(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
インターロイキン２受容体γ鎖に結合する活性を持つ物質であることを指標として選択することを特徴とする、インターロイキン４シグナル伝達系の阻害剤を選択する方法。
【請求項２】
インターロイキン２受容体γ鎖に結合する活性を持つ物質がモノクローナル抗体である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
モノクローナル抗体がＧＰ−２である、請求項２記載の方法によって選択されたインターロイキン４シグナル伝達系の阻害剤。
【請求項４】
モノクローナル抗体がＧＰ−４である、請求項２記載の方法によって選択されたインターロイキン４シグナル伝達系の阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、インターロイキン４（以下、ＩＬ−４ということがある）のシグナル伝達系の阻害剤を含有する免疫抑制、抗アレルギー剤、より詳細には、インターロイキン４のシグナル伝達系の阻害剤として、抗インターロイキン２受容体γ鎖抗体に認識されるエピトープを有し、インターロイキン４のシグナル伝達に関与するインターロイキン４受容体構成分子に対して作用する物質を含有する免疫抑制、抗アレルギー剤に関する。
【０００２】
さらに本発明は、インターロイキン４のシグナル伝達系の阻害剤として、抗インターロイキン２受容体γ鎖抗体に認識されるエピトープを有しかつインターロイキン４のシグナル伝達に関与するインターロイキン４受容体構成分子に結合する抗体、または抗体の一部のアミノ酸配列を含むポリペプチド、あるいは抗体の一部のアミノ酸配列を置換したポリペプチドを含有する免疫抑制、抗アレルギーに関する。
【０００３】
本薬剤は、ＩＬ−４の産生に伴うＩｇＥ抗体の過剰産生が発症に関与していると考えられる疾患、例えばアナフィラキシーショック、気管支喘息、アトピー性皮膚炎、じんま疹を始めとする種々のアレルギー性疾患や、慢性関節リウマチ等の自己免疫疾患を代表とする種々の慢性炎症性疾患の治療薬として有用である。
【０００４】
【従来の技術】
アレルギー性疾患、特にＩ型アレルギーに分類される疾患としては、気管支喘息、アトピー性皮膚炎、じんま疹、花粉症、アレルギー性鼻炎、アレルギー性胃腸炎、アナフィラキシーショック等が知られている。このＩ型アレルギーの発症機序は以下のように考えられている。
【０００５】
まず、抗原となる物質が生体内に侵入すると、その抗原物質に反応して、生体内の免疫反応が惹起される。すなわち、マクロファージ（Ｍφ）等の食細胞や、抗原受容体を有するＢ細胞により、抗原が貪食されたり、結合することにより細胞内へと運ばれる。細胞内において抗原は分解され、その一部の構造がＭφ細胞上の主要組織適合性抗原とともに、Ｔ細胞上の受容体を介して抗原特異的Ｔ細胞に認識される。抗原特異的Ｔ細胞は、種々のサイトカインを分泌して、抗原特異的なＢ細胞を刺激する。刺激を受けたＢ細胞は、ＩｇＥ抗体産生細胞へと分化し、抗原特異的なＩｇＥ抗体が大量に産生されるようになる。産生されたＩｇＥ抗体は、局所、あるいは血流中に存在する抗原に結合して免疫複合体を形成する。形成された免疫複合体は肥満細胞の細胞表面上に発現しているＦｃε受容体に結合し、細胞を活性化する。活性化された肥満細胞は、ヒスタミン、セロトニン、ロイコトリエン類、プロスタグランジン類を始めとする種々のケミカルメディエーターを分泌し、これらのケミカルメディエーターの作用により、平滑筋収縮や血管透過性の亢進等が生じ、前述のアレルギー性疾患として現れる。
【０００６】
現在、これらのアレルギー性疾患の治療には、その殆どが肥満細胞からのケミカルメディエーターの生成、遊離抑制剤、あるいは分泌されたケミカルメディエーターの結合する受容体拮抗剤が用いられている。しかし、それらの薬剤は、効果が見られるまでに通常長時間投与する必要があるため、副作用が懸念される。実際、抗ヒスタミン薬を代表とする胃腸障害作用は問題視されている。
【０００７】
また、効果が高く、速効性の薬剤としてステロイド剤も使われている。ステロイド剤は、ケミカルメディエーターの産生抑制作用のほかに、免疫抑制作用を併せ持つため、上記のアレルギーの発症機序における様々な作用点において抗アレルギー作用を示す。このようにステロイド剤は著効性である反面、非選択的な免疫抑制作用が故の重篤な副作用が生じることが知られている。
【０００８】
従って、副作用が少ない安全でかつ効果の高い抗アレルギー剤の開発が望まれている。
【０００９】
さて、Ｉ型アレルギー反応は上述のごとく、抗原特異的な免疫反応、特にＴ細胞／Ｂ細胞相互作用に伴う抗原特異的なＩｇＥ抗体の産生に端を発する反応である。従って、抗原特異的なＩｇＥ抗体の産生を抑制することが可能となれば、効果の高い抗アレルギー剤となりうる可能性が高い。しかも、抑制の選択性を上げることにより、副作用の惹起も最低限に抑えることができる。
