(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
酸抽出されたコラーゲンを含む第１層と、小腸の粘膜下層由来の層からなる第２層とを含む生体再編成可能な補綴物であって、
哺乳類のホストに移植したときに調節された生分解を受け、ついで生細胞によって十分に置き換えられるか、または新組織形成がなされ、移植された補綴物がホストの生細胞によって生体再編成されることを特徴する補綴物。
【請求項２】
前記コラーゲンがフィブリル状コラーゲンであることを特徴とする請求項１に記載の補綴物。
【請求項３】
前記補綴物が管状であることを特徴とする請求項１または２に記載の補綴物。
【請求項４】
動脈または静脈に用いることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の補綴物。
【請求項５】
前記管状補綴物が、６ｍｍ未満の直径を有することを特徴とする請求項３または４に記載の補綴物。
【請求項６】
前記管状補綴物が、６ｍｍ〜１２ｍｍの直径を有することを特徴とする請求項３または４に記載の補綴物。
【請求項７】
前記管状補綴物が、１２ｍｍを越える直径を有することを特徴とする請求項３または４に記載の補綴物。
【請求項８】
食道、小腸、大腸、尿管またはファロピオ管に用いることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の補綴物。
【請求項９】
前記第１層が、平滑な流れ表面を有することを特徴とする請求項１〜８のいずれか１項に記載の補綴物。
【請求項１０】
前記平滑な流れ表面が、血栓症抵抗性であることを特徴とする請求項９に記載の補綴物。
【請求項１１】
前記第２層が架橋されることを特徴とする請求項１〜１０のいずれか１項に記載の補綴物。
【請求項１２】
前記第２層が、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）で架橋されることを特徴とする請求項１１に記載の補綴物。
【請求項１３】
前記第２層が、５０ミクロン〜１５０ミクロンの厚さを有することを特徴とする請求項１〜１２のいずれか１項に記載の補綴物。
【請求項１４】
前記小腸の粘膜下層が、機械的に洗浄され、筋層および粘膜を除去することを特徴とする請求項１〜１３のいずれか１項に記載の補綴物。
【請求項１５】
前記機械的洗浄された粘膜下層が、化学的に洗浄されることを特徴とする請求項１４に記載の補綴物。
【請求項１６】
小腸の粘膜下層が滅菌されることを特徴とする請求項１〜１５のいずれか１項に記載の補綴物。
【請求項１７】
前記補綴物が第３層をさらに含むことを特徴とする請求項１〜１６のいずれか１項に記載の補綴物。
【請求項１８】
前記第１層が補綴物の内側にあることを特徴とする請求項１〜１７のいずれか１項に記載の補綴物。
【請求項１９】
前記第２層が補綴物の内側にあることを特徴とする請求項１〜１７のいずれか１項に記載の補綴物。
【請求項２０】
前記補綴物が薬剤で処理されることを特徴とする請求項１〜１９のいずれか１項に記載の補綴物。
【請求項２１】
前記第１層が薬剤で処理されることを特徴とする請求項２０に記載の補綴物。
【請求項２２】
前記第２層が薬剤で処理されることを特徴とする請求項２０または２１のいずれか１項に記載の補綴物。
【請求項２３】
前記薬剤がヘパリンであることを特徴とする請求項２０〜２２のいずれか１項に記載の補綴物。
【請求項２４】
前記薬剤が成長因子であることを特徴とする請求項２０〜２２のいずれか１項に記載の補綴物。
【発明の詳細な説明】
発明の属する技術分野
本発明は移植可能な生物学的補綴物の分野に属する。本発明は弾力性のある生体適合性の２層または３層の組織補綴物であって、平坦なシートまたは種々の内腔（ｌｕｍｉｎａｌ）直径および厚さを持つ管に設計することができる。少なくとも１つの層はコラーゲンまたはコラーゲン様物質である。本発明の補綴物はホストの細胞により徐々に分解され生体再編成され、ホスト細胞が移植された補綴物に置き換わりその形をとる。
発明の背景
米国では毎年約３００，０００人の冠状動脈バイパス手術が行われる。小径動脈の取り替えの典型的な措置としては、これまで外科医が患者自身の血管、通常は脚の伏在静脈、を使用していた。しかしながら、多くの場合、患者自身の血管を使用することは実際的ではない。その理由は、静脈は損傷を受けたり、病気を持っていたり、あるいは手に入らなかったりするからである。これらの場合、人工材料が使用されるが、長期間にわたると結果は不満足である。哺乳類の組織、特に血管を置き換えたり修理するのに成功裏に使用できる補綴物を開発することは依然として研究者のゴールで有り続ける。
