(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｄ−グルコピラノース配糖体のＤ−グルコピラノース残基の６位にＤ−キシロース残基を転移する活性を有する酵素を触媒とし、Ｄ−グルコピラノース配糖体のＤ−グルコピラノース残基の６位にキシロース供与体からＤ−キシロース残基を転移させることを特徴とする、プリメベロース配糖体の製造法。
【請求項２】
前記酵素が、アスペルギルス属に属する糸状菌に由来するペクチナーゼである請求項１に記載のプリメベロース配糖体の製造法。
【請求項３】
前記キシロース供与体が、キシロビオースである請求項１又は２に記載のプリメベロース配糖体の製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、配糖体の製造法に関し、詳しくはプリメベロース配糖体の製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
茶などの植物体に於いて、香気成分であるテルペン類はそのままの形で存在するものもあるが、その多くは配糖体の形で存在していることが知られている。また、配糖体の多くは様々な薬理作用が知られており、アグリコンを変換することにより期待できる薬理作用の種類や強さが変わることが知られている。
【０００３】
しかし、配糖体の中で、リナリル−β−プリメベロシド、ゲラニル−β−プリメベロシド、２−フェニルエチル−β−プリメベロシド、ベンジル−β−プリメベロシド、メチルサリシレート−β−プリメベロシド、trans−リナロール−３，６−オキサイド−β−プリメベロシド、cis−リナロール−３，６−オキサイド−β−プリメベロシド、オイゲニル−β−プリメベロシド、アリザリン−β−プリメベロシド、イソバニリン酸メチル−β−プリメベロシド、５−メトキシサリチル酸メチル−β−プリメベロシド等のプリメベロース配糖体については、アグリコンの変換と薬理作用の関係は未だ検討されていない。これは、任意のアグリコンを有するプリメベロース配糖体を人工的に作り難かったことに起因する。すなわち、プリメベロース配糖体の糖部分であるプリメベロースがキシロースの１位とグルコースの６位が結合したニ糖であり、この様な１−６糖転移反応を起こす活性を有する酵素が知られていなかったため、この様な配糖体を人工的に合成するのが困難だったのである。
【０００４】
そこで、任意のアグリコンを有するプリメベロース配糖体を製造する技術の確立が望まれていた。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明はこの様な状況下行われたものであり、酵素を用いて、任意のアグリコンを有するプリメベロース配糖体を製造する方法を提供することを課題とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らはかかる状況に鑑みて、プリメベロース配糖体の製造法を求めて鋭意研究を重ねた結果、キシロシダーゼ活性を指標として得られた糖転移酵素の存在下、Ｄ−グルコピラノース配糖体とキシロース供与体とを反応させることによりプリメベロース配糖体を製造しうることを見いだし発明を完成させるに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、Ｄ−グルコピラノース配糖体のＤ−グルコピラノース残基の６位にＤ−キシロース残基を転移する活性を有する酵素を触媒とし、Ｄ−グルコピラノース配糖体のＤ−グルコピラノース残基の６位にキシロース供与体からＤ−キシロース残基を転移させることを特徴とする、プリメベロース配糖体の製造法である。
【０００８】
上記製造法に用いる酵素としては、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属に属する糸状菌に由来するペクチナーゼが好適である。また、キシロース供与体としては、キシロビオースが好ましい。
【０００９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について更に詳細に説明する。
【００１０】
（１）本発明で用いる酵素
本発明で製造しようとするプリメベロース配糖体は、Ｄ−グルコピラノース配糖体の糖部分であるグルコースの６位とＤ−キシロースの１位とがエーテル結合した配糖体である。
【００１１】
かかる配糖体を製造するためには、Ｄ−グルコピラノース配糖体の糖部分であるグルコースの６位とＤ−キシロースの１位とを縮合させればよい。従って、Ｄ−グルコースの６位にＤ−キシロース残基を転移する糖転移反応を起こし得るキシロシルトランスフェラーゼ活性を有する酵素を用いれば、プリメベロース配糖体を得ることができる。
