(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ．少なくとも１つの検出可能なポリペプチドシグナルをコードする第１の核酸配列と、
ｂ．前記少なくとも１つの検出可能なポリペプチドシグナルをコードする第１の核酸配列に作動可能に連結し、少なくとも１つのプロテアーゼ認識部位をコードする第２の核酸配列と、
ｃ．前記少なくとも１つのプロテアーゼ認識部位をコードする第２の核酸配列に作動可能に連結し、未開裂のプロテアーゼバイオセンサーの細胞分布を特定の細胞内構造又は細胞質に制限する少なくとも１つの反応物標的配列をコードする第３の核酸配列とからなることを特徴とする前記プロテアーゼバイオセンサーをコードする組換え核酸。
【請求項２】
さらに、前記プロテアーゼバイオセンサーと酵素の酵素反応で生じる前記プロテアーゼバイオセンサーの断片の細胞分布を、特定の細胞内構造又は細胞質に制限する少なくとも１つの産物標的配列をコードする第４の核酸配列を含み、前記第４の核酸配列は、前記少なくとも１つの検出可能なポリペプチドシグナルをコードする第１の核酸配列に作動可能に連結した請求項１に記載の組換え核酸。
【請求項３】
さらに、少なくとも１つの検出可能なポリペプチドシグナルをコードする第５の核酸配列を含み、第５の核酸配列は、前記反応物標的配列をコードする第３の核酸配列に作動可能に連結した請求項１または２に記載の組換え核酸。
【請求項４】
前記検出可能なポリペプチドシグナルが蛍光タンパク質、発光タンパク質、配列エピトープ、および蛍光もしくは発光タンパク質を要求する補因子からなる群から選択されることを特徴とする請求項１乃至３のいずれか１項に記載の組換え核酸。
【請求項５】
検出可能なポリペプチド配列をコードする前記第１の核酸配列が配列番号：３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９および５１からなる群から選択される配列を含むことを特徴とする請求項１乃至３のいずれか１項に記載の組換え核酸。
【請求項６】
前記プロテアーゼ認識部位をコードする前記第２の核酸配列が配列番号：５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９および１２１からなる群から選択される配列を含むことを特徴とする請求項１に記載の組換え核酸。
【請求項７】
前記反応物標的配列をコードする前記第３の核酸が配列番号：１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、１４５、１４７、１４９および１５１からなる群から選択される配列を含むことを特徴とする請求項１に記載の組換え核酸。
【請求項８】
配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１および３３からなる群から選択される配列を含むプロテアーゼバイオセンサーをコードする組換え核酸。
【請求項９】
請求項１乃至８のいずれか１項に記載の前記組換え核酸に作動可能に連結したＤＮＡ制御配列を含む組換え発現ベクター。
【請求項１０】
ａ．少なくとも１つの検出可能なポリペプチドシグナルを含む第１のドメインと、
ｂ．少なくともプロテアーゼ認識部位を含む第２のドメインと、および
ｃ．未開裂のプロテアーゼバイオセンサーの細胞分布を特定の細胞内構造又は細胞質に制限する少なくとも１つの反応物標的配列を含む第３のドメイン、
とからなり、前記第１のドメインおよび前記第３のドメインが前記第２のドメインによって分離されていることを特徴とする組換えプロテアーゼバイオセンサー。
【請求項１１】
さらに、前記プロテアーゼバイオセンサーと酵素の酵素反応で生じる前記プロテアーゼバイオセンサーの断片の細胞分布を、特定の細胞内構造又は細胞質に制限する少なくとも１つの産物標的配列を含む第４のドメインからなり、前記第４のドメインおよび前記第３のドメインは前記第２のドメインによって分離されていることを特徴とする請求項１０に記載の組換えプロテアーゼバイオセンサー。
【請求項１２】
さらに、少なくとも１つの検出可能なポリペプチドシグナルを含む第５のドメインからなり、前記第５のドメインおよび前記第１のドメインは前記第２のドメインによって分離されていることを特徴とする請求項１０または１１に記載の組換えプロテアーゼバイオセンサー。
【請求項１３】
前記検出可能なポリペプチドシグナルが蛍光タンパク質、発光タンパク質、配列エピトープ、および蛍光または発光タンパク質を要する補因子からなる群から選択される請求項１０乃至１２のいずれか１項に記載のプロテアーゼバイオセンサー。
【請求項１４】
前記検出可能なポリペプチドシグナルを含む第１のドメインが配列番号：３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０および５２からなる群から選択される配列を含む請求項１０乃至１２のいずれか１項に記載のプロテアーゼバイオセンサー。
【請求項１５】
前記プロテアーゼ認識部位を含む前記第２のドメインが配列番号：５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０および１２２からなる群から選択される配列を含むことを特徴とする請求項１０に記載のプロテアーゼバイオセンサー。
【請求項１６】
前記反応物標的配列を含む第３のドメインが配列番号：１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０および１５２からなる群から選択される配列を含むことを特徴とする請求項１０に記載のプロテアーゼバイオセンサー。
【請求項１７】
配列番号：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２および３４からなる群から選択される配列を含む組換えプロテアーゼバイオセンサー。
【請求項１８】
請求項９に記載の前記組換え発現ベクターでトランスフェクトされている遺伝子工学作成宿主細胞。
【請求項１９】
ａ）請求項１０乃至１７のいずれか１項に記載の前記組換えプロテアーゼバイオセンサーを保有する宿主細胞を提供し、
ｂ）前記宿主細胞をテスト化合物と接触させ、
ｃ）前記宿主細胞における前記プロテアーゼバイオセンサー分布を測定する、ことからなり、前記プロテアーゼバイオセンサーの分布の変化が前記テスト化合物によるプロテアーゼ活性の修飾と相関することを特徴とする細胞中のプロテアーゼ活性を変調する化合物を同定する方法。
【請求項２０】
ａ）請求項１乃至８のいずれか１項に記載のプロテアーゼバイオセンサーをコードする前記組換え核酸、および
ｂ）宿主細胞中でプロテアーゼ活性を変調する化合物を同定するための前記組換え核酸の使用についての指示書、
からなることを特徴とする宿主細胞中でプロテアーゼ活性を変調する化合物を同定するためのキット。
【請求項２１】
ａ）請求項１０乃至１７のいずれか１項に記載の前記組換えプロテアーゼバイオセンサー、および
ｂ）宿主細胞中でプロテアーゼ活性を変調する化合物を同定するための前記組換えプロテアーゼバイオセンサーの使用についての指示書、
からなることを特徴とする宿主細胞中でプロテアーゼ活性を変調する化合物を同定するためのキット。
【請求項２２】
ａ）請求項９に記載の前記組換え発現ベクター、および
ｂ）宿主細胞中でプロテアーゼ活性を変調する化合物を同定するための前記組換え発現ベクターの使用についての指示書、
からなることを特徴とする宿主細胞中でプロテアーゼ活性を変調する化合物を同定するためのキット。
【請求項２３】
ａ）請求項１８に記載の前記遺伝子工学作成宿主細胞、および
ｂ）宿主細胞中でプロテアーゼ活性を変調する化合物を同定するための前記遺伝子工学作成宿主細胞の使用についての指示書、
からなることを特徴とする宿主細胞中でプロテアーゼ活性を変調する化合物を同定するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、薬物発見のための蛍光ベースの細胞および分子生物化学アッセイの分野にある。
【０００２】
（背景技術）
総合関連
本出願は、１９９６年５月２６日に出願された米国特許出願番号第６０／１３６，０７８号、１９９８年１０月３０日に出願された６０／１０６，３０８号、ならびに１９９７年２月２７日に出願された米国出願番号第０８／８１０９８３号の一部継続出願である１９９８年２月２７日に出願された出願番号第０９／０３１，２７１号の一部継続出願である１９９７年９月１７日に出願された０９／３９８，９６５号の一部継続出願である。
【０００３】
当該分野において現在行われている薬物発見は、特異的病気標的の同定、特異的標的に基づくアッセイの開発、アッセイの有効化、スクリーニングを生じるためのアッセイの最適化および自動化、「ヒット」を同定するためにアッセイを用いる化合物ライブラリーの高スループットスクリーニング、ヒットの有効化およびヒット化合物の最適化を含む長い複数のステップのプロセスである。このプロセスの結果は先導的な化合物であり、これは予備臨床実験に回され、もし有効化されれば、結局は臨床試験に回される。このプロセスにおいて、スクリーニング相はアッセイ開発相とは異なり、生きた生物学的系における化合物効率をテストすることを含む。
【０００４】
歴史的には、薬物の発見は遅くてコストのかかるプロセスであり、長い年数にわたり、創製された薬物当たり数億ドル消費する。ゲノミクスおよび高スループットスクリーニングの領域における開発の結果、標的同定およびスクリーニングした化合物の容量の分野において性能および効率の増加をもたらす。自動ＤＮＡ配列決定、ＰＣＲ適用、位置クローニング、ハイブリダイゼーションアッセイ、およびバイオインフォマティクスは、潜在的薬物スクリーニング標的を考慮する遺伝子（および遺伝子断片）の数を多いに増加させた。しかしながら、薬物スクリーニングのための基本的な概要は依然として同一である。
【０００５】
現存の方法およびプロトコルを用いる治療介入のためのポイントとしてのゲノム標的の有効化は、インビボ機能的モデル、組換えタンパク質の機能的分析、および候補遺伝子の安定な細胞系発現のような、使用される遅くて手動の方法のため、薬物発見プロセスにおいて窮屈なものとなった。自動配列決定を介して取得された一次ＤＮＡ配列データは遺伝子機能の同定を可能としないが、公知の配列データベースと比較した場合、通常の「モチーフ」および特異的遺伝子相同性についての情報を提供することができる。減算ハイブリダイゼーションおよびＲＡＤＥ（異なる発現の迅速増幅）のようなゲノム方法を用いて、病気状態モデルにおいて上昇または下降調節される遺伝子を同定することができる。しかしながら、同定および有効化は同経路の進行を遅くする。いくつかのプロテオミック方法は、逆方向遺伝学と組み合わせたタンパク質同定（グローバル発現アッセイ、２Ｄ電気泳動、無作為配列ライブラリー）を用いて注目する候補遺伝子を同定する。かかる無傷ｃＤＮＡとして単離された推定「病気関連配列」すなわちＤＡＳはこれらの方法で大きな利点であるが、それらは、コードされたタンパク質のタイプ、活性および分布に関するいずれの情報も提供することなく数百人によって同定される。薬物スクリーニング標的としてのＤＡＳのサブセットを選択することは「ランダム」であり、このように、病気とのメカニズム的リンクを提供する機能的データなしには極端に非効率的である。したがって、迅速にＤＡＳをスクリーニングして生物学的機能を確立するための新しい技術を提供し、薬物発見における標的有効化および候補最適化を改良する必要がある。
【０００６】
初期薬物発見生産性を改良するための３つの主要な途がある。まず、増大した情報取り扱い能力を提供するツールに対する要望がある。バイオインフォマティクスは、ＤＮＡ配列決定システムの迅速な開発およびゲノミクスデータベースの進化と共に花咲かせてきた。ゲノミクスは潜在的新しい標的の同定において非常に重要な役割を演じ始めている。プロテオミクスは、薬物相互作用を予測するのに、タンパク質標的の関連する構造および機能において不可欠なものとなった。しかしながら、生物学的複雑性の次のレベルは細胞である。従って、細胞からの多次元情報を取得し、管理し調査する必要がある。第２に、より高いスループットツールに対する要望がある。自動化は、ＤＮＡ配列決定および高スループット一次スクリーニングにおいて既に示されているように、生産性を改良する鍵となる。本発明は、より高いスループットツールに対する要望に適合する細胞から複数パラメータ情報を抽出する自動化システムを提供する。また、本発明はミニチュア化する方法を提供し、それにより、各アッセイで必要な試薬およびテスト化合物の用量を減少させつつ、増加したスループットを可能とする。
【０００７】
放射能は初期の薬物発見のアッセイにおいては支配的な読み出し情報であった。しかしながら、より多い情報、より高いスループットおよびミニチュア化に対する要望は蛍光検出を用いるものに向かってシフトを引き起こした。蛍光ベースの試薬は、スループットおよび情報含有量がより高く、試薬およびテスト化合物の、より少ない容量しか要しない、より強力な複数パラメータアッセイを生じさせることができる。また、蛍光は放射能ベースの方法よりもより安全かつより安価である。
【０００８】
染料および蛍光試薬で処理した細胞のスクリーニングは当該分野においてよく知られている。レポータ分子としての修飾された緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のような蛍光タンパク質を得るための細胞の遺伝子工学に関連する膨大な文献がある。野生型ＧＦＰのいくつかの特性はモリス(Morise)ら(Biochemistry13(1974)2656-2662頁）およびワード(Ward)ら(Photochem.Photobiol.31(1980)611-615頁）によって開示されている。オワンクラゲ(jellyfish Aequorea victoria)のＧＦＰは３９５ｎｍにおいて励起極大および５１０ｎｍにおいて発光極大を有し、蛍光活性のための外因性因子を要しない。前述の文献に開示されたＧＦＰについての使用は普及しており、遺伝子発現およびタンパク質の局所化の研究(チャルフィー(Chalfie)ら、Science 263(1994)12501-12504頁)を、細胞下オルガネラ（Rizzutoら、Curr.Biology5(1995)635-642頁)の可視化、分泌経路に沿ってのタンパク質輸送の可視化(ケーサー(Kaether)及びゲルデス(Gerdes),FEBS Letters 369(1995),267-271頁)、植物細胞(フー(Hu)およびチェン(Cheng),FEBS Letters 369(1995)331-334頁)およびショウジョウバエ肺(デービス(Davis)らDev.Biology 170(1995)726-729頁)における発現のためのツールとして、および注目する別のタンパク質に融合したレポータ分子（米国特許第５，４９１，０８４号）として含む。同様に、ＷＯ９６／２３８９８は、タンパク質キナーゼ活性下部位を有するＧＦＰ構築体を利用することによって細胞内プロセスに影響する生物学的活性物質を検出する方法に関する。この出願で引用したこの特許および全ての他の特許は引用してその全体を一体化させる。
【０００９】
多数の文献が生物学的系におけるＧＦＰタンパク質に関連する。例えば、ＷＯ９６／０９５９８はＧＦＰ様タンパク質の発現を利用して注目する細胞を単離するためのシステムを記載する。ＷＯ９６／２７６７５は植物におけるＧＦＰの発現を記載する。ＷＯ９５／２１１９１は突然変異形成を検出するための形質転換された生物で発現された修飾ＧＦＰタンパク質を記載する。米国特許第５，４０１，６２９号および第５，４３６，１２８号は、細胞表面レセプタを発現し、細胞表面レセプタの活性に応答する転写調節エレメントを含むレポータ遺伝子構築体を含有する組換え細胞を用い、細胞外シグナルの細胞内変換を検出し評価するためのアッセイおよび組成物を記載する。
【００１０】
数千の化合物についてスクリーニングを行うことは、多くの化合物およびアッセイ成分試薬の平行した取り扱いおよびプロセシングを要する。標準高スループットスクリーニング（「ＨＴＳ」）は、９６または３８４ウェルを持つ標準マイクロタイタープレート中のウェルのアレイにロードされたいくつかのインジケータ化合物と共に化合物および生物学的試薬の混合物を用いる。各ウェルから測定したシグナル（蛍光発光、光学密度または放射能いずれか）は、ウェル中の全ての物質からのシグナルを積分し、ウェル中の全ての分子の総じての集団平均を与える。
【００１１】
サイエンス・アプリケーション・インターナショナル株式会社(Science Applications International Corporation(SAIC))(130 Fifth Avenue Seattle,WA.98109)はイメージングプレートリーダーを記載する。このシステムは９６ウェルプレートの全面積をイメージするためにＣＣＤカメラを用いる。このイメージは分析され、ウェル中の全物質につきウェル当たりの全蛍光が計算される。
【００１２】
モレキュラー・デバイス社(Molecular Devices,Inc.(Sunnyvale,CA))は、低角レーザー走査照明およびマスクを用いて標準９６ウェルプレート中のウェルの底部のほぼ２００ミクロン内で蛍光を選択的に励起させ、細胞単層をイメージする場合にバックグラウンドを低下させるシステム（ＦＬＩＰＲ）を説明する。このシステムはプレート底部の全面積をイメージするためにＣＣＤカメラを使用する。このシステムはウェルの底部における細胞単層に由来するシグナルを測定するが、測定されたシグナルはウェルの領域にわたって平均され、従って細胞の集団の平均的応答の測定と依然として考えられる。このイメージは分析され、細胞ベースのアッセイにつきウェル当たりの全蛍光が計算される。また、マクロ−イメージングシステムを用いて全ウェル集団平均応答として観察される応答を開始するために、流体送達デバイスがＦＬＩＰＲシステムのような細胞ベースのスクリーニングシステムに取り込まれている。
【００１３】
高スループットスクリーニングとは対照的に、種々の高含有量スクリーニング（「ＨＣＳ」）は、細胞構成要素およびプロセスの時間的−空間的力学についてのより詳細な情報に対する要望に向けるために開発されてきた。高含有量スクリーニングは、細胞に取り込まれた特異的蛍光ベースの試薬に由来する多色蛍光情報の抽出を自動化する(ジュリアノ(Giuliano)およびテーラー(Taylor)(1995),Curr.Op.Cell Biol.7:4;ジュリアノ(Giuliano)ら(1995)Ann.Rev.Biophys.Biomol.Struct.24:405)。空間的ならびに時間的力学を測定できる光学システムを用いて細胞を分析する。(ファーカス(Farkas)ら(1993)Ann.Rev.Physiol.55:785;ジュリアノ(Giuliano)ら(1990)In Optical Microscopy for Biology.B.HermanおよびK.Jacobson(eds.)543-557頁。Wiley-Liss,New York;ハーン(Hahn)ら(1992)Nature 359:736;ワグナー(Waggoner)ら(1996)Hum.Pathol.27:494)。この概念は、標識された構成要素の活性についての空間的および時間的情報を有する「ウェル」として各細胞を処理することである。
【００１４】
細胞に適用された蛍光ベースの試薬を通じて今や接近可能である生化学および分子情報のタイプはイオン濃度、膜ポテンシャル、特異的転移、酵素活性、遺伝子発現ならびに代謝産物、タンパク質、脂質、炭水化物および核酸配列の存在、量、およびパターンを含む(デビアシオ(DeBiasio)ら(1996)Mol.Biol.Cell.7:1259;ジュリアノ(Giuliano)ら（1995)Ann.Rev.Biophys.Biomol.Struct.24:405;HeimおよびTsien(1996)Curr.Biol.6:178)。
【００１５】
高含有量スクリーニングは、蛍光標識抗体、生物学リガンドおよび／または核酸ハイブリダイゼーションプローブを用いて固定された細胞につき、あるいは多色蛍光インジケータおよび「バイオセンサー」を用いて生細胞につき行うことができる。固定されたもしくは生細胞のスクリーニングの選択は必要な特異的細胞ベースのアッセイに依存する。
【００１６】
固定された細胞アッセイは最も単純である。なぜなら、マイクロタイタープレート様式での最初に生きた細胞のアレイを種々の化合物で処理し、用量をテストし、次いで、細胞を特異的試薬で固定し、標識し、測定するからである。細胞の環境制御は固定後に必要である。空間的情報が取得されるが１つの時点においてのみである。細胞に適応することができる数千の抗体、リガンドおよび核酸ハイブリダイゼーションプローブの能力はこれを細胞ベースのスクリーニングの多くのタイプのため魅力的なアプローチとする。固定および標識ステップは自動化することができ、アッセイの効果的なプロセシングを可能とする。
【００１７】
生細胞アッセイはより精巧で強力である。なぜなら、所望の試薬を含有する生細胞のアレイは時間ならびに空間にわたってスクリーニングすることができるからである。細胞の環境制御（温度、湿度および二酸化炭素）が測定の間に必要である。なぜなら、細胞の生理学的健康が経時的に複数蛍光測定で維持されなければならないからである。細胞内での生化学および分子活性の変化を報告できる蛍光生理学的インジケータおよび「バイオセンサー」の増大しつつあるリストがある(ジュリアノ(Giuliano)ら(1995)Ann.Rev.Biophys.Biomol.Struct.24:405;ハーン(Hahn)ら(1993)In Fluorescent and Luminescent Probes for Biological Activity.W.T.Mason(ed.),349-359頁、Academic Press,San Diego)。
【００１８】
蛍光ベースの試薬の入手可能性および使用は、固定細胞および生細胞高含有量スクリーニング双方の開発を進めるのを助けてきた。多色高含有量情報を自動的に抽出する器具使用の進歩はＨＣＳを自動ツールに開発することを最近可能とした。テーラー(Taylor)らによる論文(American Scientists 80(1992),322-335頁）はこれらの方法およびそれらの適用の多くを記載する。例えば、プロフィト(Proffitt)ら（Cytometry 24:204-213(1996))は、種々の組織培養プレート様式、特に９６−ウェルマイクロタイタープレートにおいて原位置にて相対細胞数を定量するための半自動蛍光デジタルイメージングシステムを記載する。このシステムは電動ステージを備えたエピ蛍光倒立顕微鏡、ビデオカメラ、イメージ増感剤、およびＰＣ−ビジョンデジタイザーを備えたマイクロコンピュータからなるものであった。Ｔｕｒｂｏ  Ｐａｓｃａｌソフトウェアはステージを制御し、プレートを走査し、ウェル当たり複数イメージを撮る。このソフトウェアはウェル当たりの全蛍光を計算し、毎日のキャリブレーションを提供し、種々の組織培養プレート様式を容易に形成する。デジタルイメージの閾値設定および生細胞によって摂取される場合にのみ蛍光を発する試薬を用いて、過剰の蛍光試薬を除去することなくバックグラウンド蛍光を低下させる。
【００１９】
走査型共焦点顕微鏡イメージング(ゴー(Go)ら(1997)Analytical Biochemistry 247:210-215;ゴールドマン(Goldman)ら(1995)Experimental Cell Research 221:311-319)および多光子顕微鏡イメージング(デンク(Denk)ら(1990)Science 248:73;グラトン(Gratton)ら(1994)Proc.of the Microscopical Society of America,154-155頁)もまた、顕微鏡試料の高解像度イメージを取得するためのよく確立された方法である。これらの光学システムの主な利点は非常に浅い焦点深度であり、これは限定された軸程度の特徴がバックグラウンドに対して解像されることを可能とする。例えば、細胞表面の特徴から接着細胞の内部細胞質特徴を解像することが可能である。走査多光子イメージングは必要な高光子流速を発生するのに非常に短い持続のパルスレーザーシステムを必要とするので、蛍光の寿命もこれらのシステムで測定することができ(ラコウィッツ(Lakowicz)ら(1992)Anal.Biochem.202:316-330;Gerrittsenら(1997)J.of Fluorescene 7:11-15))、異なる検出モードのための更なる能力を提供する。半導体レーザーによるポンプレーザーのような小さくて信頼性があり、かつ比較的安価なレーザーシステムが今日利用できて、多光子共焦点顕微鏡がかなり日常的に適用できるようにする。
【００２０】
集団中の細胞の生物学的不均一性(ブライト(Bright)ら(1989).J.Cell.Physiol.141:410;ジュリアノ(Giuliano),(1996)Cell Motil.Cytoskel.35:237))ならびに細胞内に存在する化学的および分子的情報の高い空間的および時間的頻度の組み合わせは、存在する全マイクロタイタープレートリーダーを用いて細胞の集団から高含有量情報を抽出するのを不可能とする。個々に分析される細胞を用いる多色蛍光ベーススクリーニングのために、存在する高含有量スクリーニングプラットフォームは設計されていない。同様に、特にマイクロタイタープレート中で増殖した細胞から、ＨＣＳ分析によって同定される細胞応答を誘導する能力につき化合物を系統的にスクリーニングする目的で自動流体送達を細胞のアレイに組み合わせる方法は現在利用できない。さらに、１つのアッセイにおいて「ヒット」を同定するために高スループットウェル間測定を組み合わせ、続いてヒットとして同定されたウェルのみの同一プレートでの第２の高含有量細胞間測定を組み合わせる方法は当該分野では存在しない。
【００２１】
本発明は、多くの細胞スクリーニング様式を、蛍光ベースの分子試薬およびコンピュータベースの特徴抽出、データ解析および自動化と組み合わせることによって標的有効化および候補最適化を有意に改良する高スループットスクリーニング（ＨＴＳ）および高含有量スクリーニング（ＨＣＳ）を組み合わせ、その結果データ収集の増大した量およびスピード、短くされたサイクル時間および最終的には有望な薬物候補のより速い評価をもたらすシステム、方法およびスクリーニングを提供する。また、本発明は、ミニチュア化する方法を提供し、それにより、各アッセイに必要な試薬およびテスト化合物の容量を減少させつつ、増大したスループットを可能とする。
【００２２】
（発明の開示）
本発明の一つの特徴は、
・位置のアレイに蛍光レポータ分子を含有する細胞を提供し、
・１以上の試薬で位置のアレイ中の細胞を処理し、
・各位置における多数の細胞を蛍光光学でイメージし、
・光学情報をデジタルデータに変換し、
・デジタルデータを利用して、細胞中の蛍光標識レポータ分子の分布、環境または活性および細胞の分布を測定し、次いで、
・生物学的機能につきテストされるべき化合物の正の効果、負の効果または効果無しの項目につき、その情報を解釈する、
ことを含む細胞の分析方法に関する。
【００２３】
この実施形態において、この特徴に係る方法は、特定の生物学的機能に特異的に影響するものにつき多数の化合物をスクリーニングする目的で細胞中の蛍光標識レポータ分子の分布、環境または活性を迅速に測定する。位置のアレイは、位置のアレイに細胞を有するマイクロプレートであるマイクロタイタープレートまたはマイクロチップであり得る。好ましい実施形態において、この特徴に係る方法は、受領したデータを取得し、処理し、表示し、および記憶するためのコンピュータ化された手段を含む。好ましい実施形態において、この特徴に係る方法はさらに、細胞のアレイへの自動流体送達を含む。別の好ましい実施形態において、同一プレートで高スループットから得られた情報を用いて、プレート上の細胞位置のサブセットのみにつき高含有量スクリーニングを選択的に行う。
【００２４】
本発明の他の特徴は、
・顕微鏡対物レンズを有する高倍率蛍光光学系、
・細胞のアレイを含有するプレートを保持し、適切な整列のためにプレートを移動させ、細胞アレイに焦点を合わせるための手段を有するＸＹステージ、
・デジタルカメラ、
・励起光を細胞アレイに向けるための光学手段および細胞から発せられた蛍光をデジタルカメラに向けるための手段を有する光源、および
・デジタルカメラからのイメージを受け取るためのデジタルフレームグラバー、ユーザ対話型のためのディスプレイおよびアッセイ結果のディスプレイ、データ記憶および検索のためのデジタル記憶媒体、および結果の制御、取得、処理および表示のための手段を含み、デジタルカメラからのデジタルデータを受け取り、それを処理するコンピュータ手段
とを具備することを特徴とする細胞スクリーニングシステムを提供することである。
【００２５】
好ましい実施形態において、細胞スクリーニングシステムは、さらに、データを表示するためのコンピュータと作動可能に結合したコンピュータスクリーンを含む。別の実施形態において、デジタルカメラからのデジタルデータを受け取り処理するためのコンピュータ手段は、データをバイオインフォマティクスデータベースに記憶する。さらなる好ましい実施形態において、細胞スクリーニングシステムは、さらに、多くのまたは全てのウェルからのシグナルを平行して測定するリーダーを含む。別の好ましい実施形態において、細胞スクリーニングシステムは、さらに、高スループットおよび高含有量スクリーニングの間でモードを変化させるための、システムの倍率を変化させる機械的−光学手段を含む。別の好ましい実施形態において、細胞スクリーニングシステムは、さらに、プレートを囲う温度、ＣＯ２濃度および湿度を、細胞を生きて保つのに必要なレベルに維持するためのチャンバーおよび制御システムを含む。さらなる好ましい実施形態において、細胞スクリーニングシステムは共焦点走査照明および検出システムを利用する。
【００２６】
本発明のさらに他の特徴は、特異的細胞構成要素の分布および活性を規定する手法を細胞スクリーニングシステムに実行させるための指令の組を含有するプログラムを含む機械読み取り可能な記憶媒体を提供することである。好ましい実施形態において、細胞スクリーニングシステムは、細胞を保持するのに適したステージおよびこのステージを移動させるための手段を備えた高倍率蛍光光学系、デジタルカメラ、デジタルカメラからのデジタルデータを受け取り処理するための光源、およびデジタルカメラからデジタルデータを受け取り処理するためのコンピュータ手段を含む。機械読み取り可能な記憶媒体の好ましい実施形態は、図９、１１、１２、１４または１５に記載された手法を細胞スクリーニングシステムに実行させるための指令の組からなるプログラムを含む。別の好ましい実施形態は、特異的細胞構成要素およびプロセスの分布および活性を検出する手法を細胞スクリーニングシステムに実行させるための指令の組からなるプログラムを含む。最も好ましい実施形態において、細胞プロセスは、限定されるものではないが、タンパク質の各転移、細胞肥大、アポトーシス、およびタンパク質のプロテアーゼ−誘導転移を含む。
【００２７】
別の好ましい実施形態において、転写因子活性、タンパク質キナーゼ活性、細胞形態、微小管構造、アポトーシス、レセプタ内部化、およびタンパク質のプロテアーゼ−誘導転移に影響する化合物を同定するためのスクリーニングを含めた種々の自動細胞スクリーニング方法が提供される。
【００２８】
本発明のさらに他の特徴は、
ａ．少なくとも１つの検出可能なポリペプチドシグナルをコードする第１の核酸配列、
ｂ．少なくとも１つのプロテアーゼ認識部位をコードする第２の核酸配列、ここに、第２の核酸配列は、少なくとも１つの検出可能なポリペプチドシグナルをコードする第１の核酸配列に作動可能に連結しており、および
ｃ．前記第３の核酸配列は、少なくとも１つのプロテアーゼ認識部位をコードする第２の核酸配列に作動可能に連結し、少なくとも１つの反応体標的配列をコードする第３の核酸配列
とを具備するプロテアーゼバイオセンサーをコードする組換え核酸を提供することである。
【００２９】
また、本発明は、プロテアーゼバイオセンサーをコードする組換え核酸を発現できる組換え発現ベクター、ならびに発現ベクターでトランスフェクトされた遺伝的に修飾された宿主細胞を提供する。
【００３０】
本発明は、さらに、
ａ．少なくとも１つの検出可能なポリペプチドシグナルを含む第１のドメイン、
ｂ．少なくとも１つのプロテアーゼ認識部位を含む第２のドメイン、および
ｃ．少なくとも１つの反応体標的配列を含む第３のドメイン、
を含み、第１のドメインおよび第３のドメインが第２のドメインによって分離されていることを特徴とする組換えプロテアーゼバイオセンサーを提供する。
【００３１】
（発明を実施するための最良の形態）
全ての引用した特許、特許出願および他の文献は、全体に参照してここに組み込まれる。
【００３２】
本明細書中で用いるように、以下の用語は特定の意味を要する。
【００３３】
細胞ドメインのマーカ。特異的オルガネラまたは分子を含めた特定の細胞構成要素に対して高い親和性を有する発光プローブ。これらのプローブは、「標識試薬」、「環境インジケータ」または「バイオセンサー」として使用される小さな発光分子または抵抗タグ付きマクロ分子いずれかであり得る。
【００３４】
標識試薬。標識試薬は、限定されるものではないが、蛍光タンパク質アナログおよびバイオセンサーを含めた発光標識マクロ分子、緑色蛍光タンパク質およびその突然変異体で形成されたものを含めた発光マクロ分子キメラ、生理学的応答に関与した細胞抗原と反応する発光標識一次または二次抗体、発光染料および染料、および他の小分子を含む。
【００３５】
細胞転移のマーカ。いくつかの細胞プロセスまたは生理学的応答の間に１つのドメインから別のドメインに移動する発光タグ付きマクロ分子またはオルガネラ。転移マーカは細胞ドメインのマーカに対して位置を単に報告できるか、あるいはそれらは同様にいくつかの生化学または分子活性を報告する「バイオセンサー」でもあり得る。
【００３６】
バイオセンサー。内部でまたはその表面で起こる環境変化を報告する、生物学的機能ドメインおよび発光プローブまたはプローブ類からなるマクロ分子。「蛍光−タンパク質バイオセンサー」と言われてきたこれらの変化を検知し報告するように設計された発光標識マクロ分子のクラス。バイオセンサーのタンパク質構成要素は高度に進化した分子認識部位を提供する。活性部位の近隣のタンパク質構成要素に付着した蛍光分子は、本発明の細胞走査システムのような適当な時間的および空間的解像度を持つシステムを用いて検出される蛍光シグナルに環境変化を変換する。生細胞内の天然タンパク質活性の変調は可逆的であるので、かつ蛍光−タンパク質バイオセンサーはタンパク質活性の可逆的変化を検知するために設計できるので、これらのバイオセンサーは実質的に再利用可能である。
【００３７】
病気関連配列（「ＤＡＳ」）。この用語は、薬物候補化合物のものであるように、一次ＤＮＡ配列データのような標準技術、減算ハイブリダイゼーションおよびＲＡＤＥのようなゲノム方法、および逆遺伝学と組み合わせたプロテオミック方法によって同定された核酸配列を言う。この用語は、配列が病気状態と関連するに過ぎないことを意味しない。
【００３８】
高含有量スクリーニング（ＨＣＳ）は、シグナル変換経路のような複雑な分子事象に対する薬物の効果、ならびに限定されるものではないがアポトーシス、細胞分裂、細胞接着、移動、エキソサイトーシス、および細胞間通信を含めた細胞機能を測定するのに用いることができる。多色蛍光は複数標的および細胞プロセスが単位スクリーニングでアッセイされることを可能とする。細胞応答の交差−関連は、標的有効化およびリード最適化に必要な情報の利点を生じる。
【００３９】
