(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記構造を有する加水分解酵素の化学発光基質。
Lumi-M-P
ここで、Lumiは、化学発光部分であり、前記Lumi化学発光部分は、次のような構造を有するアクリジウム化合物である。
0003819294.tif 000047
ここで、Pは、水溶性媒体で熱及び加水分解により安定し、加水分解酵素により容易に除去されてLumi-Mを形成するグループであり、
Mは、酸素、窒素又は硫黄であり、
R１は、０〜２０のヘテロ原子を含むアルキル基、アルケニル基、アルキニル基又はアラルキル基であり、
アクリジニウム核の周辺位置C１、C３、C４、C５、C６、C７及びC８は、置換されるか又は置換されないものであり、置換された時、前記置換体R２a、R２b、R２C、R３a、R３b、R３C及びR３dは、同じか又は異なり、-R、置換又は非置換されたアリール、ハロゲン化物、ニトロ、スルホン酸、硫酸、ホスホン酸、-CO２H、-C(O)OR、シアノ(-CN)、-SCN、-OR、-SR、-SSR、-C(O)R、-C(O)NHR、エチレングリコール及びポリエチレングリコールであり(ここでRは、０〜２０のヘテロ原子を含むアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基又はアラルキル基から選択されたものである)、
A−は、アクリジニウム化合物の４級窒素の電気的中性のための対イオンであり、前記A−は、前記R１置換体が陰イオン及び４級アンモニウムの陽イオン性部分と共にペアを形成する強いイオン性グループを含めば存在せず、Xは、窒素、酸素又は硫黄であり、このうち、
Xが酸素であるとき、Zは省略され、Yは、置換又は非置換されたアリール基又は-N=CR９R１０であり(ここで、R９及びR１０は、同じか又は異なり、水素、置換又は非置換されたアリール、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロゲン化物、アルコキシル及びアリールオキシ基から選択されたものである)、
Xが硫黄であるとき、Zは省略され、Yは、置換又は非置換されたアリール基であり、
Xが窒素であるとき、Zは-SO２-Y’であり、このうちY’は前記で定義されたＹと同一であり、Ｙは前記で定義された通りであり、又は炭素数０〜２０の直鎖又は分枝鎖のアルキル基、ハロゲン化するかハロゲン化しない、又は置換されたアリール、又はヘテロサイクリック環システムであることができ、Y及びY’は、同じか又は異なることができる。
【請求項２】
前記R１は、スルホン酸、硫酸、-C０２H、ホスホン酸、エチレングリコール、ポリエチレングリコール、４級アンモニウム(-N+R３)及び１種以上の前記親水性グループを含有する任意のグループから選択された１種以上の親水性グループを含むメチル基、スルホアルキル基又はアルキル基である請求項１に記載の化学発光基質。
【請求項３】
前記R２C、R３a又はR３Cは、M-Pであり、前記C２周辺部は、置換されるか又は置換されないものである請求項１または２に記載の化学発光基質。
【請求項４】
アクリジニウム核の周辺位置で任意の二つの隣接した置換体は、結合されたアクリジニウム核に接合された付加的なカルボサイクリック及び／又はヘテロサイクリック環を形成することができ、前記環は、下記のものよりなるグループから選択されたものである請求項１〜３のいずれかに記載の化学発光基質。
0003819294.tif 000048
【請求項５】
前記対イオンA−は、CH３SO４−、FSO３−、CF３SO３−、C４F９S０３−、CH３C６H４S０３−、ハロゲン化物、CF３COO−、CH３COO−及びN０３−よりなるグループから選択されたものである請求項１〜４のいずれかに記載の化学発光基質。
【請求項６】
前記Xは酸素又は硫黄であり、Zは省略され、Yは、下記式の多重置換されたアリール基である請求項１から５のいずれかに記載の化学発光基質。
0003819294.tif 000049
ここで、R４及びR８は、同じか又は異なり、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキル基(-OR)、アルキルチオール基(-SR)又は置換されたアミノ基である。
【請求項７】
前記R５、R６及びR７は、同じか又は異なり、水素、-R、置換又は非置換されたアリール、ハロゲン化物、アミノ、-NHR、NR２、４級アンモニウム(-N+R３)、ヒドロキシル、ニトロ、ニトロソ、スルホン酸、硫酸、シアノ(-CN)、ホスホン酸、CO２H、-SCN、-OR、-SR、-SSR、-C(O)R、-C(O)NHR、-NHC(O)R、エチレングリコール又はポリエチレングリコールである請求項６に記載の化学発光基質。
【請求項８】
前記R４及びR８は、１〜１０の炭素原子を含む短連鎖アルキル基であり、メチル基又はR４及びR８の少なくとも一つが定義された時、他の一つは、水素又はハロゲン化物である請求項６または７に記載の化学発光基質。
【請求項９】
前記R４ないしR８中の任意の隣接した二つのグループは、置換されるか又は置換されず、１種以上の付加的な接合炭化水素芳香族環又はヘテロ芳香族環を形成することができ、前記環は、ベンゼン、ナフタリン、ピリジン、チオフェン、フラン及びピロールよりなるグループから選択されたものである請求項６から８のいずれかに記載の化学発光基質。
【請求項１０】
前記R５、R６及びR７は、同じか又は異なり、スルホン酸、硫酸、-C０２H、ホスホン酸、エチレングリコール、ポリエチレングリコール、４級アンモニウム(-N+R３)及び１種以上の親水性グループを含有する任意のグループから選ばれた親水性グループを含む請求項６に記載の化学発光基質。
【請求項１１】
加水分解酵素によるPの除去後、前記Mは、反応媒質でイオン化し、陰イオンを生成して、アクリジニウム環システムに電子を強く提供する請求項１から１０のいずれかに記載の化学発光基質。
【請求項１２】
下記構造を有する請求項１から１１のいずれかに記載の化学発光基質。
0003819294.tif 000050
ここでBは、二価の陽イオン又は一価の陽イオンであり、前記一価の陽イオンは、同じか又は異なる。
【請求項１３】
もし前記Bが一価の陽イオンならば、それぞれのBは、ナトリウム、水素、カリウム、アンモニウムであり、もし前記Bが二価の陽イオンならば、前記Bは、カルシウム及びマグネシウムである請求項１２に記載の化学発光基質。
【請求項１４】
下記構造を有する請求項１３に記載の化学発光基質。
0003819294.tif 000051
【請求項１５】
Lumi-M-P構造を有する加水分解酵素の化学発光基質であって、前記Lumiは化学発光部分であり、前記化学発光部分Lumiは、次の構造を有するアクリダン化合物である化学発光基質。
0003819294.tif 000052
ここで、R１、R２a-c、R３a-d、M、P、X、Y及びZは、請求項１で定義された通りである。
【請求項１６】
M-Pは、O-PO３Na２である請求項１５に記載の化学発光基質。
【請求項１７】
Lumi-M-P構造を有する加水分解酵素の化学発光基質であって、ここで前記Lumiは化学発光部分であり、前記化学発光部分Lumiは、次の構造を有するスピロアクリダン化合物である化学発光基質。
0003819294.tif 000053
ここで、R１、R２a-c、R３a-d、M及びPは、請求項１で定義された通りであり、
X１及びX２は、同じか又は異なり、酸素、硫黄及び窒素よりなるグループから選択されたものであり、X１及びX２の一方又は両方が酸素又は硫黄である時、対応するZ１又はZ２、又はZ１及びZ２の両方が省略され、X１及びX２の一方又は両方が窒素である時、対応するZ１又はZ２、又はZ１及びZ２の両方が水素、アルキル、アリール又は-S０２-Y’であり、
Gは、５角形ないし１０角形の環を形成するためにX１及びX２に連結されたグループである。
【請求項１８】
下記構造を有する請求項１７に記載の化学発光基質。
0003819294.tif 000054
ここで、R１１は、単一又は複数置換体であり、それぞれの置換体は、水素、-R、置換又は非置換されたアリール基(ArR又はAr)、ハロゲン化物、ニトロ基、スルホン基、硫酸基、ホスホン酸基、  -CO２H、-C(O)OR、シアノ基(-CN)、-SCN、-OR、-SR、-SSR、-C(O)R、-C(O)NHR、エチレングリコール又はポリエチレングリコールよりなるグループから選択されたものである。
【請求項１９】
下記構造を有する請求項１８に記載の化学発光基質。
0003819294.tif 000055
【請求項２０】
Lumi-M-P構造を有する加水分解酵素の化学発光基質であって、ここで前記Lumiは化学発光部分であり、前記化学発光部分Lumiは、下記構造を有するアクリジニウム化合物である化学発光基質。
0003819294.tif 000056
ここで、R１、R２a-c、R３a-d、A−、M、P、X、Y及びZは、請求項１で定義された通りであり、R１２、
R１３、R１４及びR１５は、お互いに同じか又は異なり、水素、-R、ヒドロキシル、アミノ、ハロゲン化物、ニトロ、ニトロソ、スルホン酸、硫酸、ホスホン酸基、-COOH、シアノ基(-CN)、-SCN、-OR、-SR、-SSR、-C(O)R及び-C(O)NHRよりなるグループから選択されたものである。
【請求項２１】
前記R１２ないしR１５中の任意の隣接した二つのグループは、置換されるか又は置換されず、１種以上の付加的な接合炭化水素芳香族環又はヘテロ芳香族環を形成することができ、前記環は、ベンゼン、ナフタリン、ピリジン、チオフェン、フラン及びピロールよりなるグループから選択されたものである請求項２０に記載の化学発光基質。
【請求項２２】
下記構造を有する、請求項２０に記載の化学発光基質。
0003819294.tif 000057
【請求項２３】
Lumi-M-P構造を有する加水分解酵素の化学発光基質であって、前記Lumiは化学発光部分であり、前記化学発光部分Lumiは、下記構造を有するアクリジニウム化合物である化学発光基質。
0003819294.tif 000058
ここで、R１、R２a-c、R３a-d、Ｒ５、Ｒ７、A−、M及びPは、請求項１で定義された通りであり、
R２dは、R２a-c及びR３a-dで定義された通りであり、
R１６及びR１７は、同じか又は異なり、水素、メチル、低分子量アルキル及びハロゲン化物よりなるグループから選択されたものである。
【請求項２４】
前記R１６及びR１７は異なり、その中のひとつは、水素である請求項２３に記載の化学発光基質。
【請求項２５】
前記R１６及びR１７は、共に水素である請求項２３に記載の化学発光基質。
【請求項２６】
下記の構造を有する請求項２３に記載の化学発光基質。
0003819294.tif 000059
【請求項２７】
下記式で示される酵素反応。
0003819294.tif 000060
ここで、a．Lumi-M-Pは、請求項１，１５，１７，２０または２３のいずれかの加水分解酵素の化学発光基質であり、
b．HEは、加水分解酵素であり、
c．Lumi-Mは、Lumi-M-Pと異なる性質を有する化学発光酵素生成物である。
【請求項２８】
前記性質は、放出波長、量子収量、光放出速度、純電荷分布、双極子モーメント、π-結合順序、自由エネルギー、疎水性／親水性、溶解度及び親和度よりなるグループから選択されたものである請求項２７に記載の酵素反応。
【請求項２９】
HEは、燐酸酵素、グリコシダーゼ、ペプチダーゼ、プロテアーゼ、エステラーゼ、スルファターゼ及びグアニジノベンゾアターゼよりなるグループから選択されたものである請求項２７に記載の酵素反応。
【請求項３０】
請求項２７に記載の反応でLumi-M-PからLumi-Mの間の差異を最大化することのできる光検出装置。
【請求項３１】
前記装置は、発光計、電荷結合素子カメラ、X線フィルム及び高速光フィルムよりなるグループから選択されたものである請求項３０に記載の光検出装置。
【請求項３２】
前記差異の最大化は、光学フィルタを使用することにより達成できる請求項３０に記載の光検出装置。
【請求項３３】
前記差異の最大化は、発光計での赤色−敏感性光電子増倍管又は長波放出Lumi-M又はLumi-M-Pを検出するための裏面の薄い冷却電荷結合素子を使用することにより達成できる請求項３０に記載の光検出装置。
【請求項３４】
前記差異の最大化は、短波放出Lumi-M又はLumi-M-Pを検出するための発光計での青色−敏感性光電子増倍管を使用することにより達成されることができる請求項３０に記載の光検出装置。
【請求項３５】
酵素反応後に混合物をアルカリで処理した後、過酸化水素で処理して、請求項２７に記載の反応でLumi-M-PからLumi-Mの間の差異を増強させる方法。
【請求項３６】
試料から加水分解酵素を検出及び／又は定量するための方法であって、
ａ．化学処理時に、第１の最大波長で光を放出できる、請求項１〜２２のいずれかの請求項から選ばれる酵素による加水分解可能な化学発光Lumi-M-Pを提供する段階と、
b．化学処理時に、第２の最大波長で光を放出できる前記Lumi-Mの生成のために、請求項２７、２８または２９のいずれか酵素反応を発生させるために前記酵素を含有する前記試料と前記Lumi-M-Pとを接触させる段階と、
c．酵素の存在及び/又は量の表示として前記放出された光を選択的に又は個別的に検出する段階とを含む方法。
【請求項３７】
試料から分析物質を検出及び／又は定量するための分析方法であって、
a．前記試料と加水分解酵素でラベル化された少なくとも一つの結合ペアとを結合して、結合複合体を生成する段階と、
b．化学処理時に、第１の最大波長で光を放出できる、請求項１〜２２のいずれかから選ばれる酵素による加水分解可能な化学発光Lumi-M-Pを提供する段階と、
c．化学処理時に、第２の最大波長で光を放出できる前記Lumi-Mの生成のために、請求項２７，２８または２９のいずれかの酵素反応を発生させるために前記結合複合体と前記Lumi-M-Pとを接触させる段階と、
d．分析物質の存在及び／又は量の表示として前記放出された光を選択的に又は個別的に検出する段階とを含む分析方法。
【請求項３８】
試料から加水分解酵素を検出及び／又は定量するための方法であって、
a．化学処理時に、第１の時間間隔内で光を放出できる、請求項２３〜２６のいずれから選ばれる酵素による加水分解可能な化学発光Lumi-M-Pを提供する段階と、
b．化学処理時に、第２の時間間隔内で光を放出できる前記Lumi-Mの生成のために、請求項２７，２８または２９のいずれか酵素反応を発生させるために前記酵素を含有する前記試料と前記Lumi-M-Pとを接触させる段階と、
c．酵素の存在及び／又は量の表示として光の強度での変化を認識するために、前記第１の時間間隔内で、又は前記２の時間間隔内で放出された光を検出する段階とを含む方法。
【請求項３９】
試料から分析物質を検出及び／又は定量するための分析方法であって、
a．前記試料と加水分解酵素でラベル化された少なくとも一つの結合ペアとを結合して、結合複合体を生成する段階と、
b．化学処理時に、第１の時間間隔内で光を放出できる請求項２３、２４、２５または２６のいずれかから選ばれる酵素による加水分解可能な化学発光Lumi-M-Pを提供する段階と、
c．化学処理時に、第２の時間間隔内で光を放出できる前記Lumi-Mの生成のために、請求項２７、２８または２９のいずれかの酵素反応を発生させるために前記結合複合体と前記Lumi-M-Pとを接触させる段階と、
d．酵素の存在及び／又は量の表示として光の強度での変化を認識するために、前記第１の時間間隔内で又は前記第２の時間間隔内で放出された光を検出する段階とを含む分析方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（出願と関連した相互参照文献）
この出願は、ここに参考文献として統合されている１９９９年７月３０日付けで出願された米国仮出願第６０/１４６,６４８号に基づくものである。
【０００２】
（連邦政府委託研究又は開発に関する陳述）
なし
【０００３】
（発明の分野）
本発明は、加水分解酵素の基質である新規の化学発光化合物と、明らかに異なる光放出特性(すなわち放出波長、速度又は量子収量)を有する化学発光生成物に関するものである。また、本発明は、定量化できる認識可能な信号を作るために、化学発光基質又は２つの混合物で化学発光生成物と優先的に反応する光放出試薬組成物に関するものである。また、本発明は、新規のアクリジニウム系化学発光基質、加水分解酵素及び信号放出試薬を含む検出方法に関するものである。また、本発明は、新規の化学発光基質及び加水分解酵素の使用と関連した検出装置に関するもので、検出装置は、発光物質信号の検出を最大化するために、赤色−敏感性光電子増倍管又は電荷結合素子(CCD)、及び光ろ過装置を含む。また、本発明は、生物学的試料のラベル又は標識として存在する、関心ある加水分解酵素を定量的又は定性的に検出するための分析において、この新規の化学発光基質の使用に関するものである。また、本発明は、この新規の化学発光基質の製造のための工程及び中間体に関するものである。
【０００４】
（発明の背景）
加水分解酵素の検出は、一次的にそれらの高い敏感性及び非放射性に起因して免疫分析法、核酸分析法、受容体分析法及び他の分析法に分類される診断法に幅広く使われた。加水分解酵素は、燐酸酵素、グリコシダーゼ、ペプチダーゼ、プロテアーゼ及びエステラーゼを含む。今まで最も一般的に使われたものは、燐酸酵素とグリコシダーゼである。例えば、アルカリ性燐酸酵素は、高いターン−オーバー率(turn-over rate)、優秀な熱安定性及び使用の容易性のために、多様な酵素結合免疫吸着分析法(enzyme-linked immunosorbent assay;ELISA)でラベルとして幅広く使われている。また、β−ガラクトシダーゼ及びβ−グルコニダーゼのような多くのグリコシダーゼは、それらの好ましい基質の加水分解のための非常に高い選択性のため、ELISAに使われてきた。一方、或る加水分解酵素は、人間の身体及び微生物の生物学的工程で、それら自身により重要な機能を成す。したがって、このような標識の直接的な検出は、診断の他の重要な観点である。
【０００５】
加水分解酵素の検出と関連して、発色性基質、蛍光性基質及び化学発光基質の３形態の基質がある。これらのうち、化学発光基質は、化学発光生成物の高い検出性又は低い基質及び機器の背景、及び生物学的試料からあまり干渉を受けないという本質的な長所により、優秀な酵素検出の敏感性を提供する。したがって、化学発光基質を開発し、多様な診断にそれらを利用する傾向が続いてきた。
【０００６】
安定したジオキセタン
加水分解酵素の化学発光基質として幅広く使われた一つの分類は、安定したジオキセタンである(Bronstein et al, 米国特許第４,９３１,２２３号、第５,１１２,９６０号、第５,１４５,７７２号、第５,３２６,８８２号; Schaap  et al, 米国特許第５,８９２,０６４号、第４,９５９,１８２号、第５,００４,５６５号; Akhavan-Tafti  et al, 米国特許第５,７２１,３７０号)。ここで、ジオキセタン基質のフェノール部分の熱的に安定した保護基は、保護基がホスホリル基であるか、それともβ−D−ガラクトピラノシジル基であるかによって、アルカリ性ホスフェート(AP)又はβ−ガラクトシダーゼのような関心ある加水分解酵素で切断する。新しく生成されたジオキセタン・フェノキシド・フェノキシド陰イオンは、電気的に励起した状態でメトキシカルボニルフェノキシドに自動分解される。その後、後者は、約４７０nmのλmaxで光を放出する。
