(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
活性化合物を、走査型近接場光学鏡検器械（ＳＮＯＭ器械）により観察することができ、かつ光のコントラスト機構によって特徴付けられる信号［Ｓ］の変化から検出する、活性化合物をスクリーニングする方法。
【請求項２】
走査型光学近接場を光ファイバ（１）によって提供する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
活性化合物スクリーニングが、複数の試料用コンパートメントを有する多重試料ホルダーを提供するステップ、およびこれらコンパートメントのすべてまたは若干において、好ましくは平行化ＳＮＯＭ器械により次のステップ：
ａ）分子Ａを基板（２）に直接または間接に、共有結合または非共有結合により結合するステップ、
ｂ）走査型近接場光学鏡検器械により信号［Ｓ］から検出することのできる分子Ｂを、分子Ａに非共有結合により結合させるステップ、
ｃ）活性化合物Ｗ２を含有する溶液を加え、活性化合物Ｗ２の存在を分子Ｂの結合の変化およびこうして信号［Ｓ］の変化から検出するステップ
を実施するステップを包含する、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
活性化合物スクリーニングが、複数の試料用コンパートメントを有する多重試料ホルダーを提供するステップ、およびこれらコンパートメントのすべてまたは若干において、平行にまたは順次に、次のステップ：
ａ）分子Ａを基板（２）に結合させるステップ、
ｂ）活性化合物ＷXを含有する溶液を加えるステップ、
ｃ）活性化合物ＷXをＡに結合させて、分子複合体Ａ−Ｘを形成するステップ、
ｄ）走査型近接場光学鏡検器械により信号［Ｓ］から検出することのできる分子プローブＦＩＴＣを含有する溶液を加えるステップ、
ｅ）分子プローブＦＩＴＣを複合体Ａ−Ｘに結合させるステップ、および
ｆ）Ａ−ＸへのＦＩＴＣの結合を［Ｓ］の測定により検出するステップ、
を実施するステップを包含する、請求項１または２記載の方法。
【請求項５】
信号［Ｓ］が蛍光信号である、請求項１から４までのいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
基板（２）への分子Ａの結合が吸着により生じる、請求項１から５までのいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
基板（２）がＳｉウエーハ、蒸着Ａｕコーティングを有する微量滴定プレート、雲母、黒鉛または細胞構造またはその組合せである、請求項１から６までのいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
細胞構造が膜固定レセプターである、請求項７記載の方法。
【請求項９】
分子Ａを基板（２）に、スペーサー、とくにスペルミジンまたはアミノヘキサン酸を介して間接的に結合する、請求項１から８までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
スペーサーをそれ自体、基板（２）に吸着した化合物を介して結合する、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
ＳＮＯＭ器械を包含する平行化測定装置を、活性化合物スクリーニング用の複数の試料コンパートメントの同時検出のために使用する、請求項１から１０までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
信号［Ｓ］が、物質Ｘの結合を検出するために、光のコントラスト、とくに吸収、蛍光、偏光またはその波長依存性の差を使用する、請求項１から１１までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
スペーサー結合ステップを複数回繰返す、請求項１０から１２までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１４】
活性化合物を、走査型近接場光学鏡検器械により観察することのできる信号［Ｓ］の変化から検出する、活性化合物をスクリーニングするための走査型近接場光学鏡検器械（ＳＮＯＭ器械）の使用。
