(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
修飾された自己タンパク質を調製する方法であって、前記自己タンパク質は脊椎動物由来であり、前記方法は、分子生物学的手段によって、前記自己タンパク質における一以上のペプチドを対応する数のペプチドで置換することを含み、
ここで、
１）前記置換ペプチドは、前記脊椎動物に対して免疫優性の外来Ｔ細胞エピトープを含み、
２）前記置換は、未修飾の前記自己タンパク質における全体の三次構造を本質的に維持し、
これにより、前記修飾された自己タンパク質は、前記修飾された自己タンパク質を前記脊椎動物に投与した後に、前記脊椎動物において、前記未修飾の自己タンパク質に対する抗体応答を誘発することができることを特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記免疫優性の外来Ｔ細胞エピトープは、該Ｔ細胞エピトープの両側にある未修飾の自己タンパク質由来の隣接領域を維持するように挿入されることを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の方法であって、前記免疫優性Ｔ細胞エピトープは、破傷風トキソイドまたはジフテリアトキソイドを起源とする方法。
【請求項４】
ヒトまたは動物における望ましくないタンパク質に対する自己ワクチンであって、請求項１〜３の何れかの方法に従って修飾された一以上の自己タンパク質を含有し、燐酸カルシウム、サポニン、キル（quil）Ａおよび生分解性ポリマーのような薬学的に許容可能なアジュバントと共に製剤化されたことを特徴とするワクチン。
【請求項５】
請求項４に記載の自己ワクチンであって、前記修飾された自己タンパク質は、ＧＭ−ＣＳＦまたはインターロイキン２のような免疫学的に活性な適切なサイトカイン類との融合タンパク質の形態で存在することを特徴とするワクチン。
【請求項６】
請求項４に記載の自己ワクチンであって、癌患者のような悪液質感受性の患者を治療するための、ＴＮＦαまたはγインターフェロンに対するワクチンであることを特徴とするワクチン。
【請求項７】
請求項４に記載の自己ワクチンであって、アレルギーを伴う患者を治療するための、ＩｇＥに対するワクチンであることを特徴とするワクチン。
【請求項８】
請求項４に記載の自己ワクチンであって、慢性炎症性疾患を伴う患者を治療するための、ＴＮＦα、ＴＮＦβまたはインターロイキン１に対するワクチンであることを特徴とするワクチン。
【請求項９】
請求項８に記載の自己ワクチンであって、リウマチ様関節炎または炎症性腸疾患を伴う患者を治療するためのワクチンであることを特徴とするワクチン。
【請求項１０】
請求項４または５に記載の自己ワクチンであって、真性糖尿病を治療するための、ＴＮＦαに対するワクチンであることを特徴とするワクチン。
【請求項１１】
免疫優性の外来Ｔ細胞エピトープを含む一以上のペプチドフラグメントを含んだ修飾された自己タンパク質であって、
該修飾された自己タンパク質は、未修飾の自己タンパク質が天然に存在する脊椎動物に導入されたときに、前記自己タンパク質と交差反応する抗体の産生を誘導し、
前記外来Ｔ細胞エピトープは、該Ｔ細胞エピトープの両側にある未修飾の自己タンパク質由来の隣接領域を維持するように挿入され、また前記修飾された自己タンパク質の全体の三次構造は、前記未修飾の自己タンパク質と比較して本質的に維持される、
自己タンパク質。
【請求項１２】
燐酸カルシウム、サポニン、キル（quil）Ａおよび生分解性ポリマーのような薬学的に許容可能なアジュバントと共に製剤化された、請求項１１に記載の修飾された自己タンパク質。
【請求項１３】
ＧＭ−ＣＳＦまたはインターロイキン２のような免疫学的に活性な適切なサイトカイン類との融合タンパク質の形態で存在することを特徴とする、請求項１１に記載の修飾された自己タンパク質。
【請求項１４】
癌患者のような悪液質感受性の患者を治療するための薬学的組成物の調製における、請求項１１に記載の、または請求項１〜３のいずれか１項に従って調製された修飾された自己タンパク質の使用。
【請求項１５】
アレルギーを伴う患者の治療のための薬学的組成物の調製における、請求項１１に記載の、または請求項１〜３のいずれか１項に従って調製された修飾された自己タンパク質の使用。
【請求項１６】