【０００７】
事実上、あらゆる生物学的分析が行われる水溶性の環境で、ジオキセタンの分解は、非常に低い量子収量、一般的に約０.０１%及びt１/２が１〜１０分の遅い速度で化学発光を出す。これは、有機環境でジオキセタンの分解とは非常に異なる。例えば、アセチル基又はシリル基で保護されたフェノール部分を有するジオキセタンは、塩基又はフッ化物で処理時、それぞれDMSOで２５%、アセトニトリルで９.４%の量子収量を示し、２５℃でt１/２が約５秒である(Schaap, et al: Tetrahedron Letters, ２８(１１), １１５５, １９８７, and WO ９０/０７５１１ A)。
【０００８】
Voyta等(米国特許第５,１４５,７７２号)は、酵素により生成されたフェノキシドのために、疎水性の環境を提供する高分子性アンモニウム塩を使用したジオキセタン生成物の量子収量を分子相互間に増強させる方法を開示した。
【０００９】
Akhavan-Tafti等は、高分子性ホスホニウム塩(米国特許第５,３９３,４６９号)及び二重陽イオン性(dicationic)界面活性剤(米国特許第５,４５１,３４７号、第５,４８４,５５６号)を使用したジオキセタン生成物の量子収量を分子相互間に増強させる方法を報告した。
【００１０】
Schaap等(米国特許第４,９５９,１８２号、第５,００４,５６５号)は、エネルギー受容体として蛍光性補助界面活性剤を使用したジオキセタン生成物の量子収量を増加させる他の方法を開示した。酵素により生成された、励起されたフェノキシドで具現された共鳴エネルギーは、蛍光性補助界面活性剤に效果的に伝達する。ジオキセタンの４７０nmのλmaxで光を放出する特性の代りに、このシステムは、非常に効率的な蛍光団、フルオレセインへのエネルギー伝達の結果として５３０nmのλmaxで光を放出する。
【００１１】
ジオキセタンの量子収量を向上させるための他の接近は、米国特許第５,０１３,８２７号にSchaapにより開示されたもので、光を放出するフェノキシド部分に高量子収量を有する蛍光団を共有結合させることである。励起されたフェノキシドからの共鳴エネルギーは、結合された蛍光団に分子内伝達する。後者は、順に自分の波長で光を放出する。
【００１２】
WO９４/１０２５８で、Wang等は、アリール基が適当な電子供与グループに多重置換されて強い発光が観察される、電子が豊かでアリール置換されたジオキセタン化合物の分類を明らかにした。
【００１３】
米国特許第５,７２１,３７０号でAkhavan-Tafti等は、向上した水に対する溶解度及び貯蔵安定性を有する安定した化学発光のジオキセタン化合物のグループを提供する。化合物は、ジオキセタン構造に影響を与える２つ以上の親水性グループ及び付加的なフッ素原子又は低級アルキル基で置換されている。
【００１４】
米国特許第５,８９２,０６４号でSchaap等は、二つのスピロ接合されないアルキル基(nonspirofused alkyl groups)でジオキセタン環を置換した化学発光のジオキセタン化合物の分類を開示した。
【００１５】
ヨーロッパ出願第０４０１００１A２号でUrdea等は、光を出すために二つの異なる活性化酵素の連続的な処理で誘発され得るジオキセタン化合物の他の下位分類を開示した。このシステムは、ジオキセタン基質が、励起されたフェノキシドを製造するために異なる工程により連続的に除去できる２つの保護基を有し、第一の保護基の除去は、分析でラベルとして使われた酵素により誘発されるという原理に基づく。
【００１６】
ルミノール基質
Sasamoto等[Chem. Pharm. Bull., ３８(５), １３２３(１９９０) and Chem. Pharm. Bull., ３９(２), ４１１(１９９１)]は、ルミノールの非発光形態であるo-アミノフタルヒドラジド-N-アセチル-β-D-グルコサミニド(ルミノール-NAG)及び４'-(６'-ジエチルアミノベンゾフラニル)-フタルヒドラジド-N-アセチル-β-D-グルコサミニドがN-アセチル-P-D-グルコサミニダーゼの基質であることを報告した。これらの基質で酵素の作用によってルミノール又はルミノール誘導体が生成され、０.１%過酸化水素及びペルオキシダーゼ(POD)又はFe(III)-TCPP錯物触媒で刺激することにより、化学発光信号を放出して検出することができる。
【００１７】
酵素-調節され保護されたエンハンサー及びアンチエンハンサー
【００１８】
Krickaの米国特許第５,３０６,６２１号は、任意のペルオキシダーゼで触媒された化学発光反応の光の強度がプロエンハンサー又はプロ・アンチエンハンサーに作用するAPにより調節されることができるということを開示した。例えば、ルミノールを含有する化学発光反応の強度は、ホースラディシュ過酸化物及び過酸化水素がプロエンハンサー(４-ヨードフェノール・ホスフェート)へのAPの酵素的作用により遊離したエンハンサー(４-ヨードフェノール)により増強されることができ、よって、APが分析可能である。また、付加的なエンハンサー(４-ヨードフェノール)が存在する同一の前記反応で、光の強度は、プロ・アンチエンハンサー(４-ニトロフェノールホスフェート)へのAPの酵素的作用により生成されたアンチエンハンサー(４-ニトロフェノール)により減少することがある。後者の形態で、APの存在は、光の強度で減少を測定することにより分析されることができる。
【００１９】
上記と類似して、また、加水分解酵素の定量のために酵素で誘発可能な保護されたエンハンサーを使用した分析法がヨーロッパ出願０５１６９４８ A１でAkhanvan-Taftiにより明らかになった。
【００２０】
WO/９６０７９１１でAkhanvan-Tafti等は、光を放出する種はペルオキシダーゼ及びパーオキシドによりアクリダンの酸化から生成されるという保護されたエンハンサーの原理に基づく加水分解酵素を検出する他の方法を開示した。
【００２１】
アクリデン・エノール・ホスフェート
Akhanvan-Tafti等(US５７７２９２６; WO９７/２６２４５)は、非発光アクリデン・エノール・ホスフェートで表されるヘテロサイクリック・エノール・ホスフェートの分類を開示した。燐酸酵素との反応で、光を出すため酸素分子と反応するデホスホリル・エノラートに転換される(下記スキーム参照)。また、光の出力が分析システムに陽イオン性の芳香族化合物を付加することにより大きく増強されるということが開示されている。
0003819294.tif 000002
【００２２】
加水分解酵素用の他の化学発光基質
米国特許第５,５８９,３２８号でVijayは、インドキシル・エステルの加水分解を触媒するアルカリ性燐酸酵素のような加水分解酵素を検出又は定量する化学発光分析法を開示した。この分析法は、インドキシル・エステルとテスト試料を反応させた後、直ちに又は短い時間内(一般的に約１５分以下)に得られた化学発光を測定する段階を含む。得られた化学発光は、化学発光増強剤を添加することによって増幅され得る。
【００２３】
前記化学発光加水分解酵素方法のうち、ジオキセタン・システムは、最も敏感な検出システムであるように見え、したがって多様な分析法でますます使われてきている。その幅広い使用にもかかわらず、このシステムは、酵素が存在しない時、背景の化学発光がジオキセタンの遅い熱分解及び非酵素的加水分解によって観察されるという固有の短所を持っている。他の固有の短所は、酵素反応により生成されたフェノキシドが非常に不安定で、光を放出するために容易に分解されるということである。この点で、光を放出する種であるフェノキシドは、酵素反応のあいだに絶対蓄積されない。したがって、本発明の主な目標の一つは、区別できる放出様相を有する化学発光生成物を得、全体信号が酵素反応のあいだに蓄積され、その結果、加水分解酵素の選択的で且つ敏感性のある検出方法を提供する新規の化学発光基質を提供することである。
【００２４】
（発明の要約）
本発明の第１の目的は、加水分解酵素の基質である化学発光化合物を提供することである。加水分解酵素で処理した前記化学発光基質は、明らかに異なる光放出特性を有する、対応する化学発光生成物に転換される。
【００２５】
本発明の他の目的は、加水分解酵素の基質であるアクリジニウム系化学発光化合物を提供することである。前記化学発光基質は、分子内に熱及び加水分解に安定したグループにより覆われるフェノール部分とエノール部分を含む。加水分解酵素で処理した前記化学発光基質は、明らかに異なる光放出特性を有する対応する化学発光生成物に転換される。
【００２６】
本発明の他の目的は、前記化学発光基質及び生成物が明らかに異なる光放出特性を持つため、基質と生成物がいずれも同一のテスト容器に存在する時、生成物の信号から基質信号を分離又は検出するか、その反対のものを可能にすることである。
【００２７】
本発明の他の目的は、加水分解酵素により生成された前記化学発光生成物が、その対応する化学発光基質の放出とは異なる最大放出を有することである。
【００２８】
本発明の他の目的は、加水分解酵素により生成された前記化学発光生成物が、その対応する化学発光基質の量子収量とは異なる量子収量を有することである。
【００２９】
本発明の他の目的は、加水分解酵素により生成された前記化学発光生成物が、その対応する化学発光基質の光放出速度とは異なる光放出速度を有することである。
【００３０】
本発明の他の目的は、加水分解酵素により生成された前記化学発光生成物が、その対応する化学発光基質の物理化学的性質とは異なる物理化学的性質を有することである。前記物理化学的性質は特に限定されるものではないが、基本純電荷分布、双極子モーメント、π-結合順序、自由エネルギー、又は見かけ上の疎水性/親水性、溶解度、親和度及び当業者に明白な他の性質をも含む。
【００３１】
本発明の他の目的は、光放出特性の差異がより拡張されるように、前記化学発光基質を構造的に操作することである。
本発明の他の目的は、化学発光基質に加水分解酵素作用の結果である化学発光生成物が酵素反応のあいだ実質的に分解されず、光放出試薬により誘発されるまで蓄積され得ることである。
【００３２】
前述した本発明の組み合われた目的及び利点は、次により得られる:
【００３３】
A.  第一に、下記一般式Ｉの加水分解酵素の化学発光基質は次の通りである。
【００３４】
Lumi-M-P    (式Ｉ)
【００３５】
ここで、Lumiは、(a)それ自体により、(b)結合されたMPを使用して、そして(c)結合されたMを使用して光を作ることができる化学発光部分である。Lumiは、特に限定されるものではないが、化学発光アクリジニウム化合物(例えば、アクリジニウム・エステル、アクリジニウム・カルボキシアミド、アクリジニウム・チオエステル及びアクリジニウム・オキシム・エステル)、ベンゾアクリジニウム化合物、キノリニウム化合物、イソキノリニウム化合物、フェナンスリジニウム化合物及びルシゲニン化合物又は上記の還元された(例えば、アクリダン)又はnon-N-アクリル化形態(例えば、アクリジン)、スピロ・アクリダン化合物、ルミノール化合物などを含む。Mは、酸素、窒素及び硫黄から選択された少なくとも一つの孤立電子双を有する多価のヘテロ原子であり、一端はLumiの光放出部分に、他端はPに直接結合される(M単独でLumiに結合されてLumi-Mを形成した時、もちろん陽性子又はそれと関連ある対イオンを有するか、イオン形態に存在する)。Pは、以下でより詳細に説明されるように、加水分解酵素により容易く除去できるグループである。Lumiの光放出部分はよく知られている。
【００３６】
例えば、Lumiがアクリジニウム化合物又はルミノールである場合、光放出部分は、それぞれアクリジニウム核又はフタロイル部分である。
【００３７】
B.  第二に、下記一般反応Aの酵素反応は、次の通りである:
0003819294.tif 000003
反応A
【００３８】
ここで、HEは、燐酸酵素、グリコシダーゼ、ペプチダーゼ、プロテアーゼ、スルファターゼ及びグアニジノベンゾアターゼのような加水分解酵素である。Lumi-M-Pは、加水分解酵素の化学発光基質である。Lumi-Mは、Lumi-M-Pと物理的及び/又は化学的性質が異なる化学発光生成物である。物理的及び/又は化学的性質は、放出波長、量子収量、光放出速度、基本純電荷分布、双極子モーメント、π-結合順序、自由エネルギー又は見かけ上の疎水性/親水性、溶解度、親和度及びその他の性質を含む。
【００３９】
C.  Lumi-M-P及びLumi-Mの両方で発生する光放出反応
【００４０】
化学発光基質と生成物から光の放出を誘導するための新規の光放出試薬の組成物及び試薬の添加プロトコルを提供するは、本発明の１つの目的であり、驚くべきことに、化学発光基質と生成物の信号間でより良好な差異をもたらす。前記光放出試薬の組成物は、単一試薬及び/又は複合試薬であることができ、反応容器に前記複合試薬が同時に又は連続的に付加され得る。本発明によれば、光放出反応は、式Ｉに示されたようにLumi-M-P及びLumi-Mの両方で発生し得る。
【００４１】
本発明の他の目的は、前記光放出試薬の組成物が１種以上のパーオキシド又はパーオキシド等価物を含み、前記パーオキシド又はパーオキシド等価物は、特に限定されるものではないが、過酸化水素を含むものである。
【００４２】
本発明の更に他の目的は、前記光放出試薬の組成物が化学発光基質及び生成物と特異に相互作用して２つの信号間の差異が最適化されることである。
【００４３】
本発明の更に他の目的は、前記光放出試薬の組成物が広い範囲の分子量を有する有機、無機又は高分子性化合物から選択された１種以上のエンハンサーを含み、基質又は生成物から光の出力を特異に増強させることである。
【００４４】
本発明の更に他の目的は、前記光放出試薬の組成物が広い範囲の分子量を有する有機、無機又は高分子性化合物から選択された１種以上の急冷剤(quencher)、遮断制又は抑制剤を含み、基質又は生成物からの光の出力を特異に急冷、遮断又は減少させることである。
【００４５】
前述した本発明の組み合われた目的及び利点は、光放出試薬の組成物により得られる。前記光放出試薬の組成物は、化学発光基質及び/又は生成物を含有する溶液に連続的に添加する二つの分離した試薬からなる。第一の試薬は、酸性過酸化水素溶液を含み、第二の試薬は、１種以上の洗剤を含むアルカリ性溶液を含む。また、任意の化学発光基質とそれらの生成物の信号間のより良い差異という利点のために、第一の試薬は、１種以上の洗剤を含むアルカリ性溶液を含み、第二の試薬は、酸性過酸化水素溶液を含む。
【００４６】
本発明の他の目的は、基質と生成物の光の放出間の差異が特異な応用に最適化されるようにする、前記化学発光反応のための最適の光検出方法を提供することである。前記最適の検出方法は、発光系、電荷結合素子(CCD)カメラ、X線フィルム及び高速光フィルムを含む光検出装置の使用を含む。前記発光系は、特異な応用に最適化された青色-敏感性光電子増倍管(photomultiplier tube; PMT)又は赤色-敏感性PMT又は他のPMTを含む。また、前記最適の光検出方法は、基質又は生成物から不要な光の放出を遮断又は減少させるための最適なろ過装置の使用を含む。
【００４７】
前記最適の検出方法は、不要な信号を除去するか減少させる連続的な方式で光を検出又は記録するための方法及び/又は装置をさらに含む。
【００４８】
前述した本発明の組み合われた目的及び利点は、１種以上の光検出方法により得られる。
【００４９】
好ましい光検出方法の第１は、基質の波長より長い波長で光を放出する生成物から化学発光信号を検出するために、酵素反応でのPMT及び長波通過フィルタの使用を含む。第２は、基質の波長より長い波長で光を放出する化学発光生成物の検出性を向上させるために、低温(すなわち、４℃以下)での赤色-敏感性PMT及び長波通過フィルタの使用を含む。また、第３は、放出波長が生成物の波長より短い基質からの化学発光信号の減少を検出するために、青色-敏感性PMT及び短波通過フィルタの使用を含む。また、第４は、放出速度が生成物の速度より速い基質からの化学発光信号の減少を検出するために、一定の光の測定時間内に最適フィルタをもって、又は最適フィルタ無しにPMTを使用することを含む。
【００５０】
本発明の他の目的は、１種以上の前記式Iの化学発光基質、１種以上の前記加水分解酵素、１種以上の前記光放出試薬の組成物及び１種以上の前記最適な光検出方法の使用を含む方法及び分析法を提供する。
【００５１】
本発明の他の目的は、生物学的試料のラベル又は標識として存在する１種以上の前記加水分解酵素又は酵素コンジュゲートの存在を定量又は定性的に検出するために、１種以上の前記化学発光基質を使用する方法及び分析法を提供する。
【００５２】
本発明の他の目的は、１種以上の分析物質の存在を定量的に及び/又は定性的に検出するために、１種以上の前記式Iの化学発光基質及び１種以上の前記ラベル化した加水分解酵素を利用する方法を提供する。
【００５３】
終わりに、本発明の他の目的は、前記化学発光基質の合成と関連した合成方法及び中間体を提供することである。
【００５４】
（発明の詳細な説明）
一般式Ｉの任意の新規の化学発光化合物が加水分解酵素の基質であり、下記に示した式の構造を有することが発見された:
Lumi-M-P
式Ｉ
【００５５】
ここで、式Ｉに示すように、Lumiは、(a)それ自体により、(b)結合されたMPを使用して、そして(c)単に結合したMを使用して光を作ることができる化学発光部分と定義される。Mは、酸素、窒素及び硫黄から選択された少なくとも一つの孤立電子双を有する多価のヘテロ原子であり、ここで、Mは、一端がLumiの光放出部分に、他端がPに直接結合する。Pは、加水分解酵素により容易に除去できるグループである。M単独でLumiに結合してLumi-Mを形成した時、陽性子又はそれと関連する対イオンを有するか、又はイオン形態で存在する。
【００５６】
Lumiの化学発光部分は、特に限定されるものではないが、下記に示すように、アクリジニウム化合物[アクリジニウム・エステル(Law et al,US ４７４５１８１)、アクリジニウム・カルボキシアミド(Mattingly et al., US ５４６８６４６;Kinkel et al, J. Biolumin. Chemilumin., ４１３６-１３９,１９８９)、アクリジニウム・チオエステル(Kinkel et al, J. Biolumin. Chemilumin., ４,１３６-１３９,１９８９)及びアクリジニウム・オキシム・エステル(Ghitti et al,PCT WO ９８/５６７６５)を含む]、ベンゾアクリジニウム化合物、キノリニウム化合物、イソキノリニウム化合物、フェナンスリジニウム化合物及びルシゲニン化合物又は上記の還元された(例えばアクリダン)又はnon-N-アルキル化された形態(例えばアクリジン)、スピロ・アクリダン化合物(Singhet al,PTC WO ９４/０２４８６)、ルミノール化合物及びイソルミノール化合物などを含む。
0003819294.tif 000004
先に示した反応Aで使われ得る加水分解酵素は、特に限定されるものではないが、
【００５７】
燐酸酵素:アルカリ性燐酸酵素、酸性燐酸酵素、ホスホリパーゼ、ホスホジエステラーゼ、ピロ燐酸酵素;
【００５８】
グリコシダーゼ:β-ガラクトシダーゼ、α-ガラクトシダーゼ、α-(D-)-グリコシダーゼ、β-グリコシダーゼ、β-グルクロニダーゼ、α-マンノ-シターゼ、N-アセチル-β-D-グルコサミニダーゼ、ノイラミニダーゼ、セルラーゼ、β-フコシダーゼ;
【００５９】
