(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式：
【化１】
0003863370.tif 000032
［式中、Ｘ２はＡｒ−Ｘ３であり、ここにＸ３は−Ｃ＝Ｏ、−ＣＨ２ＣＯ−であって、ここに、Ａｒはフェニルまたはインドリルであり；
Ｒ１およびＲ２は各々個々にバリンの側鎖、水素、１−４炭素の線状および分岐状のアルキル、１−４炭素の線状および分岐状の置換されたアルキルから選択され、ここに、アルキル基は、ヒドロキシ、カルボキシ、シクロヘキシル、ピリジン−３−イル、ナフタ−２−イル、フェニルまたは置換されたフェニルで置換されていてもよく、ここにフェニル基は、ヒドロキシまたはフェニルで置換されていてもよく；
Ｘ１は−ＯＨおよび
【化２】
0003863370.tif 000033
から選択され、ここに、Ｘ４は−ＯＨであり；
Ｒ３は水素、１−４炭素の線状および分岐状アルキル、１−４炭素の線状および分岐状の置換されたアルキルまたはフェニルであり、ここに、アルキル基は、ヒドロキシ、アミノ、アミド、カルボキシル、１−Ｈ−イミダゾール−４−イル、ピリジン−３−イル、クアニジニル、チアゾール−４−イル、フェニルまたは置換されたフェニルで置換されていてもよく、ここにフェニル基はヒドロキシまたはフェニルで置換されていてもよい。］
を有する化合物。
【請求項２】
Ｒ１が１−４炭素の分岐状アルキル、および１−４炭素の線状の置換されたアルキル基から選ばれる請求項１記載の化合物。
【請求項３】
Ｘ３がＣＨ２ＣＯであって、Ｒ１がイソブチルである請求項１記載の化合物。
【請求項４】
Ａｒがインドリルであり、Ｒ１はイソブチルであり、Ｒ３はカルボキシル基で置換されたアルキルである請求項１記載の化合物。
【請求項５】
Ａｒがフェニルであり、Ｒ２はフェニル基で置換されたアラルキルであり、Ｒ１がイソブチルであり、Ｒ３がカルボキシル基で置換されたアルキルである請求項１記載の化合物。
【請求項６】
Ａｒがインドリルであり、Ｘ３がＣＨ２ＣＯであり、Ｒ１がイソブチルであり、Ｒ３がカルボキシル基で置換されたアルキルである請求項１記載の化合物。
【請求項７】
哺乳動物への治療上有効な量の請求項１記載の化合物を含む20Sプロテアソーム活性を阻害するための医薬組成物。
【請求項８】
該治療上有効な量が０．００１ないし１００ｍｇ／ｋｇ哺乳動物体重の範囲である請求項７記載の医薬組成物。
【請求項９】
請求項１記載の化合物および１以上の医薬賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項１０】
該組成物が溶液の形態である請求項９記載の医薬組成物。
【請求項１１】
該組成物が錠剤の形態である請求項９記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
(発明の背景)
多触媒プロテイナーゼまたはプロテアソームはほとんどの細胞蛋白質のＡＴＰ−依存性蛋白質分解の原因である高度に保存された細胞構造である（Coux, O., Tanaka, K.およびGoldberg, A.1996 Ann. Rev. Biochem. 65, 801-847）。２０Ｓプロテアソームは複合体の触媒コアを含有し、古細菌Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ（Lowe, J., Stock, D., Jap, B., Zwicki, P., Bauminster, W.およびHuber, R.1995 Science 268, 533-539）から、および酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（Groll, M.,Ditzel, L.,Lowe, J.,Stock, D.,Bochtler, M.,Bartunik, HDおよびHuber, R.1997 Nature 386,463-471）から結晶化されている。キモトリプシン−様蛋白質分解活性を主として呈する古細菌プロテアソーム（Dahlmann, B.,Kopp,F.,Kuehn, L.,Niedel, B.,Pfeifer, G.1989 FEBSLett.251,125-131; Seemuller, E.,Lupas, A.,Zuw, F.,Zwickl, PおよびBaumeister, W.FEBS Lett. 359,173,(1995)）とは異なり、真核生物プロテアソームは少なくとも５つの同定可能な蛋白質分解活性を含有する。これらの活性のうちの３つはキモトリプシン、トリプシンおよびペプチジルグルタミルペプチダーゼに対する特異性において同様である。記載された２つの他の活性は、分岐鎖アミノ酸（ＢｒＡＡＰ）のカルボキシル側のペプチド結合の切断について、および短鎖中性アミノ酸（ＳｎＡＡＰ）の間のペプチドに向けての選択性を呈する（Orlowski, M.1990 Biochemistry 29, 10289-10297）。
【０００２】
２０Ｓプロテアソームは蛋白質コアを含有するが、それ自体が多重ＡＴＰａｓｅ活性を含有する、その構造のいずれかの端部において、それが１９Ｓキャップと複合体化しなければそれはイン・ビボで蛋白質を分解することができない。このより大きい構造は２６Ｓプロテアソームとして公知であり、８．５−ｋＤａポリペプチド複合分子のユビキチンの添加による分解について目標とされてきた蛋白質を迅速に分解するであろう（Coux, O., Tanaka, K.およびGoldberg, A.1996 Ann.Rev. Biochem. 65,801-847に総括されている）。
【０００３】
