(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細菌中で異種ポリペプチドを産生する方法であって、
（ａ）ＤsbＡまたはＤsbＣタンパク質をコードする核酸、該異種ポリペプチドをコードする核酸、ＤsbＡまたはＤsbＣタンパク質および異種ポリペプチドの両者の分泌のためのシグナル配列、およびＤsbＡまたはＤsbＣタンパク質をコードする核酸および該異種ポリペプチドをコードする核酸の両者の別個の誘発可能なプロモーターを含む細菌細胞を、グルタチオンの不在下であって、ＤsbＡまたはＤsbＣタンパク質をコードする核酸の発現を誘発した後に異種ポリペプチドをコードする核酸の発現を誘発する条件下および該異種ポリペプチドおよびＤsbＡまたはＤsbＣタンパク質の両者を細菌のペリプラズムに分泌させるかまたは該異種ポリペプチドを該細菌細胞を培養する培地に分泌させる条件下で培養する；
（ｂ）該異種ポリペプチドを該ペリプラズムまたは該培養培地から回収する；および
（ｃ）該異種ポリペプチドを活性形態へと再度折り畳むことを含み、該ポリペプチドが、組織型プラスミノーゲンアクチベーター、ｇｐ１２０、ＤＮアーゼ、インシュリン様増殖因子−I、インシュリン様増殖因子−II、脳インシュリン様増殖因子−I、リラキシン、インシュリン、プロ−インシュリン、ウロキナーゼ、ニューロトロフィン−３、ニューロトロフィン−４、ニューロトロフィン−５、ニューロトロフィン−６又は神経成長因子である方法。
【請求項２】
該異種ポリペプチドが哺乳動物のポリペプチドである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該哺乳動物のポリペプチドがヒトのポリペプチドである請求項２に記載の方法。
【請求項４】
該細菌細胞が真正細菌細胞である請求項１に記載の方法。
【請求項５】
該真正細菌細胞がエンテロバクテリアセエ細胞である請求項４に記載の方法。
【請求項６】
該真正細菌細胞が大腸菌細胞である請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ＤsbＡをコードする核酸を発現する請求項１に記載の方法。
【請求項８】
該ポリペプチドを該細菌細胞のペリプラズムから回収する請求項１に記載の方法。
【請求項９】
該ポリペプチドの回収後、ＤsbＡまたはＤsbＣタンパク質を該ポリペプチドから分離する請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
該細菌細胞をＤsbＡまたはＤsbＣタンパク質をコードする核酸および該異種ポリペプチドをコードする核酸を含む１つまたは２つの発現ベクターで形質転換する請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
該細菌細胞をＤsbＡまたはＤsbＣタンパク質をコードする核酸および該異種ポリペプチドをコードする核酸を各々含む２つのベクターで形質転換する請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ＤsbＡまたはＤsbＣタンパク質をコードする核酸および該異種ポリペプチドをコードする核酸を、該細菌細胞を形質転換する１つのベクターに含む請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
ＤsbＡまたはＤsbＣをコードする核酸の発現の誘発を培養培地にインデューサーを添加することによって行う請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
該インデューサーがＩＰＴＧ、ラクトースまたはＬ−アラビノースである請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
総ポリペプチドの収率が該方法の結果として増加し、可溶性ポリペプチドの収率が変化しないかまたは減少する請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
該培養を熱ショック転写因子をコードする核酸の発現レベルが該核酸の発現の内在レベルを越えて増強しないで行う請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
発明の技術分野
本発明はＤsbＡまたはＤsbＣタンパク質の過剰産生および分泌により細菌中でポリペプチドを産生および分泌する方法に関する。
関連開示の記載
イン・ビトロで、減弱および変性したリボヌクレアーゼを適切なジスルフィド結合を形成して活性な酵素に再度折り畳むことができることを示した、強い影響力を有するアンフィンセン（Ａnfinsen）ら、Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ、４７：１３０９−１３１４（１９６１）の発行以来、タンパク質の折り畳みの技術分野において多数の研究が行われている。後に、真核生物における酸化的折り畳みを担う触媒が見出され、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）と呼ばれた。
タンパク質の折り畳みを援助するタンパク質の２つのタイプを記す：おそらく集合および適切な折り畳み以外の事象へと導かれる不適切な相互作用を妨げる非触媒性分子シャペロン、およびタンパク質の折り畳み、シス−トランスプロピル異性化およびジスルフィド結合の形成における２工程の触媒。イン・ビボにおけるプロピルイソメラーゼ活性の必要性の明確な証拠はいまなお欠如しているが、ジスルフィド結合の形成がひどく欠けている異性体の比較的最近の単離は、この後者の折り畳み工程がイン・ビボで触媒されることを確認した。
ＰＤＩはイン・ビトロのデータにより、ジスルフィド結合および転位の触媒に関連するとされる。クレイトン（Ｃreighton）ら、Ｊ．Ｍol．Ｂiol.、１４２：４３−６２（１９８０）；フリードマン（Ｆreedman）ら、Ｂiochem．Ｓoc．Ｓymp.、５５：１６７−１９２（１９８９）。バードウェル（Ｂardwell）およびベックウィズ（Ｂeckwith）、Ｃell、７４：７６９−７７１（１９９３）。さらに、カルボキシペプチダーゼＹにおいてジスルフィド結合を形成できないＰＤＩにおける酵母変異体が同定され、イン・ビボにおけるジスルフィド結合の形成におけるＰＤＩの重要性を示唆している。ラマンティア（ＬaＭantia）およびレンナルツ（Ｌennarz）、Ｃell、７４：８９９−９０８（１９９３）。原核生物において、３つの別個の研究ブループによって大腸菌（Ｅ．coli）のペリプラズムにおいて同定された特定の遺伝子における変異は、分泌タンパク質におけるジスルフィド結合の形成の割合において劇的および多面発現的な（pleiotropic）減少を示す。この遺伝子によってコードされるタンパク質は、バードウェルら、Ｃell、６７：５８１−５８９（１９９１）およびミシアカス（Ｍissiakas）ら、Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ、９０：７０８４−７０８８（１９９３）によってＤsbＡ（ジスルフィド結合）、およびカミタニ（Ｋamitani）ら、ＥＭＢＯ Ｊ.、１１：５７−６２（１９９２）によってＰpfＡ（ペリプラズムホスファターゼ／タンパク質形成）とさまざまに呼ばれた。本明細書においては以下、Ｄsb名称によって呼ぶ。ジスルフィド結合の形成におけるこの減少によって影響を受ける分泌タンパク質は、アルカリホスファターゼおよびＯmpＡなどの大腸菌に内在性のタンパク質から組換え哺乳動物タンパク質、ウロキナーゼおよび組織プラスミノーゲンアクチベーターにおよぶ。現在、ジスルフィド結合の形成が真核生物および原核生物の両者において触媒化された工程であることは明らかである。ＰＤＩおよびＤsbＡに関する概説のためには、バードウェルおよびベックウィズ、Ｃell、上記（１９９３）を参照せよ。
該ＤsbＡタンパク質は、ジスルフィドイソメラーゼ同様に、高反応性を有するジスルフィド結合を有する。ノイバ（Ｎoiva）およびレンナルツ、Ｊ．Ｂiol．Ｃhem.、２６７：３５５３−３５５６（１９９２）；ブレイド（Ｂulleid）、Ａdv．Ｐrot.、４４：１２５−１５０（１９９３）。その結晶構造が最近明らかにされ（マーティンら、Ｎature、３６５：４６４−４６８［１９９３］）、そのレドックス電位が決定された。ブンダーリッヒ（Ｗunderlich）およびグロックシューベル（Ｇlockshuber）、Ｐrot．Ｓci.、２：７１７−７２６（１９９３）。それは細胞質チオレドキシンより有意に強力な酸化剤であり、真核生物のジスルフィドイソメラーゼにより一層類似している。折り畳まれていないＤsbＡは、およそ１８.９kＪmol-1によって反応性のジスルフィド結合を安定化させる。ザプン（Ｚapun）ら、Ｂiochemistry、３２：５０８３−５０９２（１９９３）。この結果は、ジスルフィド結合がＤsbＡの折り畳まれた形態を安定化させ、それによってその高いエネルギー容量を付与することを示唆すると解釈される。
ジスルフィド結合の形成に関与する第２のタンパク質の遺伝子、dsbＢと呼ばれるものは、２つの別個のグループによってクローニングされた。バードウェルら、Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ、９０：１０３８−１０４２（１９９３）およびミシアカスら、１９９３、上記。ＤsbＢは内膜にかかる膜内在性タンパク質である。それはＤsbＡの再酸化に関与するようであり、従って電子伝達工程を、ペリプラズムにおけるジスルフィド結合の形成へと関連する鎖の一部を形成するであろう。バードウェルら、上記（１９９３）。ジスルフィド結合の形成のための第３の遺伝子、dsbＣが近年同定された。ミシアカスら、ＥＭＢＯ Ｊ.、１３：２０１３−２０２０（１９９４）；シェブチック（Ｓhevchik）ら、ＥＭＢＯ Ｊ.、１３：２００７−２０１２（１９９４）。それは機能的にＤsbＡの代わりができる２６−kＤaのペリプラズムタンパク質をコードする。
ＤsbＡがイン・ビボおよびイン・ビトロで大腸菌のペリプラズムタンパク質のジスルフィド結合の急速な形成に必要であることが示されている。同様のことが、大腸菌のペリプラズムにおける組換え真核生物タンパク質、例えば、種々のセリンプロテアーゼ（バードウェルら、上記［１９９３］）、抗体断片（クナッピク（Ｋnappik）ら、Ｂio／Ｔechnology、１１：７７−８３［１９９３］）およびＴ細胞受容体の断片の生成に関して見出された。正確に折り畳まれた組換え分子の画分は天然のペリプラズムタンパク質の場合においてより小さくてよく、および非常に配列依存的である。ＤsbＡの過剰生産は正確に折り畳まれたペリプラズム抗体断片（クナッピクら、上記）の比率を増加させず、他の工程が、ペリプラズムにおけるその折り畳みを制限することを示唆している。さらに、ラギ（Ｒagi）からのα−アミラーゼ／トリプシンインヒビターのペリプラズムにおける折り畳みが、dsbＡ遺伝子が共発現し、ＤsbＡタンパク質が増殖培地中に存在する還元されたグルタチオンなしに共分泌した場合には改善されないが、正確に折り畳まれた分泌インヒビターにおける増加が培地に還元されたグルタチオンの添加と共にdsbＡの共発現によって観察された。
