(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
コラーゲンＶＩＩ合成促進及び／又は皮膚細胞のビタミンＣ取込み促進をすることができる、ベルトレティア抽出物を含有してなる化粧用組成物。
【請求項２】
ベルトレティア抽出物は、ベルトレティア・エクセルサ抽出物である請求項１記載の化粧用組成物。
【請求項３】
皮膚細胞のコラーゲンＶＩＩ合成促進のために使用される請求項１又は２記載の化粧用組成物。
【請求項４】
皮膚細胞のビタミンＣ取込み促進のために使用される請求項１又は２記載の化粧用組成物。
【請求項５】
ビタミンＣ又はアスコルビン酸誘導体を更に含有し、局所使用される請求項１、２、３又は４記載の化粧用組成物。
【請求項６】
ベルトレティア抽出物を、組成物の全重量に対して、０．０００１〜１重量％の濃度で含有する請求項１、２、３、４又は５記載の化粧用組成物。
【請求項７】
ベルトレティア抽出物を、組成物の全重量に対して、０．０１〜０．２５重量％の濃度で含有する請求項６記載の化粧用組成物。
【請求項８】
コラーゲンＶＩＩ合成欠乏の治療に使用するための、ベルトレティア抽出物を含有してなる薬用組成物。
【請求項９】
ベルトレティア抽出物は、ベルトレティア・エクセルサ抽出物である請求項８記載の薬用組成物。
【請求項１０】
表皮水痘症の治療に使用するための請求項８又は９記載の薬用組成物。
【請求項１１】
皮膚細胞のビタミンＣ取込み不足の治療に使用するための、ベルトレティア抽出物を含有してなる薬用組成物。
【請求項１２】
ベルトレティア抽出物は、ベルトレティア・エクセルサ抽出物である請求項１１記載の化粧用組成物。
【請求項１３】
ビタミンＣ又はアスコルビン酸誘導体を更に含有する請求項８、９、１０、１１又は１２記載の薬用組成物。
【請求項１４】
ベルトレティア抽出物を、組成物の全重量に対して０．０００１〜１重量％の濃度で含有する請求項８、９、１０、１１、１２又は１３記載の薬用組成物。
【請求項１５】
ベルトレティア抽出物を、組成物の全重量に対して０．０１〜０．２５重量％の濃度で含有する請求項１４記載の薬用組成物。
【請求項１６】
ヒト皮膚培養細胞におけるコラーゲンＶＩＩ合成促進、及び／又は、前記細胞のビタミンＣ取込み促進をすることができる、ベルトレティア抽出物を含有してなる細胞培養液用組成物。
【請求項１７】
ヒト皮膚培養細胞は、人工皮膚製造のためのものである請求項１６記載の細胞培養液用組成物。
【請求項１８】
ベルトレティア抽出物を、０．１μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌ含有する請求項１６又は１７記載の細胞培養液用組成物。
【請求項１９】
ヒト皮膚培養細胞の培養培地に、請求項１６記載の細胞培養液用組成物を使用する、前記細胞におけるコラーゲンＶＩＩ合成促進、及び／又は、前記細胞のビタミンＣ取込み促進を行うヒト皮膚細胞の培養方法。
【請求項２０】
ベルトレティア抽出物は、水、１〜４個の炭素原子を有するアルコール、１〜２個の炭素原子を有する塩素系溶媒、３〜６個の炭素原子を有する有機エステル、及び、これらの混合溶媒からなる群より選択される極性溶媒により抽出されたものである請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７又は１８記載の組成物。
【請求項２１】