【００１０】
Ｔ細胞より産生されて、Ｂ細胞に作用し、Ｂ細胞をＩｇＥ抗体産生細胞へと分化させる因子としてインターロイキン４（ＩＬ−４）が知られている（J. Immunol., 136, 4538 (1986)）。ＩＬ−４は以前、ＢＳＦ−１（Ｂ細胞刺激因子−１）、ＢＣＧＦ−１（Ｂ細胞増殖因子−１）、ＢＣＤＦγ（Ｂ細胞分化因子−γ）、ＩｇＧ１誘導因子、ＩｇＥ誘導因子等と呼ばれて個々に研究されていたが、１９８６年にその遺伝子が単離され（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 5894 (1986)）、これらの因子が同一分子であることが明らかとなるとともに、リコンビナント体を用いた研究により、更に種々の生理活性が見いだされた分子である。
【００１１】
ＩＬ−４は、ＩＬ−４応答細胞上に発現しているＩＬ−４受容体に結合して生物活性を発揮する。ＩＬ−４受容体は、Ｂ細胞、Ｔ細胞、肥満細胞、マクロファージ等種々の細胞に発現していることが知られており（J. Immunol., 140, 456 (1988)）、同受容体を構成する蛋白質の遺伝子が単離されている。同蛋白質は分子量が約１３０〜１５０ｋｄの糖蛋白であることが明らかとなっている（Cell, 59, 335 (1989)、Int. Immunol., 2, 669 (1990)）。更に、単離されたＩＬ−４受容体構成蛋白質遺伝子を導入した細胞を用いた実験から、ＩＬ−４の結合は、この分子量が約１３０〜１５０ｋｄの蛋白のみで十分であり、その結合親和力は、およそ１０-10 Ｍであることが明らかとなった（Cell, 59, 335 (1989)、Int.
Immunol., 2, 669 (1990)）。
【００１２】
ＩＬ−４の作用を抑制する方法として、ＩＬ−４とＩＬ−４受容体との結合の阻害する方法、ＩＬ−４受容体から核へのシグナル伝達を阻害する方法等が考えられる。ＩＬ−４とＩＬ−４受容体との結合の阻害する物質として抗ＩＬ−４抗体（Nature, 315, 333 (1985)）、抗ＩＬ−４受容体抗体（J. Immunol., 144, 4212 (1990)）が現在知られている。実際にこれらの抗体を用いた動物実験により、ＩＬ−４の作用を抑制すると、ＩｇＥ抗体の産生が完全に抑制されること（J. Immunol., 141, 2335 (1988)、Int. Immunol., 3, 599 (1991)）が報告されている。一方、ＩＬ−４受容体から核へのシグナル伝達を阻害する物質は現在まで知られていない。ＩＬ−４受容体から核へのシグナル伝達を阻害する物質を見いだすためには、ＩＬ−４受容体系を理解する必要があるが、ＩＬ−４の受容体系は受容体構成分子の遺伝子が単離された現在に至っても完全には明らかにされていない。
【００１３】
ところで、ＩＬ−４受容体は、その細胞外領域が、他のサイトカイン、例えばＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−５、ＩＬ−６等の受容体と一次構造上の共通性があり、いわゆるサイトカイン受容体ファミリーを形成していることが知られている（Trends. Biochem. Sci., 15, 265 (1990)、Immunol. Today, 11, 350 (1990)）。これらのサイトカイン受容体は、主にリガンドを結合する働きを持つ分子と、主にシグナル伝達やリガンドの結合親和力を変化させる働きを持つ分子の複数の構成分子から構成されているものが多い。特にＩＬ−３受容体、ＩＬ−５受容体、及びＧＭ−ＣＳＦ受容体は、それぞれのリガンドの結合親和力を上昇させ、シグナル伝達に関与する第２の構成分子が共通の分子であること（Cell, 66, 1165 (1991)、Cell, 66, 1175 (1991)）、また、同様にＩＬ−６受容体、ＬＩＦ受容体、オンコスタチンＭ受容体、ＣＮＴＦ受容体の第２の構成分子も共通の分子であることが明らかとなり（Science, 255, 1434 (1992)、Cell, 69, 1121 (1992)）、その生理的意義が注目されるとともに、サイトカイン受容体が新しいカテゴリーにより分類されつつある。
【００１４】
ＩＬ−４受容体の場合にも、細胞内領域に当たるアミノ酸配列中には、インスリン受容体やＰＤＧＦ受容体にみられるようなチロシンキナーゼ配列を見いだすことができないことや、ＩＬ−４の変異体を用いた研究結果から（EMBO J., 12, 2663 (1993)）、すでに知られている分子量約１３０〜１５０ｋｄの蛋白質に加え、ＩＬ−４の結合親和力を変化させ、シグナル伝達に関与すると考えられる第２の受容体構成分子の存在が想定されているが、その実態については殆ど明らかにされていない。
【００１５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、ヒトＩＬ−４受容体から核へのシグナル伝達の阻害剤を含有する免疫抑制、抗アレルギー剤を提供することである。
