(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ジンセノサイド類を膜に転写し、この膜を過ヨウ素酸塩で処理し、蛋白を加え抱合体を形成させ、ジンセノサイド類を膜に固定化し、ついで抗ジンセノサイドＲｂ１モノクローナル抗体を用いる抗原抗体反応でジンセノサイド類を特異的に染色する方法。
【請求項２】
ジンセノサイド類をポリビニリデンジフルオリド膜に転写し、この膜を過ヨウ素酸ナトリウムで処理し、ヒトまたはウシ血清アルブミンを加え抱合体を形成させ、ジンセノサイド類を膜に固定化し、ついで抗ジンセノサイドＲｂ１モノクローナル抗体を用いる抗原抗体反応でジンセノサイド類を特異的に染色する請求項１の方法。
【請求項３】
薄層クロマトにより薬用人参のジンセノサイド類を分離し、転写液を用いてポリビニリデンジフルオリド膜に転写し、ついで過ヨウ素酸塩で処理し、アルブミンを加えてジンセノサイド類を膜に固定化させ、さらに抗ジンセノサイドＲｂ１モノクローナル抗体、パーオキシダーゼ標識２次抗体、基質の順に添加してジンセノサイド類を特異的に発色させる方法。
【請求項４】
薬用人参の器官の切片をポリビニリデンジフルオリド膜で被いジンセノサイド類を膜へ転写し、膜を過ヨウ素酸塩で処理し、蛋白を加えてジンセノサイド類を膜に固定化させ、ついで抗ジンセノサイドＲｂ１モノクロナール抗体、パーオキシダーゼ標識２次抗体、基質の順に添加して、ジンセノサイド類が存在している部位を特異的に発色させる方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は人参の特異的な成分であるジンセノサイド類に対する抗体、すなわち抗ジンセノサイドＲｂ１モノクローナル抗体(抗ＧＲｂ１ＭＡｂ)を用いたジンセノサイド類の免疫学的染色による特異的検出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】
酵素機能を持つ蛋白やペプチド等に対する抗体を用いた組織染色は動物、植物を問わず広く行われており、グリコスフィンゴリピッド類を薄層クロマト(ＴＬＣ)にて分離し、膜に転写する方法(T.Taki et al., Analytical Biochemisry, 221巻、312-316頁、1994年)が開発されている。
しかしながら、ジンセノサイド類の様な低分子化合物に対しては膜に対する固定化が困難なことから、成功例は報告されていない。
また、抗ＧＲｂ１ＭＡｂによるジンセノサイド類の免疫学的染色は現技術において見られない。
一方、ジンセノサイドＲｂ１は有用な薬理活性を有する人参の主要な配糖体であり、医薬品としての候補化合物と目されている物質である。
しかしながら、ジンセノサイドＲｂ１の人参中の含有量は少なく、その検出は容易ではない。まして漢方薬中の含有量を精査するためには前処理等に多大な労力を要する。このため、前処理を必要とせず、再現性があり、かつ高感度な評価方法が熱望されているが、未だ満足できる方法は開発されていない。
【０００３】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、ジンセノサイド類等の低分子化合物を膜に転写し、転写後この膜を過ヨウ素酸塩で処理し蛋白を加えることにより、ジンセノサイド類は蛋白抱合体を形成し、ジンセノサイド類が膜に吸着(固定化)し、抗ジンセノサイドＲｂ１モノクローナル抗体を用いる抗原抗体反応で特異的に染色することができることを見出し、本発明を完成させたものである。
本発明方法は、例えば薄層クロマト(ＴＬＣ)上に展開したジンセノサイド類をポリビニリデンジフルオリド(ＰＶＤＦ)などの膜に転写し、ついで、過ヨウ素酸ナトリウムでジンセノサイド類の糖部分を開環し、蛋白と抱合体を形成させ、該膜に吸着させる。この操作により膜にジンセノサイド類を吸着させ、薬用人参の主要成分であるジンセノサイドＲｂ１(ＧＲｂ１)に対するモノクローナル抗体(ＭＡｂ)を用いて抗原抗体反応を行い、パーオキサイド標識２次抗体を添加し、過酸化水素と基質を加えてジンセノサイド類を発色させる方法に関する。
