(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
水又は水性緩衝溶液に溶解したヒアルロン酸又はその無機塩及びタンパク質薬物、ペプチド薬物及び抗原からなる群から選ばれる活性成分と、親油性物質を含み、前記ヒアルロン酸又はその無機塩、前記活性成分及び前記親油性物質を含む溶液を噴霧−乾燥して製造された、0.1〜200μｍの平均粒径を有する固体状親油性微細粒子。
【請求項２】
前記平均粒径が１〜５０μｍ範囲である請求項１記載の固体状親油性微細粒子。
【請求項３】
前記薬物が、ヒト成長ホルモン、ウシ成長ホルモン、ブタ成長ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン、成長ホルモン放出ペプチド、顆粒球−コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージ−コロニー刺激因子、マクロファージコロニー刺激因子、エリスロポエチン、骨格形態発生タンパク質、インターフェロン、インスリン、アトリオペプチン−III、モノクロナール抗体、腫瘍壊死因子、マクロファージ活性因子、インターロイキン、腫瘍変性因子、インスリン−類似成長因子、表面成長因子、組織プラスミノゲン活性剤およびウロキナーゼからなる群から選ばれることを特徴とする請求項１記載の固体状親油性微細粒子。
【請求項４】
前記抗原が、アデノウイルスタイプ４＆７、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、インフルエンザＡ＆Ｂウイルス、日本Ｂ脳炎ウイルス、麻疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、風疹ウイルス、小児麻痺ウイルス、狂犬病ウイルス、水痘ウイルス、黄熱ウイルスおよびヒト免疫欠乏ウイルスからなる群から選ばれる一つ以上の病原体；百日咳菌（Bordetella pertussis）、ボレリア・バルグドルフェリ（Borrelia burgdorferi）、腸管毒素原性大腸菌（enterotoxigenic E.coli）、ヘモフィルス・インフルエンザタイプｂ（Haemophilus influenzae type b）、癩菌（Mycobacterium lepre）、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）、髄膜炎菌Ａ＆Ｃ（Neisseria meningitides A&C）、髄膜炎菌Ｂ（Neisseria meningitides B）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、シュードモナス・セパシア（Pseudomonas cepacia）、サルモネラ・チフス菌（Salmonella typhi）、シゲラ腫（Shigella spp.）、肺炎球菌（Streptococcus pneumoniae）およびコレラ菌（Vibrio cholerae）からなる群から選ばれる一つ以上の病原体；コクシジオイデス・イミチス（Coccidiodes immitis）、リーシュマニア腫（Leishmania sp.）およびプラスモジウム腫（Plasmodium sp.）からなる群から選ばれる一つ以上の病原体；またはウシ気腫疽、ウシ流行熱、ウシ炭疽病、ウシアカバネ病、ウシ口蹄疫、ウシ乳房炎、ウシ伝染性鼻気管炎、ウシウイルス性下痢症、ウシ伝染性胃腸炎、ブタコレラ、ブタ流行性下痢症、ブタ萎縮性鼻炎、ブタパボウイルス性病、ブタロタウイルス性腸炎、ニワトリニューカッスル病、ニワトリマレクス病、ニワトリ脳脊椎炎、狂犬病、イヌジステンパー、イヌパボウイルス性腸炎およびイヌ伝染性肝炎からなる群から選ばれる疾病に対する病原体一つ以上から得られ、前記抗原が、弱毒化された抗原、死んだ抗原または組換え抗原；またはこの病原体から抽出されたＤＮＡ、ＲＮＡ、プラスミド、ＣｐＧ  ＤＮＡまたはオリゴヌクレオチドである請求項１記載の固体状親油性微細粒子。
【請求項５】
前記親油性物質が、脂質、脂質誘導体、脂肪酸、脂肪酸誘導体、ろうおよびこれらの混合物からなる群から選ばれる請求項１記載の固体状親油性微細粒子。
【請求項６】
前記脂質が、レシチン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミンまたはホスファチジルセリンであり、脂質誘導体は、アラキドイルホスファチジルコリンまたはステアロイルホスファチジルコリンである請求項５記載の固体状親油性微細粒子。
【請求項７】
前記脂肪酸が、ミリスチン酸、パルミチン酸またはステアリン酸であり、脂肪酸誘導体は、ステアリン酸グリセリル、パルミチン酸ソルビタン、ステアリン酸ソルビタン、モノオレイン酸ソルビタンまたはポリソルベートである請求項５記載の固体状親油性微細粒子。
【請求項８】
前記ヒアルロン酸およびその無機塩が、ヒアルロン酸ナトリウム、ヒアルロン酸カリウム、ヒアルロン酸アンモニウム、ヒアルロン酸カルシウム、ヒアルロン酸マグネシウム、ヒアルロン酸亜鉛またはヒアルロン酸コバルトである請求項１記載の固体状親油性微細粒子。
【請求項９】
水溶性賦形剤をさらに含む請求項１記載の固体状親油性微細粒子。
【請求項１０】
前記水溶性賦形剤が、糖類、タンパク質、アミノ酸、脂肪酸、無機塩、界面活性剤、ポリエチレングリコール；およびこれらの混合物からなる群から選ばれる請求項９記載の固体状親油性微細粒子。
【請求項１１】
請求項１記載の固体状親油性微細粒子を親油性媒質に分散して製造した分散液剤形。
【請求項１２】
前記親油性媒質が、食用油、鉱油、スクアレン、スクアラン、たち肝油、モノ−、ジ−またはトリ−グリセリドまたはこれらの混合物である請求項１１記載の分散液剤形。
【請求項１３】
前記食用油が、トウモロコシ油、オリーブ油、大豆油、紅花油、綿実油、落花生油、胡麻油、ヒマワリ油またはこれらの混合物である請求項１２記載の分散液剤形。
【請求項１４】
前記親油性媒質が、分散剤または防腐剤をさらに含む請求項１１記載の分散液剤形。
【請求項１５】
注射用または経口投与用として用いられる請求項１１または１４記載の分散剤剤形。
【請求項１６】
水性注射媒質および請求項１１記載の分散液剤形を含む水中油滴型エマルジョン剤形。
【請求項１７】
前記水性注射媒質が、蒸留水または緩衝溶液である請求項１６記載の水中油滴型エマルジョン剤形。
【請求項１８】
前記活性成分が抗原であり、前記水性注射媒質が第２の抗原をさらに含む請求項１６記載の水中油滴型エマルジョン剤形。
【請求項１９】
請求項１記載の固体状親油性微細粒子を含むエアロゾル剤形。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の分野】
本発明は、タンパク質薬物または抗原を含む親油性物質でコーティングされた微細粒子および前記薬物または抗原を生体内に効果的に伝達するための徐放性剤形に関する。
【０００２】
【発明の背景】
タンパク質薬物または抗原は、熱、有機溶媒および／または不適当なpHの下で変性するという問題があることはよく知られている（Weiqi Lu et al., PDA J. Pharm. Sci. Tech., 49, 13-19(1995)。これらは通常注射によって投与されるが、一回の注射投与による薬物の体内における活性維持期間が短いため、長期間の治療が必要な場合にはこれら薬物を繰返して継続的に注射投与しなければならない。たとえば、脳下垂体欠乏性矮小症の小児を治療するためには、ヒト成長ホルモン(ｈＧＨ)を６ヶ月以上毎日または隔日注射しなければならない。したがって、タンパク質薬物または抗原の効果的な徐放性剤形を開発するために多くの研究が行われている。
