(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫原性構成物の調製方法であって、
a)  有機シアン化試薬を使って少なくとも１つの第一の炭水化物含有成分を活性化し、ここで当該有機シアン化試薬は１−シアノ−４−（ジメチルアミノ）−ピリジウムテトラフルオロボレートおよびＮ−シアノトリエチルアンモニウムテトラフルオロボレートから選ばれ；そして
b)  前記活性化された炭水化物含有成分を第二成分に共有結合により結合させる；
ことを含んで成る方法。
【請求項２】
免疫原性構成物の調製方法であって、
a)  有機シアン化試薬を使って少なくとも１つの第一の炭水化物含有成分を活性化し、ここで当該有機シアン化試薬は１−シアノ−４−（ジメチルアミノ）−ピリジニウムテトラフルオロボレートおよびＮ−シアノトリエチルアンモニウムテトラフルオロボレートから選ばれ；
b)  前記第一成分を二価性スペーサー試薬に共有結合により結合させ；そして
c)  第二成分を段階b)の二価性スペーサー試薬に共有結合により結合させる；
ことを含んで成る方法。
【請求項３】
前記免疫原性構成物が二元担体構成物である、請求項１または２の方法。
【請求項４】
前記二価性試薬がエチレンジアミン、１，６−ヘキサンジアミン、アジピン酸ジヒドラジド、シスタミン、グリシンおよびリジンから成る群より選択される、請求項１または２の方法。
【請求項５】
請求項１または２の方法に従って製造された二元担体免疫原性構成物。
【請求項６】
前記第一成分がデキストラン、肺炎球菌多糖、インフルエンザ菌多糖（ＰＲＰ）、ウイルス多糖および細菌多糖から成る群より選択される、請求項１または２の方法。
【請求項７】
前記第二成分がウシ血清アルブミン、百日咳トキソイド（ＰＴ）、破傷風トキソイド（ＴＴ）、マラリア由来ペプチドP28、抗体、トキソイドおよび毒素から成る群より選択される、請求項１または２の方法。
【請求項８】
前記免疫原性構成物がPT−Pn14（肺炎球菌14型多糖）、PT−PRP、TT−Pn14、Ｈδa・/1−デキストランおよびマラリア由来ペプチドP28−TT−Pn14から成る群より選択される、請求項１または２の方法に従って製造された免疫原性構成物。
【発明の詳細な説明】
合衆国政府の権利
合衆国政府は、本発明者らに特許権使用料を支払わずに、本明細書に記載される発明を製造、認可および使用することができる。
発明の分野
本発明は免疫原性構成物の改良製造方法に関する。
発明の背景
予防接種の過程で、医学は、病気を引き起こさずにその病気に対して保護する抗体の形成を刺激することのできる抗原を使って体を免疫化することにより侵略物質に対して自分を保護する生得能力を利用する。例えば、腸チフスや百日咳のような細菌病に対して保護するには死菌を注射し、破傷風やボツリヌス中毒に対して保護するには毒素を注射し、そしてポリオや麻疹のようなウイルス病に対して保護するには弱毒化株を注射する。
しかしながら、単に外来物質を注射するだけで常に抗体形成を刺激することができるとは限らない。ワクチン製剤は免疫原性でなければならず、即ち、免疫応答を誘導することができなければならない。免疫応答は、一般に次のように表すことができる複雑な反応の連鎖である：
1.  抗原が体内に入り、抗原を処理し且つ表面上に抗原の断片を保持する抗原提示細胞と出会う；
2.  抗原提示細胞上に保持された抗原断片がＴ細胞により認識され、それがＢ細胞に介助を与える；そして
3.  Ｂ細胞が刺激されて増殖しそして抗体産生細胞に分化し、その抗体産生細胞が抗原に対する抗体を分泌する。
破傷風トキソイドのような或る種の物質は生来、免疫応答を惹起することができるので、変更なしで投与することができる。しかし、他の重要な物質は免疫原性でないので、免疫応答を誘発し得るためにはそれを免疫原性分子に変更しなければならない。
免疫原性分子を製造する１つの方法は、1992年２月11日出願の関連米国特許出願第07/834,064号と、1993年２月10日出願のそれの一部継続出願第08/055,163号に与えられている。それらの明細書は本明細書中に組み込まれる。それらの２つの関連出願は、非常に望ましい免疫原性構成物である二元担体免疫原性構成物を記載している。
米国特許出願第07/834,064号と同第08/055,163号の二元担体免疫原性構成物並びに他の全ての免疫原性構成物のような免疫原性分子を調製する場合に使われる方法は、該分子上に重要な抗原部位、即ちエピトープを保持するのに十分な位温和であるべきである。よって、それらの構造の完全性を維持し且つそれらの分子中のエピトープを保存することが望ましい。不運にも、従来技術において現在使われている調製段階はしばしば温和でなく、生来の炭水化物および／またはタンパク質構造を破壊することがある。更に、従来の炭水化物修飾技術の大部分は無水条件を要求するが、不運にも炭水化物はしばしば有機溶媒に不溶である。Marburg他、J.Amer.Chem.Soc.,108:5282（1986）。
免疫原性構成物を製造するには次の２つの一般的方法がある：
(1)  炭水化物とタンパク質の直接結合；または
(2)  二価性リンカーまたはスペーサー試薬を介した炭水化物とタンパク質の結合。
一般に、どちらの形の結合も、誘導体化の前に炭水化物成分の化学的活性化を必要とする。化学的活性化とは、追加の化学反応を行うことができる形態への官能基の変換、例えば官能基の付加またはタンパク質などの大型成分の付加を言う。誘導体化はタンパク質への１もしくは複数の化学的官能基または１もしくは複数のスペーサー試薬の付加である。
或る種の炭水化物は、接合前により一層容易に活性化または誘導体化することができる基、例えばアミノまたはカルボキシル基を含む。例えば、シュードモナス菌（Pseudomonas）フィッシャーＩ型中のアミノ基は、ヨードアセチル基を使って容易に誘導体化することができ、そしてチオール含有タンパク質に結合させることができる。肺炎球菌（Pneumococcal）III型のような炭水化物中のカルボキシル基は、水溶性カルボジイミド（例えばＥＤＣ）を使って容易に活性化することができ、次いでタンパク質に直接結合させることができる。しかし、不運にも、この種の炭水化物は限られている。
他の炭水化物は、還元末端のところに誘導体化と結合に活用することができるアルデヒド基を有する。過ヨウ素酸ナトリウムでの処理により還元末端にアルデヒド基を作ることも可能である。アルデヒド基を使用すれば炭水化物の活性化が必要でないかもしれないので、アルデヒド基の存在は有益であろう。
それらのアルデヒド基はタンパク質上のアミノ基とまたは二価性リンカー試薬と縮合させることができる。しかしながら、この縮合反応、特に還元末端との縮合反応は、しばしば非常にゆっくりと非能率的に進行する。炭水化物アルデヒドをタンパク質に直接結合させる時、これはいっそう悪化する。更に、過ヨウ素酸ナトリウムは炭水化物を小断片に分離しそして／またはエピトープを破壊することがあり、それは望ましくないだろう。
しかしながら、大部分の炭水化物は結合前に活性化しなければならず、そして活性化剤としてしばしば臭化シアンが選択される。例えば、Chu他、Inf.&Imm.,40:245（1983）を参照のこと。簡単に言えば、臭化シアンを高pH、典型的にはpH10〜12で炭水化物と反応させる。この高pHでは、炭水化物のヒドロキシル基とでシアン酸エステルが形成される。次いでそれらを二価性試薬、通常はジアミンまたはジヒドラジドと反応させる。次いで二価性基を介してそれらの誘導体化された炭水化物を結合させる。シアン酸エステルを直接タンパク質と反応させることもできる。
