、実施例１で調製されたｃＤＮＡを、よく知られている方法に従ってサブトラクションクローニングに供した。このために、下記の６個のオリゴヌクレオチドを調製した：
５' −ＡＧＣＡＣＴＣＴＣＣ  ＡＧＣＣＴＣＴＣＡＣ  ＣＧＣＡ−３' （配列番号：１）；
５' −ＧＡＴＣＴＧＣＧＧＴ  ＧＡ−３' （配列番号：２）；
５' −ＡＣＣＧＡＣＧＴＣＧ  ＡＣＴＡＴＣＣＡＴＧ  ＡＡＣＡ−３' （配列番号：３）；
５' −ＧＡＴＣＴＧＴＴＣＡ  ＴＧ−３' （配列番号：４）；
５' −ＡＧＧＣＡＡＣＴＧＴ  ＧＣＴＡＴＣＣＧＡＧ  ＧＧＡＡ−３' （配列番号：５）；および
５' −ＧＡＴＣＴＴＣＣＣＴ  ＣＧ−３' （配列番号：６）。
【００１４】
これらを、本明細書中に説明されているように使用した。二本鎖ｃＤＮＡ（２μｇ）を制限エンドヌクレアーゼＤｐｎＩＩで消化し、フェノール−クロロホルムで抽出し、エタノールで沈殿させ、２０μｌのＴＥ（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）；１ｍＭのＥＤＴＡ）に再懸濁した。１２μｌ（１．２μｇ）の切断されたｃＤＮＡを、４μｌの脱塩された配列番号：１（２ｍｇ／ｍｌ）、４μｌの脱塩された配列番号：２（１ｍｇ／ｍｌ）、１０μｌの５Ｘアダプター緩衝液（３３０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、５０ｍＭのＭｇＣｌ2 、５ｍＭのＡＴＰ）、７μｌのＤＴＴ（１００ｍＭ）および２８μｌのＨ2 Ｏを含む混合物中で二本鎖の配列番号：１および２に連結した。オリゴヌクレオチドを、混合物を５０℃に加熱し、その後、混合物を１０℃まで１時間かけて冷却することによって、互いに、そして試料ＤＮＡにアニーリングさせた後、５μｌのＴ４ＤＮＡリガーゼを加えて、１２℃〜１６℃で１２時間〜１４時間インキュベーションした。混合物を、１４０μｌのＴＥを加えることによって希釈した。その後、ＰＣＲを、下記に記載されているように２００μｌの試料で行った。
【００１５】
実施例３
ＰＣＲを行うために、まず、６６ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、４ｍＭのＭｇＣｌ2 、１６ｍＭの（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 、３３μｇ／ｍｌのＢＳＡ、０．３ｍＭの各ｄＮＴＰ（濃度：５００μＭ）、および２μｇの配列番号：２からなる緩衝液に２μｌの連結産物を含む２００μｌの試料を７２℃で３分間加熱して、実施例２の生成物にハイブリダイゼーションする配列番号：１を除いた。その後、３' 末端を、５ＵのＴａｑポリメラーゼを使用することによって埋めた（５分、７２℃）。２０サイクルの増幅を行った（１サイクル：９５℃で１分、および７２℃で３分）。その後、生成物を一緒にし、フェノール抽出およびエタノール沈殿を行い、ＴＥ緩衝液に０．５μｇ／μｌの濃度で再懸濁した。下記において、これは提示物と呼ばれる。
【００１６】
実施例４
次に、提示物を、ＤｐｎＩＩを用いた消化により配列番号：１をそれから除くことによってサブトラクティブハイブリダイゼーションのために調製した。得られた消化物をフェノール抽出してエタノール沈殿した。未刺激の試料の場合、これによりドライバーが得られ、一方、刺激された試料によりテスターが得られた。テスターの一部（２０μｇ）を１．２％アガロースゲルでゲル精製して単離した。試料（２μｇ）を、上記に記載されているように、配列番号：１および２が連結された同じ方法で配列番号：３および４に連結した。
【００１７】
サブトラクティブハイブリダイゼーションの最初のサイクルにおいて、配列番号：３および４が連結されたテスターの０．４μｇ試料を４０μｇのドライバーｃＤＮＡと混合した。混合物をフェノール抽出し、エタノール沈殿して、２μｌの３ＸＥＥ緩衝液（３０ｍＭのＥＰＰＳ、ｐＨ８．０）、３ｍＭのＥＤＴＡ；ｐＨ８．０、３ｍＭのＥＤＴＡに溶解した。これに３０μｌのミネラルオイルを重層し、９８℃で５分間変性させた。５ＭのＮａＣｌ溶液（０．５μｌ）を加えて、ＤＮＡを６７℃で２０時間ハイブリダイゼーションさせた。反応混合物をＴＥで２００μｌに希釈し、ｔＲＮＡキャリアを加えた。この試料を７２℃で３分間インキュベーションして、配列番号：４を融解解離させた後、４つのＰＣＲ反応物（２００μｌ）を調製した。これらは、プライマーを含まない２０μｌの希釈したハイブリダイゼーション混合物を含み、これにより、再アニーリングしたテスターの両端を埋め、その後、配列番号：３の試料を加えた後、１０サイクルの増幅を行った（１サイクル：９５℃で１分、７０℃で３分）。その後、生成物を一緒にして、フェノール抽出し、エタノール沈殿して、４０μｌの０．２ＸＴＥ緩衝液に再懸濁した。一本鎖ＤＮＡを、４０μｌの総容量で、２０Ｕのマングビーンヌクレアーゼで２０μｌのこの物質を３０分間処理することによって分解した。試料を５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．９）で希釈（１：５）した後、９８℃で５分間加熱して、酵素を不活性化した。別のＰＣＲを、２０μｌの上記に記載される生成物、２μｌの配列番号：３（１ｍｇ／ｍｌ）、および１μｌ（５Ｕ）のＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを使用して行った。合計で１８サイクルを行った（１サイクル：９５℃で１分、７０℃で３分）。生成物を一緒にして、フェノール抽出し、エタノール沈殿して、０．５〜１μｇ／μｌで再懸濁した。この生成物は、「ＤＰ１」または第１の差生成物と呼ばれる。
【００１８】
実施例５
次に、ＤＰ１を、上記に記載されているようにエンドヌクレアーゼＤｐｎＩＩで消化し、配列番号：１、２、３および４に関して記載されている同じ手法に従って配列番号：５および６に連結した。サブトラクティブハイブリダイゼーションおよび選択的増幅を、実施例４に記載されているように繰り返して、第２の差生成物または「ＤＰ２」を作製した。これらの実験では、５０ｎｇのＤＰ１がテスターであった。ドライバー（４０μｇ）は、上記に記載されている通りであった。このプロセスを、第３の差生成物を作製するために、アダプターとして配列番号：３および４を使用して繰り返した。この第３の生成物を作製するために、１００ｐｇのテスターを４０μｇのドライバーと混合した。上記のプロトコルの全工程を繰り返したが、最後の増幅を２２サイクル行った。この場合の１サイクルは、９５℃での１分および７０℃での３分であった。これにより、最後の差生成物が得られた。
