(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
DNAポリメラーゼによる伸長のためのヘアピンオリゴヌクレオチドプライマーであって、相補的3'及び5'アーム配列によって形成されたステム、並びに該アーム配列を分離させている一重鎖ループ配列を含み、該3'アーム配列及び該ループ配列は双方とも、標的核酸鎖の選択されたプライミング領域に対して完全に相補的であり、該ステムの3'末端の一重鎖オーバーハングは、相補的配列と核形成して分岐点移動の開始点を付与することができず、該プライマーと該選択されたプライミング領域との接触は、該ステムの解離並びに該選択されたプライミング領域に対する該ループ及び3'アーム配列のハイブリダイゼーションを引き起こし、該3'アームはDNAポリメラーゼによって伸長可能となり、且つ該ループ配列とは完全に相補的であるが該3'アーム配列とは相補的ではない配列と該プライマーとの接触は、該ステムの解離を引き起こさない、前記プライマー。
【請求項２】
3'及び5'アーム配列に結合した相互作用的な蛍光標識部分をさらに含み、それによって、二重鎖核酸中へのプライマーの取り込みが、該標識部分によって放射される蛍光を検出可能に変える、請求項１記載のプライマー。
【請求項３】
上記相互作用的な蛍光標識部分がフルオロフォア及び非蛍光性クエンチャーを含む、請求項２記載のプライマー。
【請求項４】
上記ループ配列が5個から9個のヌクレオチドの長さであり、且つ上記相補的3'及び5'アーム配列が5個から12個のヌクレオチドの長さのステムを形成する、請求項１〜３のいずれか１項記載のプライマー。
【請求項５】
改変されたヌクレオチド、改変されたヌクレオチド間結合又はその双方を含む、請求項１〜４のいずれか１項記載のプライマー。
【請求項６】
上記ループ配列と上記5'アーム配列との間にターミネーターヌクレオチドを含む、請求項１〜５のいずれか１項記載のプライマー。
【請求項７】
上記プライミング領域が変異を起こしやすい単一のヌクレオチドを含み、且つ上記ループ配列が該ヌクレオチドを含んでいる該プライミング領域の部分に対して相補的である、請求項１〜６のいずれか１項記載のプライマー。
【請求項８】
DNAポリメラーゼによる、請求項１〜７のいずれか１項記載のプライマーの伸長を含む核酸増幅方法であって、該プライマーのステムが解離され、該プライマーのループ及び3'アーム配列が核酸にハイブリダイズし、該3'アーム配列がDNAポリメラーゼによって伸長される、前記方法。
【請求項９】
上記ループが5個から9個のヌクレオチドの長さであり、且つ上記ステムが5個から12個のヌクレオチドの長さである、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
上記方法がポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、ストランド置換反応(SDA)、核酸配列ベース増幅(NASBA)、転写介在増幅(TMA)及びローリングサイクル増幅(RCA)からなる群から選択されるものである、請求項８又は９記載の方法。
【請求項１１】
増幅プライマーのペアが使用される、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
少なくとも1つがフルオロフォアである相互作用的な標識を有する別個の検出用プローブを用いる、意図した増幅産物のリアルタイム検出を含むか、又は、上記プライマーの少なくとも1つが3'及び5'アーム配列に結合した相互作用的な蛍光標識部分をさらに含み、それによって、二重鎖核酸中へのプライマーの取り込みが、該標識部分によって放射される蛍光を検出可能に変える、リアルタイム検出を含む、請求項１０又は１１記載の方法。
【請求項１３】
上記相互作用的な蛍光標識部分がフルオロフォア及び非蛍光性クエンチャーを含む、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
増幅バッファー、dNTP、請求項１〜７のいずれか１項記載のプライマーの少なくとも1つ及び増幅を行うための説明書を含む、標的核酸配列の増幅を行うための試薬キット。
【請求項１５】
上記プライマーの少なくとも1つが、第1のプライマー、及び該第1のプライマーとはループ配列の単一のヌクレオチドのみが異なる第2のプライマーを含む、請求項１４記載の試薬キット。
【請求項１６】
上記第1及び第2プライマーの各々において、ループ配列が5個から9個のヌクレオチドの長さであり、且つ相補的3'及び5'アーム配列が5個から12個のヌクレオチドの長さのステムを形成する、請求項１５記載の試薬キット。
【請求項１７】
上記第1及び第2プライマーの各々が3'及び5'アーム配列に結合した相互作用的な蛍光標識部分を含んでおり、それによって該プライマーの各々の二重鎖核酸への取り込みが、該標識部分によって放射される蛍光を検出可能に変える、請求項１５又は１６記載の試薬キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は標的配列の増幅を含む核酸の検出法に関する。
【０００２】
本発明の背景
DNAプライマーおよびDNAポリメラーゼを用いる増幅法は標的核酸配列を検出するための技法としてよく知られている。指数関数的増幅のための方法としては、ポリメラーゼ連鎖反応法(PCR)、ストランド置換反応(strand displacement amplifiction (SDA))、核酸配列ベース増幅(nucleic acid sequence-based amplification (NASBA))、転写介在増幅(transcription-mediated amplification (TMA))、およびローリングサイクル増幅(rolling-cycle amplification (RCA))が挙げられる。多数のDNAポリメラーゼのうち、Thermus aquaticusのDNAポリメラーゼ、および逆転写酵素が一般的に用いられている。直鎖状のDNAオリゴヌクレオチド増幅プライマーのデザインは通常はその目的のためにデザインされたコンピュータープログラムの助けを借りて行われる。利用可能なプログラムとしては、PRIDE(Haasら, 1998)、OLIGO(Rychlikら, 1989)、OSP(Hilberら, 1991)、Primo(Liら, 1997)、およびPrimer Master(Proutskiら, 1996)がある。
【０００３】
よくある問題点は「プライマーダイマー」として知られている。プライマーダイマーは、2つのプライマーがオーバーハングのある状態でお互いにハイブリダイズし、それによってポリメラーゼの結合部位が作られ、DNAの合成が開始されるために作られる偽の増幅産物(アンプリコン)である。プライマーダイマーは、目的の増幅と競合し、通常はアッセイの信頼性と感度を低下させる。もう1つのある問題点は、そのプライマーに対して部分的に相補的なサンプル中の配列のミスプライミングである。これによっても偽の増幅産物が生じ、信頼性と感度が低下する。
【０００４】
標的増幅法の適用用途の主要なものの１つはin vitroの診断である。核酸をベースとする技法による病的状態の診断においては、病原体由来のユニークな核酸配列が臨床で採取されたサンプル中の核酸全体の中のまれな構成成分であることが一般的な状況である。例えば、マラリア原虫のゲノムDNAは患者の血液から抽出されるDNA全体の非常に小さな画分を占める。まれにしか存在しない、病因となる標的配列の増幅は、ある場合には検出のための有効な方法となるが、それは豊富に存在するヒトの配列を診断目的のために十分な程度に無視するようにプライマーをデザインすることができるからである。しかし、まれな標的配列が豊富に存在する配列と類似しているような状況も多数存在し、ある場合にはヌクレオチド1個のみが相異する。例えば、ある種のヒトの癌は遺伝子中のわずか1個のヌクレオチドの位置における変化によって特徴づけられている(Lengauerら, 1998)。これらの癌を早期の段階で検出するため、または腫瘍を外科的に除去した後に残存したものがないか検出するために、豊富に存在する配列との相異がヌクレオチド1個分である、まれな配列を検出することが必要である。癌の存在を示す配列がまれなものである場合には、その配列を検出する困難性は時に「最小残基疾患問題(minimal residual disease problem)」と言われる。患者が薬剤での治療を受ける際に、薬剤耐性細菌もしくはウイルスの出現をできるだけ早期に検出する必要がある場合には同様な問題が生じるが、それは多数の薬剤耐性遺伝子型は、病原性配列中で1個のヌクレオチドのみの置換によって特徴づけられるからである。上述の用途などに適用するためには、単一標的増幅法は効果的ではない。なぜならば、プライマーが1個のヌクレオチドのみの置換によって互いに相異している2つの配列を十分に区別できないからである。
