(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
シバ植物のカルスから緑色細胞塊を誘導し、この緑色細胞塊を無糖固体培地に置床して発芽、生育させることを特徴とするシバ植物カルスからの植物体の作出方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、シバ植物のカルスから効率的に植物体を作出する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
植物組織培養技術を用いた植物の大量増殖方法として、液体培地中でカルスから不定胚や胚様体等を誘導し、これを糖を含む固体培地上で発芽、発根することによって幼植物体を得る方法が知られている（Saito,et al.1991,Ammirato,P.V.,1989 ）。しかし、不定胚、胚様体等は殆ど光合成能力を持たないため、これらを発芽、発根させるためには固体培地への糖の添加が必要である。そのため、この方法では不定胚、胚様体等の発芽、発根を無菌的環境下で行なう必要がある。
【０００３】
また、液体培地中でイネのカルスを発芽、発根させることによって幼植物体を再分化し、これを糖を含まない固体培地上に移植し、１〜１０％の炭酸ガス施用することによって幼植物体をさらに苗として利用できるまで育成する方法が知られている（瀬古ら、1992）。この方法では、有菌的環境下で幼植物体を育成することが出来るが、カルスから不定胚や胚様体等が誘導する時期、さらに液体培地中で発芽、発根する時期が異なるため、幼植物体の大きさ、生育ステージに差異が生じる。このような大きさ、生育ステージの異なる幼植物体を混在したまま育成すると、未分化の細胞や大きくなりすぎた植物体が他の植物の生育を阻害するので、幼植物体を育成する前に選別等の煩雑な操作が必要である。
【０００４】
ところで、液体培地中でシバ植物のカルスを発芽、発根させることによって幼植物体得る方法が知られている（篠崎ら、1995）。しかしながら、この方法では幼植物体の効率的な育成方法は知られておらず、さらにシバ植物のカルスから再分化した幼植物体は、イネのカルスから再分化した幼植物体と同じ問題点を持っている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、従来技術の問題点を解消し、シバ植物のカルスから効率的に植物体を作出する方法を提供することを目的とするものであり、より具体的にカルスの再分化時期を同調化し、有菌的環境下で大きさ、生育ステージを揃えて植物体を生育させることのできる方法を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、カルスを緑色細胞塊に誘導した後、固体培地に置床すると、大きさ、生育ステージを揃えて植物体を生育させることをできるのを見出し、本発明を完成した。
即ち、本発明は、シバ植物のカルスから緑色細胞塊を誘導し、この緑色細胞塊を固体培地に置床して発芽、生育させることを特徴とするシバ植物カルスからの植物体の作出方法である。
【０００７】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明におけるシバ植物とは、イネ科に属するすべてのシバを意味する。具体的な植物名を例示すると、フェスティカ属に属するトールフェスク、レッドフェスク、ロリウム属に属するイタリアンライグラス、ペレニアルライグラス、イチゴツナギ属に属するケンタッキーブルーグラス、ゾイシア属に属するノシバ、コウライシバ等を挙げることができる。
【０００８】
本発明において、緑色細胞塊とは、カルスから誘導される細胞塊であって、茎、葉、根の分化はみられないが、十分な光合成能力を有するものをいい、通常、緑色細胞塊を構成する個々の細胞には多数の緑色の突起様構造がみられる。この緑色細胞塊は、十分な光合成能を有する点、即ち、光と二酸化炭素があれば糖を含まない培地で発芽、生育できる点で、カルス、並びに不定胚、胚様体及び不定芽と明確に相違し、また、茎、葉、根の分化がみられない点で、幼植物体と明確に相違する。
【０００９】
カルスから緑色細胞塊への誘導は、以下のようにして行うことができる。
１）通気攪拌条件
