(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
加水分解酵素を、式ArOX（ここでXは加水分解酵素と反応性のある脱離基であり、Arはヨウ素原子、臭素原子またはアクリル酸基でp−位にて置換されたフェニル基、ナフチル基、及び臭素原子で６位にて置換されたナフチル基からなる群より選択される基である）で表される保護された強化剤と、過酸化化合物と、ペルオキシダーゼと、該過酸化化合物及び該ペルオキシダーゼと反応する際に発光する下記一般式、
0003828150.tif 000005
（ここで、Rはアルキル基、ヘテロアルキル基及びアラルキル基より選択される基、R1からR8まではそれぞれ発光を生じさせる基より選択される基、Yはアリールオキシ基、ハロゲン原子で置換されたフェノキシ基、アリールチオ基、ハロゲン原子で置換されたフェニルチオ基及びスルフォンイミド基からなる群より選ばれる脱離基である）で表されるアクリダン化合物と、反応させ、該加水分解酵素が保護された強化剤化合物と反応するとX基が離脱し、これにより該アクリダン化合物による発光のレベルを該強化剤なしのレベルに比し増強することを含む化学発光発生方法。
【請求項２】
(a)加水分解酵素を保護された強化剤と最初の期間水溶液中にて反応させ、次いで、
(b)加水分解酵素と保護された強化剤とを含有する溶液を、アクリダンと、過酸化化合物と、ペルオキシダーゼとを含有する溶液と混合して発光させることをさらに含む請求項１記載の化学発光発生方法。
【請求項３】
基R1からR8までの少なくとも１個がC1〜C20のアルコキシ基であり、RがC1〜C20のアルキル基である請求項１記載の発光発生方法。
【請求項４】
アクリダンが、2',3',6'−トリフルオロフェニル 3−メトキシ−10−メチルアクリダン−9−カルボキシレートである請求項１記載の発光発生方法。
【請求項５】
加水分解酵素が、ハプテン、抗原、抗体、たんぱく質、オリゴヌクレオチド及び核酸からなる群より選択された特異的な結合対のメンバーに付着している請求項１記載の発光発生方法。
【請求項６】
試料物質が加水分解酵素および加水分解酵素と生体分子との抱合体からなる群から選択される、化学発光反応によるアッセイ法における試料物質の有無または量の検出方法において、(a)加水分解酵素を、式ArOX（ここでXは加水分解酵素と反応性のある脱離基であり、Arはヨウ素原子、臭素原子またはアクリル酸基でp−位にて置換されたフェニル基、ナフチル基、及び臭素原子で６位にて置換されたナフチル基からなる群より選択される基である）で表される保護された強化剤と、過酸化化合物と、ペルオキシダーゼと、該過酸化化合物及び該ペルオキシダーゼと反応する際に発光する下記一般式、
0003828150.tif 000006
（ここで、Rはアルキル基、ヘテロアルキル基及びアラルキル基より選択される基、R1からR8まではそれぞれ発光を生じさせる基より選択される基、Yはアリールオキシ基、ハロゲン原子で置換されたフェノキシ基、アリールチオ基、ハロゲン原子で置換されたフェニルチオ基及びスルフォンイミド基からなる群より選ばれる脱離基である）で表されるアクリダン化合物と反応させ、該加水分解酵素が保護された強化剤化合物と反応するとX基が離脱し、これにより脱アクリダン化合物による発光のレベルを該強化剤なしのレベルに比し増強することと、
(b)発生した光の量が、試料物質の有無または量と相関することと、
を含むことを特徴とする、化学発光反応によるアッセイ法における試料物質の有無または量の検出方法。
【請求項７】
基R1からR8までの少なくとも1個がC1〜C20のアルコキシ基であり、RがC1〜C20のアルキル基である請求項６記載の検出方法。
【請求項８】
アクリダンが、2',3',6'-トリフルオロフェニル 3−メトキシ−10−メチルアクリダン−9−カルボキシレートである請求項６記載の検出方法。
【請求項９】
試料物質が加水分解酵素である請求項６記載の検出方法。
【請求項１０】
加水分解酵素が、ハプテン、抗原、抗体及びオリゴヌクレオチドからなる群より選択された特異的結合対のメンバーと結合している請求項６記載の検出方法。
【請求項１１】
化学発光反応によるアッセイ法において試料物質の有無または量を検出するためのキットにおいて、
(a)下記一般式、
0003828150.tif 000007
（ここで、Rはアルキル基、ヘテロアルキル基及びアラルキル基より選択される基、R1からR8まではそれぞれ発光を生じさせる基より選択される基、Yはアリールオキシ基、ハロゲン原子で置換されたフェノキシ基、アリールチオ基、ハロゲン原子で置換されたフェニルチオ基及びスルフォンイミド基からなる群より選ばれる脱離基である）で表されるアクリダン化合物と、
(b)過酸化化合物と、
(c)式ArOX（ここでXは加水分解酵素と反応性のある脱離基であり、Arはヨウ素原子、臭素原子またはアクリル酸基でp−位にて置換されたフェニル基、ナフチル基、及び臭素原子で６位にて置換されたナフチル基からなる群より選択される基である）で表される保護された強化剤と、