【００１９】
実施例６
最後の差生成物をＤｐｎＩＩで消化し、その後、市販のベクター（すなわち、ｐｔＺ１９Ｒ）のＢａｍＨＩ部位にクローニングした。二本鎖ＤＮＡプラスミドを調製し、その後、標準的な方法を使用して配列決定した。その配列を、ＢＬＡＳＴ検索プログラムを使用して、ＧｅｎＢａｎｋおよびＥＭＢＬのデータベースにおいて知られている配列と比較した。
【００２０】
このサブトラクション手順の終わりに、短いｃＤＮＡフラグメントが同定された（すなわち、長さが約２００塩基対のフラグメント）。このフラグメントを使用して、ＢＷ５１４７細胞から得られたｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。最大長のクローンを配列決定した。これは下記で議論される。このクローンは、知られているどの配列にも相当しない。
【００２１】
ヌクレオチド配列（配列番号：７）は、１１２１塩基長であり、１７９アミノ酸長のタンパク質をコードする５３７塩基対のオープンリーディングフレームを含む。タンパク質の予想される分子量は２０、０９３である。開始コドンとして作用した場合に、１７２アミノ酸および１６７アミノ酸の長さを有し、それぞれの分子量が１９，３３５ダルトンおよび１８，７７０ダルトンであるタンパク質を生成する２つのさらなるＡＴＧコドンが存在する。タンパク質の各形態は、成熟タンパク質をもたらすために小胞体によって分子から切断される疎水性アミノ酸の配列を特徴とする。
【００２２】
配列分析により、３つのＡＴリッチモチーフ（ＴＴＡＴＴＴＡＴ）が明らかにされる。このようなモチーフは、サイトカインおよびガン遺伝子の５' 非翻訳領域に見出されることが多い。Ｋｒｕｙｓら（Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４５：８５２  （１９８９））は、この反復がＴＩＦのｍＲＮＡの安定性を調節していることを明らかにしている。
【００２３】
実施例７
次に、上記の実施例６で単離および分析されたｃＤＮＡを、ＴＩＦαのゲノムＤＮＡを同定するためのプローブとして使用した。
【００２４】
マウス系統１２９から調製されたゲノムライブラリーを、標準的な方法に従って配列番号：７でスクリーニングした。陽性クローンから得られたＥｃｏＲＩフラグメントをプラスミドｐＺＥＲＯにサブクローニングして、その一部を配列決定した。この部分配列は配列番号：８として示されている。
【００２５】
実施例８
上記の実施例７に記載される陽性クローンから得られる別のＥｃｏＲＩフラグメントもまたサブクローニングした。非常に大きな相同性があったが、その配列は同一ではなかった。詳しくは、この配列のイントロン１は配列番号：８と９８％の同一性を有し、イントロン２は１００％の同一性を有し、イントロン３は９２％の同一性を有していた。
【００２６】
これらの配列について驚くべきことは、それらのプロモーターが全く相同的ではないことである。このことにより、独立した調節が示唆される。それらの５' 非翻訳領域は９２％の同一性を有する。ＴＩＦαの第１エキソンは、エキソン１αおよびエキソン１βに分かれている。第１のコードエキソン（ＴＩＦαではエキソン１ｂであり、ＴＩＦβではエキソン１である）は９９．５％の同一性を有しているが、第２エキソンは１００％の同一性を有し、第３エキソンは９７％の同一性を有し、第４エキソンは９８．５％の同一性を有し、第５エキソンは９６％の同一性を有している。３' 非翻訳領域では、相同性が９６％である。
【００２７】
実施例９
上記の実施例８に記載される情報を使用して、ＴＩＦβと名付けられた第２のクローンのｃＤＮＡ配列を求めた。これは配列番号：９として示されている。ゲノムＤＮＡ配列もまた、上記に記載されている同じ方法で確認した。これは配列番号：２９として示されている。
【００２８】
ＴＩＦαのコード領域と比較した場合、ＴＩＦβのコード領域には６つのサイレント型変化が存在する。重要でないアミノ酸の変化をもたらす変化が２つ存在している（３６位および１１３位の両方において、ＴＩＦαにおけるＶａｌがＴＩＦβではＩｌｅになっている）。また、より重要な変化が１１２位に存在している。この場合、ＧｌｎがＡｒｇになっている。
【００２９】
実施例１０
ＴＩＦ類の発現を調べるための実験を行った。ＢＷ５１４７細胞を、組換えネズミＩＬ−９（２００Ｕ／ｍｌ）を用いて様々な時間（０．２時間、０．５時間、１時間、２時間＆２４時間）にわたって刺激した。その後、全ＲＮＡを、標準的な方法および試薬を使用して単離した。その後、５μｇの全ＲＮＡおよびオリゴ（ｄＴ）プライマーを使用して逆転写を行った。その後、２０ｎｇの全ＲＮＡに対応するｃＤＮＡ試料を、種々のプライマーを使用して２５サイクル増幅した（１サイクルは、９４℃で４分、５７℃で１分、および７２℃で２分であった）。下記のＴＩＦプライマーを使用した：
５' −ＣＴＧＣＣＴＧＣＴＴ  ＣＴＣＡＴＴＧＣＣＣ  Ｔ−３' （配列番号：１０）および
５' −ＣＡＡＧＴＣＴＡＣＣ  ＴＣＴＧＧＴＣＴＣＡ  Ｔ−３' （配列番号：１１）
（それぞれ、センスおよびアンチセンス）。
【００３０】
これらは、それぞれ、配列番号：７のヌクレオチド１０６〜１２６およびヌクレオチド７６４〜７８４に対応する。コントロールとして、β−アクチンを同様に１８サイクル増幅した（最初のサイクル：９４℃で４分、６０℃で１分、７２℃で２分。その後のサイクルは、９４℃で１分、６０℃で１分、７２℃で２分であった）。
【００３１】
増幅後、ＰＣＲ後の生成物を１％アガロースゲルで分析し、特異的な増幅を、内部の放射性プローブを使用してブロッティング後に確認した。ＴＩＦのプローブは、
５' −ＧＡＣＧＣＡＡＧＣＡ  ＴＴＴＣＴＣＡＧＡＧ−３' （配列番号：１２）
であった。示された条件およびプローブは、ＴＩＦの１つまたはそれ以外の形態に特異的ではなかった。しかし、ＴＩＦαの増幅産物はＫｐｎＩ制限部位を含み、一方、ＴＩＦβにはその制限部位は含まれない。増幅産物をＫｐｎＩで消化することによって、ＩＬ−９により誘導されたＴＩＦのｍＲＮＡの大部分（すべてではない）がＴＩＦαであることが示された。このことは、ＴＩＦαの発現がＩＬ−９を介して迅速に誘導されたことを示唆している。ＴＩＦαのｍＲＮＡは刺激の３０分後に検出することができ、１時間〜２４時間でプラトーに達した。
