(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下からなる軟部組織再構築用のバイオマテリアル：
（ａ）ヒアルロン酸のベンジルエステルからなる支持物質；および、
（ｂ）該支持物質上にシードされた前脂肪細胞。
【請求項２】
間葉幹細胞および内皮細胞からなる群から選択される少なくとも１つをさらに含有する、請求項１に記載のバイオマテリアル。
【請求項３】
該ヒアルロン酸のベンジルエステルが１００％エステルであり、ここに該ヒアルロン酸のすべてのカルボキシル基がベンジルアルコール残基でエステル化されている、請求項１または２に記載のバイオマテリアル。
【請求項４】
該ヒアルロン酸のベンジルエステルが５〜９９％エステルであり、ここに該ヒアルロン酸の５〜９９％のカルボキシル基がベンジルアルコール残基でエステル化され、残りの基が塩化されている、請求項１または２に記載のバイオマテリアル。
【請求項５】
該支持物質がスポンジ性または不織物質の形態の骨格である、請求項１〜４のいずれかに記載のバイオマテリアル。
【請求項６】
前脂肪細胞、間葉幹細胞および内皮細胞の少なくとも１つがヒト細胞である、請求項１〜５のいずれかに記載のバイオマテリアル。
【請求項７】
軟部組織損傷を処置するための、請求項１〜６のいずれかに記載のバイオマテリアル。
【請求項８】
軟部組織損傷の再構築処置のための、請求項１〜７のいずれかに記載のバイオマテリアル。
【請求項９】
以下からなる軟部組織欠損および陥没を充填するための注射用調製物：
（ａ）全体的に水溶性のヒアルロン酸誘導体または部分的に水溶性のヒアルロン酸誘導体および、
（ｂ）該調製物中に懸濁されている前脂肪細胞。
【請求項１０】
間葉幹細胞および内皮細胞からなる群から選択される少なくとも１つをさらに含有する、請求項９に記載の注射用調製物。
【請求項１１】
全体的に水溶性のヒアルロン酸誘導体がヒアルロン酸のアミドである、請求項９または１０に記載の注射用調製物。
【請求項１２】
全体的に水溶性のヒアルロン酸誘導体がヒアルロン酸のドデシルアミドである、請求項９または１０に記載の注射用調製物。
【請求項１３】
部分的に水溶性のヒアルロン酸誘導体が５〜９９％エステルであり、ここに該ヒアルロン酸の５〜９９％のカルボキシル基がベンジルアルコール残基でエステル化され、残りの基が塩化されている、請求項９または１０に記載の注射用調製物。
【請求項１４】
部分的に水溶性のヒアルロン酸誘導体が８５％エステルであり、ここに該ヒアルロン酸の８５％のカルボキシル基がベンジルアルコール残基でエステル化され、残りの基が塩化されている、請求項９または１０に記載の注射用調製物。
【請求項１５】
前脂肪細胞、間葉幹細胞および内皮細胞の少なくとも１つがヒト細胞である、請求項９または１０に記載の注射用調製物。
【請求項１６】
必要とする患者における軟部組織欠損、陥没、しわおよび変形を充填するための、請求項９〜１５のいずれかに記載の注射用調製物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の要旨
本発明は、軟部組織に関する再建外科手術における、ヒアルロン酸のエステル類、例えばベンジルエステル類、およびアミド類から構成される支持物質（材料）および注射用調製物、特に脂肪前駆細胞用の支持物質および注射用調製物の使用に関する。
【０００２】
発明の背景
軟部組織欠損の矯正は形成手術および再建外科手術における重要なチャレンジである。フリーの移植片としての脂肪組織は軟部組織欠損の再建用に１００年以上使用されてきた。しかし、軟部組織置換用の最適な移植材料は欠如している。フリーの脂肪組織移植片が使用されるが、その結果は貧素で予測不能なものである。移植片は大部分が吸収され、繊維組織および油シストによって置換される。最近再流行している、吸引された脂肪断片を注射する技術は、移植片の５０％収縮から完全再吸収の不満足な結果を与える。フリーの脂肪自己移植片の貧素な結果は、虚血に対する脂肪細胞の低い寛容度および血管再生の遅い速度のせいであると考えられる。
【０００３】
脂肪組織の間質にある脂肪前駆細胞は、単離し、培養することが可能である。これらの細胞は種々の条件下でインビトロ分化および脱分化を示し、その増殖および分化能のために軟部組織操作のための可能性のあるソースである。予備実験では、発明者らは前脂肪細胞が、移植後、迅速に血管再生し、脂肪を再蓄積することを観察した。最近の実験では、ラット前脂肪細胞は、移植後、ＰＬＧＡ骨格において分化した。
【０００４】
最近では、成人骨髄から得られる間葉幹細胞（ＭＳＣｓ）が種々の組織細胞タイプ（型）の作成に用いられている。これらの単離された幹細胞は、胚性幹細胞のように全能性ではないが、多能性であり、結合組織およびその派生物に分化可能である。間充織は、結合組織、例えば筋肉、腱および靭帯のソースであるばかりでなく、血液、軟骨、骨、脂肪細胞および血管の外層のソースである。今日までに、ＭＳＣｓは首尾よく脂肪細胞、軟骨細胞および骨細胞に分化した（Pittenger et al. (1999) Science 284:143-7）。
【０００５】
しかし、組織操作用の良好なバイオ人工軟部組織充填物質の必要性が未だ存在する。これは、理想的には、移植手順におけるヒト前脂肪細胞を支持するデリバリービヒクルであろう。この材料は、移植された細胞（前脂肪細胞）を支持する構造および、移植後、この細胞が浸潤し、分化することを可能にする構造を提供すべきである。血管原性である内皮細胞の導入は、バイオ人工軟部組織充填材料の性能を高めるだろう。より多数の成熟脂肪細胞が十分に血管形成された脂肪組織に見られる。これは内皮細胞が有する、前脂肪細胞および脂肪細胞の分化に対する影響のせいであろう。結果的に、内皮細胞は、前脂肪細胞に基づく脂肪組織操作において特に有用である。担体の機械的安定性はまた重要であり、材料／担体は、移植後、あまりに迅速には再吸収されてはならない。
【０００６】
これらの必要性は、インビトロおよびインビボの単離および培養されたヒト前脂肪細胞、間葉幹細胞および内皮細胞に関する最適な基質を提供する本発明によって満足される。本発明はまた、インビボ脂肪生成を支持する能力を有する、バイオ人工軟部組織充填材料、特に前脂肪細胞、間葉幹細胞および／または内皮細胞に関する骨格として有用である。
【０００７】
発明の詳細な記述
形成外科手術または再建外科手術による軟部組織欠損の矯正は、単離され、培養発達された脂肪前駆細胞、ＭＳＣｓおよび／または内皮細胞の移植によって行うことができる。脂肪前駆細胞は、移植されると、脂肪細胞へ分化する。これは、脂肪の合成および保存に特化した動物結合組織細胞である。ＭＳＣｓは、いくつかの場合において、まず分化を開始するためのインビトロ操作を必要とすることがあり、これら細胞はまた脂肪細胞を生産できる。しかし、この軟部組織操作においては、前駆細胞、ＭＳＣｓまたは内皮細胞の分化および増殖を可能にし、ならびに促進するために適当な支持体または骨格が必要とされる。
【０００８】
本発明では、軟部組織修復用のバイオマテリアルは、スポンジ型または不織基質形態の、ヒアルロン酸のベンジルエステルからなる好ましい支持体または骨格から構成される。別法では、このバイオマテリアルは、トータルで水溶性のヒアルロン酸誘導体または部分的に水溶性のヒアルロン酸誘導体から構成される注射用調製物であり、ここに誘導体は特にベンジルエステルまたはアミド誘導体である。具体的には、８５％またはそれ以下のエステル化を有するベンジルエステル誘導体およびＨＡのドデシルアミドは注射用調製物に好ましい。このようなベンジルエステルの調製はＥＰ ０ ２１６ ４５３ Ｂ１に記載され、アミド誘導体の調製はＷＯ ００／０１７３３に記載されている。
【０００９】
用語「ヒアルロン酸］（これは以下「ＨＡ」とも称する）は、文献中でＤ−グルクロン酸およびＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン残基によって構成される様々な分子量を有する酸性の多糖類を意味するのに使用されており、このものは細胞表面、脊椎動物の結合組織の塩基性細胞外物質、関節液、眼のガラス液、ヒトのさい帯の組織および雄鶏の冠に存在する。
【００１０】