発明の要約
本発明は、補綴物に関し、この補綴物は哺乳類のホストに移植したときに調節された生体分解を受け、ついで生細胞によって十分に置き換えられるか、または新組織形成がなされ、初めに移植された補綴物がホストの酵素によって消化されてしまう前にホストの細胞によって生体再編成される補綴物に関する。本発明の補綴物は少なくとも２つの層を備える。すなわち、（ａ）少なくとも１つの層はコラーゲンまたはコラーゲン様材料からなり、そして（ｂ）少なくとも１つの層は構造的安定性を与え、曲げやすく、半透過性であり、縫合することができる層である。本発明の好適な実施態様においては、２層構造の補綴物は平滑な、抗血栓症流の表面を与える内側（内腔）層と、構造的安定性を与え、曲げやすく、半透過性であり、縫合可能である外側構造層とを有する。本発明の他の好適な実施態様においては、補綴物は３つの層、すなわち、（ａ）平滑な、抗血栓症流の表面として作用する内側（内腔）層；構造的安定性を与え、曲げやすく、半透過性であり、縫合可能である中間層；および、外側（外腔（ａｂｌｕｍｉｎａｌ））層を有する。２層または３層補綴物の外側層はグラフトに強度を与え、患者のホスト細胞がグラフトに付着しその中に内生することを許容し、それにより生体再編成を促進する。
本発明は、また、（ａ）曲げやすく、半透過性であり、縫合可能な環状の構造層を形成し；（ｂ）工程（ａ）の前記外側層の内腔表面に酸抽出されたフィブリル状コラーゲンを堆積することにより平滑な流れ表面として作用する内側層を形成し；かつ、（ｃ）内腔を創成することにより、生体再編成可能な２層または３層の環状の血管補綴物を製造する方法を指向している。内側層は、また、ヘパリンその他の適当な剤のような抗血栓症効果を与えるための医薬で処理してもよい。ついで、この補綴物を哺乳類のホストに移植するが、そこでは補綴物は調節された生分解を受け、ついで生細胞によって十分に置き換えられるか、または新組織形成がなされ、初めに移植された補綴物がホストの細胞によって生体再編成される。
【図面の簡単な説明】
図１Ａ、１Ｂおよび１Ｃは、本発明の好適な補綴物の概略断面図である。
図２は、移植前の本発明の３層補綴物のマッソン氏トリクローム染色（１０倍）図である。
図３は、移植前の本発明の３層補綴物のマッソン氏トリクローム染色（２５倍）図である。
図４は、犬の大腿に挿入する補綴物として移植された本発明の３層補綴物（２５６日）の基部吻合のマッソン氏トリクローム染色（１０倍）図である。
図５は、犬の大腿に挿入する補綴物として移植されたｅ−ＰＴＦＥグラフト（２５６日）の基部吻合のマッソン氏トリクローム染色（１０倍）図である。
図６は、犬の大腿に挿入する補綴物として移植された本発明の３層補綴物（２５６日）の基部吻合のマッソン氏トリクローム染色（２５倍）図である。
図７は、犬の大腿に挿入する補綴物として移植されたｅ−ＰＴＦＥグラフト（２５６日）の基部吻合のマッソン氏トリクローム染色（２５倍）図である。
図８は、犬の大腿に挿入する補綴物として移植された本発明の３層補綴物（２５６日）の基部吻合のヴェルヘッフ氏エラスチック染色（１０倍）図である。
図９は、犬の大腿に挿入する補綴物として移植されたｅ−ＰＴＦＥグラフト（２５６日）の基部吻合のヴェルヘッフ氏エラスチック染色（１０倍）図である。
発明の詳細な説明
本発明は補綴物に関し、この補綴物は哺乳類のホストに移植されたときに、体の一部分または組織構造の機能する代替物として働き、調節された生分解を受けるとともにそれと同時に起きるホスト細胞による生体再編成を受ける。本発明の補綴物は、従って、その種々の態様において、二重の性質を有する。すなわち、第一に、体の一部分の代替物として機能すること、第二に、体の一部分の代替物として機能しながら、ホスト細胞が内生するための生体再編成テンプレートとして機能すること、である。
本発明の補綴物が体の一部分の代替物として機能するときは、血管グラフトとして使用するのが好ましい。血管グラフト補綴物は管状でも平坦状でもよい。管状グラフトは動脈または静脈をバイパスするかあるいは置き換える導管として使用される。平坦なシートに形成されたときは、本発明の補綴物は血管または心臓内の貼剤（ｐａｔｃｈ）として使用することができる。さらに、この補綴物は食道、小腸、大腸、尿管、ファロピオ管を含む、病気にかかったまたは損傷された器官を置き換えるために移植することができる。これらの器官はすべて外側表面と内腔表面とを有する基本的な管状形態をしている。さらに、この補綴物は神経の再成長および再生のための導管として使用することができる。
本発明の補綴物は弾力性が向上されており、すなわち、「弾けるように開く」（ｓｐｒｉｎｇ−ｏｐｅｎ）または「弾けるように戻る」（ｓｐｒｉｎｇ−ｂａｃｋ）性質がある。弾けるように戻る性質は血管または貼剤のような用途には重要である。
