(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ショウジョウバエのパッチド遺伝子以外の単離された核酸であって、当該核酸は配列番号：９又は18に示される脊椎動物のパッチド核酸に、65℃にて0.2×SSCの洗浄段階を含む高ストリンゼント条件下でハイブリダイズし、そしてソニックヘッジホッグポリペプチドに結合するパッチドポリペプチドをコードすることを特徴とする、前記核酸。
【請求項２】
前記核酸が哺乳類パッチドポリペプチドをコードする請求の範囲第１項記載の核酸。
【請求項３】
前記核酸が、ヒト又はマウスのパッチドポリペプチドをコードする請求の範囲第１項記載の核酸。
【請求項４】
前記核酸の配列がヒト配列である請求の範囲第３項記載の核酸。
【請求項５】
前記核酸の配列がマウス配列である請求の範囲第４項記載の核酸。
【請求項６】
請求の範囲第１項に記載の核酸の少なくとも18bpのフラグメントであるプローブ。
【請求項７】
制限酵素認識配列を含んで成る核酸配列に連結される請求の範囲第１項記載の核酸。
【請求項８】
発現宿主において機能的な転写開始領域、前記転写開始領域の転写調節下での請求の範囲第１項記載の核酸、及び前記発現宿主において機能的な転写終結領域を含んで成る発現カセット。
【請求項９】
前記転写開始領域が請求の範囲第１項記載の核酸に対して異種である請求の範囲第８項記載の発現カセット。
【請求項１０】
前記転写開始領域が請求の範囲第１項記載の核酸に対して同種であり、そしてエンハンサー領域を含む請求の範囲第８項記載の発現カセット。
【請求項１１】
プラスミドの一部としての請求の範囲第８項記載の発現カセット又は宿主細胞及び前記宿主細胞の細胞性子孫中への前記発現カセットの導入の結果として前記宿主細胞のゲノム中に組込まれる前記発現カセットを含んで成る細胞。
【請求項１２】
前記発現カセットがパッチドポリペプチドをコードしており、当該パッチドポリペプチドが前記宿主細胞の細胞膜に存在する、請求の範囲第11項記載の細胞。
【請求項１３】
前記パッチドポリペプチドがマウスのパッチドポリペプチドである請求の範囲第11項記載の細胞。
【請求項１４】
前記発現カセットがヒトのパッチドポリペプチドをコードするパッチド遺伝子を含んでなる請求の範囲第11項記載の細胞。
【請求項１５】
前記転写開始領域が、異種遺伝子に連結されるプロモーター及びエンハンサーを含んで成るショウジョウバエのパッチド遺伝子転写開始領域である請求の範囲第11項記載の細胞。
【請求項１６】
発現カセットを含んでなる細胞であって、当該発現カセットが、（ｉ）発現宿主において機能する転写開始領域であって、プロモーター及びエンハンサーを含んでなるもの、（ii）前記転写開始領域転写調節の下にある請求の範囲第１項に記載の核酸、（iii）マーカー遺伝子、及び（iv）前記発現宿主中で機能的な転写終結領域、を含んでなり、
前記発現カセットは、プラスミドの一部として存在するか、又は前記宿主もしくはその細胞性子孫中への前記発現カセットの導入の結果として宿主細胞のゲノム中に組込まれる、
ことを特徴とする前記細胞。
【請求項１７】
前記転写開始領域がショウジョウバエの領域である請求の範囲第16項記載の細胞。
【請求項１８】
ヒト以外の動物の胚にパッチドポリペプチドを用いて該胚の成長を追跡するための方法であって、
請求の範囲第16項に記載の発現カセットを該胚中に組込み；
該胚の細胞を増殖し、それにより増殖及び分化が生じ；そして
前記マーカー遺伝子の発現によりパッチドポリペプチドの発現を含んで成る細胞の位置を決定する；
ことを含んで成る方法。
【請求項１９】
請求の範囲第11項記載の細胞を増殖し、それによりパッチドポリペプチドを発現し；そして
他のタンパク質を含まない前記パッチドタンパク質を単離する；
ことを含んで成る、パッチドポリペプチドを生成するための方法。
【請求項２０】
パッチドポリペプチドに対する結合親和性のための候補体化合物をスクリーンするための方法であって、
前記候補体化合物と、脊椎動物又は無脊椎動物の細胞の膜における前記パッチドポリペプチド、及び前記細胞において機能的な転写開始領域、前記転写開始領域の転写調節下で完全なコード配列を含んでなる請求の範囲第１項記載の核酸、及び前記細胞において機能的な転写終結領域を含んでなる発現カセットを含んで成る前記脊椎動物又は無脊椎動物細胞とを一緒にし、前記パッチドポリペプチドを前記細胞において発現し；そして
前記パッチドポリペプチドへの前記候補体化合物の結合性についてアッセイする；
ことを含んで成る方法。
【請求項２１】
パッチドポリペプチドによりアゴニスト活性のための候補体化合物をスクリーニングするための方法であって、
前記候補体化合物と、脊椎動物又は無脊椎動物の細胞の膜における前記パッチドポリペプチド、及び請求の範囲第16項に記載の発現カセットを含んで成る前記脊椎動物又は無脊椎動物細胞とを一緒にし；そして
前記マーカー遺伝子の発現についてアッセイする；
ことを含んで成る方法。
【請求項２２】
請求の範囲第１項に記載のパッチドポリペプチドに特異的に結合する抗体。
【請求項２３】
ヘッジホッグポリペプチドに結合する天然の脊椎動物パッチドポリペプチドをコードするパッチド核酸又はその対立遺伝子を含んでなる単離された核酸であって、前記のパッチド核酸が配列番号：９又は18に示される配列と、50℃にて0.1×SSCの洗浄段階を含む高ストリンゼント条件下でハイブリダイズする、ことを特徴とする単離された核酸。
【請求項２４】
前記パッチド核酸が、配列番号：９又は18に示される配列と、65℃にて0.2×SSCの洗浄段階を含む高ストリンゼント条件下でハイブリダイズする、請求の範囲第23項に記載の単離された核酸。
【請求項２５】
前記パッチドポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号：10又は19に記載の配列と同じである、請求の範囲第23項記載の核酸。
【請求項２６】
前記パッチド核酸の配列が、配列番号：９又は18に記載の配列と同じである、請求の範囲第23項記載の核酸。
【請求項２７】
脊椎動物ポリペプチドをコードする核酸配列を含んでなる単離された核酸であって、前記脊椎動物ポリペプチドは、ヘッジホッグ結合配列を含み、当該ヘッジホッグ結合配列は、番号：９又は18に記載の配列に、50℃にて0.1×SSCの洗浄段階を含む高ストリンゼント条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされており、当該ポリペプチドはヘッジホッグ結合活性を維持している、ことを特徴とする単離された核酸。
【請求項２８】
前記ヘッジホッグ結合配列が、配列番号：９又は18に記載の配列に、65℃にて0.2×SSCの洗浄段階を含む高ストリンゼント条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされている、請求項27に記載の核酸。
【請求項２９】
（ｉ）脊椎動物天然パッチド遺伝子又はその対立遺伝子変異体のヌクレオチド配列であって、（ａ）配列番号：９又は18に記載の配列に、50℃にて0.1×SSCの洗浄段階を含む高ストリンゼント条件下でハイブリダイズし、そして（ｂ）ヘッジホッグ蛋白質に結合するポリペプチドをコードするもの、及び
（ii）前記コード配列の転写を制御する異種性転写開始領域、
を含んでなる核酸。
【請求項３０】
請求の範囲第23、24、27又は29項に記載の核酸を含んで成り、それを発現させる細胞。
【請求項３１】
真核細胞である、請求の範囲第30項に記載の細胞。
【請求項３２】
哺乳類細胞である、請求の範囲第31項に記載の細胞。
【請求項３３】
請求の範囲第１項に記載の核酸によりコードされるポリペプチド。
【請求項３４】
モノクローナル抗体である、請求の範囲第22項に記載の抗体。
【請求項３５】
パッチドポリペプチドに対するアンタゴニスト活性について候補化合物をスクリーニングする方法において、
前記候補化合物を、脊椎動物又は非脊椎動物の細胞と一緒にし、ここで、当該細胞は当該細胞の細胞膜中の前記パッチドポリペプチド及び請求の範囲第16項に記載の発現カセットを含んで成り；そして
前記マーカー遺伝子の発現を測定する；
ことを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明の分野は、セグメント極性遺伝子及びそれらの使用に関する。
背  景