【００３２】
実施例１１
次に、上記に記載されているＩＬ−９によるＴＩＦのｍＲＮＡ誘導はタンパク質合成を必要としないことが明らかにされた実験を行った。この実験において、全ＲＮＡを、実施例１０に記載されているように２４時間刺激し、しかし、タンパク質合成阻害剤であるシクロヘキシミドの１０μｇ／ｍｌの存在下または非存在下で４．５時間で処理した細胞から抽出した。比較用の実験群では、細胞を刺激しなかった。全ＲＮＡを抽出して、ＲＴ−ＰＣＲ増幅を、実施例１０に記載されているように行った。ＰＣＲ後の生成物を、臭化エチジウム染色した１％アガロースゲルで分析した。タンパク質合成が阻止されたときに、ＩＬ−９による誘導が依然として生じていることが認められた。従って、ＩＬ−９の作用は、タンパク質媒介因子の合成を必要としない直接的な作用である。
【００３３】
実施例１２
この実験において、ＴＩＦのｍＲＮＡ誘導におけるＳＴＡＴタンパク質の役割を細胞株ＢＷ５１４７の誘導体で調べた。最初の株ＢＷｈ９Ｒは、野生型のヒトＩＬ−９レセプターを発現する。ＢＷ−Ｐｈｅ１１６株は、レセプターがＳＴＡＴ転写因子を活性化することができなくなっている１つの変異を（１１６位に）有するトランスフェクタントである。さらに別の細胞株ＢＷ−ｍｕｔ６は、レセプターがＳＴＡＴ５を活性化することができなくなっている変異を有するが、ＳＴＡＴ１およびＳＴＡＴ３を活性化する能力は保持されている。最後に、細胞株ＢＷ−ｍｕｔ７は、ＩＬ−９レセプターがＳＴＡＴ１およびＳＴＡＴ３を活性化することができなくなっている１つの変異を有するが、ＳＴＡＴ５を活性化する能力は保持されている。
【００３４】
細胞刺激、全ＲＮＡの単離、逆転写およびｃＤＮＡの増幅はすべて、実施例１０に記載されているように行った（細胞を２４時間刺激した。ヒトおよびネズミの両方の組換えＩＬ−９を使用した）。ＰＣＲ産物を、上記に記載されているように、臭化エチジウム染色した１％アガロースゲルで分析した。
【００３５】
分析により、ヒトＩＬ−９はＢＷ−Ｐｈｅ１１６において発現を誘導しないことが明らかにされた。このことは、ＳＴＡＴ転写因子の関与を示唆している。ＩＬ−９は、ＢＷ−ｍｕｔ６変異体においてＴＩＦの発現を誘導したが、ｍｕｔ７変異体では誘導しなかったことが見出された。このことは、ＳＴＡＴ１またはＳＴＡＴ３が関与し、ＳＴＡＴ５は関与していないことを示唆している。
【００３６】
実施例１３
次に、正常なマウス脾臓細胞におけるＴＩＦのｍＲＮＡ発現を調べた。
【００３７】
１０週齢〜１２週齢のＢａｌｂ／ｃマウスの脾臓細胞を、コントロール培地、あるいは２０μｇ／ｍｌの（Ｂリンパ球およびマクロファージを活性化する）ＬＰＳ、または（Ｔ細胞を活性化する）ＣｏｎＡ、またはＣｏｎＡおよび１％のネズミＩＬ−９に対する阻止抗血清を補充したコントロール培地で２４時間培養した。βアクチンをコントロールとして使用した。ＲＮＡの精製、ＲＴ−ＰＣＲ分析を、上記に記載されているように行った。
【００３８】
結果は、ＴＩＦは、最もよいときでも、休止脾臓細胞で非常に弱く発現し、ＬＰＳによって誘導されないが、ＣｏｎＡによって強く誘導されることを示している。抗ＩＬ−９抗血清は、ＣｏｎＡによる誘導に影響しなかった。このことは、その作用は、ＩＬ−９によって媒介されないこと、すなわち、他のサイトカインによって媒介されることを示唆している。
【００３９】
ＣｏｎＡで活性化された脾臓細胞を、ＲＴ−ＰＣＲ産物の配列を使用して分析した場合、これらの細胞がＴＩＦαを優勢に発現しているか、またはＴＩＦαを独占的に発現していることが見出された。
【００４０】
実施例１４
さらなる実験により、ＴＩＦのｍＲＮＡが、ＩＬ−９による誘導がない場合でも発現していることが明らかにされた。
【００４１】
５週齢のＦＶＢマウスの脾臓細胞を、ナイロンウールカラムを使用してＴ細胞を濃縮した。その後、細胞を、ＩＬ−９の存在下または非存在下のいずれかで、ＣｏｎＡ（Ｔ細胞活性化因子）またはＰＭＡ（大部分の細胞においてＰＫＣを活性化する）を補充した培地で２４時間刺激した。
【００４２】
全ＲＮＡを、標準的な技術を使用して単離し、その後、１０マイクログラムの試料を、２．２Ｍホルムアルデヒドを含む１．３％アガロースゲルで電気泳動して分画した。その後、分画物をニトロセルロースメンブランに移して、標識し、Ｖａｎ  Ｓｎｉｃｋら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６９：３６３（１９８９）（参考として援用される）に従ってハイブリダイゼーションアッセイでアッセイした。
【００４３】
その結果は、ＣｏｎＡによるＴＩＦの誘導は変化しないこと、およびＩＬ−９は、ＰＭＡで活性化された脾臓細胞においてＴＩＦのＲＮＡを誘導しないことを示していた。
【００４４】
実施例１５
様々な細胞株におけるＴＩＦのｍＲＮＡ発現を調べた。この実験では、ネズミの細胞株を特定のサイトカインで少なくとも１日間刺激した。詳しく記載すると、９Ｔ７はＴ細胞リンパ腫であり、ＩＬ−２、ＩＬ−４またはＩＬ−９に応答する。ＴＳ３およびＴＳ６の細胞株はＴヘルパー細胞クローンから得られ、ＩＬ−２またはＩＬ−９のいずれかの存在下で増殖する。ＭＣ９およびＬＩ３８は肥満細胞株であり、ＩＬ−３またはＩＬ−９のいずれかの存在下で増殖する。
【００４５】
刺激後、全ＲＮＡを、標準的なイソチオシアン酸グアニジウム溶解およびＣｓＣｌ勾配遠心分離を使用して調製した。
【００４６】
その後、９Ｔ７株を、実施例１４に記載されているようにノーザンブロッティングによって分析したが、それ以外の株は、上記に記載されているようにＲＴ−ＰＣＲ分析を使用してアッセイした。
【００４７】
ＩＬ−９はＴヘルパー細胞および肥満細胞においてＴＩＦの発現をアップレギュレーションするが、ＩＬ−２およびＩＬ−３はしないことが見出された。しかし、９Ｔ７細胞株は、サイトカインに関わらず、ほぼ同じレベルの発現を示した。このことは、ＩＬ−９はＴＩＦの発現に必須でないことを示している。
【００４８】
実施例１６
次に、Ｂ細胞におけるＴＩＦのｍＲＮＡ発現を調べた。Ａ２０、７０Ｚ／３およびＢＣＬ−１の細胞株はＢ細胞白血病細胞株であり、サイトカインの非存在下においてインビトロで成長する。これらの細胞をＩＬ−４およびＩＬ−９で２４時間刺激し、全ＲＮＡを標準的な方法を使用して単離した。発現を、上記に記載されているように、３５サイクル行われたＲＴ−ＰＣＲ、その後のブロッティングおよびハイブリダイゼーションによって分析した。
