(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物により直接発酵生産されたＤ−パントテン酸の発酵液から不溶物を分離し；
活性炭を用いて発酵液を脱色して、Ｄ−パントテン酸を含む溶液を得；
Ｄ−パントテン酸を含む溶液のｐＨを１〜５に調整し；
Ｄ−パントテン酸を含む溶液を、糖類がＤ−パントテン酸よりも低い吸着力を有し、２基以上直列に連結したカラムに充填した粒状または顆粒状活性炭と連続して接触させて、Ｄ−パントテン酸を活性炭に飽和吸着点まで吸着させ；
親水性有機溶媒でＤ−パントテン酸を溶出させ；
カルシウムを含むアルカリ剤で溶出液を中和し、Ｄ−パントテン酸カルシウムを析出させ；
Ｄ−パントテン酸カルシウムを採取する、
工程を含むことを特徴とするＤ−パントテン酸カルシウムの製造法。
【請求項２】
親水性有機溶媒が炭素数１〜５の低級アルコールである請求項１記載の製造法。
【請求項３】
低級アルコールがメチルアルコールである請求項２記載の製造法。
【請求項４】
カルシウムを含むアルカリ剤が水酸化カルシウムである請求項１記載の製造法。
【請求項５】
親水性有機溶媒がメチルアルコールであり、カルシウムを含むアルカリ剤が水酸化カルシウムであって、Ｄ−パントテン酸カルシウムを４分子のメチルアルコール、１分子の水をもつ結晶として採取する請求項１記載の製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は微生物により直接生産されたＤ−パントテン酸発酵液からのＤ−パントテン酸カルシウムの製造法に関する。Ｄ−パントテン酸カルシウムはビタミンとして医薬, 食品および飼料分野で広く使用される有用なものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来、パントテン酸カルシウムの製法は、化学合成法と直接発酵法に大別される。化学合成法としては、イソブチルアルデヒドを出発原料として合成されたＤ, Ｌ−パントラクトンを化学的あるいは酵素的方法で光学分割し、得られたＤ−パントラクトンをβ−アラニンカルシウムと縮合させてＤ−パントテン酸カルシウムとする方法が工業的規模で広く行われている。直接発酵法としては最近、糖, β−アラニンを原料として微生物によりＤ−パントテン酸を直接生産させる新規な製造法が報告された(特開平６−２６１７７２)。その中では、Ｄ−パントテン酸直接発酵液からのＤ−パントテン酸カルシウムの製造法として、イオン交換樹脂による脱塩処理後中和してカルシウム塩として濃縮し、メチルアルコール添加後(メチルアルコール濃度８３v／v％)Ｄ−パントテン酸カルシウム結晶を析出させるという方法が記載されている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
直接発酵法は化学的合成法に較べ光学分割が不要であるなどより効率的ではあるが、発酵液はＤ−パントテン酸の他菌体などの不溶物および単糖、オリゴ糖、有機酸、タンパク質、無機塩(陽イオン、陰イオン)など種々の可溶性不純物を含んでいるので、この発酵液からいかに効率的かつ収率良く純度の高いＤ−パントテン酸カルシウムを分離精製するかが最大の問題点であった。