【００１６】
本薬剤は、ＩＬ−４の産生に伴うＩｇＥ抗体の過剰産生が発症に関与していると考えられる疾患、すなわちアナフィラキシーショック、気管支喘息、アトピー性皮膚炎、じんま疹を始めとする種々のアレルギー性疾患や、慢性関節リウマチ等の自己免疫疾患を代表とする種々の慢性炎症性疾患の治療薬として有用である。
【００１７】
【課題を解決するための手段】
本発明の目的である、ヒトＩＬ−４受容体から核へのシグナル伝達の阻害剤を含有する免疫抑制、抗アレルギー剤を提供するためには、ＩＬ−４のシグナル伝達に関与すると考えられる第２の構成分子を取得することが必要である。
【００１８】
ところが、上述のように、ＩＬ−４のシグナル伝達に関与すると考えられる第２の構成分子については現在まで殆ど情報がないため、直接該構成分子に結合してＩＬ−４のシグナル伝達を阻害する活性を有するモノクローナル抗体を作製するのは非常に困難である。
【００１９】
ところで本発明者らは、既にインターロイキン２（以下、ＩＬ−２ということがある）受容体の構成分子であるＩＬ−２受容体γ鎖分子の遺伝子を単離するとともに、ＩＬ−２受容体系を完全に解明している（欧州特許出願公開 O 578 932A、Science, 257, 379 (1992)）。すなわち、該ＩＬ−２受容体γ鎖分子は、分子量が６４ｋｄで、ＩＬ−２の結合親和力を上昇させ、シグナル伝達に直接関与する分子である。また、ＩＬ−２のシグナル伝達を抑制する活性を有するＩＬ−２受容体γ鎖分子に対するモノクローナル抗体も作成している（特願平6-82836）。
【００２０】
そこで本発明者らは、ＩＬ−４受容体とＩＬ−２受容体β鎖分子の細胞内領域の一部のアミノ酸配列が似ていることに注目し、ＩＬ−２受容体β鎖分子に結合して、ＩＬ−２シグナル伝達に関与するＩＬ−２受容体γ鎖分子が、１３０〜１５０ｋｄのＩＬ−４受容体構成分子にも結合して、ＩＬ−４のシグナル伝達に関与する構成分子としても機能しているのではないかという仮説をたてた。
【００２１】
そして、既に本発明者らにより発明された、ＩＬ−２のシグナル伝達を抑制する活性を有するＩＬ−２受容体γ鎖分子に対するモノクローナル抗体（特願平6-82836）を用いて実証を試みた。その結果、該モノクローナル抗体は、ＩＬ−４の作用をも抑制する活性を有することが明らかとなり本発明を完成するに至った。
【００２２】
すなわち、ＩＬ−４受容体にはシグナル伝達に関与すると考えられる第２の構成分子が存在し、該構成分子は、ＩＬ−２受容体γ鎖分子と共通であることを世界に先駆けて明らかにするとともに、ＩＬ−２受容体γ鎖分子に結合して、ＩＬ−２のシグナル伝達を抑制する活性を有するモノクローナル抗体は、ＩＬ−４受容体の第２の構成分子にも結合して、ＩＬ−４のシグナル伝達を抑制する活性を有するモノクローナル抗体でもあることを明らかにした。
【００２３】
本発明は、これらの知見に基づき完成された。すなわち、ＩＬ−４の受容体の第２の構成分子に結合して、ＩＬ−４のシグナル伝達を抑制する活性を有するモノクローナル抗体が提供されたことにより、ＩＬ−４の産生に伴うＩｇＥの過剰産生が関与していると考えられる疾患、例えばアナフィラキシーショック、気管支喘息、アトピー性皮膚炎、じんま疹を始めとする種々のアレルギー性疾患や、慢性関節リウマチ等の自己免疫疾患を代表とする種々の慢性炎症性疾患の治療薬が提供されたのである。また、同治療薬においては、ＩＬ−４の受容体の第２の構成分子に結合して、ＩＬ−４のシグナル伝達を抑制する活性を有する物質であれば、モノクローナル抗体に限定されることなく用いられる。
【００２４】
従って本発明を列挙すると、
１）インターロイキン４のシグナル伝達系の阻害剤を含有する免疫抑制、抗アレルギー剤；
２）インターロイキン４のシグナル伝達系の阻害剤が、抗インターロイキン２受容体γ鎖抗体に認識されるエピトープを有しかつインターロイキン４のシグナル伝達に関与するインターロイキン４受容体構成分子に対して作用する物質である１）記載の免疫抑制、抗アレルギー剤；
３）インターロイキン４のシグナル伝達系の阻害剤が、インターロイキン２受容体γ鎖分子に対して作用する物質である２）記載の免疫抑制、抗アレルギー剤；
４）インターロイキン４のシグナル伝達系の阻害剤が、抗インターロイキン２受容体γ鎖抗体に認識されるエピトープを有しかつインターロイキン４のシグナル伝達に関与するインターロイキン４受容体構成分子に結合する抗体、または抗体の一部のアミノ酸配列を含むポリペプチド、あるいは抗体の一部のアミノ酸配列を置換したポリペプチドである２）記載の免疫抑制、抗アレルギー剤；
５）インターロイキン４のシグナル伝達系の阻害剤が、インターロイキン２受容体γ鎖分子に結合する抗体、または抗体の一部のアミノ酸配列を含むポリペプチド、あるいは抗体の一部のアミノ酸配列を置換したポリペプチドである３）記載の免疫抑制、抗アレルギー剤；