慢性炎症性疾患を伴う患者の治療のための薬学的組成物の調製における、請求項１１に記載の、または請求項１〜３のいずれか１項に従って調製された修飾された自己タンパク質の使用。
【請求項１７】
リウマチ様関節炎または炎症性腸疾患を伴う患者の治療のための薬学的組成物の調製における、請求項１１に記載の、または請求項１〜３のいずれか１項に従って調製された修飾された自己タンパク質の使用。
【請求項１８】
真性糖尿病の治療のための薬学的組成物の調製における、請求項１１に記載の、または請求項１〜３のいずれか１項に従って調製された修飾された自己タンパク質の使用。
【発明の詳細な説明】
〔発明の分野〕
本発明は、何らかの理由で個体内において存在が望ましくない自己タンパク質を除去するため、および／または低く調節するために免疫器官を利用するための新規の方法に関する。それらは、疾病および／またはその他の望ましくない症状もしくは疾病の徴候の原因となるタンパク質となり得る。その様なタンパク質は、ワクチン接種により特異的に誘発される、体内を循環する自己抗体により除去される。本発明は、その様な自己ワクチン（autovaccines）を開発するための方法を説明する。
〔発明の背景〕
生理学的には、脊椎動物の免疫系は、微生物のような感染物による身体への侵入に対する防御機構として働く。外来タンパク質は、体内を循環する特異性が極めて高い抗体により、細網内皮系を経由して効果的に除去され、ウイルスおよび細菌は、抗体、細胞傷害性Ｔリンパ球、ナチュラルキラー細胞、補体などを含む、複雑な一連の細胞性機構及び体液性機構の攻撃を受ける。この戦闘を主導するのがＴヘルパー（ＴＨ）リンパ球であり、これは抗原提示細胞（ＡＰＣ）と協力してサイトカインの複雑なネットワークを通して免疫的防御を調節する。
ＴＨリンパ球は、ＡＰＣの表面上に提示されるタンパク質抗原を認識する。しかしながら、それらは、それ自体では抗原そのものを認識できない。その代わりにそれらは、「処理された（processed）」（断片化された）タンパク質抗原（いわゆるＴ細胞エピトープ）と主要組織適合遺伝子複合体のクラスＩＩ分子との２つの構成成分からなる複雑なリガンドを認識するものと思われる（O.Werdelin et al.,Imm.Rev. 106,181（1988））。最終的にはこの認識により、Ｂリンパ球による元のタンパク質抗原に対して特異的な抗体の産生を、ＴＨリンパ球が特異的に補助することが可能となる（O.Werdelin et al.,supra）。特定のＴ細胞は、特定の抗原−ＭＨＣ結合体のみを認識し、もう１つのＭＨＣ対立遺伝子の遺伝子産生物により提示される、同一もしくは別の抗原を認識することはない。この現象を、ＭＨＣ拘束と称する。
通常、個体自身のタンパク質（いわゆる自己タンパク質）は、免疫器官により攻撃されることはない。したがって、本発明に関して説明される事象は、一般的には当該個体にとって有益であるのだが、しかしまれな事例においては過程がうまく進行せず、免疫系はその個体自身の構成要素に向かって働き、それにより自己免疫疾患を導くことがある。
幾つかの自己タンパク質の存在は、昂進して疾病の症状を誘発する状態においては不適当なものとなる。例えば、高水準のＩｇＥクラスのイムノグロブリンは、タイプＩアレルギーの誘発にとって重要であることが知られており、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）は、癌患者及び他の慢性疾患を病んでいる患者における悪液質の原因となり得ることが知られている（H.N.Langstein et al.,Cancer Res. 51,2302-2306,1991）。ＴＮＦαは、炎症過程においてもまた重要な働きをする（W.P.Arend et al.,Arthritis Rheum.33,305-315,1990）。性ホルモン依存性の癌においてはホルモンが、特定の状態においては望ましくないタンパク質の、別の事例である。それ故、本発明は、その様な自己タンパク質に対する自己ワクチンを開発するための方法を提供する必要が存在する。
自己タンパク質の断片もまたＡＰＣにより提示されるが、しかし、通常はその様な断片はＴヘルパーリンパ球からは無視されるか、これによっては認識されない。これが、一般的に個体がその血清中の自己抗体を含まないことの主な理由である。