【００４９】
その結果は、ＴＩＦの発現がＢ細胞で検出可能であるが、ＩＬ−９およびＩＬ−４の存在下では、最もよいときでも弱くアップレギュレーションされることを示していた。
【００５０】
実施例１７
次に、実験を、Ｔヘルパー細胞株における本発明の分子の発現を調べるために行った。ＴＳ２およびＴＳ１は、Ｔヘルパー細胞クローンに由来する公知のＴヘルパー細胞株であり、ＩＬ−９またはＩＬ−２のいずれかの存在下で増殖し（ＴＳ２）、そしてＩＬ−９またはＩＬ−４のいずれかの存在下で増殖する（ＴＳ１）。詳細に記載すると、ＴＳ１細胞またはＴＳ２細胞を、列記されたサイトカインの存在下で少なくとも１０日間成長させ、その後、ＲＮＡを、公知の方法を使用して抽出した。本発明の分子の発現を、上記に記載されているプロトコルを使用してＲＴ−ＰＣＲ（３５サイクル）によって調べた。ＴＳ１細胞の場合、ＩＬ−４およびＩＬ−９はともにＴＩＦの発現を誘導するが、ＴＳ２細胞では、ＩＬ−２はＴＩＦの発現を誘導しない。
【００５１】
実施例１８
様々なマウス器官におけるＴＩＦのｍＲＮＡ発現を調べた。全ＲＮＡを、肝臓、腎臓、心臓、脳、腸、脾臓、胸腺、肺、筋肉および骨髄から、標準的なイソチオシアン酸グアニジウム法およびＣｓＣｌ勾配遠心分離を使用して調製した。４０サイクルのＲＴ−ＰＣＲを、上記に記載されているプロトコルを使用して行った。最も強い発現が胸腺組織で見出されたが、脳組織ではシグナルはほとんど見出されず、残りの組織ではより弱い発現が見出された。
【００５２】
実施例１９
下記の実験は、ＴＩＦαが２９３−ＥＢＮＡ細胞で産生されることを記載する。
【００５３】
ＴＩＦαの相補的ＤＮＡは上記に記載された。相補的ＤＮＡを、ＣＭＶプロモーターと機能的に連結して市販の発現ベクターｐＣＥＰ−４にサブクローニングした。得られたプラスミドを、標準的なリポフェクタミン法を使用して２９３−ＥＢＮＡ細胞にトランスフェクションした。トランスフェクション後、細胞を、35Ｓ標識メチオニンを補充したメチオニン不含有培地で２４時間インキュベーションした。上清を集め、アクリルアミドゲルで電気泳動した。その後、ゲルを乾燥してオートラジオグラフィーに１日曝した。その後、コントロールを、ｃＤＮＡがアンチセンス方向でクローニングされた同じプラスミドで細胞をトランスフェクションすることによって処理した。
【００５４】
約２５キロダルトン〜３０キロダルトンの異種バンドが、センス方向のＴＩＦでトランスフェクションされた細胞で見出された。予想される分子量とシステムにおける実際の分子量との不一致および異種性は、グリコシル化のためと考えられる。一連の並行した実験において、ヒトＴＩＦをコードするｃＤＮＡを、ネズミｃＤＮＡを発現させたのと同じ方法で発現させた。ｃＤＮＡの違いを除いて、すべての実験パラメーターは同じであった。
【００５５】
実施例２０
さらなる実験を、ＣＯＳ細胞におけるＴＩＦαの産生を調べるために行った。詳細に記載すると、ＴＩＦαのｃＤＮＡを、ＥＦ−１αプロモーターと機能的に連結して、Ｄｅｍｏｕｌｉｎら（上記）によって記載されるプラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ．ｐｕｒｏにサブクローニングした。プラスミドｃＤＮＡを、上記に記載される同じリポフェクタミン法を使用してＣＯＳ細胞にトランスフェクションした。細胞を、35Ｓメチオニンを補充したメチオニン不含有培地で２４時間インキュベーションした。その後、上清を、上記の実施例２０に記載されているように処理した。再度ではあるが、２５キロダルトン〜３０キロダルトンの異種バンドが、本発明の分子の非グリコシル化形態を表すと考えられる１８キロダルトンのバンドと同様に認められた。
【００５６】
実施例２１
この実験において、ＴＩＦが、メサンギウム細胞、神経細胞メラノーマ細胞および肝腫瘍細胞においてＳＴＡＴの活性化を誘導することが発見された。サイトカインによってＳＴＡＴ因子が活性化されたとき、該因子はダイマー化して、細胞質から核に移行し、プロモーター内の標的配列に結合することが知られている。実験の細部を下記に示す。
【００５７】
上記に記載されているトランスフェクションされた２９３−ＥＢＮＡ細胞を、コントロール（これもまた上記に記載されている）から得られる上清である正常な培地中で４８時間インキュベーションした後に使用した。マウスの腎臓メサンギウム細胞株（以降、「ＭＥＳ１３」）、ラットのクロム親和性細胞腫細胞株  （以降、「ＰＣ１２」）、４種の異なるヒトメラノーマ（ＳＫ２３、ＡＵＭＡ、ＮＡ−８ｍｅｌおよびＭＵＬＬ）、ヒト肝腫瘍（ＨｅｐＧ３）およびラット肝腫瘍（Ｈ−４−ＩＩ−Ｋ）の試料を使用した。細胞試料（０．５ｘ１０6 ）を１％の上清の存在下で５分間〜１０分間刺激した。その後、核抽出物を、Ｄｅｍｏｕｌｉｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１６：４７１０（１９９６）（これは参考として援用される）に従って調製した。簡単に記載すると、細胞をＰＢＳで洗浄し、その後、１ｍｌの氷冷した低張液に１５分間再懸濁した（緩衝液は、１０ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ2 、５％グリセロール、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、０．１ｍＭのＥＧＴＡ、０．５ｍＭのジチオスレイトール、および１ｍＭのＰｅｆａｂｌｏｃを含む１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１ｍＭのＮａ3 Ｖ4 、ならびに５ｍＭのＮａＦであった）。その後、細胞を、６５μｌのＮＰ−４０を加えた後に激しく攪拌することによって溶解した。核を、１４，０００ｒｐｍで３０秒間激しく攪拌し、その後、ＨＥＰＥＳ（２０ｍＭ）、グリセロール（２０％）およびＮａＣｌ（４２０ｍＭ）を補充した緩衝液で抽出することによってペレット化した。核破砕物を２分間遠心分離することによって除いた。ＤＮＡ結合活性を、ＦｃγＲＩ遺伝子プロモーターのＳＴＡＴ結合部位を含む  「ＧＲＲ」と呼ばれる下記の32Ｐ標識の二本鎖オリゴヌクレオチドを使用して、Ｄｅｍｏｕｌｉｎら（上記）に従って測定した：