６）抗体が、ＧＰ−２である５）記載の免疫抑制、抗アレルギー剤；
７）抗体が、ＧＰ−４である５）記載の免疫抑制、抗アレルギー剤；
８）抗体が、ＡＧ４３である５）記載の免疫抑制、抗アレルギー剤；
９）抗体が、ＡＧ１８４である５）記載の免疫抑制、抗アレルギー剤
となる。
【００２５】
以下、本発明について詳細に説明する。
まず本発明者らは、ＩＬ−２受容体γ鎖分子がＩＬ−４のシグナル伝達に関与するＩＬ−４受容体の第２の構成分子としても機能しているのではないかという仮説を検証するために、ＩＬ−２受容体γ鎖分子に結合し、ＩＬ−２のシグナル伝達を阻害する活性を有するモノクローナル抗体産生ハイブリドーマの作製を行った。以下にその作製法を記す。
【００２６】
ハイブリドーマは骨髄腫細胞と抗体産生細胞を融合することにより製造される。抗体産生細胞としては、リコンビナントヒトＩＬ−２受容体γ鎖分子（欧州特許出願公開  O 578 932 A、 Science, 257, 379 (1992)）で免疫されたマウスやラットなどの動物からの脾臓またはリンパ節細胞を用いればよい。なお、免疫する物質としては、リコンビナントヒトＩＬ−２受容体分子の場合、単独、あるいは他の蛋白質との融合分子、分子の一部のポリペプチド等を用いても差し支えない。その場合、リコンビナントヒトＩＬ−２受容体分子のうち、細胞外領域のみからなる分子を用いると特に効率的である。
【００２７】
ヒトリコンビナントＩＬ−２受容体γ鎖分子の細胞外領域のみからなるポリペプチドは、同分子をコードする遺伝子を含む発現プラスミドベクターを有する形質転換体を培養することにより得られる。形質転換体としては大腸菌等の原核細胞、ＣＨＯ細胞等の真核細胞などいずれを用いても構わない。
【００２８】
また、リコンビナントヒトＩＬ−２受容体γ鎖分子の代わりに、ヒトＩＬ−２受容体γ鎖分子を発現しているヒト細胞、ヒトＩＬ−２受容体γ鎖分子をコードする遺伝子が導入され、該γ鎖分子を生合成するに至ったマウス細胞等を用いても構わない。また、それらの細胞より精製したγ鎖分子そのものを免疫原として用いてもさしつかえない。
【００２９】
抗体産生細胞と骨髄腫細胞の由来する動物の種は、両細胞が融合可能な限り異なってもよいが、通常同一種の細胞を用いた方が良い結果が得られる。本発明実施のための一つの好ましいハイブリドーマは、ヒトリコンビナントＩＬ−２受容体γ鎖分子の細胞外領域のみからなるポリペプチドで免疫したマウスの脾臓細胞またはリンパ節細胞と、マウス骨髄腫細胞との間のハイブリドーマである。
【００３０】
例えば、生理食塩水に懸濁したヒトリコンビナントＩＬ−２受容体γ鎖分子の細胞外領域のみからなるポリペプチドで免疫したBalb/cマウスの脾臓細胞とBalb/cマウスの骨髄腫細胞SP2/0-Ag14の間のハイブリドーマで後記の実施例でも示す様に優れた結果が得られた。
【００３１】
骨髄腫細胞としては、SP2/0-Ag14のほかに、X63-Ag8-6.5.3, P3-X63-Ag8-U1, P3-X63-Ag8, P3-NSI/1-Ag4-1, MPC11-4.5.6.TG.1.7, （以上マウス細胞）、210.RCY.Ag1.2.3 （ラット細胞）、SK0-007,GH15006TG-A12 （以上ヒト細胞）等の８アザグアニン耐性の細胞株を用いてもよい。ハイブリドーマの作成と、更にその中からＩＬ−２受容体のγ鎖分子に結合し、ＩＬ−２応答を遮断する活性を有するモノクローナル抗体を産生しているハイブリドーマクローンの選択は、例えば次の様にして行える。ポリエチレングリコール、あるいはセンダイウイルスなどを用いて抗体産生細胞と骨髄腫細胞とを融合させる。融合したハイブリドーマのみが、ヒポキサンチン、チミジン、アミノプテリンを含む培地（ＨＡＴ培地）中で生育することができる。得られたハイブリドーマがすべて抗体を産生しているわけではないし、抗体を産生しているハイブリドーマがすべて目的とする抗体を産生しているわけではないので、それらのハイブリドーマクローンの中からＩＬ−２受容体のγ鎖分子に結合し、ＩＬ−２応答を阻害する活性を有しているモノクローナル抗体を産生しているハイブリドーマクローンを選択しなければならない。
【００３２】
その選択は例えば以下の様な方法を用いて行うことができる。すなわち、ハイブリドーマ培養上清中に産生されている抗体の、γ鎖発現ヒト細胞株であるＭＵＬＴ４細胞への結合と、γ鎖非発現ヒト細胞であるＴＨＰ−１細胞への結合を測定し、前者に対して結合量が高く、後者に対して結合量の低いものを選択する。そのような抗体を産生しているハイブリドーマがＩＬ−２受容体のγ鎖分子に特異的に結合する抗体を産生しているハイブリドーマとなる。そのほかにも、ハイブリドーマ培養上清中に産生されている抗体の、ヒトＩＬ−２受容体γ鎖分子をコードする遺伝子が導入され、該ペプチドを発現しているマウスＬ９２９細胞（以下Ｌγ細胞と称する）への結合と、ヒトＩＬ−２受容体β鎖分子をコードする遺伝子が導入され、該ペプチドを発現しているマウスＬ９２９細胞（以下、Ｌβ細胞と称する）への結合を測定し、前者に対して結合量が高く、後者に対して結合量の低いものを選択することによってもハイブリドーマクローンの選択は可能である。そのような抗体を産生しているハイブリドーマがＩＬ−２受容体のγ鎖分子に特異的に結合する抗体を産生しているハイブリドーマとなる。