ペプチダーゼ及びプロテアーゼ:ジペプチジルペプチダーゼＩ、ＩＩ及びＩＶ、プラミノゲン活性子、カルパイン、エラスターゼ、トリプシン、カテプシンB、C、L及び０、ウロキナーゼ、グランザイムA、プロスタチン、トロンビン、トリパーゼ、ホリプシン、カリクレイン、プラスミン、プロホルモン・チオール・プロテアーゼ、アミロイドA４-発生酵素、ヒト・アデノウイルス、蛋白質分解酵素、カリクレイン、HIVプロテアーゼ;
【００６０】
エステラーゼ:コリンエステラーゼ、リパーゼ;及びスルファターゼ、グアニジノベンゾアターゼを含む。
【００６１】
水溶性の環境で熱及び加水分解にすべて安定するため、本発明の化学発光基質は、加水分解酵素の存在時に加水分解反応が容易に生じ、その結果、反応AにおいてLumi-Aで表示された生成物また化学発光体である。また、生成物の光放出特性(放出波長、速度及び量子収量)が、加水分解反応により生成された化学発光生成物の任意の化学的及び物理的性質における変化によって、対応する化学発光基質のそれとは有意的に異なる。この化学的及び物理的性質は、基本純電荷分布、双極子モーメント、π-結合順序、自由エネルギー又は見かけ上の疎水性/親水性、溶解度及び親和度などを含む。その結果として、１種以上のこのような差異に起因した識別可能な信号が生成され、したがって、先に示した反応Aに含まれる特定の加水分解酵素の定量的又は定性的決定に有用である。
【００６２】
１．異なる放出波長を有する基質と生成物
本発明で、式Ｉから選択された化学発光基質中のいずれか好ましい分類は、光を生成するために化学的に誘発され得る前記化合物と一緒に下記の式ＩＩで表示される新規の化学発光アクリジニウム化合物に関するものである:
0003819294.tif 000005
（式ＩＩ）
【００６３】
式ＩＩに示すように、Pは、水溶性媒質で熱及び加水分解に安定するが、加水分解酵素により容易に除去されるのでLumi-Mを形成するグループが望ましく;Mは、酸素、窒素及び硫黄から選択された少なくとも一つの孤立電子双を有し、Pの除去後にアクリジニウム核に電子を与える能力の強い多価のヘテロ原子が好ましい。加水分解酵素により保護基(P)の除去後に、Mは、反応媒質でイオン化されて陰イオンが生成され、したがって、アクリジニウム環システムに電子を強く提供するのが好ましい。
【００６４】
式ＩＩに示すように、R１は、０〜２０のヘテロ原子を含むアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、又はアラルキル基が望ましく;より好ましいR１は、メチル基であり、最も好ましいR１は、スルホン酸基、硫酸基、-C２０H、ポスホン酸基、エチレン・グリコール、ポリエチレン・グリコール、４級アンモニウム(-N+R３)又は１種以上の前記４級アンモニウム(-N+R３)を含有する任意のグループから選択された１種以上の親水性グループを含むスルホアルキル基又はアルキル基である。R１で親水性部分の含有物は、分子の水に対する溶解度を増加させる役割をする。
【００６５】
式ＩＩに示すように、アクリジニウム核の周辺位置にあるC１、C３、C６及びC８は、置換されるか、置換されないことがある。前記位置の１個以上が置換された時、置換体(R２a、R２b、R３b及びR３d各々)は、同じ又は異なるもので、置換又は非置換されたアリール(ArR又はAr)、ハロゲン化物、ニトロ、スルホン酸、硫酸、ホスホン酸、-C０２H、-C(０)OR、シアノ(-CN)、-SCN、-OR、-SR、-SSR、-C(O)R、-C(O)NHR、エチレン・グリコール又はポリエチレン・グリコールから選択されたものである。Rは、０〜２０のヘテロ原子を含むアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール基よりなるグループから選択されたものである。
【００６６】
式ＩＩに示すように、アクリジニウム核の周辺位置にあるC４、C５及びC７は、置換されるか、置換されないことがある。前記位置の１個以上が置換された時、置換体(R２c、R３a、及びR３c各々)は、同じ又は異なり、R２a、R２b、R３b及びR３dと同様に定義される。また、R２c、R３a及びR３cのうち一つは、M-Pと定義されることができる。この場合、C２周辺位置は、置換されるか、置換されないことがある。置換された時、置換体は、R２a、R３d、R２b及びR３bと定義されることができる。
【００６７】
また、式ＩＩに示すように、アクリジニウム核の周辺位置で任意の二つの隣接した置換体は、下記に示すように、結合されたアクリジニウム核に接合された付加的な不飽和カルボサイクリック及び/又はヘテロサイクリック環を形成するために、下記の実施例のように結合されることができる。
0003819294.tif 000006
【００６８】
式ＩＩで提供されているように、A−は、アクリジニウム化合物の四級窒素の電気的に中性のための対イオンであり、アルキル化剤と一緒に中間体アクリジンの４級化の結果として、又は引き続く合成段階中又は次の反応混合物の準備及び他の陰イオンを過量で含有する液相で、目的とする化合物の精製で発生する陰イオン交換により導入される。このような対イオンの例には、CH３SO４−、FSO３−、CF３SO３−、C４F９S０３−、CH３C６H４S０３−、ハロゲン化物、CF３COO−、CH３COO−及びN０３−を含む。もしR１置換体が４級アンモニウム陽イオン性部分と陰イオン及び双を形成できる強いイオン化グループを含むならば、A−は、一般的に存在しない。
【００６９】
Xは、窒素、酸素又は硫黄である。
【００７０】
Xが酸素又は硫黄である時、Zは省略され、Yは置換又は非置換されたアリール基であり、より好ましいYは式ＩＩＩの多重置換されたアリール基である:
0003819294.tif 000007
式ＩＩＩ
【００７１】
式ＩＩＩに示すように、R４及びR８は、同じか又は異なるもので、立体及び/又は電子効果によりアクリジニウム核とY部分間の-COX-結合を安定化する役割をするアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基(-OR)、アルキルチオール基(-SR)又は置換されたアミノ酸基であり;より好ましいR４及びR８は、１〜１０の炭素原子の短連鎖(short chain)アルキル基であり、さらに好ましくは、メチル基又はR４及びR８中の少なくとも一つが定義されるならば、他の一つは、水素又はハロゲン化物から選択された原子である。R５、R６及びR７は、同じか又は異なるもので、水素、-R、置換又は非置換されたアリール、ハロゲン化物、アミノ、-NHR、NR２、４級アンモニウム(-N+R３)、ヒドロキシル、ニトロ、ニトロソ、スルホン酸、硫酸、シアノ(-CN)、ホスホン酸、CO２H、-SCN、-OR、-SR、-SSR、-C(O)R、-C(O)NHR、-NHC(O)R、エチレン・グリコール又はポリエチレン・グリコールから選択されたものである。好ましいR５、R６及びR７は、同じか又は異なるもので、スルホン酸、硫酸、-C００H、燐酸塩、エチレン・グリコール、ポリエチレン・グリコール、４級アンモニウム(-N+R３)又は１種以上の前記４級アンモニウム(-N+R３)を含有する任意の親水性部分から選択された親水性グループである。この親水性グループは、分子の水に対する溶解度を増加させる役割をする。
【００７２】
式ＩＩＩで、R４ないしR８のうち任意の隣接した二つのグループは、置換されるか又は置換されず、１種以上の付加的な接合炭化水素芳香族環又はヘテロ芳香族環を形成することができる。付加的な接合炭化水素芳香族環又はヘテロ芳香族環は、特に限定されるものではないが、ベンジン、ナフタリン、ピリジン、チオフェン、フラン及びピロールなどを含む。
【００７３】
また、式ＩＩは、他の分類であるLumi-M-Pで表示されることができるが、Lumiは、アクリジニウム・オキシム・エステル(参考文献で統合されているPCT #WO ９８/５６７６５に記載される)であり、M-Pは、前記で定義した通りである。Lumiがアクリジニウム・オキシム・エステルである時、式ＩＩで前記X、Y及びZは各々次のように定義される:
【００７４】
式ＩＩに示すように、Xが酸素である時、Zは省略され、Yは前記で定義されたもの又は-N=CR９R１０である。ここで、R９及びR１０は、同じか又は異なるもので、水素、置換又は非置換されたアリール、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロゲン化物、アルコキシル及びアリールオキシ基から選択されたものである。
【００７５】
式ＩＩに示すように、Xが窒素である時、Zは-SO２-Y'であり、このうちY’は、前記で定義されたYと同一であり、Y及びY’は、同じか又は異なることができる。また、Y自体は、炭素数１〜２０の直鎖又は分枝鎖のアルキル基、ハロゲン化するか又はハロゲン化しない、又は置換されたアリール基、又はヘテロサイクリック環システムであり得る。
【００７６】
したがって、前記で説明された変形例を提示すれば、式ＩＩでX、Y及びZは、次のように定義することができる:
【００７７】
Xは、窒素、酸素又は硫黄であり;
【００７８】
Xが酸素である時、Zは省略され、Yは、置換又は非置換されたアリール基又は−N=CR９R１０であり(ここで、R９及びR１０は、同じか又は異なるもので、水素、置換又は非置換されたアリール、アルキル、アルケニル、アメキニル、ハロゲン化物、アルコキシル及びアリールオキシ基から選択されたものである);
【００７９】
Xが硫黄である時、Zは省略され、Yは置換又は非置換されたアリール基であり;
【００８０】
Xが窒素である時、Zは-SO２-Y'であり、このうちY’は前記で定義されたYと同一であり;Yは前記で定義されたものと同じか、又は炭素数０〜２０の直鎖又は分枝鎖のアルキル基、ハロゲン化されるか又はハロゲン化されない、又は置換されたアリール、又はヘテロサイクリック環システムであることができ;Y及びY’は、同じか又は異なることができる。
【００８１】
式ＩＩの化学発光アクリジニウム化合物と構造的に密接に関連したものには、それらの還元された形態として、式ＩＶで表示される化学発光アクリダン化合物があるが、ここで、あらゆる置換体は、式ＩＩで定義された通りである。この化合物は、式ＩＩのアクリジニウム化合物の生成物と同一の、電気的に励起された生成物を形成できるように、アクリジニウム中間生成物の生成により及び/又は直接的な酸化により、光を生成できるように化学的に誘引され得る。
0003819294.tif 000008
式ＩＶ
【００８２】
式ＩＩのアクリジニウム基質と構造的に関連した化学発光基質の他の分類は、式Ｖのスピロアクリダン化合物である。ここでX１及びX２は、同じか又は異なるもので、酸素、硫黄及び窒素よりなるグループから選択されたものであり、X１及び/又はX２が酸素又は硫黄である時、Z１及び/又はZ２が省略され、X１及び/又はX２が窒素である時、Z１及び/又はZ２は、水素、アルキル、アリール又は-S０２Y'であり;Gは、５角形ないし１０角形の環を形成するためにX１及びX２と連結されたグループであり;R１、R２a-c、R３a-d、M及びPは、式ＩＩで定義された通りである。
0003819294.tif 000009
式Ｖ
【００８３】
式Ｖの化学発光スピロアクリダン基質内には、下記式ＶＩに示した下位分類及び式ＶＩを有する基質の下位分類があり、ここでGは、単一又は複数置換(R１１)又は０ないし３のヘテロ原子を有する非置換芳香族環であり、ここでR１１は、水素、-R、置換又は非置換アリール基(ArR又はAr)、ハロゲン化物、ニトロ基、スルホン基、硫酸基、ホスホン基、-CO２H、-C(O)OR、シアノ基(-CN)、-SCN、-OR、-SR、-SSR、-C(O)R、-C(O)NHR、エチレン・グリコール又はポリエチレン・グリコールである。
0003819294.tif 000010
式ＶＩ
【００８４】
式ＩＩの本発明の新規の好ましい化学発光アクリジニウム基質は、下記式ＶＩＩで表示される化合物の下位分類であり、ここで多価のヘテロ原子Mは、酸素(O)であり、Pは燐酸基、-PO３Na２であり、この二つのナトリウム陽イオンは、前記分子の電気的中性のための目的のみにより個別的に水素、カリウム、マグネシウム、カルシウム又はその他の陰イオン又は陰イオン基で代替され得る。
0003819294.tif 000011
式ＶＩＩ
【００８５】
スキームＩに示したような、好ましい加水分解酵素(HE)には、燐酸加水分解酵素がある。より好ましくは、式ＶＩＩにより定義された化合物と共に燐酸加水分解酵素を使用することである。
【００８６】
式ＶＩＩの好ましい化学発光アクリジニウム化合物と構造的に密接に関連したものは、式ＶＩＩＩで表示されるそれらの還元された形態である化学発光アクリダンであり、励起されたあらゆる置換基は、式ＶＩＩで定義された通りである。式ＶＩＩの化合物は、式ＶＩＩのアクリジニウム化合物の生成物と同一の、電気的に励起された生成物を形成できるように、アクリジニウム中間生成物の生成により、及び/又は直接的な酸化により光を生産できるように化学的に誘発され得る。
0003819294.tif 000012
式ＶＩＩＩ
【００８７】
式ＶＩＩの好ましい化学発光アクリジニウム化合物と構造的に関連した化合物のまた他の下位分類には、式ＩＸのスピロアクリダン化合物があり、ここで、X１、X２、Z１、Z２、R´、R１、R２a-c、R３a-d、M及びPは、式ＶＩで定義した通りであり、二つのナトリウム陽イオンは、式ＶＩＩで定義した通りである。
0003819294.tif 000013
式ＩＸ
【００８８】
式ＶＩＩから選択された好ましい化合物のうち一つは、下記１に示すような構造を有する２-ホス-DMAE(２-phos-DMAE)であり、式の中でR２a-c、R３a-dは水素、R１はメチル基、Xは酸素、Zは省略され、YはR４及びR８がメチル基で、R５及びR７が水素で、R６がカルボキシル基(-CO２H)である式ＩＩＩの多重置換アリール部分である(図１A参照。注:下記構造１は、添付された図１Aにも示した。同様に、本出願での他の構造式は、図１に特定序列番号に対応する番号で言及される)。
0003819294.tif 000014
１
【００８９】
実施例部分に記載される通り、２-ホス-DMAE(１)は、アルカリ性燐酸加水分解酵素(AP)の優秀な基質である。広いpH範囲のアルカリ性水溶性媒質で、それはAPにより容易に脱燐酸化され、反応Bに説明されるような２-OH-DMAE(２)を形成する。１と２は、共に化学発光体である。図２A、２B及び表１に開示されるように、化合物１と２の各々は、それらが濃いアルカリ性溶液に過酸化水素と共に投与される時、異なる最大放出波長で光を放出するということが予想に反して発見された。特に、化合物１は、４７８nmのλmaxで強く鮮明な青色光を放出する反面、化合物２は、６０２nmのλmaxで強く鮮明なオレンジ光を放出するので、１２８nmの最大放出波長の深色移動がある。図１に示すような構造を有する一対のスピロアクマリダン(１１と１２)だけでなく、複数対の誘導体(３と４、５と６、７と８)も、同じ光放出特性を有する。化合物７と８は、やはりアクリジニウム核の窒素に付加的な親水性グループを提供する。
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反応B
【００９０】
反応Cに説明される通り、アクリジニウム化合物の化学発光反応は、濃いアルカリ性溶液で過酸化水素により誘発される。高エネルギー・ジオキセタノン(dioxetanone)が形成されると、次いで離脱基LGが離脱する。非常にストレイン(strain)されたジオキセタノン中間生成物は、電気的に励起された状態で形成された部分を有するアクリドンに分解される。励起されたアクリドンが底状態に転移する時、光が放出される。放出波長は、最初の励起状態と底状態の間のエネルギー差異により決定され、多様な作用基Tを有するアクリドンの特定構造により順に決定される。参考文献に統合されているWO ００/０９４８７に記載されたように、アクリドンの最初の励起状態と底状態の間のエネルギー差異に影響を与え、放出波長に影響を与え得るいくつの要因がある。これらの要因中の一つは、必須作用基Tをアクリジニウム核の周辺位置中の一つに直接結合させることである。ヒドロキシル基が２-OH-DMAE(２)でのように、(２)又は(７)位置に配置される時、その化合物は、濃いアルカリ性溶液下で６０４nmのλmaxで光を放出するということが発見され、WO ００/０９４８７に開示されている。これは、濃いアルカリ性溶液でヒドロキシル基が脱陽性子化して、結果的に陰に荷電したオキシ陰イオンがアクリジニウム核に強い電子供与効果を発現させて、結果的にアクリドンの最初の励起状態と底状態の間のエネルギー差異を減少させて、非置換アクリジニウム化合物の光放出波長を４３０nmから６０２nmに深色移動させる原因となる。
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反応C
【００９１】
本発明で、１の(２)の位置にあるホスホリルオキシ基は、隠されたヒドロキシル基の役割をする。前記ホスホリルオキシ基は、事実上あらゆる加水分解酵素反応が発生する広いpH範囲の水溶性媒質で熱及び加水分解に安定する。またこれは、アクリジニウム化合物を光放出性のアクリドンに変換させるために必要な時間のあいだ、過酸化水素と濃いアルカリ性溶液の混合物で安定する。１でホスホリルオキシ基は、加水分解が存在しない時、実際の反応中に反応せず、過酸化水素と濃いアルカリ性溶液にも安定するから、アクリジニウム核に対して(２)位置に直接取り付けられた酸素の電子供与効果は大きく減少する。したがって、放出波長の深色移動は発生しなくなる。これが加水分解酵素の存在下に反応生成物の２-OH-DMAH(２)の状況とは大きな対照を示す。後者の場合、(２)の位置のヒドロキシル基は、アクリジニウム核に強い電子供与効果を有する、陰に荷電したオキシ陰イオンにイオン化し、放出波長の有意的な深色移動を起こす。
【００９２】
化学発光基質として１を使用したシステムで、ラベルとして使われるか、生体分子の標識として存在するAPなどのような特定加水分解酵素は、短波長を放出する１を、長波長を放出する２に変換させることが好ましい。また、過酸化水素と濃いアルカリ性溶液を処理した状態で、１と２を共に含む反応混合物は、各々自分の最大値４７８nmと６０２nmを有する光信号の混合物を生成する。短い信号(４７８nmのλmax)での減少又は長い信号(６０２nmのλmax)での増加は、酵素の量と直接的に関連する。
【００９３】
式ＶＩＩから選択された、また別の好ましい化合物には、２-Phos-７-MeO-DMAE(９)がある。反応Dで脱燐酸化した生成物である２-OH-７-MeO-DMAE(１０)は、メトキシ化しない化合物２(２-OH-DMAE)よりも６０ないし７０nm長い最大放出波長を有するものと発見された反面、二つの対応する２-燐酸化した形態は、ほぼ同一の光最大放出波長を有する。したがって、２-Phos-７-MeO-DMAEと２-OH-７-MeO-DMAEよりなる化学発光基質と生成物の双は、光放出波長でより向上した差異を效果的に提供する。この発見は、また別の好ましいアクリジニウム系化学発光基質のセットを誘導し、この時式ＶＩＩは、R３cの置換基がヒドロキシル基、チオール基、アミノ基、モノアルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、アルコキシ基又はチオアルキル基などのような所定の電子供与グループであるという点を除いては、前記で定義した通りである。この第２の電子供与グループが存在することによって、光-放出アクリドンの電気的に励起した状態と底状態の間のエネルギー差異が一層減少する。結果的に、光の放出時、赤色移動(red-shift)が２-ヒドロキシ-DMAEに比べてより多く観察される。このような移動は、青色及び赤色放出型アクリジニウム・エステル双の増加されたスペクトラム差異に起因する。