本発明の１つの態様において、顕微鏡対物レンズ、細胞を保持するための位置のアレイを備えたプレートを保持するのに適し、プレートを移動させて顕微鏡対物レンズを備えた位置を整列させるための手段を有するＸＹステージおよびプレートを焦点合わせを行う方向に移動させるための手段を有する高倍率蛍光光学、位置のアレイにある細胞に励起光を向けるための光学手段および細胞から発せられた蛍光をデジタルカメラに向けるための手段を有する光源、およびデジタルカメラからのデジタルデータを受け取り処理するためのコンピュータ手段を含み、ここに、コンピュータ手段は、カメラからのイメージを受け取るためのデジタルフレームグラバー、ユーザ相互作用のためのディスプレイおよびアッセイ結果のディスプレイ、データ記憶および検索のためのデジタル記憶媒体、および結果の制御、取得、処理および表示のための手段を含むことを特徴とする細胞スクリーニングシステムが提供される。
【００４０】
図１は、細胞走査システムの好ましい実施形態の模式図である。カメラに対して１−１００×の倍率を持つ標準的な対物レンズ、および電源２を備えた白色光源（例えば、１００Ｗ水銀灯または７５Ｗキセノンランプ）を使用するツァイス・アキシオバート(Zeiss Axiovert)倒立型蛍光顕微鏡のような倒立型蛍光顕微鏡１を用いる。プレート４を顕微鏡対物レンズ上にＸＹ方向に移動させるためのＸＹステージ３がある。Ｚ軸焦点ドライブ５は焦点合わせのために対物レンズをＺ方向に移動させる。ジョイスティック６はＸＹＺ方向のステージの手動移動を提供する。高分解能デジタルカメラ７は、プレート上の各ウェルまたは位置からイメージを取得する。カメラ電源８、自動コントローラ９および中央プロセシングユニット１０がある。ＰＣ１１はディスプレイ１２を提供し、関連ソフトウェアを有する。プリンタ１３はハードコピーレコードの印刷を提供する。
【００４１】
図２は、本発明の顕微鏡アセンブリ１の１つの実施形態の模式図であり、ＸＹステージ３、Ｚ軸焦点ドライブ５、ジョイスティック６、光源２、および自動コントローラ９をより詳細に示す。各々、コンピュータ１５および顕微鏡１６へのケーブルが提供される。加えて、図２は、ＸＹ方向にＸＹステージ３上に移動する９６ウェルマイクロタイタープレート１７を示す。光源２からの光はＰＣ制御のシャッター１８を通って、励起フィルタ２０を備えた電動フィルタホイール１９まで通過する。光は、ダイクロイックミラー２６および発光フィルタ２７を有するフィルタキューブ２５を通過する。励起光はダイクロイックミラーで反射してマイクロタイタープレート１７中のウェルに至り、蛍光２８はダイクロイックミラー２６および発光フィルタ２７を通ってデジタルカメラ７まで通過する。
【００４２】
図３は、好ましいカメラアセンブリの模式的図面を示す。露光制御のための自動シャッターおよび電源３１を含有するデジタルカメラ７は顕微鏡アセンブリからの蛍光２８を受け取る。デジタルケーブル３０はデジタルシグナルをコンピュータまで輸送する。
【００４３】
前述した標準的な光学立体配置は、カメラセンサー上に検体の拡大されたイメージを直接的に生じさせて検体の高分解能イメージを捕らえるために顕微鏡光学を用いる。この光学システムは、通常、「広視野」顕微鏡という。顕微鏡の分野の当業者であれば、検体の高分解能イメージは、限定されるものではないが、検体上を走査した照明の焦点合わせした点または線の標準的な走査共焦点検出(ゴー(Go)ら,1997,上記)、および多光子走査型共焦点顕微鏡(デンク(Denk)ら,1990,上記)（この双方は、ＣＣＤ検出器上に、または光電子増倍管のアナログ出力の同調デジタル化によってイメージを形成することができる）含めた種々の他の光学系によって生じさせることができるのを認識するであろう。
【００４４】
スクリーニング適用において、特定の細胞系または一次細胞培養を用いてそれらの細胞の特定の特徴を利用するのがしばしば必要である。細胞培養の分野の当業者であれば、いくつかの細胞系は接触阻止され、それらは他の細胞によって囲まれるようになると増殖を停止し、他方、他の細胞系はそれらの条件下で増殖し続け、この細胞は文字通り積み上がり、多くの層を形成することを認識するであろう。そのような細胞系の実施例はＨＥＫ２９３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５７３）系である。多層調製物中の単一細胞層のイメージを取得できる光学系は、層を形成する傾向がある細胞系で用いるのに必要である。広視野顕微鏡の視野の大きな深度は、多層の細胞を通っての投影であるイメージを生じ、層形成細胞で極端に困難な細胞下空間分布の分析をなす。別法として、共焦点顕微鏡で達成することができる視野の非常に浅い深度（約１ミクロン）は高分解能にて単一細胞層の区別を可能とし、細胞下空間分布の測定を単純化する。同様に、蛍光寿命イメージングのような検出モードが必要とされる場合に共焦点イメージングが好ましい。
【００４５】
顕微鏡のための標準的共焦点イメージング結合の出力はデジタルイメージであり、これは、他の前述した細胞スクリーニングシステムによって生じたイメージと同一のフォーマットに変換することができ、従って、それらのイメージと正確に同様に処理することができる。この実施形態における総じての制御、取得および分析は実質的に同一である。共焦点顕微鏡システムの光学配置は、照明器および検出器を除いて前述したものと実質的に同一である。共焦点顕微鏡で必要な照明および検出システムは、本発明のもののような標準的顕微鏡光学系に付着されるアクセサリとして設計されている(ツァイス(Zeiss),ドイツ製(Germany))。従って、これらの代替光学系は前述したようにシステムに容易に取り込むことができる。
【００４６】
図４は本発明の代替実施形態を示し、ここに、細胞アレイはマイクロプレート４１上のマイクロウェル４０の中にあり、これは出典明示してその全体を本明細書の一部とみなす同時係属米国出願Ｓ／Ｎ  ０８／８６５，３４１に記載されている。典型的には、８６ｍｍ×１２９ｍｍである標準９６ウェルマイクロタイタープレートと比較して、マイクロプレートは２０ｍｍ×３０ｍｍである。マイクロプレート上の細胞のより高い密度のアレイは、マイクロプレートが、高スループットのために画素当たり数ミクロンの低分解能にてイメージされるのを可能とし、マイクロプレート上の特定の位置が画素当たり０．５ミクロン未満のより高い分解能にてイメージされるのを可能とする。これらの２つの分解能モードはシステムの全スループットを改良するのを助ける。
【００４７】
マイクロプレートチャンバー４２は化合物の細胞への付加のためのミクロ流体送達系として働く。マイクロプレートチャンバー４２中のマイクロプレート４１はＸＹマイクロプレートリーダー４３中に入れられる。デジタルデータは前述したように処理される。マイクロプレートシステムの小さなサイズはスループットを増加させ、試薬の容量を最小化し、速くて正確な細胞ベースの分析のための細胞の分布および変位の制御を可能とする。処理されたデータはＰＣスクリーン１１上に表示でき、培養情報科学データベース４４の一部をなす。このデータベースは本発明の方法を通じて得られたデータの記憶および検索を可能とするのみならず、細胞に関する外的データの取得および記憶を可能とする。図５はソフトウェアの操作を説明するＰＣディスプレイである。
【００４８】
代替実施形態において、高スループットシステム（ＨＴＳ）は同一プラットフォーム上または電子的に（局所領域ネットワークを介して）結合した２つの別々のプラットフォーム上でＨＣＳと直接カップリングされる。デュアルモード光学系といわれる本発明のこの実施形態は、それをＨＴＳとカップリングさせ、それにより、カップリングされたＨＴＳにおいて応答を示すウェルの小さなサブセット上のみのより遅い高分解能データ取得および分析を必要とすることによって、ＨＣＳのスループットを増加させる利点を有する。
【００４９】
高スループット「全プレート」リーダーシステムは当該分野においてよく知られており、通常は、非常に多数の化合物をスクリーニングするのに使用されるＨＴＳシステムの構成要素として使用される(ベグス(Beggs)(1997),J.of Biomolec.Screening 2:71-78;マカフレー(Mccaffrey)ら(1996)J.Biomolec.Screening 1:187-190)。
【００５０】
デュアルモード細胞ベースのスクリーニングの１つの実施形態において、１つのプラットフォーム上で高スループット取得が起こり、第２のプラットフォーム上で高含有量取得が起こる２プラットフォーム構築が提供される（図６）。プロセシングは各プラットフォーム上で独立して起こり、結果はネットワークインターフェースを通過し、あるいは単一コントローラを用いて両プラットフォームからのデータを加工する。
【００５１】
図６に示されるように、例示した２プラットフォームデュアルモード光学系は、マイクロプレート上のマイクロタイタープレートまたはマイクロウェルアレイ中で培養した細胞から発せられた蛍光を読み取り、電子的結合６４を介して相互に連絡する２光光学インスツルメント、高スループットプラットフォーム６０および高含有量プラットフォーム６５からなる。高スループットプラットフォーム６０は平行してまたは迅速系列的様式にて全プレート中の全てのウェルを分析する。スクリーニングの分野の当業者であれば、デュアルモード細胞ベースのスクリーニングシステムに取り込むことができる多くのそのような商業的に入手可能な高スループットリーダーシステムがあるのを認識するであろう(Topcount (Packard Instruments,Meriden,CT);Spectramax,Lumiskan(Molecular Devices,Sunnyvale,CA);Fluoroscan(Labsysytems,Beverly,MA))。前述した高含有量プラットフォーム６５はウェル間で走査し、ウェル内の個々の細胞から収集された高分解能イメージデータを分析する。
【００５２】
システムのコンピュータ６２に存在するＨＴＳソフトウェアは高スループット器具を制御し、結果はモニター６１に表示される。そのコンピュータシステム６７に存在するＨＣＳソフトウェアは高含有量器具ハードウェア６５、任意のデバイス（例えば、プレートローダー、環境チャンバー、流体ディスペンサ）を制御し、プレートからのデジタルイメージデータを解析し、モニター６６上に結果を表示し、統合したデータベースに測定されたデータを管理する。２つのシステムは単一のコンピュータを共有し、この場合、局所領域ネットワークがデータを移動させる必要なくして、全てのデータがそのコンピュータに収集され、加工され、表示されるであろう。当該分野においてよく知られているように、手動によりまたはロボットプレート移動デバイスによって、マイクロタイタープレートは高スループットシステムから高含有量システム６３に移動される(ベグス(Beggs)(1997),上記;マカフレー(Mccaffrey)(1996)，上記)。
【００５３】
好ましい実施形態において、デュアルモード光学系は単一プラットフォームシステムを利用する（図７）。それは２つの別の光学モジュール、ある時点で１つのみがマイクロタイタープレート２０１からデータを収集するのに使用されるように独立してまたは集合的に移動することができるＨＣＳモジュール２０３およびＨＴＳモジュール２０９からなる。マイクロタイタープレート２０１は電動Ｘ、Ｙステージに設置され、従って、それはＨＴＳまたはＨＣＳモードいずれかでイメージングするために位置決定することができる。後記するようにＨＴＳイメージデータを収集し、分析した後、ＨＴＳ光学モジュール２０９を光路から外し、ＨＣＳ光学モジュール２０３を所定の位置に移動させる。
【００５４】
ＨＴＳ２０９のための光学モジュールは投影レンズ２１４、励起波長フィルタ２１３およびダイクロイックミラー２１０からなり、これらを用いて、通常の顕微鏡ランプシステム（図示せず）からの特定波長バンドにてプレートの全底部を照明する。蛍光発光は、センサー２１５を備えたカメラ２１６上にイメージを形成するレンズ２１２によってダイクロイックミラー２１０および発光波長フィルタ２１１を通って収集される。
【００５５】
ＨＣＳ２０３のための光学モジュールは投影レンズ２０８、励起波長フィルタ２０７およびダイクロイックミラー２０４からなり、これらを用いて、標準的顕微鏡照明システム（図示せず）から、顕微鏡対物レンズ２０２の裏側開口、およびそれにより、その対物レンズの視野を照明する。蛍光発光は顕微鏡対物レンズ２０２によって収集され、ダイクロイックミラー２０４および発光波長フィルタ２０５を通過し、センサー２１５を備えた同一カメラ２１６上にイメージを形成するチューブレンズ２０６によって焦点が結ばれる。
【００５６】
本発明の代替実施形態において、細胞スクリーニングシステムは、さらに、細胞スクリーニング方法の生細胞実施形態で使用するための流体送達デバイスを含む（以下参照）。図８は本発明のシステムで使用される流体送達デバイスを例示する。それは、単一モータドライブによって駆動される１２のシリンジポンプ７０１のバンクからなる。各シリンジ７０２は各ウェルに送達されるべき容量に従ったサイズ、典型的には１から１００μｌの間である。各シリンジは柔軟なチューブ７０３を介して標準的なピペットチップ７０５を受け入れるコネクタの同様のバンクに付着される。ピペットチップのバンクは、それがマイクロタイタープレート７０６に対して下降または上昇されて各ウェルに流体を送達できるように、駆動システムに付着される。プレートはＸ，Ｙステージに設置され、データ収集目的で光学系７０７に対する移動を可能とする。この設定は、一組のピペットチップ、または単一のピペットチップさえが、試薬をプレート上の全てのウェルに送達するのを可能とする。シリンジポンプのバンクは流体を１２のウェルに同時に送達するか、あるいは先端のいくつかを取り出すことによってより少数のウェルに送達するのに使用することができる。
【００５７】
別の態様において、本発明は、複数細胞を含有する位置のアレイを提供し、ここに、この細胞は１以上の蛍光レポータ分子を含有し、細胞を含有する位置の各々にある複数細胞を走査して細胞中の蛍光レポータ分子から蛍光シグナルを得、蛍光シグナルをデジタルデータに変換し、次いで、細胞内の蛍光レポータ分子の分布、環境または活性を測定することを特徴とする細胞の分析方法を提供する。
【００５８】
細胞アレイ
特定の生物学的機能に関する活性についての多数の化合物をスクリーニングすることは、細胞および試薬の平行した取り扱いのための細胞のアレイを調製することを要する。８６ｍｍ×１２９ｍｍで、９ｍｍピッチで６ｍｍ直径を持つ標準９６ウェルマイクロタイタープレートを、現行の自動ローディングおよびロボット取り扱い系に適合させるために使用する。マイクロプレートは、典型的には、２０ｍｍ×３０ｍｍであり、約５００ミクロンのピッチで寸法が１００−２００ミクロンである細胞位置を持つ。マイクロプレートを作成する方法は、参照としてその全体に組み込まれる米国特許出願番号０８／８６５，３４１に記載されている。マイクロプレートは、細胞が付着した材料の共平面層からなり、細胞が付着するであろう材料でパターン化されているか、あるいは同様のパターン化材料のエッチングされた三次元表面を持つ。以下の議論の目的では、用語「ウェル」および「マイクロウェル」とは、それに細胞が付着される、あるいはその中で細胞がイメージされるいずれかの構成のアレイにおける位置をいう。また、マイクロウェルはウェル間のスペースに流体送達チャンネルを含むことができる。同様の様式のマイクロプレートは、調製の間の試薬、記憶および取り扱いの量、および走査操作に必要な全移動を最小化することによってシステムの全効率を増大させる。加えて、マイクロプレートの全領域をより効果的にイメージすることができ、本明細書で後に記載するマイクロプレートリーダーでの第２のモードの操作を可能とする。
【００５９】
蛍光レポータ分子
新しい薬物発見範例の主要構成要素は、分子内イオン、代謝産物、マクロ分子およびオルガネラの時間的および空間的分布、含有量および活性を測定するのに使用される蛍光および発光試薬の継続して増大するファミリーである。これらの試薬のクラスは、生細胞および固定細胞中の分子の分布および量を測定する標識試薬、時間および空間におけるシグナル変換事象を報告する環境インジケータ、および生細胞内での試薬分子活性を測定する蛍光タンパク質バイオセンサーを含む。単一細胞においていくつかの試薬を組み合わせるマルチパラメータアプローチは薬物発見のための強力な新しいツールである。
【００６０】
本発明の方法は特異的細胞構成要素に対する蛍光または発光分子の高い親和性に基づいている。特異的構成要素に対する親和性は、イオン相互作用、共有結合（タンパク質ベースの色原体、発蛍光体、およびルミフォアとのキメラ融合を含む）、ならびに疎水性相互作用、電気ポテンシャルおよび、ある場合は、細胞構成要素内での単純な捕獲のような物理的力によって支配される。発光プローブは小分子、標識マクロ分子、または遺伝子工学作成タンパク質であり得るが、限定されるものではなく、緑色蛍光タンパク質キメラを含む。
【００６１】
当業者であれば、限定されるものではないが、タンパク質、リン脂質およびＤＮＡハイブリダイジングプローブのような蛍光標識生体分子を含めた、本発明で用いることができる広く種々の蛍光レポータを認識するであろう。同様に、結合または会合の特定の化学的特性でもって特異的に合成された蛍光試薬は蛍光レポータ分子として使用されてきた(バラク(Barak)ら(1997),J.Biol.Chem.272:27497-27500;サウスウイィック(Southwick)ら,(1990),Cytometry 11:418-430;Tsien(1989)in Methods in Cell Biology, Vol.29 テーラー(Taylor)およびWang(編),127-156頁)。蛍光標識抗体は、細胞または組織と同程度に複雑な分子の混合物中の単一分子に付着するためのその高度な特異性度のため特に有用なレポータ分子である。
【００６２】
発光プローブは生細胞内で合成することができるか、あるいは、拡散、促進化または能動輸送、シグナル−配列−媒介輸送、およびエンドサイトーシスまたはピノサイトーシス摂取を含めたいくつかの非機械的様式を介して細胞に輸送することができる。また、当該分野においてよく知られた機械的バルクローディング方法を用いて、発光プローブを生細胞にロードすることもできる(バーバー(Barber)ら(1996),Neuroscience Letters 207:17-20;Brightら(1996),Cytometry24:226-233;McNeil(1989)in Methods in Cell Biology,Vol.29,テーラー(Taylor)およびワン(Wang)(編),153-173頁)。これらの方法はエレクトロポシーションならびにスクレイプ−ローディング、ビーズ−ローディング、インパクト−ローディング、シリンジ−ローディング、高張および低張ローディングのような他の機械的方法を含む。加えて、細胞は遺伝子工学的に作成して、従前に記載されているような注目するタンパク質にカップリングされた、ＧＦＰのようなレポータ分子を発現させることができる(チャルフィー(Chalfie)およびPrasher,米国特許第５，４９１，０８４号;Cubittら(1995),Trends in Biochemical Science 20:448-455)。
【００６３】
いったん細胞中に入れば、発光プローブは、標的ドメインとの特異的および高親和性相互作用ならびにシグナル−配列−媒介輸送のような分子標的化の他のモードの結果としてそれらの標的ドメインに蓄積する。蛍光標識レポータ分子は、レポータの位置、量および化学的環境を測定するのに有用である。例えば、レポータが親油性膜環境にあるかまたはより水性環境にあるかを測定することができる(ジュリアノ(Giuliano)ら(1995),Ann.Rev.of Biophysics and Biomolecular Structure 24:405-434;ジュリアノ(Giuliano)およびテーラー(Taylor)(1995),Methods in Neuroscience 27:1-16)。レポータのｐＨ環境を測定することができる(ブライト(Bright)ら(1989),J.Cell Biology 104:1019-1033;ジュリアノ(Giuliano)ら(1987),Anal.Biochem.167:362-371;Thomasら(1979),Biochemistry 18:2210-2218)。キレート化基を有するレポータがＣａ＋＋のようなイオンに結合するか否かが測定できる(Brightら(1989),In Methods in Cell Biochemistry (Tokyo)251:405-410;Tsien(1989)In Methods in Cell Biology,Vol.30,テーラー(Taylor)およびワン(Wang)(編),127-156頁)。
【００６４】
さらに、オルガネラ内のある細胞型は、他の細胞型では起こり得ない特異的に標識することができる構成要素を含有し得る。例えば、内皮細胞はしばしば分極した膜構成要素を含有する。すなわち、これらの細胞はその原形質膜に沿ってマクロ分子を非対称的に分布させる。結合または支持組織は、しばしば、その細胞型に特異的な分子（例えば、ヘパリン、ヒスタミン、セロトニン等）が捕獲された顆粒を含有する。ほとんどの筋肉組織細胞は筋小胞体、その機能が細胞質内のカルシウムイオンの濃度を調製することにある特殊化されたオルガネラを含有する。多くの神経組織細胞は、神経ホルモンまたは神経伝達物質が捕獲された二次顆粒および小胞を含有する。従って、蛍光分子は、特異的細胞内の特異的構成要素のみならず混合された細胞型の集団内の特異的細胞も標識するように設計することができる。
【００６５】
当業者であれば、広く種々の蛍光を測定する方法を認識するであろう。例えば、ある蛍光レポータ分子は励起または発光スペクトルの変化を呈し、あるものは、１つの蛍光レポータが蛍光を喪失する一方で第２のものが蛍光を取得する共鳴エネルギー移動を呈し、あるものは蛍光の喪失（消光）または出現を呈し、他方、あるものは合理的移動を呈する(ジュリアノ(Giuliano)ら(1995),Ann.Rev.of Biophysics and Biomol.Structure 24:405-434;ジュリアノ(Giuliano)ら(1995),Methods in Neuroscience 27:1-16)。
【００６６】
細胞アレイの走査
図９を参照し、実行すべきアッセイ、試料内の蛍光シグナルの分布についての細胞スクリーニングシステムによるデータ取得および対話型データレビューおよび分析に基づいて選択されるべきオペレータ−指向性パラメータを含む細胞を分析する好ましい実施形態が提供される。自動走査の開始において、オペレータは、試料を記載し、使用すべき生物学的標識および求められる情報にマッチするフィルタ設定および蛍光チャンネルを特定し、次いで、試料の明るさをマッチさせるようにカメラ設定を調整する情報１００を入力する。ある範囲の試料を取り扱う柔軟性については、ソフトウェアは、核および細胞質を同定するのに用いる種々のパラメータ設定の選択、および異なる蛍光試薬、形態または明るさに基づく注目する細胞の同定、およびウェル当たりの分析すべき細胞数の選択を可能とする。これらのパラメータは、各自動実行用の容易な検索のためにシステムに記憶される。システムの対話型細胞同定モードは、分析すべき細胞のサイズ、形状および強度の範囲のような形態的パラメータの限界の選択を単純化する。ユーザは、システムのプレートのいずれのウェルが走査するか、およびいくつの視野またはいくつの細胞を各ウェルで分析すべきか特定する。ステップ１０１におけるユーザによって選択された設定モードに応じて、システムは、プレートの領域を自動的に予め焦点合わせして、プレート１０２の「焦点を見出す」に対するオートフォーカス手法を用いて走査されるようにするか、あるいはユーザが、走査されるべき三角形領域を規定する３つの「タグ」点を選択することによって走査領域を対話型により予め焦点合わせする１０３。最小自乗「焦点平面モデル」を次いでこれらのタグ点から計算して、自動走査の間に各ウェルの焦点を評価する。各ウェルの焦点は、走査の間に焦点平面モデルから内挿することによって見積もられる。
【００６７】
自動走査の間に、ソフトウェアは、分析された細胞の数、分析されるべき現在のウェル、それらが取得される各独立した波長のイメージ、それが決定される各ウェルについてのスクリーニングの結果を含めた走査状態を動的に表示する。プレート４（図１）はサーペンタイン様式で評価される。ソフトウェアは電動顕微鏡ＸＹステージ３をウェル間でおよび９６−ウェルプレートの各ウェル内の視野間で自動的に移動させる。プログラミングの分野における当業者であれば、２４、４８および３８４ウェルプレートのような他のマイクロプレート様式の走査のためにソフトウェアを適合する仕方を認識するであろう。全プレートの走査パターンならびに各ウェル内の視野の走査パターンがプログラムされる。システムはＺ軸焦点ドライブ５を通じてオートフォーカス手法１０４（図９）にて試料の焦点を調整し、電動フィルタホイール１９を介してフィルタ選択を制御し、４つまでの異なる色（「チャンネル」または「波長」）のイメージを取得し、それを分析する。
【００６８】
典型的には、各ウェルにおける最初の視野のために、次いで、各ウェル内の４乃至５視野毎に１回、オートフォーカス手法がユーザ選択頻度にて要求される。オートフォーカス手法は、予め計算された平面焦点モデルから内挿するごとによって出発Ｚ軸点を計算する。この設定点未満またはそれを超えるプログラム可能な距離で出発し、この手法は多数の異なる位置を通って機械的Ｚ軸を移動させ、各位置においてイメージを取得し、各イメージのコントラストを見積もる計算された焦点スコアの最大を見出す。最大焦点スコアを持つイメージのＺ位置は特定の視野についての最良の焦点を決定する。当業者であれば、これを、ハームズ(Harms)ら,in Cytometry 5(1984),236-243、Groenら,in Cytometry 6(1985),81-91、およびファイアストーン(Firestone)ら,in Cytometry 12(1991),195-206に記載されている自動焦点合わせ方法の変形として認識するであろう。
【００６９】
イメージ取得には、カメラの露光時間を各染料につき別々に調整して、各チャンネルからの高品質イメージを保証する。ユーザのオプションにてソフトウェア手法を呼び出して、いずれかの更なる実験を行う前に波長間の直線（ＸＹ）シフトにつき計算することによって波長間の登録シフトを修正することができる。試料の光漂白が最小に保たれるように電子シャッター１８を制御する。バックグラウンドの明暗の歪みおよび不均一な照明は当該分野において知られた方法を用いるソフトウェアによって修正することができる(ブライト(Bright)ら(1987),J.Cell Biol.104:1019-1033)。
【００７０】
１つのチャンネルにおいて、適合閾値設定手法を用いてセグメント化される（「同定される」）一次マーカ１０５（図９）（典型的には、DAPIまたはPI蛍光染料で逆染色された細胞核）につきイメージを取得する。適合閾値設定手法１０６を用いて、バックグラウンドから細胞を分離するためにイメージの閾値を動的に選択する。蛍光染料での細胞の染色は、マイクロタイタープレート試料においてならびにマイクロタイタープレートの各ウェル内の細胞の視野のイメージ内で細胞を横切って未知の程度変化し得る。この変動は、試料調製および／または細胞の動的性質の結果として起こり得る。全体的閾値が完全なイメージにつき計算されてバックグラウンドから細胞を分離し、視野間の変動を説明する。これらの全体的適合技術は当該分野において記載されたものの変形である(キトラー(Kittler)ら,in Computer Vision,Graphics,and Image Processing 30(1985),125-147、リドラー(Ridler)ら,in IEEE Trans.Systems,Man,およびCybernetics(1978),630-632.)。
【００７１】
代替適合閾値設定方法は、全体的イメージ閾値設定とは対照的に局所領域閾値設定を利用する。局所領域のイメージ分析は良好な総じてのセグメント化に導く。なぜなら、細胞核（ならびに他の標識された構成要素の染色はイメージを横切って変化し得るからである。この全体的／局所領手法を用い、低下した分解能イメージ（２乃至４のファクターだけサイズが低下）をまず（適合閾値設定を用いて）全体的にセグメント化して、イメージ中に注目する領域を見出す。次いで、これらの領域をガイドとして働かせて、十分な分解能にて同一領域をより十分分析する。次いで、注目する各領域につき、（再度適合閾値設定を用い）より局所化された閾値を計算する。
【００７２】
セグメント化手法の出力はバイナリーイメージであり、ここに、対象は白色であって、バックグラウンドは黒色である。当該分野においてマスクとも呼ばれるこのバイナリーイメージを用いて、視野が対象１０７を含有するかを決定する。このマスクを小斑点標識方法で標識し、それにより、各対象（または小斑点）はそれに割り当てられたユニークな数を有する。小斑点の面積および形状のような形態的特徴を用いて、人工物と考えられるものから細胞であるように見える小斑点を区別する。公知の細胞の形態的特徴におけるタイプ分けによって、または対話形式トレーニングユーティリティを用いることによって、ユーザは形態的選択基準を予備設定する。もし注目する対照が視野中に見出されれば全ての他の活性なチャンネル１０８につきイメージが取得され、さもなければ、ステージを現在のウェル中の次の視野１０９まで進める。注目する各対象を、さらなる分析１１０のためにイメージ中に位置させる。その形態的特徴（サイズおよび形状）を測定することによって、ソフトウェアは有効な細胞核１１１についての基準を対照が満たすかを決定する。各有効な細胞につき、ＸＹＺステージの位置を記録し、細胞の小さなイメージを記憶し、特徴を測定する１１２。
【００７３】
多数の分析方法を同時に適用して複数波長において特徴を測定することによって、本発明の細胞走査方法を用いて細胞試料につき多くの異なるアッセイを行うことができる。１つのそのようなアッセイの実施例は以下の測定を提供する。
【００７４】
１．色１−４についての細胞核内の全蛍光強度
２．色１についての細胞核の面積（一次マーカ）
３．色１についての細胞核の形状は３つの形状特徴によって記載される。
【００７５】
ａ）周辺四角面積
ｂ）箱型面積比率
ｃ）高さ幅比率
４．色１−４についての細胞核内の平均蛍光強度（すなわち、番号１を番号２で割る）
５．色２−４についての細胞の細胞質（細胞質マスク）の蛍光を表す核の外側のリングの全蛍光強度（図１０参照）
６．細胞質マスクの面積
７．色２−４についての細胞質マスクの平均蛍光強度（すなわち、番号５を番号６で割る）
８．色２−４についての細胞核内の平均蛍光強度に対する細胞質マスクの平均蛍光強度の比率（すなわち、番号７を番号４で割る）
９．色２−４についての細胞質マスクの平均蛍光強度および細胞核内の平均蛍光強度およびの差異（すなわち、番号７から番号４を引く）
１０．色２−４についての細胞核内の蛍光ドメイン（スポット、ドットまたは粒とも呼ばれる）の数
特徴１乃至４は本発明の異なる細胞スクリーニングアッセイの一般的特徴である。これらのステップは種々のイメージ分析適用で通常使用され、当該分野においてよく知られている(ラス(Russ)(1992)The Image Processing Handbook,CRC Press Inc.;ゴンザレス(Gonzales)ら(1987),Digital Image Processing.Addison-Wesley Publishing Co.391-448頁)。特徴５−９は、細胞の局所細胞質領域内の細胞の蛍光分子の測定および細胞質から核への蛍光分子の転移（すなわち、移動）を提供するために特異的に開発された。これらの特徴（ステップ５−９）は、核転移の阻害についてマイクロプレート中の細胞を分析するのに使用される。例えば、転写因子の核転移の阻害は、無傷細胞のスクリーニングに対する新規アプローチを提供する（他のタイプのスクリーニングの詳細な実施例は後に提供されるであろう）。特異的方法は、各細胞の領域（特徴４）−対−局所細胞質領域（特徴７）中のプローブの量を測定する。これらの２つの細胞下区画の間の差異の定量は細胞質−核転移の尺度を提供する（特徴９）。
【００７６】
特徴１０は、色２−４における核領域内でのＤＮＡまたはＲＮＡプローブのカウントに使用されるスクリーニングを記載する。例えば、プローブは染色体−特異的ＤＮＡ配列を同定するために商業的に入手可能である(Life Technologies,Gaithersburg,MD;Genosya,Woodlands,TX;Biotechnologies,Inc.,Richmonda,CA;Bio 101,Inc.,Vista,CA)。細胞は性質が三次元的であり、顕微鏡下高倍率で調べると、１つのプローブは焦点が合わすことができるが、他方、別のプローブは完全に焦点から外れ得る。本発明の細胞スクリーニング方法は、複数焦点平面からイメージを取得することによって、核中の三次元プローブの検出を提供する。ソフトウェアは少ないステップでＺ軸モータドライブ５を移動させ（図１）、ここに、このステップ距離は広い範囲の異なる核直径を説明するためにユーザが選択する。焦点ステップの各々において、イメージが取得される。各イメージ中の各画素からの最大灰色レベル強度が見出され、得られた最大投影イメージに記憶される。次いで、最大投影イメージを用いてプローブをカウントする。この方法は、別のものの上または下に直接積み重ねられないプローブをカウントするのに効果的である。Ｚ方向に総合の頂部に積み重ねられたプローブにつき計算するために、ユーザが、取得された焦点平面の各々におけるプローブを分析するオプションを選択することができる。このモードにおいて、走査システムは前述した最大平面投影方法を実行し、このイメージ中の注目するプローブ領域を検出し、次いで、全ての焦点平面イメージにおいてこれらの領域をさらに分析する。
【００７７】
細胞特徴１１２を測定した後（図９）、システムは、現在の視野１１３にいずれからの未処理対象があるかをチェックする。もしいずれかの未処理対象があれば、それは次の対象１１０を位置決めし、それが有効な細胞核１１１についての基準を満たすか否かを決定し、その特徴を測定する。いったん、現在の視野中の全ての対象が処理されれば、システムは、現在のプレートの分析が完了したか否かを判断し１１４、もし完了していなければ、それは現在のウェル１１５中でより多くの細胞を見出す必要性を決定する。もし必要性が存在すれば、システムは、ＸＹＺステージを現在のウェル１０９内の次の視野に進めるか、あるいはステージをプレートの次のウェル１１６に進める。
【００７８】
プレートの走査が完了した後、システムのイメージレビュー、データレビュー、および概要レビュー設備でイメージおよびデータレビューすることができる。走査からの全てのイメージ、データ、および設定は、後のレビューのために、またはネットワーク情報管理システムと接続させるためにシステムのデータバンクで検索される。また、データを他の第３者の統計学パッケージに輸出して、結果を表とし、他のレポートを作成することもできる。ユーザは、対話形式イメージレビュー手法１１７を備えたシステムによって分析された各細胞のイメージを単独でレビューすることができる。ユーザは、対話形式グラフ、測定された特徴のデータスプレッドシートおよび対話形式細胞間データレビュー手法１１８での注目する全ての蛍光チャンネルのイメージの組み合わせを用いて細胞間ベースでデータをレビューすることができる。ヒストグラムおよびばらつきプロットのような対話形式グラフを介してデータを解析することができるグラフプロッティング能力が提供される。ユーザは、対話形式ウェル間レビュー手法１１９にてプレートの各ウェル内の全ての細胞につき蓄積されまとめられた概要データをレビューすることができる。グラフおよびイメージのハードコピーを広い範囲の標準的なプリンタで印字することができる。