ヒドロキシル基をイオン化するのには高いpHが必要である。何故なら、この反応はシアンイオン（ＣＮ-）上へのヒドロキシルイオンの求核攻撃を必要とするからである。結果として、臭化シアンは多数の副反応を引き起こし、その中には多糖に荷電基や新生抗原（neo-antigen）を付加するものがある。M.Wilcheck他、Affinity Chromatography.Meth.Enzymol.,104C:3-55。しかし、もっと重要なのは、臭化シアン活性化を行うのに必要である高いpHによって、多くの炭水化物が加水分解されたり破壊されたりしてしまうことである。
加えて、臭化シアンによる活性化後に形成されるシアン酸エステルは高pHで不安定であり、容易に加水分解して誘導体化された炭水化物の収率を減少させ、よってタンパク質に結合された炭水化物の全収率を減少させる。多数の他の非生産的副反応、例えばカルバメートや直鎖状イミドカルボネートを生成する反応も、高pHにより促進される。Kohn他、Anal.Biochem.,115:375（1981）。更に、臭化シアンそれ自体も高pHで非常に不安定であり、自然に加水分解して全収率を更に低下させる。
更に、臭化シアン活性化は実施が困難であり且つ当てにならない。臭化シアンは非常に毒性が高く、潜在的に爆発性である。全ての作業は適当なヒュームフード中で実施しなければならない。臭化シアンのバッチによっては良く反応するものもありそうでないものもあるので、活性化は容易に再現可能でないことは当業者に周知である。臭化シアンはまた、水に難溶性であり、それが炭水化物との反応に利用できる可溶性臭化シアンの量を調節することを困難にする。同じバッチの臭化シアンを使用し且つ見かけ上同一の反応条件を使っても、いつも同じ結果が得られるとは限らない。
それらの欠点に加えて、臭化シアンを使うことによって達成される炭水化物活性化の程度を調節することは非常に難しい。この方法を使って高レベルの炭水化物活性化を達成することも非常に難しい。存在する臭化シアンの量を増加させることは非能率的であり、活性化を増大させることなく副反応を増加させるだけである。Kohn他、Applied Biochem and Biotech,9:285（1984）。従って、温和であり、炭水化物とタンパク質の構造の完全性を維持し、該化合物中のエピトープを保持し、実施が容易であり、信頼でき、且つ容易に再現可能である、免疫原性構成物を製造する方法が当業界において要望されている。
発明の要約
本発明は、安全で、容易で、安価で、且つ炭水化物にとって温和である炭水化物活性化法を使う接合方法を提供することにより、従来技術の免疫原性構成物の製造方法の課題および欠点を克服する。
本発明の方法は、炭水化物含有抗原を活性化するのに新規シアン化試薬を使用する。このシアン化試薬の反応条件はとても温和であるので、炭水化物構造の破壊の危険、および天然エピトープの破壊の危険が大きく減少する。この方法は広範な可溶性炭水化物に適用可能であり、そして本発明の方法を使って活性化された炭水化物は、直接タンパク質に結合させることができ、またはスペーサーもしくはリンカーの使用によって間接的にタンパク質に結合させることができる。この方法は、従来技術の方法を使って製造された免疫原性構成物よりも効率的で且つ安価に、より効果的な免疫原性構成物を製造することを可能にするだろう。下の表１に示すように、この方法は現在使用されている臭化シアンよりも有利である。
0003828145.tif 000002
好ましい実施態様では、本発明の方法は、１−シアノ−４−（ジメチルアミノ）ピリジニウムテトラフルオロボラート（CDAP）試薬を使って第一の炭水化物含有成分を活性化することを含んで成る。別の好ましい実施態様では、該方法は、前記活性化された炭水化物含有成分を第二の成分に直接結合させることを更に含んで成る。別の好ましい実施態様では、本発明の方法は、CDAPを使って炭水化物含有成分を活性化し、前記活性化された成分に二価性試薬を共有結合により結合させ、そして最後に、前記二価性試薬を第二の成分、典型的にはＴ依存性抗原と反応させて、炭水化物含有性分とＴＤ成分が二価性試薬によって結合されている複合免疫原性構成物を形成せしめることを含んで成る。
CDAPを使うことの追加の利点は、(1)この試薬はあらかじめ調製することができ、且つ数カ月間溶液中で貯蔵することができること；および(2)301nmでの吸光度から活性試薬の濃度を容易に決定することができることである〔Kohn他、Anal.Biochem.,115:375（1981）〕。この結果、試薬濃度を標準化できるようになり、且つ炭水化物の誘導体化がより再現性の高いものになる。このことはワクチン製造に使用する場合には重要である。
上述した利点は全て、炭水化物へのタンパク質の直接結合とスペーサーを介した間接結合の両方に当てはまる。
本発明の追加の目的および利点は、一部は下記記載の中に記載され、そして一部は下記記載から明白であるかまたは本発明の実施により知るかもしれない。本発明の目的および利点は、添付の請求の範囲に特に指摘される要素および組合せによって実現されそして獲得されるだろう。
上記の一般的記載も下記の詳細な記載も共に、本発明を例証し説明するためだけに役立ち、本発明を制限するものではないと理解すべきである。
本明細書中に組み込まれそして本明細書の一部分を構成する添付図面は、本発明の幾つかの態様を説明し、そして明細書中の記載と共に、本発明の理論を説明するために役立つ。
【図面の簡単な説明】
図１は、シアン化試薬を使った炭水化物の活性化のための概略スキームを示す。
図２は、活性化された炭水化物のタンパク質への直接結合（図面の左側）と、二価性試薬を使った活性化された炭水化物のタンパク質への間接結合（図面の右側）を示す。
図３は、免疫原性構成物のモデルを表す。
図４は、添加したCDAPのモル／デキストランのモルに対するデキストラン中へのNH2基の取込みを示す。
図５は、S400SFゲル濾過カラムからの3Ｈ−ＢＳＡ−デキストラン接合体の溶出曲線を示す。
図６は、S400SFゲル濾過カラムから溶出された、本発明の方法に従って調製した免疫原性構成物のOD280吸光度を示す。Ａ：PT-PRT；Ｂ：P28-PT-Pn14。
図７は、S400SFゲル濾過カラムからのＨδa/1−(CDAP)−デキストランの溶出曲線を示す。
図８は、Ｈδa/NH2−(CDAP)−デキストランが充填されたS400SFゲル濾過カラムから溶出されたカラム試料のOD280とOD480値を示す。
図９は、本発明の方法を使って調製した免疫原性構成物の免疫反応性を示す。
好ましい実施態様の記載
その例が添付図面に図解されている本発明の現在好ましい実施態様に詳しく言及することにする。
本発明は免疫原性構成物の調製に使われる炭水化物含有抗原の活性化方法に関する。本発明は更に、シアン化試薬を使った炭水化物含有成分の活性化を含んで成る免疫原性構成物の調製方法にも関する。図１には、シアン化試薬を使った炭水化物の活性化についての概略スキームが示される。図２は、タンパク質への直接結合または二価性リンカー試薬を使った間接結合への活性化炭水化物の利用を表す。
本明細書中で用いる時、免疫原性構成物とは免疫応答を刺激することのできる存在物を言う。好ましい態様では、それは、タンパク質である少なくとも１つの第二成分に結合された少なくとも１つの炭水化物含有成分である。本明細書中で用いる時、「炭水化物」とは、任意の可溶性単糖、二糖、オリゴ糖または多糖を意味する。多糖としてはデンプン、セルロースおよびペクチンが挙げられるが、それらに限定されない。別の好ましい態様では、図３に表されるように、第二成分は炭水化物に結合されたＴ依存性抗原である。