(d)ペルオキシダーゼと、
(e)場合により、単独か、または特異的な結合対のメンバーと結合している加水分解酵素と、
を１個以上のコンテナにおいて提供することを特徴とする、試料物質の有無または量の検出用のキット。
【請求項１２】
基R1からR8までの少なくとも１個がC1〜C20のアルコキシ基であり、RがC1〜C20のアルキル基である請求項１１記載のキット。
【請求項１３】
アクリダンが、2',3',6'-トリフルオロフェニル 3−メトキシ−10−メチルアクリダン−9−カルボキシレートである請求項１１記載のキット。
【請求項１４】
化学発光反応によるアッセイ法において試料物質の有無または量を検出するためのキットにおいて、
(a)式ArOX（ここでXは加水分解酵素と反応性のある脱離基であり、Arはヨウ素原子、臭素原子またはアクリル酸基でp−位にて置換されたフェニル基、ナフチル基、及び臭素原子で６位にて置換されたナフチル基からなる群より選択される基である）で表される保護された強化剤と、過酸化化合物と、ペルオキシダーゼと、該過酸化化合物および該ペルオキシダーゼと反応する際に発光する下記一般式、
0003828150.tif 000008
（ここで、Rはアルキル基、ヘテロアルキル基及びアラルキル基より選択される基、R1からR8まではそれぞれ発光を生じさせる基より選択される基、Yはアリールオキシ基、ハロゲン原子で置換されたフェノキシ基、アリールチオ基、ハロゲン原子で置換されたフェニルチオ基及びスルフォンイミド基からなる群より選ばれる脱離基である）で表されるアクリダン化合物と、を水溶液中に含有する、加水分解酵素の存在下で発光する試薬組成物であって、該加水分解酵素が保護された強化剤化合物と反応するとX基が離脱し、これにより該アクリダン化合物による発光のレベルを該強化剤なしのレベルに比し増強する試薬組成物と、
(b)場合により、単独か、または特異的な結合対のメンバーと結合している加水分解酵素と、
を提供することを特徴とする、試料物質の有無または量の検出用のキット。
【請求項１５】
基R1からR8までの少なくとも１個がC1〜C20のアルコキシ基であり、RがC1〜C20のアルキル基である請求項１４記載のキット。
【請求項１６】
アクリダンが、2',3',6'-トリフルオロフェニル 3-メトキシ−10-メチルアクリダン-9-カルボキシレートである請求項１４記載のキット。
【請求項１７】
試料物質が加水分解酵素および加水分解酵素と生体分子との抱合体からなる群から選択される、化学発光反応によるアッセイ法における試料物質の有無または量の検出用組成物において、水溶液中に、
(a)過酸化化合物と、
(b)ペルオキシダーゼと、
(c)該過酸化化合物及び該ペルオキシダーゼとの反応に際し発光する下記一般式、
0003828150.tif 000009
（ここで、Rはアルキル基、ヘテロアルキル基及びアラルキル基より選択される基、R1からR8まではそれぞれ発光を生じさせる基より選択される基、Yはアリールオキシ基、ハロゲン原子で置換されたフェノキシ基、アリールチオ基、ハロゲン原子で置換されたフェニルチオ基及びスルフォンイミド基からなる群より選ばれる脱離基である）で表されるアクリダン化合物と、
(d)式ArOX（ここでXは加水分解酵素と反応性のある脱離基であり、Arはヨウ素原子、臭素原子またはアクリル酸基でp−位にて置換されたフェニル基、ナフチル基、及び臭素原子で６位にて置換されたナフチル基からなる群より選択される基である）で表される保護された強化剤であって、該加水分解酵素が保護された強化剤化合物と反応するとX基が離脱し、これにより該アクリダン化合物による発光のレベルを該強化剤なしのレベルに比し増強する保護された強化剤と、
を含有することを特徴とする検出用組成物。
【請求項１８】
基R1からR8までの少なくとも１個がC1〜C20のアルコキシ基であり、RがC1〜C20のアルキル基である請求項１７記載の検出用組成物。
【請求項１９】
アクリダンが、2′,3′,6′−トリフルオロフェニル 3−メトキシ−10−メチルアクリダン−9−カルボキシレートである請求項１７記載の検出用組成物。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、化学発光反応を触媒するペルオキシダーゼ酵素の反応性を促進する薬剤を生成する酵素の作用により、化学的に光を発生（化学発光）させる改良された方法に関する。本発明はまた、第一の酵素を検出するための本方法の使用に関する。さらに、本発明は、イムノアッセイの技術によってハプテン、抗原および抗体を検出、定量したり、ウェスタンブロッティングによってタンパク質を検出、定量したり、サザンブロッティングおよびノーザンブロッティングによってそれぞれＤＮＡおよびＲＮＡを検出、定量したりすることをはじめとする、種々の生体分子の検出および定量のための本方法の使用に関する。本方法はまた、ＤＮＡの配列決定用途においてＤＮＡを検出するのに用いることもできる。本方法はまた、ＤＮＡ突然変異を検出するのに用いることもできる。
