(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＲＲＳウイルスのゲノム由来であり、配列番号３，５，７，９，１１および１３からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、免疫応答をしうる（免疫原性の）蛋白質をコードする単離されたｃＤＮＡ。
【請求項２】
前記蛋白質が配列番号７のアミノ酸配列からなる請求項１に記載のｃＤＮＡ。
【請求項３】
前記ｃＤＮＡが、ファージラムダベクターに含まれている請求項１に記載のｃＤＮＡ。
【請求項４】
前記ｃＤＮＡが、宿主細胞に入っている請求項１に記載のｃＤＮＡ。
【請求項５】
前記宿主細胞が原核細胞である請求項４に記載のｃＤＮＡ。
【請求項６】
配列番号１，２，４，６，８，１０および１２からなる群から選択されるＤＮＡ配列からなる配列であるＰＲＲＳウイルス−特異的cＤＮＡ。
【請求項７】
前記cＤＮＡが、プラスミド中に含まれる請求項６に記載のcＤＮＡ。
【請求項８】
宿主細胞に入っている請求項６に記載のcＤＮＡ。
【請求項９】
前記宿主細胞が原核細胞である請求項８に記載のcＤＮＡ。
【請求項１０】
配列番号３、５、７、９、１１および１３からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＰＲＲＳウイルス−特異的cＤＮＡによりコードされる免疫原性蛋白質を含有するワクチン。
【請求項１１】
前記免疫原性蛋白質が配列番号７のアミノ酸配列からなる請求項１０に記載のワクチン。
【請求項１２】
豚に請求項１０に記載のワクチンを投与する工程を含む、豚繁殖呼吸症候群（ＰＲＲＳ）に対して豚を免疫する方法。
【発明の詳細な説明】
配列表
この出願には配列表が伴っており、コンピューターで読み出し可能なＡＳＣＩＩファイル形式の同じ内容のものも提出する。
発明の背景
１．発明の技術分野
本発明は分子遺伝学、特に動物の病気を診断する、または動物の病気に対して予防接種する際の人工ヌクレオチドの使用方法に関する。より詳細には好ましいヌクレオチドは豚繁殖呼吸症候群（porcine reproductive and respiratory syndorome（ＰＲＲＳ））ウィルスの別の株に由来し、予防接種や診断技術への応用において選択的にこのウィルスを標的にする。
２．先行技術の記載
１９８７年に北アメリカで新しい豚のウィルス性の病気が見つかり、不可解な豚病委員会会議、１０月６日、デンバー、コロラドのマジソン動物保存研究所、ウィスコンシン、から出された議事録２９〜３０頁（１９９０）において、ヒルにより「不可解な豚病の概要と歴史（豚の不妊呼吸症候群）」（Overview and History of Mystery Swinne Disease（Swine Infertility and Respiratory syndrome））が報告された。実質的に同一の症状の徴候をもつ病気が１９９０年ヨーロッパで見つかり、パットン（Paton）等により「豚の青耳病」１２８、ベット  レック（Vet Rec）６１７（１９９１）が報告された。病状から観察された病気は普通豚繁殖呼吸症候群（ＰＲＲＳ）、豚不妊呼吸症候群（ＳＩＲＳ）、豚流行性流産呼吸症候群（ＰＥＡＲＳ）、不可解な豚病、を含む様々な名称で知られているが、ここではＰＲＲＳという用語をでこれらの名称すべてを示すこととする。
この病気の結果には、ほとんど回復せずあっけなく死んでしまう幼い豚の呼吸不全と同様に、雌豚における後期の流産、死産が含まれる。雌豚においては妊娠速度および胎児の大きさに減少が見られた。推定では繁殖が出来ないために豚の生産の約１０〜１５％が年間で失われた。この疾患の初期の臨床上の症状としては食欲減退や微熱が挙げられた。他の症状としては病気の一群の動物の皮膚に青くしみが出来、そのしみははじめは耳、乳頭、耳口部、首や肩の前部にできた。検死結果により、マクロファージ、退化した細胞、肺胞中のくずによって肺胞中空の肥大が引き起こされたことがわかった。これらの異常によりＰＲＲＳウィルスの存在が示された。
この原因となるウィルス因子は、小さく、エンベロープ（細胞膜）に包まれたプラス（＋）鎖のＲＮＡウィルスと予想されベンフィールド等「豚の不妊呼吸症候群（ＳＩＲＳ）ウィルス（単離ＡＴＴＣ  ＶＲ−２３３２）の特徴」４．ジャーナル  オブ  ベトリナリー  ダイアグノシス  インベスティゲイション  １２７〜１３３頁（１９９２）（Benfield et al.,Characterization of swine infertility and respiratory syndoromu（SIRS）virus（isolate ATCC VR-2332）,4 J.Vet, Diagn.Invest.127-133（1992））およびウェンスボート等、レリスタッドウィルス、豚流行性流産呼吸症候群の原因：レリスタッドにおける不可解な豚病の研究の概観、３３  ベット  マイクロ  １８５〜１９３頁（１９９２）（Wensvoort et al., Lelystad virus,the cause of porcine epidemic abortion and respiratory syndrome: a review of mystery swine disease research at Lelystad, 33 Vet. Micro. 185-193（1992））。レリスタッド（ＬＶ）ウィルスの単離技術は感染した豚の肺組織をすりつぶすこと；ホモジェネイトを生理食塩水、例えばリンガー溶液、ハンクス液、最小必要培地（ＭＥＭ）を破砕物の１０％wt/volになるように混合すること；および該混合物を０．４５、０．２および０．１マイクロフィルターで濾過することを含む。
プラグマン等、「乳酸デヒドロゲナーゼ−促進ウィルス、馬アルテリティスウィルスおよびシアミン出血性熱ウィルス：プラス（＋）鎖ＲＮＡウィルスの新しいグループ」、４１  アドバンテージ  オブ  ウィルス  リサーチ  ９９−１９２頁（１９９２）（Plagemann et al., Lactate dehydrogenase elevating virus, equine arteritis virus and simian hemorrhagic fever virus: a new group of positive-strand RNA viruses, 41 Adv. Vir. Res. 99-192（1992））によれば、ＬＶウィルスは、形態学、ゲノム構成、転写調節、およびマクロファージ特異性においてアルテリウィルス（arterivirus）に非常に近いらしい。
ＰＲＲＳウィルスのＬＶ株の完全なヌクレオチド配列はニューレンバーク等、「レリスタッドウィルス、豚流行性流産呼吸症候群（ＰＥＡＲＳ）の原因はＬＤＶとＥＡＶに関係している。」１９２ヴィロロジイ  ６２〜７２頁（１９９３）（Meulenberg et al., Lelystad virus, the causative agent of porcine epidemic abortion and respiratory syndrome（PEARS）,is related to LDV and EAV,192 Virology 62-72（1993））により同定された。部分的なＬＶ配列もまたコンゼルマン等「豚繁殖呼吸症候群ウィルス、アルテリウィルス群の一員の分子的な特徴。」１９３  ウィロロジイ  １９３、３２９〜３３９頁（Conzelmann et al., Molecular characterization of porcine reproductive and respiratory syndrome virus, a member of the arterivirus group, 193 Virology 193, 329-339）により同定された。ＬＶウィルスのプラス鎖ゲノム（配列番号１４〜２６）はコロナウィルスとアルテリウィルスの遺伝子と比べて幾分似ている８つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含んでいた。２つのオープンリーディングフレームは同様にウィルスＲＮＡポリメラーゼをコードしていた。２から６までのＬＶ  ＯＲＦはウィルスの膜と関係のある構造蛋白質をコードしているようで、ＬＶ  ＯＲＦ 7はヌクレオカプシドをコードしていると思われた。
ＬＶウィルス蛋白質は３’末端が重複しているＲＮＡ転写物のいれこ状のセットから発現された。この発現方法はコロナウィルス属と共通であるが、ＬＶウィルスの生理学的な性質は本来トガウィルス（Togavirus）族と同じである。
プラグマン等（上述）はこれらの二重の性質を有するウィルスを含む新しい族、アルテリヴィリダ（Alteriviridae）を提唱した。この族にはＰＲＲＳウィルス、馬アルテリティスウィルス（ＥＡＶ）、乳酸デヒドロゲナーゼ−促進ウィルス（ＬＤＬ）、およびシミアン出血性熱ウィルス（ＳＨＦＶ）が含まれる。
ベンフィールド等「豚不妊呼吸症候群（ＳＩＲＳ）ウィルス（単離ＡＴＣＣ  ＶＲ−２３３２）の特徴決定」、４  ジャーナル  オブ  ベトリナリー  ダイアグノシス  インベスティゲイション  ４、１２７〜１３３（１９９２）（Benfield et al., Characterization of swine infertility and respiratory syndrome（SIRS）virus（isolate ATCC VR-2332）, 4 J. Vet. Diagn. Invest. 4, 127-133（1992））により報告されたとおり、ＰＲＲＳウィルスの第二株（ＶＲ−２３３２）は第４継代細胞培養として単離された。それにもかかわらず、該ウィルスのゲノムの配列は決定されなかった。ＶＲ−２３３２単離体はアメリカン  タイプ  カルチャー  コレクションに寄託され、現在ＡＴＣＣカタログ番号ＶＲ−２３３２になっている。ＶＲ−２３３２ウィルスは平均直径６２ｎｍでエンベロープにより囲まれた２５〜３０nmの核を有する球状であると特徴づけられた。ウィルス粒子は塩化セシウム中で１．１８−１．１９ｇ／ｍｌの浮遊密度を有し、組織の破砕物を塩化セシウム濃度勾配をかけて遠心し濾過してさらに精製した。
それぞれＶＲ−２３３２とＬＶウィルス単離体は、特に共通の形態学的および豚の似かよった臨床上の症状の点から、抗原性の多様性に広範な違いを示した。ヨーロッパと北アメリカから得た２４カ所の血清と７つのウィルス単離体は、ウェンスボート等、「レリスタッドウリルスと豚不妊呼吸症候群（ＳＩＲＳ）ウィルスの抗原性の比較」。４  ジャーナル  オブ  ベトリナリー  ダイアグノシス  インベスティゲイション  １３４〜１３８頁（１９９２）（Wensvoort et al., Antigenic comparison of Lelystad virus and swine infertility and respiratory syndrome（SIRS）virus,4 J. Vet. Diagn. Invest. 134-138（1992））に報告されたとおり、両方のウィルスに対して信頼できる方法で感染を診断できる単一の共通する抗原を認識することができなかった。したがって、２つのウィルス株間の構造および徴候学的な類似性にかかわらず、豚を２つの株にたいして免疫する目的にたいして単一の株のウィルスから単一のワクチンを開発することは無理のようである。
