(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一本鎖ＤＮＡと刺激応答性ポリマーが連結されてなるＤＮＡ複合体の一本鎖ＤＮＡを標的ｍＲＮＡに結合させて標的ｍＲＮＡの転写翻訳を阻害させる方法において、外的刺激により刺激応答性ポリマーの構造を変化させることによって、一本鎖ＤＮＡと標的ｍＲＮＡとの結合をON-OFF制御することを特徴とする遺伝子発現制御方法。
【請求項２】
刺激応答性ポリマーが、温度応答性ポリマーである請求項１の遺伝子発現制御方法。
【請求項３】
温度応答性ポリマーがポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）である請求項２の遺伝子発現制御方法。
【請求項４】
請求項３の遺伝子発現制御方法において、ＤＮＡ複合体が、末端アミノ化一本鎖ＤＮＡとメタクリロイルオキシスクシンイミドとのカップリング反応により得られる末端ビニル化一本鎖ＤＮＡとＮ−イソプロピルアクリルアミドモノマーをラジカル重合して製造される請求項３の遺伝子発現制御方法。
【請求項５】
末端アミノ化一本鎖ＤＮＡが、３’末端アミノ化一本鎖ＤＮＡである請求項４の遺伝子発現制御方法。
【請求項６】
一本鎖ＤＮＡがオリゴデオキシリボヌクレオチドである請求項１ないし５のいずれかの遺伝子発現制御方法。
【請求項７】
標的mRNAと結合する一本鎖DNAに刺激応答性ポリマーが連結されており、外的刺激による刺激応答性ポリマーの構造変化によって、標的mRNAへの一本鎖DNAの結合がON-OFF制御されるDNA複合体を含むことを特徴とするアンチセンス試薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この出願の発明は、遺伝子発現制御方法に関するものである。さらに詳しくは、この出願の発明は、遺伝子にＤＮＡ複合体を結合させ、ＤＮＡ複合体の遺伝子翻訳抑制機能を外的刺激により制御することによって遺伝子発現を制御する遺伝子発現制御方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術とその課題】
遺伝子の変異による疾患は、およそ５０００種類あるといわれており、いわゆるヒトゲノムプロジェクトにより、約１０００種類について原因遺伝子が判明したといわれている。なかでも、アルツハイマー病等の神経疾患、癌、血友病、あるいはＨＩＶ等のウィルス性疾病については研究が進んでおり、その原因遺伝子や変異の形態に関する様々な知見が得られている。そして、このような知見を元に、これらの疾患に対する様々な治療法が研究、報告されている。
【０００３】
とくに注目される遺伝子変異性疾患の治療法の一つにアンチセンス法がある。アンチセンス法は、遺伝子（ｍＲＮＡ）上の特定領域に対して相補的な塩基配列を有する一本鎖ＤＮＡ（例えばＯＤＮ：オリゴデオキシリボヌクレオチド）を結合させることによって、その遺伝子の転写や翻訳を阻害し、結果的に有害なタンパク質の発現を抑える手法である。つまり、アンチセンス法は、特定の遺伝子配列に結合する物質により、疾患の原因遺伝子を無力化する方法であるといえ、一般に標的ｍＲＮＡに対する相補的遺伝子（一本鎖ＤＮＡ）もしくはその類縁体を用いて、疾患の原因となる遺伝子の発現を抑えるものである。
【０００４】
しかし、従来のアンチセンス法では、遺伝子やその類縁体を用いることにより、遺伝子の発現を抑制することはできるものの、発現をＯＮ−ＯＦＦ的に自在に制御することはできなかったのが実情である。
【０００５】
また、このようなアンチセンス法が実用化されるためには、一本鎖ＤＮＡが生体内でヌクレアーゼによって分解されやすいという問題が残されていたのである。
【０００６】