前記公開特許公報記載の方法においては、イオン交換樹脂による脱塩処理後Ｄ−パントテン酸を中和してカルシウム塩として濃縮し、メチルアルコールを添加して(メチルアルコール濃度８３％)Ｄ−パントテン酸カルシウム結晶を析出させる製造法が記載されているが、▲１▼発酵液に含まれる単糖、オリゴ糖がイオン交換樹脂処理では分離除去できず晶出原液の段階でパントテン酸あたり約１０％存在し、そのためイオン交換樹脂処理液濃縮時の熱による発色や、晶出時の晶出収率の低下の原因となる、さらに▲２▼高晶出収率を得るために晶出原液のＤ−パントテン酸カルシウム濃度が７w／v％以上でメチルアルコール濃度が約９０v／v％となるようメチルアルコール添加前に水性溶出液を高濃度に(Ｄ−パントテン酸カルシウム約５０w／v％)濃縮する必要があるが、この濃度付近のＤ−パントテン酸カルシウム溶液の粘度はかなり高く濃縮操作が困難であるといった欠点がある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは直接発酵法によって得られ、Ｄ−パントテン酸以外に糖等の不純物を含む培養液から効率的かつ収率良く高品質のＤ−パントテン酸カルシウムが得られるような製造法を鋭意研究した結果、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は、微生物により直接発酵生産されたＤ−パントテン酸を含む溶液を活性炭と接触させてＤ−パントテン酸を活性炭に吸着させたのち、親水性有機溶媒で溶出し、ついでカルシウムを含むアルカリ剤で中和して析出するＤ−パントテン酸カルシウムを採取することを特徴とするＤ−パントテン酸カルシウムの製造法である。
本発明における微生物により直接生産されるＤ−パントテンを含む溶液は特開平６−２６１７７２に記載されているようにＤ−パントテン酸合成能を有する微生物、例えば腸内細菌エシェリヒア・コリ  ８１４／pＦＶ３１株(ＩＦＯ  １５３７４, ＦＥＲＭ  ＢＰ４４０１)を例えばグルコースを糖原料とする培地で培養し、β−アラニンを接触させて得られる。このときＤ−パントテン酸の生成量は通常４０g／リットルである。該溶液はたとえば遠心分離、濾過など、通常液中の不溶物を除去する方法により菌体などの不溶性固形物を除いておくのが後の活性炭処理での炭の汚れ防止、炭の寿命延長などの点から望ましい。
菌体などの不溶性固形物が除かれたＤ−パントテン酸を含む溶液はたとえば塩酸、硫酸などの無機酸によりpＨを通常１〜５、好ましくはpＨ２〜４に調整する。pＨが１未満になるとＤ−パントテン酸の分解が起こりやすくなり収率が低下し、pＨが５を越えるとＤ−パントテン酸の活性炭への吸着量が少なくなり、一方糖の吸着力が増して糖類の分離除去が悪くなる。
【０００５】
本発明に用いられる活性炭は特に限定されないが、通常液相分離用として市販されているものならどのようなものでも用いることができる。例えば、直径３００Å以下の細孔の全細孔容積(以下単に「細孔容積」という。)が０.４cc／g以上、直径３００Å以下の細孔の平均細孔直径(以下単に「平均孔径」という。)が１７Å以上の細孔特性を有する活性炭が好適なものとして挙げられる。このような特定の細孔特性を有する活性炭は例えば、１)木材片、ヤシガラなどの木質原料を、塩化亜鉛、リン酸、塩化カルシウムなどの薬品に浸漬し、約６００〜７００℃で焼成した後、例えば、塩酸などの酸によって添加薬品類を脱離、洗浄することにより、あるいは２)石炭、石油ピッチなどの鉱物系原料を、アルカリで処理してから、水蒸気、炭酸ガスなどにより７５０〜９００℃で賦活することによって得られる。活性炭の形状は粉末状、粒状、顆粒状のいずれでもよいが、カラムに充填して使用する場合塔圧抑制から粒状、顆粒状が好ましい。活性炭の具体例としては、粒状白鷺ＫＬＨ(武田薬品製, 細孔容積１.０９cc／g, 平均孔径３２Å)、粒状白鷺Ｗ(武田薬品製, 細孔容積０.４９cc／g, 平均孔径１８Å)、粒状白鷺ＬＨ２Ｃ(武田薬品製, 細孔容積０.７４cc／g, 平均孔径１９Å)、ＣＡＬ(ＣalgonＣorporation製, 細孔容積０.５５cc／g, 平均孔径２１Å)、粒状活性炭ダイヤホープ００８(三菱化学製, 細孔容積０.６１cc／g, 平均孔径２０Å)等が挙げられる。
