(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
医薬的に許容される担体中、有効量のマクロファージ刺激プロテインを含む、哺乳類中の血小板の生産を刺激するための医薬組成物。
【請求項２】
該マクロファージ刺激プロテインがヒトのマクロファージ刺激プロテインである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
化学療法剤を投与した後に投与される、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
化学療法剤を投与する前に投与される、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項５】
該医薬的に許容される担体が無菌食塩水である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項６】
該医薬的に許容される担体中、マクロファージ刺激プロテインの有効量を含む、血小板減少症に羅患していると診断された哺乳類における血小板減少症を処置するための医薬組成物。
【請求項７】
有効量のマクロファージ刺激プロテインの存在下に巨核芽細胞、プロ巨核球および／または好塩基性巨核球を含むと推測される細胞試料を培養することを含む、試験管内で巨核球の成熟を刺激する方法。
【請求項８】
マクロファージ刺激プロテインの量が１０ｎｇ／ｍＬから１００ｎｇ／ｍＬである請求項７に記載の方法。
【請求項９】
容器、
その容器のラベル、および
その容器内に含まれる組成物
を含む、巨核球の成熟および血小板の生産を刺激するための製品
［ここに、その組成物は巨核球の成熟および血小板の生産を刺激するために有効であり、その容器上ラベルにはその組成物が巨核球の成熟および血小板の生産を刺激するために使用できることが記載され、さらにその組成物中の活性薬剤はマクロファージ刺激プロテインを含む］。
【請求項１０】
さらに哺乳類にマクロファージ刺激プロテインを投与するための指示を含む、請求項９に記載の製品。
【請求項１１】
さらに試験管内細胞培養においてマクロファージ刺激プロテインを使用するための指示を含む、請求項９に記載の製品。
【請求項１２】
第一の容器、その容器のラベル、およびその容器内に含まれる組成物；
［ここに、その組成物は巨核球の成熟および血小板の生産を刺激するために有効であり、その容器のラベルにはその組成物が巨核球の成熟および血小板の生産を刺激するために使用できることが記載され、さらにその組成物中の活性薬剤はマクロファージ刺激プロテインを含む］；および
緩衝液を入れた第二の容器；
を含む、巨核球の成熟および血小板の生産を刺激するための製品。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は一般的に巨核球の形成および血小板の形成を刺激する方法に関する。さらに特定的には、本発明はマクロファージ刺激プロテインを使用して巨核球の成熟および血小板の生産を刺激する方法に関する。本発明はまた、たとえば血小板減少症のようなある種の造血器疾患の処置法、およびマクロファージ刺激プロテインを含むキットに関する。
発明の背景
１．肝実質細胞増殖因子
肝実質細胞増殖因子（「ＨＧＦ］）は、特定の組織および細胞型に対する増殖因子として機能する。ＨＧＦは最初は肝実質細胞に対する有糸分裂促進剤として確認された（Ｍｉｃｈａｌｏｐｏｕｌｏｓなど、Ｃａｎｃｅｒ・Ｒｅｓ．、４４巻：４４１４〜４４１９頁（１９８４年）；Ｒｕｓｓｅｌなど、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、１１９巻：１８３〜１９２頁（１９８４年）；Ｎａｋａｍｕｒａなど、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．、１２２巻：１４５０〜１４５９頁（１９８４年）］。前記のＮａｋａｍｕｒａなどは肝臓を部分的に切除したラットの血清から得たＨＧＦの精製を報告している。それに続いてＨＧＦはラット血小板から精製され、そのサブユニットの構造が決定された［Ｎａｋａｍｕｒａなど、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８３巻：６４８９〜６４９３頁（１９８６年）；Ｎａｋａｍｕｒａなど、ＦＥＢＳ・Ｌｅｔｔｅｒｓ、２２４巻：３１１〜３１６頁（１９８７年）］。ヒトの血漿から得られたヒトＨＧＦ（「ｈｕＨＧＦ」）の精製はＧｏｈｄａなど、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、８１巻：４１４〜４１９頁（１９８８年）によって最初に記載された。
ラットＨＧＦおよびｈｕＨＧＦはともに分子としてクローニングされており、「デルタ５−ＨＧＦ」と命名された天然起源アミノ酸５個欠失変異体を含めてクローニングおよび配列決定がされている［Ｍｉｙａｚａｗａなど、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．、１６３巻：９６７〜９７３頁（１９８９年）；Ｎａｋａｍｕｒａなど、Ｎａｔｕｒｅ、３４２巻：４４０〜４４３頁（１９８９年）；Ｓｅｋｉなど、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．、１７２巻：３２１〜３２７頁（１９９０年）；Ｔａｓｈｉｒｏなど、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８７巻：３２００〜３２０４頁（１９９０年）；Ｏｋａｊｉｍａなど、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１９３巻：３７５〜３８１頁（１９９０年）］。
ｈｕＨＧＦの成熟型はヒトの血清から精製したものの主たる型に対応するが、これはヒトのプロホルモンのアミノ酸Ｒ４９４とＶ４９５番との間で蛋白分解的切断によって誘導されたジスルフィドで結合したヘテロ二量体である。この切断過程は４４０アミノ酸のα−サブユニット（Ｍr６９ｋＤａ）および２３４アミノ酸のβ−サブユニット（Ｍr３４ｋＤａ）から構成される分子を発生する。ｈｕＨＧＦのｃＤＮＡのヌクレオチド配列はα−鎖およびβ−鎖の両方がプレプロ前駆体蛋白質をコードする単一の読取り枠中に含まれていることを示す。予想される成熟ｈｕＨＧＦの一次構造において、鎖間Ｓ−Ｓ橋はα−鎖のＣｙｓ４８７およびβ−鎖のＣｙｓ６０４の間で形成されている［Ｎａｋａｍｕｒａなど、Ｎａｔｕｒｅ、前出、参照］。α−鎖のＮ−末端にはメチオニン基に始まる５４アミノ酸が先行する。このセグメントは３１残基の特徴的疎水性リーダー（シグナル）配列およびプロ配列を含む。α−鎖はアミノ酸（ａａ）５５から始まり、クリングルドメイン４個を含む。α−鎖のクリングル１ドメインは約ａａ１２８から約ａａ２０６までに伸長し、クリングル２ドメインは約ａａ２１１と約ａａ２８８との間にあり、クリングル３ドメインは約ａａ３０３から約ａａ３８３までに伸長するものと定義され、およびクリングル４ドメインは約ａａ３９１から約ａａ４６４までに伸長している。
種々のクリングルドメインの定義は他の蛋白質（プロトロンビン、プラスミノーゲン）にあるクリングル様ドメインとの相同性に基づくので、それ故に前記の限定は近似的なものに過ぎない。未だにこれらクリングルの機能は結論付けられていない。ｈｕＨＧＦのβ−鎖はセリンプロテアーゼの触媒ドメインと高度な相同性を示す（プラスミノーゲンのセリンプロテアーゼドメインに対して３８％の相同性）。しかしながら、セリンプロテアーゼの触媒三回対称軸を形成する残基３個の中で２個はｈｕＨＧＦ中には保存されていない。それ故に、そのセリンプロテアーゼ様ドメインにもかかわらず、ｈｕＨＧＦはプロテイン分解的活性を持たないと思われ、β−鎖の正確な役割は未だ知られていない。ＨＧＦはα−鎖の２９４位および４０２位およびβ−鎖の５６６位および６５３位に位置する推測上のグリコシル化部位４個を含有する。
ヒト白血球から分離したｃＤＮＡの一部には１５塩基対のフレーム内欠失が観察された。ＣＯＳ−１細胞でのそのｃＤＮＡ配列の一過性発現で、コードされているクリングル１ドメイン内にアミノ酸５個を欠失したＨＧＦ分子（デルタ５ＨＧＦ）が完全な機能を果たすことが示された［Ｓｅｋｉなど、前出］。
天然起源ｈｕＨＧＦ変異体が確認されており、それはＮ−末端フィンガーに対するコード配列および成熟ｈｕＨＧＦのクリングルドメインの最初の２個を含むｈｕＨＧＦ転写の別種スプライシング型に対応する［Ｃｈａｎなど、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５４巻：１３８２〜１３８５頁（１９９１年）；Ｍｉｙａｚａｗａなど、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ.、１９７巻：１５〜２２頁（１９９１年）］。この変異体はＨＧＦ／ＮＫ２と命名され、成熟ｈｕＨＧＦの競合的拮抗剤であると提唱されている。ラットＨＧＦとｈｕＨＧＦとのアミノ酸配列の比較ではこの配列２個は高度に保存されて同一の構造的特性を持つことが示されている。ラットＨＧＦにあるクリングルドメイン４個の長さはｈｕＨＧＦにあるものと正確に同一である。さらにその上、全システイン残基は正確に同一の位置に配置されており、類似の第三次元構造を示唆する［Ｏｋａｊｉｍａなど、前出；Ｔａｓｈｉｒｏなど、前出］。
