(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料塗布層が黒鉛不織布又は黒鉛織布から作成され且つ架橋ポリビニルアルコールを結合剤として含んでなることを特徴とする試薬層と試料塗布層を含んでなる多層試験材。
【請求項２】
試料塗布層がさらに試薬を含んでなる請求項１に記載の試験材。
【請求項３】
試料塗布層が赤血球の凝集と保持を生じさせる物質を含んでなる請求項１若しくは２に記載の試験材。
【請求項４】
電気化学バイオセンサにおける参照電極としても同時に働く、血液から細胞成分を除去するための、架橋ポリビニルアルコールを結合剤として含んでなる黒鉛不織布又は黒鉛織布の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、血液成分の分析のために血液と対応する試験材から細胞成分を除去するための黒鉛不織布と黒鉛織布の使用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
全血からの血清又は血漿の分離は、臨床化学において最も重要である。特に、血液成分の多くの診断検出反応は、赤血球が分離された後においてのみ、損傷なしに進行する。これは、特に、反射率計により、若しくは視覚的に、又は電気化学的に評価される着色反応に当てはまる。
【０００３】
赤血球を分離するための最も一般の形態は、遠心分離である。しかし、これはは、特に少量血液試料に関する問題を提起し、そのため、例えば、ドイツ特許出願公告２５  ５９  ２４２号において記載される如く、一連の補助手段が、これに対して公知である。
【０００４】
家庭使用者条件下での血糖監視の如く、試験ストリップを用い全血分析の分野では、特殊な赤血球保持支持体の使用が、特に重要である。
【０００５】
先行技術として、試薬層と、互いに異なってもよい少なくとも一つ以上のガラス繊維層からなる赤血球分離帯を含む多層試験系が、例示される（米国特許第４
４７７  ５７５号）。
【０００６】
全血が、ガラス繊維層に塗布され、赤血球は、凝集作用の結果として、この層へ吸着され、血漿と血清は、試薬層へ拡散し、そこで検出反応が、赤血球に妨害されることなしに進行する。
【０００７】
欧州特許第１３３  ８９５号において記載される如く、ガラス繊維層は、赤血球の凝固又は凝集作用の影響を有する極性染料のような、補助試薬を含んでなる。
【０００８】
ドイツ特許出願公告第３０  ２９  ５７９号によれば、ガラス繊維は緩く積み重ねられ、紙、不織布又はフェルトの形態で加工され、ガラス繊維を充填したカラムも特許請求されている。米国特許第４  ４７７  ５７５号によれば、使用されるガラス繊維は、０．２〜５．０μｍの直径を有し、０．１〜０．５ｇ／ｃｍ2の密度を有する。
【０００９】
ガラス繊維不織布の赤血球保持支持体を有する診断試験系の不都合は、比較的高い全血量が要求されることであり、公知のＲｅｆｌｏｔｒｏｎ（商標）グルコース試験系については約１０μｌである。しかし、例えば５μｌ以下の少量の血液は、特に、できるだけ痛みなしに、血液を獲得するのに大いに有利である。
【００１０】
ガラス繊維不織布の別の重要な不都合は、例えば、薄い吸取紙に対して知られている値よりもずっと小さな機械的強度である。
【００１１】
機械的作業、例えば、引裂き強さを必要とする従来の機械を使用する切削又は含浸は、結果として、例外なく困難になる。
【００１２】
国際公開第９４／２７１４０号は、例えば、凝集剤としてデキストラン、ポリリシン、ポリブレン又はプロタミンを含む多孔質膜マトリックスの赤血球保持層を記載する。しかし、上記のガラス繊維系と比較すると、これらの膜層は、作製する上でより複雑であり、層厚、吸収体積と流量又は輸送特性に関して可変性に乏しく、特に、ある一定の試験ストリップフォーマットの実現するためには、水平の、クロマトグラフィー状輸送機能を実現することは不可能である（例えば、米国特許第４  ４７７  ５７５号の図４）。