セグメント極性遺伝子（Segment Polarity qene）は、体セグメントの構造のパターンを変える突然変異としてハエに発見された。遺伝子における突然変異は本体セグメントの表面上での変更されたパターンの動物における進行を引き起こし、この変更は先端から末端の軸にそってのパターンに影響を及ぼす。たとえば、パッチド遺伝子における突然変異は、個々のセグメントの中心に通常の構造を伴わないで個々の本体セグメントの発達を引き起こす。それらの代わりに、前方セグメントに通常見出されるパターンの鏡像が存在する。従って、セグメントの中央における細胞は誤った構造を作り、そして動物の全体的頭対尾極性に関して誤った方向にそれらを向ける。このクラスにおいては、約16種の遺伝子が知られている。コードされたタンパク質は、キナーゼ、転写因子、細胞結合タンパク質、ウィングレス（Wingless；WG）及びヘッジホッグ（hedgehog；HH）と呼ばれる２種の分泌されるタンパク質、パッチドと呼ばれる単一のトランスメンブランタンパク質（PTC）、及びいづれの既知のタンパク質にも関係しないいくつかの新規タンパク質を包含する。それらのタンパク質のすべては、細胞の運命及び極性を決定するためにそれらの隣りのものを細胞に知らせるシグナル経路において一緒に作動すると思われる。
ショウジョウバエ及び他の無脊椎動物のセグメント極性タンパク質の多くは、脊椎動物に密接に関連しており、すなわち包含されるその分子機構が極めて古いことを意味する。ハエ遺伝子に関連する脊椎動物タンパク質の中には、脊椎動物の脳の発達において作用するEn−１及び−２、並びに脳の発達にも関与するが、しかしマウス乳癌の多くの場合において関係する腫瘍遺伝子として最初に見出されたWNT−１が存在する。ハエにおいては、パッチド（Patched）遺伝子は、胚においては複雑且つダイナミックなパターンでRNAに転写され、すなわち個々の体セグメント原基において５種の横方向ストライプを含む。コードされたタンパク質は、多くのトランスメンブランドメインを含むことが予測される。それはいづれの他の既知のタンパク質に対しても有意な類似性を有さない。多数のトランスメンブランドメインを有する他のタンパク質は、種々の膜タンパク質、膜を通してのチャネル及び膜を通しての輸送体を包含する。
ハエのヘッジホッグ（HH）タンパク質は、少なくとも３種の脊椎動物関連物、すなわちソニックヘッジホッグ（Sonic hedgehog）（Shh）；インデアンヘッジホッグ（Indian hedgehog）及びデザートヘッジホッグ（Desert hedgehog）を有することが示された。Shhは個々の成長する肢（limb）の後部の一群の細胞において発現される。これは成長する肢に対しての極性を伝達するのに重要な役割を有することが見出された細胞の全く同じ群である。シグナルは、後部指及び他の肢構造体を形成するシグナルの後部源に近い細胞、及びより前部の構造体を形成するシグナル源からの追加の細胞により類別されると思われる。シグナル細胞、すなわち“分極活性化の領域（Zone of polarizing activity；ZPA）”として知られる肢芽の領域の移植が、肢パターン化に対して劇的な効果を有することがこれまで知られて来た。肢の前部への第２ZPAの移植は、前部の特徴を置換する後部の特徴を有する肢（実質的には、母指ではなく小指）の成長を引き起こす。Shhは、長く捜し求められて来たZPAシグナルであることが見出されている。Shhタンパク質（SHH）を生産する培養された細胞は、前部肢領域中に移植される場合、移植されたZPAと同じ効果を有する。これは、Shhが明確に、後部肢の成長の決定的な引き金であることを確立した。
ZPAにおける因子は、成長する脊髄を分極化するもう１つの重要な成長シグナルに関連していると時々思われて来た。脊索、すなわち初期脊椎動物の胚の背側にそって走る中胚葉の杆状体が、背側−腹側軸にそって神経管を分極化するシグナル源である。シグナルは、脊索に最も近い神経管の部分の、底板（floor plate）、すなわち神経管の形態学的に区別される部分形成を引き起こす。底板は今度は、細胞の運命をさらに決定するために神経管のより背側部にシグナルを送る。ZPAは、神経管に隣接して移植される場合、脊索と同じシグナル効果を有することが報告されており、これはZPAが脊索と同じシグナルを生成することを示唆する。この観点から、Shhは脊索細胞及び底板細胞により生成されることが見出された。マウスにおけるShhの例外的な発現の試験は、通常、底板遺伝子の例外的な発現を開始せしめない細胞におけるそれらの発見を導く。従って、Shhは、脊索から底板及び底板から神経管のより背部の部分の成分であると思われる。肢及び神経管の他に、脊椎動物のヘッジホッグ遺伝子はまた、多くの他の組織、たとえば末梢神経系、脳、肺、肝臓、腎臓、歯の原基、生殖器、及び後腸及び前腸内胚葉（但し、これらだけには限定されない）においても発現される。
PTCは、ハエにおける遺伝子実験に基づいてHHタンパク質のための受容体として提案されて来た。この関係のためのモデルは、PTCがそれ自体の転写及びウィングレスセグメント極性遺伝子の転写の両者を不活性化するために、多分、知られていない経路を通して作用することである。このモデルは、隣接する細胞から分泌されるHHタンパク質がPTC受容体に結合し、それを不活性化し、そしてそれにより、PTCがそれ自体の転写又はウィングレスの転写を停止することを防ぐことを示す。多くの実験は、PTCとHHとの間の同等の出来事を示した。
関連する文献
パッチドのみ又はヘッジホッグと共にその役割の記載が次のものに見出され得る：Hooper and Scott，Cell 59，751-765（1989）；Nakanoなど.，Nature，341，508-513（1989）（前記両者はまた、ショウジョウバエのパッチドのための配列も記載する）；Simcoxなど.，Development 107，715-722（1989）；Hidalgo and Ingham，Development，110，291-301（1990）；Phillipsなど.，Development，110，105-114（1990）；Sampedro and Guerrero，Nature 353，187-190（1991）；Inghamなど.，Nature 353，184-187（1991）；及びTaylorなど.，Mechanism of Development 42，89-96（1993）。ヘッジホッグの役割の論議は次のものに見出される：Riddleなど.，Cell 75，1401-1416（1993）；Echelardなど.，Cell 75，1417-1430（1993）；Krausaなど.，Cell 75，1431-1444（1993）；Tabata and Kornberg，Cell 76，89-102（1994）；Heemskerk & DiNardo，Cell 76，449-460（1994）；Relinkなど.，Cell 76，761-775（1994）；及びIngham，Current Biolog 4，347-350（1994）による短い書評文献。ショウジョウバエの５′非コード領域についての配列は、Gen Bank、受理番号Ｍ28418、Hooper and Scott（1989）、前記に報告されている。また、Forbes、など.，Development 1993 Supplement 115-124も参照のこと。
発明の要約
パッチド遺伝子、特に哺乳類のパッチド遺伝子、たとえばマウス及びヒトパッチド遺伝子、及び無脊椎動物のパッチド遺伝子及び配列を単離するための方法が提供される。前記方法は、他の種、及びタンパク質の同じファミリーのメンバーからのパッチド遺伝子の同定を包含する。対象の遺伝子はパッチドタンパク質を生成するための方法を提供し、ここで前記遺伝子及びタンパク質は研究、診断、その単離及び精製のためへのヘッジホッグタンパク質の結合、遺伝子療法及び他の利用のためのプローブとして使用され得る。
【図面の簡単な説明】
図１は、ショウジョウバエのパッチド遺伝子の開始コドンから上流の５′領域の約10kbpの制限地図を有するグラフ、及びβ−ガラクトシダーゼに連結される５′領域の切断された部分の構造体の棒グラフであり、ここで前記構造体は胚の生成のためにハエ細胞系中に導入される。胚の初期及び後期成長の間、胚におけるβ−galの発現が右側の表に示される。＋の数が多くなるほど、染色の強さが増す。
特定の態様の記載
無脊椎動物及び脊椎動物、たとえば哺乳類からのパッチド（ptc）遺伝子ファミリーのメンバー、並びにマウス及びヒトパッチド遺伝子の完全なcDNA配列を同定するための方法が提供される。また、無脊椎動物のパッチド遺伝子についての配列が提供される。パッチド遺伝子は、多数のトランスメンブラン配列を有するトランスメンブランタンパク質をコードする。