ＨＧＦ受容体はｃＭｅｔ−プロトオンコジーンの産物と同定されている［Ｂｏｔｔａｒｏなど、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５１巻：８０２〜８０４頁（１９９１年）；Ｎａｌｄｉｎｉなど、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、６巻：５０１〜５０４頁（１９９１年）］。この受容体はｐ１９０METと命名され、１９０ｋＤａのヘテロ二量体（ジスルフィド結合した５０ｋＤａのα−鎖および１４５ｋＤａのβ−鎖）である膜スパンニングしたチロシンキナーゼ蛋白質からなる［Ｐａｒｋなど、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８４巻：６３７９〜６３８３頁（１９８７年）］。ＨＧＦのその受容体への結合活性はその分子の最初のクリングル２個を含むＮ−末端部分の機能ドメインによって伝達される［Ｍａｔｓｕｍｏｔｏなど、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．、１８１巻：６９１〜６９９頁（１９９１年）；Ｈａｒｔｍａｎｎなど、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、８９巻：１１５７４〜１１５７８頁（１９９２年）；Ｌｏｋｋｅｒなど、ＥＭＢＯ・Ｊ．、１１巻：２５０３〜２５１０頁（１９９２年）；ＬｏｋｋｅｒおよびＧｏｄｏｗｓｋｉ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６８巻：１７１４５〜１１７１５０頁（１９９１年）］。ｃ−Ｍｅｔ蛋白質はＨＧＦが結合すると１４５ｋＤａβ−サブユニットのチロジン残基が燐酸化される。ＨＧＦ遺伝子とＨＧＦ受容体遺伝子は共に染色体７の長アームのｑ１１．２〜ｑ２１．１領域内に配置されている［Ｄｅａｎなど、Ｎａｔｕｒｅ、３１８巻：３８５〜３８８頁（１９８５年）；Ｗｅｉｄｎｅｒなど、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８巻：７００１〜７００５頁（１９９１年）；Ｓａｃｃｏｎｅなど、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、１３巻：９１２〜９１４頁（１９９２年）］。
肝不全患者の血漿［Ｇｏｈｄａなど、前出］および実験的に肝損傷を導入した動物の血漿［Ｌｉｎｄｒｏｏｓなど、Ｈｅｐａｔｏｌ．、１３巻：７３４〜７５０頁（１９９１年）］または血清［Ａｓａｍｉなど、、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１０９巻：８〜１３頁（１９９１年）］ではＨＧＦの濃度が増大することが観察されている。この応答の機序は迅速であって肝臓再生の間のＤＮＡ合成の第一段階に先行する。ＨＧＦはまた黒色素胞、尿細管細胞、ケラチノサイト、ある種の内皮細胞および上皮起源の細胞を含むある種の細胞型に対する有糸分裂促進剤であることが証明されている［Ｍａｔｓｕｍｏｔｏなど、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、１７６巻：４５〜５１頁（１９９１年）；Ｉｇａｗａなど、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、１７４巻：８３１〜８３８頁（１９９１年）；Ｈａｎなど、Ｂｉｏｃｈｅｍ．、３０巻：９７６８〜９７８０頁（１９９１年）；Ｒｕｂｉｎなど、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８巻：４１５〜４１９頁（１９９１年）］。ＨＧＦはまた試験管内で上皮細胞および血管上皮細胞の剥離を促進する活性である「散乱因子」としても作用できる［Ｓｔｏｋｅｒなど、Ｎａｔｕｒｅ、３２７巻：２３９〜２４２頁（１９８７年）；Ｗｅｉｄｎｅｒなど、Ｊ．Ｃｅｌｌ・Ｂｉｏｌ．、１１１巻：２０９７〜２１０８頁（１９９０年）；Ｎａｌｄｉｎｉなど、ＥＭＢＯ・Ｊ．、１０巻：２８６７〜２８７８頁（１９９１年）；Ｇｉｏｒｄａｎｏなど、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０巻：６４９〜６５３頁（１９９３年）］。これに加えて最近、ＨＧＦは上皮形態形成剤として記載された［Ｍｏｎｔｅｓａｎｏなど、Ｃｅｌｌ、６７巻：９０１〜９０８頁（１９９１年）］。それ故、ＨＧＦは腫瘍の侵襲においておよび胚の発達において重要であることが仮定されている。慢性ｃ−Ｍｅｔ／ＨＧＦ受容体活性化はある種の悪性腫瘍で観察された［Ｃｏｏｐｅｒなど、ＥＭＢＯ・Ｊ．、５巻：２６２３頁（１９８６年）；Ｇｉｏｒｄａｎｏなど、Ｎａｔｕｒｅ、３３９巻：１５５頁（１９８９年）］。
ＨＧＦおよびＨＧＦ変異体はさらに米国特許第５２２７１５８号、第５３１６９２１号、および第５３２８８３７号にも記載されている。
２．マクロファージ刺激蛋白質
ＨＧＦに関係する蛋白質が最近確認された。この蛋白質は、ＨＧＦ様［Ｈａｎなど、前出；Ｄｅｇｅｎなど、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３０巻：９７８１頁（１９９１年）；Ｓｈｉｍａｍｏｔｏなど、ＦＥＢＳ、３３３巻：６１〜６６頁（１９９３年）］またはマクロファージ刺激蛋白質（「ＭＳＰ」）［Ｌｅｏｎａｒｄなど、米国特許第５２１９９９１号；Ｓｋｅｅｌなど、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７３巻：１２２７〜１２３４頁（１９９１年）；Ｌｅｏｎａｒｄなど、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ・Ｒｅｓ．、１１４巻：１１７〜１２６頁（１９７８年）；Ｙｏｓｈｉｍｕｒａなど、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６８巻：１５４６１〜１５４６８頁（１９９３年）］と命名され、ＨＧＦとはクリングル構造全部で４個を共有する。
ＭＳＰをコードするｃＤＮＡも確認されている。この蛋白質はクリングルドメイン４個とそれに続いてセリンプロテアーゼドメインを有しＨＧＦと類似のドメイン構造を含むと思われる。ＭＳＰは５３ｋＤａのα−鎖および２５ｋＤａのβ−鎖を含むヘテロ二量体である。しかしながら、ＭＳＰは単鎖の前駆体として分泌される［Ｙｏｓｈｉｍｕｒａなど、前出］。ＨＧＦ前駆体［Ｎａｌｄｉｎｉなど、ＥＭＢＯ・Ｊ．、１１巻：４８２５〜４８３３頁（１９９２年）］と同様に現在ではＭＳＰの生物学的に活性なα−β−ヘテロ二量体への成熟は血清依存性の蛋白質分解的切断によって達成されると信じられている［Ｗａｎｇなど、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６９巻：３４３６〜３４４０頁（１９９４年）；Ｗａｎｇなど、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６９巻：１４０２７〜１４０３１頁（１９９４年）］。Ｗａｎｇなど、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６９巻：１３８０６〜１３８１０頁（１９９４年）は、たとえば血清カリクレイン、第ＸＩＩａ因子、γ−神経栄養因子および表皮性増殖因子結合蛋白質のようなある種のプロテアーゼはプロ−ＭＳＰをα−β−ヘテロ二量体にまで切断し、活性化することを報告している。
ＭＳＰは「ｐ１８５RON」または「ＲＯＮ」と命名されたヘテロ二量体膜貫通グリコプロテインからなる受容体に結合して、活性化することが見出されている［Ｇａｕｄｉｎｏなど、ＥＭＢＯ・Ｊ．、１３巻：３５２４〜３５３２頁（１９９４年）；Ｗａｎｇなど、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６６巻：１１７頁（１９９４年１０月７日）］。このグリコプロテインはジスルフィド結合によって結合された鎖２本：β（１５０ｋＤａ）およびα（３５ｋＤａ）を持つ。ｐ１８５RONは単鎖前駆体（ｐｒ１７０RON）として合成され、これが続いて蛋白質分解的切断により成熟したヘテロ二量体型に変換される。プロセッシングされていない単鎖前駆蛋白質と異なり、この蛋白質のヘテロ二量体型は細胞表面まで送達される。
ＲＯＮをコードする蛋白質配列はＲｏｎｓｉｎなど、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、８巻：１１９５〜１２０２頁（１９９３年）が記載したヒトのケラチノサイトｃＤＮＡライブラリーからクローニングされたｃＤＮＡから誘導された。このＲＯＮのｃＤＮＡは１４００アミノ酸の蛋白質をコードするが、これは構造的にＨＧＦの受容体と全体的な類似性を共有し、触媒ドメインでは約６３％の配列同一性を持つ。ＭＳＰの遺伝子およびＲＯＮ受容体の遺伝子は共に染色体３ｐ２．１［Ｈａｎなど、前出；Ｒｏｎｓｉｎなど、前出］地図に配置されている。