【００３３】
細胞への抗体の結合量の測定は、放射標識された抗マウスイムノグロブリン抗体を用いたラジオイムノアッセイ、蛍光色素標識された抗マウスイムノグロブリン抗体を用いた蛍光イムノアッセイなどいかなる方法を用いてもかまわない。また、スクリーニングに用いる細胞は、ヒトγ鎖を発現している細胞とヒトγ鎖を発現していない細胞との組み合わせである限りいかなる細胞を用いてもかまわない。
【００３４】
ＩＬ−２受容体のγ鎖分子に特異的に結合する抗体が、すべてＩＬ−２シグナルを阻害する活性を有する抗体とは限らないので、更に例えば以下のような方法により、ＩＬ−２受容体のγ鎖分子に対する抗体を産生しているハイブリドーマの中から、ＩＬ−２シグナルを阻害する活性を有する抗体を産生しているハイブリドーマを選択する。
【００３５】
ハイブリドーマ培養上清を、ヒトＩＬ−２依存的に増殖活性を示すヒト成人Ｔ細胞白血病ウイルス感染Ｔ細胞株ＩＬＴ−Ｍａｔ細胞に加え、ＩＬＴ−Ｍａｔ細胞の増殖阻害活性を測定する（Journal of Experimental Medicine、１６９巻、１３２３頁）。増殖阻害活性を有していれば、そのハイブリドーマが目的とするモノクローナル抗体産生細胞ということになる。なお、ＩＬ−２受容体のγ鎖分子に対する抗体を産生しているハイブリドーマの中から、ＩＬ−２シグナルを阻害する活性を有する抗体を産生しているハイブリドーマを選択する方法としては、ＩＬＴ−Ｍａｔ細胞を用いる方法以外にも、たとえば、ＰＨＡ（フィトヘマグルチニン）刺激したヒト末梢血リンパ球のＩＬ−２による増殖を阻害する抗体を産生するものを選択する方法などがあり、ヒト細胞を用いて行うヒトＩＬ−２の生物活性測定法を利用する限りいかなる方法を用いても構わない。こうして得られたハイブリドーマクローンとして、例えばＧＰ−２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４６４１）、ＧＰ−４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４６４０）、ＡＧ４３（ＦＥＲＭ  Ｐ−１４４８４）、及びＡＧ１８４（ＦＥＲＭ  Ｐ−１４４８５）と呼ばれる細胞がある。
また、モノクローナル抗体の大量調製を行うには、ＧＰ−２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４６４１）、ＧＰ−４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４６４０）、ＡＧ４３（ＦＥＲＭ  Ｐ−１４４８４）、あるいはＡＧ１８４（ＦＥＲＭ  Ｐ−１４４８５）細胞を、組織適合性動物、あるいは胸腺欠損ヌードマウスなどの腹腔内に接種して増殖させ、該動物の腹水中に産生された抗体を回収して、塩析、イオン交換クロマトグラフィーなどの操作により精製すればよい。
【００３６】
次に、このようにして得られた、ＩＬ−２受容体γ鎖に結合してＩＬ−２のシグナル伝達を抑制する活性を有するモノクローナル抗体による、ＩＬ−４のシグナル伝達阻害活性を測定する。測定法は、ヒト細胞を用いてＩＬ−４の生物活性が測定できる系であれば如何なる系を用いてもよいが、本発明者らは、ヒトの末梢血リンパ球のＩｇＥ産生誘導阻害能を指標に、抗体のシグナル伝達阻害活性を測定した。その結果、ＧＰ−２抗体、ＧＰ−４抗体、ＡＧ４３抗体、ＡＧ１８４抗体ともＩＬ−４によるヒトの末梢血リンパ球のＩｇＥ産生誘導阻害活性を有していることが確認され、該モノクローナル抗体が認識するＩＬ−２受容体γ鎖分子は、ＩＬ−４のシグナル伝達に関与する第２の構成分子と共通であることを示唆するとともに、該モノクローナル抗体は、ＩＬ−４のシグナル伝達を阻害する活性を有していることが示された。該モノクローナル抗体は、ＩＬ−４の産生に伴うＩｇＥ抗体の過剰産生が発症に関与していると考えられる疾患、例えばアナフィラキシーショック、気管支喘息、アトピー性皮膚炎、じんま疹を始めとする種々のアレルギー性疾患や、慢性関節リウマチ等の自己免疫疾患を代表とする種々の慢性炎症性疾患の治療薬として有用である。
【００３７】
本発明の免疫抑制、抗アレルギー剤に用いることのできる物質は、ここで得られたハイブリドーマクローンの産生するモノクローナル抗体に限定されるものではなく、ＩＬ−４受容体の第２の構成分子に作用し、かつＩＬ−４のシグナル伝達を阻害する活性を有する物質である限りいかなる物質でも本発明に含まれる。もちろん、ＩＬ−４受容体の第２の構成分子に結合する該モノクローナル抗体以外のモノクローナル抗体も含まれるし、モノクローナル抗体のＣ領域を公知の方法により、ヒトＣ領域へと変換したキメラ抗体、Ｖ領域のＦＲをヒト化した抗体や、Ｈ鎖、及びＬ鎖両Ｖ領域をペプチドリンカーでつないだ、いわゆるＦｖ抗体、さらには、抗体のＶ領域の一部のアミノ酸配列からなるペプチド等もＩＬ−４受容体の第２の構成分子に結合し、かつＩＬ−４のシグナル伝達を阻害する活性を有する限り本発明に含まれる。