【００７９】
完全な走査の最終段階として、測定された特徴の１以上の統計についてレポートを作成することができる。ユーザは、対話形式レポート作成手法１２０を用いプレートの走査された領域に対しウェル間ベースでまとめられたデータのグラフレポートを作成することができる。このレポートは、表およびグラフ様式でのウェルによる統計のまとめおよび試料についての同定情報を含む。レポートウィンドウは、オペレータが後の検索のために走査に関するコメントを入力することを可能とする。複数のレポートを多くの統計につき作成することができ、１つのボタンに触れば印字することができる。印字の前にレポートを配置およびデータにつき予めレビューすることができる。
【００８０】
この方法の前で述べた実施形態は、高含有量スクリーニング（ＨＣＳ）モードといわれる単一高分解能モードで走査される。このＨＣＳモードは、細胞内ならびにウェル内の個々の細胞内での物質の分布を規定するのに（１μｍのオーダーで）ウェル内の十分な空間的分解能を提供する。そのモードで接近可能な情報含有量の高い程度は、必要なシグナル処理のスピードおよび複雑性を犠牲にして実現される。
【００８１】
代替実施形態において、高スループットシステム（ＨＴＳ）を、同一プラットフォーム上または（例えば、局所領域ネットワークを介して）電子的に結合された２つの別々のプラットフォーム上でＨＣＳに直接カップリングされる。デュアルモード光学系といわれる本発明のこの実施形態は、それをＨＴＳとカップリングさせ、それにより、カップリングしたＨＴＳにおける応答を示すウェルの小さなサブセットのみ、より遅い高分解能データ取得および分析を要求することによって、ＨＣＳのスループットを増加させる利点を有する。
【００８２】
高スループットの「全プレート」リーダーシステムは当該分野においてよく知られており、多数の化合物をスクリーニングするのに使用されるＨＴＳシステムの構成要素として通常使用される(ベグス(Beggs)ら(1997),上記;マキャフリー(McCaffrey)ら(1996),上記)。本発明のＨＴＳは、十分な分解能にて同時にプレート中の多くのまたは全てのウェルを読んでウェル間ベースで決定を行うことによって、マイクロタイタープレートまたはマイクロウェルアレイにつき行われる。すなわち、各ウェル中の多くの全ての細胞あるいは物質のバルクの全シグナル出力を平均することによって計算がなされる。ＨＴＳにおいていくつかの定義された応答を呈するウェル（「ヒット」）がシステムによって伝達される。次いで同一のマイクロタイタープレートまたはマイクロウェルアレイに関し、ヒットと同定された各ウェルは前述したようにＨＣＳを介して測定される。このように、デュアルモード処理は以下のものを含む。
【００８３】
１．マイクロタイタープレートまたはマイクロウェルアレイの多数のウェルを迅速に測定する。
【００８４】
２．ウェル間ベースで細胞中の蛍光標識レポータ分子の全活性を決定して「ヒット」（定義された応答を呈するウェル）を同定するためにデータを解釈する。
【００８５】
３．各「ヒット」において多数の細胞をイメージする。および、
４．個々の細胞中の蛍光標識レポータ分子の分布、環境または活性（すなわち、細胞内測定）および細胞の分布を測定して特異的生物学的機能につきテストするためにデジタルイメージデータを解釈する。
【００８６】
デュアルモードプロセシングの好ましい実施形態において、実行３０１のスタート時点で、オペレータは、プレートおよびその内容を記載する情報３０２を入力し、使用される生物学的標識をマッチさせるためにフィルタ設定および蛍光チャンネル、求められる情報および試料の明るさをマッチさせるためのカメラ設定を特定する。これらのパラメータは、各自動化された実行用の容易な検索のためにシステムのデータベースに記憶される。マイクロタイタープレートまたはマイクロウェルアレイは、ロボットローディングデバイスを制御することによって、手動によりまたは自動的に細胞スクリーニングシステム３０３にロードされる。任意の環境チャンバー３０４をシステムによって制御して、マイクロタイタープレートまたはマイクロウェルアレイ中の空気に囲まれた生細胞における温度、湿度およびＣＯ２を維持する。任意の流体送達デバイス３０５（図８参照）をシステムによって制御して、流体を走査の間にウェルに分注する。
【００８７】
プレート中のウェルの各々からのシグナルを取得し、それを分析することによって、マイクロタイタープレートまたはマイクロウェルアレイにつき高スループットプロセシング３０６をまず実行する。高スループットモード３０７で実行したプロセシングは図１２で説明し、後に記載する。この高スループットモードにおいてある選択された強度の応答を呈するウェル（「ヒット」）がシステムによって同定される。システムはヒットにつきテストする条件付き走査３０８を実行する。もしヒットが見つかれば、それらの特異的ヒットウェルを高含有量（ミクロレベル）モード３０９でさらに分析する。高含有量モード３１２で実行したプロセシングを図１３に示す。次いで、システムはプレートでの測定の結果をもってインフォマティックスデータベース３１１を更新する３１０。もし分析すべきより多くのプレートがあれば３１３、システムは次のプレートをロードする３０３。さもなければ、プレートの分析は終了する３１４。
【００８８】
以下の議論は図１２に示された高スループットモードについて記載する。システムの好ましい実施形態である単一プラットフォームデュアルモードスクリーニングシステムを記載する。当業者であれば、操作的にはデュアルプラットフォームシステムは光学を移動させるよりはむしろ２つの光学系の間でプレートを移動させることを単に含むことを認識するであろう。いったんシステムが設定されて、プレートがロードされれば、システムはＨＴＳ取得および分析を開始する４０１。ＨＴＳ光学モジュールは、デュアルモードシステムにて電動光学位置決めデバイス４０２を制御することによって選択される。１つの蛍光チャンネルにおいてプレート上の一次マーカからのデータが取得され４０３、マスキング手法４０４を用いてプレートバックグラウンドからウェルが単離される。また、使用されるべき他の蛍光チャンネルにおいてイメージが取得される４０５。各ウェル４０６に対応する各イメージ中の領域が測定される４０７。特定のウェルについての測定から計算された特徴を所定の閾値または強度応答４０２と比較し、結果に基づいて、ウェルを「ヒット」４０９として伝達するかまたは伝達しない。ヒットとして伝達されたウェルの位置を、引き続いての高含有量モードのプロセシングのために記録する。もし処理すべき残りのウェルがあれば４１０、プログラムは、すべてのウェルが処理され４１１、かつシステムが高スループットモードから出るまでループバッグする４０６。
【００８９】
ＨＴＳ分析に続き、システムは図１３に規定される高含有量モードプロセシング５０１を開始させる。電動位置決めシステムを制御することによって、システムはＨＣＳ光学モジュール５０２を選択する。高スループットモードで同定された各「ヒット」ウェルにつき、ウェルのＸＹステージ位置をメモリまたはディスクから選択し、次いで、ステージを選択されたステージ位置５０３まで移動させる。オートフォーカス手法５０４が各ヒットウェル中の最初の視野で呼び出され、次いで、各ウェル内で５乃至８視野ごとに一度呼び出される。１つのチャンネルにおいて、一次マーカ５０５（典型的には、DAPI、ヘキスト(Hoechst)またはPI蛍光染料で逆染色した細胞核）のイメージを取得する。次いで、適合閾値決定手法５０６を用い、イメージをセグメント化し（核および非核の領域に分ける）。セグメント化手法の出力はバイナリーマスクであり、ここに、対象は白色であって、バッググラウンドは黒色である。当該分野においてマスクとも呼ばれるこのバイナリーイメージを用いて、視野が対象５０７を含有するかを判断する。このマスクを小斑点標識方法で標識し、それにより、各対象（または小斑点）はそれに割り当てられたユニークな数を有する。もし対象が視野中で見出されれば、全ての他の活性チャンネル５０８につきイメージを取得し、そうでなければ、ステージを現在のウェル中の次の視野５１４に進める。さらなる分析５０９のため各対象をイメージ中に位置させる。対象の面積および形状のような形態的特徴をを用いて、細胞核５１０であるように見える対象を選択し、人工物であると考えられるものを捨て（それについてさらに処理しない）。各有効な細胞核についてＸＹＺステージ位置を記録し、細胞の小さなイメージを記憶し、アッセイの特異的特徴を測定する５１１。次いで、いくつかの分析方法を適用していくつかの波長の各々で特徴を測定することによって、システムは複数のテストを実行する。細胞の特徴を測定した後、システムは、現在の視野５１２中にいずれかの未処理対象があるかをチェックする。もしいずれかの未処理対象があれば、それは次の対象５０９を位置決めし、それが有効な細胞核５１０についての基準を満たすか否か決定し、その特徴を測定する。現在の視野中の全ての対象を処理した後、システムは、現在のウェル５１２中により多くの細胞または視野を見出す必要があるか否かを決定する。もし現在のウェル中でより多くの細胞または視野を見出す必要があれば、それはステージを現在のウェル５１５内の次の視野に進める。そうでなければ、システムは、それが測定すべきいずれかの残りのヒットウェルを有するか否かをチェックする５１５。もしそうであれば、それは次のヒットウェル５０３まで進み、取得および分析の別のサイクルを通じて進行し、さもなければ、ＨＣＳモードは終了する５１６。
【００９０】
本発明の代替実施形態において、動的生細胞スクリーニングの方法が提供される。本発明の先に記載した実施形態を用いて、時間における特定の地点（化学的固定の時点）において細胞構成要素の空間的分布を特徴付ける。それ自体、イメージ取得の連続的性質、およびプレート上の全てのウェルを読むのに必要な時間の長さのため、動的ベースのスクリーニングを実行するには利用性が制限される。例えば、プレートは全てのウェルを読み終えるのに３０乃至６０分を要するので、生細胞のプレートを単に調製し、次いで、１回を超える回数全てのウェルを読み終えることによって、非常に遅い動的プロセスが測定できるに過ぎない。次のウェルに進む前に各ウェルの複数読み取りを行うことによってより速い動的プロセスを測定することができるが、最初および最後のウェルの間で経過した時間は余りにも長く、最後のウェルを読む前に速い動的プロセスは完了しているようである。
【００９１】
本発明の動的生細胞延長は、その空間的特徴の代わりのまたはそれに加えてのその動力学によって生物学的プロセスが特徴付けられるスクリーニングの設計および使用を可能とする。多くの場合、生細胞での応答は、試薬を適当なウェルに添加し、適当なタイミングにてそのウェルにつき複数の測定を行うことによって測定することができる。従って、本発明のこの動的生細胞実施形態は、ウェルを読み取る内の特定の時点に試薬を各ウェルに送達するためのシステムの個々のウェルへの流体送達用の装置を含む。それにより、この実施形態は動的測定がプレートの各ウェルについて数秒乃至数分の時間的分解能にて行われるのを可能とする。動的生細胞システムの全効率を改良するためには、取得制御プログラムを修飾してプレートのサブ領域からの反復的データ収集を可能とし、システムが個々のウェルに必要な時点の間に他のウェルを読むのを可能とする。
【００９２】
図８は本発明の生細胞実施形態で使用される流体送達デバイスの実施例を記載し、これは前述されたものである。この設定は、ピペットチップ７０５の１つの組、または単一のピペットチップでさえプレート上の全てのウェルに試薬を送達するのを可能とする。シリンジポンプ７０１のバンクを用いて流体を１２のウェルに同時に送達することができるか、あるいは先端７０５のいくつかを除去することによってより少数のウェルに送達することができる。従って、先端および走査パターンの数を以下のように変更することによってデータ収集効率を犠牲にすることなく、システムの時間的分解能を調整することができる。典型的には単一のウェルからのデータ収集および分析は約５秒を要する。ウェル間の移動およびウェルにおける焦点合わせは約５秒を要し、従って、ウェルに対する全サイクル時間は約１０秒である。従って、もし単一のピペットチップを用いて流体を単一のウェルに送達するなら、そのウェルから反復してデータが収集され、約５秒の時間的分解能にて測定を行うことができる。もし６つのピペットチップを用いて流体を６つのウェルに同時に送達するならば、システムは全ての６つのウェルを反復して走査し、各走査は６０秒を要し、それにより、時間的分解能が確立される。８分ごとにデータ収集を要するに過ぎないより遅いプロセスでは、流体送達相の間にプレートを移動させ、次いで、プレートのその半分を反復的に走査することによって、流体をプレートの１／２に送達することができる。従って、プレート上で走査されるべきサブ領域のサイズを調整することによって、取得の間に待ち時間を挿入する必要なしに時間的分解能を調整することができる。システムは継続的にデータを走査し取得するので、従って、プレートからの動的データ組を収集する全時間は、単に、プレートの単一走査を実行する時間に必要な時点の数を掛け合わせたものである。典型的には、化合物添加前の位置時点、および添加後の２または３時点がスクリーニング目的では十分なはずである。
【００９３】
図１４は動的分析で用いられる取得配列を示す。プロセシング８０１の開始はシステムの配置であり、その多くは標準的なＨＣＳ配置と同じである。加えて、オペレータは、サブ領域のサイズ、必要な時点の数および必要な時間増分のような、実行されるべき動的分析に特異的な情報８０２を入力しなければならない。サブ領域は反復的に走査して動的データを蓄積するウェルの群である。サブ領域のサイズは、単一の時間増分の間にシステムが１回全サブ領域を走査でき、このように、待ち時間を最小化できるように調整され、最適サブ領域サイズは設定パラメータから計算され、必要であればオペレータによって調整される。次いで、システムはプレートを最初のサブ領域８０３に、次いでそのサブ領域８０４中の最初のウェルに移動させて予備的刺激（時刻＝０）時点を取得する。各ウェルで実行された取得配列は、動的モードで実行されるべき特異的ＨＣＳに必要なものと正確に同一である。図１５はその処理のためのフローチャートを詳細に示す。開始９０１および戻る９０２の間のステップの全ては図１３中のステップ５０４−５１４に記載されたものと同一である。
【００９４】
サブ領域中の各ウェルを処理した後、システムはサブ領域中の全てのウェルが処理されたかを見るためにチェックし８０６（図１４）、全領域が処理されるまで全てのウェルを通じてサイクルを実行する。次いで、システムはプレートを流体添加のための位置まで移動させ、流体の全サブ領域８０７への流体システム送達を制御する。これはプレート中のいくつかの行にわたるサブ領域に関して複数の添加が必要であり、システムはプレートを添加の間にＸ，Ｙステージ上に移動させる。いったん流体が添加されれば、システムはサブ領域８０８中の最初のウェルに移動して時点の取得を開始する。データは各ウェル８０９から取得され、前述したようにシステムはサブ領域８１０中の全てのウェルを通るサイクルを行う。各々がサブ領域を通過した後、システムは全ての時点が収集されたがチェックし８１１、もしそうでなければ、必要であれば８１２、停止して８１３、必要な時間増分にて同調させたままとする。そうでなければ、システムはプレート８１４上のさらなるサブ領域をチェックし、次のサブ領域８０３まで移動するか、あるいは終了する８１５。このように、動的分析モードは、引き続いてのサブ領域でのデータ取得に先立ってのサブ領域内でのデータ取得とともに、調べるべき動的応答に基づいて、スクリーニングすべきマイクロタイタープレートまたはマイクロウェルのサブ領域のオペレータ同定を含む。
【００９５】
特異的スクリーニング
本発明の別の態様において特異的細胞構成要素プロセスの分布および活性を規定するための手法を細胞スクリーニングシステムに実行させるための指令の組を含有するプログラムを含む細胞スクリーニング方法および機械読み取り可能な記憶媒体が提供される。好ましい実施形態において、細胞スクリーニングシステムは細胞を保持するのに適したステージおよびステージを移動させるための手段を備えた高倍率蛍光光学系、デジタルカメラ、デジタルカメラからデジタルデータを受け取り処理するするための光源、およびデジタルカメラからのデジタルデータを受け取り処理するためのコンピュータ手段を含む。本発明のこの態様は、本発明の発光プローブ、光学イメージングシステムおよびパターン認識ソフトウェアを用いて特異的細胞構成要素およびプロセスの分布および活性を規定する細胞スクリーニングシステムを指令するプログラムを含む。機械読み取り可能な記憶媒体の好ましい実施形態は、図９、１１、１２、１３、１４または１５に記載された手法を細胞スクリーニングシステムに実行させるための指令の組からなるプログラムを含む。別の好ましい実施形態は、特異的細胞構成要素およびプロセスの分布および活性を検出する手法を細胞スクリーニングシステムに実行させるための指令の組みからなるプログラムを含む。最も好ましい実施形態において、細胞プロセスは、限定されるものではないが、タンパク質の核転移、細胞形態、アポトーシス、レセプタ内部化、およびタンパク質のプロテアーゼ−誘導転移を含む。
【００９６】
好ましい実施形態において、細胞スクリーニング方法を用いて種々の細胞プロセスを修飾する化合物を同定する。細胞をテスト化合物と接触させることができ、特定の細胞プロセスに対するテスト化合物の効果を分析することができる。別法として、テスト化合物および特定の細胞プロセスを修飾する公知の薬物と細胞とを接触させて、テスト化合物が公知の薬物の効果を阻害または増強できるかを測定することができる。このように、この方法を用いて、特定の細胞応答を増加または減少させるテスト化合物を同定し、ならびに特定の細胞応答を増加または減少させる他の薬物の能力に影響するテスト化合物を同定することができる。
【００９７】
別の好ましい実施形態において、高スループットモードにて低分解能にてこの方法を用い、細胞を含有する位置を分析し、細胞を含有する位置のサブセットのみを高含有量モードで分析して、分析すべき細胞の細胞下区画において発光標識レポータ分子からの発光シグナルを得る。
【００９８】
以下の実施例は説明目的を意図し、添付の請求の範囲に定義された本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
【００９９】
以下の実施例で言及される種々の化学化合物、試薬、色素および抗体はSigma Chemical(St.Louis,MO)、Molecular Probes(Eugene,OR)、Aldrich Chemical Company(Milwaukee,WI)、Accurate Chemical Company(Westbury,NY)、Jacson Immunolabs,and Clontech(Palo Ato,CA)のような入手源から商業的に入手可能である。
【０１００】
実施例１  細胞質から核への転移のスクリーニング：
ａ．転写因子
いくつかの遺伝子の転写の調節は細胞質における転写因子の活性化を含み、その結果、その因子は核に輸送され、そこでそれは特定の遺伝子または遺伝子類の転写を開始できる。転写因子の分布のこの変化は、特定の遺伝子または遺伝子の群の転写を阻害または誘導する化合物を検出する細胞ベースのスクリーニングシステムに対するスクリーニングの基礎である。スクリーニングの一般的説明をし、続いて具体的な実施例を説明する。
【０１０１】
転写因子の分布は、核をＤＮＡ特異的蛍光団様ヘキスト(Hoechst)  ３３４２３で標識し、転写因子を特異的蛍光抗体で標識することによって測定される。ヘキスト(Hoechst)標識核に対して自動焦点合わせした後、細胞ベースのスクリーニングシステムで核のイメージを取得し、これを用いて、前述したいくつかの任意の閾値設定方法の内の１つによってマスクを作成する。このマスクによって規定された領域の形態的記述子をユーザが規定したパラメータと比較し、有効な核マスクを同定し、転写因子分布を抽出するための以下の方法で用いる。各有効な核マスクを腐食させてわずかにより小さな核領域を規定する。次いで、元の核マスクを２ステップで膨張させて、核の回りのリング形状領域を形成させ、これは細胞質領域を代表する。これらの２つの領域の各々において平均抗体蛍光を測定し、これらの平均の間の差異をＮｕｃＣｙｔ差異と定義する。各転移を測定する２つの実施例を以下に記載し、図１０Ａ−図１０Ｊに示す。図１０Ａはその核２００が青色蛍光団で標識され、細胞質２０１中の転写因子が緑色蛍光団で標識された未刺激細胞を示す。図１０Ｂは細胞ベースのスクリーニングシステムによって駆動された核マスク２０２を示す。図１０Ｃは緑色波長でイメージした未刺激細胞の細胞質２０３を示す。図１０Ｄは、核マスク２０２がいったん腐食（還元）されて、最小細胞質分布を持つ核サンプリング領域２０４を形成することを示す。
【０１０２】
核領域２０２を数回膨張（拡大）させて２−３画素の広さであるリングを形成させ、これを用いて同細胞につき細胞質サンプリング領域２０５を規定する。図１０Ｅは、さらに、核サンプリング領域２０４および細胞質サンプリング領域２０５を示す側面図を示す。これらのサンプリング領域を用い、核転移についてのデータを、細胞間ベースでの細胞ベースのスクリーニングシステムによって自動的に分析することができる。図１０Ｆ−Ｊは刺激された細胞において核転移を決定するための戦略を示す。図１０Ｆは、その核２０６が青色蛍光団で標識され、細胞質２０７中の転写因子が緑色蛍光団で標識された刺激細胞を示す。図１０Ｇ中の核マスク２０８は細胞ベースのスクリーニングシステムによって駆動される。図１０Ｈは緑色波長でイメージした刺激細胞の細胞質２０９を示す。図１０Ｉは刺激細胞の核サンプリング領域２１１および細胞質サンプリング領域２１２を示す。図１０Ｉは、さらに、核サンプリング領域２１１および細胞質サンプリング領域２１２を示す側面図を示す。
【０１０３】
この方法の特異的適用はスクリーニングとしてのこの方法を有効化するのに使用されてきた。ヒト細胞系を９６ウェルのマイクロタイタープレート中で平板培養した。ウェルのいくつかの行をＩＬ−１、ＮＦ−ＫＢ転写因子の公知のインデューサで力価測定した。次いで、細胞を固定し、転写因子に対するフルオレセイン標識抗体およびヘキスト(Hoechst)  ３３４２３での標準的な方法によって染色した。細胞ベースのスクリーニングシステムを用いて、このプレートからのイメージを取得し、分析し、図１６に示すように、ＮｕｃＣｙｔ差異はウェルに添加したアゴニストの量に強く相関することが判明した。第２の実験において、ＩＬ−１、ＩＬ−１ＲＡに対するレセプタに対するアゴニストをＩＬ−１αの存在下で力価測定し、ＩＬ−１αによって誘導された転移を徐々に阻害した。ＮｕｃＣｙｔ差異は、図１７に示すように、転移のこの阻害と強く相関することが判明した。
【０１０４】
追加の実験は、ＮｕｃＣｙｔ差異ならびにＮｕｃＣｙｔ比率が広い範囲の細胞密度および試薬濃度にわたって合致する結果を与え、従って、それを日常的に用いて特異的核転移活性につき化合物ライブラリーをスクリーニングすることができることを示した。さらに、同方法は他の転写因子、またはＧＦＰ転写因子キメラあるいは生細胞もしくは固定細胞に導入された蛍光標識転写因子に対する抗体で用いて、転写因子活性の調節に対する効果につきスクリーニングすることができる。
【０１０５】
図１８は、実施例１で得られたデータのＰＣスクリーニングについての代表的なディスプレイである。グラフ１  １８０は核サンプリング領域および細胞質サンプリング領域における平均抗体蛍光間の差異、ＮｕｃＣｙｔ差異−対−ウェル番号をプロットする。グラフ２  １８１は核サンプリング領域における抗体の平均蛍光、ＮＰ１平均、−対−ウェル番号をプロットする。グラフ３  １８２は細胞質サンプリング領域における平均抗体蛍光、ＬＩＰ１平均、−対−ウェル番号をプロットする。ソフトウェアは各細胞からの表示を可能とする。例えば、図１８は、細胞番号２６につき、スクリーニングディスプレイ１８３、核イメージ１８４および蛍光抗体イメージ１８５を示す。
【０１０６】
図１８のグラフ１  １８０において言及したＮｕｃＣｙｔ差異は平均細胞質プローブ（蛍光レポータ分子）強度および平均核プローブ（蛍光レポータ分子）強度の間の差異である。図１８のグラフに  １８１で言及したＮＰ１平均は、核サンプリング領域内での細胞質プローブ（蛍光レポータ分子）の平均である。図１８のグラフ３  １８２で言及したＬ１Ｐ１平均は細胞質サンプリング領域内での平均プローブ（蛍光レポータ分子）強度である。
【０１０７】
本発明のこの態様は、活性化に際して細胞質から核に転移する他の転写因子を用いて行うことができるのは当業者に理解されるであろう。別の特別の実施例において、ｃ−ｆｏｓ転写因子の活性化は細胞内でこの空間的位置を規定することによって評価された。活性化されたｃ−ｆｏｓは核内でのみ見出され、他方、不活化されたｃ−ｆｏｓは細胞質内に存在する。３Ｔ３細胞をPolyfiltronics９６−ウェルプレート中でウェル当たり５０００−１００００細胞にて平板培養した。細胞を付着させ、一晩増殖させた。細胞を１００μｌ無血清培地で２回すすぎ、無血清ＭＥＭ培養培地中で２４−３０時間インキュベートし、次いで、１−５０ｎｇ／ｎｌの範囲の濃度に無血清培地に直接付着した血小板由来成長因子(PDGF-BB)(Sigma Chemical Co.St.Louis,MO)で平均２０分間刺激した。
【０１０８】
刺激に続き、細胞を１Ｘハンク(Hank)緩衝化生理食塩水(HBSS)中の３．７％ホルムアルデヒド溶液で２０分間固定した。固定後、細胞をＨＢＳＳで洗浄して残存する固定剤を除去し、ＨＢＳＳ中の０．５％トリトンＸ−１００溶液で９０秒間浸透化させ、ＨＢＳＳで２回洗浄して残存する洗剤を除去した。次いで、ＨＢＳＳ中のＢＳＡの０．１％溶液で細胞を１５分間ブロックし、希釈された一次抗体溶液の添加に先立ってＨＢＳＳでさらに洗浄した。
【０１０９】
ｃ−ｆｏｓウサギポリクローナル抗体(Calbiochem,PC05)をＨＢＳＳ中で１：５０希釈し、５０μｌの希釈物を各ウェルに適用した。一次抗体の存在下で細胞を室温にて１時間インキュベートし、次いで、ＨＢＳＳ中の１００μｇ／ｍｌストックから１：５００希釈したＡＬＥＸＡＴＭ４８８(Molecular Probes)にコンジュゲートしたヤギ抗−ウサギ二次抗体を含む光密容器中にて室温で１時間インキュベートした。次いで、ヘキスト(Hoechst)  ＤＮＡ色素(Molecular Probes)を製造業者のストック溶液の１：１０００希釈にて添加した（１０ｍｇ／ｍｌ）。次いで、細胞をＨＢＳＳで洗浄し、本発明の細胞スクリーニングシステムでの分析に先立ってプレートをシールした。これらの実験からのデータは、本発明の方法を用いて、細胞内でのその空間的位置を規定することによってｃ−ｆｏｓの転写活性化を測定することができるのを示した。
【０１１０】
当業者であれば、以下の方法をｃ−ｆｏｓ活性化の検出に適用しつつ、それを、活性化に際して細胞質から核へ転移するいずれかの転写因子の分析に適用することができるのを認識するであろう。そのような転写因子の実施例は、限定されるものではないが、ｆｏｓおよびｊｕｎホモログ、ＮＦ−ＫＢ（Ｂ細胞からの核因子カッパ）、ＮＦＡＴ（活性化されたＴ−リンパ球の核因子）、およびＳＴＡＴ（転写のシグナルトランジューサおよびアクチベータ）因子を含む(例えば、Strehlow,I.,およびSchindler,C.1998.J.Biol.Chem.273:28049-28056;チャウ(Chow)ら,1997 Science.278:1638-1641;ディング(Ding)ら.1998 J.Biol.Chem.273:28897-28905;Baldwin,1996。Annu Rev Immunol.14:649-83;Kuo,C.T.,およびJ.M.Leiden.1999。Annu Rev Immunol.17:149-87;ラオ(Rao)ら,1997。Annu Rev Immunol.15:707-47;マスダ(Masuda)ら,1998。Cell Signal.10:599-611;Hoey,T.,およびU.Schindler.1998。Curr Opin Genet Dev.8:582-7;リュー(Liu)ら,1998。Curr Opin Immunol.10:271-8参照)。
【０１１１】
このように、本発明のこの態様において、インジケータ細胞をテスト化合物で処理し、発光標識転写因子の分布を前述開示のもののような細胞スクリーングシステムを用いて空間的および時間的に測定する。発光標識転写因子は、細胞をテスト化合物と接触させる前、それと一緒に、またはその後に細胞によって発現されるか、あるいはそれに添加される。
【０１１２】
例えば、転写因子はトランスフェクトされたインジケータ細胞によって発光標識タンパク質キメラとして発現させることができる。別法として、発光標識転写因子は前述したように発現させ単離し、インジケータ細胞にバルク−ロードさせることができるか、あるいは転写因子は単離後に発光により標識することができる。さらなる代替法として、転写因子はインジケータ細胞によって発現され、これを引き続いて転写因子を検出する抗体のような発光標識と接触させる。
【０１１３】
さらなる態様において、注目する転写因子を特異的に認識する抗体、および前述した方法を行うための抗体を用いる指示書を含むことを特徴とする転写因子活性化を分析するためのキットが提供される。好ましい実施形態において、転写因子−特異的抗体、または転写因子抗体を検出する二次抗体を発光標識する。さらなる好ましい実施形態において、キットは注目する転写因子を発現する細胞を含有し、および／またはキットは、限定されるものではないが、共にｆｏｓ活性化を修飾する血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）および血清、および共にＮＦ−ＫＢ活性化を修飾するインターロイキン１（ＩＬ−１）および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）を含めた、注目する転写因子の活性化を修飾することが知られている化合物を含有する。
【０１１４】
別の実施形態において、キットは、活性化に際して細胞質から核に転移する注目する転写因子をコードする核酸、および注目する細胞中で転写因子活性化を修飾する化合物を同定するために発現ベクターを用いる指示書を含む組換え発現ベクターを含む。別法として、キットは精製された発光標識転写因子を含有する。好ましい実施形態において、転写因子は、限定されるものではないが、緑色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼまたはその突然変異体もしくは断片を含めた、発光タンパク質との融合タンパク質として発現される。種々の好ましい実施形態において、キットは、さらに、発現ベクターでトランスフェクトされた細胞、注目する転写因子に特異的に結合する抗体または断片、および／または（前述した）注目する転写因子の活性化を修飾することが知られている化合物を含有する。
【０１１５】
ｂ．タンパク質キナーゼ
細胞質から核へのスクリーニング方法を用いて、細胞質中では不活性状態で存在し、活性化に際して核に輸送されるか、あるいはリン酸化に際して細胞質から核に転移する基質をリン酸化するいずれかのタンパク質キナーゼの活性化を分析することもできる。適当なタンパク質キナーゼの実施例は、限定されるものではないが、細胞外シグナル−調節タンパク質キナーゼ（ＥＲＫ）、ｃ−Ｊｕｎアミノ−末端キナーゼ（ＪＮＫ）、Ｆｏｓ調節タンパク質キナーゼ（ＦＲＫ）、ｐ３８マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ｐ３８ＭＡＰＫ）、タンパク質キナーゼＡ（ＰＫＡ）、およびマイトジェン活性化タンパク質キナーゼキナーゼ（ＭＡＰＫＫ）を含む。(例えば、ホール(Hall)ら，1999、J Biol Chem.274:376-83;Hanら、1995 Biochim.Biophys.Acta.1265:224-227;Jaaroら 1997 Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.94:3742-3747;テーラー(Taylor)ら 1994 J.Biol,Chem.269:308-318;Zhao,Q.,およびF.S.Lee.1999.J Biol Chem.274:8355-8;Paolilloetら 1999.J Biol CHem.274:6546-52;Cosoら.1995.Cell 81:1137-1146;Tibbles,L.A.,およびJ.R.Woodgett.1999.Cell Mol Life Sci.55:1230-54;Schaeffer,H.J.,およびM.J.Weber.1999.Mol Cell Biol.19:2435-44参照)。
【０１１６】
別法として、タンパク質キナーゼ活性は、注目するタンパク質キナーゼによってリン酸化される前に細胞質から核への発光標識タンパク質キナーゼ基質の転移をモニターすることによってタンパク質キナーゼ活性がアッセイされる。この実施形態において、基質はリン酸化されず、リン酸化に先立って細胞質にあり、タンパク質キナーゼによるリン酸化に際して核に転移される。タンパク質キナーゼそれ自体が本実施形態において細胞質から核に転移する要件はない。そのような基質（および対応するタンパク質キナーゼ）の実施例は、限定されるものではないが、ｃ−ｊｕｎ（ＪＮＫ基質）、ｆｏｓ（ＦＲＫ基質）およびｐ３８（ｐ３８  ＭＡＰＫ基質）を含む。
【０１１７】
このように、これらの実施形態において、インジケータ細胞をテスト化合物で処理し、発光標識タンパク質キナーゼまたはタンパク質キナーゼ基質の分布は前述で開示したもののような細胞スクリーニングシステムを用いて空間的および時間的に測定される。発光標識タンパク質キナーゼまたはタンパク質キナーゼ基質は、テスト化合物と細胞を接触させる前、それと一緒に、またはその後に細胞によって発現されるか、あるいは細胞に添加される。例えば、タンパク質キナーゼまたはタンパク質キナーゼ基質はトランスフェクトされたインジケータ細胞によって発光標識タンパク質キメラとして発現させることができる。別法として、発光標識タンパク質キナーゼまたはタンパク質キナーゼ基質は前述したようにに発現させ、単離し、インジケータ細胞にバルク−ロードさせることができるか、あるいはタンパク質キナーゼまたはタンパク質キナーゼ基質は単離後に発光により標識することができる。さらなる代替法としてタンパク質キナーゼまたはタンパク質キナーゼ基質はインジケータ細胞によって発現され、これを引き続いてタンパク質キナーゼまたはタンパク質キナーゼ基質を検出する標識された抗体のような発光標識と接触させる。
【０１１８】
さらなる実施形態において、タンパク質キナーゼ活性は、タンパク質キナーゼ基質のリン酸化状態（すなわち、リン酸化されているかまたはリン酸化されていない）をモニターすることによってアッセイされる。この実施形態において、タンパク質キナーゼまたはタンパク質キナーゼ基質は活性化に際して細胞質から核に転移する要件はない。好ましい実施形態において、（例えば、米国特許第５，５９９，６８１号に開示されているように）リン酸化状態は注目するタンパク質キナーゼ基質のリン酸化形態のみに結合する抗体と細胞とを接触させることによってモニターされる。