【０００３】
たとえば、タンパク質薬物または抗原を、ポリラクチド、ポリグリコリド、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）、ポリ−オルト−エステルおよびポリアンヒドリドなどの合成生分解性高分子でコーティングして製造され、前記高分子が体内で分解するにつれて薬物または抗原を持続的に放出する徐放性微細粒子剤形を開発するための多くの研究が行われている（M. Chasin and R. Langer, ed., Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems, Marcel Dekker(1990); and Heller, J., Adv. Drug Del. Rev., 10, 163(1993)）。このような形態の剤形は色々な長所を有するが、その製造過程中有機溶媒との接触によって薬物または抗原が変性するという深刻な問題がある（Park, T. G. et al., J. Control. Rel., 33, 211-223(1995)）。生分解性高分子は塩化メチレン、酢酸エチル、アセトニトリル、クロロホルムまたはアセトンのような有機溶媒中でのみ溶解するため有機溶媒の使用は避けられない。
【０００４】
薬物または抗原の有機溶媒との好ましくない接触を避けるためにリーらは抗原を水溶性高分子でコーティングして一次粒子を得、生分解性高分子を含む有機溶媒中に一次粒子を分散した後、この分散液を乾燥して最終粒子を得ることによって微細粒子を製造した（Lee, H. K. et al., J. Control. Rel., 44, 283-294(1997);および米国特許第5,753,234号）。しかし、このような微細粒子の製造過程は複雑で経済的でない。
【０００５】
また、ゼラチン、コラーゲン、キトサン、カルボキシメチルセルロース、アルギネートおよびヒアルロン酸のような天然高分子を含む持続性剤形を開発するための研究も進まれている。一般に、これらの天然高分子は、水を容易に吸収し、薬物と抗原を徐放出する高粘度のゲルを形成する。たとえば、米国特許出願第５，４１６，０１７号は、０．０１〜３％のヒアルロン酸を含むゲルを用いたエリスロポエチン（erythropoietin）の徐放性注射剤を開示しており、日本特開平１−２８７０４１号は、１％のヒアルロン酸で製造されたゲルを用いたインスリンの徐放性注射剤を開示しており、また日本特開平２−００２１３号は、５％のヒアルロン酸を含むゲルを用いたカルシトニンまたはヒト成長ホルモンの徐放性剤形を開示しており、メイヤーらは０．５〜４％のヒアルロン酸を含むゲルを用いた顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）の徐放性剤形を報告した（Meyer, J. et al.  J. Controlled Rel., 35, 67(1995)）。
【０００６】
このようなヒアルロン酸ゲル剤形は、タンパク質薬物が高粘土のゲルマトリックスを徐々に通過するため徐放出効果を有する。しかし、数％濃度のヒアルロン酸を含むゲルは、１０5〜１０7センチポイズ程の高い粘度を有するため、注射することが難しい。さらに、薬物とヒアルロン酸はいずれも水に溶解するため、ヒアルロン酸剤形は注射後体液によって容易に希釈され、結果的には通常薬物の放出が１日以上持続しない。たとえば、日本特開平１−２８７０４１号は、インスリンを含むヒアルロン酸ゲル剤形をウサギに注射した場合、血中グルコース濃度を低下させる治療効果が２４時間以上持続しないことを開示しており、また、メイヤーら（前記）と米国特許第５，４１６，０１７号は、顆粒球コロニー刺激因子を含有する２％のヒアルロン酸ゲル剤形とインターフェロン−αおよび血漿タンパク質を含有する１．５％のヒアルロン酸剤形を実験動物に投与した場合、これらのタンパク質薬物の血中濃度が２４時間以内に初期濃度の１／１０以下に急激に落ちることを開示している。
【０００７】
天然ヒアルロン酸をベンジルアルコールでエステル化して得られた合成エステルであるヒアルロン酸ベンジル（HYAFFTM、Fidia S. P. A.）は水に溶けないが、ジメチルスルホキシド（DMSO）のような有機溶媒に溶ける。タンパク質薬物を含む固形のヒアルロン酸ベンジル微細粒子を封入した薬物組成物はエマルジョン−溶媒抽出法（Nightlinger，N．S. et al．， Proceed． Intern． Symp．Control Rel．Bioact．Mater．， 22nd, Paper No., 3205(1995); and Ilum, L. et al., J. Controlled Rel., 29, 133(1994)）に従って、ヒアルロン酸ベンジルをＤＭＳＯに溶解し、この溶液にタンパク質薬物を分散させた後、この分散液を鉱油に加え、エマルジョンを形成させ、このエマルジョンに酢酸エチルのようにDMSOと混合可能な有機溶媒を加え、ＤＭＳＯを抽出してタンパク質薬物およびヒアルロン酸ベンジルを含む固形微細粒子を製造した。
【０００８】
しかし、ヒアルロン酸ベンジル剤形は、タンパク質薬物が製造段階に用いられる有機溶媒と疎水性ヒアルロン酸ベンジル自体によって変性しやすいという短所を有する。顆粒球マクロファージ−コロニー刺激因子（GM-CSF）を含むヒアルロン酸ベンジル微細粒子のインビトロ放出試験結果、初期２日間顆粒球マクロファージ−コロニー刺激因子の２５％のみが放出され、その後それ以上放出されなかったが（Nightlinger, N. S. et al., 前記）、これはタンパク質薬物が大部分変性したことを示す。
【０００９】
一方、特に、５μｍ以下の粒子サイズを有する抗原を含む微細粒子は食細胞によって食われる事実を用いて、タンパク質薬物または抗原の経口剤形を開発するための多くの試みが行なわれた。したがって、抗原を体内の特定位置、たとえば、小腸のペイヤース板（Payer's plate）に標的することができると期待される。
【００１０】
しかし、ペイヤース板のＭ細胞は、抗原の親水性と高分子量のため抗原を容易に吸収できない。Ｍ細胞による抗原の吸着を促進するために、混合胆汁脂肪酸ミセル、キレーター、脂肪酸、リン脂質、アクリルカルニチン、界面活性剤、中鎖グリセリドのような吸収促進剤が用いられた（Lee, V. H. L., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Systems, 5, 69-97(1988); Yoshioka, S. et al., J. Pharm. Sci., 71, 593-597(1982); Scott-Moncrieff, J. C. et al., J. Pharm. Sci., 83, 1465-1469(1994); Muranishi, S. et al., Chem. Pharm. Bull., 25, 1159-1163(1977); Fix, J. A. et al., Am. J. Physiol., 251, G332-G340(1986); Shao, Z. et al., Pharm. Res., 10, 143-250(1993); Constantinides, P. P. et al., Proc. Int. Symp. Control. Release Bioactive Mater., 20, 184-185(1993); and Bjork, E. et al., J. Drug Targeting, 2, 501-507(1995)）。また、ウシ血清アルブミンをレシチン−コレステロールリポソームに封入して製造された微細粒子を動物に経口投与した場合、唾液腺においてＩｇＡ反応が増加すると報告された（Genco, R. et al. Ann. N. Y. Acad. Sci. 409, 650-667(1983)）。