背景技術
（ａ）10−メチルアクリダン−9−カルボン酸のアリールおよびアルキルエステルは、強塩基性の双極中性溶媒中で自動酸化されてN−メチルアクリドンとなり、化学発光を起こす（F. McCapra, Acc. Chem. Res., 9(6), 201-8（1976））。化学発光の量子収量は、10-5から0.1の範囲で、フェノールまたはアルコール脱離基（leaving group）のpKaが低下するのにしたがって増大することが分かっている。また、水溶液中では、中間生成物が発光を伴わない競合反応により分解するため、量子収量が有意に低下した。カチオン界面活性剤ＣＴＡＢを添加すると、この競合的暗反応が抑制されるため、見かけの光収量は130倍に増大した。
本出願人による同時係属出願である1993年５月17日出願の第08/061,810号、1994年３月２日出願の第08/205,093号および1994年４月15日出願の第08/228,290号は、ペルオキシダーゼ酵素、たとえばホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の検出に有用である化学発光性アクリダン化合物を開示している。本出願人の前記同時係属出願以外、アクリダンを酸化させて化学発光を起こさせるためのペルオキシダーゼまたは他の酵素の使用に関する報告は存在しない。
（ｂ）酵素的増幅法
Krickaへの米国特許第5,306,621号明細書は、ルミノールのＨＲＰ接触化学発光酸化のための、不活性プロエンハンサからの強化剤の酵素的生成方法を記載している。化学発光性基質としてのアクリダンの使用は、開示されてもいないし提案されてもいない。この方法の比較的劣る感度（アルカリホスファターゼの10-16mol）は多くの用途に不十分であると報告されている。
アルカリホスファターゼの比色検出に用いるための結合酵素カスケード反応が報告されている（D. M. Obzansky et al, Clin. Chem., 37, 1513-8（1991））。この方法では、アルカリホスファターゼが、不活性形態の第二の酵素と反応して、それをその活性形態に転換する基質を生成する。第二の酵素はそれ自体の基質と反応してH2O2を生成する。このH2O2を後で比色法によって検出する。化学発光検出は、開示されてもいないし提案されてもいない。
結合したＨＲＰ−抗体の抱合体（coujugate）が反応を触媒して、ビチオン−フェノール抱合体を膜の表面に付着させる化学発光ウェスタンブロッティング法が報告されている。結合したビチオンは、さらなるＨＲＰ−ストレプトアビジン抱合体を捕捉するのに使用される。捕捉した酵素をルミノール化学発光によって検出した（D. A. Wigle, N. N. Radakovic, S. L. Venance, S. C. Pang, BioTechniques, 14, 562-3（1993））。化学発光性基質としてのアクリダンの使用は、開示されてもいないし提案されてもいない。
多数の酵素を用いるいくつかの生発光反応および化学発光反応が公知である（A. Tsuji, M. Maeda, H. Arakawa, Anal. Sci., 5, 497-506（1989））。これらの手法の大多数では、作用の形態を注意深く考察すると、本発明とは対照的に、一つの増幅段階しか生じないことが明らかである。すべての後続段階は、最終的な発光反応を生じさせるための電子中継系を形成するにすぎない。アルカリホスファターゼによるNADP+の生成に基づく比色法だけが真の二段階増幅法といえる（A. Johannsson, C. J. Stanley, C. H. Self, Clin. Chim. Acta, 148, 119-24（1985））。また、同じ原理に基づく蛍光測定アッセイが公知である（D. B. Cook, C. H. Self, Clin. Chem., 39, 965-71（1993））。いずれの引用例も化学発光の利用を教示してもいないし提案してもいない。
発明の開示
したがって、本発明の目的は、加水分解酵素およびその抱合体の検出のために、保護された強化剤を使用して、ペルオキシダーゼ酵素の作用によって化学発光を起こす方法を提供することである。本発明のもう一つの目的は、生体物質および化合物の検出のために、保護された強化剤を使用して、ペルオキシダーゼ酵素の作用によって化学発光を起こす方法を提供することである。検出は、溶液中のイムノアッセイ、ウェスタンブロットにおけるタンパク質の検出およびサザンブロットにおけるＤＮＡの検出またはＤＮＡ配列決定用途ならびに他のＤＮＡハイブリッド形成アッセイ、たとえば突然変異の検出の形態をとることができる。
【図面の簡単な説明】