５' −ＡＴＧＴＡＴＴＴＣＣ  ＣＡＧＡＡＡ−３' （配列番号：１３）
および
５' −ＣＣＴＴＴＴＣＴＧＧ  ＧＡＡＡＴＡＣ−３' （配列番号：１４）。
【００５８】
これらは、ＧＲＲプローブ内の結合部位の上部鎖および下部鎖に対応する。簡単に記載すると、５μｌ容量の核抽出物を結合緩衝液（１２ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．６）、１０ｍＭのＫＣｌ、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、２．５％グリセロール、０．１ｍｇ／ｍｌのポリ（ｄＩ−ｄＣ））中で５分間インキュベーションした。放射能標識したＧＲＲプローブ（１０5 ｃｐｍ；約０．５ｎｇ）を加えて、インキュベーションを２５分間続けた後、非変性ポリアクリルアミドゲルに負荷した。
【００５９】
上記に記載されるＭＥＳ１３細胞で認められる複合体は、一部が抗ＳＴＡＴ５抗体および抗ＳＴＡＴ３抗体の両方によって過度に移動したこともまた注目された。このことは、（ｉ）試験中の細胞はＴＩＦの標的であったこと、ならびに  （ｉｉ）ＳＴＡＴ３およびＳＴＡＴ５は、ＴＩＦにより活性化される複合体の主要成分であることを示している。上記の実施例１２におけるプロフィールと比較すると、ＳＴＡＴのプロフィールの差は細胞源の差（ヒト対マウス）に起因し得る。ヒトＴＩＦがネズミ細胞で機能すること、およびその逆の場合も機能することもまた認められた。
【００６０】
実施例２２
本実施例は、ヒトＴＩＦをコードする核酸分子の単離およびクローニングを詳述する。最初に、ヒト末梢血単核細胞を標準的な密度勾配遠心分離によって調製した。この調製後、試料を抗ＣＤ３モノクローナル抗体の存在下または非存在下のいずれかにおいて３ｘ１０6 細胞／ｍｌで２４時間培養した（抗体は市販のＯＫＴ３ｍＡｂであり、１／５００に希釈した腹水の形態で使用した）。一般に、Ｔ細胞由来サイトカインは、例えばＣＤ３に特異的な抗体によって活性化されたときにのみ発現することから、この抗体を使用した。
【００６１】
全ＲＮＡを、標準的なイソチオシアン酸グアニジウム／ＣｓＣｌ勾配超遠心分離技術を使用してこのような細胞から単離した。単離後、ＲＮＡの１０μｇ試料を、オリゴ（ｄＴ）１５プライマーを使用して逆転写した。
【００６２】
上記に概略されているようにしてｃＤＮＡを調製した後、１００ｎｇの全ＲＮＡに対応する試料を、下記のプライマーを使用してＰＣＲにより増幅した：
５' −ＡＧＣＴＧＣＴＣＡＡ  ＣＴＴＣＡＣＣＣＴＧ  ＧＡ−３' （配列番号：１５）
５' −ＣＣＡＣＴＣＴＣＴＣ  ＣＡＡＧＣＴＴＴＴＴ  ＣＡ−３' （配列番号：１６）
これらはネズミのｃＤＮＡ配列（すなわち、配列番号：７）に基づく。ＰＣＲ条件は、１サイクルが９４℃で１分、その後、４２℃で１分、次いで７２℃で２分として規定される３０サイクルの増幅を含んだ。増幅産物を、標準的な方法を使用してアガロースゲルで分離した後に配列決定した。その結果は、ｃＤＮＡのフラグメントが増幅されたことを示していた。従って、２回目の反応を、配列番号：１６を下記の配列番号：１７に代えたことを除いて、同じ物質を使用して行った：
５' −ＣＡＡＧＴＣＴＡＣＣ  ＴＣＴＧＧＴＣＴＣＡ  Ｔ−３'
この２回目のＰＣＲ反応を２５サイクル行った。１サイクルは、９４℃で１分、その後、４５℃で１分、次いで７２℃で２分として規定される。増幅産物を、１回目の場合と同じ工程に供した。再度ではあるが、ｃＤＮＡのフラグメントが増幅された。
【００６３】
実施例２３
増幅産物を調製した後、ｃＤＮＡの５' 末端を、標準的な５' −ＲＡＣＥ技術を使用して単離した。簡単に記載すると、第一鎖ｃＤＮＡを、下記の配列番号：１８をプライマーとして使用して調製した：
５' −ＴＧＧＣＣＡＧＧＡＡ  ＧＧＧＣＡＣＣＡＣＣ  Ｔ−３'
このプライマーは、実施例２２に従って得られた配列情報に基づいた。簡単に記載すると、５' −ＲＡＣＥ法を、上記に記載されているようにして調製された全ＲＮＡの１μｇ、２．５ｐｍｏｌの配列番号：１８、逆転写酵素、逆転写酵素緩衝液、２．５μｌのｄＮＴＰ混合物（１０ｍＭ）、２．５μｌのＭｇＣｌ2 （２５ｍＭ）、および２．５μｌのジチオスレイトール（０．１Ｍ）を一緒にすることによって行った。反応を行い、終了後、元のＲＮＡを、ＲｎａｓｅＨおよびＲｎａｓｅＴＩを加えることによって除いた。取り込まれなかった各ｄＮＴＰならびにプライマーおよびタンパク質を除いた。ｃＤＮＡに、ターミナルトランスフェラーゼ（すなわち、「ＴｄＴ」）を使用してテイルを付加させた。この酵素は、下記に記載されているように、短縮アンカープライマーに対する３' −結合部位をもたらす。テイル付加を、精製された第一鎖ｃＤＮＡ、ＴｄＴ、緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、２５ｍＭのＫＣｌ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ2 ）、および２００μＭのｄＣＴＰを一緒にすることによって行った。
【００６４】
テイル付加反応の後、ＰＣＲを、下記のプライマーを使用して行った：
５' −ＴＧＧＣＣＡＧＧＡＡ  ＧＧＧＣＡＣＣＡＣＣ  Ｔ−３' （配列番号：１９）
および５' −ＲＡＣＥ短縮アンカープライマー：
５' −ＧＧＣＣＡＣＧＣＧＴ  ＣＧＡＣＴＡＧＴＡＣ  ＧＧＧＩＩＧＧＧＩＩ  ＧＧＧＩＩＧ−３' （配列番号：２０）
増幅は３５サイクルを含んだ（１サイクルは、９４℃で１分、５６℃で１分、および７２℃で２分として規定された）。この後、ネスティッド増幅を、５μｌの１／１００希釈した増幅生成物で、配列番号：１９および下記の短縮ユニバーサル増幅プライマーを使用して行った：
５' −ＧＧＣＣＡＣＧＣＧＴ  ＣＧＡＣＴＡＧＴＡＣ−３' （配列番号：２１）
増幅は３０サイクルを含んだ（１サイクルは、９４℃で１分、５６℃で１分、および７２℃で２分として規定された）。得られたＰＣＲ産物を、標準的な手順に従ってクローニングして配列決定した。
【００６５】
これらの３つのプロトコル、すなわち、フラグメントが得られた上記に記載される２つの実験、および同様に上記に記載される５' −ＲＡＣＥ  ＰＣＲは、配列決定された増幅産物の配列比較により、完全な配列の作製を可能にした。
【００６６】
