(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数種の抗体を産生する単一のハイブリドーマを継代培養して複数種のハイブリドーマの混合物を得、各ハイブリドーマをクローニングし、次いでそのハイブリドーマが分泌する抗体を、電気泳動および／またはクロマトグラフィーにかけることにより、均一なモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマをスクリーニングすることを特徴とする、ハイブリドーマの選抜方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマの選抜方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
モノクローナル抗体は分子量、約１５０，０００のタンパク質であり、その高い抗原認識能と抗原結合能により、医学分野の診断、治療、研究において多く用いられている。モノクローナル抗体は、主に目的の抗原で予め感作された抗体産生細胞とマウス形質細胞腫細胞とのハイブリドーマから分泌され、培養上清またはマウス腹水より精製されて用いられる。このモノクローナル抗体は、単一クローンの抗体産生細胞が産生する抗体と同様に、一次構造が均一である。
【０００３】
しかし、いくつかのモノクローナル抗体の混合物を分泌するハイブリドーマが認められている。例えばマウス形質細胞腫細胞ＮＳー１は、自ら抗体のＬ鎖を合成する能力を持っており、これをハイブリドーマ作製の細胞融合に用いた場合、ＮＳー１由来の抗体のＬ鎖と抗体産生細胞由来のＨ鎖とが組合わされたモノクローナル抗体、抗体産生細胞由来のＨ鎖とＬ鎖が組み合わされたモノクローナル抗体、およびＮＳー１由来のＬ鎖（１本）と抗体産生細胞由来のＨ鎖（２本）とＬ鎖（１本）とが組み合わされたモノクローナル抗体が分泌される可能性がある。即ち、３種のモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマが得られることがある。
【０００４】
しかし、このようなハイブリドーマばかり得られるわけではなく、抗体産生細胞由来のＨ鎖とＬ鎖が組み合わされたモノクローナル抗体だけを分泌するハイブリドーマや、ＮＳー１由来のＬ鎖と抗体産生細胞由来のＨ鎖とが組合わされたモノクローナル抗体だけを分泌するハイブリドーマも、同時に得られる。このようにＮＳー１を細胞融合に用いた場合、種々の抗体を分泌するハイブリドーマが得られ、これらのハイブリドーマを分離するには、通常のクローニングおよび抗体活性の測定では困難であった。
【０００５】
また本発明者らが新たに見出だした知見によれば、上述のような３種のモノクローナル抗体を分泌する単一のハイブリドーマを継代培養したところ、培養中に、ハイブリドーマの遺伝子の脱離などが生じ、種々のハイブリドーマの混合物となることが観察された。即ち単一ハイブリドーマの継代培養により、上述の３種のモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ、抗体産生細胞由来のＨ鎖とＬ鎖が組み合わされたモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ、およびＮＳー１由来のＬ鎖と抗体産生細胞由来のＨ鎖とが組合わされたモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマの混合物が得られることが判明した。これらのハイブリドーマを分離することも、通常のクローニングおよび抗体活性の測定では困難である。
【０００６】
またＳＰ２／０のような自ら抗体を合成する能力を持たないマウス形質細胞腫細胞を用いてハイブリドーマを作製した場合でも、１つのマウス形質細胞腫細胞に多数の抗体産生細胞が融合した場合などには、上述の場合と同様に複数種のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ、および種々のモノクローナル抗体を産生する種々のハイブリドーマが得られると考えられ、それらの分離をすることも、通常のクローニングおよび抗体活性の測定では困難であった。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