【００１３】
上記の白ガラス繊維層の場合の如く、血液の塗布後に、保持層の激しい赤変色が生ずる。この赤いバックグランド呈色のために、望ましくない干渉問題が、上部の試薬層の反射率計の評価において発生する。
【００１４】
【発明の構成】
意外にも、黒鉛繊維の不織布は、上記の不都合の発生なしに、傑出した方法において赤血球分離機能に課せられた要求を満たすことが判明した。
【００１５】
そのような黒鉛不織布は、ＳＧＬ  Ｃａｒｂｏｎ  Ｇｒｏｕｐ社により生産され、形式Ｓｉｇｒａｆｉｌ（商標）  ＳＰＣ  ７０１１は、本発明による赤血球分離層のために特に適切であることが立証された。
【００１６】
これらは、７μｍの平均繊維径、３０ｇ／ｍ2の重量／単位面積、０．５ｍｍの厚さを有する黒鉛繊維と、その含有量が２０〜２４％重量である架橋ポリビニルアルコールの結合剤系を含む高引き裂き強度の黒不織布である。
【００１７】
同様に黒鉛繊維から生産され、名称Ｓｉｇｒａｔｅｘ（商標）の下で販売されている織布がまた、本発明による赤血球保持層を調製するために適切である。
【００１８】
この極めて親水性の重合結合剤により、Ｓｉｇｒａｆｉｌ（商標）黒鉛不織布は、その上、優れた湿潤性によって特徴付けられる。ガラス繊維不織布と同様に、非常に急速な液体輸送は、水平及び垂直方向において観察される。高い層厚（０．８ｍｍ）によって上記の形式７０１１とは異なる、Ｓｉｇｒａｆｉｌ形式ＳＰＣ７０１６により同様に良好な結果を達成することが可能であった。
【００１９】
赤血球を分離するために可能である他の適切な不織布は、炭素ステープルファイバーから作製され、同様にＳＧＬ  Ｃａｒｂｏｎ  Ｇｒｏｕｐによって販売されるＳｉｇｒａｔｈｅｒｍ（商標）紙である。これらの黒鉛不織布の約１６０Ｎ／５ｃｍの高い引裂き強さは特筆すべきであり、引き裂き強さを必要とする従来の加工機械による加工上の問題は存在しなくなる。
【００２０】
平均繊維直径が７μｍである上記の黒鉛不織布の補助による赤血球の分離は、米国特許第４  ７７７  ５７５号により、この範囲の繊維径を有するガラス繊維不織布が、赤血球の除去のためにもはや適切でないために驚くべきであると記載する必要がある。
【００２１】
例えば、米国特許第４  ４７７  ５７５号からの表２において、２μｍを超える繊維径を有するガラス繊維不織布が、血漿又は血清分離のためにもはや適切でないことが示される。
【００２２】
本発明による黒鉛不織布赤血球保持支持体のさらに２つの重要な利点は、その黒色から生じる。例えば保持層と試薬膜の二層試験系上への血液の塗布の後に、黒鉛不織布において保持された赤血球が、かろうじて視覚的に検出されるにすぎず、美的利点として評価されることである。この利点はまた、従来の系（バックグランドとして赤色の赤血球含有ガラス繊維層）と対照的に、有害な反射率計干渉が生じないために、試薬膜における着色反応の反射率計の評価において現れる。
【００２３】
レクチンのような公知の凝集剤を含浸された本発明による黒鉛不織布は、一層又は多層系として使用される。多層保持支持体の場合に、すべての又は個々の黒鉛不織布層は、一つ又は多様な凝集剤を含浸される。多層保持材料はまた、黒鉛不織布のほかに、基本構成要素として、ポリビニルアルコール不織布、若しくはモノ又はマルチフィラメント織布の如く、他の多孔質層を含んでなる。
【００２４】
凝集した赤血球の主含量が、黒鉛不織布層において保持され、好ましくは最上層（血液の塗布）と試薬膜に密接な層が、黒鉛不織布から作られることは、本質的である。
【００２５】
黒鉛不織布の別の典型的な特性は、炭素繊維に典型的な数オームの領域にある電気伝導率である。
【００２６】
