(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
γ−グルタミルシステインを固形分に占める割合で１重量％以上含有する食品素材を、糖の非存在下かつ水の存在下、ｐＨ１〜７において５０〜１２０℃に保持することを特徴とするシステイン高含有食品素材の製造法。
【請求項２】
γ−グルタミルシステインを固形分に占める割合で１重量％以上含有する食品素材に、γ−グルタミルペプチド加水分解酵素を水の存在下、ｐＨ３〜９かつ１５〜７０℃において作用させることを特徴とするシステイン高含有食品素材の製造法。
【請求項３】
γ−グルタミルペプチド加水分解酵素がγ−グルタミルトランスフェラーゼ、γ−グルタミルシクロトランスフェラーゼまたはグルタミナーゼであることを特徴とする請求項２記載のシステイン高含有食品素材の製造法。
【請求項４】
原料の食品素材が酵母エキスまたは酵母菌体であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のシステイン高含有食品素材の製造法。
【請求項５】
γ−グルタミルシステイン又はγ−グルタミルシステインを固形分に占める割合で１重量％以上含有する食品素材を、還元糖の非存在下かつ水の存在下、ｐＨ１〜７において５０〜１２０℃に３〜３００分間保持した後に還元糖を前記γ−グルタミルシステインに対する割合で１〜１０倍モル加えることを特徴とする食品の風味増強用素材の製造法。
【請求項６】
γ−グルタミルシステイン又はγ−グルタミルシステインを固形分に占める割合で１重量％以上含有する食品素材に、γ−グルタミルペプチド加水分解酵素を水の存在下、ｐＨ３〜９かつ１５〜７０℃において１〜３００分間作用させた後に還元糖を前記γ−グルタミルシステインに対する割合で１〜１０倍モル加えることを特徴とする食品の風味増強用素材の製造法。
【請求項７】
γ−グルタミルペプチド加水分解酵素がγ−グルタミルトランスフェラーゼ、γ−グルタミルシクロトランスフェラーゼまたはグルタミナーゼであることを特徴とする請求項６記載の食品の風味増強用素材の製造法。
【請求項８】
原料の食品素材が酵母エキスまたは酵母菌体であることを特徴とする請求項５〜７のいずれかに記載の食品の風味増強用素材の製造法。
【請求項９】
請求項５〜８のいずれかに記載の食品の風味増強用素材を５０〜１８０℃に１０〜３００分間保持することを特徴とする食品の風味増強剤の製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、固形分中γ−グルタミルシステイン（本明細書においては、別異の指示のない時は、γ−グルタミルシステインは、その酸化型ジスルフィドを含む）を１％（重量％）以上の高含有量で含有する酵母エキスおよび酵母菌体などの食品素材を原料として、これをｐＨ酸性乃至中性領域で加熱すること、またはこれにγ−グルタミルペプチド加水分解酵素を作用させることにより、容易にシステイン（本明細書においては、別異の指示のない時は、システインは、その酸化型ジスルフィドであるシスチンを含む）を高含有量で含む食品素材を得る方法に関する。
本発明は、また、γ−グルタミルシステイン又は固形分中γ−グルタミルシステインを１％（重量％）以上の高含有量で含有する酵母エキスおよび酵母菌体などの食品素材を原料として、これをｐＨ酸性乃至中性領域で加熱し、またはこれにγ−グルタミルペプチド加水分解酵素を作用させた後に還元糖を加えることにより容易に食品の風味増強用素材を得る方法、及びこのような方法によって得られた食品の風味増強用素材を加熱することにより容易に食品の風味増強剤を得る方法に関する。
本発明は、さらにまた、γ−グルタミルシステインを高含有量で含有する食品用途酵母菌体そのもの、延いては酵母エキスそのもの、又はこれらを製造する方法に関する。
【０００２】
（背景技術）
システインは食品の風味改善などを目的に用いられている。システインの製法については蛋白分解法や半合成法などが知られているが、現在主に用いられている方法は蛋白分解法と半合成法である。
システインを上記の目的で用いる場合、これを高含有量で含有する食品素材の強い要望があるが、システインを高含有量で含有する食品素材は従来ほとんど知られていない。
例えば、γ−グルタミルシステインを酵母菌体内に蓄積させた例として、遺伝子工学的にγ−グルタミルシステイン合成酵素を過剰発現させ、菌体乾燥重量当たり最高２％のγ−グルタミルシステインを蓄積させた報告がある（大竹ら、バイオサイエンスとインダストリー、５０巻、１０号、９８９〜９９４頁、１９９２年）。しかし、この結果はあくまで遺伝子工学を用いた実験室酵母というモデルを用いて、自然界では通常あり得ない形で作製されたγ−グルタミルシステインの高蓄積酵母についてのものである。また、この報告においては、この酵母を用いて食品用途の素材とするなどという発想の記載はない。