0003749257.tif 000002
およびグロックシューベル、Ｊ．Ｂiol．Ｃhem.、２６８：２４５４７−２４５５０（１９９３）。さらに、ブンダーリッヒおよびグロックシューベルは分泌α−アミラーゼ／トリプシンインヒビタータンパク質の総蓄積において全く増加を示さない。
0003749257.tif 000003
Ｍolecular Ｍicrobiology、１２：６８５−６９２（１９９４）は、ＤsbＡおよび低温での大腸菌の熱ショックタンパク質の適度な過剰発現によって、大腸菌のペリプラズムにおいてＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の機能的断片を産生した。後者はrpoＨ（熱ショックシグマ因子、シグマ32をコードする）の過剰発現によって達成された。これはペリプラズムにおけるＴＣＲ断片の折り畳み率をおよそ２倍に増加させた。その収率がrpoＨの過剰産生の不在下にあるものは知られていない。米国特許第５,２７０,１８１号および第５,２９２,６４６号は、高い安定性および可溶性のため、チオレドキシン様タンパク質（ＰＤＩのチオレドキシン様ドメインなど）を有する融合タンパク質としての発現によって異種タンパク質の組換え産生を開示する。１９９４年２月１５日に公開されたＪＰ ６０−３８７７１号は、ヒト血清アルブミンプレ−プロ配列に連結したヒトＰＤＩ遺伝子の発現およびこの連結した遺伝子およびポリペプチドをコードする外来遺伝子の共発現を開示する。１９９３年１２月３２日に公開されたＷＯ ９３／２５６７６号はＰＤＩ、好ましくは酵母のＰＤＩを用いてジスルフィド結合した組換えタンパク質の産生を開示する。１９８８年１２月７日に公開されたＥＰ ２９３,７９３号は、組換えタンパク質における天然のジスルフィド架橋配列を確実にするＰＤＩ活性を有するポリペプチドを開示する。１９９４年４月１４日に公開されたＷＯ ９４／０８０１２号は熱ショックタンパク質またはＰＤＩなどのシャペロンタンパク質の共発現による過剰発現した遺伝子産物の分泌の増加を開示する。１９９２年１０月２１日に公開されたＥＰ ５０９,８４１号は、ＰＤＩおよびタンパク質を含む共発現系を用いての酵母細胞からヒト血清アルブミンの分泌増加を開示する。
原核生物によって分泌されるタンパク質の総収率を増加する必要性が続いて存在している。
従って、細菌内において外来ポリペプチドの蓄積を増強する細胞内環境を生理学的に制御することに関する経済的に実行可能な方法を用いてポリペプチド収率を増加する方法を提供するのが本発明の目的である。
本目的および他の目的は当業者には明らかであるだろう。
本発明の概要
従って、本発明の一態様においては、細菌中で異種ポリペプチドを産生する方法であって、（ａ）ＤsbＡまたはＤsbＣタンパク質をコードする核酸、該異種ポリペプチドをコードする核酸、ＤsbＡまたはＤsbＣタンパク質および異種ポリペプチドの両者の分泌のためのシグナル配列、およびＤsbＡまたはＤsbＣタンパク質をコードする核酸および該異種ポリペプチドをコードする核酸の両者の誘発可能なプロモーターを含む細菌細胞を、ＤsbＡまたはＤsbＣタンパク質をコードする核酸の発現を誘発した後に異種ポリペプチドをコードする核酸の発現を誘発する条件下および該異種ポリペプチドおよびＤsbＡまたはＤsbＣタンパク質の両者を細菌のペリプラズムに分泌させるかまたは該異種ポリペプチドを該細菌細胞を培養する培地に分泌させる条件下で培養する；および（ｂ）該異種ポリペプチドを該ペリプラズムまたは該培養培地から回収することを含む方法を提供する。
細菌タンパク質ＤsbＡまたはＤsbＣ過剰発現および分泌は、細菌のペリプラズムまたは培養培地において産生された異種ポリペプチドの量の有意に増加させる。以下に示す具体例では、大腸菌のタンパク質ＤsbＡの過剰発現および分泌が、大腸菌のペリプラズム領域における含有体に預けたヒトＩＤＦ−Ｉの総収率において大きく増加した。さらに、この総収率の増加は、該培地中での全くのグルタチオン不在下での培養により、大腸菌熱ショック転写因子、ＲpoＨの共発現、または過剰発現なしに達成される。
ＤsbＡが大腸菌のペリプラズムおよび外壁のタンパク質の折り畳みに関与すると示唆されているが、このタンパク質をコードする遺伝子の過剰発現がそれ自体で分泌されたヒトタンパク質にいずれかの影響を及ぼすかどうかは分からない。また、dsbＡ遺伝子の過剰発現がＤsbＡ関連活性を一層高いレベルとさせるかどうかは分からない。いずれかの影響が見られるならば、ＤsbＡ活性の高いレベルがＩＧＦポリペプチドの適切な折り畳みを促進し、折り畳まれた、可溶性のＩＧＦ−Ｉモノマーの高いレベルになるであろう。対照的に、ＩＧＦ−Ｉの総収率の有意な増加が観察され（不溶性集合体へのＩＧＦ−Ｉポリペプチドの沈積による）および可溶性の、適切に折り畳まれたタンパク質の収率は減少した。これらの不溶性集合物を生理活性ポリペプチドに折り畳みこむため有効な方法が存在するという事実のため、不溶性ポリペプチドにおける増加は非常に有用な結果である。
【図面の簡単な説明】
図１はpＪＪ４２、ＩＧＦ−Ｉを産生するために用いる、すなわちpＢＫＩＧＦ−２Ｂ、pＪＪ４１およびpＫＭtacIIの構築において使用されたプラスミドを示す。
図２はＩＧＦ−Ｉを産生するために使用したプラスミドpＪＪ４０の構築を示す。
図３はＩＧＦ−Ｉを産生するために使用したプラスミドpＢＫＩＧＦ２Ｂ−Ａの構築を示す。
好ましい態様の詳細な説明
Ａ．定義
本明細書で使用する『dsbＡ』および『dsbＣ』は、それぞれＤsbＡまたはＤsbＣタンパク質として文献で公知の細菌ペリプラズムタンパク質をコードする遺伝子をいう。それらは任意の細菌由来であってよく、例えば、大腸菌からのdsbＡ遺伝子はバードウェルら、上記（１９９１）およびカミタニら、上記によって記載され、大腸菌からのdsbＣ遺伝子はミシアカスら、１９９４、上記によって記載されている。本明細書で使用する該dsbＡおよびdsbＣ遺伝子およびその産物にはＰＤＩまたはタンパク質ジスルフィドイソメラーゼとして機能する他のいずれかの真核生物タンパク質（米国特許第５,２７０,１８１号および第５,２９２,６４６号；ＪＰ ６０−３８７７１号；ＷＯ ９３／２５６７６号；ＥＰ ２９３,７９３号；ＷＯ ９４／０８０１２号；およびＥＰ ５０９,８４１号、すべて上記に開示されているものを含む）を含まない。ＤsbＡおよびＤsbＣはＰＤＩと多くの点で異なる。例えば、ＤsbＡおよびＤsbＣはレドックスバッファーの不在下でイソメラーゼ活性を保有するが、ＰＤＩはそのイソメラーゼ活性にレドックスバッファーを必要とする。さらに、ＤsbＡおよびＤsbＣはそれぞれ配列分析から２１kＤおよび２５kＤの分子量を有し、それぞれ２および４のシステイン残基を含むが、ＰＤＩは配列分析から５７kＤの分子量で６つのシステイン残基を含む。
本明細書で使用する、『シグナル配列』または『シグナルポリペプチド』とは、異種ポリペプチドを培養した細菌のペリプラズムまたは培地に分泌させるかまたはＤsbＡまたはＤsbＣタンパク質をペリプラズムに分泌させるのに用いられることができるポリペプチドをいう。異種ポリペプチドのシグナルは細菌に同種であるかまたは異種であってよく、該細菌中で産生されるポリペプチド原産のシグナルを含む。dsbＡおよびdsbＣに関して、該シグナル配列は細菌細胞に内在的であるもので典型的であるが、その目的に関して有効である限りは必要ではない。
『過剰発現』遺伝子産物は、その遺伝子産物の通常の内在的な発現より多大なレベルで発現しているものである。それは、例えば宿主細胞において遺伝子産物の発現を指令する組み換え構築物等を導入することによって、または例えば転写を誘発することによって内在的遺伝子産物の発現の基礎レベルを変えることによって達成することができる。
本発明のプロモーターは『誘発可能な』プロモーター、すなわち、転写因子の結合に関する増加または減少した割合で転写を指令するプロモーターである。本明細書で使用する『転写因子』とは、プロモーターの調節または制御領域に結合することができ、それによって転写に影響を及ぼすことができるいずれかの因子を含む。宿主細胞内の転写因子の合成またはプロモーター結合能力は該宿主を『インデューサー』にさらすことによって、またはインデューサーを宿主細胞培地から除去することによって制御することができる。従って、誘発可能なプロモーターの発現を調節するため、インデューサーを宿主細胞の増殖培地に添加するかまたは除去する。
本明細書で使用する『発現を誘発する』との句は、このような遺伝子を含む細胞をエフェクターまたはインデューサーにさらすことによって特異的な遺伝子からの転写量を増加させることを意味する。
『インデューサー』とは、細胞集団に与えられると特異的な遺伝子からの転写量を増加させるであろう化学薬剤または物理的作用剤をいう。これらは通常、その効果が特定の遺伝子のオペロンまたは基に特異的である小分子であり、リン酸塩、アルコール、金属鉄、ホルモン、熱、冷気などを含む。例えば、イソプロピルチオ−β−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）およびラクトースはtacIIプロモーターのインデューサーであり、Ｌ−アラビノースはアラビノースプロモーターの適当なインデューサーである。phoＡおよびpho５などのpho遺伝子プロモーターは培地中の低濃度のリン酸塩によって誘発可能である。
本明細書で使用する『ポリペプチド』または『関心のあるポリペプチド』とは、概して１０より多いアミノ酸を有するペプチドおよびタンパク質をいう。該ポリペプチドは『外在性』（それらが『異種』であること、すなわちＣＨＯ細胞によって産生されるヒトタンパク質または哺乳動物細胞によって産生される酵母ポリペプチドまたはポリペプチドの本来の源ではないヒト細胞株から産生されるヒトポリペプチドなどの利用される宿主細胞に異種であることを意味する）であるのが好ましい。