【００１１】
しかし、これまで成功的に開発された有効な経口ワクチン剤形としては腸受容体があるポリオワクチンが唯一であり、リポソーム微細粒子は構造的に不安定な問題が有する。
【００１２】
【発明の要約】
したがって、本発明の目的は、安定性が改善され、タンパク質薬物または抗原を効果的に伝達する微細粒子を提供することである。
【００１３】
本発明の他の目的は、前記微細粒子を含む徐放性剤形を提供することである。
【００１４】
本発明の一実施態様に従って、本発明では親油性物質および、タンパク質またはペプチド薬物および抗原からなる群から選ばれる活性成分を含む、０．１〜２００μｍの平均粒径を有する親油性微細粒子が提供される。
【００１５】
【発明の詳細な記述】
本発明の前記および他の目的および特色は、下記の図面を伴う本発明の説明によって明らかになる。
【００１６】
本発明の固形親油性微細粒子は親油性物質と活性成分を含む。
本発明に使用され得る活性成分は、タンパク質薬物、ペプチド薬物または抗原である。代表的なタンパク質またはペプチド薬物としては、ヒト成長ホルモン、ウシ成長ホルモン、ブタ成長ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン、成長ホルモン放出ペプチド、顆粒球−コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージ−コロニー刺激因子、マクロファージ−コロニー刺激因子、エリスロポエチン、骨格形態発生タンパク質、インターフェロン、インスリン、アトリオペプチン−III、モノクロナール抗体、腫瘍怪死因子、マクロファージ活性因子、インターロイキン、腫瘍変性因子、インスリン−類似成長因子、表面成長因子、組織プラスミノゲン活性剤およびウロキナーゼなどがあるが、これらは本発明に使用され得るタンパク質またはペプチド薬物を限定しない。
【００１７】
代表的な抗原としては、アデノウイルスタイプ４＆７、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、インフルエンザＡ＆Ｂウイルス、日本Ｂ脳炎ウイルス、麻疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、風疹ウイルス、小児麻痺ウイルス、狂犬病ウイルス、水痘ウイルス、黄熱ウイルスおよびヒト免疫欠乏ウイルスからなる群から選ばれる一つ以上の病原体；百日咳菌（Bordetella pertussis）、ボレリア・バルグドルフェリ（Borrelia burgdorferi）、腸管毒素原性大腸菌（enterotoxigenic E.coli）、ヘモフィルス・インフルエンザタイプｂ（Haemophilus influenzae type b）、癩菌（Mycobacterium lepre）、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）、髄膜炎菌Ａ＆Ｃ（Neisseria meningitides Ａ＆Ｃ）、髄膜炎菌Ｂ（Neisseria meningitides Ｂ）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、シュードモナス・セパシア（Pseudomonas cepacia）、サルモネラ・チフス菌（Salmonella typhi）、シゲラ腫（Shigella spp.）、肺炎球菌（Streptococcus pneumoniae）およびコレラ菌（Vibrio cholerae）からなる群から選ばれる一つ以上の病原体；コクシジオイデス・イミチス（Coccidiodes immitis）、リーシュマニア腫（Leishmania sp.）およびプラスモジウム腫（Plasmodium sp.）からなる群から選ばれる一つ以上の病原体；およびウシ気腫疽、ウシ流行熱、ウシ炭疽病、ウシアカバネ病、ウシ口蹄疫、ウシ乳房炎、ウシ伝染性鼻気管炎、ウシウイルス性下痢症、ウシ伝染性胃腸炎、ブタコレラ、ブタ流行性下痢症、ブタ萎縮性鼻炎、ブタパボウイルス性病、ブタロタウイルス性腸炎、ニワトリニューカッスル病、ニワトリマレクス病、ニワトリ脳脊椎炎、狂犬病、イヌジステンパー、イヌパボウイルス性腸炎およびイヌ伝染性肝炎からなる群から選ばれる疾病に対する病原体から得られたものを含み、この際、抗原は弱毒化された抗原、死んだ抗原または組換え抗原；またはこの病原体から抽出されたＤＮＡ、ＲＮＡ、プラスミド、ＣｐＧ  ＤＮＡまたはオリゴヌクレオチドであり得るが、これらは本発明に使用され得る抗原を限定しない。
【００１８】
本発明に使用され得る親油性物質としては、脂質およびその誘導体、脂肪酸およびその誘導体、ロウおよびこれらの混合物などがある。代表的な脂質としては、レシチン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリンおよびホスファチジルイノシトールがある。代表的な脂質誘導体としては、アラキドイルホスファチジルコリンおよびステアロイルホスファチジルコリンがある。代表的な脂肪酸としては、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸およびこれらの塩がある。代表的な脂肪酸誘導体としては、ステアリン酸グリセリル、パルミチン酸ソルビタン、ステアリン酸ソルビタン、モノオレイン酸ソルビタンおよびポリソルベートがある。代表的なロウとしては、アニオン性エマルジョン化ロウ、カルナウバロウおよび微細結晶質ロウがある。二重レシチン、ホスファチジルコリンおよびホスファチジルエタノールアミンのような界面活性を有する親油性物質が好ましい。
【００１９】
本発明の親油性微細粒子は、微細粒子重量に対して０．００１〜９９重量％、好ましくは０．１〜１０重量％の活性成分、および１〜９９．９９９重量％、好ましくは５〜５０重量％の親油性物質を含む。
【００２０】
本発明の微細粒子は、活性成分の他にヒアルロン酸またはその無機塩をさらに含み得る。代表的なヒアルロン酸の無機塩としては、ヒアルロン酸ナトリウム、ヒアルロン酸カリウム、ヒアルロン酸アンモニウム、ヒアルロン酸カルシウム、ヒアルロン酸マグネシウム、ヒアルロン酸亜鉛およびヒアルロン酸コバルトがある。ヒアルロン酸またはその無機塩は微細粒子重量に対して０．１〜９９重量％の量で用いられる。
【００２１】