液体培地中でカルスを緑色細胞塊へ誘導するためには、カルスに酸素を供給する必要があり、カルスの懸濁液に通気攪拌を加え、液体培地中の溶存酸素量を増やすことが望ましい。但し、通気攪拌によるカルスへのストレスが大きすぎるとカルスが緑色細胞塊に誘導される前に褐変枯死してしまい、逆にストレスが小さすぎると緑色細胞塊は誘導されるものの、その大きさが不揃いになり好ましくない。緑色細胞塊に誘導するための通気攪拌条件としては、回転数：１０〜６０回転／分、通気量は培地１Ｌ当り０．０５〜０．５Ｌ／ｍｉｎ（但し、通気する空気は６０％程度の酸素が含まれる様に調製する）するのが好ましく、回転数：２０〜３０回転／分、通気量０．１〜０．２Ｌ／ｍｉｎとするのが特に好ましい。このような通気攪拌条件を与える培養装置としては、例えば、ローラーボトル（柴田ハリオ社製）などを挙げることができる。
【００１０】
２）培養期間
培養期間は６週間程度必要であるが、緑色細胞塊の誘導状況によってこれより短くしても長くしてもよい。また、培養から３週間程度で培地の交換を行うことが望ましい。
３）培地
緑色細胞塊の誘導に用いる最初の培地（以下「初期誘導培地」という）は、植物組織の培養に常用されるものであればどのようなものでもよいが、糖、オーキシン、サイトカイニンを含むものが好ましい。糖としては、シュークロースが好ましく、その濃度は１５ｇ／Ｌ程度が適当である。オーキシンとしては、ＮＡＡが好ましく、その濃度は０．４ｐｐｍ程度が適当である。サイトカイニンとしては、カイネチンが好ましく、その濃度は０．５ｐｐｍ程度が適当である。
【００１１】
培養の途中で交換する培地（以下「交換培地」という）も、植物組織の培養に常用されるものであればどのようなものでもよいが、糖、オーキシン、サイトカイニンを含むものが好ましい。糖としてはシュークロースが好ましく、その濃度は１５ｇ／Ｌ程度が適当である。オーキシンとしては、ＮＡＡが好ましく、その濃度は１ｐｐｍ程度が適当である。サイトカイニンとしては、カイネチンが好ましく、その濃度は０．５ｐｐｍ程度が適当である。
【００１２】
４）他の条件
誘導に用いるカルスの置床量は、培地１Ｌ当たり１０ｇ程度が適当であるが、これに限定されるものではない。
光条件は、４，０００〜１０，０００Ｌｕｘで１２〜２４時間日長とするのが好ましい。
【００１３】
以上のようにして誘導された緑色細胞塊を、糖を含まない固体培地に置床し、発芽、生育させる。このように糖を含まない培地を用いることにより、有菌環境下で培養を行うことが可能になり、滅菌操作等を省略することができる。培地の固形剤としては特別なものを用いる必要はなく、ゲルライト等の一般的なものでよい。
【００１４】
また、緑色細胞塊を糖を含まない培地上で発芽、生育させるためには、炭酸ガスと光の供給が必須である。炭酸ガスの供給は、炭酸ガス濃度を１％〜１０％に調製した高濃度炭酸ガスを培養器１Ｌ当たり１分間に０．１〜０．５Ｌ程度送ることにより行う。また、光条件は、８，０００〜２０，０００Ｌｕｘで１２〜２４時間日長とするのが好ましい。以上のような条件で３週間程度培養を行うと緑色細胞塊の発芽が観察される。
【００１５】
【実施例】
〔実施例１〕
ノシバの種子２５０粒をサンプルパックにいれ、ビーカに入れた７０％エタノールに３０秒浸漬し、次いで別のビーカに入れた２．５％ＮａＯＣｌ液に浸漬し、これをデシケータに入れて吸引ポンプにより脱気した。種子から泡が出はじめてから２分間滅菌した後、ビーカをデシケータから取り出し、２．５％ＮａＯＣｌ液を新しいものと交換し、クリーンベンチ内でさらに１０分間滅菌を行った。種子を滅菌水で洗浄した後、「発芽培地」へ播種し、暗黒下、２８℃で１週間培養した。発芽後、種子の根を基部から除去し、「カルス誘導培地」に移植した。温度２８℃、高湿度条件において培養開始から２〜３週間は暗黒下で、その後の１週間は４０００Ｌｕｘ程度の光照射下で培養した。「発芽培地」及び「カルス誘導培地」の組成は以下の通りである。
【００１６】
（発芽培地）
Ｎ６，３０ｇ／Ｌシュークロース，４ｇ／Ｌゲルライト
（カルス誘導培地）
ＭＳ，３０ｇ／Ｌシュークロース，５ｍｇ／Ｌ２，４−Ｄ，０．５ｍｇ／ＬＢＡ，３ｇ／ｌゲルライト
【００１７】
〔実施例２〕