また、γ−グルタミルシステインまたはγ−グルタミルシステインを含有する酵母エキスなどを食品に添加するとコク味が増強されることが知られている。また、γ−グルタミルシステインまたはγ−グルタミルシステインを含有する酵母エキスなどを糖の共存下で加熱して得られる食品素材が食品の風味増強に有効であることは、例えば、特開平４−６６０６９号公報、同４−９１７６２号公報などにより既に知られている。
詳述すると、前者（特開平４−６６０６９号公報）によれば、「より好ましいミートフレーバー調味料を得るべく、鋭意研究を重ねた結果、グルタチオン、システイン、またはグルタミルシステインなどの含硫化合物を２〜２０重量％（固形物濃度）含有する酵母エキスに糖類および必要に応じてアミノ酸類を添加し、脂肪非存在下で加熱することにより、上述の酵母由来の不快臭・不快味がない、良質で安定性に優れたローストミートフレーバー様調味料が得られるとの知見を得るに至」り（同公報「問題を解決するための手段」冒頭）、このような知見に基づいて「グルタチオン、システイン、またはグルタミルシステインなどの含硫化合物を一定量（エキス当たり２〜２０重量％）含有する酵母エキスに糖類並びに必要に応じてアミノ酸を添加し、脂肪非存在下で温度７０〜１８０℃、１０〜１８０分間加熱することを特徴とする調味料の製造法」を完成したという（同公報「特許請求の範囲」）。
また、後者（特開平４−９１７６２号公報）によれば、「既存のミートフレーバーには多種多様のものがあるが、いずれも、天然の肉のロースト香とは異なる質を有するものであり、天然のローストミートフレーバーにより近い質をもった、フレーバー付与剤が望まれていた。」ところ（同公報「発明の解決しようとする問題点」）、「これらの欠点を解決することを目的として、各種アミノ酸と糖類の加熱褐変フレーバーに関する研究を行った結果、γ−グルタミルシステインに糖類を添加した後に水に溶解し、温度７０〜１８０℃、１０〜１８０分間加熱反応を行うことによって、従来なしえなかった良好なローストミート香を有するフレーバー組成物を製造し得ることを発見し、本発明を完成した。」とし（同公報「問題点を解決するための手段」）、「γ−グルタミルシステインに、糖類を添加して、温度７０〜１８０℃、１０〜１８０分間加熱することを特徴とするフレーバー組成物の製造法。」を開示する。
しかしながら、これらのフレーバー調味料については、ミートフレーバーが増加するが、これと同時にコゲ臭が強くなるという問題点が指摘される。
【０００３】
（発明の開示）
前項記載の従来技術の背景下に、本発明は、システインを高含有量で含有する食品素材を提供することを目的とする。
前項記載の従来技術の背景下に、本発明は、また、コゲ臭が強いなどの前記問題点を免れた、飲食品にビーフフレーバーや鰹節フレーバー等の風味を増強する食品の風味増強用素材及び風味増強剤を提供することを目的とする。
前項記載の従来技術の背景下に、本発明は、さらにまた、上記の食品素材、食品の風味増強用素材又は風味増強剤の製造原料として適当なγ−グルタミルシステインを高含有量で含有する食品用途酵母菌体、延いては酵母エキスを提供することを目的とする。
本発明者は、前項記載の目的を達成すべく鋭意検討の結果、γ−グルタミルシステインは、これをｐＨ１〜７において５０〜１２０℃で加熱すると３〜３００分でシステインとＰＣＡ（ピロリドンカルボン酸）に分解するため、システインが全体として高収率で得られること、また、γ−グルタミルシステインをγ−グルタミルペプチド加水分解酵素を用いて加水分解させるとγ−グルタミルシステインはシステインとグルタミン酸に分解するため、システインが全体として高収率で得られること、さらにまた、γ−グルタミルシステインを１％（重量％）以上含有する酵母菌体または酵母エキスを、糖の非存在下、含水状態で同様に加熱し、またはこれにγ−グルタミルペプチド加水分解酵素を作用させるとシステイン高含有酵母エキスが得られることを見出し、このような知見に基づいて本発明の第一（第一の発明）を完成した。
すなわち、本発明は、γ−グルタミルシステインを固形分に占める割合で１重量％以上含有する食品素材を、糖の非存在下かつ水の存在下、ｐＨ１〜７において５０〜１２０℃に保持する、またはこれにｐＨ３〜９で１５〜７０℃においてγ−グルタミルペプチド加水分解酵素を作用させることを特徴とするシステイン高含有食品素材の製造法、およびこのような方法であって原料の食品素材が酵母エキスまたは酵母菌体であることを特徴とするものに関する。
