(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物の胸腺細胞核をペプシン酵素分解処理して得た高リシンヒストン画分から抽出された蛋白質を含有し、且つ、二次元電気泳動ゲル上で、下記ａ）及びｂ）の性質を示すことのできる組成物:
ａ）健康な人の血清からはβ−、α1−及びα2−マクログロブリン類に隣接した位置に単一の連続した沈殿スパーを沈殿させることが出来、且つ、
ｂ）ＡＩＤＳ患者の血清からはβ−、α1−及びα2−マクログロブリン類に隣接した位置に単一の連続した沈殿スパーを沈殿させることがない。
【請求項２】
ｐＨが約７．６４と８．６との間にある請求項１記載の組成物。
【請求項３】
採取検体中にａ胸腺因子蛋白質の断片が存在するか否かを検定し、それが検出された際、その断片化パターンを検定して、前記ａ胸腺因子蛋白質断片を生ずる感染症を診断する方法に於いて前記ａ胸腺因子蛋白質断片に結合させるために使用される請求項１記載の組成物。
【請求項４】
前記断片化パターンを前記組成物中の蛋白質と結合したａ胸腺因子蛋白質断片の沈殿パターンより検定する方法に用いられる請求項３記載の組成物。
【請求項５】
二次元ゲル電気泳動を使用し、且つ、該電気泳動に於ける前記蛋白質と前記ａ胸腺因子蛋白質との沈殿パターンがβ−、α1−及びα2−マクログロブリン類に対する位置からも検定される沈殿パターン検定方法に用いられる請求項４記載の組成物。
【請求項６】
前記採取検体が血清、血液および血漿よりなる群から選択される請求項５記載の組成物。
【請求項７】
（ａ）哺乳動物の胸腺細胞から核を分離し、ペプシン酵素分解してリシンに富んだヒストン部分を抽出、精製する工程；（ｂ）前記高リシンヒストン部分がカチオン交換クロマトグラフィ物質に結合するのに充分な時間両者を接触させる工程；及び（ｃ）適当な塩水溶液を接触させて前記カチオン交換クロマトグラフィ物質から前記高リシンヒストン画分を溶離させる工程；からなることを特徴とする請求項１に記載の組成物の調製方法。
【請求項８】
更に、前記高リシンヒストン画分の溶離物を捕集する工程を含む請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記カチオン交換クロマトグラフィ物質がカルボキシメチルカラムクロマトグラフィであり、該カルボキシメチルカラムは洗浄され、そして前記高リシンヒストン画分は、０．０５Ｍ酢酸ナトリウム溶液中で塩化ナトリウムのリニアー斜傾溶出法を適用してｐＨ６．８で溶離される請求項７又は８記載の方法。
【請求項１０】
前記高リシンヒストン画分が、細胞核をペプシンを用いた酵素処理により解凝集し、該解凝集された混合物を精製して得られたものである請求項７乃至９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
哺乳動物の胸腺細胞核をペプシン酵素分解処理して得た高リシンヒストン画分から抽出された蛋白質であって、
前記蛋白質は、メチル化されている又はメチル化されていない或いは両者が混在するものからなり、且つ、メチル化されていないものは、１１％の非還元性ドデシル硫酸ナトリウム塩・ポリアクリルアミドゲル電気泳動で測定して約３５キロドルトンの分子量を、メチル化されているものは、約２８キロドルトンの分子量を、それぞれ有すると共に前記蛋白質は約５．６の等電点を有し、然も、二次元電気泳動ゲル上で、下記ａ）及びｂ）に記載の性質を示す蛋白質：
ａ）健康な人の血清からはβ−、α1−及びα2−マクログロブリン類に隣接した位置に単一の連続した沈殿スパーを沈殿させることが出来、且つ、
ｂ）ＡＩＤＳ患者の血清からはβ−、α1−及びα2−マクログロブリン類に隣接した位置に単一の連続した沈殿スパーを沈殿させることがない。
【請求項１２】
流体状の検体を分配させるための領域及び請求項１記載の組成物又は請求項１１記載の蛋白質を分配させるための領域を有する固体担体を含み、該固体担体は検体を前記組成物又は蛋白質と接触させて沈殿を生成させ、且つ、その沈殿の検出が可能に構成された人のＨＩＶ感染症用のインビトロ検出装置。
【請求項１３】
前記固体担体が二次元電気泳動用ゲルであり、前記接触と沈殿が二次元電気泳動法により達成され、且つ前記検体が血液、血清及び血漿よりなる群から選ばれる請求項１２記載の装置。
【請求項１４】
ａ）前記請求項１に記載の組成物又は前記請求項１１に記載の蛋白質を収容した容器、及び、ｂ）二次元電気泳動を行うのに適する電気泳動ゲルを備えた装置、よりなる人のＨＩＶ感染症用のインビトロ検出に有用なキット。
【請求項１５】
ａ）哺乳動物の胸腺から細胞核を抽出する工程、ｂ）該細胞核からペプシン酵素分解を含む処理により高リシン蛋白質部分を得る工程、及び、ｃ）β−、α1−及びα2−マクログロブリン類を沈殿させる能力を基準として前記高リシン部分から蛋白質を精製する工程からなる請求項１１に記載の蛋白質を精製する方法。
【請求項１６】
ＨＩＶ感染者の処置のために投与される組成物であって、請求項１１記載の蛋白質を含有することを特徴とする組成物。
【請求項１７】
前記蛋白質が人以外の哺乳動物の胸腺細胞核から得られたものである請求項１６記載の組成物。
【請求項１８】
前記請求項１１記載の蛋白質の精製物からなる人の抗−ＨＩＶ免疫応答を増進するために投与される組成物。
【発明の詳細な説明】
これは１９９５年５月１日に出願された米国特許出願番号０８／４３１，８８３号の一部継続出願である１９９５年６月７日に出願された米国特許出願番号０８／４８５，５４８の一部継続特許出願である。
発明の技術分野
本発明は免疫学およびウイルス学の分野に関し、そして特にヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染症並びに関連疾病、例えば後天性免疫不全症候群（エイズ）およびエイズ関連合併症（ＡＲＣ）のための診断用剤、処置又は免疫応答増進用剤として有用な哺乳動物の胸腺細胞から得られる胸腺因子蛋白質およびそれからなる組成物に関する。
更に、該蛋白質および組成物を使用する診断装置、キットにも関する。
発明の背景
骨髄は免疫細胞になることが予定されている細胞を生成する。これらの細胞はリンパ球または食細胞になる。リンパ球は免疫系の活動を行うための主な任務を有する小白血球である。リンパ球の２つの主な種類はＢ細胞およびＴ細胞である。Ｂ細胞は骨髄中で成熟する（それ故「Ｂ細胞」という名称である）。Ｔ細胞は胸腺に泳動し（それ故「Ｔ細胞」という名称である）、そこでそれらは増殖しそして免疫応答可能細胞に成熟する。骨髄および胸腺から出ると、ＢおよびＴ細胞の両者は身体の中を広く且つ連続的に移動する。
Ｔ細胞には２つのタイプ、すなわち２つの主なやり方で免疫防御に寄与する調節および細胞障害性Ｔ細胞、がある。Ｔ細胞の中で主なものは「ヘルパー／インデューサー」細胞である。Ｔ４細胞マーカーにより同定できるようにヘルパーＴ細胞がＢ細胞および他のＴ細胞並びに天然キラー細胞および大食細胞を活性化させるために必須である。細胞障害性Ｔ細胞は、例えばウイルスにより感染されているかまたは癌により形質転換されている細胞本体を直接攻撃しそして除去する。
重要な食細胞は単細胞および大食細胞である。単細胞は血液の中を循環し、次に組織の中に泳動し、そこでそれらが大食細胞「ビッグイーター」に発達する。大食細胞は身体組織全体で見られそして多くの役割を演ずる多目的細胞である。スカベンジャーとして、それらは疲弊細胞および他の破片を除去する。最初に抗原を消化しそして処理したＴ細胞に対して抗原を示す最も重要な細胞である大食細胞が免疫応答において重大な役割を演ずる。分泌細胞として、単細胞および大食細胞は免疫応答の調節にとって必須である。それらはまた微生物および主要細胞を追跡するためにリンホカイン類を「活性化させる」リンホカイン用の受容体も運ぶ。
後天性免疫不全症候群（エイズ）はウイルスであるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）により引き起こされる。ＨＩＶはヘルパーＴ細胞を破壊しそして大食細胞および単細胞中に固定される。エイズは種々の異常な感染症およびそうでなければ稀な癌により特徴づけられる。ＨＩＶはまた脳および脊髄の組織に損傷を与えて、進行性痴呆症を生ずる。