哺乳動物のポリペプチドの例には例えば、レニン、ヒト成長ホルモンを含む成長ホルモン；ウシ成長ホルモン；成長ホルモン放出因子；副甲状腺ホルモン；甲状腺刺激ホルモン；リポタンパク質；α１−抗トリプシン；インシュリンＡ−鎖；インシュリンＢ−鎖；プロインシュリン；トロンボポエチン；卵胞刺激ホルモン；カルシトニン；黄体形成ホルモン；グルカゴン；第ＶIIIＣ因子、第IＸ因子、組織因子およびフォン・ウィルブラント因子などの凝固因子；プロテインＣなどの抗凝固因子；ナトリウム利尿因子；肺界面活性剤；ウロキナーゼまたはヒト尿素または組織型プラスミノーゲンアクチベーター（ｔ−ＰＡ）などのプラスミノーゲンアクチベーター；ボンベシン；トロンビン；造血増殖因子；腫瘍壊死因子−アルファおよび−ベータ；エンケファリンアーゼ；ヒト血清アルブミンなどの血清アルブミン；ミューラー管抑制物質；リラキシンＡ−鎖；リラキシンＢ−鎖；プロリラキシン；マウス性腺刺激ホルモン関連ペプチド；ベータ−ラクタマーゼなどの微生物タンパク質；ＤＮアーゼ；インヒビン；アクチビン；血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）；ホルモンまたは増殖因子の受容体；インテグリン；プロテインＡまたはＤ；リウマチ因子；脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３、−４、−５または−６（ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＮＴ−５またはＮＴ−６）などの神経栄養因子またはＮＧＦ−βなどの神経成長因子；カルディオトロフィン−１（cardiotrophin）（ＣＴ−１）などのカルディオトロフィン（心臓高栄養因子（cardiac hypertrophy factor））；血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）；aＦＧＦおよびbＦＧＦなどの線維芽細胞増殖因子；上皮増殖因子（ＥＧＦ）；ＴＧＦ−アルファおよびＴＧＦ−ベータ（ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦ−β４またはＴＧＦ−β５を含む）などのトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）；インシュリン様増殖因子−Ｉおよび−II（ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−II））；des（１−３）−ＩＧＦ−Ｉ（脳ＩＧＦ−Ｉ）、インシュリン様増殖因子結合タンパク質；ＣＤ−３、ＣＤ−４、ＣＤ−８およびＣＤ−１９などのＣＤタンパク質；エリスロポエチン；骨誘導因子；イムノトキシン；骨形態形成タンパク質（bone morphogenetic protein）（ＢＭＰ）；インターフェロン−アルファ、−ベータおよび−ガンマなどのインターフェロン；コロニー刺激因子（ＣＳＦｓ）（例えば、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦ）；インターロイキン（ＩＬｓ）（例えば、ＩＬ−１からＩＬ−１０まで）；抗−ＨＥＲ−２抗体；スーパーオキシドジムスターゼ；Ｔ−細胞受容体；表面膜タンパク質；崩壊促進因子；例えば、ＡＩＤＳエンベロープの一部などのウイルス抗原；輸送タンパク質；ホーミング受容体；アドレッシン（addressin）；調節タンパク質；抗体；および上記に列挙したポリペプチドのいずれかの断片。
関心のある好ましい外在性ポリペプチドは哺乳動物のポリペプチドである。このような哺乳動物のポリペプチドの例にはt−ＰＡ、gp１２０、抗−ＨＥＲ−２、ＤＮアーゼ、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−II、脳ＩＧＦ−Ｉ、成長ホルモン、リラキシン鎖、成長ホルモン放出因子、インシュリン鎖またはプロ−インシュリン、ウロキナーゼ、イムノトキシン、神経栄養因子および抗原が含まれる。特に好ましい哺乳動物のポリペプチドには、例えば、t−ＰＡ、gp１２０（IIIb）、抗−ＨＥＲ−２、ＤＮアーゼ、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−II、成長ホルモン、ＮＧＦ、ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＮＴ−５およびＮＴ−６、より好ましくはＩＧＦ、最も好ましくはＩＧＦ−Ｉおよび最も好ましい哺乳動物のポリペプチドはヒトのポリペプチドである。
本明細書で使用する『ＩＧＦ−Ｉ』とは、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマおよび好ましくはヒトを含むいずれかの種に本来存在する配列または変異形態および組換えにより産生されたものにおけるインシュリン様増殖因子をいう。好ましい方法において、該ＩＧＦ−Ｉはクローニングされ、ついでそのＤＮＡは発現させられる（例えば、１９８４年１２月１９日に公開されたＥＰ第１２８,７３３号に記載されている方法によって）。
『コントロール配列』との表現は、特定の宿主生物における実施可能に結合しコーディング配列の発現に必要なＤＮＡ配列をいう。細菌に適したコントロール配列はアルカリホスファターゼプロモーター、任意にはオペレーター配列およびリボソーム結合部位を含む。
他の核酸配列と機能的な関係におかれた場合、核酸は『実施可能に結合した』という。例えば、プレ配列または分泌リーダーのＤＮＡは、それがポリペプチドの分泌に関与するタンパク質として発現するなら、ポリペプチドのＤＮＡに実施可能に結合する；プロモーターまたはエンハンサーは、コーディング配列の転写に影響を及ぼすなら、該配列に実施可能に結合する；またはリボソーム結合部位をコーディング配列の翻訳を促進するように配置するなら、該配列に実施可能に結合する。一般に、『実施可能に結合した』とは、結合したＤＮＡ配列同士が隣接しており、分泌リーダーの場合においては隣接し、リーディング相にある。結合は都合の良い制限部位でライゲーションすることによって行う。このような部位が存在しない場合には、該合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを従来の手腕に従って使用する。
本明細書で使用する表現『細胞』、『細胞株』および『細胞培養』は、相互変換できるように使用し、このような語はすべてその子孫も含む。従って、『形質転換体』および『形質転換細胞』は、第一代対象細胞およびトランスファー数に関係なく、それら由来の培養物も含む。また、すべての子孫は、故意または偶然の変異のためにＤＮＡ内容物において厳密に同一でないかもしれないと理解される。もともと形質転換した細胞においてスクリーニングされたのと同様の機能または生物学的活性を有する変異子孫を含む。特別な呼称が意図される場合は文脈から明らかであるだろう。
本明細書で使用する『ポリメラーゼチェーンリアクション』または『ＰＣＲ』の技術とは、一般に核酸、ＲＮＡおよび／またはＤＮＡの特定部分の微少量を１９８７年７月２８日に発行された米国特許第４,６８３,１９５号に記載されたように増幅する方法をいう。概して、オリゴヌクレオチドプライマーを設計することができるよう関心のある領域の配列情報またはそれを越える配列情報が利用されるべき必要性がある；これらのプライマーは増殖されるべき鋳型の反対鎖配列に同一または類似であろう。該２つのプライマーの５'−末端ヌクレオチドは増殖された物質の両端に一致する。ＰＣＲは特異的なＲＮＡ配列、総ゲノムＤＮＡからの特異的なＤＮＡ配列および総細胞ＲＮＡ、バクテリオファージまたはプラスミド配列などから転写されたcＤＮＡを増幅するのに使用することができる。一般的に、ミュリス（Ｍullis）ら、Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｓymp．Ｑuant．Ｂiol.、５１：２６３（１９８７）；アーリッヒ（Ｅrlich）、編、ＰＣＲ Ｔechnology、（ストックトン・プレス（Ｓtockton Ｐress）、ニューヨーク、１９８９）参照。ＰＣＲの進歩に関する最近の概説には、アーリッヒら、Ｓcience、２５２：１６４３−１６５０（１９９１）参照。
本明細書で使用するＰＣＲは、プライマーとしての公知の核酸および核酸の特定の部分を増幅または産生するための核酸ポリメラーゼの使用を含む核酸試験サンプルを増幅するための核酸ポリメラーゼ反応方法の１つの、しかし唯一ではない例であると考えられる。
Ｂ．本発明の実施方法
本発明の工程において、dsbＡまたはdsbＣ遺伝子の発現を異種遺伝子発現のちょうど前（直前）に誘発する。該異種ポリペプチドおよびＤsbＡまたはＤsbＣタンパク質は両者ともがペリプラズムに分泌されるか、または異種ポリペプチドがこれらのポリペプチドをコードする核酸が導入される細菌の培養培地中に分泌される。該ポリペプチドが細菌ペリプラズムから回収されるのが好ましい。
dsbＡまたはdsbＣ核酸は、任意の細菌源からのcＤＮＡまたはゲノムＤＮＡであってよく、一般に天然に存在する配列である。それは、核酸同士が同じベクター上にある、すなわちそれらが結合していないなら、異種ポリペプチドをコードする核酸から適切に分離して置かれる。さらに、ＤsbＡまたはＤsbＣをコードする核酸および異種ポリペプチドをコードする核酸が別個の、多様な誘発可能なプロモーターの下にある結果、発現の誘発が必要とされる配列順に起こることができる。ＤsbＡまたはＤsbＣをコードする核酸および異種ポリペプチドをコードする核酸は宿主細胞ゲノムに組み込まれるか、または自動的に複製するプラスミドに含まれる。
もし、ＤsbＡまたはＤsbＣが宿主細胞の本来の産物である場合、およびこれらの天然に存在する遺伝子の発現を制御する因子が理解されるなら、このような因子はdsbＡまたはdsbＣの過剰な発現を例えば、公知のインデューサー分子を用いて天然のプロモーターからの転写を誘発すること、遺伝子産物を誘発的に過剰発現している変異株を産生するための遺伝子産物の発現を制御または抑制する核酸の変異、該遺伝子産物の転写を通常抑制する因子の合成または機能を抑制する第２部位の変異などによって達成するよう操作されることができる。
別の態様において、該細菌は、ＤsbＡまたはＤsbＣタンパク質をコードする核酸および異種ポリペプチドをコードする核酸をそれぞれ含む２つの別個のベクターを含む。
別の態様において、ＤsbＡまたはＤsbＣタンパク質をコードする核酸および異種ポリペプチドをコードする核酸は同じベクターに含まれるが別個の誘発可能なプロモーターおよび別個のシグナル配列の制御下にある。