配列比較の後、推定されるオープンリーディングフレームに隣接する下記のオリゴヌクレオチドを作製した：
５' −ＣＣＴＴＣＣＣＣＡＧ  ＴＣＡＣＣＡＧＴＴＧ−３' （配列番号：２２）
および
５' −ＴＡＡＴＴＧＴＴＡＴ  ＴＣＴＴＡＧＣＡＧＧ−３' （配列番号：２３）
これらのプライマーは、上記に記載されているように、ＣＤ３に特異的なｍＡｂで刺激された細胞から得られたｍＲＮＡを使用してオープンリーディングフレーム全体を増幅するために使用された。増幅は２５サイクルであった（１サイクルは、９４℃で１分、５６℃で１分、および７２℃で２分として規定された）。
【００６７】
ヒトｃＤＮＡの完全な配列は、配列番号：２４に示されている。
【００６８】
ネズミの配列の場合のように、開始コドンと考えられるコドンが、アミノ酸１および１３に相当する配列番号：２４の位置に存在し、そしてメチオニンに対応するコドンがアミノ酸５８、８５および９２の位置に存在する。この可能な開始コドンは、それぞれ、１９，９９８ダルトンおよび１８，７３５ダルトンの計算された分子量を有するタンパク質（それぞれ、１７６アミノ酸または１６７アミノ酸））に対応する。ネズミ型のタンパク質の場合のように、約２０アミノ酸〜約４０アミノ酸のＮ末端シグナル配列を示す疎水性のリーダー配列が認められる。
【００６９】
実施例２４
この実験は、上記に記載されたｃＤＮＡに対応するヒトゲノムＤＮＡの単離に関する研究を詳述する。
【００７０】
ｃＤＮＡ配列に基づいて、配列番号：２４のヌクレオチド５１〜７０とヌクレオチド６３１〜６５０の相補体とに対応するプライマーを作製した。ＰＣＲを、標準的な方法を使用して行った。詳細に記載すると、１００ｎｇのゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用し、３３サイクルの増幅を行った（１サイクルは、９４℃で３０秒、５０℃で３０秒、および７２℃で５分として規定された）。配列が単離されると、配列決定を行った。これは配列番号：２５として示されている。この配列は、長さが約４．８キロベースであり、ＴＩＦ分子をコードするが、５' 隣接領域、プロモーターおよび３' 末端を有しないだけのゲノム配列全体を含むと考えられる。
【００７１】
実施例２５
上記に議論されたゲノムＤＮＡがヒトゲノムに存在するかどうかを同定することが注目された。この確認のために、２つの異なる方法を取った。第１に、上記に議論された配列（すなわち、配列番号：２５）を蛍光標識で標識し、その後、標準的な方法を使用する蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（「ＦＩＳＨ」）によってヒトゲノムを調べるために使用した。
【００７２】
第２の方法では、一連の放射性ハイブリッドクローンを、配列番号：２４のヌクレオチド５１〜７０および５' −ＡＴＣＡＧＡＴＧＧＡＴＴＡＣＴＧＡＡＴＧ−３' （配列番号：２６）からなるプローブを使用してスクリーニングした。ＰＣＲを、２５ｎｇのゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用して３５サイクル行った。この場合、１サイクルは、９４℃で１分、５５℃で１分、および７２℃で２分として規定された。
【００７３】
両方の方法により、遺伝子が染色体１２ｑ１５に存在することが示された。いくつかの研究は、喘息関連疾患をこの部位に関連させている。例えば、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１５：３８９〜３９２（１９９７）；Ｏｂｅｒら、Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．７（９）：１３９３〜１３９８（１９９８）；Ｎｉｃｋｅｌら、Ｇｅｎｏｍｉｃ、４６（１）：１５９〜１６２（１９９７）；Ｔａｋａｈａｓｈｉら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、４４（１）：１５０〜２（１９９７）；Ｂａｒｎｅｓら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、３７（１）：４１〜５０（１９９６）を参照のこと（これらはすべて参考として援用される）。
【００７４】
実施例２６
この実験は、ＴＩＦタンパク質に結合する抗体の製造を記載する。抗体を作製するために、配列番号：７によってコードされるアミノ酸４０〜６１からなるペプチドを、標準的な技術および１ｍｇのキャリアタンパク質に対して１ｍｇのペプチドの比を使用してＫＬＨキャリアタンパク質に結合させた。被験動物（ウサギ）に、１５０μｇの複合体とともに２週間間隔で３回免疫化した。免疫原は、最初の注射の場合には完全フロイントアジュバントで乳化し、その後の２回の場合には不完全フロイントアジュバントで乳化した。
【００７５】
最初の採血を、最後の注射を行った１ヶ月後に行い、知られている方法に従って血清を調製した。
【００７６】
その後、血清を標準的なウエスタンブロットで調べた。簡単に記載すると、配列番号：７または配列番号：２４のいずれかでトランスフェクションされた細胞から得られた１０μｌの上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動で分離し、その後、ＰＶＤＦ膜にブロッティングした。抗血清を１：５００に希釈して、標準的なウエスタンブロットプロトコルで、二次抗体としての抗ウサギ抗体および市販の検出キットと一緒に使用した。
【００７７】
血清が、実際にＴＩＦタンパク質を認識することが見出された。
【００７８】
図１には、ネズミＴＩＦおよびヒトＴＩＦの推定アミノ酸配列が示されている。大きな相同性が、四角で囲まれた領域で認められる。
【００７９】