通常、ＮＳー１由来のＬ鎖と抗体産生細胞由来のＨ鎖とが組合わされてできたモノクローナル抗体は、抗体産生細胞由来のＨ鎖とＬ鎖が組み合わされてできたモノクローナル抗体に比べて抗原結合能が低く、臨床診断などの超微量定量が必要とされる領域や、免疫学などにおける高度な特異性を要する分析試薬としては適当ではない。また複数種のモノクローナル抗体を産生する１つのハイブリドーマから、１種のモノクローナル抗体だけを分泌させる方法はなく、精製する段階で僅かに異なる抗体の分子量や電気的性質、疎水性などを利用して分離し、均一化していた。しかし、このような方法で抗体を均一化するためには熟練を要し、また、完全に均一化することは事実上困難である。
【０００８】
従って本発明は、各種のハイブリドーマを分離・選抜する方法を提供することを目的とし、それにより均一なモノクローナル抗体を得ることを目的とするものである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、本発明を完成するに至った。即ち本発明は、ハイブリドーマをクローニングし、次いでそのハイブリドーマが分泌する抗体を電気泳動および／またはクロマトグラフィーにかけることによりハイブリドーマをスクリーニングすることを特徴とする、ハイブリドーマの選抜方法である。以下、本発明をさらに詳細に説明する。
【００１０】
本発明では、クローニングは通常行われているハイブリドーマのクローニング方法でよく、例えば限界希釈法などがあげられる。具体的にはハイブリドーマを通常用いられている動物細胞培養用培地で培養し、限界希釈法にて１ウェルに１個のハイブリドーマが入るように、通常用いられる９６ウェルイムノプレートに分注する方法などがあげられる。
【００１１】
次いでクローニングされたハイブリドーマが分泌する抗体を、電気泳動および／またはクロマトグラフィーにかけることにより、ハイブリドーマをスクリーニングすればよい。ハイブリドーマが分泌する抗体は、ハイブリドーマをマウス腹水または培養液中で培養し、腹水または培養上清を回収することによって得ることができる。例えばイムノプレートでクローニングされたハイブリドーマを３７℃、９５％空気、５％ＣＯ2の雰囲気下で培養を続け、細胞が増殖してコロニーを形成する頃に、培養上清を採取すればよい。この培養上清に含まれる抗体は、単一のモノクローナル抗体とは限らず、前述のようにモノクローナル抗体の混合物の可能性がある。従って、それらを判別し、目的とする抗体を産生するハイブリドーマを選抜すべくスクリーニングを行う。
【００１２】
スクリーニングは、ハイブリドーマが分泌する抗体を電気泳動および／又はクロマトグラフィーにかけることによって行い、混在する可能性のある複数種のモノクローナル抗体が分離されるような条件下で行う。このときの抗体は、インタクトでも、またはＦａｂ、Ｆ（ａｂ）´２、Ｆａｂ´、Ｌ鎖、Ｈ鎖などフラグメント化したものでもかまわない。
【００１３】
電気泳動を用いる場合は、通常行われている方法により行えばよく、特に限定はない。混在する可能性のある複数種のモノクローナル抗体が分離されるような条件で泳動を行えばよく、特に還元系での電気泳動を行うことにより、混在するモノクローナル抗体のＬ鎖、Ｈ鎖の違いを認識することができる。例えば、ＳＤＳを用いたポリアクリルアミド電気泳動、アガロース電気泳動、等電点電気泳動などにより電気泳動を行えばよい。電気泳動を用いれば、多数の試料を同時に簡便に扱うことができる。
【００１４】