【０１１９】
別の好ましい実施形態において、リン酸化のバイオセンサーを用いる。例えば、発光標識タンパク質またはその断片を、（ａ）注目するタンパク質キナーゼによって認識されるリン酸化部位、および（ｂ）リン酸化によってマスク解除される核局所化シグナルを含有するように作成されているタンパク質に融合させることができる。そのようなバイオセンサーは、このように、リン酸化に際して核に転移し、その転移はタンパク質キナーゼ活性化の尺度として用いることができる。
【０１２０】
別の態様において、タンパク質キナーゼ、タンパク質キナーゼ基質、注目するタンパク質キナーゼ基質のリン酸化形態に特異的に結合する一次抗体、および注目する細胞中でタンパク質キナーゼの活性化を修飾する化合物を同定するのに一次抗体を用いる指示書を含むことを特徴とするタンパク質キナーゼ活性化を分析するためのキットが提供される。好ましい実施形態において、一次抗体、または一次抗体を検出する二次抗体を発光により標識する。他の好ましい実施形態において、キットはさらに、注目するタンパク質キナーゼを発現する細胞、および／または限定されるものではないがジブチリルｃＡＭＰ（モディファイアーＰＫＡ）、フォスコリン（ＰＫＡ）、およびアニソマイシン（ｐ３８ＭＡＰＫ）を含めた、注目するタンパク質キナーゼの活性化を修飾することが知られている化合物を含む。
【０１２１】
別法として、キットは、活性化に際して細胞質から核に転移する注目するタンパク質キナーゼまたはタンパク質キナーゼ基質をコードする発現ベクター、および注目する細胞中でタンパク質キナーゼ活性化を修飾する化合物を同定するための発現ベクターを用いる指示書を含む。別法として、キットは精製された発光標識タンパク質キナーゼまたはタンパク質キナーゼ基質を含有する。好ましい実施形態において、注目するタンパク質キナーゼまたはタンパク質キナーゼ基質は発光タンパク質との融合タンパク質として発現される。さらなる好ましい実施形態において、キットは、さらに、発現ベクターで形質転換された細胞、注目するタンパク質キナーゼまたはタンパク質キナーゼ基質に特異的に結合する抗体またはその断片、および／または（前述した）注目するタンパク質キナーゼの活性化を修飾することが知られている化合物を含む。
【０１２２】
別の態様において、本発明は、転写因子またはタンパク質キナーゼの活性化を分析するのに開示された方法を細胞スクリーニングシステムに実行させるための指令の組を含有するプログラムを含み、ここに、細胞スクリーニングシステムは細胞を含有するプレートを保持するのに適したステージ、デジタルカメラ、細胞から発せられた蛍光または発光をデジタルカメラに向けるための手段、およびデジタルカメラからのデジタルデータを受け取り処理するためのコンピュータ手段を含むことを特徴とする機械読み取り可能な記憶媒体を含む。
【０１２３】
実施例２  細胞形態を修飾する化合物についての自動スクリーニング
細胞のサイズの変化は、肥大、細胞付着および展延、分化、増殖および分裂、壊死およびプログラムされた細胞の死滅、細胞移動度、形態形成、管形成およびコロニー形成のような多数の細胞状態に関連する。
【０１２４】
例えば、細胞肥大は遺伝子発現の改変のカスケードと関連付けられており、カバーグラス上で増殖する接着性細胞で明瞭に見ることができる、細胞サイズの改変によって細胞培養で特徴づけることができる。
【０１２５】
また、細胞サイズを測定して接着性細胞の付着および展延を測定することもできる。細胞展延は細胞表面レセプタの基質リガンドへの選択的結合および細胞骨格へのシグナリング経路の引き続いての活性化の結果である。基質分子への細胞の付着および展延は、癌細胞の転移、炎症応答の間の白血球活性化、創傷治癒の間のケラチノサイト移動および血管形成の間の内皮細胞移動についての重要なステップである。これらの細胞レセプタ、シグナリング経路、または細胞骨格に影響する化合物は細胞展延に影響し、細胞サイズを測定することによってスクリーニングすることができる。
【０１２６】
全細胞面積は、ＤＮＡ標識と組み合わせて、細胞骨格マーカ、細胞ゾル容積マーカまたは細胞表面マーカを用いて全細胞体または細胞質を標識することによってモニターすることができる。そのような標識の実施例(多くは、Molecular Probes(Eugene,Oregon)およびSigma Chemical Co.(St.Louis,Missouri)から入手できる）は以下のものを含む。
【０１２７】
【表１】
0003863372.tif 000002
これらの種々の剤での細胞染色のためのプロトコルは当業者によく知られている。細胞を生きたまままたは固定後に染色し、細胞面積を測定することができる。例えば、ＤｉＩＣ１６で染色した生細胞は均一に標識され原形質膜を有し、細胞の投影された断面積は染料の蛍光強度によってバックグラウンドから均一に区別される。ＣＭＦＤＡのような細胞ゾル染料で染色した生細胞は、細胞厚みに比例する蛍光強度を生ずる。細胞標識は細胞の薄い領域でより暗いが、全細胞面積はバックグラウンドから区別することができる。固定された細胞は、重合されたアクチンを標識するＡＬＥＸＡＴＭ４８８ファロイジンのような細胞骨格マーカで染色することができる。ファロイジンは細胞質を均一に染色しないが、全細胞面積をバックグラウンドから依然として区別する。
【０１２８】
細胞肥大
細胞肥大を分析するためのスクリーニングは以下の戦略を用いて実行される。一次単球を９６ウェルのプレート中で培養し、種々の化合物で処理し、次いで、固定し、ＤＮＡ標識様ヘキスト(Hoechst)と組み合わせた、細胞表面マーカに対する抗体のような細胞膜または細胞質、あるいは細胞骨格に対する蛍光マーカ、あるいは細胞骨格様ローダミン−ファロイジンに対する蛍光マーカで標識することができる。
【０１２９】
ヘキスト(Hoechst)標識核に焦点を合わせた後、２つのイメージを取得し、１つはヘキスト(Hoechst)標識核であり、１つは蛍光細胞質イメージである。閾値設定してマスクを作成し、次いで、マスクの形態的記述子をユーザが規定した記述子値の組と比較することによって核を同定する。次いで、各非核イメージ（または「細胞質イメージ」）を別々に処理する。元の細胞質イメージを閾値設定して、細胞質マスクイメージを作成することができる。細胞を含有する局所領域を核のまわりに規定する。次いで、蛍光抗体イメージ中の同一領域に対する局所動的閾値操作によってそれらの領域中の細胞の限界を規定する。腐食および膨張の系列を用いてわずかに接触する細胞を分離し、形態的記述子の第２の組を用いて単一細胞を同定する。個々の細胞の面積を表として、正常および肥大細胞からのサイズデータとの比較のために細胞サイズの分布を規定する。
【０１３０】
前に述べた方法によって（平均細胞質面積／細胞として測定した）全９６−ウェルプレートからの応答を分析し、結果は、アッセイがウェル間、プレート間、および日間ベースで同一のものを実行するのを示した（最大シグナルに対して１５％ｃｏｖ未満）。このデータは毎日非常に良好な相関を示し、プレート中のウェル位置による変動はないことを示した。
【０１３１】
以下の全部は視野に対して計算することができる。総計全核面積は核マスク中の非ゼロ画素の数である。平均全核面積は、総計全核面積を核の全数で割ったものである。各細胞質イメージでは、いくつかの値を計算することができる。これらは全細胞質領域であり、これは細胞質マスクにおける非ゼロ画素のカウントである。総計細胞質強度は、細胞質マスクにおける全ての画素の強度の合計である。核当たりの細胞質面積は全細胞質面積を全核カウントで割ったものである。核当たりの細胞質強度は総計細胞質強度を全核カウントで割ったものである。平均細胞質強度は総計細胞質強度を細胞質面積で割ったものである。細胞質核比率は全細胞質面積を全核面積で割ったものである。
【０１３２】
加えて、主要筋肉タンパク質アクチンまたはミオシンのように他の細胞タンパク質に対する１以上の蛍光抗体を含めることができる。これらのさらなる標識タンパク質のイメージを取得し、後のレビューのためにこのイメージで記憶して、肥大細胞におけるこれらのタンパク質の分布および形態における異常を同定することができる。マルチ−パラメータスクリーニングのこの実施例は細胞肥大の同時分析およびアクチンまたはミオシン分布の変化を可能とする。
【０１３３】
当業者であれば、この実施例は単球の肥大を分析するものであるが、この方法をいずれの細胞型における肥大、または一般的形態的変化を分析するのにも適用できるのを認識するであろう。
【０１３４】
前立腺癌についての細胞形態アッセイ
細胞展延は基質付着リガンドに対する細胞表面レセプタの応答の尺度である。展延はリガンド濃度に、あるいはレセプタ−リガンド機能を低下させる濃度に比例する。選択的な細胞−基質付着の１つの実施例は細胞外マトリックスタンパク質コラーゲンへの前立腺癌細胞の接着である。前立腺癌細胞はコラーゲンへの選択的接着を介して骨に転移する。
【０１３５】
前立腺癌細胞の転移干渉する化合物は以下のようにスクリーニングした。ＰＣ３ヒト前立腺癌細胞は適当な刺激体を含む培地中で培養し、コラーゲン被覆９６ウェルプレートに継代する。リガンド濃度を変化させることができるか、あるいは細胞展延の阻害剤をウェルに添加することができる。展延に影響できる化合物の実施例は、インテグリン−またはプロテオグリカン−ブロッキング抗体のようなレセプタアンタゴニスト、ホスファチジルイノシトール−３キナーゼ阻害剤を含めたシグナリング阻害剤、およびサイトカラシンＤのような細胞骨格阻害剤である。２時間後、細胞肥大についてのプロトコルにより、細胞を固定し、ＡＬＥＸＡＴＭ４８８ファロイジン(Molecular Probes)およびヘキスト(Hoechst)  ３３３４２で染色した。細胞質染色によって測定したように、これらの種々の条件下での細胞のサイズはバックグラウンドレベルを超えて区別することができる。視野当たりの細胞の数は、ヘキスト(Hoechst)  ＤＮＡ染料で染色した核の数を測定することによって決定される。細胞当たりの面積は、細胞質面積（ファロイジンイメージを細胞質イメージヘキスト(Hoechst)）によって割ることによって見出される。細胞のサイズはリガンド−レセプタの機能に比例する。この面積はリガンド濃度によって、および細胞の得られた機能によって決定されるので、薬物効率ならびに薬物効力はこの細胞ベースのアッセイによって決定することができる。他の測定は細胞肥大について前述したようになすことができる。
【０１３６】
細胞形態を分析する方法は組み合わせた高スループット−高含有量スクリーニングで用いることができる。１つの実施例において、高スループットモードは蛍光ファロイジン強度の増加につき全ウェルを走査する。閾値は、核（ヘキスト(Hoechst)）および細胞（ファロイジン）双方が高含有量モードで測定されるのを超えて設定される。別の実施例において、環境バイオセンサー（その実施例は、限定されるものではないが、カルシウムおよびｐＨ変化に対して感受性であるバイオセンサーを含む）を細胞に添加し、細胞を化合物と接触させる。細胞を高スループットモードで走査し、バイオセンサーの発光について予め決定した閾値を超えるウェルを高含有量モードで走査する。
【０１３７】
さらなる態様において、細胞質、膜、または（前述したもののような）細胞骨格を特異的に標識するのに使用することができる発光化合物、およびこの方法に従い細胞形態の変化を誘導または阻害するテスト刺激体を同定するために発光化合物を用いる指示書を含むことを特徴とする細胞形態を分析するためのキットが提供される。好ましい実施形態において、キットはさらに細胞核についての発光マーカを含む。さらなる好ましい実施形態において、キットは、限定されるものではないが、インテグリン−またはプロテオグリカン−ブロッキング抗体、ホスファチジルイノシトール−３キナーゼ阻害剤、およびサイトカラシンＤのような細胞骨格阻害剤を含めたシグナリング阻害剤を含む細胞形態を修飾することが知られている少なくとも１つの化合物を含む。
【０１３８】
別の態様において、本発明は、細胞形態を分析するための開示方法を細胞スクリーニングシステムに実行させるための指令の組を含有するプログラムを含み、ここに、この細胞スクリーニングシステムは細胞を含有するプレートを保持するのに適したステージを備えた光学系、デジタルカメラ、細胞から発せられた蛍光または発光をデジタルカメラに向けるための手段、および、デジタルカメラからのデジタルデータを受け取り処理するためのコンピュータ手段を含むことを特徴とする機械読み取り可能な記憶媒体を含む。
【０１３９】
実施例３  デュアルモード高スループットおよび高含有量スクリーニング
以下の実施例は、原形質膜から基部側核位置へのＧＰＣＲの転移によって検出されたＧ−プロテイン結合レセプタ（ＧＰＣＲ）の活性化についてのスクリーニングである。この実施例は、細胞ベースのスクリーニングのためのデュアルモードシステムにおいて、どのようにして高スループットスクリーニングを高含有量スクリーニングとカップリングすることができるかを示す。
【０１４０】
Ｇ−プロテイン結合レセプタは７つの膜貫通ドメイン細胞表面レセプタの大きなクラスである。これらのレセプタに対するリガンドは細胞中で二次シグナルのカスケードを刺激し、これは、限定されるものではないが、Ｃａ＋＋一過性環状ＡＭＰ産生、イノシトール三リン酸（ＩＰ３）産生およびリン酸化を含むことができる。これらのシグナルの各々は迅速であり、数秒乃至数分で起こるが、一般的でもある。例えば、活性化された場合、多くの異なるＧＰＣＲは二次Ｃａ＋＋シグナルを生じる。ＧＰＣＲの刺激の結果、そのＧＰＣＲは、細胞表面膜から内部の基部側核区画へ輸送される。この内部化は、前述した二次シグナルよりも、特定のレセプタの活性化のかなりのレセプタ−特異的インジケータである。
【０１４１】
図１９はＧＰＣＲの活性化についてのデュアルモードスクリーニングを示す。青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）と共にＧＰＣＲの安定なキメラを運ぶ細胞には、Ｆｌｕｏ−３のアセトキシメチルエステル、このエステルの加水分解によって生細胞に捕獲される細胞透過性カルシウムインジケータ（緑色蛍光）がロードされるであろう。次いで、それらはマイクロタイタープレート６０１のウェルに沈積するであろう。次いで、流体送達システムを用い、ウェルがテスト化合物のアレイで処理され、全マイクロタイタープレートのＦｌｕｏ−３イメージの短い系列が取得され、カルシウム応答を呈するウェルにつき分析されるであろう（すなわち、高スループットモード）。このイメージは図１９におけるマイクロタイタープレート６０１の例示のように見えるであろう。この例示におけるウェルＣ４およびＥ９のような少数のウェルは、レセプタの刺激に際して放出されるＣａ＋＋のため、より明るく蛍光を発するであろう。次いで、応答６０２を誘導した化合物を含有するウェルの位置はＨＣＳプログラムに移動され、核周囲領域へのＧＰＣＲ転移の証拠についての青色蛍光の詳細な細胞管分析のために光学にスイッチが入れられるであろう。図１９の底部は高分解能細胞データの分析の２つの可能な結果を示す。カメラはウェル領域６０３のサブ領域６０４をイメージし、蛍光細胞６０５のイメージを生じる。ウェルＧ４において、細胞における蛍光の均一な分布はレセプタが内部化されていないことを示し、これはＣａ＋＋応答が細胞中のある他のシグナリングシステムの刺激の結果であったことを意味する。他方、ウェルＥ９  ６０６中の細胞は、核周辺領域におけるレセプタの濃度を明瞭に示し、これはレセプタの十分な活性化を示す。少数のヒットウェルが高分解能にて分析されなければならないに過ぎないので、デュアルモードシステムの総じてのスループットはかなり高くなることができ、高スループットシステム単独に匹敵する。
【０１４２】
実施例４  動的高含有量スクリーニング
以下はレセプタの内部化の速度論を測定するスクリーニングの実施例である。前述したように、ＧＰＣＲの刺激の結果、約１５分の経過により、レセプタの内部化が起こる。内部化されたか否かとしての終点を単に検出することは、化合物の能力をＧＰＣＲアゴニストまたはアンタゴニストとして定義するのに十分ではないであろう。しかしながら、５分間隔の３時点は測定の経過の間の能力についての情報を提供するのみならず、データのより長時間への外挿を可能とするであろう。このアッセイを行うには、サブ領域は２行と規定され、サンプリング間隔は５分と規定され、時点の合計数は３である。次いで、２行を走査し、次いで、試薬を２行に添加することによってシステムは開始され、時間＝０参照を確立する。試薬添加の後、システムは２行のサブ領域を再度走査し、最初の時点のデータを取得する。このプロセスは、サブ領域の出発まで溯って走査することを含めて約２５０秒を要するので、システムは第２の時点の取得を開始するのに５０秒待つであろう。あと２サイクルで３時点を生じ、システムは第２の２行サブ領域に移動するであろう。最後の２つの２行サブ領域が走査されてプレート上の全てのウェルを終了し、その結果、全プレートにわたり各ウェルにつき４時点となる。ウェルに対する時点は時間＝０に対してわずかに相殺され、時点の間隔は必要な５分に非常に近く、現実の取得時間および結果は固定された細胞スクリーニングにおけるよりもかなり高い精度をもって記録される。
【０１４３】
実施例５  ヒト糖質コルチコイドレセプタ転移の高含有量スクリーニング
ＨＣＳの１つのクラスは細胞内構成要素の薬物−誘導動的再分布を含む。ヒト糖質コルチコイドレセプタ（ｈＧＲ）、細胞の複雑な環境応答機械における単一「センサー」は、細胞へ拡散したステロイド分子に結合する。リガンド−レセプタ複合体は核に転移し、そこで翻訳活性化が起こる(Htunら,Proc.Natl.Acad.Sci.93:4845,1996)。
【０１４４】
一般に、それらの活性は鍵となる細胞内シグナリング経路の先端にあるので、ホルモンレセプタは優れた薬物標的である。従って、ｈＧＲ転移の高含有量スクリーニングはインビトロでのリガンド−レセプタ結合アッセイとは区別される利点を有する。本発明の細胞スクリーニングシステムにおける蛍光の２以上までのチャンネルの利用可能性は、他のレセプタ、他の区別される標的または他の細胞プロセスのような、平行した２つのさらなるパラメータをスクリーニングが含有することを可能とする。
【０１４５】
プラスミド構築体。緑色蛍光タンパク質−ヒト糖質コルチコイドレセプタ（ＧＦＰ−ｈＧＲ）キメラについてのコーディング配列を含有する真核生物発現プラスミドはＧＦＰ突然変異体を用いて調製した(Palmら,Nat.Struct.Biol.4:361(1997))。この構築体を用いてヒト頸癌細胞系（ＨｅＬａ）をトランスフェクトした。
【０１４６】
細胞の調製およびトランスフェクション。トランスフェクションの１２−２４時間先立って、５％木炭／デキストラン−処理胎児ウシ血清（ＦＢＳ）（ＨｙＣｌｏｎｅ）および１％ペニシリン−ストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ（Ｃ−ＤＭＥＭ）を用い、ＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２）をトリプシン処理し、平板培養し、３７℃および５％ＣＯ２でインキュベートした。トランスフェクションはリン酸カルシウム共沈殿によって(グラハム(Graham)およびVan der Eb,Virology 52:456,1973;サムブルック(Sambrook)ら,(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第２編 Colod Spring Harbor Laboratory Press,Colod Spring Harbor 1989)またはリポフェクタミン(Life Technologies,Gaithersburg,MD)で行った。リン酸カルシウムトランスフェクションでは、トランスフェクションに先立って、培地を５％木炭／デキストラン−処理ＦＢＳを含有するＤＭＥＭで置き換えた。細胞を３７℃および５％ＣＯ２にてリン酸カルシウム−ＤＮＡ沈殿と共に４−５時間インキュベートし、ＤＭＥＭで３乃至４回洗浄して沈殿を除去し、続いてＣ−ＤＭＥＭを添加した。
【０１４７】
リポフェクタミントランスフェクションは製造業者の指示(Life Technologies,Gaithersburg,MD)に従って抗生物質を含まない無血清ＤＭＥＭ中で行った。ＤＮＡ−リポソーム複合体との２乃至３時間のインキュベーションの後、培地を取り出し、Ｃ−ＤＭＥＭで置き換えた。９６−ウェルマイクロタイタープレート中の全てのトランスフェクトされた細胞を、薬物処理に先立って、３３℃および５％ＣＯ２にて２４−４８時間インキュベートした。実験はＨｅＬａ細胞中にて一過的に発現されたレセプタで行った。
【０１４８】
ＧＦＰ−ｈＧＲ転移のデキサメタゾン誘導。レセプタ−リガンド転移の動的データを得るために、トランスフェクトされた細胞の核を、まず、３３℃および５％ ＣＯ２にてＣ−ＤＭＥＭ中の５−μｇ／ｍｌ  ヘキスト(Hoechst)  ３３３４２(Molecular Probes)で２０分間標識した。細胞をハンクの平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）中で１回洗浄し、続いて、１％木炭／デキストラン−処理ＦＢＳを含むＨＢＳＳ中の１００ｎＭデキサメタゾンを添加した。固定時点デキサメタゾン力価測定データを得るために、トランスフェクトされたＨｅＬａ細胞を、まず、ＤＭＥＭで洗浄し、次いで、１％木炭／デキストラン−処理ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ中の０−１０００ｍＭデキサメタゾンの存在下で３３℃および５％ＣＯ２にて１時間インキュベートした。細胞は生きたまま分析するか、あるいはそれをＨＢＳＳですすぎ、ＨＢＳＳ中の３．７％ホルムアルデヒドで１５分間固定し、ヘキスト(Hoechst)  ３３３４２で染色し、分析前に洗浄した。細胞内ＧＦＰ−ｈＧＲ蛍光シグナルはこの固定手法によって減少しなかった。
【０１４９】
イメージの取得および分析。デキサメタゾンの添加後、生細胞の視野から蛍光イメージ対（ＧＦＰ−ｈＧＲおよびヘキスト(Hoechst)  ３３３４２−標識核）を１分間隔で３０分間取得することによって動的データを収集した。同様に、デキサメタゾンの添加から１時間後、固定時点スクリーニングプレートの各ウェルからイメージ対を得た。両方の場合、各地点で得られたイメージ対を用いて各細胞における核および細胞質領域を規定した。ＧＦＰ−ｈＧＲの転移は、核におけるＧＦＰ−ｈＧＲの積分蛍光強度を細胞質におけるキメラの積分蛍光強度で割ることによって、あるいはＧＦＰ蛍光の核−細胞質差異として計算した。固定時点スクリーニングにおいて、この転移比率は、テストしたデキサメタゾンの各濃度における少なくとも２００細胞から得られたデータから計算した。従って、細胞質から核へのＧＦＰ−ｈＧＲの薬物−誘導転移は転移比率の増加と相関した。
【０１５０】
結果。図２０はヒト糖質コルチコイドレセプタの薬物−誘導の細胞質２５３から核２５２への転移を模式的に表示する。模式図の上方対はデキサメタゾンでの刺激前２５０（Ａ）および後２５１（Ｂ）における細胞内のＧＦＰ−ｈＧＲの局所化を示す。これらの実験条件下で、薬物は細胞質ＧＦＰ−ｈＧＲの大部分を核へ転移するのを誘導する。この再分布は、処理２５５および未処理２５４細胞における細胞質および核蛍光の積分強度の比率を測定することによって定量される。蛍光顕微鏡写真の下方対は処理前２５４および後２５５における単一細胞中でのＧＦＰ−ｈＧＲの動的再分布を示す。ＨＣＳは、トランスフェクトされた数百乃至数千の細胞を含有するウェルにつき行い、ＧＦＰ蛍光を呈する視野中の各細胞につき転移が定量される。安定にトランスフェクトされた細胞系の使用は最も首尾一貫した標識細胞を生じるであろうが、一過性トランスフェクションによって誘導されたＧＦＰ−ｈＧＲ発現の不均一レベルは、本発明の細胞スクリーニングシステムによる分析に干渉しなかった。
【０１５１】
スクリーニングを実行するには、細胞スクリーニングシステムはプレートの各ウェルを走査し、各々における細胞の集団をイメージし、細胞を個々に分析する。ここに、蛍光の２つのチャンネルを用いて、各細胞内のＧＦＰ−ｈＧＲの細胞質および核分布を規定する。図２１に描かれたものは、ＧＦＰ−ｈＧＲスクリーニングの終わり近くでの細胞スクリーニングシステムのグラフ表示ユーザインターフェースである。ユーザインターフェースはシステムの平行したデータ収集および分析能力を描く。「核」２６１および「ＧＦＰ−ｈＧＲ」２６２の印を付けたウィンドウは単一視野で得られ分析される蛍光イメージの対を示す。「色の上塗り」２６０と印を付けられたウィンドウは、このイメージを偽脱色し、それらを融合することによって形成され、従って、ユーザは直ちに細胞の変化を同定することができる。「保存した対象領域」ウィンドウ２６５内では、各分析した細胞およびその隣の細胞を含むイメージが、それが検索されると提示される。さらに、ＨＣＳデータが収集されつつある場合、それらは分析され、ＧＦＰ−ｈＧＲ転移についてのこの場合、即座の「ヒット」応答に翻訳される。スクリーニング２６７の下方ウィンドウに描かれた９６ウェルプレートは、ユーザが規定したスクリーニング基準の組にいずれのウェルが適合するかを示す。例えば、白色のウェル２６９は、薬物誘導転移が５０％の所定の閾値を超過したことを示す。他方、黒色のウェル２７０は、テストされる薬物が１０％未満の転移を誘導したことを示す。灰色のウェル２６８は、転移値が１０％および５０％の間に入る「ヒット」を示す。分析される９６ウェルプレート２６６上の行「Ｅ」は、ＧＦＰ−ｈＧＲ転移を活性化されることが知られている薬物デキサメタゾンでの力価測定を示す。本実施例のスクリーニングは２つの蛍光チャンネルのみを用いた。２つのさらなるチャンネル（チャンネル３  ２６３および４  ２６４）は、複数パラメータスクリーニングを作り出すために他の特異的標的、細胞プロセス、または細胞毒性の平行分析で利用できる。
【０１５２】
新しいスクリーニングの有効化プロセスの間に強力なツールであるイメージデータベースおよび上方データベースの間のリンクがある。スクリーニングの完了において、ユーザはイメージおよび計算されたデータに全部接近できる。（図２２）。細胞スクリーニングシステムの包括的なデータ分析パッケージはユーザが複数レベルでＨＣＳデータを調べるのを可能とする。個々の細胞についてのスプレッドシート２７９中のイメージ２７６および詳細なデータは別々に見ることができるか、あるいはまとめたデータをプロットすることができる。例えば、９６ウェルプレート中の各細胞についての単一パラメータについての計算された結果をグラフ１  ２７５と印されたパネルに示す。グラフ中で単一の点を選択することによって、ユーザは、現存のデータベースから呼び出した特定の細胞についての全データ組を表示することができる。ここに示すのは、単一細胞（細胞番号１１８、灰色の線２７７）からのイメージ対２７６ならびに詳細な蛍光および形態データである。大きなグラフの挿入２７８はＧＦＰ−ｈＧＲの転移についてのデキサメタゾン濃度の結果を示す。各点は少なくとも２００細胞からのデータの平均である。このアッセイでのデキサメタゾンについてのＥＣ５０は２  ｎＭである。
【０１５３】
細胞スクリーニングシステムでのＨＣＳの強力な態様は、生細胞における多色蛍光および形態パラメータを用いる動的測定の能力である。時間的および空間的測定は、視野中の細胞の集団内で単一の細胞につき、なすことができる。図２３は単一視野内でのいくつかの細胞におけるＧＦＰ−ｈＧＲのデキサメタゾン−誘導転移についての動的データを示す。ＧＦＰ−ｈＧＲでトランスフェクトしたヒトＨｅＬａ細胞を１００ｎＭで処理し、ＧＦＰ−ｈＧＲの転移を単一細胞の集団において経時的に測定した。グラフはトランスフェクト細胞２８５、２８６、２８７および２８８および非トランスフェクト細胞２８９の応答を示す。また、これらのデータは異なる発現レベルで細胞を分析する能力を説明する。
【０１５４】
実施例６  薬物−誘導アポトーシスの高含有量スクリーニング
アポトーシスは、膨大な分子の事象および経路を含む複雑な細胞プログラムである。このプロセスに対する薬物作用のメカニズムを理解するには、時間的および空間的分解能でもって細胞内のできる限り多くのこれらの事象を測定するのが必須である。
【０１５５】
従って、ほとんど細胞試料の調製を要しないが、いくつかのアポトーシス−関連パラメータの自動読み出しを供するアポトーシススクリーニングが理想的であろう。細胞スクリーニングシステムのために設計された細胞ベースのアッセイを用いて、パクリタキセル−誘導アポトーシスの形態、オルガネラ、およびマクロ分子のホールマークのいくつかを同時に定量した。
【０１５６】
細胞の調製。この実験のために選択した細胞はマウス結合組織繊維芽細胞(L-929;ATCC CCL-1)および高度に侵入的な神経膠細胞系(SNB-19;ATCC CRL-2219)(ウェルチ(Welch)ら.,In Viro Cell,Dev.Biol.31:610,1995)であった。アポトーシス誘導薬物での処理の前日に、３５００細胞を９６−ウェルプレートの各ウェルに入れ、湿潤５％ＣＯ２雰囲気中で３７℃において一晩インキュベートした。翌日、培養培地を各ウェルから取り除き、ＤＭＳＯ中で作成した２０ｍＭストックからの種々の濃度のパクリタキセル（０／５０μＭ）を含有する新鮮な培地と交換した。これらの実験で使用したＤＭＳＯの最大濃度は０．２５％であった。次いで、前述したように細胞を２６時間インキュベートした。パクリタキセル処理時間の最後に、７５０ｎＭ  Mito Tracker Red(Molecular Probes;Eugene,OR)および３μｇ／ｍｌ  ヘキスト(Hoechst)  ３３３４２  ＤＮＡ−結合染料(Molecular Probes;Eugene,OR)を含有する新鮮な培地を各ウェルに摂取させ、前述したように２０分間インキュベートした。次いで、プレート上の各ウェルをＨＢＳＳで洗浄し、室温にてＨＢＳＳ中の３、７％ホルムアルデヒドで１５分間固定した。このホルムアルデヒドをＨＢＳＳで流し去り、０．５％（ｖ／ｖ）トリトンＸ−１００で９０秒間細胞を浸透させ、ＨＢＳＳで洗浄し、２Ｕｍｌ−１  Ｂｏｄｉｐｙ  ＦＬファラシジン(Molecular Probes)と共に３０分間インキュベートし、ＨＢＳＳで洗浄した。次いで、プレート上のウェルに２００μｌ  ＨＢＳＳを満たし、シールし、必要であればプレートを４℃で保存した。このように保存したプレートからの蛍光シグナルは調製後少なくとも２週間安定であった。核転移アッセイにおけるように、蛍光試薬はこのアッセイを生細胞高含有量スクリーニングに変換するように設計することができる。
【０１５７】
アレイ走査システムでのイメージ取得および分析。細胞内Ｍｉｔｏ  Ｔｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄ，ヘキスト(Hoechst)  ３３３４２およびＢｏｄｉｐｙ  ＦＬファラシジンの蛍光強度を前述したような細胞スクリーニングシステムで測定した。各ウェルから得られたイメージの各対からの形態データを得て、イメージ視野中の各対象（例えば、細胞および核）を検出し、そのサイズ、形状および積分強度を計算した。
【０１５８】
計算および出力。イメージ視野当たり合計５０−２５０細胞を測定した。細胞の各視野につき、以下の計算を行った。（１）平均核面積（μｍ２）は、視野中の合計核面積を検出した核の数で割ることによって計算した。（２）平均核周囲（μｍ）は、視野中の全ての核の周囲の合計をその視野中で検出された核の数で割ることによって計算した。かなり込み入ったアポトーシス核は最大核周囲値を有した。（３）平均核明るさは、核の全視野の積分強度をその視野中の核の数で割ることによって計算した。（４）平均細胞明るさは、Ｍｉｔｏ  Ｔｒａｃｋｅｒ染料で染色した細胞の全視野の積分強度をその視野中の核の数で割ることによって計算した。ミトコンドリア内で蓄積するＭｉｔｏ  Ｔｒａｃｋｅｒ染料の量はミトコンドリアポテンシャルに比例するので、平均細胞明るさの増加はミトコンドリアポテンシャルの増加と合致する。（５）また、平均細胞明るさは、Ｂｏｄｉｐｙ  ＦＬファラシジン染料で染色した細胞の全視野の積分強度をその視野中の核の数で割ることによって計算した。ファロトキシンは高親和性でもってアクチンの１５形態に結合するので細胞内に蓄積するＢｏｄｉｐｙ  ＦＬファラシジジン染料の量はアクチン１５状態に比例する。平均細胞明るさの増加はアクチン１５の増加に合致する。
【０１５９】
結果。図２４（頂部パネル）はＬ−９２９細胞の核形態で誘導されたパクリタキセル変化を示す。パクリタキセルの増大する量は核を拡大させ、断片化させる２９３（アポトーシスのホールマーク）。細胞スクリーニングシステムによって得られたこれらおよび他のイメージの定量的分析は同一図面に示す。測定された核パラメータは、Ｌ−９２９細胞２９６は、ＳＮＢ−１９細胞２９７よりも低濃度のパクリタキセルに対して感受性が低かった。しかし、より高濃度では、Ｌ−９２９細胞は測定された各パラメータに対する応答を示した。このアッセイのマルチパラメータアプローチは、薬物作用のメカニズムを解明するのに有用である。例えば、核２９８の面積、明るさ、および断片化ならびにアクチン１５値２９４は、ＳＭＢ−１９細胞が１０ｎＭパクリタキセルで処理された場合に最大値に達した（図２４；頂部および底部グラフ）。しかしながら、ミトコンドリアポテンシャル２９５は同一濃度のパクリタキセルで最小であった（図２４；中央のグラフ）全ての測定されたパラメータが増大するパクリタキセル濃度（＞１０ｎＭ）において対照レベルに接近したという事実は、ＳＮＢ  １９細胞が、薬物の十分に高いレベルで補償的である低親和性代謝またはクリアランス経路を有することを示唆する。ＳＮＢ−１９細胞２９７の薬物感度を対照させると、Ｌ−９２９はパクリタキセル２９６に対して異なる応答を示した。これらの繊維芽細胞は、５μＭパクリタキセル（ＳＮＢ−１９細胞よりも５００倍高い用量）において多くのパラメータで最大応答を示した。さらに、Ｌ−９２９細胞はテストしたパクリタキセル濃度のいずれにおいてもミトコンドリアポテンシャル２９５の鋭い減少を示さなかった。この結果は、正常および癌細胞系の間でのユニークなアポトーシス経路の存在と合致する。従って、これらの結果は、比較的単純な蛍光標識プロトコルを本発明の細胞スクリーニングシステムとカップリングさせて、プログラムされた細胞の死滅に関与する鍵となる事象の高含有量スクリーニングを作り出すことができる。
【０１６０】
バックグラウンド
アポトーシスのメカニズムに対する鍵は、致死的刺激とは無関係に死滅の結果、細胞およびオルガネラの解体および再パッケージング、ヌクレオソームサイズの断片へのＤＮＡ切断、および炎症反応を回避するための断片化細胞の巻き込みを含む同一のアポトーシス形態をもたらす発見であった。従って、アポトーシスは、細胞に対する急性外傷によってより媒介され、その結果、潜在的毒性および抗原性細胞成分が細胞間媒質にこぼされ、炎症反応に至る壊死とは区別される。
【０１６１】
細胞がアポトーシスを受けているか否かを判断するための基準(ワイリィ(Wyllie)ら.1980.Int Rev Cytol.68:251-306;Thompsom.1995.Science.267:1456-62;Majno及びJoris.1995.Am J Pathol.146:3-15;アレン(Allen)ら 1998.Cell Mol Life Sci.54:427-45)は、細胞の外観の区別される形態的変化、ならびに生化学および分子マーカの変化を含む。例えば、アポトーシス細胞は、しばしば、細胞質膜ブレブを受け、それらの染色体は迅速に凝縮し、核周囲の回りに凝集し、核断片およびアポトーシス体が形成される。全てではないが、多くのアポトーシス細胞においては、クロマチンはＤＮＡを切断する特異的ヌクレアーゼの標的となる。