多数の基質−由来の機能が、優れたセリンおよびチオールプロテアーゼ阻害剤として使用されてきた。これらのモチーフのいくつかはプロテアソームに対する阻害剤として記載されてきた。これらはペプチドアルデヒド（Vinitsky, A., Michaud, C,,Powers, J.およびOrlowski, M. 1992 Biochemistry 31, 9421-9428; Tsubuki, S., Hiroshi, K.,Saito, Y., Miyashita, N., Inomata, M., およびKawashima, S. 1993 Biochem.Biophys.Res.Commun.196,1195-1201;Rock,K,I.,Gramm,C., Rothstein, L., Clark,K.,Stein, R.,Dick, L., Hwang, D. およびGoldberg, A.L.(1994)Cell 78,761-771）、Ｎ−アセチル−Ｌ−ロイシニル−Ｌ−ロイシニル−Ｌ−ノルロイシナール（ＡＬＬＮ）およびＮ−アセチル−Ｌ−ロイシニル−１−ロイシニル−メチオナール（ＬＬＭ）を含み、このタイプの最も優れた阻害剤はＮ−カルボベンゾキシル−１−Ｌ−ロイシニル−Ｌ−ロイシニル−Ｌ−ノルバリナール（ＭＧ１１５）である。他の報告は、１０ないし１００ｎＭの範囲のＩＣ５０値を有する一連のジペプチド阻害剤を記載している（Iqbal, M.,Chatterjee S.,Kauer, J.C.,Das, M.,Messina, P.,Freed, B.,Biazzo, WおよびSiman, R. 1995 I-Med.Chem.38, 2276-2277）。一連のα−ケトカルボニルおよびボロニックエステル由来ジペプチド（Iqbal, M.,Chatterjee S.,Kauer, J.C., Mallamo, J.P.,Messina, P.A.,Reiboldt, A.およびSiman, R. 1996 Bioorg. Med-Chem.Lett 6, 287-290）およびエポキシケトン（Spattenstein, A., Leban, JJ.,Huang, J.J.,Reinhardt, K.R.,Viveros, O.H., Sigafoos, J.およびCrouch, R. 1996 Tet.Lett.37, 1434-1346）もまたプロテアソームの優れた阻害剤であることを記載している。
【０００４】
プロテアソーム活性の阻害において特異性を呈する異なる化合物はＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ代謝産物であるラクタシスチン（Fenteany, G., Standaert, R.F., Lane, W.S., Choi, S., Corey, E.J.およびSchreiber, S.L.1995 Science 268, 726-731）である。この分子は神経芽細胞系における軸索発芽後成長を誘導するその能力につき元来発見され（Omura, S., Matsuzaki, K., Fujimoto, T., Kosuge, K., Furuya, T., Fujita, S.およびNakagawa, A. 1991 J.Antibiot.44, 117-118）、後者はいくつかの細胞タイプの増殖を阻害することが示されてきた（Fenteany, G., Standaert, R.F., Reichard, G.A., Corey, E.J.およびSchreiber, S.L.1994 Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA91,3358-3362）。
【０００５】
今回、プロテアソームが、細胞分裂、抗原プロセッシングおよび腫瘍遺伝子産物、サイクリンおよび転写因子のごとき寿命が短い調節蛋白質の分解のような多様な細胞機能に必須の蛋白質分解に関与する主要なリソソーム外蛋白質分解系であることが十分に確立された。（Ciechanover, A.(1994)Cell  79, 13-21;Palombell, V.J.,Rando, O.J.,Goldberg, A.L.およびManiatis, T.1994 Cell 78,773-785）。例えば、ＮＦ−κＢの活性形態はｐ６５およびｐ５０サブユニットよりなるヘテロダイマーである。後者は不活性前駆体（ｐ１０５）としてサイトゾルに存在する。ｐ５０を生成させるためのｐ１０５の蛋白質分解プロセッシングはユビキチン−プロテアソーム経路を介して起こる。加えて、プロセッシングしたｐ５０およびｐ６５は、阻害性蛋白質ＩκＢに結合した不活性複合体としてサイトゾルに維持される。ＬＰＳのごとき炎症刺激剤は、ＩκＢの分解に至るシグナリング経路を開始させることによってＮＦ−κＢを活性化させる。また、これらのシグナルはｐ１０５からｐ５０へのプロセッシングを刺激する。かくして、共にユビキチン−プロテアソーム経路によって支配される２つの蛋白質分解事象が、ＮＦ−κＢのシグナル誘導化活性化に必要である。
【０００６】
ユビキチン媒介プロテアソーム蛋白質分解がＮＦ−κＢの活性化で臨界的役割を演じるという観察は、プロテアソームに向けられた阻害剤の使用によって臨床的に開発することができた。ＮＦ−κＢの異常活性化、続いてのサイトカイン合成の刺激が種々の炎症性および感染性疾患で観察されてきた。また、ＮＦ−κＢの活性化は脈管形成に、および接着分子（ＣＡＭおよびセレクト）の発現に必須であり、かくして、プロテアソーム阻害剤は血管系に関連した病気の治療で有用性を有し得る。
【０００７】
ユビキチン−プロテアソーム経路は有糸分裂からの脱出を支配し、細胞が細胞周期の次の相に進行するのを可能とするサイクリンの調節された破壊に非常に重要であることがよく記載されている（Glotzer, M.,Murray, A.W.およびKirschner, M.W.(1991)Nature 349,132-138）。かくして、プロテアソーム阻害剤を用いることによるサイクリンの分解の阻害は成長阻止を引き起こす。従って、プロテアソーム阻害剤のもう１つの潜在的利用性は異常細胞分裂に由来する病気の治療におけるそれらの使用である。
【０００８】
２０Ｓプロテアソームのペプチド阻害剤のいくつかのクラスが、最近の文献に報告されている。α−ケトアミド基は多数の症状でプロテアーゼ阻害剤として使用されてきた。具体的には、一連のα−ケトカルボニルおよびボロニックエステル由来のジペプチド（Iqbal, M., Chatterjee, S., Kauer, J.C.,Mallamo, J.P., Messina, P.A., Reiboldt, A.およびSiman, R.1996 Bioorg. Med.Chem.Lett 6, 287-290）が２０Ｓプロテアソーム機能の優れた阻害剤として報告されている。３−インドールピルビン酸の誘導体が、脳におけるキヌレン酸レベルを変調するメカニズムを介して中枢神経系（Ｄｅ  Ｌｕｃａ，ら  ＷＯ８８／０９７８９）の乱れの治療用の医薬上活性な化合物として特許請求されてきた。