【０００４】
本発明者は、前項記載の目的を達成すべく更に鋭意研究の結果、γ−グルタミルシステイン又はγ−グルタミルシステインを固形分に占める割合で１％（重量％）以上の高含有量で含有する酵母菌体もしくは酵母エキスを還元糖の非存在下、酸性乃至中性のｐＨ領域において５０〜１２０℃で３〜３００分加熱し、またはｐＨ３〜９かつ１５〜７０℃においてγ−グルタミルペプチド加水分解酵素を作用させた後に、続いて還元糖を加えて得られる素材が食品の風味増強に有効であること、及びこのような素材を加熱すると食品の優れた風味増強剤となり得ることを見出し、このような知見に基づいて本発明の第二（第二の発明）を完成した。
すなわち、本発明は、γ−グルタミルシステイン又はγ−グルタミルシステインを固形分に占める割合で１重量％以上含有する食品素材を、還元糖の非存在下かつ水の存在下、ｐＨ１〜７において５０〜１２０℃に３〜３００分間保持し、またはｐＨ３〜９かつ１５〜７０℃においてγ−グルタミルペプチド加水分解酵素を作用させた後に還元糖を前記γ−グルタミルシステインに対する割合で１〜１０倍モル加えることを特徴とする食品の風味増強用素材の製造法、およびこのようにして得られた食品の風味増強用素材を５０〜１８０℃に１０〜３００分間保持することを特徴とする食品の風味増強剤の製造法に関する。
本発明者は、前項記載の目的を達成すべく更に鋭意研究の結果、食品用途酵母として代表的なＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて、１％を超える乾燥菌体あたりの重量をもつγ−グルタミルシステインを高含有する酵母を作出し、その酵母菌体から酵母エキスを調製する方法（このエキス中にはγ−グルタミルシステインが高濃度で含有されている）、さらにその酵母エキスを加熱処理することにより、加熱前よりもシステインの含有量が上昇した酵母エキスを得ることに成功し、これに基づいて本発明の第三（第三の発明）を完成した。すなわち、本発明は、γ−グルタミルシステインを固形分に占める割合で１重量％以上の高含有量で含有することを特徴とする食品用途酵母菌体又は酵母エキスに関する。
因みに、上記本発明の第一、本発明の第二および本発明の第三は、これまでの説明からおよびこれからの説明から理解できるように、単一の一般的発明概念を形成するように連関している一群の発明を構成している。
【０００５】
以下、本発明を詳細に説明する。
【０００６】
先ず、上記第一の発明について説明する。
本発明の製造法における原料である食品素材は、γ−グルタミルシステインを固形分に占める割合で１重量％以上の高含有量で含有する食品素材である。γ−グルタミルシステインの含有量が１％以下のものは、得られる風味力価が弱く工業的には実用的でないので好ましくない。
そのような食品素材としては、例えば、γ−グルタミルシステインの固形分に占める割合が１重量％以上の酵母菌体や酵母エキスを挙げることができる。因みに、このようなγ−グルタミルシステインを高含有量で含有する酵母菌体は、例えば、後掲実施例７に記載の方法または突然変異でγ−グルタミルシステインを高含有するようになった酵母を自然界より分離もしくは変異処理することによって得ることができる。また、酵母エキスは、このような酵母菌体から抽出もしくは自己消化することにより又はγ−グルタミルシステインの含有量が前記所定量に達していない酵母エキスにγ−グルタミルシステインを補添することにより調製することができる。
本発明によれば、このような食品素材を水の存在下、酸性乃至中性のｐＨ領域、すなわち、ｐＨ１〜７において５０〜１２０℃に保持して加熱をする。水の存在量は、操作性の見地から定められ、例えば、食品素材に対し、その１重量部（乾物換算）当たり１〜１００重量部とすることができる。ｐＨは前記の範囲外では、システインの生成量が少なくなり好ましくない。なお、ｐＨの調整は、食品として許容される塩酸などの酸や水酸化ナトリウムなどの塩基によって行うことができることは言うまでもない。加熱温度は、これが低温に過ぎるとγ−グルタミルシステインの分解反応の進行が遅く、逆に、高温に過ぎると一旦生成したシステインが副反応によって減少してしまい好ましくない。上記の加熱条件で食品素材を加熱処理すると、３〜３００分間でシステインが多量に生成蓄積したシステイン高含有食品素材が得られる。加熱時間は、これが短かすぎると反応が完了せず、逆に長すぎるとやはり一旦生成したシステインが副反応により減少してしまい好ましくない。
γ−グルタミルシステイン分解反応は、糖、特にグルコース、フラクトース、キシロース、マルトースなどの還元糖を添加せず、それらの非存在下で行うことが肝要である。これは生成したシステインが糖、特にこれらの還元糖と反応して焦げ臭を発するのや褐変反応を防ぐためである。