とは言え、自己タンパク質に対する抗体を人工的に誘発することは可能である。上記のように、自己タンパク質を、例えば破傷風トキソイドまたはキーホール・リンペット・ヘモシアニン（ＫＬＨ）のような適当な大きさの外来キャリヤータンパク質に共有結合させた複合体により、誘発が可能である。タルワーら（G.P.Talwar et al,Int.J.Immunopharmacol.14,511-514,1992）は、ヒト柔毛膜性生殖腺刺激ホルモンと破傷風トキソイドとの複合体からなるワクチンを用いることにより、女性の生殖を阻害することができた。そのような自己免疫性複合体を、ヒトおよび動物モデルにおいて治療に用いたことの別の事例もまた存在する（D.R.Stanworth et al.,Lancet 336,1279-1281（1990））。ＡＰＣにおいてその様な複合体が加工処理（プロセシング）される間に、必要なＴＨリンパ球刺激性エピトープが外来タンパク質から提供され、最終的にキャリヤータンパク質に対してと同様に自己タンパク質に対しても抗体誘発が導かれる。しかしながら、この原理を用いる上での一つの欠点は、自己タンパク質に対する抗体応答が、共有結合しているキャリヤータンパク質によるエピトープの遮蔽により限定されうるということである。もう一つの欠点は、外来のキャリヤータンパク質に対して、望ましくない極めて強力な抗体応答を同時に誘発することにより、アレルギー的副作用を引き起こす危険性が大きくなることである。
他の研究者は、Ｔ細胞エピトープであると予測される一本鎖ペプチドを化学的に、キャリヤーとしてのハプテン作用を有するデカペプチドである自己ペプチド［Ｄ−Ｌｙｓ６］ＧｎＲＨに複合化し、その特定のＴ細胞エピトープについての、ＭＨＣ拘束を伴う自己抗体応答の誘発を達成した（S.Sad et al., Immunology 76,599-603,1992）。この方法は、巨大キャリヤータンパク質への複合化と比較して、より効果的であると思われる。しかしながら、この方法では、適切なＭＨＣ分子を発現する個体群においてしか抗体を誘発しないであろう。このことは、かなり多数の異なるＴ細胞エピトープを自己ペプチドに複合化しなければならず、そうすれば結局は、自己ペプチドの表面上のＢ細胞エピトープを混乱させるであろうことを意味する。さらに、タンパク質の徹底的な複合化は、免疫原性に関して反対の効果を有することがあり（国際特許出願ＷＯ８７／０００５６号）、ペプチドのＴ細胞エピトープの露出された表面は、抗原を処理する間にタンパク質分解酵素により破壊されることがあり（S.Mouritsen,Scand.J.Immunol. 30,723,1989）、したがって、上記方法は不適当なものとなる。また、そのような多複合的（multi-conjugated）自己ペプチドの正確な構造は、化学的にも薬学的にも良好に定義できないであろう。
最近、分子量の大きいデキストラン分子にＢ細胞エピトープを（およびＴ細胞エピトープをも任意に）化学的に結合させた複合体による、Ｂ細胞の自己免疫反応を破壊するための改善された方法が提示された（ＷＯ９３／２３０７６、１９９３年１１月２５日公開）。しかしながら上記の欠点は、この方法についてもまた当てはまる。
組換えＤＮＡ技術を用いて（ＥＰ−Ａ２−０３４３４６０）、広く認識される強力なＴ細胞エピトープを、Ｂ細胞エピトープを示す抗原構造を有する外来ペプチドに連結させることができる。例えばワクチンのような免疫原性組成物の調製において、ヘルパーＴ細胞（ＴＨリンパ球）反応性エピトープおよび好ましくはＢ細胞反応性エピトープを組み込んでいる免疫原性ペプチドまたは抗原性ペプチドを含むペプチジル樹脂複合体を使用することもまた示唆された。好ましくはポリアミド樹脂上で、固相合成により複合体を調製する。（ＷＯ９０／１５６２７）。意図するところは当該ペプチドに対する抗体応答を増幅することであるが、免疫系の自己寛容を破壊する目的でこれを行うことができることは提案されなかった。自己タンパク質に対する自己抗体を誘発するためにこれらの方法を用いるに当たって、応答のＭＨＣ拘束についての上記限定に関して、同一の規則（rules）が当てはまることが直観的に予想されるであろう。しかしながら驚くべきことに、免疫優性Ｔ細胞エピトープを含むことが知られている対応数のペプチドを用いての１以上のペプチド断片の置換により、自己タンパク質類似体を産生し、前記置換を行うことにより起源の自己タンパク質の３次構造全体を本質的に維持するものである本発明に従った方法を用いての自己タンパク質の調節により、用いられたＴ細胞エピトープ挿入物が免疫感作されたマウスのＭＨＣ分子に制限されないという事実にもかかわらず、ＴＮＦαに対して自己抗体応答を、等しく高速であり、且つ、より強力にさえ誘発することが可能となる（以下例３参照）。