マウス及びヒトパッチド遺伝子を同定する場合、既知のショウジョウバエptc配列からのプライマーが進化系図を通して移動せしめるために使用された。関連する無脊椎動物、たとえば蚊のゲノムDNAの部分を増幅するために適切な制限酵素リンカーを有するショウジョウバエ配列からの２種のプライマーが使用される。前記配列は、進化時間にわたって逸脱せず、そして低い変性のものである領域から選択される。便利には、前記領域は、タンパク質の最初の親水性ループにおけるcDNAのコード領域の最初の1.5kb、通常、最初の１kb以内のＮ−末端近位配列である。プライマーによるポリメラーゼ鎖反応（PCR）を用いる場合、蚊のゲノムDNAからのバンドが使用され得る。次に、そのバンドが増幅され、そしてプローブとして使用され得る。進化系図の異なったブランチの生物、たとえばチョウからのcDNAライブラリーをプローブするためにこのプローブを使用することができる。前記ライブラリーをスクリーニングし、そして前記プローブにハイブリダイズする配列を同定することによって、チョウのパッチド遺伝子の一部が得られる。次に、１又は複数のその得られるクローンは、完全なコード領域及び非コード５′−並びに３′−配列までの及びそれらを含む延長された配列を得るために前記ライブラリーを再スクリーンするために使用され得る。適切な場合、その得られるcDNAコード配列のすべて又は一部を配列決定することができる。
前配列の１つ又は両者から適切なプローブにより進化基準において高等な種のゲノム又はcDNAライブラリーをスクリーンすることができる。遠い関係にある無脊椎動物、たとえば昆虫のゲノムライブラリーをスクリーンすることが特に興味の対象であり、ここで、前の２つの種、この場合、ショウジョウバエ及びチョウから得られる配列の組合せを用いることができる。適切な技法により、プローブに結合し、次に個々のプローブとのそれぞれの交差ハイブリダイゼーションのためにスクリーンされ得る特定のクローンを同定することができる。次に、その得られるフラグメントが、たとえばサブクローニングにより増幅され得る。
４種の異なったパッチド遺伝子、現在例示される例においては、ショウジョウバエ（ハエ）、蚊、チョウ及び昆虫のパッチド遺伝子のすべて又は一部を有することにより、保存された配列についてパッチド遺伝子を比較することができる。パッチドを発現する適切な哺乳類肢又は他の細胞、たとえば脊索、神経管、腸、肺芽又は他の組織、特に胎児組織からの細胞が、スクリーニングのために使用され得る。他方、パッチドを生成する成熟組織もスクリーニングのために使用され得る。４つの他の種から入手できるコンセンサス配列に基づけば、個々の部位で少なくとも２つの配列が同じヌクレオチドを有し、そして個々の種がユニークなヌクレオチドを有し、すなわちすべての４種のヌクレオチドに結合するイノシンが使用され得る部位が変化するプローブを開発することができる。
いづれかのPCRがプライマーを用いて使用され得、又は所望により、適切な源からのゲノムライブラリーがプローブされ得る。PCRによれば、cDNAライブラリーを使用し、又は逆転写酵素−PCR（RT-PCR）を使用することができ、ここでmRNAは組織から入手できる。通常、胎児組織が使用される場合、特定の宿主に依存して、第１又は第２トリメスター、好ましくは第１トリメスター又は第２トリメスターの後半の半分からの組織を用いることができるであろう。組織の年齢及び源は、そのサイズに基づいて組織を手術的に分離する可能性、組織の細胞におけるパッチドの発現のレベル、組織の入手可能性、パッチドを発現する細胞の数及び同様のものに有意な程度依存するであろう。入手できる組織の量は、有用に転写され、そして増幅されるべき十分な量のmRNAを供給するために十分に多量であるべきである。マウス組織に関しては、約10〜15dpc（受胎後の日数）からの肢が使用され得る。
プライマーにおいては、相補的結合配列は通常、少なくとも14個のヌクレオチド、好ましくは少なくとも約17個のヌクレオチド及び通常、約30個よりも多くないヌクレオチドであろう。プライマーはまた、単離及びクローニングのための制限酵素配列を含むことができる。RT-PCRにより、mRNAは既知手段により富化され、逆転写され、続いて適切なプライマーにより増幅され得る。（分子クローニングのために使用される方法は、Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Sambrookなど.，eds.，Cold Spring Habor Laboratories，Cold Spring Habor，NY，1988に見出され得る）。特に、プライマーは便利には、Ｎ−末端近位配列又は他の保存された領域、たとえば少なくとも５個のアミノ酸が４個の配列のうち３個の配列において８個のアミノ酸から保存されているそれらの配列からのものである。これは配列（配列番号11）IITPLDCFWEG、（配列番号12）LIVGG及び（配列番号13）PFFWEQYにより例示される。予測される大きさの得られるPCR生成物がサブクローン化され、そして所望により配列決定され得る。
次に、クローン化されたPCRフラグメントは、パッチドを発現する哺乳類の組織細胞のcDNAライブラリーをスクリーンするためのプローブとして使用され得、ここでハイブリダイズするクローンが適切な緊縮条件下で単離され得る。再び、cDNAライブラリーは、パッチドを発現する組織からのものであり、この組織は前に記載された制限内からのものであろう。ハイブリダイズするクローンは、サブクローン化され、そして再スクリーンされ得る。次に、ハイブリダイズするサブクローンが単離され、そして配列決定され、又はRNAブロット及び現場ハイブリダイゼーションを用いることによって、完全な及び切断された胚においてさらに分析され得る。便利には、Ｎ−末端コード領域の約0.5〜１kbpのフラグメントがノザンブロットのために使用され得る。
哺乳類遺伝子が配列決定され、そして上記のようにして、保存された領域が同定され、そして他の種を調査するためにプライマーとして使用され得る。Ｎ末端近位領域、Ｃ末端領域又は中間領域が配列のために使用され得、ここで最小の変性、及びプローブ配列に対して所望するレベルの保存性を有する配列が選択されるであろう。
PTCをコードするDNA配列は、cDNAもしくはゲノムDNA又はそれらのフラグメント、特にゲノムDNAからの完全なエキソンであり、染色体から野生型配列を実質的に有さない配列として単離され、50kbpのフラグメント又はそれよりも小さなフラグメントであり得、プライマー、プローブ又は同様のものとして使用するための制限部位又は他の同定DNAであり得る、単一のオリゴヌクレオチド、50pbまでのオリゴヌクレオチド、又は核酸がクローニング又は発現ベクターの一部であり得る50bp以上の核酸であり得る異種又は外来性DNAに連結され得、発現カセットの調節領域を含んで成り、又は同様のものであり得る。前記DNAは、単離され、精製され、タンパク質及び他の核酸を実質的に有さず、溶液において存在し、又は同様のものであり得る。
本発明の遺伝子は、パッチドタンパク質のすべて又は一部を生成するために使用され得る。本発明の遺伝子又はそのフラグメント、一般的には少なくとも12bp、通常少なくとも18bpのフラグメントが、染色体外維持のために適切なベクター中に又は組込みのために宿主中に導入され得る。フラグメントは、５′及び／又は３′末端で天然の又は野生型の遺伝子に見出されないヌクレオチド又は配列に直接連結され、又は核酸配列以外のラベルに連結され得る。発現に関しては、誘発性又は構成的であり得る転写及び翻訳開始領域、転写開始領域の転写制御下でのコード領域、及び転写及び翻訳停止領域を提供する発現カセットが使用され得る。発現宿主において機能的である種々の転写開始領域が使用され得る。ペプチドは、発現の目的に依存して、従来の手段に従って原核生物又は真核生物において発現され得る。タンパク質の多量生成のためには、単細胞生物、又は高等生物、たとえば真核生物、たとえば脊椎動物、特に哺乳類の細胞が、発現宿主、例えばＥ．コリ（E．coli），Ｂ．サブチリス（B．subtilis），Ｓ．セレビシアエ（S．cerevisiae）及び同様のものとして使用され得る。多くの状況においては、哺乳類宿主においてパッチド遺伝子を発現することが所望され、これによりパッチド遺伝子が種々の研究のために細胞膜に輸送されるであろう。タンパク質は、合計６個の細胞外ループと共に合計６個のトランスメンブラン領域を提供する２つの部分を有する。タンパク質の特徴は、トランスポータータンパク質に対して類似性を有する。タンパク質は２つの保存されたグリコシル化シグナル３回対称軸を有する。
対象の核酸配列は、種々の目的のために変性され得、特にそれらは、核酸切断剤、たとえばキレート化された金属イオン、たとえば鉄又はクロムに、遺伝子の切断のために連結されることによって細胞内で使用され；アンチセンス配列として使用され得；又は同様のものとして使用され得る。変性は、硫黄又は窒素によるリン酸エステルの酸素の置換、ホスホラミドによるリン酸の置換、等を包含する。