ＨＩＶが人間患者に感染する時には、それはそれ自身で免疫細胞のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の中に入りそして３カ月〜７年間の間の不定期間にわたり患者は免疫不全症状を示さないかもしれずそして時には検出可能水準のエイズに対する抗体を生成しないかもしれない。初期ＨＩＶ感染症は直ちに検出可能な臨床的疾病症状または検出可能水準の抗体を生じないかもしれないため、ここで使用されている「ＨＩＶ−感染症」とは感染症およびそれから生ずる疾病の両者を包括しており、後者は「ＨＩＶ−関連疾病」と称される。ＨＩＶ−関連疾病の例はエイズおよびＡＲＣである。以上の潜伏期間後に、ＨＩＶは感染細胞内で増殖しそして実際に宿主細胞を破裂させ、それにより新たに製造されたウイルスが放出される。宿主細胞はこの方法において破れるため、患者の免疫系が損なわれそして宿主は無傷の免疫系を有する人間にとっては敏感ではない日和見感染性の疾病に対して敏感となる。人間では、一般的にはエイズウイルスは増殖するであろうしそして人間は実際に重い免疫不全症によって死亡するであろう。興味あることに、人間だけがエイズにかかる。非−人間哺乳動物、例えばウサギ、マウス、ラットまたは牛、がＨＩＶに感染する時には、この動物は少量の一時的に破壊されたＴ細胞を有するかもしれない。しかしながら、感染から１４〜２１日後に、動物は抗体攻撃を増加しそしてエイズに屈服しない。それ故、エイズに関する動物モデルはない。
現在では、エイズのための治療や有効な療法はない。この分野における研究は開発途中である。
エイズを疾病の初期段階において正確に診断する方法に関しては絶えざる研究がなされている。現在、商業的に利用できる診断試験は一般的にはＨＩＶに対する患者の抗体の検出に向けられている。そのような試験は患者がエイズに感染した時から患者がそのウイルスに対する抗体を生成する時までの約１４〜２１日の空白部分を有する。従って、患者をこの空白時間中に試験する場合には、これらの試験は偽陰性結果を生ずるであろう。他方で、これらの試験の一部は抗体の非−特異的結合による偽陽性結果を与えることもある。ウイルス感染を検出するための他の手段は核酸のハイブリッド形成によるものである。
断らない限り、下記の事項はStein, D.S., et al., J. Infect. Diseases, 165:352(1992)を基にしている。ＨＩＶ感染段階と最も緊密に関連する代用マーカーはＣＤ４+、すなわちＴヘルパー、細胞数である。ＨＩＶ−１エンベロープ糖蛋白質、ｇｐ１２０、はＴリンパ球のサブセット中で最高濃度でそして単細胞および大食細胞上でそれより少ない量で発現されるＣＤ４受容体と特異的に結合する。ＣＤ４受容体を発現する細胞は「ヘルパー／インデューサー」サブセットと称され、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）II種受容体を有する細胞上で発現される抗原に関する応答用ヘルパー細胞としておよびＴ細胞が免疫応答を抑制するインデューサー細胞の両者としての役割を呈する。ＣＤ４+細胞の選択的損失はエイズの特徴である日和見感染性の感染症に対する敏感性と関連する多くの免疫不全をもたらす。
ＨＩＶコア抗原ｐ２４をＨＩＶ抗体の出現前に検出することができる。スクリーニング酵素−結合免疫吸収剤検定法（エリザ）によるＨＩＶ抗体の出現後に、ｐ２４抗原血症は一般的に検出不能になるが、それは場合により持続しそして疾病後期に再発するであろう。血漿および末梢血液単核細胞培養物中で見られるＨＩＶ−Ｉ力価は特異的抗体が検出可能になるにつれて急速に低下し、そのことは少なくとも一時的な有効な宿主免疫応答を示唆している。免疫刺激のマーカーはβ2−ミクログロブリンを含む。
血清交換時から追跡した患者では、ＣＤ４+細胞減少はエイズへの進行と関連していた。β2−ミクログロブリンの血清水準および血液中のｐ２４抗原の検出は両者とも独立して進行速度と関連していた。ＣＤ４+細胞数と組み合わされたβ2−ミクログロブリンおよびｐ２４抗原の使用が、ＣＤ４+細胞数だけの場合と比べてエイズの進行に関する予後判定精度を増加させた。
しかしながら、血清交換者が次の３年間にわたるＣＤ４+細胞のそれらの百分率において一定の減少を有することは稀であった。来院の間に、ＣＤ４+細胞百分率の安定しているかまたは減少する水準が対象の３８％で見られ、１２％は減少を経験し、その後に彼らのＣＤ４+細胞の損失速度は一定になる。全体として、６２％が３年間にわたる追跡で彼らのＣＤ４+百分率において減少を経験した。
血清交換時期がわからない３０６人のＨＩＶが感染された血清陽性同性愛男性の研究では、＜５００／μｌのＣＤ４+細胞数およびｐ２４抗原検出の両者が３０カ月以内のエイズが仮定された。
ＣＤ８+細胞数の増加がその後のエイズ進行のいくらか予測することが見いだされた。
例えば生存およびエイズへの進行の如き臨床的最終点と抗ウイルス療法効果の代用マーカーとをより良く関連づけるために、例えば中でもネオプテリンおよびβ2−ミクログロブリンの如き別のマーカーの分析をＣＤ４+細胞数およびｐ２４抗原と組み合わせた。
抗−エイズ薬であるジドブジンに対して耐性があり且つ１２週間にわたり生存したエイズおよびＡＲＣ患者の限定された研究｛Jacobson, M.A., BNJ, 302:73(1991)｝では、下記のことが見いだされた。
３つの要素（年令、基準としてのエイズの診断、基準としての血清ネオプテリン濃度の対数）に関して調節した後には、経時的変化でなく８−１２週間におけるＣＤ４+細胞数の対数がその後の生存を最も良く予測した。８−１２週間におけるβ2−ミクログロブリン濃度における減少は生存を意義あるほど予測し、そしてＣＤ４+細胞数の対数と組み合わすと最良の予測モデルを与えた。ｐ２４抗原血症、血清ネオプテリン濃度、およびカルノフスキー行動状態（日常活動における機能の測定値）における減少、は治療時の生存と意義あるほど関連していなかった。
上記のStein, D.S., et al.は、ＣＤ４+細胞数および他の代用マーカーにおける変化を早期ＨＩＶ感染患者における薬品または療法の抗レトロウイルス活性の調査研究用の単一決定点として次第に使用されるかもしれないと結論づけている。
発明の要旨
本発明の一面は例えばエイズ及びＡＲＣの如きＨＩＶ感染症を診断し、或いは、処置するために有用な胸腺因子蛋白質及び該蛋白質からなる組成物を提示する。
本発明の他の面は哺乳動物の胸腺細胞から上記組成物を調製する方法及び胸腺因子蛋白質の精製方法を提示する。
本発明の他の面は上記組成物又は蛋白質を使用してＨＩＶ感染症のインビトロ検出用の装置及びキットを提示する。
【図面の簡単な説明】
図１は胸腺因子（「ＴＦ」）調合物のクロマトグラフィーを表す。
図２は二次元ゲルの第一の次元での配置をグラフ表示している。
図３は二次元ゲルの第二の次元での配置をグラフ表示している。
図４は〜１１はＨＩＶ−陽性またはエイズの人間対象および健康な人間対象からの血清サンプルを用いるＴＦの沈澱パターンを示す二次元ゲルの写真である。
図１２は図７およびその分析用に測定された距離をグラフ表示している。
図１３はＨＩＶ−陰性人間対象からの血清サンプルを用いる沈澱パターンを示す二次元電気泳動ゲルの写真である。
図１４はＨＩＶ−陽性人間対象からの血清サンプルを用いる沈澱パターンを示す二次元電気泳動ゲルの写真である。
図１５は１９９５年５月４日に実施例３の試験対象から集められた血清サンプルの二次元電気泳動ゲルの写真である。
図１６は１９９５年５月１１日に実施例３の試験対象から集められた血清サンプルの二次元電気泳動ゲルの写真である。
図１７は１９９５年５月１８日に実施例３の試験対象から集められた血清サンプルの二次元電気泳動ゲルの写真である。
図１８は１９９５年５月２４日に実施例３の試験対象から集められた血清サンプルの二次元電気泳動ゲルの写真である。
図１９は１９９５年５月３１日に実施例３の試験対象から集められた血清サンプルの二次元電気泳動ゲルの写真である。
発明の詳細な説明
本発明はここでは胸腺因子（「ＴＦ」）と称する蛋白質を提示するものであり、それはＴＦと結合可能なここでａＴＦと称する別の蛋白質のフラグメンテーションを引き起こすＨＩＶの検出用に有用である。
ＨＩＶがａＴＦのフラグメンテーションを引き起こすと仮定される。それ故、ＨＩＶにより感染されていない人間は無傷のａＴＦを有するが、ＨＩＶで感染されている人間はａＴＦのフラグメントを有する。感染の早期段階ではフラグメンテーション化されているａＴＦの量は感染の後期段階におけるものより少ないことも仮定される。同様に、これらのフラグメントは感染の後期段階では寸法が比較的小さい。それ故、ａＴＦの検出はＨＩＶによる感染症を示す。ａＴＦの量および寸法は感染症の段階を示す。ａＴＦおよびそのフラグメントはＴＦを用いるそれらの沈澱パターンにより、特に下記の実施例２に記載されているように例えばゲル電気泳動におけるβ−、α1−およびα2−マクログロブリン類に関する沈澱の位置により、検出することができる。