【００１２】
このような酵素は、例えば、以下のようにキシロシダーゼ活性を指標として見いだすことができる。まず、ｐ−ニトロフェニルキシロピラノシドを基質とし、各種酵素の存在下で、黄色の発色を呈するｐ−ニトロフェノールの発色の強さからｐ−ニトロフェノールの発生量を測定し、キシロシダーゼ活性を調べる。そして、キシロシダーゼ活性を示すものを選択し、Ｄ−グルコピラノース配糖体のグルコピラノース残基の６位にＤ−キシロース残基を転移する活性を確認する。
【００１３】
更に、選択した酵素をｐ−ニトロフェノール−Ｄ−グルコピラノシドに作用させ、グルコシダーゼ活性を確認することが好ましい。グルコシダーゼ活性を有しない酵素を用いれば、グルコース配糖体はグルコースとアグリコンとに加水分解されず収率が向上する。また、選択した酵素が本来的にはグルコシダーゼ活性を有するものであっても、グルコシダーゼ活性を抑制することにより本発明の製造法に好適に用いることができる。
【００１４】
好ましい酵素としては、微生物、例えばアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属に属する糸状菌に由来するペクチナーゼ等が挙げられる。このペクチナーゼは、例えば、天野製薬株式会社製のペクチナーゼＧ（商品名）等の様に市販されている。本発明ではこのような市販されているペクチナーゼを使用することができる。アスペルギルス属に属する糸状菌に由来するペクチナーゼにはグルコシダーゼ活性を有するものもあるが、例えばＤ−グルコン酸δ−ラクトンをグルコシダーゼ活性の阻害剤として用いること等により、プリメベロース配糖体の収率を向上させることができる。
【００１５】
（２）本発明のプリメベロース配糖体の製造法
本発明のプリメベロース配糖体の製造法は、Ｄ−グルコピラノース配糖体のＤ−グルコピラノース残基の６位にＤ−キシロース残基を転移する活性を有する酵素を触媒とし、Ｄ−グルコピラノース配糖体のＤ−グルコピラノース残基の６位にキシロース供与体からＤ−キシロース残基を転移させることを特徴とする。
【００１６】
Ｄ−グルコピラノース配糖体のＤ−グルコピラノース残基の６位にＤ−キシロース残基を転移する活性を有する酵素は、上記（１）のようにして得ることができ、好ましくはアスペルギルス属に属する糸状菌に由来するペクチナーゼが好適に用いられる。
【００１７】
Ｄ−グルコピラノース配糖体は、配糖体としては一般的であり、多くのものが市販されている。またその製造も、例えば、糖の塩化物とアグリコンとを硝酸銀などを触媒とし縮合すれば容易に得ることもできる。
【００１８】
本発明で用いるグルコピラノース配糖体のアグリコンには特段の制限はなく、任意のアグリコンを有するグルコピラノース配糖体を本発明の製造法に用いることができる。かかるアグリコンとしては、テルペン類、フラボン類、イソフラボン類、カルコン類、ステロイド類、フェノール又はポリフェノール類とその誘導体類、アルカロイド類などが例示できる。これらをアグリコンとするグルコピラノース配糖体は数多く知られており、市販されているものも多い。又、市販されていないグルコピラノース配糖体についても、常法に従って合成することができる。例えば、アセチルグルコピラノースとアグリコンのトリメチルシリル化物とを硝酸銀及び／又は塩化第二スズ等のルイス酸を触媒として縮合させ、しかる後にアセチル基をメタノール性アンモニアなどを用いて外せば所望のＤ−グルコピラノース配糖体が得られ、これを原料として用いることができる。
【００１９】
原料として用いることができるＤ−グルコピラノース配糖体としては、例えば、ｐ−ニトロフェノール−β−Ｄ−グルコピラノシド、リナリル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ゲラニル−β−Ｄ−グルコピラノシド、２−フェニルエチル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ベンジル−β−Ｄ−グルコピラノシド、サリチル酸メチル−β−Ｄ−グルコピラノシド、trans−リナロール−３，６−オキサイド−β−Ｄ−グルコピラノシド、cis−リナロール−３，６−オキサイド−β−Ｄ−グルコピラノシド、オイゲニル−β−Ｄ−グルコピラノシド、アリザリン−β−Ｄ−グルコピラノシド、イソバニリン酸メチル−β−Ｄ−グルコピラノシド、５−メトキシサリチル酸メチル−β−Ｄ−グルコピラノシド等が挙げられる。
【００２０】