前記の実施例により本発明が説明されている。本発明の１つの側面は、配列番号：７、２４または２５のヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列を有するタンパク質などのＴＩＦタンパク質をコードする単離された核酸分子である。遺伝子コードの縮重により、配列番号：７、２４または２５のヌクレオチド配列と同一ではないが、同じタンパク質をコードするヌクレオチド配列を調製できることが当業者により理解される。当然のことではあるが、配列番号：７、２４および２５は本発明の好ましい実施形態であるが、他の実施形態もまた本発明の一部である。ゲノムＤＮＡ、相補的ＤＮＡ、およびメッセンジャーＲＮＡなどのＲＮＡは、すべて本発明に含まれるものとする。他の哺乳動物を含む他の動物種からの単離された核酸分子もまた本発明の一部である。本発明の好ましい側面は、相補体が、ストリンジェントな条件のもとで、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９または配列番号：２４にハイブリダイゼーションする単離された核酸分子である。本明細書中で使用されている「ストリンジェントな条件」は、例えば、緩衝液（３．５ｘＳＳＣ）、０．０２％Ｆｉｃｏｌｌ、０．０２％ポリビニルピロリドン、０．０２％ウシ血清アルブミン、２５ｍＭのＮａＨ2 ＰＯ4 （ｐＨ７）、０．１％のＳＤＳ、２ｍＭのＥＤＴＡにおける６５℃でのハイブリダイゼーション、その後の洗浄を室温において２ｘＳＳＣで行い、次いで、例えば、約６５℃もの高温において０．１ｘＳＳＣ／０．２ｘＳＤＳで行うことをいう。０．１ｘＳＳＣなどのよりストリンジェントな条件もまた使用することができる。これらの核酸分子は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで決定されたときに約１７ｋＤ〜２２ｋＤのタンパク質で、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ３および／またはＳＴＡＴ５などのＳＴＡＴタンパク質を活性化するタンパク質をコードする。グリコシル化形態において、これらのタンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで決定されたときに約１７ｋＤから約３０ｋＤまで変化し得る。
【００８０】
ＤＮＡの発現を容易にするようにプロモーターに機能的に連結された本発明の核酸分子を含む発現ベクターも、また本発明の一部である。そのようなベクターを調製することは当業者の範囲に含まれる。
【００８１】
ベクター、ならびに核酸分子自体は、真核生物または原核生物である組換え細胞を調製するために使用することができる。この場合、発現ベクターまたは核酸分子自身のいずれかが取り込まれる。大腸菌、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞などが、本発明のこの側面に従って使用され得る細胞タイプの例である。
【００８２】
上記の核酸分子によってコードされるタンパク質（好ましくは、単離された形態のそのようなタンパク質）は、本発明の別の特徴である。「タンパク質」は、核酸分子の発現直後の生成物およびそのグリコシル化形態の両方、ならびに二量体、三量体などの多量体形態などを意味する。少なくとも１つの本発明のタンパク質分子と、少なくとも１つの異なるタンパク質分子とを含む二量体などの多量体もまた本発明の一部である。好ましくは、この異なるタンパク質分子は、ＩＬ−１０などのサイトカインである。本発明の特徴として、融合タンパク質などの構築物も含まれる。この場合、上記に記載されたタンパク質のすべてまたは一部が、融合タンパク質などの特定の様式で、少なくとも１つのさらなるタンパク質またはペプチド（すなわち、アミノ酸配列）に連結される。「融合パートナー」は、例えば、認識可能なシグナルを直接的または間接的のいずれかで提供する分子とすることができ、例えば、ＦＬＡＧペプチド、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼなどである。このような融合パートナーは、好ましくは、タンパク質のＮ末端および／またはＣ末端において、上記に記載されている分子と結合させられる。しかし、多数の技術が分子をアミノ酸に結合させるために知られていることを理解しなければならない。このような方法のいずれかおよびすべてによって、本発明の一部である構築物を作製することができる。
【００８３】
上記に記載されているように、本発明の個々のタンパク質分子は、好ましくは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで決定されたときに約１７キロダルトン〜約３０キロダルトンの分子量を有する。多量体形態の場合、当然のことではあるが、複合体の分子量は変化する。しかし、それに含まれるＴＩＦ分子は、それぞれが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで決定されたときに約１７キロダルトン〜約３０キロダルトンの分子量を有する。
【００８４】
タンパク質は、好ましくは、少なくとも約１２０アミノ酸、そして約２００以下のアミノ酸からなる。好ましくは、そのアミノ酸配列は、配列番号：７、８、９、２４または２５によってコードされるアミノ酸配列のすべてまたは一部からなるか、あるいはそのようなアミノ酸配列のすべてまたは一部を含む。より好ましくは、アミノ酸配列は、上記の配列番号によってコードされる最初の約４０アミノ酸を除くすべてを含む。さらにより好ましくは、アミノ酸配列は、これらの配列によってコードされる最初の約２０アミノ酸を除くすべてを含む。最も好ましくは、タンパク質は、配列番号：２７または２８で示されるアミノ酸を含む。
【００８５】
上記に示された核酸分子によってコードされるタンパク質は本発明の特徴であり、標準的なプロトコルに従って抗体を作製するために使用できることが当業者により理解される。モノクローナル形態およびポリクローナル形態のそのような抗体は本発明のさらなる特徴を構成する。そのような抗体のフラグメント、キメラ形態、ヒト化形態、組換え形態なども本発明の特徴を構成する。また、本発明の特徴は、本発明のタンパク質分子のアミノ酸配列のすべてまたは一部を含む免疫原であり、好ましくは、完全フロイントアジュバントまたは不完全フロイントアジュバントなどのアジュバントと組み合わせたそのような免疫原である。タンパク質配列の一部をキーホールリンペットヘモシアニンンなどの他の分子に結合させて、免疫原性をより大きくすることができる。このような抗体を使用して、例えば、本発明のタンパク質が存在するかどうかを明らかにすることができる。これは、次に説明されているように、本発明のさらなる特徴である。本発明の核酸分子がＩＬ−９の存在下で発現したことは、実施例において明らかにされている。従って、本発明のさらなる特徴は、ＩＬ−９が存在するか、または存在しているかどうかを決定する方法である。