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反応D
【００９４】
本発明に開示された酵素検出方法のうち一つは、酵素反応から発生する生成物(２)の長波長信号を検出することである。光の検出のために通常使われる方法では、０００発光計、CCDカメラ、X線フィルム及び高速光フィルムを含む。検出される加水分解酵素は、大概は試料中に少量存在するので、酵素により発生する生成物の量は、反応時に使われた基質の量より、比較的少量である。したがって、基質の強い信号の存在下にこのような少量の信号を検出できることは重要である。
【００９５】
加水分解酵素により生成された２のような生成物の長波長放出信号を検出することと関連して、本発明の一つの重要な側面は、赤色-敏感性光電子増倍管(PMT)を具備する発光計を使用することである(大概このような形態のPMTは、システムノイズを減少させるために使用するあいだ冷却される)。最も普遍的に使われる市販の光電子増倍管は、暗電流が低いバイアルカリ物質で構成される。これは、短波長領域で優秀な量子収量を持つが、長波長領域では非常に低い量子収量を持つ。例えば、ハママツのバイアルカリPMTモデルR２６８は、４００ないし５００nmの範囲で約２２%の量子収量を持ち、６００nm及びその以上でたった２%以下の量子収量を持つので、これの適用は望ましくない。一方、マルチアルカリ物質から製造されたPMTは、バイアルカリ物質から製造されたPMTより比較的赤色に敏感である。例えば、ハママツのマルチアルカリPMTモデルR２２２８は、４００ないし５００nmの範囲以上で３ないし５%の量子収量を持ち、６００nm附近で約５%の量子収量を持つ。これは、適用するにより好ましい。このPMTの欠点は高い暗電流で、したがって、これは暗電流を抑制するために低温で作動させなければならない。図３及び図４は、各々バイアルカリR２６８とマルチアルカリR２２２８PのPMTの量子効率を示すものである。
【００９６】
生成物の長波放出信号を検出することと関連した本発明のまた別の有用な側面は、電荷結合素子(CCD)カメラ、特に薄くてかつ後方で照射される冷却型CCDを使用することである。図５に示すように、前記CCDは、４００nmで約８０%の量子効率を持ち、７００nmで約９０%の量子効率を持つので、長波放出(＞５５０nm)信号の検出率が、R２６８より１０ないし２０倍又はそれ以上増加し得る。
【００９７】
本発明の基質と生成物は、いずれも化学発光体であるから、２の長波放出信号を検出することと関連した本発明の必須的なな側面は、１から短波信号を遮断するためにろ過装置を使用することである。図６及び図７は、各々コリオン(Corion)LL７００及びLL６５０の長波通過フィルタ(Corion、Franklin、MA)の透過率を示すものである。
【００９８】
加水分解酵素を検出するために１のような化学発光アクリジニウム基質を使用することにおける一つの利点は、酵素反応の間に酵素により生成された２のような生成物が実質的な分解を経ることなく蓄積され得るということである。図８及び図９は、pH９及び１０．５の水溶性担体で、かつ、異なる上昇温度で２-OH-DMAE(２)の安定性を示すものである。
【００９９】
加水分解酵素により生成された生成物の長い放出信号の検出と関連した感度は、生成物(２)と基質(１)の信号の差異に大きく依存する。したがって、高感度システムを得るために、基質２-ホス-DMAEの背景の放出を減少させることが好ましい。アクリジニウム化合物から光を発生させることは、伝統的に酸性の過酸化水素溶液をまず処理した後、アルカリ性の界面活性剤溶液で処理することによって製造される。酸は、アクリジニウム化合物の擬似形態を４級形態に変換するために添加され、界面活性剤は、アクリジニウム化合物の量子収量を向上させることを補助するために添加される。好ましくは、前記酸性の過酸化水素溶液は、過酸化水素を０.００１ないし５%の濃度で含み、窒酸を０.００１ないし１Nの濃度で含み、前記アルカリ性の界面活性剤溶液は、水酸化ナトリウムを０.０１ないし１Nの濃度で含み、AQUARD(CTAB)を０.０１ないし１%の濃度で含むことである。より好ましくは、前記酸性過酸化水素溶液は、０.５%の過酸化水素と０.１Nの窒酸を含み、前記アルカリ性界面活性剤溶液は、０.２５Nの水酸化ナトリウムと０.５%のAQUARD(CTAB)を含むことである。
【０１００】
予想外の発見として、２から長波放出信号を検出することの利点は、任意の条件下で１からの化学発光が選択的に、かつ有意的に抑制されるので、これにより１に対する２の全体信号の差異が向上する。特に、１の化学発光は、前記溶液がアルカリ溶液でまず処理され、その後過酸化水素溶液で処理される場合、有意的に低くなる。より具体的には、１の溶液が０.５%のAQUARDを含む０.２５Nの水酸化ナトリウム溶液でまず処理された後、０.５%の過酸化水素を処理する場合、１の量子収量が３０倍以上低くなる。反対に、同じ条件下で、２の量子収量は基本的に影響を受けない。その結果、信号の差異の全体的な向上は３０倍である。したがって、特定の化学発光生成物とそれらの基質との信号間での一層良好な差異という利点のため、好ましくは、前記アルカリ性溶液は、０.０１ないし１Nの水酸化ナトリウムと、０.０１ないし１%のAQUARDを含み、前記過酸化水素溶液は、０.００１ないし５%の濃度の過酸化水素を含む。より好ましくは、前記アルカリ溶液は、０.２５N水酸化ナトリウムと、０.５%AQUARDを含み、前記過酸化水素溶液は、０.５%過酸化水素を含む。
【０１０１】
前記の試みを一つ以上結合させることによって、２-ホス-DMAE(１)へのAPの作用で発生する長い放出信号を検出する原理に基づく数個の分析システムが構成され、これらは、実施例に記載されている。一つの実施例(実施例１７)は、４５℃で１時間１００mMのpH９トリス緩衝溶液中に０.１mMの２-ホス-DMAE(１)、１mMの塩化マグネシウムを含む基質溶液でのAP標準物の培養から構成される。光の出力は、４℃の冷たい室内にある、赤色に敏感なPMT(R２２２８P)及び長波通過フィルタ(LL７００)を備える発光計を用いて測定された。試料は、０.５%のAQUARDを含有する０.２５Nの水酸化ナトリウム溶液でまず処理した後、すぐに０.５%の過酸化水素を処理した。図１２に示すように、APは１.０E-１８モル以下の水準で検出される。同じ条件下で別の実施例が実施例１６に提供され、その結果は、図１０及び図１１に示されている。
【０１０２】
２-ホス-DMAE(１)の背景を選択的に減少させるための他の重要な方法は、選択的急冷によるものである。ここで、そして以後で、選択性急冷は、エネルギー伝達メカニズムを介して化合物１のような基質の化学発光を選択的に減少させるために、一つ以上の化合物又は化学的部分を使用することを意味する。
【０１０３】
スキームＩＩＩの後ろで言及したが、アクリジニウム化合物の化学発光反応から起因する励起するアクリドン(供与体)のエネルギーは、隣接した非蛍光分子(non-fluorescent;受容体又は急冷剤)に伝達されることができる。このような非蛍光分子は、非放射経路を通じて底状態に変換されてエネルギーを放出する。アクリジニウム化合物の量子収量は、急冷の結果として弱化するか又は減少する。急冷効果は、距離、スペクトラムの重なり及びアクリジニウム化合物と急冷剤の転移双極子-双極子相互作用に影響を受ける。第一に、電子伝達の効果は、供与体と受容体間の距離の６倍強さに反比例するので、アクリジニウム化合物と急冷剤は、隣接する必要があり、２０ないし１００%の急冷効果を達成するためには１０nmより近い距離に位置するのが好ましい。第二に、急冷剤のUV吸収スペクトラムは、アクリジニウム化合物の放出スペクトラムと少なくとも部分的に重なる必要がある。最後に、効果的な転移双極子-双極子相互作用を得るために、二つの関連分子の空間構造を制御することが容易なことではないが、空間的に隣接して位置した２分子の相対的に自由な運動は、このような要件を充足させる。
【０１０４】
一般的な２つの急冷法には、分子内急冷及び分子相互間急冷がある。特に本発明と関連して、同一の溶液内に急冷剤とアクリジニウム化合物が共存するが、２分子が相互連結されていない場合を分子相互間急冷と言い、急冷剤とアクリジニウム化合物が共に１分子に共有結合されている場合を分子内急冷という。分子相互間急冷の場合、急冷効果は、アクリジニウム化合物の濃度に対する急冷剤の濃度に依存する。急冷剤又は基質又はこれら両者の濃度は、急冷を效果的にするために、ミリモルの範囲でなければならない。しかし、分子内急冷の場合、急冷効果は、２分子間の結合距離により決定され、２つを連結したテザーの長さを適切に選択することによって順に認定されることができる。
【０１０５】
急冷剤の選択と密接に関連した他の側面では、急冷剤は、２-ホス-DMAE(１)の光をただ選択的に又は優先的に急冷する必要があり、２-OH-DMAE(２)の光放出にほとんど又は全く影響を及ぼしてはならないことである。これを達成するために、急冷剤のUV吸収スペクトラムは、最小の重なりでなく、(１)の放出スペクトラムと最大の重なりを持つべきで、(２)の放出スペクトラムとは全く重ならないことが好ましい。このような事実を適用させるために効果的な急冷剤の他の基準には、大きいモル急冷定数と、充分な水溶解性を含む。急冷剤の役割をするのに適合した化合物の例を示すが、下記化合物に限定されるものではない。
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【０１０６】
本発明の目的は、選択的な急冷により基質の光放出を選択的に減少させることができる一つのメカニズムを提供することであり、その目的がこれに限定されるものではない。また、化学発光基質の量子収量を選択的に減少させることができる他の接近又はメカニズムも、本発明の範囲に属するものと理解することができる。
【０１０７】
光検出の２番目の方法は、酵素活性効果の結果として減少された基質(１)の短い放出信号を検出することである。このような検出方式は、前述したように、バイアルカリ及び青色-敏感性PMTの高い量子収量という利点を持つ。また、青色-敏感性PMTの使用と関連して、加水分解酵素反応で生成物の長波長光の放出を遮断するために、長い放出信号を遮断できるろ過装置が使用される必要がある。
【０１０８】
式ＩＩに属するもので、本発明と関連した化学発光基質のまた別の重要な下位分類は、「逆放出」可能な基質であり、そのうちLumi-M-Pは長波長の光を放出できる反面、生成物Lumi-Mは短波長の光を放出することができる。このような逆放出方式の一つの主要な利点は、生成物が短い放出信号で短波通過フィルタが設置されたバイアルカリ、青色-敏感性PMTにより検出され、前記PMTの量子収量は、２２%と高い。
【０１０９】
逆放出が可能な化学発光基質は、式ＩＩのM-Pを式Ｘで代替したものである。
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式Ｘ
【０１１０】
式Ｘに提供されるように、好ましいMとPは、式ＩＩで定義した通りである。EDは、電子双を共役系に与える電子供与グループ、望ましくはイオン化グループであり、ヒドロキシル、-OR、-NR´R″、チオール(-SH)、-SR及び-CHW(ここで、nは１又は２であり、Wは特に限定されるものではないが、ニトロ基、ニトロソ基、シアノ基(-CN)、-CHO、-C(O)R、-N＋RR´R″、-CO２H、-COOR、-S(O)R、-SO２R、-SO２OR、-SO２NHR、-SO２NR´R″-SO３H又はFを含む電子を引っ張るグループ(electron withdrawing group)であり、Rは式ＩＩで定義されており、R´とR″はヒドロキシル又は低級アルキル基であり、R、R´及びR″はすべて同一であるか異なる場合もある)から選択される。EDは、R１２又はR１５と相互交換することができる。
R１２、R１３、R１４及びR１５は、同じか又は異なることができ、水素、-R、ヒドロキシ基、アミノ基、ハロゲン化物、ニトロ基、ニトロソ基、スルホン基、硫酸基、ホスホン酸基、-CO２H、シアノ基(-CN)、-SCN、-OR、-SR、-SSR、-C(O)R、及び-C(O)NHR及びRから選択され、Rは、式ＩＩで定義されており;また、R１２ないしR１５の任意の２つの隣接グループは、置換されるか又は置換されない一つ以上の付加的な接合炭化水素芳香族環又はヘテロ芳香族環を形成することができ、前記付加的な接合炭化水素芳香族環及びヘテロ芳香族環は、特に限定されるものではないが、ベンゼン、ナフタリン、ピリジン、チオフェン、フラン及びピロールなどを含む。
【０１１１】
好ましくは、R１２、R１３、R１４及びR１５はすべて水素であり、EDはヒドロキシであり、逆放出可能な化学発光基質は、式ＸＩで表示される。
0003819294.tif 000020
式ＸI
【０１１２】
また、式Ｘで表示されるグループは、アクリジニウム核のC３の位置に存在し得、下記式ＸＩＩで表示される。
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式ＸＩＩ
【０１１３】
より好ましくは、式ＸＩ及びＸＩＩで、Mは酸素;Pはホスホリル基、-PO３Na２であり、この時、２つのナトリウム陽イオンは、分子の電子中性化を維持するために、水素、カリウム、マグネシウム、カルシウム又は他の陽イオン(１つないし複数)又は陽イオン基(１つないし複数)で個別的に交換できる;R２a-cとR３a-dは水素、R１はメチル;Xは酸素で、Zは省略され、Yは、式中のR４及びR８がメチル基で、R５及びR７が水素で、R６がカルボキシル基(-CO２H)である式ＩＩＩの多重置換型アリール部分である。逆放出可能な最も好ましい化学発光基質のうちの一つは、構造１３を持つ。それは、アルカリ性燐酸酵素によりそのケト(keto)形態(１４)に容易に変換される。
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【０１１４】
逆放出可能な他の好ましい化学発光基質は、１５で示すような、化合物１３の還元された形態である。１３と同様に、化合物１５もアルカリ性燐酸酵素によりそのケト形態(１６)に容易に変換される。
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【０１１５】
化合物１３と１５は、いずれも非常に長い波長で光を放出できるという予想外の現象が発見された。図２Mは、FFFSにより測定された化合物１５の放出スペクトラムであり、６７８nmのλmaxで光を放出するものと現れた。図２Nは、APを処理した後、１５の生成物である化合物１６の放出スペクトラムである。それは、１６が４５０nmのλmaxで光を放出することを示し、１５の合計２２８nmの浅色移動を示す。
【０１１６】
溶媒を含む因子の数に起因した放出波長の浅色移動と、アクリジニウム化合物に対する化学置換効果は、参考文献に含まれたWO ００/０９４８７に記載されている。特徴的に、化合物１３から１４、１５から１６への放出波長の大きい浅色移動と関連した本発明の発見の一つは、酵素的脱燐酸化により生ずる電子が豊富な芳香族側鎖とアクリジニウム核との間で電子コンジュゲーションの妨害に起因することである。
【０１１７】
２．異なる放出速度を有する基質及び生成物
生成物、酵素-媒介されたアクリジニウム-エステル閃光速度の交代から化学発光基質を判別する手段としてスペクトラム特性に加えて酵素の濃度をモニターし測定することも効果的な方法である。したがって、この方法論は、酵素が分析でラベルとして使われる時、交代の「送信」信号を提供する。アクリジニウム・エステル光-放出速度を調節するための一つの接近は、反応Eに示されるように、フェノールに位置した適切な作用基の電子特性を変更させることである。アクリジニウム・エステルの化学発光の反応中に、フェノール・エステルを切断することは、結局光放出の原因となるジオキセタノン前駆体の生成のための前提条件である。もしこのフェノール・エステルの切断がフェノールをより良好な又は弱い離脱グループに作ることにより、予測可能な方法に変更され得るならば、対応アクリジニウム・エステルからの光放出の速度を調節することができる。例えば、フェノールのヒドロキシ部分とオルソ又はパラに位置した電子供与グループは、電子が豊富なフェノールとなり、弱い離脱グループとなる。これは、光の放出を遅くするはずである。電子供与グループの電子を引っ張るグループへの転換は、フェノール性エステルの切断を加速化するはずであり、速い光の放出が得られるはずである。電子供与グループの電子を引っ張るグループへの転換又はその反対は、酵素的に達成することができる。例えば、ペルオキシダーゼのような酸化酵素は、アミノグループのような電子供与グループを、ニトロソ又はニトログループのような電子を引っ張るグループに酸化させ得るということがよく知られている。一方、加水分解酵素は、電子を引っ張るグループ又は中性作用グループを電子供与グループに転換することができる。この場合、アクリジニウム・エステルから光の放出速度は、酵素ラベルにより遅くなる。
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反応E
【０１１８】
４'-ヒドロキシ基を有するフェノールを含有するアクリジニウム・エステルは、濃いアルカリ性溶液での過酸化水素との反応で、それらの光放出において遅い放出速度を示す。これは、一次的に４'-ヒドロキシ基を含有するアクリジニウム・エステルでのフェノールが弱い離脱グループであるからである。このヒドロキシ基の燐酸エステルへの転換は、４'-酸素置換体の電子供与能力を多少減少させる。４'-ホスホ置換体を含有するアクリジニウム・エステルから光の放出は、それらの４'-ヒドロキシ対応部分より相対的に速い。この範ちゅう内のものが、加水分解酵素で処理した後、遅い放出速度で光を放出できる化学発光アクリジニウム基質の下位グループであり、前記化学発光基質の下位グループは、式ＸＩＩＩを有する。ここで、Rl、R２a-c、R３a-d、A−、M及びPは、式ＩＩで定義された通りであり、R２dは、R２a、R２b、R３b及びR３dの定義と同様であり、R５及びR７は、式ＩＩＩで定義された。R１６及びR１７は、同じか又は異なるもので、水素、メチル、低分子量アルキル及びハロゲン化物から選択されたグループである。好ましくは、R１６及びR１７は相異なり、それらのうち一つは水素である。R１６及びR１７のいずれも水素であれば、さらに好ましい。
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式ＸＩＩＩ
【０１１９】
式ＸＩＩＩのより好ましい化学発光アクリジニウム基質のうち一つは、化合物４'-Phos-AE(１７)である。反応Fで示すように、１７は、APにより容易に転換されて生成物４'-OH-AE(１８)となる。短い測定時間(０.５〜０.３秒)で、１７は、１８より約１９０倍速く光を放出するということを発見した。理論的に基質又は生成物の濃度は、酵素活性を評価するために測定され得るが、基質４'-Phos-AE(１７)の化学発光活性を測定するために(効果的な信号の判別のために)、一層便利であるということが発見された。基質として１７を使用したアルカリ性燐酸酵素の濃度に対応する化学発光は、図１３に示した。