ＴＦがＨＩＶで感染されていない人間からの血清と相互作用して血清中のβ−、α1−およびα2−マクログロブリン類との連続的な沈澱スパーを生成することが二次元電気泳動ゲルで観察された。ＴＦがＨＩＶで感染された人間からの血清と相互作用する時にはマクログロブリン類の１種もしくはそれ以上に沿って沈澱スパーが破れるかまたはそれらが存在していない。ＴＦが健康な人間のβ−、α1−およびα2−マクログロブリン類で見られるａＴＦを沈澱させ、それがβ−、α1−およびα2−マクログロブリン類と結合しそしてその結果として沈澱スパーがβ−、α1−およびα2−マクログロブリン類に沿って連続していることが仮定される。ＨＩＶで感染された人間の場合には、ａＴＦはフラグメンテーション化され、その結果としてマクログロブリン類を用いて沈澱スパーの破壊または沈澱スパーの不存在を引き起こす。
それ故、ＴＦは人間の生物学的サンプル中で見られるａＴＦと共に沈澱する。生物学的サンプルの例は体液、例えば血液、血清および血漿である。実施例２に記載されている二次元ゲル電気泳動の他に、抗体とそれらの抗原との間の免疫沈澱パターンを検出するために使用される方法を含む当技術の専門家に既知である多数の技術を使用して沈澱パターンを検出することができ、それらの技術の例はOudin, J., C.R. Acad Sci., 222:115(1946); Oudin, J., Methods in Medical Research, V:335-78, Corcoran A.C., ed., Year Book Publishers Inc.(1952); Ouchterlony, O., Acta. Path. Microbiol. Scand.,, 25:186(1948); Ouchterlony, O., Progress in Allergy, V:1-78, Kallos P. & Wakeman B.H., Basel and Karger, New York(1958); Ouchterlony, O., Progress in Allergy, VI:30-154, Kallos P. & Wakeman B.H., Basel and Karger, New York(1962); Mancini, G. et al., Prot. Biol. Fluids 11th Colloqu. Bruges, pp. 370-3, Peters, H., ed.(1964); Mancini, G. et al., Immunochemistry, 2:235(1965)である。
ＴＦは例えばエイズおよびＡＲＣの如きＨＩＶ感染症を処置するために使用することもできる。ＴＦはメチル化されているまたはメチル化されていない状態で存在できる。ここで使用される「ＴＦ」という語は、例えば「メチル化されているＴＦ」のように特別に修飾されていない限り、メチル化されているおよびメチル化されないＴＦの両者を意味する。
本発明はまた、特に胸腺細胞からＴＦを得るための方法も提示する。胸腺細胞は好適にはＨＩＶにより感染されているかどうかにかかわらず非−人間哺乳動物からのものであるが、ＨＩＶで感染された非−人間哺乳動物の方がＴＦのより高い力価を有する。非−人間哺乳動物の例は、猿、ゴリラ、チンパンジー、モルモット、牛、ウサギ、犬、マウスおよびラットである。
メチル化されているおよびメチル化されていないＴＦの両者ともａＴＦと結合することができそしてその結果としてＨＩＶ感染症、特にエイズ、を診断するために使用することができる。しかしながら、少なくとも人間試験対象からの血清の場合には、メチル化されているＴＦはメチル化されていないＴＦと比べて他の蛋白質との非−特異的結合を少なく受ける。それ故、メチル化されているＴＦが好ましい。メチル化されていないＴＦは例えば下記の実施例１に記載されているような当技術で既知の方法を使用して化学的にメチル化することができる。
メチル化されているＴＦはＨＩＶ感染症、特にエイズ、用の療法として使用することができる。
ＴＦは好適には殺害したての、すなわち殺害後４時間以内の、哺乳動物、例えば猿、ゴリラ、チンパンジー、モルモット、牛、ウサギ、犬、マウスおよびラット、の胸腺細胞から精製される。胸腺細胞からの核を当技術で既知の方法を使用して単離する。それらのリシンに富んだヒストンフラクションの一部を米国特許第４，４１５，５５３号のペプシン分解法を使用して抽出する。例えばトリプシン分解、パパイン分解、ＢｒＣＮ分解の如き他の分解方法はＴＦの抽出において有効でないようである。単離体の蛋白質に富んだフラクションをカチオン交換クロマトグラフィーにより精製する。ＴＦフラクション（メチルされているおよびメチルされていない）中の蛋白質は例えば硫酸アンモニウムを用いる高圧沈澱を含む当技術で既知の数種の技術の１つによりまたは限外濾過により濃縮することができる。ＴＦを沈澱により濃縮する場合には、それを好適にはその後に１種もしくは複数のプロテアーゼ抑制剤を含有する適当な生理学的に均衡させた塩溶液の中に再懸濁させる。
ＨＩＶ感染症に対する療法としてのＴＦ投与
出願人は、ＨＩＶに感染されたがエイズを発症していない例えば牛の如き非−人間哺乳動物が無傷のＴＦを有することを見いだした。本発明はＴＦがＨＩＶ感染症、特にエイズ、の進行を防止する際にある役割を演ずることを仮定している。従って、ＴＦをＨＩＶで感染された人間に投与することは治療になるであろう。ＴＦは好適にはＨＩＶで感染された時にエイズを発症していない非−人間哺乳動物からのものである。メチル化されている非−哺乳動物ＴＦが好ましい。さらに、感染された人間が処置下で免疫応答を引き起こすことも好ましい。そのためには、ＴＦは好適には添加剤と共に分配されるか、またはＴＦが患者における抗体応答を引き起こすであろう免疫学的担体と化学的に共役されている。免疫学的担体の例は、キーホールリンペットおよび牛血清アルブミンである。
本発明の一面では、ＴＦを使用してＨＩＶ感染症、特にエイズおよびＡＲＣ、を処置または治療するためのワクチン処理をする。例えば、ＴＦはそれを所望する純度で添加剤または生理学的に許容可能な担体、すなわち使用する薬用量および濃度において受容者にとって無毒である担体、と混合することにより投与用に調合される。望ましくはＴＦが添加剤と共に投与されるが、第１回接種がＴＦと共に分配されるような状況では、ＴＦを含む追加接種（ブースター）は添加剤を必要としない。
注射（筋肉内または皮下）が本発明のワクチンの治療投与用の主な方式である。しかしながら、静脈分配、カテーテルを通す分配、または他の外科的な管形成を使用してもよい。別の方式には錠剤など、液体調合物、および凍結乾燥もしくはエーロゾル化受容体の吸入が包含される。液体調合物は粉末調合物からの再構成後に使用してもよい。
ＴＦを微球、リポソーム、他の微粒子分配系または血液を含むある種の組織の中に置かれた持続放出調合物により投与してもよい。
投与されるＴＦの薬用量は、医師の専門知識内である使用する調合物の性質、例えばその結合活性およびインビボ血漿半減期、調合物中のＴＦの濃度、投与方式、投与の部位および速度、当該患者の臨床的耐性、患者を苦しめる病理学的状態などに依存するであろう。一連の連続的接種中に異なる薬用量が使用され、実施者は第１回接種を投与しそして次に相対的に少ない薬用量のＴＦを追加接種することができる。
下記の事項はＴＦ調合物、薬用量および投与スケジュールの例である。患者に１ｋｇの患者体重当たり８ｍｇのＴＦ（好適には生理学的に許容可能な溶液中に４ｍｇ／ｍｌのＴＦを含有する２ｍｌの調合物）または５７μｇのＴＦ蛋白質を含有する筋肉内または皮下注射を投与する。各々の処置工程は１６回の注射からなっており、１週間当たり連続日に２回の注射を８週間にわたり行う。患者の疾病状態を以下にさらに記載されている方法により監視する。最後の注射から３カ月後に、患者が依然として罹病しているなら、処置処方を繰り返す。処置処方は満足のいく結果が得られるまで、例えば疾病の進行が半分になるかまたは遅延するか、疾病が軽減するかまたは治癒が見られるまで、繰り返すことができる。好適には、ＴＦは水酸化アルミニウム添加剤の中で調合される。最終的ＴＦ調合物の最終的１ｍｌが４ｍｇのＴＦ、０．０１６Ｍ  ＡｌＰＯ4（すなわち０．５ｍｇのＡｌ3+）、０．１４Ｍ  ＮａＣｌ、０．００４Ｍ  ＣＨ3ＣＯＯＮａ、０．００４Ｍ  ＫＣｌを含有し、ｐＨは６．２である。