そこで、この出願の発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであり、従来技術の問題点を解消し、標的遺伝子の発現をＯＮ−ＯＦＦ制御できる遺伝子発現制御方法と、この方法において用いられる生体内においても高い安定性を有するアンチセンス試薬を提供することを課題としている。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
発明者らは、これまでに、一本鎖ＤＮＡと刺激応答性物質の複合体が、特定の条件下において可逆的にコンホメーションの変化を起こすことを発見した。そして、このような知見を元にさらなる鋭意研究を重ね、この出願の発明を完成した。
【０００８】
この出願の発明は、以上のとおりの経緯によりなされたものであって、上記の課題を解決するものとして、まず第１には、遺伝子の目的部位に結合する一本鎖ＤＮＡと刺激応答性ポリマーが連結されてなるＤＮＡ複合体の遺伝子への結合を、外的刺激により制御し、該ＤＮＡ複合体の遺伝子翻訳抑制機能を制御する遺伝子発現制御方法を提供する。
【０００９】
この出願の発明は、第２には、刺激応答性ポリマーが温度応答性ポリマーである遺伝子発現制御方法を、また、第３には、このような温度応答性ポリマーがポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）である遺伝子発現制御方法を提供する。
【００１０】
この出願の発明は、第４には、上記の遺伝子発現制御方法において、ＤＮＡ複合体が、末端アミノ化一本鎖ＤＮＡとメタクリロイルオキシスクシンイミドとのカップリング反応により得られる末端ビニル化一本鎖ＤＮＡとＮ−イソプロピルアクリルアミドモノマーをラジカル重合して製造されることを、第５には、末端アミノ化一本鎖ＤＮＡが、３’末端アミノ化一本鎖ＤＮＡであることを前記遺伝子発現制御方法の好ましい態様として提供する。
【００１１】
さらに、第６には、この出願の発明は、以上の遺伝子発現制御方法において、一本鎖ＤＮＡが、オリゴデオキシリボヌクレオチドである遺伝子発現制御方法を提供する。
【００１２】
この出願の発明は、第７には、上記第１〜第６の発明のいずれかの遺伝子発現制御方法を用いて遺伝子の翻訳抑制機能を制御するアンチセンスドラッグをも提供する。
【００１３】
また、第８には、この出願の発明は、末端アミノ化一本鎖ＤＮＡとメタクリロイルオキシスクシンイミドとのカップリング反応により得られる末端ビニル化一本鎖ＤＮＡとＮ−イソプロピルアクリルアミドモノマーをラジカル重合することを特徴とするＤＮＡ複合体の製造方法を提供する。
【００１４】
そして、この出願の発明は、第９には、末端アミノ化一本鎖ＤＮＡが、３’末端アミノ化一本鎖ＤＮＡであるＤＮＡ複合体の製造方法を提供する。
【００１５】
また、第１０には、この出願の発明は、前記ＤＮＡ複合体の製造方法において、末端アミノ化一本鎖ＤＮＡが末端アミノ化オリゴデオキシリボヌクレオチドであるＤＮＡ複合体の製造方法をも提供する。
【００１６】
【発明の実施の形態】
この出願の発明の遺伝子発現制御方法は、ＤＮＡ複合体におけるＤＮＡ部分の標的遺伝子への結合形態が、ＤＮＡ複合体における刺激応答性ポリマー部分の外部刺激による構造変化に伴って変化するという機構に基づくものである。
【００１７】
図１にこの出願の発明の遺伝子発現抑制方法の概略摸式図を示した。
【００１８】
この出願の発明の遺伝子発現制御方法では、ある条件（Ａ）下では、遺伝子（１）の目的部位（２）に結合する一本鎖ＤＮＡ（３）と刺激応答性ポリマー（４）が連結されてなるＤＮＡ複合体（５）が、遺伝子（１）の目的部位（２）に結合するため、遺伝子上に相補鎖（２’）が形成し、遺伝子の発現が抑制される。一方、条件（Ｂ）下では、ＤＮＡ複合体（５）の刺激応答性ポリマー（４）部分の構造変化により、一本鎖ＤＮＡ（３）部分が目的部位（２）に結合できなくなり、目的部位（２）における翻訳が開始される。つまり、遺伝子発現は抑制されない。
