(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞溶解性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）活性を有するリンパ球細胞を有効成分として含む、特異的抗原を提示する特定の腫瘍細胞によって形成される癌を有する個体を治療するための免疫療法的方法に使用するための抗癌剤であって
ここにおいて、前記リンパ球細胞は、該リンパ球細胞中にＣＴＬ活性を誘導するのに十分な量のインターロイキン−７（ＩＬ−７）ポリペプチドまたはＩＬ−７活性を有するそのポリペプチド誘導体を含む培養培地中で生体外（ex vivo）で培養することによって生産することができる；前記リンパ球細胞は、前記特定の腫瘍から腫瘍部位又はウイルス感染部位を排膿する末梢排膿リンパ節、あるいは、前記特定の腫瘍からの腫瘍部位又はウイルス感染部位の下流の排膿リンパ節、から予め得られたものである（ヒトに前記特異的抗原を投与し、当該ヒトから得られたリンパ球細胞を除く）
前記抗癌剤。
【請求項２】
抗腫瘍有効量のＩＬ−７ポリペプチドまたはＩＬ−７活性を有するそのポリペプチド誘導体をさらに含む、請求項１に記載の抗癌剤。
【請求項３】
細胞溶解性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）活性を有するリンパ球細胞の生体外（ex vivo）での集団を有効成分として含む、特異的抗原を提示する特定の腫瘍細胞によって形成される癌を有する個体を治療するための免疫療法的方法に使用するための抗癌剤であって、
ここにおいて前記細胞の集団は、前記特定の腫瘍から腫瘍部位又はウイルス感染部位を排膿する末梢排膿リンパ節、あるいは、前記特定の腫瘍からの腫瘍部位又はウイルス感染部位の下流の排膿リンパ節、から予め得られたリンパ球（ヒトに前記特異的抗原を投与し、当該ヒトから得られたリンパ球細胞を除く）を得ること；そしてリンパ球細胞中でのＣＴＬ活性を誘導するのに十分な量のインターロイキン−７（ＩＬ−７）ポリペプチドまたはＩＬ−７活性を有するそのポリペプチド誘導体を含む培養培地中でリンパ球細胞を生体外（ex vivo）で培養することを含む方法によって生産することができる、
前記抗癌剤。
【請求項４】
培養培地中のＩＬ−７ポリペプチドまたはＩＬ−７活性を有するそのポリペプチド誘導体の濃度が2ng/mlから20ng/mlである、請求項３に記載の抗癌剤。
【請求項５】
インターロイキン−２（ＩＬ−２）ポリペプチドまたはＩＬ−２活性を有するそのポリペプチド誘導体、インターロイキン−４（ＩＬ−４）ポリペプチドまたはＩＬ−４活性を有するそのポリペプチド誘導体、有糸分裂を不活性化した特定の腫瘍細胞の集団、またはこれらの組み合わせである、有効量の細胞溶解刺激物質を培養培地にさらに含む、請求項３または４に記載の抗癌剤。
【発明の詳細な説明】
発明の技術分野
本発明は癌またはウイルスの感染のある個体を治療するための、特定の抗原に予めさらした抹消リンパ球のサンプルを得ること、そのリンパ球中でＣＴＬ活性を活性化させるのに十分な濃度でインターロイキン−７（ＩＬ−７）ポリペプチドまたはその誘導体を含む培養培地中でリンパ球を生体外で培養すること、および活性化したリンパ球を個体に投与することから成る選定免疫療法のための方法に関する。
本発明の背景
正常なマウスから得た増殖していないリンパ球をインターロイキン−２（ＩＬ−２）またはインターロイキン−４（ＩＬ−４）存在下で試験管内で培養すると、腫瘍細胞に対して細胞毒性のあるリンパ球の集団が生ずることが示されている。これらの細胞は一般的にリンフォカインによって活性化されたキラー細胞（ＬＡＫ）と呼ばれる。ＩＬ−２およびＩＬ−４は別個のＴ細胞に由来するサイトカイン、すなわちより具体的にはリンフォカインである。ＩＬ−２およびＩＬ−４はいくつかの重複する活性をもつことが示されている。例えば、ＩＬ−２は最初はＴ細胞成長因子として同定されたが、それ以来Ｂ細胞、単核細胞、表皮性ランゲルハンス細胞、乏突起膠細胞およびＮＫ細胞のような様々な細胞のタイプに結合して増殖または機能を促進することが示されている。さらにＩＬ−４はＢ細胞の増殖および成熟によって誘導されることによって主に機能すると本来考えられていたが、ＩＬ−４はそれ以来造血幹細胞、マクロファージ、肥満細胞、およびＴ細胞と相互作用することが示されている。
哺乳類のインターロイキン−７（ＩＬ−７）は以前はリンフォポエチン−１と呼ばれた。ヒトおよびマウスＩＬ−７のクローニングおよび発現は、1990年10月23日に発行された米国特許第4,965,195号に記述されており、その開示はこの言及によって本明細書中に含まれるものとする。インターロイキン−７は、骨髄中でＢおよびＴ細胞の先祖の生長を刺激する能力を利用して最初に単離されたクローニングされたリンパ球生成のための生長因子である。公開されたＰＣＴ出願ＷＯ８９／０３８８４号（１９８９年５月５日）および第ＥＰ−Ａ−０３１４４１５号（１９８９年５月３日）は、ＤＮＡ、ベクターおよび組換えＤＮＡ技術によって哺乳類のＩＬ−７ポリペプチドを生産するための関連した過程に言及している。これらの発表された特許出願の関連した開示はこの言及によって本明細書に含まれるものとする。ネズミＩＬ−７のクローニングは学術誌中にナーメン（Ｎａｍｅｎ）らによってＮａｔｕｒｅ ３３３巻：５７１ページ（１９８８年）に最初に報告され、そしてヒトＩＬ−７はゴッドウイン（Ｇｏｏｄｗｉｎ）らによってＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６巻：３０２ページ（１９８９年）に報告された。形質転換した骨髄間質細胞系列の上清から精製したネズミＩＬ−７は約２５，０００ダルトンの見かけの分子量を示した（例えばナーメン（Ｎａｍｅｎ）ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６７巻：９８８ページ（１９８８年）を見よ）。ナーメン（Ｎａｍｅｎ）らおよびゴッドウイン（Ｇｏｏｄｗｉｎ）らによって報告されたクローニングされたＤＮＡは、任意の配糖化を除けばネズミおよびヒトＩＬ−７ポリペプチドの最小分子量がそれぞれ１４，８９７および１７，３８７ダルトンであることを示唆する。
ＩＬ−７のクローニング、特性決定および十分な量の発現によって、その生物学的活性のスペクトルの同定を始めるための十分な組換えポリペプチドを提供することができるようになった。ＩＬ−７は、長期間の骨髄培養に由来する前Ｂ細胞（Ｂ２２０+）の増殖を刺激する能力によって当初は定義された（ウイットロック（Ｗｈｉｔｌｏｃｋ）ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ６７巻：３５５−６９ページ（１９８４年）を見よ）。しかしＩＬ−７は成熟したＢ細胞の増殖を刺激すること、または前Ｂ細胞の表面Ｉｇ+細胞への分化を誘導することは不可能である（リー（Ｌｅｅ）ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４２巻：３８７５−８３ページ（１９８９年））。
さらに新しい文献にはＴ細胞の系統細胞がＩＬ−７に応答することが示されている。例えば大部分の表面の表現型の増殖していない胎児のおよび成熟した胸腺細胞は、ＩＬ−２，ＩＬ−４またはＩＬ−６と無関係にＩＬ−７に応答して増殖する（コンロン（Ｃｏｎｌｏｎ）ら、Ｂｌｏｏｄ ７４巻：１３６８−７３ページ（１９８９年））。さらに、成熟した抹消Ｔ細胞は最適状態に及ばない濃度での有糸分裂促進物質の存在下でＩＬ−７に応答する（チャゼン（Ｃｈａｚｅｎ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６巻：５９２３−２７ページ（１９８９年））。モリセイ（Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ）ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６９巻：７０７−１６ページ（１９８９年）の文献は、ＩＬ−７はＩＬ−２の生産を誘導することによって、精製したネズミＴ細胞のＣＯＮＡへの試験管内での増殖の応答のための共同して刺激する信号を提供することができることを示している。さらに、チャゼン（Ｃｈａｚｅｎ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６巻：５９２３−２７ページ（１９８９年）の文献は、ＰＭＡと組み合わせてＩＬ−７は、他のサイトカインのメッセンジャーによる介入なしでＴ細胞の活性化を直接刺激することができることをさらに示している。ＩＬ−７およびＰＭＡの組み合わせに対する応答はＩＬ−２またはＩＬ−４に対する中和のための抗体を高濃度で用いることでは阻害されず、そしてＣｓＡの免疫抑制効果にはかなり耐性を示したのだが、ここでＣｓＡはＩＬ−２、ＩＬ−４およびインターフェロン−γをコードする遺伝子を含む多くのリンフォカインの遺伝子の転写を阻害する薬物である。
ネズミの細胞系列および主な細胞系列の多くがＩＬ−７レセプターを示す。これらの細胞系列はリンパ球および骨髄を起源とする細胞を含む。したがってサイトカインＩＬ−７は広範囲の細胞のタイプに対して広範囲の活性をもつ可能性がある。