液体の水平輸送の顕著な特性と電気伝導率の組合せの結果として、二機能作用を有する層が、電気化学センサ系では構成される。実施例２において詳細に示される如く、電流試験フォーマットにおいて、黒鉛不織布層は、液を汲み上げる毛細管の機能（バイオセンサにおいて普及した塗布モード（ヨーロッパ特許第０  ４７１  ９８６号））及び参照電極としての機能を同時に発揮する。
【００２７】
【実施例】
実施例１
視覚血糖試験
ａ）  赤血球保持層
黒鉛不織布（ＳＧＬからのＳＰＣ７０１１）に、次の溶液を含浸させ、温風で乾燥させた。
【００２８】
０．０４ｇのレクチン（ポテト、ＳＥＲＶＡ、ポテトレクチン）を、１．５ｍｌの次のＣｒｅｍｏｐｈｏｒｅ  ＥＬ表面活性剤溶液［９７．６０ｇの水、０．８５ｇのＣｒｅｍｏｐｈｏｒｅ  ＥＬ（Ｓｉｇｍａ、Ｃ  ５１３５）、および２．２０ｇのＨＥＰＥＳ緩衝剤０．５Ｍ（Ｓｉｇｍａ、Ｈ  ７００６）；ｐＨ  ７．５］で溶解した。
【００２９】
ｂ）  試薬層
−  膜マトリックスの調製（ドイツ特許出願公告第４  ３０８  １５０号）
２０．０ｇのＤｒａｌｏｎ  Ｌ（ポリアクリロニトリル、Ｂａｙｅｒ  ＡＧ）
８０．０ｇのＵｌｔｒａｓｏｎ  Ｅ（ポリエーテルスルホン、ＢＡＳＦ）
２０．０ｇのＡｅｒｏｓｉｌ  ２００（高分散性珪酸、Ｄｅｇｕｓｓａ）
９０．０ｇのＰｌｕｒｉｏｌ  Ｐ  ９００（ポリプロピレングリコール、ＢＡＳＦ）
４１３．４ｇのＮメチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ、Ｒｉｅｄｅｌ  ｄｅＨａｅｅｎ）
キャスト溶液を、高速撹拌器で調製し、脱気の後に、ドクターブレードによりポリエステル不織布（ＦｒｅｕｄｅｎｂｅｒｇからのＦＣ  ２４０２）の上に被覆し、水（４０゜Ｃ）で凝固した。
【００３０】
多孔質キャリヤ支持膜（平均孔サイズ約５〜８μｍ）を得て、乾燥後に、次の含浸のために使用された。
【００３１】
ポリマーブレンド膜の含浸
含浸溶液  １
１５．０ｍｌのペロキシダーゼ（６１８Ｕ／ｍｇ）
５０．０ｍｇの３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン塩酸塩
７．５ｍｌのメタノール
７．５ｍｌのリン酸カリウム緩衝剤０．１モル／ｌ  ｐＨ７．０
含浸溶液  ２
１００．０ｍｇの３−ジメチルアミノ安息香酸
７．５ｍｌのメタノール
７．５ｍｌのリン酸カリウム緩衝剤０．１モル／ｌ  ｐＨ７．０
含浸溶液  ３
７７．２５ｍｇのグルコースオキシダーゼ（１５１Ｕ／ｍｇ）
１５．０ｍｌのリン酸カリウム緩衝剤０．１モル／ｌ  ｐＨ７．０
温風乾燥の後に、試薬膜を得た。血糖検出のための多層試験系が、次のダイアグラムに従って構成した。
【００３２】
サンドイッチ構造：  着色反応は下面から読み出される。
【００３３】
構造は、図１に示されている。
【００３４】
１．試験ストリップ保持器、穿孔付き
２．透明な穿孔被覆フィルム
３．試薬膜
４．含浸黒鉛不織布
血液を、２ａ）における開口を介して塗布し、反対側で、赤血球によって損なわれない全血のグルコース濃度と相関した青色反応を、数秒の後に観察した。血液成分は、黒鉛不織布へ完全に浸透し、その結果、反応の後に、不織布の黒色のために、「赤色残留物」は全く検出されず、先行技術と比較して美的利点として評価される。５ｍｍの層径（試薬膜、黒鉛不織布）に対して５μｌに塗布される血液量を制限することが可能であった。
【００３５】
毛管流系：  上部からの着色反応の観察
構造は、図２において示される。
【００３６】
１：試験ストリップ保持器
２：含浸黒鉛不織布
３：試薬膜
全血を、５に塗布し、数秒の後、赤血球によって損なわれていない着色反応が、試薬膜３の表面において観察された。
【００３７】
試験溶液のグルコース濃度が増加した時、青色強度の増大が観察された。
【００３８】
実施例２
視覚コレステロール試験
試薬膜の赤血球保持層を調製し、次いで試験条片を、実施例１と同様に構成した。
【００３９】
試薬膜の含浸配合
含浸溶液  １
