(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Gly Ile Gly Lys Arg Thr Asn Glu His Thr Ala Asp Cys Lys Ile Lys Pro Asn Thr Leu His Lys Lys Ala Ala Glu Thr Leu Met Val Leu Asp Gln Asn Gln Proのアミノ酸配列を有することを特徴とする、哺乳類動物において骨刺激活性を示すポリペプチド。
【請求項２】
哺乳類動物における骨刺激活性が保持され、且つ、上記アミノ酸配列中の一または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加された請求項１のポリペプチド。
【請求項３】
請求項１または２のポリペプチドをエンコードする核酸配列を有する核酸。
【請求項４】
請求項１または２のポリペプチドをエンコードするＤＮＡ配列を有するＤＮＡ。
【請求項５】
請求項４のＤＮＡ配列からなるベクター。
【請求項６】
請求項１または２のポリペプチドに対する抗体。
【請求項７】
レポーターシステムに結合された請求項１または２のポリペプチドに対する抗体を含み、該レポーターシステムは所定量の該ポリペプチドと該抗体との結合が行われたときに検出可能な反応を示すことを特徴とする装置。
【請求項８】
上記レポーターシステムが上記反応とポリペプチドの上記所定量とを関連付ける手段を有する、請求項７の装置。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は骨の成長を刺激促進するタンパク質及びポリペプチドに関する。
発明の背景
成人の骨であっても骨は代謝回転を繰り返し行っていることが知られている。内耳包み（internally auditory capsule）等の部位においては器官形成後の代謝はない。その他の部位、特に中央骨格軸においては成人後も代謝回転が継続される。骨の代謝回転はタンパク質（主にコラーゲン）と無機物とからなる既存の骨マトリックスの表面上で行われる。骨の代謝回転は破骨細胞による骨マトリックスの破壊によって開始される。破骨細胞は多核細胞であって、酸及びタンパク質分解酵素を分泌してコラーゲンマトリックスタンパク質のリーシスを促進すると共に細胞外の分泌室内に無機物を解放する。この初期の骨破壊段階ないし吸収段階に続いて新たな骨タンパク質マトリックスの生成が行われる。親骨タンパク質が堆積され、これにやや遅れて無機物が新たに形成されたマトリックス中に混入し始める。骨マトリックスの形成及びその後に引き続いて行われる無機物化は単核細胞である造骨細胞の機能による。この形成過程の後にはしばしば不活性期間（１，２）が訪れる。吸収は生体内で形成（３）と緊密に結合される。すなわち骨の代謝回転は骨代謝ユニット（ＢＭＵ）として知られている箇所で起こる一連の現象であると理解される。骨代謝回転を媒介すると推定されている造骨細胞及び破骨細胞は２つの異なる細胞系統に属するものと考えられる。これら２種の細胞は予造される細胞ではなく、細胞活動（４，５，６）を通じてそれらの先駆物質から分化する。
骨マトリックスは、内耳包みについては骨代謝回転の全停止によって、或いは形成と吸収とのバランスによって維持される。骨格変化の研究によれば、成長期に前身の骨が増大し、初期成人で骨格量は最大となる。その後は年令と共に骨の量が減少する。女性の場合には閉経期近くにおいて急速な骨損失期間が見られるため、しばしば骨損失が男性よりも深刻な問題となる。従ってＢＭＵ内の骨バランスを理解することは骨格の老化の原因を究明するために重要である。骨の代謝回転を制御する機構は複雑であり現時点においても十分に解明されていない。骨損失を低減させるために様々な試みがなされている。
概して言えば骨の代謝回転は２つの異なる段階で制御することができる。それは先駆物質細胞の活性化段階で制御可能である。細胞活性化制御は骨格内の活性ＢＭＵ数を制御するだけでなく、個々のＢＭＵ内の造骨細胞及び破骨細胞数を制御可能である。或いはまた骨代謝回転は分化された骨細胞の段階で制御可能である。骨細胞システムが複雑であるために、これら２つの段階での制御を別々に研究することが困難となっていた。
骨レギュレータは２つのカテゴリーに属する。第１は細胞膜上でレセプターと作用し合う。これら制御の１つのクラスは、アデニル酸シクラーゼを触媒としてタンパク質キナーゼＫシステムに作用する第２メッセンジャーとして細胞内サイクリックＡＭＰを生成させる。副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）とカルシトニン（ＣＴ）がこのクラスに属するものと考えられる。２番目のクラスもまた膜レセプターと相互作用してホスホイノシチド（phosphoinositide）からの細胞内分子解放を促進し、細胞内カルシウムとキナーゼＣ活性を増大させる。３つ目のクラスは細胞表面レセプターとの相互作用を包含するが、レセプター分子自身により二次信号を発してチロシンキナーゼを活性化させる。成長因子の多くはこのようにして活性化する。レギュレータの第２のカテゴリーは細胞膜レセプターと相互作用せず、細胞膜と交差してシトソルのレセプターと結合する。レギュレータは次いでシトソルレセプターによって核膜に運ばれてＤＮＡと相互作用し、特定の遺伝子の転写を増大させる。ビタミンＤを含むステロイドホルモンがこのような作用を有するものと考えられる。
多くのホルモンは破骨細胞の増殖に対して刺激を与える。例えば１,２５(ＯＨ)2ＤやＰＴＨ及びプロスタグランジンがこれに該当する。破骨細胞内のＰＴＨ及び１,２５(ＯＨ)2Ｄレセプターは未だに明らかにされていない。培養組織内ではこれら２つのホルモンは破骨細胞に対して何らの影響をも与えないように見える。しかしながら破骨細胞を造骨細胞のような細胞ラインと共に培養すると、ＰＴＨ及び１,２５(ＯＨ)2Ｄは破骨細胞の増殖を刺激する。ＩＬ−１及びＴＮＦもＰＴＨ及び１,２５(ＯＨ)2Ｄと同様に作用する。ＥＧＦ，ＴＦＧ，ＰＤＧＦ等の他の成長因子はＰＧＥ生成増大を通じて破骨細胞を刺激するものと考えられる。カルシトニン及びコルチコイドは二リン酸塩等の薬液と共に破骨細胞抑制剤として知られている。
現在ではインターロイキン１はコラーゲン及び非コラーゲン骨タンパク質及びＤＮＡ合成を刺激し得るものとして知られている。骨合成に対する効果はインドメサシンによって遮断され、ＩＬ−１のこの作用はＰＧＥによって媒介される。インドメサシンは造骨細胞のＤＮＡ合成に対するＩＬ−１の作用には何の効果もない。造骨細胞のような細胞ラインについての培養研究によると、局所的に発生されるある種の成長因子がＤＮＡ及びコラーゲンの剛性を刺激することが示唆されている。骨細胞培養ではＰＴＨ又はビタミンＤはコラーゲン合成を抑制する。このＰＴＨの生体内作用はヒト解剖用死体及び実験動物について観測される生体内作用と対照的である。上皮小体機能亢進症に罹ったネズミ及びヒトを対象とする実験の結果、無機物化した骨マトリックスの堆積に対してＰＴＨが刺激を与えることが確認された。骨粗鬆症の治療におけるＰＴＨ1-34アミノ酸フラグメントの効力についての予備的な臨床研究は、このＰＴＨフラグメントが柱のボリュームを増大させる効果があることを示している。このような矛盾が生ずることの原因は未だ十分に解明されていない。
副甲状腺ホルモンは成熟体で８４個のアミノ酸よりなるペプチドである。当初のプレプロ副甲状腺ホルモンはこれよりもずっと大きい。プレシーケンスはペプチドがラフな細胞質網状構造に入るときに切断（クリーブ）される信号シーケンスである。ゴルジ装置においてプロシーケンスがクリーブされて分泌粒に包まれた完全な成熟ホルモンを分泌する。分泌速度は細胞内ペプチドの生成速度によってはそれほど影響を受けず、むしろ細胞内破壊速度によって支配される。細胞内で成熟ペプチドはアミノ及びカルボキシル末端基で切頭される。切頭ペプチドは不活性フラグメントとして血液循環内に分泌する。成熟ペプチドの分泌は細胞外カルシウム濃度の低下によって促進される。一方において血清カルシウム濃度の上昇はＰＴＨの分泌を抑制する。血液循環に戻り、成熟ペプチドは３８個のアミノ酸残基を有する分子の多くの部位で肝臓内において急速に分裂する。最初の３４個のアミノ酸を含むアミノ末端基における最小フラグメントは腎臓、腸及び骨に対してよく知られた生物学的活性を示す。それはまた細胞膜レセプターと十分に結合してｃＡＭＰ生成を促進する。血清中の１−３８フラグメントのレベルは通常測定不能であり、これは該フラグメントの循環寿命が小さいことを示している。大きな不活性カルボキシル末端フラグメントは比較的長い半減期を持ち、循環系に最大量の免疫反応性ＰＴＨを運ぶ。循環系におけるすべてのフラグメントは最後には腎臓及び肝臓で壊滅する。循環する不活性ＰＴＨフラグメントを駆除する腎臓メカニズムの一つは腎糸球体による瀘過作用である。