また、γ−グルタミルシステインは、これからシステインを生成させるには酵素を作用させる方法も挙げられる。すなわち、γ−グルタミルシステインのペプチド結合を加水分解する酵素（γ−グルタミルペプチド加水分解酵素）を前記の食品素材にｐＨ３〜９かつ１５〜７０℃において作用させる。水の存在量は、操作性の見地から定められ、例えば、食品素材に対し、その１重量部（乾物換算）当たり１〜１００重量部とすることができる。ｐＨおよび温度は前記の範囲外ではγ−グルタミルペプチド加水分解酵素の活性が弱まり、好ましくない。上記の条件で食品素材を酵素処理すると、１〜３００分間でシステインが多量に生成蓄積したシステイン高含有食品素材が得られる。
γ−グルタミルペプチド加水分解酵素には数多くの種類が存在するが、特に本発明の実施上有用なものとしてはγ−グルタミルトランスフェラーゼ、γ−グルタミルシクロトランスフェラーゼ、グルタミナーゼなどを挙げることができる。
このように作成したシステイン高含有食品素材は、そのまま液体の状態で、濃縮してペーストの状態で、または乾燥して粉末の状態で、その他顆粒の状態など、適宜の形態で流通におくことができる。
【０００７】
次に、前記第二の発明について説明する。
まず第一に、本発明の食品の風味増強用素材の製造方法について説明する。これは、例えば、先に述べたように、ｐＨ酸性乃至中性領域においてγ−グルタミルシステイン又はγ−グルタミルシステインを１％（重量％）以上含有する酵母菌体または酵母エキスを還元糖の非存在下で加熱し、またはγ−グルタミルペプチド加水分解酵素を作用させ、続いて糖を加えることにより製造することができる。
このような製造法における原料である食品素材は、本発明の第一に関して先に説明したところと同様に、γ−グルタミルシステインを固形分に占める割合で１重量％以上の高含有量で含有する食品素材である。γ−グルタミルシステインの含有量が１％以下のものは、得られる風味力価が弱く工業的には実用的でないので好ましくない。
そのような素材としては、例えば、γ−グルタミルシステインの固形分に占める割合が１重量％以上の酵母菌体や酵母エキスを挙げることができる。因みに、このようなγ−グルタミルシステインを高含有量で含有する酵母菌体は、例えば、後掲実施例７に記載の遺伝子工学的方法によって得ることができる。また、酵母エキスは、このような酵母菌体から抽出もしくは自己消化することによりまたはγ−グルタミルシステインを補添することにより調製することができる。これは、本発明の第一に関して先に説明したところと同様である。
本発明によれば、先ず、γ−グルタミルシステイン又はγ−グルタミルシステインを高含有量で含有する前記のような食品素材を還元糖の非存在下かつ水の存在下、酸性乃至中性のｐＨ領域、すなわち、ｐＨ１〜７において５０〜１２０℃に３〜３００分間保持して加熱をする。このようなｐＨ、温度および時間の条件それ自体は、本発明の第一に関して先に説明したところと同様である。
水の存在量は、操作性の見地から定められ、例えば、γ−グルタミルシステイン又はこれを高含有量で含有する食品素材に対し、その１重量部（乾物換算）当たり１〜１００重量部とすることができる。
因みに、本発明者は、別途、γ−グルタミルシステインをｐＨ１〜７において５０〜１２０℃で、例えば３〜３００分加熱すると、γ−グルタミルシステインはシステインとＰＣＡ（ピロリドンカルボン酸）に分解するため、システインが全体として高収率で得られること、さらに又、γ−グルタミルシステインを１％（重量％）以上含有する酵母菌体または酵母エキスを、還元糖の非存在下、含水状態で同様に加熱するとシステイン高含有酵母エキスが得られることを見出しているが、本発明に係わる食品用組成物の風味増強作用は、γ−グルタミルシステインからこのようにして生成するシステインによるものである。
そして、ｐＨは前記の範囲外では、システインの生成量が少なくなり好ましくない。なお、ｐＨの調整は、食品として許容される塩酸などの酸や水酸化ナトリウムなどの塩基によって行うことができることはいうまでもない。これは、本発明の第一に関して上に説明したところと同じである。
加熱温度は、これが低温に過ぎるとγ−グルタミルシステインの分解反応の進行が遅く、逆に、高温に過ぎると一旦生成したシステインが副反応により減少してしまい好ましくない。加熱時間は、これが短すぎると反応が完了せず、逆に長すぎるとやはり一旦生成したシステインが副反応により減少してしまい好ましくない。これも、また、本発明の第一に関して上に説明したところと同じである。