【００１９】
このとき、ＤＮＡ複合体（５）を構成する刺激応答性ポリマー（４）を選択することにより、通常ＤＮＡ分解酵素（ヌクレアーゼ）によって分解されやすい一本鎖ＤＮＡ（３）部分にヌクレアーゼ耐性を付与することができる。
【００２０】
この出願の発明の遺伝子発現抑制方法においては、上記の刺激応答性ポリマー（４）は、温度、光、酸、塩基、ｐＨ、電気等の様々な物理的、あるいは化学的信号に応答して構造変化を起こすものであればどのようなものであってもよい。中でも温度応答性ポリマーは、生体中でも比較的容易に刺激を与えることができ、好ましい。当然ながら、温度応答性ポリマーを結合させたＤＮＡ複合体では、外部刺激として、温度（加熱／冷却）を用いる。また、光応答性ポリマーでは光を、ｐＨ応答性ポリマーでは、緩衝剤（酸性、塩基性）などによるｐＨ変化を、電気応答性ポリマーでは電気信号を用いて刺激を与えればよい。
【００２１】
このようなポリマーとしては、公知、新規の各種のものが考慮される。例えば、温度応答性ポリマーとしては、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）（ＰＮＩＰＡＡｍ）、光応答性ポリマーとしては、ポリ（スチレン−コ−ｐ−フェニルアゾメタクリルアニリド）、ｐＨ応答性ポリマーとしては、ポリ（アクリル酸）などが挙げられる。温度応答性ポリマーであるＰＮＩＰＡＡｍは、その温度応答挙動もよく知られており（Schild, H.G., Prog.Polym.Sci. 17, 163-249, (1992)）、一本鎖ＤＮＡと複合体を形成した際には、応答温度範囲が比較的低く、扱いやすい上、ヌクレアーゼ耐性も高くなるため、好ましい。もちろん、この出願の発明の遺伝子発現制御方法では、ＤＮＡ複合体（５）において用いられる刺激応答性ポリマー（４）はこれらに限定されない。
【００２２】
この出願の発明の遺伝子発現制御方法において、刺激応答性ポリマー（４）をＰＮＩＰＡＡｍとした場合には、ＤＮＡ複合体（５）は、一本鎖ＤＮＡ−ＰＮＩＰＡＡｍとなる。このような一本鎖ＤＮＡ−ＰＮＩＰＡＡｍの製造方法としては、種々の方法が適用されるが、好ましくは、末端アミノ化一本鎖ＤＮＡとメタクリロイルオキシスクシンイミド（ＭＯＳｕ）をカップリングさせ、末端ビニル化一本鎖ＤＮＡとした後、これをＮ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＡｍ）モノマーとラジカル共重合させて得る方法が挙げられる。このとき、カップリング反応や共重合の触媒はどのようなものであってもよく、反応条件もとくに限定されない。例えば、末端アミノ化一本鎖ＤＮＡとＭＯＳｕをＮａ2ＣＯ3−Ｎａ2ＨＣＯ3下でｐＨを調整した反応系でカップリングし、生成物とＮＩＰＡＡｍをＴｒｉｓ−ＨＣｌ下でｐＨを調整し、Ｎ，Ｎ，Ｎ’Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）を開始剤としてラジカル重合させてもよい。もちろん、これら以外の触媒を用いたり、助触媒や添加剤を用いてもよい。また、溶媒、緩衝液、反応温度等も限定されない。さらに、末端アミノ化一本鎖ＤＮＡは、３’末端アミノ化ＤＮＡであることが好ましい。
【００２３】
この出願の発明は、以上のとおりのＤＮＡ複合体（５）の製造方法をも提供する。
【００２４】