ＲＯＮ受容体は主として上皮起源の細胞上および単球中に発現される。ｐ１８５RONはまた固有のチロジンキナーゼ活性を有しており、これはＭＳＰおよびＭＳＰ融合プロテインであるＭＳＰ−ＮＫ２によって刺激される［Ｇａｕｄｉｎｏなど、前出］。しかしながら、このチロジンキナーゼ活性はＨＧＦ［同］によっては刺激を受けない。この交差反応性の不在はさらにＭＳＰは、ＨＧＦ受容体であるｐ１９０MET［同］に結合して活性化することができないことによって証明された。
ＭＳＰをコードするｍＲＮＡは主に肝臓中で発現される。それは肺臓、副腎および胎盤中にも低濃度で発現される。現在までに体内でのＭＳＰの生理学的役割は完全には判明していない。血清ＭＳＰは２４時間以内には静脈内リポポリサッカライドに反応して増加することはなく、ＭＳＰは急性相蛋白質であるとは思えないことを示す［Ｗａｎｇなど、Ｊ．Ｌｅｕｋ．Ｂｉｏｌ．、５４巻：２８９〜２９５頁（１９９３年）］。Ｙｏｓｈｉｍｕｒａなど、前出、はマクロファージ中でＭＳＰがＣ５ａに対する化学走性的応答を刺激すると報告している。Ｌｅｏｎａｒｄなどは、米国特許第５２１９９９１号に高度に精製したＭＳＰの病原性感染症の処置のための使用を開示している。
３．巨核球および血小板の生産
哺乳類の骨髄に一次的に見出される多能幹細胞は末梢血内で循環している様々な型の血球を生産する潜在能力を有する［Ｄｅｘｔｅｒなど、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ・Ｂｉｏｌ．、３巻：４２３〜４４１頁（１９８７年）］。多能幹細胞は成熟段階を経て種々の血球系統に分化した明確な血球型を生産する。骨髄中で分化した血球系統の一つは巨核球系統である。
巨核球の形成および血小板生産の制御はＭａｚｕｒ、Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔ．、１５巻：２４８頁（１９８７年）およびＨｏｆｆｍａｎ、Ｂｌｏｏｄ、７４巻：１１９６〜１２１２頁（１９８９年）に綜説がされている。巨核球の始原細胞の少なくとも３種が確認されている：（１）バースト形成ユニット巨核球（ＢＦＵ−ＭＫ）；（２）コロニー形成ユニット巨核球（ＣＦＵ−ＭＫ）；および低密度巨核球始原細胞（ＬＤ−ＣＦＵ−ＭＫ）。巨核球の成熟も標準的な形態学的判断基準に基づいて数段階に分類されている。最先の認識できる細胞は巨核芽球である。細胞の中間型はプロ巨核球または好塩基性巨核球と命名されている。細胞の最後の型は成熟（好酸性、顆粒性または血小板形成）巨核球として呼称される。成熟巨核球は原形質のフィラメントをシヌソイド空隙に伸長して、そこで、個別の血小板または「プレートレット」に解離し、断片化する。［Ｗｉｌｌｉａｍｓなど、「血液学（Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ）」、第１版、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ社、ニューヨーク、ニューヨーク（１９７２年）］。
巨核球の形成は数種の制御因子が関与すると信じられている［Ｗｉｌｌｉａｍｓなど、Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．、５２巻：１７３頁（１９８２年）；Ｗｉｌｌｉａｍｓなど、Ｊ．Ｃｅｌｌ・Ｐｈｙｓ．、１１０巻：１０１頁（１９８２年）］。巨核球形成の初期は有糸分裂であって、一次的に細胞増殖およびＣＦＵ−ＭＫからのコロニー始動を含むが、しかし血小板のカウントには影響されないと信じられる［Ｂｕｒｓｔｅｉｎなど、Ｊ．Ｃｅｌｌ・Ｐｈｙｓ．、１０９巻：３３３頁（１９８１年）；Ｋｉｍｕｒａなど、Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．、１３巻：１０４８頁（１９８５年）］。成熟の後期は一次的に非有糸分裂であり、核の倍数体化と原形質の成熟とを含む［Ｏｄｅｌｌなど、Ｂｌｏｏｄ、４８巻：７６５頁（１９７６年）；Ｅｂｂｅなど、Ｂｌｏｏｄ、３２巻：７８７頁（１９６８年）］。
血小板は一般に血液中で循環し、血液凝固および傷害に対する体の反応に重要な役割を演じている。血小板の循環血中濃度の減少は様々な病理学的状況および治療に由来できる。血小板減少症は、例えば、骨髄による血小板生産の減損、脾臓における血小板隔離、および放射線または化学療法による血小板の破壊増進に由来できる。大量な血液製剤の急速な投与を受けている患者は血液の希釈に基づく血小板減少症が進行することもある。血小板減少性疾患はさらにＳｃｈａｆｎｅｒ、「血小板減少症および血小板機能の疾患（Ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉａ・ａｎｄ・Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ・ｏｆ・Ｐｌａｔｅｌｅｔ・Ｆｕｎｃｔｉｏｎ）」、Ｉｎｔｅｒｎａｌ・Ｍｅｄｉｃｉｎｅ社、第３版、Ｈｕｔｔｏｎなど編（１９９０年）に記載されている。
ある種のサイトカインと増殖因子とは血小板の生産および巨核球の増殖を誘導することが確認されている。巨核球刺激活性（ＭＫ−ＣＳＡ）を持つと報告されているサイトカインにはインターロイキン−３（ＩＬ−３）［Ｗｉｌｌｉａｍｓなど、Ｌｅｕｋｅｍｉａ・Ｒｅｓ．、９巻：１４８７〜１４９１頁（１９８５年）］、インターロイキン−６（ＩＬ−６）［Ｂｒｕｎｏなど、Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔ．、１７巻：１０３８〜１０４３頁（１９８９年）］、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）［Ｉｓｈｉｂａｓｈｉなど、Ｂｌｏｏｄ、７５巻：１４３３〜１４３８頁（１９９０年）］、インターロイキン−１１（ＩＬ−１１）［Ｘｕなど、Ｂｌｏｏｄ、８３巻：２０２３〜２０３０頁（１９９４年）］、エリトロポイエチン（Ｅｐｏ）［Ｓａｋａｇｕｃｈｉなど、Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔ．、１５巻：１０２３〜１０３４頁（１９８７年）］、およびインターロイキン−１２（ＩＬ−１２）［Ｗａｌｄｂｕｒｇｅｒなど、Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔ．、２２巻：４９７ａ頁（１９９４年）（補）］を包含する。その他のサイトカインをＭＫ−ＣＳＡを有することが確認された増殖因子と混合した時には血小板の発達を調整すると報告されている。これらのサイトカインには、ＩＬ−１α［Ｇｏｒｄｏｎなど、Ｂｌｏｏｄ、８０巻：３０２〜３０７頁（１９９２年）］および白血病阻止因子（ＬＩＦ）［Ｍｅｔｃａｌｆなど、「巨核球および血小板の形成に及ぼす白血病阻止因子の作用］、ＣＩＢＡ基金シンポジウム集］を包含する。ｃＭｐｌリガンドも巨核球の形成および血小板の形成の刺激剤であると報告されている［ｄｅ・Ｓａｕｖａｇｅなど、Ｎａｔｕｒｅ、３６９巻：５３３〜５３８頁（１９９４年）；Ｌｏｋなど、Ｎａｔｕｒｅ、３６９巻：５６５〜５６８頁（１９９４年）；Ｋａｕｓｈａｎｓｋｙなど、Ｎａｔｕｒｅ、３６９巻：５６８〜５７１頁（１９９４年）］。さらに、血小板の形成を刺激すると報告されている合成蛋白質の一つはＰＩＸＹ３２１である［ｖａｎ・ｄｅ・Ｖｅｎなど、Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．、２０巻：７４３〜７５１頁（１９９２年）；Ｗｉｌｌｉａｍｓなど、Ｂｌｏｏｄ、８２巻：３６６ａ頁（１９９３年）（補）；Ｃｏｌｌｉｎｓなど、Ｂｌｏｏｄ、８２巻：３６６ａ頁（１９９３年）（補）］。ＰＩＸＹ３２１は合成ペプチド鎖によって結合されたＧＭ−ＣＳＦとＩＬ−３とから構成される融合蛋白質である［Ｗｉｌｌｉａｍｓなど、Ｃａｎｃｅｒ、６７巻：２７０５〜２７０７頁（１９９１年）］。
ＩＬ−３は原理的に血小板形成の過程の分化（最先）相に影響を与えると信じられる［Ｍｏｏｒｅなど、Ｂｌｏｏｄ、７８巻：１頁（１９９１年）；Ｓｏｎｏｄａなど、、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５巻：４３６０頁（１９８８年）］。ＩＬ−６はマウスおよび霊長類モデルで巨核球始原細胞の増殖ならびに成熟を誘導することが証明されているが、一部の研究者はＩＬ−６は細胞の成熟にのみ影響を与えるとの観察をしている。ＩＬ−３とＩＬ−６との間の相互作用は現在不明確であるが、いくつかの報告ではマウスのＩＬ−６に対する抗体がマウスＩＬ−３のＭＫ−ＣＳＡを排除することが発見されたので、ＩＬ−３のＭＫ−ＣＳＡはＩＬ−６が仲介していると指摘している［Ｌｏｔｅｍなど、Ｂｌｏｏｄ、７４巻：１５４５〜１５５１頁（１９８９年）］。その他の研究者はＩＬ−６単独の中和抗体は形成不能性患者から調製した血清のＭＫ−ＣＳＡを減少させないことを報告し、巨核球の形成におけるＩＬ−６の重大な役割を低く評価している。それにもかかわらず、多数の研究は致死量の放射能を受けた動物に投与した時のＩＬ−６の刺激効果を証明している［Ｂｕｒｓｔｅｉｎなど、Ｂｌｏｏｄ、８０巻：４２０〜４２８頁（１９９２年）；Ｈｅｒｏｄｉｎなど、Ｂｌｏｏｄ、８０巻：６８〜７４頁（１９９２年）］。