第1図は、本発明の試薬組成物を使用してアルカリホスファターゼ（ＡＰ）を検出した場合の直線性を示すグラフである。保護されたHRP強化剤２−ナフチルホスフェートを含有する溶液を各指定量のＡＰでインキュベートした。37℃で30分間の最初の反応期間ののち、室温に維持しておいた本発明の試薬50μLを加えた。この試薬は、0.1mMの2′，3′，6′−トリフルオロフェニル 3-メトキシ−10−メチルアクリダン−9−カルボキシレート、1.2mMの過酸化尿素、２mMのＥＤＴＡ、0.05のTWEEN 20および40pmolのＨＲＰを含有するものであった。光の強さを15分後に計測した。Ｓ−Ｂは、ＡＰの存在下のＲＬＵ単位の化学発光信号（Ｓ）を、ＡＰの不存在下のバックグラウンド化学発光（Ｂ）に関して補正したものを指す。このようにして、0.1amol（１×10-19mol）のＡＰが検出可能であった。
第2図は、本発明の試薬組成物を使用してβ−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）を検出した場合の直線性を示すグラフである。0.005Mのリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.0）中に保護されたＨＲＰ強化剤パラ−フェニルフェノールガラクトシドを含有する溶液を、室温で、各指定量のβ−Ｇａｌでインキュベートした。30の最初の反応期間ののち、室温に維持しておいた検出試薬50μLを加えた。この試薬は、0.01Ｍのトリス緩衝液（pH8.0）中に0.1mMの2′，3′，6′−トリフルオロフェニル３−メトキシ−10−メチルアクリダン−９−カルボキシレート、1.2mMの過酸化尿素、２mMのEDTA、0.05％のTWEEN 20および40pmolのＨＲＰを含有するものであった。光の強さを15分後に計測した。このようにして、0.56amol（5.6×10-19mol）のβ−Galが検出可能であった。
発明を実施するための最良の形態
本発明は、保護された強化剤化合物を第一の酵素と反応させて、アクリダン化合物、好ましくはＮ−アルキルアクリダンカルボン酸誘導体および過酸化物とペルオキシダーゼ酵素との反応を促進する強化剤物質を生成して、化学発光を起こす方法に関する。好ましい実施形態においては、第一の酵素は加水分解酵素である。好ましいアクリダン化合物は、式
0003828150.tif 000002
（ここで、Ｒはアルキル基、ヘテロアルキル基及びアラルキル基より選択される基、R1からR8まではそれぞれ発光を生じさせる基より選択される基、Ｙは、過酸化物およびペルオキシダーゼとの反応によってアクリダンからの発光を可能にする脱離基（leaving group）である）で表されるものである。
本発明はまた、試料物質が第一の酵素と直接的または間接的に結合しているか、結合することができ、発せられる光の量が試料物質の量に相関する、化学発光反応によるアッセイ手法において、試料物質を検出するための本方法の使用に関する。たとえば、本方法は、イムノアッセイの技術によってハプテン、抗原および抗体を検出したり、ウェスタンブロッティングによってタンパク質を検出したり、サザンブロッティングおよびノーザンブロッティングによってそれぞれＤＮＡおよびＲＮＡを検出したりするのに使用することができる。本方法はまた、ＤＮＡの配列決定用途においてＤＮＡを検出するのに用いることもできる。
本発明はまた、加水分解酵素または加水分解酵素と生体分子との抱合体を検出するための本方法の使用に関する。
本発明はまた、化学発光反応によるアッセイ法において試料物質を検出する方法における改良であって、加水分解酵素の存在下に発光する試薬組成物を提供することを含む改良に関する。試薬組成物は、式
0003828150.tif 000003
のN−アルキルアクリダンカルボン酸誘導体と、過酸化化合物と、ペルオキシダーゼ酵素と、ペルオキシダーゼの反応性を強化するフェノール化合物であることができる保護された強化剤物質と、光の発生を増大させる界面活性剤と、ペルオキシダーゼとの反応の前に過酸化化合物がN-アルキルアクリダンカルボン酸誘導体を活性化してしまうことを防止するキレート化剤とを含有する水溶液を含む。
本発明は、化学発光反応を真に触媒するペルオキシダーゼ酵素の作用を強化または増幅する第一の酵素の作用によって強化剤または環化剤を生成する方法を含む。このため、本発明は、二つの信号増幅過程によって、非常に高い感度をもって第一の酵素を検出するための本発明の使用を可能にする。得られる光の強さが、標識された有機分子または生体分子の量の直接的な計測を提供する。
本発明はまた、化学発光反応によるアッセイ法において試料物質、加水分解酵素または加水分解酵素抱合体のいずれかを検出するためのキットを企図する。本発明の任意具体例を実施するのに有用なキットは、１個以上のコンテナに、
ａ）上記のアクリダン化合物、
ｂ）過酸化物（検出する試料物質がその過酸化物または過酸化物を生成する試薬ではない場合）、