ＰＴＨはカルシウム及び骨格ホメオスタシスに関係する。ＰＴＨは腎臓によるカルシウムの管状吸収を刺激し、腎臓尿細管によるリン酸塩と重炭酸塩の再吸収を抑制する。腎臓に対するＰＴＨの第２の作用は１,２５(ＯＨ)2Ｄ生成の刺激である。このビタミンＤ代謝産物は腸のカルシウム吸収の促進物質であると共に破骨細胞に対する生体内刺激物質である。ＰＴＨ刺激後の腸によるカルシウム吸収の増大はこのビタミンＤ代謝産物を媒介とする。生体内においてＰＴＨはカルシウムを循環系に解放することにより破骨細胞吸収を刺激する。ＰＴＨはまた増骨組織の増殖をもたらす。上皮小体機能亢進症の多くの事例において骨格損失が見られる。しかしながら、腎臓機能不全を悪化させる第２期の上皮小体機能亢進症及び第１期の上皮小体機能亢進症の数例においては脊髄密度の増大が報告されている。Kalu及びWalkerは上皮小体抽出物の少量を長期間に亙って投与することによりネズミの骨に硬化症が発生したと報告している。Tamらはテトラサイクリン標識による低カルシウム食餌療法がネズミの骨無機物生成にもたらす効果について研究し、組織学的には（第２期上皮小体機能亢進症によって）骨吸収の増大により骨の損失が生ずるにも拘わらず、骨無機物生成率は増大することを見いだした。更に軽微な第１期上皮小体機能亢進症の患者２３例において骨無機物生成率の増大が観察された。４人の患者から上皮小体アデノーマを除去した後は生成率が比較例のレベルに戻った。更にＰＴＨによる無機物生成に対する刺激及び促進は投与量によって支配されることが分かった。１−３４フラグメント及び純粋ＰＴＨホルモンの効用は質量ベースでほぼ同等であると見られる。これは純粋ホルモンの生物学的活性をもたらすＰＴＨ分子の１−３４フラグメントと一致している。骨格ホメオスタシスに対するＰＴＨ投与の最終結果はホルモンの投与方法に依存することが分かった。毎日のホルモン投与を１度の注射で行うものとした場合の骨量増大は投与量に依存する。しかしながら同量を皮下浸透圧ポンプを用いた点滴で連続的に投与した場合の結果は骨損失である。点滴投与はその投与量に応じて血清カルシウムを増大させるが、断続的な注射は血清カルシウムレベルに実質的に効果がない。これら２つの方法による骨無機物生成率に対するＰＴＨの効用はテトラサイクリン標識による測定では同等である。この異なる効用の理由は不明である。
骨の成長とその制御についての一般的理解の下で、骨質量が減少及びそれに伴う障害を含む疾患を治療するために様々な試みが特許文献に示されている。例えば、1992年9月17日に公開されたPCT出願第9215615号には、ブタの膵臓から抽出したタンパク質が血清カルシウムレベルを低下させるため、血清カルシウムレベルを上昇させる骨疾患の治療に有用であると記載されている。1992年9月23日に公開された欧州特許出願第504938号には骨疾患の治療にシステインプロテアーゼを抑制するジペプチド及びトリペプチドを用いることについて記述している。1992年9月3日に公開されたPCT出願第9214481号は濾胞ホルモン及び骨形態発生蛋白質を含む骨成長誘発化合物を開示している。1992年8月19日に公開された欧州特許出願第499242号に開示される細胞増殖因子化合物は造骨細胞を増殖させるために骨質量減少をもたらす骨疾患の治療に有効であると記載されている。1992年6月17日に公開されたPCT出願第4039656号はヒトＮ−末端ＰＴＨフラグメント１−３７を含む薬剤を開示している。1991年9月16日に公開された欧州特許出願第451867号はカルシウム又はリン酸に関連する骨粗鬆症等の治療に用いる副甲状腺ホルモンペプチド拮抗薬を開示している。
ＰＴＨの血清内における比較的短い半減期と断続的ＰＴＨ注入による比較的長い効果は、ＰＴＨが循環系に第２の因子を誘発し得ることを本研究者に予測させた。ネズミとヒトの血清における該第２の因子の存在についての研究が行われた。
ネズミの血清からポリペプチド物質を単離することに成功した。このポリペプチド物質をＰＴＨ分泌不能なネズミ（上皮小体摘出を受けたネズミ）に投与すると骨無機物生成率の増大が観測された。少なくとも研究した範囲の投与量及び投与時間においては、骨成長率は単離物質の投与量と共に増大することが分かった。物質は２つの形態に単離され、第１の大きなポリペプチドは第２の小さなポリペプチドの約２倍の分子量を有する。小さいほうのポリペプチド配列の最初の１１個のアミノ酸は、Gly-Pro-Gly-Gly-Ala-Gly-Glu-Thr-Lys-Pro-Ile（SEQ-ID No.1）であると認められた。大きいほうのポリペプチド配列の最初の７個のアミノ酸は、Gly-Pro-Gly-Gly-Ala-Gly-Glu（SEQ-ID No.2）であると認められた。これら２つのNH2-末端シーケンスの類似性により、大きいポリペプチドは小さいポリペプチドの二量体であり得ることが理解される。
ネズミペプチドのアミノ酸配列に基づく核酸プローブが合成され、ヒトの肝臓ｃＤＮＡ胎児ライブラリをスクリーンして骨増殖ポリペプチドのためのヒト核酸配列コーディングを単離するために用いられた。Gly-Ile-Gly-Lys-Arg-Thr-Asn-Glu-His-Thr-Ala-Asp-Cys-Lys-Ile-Lys-Pro-Asn-Thr-Leu-His-Lys-Lys-Ala-Ala-Glu-Thr-Leu-Met-Val-Leu-Asp-Gln-Asn-Gln-Pro（SEQ-ID No.11）の配列に従ってポリペプチドが化学合成される。活性ポリペプチドは前記シーケンスの二量体であってよいと考えられる。該二量体は記述されたシーケンスを有する２つのポリペプチド間の二硫化物架橋によって形成され得る。
ネズミの骨増殖率はこの化学合成された物質の投与により投与量に応じて増大することが確認された。
【図面の簡単な説明】
以下の記述において添付図面が参照される。
図１は４８時間間隔でオキシテトラサイクリンを静脈注射したネズミの骨形成部位におけるオキシテトラサイクリンのトレース図である。下向き矢印は注射が施された地点を示す。“Ｄ”はトレース図上のこれら２地点間の距離を示す。光学倍率２５０倍、機械倍率５５．６倍である。
図２は骨無機物成長率を測定するＭＰＶ−ＣＤ装置のグラフである。装置において顕微鏡グリッドがスキャンされている。観測距離がグリッド距離に対してプロットされている。誤差は標準偏差の±１である。
図３はSephadex G50コラムのグラフである。コラムは内径2.5ｃｍ、長さ90cmである。移動相は流速2.5ml/分の20mM Tris.Cl（pH7.2）及び50mM NaClであった。用いた分子量標準はヒトIgG（MW110）、ウシ血清アルブミン（MW 66K）、卵白アルブミン（45K）及びシトクロム（12.4K）であった。10ml画分で要素を収集した。個々の画分のO.D.280吸収が示されている。
図４はある血清成分の骨増殖に対する効果を示す。テトラサイクリン標識により骨増殖率を測定した。測定法の詳細は後述される。十分なカルシウム（0.5％）を与えたネズミとカルシウム不足（0.1％）のネズミからの血清をゲル浸透により計測した分子量に応じて分画した。66Kと45Kの間の分子量（比較グループのネズミ３匹、試験グループのネズミ４匹）、45Kと12.4Kとの間の分子量（比較グループのネズミ４匹、試験グループのネズミ４匹）及び12.4K以下の分子量（各グループ４匹ずつ）においてそれぞれの画分を試験した。２匹のネズミからの血清画分を250〜300gの上皮小体摘出ネズミで試験した。３匹の比較グループと３匹の試験グループである。12.4Ｋ以下の分子量での血清画分を受け取った試験グループは対応する比較グループよりも高い骨無機物増殖率を示した。