【００３８】
本発明の抗アレルギー剤は上記モノクローナル抗体、あるいはペプチドを0.1重量％〜100重量％、好ましくは0.5重量％〜70重量％の割合で含有すればよい。したがって、本発明のモノクローナル抗体、あるいはペプチドをそのまま投与してもよいし、また通常製剤用担体と混合して調製した製剤の形で投与される。製剤用担体としては、製剤分野において常用され、かつ本発明のモノクローナル抗体、あるいはペプチドと反応しない物質が用いられる。注射剤の場合には、本発明のモノクローナル抗体、あるいはペプチドを水に溶解させて調製されるが、必要に応じて生理食塩水、ぶどう糖溶液に溶解させてもよく、また緩衝剤、保存剤、あるいは安定化剤を含有させてもよい。また、これらの製剤は治療上価値のある他の成分を含有していてもよい。
【００３９】
本発明に係る抗アレルギー剤の投与方法としては、経口、注射、直腸内などいずれの方法を用いてもかまわないが、注射による投与が好ましい。投与量は、投与方法、患者の症状、年齢などにより異なるが、通常１回0.001〜1000mg、好ましくは0.01〜10mgを１日当り１〜３回投与すればよい。
【００４０】
以下本発明を実施例に基づいて更に詳細に説明する。尚、本発明は実施例に限定されるものではない。
【００４１】
【実施例】
（実施例１、細胞外領域のみからなるリコンビナントヒトＩＬ−２受容体γ鎖ポリペプチドの調製）
大腸菌発現の可溶性リコンビナントＩＬ−２レセプターγ鎖分子を調製するため、５’側プライマーとして内部にＮｄｅＩサイトと開始コドンであるＡＴＧを有するオリゴマー5'-GGACATATGCTGAACACGACAATTCTG-3'（配列番号１）と、３’側プライマーとして内部にＨｉｎｄIIIサイトとストップコドンであるＴＡＡ有するオリゴマー5'-GAAAAGCTTCTATTATGAAGTATTGCTCC-3'（配列番号２）をＤＮＡ合成機３８０Ａにより合成した。両オリゴマーをプライマーとし、ＩＬ−２受容体γ鎖分子の全ｃＤＮＡを含むプラスミド（本プラスミドで形質転換された大腸菌は、通産省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−４２００として寄託されている）を鋳型としてサーマルサイクラーを用い、TaqポリメラーゼによるＰＣＲ（変性９４℃、アニール５５℃、合成７２℃、２０サイクル）を行った。その結果、配列番号３に示す塩基配列を有するＩＬ−２受容体γ鎖の細胞外領域に相当するＤＮＡ断片がえられた。
【００４２】
得られたＩＬ−２受容体γ鎖の細胞外領域に相当するＤＮＡ断片約０、７ｋｂを回収して、ＮｄｅＩとＨｉｎｄIII（宝酒造社製）にて切断後、プラスミドｐＦｖ（ＴＵ２７）−ＤＥ（本プラスミドで形質転換された大腸菌は、通産省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−３９７３として寄託されている）をＮｄｅＩとＨｉｎｄIIIで切断し回収した大きな断片とライゲーションし、ｐＩＬ−２ＲＧＳを構築した（図１）。
【００４３】
ｐＩＬ−２ＲＧＳで形質転換された大腸菌ＨＢ１０１をＭ９−カザミノ酸培地にて培養し、大腸菌の菌体内に顆粒として発現させた。大腸菌を超音波破砕し、３，０００ｘｇで遠心分離する事により顆粒を分離した。更に、顆粒を６Ｍグアニジン塩酸にて溶解した後、最終濃度が３，５Ｍグアニジン塩酸、３０μＭ還元型グルタチオン、３μＭ酸化型グルタチオン存在下、蛋白濃度が５０μｇ／ｍｌの条件で、室温で一晩攪拌することにより巻戻しを行い、１５０ｍＭＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，５）（以下、ＰＢＳと略す）に対して透析する事により、可溶性の細胞外領域のみからなるリコンビナントヒトＩＬ−２受容体γ鎖ポリペプチドを調製した。
【００４４】
（実施例２、ハイブリドーマの調製）
６〜８週令の雌のBALB/cマウスに、細胞外領域のみからなるリコンビナントヒトＩＬ−２受容体γ鎖ポリペプチドを１匹あたり１００μｇずつフロインドの完全アジュバント（バクト社製）とともに皮下投与することにより免疫した。３週間おきに同様の操作により２回追加免疫し、マウスの眼窩静脈より採血して、後に述べる方法に従って、細胞外領域のみからなるリコンビナントヒトＩＬ−２受容体γ鎖ポリペプチドへの結合量を調べることにより抗体価を測定した。抗体価の高かったマウスを更に同様の操作にて最終免疫し、その３日後、脾臓を摘出して脾臓細胞とマウス骨髄腫細胞（SP2/0-Ag14）とを、５０％ポリエチレングリコール＃４０００（ナカライテスク社製）存在下にて細胞数で１０：１の割合で混合し、細胞融合させた。