ｃ）ペルオキシダーゼ酵素（検出する試料物質がそのペルオキシダーゼまたはペルオキシダーゼと試料物質との抱合体もしくはペルオキシダーゼと試料物質とで特異的結合対を形成する試薬との抱合体ではない場合）、
ｄ）保護された強化剤化合物、ならびに、場合によっては、
ｅ）界面活性剤およびキレート化剤
を含む。キットの各成分は、以下に詳述する本発明の反応を実施する種々の形態を考察して明らかになるように、別個に充填することもできるし、種々の組み合わせで充填することもできる。
本発明の反応方法は、いくつかの異なる形態で実施することができる。ある形態または実施態様では、加水分解酵素を、ほぼ室温から少なくとも約40℃の温度で、保護された強化剤の水溶液と別個に反応させる。この溶液は、酵素の活性に有益である、金属イオンのような薬剤を含有するものでもよい。適当な反応またはインキュベーション期間ののち、この溶液またはその一部を、アクリダン化合物、過酸化物およびペルオキシダーゼを含有する第二の溶液と混合する。第二の溶液は、場合によっては、界面活性剤および金属キレート化剤をはじめとする他の薬剤を含有するものでもよい。もう一つの実施形態では、アクリダン化合物は第二の溶液に含まれず、最終の反応溶液に別個に添加される。さらなる実施形態では、保護された強化剤、アクリダン、過酸化物、ペルオキシダーゼおよび界面活性剤が加水分解酵素との直接反応のためにすべて水溶液に含まれる。
反応手順１
0003828150.tif 000004
酵素により、保護された強化剤からＸ基が除かれると、ペルオキシダーゼ酵素、特にホースディッシュペルオキシダーゼがN−アルキルアクリダンカルボン酸誘導体の過酸化水素による酸化を触媒して発光させる能力を大幅に高める、フェノールのような触媒または強化剤が生成される。保護された強化剤の好ましい類は、式Ａｒ−ＯＸ（式中、Ａｒは芳香族基であり、Ｘは、加水分解酵素によって開裂させてフェノール化合物Ａｒ−ＯＨまたはそのアニオンを生成することができる脱離基である）の化合物を含む。マスクまたは保護されたフェノールの例を特定の脱離基Ｘとともに反応手順１に示す。Ｘ基を開裂し、フェノールを遊離させることによって適当に保護されたフェノールと反応する特定の酵素の例には、酸ホスファターゼ、アルカリホスファターゼ、ホスホジエステラーゼ、ホスホリパーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、β−グルコシダーゼ、ラクターゼ、カルボキシルエステラーゼおよびアセチルコリンエステラーゼがある。可能なＯ−Ｘ基には、アルキルもしくはアリールカルボキシルエステル、リン酸塩および硫酸塩を含む無機酸素酸塩ならびにβ−Ｄ−ガラクトシド、β−グルクロニドおよびβ−グルコシドを含む酸素−ピラノシドならびに当業者には明白である同様なものをはじめとする、使用条件下で安定であり、酵素との反応によって開裂させることができる化学脱離基がある。他のペルオキシダーゼ反応を強化することが知られるフェノール化合物は、G. Thorpe, L. Kricka, in Bioluminescence and Chemiluminescence, New Perspectives, J. Scholmerich, et al, Eds., pp. 199-208（1987）, M. Ii, H. Yoshida, Y. Aramaki, H. Masuya, T. Hada, M. Terada, M. Hatanaka, Y. Ichimori, Biochem. Biophys. Res. Comm., 1963(2), 540-5（1993）ならびに引用例として本明細書に含める米国特許第5,171,668号明細書および第5,206,149号明細書に記載されている。好ましい強化剤は、置換フェノール、非置換および置換ナフトール、たとえばパラ−フェニルフェノール、パラ−ヨードフェノール、パラ−ブロモフェノール、パラ−ヒドロキシケイ皮酸、２−ナフトールおよび６−ブロモ−２−ナフトールからなる群より選択されるものである。
数多くのアクリダン化合物が本発明の実施に有用である。本出願人の同時継続出願である、1993年５月17日に出願された第08/061,810号、1994年３月２日に出願された第08/205,093号および1994年４月15日に出願された第08/228,290号は、アリールエステル（Ｙ＝ＯＡｒ）、特にハロゲン置換フェニルエステル、チオエステル（Ｙ＝ＳＡｒ）、特にフェニルチオエステルおよびハロゲン置換フェニルチオエステルならびにアリールスルホンイミド（Ｙ＝ＮＲ9ＳＯ2Ａｒ）をはじめとする種々の化学発光性アクリダン化合物を開示している。引用した三つの出願の開示内容を引用例として本明細書に含める。環の置換をもつ、すなわち、Ｒ1からＲ8までの１個以上が水素以外の原子または基であるところのアクリダンが、本発明の実施に用途を見いだす化合物の範囲に含まれる。
