(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＧＦを有効成分として含有することを特徴とするコラーゲン分解促進剤（但し、肝線維症治療剤を除く）。
【請求項２】
線維症障害治療剤であることを特徴とする請求項１記載のコラーゲン分解促進剤。
【請求項３】
線維症障害が、動脈硬化、慢性糸球体腎炎、皮膚ケロイド生成、進行性全身性硬化症（ＰＳＳ）、肺線維症、嚢胞性線維症、慢性の対宿主移植片疾患、硬皮症（局部及び全身）、ペイロニー氏病、陰茎の線維症、膀胱鏡検査後の尿道狭窄症、外科手術後の内部癒着、骨髄線維症及び特発性後部腹膜線維症からなる群から選ばれることを特徴とする請求項２記載のコラーゲン分解促進剤。
【請求項４】
ＨＧＦを有効成分として含有することを特徴とするコラゲナーゼ活性の増加剤（但し、肝線維症治療剤を除く）。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、コラーゲン分解促進剤及び線維症障害治療剤に関する。より詳細には、ＨＧＦ(Hepatocyte Growth Factor)類を有効成分としたコラーゲン分解促進剤及び線維症障害治療剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
線維症とは、結合組織成分の過度の蓄積で特徴づけられる疾患であり、線維症においてその中心をなし最も注目すべきものはコラーゲンである。コラーゲンの蓄積は種々の内臓で生じ、例えば、肺においては肺線維症、肝臓においては肝線維症のような病態で生じる。また、皮膚においても、例えば、皮膚ケロイド生成のような病態で生じる。
多くの場合、線維症におけるコラーゲンの正味の蓄積は、コラーゲンの生産及び分解を起す因子の間の不均衡の結果である。
線維症の疾患及び障害を治療するために種々の投薬法が行われてきたが、一般にそれらは障害の対症療法が中心であり、そのもとである病理すなわちコラーゲンその他の結合組織成分の生産及び分解を調節する代謝因子のなかの不均衡を解消することを目指したものではなかった。それゆえ、これらの治療法のなかには、組織の改善という点で特に有効とされるものはなかった。すなわち、例えば、皮膚ケロイド生成の初期の炎症段階を治療するのに局部コルチコステロイドが使用されて或る程度成功したが、過度のコラーゲン生産の結果としてケロイドが実際に生成した場合のような後期の線維症の段階ではそのようなステロイドは殆ど又は全く効果がない。
このように、従来技術では、安全で有効な方法でヒトの線維症障害を治療して、それ以上の線維症の組織の生成を阻止し、既に生成している線維症の病巣を減少させ又は完全に除去するような方法は見出せなかった。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明が解決しようとする課題は、組織内における過度に蓄積された結合性組織のコラーゲンマトリックスの分解を誘導することのできるコラーゲン分解促進剤及び線維症障害の治療に有用な治療剤を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、上記の課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、ＨＧＦ類がコラーゲンの分解を促進する作用を有し、その作用に基づき線維症障害の治療に有効であることを見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、
▲１▼ＨＧＦ類の少なくとも一種を有効成分として含有することを特徴とするコラーゲン分解促進剤；
▲２▼ＨＧＦ類の少なくとも一種を有効成分として含有することを特徴とする線維症障害治療剤；
に関する。