ヒアルロン酸は、生体中で重要な役割を果たしており、第１に多数の組織（例えば、皮膚、腱、筋肉および軟骨）の細胞の機械的な支持物として役割を果たしており、従ってそれは細胞内基質の主成分である。ヒアルロン酸は生物学的なプロセスにおける他の機能（例えば、組織の水和作用、潤滑、細胞の移動、細胞の機能および分化）をも果たしている（例えば、A. BalazsらによるCosmetics & Toiletries, 5/84号, 8−17頁を参照）。ヒアルロン酸は上記の天然の組織（例えば、雄鶏の冠）またはある細菌からも抽出し得る。今日、ヒアルロン酸は微生物学的な方法によっても製造可能である。抽出によって得られる全てのヒアルロン酸の分子量は８百万〜１千３百万の範囲にある。しかしながら、該多糖類の分子鎖は多数の物理学的もしくは化学的要因（例えば、機械的な影響）の影響下で、または放射剤、加水分解剤、酸化剤もしくは酵素剤の影響下で全く容易に分解し得る。このため、もとの抽出物の通常の精製法においてはよく、低分子量の分解した画分を得る（Balazらによる上記の引用文献を参照）。ヒアルロン酸、その分子画分および個々の塩は薬物として使用されており、それらの使用は化粧品の分野でも提案されている（例えば、Balazによる上記の文献およびフランス特許第2478468号を参照のこと）。
【００１１】
治療剤として、ヒアルロン酸およびその塩は、特に、関節障害の治療、例えばウマの関節炎の治療のための獣医学において用いられてきた［Acta Vet. Scand. 167, 379 (1976)］。天然組織および器官に関する補助および置換治療物質として、ヒアルロン酸およびその分子フラクションおよびそれらの塩は眼の手術において用いられてきた（例えば Balazs et al., Modern Problems in Ophthalmology, Vol. 10, 1970, p. 3- E.B. Strieff, S. Karger eds., Basel; Viscosurgery and the Use of Sodium Hyaluronate During Intraocular Lens Implantation, Paper presented at the International Congress and First Film Festival on Intaocular Implantation, Cannes, 1979; 米国特許第４，３２８，８０３号（眼科学におけるＨＹの使用に関する文献の要旨を伴う）；および米国特許第４，１４１，９７３号）。欧州特許公開第０１３８５７２号は、例えばナトリウム塩として目の内部液の置換および関節障害の治療に適する眼内および関節内注射のために使用可能なヒアルロン酸の分子フラクションを記載する。
【００１２】
ヒアルロン酸はまた、医療および外科物品用に用いられる幅広いポリマー材料、例えばポリウレタン類、ポリエステル類、ポリオレフィン類、ポリアミド類、ポリシルオキサン類、ビニル性およびアクリル性ポリマーおよび炭素繊維に関する添加剤として用いることができ、これはこれらの物質に生適合性を付与する作用を有する。この場合、ＨＹまたはその塩の１つの添加は、このような物質の表面をカバーするか、これを分散するか、あるいはこれらの両手法を用いて行う。このような物質は種々の衛生および医療物品、例えば心臓弁、眼内レンズ、血管クリップ、ペースメーカーなどの製造用に用いることができる（米国特許第４，５００，６７６号を参照のこと）。
【００１３】
用語「ヒアルロン酸」は、不適当な意味で用いられているが、上記の通り、様々な分子量を有するＤ−グルクロン酸およびＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン残基の改変を有する多糖類の全ての群またはその分解した画分を意味し、そこで複数形の「ヒアルロン酸類」がより適当と思われるかもしれないが、本明細書における記載では、様々な形態（例えば、分子画分を含む）のヒアルロン酸を意味するのに単数形を使用し続ける。略号「ＨＡ」もまた、このひとまとめにした用語を記載するのに使用する。
【００１４】
ＥＰ ０ ２１６ ４５３ Ｂ１は、脂肪族または芳香族シリーズのアルコールでのヒアルロン酸のトータルまたは部分的エステル類またはこのような部分的エステルの無機または有機塩基との塩を記載する。このようなエステル群は、興味深いバイオ形成性および医薬特性を保持し、化粧、外科手術および医療を含む種々の分野で用いることができる。新規製品が同一または同様の物理−化学的、医薬または治療特性を定性的に保持するヒアルロン酸の場合、これらは、特に、生体内の多糖類分子の分解を担う天然の酵素、例えば特にヒアルロニダーゼの作用に関して、かなり安定であり、したがって、非常に長い期間上記性質を保存する。
【００１５】
ＷＯ ００／０１７３３は、スペーサー鎖を用いずに、脱アセチル化反応から生じるカルボキシ基またはアミノ基をアミン類、および脂肪族、芳香族、アリール脂肪族、シクロ脂肪族、ヘテロ環式シリーズの酸と反応させることによって得られるヒアルロン酸のアミド類およびその誘導体を記載する。これらの化合物は、酸、アミン、アミド結合のパーセンテージまたはアミドの製造に用いられるヒアルロン酸の誘導体に応じて、水溶性または不溶性であってよい。これらのアミド類は、外科手術、外科手術後の接着および肥大性瘢痕の予防、心臓学、皮膚科学、眼科学、耳鼻咽喉科学、歯科学、整形外科学、ギアエコロジー（gyaecology）、泌尿器科学、体外血液循環および酸素化、化粧および脈管学の種々の分野において用いることができる。上記エステル類と同様に、これらのヒアルロン酸のアミド類は遊離のヒアルロン酸の粘度を保持するが、より安定であり、分解されるまでにより長く存続する。
【００１６】
本発明では、ベンジルアルコールでのＨＡのエステル（ベンジルエステル）またはＨＡのアミドは脂肪前駆細胞の支持体または骨格として利用される。本発明において利用されるＨＡのベンジルエステルは「トータルエステル」（いわゆる、ＨＡのすべてのカルボキシル基がベンジルアルコールでエステル化されている誘導体）または５−９９％エステル（いわゆる、５−９９％のカルボキシル基がエステル化され、残りの基は塩化されている誘導体）のいずれかが好ましい。これらの誘導体は、ヒト前脂肪細胞、ＭＳＣｓおよび／または内皮細胞の培養および生育用の好ましい骨格支持体材料を提供する。これらの誘導体はまた、注射により、付随する細胞集団（前脂肪細胞、間葉幹細胞または内皮細胞）とともにデリバリーすることができる。ここに例えば、ＨＡのベンジルエステルまたはアミドを前脂肪細胞および／またはＭＳＣｓおよび／または内皮細胞の集団と混合した後、陥没、欠損、しわまたは変形を含有する軟部組織の部位へ注射する。ヒアルロン酸誘導体、特にＨＡの８５％またはそれ以下のカルボキシル基がベンジルアルコールでエステル化されているものおよびＨＡのドデシルアミドは特に好ましい。特に好ましい組み合わせの１つはＨＡのドデシルアミドおよび前脂肪細胞である。
【００１７】
ベンジルエステルは上記のように、ＥＰ ０ ２１６ ４５３ Ｂ１に記載の手法にしたがって製造できる（実施例１−４を参照のこと）。アミド類はＷＯ ００／０１７３３に記載の手法にしたがって製造できる（実施例５−２４を参照のこと）。
【００１８】
実施例１−ヒアルロン酸（ＨＹ）のベンジルエステルの製造
単量体２０ｍ.Ｅｑ．に相当する分子量１７０，０００を有するＨＹテトラブチルアンモニウム塩１２．４ｇを２５℃のジメチルスルホキシド６２０ｍＬに溶解し、ベンジルブロミド４．５ｇ（２５ｍ.Ｅｑ.）およびテトラブチルアンモニウムヨーダイド０．２ｇを加え、この溶液を１２時間３０℃で維持する。
得られた混合物を一定攪拌下で酢酸エチル３，５００ｍＬにゆっくり注ぐ。沈殿が形成され、これをろ過し、酢酸エチル５００ｍＬで４回洗浄し、最後に３０℃で２４時間減圧乾燥する。
標題のベンジルエステル生成物９ｇを得る。エステル基の定量的測定は Siggia S. and Hanna J.G. "Quantitative organic analysis via functional groups" 4th edition, John Wiley and Sons １６０〜１７２ページに記載される方法にしたがって行う。
【００１９】
実施例２−ヒアルロン酸ＨＹのベンジルエステルの製造