１５．０ｍｌのペロキシダーゼ（６１８Ｕ／ｍｇ）
５０．０ｍｇの３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン塩酸塩
７．５ｍｌのメタノール
７．５ｍｌのリン酸カリウム緩衝剤０．１モル／ｌ  ｐＨ７．０
含浸溶液  ２
１００．０ｍｇの３−ジメチルアミノ安息香酸
７．５ｍｌのメタノール
７．５ｍｌのリン酸カリウム緩衝剤０．１モル／ｌ  ｐＨ７．０
含浸溶液  ３
１６．０ｍｇのコレステロールオキシダーゼ（２４．３Ｕ／ｍｇ）
９．０ｍｇのコレステロールエステラーゼ（１１８Ｕ／ｍｇ）
５００μｌのリン酸カリウム緩衝剤０．１モル／ｌ  ｐＨ７．０
試薬膜を、循環空気乾燥キャビネット中で４５゜Ｃにて乾燥した。
【００４０】
全血（種々のコレステロール含量の試料）による試験中、着色強度が特定のコレステロール濃度と相関された青色反応が、観察された。
【００４１】
実施例３
電流計試験キット
構造は、図３において示される。
【００４２】
１：キャリヤフィルム（ベ―スフィルム）
２：導電層（例えば、黒鉛、金又はパラジウム）
３：多孔質誘電体層（膜又は不織布）
４：黒鉛不織布
５：両面接着テープ
６：上面フィルム
７：参照電極との接触
８：作用電極との接触
９：試料液体の塗布
電圧を４００ｍＶにセットし、上記の図に従い接触されたポテンシオスタットを用いて、時間電流測定（例えば、Ｃｈｅｍ．ｉｎ  ｕｎｓｅｒｅｒ  Ｚｅｉｔ１５（１９８１）  ２１  ｅｔ  ｓｅｑ．）が、実施された。ピペットを用いて、黒鉛不織布前縁（９）を介して塗布された使用試験溶液は、フェリ／フェロシアン酸塩試験溶液であり、次の一連の試料液体が分析された。
【００４３】
１．Ｋ3Ｆｅ（ＣＮ）6（カリウムヘキサシアノ鉄酸塩）、水において２００ｍｍｏｌ（貯蔵液において）
２．１９８ｍｍｏｌの貯蔵液における２ｍｍｏｌのＫ4ＦＥ（ＣＮ）6
３．１９６ｍｍｏｌの貯蔵液における４ｍｍｏｌのＫ4ＦＥ（ＣＮ）6
４．１９４ｍｍｏｌの貯蔵液における６ｍｍｏｌのＫ4ＦＥ（ＣＮ）6
５．１９２ｍｍｏｌの貯蔵液における８ｍｍｏｌのＫ4ＦＥ（ＣＮ）6
６．１９０ｍｍｏｌの貯蔵液における１０ｍｍｏｌのＫ4ＦＥ（ＣＮ）6
時間電流評価において、１／ｔ1/2とともに減少する電流曲線が、Ｃｏｔｒｅｌｌ式に従い、μＡ範囲において見いだされ、電流収量の増大が、Ｋ4Ｆｅ（ＣＮ）6濃度の増大により達成された。
【００４４】
本発明の主なる特徴及び態様は以下のとおりである。
【００４５】
１．試料塗布層が黒鉛不織布又は黒鉛織布から作成されることを特徴とする試薬層と試料塗布層を含んでなる多層試験材。
【００４６】
２．試料塗布層が、さらに、試薬を含む上記１に記載の試験材。
【００４７】
３．試料塗布層が、赤血球の凝集と保持を生じさせる物質を含む上記１と２に記載の試験材。
【００４８】
４．電気化学バイオセンサにおける参照電極として、血液から細胞成分を除去するための黒鉛不織布又は黒鉛織布の使用。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１に従って構築される試験系の一態様を示す略図である。
【図２】実施例１に従って構築される試験系の別の態様を示す略図である。
【図３】実施例３に従って構築される電流計試験キットを示す略図である。
【符号の説明】
１  試験ストリップ保持器又はキャリヤフィルム
２  透明な穿孔被覆フィルム
３  試薬膜又は導電層
４  含浸黒鉛不織布
５  両面接着テープ
６  上面フィルム
【図１】
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【図２】
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【図３】
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