【０００５】
この問題に対処するために2種類のアプローチが用いられてきた。第1は増幅に必要な2個のオリゴヌクレオチドプライマーのうちの1個をヌクレオチドの置換部位を包含する配列で標的に結合するようにデザインすることである。そのプライマーが目的の標的配列に対して完全に相補的な場合には、プライマー−標的ハイブリッドが形成され、標的核酸配列の増幅されたコピーが作成される。ヌクレオチドの置換が存在している場合には、ミスマッチしたプライマー−標的ハイブリッドが形成されず、その核酸配列の増幅コピーが作成されなくなることが望ましい。しかし、この二分法は実際にはうまく働かず、変異型および野生型の鋳型の双方が増幅される。完全なおよびミスマッチの標的増幅産物（アンプリコン）は互いに区別が付かない。サンプル中にミスマッチの標的配列のみが存在しているとしても、そのプライマーは時にはそのミスマッチの標的配列のDNA合成を開始してしまう。その結果得られる産物は用いたプライマー配列の完全な相補物を含有しているので、この初回産物の指数関数的な増幅が急速に起こる。標的配列中の変異を検出するために用いられる第2のアプローチは、変異を有している可能性のある配列の外側に結合するプライマーを用いてその変異の部位を含む配列が結果として得られる増幅産物の一部となるようにすることである。次いで別のハイブリダイゼーションプローブを用いてその増幅産物の内部に変異が存在するか否かを調べる。変異を有している増幅産物の比率は出発サンプル中の変異の相対量もしくは絶対量の尺度である。このアプローチは多くの状況下でうまく働くが(Tyagiら, 1996、Tyagiら, 1998)、感度の点では限界がある：変異を含む増幅産物が全増幅産物の2〜3%未満である場合には、検出することができない。
【０００６】
希少である、すなわち野生型配列の2〜3%、この量はハイブリダイゼーションプローブによる検出には必要な量であるが、これより少量しか存在しない変異型を検出するためには、"amplification refractory mutation system"(ARMS)が用いられてきた(Newtonら, 1989; Wuら, 1989)。この方法では2つの増幅反応が別々の反応管で行われる。2つの反応の相異はプライマーの一方が各試験管内でわずかに異なることを意味する。2つのプライマー間の相異はそれらの3'末端にある。一方の反応管中のプライマーの3'ヌクレオチドは野生型ヌクレオチドとその変異の起こる部位で相補的であり、もう一方の反応管中のプライマーの3'ヌクレオチドは変異の部位で変異型ヌクレオチドと相補的である。もし反応管中のそのプライマーが標的配列に対してそのプライマーの3'末端のヌクレオチドを含めて完全に相補的であるならば、そのプライマーはDNAポリメラーゼとインキュベートすることによって効果的に伸長させることができる。しかし、反応管内のプライマーの標的配列との結合がミスマッチした3'末端ヌクレオチドを作る場合には、プライマーはDNAポリメラーゼとのインキュベーションによって効果的に伸長させることはできない。ミスマッチの鋳型の増幅は著しく遅くなる、すなわち、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅で増幅産物が検出可能となるまでに必要な熱サイクルの数(もしくは等温増幅で増幅産物の量が検出可能な程度に生成されるためにかかる時間)が、プライマーの3'ヌクレオチドがサンプル中に存在する配列と相補的でない場合には著しく大きくなる。
【０００７】
ARMSプライマーおよび従来のプライマーは共に擬陽性のシグナルを生じやすいが、それはそれらが目的ではない増幅産物の指数関数的増殖を完全に相補的な標的配列がなくとも開始できるからである。これらの「偽の増幅産物」はプライマーの3'末端領域が、サンプル中に存在する標的とは無関係の、部分的に相補的な配列と結合しうるために生ずる。「偽の増幅産物」はまた、1つのプライマー分子が別のプライマー分子と結合し、その結果DNA合成が開始されること(プライマーダイマー)からも生ずる。どちらの場合においても、結果として得られる伸長産物は通常どおり指数関数的に増幅することができ、その結果、偽の増幅産物が合成される。偽の増幅産物の生成は、目的の増幅産物の同定を困難にするのみならず、アッセイの感度を制限するが、それは偽の増幅産物が目的の増幅産物と競合し、それによって目的の増幅産物の量を低減させるためである。例えば、あるまれな標的配列のバックグラウンド値より高い検出可能な量となるまでの増幅に38サイクルのPCRが必要で、反応液中の偽の増幅産物は35サイクルで検出可能となるとすれば、そのまれな標的配列は検出可能なレベルに達しないこととなる。
【０００８】
本発明はオリゴヌクレオチドプライマーの特異性を著しく改善する。
【０００９】
本発明の1態様は、標的核酸よりはるかに多量に存在する野生型の核酸の集団中にあるヌクレオチド1個の置換を有する標的核酸を検出するアッセイの感度を改善して、2〜3%未満のレベルの検出を可能とするものである。
【００１０】
本発明の別の1態様においては、プライマーダイマーを含む、偽の増幅産物の形成を低減する。
【００１１】
本発明の別の1態様においては、本発明は核酸集団の一部分であって変異型であるものを野生型の部分と区別することができ、特にその部分が非常に小さいかもしくは非常に大きい場合に区別することができる。
【００１２】
本発明の別の1態様は、標的増幅反応の偽の増幅産物を産生しようとする傾向を低減もしくは排除するものである。
【００１３】
本発明の別の1態様は、プローブもしくは非特異的な介在試薬を用いることなく、増幅産物を蛍光性の部分を用いて標識して増幅反応をリアルタイムでモニターする方法を提供するものである。
【００１４】
本発明の概要
本発明には核酸増幅のためのオリゴヌクレオチドプライマーが含まれている。標的と結合していない場合には、本発明のプライマーは特定のタイプのヘアピン構造を形成し、その構造ではプライマーの3'末端領域がそのプライマーの5'末端領域とハイブリダイズして2重鎖のステムを形成する。プライマーの中央部分のみが1重鎖で相補的標的との最初のハイブリダイゼーションに利用されるが、このプロセスは時に「核形成(nucleation)」と呼ばれる。本発明はまた、このようなプライマーを用いる増幅方法およびアッセイ、ならびにそのようなアッセイを行うためのキットをも含む。これらの方法およびアッセイは現行の方法およびアッセイを限定されたものとしている偽の増幅産物の合成を低減する。
【００１５】
本発明のある種のプライマーは、大部分が野生型からなる集団中のヌクレオチド1個の置換を有する変異型の存在を検出するために有用であり、そのような変異型は通常は2〜3%で、現在はその検出は標識した検出プローブの使用、もしくは3'末端ヌクレオチドが変異を起こしやすいヌクレオチドの位置でハイブリダイズする直鎖状プライマーの使用によって行われている。本発明のループのあるプライマーであれば、それは変異を起こしやすい位置のヌクレオチドを含む配列の位置で標的とハイブリダイズし、非常に低いレベルの変異した鎖の検出が可能となる。
【００１６】