分子量１６２，０００を有するＨＹのカリウム塩３ｇをジメチルスルホキシド２００ｍＬに懸濁し；テトラブチルアンモニウムヨーダイド１２０ｍｇおよびベンジルブロミド２．４ｇを加える。
この懸濁物を３０℃攪拌下に４８時間置く。得られた混合物を一定攪拌下で酢酸エチル１，０００ｍＬにゆっくり注ぐ。沈殿が形成され、これをろ過し、酢酸エチル１５０ｍＬで４回洗浄し、最後に３０℃で２４時間減圧乾燥する。
標題のベンジルエステル生成物３．１ｇを得る。エステル基の定量的測定は Siggia S. and Hanna J.G. "Quantitative organic analysis via functional groups" 4th edition, John Wiley and Sons １６０〜１７２ページに記載される方法にしたがって行う。
骨格支持物質はＨＡベンジルエステルからなるスポンジ性材料から構成され、これは以下のように製造できる。
【００２０】
実施例３−ヒアルロン酸エステルからなるスポンジ性材料の製造
すべてのカルボキシル基がエステル化されている、（上記実施例で得られた）分子量１７０，０００を有するヒアルロン酸のベンジルエステル１ｇをジメチルスルホキシド５ｍＬに溶解する。各１０ｍＬの調製された溶液に、３００μに相当する粒度を有する塩化ナトリウム３１．５ｇ、重炭酸ナトリウム１．２８ｇおよびクエン酸１ｇの混合物を加え、すべてをミキサーでホモジナイズする。
ペースト性混合物は種々の方法、例えば２つの間に調節可能な距離を有し、互いに反対に回転する２つのローラーからなるマンジ（mange）で層状にされる。この距離を制御し、一片のシリコンペーパーを有するローラー間に通し、これはこのように形成された一層のペーストに対する支持体として働く。この層を所望の寸法の長さおよび幅でカットし、シリコンから取り外し、フィルターペーパーでラップし、適当な溶媒、例えば水に入れる。このように得られたスポンジを適当な溶媒、例えば水で洗浄し、任意的にガンマ線で滅菌する。
【００２１】
ＨＡベンジルエステルの不織材料（ＨＹＡＦＦ１１として既知である）からなる骨格支持体は、以下の手順にしたがって、米国特許第５，５２０，９１６号に記載のように製造できる。
【００２２】
実施例４
タンク中、ジメチルスルホキシド中、１３５ｍｇ／ｍＬの濃度のＨＹＡＦＦ１１の溶液を製造し、ギアメーターポンプによって、各６５ミクロンを計る３０００孔からなる湿噴出用の紡糸口金内に送る。
噴出された塊の糸を、無水エタノールを含有する凝固浴内に通す。次いでこれを輸出ローラーを超えて、無水エタノールを含有する２つの連続する洗浄浴に移す。第一ローラーの牽引率をゼロにセットし、他方のローラー間の牽引率を１．０５にセットする。洗浄浴に通した後、一かせの糸を、４５℃〜５０℃の熱風を吹きつけて乾燥させ、ローラーカッターで４０ｍｍ繊維にカットする。
このように得られた多数の繊維を、カーディング／クロスラッピングマシンに続くシュートに入れ、ここからこれはウェブ、厚さ１ｍｍおよび重量４０ｍｇ／ｍｑとして放出される。次いでこのウェブに、ジメチルスルホキシド中、８０ｍｇ／ｍＬのＨＹＡＦＦ１１をスプレーし、エタノール凝固浴、洗浄チャンバー、および最後に乾燥チャンバーに置く。
この材料の最終の厚さは０．５ｍｍである。
【００２３】
実施例５
ナトリウム塩形態の部分Ｎ−脱アセチル化ヒアルロン酸（ＤＨＡ／Ｎａ）の製造  平均分子量６００Ｋｄａのヒアルロン酸ナトリウム（１ｇ）を、１％ヒドラジン硫酸塩のヒドラジン・モノ水和物溶液（５０ｍＬ）に溶解する。
このものを５５℃で撹拌下、５日間（１２０時間）反応させ、その後、反応をエタノール（１００ｍｌ）を加えることによって停止させる。
そうして生成した沈殿物をグーチるつぼを通してろ過し、エタノールで洗浄、次いで減圧下、室温で乾燥させる。ヒドラジン分解による反応の間に生成するであろうヒアルロン酸のヒドラジドは、ＨＩＯ3（ヨウ素酸）を用いた反応によって分解される。反応が非常に激しい場合は、氷水中で反応容器を冷却しながら行う。
ヒドラジン分解の生成物を５％酢酸ナトリウム（５０ｍＬ）中に溶解し、０.５Ｍヨウ素酸（２５ｍＬ）と反応させる。
反応は、攪拌下、３０分間で進行し、その後、すべての未反応のＨＩＯ3を分解するのに、５７％ＨＩ溶液（５ｍＬ）を加える。
生成したヨウ素はエチルエーテル（３０ｍＬ）を少なくとも３回用いて、その水溶液から抽出する（水相の完全な脱色まで）。その水溶液を、０.５Ｍ  ＮａＯＨ溶液を加えることによってｐＨを中性とし、続いてエタノール（１００ｍＬ）を用いて処理する。得られた沈殿物をグーチるつぼを用いてろ過し、エタノールを用いて洗浄、次いで室温で減圧下、乾燥させる。得られた生成物を、Ｎ−脱アセチル化基のパーセンテージおよび平均分子量を測定するために、分析的に確認する。
反応の収率                    ９０％
Ｎ−脱アセチル化の％          ２６％
平均分子量                    １３０Ｋｄａ
【００２４】
実施例６
部分Ｎ−脱アセチル化したヒアルロン酸のテトラブチルアンモニウム塩（ＤＨＡ／ＴＢＡ)の製造
部分Ｎ−脱アセチル化したヒアルロン酸ナトリウム塩（１ｇ、２.５ｍｍｏｌ）を水（６０ｍｌ）に溶解し、その溶液をカラム（テトラブチルアンモニウム塩（ＴＢＡ）形態のスルホン酸樹脂（２５ｍＬ）を充填）に浸出ろ過させる。Ｈ+形態のスルホン酸樹脂をＴＢＡＯＨ（４０ｗ／ｖ％）溶液を用いて活性化する。Ｎ−脱アセチル化ヒアルロン酸・ＴＢＡ塩を含有する溶出液を集め、凍結乾燥する。
【００２５】
実施例７
安息香酸のｐ−ＮＯ2−フェニルエステル（アシル化剤）の製造
安息香酸（１ｇ、０.０８２ｍｏｌ）をＣＨ2Ｃｌ2（８００ｍＬ）に溶解し、その後、ｐ−ＮＯ2−フェノール（１１.４ｇ、０.０８２ｍｏｌ）およびＤＣＣ（ジシクロヘキシルカルボジイミド）（１６.９ｇ、０.０８２ｍｏｌ）を加える。
続いて、生成するジシクロヘキシルウレアをろ過し、ろ過した生成物を減圧下で、回転蒸発器を用いて乾燥させる。そうして得られた生成物を酢酸エチル中で、結晶化を繰り返すことによって精製する。結晶をろ過し、減圧下、室温で乾燥するまで放置する。
該誘導体をＴＬＣ分析（溶出液：ＣＨ2Ｃｌ2／酢酸エチル（９０／１０）およびＲf＝０.７７）、ＩＲおよびＵＶ分光学によって確認する。
反応収率                    ９２％
【００２６】
実施例８
ケイ皮酸のｐ−ＮＯ2−フェニルエステル（アシル化剤）の製造
ケイ皮酸（１２ｇ、０.０８２ｍｏｌ）をＣＨ2Ｃｌ2（８００ｍＬ）に溶解し、その後、ｐ−ＮＯ2−フェノール（１１.４ｇ、０.０８２ｍｏｌ）およびＤＣＣ（ジシクロヘキシルカルボジイミド）（１６.９ｇ、０.０８２ｍｏｌ）を加える。反応を２時間進行させ、その間、溶液は沸騰し、還流する。
続いて、ジシクロヘキスルウレアをろ過し、ろ過した生成物を減圧下、回転蒸発器を用いて乾燥させる。得られた生成物を酢酸エチル中で結晶化を繰り返すことによって精製し、その結晶をろ過し、室温で減圧下、乾燥させる。
その誘導体をＴＬＣ分析（溶出液：ＣＨ2Ｃｌ2／酢酸エチル（９０／１０）、Ｒf＝０.７７）、ＩＲおよびＵＶ分光学によって確認する。
反応収率                    ８９％
【００２７】
実施例９
ドデカン酸のｐ−ＮＯ2−フェニルエステル（アシル化剤）の製造
ドデカン酸（１６ｇ、０．０８２ｍｏｌ）をＣＨ2Ｃｌ2（１Ｌ）に溶解し、その後、ｐ−ＮＯ2−フェノール（１１.４ｇ、０.０８２ｍｏｌ）およびＤＣＣ（ジシクロヘキシルカルボジイミド）（１６.９ｇ、０.０８２ｍｏｌ）を加える。反応を２時間進行させ、その間、溶液は沸騰し、還流する。
続いて、ジシクロヘキスルウレアをろ過し、ろ過した生成物を減圧下、回転蒸発器を用いて乾燥させる。得られた生成物を酢酸エチル中で結晶化を繰り返すことによって精製し、その結晶をろ過し、室温で減圧下、乾燥させる。
その誘導体をＴＬＣ分析（溶出液：ＣＨ2Ｃｌ2／酢酸エチル（９０／１０）、Ｒf＝０.７７）およびＩＲおよびＵＶ分光学によって確認する。
反応収率                      ９３％
【００２８】
実施例１０
ステアリン酸のｐ−ＮＯ2−フェニルエステル（アシル化剤）の製造