本発明の補綴物の第二の機能は、生体再編成のテンプレートとしての機能である。ここで、「生体再編成」は、ホスト細胞の内生の速度が、ホスト酵素による生分解のため移植された補綴物の生体力学的な強度の消失よりも速い速度で起きることによる構造コラーゲンの生成、血管新生および上皮形成を意味する。補綴物は最初に移植された補綴物の明白な特徴を保持するが、生体によって、すべてまたは実質的にすべて「自己」に再編成され、そしてそのようなものとして機能する組織構造として機能する。
本発明の補綴物は少なくとも２つの層、すなわち、（ａ）平坦な、均一な直径の形状を有し、かつ血栓を生じない、コラーゲンまたはコラーゲン様材料から成る少なくとも１層と、（２）構造的安定性と生体力学的性質を与える少なくとも１層とからなる。機械的統合性は補綴物が生体再編成中に拡張せず、脈瘤を生じることがなく、加えて曲げやすく、縫合可能であることを意味する。「曲げやすい」という用語は操作性がよいことを意味する。「縫合可能」という用語は、当該層の機械的性質が、吻合術として知られる、補綴物を自然の脈管の切片に縫合する際に、針と縫合材料が補綴物を通過することができる縫合保持を含むことを意味する。縫合の間に、そのような脈管（血管）グラフトは縫合により加えられる張力の結果裂けてしまってはいけないし、縫合を結び目を作るときに裂けてもいけない。脈管グラフトの縫合性、すなわち、グラフトが縫合されている際に裂けることに抵抗する能力は補綴物材料の本来の機械的強度、グラフトの厚さ、縫合に加えられる張力、および結び目が引っ張られ閉じられる速度に関係づけられる。
本発明の補綴物は、特にホストである患者の小径の血管のバイパスまたは代替物として使用することを指向している。ここに用いられているように、また、当業者には明らかなように、、小径管は６ｍｍ未満、典型的には３〜４ｍｍ程度である。中径管は６〜１２ｍｍである。大径管は１２ｍｍより大きい。例えば、成人の種々の脈管の径は次の通りである。すなわち、大動脈管の直径は約１２〜２２ｍｍ；腸骨静脈の直径は８〜１２ｍｍ；浅在性大腿静脈管の直径は６ｍｍである。膝の上部では大腿静脈管の直径は６ｍｍである。膝を横切る大腿静脈管の直径は４〜６ｍｍである。
本発明の補綴物の２層の組合せは、管状脈管グラフトとして使用されるときは、内側（内腔）のコラーゲン様層上の平滑な、血栓症抵抗性流れ表面と、他の性質に加えて内腔のクリープを防止し、公称直径を維持するのを助ける構造層とを組合せることにより有利に働く。拡張する（または脈瘤を生じる）ことによる不具合が生じるのは、脈圧および力がグラフトの直径の増加に抵抗する能力を超えるときである。拡張または脈瘤形成は公称直径を超える直径の増加である。これは補綴物にもアテローム性動脈硬化症にも起きる。ここで用いているように、「非拡張性」（ｎｏｎ−ｄｉｌａｔｉｎｇ）という用語は補綴物の生体力学的性質により、移植後に補綴物の直径が公称限界を超えて伸張したり、拡大したり、膨張しないように耐性が与えられていることを意味する。以下に説明するように、本発明の移植された補綴物の全拡張度は受容し得る限界内にある。本発明の補綴物は、構造コラーゲンをホスト細胞が移植された材料の生分解および再編成による機械的強度損失の速度よりも速い置き換え速度による移植後の細胞の生体再編成の機能として拡張に対する抵抗性を獲得する。
本発明の補綴物により種々の管状形状が具現化されている（図１Ａ、１Ｂおよび１Ｃ）。図１Ａは、外側のコラーゲン様層と内側の構造層とを持つ２層補綴物を示す。図１Ｂは、内側および外側コラーゲン様層と中間の構造層の３層を持つ補綴物を示す。図１Ｃは、内側コラーゲン様層と外側構造層とを持つ２層補綴物を示す。
これら種々の具体例はそれぞれ特定のグラフト代替物に対する用途を持つ。図１Ａに示す２層補綴物は、外側コラーゲン様層と内側構造層とを持ち、脈管または、食道、小腸、大腸、尿管またはファロピオ管のような、平坦さのより少ない内側または内腔表面を許容し得る中空の器官用の代替物として有用である。外側コラーゲン様層はグラフトに強度を追加し、ホストの細胞がグラフトに付着するのを許容し、グラフト内に内生することができるようにしている。これに対して、図１Ｂおよび図１Ｃに示す補綴物は、内側の平坦なコラーゲン様層を持ち、血管の代替物として有用である。内側のコラーゲン様層が平坦な流れの表面をして機能する。