発明の要約
本発明は、免疫学的にＰＲＲＳウィルスのＶＲ−２３３２株と異なった人工ヌクレオチド配列、同様にこれら核酸由来のワクチンおよび対応する予防接種の方法を提供することを概要とする問題を解決する。
広くいえば、本発明はＰＲＲＳ病原体のＶＲ−２３３２に由来する物質および方法を含む。該物質は好ましくはＶＲ−２３３２ウィルスに由来する核酸、およびＰＲＲＳ病原体のＬＶ型と比較してそれらを特異なものにするのに充分な長さを有する蛋白質を含む。上記方法は診断における分析や予防接種方法にこれらの物質を使用することを含む。
本発明において、特に好ましい物質は、精製され単離されたＯＲＦ２とＯＲＦ７の間のＶＲ−２３３２ゲノム配列の断片部分をコードする核酸を含む。これらの配列はＬＶウィルスゲノムに関して特異的であり、好ましくは豚の抗−ＶＲ−２３３２ＰＲＲＳ免疫反応を誘導することができるポリペプチドの発現物をコードする。ＶＲ−２３３２およびＬＶウィルス間のＰＲＲＳの臨床上の症状およびウィルス形態学的な類似性にかかわらず、ＶＲ−２３３２由来のオリゴヌクレオチドはＶＲ−２３３２  ｃＤＮＡの選択的増幅のためにポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）のプライマーとして用いることができる。これらの配列はＶＲ−２３３２ゲノム由来の逆の相補的オリゴヌクレオチド配列も含む。これらのヌクレオチド配列はまた選択的に野生型ＶＲ−２３３２  ｃＤＮＡを同定するためのハイブリダイゼイションの研究においてプローブとして用いることができる。
ＶＲ−２３３２ヌクレオチド配列は部分的に、キメラベクターと組み替えられて、挿入したＶＲ−２３３２コード領域の挿入物を適当なプロモーター配列とターミネーター配列の制御下に置く。このベクターは挿入物によってコードされる蛋白質の宿主での発現に用いられる。宿主での発現は原核細胞でも真核細胞でも成し遂げられる。これらのベクターは組み替えプラスミドとして構築され、宿主の豚がウィルス蛋白質を生産するとき免疫応答を誘導するように直接豚に導入する。さもなければ、ウィルス蛋白質を細胞培養で生産して、免疫応答を誘導するために豚に導入する。
これらのヌクレオチド配列はまた、ＶＲ−２３３２由来ｃＤＮＡまたはＬＶ由来ｃＤＮＡを選択的に増幅するプライマーを用いて、ＰＣＲ診断分析に使用できる。または、これらのプライマー配列の特定のＰＲＲＳ原因ウィルスの存在を示すハイブリダイゼーション反応に使用することができる。
他の目的、本発明の有利で顕著な特徴は、添付される図面と共に考慮され、本発明のいくつかの実施例を開示する以下の詳細な説明で明らかになる。
【図面の簡単な説明】
図１は、配列番号１を生産するＰＲＲＳウィルスのＶＲ−２３３２株のヌクレオチド配列を決定するために使用された種々のクローンから得たｃＤＮＡ断片に対応する影付き領域を参考にＶＲ−２３３２  ＯＲＦ２〜７の位置的構造を示す。
図２は配列番号１〜１３に対応するＶＲ−２３３２  ＯＲＦ２〜７のヌクレオチドと推定アミノ酸配列を示す。
図３Ａは、ＩＵＰＡＣ一文字表記アミノ酸コードに従ってＶＲ−２３３２とＬＶウィルスのＯＲＦ７のそれぞれのアミノ酸配列間の比較を示し、同一の残基は大文字で表し、異なっている残基は小文字で表し、これらの残基に対する完全な３文字アミノ酸コードは配列番号１３（ＶＲ−２３３２）と配列番号２６（ＬＶ  ウィルス）に表す。
図３ＢはＶＲ−２３３２  ＯＲＦ７の疎水性プロフィール（hydropathy profile）を示し、ここで縦軸は疎水性の値を示し、横軸は残基の番号を示す。
図３ＣはＬＶウィルスＯＲＦ７の疎水性プロフィールを示し、実質的に図３Ｂに類似している。
図４ＡはＩＵＰＡＣ一文字表記アミノ酸コードに従ってＶＲ−２３３２とＬＶウィルスのＯＲＦ６のそれぞれのアミノ酸の配列間の比較を示し、同一の残基は大文字で表し、異なっている残基は小文字で表し、これらの残基に対する完全な３文字アミノ酸コードは配列番号１１（ＶＲ−２３３２）と配列番号２４（ＬＶウィルス）に表す。
図４ＢはＶＲ−２３３２  ＯＲＦ６の疎水性プロフィールを示し、ここで縦軸は疎水性の値を示し、横軸は残基の番号を示す。
図４ＣはＬＶウィルスＯＲＦ６の疎水性プロフィールを示し、実質的に図４Ｂに類似している。
図５ＡはＩＵＰＡＣ一文字表記アミノ酸コードに従ってＶＲ−２３３２とＬＶウィルスのＯＲＦ５のそれぞれのアミノ酸の配列間の比較を示し、同一の残基は大文字で表し、異なっている残基は小文字で表し、これらの残基に対する完全な３文字アミノ酸コードは配列番号９（ＶＲ−２３３２）と配列番号２２（ＬＶウィルス）に表す。
図５ＢはＶＲ−２３３２  ＯＲＦ５の疎水性プロフィールを示し、ここで縦軸は疎水性の値を示し、横軸は残基の番号を示す。
図５ＣはＬＶウィルスＯＲＦ５の疎水性プロフィールを示し、実質的に図５Ｂに類似している。
図６ＡはＩＵＰＡＣ一文字表記アミノ酸コードに従ってＶＲ−２３３２とＬＶウィルスのＯＲＦ４のそれぞれのアミノ酸の配列間の比較を示し、同一の残基は大文字で表し、異なっている残基は小文字で表し、これらの残基に対する完全な３文字アミノ酸コードは配列番号７（ＶＲ−２３３２）と配列番号２０（ＬＶウィルス）に表す。
図６ＢはＶＲ−２３３２  ＯＲＦ４の疎水性プロフィールを示し、ここで縦軸は疎水性の値を示し、横軸は残基の番号を示す。
図６ＣはＬＶウィルスＯＲＦ４の疎水性プロフィールを示し、実質的に図６Ｂに類似している。
図７ＡはＩＵＰＡＣ一文字表記アミノ酸コードに従ってＶＲ−２３３２とＬＶウィルスのＯＲＦ３のそれぞれのアミノ酸の配列間の比較を示し、同一の残基は大文字で表し、異なっている残基は小文字で表し、これらの残基に対する完全な３文字アミノ酸コードは配列番号５（ＶＲ−２３３２）と配列番号１８（ＬＶウィルス）に表す。
図７ＢはＶＲ−２３３２  ＯＲＦ３の疎水性プロフィールを示し、ここで縦軸は疎水性の値を示し、横軸は残基の番号を示す。
図７ＣはＬＶウィルスＯＲＦ３の疎水性プロフィールを示し、実質的に図７Ｂに類似している。
図８ＡはＩＵＰＡＣ一文字表記アミノ酸コードに従ってＶＲ−２３３２とＬＶウィルスのＯＲＦ２のそれぞれのアミノ酸の配列間の比較を示し、同一の残基は大文字で表し、異なっている残基は小文字で表し、これらの残基に対する完全な３文字アミノ酸コードは配列番号３（ＶＲ−２３３２）と配列番号１６（ＬＶウィルス）に表す。
図８ＢはＶＲ−２３３２  ＯＲＦ２の疎水性プロフィールを示し、ここで縦軸は疎水性の値を示し、横軸は残基の番号を示す。
図８ＣはＬＶウィルスＯＲＦ２の疎水性プロフィールを示し、実質的に図８Ｂに類似している。
図９はそれぞれＶＲ−２３３２とＬＶウィルス３’の非翻訳領域の比較を示す。
好ましい実施例の詳細な説明
以下の限定していない実施例は本発明を実施するための好ましい方法と物質を提示する。
実施例１
ＶＲ−２３３２ウィルスの生育
ＡＴＣＣ  ＶＲ−２３３２ウィルスのウィルス的に純粋なＭＡ−１０４セルラインの培養物はウィルスの接種物として使用するために得られた、リッジフィールド、コネチカットのベーリンガーインゲルハイム（Boehringer Ingelheim of Rdgefield, Connecticut）に多謝。
培養物はＶＲ−２３３２接種物を繁殖させるために調製された。ＶＲ−２３３２ウィルスは、グレイベル等、１８１  プロシーディング  オブ  ソサイティ  オブ  エクスプレシング  バイオロジカル  メヂシン、１１２〜１１９（Gravell et al., 181 Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 112-119）に概説される方法に従って、サル腎臓セルライン由来の細胞中で増殖された。当業者は、又は２６２１、ＭＡ−１０４やＵに言及してもよい。非感染細胞は、セントルイス、ミズーリのシグマケミカル社から購入した１０％胎児牛血清、５０μｇ／ｍｌゲンタマイシンイーグルを添加したＭＥＭ培地（ゲイサースバーグ、メリーランドのライフテクノロギー社から購入）５０ｍｌで培養された。細胞はトリプシン−ベルセン（versene）でフラスコ表面からはがされ、遠心して細胞を沈澱させ、トリプシン−ベンセン（versene）上清から分離され、前培養のために１：４に分けられた。細胞は加湿した５％二酸化炭素大気中、３７℃で７５ｃｍ2プラスチック組織培養フラスコ中で、５〜７日間隔で培地を交換して継代された。
４つの５０ｍｌ細胞培養物は、増殖培地を除去して、だいたい１０5〜１０6組織培養感染単位（ＴＣＩＤ50）の力価を有する増殖培地１ｍｌ中のＶＲ−２３３２接種物を添加して、それぞれ感染させられた。得られた混合物は３０分間保温して、時間経過後、４％胎児牛血清を含有する新鮮なＭＥＭ培地３０ｍｌを添加した。
感染した細胞は２４または４８時間、上述のとおり二酸化炭素雰囲気下で保温され、培地を除去して、フラスコ壁面に付着した細胞を取り出して回収される。
実施例２
ｃＤＮＡライブラリーの構築
実施例１で回収された細胞はリン酸で緩衝した生理食塩水で洗浄して、５Ｍグアニジンイソチオシアネイトを添加して溶解された。全細胞ＲＮＡは、コムジンスキー等、「チオシアン酸グアニジニウム−フェノール−クロロフォルム抽出によるＲＮＡ単離の１段階法」、１６２  アナリティカル  バイオケミストリー  １５６〜１５９（１９８７）（Chomczynski et al., Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform ectraction,162 Anal. Biochem. 156-159（1987））に記載された方法に従って抽出された。ポリＡ含有ＲＮＡはゲイサースバーグ、メリーランドのギブコＢＲＬの通常の装置と方法を使ってオリゴｄＴカラムクロマトグラフィーにより選抜された。
ｃＤＮＡライブラリーはキットの説明書（ラホヤ、カリホルニアのストラタジーン社）に従って、Ｇｉｇａｐａｃｋ▲Ｒ▼ＩＩ  Ｇｏｌｄ1パッケージング抽出物と大腸菌ＳＵＲＥTMを用いてラムダ一方向性ファージベクターＵｎｉＺａｐTMＸＲ中でで構築された（ＵｎｉＺａｐTMＸＲ、Ｇｉｇａｐａｃｋ▲Ｒ▼ＩＩ  ＧｏｌｄＳＵＲＥTMはラホヤ、カリホルニアのストラタジーン社の商標である）。この方法は市販のキットで提供される材料を参考にしてまとめられる。
細胞溶解物２ｍｌから得られたポリＡ選抜ＲＮＡはモロニーネズミ白血病ウィルス逆転写酵素とＸｈｏＩ制限酵素部位を含む配列をもつ合成５０塩基オリゴｄＴプライマーにより以下のとおり逆転写された。
0003748887.tif 000002
第一の鎖合成反応は５−メチル  ｄＣＴＰを含有した。第二の鎖合成はＤＮＡポリメラーゼIと５−メチル  ｄＣＴＰの代わりに標準ｄＣＴＰを用いて行われた。二重鎖ｃＤＮＡの末端はＴ４ＤＮＡポリメラーゼにより平滑化され、ＥｃｏＲＩアダプターがＴ４ＤＮＡリガーゼにより付着された。該アダプターは以下のような合成ヌクレオチド配列を有した：