図５ないし図９はMW＜12.4Kでのカルシウム不足のネズミ画分をC18逆相HPLCで色層分離した結果を示す。55分近くに一つの大きなピークが見られる。上皮小体摘出ネズミについて試験したところ、このピークは他のピークに比べて顕著に優れた刺激効果を示した。図９に示される比較例は普通のネズミからの血清について示す。
図１０はC18コラムからの抽出物質の生物学的活性を示す。ピークを凍結乾燥して緩衝剤2.5mlに再溶解した。このうち0.4mlを上皮小体摘出された検体動物に注射した。２体の動物が個々のピークのために用いられた。“×”は個々の検体動物の率を示し、ヒストグラフは平均を示している。動物数が少ないために統計的分析はできなかった。
図１１は骨増殖に対するピーク“Ｃ”の物質の投与量に応じた効果を示す。ポリペプチド濃度はBelford Reagentにより測定した。３匹のネズミの第１グループ（グラフ中央のバー）では１匹当たり6μgを用い、３匹のネズミの第２グループ（最後のバー）では１匹当たり12μgを投与した。３匹のネズミの比較グループ（最初のバー）はキャリア緩衝剤を受けた。検体動物は予め上皮小体摘出術を施された。投与量に応じた結果が得られた（P＜0.05）。
図１２は分子量30〜3Kでのカルシウム欠乏ネズミ血清画分のアクリルアミドゲル電気泳動を示す。カルシウム欠乏ネズミは30〜3KのMWCO（分子量カットオフ）膜で限外瀘過処理され、30〜3KのMW画分とされた。Belford Reagentにより測定された100μg画分を15％リン酸アクリルアミドゲルに投与した。ゲルを100mMのpH6.9、0.1％SDSの第三リン酸塩で処理した。サンプルを100mMのpH6.9、0.1％SDSの第三リン酸塩で60℃にて30分間還元剤を用いずに処理した。サンプルを次いで100Vの定電圧（約8V/cm）で２時間でロードし、クロマシーブルー（cromassie blue）で着色した。５個の低分子量バンドがTA,TB,TE,TF,TGと同定され標本化された。
図１３はアクリルアミドゲル電気泳動におけるバンドから抽出された物質の生物学的活性を示す。ゲル内バンドをカットアウトし、20mM Tris.Cl（pH7.2），50mM NaCl, 0.1％Triton×1mM DTT及び1mM PMSTで４８時間浸漬した。抽出物質を20mM Tris.Cl（pH7.2），50mM NaCl, 1mM PMST及び1mM DTTの緩衝剤に対して3.5KのMWCO膜で透析し、500mlに濃縮した。Belford Reagentにより蛋白質含量を測定し、物質24μgを前記と同様に予め上皮小体摘出ネズミで試験した。４匹の比較グループにはキャリア緩衝剤を与えた。TA（３匹）、TB（３匹）及びTE（４匹）のバンドにのみ十分な試験物質が含まれていた。TB及びTEは骨増殖（P<0.025）に対して顕著な刺激効果を示したがTAは効果がなかった。
図１４は大腸菌内のヒトポリペプチドのクロマトグラム（C3コラム上のHPLC）を示す。大腸菌媒体を12,000Gで２回、各15分間遠心分離した。YMS膜（MWCO 3K）を用いて１０回濃縮した。リン酸ナトリウム（pH7.2）で濃縮する前に媒体の塩濃度を100mMに調整した。ヒト血清から単離したポリペプチドの場合と同様の条件、すなわち62〜63％CH3CNにおいて十分に溶解されたピークが抽出された。
図１５は大腸菌内から絞り出したヒトポリペプチドのネズミ骨増殖に対する効果を示す。比較ネズミ（６匹）にはキャリア緩衝剤を注射した。試験ネズミの第１グループ（４匹）にはポリペプチドの0.7 O.D.（280nm）ユニットを注射し、第２グループ（６匹）にはポリペプチド0.3 O.D.ユニットを注射した。ポリペプチド物質は比較グループに比べてより顕著な生物学的活性（P<0.05）を示した。
図１６はヒトの化学合成したポリペプチド（SEQ ID NO.11）のトリシン（tricine）SDS電気泳動ゲルを示す。
図１７はネズミの右下肢大腿骨の縦断面図である。下方松果体が矢印Ａで示されている。斜線部は骨のメタフィシス（metaphysis）Ｂ及び中軸部分Ｃである。
図１８は最初のバー（検体数９）において化学合成したヒトポリペプチドをネズミに25μg投与した場合の骨増殖率（μm／日）を示す。第２のバーの比較グループＡ（９匹）には0.1％酢酸中の0.1％BSA溶液1mlを注射した。第３のバーが示す比較グループCH.CN（７匹）には予め10分間ボイルしてBSAを変性させた0.1％酢酸中の0.1％BSA溶液1mlを注射した。
図１９はネズミの右下肢大腿骨の縦断面図である。斜線部は骨増殖測定のために切除した下方松果体Ａ部分を示す。矢印Ｂは軟骨部分を示す。
図２０はネズミの右下肢大腿骨の横断面図である。右下肢大腿骨の骨内膜表面に囲まれた柱骨内の３０箇所で骨増殖を測定した。破線で示した断面箇所でスキャンした。矢印は領域をカバーするための顕微鏡ステージの移動方向を示す。
図２１はネズミにおける骨無機物増殖率（μm／日）と化学合成したヒトポリペプチド（SEQ ID NO.11）投与量との関係を投与したポリペプチド重量（μg）で示すものである。各グループの検体数はすべて４匹である。
図２２はネズミにおける骨無機物増殖率（変化率）と化学合成したヒトポリペプチド（SEQ ID NO.11）投与量との関係を投与したポリペプチド重量（μg）で示すものである。
一般的方法論
ネズミにおける上皮小体亢進状態の誘引
上皮小体亢進状態の誘引のために用いたカルシウム欠乏食餌療法（カタログ#113034、ロット#0186-3）は2508 Easton Avenue, Bethlehem, Pennsylvania 18017, U.S.A.のDyets社から購入した。この餌には0.1％カルシウムと0.05％リンが含まれる。比較グループの動物に用いたカルシウム豊富食餌療法（カタログ#113035，ロット#01864）は同じくDyets社から購入したもので、0.5％カルシウムと0.05％リンが含まれる。両方の餌にはビタミンＤが１i.u./gの濃度で含まれる。これら餌は小球状とされ、脱塩水と共に１日１０粒を２週間に亙って各動物に与えた。
実験ネズミ
Charles River LaboratoryからのSprague-Dawleyネズミを標準実験動物とした。購入時に200〜250gであった雌ネズミを用い、同じケージにペアで収容した。
ネズミにおける骨無機物成長率測定のためのテトラサイクリン標識
静脈注射による場合は体重1kgに対して24mgのテトラサイクリンの投与が３０分以内に循環系に流れ込むことが分かった。すなわちこの時間内に血清中のテトラサイクリン量は生物学的検定法によっては測定不能となる。6〜24mg/kg（体重）のテトラサイクリンを断続的に投与した場合にも同様の骨成長率が測定された。したがって断続的与えられるテトラサイクリンは骨無機物成長率の研究のための標識に用いるに好適であることが理解される。
しかしながら、無機物化した骨マトリックスの堆積物であるBMUは骨増殖箇所において妨害を受けやすいこともまた示されている。この妨害には特にテトラサイクリンの投与間隔が７日以上となったときに起こりやすい。この妨害は同じマトリックス表面箇所上において連続して活性化される造骨細胞のグループが一つ以上あることによって生ずる。かかる造骨細胞の活性化はランダム又は非ランダムである。この現象が骨無機物成長率の測定に対して影響を与えることを防止するために、標識間の間隔を４８時間に設定した。治療目的の投与に用いられる場合に８時間の血清半減期を有するテトラサイクリン塩酸塩を専ら用いた。