異種核酸（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）は細菌の適切なプロモーターの制御下での細菌中での発現のため複製可能なベクターに適切に挿入される。多数のベクターはこの目的に利用することができ、適切なベクターの選択は該ベクターに挿入しようとしている核酸の大きさおよび該ベクターで形質転換しようとする特定の宿主細胞の大きさに主として依存するであろう。各ベクターはその機能（ＤＮＡの増幅またはＤＮＡの発現）および調和している特定の宿主細胞に依存している多様な要素を含む。細菌の形質転換に関するベクターの要素には一般的に、以下の１つまたはそれ以上をこれらに限定するわけではないが含む；シグナル配列、複製起点、１つまたはそれ以上のマーカー遺伝子および誘発可能なプロモーター。
概して、宿主細胞に一致する種に由来するレプリコンおよびコントロール配列を含むプラスミドベクターが細菌の宿主と関連して使用される。該ベクターは、通常、複製部位ならびに形質転換した細胞における表現型選択を提供することができるマーキング配列を有する。例えば、大腸菌は大腸菌種由来のプラスミド（例えばボリバー（Ｂolivar）ら、Ｇene、２：９５［１９７７］参照）pＢＲ３２２を用いて典型的には形質転換される。pＢＲ３２２はアンピシリンおよびテトラサイクリン耐性の遺伝子を含有し、従って、形質転換した細胞を同定するのに容易な手段を提供する。該pＢＲ３２２プラスミドまたは他の微生物プラスミドまたはファージも一般には選択可能なマーカー遺伝子の発現のための微生物によって用いられることができるプロモーターを含むか、または含むように修飾される。
本明細書で関心のあるポリペプチドをコードするＤＮＡは直接、ならびに他のポリペプチド、好ましくはシグナル配列または成熟ポリペプチドのＮ−末端で特異的な開裂部位を有する他のポリペプチドとの融合にて発現されてよい。概してシグナル配列は該ベクターの要素であってよく、または該ベクターに挿入されるポリペプチドＤＮＡの一部分であってよい。選択された異種シグナル配列は宿主細胞によって認識および所有される（すなわち、シグナルペプチダーゼによって開裂される）ものであるべきである。天然のシグナル配列を認識および所有しない細菌宿主細胞については、該シグナル配列は、例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐまたは耐熱性エンテロトキシンIIリーダーよりなる群から選択される細菌のシグナル配列によって置換される。
発現およびクローニングベクターは、ベクターが１つまたはそれ以上の選択された宿主細胞で複製することができるようにする核酸配列を含む。一般に、クローニングベクターにおいて、該配列は宿主の染色体ＤＮＡとは独立して複製することができるものであり、複製起点または自律複製配列を含む。このような配列は多様な細菌に関してよく知られている。プラスミドpＢＲ３２２からの複製起点は最もグラム陰性細菌に適している。
発現およびクローニングベクターは一般に選択遺伝子（選択可能なマーカーと名付けられてもいる）も含む。この遺伝子は選択培養培地中で増殖した形質転換細胞の生存または増殖に必要なタンパク質をコードする。選択遺伝子を含むベクターで形質転換していない宿主細胞は培養培地中で生存しないであろう。典型的な選択遺伝子は（ａ）抗生物質または他の毒素（例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートまたはテトラサイクリン）に対する抵抗性を与える、（ｂ）栄養要求性欠乏症を補う、または（ｃ）複雑培地例えば桿菌のＤ−アラニンラセミ化酵素をコードする遺伝子から入手できない重要な栄養素を補給するタンパク質をコードする。選択案の一例は宿主細胞の増殖を阻害する薬剤を利用するものである。異種遺伝子でうまく形質転換したそれらの細胞は薬剤耐性を与えるタンパク質を産生し、従って選択支配を生き残る。
異種ポリペプチドを産生するための発現ベクターもまた、宿主の細菌生物によって認識され、関心のあるポリペプチドをコードする核酸に実施可能に結合している誘発可能なプロモーターを含む。それはまた、ＤsbＡまたはＤsbＣタンパク質をコードする核酸に実施可能に連結した別個の誘発可能なプロモーターをも含む。細菌宿主での使用に適している誘発可能なプロモーターは、β−ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系（チャン（Ｃhang）ら、Ｎature、２７５：６１５［１９７８］；ゲッデル（Ｇoeddel）ら、Ｎature、２８１：５４４［１９７９］）、アラビノースプロモーター系（ガズマン（Ｇuzman）ら、Ｊ．Ｂacteriol.、１７４：７７１６−７７２８［１９９２］）、アルカリホスファターゼ、トリプトファン（trp）プロモーター系（ゲッデル、Ｎature Ａcids Ｒes.、８：４０５７［１９８０］およびＥＰ第３６,７７６号）およびtacプロモーターなどのハイブリッドプロモーター（デボーア（deＢoer）ら、Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ、８０：２１−２５［１９８３］）を含む。しかしながら、他の公知の細菌の誘発可能なプロモーターは適切である。それらのヌクレオチド配列は公開され、それによって当業者はそれらを、任意の必要とされている制限部位を供給するためのリンカーまたはアダプターを用いて、関心のあるポリペプチドをコードするＤＮＡまたはdsbＡまたはdsbＣ遺伝子（ジーベンリスト（Ｓiebenlist）ら、Ｃell、２０：２６９［１９８０］）にライゲーションすることができる。
細菌系において使用するためのプロモーターはまた、一般に関心のあるポリペプチドをコードするＤＮＡに実施可能に連結したシャイン・ダルガノ（Ｓ.Ｄ.）配列を含む。該プロモーターは制限酵素消化によって細菌由来のＤＮＡから除去され、ついで目的のＤＮＡを含むベクターに挿入されることができる。
１つまたはそれ以上の上記に列挙した要素を含む適切なベクターの構築には標準的なライゲーション技術を用いる。単離されたプラスミドまたはＤＮＡ断片は必要とするプラスミドを得るために望ましい形態で開裂され、合わせられついで再度ライゲーションされる。
構築されたプラスミドにおいて正確な配列を確認するための分析のため、ライゲーション混合物が、大腸菌Ｋ１２ ２９４株（ＡＴＣＣ受託番号３１,４６６号）またはその他の株を形質転換するのに使用され、成功した形質転換体を適切なアンピシリンまたはテトラサイクリン抵抗性によって選択する。形質転換体からのプラスミドが調製され、制限エンドヌクレアーゼ消化によって分析され、および／またはサンガー（Ｓanger）ら、Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ、７４：５４６３−５４６７（１９７７）またはメッシング（Ｍessing）ら、Ｎucleic Ａcids Ｒes.、９：３０９（１９８１）またはマキサム（Ｍaxam）ら、Ｍethods in Ｅnzymology、６５：４９９（１９８０）の方法によってシークエンシングされる。
この目的に適切な細菌には、古細菌および真性細菌、特に真性細菌および最も好ましくはエンテロバクテリアセエ（Ｅnterobacteriaseae）を含む。有用な細菌の例にはエシェリキア（Ｅscherichia）、エンテロバクター（Ｅnterobacter）、アゾトバクター（Ａzotobacter）、エルウィニア（Ｅrwinia）、バシラス（Ｂacillus）、シュードモナス（Ｐseudomonas）、クレブシエラ（Ｋlebsiella）、プロテウス（Ｐroteus）、サルモネラ（Ｓalmonella）、セラチア（Ｓerratia）、シゲラ（Ｓhigella）、リゾビア（Ｒhizobia）、ビトレオスシラ（Ｖitreoscilla）およびパラコッカス（Ｐaracoccus）を含む。適切な大腸菌宿主には、大腸菌Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ受託番号第２７,３２５号）、大腸菌２９４（ＡＴＣＣ受託番号第３１,４４６号）、大腸菌Ｂおよび大腸菌Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ受託番号第３１,５３７号）を含む。これらの例は制限するよりむしろ例示するものである。上記した細菌のいずれかの変異細胞もまた、使用されてよい。勿論、細菌の細胞におけるレプリコンの複製性を考慮に入れて適切な細菌を選択することが必要である。例えば、大腸菌、セラチアまたはサルモネラ種はｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、pＡＣＹＣ１７７またはpＫＮ４１０などのよく知られたプラスミドはレプリコンを提供するのに使用される。
大腸菌Ｗ３１１０株は宿主として、または親宿主として好ましい、というのは組換え体ＤＮＡ産物の発酵のための一般的な宿主株であるからである。好ましくは、宿主細胞はタンパク質分解酵素の微少量を分泌すべきである。例えば、Ｗ３１１０株は、大腸菌Ｗ３１１０株１Ａ２（完全なtonＡΔ表現型を有する）；大腸菌Ｗ３１１０株９Ｅ４（完全なtonＡΔptr３表現型を有する）；大腸菌Ｗ３１１０株２７Ｃ７（ＡＴＣＣ受託番号第５５,２４４号）（完全なtonＡΔptr３phoＡΔＥ１５Δ（argＦ-lac）１６９ompＴΔdegＰ４１kanr表現型を有する）；大腸菌３１１０株３７Ｄ６（完全なtonＡΔptr３phoＡΔＥ１５Δ（argＦ-lac）１６９ompＴΔdegＰ４１kanrrbs７ΔilvＧ表現型を有する）；大腸菌Ｗ３１１０株４０Ｂ４（非カナマイシン耐性degＰ欠失変異を有する３７Ｄ６株）；大腸菌Ｗ３１１０株３３Ｄ３（完全なtonＡptr３lacＩqＬacＬ８ompＴdegＰkanr表現型を有する）；大腸菌Ｗ３１１０株３６Ｆ８（完全なtonＡphoＡΔ（argＦ-lac）ptr３degＰkanRilvＧ＋表現型を有し、３７℃での温度耐性がある）；１９９０年８月７日に発行された米国特許第４,９４６,７８３号に開示された変異ペリプラズムプロテアーゼを有する大腸菌株などを含むような宿主の例とともに、タンパク質をコードする遺伝子において遺伝子的変異に影響を及ぼすよう修飾されてよい。
宿主細胞をトランスフェクションし、好ましくは上述した発現ベクターで形質転換し、プロモーターを誘発し、形質転換体を選択し、または目的の配列をコードする遺伝子を増幅するのに適するように修飾された従来の栄養培地中で培養する。
トランスフェクションとは、いずれかのコーティング配列が、実際に発現していようといまいと、宿主細胞によって発現ベクターに取り込まれることをいう。トランスフェクションの多数の方法は当業者に公知であり、例えば、ＣaＰＯ4およびエレクトロポレーションである。上手なトランスフェクションは、概して、このベクターの操作の任意の指令が宿主細胞内で起こる場合に認められる。