この観察結果についての理由は明らかではないが、しかし、自己タンパク質における突然変異領域内の新規のＭＨＣ結合部分の出現によるものと考えられる。しかしながら、例５に示された実験からは、恐らく上記の理由ではないであろう事が例証される。というのは、ユビキチンに移植された卵アルブミンＴ細胞エピトープの重複領域に対応する合成ペプチドは、この組換え分子の免疫原性が高いものであるＨ−２ｋマウスの、ＭＨＣクラスＩＩ分子のいずれに対しても強力には結合しなかった。
タンパク質の潜在的なＭＨＣクラスＩＩ結合部分のほとんどは、通常は露出しておらず、抗原提示細胞により宿主Ｔ細胞に提示されない（S.Mouritsen et al,Scand.J.Immunol. 34,421,1991）。挿入されたＴ細胞エピトープのＭＨＣ拘束と抗体応答の制限との間の一致の欠如が観察されることから、恐らく自己タンパク質の異なる部分による、ＭＨＣ分子への結合についての分子内競合の一般的な外乱によるものであろう。本発明の方法に従って、Ｔ細胞に対して、隠れている非寛容化された（non-tolerized）自己タンパク質の一部を提示することができ、その結果、タンパク質に対するＢ細胞の自己免疫寛容と同様にＴ細胞の自己免疫寛容も破壊される。本発明に合致し、下記の実施例すべてにおいて例証されるように、自己タンパク質の断片は、外来のＴ細胞エピトープに置換された。この欠失に続くほかのタンパク質断片による置換は、自己タンパク質の３次構造の不明確化を最小にするが、ＭＨＣクラスＩＩ結合自己断片（binding self-segments）の前記分子内競合の外乱についてもまた強く関与するであろう。したがって、この概念は、上記の先行技術の機構および方法とは明確に異なる。本発明にしたがった方法による挙動の操作機構とは無関係に、Ｂ細胞の自己免疫寛容を破壊するための従来の方法と比較して、それはより技術的に優れたものである。というのは、最小数の異なる外来Ｔ細胞エピトープの挿入物により、広範なＭＨＣ分子において抗体を誘発することが可能だからである。
このように、本発明は、本質的に３次構造が維持された自己タンパク質類似体を産生するように、１以上のペプチド断片の欠失および同時になされる対応数の外来のＴ細胞エピトープを挿入することにより適切に調節された（modulated）組換え自己タンパク質を注射することにより、改変されていない自己タンパク質に対する意味深い（profound）自己抗体応答が誘発されるという驚くべき事実を基礎とするものである。驚くべきことに、誘発された自己抗体応答のＭＨＣ拘束は、必ずしも挿入されたＴ細胞エピトープのそれに制限されない。ＴＮＦαにおいてと同様、良好に保存される（highly conserved）自己タンパク質のユビキチンにおいても最小の３次構造変化を誘発することにより、遺伝子工学的方法を用いて、１２−１５アミノ酸長を有する外来のＴ細胞エピトープを挿入した。これらの組換え自己タンパク質類似体を精製し、アジュバントに乳化し、マウスに注射した。僅かに１週の間に、これらのマウスからの血清中において、ユビキチンに対する自己抗体応答を検出できた。同様に処理され、注射された、改変されていない組換えユビキチンは、応答を誘発できなかった。
望ましくないタンパク質に対するワクチンを開発するためにこの原理を用いることにより、アレルギー的副作用を誘発する危険性が少なくなり、タンパク質の生物学的な活性を有する部分を除去するかまたは突然変異させることにより、ＴＮＦαのような毒性自己タンパク質を同時に無毒化できる。上記のエピトープ遮蔽効果は問題にはならず、キャリヤーのタンパク質またはペプチドに自己タンパク質を複合化させる従来の技術と比較して、ユビキチンに対する自己抗体をより早く誘発した。重大なことは、この方法によりさらに、個体のＢ細胞の自己免疫寛容と同様にＴ細胞の自己免疫寛容を一時的に破壊することが可能であるように思われ、それによる組換えタンパク質は、多くの異なるＭＨＣクラスＩＩ分子を発現する大きな群（a large population）において自己免疫的であろう。