リンパ球の一連の細胞の分化は、複雑で現在まだよく解明されていない一連のできごとを含む。共通の前駆細胞または幹細胞がＢおよびＴリンパ球になると信じられているが、分化の過程に含まれる段階はわかりにくいままである。初期ＣＤ４-／ＣＤ８-胸腺細胞は放射線にさらされた受容者の胸腺に再びとどまることができて、様々な胸腺細胞の特定生物型群に分化できる。分化の過程にどの因子が含まれるのかはわかっていない。
コンロン（Ｃｏｎｌｏｎ）ら、Ｂｌｏｏｄ ７４巻：１３６８−７３ページ（１９８９年）の文献にはネズミの胸腺細胞のネズミＩＬ−７への増殖の応答について言及している。ＩＬ−７単独では胸腺細胞に対する細胞分裂促進性があり、そしてＣＯＮＡを用いたＩＬ−７の応答をさらに増加させた。コンロン（Ｃｏｎｌｏｎ）らは、ＩＬ−７が、最小に分化した胸腺細胞の特定生物型群であると信じられているものと代表するＣＤ４-／ＣＤ８-細胞の増殖を刺激したことをさらに実証した。さらに胸腺細胞のＩＬ−７への応答は、ＩＬ−２およびＩＬ−４のような他の既知のＴ細胞生長因子の生産のためであるようには見えなかった。このＩＬ−７の活性はＩＬ−１またはＩＬ−６のようなほかのリンフォカインの活性とは対照的であり、後者はＩＬ−２，ＩＬ−４の生産によって、またはＩＬ−２レセプターの活性化によってまたは両方によってＴ細胞の応答性を増強することが示されている。
選定免疫療法およびその様々な変法の技術は、例えばローゼンベルグ（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ）、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ  ６２−６９ページ（１９９０年５月）に記載されている。選定免疫療法のモデルはＩＬ−２を用いて最初に発展した。手順はマウスを用いて発展した。簡潔に説明すると、まず健康な同系のマウスから脾臓を取り出して、リンパ球を単離して、ＩＬ−２を含む培養培地中で単離したリンパ球を培養する。ＩＬ−２は培養中に細胞溶解性で腫瘍殺傷性になるある種のリンパ球およびＮＫ細胞を誘導する。癌の免疫療法の方法として活性化したリンパ球およびＩＬ−２を腫瘍の生じたマウスに注射する。ヒトの臨床の研究では、患者の血液の全体からリンパ球を単離して、ＬＡＫ活性を誘導するためにリンパ球をＩＬ−２とともに培養して活性化させて、ヒトＩＬ−２とともに静注された５００億個のＬＡＫ細胞を用いて患者を治療している。様々な臨床の研究から、活性化させたリンパ球とともにＩＬ−２を注射することの必要性が明らかになった。
ローゼンベルグ（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ）および彼の同僚はＩＬ−２と組み合わせた活性化させたＬＡＫ細胞でおよびＩＬ−２単独で投与して様々なな癌を治療することを試みた。現在までの結果では、ＩＬ−２および活性化させたＬＡＫ細胞の組み合わせでは１７７人の患者の中で１４人に完全な癌の軽減が見られ、ＩＬ−２単独では１３０人中４人であることが示されている。部分的な軽減の場合を考えると、活性化させたＬＡＫ細胞およびＩＬ−２を投与された患者の２５％は改善されて、ＩＬ−２単独を投与された患者の１７％が改善された。
ＩＬ−２によって活性化されて、ＩＬ−２とともに投与されたリンパ球を用いる選定免疫療法の技術には副作用が報告されている。副作用は、生きている器官の機能を妨げる組織中でのリンパ球の増殖を含む。ＩＬ−２を投与すると血液から組織への体液の漏れが起こり、その結果体重が増加する。
したがって当該分野においてＩＬ−７ポリペプチドの正確な生理学的および免疫学的機能をより良く特徴づける必要がある。異なる放射線にさらした条件下で、異なる組み合わせでおよび異なる薬物動力学のパラメーターで異なるサイトカインを用いた免疫療法の技術に改良を加えるべき必要が当該分野にはまだある。本発明は、ＩＬ−７ポリペプチド単独でのまたは他のサイトカインまたは他の因子との組み合わせに対する最良の免疫療法の使用を見い出す努力をしている中から生まれた。
発明の要約
本発明は、ＩＬ−７ポリペプチドまたはその誘導体の存在下で活性化されたＣＴＬｓ（細胞溶解性Ｔリンパ球）を用いた選定免疫療法による、癌またはウイルスの感染のある個体を治療するための方法に関する。本発明は、腫瘍細胞の集団又はウイルスの感染（すなわち、特定の抗原）に予めさらした同系の抹消リンパ球を得ること、リンパ球中でＣＴＬ活性を誘導するのに十分な量の同種のＩＬ−７ポリペプチドまたはそれの誘導体を含む培養培地中でリンパ球を生体外で培養すること、およびＣＴＬ活性を示すリンパ球を個体に投与することから成る。培養培地はさらに約３ｎｇ／ｍｌまでの同種のＩＬ−２ポリペプチドまたはその誘導体および／または約１０ｎｇ／ｍｌまでの同種のＩＬ−４ポリペプチドまたはその誘導体を含むことが好ましい。
同系の抹消リンパ球は腫瘍またはウイルスに感染した場所に隣接した排膿するリンパ節から得ることが好ましい。ヒトの場合には自己のリンパ球を用いることが一番好ましい。自己のリンパ球はその後にその細胞で治療される同じ人から得る。
細胞溶解性Ｔ白血球（ＣＴＬ）をＩＬ−７単独またはＩＬ−７およびＩＬ−２の組み合わせを用いて生体外の培養によって活性化させて、腫瘍細胞を特異的に溶解する活性を用いた癌の選定免疫療法のために使用することができる。さらに細胞のＣＴＬ活性を増強するために生体外の培養に有糸分裂を阻害した腫瘍細胞をさらに加えることが可能である。
さらにＣＴＬ活性を示すリンパ球の個体への投与の段階は個体へのサイトカインの投与から成ってもよく、その場合にはＩＬ−７ポリペプチドまたはその誘導体、ＩＬ−２ポリペプチドまたはその誘導体またはＩＬ−４ポリペプチドまたはその誘導体と組み合わせたＩＬ−７ポリペプチドまたはその誘導体の組み合わせおよびＩＬ−７ポリペプチドまたはその誘導体の組み合わせ、およびＩＬ−２ポリペプチドまたはその誘導体、ＩＬ−４ポリペプチドまたはその誘導体からなる群からサイトカインを選択する。サイトカインの好ましい１日の投与量はＩＬ−２では約１０から約２０００μｇ／ｋｇ／日、ＩＬ−４およびＩＬ−７では約４から約１０００μｇ／ｋｇ／日を含む。ＩＬ−２の１日の投薬は１日当たり３回の別々の投与とし、ＩＬ−４およびＩＬ−７では１日当たり２回（ｂｉｄ）とするのが最も好ましい。
癌の選定免疫療法のための同系のリンパ球の集団を得ることができる。同系のリンパ球の集団は抹消リンパ球から得られるのだが、特定の腫瘍の場所を排膿している抹消リンパ球から得るのが好ましい。同系の抹消リンパ球を、リンパ球中でＣＴＬ活性を誘導するのに十分な量の同種のＩＬ−７ポリペプチドまたはその誘導体中で生体外で培養し、その際ＣＴＬ活性はＣＤ８陽性Ｔ細胞によって同定する。培養培地はさらに約３ｎｇ／ｍｌまでの同種のＩＬ−２ポリペプチドまたはその誘導体および／またはＩＬ−４ポリペプチドまたはその誘導体および有糸分裂を阻害することが可能な腫瘍細胞から成ることが好ましい。
本発明は、特定の抗原を示す標的細胞（例えば、腫瘍細胞またはウイルスに感染した細胞）を特異的に溶解する。増殖させて活性化させた細胞溶解性Ｔリンパ球の集団を含む。本発明で用いる細胞は、腫瘍細胞の集団またはウイルスの感染に予めさらした同系の抹消リンパ球を得ること、およびリンパ球中でＣＴＬ活性を誘導するのに十分な量の同種のＩＬ−７ポリペプチドまたはその誘導体を含む培養培地中で生体外でリンパ球を培養することから成る過程によって生体外で生産される。本発明で用いる細胞は癌およびウイルスの感染の選定免疫療法において有用である。本発明で用いる細胞はＣＤ８陽性Ｔ細胞の集団および実質的にＮＫ細胞を欠損していることでさらに特徴づけられる。培養培地中に約３ｎｇ／ｍｌまでの同種のＩＬ−２ポリペプチドまたはその誘導体および有糸分裂を阻害することが可能な腫瘍細胞をさらに含むことが好ましい。ＩＬ−７ポリペプチドまたは等しい効力をもったものまたは活性のあるその誘導体を培養培地に加えるときの好ましい量は約２．５ｎｇ／ｍｌから約２０ｎｇ／ｍｌである。ＩＬ−７ポリペプチドまたは等しい効力をもったものまたは活性のあるその誘導体の量は約１０ｎｇ／ｍｌであることが最も好ましい。
図の簡単な説明
図１は排膿するリンパ節細胞（ＤＬＮ）またはコントロールのリンパ節細胞（ＣＬＮ）について培地中に２．５，１０または２０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７の存在下またはＩＬ−７なし（コントロール）で培養された様々なエフェクターの標的比細胞力価の比較を説明する。データはコントロールのＣＬＮｓ、２０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７でインキュベートしたＣＬＮ、コントロールのＤＬＮ、または２．５，１０または２０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７でインキュベートしたＤＬＮで試験管内で処理されたときの１０２４個の腫瘍細胞の溶解のパーセントを比較している。これらのデータは、ＤＬＮをＩＬ−７中でインキュベートしたときに標的細胞に対する一定のエフェクター細胞の溶解の量が最大に達することを示している。