被処理液と活性炭とを接触させる方法としては、例えば、固定床吸着法、すなわちカラムに充填した活性炭に被処理液を流す方法が適当である。この方法によれば、不純物のクロマト的分離除去ができ、さらに親水性有機溶媒によるＤ−パントテン酸の溶出液の分画も容易にできる。実用的には、直列する２基以上の活性炭充填カラムに被処理液を流してＤ−パントテン酸を活性炭に吸着させる、いわゆるシリーズ吸着が好ましい。
【０００６】
２つのカラムを用いる場合を例にとって吸着処理法を説明する、すなわち図１に示すように、活性炭充填カラムＡ塔およびＢ塔を直列に繋ぎ通液路(i)→(ii)→(iv)→(v)→(vi)の順に被処理液を流し、Ａ塔の出口のパントテン酸濃度がＡ塔の入口の濃度と同一になる時点まで通液する。出口と入口の濃度が同一となればＡ塔とＢ塔を切り離し、Ｂ塔へ通液を切り替え、Ｂ塔に別の活性炭塔を直列に繋ぎ、Ｂ塔の出口と入口のパントテン酸濃度が同一になるまで通液する。
図２はＬＨ２Ｃ炭塔にＤ−パントテン酸直接発酵液を菌体分離および脱色用活性炭で脱色処理し、塩酸でpＨ３に調整したＤ−パントテン酸を含む溶液を通液したときのＤ−パントテン酸および糖類の成分漏出曲線を示す。Ａ塔出口と入口のパントテン酸濃度が同一となる点は飽和吸着点(b)であり、Ｄ−パントテン酸の漏れのない(a)で示される破過吸着点までと較べると約１.５倍のＤ−パントテン酸を吸着している(約２００g／リットル−ＬＨ２Ｃ)。破過吸着点以降漏れ始めたＤ−パントテン酸は次塔で吸着される。このとき被処理液に共存する糖類や他の不純物の活性炭に対する吸着力がＤ−パントテン酸より弱いため通液途中Ｄ−パントテン酸に追い出され漏出率が２５０％まで達しその後飽和吸着点に至るまで処理すると、被処理液中の糖類の９０％以上が分離除去されることを見いだした。このことは当業者にとっても全く予想外の新知見であった。また被処理液に含まれる無機塩(陽イオン、陰イオン)は活性炭に吸着されず吸着廃液に流れ分離除去できる。
【０００７】
次にＤ−パントテン酸が飽和吸着された活性炭カラムに親水性有機溶媒を流しＤ−パントテン酸を溶出する。親水性有機溶媒としてメチルアルコール、エチルアルコール、イソプロピルアルコールなどの炭素数１〜５の低級アルコールを有利に使用することができるがメチルアルコールが後工程の晶出の際特に有利である。すなわちＤ−パントテン酸カルシウムの結晶は多晶形で溶媒環境によりα,β,γ晶、４分子のＭeＯＨ・１分子のＨ2Ｏをもつ結晶(４ＭeＯＨ・１Ｈ2Ｏ晶)、および無晶形をとるが、メチルアルコールを溶出溶媒として用いた場合の晶出原液から析出する４ＭeＯＨ・１Ｈ2Ｏ晶は粒状であり、分離性が極めて良い。溶出温度は１０〜３０℃、好ましくは２０〜３０℃である。
メチルアルコールを使用して活性炭カラムからＤ−パントテン酸を溶出させる状況を実施例１における成分溶出曲線を示す図３を例にとって説明する。
最初の０.７vol溶出区分(対ＬＨ２Ｃ炭  vol)はカラムに保持されている水が押し出される区分であり、この区分のＤ−パントテン酸濃度はわずか０.４％w／v％であった。次の１.５vol溶出区分はＤ−パントテン酸濃度が８.７w／v％（移行量９０％）、水分含量が７.５w／v％であった。被処理液のＤ−パントテン酸濃度は２.６w／v％であったので、この溶出区分は吸着、溶出により約３.４倍濃縮されたことになる。さらに最後の０.８vol溶出区分はＤ−パントテン酸濃度が０.９w／v％(移行量４％)、水分含量が０.０５w／v％であった。