転移肉腫および肺癌のための化学療法剤を高用量投与されている患者では、ＩＬ−６は血小板数の減少を削減し、ベースライン水準への回復を促進した［Ｄｅｍｅｔｒｉなど、Ｂｌｏｏｄ、８２巻：３６７ａ頁（１９９３年）（補）；Ｃｒａｗｆｏｒｄなど、Ｂｌｏｏｄ、８２巻：３６７ａ頁（１９９３年）（補）］。ＩＬ−６で処置した自家骨髄移植のレシピエントはマッチした対照よりも循環血小板の比較的迅速な回復と短期な血小板注入依存性を経験することが報告されている。
生体内および試験管内で血小板の生産を刺激することのできる分子を確認することが本発明の目的である。
生体内および試験管内で巨核球の成熟を刺激することのできる分子を確認することが本発明の他の目的である。
現存するか、または予想される循環血小板の低下によって特徴付けられる生理学的な条件の処置における使用のために医薬的に許容される担体中でその分子を提供することが本発明の他の目的である。
血小板の生産および巨核球の成熟を刺激する目的のために採用できる製造物またはキットにおけるその分子を提供することが本発明のさらに別の目的である。
本発明のこれらおよびその他の目的は本明細書全体を考慮すれば当技術分野における通常の熟練者には明確になるものである。
発明の要約
従って、本発明の態様の一つではマクロファージ刺激蛋白質を使用して血小板の生産を刺激する方法を提供する。
本発明のその他の態様では巨核球の成熟のための方法を提供する。
本発明のさらに別の態様ではマクロファージ刺激プロテインを含有する製造物およびキットを提供する。このマクロファージ刺激蛋白質は巨核球の成熟および血小板の生産のための活性成分としてのマクロファージ刺激蛋白質を確認するラベルを持つ容器に入れて提供される。
血液中の血小板濃度低下は個体の健康を危険にさらすことがある。発明の背景の欄で検討したように、危険な程に低下した血液中の血小板濃度は種々の病原的状況ならびに化学療法および放射線照射の結果かもしれない。本出願人は驚くべきことにマクロファージ刺激蛋白質が巨核球の成熟および血小板の生産を刺激するために有用であることを発見した。本発明のマクロファージ刺激蛋白質は試験管内および生体内で採用できる。生体内での使用にはマクロファージ刺激蛋白質は血小板減少症のような造血器官の疾患に悩む個体のための治療的療法剤として投与できる。このマクロファージ刺激蛋白質は放射線および／または化学療法を受けているか、またはこれから受けようとしている個体のための予防的な療法剤としても投与できる。
好適な態様の詳細な記載
１．定義
ここに使用する用語「マクロファージ刺激プロテイン」および「ＭＳＰ」は増殖因子の一つを示し、この増殖因子は典型的にはクリングルドメイン４個を含む構造を持つ。この用語「マクロファージ刺激蛋白質」および「ＭＳＰ」は天然起源から精製されたか、化学的に合成されたか、または組換え的に製造されたか、のいずれかのこのプロテインの成熟、プレ、プレプロ、およびプロ型を示す。マクロファージ刺激蛋白質は単鎖型またはヘテロ二量体型をとりうる。本定義は特にＹｏｓｈｉｍｕｒａなど、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６８巻：１５４６１〜１５４６８頁（１９９３年）（ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ／ＤＤＢＪから受理番号Ｌ１１９２４の下に入手でき、このヌクレオチドおよびアミノ酸配列は本明細書中の配列リストにもおのおの配列番号１および配列番号２として提示する）が記載した配列がコードするマクロファージ刺激蛋白質を包含する。本明細書で「ＭＳＰ−ＮＫ２」と記載するヒトＩｇＧ−γ１重鎖のＣ末端領域と融合したマクロファージ刺激プロテインのＮ−末端領域（最初のクリングルドメイン２個）を含む融合蛋白質も特に本定義内に包含する。マクロファージ刺激蛋白質の断片には本明細書中に記載するマクロファージ刺激蛋白質と同じ活性を持つものがあり、そのような活性を有する断片の使用は本発明の範囲内にあると考える。
用語「アミノ酸」および「複数のアミノ酸」は全ての天然起源Ｌ−α−アミノ酸を示す。この定義はノルロイシン、オルニチン、およびホモシステインを包含するものである。これらのアミノ酸は１字表記か３字表記かのいずれかによって記載される：
Ａｓｐ  Ｄ  アスパラギン酸  Ｉｌｅ  Ｉ  イソロイシン
Ｔｈｒ  Ｔ  トレオニン  Ｌｅｕ  Ｌ  ロイシン
Ｓｅｒ  Ｓ  セリン  Ｔｙｒ  Ｙ  チロジン
Ｇｌｕ  Ｅ  グルタミン酸  Ｐｈｅ  Ｆ  フェニルアラニン
Ｐｒｏ  Ｐ  プロリン  Ｈｉｓ  Ｈ  ヒスチジン
Ｇｌｙ  Ｇ  グリシン  Ｌｙｓ  Ｋ  リジン
Ａｌａ  Ａ  アラニン  Ａｒｇ  Ｒ  アルギニン
Ｃｙｓ  Ｃ  システイン  Ｔｒｐ  Ｗ  トリプトファン
Ｖａｌ  Ｖ  バリン  Ｇｌｎ  Ｑ  グルタミン
Ｍｅｔ  Ｍ  メチオニン  Ａｓｐ  Ｎ  アスパラギン
用語「巨核球の成熟」は巨核芽細胞およびプロ巨核球または好塩基性巨核球の成熟した血小板産生細胞への分化を含む過程を示す。巨核球の成熟は典型的には、たとえば膜の倍数性および分画のような細胞の変化を伴い、例えば倍数性分析および顕微鏡的分析によって観察し、定量化できる。
用語「血小板減少症」は典型的には約１５０×１０9個／リットル血液以下の血小板レベルによって特徴付けられる生理学的状況を示す。
用語「処置すること」、「処置」、および「治療」は治療的処置、予防的処置および防止的処置を示す。
用語「哺乳類」はヒト、ウシ、ウマ、イヌ、およびネコを含む哺乳類に分類される哺乳類のいずれをも示す。本発明の好適な態様では、この哺乳類はヒトである。
２．本発明の方法および組成物
本発明は以後「ＭＳＰ」として示すマクロファージ刺激プロテインを使用して巨核球の成熟および血小板の生産を刺激する方法を提供する。本発明の実施に有用なＭＳＰは多数の方法によって製造できる。例えば、このＭＳＰはＭＳＰの単離型または精製型を使用して製造できる。天然起源からＭＳＰを単離および精製する方法は当技術分野では知られており、例えばＳｋｅｅｌなど、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７３巻：１２２７〜１２３４頁（１９９１年）およびＬｅｏｎａｒｄなど、米国特許第５２１９９９１号に記載されている。このような単離法および精製法は血清または血漿からＭＳＰを得るために採用できる。これとは別に、ＭＳＰは化学的に合成でき、および当技術分野で知られており、下記実施例１、２および３にさらに詳記する組換えＤＮＡ技術を使用しても製造できる。
このＭＳＰはヒトからまたはいずれかの非ヒト種からのものであってもよい。例えば、哺乳類に別の哺乳類種からのＭＳＰを投与することもありうる（たとえばマウスをヒトＭＳＰで処置できる）。マウスＭＳＰおよびヒトＭＳＰの間にはかなりの相同性（アミノ酸同一性約８１％）が存在するので、別種の哺乳類からのＭＳＰを採用できることが期待される。しかしながら、ＭＳＰに対する潜在的免疫反応を回避するため哺乳類を相同的ＭＳＰで処置するのが好ましい（たとえばヒトをヒトＭＳＰで処置する）。
本発明は生体内および試験管内における巨核球の成熟および血小板の生産方法を包含する。試験管内で巨核球の成熟を刺激するための本発明の方法に従えば、巨核芽細胞、プロ巨核球および／または塩基性巨核球を含有すると推定される骨髄細胞または細胞試料を取り、細胞培養培地に入れる。次にこれらの細胞を有効量のＭＳＰの存在下に培養する。
適当な組織培養培地は当技術分野における熟練者にはよく知られており、これに限定するものではないが、最小必須培地（「ＭＥＭ」）、ＲＰＭＩ−１６４０およびダルベッコの修正イーグル培地（「ＤＭＥＭ」）を包含する。これら組織培養培地はＳｉｇｍａ・Ｃｈｅｍｉｃａｌ社（セントルイス、ＭＯ）およびＧＩＢＣＯ社（グランドアイランド、ＮＹ）から商業的に入手できる。次に細胞が生存し、増殖するために十分な条件下にこれら細胞を細胞培養培地中で培養する。細胞は、クロット、寒天または液体培地中での培養を包含する種々の方法によって培養できる。
これらの細胞は有効量のＭＳＰの存在下に培養される。ＭＳＰの量は変動しうるが、しかし、約１０ｎｇ／ｍＬから約１００ｎｇ／ｍＬの範囲内が好ましい。このＭＳＰには勿論当業者が過重な実験なしに実験的に決定する用量を培地に添加できる。培地中のＭＳＰ濃度は、たとえば細胞およびＭＳＰを培養する条件のような種々の因子に依存するものである。特定の温度およびインキュベーション時間、ならびにその他の培養条件は、たとえばＭＳＰ濃度および細胞および培地の型のような因子に依存して変化できる。当技術分野の熟練者は操作および最適培養条件を過大な実験なしに決定できるものである。培地中の巨核球の成熟は、たとえばＷｉｌｌｉａｍｓなど、Ｌｅｕｋｅｍｉａ・Ｒｅｓ．、９巻：１４８７〜１４９１頁（１９８５年）；Ｂｒｕｎｏなど、Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．、１７巻：１０３８〜１０４３頁（１９８９年）；Ｉｓｈｉｂａｓｈｉなど、Ｂｌｏｏｄ、７５巻：１４３３〜１４３８頁（１９９０年）；Ｘｕなど、Ｂｌｏｏｄ、８３巻：２０２３〜２０３０頁（１９９４年）；Ｓａｋａｇｕｃｈｉなど、Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．、１５巻：１０２３〜１０３４頁（１９８７年）］のような当技術分野で知られる種々の検定によって測定できる。