本発明の増幅反応およびアッセイにおいて、本発明のヘアピンプライマーを少なくとも1つ用いている。指数関数的増幅反応およびアッセイ(例えば、ポリメラーゼ連鎖反応法)はプライマーのペアを用い、それは時に「フォワード」および「リバース」プライマーと呼ばれるが、そのうちの1つは一方の核酸鎖に対して相補的であり、他の一方はその鎖の相補体に対して相補的である。増幅プライマーのペアが用いられる場合には、本発明ではそのうちの一方もしくは双方が本発明のヘアピンプライマーである。
【００１７】
本発明のアッセイ法には増幅産物を検出するためのいかなる検出方法も用いることができる。そのような方法としては、ゲル電気泳動、介在色素、副溝結合色素(minor groove binding dye)、蛍光偏光、マススペクトル、および標識した検出プローブを挙げることができる。検出はエンドポイント、すなわち、増幅が完了した際に行われるか、もしくはリアルタイム、すなわち、増幅プロセスの途上で行われるものとすることができる。リアルタイムのプローブをベースとする検出方法としては、5'ヌクレアーゼアッセイ法(Gelfandら, 1996; Livakら, 1996)、および分子ビーコンアッセイ法(molecular beacon assay)(Tyagiら, 1996; Tyagiら, 1997; Tyagiら, 1998)が挙げられる。あるいはまた、本発明のプライマーは相互作用的な蛍光標識ペア、例えば2つのフルオロフォアもしくは1つのフルオロフォアと1つの非蛍光性のクエンチャーなどで標識して、蛍光シグナルの変化が伸長されたプライマーの存在を示し、従ってサンプル中のプライマーの標的の存在を示すこととなるようにすることができる。標識物間の相互作用は、蛍光共鳴エネルギー移動（fluorescense resonance energy transfer)(FRET)、接触(touching)、もしくはその双方によって行われる。本発明の標識プライマーを用いたアッセイ法はリアルタイムアッセイ、ならびにエンドポイントアッセイで用いるものとすることができる。
【００１８】
本発明のキットには、増幅用試薬、通常は少なくとも増幅用バッファーおよびdNTP、ならびに一般的にはDNAポリメラーゼ、ならびに本発明のプライマーの少なくとも1個を含んでいる。キットにはさらに別の試薬を含めることができ、それは例えば検出試薬であり、およびアッセイ法を行うための説明書を含ませることができる。
【００１９】
発明の詳細な説明
本発明の重要な態様は、希少な配列の増幅に関して現在使われる増幅法およびアッセイよりも偽増幅産物を作製する傾向が低くかつ感度が高い標的の増幅法およびアッセイであり、例えば、野生型配列集団内の希少な突然変異型配列の検出またはその逆が挙げられる。本発明に基づくアッセイは、一本鎖「ループ」および二本鎖「ステム」を含んでなるヘアピンとして存在し得るプライマーを用いる。図1を参照して説明すると、これらのプライマー1は3つの部分、すなわち5'アーム配列2、中央ループ配列3、および5'アーム2と相補的である3'アーム配列4から成る。ヘアピン1のループ3および3'アーム4は、標的5の一本鎖と相補的であるが、5'アーム2はプライマーをヘアピン形状分子に変換するように設計されている。従って、本発明によるプライマーは、標的と相補的であるループおよび3'アームの両方、ならびに3'アームとのハイブリダイゼーションを標的と競合する5'アームを有する。ループ3の配列が標的5の相補体と結合すると、ヘアピン形状のプライマー1がほどけて3'アーム4が標的とアニールする。これはプライマー1の酵素による伸長のための基質を作製する。標的5は一本鎖であっても二本鎖であってもよい。いずれの場合においても、通常の直鎖プライマーであってもよい第二のプライマー6は、指数的増幅が可能であって二本鎖増幅産物7を生成する。本発明によるプライマーは、ループと3'アームの両方が標的と相補的でなければ、ほどけることもまたは解離することもないステムを有する。もし本発明によるプライマーを、ループの長さでありかつループと完全に相補的である非標的モデルに対して試験すれば、ステムは解離しない。
【００２０】
少なくとも5'アームの一部分が目的の標的と少なくとも部分的に相補的である特別なケースがある。以下に記載の設計判定基準に従い、1または数個の標的と相補的な5'アームの3'末端ヌクレオチドを有するプライマーを設計することができる。以下の実施例4はこの状況を例示する。5'アーム全体が標的と相補的である場合はまれである。
【００２１】
プライマーの3'部分が二本鎖状態であるので、プライマーダイマー形成または3'末端のミスプライミングによる偽増幅産物の作製は大幅に阻止される。もしサンプルがループ3の配列と相補的でない1個のヌクレオチドだけ標的5と異なる核酸を含有すれば、ループはその核酸と結合できないので、3'アーム4は核酸とアニールしてDNA合成を開始することができない。結局、標的分子（例えば、野生型もしくは突然変異型DNA鋳型分子、または野生型もしくは突然変異型RNA鋳型分子）がサンプル中に存在すると増幅産物合成は起こるが、標的配列と1個のヌクレオチド置換だけ異なる分子が存在すると増幅産物合成は起こらないし、または非常にまれな場合にプライマーがミスマッチした鋳型とたまたま結合して増幅産物合成を開始することがあっても増幅産物合成は著しく遅延するであろう。
【００２２】
図1を参照すると、示された実施形態においては、プライマーの2つの末端ヌクレオチドは相補的であってステム部分を形成する。本発明者らはこれらを「アーム」と呼称する。これはまた、図5に示した実施形態でもその通りである。これは本発明者らが好ましいとする構成であり、以下の複数の実施例で利用される。しかし、非相補的なヌクレオチドがステム内に含まれてステムの強度を低下しうるか、または非相補的なステムの末端ヌクレオチド、例えば、一本鎖オーバーハングとして含まれる場合は、本発明の範囲内にある。後者は偽プライミングの危険があるので、どのオーバーハングも他の核酸配列と核形成（nucleation）して分枝点移動の開始点を与える能力のないものでなければならない。本発明によるプライマーにおいて核形成は、ループ配列の標的とのアニーリングによる。本出願および添付の請求の範囲に使われる「ステム」ならびに「相補的な3'および5'アーム配列」は十分広く、上記変異型を包含すると理解されるであろう。
【００２３】
5'アームが意図する標的と完全に非相補的であっても、プライマーを含有するオリゴヌクレオチドをコピーして合成される増幅産物はプライマーの完全な相補体を含有しうることは理解されるであろう。これは、合成の第一回目に達成した偽増幅産物の抑制などの識別の有効性を低下させ得る。最初の効果を増幅全体に維持するために、本発明によるプライマーのある特定の好ましい実施形態は、ループと5'アームとの間に「ターミネーターヌクレオチド」を装入することが挙げられる。本明細書に使われる「ターミネーターヌクレオチド」は、DNA合成中のポリメラーゼによる伸長を停止するヌクレオチドである。ターミネーターヌクレオチドは、例えば、4-メチルインドールβ-デオキシヌクレオシド（Moranら, 1996）であってもよい。5'アームとループの間にターミネーターヌクレオチドを挿入すると、5'アームのコピーが防止される。
【００２４】
本発明のヘアピンプライマーは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、ペプチド核酸（PNA）、他の改変したヌクレオチド、またはこれらの組合わせを含有してもよい。改変したヌクレオチドは、例えば、2'-O-メチルリボヌクレオチドまたはニトロピロールに基づくヌクレオチドが挙げられる。改変したヌクレオチド間連結はまた、例えば、ホスホロチオエートが挙げられる。5'アーム中の改変したヌクレオチドを利用すると、ステム強度を調節する方法が与えられる。特定の適用に対してそのような改変を用いることの他の利点は、当業者には明らかであろう。特に、改変したヌクレオチドから構築した本発明によるヘアピンプライマーは、そのプライマーをデオキシリボヌクレオチドから構築した場合より強いハイブリッドを形成しうるので、より容易にアクセスしうる構造化標的配列（メッセンジャーRNAで生じるもののような）が可能になる。
【００２５】