或いは、ＨＩＶ感染患者または未感染対象に対して５カ月後に、より好適には６カ月ないし２年後に、そしてさらに好適には８カ月ないし１年後に、接種して患者の「免疫記憶」を高めてもよい。Anderson et al., J. Infectious Diseases, 160(6):960-969(1989)を参照のこと。一般的には、相対的に長い間隔で離されているＴＦを用いる頻繁でない免疫化の方が頻繁な免疫化より最大免疫応答を誘発する際および予防効果を誘発する際には好ましい。
ＴＦは種々の方法でそして異なる種類の受容者に投与することができる。ＨＩＶへの露呈の危険性があるかまたはないかもしれない人々にワクチン処理するためにＴＦを使用することができ、そしてさらにこれらのワクチンは望ましくは血清陽性の人々およびすでにＨＩＶに露呈された人々にも投与される。
ＴＦとは他の抗原と組み合わせて単一接種「カクテル」中で投与することができる。ＴＦは経時的な接種投与シリーズで投与することもできる。そのようなシリーズにはＨＩＶ抗原または他のワクチンの同一もしくは相異なる調合物を用いる接種が包含される。
選択される処置パラメーター、例えば薬用量、スケジュール、添加剤選択などの適合性は、患者から血清のアリコートを採取しそして処置プログラム工程中に抗体および／またはＴ細胞力価に関して検定することにより、決められる。Ｔ細胞力価は一般的方法により監視することができる。例えば、Ｔリンパ球はIn Vitro Methods in Cell Mediated and Tumor Immunity, B.R. Bloom,J.R. David eds., Academic Press, New York(1976)中にあるBach, J.F., Contemporary Topics in Immunology, Vol. 2: Thymus Dependency, p. 189, Plenum Press, Nwe York, 1973; Hoffman, T. & Kunkel, H.G., and Kaplan, M.E., et al.,の両論文に記載されているようなＥ−ロセット調合物により検出することができる。例えば、Ｔ細胞ロセット調合物の量をＴＦ処置の第３週以後であるが第１０週以前に検定することができる。６５％以上のロセット調合物が患者における良好な細胞介在免疫応答を示す。監視用の他の指示法は患者により製造されるａＴＦであり、これは以下でさらに記載されている二次元電気泳動法により監視することができる。
さらに、所望する効果、例えば抗−感染効果、に関して患者の臨床的状態を監視することもできる。不適切な効果が得られたら、患者にさらにＴＦ処置を追加接種することができ、そして処置パラメーターを監視して例えばＴＦおよび／または添加剤の量を増加させることにより、ＴＦを担体と錯体生成することにより、またはそれを免疫学的蛋白質と共役させることにより、または投与方式を変えることにより、免疫応答を増加させることができる。
ＴＦは場合により例えばエイズおよびＡＲＣの如きＨＩＶ感染症を処置するために使用される他の薬理学的試薬と共に投与してもよい。これらの薬理学的試薬の例は、ＡＺＴ、抗生物質、免疫調節剤、例えばインターフェロン、抗炎症剤および抗−腫瘍剤である。
ＨＩＶ感染症を検出するための診断装置
本発明の他の面はＨＩＶ感染症のインビトロ検出用に有用な診断装置を提示する。この装置は生物学的サンプル中のＴＦとａＴＦとの間の相互作用の検出を可能にするように設計されている。より好適には、生物学的サンプルが血液、血清、または血漿である場合には、この装置はサンプル中のβ−、α1−、およびα2−マクログロブリン類に関連するＴＦの沈澱パターンの検出を可能にする。それ故、好適には、この装置はＴＦ用の部位および試験サンプル用の部位を含有する。下記の実施例２に記載されているような二次元ゲル電気泳動が好ましいため、この装置は最も好適にはＴＦおよび例えば血清サンプルの如き試験サンプルをそれぞれ含有するためのスロットを有するゲルからなっている。この装置は好適には試験を行うために必要な試薬、例えば緩衝溶液およびＴＦ用の容器を有するキットと共に包装されている。好適には、この装置は二次元電気泳動を行うための専用電源、例えば電池、を有する。そうでなければ、それは好適には外部電源と連結できるように設計される。
出願人が彼らの発明であると信じていることを記載してきたが、下記の実施例は本発明を説明するために提示されており、そして本発明の範囲を限定しようとするものではない。
実施例
実施例１
胸腺因子の単離と精製
以下の実験は犠牲後４時間の仔ウシの胸腺からＴＦを単離、精製し、特徴を明らかにすることを示している。
ペプシンによる酵素分解で胸腺の細胞からリシンに富んだヒストン分画の抽出
この項において使用される緩衝液および溶液の全ては濾過により滅菌された。必要に応じて、緩衝液の表示されたpasは0.2NのNoahまたは0.1NのHClにより調整された。緩衝液および溶液を調製するための全ての化学薬品は蒸留水を含めてUSP級であった。
胸腺の組織およびその関連する結合組織は仔ウシからその犠牲後４時間以内に分離された。その組織を4℃で5分間、0.14MのNaClおよび0.005MのEDTA-Na3を含有する溶液で洗浄した。洗浄溶液をデカントし、組織を同じ条件下で二回目の洗浄を行った。洗浄溶液をデカントした後で、組織の重量を計量した。組織は組織ホモジナイザー（ニューヨーク州ウエストバリーのブリンクマン・インストルメンツ社製のブリンクマン・ポリトロン・ホモジナイザー）で0.14MのNaCl、0.005MのKCl、0.005MのMgCl2、0.003MのCaCl2、0.15MのTRIS-HCl、pH7.6、0.25Mの蔗糖中で4℃で一定のprmで、細胞核を除去するためにホモジナイザーの製造者が薦める時間で均質化された。組織対緩衝液の割合は１：４（重量／重量）であった。
次に、組織の均質液を真空によりガーゼのパッドを濾過させた。濾液を90分間、4℃で1,000gで遠心分離した。上澄み液を捨てた。ペレットを0.008MのNaCl、0.003MのCaCl2、0.003MのMgCl2、0.08MのNaH2PO4、0.002MのTRIS-HCl、0.25Mの蔗糖pH5.2に再懸濁した。ペレット対緩衝液の割合は１：４であった（重量／重量）。再懸濁液は磁性攪拌装置付きのビーカーにおいて200rpm、4℃で5分間の均質化を行った。次に、均質液を60分間4℃、3500gで遠心分離した。上澄み液を捨てた。ペレットを0.014MのNaCl、0.001MのCaCl2、0.002MのMgCl2、0.001MのEDTA-Na3、0.002MのTRIS-HCl、0.25Mの蔗糖、pH4.2にペレット対緩衝液の割合１：４で再懸濁した（重量／重量）。再懸濁液は磁気攪拌装置付きのビーカーにおいて200rpm、4℃で5分間の均質化を行った。次に、均質液を60分間4℃、8000gで遠心分離した。上澄み液を捨てた。ペレットは１部（容量／容量）の溶液１、２部の溶液２および17部の緩衝液４を含有する予め調製された緩衝液に１：４の割合（重量／重量）で再懸濁された。溶液１は水／エタノール中に10%ドデシル硫酸ナトリウムを溶解して成る（55:45容量／容量）。溶液２は10%Tween80溶液（蒸留水に溶解）から成る。緩衝液４は0.011MのNaH2PO4と0.19MのNa2HPO4、pH7.4から成る。
再懸濁液は磁気攪拌装置付きのビーカーにおいて200rpm、4℃で15分間の均質化を行った。次に、均質液を60分間4℃、12000gで遠心分離した。上澄み液を捨てた。ペレットの重量を計量してから、0.05MのNa3C6H5O7, 0.05MのCH3COONa、0.1NのHCl、pH2.8にペレット対緩衝液の割合１：４で（重量／重量）再懸濁した。再懸濁液は1000rpm、4℃で1分間の均質化を組織ホモジナイザーにより行った。