図２では、腫瘍細胞で攻撃して、そして２０ｎｇ／ｍｌの組換えネズミＩＬ−７中で培養したＣＬＮおよびＤＬＮの様々な構成物で処理したマウスの生体内での腫瘍の生長速度を、培地単独で培養したＣＬＮおよびＤＬＮで処理したものとの比較として比較している。ＩＬ−７でインキュベートしたＤＬＮｓは最も良い抗腫瘍治療活性を示した。２０ｎｇ／ｍｌのネズミＩＬ−７で予めインキュベートした３×１０6または６×１０6個のＤＬＮ細胞を注射されたマウスでは完全な腫瘍の緩解が見られた。
図３では、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７中で培養した幾通りかの濃度のＣＬＮｓまたはＤＬＮで処理もしたＣ３Ｈマウス中へ腫瘍細胞を注射してから数日後の腫瘍の大きさの平均の比較であり、培地のみで培養したＣＬＮｓおよびＤＬＮを用いたときと比較させて説明している。これらのデータは、刺激された細胞毒性のＴリンパ球の腫瘍殺傷の性質の比較を説明する。腫瘍の大きさの完全な緩解は、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７で予めインキュベートした６×１０6個のＤＬＮ細胞をマウスに注射したときにのみ起きた。
図４では、２．５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７を含む培地中で培養したＤＬＮ細胞を用いて腫瘍を攻撃してから数日後の生体内での腫瘍の大きさの平均を、ＩＬ−７を含まない培地中で培養した細胞を用いたときと比較させて説明する。
図５−１４では、２×１０6個の生存できる１０２４腫瘍細胞（マウス１匹当たり）を注射した８日前のＣ３Ｈマウスから排膿しているリンパ節（ＤＬＮ）細胞を得たときの実験のデータを説明する。ＤＬＮ細胞はＩＬ−２，ＩＬ−７またはＩＬ−２およびＩＬ−７の組み合わせのいずれかを含む培地中で生体外で培養した。腫瘍をさらしていないＣ３Ｈマウスから得たコントロールのリンパ節（ＣＬＮ）を用いて同時に行う培養を計画して、培地のみでまたはＩＬ−２またはＩＬ−２およびＩＬ−７の組み合わせを含む培地中で生体外でインキュベートした。培養してから４日後に、51Ｃｒ放出でアッセイしたときの試験管内での抗腫瘍細胞溶解活性および単一の塊体の腫瘍の緩解を測定することによる試験管内での抗腫瘍活性について細胞集団を評価した。この実験のデータは図５−１４に示す。
図５では、サイトカインなしまたは２ｎｇ／ｍｌのＩＬ−２存在下で培養したＤＬＮまたはＣＬＮ細胞の集団の溶解活性を説明する。これらのデータは、ＤＬＮはＣＬＮよりも優れた溶解活性をもち、そしてＩＬ−２でインキュベートしたＤＬＮはこの集団の中では最良の溶解活性をもつことを示している。
図６ではＣ３Ｈマウスに注射した１０２４腫瘍の腫瘍の大きさの平均を比較している。２ｎｇ／ｍｌのＩＬ−２またはサイトカインなしで予めインキュベートしたＣＬＮまたはＤＬＮを治療に適した濃度を何通りか変えて、マウスに投与した。これらのデータはＤＬＮ細胞はＣＬＮ細胞よりも優れた抗腫瘍活性をもつことを示す。ＤＬＮ細胞の培地中にＩＬ−２を加えてもＤＬＮ細胞の抗腫瘍活性を実質的に増強しなかった。
図７には、２ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７または２ｎｇ／ｍｌのＩＬ−２および１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７の組み合わせでインキュベートしたＤＬＮおよびＣＬＮの溶解活性を示す。
これらのデータは、加えるべきサイトカインを加えずに培養したＤＬＮと比較すると２ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７の存在下で培養したＤＬＮはより優れた溶解活性をもつことを示している。
図８には、ＩＬ−７またはＩＬ−２およびＩＬ−７の組み合わせでインキュベートした様々な細胞の生体内での抗腫瘍活性の比較を説明する。腫瘍の大きさの平均は腫瘍の攻撃から数日後に比較した。これらのデータは、加えるべきサイトカインを加えずにインキュベートしたＤＬＮまたは、ＩＬ−７またはＩＬ−２およびＩＬ−７の組み合わせでインキュベートしたＣＬＮと比較して、ＩＬ−７でインキュベートしたＤＬＮが優れた腫瘍殺傷活性をもつことが実証されたことを説明している。
図９では、サイトカインなしでまたは１０ｎｇ／ｍｌの濃度のＩＬ−７を存在させてインキュベートしたＤＬＮまたはＣＬＮの溶解活性を比較している。ＩＬ−７でインキュベートしたＤＬＮはこの試験管内でのモデルにおいて優れた溶解活性をもつことを実証した。
図１０では、サイトカインなしでまたは１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７の存在下でインキュベートしたＤＬＮまたはＣＬＮの生体内での腫瘍殺傷活性を比較している。完全に腫瘍が治癒する段階の優れた腫瘍殺傷活性は、ＤＬＮを１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７の存在下で４日間培養した後６×１０6個のＤＬＮ細胞をＣ３Ｈマウスに注射することによって証明された。
図１１には、サイトカインの非存在下でまたは２０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７または１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７を加えた２ｎｇ／ｍｌのＩＬ−２で培養したＤＬＮおよびＣＬＮの試験管内での溶解活性を比較するデータを示す。優れた溶解活性は、より高濃度のＩＬ−７の存在下で培養したＤＬＮを用いて証明された。
図１２では、サイトカインなしでまたは２０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７の存在下で培養したＤＬＮおよびＣＬＮの腫瘍殺傷活性を比較する生体内でのデータを示す優れた腫瘍殺傷活性は、ＩＬ−７でインキュベートしたＤＬＮを用いるときに得られた。
図１３では、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７を加えた２ｎｇ／ｍｌのＩＬ−２でインキュベートしたＤＬＮを用いたときの優れた試験管内での溶解活性を比較するデータを示す。
図１４では、様々なＤＬＮおよびＣＬＮの生体内での腫瘍殺傷活性を比較するデータを示す。ＩＬ−７を加えたＩＬ−２の組み合わせの存在下で培養したＤＬＮは最良の抗腫瘍活性を示した。
図１５−１８ではサイトカインを補給した長期間の培養条件で維持したＤＬＮおよびＣＬＮの生体内での抗腫瘍活性および試験管内での溶解活性を比較する実験から得たデータを示す。培養培地にサイトカインを加えないおよそ１週間内にリンパ球が死に絶えるので、細胞を長期間の培養条件下で維持することができなかった。長期間の培養には、放射線にさらした特定の腫瘍細胞（ガンマー線を２０００ラド照射したＢ１０．５細胞）をさらに含めてもよい。
図１５にはＤＬＮおよびＣＬＮの生体内での抗腫瘍活性の比較を示す。これらのデータは、特定の腫瘍（Ｂ１０．５）のみを、特定の（Ｂ１０．５）腫瘍に予めさらされたＤＬＮの短期間の培養によって除去することができたが、交差反応性のない腫瘍（Ｂ１０．２）にさらされたときは除去できなかったことを示している。
図１６には、示したサイトカインを用いた、ＤＬＮ細胞の長期間（５週間）の培養の試験管内での溶解活性を示す。特異的な溶解活性は、非特異的なＢ１０．２腫瘍細胞に対するよりもむしろ特異的なＢ１０．５腫瘍細胞に対して示された。
図１７には、示したサイトカインを用いて長期間の培養条件下で維持したＤＬＮ細胞のフローサイトメトリー分析を示す。ＩＬ−７を用いて維持したＤＬＮ細胞はＣＤ８陽性のＴ細胞を多く含む集団になった。
図１８には、示したサイトカインを用いた長期間の培養条件下で維持したＤＬＮの生体内での抗腫瘍のデータを示す。ＩＬ−７を含む培地中で長期間培養したＤＬＮ細胞は免疫療法において、特定の（Ｂ１０．５）腫瘍を攻撃して除去するのに有効だったが、非特異的な（Ｂ１０．２）腫瘍を攻撃して除去するのには有効ではなかった。
図１９には、同時に培養した９週週間後の同じマウスＤＬＮ細胞の写真を示す。図１９ａにはマウスＩＬ−７を用いて生長させたＤＬＮ細胞を示し、図１９ｂにはマウスＩＬ−７およびマウスＩＬ−２を用いて生長させた細胞を示し、そして図１９ｃにはＩＬ−２のみを用いて生長させた細胞を示す。細胞に加えるべきサイトカインを加えないならば、３枚の写真で示した９週間の時点まで生き残れないだろう。
本発明の詳細な説明
本発明は、特定の抗原に予めさらしたＴ細胞の集団を生物学的に効果のある量のＩＬ−７ポリペプチドまたはその誘導体に接触させることから成る、特定の抗原を提示する細胞に対する溶解活性をもつ活性化された哺乳類の細胞溶解性のＴリンパ球の集団を形成するための方法に関する。哺乳類の細胞障害性Ｔリンパ球はヒトの細胞であり、そして固型癌のような腫瘍の場所を奪い去るまたはウイルスの感染した場所を奪い去る抹消の排膿しているリンパ節から得るのが好ましい。排膿しているリンパ節細胞は、特定の抗原へ予めさらしたＴリンパ球の集団を含む。特定の抗原は、腫瘍細胞、またはウイルスが感染した細胞上に、またはウイルスによって提示される。