【０００９】
種々の組成物が細胞増殖をある程度阻害することが発見されているものの、２０Ｓプロテアソームを介して細胞増殖を阻害する、より優れた化合物に対する要望が依然として存在する。
【００１０】
（発明の概要）
本発明の目的は、従前はその細胞増殖阻害剤特性につき知られていない、治療上有効量の組成物を使用する、哺乳動物において細胞増殖を阻害する方法を提供することにある。
【００１１】
また、本発明の目的は、プロテアソーム機能阻害によって作用し得る病気の治療のための方法を提供することにある。
【００１２】
さらに、本発明の目的は、プロテアソーム機能阻害によって作動する増殖病の治療のための方法を提供することにある。
【００１３】
本発明のもう１つの方法は、ヒトにおいて細胞増殖障害を阻害する治療上有効量の組成物を使用することにある。
【００１４】
本発明のさらにもう１つの方法は、プロテアソーム機能を阻害する治療上有効量の組成物を使用することにある。
【００１５】
１つの実施形態において、本発明は、式：
【化３】
0003863370.tif 000002
［式中、Ｘ２はＡｒ−Ｘ３であり、ここにＸ３は−Ｃ＝Ｏ、−ＣＨ２ＣＯ−であって、ここに、Ａｒはフェニルまたはインドリルであり；
Ｒ１およびＲ２は各々個々にβ−アラニン、バリンの側鎖、水素、１−４炭素の線状および分岐状のアルキル、１−４炭素の線状および分岐状の置換されたアルキルから選択され、ここに、アルキル基は、ヒドロキシ、カルボキシ、シクロヘキシル、ピリジン−３−イル、ナフタ−２−イル、フェニルまたは置換されたフェニルで置換されていてもよく、ここにフェニル基は、ヒドロキシまたはフェニルで置換されていてもよく；
Ｘ１は−ＯＨおよび
【化４】
0003863370.tif 000003
から選択され、ここに、Ｘ４は−ＯＨであり；
Ｒ３はβ−アラニン、水素、１−４炭素の線状および分岐状アルキル、１−４炭素の線状および分岐状の置換されたアルキルまたはフェニルであり、ここに、アルキル基は、ヒドロキシ、アミノ、アミド、カルボキシル、１−Ｈ−イミダゾール−４−イル、ピリジン−３−イル、クアニジニル、チアゾール−４−イル、フェニルまたは置換されたフェニルで置換されていてもよく、ここにフェニル基はヒドロキシまたはフェニルで置換されていてもよい。］
を有する化合物である。
【００１６】
もう１つの実施形態において、本発明は、治療上有効量の前記開示の組成物を哺乳動物に投与することを特徴とする哺乳動物においてプロテアソームプロテアーゼ因子を阻害する方法である。
【００１７】
さらにもう１つの実施形態において、本発明は、請求項１記載の組成物および１以上の医薬賦形剤を含む医薬組成物である。
【００１８】
（発明の詳細な記載）
本発明は、以下の一般式：
【化５】
0003863370.tif 000004
［式中、Ｘ２はＡｒ−Ｘ３であり、ここにＸ３は−Ｃ＝Ｏ、−ＣＨ２ＣＯ−であって、ここに、Ａｒはフェニルまたはインドリルであり；
Ｒ１およびＲ２は各々個々にβ−アラニン、バリンの側鎖、水素、１−４炭素の線状および分岐状のアルキル、１−４炭素の線状および分岐状の置換されたアルキルから選択され、ここに、アルキル基は、ヒドロキシ、カルボキシ、シクロヘキシル、ピリジン−３−イル、ナフタ−２−イル、フェニルまたは置換されたフェニルで置換されていてもよく、ここにフェニル基は、ヒドロキシまたはフェニルで置換されていてもよく；Ｒ２は好ましくはフェニル基で置換され、さらにフェニル基で置換されたアルキルであり、Ｒ１は好ましくはイソブチルである。
Ｘ１は−ＯＨおよび
【化６】
0003863370.tif 000005
から選択され；
Ｘ４は−ＯＨであり；
Ｒ３はβ−アラニン、水素、１−４炭素の線状および分岐状アルキル、１−４炭素の線状および分岐状の置換されたアルキルまたはフェニルであり、ここに、アルキル基は、ヒドロキシ、アミノ、アミド、カルボキシル、１−Ｈ−イミダゾール−４−イル、ピリジン−３−イル、クアニジニル、チアゾール−４−イル、フェニルまたは置換されたフェニルで置換されていてもよく、ここにフェニル基はヒドロキシまたはフェニルで置換されていてもよく；Ｒ３は好ましくは、カルボキシル基で置換されたアルキルである。］
を有する組成物、及び該組成物を含む、哺乳動物、特にヒトにおいて、細胞増殖障害、感染病および免疫学的病気等の20Sプロテアソーム活性を阻害するための医薬組成物である。
【００１９】
以下のものは本明細書中で用いるある用語についての定義である。
【００２０】
「ハロゲン」とはフッ素、臭素、塩素およびヨウ素原子をいう。
【００２１】
「ヒドロキシル」とは−ＯＨ基をいう。
【００２２】
「チオール」または「メルカプト」とは−ＳＨ基という。
【００２３】
「アルキル」とは１ないし１０個の炭素原子の環状鎖、分岐鎖または直鎖のアルキルをいう。この用語はさらにメチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、ｉ−ブチル（または３−メチルプロピル）、シクロプロピルメチル、ｉ−アミル、ｎ−アミル、ｎ−ヘキシル等のような基によって例示される。
【００２４】
「置換されたアルキル」とはヒドロキシル、チオール、アルキルチオール、ハロゲン、アルコキシ、アミノ、アミド、カルボキシル、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、複素環、シクロヘテロアルキル、置換されたシクロヘテロアルキル、アシル、カルボキシル、アリール、置換されたアリール、アリールオキシ、ヘトアリール、置換されたヘトアリール、アラルキル、ヘテロアラルキル、アルキルアルケニル、アルキルアルキニル、アルキルシクロアルキル、アルキルシクロヘテロアルキル、シアノのごとき１以上の基を含めた丁度記載された低級アルキルをいう。これらの基は低級アルキル部位のいずれかの炭素原子に付着することができる。
【００２５】
「アリールオキシ」とはＡｒがアリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、または後記にて定義する置換されたヘテロアリール基である基−ＯＡｒを示す。
【００２６】