また、本発明の微細粒子は活性成分を安定化させる目的で水溶性賦形剤をさらに含み得る。本発明に使用され得る水溶性賦形剤としては、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、キトサン、アルギネート、グルコース、キシロース、ガラクトース、フルクトース、マルトース、サッカロース、デキストランおよびスルホン酸コンドロイチンのような糖類；アルブミンおよびゼラチンのようなタンパク質；グリシン、アラニン、グルタミン酸、アルギニン、リシンおよびこれらの塩のようなアミノ酸；ステアリン酸のような脂肪酸；リン酸塩のような無機塩；ツイーン(登録商標）（ＩＣＩ）のような界面活性剤；ポリエチレングリコール；およびこれらの混合物がある。前記水溶性賦形剤は、微細粒子重量に対して０．００１〜９９重量％、好ましくは０．１〜５０重量％の量で用いられる。
【００２２】
本発明の親油性微細粒子は、活性成分を含む固形粒子を下記の方法のいずれか一つに従って親油性物質でコーティングして製造できる。
【００２３】
本発明の親油性微細粒子は、活性成分をヒアルロン酸および水溶性賦形剤のようなその他の任意成分を含む水溶液に溶かした後、得られた溶液を噴霧または凍結乾燥して活性成分を含む固形粒子を得、該固形粒子を親油性物質を含む有機溶媒に分散させた後、次いでこの分散液を乾燥して固形親油性微細粒子を得ることによって製造できる。前記過程に使用され得る有機溶媒としては、エタノール、塩化メチレンおよびイソプロピルアルコールがある。
【００２４】
他の方法としては、本発明の親油性微細粒子は、活性成分をヒアルロン酸および水溶性賦形剤のようなその他の任意成分を含む水溶液に溶かした後、これにレシチンのような界面活性を有する親油性物質を加えて界面活性親油性物質を水和させた後、得られた溶液を噴霧乾燥して製造できる。噴霧乾燥段階において、界面活性親油性物質は液滴の表面に移動して活性成分を含む粒子をコーティングする。
【００２５】
このようにして得られた本発明の微細粒子は、０．１〜２００μｍの平均粒径を有し、好ましくは１〜５０μｍ、さらに好ましくは１〜１０μｍの平均粒径を有する。
【００２６】
活性成分を含む本発明の微細粒子は、（１）活性成分が変性せずに完全な活性を保持し、（２）活性成分を長期間にわたって完全に放出し、（３）油のような親油性媒質中に容易に分散され、このようにして得られた分散液は低粘度を有し、活性成分の活性を完全に保持し、（４）体のリン脂質膜と容易に融合して活性成分を体に効果的に輸送し、および（５）経口投与したとき、小腸に位置するペイヤース板のＭ細胞に伝達されるという種々の長所を有する。
本発明の微細粒子は、分散液、エマルジョンおよびエアロゾルの形態で剤形化され得る。
【００２７】
したがって、本発明は、本発明の親油性微細粒子を親油性媒質中に分散させて製造される分散液剤形を提供する。本発明に使用され得る親油性媒質としては、食用油、鉱油、スクアレン、スクアラン、たち肝油、モノ−、ジ−またはトリ−グリセリドおよびこれらの混合物がある。代表的な食用油としては、トウモロコシ油、オリーブ油、大豆油、紅花油、綿実油、落花生油、胡麻油、ヒマワリ油およびこれらの混合物を挙げることができる。また、親油性媒質は、分散剤または防腐剤をさらに含み得る。分散液剤形は、注射用または経口投与用として使用され得る。
【００２８】
また、本発明は、水性注射媒質と分散液剤形を含む水中油滴型エマルジョン剤形を提供する。水性注射媒質としては、蒸留水および緩衝溶液がある。エマルジョン剤形においては、親油性微細粒子が油でコーティングされて油相中に残る反面、油中水滴型エマルジョンの形成と安定性を増加させる。エマルジョン剤形は注射用として使用され得る。
【００２９】
エマルジョン剤形は、その活性成分が抗原である場合、水性注射媒質にその他の抗原を含ませることによって製造される混合ワクチン剤形を提供する。たとえば、食用油に分散されたＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）の微細粒子を含む分散液剤形を、ミョウバンに吸着したＤＴＰ抗原を含む水溶液ＤＴＰワクチンと混ぜることによって水中油滴型エマルジョン剤形が得られる。このように得られたエマルジョン剤形は、ミョウバンに吸着したＤＴＰ抗原を含む水相とＨＢｓＡｇの固形微細粒子を含む油相とからなる。このエマルジョン剤形において、ＨＢｓＡｇおよびＤＴＰ抗原は各々水性相と油相に分かれて存在することによって、ＨＢｓＡｇおよびＤＴＰ抗原の間に好ましくない副作用を防止する。これとは対照的に、水溶液中に数々抗原をミョウバンに吸着させて製造した混合ワクチン剤刑は抗原間に好ましくない相互作用によって低い免疫化効果を見せるという問題があると知られている。
【００３０】
さらに、本発明は、前記微細粒子を含むエアロゾル剤形を提供する。エアロゾル剤形は通常の賦形剤を用いて通常の方法に従って製造できる。エアロゾル剤形は鼻または気管支粘膜を通じて投与され得る。
【００３１】
下記実施例および試験例は本発明を例示するのみであり、本発明の範囲を制限しない。
【００３２】
また、固体中の固体、液体中の液体および液体中の固体に対する各々の百分率は別に言及しない限り、重量／重量、体積／体積および重量／体積に基づく。
【００３３】
【実施例】
実施例１：親油性微細粒子の製造
レシチンを１０ｍＭリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）に２％（ｗ／ｖ）の濃度で加え、完全に水和させた。これに組換えＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ、ＬＧ化学株式会社）を０．５ｍｇ／ｍｌの濃度で加えた後、この溶液を噴霧乾燥器（Ｂｕｃｈｉ  １９１）に０．５５ｍｌ／分の流速で供給して固形微細粒子（微細粒子１）を得た。この段階において入口空気温度は７０℃であり、出口空気温度は５０℃であった。得られた微細粒径は０．１〜５μｍであった。
【００３４】
実施例２：親油性微細粒子の製造
組換えＨＢｓＡｇを１０ｍＭ  ＰＢＳに０．５ｍｇ／ｍｌの濃度で溶かした後、これにカルボキシメチルセルロースを３％（ｗ／ｖ）の濃度で加えた。この溶液を噴霧乾燥器（Ｂｕｃｈｉ  １９１）に０．５５ｍｌ／分の流速で供給して１次粒子を得た。この段階において入口空気温度は７０℃であり、出口空気温度は５０℃であった。
【００３５】
エタノールに５％（ｗ／ｖ）レシチンを溶解した溶液を製造した後、これに１次粒子を５％（ｗ／ｖ）の濃度で分散した。この分散液を噴霧乾燥機（Ｂｕｃｈｉ  １９１）に１．０ｍｌ／分の流速で供給して固形微細粒子（微細粒子２）を得た。この段階において入口空気温度は８５℃であり、出口空気温度は５０℃であった。得られた微細粒子粒径は０．１〜５μｍであった。
【００３６】
実施例３：親油性微細粒子の製造
カルボキシメチルセルロースを１０ｍＭ  ＰＢＳに３％（ｗ／ｖ）の濃度で溶解した。これにレシチンを２％（ｗ／ｖ）の濃度で加え、完全に水和させた。これに組換えＨＢｓＡｇを０．５ｍｇ／ｍｌになるように加えた。この溶液を噴霧乾燥器（Ｂｕｃｈｉ  １９１）に０．５５ｍｌ／分の流速で供給して固形微細粒子（微細粒子３）を得た。この段階において入口空気温度は７０℃であり、出口空気温度は５０℃であった。得られた微細粒径は０．１〜５μｍであった。
【００３７】
実施例４〜９：親油性微細粒子の製造
表Ｉに示す種々の成分を用いて実施例３の手順を繰り返すことによって種々の固形微細粒子（微細粒子４〜９）を得た。
【００３８】
【表１】
0003802348.tif 000002
【００３９】
実施例１０：親油性微細粒子の製造