試験管内で巨核球の成熟を刺激するためにＭＳＰを使用することは種々の目的において有用であることが企図されている。例えば、試験管内でＭＳＰの存在下に培養された巨核球を血小板形成細胞レベルが低下した哺乳類に注入できる。
本発明の方法に従えば、哺乳類における巨核球の成熟および血小板の生産を刺激するためにはその哺乳類に有効量のＭＳＰを投与する。哺乳類に血小板の血中レベルに悪影響を与えることのある、たとえば高用量の放射線または化学的療法のような治療を施した時またはその後にＭＳＰを投与することを企図している。ＭＳＰはまた血中血小板濃度の減少を回避するために予防的にも投与しうる。
このＭＳＰは医薬的に許容される担体の中で哺乳類に投与するのが好ましい。適当な担体およびその製剤は「レミントンの医薬品科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ・Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ・Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」、第１６版、１９８０年、Ｍａｃｋ・Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ社、Ｏｓｌｏなど編、に記載がある。この発明を実行するため使用するＭＳＰの臨床的投与のために殊によく適合している組成物は無菌水溶液または、たとえば凍結乾燥した蛋白質のような無菌の水和性粉剤を包含する。典型的には、製剤を等張性にするために適切な量の医薬的に許容される塩も使用する。医薬的に許容される担体の例には食塩水、リンゲル液およびデキストロース溶液を包含する。たとえば投与経路および投与するＭＳＰの濃度などに依存して、ある種の担体がより好適になりうることは当分野の熟練者には明白なこととなろう。このＭＳＰは哺乳類に注射（たとえば、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内など）または、たとえば活性な型の血流中への送達を確実にする点滴のようなその他の方法によって投与するのが好ましい。
ＭＳＰの有効量および投与計画は実験的に決定しうるが、そのような決定をすることは当分野の熟練の範囲内にある。用量の異種間スケール交換は当技術分野で知られている方法、たとえばＭｏｒｄｅｎｔｉなど、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ．Ｒｅｓ．、８巻：１３５１頁（１９９１年）に開示されているようにして、実行できる。投与すべきＭＳＰの用量は、例えばＭＳＰを投与される哺乳類、血小板水準低下の原因であると信じられる医学的状況または治療の性質、血球生産組織の損傷の程度、投与経路、およびその哺乳類に投与されている他種薬剤の同一性などに依存して変化するものであることは当技術分野での熟練者の理解する所である。またＭＳＰの用量を１回以上投与する必要がありうることも理解される。一般にＭＳＰの多回用量が投与のためには必要となろう。ＭＳＰの投与はその哺乳類における血小板が許容水準に達するまで継続すべきである。
本発明はまた哺乳類において、血小板減少症を処置する方法も提供する。この方法ではその哺乳類がまず血小板減少症であることを診断する。この診断の実行は当技術分野の熟練の範囲内にある。当技術分野の熟練者はまた様々な血小板水準が異なる哺乳類種について血小板減少症の診断を保証しうることも認識するであろう。この診断はヒトでは通常血小板レベルが約１５０×１０9個／Ｌ血液以下に落ちた時に行われる。血小板減少症は血小板または血小板生産細胞の生産、分布または破壊にある異常の結果であることがある。血小板減少症を処置するためには、前記した投与の様式と計画に従ってＭＳＰをその哺乳類に投与する。
前記方法において、ＭＳＰは生物学的または化学的に活性な薬剤１種またはそれ以上と結合して投与できる。好ましくは、そのような薬剤は巨核球の形成または血小板の形成作用を持つ。現在では、例えばＭＳＰはｃＭｐｌリガンドまたはトロンボポイエチン［ｄｅ・Ｓａｕｖａｇｅなど、前出；Ｌｏｋなど、前出；Ｋａｕｓｈａｎｓｋｙなど、前出］、ＩＬ−３、ＧＭ−ＣＳＦ、またはＬＩＦと組合せて投与できると信じられている。熟練した医師は本発明のためにＭＳＰをこれら薬剤のいずれかと混用する時は、有用な各薬剤の通常の用量を削減した適切な用量を決定できる。このＭＳＰは他の薬剤と同一の製剤中で投与できるし、またはＭＳＰとその他の薬剤とは別に投与することもできる。その他の薬剤もその特定の薬剤に適当な様式、経路および計画に従って投与される。
巨核球の成熟および血小板の生産は種々の方法で測定し、監視できる。例えば成熟と血小板の生産は試験管内検定法を使用して測定できる。巨核球始原細胞検定法は当技術分野では知られており、例えばＴａｎａｋａなど、Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．、７３巻：１８頁（１９８９年）に記載のように細胞をメチルセルロース中で培養することによって実行できる。単細胞増殖検定法はＷｉｌｌｉａｍｓなど、Ｃｅｌｌ・Ｔｉｓｓｕｅ・Ｋｉｎｅｔｉｃｓ、１５巻：４８３頁（１９８２年）；Ｂａｎｕなど、Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．、７５巻：３１３頁（１９９０年）；Ｏｏｎなど、Ｌｅｕｋｅｍｉａ・Ｒｅｓ．、１０巻：４０３頁（１９８６年）；Ｓｐａｒｒｏｗなど、Ｌｅｕｋｅｍｉａ・Ｒｅｓ．、１１巻：３１頁（１９８７年）に記載のようにして実行できる。
成熟および血小板の生産は末梢血または骨髄の分析によっても監視できる。循環血中の血小板水準は細胞計数分析により決定できる。セルカウント分析は生存細胞をトリパンブルー排除によって計数することによって実行することもある。細胞は形態学的に検査することもできる。例えば、骨髄試料を哺乳類から採取し、当技術分野で知られている標準的な組織学的技術を使用して顕微鏡検査のために準備する。細胞を染色することによって、その骨髄試料中にある巨核球のサイズ、細胞の特徴、および数を観察できる。
本発明はさらに巨核球の成熟および血小板の生産を刺激するために有用な物質を含有する製造物およびキットを提供する。製造物にはラベルを有する容器を含む。適当な容器には、例えばビン、バイアルおよび試験管を包含する。これら容器は、たとえばガラスまたはプラスチックのような各種の材料から成形しうる。この容器には巨核球の成熟および血小板の生産を刺激するために有効な組成物を入れてある。この組成物中の活性薬剤はＭＳＰである。その容器のラベルには、その組成物が巨核球の成熟および血小板の生産を刺激するために使用されることを指摘し、また前記のような生体内または試験管内のいずれかでの使用に対する指示を記載してあってもよい。
本発明のキットは前記容器および緩衝液を入れた第二の容器を含む。これにはさらに、別の緩衝液、希釈剤、フィルター、注射針、注射筒、および使用のための指示を記載した包装挿入物を含む、商業的視点および使用者の視点から望ましいその他の材料も包含しうる。本発明は次の実施例を参照することによって、さらに完全に理解することとなろう。それら実施例がしかしながら本発明の範囲を限定すると解釈すべきでない。本明細書に記載の引用文献は参考のために記載したものである。
実施例
実施例１：ＭＳＰの組換え生産
全長ＭＳＰをコードするｃＤＮＡはＭＳＰのアミノ酸１〜３４０をコードするｃＤＮＡ（クローン５’−ＭＳＰ）と３４１〜７１１（クローン３’ＭＳＰ）をコードするｃＤＮＡとを結合して構築できる（Ｙｏｓｈｉｍｕｒａなど、前出、が報告した番号付けを使用）。これらのｃＤＮＡはヒトの肝臓からのｃＤＮＡのＰＣＲ増幅によって単離できる（１９８７年７月２８日発行の米国特許第４６８３１９５号および「分子生物学における最新プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ・Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ・ｉｎ・Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ・Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、Ａｕｓｂｅｌなど編、Ｇｒｅｅｎｅ・Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ社およびＷｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ社、１９９１年、２巻：第１５章に記載のようにして）。ランダムヘキサマーおよびオリゴｄＴの混合物を使用する、Ｍ−ＭＬＶ−ＲＴ（英国のＢＲＬ社から商業的に購入できる）を用いる逆転写（ＲＴ）のための鋳型としてヒト全肝臓ＲＮＡ（１０μｇ）を使用する。