「アミノ」とはＲおよびＲ’が独立して水素、低級アルキル、置換された低級アルキル、アリール、置換されたアリール、ヘトアリール、または後記で定義する置換されたヘトアリール、またはアシルであり得る基ＮＲＲ’をいう。
【００２７】
「アミド」とはＲおよびＲ’が独立して水素、低級アルキル、置換された低級アルキル、アリール、置換されたアリール、ヘトアリール、または後記で定義する置換されたヘトアリールであり得る基−Ｃ（Ｏ）ＮＲＲ’を示す。
【００２８】
「カルボキシル」はＲが独立して水素、低級アルキル、置換された低級アルキル、アリール、置換されたアリール、ヘトアリール、定義した置換されたヘトアリールなどであり得る基−Ｃ（Ｏ）ＯＲを示す。
【００２９】
「アリール」または「Ａｒ」とは少なくとも１つの芳香族環を有する芳香族炭素環基（例えば、フェニルまたはビフェニル）または少なくとも１つの環が芳香族である複数縮合環（例えば、１，２，３，４−テトラヒドロナフチル、ナフチル、アントリルまたはフェナントリル）をいう。
【００３０】
「置換されたアリール」とは所望により１以上の官能基、例えば、ハロゲン、低級アルキル、低級アルコキシ、アルキルチオ、アセチレン、アミノ、アミド、カルボキシル、ヒドロキシル、アリール、アリールオキシ、複素環、ヘトアリール、置換されたヘトアリール、ニトロ、シアノ、チオール、スルファミド等で置換されたアリールをいう。
【００３１】
「複素環」とは所望により置換されていないか、または例えばハロゲン、低級アルキル、低級アルコキシ、アルキルチオ、アセチレン、アミノ、アミド、カルボキシル、ヒドロキシル、アリール、アリールオキシ、複素環、ヘトアリール、置換されたヘトアリール、ニトロ、シアノ、チオール、スルファミド等で置換された、単一の環（例えば、モルホリノ、ピリジルまたはフリル）または複数の縮合環（例えば、ナフトピリジル、キノキサリル、キノリニル、インドリジニルまたはベンゾ［ｂ］チエニル）を有し、かつ環内にＮ、ＯまたはＳのごとき少なくとも１個のヘテロ原子を有する飽和、不飽和、または芳香族炭素環基をいう。
【００３２】
「ヘテロアリール」または「ヘトアル」とは少なくとも１つの複素環が芳香族性である複素環をいう。好ましいヘテロアリールはフェニル、置換されたフェニル、インドールおよび置換インドールである。
【００３３】
「置換されたヘテロアリール」とは所望により１以上の官能基、例えば、ハロゲン、低級アルキル、低級アルコキシ、アルキルチオ、アセチレン、アミノ、アミド、カルボキシル、ヒドロキシル、アリール、アリールオキシ、複素環、ヘトアリール、置換されたヘトアリール、ニトロ、シアノ、チオール、スルファミド等でモノまたはポリ置換された複素環をいう。
【００３４】
「シクロアルキル」とは３ないし１５個の炭素原子を含有する二価環状またはポリ環状アルキル基をいう。
【００３５】
「置換されたシクロアルキル」とは１以上の置換基、例えば、ハロゲン、低級アルキル、置換された低級アルキル、アルコキシ、アルキルチオ、アセチレン、アリール、アリールオキシ、複素環、ヘトアリール、置換されたヘトアリール、ニトロ、シアノ、チオール、スルファミド等、を含むシクロアルキル基をいう。
【００３６】
本発明の治療方法で有用、特にプロテオソーム機能の阻害剤として有用であり得る化合物の例は以下の表１で確認される：
本発明の治療方法で有用となり得る（特に、プロテオソーム機能の阻害剤として有用な）化合物の例を以下の表にリストする。
【００３７】
表１  ２０Ｓプロテオソームを阻害するのに用いられる組成物
【表１】
0003863370.tif 000006
【表２】
0003863370.tif 000007
【表３】
0003863370.tif 000008
【表４】
0003863370.tif 000009
【表５】
0003863370.tif 000010
【表６】
0003863370.tif 000011
【表７】
0003863370.tif 000012
【表８】
0003863370.tif 000013
【表９】
0003863370.tif 000014
【表１０】
0003863370.tif 000015
【表１１】
0003863370.tif 000016
【表１２】
0003863370.tif 000017
【表１３】
0003863370.tif 000018
【表１４】
0003863370.tif 000019
【表１５】
0003863370.tif 000020
【表１６】
0003863370.tif 000021
【表１７】
0003863370.tif 000022
【表１８】
0003863370.tif 000023
【表１９】
0003863370.tif 000024
【表２０】
0003863370.tif 000025
【表２１】
0003863370.tif 000026
【表２２】
0003863370.tif 000027
前記した化合物は抗増殖病、癌、炎症のごとき２０Ｓプロテアソームによって媒介される病気および障害を治療するのに有用である。本発明の組成物は抗増殖障害および炎症を治療するのに用いるのが好ましい。本発明の化合物は炎症病を治療するのに用いるのが最も好ましい。
【００３８】
本発明の化合物は哺乳動物において２０Ｓプロテアソームによって媒介される障害を治療するのに有用である。
【００３９】
本発明の化合物は本発明の少なくとも１つの化合物を２０Ｓプロテアソームに供給することができるいずれかの投与プロトコルによって予防的におよび治療的に哺乳動物に投与することができる。有用な投与プロトコルの非限定的な例は経口投与、非経口投与、皮膚投与、経皮投与、直腸投与、鼻孔内投与または当業者の知識内にあるいずれかの他の適当な医薬組成物投与プロトコルによるものを含む。
【００４０】
本発明の組成物は適当な医薬投与形態で投与することができる。医薬投与形態は使用される投与プロトコルに大いに依存するであろう。医薬投与形態なる用語は、単独でまたは１以上の医薬賦形剤の存在下で本発明の２０Ｓプロテアソーム阻害剤を含む錠剤、カプセル剤、液剤および散剤のごとき項目をいう。かかる賦形剤およびアジュバントのような添加剤の選択は、再度、選択された投与プロトコルに大いに依存するであろう。医薬分野の当業者であれば本発明の化合物を投与するための非常に多様な処方および賦形剤を認識するであろう。
【００４１】