さらに、この出願の発明は、前記の遺伝子発現制御方法を用いて遺伝子の翻訳抑制機能を制御するアンチセンス試薬をも提供する。このようなアンチセンス試薬は、前記のとおりに、一本鎖ＤＮＡ（３）部分の標的遺伝子（１）への結合形態が、この一本鎖ＤＮＡ（３）部分に連結した刺激応答性ポリマー（４）部分の外部刺激による構造変化に伴って変化するものであれば、どのようなものであってもよい。
【００２５】
そして、以上のとおりの遺伝子発現制御方法、ＤＮＡ複合体（５）、およびその製造方法において、一本鎖ＤＮＡ（３）は、遺伝子（１）の目的部位（例えば、具体的には、ｍＲＮＡ上のリポソーム結合部位（Shine-Dalgarno配列））に結合でき、遺伝子（１）の転写や翻訳を阻害できるものであればどのようなものであってもよく、分子量や重合度はとくに限定されない。とくに好ましいものとしては、オリゴデオキシリボヌクレオチド（ＯＤＮ）が例示される。
【００２６】
以下、添付した図面に沿って実施例を示し、この発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、この発明は以下の例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることは言うまでもない。
【００２７】
【実施例】
＜実施例１＞  ＤＮＡ複合体の合成
以下の化学式（I）にしたがって、ＤＮＡ複合体を合成した。
【００２８】
【化１】
0003863711.tif 000002
【００２９】
配列表１〜４に示した各種３’末端Ｃ7アミノ化ＯＤＮ（ｍＲＮＡ上のリボソーム結合部位（Shine-Dalgarno配列）を標的配列とした相補的ＯＤＮ；１５アミノ酸配列、２０アミノ酸配列、２０アミノ酸のＭｉｓｍａｔｃｈ配列、２０アミノ酸のＳｃｒａｍｂｌｅ配列）とメタクリロイルオキシスクシンイミド（ＭＯＳｕ）をＮａ2ＣＯ3−Ｎａ2ＨＣＯ3下（ｐＨ７．９）で各々カップリングし、各ＯＤＮの末端にビニル基を導入した。得られた末端ビニル化ＯＤＮとＮ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＡｍ）をＴＥＭＥＤを開始剤としてラジカル共重合させ、ＯＤＮ−ＰＮＩＰＡＡｍ複合体（Ａ１５複合体、Ａ２０複合体、Ｍｉｓｍａｔｃｈ複合体、Ｓｃｒａｍｂｌｅ複合体）を合成した。
【００３０】
反応物を精製した後、逆相ＨＰＬＣによって未反応物を除去した。
＜実施例２＞  遺伝子発現の制御
オワンクラゲ（Aequorea victoria）由来の蛍光タンパク質（ＧＦＰ：Green Fluorescent Protein）をレポーター遺伝子とするin vitro転写／翻訳システムを用いた。
【００３１】
制限酵素ＢａｍＨI、ＢｇｌIIにてＧＦＰのｃＤＮＡを切断、回収し、これを大腸菌発現用ベクターであるｐＥＴ−１６ｂのＴ７プロモーターの制御下へクローニングすることによって、ＧＦＰ発現用ベクター（ｐＥＴ−ＧＦＰ）を構築した。
【００３２】
ＰＮＩＰＡＡｍのみ、Ａ１５複合体、Ａ２０複合体、Ｍｉｓｍａｔｃｈ複合体、およびＳｃｒａｍｂｌｅ複合体の各試料の相転移温度（Ｔｃ）を生理条件下（１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．４）にて測定した。
【００３３】
結果を表１に示した。
【００３４】
【表１】
0003863711.tif 000003
【００３５】
表１より、各ＯＤＮ複合体の相転移温度が３２〜３４℃であることが分かった。したがって、in vitro転写／翻訳実験におけるスイッチング温度を、これらの相転移温度を挟む２７℃と３７℃に設定した。
【００３６】
コントロール発現系（TemplateＤＮＡのみ）での５０９ｎｍにおける蛍光強度を１００％とし、各試料のＧＦＰ発現率を２７℃、および３７℃でインキュベートした場合について求めた。