ステアリン酸（２３.３ｇ）をＣＨ2Ｃｌ2（１Ｌ）に溶解し、その後、ｐ−ＮＯ2−フェノール（１１.４ｇ、０.０８２ｍｏｌ）およびＤＣＣ（ジシクロヘキシルカルボジイミド）（１６.９ｇ、０.０８２ｍｏｌ）を加える。反応を２時間進行させ、その間、溶液は沸騰し、還流する。
続いて、ジシクロヘキシルウレアをろ過し、そのろ過した生成物を減圧下、回転蒸発器を用いて乾燥させる。得られた生成物を酢酸エチル中で結晶化を繰り返すことによって精製し、その結晶をろ過し、室温で減圧下、乾燥させる。
その誘導体をＴＬＣ分析（溶出液：ＣＨ2Ｃｌ2／酢酸エチル（９０／１０）、Ｒf＝０.７７）およびＩＲおよびＵＶ分光学によって確認する。
反応収率                    ８７％
【００２９】
実施例１１
ｏ−アセチルサリチル酸のｐ−ＮＯ2−フェニルエステル（アシル化剤）の製造  アセチルサリチル酸（１４.７ｇ）をＣＨ2Ｃｌ2（１Ｌ）に溶解し、その後、ｐ−ＮＯ2−フェノール（１１.４ｇ、０.０８２ｍｏｌ）およびＤＣＣ（ジシクロヘキシルカルボジイミド）（１６.９ｇ、０.０８２ｍｏｌ）を加える。反応を２時間進行させ、その間、溶液は沸騰し、還流する。
続いて、生成するジシクロヘキシルウレアをろ過し、そのろ過した生成物を減圧下、回転蒸発器を用いて乾燥させる。得られた生成物を酢酸エチル中で結晶化を繰り返すことによって精製し、その結晶をろ過し、室温で減圧下、乾燥させる。
その誘導体をＴＬＣ分析（溶出液：ＣＨ2Ｃｌ2／酢酸エチル（９０／１０）、Ｒf＝０.７７）およびＩＲおよびＵＶ分光学によって確認する。
反応収率                    ８０％
【００３０】
実施例１２
部分Ｎ−アセチル化ヒアルロン酸の製造（安息香酸誘導体を使用）
ＤＨＡ／ＴＢＡ（２６％脱アセチル化）（１ｇ、１.６ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（５０ｍＬ）に溶解し、その後、１０％安息香酸ｐ−ＮＯ2−フェニルエステルのＤＭＳＯ溶液（実施例７の記載に従って製造）のＤＭＳＯ溶液（５ｍＬ）を加える。その反応を室温で攪拌下、２４時間進行させ、その後、飽和ＮａＣｌ溶液（２.５ｍＬ）を加えることによって停止させる。このものを３０分間反応させ、次いでエタノール（１００ｍＬ）をゆっくりと加える。そうして得られた沈殿物をグーツるつぼを通してろ過し、エタノールおよびエチルエーテルを用いて洗浄し、最後に室温で減圧下、乾燥させる。
その誘導体をＴＬＣ分析（アミドの加水分解後）、比色定量分析（遊離ＮＨ2基のパーセンテージについて）、ＩＲおよびＵＶ分光学によって分析する。
反応収率                    ８５％
遊離ＮＨ2の％               １１％
Ｎ−アシル化の％            １５％
【００３１】
実施例１３
部分Ｎ−アセチル化ヒアルロン酸の製造（ケイ皮酸誘導体を使用）
ＤＨＡ／ＴＢＡ（２６％脱アセチル化）（１ｇ、１.６ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（５０ｍＬ）に溶解し、その後、１０％ケイ皮酸ｐ−ＮＯ2−フェニルエステル（実施例８の記載に従って製造）のＤＭＳＯ溶液（５ｍＬ）を加える。その反応を室温で攪拌下、２４時間進行させ、その後、飽和ＮａＣｌ溶液（２.５ｍＬ）を加えることによって停止させる。このものを３０分間反応させ、最後にエタノール（１００ｍＬ）をゆっくりと加える。そうして得られた沈殿物をグーチるつぼを通してろ過し、エタノール／水（９：１）、エチルエーテルを用いて洗浄し、最後に室温で減圧下、乾燥させる。
その誘導体をＴＬＣ分析（アミドの加水分解後）、比色定量分析（遊離ＮＨ2基のパーセンテージについて）、ＩＲおよびＵＶ分光学分析によって分析する。
反応収率                    ８５％
遊離ＮＨ2の％               １１％
Ｎ−アシル化の％            １５％
【００３２】
実施例１４
部分Ｎ−アセチル化ヒアルロン酸の製造（ドデカン酸誘導体を使用）
ＤＨＡ／ＴＢＡ（２６％脱アセチル化）（１ｇ、１.６ｍｍｏｌ）をＮＭＰ（５０ｍＬ）に溶解し、その後、１０％ドデカン酸ｐ−ＮＯ2−フェニルエステル（実施例９の記載に従って製造）のＮＭＰ溶液（５ｍＬ）を加える。その反応を室温で攪拌下、２４時間進行させ、その後、飽和ＮａＣｌ溶液（２.５ｍＬ）を加えることによって停止させる。このものを３０分間反応させ、その後、エタノール（１００ｍＬ）を徐々に加える。得られた沈殿物をグーチるつぼを通してろ過し、エタノールおよびエチルエーテルを用いて洗浄し、最後に室温で減圧下、乾燥させる。
その誘導体をＴＬＣ分析（アミドの加水分解後）、比色定量分析（遊離ＮＨ2基のパーセンテージについて）、ＩＲおよびＵＶ分光学によって分析する。
反応収率                    ８８％
遊離ＮＨ2の％               １０％
Ｎ−アシル化の％            １６％
【００３３】
実施例１５
部分Ｎ−アセチル化ヒアルロン酸の製造（ステアリン酸誘導体を使用）
ＤＨＡ／ＴＢＡ（２６％脱アセチル化）（１ｇ、１.６ｍｍｏｌ）をＮＭＰ（５０ｍＬ）に溶解し、その後、１０％ステアリン酸ｐ−ＮＯ2−フェニルエステル（実施例１０の記載に従って製造）のＮＭＰ溶液（５ｍＬ）を加える。その反応を室温で攪拌下、２４時間進行させ、その後、飽和ＮａＣｌ溶液（２.５ｍＬ）を加えることによって停止させる。このものを３０分間反応させ、次いで、エタノール（１００ｍＬ）をゆっくりと加える。そうして得られた沈殿物をグーチを通してろ過し、エタノールおよびエチルエーテルを用いて洗浄し、最後に室温で減圧下、乾燥させる。
その誘導体をＴＬＣ分析（アミドの加水分解後）、比色定量分析（遊離ＮＨ2基のパーセンテージについて）、ＩＲおよびＵＶ分光学によって分析する。
反応収率                    ８５％
遊離ＮＨ2の％               １２％
Ｎ−アシル化の％            １４％
【００３４】
実施例１６
部分Ｎ−アセチル化ヒアルロン酸の製造（アセチルサリチル酸誘導体を使用）
ＤＨＡ／ＴＢＡ（２６％脱アセチル化）（１ｇ、１.６ｍｍｏｌ）をＮＭＰ（５０ｍＬ）に溶解し、その後、１０％アセチルサリチル酸ｐ−ＮＯ2−フェニルエステル（実施例１１の記載に従って製造）のＮＭＰ溶液（５ｍＬ）を加える。その反応を室温で攪拌下、２４時間進行させ、その後、飽和ＮａＣｌ溶液（２.５ｍＬ）を加えることによって停止させる。このものを３０分間反応させ、最後にエタノール（１００ｍＬ）をゆっくりと加える。そうして得られた沈殿物をグーチを通してろ過し、エタノールおよびエチルエーテルを用いて洗浄し、次いで室温で減圧下、乾燥させる。
その誘導体をＴＬＣ分析（アミドの加水分解後）、比色定量分析（遊離ＮＨ2基のパーセンテージについて）、ＩＲおよびＵＶ分光学によって分析する。
反応収率                    ９０％
遊離ＮＨ2の％               １０％
Ｎ−アシル化の％            １６％
【００３５】
実施例１７
ヒアルロン酸ベンジルアミドの製造
ヒアルロン酸のテトラブチルアンモニウム塩（２ｇ、３.２ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１００ｍｌ）に溶解する。この溶液にフミン酸（ｈｕｍｉｄ  ａｃｉｄ）樹脂のＤＭＳＯ（３ｍＬ）および１,１−カルボニルジイミダゾール（７８４ｍｇ、４.８ｍｍｏｌ）を加える。このものを攪拌下、１２時間反応させ、その後、グーチるつぼを通してろ過して、該樹脂を溶出させ、そのろ過した生成物をベンジルアミン（１ｍＬ、９.６ｍｍｏｌ）を加える。このものを４８時間反応させ、次いで飽和ＮａＣｌ溶液（５ｍＬ）を加え、攪拌下、３０分間放置する。アセトン（２００ｍＬ）を加え、そうして得られた沈殿物をろ過し、減圧下で乾燥する。
乾燥誘導体を、ＴＬＣ、ＩＲおよびＨＰＬＣ分析によって確認する。
アミド化の％                    ２５％
【００３６】
実施例１８
ヒアルロン酸ベンジルアミドの製造