【請求項１５】
請求項１から１３までのいずれか１項記載の方法の１種を実施する、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
近接場鏡検器械、試料用コンパートメントを有する単一または多重試料ホルダー、および単一または多重試料ホルダーの個々のコンパートメントを、近接場鏡検器械でアドレスするための制御装置を包含する、請求項１から１４までのいずれか１項記載の方法に使用する装置。
【請求項１７】
近接場鏡検器械、試料用コンパートメントを有する単一または多重試料ホルダー、および近接場鏡検器械を単一または多重試料ホルダーによりアドレスするための制御装置を包含する、請求項１から１４までのいずれか１項記載の方法に使用する装置。
【請求項１８】
単一または多重試料ホルダーがマルチウエルの微量滴定プレートである、請求項１６または１７記載の装置。
【請求項１９】
試料用コンパートメントを有する単一または多重試料ホルダーが、平面プレートおよびその上に配置された複数のナノコンパートメントを包含し、コンパートメントの寸法（直径）が１０〜１００ｎｍである多重ナノ滴定器械である、請求項１６から１８までのいずれか１項記載の装置。
【請求項２０】
ナノコンパートメントがウエルの形である、請求項１９記載の装置。
【請求項２１】
ナノコンパートメントが、平面プレートの残存範囲から区切らており、その寸法（直径）を残存範囲のものとは異なる化学構造または組成により決定する、請求項１９記載の装置。
【請求項２２】
平面プレートが疎水性シリコンであり、ナノコンパートメントが表面構造の変化により決定されている、請求項１９から２１までのいずれか１項記載の装置。
【発明の詳細な説明】
本発明は、活性化合物をスクリーニングする方法、とくに活性化合物領域におけるマススクリーニングする方法に関する。さらに本発明は、近接場鏡検器械の使用および近接場鏡検器械および制御装置を包含する装置に関する。さらに本発明は、ナノ滴定器械に関する。
酵素、またはレセプター、ＤＮＡヌクレアーゼまたはポリメラーゼ、プロテアーゼ、たとえばトロンビン、膜レセプター、核レセプターまたは結合タンパク質に対するその作用に関し改善されている新基本構造、つまりリガンド、アゴニストまたは活性化合物のような分子構造の発見は、現在でもなお労力および時間を消費する探索プロセスである。
その成功は大いにチャンスに依存する、それというのも非常に多数の物質を標的分子−たとえばレセプター−に対する活性物質が見つかるまで残らず探査しなければならないからである。多数−たとえば１０００００〜１００００００−の物質の生物活性の調査は、たとえば細胞または酵素での活性試験が長いインキュベーション時間を必要とすることを回顧すれば、長い時間がかかる。従って、このような多数の物質は、試験が同様に高い感度および非常に速い場合にのみ、急速に試験し、調査することができるにすぎない。
多数の場合に、このような試験において蛍光法が使用される。これらは非常に敏感であるが、故障しやすい。さらに、かかる試験法は非常に時間を消費する、それというのも実際のインキュベーションから測定プロセスまでに多数の処理ステップが必要であることを考慮しなければならないからである。ここで、これらは、とくにバックグラウンド蛍光を減少し、こうして信号対雑音比を改善するための洗浄ステップを包含する。一般に、検出法の感度の改善は試験速度を遅くすることを述べることができる。単一試験法によるかまたは相応する装置による２つの問題の同時解決は、これまで不可能と思われていた。
最近、ビンニヒ（Binnig）およびローレル（Rohrer）［G.Binnig,H.Rohrer,C.Gerber,E.Weibel,Phys.Rev.Lett.49（1982）,57］による走査型トンネル鏡検法（ＳＴＭ）の発見は、超高感度走査型プローブ（ultra-high-sensitivity scanning probe methods）法の急速な発展をもたらした。