カルボキシメチルセルロースを１０ｍＭ  ＰＢＳに３％（ｗ／ｖ）の濃度で溶解した後、反応溶液を濾過し、滅菌した。これにレシチンを２％（ｗ／ｖ）の濃度で加え、完全に水和させた。大腸菌から抽出したＤＮＡを１０ｍＭ  ＰＢＳに１ｍｇ／ｍｌの量で溶解した後、この溶液を前記混合物に混合物の総重量に対して６重量％の濃度で加えた後、磁気攪拌器で混合した。この懸濁液を噴霧乾燥機（Ｂｕｃｈｉ  １９１）に０．５５ｍｌ／分の流速で供給して固形微細粒子（微細粒子１０）を得た。この段階において、入口空気温度は７０℃であり、出口空気温度は５０℃であった。得られた微細粒径は０．２〜３μｍであった。
【００４０】
実施例１１：親油性微細粒子の製造
ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）を５ｍＭ  ＰＢＳに２ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解した後、ツイーン８０をＰＢＳ重量に対して０．０１重量％の量で加えた。これに、分子量１，０００，０００のヒアルロン酸ナトリウムを０．２％（ｗ／ｖ）の濃度で溶解した。この溶液を３ｍｌ／分の流速で噴霧乾燥機（Ｂｕｃｈｉ １９０）に供給して１次粒子を得た。この段階において、入口空気温度は８５℃であった。１次粒子の平均粒径は３μｍであった。
【００４１】
レシチンをエタノールに１％（ｗ／ｖ）の濃度で溶解した後、これに１次粒子を１％（ｗ／ｖ）の濃度で懸濁した。この懸濁液を噴霧乾燥器（Ｂｕｃｈｉ  １９０）に供給して微細粒子（微細粒子１１）を得た。得られた微細粒子の平均粒径は７μｍであった。
【００４２】
実施例１２〜２４：親油性微細粒子の製造
表IIに示す種々の成分を用いて実施例１１の手順を繰り返すことによって種々の固形微細粒子を得た（微細粒子１２〜２４）。
【００４３】
【表２】
0003802348.tif 000003
【００４４】
実施例２５：微細粒子３の綿実油分散液剤形の製造
実施例３で製造された微細粒子３を綿実油に加え、磁石攪拌器で分散して各々２０、５０、１００、２００および５００ｍｇ／ｍｌの微細粒子３を含む５個の綿実油分散液を製造した。
【００４５】
実施例２６：微細粒子３の食用油分散液剤形の製造
大豆油、トウモロコシ油、胡麻油を用いて実施例２５の手順を繰り返すことによって各々１００ｍｇ／ｍｌの微細粒子３を含む大豆油、トウモロコシ油および胡麻油分散液を得た。
【００４６】
実施例２７：微細粒子８の食用油分散液剤形の製造
微細粒子８を用いて実施例２５の手順を繰り返すことによって各々１００ｍｇ／ｍｌの微細粒子８を含む綿実油、大豆油、トウモロコシ油および胡麻油を得た。
【００４７】
実施例２８：微細粒子９の食用油分散液剤形の製造
微細粒子９を用いて実施例２５の手順を繰り返すことによって各々１００ｍｇ／ｍｌの微細粒子９を含む綿実油、大豆油、トウモロコシ油および胡麻油分散液を得た。
【００４８】
実施例２９：微細粒子１０の食用油分散液剤形の製造
微細粒子１０を用いて実施例２５の手順を繰り返すことによって各々１００ｍｇ／ｍｌの微細粒子１０を含む綿実油、大豆油、トウモロコシ油および胡麻油分散液を得た。
【００４９】
実施例３０：微細粒子１２の綿実油分散液剤形の製造
微細粒子１２を用いて実施例２５の手順を繰り返すことによって５０、１００、２００、３６０および５００ｍｇ／ｍｌの微細粒子１２を含む５個の綿実油分散液を得た。
【００５０】
実施例３１：微細粒子１２の食用油分散液剤形の製造
微細粒子１２を用いて実施例２５の手順を繰り返すことによって各々１００ｍｇ／ｍｌの微細粒子１２を含む綿実油、大豆油、トウモロコシ油および胡麻油分散液を得た。
【００５１】
実施例３２：微細粒子１４の食用油分散液剤形の製造
微細粒子１４を用いて実施例２５の手順を繰り返すことによって各々３６０ｍｇ／ｍｌの微細粒子１４を含む綿実油、大豆油、トウモロコシ油および胡麻油分散液を得た。
【００５２】
実施例３３：微細粒子１５の食用油分散液剤形の製造
微細粒子１５を用いて実施例２５の手順を繰り返すことによって各々３６０ｍｇ／ｍｌの微細粒子１５を含む綿実油、大豆油、トウモロコシ油および胡麻油分散液を得た。
【００５３】
実施例３４：微細粒子１８の食用油分散液剤形の製造
微細粒子１８を用いて実施例２５の手順を繰り返すことによって各々３６０ｍｇ／ｍｌの微細粒子１８を含む綿実油、大豆油、トウモロコシ油および胡麻油分散液を得た。
【００５４】
実施例３５：微細粒子３のエマルジョン剤形の製造
実施例２６で得られた大豆油、トウモロコシ油および胡麻油を各々４倍体積の０．９％ＮａＣｌ溶液に加えて２０ｍｇ／ｍｌ微細粒子３を含む油と水の混合物（１：４）を得た。この混合物を混合して均一な白色不透明水中油滴型エマルジョンを得た。
【００５５】
実施例３６：微細粒子１２のエマルジョン剤形の製造
実施例３０で得られた綿実油分散液を用いて実施例３５の手順を繰り返すことによって、各々５、２０、５０、１２０および２００ｍｇ／ｍｌの微細粒子１２を含み、各々の油に対する水の比率が１：９、１：４、１：３、１：２および２：３である５個の均一な白色不透明水中油滴型エマルジョンを得た。
【００５６】
これらのエマルジョン剤形において、固形微細粒子は油相として分散されており、微細粒子を含む油滴は微細粒子の親油性表面によって安定であった。エマルジョンは室温で２週間以上安定であった。
【００５７】
実施例３７：微細粒子１２のエマルジョン剤形の製造
実施例３１で得られた大豆油、綿実油および胡麻油分散液を用いて実施例３５の手順を繰り返すことによって均一な白色不透明水中油滴型エマルジョン剤形を得た。
【００５８】
実施例３８：微細粒子２２のエマルジョン剤形の製造
微細粒子２２および大豆油を用いて実施例２５の手順を繰り返すことによって１００ｍｇ／ｍｌの微細粒子２２を含む大豆油分散液を得た。この分散液を用いて実施例３５の手順を繰り返すことによって均一な白色不透明水中油滴型エマルジョン剤形を得た。
【００５９】
実施例３９：微細粒子２３のエマルジョン剤形の製造
微細粒子２３および大豆油を用いて実施例２５の手順を繰り返すことによって１００ｍｇ／ｍｌの微細粒子２３を含む大豆油分散液を得た。この分散液を用いて実施例３５の手順を繰り返すことによって均一な白色不透明水中油滴型エマルジョン剤形を得た。
【００６０】
実施例４０：微細粒子２４のエマルジョン剤形の製造
微細粒子２４および大豆油を用いて実施例２５の手順を繰り返すことによって１００ｍｇ／ｍｌの微細粒子２４を含む大豆油分散液を得た。この分散液を用いて実施例３５の手順を繰り返すことによって均一な白色不透明水中油滴型エマルジョン剤形を得た。
【００６１】
実施例４１：微細粒子１４のエマルジョン剤形の製造
実施例３２で得られた綿実油、大豆油、トウモロコシ油および胡麻油分散液、および２倍体積の０．９％ＮａＣｌ溶液を用いて実施例３５の手順を繰り返すことによって、４個の均一な白色不透明水中油滴型エマルジョン剤形を得た。得られた各々の剤形は油と水の混合物（１：２）中に１２０ｍｇ／ｍｌの微細粒子１４を含んだ。
【００６２】
実施例４２：微細粒子１５のエマルジョン剤形の製造
実施例３３で得られた綿実油、大豆油、トウモロコシ油および胡麻油分散液、および２倍体積の０．９％ＮａＣｌ溶液を用いて実施例３５の手順を繰り返すことによって４個の均一な白色不透明水中油滴型エマルジョン剤形を得た。得られた各々の剤形は油と水の混合物（１：２）中に１２０ｍｇ／ｍｌの微細粒子１５を含んだ。
【００６３】