テトラサイクリンは長い紫外線（ブルーレンジに近いレンジを持つもの）照射及び明るい黄色の蛍光発光により励起される。この蛍光発光は蛍光顕微鏡により骨部位にて検出可能である。テトラサイクリンは新たに形成されたコラーゲンマトリックスがカルシウムを受け入れ始めたときに骨表面を標識付けし、該骨表面が切開されたときにテトラサイクリンが黄色蛍光バンドとして現れる。その後に投与されたテトラサイクリンは第１のバンドの表面上に形成される第２のバンドとして現れる。第１と第２のバンドの間隔は２回の投与の間に形成された骨マトリックスの厚さを示す。バンド間隔を投与間の時間経過で割ることにより骨堆積（増殖）率が算出される。成長する骨表面に対して垂直でない切断が行われると測定誤差が生ずる。この誤差を減少するために２つのバンドが平行間隔で離れている箇所のみを測定箇所として用いる。この要求を満たす１０カ所をランダムに選定して測定して平均値を取った。
測定装置はLeiz社の走査型光学顕微鏡測光器MPV-CDであり、紫外線照射源には100Wの水銀バーナーを用いた。試験片を移動スキャニングスリットを用いた16倍対物レンズで拡大し、蛍光バンドの強度を増幅して記録した。光線信号をデジタル出力に変換し、テトラサイクリンの強さを記録した。強度ピークの間隔を２つのテトラサイクリンバンドの間隔とみなして図１に示した。機械的誤差は５％未満である。測定された間隔を顕微鏡グリッドで周規的にキャリブレートしたところ、図２に示すような良好な関連性が見いだされた。
ネズミにおける骨無機物増殖の研究のための骨格部位
特に注記しない場合には右大腿骨の下方松果体部分を用いて測定部位とした。この部位は下肢大腿骨成長板の約１mm上方に位置し、約５mmの間隔で軸方向に延長している。
ネズミの骨成分の組織学的調製
犠牲的行為の後に動物から骨サンプルを解剖採取した。採取した骨サンプルを直ちにpH7.2の50mMリン酸塩緩衝剤に緩衝したホルムアルデヒド10％水溶液中に固定した。低pHは骨マトリックスからのテトラサイクリンの浸出を促す。24時間の固定後サンプルを次のようにして処理した。
80％エタノール                24時間
95％エタノール                24時間
純粋エタノール                24時間
純粋エタノール                24時間
アセトン                      24時間
Spuu社薬剤：アセトン，1：1    24時間
Spuu社薬剤：アセトン，1：4    24時間
Spuu社薬剤                    24時間
サンプルを次いでSpuu社薬剤の新たな液中に浸けて45℃で24時間養生処理し、更に80℃で24時間処理した。
養生したブロックをダイアモンド刃を有するLeitz社のミクロトームを用いて400μm厚の部分まで切断した。比較的厚い部分はカーボランダム（商標名）研磨剤を用いてラフにしたガラス板による２つのグラインダーの間に挟んで水を潤滑財として用いて研磨した。薄い部分は乾燥して汚さずにPermount（Fisher社、商標名）内で保存した。
試験材料の骨成長に対する効果を評価するためのネズミ上皮小体摘出
約200〜250gの雌のSprague-Dawleyネズミをネンブタール（商標名）麻酔の下で上皮小体摘出した。冷凍と解凍とを繰り返すことにより副甲状腺を破壊した。術後１週間で動物に再度麻酔をかけ、0.5mlの血液を尾の静脈から採取した。動物には一晩中餌を与えなかった。翌朝動物に再度麻酔をかけて0.5mlの血液を尾の静脈から採取した。絶食の前後に血清カルシウムを測定した。絶食状態において血清カルシウムが1.8mM又はそれ以下に減少したことは手術の成功を示しているものとみなされる。次いで試験物質を尾の静脈中に注射し、テトラサイクリンの第１回目の投与を静脈注射により行った。２回目のテトラサイクリン標識は48時看護に行い、その後炭酸ガス麻酔により動物は死亡した。骨無機物増殖率の測定のために骨サンプルを採取した。
ゲル浸透によるネズミの血清蛋白質及びペプチドの初期スクリーニング
血清中の蛋白質及びペプチドの分子量範囲は広く、血液中を循環する蛋白質及びペプチドの数も膨大である。ある範囲の分子量により血清蛋白質成分を一次的に分類するため、及び分類された各クラスの無機物化骨マトリックス成長に体する生物学的効果を試験するために、ゲル浸透を用いた。
物質及び方法
内径2.5cm、長さ90cmのガラスコラムを用いた。medium fine grain matrixを与えるSigma社のSephadex G50を用いた。乾燥させたSephadexマトリックス25gを1000mlの円錐フラスコに注入し、0.02％NaN3を含む消イオン水800mlを加えて乾燥マトリックスを膨潤させた。これを室温にて一晩放置してマトリックスの膨潤を十分に進行させた。
Sephadexマトリックスを膨潤させた後、コラム上端に容器を接続し、膨潤マトリックスをコラム内に約３時間保持した。容器を取り除き、コラム上端を閉止して、コラムを20mMのTris.Cl（pH7.2）及び50mMのNaClよりなる緩衝剤で平衡化した。緩衝剤は蠕動ポンプ（Pharmacia社製品）により毎分2.5mlで供給した。この処理の間マトリックスはコラム内で沈下し、完全に充填されるまでマトリックスをコラムに周期的に再充填する必要があった。コラムを次いで更に同一の緩衝剤で３時間４℃にて平衡化した。
Sephadex G50コラムは次の分子分子標識により平衡化した。
ヒト IgG            M.W. 110,000         6.00mg
BSA                 M.W.  66,000        10.00mg
卵白アルブミン      M.W.  45,000         8.25mg
シトクロムＣ        M.W.  12,400         4.00mg
これらはSigma社より入手し、消イオン水2ml中に溶解した。分子標識（molecular marker）を投入して平衡化緩衝剤と共に毎分2.5mlの速度で走行させたところ、10mlの画分50個が収集された。個々の画分による280nmにおけるＵＶ吸収がVarian UV/VIS分光光度計で測定された。
173〜212gの40匹の雌のSprague-Dawleyネズミを用いた。これらのうち４匹は実験中に病気（呼吸感染症であると診断された）になったために除外した。残る36匹のネズミを各々18匹ずつの試験グループと比較グループとに分けた。試験グループのネズミにはカルシウム欠乏餌を与え、比較グループにはカルシウム豊富餌を与えた。これらについては既述した。すべてのネズミを死亡させて血清を収集保存した。保存血清中のカルシウム及びリンの濃度をWorthingtonから購入したキットを用いて比色定量分析法により測定した。
ゲル浸透のためのネズミ血清の調製
各ネズミから採取した死後の血液サンプルをJS 4.2ロータを有するBeckman J6B遠心分離機を用いて2,000rpmで15分間遠心分離処理した。同じグループのネズミからの血清を一緒に保存した。PMSF（Sigma社）及びdithiothreitol（Biorad社）を1mM濃度ごとに添加した。血清を-85℃で凍結保存した。ゲル浸透のために凍結血清をBeckman J2-21遠心分離機に投入してJA 17ロータを用いて12,000gにて30分間遠心分離処理して粒状物のサンプルと脂質を除去した。
試験ネズミ血清のゲル浸透クロマトグラフィ
血清10mlを投入して平衡化処理に用いたと同じ緩衝剤によりクロマトグラフィ分析を行った。投入前にコラムを緩衝剤にて３時間平衡化し、10ml画分に収集された溶離剤でサンプルを毎分2.5mlの流速で流した。
収集された画分を分子量に従って保存し、PMSFとDDTを各々1mMを含む20mM Tris.Cl（pH7.2）1000ml内でMWCO 3500と共に2.5cm幅のSpectophor透析バッグを用いて透析した。透析は４℃で24時間に亙り行い、その間に透析緩衝剤を３回交換した。その後踪跡サンプルをVirtus凍結乾燥機で凍結乾燥し、-20℃で保存した。
血清画分の生物学的活性についての試験