【０１６２】
アポトーシスには、核形態の特徴的変化（クロマチンの凝縮および断片化）および２００塩基対のモノ−またはオリゴマー断片の形成が頂点に達するＤＮＡの段階的断片化が通常伴う。ミトコンドリア膜ポテンシャルのようなオルガネラ機能の特異的変化が起こる。加えて、特異的システインプロテアーゼ（カスパーゼ）が活性化され、これは、特異的アスパラギン酸残基の後、タンパク質分解切断によるタンパク質分解の高度に選択的なパターンを触媒する。加えて、（通常は内部膜リーフレット上の）ホスフォアチジルセリン残基の外部表面露出は、膜が破壊され、サイトゾルまたはオルガネラが細胞間スペースにこぼれ、炎症反応を惹起する前に、アポトーシスの認識および排除を可能とする。さらに、アポトーシスを受けつつある細胞は、減少した細胞内カリウムレベルを有しつつ収縮する傾向にある。
【０１６３】
アポトーシスシグナルの一般的パターンは、異なる細胞型およびアポトーシスインデューサの中で非常に似ている。しかしながら、この経路の詳細は、現実には、細胞型およびインデューサに応じてかなり変化する。アポトーシスに関与する種々のシグナル変換の従属性および独立性は活発な研究の現在のトピックスである。本発明者らは、ここに、この経路は特異的細胞型におけるインデューサの用量においても変化することを示す。
【０１６４】
核形態
アポトーシスを受けつつある細胞は、一般に、２つのタイプの核変化、断片化または凝集を呈する。((MajnoおよびJoris,1995),(Earnshaw,1995))。所与の細胞型における応答は、アポトーシスインデューサに応じて変化するように見える。核の断片化の間に、丸いまたは卵形の核は益々耳たぶ状になる。結局は、核は多数の亜核に劇的に断片化される。時々、耳たぶ状核内のクロマチンの密度は分布の空間的変動を示すことができ（ヘテロクロマチン化）、核の凝集で見られるへり形成に近くなる。
【０１６５】
核の凝集はＭＣＦ−７のようないくつかの細胞型において報告されてきた(Saundersら.1997.Int J Cancer.70:214-20)。凝縮は真正染色質、核マトリックスおよび核板の構造的一体性の喪失の結果として起こるようである(Hendzelら.1998 J Biol Chem.273:24470-8)。核の凝縮の間に、クロマチンは、核の周辺の近くに濃縮され、核の全体的収縮に至る。このように、アポトーシスの尺度としての核形態の使用は凝縮および断片化の双方を考慮に入れなければならない。
【０１６６】
材料および方法
細胞を３×１０３乃至１×１０４細胞／ウェルの密度にて９６−ウェルプレートに平板培養した。翌日、アポトーシスインデューサを示された濃度にて添加し、細胞を示された時間（通常１６−３０時間）インキュベートした。翌日培地を取り出し、新鮮な培地中の５μｇ／ｍｌ  ヘキスト(Hoechst)(モレキュラー・プローブ社(Molecular Probes,Inc.))で細胞を染色し、３７℃にて３０分間インキュベートした。細胞をハンク平衡塩（ＨＢＳＳ）中で洗浄し、室温にてＨＢＳＳ中の３．７％ホルムアルデヒドで固定した。細胞を室温にてＨＢＳＳで２回洗浄し、プレートをシールした。
【０１６７】
アポトーシスの誘導に際しての核形態の変化の定量は（１）核領域の有効サイズを測定し、次いで、（２）周辺の複雑性の度合いを測定することによって達成された。サイズパラメータは核凝縮のより感受性の尺度を提供し、他方、周辺の尺度は核断片化のより感受性の尺度を提供する。
【０１６８】
結果および考察
Ｌ９２９細胞はスタウロスポリン（３０時間）およびパクリタキセル（３０時間）双方に応答し、核形態の用量依存的変化を伴った（図２５Ａおよび２５Ｂ）。ＢＨＫ細胞はわずかにより複雑であるが明瞭に見える応答を示した。スタウロスポリンはより低い用量で核凝縮を刺激するように見え、より高い用量で核断片化を刺激するように見えた（図２５Ｃおよび２５Ｄ）。対照的に、パクリタキセルは増大する濃度にて核断片化の終始一貫した増加を誘導した。ＭＣＦ−７細胞の応答は、アポトーシスインデューサに応じて劇的に変化した。スタウロスポリンは核凝縮を誘導するように見え、他方、パクリタキセルは各断片化を誘導した（図２５Ｅおよび２５Ｆ）。
【０１６９】
図２６は核サイズおよび核周辺複雑性双方の点における用量応答を示す。断片化を先行する核の膨潤があるように見える。
【０１７０】
評価の結果：細胞系によるおよびアポトーシスインデューサによる異なる応答が用量依存的に観察され、このアッセイがアポトーシスの核特徴の変化を検出するのに有用であろうことを示す。
【０１７１】
アクチン再組織化
本発明者らは、アポトーシス変化に関連する可能なパラメータとしてアクチン細胞骨格の変化を評価した。これは、蛍光ファロイジン標識、ｆ−アクチン特異的染料で検出されたｆ−アクチン含有量の初期の増加の予備的観察に基づくものであった(未公表データ;レヴィー(Levee)ら 1996.Am J Physiol.271:C1981-92;マエカワ(Maekawa)ら.1996.Clin Exp Immunol.105:389-96)。アポトーシスの間のアクチン細胞骨格の変化は全ての細胞型で観察されていない(エンドレセン(Endresen)ら 1995.Cytometry.20:162-71,van エンゲランド(Engeland)ら.1997.Exp Cell Res.235:421-30)。
【０１７２】
材料および方法
細胞は３×１０３乃至１×１０４細胞／ウェルの密度で９６−ウェルプレート中で平板培養した。翌日、アポトーシスインデューサを示された濃度で添加した。細胞を示された時間（通常１６−３０時間）インキュベートした。翌日、培地を取り出し、新鮮な培地中の５μｇ／ｍｌ  ヘキスト(Hoechst)(Molecular Probes,Inc.)で細胞を染色し、３０℃で３０分間インキュベートした。細胞をＨＢＳＳ中で洗浄し、室温にてＨＢＳＳ中の３．７％をホルムアルデヒドで固定した。プレートをＨＢＳＳで洗浄し、室温にてＨＢＳＳ中の０．５％ｖ／ｖトリトンＸ−１００で浸透化させた。プレートをＨＢＳＳ中で洗浄し、１００μｌの１Ｕ／ｍｌのＡｌｅｘａ４８８ファロイジンストック（１００μｌ／ウェル、Molecular Probes,Inc.）で染色した。細胞を室温にてＨＢＳＳで２回洗浄し、プレートをシールした。
【０１７３】
ｆ−アクチン含有量の定量は、核の回りのファロイジン染色の強度を測定することによって達成した。これは、強度の十分な細胞質平均の理想的な近似であると判断された。この細胞質尺度を近似するのに用いたマスクは、ヘキスト(Hoechst)染料によって規定された核マスクに由来するものであった。由来は腐食および膨張の組合せによって達成された。
【０１７４】
結果および考察
ｆ−アクチン含有量の変化は細胞型およびアポトーシスインデューサに基づいて変化した（図２７）。スタウロスポリン（３０時間）はＬ９２９（図２７Ａ）およびＢＨＫ（図２７Ｂ）細胞におけるｆ−アクチンの増加を誘導した。ＭＣＦ−７細胞は濃度−依存性応答を呈した。低濃度においては（図２７Ｅ）、ｆ−アクチン含有量の減少があるように見えた。より高い濃度では、ｆ−アクチン含有量は増加した。パクリタキセル（３０時間）処理は広く種々の応答に導いた。Ｌ９２９細胞はｆ−アクチンの少しずつの増加に応答し（図２７Ｂ）、他方、ＢＨＫおよびＭＣＦ−７応答は高度に可変的であった（各々、２７Ｄおよび２７Ｆ）。
【０１７５】
評価の結果：シグナル強度の増加および減少は共にいくつかの細胞系で測定され、濃度依存的応答を呈することが判明した。ある細胞系／アポトーシスインデューサ対では、これは統計的に有意にアポトーシスインジケータであり得た。
【０１７６】
ミトコンドリア質量／ポテンシャルの変化
導入
ミトコンドリアの変化はアポトーシスにおいて中枢的な役割を演じる(ヘンカート(Henkart)およびGrinstein.1996.J Exp Med.183-1293-5)。ミトコンドリアは外方膜を通じてアポトーシス形成因子を放出し、内方膜の電気化学勾配を消失させる。これはミトコンドリア透過性転移（ＭＰＴ）の形成を介して起こると考えられるが、明らかに全ての場合には当てはまらない。ＨＰＴの形成の明白な発現はミトコンドリア膜ポテンシャルの崩壊である。抗−アポトーシスタンパク質Ｂｃｌ−２の薬理学的介入またはミトコンドリア発現によるＭＰＴの阻害は細胞の死滅を妨げ、これは、ＭＰＴの形成が死滅プロセスの律速事象で有り得ることを示唆する（レビューについては(クレーマー(Kroemer)ら 1998.Annu Rev Physiol.60:619-42参照)。また、ミトコンドリアはアポトーシスの刺激の間に増殖できることも観察されている(マンシーニ(Mancini)ら.1997.J Cell Biol.138:449-69;Camillen-Broetら.1998.Exp Cell Res.239:277-92)。
【０１７７】
ミトコンドリアにおけるアポトーシス−誘導変化を測定するための１つのアプローチはミトコンドリア膜ポテンシャルを測定することである。利用できる方法のうち、最も単純な尺度は、膜ポテンシャルに基づく細胞内オルガネラ内に分布するカチオン性染料の再分布である。そのようなアプローチは、伝統的には、測定のために生細胞を必要とする。Mito Tracker染料の最近の導入(プート(Poot)ら 1997.Cytometry.27:358-64;Molecular Probes,Inc.Oregonから入手可能)は、固定後にミトコンドリア膜ポテンシャルを測定する手段を提供する。
【０１７８】
アポトーシスの間におけるミトコンドリア質量の可能な増加が観察されたとすれば、ミトコンドリアを標識する染料の量はミトコンドリアの膜ポテンシャルおよび数の双方に関連する。もしミトコンドリアの数が一定なままであれば、染料の量は膜ポテンシャルに関連する。もしミトコンドリアの数が一定でなければ、シグナルは質量の増加によって支配されるようである(ライパート(Reipert)ら.1995 Exp Cell Res.221-281-8)。
【０１７９】
ＨＣＳアッセイにおける質量およびポテンシャルの変化の間の明瞭な分離を可能とするプローブが入手できる。ミトコンドリアの質量は、MitoTracker Green FMで標識することによって直接測定される(プート(Poot)およびピアス(Pierce),1999,Cytometry,35:311-7;モレキュラー・プローブ社(Molecular Probes,Inc.),Oregonから入手可能)。標識はミトコンドリア膜ポテンシャルから独立しているが、ミトコンドリアの質量に比例する。また、これはミトコンドリア質量に関して各細胞における他のミトコンドリア尺度を正規化する手段を提供する。
【０１８０】
材料および方法
細胞を、３×１０３から１×１０４細胞／ウェルまでの密度で９６孔平板に載せた。以下の日のアポトーシス誘導物質を、指示の濃度で添加し、そして細胞を、指示期間（通常１６−３０時間）の間インキュベートした。細胞を、新鮮な培地中の５μｇ／ｍｌヘキスト(Hoechst)(モレキュラー・プローブ社(Molecular Probes,Inc.))および７５０ｎＭ  MitoTracker Red(CMXRos、モレキュラー・プローブ社(Molecular Probes,Inc.))で染色し、そして３７℃で、３０分間インキュベートした。細胞を、ＨＢＳＳで洗浄し、そして室温でＨＢＳＳ中の３．７％ホルムアルデヒドで固定した。平板を、ＨＢＳＳで洗浄し、そして室温で、ＨＢＳＳ中の０．５％ｖ／ｖトリトンＸ−１００で透過させた。細胞を、室温でＨＢＳＳで２回洗浄し、そして平板を封印した。ミトコンドリアの二重標識のために、固定の前に、０．５時間、細胞を、２００ｎＭ  MitoTracker Greenおよび２００ｎＭ  MitoTracker Redで処理した。
【０１８１】
結果および検討
スタウロスポリンおよびパクリタキセルによるアポトーシスの誘導は、刺激によって可変のミトコンドリアの変化に至った。Ｌ９２９細胞は、スタウロスポリン濃度が増加しつつ、ミトコンドリアの質量における明確な増大を示した（図２８）。ＢＨＫ細胞は、低濃度のスタウロスポリンで膜電位での減少か、高濃度のスタウロスポリンでの質量における増大のいずれかを示した（図２８Ｃ）。ＭＣＦ−７細胞は、スタウロスポリンの濃度が増加することに対応してミトコンドリア膜電位での一致した減少により応答した（図２８Ｅ）。パクリタキセルの濃度が増大することで、ミトコンドリア質量における一致した増加を引き起こした（図２８Ｂ、２８Ｄおよび２８Ｆ）。
【０１８２】
ミトコンドリア膜電位は、MitoTracker Green FMおよびMitoTracker Red(モレキュラー・プローブ社(Molecular Probes,Inc.))の両方でミトコンドリアを標識することによって測定される。MitoTracker Red標識は、質量および膜電位の両方に比例する。MitoTracker Green FM標識は、質量に比例する。MitoTracker Red信号対MitoTracker Green FM信号の比は、ミトコンドリア膜電位の測定値を供する(プート(Poot)およびピアス(Pierce)、1999)。この比は、MitoTracker Red信号に関するミトコンドリア質量を正常化する。（図２８Ｇを参照）。ミトコンドリア質量を正常化する能力を、膜電位の測定値と合せて、両方のパラメータの独立の評価を可能にする。
【０１８３】
評価の結果：電位における減少および質量における増加の両方が、試験されたセルラインおよび誘導物質によって観察された。用量依存性相互作用は、これは、予想のアポトーシス誘導物質であることを示す。
【０１８４】
蛍光分光法のスペクトルのドメインを利用することによってアポトーシスの多重測定を組合わせることが可能である。実際、先に示された核形態／ｆ−アクチン定数／ミトコンドリア質量電位のデータの全ては、多重パラメータアッセイとして収集されたが、しかし明瞭さについて個々に表された。
【０１８５】
実施例７  細胞質から核までの疾病関連配列を含む信号発生酵素のプロテアーゼで誘導される翻訳
プラスミド構築物。緑色蛍光タンパク質についてのコーディング配列を含む真核生物の発現プラスミド−カスパーゼ(コーエン(Cohen)(1997)、Biochemical J.326:1-16;Liangら(1997)、J.of Molec.Biol.274:291-302)キメラは、ＧＦＰ突然変異体を使用して作製する。構築物は、真核細胞の生物を形質移入するのに使用される。
【０１８６】
細胞作製および形質移入。細胞をトリプシン処理し、そして形質移入の２４時間前にプレートに載せ、そして３７℃および５％ＣＯ２でインキュベートする。それに限定されないが、リン酸カルシウム共沈殿またはリポ移入を含めた方法によって形質移入を行う。細胞を、４−５時間、３７℃および５％ＣＯ２で、リン酸カルシウム−ＤＮＡ沈殿でインキュベートし、ＤＭＥＭで３−４回洗浄して、沈殿物を除去し、続いてＣ−ＤＭＥＭを添加する。製造業者の指示によって、抗体なしに血清不含ＤＭＥＭ中でリポフェクタミン形質移入を行った。ＤＮＡ−リポゾーム複合体と２−３時間のインキュベーションに続いて、培地を除去し、そしてＣ−ＤＭＥＭに交換する。
【０１８７】
カスパーゼ−ＧＦＰ転位のアポトーシス誘導。カスパーゼ−ＧＦＰ翻訳速度論データを得るために、形質移入細胞の核を、２０分間、３７℃および５％ＣＯ２で、５μｇ／ｍｌヘキスト(Hoechst)  ３３３４２（モレキュラープローブス）で最初に標識する。細胞を、ハンクの平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）で１回洗浄し、続いてアポトーシスを誘導する化合物を添加する。これらの化合物は、それに限定されないが、パクリタキセル、スタウロスポリン、セラミド、および腫瘍自然死因子が挙げられる。固定された時点の滴定データを得るために、形質移入された細胞を、最初にＤＭＥＭで洗浄し、そしてその後、ＤＭＥＭ中の０−１０００ｎＭ化合物の存在下で１時間、３７℃および５％ＣＯ２で、インキュベートする。細胞を、生で分析するか、またはそれらを、ＨＢＳＳで洗浄し、１５分間、ＨＢＳＳ中の３．７％ホルムアルデヒドで固定し、ヘキスト(Hoechst)  ３３３４２で染色し、そして分析の前に洗浄する。
【０１８８】
画像取得および分析。速度論データは、化合物の添加の後に３０分間、１分の間隔で生きている細胞のフィールドから蛍光画像対（カスパーゼ−ＧＦＰおよびヘキスト(Hoechst)  ３３３４２−標識核）を取得することによって収集する。同様に、画像対は、化合物の添加の１時間後に、固定された時点のスクリーニングプレートの各ウェルから得る。両方の場合に、各時点で得られる画像対を、各細胞での核および細胞質領域を定義するのに使用する。カスパーゼ−ＧＦＰの転位は、細胞質中のキメラの積分蛍光郷土によるか、またはＧＦＰ蛍光の核−細胞質差異として核中のカスパーゼ−ＧＦＰの積分蛍光強度を分割することによって計算される。固定された時点のスクリーンで、この転位比は、試験した化合物の各濃度で、少なくとも２００個の細胞から得られるデータから計算される。したがって、細胞質から核までのカスパーゼ−ＧＦＰの薬物誘導転位は、転位比での増大と相互関係がある。それに限定されないが、アポトーシス活性化酵素の推定アクチベータまたは阻害剤を含むものが含まれる分子相互作用ライブラリーを、指標セルラインをスクリーニングするのに使用し、そしてＤＡＳについての特定のリガンド、および化合物活性によって活性化された経路を同定する。
【０１８９】
実施例８  ＤＡＳからの新規ステロイドレセプタの同定
材料および／または情報の２つの起源は、この実施形態を利用するために必要とされ、そしてそれは、特徴付けられていない遺伝子の機能を評価することを可能にする。最初に、哺乳類細胞への形質移入について適するｃＤＮＡ配列を含む疾病関連配列バンクを、使用できる。各ＲＡＤＥまたは分化発現実験は、数百の配列まで発生するので、ＤＡＳのアンプル供給を発生することが可能である。第２に、一次配列データベース調査から得られる情報は、ＤＡＳを広範なカテゴリーに置くのに使用でき、そしてそれは、限定されないが、信号配列、７つの膜貫通モチーフ、保存プロテアーゼ活性部位ドメイン、または他の同定可能なモチーフを含有するものが挙げられる。これらの起源から取得される情報に基づいて、方法のタイプおよび形質移入されるべき指標セルラインが選択される。多量のモチーフは、すでに十分に特徴づけられ、そして存在するゲノムデータベース内の多数の遺伝子内に含まれる線形配列にコードされている。
【０１９０】
１つの実施形態では、以下の段階が取られる。
【０１９１】
１）ＤＡＳ同定実験から得られる情報（データベース調査を含めて）を、相対的生物学的行程を選択するための概念として使用する。（例えば、細胞サイクル調節、アポトーシス代謝プロテアーゼなどのための腫瘍セルラインから得られるＤＡＳを参照すること）。
【０１９２】
２）同定可能なモチーフ（すなわち、信号配列７−膜貫通ドメイン、保存プロテアーゼ活性部位ドメインなど）によってＤＮＡ配列またはＤＡＳの分類すること。この当初の群は、上で記述されるとおり、蛍光タグ付け攻略法、宿主セルライン指標セルライン、およびスクリーニングされた生物活性分子のバンクを決定する。
【０１９３】
３）十分に樹立された分子生物学法を使用して、この目的のために設計された発現ベクターにＤＡＳを連結する。一般化された発現ベクターは、一過性の発現について細胞のために標的発現を集めるプロモータ、エンハンサー、およびターミネータを含む。このようなベクターは、抗体タグ付き配列、直接会合配列、宿主によって発現されるときに検出を促進するＧＦＰのような発色団融合配列も含まれ得る。
【０１９４】
４）リン酸カルシウム共沈殿、リポソーム依存性、ＤＥＡＥデキストラン依存性、ポリカチオン依存性、ウイルス依存性、または電気穿刺を含めた標準形質移入プロトコールを用いてＤＡＳ含有ベクターで細胞を一過的に形質移入し、そしてマイクロタイタープレートまたはマイクロウェルアレイに載せる。代替的に、形質移入は、マイクロタイタープレートそれ自身で直接行われ得る。
【０１９５】
５）上で記述されたとおり細胞スクリーニング法を行う。
【０１９６】
この実施形態では、転写活性電位（例えば、ＤＮＡ結合ドメイン、アミノ末端調節ドメイン、ヒンジ領域、またはカルボキシ末端リガンド結合ドメイン）を示唆するモチーフを保有することが示されたＤＡＳは、新規ステロイドレセプタを同定するのに利用される。
【０１９７】
この実験のための蛍光タグを定義するのは、染色を通した核の同定に関与し、そして発現ベクターへのＤＡＳの挿入を介してＧＦＰキメラを作製することによるＤＡＳをタグ付けして、ＧＦＰをコードする遺伝子に隣接に融合した。代替的に、発現ＤＡＳのある程度の部分に高い親和性を示す一本鎖抗体断片は、当該分野において利用可能な技術(Cambridge Antibody Technologies)を用いて構築され、そして発色団（ＦＩＴＣ）に結合して、細胞中で推定転写アクチベータ／レセプタにタグ付けし得たであろう。この代替法は、ＤＮＡ転写を必要としない内部タグを提供し、そしてしたがって、分布データが、ＤＡＳを生じるために使用された当初の一次培養物から集められる場合に有用である。
【０１９８】
プラスミド構築物。緑色の蛍光タンパク質のためのコーディング配列を含む真核生物の発現プラスミド−ＤＡＳキメラは、ＧＦＰ突然変異体を使用して作製する。構築物を、ＨｅＬａ細胞を形質移入するのに使用する。宿主細胞に形質移入されるとき、プラスミドは、ＤＡＳタンパク質産物に融合したＧＦＰを産生し、ＧＦＰ−ＤＡＳｐｐと称される。
【０１９９】
細胞作製および形質移入。ＨｅＬａ細胞をトリプシン処理し、そして１２−２４時間前に、５％カロコール／デキストラン処理胎仔ウシ血清（ＦＢＳ）（ＨｙＣｌｏｎｅ）および１％ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｃ−ＤＭＥＭ）を含むＤＭＥＭを用いてプレートに付着させ、そして３７℃および５％ＣＯ２でインキュベートする。リン酸カルシウム共沈殿により、またはリポフェクタミン(Life Technologies)を用いて形質移入を行う。リン酸カルシウム形質移入について、形質移入の前に、５％カロコール／デキストラン処理ＦＢＳを含むＤＭＥＭに培地を取替える。細胞を、３７℃および５％ＣＯ２でリン酸カルシウム−ＤＮＡ沈殿物と共にインキュベートし、そして沈殿物を除去するために３−４回ＤＭＥＭで洗浄し、続いてＣ−ＤＭＥＭを添加する。製造業者により、抗体なしに血清不含ＤＭＥＭリポフェクタミン形質移入を行う。ＤＮＡ−リポソーム複合体との２−３時間インキュベートに続いて、培地を取り除き、そしてＣ−ＤＭＥＭに置換する。９６孔マイクロタイター平板中の全ての形質移入細胞を、薬物処置の前に、２４−４８時間、３３℃および５％ＣＯ２でインキュベートする。ＨｅＬａ細胞で一過性に発現されたレセプタを用いて、実験を行う。
【０２００】
発現ＧＦＰ−ＤＡＳｐｐ内側細胞の局在化。細胞分布データを得るために、形質移入細胞の核を、最初に、２０分間、３３℃および５％ＣＯ２でＣ−ＤＭＥＭ中の５μｇ／ｍｌヘキスト(Hoechst)  ３３３４２（モレキュラープローブズ）で標識する。細胞を、ハンクの平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）で１回洗浄する。細胞を生きたまま分析する。それらを、ＨＢＳＳで洗浄し、ＨＢＳＳ中の３．７％ホルムアルデヒドで１５分間固定し、ヘキスト(Hoechst)  ３３３４２で染色し、そして分析前に洗浄する。
【０２０１】
好ましい実施形態では、本発明の細胞スクリーニング系を用いて、画像取得および分析を行う。蛍光画像対（ＧＦＰ−ＤＡＳｐｐおよびヘキスト(Hoechst)  ３３３４２−標識核）を取得することによって、細胞内のＧＦＰ−ＤＡＳｐｐ蛍光信号を収集する。各時点で得られる画像対は、各細胞中の核および細胞質を定義するのに使用される。細胞質中の分散信号を示すデータは、ＤＮＡ転写性アクチベータである公知ステロイドレセプタに一致する。
【０２０２】
ＧＦＰ−ＤＡＳｐｐ転位の誘導についてのスクリーニング。指標セルラインとしてＧＦＰ−ＤＡＳｐｐの適切な発現について確認した上記構築物を用いて、一連のステロイド型リガンドを用いて種々のリガンドのスクリーニングを行い、そしてそれに限定されないが、エストロゲン、プロゲステロン、レチノイド、成長因子、アンドロゲン、および多くの他のステロイドおよびステロイド基本分子が挙げられる。本発明の細胞スクリーニング系を用いて、画像取得および分析を行う。フィールド細胞から蛍光画像対（ＧＦＰ−ＤＡＳｐｐおよびヘキスト(Hoechst)  ３３３４２−標識核）を取得することによって、細胞内ＧＦＰ−ＤＡＳｐｐ蛍光信号を収集する。各時点で得られる画像対を、使用して、各細胞中の核および細胞質領域を定義する。細胞質中のキメラの積分蛍光強度によって、またはＧＦＰ蛍光の核−細胞質差異として核中のＧＦＰ−ＤＡＳｐｐの積分蛍光強度を分割することによって、ＧＦＰ−ＤＡＳｐｐの転位を計算する。細胞質から核への転位は、ＤＡＳｐｐのリガンド結合活性を示し、それにより電位レセプタクラスおよび作用が同定される。公知阻害剤およびステロイドレセプタの修飾因子を用いてこのデータを、類似の形態で他のデータと組合せて、標的としてＤＡＳｐｐを有効にするか、またはより多くのデータが、種々の起源から発生される。
【０２０３】
実施例９  付加スクリーン
原形質膜および細胞質の間の転位：
プロフィラクチン複合体解離および原形質膜へのプロフィリンの結合。１つの実施形態では、２−３００ｎｓの範囲にある蛍光寿命を保持するプローブを用いて、プロフィリン膜結合の蛍光タンパク質バイオセンサーを作製する(Federovら(1994)、J.Molec.Biol.241:480-482;Lanbrechtsら(1995)、Eur.J.Biochem.230:281-286)。標識したプロフィリンを、バルクロード形態を用いて、生きている指標細胞に導入し、そして指標細胞を、試験化合物で処置する。蛍光のアニソトロフィー画像顕微鏡(Goughおよびテーラー(Taylor)(1993)、J.Cell Biol.121:1095-1107)を使用して、０．１秒から１０時間までの範囲にある処理の後の期間に細胞質および膜の間のプロフィリンの蛍光誘導体の試験化合物依存性運動を測定する。
【０２０４】
膜に対するＲｈｏ−ＲｈｏＧＤＩ複合体転位。別の実施形態では、指標細胞を、試験化合物で処理し、そしてその後、固定し、洗浄し、そして透過性にする。指標細胞原形質膜、細胞質、および核を、際立って着色したマーカで全て標識し、続いて、Ｒｈｏタンパク質(セルフ(Self)ら(1995)、Methods in Enzymology 256:3-10;タナカ(Tanaka)ら(1995)、Methods in Enzymology 256:41-49)を、４番目の色で標識された抗体を用いて免疫化する。４つの標識の各々は、細胞スクリーニング系を用いて別々に画像化され、そして画像を、試験化合物によって影響される転位の阻害および活性化の量を計算するために使用する。この計算を行うために、原形質膜および細胞質に印をつけるために使用されるプローブの画像を使用して、細胞内のＲｈｏタンパク質の位置を印しをつける免疫学的プローブの画像を覆う。核被覆下の単位領域当たりの積分した明るさを使用して、対照および実験ウェルから得られる転位商の値を比較することによって、各電位ロード化合物について転位率を計算する。
【０２０５】
Ｇ−タンパク質レセプタ活性化における原形質膜へのβ−アレスチン転位
膜転位高含有量スクリーンに対する細胞質の別の実施形態では、細胞質から原形質膜までのβ−アレスチンタンパク質の転位を、細胞処理に対する応答で測定する。転位を測定するために、発光のドメインマーカを含む生きた指標細胞を、試験化合物で処理し、そしてβ−アレスチンマーカの動きを、本発明の細胞スクリーニング系を用いて時間および空間で測定する。好ましい実施形態では、指標細胞は、一過性または安定な細胞形質移入および細胞質および膜ドメインに印をつけるのに使用される他のレポータの使用を通して、指標細胞によって発現される緑色の蛍光タンパク質β−アレスチン（ＧＦＰ−β−アレスチン）タンパク質キメラから構成される発光のマーカを含有する(バラク(Barak)ら(1997)、J.Biol.Chem.272:27497-27500;Daakaら(1998)、J.Biol.Chem.273:685-688)。指標細胞が、静止状態にある場合、ドメインマーカ分子は、原形質膜中に、または細胞質中に優先的に分配する。高含有量スクリーンでは、これらのマーカは、蛍光の区別できるチャンネル中に細胞の細胞質および原形質膜を描くのに使用される。指標細胞を、試験化合物で処理したときに、ＧＦＰ−β−アレスチンの動的再分配を、０．１秒から１０時間までの範囲にある時間規模をかけて、一連の画像として記録する。好ましい実施形態では、時間規模は、１時間である。原形質膜および細胞質の間のＧＦＰ−β−アレスチンタンパク質の運動を定量する方法によって、各画像を分析する。この計算を行うために、原形質膜および細胞質に印をつけるために使用されたプローブの画像を、細胞内のＧＦＰ−β−アレスチンタンパク質の位置に印をつけるＧＦＰ−β−アレスチンプローブの画像を被覆するのに使用する。各マスク下の単位領域当たりの積分した明るさは、原形質膜の積分した明るさ／領域を、細胞質の積分した明るさ／領域によって分割することによって、転位商を形成するのに使用される。対照および実験ウェルから得られる転位商の値を比較することによって、転位率を、各電位ロード化合物について計算する。高含有量スクリーンの出力は、目的の試験化合物で処理された多数の個々の細胞内で転位の規模を示す定量的データに関連する。
【０２０６】
小胞体およびゴルジ体の間の転位：
ゴルジ体転位高含有量スクリーンに対する小胞体の１つの実施形態では、小胞体からゴルジ体ドメインまでの水泡性口内炎ウイルス(エレンバーグ(Ellenberg)ら(1997)、J.Cell Biol.138:1193-1206;プレスリー(Presley)ら(1997)、Nature 389:81-85)のｔｓ０４５突然変異株からのＶＳＶＧタンパク質の転位を、細胞処理に応答して測定する。転位を測定するために、発光のレポータを含む指標細胞を、化合物で処理し、そしてレポータの運動を、本発明の細胞スクリーニング系を用いて空間および時間で測定する。指標細胞は、小胞体およびゴルジ体ドメインの局在化を測定するために使用される一過性または安定性細胞形質移入および他のドメインマーカの使用を通して、指標細胞によって発現されるＧＦＰ−ＶＳＶＧタンパク質キメラから構成される発光のレポータを含む。指標細胞が、４０℃でそれらの静止状態にある場合、ＧＦＰ−ＶＳＶＧタンパク質キメラ分子を、小胞体中に優先的に分配する。この高含有量スクリーンで、際立った色のドメインマーカを、蛍光の区別できるチャンネル中に小胞体およびゴルジ体ドメインを描くのに使用される。指標細胞を、試験化合物で処理し、そして温度を、３２℃に同時に低下させるときに、ＧＦＰ−ＶＳＶＧタンパク質キメラの動的再分配を、０．１秒から１０時間までの範囲にある時間規模をかけて、一連の画像として記録する。小胞体およびゴルジ体ドメインの間のＧＦＰ−ＶＳＶＧタンパク質の運動を定量する方法によって、各画像を分析する。この計算を行うために、小胞体およびゴルジ体ドメインに印をつけるために使用されたプローブの画像を、細胞内のＧＦＰ−ＶＳＶＧタンパク質の位置に印をつけるＧＦＰ−ＶＳＶＧプローブの画像を被覆するのに使用する。各マスク下の単位領域当たりの積分した明るさは、小胞体の積分した明るさ／領域を、ゴルジ体の積分した明るさ／領域によって分割することによって、転位商を形成するのに使用される。対照および実験ウェルから得られる転位商の値を比較することによって、転位率を、各電位ロード化合物について計算する。高含有量スクリーンの出力は、１分から１０時間までの範囲にある期間、１０−１２Ｍから１０−３Ｍｍでの範囲に入る最終濃度で、目的の試験化合物で処理された多数の個々の細胞内で転位の規模を示す定量的データに関連する。
【０２０７】
臓器機能の誘導および阻害：
細胞内微小管安定性
本発明の別の態様では、微小管構造を改修する化合物を同定する自動化法を提供する。この実施形態では、指標細胞を、試験化合物で処理し、そして発光の微小管標識分子の分布を、上で開示されたもののような細胞スクリーニング系を用いて空間および時間で測定する。発光の微小管標識分子は、細胞を試験化合物と接触させる前と一緒に、または後のいずれかで、その細胞によって発現されるか、または細胞に添加され得る。
【０２０８】
本発明のこの態様の１つの実施形態では、生きた細胞は、発光タンパク質に融合した微小管を標識するタンパク質を特徴とする、微小管力学の発光で標識されたタンパク質バイオセンサーを発現する。本発明のこの態様についての適当な微小管を標識するタンパク質としては、それに限定されないが、αおよびβチューブリン異形態、およびＭＡＰ４が挙げられる。発光タンパク質の好ましい実施形態としては、それに限定されないが、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）およびＧＦＰ突然変異体が挙げられる。好ましい実施形態では、その方法は、微小管を標識するタンパク質が、それに限定されずに、α−チューブリン、β−チューブリン、または微小管関連タンパク質４（ＭＡＰ４）であり得ることを特徴として、細胞を、微小管を標識する発光タンパク質で形質移入することに関する。ここに概説されるアプローチ法は、当業者が、生きた細胞測定を行って、インビボでのチューブリン活性および微小管安定性における先導化合物の効果を決定するのを可能にする。
【０２０９】
最も好ましい実施形態では、ＭＡＰ４は、改変されたオワンクラゲ(Aequorea victoria)緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）に融合させる。ＥＧＦＰコーディング配列(Clontechから入手可能)と、マウスＭＡＰ４についてのコーディング配列との間の融合から構成されるＤＮＡ構築が行われた。(Olsonら(1995)、J.Cell Biol.130(3):639-650)。ＭＡＰ４は、インターフェース並びに有糸分裂細胞で微小管と相互作用することが知られているユビキチンの微小管関連タンパク質である(オムステッド(Olmsted)およびムロフシ(Murofushi)(1993)、「Guidebook to the Cytoskeleton and Motor Proteins」におけるMAP4、Oxford University Press、T.KreisおよびR.Vale編)。その後、その局在化は、細胞基本ＨＣＳアッセイのための細胞サイクルの全ての段階で、生きた（または固定した）細胞における微小管の局在化、組織化および完全性の指標として働き得る。ＭＡＰ２およびタウ（神経細胞で特異的に発現される微小管関連タンパク質）が、ＧＦＰキメラから形成されるために使用した(ケチョ(Kaech)ら(1996)Neuron.17:1189-1199;ホール(Hall)ら(1997)、Proc.Nat.Acad.Sci.94:4733-4738)一方で、過剰発現したときのそれらの制限された細胞型分布および微小管を束ねるためにこれらのタンパク質の傾向は、これらのタンパク質を、可変の組織および臓器から生じる生きた細胞での分析のための分子試薬として好ましくしない。ＧＦＰ−ＭＡＰ４の中程度の過剰発現は、微小管機能または完全性を崩壊させない（オルソン(Olson)ら、1995）。類似の構築物は、当業界で水準技術を介してβ−チューブリンまたはα−チューブリンを用いて作られる。これらのキメラは、細胞サイクルの全段階の間中、微小管活性を観察および分析する手段を提供する。