ヒアルロン酸のテトラブチルアンモニウム塩（ＨＡ／ＴＢＡ）（２ｇ、３.２ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１００ｍＬ）に溶解する。その溶液をＨＣｌ（１Ｍ）を用いてｐＨ３に調節し、次いで１,１−カルボニルジイミダゾール（７８４ｍｇ、４.８ｍｍｏｌ）を加える。このものを攪拌下、１２時間反応させ、次いでそのものをグーチるつぼを通してろ過して該樹脂を溶出させ、そのろ過生成物にベンジルアミン（１ｍｌ、９.６ｍｍｏｌ）を加える。このものを４８時間反応させ、次いで飽和ＮａＣｌ溶液（５ｍＬ）を加え、攪拌下、３０分間放置する。このものにアセトン（２００ｍＬ）を加え、そうして得られた沈殿物をろ過し、減圧下で乾燥させる。
乾燥誘導体をＴＬＣ、ＩＲおよびＨＰＬＣ分析によって確認する。
アミド化の％                    １５％
【００３７】
実施例１９
ヒアルロン酸ベンジルアミドの製造
酸形態のヒアルロン酸（２ｇ、５.２ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１００ｍＬ）に溶解する。この溶液に、１,１−カルボニルジイミダゾール（８５４ｍｇ、５.２ｍｍｏｌ）を加える。このものを攪拌下、６時間反応させ、その後、ベンジルアミン（１.１３ｍｌ、１０.４ｍｍｏｌ）を加える。反応を４８時間進行させ、次いでアセトン（２００ｍＬ）を加えることによって停止させる。そうして得られた沈殿物をろ過し、減圧下で乾燥する。
乾燥誘導体をＴＬＣ、ＩＲおよびＨＰＬＣ分析によって確認する。
アミド化の％                    ６０％
【００３８】
実施例２０
ヒアルロン酸ベンジルアミドの製造
酸形態のヒアルロン酸（２ｇ、５.２ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１００ｍＬ）に溶解する。この溶液にピリジン（２ｍｌ）、ｐ−ＮＯ2−フェノール（３.６８ｇ、０.０２６ｍｏｌ）およびピリジンクロリドをｐＨが７／８に達するまで加える。最後に、ＤＣＣ（５.３、０.０２６ｍｏｌ）およびベンジルアミン（２.８、０.０２６ｍｏｌ）を加える。このものを攪拌下、１６時間反応させ、その後、反応をアセトン（２００ｍＬ）を加えることによって停止させる。そうして得られた沈殿物をろ過し、減圧下で乾燥させる。
乾燥誘導体をＴＬＣ、ＩＲおよびＨＰＬＣ分析によって確認する。
アミド化の％                    ５％
【００３９】
実施例２１
ヒアルロン酸ベンジルアミドの製造
ＨＡ／ＴＢＡ（２ｇ、３.２ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１００ｍＬ）に溶解させる。反応混合物のｐＨが４.５〜５の間に達するまで、その溶液にＨＣｌガスを吹き込む。続いて、カルボニルジイミダゾール（５１８ｍｇ、３.２ｍｍｏｌ）を加える。攪拌下、１時間反応させ、その後、ベンジルアミン（０.７００ｍＬ、６.４ｍｍｏｌ）を加える。反応を１６時間〜１８時間進行させる。この後、飽和ＮａＣｌ溶液（５ｍｌ）を加える。アセトン（２００ｍＬ）を加えることによって沈降させ、そうして得られた沈殿物をろ過し、減圧下で乾燥させる。
乾燥誘導体をＴＬＣ（加水分解反応後）、ＩＲおよびＨＰＬＣ分析によって確認する。
アミド化の％                    ５０％
【００４０】
実施例２２
ヒアルロン酸オクチルアミドの製造
ＨＡ／ＴＢＡ（２ｇ、３.２ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１００ｍＬ）に溶解させる。反応混合物のｐＨが４.５〜５の間に達するまで、その溶液にＨＣｌガスを吹き込む。続いて、カルボニルジイミダゾール（２０７ｍｇ、１.２８ｍｍｏｌ）を加える。攪拌下、１時間反応させ、その後、オクチルアミン（０．４１７ｍＬ、３.２ｍｍｏｌ）を加える。その反応を１６〜１８時間反応させる。この最後に、飽和ＮａＣｌ溶液（５ｍＬ）を加える。アセトン（２００ｍＬ）を加えることによって沈降させ、得られた沈殿物をろ過し、減圧下で乾燥させる。
乾燥誘導体はＴＬＣ、ＩＲおよびＨＰＬＣ分析によって確認する。
アミド化の％                    ２５％
【００４１】
実施例２３
ヒアルロン酸ドデシルアミドの製造
ＨＡ／ＴＢＡ（２ｇ、３.２ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１００ｍＬ）に溶解させる。反応混合物のｐＨが４.５〜５の間に達するまで、その溶液にＨＣｌガスを吹き込む。続いて、カルボニルジイミダゾール（１０４ｍｇ、０.６４ｍｍｏｌ）を加える。攪拌下、１時間反応させ、その後、ドデシルアミン（６００ｍｇ、３.２ｍｍｏｌ）を加える。その反応を１６〜１８時間進行させる。この後、飽和ＮａＣｌ溶液を加える。アセトン（２００ｍＬ）を加えることによって沈降させ、得られた沈殿物をろ過し、減圧下で乾燥させる。
乾燥誘導体はＴＬＣ、ＩＲおよびＨＰＬＣ分析によって確認する。
アミド化の％                    １５％
【００４２】
実施例２４
ヒアルロン酸ヘキサデシルアミドの製造
ＨＡ／ＴＢＡ（２ｇ、３.２ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１００ｍＬ）に溶解させる。反応混合物のｐＨが４.５〜５の間に達するまで、その溶液にＨＣｌガスを吹き込む。続いて、カルボニルジイミダゾール（５２ｍｇ、０.３２ｍｍｏｌ）を加え、攪拌下、室温で１時間反応させ、その後、ヘキサデシルアミン（７８０ｍｇ、３.２ｍｍｏｌ）を加える。その反応を１６〜１８時間進行させる。この後、飽和ＮａＣｌ溶液（５ｍＬ）を加える。アセトン（２００ｍＬ）を加えることによって沈降させ、得られた沈殿物をろ過し、減圧下で乾燥させる。
乾燥誘導体はＴＬＣ、ＩＲおよびＨＰＬＣ分析によって確認する。
アミド化の％                    ５％
【００４３】
生物学的特性の評価
この実験では、ヒト前脂肪細胞を単離し、培養した。１０６前脂肪細胞を種々の骨格にまき、４２ヌードマウスに移植して新規材料を試験した。エステル化によって修飾されたヒアルロン酸（ＨＹＡＦＦ１１）を基本成分とするスポンジおよび不織材料およびコラーゲンスポンジを用いた。細胞を伴わない骨格は同一動物におけるネガティブコントロールとする。３および８週間後、移植片を外植した。肉眼での外観、重量、厚さ、顕微鏡、免疫組織化学およびＴＥＭ（骨格構造、細胞性、まかれた細胞の浸透の深さ、血管形成）を評価し、骨格−細胞相互作用における相違を評価した。
【００４４】
結果：インビトロ前脂肪細胞は、ＨＹＡＦＦ１１骨格と結合した場合、初期から分化した。肉眼では、すべての前脂肪細胞−構築物は黄色がかって見え、多数の血管を提示し、コントロールは白色で血管なしの外観であった。顕微鏡では、ＨＹＡＦＦ１１構築物はコラーゲン構築物より高い細胞密度を示した。スポンジの孔は不織材料より分化した脂肪細胞を含有し、未分化の前脂肪細胞は不織材料中により多数存在した。脂肪前駆細胞の浸透はより深く、ＨＹＡＦＦ１１骨格においてより均質であった。すべての前脂肪細胞移植片はコントロールより良好な血管形成を示した；血管形成は成熟脂肪細胞まわりにより多く見られた。電子顕微鏡では、ＨＹＡＦＦ１１スポンジ中、前脂肪細胞まわりに、十分に分化した脂肪細胞および大量のＥＣＭが観察された。
【００４５】
結論：インビトロ培養されたヒト前脂肪細胞は脂肪様組織に分化する。この促進方法は、軟部組織欠損の未来の再建（再構築）に用いられる。ＨＹＡＦＦ１１スポンジは、脂肪前駆細胞の発達および分化を支持した。この担体は、脂肪細胞分化に関して不織材料より優れており、細胞性に関してコラーゲンスポンジより優れている。
【００４６】
材料および方法
骨格
コラーゲンスポンジ（ＣＳ）
コラーゲンスポンジ骨格は、Heschal et al., Possible application of directional solidification techniques in cryobiology. In P. Kittel (Ed.) Advances of Cryogenic Engineering. Vol. 41, New York: Plenum Press, 1996 に記載される直接凝固法によって作成された。ウシＩ型コラーゲン（１．８重量％）懸濁液（Dr. Otto Suwelack GmbH, Germany）を冷凍し、次いで凍結乾燥した（WO 99/27315 を参照のこと）。残りの孔は以前の氷結晶構造に相当し、平均５０μｍの孔サイズである（Schoof et al., Einflu des Einfriervorganges auf die Porenstruktur gefriergetrockneter Kollagenschw舂me. Ki-Luft und K舁tetechnik 34, 1998）。