構造層は生体再編成可能なコラーゲンまたはコラーゲン様材料；またはポリ乳酸またはポリグリコール酸あるいはそれらの混合物のような生分解性ポリマー；またはポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリエチレン、あるいはそれらの混合物のような、生安定性ポリマーから作製される。好適な実施態様においては、哺乳類の体からのコラーゲン様組織部分からのコラーゲン様材料がこの層を作製するのに使用される。そのような組織には、限定はされないが、小腸、大腿筋膜、または硬膜が含まれる。構造層として最も好適な材料は小腸の粘膜下層であり、ここでは「小腸コラーゲン層」という。ここで用いられているように、構造層は典型的には厚さが約５０ミクロン〜約１５０ミクロン、好ましくは約７５ミクロン〜約１２５ミクロンである。これらの寸法は機械的に洗浄した後であって、以下に説明する熱溶接および架橋による細管形成を行う前の小腸コラーゲン層についてであり、機械的洗浄および熱溶接はともに、小腸コラーゲン層の「見掛け」厚さを顕著に減少させる。
組織由来のコラーゲン様材料を用いて構造層を形成するときは、架橋して構造に強度を与えてもよい。また、コラーゲン様材料を架橋すると材料に若干の剛性を与えて操作性を改善する。さらに、コラーゲン様材料をマンドレル上で架橋すると材料を架橋しなかったときよりも直径がより均一な管を生じる。これにより、血管の形状に不連続な部分があると高まる血栓症の危険を最低限にできる。架橋剤はホスト細胞により生体再編成される能力を持つ生体適合性材料を産生する様に選択する必要がある。種々のタイプの架橋剤が知られており、本発明で使用することができる。これは好適な実施態様とともに以下に説明する。好適な架橋剤は１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）である。本発明の補綴物には使用できない若干の架橋剤があるが、それはホスト細胞による再編成を受けない架橋された材料を生成するためである。例えば、グルタルアルデヒドは本発明で架橋するのに有用ではない。というのは、残留するグルタルアルデヒドモノマーおよび低分子ポリマーは細胞毒性を有するからである。従って、グルタルアルデヒドは細胞の内生と生体再編成を阻止する。
構造層は、少なくとも、小腸コラーゲン層のような生体再編成可能なコラーゲンまたはコラーゲン様材料で作製したときは、「半透過性」、すなわち、再編成のためまたはコラーゲン様層の堆積のためのホスト細胞の内生を、以下に説明するように、許容する。ＩＣＬを架橋すると、材料は水を用いた多孔度テストにより測定すると比較的に透過性が少なくなる。
補綴物のもう１つの層はコラーゲン様層であり、その機能は、最終用途の如何に拘わらず、平坦な流れ表面として作用することである。補綴物の内側の、内腔層として使用するときは、その機能は平滑な接触平面、特に血液接触流表面を提供することである。
この平滑なコラーゲン様層は酸抽出されたフィブリル状または非フィブリル状コラーゲンから作製してもよい。このコラーゲンは主としてタイプＩコラーゲンであるが、タイプ３または４コラーゲン、あるいはそれらの双方を含んでいてもよい。この使用されるコラーゲンは何れの哺乳類の入手源、典型的には、牛、豚、羊の皮革または腱、に由来するものであってもよい。コラーゲンは好ましくは酸抽出処理をしてフィブリルを分散し、または高品質ゲルとしたものである。コラーゲンはコラーゲン源から、酢酸、クエン酸または蟻酸のような弱酸を用いて酸抽出してもよい。溶液に抽出すると、コラーゲンはＮａＣｌを用いて塩析し、遠心や濾過のような標準的技法を用いて回収することができる。酸抽出されたコラーゲンの詳細は、例えば、米国特許第５，１０６，９４９号公報明細書に記載されており、ここに当該米国特許公報の番号を引用することによりその内容が本明細書の一部を構成するものとする。
本発明で使用するためのコラーゲン分散物またはゲルは一般に約１〜１０ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは約２〜６ｍｇ／ｍｌ、および最も好ましくは約２〜４ｍｇ／ｍｌの濃度および約２〜４のｐＨである。コラーゲンのための好適な溶媒は希酢酸、例えば、約０．０５〜０．１％である。他の慣用のコラーゲン用溶媒もそのような溶媒が相溶性である限り使用してもよい。
さらに、本発明の他の実施態様において、コラーゲン様層は機械的に剪断または切断されたコラーゲン繊維を含んでいてもよい。切断されたコラーゲン繊維はコラーゲン様層の弾かれたように戻る性能を改善する。切断された繊維は酸抽出されたコラーゲンゲルの形成に使用されるコラーゲン溶液に添加してもよい。この繊維を導入した構造の性質は繊維の長さと直径を変えることにより、使用した繊維と部分的に架橋している繊維との割合を変えることにより、変えられる。繊維の長さは５ｃｍから５．０ｃｍであり、典型的にはコラーゲンゲルに５〜６０の濃度で導入することができる。