哺乳類の細胞毒性のＴリンパ球の集団は、ウイルス、ウイルスが感染した哺乳類の細胞または腫瘍細胞によって示される特定の抗原に予めさらしておく必要がある。腫瘍の生長またはウイルスの感染の場所の下流（血流またはリンパの排膿によって）排膿しているリンパ節はＤＬＮ（排膿しているリンパ節）細胞を含むだろう。ＤＬＮ細胞を生体外で本発明の過程によって活性化させる。特定の抗原に予めさらされなかった同系のＣＬＮ（コントロールのリンパ節）細胞は、本発明の方法にしたがってＩＬ−７ポリペプチドまたはその誘導体を用いて生体外で活性化させた後に効果がより低いだろう。ＣＬＮ細胞は、特定の抗原に予めさらしていない細胞として実験のコントロールに用いることができる。
特定の抗原の予めさらした哺乳類の細胞溶解性Ｔリンパ球は排膿しているリンパ節から得るのが好ましい。特定の抗原にさらした抹消血液リンパ球を得ることも可能である。本開示の目的のために、特定の抗原に予めさらした任意の哺乳類のＴリンパ球は、それがどこでまたはどのようにして得られたのかにかかわらずに、特定の抗原に予めさらしたＤＬＮ細胞と考えられるだろう。ＤＬＮ細胞は、生物学的に有効な量のＩＬ−７ポリペプチドまたはその誘導体を含む培養培地中でインキュベートすることによって生体外の培養中で増殖する培養培地は、約３ｎｇ／ｍｌまでのＩＬ−２ポリペプチドまたはその誘導体、および／または特定の抗原を提示している有糸分裂の阻害された特定の腫瘍細胞の集団をさらに含んでもよい。例えば少なくとも５００ラドの、好ましくは２０００ラドのガンマー線を照射することによって腫瘍細胞の有糸分裂を阻害してよい。別の量または型の放射線の照射で効果的に腫瘍細胞の有糸分裂を阻害でき、腫瘍細胞は細胞分裂は不可能だが、しかしまだ代謝は活発なままであるようになる。特定の腫瘍細胞の有糸分裂を阻害するための別の手段はマイトマイシンＣのような化学薬品で処理することである。
培養培地は、ＩＬ−７ポリペプチドまたはその誘導体を含む。本発明に調和した使用のために、当該分野で既知の方法で記述されるように、例えば哺乳類細胞系列または原核生物中での発現によるような、任意の都合の良い方法によってＩＬ−７を生産することができる。ＩＬ−７ポリペプチドまたはその誘導体は同種であるべきであり、すなわち、活性化されたＤＬＮ細胞を受容されるであろう特定の生物種のＩＬ−７ポリペプチドとアミノ酸配列が実質的に同じであるべきであることを意味している。これはヒトに使用する場合には、異物としてサイトカインが認識される可能性が最小となるように、ＩＬ−７ポリペプチドまたは他のサイトカインは実質的にはヒトのものの配列をもつべきであることを意味している。
ヒトおよびネズミのＩＬ−７のアミノ酸配列を下の表１および２中に示す：
0003825467.tif 000002
0003825467.tif 000003
前述のポリペプチドの様々な生物学的に活性のある誘導体または類縁体も本発明の方法および組成物のために使用できるだろう。ここで使用するように、同種のＩＬ−７またはその誘導体は、その特定の哺乳類の種の本来のＩＬ−７ポリペプチドと実質的なアミノ酸配列の相同性をもちそして実質的に同等の生物学的な活性をもつポリペプチドを指す。例えば同種のヒトＩＬ−７ポリペプチドまたはポリペプチドの誘導体はヒトの本来のＩＬ−７ポリペプチドを実質的に類似なアミノ酸配列をもち、受容者の免疫系によって異物として認識されないようにするべきである。実質的に同等の生物学的な活性とは、標準的なバイオアッセイまたはＩＬ−７レセプターに結合する親和性を測定するためのアッセイにおいて類似の結果を示すことを意味する。ＩＬ−７誘導体は、ＩＬ−７の生物学的な活性を示す様々な非ペプチド性の化合物もさらに含む。これらの化合物はＩＬ−７レセプターのアゴニストを含む。ＩＬ−７レセプターはゴッドウイン（Ｇｏｏｄｗｉｎ）ら、Ｃｅｌｌ ６０巻：９４１ページ１９９０年の文献中に記述されている。
ＩＬ−７ポリペプチドを組換えＤＮＡ技術によって生産するのが好ましい。組換えＤＮＡの発現系は、ＩＬ−７の生物学的な活性をもつ同系のＩＬ−７ポリペプチドまたはポリペプチドのその誘導体をコードするクローンを発現ベクター中に挿入したものである。発現ベクターを宿主細胞へ導入する。宿主細胞のタンパクの合成のための機構によって組換えＩＬ−７ポリペプチドを合成する。
組換え発現ベクターは、ＩＬ−７ポリペプチドまたは生物学的な活性のあるその誘導体をコードする合成またはｃＤＮＡに由来するＤＮＡ断片を含む。ＩＬ−７ポリペプチドまたはその誘導体をコードするＤＮＡは、哺乳類、微生物、ウイルスまたは昆虫の遺伝子に由来するもののような適切な転写のまたは翻訳の制御をするヌクレオチド配列または構造遺伝子のヌクレオチド配列に適当な方法でつなげる。制御配列の例は、例えば遺伝子発現において制御の役割をもつ遺伝子の配列（例えば、転写のプロモーターまたはエンハンサー）、転写を制御するための予備的なオペレーター配列、適当なｍＲＮＡ上のリボゾーム結合サイトをコードする配列、転写および翻訳の開始および終結を制御する適当な配列を含む。制御配列を構造遺伝子に機能的に関連させるときには、ヌクレオチド配列を適当な方法でつなげる。例えば、ＩＬ−７ポリペプチドの分泌に関与する前駆体のアミノ酸配列としてシグナルペプチドを発現させるならば、シグナルペプチド（分泌のための先頭配列）のためのＤＮＡ配列をＩＬ−７ポリペプチドまたはその誘導体のための構造遺伝子のＤＮＡ配列に適当な方法で結合させることができる。さらに、プロモーターのヌクレオチド配列が構造遺伝子のヌクレオチド配列の転写を制御するならば、プロモーターのヌクレオチド配列をタンパクをコードする配列（例えば構造遺伝子のＤＮＡ）に適当な方法で結合させる。さらには翻訳を促進させるためにリボゾーム結合サイトをベクター内に入れるならば、リボゾーム結合サイトを構造遺伝子のヌクレオチドがアミノ酸をコードする配列（例えばＩＬ−７ポリペプチド）に適当な方法で結合させてよい。
同種のＩＬ−７ポリペプチドまたはその誘導体の発現のための適当な宿主細胞は適当なプロモーターの制御下で原核生物、酵母または高等な真核生物の細胞がある。原核生物は例えば大腸菌またはバチルスのようなグラム陰性またはグラム陽性の生物を含む。形質転換のために適当な原核生物の宿主細胞は、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、バチルス  サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、サルモネラ  チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、およびシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、およびスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属の中の様々な他の種を含む。高等な真核生物の細胞は下に記述したように哺乳類を起源とする確立された細胞系列を含む。本明細書中に開示したＤＮＡの構築物に由来するＲＮＡを用いて、哺乳類の同種のＩＬ−７ポリペプチドまたはその誘導体を生産するために無細胞系の翻訳系も使用することができるだろう。バクテリア、真菌、酵母、および哺乳類の細胞の宿主を使用するときの適当なクローニングおよび発現ベクターは例えば、パウエルズ（Ｐｏｕｗｅｌｓ）ら、クローニングベクター；Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖａｃｔｏｒｓ；Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、エルセビアー（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ）、ニューヨーク、１９８５の文献に記述されている。
ＩＬ−７ポリペプチドまたはその誘導体を酵母を宿主細胞として発現させるときには、ＩＬ−７ポリペプチドまたはその誘導体の発現のためにコードするヌクレオチド配列（例えば構造遺伝子）は先頭配列を含んでよい。先頭配列を用いることによって、酵母を宿主細胞としたときの翻訳したポリペプチドの細胞外への分泌を改善することが可能である。
あるいは、大腸菌のような原核生物の宿主細胞においては、原核生物の宿主細胞における組換えポリペプチドの発現を促進させるために、Ｎ末端にメチオニン残基を含めてよい。Ｎ末端のメチオニン残基は発現させた組換えＩＬ−７ポリペプチドまたはその誘導体から切断されるかもしれない。
さらには、広範なタンパク分解またはジスルフィド結合を形成する過程を必要としないＩＬ−７ポリペプチドまたはその誘導体の発現のために原核生物の宿主細胞を使用してよい。
組換えＩＬ−７構造遺伝子のヌクレオチド配列またはその誘導体を含む組換え発現ベクターを、適当な宿主の微生物または哺乳類の細胞系列の実質的に均一な培養にトランスフェクトさせるかまたは形質転換させる。適当な宿主細胞の例は、大腸菌のようなバクテリア、Ｓ．セレビシアエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のような酵母、またはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞のような哺乳類の細胞系列を含む。
形質転換された宿主細胞とは、ＩＬ−７またはその誘導体の構造遺伝子のヌクレオチド配列で形質転換したまたはトランスフェクトさせた細胞のことである。宿主細胞または宿主細胞への挿入された遺伝子の構築物の性質に依存して、発現したＩＬ−７ポリペプチドは宿主細胞の中に存在し、および／または培養上清中に分泌される。