本発明に従ったワクチンは、上記のように調節され、リン酸カルシウム、サポニン、キル（quil）Ａもしくは生分解性ポリマー適切なアジュバントを用いて製剤化された１以上の自己タンパク質類似体とからなる。この調節された自己タンパク質類似体は、ＧＭ−ＣＳＦまたはインターロイキン２のような適切な免疫学的に活性なサイトカインを伴う融合タンパク質として調製される。
自己ワクチンは疾患がないとき（i.a.）でも、例えばガン患者のような悪液質の患者の治療のためのＴＮＦαまたはγ−インターフェロンに対するワクチン、またはアレルギー患者の治療のためのＩｇＥに対するワクチンとなり得る。更に、慢性炎症疾患の患者の治療のためのＴＮＦα、ＴＮＦβまたはインターロイキン１に対するワクチンともなり得る。
本発明は、以下の実施例において詳細に示される。
例１：  ユビキチンへの外来Ｔ細胞エピトープの置換
例としてＴ細胞エピトープＭＰ７を用いて、図１に本発明の手順の外観を示す。適切な制限酵素クローン化部位を有するように設計された２つの相補性オリゴヌクレオチドとして、ＭＰ７（ＭＰ７．１−ＣおよびＭＰ７．１−ＮＣ）で表される遺伝子配列を合成した。そのＭＰ７のアミノ酸配列は、ＰＥＬＦＥＡＬＱＫＬＦＫＨＡＹである（Mouritsen et al,Scand.J.Immunol. 30,723-730,1989）。このオリゴヌクレオチドを、従来の自動固相オリゴヌクレオチド合成により合成し、アガロースゲル電気泳動および低融点（low melting）アガロースを用いて精製した。求められるバンドをゲルより切り取り、既知量のオリゴヌクレオチドを混合し、１−２時間ゲルの理論的な融点より５℃低い温度（通常は約６５℃）まで加熱し、３７℃まで穏やかに冷却する。この温度で、ハイブリッド化されたオリゴヌクレオチドを、ユビキチン遺伝子の一部を含むベクター断片に連結した。それに続く、制限断片分析およびＤＮＡ配列決定を用いた陽性クローンの分析を、従来の方法により行った（"Molecular Cloning",Eds.:T.Maniatis et al.2 ed.CSH Laboratory Press,1989）。
例２：  改変されたユビキチン類似体でのワクチン接種によるユビキチンに対する自己抗体の誘発
熱感受性λリプレッサー（抑制因子）により調節されるプロモーターの制御下で、外来のＴ細胞エピトープの、卵アルブミン（ＯＶＡ）由来のＯＶＡ（３２５−３３６）およびニワトリ卵白ライソザイム（ＨＥＬ）由来のＨＥＬ（５０−６１）をコードする配列を含む遺伝子を、大腸菌ＡＲ５８において発現させた。ポリクローナル抗ユビキチン抗体およびウエスタン・ブロッティングを利用して、組換えユビキチンタンパク質の発現を確認した（"Antibodies",Eds.:D.Harlow et al.,CSH Laboratory Press, 1988）。組換えタンパク質は、従来の方法を用いて精製された（Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，上掲）。
フロイントの完全アジュバントに乳化されたリン酸緩衝生理的食塩水（ＰＢＳ）中の１００μｇのユビキチンまたはその類似体をマウス胸部（i.p.）に注射した。フロイントの不完全アジュバントに１：１に乳化された、上記と同じ量の抗原のブースター（追加抗原）注射を、１４日目と２８日目に胸部に実施した。それぞれの群において５匹のＢａｌｂ／Ｃマウスを試験し、従来のＥＬＩＳＡ法を用いて、７日目、１４日目、２１日目、２８日目、３５日目および４２日目に、抗ユビキチン抗体の存在について血液試料を調べた。
Ｔ細胞エピトープＯＶＡ（３２５−３３６）またはＨＥＬ（５０−６１）を含む２つの異なるユビキチン類似体のそれぞれに対する抗体応答により得られた結果を図２に示す。挿入されたＯＶＡ（３２５−３３６）エピトープのアミノ酸配列は、ＱＡＶＨＡＡＨＡＥＩＮＥであり、ＨＥＬ（５０−６１）エピトープのアミノ酸配列は、ＳＴＤＹＧＩＬＱＩＮＳＲである。
最初の抗原の注射からわずか１週間以内に、天然のユビキチンに対する明らかな抗体応答を検出することが可能であり、２週間以内に最大に達した。ウシ・イムノグロブリンとの共有結合によるユビキチン複合体により、ウサギにおいて産生された抗ユビキチン抗体は更に長い免疫感作期間の後に最大値に達した（データなし）。
例３：  適切に改変された腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）類似体を用いたワクチン接種によるＴＮＦに対する自己抗体の誘発
ＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）でのクローン化により、天然のネズミＴＮＦαタンパク質（ＭＲ１０１）の構造的部分をコードする遺伝子を得た。ＭＲ１０３  ＴＮＦα類似体において、両親媒性のα−ヘリックスの置換として、クローン化ＴＮＦα配列におけるアミノ酸２６−３５を、卵アルブミン（ＯＶＡ）Ｈ−２ｄ制限化Ｔ細胞エピトープ配列３２５−３３４（ＱＡＶＨＡＡＨＡＥＴ）に置き換える。ＴＮＦαのこの領域における置換により組換えタンパク質を無毒化する（X.Van Ostade et al., Nature 361,266-269,1993）。ＭＲ１０５  ＴＮＦα類似体において、クローン化ＴＮＦα配列におけるアミノ酸５−２０を、ニワトリ卵白ラインザイム（ＨＥＬ;hen eggwhite lysozyme）からのＨ−２ｋ制限化Ｔ細胞エピトープであるアミノ酸配列８１−９６（ＳＡＬＬＳＳＤＩＴＡＳＶＮＣＡＫ）に置き換える。ＭＲ１０６  ＴＮＦα突然変異株において、クローン化ＴＮＦα配列におけるアミノ酸１２６−１４０を、上記と同じエピトープであるアミノ酸配列８１−９５（ＳＡＬＬＳＳＤＩＴＡＳＶＮＣＡ）に置き換える。遺伝子構築物を図３に示す。Ｔ細胞エピトープをコードするＤＮＡを伴うＴＮＦα遺伝子の一部を交換するために、例１に記載された技術とは異なる技術を用いた。Ｔ細胞エピトープを誘発するために用いられる部位に隣接するＴＮＦα遺伝子の一部のＰＣＲリクローニング（再クローン化）を用いて突然変異配列を誘発することにより、ＭＲ１０５および１０６構築物を作成した。突然変異オリゴヌクレオチドプライマーは、Ｔ細胞エピトープをコードするＤＮＡ配列と同様にＴＮＦαのＤＮＡ配列に相同なＤＮＡ配列もともに含んでいた。ＴＮＦα遺伝子のＰＣＲリクローン化部分を次いで、適切な制限酵素により切断し、ＭＲ１０１遺伝子にクローン化した。「スプライシング・バイ・オーバーラップ・エクステンション（重複延長によるスプライシング）」ＰＣＲ技術（R.M.Horton et al., Gene 77,61,1989）の変法により、ＭＲ１０３構築物を作製した。ここでは、それぞれがＴＮＦα遺伝子の一部をカバーするように２つのＰＣＲ産生物を産生させ、加えて、それぞれのＰＣＲ産生物は、Ｔ細胞エピトープ配列の半分を含む。次いで、第２のＰＣＲにおいて２つのＰＣＲ産生物を結合することにより、完全な突然変異ＴＮＦαを作製した。最終的には、完全な遺伝子構築物をタンパク質発現ベクターに挿入した。続いて、制限断片分析と従来の方法を用いたＤＮＡ配列決定とにより、すべての遺伝子構築物を分析した（"Molecular Cloning",Eds,:T.Maniatis et al. 2.ed. CSH Laboratory Press,1989）。組換えタンパク質は、大腸菌において発現され、従来のタンパク質精製方法により精製された。
フロイントの完全アジュバントにエマルジョン化された１００μｇの半精製のＭＲ１０３およびＭＲ１０６を用いて、ＢＡＬＢ／Ｃ（ＭＨＣハプロタイプＨ−２ｄ）およびＣ３Ｈ（ＭＨＣハプロタイプＨ−２ｋ）のマウスの群をそれぞれ、皮下注射により免疫感作させた。フロイントの不完全アジュバントを用いて、２週ごとに免疫感作を反復した。生物学的に活性を有するＭＲ１０１に対して、全てのマウスが速やかに強力な抗体応答を発現した。これは、受動的に吸着された１００％精製ＭＲ１０１を用いての直接ＥＬＩＳＡ法により測定された（図４）。ＭＲ１０１とＰＢＳとのそれぞれにより免疫感作された対照マウスは、ＭＲ１０１に対する抗体反応を示さなかった。
ここで際立っていることは、異なるように制限されたＴ細胞エピトープを含むＭＲ１０３およびＭＲ１０６に、ＭＨＣハプロタイプの異なる両株のマウスが良好に反応したことから、移植されたＴ細胞エピトープに対応するようにはＭＲ１０１に対する抗体応答は、ＭＨＣ拘束がなされなかったことである（図４）。それらを一緒に取り上げれば、上記の結果は、（ａ）本発明に従った方法により産生された自己タンパク質類似体の、分泌された自己タンパク質に対する自己抗体を誘発する能力および（ｂ）挿入されたＴ細胞エピトープのＭＨＣ結合能力から予想された以上に広範なＭＨＣ群における応答の誘発について、ここで記載された方法において向上した作用能力を例証した。アルデヒド複合化ＭＲ１０１により誘発された免疫応答と比較して、組換え自己タンパク質類似体ＭＲ１０３およびＭＲ１０６対する免疫応答は、より強力であり、より高力価であった（例４参照）。