0003748887.tif 000003
得られたｃＤＮＡはポリヌクレオチドキナーゼで処理され、５’末端をリン酸化され，ＸｈｏＩで完全に消化して、セファクリルＳ−４００カラムで精製した。
ｃＤＮＡはＵｎｉ−ＺａｐTMＸＲベクターのアームとＤＮＡリガーゼで連結され、高効率パッケージ抽出、Ｇｉｇａｐａｃｋ▲Ｒ▼ＩＩ  ゴールド中でパッケージングを行った。得られたパッケージングされた感染力のあるファージ調製物は大腸菌セルラインＳＵＲＥTMに感染させた。
実施例３
ＰＣＲによるｃＤＮＡライブタリーのスクリーニング
報告されたＬＶウィルス由来のＰＣＲプライマー配列を使って複製連鎖反応によりＶＲ−２３３２陽性プラークを同定することを目的として実施例２のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするためになされた多くの試みは、不成功に終わった。合成ＤＮＡ配列またはプライマーは、通常の方法に従って指示体として作られ、32Ｐでラベルされた。ニューレンバーク等、「レリスタッドウィルス、豚流行性流産呼吸症候群（ＰＥＡＲＳ）の原因はLDVとＥＡＶに関係している。」１９２  バイロロジイ  ６２〜７２頁（１９９３）（Meulenberg et al., Lelystad virus, the causative agent of porcine epidemic abortion and respiratory syndrome（PEARS）,is related to LDV and EAV,192 Virology 62-72（1993））に報告されたとおり、これらのオリゴヌクレオチドプライマーは、ＬＶウィルスのＯＲＦ２、６、および７の部分を複製した。ＰＣＲで増幅されたヌクレオチド産物は、いかなる条件下でも全く得られなかった。
ＶＲ−２３３２の核酸配列のＰＣＲによる増幅で観察された全ての失敗により、２種（ＬＶとＶＲ−２３３２）のウィルスは、ＬＶ由来プライマーを用いたＶＲ−２３３２のｃＤＮＡの特異的ＰＣＲ増幅を妨げるのに充分な著しいヌクレオチド配列の相違を有していることが示された。それ故、ＰＲＲＳウィルスのＶＲ−２３３２株の構造遺伝子に相当するヌクレオチド配列を決定するために、ＬＶ配列をＰＣＲのためでなくハイブリダイゼーションのために用いる別のクローニング戦略が考え出された。
実施例４
プラークハイブリダイゼイションによるｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング
ＬＶ  ＯＲＦ７（ＬＶウィルスの配列番号２６）由来のｃＤＮＡを複製するＰＣＲにより作られたヌクレオチド断片が32Ｐでラベルされ、ＶＲ−２３３２ウィルスにより感染したＭＡ−１０４細胞を用いるプローブノーザンブロットに使用された。ラジオグラフのバンドが感染した細胞から得られたが、感染していない細胞からは得られなかった。これらのバンドはＬＶとＶＲ−２３３２が実施例３でＰＣＲができなかったのにかかわらず、ハイブリダイゼイションはできるような類似する配列を共有することを示した。
全部でおよそ５０，０００のプラークができている、１５ｃｍの寒天プレート枚数をＮｉｔｏｒＰｌｕｓニトロセルロース膜（マサチューセッツ、ウエストボロのマイクロセパレーション社）で複製体からスクリーニングされた。相当するＬＶウィルスプローブにハイブリダイズされた陽性プラークは、Ｘ線フィルムへの照射により決定されたとおり、対応するラジオグラフのバンドにより同定された。これらの陽性プラークは確認のために、再度播き直して、スクリーニングされた。ハイブリダイゼイション陽性組み替えＵｎｉ−ＺａｐTMＸＲファージに、配列分析のためのプラスミドＤＮＡを得るために、ストラタジーン社の解説書に記載の通りインビボでの抽出が行われた。ストラタジーン社の方法を以下に概説する。
組み替えファージは、ＥｘＡｓｓｉｓｔヘルパーファージと同様に３７℃１５分間で、大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞に組み込んで、３７℃で振とうしながら２〜３時間栄養豊富な培地で培養した。培養物は７０℃で２０分間暖められ、遠心により、不純物を除かれた。回収されたファージミドを含む上清はＳＯＬＲ細胞に加えられ、アンピリシン含有寒天プレートにまかれた。これらのバクテリアのコロニーは、組み替えプラスミドを含んでいた。
得られたクローンは液体培地で増殖された。ＤＮＡは抽出され、さらにＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩ制限エンドヌクレアーゼ消化（１０倍過剰）で分析された。ＶＲ−２３３２特異的挿入物のサイズは、分子量スタンダードを用いて、寒天ゲル中での電気泳動により見積もられた。次いで、２３クローンのヌクレオチド配列がシーケナーゼ、35Ｓ−ｄＡＴＰおよびストラタジーン社の合成Ｍ１３−２０プライマーを使ったジデオキシヌクレオチド配列決定により決定された；
0003748887.tif 000004
配列決定産物は６％変性ポリアクリルアミドゲルで分析された。２３クローンのうち２０が３’配列と同一であり、これらのクローンは両末端とも入れ子状になっていることを示唆した。全て同じ３’末端を含有している、これらの様々なサイズの２０クローンのうち６つはさらにＤＮＡ配列決定のために選抜された。
実施例５
ＶＲ−２３３２配列分析
ヌクレオチド配列データはシーケナーゼを用いた手動ジデオキシヌクレオチド配列決定（オハイオ、クリーブランド、ＵＳバイオケミカルズ社）と自動蛍光配列決定（カリホルニア  フォスターシティ  アプライドバイオシステムズ社）により実施例４の６つの選択されたクローンそれぞれに対して得られた。
図１は６つのクローンの本来の位置を図示したもので、つまりこれらはさらに配列分析のために選ばれて７６１、７１２、４３１、４１２、５１３、および４１６と名づける。配列番号１を位置の参照にすると、断片の長さの範囲は０から３．５ｋｂにわたる、。クローン４３１、４１２、５１３、および４１６は５’末端から次の小さいクローンから得られた配列と重なるまで配列決定が行われた。クローン４１６の５’末端とＯＲＦ２の間の間隔はクローン７１２と７６１の両方から配列決定がされ、合成ＶＲ−２３３２特異的プライマーにより両末端から配列が決定された。更なる配列決定が逆の鎖で配列を確認するために行われた。この方法により６つの独立したクローンを組み合わせて両方の鎖から、３３５８ヌクレオチド、つまり、配列番号１の配列を読んだ。図２はこの全配列を、それから導きだれるアミノ酸翻訳とともに示す。
ＬＶとＶＲ−２３３２ウィルスの多くの違いは、３’末端非翻訳領域と同様にＯＲＦ２から７をコードする３’ゲノム配列にわたって起こった。これらの違いはヌクレオチドの置換、塩基の欠損、塩基の付加によって起こった。この配列の違いはたぶんエラーが起こりやすい複製から起こり、ウィルスのレプリカーゼは精度が低く、プルーフリーディング活性が欠けている。
実施例６
アミノ酸残基配列比較および免疫交差反応性
はじめの調査はこれら６つのＶＲ−２３３２ＯＲＦから導き出された蛋白質はＬＶウィルス、ＬＤＶ、ＥＡＶのそれぞれにおいて知られているＯＲＦ２〜７とに大雑把に相当することを示した。従って、ＬＤＶとＥＡＶを含む他のアルテリビリダと同様に、ＶＲ−２３３２とＬＶウィルスのアミノ酸残基配列の間の違いを決定するために詳細な比較研究を行った。アミノ酸配列比較はＧＣＧ（ウィスコンシン、マジソン、ウィスコンシン大学）とインテリジェネテックス社（カリホルニア、マウンテンビュー）（Intelligenetics,Inc.（Mountain View,Ca））のソフトウェアーを用いて行われた。配列番号１は、ＯＲＦ２の開始点に先行する最も５’よりの８４塩基と共にＶＲ−２３３２ヌクレオチド配列の最も３’よりの３４４２塩基に対するＶＲ−２３３２配列を含む。これら３３５８ヌクレオチドはウィルスの構造蛋白質をコードし、それぞれ配列番号２〜１３に対応する各ＯＲＦを備える６つのＯＲＦを含む。これらのＶＲ−２３３２  ＯＲＦはＬＶウィルス，ＬＤＶ、ＥＡＶを含むアルテリビリダ族の他のウィルスと同様にＬＶ  ＯＲＦ２〜７と比較して様々な程度の相同性を有する。さらに詳細には、比較配列分析はＶＲ−２３３２ウィルスとＬＶウィルスの間のアミノ酸配列相同性がＯＲＦ５の５５％からＯＲＦ６の７９％にわたることを示す。表１はこのアルテリビリダ族の比較結果を示す。
0003748887.tif 000005
ＶＲ−２３３２のＯＲＦは最もＬＶウィルスに似ているが、ＶＲ−２３３２とＬＤＶの比較は進化における歴史をＬＤＶと共有していることを示した。ＶＲ−２３３２はＬＶウィルスのＯＲＦ５と５５％の同一性を有するが、ＬＶとの相同性の程度にわたって最も低い。ＶＲ−２３３２  ＯＲＦ５はＬＤＶの相当する物の相同性全体にわたって高い程度を示す。ＶＲ−２３３２  ＯＲＦ５はＬＤＶ  ＯＲＦ５と５２％の同一性を有し、ＬＤＶよりＬＶにほんの少し似ている。ＶＲ−２３３２がＬＤＶと比較される場合、相同性はＯＲＦ２、３および４より、ＯＲＦ５、６および７において高い。これらの関連するウィルス間の観察された抗原性の違いを説明する根拠を提供するほかには、部分的にはＯＲＦ２、３、および４由来の蛋白質の機能は知られていないために、これ以上の相違の重要性は不明である。
これらアミノ酸配列分析はまた、殆ど予期しなかったが、配列の相違は広く分布していたことを示した。重要な相違はシグナル配列をコードするＯＲＦの５’末端とアミノ酸残基５０〜７０の領域にあるＯＲＦ４にあった。
ＶＲ−２３３２とＬＶウィルスの両者はＰＲＲＳの臨床上の症状を引き起こす異なった感染要因として同定されが、ウェンスバート等により報告されたとおり（上述）あってもほんの僅かしか免疫学的交差反応を示さなかった。それにもかかわらず、ＶＲ−２３３２の３’末端から誘導されたアミノ酸配列（配列番号３、５、７、９、１１、および１３）はアルテリビリダの特徴を有するゲノム構造を明らかにした、つまり、配列番号１の異なるリーディングフレームのコード領域が重なっていた。
ドット−マトリックス分析がＶＲ−２３３２とＬＶウィルスとＶＲ−２３３２のＯＲＦ２〜７とＬＶウィルスの予測されるタンパク構造を比較するためにＧＣＧソフトウェアーを使って行われた。当業者には理解できるとおり、ドット−マトリックス分析はそれぞれの部位で１３の同一の残基を必要とする２１アミノ酸のスライドする枠を使って通常の技術に従って行われた。この分析はＶＲ−２３３２とＬＶの間でＯＲＦの全部が実質的に同一線上にある、つまり、それぞれのウィルスの構造は、アミノ酸が多岐にわたるのにかかわらず、非常に似ていることを示した。ＶＲ−２３３２とＬＶのＯＲＦのほとんど同一線上にある性質はアミノ酸残基の相違はゲノムの組み替えによって起こるのではないこともまた示した。表２はＶＲ−２３３２とＬＶウィルスのそれぞれのＯＲＦに対応する様々な導き出されたアミノ酸残基の詳細な比較を示す。
0003748887.tif 000006
これらの研究がＶＲ−２３３２がアルテリビリダの他の構成員よりＬＶウィルスに非常に関係することを示したにもかかわらず、相同性は同じ病気を引き起こす２つのウィルスに予想されたよりずっと低かった、つまり、比較する配列の全体に生じた置換、欠損、および付加が起こった。予想された蛋白質は異なった分子量、等電点、および異なった予想されるグリコシル化部位を有した。（表２）