Pepsinペプシン（ミズーリ州セントルイスのシグマ・ケミカル・カンパニ社製のカタログ番号Ｐ7000）を蒸留水に1:10000の割合で希釈し、蛋白質１mgあたり800-2500単位の活性を有する希釈液を、ペプシン（粉末）対ペレットの均質化後の重量比＝100:1.8で均質液に添加した。この混合物をビーカーに入れて窒素の雰囲気下で磁気攪拌装置を使って45rpmで4℃で12時間にわたり攪拌した。次に、得られた混合物を60分間4℃で12000gで遠心分離した。ペレットを捨てた。上澄み液を除去し、飽和(NH4)2SO4から成る溶液で沈降させた。上澄み液の１部を溶液の１部と混合し、磁気攪拌装置で600rpmで6時間4℃で攪拌した。次に、混合物を60分間4℃で12000gで遠心分離した。上澄み液を捨てた。ペレットを0.1MのNaCl、0.1MのCH3COONa、0.02Mのチオジグリコールの最小限度の量を含有する溶液中に溶解した。得られた溶液を0.01MのNaCl、0.01MのCH3COONa、pH6.4に対して透析し、硫酸アンモニウムを透析物から除去した。
透析物中の蛋白質はロウリー法により測定された。溶液は希釈されて2mg/mlの蛋白質を得た。次に、溶液のpHを0.1規定のNaOHにより7.2まで調整した。0.2Mブロム酢酸溶液がブロム酢酸を10mL以下の水に溶解して別に調製され、pHが0.1規定のNaOHにより7.0に調整された。得られたブロム酢酸溶液を蛋白質溶液に添加し、混合物を磁気攪拌装置で48時間にわたり窒素雰囲気下で攪拌した。混合物のpHは反応中は7.2に維持された。反応の終わりに、硫酸アンモニウムの沈降工程がロウリー法により蛋白質濃度を測定する工程に至るまで繰り返された。最終溶液は必要に応じて希釈または濃縮され、200ｇの仔ウシの胸腺細胞から蛋白質ＴＦ4mg/mLを得た。
カルボキシメチル・カラム・クロマトグラフィ
4mgの蛋白質を含有する上記ＴＦの１mLを、0.05Mの酢酸ナトリウムで平衡化した0.9x14cmのカルボキシメチルカラムに使用した。このカラムは洗浄され、0.05Mの酢酸ナトリウム、pH6.8中に塩化ナトリウムの直線グラディエントを使用することにより溶離された。グラディエントを創り出すために、２個の同じサイズと形のフラスコを接続するためにサイホンを使用した。一方のフラスコには0.05M酢酸ナトリウム50mL、pH6.8を入れ、他方のフラスコには0.5Mの塩化ナトリウムを含有する0.05M酢酸ナトリウム50mL、pH6.8を入れた。0.5Mの塩化ナトリウムを含有するフラスコのみをカラムに接続した。グラディエントは０から0.5ｍまでの塩化ナトリウムであった。２個のフラスコはよく混合するために激しく攪拌されなければならなかった。それぞれ1mLの分画が集められた。溶出液は280nmの吸光度目盛りに調整されたフロー分光計により検査された。溶出液分画45は蛋白質を含有して入ることが測定された（図１参照）。ＴＦ分画は10,000rpmで遠心分離され、２つのバンドの沈降が観察された。分画45が集められ、硫酸アンモニウム沈降により濃縮された。
得られた濃縮分画をさらに下記のように分析した。
i)  分子量の測定
集められたＴＦ分画の分子量は、レムリ法（Laemmli, U.K., Nature, 227:680(1970))を使い、シグマ・テクニカル・ブルティンMWS-877L（ミズーリ州セントルイスのシグマ・ケミカル・カンパニ）に開示された教示に従って、銀で染色された11%非還元性SDS-PAGE（ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動）により測定された。ラピッド・シルバー・ステイン（RSK-1、シグマ・ケミカル・カンパニ）が使用され、蛋白質を染色した。低分子量基準（M5630、シグマ・ケミカル・カンパニ）が使用され、それは５種類の蛋白質の混合物を含んでいた（合計の蛋白質濃度1ng/ml）：ウシの血清アルブミン（66,000分子量、MW）；ブタの心臓のフマローズ（48,500MW)、ウシの赤血球の炭酸アンヒドラーゼ(29,000MW）；牛乳β−ラクトグロブリン（18,400MW）；および牛乳α−ラクトアルブミン（14,200MW)を含有した。
２つのバンドがゲル上に観察された。大きい方のバンドは非メチル化ＴＦであり、98%のＴＦ分画を構成した。小さい方のバンドはメチル化ＴＦであり、ＴＦ分画の残りの2%を構成した。
蛋白質換算曲線に基づき、非メチル化ＴＦが約35キロダルトン(Kd)の分子量を有し、メチル化ＴＦは約28Kdの分子量を有することが測定された。
ＴＦ組成物（メチル化および非メチル化ＴＦ）はpH滴定により約7.64から8.6までのpHを有する。ＴＦ組成物の等電点は、免疫電気焦点合わせにより測定されるように約5.6±0.1である。
ＴＦ分画において発見された蛋白質のメチル化
ＴＦはメチル化されて、下記の実施例で使用されるメチル化ＴＦ製剤を形成した。メチル化は下記のように行われた。
ＴＦは充分な量のCH2BrCOOHと混合され、0.2MのCH2BrCOOHの最終溶液を生成した。例えば、2.78gのCH2BrCOOHを10mLの蒸留水に溶解し、700mgのＴＦを含有する100mLのＴＦ（7mg/mL)に添加した。混合物のpHは0.1MのNaOHで7.24に調整され維持された。混合物は６−８時間の範囲で培養された。得られた水性分画中の蛋白質は当該技術に周知の方法を使って、硫酸アンモニウム沈降により濃縮された。メチル化ＴＦ分画の10mLに、等量の飽和硫酸アンモニウムが加えられた。混合物は12時間冷蔵され、次に、60分間20,000rpmで遠心分離された。ペレットが取り出され、0.1MのNaCl、0.1Mのクエン酸ナトリウム、0.02Mのチオジグリコールを含有する最終緩衝液に溶解された。次に、混合物は硫酸アンモニウムを除去するために24時間にわたり同じ緩衝液に接して透析された。
実施例２
ＨＩＶ感染の診断
実施例１から得られたメチル化ＴＦが使用され、与えられたヒト血清試料がＨＩＶ感染患者からのものかどうか測定した。実験は下記の通り行われた。
この実験のヒト血清試料はカリフォルニア州ロスアンジェルスのエイズ健康財団により提供された。エイズ健康財団は市販の酵素結合イムノソルベント分析検査(ELISA)およびウエスターンしみ法を使用して試料を試験し、患者のＨＩＶに対する抗体を検出した。ELISAは最初に行われた。もしELISAがＨＩＶ感染（ＨＩＶ陽性）を示したなら、ウエスターンしみ法が確認試験として行われた。
本発明を使って、上記の試料が二次元電気泳動を使って試験された。使用された装置は海中ミニゲル電気泳動ユニットであった。（シグマ・ケミカル・カンパニのカタログ番号E0638）であった。このユニットには、800mLの緩衝液を入れるための容量を有する緩衝液室が含まれていた。このユニットはまた緩衝液を再循環させるための蠕動ポンプを備えていた。電源の出力範囲は20から-240Ｖまで、０から100mAまでの範囲で、一定の電流と電圧出力を備えていた。
ゲルは1%アガロース（シグマ・ケミカル・カンパニのカタログ番号A4679）で調製された。ゲル緩衝液は0.0257MのTRIS-HCl、0.009Mのほう酸ナトリウム十水和物、0.067Mのグリシン、0.0034Mの酢酸ナトリウム三水和物、0.015Mの2-メルカプロエタノールおよび0.015Mのチオジグリコール、pH7.64から成る。14.25mLの1%溶解アガロースゲルが電気泳動ゲルプレートに塗布された。硬化ゲルの厚さは0.2cm、寸法は7.5cmx7.5cmであった。ゲルは同じ緩衝液で覆われた。注射器の針（直径0.9mmの口径を有する）を使ってゲルに半径0.9mmの孔が開けられ、５μLの血清試料を射出した。最初の寸法の実験について、血清蛋白質を分離するために、使用された電圧は9V/cmであり、電流は27mA/cm2であり、14℃で90分間通電された。図２は最初の寸法の配列を示す略図であり、１は血清試料用の孔を示す。第二の寸法の実験については、ゲルのプレートは90°回転され、0.9x45mmの溝が新しいカソードと血清の孔との間で、カソード−アノードの線に垂直に、新しいカソードの位置の側のゲルから取り出された。図３は第二の寸法のゲルの配置を示す略図であり、２は溝を示す。この溝は実施例１のメチル化ＴＦの100μLで満たされた。このゲルに対して14℃で50分間同じ電圧と電流が加えられた。二次元的電気泳動の隅から隅まで、緩衝液が25mL/分で再循環された。最後の実験の後で、電源が切られ、ゲルは数秒後に取り出された。次に、ゲルは、3部のメタノール、１部のエタノール、12%の酢酸および0.1%のブロムフェノール・ブルー（シグマ・ケミカル・カンパニのカタログ番号B-8026）を含有する溶液中で、45分間、固定と染色が同時に行われた。ゲルは3-4時間蒸留水に漬けて脱色し、乾燥した。