原核生物の宿主細胞にトランスフェクトさせる発現ベクターには１つ以上の表現型として現れる選択マーカーが一般には含まれる。表現型として現れる選択マーカーとは例えば、抗生物質に対する耐性を与える、または自主栄養の要求を提供するタンパクをコードする遺伝子および宿主内での増殖を保証するための宿主が認識できる複製起源である。原核生物の宿主細胞のための他の有用な発現ベクターには市販されているプラスミドに由来するバクテリアを起源とする選択マーカーが含まれる。この選択マーカーはクローニングベクターであるｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ３７０１７）の遺伝子の成分を含めることができる。ｐＢＲ３２２はアンピシリンおよびテトラサイクリン耐性のための遺伝子を含んでおり、形質転換した細胞を同定する簡単な方法を提供する。ｐＢＲ３２２の「骨格」の部分を適当なプロモーターおよびＩＬ−７の構造遺伝子の配列に結合させる。他の市販されているベクターには例えば、ｐＫＫ２２３−３（ファルマシア  ファイン  ケミカルズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、ウプサラ（Ｕｐｐｓａｌａ）、スウェーデン）およびｐＧＥＭ１（プロメガバイオテック（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｂｉｏｔｅｃ）、マジソン（Ｍａｄｉｓｏｎ）、ウィスコンシン州、アメリカ合衆国）が含まれる。
原核生物を宿主細胞とする組換え発現ベクターを使用するためにプロモーター配列を一般に使用する。よく用いられるプロモーター配列は、β−ラクタマーゼ（ペニシラーゼ）、ラクトースプロモーター系（チャン（Ｃｈａｎｇ）ら、Ｎａｔｕｒｅ ２７５巻：６１５ページ，１９７８年；およびゲーデル（Ｇｏｅｄｄｅｌ）ら、Ｎａｔｕｒｅ ２８１巻：５４４ページ，１９７９年）、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（ゲーデル（Ｇｏｅｄｄｅｌ）ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．８巻：４０５７ページ、１９８０年；およびＥＰＡ３６，７７６）およびｔａｃプロモーター（マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｕｕａｌ，コールド  スプリング  ハーバー  ラボラトリー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）４１２ページ，１９８２年）を含む。特に有用な原核生物を宿主細胞とする発現系はファージλＰLプロモーターおよびｃＩ８５７ｔｓの熱に不安定なリプレッサー配列を用いたものである。λＰLプロモーターの誘導体を寄託されているアメリカンタイプカルチャーコレクションから入手できるプラスミドは、プラスミドｐＨＵＢ２（大腸菌菌株ＪＭＢ９中に導入してある（ＡＴＣＣ３７０９２））およびｐＰＬｃ２８（大腸菌ＲＲ１中に導入してある（ＡＴＣＣ５３０８２））が含まれる。
同種の哺乳類のＩＬ−７ポリペプチドおよび誘導体のポリペプチドを酵母の宿主細胞、好ましくはサッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属（例えばＳ．セレビジアエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓａｅ））のイーストの宿主細胞中で発現させることができる。ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）またはクルイベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）のような他の属のイーストも使用できる。酵母のベクターには、２μ酵母プラスミドに由来する複製起源の配列、自律的複製配列（ＡＲＳ）、プロモーター部分、ポリアデニル化のための配列、および転写終結のための配列がしばしば含まれる。酵母ベクターには複製起源のための配列および選択マーカーが含まれるのが好ましい。酵母ベクターのための適当なプロモーター配列には、メタロチオネイン、３−ホスホグリセリン酸キナーゼのプロモーター（ヒンツェマン（Ｈｉｎｔｚｅｍａｎ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５巻：２０７３ページ，１９８０年）、エノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸、デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、およびグルコキナーゼのような他の解糖の酵素のプロモーター（ヘス（Ｈｅｓｓ）ら、Ｊ．Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｅ．Ｒｅｇ．７巻：１４９ページ、１９６８年；およびハランド（Ｈｏｌｌａｎｄ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７巻：４９００ページ，１９７８年）が含まれる。酵母での発現において使用する他の適当なベクターおよびプロモーターはヒッツェマン（Ｈｉｔｚｅｍａｎ）、ＥＰ−Ａ−７３，６５７中にさらに記載されている。
例えば、大腸菌中での選択および複製のためのｐＢＲ３２２に由来するＤＮＡの配列（Ａｍｐr遺伝子および複製起源）を用いて、酵母ベクターを組み立てることができる。酵母中での発現のための構築物に含めることができる他の酵母のＤＮＡ配列は、グルコースによって抑制できるＡＤＨ２プロモーターおよびα−因子分泌リーダーを含む。ＡＤＨ２プロモーターは、ラッセル（Ｒｕｓｓｅｌｌ）ら、（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８巻：２６７４ページ、１９８２年）およびベイアー（Ｂｅｉｅｒ）ら（Ｎａｔｕｒｅ ３００巻：７２４ページ、１９８２年）に記述されている。イーストα−因子先頭配列によって外来のポリペプチドの分泌を促進する。プロモーター配列および構造遺伝子配列の間にα−因子先頭配列をしばしば挿入する。例えば、クルヤン（Ｋｕｒｊａｎ）ら、Ｃｅｌｌ ３０巻：９３３ページ，１９８２年；およびビター（Ｂｉｔｔｅｒ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１巻：５３３０ページ，１９８４年の文献を見よ。１つ以上の制限サイトを導入するために先頭配列の３’末端付近を修飾できる。これによって先頭配列を構造遺伝子に容易に結合させることができる。
当業者は酵母を形質転換させる技術を知っている。１つのそのようなプロトコールは、ヒネン（Ｈｉｎｎｅｎ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７５巻：１９２９ページ，１９７８年の文献に記述されている。ヒネン（Ｈｉｎｎｅｎ）らのプロトコールでは選択培地中でＴｒｐ+形質転換体を選択するものであり、その際、選択培地は０．６７％酵母窒素塩基、０．５％カザミノ酸、２％グルコース、１０μｇ／ｍｌアデニンおよび２０μｇ／ｍｌウラシルから成る。
ＡＤＨ２プロモーター配列を含むベクターによって形質転換された酵母の宿主細胞を、発現を誘導するために「栄養の豊富な」培地中で生長させてよい。栄養の豊富な培地の例は、８０μｇ／ｍｌアデニンおよび８０μｇ／ｍｌウラシルを添加した１％酵母エキス、２％ペプトン、および１％グルコースから成る培地である。培地からグルコースが消費されつくすと、ＡＤＨ２プロモーターの作用は抑制される。
組換えＩＬ−２ポリペプチドまたはその誘導体を発現させるために、哺乳類または昆虫の宿主細胞の培養系も使用できるだろう。適当な哺乳類の宿主細胞系列の例は、サル腎細胞のＣＯＳ−７系列（グルツマン（Ｇｌｕｚｍａｎ）、Ｃｅｌｌ ２３巻：１７５ページ，１９８１年）、Ｃ１２７細胞、３Ｔ３細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒーラ細胞、およびＢＨＫ細胞系列を含む。適当な哺乳類の発現ベクターには、複製起源、プロモーター配列、構造遺伝子に連結させたエンハンサーのような非翻訳成分、リボーゾーム結合サイト、ポリアデニル化サイト、スプライシングのためのドナーおよびアクセプターサイト、および転写終結配列のような他の５’または３’に近接する非翻訳配列が含まれる。
哺乳類を宿主細胞とする発現ベクター中で転写または翻訳を制御する配列をウイルス源から入手できる。例えば、哺乳類の細胞のためのよく用いられるプロモーター配列およびエンハンサー配列はポリオーマ、アデノウイルス２、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、およびヒトサイトメガロウイルスに由来する。例えばＳＶ４０複製起源、初期および後期プロモーター、エンハンサー、スプライシングサイトおよびポリアデニル化サイトのようなＳＶ４０ウイルスのゲノムに由来するＤＮＡ配列を、哺乳類の宿主細胞において構造遺伝子の配列を発現させるときに必要な他の遺伝子の成分を提供するために使用してよい。ウイルスの初期および後期プロモーターは、ウイルスの複製起源も含むかもしれない断片としてウイルスのゲノムから簡単に得られるので（フィアーズ（Ｆｉｅｒｓ）ら、Ｎａｔｕｒｅ ２７３巻：１１３ページ，１９７８年）、これらは特に有用である。ＳＶ４０ウイルスの複製起源中に位置するＨｉｎｄIIIサイトからＢｇｌＩサイトへ伸びる約２５０ｂｐの配列を含むならば、より小さなまたはより大きなＳＶ４０の断片も用いてよい。