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反応F
【０１２０】
３.  光放出スペクトラム
化合物１〜１２及び１５〜１８の光放出スペクトラムは、米国Burbank, Calif.のPhoto Research(division of Kollmorgen社)の迅速なスペクトラム・スキャニングシステム(Fast Spectral Scanning System;FSSS)で測定された。実験は暗室で行われた。各々の化合物は、アセトニトリル又はN、N-ジメチルホルムアミドで溶解させた。閃光時に充分な強度で光を放出する作業溶液を製造するために、得られた濃縮物を同一な溶媒で希釈した。一般的な実験は、１３x１００ｍｍのホウ珪酸試験管に含有された５００μｌの溶媒で１０〜１００μg又はそれ以上の試料を利用した。試験管を適当な高さに上げられている試験管棚に載置した。放出された光の検出率を向上させるために、試験管の裏面にアルミニウム箔片を配置した。試験管の液体に焦点が合わせられたレンズを有するFSSSの光学ヘッドを約１３０ｍｍの隣接距離で試験管の前方に配置した。試料溶液を０.１Nの窒酸と０.５%の過酸化水素を含有する０.３５mlの閃光剤#１(Bayer Diagnostics)でまず処理した。次いで、室内を暗くして、０.２５Nの水酸化ナトリウムと０.５%のARQUADを含有する０.３５mlの閃光剤#２(Bayer Diagnostics)を直ちに反応混合液に添加した(参考文献に一般的に割り当てられ統合された米国特許第４,９２７,７６９号参照)。試薬#２の添加後に直ちに発生した光が試薬#２の添加前に約１秒から始まり、５秒間FSSSに記録された。FSSSで測定された多様な放出スペクトラムが図２A〜２Pに示されており、表１にまとめられている。
【表１】
0003819294.tif 000027
領域は、ピック高さの約５%の信号強度を有するスペクトラムの領域を示す。
^  放出スペクトラムの範囲がFSSSのスキャニング範囲(３８０-７８０nm)を外れたものである。
【０１２１】
４.  結合分析法での化学発光酵素基質の適用
ここに開示された実際診断分析法の特定の実施例は、アルカリ性燐酸酵素のための化学発光基質として２-Phos-DMAE(１)を使用するが、多様な加水分解酵素が内因性診断酵素の標識又は加水分解酵素がラベルとして使われるべき他の臨床的に関連ある診断標識の検出のための多様な分析法の構成(architectures)において、適当な化学発光基質と共に使われ得ると結論づけることが合理的である。アルカリ性燐酸酵素は、血清でヒト・チロイド刺激ホルモン(human thyroid stimulating hormone;TSH)の検出のためにラベルとして使われるものである。したがって、酵素的な診断分析法の分野における当業者に自明であるようにこれらの分析法の構成を主張するが、このような主張が下記の説明に限定されるものではない。
【０１２２】
ａ.  比色又は蛍光検出からの分析送信システムの化学発光検出への転換:
酵素ラベルとそれらに依存する発光化学の生物分析技術への共同-適用は、非常に敏感な臨床検出方法を開発するための幾つかの戦略のうち一つとして報告された  Kricka, [Clin.Biochem.,２６,３２５,(１９９３)]。特に、これら比色又は蛍光分析法がすでに様々な形態で存在するため、それらの比色又は蛍光測定の現在の方法から、既存の診断テスト形態の化学発光検出の潜在的により敏感な方法へ転換することは、臨床分析で多様な適用を有する。前述したように、発色性及び蛍光性の指示物質は、酵素又は分析物質の検出のために酵素基質の形態で敏感性免疫分析法において使用され、これら酵素は、ラベルとして敏感性免疫分析法と関連がある。本発明は、一般的に酵素基質の化学発光-放出特性が得られた生成物と区別され、前記基質の生成物への触媒的転換のための酵素源が、酵素又は分析物質の測定のために直接的に酵素活性を測定するのに使われることができ、酵素がラベルとして取り付けられているという分析順序を開示する。
【０１２３】
ｂ.  下記実施例でヒトTSHのような分析物質は、各々固相に固定され、酵素ラベルで表示化された二つの異なる抗体で特異に複合化される。試料において分析物質の定量は、捕獲化したラベル、この場合はアルカリ性燐酸酵素の量に補正されなければならないし、最後に観察された化学発光の大きさに補正される必要がある。しかし、それぞれ免疫分析法及び核酸分析法として言及された二つの分類に一般的に分離された次の分析法構成のスキームをより広く想定する。これら分類は、固定されない分析物質からバウンドの分離に基づいて均一又は不均一な分析法の形態にさらに分離した。しかも、ラベルとして酵素を使用するそのような現在の分析システム、すなわちEIA、ELISA、Emit（登録商標）等に対する主張を制限するものではないが、酵素が非酵素ラベル、すなわち放射性同位元素、色素団、蛍光剤等に自由に代替できるという臨床的診断の領域をも含む。
【０１２４】
ｃ.  不均一化学発光の分析
固相基質、例えば、ポリスチレン表面、磁気粒子又はこれらの結合により又は沈殿する蛋白質により吸着のように非特異的に、又は固相に非共有結合的に付着することにより、あるいは相補核酸序列、ビオチン、抗体、結合蛋白質、受容体、リガンドなどを含む(直接的な)結合パートナーにより特異的に捕獲された酵素が、化学発光基質の適用以前に他の分析成分から固相の分離を通じて妨害物質から分離された。
【０１２５】
酵素は、共有結合されたラベルで、関心のある内因性診断標識であるか、あるいは特定の結合パートナー（一般的に追跡子又はプローブと称する）であり、酵素-循環分析法でのように信号の発生又は増幅のために必要な固相又は二次試薬により捕獲された。これらの分析法形態の例は、文献に幅広く報告され、特定の形態物の要約が公開された(Maggio,E.Enzyme-immunoassay;（１９８０）CRC Press)(Wild,D.;The Immunoassay Handbook;(１９９４);Stockton Press)。
【０１２６】
燐酸酵素の検出のための不均一な酵素-免疫分析法は、いくつかの形態に確立されることができた。最も簡単な方法は、分離可能な固相に特異的に燐酸酵素を結合し、化学発光の燐酸化した基質の添加前に固相から妨害物質を洗浄する抗体を使用して燐酸酵素を捕獲することである。蛋白質分析物質と関連した二番目の方法は、前述したように固相に結合された第１抗体と、アルカリ性燐酸酵素、β-ガラクトシダーゼなどの信号生成システムに結合される第２抗体を利用するサンドウィッチ分析法で類型化されることができる。分析法で酵素ラベルの濃度は、特定の化学発光基質の適用により測定される。また、小さな分析物質のための競争的分析法で、アルカリ性燐酸酵素のような化学発光生成酵素は、追跡子として分析で使用するための同一なヘプテンに結合されることができ、ここで内因性分析物質とヘプテン-酵素コンジュゲートは、サンドウィッチ分析法のための前記説明でのように、類似の信号送信メカニズムを用いた限定された数の固相結合部位のために競争した。
【０１２７】
d.  均一な化学発光分析法
また、均一な形態を適用する分析法は本発明に結合されることができる。均一な分析法の構成は、陰と陽の分析物質対照群を識別するための分析成分の分離を必要とせず、不均一な分析法より少ない工程段階を含む。
【０１２８】
Emit（登録商標）及びCEDIATMのような均一な分析技術は、化学発光検出に適用されることができた。小さな分析物質のためのEmit（登録商標）分析法は、前述したものと類似したヘプテン-酵素結合及び分析物質の特異的抗体が共に臨床試料に添加されるように開発されることができた。得られた化学発光体は、抗体-酵素複合体の生成と一緒に発生する酵素抑制の程度に依存した。CEDIATM分析法は、ヘプテンがβ-ガラクトシダーゼのアミノ-末端断片又は酵素供与体(enzyme donor;ED)断片に共有結合されることが考慮される。ヘプテン-EDコンジュゲート及び分析物質特異的抗体は、いずれも酵素受容体(enzyme acceptor;EA)と命名されたβ-ガラクマトシダーゼのカルボキシ-末端断片の存在下に臨床試料と一緒に培養された(Engel,W０.; Khanna, P.; J. Immunol. Methods:(１９９２);１５０;９９)。提案された酵素基質分析生成物(２-hydroxy-DMAE)から得られた化学発光の大きさは、残存する酵素不活性の程度に依存する。
【０１２９】
e.  化学発光ヘキサン分析
核酸分析法で核酸のラベリング及び/又は検出のために前記化学発光酵素基質システムの適用を明確に提案する。
【０１３０】
ここに開示された本発明が説明されるが、下記実施例に限定されるものではない。
【０１３１】
実施例１
【０１３２】
(２'、６'−ジメチル−４'−ベンジルオキシカルボニル)フェニル２−ヒドロキシ−１０−メチル−アクリジ二ウム−９−カルボキシレートトリフルオルアセテート(２−OH−DMAE−Bn、４)の合成。
0003819294.tif 000028
【０１３３】
４−メトキシエトキシメトキシ−ヨードベンゼン
無水テトラヒドロフラン２００mlに４−ヨードフェノール(１０g、４５.４５mmol)溶液を水素化ナトリウム(２.３６g、６０%分散、５９.０９mmol)で０℃で５分間処理した。得られた混合物に、メトキシエトキシメチルクロライド(８.３ml、７２.７３mmol)を５分間隔で徐々に添加した。混合物を０℃で窒素下で３０分間撹伴し、室温まで昇温した後、２４時間撹伴した。溶媒を減圧下除去した。残留物をエーテル５００mlに入れて、５%の水酸化ナトリウム(４x２００ml)、水(４x２００ml)、飽和塩化ナトリウム(１x２００ml)で洗浄した後、硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下溶媒を蒸発して油状の生成物１４.１gを得た。TLC(シリカゲル、エーテル):Rf０.５.
【０１３４】
N−(４−メトキシエトキシメトキシ)フェニルイサチン
無水N、N−ジメチルホルムアルデヒド２００mlにイサチン(４.０g、２７.２mmol)溶液を水素化ナトリウム(１.０３６g、６０%分散、３２.６４mmol)で室温にて０.５時間処理した後、４−メトキシエトキシメトキシ−ヨードベンゼン(１２.５７g、４０.８mmol)と沃化銅(Ｉ)(１０.３４g、５４.４mmol)を添加した。得られた混合物を１６０℃で窒素下で１７時間撹伴した。室温まで冷却し、クロロホルム４００mlで希釈した。生成混合物を無機物の除去のためにろ過した。濾液を減圧下蒸発して主産物として、N−(４−メトキシエトキシメトキシ)フェニルイサチンを含む粗混合物を得た。TLC(シリカゲル、エーテル):Rf０.８.
【０１３５】
２−メトキシエトキシメトキシ−アクリジン−９−カルボン酸
精製なしで前記粗４−メトキシエトキシメトキシフェニルイサチンを１０%の水酸化カリウム１２０mlに懸濁した。懸濁液を１５０℃で５時間還流した。室温まで冷却した後、混合物のオレンジ色の不純物を除去するためにろ過した。濾液を濃塩酸でアイスウォーターバスによりpH２に酸性化した。生成された黄色の沈殿物を回収した後、水(４x５０ml)で洗浄して、空気乾燥した。乾燥された物質をエーテル(６x５０ml)でさらに洗浄して６.７gの目的物を得た。TLC(シリカゲル、３０%メタノール/クロロホルム):Rf０.５.
【０１３６】
(２'、６'−ジメチル−４'−ベンジルオキシカルボニル)フェニル２−メトキシ−エトキシ−メトキシ−アクリジン−９−カルボキシレート
無水ピリジン１５０mlに２−メトキシエトキシメトキシ−アクリジン−９−カルボン酸(３.６g、１１mmol)溶液をp−トルエンスルホニルクロライド(４.１８３g、２２mmol)で０℃で５分間処理して均一な茶色の溶液を得た。その次、ベンジル３、５−ジメチル−４−ヒドロキシ−ベンゾエート(２.８１８g、１１mmol)を添加した。溶液を窒素下で室温にて２０時間撹伴した。溶媒を減圧下除去した。残留物を、ヘキサンが満たされたシリカフラッシュクロマトグラフィーで分離した。５０%エーテル/ヘキサン(１リットル)で溶離した後、７０%エーテル/ヘキサン(３リットル)で溶離した。生成物の分画を７０%エーテル/ヘキサン溶離液から得た。減圧下溶媒を蒸発して３.７４gの目的物を得た。TLC(シリカゲル、エーテル):Rf０.８.
【０１３７】
(２'、６'−ジメチル−４'−ベンジルオキシカルボニル)フェニル２−ヒドロキシ−１０−メチルアクリジ二ウム−９−カルボキシレートトリフルオルアセテート
無水メチレンクロライド２０mlに(２'、６'−ジメチル−４'−ベンゾイルオキシカルボニル)フェニル２−メトキシエトキシメトキシ−アクリジン−９−カルボキシレート(４００mg、０.７０８mmol)のうすい黄色溶液を窒素下で室温にて１４時間撹伴しながらメチルトリフルオルメタンスルホネート(０.４ml、３.５４mmol)で処理した。得られた混合物を無水エーテル(２０ml)で処理した。沈殿物を回収した後、エーテル(４x２０ml)で洗浄して粗生成物３２５mgを得た。MS:(ESI):m/z４９２.６(M+)。１H NMR(３００MHz、MeOD−d４/CDC１３):δ２.５２(６H、s)、５.０１(３H、s)、５.４２(２H、s)、７/３７−７.５１(５H、m)、７.８１(１H、d、J=２.６Hz)、７.９７(２H、s)、８.１０(１H、t、J=７.０Hz)、８.１６(１H、dd、J１=８.０Hz、J２=２.６Hz)、８.４２(１H、t、J=７.０Hz)、８.６０(１H、d、J=８.８Hz)及び８.７３(２H、二つに重なった二重線、J−８.０Hz)。生成物(２５mg)を０.０５%のTFA/水(溶媒A)と０.０５%TAFの/アセトニトリル(溶媒B)との混合による勾配で溶離される精製HLPCコラム(YMC、２５０x３０mm、ODS、１０μｍ)で次のような方法でさらに精製した:４０〜６０%の溶媒Bで４０分、流速２０ml/分、２６０nmでモニターする。約３０分の保持時間のうちに目的物を回収して、メチレンクロライド/エーテルで結晶化して１７mgの純粋な４を得た。
【０１３８】
実施例２
(２'、６'−ジメチル−４'−ベンジルオキシ−カルボニル)フェニル２−ホスホリルオキシ−１０−メチル−アクリジ二ウム−９−カルボキシレートトリフルオルアセテート(２−ホス−DMAE−Bn、３)の合成
0003819294.tif 000029
【０１３９】
ピリジン(０.５ml)に(２'、６'−ジメチル−４'−ベンジルオキシカルボニル)フェニル−２−ヒドロキシ−１０−メチル−アクリジ二ウム−９−カルボキシレートトリフルオルメタン−スルホネート(５０mg、０.１０２mmol)溶液を０℃で冷却した後、予冷したピリジン０.５mlにオキシ塩化リン(５７μl、６eq.)溶液を３分間隔で滴下した。反応混合物を窒素下で３０分間撹伴した。反応液を０.５NのNaOH４００μｌで急冷した後、１NのNaOH２００μｌで急冷した。混合物を水１mlで希釈した後、ろ過した。得られた黄色の固体をDMFと水との混合液に溶解した後、０.０５%TFA/水(溶媒A)と０.０５%TAF/アセトニトリル(溶媒B)との混合による勾配で溶離される精製HLPCコラム(YMC、２５０x３０mm、ODS、１０μｍ)で次のような方法で分離した:３０〜６０%の溶媒Bで４０分、流速２０ml/分、２６０nmでモニターする。３２分の保持時間のうちに目的物(３) ２０mgを得た。MS(MALDI−TOF):m/z５７３(M+１)。
実施例３
(２'、６'−ジメチル−４'−カルボキシル)フェニル２−ヒドロキシ−１０−メチル−アクリジ二ウム−９−カルボキシレートトリフルオルアセテート(２−OH−DMAE、２)の合成
0003819294.tif 000030
【０１４０】
酢酸での３０%臭化水素４mlに(２'、６'−ジメチル−４'−ベンジルオキシ−カルボニル)フェニル２−ヒドロキシ−１０−メチル−アクリジ二ウム−９−カルボキシレートトリフルオルメタンスルホネート(１００mg)を窒素下で５５℃で１時間撹伴した後、無水エーテル１０mlで処理した。得られた沈殿物を回収し、エーテル(４x１０ml)で洗浄して(４−カルボキシル−２、６−ジメチル)フェニル２−ヒドロキシ−１０−メチルアクリジ二ウム−９−カルボキシレートブロマイド８０mgを得た。MS(ESI):m/z４０２.７(M+)。１H NMR(３００MHz、CD３CN/MeOD−d４):δ２.５２(６H、s)、４.９５(３H、s)、７.７８(１H、d、J=２.７Hz)、７.７６(２H、s)、８.１０(１H、t、J=７.０Hz)、８.１３(１H、dd、J１=９.９Hz、J３=２=２.７Hz)、８.４０(１H、dt、Jl２.７Hz、J２=８.０Hz)、８.６２(１H、d、J=８.０Hz)、８.７７(１H、d、J=９.２Hz)及び８.７８(１H、d、J=９.９Hz)。前記生成物(６８mg)を０.０５%TFA/水(溶媒A)と０.０５%TAF/アセトニトリル(溶媒B)との混合による勾配で溶離される精製HLPCコラム(YMC、２５０x３０mm、ODS、１０μｍ)で次のような方法でさらに精製した:１０〜６０%の溶媒Bで４０分、流速２０ml/分、２６０nmでモニターする。約２７分の保持時間のうちに目的物(２)４６mgを得た。
【０１４１】
実施例４
(２'、６'−ジメチル−４'−カルボキシル)フェニル１０−メチル−２−ホスホリルオキシ−アクリジ二ウム−９−カルボキシレートブロマイド(２−ホス−DMAE、１)の合成
0003819294.tif 000031
【０１４２】
(２'、６'−ジメチル−４'−ベンジルオキシカルボニル)フェニル１０−メチル−２−ホスホリルオキシ−１０−メチル−アクリジ二ウム−９−カルボキシレートトリフルオルアセテート(３、３７mg)と酢酸での３０%臭化水素２.５mlとの混合液を窒素下で５０℃で１.５時間撹伴した。得られた混合物を室温まで冷却し、エーテルで処理して黄色の沈殿物を形成した。少量のトリエチルアミンが混合された沈殿物をDMF/水に溶解した。混合物を０.０５%TFA/水(溶媒A)と０.０５%TAF/アセトニトリル(溶媒B)との混合による勾配で溶離される精製HLPCコラム(YMC、２５０x３０mm、ODS、１０μｍ)で次のような方法で分離した:１０〜６０%の溶媒Bで４０分、流速２０ml/分、２６０nmでモニターする。約１７分の保持時間のうちに分画を収集して、乾燥のために凍結乾燥して純粋な１を５.３mg得た。MS(DALTI−TOF):m/z４８２.８１８(M+１)。
【０１４３】
実施例５
フェニル２−ヒドロキシ−１０−メチル−アクリジ二ウム−９−カルボキシレートトリフルオルメタンスルホネート(２−OH−AE、６)の合成
0003819294.tif 000032
【０１４４】
フェニル２−メトキシエトキシメトキシ−アクリジン−９−カルボキシレート
無水ピリジン５mlに２−メトキシエトキシメトキシ−アクリジン−９−カルボン酸(１０１mg、０.３０８mmol)溶液にp−トルエンスルホニルクロライド(１１７mg、０.６１６mmol)を添加した。５分間０℃で撹伴して、フェノ−ル２９mg(０.０３８mmol)を添加する前に室温にて１０分間続けて撹伴した。反応液を窒素下で室温にて一日間撹伴した。反応混合液を減圧下蒸発した。残留物をメタノールとエチルアセテートとの混合液に懸濁した後、ろ過した。得られた濾液を少量の容積に減らした後、ヘキサン/エーテル(２:１)で展開する４精製シリカゲルプレート(２０x２０cmx２mmの厚さ)に分離した。主産物バンドを収集した後、同一な溶媒システムで溶離した。溶媒を除去して純粋な生成物２７mgを得た。TLC(シリカゲル、ヘキサン/エーテル２:１):Rf０.９.