本発明の他の実施態様においては、内側または外側コラーゲン様層の形成は予め形成されたコラーゲン糸を導入することでもよい。例えば、ミクロン直径のコラーゲン糸をコラーゲン内側層の形成の一部として導入することもできよう。コラーゲン糸の螺旋またはブレードの直径の寸法は２５〜５０ミクロン、好ましくは２５〜４０ミクロンの範囲内である。従って、コラーゲン層の性質は補強用に使用した糸の形状により変えることができる。デザインの機能性はブレードまたは撚糸の形状によって決まる。これらの多くが物性（すなわち、追従性、半径方向の強さ、ねじれ耐性、縫合保持）にも影響する。糸の物性も架橋により変えることができる。
使用される繊維のある部分または全部をポリ乳酸とすることができる。乳酸繊維自体の物性および分解性は分子量を変えることにより、並びに乳酸のＤもしくはＬラセミ体あるいはＤ／Ｌ混合物を使用することにより操作することができる。ポリグリコール酸、カプロラクトンおよびポリジオキシノンのような分解性ポリマーから作製された他の繊維も使用することができる。
小径２層管状補綴物：製造法
本発明の補綴物をさらに説明するために、小径２層管状補綴物の作製方法を以下に説明する。上述の２層補綴物は、酸抽出されたフィブリル状コラーゲンからなる内側（内腔）表面と哺乳類の小腸からの粘膜下層からなる外側（外腔）構造層とを有する。平坦状補綴物はマンドレルの代わりに平坦形状を用いることにより、上述の方法により同様に製造して補綴物を製造することができる。
１．構造層の調製
哺乳類源、典型的には豚、牛、羊からの粘膜下層、すなわち小腸コラーゲン層は対向ロールの間を通して原材料を搾り、筋層（ｔｕｎｉｃａ  ｍｕｓｃｕｌａｒｉｓ）と粘膜（ｔｕｎｉｃａ  ｍｕｃｏｓａ）を除去することにより機械的に洗浄する。小腸の粘膜下層はそれを取りまく組織よりも硬く剛性があり、ロールは粘膜下層からより柔軟な成分を絞り出す。機械的に洗浄された粘膜下層は若干の隠れた、機械的性質のコンシステンシーに影響する視覚的には明らかではない損傷があるかも知れないので、４℃の緩衝溶液中に、トリトンやＳＤＳのような洗剤を用いずに、浸漬し、またはＮａＯＨもしくはトリプシンを用いて浸漬するか、あるいは他の公知の洗浄技法により、粘膜下層を化学的に洗浄してコラーゲン以外の物質を除去する。
洗浄後、小腸コラーゲン層（ＩＣＬ）を滅菌する必要があるが、これは好ましくは、米国特許出願第０８／１７７，６１８号明細書（番号を引用することによりその記載内容が本明細書の一部を構成するものとする）に記載の希過酢酸溶液を用いて行う。コラーゲン用の他の滅菌系が当業界において知られており、それらを使用することができる。
ＩＣＬは種々の代替手段またはそれらの組合せにより細管化してもい。ＩＣＬ材料は正常または外転された位置の管に成形してもよく、外転位置が好ましい。管は機械的に作製することができ、これは適当な縫合材料を用いて交互にノット（結び目）とステッチを使用して縫合することにより行うことができる。ノット・ステッチは有利であるが、これは外科医が移植時に解くことなく管をトリムし成形することができるからである。粘膜下層を縫い合わせる他の方法には接着剤による接合、例えばフィブリン基糊またはポリウレタン、酢酸ビニルまたはポリエポキシのような工業型接着剤の使用を含めてもよい。縫い目を加熱溶接またはレーザー溶接し、次いで冷却してこのようにして形成された管の側面をシールする加熱接合技法も使用してもよい。これらの細管化技法を用いて、側面の端面を突き合わせ終端させまたは重複させてもよい。側面を重複させるときは、管が形成されたら側面をトリムしてもよい。さらに、これらの細管化技法を典型的にはマンドレル上で行い、所望の直径を決定するようにしている。
このようにして形成された構造管をマンドレルまたは他の適当な軸上に保持してさらに加工することができる。生分解速度、従って生体再編成中の補綴物の強度低下速度を調節するためには、補綴物を架橋するのが好ましいが、この架橋は適当な架橋剤、例えば１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）を使用して行う。補綴物を架橋すると、内腔のクリープの防止、管の直径の均一性保持および破裂強度の増加にも役立つ。小腸コラーゲン層を架橋すると、割れの伝搬に対する抵抗性を改善することにより縫合保持強度も改善する。
２．コラーゲン様層の堆積
