(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
支持体、該支持体上の試薬層及び該試薬層上の多孔性展開層を有して成り、該試薬層及び該展開層の少なくとも一方が、
硫酸抱合型胆汁酸脱硫酸酵素、
３β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ
並びに
チオ−ＮＡＤ+及び還元型ＮＡＤ類、又は還元型ＮＡＤＰ類
を含む硫酸抱合型胆汁酸分析用一体型多層分析用具において、該試薬層が
水溶性高分子、
糖アルコール類又はＭn2+、若しくはその両者
及び
緩衝剤
を含有することを特徴とする硫酸抱合型胆汁酸分析用一体型多層分析用具。
【請求項２】
水溶性高分子が、水溶性合成高分子又は水溶性醗酵粘物質である請求項１に記載の硫酸抱合型胆汁酸分析用一体型多層分析用具。
【請求項３】
試薬層中に含有された緩衝剤が、pＨ４〜１０の領域に緩衝能を有する緩衝剤である請求項１または２に記載の硫酸抱合型胆汁酸分析用一体型多層分析用具。
【請求項４】
緩衝剤がピペラジン−グリシルグリシン緩衝剤である請求項３に記載の硫酸抱合型胆汁酸分析用一体型多層分析用具。
【請求項５】
該試薬層が、（１）水溶性高分子；（２）糖アルコール類、又は糖アルコール類とＭｎ２＋；及び（３）緩衝剤を含有する請求項１に記載の硫酸抱合型胆汁酸分析用一体型多層分析用具。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、水性液体試料中の硫酸抱合型胆汁酸を分析する一体型多層分析用具に関し、更に詳しくは生物体液、例えば血液(全血、血漿、血清)、髄液、リンパ液、唾液、尿等の水性液体試料中の硫酸抱合型胆汁酸を定量分析する為の、乾式操作可能で臨床的に有用な一体型多層分析用具に関する。
【０００２】
【従来の技術】
硫酸抱合型胆汁酸の測定法としては、溶液法ではあるが、硫酸抱合型胆汁酸脱硫酸酵素(Ｂileacid  Ｓulfate  Ｓulfatase。以下、「ＢＳＳ」と略記する。)を用いて硫酸抱合型胆汁酸をまず３β−ヒドロキシ胆汁酸とし、これに３β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ(以下、「３β−ＨＳＤ」と略記する。)と、補酵素としてニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類(以下、「ＮＡＤ類」と略記する。)またはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸類(以下、「ＮＡＤＰ類」と略記する。)を反応させて、硫酸抱合型胆汁酸量に比例して生成するＮＡＤＨ類(還元型ＮＡＤ類)量またはＮＡＤＰＨ類(還元型ＮＡＤＰ類)量を測定する方法が開示されている(特開平２−１４５１８３号公報参照)。
ところが、この方法は発色系にテトラゾリウム塩類を用いるため、乾式分析に適用するには発色量が低すぎるという問題点があった。
【０００３】
また、胆汁酸の高感度定量法の一つに、酵素的サイクリングを用いて測定を行う方法がある(特開平３−２２４４９８号公報参照)。この方法では、α−ＨＳＤを用いて、α−型胆汁酸の高感度定量を液系で行っている。
【０００４】
そこで、上記２つの方法を組み合わせた形で、ＢＳＳにより脱硫酸された３β−ヒドロキシ胆汁酸を基質とし、３β−ＨＳＤによって基質の定量を試みたところ、比較的単純な試薬組成でチオ−ＮＡＤＨの着色を促えることが可能であることが判った。
ところが、液系での測定は煩雑さを伴うので、簡便かつ高感度な乾式の一体型多層分析用具の出現が望まれていた。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
酵素的サイクリング法を用いた乾式の一体型多層分析用具を、単純に従来の乾式試験紙の製造方法で作製しようと試みると、以下のような問題が生じる：
(１)製造過程で還元型チオ−ＮＡＤ(チオ−ＮＡＤＨ)の発色によると思われるバックグラウンドの発色が起こるために、充分な測定レンジが得られない。
