(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の一般式（Ｉ）：
Ｈ−Ｘ−(D)Phe−Pro−Arg−Gly−Phe−Ｙ−ＯＨ  （Ｉ）
［式中、ＸはGly、ＹはPro−Ala、Gly−Ala、Pro−Ala−Gly−GlyまたはGly−Ala−Gly−Glyを表す。］
で示されるペプチドまたはその塩。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はトロンビン切断性を有するペプチドおよびその塩に関する。本発明のペプチドおよびその塩は、トロンビンによって選択的に切断されかつ安全性に優れることから、トロンビン検出システムおよびトロンビン応答性材料、例えば凝固系の状態、創治癒状態、炎症状態等のモニター、凝固系の異常、創傷、炎症等の診断および治療に用いる材料の構成要素として有用である。
【０００２】
【従来の技術】
トロンビンは血液凝固因子IIaと呼ばれる凝固系を代表する酵素であり、フィブリノーゲンをフィブリンに分解する。最近、トロンビンの凝固系に対する作用以外の作用、すなわち創傷治癒促進作用［例えば、R. Morris, et al., Annals Rheumat. Diseases, 53, 72-79(1994); J. Stiernberg, et al., Thrombosis and Haemostasis, 70, 158-162(1993); D. H. Carney, et al., J. Clin. Invest., 89, 1469-1477(1992)]、単球遊走タンパク産生刺激作用[ 例えば、G. Grandaliano, et al., J. Exp. Med., 179, 1737-1741(1994)]、マトリクスフィブロネクチン産生刺激作用[ 例えば、M. T. Armstrong, et al., J. Cell. Phys., 166 , 112-120 (1996)] 、血管内皮細胞活性化および透過性亢進作用[例えば、J. G. N. Garcia, Blood Coagulation and Fibrinolysis, 6, 609-626(1995)]等が報告されている。
【０００３】
トロンビン切断性ペプチドとしては、トロンビンの酵素活性測定のために用いる蛍光性のトリペプチド誘導体（t-Butyloxycarbonyl-L-Valyl-L-Propyl-L-Arginine 4-Methyl-Coumaryl-7-Amide：Boc-Val-Pro-Arg-MCA）［例えば、T. Morita, et al., J. Biochem., 82, 1495(1977)］、フィブリノーゲンのトロンビン切断部位と同じアミノ酸配列を有する７〜１６量体のペプチド［H. C. Marsh, et al., Biochemistry, 21, 6167-6171(1982)］、アミノ酸もしくはペプチドのエステルまたはアミドからなる合成基質［C.Izquierdo and F.J.Burguillo, Int, J. Biochem., 21, 579-592(1989)］、３０種のポリペプチドホルモンおよびその誘導体［J-Y. Chang, Eur. J. Biochem., 151, 217-224(1985)］等が報告されている。
また発色性のペプチド基質を用いた検討により、トロンビンによって切断されるアミド結合からアミノ末端方向へ１番目のアミノ酸（P1）はArgが好適であり、２番目のアミノ酸（P2）はProまたはPro誘導体が好適であり、３番目のアミノ酸（P3）は非極性アミノ酸が好適であることが報告されている［R. Lottenberg, et al., Biochim. Biophys. Acta, 742 , 539-557(1983)］。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