画分内の化合物濃度が異なるために重量による画分間の活性を比較することは困難である。２匹のネズミからの任意の画分を１匹の試験動物に投与した。20mM Tris.Cl（pH7.2）と50mM NaCl 0.5mlに溶解した投薬をPTX試験動物に筋肉注射した。その直後に上記した要領でテトラサイクリン塩酸塩を静脈注射により投与した。24時間後にもう１度テトラサイクリンを静脈注射し、その24時間後にネズミを殺して上述の要領にて骨無機物増殖率を測定した。
ネズミポリペプチドの単離を含む初期結果
（分子標識溶離プロフィールが図３及び表１に示される。）
0003733381.tif 000002
カルシウム欠乏餌を与えたネズミからの血清であってもカルシウム豊富餌を与えたネズミからの血清であってもそのカルシウム及びリン濃度に目立った差は見られなかった。カルシウム濃度については前者の2.55mMと後者の2.85mMとで若干の差があった。リン濃度は前者が0.33mM、後者が0.43mMであった。これらの相違はカルシウム欠乏餌を与えたネズミに対して補償的な二次上皮小体摘出を行ったことによる結果であると考えられる。しかしながらこれはカルシウム欠乏餌を与えたネズミにおけるPTH分析では確認できなかった。
比較及び試験グループのネズミからの血清画分を分子量範囲に応じてプールした結果が表１に示されている。
上皮小体摘出を施した40匹のネズミのうち25匹だけが手術に耐えて生存した。これら25匹のネズミの非絶食状態における血清Caは2.57±S.D.0.05mMであり、絶食状態におけるそれは1.70±S.D.0.04mMであった。これら動物には手術は成功したものと結論された。110,000よりも大きな分子量及び110,000-66,000の間の分子量を有する画分は、それらの蛋白質含量が動物に病的効果を与えずに１度に投与するには過大であったために試験しなかった。従ってわずか３つの画分をカルシウム豊富血清とカルシウム欠乏血清のために試験した。各画分について４体の動物を用いた。カルシウム豊富血清からの分子量66,000-45,000の画分を与えられた１匹のネズミはテトラサイクリンを静脈内に投与したときに麻酔中に死亡した。結果は図４に示されている。
分子量14,500未満のカルシウム豊富画分を与えられたネズミとカルシウム欠乏血清（P<0.05）からの対応する画分を与えられたネズミとにおいて骨無機物増殖に顕著な統計的相違が認められた。
これらの仮の結論は分子量14,500未満の化合物を有する血清画分が無機物化された骨マトリックスの増殖率に対して刺激効果を持つことを示唆している。
カルシウム欠乏ネズミ血清からの低分子量血清化合物についての実験
材料及び方法
200〜250gの40匹の雌Sprague-Dawleyネズミを用いた。半分のネズミにはカルシウム欠乏餌を与え、残り半分にはカルシウム豊富餌を与えた。これらのネズミを２週間の食餌療法の後に炭酸ガス麻酔により死亡させた。死亡直後に死後血清を心臓穿刺（cardiac puncture）により血清バキューム内に吸入した。Beckman J6B遠心分離機を４±にて20分間2,000rpmで運転して遠心分離した。血清サンプルを試験血清（カルシウム欠乏）と比較血清（カルシウム豊富）とに従ってプールし、100μlをカルシウム及びリン濃度測定のために用いた。PMSF及びDTTを1mM濃度ごとに添加した。次いで血清を-85℃で凍結した。
ネズミ血清の分別法：ゲル浸透及び逆相HPLC
既述したようにしてSephadex G 50コラムを用いた初期ゲル浸透を行った。分子量14,500未満の画分を前記と同様にして収集し、透析し、凍結乾燥した。
凍結乾燥した物質を25mM Tris.Cl（pH7.5）、150mM NaCl、1mM PMSF及び1mM DTTよりなる緩衝剤5mlに溶解した。幾つかの物質は不溶性であることが判明し、JA 17ロータを用いてBeckman J2-21遠心分離機にて12,000gで遠心分離することにより粒状化して廃棄した。溶解した物質800μlを蛋白質測定のために用いた。
上記緩衝剤１ml中の物質0.5mgをhewlett Packerサンプルフィルタで投入前に濾過した。用いたコラムはBeckmanの予備C18コラム（2.12×150cm）であった。溶剤供給システムはBeckman勾配溶剤供給システムモデル126をBeckmanUV検出器モデル167と共に用いた。データをBeckman System Goldソフトウエアを用いて分析した。サンプルをValco注射器で注射し、毎分２mlの流速で溶離した。勾配は次のように設定した。
溶媒Ａ：トリフルオロ酢酸０.１％を加えた水
溶媒Ｂ：トリフルオロ酢酸０.１％を加えた水に95％アセトニトリルを溶解したもの
プログラム：
0003733381.tif 000003
0.5分ごとにGilson画分収集器モデル202で画分を収集し、プールし凍結乾燥された４つのランの対応するピークを観察した。
試験血清のカルシウム濃度は2.50mMであり、比較血清のそれは2.87mMであった。リン濃度は試験血清で0.35mM、比較血清で0.45mMであった。再溶解した凍結乾燥物質の蛋白質濃度は試験血清で1ml当たり1.2mg、比較血清で1ml当たり1.5mgであった。試験物質及び比較物質の溶離プロフィールが図５ないし図９に示されている。試験血清と比較血清との溶離プロフィールにはある相違が認められた。試験物質では４つのランのうちの３つに55分の直前に顕著なピークがあった。比較血清では55分の直後に２つのピークがある。
カルシウム欠乏餌を与えたネズミ血清から得た試験画分の骨増殖率に対する効果
材料及び方法
試験血清についてのみ様々な画分が無機物化された骨増殖率に対して及ぼす効果についての生物学的試験を行った。その目的は生物学的活性を有する一つの化合物を見いだすことにある。４つのランからの対応するピークをプールして10mM tris.Cl（pH7.2）及び50mM NaClの2.5mlに溶解した。物質の0.8mlを試験に用い、残りの物質は将来の使用に備えて凍結した。
10匹のSprague-Dawleyネズミに上皮小体摘出術を施し、各ピークからの物質0.4mlを各試験動物に注射した。収集した５つのピーク（図５Ａ〜８においてＡ〜Ｅとして示される）の各々について２匹の動物を用いた。既述した方法に従ってテトラサイクリン標識により骨無機物増殖率を測定した。
５つの試験ピークのうちピークＡ，Ｂ，Ｄ及びＥは骨無機物増殖に対して同様の効果を示したが、ピークＣは他のグループよりも高い増殖率を示した。
逆相HPLCによりネズミ血清から単離した特定画分に対する骨無機物増殖率の投与量依存性
ピークＣからの物質1.7mlを解凍して400μlを取り出し、800μlに希釈してBelford方によるタンパク質濃度測定に用いた。残部は同じ可溶化緩衝剤で調整して100μl当たり3μgの濃度とし、９引きのネズミには上皮小体摘出術を施した。それらの非絶食状態及び絶食状態のカルシウム濃度は手術の成功を示していた。３匹のネズミにはピークＣからの試験物質を200μlの体積で6μg静脈注射した。３匹のネズミには可溶化緩衝剤で200mlに調整した後に3μgの物質を注射した。３匹のネズミは比較例として可溶化緩衝剤200μlを投与した。骨無機物増殖率を既述したと同様にして測定した。
比較例の増殖率は１日当たり0.81μm（S.D.=0.09）であり、ピークＣ物質3μg投与ネズミでは１日当たり1.51μm（S.D.=0.23）、ピークＣ物質6μg投与ネズミでは１日当たり2.36μm（S.D.=0.23）であって、グループ（P<0.05）によって顕著な相違が認められた。図１１を参照。
以上より、２週間に亙ってカルシウム欠乏餌を与えられたネズミの血清中に見られるタンパク質及びペプチドの種類はネズミの骨無機物増殖を刺激することができるものであることが実証された。この効果は約300gネズミ当たり6μgまでの間は投与量に依存する。
カルシウム欠乏餌を与えたネズミからの血清の低分子量画分の電気泳動分別
分子量30,000未満の血清成分を分子量ポリアクリルアミドゲル電気泳動によりクロマトグラフィ分析した。
材料及び方法