【０００５】
本発明において、ＨＧＦ類とは、肝細胞増殖活性を示す蛋白質をいい、例えば、ＨＧＦ(Hepatocyte Growth Factor)などが挙げられる。
本発明で使用されるＨＧＦ類としては、医薬として使用できる程度に精製されたものであれば、種々の方法で調製されたものを用いることができる。
ＨＧＦの調製方法としては、各種の方法が知られている。例えば、ラット、ウシ、ウマ、ヒツジなどの哺乳動物の肝臓、脾臓、肺臓、骨髄、脳、腎臓、胎盤等の臓器、血小板、白血球等の血液細胞や血漿、血清などから抽出、精製して得ることができる(FEBS Letters, 224, 312, 1987、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 5844, 1989など参照)。
また、ＨＧＦを産生する初代培養細胞や株化細胞を培養し、培養物（培養上清、培養細胞等）から分離精製してＨＧＦを得ることもできる。あるいは遺伝子工学的手法によりＨＧＦをコードする遺伝子を適切なベクターに組込み、これを適当な宿主に挿入して形質転換し、この形質転換体の培養上清から目的とする組換えＨＧＦを得ることができる(例えば、Nature, 342, 440, 1989、Biochem. Biophys. Res. Commun., 163, 967, 1989など参照)。上記の宿主細胞は特に限定されず、従来から遺伝子工学的手法で用いられている各種の宿主細胞、例えば大腸菌、枯草菌、酵母、糸状菌、植物又は動物細胞などを用いることができる。
【０００６】
より具体的には、ＨＧＦを生体組織から抽出精製する方法としては、例えば、ラットに四塩化炭素を腹腔内投与し、肝炎状態にしたラットの肝臓を摘出して粉砕し、Ｓ−セファロース、ヘパリンセファロースなどのゲルカラムクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ等の通常の蛋白質精製法にて精製することができる。
また、遺伝子組換え法を用い、ヒトＨＧＦのアミノ酸配列をコードする遺伝子を、ウシパピローマウィルスＤＮＡなどのベクターに組み込んだ発現ベクターによって動物細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、マウスＣ１２７細胞、サルＣＯＳ細胞などを形質転換し、その培養上清より得ることができる。
【０００７】
かくして得られたＨＧＦ類は、ＨＧＦ類と実質的に同効である限り、そのアミノ酸配列の一部が欠失又は他のアミノ酸により置換されていたり、他のアミノ酸配列が一部挿入されていたり、Ｎ末端及び／又はＣ末端に１又は２以上のアミノ酸が結合していたり、あるいは糖鎖が同様に欠失又は置換されていてもよい。
【０００８】
本発明のコラーゲン分解促進剤は上記のＨＧＦ類を有効成分とし、ＨＧＦ類は後記試験例に示されるように、コラーゲンの分解（コラゲナーゼ活性の増加）を促進する作用を有する。従って、下記の線維症障害の治療の他、その予防にも有用であり、またコラゲナーゼ活性が低下した疾患、例えば、大理石骨病などの治療・予防に有用である。
また、本発明の線維症障害治療剤は、同様に上記のＨＧＦ類を有効成分とし、コラーゲン、フィブロネクチン及びグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）を含む結合性組織マトリックスの過度の線維芽細胞生産によって特徴づけられる線維症障害の治療に有用である。これには下記の障害が包含される。
【０００９】
動脈硬化、
慢性糸球体腎炎、
皮膚ケロイド生成、
進行性全身性硬化症（ＰＳＳ）、
肝線維症、
肺線維症、
嚢胞性線維症、
慢性の対宿主移植片疾患、
硬皮症（局部及び全身）、
ペイロニー氏病、
陰茎の線維症、