従来のトロンビン切断性ペプチドの研究は、トロンビンによって切断されるアミド結合からアミノ末端方向へ１〜４番目までのアミノ酸配列に関する検討がほとんどであり、酵素切断部位からカルボキシル末端側のアミノ酸配列に関する詳細な検討は極めて少ない。
酵素切断部位からカルボキシル末端側にもペプチド鎖を持つペプチドの切断性の検討例としては、上記のフィブリノーゲンのトロンビン切断部位と同じアミノ酸配列を有する７〜１６量体のペプチド、並びに３０種のポリペプチドホルモンおよびその誘導体の例があるが、これらのうちのほとんどは実用的な速度では切断されなかった。なかには実用的な速度で切断されるものもあるが、強い生理活性を有するため、トロンビン検出システムやトロンビン応答性材料の構成要素に用いる場合には副作用の心配がある。
また、酵素切断部位に直接アミド結合またはエステル結合で発色性あるいは蛍光性色素が結合された上記の合成基質では、色素の代わりに薬剤や生理活性蛋白質を結合し、これを酵素産生等の刺激に応答して放出しようとすることは、立体障害等のために困難であった。
しかるに、本発明の目的は、トロンビンによって選択的に切断され、トロンビン検出システム、トロンビン応答性材料の構成要素として有用な安全性に優れるペプチドおよびその塩を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明によれば、上記の目的は、下記の一般式（Ｉ）：
Ｈ−Ｘ−(D)Phe−Pro−Arg−Gly−Phe−Ｙ−ＯＨ  （Ｉ）
［式中、ＸはGly、ＹはPro−Ala、Gly−Ala、Pro−Ala−Gly−GlyまたはGly−Ala−Gly−Glyを表す。］
で示されるペプチドまたはその塩を提供することによって達成される。
【０００６】
本明細書においては各種アミノ酸残基を次の略号で記述する。
Ala ：Ｌ−アラニン残基
Arg ：Ｌ−アルギニン残基
Asn ：Ｌ−アスパラギン残基
Asp ：Ｌ−アスパラギン酸残基
Cys ：Ｌ−システイン残基
Gln ：Ｌ−グルタミン残基
Glu ：Ｌ−グルタミン酸残基
Gly ：グリシン残基
His ：Ｌ−ヒスチジン残基
Ile ：Ｌ−イソロイシン残基
Leu ：Ｌ−ロイシン残基
Lys ：Ｌ−リシン残基
Phe ：Ｌ−フェニルアラニン残基
(D)Phe ：Ｄ−フェニルアラニン残基
Pro ：Ｌ−プロリン残基
Ser ：Ｌ−セリン残基
Thr ：Ｌ−トレオニン残基
Trp ：Ｌ−トリプトファン残基
Tyr ：Ｌ−チロシン残基
Val ：Ｌ−バリン残基
Nle ：Ｌ−ノルロイシン残基
また、本明細書においては、常法に従ってペプチドのアミノ酸配列を、そのアミノ末端側のアミノ酸残基が左側に位置し、カルボキシル末端側のアミノ酸残基が右側に位置するように記述する。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明のペプチドは、式：−(D)Phe−Pro−Arg−Gly−Phe−で示される配列を含有することが必要である。該配列において、(D)PheがPhe、Tyr、(D)Tyrの場合、Proがピペコリン酸等のプロリン類縁化合物の場合、ArgがLys等の塩基性アミノ酸残基の場合でもトロンビンによって切断され得るが、これらの場合には切断速度が遅く、またトロンビン選択性が低くなる。さらに、Proがピペコリン酸等のプロリン類縁化合物の場合には、光学純度の高い化合物が得られ難い。
【０００８】
上記の一般式（Ｉ）におけるＸはGlyである。ＸがGly以外の場合には、切断速度が遅く、またトロンビン選択性が低くなることがある。