【０２１０】
別の実施形態では、微小管力学の発光で標識されたタンパク質バイオセンサーを、発現、単離し、そして微小注入、スクラップロード、および衝撃指向性ロードのような塊状ロード技術を介して分析されるべき細胞に添加する。この実施形態では、細胞内に過剰発現の問題はなく、したがって、αおよびβチューブリン異形態、ＭＡＰ４、ＭＡＰ２および／またはタウはすべて使用できる。
【０２１１】
さらなる実施形態では、タンパク質バイオセンサーは、細胞によって発現され、そして細胞を、タンパク質バイオセンサーを検出する標識抗体、内因性レベルのタンパク質抗原、またはその両方のような発光の標識と連続して接触させる。この実施形態では、αおよび／またはβチューブリン異形態を検出する発光標識ＭＡＰ４、ＭＡＰ２および／またはタウを使用できる。
【０２１２】
多様なＧＦＰ突然変異体は、入手可能であり、その全ては、本発明で有効であり、そしてそれに限定されないが、市販で入手可能であるＧＦＰ突然変異体(クローンテック(Clontech)、カルフォルニア(California))が挙げられる。
【０２１３】
ＭＡＰ４構築物は、数種の哺乳類セルライン(BHK-21、Swiss 3T3、HeLa、HEK293、LLCPK)に導入され、そしてチューブリンの組織化および局在化は、ＭＡＰ４局在化の指標としてＧＦＰ蛍光によって生きた細胞で可視化された。構築物が、一過的に発現できるか、または安定なセルラインを、標準法によって製造できる。ＥＧＦＰ−ＭＡＰ４キメラを発現する安定なＨｅＬａセルラインを得て、それによりキメラの発現が毒性でなく、そして有糸分裂を干渉しないことを示す。
【０２１４】
安定なセルラインの樹立および維持のための可能な選択性マーカとしては、それに限定されないが、ネオマイシン耐性遺伝子、ヒグロマイシン耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、プロマイシン耐性遺伝子、ブレオマイシン耐性遺伝子、およびブラスタシジン耐性遺伝子が挙げられる。
【０２１５】
微小管組立、分解および再配列を監視するためのこの方法の利用性は、パクリタキセル、ノコダゾール、ビンクリスチン、またはビンブラスチンのような微小管の薬物での一過的にそして安定に形質移入した細胞の処理によって示された。
【０２１６】
本発明の方法は、１つのパラメータとして、高含有量および高処理量−高含有量の組合せた細胞基本のスクリーン、特に多パラメータの癌標的スクリーンを提供する。ここに使用されるＥＧＦＰ−ＭＡＰ４構築物は、多信号発生経路または生理学的事象を測定する高含有量スクリーンの成分の１つとして使用され得る。好ましい実施形態では、細胞を含む位置の各々にある複数細胞が、高処理量モードで分析され、そして細胞を含む位置のサブセットのみが、高含有量モードで分析される、高処理量および高含有量のスクリーンを使用する。高処理量スクリーンは、さらに分析されるべき細胞を含むそれらの位置を同定するのに有用である任意のスクリーンであり得て、それに限定されないが、発光強度が増大されつつ位置を同定すること、レポータ遺伝子の発現を示すもの、カルシウム変化を受けるもの、およびｐＨ変化を受けるものが挙げられる。
【０２１７】
薬物スクリーニング用途に加えて、細胞分裂および運動性のような基礎的細胞過程が、微小管力学に非常に依存するので、本発明は、臨床的診断、化学的および生物学的武器、および基本的研究市場の検出に使用され得る。
【０２１８】
画像取得および分析
画像データは、固定または生きた指標細胞のいずれかから得られ得る。各画像から得られる形態のデータを抽出するために、得られた以下分析の方法を使用する。
【０２１９】
１．核または細胞束の外側の各画素について値＝０を示すマスクを生じる各核および細胞質の画像閾値
２．元の画像にマスクを被せ、フィールド中の各目的物（例えば、核または細胞）を検出し、そしてそのサイズ、形、および積分強度を計算する。
【０２２０】
３．対応の発光の微小管画像で上に得られた全細胞マスクを被せ、そして１つまたはそれ以上の以下の組の選別機を使用して、微小管形態および微小管形態における薬物の効果を測定する。
【０２２１】
微小管形態は、態様の微小管の型、サイズ、凝集状態および重合状態を定量する一組の選別機を用いて定義される。これらの選別機は、同時発生マトリックス、組織測定、スペクトル法、構造的方法、小波形質転換、統計的方法、またはその組合せを含めたアプローチ法に基づき得る。このような選別機の実施形態は、以下のとおりである。
【０２２２】
１．個々の細胞中の末端強度を測定し、各細胞内の総末端強度を計算する非自動化法を開示するコレガ(Kolega)ら((1993)、BioImaging 1:136-150)で検討されたもののような末端検出法を用いて微小管長および幅を定量する選別機。細胞サイズを正常化するために、総末端強度を、細胞領域に分割して、「微小管形態」値を付与できる。大型微小管形態値は、強力な末端強度と関連し、したがって、際立った微小管構造を含む細胞で最大である。同様に、小型微小管形態値は、弱い末端強度と関連し、したがって、脱重合化した微小管を有する細胞で最小である。微小管形態の生理学的範囲は、微小管を安定化する薬物パクリタキセル（１０μＭ）または微小管を脱重合化する薬物ノコダゾール（１０μｇ／ｍｌ）のいずれかを有する細胞を処理することによって設定される。
【０２２３】
２．上で検討されたレセプタ吸収法から得られる方法論を用いて、斑状のスポットまたは焦点に微小管凝集を定量する選別機。
【０２２４】
３．画像組織の測定値を用いて微小管脱重合化を定量する選別機。
【０２２５】
４．微小管の見かけの相互連結性、または分岐（または両方）を定量する選別機。
【０２２６】
５．試験化合物で処理した細胞の画像時間経過での上の選別機を用いた微小管再組織化の速度論の測定。
【０２２７】
さらなる態様では、微小管標識タンパク質をコードする核酸を含む発現ベクター、そして上に記述される方法を行うためにその発現ベクターを使用することについての指示を包含することを特徴とする、微小管安定性を分析するキットが提供される。好ましい実施形態では、発現ベクターは、微小管結合タンパク質およびその発光タンパク質が、融合タンパク質として発現されることを特徴とする、さらに発光のタンパク質をコードする核酸を包含する。代替的に、キットは、微小管標識タンパク質に特異的に結合する抗体を含み得る。別の実施形態では、キットとしては、微小管標識タンパク質を発現する細胞が挙げられる。好ましい実施形態では、細胞を、発現ベクターで形質移入する。別の好ましい実施形態では、キットは、さらに、微小管構造を崩壊することが知られている化合物を含み、そしてそれに限定されないが、クラシン、ノコダゾール、ビンクレスチン、またはビンブラスチンが挙げられる。別の好ましい実施形態では、キットは、さらに、微小管構造を安定化する化合物を含み、そしてそれに限定されないが、トキソール（パクリタキセル）、およびジスコデルモリドが挙げられる。
【０２２８】
別の態様では、本発明は、細胞スクリーニング系に、微小管安定性を分析するための開示の方法を行わせるための支持の組を含むプログラムを包含する機械読み取り可能な保存媒体を含み、細胞スクリーニング系は、細胞を含むプレート、デジタルカメラ、細胞からデジタルカメラに排出された蛍光または発光を検出するための手段、およびデジタルカメラから得られるデジタルデータを受取りそして加工するコンピュータ手段を保持するのに適したステージを有する光学系を包含する。
【０２２９】
巨大分子の機能的局在化に関与する高含有量スクリーン
このクラスの高含有量スクリーン内で、外部刺激に対応した巨大分子の機能的局在化が、生きた細胞内で測定される。
【０２３０】
解糖酵素活性制御。細胞の酵素活性高含有量スクリーンの好ましい実施形態では、主要な解糖制御酵素の活性を処理細胞で測定する。酵素活性を測定するために、発光標識試薬を含む指標細胞を、試験化合物で処理し、そしてレポータの活性を、本発明の細胞スクリーン系を用いて、空間および時間で測定する。
【０２３１】
１つの実施形態では、細胞内の酵素活性のレポータは、フルクトース−６−リン酸塩、２−キナーゼ／フルクトース−２，６−ビスホスファターゼ（ＰＦＫ−２）、そのリン酸化状態が、細胞内の炭化水素同化作用または異化作用を示す制御酵素である(デプレ(Deprez)ら(1997)、J.Biol.Chem.272:17269-17275;キーラー(Kealer)ら(1996)FEBS Letters 395:225-227;リー(Lee)ら(1996)、Biochemistry 35:6010-6019)。指標細胞は、ＰＦＫ−２リン酸化の蛍光タンパク質バイオセンサーの発光レポータを含有する。蛍光タンパク質バイオセンサーは、酵素の公知リン酸化部位の近くに環境的に感受性の染料を導入することによって構築される(Deprezら(1997)、上記;ジュリアノ(Giuliano)ら(1995)、上記)。染料は、ケトシアニンクラス(ケスラー(Kessler)およびWolfbeis(1991)、Spectrochimica Acta 47A:187-192)のもの、またはタンパク質活性部分、およびその励起または放出スペクトルが、溶液偏光性に感受性がある発色団を含む任意のクラスのものであり得る。蛍光タンパク質バイオセンサーを、バルクロード方法論を用いて、指標細胞に導入する。
【０２３２】
生きた指標細胞を、１０−１２Ｍから１０−３Ｍまでの範囲にある最終濃度で、０．１秒から１０時間までの範囲にある時間の間、試験化合物で処理する。好ましい実施形態では、各時点での蛍光画像のスペクトル対を収集することによって、生きた処理された指標細胞から比画像データを得る。各時点から形態的データを抽出するために、画素から画素へ、各時点で２つのスペクトル画像を膨大に分割することによって、各対の画像の間で比を行う。その後、各画素値を使用して、ＰＦＫ−２の画分のリン酸化を計算する。リン酸の小さな画分値で、ＰＦＫ−２が、炭化水素の異化作用を刺激する。リン酸化の高い画分の値で、ＰＦＫ−２は、炭化水素の同化作用を刺激する。
【０２３３】
プロテインキナーゼＡ活性および副単位の局在化。高含有量のスクリーンの別の実施形態で、指標細胞中のプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）のドメイン局在化および活性の両方が、試験化合物で処理するのに応じて測定する。
【０２３４】
指標細胞は、ＰＫＡ活性化の蛍光タンパク質バイオセンサーを含めた発光レポータを含む。蛍光タンパク質バイオセンサーは、ＰＫＡの制御副単位と相互作用することが知られる部位の近くで、ＰＫＡの環境的に感受性のある蛍光染料を、触媒副単位に導入することによって構築される(ハルーツニアン(Harootunian)ら(1993)、Mol.Biol.of the Cell 4:993-1002;ジョンソン(Johnson)ら(1996)、Cell 85:149-158;ジュリアノ(Giuliano)ら（1995)、上記)。染料は、ケトシアニンクラス(ケスラー(Kessler)およびWolfbeis(1991)、Spectrochimica Acta 47A:187-192)のもの、またはタンパク質活性部分、およびその励起または放出スペクトルが、溶液偏光性に感受性がある発色団を含む任意のクラスのものであり得る。ＰＫＡ活性化の蛍光タンパク質バイオセンサーを、バルクロード方法論を用いて、指標細胞に導入する。
【０２３５】
１つの実施形態では、生きた指標細胞を、１０−１２Ｍから１０−３Ｍまでの範囲にある最終濃度で、０．１秒から１０時間までの範囲にある時間の間、試験化合物で処理する。好ましい実施形態では、生きた処理された指標細胞から比画像データを得る。各時点からバイオセンサーデータを抽出するために、各対の画像の間で比を行い、そしてその後、各画素値を使用して、ＰＫＡ（例えば、ｃＡＭＰ結合の後の触媒および制御サブユニットの分離）の画分活性化を計算する。活性の高い画分値で、ＰＦＫ−２が、生きた細胞内の生化学的カスケードを刺激する。
【０２３６】
ＰＫＡの触媒的サブユニットの転位を測定するために、発光レポータを含む指標細胞を、試験化合物で処理し、そしてレポータの運動を、細胞スクリーニング系を用いて、空間および時間で測定する。指標細胞は、細胞質および核のドメインの局在化を測定するのに使用されるドメインマーカから構成される発光レポータを含有する。指標細胞を、試験化合物で処理するときに、ＰＫＡ蛍光タンパク質バイオセンサーの力学的再分配を、０．１秒から１０時間までの範囲にある時間規模をかけて、一連の画像として細胞内で記録する。細胞質および核ドメインの間のＰＫＡの運動を定量する方法によって、各画像を分析する。この計算を行うために、細胞質および核ドメインに印をつけるのに使用されるプローブの画像は、ＰＫＡ蛍光タンパク質バイオセンサーの画像を覆うのに使用される。各マスク下の単位領域当たりの積分された明るさは、細胞質の積分した明るさ／領域を、核の積分した明るさ／領域によって分割することによって、転位商を形成するのに使用される。対照および実験ウェルから得られる転位商の値を比較することによって、転位率を、各電位ロード化合物について計算する。高含有量スクリーンの出力は、１０−１２Ｍから１０−３Ｍまでの濃度範囲にある試験化合物で処理された多数の個々の細胞内で転位の規模を示す定量的データに関連する。
【０２３７】
遺伝子発現の誘導または阻害に関与する高含有量スクリーン
ＲＮＡ基本蛍光バイオセンサー
細胞骨格のタンパク質転写およびメッセージ局在化。細胞基質接着、細胞−細胞接着、信号導入、細胞サイクル事象、中間および信号発生分子代謝、細胞運動、細胞−細胞連絡、および細胞死を含めた細胞の生理学的反応の一般的クラスの制御は、遺伝子発現の改変に関与し得る。高含有量スクリーンは、このクラスの生理学的反応を測定するようにも設計され得る。
【０２３８】
１つの実施形態では、細胞内の遺伝子発現のレポータは、標的ｍＲＮＡとハイブリッド形成し、そしてその蛍光信号を改変できるオリゴヌクレオチドである。好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、分子ビーコン(チャギ(Tyagi)およびクレーマー(Kramer)(1996)Nat.Biotechnol.14:303-308)、その蛍光信号が、細胞間および細胞内相互作用に依存する発光基本試薬である。試薬の各末端（５'および３'）にあるものがあるように、蛍光エネルギー移行対の蛍光染料を誘導することによって、蛍光バイオセンサーを構築する。染料は、タンパク質反応性部位、およびその励起または放出スペクトルが、静止状態にある染料の間に蛍光エネルギー移行を提供するのに十分に重なる発色団を含有する任意のクラスのものであり得て、それに制限されないが、フルオレセインおよびローダミン(モレキュラー・プローブ社(Molecular Probes,Inc.))が挙げられる。好ましい実施形態では、メッセージコーディングの一部(Kislauskisら(1994)、J.Cell Biol.127:441-451;マッキャン(McCann)ら(1997)、Proc.Natl.Acad.Sci.94:5679-5684;スートー(Sutoh)(1982)、Biochemistry 21:3654-3661)を、分子内のハイブリッド形成により、一緒に拘束された末端を有するヘヤピン型オリゴヌクレオチドのループ領域に挿入する。バイオセンサーの各末端で、蛍光ドナー（フルオレセイン）および蛍光受容体（ローダミン）を共有結合で結合させる。拘束された状態で、蛍光エネルギー移行は、最大であり、そしてしたがって、非ハイブリッド形成分子を示す。β−アクチンをコードするｍＲＮＡとハイブリッド形成させるときに、拘束を破壊し、そしてエネルギー移行が失われる。完全な蛍光バイオセンサーを、バルクロード方法論を使用して、指標細胞に導入する。
【０２３９】
１つの実施形態で、生きた指標細胞を、０．１秒から１０時間までの範囲にある時間、１０−１２Ｍから１０−３Ｍまでの最終濃度で、試験化合物と処理する。好ましい実施形態では、比画像データは、生きた処理指標細胞から得る。各時点から形態的データを抽出するために、各対の画像の間で比を行い、そしてその後、各画素値を使用して、標識ヌクレオチドの画分のハイブリッド形成を計算する。ハイブリッド形成の小さな画分の値で、β−アクチンの発現は、ほとんど示されない。ハイブリッド形成の高い画分の値で、β−アクチンの最大の発現が示される。さらに、指標細胞の細胞質内のハイブリッド形成分子の分布は、指標細胞の生理学的反応の測定値である。
【０２４０】
リガンドの細胞表面結合
生きた細胞での細胞表面レポータへの標識インスリン結合。その原形質膜ドメインが、特定の色の標識試薬で標識された細胞を、適切な条件下で適切な時間、異なる色の発光プローブで標識されるインスリン分子(リー(Lee)ら(1997)、Biochemistry 36:2701-2708;マルティネス・ザグリアン(Martinez-Zaguilan)ら(1996)、Am.J.Physiol.270:C1438-C1446)を含有する溶液とインキュベートする。インキュベート後、未結合インスリン分子を洗い流し、細胞を固定し、そして原形質膜でのインスリンの分布および濃度を測定する。これを行うために、細胞膜画像を、インスリン画像のためにマスクとして使用する。覆ったインスリン画像から得られる積分した強度を、公知量の標識インスリンを含む１組の画像と比較する。細胞に結合したインスリンの量を、標準法から決定し、そして細胞でインキュベートされた総濃度のインスリンとの接合に使用して、解離定数またはこの細胞表面レポータに対するインスリンを計算する。
【０２４１】
細胞区分の標識
全細胞標識
全細胞標識は、細胞の細胞形および完全性の力学が、細胞の蛍光画像を分析することによって時間をかけて測定できるように細胞の成分を標識することによって達成される。
【０２４２】
１つの実施形態では、小型反応性蛍光分子を、生きた細胞に導入する。これらの膜透過性分子は、両方とも、原形質膜中のタンパク質成分を通して拡散し、そして反応する。染料分子は、各分子から排出される蛍光信号を増大し、そして生きた細胞内に蛍光染料を捕捉するための両方で細胞内分子と反応する。これらの分子としては、アミノクマリン、ヒドロキシクマリン、エオシンジアセテート、フルオレセインジアセテート、いくつかのＢｏｄｉｐｙ染料誘導体、およびテトラメチルローダミンの反応性クロロメチル誘導体が挙げられる。巨大分子に対するこれらの染料の反応性は、遊離の一次アミノ基および遊離スルフヒドリル基が挙げられる。
【０２４３】
別の実施形態では、細胞を、細胞表面で分子と特異的に反応する蛍光的に標識した抗体またはレクチン(Sigma Chemical Company,St.Louis,MO)と相互作用させることによって、細胞表面を標識する。緑色蛍光タンパク質成分、またはその突然変異体を含有する目的の細胞によって発現される細胞表面タンパク質キメラは、全細胞表面を蛍光で標識するために使用もされる。いったん全細胞が標識されると、全細胞の画像または細胞アレイは、高含有量スクリーンでパラメータになり得て、それにより細胞形、完全性、サイズおよび成長および分配の測定に関与する。
【０２４４】
原形質膜標識
１つの実施形態では、全原形質膜を標識するのに、全細胞を標識するために上で記述されたのと同じ方法論のうちのいくつかを使用する。全細胞を標識する発光分子は、原形質膜を描くように作用する。
【０２４５】
第２の実施形態では、原形質膜のサブドメイン、細胞外表面、脂質二層、および細胞内表面は、別々に標識され、そして高含有量スクリーンの成分として使用される。第１の実施形態で、細胞外表面は、スクシニミジルエステルまたはフルオレセイン、ローダミン、シアニン、およびＢｏｄｉｐｙのような蛍光染料のヨードアセトアミド誘導体のような反応性蛍光分子での簡潔な処置を使用して標識される。
【０２４６】
第３の実施形態では、細胞外の表面を、細胞表面分子について高い親和性を示す、蛍光で標識した巨大分子を用いて標識する。これらとしては、フルオレセイン、ローダミン、およびタチナタマメ、赤色インゲンマメ（赤凝集素ＰＨＡ−Ｅ）、または小麦の麦芽から誘導されるレクチンのシアニン誘導体（コンカナバリンＡ）が挙げられる。
【０２４７】
第４の実施形態では、細胞表面成分について高い親和性を示す蛍光で標識された抗体を、原形質膜の細胞外領域を標識するのに使用する。細胞表面レセプタおよびイオンチャンネルの細胞外領域は、抗体で標識され得るタンパク質の実施例である。
【０２４８】
第５の実施形態では、原形質膜の脂質二重層を、蛍光分子で標識する。これらの分子としては、原形質膜脂質二重層の中心で疎水性領域で強力に相互作用する長鎖疎水性分子に付着した蛍光染料が挙げられる。これらの染料の実施例としては、ＰＫＨシリーズの染料（米国特許番号第４，７８３，４０１号、第４，７６２，７０１号、および第４，８５９，５８４号；Sigma Chemical Company,St.Louis,MOから市販で入手可能な）、ニトロベンゾキサジアゾールグリセロホスホエタノールアミンおよび蛍光誘導ジヘキサデカノイルグリセロホスホエタノアミンのような蛍光リン脂質、５−ブチル−４，４−ジフルオロ−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−ノナン酸および１−ピレンデカノ酸(モレキュラー・プローブ社(Molecular Probes,Inc.))のような蛍光脂肪酸、コレステリル４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−ドデカノエートおよびコレステリル１−ピレンヘキサノエートを含めた蛍光ステロール、およびアネキシンＶの蛍光誘導体(Caltag Antibody Co.Burlingame CA)のような脂質二重層成分と特異的に相互作用する蛍光標識タンパク質が挙げられる。
【０２４９】
別の実施形態では、原形質膜の細胞内成分を、蛍光分子で標識する。これらの分子の実施例は、三量体Ｇ−タンパク質レセプタの細胞内成分、アデニリルサイクラーゼ、およびイオン性輸送タンパク質である。これらの分子を、蛍光で標識された特異的抗体に対する密接な結合の結果として、または膜会合タンパク質および緑色蛍光タンパク質、およびその突然変異体から構成される蛍光タンパク質キメラの取込みにより標識され得る。
【０２５０】
エンドソーム蛍光標識
１つの実施形態では、レセプタ指向性エンドサイトーシスにより細胞に輸送されるリガンドを、エンドソームの細胞小器官の力学を追跡するのに使用される。標識リガンドの実施例としては、ボディフィーＦＬ−標識低密度リポタンパク質複合体、テトラメチルローダミントランスフェリン類似体、および蛍光で標識された表皮成長因子(モレキュラー・プローブ社(Molecular Probes,Inc.))が挙げられる。
【０２５１】
第２の実施形態では、エンドソームのリガンドを特異的に標識する蛍光で標識された一次または二次抗体(Sigma Chemical Co.、St.Louis,MO;モレキュラー・プローブ社(Molecular Probes,Inc.)、Eugene OR;Caltag Antibody Co.)を、細胞内のエンドソームの区分を覆うのに使用する。
【０２５２】
第３の実施形態では、エンドソームを、緑色蛍光タンパク質、またはその突然変異体を、その内在化がエンドソームを標識するレセプタと融合させることによって形成されたタンパク質キメラを発現する細胞内で蛍光で標識する。ＥＧＦ、タランスフェリン、および低密度リポタンパク質レセプタのキメラは、これらの分子の実施例である。
【０２５３】
リソソーム標識
１つの実施形態では、膜永久性リソソーム特異的発光試薬を、生きたおよび固定細胞のリソソーム区分を標識するのに使用する。これらの試薬としては、発光の分子中性赤、Ｎ−（３−（（２，４−ジニトロフェニル）アミノ）プロピル）−Ｎ−（３−アミノプロピル）メチルアミン、およびリソソーム内のｐＨ、並びにリソソーム(モレキュラー・プローブ社(Molecular Probes,Inc.))の力学分布を報告するＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒプローブが挙げられる。
【０２５４】
第２の実施形態では、リソソームの抗原に対する抗体(Sigma Chemical Co.;モレキュラー・プローブ社(Molecular Probes,Inc.);Caltag Antibody Co.)を、特異的リソソームのドメインで局在化されるリソソームの成分を標識するのに使用する。これらの成分の実施例は、コレステロールエステル加水分解、核タンパク質プロテアーゼ、およびヌクレアーゼ、並びにＡＴＰ誘導リソソームのプロトンポンプに関与した分解性酵素である。
【０２５５】
第３の実施形態では、緑色蛍光タンパク質、またはその突然変異体のような内在的に発光のタンパク質に遺伝的に融合したリソソームのタンパク質から構成されるタンパク質キメラを、リソソームドメインを標識するのに使用する。これらの成分の実施例は、コレステロールエステル加水分解、核タンパク質プロテアーゼ、およびヌクレアーゼ、並びにＡＴＰ誘導リソソームのプロトンポンプに関与した分解性酵素である。
【０２５６】
細胞質蛍光標識
１つの実施形態では、反応性基を伴う細胞透過性蛍光性染料(モレキュラー・プローブ社(Molecular Probes,Inc.))を、生きた細胞と反応する。モノブロモビメート、５−クロロメチルフルオレセインジアセテート、カルボキシフルオレセインジアセテート、スクシニミジルエステル、およびクロロメチルテトラメチルローダミンを含めた反応性染料は、細胞の細胞質の長期標識のために使用される細胞透過性蛍光性染料の実施例である。
【０２５７】
第２の実施形態では、バルクロード法を用いて、ルシファー黄色およびカスケード青基本の蛍光染料(モレキュラー・プローブ社(Molecular Probes,Inc.))のような極性トレーサ分子を、細胞に導入し、そして細胞質標識にも使用する。
【０２５８】
第３の実施形態では、細胞質成分に対する抗体(Sigma Chemical Co.;モレキュラー・プローブ社(Molecular Probes,Inc.);Caltag Antibody Co.)を、細胞質を蛍光で標識するのに使用する。細胞質抗原の実施例は、中間代謝に関与した酵素の多くである。エノラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、およびアセチル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼは、非均一に分配された細胞質抗原の実施例である。
【０２５９】
第４の実施形態では、緑色蛍光タンパク質、またはその突然変異体のような内在的に発光のタンパク質に遺伝的に融合した細胞質タンパク質から構成されるタンパク質キメラを、細胞質を標識するのに使用する。均質に分配されたタンパク質の蛍光のキメラを、全細胞質ドメインを標識するのに使用する。これらのタンパク質の実施例は、内在的に代謝に関与したタンパク質の多くであり、そしてエノラーゼ、ラクテートデヒドロゲナーゼ、およびヘキソキナーゼが挙げられる。
【０２６０】
第５の実施形態では、細胞質の抗原に対する抗体(Sigma Chemical Co.;モレキュラー・プローブ社(Molecular Probes,Inc.);Caltag Antibody Co.)を、特異的細胞質サブドメインで局在化される細胞質の成分を標識するのに使用する。これらの成分の実施例は、細胞骨格のタンパク質アクチン、チューブリン、およびサイトケラチンである。細胞内のこれらのタンパク質の集団は、別個の構造に組立られ、そしてこの場合には、繊維状である。したがって、抗体基本の試薬を用いたこれらのタンパク質の蛍光標識は、細胞質の特異的サブドメインを標識する。
【０２６１】
第６の実施形態では、細胞質タンパク質に強力に相互作用する非抗体基本の蛍光で標識された分子を、特異的細胞質成分を標識するのに使用する。１つの実施例は、酵素ＤＮＡアーゼＩ(モレキュラー・プローブ社(Molecular Probes,Inc.))の蛍光性類似体である。この酵素の蛍光類似体は、細胞質アクチンに密接にそして特異的に結合し、したがって、細胞質のサブドメインを標識する。別の実施形態では、マッシュルーム毒ファロイジンまたは薬物パクリタキセル(モレキュラー・プローブ社(Molecular Probes,Inc.))の蛍光類似体を、それぞれ、アクチンおよび微小管−細胞骨格の成分を標識するのに使用する。
【０２６２】
第７の実施形態では、緑色蛍光性タンパク質のような内在的に発光のタンパク質に遺伝的に融合された細胞質タンパク質、またはその突然変異体から構成されるタンパク質キメラは、細胞質の特異的ドメインを標識するのに使用する。高度に局在化されたタンパク質の蛍光性キメラを、細胞質サブドメインを標識するのに使用する。これらのタンパク質の実施例は、細胞骨格を制御するのに関与したタンパク質の多くである。それらとしては、構造的タンパク質であるアクチン、チューブリン、およびケトケラチン、並びに制御タンパク質である微小管関連タンパク質４およびα−アクチンが挙げられる。
【０２６３】
核標識
１つの実施形態では、膜透過性核酸特異的発光試薬(モレキュラー・プローブ社(Molecular Probes,Inc.))を、生きたおよび固定した細胞の核を標識するのに使用する。これらの試薬としては、シアニン基本の染料（例えば、ＴＯＴＯＴＭ、ＹＯＹＯＴＭ、およびＢＯＢＯＴＭ）、フェナンチジンおよびアクリジン（例えば、臭化エチジウム、ヨウ化プロピジウム、およびアクリジンオレンジ）、インドールおよびイミダゾール（例えば、ヘキスト(Hoechst)  ３３２５８、ヘキスト(Hoechst)  ３３３４２、および４'，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）、および他の類似試薬（例えば、７−アミノアクチノマイシンＤ、ヒドロキシスチルバミジン、およびソラレン）が挙げられる。
【０２６４】
第２の実施形態では、核の抗原に対する抗体(Sigma Chemical Co.;モレキュラー・プローブ社(Molecular Probes,Inc.);Caltag Antibody Co.)を、特異的核ドメインで局在化される核の成分を標識するのに使用する。これらの成分の実施例は、ＤＮＡ構造および機能を維持する上で関与した巨大分子である。ＤＮＡ、ＲＮＡ、ヒストン、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、ラミン、およびアクチンのような細胞質タンパク質の核の変異体は、核の抗原の実施例である。
【０２６５】
第３の実施形態では、タンパク質キメラは、緑色蛍光性タンパク質のような内在的に発光のタンパク質に遺伝的に融合された核のタンパク質、またはその突然変異体から構成されるタンパク質キメラは、核のドメインを標識するのに使用する。これらのタンパク質の実施例は、ＤＮＡ構造および機能を維持するのに関与したタンパク質の多くである。ヒストン、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、ラミン、およびアクチンのような細胞質タンパク質の核の変異体は、核の抗原の実施例である。
【０２６６】
ミトコンドリア標識
１つの実施形態では、膜透過性ミトコンドリア特異的発光試薬(モレキュラー・プローブ社(Molecular Probes,Inc.))を、生きたおよび固定した細胞の核を標識するのに使用する。これらの試薬としては、ローダミン１２３、テトラメチルロサミン、ＪＣ−１、およびミトトラッカー反応性染料が挙げられる。
【０２６７】
第２の実施形態では、ミトコンドリアの抗原に対する抗体(Sigma Chemical Co.;モレキュラー・プローブ社(Molecular Probes,Inc.);Caltag Antibody Co.)を、特異的ミトコンドリアのドメインで局在化されるミトコンドリアの成分を標識するのに使用する。これらの成分の実施例は、ＤＮＡ構造および機能を維持する上で関与した巨大分子である。ＤＮＡ、ＲＮＡ、ヒストン、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、およびミトコンドリアのｔＲＮＡおよびｒＲＮＡのような細胞質巨大分子のミトコンドリアの変異体は、ミトコンドリアの抗原の実施例である。ミトコンドリアの抗原の他の実施例は、ミトコンドリアで見られる酸化的リン酸系の成分（例えば、シトクロムｃ、シトクロムｃオキシダーゼ、およびスクシネートデヒドロゲナーゼ）である。
【０２６８】
第３の実施形態では、緑色蛍光性タンパク質のような内在的に発光のタンパク質に遺伝的に融合されたミトコンドリアのタンパク質、またはその突然変異体から構成されるタンパク質キメラは、ミトコンドリアのドメインを標識するのに使用する。これらの成分の実施例は、ミトコンドリアのＤＮＡ構造および機能を維持するのに関与した巨大分子である。実施例としては、ヒストン、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、およびミトコンドリアに見られる酸化的リン酸化系の成分（例えば、シトクロムｃ、シトクロムｃオキシダーゼ、およびスクシネートデヒドロゲナーゼ）が挙げられる。
【０２６９】
小胞体標識
１つの実施形態では、膜透過性小胞体特異的発光試薬(モレキュラー・プローブ社(Molecular Probes,Inc.))を、生きたおよび固定した細胞の小胞体を標識するのに使用する。これらの試薬としては、短鎖カルボシアニン染料（例えば、ＤｉＯＣ６およびＤｉＯＣ３）、長鎖カルボシアニン染料（例えば、ＤｉＩＣ１６およびＤｉＩＣ１８）、およびコンカナバリンＡのような発光で標識したレクチンが挙げられる。
【０２７０】
第２の実施形態では、小胞体の抗原に対する抗体(Sigma Chemical Co.;モレキュラー・プローブ社(Molecular Probes,Inc.);Caltag Antibody Co.)を、特異的小胞体で局在化される小胞体を標識するのに使用する。これらの成分の実施例は、脂肪酸伸長系、グルコース−６−ホスファターゼ、およびＨＭＧ  ＣｏＡ−レダクターゼに関与した巨大分子である。
【０２７１】
第３の実施形態では、緑色蛍光性タンパク質のような内在的に発光のタンパク質に遺伝的に融合された小胞体、またはその突然変異体から構成されるタンパク質キメラは、小胞体ドメインを標識するのに使用する。これらの成分の実施例は、脂肪酸伸長系、グルコース−６−ホスファターゼ、およびＨＭＧ  ＣｏＡ−レダクターゼに関与した巨大分子である。
【０２７２】
ゴルジ体標識
１つの実施形態では、膜透過性ゴルジ体特異的発光試薬(モレキュラー・プローブ社(Molecular Probes,Inc.))を、生きたおよび固定した細胞のゴルジ体を標識するのに使用する。これらの試薬としては、小麦の麦芽アグルチニンおよびブレフェルジンＡのような発光で標識された巨大分子、並びに発光で標識されたセラミドが挙げられる。
【０２７３】
第２の実施形態では、ゴルジ体抗原に対する抗体(Sigma Chemical Co.;モレキュラー・プローブ社(Molecular Probes,Inc.);Caltag Antibody Co.)を、特異的ゴルジ体ドメインで局在化されるゴルジ体を標識するのに使用する。これらの成分の実施例は、Ｎ−アセチルグルコサミンホスホトランスフェラーゼ、ゴルジ体特異的ホスホジエステラーゼ、およびマンノース−６−リン酸塩レセプタタンパク質である。
【０２７４】