極性溶媒は、水、メタノール、エタノール、及び、これらの混合溶媒からなる群より選択されるものである請求項２０記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、化粧又は製薬分野、特に皮膚科学分野におけるベルトレティア（Ｂｅｒｔｈｏｌｌｅｔｉａ）抽出物の新規使用に関する。更に、細胞培養培地、特にヒト皮膚細胞を培養する培地での該抽出物の新規使用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ベルトレティアはサガリバナ科に属し、ベルトレティア・エクセルサ（Ｂｅｒｔｈｏｌｌｅｔｉａ  ｅｘｃｅｌｓａ）とベルトレティア・ノビリス（Ｂｅｒｔｈｏｌｌｅｔｉａ  ｎｏｂｉｌｉｓ）という２つの非常に似通った種を含む属である。これらは南アメリカ、特にブラジルの熱帯地方で見られる樹木である。高さは３０〜４０メートルに達する。一般にはブラジルクルミ又はブラジルクリノキと呼ばれている。この２種類の木の実は類似点が多く、実際に混同されることがある。これらは食用である。これらについては、特にパウル・Ｈ．メンシエ（Ｐａｕｌ  Ｈ．Ｍｅｎｓｉｅｒ）著、パウル・レシェバリエ（Ｐａｕｌ  Ｌｅｃｈｅｖａｌｉｅｒｓ）社出版、パリ、１９５７年の「ディクショネア・デ・ユイル・ベジタル（Ｄｉｃｔｉｏｎｎａｒｉｅ  ｄｅｓ  Ｈｕｉｌｅｓ  Ｖｅｇｅｔａｌｅ）（植物油辞典）」で記述されている。
【０００３】
アマゾンでは、ベルトレティア・エクセルサの幹の樹皮は、特にサポニンを含有するため、肝臓の病気を抑制する煎じ薬として使用されている。その実から採れる油脂は石鹸の製造に使用できる（Ｒ．Ｅ．シュルツ（Ｒ．Ｅ．Ｓｃｈｕｌｔｅｓ）ら、「ザ・ヒーリング・フォレスト（Ｔｈｅ  ｈｅａｌｉｎｇ  ｆｏｒｅｓｔ）」、ディスコリヅ・プレス（Ｄｉｓｃｏｒｉｄｅｓ  Ｐｒｅｓｓ）、ポートランド、オレゴン、米国、１９９０、２巻、２２５〜２２６頁）。
【０００４】
本発明者は、ベルトレティアの抽出物は、コラーゲンＶＩＩ合成に対する活性と細胞内へのビタミンＣ輸送に対する効果を有するため、化粧又は製薬分野、特に皮膚科学分野において極めて有用であることを見いだした。周知のように、皮膚は本質的にコラーゲンＩを含有する。コラーゲンＩは、真皮中で最も数の多い細胞である繊維芽細胞により合成される蛋白質である。この蛋白質は支持的役割を果たし、真皮の生物力学的性質、特にその張り、及び、その構造の維持に関して役割を持っている（Ｅ．Ｕ．クカルツ（Ｅ．Ｕ．ＫＵＣＨＡＲＺ）、「ザ・コラーゲン：バイオケミストリー・アンド・パトフィジオロジー（Ｔｈｅ  ｃｏｌｌａｇｅｎｓ：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ）」、シュプリンガー・フェルラーク、ベルリン、１９９２）。また、老人は若者よりも真皮の繊維芽細胞におけるコラーゲン分泌量が少ないことが分かっている（Ｍ．デュマス（Ｍ．ＤＵＭＡＳ）ら、Ｍｅｃｈ．Ａｇｅｉｎｇ  Ｄｅｖ．、１９９４、７３巻、１７９〜１８７頁）。従って、年齢と共に、皮膚の流動学的性質や日々受ける圧力に対する応答が衰える。皮膚はたるみ、伸びに対する応答が乏しくなり、張りを失い、皺が深くなる。
【０００５】
同じく周知のように、コラーゲンＩＶは表皮−真皮接合部の主要コラーゲンである。この課題に関する参考文献としては、ブリッガマンＲ．Ａ．（Ｂｒｉｇｇａｍａｎ  Ｒ．Ａ．）著、「バイオケミカル・コンポジション・オブ・ザ・エピダーマル−ダーマル・ジャンクション・アンド・アザー・ベイスメント・メンブラン」、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．、１９８２、７８巻、１〜６頁、及び、Ｐ．フェランド（Ｐ．Ｖｅｒａｎｄｅ）著、「ラ・ジォクショ・デルモエピデルミク（Ｌａ  ｊｏｎｃｔｉｏｎ  ｄｅｒｍｏｅｐｉｄｅｒｍｉｑｕｅ）」、エセルム・イン・セミネール・エセルム（Ｉｎｓｅｒｍ  ｉｎ  Ｓｅｍｉｎａｒｉｅ  Ｉｎｓｅｒｍ）、１９９１年、２１４巻、８３〜１００頁がある。
【０００６】