５’−ＭＳＰクローンを得るために１０μＬのＲＴ反応混合物を含有する１００μＬ容中で１ＵのＶｅｎｔＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ・Ｅｎｇｌａｎｄ・Ｂｉｏｌａｂｓ社から商業的に入手できる）および各５０ピコモルの正方向プライマー：ＣＡＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＣＡＧＣＣＡＧＡＡ（配列番号３）および逆方向プライマー：ＣＴＧＴＡＣＡＡＣＧＣＣＧＧＡＴＣＴＧＧＴＡＧ（配列番号４）を使用するＰＣＲ反応を実行する。変性（９５℃、１分間）、アニーリング（５５℃、４５秒）および伸長（７２℃、２分間）を３０サイクルの後、ＰＣＲ反応物の２μＬをネステド（入れ子状にした）正方向プライマー：ＡＧＧＡＣＧＡＡＴＣＣＡＣＣＡＴＧＧＧＧＴＧＧＣＴＣＣＣＡＣＴＣＣＴＧＣＴＧＣＴＴＣＴＧＡＣＴ（配列番号５）およびネステド逆方向プライマー：ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＧＡＡＣＴＴＣＴＧＣＣＧＧＡＡＣＣＣＣＧＡＣ（配列番号６）で再増幅する。クローン３’ＭＳＰを得るためには正方向プライマー：ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＧＡＡＣＴＴＣＴＧＣＣＧＧＡＡＣＣＣＣＧＡＣ（配列番号７）および逆方向プライマー：ＡＣＧＧＡＡＴＴＣＣＣＡＡＧＧＣＡＴＡＴＧＧＣＡＴＣＡＡＧＧＣＴ（配列番号８）を使用する。ＰＣＲ生成物をＥｃｏＲＩ制限酵素（Ｎｅｗ・Ｅｎｇｌａｎｄ・Ｂｉｏｌａｂｓ社から商業的に入手できる）で消化し、精製したのち、ベクターｐＲＫ７（８／１７／８８付与の欧州特許第２７８７７６号）にクローニングする。別々のＰＣＲ反応で増幅した挿入物の配列を次にジデオキシヌクレオチド配列決定法によって決定する。このｃＤＮＡはＹｏｓｈｉｍｕｒａなど、前出、に記載の技術を使用して発現し、精製できる。
実施例２：ＭＳＰ／ＮＫ２融合蛋白質の組換え製造
ＭＳＰのＮ−末端２６８アミノ酸を含む部分的ｃＤＮＡ［Ｙｏｓｈｉｍｕｒａなど、前出、が報告した番号付けを使用］をヒトのＩｇＧガンマ１重鎖の配列に融合する［Ｂｅｎｎｅｔｔなど、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６６巻：２３０６０〜２３０６７頁（１９９１年）］。これはＭＳＰ中の独特なＢａｍＨＩ部位を介してＭＳＰ配列をヒトのＩｇＧ−ガンマ重鎖ｃＤＮＡ［前記］中のＢｓｔＥＩＩ部位に結合するために合成した相補性オリゴヌクレオチド：ＧＡＴＣＣＧＣＡＧＡＴＣＧＡＧＣＧＡＧＡＡＴＴＣＴＧＴＡＣＣＴＧＣＣＧＣＧＧＴＧＣＧＡＧＡＣＧ（配列番号９）および：ＧＴＧＡＣＣＧＴＣＴＣＧＣＡＣＣＧＣＧＧＣＡＧＧＴＣＡＣＡＧＡＡＴＴＣＴＣＧＣＴＣＧＡＴＣＴＧＣＧ（配列番号１０）を使用して達成できる。得られた構築物はＭＳＰのアミノ酸１〜２６８のコード配列、アミノ酸Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、およびＴｈｒをコードするするリンカー配列およびこれに続いてヒトのＩｇＧ−ガンマ１重鎖のアミノ酸２１６〜４４３のコード配列を含有する。
このＭＳＰ／ＮＫ２をコードするｃＤＮＡはＥＢＶ−由来の発現プラスミドであるｐＣＩＳ．ＥＢＯＮ［米国特許第５３２８８３７号］に挿入し、２９３細胞［ヒト胎児腎細胞系統、Ｃｒａｈａｍなど、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．、３６巻：５９頁（１９７７年）］中にＣａｃｈｉａｎｅｓなど、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１５巻：２５５〜２５９頁（１９９３年）に記載された操作を使用して挿入できる。ＭＳＰ／ＮＫ２の精製のために、ＭＳＰ／ＮＫ２を発現する２９３細胞からの血清不含調整培地を無菌濾過し、クエン酸緩衝液（ｐＨ６）を添加して最終濃度１００ｍＭ−クエン酸とする。精製操作は全て４℃で実行する。濾過した培地を次に１００ｍＭ−クエン酸、ｐＨ６と平衡しておいたＨｉＴｒａｐTMプロテインＡカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ・ＬＫＢ社、ピスカタウエー、ＮＪ）上に負荷する。結合した蛋白質を１００ｍＭ−クエン酸、ｐＨ６、３．５Ｍ−ＭｇＣｌ2、２％（ｖ／ｖ）グリセリンで溶離する。各画分をあらかじめ燐酸塩緩衝食塩水と平衡しておいたＰＤ−１０カラム（Ｓｅｐｈａｄｅｘ・Ｇ−２５）に直ちに通して緩衝液交換をする。次にこの画分を集めて濃縮する。蛋白質濃度は抗ヒトＦｃ・ＥＬＩＳＡによって（例えば、米国特許第５３１６９２１号および第５３２８８３７号参照）およびアミノ酸の全加水分解によって決定できる。精製したＭＳＰ／ＮＫのＮＨ2−末端配列は蛋白質配列決定法によって確認できる。蛋白質の純度および均一性はＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの銀染色により、ならびにヒトＩｇＧ１のＦｃ領域に対して指向する抗体を使用するウエスタンブロティングによって、評価できる。
実施例３：ヒトの巨核球細胞系統の成熟に及ぼすＭＳＰの効果
ヒトの巨核球細胞系統を試験管内でおのおの下記のＡ節およびＢ節に記載するようにして製造したＭＳＰおよび組換えｈｕＨＧＦを含有する種々の濃度の調整培地に対する反応について分析した。
Ａ．ＭＳＰを含有する調整培地の製造
ＭＳＰをコードするｃＤＮＡを実施例１記載の通りに製造した。このＭＳＰの配列はＹｏｓｈｉｍｕｒａなど、前出、に報告されているヒトのＭＳＰの配列と同一であった。このｃＤＮＡを発現プラスミドｐＣＩＳ．ＥＢＯＮ（実施例２に記載）中に挿入し、これらのプラスミドを含有する２９３細胞の安定な集団（実施例２に記載）をＣａｃｈｉａｎｅｓなど、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、前出に記載のようにして樹立した。２９３対照細胞およびＭＳＰ遺伝子移入体細胞から得た培地を使用の前に５％ＦＣＳと３７℃で１時間処理［Ｗａｎｇなど、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６９巻：３４３６〜３４４０頁（１９９４年）］してプロＭＳＰを成熟２鎖型までプロセッシングした。ベクターのみか、ＭＳＰを含むベクターかのいずれかを遺伝子移入した細胞からの調整培地を４８時間にわたって集め、下記検定法では１：１０希釈で使用した。
Ｂ．組換えｈｕＨＧＦの製造
組換えｈｕＨＧＦを本質的に米国特許第５２２７１５８号に記載の通りに製造した。Ｓｅｋｉなど、前出、に記載のヒト白血球ライブラリーから分離したｈｕＨＧＦｃＤＮＡクローン（ＨＣＬ３）を発現ベクターｐＳＶＩ６Ｂ５（ＡＴＣＣ寄託番号６８１５１）中にクローニングした。ヒト白血球ＨＧＦの完全アミノ酸配列は米国特許第５２２７１５８号、配列番号２に記載されている。ＣＨＯ−ｄｈｆｒ細胞［Ｕｒｌａｕｂなど、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７巻：４２１６〜４２２０頁（１９８０年）］に前記ｐＳＶＩ６Ｂ５由来のｈｕＨＧＦ発現ベクターとｄｈｆｒ選択ベクターｐＦＤ１１［Ｓｉｍｏｎｓｅｎなど、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８０巻：２４９５〜２４９９頁（１９８３年）］とをＧｒａｈａｍなど、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、５２巻：４５６〜４６７頁（１９７３年）の一般法を使用して、共遺伝子移入した。後者のプラスミドはＤＨＦＲをコードしており、それによって遺伝子移入された細胞にメトトレキセート耐性を与えてｈｕＨＧＦ発現形質転換体を選択させる。形質転換したｄｈｆｒ細胞をグリシン−、ヒポキサンチン−およびチミジン−欠失培地中で増殖させて選択した。この選択培地に発生したコロニーを綿棒を使用して分離し、同一培地中で数代にわたって増殖させた。細胞の増殖後、標準技術を使用してメトトレキセート量を増加させつつ細胞を増幅し、選択した。選択培地中で増殖でき、それ故、遺伝子移入したＤＨＦＲを含有するプラスミドが導入されたクローンを分泌されたＨＧＦの存在について検索した。これらのクローンの培地中のＨＧＦ活性はＮａｋａｍｕｒａなど、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８０巻：７２２９〜７２３３頁（１９８３年）に記載の有糸分裂検定法で検定した。培養培地中のＨＧＦ活性はＮａｋａｍｕｒａなど、Ｎａｔｕｒｅ、３４２巻：４４０〜４４３頁（１９８９年）に記載のラット肝細胞一次培養物への125Ｉ−標識デオキシウリジンの取込によっても測定しうる。次にｈｕＨＧＦを本質的にＮａｋａｍｕｒａなど、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、前出、に記載のようにして精製した。
Ｃ．細胞培養検定法