本発明の化合物のために選択された投与プロトコルは、結局は、本発明の２０Ｓプロテアソーム阻害剤を含む医薬投与形態の最終的形態および組成を指令するであろう。例えば、本発明の化合物の内部投与は、散剤、錠剤、カプセル剤、ペースト剤、ドリンク剤、顆粒剤または溶液剤、経口投与することができる懸濁剤および乳剤、またはボーラス（大丸薬）の形態にて、医療食品中にて、または飲料水中にて経口的に行われる。また、内部投与は界面活性剤または澱粉被覆カプセル剤のごとき添加剤を含めた適時放出処方を用い、あるいは凍結乾燥迅速溶解錠剤のごとき迅速放出処方を用いて達成することができる。皮膚投与は、例えば経皮パッチ、スプレーイングまたはポアリング−オンおよびスポッティング−オンの形態で行われる。非経口投与は、例えば、注射（筋肉内、皮下、静脈内、腹腔内）またはインプラントによる形態で行われる。
【００４２】
本発明の２０Ｓプロテアソーム阻害剤を配合した適当な医薬投与形態は、限定されるものではないが注射用溶液、経口溶液、希釈後の経口投与用濃縮物、皮膚上または体腔内で用いる溶液、ポア−オンおよびスポット−オン処方、ゲルのような溶液；経口または皮膚投与用のおよび注射用のエマルジョンおよび懸濁物；半固体製剤；活性化合物がクリーム基剤中または水中油型または油中水型エマルジョン基剤中に配合された処方；粉末、プレミックスまたは濃縮物、顆粒剤、ペレット、錠剤、ボリ、カプセル剤のごとき固体製剤；エアロゾルおよび吸入剤、および活性化合物を含有する成形製品を含む。
【００４３】
溶液である医薬投与形態は注射によって、静脈内、筋肉内および皮下投与することができる。注射用溶液は、活性化合物を適当な溶液に溶解させ、適当であれば、可溶化剤、酸、塩基、緩衝塩、抗酸化剤および防腐剤のごときアジュバントを添加することによって調製される。溶液は滅菌濾過し流し出す。
【００４４】
別法として、本発明の組成物を含む溶液は経口投与することができる。本発明の組成物の濃縮物は、好ましくは、投与濃度まで濃縮物を希釈した後のみ経口投与される。経口用溶液および濃縮物は、前記した注射用溶液の場合のごとく調製される。皮膚上で用いられる溶液は滴下適用され、ブラシ適用され、擦り込まれ、散布されまたは噴霧される。これらの溶液は前記した注射用溶液の場合のごとく調製される。
【００４５】
ゲルは皮膚に投与されるか、あるいは体腔に導入される。ゲルは、クリーム状粘性の透明な物質が形成されるような増粘剤の量にて、注射用の溶液の場合に記載したごとくに調製された溶液を処理することによって調製されるか、あるいは当業者に知られている別の方法でなされる。
【００４６】
ポア−オンおよびスポット−オン処方は皮膚の限定された領域に注がれるか散布され、活性化合物は皮膚に浸透し、全身に作用する。ポア−オンおよびスポット−オン処方は活性化合物を皮膚によって許容される適当な溶媒または溶媒混合液中に溶解し、懸濁しまたは乳化することによって調製される。適当には、着色剤、再吸収加速剤、抗酸化剤、光安定化剤および粘着剤のごとき他のアジュバントを添加する。
【００４７】
エマルジョンは経口、皮膚、または注射の形態にて投与することができる。エマルジョンは油中水型または水中油型のいずれかである。それらは、２０Ｓプロテアソーム阻害剤を疎水性または親水性相いずれかに溶解させ、乳化剤、着色剤、再吸収加速剤、防腐剤、抗酸化剤、光安定化剤、増粘物質のごとき適当なアジュバントの助けを借りて該相を反対相の溶媒と共にホモジネートすることによって調製される。
【００４８】
懸濁液は経口、皮膚または注射の形態にて投与することができる。それらは、適当には、湿潤剤、着色剤、再吸収加速剤、防腐剤、抗酸化剤および光安定化剤のごときさらなるアジュバントを添加し、活性化合物を液体中に懸濁させることによって調製される。
【００４９】
本発明の医薬組成物は医薬上許容される添加剤の形態にて１以上の添加剤を含むことができる。有用な添加剤は溶媒、安定化剤、防腐剤、増粘剤、湿潤剤、着色剤、再吸収加速剤、抗酸化剤、光安定化剤、粘着剤、増粘物質、充填剤、フレーバー剤、潤滑剤、当業者に知られたいずれかの他の医薬組成物添加剤を含む。
【００５０】
添加剤は水、エタノール、ブタノール、ベンジルアルコール、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、Ｎ−メチル−ピロリドン、アルカノール、グリセロールのごときアルコール類、ベンジルアルコール、フェニルエタノール、フェノキシエタノールのごとき芳香族アルコール類、酢酸エチル、酢酸ブチル、安息香酸ベンジルのごときエステル類、ジプロピレングリコールモノメチルエーテル、ジエチレンングリコールモノブチルエーテルのごときエーテル類、アセトン、メチルエチルケトンのごときケトン類、芳香族および／または脂肪族炭化水素類、植物もしくは合成油類、ＤＭＦ、ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチル−ピロリドン、２，２−ジメチル−４−オキシメチレン−１，３−ジオキソランである。
【００５１】
以下の添加剤は本発明の組成物の可溶化剤として有用であり得る：主要溶媒中の活性化合物の溶液を増強するかあるいはその沈殿を妨げる溶媒。その例はポリビニルピロリドン、ポリオキシエチル化ヒマシ油、ポリオキシエチル化ソルビタンエステルである。
【００５２】
有用な防腐剤は、例えば、ベンジルアルコール、トリクロブタノール、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル、ｎ−ブタノールである。
【００５３】
有用な増粘剤はベントナイト、コロイド状シリカ、モノステアリン酸アルミニウムのごとき無機増粘剤、セルロース誘導体、ポリビニルアルコールおよびそのコポリマー、アクリレートおよびメタクリレートのごとき有機増粘剤を含む。
【００５４】
本発明の医薬投与形態で有用であり得る他の液体は、例えば、均質溶媒、溶媒混合液、および典型的には界面活性剤である湿潤剤である。
【００５５】
有用な着色剤は非毒性であって、溶解もしくは懸濁させることができるすべての着色剤である。
【００５６】
有用な再吸収加速剤はＤＭＳＯ、ミリスチン酸イソプロピル、ジプロピレングリコールペルアルゴネート、シリコーン油、脂肪酸エステル類、トリグリセリド、脂肪族アルコールのごとき展着性油である。
【００５７】