このコラーゲンＩＶは稠密層に存在するもので、細胞の固着に関与し、表皮ケラチン細胞により合成される。基底板は、表皮ケラチン細胞につながるアンカリングフィラメントとコラーゲン繊維（コラーゲンＩ及びＩＩＩ）からなる真皮の細胞外マトリックスをつなぎとめるものである。この基底板はコラーゲンＩＶからなり、２つの皮膚の仕切りの機能的な界面維持に必要である。また、コラーゲンＩＶは瘢痕化の過程において重要な役割を果たし、良質な瘢痕組織の形成を可能にする。
【０００７】
ＶＩＩ型コラーゲンは、基底膜に会合している、表皮と真皮をつなぐアンカリングフィラメントの主要構成要素である。Ｒ．バーゲソン（Ｒ．ＢＵＲＧＥＳＯＮ）、タイプＶＩＩ・コラーゲン、アンカーリング・フィブリルズ、アンド・エピダーモリシス・ブローサ、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．、１０１巻、２５２〜２５５巻（１９９３年）に記載されているように、基底表皮ケラチン細胞と、少量ではあるが、真皮の繊維芽細胞とがコラーゲンＶＩＩを合成する。最近の研究では、レチノイン酸を局部に塗布すると、化学線曝露により老化した皮膚においてアンカリングフィラメントの数が増加することが分かっている。
【０００８】
Ｙ．Ｑ．チェン、Ａ．モービール、Ｊ．リーナネン、Ｓ．ソルバーグ、Ｊ．ユイト（Ｙ．Ｑ．ＣＨＥＮ，Ａ．ＭＡＵＶＩＥＬ，Ｊ．ＲＹＹＮＡＥＮ，Ｓ．ＳＯＬＬＢＥＲＧ，Ｊ．ＵＩＴＴＯ）、「タイプＶＩＩ・コラーゲン・ジーン・イクスプレッション・バイ・ヒューマン・スキン・フィブロブラスツ・アンド・ケラチノサイツ・イン・カルチャー：インフルエンス・オブ・ドナー・エイジ・アンド・サイトカイン・レスポンシズ」、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．、１０２巻、（２）、２０５〜２０９巻（１９９４年）によれば、皮膚がもろくなったり表皮の修復能が減少するといった皮膚の老化の兆候は、老人におけるコラーゲンＶＩＩ合成の減少に起因する可能性がある。
【０００９】
本発明者は、全く驚くべきことに、ベルトレティア抽出物が健常人表皮ケラチン細胞の培養株によるコラーゲンＶＩＩ分泌に対して効果を有することを見いだした。この発見から、特に表皮−真皮接合を促進する観点から、コラーゲンＶＩＩ合成の促進が望ましい部位への塗布に好適に使用される新規の化粧用又は薬用組成物、特に皮膚科用組成物の開発が実現した。この特性は、局部的な化粧用又は皮膚科用組成物の開発に極めて有用であることを証明した。このような組成物を用いると、特に張りを失ってたるんだ皮膚の表皮−真皮接合を促進することが可能となり、また表皮溶解性水疱等の表皮−真皮接合部の欠陥に起因する病状を治療することができる。更に、ベルトレティア抽出物は驚くべきことに、皮膚細胞、特に繊維芽細胞のビタミンＣ取込み（すなわち輸送）を大きく改善できることをも見いだした。
【００１０】
ところで、周知のようにビタミンＣ即ちＬ−アスコルビン酸は、哺乳類の細胞において種々のレベルで：
−その還元電位の低さ故の、特にミトコンドリア呼吸鎖が絶えず作りだす過酸化物に対する細胞の保護機構において作用する酸化防止剤、及び、
−Ｉ型及びＩＩＩ型コラーゲン合成に必須のヒドロキシラーゼ等の酵素の補助因子として関与する。
従って、ビタミンＣは、細胞の持ついくつかの生体内機能において極めて重要であり、このことから、細胞外媒質から細胞質内へのビタミンＣ輸送の重要性が理解される。しかし、ヒト細胞、特に皮膚細胞はこの分子を合成しない。食料により供給され、腸で吸収されて、血液が全組織に輸送する。血漿内濃度は通常約２５μＭである。高い親和性を有する蛋白質輸送体が、蛋白質の濃度勾配に逆らって細胞内にビタミンＣを取り入れる。
【００１１】