【０００９】
上記の一般式（Ｉ）におけるＹは、トロンビンによる切断のされ易さおよびその切断速度の点から、Pro−Ala、Gly−Ala、Pro−Ala−Gly−GlyまたはGly−Ala−Gly−Glyである。
【００１０】
本発明のペプチドの具体例としては、下式に示すものが挙げられる。
(2)：Gly−(D)Phe−Pro−Arg−Gly−Phe−Pro−Ala    （配列番号：２）
(3)：Gly−(D)Phe−Pro−Arg−Gly−Phe−Pro−Ala−Gly−Gly（配列番号：３）
(4)：Gly−(D)Phe−Pro−Arg−Gly−Phe−Gly−Ala    （配列番号：４）
(5)：Gly−(D)Phe−Pro−Arg−Gly−Phe−Gly−Ala−Gly−Gly（配列番号：５）
【００１１】
本発明のペプチドは、ペプチドの合成において通常用いられる方法、例えば固相合成法または液相合成法によって調製されるが、固相合成法が操作上簡便である〔例えば、日本生化学会編「続生化学実験講座２  タンパク質の化学（下）」（昭和６２年５月２０日  株式会社東京化学同人発行）、第６４１〜６９４頁参照〕。
【００１２】
本発明のペプチドの固相合成法による調製は、例えば、反応溶媒に不溶性であるスチレン−ジビニルベンゼン共重合体等の樹脂に目的とするペプチドのカルボキシル末端に対応するアミノ酸をそれが有するα−カルボキシル基を介して結合させ、次いで該アミノ酸に目的とするペプチドのアミノ末端の方向に向かって、対応するアミノ酸またはペプチド断片を該アミノ酸またはペプチド断片が有するα−カルボキシル基以外のα−アミノ基等の官能基を保護したうえで縮合させて結合させる操作と、該結合したアミノ酸またはペプチド断片におけるα−アミノ基等のペプチド結合を形成するアミノ基が有する保護基を除去する操作とを順次繰り返すことによってペプチド鎖を伸長させ、目的とするペプチドに対応するペプチド鎖を形成し、次いで該ペプチド鎖を樹脂から脱離させ、かつ保護されている官能基から保護基を除去することにより目的とするペプチドを得、次いでこれを精製することによって実施される。ここで、ペプチド鎖の樹脂からの脱離および保護基の除去は、トリフルオロ酢酸を用いて同時に行うのが副反応を抑制する観点から好ましい。また、得られたペプチドの精製は逆相液体クロマトグラフィ−で行うのが効果的である。
【００１３】
本発明のペプチドの塩は生理学的に許容される塩であり、その塩としては、例えば、塩酸、硫酸、燐酸、乳酸、酒石酸、マレイン酸、フマル酸、シュウ酸、リンゴ酸、クエン酸、オレイン酸、パルミチン酸等の酸との塩；ナトリウム、カリウム、カルシウム、アルミニウム等のアルカリ金属またはアルカリ土類金属の水酸化物または炭酸塩との塩；トリエチルアミン、ベンジルアミン、ジエタノ−ルアミン、ｔ−ブチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、アルギニン等との塩などが挙げられる。これらは、通常の塩生成反応を利用することにより調製される。
【００１４】
本発明のペプチドおよびその塩（以下、これらをペプチド類と略称することがある）は、トロンビン切断性を有し、かつ毒性試験において低毒性であることが確認されている。
したがって、本発明のペプチド類は凝固の亢進や低下等の凝固系の状態、肉芽形成や上皮化等の創治癒状態、血管透過性や単球遊走活性化等の炎症状態のモニター、凝固系の異常、創傷、炎症等の診断および治療に用いる材料の構成要素として用いることができる。
【００１５】