またクロマトグラフィーは、電気泳動と比較してより厳密に抗体の性質を認識することができるので、分離すべき複数の抗体のインタクトまたはフラグメントの分子量が互いに近いときには、特に好ましい方法である。クロマトグラフィーとしては、混在する種々のモノクローナル抗体が分離されるような条件で行えばよく、分離すべきモノクローナル抗体の性質に応じて適宜選択すればよい。例えば、分離すべきモノクローナル抗体に応じて、疎水クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィーなどにかけれはばよい。充填剤としては、具体的には、例えばＰｈｅｎｙｌ・５ＰＷ、ＤＥＡＥ・５ＰＷ、Ｇ３０００ＳＷXL（いずれも東ソー株式会社製）などがあげられる。
【００１５】
【発明の効果】
以上の説明から明らかなように本発明によれば、種々のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの混合物からから短期間で、遺伝子操作など必要なく簡便に、目的とするモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを選抜できる。このことにより、臨床診断などの超微量定量が必要とされる領域や、免疫学などにおける高度な特異性を要する研究のための分析試薬として、該モノクローナル抗体が果たす役割は非常に重要であると考えられる。
【００１６】
【実施例】
以下に本発明を実施例により詳細に説明する。しかし、本発明はこれらの実施例のみに限定されるものではない。
【００１７】
実施例１
（Ａ）ハイブリドーマのクローニング
マウス形質細胞腫細胞ＮＳー１とフェリチンに対する抗体産生細胞とを融合して得たハイブリドーマを、限界希釈法にてクローニングし、単一クローンのハイブリドーマＳＧ１１を得た。ハイブリドーマＳＧ１１は、３種のモノクローナル抗体を分泌する事が確認された。即ちＳＧ１１は、（１）ＮＳ−１由来のＬ鎖  （２本）と抗体産生細胞由来のＨ鎖（２本）とからなるモノクローナル抗体、  （２）抗体産生細胞由来のＨ鎖とＬ鎖とからなるモノクローナル抗体、（３）ＮＳ−１由来のＬ鎖（１本）と、抗体産生細胞由来のＨ鎖（２本）とＬ鎖（１本）とからなるモノクローナル抗体、の３種のモノクローナル抗体を分泌することが確認された。
【００１８】
このハイブリドーマＳＧ１１を１００日間継代培養した後、１０％牛胎児血清を含むＲＤＦ培地（極東製薬社製）（以下、１０％ＦＣＳＲＤＦと省略する）で培養し、血球計算盤で細胞数を計算した。細胞数を１ウェルあたり１個／１００μＬとなるように１０％ＦＣＳＲＤＦで希釈し、９６ウェルイムノプレート（インターメッド社製）に１００μＬずつ分注した。培養１０日目前後から細胞コロニーが認められたウェルについて、細胞を直径３ｃｍの培養用ディッシュ（Ｆａｌｃｏｎ社製）に移し、さらに１０％ＦＣＳＲＤＦを２ｍＬ加えた。培養を続け、細胞数が５×１０6個以上に増殖したら、培養上清を採取した。
【００１９】
（Ｂ）培養上清の電気泳動
上記培養上清２ｍＬにＰｒｏｔｅｉｎ−Ａ，ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（東ソー株式会社製）懸濁液１００μＬを加え、２時間、室温で振盪し、抗体を吸着させた。５分間静置してＰｒｏｔｅｉｎ−Ａ，ＴＯＹＯＰＥＡＲＬを沈澱させた後、上清を除去した。これにリン酸緩衝化生理食塩水（０. ８５％ＮａＣｌ含有０. ０１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７. ２；以下ＰＢＳと略す）２ｍＬを加えてＰｒｏｔｅｉｎ−Ａ，ＴＯＹＯＰＥＡＲＬを懸濁し、５分間静置した後上清を除去した。この洗浄操作を３回繰り返した。
【００２０】
洗浄後のＰｒｏｔｅｉｎ−Ａ，ＴＯＹＯＰＥＡＲＬに２０μＬの試料溶解液  （０. １２５ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，４％ドデシル硫酸ナトリウム、１０％βメルカプトエタノール、２０％シュークロース、０. ００４％ブロムフェノールブルー、ｐＨ６. ８）を加えて３分間煮沸した。試料溶液を５分間静置してＰｒｏｔｅｉｎ−Ａ，ＴＯＹＯＰＥＡＲＬを沈澱させた後、上清を１２％ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動にかけた。