発現宿主を用いることによる多量のタンパク質の利用性により、タンパク質が従来の手段に従って単離され、そして精製され得る。溶解物は発現宿主から調製され得、そして溶解物はHPLC、排除クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、親和性クロマトグラフィー又は他の精製技法を用いて精製され得る。精製されたタンパク質は一般的に少なくとも約80％の純度、好ましくは少なくとも約90％の純度であり、そして100％までの純度でもあり得る。純粋とは、他のタンパク質、及び細胞残骸を有さないことを意味する。
ポリペプチドは抗体の生成のために使用され得、ここで短いフラグメントが特定のポリペプチドに対して特異的な抗体を供給し、そして大きなフラグメント又は完全な遺伝子はポリペプチド又はタンパク質の表面上での抗体の生成を可能にし、ここでタンパク質はその天然の形態で存在できる。
抗体は従来の手段に従って、発現されたポリペプチド又はタンパク質は、単独で免疫原として使用され、又は既知の免疫原性キャリヤー、たとえばKLH、pre-S HBsAg、他のウィルス性又は真核性タンパク質又は同様のものに接合され得る。種々のアジュバンドが、適切な場合、一連の注射に使用され得る。モノクローナル抗体のためには、１又は複数回の追加免疫注射の後、脾臓が単離され、脾臓細胞が不滅化され、そして次に高い親和性の抗体の結合のためにスクリーンされ得る。次に、所望する抗体を生成する不滅化された細胞、たとえばハイブリドーマが拡張され得る。さらなる説明のためには、Monoclonal Antibodies；A Laboratory Manual，Harlow and Lane eds.，Cold Spring Harbor Laboratories，Cold Spring Harbor，New York，1988を参照のこと。所望により、Ｈ鎖及びＬ鎖をコードするmRNAが単離され、そしてＥ．コリにおけるクローニングにより変異誘発され、そしてＨ鎖及びＬ鎖が抗体の親和性をさらに増強するために組合わされ得る。抗体は、細胞の表面上でのPTCタンパク質の存在の検出のために診断アッセイに使用され、又は結合部位のために競争することによりPTCタンパク質リガンドによるシグナルのトランスダクションを阻害するために使用され得る。
マウスのパッチド遺伝子（配列番号９）は、約1,200個のアミノ酸にわたってハエPTC（配列番号６）に対して約38％の同一性のアミノ酸を有するタンパク質（配列番号10）をコードする。この保存の量は、Ｃ末端領域を除くタンパク質の多くを通して分散される。マウスタンパク質はまた、ハエタンパク質に関する50個のアミノ酸の挿入体を有する。ヒトパッチド遺伝子（配列番号18）は、マウスptc（配列番号９）に対して約96％の同一性（98％の類似性）を有する約1450個のアミノ酸（配列番号19）の読み取り枠を含む。コード及び非コード配列を含むヒトパッチド遺伝子（配列番号18）は、マウスパッチド遺伝子（配列番号９）に対して約89％の同一性を有する。
チョウPTC相同体（配列番号４）は、1,300個のアミノ酸の長さであり、そして全体的に、ハエPTC（配列番号６）に対して50％のアミノ酸同一性を有する。逸脱したＣ末端を除いて、この相同性はそのコード配列を通して均等に広げられる。昆虫パッチド遺伝子からの267bpのエキソンは、それぞれハエ及びチョウのその対応する領域に対して44％及び51％の同一性を有することが見出された89個のアミノ酸のタンパク質フラグメントをコードする。
マウスptcメッセージは約８kbの長さであり、そしてそのメッセージは７dpcほどの初期で低レベルで存在し、11及び15dpcでそのレベルは高まる。ノザンブロットは、17dpcでメッセージの量の明確な低下を示す。成人においては、PTC RNAは、脳及び肺において高い量で存在し、そして腎臓及び肝臓においては中ぐらいの量で存在する。弱いシグナルが心臓、脾臓、骨格筋及び乳頭に検出される。
マウス胚においては、ptc mRNAは、現場ハイブリダイゼーションを用いる場合、７dpcで存在する。ptcは8.5dpcの胚の神経軸にそって高レベルで存在する。11.5dpcまでに、ptcは成長する肺芽及び腸において検出され得、これはそのノザンプロフィールと一致する。さらに、その遺伝子は、中枢神経系の脳室領域及び前脳において高レベルで存在する。ptcはまた、11.5及び13.5dpcの肢芽の軟骨膜濃縮軟骨において、及び体節の腹側部分、すなわち、それぞれの硬節であり、そして結局、背柱において骨を形成する領域において強く転写される。PTCは、内胚葉、中胚葉及び外胚葉起原の広範囲の組織に存在し、軟骨の濃縮、肢のパターン化、肺組織の分化及びニューロンの生成を包含する胚の成長の多くの観点において基本的な役割を示す。
パッチド核酸は、注目の種々の哺乳類源、特に霊長類、より特定にはヒト、又は家畜、たとえばウサギ、ゲッ歯類、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、羊、ウマ、等から遺伝子を単離するために使用され得る。プローブ、特にDNA配列、すなわちパッチド遺伝子のラベルされたプローブを用いることによって、mRNA又はゲノムDNAを単離することができ、次にそれらは、特に遺伝子疾患、たとえば二分脊椎、肢欠損、肺欠損、歯の成長、肺及び腎臓の成長、末梢神経系の成長、及びパッチド遺伝子が調節において関与する他の部位に関する問題に関係する突然変異を同定するために使用され得る。対象のプローブはまた、発現及び精子生成のレベルとの関係を決定するために精巣に関連する細胞の発現のレベルを同定するためにも使用され得る。
遺伝子又はそのフラグメントは、転写開始領域、特にパッチドの転写を調節するエンハンサーを含んで成る５′非コード領域を同定するためのプローブとして使用され得る。特に、その５′コード領域を含んで成るプローブによりゲノムライブラリーをプローブすることによって、５′非コード領域を含んで成るフラグメントを得ることができる。必要なら、エンハンサーの少なくとも機能的部分を有することを確かめるために追加の５′配列の獲得に前記フラグメントを使用することができる。エンサーは５′コード領域に最とも近く、一部が転写された配列に及びプロモーター配列から下流に存在することが見出される。転写開始領域は、多くの目的のために、すなわち、胚の成長の研究のために、胚の成長の間又はその後、パッチドタンパク質又は他の興味あるタンパク質の調節された発現を提供するために、及び遺伝子療法に使用され得る。
その遺伝子はまた、胚幹細胞又は成熟細胞中への正常な遺伝子のトランスフェクションにより遺伝子療法のためにも使用され得る。広範囲の種類のウィルスベクターが、細胞のゲノム中への遺伝子のトランスフェクション及び安定した組込みのために使用され得る。他方、適切な宿主細胞中への遺伝子の導入のために、マイクロインジェクション、融合又は同様の方法が使用され得る。たとえば、Dhawanなど.，Science 254，1509-1512（1991）及びSmithなど.，Molecular and Cellular Biology（1990）3268-3271を参照のこと。
多量のPTCタンパク質の生成を提供することによって、PTCタンパク質に結合するリガンドを同定するためにそのタンパク質を用いることができる。特に、細胞においてタンパク質を生成することができ、そしてPTCタンパク質のためのリガンドを単離するためにカラムにおいてリポソームを用いることができる。タンパク質と適切な脂質界面活性剤、たとえばリン脂質、コレステロール、等とを組合すことによってリポソーム中にPTCタンパク質を組込み、そして水性媒体中においてPTCタンパク質及び界面活性剤の混合物を音波処理することができる。１又は複数の確立されたリガンド、たとえばヘッジホッグにより、リガンドの結合を阻害するアンタゴニストについてスクリーンするためにPTCタンパク質を用いることができる。この場合、正常又は異常な細胞においてPTCタンパク質によるシグナルのトランスダクションを阻止することができる薬物が同定され得る。