第３の実施形態では、緑色蛍光性タンパク質のような内在的に発光のタンパク質に遺伝的に融合されたゴルジ体、またはその突然変異体から構成されるタンパク質キメラは、ゴルジ体ドメインを標識するのに使用する。これらの成分の実施例は、Ｎ−アセチルグルコサミンホスホトランスフェラーゼ、ゴルジ体特異的ホスホジエステラーゼ、およびマンノース−６−リン酸塩レセプタタンパク質である。
【０２７５】
存在した実施例の多くは、単独の細胞過程の測定に関与する一方で、これは、さらに、例示の目的のみについて意図される。複数パラメータ高含有量スクリーンは、数種の単独のパラメータスクリーンを、複数パラメータ高含有量スクリーンに合せるか、または細胞のパラメータを、任意の存在する高含有量スクリーンに添加することによって産生され得る。さらに、各サンプルが、生きたおよび固定した細胞のいずれかに基づいていると記述される一方で、各高含有量スクリーンは、生きたおよび固定した細胞の両方で使用されると称され得る。
【０２７６】
当業者は、ここに提供される開示に基づいて開発され得る広範な多様な別個のスクリーンを認識する。細胞の特異的成分の転位または再組織化に関与する、細胞中の公知生化学的および分子過程の大きく、そして成長するリストがある。細胞表面から細胞内の標的部位までの信号発生経路は、細胞質への原形質膜会合タンパク質の転位に関与する。例えば、タンパク質チロシンキナーゼのｓｒｃファミリーの内の１つｐｐ６０ｃ−ｓｒｃ(ウォーカー(Walker)ら(1993)、J.Biol.Chem.268:19552-19558)が、血小板由来の成長因子（ＰＤＧＦ）を用いた線維芽細胞の刺激により、原形質膜から細胞質まで転位することが知られている。さらに、スクリーニングの標的は、それ自身、リガンド結合および後期転位修飾を含めた分子変化を報告する蛍光基本の試薬に変換され得る。
【０２７７】
プロテアーゼバイオセンサー
（１）バックグラウンド
・ここに使用される場合、以下の用語は、以下のとおり定義される。
【０２７８】
・反応物−タンパク質分解性酵素と相互作用する親バイオセンサー。
【０２７９】
・産物−酵素と反応物の相互作用によって発生される信号含有タンパク質分解断片（類）。
【０２８０】
・反応物標的配列−細胞の特定の細胞副ドメインへの反応物の細胞分布に制限を付与するアミノ酸配列。
【０２８１】
・産物標的配列−細胞の特定の細胞副ドメインに標的にされた酵素的反応の信号含有産物（類）の細胞分布に制限を付与するアミノ酸配列。産物が、膜結合区分内に当初に局在化される場合、産物標的配列は、膜結合区分の外に産物を輸送する能力を組込むに違いない。最初に、膜結合区分の外に産物を移動させ、そしてその後、最終区分まで産物を標的にする二機能性配列を、使用できる。一般に、同じアミノ酸配列は、反応物標的配列および産物標的配列のいずれか、またはその両方として作用し得る。これに対する例外としては、核のエンベロープ、ゴルジ装置、小胞体を標的にするアミノ酸配列が挙げられ、そしてそれは、ファルネシル化に関与し、それは、反応標的配列としていっそう適している。
【０２８２】
・プロテアーゼ認識部位−プロテアーゼについての基質を擬態し、特異的結合および開裂部位を提供することによって特異性を付与するアミノ酸配列。典型的に、アミノ酸の短配列が、プロテアーゼについての最小の開裂部位を表す（例えば、カスパーゼ−３のためのDEVD、Villa,P.、S.H.Kaufmann、およびW.C.Earnshaw、1997、カスパーゼおよびカスパーゼ阻害剤。Trens Biochem Sci.22:388-93)が、より大きな特異性が、樹立された基質から得られる長い配列を使用することによって樹立され得る。
【０２８３】
・区分−任意の細胞の副構造または細胞の巨大細胞成分、それはタンパク質、脂質、炭化水素、または核酸から作られるかどうか。巨大分子の組立物または細胞小器官であり得る（膜は、細胞成分の範囲を決める）が、それに限定されずに、細胞質、核、仁、核エンベロープの内側および外側表面、細胞骨格、ペロキシソーム、エンドソーム、リソソーム、原形質膜の内側リーフレット、原形質膜の外側リーフレット、ミトコンドリア膜の外側リーフレット、ミトコンドリア膜の内側リーフレット、ゴルジ体、小胞体、または細胞外空隙が挙げられる。
【０２８４】
・信号−検出され得るアミノ酸配列。これは、それに限定されないが、生得的な蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質）、補助因子必要蛍光または発光タンパク質（例えば、フィコビプロテインおよびルシフェラーゼ）、および特異的抗体または、それに限定されないが、染料、酵素コファクターおよび操作された結合分子を含めた他の特異的天然または人工結合プローブによって認識されるエピトープが挙げられ、そしてそれは、蛍光で、または発光で標識される。さらに、含まれるのは、発光染料を含有する部位特異的に標識されたタンパク質である。タンパク質の部位特異的標識のための方法論としては、それに限定されないが、操作された染料−反応性アミノ酸(ポスト(Post)ら、J.Biol.Chem.269:12880-12887(1994))、酵素基質のタンパク質への酵素基本の取込み(バックラー(Buckler)ら、Analyt.Biochem.209:20-31(1993);タカシ(Takashi)、Biochemistry.27:938-943(1988))、および未標識アミノ酸のタンパク質への取込み(ノーレン(Noren)ら、Science.244:182-188(1989))が挙げられる。
【０２８５】
・検出−信号の存在、位置または量を記録するための手段。アプローチ法は、信号が、生得的に蛍光である場合、直接的であるか、または例えば、信号が、標識抗体で連続して検出されるべきであるエピトープである場合間接的である。検出の態様としては、それに限定されないが、蛍光、発光、またはリン光の空間の位置が挙げられる。（１）強度、（２）偏光、（３）寿命、（４）波長、（５）エネルギー移行、および（６）光脱色後の回復である。
【０２８６】
本発明のプロテアーゼバイオセンサーの基本概念は、タンパク質分解性反応の間に発生される産物から反応物を空間的に分離することである。反応物から産物の分離は、バイオセンサー内のプロテアーゼ認識部位のタンパク質分解性開裂により起こり、それによって、細胞の区分に結合するか、拡散するか、または移入される産物を、反応物のものから異なるようにする。この空間的分離は、生きた、または固定された細胞中で直接的にタンパク質分解性過程を定量する手段を提供する。バイオセンサーのある種の設計は、バイオセンサーを、細胞の区分に結合または移入するタンパク質配列（「反応性標的配列」）によって、反応物（未開裂バイオセンサー）を、特定の区分に制限する手段を提供する。これらの区分としては、それに限定されないが、任意の細胞構造、巨大分子の細胞成分、膜限定細胞小器官、または細胞外空間が挙げられる。タンパク質分解性反応の特徴が付与されるのは、反応物濃度によって分割される産物濃度に関連し、産物および反応物の空間の分離は、単独細胞における産物および反応物を特徴的に定量する手段を提供し、それにより、タンパク質分解活性のいっそう直接的な測定を可能にする。
【０２８７】
分子基本のバイオセンサーは、形質移入を介して細胞に導入でき、そして発現キメラタンパク質は、一過性細胞集団または安定なセルラインで分析される。それらは、例えば、原核生物のまたは真核生物の発現系における産生によって、予備形成もでき、そして精製タンパク質は、多数の物理的機構を介して細胞に導入されたが、それにより、限定されないが、微細注入、スクラップロード、電気穿刺、信号配列指向性ロードなどが挙げられる。
【０２８８】
測定の態様としては、それに限定されないが、蛍光、発光、またはリン光での比または差異が挙げられる。（ａ）強度、（２）偏光、または（ｃ）反応物と産物の間の寿命である。これらの後者の態様は、産物と反応物との間の適切な分光測定差を必要とする。例えば、限定された可動シグナルを含む反応物を、非常に小さな転位成分に開裂し、そして比較的大きな非転位成分は、偏光により検出され得る。代替的に、反応物と産物との間の明らかに異なる排出寿命は、画像および非画像形態での検出を可能にする。
【０２８９】
このバイオセンサーが、活性を報告するように構築され得る１つのファミリーの酵素の１つの実施例は、カスパーゼである。カスパーゼは、アポトーシスの間中広範な多様な標的のタンパク質分解性開裂を触媒するタンパク質のクラスである。アポトーシスの開始に続いて、クラスＩＩ「下流」カスパーゼが活性化され、そして細胞死に至る経路に戻らない点であり、それにより標的タンパク質の下流の開裂が生じられる。特異的実施形態では、ここに記述されるバイオセンサーは、カスパーゼ活性化の測定可能な指標として開裂ＧＦＰの核転位を使用するために操作された。さらに、自然に起こるタンパク質での二次構造形成に関与した周囲のアミノ酸を取込む特異的認識配列の使用は、このクラスのバイオセンサーの特異性および感受性を増大し得る。
【０２９０】
このバイオセンサーが、活性を報告するように構築され得るプロテアーゼクラスの別の実施例は、亜鉛メタロプロテアーゼである。このクラスの２つの特異的実施例は、クロストリジウム属種C.botulinumおよびC.tetaniおよびバシラス族アントラシスから由来する生物学的毒素である。(エレロス(Herreros)ら、「The Sourcebook of Bacterial Protein Toxins」における、J.E.AloufおよびJ.H.Freer編、第２版、San Diego Academic Press、1999;202-228頁)。これらの細菌は、真核生物の細胞を入れ、そして個別の標的タンパク質を特異的に開裂する亜鉛メタロプロテアーゼを発現および分泌する。例えば、バシラス属アントラシスから得られるアントラックスプロテアーゼは、そのタンパク質分解活性が、分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼであるキナーゼ１または２（ＭＥＫ１またはＭＥＫ２）の開裂を通して、ＭＡＰ−キナーゼ信号発生カスケードを不活性化するアクセサリ穴形成タンパク質を介して標的細胞の細胞質に送出される。(Leppla,S.A.、「The Sourcebook of Bacterial Protein Toxins」で、J.E.AloufおよびJ.H.Freer編、第２版、San Diego Academic Press、1999;243-263頁)。ここに記述された毒素バイオセンサーは、反応標的を達成するこれらおよび他の標的タンパク質の天然のサブ細胞の局在化の利益を得る。開裂によって、信号（産物標的配列を伴うか、またはなし）を、反応物から分離して、高含有量バイオセンサーを作製する。
【０２９１】
当業者は、本発明のこの態様のタンパク質バイオセンサーが、構築物の任意のところで、適切なプロテアーゼ認識部位を置換することによって、プロテアーゼ、並びに任意の他のプロテアーゼのカスパーゼファミリーの任意の構成員の活性を伝えるのに適合し得ることを認識する（図２９Ｂ参照）。これらのバイオセンサーは、酵素的活性の活性化をインビボで検出し、そして公知認識モチーフの開裂によって、特異的活性を同定する高含有量スクリーンで使用できる。このスクリーンは、生きた細胞および固定最終点アッセイの両方のために使用でき、そして多パラメータアッセイを供する別の測定と組合せ得る。
【０２９２】
したがって、別の態様で、本発明は、
ａ．少なくとも１つの検出可能なポリペプチド信号をコードする第１の核酸配列、
ｂ．第２の核酸配列が、少なくとも１つの検出可能なポリペプチド信号をコードする第１の核酸配列に操作可能に連結されていることを特徴とする少なくとも１つのプロテアーゼ認識部位をコードする第２の核酸配列、および
ｃ．第３の核酸配列が、少なくとも１つのプロテアーゼ認識部位をコードする第２の核酸配列に操作可能に連結されていることを特徴とする少なくとも１つの反応物標的配列をコードする第３の核酸配列、
を含むことを特徴とする、プロテアーゼバイオセンサーをコードする組換え核酸を提供する。
【０２９３】
この態様では、第１および第３の核酸配列は、プロテアーゼ認識部位をコードする第２の核酸配列によって分離される。
【０２９４】
別の実施形態では、プロテアーゼバイオセンサーをコードする組換え核酸は、第４の核酸配列が、少なくとも１つの検出可能なポリペプチド信号をコードする第１の核酸配列に操作可能に連結されることを特徴とする少なくとも１つの産物標的配列をコードする第４の核酸配列を包含する。
【０２９５】
さらなる実施形態では、プロテアーゼバイオセンサーをコードする組換え核酸は、第５の核酸配列が、反応物標的配列をコードする第３の核酸配列に操作可能に連結されることを特徴とする少なくとも１つの検出可能なポリペプチド信号をコードする第５の核酸配列を包含する。
【０２９６】
好ましい実施形態では、検出可能なポリペプチド信号は、蛍光タンパク質、発光タンパク質、および配列エピトープから構成される群から選択される。最も好ましい実施形態では、ペプチド配列をコードする第１の核酸は、配列番号：３５、３７、４１、４３、４５、４７、４９および５１から構成される群から選択される配列を包含する。
【０２９７】
別の好ましい実施形態では、プロテアーゼ認識部位をコードする第２の核酸は、配列番号：５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９，１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９および１２１から構成される群から選択される配列を包含する。別の好ましい実施形態では、反応物標的配列をコードする第３の核酸は、配列番号：１２３、１２５、１２７、１２９，１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、１４５、１４７、１４９、および１５１から構成される群から選択される配列を包含する。
【０２９８】
最も好ましい実施形態では、プロテアーゼバイオセンサーをコードする組換え核酸は、配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１および３３から構成される群から選択される配列に実質的に類似する配列を包含する。
【０２９９】
別の態様では、本発明は、上に記述された組換え核酸に操作可能に結合された核酸対照配列を含む組換え発現ベクターを提供する。さらに別の態様では、本発明は、本発明の組換え発現ベクターで形質移入された遺伝子操作した宿主細胞を提供する。
【０３００】
別の態様では、本発明は、第１のドメインおよび第３のドメインは、第２のドメインによって分離されていることを特徴とし、
ａ．少なくとも１つの検出可能なポリペプチド信号を含む第１のドメイン、
ｂ．少なくとも１つのプロテアーゼ認識部位を含む第２のドメイン、および
ｃ．少なくとも１つの反応物標的配列を含む第３のドメイン、
を含むことを特徴とする組換えプロテアーゼバイオセンサーを提供する。
【０３０１】
本実施形態で生来得られるのは、反応物標的配列が、活性化の後に起こる産物の再分布（すなわち、プロテアーゼ開裂）と共に、反応物の細胞分布を制限する概念である。産物分布が、産物標的信号の不在下で反応物分布と部分的に重複し得るので、この再分布は、産物および反応物の完全な除去を必要としない（以下参照）。
【０３０２】
好ましい実施形態では、組換えプロテアーゼバイオセンサーは、さらに、第４のドメインおよび第１のドメインが、操作可能に結合するか、または第２のドメインによって第３のドメインから分離されることを特徴とする、少なくとも１つの産物標的配列を含む第４のドメインを包含する。別の実施形態では、組換えプロテアーゼバイオセンサーは、さらに、第５のドメインおよび第３のドメインが操作可能に結合されるか、または第２のドメインから分離されることを特徴とする、少なくとも１つの検出可能なポリペプチド信号を含む第５のドメインを包含する。
【０３０３】
好ましい実施形態では、検出可能なポリペプチド信号ドメイン（第１または第５のドメイン）は、蛍光タンパク質、発光タンパク質、および配列エピトープから構成される群から選択される。最も好ましい実施形態では、検出可能なポリペプチド信号ドメインは、配列番号：３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、および５２から構成される群から選択される配列を含む。
【０３０４】
別の好ましい実施形態では、第２のドメインは、配列番号：５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、および１２２から構成される群から選択される配列を包含する。別の好ましい実施形態では、反応物および／または標的配列ドメインは、配列番号：１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、および１５２から構成される群から選択される配列を包含する。最も好ましい実施形態では、組換えプロテアーゼバイオセンサーは、配列番号：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、および３４から構成される群から選択される配列に実質的に類似する配列を含む。
【０３０５】
さらに別の好ましい実施形態では、本発明は、プロテアーゼ活性に影響を及ぼす化合物を同定する発明のプロテアーゼバイオセンサーを保持する細胞を使用することを特徴とする、細胞の自動化分析のための方法およびキットを提供する。この方法は、多様な可能性のある多パラメータアッセイでの本発明の他の方法と組合せ得る。
【０３０６】
これらの種々の実施形態では、塩基性プロテアーゼバイオセンサーは、多重ドメインから構成され、それにより、検出可能な信号ドメインおよび反応物標的ドメインが、プロテアーゼ認識ドメインによって分離されることを特徴とする、少なくとも第１の検出可能なポリペプチド信号ドメイン、少なくとも１つの反応物標的ドメイン、および少なくとも１つのプロテアーゼ認識ドメインが挙げられる。したがって、分子中の正確な桁のドメインは、プロテアーゼ認識ドメインが、反応物標的および第１の検出可能な信号ドメインを分離する限り、一般に問題でない。各ドメインについて、１つまたはもう１つの特異的認識配列が存在する。
【０３０７】
ある種の場合に、バイオセンサーナトリウムにおけるドメインの桁は、産物（類）および／または反応物を適切な細胞の区分（類）に適切な標的にすることについて重大であり得る。例えば、産物または反応物を、ペルオキシソームに適切に標的にすることは、ペルオキシソーム標的化ドメインが、タンパク質の少なくとも３つのアミノ酸を包含することを必要とする。バイオセンサー内の標的化ドメインの相対的交換が、重大であるようなバイオセンサーの決定は、日常的な実験を通して当業者によって決定できる。
【０３０８】
プロテアーゼバイオセンサー内のドメインの基本的組織化のいくつかの実施例は、図３０に示される。当業者は、適切なコーディング配列を、多ドメイン構築物に置換することによって、広範な多様なプロテアーゼ認識部位、産物標的配列、ポリペプチド信号、および／または産物標的配列の内のいずれか１つが、本発明のタンパク質バイオセンサーにおける種々の組合せで使用できることを認識する。このような代替配列の非限定実施例は、図２９Ａ−２９Ｃに示される。同様に、当業者は、ドメインの機能を保持しながら、修飾、置換、および欠失が、バイオセンサー内の個々の個別のドメインのコーディング配列およびアミノ酸配列に行うことができることを認識する。個々のドメインに対するドメインと、修飾、置換および欠失のこのような種々の組合せは、本発明の範囲内にある。
【０３０９】
ここに使用される場合、用語「コーディング配列」または、特定のポリペプチド配列を「コードする」配列は、適切な制御配列の対照下に置かれた場合、インビトロまたはインビボでポリペプチドへの転写（ＤＮＡの場合に）および翻訳（ｍＲＮＡの場合に）される核酸配列に該当する。コーディング配列の束は、５'（アミノ）末端での出発コドン、および３'（カルボキシ）末端での翻訳停止コドンによって測定される。コーディング配列としては、それに限定されないが、原核生物または真核生物のｍＲＮＡから得られるｃＤＮＡ、原核生物または真核生物のＤＮＡから得られるゲノムＤＮＡ配列、および合成ＤＮＡ配列が挙げられる。転写終止配列は、通常、コーディング配列に３'で配置される。
【０３１０】
ここに使用される場合、用語ＤＮＡ「対照配列」は、集約的に、プロモータ配列、リボソーム結合部位、ポリアデニル化信号、転写終止配列、上流制御ドメイン、エンハンサー、および同等物に該当し、そしてそれは、集約的に、宿主細胞におけるコーディング配列の転写および翻訳に対処する。目的のＤＮＡ配列が、適切に転写および翻訳される能力がある限り、これらの対照配列の全てが、組換えベクターに常に存在する必要はない。
【０３１１】
ここに使用される場合、用語「操作可能に結合した」は、そのように記述された成分が、それらの通常の機能を行うことにより形成されることを特徴とする要素の配列に該当する。したがって、コーディング配列に操作可能に結合された対照配列は、コーディング配列の発現に影響する能力がある。対照配列は、それらが、その配列を指示する機能がある限り、コーディング配列と隣接していないことを必要とする。したがって、例えば、介在する未翻訳で、まだ転写されていない配列は、プロモータ配列と、コーディング配列との間に存在でき、そしてプロモータ配列は、なお、コーディング配列に「操作可能に結合される」と考え得る。
【０３１２】
さらに、核酸コーディング配列は、両方の核酸分子についてのコーディング領域が、同じ読み取り枠で発現する能力があるとき、別の核酸コーディング配列に操作可能に結合される。核酸配列は、それらが、同じ読み取り枠で発現する能力がある限り、隣接されない必要がある。したがって、例えば、介在するコーディング領域は、特定された核酸コーディング配列の間に存在でき、そして特定された核酸コーディング領域は、さらに「操作可能に結合した」と考え得る。
【０３１３】
バイオセンサーの種々のドメイン間の介在するコーディング配列は、各ドメインの機能が保持される限り任意の長さのものであり得る。一般に、これは、介在タンパク質配列の二次元および三次元構造が、産物または反応物ターゲッティング、検出可能なポリペプチド信号のバイオセンサー、蛍光または発光に相互作用するプロテアーゼの結合、または蛍光で標識したエピトープ特異的抗体の結合のような、バイオセンサーのドメインの結合または相互作用要求を妨げないことを必要とする。
【０３１４】
プロテアーゼバイオセンサーのドメイン間の距離が、重要である場合は、目標が、蛍光共鳴エネルギー移行対を作製することである場合である。この場合に、ＦＲＥＴ信号は、ドナーと受容体の間の距離が、エネルギー移行を可能にするのに十分に小さい場合にのみ存在する(Tsien、HeimおよびCubbit、WO97/28262)。ドナーと受容体部分の間の平均距離は、１ｎｍと６ｎｍの間の優位を伴って１ｎｍと１０ｎｍの間であるべきである。これは、ドナーおよび受容体の間の物理的距離である。介在配列の長さは、そのペプチドの三次元構造が、ドナーおよび受容体間の物理的距離を決定するので、非常に変化できる。
【０３１５】
「組換え発現ベクター」としては、遺伝子産物の発現に影響を及ぼす能力のある任意のプロモータに、核酸コーディング領域または遺伝子を操作可能に結合するベクターが挙げられる。プロテアーゼバイオセンサーの発現を起動するのに使用されるプロモータ配列は、構築的（それに限定されないが、ＣＭＶ、ＳＶ４０、ＲＳＶ、アクチン、ＥＦを含めた多様なプロモータの内のいずれかによって起動される）であるか、または誘導性（それに限定されないが、テトラサイクリン、エクダイソン、ステロイド応答性を含めた多数の誘導性プロモータの内のいずれかによって起動される）であり得る。発現ベクターは、エピソームとして、または宿主染色体ＤＮＡへの組込によるかのいずれかで、宿主生物中で複製可能であるべきである。好ましい実施形態では、発現ベクターは、プラスミドを包含する。しかし、本発明は、ウイルス性ベクターのような任意の他の適切な発現ベクターを含むことが意図される。
【０３１６】
用語「実質的に類似する」は、ＤＮＡのヌクレオチド配列、またはタンパク質のアミノ酸配列に関してここに使用され、ここに開示されるプロテアーゼバイオセンサー配列から得られる１つのまたはそれ以上の保存または非保存性多様性を示し、それに限定されないが、生じた核酸および／またはアミノ酸配列が、ここに開示されそして主張される配列に機能的に等価であることを特徴とする欠失、添加または置換が挙げられる。機能的に等価な配列は、ここに開示され、そして主張される核酸およびアミノ酸組成物として同じプロテアーゼバイオセンサーを実質的に生じる実質的に同じ手段で機能する。例えば、機能的に等価なＤＮＡは、他の非極性残基についての非極性残基、または同様にロードされた残基についてのロード残基の置換、または機能性にとって重要でないプロテアーゼバイオセンサーの領域への付加／欠失のような、ここに開示されるものと同じであるか、または１つまたはそれ以上の保存アミノ酸多様性を示すプロテアーゼバイオセンサーをコードする。これらの変化としては、タンパク質の三次構造を実質的に改変しない置換、欠失、および／または付加として、当業者によって認識されるものが挙げられる。
【０３１７】
ここに使用されるとおり、ヌクレオチドまたはアミノ酸の実質的に同様な配列配列、少なくとも約７０％−７５％同一性、さらに好ましくは、８０％−８５％同一性、そして最も好ましくは９０−９５％同一性を共有する。しかし、上に記述されたレベルより低い相同性を含むか、または保存アミノ酸置換（またはコドンを分解する置換）によって修飾されるタンパク質（およびこのようなタンパク質をコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡ）は、本発明の範囲内にあると意図されることが認識される。
【０３１８】
それが、コーディング配列および対照配列のような核酸配列に関する用語「異種の」は、組換え構築物の領域と正常に会合していない、および／または特定の細胞と正常に会合していない配列を示す。したがって、核酸構築物の「異種の」領域は、自然に他の分子に会合していることが分かっていない別の核酸分子内にまたは付着した核酸の同定可能なセグメントである。例えば、構築物の異種の領域は、自然にコーディング配列に会合することが分かっていない配列によって挟まれたコーディング配列を含み得たであろう。異種のコーディング配列の別の実施例は、コーディング配列それ自身が、自然界に見られていない（例えば、生来の遺伝子から異なるコドンを有する合成配列）構築物である。同様に、宿主細胞に正常に存在しない宿主細胞は、本発明の目的のために異種であると考えられる。
【０３１９】
この用途で、特に指示されない限り、利用される技術は、Molecular Cloning:Laboratory Manual(サムブルック(Sambrook)ら、1989、Cold Spring Harbor Laboratory Press)、Gene Expression Technology(Methods in Enzymology、Vol.185、D.Goeddel編、1991、Academic Press、San Diego,CA);Methods in Enzymology(M.P.Deutshcer編、(1990)、Academic Press,Inc.)における、「Guide to Protein Purification」;PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications(Innisら、1990、Academic Press、San Diego,CA);Culture of Animal Cells:A Manual of Basic Technologies、２版、(R.I.Freshney、1987、Liss,Inc.、New York,NY);Gene Transfer and Expression Protocols、109-128頁、E.J.Murray編、The Humana Press,Inc.、Clifton,N.J.)、およびAmbionの1998 Catalog(Ambion、Austin TX)のような数種のよく知られた参考文献のいずれかで見られ得る。
【０３２０】
本発明のバイオセンサーが、構築され、そして分子生物学の技術での標準法を使用して宿主細胞を形質移入するのに使用する。その全てが本発明の範囲内にある任意の数のこのような技術は、プロテアーゼバイオセンサーをコードするＤＮＡ構築物、そしてバイオセンサーを発現する遺伝的に形質移入された宿主細胞を発生するのに使用できる。続く限定されない実施例は、本発明のバイオセンサーを構築するためのこのような技術の１つを示す。
【０３２１】
プロテアーゼバイオセンサー構築および使用の実施例
以下の実施例では、特異的産物標的配列を有するカスパーゼ特異的バイオセンサーは、４プライマー（２つのセンスおよび２つのアンチセンス）の組を使用して構築された。これらのプライマーは、それらの末端に重複領域を有し、そしてプライマー作業技術(サムブルック(Sambrook),J.、Fritsch,E.F.およびManiatis,T.(1989)、Molecular Cloning:Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor,New York)を介してＰＣＲに使用される。ＧＦＰ−含有ベクター(クローンテック(Clontech),カルフォルニア(California))の５'ポリリンカー（ＢｓｐＩ）から、設計バイオセンサー配列の中間まで出発する２つのセンスプライマーを選択した。２つのアンチセンスプライマーは、３'ＧＦＰベクター部位（ＢａｍＨＩ）から出発し、そしてその中間で１２ヌクレオチドによってセンスプライマーに重なる。
【０３２２】
ＰＣＲ条件は、以下のとおりであった。１５サイクルについて、変性のために３０秒間９４℃、アニーリングのために３０秒間５５℃で、そして伸長のために３０秒間７２℃。プライマーは、両方の末端に、制限エンドヌクレアーゼ部位を有し、生じたＰＣＲ産物の連続クローニングを促進する。
【０３２３】
生じるＰＣＲ産物を、ゲル精製し、プライマーに存在するＢｓｐＥ１およびＢａｍＨＩ制限部位で開裂し、そして生じる断片をゲル精製した。同様に、ＧＦＰベクター(クローンテック(Clontech),サンフランシスコ(San Francisco),CA)を、ポリリンカーでのＢｓｐＥ１およびＢａｍＨＩ部位で消化した。１６℃で一夜、標準法を用いて、ＧＦＰベクターとＰＣＲ産物の連結を行った。Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を、標準技術を用いて連結混合液で形質移入させた。形質転換した細胞を、適切な抗体を用いてＬＢ寒天から選択した。
【０３２４】
細胞および形質移入。ＤＮＡ形質移入のために、ＢＨＫ細胞およびＭＣＦ−７細胞を、３７℃で、５％ＣＯ２インキュベータで、約３６時間、１０％胎仔ウシ血清、１ｍＭのＬ−グルタミン、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン、５０μｇ／ｍｌペニシリン、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、１ｍＭピルビン酸および１０μｇ／ｍｌのウシインスリン（ＭＣＦ−７細胞のみについて）を伴う３ｍｌの最小イーグル培地（ＭＥＭ）を含有する５孔平板で５０−７０％密集まで培養した。細胞を、血清不含ＭＥＭ培地で洗浄し、そして５時間、血清不含ＭＥＭ培地中に１μｇの適切なプラスミドおよび４μｇのリポフェクチミン（ＢＲＬ）を含む１ｍｌの形質移入混合液でインキュベートした。続いて、形質移入培地を除去し、そして３ｍｌの正常な培養培地に交換した。標準分子生物学の方法（Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９５）に基づいて、安定な細胞の選択を行う前に、形質移入した細胞を、少なくとも１６時間、成長用培地で維持した。
【０３２５】
アポトーシスアッセイ。アポトーシスアッセイのために、適当なプロテアーゼバイオセンサー発現ベクターで安定に形質移入される細胞（ＢＨＫ、ＭＣＦ−７）を、５０−６０％密集で、組織培養処理した９６孔平板に載せ、そして３７℃、５％ＣＯ２で一夜培養した。正常な培養培地中のシス−プラチン、スタウロスポリン、またはパクリタキセルの濃度を変化させて、保存液から新たに作製し、そして細胞培養皿に添加して、古い培養培地を交換した。その後、細胞を、指示時間で、生きた細胞実験として、または固定最終点実験としてのいずれかで、本発明の細胞スクリーニング系で観察した。
【０３２６】
１．３−ドメインプロテアーゼバイオセンサーの構築
ａ．アネクシンＩＩ反応物標的ドメイン(pljkGFP)を有するカスパーゼ−３バイオセンサー
このバイオセンサーの設計は、図３１に概説され、そしてその配列は、配列番号：１および２に示される。
【０３２７】
カスパーゼ３についてのプライマー、産物標的配列＝なし(CP3GFP-CYTO)：
0003863372.tif 000003
このバイオセンサーは、反応物標的配列によって細胞質に制限された。反応物標的配列は、アネクシンＩＩ細胞骨格の結合ドメイン(MSTVHEILCKLSLEGVHSTPPSA)（配列番号：１２４）（図２９Ｃ）(エーベルハルト(Eberhard)ら、1997、Mol.Biol.Cell 8:293a)である。酵素認識部位は、アミノ酸配列ＤＥＶＤ（配列番号：６０）（図２９Ｂ）の２つのコピーに対応し、それは、カスパーゼ−３の認識部位として役割を果す。自然に生じるプロテアーゼ認識部位から得られる異なる数のプロテアーゼ認識部位および／または追加のアミノ酸を有する他の実施例は、以下に示される。信号ドメインは、ＥＧＦＰ（配列番号：４６）（図２９Ａ）(クローンテック(Clontech),カルフォルニア(California))である。親バイオセンサー（反応物）は、アネクシンＩＩドメインを、細胞骨格に結合させることによって細胞質に制限させ、そしてしたがって、核から排除する。それは、あらゆる特異的標的配列を欠き、そして受動的に核を入れるのに十分小さいので、カスパーゼ３によるプロテアーゼ認識部位の開裂により、信号ドメイン（ＥＧＦＰ）を、反応物標的ドメイン（アネクシンＩＩ）から放出し、そして全容量の細胞中に分配する（図３３）。
【０３２８】
信号の有効な細胞質−対−核転位を定量することによって、バイオセンサー応答を測定する（上記参照）。応答の測定は、数種の形態の内の１つにより、そしてそれは、積分または平均核領域強度、積分または平均細胞質強度対、積分または平均核強度の比または差異が挙げられる。核は、ヘキスト(Hoechst)  ３３３４２のようなＤＮＡ特異的染料を用いて定義される。
【０３２９】
このバイオセンサーは、細胞内のアネクシンＩＩ細胞骨格結合部位の周囲のタンパク質分解性活性の測定値を提供する。細胞骨格の分散特性を付与し、そして細胞ゾル性酵素の状態を有効に分散して、これは、一般に、細胞質の有効な測定値を提供する。
【０３３０】
結果および検討：
図３３は、カスパーゼ３バイオセンサーで形質移入した、ＢＨＫ細胞中のシス−プラチンにより、アポトーシスの刺激の前後の画像を例示する。画像は、核での蛍光の蓄積を明らかに例示する。蛍光における空間的変化の発生は、可逆性でなく、したがって、アッセイのタイミングは、柔軟性がある。このバイオセンサーについての対照としては、カスパーゼ−３特異的部位が、排除されたバージョンを使用することが挙げられる。さらに、連続の細胞巡回での細胞骨格の中断は、蛍光分布に変化を発生しなかった。我々の実験は、カスパーゼ活性の活性化との核の縮合の相互関係を示す。我々は、ＭＣＦ−７細胞でのこのバイオセンサーをも試験した。最近の報告では、ＰＡＲＰの開裂に付随されたエトポシドでのＭＣＦ−７細胞の刺激の６時間後のカスパーゼ−３活性におけるピーク応答が測定された(ベンジャミン(Benjamin)ら、1998、Mol.Pharmacol.53:446-50)。しかし、別の最近の報告では、ＭＣＦ−７は、カスパーゼ−３活性を保有しないこと、そして実際、カスパーゼ−３遺伝子は、機能的に欠失される(イェーニッケ(Janicke)ら、1998、J.Biol.Chem.273:9357-60)が分かった。カスパーゼ−３活性は、１００μＭエトポシドで１５時間処理した後、ＭＣＦ−７細胞中のカスパーゼバイオセンサーで検出されなかった。