後者の発見により、皮膚細胞、特に繊維芽細胞のビタミンＣ取込みの改善が望まれる部位への塗布に好適に使用される新規の化粧用又は薬用組成物、特に皮膚科用組成物の開発が可能となった。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上述の現状に鑑み、皮膚細胞、特に繊維芽細胞のビタミンＣ取込みの改善が望まれる部位への塗布に好適に使用される新規の化粧用又は薬用組成物、特に皮膚科用組成物、並びに、ヒト皮膚培養細胞におけるコラーゲンＶＩＩ合成促進、及び／又は、上記細胞のビタミンＣ取込み促進をすることができる細胞培養液用組成物を提供することを目的とする。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明は、コラーゲンＶＩＩ合成促進及び／又は皮膚細胞のビタミンＣ取込み促進をすることができる、ベルトレティア抽出物を含有してなる化粧用組成物である。
本発明はまた、コラーゲンＶＩＩ合成欠乏による症状の治療に使用するための、ベルトレティア抽出物を含有してなる薬用組成物であり、更に、皮膚細胞のビタミンＣ取込み不足による症状の治療に使用するための、ベルトレティア抽出物を含有してなる薬用組成物でもある。
本発明は、更に、ヒト皮膚培養細胞におけるコラーゲンＶＩＩ合成促進、及び／又は、前記細胞のビタミンＣ取込み促進をすることができる、ベルトレティア抽出物を含有してなる細胞培養液用組成物でもある。
【００１４】
従って、本質的な特徴の１つによれば、本発明は、コラーゲンＶＩＩ合成促進及び／又は皮膚細胞、特に繊維芽細胞のビタミンＣ取込み促進を目的とする化粧剤としてのベルトレティア抽出物、好ましくはベルトレティア・エクセルサ抽出物の使用に関する。上記化粧剤は、化粧学的に許容される媒体を含有する化粧用組成物に配合することができ、上記抽出物はこれに溶解又は懸濁される。
【００１５】
第一の特徴によると、化粧剤がコラーゲンＶＩＩ合成の促進を目的とする場合、上記組成物は表皮−真皮接合の改善が望まれる部位への塗布に好適に使用される。この使用は、特にしわ防止製品、又は、皮膚の化学線老化、即ち放射線、特に太陽の放射する紫外線による老化を抑制する製品への使用を含む。一般に、上記第一の特徴によると、上記本発明の化粧用組成物は、肌引き締め用製品、特にゆるんだ皮膚や張りを失った皮膚に用いる製品として好適に使用される。
【００１６】
第二の特徴によると、上記化粧用組成物はまた、皮膚細胞のビタミンＣ取込みの改善を目的とすることができる。この効果は、細胞代謝の改善、特に種々のコラーゲン及びエラスチンの細胞内合成の活性化につながる。従って、ベルトレティア抽出物、好ましくはベルトレティア・エクセルサ抽出物は、ビタミンＣ取込みを促進することにより、特にその張りと弾力性を保持又は増加させ、しわの出現を遅らせて皮膚の状態を改善する。
【００１７】
以上二つの特徴のいずれかにおけるある態様によると、ビタミンＣ又はアスコルビン酸誘導体を更に含有し、局所使用を目的とする組成物に、上記化粧剤を配合する。
【００１８】
本発明は更に、表皮−真皮接合部の欠陥、特にコラーゲンＶＩＩ合成の欠乏による症状の治療を目的とする薬用組成物の製造のための上記ベルトレティア抽出物の使用に関する。
上記症状の例として、例えば、表皮水疱症が挙げられる。
【００１９】
本発明の別の態様によると、ベルトレティア抽出物は、皮膚細胞、特に繊維芽細胞のビタミンＣ取込み不足による症状の治療を目的とする薬用組成物、特に皮膚科用組成物の製造に用いられる。上記薬用組成物は、好ましくは薬学的に許容される媒体を含有するもので、上記ベルトレティア抽出物はこれに溶解又は懸濁される。
【００２０】
ある有利な様態によると、上記薬用組成物は、ビタミンＣ又はアスコルビン酸誘導体を更に含有する。このような組成物に含有されるベルトレティア抽出物は、ビタミンＣが欠乏する細胞の同化合物取込みを改善する効果を持つ。
【００２１】
ある態様によると、本発明の関与する種々の化粧用又は薬用組成物において、上記ベルトレティア抽出物は、この植物の樹皮の抽出物であり、好ましくはベルトレティア・エクセルサの幹の抽出物である。