20匹のSprague-Dawleyネズミに３週間に亙ってカルシウム欠乏餌を与えた。到着時の体重は209〜245gであった。２週間の食餌飼育の後に体重は248〜302gとなった。その後炭酸ガス麻酔でネズミを死亡させ、死後血液を心臓穿刺により採取した。既述したようにして血清サンプルを収集しプールした。血清カルシウム濃度が2.56mMであり、リン濃度が0.33mMであった。血清の全容量は92mlであった。PMSFとDTTを1mMに対してそれぞれ添加した。次いで血清をJA 17ロータを用いたBeckman J2-21遠心分離機で12,000gにて30分間遠心分離した。
分子量3,000〜30,000の画分を収集して限外瀘過により濃縮した。最初にAmicon 50ml濃縮機でYM 30膜を用いて分子カットオフポイントを30,000として濃縮した。瀘液を収集した。保持された容量が当初の92mlから10mlに減少したとき、10mM Tris.Cl（pH7.2），50mM NaCl，1mM PMSF及び1mM DTTよりなる緩衝剤40mlを加えて保持容量が再度10mlに減少するまで限外瀘過を継続した。この第２の瀘液を第1の瀘液と共にプールし、最後に保持された容量は廃棄した。
プールされた瀘液を更に同一のユニットによりYM 3膜を用いて分子カットオフポイントを3,000として限外瀘過した。このときの瀘液は廃棄し、保持された容量を保存した。これが10mlに減少したときに40mlの同一の緩衝剤を加えて限外瀘過を係属した。この工程を１度繰り返した。最終保持容量が10mlに減少したときにこれを別の10ml容量のAmicon濃縮機に移し、最終容積1mlにまで濃縮した。限外濾過は４℃の予備精製した窒素の55psiにて行った。
アクリルアミドゲル電気泳動
Hoeffer Mightyの小さな垂直ゲル装置を用いた。0.75mm厚さの15％リン酸塩ゲルを次のように処理した。
0003733381.tif 000004
ゲルを100Vの定圧にて30分間流動させた。サンプルを100Vの定圧にて2時間流動させた。20℃の水を冷却装置に循環させた。
Belford方によりタンパク質濃度を測定した。Tris.リン酸塩pH6.9 1及びSDSをサに加えて流動緩衝剤の濃度と同等にした。タンパク質濃度を15μl当たりにして100μgに調整した。サンプルの全容量は1.65mlであった。このサンプルを投入前に60℃で30分間培養した。
BDHからの低分子量マーカーをサンプルと同様にして処理した。濃度を12ml当たりの各マーカー1μgに調整した。サとマーカーの15μlを0.5cm幅の受け室に投入した。
リン酸塩ゲルの電気泳動の結果が図１２に示される。１つの大きな分子量バンドとにより高い幾つかの分子量バンドがある。幾つかの低分子量バンドも存在し、これらはTA〜TEとして示されている。
アクリルアミドゲルの電気泳動により分別されたネズミ血清成分の生物学的活性
図１２に示されるリン酸塩ゲルの各バンドの生物学的活性を調べた。
先の部分の限外瀘過サンプルの1.5ml残部をクロマトグラフィで分析した。サンプルの濃縮を100mM Tris.リン酸（pH6.9）と0.1％SDSよりなる同一の緩衝剤で調整した。調整されたサンプルを投入前に30分間60℃で培養した。
ゲル厚みを1mmとした以外が先の部分と同様にしてアクリルアミドゲルを調製した。投入容積は室当たり20μlであった。ゲルを30分間あらかじめ流動させておいてからサンプルを100Vの定圧で２時間流動させた。全容量1.5mlを10個のゲルに流動させた。
より高い分子量の物質は試験をしなかった。TAからTEまでの５つのバンドはクロマシーブルーで着色した後に除外した。各バンドをプールし、シリコン処理したガラスで小片となるまで研磨し、10mM Tris.Cl（pH7.2）、50mM NaCl、1mM PMSF及び0.1％Triton X-100よりなる緩衝剤5mlに４℃で24時間浸漬した。浸漬緩衝剤をMWCO3,500のspectrophor透析バッグに移した。10mM Tris.Cl（pH7.2）、50mM NaCl及び1mM PMSFよりなる緩衝剤の100倍容積で材料を４℃にて48時間透析した。この間に緩衝剤を５回交換した。透析したサンプルをMWCO3,500のYM 3膜を有するAmicon 10ml容量の濃縮機で500μlに濃縮した。
サンプル（80μl）を水で800μlに希釈してBelford試薬でタンパク質濃度を測定した。材料濃度を透析緩衝剤で100μl当たり12μgの濃度に調整した
16匹のSprague-Dawley雄ネズミに上皮小体摘出術を施して既述したようにテトラサイクリン標識で試験した。それらの前-PTX及び後-PTX血清カルシウムレベルはそれぞれ2.51(S.D.=0.002)及び1.53(S.D.=0.001)であった。試験物質（200μl）を各動物に注射した。４匹のネズミを用いて各バンドから分別した材料の活性を試験した。比較グループの４匹のネズミにはキャリア緩衝剤200μlを注射した。
収集した５つのうちの３つのバンドには試験に十分な材料が含まれていた。入手した材料の量はTEバンドに50μg、TBバンドに55μg、TAバンドに59μgであった。TC及びTDバンドのタンパク質濃度は検出不能なほど低く、これらのバンドは試験しなかった。TAを接種された１匹のネズミとTBを接種された１匹のネズミは尾の静脈穿刺の間に麻酔で死んだ。
図１３は上皮小体摘出されたネズミの骨無機物増殖率に対する試験材料の効果を示している。緩衝剤を接種された比較ネズミは１日当たりの増殖率が1.28μm(S.D.=0.21)であった。試験材料を与えられたネズミは１日当たりの増殖率がTA、TB及びTEの各バンドにおいてそれぞれ1.27μm(S.D.=0.21)、2.14μm(S.D.=0.14)及び2.24μm(S.D.=0.28)であった。バンドTB及びTEについての増殖率は比較例及びバンドTA（P<0.025）に比べて顕著に高いものであった。この実験における比較ネズミは先の実験におけるよりも高い増殖率を示しているが、その理由は不明である。
ここに分子量約6〜6.5kilodaltons（TB）及び分子量約12〜13kilodaltons（TE）を有する少なくとも２つの活性ポリペプチドの存在が確認された。これら２つのペプチドの間の関係はこの結果からは明らかではない。
ネズミ血清成分の電気泳動画分から単離されたバンドのアミノ酸シーケンスの決定
材料及び方法
先の限外瀘液から約100μｌの材料をシーケンス決定のために用いた。100mM Tris.リン酸塩（pH6.9）、0.1％ SDS、1mM DTT及び50mM NaClよりなる緩衝剤を用いて15μl中に100μgの濃度に希釈した。リン酸塩ゲル電気泳動を先の部分において既述したと同様にして行った。ゲル厚みは1mmであった。材料100μlを５レーンに投入し、BDH低分子量マーカーを用いた。
小型Hoefferタンパク質トランファユニットを用いた。ゲルをPVDF膜（Millipore）に投入して250Vの定圧で１時間動かした。二重層の膜を用いてゲル内のすべてのタンパク質を膜に捕捉した。トランファ後膜をクロマシーブルーで着色した。各バンドを標識付けのためにカットオフした。
公知の方法により次のシーケンスが決定された。
TBシーケンス（SEQ ID NO.1）：Gly Pro Gly Gly Ala Gly Glu Thr Lys Pro Ile
TEシーケンス（SEQ ID NO.2）：Gly Pro Gly Gly Ala Gly Glu
すなわちTBとTEはそれらのN-末端の最初の６個のアミノ酸が全く同じアミノ酸配列を有する点で同族のペプチドであることが判明した。この結果からはTBがTEの活性フラグメントであるのかあるいはTEがTBの二量体又はポリマーであるのかは明らかではない。
合成ヒトポリペプチドの実験
循環するポリペプチドをエンコードするDNAシーケンスのためのヒトcDNAライブラリのスクリーニング
ネズミ血清から単離されるポリペプチドについて決定されたアミノ酸シーケンスに基づいて核酸プローブを合成し、ヒトcDNAライブラリをスクリーニングした。循環血清ペプチド及びタンパク質合成のための主な部位は肝臓であることが知られており、慢性肝不全を患う患者にしばしば骨損失が生ずることが報告されている。この理由により肝臓細胞から誘導されるヒトcDNAライブラリをスクリーニングした。