【００３７】
結果をそれぞれ図２（ａ）および（ｂ）に示した。
【００３８】
ＰＮＩＰＡＡｍのみを用いた場合には、ＧＦＰ発現率がいずれの温度においてもほぼ１００％であった。したがって、ＰＮＩＰＡＡｍは、ＧＦＰの発現に対して阻害効果を有さないことが示された。つまり、ＯＤＮ複合体によるＧＦＰの発現抑制効果は、ＯＤＮ部位のアンチセンス効果によるものであることが示唆された。（図２（ａ）、（ｂ））
また、２７℃では、Ａ１５、Ａ２０のネイティブＯＤＮおよびこれらのＰＮＩＰＡＡｍ複合体（Ａ１５複合体、Ａ２０複合体）は、高いＧＦＰ発現抑制効果を示した。さらに、そのＧＦＰ発現抑制効果は、ｍＲＮＡに対してより安定な相補鎖を形成できるＡ２０の方が高かった。（図２（ａ））
一方、３７℃では、Ａ１５複合体とＡ２０複合体によるＧＦＰ発現の抑制効果が、ネイティブＯＤＮと比べて低かった。（図２（ｂ））
これは、温度上昇による相補鎖の不安定化によるものではなく、ＯＤＮ末端に連結されたＰＮＩＰＡＡｍが相転移することによってＯＤＮとｍＲＮＡとの相補鎖形成が阻害され、結果としてアンチセンス効果が低下したためと考えられる。
【００３９】
以上より、各ＯＤＮ複合体を用いれば、相転移温度を挟んで温度を上下させることにより、ＧＦＰ遺伝子の発現をＯＮ−ＯＦＦ制御できることが確認された。
【００４０】
さらに、Ａ２０とそのＭｉｓｍａｔｃｈ配列およびＳｃｒａｍｂｌｅ配列の各複合体による発現抑制効果を比較したところ、Ｍｉｓｍａｔｃｈ複合体とＳｃｒａｍｂｌｅ複合体の発現抑制効果は、ネイティブＡ１５やネイティブＡ２０よりも低かった。これより、ＯＤＮ複合体による遺伝子発現抑制効果は、ＯＤＮが特異的にｍＲＮＡに作用することによって起こることが示された。
＜実施例３＞  ＯＤＮ複合体のヌクレアーゼ耐性
実施例１で合成された各ＯＤＮ複合体のヌクレアーゼ耐性を評価するために、一本鎖ＤＮＡを特異的に分解するＳ１ ヌクレアーゼを添加した。
【００４１】
ＯＤＮがモノヌクレオチドに分解されると吸光度が上昇することから、Ｓ１ヌクレアーゼ添加後、２６０ｎｍ（ＤＮＡ由来のピーク波長）における吸光度を追跡した。
【００４２】
結果を図３に示した。
【００４３】
Ａ２０複合体における吸光度の上昇が、ネイティブＡ２０の場合よりも遅く、かつ、より低い吸光度で飽和に達したことから、複合体はネイティブＯＤＮに比べて分解されにくいことが確認された。
【００４４】
【発明の効果】
以上詳しく説明したとおり、この発明によって、標的遺伝子の発現をＯＮ−ＯＦＦ制御できる遺伝子発現制御方法と、この方法において用いられる生体内での安定性の高いアンチセンス試薬が提供される。
【００４５】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】この発明の遺伝子発現制御方法を説明する概略摸式図である。
【図２】この発明の実施例において、各ＯＤＮ複合体によるＧＦＰタンパク質の発現率を示した図である。（ａ）２７℃、（ｂ）３７℃
【図３】この発明の実施例において、Ｓ１ヌクレアーゼの存在下におけるＯＤＮとＯＤＮ複合体の分解挙動を２６０ｎｍでの吸光度の経時変化より示した図である。
【符号の説明】
１  遺伝子
２  目的部位
２’  相補鎖
３  一本鎖ＤＮＡ
４  刺激応答性ポリマー
５  ＤＮＡ複合体
【図１】
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【図２】
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【図３】
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