本明細書中で使用する時、成分は任意の物質であることができ、そのようなものとしては、非限定的例として、独力でまたは１度カップリングして、免疫系を刺激することができる物質が挙げられる。成分の例としては炭水化物、タンパク質、ペプチド、他の抗原、補助分子、ハプテン、またはそれらの組合せが挙げられる。ハプテンとは、独力では抗体応答を惹起することができないが、一度担体にカップリングすれば抗体応答を惹起することができる小分子、例えば化学薬品、塵およびアレルゲンを言う。抗原は正常な環境下で抗体の形成を誘導することができる任意の分子である。それらのハプテンや抗原や細菌、リケッチア、真菌、ウイルス、寄生虫、薬物または薬品から誘導することができる。それらの例としては、ペプチド、オリゴ糖〔例えばインフルエンザ菌（H.influenzae）のポリリボシルリビトールリン酸〕、毒素、内毒素が挙げられる。
本発明の構成物を合成する方法は、最終生成物の物理的および化学的性質を有利に調節することができる。調節することができる性質としては、第一および第二成分上の電荷の変更（陽イオン化タンパク質がより免疫原性となり得るという証拠の点から有利）、炭水化物含有成分の大きさを変えることによる構成物の大きさの変更、構成物の架橋度の選択（大きさのバリエーションを得るため）、炭水化物含有成分に結合された第二成分のコピー数の選択、および特定の細胞集団（例えば抗原提示を増加させるためにマクロファージ）への標的指向（ターゲティング）が挙げられる。Dick & Beurret,“Glycoconjugates of Bacterial Carbohydrate Antigens,”Conjugate Vaccines,J.M.Cruse & R.E.Lewis編，第10巻，48-114頁（1988）。
本発明の構成物に対する免疫応答は、免疫調節剤および／または細胞標的指向成分の添加により更に増強することができる。それらの存在物としては、例えば、(1)無毒化されたリポ多糖または誘導体、(2)ムラミルジペプチド、(3)細胞表面決定基と相互作用して該構成物を免疫学的関連細胞にターゲティングすることができる炭水化物、脂質およびペプチド、(4)インターロイキン、および(5)抗体が挙げられる。
炭水化物含有成分は、天然の、半合成のまたは完全に合成の高分子量分子であることができる。好ましい態様では、少なくとも１つの炭水化物含有成分が、大腸菌〔Ｅ．コリ（E.coli）〕多糖、黄色のブドウ球菌〔Ｓ．アウレウス（S.aureus）〕多糖、デキストラン、カルボキシメチルセルロース、アガロース、肺炎球菌〔ニューモコッカル（Pneumococcal）〕多糖、フィコール、クリプトコックス・ネオフォルマンス（Cryptococcus  neoformans）、インフルエンザ菌〔Ｈ．インフルエンゼ（H.influenzae）〕ＰＲＰ、緑膿菌〔Ｐ．アエルギノーザ（P.aeruginosa）〕、肺炎連鎖球菌〔Ｓ．ニューモニエ（S.pneumoniae）〕、リポ多糖、およびそれらの組合せである。
最も好ましい態様では、炭水化物含有成分がデキストランである。本明細書中で使用する時、デキストランとは単糖から構成される多糖を指し、Pharmaciaなどの多糖の商業源から得ることができる。半合成ポリマーの一例であるフィコールは、不活性な合成非イオン性高分子量ポリマーである。合成ポリマーの一例はポリビニルアルコールである。これらはいずれも炭水化物含有成分の例である。
好ましい態様では、第二成分はアルブミン、トキソイド、タンパク質、ペプチド、Ｔ細胞もしくはＢ細胞補助化合物、またはＴ細胞介助を活性化しそして回復することができる他の任意の化合物である。タンパク質は、ウイルス、細菌、寄生虫、動物および真菌タンパク質から成る群より選択することができるが、それらに限定されない。より好ましい態様では、第二成分はウシ血清アルブミン、破傷風トキソイド、百日咳トキソイド、ジフテリアトキソイド、熱ショックタンパク質、Ｔ細胞超抗原、または細菌の外膜タンパク質であり、それらは全て生化学物質もしくは医薬品供給業者から得ることができるかまたは標準方法論〔J.M.Cruse & R.E.Lewis編、Conjugate Vaccines in Contributions to Microbiology and Immunology，第10巻（1989）；これは参考として本明細書中に組み込まれる〕により調製することができる。他のタンパク質は免疫学の技術者に既知であろう。
本発明の第二成分は少なくとも１つの炭水化物含有成分に結合させることができる。第二成分が炭水化物含有成分と反応することのできる官能基を含んでもよいし、または炭水化物含有成分と反応することができるように第二成分を化学的に修飾してもよい。
特定の第二成分の多数のコピー並びに多様な第二成分を炭水化物含有成分に結合させることができる。第一成分への第二成分の多重コピーの結合は第二成分に対する抗体産生をかなり増大させる。
別の態様では、１もしくは複数の第一および／または第二成分に第三成分を更に結合させてもよい。関連出願中に記載されたように、そのような結合は第三成分に対する抗体応答を増強する。第一または第二成分のいずれかに様々な成分を結合させる技術は当業者に周知であり、一部は、利用可能な官能基（例えばアミノ、カルボキシル、チオおよびアルデヒド基）を通したカップリングを包含する。S.S.Wong,Chemistry of Protein Conjugate and Crosslinking CRC Press (1991)およびBrenkeley他、“Brief Survey of Methods for Preparing Protein Conjugates With Dyes,Haptens and Cross-Linking Agents,”Bioconjugate Chemistry,3:1（1992年１月）を参照のこと。これらは参考として本明細書中に組み込まれる。
本発明の方法では、シアン化試薬を使って炭水化物含有成分を活性化する。シアン化試薬はシアネートの求電子性を高め、そして炭水化物含有成分と反応させると、シアン化試薬が炭水化物のヒドロキシル基にシアノ基を転移し、それによって次の反応、即ちタンパク質への直接または間接結合に備えることができる。活性化反応は中性pHで実施でき、多糖の安定性と完全性を改善する。
様々なシアン化試薬が既知であり、例えばＮ−シアノトリエチルアンモニウムテトラフルオロボラート（CTEA）、１−シアノ−４−（ジメチルアミノ）ピリジニウムテトラフルオロボラート（CDAP）、ｐ−ニトロフェニルシアネート（pNPC）がある。Wakselman他は、CDAPがタンパク質のシステイン基の修飾に用いることができる温和な試薬であると報告している。J.C.S.Chem.Comm.,1976:21(1976)。それらの試薬の中で、CDAPは最も安定でありフードなしで使うことができるので、CDAPが最も好ましいが、CTEAとpNPCも本発明の一部である。様々な対イオンとシアネート基を有するその他の第三アミン錯体も本発明の範囲内に含まれる。特に有用なのはテトラフルオロボラートのような非求核性対イオンである。