形質転換とは、ＤＮＡを生物体に導入し、そのＤＮＡを染色体外要素として、または染色体組み込みによって複製可能にすることを意味する。使用する宿主細胞に応じて、形質転換はそのような細胞に適した標準的技術を使用して行う。塩化カルシウムを用いたカルシウム処理（サンブルック（Ｓambrook）ら、モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ｍolecular Ｃloning：Ａ Ｌaboratory Ｍanual）［ニューヨーク：コールド・スプリングハーバー・ラボラトリー・プレス（Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｐress）、１９８９］中、１.８２章に記載されたように）は概して実質的な細胞壁障害を含む細菌細胞のために使用される。形質転換のために他の方法はチャン（Ｃhung）およびミラー（Ｍiller）、Ｎucleic Ａcids Ｒes.、１６：３５８０（１９８８）に記載されているように、ポリエチレングリコール／ＤＭＳＯを用いる。さらに別の方法は、エレクトロポレーションと名付けられた技術を使用する。
本発明の目的のために関心のあるポリペプチドを産生するため使用される細菌細胞は異種ポリペプチドをコードする核酸およびＤsbＡまたＤsbＣをコードする核酸のプロモーターが一般的に、例えばサンブルックら、上記に記載されるように人工的に誘発されることができるような適切な培地中で培養する。適切な培地の例としては、米国特許第５,３０４,４７２号および第５,３４２,７６３号に提示されている。
炭素、窒素および無機リン酸源の他に必要ないずれかの補足物もまた、単独、または複合窒素源などの他の補足物または培地との混合物として導入され、適切な濃度で含まれてよい。培地のｐＨは、およそ５−９のいずれであってよく、主として宿主生物に依存する。好ましくは、培地は還元されたグルタチオンを全く含まず、細菌は熱ショック転写因子、ＲpoＨをコードする核酸を過剰発現すように培養されない。
誘発に関して、典型的に細胞を、dsbＡまたはdsbＣ遺伝子の発現を誘発するため、例えば、およそＡ550６０−８０（点誘発（例えば、インデューサーの添加によって、または培地成分の枯渇によってなど）が始まるところで）においてある吸光度になるまで培養する。該吸光度がより一層高い量に達する（例えば、およそＡ550８０−１００）と、異種ポリペプチドの第２プロモーターの誘発が影響を受ける。
遺伝子発現は、サンプル中で直接的に、例えばｍＲＮＡの転写を定量するために従来のノーザンブロットによって測定されてよい。トーマス（Ｔhomas）、Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ、７７：５２０１−５２０５（１９８０）。種々の標識が使用され、最も一般的なものは、放射性同位体、特に32Ｐが使用される。しかしながら、ポリヌクレオチドへの導入のためにビオチン修飾ヌクレオチドを用いるなど、他の技術も使用してよい。ついで、ビオチンはアビジンまたは抗体と結合するための部位として機能し、広範囲の種々の標識（放射性核種、蛍光、酵素など）で標識されてよい。
発現しているまたは過剰に発現している遺伝子産物が分泌されているかどうかを観察する手法は、容易に当業者には利用できる。一度培養培地が宿主細胞から分離されると（例えば、遠心または濾過によって）、遺伝子産物はその遺伝子産物に特徴的である公知の性質を利用することによって、無細胞系の培養培地において検出されることができる。このような特性は、その遺伝子産物の顕著な免疫学的、酵素的または物理学的特性を含むことができる。
例えば、もし過剰発現した遺伝子産物が独特の酵素活性を有するならば、その活性のアッセイは宿主細胞によって使用される培養培地で行われることができる。さらに、与えられた遺伝子産物に対して応答する抗体が利用できる場合、このような抗体は公知のいずれかの免疫学的アッセイ（例えば、ハーロウ（Ｈarlowe）ら、アンチボディーズ：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ａntibodies：Ａ Ｌaboratory Ｍanual）、コールド・スプリング・ハーバー・プレス、ニューヨーク、１９８８）にて遺伝子産物を検出するのに使用することができる。
分泌された遺伝子産物または、ポリペプチドを分子量などの特徴的な物理学的な特性に基づいて区別する試験を用いて検出することもできる。その遺伝子産物の物理学的特性を検出するため、宿主細胞によって新しく合成された全てのポリペプチドを標識する（例えば、放射性同位元素で）ことができる。宿主細胞内で合成されたポリペプチドを標識するのに使用されることができる一般的な放射性同位元素は、トリチウム（3Ｈ）、炭素−１４（14Ｃ）、硫黄−３５（35Ｓ）などを含む。例えば、宿主細胞は35Ｓ−メチオニンまたは35Ｓ−システイン培地中で増殖されることができ、ついで35Ｓ標識の有意な量は、過剰発現した異種ポリペプチドを含む新規に合成されたポリペプチドのいずれかに好ましく組み込まれるであろう。ついで35Ｓ含有培養培地を除去し、細胞を洗浄し、新鮮な放射性活性を有さない培養培地中に静置する。35Ｓ標識した発現した異種ポリペプチドの分泌を可能にするのに十分な条件下でしばらく新鮮培地中で細胞を維持した後、該培養培地を回収し、宿主細胞から分離する。培養培地中で分泌され、標識されたポリペプチドはついで公知の手法、例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動などによって決定されてよい。分泌された遺伝子産物を検出するためのこのような手法および／または他の手法はゲッデル（編）１９９０、Ｇene Ｅxpression Ｔechnology、Ｍethods in Ｅnzymology、Ｖol．１８５（アカデミック・プレス（Ａcademic Ｐress））およびサンブルックら、上記に提供されている。
発現または過剰発現された遺伝子産物の分泌に関して、宿主細胞は該遺伝子産物の分泌に十分な条件下で培養される。このような条件には、例えば、温度、栄養および該細胞による分泌を可能にする細胞密度条件などが含まれる。さらに、このような条件は当業者に公知のように、細胞が転写、翻訳および１つの細胞コンパートメントから他のコンパートメントへのタンパク質の輸送の基礎的な細胞機能を行うことができるような条件である。
本発明の工程の実施において、総ポリペプチドの収率は一般的に増加するが、可溶性ポリペプチドの収率は不変であるかまたは減少する、すなわち、不溶性（集合した）ポリペプチドの収率が増加する。
関心のあるポリペプチドは分泌ポリペプチドとしてペリプラズムまたは培養培地から回収される。しばしば、組換え体細胞タンパク質またはポリペプチドから、および関心のあるポリペプチドに実質的に類似である調製物を得るためのＤsbＡまたはＤsbＣタンパク質から関心のあるポリペプチドを精製することは好ましい。第１工程として、培養培地またはリゼイトは粒子性細胞破片を除去するため遠心される。該膜および可溶性タンパク質画分はついで必要ならば分離される。ついで該ポリペプチドは可溶性タンパク質画分および培養リゼイトの膜分画から、該ポリペプチドが膜結合か、可溶性か、または集合した形態で存在しているかにより精製される。その後、ポリペプチドは可溶化され、再び折り畳まれ、必要ならば、可溶性タンパク質およびポリペプチドの夾雑物から精製される。好ましい態様において、集合したポリペプチドは単離され、米国特許第５,２８８,９３１号に開示されているようについて自発可溶化および再折り畳み工程が続く。
上に記載されたものなどのポリペプチドおよび発酵ブロス中に含有された非ポリペプチドを含む複合生物学的混合物からの外在性ポリペプチドを単離する好ましい方法は、細胞好ましくは細胞培養（本来の形態ではないポリペプチドを含む）と試薬との接触に関与し、その結果水溶性抽出／単離が起こる。好ましくは、該方法は該ポリペプチドが組換えで生成された後、発酵導管に試薬を直接添加し、それによって、回収、ホモジナイゼーションおよびポリペプチドを得るための遠心の余分な工程を回避する。残存する粒子はガウリンホモジナイゼーションおよび再懸濁、濾過またはその組み合わせによって除去されることができるが、この方法は残存粒子からの組換え体ポリペプチドを精製する多相抽出を利用する。
とりわけ、この方法は、細胞のペリプラズム中にリフラクティル体（refractile bodies）を形成する、大腸菌を含む細菌細胞中に組換え体として産生される本来は存在しない哺乳動物ポリペプチドにとって好ましい。この系において、尿素、塩酸グアニジンおよび／または塩基、およびジチオトレイトールまたはシステインなどの１つまたはそれ以上の、変性剤（カオトロピック剤）をポリペプチド含有培地に添加し、ついで該ブロスに相を形成する種を添加する。一度この第２群の薬剤をブロスに添加すると多相が形成され、それによって１つの相がポリペプチド中で豊富にされ、生物量固体および核酸中で枯渇される。好ましくは該系は２ないし４の相を有し、より好ましくは２つの相、１つはポリペプチド中で豊富にされ、他方は生物量固体および核酸中で豊富にされるものを有する。好ましくは、望ましいポリペプチドの配分は上相に存在し、その結果該上相は該ポリペプチドが豊富であり生物量固体および核酸中に枯渇される。
特に、発酵が完了したのち、該細胞培養を１つまたはそれ以上のカオトロピック剤に接触させ、時に還元剤に、および相形成薬剤に接触させ、多相を形成し、そのうちの１つの相は関心のあるポリペプチド中で豊富である。細胞からポリペプチドを抽出するカオトロピック剤および還元剤を最初に添加するのが好ましく、ついで相形成剤を添加する前にブロス中でその可溶度を維持するのが好ましい。また、関心のあるポリペプチドが任意の相から（および任意の相に豊富である）抽出されることができるが、好ましくは最上相から回収する。
最も好ましくは、カオトロピック剤および任意の還元剤を直接ポリペプチドの単離前に発酵導管中の発酵ブロスに添加すると該薬剤は細胞に浸透でき、該ポリペプチドは可溶化され、周囲の培地に拡散することができる。該還元剤はもしポリペプチドが少なくとも１つのスルフヒドリル基を含む場合には添加する。適切な還元剤の例には、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、β−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）、システイン、チオグリコレートおよび水素化ホウ素ナトリウムを含む。バッファー中に存在する還元剤の量は主として還元剤およびカオトロピック剤のタイプ、使用するバッファーのタイプとｐＨおよびバッファー中のポリペプチドのタイプおよび濃度による。還元剤の有効量は、分子内ジスルフィド媒介集合を排除するのに十分であるものである。例えば、０.５−６mg／mＬ ＩＧＦ−ＩのｐＨ７.５−１０.５での１−４Ｍ尿素を含むバッファー溶液中で、ＤＴＴ濃度がおよそ１−２０mＭで、システイン濃度がおよそ１０−５０mＭである。好ましい還元剤はおよそ２−１０mＭ ＤＴＴまたはおよそ３０−５０mＭシステインである。