材料及び方法
胎児のライブラリからのcDNA単離
ClontechからのヒトcDNAライブラリを用いた。このライブラリは妊娠22週期のヒトの胎児から性別無差別に調製したものである。母親の血液型はＯ型（カタログ#HL1064A）であった。単離された肝臓mRNAを逆転写酵素を用いてオリゴＴプライマーで複製し、cDNAの第１ストランドを合成した。これに引き続いてS1ヌクレアーゼの消化（digestion）によりDNAポリメラーゼによる第２ストランドを合成した。blunt-ended double strain cDNAをECoR1リンカーに結紮してlambda gt10とした。
次いでcDNAライブラリを繁殖させた。SM媒体によりライブラリの希釈物を調製した。0.2％マルトースを用いたLB肉汁内の大腸菌E.coli C600 hfl培養菌を作り、これを安定した遅い成長相（通常一晩の培養）で培養した。希釈したライブラリ懸濁物100μlをSM300μlと一晩培養したE.coli C600  hfl培養菌600μlに添加し、37℃にて20分間培養した。懸濁物を次いで0.7％アガロース寒天3mlに注入し、50℃で溶融状態に維持した。これをすぐにあらかじめ37℃に暖めた0mm径の丸いLB寒天プレートに注入した。寒天培地表面のアガロースを室温で固化させ、血小板が見えるようになるまで（1mm径よりもわずかに小さい程度）LB寒天プレートを37℃で培養した。滴定量がプレート当たり30,000個の血小板が観察された時点の希釈液を後の増殖に用いた。
cDNAライブラリを次いでニトロセルロース膜に固定した。90mmプレート当たり30,000個の血小板濃度で各cDNAライブラリを培養した。血小板が1mmよりわずかに小さい径に達したときにプレートを一晩４℃で冷蔵した。翌日ニトロセルロース濾紙（Amershamからの0.45u）を柔らかいアガロースの上に積層し、３分間放置した。後に膜（又はそのＸ線写真）をプレートに対して整列させるために、針を用いて膜の３カ所又はより多くの非対称位置において寒天プレートに達する穴をあけた。次いで膜を持ち上げてDNAを上方にして0.4N NaOHを含む培養プレート上に乗せ、20分間その場所で浮遊させた。次にこれを6×SSCに20分間移し、育種のために空気乾燥した。
Cyclone-plusオリゴヌクレオチド合成装置（Milligen）によりphospoarmidite作用を用いてA 32 merオリゴヌクレオチドプローブを合成した。プローブをDMTグループに合成し、次の逆相HPLCによる精製のためにそのまま放置した。プローブは0.2μモルスケール上に合成した。合成後プローブを4mlの水酸化アンモニウムで24時間室温でdeprotectした。この材料を４等分してSpeed-vac濃縮機で乾燥した。用いた核酸プローブは次のシーケンス（SEQ ID NO.3）を持つ。
0003733381.tif 000005
括弧内のベースは変性コドンを示す。この核酸に対応すると推測されるタンパク質はSEQ ID nO.4によって与えられる。
プローブを逆相HPLCにより精製した。乾燥材料の部分標本を1mlの100mM TEAA（pH7.0）に溶解した。Hewlett Packerのサンプルフィルターでサンプルを瀘過し、C18 semiprep Beckmanコラム，7.5×150mmに投入した。サンプルを既述したBeckmaの装置でクロマトグラフィ分析した。勾配プログラムは次の通り。
溶媒Ａ：100mM TEAA pH 7.2
溶媒Ｂ：アセトニトリル
0003733381.tif 000006
失敗シーケンスが最初に抽出され、約35分後に純粋なシーケンスが得られた。ピークを収集して乾燥した。1％TFAを添加してDMTをdetritylateした後に再び乾燥した。3％水酸化アンモニウムを100μl添加して乾燥後に残っているTFAを中和した。材料を再び乾燥し水に再溶解した。溶解した材料100μlを0.1ml G25スパンコラムに通し、260nmでの吸収によりDNA濃度を測定した。260nmにおける１O.D.ユニットを取り出して測定するとそのDNA濃度は約33μg/mlであった。
プローブを次いでキナーゼで処理した。プローブ50pモルをmモル当たり>3,000 Ci及び10uCi/μl（Amersham）活性を有する50 pモルの32P標本ATPを用いてT4 DNAキナーゼ（Pharmacia）により処理した。
このプローブをニトロセルロース膜に固定したDNAにより育種した。乾燥したニトロセルロース膜を42℃溶液中で２時間培養した。容積は50mlであった。標本化した50pモルのプローブを添加して一晩42℃で育種した。50ml溶液中の膜数は50であった。翌日膜を300mlの2×SSCを用いて室温で１回当たり約５分間４回洗った。この膜を50mlの1×SSC中で68℃にて１時間培養し、室温にて1×SSC中で１度すすぎ洗いした後乾燥した。放射性インク1μlをフィルターの各穿刺部分にスポットして膜位置をマーキングした。膜を次いで補力スクリーンを用いて85℃でAmershamハイパーフィルムに晒した。フィルムを展開してクローン同定のために寒天培地と整列させた。確認のために積極的クローンを取り出して寒天培地中で一度増殖させ、再育種した。
一つの積極的クローンはスクリーニング後に約300,000個の血小板を有するものと確認された。
ヒトの循環性骨成長因子のcDNA配列の増幅
cDNAクローンをManiatisらの手法に基づいて増幅した。積極多岐な血小板HL 1-7を滅菌ピペットで採取し、1mlの60％SM及び40％グリセロール中に最初は37℃で２時間、次いで４℃で一晩配置した。大腸菌E.coli C600 hflの１つのコロニーを10mlのLB肉汁に0.2％マルトースと共に接種した。培養物を200rpmで運転する撹拌インキュベータ（Queue)内で一晩37℃にて培養した。翌朝HL 1-7懸濁物100μlをSM 300ml及び一晩培養したE.coli C600 hfl 600μlにて20分間37℃で培養した。この培養物のループをLB寒天プレートに筋状に載置し、コロニーが肉眼で視認できるまで30℃で培養した。幾つかのコロニーを選んで番号を付け、各コロニーをLB寒天プレートに載置した。一つのプレートは30℃で培養し、他は40℃で培養した。30℃でのみ成長し40℃で分離したコロニーをHL1-7の繁殖に用いた。
一つのHL 1-7病原性コロニーを10ml LB肉汁に0.2％マルトースと共に接種し、培養物が濃密になるまで撹拌インキュベータ内で30℃にて培養した。O.D.を600nmで測定した。600nmにおけるO.D.ユニットを採取すると１ml当たりにして8×108の大腸菌細胞濃度が測定された。予備加熱したNZCYM媒体の500mlを用いて1010の細胞を培養し、他の500ml媒体を同様にして培養した。両方の媒体ボトルを撹拌インキュベータにて一晩200rpm及び37℃の条件で培養した。翌朝各500ml培養体にクロロホルム10mlを加えて30分間培養を継続した。培養体を室温に冷却した後DNAse及びRNAse Aをiμg/mlの濃度となるまで添加した。30分間培養体を室温に維持し、NaClを1M濃度に添加した。培養体を１時間氷上に放置した後、微生物残渣を11,000を越えないg力を用いて10分間遠心分離した。各500ml培養体に50gのPEG 8000を加え、PEGが溶解するまでもう１時間氷上に放置した。相を10分間11,000gで４℃にて遠心処理して、上澄を廃棄した。沈殿物を16mlのTMに再懸濁し、溶液を等量のクロロホルムで抽出した。液相に4mlのグリセロールを添加し、次のようにして勾配遠心分離処理した。
完全無菌のBeckman超遠心分離チューブの底部にCsCl(s.gr 1.6)層を添加し、CsCl(s.gr 1.4)層を底部層上に積層した。HL  1-7懸濁物をCsCl勾配上に積層し、Ti60固定アングルロータを用いたBeckman L8-70超遠心分離機で２時間４℃にて35,000rpmで遠心分離した。ファージ粒子がCsCl勾配の２層の間の青いバンドとして現れた。注射器の先端につけた針を用いてファージ粒子を遠心分離チューブからその壁面にあけた穴を介して引き出した。懸濁物をフェノールを用いて１回、次いでフェノール／クロロホルムの１：１混合物により１回、さらにクロロホルムにより２回抽出した。ファージDNAをエタノール沈殿により回収した。存在するDNA量を260nmでの吸収により測定した。