本発明者の知見によれば、先に説明したように、γ−グルタミルシステインをｐＨ１〜７の酸性乃至中性領域において特定の温度で特定時間加熱すると、γ−グルタミルシステインはシステインとＰＣＡ（ピロリドンカルボン酸）に分解して最終的にシステインが高収率で得られ、また、γ−グルタミルシステインを１％（重量％）以上含有する酵母菌体または酵母エキスを、還元糖の非存在下、含水状態で同様に加熱するとシステイン高含有酵母エキスが得られるのである。
γ−グルタミルシステインのこのような分解反応は、例えば、グルコース、フラクトース、キシロース、マルトースなどの還元糖を添加せず、これの非存在下で行うことが肝要である。これは、生成したシステインがこれらの還元糖と反応して焦げ臭を発するのや褐変反応を防ぐためである。これは、本発明の第一に関して上に説明したところと同じである。
また、γ−グルタミルシステインは、これからシステインを生成させるには酵素を利用する方法も挙げられる。すなわち、γ−グルタミルシステインのペプチド結合を加水分解する酵素（γ−グルタミルペプチド加水分解酵素）をγ−グルタミルシステイン又は前記の食品素材にｐＨ３〜９かつ１５〜７０℃において１〜３００分間作用させる。水の存在量は、操作性の見地から定められ、例えば、食品素材に対し、その１重量部（乾物換算）当たり１〜１００重量部とすることができる。ｐＨおよび温度は前記の範囲外ではγ−グルタミルペプチド加水分解酵素の活性が弱まり、好ましくない。これは、本発明の第一に関して上に説明したところと同じである。
γ−グルタミルペプチド加水分解酵素には数多くの種類が存在するが、特に本発明の実施上有用なものとしてはγ−グルタミルトランスフェラーゼ、γ−グルタミルシクロトランスフェラーゼ、グルタミナーゼなどを挙げることができる。これも、本発明の第一に関して上に説明したところと同じである。
このように作成したシステイン高含有の加熱処理生成物は、これに前記のような還元糖を前記γ−グルタミルシステインに対する割合で１〜１０倍モル加えることにより本発明の食品の風味増強用素材とすることができる。
還元糖としては、グルコース、フラクトース、キシロース、マルトースなどを挙げることができ、これらの還元糖は、安価で入手容易であり、また食品としての利用可能の理由から好ましい。
還元糖の添加量（使用量）は、上記のように、原料のγ−グルタミルシステイン又はこれを含有する酵母菌体若しくは酵母エキスなどの天然食品素材に含まれるγ−グルタミルシステインに対する割合でこれの１モル当たり１〜１０モルである。添加量がこの範囲より少ないと効果が弱く、一方、多いと甘味が強くなって共に好ましくない。
このようにして製造することのできる風味増強用素材は、これをそのまま液体の状態で、濃縮してペーストの状態で、または乾燥して粉末の状態で、その他顆粒の状態など、適宜の形態で流通に置くことができる。本発明の風味増強用素材は、後に食品加工に使用された場合に加工処理における加熱工程において、それに含まれるシステインと還元糖が反応して風味増強効果を奏するのである。
次に、本発明の食品の風味増強剤の製造法について説明する。これは、例えば、上に説明した本発明の風味増強用素材を適当な条件で加熱処理することによって得ることができる。
加熱処理に際して、風味増強効果を得る目的で、システイン濃度が０．１重量％以上、好ましくは０．６重量％以上になるように必要に応じて濃縮してから加熱する。加熱条件は、５０〜１８０℃で１０〜３００分の範囲で焦げ臭や褐変反応の起こらない範囲とする。このような加熱条件には、例えば、５０〜６０℃で１８０〜３００分というような低温で長時間および９０〜１００℃（沸点前後）で３０〜１２０分というような高温で短時間加熱する条件が含まれる。
例えば、このように作成することのできる本発明の食品の風味増強剤は、先の風味増強用素材と同様に、そのまま液体の状態で、濃縮してペーストの状態で、または乾燥して粉末の状態で、その他顆粒の状態など、適宜の形態で流通に置くことができる。
【０００８】
最後に、前記第三の発明について説明する。
γ−グルタミルシステインを高含有量で含有する、本発明の食品用途酵母（菌体）は、次のようにして作成する。すなわち、先ず、グルタチオン合成酵素の遺伝子であるＧＳＨ２を破壊することによってグルタチオン合成酵素が機能しなくなった酵母を作成し、次に、これを常法により培養するのである。
因みに、ＧＳＨ２遺伝子が生育に必須な遺伝子でないことは既に報告されている（Ｃｈｒｉｓ  Ｍ．Ｇｒａｎｔら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ、８巻、１６９９頁から１７０７頁、９月、１９９７年）。生育に必須でない遺伝子の破壊は、公知のごとく１遺伝子の自然突然変異でも容易に生起する現象であることから、本発明の後掲実施例７は、自然な状況下で起こりうる結果の一例であるといえる。