【０１４５】
フェニル２−ヒドロキシ−１０−メチルアクリジ二ウム−９−カルボキシレートトリフルオルメタンスルホネート
無水塩化メチレン１.５mlにフェニル２−メトキシエトキシメトキシ−アクリジン−９−カルボキシレート(２５mg、０.０６２mmol)溶液を窒素下で室温にて一日間撹伴しながらメチルトリフルオルメタンスルホネート(３８μl、０.３３６mmol)で処理した。反応液を他の０.５mlの塩化メチレンで希釈した後、無水エーテル(４ml)で処理した。得られた沈殿物を回収して、エーテルで洗浄して６を１９mg得た。MS(ESI):m/z３３０(M+)。
【０１４６】
実施例６
フェニル１０−メチル−２−ホスホリルオキシ−アクリジ二ウム−９−カルボキシレートトリフルオルアセテート(２−ホス−AE、５)の合成
0003819294.tif 000033
【０１４７】
ピリジン(０.３ml)にフェニル２−ヒドロキシ−１０−メチルアクリジ二ウム−９−カルボキシレートトリフルオル−メタンスルホネート(１９mg、０.０４０mmol)溶液を０℃に冷却した後、予冷したピリジン０.３mlにオキシ塩化リン(２２μl、０.２４mmol)溶液を徐々に添加した。反応混合液を０℃で窒素下で３０分間撹伴して、５００μlの５%水酸化アンモニウムで１０分間急冷した。溶液を１mlの水で希釈した後、１Nの塩酸で中和した。混合物を０.０５%TFA/水(溶媒A)と０.０５%TAF/アセトニトリル(溶媒B)との混合による勾配で溶離される精製HLPCコラム(YMC、３００x２０mm、ODS、１０μｍ)で次のような方法で分離した:１０〜６０%の溶媒Bで４０分、流速２０ml/分、２６０nmでモニターする。１８分の保持時間のうちに目的物(５)８mgを得た。MS(ESI):m/z４１０(M+)。
【０１４８】
実施例７
(２'、６'−ジメチル−４'−カルボキシル)フェニル２−ホスホリルオキシ−１０−スルホブチル−アクリジ二ウム−９−カルボキシレート(２−ホス−NSB−DMAE、７)の合成
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【０１４９】
(２'、６'−ジメチル−４'−ベンジルオキシカルボニル)フェニル２−ヒドロキシ−アクリジン−９−カルボキシレート
【０１５０】
塩化メチレン(５ml)に(２'、６'−ジメチル−４'−ベンジルオキシ−カルボニル)フェニル２−メトキシエトキシメトキシ−アクリジン−９−カルボキシレート(９６０mg、１.７mmol)溶液を室温にてトリフルオル酢酸(５ml)で１９時間処理した。反応混合液を乾燥させるために窒素気流を吹き込んで、残留物をエーテルに懸濁した。生成物を回収した後、エーテル(２x１０ml)でさらに洗浄して６１０mgを得た。MS(MALTI−TOF):m/z４７９(M+１)。
【０１５１】
(２'、６'−ジメチル−４'−ベンジルオキシカルボニル)フェニル２−ジメチルホスホリルオキシ−アクリジン−９−カルボキシレート
窒素下で０℃でピリジン(２ml)に(２'、６'−ジメチル−４'−ベンジルオキシカルボニル)フェニル２−ヒドロキシ−アクリジン−９−カルボキシレート(５０mg、０.１０５mmol)に水素化ナトリウム(５mg、０.２０８mmol)を添加した。ジメトキシクロロフォスフェイト(５６μl、０.５１９mmol)を添加する前に室温にて１時間撹伴した。反応液を３時間続けて撹伴した。生成物を精製HLPCコラム(YMC、２５０x３０mm、ODS、１０μｍ)より分離した。コラムを０.０５%TFA/水(溶媒A)と０.０５%TFA/アセトニトリル(溶媒B)との混合による勾配で次のような方法で溶離した:４０〜８０%の溶媒Bで４０分、流速２０ml/分、２６０nmでモニターする。約５２分の保持時間のうちに分画を収集して凍結乾燥して目的物４５mgを得た。MS(MALTI−TOF):m/z５８７(M+１)。
【０１５２】
(２'、６'−ジメチル−４'−ベンジルオキシカルボニル)フェニル２−ジメチルホスホリルオキシ−１０−スルホブチル−アクリジニウム−９−カルボキシレート
(２'、６'−ジメチル−４'−ベンジルオキシカルボニル)フェニル２−ジメチルホスホリルオキシ−アクリジン−９−カルボキシレート(４５mg、０.０７６８mmol)と１、４−ブタンスルトン(１ml、９.７８mmol)の混合物を窒素下で１５０℃で６時間撹伴した。得られた厚いガムをアセトニトリル/水の混合液に溶解した。溶液を精製HLPCコラム(YMC、２５０x３０mm、ODS、１０μｍ)より分離した。コラムを０.０５%TFA/水(溶媒A)と０.０５%TFA/アセトニトリル(溶媒B)との混合による勾配で次のような方法で溶離した:４０〜８０%の溶媒Bで４０分、流速２０ml/分、２６０nmでモニターする。約２１分の保持時間のうちに分画を収集して凍結乾燥して目的物１mgを得た。MS(MALTI−TOF):m/z７２３(M+１)。
(２'、６'−ジメチル−４'−カルボキシル)フェニル２−ホスホリルオキシ−１０−スルホ−ブチル−アクリジ二ウム−９−カルボキシレート
クロロホルム(０.５ml)に(２'、６'−ジメチル−４'−ベンジルオキシカルボニル)フェニル２−ジメチルホスホリルオキシ−１０−スルホブチル−アクリジニウム−カルボキシレート(１mg、０.００１４０mmol)を三臭素化ホウ素(４μl、０.０４２３mmol)で処理した。窒素下で室温にて３時間撹伴した。混合物を乾燥させるために窒素気流を吹き込んだ後、アセトニトリルと水との混合液に溶解した。目的物を半精製HLPCコラム(Phenomenex、３００x７.８mm、ODS、１０μｍ)より分離した。コラムを０.０５%TFA/水(溶媒A)と０.０５%TFA/アセトニトリル(溶媒B)の混合による勾配で次のような方法で溶離した:１０〜６０%の溶媒Bで４０分、２.５ml/分の流速、２６０nmでモニターする。約１７分の保持時間のうちに分画を収集して、凍結乾燥して目的物０.１mgを得た。MS(MALTI−TOF):m/z６０５(M+１)。
【０１５３】
実施例８
(２'、６'−ジメチル−４'−カルボキシル)フェニル２−ヒドロキシ−１０−スルホブチル−アクリジ二ウム−９−カルボキシルレート(２−OH−NSB−DMAE、８)の合成
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【０１５４】
N−(４−メトキシフェニル)イサチン
無水DMF(５０ml)にイサチン(２.５g、０.０１７mol)溶液を窒素雰囲気下で０℃で冷却した後、水素化ナトリウム(０.５g、１.２当量)で処理した。０℃で３０分間撹伴してパープル溶液を形成した後、室温まで昇温した。４−ブロムアニソール(２.１３ml、１当量)を添加し、その次、沃化銅(６.４６g、２当量)を添加した。反応液をオイルバス処理として１４５℃で７時間加熱した。反応液を室温まで冷却して、同一容積のエチルアセテートで希釈した。この懸濁液をろ過して、濾液を蒸発乾燥した。TLC(１:４、エチルアセテート:ヘキサン)は非常に完全な反応であることを暗示する;Rf(生成物)=０.５。粗物質を次の反応のために使用した。
【０１５５】
２−メトキシ−アクリジン−９−カルボン酸
前記粗N−(４−メトキシフェニル)イサチンを１０%の水溶性水酸化カリウム(１５０ml)に懸濁した後、窒素雰囲気下で還流した。４時間後、還流を止めて、反応液を続けて加熱しながらろ過した。濾液を水(約１５０ml)及び氷で希釈した。その次に、溶液を濃塩酸で酸性化した。黄色の沈殿物が現われればろ過して回収した。沈殿物を冷水及びエーテルで洗浄した後、空気乾燥した。乾燥された残留物を、メタノールを使用して丸底型のフラスクに移した後、溶液の一部を蒸発乾燥した。生成された残留物をトルエンで２回蒸発乾燥した。黄褐色のパウダー１.１５gを回収した。TLC(１:４、メタノール:クロロホルム)は完全な反応であることを暗示する;Rf(生成物)=０.１４。この物質を次の反応のために使用した。
【０１５６】
２'、６'−ジメチル−４'−ベンジルオキシカルボニルフェニル)フェニル２−メトキシアクリジン−９−カルボキシレート
無水ピリジン(５０ml)に２−メトキシアクリジン−９−カルボン酸(０.８g、０.００３２mol)を窒素雰囲気下でアイスバスにより冷却して、p−トルエンスルホニルクロライドと４−ベンジルオキシカルボニル−２、６−ジメチルフェノール(０.８１g、０.００３２mol)で処理した。反応液を室温まで昇温した後、窒素雰囲気下で２４時間撹伴した。溶媒を減圧の下に除去した後、残留物をクロロホルム(１０ml)に溶解した。生成物を５%のエチルアセテート、２５%のクロロホルム、７０%のヘキサンを使用するフラッシュクロマトグラフィーを使用して精製した。生成物を含むフラッシュ分画の蒸発で、鮮明な黄色の固体０.８４gを得た。MS(MALDI−TOF):m/z MS４９２.８(M+１)。
【０１５７】
(２'、６'−ジメチル−４'−ベンジルオキシカルボニル)フェニル２−メトキシ−１０−スルホブチル−アクリジ二ウム−９−カルボキシルレート
１、４−ブタンスルトン２mlに(２'、６'−ジメチル−４'−ベンジルオキシカルボニル)フェニル２−メトキシ−アクリジン−カルボキシレート(２００mg、０.４０７mmol)の混合物を窒素下で１５０℃で１９時間撹伴した。生成された厚いガムをアセトニトリル/水の混合溶媒で溶解した。溶液を精製HLPCコラム(YMC、２５０x３０mm、ODS、１０μｍ)より分離した。コラムを０.０５%TFA/水(溶媒A)と０.０５%TFA/アセトニトリル(溶媒B)の混合による勾配で次のような方法で溶離した:３０〜６０%の溶媒Bで４０分、２０ml/分の流速、２６０nmでモニターする。約３７分の保持時間のうちに分画を収集して、凍結乾燥して目的物５８.５mgを得た。MS(MALTI−TOF):m/z６２９(M+１)。
【０１５８】
(２'、６'−ジメチル−４'−カルボキシル)フェニル２−ヒドロキシ−１０−スルホブチル−アクリジニウム−９−カルボキシレート
クロロホルム(４ml)に(２'、６'−ジメチル−４'−ベンジルオキシカルボニル)フェニル２−メトキシ−１０−スルホブチル−アクリジニウム−９−カルボキシレート(５０mg、０.０８０mmol)溶液を三臭素化ホウ素(５０μl、０.５２９mmol)で処理して、窒素下で室温にて３時間撹伴した。反応液を乾燥させるために窒素気流を吹き込んだ後、アセトニトリルと水との混合液に溶解した。目的物を精製HLPCコラム(YMC、２５０x３０mm I.D.、ODS、１０μｍ)より分離した。コラムを０.０５%TFA/水(溶媒A)と０.０５%TFA/アセトニトリル(溶媒B)との混合による勾配で次のような方法で溶離した:１０〜６０%の溶媒Bで４０分、２０ml/分の流速、２６０nmでモニターする。約２６分の保持時間のうちに分画を収集して、凍結乾燥して目的物１８mgを得た。MS(MALTI−TOF):m/z５２５(M+１)。この化合物を他の精製HLPCコラム(YMC、３００x２０mm I.D.、ODS、１０μm)を使用してさらに精製した。コラムを０.０５%TFA/水(溶媒A)と０.０５%TFA/アセトニトリル(溶媒B)との混合による勾配で次のような方法で溶離した:１０〜６０%の溶媒Bで４０分、１６ml/分の流速、２６０nmでモニターする。純粋な生成物４mgを得た。MS(MALTI−TOF):m/z５２５(M+１)。
【０１５９】
実施例９
【０１６０】
(２'、６'−ジメチル−４'−カルボキシル)フェニル２−ヒドロキシ−７−メトキシ−１０−メチルアクリジ二ウム９−カルボキシレート(２−OH−７−MeO−DMAE、１０)と(２'、６'−ジメチル−４'−カルボキシル)フェニル２−ホスホリルオキシ−７−メトキシ−１０メチルアクリジ二ウム−９−カルボキシレート(２−ホス−７−MeO−DMAE、９)の合成
0003819294.tif 000036
【０１６１】
４−ベンジルオキシブロムベンゼンの合成
アセトン(４０ml)に４−ブルモフェノール(２g、０.０１１６mol)を炭酸カリウム(１.９１g、１.２当量)と臭素化ベンジル(１.４４ml、１.０５当量)で処理した。反応液を窒素下で還流した。還流して５〜６時間後、反応液を室温まで冷却した後、同一容積のエチルアセテートで希釈した。これを水で希釈した後、有機層を分離して、硫酸マグネシウムで乾燥した後、蒸発乾燥して白色のフワフワした粉末を得た。収率=２.３６g(７３%)。
【０１６２】
N−(４'−ベンジルオキシ)フェニル−５−メトキシイサチンの合成
無水DMF(５０ml)に５−メトキシイサチン(１.５g、０.８４７mmol)を窒素下でアイスバスにより冷却した後、水素化ナトリウム(０.２５g、１.２当量)で処理した。氷での１５〜２０分後、DMF(約３ml)への４−ベンジルオキシブロムベンゼン(２.３６g)溶液を沃化銅(３.２３g、２当量)と共に添加した。生成反応液をオイルバス処理により２４時間窒素下で１４０℃で加熱した。反応液をろ過した後濾液を蒸発乾燥した。残留物をエチルアセテートに 懸濁した後、ヘキサンへの３５%エチルアセテートを使用したフラッシュクロマトグラフィーで精製した。フラッシュ分画を蒸発してオレンジ系茶色の固体によりアルキル化されたイサチンを得た。収率=１g(３２%)。
【０１６３】
２−ベンジルオキシ−７−メトキシアクリジン−９−カルボン酸の合成
前記N−アルキル化されたイサチン(１g)を１０%の水酸化カリウム(１００ml)に懸濁して、窒素下で４時間還流した。反応液を続けて加熱しながらろ過して、濾液を氷の中で冷却した。これを黄色の沈殿物が分離されて出てくるまで氷と濃塩酸との混合物で注意深く酸性化した。沈殿物を約１５分間放置して、ろ過により回収した。エーテルで洗浄した後、生成物を空気乾燥した。
【０１６４】
収率=０.７５g(７５%)。
【０１６５】
(２'、６'−ジメチル−４'−ベンジルオキシカルボニル)フェニル２−ベンジルオキシ−７−メトキシ−アクリジン−カルボキシレートの合成
無水ピリジン(３０ml)に２−ベンジルオキシ−７−メトキシ−アクリジン−９−カルボン酸(０.３６g、０.００１mol)をアイスバスにて窒素下で冷却して、p−トルエンスルホニルクロライド(０.３９g、２当量)で処理後、４−カルボベンジルオキシ−２、６−ジメチルフェノール(０.３g、１.２当量)を処理した。反応液を室温まで昇温して、窒素下で１６時間撹伴した。溶媒を減圧下除去した後、残留物をクロロホルム(約６０ml)で溶解した。クロロホルム溶液を３%の水溶性塩化アンモニウムで洗浄した。硫酸マグネシウムで乾燥した後、蒸発乾燥した。粗生成物を７０%のヘキサン、２７%のクロロホルム、３%のメタノールを使用した精製TLCで精製した後、黄色の固体を分離した。収率=０.３１g(５０%)。MALDI−TOF MS５９９.０２観察値(５９７.６７計算値)。
【０１６６】
(２'、６'−ジメチル−４'−ベンジルオキシカルボニル)フェニル２−ベンジルオキシ−７−メトキシ−１０−メチル−アクリジニウム−９−カルボキシレートリフルオルメタンスルホネートの合成
前記アクリジンエステルをジクロロメタン(５ml)に溶解した後、メチルトリフルオルメタンスルホネート(０.５７５ml、１０当量)で処理した。その次、反応液を室温にて１６時間撹伴した。エーテル(１５０ml)を添加して、沈殿された生成物をろ過により回収した後、空気乾燥した。収率=０.２３g。MALDI−TOF MS６１３.３３観察値(６１２.７計算値)
【０１６７】
(２'、６'−ジメチル−４'−カルボキシル)フェニル２−ヒドロキシ−７−メトキシ−１０メチルアクリジ二ウム−カルボキシルレート(１０)の合成
前記アクリジニウムエステル(０.１２４g)を硫化メチルと３０%HBr/AcOH(１:１、４ml)の混合物で撹伴した。４時間後、生成物を沈殿させるためにエーテルを添加して、ろ過で回収した後、空気乾燥した。これをメタノールに溶解した後、３.９x３００mmC１８コラム、それぞれ０.０５%TFAを含む１０−１００%のアセトニトリル/水の３０分勾配、１ml/分の流速、及び２６０nmでUV検出を使用する分析用HPLCで分析した。出発物質を２４分間溶離し、生成物質を１５分間溶離した。また、粗物質６０%を精製HPLCで精製して、HPLC分画を凍結乾燥した。収率=４２mg(８０%)。MALDI−TOF MS４３２.８７観察値(４３２.４５計算値)
【０１６８】
（２’、６’−ジメチル−４’−カルボキシル）フェニル２−ホスホリルオキシ−７−メトキシ−１０−メチル−アクリジ二ウム−９−カールボキシレート（９）
前記保護されない粗アクリジ二ウムエステル（８０mg）をピリジン（２５ml）に溶解した後、０℃で窒素下、オキシ塩化リン（３x７５nm、約１５当量）で処理した。反応液を１時間撹伴した後、水（３ml）で急冷して、さらに室温にて撹伴した。反応液を少量の容積に濃縮した。前記１０−６０%のアセトニトリル/水（それぞれ０.０５%TFA含有）の４０分勾配を使用することを除いては、前述と同様な条件を使用するHPLC分析で出発物質を２４分間溶離して、生成物質を２０分間溶離した。生成物を精製HPLCで分離して、HPLC分画を凍結乾燥した。収率=３mg黄色の粉末。MALDI−TOF MS５１３.００観察値(５１３.２６計算値)
【０１６９】
実施例１０
【０１７０】
２−OH−スピロアクリダン（１２）及び２−ホス−スピロアクリダン（１１）の合成
0003819294.tif 000037
【０１７１】
N−(４'−ベンジルオキシ)フェニルイサチン)
DMF(５０ml)、イサチン(４g、２７.２mmol)溶液に窒素下で室温にて水素化ナトリウム(８７１mg、３４.５mmol)を添加した。反応溶液の色がオレンジからピンクに変わった。４−ベンジルオキシフェニルブロマイド(１０.２１g、３８.８mmol)と沃化銅(１０.３４g、５４.４.mmol)を添加する前に室温にて３０分間撹伴した。窒素下でオイルバス処理により１６０℃で２０時間還流した。室温まで冷却した後、反応溶液をクロロホルム(４００ml)に付加してろ過した。濾液を減圧下に濃縮乾燥して茶色のガムで目的物を得た。追加のろ過なしで、次の段階で使用した。
【０１７２】
２−ベンジルオキシアクリジン−９−カルボン酸
１０%KOH/H２O(２２０ml)に前記混合物を１３０℃で２０時間還流した。反応液を加温しながらろ過して、濾液を濃塩酸でpH３に酸性化する前に０℃に冷却した。黄色の沈殿物をろ過して、ろ過ケーキを水(４x２００ml)で洗浄した。減圧下に５０℃で２０時間乾燥した。目的物１.８gを得た。MS(MALTI−TOF):m/z３３１(M+１)にて確認した。
【０１７３】
(２'−ベンジルオキシ)フェニル２−ベンジルオキシアクリジン−９−カルボキシレート
ピリジン(３０ml)に２−ベンジルオキシアクリジン−９−カルボン酸(３０６mg、０.９３mmol)溶液を２−（ベンジルオキシ）フェノールを添加する前に、p−トルエンスルホニルクロライド(２７６mg、１.４５mmol)として窒素下で室温にて３０分間処理した。反応液を室温にて２０分間撹伴した。減圧下濃縮乾燥した。生成物質は１０%で始まるエチルアセテート/ヘキサンの溶媒システムの勾配で溶離させるフラッシュコラムで精製した。目的とする分画を混合した後、減圧下濃縮乾燥して目的物２２６mgを得た。MS(MALTI−TOF):m/z５１３(M+１)にて確認した。
【０１７４】
(２'−ベンジルオキシ)フェニル２−ベンジルオキシ−１０−メチル−アクリジン−９−カルボキシレートトリフルオルメタンスルホネート
ジクロロメタン(５ml)に(２'−ベンジルオキシ)フェニル２−ベンジルオキシアクリジン−９−カルボキシレート(１０９mg、０.２１３mmol)溶液を窒素下で室温にてメチルトリフルオルメタンスルホネート(２６０μl、２.３０mmol)で処理した。反応液を乾燥させるために窒素を吹き込んで、エーテルで懸濁した。黄色の沈殿物を追加のエーテル(４x１０ml)で洗浄した。生成された固体を減圧下乾燥して目的物７１.３５mgを得た。
【０１７５】
２−OH−スピロアクリダン（１２）
３０%HBr/AcOH（４００μl）に（２’−ベンジルオキシ）フェニル２−ベンジルオキシ−１０−メチル−アクリジン−カルボキシレート（３０mg、０.０４３mmol）の混合物を４５℃で１時間撹伴した。乾燥のために窒素を吹き込んだ後、エーテルに懸濁した。固体をろ過して、追加のエーテル（４x１０ml）で洗浄した後、減圧下乾燥して目的物１７mgを得た。この生成物の一部（１１mg）を精製HLPCコラム（YMC、２５０x２０mm I.D.、ODS、１０μｍ）で精製した。コラムを０.０５%TFA/水(溶媒A)と０.０５%TFA/アセトニトリル（溶媒B）との混合による勾配で次のような方法で溶離した:１０〜６０%溶媒Bで４０分、１６ml/分の流速、２６０nmでモニターする。約２５分の保持時間のうちに分画を収集して、凍結乾燥して純粋な生成物７.３mgを得た。MS(MALTI−TOF):m/z３４７（M+１）にて確認した。
【０１７６】
２−ポス−スピロアクリダン(１１)
窒素下、０℃でピリジン(０.５ml)、前記２−OH−スピロアクリダン(５.６６mg、０.０１６mmol)溶液にオキシ塩化リンPOC１３、(７.６５μl、０.０８２mmol)を添加した。同一な温度で１時間撹伴した後、水(０.５ml)で急冷して、続けて１５分間撹伴した。減圧下濃縮乾燥して、精製HLPCコラム(YMC、２５０x２０mm I.D.、ODS、１０μｍ)で精製した。コラムを０.０５%TFA/水(溶媒A)と０.０５%TFA/アセトニトリル(溶媒B)との混合による勾配で次のような方法で溶離した:１０〜６０%溶媒Bで４０分、１６ml/分の流速、２６０nmでモニターする。約１８分の保持時間のうちに分画を収集して、凍結乾燥して純粋な生成物２.３mgを得た。MS(MALTI−TOF):m/z４２７(M+１)にて確認した。
【０１７７】
実施例１１
【０１７８】
(２'、６'−ジメチル−４'−カルボキシル)フェニル３−(β−ホスホリルオキシ−４'−ヒドロキシスチリル)−１０−メチル−アクリジ二ウム−９−カルボキシレートトリフルオルメタンスルホネート(３−エノール−ホス−DMAE、１３)及びこれの対応アクリダン(３−エノールエノール−ホス−アクリダン、１５)
0003819294.tif 000038
【０１７９】
N−［３−(１、３−ジオキソリル)フェニル］イサチン
イサチン(３.２g、０.０２１８mol)を無水DMF(７５ml)に溶解した後、窒素雰囲気下でアイスバスにて冷却した。この冷たい溶液に、水素化ナトリウム(０.５７５g、０.０２３９mol)を添加して、０℃で１.５時間撹伴した。溶液を２−(３−ブロモフェニル)−１、３−ジオキソラン(５g、１当量)で処理した後、沃化銅(８.３g、２当量)で処理した。生成された懸濁液をオイルバス処理により窒素下で１３０〜１４０℃で１６時間加熱した。室温まで冷却した後、同一容積のクロロホルムで希釈した。この懸濁液をろ過して、濾液を減圧下濃縮した。粘性の茶色のオイルを回収した後、ザイレン(１５０ml)に懸濁時して、蒸発乾燥した。残留物を、次の反応液で使用した。TLC(クロロホルムに５%エタノール)は完全な転換を表した;Rf(生成物)=０.８６.