上記で得られたカルスを１００ｃｃフラスコ（コントロール）、１．６Ｌターボリフトファーメンター（東京理科社製、回転数３０）、１Ｌエアーリフト（柴田ハリオ社製、回転数３０）、１Ｌローラーボトル（柴田ハリオ社製、回転数２０）の培養容器を用いて培養し、緑色細胞塊を誘導した。各容器の培地量は、１００ｃｃフラスコは２０ｃｃ、１．６Ｌターボリフトファーメンターは８００ｃｃ、１Ｌエアーリフトは１Ｌ、１Ｌローラーボトルは１Ｌである。また、各容器の培地１Ｌ当たり１０ｇになるようにカルスを置床した。培養は、最初に「初期誘導培地」で３週間培養し、次いで等量の「交換培地」で培地を交換し、更に３週間培養した。培養期間中の温度は２８度前後になるように制御し、光条件は、４，０００Ｌｕｘで２４時間日長とした。「初期誘導培地」及び「交換培地」の培地組成は以下の通りである。
（初期誘導培地）
１／２Ｎ６（ビタミン類の濃度はＮ６のまま），シュークロース１０ｇ／Ｌ，プロリン１．４ｇ／Ｌ，カゼイン０．１ｇ／Ｌ，ソルビトール１５ｇ／Ｌ，ＭＥＳ０．５ｇ／Ｌ，ＮＡＡ０．４ｐｐｍ，カイネチン０．５ｐｐｍ
【００１８】
（交換培地）
１／２Ｎ６（ビタミン類の濃度はＮ６のまま），シュークロース１５ｇ／Ｌ，カゼイン１ｇ／Ｌ，ソルビトール１５ｇ／Ｌ，ＭＥＳ０．５ｇ／Ｌ，ＮＡＡ１ｐｐｍ，カイネチン０．５ｐｐｍ
表１に各容器ごとの、「緑色細胞塊の個数（置床カルス当たりの個数及び培地当たりの個数）」及び「緑色細胞塊の大きさ」を示す。
また、図１に培養容器中のカルスの形態、図２に培養容器中の緑色細胞塊の形態、図３に拡大した緑色細胞塊の形態を示す。
【００１９】
【表１】
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【００２０】
〔実施例３〕
実施例２の１Ｌローラーボトルより得られた緑色細胞塊１００ｍｇ（細胞塊数２０ケ）を、「無糖固体培地」に置床して発芽、生育させた。培養期間中の温度は２８度前後になるように制御し、光条件は、１０，０００Ｌｕｘで２４時間日長とした。また、炭酸ガスを５％含む空気を培養器１Ｌ当たり１分間に０．２Ｌ送った。「無糖個体培地」の組成は以下の通りである。
（無糖固体培地）
１／４Ｎ６（ビタミンは除く）、４ｇ／Ｌゲルライト
置床から３週間後の緑色細胞塊の発芽率・活着率、及び草丈を表２に示す。また、図４に発芽後の緑色細胞塊の形態を示す。図４の右が高濃度炭酸ガスを施用して発芽させたものであり、左が炭酸ガス空気を施用しないで発芽させたものである。
【００２１】
〔比較例１〕
シバ植物としてノシバの代わりにトールフェスクを用い、それ以外は実施例１と同様の方法でカルスを誘導した。得られたカルスを培地１Ｌ当り１０ｇになるように１Ｌエアーリフトに置床し、これを培養して幼植物体を誘導した。培養は実施例２と同じである。この幼植物体を上記の「無糖固体培地」に置床して発芽、生育させた。置床から３週間後の幼植物体の発芽率・活着率、及び草丈を表２に示す。また、図５に培養容器中のカルスの形態、図６に培養容器中の幼植物体の形態を示す。
【００２２】
【表２】
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【００２３】
【発明の効果】
本発明の緑色細胞塊は、糖を含まない培地で発芽、生育させることができるので、有菌環境下での培養が可能である。また、緑色細胞塊は、同調的に発芽するので、植物体の大きさ、生育ステージを揃えて生育させることが可能である。このため本発明の方法は、選抜や滅菌処理等の煩雑な操作を省略することができ、効率的にカルスから植物体を作出することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  ノシバカルスの生物の形態を示す写真である。
【図２】  ノシバ緑色細胞塊の生物の形態を示す写真である。
【図３】  拡大したノシバ緑色細胞塊の生物の形態を示す写真である。
【図４】  発芽したノシバ植物の生物の形態を示す写真である。
【図５】  トールフェスクカルスの生物の形態を示す写真である。
【図６】  トールフェスク幼植物体の生物の形態を示す写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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