さらには、同種の哺乳類のゲノムのＩＬ−７プロモーター、制御および／またはシグナル配列を利用してよいのだが、ただしそのような制御配列は選択した宿主細胞と組み合わせて不都合がないときに利用できる。典型的なベクターはオカヤマ（Ｏｋａｙａｍａ）およびバーグ（Ｂｅｒｇ）によって発表されたように（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３巻：２８０ページ，１９８３年）構築できる。
ＩＬ−２ポリペプチドおよびそのポリペプチド誘導体およびＩＬ−４ポリペプチドおよびそのポリペプチド誘導体は、ＩＬ−７ポリペプチドについて本明細書中で記載したものとほぼ同じ方法で、生産できる。さらにＩＬ−２誘導体は、ＩＬ−２レセプターのアゴニストとして作用できる非ペプチド性の化合物を含む。ＩＬ−２レセプターは例えば、１９８４年７月２日に出願された米国特許出願第６２６，６６７号および１９８８年９月２３日に公告されたヨーロッパ特許出願第ＥＰ−Ａ−０１６２６９９号に記述されており、この言及により前者の内容は本明細書中に含まれるものとする。
哺乳類のＤＬＮまたはＣＬＮ細胞は、正常な培養条件下では７から１０日を越えて細胞培養中の試験管内で生き残ることはできない。ＩＬ−７ポリペプチドまたはその誘導体を培養培地に加えることにより、同一のまたは類似の培養条件下で長期間生き残れるようになり、１０日を越えてよく生長できるようになる。さらには、同種のＩＬ−２ポリペプチドまたはその誘導体またはＩＬ−４ポリペプチドまたはその誘導体をさらに加えても、細胞の生存を伸長させるＩＬ−７の効果を抑止しない。マウスのＤＬＮの培養にマウスＩＬ−２を加えると、細胞の長期間の生存は伸長したが、顕微鏡で観察すると、細胞は不健康で、見た目には凝集しているように見える。さらには、培養時間を伸ばすためにＩＬ−２のみを用いて生体外で培養したＤＬＮ細胞は有意なＣＴＬまたはＬＡＫ活性を示さず、加えるべきサイトカインとして最少のＩＬ−７を用いて長期間の培養中で維持したＤＬＮ細胞は対照的である。さらに、有糸分裂を不活性化した腫瘍細胞群を、ＩＬ−７ポリペプチドが存在するカルチャーに添加しても、逆にＤＬＮ細胞の生存には影響しない。実際、ＤＬＳは細胞培養中に、特異抗原を提示する添加された腫瘍細胞に対してしばしば細胞溶解性であり、有糸分裂を阻害された特異腫瘍細胞の添加がＤＬＮ細胞の培養中の生存を培養されたＤＬＮ細胞の増殖を誘導することによって強めることを見いだ出した。
増殖した哺乳類の細胞溶解性のＴリンパ球は、特定の抗原を提示している細胞（例えば、腫瘍細胞）に対して特異的な溶解性をもっている。細胞溶解性のＴ細胞は、特定の抗原に予めさらした排膿しているリンパ節または他の供給源（例えば抹消血液または脾臓）から得る。ＩＬ−７ポリペプチドまたはその誘導体を含む培養培地へ生体外でさらした後に、細胞溶解性Ｔ細胞は活性化された状態になり、特定の抗原を提示する標的細胞に対する溶解の特異性を保持する。培養培地中にＩＬ−７またはその誘導体を存在させてインキュベートして活性化させて増殖させたＣＬＮ細胞の溶解活性は、培養培地中にＩＬ−２ポリペプチドを加えてインキュベートした同じ細胞よりもかなり強い。ＩＬ−７の存在下でインキュベートしたＣＬＮ細胞はＣＤ８+ＬＡＫ活性を示す。しかし特定の抗原を認識するＴ細胞が好ましい。ＩＬ−７ポリペプチドの存在下でインキュベートしたそのような細胞の長期間の培養によって、ＬＡＫ（リンフォカインによって活性化されたキラー）活性を最小にして、そして特定の抗原を提示している標的細胞（例えば、腫瘍細胞、ウイルスに感染した細胞またはウイルス）に対して特異的なＣＴＬ活性が支配的になる。ＣＤ８陽性リンパ球とともにＮＫ細胞が媒介するとＬＡＫ活性は、ＩＬ−２の活性化に特有であり、ＩＬ−２によって活性化されたリンパ球の主要な活性である。本発明のＩＬ−７によって活性化された細胞溶解性のＴ細胞は、腫瘍細胞のような標的細胞に対する抗原の特異性によって特徴づけられる、主要なＣＴＬ活性をもつ。ＩＬ−２ポリペプチドまたはその誘導体および／またはＩＬ−４ポリペプチドまたはその誘導体を培養培地へさらに加えることでＣＴＬ活性が増強される。しかし、ＩＬ−２および／またはＩＬ−４をさらに加えることで増強される治療的な効果は最小である（例えば、２倍）。さらに有糸分裂を阻害した特定の腫瘍細胞をさらに加えることで、細胞溶解性のＴリンパ球を培養中で増殖させるのを促進するための特定の抗原の供給源を提供することができる。これによって培養におけるＤＬＮ細胞のＣＴＬ活性をさらに増強させることができる。
リンパ球を特定の抗原へさらす機会を与えた後に、個体から同系の抹消リンパ球（例えばＤＬＮ細胞）を得る。そのような細胞を、例えば、腫瘍またはウイルスが感染した場所で排膿しているリンパ節のような、排膿しているリンパ節から得ることができる。抹消リンパ球は、例えば、排膿しているリンパ節を吸引または除去してさらに切開することによって得てよい。排膿しているリンパ節から得たリンパ球を、ふるいのような機械的な手段によってリンパ球の単一の細胞懸濁液へ入れてよい。望ましくない繊維芽細胞を除去するために細胞を細胞選別機で分類して、次にＩＬ−７ポリペプチドまたはその誘導体を含む培養培地へ入れてよい。
排膿しているリンパ節から得た細胞は一般に、特定の抗原に予めさらしたＴ細胞の集団を含む。標準的な培養培地（例えば、ＲＰＭＩ１６４０、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、２ｍＭグルタミン、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、５０ｕ／ｍｌペニシリン、５０ｕ／ｍｌストレプトマイシン、１０％胎児の牛の血清、および５×１０-5Ｍ２−メルカプトエタノール）を細胞へ加える。標準的な培養培地の別の例は最小必須培地である。加湿したインキュベーター中で、空気中で６％のＣＯ2、約３７℃のような、培養条件は細胞の生存および増殖に最適なものである。
ＩＬ−７ポリペプチドまたはＩＬ−７の生物学的な活性をもつその誘導体を培養培地へ加える。加えるＩＬ−７ポリペプチドの量は、培養するリンパ球中でＣＴＬ活性を誘導するのに十分な量にする。培養培地へ加えるヒトＩＬ−７の量は約２．５ｎｇ／ｍｌから約２０ｎｇ／ｍｌまでが好ましい。加えるＩＬ−７ポリペプチドの量は約１０ｎｇ／ｍｌであることが最も好ましい。培養中での細胞の生存を増強させて、そしてＣＴＬ活性化を増加させるために、他の化合物を培養培地へ加えることができる。培養培地へ加えるＩＬ−７誘導体の量は誘導体の比活性に依存している。例えば、野生型のヒトＩＬ−７とほぼ等しい有効性のある誘導体の場合には、重量を基準にして濃度になるように加えるだろう。他の化合物は、同種のＩＬ−２ポリペプチドまたはその誘導体および／または同種のＩＬ−４ポリペプチドまたはその誘導体、および／または抗定の抗原をもつ有糸分裂を阻害させた腫瘍細胞の集団を含む。加えるサイトカインの培養での濃度は、ＩＬ−２においては、約０．５から約２０ｎｇ／ｍｌまでが好ましく、ＩＬ−４においては約１から約２０ｎｇ／ｍｌまでが好ましい。
同種のＩＬ−２ポリペプチドまたはその誘導体は、ＩＬ−２の生物学的な活性を示す任意のポリペプチドまたは他の有機分子である。ＩＬ−２の生物学的な活性は、ＩＬ−２レセプターのポリペプチドに特異的な生物種への結合能力によって特徴づけられる。ＩＬ−２の生物学的な活性は、ＣＴＬＬまたはＨＴ２細胞の試験管内での増殖の刺激によって測定することもできる。ＣＴＬＬおよびＨＴ２の両細胞系列の生存は、培地中でのＩＬ−２活性の存在が依存する。
有糸分裂を阻害させた腫瘍細胞の集団から、リンパ球に予めさらしたのと同じ特異性の抗原が生産される。有糸分裂の阻害とは、腫瘍細胞は「生きている」が（すなわち細胞の代謝および呼吸は可能である）、しかし細胞分裂およびコロニーの生長は実質的に不可能であることを意味する。したがって、有糸分裂を阻害した腫瘍細胞は、細胞溶解性のＴリンパ球および他の細胞の型を培養中で圧倒するまたは過剰に生長させる能力はもたず、培養培地への特定の抗原の供給源となる。
本明細書中で記述した培養条件下で生長させた本発明の細胞は、加えるべきＩＬ−７の生物学的活性を加えなかったときよりも、ＩＬ−７ポリペプチドまたはその誘導体を培養培地に存在させたときに、かなりより長期間の生存ができる。培養したリンパ節細胞またはＴリンパ球は、加えるべきＩＬ−７の生物学的な活性を加えなかったときには最適な培養条件下でせいぜい７から１０日間は試験管内で生存することができるのみである。対照的に、同じ細胞がＩＬ−７の生物学的な活性の存在下で少なくとも１８週間は連続して培養できる。図１９に印刷した写真は、マウスＩＬ−２、マウスＩＬ−７またはマウスＩＬ−２およびマウスＩＬ−７の組み合わせの存在下で培養したマウスＤＬＮの９週間後の培養の顕微鏡写真を示す。ＩＬ−７の存在下で（ＩＬ−２の存在下または非存在下で）培養した細胞のみが活動的なままであり、培養のウエルの基部へ付着するための仮足をより多く示し、より特異的な（すなわち抗原に特異的な）細胞溶解性の活性を維持した。ＩＬ−２またはＩＬ−２を加えずに培養した細胞は生存できず、研究できないだろう。