同一の病気を起こすと思われるウィルス間で予想されるより、アミノ酸相同性は、実質的には少ないが、得られた知見はウェンスバート等による血清学的研究から報告された目立った抗原性の多様性と一致する。これらの研究はなぜ野生のＶＲ−２３３２とＬＶウィルス間の血清学的交差反応性が、仮にあっても僅かしか観察されないのかに関する説明を提供した。ＶＲ−２３３２とＬＶウィルス間の抗原性の違いは豚のウィルスの似ていないアミノ酸配列領域に対する免疫学的な反応性による。
実施例７
疎水性プロフィールの研究
疎水性プロフィールと百分率の塩基特性を含む予想される蛋白質の他の特徴が比較された。結果は２つのウィルス（ＬＶとＶＲ−２３３２）は実施例６のアミノ酸比較や免疫交差反応の報告により示されるより非常に似ている機能と構造を有することを確認した。
比較疎水性プロフィールはシンシナティー、オハイオのダニベンシステムズ社のＥＵＧＥＮＥソフトウェアーパックを用いて作られ、ＶＲ−２３３２（配列番号２〜１３）とＬＶウィルス（配列番号１４〜２６）の導き出されたアミノ酸残基配列に基づいた。これらのプロフィールはＶＲ−２３３２とＬＶウィルスのＯＲＦが著しいアミノ酸残基配列の違いにもかかわらず構造的に対応することを示した。これらの結果は観察された生物学的類似性と一致し、ＶＲ−２３３２とＬＶウィルス単離物の間の異なった血清学的役割と対照をなす。
疎水性プロフィールは、蛋白質構造や蛋白質機能が大きな配列の差にかかわらず保存されていたことを示すためにＶＲ−２３３２とＬＶウィルスのそれぞれに対応する各ＯＲＦを比較した。これらのプロフィールにより無電荷、および電荷を有するアミノ酸の高度に類似した領域を示し、膜を貫通するもの、しないもののどちらの領域の膜結合蛋白質の類似する機能を正確に予測するものある。このように、ＶＲ−２３３２蛋白質は構造及び機能においてＬＶウィルスの蛋白質と似ているが、ウィルス蛋白質の広範なアミノ酸の相違は血清学的交差反応の大きな差を説明する。
図３、３Ａ、３Ｂ、および３ＣはＶＲ−２３３２（配列番号１３）とＬＶ（配列番号２６）のＯＲＦ７のアミノ酸配列をならべたものと疎水性プロフィールを示す。このＯＲＦは、ゴッデニイ等、乳酸デヒドロゲナーゼ−促進ウィルス（ＬＤＶ）カプシド蛋白質（Ｖｐｌ））遺伝子地図の位置決め、１７７  バイロロジイイ  ７６８−７７１（１９９０）（Godeny et al., Map location of actate dehydrogenase-elevating virus（LDV）capsid protein（Vp1）gene,177 Virol. 768-771（1990））とデブリエス等、馬アルテリティスウィルスの構造蛋白質、６６  ジャーナル  オブ  バイロロジイ  ６２９４−６３０３（１９９２）（de Vries et al., Structural proteins of equine arteritis virus, 66 J. Virol. 6294-6303（1992））により報告されたとおり、ＬＤＶとＥＡＶでヌクレオカプシド蛋白質が位置するＬＶゲノムの３’末端に位置する。ＯＲＦ７はＰＰＲＳウィルスのヌクレオカプシド蛋白質を最も形成している可能性が高い。該蛋白質はＶＲ−２３３２とＬＶウィルス間で６４％類似しており、ＶＲ−２３３２のＯＲＦ７は５アミノ酸だけ小さかった。それにもかかわらず、ＯＲＦ７によりコードされる両方の蛋白質のＮ末端部分は２６〜２８％塩基性で、疎水性の様子は殆ど同一である。該塩基性残基はＲＮＡゲノムとの相関作用をたぶん容易にする。
図４、４Ａ、４Ｂおよび４ＣはＶＲ−２３３２（配列番号１１）とＬＶ（配列番号２４）のＯＲＦ６のアミノ酸配列のならべたものと疎水性プロフィールを示す。ＯＲＦ６は、ＬＶウィルスの相当する部分に最もよく似たＶＲ−２３３２の蛋白質であり、明らかなアミノ末端シグナル配列をコードする唯一のＯＲＦであった。ＬＶとＶＲ−２３３２蛋白質は７９％同一で、１つのグリコシル化部位を予期させる。（ＬＶウィルスはＶＲ−２３３２に見つかっていないもう１つのグリコシル化部位を有していた。）ＶＲ−２３３２，ＬＶおよびＥＡＶのＯＲＦ６の疎水性プロフィールはすべてに膜貫通領域を示す蛋白質のＮ末端半分に３つの非常に疎水性が高い領域を示した。これらの領域はアルテリビリダのすべての膜の保存された特徴らしい。
図５、５Ａ、５Ｂ、および５ＣはＶＲ−２３３２（配列番号９）とＬＶ（配列番号２２）のＯＲＦ５のアミノ酸配列のならべたものと疎水性プロフィールを示す。ＯＲＦ５はその疎水性プロフィールと予測されるグリコシル化部位のためアルテリビリダ中のエンベロープ蛋白質をコードすると思われる。同様に、デブリエス等（上記参照）によれば、ＥＡＶのＧＬやＯＲＦ５蛋白質はグリコシル化されている。ＶＲ−２３３２のＯＲＦ５は３つの潜在的なグリコシル化部位を含んでおり、そのうち２つは、ＬＶと共通である。それらの百分率の同一性（５５％）はすべてのＯＲＦのうち最も低いにかかわらず、ＬＶとＶＲ−２３３２の疎水性プロフィールは非常に似ている。特に、アミノ末端の４０アミノ酸のうち７残基だけが同じだが、疎水性プロフィールは事実上同一である。６５残基と１３０残基の間の膜貫通領域と予想されるところはＶＲ−２３３２でより明言されている。
図６、６Ａ、６Ｂ、および６ＣはＶＲ−２３３２（配列番号７）とＬＶ（配列番号２０）のＯＲＦ４のアミノ酸配列のならべたものと疎水性プロフィールを示す。ＯＲＦ６の後で、ＯＲＦ４は基もよく保存されているＯＲＦである。カルボキシル末端もまた例外的に両方のウィルスで疎水性である。５つの予想される膜貫通領域はＶＲ−２３３２とＬＶウィルスで非常に異なっている。
図７、７Ａ、７Ｂ、および７ＣはＶＲ−２３３２（配列番号７）とＬＶ（配列番号１８）のＯＲＦ３のアミノ酸配列のならべたものと疎水性プロフィールを示す。ＯＲＦ３はＶＲ−２３３２とＬＶウィルス間で６０％類似している。それにもかかわらず、ＯＲＦ３は疎水性プロフィールによれば２つのウィルス間で最も似ていない蛋白質で、ＶＲ−２３３２では、カルボキシル末端の１２アミノ酸が欠損している。これらの相違の結果として、対応するＬＶの蛋白質は残基２４０を中心とする非常に親水性な領域を有しているが、一方ＶＲ−２３３２蛋白質は、この領域で両親媒性らしい。ＯＲＦ３の形式上の分子量はだいたい３０ｋＤで、しかしそれぞれのウィルスで、この蛋白質は７つの潜在的なグリコシル化部位を有しており、そのため見かけ上の大きさはずっと大きいであろう。
図８、８Ａ、８Ｂ、および８ＣはＶＲ−２３３２（配列番号５）とＬＶ（配列番号１６）のＯＲＦ２のアミノ酸配列のならべたものと疎水性プロフィールを示す。ＯＲＦ２はＶＲ−２３３２の３’ＯＲＦのうち最も大きいことが決定され、２５６アミノ酸の発現物をコードしている。それは１１．０という非常に塩基性な等電点を有しており、１１．３の等電点をもつＯＲＦ６だけがこれを上回っている。ＶＲ−２３３２とＬＶウィルス間のアミノ酸配列のこの違いはＯＲＦ全体に分布しているが、疎水性プロフィールの基本的な効果はアミノ酸末端にあるようだった。
図９のＶＲ−２３３２はＶＲ−２３３２とＬＶウィルスのＯＲＦ７に続く３’末端の非翻訳配列を並べた物を示す。この領域はＶＲ−２３３２においては１５１ヌクレオチドと１９から２０塩基のポリＡテールから成っていた。同様に、ＬＶウィルスは１１５塩基の非コード領域を有していた。ＶＲ−２３３２の非コード領域の５０から１７１塩基はＬＶの非コード領域の１３から１３５塩基と強い相同性を共有していた。
実施例８
ＶＲ−２３３２のＲＮＡの単離
感染した細胞の上清から得られるウィルスＲＮＡはＬＶまたはＰＲＲＳの診断手段として選択的にＶＲ−２３３２もＬＶウィルスヌクレオチドも増幅する逆転写とＰＣＲ増幅反応を使って、単離される。さらに、ＰＣＲ増幅はワクチンに使用するヌクレオチドを量産するのに使われる。
診断における測定として、豚肺組織破砕物を好ましくは、ＰＲＲＳに典型的である歯茎音異状疾患から組織サンプルの選抜により得られる；これらのサンプルを破砕し；適当な生理食塩水、例えば最小必須培地と、１０％（ｗ／ｖ）組織濃度に成るよう破砕物を混合し；０．４５、０．２および０．１マイクロの孔があいている一連のフィルターを通して破砕物混合液を濾過する。
濾過した破砕物は適当なセルライン、例えばサル腎臓細胞やＭＡ−１０４、の細胞を感染させるための接種物として使われる。接種された培養物はおよそｌｏｇ５からｌｏｇ７の高いウィルス力価を持った培養物ストックが得られるまで、保温する。
５Ｍイソチオシアン酸グアニジニウム、５０ｍＭトリス−塩酸ｐＨ７．５、２５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５ｗ／ｖ  サルコシル、および１％（ｖ／ｖ）２−メルカプトエタノールを含む第一の溶液が調製される。この溶液を１０ｍｌに分けた物が１００μｌの２−メルカプトエタノールと混合される。ウィルスストック培養物の２ｍｌがチューブ中で第一の溶液２ｍｌと、０．４ｍｌの２Ｍ酢酸ナトリウム、４ｍｌフェノール、およびクロロホルム対イソアミルアルコールを２４対１で混合したクロロホルム−イソアミルアルコール溶液１ｍｌと同様に、混合される。それぞれの試薬を混合した後、ウィルスを含有した混合液は短時間ボルテックス（vortexed）にかけられる。最終混合液は３０秒間ボルテックスにかけられ、１５秒間氷の上で冷やされて、次いでＪＡ−２０ローターで８０００ｒｐｍ、２０分間、４℃で遠心される。水相は遠心により一番上にきて分けられ、目的のＲＮＡが含まれている。
水相は除去され新しいチューブに移される。滅菌前のジエチルピロカーボネイトが２％（ｖ／ｖ）で含まれているおよび４ｍｌの滅菌水が、４ｍｌのフェノール、１．６ｍｌの２４：１のクロロホルム−イソアミルアルコール混合液と同様に、この第二のチューブに加えられる。これらの成分はボルテックスされ、１５分間氷の上で冷やされて、次いでＪＡ−２０ローターで８０００ｒｐｍ、２０分間、４℃で遠心され、水相が再び抽出される。得られた水相抽出液は等量のイソプロパノールと混ぜて、氷の上で１時間冷やしてＲＮＡを沈澱させる。
沈澱したＲＮＡはＪＡ−２０ローターで８０００ｒｐｍ、２０分間、４℃で遠心により沈澱された。イソプロパノールが除去され、見えないＲＮＡ沈澱物が５Ｍイソチオシアン酸グアニジニウム、５０ｍＭトリス−塩酸  ｐＨ７．５、２５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５％サルコシル、および１％  ２−メルカプタノール、および０．１％  ２−メルカプトエタノールを含む溶液０．３ｍｌに溶解される。溶解した沈殿物を含む溶液は１．５ｍｌマイクロフュージチューブに移されて、ＲＮＡは再び０．３ｍｌのイソプロパノールで、氷上で１時間で、沈澱される。冷やした溶液は１０分間、マイクロフュージチューブ中で、１５，０００ｒｐｍで遠心され、その後にイソプロパノールを除去する。