【０１８０】
２−(９'−カルボキシアクリジン−３'−イル)−１、３−ジオキソラン
前記粗N−［３−(１、３−ジオキソリル)フェニル］イサチンを１０%KOH(１５０ml)に懸濁した後、生成された懸濁液を窒素下で４.５時間還流した。反応液を室温まで冷却した後、ろ過した。濾液を氷により希釈した後、弱酸性になるまで、２０−３０%の塩酸で酸性化した。黄色の沈殿物をろ過として分離した後、収集して、空気乾燥した。収率は約５gであり、黄色の粘着性のある固体は次の反応で使用した。
【０１８１】
アクリジン−９−カルボン酸−３−カルボキシアルデヒド
粗２−(９'−カルボキシアクリジン−３'−イル)−１、３−ジオキソラン(約５g)を８０%の水溶性酢酸(１００ml)に懸濁した。この懸濁液を窒素下で１６時間８０℃で加熱した。反応液で黄色の沈殿物が現れた。反応混合液を室温まで冷却した後、無水エーテル(約５００ml)で希釈した。沈殿された固体をろ過により回収した後、エーテルで洗浄して、空気乾燥した。これを丸底型のフラスクに移した後、トルエン(５０ml)に懸濁した後、蒸発乾燥した。この過程をもう一度繰り返した。鮮明な黄色の固体を回収した。収率=１.７２g(全体の３１%)。MALDI−TOF MS２５２.３観察値(２５１.２４計算値)。
【０１８２】
(２'、６'−ジメチル−４'−ベンジルオキシカルボニル)フェニルアクリジン−９−カルボキシレート−３−カルボキシアルデヒド
ピリジン(５０ml)にアクリジン−９−カルボン酸−３−カルボキシアルデヒド(０.３g、０.００１２mol)を窒素下でアイスバスにて冷却して、p−トルエンスルホニルクロライド(０.４５６g、０.００２３９mol)で処理した。反応液を０℃で１５分間撹伴した後、２、６−ジメチル−４−ベンジルオキシカルボニルフェノ−ル(０.３０６g、１当量)を添加した。反応液を室温まで昇温して、窒素下で４８時間撹伴した後、減圧下濃縮した。残留物をクロロホルムに溶解して、水溶性重炭酸塩及び水溶性塩化アンモニウムで洗浄した。有機層を分離して、硫酸マグネシウムで乾燥した後、減圧下濃縮した。粗残留物(０.６g)をクロロホルムへの１０%のエチルアセテートを使用するシリカ上の精製TLCで精製した;Rf(生成物)=０.６.収率=０.２４g(４１%);鮮明な黄色の固体。MALDI−TOF MS４９０.７８観察値(４８９.５３計算値)。;１H−NMR(CDC１３):δppm２.４６(s、６H)、５.４０(s、２H)、７.３７−７.５０(m、５H)、７.７８(m、１H)、７.９４(m、３H)、８.１２(d、１H、J=９.３Hz)、８.３９(d、１H、J=８.６Hz)、８.４５(d、１H、J=８.６Hz)、８.５１(d、１H、J=９.２Hz)、８.７９(s、１H)、１０.３１(s、１H)。
【０１８３】
(２'、６'−ジメチル−４'−ベンジルオキシカルボニル)フェニル３−（l'−ヒドロキシ−２'−(４'−ベンジルオキシフェニル)エチル]−アクリジン−９−カルボキシレート
無水THF(２０ml)にベンジルオキシベンジルクロライド(１g、０.００４３mol)を新たな表面に露出させるために小さなピースに割ったMg破片(約０.５g)で処理した。若干加温された時、グリニャール反応(Grignard reaction)を始めて、反応が完了するまで冷水で冷却した。グリニャール試薬の溶液をドライアイス・アセトンバスにて冷却して、ドライアイス・アセトンバスにて完全に冷却されたTHF(１０ml)、前記アルデヒド溶液(０.５g、０.００１mol)に注射器で徐々に滴下した。反応液をTLCで出発物質が完全に消耗されたことが表れるまで−７８℃で３０分間撹伴した。反応液をエチルアセテート(５０ml)で希釈した後、反応溶液を冷たい水溶性塩化アンモニウムに注いだ(約２%、２００m)。有機層を分離した後、硫酸マグネシウムで乾燥して、蒸発乾燥した。粗残留物をヘキサンでの１:４エチルアセテートを使用したシリカ上の精製TLCで精製した。生成物を黄色の固体で回収しており、これは次の反応で使われる。収率=０.３８g(５４%)。
【０１８４】
(２'、６'−ジメチル−４'−ベンジルオキシカルボニル)フェニル３−(４'−ベンジルオキシフェニルアセチル)−アクリジン−９−カルボキシレートの合成
ジクロロメタン(３０ml)に前記アルコール(０.３８g、０.５５mmol)をPCC(０.１８g、約５当量)で処理した。反応液を窒素下で室温にて撹伴した。１時間後、追加の１０当量のPCCを添加した。２時間後、反応液をエチルアセテート(２５ml)で希釈して、ろ過した。濾液を減圧下濃縮した。残留物をクロロホルムへの５%のエチルアセテートを使用したシリカ上の精製TLCで精製した。生成物を鮮明な黄色の固体で回収した。収率=８０mg(２０%)。１H−NMR(CDCl３):δppm２.４６(s、６H)、４.４７(s、２H)、５.０４(s、２H)、５.３９(s、２H)、６.９７(d、２H、J=８.７Hz)、７.２６−７.４９(m、１０H)、７.７６(dd、１H)、７.９０(dd、１H)、７.９５(s、２H)、８.２３(d、１H、J=９.３Hz)、８.３９(d、１H、J=８.７Hz)、８.４５(d、１H、J=６.９Hz)、８.４８(d、１H、J=９.３Hz)、９.０２(s、１H)。MALDI−TOF MS６８７.２７観察値(６８６.７８計算値)。
【０１８５】
(２'、６'−ジメチル−４'−ベンジルオキシカルボニル)フェニル３−(β −ジベンジル亜リン酸トリエステル−４'−ベンジルオキシスチリル)−アクリジン−９−カルボキシレート
無水ベンゼン(４ml)にジベンジル亜リン酸塩(０.２６３g、０.００１mol)をN−クロロスクシンイミド(０.１３４g、１当量)で処理した。反応溶液を窒素下で室温にて１時間撹伴した。前記アクリジンエステルケトン(８０mg、０.１１７mmol)を無水THF(５ml)に溶解した後、窒素下でドライアイス・アセトンバスにて−７８℃に冷却して、リチウムビス(トリメチルシリル)アミド(１.０Mの０.６−０.７ml)を注射器で滴下した。ピンク色の溶液が得られて、これをドライアイス・アセトンバスで２０分間撹伴した後、ジベンジルホスホクロライデートのベンゼン溶液を滴下して、室温まで昇温した。約１５分後に、反応溶液の濃ピンクが濃黄色に薄くなった。これをエチルアセテート(２５ml)で希釈して、水溶性塩化アンモニウム(約２%)で２回洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥した後、蒸発乾燥した。生成物をヘキサンへの２:３のエチル:アセテートを使用する精製TLCで精製した。収率=５９mg(５３%)、オレンジ系黄色のオイル性の固体。１H−NMR(CDC１３):δppm２.４７(s、６H)、４.９１(m、４H)、５.０７(s、２H)、５.３９(s、２H)、６.７６(s、１H、ビニール)、６.９７(d、２H)、７.１５−７.５０(m、２０H)、７.６９(m、２H)、７.８７(m、１H)、７.９６(s、２H)、８.３４(d、１H)、８.４１(d、１H)、８.５７ (s、１H)。MALDI−TOF MS９４７.１１観察値(９４７.０１計算値)。
【０１８６】
(２'、６'−ジメチル−４'−ベンジルオキシカルボニル)フェニル３−(β−ジベンジル亜リン酸トリエステル−４'−ベンジルオキシスチリル)−１０−メチル−アクリジ二ウム−９−カルボキシレートトリフルオルメタンスルホネート
前記アクリジンエノール−フォスフェイトトリエステル(５９mg、０.０６２４mmol)をジクロロメタン（５ml）に溶解した後、メチルトリフルオルメタンスルホネート(７１nm、１０当量)で処理した。反応溶液を室温にて１６時間撹伴した。３.９x３００mm、C１８コラム及びそれぞれ０.０５%のTFAを含む１０−１００%のアセトニトリル/水の３０分勾配、１ml/分の流速及び２６０nmでのUV検出を使用する反応混合物のHPLC分析;１９.２分間溶離される生物性が表れる(６０%転換)。生成物を精製HPLCで分離して、HPLC分画を減圧下濃縮した。アクリジ二ウムエステルをピンク色の固体により分離した。収率=２９mg(４３%)。MALDI−TOF MS９６２.１１観察値(９６２.０４計算値)。
【０１８７】
(２'、６'−ジメチル−４'−カルボキシル)フェニル３−(β−ホスホリルオキシ−４'−ヒドロキシスチリル)−１０−メチル−アクリジニウム−９−カルボキシレートトリフルオルメタンスルホネート(１３)
前記テトラベンジル−保護されたアクリジ二ウムエステル(１２.８mg、０.０１２mmol)を硫化メチル(１ml)に溶解して、酢酸に３０%HBrで処理した。反応液を室温にて撹伴した。４時間後、エーテル(２０ml)を添加して、沈殿された固体をろ過して収集した。生成物をメタノール(１０ml)に溶解した後、約１６分間溶離される生成物において完全な転換を表す分析用HPLC(前記参照)で分析した。HPLC分画を回転蒸発により少量の容積に濃縮して、凍結乾燥した。収率=６mg(７１%)。MALDI−TOF MS６０１.３４観察値(６００.５４計算値)。
【０１８８】
(２'、６'−ジメチル−４'−カルボキシル)フェニル３−(β−ホスホリルオキシ−４'−ヒドロキシスチリル)−１０−メチルアクリダン(１５)
粗テトラベンジル保護されたアクリジ二ウムエステル(約４０mg)をメタノール(１４ml)、アセトン(５ml)及びpHが６.９の０.１Mのアンモニウムアセテート(１.５ml)の混合物に溶解した。この溶液をパラジウムブラック(１８mg)で処理した。得られた懸濁液を室温にてバルーンを使用して水素化した。３−４時間後、薄緑の溶液を得た。反応液をろ過して、濾液を少量の容積に濃縮した。C１８コラム(３０x２５０mm)上の水に３０〜９０%のメタノール(それぞれ０.０５%のTFA含有)２５分勾配及び２６０nmでのUV検出を使用する精製HPLCでにより物質の半分を精製した。生成物が約２６.５分間幅の広いピークで溶離された。生成物を含むHPLC分画を濃縮乾燥してピンク色の固体を得た。収率=８mg。MALDI−TOF MS６００.２５観察値(６０１.５５計算値)。
【０１８９】
実施例１２
(２'、６'−ジメチル−４'−カルボキシル)フェニル３−(β−ホスホリルオキシ−４'−ヒドロキシスチリル)−１０−メチルアクリジニウム−９−カルボキシレートトリフルオルメタンスルホネート(１３)より、それのケト生成物（３−(４'−ヒドロキシベンジル)カルボニル−DMAE、１４）への酵素的転換
0003819294.tif 000039
【０１９０】
アクリジ二ウム３−エノール−フォスフェイト(１３)の１mM DMF溶液をpH９であり、１mMのMgCl２を含む１００mMのトリスpH９の１５０μｍと混合した。アルカリ性リン酸酵素(２mg/nm溶液、５μl)を添加して、反応液を室温にて約１時間培養した。３.９x３００mmC１８コラム及びそれぞれ０.０５%のTFAを含む水にMeCNの３０分勾配、１ml/分の流速及び２６０nmでのUV検出を使用するHPLC分析は完全な転換を表した;Rt(出発物質)=１６分、Rt(生成物)=２０分。生成物は７.８x３００mm、C１８コラムを使用する半精製HPLCで分離した。生成物のMALDI−TOF MSは、これがケト生成物(１４)ということを表す:m/z５２１.３６観察値(５２０.５６計算値)
【０１９１】
実施例１３
(２'、６'−ジメチル−４'−カルボキシル)フェニル３−(β−ホスホリルオキシ−４'−ヒドロキシスチリル)−１０−メチルアクリダン(３−エノール−ホス−アクリダン、１５)より、それのケト生成物（３−(４'−ヒドロキシベンジル)カルボニル−アクリダン、１６）への酵素的転換
0003819294.tif 000040
【０１９２】
アクリダン(１５)、（１.７mM）の２０μlDMF溶液をpH１０.３で、１mMのマグネシウムアセテートを含む０.１５Mの２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール１８０μlと混合した。鮮明な青色の溶液を得て(０.１７mM基質)、これをリン酸酵素(１０−１０モル)で処理した。青色を直ちに除いた。１時間後、C１８コラム(３.９x３００mm)及びそれぞれ０.０５%のTFAを含む１０〜９０%のMeCN/水の４０分勾配、１ml/分の流速及び２６０nmでのUV検出を使用するHPLC分析により２１.３分間生成物を溶離させる完全な転換を表した(出発物質が１９.３分で溶離された。)。図２Nに示すような生成物の光放出スペクトラムを決定するために反応混合物をFSSSで評価した。生成物を半精製HPLCとして分離した。MALDI−TOFMSはこれがアクリダンのケト化合物(１６)であることを表す:m/z５２１.６７観察値(５２１.５６計算値)。
【０１９３】
実施例１４
４'−ヒドロキシフェニル１０−メチル−アクリジ二ウム−９−カルボキシレートトリフルオルメタンスルホネート(４'−OH−AE、１８)
0003819294.tif 000041
【０１９４】
１、４−ジヒドロキシベンゼンモノ−ｔ−ブチルジメチル−シリルエーテルの合成
THF(２５−３０ml)にヒドロキノン(０.５g、０.００４５mol)を窒素下でイミダゾール(０.４３４g、１.５当量)とｔ−ブチルジメチルクロロシラン(０.６８６g、１当量)で処理した。反応液を窒素下で室温にて撹伴した。クロロシランの添加時、直ちに沈殿物が現われた。３〜４時間後、反応液をエチルアセテートで希釈して、水溶性重炭酸ナトリウム(約２%)及び塩水で洗浄した。硫酸マグネシウムで乾燥後、蒸発乾燥した。生成物をヘキサンに入れて２５%エチルアセテートを使用する精製TLCで精製した。オイルの生成物を得た。収率=０.５g(５０%)。
【０１９５】
４'−t−ブチルジメチルシリルオキシフェニルアクリジン−９−カルボキシレートの合成
無水ピリジン(１０ml)にアクリジン−９−カルボン酸(０.２９g、０.００１３mol)を窒素下で氷の中で冷却して、p−トルエンスルホニルクロライド(０.５９５g、２当量)で処理した。氷にて１０分間撹伴した後、ヒドロキノン モノ−t−ブチルジメチルシリルエーテル(０.２９g)を添加した。反応液を室温まで昇温した後、窒素下で１６時間撹伴した。反応液を蒸発乾燥した。残留物をエチルアセテート(５０ml)に溶解して、水溶性重炭酸ナトリウム(約２%)で洗浄した。エチルアセテート層を硫酸マグネシウムで乾燥して、蒸発乾燥した。粗生成物をヘキサンへの２５%エチルアセテートを使用するシリカ上の精製TLCを使用して精製した。収率=０.２５g(４５%)。MALDI−TOF MS４３１.６１観察値(４２９.５８計算値)。
【０１９６】
４'−ヒドロキシフェニル１０−メチルアクリジ二ウム−９−カルボキシレートトリフルオルメタンスルホネート(１８)の合成
【０１９７】
ジクロロメタン(約１０ml)に前記アクリダンエステル(９０.２５g、０.５８mmol)をメチルトトリフルオルメタンスルホネート(０.６６ml、１０当量)で処理した。反応液を室温にて１６時間撹伴した。生成物の沈殿のためにエーテルを添加し、ろ過して生成物を回収した。黄色の粉末を得た。収率=０.１９g。MALDI−TOF MS３３０.６８観察値(３３０.３６計算値)。
【０１９８】
実施例１５
【０１９９】
４'−ホスホフェニル１０−メチルアクリジ二ウム−９−カルボキシレートトリフルオルメタンスルホネート(４'−ホス−AE、１７)の合成
0003819294.tif 000042
【０２００】
前記４'−ヒドロキシフェニル１０−メチルアクリジ二ウム−９−カルボキシレートトリフルオルメタンスルホネート(３２mg、０.０６９mmol)をピリジン(１ml)に溶解して、窒素下でアイスバスにて冷却した。オキシ塩化リン(４５nm、５当量)を添加して、反応液を３０分間氷の中で撹伴した。反応液を５NのNaOH０.２５mlを含む冷たい氷水(９５０ml)に注いだ。少し撹伴した後、この溶液をクロロホルムで抽出し、続いてエチルアセテートで抽出した。水溶液を凍結乾燥した。鮮明な黄色の粉末を得て、３.９x３００mmのC１８コラム及びそれぞれ０.０５%のTFAを含む１０〜９０%のアセトニトリル/水の４０分勾配、１ml/分の流速及び２６０nmでのUV検出を使用するHPLCで分析した。生成物を１５分間溶離させるごく小さな出発物質と共に１２分間溶離した。生成物を精製HPLCで精製して、HPLC分画を凍結乾燥した。収率=１４mg、黄色のフワフワした粉末、MALDI−TOF MS４１１.１３観察値(４１０.３３計算値)
【０２０１】
実施例１６
２−ホス−DMAE(１)を使用したアルカリ性リン酸酵素の分析(４５℃、０.５時間)
２−ホス−DMAE(１)の基質溶液を、１mMのMgCl２を含むpH９、１００mMのトリス緩衝液を使用して１.０mMで製造した。アルカリ性リン酸酵素標準物質ら(シグマカタログ番号P−３６８１、活性が４９００ユニット(DEA)/mgプロテイン)を水で製造した。それぞれのアルカリ性リン酸酵素標準物質２μlを基質溶液４８μｍと共に、対照群は水２ILと共に４５℃で０.５時間培養した。その次、溶液をそれぞれ１mMのMgCl２を含むpH９、１００mMのトリス緩衝液を使用して１００倍希釈した。それぞれの希釈液(２５μｍ)を０.５%CTABを含む０.２５NのNaOH３００μlで５回繰り返して閃光した後、０.５%の過酸化水素３００μｍで閃光した。光の出力をR２６８ PMTと二つのLL６５０波長通過フィルター(Corion、Lot No.CFS−００２６４５)を備えたBayer Diagnostics社のマジックライト分析器１(MLA−１)で２回測定した。その結果を図１に示す。また、希釈物質をR２２２８P PMT及び二つのLL７００波長通過フィルターを備えたMLA−１で閃光し、ユニットは冷凍室(４℃)で予冷した。その結果を図１１に示す。
【０２０２】
実施例１７
【０２０３】
２−ホス−DMAE(１)を使用したアルカリ性リン酸酵素の分析(４５℃、１時間)
【０２０４】
実施例１６のように、アルカリ性リン酸酵素の分析は基質溶液９５nmにAP標準物質５μｍを添加することにより行われた。溶液を４５℃で１時間培養して、トリス緩衝液で１００倍希釈した。希釈液(２５μl)を０.５%CTABを含む０.２５NのNaOH３００μlで３回繰り返して閃光した後、０.５%の過酸化水素３００μlで閃光した。光の出力をR２２２８PMTと二つのLL７００波長通過フィルターを備えたMLA−１で２秒間測定して、ユニットは冷凍室(４℃)で予冷した。その結果を図１２に示す。