本発明によるプライマーのある特定の実施形態は、単一ヌクレオチド置換に対して高度の識別性がある。これらの実施形態においては、ループが置換を受け易い標的ヌクレオチドを含有する標的領域と相補的である。本発明ではそのヌクレオチドをループの中央部近くに配置する。さらに本発明では、単一ミスマッチの影響を最大限にするため、ループをできるだけ短く、すなわち、5〜9個のヌクレオチド長で作製する。
【００２６】
本発明のヘアピンプライマーは蛍光による増幅反応のモニタリングを可能にする。これらのプライマーを相互作用性蛍光部分を用いておよび他の標識を用いて標識し、遊離のプライマーが標識部分とは相互作用し得るが、二本鎖増幅産物と結合したプライマーの標識とは相互作用しないようにすることができる。検出に利用できる相互作用の1つは蛍光エネルギー移動であり、遊離のプライマーの蛍光をクエンチ（quench）するが、増幅産物と結合しているプライマーの蛍光はクエンチしない。その結果、増幅反応の経過を蛍光測定によってモニターしうる。特に有用なのは接触（touching）によるクエンチの相互作用であり、DABCYL、DABMI、DABSYLまたはメチルレッドなどの非蛍光のクエンチ分子を使い、フルオロフォア（fluorophore）が蛍光発色するのを防止し、遊離の浮遊プライマーを暗色にする。(a)本発明によるヘアピンプライマーは非常に特異的であって偽増幅産物を作製することはほとんど考えられず、また(b)本発明によるヘアピンプライマーの特定のヘアピン形状はそれらがお互いに相互作用してプライマーダイマーを形成する確率を著しく低下させるので、本発明によるヘアピンプライマーを利用する反応における蛍光シグナルの発生は、意図した増幅産物が合成されたことの優れた指標となる。さらに、増幅産物のリアルタイム検出中に発生する蛍光シグナルにより、サンプルに含まれる標的配列の初期数を正確に定量することができる。これは当業界の現行技術を超える改善である。現行技術においては、増幅反応をモニターするためにハイブリダイゼーションプローブを使わねばならないか、または他の増幅産物標識方法を用いるときはそれらの方法が目的の増幅産物から偽増幅産物を識別するのに十分に特異的ではなかった（Nazarenkoら,1997；Wittwerら,1997）。
【００２７】
本発明のヘアピンプライマーを用いる利点は予想されなかったものである。普通、プライマーのプライミング領域のヘアピンの存在は、プライマーのプライミング能力を低下させて有害であると考えられていた。そのような教示の例は、ポリメラーゼ連鎖反応用プライマーを設計するために使われるコンピュータープログラムに見られ、それらでは、アルゴリズムが自己相補的な（ヘアピンを形成する）配列を持つ推定プライマー配列を拒絶する（例えば、Haasら, 1998；およびRychlikら, 1989）。
【００２８】
本発明のヘアピンプライマーを用いて増幅反応における偽増幅産物合成の問題を解決することができる。普通のプライマー、すなわち、標的相補性領域が直鎖であるプライマーは偽増幅産物を産生しがちであり、その理由は、それらの3'末端が、無関係なDNAのまたは他のプライマーの部分的に相補的な配列と結合してDNA合成を開始し、目的ではないDNAポリメラーゼ用鋳型を産生するからである。次いでこれらの鋳型は、通常通り増幅され、偽陽性シグナルを生じる。しかし、本発明によるヘアピンプライマーの3'末端の配列は5'末端の配列とハイブリダイズしており、従ってそのループ配列が最初に標的配列にアニーリングしなければほとんど全く標的配列と結合することはない。ループ配列が標的配列の一部分と結合して形成されたハイブリッドは、次いで、分枝点移動によって長くなり、3'アーム配列は標的配列の残部と結合する。このプロセスは、標的配列が完全にループ配列と相補的でなければ、決して起こり得ないかまたは非常にまれである。部分的に相補的な配列がこの一連の事象に加わることはほとんど全くなくかつプライミングは起こらない。それ故に、非常にまれな場合を除いて、プライミングは標的鎖に完全に相補的な部位にだけ起こる。
【００２９】
本発明のヘアピンプライマーは、プライマーを利用する多数の核酸増幅プロセスに利用することができ、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、ストランド置換増幅（SDA）、核酸配列ベース増幅（NASBA）、転写介在増幅（TMA）、およびローリングサイクル増幅（RCA）が挙げられる。高い特異性とその結果としての低いミスプライミングにより、完全に相補的な標的以外の配列からのシグナルは、著しくかつ検出できる程度で遅延する。この遅延は、サーマルサイクリング増幅ではより遅い閾値サイクル数として；また等温増幅ではより遅い検出シグナル発生までの時間として現れる。
【００３０】
本発明のヘアピンプライマーを利用する核酸増幅アッセイは、反応終了時に増幅産物をポリアクリルアミドゲル電気泳動などの通常の方法によって検出するように設計してもよいし、または産物を増幅中にリアルタイムで通常の検出方法を使って検出してもよい。インターカレーション色素の使用およびプローブに基づく方法などの様々なリアルタイム検出法を利用してもよいし（Zubritsky, 1999によるレビューあり）、または標識したヘアピンプライマーの蛍光それ自身を、以下の実施例３に記載したように利用してもよい。
【００３１】
突然変異型であるサンプル中の突然変異型および野生型配列の割合を決定するために、DNAを含むサンプルの一部分を第１の反応で本発明の野生型特異的プライマーを使って増幅し、DNAを含むサンプルの第２の部分を本発明による突然変異型特異的プライマーを使って第２の反応で増幅する。もし増幅がサーマルサイクリングであれば、両反応の閾値サイクル数の差が元来のサンプル中の突然変異型および野生型配列の相対比率を示す。差が大きいほど、突然変異型の分率は小さい。もし増幅が等温であれば、検出シグナルが生じるのに必要な時間の差が相対比率を示す。
【００３２】
本発明によるヘアピンプライマーは、最初にプライミング配列である目的の標的に相補的な部分、すなわち、ループ３および3'アーム４（図１）を通常の方法で設計して調製できる。この目的のために、多数の設計プログラムが利用可能でありかつ文献に報じられている。例えば、Haasら（1998）、Rychlikら（1989）、Hillierら（1991）、Liら（1997）およびProutskiら（1996）を参照すること。一般的にこれらのプログラムは、15〜20個のヌクレオチド長の、場合によってはそれより若干長いプライマー配列を提供する。次に、5'アーム２（図１）を3'アーム４（図１）に相補的なオリゴヌクレオチド配列として設計し、ループ３用に５〜９個のヌクレオチド（短いプライミング配列用に５個のヌクレオチドおよび19個以上のヌクレオチドのプライミング配列用に９個のヌクレオチド）を残す。しかし、もし単一ヌクレオチド変化に対する識別が必要でなければ、ループ長は数個のヌクレオチドだけ増加し（実施例４）、13個のヌクレオチド長のループをもつプライマーであってもよい。
【００３３】
完全に相補的なDNA配列からDNA合成を開始し得るが、単一ヌクレオチド置換を含有する配列から開始することのない本発明によるプライマーを設計するには、プライマーの特異性を最大限にする必要がある。一般的に、プライマーが小さいほど、プライミングはより特異的である。しかし、ある特定の長さより小さいプライマーは相補的配列と結合しないので、DNA合成をプライミングできないであろう。本発明のヘアピンプライマーは、そのステムの効果によって高い特異性を達成する。ヘアピンステムの3'アームの配列およびヘアピンループの配列は、目的の（完全に相補的な）標的配列に相補的であるが、ヘアピンステムの5'アーム配列は目的の標的配列と結合しない。しかし、ヘアピンプライマーの伸長産物であるテンプレート分子をコピーして作製された増幅産物は、全ヘアピンプライマー配列の完全な相補体を含有し、従って、ヘアピンプライマーの5'アーム配列、ならびにループ配列および3'アーム配列は、その後の増幅ラウンドにおいてこれらの増幅産物と結合するであろう。従って、初期プライミング事象は増幅の特異性を決定するのに非常に重要である。ヘアピンプライマーのステムが長い（または強い）ほど、テンプレートとのアニーリングはより特異的であり、従ってプライミング反応はより特異的であろう。しかし、より長いステムを作ることはまた、プライマーの全長も増加するので、プライマーの特異性は低下する。これらの２つの設計判定基準をそれぞれ独立して最適化すると、ステム長に逆の影響を与える。従って、最大の識別を達成し得るステムに対する最適長さがある。ステム配列は突然変異部位周囲の標的配列により決定されるので、最適長さは標的配列の同一性に依存するであろう。ステムの最適長さは、通常５〜12個のデオキシリボヌクレオチドの間にあり、これは本発明の好ましい範囲である。下限はGCリッチ配列に対してであり、上限はATリッチ配列に対してである。DNAフォールディングプログラムを使ってプライマーのヘアピン構造を設計し、またそれらの安定性を予測することができる（SerraおよびTurner, 1995）。
