(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
次式（Ｉ）：
【化１】
0003858061.tif 000006
で表される新規物質シクロ−Ｌ−アルギニル−Ｄ−プロリン。
【請求項２】
シュードモナス属に属し、シクロ−Ｌ−アルギニル−Ｄ−プロリン生産能を有する微生物を培地で培養し、培養物からシクロ−Ｌ−アルギニル−Ｄ−プロリンを採取することを特徴とするシクロ−Ｌ−アルギニル−Ｄ−プロリンの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、新規物質シクロ−Ｌ−アルギニル−Ｄ−プロリンに関するものである。シクロ−Ｌ−アルギニル−Ｄ−プロリンは、その優れたキチナーゼ阻害能力により抗真菌剤、農薬として有用である。
【０００２】
【従来の技術】
キチンは、甲殻類、昆虫類、カビ、酵母等に幅広く分布している。甲殻類、昆虫類においては、クチクラの主成分がキチンであり、脱皮、成長の過程で、キチンの合成と分解が巧みに制御されていることが知られている。また、カビ、酵母等の真菌類は、分裂及び増殖の過程でキチンの合成と分解が制御されている。キチナーゼは、キチンをＮ−アセチルキトビオースにまで分解する酵素であり、この酵素が阻害剤によって阻害されれば、甲殻類、昆虫類の脱皮、成長また、カビ、酵母等の分裂、増殖に影響を与えることになる。すなわち、キチナーゼは、この代謝系に関わる重要な酵素であり、キチナーゼに対する阻害剤は、新しいタイプの抗真菌剤あるいは昆虫の成長制御剤になることが期待される。
【０００３】
これまでに、キチナーゼ阻害剤としては、アロサミジン及びその誘導体（バイオサイエンスとインダストリー，作田庄平  51巻，18-23 1993年) 知られている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、高いキチナーゼ活性を有する新規物質を提供することである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、キチナーゼ阻害活性を有する物質を種々の海洋性細菌の生産物より探索した結果、シュードモナス属に属する微生物の生産する、新規物質シクロ−Ｌ−アルギニル−Ｄ−プロリンが高いキチナーゼを阻害活性を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
即ち、本発明は、次式（Ｉ）：
【０００７】
【化２】
0003858061.tif 000002
【０００８】
で表される新規物質シクロ−Ｌ−アルギニル−Ｄ−プロリンである。
また、本発明は、シュードモナス属に属し、シクロ−Ｌ−アルギニル−Ｄ−プロリン生産能を有する微生物を培地で培養し、培養物からシクロ−Ｌ−アルギニル−Ｄ−プロリンを採取することを特徴とするシクロ−Ｌ−アルギニル−Ｄ−プロリンの製造方法である。
【０００９】
以下、本発明を詳細に説明する。
シクロ−Ｌ−アルギニル−Ｄ−プロリンの理化学的性質は以下の通りである。１．色性状：無色
２．分子量：253
３．分子式：Ｃ11Ｈ19Ｎ5Ｏ2 
４．ＩＲスペクトルνmax(KBr, cm-1) : 3424, 1673, 1458, 1205, 1137
５．水素核磁気共鳴スペクトル（重水中，pD3.0, δppm) : 1.77(m,2H),
1.92(m,2H), 1.99(m,2H), 2.13(m,1H), 2.41(m,1H), 3.29(t,2H), 3.62(m,2    H), 4.08(t,1H), 4.43(t,1H)
６．炭素核磁気共鳴スペクトル（重水中，pD3.0, δppm) : 24.0, 26.4,
30.8, 32.7, 43.0, 48.3, 59.1, 60.8, 159.4, 170.2, 174.0
７. 高分解能質量分析スペクトル： HR FABMS m/z 254.1627［(M+H)+］
（計算値：254.1617）
８．旋光度［α］D29  ＋42.0(c0.24, H2O）
シクロ−Ｌ−アルギニル−Ｄ−プロリンを生産する菌株としては、例えば、IZ 208株を挙げることができる。
【００１０】
IZ 208株の菌学的性質は下記に示すが、培地は、マリンアガー（Bacto Marine Agar 2216 (Difco社製) ）あるいはマリンブロス（Bacto Marine Broth 2216 (Difco社製) ）を用いた。これらの培地に植菌し30℃で24から48時間培養し、光学顕微鏡及び透過型電子顕微鏡を用いて形態観察を行った。
（１）形態（好気的条件下）
細胞の形及び大きさ  ：  曲がりのない桿菌、大きさ 0.8×2.1 μm
細胞多形成の有無  ：  なし
運動性  ：  あり
鞭毛の着生状態  ：  あり、極毛性
胞子の有無  ：  なし
グラム染色性  ：  陰性
（２）各培地における生育状態
マリンアガー平板培養  ：  良好に生育、コロニーは、円形、凸円状、    全縁、湿光、不透明乳白色
マリンアガー斜面培養  ：  良好に生育、糸状、乳白色
マリンブロス培養  ：  良好に生育、培養液は均一に濁る。
【００１１】