【００４７】
ＨＹＡＦＦ１１スポンジ（ＨＳ）
ＨＹＡＦＦ１１（ヒアルロン酸の直線状誘導体はグルクロン酸のカルボキシル官能基をベンジル基で完全エステル化することによって修飾される）スポンジを、上記のように、ならびに Rastrelli et al., Hyaluronic acid esters, a new class of semisynthetic biopolymers: chemical and physio-chemical properties. Clin. Implant. Mater. 9: 199, 1990 によって製造した。ＨＳ構造は、相逆転プロセスを低圧ガスプロセスとカップリングさせる技術によって得られた開口相互連結孔を有する。この孔サイズは５０〜３４０μｍまで変化する。
【００４８】
ＨＹＡＦＦ１１不織（ＨＶ）
ＨＶは、ヒアルロナンベンジルエステルの不織繊維（厚さ２０μｍ）から構成され、特定重量１００ｇ／ｍ２を有し、これもまた上記のように製造されたものである。
実験では、すべての滅菌された材料がサンプル（０．７５ｃｍ×０．７５ｃｍ×０．５ｃｍ）にカットされた。
【００４９】
インビトロ細胞培養およびバイオハイブリッド
Department of Plastic Surgery and Hand Surgery - Burn Center において、選択的手術（例えば減少乳房形成術）を受けた若年成人（年齢：１８−２９年）の新たに切除されたヒト皮下脂肪組織（０．４〜０．７グラム）から前脂肪細胞を単離した。繊維組織を除去し、脂肪組織を切り刻んで断片にし、水浴中、３７℃で６０分間、一定に振とうしながら、コラゲナーゼ０．１ＵｍＬ−１／ディスパーゼ０．８ＵｍＬ−１（Boehringer Mannheim, Germany）によって消化した。１５％ＦＣＳ（Biochrom, Berlin, Germany）を含有する Dulbecco の修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）を加えて消化を停止し、赤血球溶解バッファー（１５４mmol Ｌ−１ ＮＨ４Ｃｌ、１０mmol Ｌ−１ ＫＨＣＯ３、１mmol Ｌ−１ ＥＤＴＡ、１０分間）をインキュベートした。細胞懸濁液を遠心分離（２００×ｇ、１７℃、１０分間）し、細胞を、密度３×１０４細胞／ｃｍ２で、ＤＭＥＭ１５％ＦＣＳ（１００Ｕ ｍＬ−１ ペニシリン、１００μｇ ｍＬ−１ ストレプトマイシンを添加）組織培養皿（６３．６ｃｍ２、Greiner, Solingen, Germany）にまいた。細胞を、３７℃、１０％ＣＯ２で培養し、２日で培地を交換し、ＥＧＦ（上皮細胞成長因子、１０ｎｇ ｍＬ−１、Sigma）を補った。集密した第二の経過の前脂肪細胞をトリプシン処理し、再懸濁し、血球計数器でカウントした。１×１０６±５×１０４細胞（前脂肪細胞プール）を含有する１００μＬの懸濁液を、ＦＣＳで湿らせたものに穏やかにドロップすることによって上部表面にまき（３７℃で２４時間継続する（lastet）骨格のＦＣＳ浸漬後、細胞をまく）、インキュベーター中に２４時間置き、細胞を結合させた。
【００５０】
インビボ実験モデル
ヌード無胸腺マウス（８週齢、ＮＭＲＩ ｎｕ／ｎｕ）を無菌条件および吸入麻酔（Enflurane（登録商標））下で手術した。４２組立て前脂肪細胞／骨格（＋）構築物および４２ネガティブ（−）コントロール（細胞を伴わない骨格、２４時間 ＤＭＥＭと浸漬）を移植した。すべての動物は１前脂肪細胞／骨格構築物を皮下、別々の切除を介して、左肩甲部および反対側の適合するコントロールに受けた。構築物の底部を筋膜に設置した。すべての動物実験は動物保護に関するドイツの法律にしたがって行った。３週間（グループＡ、７ＣＳ＋および７ＣＳ−、７ＨＳ＋およびＨＳ−、７ＨＶ＋および７ＨＶ−を保持する２１動物）および８週間（グループＢ、２１動物、７ＣＳ＋および７ＣＳ−、７ＨＳ＋およびＨＳ−、７ＨＶ＋および７ＨＶ−）後、マウスをガス状麻酔の過剰投与によって殺生した。標本を肉眼（色、血管、未成長）および顕微鏡分析によって除去した。各スポンジの重量を移植前および外植後に評価した。
【００５１】
組織学および免疫組織学
垂直に二分された標本の一方を４％緩衝化ホルムアルデヒド溶液中で固定し、その後、パラフィンに包埋し、他方を寒冷固定した。両者を垂直に分けた。超構造イメージをインビトロ（３標本）およびインビボ標本（６標本）から得た。６μｍの組織スライス（パラフィン標本）を調製し、ヘマトキシリン−エオシンおよびギムザ染色した。脂質空胞の同定のために、寒冷固定断片をオイル−レッドで染色した。シードされた基質およびシードされていないコントロールのパラフィンセクションを、１：１０希釈のヒトビメンチンに特異的なモノクローナル抗体（mahv, clone V9, Code Nr. M 0725 Lot 057, DAKO, Denmark）で染色した。セクションがいずれのグループに属するかを知らない３実験者が独立して組織学的セクションを評価した。両評価間に相違が存在した場合、平均値が計算された。
【００５２】
２００×倍率で、クロスセクションの５の規定された顕微鏡フィールドにおけるすべてのギムザ染色された細胞核をカウントすることによって、非特異的細胞性（ドナーおよびホスト）を評価した。
【００５３】
２００×倍率で、クロスセクションの５の規定された顕微鏡フィールドにおけるすべてのヒトビメンチンポジティブ細胞特異的細胞性（ドナー＝ヒト）を評価した。眼内ミクロメーター（Zeiss）を用い、２００×倍率で、３の規定された顕微鏡フィールドにおけるドナー細胞の浸透の深さを測定した。
【００５４】
クロス−セクションにおいて移植片の血管形成を評価した。血管なしの場合、「−」を記載し、１またはそれ以上の表面領域の血管は「＋」と評価し、中央領域の血管は「＋＋」、ならびに移植片内の血管の均一分布は「＋＋＋」を記載した。
【００５５】
ポスト固定（postfixation）プロセッシング後、移植片の超構造（Ultrastructure）を評価し、Philips EM 400 電子顕微鏡で観察した。
【００５６】
統計学的評価
移植片の重量および厚さ、移植片内の全体の細胞性およびシードされたヒト前脂肪細胞の浸透の深さのデータを平均値および標準偏差で記載した。異なる移植期間間および前脂肪細胞／骨格構築物およびネガティブコントロール間の差異の有意さはWilcoxon signed rank 試験によって評価した。ｐ＜０．０５の差異を有意とみなした。
【００５７】
結果：
培養
シーディング２４時間後に細胞は骨格に十分に接着した（図１）。インビトロにおける細胞の浸透は、骨格表面領域において唯一観察された。移植直前に、ＨＳ＋およびＨＶ＋内の脂肪前駆体は、組織学および超構造において、分化の徴候として、いくつかの細胞質空胞および丸い形態を示した（図１）。これはＣＳ＋標本では観察されなかった。
【００５８】
肉眼的形態学（Gross Morphology）
すべての標本は容易に同定された。ＣＳ＋およびＨＳ＋標本の肉眼的形態は３および８週間後にほとんど変化がなかった。ＣＳ−およびＨＳ−標本は丸いエッジを示し、ＣＳ＋およびＨＳ＋より小さく見えた。ＨＶ＋は標本間で大きなバリエーションを示し、ＨＶ−骨格は最高の変形および収縮を示した。すべての前脂肪細胞／骨格構築物は、肉眼では黄色の組織の堅い結合層および上方の新規血管によって覆われていた（図２）。コントロール移植片は白色に見え、ほとんど血管がなかった（図２）。
【００５９】
時間の関数としての重量変化（表１）
ＣＳ＋およびＣＳ−重量：インビトロ２４時間後、前脂肪細胞を保持するコラーゲン骨格ＣＳ＋およびその細胞を有さないＣＳ−間の重量に差異はなかった。インビボ３週間後、ＣＳ＋およびＣＳ−に関して有意な重量喪失が見られた。ＣＳ＋はＣＳ−より有意に高い重量を示した。３および８週の間の重量減少は、移植から３週までの間の重量減少より低かった。