【００２２】
別の様態によると、ベルトレティア抽出物は、ベルトレティアの果実すなわち木の実の抽出物である。好ましくはベルトレティア・エクセルサの木の実の果皮の抽出物が用いられる。
【００２３】
好ましくは、ベルトレティア抽出物は以下で示す方法により得られるが、決してこれらのみに限定されるものではない。最初の抽出は、水、好ましくは１〜４個の炭素原子を有するアルコール、好ましくは１〜２個の炭素原子を有する塩素系溶媒、好ましくは３〜６個の炭素原子を有する有機エステル、及び、これらの溶媒の混合物を基礎とする混合溶媒からなる群より好適に選択される極性溶媒を用いて、上記植物の樹皮又は木の実、好ましくは幹の樹皮又は木の実の果皮において行う。
【００２４】
上記最初の抽出に用いる溶媒は、水、メタノール、エタノール、メタノール／水の混合物又はエタノール／水の混合物、クロロホルム及びジクロロメタンからなる群より選択されるのがより好ましい。更に好ましくは上記溶媒は、水、メタノール、エタノール又はこれらの溶媒の混合物である。
【００２５】
本発明の最も好ましい抽出物は、ベルトレティア、更に好ましくはベルトレティア・エクセルサの木の実の果皮からの水抽出物である。
【００２６】
上記抽出溶媒に対する樹皮又は木の実、好ましくは木の実の果皮の比率は特に限定されず、通常は１：５〜１：２０重量部である。上記抽出は、一般に室温から使用溶媒の沸点までの温度で行う。
【００２７】
上記最初の抽出は、大気圧下で２〜４時間還流させて行うのが好ましい。また、上記抽出溶媒中で２〜４時間の低温浸漬により行うのも好ましい。
抽出終了後、抽出物を含む溶媒相をろ過し、減圧下で濃縮及び／又は蒸発・乾燥させて、本発明における最初のベルトレティア粗抽出物を得る。この粗抽出物は、当業者に周知の種々の方法により精製することができる。
【００２８】
ベルトレティア、特にベルトレティア・エクセルサの抽出物は、サポニンを多く含有する。また、上記抽出物、特にベルトレティア・エクセルサの木の実の果皮の抽出物は、水やメタノール等の使用する極性抽出溶媒の種類に関わらず、タンニン、中でもエラジタンニン及びガロタンニンを含有する。
【００２９】
サポニンを、本発明におけるベルトレティア抽出物に多く含有させることを望む場合には、以下に示す方法が用いられるが、決してこれに限定されるものではない。上記最初の抽出により得られた抽出物を蒸発乾燥させ、残滓をメタノールに溶解させる。この溶液をアセトンに注ぎ込み、生じた沈殿物をろ過により回収する。好ましくは、この沈殿物を乾燥後、脱塩水を用いて透析を行う。最後に抽出物を凍結乾燥することにより、サポニンを多く含有する本発明のベルトレティア乾燥抽出物が得られる。
上述した抽出過程は、特にベルトレティア・エクセルサ種に適用できる。
【００３０】
上記特徴のいずれにおいても、ベルトレティア抽出物、好ましくはベルトレティア・エクセルサ抽出物は、目的組成物の全重量に対して０．０００１〜１重量％の濃度で用いられるのが好ましい。より好ましくは、目的組成物の全重量に対して０．０１〜０．２５重量％の濃度である。
【００３１】
また上記特徴のいずれにおいても、本発明による組成物は、マデカシン酸（ｍａｄｅｃａｓｓｉｃ  ａｃｉｄ）、アシアチン酸（ａｓｉａｔｉｃ  ａｃｉｄ）、マデカソサイド（ｍａｄｅｃａｓｓｏｓｉｄｅ）、アシアチコサイド（ａｓｉａｔｉｃｏｓｉｄｅ）、α−１−プロテイナーゼ阻害剤、レチノイン酸等のコラゲナーゼ阻害剤、エラスターゼ阻害剤、リジン、プロリン、２−オキソグルタレート、ジンセノサイドＲ0 （ｇｉｎｓｅｎｏｓｉｄｅＲ0 ）、ビタミンＤ及びその誘導体、エクジステロイド特にβ−エクジソン、並びに、ビタミンＥからなる群より選択される有効物質を更に含有することが好ましい。
【００３２】