【０００４】
また、薬用人参の根切片をＰＶＤＦ膜でカバーし、ジンセノサイド類を膜に転写し、この膜をＴＬＣと同様な手順で処理しジンセノサイド類を発色させる方法にも関する。
本発明方法によれば、ジンセノサイド類のアグリコンであるダンマラン骨格を持つパナクサトリオールを特異的に認識し、他の骨格を持つ化合物は一切認識しない。
【０００５】
本発明方法に用いられる蛋白としては、ウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)、ヒト血清アルブミン(ＨＳＡ)、スキンミルク、ゼラチン等が挙げられ、特にＢＳＡが好ましい。
転写液としては、ノルマルブタノール、ノルマルプロパノール、イソプロパノール、メタノール、エタノール等低級アルコール類が挙げられ、特にノルマルプロパノールが好ましい。
転写用膜としてはＰＶＤＦ膜以外ではニトロセルロース膜、ナイロン膜が使用でき、ＰＶＤＦが好ましい。
基質としては４−クロロ−１−ナフトール、ジアミノベンジジンが挙げられ、特に４−クロロ−１−ナフトールが好ましい。
以下本発明方法について、さらに詳細に説明する。
【０００６】
(１)  人参や関連生薬の粗抽出エキスをＴＬＣにスポットし、適切な展開溶媒で展開する。展開したＴＬＣをＰＶＤＦ膜で被い、熱をかけて転写する。
(２)  転写した膜を過ヨウ素酸塩溶液中で反応させ、ついで蛋白溶液につけて蛋白抱合体を形成させることにより吸着を完結する。
(３)  抗ＧＲｂ１ＭＡｂと反応させた後、パーオキサイド標識２次抗体と過酸化水素、基質を加えて反応させ、発色させる。
【０００７】
【発明の実施の形態】
(ａ)  各種人参や人参製剤、関連植物等の粉末１０mg程度をメタノール１mlにて５回抽出する。遠心にかけ上清のメタノールを窒素気流中で留去する。小量のメタノールに溶解し、ＴＬＣプレートにスポットする。クロロホルム−メタノール−水(７：４：１)またはブタノール−酢酸エチル−水(１５：１：４)で展開する。展開したＴＬＣにノルマルプロパノール−メタノール−水混合液をスプレーする。ＴＬＣをＰＶＤＦ膜で被い、グラスフィルターをカバーし、その上にステンレスの板を置き、その上からアイロンで１４０℃、３０秒加熱する。この操作によりＴＬＣ上の化合物は全てＰＶＤＦ膜に転写される。
(ｂ)  (ａ)で転写した膜を過ヨウ素酸ナトリウム溶液(１０mg／ml)中で１時間反応する。反応後ＰＶＤＦ膜を水洗し、ＢＳＡ含有炭酸緩衝液に移し３時間反応する。反応後ＰＢＳで洗浄する。非特異的結合を避けるためにスキンミルク−リン酸緩衝食塩水(ＰＢＳ)で３時間ブロッキングを行う。これによりジンセノサイド類が完全にＰＶＤＦ膜へ吸着する。
(ｃ)  ＰＶＤＦ膜へ抗ＧＲｂ１ＭＡｂを添加し３時間反応する。ツイーン添加ＰＢＳ溶液で洗浄し、１，０００倍希釈したパーオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧヤギ抗体を加えて３時間反応を行う。ツイーン添加ＰＢＳ(Ｔ−ＰＢＳ)で洗浄後、基質の４−クロロ−１−ナフトールと過酸化水素を添加して１５分間反応して発色する。  また、組織染色は以下の通りである。
人参の根の切断面をＰＶＤＦ膜で被い、５時間放置する。転写した膜を上記の(ｂ)、(ｃ)と同様に処理して発色させる。
【０００８】
実施例１  ＴＬＣによるジンセノサイド類の検出