また、キシロース供与体としてはキシロース又はそれを含有する多糖類が例示でき、これらの内ではキシロビオースが特に好ましい。
糖転移反応の条件は、Ｄ−グルコピラノース配糖体のＤ−グルコピラノース残基の６位にＤ−キシロース残基を転移する活性を有する酵素により適宜選択することができるが、例えばアスペルギルス属に属する糸状菌に由来するペクチナーゼを用いる場合、次のような条件の下、プリメベロース配糖体の製造を行うことができる。
【００２１】
Ｄ−グルコピラノース配糖体を水或いは溶媒に溶解又は分散させ、更にキシロース供与体とペクチナーゼを混合し、反応温度を好ましくは３０〜５０℃、特に好ましくは４０℃程度、反応時間を好ましくは１２〜２４時間、特に好ましくは１８時間程度の条件で糖転移反応させることによりプリメベロース配糖体を合成することができる。この際、キシロース供与体はＤ−グルコピラノース配糖体に対して当量より多めが好ましく、具体的にはキシロース残基がグルコピラノース残基に対して１〜５倍当量となる量を混合することが好ましく、特に好ましくは３倍当量程度となる量を混合する。ペクチナーゼは触媒量存在すればよい。例えば、触媒量として好ましくはＤ−グルコピラノース配糖体量の１／５〜１／１０量とすることが好適である。又、溶媒として好ましくはアセトン又はアセトニトリルを含有する水系溶媒が挙げられる。これらは原料及び生成物を溶解する能力に優れ、また酵素活性を阻害しないので、プリメベロース配糖体の収量向上などの点で好適である。配糖体を合成する溶液中のアセトンの濃度として好ましくは５〜２０％（V/V）、特に好ましくは１０％（V/V）程度であり、アセトニトリルの濃度として好ましくは５〜２０％（V/V）、特に好ましくは１０％（V/V）程度である。更に上記のような溶媒の変わりにシクロデキストリンを用いて原料を包接可溶化することもできる。シクロデキストリンは、好ましくは１０〜３０％（W/W）、特に好ましくは２４％（W/W）程度配糖体を合成する溶液に混合する。また、配糖体を合成する溶液のｐＨは、好ましくは３〜６、特に好ましくは４程度に調整する。ｐＨの調整は通常用いられている緩衝液により行うことができる。また、プリメベロース配糖体を合成する溶液中には、合成に用いる酵素のグルコシダーゼ活性を抑制するために、例えば、Ｄ−グルコン酸δ−ラクトン等を混合してもよい。
【００２２】
反応を停止するには、例えば反応液を約５分程度煮沸すればよい。反応を停止した後、ＯＤＳ、シリカゲル、イオン交換樹脂等を担体としたカラムクロマトグラフィー等によりプリメベロース配糖体の精製物を得ることができる。
【００２３】
【実施例】
以下に実施例を示し、本発明について更に詳細に説明するが、本発明がこれら実施例にのみに限定を受けないことは言うまでもない。
【００２４】
【実施例１】
製造例
ｐ−ニトロフェノール−β−Ｄ−グルコピラノシド３７．５ｍｇ、Ｄ−グルコン酸δ−ラクトン１１ｍｇ、キシロビオース１２ｍｇ、ペクチナーゼ（商品名：ペクチナーゼＧ、天野製薬社製）２．９ｍｇ、α−シクロデキストリン１２０ｍｇ、０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４）６０μｌ、水２４０μｌを試験管に秤込み、４０℃で１５時間インキュベートした。これを５分間煮沸し反応を停止し、これをＯＤＳを充填したカラムにチャージし、２５％メタノール水溶液を溶出溶液としてカラムクロマトグラフィーで精製した。溶出したピークフラクションをトヨパールＨＷ−４０Ｓ（東ソー株式会社製）を充填したカラムにチャージし２５％メタノール水溶液を溶出溶媒としてカラムクロマトグラフィーにより更に精製し、３５７μｇのｐ−ニトロフェノールプリメベロシドを得た。
【００２５】
【実施例２】
製造例
ｐ−ニトロフェノール−β−Ｄ−グルコピラノシド３７．５ｍｇ、Ｄ−グルコン酸δ−ラクトン１１ｍｇ、キシロビオース１２ｍｇ、ペクチナーゼ（商品名：ペクチナーゼＧ、天野製薬社製）２．９ｍｇ、アセトニトリル３０μｌ、０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４）６０μｌ、水２４０μｌを試験管に秤込み、４０℃で１５時間インキュベートした。これを５分間煮沸し反応を停止し、これをＯＤＳを充填したカラムにチャージし、２５％メタノール水溶液を溶出溶液としてカラムクロマトグラフィーで精製した。溶出したピークフラクションをトヨパールＨＷ−４０Ｓ（東ソー株式会社製）を充填したカラムにチャージし２５％メタノール水溶液を溶出溶媒としてカラムクロマトグラフィーにより更に精製し、５３２μｇのｐ−ニトロフェニルプリメベロシドを得た。