例４：  大腸菌タンパク質に複合化された非改変自己タンパク質と比較しての本発明に従った方法により産生された自己タンパク質類似体によるＴＮＦαに対する自己抗体の誘発
大きなキャリヤータンパク質とともに小さな一本鎖のＴ細胞エピトープ・ペプチドをも間違いなく含んでいる、ＴＮＦαと大腸菌タンパク質との複合体を用いた場合に誘導される自己抗体応答に対して、本発明の方法によるＴＮＦαに対する自己抗体の誘発を直接比較した。
０．５％ホルムアルデヒドを用いて、ｐＨ７．４のＰＢＳ中の大腸菌タンパク質に、半精製の組換えネズミＴＮＦα（ＭＲ１０１）を複合化させた。該タンパク質の複合化を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認した。続いて、これらの複合体をＣ３Ｈマウスの免疫感作に用いた。別群のＣ３Ｈマウスを、半精製の複合化されていない自己タンパク質類似体ＭＲ１０５によりワクチン接種した。約１００μｇの組換えＴＮＦα類似体および複合体をフロイントの完全アジュバント中に１：１にエマルジョン化し、それぞれの群のマウスに皮下注射した。ＴＮＦαについてＬ９２９バイオアッセイにより判定したところ、ＭＲ１０５は生物学的に不活性である。続く免疫感作において、２週ごとにフロイントの不完全アジュバントを用いた。結局、ＥＬＩＳＡで測定したところ、両群は、高度に精製された生物学的活性を有するＭＲ１０１に対する自己抗体を発現したが、しかし、本発明の方法により産生された複合化されていないＭＲ１０５類似体に対する免疫応答を、より早く、且つより高い力価で誘発した（図５）。
例５：  ユビキチンに挿入された卵アルブミンＴ細胞エピトープにおいて、および自己タンパク質の重複配列を表すペプチドにおいて可能なＭＨＣクラスＩＩの結合
室温で３日間、125Ｉでラベル化されたペプチド（１０−１００ｎＭ）をアフィニティ精製されたＭＨＣクラスＩＩ分子とともにインキュベートすることにより、ペプチド−ＭＨＣ複合体を得た（S.Mouritsen,J.Immunol. 148,1438-1444,1992）。以下のペプチドを結合の放射性標識マーカーとして用いた：Ｅｋ分子に強力に結合するＨｂ（６４−７６）ＹおよびＡｋ分子に強力に結合するＨＥＬ（４６−６１）Ｙ。これらの複合体を、完全にすべての、免疫学的に関連があるＭＨＣクラスＩＩ結合を阻害するのに十分に多量の、コールドな（放射性ラベル化されていない）ペプチド（＞５５０μｍ）と共にインキュベートした。同一のペプチドを用いたにしても、３つの異なる重複ペプチドを用いたにしても、これらのペプチドは、ユビキチンの中に置換されたＯＶＡ（３２５−３３６）Ｔ細胞エピトープの全体と同様に隣接領域も表す（例２参照）。３種類のペプチドは、ＴＩＴＬＥＶＥＰＳＱＡＶＨＡＡ（Ｕ（１２−２６））、ＰＳＱＡＶＨＡＡＨＡＥＩＮＥＫＥ（Ｕ（１９−３４））およびＨＡＥＩＮＥＫＥＧＩＰＰＤＱＱ（Ｕ（２７−４１））であった。Ｇ２５螺旋カラムを用いてゲル濾過により遊離のペプチドから、８ｍＭのクエン酸塩，１７ｍＭのリン酸塩，および０．０５％ＮＰ−４０（ｐＨ５）を含む反応緩衝液ならびにペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ複合体を（２重に（in duplicate））分離した。除外された「ボイド」量および包含された量の放射活性を共に、ガンマ分光法で測定した。コールドなペプチドの添加により、（パーセントで）最大結合値の競合阻害を計算した。結果を表Ｉに示す。
0003825041.tif 000002
ＥｋおよびＡｋそれぞれへの放射性ラベル化されたペプチドＨｂ（６４−７６）ＹおよびＨＥＬ（４６−６１）Ｙの結合についての完全な阻害は、同じペプチドのコールド・バージョンを用いてのみ達成し得たように思われた。これら極端な量のコールドなペプチドを用いることで、Ｕ（１２−２６）およびＵ（１９−３４）により結合に幾らかの阻害がみられたが、Ｈ−２ｋ  ＭＨＣクラスＩＩ分子へのこれらペプチドの親和性は、極めて低い傾向がある。
例６：  適切に改変されたＴＮＦα類似体でのワクチン接種による糖尿病または炎症疾患の治療