走査型トンネル鏡検法においては、金属チップ（tip）を伝導性または半導体試料上にラインごとに移動（走査）させる。チップと試料の間の非常に小さい距離で発生するトンネル電流は、調査下の表面の高さプロファイルおよび／または電子構造プロファイルを、調節変数として記録するのを許容する。これは、標準実験室条件下に、約０．１ｎｍの原子分解能での構造の調査を許容する。１９８６年に、これは不伝導性試料に走査型原子間力鏡検法（SAFM）［G.Binnig,C.F.Quate,C.Gerber,Phys.Rev.Lett.56（1986）930］により適用された。これは、高分子材料［G.Krasch,M.Hipp,M.Boeltau,O.Marti,J.Mlynek,Macromolecules28（1995）260］および生物学的構造の調査を、生理的条件下でも許容する［C.Bustamante,D.Keller,Physics Today,December1995,32］。ＳＡＦＭにおいては、走査は可撓性片持レバー上のシリコンまたは窒化ケイ素チップ（通常ピラミッド状の）を使用して実施される。片持レバーの撓みは、一般に光学的に測定され、高さプロファイルを再構成するために使用される。
記載したチップの代わりに、たとえばレーザー光が送入される先鋭化した光ファイバを探針として試料上に移動させ、試料の性質に依存して反射または透過した光を光検出器を使用して検出する場合、走査型近接場光学的鏡検（ＳＮＯＭまたはＮＳＯＭ）が達成される（H.Heinzelmann,D.W.Pohl,Appl.Phys.A59（1994）89;E.Betzig,J.Trautman,Science257（1992）189）。通常の光学において起きる回折限界を避けることにより、これらの方法は、吸収、反射、偏光、蛍光等のようなすべての普通の光のコントラスト機構を用いて、ナノメーター領域への非常に高い局所的分解能を許容する。蛍光鏡検法においては、個々の蛍光分子の検出を許容する感度が達成される［E.Betzig,R.J.Chichester,Science262（1993）1422］。この方法は、図１に図示されている。
上記例により記載されたＳＮＯＭ機構（set-up）の外に、さらなる機構は先行技術に記載されている。たとえば、四面体チップ（Koglin J.et al., Photons and Local PProbes.Proc.of the NATO Advanced Research Workshop.Ed.Mart O.et al.Kluwer Academic Publ.1995）またはたとえば光導電チップ（Akamine S.et al.,Proceedings.IEEE Micro Electro Mechanical Systems 1995,page 155）を使用することができる。
これらの技術は、生物学的領域における散発性調査のために使用されたにすぎない［たとえばS.Smith et al.,Proc.SPIE-Int.Soc.Opt.Eng.1855,81（1994）（Scanning Probe Microscopies II）またはD.M.N.Jondle et al.,Chromosome Reserch 3,239（1995）］。後者の参考文献は、ＳＡＦＭによるショウジョウバエの唾液腺からの多糸性染色体の超微細構造の調査を記載している。
本発明の目的は、多数の試料を非常に短時間に調査することのできる、活性化合物をスクリーニングする方法を提供することである。この方法は、時間節約だけでなく、これまでの慣例法と比較してできるだけ僅かな作業を要求すべきである。
この目的は、活性化合物を、走査型近接場光学鏡検器械（SNOM instrument）により観察することのできる信号［Ｓ］の変化から検出する方法により達成されることが判明した。また本発明は、スクリーニング法におけるＳＮＯＭ器械の使用および近接場鏡検器械、単一または多重（single or multiple）試料ホルダーおよびＳＭＯＮ器械によ単一または多重試料ホルダーの個々のコンパートメントを選択するための制御装置を包含する装置にも関する。
本発明の好ましい実施態様は、従属請求項の対象である。
図面において：
図１は、光ファイバを使用するＳＮＯＭ器械の原則的構造を示し；