PTCタンパク質、特にその結合フラグメント、タンパク質をコードする遺伝子又はそのフラグメント、特に少なくとも約18個のヌクレオチド、時おり少なくとも約30個のヌクレオチド及び完全な遺伝子までのフラグメント、より特定には、親水性ループに関連する配列が、広範囲の種類のアッセイに使用され得る。それらの状況においては、特定の分子が通常、ラベルとして作用するもう１つの分子に連結され、ここで前記ラベルが検出可能なシグナルを直接的に又は間接的に提供する。種々のラベルは、放射性同位体、螢光体、化学螢光体、酵素、特定の結合分子、粒子、たとえば磁気粒子及び同様のものを包含する。特定の結合分子は、対、たとえばビオチン及びストレプタビジン、ジゴキシン及びアンチジゴキシン、等を包含する。特定の結合メンバーのためには、相補的なメンバーが、既知の方法に従って、検出を提供する分子により通常ラベルされる。パッチド遺伝子又はPTCタンパク質に結合する分子の存在を検出するために、パッチド遺伝子に結合する分子を単離するために、タンパク質又はメッセージのいづれかとしてパッチドの量を測定するために、アゴニストもしくはアンタゴニストとして作用することができる分子を同定するために、又は同様のことのためにアッセイを使用することができる。
種々の型式がアッセイに使用され得る。たとえば、哺乳類又は無脊椎動物細胞が企画され得、ここで前記細胞は、アゴニストが細胞の膜においてPTCに結合する場合に応答する。発現カセットが細胞中に導入され得、ここでパッチドの転写開始領域がマーカー遺伝子、たとえばβ−ガラクトシダーゼに連結され、このためには、青色の色素を形成する基質が利用できる。PTCシグナル化に応答する1.5kbのフラグメントが同定されており、そして胚の成長の間、異種遺伝子の発現を調節することが示されている。アゴニストがPTCタンパク質に結合する場合、細胞は青色に変化するであろう。アゴニストと対象の化合物との間の競争を用いることによって、青色形成の不在はアンタゴニストの存在を示すであろう。それらのアッセイは文献において良く知られている。細胞の代わりに、膜環境におけるタンパク質を用いることができ、そして化合物の結合親和性を決定することができる。PTCは、使用されるPTCために表面及びラベルされたリガンドに結合され得る。多くのラベルが前で示された。候補体化合物が、PCT結合表面に適切な緩衝媒体におけるラベルされたリガンドと共に添加される。結合が生じたことを確かめるためにインキュベーションの後、その表面は洗浄され、アッセイ媒体のいづれかの非特異的に結合された成分、特に非特異的に結合されたラベルされたリガンドが除去され、そしてその表面に結合されるいづれかのラベルが決定され得る。ラベルが酵素である場合、検出可能な生成物を生成する基質が使用され得る。ラベルが検出され、そして測定され得る。基準を用いることによって、候補体化合物の結合親和性が決定され得る。
遺伝子及びタンパク質の利用性は、胎児の成長の研究及びパッチド及び他の分子がそのような成長において演じる役割の研究を可能にする。その配列が培養における細胞に導入され得る、パッチド遺伝子のアンチセンス配列、又は細胞中に導入されるパッチド遺伝子のアンチセンスの転写を提供するベクターを用いることによって、PTCタンパク質が細胞の成長において演じる役割を研究することができる。リガンドのために正常な細胞PTCタンパク質と競争することができる。可溶形でのPTCタンパク質又はそのフラグメントを提供することによって、宿主の細胞成長に対する、PTCタンパク質のためのリガンドの濃度の変化の効果を見出すために、細胞PTCタンパク質へのリガンドの結合を阻害することができる。PTCに対する抗体はまた、PTCが細胞表面上に暴露されるので、機能を阻止するためにも使用され得る。
対象の遺伝子はまた、胚成長及びPTCタンパク質がそのような成長において演じる役割を研究するために役だつことができるトランスジェニック実験用動物を調製するためにも使用され得る。構成的であるか又は誘発性であり得る異なった転写開始領域を用いて、PTCタンパク質の発現における変動を提供することによって、PTCタンパク質レベルにおける差異の効果を決定することができる。他方、単一の機能的なパッチド遺伝子のみを有し、又は機能的なパッチド遺伝子を欠いている宿主を生成するために、胚幹細胞におけるPTCタンパク質をノックアウトするDNAを用いることができる。相同組換えを用いることによって、選択的に調節される、たとえば胎児の成長に対して発現されるが、しかし成人においては発現されないパッチド遺伝子を導入することができる。通常、又は成長の異常な時点で発現されない、細胞又は組織におけるパッチド遺伝子の発現をまた提供することができる。ヒト疾病を模倣するために一定の組織における誤った発現又は発現の失敗を提供することができる。従って、脊髄の成長における二分脊椎又は異常な運動ニューロン分化のマウスモデルが利用できる。さらに、通常、生成されない、細胞におけるPTCタンパク質の発現を提供することによって、PTCタンパク質へのリガンドの結合に基づいて細胞の挙動性の変化を誘発することができる。
研究の範囲は、癌処置の開発を包含することができる。その転写がPTCによりハエにおいて調節されるウィングレス遺伝子は、哺乳類腫瘍遺伝子、すなわちマウス乳癌の多くの場合においてキー因子であるWnt−１に密接に関係している。分泌されたシグナル化タンパク質である他のWntファミリーのメンバーは、成長の多くの観点において包含される。ハエにおいては、哺乳類における増殖及び成長に対して影響を及ぼすことが知られている、シグナル化タンパク質のTGF−βファミリーのメンバーであるシグナル因子デカペンタプレジック（decapentaplegic）がまた、PTCにより制御される。TGF−β及びWntファミリーの両者のメンバーはパッチドによるオーバーラップに接近する場所でマウスにおいて発現されるので、通常の調節が癌の処置において機会を提供する。また、修復及び再生に関しては、PTCタンパク質を製造する増殖コンピテント細胞は、ptc遺伝子及びその正常な転写開始領域又は変性された転写開始領域により損傷を受けた組織の細胞をトランスフェクトすることによって再生され得る損傷を受けた組織の再生及び治癒を促進することができる。たとえば、PTCは、そのタンパク質が初期成長段階の間、存在し、又は発現される、はぐき又は他の組織の細胞を構築することによって新しい歯の増殖を刺激するために有用である。
ノザンブロット分析は、ptcが成人の肺組織に高レベルで存在することを示すので、ptc発現又はその天然のリガンドへの結合の調節は、癌性の肺細胞の増殖を阻害するために作用する。PTCをコードする遺伝子の利用性及びその遺伝子の発現は、アゴニスト及びアンタゴニストの開発を可能にする。さらに、PTCは成長における初期でのニューロンの分化する能力に対して重要である。遺伝子の利用性は、分裂及び／又は分化の胎児のプログラムを刺激する、宿主の疾患組織中へのPTCの導入を可能にする。これは、PTC活性を調節するリガンドを提供する他の遺伝子と一緒に、又は天然のリガンド以外のアゴニストを提供することによって行なわれ得る。
種々の種からの種々のptc遺伝子のためのコード領域の利用性は、ptc遺伝子の調節に関連して遺伝子の調節を可能にするptc遺伝子又は他の遺伝子の転写及び後−転写調節を提供するために、ptc遺伝子に関連するプロモーター及びエンハンサーを含んで成る５′非コード領域の単離を可能にする。ptc遺伝子は自動調節されるので、ptc遺伝子の活性化は、ptc遺伝子の転写開始領域の転写制御下での遺伝子の転写の活性化をもたらすであろう。その転写開始領域は、いづれかの宿主種からでも得られることができ、そしてそのような開始領域が外来性宿主において所望する程度、機能的である異種宿主種中に導入され得る。たとえば、開始コドンから上流の約1.5kbから約10kbまで、好ましくは約５kbまでのフラグメントが、PTCタンパク質、特にショウジョウバエの５′−非コード領域により調節される転写開始を提供するために使用され得る（Gen Bank受理番号Ｍ28418）。
次の例は例示的であって、本発明を制限するものではない。
実  験
方法及び材料
Ｉ．蚊（アノペレス  ガムビアエ）（Anopheles gambiae）ゲノムDNAに対するPCR
PCRプライマーは、進化時間にわたって逸脱する傾向がなく、そして低い縮重のものであるハエPTCのアミノ酸範囲に基づいた。２種のそのようなプライマーP2R1（配列番号14）：GGACGAATTCAARGTNCAYCARYTNTGG、及びP4R1（配列番号15）GGACGAATTCCYTCCCARAARCANTC（下線の配列はEcoRＩリンカーである）は、PCRを用いて蚊のゲノムDNAからの適切に分類されたバンドを増幅した。プログラム条件は次の通りであった：
94℃，４分；72℃でのTaqの添加；
〔49℃，30秒；72℃，90秒；94℃，15秒〕３回
〔94℃，15秒；50℃，30秒；72℃，90秒〕35回
72℃，10分；４℃での維持。
このバンドを、pBluescriptIIのEcoRＶ部位中にサブクローン化し、そしてUSB Sequenceキットを用いて配列決定した。
II．蚊PCR生成物によるハエcDNAライブラリーのスクリーン