マリンブロスゼラチン穿刺培養  ：  液化しない。
（３）生理学的性質
硝酸塩の還元  ：  還元しない。
硝酸呼吸  ：  硝酸呼吸しない。
インドールの生成  ：  生成しない。
【００１２】
0003858061.tif 000003
【００１３】
色素の生成  ：  生成しない。（蛍光色素の生成なし。）
ウレアーゼ活性  ：  陰性
オキシダーゼ活性  ：  陽性
カタラーゼ活性  ：  陽性
生育の範囲（温度、ｐＨ）：  温度４〜50℃、ｐＨ５〜10
酸素に対する態度  ：  好気性
Ｏ−Ｆテスト  ：  酸性化
メチルレッド試験  ：  陰性
ＶＰ反応  ：  陰性
0003858061.tif 000004
以上の菌学的性質からバージーズ・マニュアル・オブ・デターミネイティブ・バクテリオロジー第８版の分類基準に従って公知の菌株と比較した結果、本菌株は、シュードモナス属に属すると考えられ、本菌株をシュードモナスsp.IZ208株と同定し、平成７年１月19日付で工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託した（FERM P-14738) 。
【００１４】
シクロ−Ｌ−アルギニル−Ｄ−プロリンは、シュードモナス属に属し、シクロ−Ｌ−アルギニル−Ｄ−プロリン生産能を有する微生物を培地で培養し、その培養物から得ることができる。シクロ−Ｌ−アルギニル−Ｄ−プロリン生産能を有する微生物としては、シュードモナス属に属する微生物であれば、いずれの菌株でも用いることができる。また、これら微生物の人工的変異方法、例えば紫外線照射、Ｘ線照射、変異誘起剤処理など、あるいは自然発生による変異株、また遺伝子操作、細胞融合による変異株でもシクロ−Ｌ−アルギニル−Ｄ−プロリンを生産するものであればいずれも本発明を用いることができる。このようなシクロ−Ｌ−アルギニル−Ｄ−プロリン生産能を有する菌株を選定するには、実施例に示すように菌株の培養物を取り出し、そのキチナーゼ阻害活性を測定することにより行うことができる。シクロ−Ｌ−アルギニル−Ｄ−プロリン生産株のうち、代表的な株としては、シュードモナスsp.IZ 208 株を挙げることができる。
【００１５】
上記微生物を一般に微生物の培養に用いられる培地で培養し、生産されるシクロ−Ｌ−アルギニル−Ｄ−プロリンを常法により分離、精製することができる。
まず培養法について述べる。キチナーゼ阻害活性をもつ微生物の培養には通常の培養方法を用いることができる。培地としては資化可能な炭素源、窒素源、無機物および必要な生育、生産促進物質を程よく含有する培地であれば合成培地、天然培地いずれでも使用可能である。炭素源としては、グルコース、澱粉、デキストリン、マンノース、フラクトース、シュークロース、ラクトース、キシロース、アラビノース、マンニトール、糖蜜などを単独または組み合わせて用いられる。更に、菌の資化能によっては炭化水素、アルコール類、有機酸なども用いられる。窒素源としては塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、尿素、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、乾燥酵母、コーン・スチーブ・リカー、大豆粉、カザミノ酸などが単独または組み合わせて用いられる。そのほか、食塩、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、炭酸カルシウム、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、硫酸第一鉄、塩化カルシウム、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、硫酸銅などの無機塩類や海水を必要に応じて加える。更に使用菌の生育やシクロ−Ｌ−アルギニル−Ｄ−プロリンの生産を促進する微量成分を適当に添加することができる。
【００１６】
培養法としては、一般の培養方法が用いられるが、液体培養法、とくに深部攪拌培養法がもっとも適している。培養温度は16〜37℃、特に22〜30℃が適当であり、培養中の培地のｐＨはアンモニア水や炭酸アンモニウム溶液、塩酸溶液などを添加して、４〜10、特に６〜８に維持することが望ましい。液体培地で通常１〜８日培養をおこなうと、目的物質のシクロ−Ｌ−アルギニル−Ｄ−プロリンが菌体外に生成される。培養物中の生成量が最大に達したときに培養を停止する。
【００１７】
培養物からシクロ−Ｌ−アルギニル−Ｄ−プロリンの分離、精製は、微生物代謝産物をその培養物から単離精製するために常用される方法に従っておこなわれる。例えば培養物を濾過により培養濾液と菌体に分け、培養ろ液の脂溶性画分を有機溶剤（例えば、ヘキサン、ベンゼン、クロロホルム、アセトン、エーテル、酢酸エチルなど）で取り除く。ついで、活性炭、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相カラムクロマトグラフィー等でシクロ−Ｌ−アルギニル−Ｄ−プロリンを分離、精製する。
【００１８】