分子量測定のために、対照の二次元的電気泳動が同じ条件下であるが、実施例１で説明された血清とＴＦの代わりに銀染色低分子量マーカーを使って別個に行われた。
二次元的電気泳動ゲル上の血清蛋白質の位置は図４に示された。図４において、免疫グロブリン染色３は患者の血清試料を含む血清孔１の隣に現れ、β−マクログロブリン４も同様に現れ、さらに血清孔から離れたところにα2−マクログロブリン５、α1−マクログロブリン６およびアルブミン７が現れた。
血清中にａＴＦと共にＴＦの沈降は微細な不透明な線（沈降突起）の出現により検出された。これらの沈降突起の模様は試験の被験者がＨＩＶ感染しているかどうかを示す：
図４に示されるように、β−マクログロブリンおよびα1−マクログロブリンに並んでα2−マクログロブリンのそばまで続く連続的な沈降突起８は試験の被験者がＨＩＶに感染していないことを示している。β−マクログロブリン、α1−マクログロブリンおよびα2−マクログロブリンのそばにある非連続的な（すなわち、断続的）沈降突起および／またはマクログロブリンのどれかまたは全てのそばに並んでいない突起はＨＩＶ感染を示す。
さらに、試験被験者のＨＩＶ感染（例えば、エイズ）が進行するにつれて、沈降物は少なくなるので、沈降突起はさらにかすかになった。
以上の観察は、健康な血清中に発見されたａＴＦはＨＩＶ感染の間に破片にされ、ＴＦと破片ａＴＦとの間に断片的な沈降突起が得られることを示唆している。この破片は完全なａＴＦより分子量が少ないので、さらに電場で移動する。従って、沈降突起はさらにＴＦ溝から離れる。この仮説により限定されることを望まないなら、エイズ、すなわちＨＩＶ関連病またはＨＩＶ感染がさらに進行する場合にａＴＦはさらに細かく分断されると仮定される。従ってＴＦを含む溝からからに離れた距離に断続的な沈降突起が増えるはずだ。従って、沈降の模様はまた病気の進行段階を示す。
このように、図面に示されるゲルは下記のように解釈される：
図５は被験者がＨＩＶ陽性であることを示す断続的沈降突起９を示す。この被験者の血清が採取され、ELISAおよび本発明の試験により試験されてＨＩＶ陽性と判定された。血清が採取された時点で、被験者はなんらエイズの臨床的症状を示さなかった。
図6-9は位置10を示し、そこにはβ−マクログロブリンが位置し、健康な被験者の沈降突起が隣接しているはずであり、その突起はβ−マクログロブリン、α−マクログロブリンおよびα2−マクログロブリンの位置のそばに広がる連続的な突起であるはずである（図４に示すように）。それに対して、図6-9において、被験者の沈降突起11は断続的であり（すなわち、β−、α−、α2−マクログロブリンの位置のそばで連続的でなく）、位置10の下側にある。試験の被験者の沈降突起の位置は健康な被験者の沈降突起より分子量が少ないことを示した。断続的な破片と突起およびそれらの分子量が少ないことは、試験の被験者がＨＩＶ陽性であることを示した。この試験の前の3-6カ月間に、これらの被験者はELISAにより試験されＨＩＶ陽性と判断された。この試験では、ELISA試験用の血清と同時に採取された血清を使用した。この試験の時点で、被験者はエイズの臨床的症状を示さなかった。被験者間の病状の厳しさは図６（エイズの最も厳しい症例）、図７、図８、図９（エイズの症例の厳しさの最も少ない症例）の被験者の順序であった。臨床上観察されたこの病気の重さは図に示された沈降の模様と一致した。まず、健康な被験者について予想される突起の位置から距離がはるかに離れている沈降突起を有するゲルは、健康な患者の予想される突起位置の方に接近している沈降突起を有するゲルよりもａＴＦの破片が小さく、従ってエイズの症例がさらに重いことを示している。例えば、この距離は、健康な被験者の予想突起があるべき位置から最初の沈降突起、すなわち血清の孔１に対して垂直距離が最も近い突起までの相対的距離に基づいて測定できる。健康な被験者の突起の位置からの水平方向および垂直方向の両方向の相対距離が離れるにつれて、病気は重くなる。第二に、もし上記因子が２人のエイズ被験者のゲル間の違いを識別できないなら、濃い方の、数の少ない突起を示すゲルを有する被験者の病気の方が重くない。沈降突起の数が減り、沈降が重くなるほど、ａＴＦの破片は少なくなり濃度が高くなり、従って、エイズの症例は重くなくなる。
最初の分析の応用例は図６から図10までを分析するのに使用される。これらの図面の比較を標準化するために、全ての図面の定点、この場合、血清の孔１が基線14として選ばれる。最初の沈降突起は基線１４から垂直距離１５にある最も近いものである（図12参照）。健康な被験者の沈降突起はβ−マクログロブリンおよびα1−マクログロブリンの位置に隣接する所からα2−マクログロブリンの位置まで（図４に示されるように）広がるので、β−マクログロブリン、α−マクログロブリン、またはα2−マクログロブリンのいずれかの位置からの相対的距離を測定できる。この場合、β−マクログロブリンの位置10が選ばれた。β−マクログロブリン10の位置からの突起までの垂直距離17および水平距離16（図12参照）が測定され、これら一連の図について比較された。β−マクログロブリン10の位置から突起までの垂直距離17および水平距離16が長くなるほどそのゲルを生成した血清の被験者は、距離の短い被験者より病気が重くなる症例を示す。比較により下記の順位が明らかとなった：図６（エイズが最も重い症例）、図７、図８、図９（エイズが最も軽い症例）。これは最初の分析の応用例である。当該技術に精通した者なら、基線が全てのゲルの写真について標準化される別の位置となることも可能であり、相対的距離が血清の広がり内に位置する別の点からも測定できることは、これらの点が比較される全ての写真について一致していて、相対距離を測定するために首尾一貫して使用される限り可能であることは容易に理解されよう。他の変更も最初の分析の精神から逸脱しない限り使用できる。
図10は、この試験のための血清が採取された時点で、被験者がELISA上でＨＩＶ陰性と判定されたので、重要である。しかし、本発明の試験は、該被験者が断続的沈降突起11により示されるように、ＨＩＶ陽性であることを示した。試験用血清が採取されてから２カ月後に、被験者はELISA上でＨＩＶ陽性と判定された。従って、図は本発明の試験が従来のELISAよりＨＩＶ感染の早期検出を可能にすることを確認するものである。
図11は、臨床上エイズと診断された被験者が健康なドナーから輸血された後で血清試料が採取されたので、重要である。ドナーの血清によりもたらされた沈降突起は矢印12により示されるように高分子量の位置にあり、これは健康なドナーからの完全なａＴＦの破片化が最初少量であり、従って、突起の位置が健康な被験者について予想される分子量の方に接近しており、感染の早期を示しており、この突起が図10の突起とかなり類似の位置にあることから明らかである。エイズ被験者の血清によりもたらされた沈降突起は矢印13により示されるように低分子量の位置にあり、これは患者からのａＴＦが破片化されて、小さくなり、ＨＩＶ感染を示している。
ここに示される二次元ゲル電気泳動は試験被験者からのＨＩＶ感染の存在について生物学的流体試料を試験するためのin vitro（試験管内）装置として大量生産される。ゲルは包装および輸送を簡単にするために乾燥することができる。包装されたゲルは試料用に予め形成された孔とＴＦ用の溝を有することができる。ＴＦは容器の中に貯蔵され、別個にまたはキットとしてゲルと共に販売できる。さらに、このキットはまた電気泳動用緩衝液、染色液および／または分子量標準液の容器を備えることもできる。対照のために、キットにはさらに健康な被験者からの血清試料を入れた容器を備えてもよい。
本発明にはこれまでに明記された分析検査の他に、上記分析検査を変更したもの、ａＴＦを使う被験者の生物学的流体試料の沈降模様の測定を好ましくはβ-マクログロブリン、α-マクログロブリン、およびα2-マクログロブリンとの関連において行うことのできるどんな分析検査も包含される。これらの分析検査に必要とされる試薬及び材料を含むキットも本発明に包含される。
実施例３
この実施例はエイズ患者（この実施例3では「試験被験者」とも呼ぶ）が本発明のＴＦ組成物で治療された研究を説明する。患者は研究中は他の治療または薬剤を受けなかった。