プローブとして蚊のPCR生成物（配列番号７）を用いて、３日の胚のPrecis coenia λgt 10 cDNAライブラリー（Sean Carrollにより豊富に提供された）をスクリーニングした。フィルターを65℃で一晩、５×SSC、10％の硫酸デキストラン、５×Denhardt's，200μｇ／mlの音波処理されたサケ精子DNA及び0.5％のSDSを含む溶液においてハイブリダイズせしめた。フィルターを、0.1×SSC、0.1％のSDSにおいて室温で数回、洗浄し、非特異的なハイブリダイゼーションを除去した。始めにスクリーニングされた100,000個のプラークのうち、２つのオーバーラップするクローン、すなわちＬ１及びＬ２を単離し、これらはチョウのPTCのＮ末端に対応した。プローブとしてＬ２を用いて、ライブラリーフィルターを再スクリーニングし、そしてptcコード配列の残りを包含する３種の追加のクローン（Ｌ５，Ｌ７，Ｌ８）を単離した。チョウのptc（配列番号３）の完全な長さの配列を、ABI自動配列決定により決定した。
III．蚊のPCR生成物及びチョウのクローンからの900bpのフラグメントによるトリボリウム（Tribolium）（甲虫）ゲノムライブラリーのスクリーン
トリボリウム  カステネウム（Tribolium casteneum）からのλgem 11ゲノムライブラリー（Rob Demellからの贈与物）を、蚊のPCR（配列番号７）生成物及びＬ２のBst XI／EcoRＩフラグメントの混合物によりプローブした。フィルターを55℃で一晩ハイブリダイズし、そして上記のようにして洗浄した。スクリーンされた75,000個のプラークのうち、14個のクローンを同定し、そして蚊／及びチョウのプローブにより交差ハイブリダイズされる、Ｔ８（配列番号１）のSacＩフラグメントをpBluescript中にサブクローン化した。
IV．４種の昆虫相同体に保存される領域に由来する縮重プライマーを用いてのマウスcDNAに対するPCR
２種の縮重PCRプライマーP4REV：（配列番号16）：GGACGAATTCYTNGANTGYTTYTGGGA及びＰ22：（配列番号17）：CATACCAGCCAAGCTTGTCNGGCCARTGCATを、ハエ（ドロソフィラ  メラノガスター（Drosophila melanogaster）（配列番号６）、蚊（アノペレス  ガムビアエ）（配列番号８）、チョウ（トリボリウム  カステネウム）（配列番号２）及び甲虫（トリボリウム  カステネウム）（配列番号２）からのPTCアミノ酸配列の比較に基づいて企画した。すべての４種のヌクレオチドと塩基対を形成することができる１つはイノシンを表わす。Ｐ22を用いて、37℃で90分間、12.5dpcのマウス肢芽（David Kingsleyからの贈与物）からのRNAを逆転写せしめた。次に、P4REV（配列番号17）及びＰ22（配列番号18）を用いてのPCRを、次の条件下でその得られるcDNA１μｌに対して実施した：
94℃，４分；72℃でのTaqの添加；
〔94℃，15秒；50℃，30秒；72℃，90秒〕35回、
72℃，10分；４℃での維持。
予測される大きさのPCR生成物をTAベクター（Inritrogen）中にサブクローン化し、そしてSequenase Version 2.0 DNA Sequencing Kit（U.S.B.）により配列決定した。
クローン化されたマウスPCRフラグメントをプローブとして用いて、マウス8.5dpc λgt 10 cDNAライブラリー（Brigid Huganからの贈与物）の300,000個のプラークを65℃で上記のようにしてスクリーンし、そして２×SSC、0.1％SDSにおいて室温で洗浄した。７個のクローンを単離し、そして３種（Ｍ２，Ｍ４，及びＭ８）をpBluescriptII中にサブクローン化した。このライブラリーの200,000個のプラークを、まず、６個のクローン（Ｍ９〜Ｍ16）を同定するためにＭ２からの1.1kbのEcoRＩフラグメントを用いて、そして、第２に、５個のクローン（Ｍ17〜Ｍ21）を単離するためにほとんどのＮ末端配列（Ｍ２からのXRoＩフラグメント）及びほとんどのＣ末端配列（Ｍ９からのBamHＩ／BglIIフラグメント）を含む混合されたプローブを用いて再スクリーンした。Ｍ９，Ｍ10，Ｍ14及びＭ17〜21を、pBluescriptII（Stratagene）のEcoRＩ部位中にサブクローン化した。
Ｖ．完全な及び断片化されたマウス胚におけるRNAブロット及び現場ハイブリダイゼーション
ノザン：
マウス胚のノザンブロット及び成人の複数組織のノザンブロット（Clontechから得られた）を、マウスptcのＮ末端コード領域からの900bpのEcoRＩフラグメントによりプローブした。ハイブリダイゼーションを、５×SSPE、10×Denhardt's、100μｇ／mlの音波処理されたサケ精子DNA及び２％SDSの溶液において65℃で実施した。２×SSC、0.05％SDSにより室温で数回洗浄した後、そのブロットを50℃で0.1×SSC、0.1％SDSにより高い緊縮性で洗浄した。
断片の現場ハイブリダイゼーション：
7.75，8.5，11.5及び13.5dpcのマウス胚をPBSにおいて切開し、Tissue-Tek媒体において−80℃で凍結せしめた。12〜16μｍの凍結断片を切断し、Vecta Band（Vector Laboratories）被覆のスライド上に集め、そして室温で30〜60分間乾燥せめした。PBS中、４％パラホルムアルデヒドにおける10分間の固定の後、スライドをPBSにおいて３分間、３度洗浄し、トリエタノールアミン中、0.25％の無水酢酸において10分間アセチル化し、そしてPBSにおいて５分間、３回以上洗浄した。プレハイブリダイゼーション（50％ホルムアミド、５×SSC、250μｇ／mlの酵母tRNA、500μｇ／mlの音波処理されたサケ精子DNA及び５×Denhardt's）を、50％ホルムアミド／５×SSC湿潤化チャンバーにおいて室温で６時間実施した。ptcのＮ末端からの１kbから成るプローブを、プレハイブリダイゼーションのために使用される同じ溶液中に200〜1000ng／mlの濃度で添加し、そして次に、80℃で５分間、変性した。約75μｌのプローブを個々のスライドに添加し、そしてパラフィンにより被覆した。スライドを前で使用された同じ湿潤化チャンバーにおいて65℃で一晩インキュベートした。次の日、プローブを、５×SSC（65℃で５分）、0.2×SSC（65℃で１時間）及び0.2×SSC（室温で10分）において連続的に洗浄した。緩衝液Ｂ１（0.1Ｍのマレイン酸、0.15ＭのNaCl、pH7.5）において５分間放置した後、スライドを緩衝液Ｂ１における１ｄ．ブロッキング試薬（Boerhinger-Mannheim）において室温で１時間ブロックし、そして次に、１：5000の希釈度で、DIG-AP接合抗体（Boerhinger-Mannheim）を含む緩衝液Ｂ１において４時間インキュベートした。過剰の抗体を、緩衝液Ｂ１における２回の15分間の洗浄、続く緩衝液Ｂ３（100mMのトリス、100mMのNaCl、５mMのMgCl2、pH9.5）における５分間の洗浄の間に除去した。抗体を、アルカリホスファターゼ基質（100mlの緩衝液Ｂ３における、DMF中、75mg／mlのＸ−ホスフェート350μｌ、70％DMF中、50mg／mlのNBT 450μｌ）を添加し、そして暗室において一晩、反応を進行せしめることによって検出した。10mMのトリス、１mMのEDTA（pH8.0）における短いすすぎの後、スライドをAquamount（Lerner Laboratories）により積層した。
VI．ショウジョウバエの５′−転写開始領域β−gal構造体
ptc発現パターンのcis調節を研究するためにLacZレポーター遺伝子にショウジョウバからのptcプロモータの異なった領域を連結する一連の構造体を企画した。図１を参照のこと。その３′−末端でmRNAの５′−非コード領域を含んで成る10.8kbのBamHＩ／BspM１フラグメントを得、そして図１に示されるように制限酵素消化により切断した。それらの発現カセットをＰ−要素ベクター（Thummelなど.，Gene 74，445-456（1988））を用いてショウジョウバエ系中に導入し、これを胚中に注入し、胚を生成するために成長せしめられ得るハエを供給した。（この方法の記載のためには、Spradling and Rubin，Science（1982）218，341-347を参照のこと。）ベクターは、黄色の眼を提供するための白色遺伝子、組込みを提供するためのＰ−要素の部分が導入されているpUC8バックグラウンドを使用し、そして構造体はLacZ遺伝子からの上流のポリリンカー中に挿入された。得られる胚を、HRPに接合されるLacZタンパク質に対する抗体を用いて染色し、そして胚をOPD色素と共に成長せしめ、LacZ遺伝子の発現を同定した。その染色パターンは図１に記載されており、これは胚の初期及び後期成長の間に染色が存在したかどうかを示す。