【００３４】
ヘアピンプライマーと標的配列間の最初の接触は、3'アームが5'アームと結合していて標的配列との最初のハイブリダイゼーションに利用できないので、ヘアピンプライマーのループによってなされる。もし標的が完全に相補的であると認識されると、3'アームは5'アームから解離して標的と結合する。しかし、標的配列がループ配列と完全に相補的でなければ、最初の接触は短命でプライマーは標的配列から解離する。完全に相補的な標的配列とミスマッチ標的配列との間を識別する能力は、ループ長が減少するほど増加する。しかし、非常に短いループは標的とアニーリングするには短すぎるであろう。５〜９個のデオキシリボヌクレオチドのループが最適である。
【００３５】
上記の最初に設計したプライマーを、目的のアッセイにおいて完全に相補的な標的分子を用いて、および目的のアッセイにおいて１個のヌクレオチドが異なるのみである分子を用いて試験することができる。このような試験を以下の実施例１に記載した。試験の目的はアッセイに要求される特異性の程度が達成されているかどうかを確認することである。本発明によるプライマーは、相補的な標的のプライミングが、ヌクレオチドミスマッチをもつ配列のプライミングより少なくとも1000倍効率的であり、好ましくは5000倍効率的である。本発明者らは広範な最適化なしに10,000倍効率的である本発明によるプライマーを作っている。もし最初に設計したプライマーが、使用される増幅方法またはアッセイにおいて十分な特異性を有しない場合は、ステムの強度を増加すべきである。これは、例えば、（プライミング配列の長さを維持する）あるヌクレオチドを加えて5'アーム配列の長さを増加してもよい。長さを変える代わりの方法は、5'アームにおいて改変したヌクレオチドを置換することである。他の代わりの方法でかつ好ましい実施形態の一つは、ループと5'アームの間にターミネーターヌクレオチドを加えることである。ターミネーターヌクレオチドは、例えば、4-メチルインドールβ-デオキシヌクレオシド（Moranら,1996）であってもよい。ターミネーターヌクレオチドを使うことにより、作製された増幅産物はプライマーの5'アームと相補的な配列を含まない。これにより、第１ラウンドまたはサイクルに続く合成ラウンドにおいて最初の特異性が維持され、それによって全体の特異性が増加する。もしプライマーが、その完全に相補的な標的を増幅しない場合には、そのループ長さを増加すべきである。当業者であれば、記載の方法で容易にプライマーを最適化し得るであろう。
【００３６】
増幅中のアニーリング工程の温度は、プライミングの特異性に影響する非常に重要なパラメーターである。ポリメラーゼ連鎖反応において、特異性を最大化するためにこの温度を調節し得る。この調節は、等温である増幅方法ではできない。アニーリング温度が高いほど、特異性は高い。これは本発明のヘアピンプライマーについても成立する。ループ配列と3'アーム配列とを組合せた長さは、ヘアピンプライマーとサンプル中に存在する標的配列とのアニーリングにより形成される最初のプローブ標的ハイブリッドが、増幅反応のアニーリング温度より若干高い温度で解離するように選択する。最大の識別を与える正確なアニーリング温度は、体系的にアニーリング温度を変え、識別の程度を確認することにより、またはアニーリング工程の温度を一定の範囲内で変化させ得るグラジエントサーマルサイクラーを用いてこれらの測定を実施することにより実験的に見出すことができる。
【００３７】
本発明のプライマーは、それらが増幅産物中に取り込まれたことを蛍光によりモニターできるように、相互作用的な標識部分を用いて標識できる。増幅産物中に取り込まれたプライマーの蛍光は取り込まれていないものと非常に異なる。これにより、さらに分析をすることなく増幅産物を同定できる。さらに、相互作用的な標識部分を使用すると、合成される増幅産物のリアルタイム検出を実施することにより、最初の標的分子数を正確に定量することができる。
【００３８】
本発明者らは、「分子ビーコン」と呼ばれるヘアピン形状プローブに対し、相互作用的なフルオロフォアおよびクエンチャー（ならびに他の標識部分）を選択しかつ結合する最適な方法を記載した（TyagiおよびKramer, 1996；Tyagiら,1997；Tyagiら,1998）。分子ビーコンを用いるアッセイにおいてより高いシグナル-バックグラウンド比を得るには、フルオロフォアおよびクエンチャーがこれらのプローブのヘアピン状態ではお互いに非常に近く、そしてかつ標的結合状態ではお互いに離れていることが望ましい。本発明によるヘアピンプライマーに対しても両標識の同様な結合様式が理想的である。しかし、分子ビーコンにおいては、クエンチャー部分DABCYLは通常3'-ヒドロキシル基に結合していて、DNAポリメラーゼが存在する場合にはプローブの3'末端における伸長をブロックする。しかし、ヘアピンプライマー（テンプレート鎖のコピー合成を開始することを目的とするもの）においては、伸長が起こるために非ブロックの3'-ヒドロキシル基が必要である。このため、3'-ヒドロキシル位置への標識の結合は不可能である。本発明者らは、標識を結合する他の方法を探索した。第１の方法においては、フルオロフォアを分子ビーコンの場合のようにプライマーの5'アームの5'末端に結合させる；しかし、クエンチャーは3'アーム内の内部位置に結合させる。フルオロフォアおよびクエンチャーをお互いに近く運ぶアーム内のクエンチャーの位置は、3'末端から約４〜６ヌクレオチドである。好ましい実施形態においては、クエンチャーを、それらの位置の１つでチミジンヌクレオチドに（それが可能な配列であれば）結合させる。結合は、チミジン環から出ている6-炭素スペーサーを有しかつ第一級アミノ基末端をもつチミジン誘導体を用いて達成する。クエンチャーをこの第一級アミノ基に、TyagiおよびKramer（1996）が記載した方法を用いてコンジュゲートできる。あるいは、スペーサーおよびクエンチャーを含有するチミジンホスホロアミダイトを自動DNA合成中に使用して、後合成ステップの必要性を省く。実施例３はそのようなプライマーを記載する。第２の方法においては、クエンチャーを担持するチミジン残基もプライマーの3'末端に配置してもよい。得られる分子は、3'-ヒドロキシル部分が伸長に利用可能であり、かつ非常によく消光される（２つの標識部分はお互いに近接していてかつお互いに相互作用しない）ので良いプライマーとなる。
【００３９】
これらのプライマーは、異なる色範囲で蛍光を放射する様々なフルオロフォアを用いて標識することができる。複数のこれらの異なる色のヘアピンプライマーを同じ反応混合物中に使って異なる標的配列のコピーを同時に作製してもよく、増幅産物のそれぞれのタイプはそれ自身の特徴的な色を蛍光発色するであろう（そのヘアピンプライマーと連結したフルオロフォアの同一性によって確認する）。Tyagiら（1998）が記載した方法を使って、これらのプライマーのフルオロフォアの標識および適当なクエンチングを実施することができる。
【００４０】
実施例１