図２ａ）およびｂ）は、ＳＮＯＭを使用する本発明によるスクリーニング方法において、レセプターＲ1および蛍光標識した活性化合物Ｗ1の複合体に活性化合物Ｗ2および他の活性化合物ＷXを含有する溶液の添加前［ａ）］または添加後［ｂ）］に起きるプロセスのステップを示し；
図３ａ）およびｂ）は、図２ａ）および２ｂ）におけると同じであるが、レセプターＲ1および活性化合物Ｗ1の位置が交替されているプロセスのステップを示し；
図４は、サンドイッチ技術の形の、本発明による方法の１実施態様において経過するプロセスのステップを示し；
図５は、未知の活性化合物ＷXがレセプターの立体配座の変化から間接的に検出される本発明による方法の他の実施態様を示す。
図１に概略的に示したようなＳＮＯＭ器械は、原則として、その中へたとえば光源（３）からのＡｒレーザが送入され、制御ユニット（４）によりプローブ（２）上へ誘導される先鋭化した光ファイバ（１）およびさらにプローブ（２）により反射または透過された光のための検出電子回路（６）を有する光検出器（５）を示す。
記述したように本発明は、ＳＮＯＭ技術が使用される、とくにマススクリーニングの領域における活性化合物をスクリーニングする方法にも関する。この技術を使用して、プローブと試料の間の距離が数ｎｍの範囲内にある場合に、個々の分子の蛍光を検出することが可能である。しかし、新規方法におけるＳＮＯＭ技術の使用は、原則的に蛍光法の領域に制限されず；むしろ発見すべき新活性化合物が光信号の変化を惹起する任意の検出方法を使用することができる。従って、光信号は、蛍光の他に、吸収、偏光またはこれらの性質に依存する波長の変化であってもよい。
新規方法において使用されるＳＮＯＭ技術は、同様に−図１、２および３に示したように−光ファイバにより提供される光学的近接場に制限されない。すべての走査型光学器械は、これらが光ファイバを用いて可能であると類似の分解能を達成することのできる近接場を提供する限り使用することができる。これらは、たとえば上述した四面体または光導電性のチップを包含する。
活性化合物のスクリーニングのためには、ＳＮＯＭをたとえば次の方法で有利に使用することができる：
最初に、レセプターＲ１（図２）または対照活性Ｗ１化合物（図３）が、基板２の適当な表面に固定される。用語レセプターはここでは非常に広義に使用されていて、たとえば広義のフィブリノーゲン、エンドセリン、ＤＮＡまたはＲＮＡ、タンパク質および脂質、全細胞または組織片をも包含する。固定すべきこの物質は、下記に分子Ａと呼称する。基板は、蒸着金コーティングを有するシリコンウエーハ、変性、たとえばシラン化されたシリコン表面または他の平面基板、たとえば雲母、黒鉛等であってもよい。生物学的基板を使用することも可能であるが、その際上述した無機基板上に予めそれを固定することが必要である。固定レセプター（Ｒ1）（図２）または対照活性化合物（Ｗ1）（図３）は、蛍光標識活性化合物（Ｗ1−Ｆ）または蛍光標識レセプター（Ｒ1−Ｆ）により占有、いわば遮断される。より強い結合を形成する高い親和力の活性化合物Ｗ2を加える［図２ｂ）］または［図３ｂ）］と、対照活性化合物（Ｗ1）がレセプター結合部位から追出され、活性化合物（Ｗ2）が結合する。こうして、蛍光標識活性化合物Ｗ1は表面から追出される（図２ｂ）。同じプロセスは反対の場合、対照活性化合物Ｗ1が基板に固定されている場合に起き、２つの活性化合物Ｗ1およびＷ2は固定されていない蛍光標識レセプターに結合するために競合する（図３）。双方の場合、外観上直接レセプターの上方にある光ファイバにより記録された蛍光は減少するかまたは丁度ゼロに低下する。しかし、蛍光はたんに変調され、たとえばその波長依存性が変更されていてもよい。この場合、変化するのは蛍光の強さでなく、色である。
ＳＮＯＭ技術を使用する新規方法の特別の利点は、拡散に基づき溶液中で自由に運動する蛍光分子は実際に重要でないことである、それというのもこれらの分子はＳＮＯＭプローブにより検出されないからである。ＳＮＯＭ使用の適切な情報から生じる体積は、信号の高い距離依存性のため極めて小さい。これは、数ｎｍ3から数１００００ｎｍ3に達する。これにより、自由に拡散する蛍光分子はこの方法においては重要でないので、非常に良好な信号対騒音比が生じる。これはまた、現在まで公知の高感度測定法を越える決定的な利点を有し、たとえば繰返し洗浄することによる、試料の時間浪費の後処理は不必要である。
