(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
エラスターゼの活性を指標とする、紫外線Ａの皮膚への影響の鑑別方法。
【請求項２】
紫外線Ａの皮膚への影響が、光老化作用である請求項１に記載の鑑別方法。
【請求項３】
エラスターゼ活性を指標とする紫外線Ａ防護剤のスクリーニング方法。
【請求項４】
エラスターゼ活性を指標とする光老化防止剤のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、光老化の鑑別や光老化防止剤のスクリーニングに好適な紫外線Ａの皮膚への影響の鑑別方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
生物が年を重ねるに従ってその機能を低下させる、いわゆる老化の克服は古来より人類の夢であった。取り分け、容貌等の印象形成に大きな影響を与える顔などの皮膚の老化の防止は、誰しもが願うことであった。この為、新規の保湿剤などを開発して、皮膚の老化を防止する試みが行われてきた。しかしながら、この様な試みでは、老化の影響を遅延させることすらなかなか難しいことであった。これは老化のメカニズムが解明し尽くされていないことが原因であった。
【０００３】
老化のメカニズムを調べるに従って、その原因の一つに光の影響があることが近年知られるようになってきた。光による老化は、経時的な生理変化の老化とは別のメカニズムで起こることが既に知られており、それは紫外線Ｂによって起こされる炎症反応が主たる原因であるとされてきた。紫外線Ａの影響は、紫外線Ｂの皮膚への影響を増悪させるものとして認識され、そのもの自身のみでは肌へ影響は鑑別されにくいとされてきた。紫外線Ａ単独で光老化の原因となりうることは良く解明されていなかった。
【０００４】
エラスターゼが炎症によって放出されることは知られていたが、紫外線Ａによる皮膚の影響の指標となりうる事は知られていなかった。又、この酵素の活性が光老化の指標、光老化防止剤のスクリーニングの指標になることも知られていなかった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明はこの様な状況を踏まえて為されたものであり、紫外線Ａの皮膚への影響を鑑別する手段を提供することを課題とする。
【０００６】
【課題を解決する手段】
この様な状況に鑑みて、本発明者らは紫外線Ａの皮膚への影響を鑑別する手段を求めて鋭意研究を重ねた結果、皮膚に紫外線Ａを照射した前後のエラスターゼの挙動を調べることにより、紫外線Ａの皮膚への影響を鑑別できることを見いだし、発明を完成させるに至った。即ち、紫外線Ａ照射後、エラスターゼの上昇が著しければ紫外線Ａの皮膚への影響が大きいと鑑別できることを見いだした。以下、本発明について実施の形態を中心に詳細に説明する。
【０００７】
【発明の実施の形態】
（１）本発明の鑑別方法
本発明の鑑別方法はエラスターゼの活性を指標とする事を特徴とする。エラスターゼはエラスチン等の結合組織蛋白を特異的な基質とするプロテアーゼで、膵臓エラスターゼ、白血球エラスターゼ等が存在し、その前駆体であるプロエラスターゼがトリプトファンにより末端アミノ酸がはずれることによりエラスターゼとなり活性化される。エラスターゼは炎症などにより白血球が浸潤してくるとその濃度が上昇することが知られている。特に、エラスターゼは実際にその反応が未だ肉眼で確認できない初期の微小炎症でも活性が上昇する事が知られている。エラスターゼ活性は、既に知られている方法で測定することができ、例えば、検体にパラニトロアニリル基を導入したエラスチン誘導体を基質として加え、これをインキュベーションし遊離したパラニトロアニリンを４０５ｎｍの吸光度で定量すれば測定することができる。その他の方法でエラスターゼ活性を測定し、紫外線の皮膚への影響の鑑別に用いることも本発明の鑑別方法に属する。紫外線Ａを照射することによって、皮膚のエラスターゼの活性が増加すれば、光老化などの皮膚に好ましくない影響を紫外線Ａが与えていると鑑別でき、この増加が著しいほど、影響も重大であることが判る。
【０００８】
（２）紫外線Ａの与える影響
従来は、紫外線Ａのみを皮膚に照射した場合、肉眼による皮膚の観察においても、病理所見においても炎症の存在を認めなかったため、紫外線Ａのみでは皮膚に影響を与えず、紫外線Ｂが混在することによって、紫外線Ｂの皮膚への悪影響を増悪するものと考えられていた。しかしながら、後記実施例に示すように、紫外線Ａの照射はエラスターゼ活性を増大させ、エラスチン等の結合組織蛋白にダメージを与えることにより、しわの形成の原因となっていることから、光老化の原因となっていることが分かる。従って、エラスターゼ活性を測定することによって光老化の程度を知ることもできる。
【０００９】
（３）本発明のスクリーニング方法
本発明のスクリーニング方法は、紫外線Ａ照射によって上昇するエラスターゼ活性を、検体の投与によってどの程度抑制しうるかによって、その検体の紫外線Ａ防護作用や光老化防止効果を検定することができる。特に本発明では、紫外線Ａそのものの作用が従来では検知できなかったのが検知できるようになったため、この様なスクリーニングが可能となったことは、注目すべき事である。