排膿するリンパ節から得て、生体外で培養した細胞の集団はＣＴＬ活性を示し、特定の抗原をもつ細胞に向けられたＣＤ８陽性Ｔ細胞によって、およびＮＫ細胞に特徴的な（非特徴的な溶解活性によって媒介される）非特異的なＬＡＫ活性を相対的に欠損していることによって特徴づけられる。ＣＴＬ活性は、特定の抗原を提示するこれらの細胞にのみ向けられた溶解活性を示す、抗原特異的な細胞溶解性のＴ細胞によって媒介されると考えられている。ＣＴＬ活性は標的細胞または抗原に特異的なので、ＬＡＫ活性よりもより好ましい溶解活性の型である。したがって、ＣＴＬ活性をもつ細胞を用いた免疫療法では、非特異的なＬＡＫ活性をもつ細胞を用いたときの同等の溶解活性を利用するよりも副作用をより低くすることができるだろう。
ＩＬ−７ポリペプチドまたは生物学的に活性のあるその誘導体を生物学的に効果のある量で存在させて培養して活性化させた培養したＴリンパ球を選定免疫療法の型で個体へ投与する。生体外で細胞内のＣＴＬ活性を活性化させるために用いた特定のサイトカイン（例えばＩＬ−７およびあるいはＩＬ−４および／またはＩＬ−２）を細胞とともに投与することができる。サイトカインの１日当たりの投与量は、ＩＬ−２の場合には約１０から約２０００μｇ／ｋｇ／日、ＩＬ−４およびＩＬ−７の場合には約４から約１０００μｇ／ｋｇ／日を含むことが好ましい。ＩＬ−２の１日当たりの投与量は３回の投与に分け、ＩＬ−４およびＩＬ−７の場合には２回に（ｂｉｄ）分けるのが１番好ましい。
リンパ球細胞は、ＩＬ−７ポリペプチドまたはその誘導体の存在下で少なくとも４日間培養して活性化させることが必要である。活性化させた細胞の集団を個体へ静脈注射によって、または腫瘍の部位へ直接注射によって投与する。活性化させた細胞の集団を他の可能な投与方法を用いて投与してもよい。
特定の抗原を提示する細胞は、ＣＴＬ活性の標的である。特定の抗原は、例えば、腫瘍細胞の特定の集団によって提示される抗原であり、または、ウイルスに感染された宿主細胞の集団によって提示されるウイルスの抗原である。既知の腫瘍の抗原の例にはＭｅｔｈＡ、腫瘍Ａ5、およびＰ８１５腫瘍Ａ5が含まれ、既知のウイルスの抗原にはインフルエンザ、ワクシニア、およびリンフォコリオメニンギチスウイルスが含まれる。特定の抗原を提示する細胞は活性化させたリンパ球のＣＴＬ活性の標的細胞になる。
以下の例では、本発明の様々な面を説明することをめざした。
実施例１
この例では、ＤＬＮの試験管内の培養培地へＩＬ−７ポリペプチドを加えたときの効果を説明する。培養培地へのＩＬ−７の投与は、試験管内での抗腫瘍ＣＴＬ活性、および生体内での抗腫瘍の治療の効力を増強する。ＣＨ３マウスへ３×１０6個の１０２４腫瘍細胞を注射した。１０日後に無菌条件下で排膿しているリンパ節（ＤＬＮ）を手術して取り出して、分離した単一の細胞懸濁液とし、組織培養中へ置いた。１９８８年１０月７日に出願された米国特許出願第０７／２５５，２０９号に記述されたように、組換えヒトＩＬ−７を培養培地中に０（コントロール）、２．５，１０，および２０ｎｇ／ｍｌの濃度で加えた。なお、前述の特許出願の内容はこの言及によって本明細書中に含まれるものとする。１０２４腫瘍に予めさらさなかったＣＨ３マウスから得たコントロールのリンパ節（ＣＬＮ）細胞を同時に培養したものを同じ培養培地へ置いた。
培養を始めてから４日後に、試験管内での細胞溶解活性について培養の一部分をアッセイした。リンチ（Ｌｙｎｃｈ）ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３６巻：１５２１ページ，１９８６年の文献に記述されているように、細胞溶解活性は６時間の51Ｃｒ−放出アッセイによって決定した。２０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７を用いて培養したＣＬＮ細胞は、ＩＬ−７によって誘導されて残存するネズミＬＡＫ活性に一致したわずかなそして「適度な」細胞溶解活性を示した。培地のみで培養したＤＬＮ細胞は、培養培地へ加えるべきＩＬ−７を加えなかったときの抗腫瘍細胞溶解活性を示した。しかし、細胞溶解活性は、培養培地へのＩＬ−７の添加によってかなり増強された。細胞溶解のデータを図１に示す。図１では、ＩＬ−７なしで培養したＣＬＮ、２０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７を用いて培養したＣＬＮ、ＩＬ−７なしで培養したＤＬＮ、および異った濃度のＩＬ−７を用いて培養したＤＬＮについての、標的細胞に対するエフェクター細胞のいくつかの比における細胞溶解活性（すなわち、溶解のパーセント）を比較する。ＩＬ−７を用いて培養したＤＬＮは、標的細胞に対するエフェクターの全ての比において最も大きい溶解活性を示した。
培養した細胞の生体中での効力は、数を数えたＤＬＮ細胞（１×１０6，３×１０6，または６×１０6細胞）を、ＩＬ−７の存在下または非存在下で培養してＣＨ３マウスの集団（１集団当たり４匹のマウス）へ選定的に（静注によって）移すことによって決定した。もともと備わっている初期免疫応答を起こさせないために、マウスに予め致死量に近いの量の（５００ラド）の放射線を照射した。コントロールのマウス（５００ラドを照射した）には細胞を注射しないまたは２０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７の存在下または非存在下の培養培地中で４日間培養した６×１０6個のＣＬＮ細胞を注射した。全ての処理をする集団のマウスには５×１０5個の生存能力のある１０２４腫瘍細胞を皮内へ注射して免疫性をテストした。腫瘍の生長速度を、腫瘍の大きさ（ｍｍ2）を測定することで、その後の３６日間以上の期間にわたって決定した。
腫瘍の攻撃は、細胞を注射しなかった、または２０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７を用いて培養した６×１０6個のＣＬＮ細胞を注射した、放射線を照射したマウスにおいて同じ速度で生長した（図２）。ＩＬ−７の非存在下で培養した、１×１０6，３×１０6または６×１０6個のＤＬＮ細胞を注射したマウスにおいては腫瘍の生長速度がかなりより遅かったが、しかし腫瘍細胞は検出されなかった（図２）。２０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７中で培養した３×１０6または６×１０6個のＤＬＮ細胞を注射したマウスでは、全ての例において腫瘍の攻撃を拒絶することが明らかになった。２０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７中で培養した１×１０6個のＤＬＮ細胞を注射したマウスにおいては、培地のみで培養した６×１０6個のＤＬＮ細胞を注射したマウスと同じ速度で腫瘍の攻撃が生長した。これらのデータは、ＩＬ−７の非存在下で培養した同じＤＬＮ細胞よりも、ＩＬ−７を用いて培養したＤＬＮ細胞は約６倍の生体内での治療効果があることを示している。
図３および図４には、培養培地にそれぞれ１０ｎｇ／ｍｌおよび２．５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７を含めたときの同じ腫瘍の生長速度を観察したときの結果を示す。これらのデータ（図１−４中の）は、抗腫瘍性の細胞溶解性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の活性を用いた治療の効力は、培地のみでＤＬＮ細胞の培養と比較して、ＩＬ−７を含む培養培地中でのＤＬＮ細胞の生体外での培養によって約６倍に増強される。２０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７を用いて培養したＣＬＮ細胞を注射したマウスでは、ＩＬ−７の非存在下で培養したＣＬＮ細胞を注射したコントロールのマウスと同じ速度で腫瘍の攻撃が生長したので、ＤＬＮ細胞を培養したときに用いたＩＬ−７の生体内での抗腫瘍の効果を、ＩＬ−７が誘導した非特異的なＬＡＫ活性のためであるとは考えられない。
実施例２
この例では、細胞溶解性のＴ細胞を生体外で培養する際に、ＩＬ−７ポリペプチドとともに培養培地へＩＬ−２ポリペプチドを加えるときの効果を説明する。実施例１で記述したように、ＤＬＮおよびＣＬＮをＣＨ３マウスから得た。８日前にＤＬＮ細胞を２×１０6個の生存能力のある１０２４腫瘍細胞へさらした。ＤＬＮおよびＣＬＮ細胞を分離して単一な細胞懸濁液にして、完全ＲＰＭＩ１６４０培地中で培養した。培養培地には、（Ａ）加えるべきサイトカインを加えないコントロール培地、（Ｂ）２ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−２、（Ｃ）２０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−７、（Ｄ）１０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−７、（Ｅ）２ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−７、または（Ｆ）２ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−２＋１０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−７の中の任意の１つを補った。実施例１で記述したように、培養を始めてから４日後に、６時間の51Ｃｒ放出アッセイを用いて各培養から採った細胞の一部分を、抗腫瘍性の細胞溶解活性についてアッセイした。