また、本発明においては、作製した酵母から実際に酵母エキスを作製し、それがγ−グルタミルシステイン、延いてはシステインを高含有する食品素材であることを明らかに示した。
【０００９】
（発明を実施するための最良の形態）
以下、検査例および実施例により本発明を更に詳しく説明する。
【００１０】
先ず、本発明の第一の検査例および実施例を掲げる。
検査例１（加熱によるγ−グルタミルシステインからのシステインの生成）
ｐＨの異なる（すなわち、ｐＨ３、５および７の）還元型γ−グルタミルシステインの１ｍｍｏｌ濃度の水溶液を９８℃で加熱した際の生成システイン量の経時的消長を調べた。結果を後掲図１〜３に示す。図中、ＰＣＡはピロリドンカルボン酸を、γ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓは還元型γ−グルタミルシステインを、そしてＴｏｔａｌ  Ｃｙｓｔｅｉｎｅはシステインを表す。
図１〜３より理解されるように、加熱によりγ−グルタミルシステインからシステインが高収率で得られる。
検査例２（酵素によるγ−グルタミルシステインからのシステインの生成）
ｐＨの異なる（すなわち、ｐＨ５、７および９の）還元型γ−グルタミルシステインの１ｍｍｏｌ濃度の水溶液に「グルタミナーゼ  ダイワ」（大和化成社製グルタミナーゼ、比活性３．０ｍＭ／ｍｉｎ／ｍｇ）を種々の濃度で加え、３７℃で１０分間作用させたときの生成システインの量を調べた（γ−グルタミルシステインの加水分解の酵素量依存性）。結果を後掲図４〜６に示す。図中、γ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓは還元型γ−グルタミルシステインを、そしてＴｏｔａｌ  Ｃｙｓｔｅｉｎｅはシステインを表す。
図４〜６より理解されるように、グルタミナーゼによりγ−グルタミルシステインの加水分解にともなってこれから等モルのシステインが得られる（高収率）。
実施例１
γ−グルタミルシステインを４．５％含有する酵母エキス粉末に水を加え、塩酸でｐＨを５に調整し、濃度２％の水溶液を作成し、これを９８℃で１８０分間加熱した後凍結乾燥したところ、２．０％のシステイン含有量を有する酵母エキス粉末が得られた。
因みに、この酵母エキス粉末を調味料の製造に用いたところ、良好なローストミートフレーバを有する調味料が得られた。
実施例２
γ−グルタミルシステインを４．５％含有する酵母エキス粉末に水を加え、１Ｎ  ＮａＯＨを用いてｐＨを７に調整し、濃度２％の水溶液を作成した。この溶液にグルタミナーゼ（検査例２で使用のものと同じ）を１ｍｇ／ｍｌの濃度になるように加え、３７℃で１０分間インキュベートした後凍結乾燥したところ、２．５％のシステイン含有量を有する酵母エキス粉末が得られた。
因みに、この酵母エキス粉末を調味料の製造に用いたところ、実施例１と同様に良好なローストミートフレーバを有する調味料が得られた。
【００１１】
次に、本発明の第二の実施例および検査例を掲げる。
実施例３（γ−グルタミルシステイン）
１Ｎ  ＮａＯＨを用いてｐＨを５に調整したγ−グルタミルシステインの４％水溶液を９８℃で３時間加熱した。加熱後グルコースを溶液に対して４％（γ−グルタミルシステイン１モル当たり１．４モルに相当する）加えた（風味増強用素材）。これを６０℃で１８０分間加熱した後凍結乾燥した（風味増強剤）。
このようにして得られた凍結乾燥物（本発明の食品の風味増強剤）を用いて市販ビーフコンソメスープの系における官能評価を実施した。本凍結乾燥物は、市販ビーフコンソメスープの固形分に対して０．０５％になるように添加し、無添加のものを対照として１５名のパネルにより、各評価項目について、より好ましい方またはより強い方を選択させる方法で評価を行った。
結果を下記第１表に示す。表中の人数は、より好ましいまたはより強いとして選択したパネル員の人数である。
0003733585.tif 000002
実施例４（γ−グルタミルシステイン）
１Ｎ  ＮａＯＨを用いてｐＨを７に調整したγ−グルタミルシステインの４％水溶液に１ｍｇ／ｍｌとなるようにグルタミナーゼを加え、３７℃で２時間インキュベートした。反応後グルコースを溶液に対して４％（γ−グルタミルシステイン１モル当たり１．４モルに相当する）加えた（風味増強用素材）。これを６０℃で１８０分間加熱した後凍結乾燥した（風味増強剤）。