本発明のペプチド類が構成要素となる材料は、例えば水膨潤性高分子ゲルに適当なスぺーサーと本発明のペプチド類を介して薬剤を結合することにより製造される（特開平８−２４３２５号参照）。製造された材料はトロンビンの量に応じた薬剤の放出が可能になるので、トロンビンが産生される病巣においてのみ治療に有効な量の薬剤が放出され、トロンビンが産生されない部位では薬剤が放出されないので薬剤耐性発現や副作用を低減できる。したがって、本発明のペプチド類が構成要素となる材料は、創傷被覆材、生体組織接着材、癒着防止材、骨補強材、生体信号検出材料および薬剤放出基材として有用である。
【００１６】
本発明のペプチド類が構成要素となる材料は、多糖類やポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール等の水溶性高分子化合物を、本発明のペプチド類を含む架橋剤で架橋処理することによっても製造することができる。該材料は接触する環境のトロンビン濃度に応じて架橋が切断されるので、内包する薬剤や結合した薬剤を刺激に応答して放出することができる。
【００１７】
本発明のペプチド類が構成要素となる材料は、凝固系異常が関与する疾患、創傷、炎症等の患者の血液または体液を採取して接触させるか、あるいは患部に直接貼付けてモニターや診断の目的に用いることができる。治療に用いる場合にはこれらの患者の患部に直接貼付けて用いることができる。
【００１８】
【実施例】
以下、実施例により本発明を具体的に説明する。なお、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【００１９】
合成参考例１
式（１）：Gly−(D)Phe−Pro−Arg−Gly−Phe（配列番号：１）で示されるペプチドをペプチド自動合成装置を用いて固相合成法により合成した。すなわち、４−ヒドロキシメチル−フェノキシ−メチル基を０．８９ミリモル／ｇ（樹脂）の割合で有するスチレン−ジビニルベンゼン共重合体〔スチレンとジビニルベンゼンの構成モル比：９９対１〕からなる粒状樹脂〔米国アプライド・バイオシステムズ社製、ＨＭＰレジン〕０．２５ミリモルを用い、目的とするペプチドのカルボキシル末端からアミノ末端に向かって順次対応するアミノ酸を結合させた。結合反応において、アミノ酸として、米国アプライド・バイオシステムズ社製のＮα−９−（フルオレニルメトキシカルボニル）−Ｌ−フェニルアラニン〔Ｆｍｏｃフェニルアラニン〕、Ｎα−９−（フルオレニルメトキシカルボニル）−グリシン〔Ｆｍｏｃグリシン〕、Ｎα−９−（フルオレニルメトキシカルボニル）−Ｎｇ−４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルフォニル−Ｌ−アルギニン〔Ｆｍｏｃアルギニン〕、Ｎα−（フルオレニルメトキシカルボニル）−Ｌ−プロリン〔Ｆｍｏｃプロリン〕、およびスイス国バッケムファインケミカ社製のＮα−９−（フルオレニルメトキシカルボニル）−Ｄ−フェニルアラニン〔Ｆｍｏｃ−Ｄ−フェニルアラニン〕をそれぞれ１ミリモル用いた。
【００２０】
得られたペプチド樹脂を、５％の水、５％のチオアニソール、７．５％のフェノール、２．５％のエタンジチオールを含むトリフルオロ酢酸１０ｍｌで６時間処理した。ジエチルエーテルに、得られた溶液を加えて生じる沈殿をさらに数回ジエチルエーテルで洗浄して、脱保護と固相からの脱離を行った。粗生成物をミリポア・ウォ−タ−ズ社製分取用高速液体クロマトグラフ〔カラム：デルタパックＣ１８  ４７×３００mmプレップパック１０００加圧モジュ−ル付〕で精製した。得られた精製ペプチドを島津製作所株式会社製ＬＣ６Ａ分析用高速液体クロマトグラフ〔カラム：東ソ−株式会社製ＴＳＫｇｅｌ  ＯＤＳ−８０ＴＭ  ＣＴＲ、移動相：トリフルオロ酢酸を０．０５容量％含有するアセトニトリルと水の混合溶媒（アセトニトリル濃度を３０分間で５容量％から５０容量％に変化させた）、流速１ｍｌ／分〕に付したところ、１８.１分に単一のピ−クが示された。ＦＡＢ法マススペクトルにより求めた精製ペプチドの分子量は６８０であった（理論値：６７９．７７）。