Kohen他は、不溶性多糖樹脂であるアガロースの活性化剤としてCDAP、CTEAおよびpNPCを比較している。Kohn他、Anal.Biochem.,115:375（1981）。別の研究者らは、CDAPを使ってセファロースやグリセリル細孔制御ガラスのような別の形態の不溶性粒子を活性化している。A.Carpenter他、Journal of Chromatography,573:132-135（1992）。本明細書に記載される免疫原性構成物の製造とは異なり、それらの文書はアフィニティークロマトグラフィー用ゲルを調製するための活性化不溶性粒子の利用を開示している。
タンパク質との結合前に可溶性多糖を活性化するのにCDAPを使った唯一の報告であるAndersson他、International Journal of Cancer,47:439-444（1991）の中で、Anderssonらはシアネートを使って活性化された低分子量40kDaデキストランに表皮増殖因子（ＥＧＦ）を直接接合している。彼らは、約50：1（wt/wt）の非常に高いデキストラン：ＥＧＦ比を使ってデキストラン−ＥＧＦ接合体を製造し、培養細胞へのこの接合体の結合を研究したが、免疫原としては該接合体を使用しなかった。実際、低分子量デキストランへのタンパク質の接合は不十分であるかまたは非免疫原性である。T.E.Wileman,J.Pharm.Pharmacology,38:264（1985）。
好ましい方法では、シアン化試薬を使った活性化は非求核性緩衝液中でpH6〜8にて実施される。シアン化試薬活性化方法は、当業界で既知である様々な適当な緩衝液中で6〜8のpH域で実施することができる。適当な非求核性緩衝液の例としては塩類溶液、HEPES、リン酸塩、水および幾つかの有機溶媒が挙げられるが、それらに限定されない。
本発明の好ましい実施態様では、CDAPは原液中では乾燥アセトニトリル中100mg／mlの濃度で溶解される。本発明の方法での使用に適当であるのは0.1〜10mg／mlのCDAP濃度である。使用する炭水化物含有成分の性質および所望する活性化の度合に依存して、異なる濃度が最適となり得るだろう。
好ましい態様では、炭水化物含有成分の濃度は最適には１〜15mg／mlである。活性化反応は約100mg／mlまでの炭水化物含有成分の濃度で好結果に実施することができる。
好ましい態様では、タンパク質の直接結合の場合のCDAP：炭水化物含有成分の比は、炭水化物含有成分100kDaあたり1:100〜1:500である。別の好ましい態様では、スペーサーを使ったタンパク質の間接結合の場合のCDAP：炭水化物含有成分の比は、炭水化物含有成分100kDaあたり1:10〜1:500である。該成分の性質と使用条件によって、異なる成分比が最適となり得る。
１つの好ましい態様では、シアン化試薬を使って活性化されている炭水化物含有成分を第二成分に直接結合して免疫原性構成物を製造する。本発明の別の好ましい態様では、シアン化試薬を使って活性化されている炭水化物含有成分を、適当な二価性試薬に共有結合的に結合せしめる。適当な二価性試薬の例としては、エチレンジアミン、１，６−ヘキサンジアミン、アジピン酸ジヒドラジド、シスタミン、リジン、グルタミン酸、チオールヒドラジド、チオールアミン、チオールヒドラジドが挙げられるが、それらに限定されない。Wong他、“Chemistry of Protein Conjugate and Crosslinking,”CRC Press (1991)を参照のこと。次いで、他方の末端が既に炭水化物含有成分に共有結合により結合されている二価性試薬に第二成分を共有結合により結合させる。
好ましい態様では、中間のVon Braun錯体の形成によりシアン化反応を促進するためにトリエチルアミン（ＴＥＡ）が使われる。ＴＥＡは、Von Braun錯体を形成することができる別の第三アミンにより置換することができる。J.Von Braun,Chem.Ber.,33:1438(1990)。
ある直接結合反応には、グリシンアミノエタノールまたは別のアミノ含有試薬を使って反応を静めることができる。
別の態様では、本発明は、医薬上許容される担体と一緒になって免疫原性構成物を構成するワクチンに関する。そのようなワクチンは、有効治療量の免疫原性構成物と共に、患者への適切な投与形態を提供するように適当量の担体を含有するだろう。それらのワクチンはミョウバンまたは他のアジュバントを含んでもよい。
医薬上許容される担体は、無菌の液体、例えば水および油であることができ、それらの油としては、石油、動物、植物または合成源のもの、例えば落花生油、大豆油、鉱油、ゴマ油等が挙げられる。医薬素生物を静脈内に投与する時には水が好ましい担体である。塩類溶液、水性ブドウ糖およびグリセロール溶液も、特に注射液用の液体担体として使用することができる。適当な医薬担体はE.W.Martin,Remington's Pharmaceutical Sciences （これは参考として本明細書中に組み込まれる）中に記載されている。
本発明の免疫原性構成物から調製することができるワクチンとして、チャート１に与えられるワクチンが挙げられるが、それらに限定されない。
チャート１
ジフテリアワクチン
百日咳（サブユニット）ワクチン
破傷風ワクチン
インフルエンザ菌、ｂ型（ポリリボースリン酸）
肺炎連鎖球菌、全血清型
大腸菌、内毒素またはＪ５抗原（ＬＰＳ，リピドＡおよびゲンタビオース）
大腸菌、Ｏ多糖（血清型特異的）
クレブシエラ菌、多糖（血清型特異的）
黄色ブドウ球菌、５型と８型（血清型特異的抗原および共通保護抗原）
表皮ブドウ球菌、多糖Ｉ，IIおよびIII血清型（および共通保護抗原）
髄膜炎菌、血清型特異的抗原またはタンパク質抗原
ポリオワクチン
おたふくかぜ、麻疹、風疹ワクチン
ＲＳウイルス（Respiratory Syncytial Virus）
狂犬病
Ａ型，Ｂ型，Ｃ型および他の肝炎
ヒト免疫不全ウイルスＩおよびII（GP120，GP41，GP160，p24他）
単純ヘルペス１および２型
ＣＭＶ
ＥＭＶ
水痘／帯状疱疹
マラリア
結核
カンジダ菌、他のカンジダ属
ニューモシスチス・カリニ（Pneumocystis carinii）
マイコプラズマ
Ａ型およびＢ型インフルエンザウイルス
アデノウイルス
連鎖球菌Ａ群
連鎖球菌Ｂ群、血清型Ｉａ，Ｉｂ，IIおよびIII
緑膿菌（血清型特異的）
リノウイルス
パラインフルエンザ、１，２および３型
コロナウイルス
サルモネラ
シゲラ
ロタウイルス
エンテロウイルス
クラミジア・トラコマチス（Chlamydia  trachomatis）およびニューモニエ（C.pneumoniae）（TWAR）
糖タンパク質
クリプトコックス・ネオフォルマンス（Cryptocuccus  neoformans）
本発明は、免疫促進量のワクチンの投与による患者の処置にも関する。患者とは、処置が有益となるような任意の被検体を指し、例えば哺乳類、特にヒト、ウマ、ウシ、イヌおよびネコ、並びに他の動物、例えばニワトリを包含する。免疫促進量とは、病気の予防、緩和または治療のために患者の免疫応答を促進することができるワクチンの量を言う。本発明のワクチンはいずれの経路によっても投与することができるが、好ましくは静脈内、筋肉内および皮下注射により投与される。