【０２０５】
実施例１８
４'−ホスホリルオキシフェニル−１０−メチルアクリジ二ウム−９−カルボキシレート(４'−ホス−AE、１７) を使用するアルカリ性リン酸酵素分析
１mMのMgCl２を含むpH９、１００mMのトリス緩衝液の４'−ホス−AE(１７、０.１mM)溶液を多様な濃度のアルカリ性リン酸酵素で処理した。反応液を室温で３−４時間培養した後、連続的に１０４倍に希釈して"閃光緩衝液"を作った。閃光緩衝液は１５０mMのNaCl、０.１%のBSA及び０.０５%のアジ化ナトリウムと共にpHが８、１０mMのリン酸塩を含む。２５μl溶液の化学発光をBG３８フィルターを備えたBayer Diagnostics社のマジックライト分析器１(MAL１)で測定した。測定時間は０.３秒である。反応溶液の化学発光活性の評価は酵素の濃度を増加させることによって全体の化学発光が持続的に減少することを表れた。したがって、酵素の濃度を増加させることにより、速い放出基質の４'−ホス−AEの多量の部分が光の出力で全体的な減少を誘発する緩い放出生成物４'−OH−AE(１８)に転換される(短い測定時間で)。また、添加量−反応曲線はＳ字状のものであることが現われた(log−log曲線を表１３に示す)。アルカリ性リン酸酵素はこの分析法で５x１０−１７モル（０.１ml反応容積）で容易に検出した。
【０２０６】
実施例１９
抗−αTSH−アルカリ性リン酸酵素結合の製造
ミューリン、単クローン坑−TSHのチオール化
人間の甲状腺刺激ホルモン(TSH)のα−サブユニットと結合親和性があるミューリン、単クローン抗体(３２nmole、４.９５mgs)を０.１０MのNa２HP０４、０.１５MのNaCl及び５.０mMのEDTA(pH８.１)に２−イミノチオラン(０.３２μmole、１０当量)で室温にて１時間誘導した。Sephadex（登録商標）G−２５微細コラム(１.５cmi.d.x８０mLs)の空隙容積で０.１０MのNa２HP０４、０.１５MのNaCl及びpH７.０、５.０mMのEDTAでチオール化された抗−αTSHを分離した。収率は４.６５mgs蛋白質(９３.４%回収率)である。MALDI−TOF MSで測定された混入されたチオールは３.８/抗−αTSHである。
【０２０７】
アカリ性リン酸酵素のマレイミド活性
【０２０８】
３、８８０pNPP U/mgの特定活性を有する小牛の腸のアルカリ性リン酸酵素[EC ３.１.３.１](３９nmole、５.５０mgs)を０.１０MのNa２HP０４、０.１５MのNaCl及びpH７.０、５.０mMのEDTAにスルホスクシンイミジル４−(N−マレイミドメチル)シクロヘキサン１−カルボキシレート(スルホ−SMCC)(８９nmole、２.３当量)で室温にて１時間誘導した。マレイミド−アルカリ性リン酸酵素を多重緩衝溶液の交換サイクルを使用して３０kDの分子量がカットオフである孤立保持性の遠心分離したろ過で０.１０MのNa２HP０４、０.１５MのNaCl及びpH７.０、５.０mMのEDTAで分離した。収率は４.６４mgs蛋白質(８４.４%回収率)である。MALDI−TOFMSで測定した混入マレイミドは１.０マレイミド/アルカリ性リン酸酵素である。
【０２０９】
マレイミド−アルカリ性リン酸酵素のチオール化された抗−αTSHへの結合
マレイミド−アルカリ性リン酸酵素(１２nmole、０.６２当量)を４℃で１６時間０.１０MのNa２HP０４、０.１５MのNaCl及びpH７.０、５.０mMのEDTA、チオール化された抗−αTSHに結合した。Sephadex（登録商標）G−２００コラム(１.５cm i.d.x８０mLs、４０〜１２０m)を使用して室温にて０.１０Mのトリス及びpH７.４、０.０５MのNaClでSECにより結合を分離した。１価の結合はMALDI−TOFにて確認した。
【０２１０】
実施例２０
人間の血清でTSHの化学発の光検出のための基質として２−ホス−DMAE(１)の利用を説明する、不均一な免疫分析法
【０２１１】
化学発光基質として２−ホス−DMAEの診断分析の適用性は、血清でのTSHの臨床的な定量のために考案した２価のサンドイッチ酵素−免疫分析法(EIA)で評価した。この分析法において、アルカリ性リン酸酵素−抗−Αtshコンジュゲーション(以下、'追跡子'と称する)は、非共有結合する抗原−抗体の複合体を形成するために、選択された分析物質、患者試料またはTSH含有標準物質(Bayer Diagnostics社、Walpole、MA)に存在する人間のTSHと相互作用するα−サブユニットに特異的に結合する必要がある。追跡子−分析物質の複合体は、人間のTSHに相互作用するα−サブユニットのための結合親和力で２番目、ミューリン、単クローン抗体に共有結合する、磁器ビード固相に順に捕獲される。
結合された追跡子は、結合されない追跡子から磁器的に分離されて、使われた化学発光基質の酵素加水分解により定量化する。標準曲線データは数種の対照試料のTSH濃度を計算するのに使用した。
【０２１２】
追跡子はACS(登録商標)TSH３ライト試薬緩衝液(Bayer Diagnostics社、Walpole、MA)を使用して１.０nmの作業濃度で希釈した。TSH分析は追跡子１００μlをTSH標準物質または対照物質２００μlと混合した時開始される。使われた８個のTSH標準物質はTSHを０.０００、０.１２０、０.７４０、１.９２、３.８６、８.９９、１９.９及び４９.６μI.U./ml濃度で含む(Bayer Diagnostics社、Walpole、MA)。また、３個の対照を分析した。それぞれ０.６０、５.１及び１８.４μI.U./mlの平均濃度でTSHを含むBayer Diagnostics社からのリガンド１、２及び３である。混合物はCorning社のモデル４０１０マルチチューブ・ボールテクサー (Multi−Tube Vortexer)に５をセッティングして、一括的に３回渦動した。データ値を３回繰り返して得た。２２５μlの坑−ΒTSH MLP固相(約５６μgs)をそれぞれの分析物質に添加した後、分析混合物を室温にて３０分間培養した。分析混合物を前述したように３回渦動した後、室温にて３０分間培養した。固相はBayer Magic Lite Assay Rackで永久磁石の分析を３分間適用して上澄み液から磁器的に分離した。上澄み液は固相を傾けて注いだ。残留の上澄み液は３分間吸入した後、さらに１分間吸入して除去した。固相を二つの分離した１ml容積の水で洗浄して、１００mMのトリス及びpH９.０.、１.０mMのMgCl２に０.１mMの２−ホス−DMAE(１)を含む基質溶液１００μlに懸濁した。酵素反応を４５℃で１時間行って、１０mMのリン酸ナトリウム、０.１５Mの塩化ナトリウム、０.０５%(w/v)のアジ化ナトリウム及び０.１%(w/v)のBSAを含む閃光緩衝液２.０mlを添加して、反応を止めた。二つのCorion LL−６５０光学フィルターを備えたBayer Diagnostics社のマジックライト分析器で希釈した反応混合物２５μlに閃光剤１(０.２５Nの水酸化ナトリウム、０.５%(w/v)N、N、N、N−ヘキサデシルトリメチルアンモニウム・クロライド界面活性剤)と閃光剤２(０.５%(w/v)過酸化水素)の各々を３００μl連続して添加することにより化学発光反応を開始した。化学発光データは、マジックライト分析器で検出した陽性子で収集して、相対的光ユニット(RLUs)で表示した。
【０２１３】
サンドイッチ分析変数のための計算方法
特定分析物質の濃度から得たRLUs(ここではμと表示する)の算術平均を３回繰り返して計算した。また、非追跡子分析試薬は、場合によって多数のRLUに寄与するが、寄与度は低い。ここで、追跡子を除いて全ての分析試薬を含む対照反応は、非追跡子の試薬背景(ここでnと表す)を測定するために対応するように行った。算術平均RLUs(μ)は、ただ追跡子から得たRLUs(ここでBと表す)で表すために補正しなければならない(B=μ−n)。分析物質の濃度が濃い場合、その点で補正された算術平均RLU価格はBmaxで表示される。標準物質に存在する分析物質の濃度と検出されたRLUs間の直線であるが非線形関係が存在する。したがって、同一の直線のＳ字型相関関係は分析物質の濃度と%B/Bmax結果と関連があり、正確に次のような実験による線形で表示されることができる。
0003819294.tif 000043
【０２１４】
ここで、xは分析物質の濃度であり、Yは%B/BmaxまたはRLUs(参考文献A、B及びC)で発生する観察信号である。
【０２１５】
A.Rodbard、David;Ligand Analysis;(１９８１);Langon、J.;Clapp、J.(Eds.); Masson Publishing、Inc.、New York;pp４５−１０１.
【０２１６】
B. Nix、Barry;The Immunoassay Handbook;(１９９４);Wild、David(Ed.); Stockton Press、Inc.、New York;pp.１１７−１２３.
【０２１７】
C. Peterman、Jeffrey H.;Immunochemistry of Solid−Phase Immunoassay; (１９９１);Butler、J.(Ed.);CRC Press、Inc.、.Boca Raton;pp.４７−６５.)。
【０２１８】
また、４個の追加変数、すなわち、回帰常数b、回帰係数m、分析物質の濃度が０である時、アシンプトチック非特異結合(NSB) yo及び無限大の濃度のためのアシンプトチック無限限界反応yooがある。これらの変数のうち、後者の３個はDOSECALC.EXE Rev.１.７３プログラム(Bayer Diagnostics社、Walpole、MA)の反復及び加重した、４個の変数の論理的(４PL−WTD)な分析器能を使用して直接計算する。
【０２１９】
回帰常数bの算術平均は、さらに使われた添加量の反応表現から計算した次のような分析物質の濃度の全範囲にわたって決定した。
0003819294.tif 000044
【０２２０】
未知の分析物質の濃度は次のように整理した添加量反応の方程式を使用して実質的に計算する。
0003819294.tif 000045
【０２２１】
化学発光基質として２−ホス−DMAE(１)を使用したTSH酵素−免疫分析法の標準曲線
TSH分析データは、図１４に示す化学発光とTSHとの関係ように図式化した。動的な範囲が分析物質濃度の大きさの２次式に拡張される:３個の対照血清標準物質のため、かつTSH濃度の正確な決定のための場合において満足する。
【０２２２】
TSH濃度の決定における分析の正確性
SHの濃度は加重された４PL機能を使用したBayer Diagnostics社のリガンド１、２及び３で計算した。計算値は関連した生成物の文献に記載に確立された値と正確に一致した。したがって、化学発光基質(２−ホス−DMAE)は人間の血清でTSH濃度の正確な決定のために論証可能な有用性を有している。
0003819294.tif 000046
アボットＩmx TSHキット(MEIA)に記録
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１A-１Fは、短波長を放出する化学発光基質(２-ホス-アクリジニウム・エステル)及び長波長を放出するそれらの対応化学発光生成物(２-ヒドロキシ-アクリジニウム-エステル)の構造を示し、図１G-１Lは、短波長を放出する化学発光基質(２-ホス-アクリジニウム・エステル)及びスピロ化合物(図１K〜１L)を含む長波長を放出するそれらの対応化学発光生成物(２-ヒドロキシ-アクリジニウム-エステル)の構造を示し、図１M-１Pは、長波長を放出できる化学発光基質と、短波長を放出できるその対応生成物の構造を示し、図１Q-１Rは、異なる放出速度を有する化学発光基質とその対応生成物の構造を示す。
【図２】  図２A-２Pは、迅速なスキャニング・スペクトラム・システム(Fast Scanning Spectral System;FSSS)で測定した長波長を放出できる化学発光基質と、短波長を放出できるそれらの対応生成物のスペクトラムだけでなく、化学発光基質(２-ホス-アクリジニウム・エステル)及びそれらの対応する化学発光生成物(２-ヒドロキシ-アクリジニウム・エステル)の放出スペクトラムを示す。また、異なる放出速度を有する化学発光基質と対応する生成物の放出スペクトラムをも示した。
【図３】  図３は、ハママツ(Hamamatsu)光電子増倍管R２６８の波長と量子収量の関係を示す図である。
【図４】  図４は、ハママツ光電子増倍管R２２２８Pの波長と量子収量の関係を示す図である。
【図５】  図５は、薄形で、後方照査される電荷結合素子(thinned CCD）の波長と量子収量の関係を示す図である。
【図６】  図６は、コリオンカット-オン長波通過フィルタLL６５０(Lot No.CFS-００２６４５)の透過率のプロフィールである。
【図７】  図７は、コリオン長波通過フィルタLL７００の透過率のプロフィールである。
【図８】  図８は、作用時間のあいだMgCl２を含有するpH１０.５、１００mMのトリス緩衝液で化学発光生成物(２-OH-DMAE）の安定性を示す図である。
【図９】  図９は、作用時間のあいだMgCl２を含有するpH１０.５、１００mMのトリス緩衝液で化学発光生成物(２-OH-DMAE）の安定性を示す図である。
【図１０】  図１０は、基質として２-ホス-DMAEを使用したアルカリ性燐酸酵素の検出率を示す図である。酵素反応は、４５℃で０.５時間培養した。反応混合物を０.５%のCTABを含有する０.２５Nの水酸化ナトリウムで閃光させた後、直ちに０.５%の過酸化水素で処理した。光の出力をR２６８PMT及び二つのLL６５０長波通過フィルタが装着されたMLA-１で２秒間測定した。
【図１１】  図１１は、光の出力をR２２２８PMT及び二つのLL６５０長波通過フィルタが装着されたMLA-１で測定し、ユニットを４℃で予め冷却するということを除いて、図１０の記載と同様の反応条件下でアルカリ性燐酸酵素の検出率を示す図である。
【図１２】  図１２は、基質として２-ホス-DMAEを使用したアルカリ性燐酸酵素の検出率を示す図である。酵素反応は、１時間４５℃で培養した。反応混合物を０.５%のCTABを含有する０.２５Nの水酸化ナトリウムで閃光させた後、直ちに０.５%の過酸化水素で処理する。光の出力をR２２２８PMT及びLL７００長波通過フィルタが装着されたMLA-１で２秒間測定し、ユニットを４℃で予め冷却した。
【図１３】  図１３は、基質として４'-ホス-AE(図１Q)を使用したアルカリ性燐酸酵素の検出率を示す図である。
【図１４】  図１４は、化学発光基質として２-ホス-DMAE(１)と、ラベルとしてアルカリ性燐酸酵素を使用したTSH免疫分析法の標準曲線を示す図である。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
0003819294.tif 000062
【図１Ｃ】
0003819294.tif 000063
【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
0003819294.tif 000065
【図１Ｆ】
0003819294.tif 000066
【図１Ｇ】
0003819294.tif 000067
【図１Ｈ】
0003819294.tif 000068
【図１Ｉ】
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【図１Ｊ】
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【図１Ｋ】
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【図１Ｌ】
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【図１Ｍ】
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【図１Ｎ】
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【図１Ｏ】
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【図１Ｐ】
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【図１Ｑ】
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【図１Ｒ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図２Ｇ】
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【図２Ｈ】
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【図２Ｉ】
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【図２Ｊ】
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【図２Ｋ】
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【図２Ｌ】
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【図２Ｍ】
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【図２Ｎ】
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【図２Ｏ】
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【図２Ｐ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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