得られた沈殿物は０．２％（ｖ／ｖ）ジエチルピロカーボネイトを含む２５％の水と混ぜた７５％のエタノールを含む溶液、およそ０．５ｍｌで洗浄される。洗浄後、混合物をボルテックスにかけ、５〜１０分遠心する。アルコールは除去され、ＲＮＡ沈澱は３分間吸引乾燥する。沈殿物は０．２％（ｖ／ｖ）ジエチルピロカーボネイトを含有する水５０ｍｌで溶解される。
実施例９
ｃＤＮＡを形成するためのＲＮＡの逆転写
ＲＮＡと０．２％のジエチルピロカーボネイト水を含有する実施例８で得られた溶液は、次いでｃＤＮＡの相補断片を得るためにＲＮＡの逆転写に供される。この方法は、パーキンエルマー社のＲＴ−ＰＣＲキットのような市販されているキットを用いて行うのが好ましい。キットは、該キットの試薬の適切な使用が記載されている業者の指示書に従って使用する。
実施例によれば、主混合液は、４μｌ  塩化マグネシウム、２μｌ  １０倍濃縮バッファー、２μｌ  ｄＧＴＰ、２μｌ  ｄＡＴＰ、２μｌ  ｄＣＴＰ、２μｌ  ＴＴＰ、１μｌ  ＲＮアーゼ阻害剤、および１μｌ逆転写酵素を混合することによってＲＴ−ＰＣＲキットと名付けられた試薬から調製される。３μｌ等量のＲＮＡと０．２％ジエチルピロカーボネイト水の混合液を注意してマイクロフュージチューブに入れ、必要ならチューブ内の全ＲＮＡ量が１μｇ以上にならないように等量の０．２％ジエチルピロカーボネイト水で希釈する。キットはランダム６マーの混合液を含有し、この溶液の１μｌがＲＮＡとジエチルピロカーボネイト水に添加される。この溶液は、次いで任意に６５〜７０℃で５〜１０分間熱して、氷上に静置しても良い。主混合液１６μｌがサンプルに添加され、室温で１０分間保温される。それから、以下の条件でチューブをサーマルサイクラーで保温する：４２℃１５分間、９９℃５分間、および５℃５分間。チューブをサーマルサイクラーからはずし、４℃で保存する。この逆転写酵素反応の結果、ｃＤＮＡが得られ、それは続いてＰＣＲ増幅が行われる。
実施例１０
ｃＤＮＡの選択的ＰＣＲ増幅
ＰＣＲ増幅の準備において、以下の試薬の主混合液が用意される；塩化マグネシウム１μｌ、１０倍濃縮バッファー２μｌ、５’プライマー０．５μｌ、３’プライマー０．５μｌ、滅菌水１５．８７５μｌ、およびＴａｑポリメラーゼ０．１２５μｌ。５’および３’プライマーはおよそ１０μＭの濃度であり、好ましくは以下の表３に挙げられた配列に基づいた合成ヌクレオチドを含む。５μｌ等量の実施例９の逆転写酵素反応溶液が２０μｌの主混合液に添加される。その結果得られる主混合液と逆転写酵素ｃＤＮＡを組み合わせた物２５μｌとミネラル油１００μｌとチューブの中にいれる。チューブはサーマルサイクラーで以下の条件下、保温される：９３℃４分を１サイクル、５５℃３０秒、７２℃４５秒で、９３℃４５秒を３０サイクル行い；５５℃３０秒、続いて７２℃１０分を１サイクル。これら３２サイクルの後、溶液をサーマルサイクラーから回収するまで４℃で保存する。得られた溶液はＰＣＲで増幅されたｃＤＮＡを含んでおり、アガロースゲルで分析される。
アガロースゲルはＴＡＥバッファーと混合された１．５％寒天、つまり１００ｍｌのバッファーに対して１．５ｇの寒天、を含んでいることが好ましい。混合液は電磁波で溶解され、１０ｍｇ／ｍｌエチジウムブロマイド溶液１μｌがゲル１００ｍｌに対して加えられる。混合液を型にそそぎ込み３０〜４５分固定しておく。ＰＣＲ反応溶液の５μｌがチューブに加えられ、ＵＶ反応性の泳動染色液（running dye）が添加される。さらにギブコ−ＢＲＬ社の１００塩基ラダーのような適当な分子量マーカー１〜２μｌも添加される。ゲルは電気泳動漕に置かれ、泳動層は通常のＴＡＥ泳動バッファーで満たされる。サンプルが搭載され、８０ボルトで１時間泳動が実施される。電気泳動されたＰＣＲ産物はＵＶ照射下で見ることができる。アガロースゲル電気泳動後、ＵＶ照射下で見ることができるＰＣＲで作られた断片は、ウィルスヌクレオチド産物の同一性をはっきり確認するためにＤＮＡ配列決定が行われる。
実施例１１
選択的ＰＣＲ増幅またはハイブリダイゼイションのためのオリゴヌクレオチド設計
実施例１０のＰＣＲ増幅に使われる５’および３’プライマーは、ＶＲ−２３３２ゲノムの関心のある領域を複製する合成ヌクレオチド配列として、好ましくは、通常の方法に従うか、商業的な注文により構築される。プライマーの設計は、好ましくは、ウィルス蛋白質、選択されたＯＲＦ、又は、最も好ましくは蛋白質断片を表すアミノ酸配列をコードする領域の全アミノ酸コード配列として、適当なプライマーを選択して含んでいる。
好ましいオリゴヌクレオチドはＶＲ−２３３２のコード領域の小さな部分を特異的に標的とするが、ＬＶ由来ヌクレオチドとはアニールできないものを含むよう選択される。これらの好ましいオリゴヌクレオチドはワクチンと予防接種の方法に用いられるプライマーにより選択されるｃＤＮＡの長い配列を複製するＰＣＲ増幅技術のプライマーとして用いられる。同様にオリゴヌクレオチドも続いて行うハイプリダイゼーション、クローニング、蛋白質断片の宿主発現、および続いてワクチンに用いるヌクレオチド産物のプローブとしても用いられる。
これらの末端配列はウィルス蛋白質の通常成熟型には存在しないから、ワクチンを生産する際に用いるために選ばれる発現された蛋白質断片のｃＤＮＡコード領域の好ましい実施例は翻訳されたアミノ酸末端疎水性配列を除かれたものを含む。膜貫通配列は免疫反応を誘導しないだろうし、この除去により組み替え遺伝子技術により免疫学的に反応性を有する蛋白質の生産が簡単になるので、選ばれたｃＤＮＡコード領域は膜を貫通すると推定される領域を除いた蛋白質断片もコードする。
以下の表３に挙げられた配列は添付する配列表で位置を参照してプライマーを例示する。すべての配列は５’から３’方向に記載する。実施例をとおして、プライマーＡは配列５’−ＧＣＴＧＴＴＡＡＡＣＡＧＧＧＡＧＴＧＧ−３’を表す。プライマーＡ’は配列５’−ＧＴＣＡＣＣＴＡＴＴＣＡＡＴＴＡＧＧＧ−３’（配列番号１の３２７１−３２８９の位置）の逆の相補鎖、つまり逆の順の相補的なヌクレオチドが２７１−３２８９の位置で配列に置き換わっている配列５’−ＣＣＣＴＡＡＴＴＧＡＡＴＡＧＧＴＧＡＣ−３’である。
0003748887.tif 000007
0003748887.tif 000008
表３のプライマーＡとＡ’はＬＶ単離物を含む他のウィルスのヌクレオチドの単離物からＶＲ−２３３２のヌクレオチドを見分けてＶＲ−２３３２  ＯＲＦ７蛋白質コードヌクレオチドを選択的に増幅する。同様に、プライマーＢとＢ’は他のウィルスのヌクレオチドの単離物からＶＲ−２３３２のヌクレオチドを見分けてＶＲ−２３３２  ＯＲＦ６蛋白質コードヌクレオチドを選択的に増幅する。一方、プライマーＣとＣ’はＶＲ−２３３２のＯＲＦ６を増幅せずに、ＬＶウィルス  ＯＲＦ６コード領域を選択的に増幅する。プライマーＤとＤ’はＶＲ−２３３２のＯＲＦ７を増幅せずに、ＬＶ  ＯＲＦ７を選択的に増幅する。
表３の好ましいオリゴヌクレオチドはｃＤＮＡのＰＣＲ増幅や通常のハイブリダイゼイション反応を試みることによって特定のＰＲＲＳ原因株やウィルスの診断に使用される。実施例を通して、ＰＲＲＳの症状が病気の動物に臨床的に確認され、レリスタッドウィルス（例えばプライマーＣ、Ｃ’やＤ、Ｄ’）の増幅に特異的なプライマーがＰＣＲ反応でｃＤＮＡ増幅を生産できなかったら、そのときはＬＶのｃＤＮＡがないことはＶＲ−２３３２の感染の診断と一致している。一方、ＶＲ−２３３２のプライマーＡ，Ａ’やＢ，Ｂ’がＰＣＲで増幅できないことはＬＶの感染診断と一致している。
ウィルスｃＤＮＡの存在が表３のこれらプライマーやプローブに対するハイブリダイゼーションにより確認されたときは、ハイブリダイゼーションはニトロセルロースやナイロン膜のような固体の支持体に固定されたｃＤＮＡやＲＮＡのどちらかの含まれた溶液中でおこる。回収されたハイブリダイズした産物は通常の放射線活性や放射線を使用しない技術で検出され、ウィルス核酸配列の存在を示す。当業者は診断技術の必須項目にドットブロットハイブリダイゼーション、スロットブロットハイブリダイゼイション、溶液ハイブリダイゼーション、サザンブロット、ノーザンブロット、ＲＮａｓｅプロテクション分析を含むことを理解するだろう。
実施例１２
組み替え技術に由来するウィルス蛋白質の生産のための宿主発現系におけるＶＲ−２３３２蛋白質コード配列のクローニング
ＶＲ−２３３２ヌクレオチド配列（配列番号１、２、４、６、８、１０、および１２）の選択された部分は１つのオープンリーディングフレーム、または複数のオープンリーディングフレームを宿主生物内での蛋白質発現のために設計されている市販されているプラスミド中で増やすために用いられる。真核あるいは原核細胞中でウィルス蛋白質の発現に使用される市販されている、または自分で設計した系の例は以下のとおりである。
サンディエゴ、カリホルニアのパーミンゲン社から市販されている真核バキュロウィルス系は、ベクターｐＡｃＧＰ６７Ｂを含んでおり、プライマーＣおよびＣ’に使用するのが好ましい。表３で示したとおり、プライマーＣおよびＣ’はそれぞれこれらのプライマーをｐＡｃＧＰ６７Ｂベクターと結合させる際に使用するための合成により結合されたヌクレオチドにより形成されたＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩ制限酵素部位を含んで提供されても良い。この方法によって、得られた増幅されたｃＤＮＡは実質的にＶＲ−２３３２のＯＲＦ７の全体のコード領域を取り入れて、最も３’よりもＥｃｏＲＩサイトと同様に最も５’末端よりのＢａｍＨＩサイトも有する。これらの制限酵素部位はＶＲ−２３３２のコード領域をＶＲ−２３３２のＯＲＦ７蛋白質の真核細胞宿主発現ために適当なｐＡｃＧＰ６７Ｂのプロモーターや終結配列の制御下に置くために使われる。
ウィルス蛋白質の原核細胞宿主発現は多様な市販されている宿主発現系において行われる。ウィスコンシン、マゾソンのノバゲン社のＰＥＴシステムが原核生物での発現には好ましく、ベクターｐＥＴ２５ｂを含む。ＰＥＴシステムはプライマーＤとＤ’を使用するのに好ましく、ＶＲ−２３３２のＯＲＦ７コード領域を適当なプロモーターや終了配列の制御下に置いて使うためにそれぞれＮｄｅｌとＨｉｎｄＩＩＩの制限酵素部位を有して提供されても良い。
配列番号１２と１３のＶＲ−２３３２のＯＲＦ７に相当する蛋白質はＯＲＦ７の成熟蛋白質と推定されるものに相当する選択された蛋白質のコード配列を増幅することにより発現される。この増幅方法は実施例８、９および１０に概説されるＲＴ−ＰＣＲ増幅方法に続く。ＰＣＲプライマーは好ましくはｐＥＴ２５ｂベクターにクローニングするためにＮｄｅｌおよびＨｉｎｄＩＩＩを含むように設計される。これらの部位により結果としてｐｅｌＢリーダーやＨｉｓＴａｇ配列のない蛋白質ができ、これにより他の発現系を任意に選ぶこともできる。この成熟蛋白質はアミノ酸番号２０または３０のどちらかをコードするヌクレオチド配列で始めることによりシグナルペプチドなしで発現される。ＰＣＲ断片はｐＥＴ２５ｂベクター増幅配列中にクローニングし、宿主発現系で使用する。
ＯＲＦ７以外の蛋白質コード領域を選ぶ際に、特定の蛋白質コード領域を欠損させたり、短くしたりする方が有利である、例えば、ＯＲＦ４由来の膜を貫通するＣ−末端１７アミノ酸の欠失は該蛋白質の生物学的に意味のある部分に対する抗体応答に直接結びつくであろう。