DNAインサートをアガロースゲル電気泳動によりサイズ処理した。HL 1-7 DNAの15μgを2×Pharmacia one-phor-all緩衝剤よりなる蒸解緩衝剤150μlに蒸解した。蒸解はWCoR1（Pharmacia)25ユニットを用いて37℃で1.5時間行った。蒸解後DNAをフェノールクロロホルム抽出及びエタノール沈殿により精製した。0.5cm厚の1.2％seakem GTGグレードのアガロースゲルを注入した。8mm幅の5つの室を有する櫛体を用いた。蒸解したDNAを一つの室に投入してPharmaciaΦX174マーカーを標準として用いた。ゲルをTBE緩衝剤内においてゲル1cm当たり8Vで流動させた。ゲルをエチジウムで着色した。
キャビラリー電気泳動のために水に溶解した10μg/mlDNA濃縮液を用いた。緩衝剤は89mMホウ酸及び89mM Tris pH 8.5, 2mMEDTA及び0.5％ヒドロキシプロピルメチルセルロース（Sigma）であった。装置はBeckmanキャビラリー電気泳動ユニット、モデル2100であった。サンプルを100μm内径、27cm長のDBI7コートキャビラリーチューブ（J&W Scientific Inc.）に７kVにて７分間の動電学力により導入した。次いで消水栓の圧力注入を５秒間行った。電気泳動を6.25kVの定圧にて12分間行った。Beckman System Gold Softwareを用いて260nmにおける吸収を記録した。Boehringer Manheim DNA分子マーカーVIを標準として用いた。
ファージDNAにPCR増幅を施した。ファージDNAをエタノール沈殿によりファージ懸濁物1MLから沈殿させた。ファージに関連するタンパク質が4M過塩素酸ナトリウムにより取り除かれ、次にフェノール／クロロホルムで２つの抽出物が得られ、さらに２つの抽出物がクロロホルムにより抽出された。エタノール沈殿を２回行うことによりDNAが回収され、centricon 30（Amicon）により水洗した。DNA溶液の最終ボリュームを水で0.5mlに調整した。
PCRをthermocyler（M.J.Research Inc.］を用いて行った。50mM KCl, 10mM Tris.Cl（pH 8.3），2.5mM MgCl2，0.1％ゼラチン、0.45％Tween 20及び0.45％NP 40からなる緩衝剤を用いた。緩衝剤にはそれぞれ50pモルの増幅プライマー（Clontech cat. #5411），0.125mM dNTPs, imM DTT及び2.5ユニットのTag DNAポリメラーゼが含まれていた。精製ファージ10μlをテンプレートに用いた。一つのプライマーはECoR1部位の５インチ中流のHind III部位にDNAを複製し、それは5'-AAG CTT CAC ACC ACG AAC CAG-3'のシーケンス（SEQ ID NO.5）を有するものであった。他のプライマーはECoR1部位の３インチ下流部位にHL1-7のシーケンスを有し、それは5'-TTA TGA GTA TTT CTT CAA GGG-3'（SEQ ID NO.6）であった。
PCRプログラムは次の通りである。
0003733381.tif 000007
製品をクロロホルム／フェノールで１回、クロロホルムで２回チュウシュツシ、エタノールを100μlの水に沈殿溶解させた。得られたファージDNAの量は培養物１リットル当たり約15〜18μgであった。再生されたDNAは十分に純粋であり、約1.7の260対280比を有していた。
アガロース電気泳動とキャビラリー電気泳動とによるサイジングの結果によりインサートが約300塩基対を有する大きさのものとなった。キャビラリー電気泳動において観測されたサイズは約600個の塩基対であるが、これはベクターから５インチ部位（Hind IIIからECoR1にかけての部位）に余分な285個の塩基対を含んでいる。
ファージHL1-7 cDNAのシーケンシング
ファージDNAの15μgを水酸化ナトリウムで変性して酢酸ナトリウム（pH4.5）とエタノールにより沈殿させた。これを一つのプライマー（Clontech CAT#6184, 6186）でアニールした。Pharmacia T7 DNAポリマラーゼシーケンサーを用いてSanger dideoxy鎖末端によりシーケンシングを行った。32PdATP（Amersham sp.活性＞3,000Ci/mモル，10μCi/μlを放射線標準に用いた）。シーケンシングは45cm長ゲル内でBase Runner Unit（IBI）を用いて、45ワットの定電力で行った。流動後のゲルを乾燥してAmersham Hyperfilmに一晩-85℃で晒して展開した。
シーケンシングの結果は次に示す通りである。成熟cDNAを53個のアミノ酸を符号化している。最初の１７個のアミノ酸は信号シーケンスを示す。
0003733381.tif 000008
ヒト胎児肝臓cDNAライブラリからのcDNAシーケンスの部分を符号化するDNAシーケンスの表記
オリゴヌクレオチド合成により例えばプラスミドにクローン化することにより次のシーケンスを合成した。
0003733381.tif 000009
上記核酸シーケンスのsense strandをSEQ ID NO.9として特定し、anti-sense strandをSEQ ID NO.10とし、上記ポリペプチドシーケンスをSEQ ID NO.11とする。
本発明者は上記した他にも各種の配列のポリペプチドについて試験し、いずれも骨の増殖を刺激促進する作用効果があることを確認している。これらのポリペプチド配列は別紙に記載されている。
シーケンスリスト
シーケンスＮｏ．１（SEQ ID NO.1）
長さ：１１個のアミノ酸
タイプ：アミノ酸
形態：リニア
0003733381.tif 000010
シーケンスＮｏ．２（SEQ ID NO.2）
長さ：７個のアミノ酸
タイプ：アミノ酸
形態：リニア
0003733381.tif 000011
シーケンスＮｏ．３（SEQ ID NO.3）
長さ：３２個の塩基対
タイプ：核酸
形態：リニア
0003733381.tif 000012
シーケンスＮｏ．４（SEQ ID NO.4）
長さ：１０個のアミノ酸
タイプ：アミノ酸
形態：リニア
0003733381.tif 000013
シーケンスＮｏ．５（SEQ ID NO.5）
長さ：２１個の塩基対
タイプ：核酸
形態：リニア
0003733381.tif 000014
シーケンスＮｏ．６（SEQ ID NO.6）
長さ：２１個の塩基対
タイプ：核酸
形態：リニア
0003733381.tif 000015
シーケンスＮｏ．７（SEQ ID NO.7）
長さ：３２９個の塩基対
タイプ：核酸
形態：リニア
分子タイプ：cDNA-mRNA
0003733381.tif 000016
シーケンスＮｏ．８（SEQ ID NO.8）
長さ：５３個のアミノ酸
タイプ：アミノ酸
形態：リニア
0003733381.tif 000017
シーケンスＮｏ．９（SEQ ID NO.9）
長さ：１４１個の塩基対
タイプ：核酸
形態：リニア
ANTI-SENSE：NO
0003733381.tif 000018
シーケンスＮｏ．１０（SEQ ID NO.10）
長さ：１４１個の塩基対
タイプ：核酸
形態：リニア
ANTI-SENSE：YES
0003733381.tif 000019
シーケンスＮｏ．１１（SEQ ID NO.11）
長さ：１４１個の塩基対
タイプ：核酸
形態：リニア
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図７Ａ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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