牛コラーゲンを米国特許出願第０７／５０５，６７８号明細書の実施例５（当該米国出願番号を引用することによりその記載内容が本明細書の一部を構成するものとする）に記載の粘膜下層の内表面に堆積してもよい。簡単に説明すると、構造小腸コラーゲン層の一端を取付具でシールし、コラーゲン分散物を管に充填する。この工程を、上述の米国特許出願の記載のように、静水圧ヘッドを使用して達成してもよい。コラーゲンの内側層はコラーゲンを管の両端内に同時に流し込むことにより堆積することができる。次いで、この管を等張燐酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ約７に溶解した２０％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の浴内に置く。内部のコラーゲン溶液と外部のＰＥＧ溶液との間の浸透圧勾配が組合わさってコラーゲンの同時的な濃縮および堆積が内側構造層の壁の内腔に沿って起こす。この管をＰＥＧ浴から取り出し、補綴物の内腔の直径に望まれる直径を持つガラス棒をコラーゲン溶液中に挿入する。次いで、この補綴物を乾燥させる。次いで、管をＰＢＳ中で再水和する。この方法によりコラーゲン様層が小腸構造層のわずかな不規則性を補い、均一な厚さの補綴物がられる。この方法は、また、コラーゲンゲルが小腸コラーゲン層に接合するのを容易にする。種々の厚さと密度のコラーゲン様層を、通常のパラメータの変更により決めることができる堆積条件を変えることにより、製造することができる。同じ方法を用いてコラーゲンを粘膜下層の外表面に被着して３層の補綴物を創製することもできる。
３．内側コラーゲン様層の処理
補綴物構成体は小径血管代替物においては血栓症を生じる。このため、高流量（大径）脈管における脈管用途にのみ使用できる。従って、補綴物は、小径血管の補修または代替物として使用できるようにするならば、血栓症を起こさないようにする必要がある。
ヘパリンを種々の周知の技法によって補綴物に被着することができる。説明のために例示すれば、ヘパリンを次の３つの方法で補綴物に被着することができる。第一に、ベンザルコニウムヘパリン（Ｂａ−Ｈｅｐ）溶液に補綴物を浸漬し、ついでこれを乾燥することにより補綴物にベンザルコニウムヘパリンを被着することができる。この方法はコラーゲンを、イオン結合したＢａ−Ｈｅｐで処理するものである。第二に、ＥＤＣを使用してコラーゲンを活性化し、ついでこのコラーゲンにヘパリンを共有結合することができる。第三に、ＥＤＣを使用してコラーゲンを活性化し、ついでこのコラーゲンにプロタミンを共有結合してから、このプロタミンにヘパリンをイオン結合することができる。多くの他のヘパリン塗布、結合および付着方法が周知であり、それらも本発明で使用することができる。
内側層をヘパリンに加えて薬剤で処理してもよい。薬剤は、例えば、血管化および上皮化を促進する、マクロファージ由来の成長因子（ＭＤＧＦ）、血小板由来の成長因子（ＰＤＧＦ）、内皮細胞由来の成長因子（ＥＣＤＧＦ）；外科移植から感染する可能性のあるいずれの感染症とも闘う抗生物質；あるいは、補綴物を神経再生用の導管として使用するときは内側コラーゲン様層内に導入される神経成長因子を含んでいてもよい。外腔（外側）層の処理も内腔（内側層）に対する処理と同様の方法で行ってもよい。
４．細胞の内生の促進
構造層が架橋されたＩＣＬからなる場合は、完成した２層または３層補綴物は、ＫｒＦまたはＸｅＦ波長におけるエキシマレーザを使用してレーザー・ドリルしてミクロンサイズの孔を完成された補綴物に貫通して細胞の内生を助けることができる。孔径は２０〜１００ミクロン、好ましくは約３０〜６０ミクロンであり、間隙は変えられるが、中心間で約５００ミクロンが好ましい。
５．滅菌
次いで、完成されたグラフトを滅菌する。好適な方法は米国特許出願第０８／１７７，６１８号明細書（当該出願番号を引用することによりその記載内容が本明細書の一部を構成するものとする）に記載の過酢酸を使用することである。滅菌は、また、補綴物に１０．０〜２５．０ｋＧｙのγ線処理（60Ｃｏ）を施すことによって行ってもよい。この放射線量は補綴物の生体力学的性質に悪影響を及ぼすことなく全ての微生物を殺す。
補綴物試験標準
出の試験、分析および性能パラメータは長年にわたって血管グラフト補綴物について開発されており、当業者により補綴物の特性を評価するのに使用されてきた。これらの方法はアボットら（Ａｂｂｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｓｔａｎｄａｒｄｓ  ｆｏｒ  ａｒｔｅｒｉａｌ  ｐｒｏｓｔｈｅｓｅｓ，”Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｓｕｒｇｅｒｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  １７，ｐａｇｅｓ  ７４６−７５６（１９９３）および“Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  ｆｏｒ  Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｇｒａｆｔ  Ｐｒｏｓｔｈｅｓｅｓ，”Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（１９８６）に記載されている。