本発明は、上述のワクチンにより患者を免疫処置し、その結果血漿提供者が該ワクチンに対して向けられた抗体を産生することにより、細菌、ウイルス、寄生虫、真菌または化学物質により引き起こされる感染に対する免疫療法剤を調製する方法にも関する。抗体を単離するか、またはＢ細胞を得、次いでそれをミエローマ細胞と融合せしめてモノクローナル抗体を産生することができる。モノクローナル抗体の産生方法は当業界において公知であり〔Kohler他、Nature 256:495（1975）；これは参考として明細書中に組み込まれる〕、本明細書中にこれ以上記載する必要はない。本明細書中で使う時、免疫療法剤とは、患者の受動免疫処置に使われる特定の免疫原に対して向けられる抗体の組成物を言う。血漿提供者は、ワクチン中に含まれる免疫原に対する抗体の産生のためにワクチン注射される任意の被検体である。
実施例１
スペーサーを使ったモデル炭化水素含有成分の誘導体化
Ａ．材料
CDAP、ピリジン、ヘキサンジアミン、ホウ酸ナトリウム、HEPESおよびトリエチルアミンは、Aldrich（Milwaukee,Wisconsin）から購入した。2000kDaの平均分子量を有する炭水化物含有成分T2000デキストランはPharmacia（Piscataway,New Jersey）から入手した。
100mg／mlの濃度の乾燥アセトニトリル中のCDAP原液を−20℃で貯蔵し、使用まで氷上に維持した。T2000デキストランは塩類溶液＋0.02％アジド中10.5mg／mlの濃度に作製した。水性トリエチルアミン原液は0.2Ｍ濃度に作製し、使用中は氷上に維持した。
ヘキサンジアミンは0.1Ｍホウ酸ナトリウム中0.5Ｍに調製した。
アミノ基の定量は、トリニトロベンゼンスルホネート（TNBS）と366nmでの11,000m-1の吸光係数を使って行った。Franci他、J.Imm.Methods,86:155（1986）。炭水化物は、標準物質としてT2000デキストランを使ってM.Monsigny他、Anal.Chem.,175:525(1988)の方法によりアッセイした。
Ｂ．制御反応
次の実験は、本発明の誘導体化反応に使われる全ての成分が重要であり、最終接合体中のアミノ基が炭水化物に共有結合により結合され、それらの存在が最終生成物中への試薬の「持ち越し」または人為結果によるのではないことを証明する。反応は氷上で実施した。実施される試行では、試薬の省略または置換は表２に示される通りであった。
全ての試薬を使った手順（表１の１行目）では、CDAPを300μｌのデキストラン（3.1mg）攪拌溶液に添加し、そして氷バケツに戻した。30秒後、上記攪拌溶液にTEAを加えた。CDAPを加えてから２分後に200μｌのジアミンを加え、溶液をもう１時間氷上に維持した。試料を一晩透析し、Millex GVフィルターを使って濾過し、そして１×15cmのP6DGカラム（BioRad）上で更に脱塩した。
下表２に示すように、デキストラン中へのアミノ基の取込みは、デキストラン、CDAP、TEAおよびヘキサンジアミンの存在を必要とした。表２中のデータは、検出されるアミノ基が最終生成物中への未結合の試薬の持ち越しによるのではないことを更に証明する。TEA（転移試薬）が存在しなければ、最低の誘導体化しか起こらない。
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Ｃ．ヘキサン１，６−ジアミンを使ったT2000デキストランの誘導体化
この実験は、CDAPを使って炭水化物を誘導体化し、高比率と低比率の両方でアミノ基を導入できることを証明する。モデル炭水化物としてデキストランT2000を使った。デキストランはグルコースモノマーから構成されるポリマーである。
多数の接合ワクチンの調製における第一段階はスペーサーの付加である〔Dick & Beurret,Glycoconjugates of Bacterial Carbohydrate Antigens,”Conjugate Vaccines,J.M.Cruse & R.E.Lewis編，第10巻，48-114頁（1989）〕。表３に要約される一連のこの実験は、スペーサーを容易に多糖に付加できることを強調する。
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実験は２通りの温度で行った。１〜７行目と11行目の実験では全ての試薬を氷上に維持し、そして８〜10行目の実験ではそれらは室温であった。手順と試薬は表２について上述した通りに使用し、添加した試薬量は表３に指示されている。11行目の実験では、0.15M HEPES中においてジアミンを添加した。この反応は低pHではわずかに効率が低かった。別の実施態様では、ヘキサンジアミンを0.1Ｍホウ酸塩，pH9中に調製した。
効率は、使用したCDAP１モルあたりの取り込まれたスペーサー基のモル数として定義される。最終項目の「誘導体化の％」は、スペーサーにより修飾されたデキストランのグルコースモノマー単位の百分率である。
それらの結果は図４において更に図解される。図４は、デキストラン単位１モルあたりの添加されたCDAPのモルに対する、取り込まれたアミノ基（例えば添加したスペーサー試薬）の総数を示す。このデータをCDAPのモル／デキストランのモルに対するNH2の取込みに変換すると、１未満のCDAP：グルコース比が高レベルのNH2取込みに十分であることが明らかである。よって、高レベルのNH2基取込みに最少限のデキストラン多糖の修飾が必要である。
更に、スペーサーを添加しなくても未決定量の活性シアン酸エステルが加水分解されるので、CDAP／グルコース比は実際にはポリマーの修飾の程度を過大に評価する。よって、実際の修飾の程度は計算上のCDAP／グルコース比よりも小さい。
最低の試薬量でのスペーサー基の取込みの程度は、複合ワクチンの合成に使用されたものと同等である〔Chu他、Inf.& Imm.,40:245（1983）；Dick & Beurret,“Glycoconjugates of Bacterial Carbohydrate Antigens,”Conjugate Vaccines,J.M.Cruse & R.E.Lewis編，第10巻，48-114頁（1989）〕。
前記表と図面は、スペーサー試薬を付加するためのCDAP反応が高効率であることを証明する。更なる反応条件の最適化は反応効率を増加させることができる。CDAPを使って多糖中への非常に高レベルのスペーサー基の取込みが可能であることも証明される。最高のCDAP添加量では（７行目）、グルコース単位の約1/5がスペーサーにより修飾された（20％）。このスペーサーの取込みの程度は臭化シアンを使って得ることはできない〔Kagedal & Akerstrom,Acta Chemica Scan.,25:1855（1971）〕。
反応中、デキストラン多糖の明らかな沈澱は認められなかった。対照的に、臭化シアン法では多糖の凝集と沈殿が問題となり得る〔Kagedal & Akerstrom,Acta Chemica Scan.,25:1855（1971）〕。
これらの反応は小容量（＜１ml）で実施したので、多くの試行実験を好都合に実施することができた。これは貴重な炭水化物を無駄にせず手順を最適化する時に重要である。対照的に、非常に少量の臭化シアンを使って好都合に実験することは、臭化シアンの水難溶性、不確かな力価および毒性のために難しい。
更に、表３の８〜10行目を１〜７および11行目と比較すると、カップリング反応を０℃または室温で行った時に、デキストラン中へのアミノ基の取込みのレベルがほぼ同じであったことがわかる。
Ｄ．CDAPを使った接合反応の効率の実証と放射能標識タンパク質を使った接合の確認
CDAPを使った接合反応はタンパク質濃度を評価するのに通常使われる波長である280nmでの幾らかの吸光度を引き起こすので、放射能標識タンパク質をデキストランに直接結合させた。これにより、その比活性からの独立したタンパク質濃度の測定が可能になった。タンパク質の収率と回収率を測定した。