【００４５】
融合細胞を、１０％牛胎児血清（ギブコ社製）を含むRPMI1640培地（ギブコ社製）にて５Ｘ１０6個／ｍｌとなるように懸濁し、１穴あたり５Ｘ１０5個のマウス胸腺細胞を含有する９６穴平底プレート（コーニング社製）に１００μｌずつ分注した。１日、２日、３日、６日後に培地の半量をヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジンを含む培地（ＨＡＴ培地）と交換し、以後３日ごとに同様の操作を繰り返した。融合より約２週間後、融合した細胞（ハイブリドーマ）の増殖してきた各穴の培養上清に含まれる抗体の、Ｌγ細胞とＬβ細胞への結合量を測定し、更に限界希釈法にてクローン化することによりＬγ細胞にのみ結合するハイブリドーマクローンを得た。
【００４６】
更に、得られた抗ＩＬ−２受容体γ鎖抗体産生ハイブリドーマの培養上清について、以下の方法にてＩＬ−２の生理活性の抑制能を調べた。１０％牛胎児血清（ＦＣＳ）を含むRPMI1640培地にて２Ｘ１０5個／ｍｌの濃度となるように懸濁したILT-Mat細胞液を１穴当たり１００μｌずつ９６穴平底マイクロプレートに分注して、サンプルの培養上清を５０μｌ加え、更に１０％ＦＣＳを含むRPMI1640培地にて２００ｕ／ｍｌに調製したヒトリコンビナントＩＬ−２溶液を５０μｌずつ加えて、５％ＣＯ2存在下３７℃にて４８時間培養した。最後の４時間は１μＣｉの3Ｈ−チミジン（デュポン社製）を加えて培養し、細胞内に取り込まれた放射活性量をシンチレーシンカウンター（パッカード社製）にて測定することにより、培養上清によるＩＬ−２の生理活性の阻害能を調べた。このような方法にてＩＬ−２受容体γ鎖分子に対する抗体を産生するハイブリドーマを調製した。こうして得られたハイブリドーマとしてＧＰ−２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４６４１）、ＧＰ−４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４６４０）、ＡＧ４３（ＦＥＲＭ  Ｐ−１４４８４）、及びＡＧ１８４（ＦＥＲＭ  Ｐ−１４４８５）がある。
【００４７】
（実施例３、モノクローナル抗体ＧＰ−２、ＧＰ−４、ＡＧ４３、ＡＧ１８４のＩＬ−２シグナル伝達阻害活性の検定）
１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地にて２ｘ１０5個／ｍｌの濃度となるように懸濁したILT-Mat細胞液を１穴当たり１００μｌずつ９６穴平底マイクロプレートに分注して、それぞれ４０μｇ／ｍｌの濃度に調製したサンプルを５０μｌ加え、３７℃、３０分間インキュベートした。更に１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地にて種々の濃度に調製したヒトリコンビナントＩＬ−２溶液を５０μｌずつ加えて、５％ＣＯ2存在下３７℃にて４８時間培養した。最後の４時間は１μＣｉの3Ｈ−チミジン（デュポン社製）を加えて培養し、細胞内に取り込まれた放射活性量をシンチレーションカウンター（パッカード社製）にて測定することにより、モノクローナル抗体ＧＰ−２、ＧＰ−４、ＡＧ４３、及びＡＧ１８４のＩＬ−２のシグナル伝達阻害能を調べた。
【００４８】
サンプルは、モノクローナル抗体ＧＰ−２、モノクローナル抗体ＧＰ−４、モノクローナル抗体ＡＧ４３、モノクローナル抗体ＡＧ１８４を１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０で希釈し４０μｇ／ｍｌの濃度に調製した。コントロールは、マウスＩｇＭ（ザイメット社製）を１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０で希釈し４０μｇ／ｍｌの濃度に調製したものを用いた。
【００４９】
その結果図２に示す通り、モノクローナル抗体ＧＰ−２、ＧＰ−４、ＡＧ４３、及びＡＧ１８４は、それぞれILT-Mat細胞のＩＬ−２応答を遮断する活性を有していることが明らかとなった。
【００５０】
（実施例４、モノクローナル抗体ＧＰ−２、ＧＰ−４、ＡＧ４３、ＡＧ１８４のＩＬ−４シグナル伝達阻害活性の検定）
正常人よりヘパリン加採血した血液をＰＢＳにて２倍希釈して、フィコールパック（ファルマシア社製）に重層したのち、１５００ｒｐｍにて１５分間遠心し、界面に分画された細胞を回収して末梢血リンパ球（以下、ＰＢＬと略する）を調製した。ＰＢＬを１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地にて１Ｘ１０6個／ｍｌの濃度に調製した細胞懸濁液０．５ｍｌと、４００ユニット／ｍｌのヒトリコンビナントＩＬ−４（ゲンザイム社製）を０．２５ｍｌ、及びサンプルを０．２５ｍｌ加えて、３７℃にて１０日間培養した。