これを考慮して、本発明による方法においては、近接場が光ファイバにより提供されることは重要でないことは明らかである。適当な近接場を提供する方法は、上述した利点を生じる。
本発明による方法の他の実施形（サンドイッチ技術）は、図４に示されている。これは、上記に説明した図１〜３に示した方法とは、新活性化合物ＷXが直接に検出されることにより相違する。最初に、未知の活性化合物ＷXがレセプターにＲ1に結合する。この新活性化合物ＷXはドメイン（*）を有し、これにより公知活性化合物Ｗ1と相違する。このドメインを検出するために、公知の分子プローブ、たとえばフルオレセインイソチオシアネート（FITC）で標識した抗体が利用できる。この蛍光標識した抗体を、活性化合物ＷXおよびＲ1からなる複合体に結合させる。この方法で、複合体は検出される蛍光によって直接に検出することができる。
本発明による方法の他の実施形は、図５に示されている。この実施形は、蛍光標識した抗体が直接に未知の活性化合物ＷXに結合しないことにより図４に示した実施形と相違する。むしろ、未知の活性化合物ＷXは、レセプターＲ1に結合するレセプターＲ1中に立体配座の変化を惹起する（アロステリック効果）。この立体配座の変化により、レセプターに新しい構造ドメインが露呈される。これらドメインに、生物学的分子プローブ、たとえば蛍光標識した抗体（FITC）を結合させる。この方法で、新活性化合物ＷXはそれにより惹起される蛍光により間接的に検出することができる。
上記の場合において、活性化合物は適当な溶剤、たとえば水性またはエタノール性塩溶液または適当な溶剤から添加することができる。測定自体は、溶剤中または乾燥した試料に対し実施することができる。活性化合物の分析は、個々に実施する必要はなく、その代わりに他の化合物との混合物を包含する活性化合物の混合物を同様に分析することができる（図２参照）。ＥＬＩＳＡプレート［９６ウエルの微量滴定プレート］および相応する試料および溶液取扱システム、たとえばナノ構造化システム用の自動ピペットを使用する固定化も可能である。もちろん、細胞構造に固定されたレセプターを分析するのも可能である。
分子−レセプター、リガンドまたは他の分子、たとえば神経レセプターまたは免疫系細胞上のレセプターまたは基板上の他の細胞結合タンパク質であろうとも−の固定化は、共有結合または非共有結合により生じうる。非共有結合固定化は、たとえば直接吸着によって生じる。しかし、固定化は、基板が適当な活性化表面を有する場合、共有結合によっても生じうる。たとえば、液相吸着（自己組織化［S.Akari et al.,Adv.Mater.7（1995）549］）の基板表面は、チオールカルボン酸の適用により活性化することができる。該チオールは、基板、たとえば金表面に吸着により、酸基を外側に向けて結合する。
分子Ａの結合は、直接に基板表面に対してまたはチオールカルボン酸に対して行う必要もない。結合は間接的であってもよい。たとえば、上述したチオールカルボン酸と分子Ａ、たとえばタンパク質、レセプター、リガンド等の間にスペーサーが配置されていてもよい。このタイプのスペーサーは、アミノヘキサン酸またはスペルミジンである。これらの分子は、そのアミノ基を介して上述したチオールカルボン酸に結合することができる。
次に、分子、つまりレセプター活性化合物、リガンド等が基板表面に結合する。上述した場合、この結合はスペーサーを介して共有結合により行われる。
基板表面と分析すべき分子Ａの間にスペーサーの挿入が特定の理由で、たとえば不利な立体配座のためなお不適当である場合、スペーサーの挿入ステップは多数回繰返すことができる。たとえば、上述したスペーサーアミノヘキサン酸の２個以上の分子は、互いに結合することができる。結合したスペーサーの数に対する唯１つの制限は、基板の表面とスペーサーを介してそれに結合すべき分子Ａの間の距離が大きすぎる場合、言葉の真の意味での固定化は起きない、それというのも非常に長いスペーサーは当然に相応して可撓性であり、こうしてＳＮＯＭの使用を不可能にするからである。