【００２６】
溶媒としてアセトニトリル水溶液を用いることにより収量が向上していることが判る。
【００２７】
【実施例３】
製造例
リナリル−β−Ｄ−グルコピラノシド３ｍｇ、Ｄ−グルコン酸δ−ラクトン１ｍｇ、キシロビオース１ｍｇ、ペクチナーゼ（商品名：ペクチナーゼＧ、天野製薬社製）０．３ｍｇ、アセトニトリル３０μｌ、０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４）６０μｌ、水２４０μｌを試験管に秤込み、４０℃で１５時間インキュベートした。これを５分間煮沸し反応を停止し、これをＯＤＳカラムを装着した高速液体クロマトグラフィーにより、２５％メタノール水溶液を溶出溶液として精製した。ピークフラクションをＬＣマススペクトログラフィーで分析し、リナリル−β−プリメベロシドが生成していることを確認した。
【００２８】
【実施例４】
製造例
ゲラニル−β−Ｄ−グルコピラノシド３ｍｇ、Ｄ−グルコン酸δ−ラクトン１ｍｇ、キシロビオース１ｍｇ、ペクチナーゼ（商品名：ペクチナーゼＧ、天野製薬社製）０．３ｍｇ、アセトニトリル３０μｌ、０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４）６０μｌ、水２４０μｌを試験管に秤込み、４０℃で１５時間インキュベートした。これを５分間煮沸し反応を停止し、これをＯＤＳカラムを装着した高速液体クロマトグラフィーにより、２５％メタノール水溶液を溶出溶液として精製した。ピークフラクションをＬＣマススペクトログラフィーで分析し、ゲラニル−β−プリメベロシドが生成していることを確認した。
【００２９】
【実施例５】
製造例
２−フェニルエチル−β−Ｄ−グルコピラノシド３ｍｇ、Ｄ−グルコン酸δ−ラクトン１ｍｇ、キシロビオース１ｍｇ、ペクチナーゼ（商品名：ペクチナーゼＧ、天野製薬社製）０．３ｍｇ、アセトニトリル３０μｌ、０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４）６０μｌ、水２４０μｌを試験管に秤込み、４０℃で１５時間インキュベートした。これを５分間煮沸し反応を停止し、これをＯＤＳカラムを装着した高速液体クロマトグラフィーにより、２５％メタノール水溶液を溶出溶液として精製した。ピークフラクションをＬＣマススペクトログラフィーで分析し、２−フェニルエチル−β−プリメベロシドが生成していることを確認した。
【００３０】
【実施例６】
製造例
ベンジル−β−Ｄ−グルコピラノシド３ｍｇ、Ｄ−グルコン酸δ−ラクトン１ｍｇ、キシロビオース１ｍｇ、ペクチナーゼ（商品名：ペクチナーゼＧ、天野製薬社製）０．３ｍｇ、アセトニトリル３０μｌ、０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４）６０μｌ、水２４０μｌを試験管に秤込み、４０℃で１５時間インキュベートした。これを５分間煮沸し反応を停止し、これをＯＤＳカラムを装着した高速液体クロマトグラフィーにより、２５％メタノール水溶液を溶出溶液として精製した。ピークフラクションをＬＣマススペクトログラフィーで分析し、ベンジル−β−プリメベロシドが生成していることを確認した。
【００３１】
【実施例７】
製造例
サリチル酸メチル−β−Ｄ−グルコピラノシド３ｍｇ、Ｄ−グルコン酸δ−ラクトン１ｍｇ、キシロビオース１ｍｇ、ペクチナーゼ（商品名：ペクチナーゼＧ、天野製薬社製）０．３ｍｇ、アセトニトリル３０μｌ、０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４）６０μｌ、水２４０μｌを試験管に秤込み、４０℃で１５時間インキュベートした。これを５分間煮沸し反応を停止し、これをＯＤＳカラムを装着した高速液体クロマトグラフィーにより、２５％メタノール水溶液を溶出溶液として精製した。ピークフラクションをＬＣマススペクトログラフィーで分析し、サリチル酸メチル−β−プリメベロシドが生成していることを確認した。
【００３２】
【実施例８】
製造例
trans−リナロール−３，６−オキサイド−β−Ｄ−グルコピラノシド３ｍｇ、Ｄ−グルコン酸δ−ラクトン１ｍｇ、キシロビオース１ｍｇ、ペクチナーゼ（商品名：ペクチナーゼＧ、天野製薬社製）０．３ｍｇ、アセトニトリル３０μｌ、０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４）６０μｌ、水２４０μｌを試験管に秤込み、４０℃で１５時間インキュベートした。これを５分間煮沸し反応を停止し、これをＯＤＳカラムを装着した高速液体クロマトグラフィーにより、２５％メタノール水溶液を溶出溶液として精製した。ピークフラクションをＬＣマススペクトログラフィーで分析し、trans−リナロール−３，６−オキサイド−β−プリメベロシドが生成していることを確認した。