シクロ−Ｌ−アルギニル−Ｄ−プロリンは、合成法によっても製造することができる。すなわち、保護基を有するＬ−アルギニンとＤ−プロリンをＤＣＣ法等によって縮合し、脱保護、環化反応を行うことで製造することができる。
キチナーゼの阻害活性は、シャーレー変法等の既知の方法（キチン、キトサン実験マニュアル、キチン、キトサン研究会編, p109-120) 又は、キチナーゼ阻害物質の検定法（特願平6-237650号明細書) により測定することができる。
【００１９】
本発明のシクロ−Ｌ−アルギニル−Ｄ−プロリンは、例えばカンジダ症治療剤として利用できる。カンジダ  アルビカンスは、酵母型と糸状型の二つの形態をとり、酵母型は病原性がないのに対し、糸状型は病原性があることから、糸状型への形態の変化を阻害すればカンジダ症治療剤としての効果が期待できる。本発明化合物へのカンジダ  アルビカンスへの影響は、カンジダ  アルビカンスを本発明化合物を含む培地中で培養し、その形態変化を顕微鏡で観察することで判定できる。
【００２０】
【実施例】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
［実施例１］
ペプトン５ｇ／Ｌ、酵母エキス１ｇ／Ｌ、グルコース５ｇ／Ｌ、りん酸第二鉄0.01ｇ／Ｌ、天然海水1000mlの組成を有する培養培地（殺菌前ｐＨ7.5) 150mlを500ml フラスコに加え、これにシュードモナスsp.IZ 208 株を種菌として植菌し、25℃, 72時間振盪培養した。
【００２１】
得られた培養液10Ｌを10000rpmで遠心分離し、培養上清を得た。上清を酢酸エチル（1000ml) で二層分配し、酢酸エチル層と水層を得た。水層を活性炭（和光純薬製）を充填したカラムに付し、水洗後、２Ｎ酢酸を用いて溶出した。得られた溶出画分を減圧濃縮して10mlとし、HP-20 カラム（三菱化成社製）に付し、分画を行った。活性画分を減圧濃縮して10mlとし、HW-40(東ソー製) カラムに付し、分画を行った。活性画分を２mlに減圧濃縮し、ＯＤＳカラム（ナカライテスク社製) を用いたＨＰＬＣで、水（0.１％ＴＦＡ含有）から10％アセトニトリル水溶液（0.１％ＴＦＡ含有）のグラジェント溶出（30分間）によって展開した結果、28分に活性画分が認められ分取した。分取画分を減圧濃縮してシクロ−Ｌ−アルギニル−Ｄ−プロリン５mgを得た。
［実施例２］
塩化メチレン溶液４ml中にＮ−α−ｔ−ブトキシカルボニル−Ｎ−ω−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルフォニル−Ｌ−アルギニン487mg を溶解後、Ｄ−プロリンベンジルエステル塩酸塩242mg とトリエチルアミン0.17mlを加え攪拌後、Ｎ，Ｎジクロロヘキシルカルボジイミド227mg を加え室温で２時間攪拌した。反応液は減圧濃縮し、残渣に酢酸エチル0.１mlを加え、固形物をろ過により除去後、減圧濃縮し、エーテル−石油エーテル２mlから結晶化することで、Ｎ−α−ｔ−ブトキシカルボニル−Ｎ−ω−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルフォニル−Ｌ−アルギニル−Ｄ−プロリンベンジルエステルを572 mgを得た。
【００２２】
Ｎ−α−ｔ−ブトキシカルボニル−Ｎ−ω−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルフォニル−Ｌ−アルギニル−Ｄ−プロリンベンジルエステル404 mgをトリフルオロ酢酸とアニソールの９対１混合溶液１mlに加え50℃で90分攪拌した。反応液を減圧濃縮後、生じた油状成分に水３mlを加え、トリエチルアミンでｐＨ6.０に調整後80℃で16時間攪拌した。反応液を減圧濃縮後、イソプロパノールと水の３対１溶液から結晶化することで、シクロ−Ｌ−アルギニル−Ｄ−プロリン115mg（収率76％) を得た。
［実施例３］
キチナーゼ阻害活性試験は、キチナーゼ阻害物質の検定法（特願平6-23765)に従って行った。イカ由来のキチンを含んだ寒天培地に、キチナーゼ産生菌Serratia marcescens ATCC990 の菌液を塗布し、その寒天培地上にシクロ−Ｌ−アルギニル−Ｄ−プロリンを含むペーパーディスクをのせ、24℃、48時間静置した。その後、ペーパーディスクのまわりに残存するキチンの直径を測定し、活性を測定した。結果を下表に示す。
【００２３】
0003858061.tif 000005
［実施例４］
カンジダ  アルビカンスIFO 1060をYMBroth (Difco社製) を用いて培養を行い、シクロ−Ｌ−アルギニル−Ｄ−プロリンを加えた場合と加えない場合との形態の観察を行った。その結果、シクロ−Ｌ−アルギニル−Ｄ−プロリンを加えない場合は、培養24時間後に酵母型から菌糸型への形態変化を起こしたが、シクロ−Ｌ−アルギニル−Ｄ−プロリンを６μg/disk以上の濃度にして培養すると、カンジダ  アルビカンスIFO 1060は、酵母型から、菌糸型への形態変化を起こさなかった。
【００２４】
【発明の効果】
本発明によりキチナーゼ阻害活性を有する新規物質シクロ−Ｌ−アルギニル−Ｄ−プロリンおよびその製造方法が提供される。