例えば、破傷風毒素またはインフルエンザ・ヘマグルチニン（血球凝集素）に由来するＴ細胞エピトープをコードする適切な遺伝子断片を挿入することにより、ＴＮＦαをコードする遺伝子を改変する。例えば、大腸菌または昆虫細胞内で、適切な発現ベクターにおいてそのような遺伝子を発現する。従来の方法を用いて組換えＴＮＦαタンパク質を精製した（"Molecular Cloning",Eds.:T.Maniatis et al.2.ed.CSH Laboratory Press,1989）。
ＧＭＣＳＦまたはインターロイキン２のような免疫学的に活性を有するサイトカインに、そのような組換えタンパク質を任意に連結し得る。
組換えタンパク質は、適切なアジュバントを用いて製剤化し、抗ＴＮＦαワクチンとして、ＴＮＦαが病原として重要であるような疾患を患っている患者に投与し得る。ここで誘発された抗ＴＮＦα抗体は疾病に影響を与えるだろう。
例えば、ＴＮＦαが重要な役割を演ずると信じられているリウマチ様関節炎のような慢性炎症疾患が、前記疾患の１例である（F.M.Brennan et al.,Br.J.Rheumatol. 31,293-298,1992:に概説）。ＴＮＦαは、癌においてみられる悪液質状態において、およびＡＩＤＳのような慢性の感染症においてもまた重要な役割を演ずると信じられている（M.Odeh.J.Intern.Med. 228,549-556,1990に概説）。ＴＮＦが敗血症性ショックに関与することもまた知られている（B.P.Giroir,Crit.Care.Med., 21,780-789,1993:に概説）。その上、ＴＮＦαがタイプＩＩの真性糖尿病の発現において病原として働き得ることが示されている（CH Lang et al.,Endocrinology 130,43-52,1992）。
〔図の凡例〕
図１：  移植された外来Ｔ細胞エピトープ（ＭＰ７）を伴うユビキチン遺伝子の構築において用いられたクローニング手法の模式的概観。制限酵素での消化、ハイブリダイゼーションおよび連結の手順を矢印により示す。断片の大きさを括弧内に示す。
図２：  組換えユビキチン並びにＴ細胞エピトープ移植物のＯＶＡ（３２５−３３６）を含む類似体またはＴ細胞エピトープ移植物のＨＥＬ（５０−６１）を含む類似体のそれぞれにより免疫感作されたマウス由来の血清における固定化ウシユビキチンに対しての反応性。図２ａ）の血清は、ＯＶＡ（３２５−３３６）を含む組換えユビキチンにより免疫感作されたＢａｌｂ／ｃマウスに由来する。図２ｂ）の血清は、Ｔ細胞エピトープＨＥＬ（５０−６１）を含む組換えユビキチンにより免疫感作されたＢａｌｂ／ｃマウスに由来する。図２ｃ）の血清は、非改変組換えユビキチンにより免疫感作されたＢａｌｂ／ｃマウスに由来する。固相上に固定化された非改変ウシユビキチンを用いることにより、標準的なＥＬＩＳＡアッセイにおいて血清（１：１００希釈）を試験した。
図３：  組換えＴＮＦα突然変異株の構築において用いられたクローニング手法の模式的概観。ＰＣＲ産生物および制限酵素での消化を示す。
図４：  半精製されたＭＲ１０３およびＭＲ１０６によるＢａｌｂ／ｃまたはＣ３Ｈマウスのワクチン接種によるＴＮＦα自己抗体の誘発。ＥＬＩＳＡにより抗体力価を測定し、マウス１個体からの強力な標準抗血清を参照値とした任意の単位値（arbitrary units）（ＡＵ）で表現した。プロットされた値は、動物５個体の平均力価を表す。最初の免疫感作のためのアジュバントとして、フロイントの完全アジュバントを用いた。続く１４日のインターバルをおいての免疫感作はすべて、フロイントの不完全アジュバントを用いて行われた。ＰＢＳ中の天然ＭＲ１０１を用いて平行して免疫感作されたマウスは、検出可能なＴＮＦα自己抗体を発現しなかった（データなし）。検出できなかった抗体力価を力価値１と定めた。
図５：  非複合化ＭＲ１０５および大腸菌タンパク質に複合化されたＭＲ１０１のそれぞれを用いてのワクチン接種により誘発された抗ＴＮＦα自己抗体。両調製品を用いてＣ３ＨマウスまたはＢａｌｂ／ｃマウスを免疫感作した。例４において記載したように、免疫感作、測定および平均抗体力価の計算を行った。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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