ヒトの巨核球細胞系統「ＤＡＭＩ」（Ｓ．Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ、Ｂｒｉｇｈａｍ・ａｎｄ・Ｗｏｍｅｎ’ｓ・Ｈｏｓｐｉｔａｌ、ボストン、ＭＡから入手）および「ＣＭＫ」（Ｔ．Ｓａｔｏ、千葉大学、日本から入手）をこの検定法で使用した。両細胞系統はＧｒｅｅｎｂｅｒｇなど、Ｂｌｏｏｄ、７２巻：１９６８〜１７４頁（１９８８年）およびＫｏｍａｔｓｕなど、Ｂｌｏｏｄ、７４巻：４２頁（１９８９年）に記載の培養物中に維持した。
５％血小板欠乏血漿（「ＰＰＰ」）（Ａｖｒａｈａｍなど、Ｂｌｏｏｄ、７９巻：３６５〜３７１頁（１９９２年）に記載のようにして製造）を含むＲＰＭＩ−１６４０培地中、２×１０5細胞／ｍＬの細胞を２４ウェル培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社、コーニング、ＮＹ）に入れて５日間５％ＣＯ2湿潤大気中に維持した。細胞をＭＳＰ調整培地（前記Ａに記載）中、３濃度の組換えｈｕＨＧＦ（前記Ｂに記載）または２９３細胞条件付き対照培地およびホルボール−１２−ミリステート−１３−アセテート（「ＰＭＡ」）含有または不含条件で培養した。ＰＭＡはポジティブコントロールとして使用した。ＰＭＡはＰＭＡ（Ｓｉｇｍａ社、セントルイス、ＭＯ）をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解して調製し、−８０℃で貯蔵した。使用直前に、ＰＭＡをＲＰＭＩ−１６４０培地で希釈した。希釈したＰＭＡを次に１０ｎｇ／ｍＬ濃度で細胞とインキュベーションした。インキュベーションの後、細胞をＨａｎｋ平衡塩溶液（「ＨＢＳＳ」）で２回洗浄し、核分離培地（「ＮＩＭ」；０．２％ＢＳＡ、０．４％Ｎｏｎｉｄｅｔ・ｐ４０、および１０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、ＨＢＳＳ中）プラス５４Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ単位／ｍＬのＲＮａｓｅ・Ａ（Ｂｉｏｌａｂ社、ニューイングランド、ＭＡ）中に２×１０6細胞／ｍＬで再懸濁した。
培養した細胞のＤＮＡ含有量または倍数性をヨウ化プロピジウム（Ｓｉｇｍａ社、セントルイス、ＭＯ）２５μｇ／ｍＬを含む等容のＮＩＭ（前記）で細胞を染色することによって検査した。試料を４℃の暗所に置き、同じ日にフルオレッセイン活性化細胞分別スキャンニング（Ｂｅｃｔｏｎ・Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社、マウンテンビュー、ＣＡ）およびＣｅｌｌＦｉｔTMソフトウエアを使用して分析した。結果を次の表１に示す。結果は二重に測定した実験３回のデータの平均値±ＳＥＭとして表示する。
0003769691.tif 000002
実験の結果を倍数性について検定すると、ＭＳＰ処理は一定の濃度範囲にわたってＣＭＫ細胞の成熟を強化したことを示した。これとは対照的に、ｈｕＨＧＦはこの濃度範囲にわたってＣＭＫの倍数性には効果を示さなかった。
Ｄ．ＤＡＭＩおよびＣＭＫ細胞のノーザンブロット分析
全細胞ＲＮＡをグアニジンイソチオシアネート法によってＣＭＫおよびＤＡＭＩ細胞から抽出し、このＲＮＡ２０μｇを２．２モル／Ｌのホルムアルデヒドを含む１％アガロースゲル中で電気泳動した。ナイロンフィルター（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ）に移した後、フィルターを放射能標識相補性ＤＮＡ挿入物とハイブリッド形成させた。このハイブリッド形成は３７℃で５０％ホルムアミド、３×塩化ナトリウムおよびクエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）、０．５％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１０％硫酸デキストラン、および１００μｇ／ｍＬの変性鮭精子ＤＮＡの存在下に行った。フィルターを０．２×ＳＳＣおよび０．５％ＳＤＳ中で６０℃で２時間洗浄した。膜を次にＫｏｄａｋ・Ｘｏｍａｔフィルム（Ｅａｓｔｍａｎ・Ｋｏｄａｋ社、ロチェスター、ＮＹ）に４８時間感光させた。特定のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）転写物を、キナーゼドメインから構成されるＲＯＮに対するヒトの部分的ｃＤＮＡプロープで検出した。ブロット分析の結果からＲＯＮ遺伝子の５．０ｋｂおよび２．０ｋｂの特異的な転写物が構成的にＣＭＫおよびＤＡＭＩ細胞中に発現されていることが示された（データ不掲載）。
実施例４：ヒトの骨髄巨核球によるサイトカイン分泌に及ぼすＭＳＰの効果
Ａ．試験管内検定法
特異的サイトカイン検定法を使用して、ＭＳＰ調整培地または組換えｈｕＨＧＦで処理して培養したヒトの巨核球およびＤＡＭＩ細胞からの上清液をＩＬ−６、ＩＬ−１βおよびＧＭ−ＣＳＦの合成および分泌について検定した。
骨髄を健康な提供者から標準的技術を使用して無菌条件下に保存剤不含のヘパリン中に吸引、採取した。一次骨髄巨核球をＴａｎａｋａなど、Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．、７３巻：１８〜２４頁（１９８９年）に記載のように表面ＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａに対するモノクローナル抗体のカクテルで被覆した免疫磁気ビーズ（Ｍ７５３、Ｄａｋｏ社、カーペンテリア、ＣＡ）によって分離した。次に分離した骨髄巨核球の純度をフローサイトメトリー（Ｔａｎａｋａなど、前出、の方法を使用）によって測定し、９５〜９８％の値を得た。
分離した一次骨髄巨核球（１０5細胞／ｍＬ）およびＤＡＭＩ細胞（１０6細胞／ｍＬ）（Ｓ．Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ、Ｂｒｉｇｈａｍ・＆・Ｗｏｍｅｎ’ｓ・Ｈｏｓｐｉｔａｌ、ボストン、ＭＡから入手）をＭＳＰ調整培地（実施例３のＡに記載のようにして製造）、組換えｈｕＨＧＦ（実施例３のＢに記載のようにして製造）または２９３細胞対照調整培地の存在または不在下に１％ＰＰＰ含有ＲＰＭＩ−１６４０培地（実施例３のＣに記載）中でＡｖｒａｈａｍなど、前出、に記載の条件下に２４時間培養した。各被験培養について二重に培養を行った。この検定には血小板欠乏血漿を採用して血清中に比較的高濃度で存在することがあるＴＧＦ−βおよびその他の血小板由来媒介物質の存在を回避した。
これら細胞培養物からの上清液を得て免疫反応性サイトカインについて検定した。ヒトのインターロイキン−１β、ヒトのＧＭ−ＣＳＦ、およびヒトのインターロイキン−６の免疫検定はＲ・＆・Ｄ・Ｓｙｓｔｅｍｓ社、ミネアポリス、ＭＮから購入して製造社の指示に従って使用した。各検定ではサイトカインのポジティブコントロールによる標準曲線を作成した。検出の最低限界はＩＬ−６について０．３５ｐｇ／ｍＬ、ＧＭ−ＣＳＦについて１．５ｐｇ／ｍＬ、ＩＬ−１βについて０．３ｐｇ／ｍＬであると測定された。
次の表２に報告する検定結果は二重に行った検定３回から得たデータの平均値±ＳＥＭとして表示する。統計的有意性はスチューデントのＴ−検定を使用して決定した。
0003769691.tif 000003
表２に示す通り、ＭＳＰの添加は検査した培地の全てにおいて他の全処置を超えるＩＬ−６の分泌増加を示した。同様な増加はＤＡＭＩ細胞でも観察されて、ＭＳＰ処理培養物に約９０ｐｇ／ｍＬのＩＬ−６が検出されたのに比較して非処理培地の培養物中では約３４ｐｇ／ｍＬのＩＬ−６が検出された。それ程でもないが、ＭＳＰ処理は一次骨髄巨核球に対するその他の処理のすべてを超え、またＤＡＭＩ細胞についての対照を超えて、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−１βの分泌を増加させた。
ヒトの巨核球によるＩＬ−１βの分泌はまた特異的なＩＬ−１βＥＬＩＳＡを使用して評価した。ＩＬ−１β蛋白質は未刺激巨核球の上清液中に検出された。ＭＳＰはＩＬ−１βの分泌をわずかに刺激したが、有意ではなかった。ＭＳＰまたはｈｕＨＧＦがＧＭ−ＣＳＦの分泌に及ぼす影響は観察されなかった。
Ｂ．巨核球のＲＮＡ分析
分離した一次骨髄巨核球から全細胞ＲＮＡを抽出した。このＲＮＡをグアニジンイソチオシアネート操作法によって抽出し、続いてＣｓＣｌクッションを通す超遠心分離を行った。全ＲＮＡを次に１．２％ホルムアルデヒドアガロースゲル上を移動させ、無傷のＲＮＡをエチジウムブロミド染色によって可視化させた。ＲＮＡの逆転写（ＲＴ）を各試料から得た全ＲＮＡ２μｇを使用して実行した。ＲＯＮプライマーを使用するＰＣＲ検定を正方向プライマーと逆方向プライマーとを使用して実行した。
このＰＣＲ生成物を２％アガロースゲル（ＢＲＬ社、ベセスダ、ＭＯ）で分析した。増幅されたＤＮＡバンドはＵＶトランスイルミネーターで目視した。増幅されたＤＮＡはゲルのエチジウムブロミド染色によって期待したサイズで検出できた。ＰＣＲ対照についての内部反応標準も実行した。これらの標準にはプライマー含有または不含のＲＮＡ、ＲＮＡ不含プライマーおよびアクチンプライマー含有ＲＮＡを含めた。プライマーストックの全ておよび全ＲＮＡ調製物は細胞のＤＮＡによる夾雑を除外するために分析したものである。ＲＮＡ分析のこの結果は分離された骨髄巨核球がＲＯＮに対する特異的なｍＲＮＡを発現したことを示す（データは表示せず）。