膀胱鏡検査後の尿道狭窄症、
外科手術後の内部癒着、
骨髄線維症、
特発性後部腹膜線維症
【００１０】
本発明のコラーゲン分解促進剤及び線維症障害治療剤は、ヒトの他、哺乳動物（例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、イヌ、ネコ等）におけるコラーゲン分解促進及び線維症障害治療に適用される。
【００１１】
本発明のコラーゲン分解促進剤及び線維症障害治療剤は種々の製剤形態（例えば、液剤、固形剤、カプセル剤等）をとりうるが、一般的には有効成分であるＨＧＦ類のみ又はそれと慣用の担体と共に注射剤、吸入剤、坐剤又は経口剤とされる。当該注射剤は常法により調製することができ、例えば、ＨＧＦ類を適切な溶剤（例えば、滅菌された水、緩衝液、生理食塩水等）に溶解した後、フィルター等で濾過して滅菌し、次いで無菌的な容器に充填することにより調製することができる。注射剤中のＨＧＦ類含量としては、通常0.0002〜0.2(W/V%)程度、好ましくは0.001〜0.1(W/V%)程度に調整される。また、経口薬としては、例えば、錠剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、軟又は硬カプセル剤、液剤、乳剤、懸濁剤、シロップ剤などの剤形に製剤化され、これらの製剤は製剤化の常法に準じて調製することができる。坐剤も慣用の基剤（例えば、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチン、マクロゴール、ウィテップゾル等）を用いた製剤上の常法によって調製することができる。また、吸入剤も製剤上の常套手段に準じて調製することができる。
製剤中のＨＧＦ類含量は、剤形、適用疾患などに応じて適宜調整することができる。
【００１２】
製剤化に際して、好ましくは安定化剤が添加され、安定化剤としては、例えば、アルブミン、グロブリン、ゼラチン、グリシン、マンニトール、グルコース、デキストラン、ソルビトール、エチレングリコールなどが挙げられる。さらに、本発明の製剤は製剤化に必要な添加物、例えば、賦形剤、溶解補助剤、酸化防止剤、無痛化剤、等張化剤等を含んでいてもよい。液状製剤とした場合は凍結保存、又は凍結乾燥等により水分を除去して保存するのが望ましい。凍結乾燥製剤は、用時に注射用蒸留水などを加え、再溶解して使用される。
【００１３】
本発明のコラーゲン分解促進剤及び線維症障害治療剤は、その製剤形態に応じた適当な投与経路により投与され得る。例えば、注射剤の形態にして静脈、動脈、皮下、筋肉内などに投与することができる。その投与量は、患者の症状、年齢、体重などにより適宜調整されるが、通常ＨＧＦ類として0.05mg〜500mg、好ましくは１mg〜100mgであり、これを１日１回ないし数回に分けて投与するのが適当である。
【００１４】
【発明の効果】
本発明の有効成分であるＨＧＦ類は、コラーゲンの分解（コラゲナーゼ活性の増加）を促進し、もって線維症障害を有効に治療することができる。
【００１５】
【実施例】
以下、製造例及び実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。
製造例１
ＨＧＦ製剤の生産例
(1)  ＨＧＦ                  ２０μｇ
ヒト血清アルブミン    １００ｍｇ
上記物質をｐＨ７．０の０．０１ＭのＰＢＳで溶解し、全量を２０ｍｌに調製し、滅菌後、バイアル瓶に２ｍｌずつ分注し、凍結乾燥密封した。
(2)  ＨＧＦ                  ４０μｇ
ツイーン８０              １ｍｇ
ヒト血清アルブミン    １００ｍｇ
上記物質を注射用生理食塩水に溶解し、全量を２０ｍｌに調製し、滅菌後、バイアル瓶に２ｍｌずつ分注し、凍結乾燥密封した。