1.  本質的にはBrunswick他により記載された通りに、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（3Ｈ−２，３）プロピオネート（Amersham）を使ってＢＳＡを軽く放射能標識した。放射能標識ＢＳＡをＰＢＳ＋0.02％アジド中で徹底的に透析し、S100HRカラム（Pharmacia）上でのゲル濾過クロマトグラフィーにかけて凝集物を除去し、そしてYM30フィルター（Amicon）を使った限外濾過により濃縮した。ＢＳＡ濃度は、280nmでの吸光係数（44,000Ｍ-1）から求めると21mg／mlであった。液体シンチレーションカウンティングにより測定すると、原液の比活性は5.48×1012cpm／モルであった。
2.  その他の試薬は次の通りであった。T2000デキストラン（約2000kDa）（Pharmacia）を10.5mg／mlになるように水に溶かした。CDAPは乾燥アセトニトリル中100mg／mlに調製し、トリエタノールアミン（TEA）は0.2Ｍ水溶液に調製した。グリシン（pH5.0）は１Ｍ水溶液に調製した。
3.  プロトコール：全ての試薬を氷上に維持し、全ての反応を氷上で行った。各々の添加の間は反応混合物を渦動攪拌した。25μｌのCDAPを0.5mlのデキストラン（5.25mg）に添加し、30秒後に25μｌのTEAを加えた。合計2.5分後に、5.25mgの放射性ＢＳＡを添加した。30分後、100μｌのグリシン溶液の添加により反応を停止させ、４℃で一晩置いておいた。次いでSpin-X膜（COSTAR）を使って0.6mlのアリコートを濾過した。濾過の前後の放射能アリコートの比較は、本質的に100％の放射能が濾液中に回収されることを証明した。
500μｌの前記濾液を、塩類溶液＋0.02％アジドにより平衡化されている１×57cmのS400SFゲル濾過カラム（Pharmacia）に適用し、0.2ml／分で溶出させた。0.89mlの画分を集め、分析した。デキストラン濃度は、480nmでの吸光度を使ってMonsignyらの方法により測定した。各試験管からとった50μｌアリコートの放射能を液体シンチレーションカウンティングにより測定し、その比活性を使って（3Ｈ）ＢＳＡ濃度を計算した。カラム溶出液の中の未接合ＢＳＡの位置については、独立したカラム溶出により決定した。
4.  図５に示されるように、cpmで表すとＢＳＡの大部分が、OD480によればデキストランと同じ位置において溶出する高分子量形態である。未接合タンパク質を表す少量の残余ＢＳＡピークが存在する。表４はこの精製データを含む。
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このゲル濾過カラムにより、デキストラン−ＢＳＡ接合体と未接合タンパク質ははっきりとは分離されなかった。ゲル濾過カラムにおいて高分子量ポリマーはしばしばテーリングを生じるので、これはよくあることである。更に、T2000デキストランは未分画であったので、それはある範囲のサイズを含んでいた。遊離形ＢＳＡと接合形ＢＳＡが重複している領域中の接合形ＢＳＡの量を見積もるために、我々は接合形ＢＳＡ：デキストランの比を一定と仮定した。ＢＳＡ：デキストランの比にデキストランの総モル量を掛けることにより計算した接合形ＢＳＡの総量は、2.55mgであると決定された。これは、タンパク質の87％が接合形に変換されたことを示す。
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このＢＳＡ−デキストラン実験の結果は、異なる量のCDAPとTEAを使った３通りの別の実験（２〜４行目）と共に、表５（１行目）に要約される。直接結合によって高いタンパク質：多糖の比を得るためには、TEAの量とCDAPの量の両方が重要である。この方法は少量での便利な実験が可能であるので、最適な試薬量を容易に決定することができる。
この直接結合反応は、カルボジイミドまたはヘテロ連結カップリング法とは異なり、未接合タンパク質を変更しないし、過酷な条件も使用しないことを強調しておかなければならない。よって、次の使用のために未接合タンパク質を回収することができる。多くのタンパク質抗原は貴重であるので、これは直接結合法の主な利点である。
実施例２
PT-Pn14接合の調製
この実験の目的は、(1)低分子量形から高分子量形への転換が炭水化物へのタンパク質の結合の結果であることを証明することと、(2)ある特定の条件設定下で、タンパク質を結合させるのに必要なシアン化試薬の最少量を決定することであった。
百日咳トキソイド（PT）（Mass.Public Health Biol.Labs,Boston,MAから）を0.5M NaCl,0.02Mリン酸Na,pH8.8中に0.289mg／mlの濃度になるように溶解した。PT１mlあたりの0.1mlの0.1Mホウ酸ナトリウム，pH9.1または0.75M HEPES，pH7.5を添加した。肺炎球菌14型（Pn-14）（ATTCロット83909）を0.15M塩類溶液＋0.02％アジド中に５ml／mgの濃度で溶解した。トリエチルアミン（TEA）は0.2Ｍの濃度で水に溶かした。CDAPはアセトニトリル中100mg／mlまたは10mg／mlの濃度になるように溶かした（−20℃で調製し、保存した）。グリシンは1.0Ｍ溶液，pH5.0として調製した。グリシン／HClの代わりにアミノエタノールまたは他のアミノ試薬を代用することができる。
実験１−Pn14への百日咳トキソイドの結合
各試験管は氷上で250μｇのPn14（50μｌ）を含んだ。０時に、下表中に指摘されるような様々な量のCDAPを添加し、そして30秒後に25μｌのTEAを添加した。２分後に１mlのPTを加えた。約１時間後、100μｌのグリシン溶液を添加した。
試料を４℃で一晩維持した。翌日、Costar 0.45μｍスピンフィルターを使ってそれらを濾過し、0.2M KClを使ってHPLC TSKゲル濾過カラムに流した。％HMWは、未接合形成分を示すOD280ピークに対する高分子量OD280接合体ピークの面積である。それは〔空隙容量ピーク面積％／（空隙容量ピーク面積％＋未接合形成分ピーク面積％）〕により定義される。HPLC分析から得られたこの面積率（％）は次の通りであった。
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PT対照は22％の％ HMWを有するので、この反応条件によりPTの凝集が少量引き起こされ得る。この一連のデータは、CDAP：タンパク質比を変えることにより、最終接合体におけるタンパク質：炭水化物の比を調節することが可能であることも指摘している。
実験２−PTへの単糖の結合
この実験シリーズでは、Pn14多糖の代わりに、単量体である10mg／mlグルコースの溶液150μｌを使った。ほう酸塩緩衝液の代わりにHEPES（pH7.5，0.075M）緩衝液中にPTを調製したこと以外、実験１と同じ条件を使った。また、25μｌの代わりに20μｌのTEAを使った。それらの条件は次の結果を与えた。
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No.２と３はCDAPが百日咳トキソイド自体を重合させないことを示し、従って高分子量形へのPTの変換は高分子量多糖へのPTの結合のためであってタンパク質の重合のためではないことを示す。HPLC分析からPTの分子量にわずかな増加が見られたので、PTにグルコースが結合されたことは明らかであった。