実施例５：マウス巨核球減少症に及ぼすＭＳＰの効果
マウスの巨核球分化に及ぼすＭＳＰの効果を検査するために、Ｏｏｎなど、Ｌｅｕｋｅｍｉａ・Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１０巻：４０３〜４１２頁（１９８６年）およびＳｐａｒｒｏｗなど、Ｌｅｕｋｅｍｉａ・Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１１巻：３１〜３６頁（１９８７年）に記載の方法に従って単細胞巨核球の増殖検定を実行した。
骨髄からの単細胞集団は正常Ｃ５７Ｂ１／６マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ・Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社から購入）の大腿骨に１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭを流すことによって調製した。未成熟巨核球集団をＰｅｒｃｏｌｌ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）勾配によって分離した単細胞骨髄細胞の懸濁物から１．０７〜１．０８５ｇ／ｃｍ3画分として得た。分画した細胞を１０5細胞／ｍＬでＤＭＥＭ−１０％ＦＣＳ中で５日間３７℃で湿潤インキュベーター中で１０％ＣＯ2下に、滴定量のＭＳＰ含有調整培地（実施例３のＡに記載のとおりに調製）およびＩＬ−６（Ｒ・＆・Ｄ・Ｓystems社、ミネアポリス、ＭＮから購入）の存在下に培養した。
培養物を乾燥し、Ｗｉｌｌｉａｍｓなど、Ｃｅｌｌ・Ｔｉｓｓｕｅ・Ｋｉｎｅｔｉｃｓ、１５巻：４８３〜４９４頁（１９８２年）；Ｂａｎｕなど、Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔ．、７５巻：３１３〜３１８頁（１９９０年）；Ｏｏｎなど、前出；Ｓｐａｒｒｏｗなど、前出、に記載のようにアセチルコリンエステラーゼについて染色した。単細胞のマウス巨核球は画分した骨髄細胞培養物５×１０4個当りアセチルコリンエステラーゼ陽性細胞の数として記録した。未成熟巨核球の増殖は光学顕微鏡によって検出された単球大型巨核球の数によって定量した。
その結果を表３に示す。この結果は３重の培養を行った実験３回からの平均値±ＳＥＭを示す。
0003769691.tif 000004
マウスの未成熟巨核球集団の培養液にＭＳＰを添加すると検出可能なアセチルコリンエステラーゼ陽性巨核球数の増加を伴う増殖強化の反応を示す。
間接的な免疫複合体欠乏法［Ｓｐａｒｒｏｗなど、前出］を使用する中和検定も実施した。ＩＬ−６に対する中和モノクローナル抗体はＧｅｎｅｔｉｃ・Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、ボストン、ＭＡから入手した。増殖因子（ＭＳＰおよびｈｕＨＧＦ）の最適下限濃度および抗体の至適濃度（１：１０希釈）を選択して抗体の過剰状態を作成した。種々の増殖因子および抗体を混合して、４℃で２時間インキュベーションした。対照には正常ウサギ血清（Ｓｉｇｍａ社、セントルイス、ＭＯから購入）を使用した。免疫複合体はＰｒｏｔｅｉｎ・Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ・ＣＬ−４ＢTM（Ｐｈａｒｍａｃｉａ・ＬＫＢ社、ピスカタウエー、ＮＪ）を５０μＬ添加して沈降させた。培養物の上清液を集めて前記未成熟マウス巨核球増殖検定における残留巨核球刺激活性について検定した。
中和検定の結果はＭＳＰ（ならびにＩＬ−６）に応答する未成熟マウス巨核球の増殖はＩＬ−６に指向するモノクローナル抗体によって中和されることを示した。表３参照。表３はまたＩＬ−６またはＭＳＰに添加した非免疫血清はＩＬ−６またはＭＳＰ単独を超える有意な効果を示さないことを示す。完全な理解はなされておらず、いずれの一理論に限定されるものでもないが、この結果は巨核球からのサイトカイン分泌を誘導することまたは補助細胞によるＩＬ−６の誘導によってＭＳＰが巨核球の成熟を制御する機能を果たしているであろうことを示唆している。
配  列  表
（１）一般的情報：
（ｉ）出願人：ジェネンテク・インコーポレイテッド
ニュー・イングランド・ディーコネス・ホスピタル・コーポレイション
（ii）発明の名称：マクロファージ刺激蛋白質を使用する方法およびキット
（iii）配列の数：１０
（iv）連絡先：
（Ａ）宛名：ジェネンテク・インコーポレイテッド
（Ｂ）通り：ポイント・サン・ブルーノ・ブールバード４６０番
（Ｃ）市：サウス・サン・フランシスコ
（Ｄ）州：カリフォルニア
（Ｅ）国：アメリカ合衆国
（Ｆ）ＺＩＰ：９４０８０
（ｖ）コンピューター解読書式：
（Ａ）媒体型：３．５インチ，１．４４Ｍbフロッピーディスク
（Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ ＰＣ適合
（Ｃ）オペレーティング・システム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ
（Ｄ）ソフトウエア：Winpatin（ジェネンテク）
（vi）本出願のデータ：
（Ａ）出願番号：
（Ｂ）出願日：
（Ｃ）分類：
（viii）弁理士／代理人情報：
（Ａ）氏名：マーシャング，ダイアン・エル
（Ｂ）登録番号：３５，６００
（Ｃ）参照／整理番号：Ｐ０９１２ＰＣＴ
（ix）電話連絡先情報：
（Ａ）電話番号：４１５／２２５−５４１６
（Ｂ）ファックス番号：４１５／９５２−９８８１
（Ｃ）テレックス：９１０／３７１−７１６８
（２）配列番号１の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２２３２塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号１：
0003769691.tif 000005
0003769691.tif 000006
（２）配列番号２の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：７１１アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号２：
0003769691.tif 000007
0003769691.tif 000008
0003769691.tif 000009
0003769691.tif 000010
0003769691.tif 000011
0003769691.tif 000012
（２）配列番号３の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２１塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号３：
0003769691.tif 000013
（２）配列番号４の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２３塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号４：
0003769691.tif 000014
（２）配列番号５の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：４７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号５：
0003769691.tif 000015
（２）配列番号６の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３１塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号６：
0003769691.tif 000016
（２）配列番号７の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３１塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号７：
0003769691.tif 000017
（２）配列番号８の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３２塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号８：
0003769691.tif 000018
（２）配列番号９の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：４７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号９：
0003769691.tif 000019
（２）配列番号１０の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：４９塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号１０：
0003769691.tif 000020