測定原理に基づき、方法の平行化が可能であることは非常にとくに有利である。単一の光ファイバの代わりに、複数のファイバを同時に使用することが可能である。その場合、蛍光の検出はファイバカップラおよび／または検出器アレーを経て行なうことができる。こうして、たとえばＥＬＩＳＡプレートのウエルの数または一般に９６個の検出個所を有する全プレートさえも直接に読出すことが可能である。
しかしこれは、近接場鏡検器械、単一または多重試料ホルダーおよびＳＮＯＭによる単一または多重試料ホルダーの個々のコンパートメントをアドレスするための制御装置を包含する新規装置を使用して有利に実施される。もちろん、制御プロセスを逆にする、つまり近接場鏡検器械を、可動の複数の試料ホルダーにより、常用の顕微鏡において載物台を動かすと類似にアドレスすることも可能である。
この装置における多重試料ホルダーは、たとえばＥＬＩＳＡ試験において使用する場合、有利にマルチウエル微量滴定プレートである。このタイプの多重試料ホルダーは好ましくは、新規活性化合物スクリーニング法の速度を増加するために、小型化された寸法を有する。この場合、個々のコンパートメントの寸法（直径）の下限は、たんに光ファイバの寸法によって決定される。こうして、下限は約１０ｎｍである。
原則として、上限は存在しない。しかし、スクリーニング法の速度の最適化に関して、小型化された器械におけるコンパートメントの寸法が数１００μｍ、とくに５００μｍを上回るのはあまり有効ではない。好ましい上限は１５０μｍである。個々のコンパートメントの好ましい寸法（直径）は、１０〜１００ｎｍである。
こうして小型化されたホルダーにおいては、速度を最適化するために、試料を含有する個々のコンパートメントが、通常の微量滴定プレートから公知であるようなウエル（穴）の形を有することもはや必要でない。適当な構造は、たとえばシリコンまたは他の材料、たとえばプラスチックまたはガラス中または上に、リソグラフィーおよび／またはエッチングまたはスタンピングプロセスにより製造された凹み、小鉢状部または金属の凸起である。蒸着構造または自己組織化（self-assembly）法により製造された構造を使用することも考えられる。ＬＩＧＡ法により製造された超小型構造も使用することができる。
コンパートメントのより急速な走査のためには、それがカップ、トラフまたは平らな凹みの形を有することで十分である。本発明による方法または本発明による装置において使用される多重試料ホルダーに対するこの点での最も有利な構成は、たんに、調査すべき試料が小滴の形で載置されている非常に平らな平面円板からなる。使用される基板が、試料が小滴の形でその上に載置されているＳｉウエーハである場合、当該個所の表面構造が環境と相違することが好ましい。たとえば、ウエーハが蒸着された金コーティングを有する範囲を有する場合には、個々のコンパートメントは金で裏張りされているのが好ましく、疎水性シリコンが個々のコンパートメントを互いに分離する。
近接場鏡検器械、試料のためのコンパートメントを有する単一または多重試料ホルダーおよび制御装置を包含する全装置は、制御装置がＳＮＯＭ器械でなく、多重試料ホルダーを、上記に記述したように、通常の顕微鏡を使用する光学鏡検の範囲内で顕微鏡載物台を動かすと類似の方法で制御するように変性されていてもよい。
制御機構自体は、他のコンピュータ制御器械、たとえばステップモーター制御システムから当業者に公知のものと類似であってもよい。
一般に、このタイプの多重試料ホルダーの個々のコンパートメントは、任意所望の方法で、とくに長方形または円形構造に配置することができる。
実施例
下記に、本発明による方法の１例を記載する：
蛍光は、市販のＳＮＯＭ器械（たとえばAurora,TopoMetrix Inc.）を使用して検出した。使用した基板は、蒸着した金コーティングを有するＥＬＩＳＡプレートまたはＳｉウエーハであった。これにチオールカルボン酸を液相吸着（self-assembly）により設けた。該チオールは金表面に結合し、酸基は外側に向かう。相応するレセプター、たとえばアビジンまたはトロンビンは、その上にペプチド結合により固定された。