本発明の実施に有用であるキレート化剤には、たとえば、多座（polydentate）カチオン錯化剤、たとえばEDTA、EGTAおよびそれらの塩ならびに当該技術に公知である他の試薬がある。金属依存酵素、たとえばアルカリホスファターゼがキレート化剤によって悪影響を受けることが理解されよう。本発明の方法を使用してこのような酵素を検出する際には、酵素と同じ溶液中にキレート化剤を使用することは避けるべきである。本方法の範囲で有用である界面活性剤には、アニオン界面活性剤、たとえばドデシル硫酸ナトリウム（SDS）、カチオン界面活性剤、たとえば第四アンモニウム界面活性剤または、好ましくは、非イオン界面活性剤、たとえばポリオキシエチレン化アルキルフェノール、ポリオキシエチレン化アルコール、ポリオキシエチレン化エーテル、ポリオキシエチレン化ソルビトールエステルなどがある。
本発明の重要な側面は、N−アルキルアクリダンカルボン酸誘導体、過酸化物、ペルオキシダーゼ酵素および保護された強化剤を含有する組成物が加水分解酵素の不存在下で大きなバックグラウンド化学発光信号を生成しないということにある。遊離強化剤を形成するための加水分解酵素との反応が、米国特許第5,306,621号明細書に開示されているルミノール系に比較してより長期間、化学発光を生じさせる。期間の延長は、正確な反応タイミングの必要性を省くことにより、計測を簡単にし、フィルムベースの検出方法を使用する場合の検出の感度を高める。
N−アルキルアクリダンカルボン酸誘導体およびそれを含有する本発明の組成物を公知の方法に比較した場合の他の利点は、第一の酵素の検出の増大した感度および動的範囲である。比較実験が、本発明の試薬組成物を使用すると、ルミノールを組み込んだ試薬を使用する場合に比較して、アルカリホスファターゼの検出限界が少なくとも100倍低下することを証明する。
これらの利点およびその他の利点は、以下の実施例を考察することによって明白になろう。
実施例
実施例1.パラ-ヨードフェニルフォスフェート.ジナトリウム塩の合成。ピリジン（0.395g,5mmol）を15mLの塩化メチレンに溶解した。溶液を約5℃に冷却し、攪拌しながら、オキシ塩化リン（POCl3）（2.30g,15mmol）を徐々に添加した。次に、パラ-ヨードフェノール（1.10g, 5mmol）の10mL塩化メチレン溶液を5分間に滴下した。冷却浴を取り外し、30分間攪拌を続けた。減圧下溶剤を除去し、15mLのシアノメタン（CH3CN）を加えて固体を溶解した。水酸化ナトリウム（0.80g,20mmol）を水1mLに溶かした溶液を攪拌しながら滴下すると、白色沈殿物を生じた。10分間放置後、固体を集めて多量のシアノメタン、続いてアセトンで洗浄し、空気中で乾燥した。
実施例2.パラ-フェニルフェノールフォスフェート.ジナトリウム塩の合成。ピリジン（0.395g, 5mmol）を15mLの塩化メチレンに溶解した。溶液を約5℃に冷却し、攪拌しながら、オキシ塩化リン（2.30g,15mmol）を徐々に添加した。次に、パラ-フェニルフェノール（0.85g, 5mmol）の10mL塩化メチレン溶液を5分間に滴下した。冷却浴を取り外し、30分間攪拌を続けた。減圧下溶剤を除去し、15mLのシアノメタンを加えて固体を溶解した。水酸化ナトリウム（0.80g,20mmol）を水1.2mLに溶かした溶液を攪拌しながら滴下すると、白色沈殿物を生じた。10分間放置後、固体を集めて多量のシアノメタン、続いてアセトンで洗浄し、空気中で乾燥した。
実施例3.パラ-ヨードフェニル-β-D-ガラクトピラノシドの合成。アセトン3mLに溶解したパラ-ヨードフェノール（1g, 4.5mmol）を5M水酸化カリウム（水溶液）で処理した。アセトブロモガラクトース（5.6g,13.6mmol）を攪拌しながら、溶液に分取添加した。最初4.1g分を5M水酸化カリウムの1mLと2〜3時間間隔で加え、次いで、アセトブロモガラクトース0.5g分を5M水酸化カリウムの0.5mLと共に加え、合計5.6g（3当量）になる迄加える。攪拌を一晩中続けた。水を加え、溶液を塩化メチレンで、続いて酢酸エチルで抽出した。有機層を合体して蒸発し、粗製物をシリカ上ヘキサン中30%酢酸エチルを用いてカラムクロマトグラフィで精製し、未反応の糖を除去した。適当な画分から溶剤を除去して、所望の化合物のテトラアセテートエステルを得た。300mg分を2mLのアセトンに溶解し、10MKOHの650μLと一晩中攪拌して、加水分解により所望の化合物を得た。アセトンを蒸発し、30mLの水を加えた。塩化アンモニウムを加えてpHを中和し、得られた溶液を酢酸エチルで抽出した。酢酸エチル溶液をMgSO4で乾燥し、減圧下濃縮して白色固体を得、これを更に酢酸エチル中50%メタノールを用いてカラムクロマトグラフィで精製した。:1H NMR（CD3OD）δ3.28-3.89（m,6H），4.81（d,1H），6.89-7.57（m,4H）．