本発明者らは、遺伝子内に存在すると循環器疾患のリスクが高まる、ヒトのメチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼに対する遺伝子の点突然変異（この突然変異は「C677T突然変異」と呼ばれる）である単一ヌクレオチド置換を検出するための標的増幅アッセイを設計した。本発明者らはポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を増幅プロセスとして選択した。突然変異の位置を含む遺伝子の配列を認識するために、一対のフォワードヘアピンプライマーを設計した。これらのプライマーはそれぞれ、3つの部分、すなわち5'アーム、中央ループ、および5'アームと相補的である3'アームから構成された。3'アームおよびループにより作られた配列は標的配列（C677T突然変異の部位を包含した）と相補的であった。両ヘアピンプライマーは、ループ内の１つのヌクレオチドを除くと、同一物であった。一方のプライマーは野生型標的配列と相補的であり、他方のプライマーは突然変異型標的配列と相補的であった。野生型特異的プライマーの配列は5'-GATGAAAGGAGCCGATTTCATC-3'であり、突然変異型特異的プライマーは、5'-GATGAAAGGAGTCGATTTCATC-3'であって、ここで下線は同じ配列を示し、それぞれの配列の太字(それぞれ5'側から12番目のCとT)は、C677T突然変異部位に生じうる変異型ヌクレオチドの１つに完全に相補的であるヌクレオチドを示す。これらのフォワードプライマーのそれぞれを、別々の反応において、共通のリバースプライマー（通常の直鎖プライマー）と組み合わせて使い、メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子の小セグメントを増幅した。２種類のポリメラーゼ連鎖反応の一方は野生型テンプレートを用いて開始し、他方のポリメラーゼ連鎖反応は突然変異型テンプレートを用いて開始し、それぞれの反応の進行は、得られる増幅産物をインターカレーション色素であるSYBRグリーンを用いて蛍光発色させてリアルタイムでモニターした。また対照として、本発明者らは、ヘアピンプライマーの代わりに、C677T突然変異部位の外側が標的配列である通常のフォワードプライマーを使った。この「ニュートラル」フォワードプライマーは、野生型増幅産物および突然変異型増幅産物の合成を同じ速度で行う。
【００４１】
アッセイの条件は次の通りであった；それぞれの反応物50μlは、20,000個のテンプレートDNA分子（突然変異型または野生型）、0.1μMの野生型特異的フォワードヘアピンプライマー（または0.5μMのC677T突然変異部位の外側に標的配列がある通常のフォワードプライマー）、0.5μMの通常のリバースプライマー、dATP 0.25mM、dCTP 0.25mM、dGTP 0.25mM、dUTP 0.50mM、AmpliTaq Gold DNAポリメラーゼ（Perkin-Elmer）2.5単位、KCl 50mM、MgCl2 3.5mM、1 X SYBRグリーン（Molecular Probes, Inc.）、およびTris-HCl(pH 8.3) 10mMを含有した。40サイクルの増幅（94℃変性を30秒間、55℃アニーリングを60秒間、72℃重合を30秒間）を、Applied Biosystems 7700プリズム分光蛍光サーマルサイクラー中で、密封したチューブに入れて実施した。緑色蛍光を、各サイクルのアニーリング工程中、リアルタイムでモニターした。蛍光を、各増幅に対するPCRサイクル数の関数として図２に示したが、曲線21は直鎖フォワードプライマーおよび20,000分子の野生型テンプレートを含有し；曲線22は直鎖フォワードプライマーおよび20,000分子の突然変異型テンプレートを含有し；曲線23は野生型特異的ヘアピンプライマーおよび20,000分子の野生型テンプレートを含有し；そして曲線24は野生型特異的ヘアピンプライマーおよび20,000分子の突然変異型テンプレートを含有する。
【００４２】
実施した４種類の反応のそれぞれにおける蛍光増加を図２に示した。それぞれの反応がポジティブになるサーマルサイクルである「閾値サイクル」（すなわち、蛍光シグナルが蛍光バックグラウンドの標準偏差の10倍強くなるサーマルサイクル）は反応の最初に存在していたテンプレート分子数を示す。通常のまたはニュートラルプライマーをフォワードプライマーとして（ヘアピンプライマーの１つの代わりに）使用すると、20,000分子の野生型テンプレートが最初に存在したかまたは20,000分子の突然変異型テンプレートが最初に存在したかに関わらず、同じ閾値サイクル（サーマルサイクル16）が観察され、反応が同じ数のテンプレート分子によって開始したことを示した（曲線21、22）。しかし、野生型特異的ヘアピンプライマーを使用すると、20,000分子の野生型テンプレートを用いて開始した反応は20サイクル後にポジティブとなった（曲線23）が、20,000分子の突然変異型テンプレートのみを用いて開始した反応は31サイクル後にポジティブとなった（曲線24）。増幅産物の数はサーマルサイクル毎に２倍になるので、それぞれの反応に対して観察された閾値サイクルの11サイクル差は、「遅延した」反応は「より速い」反応の1/2,000で開始したことを示す。しかし、これらの２つの反応は実際には同じ数のテンプレート分子で開始した。見かけの遅延は、突然変異型テンプレートを使って反応を開始したときの野生型特異的プライマーの増幅産物合成のプライミングにおける効率は、野生型テンプレートを使って反応を開始したときの1/2000であったことを示した。これらの結果は、ヘアピンプライマーを含有するアッセイは、野生型標的分子の1/2000の量で存在する突然変異型標的分子を検出できることを意味する。同じテンプレートおよび同じヘアピンプライマーを利用した他の実験において（および異なるテンプレートならびに適当な野生型特異的および突然変異型特異的ヘアピンプライマーを利用した実験においても）、14サーマルサイクルもの閾値サイクル差が観察されている。これらの結果はヘアピンプライマーを含有するアッセイを使って、野生型標的分子の1/10,000の量で存在する突然変異型標的分子を検出できることを実証する。
【００４３】
実施例２
多数の野生型標的を含む集団中でのごく少数の変異型標的の検出における、本発明のヘアピンプライマーの有用性を示すために、変異型鋳型と野生型鋳型の混合物により開始される一連のポリメラーゼ連鎖反応を行った。これらの混合物における変異型鋳型の割合を、０、0.1、1.0、50.0、99.0、99.9、100％まで、鋳型DNAの総濃度を常に一定(20,000分子)として変化させた。これらの各混合物を、第１の反応においては野生型特異的ヘアピンプライマーを用いて、第２の反応では対応する変異型特異的プライマーを用いて増幅した。これらのプライマーは単一のヌクレオチドが異なるものであった。反応条件は実施例１について記述された条件と同じであった。各鋳型混合物について得られた閾値サイクル数は図３にプロットされており、図中で曲線32は野生型特異的プライマーを含む反応で得られた結果を示し、曲線31は変異型特異的プライマーを含む反応で得られた結果を示す。この結果は、純粋な野生型鋳型によって、野生型特異的プライマーについては閾値サイクル数が低くなり、変異型特異的プライマーについては閾値サイクル数が高くなることを示す。純粋な変異型鋳型については逆となるのが事実である。得られる閾値サイクル数の差は純粋な鋳型に関して最大であるが、一方の鋳型の型の割合が増えて他方の鋳型の型が減ると差は減少した。99.9％の野生型鋳型を含む集団中の、わずか0.1％の変異型鋳型であっても純粋な野生型鋳型と区別することができた。図４は、図３に示された実験において得られたデータを標準曲線の作成に用いる方法を示すが、この方法では２種類の異なる増幅反応(ここでは各サンプルについて行ったポリメラーゼ連鎖反応であり、一方の反応においては野生型特異的ヘアピンプライマーを用い、他方の反応では対応する変異型特異的ヘアピンプライマーを用いた)において測定された閾値サイクル数(TC)の差を、サンプル中に存在する変異型および野生型標的の集団における変異型標的の割合に対してプロットしている。この差は、野生型特異的ヘアピンプライマーを含む反応から得られた閾値サイクル数から、変異型特異的ヘアピンプライマーを含む反応から得られた閾値サイクル数を引くことにより得られる。曲線41は、既知のサンプルを用いて得たものであり、未知のサンプル中に存在する変異型鋳型の割合を測定するための標準として利用できる。これらの結果は、本発明のエアピンプライマーが、１個のヌクレオチド置換によりもたらされる最少の残基による疾患の診断に好適であることを示す。