【００２１】
実施例１〜４および比較例１〜４
式（２）：Gly−(D)Phe−Pro−Arg−Gly−Phe−Pro−Ala（配列番号：２）で示されるペプチド（実施例１）、式（３）：Gly−(D)Phe−Pro−Arg−Gly−Phe−Pro−Ala−Gly−Gly（配列番号：３）で示されるペプチド（実施例２）、式（４）：Gly−(D)Phe−Pro−Arg−Gly−Phe−Gly−Ala（配列番号：４）で示されるペプチド（実施例３）、式（５）：Gly−(D)Phe−Pro−Arg−Gly−Phe−Gly−Ala−Gly−Gly（配列番号：５）で示されるペプチド（実施例４）、式（６）：Gly−Phe−Pro−Arg−Gly−Gly（配列番号：６）で示されるペプチド（比較例１）、式（７）：Lys−Gly−Val−Pro−Arg−Gly−Gly−Gly（配列番号：７）で示されるペプチド（比較例２）、式（８）：Gly−Tyr−Pro−Arg−Gly−Asn−Gly−Gly（配列番号：８）で示されるペプチド（比較例３）、および式（９）：Gly−Phe−Pro−Arg−Gly−Ser−Gly−Gly−Ser−Gly（配列番号：９）で示されるペプチド（比較例４）を合成参考例１と同様の方法で合成した。
【００２２】
実施例１〜４では米国アプライド・バイオシステムズ社製のＮα−（フルオレニルメトキシカルボニル）−Ｌ−アラニン〔Ｆｍｏｃアラニン〕を、比較例２ではＮα−（フルオレニルメトキシカルボニル）−Ｎε−（ｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−リジン〔Ｆｍｏｃリジン〕とＮα−（フルオレニルメトキシカルボニル）−Ｌ−バリン〔Ｆｍｏｃバリン〕を、比較例３ではＮα−（フルオレニルメトキシカルボニル）−Ｏ−（ｔ−ブチル）−Ｌ−チロシン〔Ｆｍｏｃチロシン〕とＮα−（フルオレニルメトキシカルボニル）−Ｌ−アスパラギン〔Ｆｍｏｃアスパラギン〕を、比較例４ではＮα−（フルオレニルメトキシカルボニル）−Ｏ−（ｔ−ブチル）−Ｌ−セリン〔Ｆｍｏｃセリン〕を、それぞれ合成参考例１で用いたものに加えて使用した。
【００２３】
得られたそれぞれのペプチドについて合成参考例１と同様にして脱保護と固相からの脱離を行い、粗生成物を精製した。それぞれの精製ペプチドについて、合成参考例１と同様の分析用高速液体クロマトグラフにおける溶出時間およびＦＡＢ法マススペクトルによる分子量測定結果を表１にまとめて示す。
【００２４】
【表１】
0003828214.tif 000002
【００２５】
試験例１
トロンビン切断性試験
合成参考例１、実施例１〜４および比較例１〜４で得られたペプチドの１ｍｇ／ｍｌＰＢＳ（０．１５ＭのＮａＣｌを含む０．０１Ｍリン酸塩緩衝液、ｐＨ７．４）溶液２００μｌとトロンビン（シグマ社製）の１０Ｕ／ｍｌＰＢＳ溶液２００μｌとを混合し、３７℃で静置した。１時間後に上清５０μｌを採取し、１００μｌのアセトニトリルを加え、攪拌後遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ）した。上清を合成参考例１と同様の分析用高速液体クロマトグラフに付して、１時間後のペプチドのピーク面積を求めた。０時間のペプチドのピーク面積との比率から切断率を計算し、その結果をまとめて表２に示す。
【００２６】
【表２】
0003828214.tif 000003
【００２７】
参考例１
抗菌剤結合型創傷被覆材の作製
（１）含水高分子ゲルの作製