実施例4.パラ-フェニルフェノール-β-D-ガラクトピラノシドの合成。パラ-フェニルフェノール（250mg,1.46mmol）のアセトン溶液に、10N水酸化カリウム1mL、続いてアセトブロモガラクトース（1.8g,4.37mmol）を加えた。反応混液を一晩中室温で攪拌した。TLC分析で、出発物質が残っていないことが判った。10N水酸化カリウム（1mL）を加えて脱アセチル化を完了し、溶液を再び一晩中攪拌した。アセトンを蒸発した後、粗製物を酢酸エチル中に取り、5x150mLの水で洗浄した。酢酸エチルをMgSO4で乾燥し、減圧下濃縮して白色固体を得、これを更に酢酸エチル中30%メタノールを用いてカラムクロマトグラフィで精製した。:1H NMR（CD3OD）δ3.56-3.91（m,6H），4.89（m,1H），7.15-7.57（m,9H）．
実施例5.パラ-フェニルフェノール アセテートの合成。ピリジン（2mL）を15mLの塩化メチレンに溶解した。溶液を約5℃に冷却し、攪拌しながら、酢酸クロリド（393mg,5mmol）を徐々に添加した。次に、パラ-フェニルフェノール（0.85g, 5mmol）の20mL塩化メチレンへの懸濁液を15分間に滴下した。冷却浴を取り外し、30分間攪拌を続けた。減圧下溶剤を除去し、50mLの酢酸エチルを加えて固体を溶解した。溶液を水で抽出し、Na2SO4で乾燥し、減圧下蒸発した。
実施例6.ペルオキシダーゼ基質化合物の合成。2',3',6'-トリフルオロフェニル 3-メトキシ-10-メチルアクリダン-9-カルボキシレート。
(a)3-メトキシアクリダン-9-カルボン酸を下記文献（G.Zomer, J. Staveniter, R. Van Den Berg, E. Jansen, In Luminescence Techniques in Chemical and Biochemical Analysis, W. Baeyens, D. De Keukeleire, K. Korkidis, eds., Dekker, New York, 505-521,（1991））記載の方法によって調製した。市販品（Aldrich）の3-メトキシジフェニルアミンとシュウ酸クロリドとの縮合で、3-メトキシ及び1-メトキシアクリジンカルボン酸の混合物が生成し、混合物のままエステルに転化した。
(b)3-メトキシ及び1-メトキシアクリジンカルボン酸の混合物（1.5g）を10mLのチオニルクロリドに懸濁させ、反応混液を3時間還流した。減圧下溶剤を除去し、黄色固体を得、これをアルゴン雰囲気下塩化メチレンとピリジン（0.7mL）に溶解した。2,3,6-トリフルオロフェノール（0.878g）の塩化メチレン溶液を滴下した。溶液を室温で一晩中攪拌し、次いでより多量の塩化メチレン（100mL）で希釈し、水（3x50mL）で洗浄した。有機層をNa2SO4で乾燥し、濃縮して異性体エステルの混合物を得た。生成物2',3',6'-トリフルオロフェニル 3-メトキシアクリジン-9-カルボキシレートを、シリカ上ヘキサン中25%酢酸エチルを用いてクロマトグラフィによって単離した。:1H NMR（CDCl3）δ4.043（s, 3H），7.08-8.25（m,9H）．
(c)先の化合物（0.24g）をアルゴン雰囲気下塩化メチレン（3mL）に溶解し、メチルトリフルオロメタンスルフォネート（0.1mL,1.4当量）を加えた。溶液を室温で一晩中攪拌して、淡黄色の沈澱物を得た。この沈澱物を濾過し、エーテルで洗浄し、乾燥して純粋な2',3',6'-トリフルオロフェニル 3-メトキシアクリジニウム-9-カルボキシレート トリフルオロメタンスルフォネートを黄色結晶として得た。:1H NMR（DMSO-d6）δ4.288（s, 3H），4.837（s, 3H），7.64-8.89（m,9H）．
(d)アクリジニウムエステル（35mg）を無水エタノール（15mL）に懸濁し、溶液を10分間還流して透明な溶液を得た。過剰の塩化アンモニウム（4g）を溶液に分割添加し、次いで亜鉛（4g）を添加したところ、直ちに溶液が脱色した。無色の溶液を30分間還流し、冷却し、濾過して沈澱物をエタノール（3x20mL）で洗浄した。溶液を濃縮して、灰白色の固体を得、これを塩化メチレンに再溶解して水（3x50mL）で洗浄した。塩化メチレンを蒸発した後得た粗製物をシリカゲル上（酢酸エチル／ヘキサンで）クロマトグラフィにかけ、純粋なアクリダン、2',3',6'-トリフルオロフェニル 3-メトキシ-10-メチルアクリダン-9-カルボキシレートを白色固体として得た。:1H NMR（CDCl3）δ3.422（s, 3H），3.847（s, 3H），5.25（s,1H），6.54-7.39（m,9H）．
実施例7.  ペルオキシダーゼ基質化合物の合成。2',3',6'-トリフルオロフェニル アクリジン-9-カルボキシレート。