実施例４３：微細粒子１８のエマルジョン剤形の製造
実施例３４で得られた綿実油、大豆油、トウモロコシ油および胡麻油分散液、および２倍体積の０．９％ＮａＣｌ溶液を用いて実施例３５の手順を繰り返すことによって微細粒子１８の均一な白色不透明水中油滴型エマルジョン剤形を得た。得られた各々の剤形は油と水の混合物（１：２）中に１２０ｍｇ／ｍｌの微細粒子１８を含んだ。
【００６４】
実施例４４：微細粒子３のエマルジョン剤形の製造
０．９％ＮａＣｌの代りにミョウバンを用いたことを除いては、実施例３５の手順を繰り返して均一な白色不透明水中油滴型エマルジョン剤形を得た。
【００６５】
比較実施例１：比較微細粒子１の製造
レシチンを用いずに実施例２の手順を繰り返して親油性物質でコーティングされていない比較微細粒子（比較微細粒子１）を得た。
【００６６】
比較実施例２：比較微細粒子１の分散液剤形の製造
比較微細粒子１および大豆油を用いて実施例２５の手順を繰り返すことによって１００ｍｇ／ｍｌの比較微細粒子１を含む大豆油分散液（比較分散液１）を得たが、この分散液の微細粒子は凝集しており、均一に分散されていなかった。
【００６７】
比較実施例３：比較微細粒子１のエマルジョン剤形の製造
比較微細粒子１および注射用生理食塩水を用いて実施例３５の手順を繰り返すことによってエマルジョン剤形（比較エマルジョン１）を得たが、均一なエマルジョンではなく、凝集した微細粒子の分離が観察された。
【００６８】
比較実施例４：比較微細粒子２の製造
１ｍｇ／ｍｌｈＧＨおよび分子量２，０００，０００のヒアルロン酸ナトリウムを用いて実施例１１の手順を繰り返すことによって親油性コーティングを持たない比較微細粒子（比較微細粒子２）を得た。
【００６９】
比較実施例５：比較微細粒子２の分散液剤形の製造
比較微細粒子２と綿実油を用いて実施例２５の手順を繰り返すことによって１００ｍｇ／ｍｌの比較微細粒子２を含む綿実油分散液（比較分散液２）を得た。
【００７０】
比較実施例６：比較微細粒子２のエマルジョン剤形の製造
比較分散液２を用いて実施例３５の手順を繰り返した。この混合物（比較エマルジョン２）は均一なエマルジョンを形成せず、相分離が起り、微細粒子は油相と水相の両方に分散された。
【００７１】
比較実施例７：比較微細粒子３の製造
２ｘ１０5ＩＵ／ｍｌインターフェロンα、０．２ｍｇ／ｍｌＤ−マンニトル、０．２ｍｇ／ｍｌ血清アルブミンおよび０．２５％（ｗ／ｖ）の分子量２，０００，０００のヒアルロン酸ナトリウムを用いて入口空気温度１０５℃で実施例１１の手順を繰り返すことによって平均粒径３．５μｍの、親油性コーティングを有しない比較微細粒子（比較微細粒子３）を得た。
【００７２】
比較実施例８：比較微細粒子３の油分散液剤形の製造
比較微細粒子３および綿実油を用いて実施例２５の手順を繰り返すことによって１００ｍｇ／ｍｌの比較微細粒子３を含む綿実油分散液（比較分散液３）を得た。
【００７３】
比較実施例９：比較微細粒子３のエマルジョン剤形の製造
比較分散液３を用いて実施例３５の手順を繰り返した。この混合物（比較エマルジョン３）は均一なエマルジョンを形成せず、相分離が起り、微細粒子が油相と水相の両方に分散された。
【００７４】
試験例１：微細粒子１および３の安定性試験
微細粒子に含まれた抗原がその活性を維持するか否かを調査するために、微細粒子１および３を各々水に溶かした後、１，０００〜１０，０００倍体積の水で希釈し、ＨＢｓＡｂ抗原性をＡＵＺＹＭＥキット（アボット、米国）を用いて調査した。結果を表IIIに示す。
【００７５】
【表３】
0003802348.tif 000004
【００７６】
表IIIから分かるように、本発明の微細粒子に含まれたＨＢｓＡｇの抗原性は製造前と後にも大き変化しなかった。したがって、本発明の微細粒子に含まれた抗原はその抗原性を保存する。
【００７７】
試験例２：微細粒子１１、１２および１３のインビトロ放出試験
微細粒子１１、１２および１３を各々緩衝溶液（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭリン酸塩、０．０５％アジ化ナトリウム、ｐＨ７．４）にｈＧＨ濃度が１．０ｍｇ／ｍｌになるように分散した。インビトロ放出試験は、分散液を３７℃で攪拌しながら行い、予め予定された時間に分散液を８００ｇの引力で１０分間遠心分離した後、上澄液試料を全体分散液の１／１０に相当する量で取り、同一体積の前記緩衝溶液と混合した。上澄液に含まれたｈＧＨは、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いてローリー法で定量した。
【００７８】
図１は、このように決定された微細粒子１１、１２および１３の放出プロフィルを示す。図１から分かるように、ヒアルロン酸の分子量が大きいほど、そしてｈＧＨの含量が少ないほどｈＧＨの放出速度が遅くなった。したがって、タンパク質薬物放出速度は、ヒアルロン酸の分子量とタンパク質含量を調節することによって調節が可能であることが分かる。さらに、インビトロ放出試験結果は、タンパク質薬物の初期の急激な放出がなく、放出速度はタンパク質の７０％が放出されるまで一定であることが分かる。
【００７９】
試験例３：微細粒子１２の安定性試験
微細粒子１２に含まれたｈＧＨがその活性を維持するか否かを調査するため、試験例１の手順を繰り返し、４８時間の間微細粒子１２から放出されたｈＧＨ量を逆相（ＲＰ）ＨＰＬＣおよびサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を用いて決定した。ＲＰ  ＨＰＬＣは、酸化および脱アミド化によるタンパク質の変性の測定に用い、ＳＥＣは凝集によるタンパク質の変性の測定に用いた。
【００８０】
図２（Ａ）および（Ｂ）は、微細粒子１２抽出液および微細粒子１２の製造に用いられるｈＧＨ水溶液のＲＰ−ＨＰＬＣ結果を各々示す。
【００８１】
図３（Ａ）および（Ｂ）は、微細粒子１２抽出液および微細粒子１２の製造に用いられるｈＧＨ水溶液のＳＥＣ結果を各々示す。
【００８２】
図２および３から分かるように、本発明の微細粒子から放出されたｈＧＨの量はＲＰ  ＨＰＬＣ結果に従って最初ｈＧＨ水溶液の場合と同一であり、ＳＥＣ結果は、ｈＧＨ単量体の含量が９５％以上であることを示す。この結果は、本発明の微細粒子製造過程中ｈＧＨが変性しなかったことを示す。
【００８３】
試験例４：微細粒子１４〜２１のインビトロ放出試験
微細粒子１４〜２１の各々を用いて試験例２の手順を繰り返し、１０時間目および７２時間目に放出された薬物の累積量と試料の単量体タンパク質含量を決定した。結果を表IVに示す。
【００８４】
【表４】
0003802348.tif 000005
【００８５】
表IVから分かるように、本発明の微細粒子はタンパク質薬物の変性なしに３日間タンパク質薬物を放出する。
【００８６】
試験例５：注射能試験１
本発明の微細粒子が油分散液または油−水エマルジョンに均一に分散されているかどうかを調査するために注射能試験を行った。注射能は、試料で充填された注射器を８０ｍｍ／分の一定速度で押すときに必要な力と定義した。２３ゲージ注射針が用いられた。この試験に用いられた試料はミョウバンを２０倍ＰＢＳで希釈して製造されたミョウバン分散液、大豆液、実施例２６の大豆分散液、実施例４４のエマルジョン、比較分散液２および比較エマルジョン１であり、その結果を表Ｖに示す。
【００８７】
【表５】
0003802348.tif 000006