【０３３１】
Janickeら(1998)は、カスパーゼ−３の従来の基質が、スタウロスポリンでの処置によって、ＭＣＦ−７細胞で開裂されることも示した。我々の実験は、カスパーゼ活性が、ＭＣＦ−７細胞で、またはスタウロスポリンで処置したときに、バイオセンサーを用いて測定できることを示す。スタウロスポリンによる最大規模の活性化は、ＢＨＫ細胞中のシス−プラチンで示されるおよそ二分の１であった。これは、カスパーゼ−３特異的に設計されているが、最近のバイオセンサーは、実際、カスパーゼ−３に特徴的に特異性であるよりむしろカスパーゼのクラスに特異的である。最もおこりそうな候補は、カスパーゼ−７である(イェーニッケ(Janicke)ら、1998)。これらの実験は、バイオセンサーが、ミトコンドリア膜電位における減少、核縮合、およびカスパーゼ活性の相互関係を伴い、多パラメータ実験で使用され得ることも示した。
【０３３２】
我々は、バイオセンサーを用いてカスパーゼ活性化におけるパクリタキセルの効果を特に試験した。ＢＨＫおよびＭＣ−７細胞におけるカスパーゼ活性は、パクリタキセルにより刺激した。核の形態の変化の後にカスパーゼ活性化が起こったことも明らかである。１つの警告は、上の検討に基づいて、このアッセイでのバイオセンサーによって伝えられたカスパーゼ活性は、カスパーゼ−３および少なくともカスパーゼ−７活性の組合せによりそうである。
【０３３３】
ＭＣＦ−７細胞でのスタウロスポリン刺激を用いた上の結果に一致して、パクリタキセルも、カスパーゼ活性の活性化を刺激した。規模は、スタウロスポリンのものと類似した。この実施例は、核縮合が反応を抑制するようである、先の実験より狭い範囲のパクリタキセルを用いた。
【０３３４】
ｂ．微小管結合タンパク質４（ＭＡＰ４）突起ドメイン(CP8GFPNLS-SIZEPROJ)を有するカスパーゼバイオセンサー
反応物を、細胞質に制限させる別のアプローチは、バイオセンサーを大きくしすぎて、核の孔を貫けなくすることである。このようなバイオセンサーの開裂で、核への拡散する能力のある産物を開放する。
【０３３５】
このバイオセンサーのために必要とされた別のサイズは、ＭＡＰ４（配列番号：１４２）（図２９Ｃ）(CP8GFPNLS-SIZEPROJ)の突起ドメインを用いて提供される。ＭＡＰ４の突起ドメインは、それ自身の上で微小管と相互作用せず、そして発現された場合、細胞質中に拡散して分配されるが、しかしそのサイズにより核から除外される（〜１２０ｋＤ）。したがって、このバイオセンサーは、全長ＭＡＰ５配列を用いたものから区別される（以下参照）。当業者は、多くの他のこのようなドメインが、それに限定されないが、活性ＮＬＳを欠き、そして核への拡散のための最大サイズ(およそ、60kD;Alberts,B.、Bray.D.、Raff,M.、Roberts,K.Watson,J.D.(編)、Molecular Biology of the Cell、第３版、New York;Garland publishing、1994、561-563頁)を越える任意のＧＦＰの複数コピー、または任意の他のタンパク質の１つまたはそれ以上のコピーを含めて、ＭＡＰ４突起ドメインに置換され得たであろうことを認識する。生じたバイオセンサーの完全な配列は、図３４に示される。（配列番号：３−４）異なるプロテアーゼ認識ドメインを有する類似のバイオセンサーは、図３５に示される（配列番号：５−６）。
【０３３６】
ｃ．核の輸出信号を伴うカスパーゼバイオセンサー
細胞質に反応物を制限する別のアプローチ法は、核の輸出信号を用いることによって、核から反応物を活性に制限することである。このようなバイオセンサーの開裂は、核に拡散する能力のある産物を開放する。
【０３３７】
バシラス属アントラシス細菌は、アントラックスプロテアーゼと称される亜鉛メタロプロテアーゼタンパク質複合体を発現する。ヒトの分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ、キナーゼ１（ＭＥＫ１）(シーガー(Seger)ら、J.Biol.Chem.267;25628-25631、1992)は、アミノ酸８、並びに核が、アミノ酸３２−４４（配列番号：１４０）（図２９Ｃ）で信号を輸出した後に開裂されるアントラックスプロテアーゼ認識部位（アミノ酸１−１３）（配列番号：１０２）（図２９Ｂ）を保持する。ヒトＭＥＫ２(チョン(Zheng)およびGuan、J.Biol.Chem.268:11435-11439、1993)は、アミノ酸残基１−１６（配列番号：１０４）（図２９Ｂ）およびアミノ酸３６−４８（配列番号：１４８）（図２９Ｃ）で核輸出信号を包含するアントラックスプロテアーゼ認識部位を保持する。
【０３３８】
アントラックスプロテアーゼバイオセンサーは、信号として、Ｆｒｅｔ２５（配列番号：４８）（図２９Ａ）、アントラックスプロテアーゼ認識部位、およびＭＥＫ１またはＭＥＫ２（配列番号：７−８（ＭＥＫ１；図３６）；９−１０（ＭＥＫ２）図３７）から得られる核の輸出信号を包含する。アントラックスプロテアーゼによる融合タンパク質の開裂により、ＮＥＳは、ＧＦＰから分離し、それによりＧＦＰに、核への拡散を可能にする。
【０３３９】
２．４−および５−ドメインバイオセンサーの構築
３−ドメインプロテアーゼバイオセンサーについて上に表される実施例の全てについて、産物標的配列は、それに限定されないが、核の局在化配列（ＮＬＳ）のような図２９Ｃにあるものを含めた信号配列に操作可能に結合させることができ、したがって、信号配列に、タンパク質分解性開裂の後に反応物標的ドメインから隔離を引き起こさせる。限定されないが、反応物標的ドメインに操作可能に結合された、図２９Ａにあるものを含めて第２の検出可能な信号ドメインの付加は、複数手段による反応の測定を可能にする上で有用でもある。このようなバイオセンサーの特異的実施例は、以下に表される。
【０３４０】
ａ．４ドメインバイオセンサー
１．核の局在化配列を有するカスパーゼバイオセンサー
(pcas3nlsGFP;CP3GFPNLS-CYTO)：
このバイオセンサーの設計は、図３８に概説され、そして配列は、配列番号：１１−１２（図３９）に示される。以下のオリゴヌクレオチドが使用されたことと除き、上に記述されるとおり、ＰＣＲおよびクローニング手段を行った。
【０３４１】
カスパーゼ３についてのプライマー、産物標的配列＝ＮＬＳ(CP3GFPNLS-CYTO)：
0003863372.tif 000004
このバイオセンサーは、プロテアーゼ認識部位の認識および開裂を除いて、配列番号；２０に示されるものに類似し、産物は、放出され、そして信号は、信号に付着した核局在化配列、ＲＲＫＲＯＫ（配列番号：１２８）（図２９Ｃ）(ブリッグズ(Briggs)ら、J.Biol.Chem.273:22745、1998)の存在のため、核に特異的に蓄積する。この構築物の特定の利益は、産物が、反応物から明らかに分離されることである。反応物は、細胞質に残る一方で、酵素的反応の産物は、核区分に限定される。応答は、上に記述されるとおり、信号の有効な細胞質−対−核の転位を定量することによって測定される。
【０３４２】
親バイオセンサー中の産物および反応物標的配列の両方の存在で、反応物標的配列は、バイオセンサーの活性化（例えば、プロテアーゼ開裂）の前に優勢であるべきである。これを達成するための１つの方法は、プロテアーゼ開裂後まで親バイオセンサー中の産物標的配列を覆うことによる。そのような１つの実施例では、産物標的配列は、相対的に、ポリペプチド鎖（すなわち、プロテアーゼ開裂後）の終わり付近であるときのみに機能する。代替的に、バイオセンサーは、設計でき、その結果、その三次構造が、プロテアーゼ開裂後まで標的配列の機能を覆う。これらのアプローチ法の両方は、標的のために異なる相対的強度を示す標的配列を比較することを含む。核の局在配列（ＮＬＳ）およびアネキシンＩＩ配列の実施例を用いて、ＮＬＳの異なる強度は、親バイオセンサーの細胞質制限に基づいたクローン選択にかけかれた。活性化により、産物標的配列は、その後、反応物標的配列から分離されるので、その会合した検出可能な配列ドメインの局在化を自然に抑える。
【０３４３】
このバイオセンサーを使用することの加えられた利益は、産物が、標的にされ、そしてしたがって、細胞の小さな領域に濃縮されることである。したがって、少量の産物は、産物の濃度が増大されるため、検出可能である。この濃度の効果は、反応物の細胞濃度に相対的に感受性がないことである。このような測定の信号対雑音比（ＳＮＲ）は、バイオセンサー番号１番のいっそうの分散分布を超えて改善される。
【０３４４】
カスパーゼ６（配列番号：６６）（図２９Ｂ）またはカスパーゼ８（配列番号：７４）（図２９Ｂ）のいずれかを組込む類似のバイオセンサーは、以下のプライマー組を使用する以外は、上に記述の方法を使用して行い得る。
【０３４５】
カスパーゼ６のためのプライマー、産物標的配列＝ＮＬＳ(CP6GFPNLS-CYTO)
0003863372.tif 000005
カスパーゼ８のためのプライマー、産物標的配列＝ＮＬＳ(CP8GFPNLS-CYTO)
0003863372.tif 000006
生じるバイオセンサーの配列は、図４０（カスパーゼ６）（配列番号：１３−１４）および４１（カスパーゼ８）（配列番号：１５−１６）に示される。さらに、プロテアーゼ認識部位の複数のコピーが、バイオセンサーに挿入されて、それにより図４２（カスパーゼ３）（配列番号：１７−１８）および４３（カスパーゼ８）（配列番号：１９−２０）中に示されるバイオセンサーを生じ得る。
【０３４６】
２．第２の信号ドメインとのカスパーゼ３バイオセンサー
代替的実施形態は、反応物標的ドメインに操作的に結合した第２の信号ドメインを使用する。この実施形態では、全長ＭＡＰ４は、反応物標的配列として働く。認識および開裂により、反応物標的配列を含む反応の１つの産物は、それ自身の特徴的信号を有する細胞質中の微小管に結合したままである一方で、産物標的配列を含む他の産物は、核に拡散する。このバイオセンサーは、一回に２つの活性化を、アポトーシスの間に開始された信号カスケードに関して、ＭＡＰ４反応物標的配列によって監視されて、核および微小管細胞骨格完全性へのＧＦＰの転位を用いてカスパーゼ３活性を測定する手段を提供する。
【０３４７】
このバイオセンサーについての基本的前提は、反応物が、全長微小管会合タンパク質ＭＡＰ４（配列番号：１５２）（図２９Ｃ）を包含する反応物標的配列に関して、微小管細胞骨格に拘束されるものである。この場合に、ＤＥＶＤ（配列番号：６０）（図２９Ｂ）認識モチーフは、反応物標的配列に操作可能に結合したＥＹＦＰ信号（配列番号：４４）（図２９Ａ）、並びにＭＡＰ４のＣ末端に操作可能に結合したＥＢＦＰ（配列番号：４８）（図２９Ａ）の間に配置される。生じるバイオセンサーは、図４４に示される。（配列番号：２１−２２）。
【０３４８】
このバイオセンサーは、信号ドメインに操作可能に結合したＮＬＳのような産物標的ドメインも含まれる。
【０３４９】
このバイオセンサーと、カスパーゼ−３開裂は、なおＮ末端ＦＧＰを放出し、そしてそれは、核に転位を受ける（ＮＬＳによってそこを指向した）。さらに、カスパーゼ３によるタンパク質分解に続いてなお無傷であるＭＡＰ４断片は、バイオセンサーのＣ末端に融合した第２のＧＦＰ分子を介して、アポトーシスの過程の間中、微小管細胞骨格の完全性について伝え続ける。したがって、この単独のキメラタンパク質は、多様な薬物によって誘導されるアポトーシスの間中のカスパーゼ−３活性および微小管細胞骨格の重合状態の同時分析を可能にする。このバイオセンサーは、だれもが、特定の薬物が微小管に影響することに加えてアポトーシスを誘導するかどうかを決定できるので、微小管骨格を特異的標的にする強力な薬物候補の分析のためにも有用であり得る。
【０３５０】
このバイオセンサーは、反応物についての特徴的信号、信号２から信号１までの蛍光共鳴エネルギー移行（ＦＲＥＴ）、および信号１の核蓄積である産物についての特徴的な信号局在化を強力に組合わせる。生成される産物の量は、ＦＲＥＴでの損失の規模によって示されもするが、これは、産物の反応物および空間局在化のＦＲＥＴ検出の組合せより小さなＳＮＲである。
【０３５１】
ＦＲＥＴは、ドナーの排出スペクトルが、受容体分子の吸収スペクトルを明らかに重複するときに起こり得る。(dos Remedios,C.G.およびP.D.Moens、1995、蛍光共鳴エネルギー移行分光法は、タンパク質での構造的変化を測定するための信頼できる「定規」である。未知指向因子の問題を一掃する。JStruct Biol.115:175-85;Emmanouilidou,E.、A.G.Teschemacher,A.E.Pouli、L.I.Nicholls、E.P.Seward、およびG.A.Rutter、1999、組換え標的カメレオンでセクレタリー小胞表面でのＣａ（２＋）濃度の変化の画像化。Curr Biol.9:915-918)。ドナーおよび受容体分子の間の平均物理学的距離は、１ｎｍと６ｎｍの間の優位を伴って１ｎｍから１０ｎｍの間にあるべきである。介在配列長は、ペプチドの三次元構造が、ドナーおよび受容体の間の物理的距離を決定するので、非常に変化できる。このＦＲＥＴ信号は、（１）受容体の存在下でドナーの急冷の量、（２）ドナーを励起するときの受容体排出の量、および／または（３）ドナーと受容体排出との間の比として測定できる。代替的に、ドナーと受容体との蛍光寿命は、測定され得る。
【０３５２】
この場合は、反応物標的配列の存在の特性によって、上記ＦＲＥＴバイオセンサーに値を加える。この配列は、原形質膜の内側表面のようなそれらの区分での活性のいっそう直接的な読み取りについての細胞の特異的区分へのバイオセンサーの置換を可能にする。
【０３５３】
細胞質の第２の信号は、当初の反応物足す産物の一部の両方をあらわす。核の第１の信号は、反応の別の産物を表す。したがって、酵素的反応は、それが（１）核強度、（２）核／細胞質比、（３）核／細胞質ＦＲＥＴ比、（４）細胞質／細胞質ＦＲＥＴ比として表され得るという点で、付加された柔軟性を示す。
【０３５４】
本発明のＦＲＥＴバイオセンサー設計は、それの信号測定が、強度よりむしろ空間位置に基づいているという点で、先のＦＲＥＴ基本バイオセンサー（ＷＯ９７／２８２６１；ＷＯ９８／３７２２６）と異なる。反応の産物は、反応物から分離される。それは、測定される空間位置でのこの変化である。ＦＲＥＴ基本バイオセンサーは、ドナーと受容体対の別の区分ではなく、分離に基づいている。強度変化は、タンパク質分解性開裂により、ドナーと受容体の物理的分離による。ＦＲＥＴ基本バイオセンサーの欠点は、（１）ＳＮＲが、測定するのにむしろ低く、そして困難である、（２）信号は柔軟でないことである。それは、生きた細胞を用いて記録されなければならない。例えば、ホルムアルデヒドを用いた化学的固定は、親および結果物である信号の両方を防止できない。（３）波長の範囲は、２つの発色団または１つの発色団およびクロモファーの存在により、大きな範囲のスペクトルを制限し、そして網羅する、（４）構築は、１−１０ｎｍな遺伝子に入る距離を確認して正確に並べなければならないという点でより多くの制限を示す。
【０３５５】
位置的バイオセンサーの利益としては、（１）高いＳＮＲに達するために、信号を濃縮する能力、（２）生きたまたは固定した細胞のいずれかを用いる能力、（３）単独の蛍光信号のみが、必要とされる、（４）バイオセンサーのドメインの配列は、さらに柔軟性があることである。位置的バイオセンサーの使用で唯一限定する因子は、反応物区分と産物区分の間の差異を解決するのに十分な空間的解像を示す画像法を必要とする信号の空間的位置を定義する必要性である。
【０３５６】
当業者は、このアプローチが、単に、プロテアーゼ認識配列および反応物標的配列についての適切な置換を行うことによって、活性の任意の所望の組合せを伝えるのに適合され得ることを認識し、それにより、限定されないが、図２９Ａ−Ｃで示される配列のものが挙げられる。
【０３５７】
３．核小体局在ドメインを有するカスパーゼ８バイオセンサー(CP8GFPNUC-CYTO)
このアプローチ（図４５に描かれた）は、カスパーゼ−８活性の検出ためのバイオセンサーを利用する。このバイオセンサーでは、核小体局在化信号(RKRIRTYLKSCRRMKRSGFEMSRPIPSHLT)（配列番号：１３０）（図２９Ｃ）(Uekiら、Biochem.Biophys.Res.Comm.252:97-100、1998)を、産物標的配列として使用し、そして下に記述されるプライマーを用いてＰＣＲによって行った。ＰＣＲ産物を、ＢｓｐＥ１およびＰｖｕ１で消化させ、そしてゲル精製した。ベクターおよびＰＣＲ産物を、上に記述されるとおり連結させた。
【０３５８】
カスパーゼ８についてのプライマー、核小体局在信号(CP8GFPNUC-CYTO)
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生じるバイオセンサーの配列は、図４６（配列番号：２３−２４）に示される。このバイオセンサーとしては、カスパーゼ−８についてのプロテアーゼ認識部位（配列番号：７４）（図２９Ｂ）が挙げられる。類似のバイオセンサーは、カスパーゼ−３についてのプロテアーゼ認識部位（図４７；配列番号：２５−２６）を利用する。
【０３５９】
これらのバイオセンサーは、CP3GFPNLS-CYTOのような別々の区分に標的される同じ産物信号色を保持する他のバイオセンサーと共に使用し得る。各バイオセンサー反応の産物は、産物標的配列に基づいて産物の分離により均一に測定され得る。CP8GFPNUC-CYTOおよびCP3GFPNLS-CYTOから得られる両方の産物は、産物の色が、確かに同じである場合さえ、異なる立体位置、核対仁により分離できる。２つの信号の空間的重複を避けるために、非仁、核領域を評価して、CP8GFPNUCの存在下でCP3GFPNLSの測定を行う。核の信号からの仁領域の損失は、不明瞭であり、そしてＳＮＲに明らかに影響しない。同じ産物色を用いて多パラメータを評価する概念は、生きた細胞で同時に評価できるパラメータの数を明らかに拡張する。この内容は、産物標的区分を、他の非重複まで拡張され得る。
【０３６０】
仁区分への転位の測定は、（１）それに限定されないが、ニュークレオリン(Lischweら、1981、Exp.Cell Res.136:101-109)に対する抗体を含めた核酸特異的マーカに基づいた核酸に対応するマスクを定義すること、（２）反応物標的区分についてマスクを定義すること、および（３）これらの２つの区分の間の信号の相対的分布を測定することによって行う。この相対的分布は、２つの強度での差異、または好ましくは、区分の間の強度の比によって表される。
【０３６１】
多重位置バイオセンサーの組合せは、反応物区分が重複している場合に、複雑であり得る。各信号は、各産物標的区分での信号の量を単に測定することによって測定され得るが、高いＳＮＲは、各反応物が、特徴的に同定および定量される場合に可能である。この高いＳＮＲは、対比する蛍光特性の第２の信号ドメインを添加することによって、最大限にできる。この第２の信号は、産物標的配列に操作可能に結合した信号ドメインによって、またはＦＲＥＴ（上記参照）により、または色、空間的位置、またはそれに限定されないが、偏光または寿命を含めた蛍光特性に基づいた反応物区分内のそれを特徴的に同定する反応物標的配列により発生され得る。代替的に、細胞質のような大きな区分について、同じ区分の異なる部分で、異なる、同じ着色されたバイオセンサーを載せることが可能である。
【０３６２】
４．反応物標的ドメインとして働く、第２の信号ドメインの複数のコピーを有するプロテアーゼバイオセンサー
別の実施例では、反応物のサイズを増大する(CP8YFPNLS-SIZECFPn)は、第２の信号配列、例えばＥＣＦＰ（配列番号：５０）（図２９Ａ）の複数の挿入を使用することによって、達成される(Tsein,R.Y.、1998、Annu Rev Biochem.67:509-44)。したがって、第２の信号配列の複数のコピーは、核に拡散するバイオセンサーの能力を排除することによって、反応物標的ドメインとして働く。この型のバイオセンサーは、バイオセンサー分子当たりに利用可能である別の信号の付加された利益を提供する。多蛍光プローブの凝集は、ＦＲＥＴ、自己急冷、エグザイマー形成などのような示されるべき特徴的な信号をも生じ得る。これは、反応物に対する特徴的な信号を提供できたであろう。
【０３６３】
５．膜貫通標的ドメインを有するテタヌス(Tetanus)／ボツリヌムのバイオセンサー
代替的実施形態では、膜貫通標的配列は、細胞質小胞に、反応物を拘束させるのに使用され、そして代替的プロテアーゼ認識部位を使用する。テタヌス／ボツリヌムのバイオセンサー（図４８−４９）（配列番号：２７−２８（セルブレビン）、２９−３０（シナプトブレビン）は、ＮＬＳ（配列番号：１２８）（図２９Ｃ）、Ｆｒｅｔ２５信号ドメイン（配列番号：５２）（図２９Ａ）、セルブレビンから得られるテタヌスまたはボツリヌム亜鉛メタロプロテアーゼ認識部位（配列番号：１０６）（図２９Ｂ）(マクマホーン(McMahon)ら、Nature 364:346-349、1993;Martinら、J.Cell Biol.、印刷中)またはシナプトブレビン（配列番号：１０８）（図２９Ｂ）(GenBank受託番号U64520)、およびバイオセンサーを、細胞小胞に拘束する３'末端でセルブレビンから得られる膜貫通配列（配列番号：１４６）（図２９Ｃ）またはシナプトブレビン（配列番号：１４４）（図２９Ｃ）から構成される。各タンパク質のＮ−末端を、細胞質に向ける。無傷のバイオセンサーでは、ＧＦＰは、小胞に拘束される。テタヌスまたはボツリヌム亜鉛メタロプロテアーゼによる開裂により、ＧＦＰは、もはや小胞に会合されず、そして細胞質および核を通して拡散するまで自由である。
【０３６４】
ｂ．５−ドメインバイオセンサー
１．アネクシンＩＩドメインに操作可能に結合した、核の局在化ドメインおよび第２の信号ドメインを有するカスパーゼ３バイオセンサー
このバイオセンサーの設計は、図５０に概説され、そして配列は、図５２に示される（配列番号：３３−３４）。このバイオセンサーは、反応物標的配列に操作可能に結合した第２の検出可能な信号ＥＣＦＰ（配列番号：５０）（図２９Ａ）（信号２）を含むことによって、配列番号：１１−１２と異なる。
【０３６５】
２．ＭＡＰ４突起ドメインに操作可能に結合した核の局在配列および第２の信号ドメインを有するカスパーゼ３バイオセンサー(CP3YFPNLS-CFPCYTO)。
【０３６６】
このバイオセンサー（図５１）（配列番号：３１−３２）で、ＮＬＳ産物を標的にするドメイン（配列番号：１２８）（図２９Ｃ）は、ＥＹＦＰ信号ドメイン（配列番号：４４）（図２９Ａ）の上流に存在する。ＤＥＶＤプロテアーゼ認識ドメイン（配列番号：６０）（図２９Ｂ）は、ＥＹＦＰの後と、ＭＡＰ４突起ドメイン（配列番号：１４２）（図２９Ｃ）の前との間にある。
【０３６７】
本発明の好ましい形態は、図面で示され、そして記述された一方で、好ましい形態での多様性が、当業者に明らかであるので、本発明は、示されそして記述される特定の形態に限定されると解釈されるべきでないが、その代わりに、請求項に規定されるとおりである。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は細胞ベースの走査システムの構成要素の図を示す。
【図２】  図２は顕微鏡サブアセンブリの模式図を示す。
【図３】  図３はカメラサブアセンブリを示す。
【図４】  図４は細胞走査システムプロセスを示す。
【図５】  図５はユーザをガイドするための主要な機能を示すユーザインターフェースを示す。
【図６】  図６は細胞ベースのスクリーニングについてのデュアルモードシステムの２つのプラットフォーム構築体のブロック図であり、ここに、１つのプラットフォームはマイクロタイタープレートの全てのウェルを読むために望遠レンズを用い、第２のプラットフォームはウェル中の個々の細胞を読むためにより高倍率のレンズを用いる。
【図７】  図７は、マイクロタイタープレートの全てのウェルを読むための移動可能な「望遠」レンズおよびウェル中の個々の細胞を読むために移動可能なより高倍率のレンズを用いる細胞ベースのスクリーニングについてのデュアルモードシステムの単一プラットフォーム構築体のための光学系の詳細図である。
【図８】  図８は細胞ベースのスクリーニングシステムについて動的データを取得するための流体送達系の説明図である。
【図９】  図９は細胞ベースの走査システムについての処理ステップのフローチャートである。
【図１０Ａから図１０Ｊ】  図１０Ａ−Ｊは核転移アッセイの戦略を示す。
【図１１】  図１１はマイクロタイタープレートの高スループットおよび高含有量スクリーニングを組み合わせる細胞ベースのスクリーニングについてのデュアルモードシステムにおける処理ステップを規定するフローチャートである。
【図１２】  図１２は細胞ベースのスクリーニングについてのシステムの高スループットモードにおける処理ステップを規定するフローチャートである。
【図１３】  図１３は細胞ベースのスクリーニングについてのシステムの高含有量モードにおける処理ステップを規定するフローチャートである。
【図１４】  図１４は細胞ベースのスクリーニングについてのシステムの高含有量モードにおいて動的データを取得するのに必要な処理ステップを規定するフローチャートである。
【図１５】  図１５は動的データの取得の間にウェル内で実行される処理ステップを規定するフローチャートである。
【図１６】  図１６は転移の公知の阻害剤からのデータの実施例である。
【図１７】  図１７は転移の公知の刺激剤からのデータの実施例である。
【図１８】  図１８はグラフ表示でのデータ提示を示す。
【図１９】  図１９は細胞ベースのスクリーニングについてのシステムの高スループットモードからのデータ、高含有量モードへと通過したデータの実施例、高含有量モードで取得されたデータおよびそのデータの分析の結果を示す。
【図２０】  図２０は薬物−誘導の細胞質から核への転移の測定を示す。
【図２１】  図２１は図２０で示された測定のグラフによるユーザインターフェースを示す。
【図２２】  図２２は図２０で示された測定の、データ提示と共に、グラフによるユーザインターフェースを示す。
【図２３】  図２３は図２０に示された測定から得られた動的データを表すグラフである。
【図２４】  図２４は薬物−誘導アポトーシスの高含有量スクリーニングの詳細図である。
【図２５】  図２５はアポトーシスの誘導に際しての形態の変化を示すグラフである。スタウロスポリン（Ａ）およびパクリタキセル（Ｂ）はＬ９２９細胞において古典的な核断片化を誘導する。ＢＨＫ細胞はスタウロスポリン（Ｃ）に応答して、しかしパクリタキセル（Ｄ）に対してより古典的に応答して濃度依存性変化を呈する。ＭＣＦ−７細胞は、各々、スタウロスポリンおよびパクリタキセルに応答して核凝縮（Ｅ）または断片化（Ｆ）いずれかを呈する。全ての場合において、細胞は化合物に３０分間暴露される。
【図２６】  図２６は核のサイズおよび核周辺の複雑性の点におけるスタウロスポリンに対する細胞の用量応答を示す。
【図２７】  図２７は核周辺のｆ−アクチン含有量の変化に至る、スタウロスポリンおよびパクリタキセルによるアポトーシスの誘導を描くグラフである。（Ａ，Ｂ）両方のアポトーシス刺激剤はＬ９２９細胞においてＦ−アクチン含有量の用量−依存性増加を誘導する。（Ｃ）ＨＢＫ細胞において、スタウロスポリンはｆ−アクチンの用量−依存性増加を誘導し、他方、パクリタキセル（Ｄ）はより可変的な結果を生じる。（Ｅ）ＭＣＦ−７で細胞は、スタウロスポリンの濃度に応じて減少または増加のいずれかを呈する。（Ｆ）ｆ−アクチン含有量のパクリタキセル誘導変化は高度に可変的であって、有意ではなかった。細胞は化合物に３０分間暴露された。
【図２８】  図２８はアポトーシスの誘導に応答したミトコンドリアの変化を描くグラフである。Ｌ９２９（Ａ，Ｂ）およびＢＨＫ（Ｃ，Ｄ）細胞はスタウロスポリン（Ａ，Ｃ）およびパクリタキセル（Ｂ，Ｄ）双方に応答し、ミトコンドリア質量は増加した。ＭＣＦ−７細胞は、刺激に応じて、膜ポテンシャルの減少（Ｅ、スタウロスポリン）またはミトコンドリア質量の増加（Ｆ、パクリタキセル）いずれかを呈する。細胞は３０分間化合物に暴露された。
【図２８Ｇ】  図２８Ｇは、ＢＨＫ細胞におけるミトコンドリア質量およびミトコンドリアポテンシャルに対するスタウロスポリン効果の同時測定を示すグラフである。
【図２９Ａ】  図２９Ａは種々のタイプのプロテアーゼバイオセンサードメインについての核酸およびアミノ酸配列を示す（Ａ）シグナル配列。
【図２９Ａ−２】  図２９Ａ−２は種々のタイプのプロテアーゼバイオセンサードメインについての核酸およびアミノ酸配列を示す（Ａ）シグナル配列。
【図２９Ａ−３】  図２９Ａ−３は種々のタイプのプロテアーゼバイオセンサードメインについての核酸およびアミノ酸配列を示す（Ａ）シグナル配列。
【図２９Ａ−４】  図２９Ａ−４は種々のタイプのプロテアーゼバイオセンサードメインについての核酸およびアミノ酸配列を示す（Ａ）シグナル配列。
【図２９Ｂ−１】  図２９Ｂ−１は種々のタイプのプロテアーゼバイオセンサードメインについての核酸およびアミノ酸配列を示す（Ｂ）プロテアーゼ認識部位。
【図２９Ｂ−２】  図２９Ｂ−２は種々のタイプのプロテアーゼバイオセンサードメインについての核酸およびアミノ酸配列を示す（Ｂ）プロテアーゼ認識部位。
【図２９Ｃ−１】  図２９Ｃ−１は種々のタイプのプロテアーゼバイオセンサードメインについての核酸およびアミノ酸配列を示す（Ｃ）産物／反応体標的配列。
【図２９Ｃ−２】  図２９Ｃ−２は種々のタイプのプロテアーゼバイオセンサードメインについての核酸およびアミノ酸配列を示す（Ｃ）産物／反応体標的配列。
【図２９Ｃ−３】  図２９Ｃ−３は種々のタイプのプロテアーゼバイオセンサードメインについての核酸およびアミノ酸配列を示す（Ｃ）産物／反応体標的配列。
【図３０】  図３０は本発明のプロテアーゼバイオセンサーにおけるドメインのいくつかの基本的な組織化を模式的に示す。
【図３１】  図３１は特異的３−ドメインプロテアーゼバイオセンサーの模式図である。
【図３２】  図３２は特異的３−ドメインバイオセンサーの核酸配列（配列番号：１）およびアミノ酸配列（配列番号：２）を示す。シグナルドメインはイタリック体で示し、プロテアーゼ認識ドメインは太文字で示し、反応体標的化部位は下線を施す。
【図３３】  図３３は、図３２に示したカスパーゼバイオセンサーを発現する発現ベクターでトランスフェクトされたＢＨＫ細胞に対するシスプラチンによるアポトーシスの刺激の効果を示す写真である。
【図３４】  図３４は特異的３−ドメインバイオセンサーの核酸配列（配列番号：３）およびアミノ酸配列（配列番号：４）を示す。シグナルドメインはイタリック体で示し、プロテアーゼ認識ドメインは太文字で示し、反応体標的化部位は様式化されていない。
【図３５】  図３５は特異的３−ドメインバイオセンサーの核酸配列（配列番号：５）およびアミノ酸配列（配列番号：６）を示す。シグナルドメインはイタリック体で示し、プロテアーゼ認識ドメインは太文字で示し、反応体標的化部位は様式化されていない。
【図３６】  図３６は特異的３−ドメインバイオセンサーの核酸配列（配列番号：７）アミノ酸配列（配列番号：８）を示す。シグナルドメインは下線を施しただけであり、プロテアーゼ認識ドメインは太文字であり、反応体標的化部位はイタリック体で示す。
【図３７】  図３７は特異的３−ドメインバイオセンサーの核酸配列（配列番号：９）アミノ酸配列（配列番号：１０）を示す。シグナルドメインは下線を施しただけであり、プロテアーゼ認識ドメインは太文字であり、反応体標的化部位はイタリック体で示す。
【図３８】  図３８は特異的４−ドメインプロテアーゼバイオセンサーの模式図である。
【図３９】  図３９は特異的４−ドメインバイオセンサーの核酸配列（配列番号：１１）およびアミノ酸配列（配列番号：１２）を示す。
【図４０】  図４０は特異的４−ドメインバイオセンサーの核酸配列（配列番号：１３）およびアミノ酸配列（配列番号：１４）を示す。
【図４１】  図４１は特異的４−ドメインバイオセンサーの核酸配列（配列番号：１５）およびアミノ酸配列（配列番号：１６）を示す。
【図４２】  図４２は特異的４−ドメインバイオセンサーの核酸配列（配列番号：１７）およびアミノ酸配列（配列番号：１８）を示す。
【図４３】  図４３は特異的４−ドメインバイオセンサーの核酸配列（配列番号：１９）およびアミノ酸配列（配列番号：２０）を示す。
【図４４】  図４４は特異的４−ドメインバイオセンサーの核酸配列（配列番号：２１）およびアミノ酸配列（配列番号：２２）を示す。
【図４５】  図４５は核小体局所化シグナルを含有する特異的４−ドメインプロテアーゼバイオセンサーの模式図である。
【図４６】  図４６は特異的４−ドメインバイオセンサーの核酸配列（配列番号：２３）およびアミノ酸配列（配列番号：２４）を示す。
【図４７】  図４７は特異的４−ドメインバイオセンサーの核酸配列（配列番号：２５）およびアミノ酸配列（配列番号：２６）を示す。
【図４８】  図４８は特異的４−ドメインバイオセンサーの核酸配列（配列番号：２７）およびアミノ酸配列（配列番号：２８）を示す。
【図４９】  図４９は特異的４−ドメインバイオセンサーの核酸配列（配列番号：２９）およびアミノ酸配列（配列番号：３０）を示す。
【図５０】  図５０は特異的５−ドメインプロテアーゼバイオセンサーの模式図である。
【図５１】  図５１は特異的５−ドメインバイオセンサーの核酸配列（配列番号：３１）およびアミノ酸配列（配列番号：３２）を示す。
【図５２】  図５２は特異的５−ドメインバイオセンサーの核酸配列（配列番号：３３）およびアミノ酸配列（配列番号：３４）を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２８Ｇ】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ａ−２】
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【図２９Ａ−３】
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【図２９Ａ−４】
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【図２９Ｂ−１】
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【図２９Ｂ−２】
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【図２９Ｃ−１】
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【図２９Ｃ−２】
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【図２９Ｃ−３】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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