実験３−スペーサーＡを使った有用なワクチン構成物：百日咳トキソイド−Pn14の合成
次のようにしてヘキサンジアミンで誘導体化されたPn14を調製した。10μｌのCDAP（アセトニトリル中100mg／ml）を添加した（多糖100kDaあたり193モルのCDAP）。30秒後、20μｌのTEA（0.2M）を加えた。計2.5分がたったら、0.1Mほう酸ナトリウム（pH9.1）中の0.5Mヘキサンジアミン溶液300μｌを加えた。１時間後、この溶液を水に対して透析し、濾過し、そしてP6DG（BioRad）カラム上で塩類溶液中に脱塩した。空隙容量をプールし、Centricon 30装置（Amicon）を使って濃縮した。Pn14多糖100kDaあたり33個のアミノ基を有することが決定された。
ヘテロ連結化学（Brunswick他）を使って、アミノ−Pn14に百日咳トキソイドを結合させた。0.44mlのアミノ−Pn14に50μｌの0.75M HEPES緩衝液(pH7.5)を加えた。10μｌの0.1Mヨードアセチルプロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（SIAP）を使ってそれをヨードアセチル化した。20倍モル過剰のSATA（Calbiochem,La Jolla,CA）を使って百日咳トキソイドをチオール化した。各々を塩類溶液中で脱塩し、混合し、そして0.75M HEPES,10mM EDTAおよび0.5Mヒドロキシルアミンを含有する1/9容の緩衝液を加えた。最終容量は1.1mlであった。一晩インキュベーション後、該溶液を１時間メルカプトエタノール中で0.2mMにし、次いで10分間ヨードアセトアミド中で10mMにし、その後、S400SFゲル濾過カラム（Pharmacia）上でそれを分画した（図６参照）。空隙容量ピークをプールし、PM10膜（Amicon）上での加圧濾過により濃縮した。百日咳トキソイドの約50％が接合形態で回収された。最終接合体はPn14多糖100kDaあたり0.7モルのPTを含んだ。標準物質としてPTを使ってBradfordアッセイ（BioRad）により最終結合体中のタンパク質濃度を決定した。多糖濃度は標準物質としてPn14を使ってMonsignyらの方法により決定した。
Kohn他、Anal.Biochem.,115:375（1981）に記載される通り、CTEAはCDAPよりも少ない副反応を有するという利点を与え、より純粋な生成物をもたらす。CTEAの欠点は、それが感温性であり、密閉容器中で秤量しなければならず、原液として容易に調製できないことである。
CTEAを使ったPn14へのタンパク質の直接結合
１mlの肺炎球菌14型多糖（Pn14）（塩類溶液中５mg／ml）を０℃で維持する。CTEA（Aldrich Chemical,Milwaukee,WIから入手可能）は乾燥窒素下で保存する。密閉した秤量容器中で２mgのCTEAを秤量し、激しく攪拌した冷却Pn14溶液に加えた。混合しながら即座に20μｌのTEA（水中0.2Ｍ）を添加した。60秒後、上記攪拌溶液に５mgの百日咳トキソイド（1.5mg／ml）を加えた。1.5時間後、200μｌの１Ｍグリシン（pH5.0）の添加により反応を停止した。更に１時間後、溶液を濾過し、塩類溶液で平衡化されたS400SFゲル濾過カラムで通過させた。空隙容量ピークを集め、滅菌濾過した。１：１接合体が製造される。
CTEAを使った肺炎球菌14型多糖へのスペーサー試薬の付加
１mlのPn14（塩類溶液中５mg／ml）を０℃で維持する。CTEA（Aldrich Chemical,Milwaukee,WIから入手可能）は乾燥窒素下で保存する。密閉した秤量容器中で１mgのCTEAを秤量し、激しく攪拌した冷却Pn14溶液に加えた。混合しながら20μｌのTEA（水中0.2Ｍ）を即座に添加した。60秒後、攪拌しながら、0.1Ｍほう酸塩（pH９）中の0.5Ｍヘキサンジアミン300μｌを添加した。１時間後、該溶液を塩類溶液中に徹底的に透析し、滅菌濾過した。Pn14 100kDaあたり187モルのCTEAの比を使ったので、Pn14 100kDaあたり約18のアミンを有する接合体が製造される。
実施例３
インフルエンザ菌多糖（PRP）への百日咳トキソイドの直接結合
平均分子量350kDaのPRPをMassachusetts Public Health Biologiclal Laboratoryから入手した。百日咳トキソイドも同じ源からであった。15μｌのCDAP（100mg／ml）を氷上の100μｌ（２mg）のPRPに添加した。30秒後、30μｌのTEAを添加した。これはPRP 100kDaあたり319モルのCDAPを意味した。更に２分後、0.75mlの百日咳トキソイド（1.1mg）を加えた。40分後、200μｌの１Ｍグリシン（pH5.0）を加えて反応を停止させた。更に１時間後、塩類溶液で平衡化されたS400SFゲル濾過カラムに上記溶液を通した（図７参照）。空隙容量をプールし、滅菌濾過した。生成物は、68％の全収率でPRP 100kDaあたり1.1個のPTを有すると決定された。
Chu他、Inf.& Imm., 40:245（1983）により製造されたワクチンは、PRP 100kDaあたり377モルの臭化シアンを使用し、そして50％未満の収率でPRP 100kDaあたり1.4〜2.1のPTの比を有した。よって、本発明の直接結合法は、少ない作業で、より高い収率で、且つ毒性試薬を使わずに、同様な接合体を与えた。
発表された多くのPRP接合体の調製方法はスペーサーにより誘導体化されたPRPから出発しているので〔Chu他；Schneerson他、J.Exp.Med.,152:361（1980）；Dick & Beurret,“Glycoconjugates of Bacterial Carbohydrate Antigens,”Conjugate Vaccines,J.M.Cruse & R.E.Lewis編，第10巻，48-114頁（1989）〕、PRPにスペーサーを付加するためにもCDAPを使用した。
使用した条件は上記と同様であったが、ただし百日咳トキソイドの代わりに0.1Ｍほう酸塩中の0.1Ｍヘキサンジアミン100μｌを添加した。生成物を塩類溶液中に透析した。それはPRP 100kDaあたり102個のアミノ基を有すると決定された。これは発表された方法で使われているよりも高い比率であるので、もっと少量のCDAPを使うこともできただろう。
実施例４
CDAP化学を使って調製した
ワクチンとして有用な免疫原性構成物
Ａ．CDAPと二価性試薬を使った結合
簡単に言えば、配偶子特異的タンパク質pfs25からのマラリア由来ペプチドP28：CNIGKPNVQDDQNKを破傷風トキソイド（TT）に結合させた。P28はマラリア伝染阻止抗体を誘導することがわかっている。次いでCDAPを使ってp28−TTを肺炎球菌14型（Pn14）多糖に結合させた。
ＦＤＡで認可された破傷風トキソイドをHEPES緩衝液に対して一晩透析し、そして30倍モル過剰のヨードアセチル化試薬（SIAP）と反応させた。３時間後、Macrosep 30（Filtron Technology）を使った限外濾過により試薬を除去し、新鮮な0.15M HEPES，pH7.5緩衝液中に洗浄した。穏やかに攪拌しながら、誘導体化されたTTにトリチウム標識P28を固体として添加した。４℃で一晩反応させた後、混合物を0.2mMメルカプトエタノールで処理して残りの活性基を保護し、次いでHEPES緩衝液で平衡化されているP6DGカラム上で脱塩した。該ペプチドの比活性から、生成物がTT１モルあたり20モルのP28ペプチドを含むことがわかった。この接合体を塩類溶液に対して透析し、そして滅菌濾過した。