【００８８】
表Ｖから分かるように、実施例２６の分散液は容易に注射でき、本発明の微細粒子３がレシチンコーティングを持たない微細粒子１と比べるとき、油によく分散されることを示す。特に本発明のエマルジョンは、優れた注射能を有するため、混合剤形の製造に使用できる。
【００８９】
試験例６：注射能試験２
０．９％ＮａＣｌ水溶液、綿実油、実施例３０の綿実油分散液、実施例３６のエマルジョン、比較分散液２、および比較エマルジョン２に対して２６ゲージ注射器針を用いて試験例５の手順を繰り返した。結果を表VIに示す。
【００９０】
【表６】
0003802348.tif 000007
【００９１】
表VIから分かるように、本発明の微細粒子１２は、親油性レシチンコーティングのため綿実油において優れた分散性を有し、本発明の綿実油分散液は綿実油の場合と同等な注射能を有する。さらに、実施例３６のエマルジョンは高濃度の微細粒子１２を含むにも拘わらず綿実油より低い注射能を有する。
【００９２】
これとは対照的に、比較微細粒子２は親油性コーティングがないため綿実油における分散性が劣るので、比較分散液２の注射能力が悪くなる。また、比較微細粒子２の親水性表面は比較エマルジョン２において相分離を惹起し、ヒアルロン酸ナトリウム成分が水相から溶け出して結果的に水相の粘度を高める。したがって、比較エマルジョン２は比較分散液より悪い注射能を有する。
【００９３】
試験例７：注射能試験３
実施例３８〜４０で得られたエマルジョンおよびコントロールとしての大豆油に対して試験例５の手順を繰り返した。大豆油の注射能は１．４ｋｇであり、実施例３８〜４０で得られたエマルジョンの場合は０．９％ＮａＣｌ水溶液の場合と類似な０．３〜０．５ｋｇfの範囲であった。本発明の微細粒子の親油性表面が大豆油でコーティングされることによって水の場合と同等な注射能を有する均一な水中油滴型エマルジョンを形成した。
【００９４】
試験例８：動物に対する剤形の注射
本発明の剤形を注射したときの生物学的活性を調査するために、微細粒子３を大豆油に加えて各々０．５、０．１２５、０．０３１２５および０．００７８μｇタンパク質／ｍｌの量の組換えＨＢｓＡｇを有する４個の分散液を製造した。比較剤形として、免疫賦形剤としてミョウバンを含むＢ型肝炎ワクチン（ＬＧ化学株式会社、大韓民国）をＰＢＳで希釈して各々０．５、０．１２５、０．０３１２５および０．００７８μｇタンパク質／ｍｌのＨＢｓＡｇを有する試料を製造した。
【００９５】
各分散液試料を４週齢の雄Ｂａｌｂ／Ｃ（Ｈ−２ｄ）マウス（１０匹）に腹腔内注射し、注射してから４ヶ月後これらから血液試料を採取した。血液試料から血清を得、その抗体逆価および抗体形成率（％）をＡＵＳＡＢ  ＥＩＡキット（アボット社、米国）を用いて決定し、統計的な方法（プロビット分析法）を用いて微細粒子のＥＤ50（μｇ）を計算した。その結果を表VIIに示す。
【００９６】
【表７】
0003802348.tif 000008
【００９７】
表VIIから分かるように、本発明の微細粒子は比較剤形より小さいＥＤ50値を有し、同量の抗原を注射した場合比較剤形より高い抗体逆価を有する。したがって、本発明の微細粒子は、優れた抗体形成のための賦形剤として作用する。
【００９８】
試験例９：動物に対する剤形の経口投与
本発明の剤形を経口投与した際の生物学的活性を調査するために、微細粒子３を大豆油に加えて各々５μｇタンパク質／ｍｌの量の組換えＨＢｓＡｇを有する分散液を製造した。比較剤形として、Ｂ型肝炎ワクチン（ＬＧ化学株式会社、大韓民国）をＰＢＳで希釈して５μｇタンパク質／ｍｌの同一ローディング量を得た。
【００９９】
各分散液試料を４週齢の雄Ｂａｌｂ／Ｃ（Ｈ−２ｄ）マウス（１０匹）に経口投与し、２週間および４週間後２回さらに投与した。８週間後にマウスから血液試料を採取した。血液試料から血清を得、その抗体逆価および抗体形成率（％）をＡＵＳＡＢ  ＥＩＡキット（アボット社、米国）を用いて決定した。その結果を表VIIIに示す。
【０１００】
【表８】
0003802348.tif 000009
【０１０１】
表VIIIから分かるように、本発明の微細粒子を投与したマウスは８０％の抗体形成率を有する反面、比較剤形を投与したマウスは抗体を形成しなかった。したがって、本発明の微細粒子は経口投与しても生体内において優れた抗体形成能を有する。これは、本発明の微細粒子が経口投与用剤形に有用できることを示す。
【０１０２】
試験例１０：細胞毒性リンパ球試験（Cytotoxic Lymphocyte Test）
本発明の微細粒子が細胞性免疫反応を誘導するか否かを調査するために、微細粒子３を大豆油に加えて１０μｇタンパク質／ｍｌを有する分散液を得た。比較剤形として、Ｂ型肝炎ワクチン（ＬＧ化学株式会社、大韓民国）をＰＢＳで１０μｇタンパク質／ｍｌの同一ローディング量に希釈した。
【０１０３】
各分散液剤形を４週齢の雄Ｂａｌｂ／Ｃ（Ｈ−２ｄ）マウス（１０匹）に皮下投与し、その後２ヶ月間隔で２回さらに投与した。最後の投与から２週間後免疫されたマウスからプレ細胞毒性リンパ球（pre CTL）細胞を得た後培養して効果(effector)細胞（Ｅ細胞）を得た。Ｅ細胞を標的細胞（Ｔ細胞）とともにＥ細胞に対するＴ細胞の比を変えて培養し、次いでＥ細胞によって殺傷されたＴ細胞の数を次のように決定した。
【０１０４】
特異的殺傷力（％）＝
[cpm(試料)−cpm(自然放出)]／[cpm(最大放出)−cpm(自然放出)]×１００
高い特異的殺傷力は、細胞性免疫反応が活発に誘導されることを意味する。結果を表IXに示す。
【０１０５】
【表９】
0003802348.tif 000010
【０１０６】
表IXから分かるように、本発明の微細粒子は細胞性免疫反応を誘導する反面、比較剤形は誘導しなかった。
【０１０７】
試験例１１：動物試験
本発明の微細粒子の免疫増強効果を調査するために、微細粒子９を大豆油に加えて４．０ｍｇタンパク質／ｍｌのＳＥＣ−ＳＥＲを分散液を得た。比較剤形として、ＳＥＣ−ＳＥＲ抗原を製造社の指針書に従って市販の免疫補助剤ＩＳＡと混合した後、同様な４．０ｍｇタンパク質／ｍｌに希釈した。コントロールとしては、抗原を用いなかったことを除いては実施例９の手順を繰り返して製造した微細粒子を大豆油に分散した。
【０１０８】
各分散液剤形を多くの体細胞数を有する２次または３次授乳期乳牛（５匹）に筋肉注射し、２週間および４週間後２回以上注射した。２、６、１０および１４週間後に乳牛から血液試料を採取して抗原逆価を決定した。ＥＬＩＳＡリーダー（leader）に表われた結果を表Ｘに示す。
【０１０９】
【表１０】
0003802348.tif 000011
【０１１０】
表Ｘから分かるように、本発明の剤形は、１回の注射後１４週間持続する高い水準の抗原体の形成を誘導した。したがって、本発明の剤形は、動物ワクチンとして有用できる。
【０１１１】
試験例１２：動物試験
低い成長ホルモン分泌遺伝特性を有する７週齢の矮小ラット（体重：約１００ｇ）を用いてｈＧＨを含む本発明の剤形の効果を調査した。
【０１１２】
実施例３０の分散液、実施例３６のエマルジョン、比較分散液２、比較エマルジョン２および水性剤形であるユウトロピン（登録商標）（ＬＧ化学、大韓民国）を試験用として選択し、各々を１０匹の矮小ラットからなる群にラット当り３５０μｇ  ｈＧＨの投与量で投与した後、体重の増加を調査した。コントロールとして、ｈＧＨを投与しなかったラットを用いた。平均累積純体重増加量を表XIに示す。