抽出の本方法を実施するのに適したカオトロピック剤は、例えば、グアニジンまたはチオシアン酸塩、より好ましくは、尿素、塩酸グアニジンまたはチオシアン酸ナトリウムを含む。バッファー中に存在するのに必要なカオトロピック剤の量は、例えば、存在するカオトロピック剤のタイプおよびポリペプチドのタイプに依存する。発酵ブロスに添加されるべきカオトロピック剤の量は細胞からポリペプチドを抽出しブロス中でその可溶度を維持するのに十分高いであろう。ポリペプチドが最上相から抽出されるべきなら、カオトロピック剤の量は相を形成する種の添加後、密度は固体が底に沈む代わりに上昇点までは増加しないよう十分低くなければならない。一般的に、カオトロピック剤の濃度はおよそ０.１〜９Ｍ、好ましくはおよそ０.５〜９Ｍ、より好ましくはおよそ０.５〜６Ｍおよび最も好ましくはおよそ０.５〜３Ｍである。また、好ましくはカオトロピック剤は相を形成する薬剤を添加する前に培養培地に添加する。本明細書において好ましいカオトロピック剤はおよそ１.５〜２.５Ｍ、より好ましくはおよそ２Ｍの尿素、またはおよそ０.５〜３Ｍの塩酸グアニジンである。最も好ましいカオトロピック剤は尿素である。
カオトロピック剤および還元剤が添加される水溶液中のポリペプチドの濃度は、ポリペプチドが最大収量で回収できるような濃度でなければならない。使用するのに正確な量は例えば、ポリペプチドのタイプおよび水溶液中の他の成分、例えば還元剤、カオトロピック剤、相を形成する種およびｐＨといったものの濃度およびタイプ次第である。一般に、ポリペプチドに関しては、ポリペプチドの好ましい濃度はおよそ０.１〜１５mg／mＬである。ＩＧＦ−Ｉの好ましい濃度（変性または本来のものでないＩＧＦ−Ｉの最大収量となる濃度）は、０.５〜６mg／mＬ、より好ましくは１．５〜５mg／mＬの範囲にある。
本明細書で使用する相を形成する種のタイプは多数の因子（ポリペプチドのタイプおよび処理されている発酵ブロス中の成分を含む）に依存している。該種はポリペプチドは沈澱せず、１つの相は他の相より疎水性であり、そのためポリペプチドはより疎水性の相中に存在し、生物量固体および核酸は疎水性ではない方の相に沈澱するように選択されなければならない。
相を形成する種は薬剤の組合せ（ポリマー組合せ（ポリマー−ポリマー）、ポリマー−塩組合せ、溶媒−塩およびポリマー−溶媒組合せを含む）であってよい。適切なポリマーは高親水性ポリマーおよび低親水性ポリマーの両者、すなわち当該技術分野において公知の相を形成するポリマーの任意のものである。例には、ポリエチレングリコール、またはその誘導体（ＰＥＧ４０００、ＰＥＧ６０００およびＰＥＧ８０００などの多様な分子量のＰＥＧ、記載されたＰＥＧの誘導体、（例えば、グランフェルド（Ｇrunfeld）ら、Ａppl．Ｂiochem．Ｂiotechnol.、３３：１１７−１３８（１９９２）に記載されている）およそ３６,０００ないし３６０,０００の好ましい分子量を有する、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、デキストラン（例えばデキストラン７０および５００）、デキストリンおよびマルトデキストリン（好ましい分子量はおよそ６００ないし５,０００）、スクロースおよびＦicoll−４００TMポリマー（スクロースおよびエピクロロヒドリンのコポリマー）などのデンプンが含まれる。本明細書で好ましいポリマーは、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリビニルピロリドンまたはデキストランなどのポリサッカリドである。本明細書で最も好ましいポリマーは種々の分子量のＰＥＧまたはＰＥＧ−ポリプロピレングリコールの組合せまたはコポリマーである。
適切な有機溶媒の例には、エチレングリコール、グリセロール、ジメチルスルホキシド、ポリビニルアルコール、ジメチルホルムアミド、ジオキサンおよびメタノール、エタノールおよび２−プロパノールなどのアルコールが含まれる。このような溶媒は、水溶液に添加されると、それらはその溶液の疎水度を高める。
塩は、無機または有機塩でよく、好ましくはポリペプチドを沈澱させるように機能しないのがよい。遷移元素を含有する塩はポリペプチドを沈澱させがちであるので好ましくない。アニオンは水性多相系を形成する可能性を有するものが選択される。例には硫酸アンモニウム、リン酸二塩基ナトリウム、硫酸ナトリウム、リン酸アンモニウム、クエン酸カリウム、リン酸マグネシウム、リン酸ナトリウム、リン酸カルシウム、リン酸カリウム、硫酸カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸カルシウム、クエン酸ナトリウム、硫酸マンガン、リン酸マンガンなどが含まれる。２相水性系を形成するのに有用な塩のタイプは、ザスラブスキ（Ｚaslavskii）ら、Ｊ．Ｃhrom.、４３９：２６７−２８１（１９８８）に一層完全に評価されている。本明細書の好ましい塩は、硫酸塩、リン酸塩またはクエン酸塩であり、アルカリ金属またはアルカリ土類金属である。より好ましい塩は硫酸塩およびクエン酸塩であり、最も好ましい塩はｐＨ制限が殆どないので硫酸塩が好ましい。本明細書における最も好ましい塩は硫酸ナトリウムおよびクエン酸ナトリウムである。
満足な多相系を得るための関心のあるポリペプチドに添加する相を形成する種の量は、当業者に公知である。ポリペプチドに添加される相を形成する種の量は例えば、カオトロピック剤および還元剤の量（もしあれば既に発酵ブロス中に存在している）、細胞培養培地の性質、発酵に使用される細胞のタイプ、処理されるポリペプチドのタイプ、そのポリペプチドが下相または上相から回収されるかどうか、および添加される相を形成する種のタイプなどの因子による。使用されるポリマーの一般的な濃度は必要とされる相−容量の比率の大きさに依存し、ポリマーの可溶度の制限までおよそ５％（w／w）および使用される塩の濃度は塩の可溶度の制限までおよそ３％（w／w）である。相−容量の比率は生物量固体を収容するのに十分でなければならない。有効である相を形成する種のタイプおよび量は相ダイアグラムおよび最終結果すなわち、関心のあるポリペプチドの精製の程度および収率を評価することによって決定することができる。もし相を形成する種がポリマー−塩の組合せなら、添加される塩の濃度は好ましくはおよそ４−１５％（w／w）およびポリマーの濃度は５−１８％（w／w）であり、その結果目的のポリペプチドは生物量固体および核酸が存在する相と逆の相にるであろう。
望ましい系がポリペプチドが最上の相に分布し、生物量固体および核酸が最下相に分布するものである場合、相を形成する種の濃度の窓（window）がある。一層多量なカオトロピック剤が可溶化を維持するために添加する場合、一層多量の相を形成する種が必要である。しかしながら、これらすべての薬剤の高濃度は溶液の密度を増加させる。高い密度は生物量固体を容易には沈澱させないようにする。過剰に高い密度は生物量固体を表面に浮遊させるであろう。従って、カオトロピック剤および相を形成する種の濃度はポリペプチドの完全な可溶化を維持するのに十分高くなければならず、生物量固体を逆の（下の）相に沈澱させることができるのに十分低くなければならない。
該ポリペプチドが上の相にて回収されるような場合、典型的には、例えば、塩、ポリマーおよびポリペプチドのタイプに依存して、該塩濃度はおよそ４−７％（w／w）であり、該ポリマー濃度はおよそ１２−１８％（w／w）であるであろう。もし、有機溶媒が、エタノールなどの相を形成する種として添加されるならば、好ましくは、ポリペプチドおよびアルコールのタイプに依存して、該溶液のおよそ１０〜３０％（容量／容量）の濃度にて添加され、もし他の相を形成する種が存在するならば、好ましくはおよそ２０％（v／v）の濃度で添加される。
細胞培養物と種々の薬剤を接触させる厳密な条件は、例えば、バッファーのｐＨ、相を形成する薬剤のタイプおよびポリペプチドおよびカオトロピック剤および還元剤のタイプおよび濃度に依存するであろう。反応濃度は、一般におよそ２０〜４０℃であり、より好ましくは室温である。接触工程は一般に、少なくとも３０分間、好ましくは副作用が起こるか否かによって３０分から１２時間、より好ましくはおよそ３０分〜８時間、最も好ましくは３０分〜１.５時間で行う。
もしポリペプチドが折り畳まれていないなら、折り畳まれていない程度は本来存在しないポリペプチドのクロマトグラフィー（疎水性相互作用クロマトグラフィー、またはイオン交換クロマトグラフィーを含む）によって適切に決定される。本来存在しない物質のピーク領域の増加は、どれだけ本来存在しないポリペプチドが存在しているのかを示す。
一度多相系が確立すると、１つの相はポリペプチドに富み、生物量固体および核酸を含む崩壊した粒子および細胞中に枯渇する。２相系において、最上相がポリペプチドに富み、一方で底の相は崩壊した粒子および細胞に富むのが好ましい。該ポリペプチドは容易に該相の分離によって回収することができる。この回収工程は上相をデカントすること、下相を乾燥させることまたは遠心によって達成することができる。ついで、ポリペプチドはそれが含まれている相から該ポリペプチドを沈澱させるように相のｐＨを変化させることによってか、または適切な溶媒を添加することによって単離することができ、そうすることによって、沈澱したポリペプチドは適切に遠心、または濾過によりまたはスラリーとして回収される。別法として、該ポリペプチドは適切なポリマー、塩または溶媒の添加による再抽出によってポリマー含有相から回収することができる。ＩＧＦ−Ｉの場合、該ポリペプチドはＩＧＦ−Ｉが沈澱し、ＩＧＦ−Ｉの収量が少なくともまたはおよそ９７％より多くなるようにｐＨを低くすることによって、単離されたポリマーの相から回収される。ＤsbＡまたはＤsbＣタンパク質は本段階でポリペプチドから分離されるであろう。
一度多相系の液相から得ると、または後の精製段階から得ると、該ポリペプチドは適切に活性形態へと再度、折り畳まれる。利用することができる１つの適切な再折り畳み方法は以下である。
該ポリペプチドが本明細書に記載の多相抽出系によって可溶化および抽出された後、それは溶媒、カオトロピック剤、塩および微少量の銅またはマグネシウム塩を含むバッファー中に静置または希釈される。このバッファーは任意のタイプの宿主からのポリペプチドの再折り畳み量を予期せず増加させる。このバッファーは主としてポリペプチドおよび還元剤のタイプにより、ｐＨはおよそ７〜１２、好ましくは８〜１１、より好ましくは８.５〜１１および最も好ましくは８.５〜１０.５である。