【００２１】
また継代培養後クローニングする前のハイブリドーマＳＧ１１の培養上清も同様に処理し、電気泳動を行った。
【００２２】
（Ｃ）結果
結果を図１に示す。図からも明らかなように、ハイブリドーマＳＧ１１の分泌するモノクローナル抗体には２本のＬ鎖が認められた。また継代培養後のＳＧ１１をクローニングして得たハイブリドーマ５Ｈ６、５Ｇ３には、それぞれ５Ｈ６には低分子側に１本の、５Ｇ３については高分子側に１本のＬ鎖だけが認められた。従って、種々のハイブリドーマの混合物となった継代培養後のＳＧ１１から、単一のＬ鎖を持つモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ５Ｈ６、５Ｇ３を選抜することができた。
【００２３】
実施例２
（Ａ）試料調製
実施例１のクローニングして得たハイブリドーマ５Ｈ６、５Ｇ３および実施例１で得た継代培養後のハイブリドーマＳＧ１１の培養上清１０ｍＬを、予め吸着緩衝液（０. ２Ｍグリシン、０. ８Ｍ酒石酸ナトリウム、ｐＨ９. ０）で平衡化しておいた直径１ｃｍ、長さ２ｃｍのＰｒｏｔｅｉｎ−Ａ，ＴＯＹＯＰＥＡＲＬカラムに１ｍＬ／ｍｉｎの流速でかけ、抗体を吸着させた。吸着緩衝液を２０ｍＬ流してカラムを洗浄後、溶出緩衝液（０. １Ｍクエン酸ナトリウム、０. １５Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ３. ５）５ｍＬでＰｒｏｔｅｉｎ−Ａに結合したモノクローナル抗体を溶出した。溶出されたモノクローナル抗体に直ちに３ＭＴｒｉｓを加えてｐＨを７. ２にした。
【００２４】
（Ｂ）疎水クロマトグラフィーによる分析
（Ａ）で精製された培養上清中のモノクローナル抗体に等容量の２Ｍ硫酸アンモニウムを含むＰＢＳを加えた。これをＰｈｅｎｙｌ・５ＰＷ（７. ５ｍｍＩＤ×７. ５ｃｍ、東ソー（株）社製）に０分から５分まで１Ｍ硫酸アンモニウムを含むＰＢＳ、ｐＨ７. ４を用いて１ｍＬ／ｍｉｎの流速で吸着させ、次に５分から３５分まで１Ｍ硫酸アンモニウムを含むＰＢＳに対するＰＢＳの比率が０％から１００％のリニアグラジェントでモノクローナル抗体を溶出させた。
【００２５】
（Ｃ）結果
結果を図２〜４に示す。図中、横軸は溶出時間、縦軸は２８０ｎｍにおける吸光度を示す。図２からも明らかなように、ハイブリドーマＳＧ１１には３本のピークが溶出されており、３種類のモノクローナル抗体が分泌されることが認められた。また図３からハイブリドーマ５Ｈ６についてはピーク１のみ、図４からハイブリドーマ５Ｇ３についてはピーク３のみが認められ、それぞれ単一のモノクローナル抗体を産生することが明らかとなり、単一モノクローナル抗体を産生するそれらハイブリドーマを選択することができた。
【００２６】
以上の結果から、本発明によりハイブリドーマの混合物から、必要な均一なモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを選抜することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１で行った電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）の結果を示す図である。
【図２】実施例２で継代培養後のハイブリドーマＳＧ１１の培養上清を疎水クロマトグラフィーにかけたときの溶出図である。
【図３】実施例２でハイブリドーマ５Ｈ６の培養上清を疎水クロマトグラフィーにかけたときの溶出図である。
【図４】実施例２でハイブリドーマ５Ｇ３の培養上清を疎水クロマトグラフィーにかけたときの溶出図である。
【図１】
0003858945.tif 000002
【図２】
0003858945.tif 000003
【図３】
0003858945.tif 000004
【図４】
0003858945.tif 000005