最後の特徴によると、本発明は更に、コラーゲンＶＩＩ合成の促進、又は、培養細胞、特にヒト皮膚細胞、中でも繊維芽細胞及び表皮ケラチン細胞のビタミンＣ取込みの改善を目的とする、ベルトレティア抽出物を有効量用いた組成物による上記培養細胞の培養方法に関する。上記本発明の培養細胞の培養方法は、人工皮膚製造の際に適用されるのがより好ましい。上記細胞は、基質に固定化されるとより素早く細胞外マトリックスを再構成し、表皮−真皮接合部の出現が促進される。
【００３３】
上記方法の実施の最良の形態では、培養液に対して０．１〜１０μｇ／ｍｌの濃度のベルトレティア抽出物を含有させて、培養細胞を処理する。
【００３４】
【発明の実施の形態】
本発明の他の目的、特徴及び利点については、いくつかの実施例についての以下の記述から明らかになるが、本発明はこれら実施例にのみ限定されるものではない。
実施例においては、他に記載がなければ、百分率は重量百分率で、抽出物の量は乾燥重量で表される。
【００３５】
実施例１
サポニンを多く含有する、ベルトレティア・エクセルサの幹の樹皮からのメタノール抽出物の製造
ベルトレティア・エクセルサの幹の樹皮をすりつぶして粉末状にし、得られた粉末４９ｇを５００ｍｌのメタノール中で２時間浸漬させた。この混合物を全て３時間還流し、放置冷却後にガラスフィルターにてろ過を行った。得られたろ液が本発明による最初の抽出物であり、以下においては抽出物Ｉ1 とする。この最初の抽出物を蒸発乾固し、１４．７ｇの残滓を１００ｍｌのメタノールに溶解させた。この溶液を５００ｍｌのアセトンに注ぎ込み、得られた沈殿物をろ過した。次に、この沈殿物を水酸化カリウム等の固形状脱水剤で乾燥させて、１．３３ｇの乾燥した抽出物を得た。次いで８３０ｍｇのこの抽出物を４日間、９ｍｌの脱塩水により透析したのち、凍結乾燥を行い、サポニンを多く含有する本発明の抽出物（抽出物Ｉ2 とする）１８２ｍｇを得た。
【００３６】
実施例２
ブラジリアン・ベルトレティア・エクセルサの木の実の果皮からのメタノール抽出物の製造
市販されているブラジリアン・ベルトレティア・エクセルサの木の実の果皮を集めてあらくすりつぶしたあと、粉砕した。得られた粉末状の果皮１００ｇを３０分間の還流下、１リットルのメタノールで連続的に３回抽出した。孔径０．４５μｍのろ紙を用いてそれぞれの抽出液をろ過し、３つの抽出液を合わせた。合わせた抽出液を回転式蒸発器を用いて濃縮し、乾燥した膜を得た。この膜を水で振盪し溶解させ、得られる乳状液を凍結乾燥した。これにより、サポニンを多く含有する本発明の果皮の抽出物（抽出物Ｉ3 とする）を５ｇ得た。この抽出物の収率は５％であった。
【００３７】
実施例３
水抽出物の製造
上述の粉末状の果皮を、沸騰水で３０分間かけて三度抽出し、３つの抽出液を合わせて孔径０．４５μｍのろ紙でろ過し、凍結乾燥させて光沢のある褐色の薄片を得た。最初の粉末／溶媒比は１／１０であった。抽出収率は８％であった。
【００３８】
実施例４
コラーゲンＶＩＩ合成促進の証明
以下の試験は、実施例２で得られた抽出物Ｉ3 を用いて行った。以下の試験は、遮光下で行った。
１．試験手順
ａ）表皮ケラチン細胞の由来
外科手術により得た健康な皮膚の検体から、培養健常人表皮ケラチン細胞（ＮＨＫ）を製作した。本試験は、顔の美容成形による４４歳白人女性由来の細胞株（名称はＨＫ４４歳）を用いて行った。美容成形による５６歳白人女性由来の、名称ＨＫ５６歳という他の細胞株を用いて、結果を確認した。
ｂ）培養条件
上記表皮ケラチン細胞を、完全に血清を含まない培地（名称ＳＦＭｃ、ギブコ（ＧＩＢＣＯ））で培養した。上記細胞を一次培養から一度、継代培養（名称Ｐ１）を行った。
【００３９】
ｃ）処理条件