白人(図１のレーン６：以下同じ)、紅人(レーン５)、ヒゲ人参(レーン４)、田七人参(レーン３)、アメリカ人参(レーン２)、竹節人参(レーン１)のメタノール抽出粗エキス、およびジンセノサイド類のスタンダードである、ジンセノサイドＲｂ１(レーン１２)、ジンセノサイドＲｃ(レーン１１)、ジンセノサイドＲｄ(レーン１０)、ジンセノサイドＲｅ(レーン９)、ジンセノサイドＲｇ１(レーン８)、並びに竹節サポニン(レーン７)を２枚のシリカゲルＴＬＣプレートにスポットする。これらのＴＬＣをブタノール−酢酸エチル−水(１５：１：４)で展開する。そのうちの１枚のプレートは通常の硫酸を噴霧して加熱により発色する。もう１枚のプレートは上記の方法により抗体染色する(図１)。
図１のａ図は硫酸により発色したものである。図１のｂ図はＰＶＤＦ膜に転写後本発明の抗体染色したものである。硫酸染色においてはスタンダードは勿論のこと、多くのスポットが発色している。
【０００９】
一方抗体染色の方はスタンダードおよびそれに相当するスポットのみが発色している。例えばオレアナン骨格のアグリコンを持つ竹節サポニン(レーン７)は発色していない。このことから人参に固有なダンマラン骨格を持つジンセノサイド類のみが検出されていることがわかる。
ジンセノサイドＲｅとジンセノサイドＲｇ１(レーン９と８)は最初発色するものの、時間の経過とともに退色する。このことから糖の結合位置を類推することが可能となった。
また、硫酸発色でトップ付近にアグリコンと思われるスポットが認められるが、本発明の抗体染色では認められない。これはアグリコンが糖を持たないため、ＰＶＤＦ膜に吸着されず洗浄の過程で流失したためである。
上記ジンセノサイド類の構造式は下記表１に示される。
【表１】
0003733998.tif 000002
【００１０】
実施例２  人参器官の抗体染色
人参の根の部分を縦および横に切断する。直ちにＰＶＤＦ膜を被い、５時間放置する。膜を洗浄後、上記の方法で抗体染色する。図２にこれらの抗体染色を示す。内皮部分にジンセノサイド含有量が高く、内部の髄部分には含有量が少ないことがわかる。また、髄線に沿って放射状に分布していることが明確にわかる。人参の根を縦割に、上記と同様にして抗体染色したのが図３である。この染色からも内皮部分に多く、中心部には少ないことが良くわかる。これらの抗体染色からジンセノサイドを効率良く抽出単離するためには濃く染色した部分を分離し、原料とすることが好ましい。
【００１１】
参考例  抗ＧＲ１ＭＡｂの製造
抗ＧＲｂ１ＭＡｂ産生ハイブリドーマの製造
(１)  抗原の調整：  ＧＲｂ１(１０ｍｇ)を８０％メタノール０.７ｍｌに溶かした溶液を、４ｍｇの過ヨウ素酸ナトリウムを水０．５ｍｌに溶かした溶液に撹拌しながら添加する。１時間反応後、ＢＳＡを溶かした炭酸塩バッファーを上記反応液に添加して、５時間撹拌反応する。反応後透析して１７ｍｇのＧＲｂ１−ＢＳＡ抱合体を得た。ＧＲｂ１−ＨＳＡ抱合体も同様にして得た。
(２)  免疫脾臓細胞の調整：ＧＲｂ１−ＢＳＡ抱合体５０μgをフロイント−コンプリート−アジュバントに乳濁化させ、ＢＡＬＢ／Ｃ系マウスの腹腔内に投与した。以後、２週間の間隔で５０μｇのＧＲｂ１−ＢＳＡ抱合体アジュバント溶液を２回同様に投与し、最後にＧＲｂ１−ＢＳＡ抱合体のみを１００μｇ投与し免疫を完了した。３日後にマウスを麻酔下屠殺し、脾臓を摘出した。脾臓を細断した後、１００メッシュのナイロン網でろ過し、脾臓の単離細胞を得た。
【００１２】
(３)  ハイブリドーマの調整：単離した免疫脾臓細胞に低張液(１５５ｍＭ塩化アンモニウム)を加えて赤血球を溶血した後、Iscove's Modified Dulbecco's Medium (ＩＭＤＭ)で細胞を３回洗う。マウスミエローマ細胞もＩＭＤＭで３回洗浄した。両細胞数を計測し脾臓細胞と骨髄腫細胞を１０：１の割合として遠心をする。上清を捨て、沈殿した細胞を充分解きほぐし、ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)４０００を培地で希釈した４５％液を０．５ｍｌ滴下して融合を行った。３７℃、３０秒間静置した後、ＩＭＤＭ１ｍｌを１分間かけて添加した。引き続き１０ｍｌを５分間かけて添加した。１，０００ｒｐｍで１０分間遠心した。沈殿を１０％FeＳ添加ＩＭＤＭにより洗い、遠心して上清を捨てた。ヒポキサンチン１０-4Ｍ、アミノプテリン４ｘ１０-7Ｍおよびチミジン１．５ｘ１０-5Ｍを加えた(ＨＡＴ−)１０％FeＳ添加ＩＭＤＭを用いて沈殿を再び浮遊させ、９６ウエルマイクロプレートに１００μｌずつ分注した。３日毎に同一培地を５０μｌ追加し、細胞の増殖を確認した。