【００４４】
実施例３
本発明のヘアピンプライマーが、増幅産物中へ取り込まれる際にプライマーの蛍光が増加するように標識できることを示すために、本発明者らは、図５に示す配列を有するヘアピンプライマー51を合成した。このプライマーは長さが８ヌクレオチドのループ配列と長さ７ヌクレオチドのステム配列であり、合わせて長さ15ヌクレオチドの標的と相補的な配列となっている。DABCYLクエンチャー部分52が、該オリゴヌクレオチドの3'末端から５番目のヌクレオチド(チミジンヌクレオチド)に、ヘキサアルキルスペーサー53を介して共有結合により連結され、またフルオレセイン部分54は、ヘキサアルキルスペーサー55を介してオリゴヌクレオチドの5'末端に連結されている。TyagiおよびKramer(1996)により記述された方法を用いて、このプライマーを構築した。このプライマー中のフルオロフォア54の蛍光が、プライマーを標的核酸の不在下でインキュベートした場合にクエンチされることが判明した。このプライマーを完全に相補的な標的の存在下でインキュベートした場合には、その蛍光が実質的に増大する。このプライマーを、インターカレート蛍光色素であるSYBR Greenを入れなかった以外は実施例１に記載の条件と同じ条件下で行った２種類のポリメラーゼ連鎖反応に利用した。第１の反応は、ヘアピンプライマーのループ配列および3'アーム配列に完全に相補的である標的配列を含む20,000個の鋳型分子を用いて開始し、一方で第２の反応には鋳型DNAを含めなかった。ポリメラーゼ連鎖反応の各アニーリング段階の間、フルオレセインの蛍光強度をリアルタイムでモニターし、両方の反応に関して、実行された熱サイクルの回数の関数として結果を図６にプロットした。この結果は、曲線61に示す鋳型DNAにより開始された反応混合物の蛍光が、ポリメラーゼ連鎖反応が直線期になると劇的に増加した。しかしながら、曲線62で示す、鋳型DNAを全く含まない反応での蛍光はポリメラーゼ連鎖反応の過程全体を通して低いままであった。増幅過程の終了時に２種類の反応混合物の蛍光強度を比較すると、それらの蛍光には差があり、鋳型DNAの不在下で開始された反応物は、鋳型DNAにとともに開始された反応物と、紫外線ランプで反応チューブを単に発光させることにより容易に識別することができた。本発明者らはまた、上記とは異なる標識スキームを用いた本発明のヘアピンプライマーを合成し、得られた標識ヘアピンプライマーを試験した。この別の標識スキームでは、プライマーの3'末端は、デオキシリボース部分の3'ヒドロキシル基に連結されるのではなく、ヌクレオチドに連結されたヘキサアルキルスペーサーを介してフルオレセイン部分に共有結合により連結されたチミジンヌクレオチドとした。このプライマーは5'-DABCYL部分を有していた。プライマーは良好にクエンチされ、増幅産物中に取り込まれた場合にプライマーの蛍光が回復した。フルオレセイン部分が3'ヌクレオチドに結合しているにもかかわらず、このプライマーは、増幅反応においてDNAポリメラーゼとのインキュベーションにより通常のプライマー同様に伸長された。
【００４５】
実施例４
本発明のヘアピンプライマーが、増幅反応の間に偽の増幅産物が合成されるという問題を解決することを示すために、本発明者らは、一組の従来技術の直線状プライマーであって、いずれの鋳型DNAも存在しないで開始される増幅反応において用いられた場合には通常は偽増幅産物を産生するプライマーを使用した。これらのプライマーの配列を用いて、従来技術のプライマーが結合するように設計されたのと同じ標的配列に関して、本発明のヘアピンプライマーを設計し、構築した。続いて本発明者らは、ポリメラーゼ連鎖反応において従来技術のプライマーの代わりに対応するヘアピンプライマーを使用すると、ヘアピンプライマーは、標的鋳型DNAの存在下で開始された反応では期待される増幅産物を産生したが、鋳型DNAの不在下で開始された反応では、(従来技術プライマーを含んだ反応とは異なり)偽増幅産物を産生しなかった。第１の従来技術プライマーの配列は5'-GGCCGGTGGTCGCCGCG-3'であり、第２の従来技術のプライマーの配列は5'-ACGTGACAGACCGCCGGGC-3'である。対応する第１のヘアピンプライマーの配列は5'-CGCGGCCGGTGGTCGCCGCG-3'であり、対応する第２のヘアピンプライマーの配列は5'-GCCCGGACGTGACAGACCGCCGGGC-3'であり、下線部はヘアピンのアームを示す。これらのプライマーは、ミコバクテリウム・ツベルクロシス(Mycobacterium tuberculosis)のRNAポリメラーゼ遺伝子の領域を増幅するために設計された。
【００４６】
第１および第２のヘアピンプライマーの設計は、２つの設計上のポイントの例である。第１のヘアピンプライマーに関しては、本発明者らは、長さ８ヌクレオチドのループと長さ６ヌクレオチドのステムが、第１の従来技術のプライマーの5'末端にわずか３個のヌクレオチドを付加することにより得られることに注目した。これは、偶然の相補性により、この特定の例においてのみ可能であった。第１の従来技術のプライマーの5'末端に存在する３個のヌクレオチドが、5'アーム中の３個のヌクレオチドであることに注意されたい。第２のヘアピンプライマーでは、5'アームは６個の付加されたヌクレオチドを含む。しかしながら、この例では、ループの長さは13ヌクレオチドであり、５〜12ヌクレオチドの好ましい範囲外のものである。この例では、本発明者らは１ヌクレオチド置換を識別する実験を行わなかった。４種類のポリメラーゼ連鎖反応を行った。このうちの２種が従来技術のプライマーを含み、２種がヘアピンプライマーを含んでいた。反応の各組の一方は標的鋳型DNAの存在下で開始され、反応の各組のもう一方はいずれの鋳型DNAも含んでいなかった。これらの反応の進行を、蛍光インターカレート色素であるSYBR Greenを用いて、増幅反応の過程で産生されたあらゆる増幅産物を標識してモニターした。増幅反応の過程の間に観察された蛍光強度の変化を図７に示す。この結果は、第１と第２の従来技術のプライマーおよび20,000個の鋳型分子を含んだ反応(曲線71)では、16回の熱サイクルが完了した後にポジティブとなり、従来技術のプライマーを含むが鋳型DNAを含まない反応(曲線73)では、29回の熱サイクルが完了した後にポジティブとなったことを示す。これは、反応の過程で偽増幅産物が産生されたことを示している。続いて、これらの増幅産物をポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析したところ、第１の反応では正規の増幅産物が形成されたが、第２の反応では予想外のサイズの偽増幅産物が産生されたことが示された。偽増幅産物はプライマーのダイマーと思われる。しかしながら、第１および第２のヘアピンプライマーを従来技術のプライマーの代わりに用いたところ、20,000個の標的鋳型分子ととともに開始した反応(曲線72)では17回の熱サイクルが完了した後にポジティブとなり、いずれの鋳型分子も含まない反応(曲線74)ではポジティブにはならなかった。続いて、これらの増幅産物をポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析したところ、第１の反応では期待通りの増幅産物が形成されたが、第２の反応ではいずれの増幅産物も形成されなかったことが確認された。これらの結果は、本発明のヘアピンプライマーが、増幅反応の間に偽増幅産物が合成される問題を解決するために有用であることを確証するものである。ヘアピンプライマーが偽増幅産物の合成を抑制する理由は、ループ中の配列のみがプライマー−鋳型ハイブリッドの開始に利用できるため、またヘアピンループ中のハイブリダイゼーション配列の存在により、プライマーと標的核酸間の相互作用が、従来の直線状プライマーが標的核酸にハイブリダイズする場合に生じる相互作用よりも遙かに特異性が高いためである。さらに、ヘアピンプライマーの構造は、プライマーのアーム中に存在する配列がプライマーの標的核酸への最初のハ���ブリダイゼーションに参加しないようになっている。その帰結として、増幅反応の間の、プライマー同士の結合(従来の直線状プライマーを用いた場合に生じ得る、所望ではない増幅し得るプライマーダイマーを生成され得る結合)が、ヘアピンプライマーを用いた場合には遙かに生じにくくなる。