【００６０】
ＨＳ＋およびＨＳ−重量：インビトロ２４時間後、前脂肪細胞／骨格構築物ＨＳ＋の重量はコントロールＨＳ−より高かった。ヌードマウスにおける３週間後、ＨＳ＋において重量増加が見られ、一方、コントロールＨＳ−において重量減少が見られた。差異は有意であった。８週間後、ＨＳ＋は依然コントロールより有意に高い重量を有していた。
【００６１】
ＨＶ＋およびＨＶ−重量：前脂肪細胞を伴う不織基質は、すべての時点で、コントロールより高い重量を示した。ＨＶ＋において、インビボ８週間後に顕著なバリエーションのわずかな重量増が見られた。
【００６２】
３骨格（ＣＳ、ＨＳ、およびＨＶ）を互いに比較すると、ＨＶは試験された骨格の最も低い重量、および標本間での最高のバリエーションを示した。前脂肪細胞を伴う移植片はすべての移植片において、すべての時点で、より高い重量を示し、これはＨＳ＋およびＨＶ＋に関して有意であった。有意な重量増は、前脂肪細胞を保持するＨＳ＋において観察されたのみである（これはこの骨格において発達した脂肪様組織に相当する）。
【００６３】
移植片の組織形態学的年代学
概観
すべての外植された標本は薄い繊維性カプセルに囲まれており、これにより新たに形成された脂肪様組織を伴う骨格がまわりのホスト組織から分離されていた。前脂肪細胞／骨格構築物の顕微鏡試験では、このカプセル下、骨格表面に存在する生存能を有する脂肪組織が示された。成熟脂肪細胞はこの表面のすぐ下の領域に見られた。スポンジの中央領域には分化した脂肪細胞は観察されなかった。新たに形成された脂肪組織内には、多くの血管が存在した。コントロール移植片では、脂肪細胞は全くみられなかった。ＨＶ（膨張した繊維および狭くなった孔）およびＣＳ（割れていない領域および遮断された孔）において、孔は崩壊して見えた。ＨＳにおいてのみ、孔構造は十分に維持された。これらのＨＳ＋領域では、脂肪組織は脂肪細胞のクラスターから構成されていた（図３）。
【００６４】
細胞性（Cellularity）
コラーゲン標本における非特異的（ドナーおよびホスト）細胞性は、３および８週後、ＣＳ−よりＣＳ＋においてより高く、一方、ＣＳ＋およびＣＳ−において、非特異的細胞性の減少が見られた（表２）。
ＨＹＡＦＦ１１標本では、コントロール移植片（ＨＳ−およびＨＶ−）において、前脂肪細胞を保持する標本（ＨＳ＋およびＨＶ＋）より高い非特異的細胞性が見られた。３週および８週の間、ＨＳ＋、ＨＶ＋およびＨＶ−において非特異的細胞性のわずかな減少が見られた（表２）。
【００６５】
ヒト−ビメンチンに関する染色により、ＣＳ＋、ＨＳ＋およびＨＶ＋標本中の細胞は強いポジティブであり、ヒト起源を示すことがわかった（図４）。ＣＳ−、ＨＳ−およびＨＶ−標本中には、ポジティブ染色は見られなかった。この特異的（ドナー）細胞性は、３つの異なる骨格において興味深い結果を示した（表２）。ＨＳ＋において、３週および８週の間に差異は見られず；非特異的細胞性は特異的細胞性より高かった。ＣＳ＋では、３週および８週の間にわずかな減少が見られた。ＨＶ＋では、３週および８週の間にわずかな差異が見られた。すべての骨格中、最も高い特異的細胞性は３週時にＨＶ＋において観察された（１１５細胞／フィールド）が、移植８週後、ヒト細胞の数は、ＨＶ＋において、すべての骨格のうち最低数に減少した（２６細胞／フィールド）。
【００６６】
浸透の深さ
インビボ３週後のヒト脂肪前駆細胞の浸透の深さは各材料に関して異なっていた（表３、図５）。最高の浸透はＨＳ＋において見られた。３週後、ほとんどのＨＳ＋標本は細胞の完全な浸透を示し、８週後、すべてのＨＳ＋では、浸透は完全であった。浸透の深さは３週後のＨＶ＋において骨格の厚さの３／４であり、８週後のＨＶ＋において完全であった。ＣＳ＋では、３週後に部分的浸透が深さの増加を伴って見られたが、８週後も依然部分的であった。
【００６７】
成熟脂肪細胞はいくつかの領域のみに見られた。最高数の成熟脂肪細胞はＨＳ＋において１８００μｍ浸透し（図３）、最低数の成熟脂肪細胞はＨＶ＋において２８０μｍしか浸透しなかった（表３、図５）。コントロール移植片のいずれにも脂肪細胞は見られなかった。
【００６８】
血管新生
すべての材料に関して、前脂肪細胞／骨格（＋メジアン）構築物では、ネガティブコントロール（−メジアン）と比較して顕著に良好な新規血管形成が見られた（表４）。ＨＳの開口相互連結孔では、血管新生が最高（＋＋）であった。外植された移植片のいずれにも、同質の豊富な血管分布が見られた（＋＋＋）。
【００６９】
移植片の超構造（ultrastructure）
電子顕微鏡では、ヒト脂肪前駆細胞およびその骨格との相互作用が詳細に示された。インビボ３週後、すべての前脂肪細胞において多数の細胞質脂質滴が見られた。ＨＶ＋では、主に多数の小さい脂質滴を伴うスピンドル型の前脂肪細胞が見られ（図６）、不完全な分化が示された。未分化線維芽細胞様前駆体は、担体材料に密に結合した狭い孔中の不織（ＨＶ＋）内深くに存在した。ＨＶ−では、３週後に、前脂肪細胞／骨格構築物中よりすっと多くの細胞が見られた。ネガティブコントロールＨＶ−移植片には、多数の組織細胞および巨細胞が存在した。ＨＳ＋では、単一の大きな脂質滴を伴い、脂肪細胞に典型的なシグネット（signet）リングの外観を有する丸型細胞が主に見られた（図７）。前脂肪細胞および脂肪細胞の近傍に位置する複数の毛細血管が存在した。骨格のすぐ近傍に新規コラーゲンフィブリルが見られた。脂肪細胞は骨格に密に結合し、新規コラーゲンフィブリルの束は中間部に見られた（図７）。インビボ８週後、脂肪細胞の形態学は３週標本と類似であった。骨格はより不規則な構造および、崩壊した骨格残留物によって遮断された孔を示した。いくつかの巨細胞および、主にコラーゲン繊維から構成される新規に形成されたＥＣＭが見られた。
【００７０】
表１：インビトロ（２４時間）およびヌードマウスに移植された後の、結合ヒト前脂肪細胞を伴う（＋）および伴わない（−）種々の骨格の平均重量。ＣＳ（コラーゲンスポンジ）、ＨＳ（ＨＹＡＦＦ１１スポンジ）およびＨＶ（ＨＹＡＦＦ１１不織）。
【表１】
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＊インビボ３週後、ＣＳ＋およびＣＳ−両者において有意（ｐ＜０．０５）な重量喪失が見られた。ＣＳ＋はＣＳ−と比較して有意に高い重量＊＊（ｐ＜０．０５）を有した。
＊＊＊ヌードマウス内３週後、ＨＳ＋において増加が見られたが、コントロールＨＳ−では、インビトロ重量と比較して有意な重量減少（ｐ＜０．０５）が見られた。
＊＊＊＊両時点（３週および８週）で、ＨＳ＋はコントロールＨＳ−より有意に高い重量（ｐ＜０．０５）を有する。
＊＊＊＊＊３週後、両ＨＶ＋およびＨＶ−は、移植時点より有意に低い重量を有した。
【００７１】
表２：ヌードマウスに移植された、結合ヒト前脂肪細胞を伴う（＋）および伴わない（−）種々の骨格における細胞性（平均）。非特異的にはギムザで染色されるすべての細胞（ドナーおよびホスト）が含まれ、特異的には、ＭＡＨ−Ｖｉｍで染色されるヒト起源のすべての細胞（ドナー）が含まれる。
【表２】
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【００７２】
表３：ヌードマウスに移植された種々の前脂肪細胞／骨格構築物における、ＭＡＨ−Ｖｉｍで染色される未分化のヒト前脂肪細胞の浸透の深さ（平均）。オイル−レッドで染色された分化した脂肪細胞はいくつかの領域のみに見られ、最大の深さを与えられる。
【表３】
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【００７３】
表４：ヌードマウスに移植された、結合ヒト前脂肪細胞を伴う（＋）および伴わない（−）種々の骨格における血管新生。「−」血管なし、「＋」１またはそれ以上の表面領域における血管、「＋＋」中央領域に血管、「＋＋＋」均質な血管分布（メジアン）。
【表４】
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【００７４】
組織操作された脂肪組織は、大きなドナー欠損を生じることなく、身体のすべての領域における先天的な特発性のまたは外傷性の軟部組織欠損を矯正するポテンシャルを有する。この実験は、培養された前脂肪細胞を移植し、移植後分化させることによる脂肪様組織の操作の可能性を示す。