【００１６】
実施例１
ジメチルニトロサミン肝線維化ラットに対するＨＧＦの線維化抑制作用と症状改善効果
１．試験方法
▲１▼使用動物：ウィスター系雄ラット、５週齢
▲２▼試験スケジュール
ジメチルニトロサミン（ＤＭＮ）を毎週火、水、木曜日に１０μｌ／ｋｇの用量で４週にわたり腹腔内投与した。ＨＧＦはＤＭＮ初回投与時より５００μｇ／ｋｇを１日２回（１０００μｇ／ｋｇ／日）２８日間静脈内投与した(下記投与スケジュール１参照)。２９日目に試験ラットを下記の測定に供した。
【００１７】
0003818322.tif 000002
【００１８】
▲３▼測定
ラットを解剖して肝重量を測定した。また、肝組織中のヒドロキシプロリン含量(Hyp;線維化の指標)及びコラゲナーゼ（コラーゲン分解酵素）活性を、それぞれKivirikkoらの方法(Anal. Biochem， 19, 249, 1967)及びMurawakiらの方法(J. Biochem, 108, 241, 1990)により測定した。更に、肝組織中のＤＮＡ及び蛋白含量は、それぞれDishe法のBurtonによる変法(Biochem, J, 62, 315, 1956)及びプロテインアッセイキット(バイオラット社製)により測定した。その結果を表１に示す。
また、同時に後大静脈より採血し、採取した血清の臨床生化学検査は日立7150型自動分析装置により分析した。血液検査は、後大静脈より採取したＥＤＴＡ加血液で血小板数、白血球数、赤血球数、ヘマトクリット値、ヘモグロビン濃度を多項目自動血球計数装置（Ｅ−４０００，Ｓｙｓｍｅｘ）を用いて測定した。また、３．８％クエン酸ナトリウム水溶液と後大静脈より採取した血液を１：９の割合で混合した血漿で、血漿凝固能（プロトロンビン時間、フィブリノーゲン量、ヘパプラスチンテストとトロンボテストによる凝固時間）を自動凝固能測定装置（ＫＣ−４０）を用いて測定した。その結果を表２に示す。
【００１９】
【表１】
0003818322.tif 000003
【００２０】
【表２】
0003818322.tif 000004
【００２１】
２．結果
表１及び表２に示すように、ＤＭＮの反復投与により、溶媒投与群（対照）では顕著な肝の線維化の伸展と萎縮が観察され、臨床生化学、血液及び凝固系検査値から明らかな肝機能の低下が認められた。これに対し、ＨＧＦ投与群の肝機能検査値は溶媒投与群のそれらの値より有意な差で健常動物に近い値を示し、明らかな改善効果を示していた。また、ＨＧＦ投与により肝組織中のＤＮＡ、蛋白量、コラゲナーゼ活性が有意に上昇し、線維化の指標であるヒドロキシプロリン含量は有意に低下し、肝重量はほぼ正常レベルまで回復した。
【００２２】
実施例２
四塩化炭素肝線維化ラットに対するＨＧＦの作用
ウィスター系雄ラット（６週齢）に四塩化炭素を毎週月、木曜日に０．７ｍｌ／ｋｇの用量で１２週間経口投与して肝線維化モデルを作成した。この四塩化炭素肝線維化ラットを下記の２つの試験に供した。
【００２３】
▲１▼試験Ａ
反復投与試験
上記の四塩化炭素肝線維化ラット（１群１３〜１４匹）に、ＨＧＦを５０及び５００μｇ／ｋｇで１日２回（１００及び１０００μｇ／ｋｇ／日）７日間静脈内投与した。ＨＧＦ投与開始から３、５、７日目の血清中のＧＯＴ、ＧＰＴ、γ−ＧＴＰ値の変化を溶媒投与群（対照）と比較した（下記投与スケジュール２参照）。その結果を図１に示す。
図１に示されるように、１０００μｇ／ｋｇ／日で５日目、１００μｇ／ｋｇ／日で７日目から回復促進作用が認められた。
【００２４】
0003818322.tif 000005
【００２５】
▲２▼試験Ｂ
点滴注入試験
