(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ドゥレイヤ（Deleya）属に属する細菌より産生される物質を抽出し、得られた抽出物を精製することを特徴とする次式（II）：
【化３】
0003861133.tif 000006
（式中、Ｒ1及びＲ2は、それぞれ独立して、脂肪酸由来の炭化水素残基を表す。）で示されるグルコシルフォスファチジルグリセロールの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規グリセロール誘導体及びその製造方法に関する。より詳細には、本発明は界面活性剤としての用途が期待される新規グルコシルフォスファチジルグリセロール誘導体及びその製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来より、海洋生物からは生物活性を有する様々な化学物質が発見されており、現在でも生物活性を有する化学物質の探索が行なわれ、医薬品及び研究用試薬の開発のためのリード化合物として供されている。従って、海洋生物から得られる生物活性物質に関する研究は、海洋生物の生態系を解明するための基礎的な研究にとどまらず、広く海洋生物資源の有効利用の観点において産業的にも注目されている。
【０００３】
海洋細菌についても、海洋細菌に存在する機能性成分の単離と構造解析に関する研究がなされており、例えばある種の海洋細菌、シュードモナス・エルジノーサ（Pseudomonas aeruginosa）から、抗菌活性を示す物質が単離・精製され、同定されている。本発明者らも、機能性成分をスクリーニングしているとき、ドゥレイヤ属に属する海洋細菌ドゥレイヤ・マリナ（Deleya marina）の生合成産物中に新規化合物が幾つか存在していることを見出しており、例えば、新規なN-アシルアミノ酸（J.Jap.Oil.Chem.Soc.Vol.44,No.9(1995)635-639）、新規なグリセロール誘導体（特許公報第2913033号）等を報告している。
しかし、ドゥレイヤ属に属する細菌からは未だ見出されていない化合物が数多く存在するものと推定され、詳しくは解明されていない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、海洋細菌を由来とし、界面活性能を有する新規な化学物質及びその製造方法を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決すべく、ドゥレイヤ（Deleya）属細菌を対象とし、当該菌体によって産生される物質に着目して鋭意研究をした結果、特定の新規物質を見出し、それを単離するとともに構造を決定することに成功し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
即ち、本発明は、以下の発明を包含する。
（１）次式（I）：
【化４】
0003861133.tif 000002
（式中、Ｒは、互いに同一であっても異なっていてもよく、それぞれ水素原子、脂肪族アシル基、芳香族アシル基、リン酸基、スルホン酸基、又はスルホン酸塩基を表し、Ｒ1及びＲ2は、それぞれ独立して、脂肪酸由来の炭化水素残基を表す。）で示されるグルコシルフォスファチジルグリセロール誘導体。
【０００７】
（２）次式（II）：
【化５】
0003861133.tif 000003
（式中、Ｒ1及びＲ2は、それぞれ独立して、脂肪酸由来の炭化水素残基を表す。）で示されるグルコシルフォスファチジルグリセロール。
【０００８】
（３）上記式（I）又は式（II）において、Ｒ1及びＲ2が、それぞれ独立して、炭素数８〜３０の飽和或いは不飽和炭化水素であるグルコシルフォスファチジルグリセロール誘導体。
【０００９】
（４）  ドゥレイヤ（Deleya）属に属する細菌より産生される物質を抽出し、得られた抽出物を精製することを特徴とする次式（II）：
【化６】
0003861133.tif 000004
（式中、Ｒ1及びＲ2は、それぞれ独立して、脂肪酸由来の炭化水素残基を表す。）で示されるグルコシルフォスファチジルグリセロールの製造方法。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明の化合物について更に詳細に説明する。
本発明の式（Ｉ）で示されるグルコシルフォスファチジルグリセロール誘導体は、新規化合物であって、式（I）中のＲは、水素原子、脂肪族アシル基、芳香族アシル基、リン酸基、スルホン酸基（−ＳＯ3Ｈ）、又はスルホン酸塩基であり、その各のＲは、互いに同一であっても良いし、異なっていてもよい。
【００１１】
脂肪族アシル基の代表例としては、ホルミル基、アセチル基、プロパノイル基、ブタノイル基等が挙げられるが、なかでもアセチル基が好ましい。
芳香族アシル基の代表例としては、置換若しくは無置換のベンゾイル基又はナフトイル基等のアロイル基が挙げられるが、ベンゾイル基が好ましい。また、その置換基としては、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル等のアルキル基、メトキシ、エトキシ、プロポキシ等のアルコキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基、水酸基、アミノ基、又はスルホン酸基、又はスルホン酸塩基等が挙げられる。
【００１２】
スルホン酸塩の代表例としては、スルホン酸のナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩、アンモニウム塩、有機アンモニウム塩等が挙げられる。