該バッファーの１つの鍵となる成分は、例えば、ポリペプチドおよび溶媒のタイプおよびカオトロピック剤の濃度などによって溶液のおよそ５−４０％（v／v）、好ましくは１０−３０％（溶量／溶量）の濃度でアルコールまた極性非プロトン性溶媒である。最も好ましい濃度はおよそ２０％（v／v）である。
該バッファーの第２の鍵となる成分は、主として使用するカオトロピック剤の濃度、溶媒の濃度およびアルカリ土類、アルカリ金属またはアンモニウム塩のタイプによっておよそ０.２〜３Ｍ、好ましくは０.２〜２Ｍの濃度で存在するアルカリ土類、アルカリ金属またはアンモニウム塩である。例えば、陽イオンがナトリウム、カリウムまたはアンモニウムの場合なら、濃度はおよそ０.５〜３Ｍであるが、陽イオンがマグネシウムの場合には、濃度はおよそ０.２〜１Ｍである。
該バッファーの第３の鍵となる成分は、カオトロピック剤の有効量である。このようなカオトロープ（chaotrope）の量は主としてアルカリ土類、アルカリ金属またはアンモニウム塩の濃度、溶媒の濃度、使用するアルカリ土類、アルカリ金属またはアンモニウム塩の具体的なタイプならびに該バッファーのｐＨに依存するであろうが、一般にはおよそ０.１〜９Ｍ、好ましくはおよそ０.５〜６Ｍおよび最も好ましくはおよそ１.５〜４Ｍであろう。具体的なカオトロープに関しては、好ましくは０.１〜２Ｍの塩酸グアニン、好ましくは１−３Ｍ、より好ましくはおよそ１−２.５Ｍおよび最も好ましくはおよそ２Ｍの尿素を利用する。
該バッファーの第４の鍵となる成分は、酸化およびその結果の再度折り畳みが起こるであろう銅およびマンガン塩から選択された遷移金属塩の有効量である。銅またはマンガンの量は主として使用されている遷移金属およびポリペプチドのタイプおよび存在する酸素のレベルに依存している。酸素添加または酸素のレベルの割合が低ければ低いほど、一層使用することができる銅またはマンガン塩の量は高くなる。銅またはマンガンの濃度は典型的にはおよそ０.０１〜１５μＭ、好ましくはおよそ０.０１〜１０μＭ、より好ましくは０.０１〜５μＭおよびさらに好ましくは０.０１〜０.５μＭである。上記の好ましい範囲は特にＩＧＦ−Ｉに好まれる。もし濃度がおよそ１５μＭを越えて増加するなら、正しく折り畳まれたポリペプチドの収量は、予期せずして劇的に減少する。最も好ましくは、銅またはマンガン塩の濃度はおよそ０.５μＭである。遷移金属塩は、例えば発酵の残渣またはバッファーに添加するかまたはその両者に添加するならば、既に外在性遷移金属塩をバッファーに添加しないで存在するであろう。
該バッファーは最初のバッファー溶液に、上記に列挙したいずれかであってよくＣＡＰＳＯ、グリシンおよびＣＡＰＳをｐＨ８.５−１１で、特におよそ２０ｍＭの濃度で、最も好ましくはＣＡＰＳＯおよびグリシンであってよい。該ポリペプチドは再折り畳みバッファーで好ましくは少なくとも５倍、より好ましくは少なくともおよそ１０倍に希釈されてよい。別法として、該ポリペプチドは再折り畳みバッファーに対して透析されてよい。該再折り畳みは典型的には０−４５℃、好ましくはおよそ２０−４０℃、より好ましくは２３−３７℃、さらに一層好ましくはおよそ２５−３７℃、最も好ましくはおよそ２５℃で少なくともおよそ１時間行われる。好ましい温度は塩、溶媒およびカオトロピック剤のレベルによっては明らかには影響を及ぼされないが、スクロースおよびグリセロールの存在によっては、およそ２０℃を超えて維持されるべき場合には影響を及ぼされる。該溶液は任意に還元剤およびオスモライトも含む。
該還元剤は与えられた濃度範囲中で可溶化する工程のため、上記から適切に選択される。その濃度は特にアルカリ土類、アルカリ金属またはアンモニウム塩、ポリペプチドおよび溶媒の濃度による。好ましくは還元剤の濃度はおよそ０.５〜８mＭ、より好ましくはおよそ１−５mＭ、さらに好ましくはおよそ０.５−２mＭである。好ましい還元剤はＤＴＴおよびシステインである。
任意のオスモライトは、好ましくはスクロース（およそ０.２５−１Ｍの濃度で）またはグリセロール（およそ１−４Ｍの濃度で）である。より好ましくは、スクロース濃度はおよそ１Ｍおよびグリセロール濃度はおよそ４Ｍである。
折り畳みバッファー中のポリペプチドの最初の濃度は、ＨＰＬＣ、ＲＩＡまたはバイオアッセイによって決定されるように、正確に折り畳まれたものの回収される誤って折り畳まれた形態に対する割合が最大となるであろう。その厳密な濃度は例えは使用するポリペプチドのタイプによるであろう。好ましいポリペプチドの濃度（正しく折り畳まれた形態の最大収量となる）はおよそ０.１−１５mg／mＬ、mg／mＬ、より好ましくはおよそ０.１−６mg／mＬおよび最も好ましくはおよそ０.２−５mg／mＬの範囲である。
さらに、空気または酸素ガスなどの源は、銅またはマンガン塩とともに酸化に影響を及ぼすようにバッファーに入れるかまたは導入される。該酸素はポリペプチドまたは他のいずれかの薬剤をバッファーに添加する以前をんで、どんな時点でもバッファー中に存在していてよい。
導入される酸素源の量は例えば、利用される容器のタイプ、ポリペプチドの濃度、酸素源のタイプ、銅またはマンガン塩のタイプおよび存在する還元剤の量によるであろうし、もしあれば、存在するカオトロピック剤のタイプおよび量ならびにバッファーのｐＨにもよるであろう。一般的に、該酸素源はアジテーターを用い、受動的手法によって（例えば、上部の空気空間対液体の容量の比が２：１である上部空間における空気として）導入されるであろう。別に、該酸素源はスパーガー（sparger）を用いて泡立てることによって導入されてよい。酸素の導入の速度は、好ましくは１−１２時間、より好ましくはおよそ１−６時間、最も好ましくはおよそ１−３時間で完了に達することができるよう十分でなければならない。モル酸素の添加は還元剤の濃度およびポリペプチドの濃度に比例するが、銅またはマグネシウム塩の濃度に反比例する。酸化の速度は、触媒のレベルによって制限されるが、酸素の添加速度によっては制限されない。一層高いスパーギング（sparging）の速度はより多容量の折り畳みに必要である。
この第２のインキュベーションは該ポリペプチドのＲＩＡ力価またはＨＰＬＣ分析（例えば、ビダック（Ｖydac）またはベイカー（Ｂaker）Ｃ−１８カラムなどを用いてＲＩＡ力価またはバッファー中に存在する正しく、生物学的に活性のあるポリペプチド形態の増加する量に直接相関する、正しく折り畳まれたポリペプチドピークの大きさを増加させて）適切に決定する。該インキュベーションは、ＲＩＡまたはＨＰＬＣによって決定されるように、正しく折り畳まれたポリペプチド形態の収率および正しく折り畳まれたポリペプチド形態の誤って折り畳まれたポリペプチド形態に対する割合を最大にするべく、およびマルチマー（multimer）の収率、マスバランス（mass balance）によって決定されるような関連ポリペプチドの収率を最少にするべく行われる。
以下の手法は適切な精製方法の例である：イムノアフィニティーまたはイオン交換カラム上での画分；エタノール沈澱；逆相ＨＰＬＣ；シリカまたはＤＥＡＥなどの陽イオン交換樹脂でのクロマトグラフィー；等電点クロマトグラフィー；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈澱；および例えばセファデックス（Ｓphadex）Ｇ−７５を用いたゲル濾過。
以下の例は例示のために提供されるものであって制限するためのものではない。全ての特許およびその明細書に引用されている科学的参照文献は参照のため本明細書に明確に包含される。
実施例Ｉ
dsbＡヌクレオチド配列がｐ１６−１（バードウェルら、上記、１９９１）からＰＣＲ技術を用いて増幅され、ＸbaＩ部位をＤsbＡ−コーディング配列の５'末端に、およびＣlaＩ部位を３'末端に添加した。このＤＮＡ断片は適当な制限酵素で消化し、ｐＫＭＴacIIの１.０kb ＰstＩ−ＸbaＩ断片でライゲーション（デボーアら、Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ、８０：２１−２５［１９８３］）およびｐＢＫＩＧＦ−２Ｂの３.６kb ＣlaＩ−ＰstＩ断片（米国特許第５,３４２,７６３号）でライゲーションした。その結果のプラスミドであるpＪＪ４１（図１参照）はtacIIプロモーターの制御下でdsbＡを含み、アンピシリンおよびテトラサイクリン耐性を与える。このプラスミドをＣlaＩで消化し、およびその末端はクレノウ断片およびデオキシリボヌクレオチドによって充填した。
クレノウ断片の不活性化および消化したＤＮＡの抽出の後、そのＤＮＡを配列的にＳacＩで消化し、ついでβ−ラクタマーゼ遺伝子の５'−末端を含む１.５kbの断片およびＴacII−dsbＡ要素を精製した。これはＥcoＲＩ消化の４.６kb断片でライゲーションし、pＢＫＩＧＦ−２Ｂ（これもＳacＩで消化されている）で充填した。このpＢＫＩＧＦ−２Ｂ断片はβ−ラクタマーゼの３'末端を含み、アンピシリン耐性による選択を可能とするとともに、テトラサイクリン耐性のＤＮＡ配列およびＩＧＦ−Ｉの産生のＤＮＡ配列を含んでいた。このプラスミドはpＪＪ４２（図１参照）と示される。
該プラスミドは大腸菌３３Ｄ３株（Ｗ３３１０tonＡptr３lacＩqＬacＬ８ompＴdegＰkanr表現型を有する）に形質転換した。この株はＰ１（ミラー（Ｊ．Ｍiller）、Ｅxperiments in Ｍolecular Ｇenetics、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー、１９７２）由来ファージＰ1kc、およびトランスポゾン遺伝学（クレックナー（Ｋleckner）ら、Ｊ．Ｍol．Ｂiol.、１１６：１２５−１５９［１９７７］）でトランスダクションに関与する技術を使用していくつかの工程にて構築された。使用される出発宿主は大腸菌Ｋ−１２ Ｗ３１１０（Ｆ−ラムダであるＫ−１２株（バックマン（Ｂachmann）、Ｂact．Ｒev.、３６：５２５−５５７［１９７２］；ネイダート（Ｆ．Ｃ．Ｎeidhardt）ら、編、Ｅscherichia coli and Ｓalmonella typhimurium：Ｃellular and Ｍolecular Ｂiology、第２巻、アメリカン・ソサイエティー・フォー・マイクロバイオロジー（Ａmerican Ｓociety for Ｍicrobiology）、ワシントンＤ.Ｃ.、１９８７）中、バックマン、『デリベーションズ・アンド・ジェノタイプス・オブ・サム・ミュータント・デリバティブズ・オブ・エシェリキア・コリ Ｋ−１２（”Ｄerivations and Ｇenotypes of Ｓome Ｍurtant Ｄerivatives of Ｅscherichia coli Ｋ−１２”）、１１９０−１２１９ページ）であった。