有用な抗酸化剤はメタ二亜硫酸カリウム、アスコルビン酸、ブチルヒドロキシトルエン、ブチルヒドロキシアニソール、トコフェロールのごとき亜硫酸塩またはメタ二亜硫酸塩である。
【００５８】
有用な光安定化剤はノバントソリン酸である。
【００５９】
有用な粘着剤はセルロース誘導体、澱粉誘導体、ポリアクリレート、またはアルギン酸化合物、ゼラチンのごとき天然ポリマーを含む。
【００６０】
有用な乳化剤はポリオキシエチル化ヒマシ油、ポリオキシエチル化ソルビタンモノオレエート、ソルビタンモノステアレート、グリセロールモノステアレート、ポリオキシエチルステアレート、アルキルフェノールポリグリコールエーテルのごとき非イオン性界面活性剤；ジ−Ｎａ  Ｎ−ラウリル−ベータ−イミノジプロピオネートまたはレシチンのごとき両性界面活性剤；Ｎａ−ラウリルスルフェート、脂肪族アルコールエーテルスルフェート、モノ／ジアルキルポリグリコールエーテルオルトリン酸エステルのモノエタノールアミン塩のごときアニオン性界面活性剤；塩化セチルトリメチルアンモニウムのごときカチオン性界面活性剤を含む。
【００６１】
有用な増粘物質および治療エマルジョンを安定化させる物質はカルボキシルメチルセルロース、メチルセルロースおよび他のセルロースならびに澱粉誘導体、ポリアクリレート、アルギン酸化合物、ゼラチン、アラビアガム、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、メチルビニルエーテルおよび無水マレイン酸のコポリマー、ポリエチレングリコール、ワックス、コロイド状シリカまたは前記物質の混合物を含む。
【００６２】
固体の医薬投与形態を調製するには、適当ならば、アジュバントを添加して、活性化合物を適当な添加剤と混合し、所望ならば混合物を処方する。生理学的に許容される固体不活性添加剤の例は塩化ナトリウム、炭酸カルシウム、炭酸水素塩のごとき炭酸塩、酸化アルミニウム、シリカ、粘土、沈殿したもしくはコロイド状の二酸化ケイ素およびリン酸塩を含む。固体有機添加剤の例は糖、セルロース、乾燥ミルクのごとき食品、動物ミール、穀物ミールおよび粗い穀物ミールおよび澱粉を含む。他の適当な添加剤はステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、タルク、ベントナイトのごとき潤滑剤および滑動剤；澱粉または架橋ポリビニルピロリドンのごとき崩壊剤；澱粉、ゼラチンまたは線状ポリビニルピロリドンのごとき結合剤；マイクロクリスタリンセルロースのごとき乾燥結合剤を含む。
【００６３】
本明細書中で記載される医薬投与形態において、活性化合物は少なくとも一種の他の２０Ｓプロテアソーム阻害剤との混合物の形態で存在させることができる。別法として、あるいはそれに加えて、本発明の医薬投与形態は、少なくとも一種の２０Ｓプロテアソーム阻害剤に加えて、両者を一緒に投与しても許容されない不都合な効果を生じない、いずれかの公知の疾病または障害を治療できるいずれかの医薬化合物を含むことができる。
【００６４】
２０Ｓプロテアソーム媒介の疾病および障害を治療する方法は、好ましくは医薬投与形態中に分散させた、有効量の選択された化合物またはその組合せを投与することを含む。本発明のすぐに使用できる医薬投与形態は１０重量ｐｐｍないし２０重量％、好ましくは０．１ないし１０重量％の濃度の活性化合物を含む。投与に先立って希釈される本発明の医薬投与形態は、好ましくは、０．５ないし９０重量％、好ましくは５ないし５０重量％の濃度の活性化合物を含有する。一般に、効果的な結果を達成するためには、１日につき体重１ｋｇ当たりほぼ０．０１ｍｇないしほぼ１００ｍｇの量の活性化合物を投与するのが有利であることが判明した。
【００６５】
本発明の２０Ｓプロテアソーム阻害剤を含む医薬投与形態の投与の量および頻度は、他の因子の中でとりわけ、投与経路、患者の年齢および疾患に依存して、当業者によって容易に決定されるであろう。これらの投与単位は、急性または慢性病につき毎日１ないし１０回投与することができる。本発明の化合物を本発明に従って投与する場合、許容されない毒性学的効果は予測されない。
【００６６】
本発明の２０Ｓプロテアソーム阻害剤を含む医薬投与形態は、粉砕し、混合し、造粒し、必要に応じて、錠剤形態のために圧縮し；あるいは、粉砕し、混合し、硬質ゼラチンカプセル形態のために充填することを含む医薬の通常の技術に従って作製される。液体添加剤を使用する場合、当該調製はシロップ剤、エリキシル剤、エマルジョンまたは水性もしくは非水性懸濁剤の形態とされるであろう。かかる液体処方は直接的に経口投与することができるか、あるいはソフトゼラチンカプセルに充填することができる。
【００６７】
本明細書に記載された組成物は前記したごとくに投与することができるが、本発明の方法は経口的に本明細書に記載された化合物を投与することによって達成されるのが好ましい。経口投与を選択する場合、例えば非経口的に与えられる小量と同一の効果を生じさせるためには、大量の反応性剤が必要であろう。良好な臨床的実施によると、いずれの有害な副作用も引き起こすことなく、効果的な治療結果を生じさせるであろう濃度レベルでこの方法に従って化合物を投与するのが好ましい。
【００６８】
本発明の組成物は同様に非治療的用途を有する。本発明の組成物は２０Ｓ阻害剤検定のための分析的標準として有用である。
【００６９】
（実施例１）
本発明の治療方法で有用な化合物は、有機化学の慣用的方法によって調製される。これらの化合物の合成の技術を記載するにおいて調べることができる文献はＢｏｄａｎｓｌｙの「The Practice of Peptide Synthesis」、 Springer-Verlag、 第一版、1984； 「Protective Groups in Organic Synthesis」、 第二版、John Wiley and Sons, New York, 1991 を含む。全てのペプチドカップリングは温和かつ一定に撹拌しつつ室温で達成される。ペプチドカップリングおよび脱保護はアミンについてのKaiserテストを用いてモニターされる。XaaはMBHA樹脂に予め付着させて購入することができる商業的に入手可能なアミノ酸のうちのいずれをもいう。
【００７０】