組み替えクローンはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）による誘導のためにＢＬ２１細胞に導入される。誘導して適当な保温の後、発現された組み替えバイオ蛋白質は誘導を行った細胞と誘導を行わなかった細胞から得た溶解物を比較することによってゲル上で検出される。インクルージョンボディ調製物は可溶性ＯＲＦ４蛋白質以外の蛋白質を放出させる濃度で尿素やグアニジンで洗浄される。沈殿物は尿素で再溶解され、酸化および還元グルタチオン中で巻き戻（リホールディング）される。得られた可溶性の、透析された蛋白質はさらにイオン交換およびサイズエクスクルージョンクロマトグラフィーにより精製される。
実施例１３
組み替えウィルス蛋白質の注入による動物の免疫反応の誘導
実施例１２で生産されたとおり、バクテリアや真核生物発現系から得られた精製蛋白質はＰＲＲＳウィルスのＶＲ−２３３２株に対して動物を免疫するに充分な免疫応答を誘導するように、通常の免疫化経路により動物に注入される。当該蛋白質単独でも、通常の補助剤と組み合わせてもよく、筋肉注射、皮膚注射、皮下注射、その他の方法により投与する。
もしくは、生体分子工学によるＶＲ−２３３２配列に相当する蛋白質を発現するバクテリアやウィルスは動物にインビボでＶＲ−２３３２蛋白質の発現体を注射することにより投与される。この組み替え蛋白質のインビボ発現はＶＲ−２３３２ウィルスに対する免疫応答も誘導するだろう。
実施例１４
動物における直接的な免疫応答を誘導するＶＲ−２３３２  ＤＮＡの使用
ＯＲＦやＯＲＦの断片部分をコードするＶＲ−２３３２に由来するオリゴヌクレオチド断片は動物における直接的な免疫応答を起こすのに用いられる。この方法はおおむねオマー等、２５９、サイエンス、１７４５−１７４９（１９９３）（Omer et al., 259 Science 1745-1749（1993））に記載された方法に従う。ＤＮＡは好ましくはバクテリア内で増殖するプラスミド構造体に含まれ、精製され、筋肉注射、皮膚注射、又は他の経路で動物体内に注入される。注射された動物は典型的にはクローニングされた蛋白質を発現し、発現した蛋白質に対する免疫応答を生じる。
参考文献
以下の参考文献はＰＲＲＳウィルスに関し、これをもって本明細書の一部となす。
ベンフィールド等、（１９９２）、ジャーナル  オブ  ベトリナリー  ダイアグノシス  インベスティゲイション  ４、１２７〜１３３頁（Benfield, D. A., Nelson, E., Collins, J. E., Harris. L., Goyal, S. M., Robison,D., Christianson, W. T., Morrison, R. B., Gorcyca, D. E., and Chladek, D. W.（1992）. Characterization of swine infertility and respiratory syndrome（SIRS）virus（isolate ATCC VR-2332）, J. Vet. Diagn. Invest. 4, 127-133.）
コムジンスキー等、（１９８７）、アナリティカル  バイオケミストリー  １６２、１５６〜１５９頁（Chomczynski, P. and Sacchi, N.（1987）. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform ectraction. Anal. Biochem. 162, 156-159.）
コリンズ等、（１９９２）、ジャーナル  オブ  ベトリナリー  ダイアグノシス  インベスティゲイション  ４、１１７〜１２６頁（Collins, J. E., Benfield, D. A., Christianson, W. T., Harris, L., Hennings, J. C., Shaw, D. P., Goyal, S. M., McCullough, S., Morrison, R. B., Joo, H. S., Gorcyca, D. E., and Chladek, D. W.（1992）. Isolation of swine infertility and respiratory syndrome virus（isolate ATCC VR-2332）in North America and experimental reproduction of disease in gnotobiotic pigs, J. Vet. Diagn. Invest. 4, 117-126.）
コンゼルマン等、（１９９３）、バイロロジイ  １９３、３２６〜３３９頁（Conzelmann, K., Visser, N., Van Woensel, P. and Thiel, H.（1993）. Molecular characterization of porcine reproductive and respiratory syndrome virus, a member of the arterivirus group. Virology 193, 329-339.）
デンブー等、（１９９１）、ジャーナル  オブ  バイロロジイ  ６５、２９１０〜２９２０頁（den Boon, J. A., Snijder, E. J., Chirnside, E. D., de Vries, A. A. F., Horzinek, M. C., and Spann, W. J. M.（1991）. Equine arteritis virus is not a togavirus but belongs to the coronavirus superfamily. J. Virol. 65, 2910-2920.）
デブリエス等、（１９９２）、ジャーナル  オブ  バイロロジイ  ６６、６２９４−６３０３頁（de Vries, A. A. F., Chirnside, E. D., Horzinek, M. C., and Rottier, P. J. M.（1992）. Structural proteins of equine arteritis virus. J. Virol. 66, 6294-6303.）
ゴッデニー等、（１９９０）、バイロロジイ  １７７、７６８〜７７１頁（Godeny, E. K., Speicher, D. W., and Brinton, M. A.（1990）. Map location of lactate dehydrogenase-elevating virus（LDV）capsid protein（Vp1）gene. Virol. 177, 768-771.）
ゴッデニー等、（１９９３）、第９回ウィルス学国際会議議事録  ２２頁（Godeny, E. K., Zeng, L., Smith, S. L., and Brinton, M. A.（1993）. In Proceedings of the 9th International Congress of Virology, p22, August 8-13, Glasgow, Scotland.）
グレイベル等、プロシーディング  オブ  ソサイティ  オブ  エクスプレシング  バイオロジカル  メヂシン、１８１、１１２〜１１９頁（Gravell, M., W. T. London, M. E. Leon, A. E. Palmer and R. S. Hamilton. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 181, 112-119.）
ヒル、（１９９０）、不可解な豚病委員会会議議事録  ２９〜３０頁（Hill, H.（1990）. Overview and History of Mystery Swine Disease（Swine Infertility and Respiratory syndrome）. In : Proceedings of the Mystery Swine Disease Committee Meeting, October 6, Denver CO, pp.29-30. Livestock Conservation Institute, Madison, WI.）
クー等、（１９９１）、ジャーナル  オブ  バイロロジイ  ６５、５１１８〜５１２３頁（Kuo, L., Harty, J. T., Erickson, L., Palmer, G. A., and Plagemann, P. G. W.（1991）. A nested set of eight mRNAs is formed in macrophages infected with lactate dehydrogenase-elevating virous. J. Virol. 65,5118-5123.）
ニューレンバーク等、（１９９３）、バイロロジイ  １９２、６２〜７２頁（Meulenberg, J. J. M., Hulst, M. M., de Veijer, E. J., Moone, P. L. J. M., den Besten, A., de Kluyver, E. P., Wensvoort, G., and Moormann, R. J. M.（1993）. Lelystad virus, the causative agent of porcine epidemic abortion and respiratory syndrome（PEARS）, is related to LDV and EAV. Virology 192, 62-72.）
パットン等、（１９９１）、ベット  レック  １２８、６１７頁（Paton, D. J., Brown, I. H., Edwards., S. and Wensvoort, G.（1991）. Blue ear disease of pigs. Vet Rec. 128, 617.）
プラグマン等、（１９９２）、アドバンテージ  オブ  バイロロジカルリサーチ  ４１、９９〜１９２頁（Plagemann, P. G. W. and Moennig. V.（1992）. Lactate dehydrogenase-elevating virus, equine arteritis virus and simian hemorrhagic fever virus : a new group of positive-strand RNA viruses. Adv. Vir. Res. 41, 99-192.）
ポール等、（１９９１）、ベット  キュー  １３、１３７〜１４３頁（Pol, J. M. A., Van Dijk, J. E., Wensvoort, G., and Terpstra, C.（1991）. Pathological, ultrastructural, and immunohistochemical changes caused by Lelystad virus in experimentally induced infections of mystery swine disease（synonym : porcine epidemic abortion and respiratory syndrome（PEARS）). Vet. Q. 13, 137-143.）