本発明の化合物において、Ｒ1及びＲ2は、それぞれ独立して、脂肪酸由来の炭化水素残基である。その炭化水素としては、炭素数８以上の飽和又は不飽和脂肪酸の炭化水素であり、好ましくは炭素数８〜３０の飽和又は不飽和脂肪酸の炭化水素、より好ましくは炭素数１２〜２２の飽和又は不飽和脂肪酸の炭化水素、更により好ましくは炭素数１６〜１８の飽和或いは不飽和脂肪酸の炭化水素である。
【００１３】
次に、本発明の化合物の製造方法について説明する。
菌体としてはドゥレイヤ（Deleya）属に属し、前記式（Ｉ）で表される本発明の化合物を生産するものであれば特に限定されないが、ドゥレイヤ・ベヌスタ（Deleya venusta：ATCC 27125）が好ましい。
【００１４】
本発明における前記式（Ｉ）で示される化合物は、ドゥレイヤ（Deleya）属に属する細菌、好ましくはドゥレイヤ・ベヌスタ（Deleya venusta：ATCC 27125）の生産する物質を常法により抽出し、その抽出物を精製し、次いで得られた物質を適宜誘導体化することにより得られる。
上記細菌の培養は、資化可能な炭素源、窒素源を含む培地で行なうことが好ましい。所望により、上記培地にその他の無機物、生育・促進物質等の必要な物質を加えてもよい。そのような培地であれば、合成培地、天然培地のいずれも使用可能であるが、人工海水中で培養することが好ましい。
【００１５】
上記の炭素源としては、アラビノース、フラクトース、グルコース、イノシトール、マンニトール、ラフィノース、ラムノース、シュークロース、キシロース、澱粉、デキストリン、マンノース、ラクトース、糖蜜等の糖類、酢酸等の有機酸、グリセリン等のアルコール類が挙げられ、Ｄ−グルコースが好ましく、これら炭素源を、単独でも又は２種以上を組合わせて用いてもよい。
【００１６】
上記の窒素源としては、ペプトン、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、尿素、肉エキス、酵母エキス、乾燥酵母、コーン・スチープ・リカー、大豆粉、カザミノ酸等が挙げられ、ペプトン、酵母エキス、乾燥酵母が好ましく、これら窒素源を、単独でも又は組合せて用いてもよい。
【００１７】
上記の無機物としては、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、炭酸カルシウム、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、硫酸第一鉄、塩化カルシウム、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、硫酸銅等の無機塩類が挙げられ、これら無機物を必要に応じて培地に加えてもよい。
培養温度は、通常２０〜３０℃、好ましくは２３〜２７℃である。
【００１８】
培地のｐＨは、通常５．５〜８．０、好ましくはｐＨ６．０〜７．５である。次に、培養した培養物を遠心分離によって培養ろ液と菌体とに分離する。得られた菌体を乾燥させて、乾燥菌体から目的の化合物を溶媒で抽出する。抽出に使用する溶媒としては、有機溶媒若しくは２種以上の有機溶媒の混合溶媒、又はそれらの有機溶媒と水との混合溶媒が挙げられる。
有機溶媒の代表例としては、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール等のアルコール、クロロホルム等の塩素化炭化水素等が挙げられるが、クロロホルム／メタノールの混合溶媒が好ましい。
【００１９】
次に、抽出液を濃縮した後、抽出物から目的とする本発明の化合物を分離精製する。精製方法としては、例えば、ＯＤＳカラムクロマトグラフィー、順相シリカゲルクロマトグラフィー、逆相シリカゲルクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）、逆相ＨＰＬＣ、ゲル濾過、分取用ＴＬＣ（分取用薄層クロマトグラフィー）等が挙げられ、これらを適宜組合せて行なうことができる。好ましくは、抽出物をＯＤＳカラムクロマトグラフィーにより、メタノール、クロロホルム、及び水から選択される１種以上の溶媒を組合せた混合溶媒により極性の高い溶媒から極性の低い溶媒へと順次溶出させ、目的とする化合物を含む画分を分取用ＴＬＣによりクロロホルム、メタノール、及び水から選択される１種以上の溶媒を組合せた混合溶媒で展開して他の成分と分離することにより、目的とする本発明の化合物（II）を含む画分を得る。
【００２０】
この化合物（II）を含む画分を、例えば逆相ＨＰＬＣ等の精製方法によってさらに精製することにより純粋な化合物（II）を単離することができる。
上記のようにして得られた新規化合物（II）を含む画分を、常法によりアセチル化、ベンゾイル化等のアシル化反応、又はスルホン化反応等を行なった後、通常の精製方法によりその誘導体を単離することができる。スルホン化した場合は、更に常法により前述した種々の塩の形に変換することができる。
【００２１】
以上のようにして得られる、本発明の新規グルコシルフォスファチジルグリセロール誘導体は、それを構成するグリセロールの脂肪酸エステル等が従来より非イオン性界面活性剤として用いられているように、本発明の化合物もまた界面活性作用を有する。
本発明の化合物を界面活性剤として用いる際、その有効濃度は、界面活性を発揮できる範囲内であれば特に限定されないが、５〜１０ｍｇ／ｍｌが好ましい。
【００２２】
【実施例】