患者は27歳の白人同性愛男性で、試験の初めの体重は138ポンドであった。18ヶ月前に、患者の血清を試験したところＨＩＶ抗体について陽性であった。この患者は、ＴＦ治療を開始する２週間前の1995年4月12日に採取された患者の血液試料について行われた試験に関する下記の表１に示されるように、患者の臨床上の症状、p24抗原数、絶対数の細胞数に関するCD4+およびCD8+（細胞数／μL)およびリンパ球部分集合百分率に基づいてＨＩＶ陽性と診断された。患者はＴＦ治療前も治療中もエイズで苦しまなかった。
治療は1995年4月27日に開始した。患者は毎週14mgのＴＦを２回の筋肉注射で投与されたが、１回目の注射は火曜日に行われ、２回目の注射は水曜日に行われた。各注射には7mgのＴＦ（3.5mg/mLのＴＦを含有する注射薬2mL）が注入された。ＴＦは上記実施例１に説明されるように精製され、滅菌されたＴＦ注射薬には3.5mg/mLのメチル化ＴＦ、8.1mg/mLの塩化ナトリウム、1.9mg/mLの酢酸ナトリウム、2.6mg/mlの三燐酸ナトリウム、2.1mg/mLの塩化アルミニウム、pH6.2が含まれていた。
表１は実験の結果を示す。日付は患者から血液試料が採取された日付である。試験はユニラブ・コーポレーション（カリフォルニア州ターザナ）により一般的な臨床分析検査を使って行われた。
0003816524.tif 000002
試験は以下の通りである：
"RBC"および"WBC"はそれぞれ赤血球数と白血球数(x 103/mm3)を示す。
"HEMOGLOBIN"と"PLATELET COUNT"はそれぞれヘモグロビン数(g/dL)と血小板数(x 103/mm3)を示す。
"POLYS"は白血球数の百分率として測定された好中球細胞数を示す。
"LYMPHOCYTES（リンパ球）"、"MONOCYTES（単核白血球）"、"EOSINOPHILS（好酸球）"、"BASOPHILS（好塩基球）"の数はそれぞれ白血球数の百分率として測定された。上記の完全な血液数は血液学分析装置を使って測定された。
"CD4%"と"CD8%"はそれぞれCD4+とCD8+の細胞のリンパ球部分集合百分率を示す。"CD4 ABS"と"CD8 ABS"はそれぞれCD4+とCD8+の細胞の絶対細胞数（細胞数／μL)を示す。CD4+とCD8+の細胞数はフロー血球計算により測定された。
"RATIO H/S"はヘルパーウイルスと抑制ウイルスの割合を示し、"CD4 ABS"の数を"CD8 ABS"の数で割ることにより得られた。
"TOTAL PROT."はオリンパスAU5000器具(日本東京のオリンパス社）を使ってカロリー計量法により測定された、患者の試料中の合計血液血清蛋白質（g/dL)を示す。
"ALB."はアルブミンを示す。"ALPHA-L"はα１グロブリンを示す。"ALPHA-2"はα−2グロブリンを示す。"BETA"はβ−グロブリンを示す。"GAMMA"はγ−グロブリンを示す。これらの血清蛋白質は血清蛋白質電気泳動により測定された。特定の血清蛋白質の各カラムについて、左の数はg/dLであり、右の数は全血清グロブリン中の特定の血清グロブリンの百分率分布を示す。
"P/24"はp24抗原EIA試験キット（イリノイ州アボットパークのアボット・ラボラトリーズ）により測定されたp24ウイルス核抗原を示す。
さらに、表１に明記された時点で集められた血液試料も試験され、オーガノ・テクニカ社のＨＩＶ・ELISA試験キット（北カロライナ州のラレイ）により測定されたが、ＨＩＶ抗体について陽性と判定された。患者は最初のＴＦ注射と1995年5月24日までの間に体重が７ポンド増加した。
上記結果から、ＴＦ治療開始後にCD4+細胞数の増加とCD8+細胞数の減少の傾向が明らかである。さらに、p24抗原試験は、ＴＦ治療の開始時とその前の試験被験者は陽性であったが、ＴＦ治療開始後に陰性の結果を示した。ＨＩＶ抗体分析検査は試験被験者に残留抗体が残っていたので陽性のままだった。これらの試験結果は、ＴＦ治療はＨＩＶ感染を阻止し、ＨＩＶにより引き起こされる病気の進行を食い止めるのに有効であった。
ユニラブ・コーポレーションにより行われた上記試験の他に、出願人も表１に記された時点において集められた血清試料について上記実施例２において説明されたＨＩＶ診断試験、二次元的電気泳動を実施した。
図１３と図１４は、２つの対照、すなわち、オーガノ・テクニカ社のELISA試験においてＨＩＶ抗体について陰性と判定された血清試料のヒト被験者および同じELISA試験において陽性と判定された血清試料のヒト被験者から採取された血清試料の二次元的電気泳動ゲルの写真である。図１３における沈降突起９はβ−、α1-、α2-マクログロブリンの位置のそばに広がる連続的な突起であり、これは健康なＨＩＶ陰性の被験者を示す。それに対して図１４の沈降突起９は不連続的で、被験者のＨＩＶ感染を示す。
図15-19は1995年5月11日、5月18日、5月31日にそれぞれ集められた血清試料に関する試験被験者の二次元的電気泳動ゲル試験について得られた写真である。
図１５に示されるように、上記ＴＦ治療を受けた１週間後の1995年5月4日に、試験の被験者の血清試料はβ−マクログロブリン、α1-マクログロブリン、α2-マクログロブリンの位置のそばに広がる連続的な沈降突起９により示されるように、ＨＩＶ感染について陰性との試験結果がでた。
図１６に示されるように、治療の２週間後の1995年5月11日に、試験被験者の血清はβ-マクログロブリン、α1-マクログロブリン、α2-マクログロブリンの位置のそばに連続的な沈降突起９を形成し、これは図１４の対照のＨＩＶ陽性患者について観察されたものよりさらに連続的な沈降突起である。
図１７と１８に示されるように、治療の第３週と４週の1995年5月18日と24日に、試験被験者の血清が形成した沈降突起９は連続性が減少していた。しかし、５週目の1995年5月31日に、β−マクログロブリン、α1-マクログロブリン、α2−マクログロブリンの位置のそばに再び連続的な沈降突起９が観察され、ＨＩＶ陰性の状態を示す。二次元的電気泳動試験は、本発明のＴＦ治療はＨＩＶ感染および／または病気の進行に対して有効であることを示唆する傾向にある。
実施例４
この実施例はさらに本発明のＴＦ組成物で治療された６人の患者に関するデータを提供する。これらの患者は６週間の治療期間中およびその後も他の治療や投薬を受けなかった。下記の表はまた治療期間終了後９ヶ月（患者番号1-5）および２ヶ月（患者番号６）における患者のデータを示す。
連続６週間にわたり、各患者は毎週14mgのＴＦを火曜日と水曜日の２回の筋肉注射で投与された。各注射には７mgのＴＦが注入された(3.5mgのＴＦを含有する注射薬2mL）。ＴＦは、前記実施例１に説明されたように精製され、滅菌されたＴＦ注射薬には、3.5mg/mLのメチル化ＴＦ、8.1mg/mLの塩化ナトリウム、1.9mg/mLの酢酸ナトリウム、2.6mg/mLの三燐酸ナトリウム、2.1mg/mLの塩化アルミニウム、pH6.2が含まれていた。
表2-7は各患者の調査結果を示す。試験は一般的に認められている臨床分析検査を使って実験室により行われた。表中の"ＨＩＶ-Ab, ELISA"はELISAにより測定されたＨＩＶ−１抗体を示す。"CD4 abs."と"CD8 abs."はそれぞれCD4細胞とCD8細胞の絶対細胞数（細胞数／μL)を示す。"p24 Ag"はp24抗原免疫複合体破裂（ICD)EIAにより測定されたp24ウイルス核抗原を示す。このＨＩＶ-1抗原のEIAは免疫複合体の破裂後のp24核蛋白質を検出する。"ＨＩＶ-1 RNA, PCR"はポリメラーゼ連鎖反応（PCR)増幅により試験された血漿1mL当たりのＨＩＶ-1リボ核酸（RNA）のコピーの数の定量概算を示す。検出されたウイルスRNAのコピーの数の増加／減少は血漿ウイルス血症の増加／減少と関連がある。"ＨＩＶ-1 Plasma Culture"は血漿および周辺血液単核細胞培養物中に認められたＨＩＶ-1の滴定濃度を示す。"ＨＩＶ-1 Plasma Quantitative"はmL当たりの感染性単位として表されたＨＩＶ-1ウイルス感染性を示す（IU/mL)。"Poly Cells"は絶対数中の白血球数を示す（細胞数／μL)。α-1マクログロブリン（"alpha-1 Macro"と表示）、α-2マクログロブリン（"alpha-2 Macro"と表示）およびγ-免疫グロブリン（"IgG")が血清蛋白質電気泳動により測定された。表示された数字％は全ての血清グロブリン中の特定の血清グロブリンの百分率分布である。表７において、"IgA"と"IgM"はそれぞれ免疫グロブリンAとMを示す。表７において、IgG、IgA、IgMはmg/DL血清で表される。"HLA-DR"は染色体６の上に位置するヒト主要組織適合性複合体の産出物を示す。