Ｂ．CDAPを使った直接結合
Pn14（American Tissue Type Collectionから入手）は高分子量（約106ダルトン）を有する。次のようにしてP28−TTをPn14に直接結合し。CDAP（アセトニトリル中の100mg／ml原液から10μｌ）をPn14（150μｌの塩類溶液中1.1mg）に添加した。30秒後、20μｌのトリエチルアミン（0.2M）を添加した。２分後、0.55mg（0.8mlの塩類溶液中）のP28−TTを加え、そして１時間後、200μｌの1.0Ｍグリシン（pH５）を使って１時間反応を停止させた。次いで該接合体を塩類溶液で平衡化されたS400SFゲル濾過カラムに通し、該接合体を含有する空隙容量をプールした。
図９は、P28−TTの事実上全てが空隙容量中に接合形態で見つかることを示す。
Ｃ．免疫原性構成物の免疫反応性
塩類溶液中の10μｇのP28−TTまたは（P28−TT）−Pn14接合体により、５匹のDBA/2マウスのグループをi.v.で免疫処理し、３週間後に採血し、組換えpfs25タンパク質に対する反応性について血清をELISAによりアッセイした。ペプチドP28はpfs25に由来する。別のマウスの組は、アジュバントとしてのミョウバン（Imject,Pierce Chemical Co.,Rockford,IL）と共に沈澱させた同抗原により免疫処置した。
関連出願と一致して、表７は高分子量接合体のみが良好な抗タンパク質力価を惹起したことを示す。
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これは、CDAP法が有用なワクチン構成物の調製に利用できることを証明する。有用な接合体を調製できる容易さも証明する。
実施例５
CDAPを使って調製された
生物学的に活性な多価タンパク質構成物
タンパク質を多糖に直接結合させるのにCDAPを使って調製された接合体が多価生成物（関連出願に示されるように増強された免疫原性を有する）を与えることができること、そしてこの方法が生物学的活性を保存するのに十分な程穏やかであることを証明するために、モノクローナル抗体とデキストランの様々な接合体を調製した。これらの実験は、Ｂリンパ球上の膜IgＤを架橋結合しそして増殖を誘導する抗IgＤ抗体とモノクローナル抗体Ｈδa/1を使用した〔Brunswick他、Journal of Immunol.,140:3364（1988）〕。Brunswickらにより記載されたように、2000kDaデキストランのような高分子量ポリマーへの多重コピーのＨδa/1の結合（Ｈδa/1−AECMデキストラン）は、未結合Ｈδa/1の1/1000の濃度でＢ細胞の増殖を誘導し且つより高レベルの増殖を誘導する。Brunswickらの方法では、接合体を調製するのに単純でわかりやすいが多段階で多日数の操作を必要とした。Brunswickらにより記載されたのと同様に最初にアミノエチルカルボキシメチルデキストラン（AECMデキストラン）を調製し、次いでヘテロ連結化学を使ってＨδa/1を炭水化物に結合させた。
Ｈδa/1−デキストランは、次の通り、CDAPを使った直接結合とスペーサーとCDAPを使った間接結合の両方により調製した。
直接結合：0.3mlの塩類溶液中3.2mgのT2000デキストラン（Pharmacia）の渦動攪拌溶液に、15μｌのCDAP（アセトニトリル中100mg／mlの原液から）を加えた。30秒後、穏やかに渦動攪拌しながら15μｌの0.2Ｍトリエチルアミンを添加した。更に２分後、穏やかに渦動攪拌しながら６mgのＨδa/1（0.05Mほう酸ナトリウム＋0.075M NaCl中362μｌ）を添加した。15分後、100μｌの1.0Ｍグリシン（pH5.0）の添加により反応混合物を失活させ、次いで塩類溶液で平衡化されたS400SFゲル濾過カラム（１×59cm）に通した。カラム溶出を図９に示す。空隙容量をプールし、そしてMillex GVフィルターを使って滅菌濾過した。生成物をＨδa/1−（CDAP）−デキストランと命名する。この操作手順は約３時間かかった。
スペーサー：上記と同様にCDAPを使ってデキストランを活性化した（３mlの塩類溶液中31.5mgのT2000デキストランと25μｌのCDAP、次いで25μｌのTEA、１モルのCDAP／0.06モルのグルコース単量体）。0.1Ｍほう酸ナトリウム中の0.5Ｍ１，６−ジアミノヘキサン３mlを加えた。この溶液を水中で徹底的に透析し、次いでS400HRゲル濾過カラム上で分画した。空隙容量をプールし、濃縮した。このアミノ−デキストランは、デキストラン2000kDaあたり147個のアミノ基を有すると決定された。この生成物をNH2−（CDAP）−デキストランと命名する。透析を含めて２日間の作業であった。対比して、AECM−デキストランは、Brunswickらの方法を使って調製するのに通常約一週間を要する。
Brunswickらにより記載されたヘテロ連結法を使ってＨδa/1をAECM−デキストランとNH2−（CDAP）−デキストランに接合させた。接合体をそれぞれＨδa/1−AECM−デキストランとＨδa/1−NH2−（CDAP）−デキストランと命名する。AECM−デキストランを使った接合は２日間の作業であった。
Brunswickらにより記載された通り、10,000細胞／ウエルを使ったＢ細胞増殖アッセイを実施した。表８はこれらのアッセイの結果を提供し、詳しくはcpm／ウエルとしてのＢ細胞中への三重水素化チミジンの取込みを示す。
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示さなかった結果：Brunswickらにより報告されたように、Ｈδa/1だけではそれらの濃度で全く取込みを引き起こさない。10〜100μg/mlのＨδa/l濃度では、最大の取り込みは約3000cpmである。
これらのデータは、スペーサーを伴っておよび伴わずにCDAPを使って調製した接合体が、増殖を誘導するそれらの能力の点でＨδa/1−AECM−デキストランと本質的に同等であることを示す。多価抗体だけが低用量で高レベルの増殖を誘導するので、接合体は全て多価でなければならない。CDAPを使った直接結合は抗体の生物学的活性に影響を与えなかった。直接結合法は、スペーサーを使って調製した接合体よりも著しく調製が迅速であった。更に、スペーサーを付加しCDAPを使った結合は、AECM−デキストランを調製するよりもずっと速かった。
よって、この実験は、(1)CDAPを使った多価構成物の高収率と、(2)接合体、特に直接接合体の調製の容易さと速さを証明する。CDAPと二価性試薬を使った接合は48時間以下を要し、直接接合は３時間未満を要した。
本発明の範囲または精神から逸脱することなく、免疫原性構成物の作製のための本発明の方法に様々な変更と改良を行い得ることは当業者にとって明白であろう。
本発明の他の実施態様は、本明細書の考察と本明細書中に開示される本発明の実施から当業者に明らかであろう。本明細書と実施例は単に例示としてのみ見なされ、本発明の真の範囲および精神は次の請求の範囲により指摘される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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