以下、本発明を実施例により更に具体的に説明するが、本発明の範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
実施例１
化合物（II）の単離操作
ドゥレイヤ・ベヌスタ（Deleya venusta：ATCC 27125）を１％グルコース、０．３％ペプトン、０．１％乾燥酵母エキスを含む人工海水中（Tropic Marine：Aquarien  tecnikwaterberg, Germany）、２５℃で培養した。培養液を６０００gで１０分間遠心分離にかけ菌体を分離し、これを蒸留水で１回洗浄し凍結乾燥した。得られた乾燥菌体をクロロホルム/メタノール（１/２）で抽出し、抽出液を濃縮乾固した。
次いで、クロロホルムに可溶な画分をODSカラムに吸着させて、７０％メタノール水溶液、９０％メタノール水溶液、メタノール、メタノール/クロロホルム（８/２）、メタノール/クロロホルム（１/１）、クロロホルム/メタノール/水（７/３/０．５）の順で溶出した。このうちメタノール/クロロホルム（８/２）で溶出した画分を分取用ＴＬＣにのせ、クロロホルム/メタノール/水（６５/２５/４）で展開し（Ｒｆ＝０．３６）、目的の成分をかきとってクロロホルム/メタノール（２/１及び１/２）で溶出した。その後、溶媒を留去して目的の化合物（II）を含む画分を得た。
【００２３】
実施例２
（１）化合物（II）のアセチル化誘導体の製造
本発明の化合物の化学構造を決定するために、化合物（II）のアセチル化誘導体を製造し単離した。
実施例１で得た化合物（II）を含む画分をピリジン/無水酢酸（２/１）と室温で１８時間反応させた。反応終了後、溶媒を留去して濃縮し、残渣を分取用ＴＬＣにのせ、クロロホルム/メタノール（８/２）で展開し（Ｒｆ＝０．５）目的の成分をかきとってクロロホルム/メタノール（２/１）で溶出した。溶媒を留去して化合物（II）のアセチル化誘導体を黄色油状物として得た。
【００２４】
（２）化合物（II）のアセチル化誘導体の構造解析
化合物（II）のアセチル化誘導体の構造解析を行なった。
ニンヒドリン反応は陰性であり、また、αーナフトール反応は陽性であった。ディットマー（Dittmer）試薬により陽性を示すことから、本発明の化合物はリン酸を含むことが推定された。
化合物（II）のアセチル化誘導体（図１）の1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）及び13Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）のＮＭＲデータを、以下の表１に示す。
【００２５】
【表１】
0003861133.tif 000005
【００２６】
COSYとHOHAHAスペクトルの解析から、H1-H6、H7-H9、H10-H12の結合が決定され、これらのプロトンに結合しているカーボンをHMQC（Heteronuclear MultipleQuantum Coherence：異核種多量子コヒーレンス）の測定から決定した。
H1-H12のプロトンとそのプロトンに結合しているカーボンのケミカルシフトから、H1-H6は糖、H7-H9、H10-H12はグリセロール骨格に結合したプロトンであることがわかった。アセチル化体において観測されたカップリング定数J2-3 10.31 Hz、J3-4  9.45 Hz、J4-5 10.25 Hzの値から、H2、H3、H4、H5はアキシアルの配置であることがわかった。このことから、糖骨格はグルコピラノースであることがわかった。また、J1-2  3.50 Hzであることから、このグルコピラノースはα-アノマーであることがわかった。
【００２７】
また、プロトンとカーボンのＮＭＲスペクトルから、脂肪酸の存在が推定されたので、化合物（II）のアセチル化誘導体を塩酸／メタノールでメタノリシスして乾固した後、ヘキサンと水とで２相分配してヘキサン層をとり、ヘキサン層をGC-MS（ガスクロマトグラフ−質量分析法）で分析し脂肪酸組成を決定した。マスフラグメントと分子イオンピーク（m/z＝268, 270, 296）から、炭素数１６の飽和脂肪酸、炭素数１６及び１８の不飽和脂肪酸が存在することを確認した。
【００２８】
次に、HMBC（Heteronuclear Multiple Bond Connectivity：異核種多種結合結合性）スペクトルの解析から、上記のようにして決定したグルコピラノース、グリセロール骨格及び脂肪酸の部分構造が、それぞれどの位置で結合しているかを調べた。H7からC1へHMBCの相関が出ていることより、H7-H9のグリセロール骨格と糖の結合位置がわかった。H11、H12から脂肪酸のカルボニル炭素C13、C14へHMBCの相関が出ていることから、脂肪酸はC11とC12の酸素に結合していることがわかった。またリン酸は、HMBCでまだ結合部分が決まっていないC9とC10を結ぶ間に位置すると推定された。
以上の解析から決定された化合物（II）のアセチル化誘導体の分子構造及びHMBCの主要な相関を図１に示す。
【００２９】
【発明の効果】
本発明により、界面活性剤としての用途が期待される新規なグルコシルフォスファチジルグリセロール誘導体を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の新規グルコシルフォスファチジルグリセロール誘導体の分子構造、及びHMBCの主要な相関を示した図である。図中、Ｒはアセチル基を表し、Ｒ1及びＲ2は、それぞれ独立して炭素数１６又は１８の脂肪酸由来の炭化水素基を表す。また矢印は、HMBCの相関を表す。
【図１】
0003861133.tif 000007