表2-7に使用された略字の定義は以下の通りである：
inc.＝健康な人の正常レベル；
pos.＝陽性；
＋＝陽性。陽性のレベルが増加した場合はさらに"+"と表示される；
neg.＝陰性；
−＝試験されなかった；
nt＝試験されなかった；
x＝健康な人の正常なレベルの倍数。例えば、"2x"は正常レベルの２倍を示す。
以下に各患者の状態を詳細に説明する。
患者番号１
下記の表２は患者番号１について行われた臨床試験の結果を纏めたものである。
治療の開始時に、患者番号１（21歳の女性）は脳損傷と精神障害を伴う完全なエイズ患者で、CD4の数は36、余命は6ヶ月から12ヶ月の範囲であった。患者のCD4数は36（治療開始時）から108（治療期間の終了後９ヶ月）まで増加した。治療の第４週目に初めに、p24核抗原は陰性で、5μg/mL未満であった。この陰性のp24核抗原目盛りは治療の４週目現在でウイルス活性がないことを示している。血漿ＨＩＶ-1培養物は試験したところ治療の４ヶ月目現在で陰性と判明した。陰性のプラズマＨＩＶ培養物の目盛りは、この患者の血漿から単離されたＴ細胞は、in vitro分析検査において未感染の対照血液のＴ細胞と混合した場合に非感染性であった、すなわち、陰性の血漿培養物であることを示す。それに対して、陽性血漿培養物は対照ＨＩＶ-1感染血液由来のＴ細胞がin vitro分析検査において未感染対照血液と混合された場合に得られたものである。IgG、α−１、α−２のマクログロブリン活性の増加はＴＦ治療の間およびその後に観察された。治療後９ヶ月で、患者はもはや完全なエイズ患者ではなかったが、ＨＩＶはなお陽性であった（すなわち、ELISAにおいてＨＩＶに対する抗体について試験したところ陽性と判明した）。
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患者番号２
下記の表２は患者番号２について行われた臨床試験の結果を纏めたものである。
治療の開始時に、患者番号２（３０歳の男性）はＨＩＶ陽性であった（すなわち、ELISAにおいてＨＩＶに対する抗体について試験したところ陽性であった）。しかし、患者はエイズのあらゆる症状に苦しむことはなかった。患者のCD4細胞数は193（ＴＦ治療前）から305（治療の終了から９ヶ月）まで増加した。患者のp24核抗原はＴＦ治療前も治療中も治療後も陰性のままであり、低いウイルス活性を示した。患者の血漿培養物は治療後４ヶ月で陰性に変わり、in vitro分析検査において血漿の非感染性を示した。患者の体液の免疫性の増加はIgG、α-1、α-2マクログロブリンの濃度の増加により示された。治療終了後９ヶ月の時点で、患者はなおエイズの徴候を示さなかった。
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患者番号３
下記の表４は患者番号３について行われた臨床試験の結果を纏めたものである。
治療の開始時に、患者番号３（２４歳の女性）はＨＩＶ陽性であった（すなわち、ELISAにおいてＨＩＶに対する抗体について試験したところ陽性であった）。しかし、患者はエイズのあらゆる徴候に苦しむことはなかった。患者のCD4細胞数は404（ＴＦ治療前）から636（治療の終了から９ヶ月）まで増加した。患者のp24核抗原は研究調査の間ずっと陰性のままであった。患者の血漿培養物は治療後４ヶ月で陰性に変わった。患者の体液の免疫性の増加はIgG、α-1、α-2マクログロブリンの増加により示された。治療終了後９ヶ月の時点で、患者はなおエイズの徴候を示さなかった。
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患者番号４
下記の表５は患者番号４について行われた臨床試験の結果を纏めたものである。
治療の前に、患者番号（２７歳の男性）はＨＩＶ陽性であった（すなわち、ELISAにおいてＨＩＶに対する抗体について試験したところ陽性であった）、そして完全なエイズの徴候を示した（グレード３；喉および肺の上部に日和見感染を示した）。患者のCD4細胞数は389（治療前）から599（治療の終了から９ヶ月）まで増加した。患者のp24核抗原は治療前の４週間後に陰性に変わり、陰性のままであった。患者の体液の免疫性の増加はIgG、α-1、α-2マクログロブリンの増加により示された。治療終了後12ヶ月の時点で、患者はエイズの徴候を示さなかった。
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患者番号５
この患者は実施例３の患者と同じである。
下記の表６は患者番号５について行われた臨床試験の結果を纏めたものである。
治療の前に、患者はＨＩＶ陽性であって（すなわち、ELISAにおいてＨＩＶに対する抗体について試験したところ陽性）、肺炎、嘔吐、排泄物に出血しない下痢に苦しんでいた。しかし、患者は完全なエイズではなかった。患者のCD4細胞数は治療後一定のままであった。患者のp24核抗原は治療の４週目までの間陰性に変わり、治療後７ヶ月までそのままであった。ＨＩＶ-1, RNZ, PCRは、ウイルスのコピーの数が約6,000-7,000コピー／mLに維持されていることを示した。患者の血漿培養物は治療後に非感染性であった。得られた患者の免疫系はIgG、α-1、α-2マクログロブリンを増加させた。患者は体重が10-12ポンド増加した。治療終了後10ヶ月の時点で、患者はなおエイズの徴候を示さなかった。
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患者番号６
下記の表７は患者番号６について行われた臨床試験の結果を纏めたものである。
治療の開始時に、患者は完全なエイズであった（３と４の間のグレードで、例えば、網膜炎、巨細胞ウイルス感染、喉、肺、気管および気管支における真菌感染および寝たきりなどになる程度）。患者のCD4細胞数は治療後２ヶ月後にわずかに増加した。患者のp24核抗原は治療前の４週間後に陰性に変化し、陰性のままであった。患者の血漿培養物は治療前は陽性であったが、治療後陰性に変わり、非感染性を示した。CD4数が100未満でウイルスの負荷が5x105である患者の場合は周辺血液細胞培養物は陽性である。しかし、患者番号６の場合は、治療後１ヶ月と２ヶ月の時点で周辺血液細胞にＨＩＶは全く検出されなかった。有意に、患者のウイルス負荷はウイルスRNAが5x105コピーから3x104コピーまで減少した。これはウイルスRNAの1.5 log減少に近い。患者番号６はまた治療開始以来体重が１５ポンド増加した。治療終了後３ヶ月で、患者はエイズの徴候を示さなかった。
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結論
この実施例は、P24核抗原が5μg/mL未満に変わることから明らかなようにＨＩＶウイルス活性が停止されたこと、試験方法の限度を示す。ＨＩＶ患者のCD4数の劇的な増加も示された。この増加は、例えばAZTなどの米国で市販されている抗ウイルス製品について観察された増加よりも時間を超過して劇的である。この実施例はまた定量RNAポリメラーゼ連鎖反応により測定されるように患者のウイルスの負荷の劇的な減少を示す。患者の血漿培養物は陰性に変わった。試験管内（in vitro）の系において、患者の血液の血漿は非感染性であった。患者のＴ細胞は非感染（正常）患者のin vitroのＴ細胞に感染することはできなかった。前述のことは血漿中にウイルスがないことを示しているかもしれない。それはまた患者が免疫化されたので、他の非感染患者に感染することができなかったことを示すのかもしれない。
周辺血液単核細胞(PBMC)が試験され、ＨＩＶ陰性であることが判明した。治療により完全なエイズ患者が血漿にも周辺血液細胞にも検出できないＨＩＶを有する患者へと形質転換された。患者の体液および細胞の両方の免疫性がウイルスを破壊し、効力をなくすのに利用されたようであった。
本発明は特定の実施態様を参照して説明された。しかし、この出願は当該技術に精通した者により添付の請求項の精神と範囲から逸脱することなく行われる変更および置換を包含するものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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