ウェル当たりＮＨＫが３００００個の割合で９６穴培養プレートのＳＦＭｃに、上記細胞を接種した。培養したのち細胞の良好な接着に必要な２４時間経過後、表皮ケラチン細胞の増殖を制限するために、上記培地を２％に希釈したＳＦＭｃと取り替えた。実施例２により得られた抽出物（表Ｉでの名称Ｉ3 ）の保存ＤＭＳＯ溶液を、１、２．５及び５ｍｇ／ｍｌの濃度で使用前に速やかに製作し、試験培地に最終濃度が０．１ｖ／ｖ％（すなわち抽出物の濃度は１、２．５及び５μｇ／ｍｌ）で添加した。コントロールには、抽出物の賦形剤であるＤＭＳＯを０．１ｖ／ｖ％で添加した。ＸＴＴ生存度試験及び顕微鏡による細胞観察のいずれによっても、抽出物が１０μｇ／ｍｌ以下の濃度では、細胞毒性を示さなかった（ベーリンガーＸＴＴキット（ＢＯＥＨＲＩＮＧＥＲ  ＸＴＴ  Ｋｉｔ）、参照１４６５０１５）。
【００４０】
上記細胞を処理培地と７２時間接触させた。この時間は、以前の速度論研究において最適なコラーゲンＶＩＩ合成に必要とされた時間である。培養上澄み液を取り除き、分泌コラーゲンＶＩＩの定量分析を行った。細胞内蛋白質に対するコラーゲンＶＩＩの分泌量比を決定するために、ウェルに残留している細胞シートで蛋白質を定量分析した。３つの濃度とコントロール実験それぞれに対して、６つの培養ウェルを用意した。
【００４１】
ｄ）コラーゲンＶＩＩのＥＬＩＳＡ定量分析
ＥＬＩＳＡ法によるコラーゲンＶＩＩの定量分析手順は、コラーゲンＩの定量分析において用いたもの（Ｍ．デュマス、Ｃ．ショーダン、Ｆ．ボンテ、Ａ．メーベック、「イン・ビトロ・バイオシンセシス・オブ・タイプ・Ｉ・アンド・ＩＩＩ・コラーゲンズ・バイ・ヒューマン・ダーマル・フィブロブラスツ・フロム・ドナーズ・オブ・インクリーシング・エイジ、メカニズムス・オブ・エイジング・アンド・デベロプメント、１９９４年、７３巻、１７９〜１８７頁）を適用した。以下の修正を加えた。
−第一抗体：抗ヒトＶＩＩ型コラーゲンモノクロナールマウス抗体、イソタイプＩｇＧ１（ライフ・テクノロジーズ、参照１２０７３−０１１）。
−第二抗体：アルカリフォスファターゼと結合した抗全マウスＩｇＧヤギ抗体（エテルシム（Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ）、参照１１５−０５６−０６２）。
【００４２】
ｅ）結果と統計的説明
検量線を作成するために、市販のヒトＶＩＩ型コラーゲン不存在下で表皮ケラチン細胞によるコラーゲンＶＩＩ分泌の結果を、定量分析のコントロール抽出物の値を差し引いた吸光度単位（ＯＤ−ブランク）で表した。この値は、ウェル（７２時間培養）内の細胞蛋白質量当たりに合わせた。抽出物の活性度を以下の促進百分率により評価した：
〔（処理ＮＨＫのコラーゲンＶＩＩ−コントロールＮＨＫのコラーゲンＶＩＩ）／コントロールＮＨＫのコラーゲンＶＩＩ〕×１００
処理培養及びコントロール培養で得た結果を、不対のステューデント試験を用いて比較した。有意性の基準をｐ＜０．０５とした。
【００４３】
結果と結論
異なる培養での測定値の平均に基いた結果を以下の表１に示した。
【００４４】
【表１】
0003828996.tif 000002
【００４５】
以上の結果より、ベルトレティア・エクセルサ抽出物Ｉ3 は、アンカリングフィラメントの主要構成要素であるコラーゲンＶＩＩの合成を極めて強力に促進することが分かる。故にベルトレティア抽出物は、化粧用若しくは薬用組成物、又は、表皮−真皮接合部の改善を目的とする細胞培養液に好適に用いられる。
【００４６】
実施例５
アスコルビン酸輸送に対する効果の証明
５．１．材料と方法
ａ．繊維芽細胞の由来
培養健常人繊維芽細胞（ＮＨＦ）を、外科手術により得た健康な皮膚の検体から外植片法により得た。本試験は、顔の美容成形による５３歳白人女性由来の繊維芽細胞株を用いて行った。
ｂ．培養条件
２ｍｍｏｌ／ｌのＬ−グルタミンを添加したＥ１９９培地（Ｇｉｂｃｏ（ギブコ））（Ｅ１９９ｃ）に、１０％ｖ／ｖのウシ胎児血清（ギブコ）（ＦＣＳ）を添加し、上記繊維芽細胞を培養した。初代培養段階の繊維芽細胞株を使用した。
ｃ．抽出物の保存溶液の調整