本発明の化合物は以下の一般的な手法において固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）によって調製することができる：Ｘａａ−ＭＢＨＡ−樹脂を秤量し、フリットフィルターを装備したシリンジに移す。樹脂をＤＭＦ中で予め膨潤させ、次いで、Ｎ−末端保護基をＤＭＦ中の３０％ピペリジンでの３０分間の処理によって除去する。脱保護溶液を除去する。脱保護された樹脂はＤＭＦで５回、ＭｅＯＨで５回、次いでＤＭＦで５回洗浄する。次いで、Ｙａａ、カルボジイミドカップリング試薬およびＨＯＢＴ（ヒドロキシベンゾトリアゾール）を各々３当量含有するＹａａのＤＭＦ溶液を用いて、アミノ酸Ｙａａを脱保護された樹脂にカップリングさせる。Ｋａｉｓｅｒテストに合格するカップリング効率を達成するためには、Ｙａａの溶液での順次のカップリングが必要であり得る。Ｎ−末端基脱保護およびＹａａカップリング工程を反復して、第３のアミノ酸Ｚａａをカップリングさせる。最後のカップリング工程はケト酸、カルボジイミドおよびＨＯＢＴをＤＭＦ中で使用し、この工程をカップリングがＫａｉｓｅｒテストに合格するまで反復する。樹脂上の完成したペプチド配列を真空下で少なくとも６時間乾燥し、次いで、９５／５トリフルオロ酢酸／水あるいは９０％トリフルオロ酢酸、３％エタンジチオール、５％チオアニソールおよび２％アニソールの新たに調製された溶液いずれかでの２．５時間の処理によって切断した。切断された生成物を、水からの凍結乾燥またはジエチルエーテルからのトリチュレーション(摩砕)によって回収する。生成物の純度はＴＬＣから評価する。選択されたペプチド試料を１Ｈ  ＮＭＲによってチェックして生成物の一致を確認する。
【００７１】
（実施例２）
本実施例においては、（３’−インドールピルビン酸）−Ｎ−ビフェニルアラニン−Ｄ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−ＯＨは実施例１の方法に従って調製した。
【００７２】
Ｆｍｏｃ−Ｎ−Ａｓｐ（Ｏｔ−Ｂｕ）−ＭＢＨＡ−樹脂（２０ｍｇ）を秤量し、フリット付きのフィルターを装備したシリンジに移す。樹脂を１ｍｌのＤＭＦ中で３０分間予め膨潤させる。ＤＭＦ中の２０％ピペリジンでの３０分間の処理によってＦｍｏｃ（フルオレニルメチルオキシカルボニル）保護基を除去する。脱保護溶液を除去する。脱保護樹脂をＤＭＦで５回、ＭｅＯＨで５回、次いでＤＭＦで５回洗浄する。カルボジイミド（３当量）およびＨＯＢＴ（ヒドロキシベンゾトリアゾール）（３当量）を含有する１ｍｌのＤＭＦ中のＦｍｏｃ−Ｄ−Ｌｅｕ−ＯＨ（３当量）の溶液を用い、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｌｅｕ−ＯＨを脱保護された樹脂（１当量）にカップリングさせる。Ｋａｉｓｅｒテストに合格するカップリング効率を達成するためには、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｌｅｕ−ＯＨの溶液での第２または第３のカップリングが必要であり得る。Ｆｍｏｃ脱保護およびアミノ酸カップリング工程を反復して、Ｆｍｏｃ−Ｎ−（４，４−ビフェニル）アラニンをカップリングさせる。最後のカップリング工程はＤＭＦ中のインドールピルビン酸（５当量）、ジイソプロピルカルボジイミド（５当量）およびＨＯＢＴ（５当量）を使用し、この工程をカップリングがＫａｉｓｅｒテストに合格するまで反復する。樹脂上の完成したペプチド配列を真空下で少なくとも６時間乾燥し、次いで、９５／５トリフルオロ酢酸／水あるいは９０％トリフルオロ酢酸、５％チオアニソール、３％エタンジチオール、および２％アニソールの新たに調製された溶液１ｍｌでの２．５時間の処理によって切断する。切断された生成物を、水からの凍結乾燥またはジエチルエーテルからのトリチュレーションによって回収する。生成物の純度はＴＬＣから評価する。
【００７３】
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ｄ６−ＤＭＳＯ）：δ６．５−７．７（ｍ，１４Ｈ）、４．５（ｍ，１Ｈ）、４．１（ｍ，２Ｈ）、３．４（ｍ，２Ｈ）、３（ｍ，Ｈ）、２．７（ｍ，１Ｈ）、１．１−１．５（ｍ，３Ｈ）、０．５−０．９（ｍ，６Ｈ）。
【００７４】
（実施例３）
本実施例では、Ｃｈｉｒｏｎ  Ｍｉｍｏｔｏｐｅｓ  Ｐｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙを用い、（３’−インドールピルビン酸）−Ｎ−ビフェニルアラニン−Ｄ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−ＯＨを調製した。
【００７５】
カップリング溶液（１００ｍＭ  アミノ酸、１００ｍＭ  ＤＩＣ、１０ｍＭ  ＤＭＡＰ、１／４ＤＭＦ／ＣＨ２ＣＩ２）の８００μｌ中で各ピンを２時間カップリングさせることによって、最初のアミノ酸残基Ｘａａを４−（ヒドロキシメチル）フェノキシアセトアミドハンドル樹脂ピン（５．７μモル／ピン）に付着させる。次いで、ピンを５分間のＤＭＦ洗浄、２回の５分間のＭｅＯＨ洗浄、および１５分間の風乾ですすぐ。Ｆｍｏｃ基の脱保護は、ＤＭＦ中の２０％ピペリジン８００μｌで３０分間行う。ピン洗浄（１回ＤＭＦ洗浄、２回ＭＥＯＨ洗浄、１５分間の風乾）を反復する。青色がもはやピンの表面に付着しなくなるまで、第２のアミノ酸残基Ｙａａをカップリングさせた（ＤＭＦ中で１００ｍＭ  Ｙａａ、１００ｍＭ  ＤＩＣ、１００ｍＭ  ＨＯＢＴ、およびブロモフェノールブルーインジケーター）。必要に応じてカップリングを反復する。次いで、すすぎサイクルおよびＦｍｏｃ脱保護洗浄を同様に反復する。Ｙａａをカップリングするためのカップリングおよび洗浄手法を反復し、必要であればカップリングを反復することによって次のアミノ酸Ｚａａをカップリングした。最後の残基インドールピルビン酸をＤＭＦ中で、１５当量、１００ｍＭ、１５当量のＤＩＣ、１５当量のＨＯＢＴおよびブロモフェノールインジケーターでカップリングさせる。必要であればカップリングを反復する。最後の洗浄の後、オレンジ色のピンをその支持体から取り出し、個々の２ｍｌのプラスチック遠心管内で９０％トリフルオロ酢酸、５％チオアニソール、３％エタンジチオールおよび２％アニソールの新たに調製された溶液１．５ｍｌ中で２．５時間切断した。ピンを該管から取り出し、混合物に窒素気流を吹き付けてほとんど乾固した。Ｅｔ２Ｏでトリチュレートし、各管を回転降下させる。この工程を管当たり３回反復した。沈殿したペプチドを収集し、凍結乾燥し、秤量し、使用した。生成物の純度はＴＬＣによって評価した。最初の生成物を共にスポットし、実施例１で得られた標品に対してチェックした。