【００７５】
３週および８週インビボ実験では、ヒアルロナンベンジルエステル（ＨＹＡＦＦ１１）スポンジは、コラーゲンスポンジおよびヒアルロナンベンジルエステル（ＨＹＡＦＦ１１）不織より、一定重量、生存ドナー前駆細胞の均一分布および、最後に、最も高い量の分化した脂肪組織に関して、良好な骨格を提供した。ヒアルロナンベンジルエステルスポンジは一定重量を示したばかりでなく、調査されたすべての骨格のうち最高重量を示した。軟部組織充填材料の一定重量およびサイズは臨床使用に関して最も重要な基準である。
【００７６】
ヒアルロナンベンジルエステル不織（ＨＶ＋）上の初期の特異的細胞性（インビボ３週後）はコラーゲン（ＣＳ＋）およびヒアルロナンスポンジ（ＨＳ＋）上のものより２倍高かった。スポンジ（ＣＳ＋、ＨＳ＋）上のフィールド当たりの最終の特異的細胞性（インビボ８週後）は、不織（ＨＶ＋）上のものより２倍高かった。特異的細胞性はシードされたヒト間葉前駆細胞を示す。不織の崩壊（膨張した繊維および狭められた孔）は、前脂肪細胞が分化するために利用可能なスペースを減少させる可能性がある。８週後のコラーゲン骨格の割れていない領域および遮断された孔は分化した脂肪細胞を全く示さなかった（ＣＳ＋）。ヒアルロナンベンジルエステルスポンジ（ＨＳ＋）では、８週後に多孔性構造が依然として存在し、これらの領域では、脂肪組織が脂肪細胞のクラスターから構成されていた。
【００７７】
細胞を伴わないコントロール骨格と比較して、結合ヒト前脂肪細胞を伴うすべての外植片は血管を表した。コントロールは白色でほとんど血管がないように観察された。この結果は、おそらく、培養された脂肪前駆体によって生産される細胞外基質に起因し、これは血管新生の強い誘導物質である。標本内の血管は肉眼的形態学を確実にした。血管新生は前脂肪細胞／骨格（＋）構築物内においてずっと多く見られた。
【００７８】
脂肪前駆細胞を伴わないヒアルロナンベンジルエステル骨格（ＨＳ−、ＨＶ−）における非特異的細胞性はＨＳ＋およびＨＶ＋においてより高い。ネガティブコントロールにおいてより多数の組織細胞および多核巨細胞が観察され、これは組織（外来ボディー）反応はよりずっと強いことを示す。これらの観察はコラーゲン骨格における非特異的細胞性と矛盾する。これらの結果は、今日の我々の知識では説明できない。これは、ヒアルロナンベンジルエステル材料上で生育し、移植された場合、阻害因子の前脂肪細胞分泌に帰するかもしれない。この観察はさらなる実験によって試験される必要がある。
【００７９】
細胞の基質への浸透の深さは、組織操作における骨格／細胞相互作用分析用の良好なパラメータである。この実験では、ヌードマウス内８週後に、すべての骨格タイプにおいてヒト細胞は依然として存在した。スポンジではこの期間にわたって細胞の浸透が増大した。これらの生分解性ヒアルロン酸スポンジ性担体は前駆細胞の発達および分化を支持した。シードされた細胞のより均一な分布は、試験されたフィールドにおいてより少ない集中を導き、これは移植片内へのより良好な浸透と関連した。
【００８０】
ヒト前脂肪細胞は、インビボ、ＨＳ＋において、２２２７±７０６μｍの平均の深さまで骨格に浸透し、成熟脂肪細胞が５２０μｍの平均の深さ（最大１８００μｍ）に見られた。我々は前脂肪細胞は成熟脂肪細胞に分化するために、十分な孔スペースを必要とすると結論した。脂肪組織操作に用いられる最適な材料および骨格構造を規定する必要がある。本発明の結果にしたがって、理想的な骨格は大きな（＞１２０μｍ）相互連結孔を含有し、減少した膨張特性を有するものである。この実験において、ＨＹＡＦＦ１１スポンジはＨＹＡＦＦ１１不織およびコラーゲンスポンジより優れていることが示された。
【００８１】
適用される臨床調査用の新規戦略は、同一患者の自己細胞のインビトロ誘導増殖によって得られる組織および完全器官のインビトロ再建（再構築、reconstruction）であるべきである。間葉細胞を保持する骨格の三次元構造は細胞外基質の沈着に関して重要である。この基質の性質は、この置換物の天然組織としての同様の性質を達成するために、細胞性活性の調節および細胞外基質の性質に関して重要である。したがって、シードされた細胞のビトロおよびインビボの行動に関する種々の基質の影響を調査することは重要である。過去１０年にわたり、組織操作の分野において多くの物質（材料）が調査されてきた。最初の生分解性担体の１つとしてのコラーゲンに基づく骨格および、新規材料としてのヒアルロナンに基づく骨格がこの実験で試験された。多孔性のコラーゲン基質は細胞の内部成長および新規基質合成を支持できる。コラーゲン骨格は線維芽細胞に対して良好な基質を提供し、これは完全に分化し、通常の形態および代謝をインビボにて示す。ヒアルロン酸は多くの組織の細胞外基質に存在し、胎児の間葉組織において豊富であり、ＨＡに基づくバイオマテリアルは始原細胞発生に関して支持的であり、組織修復を促進すると考えられる。脂肪細胞分化時には、前駆細胞は脂肪細胞の特性を獲得し、細胞形態に劇的な変化が生じる。一方で細胞外基質および核基質間の物理的連結、他方で細胞外基質の性質は主に脂肪細胞分化に影響する。天然脂肪組織の遊離結合組織のＥＣＭは脂肪細胞を相互連結し、インビボの脂肪細胞クラスター形成を誘導する。したがって、すべての結合組織に存在するヒアルロナンはインビボ脂肪変換にポジティブに影響することが結論される。成熟脂肪細胞のクラスターはＨＹＡＦＦ１１スポンジにおいてのみ見られ、ＨＹＡＦＦ１１不織では見られなかったことから、骨格の性質が構造と同様に重要であることが結論される。この実験では、ヒアルロナンベンジルエステルスポンジ性骨格は調査された材料のうちの最高の結果を与えた。
【００８２】
記載の本発明について、これらの方法は多数の様式に改良することができることは明らかである。それらの改良法は本発明の精神および目的を逸脱するものと考えるべきではなく、当該分野の当業者にとって明らかであろういずれの改良法も特許請求の範囲内である。
【００８３】
本明細書中に引用されるすべての参考文献は引用により本明細書中に包含される。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、ＨＹＡＦＦ１１スポンジ（ＨＳ＋）上にまいた（シードされた）後２４時間のヒト前脂肪細胞である。生存細胞が骨格に良好に接着しているのが観察できる。細胞質空胞が見られ、これらは、典型的な分化の形態学的徴候として、脂質を保存している。（トルイジン−ブルー、ｓｃ＝骨格）。
【図２】  図２は、ヌードマウスにおける３週間後の、外植されたＨＳ移植片の肉眼観察の図である。薄黄色組織は新規血管形成を伴って、前脂肪細胞移植片に存在する（右）。反対に、同じ動物由来のコントロールスポンジは、スポンジに対する変化はほとんどなく血管も見られなかった（左）。
【図３】  図３は、ヌードマウスにおける３週間後のＨＳ＋セクションの顕微鏡観察の図である。分化したクラスターの脂肪細胞は、スポンジの中心部においてさえ開口孔においてより多数である。脂質含有成熟脂肪細胞および骨格構造の強い赤色染色に注目。（オイル−レッド、ｓｃ＝骨格）。
【図４】  図４は、グループＡ（インビボ３週間）における前脂肪細胞／骨格移植片ＨＳ＋中の浸潤ヒト細胞である。骨格中、ヒト細胞の良好かつ均一な分布に注目。（ｍａｈ−ｖｉｍ染色、ｓｃ＝骨格）。
【図５】  図５は、前脂肪細胞／骨格構築物およびコントロールにおけるドナーおよびホスト細胞の細胞性。
【図６】  図６は、不織基質における前脂肪細胞の超構造（インビボ３週間後）である。細胞は複数の細胞質脂質滴を含有する。繊維および前脂肪細胞は密接していっしょに詰められている。左上角のＨＹＡＦＦ１１繊維および新規ＥＣＭ中間物に注目。
【図７】  図７は、ＨＹＡＦＦ１１スポンジ中のクラスターにおける分化した脂肪細胞（インビボ８時間後）である。細胞は大きいサイズ（＞５０μｍ）の単一の脂質滴を含有し、典型的なシグネットリングの外観を示す。細胞間の新規コラーゲン繊維に注目。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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