(２)溶液調製の過程で脱硫酸酵素が濁りを生じ、溶液中に均一に分散されないために均一な溶液を作成できず、測定誤差の原因となる。
(３)検体が尿の場合、尿のpＨに個人差があり、pＨは４〜９という広い領域に渡るので、この幅を緩衝可能で、かつ乾式へ応用可能な緩衝剤が容易に入手できない。
従って、酵素的サイクリングに高感度定量性を保持したまま、上記溶液法の試薬系をそのまま乾式分析用具へ適用することは困難であった。
本発明は、これらの問題点を解決し、高感度定量が可能な硫酸抱合型胆汁酸の測定用一体型多層分析用具の作製を可能にしようとするものである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
上記問題点は、本発明の、支持体、該支持体上の試薬層及び該試薬層上の多孔性展開層を有して成り、該試薬層及び該展開層の少なくとも一方に、硫酸抱合型胆汁酸脱硫酸酵素、３β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ並びにチオ−ＮＡＤ+及び還元型ＮＡＤ類、又は還元型ＮＡＤＰ類を含む硫酸抱合型胆汁酸分析用一体型多層分析用具において、該試薬層が、水溶性高分子、糖アルコール類又はＭn2+、若しくはその両者、及び緩衝剤を含有することを特徴とする硫酸抱合型胆汁酸分析用一体型多層分析用具により解決される。
【０００７】
検体試料が尿の場合には、先にも述べたように尿のpＨの個人差が大きいために、緩衝剤としてpＨ４〜１０の領域に緩衝能を有する緩衝剤が必要である。このような緩衝剤として、本発明では、ピペラジンとグリシルグリシンの混合緩衝剤を採用する。
【０００８】
水溶性高分子としては、水溶性合成高分子又は水溶性醗酵粘物質が望ましく、例としてはポリビニルピロリドン又はプルランが挙げられる。これら水溶性合成高分子又は水溶性醗酵粘物質を用いると。チオ−ＮＡＤ（チオ−ＮＡＤＨ）の発色によると思われるバックグラウンドの着色が解決できる。
【０００９】
また、糖アルコール類の種類は特に制限されない。もし糖アルコールを用いなければ、溶液調製の過程で脱硫酸酵素が濁りを生じる上に、試験紙中の組成物の保存安定性が格段に低下する。
糖アルコールの例としては、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール等が挙げられる。また、糖アルコールに構造的に類似な化合物、例えばスクロース、グリセロール、ポリエチレングリコール等のポリオールも使用できる。
【００１０】
Ｍｎ2+は、マンガンの塩、例えば塩化マンガン、硝酸マンガン、硫酸マンガン、リン酸マンガン、ほう酸マンガン、酢酸マンガン等、水溶性の塩であればいずれでも良い。
【００１１】
尿が検体試料の場合には、緩衝剤として上記のようにピペラジン−グリシルグリシン混合緩衝剤を用いるが、尿以外の検体試料の場合には、緩衝剤は当業者が通常用いる緩衝剤を用いてもよい。もちろん、ピペラジン−グリシルグリシン混合緩衝剤を用いても、尿以外の検体試料のpＨを緩衝できることは言うまでもない。
ＢＢＳ、３β−ＨＳＤ、ＮＡＤＨ類、チオ−ＮＡＤ+、水溶性高分子、糖アルコール又はＭｎ2+、緩衝剤の相互の量的関係は以下の通りである：
ＢＢＳ：        ２０〜２００Ｕ／ml、好ましくは５０〜１００Ｕ／ml
３β−ＨＳＤ：    ５〜１００Ｕ／ml、好ましくは２０〜４０Ｕ／ml
ＮＡＤＨ：        ０.５〜５ｍＭ、好ましくは２〜３ｍＭ
チオ−ＮＡＤ+：   １〜５ｍＭ、好ましくは１.５〜３ｍＭ
水溶性高分子：    ６〜１２％（ｗ／ｗ）、好ましくは８〜１０％（ｗ／ｗ）
糖アルコール：    １〜５％(ｗ／ｗ)、好ましく２〜３％（ｗ／ｗ）
マンガン：      ３０〜３００μＭ、好ましくは５０〜１５０μＭ
緩衝剤：      １００〜５００ｍＭ、好ましくは２００〜３００ｍＭ
【００１２】
支持体の材料は、いずれの材料でもよい。特に、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリカーボネート、ポリスチレン、セルロースエステルが例示できるが、この種の試験片に普通に使用される、シート状・フィルム状のポリマーであればいずれでも良い。