部分ケン化ポリピバリン酸ビニル（ケン化度８１％、粘度平均重合度１６５０）１０ｇをジメチルスルホキシド３００ｇに溶解し、無水コハク酸１．６４ｇおよびピリジン０．６４ｇを加えて７０℃で４時間反応させた。その結果得られた溶液約３３０ｇを、２５ｃｍ×２５ｃｍの大きさのポリスチレン製トレイに流延し、静かに水中に浸漬することにより、コハク酸が結合した部分ケン化ポリピバリン酸ビニルの含水高分子ゲルを得た。
【００２８】
（２）トロンビン切断性ペプチドと薬剤の結合
上記（１）で得られた、含水高分子ゲル１０ｇを、ジメチルホルムアミドで洗浄してゲル中の水分をジメチルホルムアミドに置換した。しかる後に、４６ｍｇのＮ−ヒドロキシコハク酸イミドと８０ｍｇの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ・ＨＣｌ）を加え、一晩振盪した。ジメチルホルムアミドと水で数回洗浄した後、実施例２で得られたペプチドGly−(D)Phe−Pro−Arg−Gly−Phe−Pro−Ala−Gly−Gly（配列番号：３）５０ｍｇとジイソプロピルエチルアミン９μｌを加えて、さらに一晩振盪し、含水高分子ゲルにペプチドを結合した。これを、水で数回、さらに０．０５Ｍの炭酸水素ナトリウム水溶液で２回洗浄した後、０．６ｇのゲンタマイシンと０．２ｇのＥＤＣ・ＨＣｌを加えて、さらに一晩振盪した。水で十分に洗浄して、抗菌剤結合型創傷被覆材を得た。
【００２９】
参考例２
参考例１において、実施例２で得られたペプチド［Gly−(D)Phe−Pro−Arg−Gly−Phe−Pro−Ala−Gly−Gly（配列番号：３）］の代わりに、比較例２で得られたペプチド［Lys−Gly−Val−Pro−Arg−Gly−Gly−Gly（配列番号：７）］を用いる以外は参考例１と同様にして抗菌剤結合型創傷被覆材を得た。
【００３０】
試験例２
疑似感染創滲出液による薬剤放出試験
参考例１および２で得られた抗菌剤結合型創傷被覆材の０．１ｇをそれぞれ計り取り、ＰＢＳ１５０μｌ、黄色ブドウ球菌培養上清５０μｌおよびヒト血漿５０μｌを加えて、３７℃で一晩振盪した。この上清７５μｌを直径８ｍｍの濾紙に吸収させて、２．５×１０6個の黄色ブドウ球菌を接種したブレイン-ハート-インフュージョン寒天培地プレート（直径１０ｃｍ）にのせて、３７℃で終夜培養した。濾紙の周囲に生じる細菌生育阻止円の直径を測定し、７５μｌのゲンタマイシン水溶液（１０μｇ／ｍｌ）を吸収させた同じ大きさの濾紙の周囲に生じる阻止円の直径との比から、上清中に放出された抗菌剤の量を計算した。
【００３１】
１時間あたりに換算した抗菌剤放出量は、参考例１で得られた抗菌剤結合型創傷被覆材の場合は約０．５２μｇ／ｇゲルであり、参考例２で得られた抗菌剤結合型創傷被覆材の場合は約０μｇ／ｇゲルであった。
【００３２】
【発明の効果】
本発明によれば、トロンビン切断性を有するペプチドおよびその塩が提供される。本発明のペプチドおよびその塩は、トロンビンによって選択的に切断されかつ安全性に優れることから、トロンビンの検出システム、トロンビン応答性材料の構成要素として有用であり、該材料から、創傷被覆材、生体組織接着材、癒着防止材、骨補強材、生体信号検出材料、薬剤放出基材等を作製することができる。
【００３３】
【配列表】
0003828214.tif 000004
【００３４】
0003828214.tif 000005
【００３５】
0003828214.tif 000006
【００３６】
0003828214.tif 000007
【００３７】
0003828214.tif 000008
【００３８】
0003828214.tif 000009
【００３９】
0003828214.tif 000010
【００４０】
0003828214.tif 000011
【００４１】
0003828214.tif 000012