【０１１３】
【表１１】
0003802348.tif 000012
【０１１４】
表XIから分かるように、ユウトロピン（登録商標）投与群においてラットの平均重量は１日目に増加したが、２日目には減少した。その後体重は対照群の場合と同様な速度で増加した。
【０１１５】
比較分散液２投与群ラットの平均体重は徐々に増加するに反して、比較エマルジョン２投与群ラットの場合は３日目に減少した。比較エマルジョン２の微細粒子は親水性表面を有するため薬物が溶解し、したがって、水性剤形であるユウトロピン（登録商標）の場合と同様な体重増加特性を有する。
【０１１６】
これとは対照的に、実施例３０の分散液と実施例３６のエマルジョンを投与したラットの体重は６日間比較分散液２または比較エマルジョン２より高い速度で増加した。レシチンコーティングを有する本発明の微細粒子は綿実油でコーティングされているので、注射後も水を徐々に吸収するため、薬物を一定速度で放出する。
【０１１７】
試験例１３：動物試験
実施例３２の分散液および実施例４１のエマルジョンを各々７週齢の雌矮小ラット（体重：約１００ｇ）にラット当り１２．５ｍｇ  ｂＳＴの量で投与し、これらの体重を調査した。コントロールとして、ｂＳＴを投与しなかったラットを用いた。平均累積純体重増加量を表XIIに示す。
【０１１８】
【表１２】
0003802348.tif 000013
【０１１９】
表XIIから分かるように、実施例３２の分散液または実施例４１のエマルジョンを投与したラットの平均体重は６日間継続的に増加し、１日当りの体重増加率は対照群より高かった。８日後からの体重増加率は微々たるもので、これはいずれの場合においても薬物放出時間が約８日であることを示す。
【０１２０】
試験例１４：細胞病変抑制試験（cytopathic Effect Inhibition Test）
実施例４３のエマルジョン、比較分散液３およびインターフェロン−α水性剤形を各々５月齢のウサギ（体重：２．５ｋｇ）に３００μｇインターフェロン−αの投与量で投与した。
【０１２１】
細胞をインターフェロン−αで処理し、これにウイルスを加えた後、細胞病変の抑制程度を決定することによって行われる細胞病変抑制試験を用いて薬物の血中水準を決定した。この試験には雄コウシ腎臓細胞（MDBO CATCC CCL-22）と水泡性口内炎ウイルス（Vesicular stomatitis virus; ATCC VR 158）を用いた。血中インターフェロン−αの逆価(IU/ml)を５日間測定し、その結果を表XIIIに示す。
【０１２２】
【表１３】
0003802348.tif 000014
【０１２３】
表XIIIから分かるように、実施例４３の分散液を投与したウサギに対するインターフェロン−αの逆価は５日間の試験全期間に亘って高く、比較分散液３に比べてインターフェロン−αの水準が２日目から高いことが分かる。したがって、本発明の分散液は、微細粒子の親油性表面のため持続的放出特性を有する。
【０１２４】
比較試験例１
ｈＧＨを５ｍＭ  ＰＢＳに２．３ｍｇ／ｍｌの濃度で溶かし、次いで分子量２，０００，０００のヒアルロン酸ナトリウムを２％（ｗ／ｖ）の濃度に加えて溶かしてヒアルロン酸ゲル剤形を得た。
【０１２５】
このゲル剤形を用いて試験例２の手順を繰り返すことによってインビトロ放出試験を行った。その結果、ｈＧＨが１時間以内に１００％上澄液に放出された。したがって、このゲル剤形は、本発明の微細粒子より非常に短い薬物放出期間を有する。
【０１２６】
比較試験例２：動物試験
５ｍｇ／ｍｌ  ｈＧＨを用いて比較試験例１のヒアルロン酸ゲル剤形製造過程を繰り返して流動性のないヒアルロン酸ゲル剤形を得た。
得られたゲル剤形を矮小ラットにラット当り１５０μｇ  ｈＧＨの量で投与した後、平均体重増加量を６日間調査した。比較剤形として、水性剤形であるユウトロピン（登録商標）をラットに同じｈＧＨ投与量で投与した。コントロールとして、ｈＧＨを投与しなかったラットを用いた。累積体重増加量に表れる結果は表XIVに示す。
【０１２７】
【表１４】
0003802348.tif 000015
【０１２８】
表XIVから分かるように、ゲル剤形を投与したラットの平均体重増加量はユウトロピン（登録商標）投与群の場合と類似である。２日目後の体重増加率は三つの投与群の間に有意味な差はなく、これはゲル剤形からの薬物放出が１日以上持続しなかったことを示す。
【０１２９】
比較試験例３
ｈＧＨを５ｍＭ  ＰＢＳに２ｍｇ／ｍｌの濃度に溶かし、これにツイーン８０を０．０１重量％加えた。この溶液を噴霧乾燥機（Ｂｕｃｈｉ  １９１）に３ｍｌ／分の流速で供給して微細粒子を得た。この段階において入口空気温度は８５℃であった。製造された微細粒子の平均粒径は２．５μｍであった。
【０１３０】
ヒアルロン酸ベンジルをジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に６％濃度で溶かし、次いでこれに微細粒子を分散した。この分散液をＡｒａｃｅｌ ＡTM（Atlas Chemical Ind.）を含む鉱油に加えた。混合物を均質化してマイクロエマルジョンを得た。このマイクロエマルジョンは、連続相としての鉱油と分散相としてのヒアルロン酸ベンジル／ＤＭＳＯ溶液とからなる。
【０１３１】
このマイクロエマルジョンに酢酸エチルを加えて攪拌しながら、分散相からＤＭＳＯを抽出してｈＧＨを含むヒアルロン酸ベンジル微細粒子を得た。微細粒子の平均粒径は５．５μｍであり、ｈＧＨ含量は４５重量％であった。
【０１３２】
得られたヒアルロン酸ベンジル剤形を用いて試験例２の手順を繰り返すことによってインビトロ放出試験を行い、累積ｈＧＨ放出量を表XVに示す。
【０１３３】
【表１５】
0003802348.tif 000016
【０１３４】
表XVから分かるように、ヒアルロン酸ベンジル剤形は５時間後に少量のｈＧＨを放出し、１４４時間の間ローディングされたｈＧＨの３０％のみを放出した。したがって、ヒアルロン酸ベンジル剤形中のｈＧＨは、大部分ヒアルロン酸ベンジルマトリックスに結合して放出されなかった。
【０１３５】
前記ヒアルロン酸ベンジル剤形を綿実油に分散し、この分散液を矮小ラットにラット当り３００μｇのｈＧＨ投与量で投与した。平均体重増加量を決定し、結果を表XVIに累積体重増加量で示す。
【０１３６】
【表１６】
0003802348.tif 000017
【０１３７】
表XVIから分かるように、ヒアルロン酸ベンジル剤形は１日後有意味な効果を示さなかった。
【０１３８】
本発明を前記特定実施態様と関連して記述したが、添付した特許請求範囲によって定義される本発明の範囲内で、当該分野の熟練者が本発明を多様に変形および変化させ得ることは勿論である。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、微細粒子１１、１２および１３のインビトロ放出プロフィルを示す。
【図２】  図２（Ａ）および（Ｂ）は、試験例３で得られた微細粒子１２抽出溶液および標準ｈＧＨ水溶液のＲＰ  ＨＰＬＣ結果を各々示す。
【図３】  図３（Ａ）および（Ｂ）は、試験例３で得られた微細粒子１２抽出溶液および標準ｈＧＨ水溶液のＳＥＣ結果を各々示す。
【図１】
0003802348.tif 000018
【図２】
0003802348.tif 000019
【図３】
0003802348.tif 000020