VII．マウスptc遺伝子の単離
ハエPTCの相同体（配列番号６）を、３種の昆虫、すなわち蚊、チョウ及び甲虫から、PCR又は低い緊縮性のライブラリースクリーンのいづれかを用いて単離した。低い突然変異性および縮重性のPTCの６個のアミノ酸範囲に対するPCRプライマーを企画した。１つのプライマー対、すなわちＰ２及びＰ４は、タンパク質の最初の親水性ループに対応する蚊のゲノムDNAからのptcの相同フラグメントを増幅した。345bpのPCR生成物（配列番号７）をサブクローン化し、そして配列決定し、そしてハエPTCに一直線に並べられる場合、67％のアミノ酸同一性を示した。
クローン化された蚊のフラグメントを用いて、チョウのλGT 10 cDNAライブラリーをスクリーンした。スクリーンされた100,000個のプラークのうち、５個のオーバーラップするクローンを単離し、そしてそれを用いて、完全な長さのコード配列を得た。チョウのPTC相同体（配列番号４）は、1,311個のアミノ酸の長さであり、そして全体的に、ハエPTCに対して50％のアミノ酸同一性（72％の類似性）を有する。逸脱するＣ−末端を除いて、この相同体はコード配列を通して均等に拡張される。蚊のPCRクローン（配列番号７）及びチョウのcDNAの対応するフラグメントを用いて、甲虫のλgem 11ゲノムライブラリーをスクリーニングした。スクリーニングされたプラークのうち、14個のクローンを同定した。元のプローブによりハイブリダイズされる１つのクローン（TS）のフラグメントを、サブクローン化し、そして配列決定した。この３kbの断片は89個のアミノ酸エクソン（配列番号２）を含み、これはそれぞれハエ及びチョウのPTCのそれらの対応する領域に対して44％及び51％の同一性を有する。
PTCの最初の親水性ループにおける一列の４種の昆虫相同体を用いて、２種のPCRプライマーを、同一であり、そして低い緊縮性のものである５及び６個のアミノ酸範囲に対して企画した。それらのプライマーを、胚の肢RNAに対するRT-PCRを用いてマウス相同体を単離するために使用した。適切にサイズ分類されたバンドを増幅し、そしてクローニング及び配列決定に基づいて、ハエPTCに対して65％の同一性を有するタンパク質をコードすることが見出された。クローン化されたPCR生成物及び続く、マウスptc cDNAフラグメントを用いて、マウス胚λcDNAライブラリーをスクリーンした。約300,000個のプラークから、17個のクローンを同定し、そしてそれらのうち７個のクローンは、ほとんどのタンパク質コード配列（配列番号９）を含んで成るオーバーラッピングcDNAを形成する。
VIIａ．マウスPTC RNAの成長及び組織分布
胚及び成人の両者のノザンブロットにおいて、ptcプローブは単一の８kbメッセージを検出する。さらなる暴露はいづれの追加のマイナーなバンドを示さない。成長的には、ptc mRNAは７dpcほどの初期において低レベルで存在し、そして11及び15dpcまでにひじょうに豊富になる。遺伝子は17dpcでまだ存在するけれども、ノザンブロットは、この段階でメッセージの量の明白な低下を示す。成人においては、ptc RNAは、脳及び肺において高い量で存在し、そして腎臓及び肝臓においては中ぐらいの量で存在する。弱いシグナルが、心臓、脾臓、骨格筋、及び精巣において検出される。
VIIｂ．完全な及び断片の胚におけるマウスPTCの現場ハイブリダイゼーション
ノザン分析は、ptc mRNAが７dpcで存在するが、ところが7.75dpcの胚からの断片においては検出できるシグナルは存在しないことを示す。この矛盾は、低レベルの転写により説明される。対照的に、ptcは8.5dpcの胚の神経軸にそって高レベルで存在する。11.5dpcまでに、ptcは成長する肺芽及び腸において検出され、これはその成人のノザンプロフィールと一致する。さらに、その遺伝子は中枢神経系の脳室領域及び前脳領域においては高レベルで存在する。ptcはまた、11.5及び13.5dpcの肢芽の濃縮軟骨において、及び体節の腹側の部分（この領域は、予期される硬節であり、そして結局、背柱において骨を形成する）において強く転写される。ptcは、胚の成長においてその基本的な役割を支持する内胚葉、中胚葉及び外胚葉起原の広範囲の組織に存在する。
VIII．ヒトptc遺伝子の単離
ヒトptc（hptc）を単離するために、ヒト肺cDNAライブラリー（HL3022a，Clonetech）からの２×105個のプラークを、１kbpのマウスptcフラグメント、すなわちＭ２−２によりスクリーンした。フィルターを一晩、減じられた緊縮性下でハイブリダイズせしめた（60℃、５×SSC、10％硫酸デキストラン、５×Denhardt's、0.2mg／mlの音波処理されたサケ精子DNA及び0.5％のSDS）。２種の陽性のプラーク（Ｈ１及びＨ２）を単離し、その挿入体をpBluescript中にクローン化し、そして配列決定に基づけば、両者はマウスptc相同体に対して高い類似性の配列を含んだ。５′末端を単離するために、追加の６×105個のプラークを、Ｍ２−３  EcoRＩ及びＭ２−３ XhoＩ（マウスptcの５′未翻訳配列を含む）プローブにより全く同一にスクリーンした。10個のプラークを精製し、そしてそれらのうち、６個の挿入体をpBluescript中にサブクローン化した。完全なコード配列を得るために、Ｈ２を完全に、そしてＨ14，Ｈ20及びＨ21を部分的に配列決定した。5.1kbpのヒトptc配列（配列番号18）は、マウスptcに対して96％の同一性及び98％の類似性を有する、1447個のアミノ酸の読み取り枠（配列番号19）を含む。ヒトptc（配列番号18）の５′及び３′未翻訳配列はまた、保存された調節配列を示すマウスptc（配列番号９）に対して高い類似性を有する。
IX．マウス、ヒト、ハエ及びチョウの配列の比較
推定されるマウスPTCタンパク質配列（配列番号10）は、約1,200個のアミノ酸にわたってハエPTCに対して約38％の同一性のアミノ酸を有する。この保存の量は、Ｃ−末端領域を除くタンパク質の多くを通して分散される。マウスタンパク質はまた、ハエタンパク質に関しての50個のアミノ酸挿入体を有する。ハエ及びマウス間でのPTCの配列保存性及びヘッジホッグの機能的保存に基づけば、ptcはそれらの２種の生物において同様に機能することが結論づけられる。マウス（mptc）（配列番号10）、ヒト（hptc）（配列番号19）、チョウ（bptc）（配列番号４）及びショウジョウバエ（ptc）（配列番号６）のアミノ酸配列の比較が、表１に示される。
0003776454.tif 000002
0003776454.tif 000003
0003776454.tif 000004
マウスライブラリーから回収される10個の他のクローンの同一性は決定されない。それらのcDNAはマウスptc配列と交差ハイブリダイズするが、しかしそれらの制限地図に関しては異なっている。それらの遺伝子は、パッチドタンパク質に関連する種類のタンパク質をコードする。コード及び非コード配列を包含する一列のヒト及びマウスヌクレオチド配列は、89％の同一性を示す。
本発明によれば、多くの目的のために作用できるパッチドタンパク質の高レベルの生成を可能にする、マウス及びヒト遺伝子を包含する哺乳類のパッチド遺伝子が提供される。このパッチドタンパク質は、アゴニスト及びアンタゴニストについてのスクリーニングに、そのリガンド、特にヘッジホッグ、より特定にはソニック  ヘッジホッグ（Sonic hedgehog）の単離のために、及びmRNA ptcの転写についてのアッセイのために使用され得る。前記タンパク質又はそのフラグメントは、タンパク質に対して特異的な抗体又はタンパク質の特定のエピトープを生成するために使用され得る。さらに、その遺伝子は、胎児組織をスクリーニングすることにより胚の成長を研究し、モデルとして作用するトランスジェニック動物を調製し、そして同様のものを研究するために使用され得る。
本明細書に引用されるすべての出版物及び特許出願は、引用により本明細書中に組込まれている。
前述の発明は、より明確に理解するために例示的且つ例的にいくらか詳細に記載して来たけれども、本発明の範囲内で一定の変更及び修飾を行なうことができることは、当業者に明らかであろう。
配列の列挙
（１）一般情報：
（ii）発明の名称：パッチド遺伝子類及びそれらの使用
（iii）配列の数：19
（２）配列番号１についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：736塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA（ゲノム）