(a)アクリヂン-9-カルボン酸（Aldrich, 0.5g）を過剰のチオニルクロリド（5mL）に懸濁し、反応混液を3時間還流した。減圧下で溶剤を除去し、黄色の固体を得、これをアルゴン雰囲気下塩化メチレンとピリヂン（0.53g）に溶解した。フェノール（0.365g）の塩化メチレン溶液を滴下した。溶液を室温で一晩中攪拌し、次いで多量の塩化メチレン（100mL）で希釈し、水（3x50mL）で洗浄した。有機層をNa2SO4で乾燥し、濃縮して生成物を得た。黄色の固体を更にエーテルで洗浄し、過剰のフェノールを除去した。（82%収率）:1H NMR（CDCl3）δ7.08-7.28（m, 2H），7.71-8.42（m,8H）．
(b) 2',3',6'-トリフルオロフェニル 10-メチルアクリジニウム-9-カルボキシレート トリフルオロメタンスルフォネート。エステル（0.30g）を次にアルゴン雰囲気下塩化メチレン（25mL）に懸濁し、メチルトリフルオロメタンスルフォネート（0.95mL）を加えた。溶液を室温で一晩中攪拌して淡黄色の沈澱物を得た。この沈澱物を濾過し、エーテルで洗浄し乾燥して、生成物を黄色結晶として得た:1H NMR（アセトン-d6）δ5.29（s, 3H），7.50-7.67（m, 2H），8.26-9.14(m,8H）．
(c)2',3',6'-トリフルオロフェニル 10-メチルアクリダン−9-カルボキシレート。アクリジニウム  エステル（0.20g）を10mLの氷酢酸に溶解して、黄色溶液を得、亜鉛（2.5g）を加えたところ、直ちに溶液が脱色した。室温で５分撹拌した後、反応混液のTLCによって無極性の物質であることが判った。酢酸をデカントし、固体を塩化メチレンで洗浄した。合体した有機溶液を蒸発し粗製物を得、これを塩化メチレンに再溶解し、50ｍＬずつの水で２または３回洗浄した。塩化メチレンを蒸発した後に得た粗製物をシリカゲルで（20-30％の酢酸エチル／ヘキサンで）クロマトグラフィにかけ、純粋な生成物を白色固体として得た。：1H NMR（CDCl3）δ3.44（s, 3H），5.29（s, 1H），6.76-6.84（m,2H），6.99-7.39（m,8H）．
実施例8.膜上アルカリホスファターゼの検出。膜上のアルカリホスファターゼ抱合体の化学発光分析用の試薬を一工程で調製した。化学発光のウエスタンブロッテイングに使用できる試薬は、1mMの保護されたHRP強化剤2-ナフチル  ホスフェイト（Aldrich）、0.05mMの2',3',6'-トリフルオロフェニル 10-メチルアクリダン−9−カルボキシレート、2.5mMの尿素過酸化物、0.5%のTWEEN 20及び40pmolのHRPをpH8.8の0.01Mトリス緩衝液中に含有するものであった。ウエスタンブロットでは、ニトロセルローズまたはPVDFの膜に固定した、アルカリホスファターゼで標識した抗体を（透明フィルムの）支持体に置いた検出試薬で膜を濡らすことによって検出し、この膜を、５秒から30分の間で、Ｘ線フィルムに暴露し、次いで現像した。
実施例9.アルカリホスファターゼを検出した場合の直線性。本発明の試薬組成物を使用してアルカリホスファターゼ（AP）を検出した場合の直線性を決定した。pH8.8で0.01Mのトリス緩衝液中に、保護されたHRP強化剤２−ナフチルホスフェート（1mM）を含有する溶液（50μL）を3.7x10-15molと1.1x10-19molの間の酵素を含有するAPでインキュベートした。37℃で30分間の最初の反応期間ののち、本発明の試薬50μLをそれぞれの溶液に加えた。この試薬は、0.1mMの2′,3′,6′-トリフルオロフェニル 3-メトキシ−10-メチルアクリダン-9−カルボキシレート、1.2mMの過酸化尿素、2mMのEDTA、0.05％のTWEEN 20および40pmolのHRPをpH8.8で0.01Mのトリス緩衝液中に含有するものであった。光の強さを15分間連続的にモニターした。報告した値は15分後に計測したものである。第１図は、得られる非常に良好な感度を示していて、0.11amol（1.1×10-19mol）のAPが検出可能であった。図中、S-Bは、APの存在下のRLU単位の化学発光信号（Ｓ）を、APの不存在下のバックグラウンド化学発光（Ｂ）に関して補正したものを指す。結果は、３サンプルの平均である。
実施例10.β−ガラクトシダーゼを検出した場合の直線性。本発明の試薬組成物を使用してβ-ガラクトシダーゼ（β-gal）を検出した場合の直線性を決定した。pH7.0で0.005Mのリン酸ナトリウム緩衝液中に、保護されたHRP強化剤パラ−フェニルフェノールガラクトシド（0.15ｍＭ）を含有する溶液（50μＬ）を5.6x10-15と1.9x10-19molの間の酵素を含有するβ-galでインキュベートした。25℃で30分間の最初の反応期間ののち、実施例９の試薬50μLをそれぞれの溶液に加えた。第２図は、得られる非常に良好な感度を示していて、0.56amol（5.6×10-19mol）のβ−ガラクトシダーゼが検出可能であった。結果は、３サンプルの平均である。
【図１】
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【図２】
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