【００１０】
【実施例】
上記に述べた本発明の特徴について、以下に実施例を挙げて更に詳細に説明するが、本発明がこれら実施例にのみ限定を受けないことは言うまでもない。
【００１１】
＜実施例１＞
紫外線Ａの影響
ＳＫｈ：ＨＲ−１ヘアレスマウス１群５匹を用いて、５ｍｍのガラスフィルターを通して紫外線Ｂを完全にカットした、２７Ｊ／ｃｍ２のエネルギー量のＢＬＢランプの光を、１日１回週５回６カ月背部皮膚に照射した。対照群は全く照射を行わなかった。照射終了後、レプリカを取った後、背部皮膚を採取し、一部は病理標本にし、一部は直径２．１ｃｍのパンチで打ち抜きエラスターゼ活性測定用サンプルとした。病理標本は、ホルマリンで固定した後、脱水し、パラフィンに包埋し、切り出し染色した。レプリカ及び病理標本は顕微鏡下観察した。エラスターゼ活性は次の手順で測定した。即ち、打ち抜いた皮膚より表皮を剥離させ、２ｍｌの０．１Ｍ−ＨＥＰＥＳ−０．５Ｍ塩化ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）を加えホジナイズした。ホモジネートは１５０００ｒ．ｐ．ｍで１０分間遠沈した後、この上清０．１ｍｌを取り出し、市販のパラニトロアニリル基を導入したエラスチン誘導体溶液（シグマ社製、N-Methoxysuccinyl-Ala-Ala-Pro-Val-p-nitroanilide）１．４ｍｌを基質として加え、３７℃で１時間インキュベートした。これを紫外可視分光光度計で４０５ｎｍの吸光度を測定した。結果は、病理標本においては、照射群には白血球の浸潤が対照群比して有意的に観察され、紫外線Ａの照射により微小炎症の蓄積があることが推察された。更に、膠原繊維の断裂も照射群が有意的に著しかった。又、レプリカからの形態的変化においては、照射群の皮溝が浅く、表面も平坦であり、これらの所見より、従来言われている光老化現象に相当することが判明した。即ち、これまで紫外線Ｂの増悪作用のみと言われていた紫外線Ａが光老化の一因となっていることがこれによって証明された。又、エラスターゼ活性値は、照射群が１６０ｍＵ／ｃｍ２であるのに対して、対照群が１０３ｍＵ／ｃｍ２であり、エラスターゼ活性と紫外線Ａの影響及び光老化の程度が良く相関していることが判る。
【００１２】
＜実施例２＞
紫外線Ａの影響
上記実施例の如く、紫外線Ａの皮膚への影響は極めて微弱なものであり、これを病理標本等からとらえるには、実施例１の様に長期の実験をくまなければならなかった。そこで短期の実験に於いて、エラスターゼ活性が変化するかどうかを調べた。方法は実施例１に準じ、ヘアレスマウスは１群３匹とした。照射は４週間計１０回行った。エラスターゼ活性は同様に測定した。結果は、非照射群が、８６ｍＵ／ｃｍ２であったのに対し、照射群は９５ｍＵ／ｃｍ２であり、エラスターゼ活性の測定により紫外線Ａの影響をより感度良く鑑別しうることが判る。又、レプリカでは照射群と非照射群の間に差は認められなかった。
【００１３】
＜実施例３＞
スクリーニング例
実施例１の方法を用いて、光老化防止剤のスクリーニングを行った。即ち、各種生薬成分を５０μｌ照射前に投与し、実施例１と同様に光照射を行った。この作業を週５回、６カ月続けた。皮膚を実施例１と同様に処理し、観察・測定した。この結果、金銀花に光老化防止作用が認められた。その結果を表１に示す。この様に本発明の鑑別方法を用いることにより光老化防止剤のスクリーニングが可能である。尚、非投与群のエラスターゼ活性値は１６０ｍＵ／ｃｍ２であった。
【００１４】
【表１】
0003749769.tif 000002
【００１５】
＜実施例４＞
使用テスト
しわに悩む人より、その日常生活よりしわの形成に光が関与していると思われる人２０名を選別し、下記の処方の美容液を６カ月間朝夕２回三日つけてもらいしわの改善をテスト終了後問診と実験の前後に採取したレプリカより評価した。結果を表２に示す。これより、本発明のスクリーニング法で光老化防止に有効と判断された金銀花エキス含む美容液により光が関与していると思われるしわが改善されていることが判る。従って、本発明の光老化防止剤のスクリーニングは正しく光老化防止剤を評価しうることが明らかである。
（美容液の処方）
金銀花エキス                                    １    重量部
エタノール                                    １０    重量部
メチルパラベン                                  ０．１重量部
グリセリン                                      ５    重量部
水                                            ８３．９重量部
【００１６】
【表２】
0003749769.tif 000003
【００１７】
【発明の効果】
本発明によれば、紫外線Ａの皮膚への影響を鑑別する手段が提供できる。