図５には、サイトカインを含まない培地中で培養したＣＬＮ細胞を用いると、抗腫瘍性のエフェクター細胞の活性が検出されず、そして２ｎｇ／ｍｌのＩＬ−２を含む培地中で培養したＣＬＮ細胞を用いると、低いレベルのＬＡＫ活性が検出されたことを示す。培地のみで培養したＤＬＮ細胞を用いると抗腫瘍性のＣＴＬ活性があり、そして２ｎｇ／ｍｌのＩＬ−２（Ｂ）を培養培地へ加えたときに、このＣＴＬ活性はかなり増強された（図５）。
生体内での治療の効力は、実施例１と同じ方法で１０２４腫瘍の大きさを測定することによって測定した。図６には、加えるべきサイトカインを加えない培地中で生長させたＣＬＮ細胞および２ｎｇ／ｍｌのＩＬ−２（Ｂ）を用いて生長させたＣＬＮ細胞を注射したマウスでは、細胞を注射しなかったコントロールの放射線を照射したマウスと同じ速度で腫瘍の攻撃が生長したことを示す。図６では、この実験において、サイトカインの非存在下で培養した６×１０6個のＤＬＮ細胞では、コントロールの集団と同じ速度で腫瘍が生長したので、培養したＤＬＮ細胞の治療の効力は無視できたことをさらに説明している。より少ない数のコントロールのＤＬＮ細胞を注射したマウスでは、コントロールの集団で観察されたのと同じ速度で、またはコントロールの集団で観察されたよりも速く、腫瘍の攻撃が生長した。ＩＬ−２（２ｎｇ／ｍｌ）を用いて培養したＤＬＮ細胞では、コントロールの集団よりも腫瘍の攻撃の生長は遅かった（図６）。
図７，９および１１では、２，１０または２０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７のそれぞれを含む培地中で培養したＤＬＮ細胞では、培地のみで培養したＤＬＮ細胞と比較して、抗腫瘍性の細胞溶解活性が著しく増強されたことを示す。（数を数えたエフェクター細胞を注射したマウスにおける腫瘍の生長速度によって決定した）ＤＬＮ細胞集団の生体内での治療の効力は、２ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７および１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７を用いて培養したＤＬＮ細胞を使用すると約６倍に、そして２０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７を用いて培養したＤＬＮ細胞を使用すると約１２倍に増強されることが見い出された（図８，１０および１２を見よ。）。１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７および２ｎｇ／ｍｌのＩＬ−２中で培養したＣＬＮ細胞は、生体内での任意の検出できる治療効果を媒介しなかったが、試験管内での重要な腫瘍殺傷性のＬＡＫ活性をもつことが明らかになった（図１３）。１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７および２ｎｇ／ｍｌのＩＬ−２中で培養したＤＬＮ細胞では、培地のみで培養したＤＬＮ細胞と比較して、治療の効力が１２倍に増強されるのが明らかになった（図１４）。
これらのデータは、４日間の生体外での培養期間中にＤＬＮ細胞の集団から生じる抗腫瘍性のＣＴＬ活性による治療の効力は、ＩＬ−７またはＩＬ−７を主としてＩＬ−２を加えた組み合わせを含む培養培地中でＤＬＮ細胞を培養することによって、約６倍から約１２倍までに増強できることを説明している。しかし、加えるべき唯一のサイトカインとしてＩＬ−２を用いて（ＩＬ−７を用いずに）培養培地中で培養したＤＬＮ細胞は、生体内でわずかにより強い治療上の活性を示した。２ｎｇ／ｍｌのＩＬ−２または１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７および２ｎｇ／ｍｌのＩＬ−２中で培養したＣＬＮ細胞の投与では、細胞で処理しなかった、またはサイトカインの非存在下で培養したＣＬＮ細胞で処理した、放射線を照射したコントロールのマウスと同じ速度で腫瘍の攻撃が生長したので、治療の効力の増加はＬＡＫ活性のためとは考えられない。
実施例３
この実施例では、長期間の培養条件下で維持したＤＬＮおよびＣＬＮ細胞によって与えられる抗腫瘍性のＣＴＬ活性を説明する。Ｂ１０マウスにＢ１０．５腫瘍細胞を注射した。９日後にＤＬＮ細胞を得た。Ｂ１０．５腫瘍細胞にさらさないＢ１０マウスからＣＬＮ細胞を同時に得た。リンパ球を単一な細胞の懸濁液中に置き、そして４日間完全ＲＰＭＩ１６４０培地中で培養した。加えるべきサイトカインを加えない培養条件で４日間培養した後に、示したような加えるべきサイトカインおよび／または有糸分裂を阻害した腫瘍細胞を用いた異なる培養条件へＤＬＮ細胞を移した。有糸分裂を阻害した腫瘍細胞は加えるが、加えるべきサイトカインを加えずにインキュベートしたＤＬＮ細胞の培養は、過剰に生長して腫瘍細胞になった。逆に、加えるべきＩＬ−７および有糸分裂を阻害した腫瘍細胞およびあるいは他のサイトカインを用いてインキュベートしたＤＬＮ細胞の培養はＤＬＮ細胞の培養のままだった。特異的なＢ１０．５腫瘍細胞および交差反応性のないＢ１０．２腫瘍細胞系列を用いた、実施例１および２と同じ方法で、腫瘍の大きさを測定することによって、生体内での抗腫瘍の効力を決定した。
図１５には、ＤＬＮ細胞はＢ１０．５腫瘍細胞の攻撃を拒絶したが、Ｂ１０．２腫瘍の攻撃を拒絶しなかったことを示す。期待されたように、ＣＬＮ細胞は、いずれの腫瘍細胞系列の拒絶も媒介しなかった。
Ｂ１０マウスから得た細胞で長期間のＤＬＮおよびＣＬＮ培養を確立した。（２０００ラドで）放射線を照射したＢ１０．５の特異的な腫瘍細胞を各培地へ、応答細胞：刺激細胞の比が５：１になるように加えた。培養培地はサイトカインの補給、または５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−２、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７または１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７及び２ｎｇ／ｍｌのＩＬ−２の補給のいずれかをなされなかった。照射腫瘍細胞を各ＤＬＮ培養へ添加した。放射線の照射量（２０００ラド）は、腫瘍細胞の有糸分裂を完全に阻害するためには不十分である。加えるべきサイトカインを加えないＤＬＮの培養は完全に過剰な生長をして腫瘍細胞になった。ある方法でサイトカインを加えた他のＤＬＮ培養では、加えた腫瘍細胞を殺して、増殖を続けた。サイトカインを同じ濃度で用いてＤＬＮ培養を維持したが、しかし、放射線を照射した腫瘍細胞を用いた後の試験管内での刺激は行わなかった。
加えるべきサイトカインを加えたＤＬＮ培養を５週間続けて、そして試験管内での細胞溶解活性についてアッセイした。図１６で、培養を始めてから５週間後の全ての場合に、抗腫瘍性の特異的なＣＴＬ活性が検出されたことを示す。Ｂ１０．２（非特異的な）腫瘍細胞を用いて攻撃したときに、細胞溶解活性は検出されなかった。これらのＤＬＮ細胞の集団のフローサイトメトリック分析（図１７）から、これらはＣＤ８+Ｔ細胞が支配的であることがわかった。
長期間の培養で維持したＤＬＮ細胞が生体内での腫瘍の拒絶を媒介できるかどうかを決定した。同系のＢ１０マウスに５００ラドの放射線を照射した。長期間（５週間）のＤＬＮ細胞（２×１０6細胞）の培養を静脈注射で、放射線を照射したマウスへ投与した。皮内注射によって投与した５×１０5個の腫瘍細胞でマウスを攻撃した。腫瘍の生長は、腫瘍の大きさを測定することで決定した。Ｂ１０．５（特異的な）またはＢ１０．２（非特異的な）腫瘍細胞を攻撃に用いた。ＩＬ−７を含む培養培地中で維持したＤＬＮ細胞のみが、特異的な（すなわち、Ｂ１０．５）腫瘍の攻撃を拒絶できたが、しかし非特異的な（すなわち、Ｂ１０．２）腫瘍の攻撃は拒絶できなかった（図１８）。培養培地へさらにＩＬ−２を加えても、ＩＬ−７の有益な効果を損わなかった。
これらのデータは、治療上有効な抗腫瘍性のＣＴＬ活性は、ＩＬ−７単独で、またはＩＬ−７およびＩＬ−２の組み合わせを含む培養培地中で生体外で時間を延長して（少なくとも５週間）維持することができることを示す。ＩＬ−２のみを含む培地中で培養したＤＬＮ細胞は、生体内での免疫療法の効力をテストするのに十分な程度までのリンパ球の生長を維持できなかったので、最も重要な要素は、ＩＬ−７を培養培地中へ加えることのように見える。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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