スパン等、（１９８８）、ジャーナル  オブ  ジェネラル  バイロロジイ  ６９、２９３９〜２９５２頁（Spaan, W. J. M., Cavanagh, D. and Horzinek, M. C.（1988）. Coronaviruses : structure and genome erxpression. J. Gen. Virol. 69, 2939-2952.）
ウェンスバート等、（１９９１）、ベット  キュー  １３、１２１〜１３０頁（Wensvoort, G., Terpstra, C., Pol, J. M. A., Ter Laak, E. A., Bloemraad, M., De Kluyver, E. P., Kragten, C., Van Buiten, L., Den Besten, A., Wagenaar, F., Broekhuijsen, J. M., Moone, P. L. J. M., Zetstra, T., De Boer, E. A., Tibben, H. J., De Jong, M. F., Van't Veld, P., Groenland, G. J. R., Van Gennep, J. A., Voets, M. T., Verheijeden, J. H. M., and Braamskamp, J.（1991）. Mystery swine disease in the Netherlands : the isolation of Lelystad virus. Vet. Q. 13, 121-130.）
ウェンスバート等、（１９９２ａ）、ベット  マイクロ  ３３、１８５〜１９３頁（Wensvoort, G., de Kluyver, E. P., Pol, J. M. A., Wagenaar, F., Moormann, R. J. M., Hulst. M. M. Bloemraad, R., den Besten, A., Zetstra, T. and Terpstra, C.（1992a）. Lelystad virus, the cause of porcine epidemic abortion and respiratory syndrome: a review of mystery swine disease research at Lelystad. Vet. Micro. 33, 185-193.）
ウェンスバート等、（１９９２ｂ）、ジャーナル  オブ  ベット  ダイアグノシス  インベスティゲイション  ４、１３４〜１３８頁（Wensvoort, G., de kluyver, E. P., Lujtze, E. A., den Besten, A., Harris, L., Collins, J. E., Christianson, W. T. and Chladek, D.（1992b）. Antigenic comparison of Lelystad virus and swine infertility and respiratory syndrome（SIRS）virus. J. Vet. Diagn. Invest. 4, 134-138.）
配列表
（１）一般的な情報
（ｉ）出願人：マートウ，ミッシェル  ピー．
（ｉｉ）発明の名称：ＶＲ−２３３２ウィルスヌクレオチド配列および使用方法
（ｉｉｉ）配列の数：２６
（ｉｖ）連絡先：
（Ａ）受信者：ジョン  エム．コリンズ
（Ｂ）通り：１１０１  ウォールナッツ，スウィート  １４００
（Ｃ）市：カンザスシティ
（Ｄ）州：ミズーリ
（Ｅ）国：アメリカ合衆国
（Ｆ）郵便番号：６４１０６
（ｖ）コンピューターで読みとり可能な形式：
（Ａ）媒体の型：フロッピーデスク
（Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ  ＰＣ  互換性
（Ｃ）操作形式：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ
（Ｄ）ソフトウェアー：パテントイン配布＃１．０、バージョン＃１．２５
（ｖｉ）現在の出願日
（Ａ）出願番号：
（Ｂ）出願日：
（Ｃ）分類：
（ｖｉｉｉ）弁理士／代理人
（Ａ）コリンズ，ジョン  エム．
（Ｂ）電話：（８１６）４７４−９０５０
（Ｃ）テレファック：（８１６）４７４−９０５７
（２）配列番号１の情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３３５８塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：不明
（ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：Ｎｏ
（ｉｖ）アンチセンス：Ｎｏ
（ｖ）起源：
（Ａ）生物名：アルテリビリダ（Ａｌｔｅｒｉｖｉｒｉｄａｅ）（未分類）
（Ｂ）株名：ＶＲ−２３３２
（ｉｘ）配列の特徴
（Ａ）特徴を表す記号：ｍｉｓｃ  ｆｅａｔｕｒｅ
（Ｂ）存在位置：１．．７６８
（Ｃ）特徴を決定した方法：Ｅ
（Ｄ）他の情報：／証拠＝実験／標準名＝ＶＲ−２３３２  ＯＲＦ２
（ｉｘ）配列の特徴
（Ａ）特徴を表す記号：ｍｉｓｃ  ｆｅａｔｕｒｅ
（Ｂ）存在位置：６２４．．１３８５
（Ｄ）他の情報：／標準名＝ＶＲ−２３３２  ＯＲＦ３
（ｉｘ）配列の特徴
（Ａ）特徴を表す記号：ｍｉｓｃ  ｆｅａｔｕｒｅ
（Ｂ）存在位置：１１６９．．１７０１
（Ｄ）他の情報：／標準名＝ＶＲ−２３３２  ＯＲＦ４
（ｉｘ）配列の特徴
（Ａ）特徴を表す記号：ｍｉｓｃ  ｆｅａｔｕｒｅ
（Ｂ）存在位置：１７１６．．２３１５
（Ｄ）他の情報：／標準名＝ＶＲ−２３３２  ＯＲＦ５
（ｉｘ）配列の特徴
（Ａ）特徴を表す記号：ｍｉｓｃ  ｆｅａｔｕｒｅ
（Ｂ）存在位置：２３０３．．２８２４
（Ｄ）他の情報：／標準名＝ＶＲ−２３３２  ＯＲＦ６
（ｉｘ）配列の特徴
（Ａ）特徴を表す記号：ｍｉｓｃ  ｆｅａｔｕｒｅ
（Ｂ）存在位置：２８１７．．３１８５
（Ｄ）他の情報：／標準名＝ＶＲ−２３３２  ＯＲＦ７
（ｘｉ）配列の記載：配列番号１
0003748887.tif 000009
0003748887.tif 000010
（２）配列番号２の情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：７６８塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ｉｘ）配列の特徴
（Ａ）特徴を表す記号：ＣＤＳ
（Ｂ）存在位置：１．．７６８
（Ｃ）特徴を決定した方法：Ｅ
（Ｄ）他の情報：／証拠＝実験／標準名＝ＶＲ−２３３２  ＯＲＦ２
（ｘｉ）配列の記載：配列番号２
0003748887.tif 000011
0003748887.tif 000012
（２）配列番号３の情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２５６アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：蛋白質
（ｘｉ）配列の記載：配列番号３
0003748887.tif 000013
（２）配列番号４の情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：７６２塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ｉｘ）配列の特徴
（Ａ）特徴を表す記号：ＣＤＳ
（Ｂ）存在位置：１．．７６２
（Ｃ）特徴を決定した方法：Ｅ
（Ｄ）他の情報：／証拠＝実験／標準名＝ＶＲ−２３３２  ＯＲＦ３
（ｘｉ）配列の記載：配列番号４
0003748887.tif 000014
0003748887.tif 000015
（２）配列番号５の情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２５４アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：蛋白質
（ｘｉ）配列の記載：配列番号５
0003748887.tif 000016
（２）配列番号６の情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：５３４塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ｉｘ）配列の特徴
（Ａ）特徴を表す記号：ＣＤＳ
（Ｂ）存在位置：１．．５３４
（Ｃ）特徴を決定した方法：Ｅ
（Ｄ）他の情報：／証拠＝実験／標準名＝ＶＲ−２３３２  ＯＲＦ４
（ｘｉ）配列の記載：配列番号６
0003748887.tif 000017
（２）配列番号７の情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１７８アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：蛋白質
（ｘｉ）配列の記載：配列番号７
0003748887.tif 000018
（２）配列番号８の情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：６００塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ｉｘ）配列の特徴
（Ａ）特徴を表す記号：ＣＤＳ
（Ｂ）存在位置：１．．６００
（Ｃ）特徴を決定した方法：Ｅ
（Ｄ）他の情報：／証拠＝実験／標準名＝ＶＲ−２３３２  ＯＲＦ５
（ｘｉ）配列の記載：配列番号８
0003748887.tif 000019
（２）配列番号９の情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２００アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：蛋白質
（ｘｉ）配列の記載：配列番号９
0003748887.tif 000020
（２）配列番号１０の情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：５２２塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ｉｘ）配列の特徴
（Ａ）特徴を表す記号：ＣＤＳ
（Ｂ）存在位置：１．．５２２
（Ｃ）特徴を決定した方法：Ｅ
（Ｄ）他の情報：／証拠＝実験／標準名＝ＶＲ−２３３２  ＯＲＦ６
（ｘｉ）配列の記載：配列番号１０
0003748887.tif 000021
（２）配列番号１１の情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１７４アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：蛋白質
（ｘｉ）配列の記載：配列番号１１
0003748887.tif 000022