この場合、本発明のタンパク質が、例えば、抗体を使用して、あるいは本発明の核酸分子をプローブとして使用し、ｍＲＮＡを使用して検出される。ｍＲＮＡは、直接的に、あるいはｃＤＮＡの形態で決定することができる。そのようなプローブは、使用者の選択肢として、標識してもよく、あるいは標識しなくてもよい。従って、例えば、ＩＬ−９の投与後、サイトカインが依然として有効であるかどうかを、本発明の核酸分子が存在するかどうかを明らかにすることによって決定することができる。このタイプのアッセイは、定量的研究のために適合させることができる。この場合、例えば、細胞がＩＬ−９に感受性であるかどうかが決定され、そして細胞がＩＬ−９に感受性である場合には、感受性がどの程度であるかが決定される。また、本発明のタンパク質を使用して、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ３および／またはＳＴＡＴ５などのＳＴＡＴタンパク質をリン酸化することができる。これにより、ＳＴＡＴタンパク質の二量体化が生じ、その後、核に移行して、これらのＳＴＡＴタンパク質が細胞に対して有する作用を引き起こす。
【００８６】
これらの分子を使用して、リンパ腫、アレルギー、後天性免疫不全症候群、自己免疫性糖尿病、甲状腺炎などの免疫系の疾患、または例えば、米国特許第５，８３０，４５４号；同第５，８２４，５５１号および係属中の特許出願第０８／９２５，３４８号（１９９７年９月８日出願、現在、特許査定）（これらはすべて参考として援用される）に記載されるそれ以外の症状のいずれかに罹っている患者などの患者に投与されたときにＩＬ−９のアゴニストまたはアンタゴニストの効力を調べることもできる。このような分子はまた、上記の状態および他の状態におけるＩＬ−９の役割を媒介させるために使用することができる。詳述すると、ＩＬ−９は様々なＴＩＦを誘導するため、そのようなＴＩＦはＩＬ−９活性の媒介因子として有用である。従って、本発明のさらなる側面は、喘息、アレルギーおよびリンパ腫などの過剰なＩＬ−９活性が関与している状況などにおいて内因性のＩＬ−９活性を決定する方法である。また、例えば、アンチセンス分子、ＴＩＦに結合する抗体、またはこのような分子の他のアンタゴニストを使用してＴＩＦまたはＴＩＦ活性を阻止または阻害することによってＩＬ−９活性を阻止または阻害することもできる。例えば、ＴＩＦレセプターに結合するが、ＴＩＦレセプターを活性化せず、それによってＩＬ−９誘導活性を阻害するＴＩＦのムテインは本発明の特徴である。そのようなＴＩＦムテインの使用によって処置され得る症状の例は、アレルギーおよび喘息などである。本発明によるムテインは、例えば、Ｗｅｉｇｅｌら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８０（２）：２９５〜３００（１９８９）およびＥｐｐｓら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ、９（３）：１４９〜１５６（１９９７）に従って作製することができる（これらはともに参考として援用される）。そのようなムテインは、喘息、アレルギーまたはその両方の処置において使用することができる。さらに、上記に記載されたモデルもまた適切なムテインをスクリーニングするために使用できることは当業者には明らかである。ＩＬ−９活性を調節できることは、上記に列記された症状などの症状、ならびにコルチゾール誘導アポトーシスを含むアポトーシス、ＢＣＬ−３の核発現を含む症状において重要である。それは、ＩＬ−９がそのような発現などを誘導することが知られているからである。本明細書中で使用されている「抗体」は、キメラ抗体およびヒト化抗体を含む、ＴＩＦに結合する抗体の任意の部分をいう。
【００８７】
本発明の別の特徴は、本発明のＴＩＦ型分子によって、当該分子が活性である組織タイプの再生を促進させることができること、あるいはそのような組織タイプの分化を阻害することができることに関する。上記に示されているように、ＴＩＦ分子は様々なガン細胞株および正常な細胞株（すなわち、メサンギウム細胞およびニューロン細胞、ならびにメラノーマ細胞および肝腫瘍細胞）を標的とする。従って、例えば、ＴＩＦ分子によって作用を受ける組織の再生が必要な試料に所定量のＴＩＦ型分子を加えることによって組織の再生を刺激することができる。この方法は、インビトロおよびインビボの両方で使用することができる。同様に、状況が、メラノーマまたは肝腫瘍などの特定タイプの組織の分化を阻害することが目的である状況である場合にはＴＩＦのアンタゴニストを加えることができる。
【００８８】
上記の実施例２５に記されているように、ＴＩＦをコードする遺伝子は第１２染色体に位置している。この染色体は、この分野で知られているように喘息と関連している。従って、本発明のさらなる実施形態は、多型、欠失、付加などの異常がＴＩＦ遺伝子の部位に存在しているかどうかを決定することによって、喘息などの状態に対する感受性または喘息に関連する感受性を決定する方法である。そのような異常は、喘息、アレルギー状態、あるいは１つまたは複数の関連する状態の感受性またはそれらが存在することの指標であり得る。ＤＮＡ配列における異常を検出し得ることはこの分野ではよく知られており、そのような方法をここで示す必要はない。好ましくは、そのような異常（１つまたは複数）は、上記に示された方法およびプライマーを使用してＰＣＲなどの標準的な技術によって検出される。
【００８９】
本発明の他の特徴は当業者には明らかであり、さらに説明する必要はない。
【００９０】
用いられている用語および表現は、説明の意味で使用されており、限定の意味では使用されていない。そのような用語および表現の使用には、示された特徴および記載された特徴またはその一部の任意の均等物を除外するという意図はなく、従って、様々な改変が本発明の範囲内で可能であることが認識される。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、ネズミＴＩＦおよびヒトＴＩＦの推定アミノ酸配列（それぞれ、配列番号：２７および２８）を比較する。
【配列表】
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【図１】
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