【００１３】
試薬層は、上記試薬を含む溶液を支持体材料上に塗布し、乾燥することにより形成することができる、あるいはその溶液を適当な基材（例えば、瀘紙、不織布、織物生地、編み物生地、ガラス繊維瀘紙など）に塗布又は含浸し、乾燥することにより作成することができる。
多孔性展開層は、瀘紙、不織布、織物生地、編み物生地、ガラス繊維瀘紙、メンブレンフィルター、ポリマーミクロビーズから成る三次元格子状構造物などの、この種の試験片に普通に使用される材料から作成する。
【００１４】
以下、本発明の一体型多層分析用具の製造方法の一例を説明する。
脱硫酸に必要なＢＳＳ、並びに酵素的サイクリング反応に必要な３β−ＨＳＤ、チオ−ＮＡＤ+及びＮＡＤＨをあらかじめ、緩衝剤溶液に溶解する。その際、糖アルコール又はＭn2+の少なくとも一方を緩衝剤溶液中に添加することによって、溶液中に生じる濁りの発生を抑制することができる。
【００１５】
次にあらかじめ上記と同種の緩衝剤溶液に溶解した水溶性高分子の溶液と、上記酵素溶液とを混合してよく攪拌する。この混合溶液を、支持体上に均一に展開させた後乾燥して試薬層を形成し、その後展開層をラミネートし、更に乾燥する。この２段階の乾燥中に望ましくない着色が生じ、バックグラウンドが上昇することがあるが、水溶性高分子、特に精製度の高いポリビニルピロリドン及び／又はプルランを用いることによって、バックグラウンドの上昇を抑えることができる。
このようにして得られた試験片原反を裁断し、粘着テープで支持体上に接着し、裁断して測定用試験片を得る。
【００１６】
【発明の効果】
本発明によれば、ブランク値の上昇を抑制でき、試薬層作成の際に用いる溶液の調製時に酵素の凝集を防止することができる。
【００１７】
【実施例】
0003864191.tif 000002
【００１８】
上記処方の成分を混合し、得られた溶液を、ＰＥＴフィルムの表面に塗布し、温度４０℃にて約１０分間乾燥する。０.０１％トリトンＸ−１００を含浸させた瀘紙を上にのせ、圧力をかけて密着させることにより、展開層をラミネートする。そして乾燥させることにより、試験片原反を得る。得られた試験片原反のＰＥＴ側に両面接着テープを貼付した後、所定の寸法に裁断し、両面接着テープにより支持体(ＰＥＴ板)に貼付して試験片を得た。
【００１９】
測定
以上のようにして作製した各試験片にリトコリルグリシン(Ｌithocholilglycine)３−スルフェート(以下、「ＧＬＣＡ」と略称する。)を検体として試験を行い、１１０秒後の反射率の変化を専用反射率計（スポットケム。株式会社京都第一科学製）により測定した。
なお、表中ではＫ／Ｓという単位を使用しているが、これは反射率を濃度換算する際に使用する単位であり、反射率をＲとすれば、
【００２０】
【化１】
0003864191.tif 000003
【００２１】
で表される。そしてこのＫ／Ｓ値は、検体中に含まれる被測定対象物質の濃度の高いときは大きい値を、濃度の低いときは小さい値を示す。
【００２２】
実施例１の結果を表１に示す。
【表１】
0003864191.tif 000004
【００２３】
実施例１ではバックグラウンドが低下したことにより、ＧＬＣＡ濃度に比例して測定に充分な感度が得られた。
また、ブランク値の経時変化を図１のグラフ示す。実施例１では値が安定していることが判る。
図中、ＰＶＰはポリビニルピロリドンを示す。
【００２４】
実施例２
１０μmol／lのＧＬＣＡを含み、１Ｎ塩酸又は１Ｎ水酸化ナトリウムにより表２に示すｐＨに調整した尿検体各５μlを試験片に点着した。
点着した尿検体のｐＨをコンパクトｐＨメータにより測定した。結果を表２に示す。
【００２５】
【表２】
0003864191.tif 000005
【００２６】
この結果から、広範囲のpＨの尿検体に対して充分な緩衝能を有していることが判る。
【図面の簡単な説明】
【図１】  実施例１の結果を示すグラフである。
【図１】
0003864191.tif 000006