（２）配列番号１２の情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３６９塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ｉｘ）配列の特徴
（Ａ）特徴を表す記号：ＣＤＳ
（Ｂ）存在位置：１．．３６９
（Ｃ）特徴を決定した方法：Ｅ
（Ｄ）他の情報：／証拠＝実験／標準名＝ＶＲ−２３３２  ＯＲＦ７
（ｘｉ）配列の記載：配列番号１２
0003748887.tif 000023
（２）配列番号１３の情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１２３アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：蛋白質
（ｘｉ）配列の記載：配列番号１３
0003748887.tif 000024
（２）配列番号１４の情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１５１０１塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：不明
（ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：Ｎｏ
（ｉｖ）アンチセンス：Ｎｏ
（ｖ）起源：
（Ａ）生物名：アルテリビリダ（Ａｌｔｅｒｉｖｉｒｉｄａｅ）
（Ｂ）株名：ＶＲ−２３３２
（ｉｘ）配列の特徴
（Ａ）特徴を表す記号：ｍｉｓｃ  ｆｅａｔｕｒｅ
（Ｂ）存在位置：７３８４．．１１７７５
（Ｃ）特徴を決定した方法：Ｅ
（Ｄ）他の情報：／証拠＝実験／ラベル＝ＯＲＦ１ｂ／引例＝（［１］）
（ｉｘ）配列の特徴
（Ａ）特徴を表す記号：ｍｉｓｃ  ｆｅａｔｕｒｅ
（Ｂ）存在位置：１１７８６．．１２５３５
（Ｄ）他の情報：／標準名＝ＬＶ  ＯＲＦ２／引例＝（［１］）
（ｉｘ）配列の特徴
（Ａ）特徴を表す記号：ｍｉｓｃ  ｆｅａｔｕｒｅ
（Ｂ）存在位置：２１２．．７４０２
（Ｄ）他の情報：／標準名＝ＬＶ  ＯＲＦ１ａ／引例＝（［１］）
（ｉｘ）配列の特徴
（Ａ）特徴を表す記号：ｍｉｓｃ  ｆｅａｔｕｒｅ
（Ｂ）存在位置：１２３９４．．１３１９１
（Ｄ）他の情報：／標準名＝ＬＶ  ＯＲＦ３／引例＝（［１］）
（ｉｘ）配列の特徴
（Ａ）特徴を表す記号：ｍｉｓｃ  ｆｅａｔｕｒｅ
（Ｂ）存在位置：１２９３６．．１３４８７
（Ｄ）他の情報：／標準名＝ＬＶ  ＯＲＦ４／引例＝（［１］）
（ｉｘ）配列の特徴
（Ａ）特徴を表す記号：ｍｉｓｃ  ｆｅａｔｕｒｅ
（Ｂ）存在位置：１３４８４．．１４０８９
（Ｄ）他の情報：／標準名＝ＬＶ  ＯＲＦ５／引例＝（［１］）
（ｉｘ）配列の特徴
（Ａ）特徴を表す記号：ｍｉｓｃ  ｆｅａｔｕｒｅ
（Ｂ）存在位置：１４０７７．．１４５９８
（Ｄ）他の情報：／標準名＝ＬＶ  ＯＲＦ６／引例＝（［１］）
（ｉｘ）配列の特徴
（Ａ）特徴を表す記号：ｍｉｓｃ  ｆｅａｔｕｒｅ
（Ｂ）存在位置：１４５８８．．１４９７４
（Ｄ）他の情報：／標準名＝ＬＶ  ＯＲＦ７／引例＝（［１］）
（ｘ）刊行物情報
（Ａ）著者：ニューレンバーク，ジェー．ジェー．エム．
ホルスト，エム．エム．
デ  ベイジャー、イー．ジェー．
ムーネン，ピー．エル．
デン  ベステン，エー．
デ  クルイバー，イー．ピー．
ウェンスバート，ジー．
ムアマン，アール．ジェー．
（Ｂ）題：レリスタッド  ウィルス、豚流行性流産呼吸症候群（ＰＥＡＲＳ）の原因因子はＬＤＶとＥＡＶに関係する。
（Ｃ）雑誌：バイロロジイ
（Ｄ）巻：１９２
（Ｆ）ページ：６２−７２
（Ｇ）日付：１９９３
（Ｋ）配列番号１４の意味のある残基：１〜１５１０１
（ｘｉ）配列の記載：配列番号１４
0003748887.tif 000025
0003748887.tif 000026
0003748887.tif 000027
0003748887.tif 000028
0003748887.tif 000029
0003748887.tif 000030
0003748887.tif 000031
0003748887.tif 000032
0003748887.tif 000033
0003748887.tif 000034
（２）配列番号１５の情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：７４７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ｉｘ）配列の特徴
（Ａ）特徴を表す記号：ＣＤＳ
（Ｂ）存在位置：１．．７４７
（Ｄ）他の情報：／標準名＝ＬＶ  ＯＲＦ２
（ｘｉ）配列の記載：配列番号１５
0003748887.tif 000035
0003748887.tif 000036
（２）配列番号１６の情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２４９アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：蛋白質
（ｘｉ）配列の記載：配列番号１６
0003748887.tif 000037
（２）配列番号１７の情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：７９５塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ｉｘ）配列の特徴
（Ａ）特徴を表す記号：ＣＤＳ
（Ｂ）存在位置：１．．７９５
（Ｄ）他の情報：／標準名＝ＬＶ  ＯＲＦ３
（ｘｉ）配列の記載：配列番号１７
0003748887.tif 000038
0003748887.tif 000039
（２）配列番号１８の情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２６５アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：蛋白質
（ｘｉ）配列の記載：配列番号１８
0003748887.tif 000040
（２）配列番号１９の情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：５４９塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ｉｘ）配列の特徴
（Ａ）特徴を表す記号：ＣＤＳ
（Ｂ）存在位置：１．．５４９
（Ｄ）他の情報：／標準名＝ＬＶ  ＯＲＦ４
（ｘｉ）配列の記載：配列番号１９
0003748887.tif 000041
（２）配列番号２０の情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１８３アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：蛋白質
（ｘｉ）配列の記載：配列番号２０
0003748887.tif 000042
（２）配列番号２１の情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：６０３塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ｉｘ）配列の特徴
（Ａ）特徴を表す記号：ＣＤＳ
（Ｂ）存在位置：１．．６０３
（Ｄ）他の情報：／標準名＝ＬＶ  ＯＲＦ５
（ｘｉ）配列の記載：配列番号２１
0003748887.tif 000043
0003748887.tif 000044
（２）配列番号２２の情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２０１アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：蛋白質
（ｘｉ）配列の記載：配列番号２２
0003748887.tif 000045
（２）配列番号２３の情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：５１９塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：不明
（ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ｉｘ）配列の特徴
（Ａ）特徴を表す記号：ＣＤＳ
（Ｂ）存在位置：１．．５１９
（Ｄ）他の情報：／標準名＝ＬＶ  ＯＲＦ６
（ｘｉ）配列の記載：配列番号２３
0003748887.tif 000046
（２）配列番号２４の情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１７３アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：蛋白質
（ｘｉ）配列の記載：配列番号２４
0003748887.tif 000047
（２）配列番号２５の情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３８４塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ｉｘ）配列の特徴
（Ａ）特徴を表す記号：ＣＤＳ
（Ｂ）存在位置：１．．３８４
（Ｄ）他の情報：／標準名＝ＬＶ  ＯＲＦ７
（ｘｉ）配列の記載：配列番号２５
0003748887.tif 000048
（２）配列番号２６の情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１２８アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：蛋白質
（ｘｉ）配列の記載：配列番号２６
0003748887.tif 000049
【図１】
0003748887.tif 000050
【図２Ｄ】
0003748887.tif 000051
【図２Ａ】
0003748887.tif 000052
【図２Ｂ】
0003748887.tif 000053
【図２Ｃ】
0003748887.tif 000054
【図３Ａ】
0003748887.tif 000055
【図３Ｂ】
0003748887.tif 000056
【図３Ｃ】
0003748887.tif 000057
【図５Ａ】
0003748887.tif 000058
【図５Ｂ】
0003748887.tif 000059
【図５Ｃ】
0003748887.tif 000060
【図６Ａ】
0003748887.tif 000061
【図６Ｂ】
0003748887.tif 000062
【図６Ｃ】
0003748887.tif 000063
【図７Ａ】
0003748887.tif 000064
【図７Ｂ】
0003748887.tif 000065
【図７Ｃ】
0003748887.tif 000066
【図８Ａ】
0003748887.tif 000067
【図８Ｂ】
0003748887.tif 000068
【図８Ｃ】
0003748887.tif 000069
【図９】
0003748887.tif 000070