以下の実施例は本発明を実施するのに使用する材料および方法をさらに説明するものである。これらの実施邸は本発明をいかなる仕方においても限定するものではない。
実施例
実施例１
２層および３層管状補綴物
豚の小腸を摘出し、機械的に細片にして粘膜下層が小腸の部分の筋層と粘膜下層の内腔部分とから剥離するようにする。（機械は機械的作用（圧搾）と洗浄（熱水を使用）の組合せを用いて、粘膜下層から粘膜と筋層を機械的に除去するためのストリッパー、クラッシャー機械であった）。これは、無傷の小腸を一連のロールを通して流し，連続層をはぎ取ることによって達成した。小腸層は機械洗浄して粘膜下層だけが残留するようにした。粘膜下層は０．１％過酢酸で１８時間４℃で処理して脱汚染または滅菌した後、洗浄した。
この機械的に洗浄された小腸コラーゲン層（ＩＣＬ）を枠に載せて展開し半径方向および長さ方向の双方にわずかに張力がかかるようにした。粗く走る仮縫いステッチ（６−０  Ｎｏｖａｆｉｌ（登録商標））を適用して小径間を形成し、粘膜下層は外転位置に置いた。伸張したＩＣＬ組織を半分の大きさに切断して重ね、フラップを形成した。６−０  Ｎｏｖａｆｉｌ（登録商標）縫合糸を使用して交互にノット・ステッチを形成してＩＣＬの両層を通して細かい縫い目を形成して最終的な内径が４．５ｍｍとなるようにした。次いで、フラップを取り除いた。小径ＩＣＬ管は、構造層として使用するときは、４．５ｍｍのガラス棒上に置き、１００ｍｍｏｌのＥＤＣ（貫通）で室温で１８時間架橋した。
機械洗浄された小腸コラーゲン層（ＩＣＬ）を完全に水和された条件でマンドレル上に両端が重なるように載置した。このＩＣＬで包まれたマンドレルを６２℃±１０℃で１５分間湿潤雰囲気下で加熱した後、氷入り水溶液内で４℃で５分間冷却した。次いで、この細管化したＩＣＬをＥＤＣで６〜１８時間架橋し、リンスし、マンドレルから取り外した。
ポリカーボネート製逆刺（一端が漏斗状に成形されたルアー（ｌｕｅｒ）ロック取付具）を管の各端部に緊密において管を水平に置いて堆積固定した。１５０ｍｍＨｇ（５フィート用）の静水圧ヘッドを持つ、２．５ｍｇ／ｍｌの酸抽出されたフィブリル状コラーゲンの１５ｍｌの溜（「高密度フィブリル状コラーゲン」（ＤＦＣ）という）（米国特許出願第０７／７７２，５７９号明細書、当該出願番号を引用することによりその記載内容が本明細書の一部を構成するものとする）を逆刺により取り付けた。（圧力はコラーゲン溜の高さによって決まる。）コラーゲンはＩＣＬ管の内腔を充填し、次いで２０％の分子量８０００のポリエチレングリコール（シグマ・ケミカル社）の撹拌浴内に４℃で１６時間置かれた。次いでこの装置を取り外した。内腔の直径を固定するために、直径４ｍｍのガラス棒をコラーゲンを充填したＩＣＬ管内に装入した。この補綴物を４℃で１８時間乾燥した。
酸抽出したコラーゲンの層を直径４．０ｍｍの多孔質セラミック製マンドレル上に、米国特許第０７／５０５，６７８号明細書（当該出願番号を引用することによりその記載内容が本明細書の一部を構成するものとする）の実施例４に記載のように６時間堆積し、４℃で脱水した。
このＩＣＬ管を上述のように、乾燥コラーゲンの上に置き、高密度フィブリル状コラーゲン（ＤＦＣ）の第２層を上述のようにＩＣＬ層の外側（外腔）に１８時間被着した。
ＫｒＦまたはＸｅＦ波長のいずれかでエキシマレーザを用いて、このＩＣＬ／ＤＦＣまたはＤＦＣ／ＩＣＬ／ＤＦＣ層に孔を空けた。孔径は約５０ミクロンであり、間隙は中心間で５００ミクロンであった。
この構造体を４℃の１Ｍ  ＰＢＳ中で６時間再水和した。この補綴物をイソプロパノールに溶解したベンザルコニウムヘパリンを適用して処理した。滅菌は０．１％過酢酸を用い、４℃で１８時間行った。
この補綴物を包装紙、１０．０〜２５．０ｋＧｙのγ線（60Ｃｏ）で滅菌した。（補綴物は乾燥したまま出荷し、そして移植前に食塩水中で再水和することもできる。）
実施例２
コラーゲングラフトの再編成：長期移植組織学
３層補綴物をウサギの腎下動脈を標準的な外科的技法を用いて移植した。プロリン７−０を用いて隣接する動脈に端部−端部吻合を構成した。グラフトは長さが１．５ｃｍ、直径が３ｍｍであった。抗血小板剤を術後に投与しなかった。