【００７６】
（実施例４）
実施例１の方法に従って調製した本発明の化合物を以下のごとくテストした。（マルチ触媒プロテイナーゼ複合体としても知られている）プロテアソームの２０Ｓ触媒サブユニットを公表された方法（Wilk S.およびOrlowski, M 1983, 40 842 J. Neurochem）に従ってウシ脳から均質に精製した。基質ペプチドのスクシニル−ロイシン−ロイシン−バリン−チオシン−７−アミノ４メチルクマリンの切断後の蛍光の増加によって、複合体のキモトリプシン活性を測定する。標準的なイン・ビトロアッセイは、ｐＨ７．５の０．１％ドデシル硫酸ナトリウムを含有する２００μｌ  ５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ中の２μｇ  ２０Ｓプロテアソーム、０．１−１００μｇ／ｍｌプロテアソーム阻害剤よりなる。５０μＭの蛍光発光性ペプチド基質の添加によって蛋白質分解反応を開始させ、３７℃で１５分間進行させる。１００μｌのｐＨ４．０の１００ｍＭ酢酸塩緩衝液の添加によって反応を停止させる。蛋白質分解の速度は、蛍光分光分析（ＥＸ３７０ｎｍ、ＥＭ４３０ｎｍ）によって測定された遊離アミノメチルクマリンの量に直接比例する。
【００７７】
２０Ｓプロテアソーム阻害剤アッセイの結果を表IIに示す。
【００７８】
表II
２０Ｓプロテアソームのキモトリプシン様活性の阻害のためのＩＣ５０値
【表２３】
0003863370.tif 000028
【表２４】
0003863370.tif 000029
【表２５】
0003863370.tif 000030
【表２６】
0003863370.tif 000031
実施例１の方法に従って調製した本発明の化合物を以下のごとくにテストした。（マルチ触媒プロテイナーゼ複合体としても知られている）プロテアソームの２０Ｓ触媒サブユニットを公表された方法（Wilk S.およびOrlowski, M 1983, 40 842 J. Neurocheｍ）に従ってウシ脳から均質に精製した。基質ペプチドのＣＢＺ−Ｄ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−（７−アミノ４−メチルクマリン）の切断後の蛍光の増加によって、複合体のトリプシン活性を測定する。標準的なイン・ビトロアッセイは、ｐＨ７．５の０．１％ドデシル硫酸ナトリウムを含有する２００ｍｌの５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ中の２μｇ  ２０Ｓプロテアソーム、０．１−１００μｇ／ｍｌプロテアソーム阻害剤よりなる。５０ｍＭ蛍光発光性ペプチド基質の添加によって蛋白質分解反応を開始させ、３７℃で１５分間進行させる。１００ｍｌのｐＨ４．０の１００ｍＭ酢酸塩緩衝液の添加によって反応を停止させる。蛋白質分解の速度は、蛍光分光分析（ＥＸ３７０ｎｍ、ＥＭ４３０ｎｍ）によって測定された遊離アミノメチルクマリンの量に直接比例する。化合物１−２０７をトリプシン活性阻害につきテストし、それらは＞１０μｇ／ｍｌにおいて阻害剤として活性であった。
【００７９】
（実施例５）
実施例１の方法に従って調製した本発明の化合物を以下のごとくテストした。（マルチ触媒プロテイナーゼ複合体としても知られている）プロテアソームの２０Ｓ触媒サブユニットを公表された方法（Wilk S.およびOrlowski, M 1983, 40 842 J. Neurocheｍ）に従ってウシ脳から均質に精製した。基質ペプチドのＣＢＺ  Ｄ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−（７−アミノ４−メチルクマリン）の切断後の蛍光性の増加によって、複合体のトリプシン活性を測定する。標準的なイン・ビトロアッセイは、ｐＨ７．５の０．１％ドデシル硫酸ナトリウムを含有する２００μｌ  ５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ中の２０μｇ  ２０Ｓプロテアソーム、０．１−１００μｇ／ｍｌプロテアソーム阻害剤よりなる。５０ｍＭ蛍光発光性ペプチド基質の添加によって蛋白質分解反応を開始させ、３７℃で１５分間進行させる。１００μｌのｐＨ４．０の１００ｍＭ酢酸塩緩衝液の添加によって反応を停止させる。蛋白質分解の速度は、蛍光分光分析（ＥＸ３７０ｎｍ、ＥＭ４３０ｎｍ）によって測定された遊離アミノメチルクマリンの量に直接比例する。化合物１−２０７をトリプシン活性阻害につきテストし、それらは＞１０μｇ／ｍｌにおいて阻害剤として活性であった。
【００８０】
（実施例６）
実施例１の方法に従って調製した本発明の化合物を以下のごとくテストした。（マルチ触媒プロテイナーゼ複合体としても知られている）プロテアソームの２０Ｓ触媒サブユニットを公表された方法（Wilk S.およびOrlowski, M 1983, 40 842 J. Neurochem）に従ってウシ脳から均質に精製した。基質ペプチドのＣＢＺ  Ｄ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−（７−アミノ４−メチルクマリン）の切断後の蛍光性の増加によって、複合体のトリプシン活性を測定する。標準的なイン・ビトロアッセイは、ｐＨ７．５の０．１％ドデシル硫酸ナトリウムを含有する２００ｍｌ  ５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ中の２μｇ  ２０Ｓプロテアソーム、０．１−１００μｇ／ｍｌプロテアソーム阻害剤よりなる。５０ｍＭ蛍光発光性ペプチド基質の添加によって蛋白質分解反応を開始させ、３７℃で１５分間進行させる。ｍｌのｐＨ４．０の１００ｍＭ酢酸塩緩衝液の添加によって反応を停止させる。蛋白質分解の速度は、蛍光分光分析（ＥＸ３７０ｎｍ、ＥＭ４３０ｎｍ）によって測定された遊離アミノメチルクマリンの量に直接比例する。化合物１−２０７を＞１０μｇ／ｍｌにおいてペプチジルグルタミル活性阻害につきテストした。化合物１９０は５μｇ／ｍｌにおいて活性であった。