（Xi）配列：配列番号１：
0003776454.tif 000005
（２）配列番号２についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：107アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（Xi）配列：配列番号２：
0003776454.tif 000006
（２）配列番号３についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：5187塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：cDNA
（Xi）配列：配列番号３：
0003776454.tif 000007
0003776454.tif 000008
0003776454.tif 000009
0003776454.tif 000010
（２）配列番号４についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：1311アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（Xi）配列：配列番号４：
0003776454.tif 000011
0003776454.tif 000012
0003776454.tif 000013
0003776454.tif 000014
0003776454.tif 000015
（２）配列番号５についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：4434塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：cDNA
（Xi）配列：配列番号５：
0003776454.tif 000016
0003776454.tif 000017
0003776454.tif 000018
0003776454.tif 000019
（２）配列番号６についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：1285アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（Xi）配列：配列番号６：
0003776454.tif 000020
0003776454.tif 000021
0003776454.tif 000022
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0003776454.tif 000024
（２）配列番号７についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：345塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA（ゲノム）
（Xi）配列：配列番号７：
0003776454.tif 000025
（２）配列番号８についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：115アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（Xi）配列：配列番号８：
0003776454.tif 000026
（２）配列番号９についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：5187塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：cDNA
（Xi）配列：配列番号９：
0003776454.tif 000027
0003776454.tif 000028
0003776454.tif 000029
0003776454.tif 000030
（２）配列番号10についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：1434アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（Xi）配列：配列番号10：
0003776454.tif 000031
0003776454.tif 000032
0003776454.tif 000033
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0003776454.tif 000035
0003776454.tif 000036
（２）配列番号11についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：11アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（Xi）配列：配列番号11：
0003776454.tif 000037
（２）配列番号12についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：５アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（Xi）配列：配列番号12：
0003776454.tif 000038
（２）配列番号13についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：７アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（Xi）配列：配列番号13：
0003776454.tif 000039
（２）配列番号14についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：28塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（Ａ）記載：／desc＝“プライマー”
（Xi）配列：配列番号14：
0003776454.tif 000040
（２）配列番号15についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：26塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（Ａ）記載：／desc＝“プライマー”
（Xi）配列：配列番号15：
0003776454.tif 000041
（２）配列番号16についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：27塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（Ａ）記載：／desc＝“プライマー”
（Xi）配列：配列番号16：
0003776454.tif 000042
（２）配列番号17についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：31塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（Ａ）記載：／desc＝“プライマー”
（Xi）配列：配列番号17：
0003776454.tif 000043
（２）配列番号18についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：5288塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：cDNA
（Xi）配列：配列番号18：
0003776454.tif 000044
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0003776454.tif 000046
0003776454.tif 000047
（２）配列番号19についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：1447アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（Xi）配列：配列番号19：
0003776454.tif 000048
0003776454.tif 000049
0003776454.tif 000050
0003776454.tif 000051
0003776454.tif 000052
0003776454.tif 000053
【図１】
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