ＭｃＤｏｗｅｌｌｓ−Ｔｒｕｍｐ固定剤を加圧還流した後、グラフトを体外移植し、光学顕微鏡および電子顕微鏡検査した。３０、６０、９０、１２０および１８０日移植体からの標本を入手できた。材料をＨ／Ｅ、フォン・ギーソン  エラスチカ（ＶｏｎＧｉｅｓｏｎ  ｅｌａｓｔｉｃａ）、マッソン氏のトリクローム、ｇ−アクチン、ファクターＶＩＩＩ、およびＲａｍ−１１（マクロファージ）染色、並びに偏光顕微鏡を用いて試験した。定性的な外形計測による比較を染色された移植されていない保持サンプルに対して行った。
組織学的評価は、グラフトはホスト細胞により容易に侵入されることを示した。内腔コラーゲンは再吸収および再編成されるともに、ホストの筋繊維母細胞により新しいコラーゲンの産生がなされる。ＩＣＬはホスト細胞により容易に侵入され、ホスト細胞が再繁殖し、再編成される。内皮細胞は補綴物の内腔表面に検出された。
３０日では、多数の単核炎症細胞がコラーゲンの内腔および外腔表面の双方上に見られた。中程度の数のＲａｍ−１１染色陽性マクロファージが観察された。流延コラーゲンの表面に、細胞に媒介されたコラーゲンの再吸収と再編成が起きた。このとき、コラーゲンのバルクの損失は最小限であった。
６０日では、細胞性応答は炎症性というよりもより筋繊維母細胞的であった。著量の新コラーゲンと少量のエラスチンが容易に同定された。約５０％の流延コラーゲンが再編成されていた。内皮細胞は、ＳＥＭによる外観、ＴＥＭ（Ｗｅｉｂｅｌ−Ｐｌａｄｅ体）およびファクターＶＩＩＩ染色陽性により同定されたように、再編成された構成体の表面を覆っていた。
９０日では、筋繊維母細胞を取りまくマトリックス（ｇ−アクチンで同定）がコラーゲンに対して顕著に染色された。細胞自体の細胞質は、以前の時点と比べると、細胞質の量が減少した。
１２０日では、ストロマはよく組織された主として半径方向および長さ方向に配向した筋繊維母細胞とホストにより産生されたコラーゲンを示した。著量のエラスチンを同定することができた。９０％を超える移植されたコラーゲンが再編成された。Ｒａｍ−１１染色マクロファージは同定されなかった。
１８０日では、新生動脈の細胞とマトリックスは全く成熟していた。コラーゲンは高密度であり、明白に半径方向と長さ方向に配向していた。
内腔コラーゲン層または外腔ＩＣＬ層のいずれに対する免疫応答の組織学的証拠は得られなかった。グラフトは拡張も脈瘤形成もしなかった。
実施例３
３層補綴物とｅ−ＰＴＦＥとの比較
２層および３層小径補綴物の双方を移植し、開存性（ｐａｔｅｎｃｙ）と再編成を経時評価した。
図４〜９は、犬の大体動脈に付いての研究において、３層補綴物と同様に構成された対照材料ｅ−ＰＴＦＥとの比較結果を示す。グラフトを犬に大腿挿入補綴物として移植した。グラフトを３０日〜２５６日で体外移植した。
３層コラーゲングラフトを組織学的に評価したところ、３０日におけるグラフト内への細胞内生を示し、９０％を超えるグラフトコラーゲンが９０日までには再編成され、そして１８０日には成熟した「新生動脈」が検出された。ホストの組織は６０日までに吻合を橋かけし、再吸収されなかった縫合により境界されているだけである。新生動脈中の優勢な細胞型はｇ−アクチン染色陽性の平滑筋様細胞であった。再編成されたグラフトの表面は内皮細胞により裏打ちされており、これはＳＥＭ、ＴＥＭ、およびファクターＶＩＩＩ染色により実証された。
これに対して、２５６日までの時点において、吻合部を横断して、あるいはグラフトの本体に沿ってのいずれにおいてもｅ−ＰＴＦＥ動脈内に内生は見られなかった。薄い平滑筋細胞の肥厚応答が隣接動脈から短い距離グラフトの内腔表面に延びていることが示された。グラフトは成熟繊維組織により囲まれ、グラフト内への細胞または組織が延在している証拠はなかった。
図４は、２５６日における３層補綴物の基部吻合のマッソン氏トリクローム染色（１０倍）図であり、ｅ−ＰＴＦＥの図５と比較した。図６は、また、２５６日における３層補綴物の基部吻合のマッソン氏トリクローム染色図（２５倍）であり、ｅ−ＰＴＦＥの図７と比較した。
図８は、犬の大腿に挿入する補綴物として移植された３層補綴物の基部吻合の２５６日におけるヴェルヘッフ氏エラスチック染色（１０倍）図であり、ｅ−ＰＴＦＥグラフトの図９と比較した。
上述の本発明は、理解を明瞭にするために、例示により詳細に説明したが、当業者には自明のように、本発明の範囲内で種々変更を施すことができ、その範囲は以下の請求項によってのみ限定されるものである。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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