【０００８】
溶出液の親水性有機溶媒濃度およびＤ−パントテン酸濃度は、のちの晶出操作における晶出効率に関連して、溶媒濃度は、通常８０〜９８v／v％、好ましくは８５〜９５％、さらに好ましくは９０〜９２％であり、Ｄ−パントテン酸濃度は７w／v％以上が好ましい。従って上記の１.５vol溶出区分はそのまま中和して晶出原液とすることができる。
ついで溶出液はカルシウムを含むアルカリ剤で中和する。このアルカリ剤は、溶出液に含まれるＤ−パントテン酸を中和するに十分なカルシウムを含むものであればどのようなものでもよいが、水酸化カルシウムが好適である。より実用的には、溶出液にＤ−パントテン酸に対してほぼ等モルの粉末状水酸化カルシウムを加える。未反応の水酸化カルシウム微粉末がでる場合は、濾過して除去するのがよい。中和は、Ｄ−パントテン酸カルシウムの結晶析出を防ぐため、液温を１５℃以上に保持するのがよい。
【０００９】
このようにして調製された晶出原液を１０℃以下、望ましくは５℃以下に冷却後Ｄ−パントテン酸カルシウムに対し種晶を約０.２％添加し０〜５℃で攪拌しながら好ましくは１０時間以上放置すればパントテン酸カルシウムの結晶を収率良く得ることができる。晶出スラリーを常法の遠心脱水機などによる遠心分離あるいはフィルタープレスなどの濾過により採取して湿結晶を得る。
メチルアルコールを溶出溶媒として用いたとき、該湿結晶は約２５w／w％のメチルアルコール、約５w／w％の水分を含有する。湿結晶はそのまま７０〜８０℃の減圧乾燥すると、水分約０.５％まで乾燥することができる、さらに必要に応じ調湿空気(８０℃, ＲＨ２０％)を用いて乾燥すれば、水分約２％に調湿することができ、実質的にメチルアルコールを含まないＤ−パントテン酸カルシウム粉末を得ることができる。また湿結晶を水に溶解し濃度約５０w／v％まで濃縮・脱溶媒した溶液を常法のスプレードライヤーにより噴霧乾燥してＤ−パントテン酸カルシウム粉末を得ることもできる。乾燥品の結晶形はすべて無晶形に転換する。
上記のごとく、本方法は活性炭カラムにＤ−パントテン酸を含む溶液を通液することにより活性炭にＤ−パントテン酸を飽和吸着させ、同時に無機イオン, 糖類が効果的に分離除去でき、アルコールなどの親水性有機溶媒で溶出して溶媒濃度、Ｄ−パントテン酸濃度を考慮した区分を選択すればそのまま中和、晶出工程の出発原液とすることができ、さらに晶出後の分離、採取も容易であるなど極めて効率的な高純度Ｄ−パントテン酸カルシウムの製造法である。
【００１０】
【実施例】
以下に実施例をもって本発明の内容をより具体的に説明するがこれらはいずれも本発明の内容を例示するものにすぎず、本発明の範囲を限定するものではない。  実施例１
エシェリヒア・コリＩＦＯ  ８１４／pＦＶ３１株を、グルコースを炭素源とする培地を用いて５リットル容ジャーファメンターで常法により培養して２.５リットルのＤ−パントテン酸直接発酵液を得た。細孔径０.１μのセラミックフィルター(東芝セラミック社製)を使用して４０℃で濾過し、菌体などの不溶性固形物を除いた濾液１.６７リットルを得た。本液にはＤ−パントテン酸が３８.５mg／ml(６４.３g)、糖(フェノール硫酸法による全糖)が１０.３mg／ml(Ｄ−パントテン酸あたり約２７％)含まれていた。本濾液を脱色用活性炭Ｋ−１(武田薬品製, 細孔容積１.