【００４７】
参考文献
Gelfandら、(1996) 米国特許第5,487,972号.
Haas, S., Vingron, M., Poustka, A.およびWiemann, S. (1998) 「大スケールでの配列決定のためのプライマーの設計」(Primer design for large scale sequencing). Nucleic Acids Res. 26, 3006-3012.
Lengauer, C., Kinzler, K. W.およびVogelstein, B. (1998) 「ヒト癌における遺伝的不安定性」(Genetic instabilities in human cancers). Nature 396, 643-649.
Livakら、(1996) 米国特許第5,538,848号.
Monia, B. P., Johnston, J. F., Ecker, D. J., Zounes, M. A., Lima, W. F.およびFreier, S. M. (1992) 「アンチセンスオリゴヌクレオチドによる変異型Ha-ras mRNA発現の選択的阻害」(Selective inhibition of mutant Ha-ras mRNA expression by antisense oligonucleotides). J. Biol. Chem. 267, 19954-19962.
Moranら、(1996) Nucleic Acids Res. 24, 2044-2052.
Nazarenko, I. A., Bhatnagar, S. K.およびHohman, R. J. (1997) 「エネルギー転移に基づくDNAの増幅および検出のための閉鎖管フォーマット」(A closed tube format for amplification and detection of DNA based on energy transfer). Nucleic Acids Res. 25, 2516-2521.
Newton, C. R., Graham, A., Heptinstall, L. E., Powell, S. J., Summers, C., Kalsheker, N., Smith, J. C.およびMarkham, A. F. (1989) 「DNAにおける任意の点変異の分析；増幅抵抗性変異系」(Analysis of any point mutation in DNA. The amplification refractory mutation system (ARMS)). Nucleic Acids Res. 17, 2503-2516.
Serra, M. J.およびTurner, D. H. (1995) 「RNAの熱力学的特性の予測」(Predicting thermodynamic properties of RNA). Methods Enzymol. 259, 242-261.
Tyagi, S.およびKramer, F. R. (1996) 「分子ビーコン：ハイブリダイゼーションの際に発光するプローブ」(Molecular beacons: probes that fluoresce upon hybridization). Nat. Biotechnol. 14, 303-308.
Tyagiら、(1997) PCT国際公開公報WO97/39008.
Tyagi, S., Bratu, D. P.およびKramer, F. R. (1998) 対立遺伝子の識別のための複数色の分子ビーコン(Multicolor molecular beacons for allele discrimination). Nat. Biotechnol. 16, 49-53.
Wittwer, C. T., Herrmann, M. G., Moss, A. A.,およびRasmussen, R. P. (1997) 高速サイクルDNA増幅の連続的蛍光モニタリング(Continuous fluorescence monitoring of rapid cycle DNA amplification). Biotechniques 22, 134-138.
Wu, D. Y., Ugozzoli, L., Pal, B. K.およびWallace, R. B. (1989) 「鎌状赤血球性貧血症の診断のためのβ-グロビンゲノムDNAの対立遺伝子特異性な酵素的増幅」(Allele-specific enzymatic amplification of beta-globin genomic DNA for diagnosis of sickle cell anemia). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 2757-2560.
Zubritsky, E. (1999) 「ピン止めPCR法」(Pinning down PCR). Anal. Chem. 71, 191A-195A.
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は本発明のヘアピンプライマーが単一ヌクレオチド置換の検出に用いられる様式を図示したものである。
【図２】  図２は単一ヌクレオチド置換を検出する、本発明のポリメラーゼ連鎖反応法(PCR)の蛍光強度の変化を完了した熱サイクルの数の関数として示す。
【図３】  図３は、本発明のプライマー、それは変異型特異的プライマーもしくは野生型特異的プライマーのいずれかであるが、それが用いられる場合に、変異型および野生型配列の双方(そこでは変異型配列は野生型配列とヌクレオチド1個の置換のみ異なっている)を含有する分子の混合物中に存在する、変異型標的の比率の関数としてどのようにPCR閾サイクル数が変化するかを示している。
【図４】  図４は、2つの異なるポリメラーゼ連鎖反応(1つの反応は本発明の野生型特異的プライマーを含有するものであり、もう一方の反応は本発明の変異型特異的プライマーを含有するものである)で測定された閾サイクル数を、変異型と野生型の配列を含有している分子の集団(そこでは変異型配列は野生型配列とヌクレオチド1個の置換のみ異なっている)中の変異型標的の相対的な量を測定するために用いることを可能にする標準曲線を示す。
【図５】  図５は、本発明の標識プライマー中のヌクレオチド配列およびフルオロフォアとクエンチャー部分の結合様式を示す。
【図６】  図６は、本発明の標識プライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応の蛍光強度の変化を完了した熱サイクルの数の関数として示す。
【図７】  図７は、本発明のプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応の蛍光強度の変化を完了した熱サイクルの数の関数として示す。
【図１】
0003843215.tif 000002
【図２】
0003843215.tif 000003
【図３】
0003843215.tif 000004
【図４】
0003843215.tif 000005
【図５】
0003843215.tif 000006
【図６】
0003843215.tif 000007
【図７】
0003843215.tif 000008