このようにして得られた凍結乾燥物（本発明の食品の風味増強剤）を用いて市販ビーフコンソメスープの系における官能評価を実施した。本凍結乾燥物は、市販ビーフコンソメスープの固形分に対して０．０５％になるように添加し、無添加のものを対照して１５名のパネルにより、各評価項目について、より好ましい方またはより強い方を選択させる方法で評価を行った。
結果を下記第２表に示す。表中の人数は、より好ましいまたはより強いとして選択したパネル員の人数である。
0003733585.tif 000003
実施例５（酵母エキス）
γ−グルタミルシステインを４．５％含有する酵母エキスの、１Ｎ  ＮａＯＨを用いてｐＨを５に調整した２０％水溶液（この水溶液におけるγ−グルタミルシステインの濃度は、０．９％）を９８℃で３時間加熱した。加熱後グルコースを溶液に対して１．８％（対γ−グルタミルシステイン１モル当たり２．８モルに相当する）加えた（風味増強用素材）。これを実施例３におけると同じように加熱した後濃縮してからスプレードライした（風味増強剤）。
本乾燥物（本発明の食品の風味増強剤）を用いて（ａ）市販ビーフコンソメスープ、（ｂ）カレーおよび（ｃ）すまし汁の各系における官能評価を実施した。結果を下記第３表に示す。なお、本乾燥物は、固形分に対して表に示す量添加し、無添加のものを対照として、１５名のパネルにより実施例３におけると同様にして評価を行ったものである。
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実施例６（酵母エキス）
γ−グルタミルシステインを４．５％含有する酵母エキスの、１Ｎ  ＮａＯＨを用いてｐＨを７に調整した２０％水溶液（この水溶液におけるγ−グルタミルシステインの濃度は、０．９％）にグルタミナーゼを１ｍｇ／ｍｌとなるように加え、３７℃で２時間インキュベートした。反応後グルコースを溶液に対して１．８％（対γ−グルタミルシステイン１モル当たり２．８モルに相当する）加えた（風味増強用素材）。これを実施例３におけると同じように加熱した後濃縮してからスプレードライした（風味増強剤）。
本乾燥物（本発明の食品の風味増強剤）を用いて（ａ）市販ビーフコンソメスープ、（ｂ）カレーおよび（ｃ）すまし汁の各系における官能評価を実施した。結果を下記第４表に示す。なお、本乾燥物は、固形分に対して表に示す量添加し、無添加のものを対照として、１５名のパネルにより実施例３におけると同様にして評価を行ったものである。
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検査例３
γ−グルタミルシステインの４％溶液にグルコースを４％加え、ｐＨ５に調整してから９８℃で３時間加熱した後直ちに凍結乾燥した。
このようにして得られた凍結乾燥物の試料（比較試料）および上掲実施例３で調製した本発明の風味増強剤（凍結乾燥物＝本発明試料）を用い、市販ビーフコンソメスープの系に添加し官能評価を実施した。これら２種類の凍結乾燥物の試料は、市販ビーフコンソメスープの固形分に対して０．０５％になるように添加し、１５名のパネルによる比較評価を行った。すなわち、上記２種類の試料について下記第５表の欄外に示す評価基準により各評価員に採点させ、その平均点を取った。
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＜評価基準＞
評点  ５：非常に強い、または好ましい
４：強い、または好ましい
３：やや強い、またはやや好ましい
２：やや弱い、またはやや好ましくない
１：弱い、または好ましくない
【００１２】
最後に、本発明の第三の実施例を掲げる。
実施例７
（ａ）γ−グルタミルシステインを乾燥菌体重量あたり１％以上含有する食品用途酵母の育種について以下に説明する。
γ−グルタミルシステインは、酵母の細胞内代謝においてはグルタチオン（ＧＳＨ）生成の１歩手前の中間代謝産物として存在する。γ−グルタミルシステインをグルタチオンに変換する酵素はグルタチオンシンターゼである。そこで、グルタチオンシンターゼの遺伝子（以下、ＧＳＨ２）の機能を失わしめることにより、γ−グルタミルシステインを食品用途酵母細胞内に蓄積させることを試みた。
（１）ＧＳＨ２遺伝子の機能を失わしめる方法として、一段遺伝子破壊法（ｏｎｅ−ｓｔｅｐ−ｇｅｎｅ−ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ法）を行った。まず、このために必要なＧＳＨ２遺伝子破壊カセットの調製を行った。
詳述すると、市販食品用途酵母（パン酵母）Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに常法により胞子を形成させ、得られた胞子を発芽させて得た株の１株（これをＨ４株と称する）のＧＳＨ２遺伝子の上流領域からＧＳＨ２遺伝子末端までの領域をＰＣＲ法により増幅した。条件は下記第６表に示す通り。