【００１３】
(４)  抗体産生ハイブリドーマの検索：ハイブリドーマが増殖したウエルの液を採取し、ＧＲｂ１−ＨＳＡ抱合体を結合させた別のウエルに添加し、直接ＥＬＩＳＡによりＧＲｂ１に対するＭＡｂ産生ハイブリドーマを検索した。すなわち、９６ウエルマイクロプレートにＧＲｂ１−ＨＳＡ抱合体０．１μｇ／１００μｌ／ウエルを分注し、２５℃で５時間インキュベートしてウエルに吸着させた。このウエルに培養上清を１００μｌずつ分注し抗原抗体反応を行った。０.０５％ツィーン２０含有リン酸緩衝食塩水(Ｔ−ＰＢＳ)で３回洗浄した。パーオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体１０００倍希釈液をウエルあたり１００μｌ添加し、１時間後にＴ−ＰＢＳで洗浄した。０.００３％過酸化水素、ＡＢＴＳ０.３ｍｇ／ｍｌ含有クエン酸緩衝液を添加して発色させた。２０分後プレートリーダーを用いて４０５ｎｍの波長で吸光度を測定した。発色したウエルの細胞を採取した。
【００１４】
(５)  抗ＧＲｂ１ＭＡｂ産生ハイブリドーマのクローニング：抗体産生ハイブリドーマを限界希釈してウエルに分注した。抗体産生能を持ち、かつ増殖したハイブリドーマを同様に３回クローニングしてクローンを得た。
(６)  抗ＧＲｂ１ＭＡｂの調整：上記の抗体産生ハイブリドーマを無血清培地(１０μｇ／ｍｌインスリン、３５μｇ／ｍｌトランスフェリン、２０μＭエタノールアミン、２５ｎＭセレニューム添加ｅＲＤＦ培地)で３７℃、炭酸ガス培養器で培養した。上清をプロテインＧＦＦカラムを用いて精製した。すなわち、上清をトリス緩衝液でｐＨ７に調整し、カラムに付す。カラムを１０ｍＭリン酸緩衝液で洗浄後、吸着している抗体を１００ｍＭクエン酸緩衝液で溶出する。得られた抗体溶液はＰＢＳに対して３回透析し、最後に凍結乾燥して精製抗体を得た。
【００１５】
【発明の効果】
抗ジンセノサイドＲｂ１モノクローナル抗体(抗ＧＲｂ１ＭＡｂ)を用いることで、ジンセノサイド類のアグリコンであるダンマラン骨格を持つパナクサトリオールを特異的に認識し、他の骨格を持つ化合物には一切反応しないため、非常に特異的であり、ジンセノサイド類のみを検出することができる。このため本発明方法により新活性ジンセノサイド類を発見し、容易に構造解析を行うことが可能になった。すなわち糖鎖部分のみの構造を解明することにより全体構造決定ができる。
【００１６】
また、薬用人参の組織、器官等はその切片にＰＶＤＦ膜を被うことでジンセノサイド類を膜に転写させ、簡便に発色、定量(検出)することができ、従って高含有部位の検索が極めて迅速に行える。
本発明方法は配糖体全般にわたり応用可能な技術であり幅広い応用面が考えられる。人参は大変高価であるので、ジンセノサイドの抽出原料としては適切ではないが、本発明方法により薬理活性の強いジンセノサイド含有植物のスクリーニングが容易に行え、適切な原料植物の発見が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  ＴＬＣ展開図の図面代用写真である。
【図２】  人参の根の部分の横断面抗体染色図の図面代用写真である。
【図３】  人参の根の部分の縦断面抗体染色図の図面代用写真である。
【図１】
0003733998.tif 000003
【図２】
0003733998.tif 000004
【図３】
0003733998.tif 000005