各群１２〜１３匹の上記四塩化炭素肝線維化ラットを用い、頸静脈に留置したカテーテルより、ＨＧＦを１００及び１０００μｇ／ｋｇ／日の割合で持続点滴注入し、ＨＧＦ投与開始から７２時間後に解剖した(下記投与スケジュール３参照)。
【００２６】
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【００２７】
血清中のＧＯＴ、ＧＰＴ、血清総蛋白、アルブミンは日立７１５０型自動分析装置により、３．８％クエン酸ナトリウム水溶液と後大静脈より採取した血液を１：９の割合で混合した血漿の凝固能については、ヘパプラスチンテストの凝固時間を自動凝固能測定装置（ＫＣ−４０）で測定した。また、線維化の指標として肝組織中ヒドロキシプロリン含量(Hyp)は、前掲のKivirikkoらの方法により測定した。その結果を表３及び図２に示す。
表３及び図２に示されるように、ＨＧＦは１００μｇ／ｋｇ／日以上で用量に依存した肝機能検査値の改善、低蛋白血症の回復及び線維化の改善を示唆する肝組織中ヒドロキシプロリン含量の低下が観察された。
【００２８】
【表３】
0003818322.tif 000007
【００２９】
実施例３
ＤＭＮによって惹起されたラット肝線維化とそれに伴う肝機能不全に対するＨＧＦの効果
▲１▼試験Ａ
ＤＭＮによって惹起された肝線維化ラットに対するＨＧＦ投与群及び非投与群における生存率を試験した。
薬剤の投与スケジュールを図３の上方に示す。生理食塩水に１％の濃度で溶解したＤＭＮを、ＳＤ系雄性ラットの体重１ｋｇあたりＤＭＮとして１０μｌの割合で、１週間に３回つづ６週間矢印で示した日に腹腔内投与した。ヒトＨＧＦ又は生理食塩液は、ＤＭＮ投与開始後２１日目よりハッチングした帯で示した期間毎日静脈内投与し、試験ラットの生存率（％）を経日的に調べた。その結果を図３に示す。図３において、点線は生理食塩液投与群（対照群、ｎ＝１０）、破線はＨＧＦ５０μｇ／ｋｇ体重投与群（ｎ＝５）、実線はＨＧＦ２００μｇ／ｋｇ体重投与群（ｎ＝５）を示す。
図３に示されるように、ＨＧＦの投与により生存率が向上し、特にＨＧＦ２００μｇ／ｋｇ体重投与群においては死亡例は認められなかった。
【００３０】
▲２▼試験Ｂ
ＨＧＦ投与又は非投与下において、ＤＭＮを投与したラット肝臓のタイプＩコラーゲン沈着（組織所見）を調べた。
即ち、線維化基質の検出のために、図３に示した試験において４２日目にラットを殺し肝臓を採取した。コラーゲンの免疫蛍光染色には、肝臓をＯＴＣ化合物のなかですばやく凍結し、作成した切片はウサギ由来抗ラットコラーゲンタイプＩ抗体（ＬＳＬ社製）、そして蛍光標識化ヤギ由来抗ウサギＩｇＧ抗体と反応させた後、標本の写真撮映を行った。その結果を図４に示す。
図４に示されるように、肝臓におけるタイプＩコラーゲンの沈着には有意な違いがあった。生理食塩液投与群の対照ラットでは、タイプＩコラーゲンの肝臓での沈着は明瞭であり、血管や肝細胞周囲に太い或いは細いタイプＩコラーゲン線維の東が広範に集積していた。
これらの所見はＨＧＦの投与によって用量依存的に消失し、また小葉構造の改善はＨＧＦ投与群においてより顕著であった。このように、ＨＧＦの肝線維化防止効果は肝臓切片の組織所見から明らかになった。
【００３１】
▲３▼試験Ｃ
ＨＧＦ投与による、プロトロンビン時間、肝細胞逸脱酵素及び肝ヒドロキシプロリン含量の変化を調べた。