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このようにして増幅した遺伝子断片（ＧＳＨ２）を、常法によりプラスミドｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）に連結させてクローン化した（以下、ＧＳＨ２／ｐＧＥＭ）。
同様にしてｏｎｅ−ｓｔｅｐ−ｇｅｎｅ−ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ法に用いる選択遺伝子マーカーとして、ＵＲＡ３遺伝子もＰＣＲ法によって増幅した。条件は下記第７表に示す通り。
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続いて、ＧＳＨ２／ｐＧＥＭを制限酵素ＭｕｎＩで切断し、常法により遺伝子末端を平滑化した。その切断末端に、制限酵素ＳｍａＩで遺伝子末端を平滑化したＵＲＡ３遺伝子を常法によりライゲーションを行い導入した（以下、ＵＲＡ３−ＧＳＨ２／ｐＧＥＭ）。
ＵＲＡ３−ＧＳＨ２／ｐＧＥＭを鋳型として、ＧＳＨ２の両端をコードする遺伝子プライマー（上述ＧＡＬ１１Ｆ、ＧＳＨ２Ｒ）を用いてＰＣＲを行い、ＧＳＨ２遺伝子破壊カセットを調製した。ＰＣＲの条件を下記第８表に示す。
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（２）以上の方法で調製したＧＳＨ２遺伝子破壊カセット（以下、ＵＲＡ３−ＧＳＨ２）を用いて、食品用途酵母Ｈ４株のＧＳＨ２遺伝子破壊を行った。
まず、Ｈ４株を３ｍｌのＹＰＤ培地中で２４時間、３０℃で振とう培養して前培養を行った。その培養菌体液１ｍｌを５０ｍｌのＹＰＤ培地中に移し、対数増殖期まで培養した後、１Ｍソルビトールに懸濁した状態にＵＲＡ３−ＧＳＨ２を混和して常法によりエレクトロポレーションを行って、ＧＳＨ２遺伝子が破壊カセットに入れ替わったＨ４株（以下、Ｈ４△ＧＳＨ２）を取得した。
（ｂ）γ−グルタミルシステインを乾燥菌体重量あたり１％以上含有する食品用途酵母の培養は、以下のようにして行った。
Ｈ４△ＧＳＨ２株を、グルタチオンを１ｍＭ含む３ｍｌの合成最少培地で２４時間、３０℃で振とう培養して前培養を行った。その培養菌体液１ｍｌを５ｍＭのシステインを含む５０ｍｌの合成最少培地中に移し、４８時間の培養を行うことにより菌体を取得した。この菌体を蒸留水で３回洗浄した後、これを７０℃で１０分間の抽出処理に付して細胞内容物を抽出した。
これを遠心処理し、得られた上清（酵母エキス抽出液）中のγ−グルタミルシステイン含量を測定した。その結果得られた酵母乾燥菌体あたりのγ−グルタミルシステイン含量を図７に示す。なお、乾燥菌体重量は、一定培地中に含まれる酵母菌体を濾紙上に取り、１０５℃で４時間加熱後に残った菌体重量をもって測定した。
さらに、上記酵母エキス抽出液を常法により凍結乾燥して粉末にした後、その粉末２０．２ｍｇを１ｍｌの水に溶かし、溶液のｐＨを５に合わせた。その一部を９８℃で３時間加熱し、加熱前および加熱後の酵母抽出物（酵母エキス）中のγ−グルタミルシステインおよびシステインの含量を測定した。結果を図８に示す。
上記図７および図８において、Ｔｏｔａｌ  Ｃｙｓｔｅｉｎｅはシステインを、γ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓは還元型γ−グルタミルシステインを、そしてＧＳＨはグルタチオンを表す。
なお、本発明の製造法によって得られるγ−グルタミルシステインを高含有量で含有する酵母菌体や酵母エキスは、本発明に係わる食品素材、食品の風味増強用素材または食品の風味増強剤の製造原料として使用することができるばかりでなく、その他の用途におけるγ−グルタミルシステインまたはシステインの優れたソースとなり得ることはいうまでもない。
【００１３】
（産業上の利用可能性）
本発明によれば、食品の風味改善などに有用なシステイン高含有酵母エキスなどのシステイン高含有天然食品素材を容易に得ることができる。
本発明によれば、また、焦げ臭が強いなどの問題点を免れた、飲食品にビーフフレーバーや鰹節フレーバー等の風味を増強する食品の風味増強用素材や風味増強剤を容易に得ることができる。
本発明に係わる方法によれば、さらにまた、γ−グルタミルシステインを高含有量で含有する酵母菌体を容易に得ることができる。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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