これは、カルボキシル変性表面またはチップを上述したようなスペーサー（たとえばアミノヘキサン酸またはスペルミジン）または他のリガンドにより誘導することにより実施した。このために、基板または金チップのカルボキシル基を、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（Ｃ4Ｈ5ＮＯ3）およびＮ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド（塩酸塩）Ｃ8Ｈ18ＣｌＮ3 １００ｍＭおよびアミノヘキサン酸またはスペルミジン（それぞれの場合１００ｍＭ）と共に５分間インキュベートした。
その後、アミノヘキサン酸誘導表面を、上記に記載したように、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドおよびＮ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミドにより再活性化し、次いで再び、たとえば１００μｇ／ｍｌの濃度のアミノ含有リガンド（たとえばトロンビンまたは他のタンパク質）と反応させた。しかし、表面に低分子量リガンド、たとえば次のトロンビン阻害剤を結合することも可能である。
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選択したスペーサーがスペルミジンである場合、その遊離アミノ基をリガンドの活性化カルボキシル基と反応させることができる。この活性化カルボキシル基は、同様に上述した方法により製造することができる。しかし、たとえばカルボキシル基を活性化するためにペプチド合成から公知のような他の方法を使用することもできる：
ａ）クロルギ酸、ＥＥＤＱ、ＩＩＤＱを使用する混合無水物を得るためのカルボン酸の活性化
ｂ）カルボジイミドを使用する対称無水物を得るためのカルボン酸の活性化
ｃ）活性エステルとして、たとえばカルボジイミド、ベンゾトリアゾールのウロニウム塩または一般にウロニウム塩および場合によりペンタフルオロフェノール、ヒドロキシスクシンイミド、ヒドロキシベンゾトリアゾールまたはその誘導体を使用する活性化
ｄ）ハロゲン化物またはシュードハロゲン化物として、たとえばフッ化物としてＴＦＦを使用、臭化物としてＢｒＯＰを使用またはアジ化物として。
それから、蛍光標識アビジンまたはトロンビンを添加し、対照活性化合物に結合し、その結果基板の表面上に直接に蛍光複合体が形成した。この個々の分子蛍光はＳＮＯＭによって検出できた。より有効な活性化合物を含有する混合物を加えた場合、標識アビジンまたはトロンビンはその結合から遊離し、表面から離れて拡散し、蛍光が減少する。しかし、添加した混合物中に存在するより有効な活性化合物は、無条件に、基板表面に固定された活性化合物と同じ個所に結合する必要はない。フルオレセイン標識分子の結合の減少は、基板上の他の個所に結合することによっても起こりうる。立体配座の変性（アロステリック効果）は、基板表面上に固定されたリガンドに対する蛍光標識分子の親和力を減少するので、小割合の蛍光分子だけが表面に結合して留まり、こうして蛍光は同様に減少する。
基板として使用することのできる細胞構造の例として、とくに古典的信号変換レセプター（たとえばＧタンパク質に結合したレセプター、リガンドおよび電圧依存性イオンチャンネル）のほかに、膜固定レセプター、免疫系の細胞または血小板上のレセプター（たとえばＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａレセプター）および重要な細胞ターゲットの細胞上の純結合タンパク質も挙げることができる。
図１
１：光ファイバ
２：試験体／基板
３：光源（たとえばＡｒレーザ）
４：光ファイバ用制御ユニット装置
５：光検出器
６：検出電子回路
図２
１：光ファイバ
２：基板（たとえば蒸着Ａｕコーティングを有するＳｉウエーハ、細胞構造
Ｒ１：レセプター
Ｗ１：活性化合物
Ｆ：蛍光標識
図３
１：光ファイバ
２：基板（たとえば蒸着Ａｕコーティングを有するＳｉウエーハ、細胞構造）
Ｒ１：レセプター
Ｗ１：活性化合物
Ｆ：蛍光標識
図４
サンドイッチ技術
図５
アロステリック効果
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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