即ち、ラットは図３で示した実験計画に従い処置した。プロトロンビン時間（ＰＴ）、アルブミン（Ａｌｂ）、グルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ（ＧＯＴ）、グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ（ＧＰＴ）及びアルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）の血清（血漿）中の値、並びに肝ヒドロキシプロリン含量（ＨＹＰ）は、健常ラット群（ｎ＝５、表４において健常ラットと表示）、ＤＭＮ処理を５週間し生理食塩液のみを投与した群（ｎ＝５、表４において５Ｗと表示）、ＤＭＮ処理を６週間し生理食塩液のみを投与した群（ｎ＝１、表４において６Ｗと表示）又は生理食塩液の代りにＨＧＦを５０μｇ／ｋｇ体重（ｎ＝３、表４において５０と表示）と２００μｇ／ｋｇ体重（ｎ＝５、表４において２００と表示）で投与した群でそれぞれ測定した。その結果を表４に示す。なお、表中、５Ｗと表示した値は３５日目にラットを屠殺して得た値であり、これ以外の値はＤＭＮ処置開始後４２日目にラットを屠殺し得たものである。
表４に示されるように、ＨＧＦの投与により、肝臓の線維化及び肝機能不全の緩和が図られていることが判明した。
【００３２】
【表４】
0003818322.tif 000008
【００３３】
実施例４
ＤＭＮ肝線維化ラットでのＨＧＦ投与による肝線維減少効果
▲１▼方法
５週齢のＳＤ系雄性ラットに、ＤＭＮを１０μｌ／ｋｇの用量で週３回（月、火、水）４週間腹腔内投与し肝線維化ラットを作製した。このラットに１ｍｇ／ｋｇのＨＧＦ又は１ｍｌ／ｋｇの溶媒（ＨＳＡ ２．５ｍｇ／ｍｌ、ツイーン８０ ０．０１％を含むリン酸緩衝生理食塩水）を週５回（月、火、水、木、金）ＤＭＮ投与開始時より投与し、４週目の４日目まで投与した。４週目の５日目にラットを屠殺、肝臓を採取後中性ホルマリンに固定し、切片作製後に線維組織を染め分けるマッソントリクローム染色を施した。なお、比較のために健常ラットの肝臓も同様に染色した。染色した各個体の肝臓組織標本について、画像解析装置(T. Watanabe et al. Analytical Cellular Pathology 4 (3), 248, 1992)を用い、組織切片の全面積中の線維化した組織の面積を計算して線維化の程度を比較した。なお、解析に用いた個体数は、健常ラット８例、ＤＭＮ＋溶媒投与群（ＤＭＮ）８例、ＤＭＮ＋ＨＧＦ投与群（ＨＧＦ＋ＤＭＮ）については血清中にＨＧＦ中和活性の生成した個体を除いた６例であった。
【００３４】
▲２▼結果
結果を図５に示した。図中の各点は、健常ラット（ｎ＝８）、ＤＭＮ投与ラット（ｎ＝８）、ＤＭＮ＋ＨＧＦ投与ラット（ｎ＝６）の各個体肝臓の線維組織の割合をパーセントで示したものである。また、横線のバーは平均値を示す。
図５に示されるように、健常ラットと比較すると、ＤＭＮでは肝臓組織中の線維組織の割合が、平均１．３％に対して７．３％に増加した。これに対してＤＭＮ＋ＨＧＦでは２．８％に低下し、ＨＧＦの投与によってＤＭＮによる肝線維化軽減が示された。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例２の試験Ａにおける、ＧＯＴ、ＧＰＴ及びγ−ＧＴＰの測定結果を示す図である。
【図２】実施例２の試験Ｂにおける、ＧＯＴ、ＧＰＴ、ヘパプラスチンテスト及び肝臓Ｈｙｐ（ヒドロキシプロリン）含量の測定結果を示す図である。
【図３】実施例３の試験Ａにおける、肝線維化ラットに対するＨＧＦの延命効果を示す図である。図３において、点線は生理食塩液投与群（対照群、ｎ＝１０）、破線はＨＧＦ５０μｇ／ｋｇ体重投与群（ｎ＝５）、実線はＨＧＦ２００μｇ／ｋｇ体重投与群（ｎ＝５）を示す。
【図４】実施例３の試験Ｂにおける、肝線維化ラットに対するＨＧＦの肝線維化軽減効果を示す写真（生物の形態）である。
【図５】実施例４における、各個体肝臓の線維組織の割合（％）を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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