ゲノムへのtonＡ（fhuＡ）変異およびptr３変異の導入は１９９４年４月１９日に発行された米国特許第５,３０４,４７２号に詳細に記載されている。結果の株は９Ｅ４と名付けられた。lacＩq（ミュラーヒル（Ｍuller-Ｈill）ら、Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ、５９：１２５９［１９６８］）およびlacＬ８（スケイフ（Ｓcaife）およびベックウィズ、Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｓymp．Ｑuant．Ｂiol.、３１：４０３［１９６７］）変異はproＣでのコトランスダクションによって９Ｅ４株に導入された。最初に、連結したＴn５挿入がＰroＣおよびphoＡΔＥ１５（サーシー（Ｓarthy，Ａ．）ら、Ｊ．Ｂacteriol.、１４５：２８８−２９２［１９８１］）変異が導入された。プロリン原栄養体へのＰ１トランスダクションはproＣ遺伝子およびphoＡ遺伝子を蓄え、また、lacＩqlacＬ８変異を導入した。lacＩq変異は野生株に比較してlacリプレッサーの過剰産生となる。lacＩq変異の存在は色素産生基質である５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシダーゼ（Ｘ−gal）を含むＬＢプレート上で観察することができる。これらのプレート上でlacＩ+株は明るい青色、lacＩq株は無色である。該ＬacＬ８変異はlacオペロン酵素レベルを低くすることになるプロモーター変異である。ＬacＬ８変異の存在は、マッコンキー（ＭacＣonkey）１％ラクトース培地上で、中心が暗赤色および周囲の端がベージュ色であるコロニーとして検出することができる。ompＴ欠失およびdegＰ変異のその株への導入は、米国特許第５,３０４,４７２号に詳細に記載されている。
最後の３３Ｄ３株はＴ１およびφ８０ファージに耐性であり、３つのプロテアーゼを欠如し、lacリプレッサーを過剰産生させ、誘発したときの野生型lacオペロン酵素レベルより低く産生する。
pＪＪ４２を含む３３Ｄ３細胞は、ついで米国特許第５,３０４,４７２号、実施例II、１×feed条件に記載されているＩＧＦ−Ｉ産生に同一の条件下で１０リッターファーメンター（１０−liter fermentor）で増殖させた。その培養物の吸光度（Ａ550）が６０に達した時、tacIIプロモーターを誘発するためにＩＰＴＧまたはラクトースを下記の所定量添加した。増殖培地を吸光度（Ａ550）が８０から１００となるようにリン酸塩欠如およびphoＡプロモーターのために設計した。総ＩＧＦ−Ｉ産生を米国特許第５,３０４,４７２号によって記載された高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）アッセイにより測定した。
その結果を下記表１に示す：
0003749257.tif 000004
その結果は細菌のペリプラズムにおけるdsbＡ遺伝子の過剰発現がいずれかのインデューサーによって誘発されたすべての工程のためのＩＧＦ−Ｉの収率を改良することを示している。ＩＧＦ−Ｉ蓄積における増加はおよそ６０％であった。正確に折り畳まれたＩＧＦ−Ｉは、上記または米国特許第５,２８８,９３１号に記載された方法によってのように酸素的再折り畳みが続く液体−液体抽出（liquid-liquid extraction）によって高収率で回収することができる。
実施例II
dsbＡヌクレオチド配列を大腸菌のゲノムからのＰＣＲ技術（ミシアカスら、上記［１９９４］）を用いて増幅し、ついでＸbaＩ部位をＤsbＣコーディング配列の５'末端およびＣlaＩ部位を該配列の３'末端に添加した。このＤＮＡ断片を適当な制限酵素で消化し、ついで１.０kbのpＫＭＴacIIのＰstＩ−ＸbaＩ断片（デボーアら、Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ、８０：２１−２５［１９８３］および３.６kbのpＢＫＩＧＦ−２ＢのＣlaＩ−ＰstＩ断片（米国特許第５,３４６２,７６３号）でライゲーションした。その結果のプラスミド、pＪＪ３７（図２参照）はＴacIIプロモーターの制御下でdsbＣを含み、アンピシリンおよびテトラサイクリン耐性を与える。このプラスミドをＣlaＩで消化し、ついでその末端をクレノウ断片およびデオキシリボヌクレオチドにより充填する。
クレノウ断片および消化ＤＮＡの不活性化後、そのＤＮＡを引き続いてＳcaＩで消化し、ついでβ−ガラクトシダーゼ遺伝子の５'末端を含む１.５kbの断片およびＴacII-dsbＣ要素を精製した。これをＥcoＲＩ消化してpＢＫＩＧＦ−２Ｂに充填した。４.６kb断片（これもまた、ＳcaＩで消化した）でライゲーションした。このpＢＫＩＧＦ−２Ｂの断片はβ−ラクタマーゼの３'末端を含み、アンピシリン耐性ならびにテトラサイクリン耐性のＤＮＡ配列の選択およびＩＧＦ−Ｉの産生を可能にした。このプラスミドはpＪＪ４０と示された（図２参照）。
このプラスミドを上記のように大腸菌３３Ｄ３株に形質転換した。ついで、pＪＪ４０を含む３３Ｄ３細胞を米国特許第５,３０４,４７２号、実施例II、１×feed条件に記載されているＩＧＦ−Ｉ産生に同一の条件下で１０−リッターファーメンターで増殖させた。その培養物の吸光度（Ａ550）が６０に達したとき、tacIIプロモーターを誘発するために１％ラクトースを添加し、それによってdsbＣ発現を増加させた。その増殖培地を吸光度（Ａ550）が８０から１００となるようにリン酸塩欠失およびphoＡプロモーターのために設計した。総ＩＧＦ−Ｉ産生を米国特許第５,３０４,４７２号によって記載されたＨＰＬＣアッセイにより測定した。
その結果は１％ラクトースは３g／Ｌ ＩＧＦ−Ｉを産生するコントロールであるpＢＫＩＧＦ−２Ｂ（インデューサーなし）に対して、４g／Ｌ ＩＧＦ−Ｉを産生するというものである。
実施例III
dsbＡ遺伝子を培地中のアラビノースの存在に応じてその遺伝子を過剰発現するクローニングされた誘発可能なアラビニースプロモーター（ガズマン（Ｇuzman）ら、上記）を含むベクターpＢＡＤ１８（図３）にクローニングした。そのdsbＡ遺伝子（クローニングにおいて容易にするために制限部位を付着させた）をＰＣＲにより増幅した。ＥcoＲＩ部位を５'端に、およびＫpnＩ部位を３'端に置いた。dsbＡをクローニングしたベクターを同じ酵素で消化し、そのdsbＡＰＣＲ産物をpＢＡＤＪ２（図３）を形成するために、消化したベクターでライゲーションした。このプラスミドpＢＡＤＪ２をＣlaＩおよびＨindIIIで消化し、ついでクレノウポリメラーゼ断片Ｉの使用によって消化した平滑末端でライゲーションした。アラビノースプロモーターとdsbＡをコードする１.９kb断片を増幅した。ついで、このdsbＡ遺伝子を有するアラビノースプロモーターを上記のようにＩＧＦ−Ｉ産生プラスミドpＢＫＩＧＦ−２ＢのＥcoＲＶ部位にクローニングした。dsbＡの転写の方向はＩＧＦ−Ｉと同様であった。このプラスミドをpＢＫＩＧＦ２Ｂ−Ａと称する。
ついでプラスミドpＢＫＩＧＦ２Ｂ−Ａを大腸菌３６Ｆ８株（表現型Ｗ３１１０tonＡphoＡΔ（argＦ-lac）prt３degＰkanRlivＧ＋、３７℃で耐熱性である）に形質転換した。この株を上記同様の基本的な技術を用いて幾つかの工程にて構築した。２７Ａ７の構築のための出発宿主は米国特許第５,３０４,４７２号に詳細に記載されている。
次に、degＰ４１kanr変異を２７Ａ７に導入した。この変異は米国特許第５,３０４,４７２号に記載されている。その株を２７Ｂ４と称する。２７Ｂ４株は３７℃および４２℃にてＬＢ培地上での増殖が乏しい。耐熱性の単離体はよく増殖した自発的なコロニーを採取することによって３７℃で得た。この株は３５Ｅ７と称する。
ついでリボース欠失がilv遺伝子に連結したＴn１０挿入物でのＰ１コトランスフェクションによって、３５Ｅ７株に導入した。イソロイシン／バリン自発栄養体はilvＧ２０９６R変異を有する株上で増殖したＰ１ファージを用いてプロトロフィー（protrophy）にトランスダクションし（ローサー（Ｌawrher）ら、Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ、７８：９２２−９２５［１９８１］）、野生型大腸菌Ｋ−１２株をバリンに感受性にさせるフレームシフトを修正する。ilv２０９６R遺伝子座を４０μg／mＬのバリンに対する３６Ｆ８宿主の耐性によって確認したrbs欠失はまた、この工程の間に修正されて、株をリボースを炭素源として利用することができるようにする。
最後の３８Ｆ８株はＴ１およびφ８０ファージに耐性であり、２つのプロテアーゼを欠如し、培地中でリン酸塩の欠失に関して、アルカリホスファターゼを過剰産生せず、３７℃でよく増殖し、バリンの毒性に感受性がない。
ついで、プラスミドpＢＫＩＧＦ２Ｂ−Ａを含む３６Ｆ８細胞を上記の米国特許第５,３０４,４７２号に記載の１×feed条件、実施例IIIに記載されているＩＧＦ−Ｉ産生に同一の条件下で１０−リッターファーメンター内で増殖させた。その培養物の吸光度（Ａ550）が８０に達した時に１％（w／v）Ｌ−アラビノースを加えた。これはdsbＡ発現を誘発およびペリプラズムにＤsbＡタンパク質の分泌という結果となる。増殖培地を吸光度（Ａ550）が１００となるようなリン酸欠失およびphoＡプロモーター誘発のために設計した。総ＩＧＦ−Ｉ産生を実施例Ｉで使用したＨＰＬＣアッセイにて測定した。
その結果を下の表２に示す：
0003749257.tif 000005
その結果は細菌のペリプラズム中でのdsbＡ遺伝子の過剰発現がアラビノースプロモーターおよびＤsbＡに関与する全ての工程の総（可溶性および不溶性）ＩＧＦ−Ｉの収量を改善することを示している。このＩＧＦ−Ｉ蓄積における増加は１％Ｌ−アラビノースを用いて約２倍となった。正確に折り畳まれた形態のＩＧＦ−Ｉは上記のように液体−液体抽出および再度折り畳まれることによって、または米国特許第５,２８８,９３１号に記載されている方法によって回復されてよい。
収量の増加は、非常に類似したプラスミドからのdsbＢを過剰発現している細胞は増加を示さないように、ＤsbＢには見られなかった。さらに、もしdsbＡ ＤＮＡおよびＩＧＦ−Ｉ ＤＮＡが同じプロモーターを用いて共発現した場合、総ＩＧＦ−Ｉ収量はdsbＡ遺伝子（pＲＫＩＧＦ−２Ｂ）なしでコントロールに比較して減少した。
【図１】
0003749257.tif 000006
【図２】
0003749257.tif 000007
【図３】
0003749257.tif 000008