【００３３】
【実施例９】
製造例
cis−リナロール−３，６−オキサイド−β−Ｄ−グルコピラノシド３ｍｇ、Ｄ−グルコン酸δ−ラクトン１ｍｇ、キシロビオース１ｍｇ、ペクチナーゼ（商品名：ペクチナーゼＧ、天野製薬社製）０．３ｍｇ、アセトニトリル３０μｌ、０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４）６０μｌ、水２４０μｌを試験管に秤込み、４０℃で１５時間インキュベートした。これを５分間煮沸し反応を停止し、これをＯＤＳカラムを装着した高速液体クロマトグラフィーにより、２５％メタノール水溶液を溶出溶液として精製した。ピークフラクションをＬＣマススペクトログラフィーで分析し、cis−リナロール−３，６−オキサイド−β−プリメベロシドが生成していることを確認した。
【００３４】
【実施例１０】
製造例
オイゲニル−β−Ｄ−グルコピラノシド３ｍｇ、Ｄ−グルコン酸δ−ラクトン１ｍｇ、キシロビオース１ｍｇ、ペクチナーゼ（商品名：ペクチナーゼＧ、天野製薬社製）０．３ｍｇ、アセトニトリル３０μｌ、０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４）６０μｌ、水２４０μｌを試験管に秤込み、４０℃で１５時間インキュベートした。これを５分間煮沸し反応を停止し、これをＯＤＳカラムを装着した高速液体クロマトグラフィーにより、２５％メタノール水溶液を溶出溶液として精製した。ピークフラクションをＬＣマススペクトログラフィーで分析し、オイゲニル−β−プリメベロシドが生成していることを確認した。
【００３５】
【実施例１１】
製造例
アリザリン−β−Ｄ−グルコピラノシド３ｍｇ、Ｄ−グルコン酸δ−ラクトン１ｍｇ、キシロビオース１ｍｇ、ペクチナーゼ（商品名：ペクチナーゼＧ、天野製薬社製）０．３ｍｇ、アセトニトリル３０μｌ、０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４）６０μｌ、水２４０μｌを試験管に秤込み、４０℃で１５時間インキュベートした。これを５分間煮沸し反応を停止し、これをＯＤＳカラムを装着した高速液体クロマトグラフィーにより、２５％メタノール水溶液を溶出溶液として精製した。ピークフラクションをＬＣマススペクトログラフィーで分析し、アリザリン−β−プリメベロシドが生成していることを確認した。
【００３６】
【実施例１２】
製造例
イソバニリン酸メチル−β−Ｄ−グルコピラノシド３ｍｇ、Ｄ−グルコン酸δ−ラクトン１ｍｇ、キシロビオース１ｍｇ、ペクチナーゼ（商品名：ペクチナーゼＧ、天野製薬社製）０．３ｍｇ、アセトニトリル３０μｌ、０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４）６０μｌ、水２４０μｌを試験管に秤込み、４０℃で１５時間インキュベートした。これを５分間煮沸し反応を停止し、これをＯＤＳカラムを装着した高速液体クロマトグラフィーにより、２５％メタノール水溶液を溶出溶液として精製した。ピークフラクションをＬＣマススペクトログラフィーで分析し、イソバニリン酸メチル−β−プリメベロシドが生成していることを確認した。
【００３７】
【実施例１３】
製造例
５−メトキシサリチル酸メチル−β−Ｄ−グルコピラノシド３ｍｇ、Ｄ−グルコン酸δ−ラクトン１ｍｇ、キシロビオース１ｍｇ、ペクチナーゼ（商品名：ペクチナーゼＧ、天野製薬社製）０．３ｍｇ、アセトニトリル３０μｌ、０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４）６０μｌ、水２４０μｌを試験管に秤込み、４０℃で１５時間インキュベートした。これを５分間煮沸し反応を停止し、これをＯＤＳカラムを装着した高速液体クロマトグラフィーにより、２５％メタノール水溶液を溶出溶液として精製した。ピークフラクションをＬＣマススペクトログラフィーで分析し、５−メトキシサリチル酸メチル−β−プリメベロシドが生成していることを確認した。
【００３８】
【発明の効果】
本発明によれば、酵素を用いて、任意のアグリコンを有するプリメベロース配糖体を製造する方法を提供することができる。従って、本発明の製造法により、プリメベロース配糖体のアグリコンの種類と期待できる薬理作用の関係を検討することが容易になるものと期待される。