【００５１】
サンプルは、モノクローナル抗体ＧＰ−２、モノクローナル抗体ＧＰ−４を１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０で希釈し図３横軸に見られる種々の濃度に調製した。コントロールは、マウスＩｇＭ（ザイメット社製）を１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０で希釈し図３横軸に見られる種々の濃度に調製したものを用いた。
【００５２】
上に記したＩｇＥを誘導する培養終了後、培養上清中に含まれるＩｇＥ量をＥＬＩＳＡにて定量した。ＥＬＩＳＡは以下の方法で行った。まず、１００ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）にて１０μｇ／ｍｌの濃度に調製したヒツジ抗ヒトＩｇＥ抗体（カッペル社製）を１００μｌずつ９６穴平底プレート（ヌンク社製）に入れ、４℃にて一晩コーティングした。２００μｌの０．５％ＢＳＡ（Bovine Serum Albumine）を含むＰＢＳ溶液（ＢＳＡ−ＰＢＳ）に置換して室温２時間放置してブロッキングを行った後、適当な濃度にＢＳＡ−ＰＢＳにて希釈した培養上清を１００μｌずつ加えて、室温にて２時間反応させた。反応終了後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ溶液（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ）にて３回洗浄したのち、ビオチン標識されたヤギ抗ヒトＩｇＥ抗体（ベクタステイン社製）を１００μｌ加えて室温にて２時間反応させた。反応終了後、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎにて３回洗浄し、アビジンとビオチン標識されたアルカリフォスファターゼ（ベクタステイン社製；ＡＢＣキット）を１００μｌ加えて、室温にて１時間反応させた。最後にＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎにて４回洗浄し、５０ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９．８）にて１ｍｇ／ｍｌの濃度に調製したｐ−ニトロフェノールフォスフェート（シグマ社製）を１００μｌずつ添加して室温に放置した後、４０５ｎｍの吸光度を測定した。ＩｇＥ誘導培養時ヒトリコンビナントＩＬ−４非添加の値を０、ヒトリコンビナントＩＬ−４のみ添加し抗体サンプルを添加しない条件での値を１００として、抗体サンプルによるＩｇＥ産生阻害率を表した。その結果、図３に示す通り、モノクローナル抗体ＧＰ−２、ＧＰ−４、ＡＧ４３、ＡＧ１８４は、コントロール抗体に比較して有意にＩｇＥの産生を抑制した。すなわち、モノクローナル抗体ＧＰ−２、ＧＰ−４、ＡＧ４３、ＡＧ１８４は、ＩＬ−４のシグナル伝達を阻害する活性を有していることが明らかとなった。
【００５３】
【発明の効果】
本発明の、分子量が６４ｋｄのヒトＩＬ−４受容体構成分子に作用する物質、該分子に対する抗体、もしくは該抗体の一部のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含有する、ヒトＩＬ−４のシグナル伝達系の阻害剤を含有する免疫抑制、抗アレルギー剤は、ＩＬ−４の産生に伴うＩｇＥ抗体の過剰産生が発症に関与していると考えられる疾患、例えばアナフィラキシーショック、気管支喘息、アトピー性皮膚炎、じんま疹を始めとする種々のアレルギー性疾患や、慢性関節リウマチ等の自己免疫疾患を代表とする種々の慢性炎症性疾患の治療薬として有用である。
【００５４】
【配列表】
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【００５５】
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【００５６】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ｐＩＬ−２ＲＧＳの構築図を示す。
【図２】モノクローナル抗体ＧＰ−２、ＧＰ−４、ＡＧ４３、ＡＧ１８４のＩＬ−２シグナル伝達阻害活性の検定結果を示す。放射ラベルしたチミジンの取り込み量が少ないほど、ＩＬ−２シグナル伝達阻害の度合が高いことを示す。
【図３】モノクローナル抗体ＧＰ−２、ＧＰ−４、ＡＧ４３、ＡＧ１８４のＩＬ−４シグナル伝達阻害活性の検定結果を示す。ＩｇＥ抗体産生を阻害するということは、ＩＬ−４シグナルの伝達が阻害されていることを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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