１２cc／g、平均孔径３２Å)を充填した内径７０mm、高さ１３０mmのカラム(充填容積５００ml)に通液し、水洗液と合わせて脱色率９９.５％の液２.４リットルを得た。本液に濃塩酸５６mlを加えpＨを３.０に調整し、液相分離用活性炭・ＬＨ２Ｃ炭(粒状・水蒸気賦活炭、武田薬品製)を充填した内径５０mm、高さ１００mmのカラム(充填容積２００ml)２塔(ＡおよびＢ塔)を直列に繋ぎ連続して通液した。Ａ塔への飽和吸着点までの通液量は２.２リットルであった。この操作によりＡ塔にはＤ−パントテン酸が２９g(１４５g／リットル−ＬＨ２Ｃ炭)吸着されたことになる。飽和吸着点以降Ａ塔とＢ塔を切り離し、残りの液はＢ塔に通液する。Ａ塔は６００mlの水で洗浄後メチルアルコールでＤ−パントテン酸の溶出を行った。すなわち最初の０.７vol・１４０mlは捨て(Ｄ−パントテン酸の損失は２％)、次の１.５vol・３００ml(Ｄ−パントテン酸移行量約９０％)を晶出工程に進めた。また最後の０.８vol・１６０ml(Ｄ−パントテン酸移行量４％)は次塔の溶出剤として使用しＤ−パントテン酸を回収した。
上記１.５vol・３００ml区分のＤ−パントテン酸含量は８.７w／v％(２６.３g)、全糖含量は０.４３w／v％(Ｄ−パントテン酸当たり５％)、またメチルアルコール濃度は９２.５v／v％であった。本溶出区分に水酸化カルシウム粉末４.８gを加え十分に攪拌しＤ−パントテン酸を中和しカルシウム塩(Ｄ−パントテン酸カルシウム２８.６g)とした。次にケイソウ土をプレコートしたヌッチェで濾過し晶出原液とした。これらの操作は２０〜２５℃で行った。晶出原液を攪拌機のついた丸底フラスコに移し５℃まで冷却後５７mg(対Ｄ−パントテン酸カルシウム０.２％)の種晶を加えさらに２℃まで冷却し、１５時間保持して晶出を行った。晶出スラリーを３Ｇのガラスフィルターで濾過し、５℃のメチルアルコールを噴霧して洗浄し４分子のＭeＯＨ、１分子のＨ2ＯをもつＭeＯＨ含量２６％、水分４％の湿結晶３６.６gを得た(Ｄ−パントテン酸カルシウム３４.４g:晶出収率９０％)。本湿結晶を常法の８０℃減圧乾燥、さらに８０℃・ＲＨ２０％の調湿空気乾燥により水分２.４％のＤ−パントテン酸カルシウム乾燥粉末２６.１gを得た。本製品は溶状（清澄度、色）、カルシウム含量、窒素含量、比旋光度、結晶型などについての日本、米国、英国規格に適合した。
【００１１】
【発明の効果】
本発明によれば、微生物が直接発酵生産したＤ−パントテン酸を含む溶液を活性炭に接触させてＤ−パントテン酸を飽和吸着させることにより不純物特に糖を効率的に除去し、その後メチルアルコールなどの親水性有機溶媒で溶出してそのまま晶出操作を行うことにより発酵濾液から非常に効率的かつ高収率で高品質のＤ−パントテン酸カルシウムを得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  活性炭充填カラムＡ塔、Ｂ塔を直列に連結した固定床の模式図であり、(i)〜(vi)は通液路を示す。
【図２】  被処理液をＬＨ２Ｃ炭カラムに通液したときの成分漏出曲線で、細実線ＡはＤ−パントテン酸の破過曲線、太実線Ｂは糖の破過曲線を示す。(a)はＤ−パントテン酸の破過吸着点、(b)はＤ−パントテン酸の飽和吸着点を示す。
【図３】  メチルアルコールを溶出溶媒とするＬＨ２Ｃ炭カラムからの成分溶出曲線を示す。細実線ＡはＤ−パントテン酸、太実線Ｂは水分、点線Ｃは糖の溶出曲線である。
【図１】
0003776160.tif 000002
【図２】
0003776160.tif 000003
【図３】
0003776160.tif 000004