実施例２で得られたベルトレティア・エクセルサの木の実の果皮からのメタノール抽出物Ｉ3 について、その溶解賦形剤と比較することによって、遮光下で試験を行った。抽出物の保存ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液を、５、２．５及び１ｍｇ／ｍｌの濃度で使用前に速やかに用意した。細胞培地に濃度０．１ｖ／ｖ％で各保存溶液を添加し、細胞の目的濃度を５、２．５及び１μｇ／ｍｌとする。ミトコンドリアのコハク酸デヒドロゲナーゼ活性の測定に基づいたＸＴＴ試験によると、上述の濃度ではＮＨＦにおいて細胞毒性を示さなかった。
【００４７】
ｄ．繊維芽細胞処理条件
ウェル当たり１３００００個のＮＨＦをマイクロタイタープレート（２４ウェル、ファルコン（ＦＡＬＣＯＮ））中の１０％ＦＣＳを添加したＥ１９９ｃ培地に接種した。培養２４時間後、上記培地をＦＣＳを含有しないＥ１９９ｃ培地と交換し、そこへ試験抽出物を指定の濃度で添加するか、又は、この抽出物の賦形剤のみを添加した（０．１ｖ／ｖ％のＤＭＳＯ）。細胞内の機能に及ぼすＤＭＳＯ固有の効果が存在しないことを実証するために、ＤＭＳＯを含有しないコントロールをさらに準備した。培養４８時間後、標識ビタミンＣのナトリウム塩（14Ｃ−Ｌ−アスコルビン酸ナトリウム）を用いてビタミンＣの細胞内輸送に関する実験を行った。
【００４８】
ｅ．繊維芽細胞への14Ｃ−Ｌ−アスコルビン酸輸送の実験条件
ウェルを無血清のＥ１９９ｃ培地を用いて３７℃で洗浄し、使用前に速やかに用意した14Ｃ−アスコルビン酸ナトリウム（アマーシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）参照：ＣＦ６２０、比放射活性は１４．１Ｃｉ／μｍｏｌ）１５０μｍｏｌ／ｌを含有する同培地０．５ｍｌを添加した。プレートを３７℃で２時間培養したのちに、培養液を除去し、細胞シートを無血清培地で洗浄して細胞外の放射能を全て取り除いた。６０％メタノールを５００μｌ／ウェル添加することにより繊維芽細胞の形質膜を透過性にし細胞内の物質を放出させた。細胞内14Ｃ−アスコルビン酸塩を含有している５００μｌの回収液は１０倍に濃縮し、ＨＰＬＣにより分析した。
【００４９】
ｆ．蛋白質の定量分析
細胞を透過性にした各ウェルの細胞シートに関して、０．１Ｍ水酸化ナトリウムに溶解させたＢＣＡ（ビシコニニン酸、シグマ（Ｓｉｇｍａ））法により蛋白質を定量分析した。ウシ血清アルブミン（シグマ）の検量線を用いて、５７０ｎｍで測定したＯＤから蛋白質のｎｇ量を得た。この値により蛋白質のμｇ当たりのアスコルビン酸塩の量を得ることが出来る。
ｇ．ＨＰＬＣによる14Ｃ−アスコルビン酸塩の定量分析
細胞内の14Ｃ−アスコルビン酸塩は、最初の14Ｃアスコルビン酸ナトリウムと保持時間が同一であるため、これにより確認することが出来る。その定量は、放射能検出器（バートホールド（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ））を用いて、対応するピークを積分することによって行った。カラムとしては、同じ固定相を充填したガードカラムにより保護されたシリカ−ＮＨ2 カラムを使用した。溶出液は、ｐＨ５．９５のリン酸緩衝液の７５％（ｖ／ｖ）グラジエントグレードのアセトニトリル（メルク（Ｍｅｒｃｋ））であった。細胞内外にある全放射活性は約９５％であった。
【００５０】
ｈ．結果及び統計的説明
14Ｃ−アスコルビン酸塩（14Ｃ−Ａｓｃと略記）の細胞内の量を、培養２時間後の蛋白質μｇ当たりのｐｍｏｌで表す。抽出物の活性（％）を表す際の補足的計算は以下のようにして行った。
【００５１】
【数１】
0003828996.tif 000003
【００５２】
処理及びコントロール培養について得られた結果を、不対ステュ−デントｔ試験により比較した。得られたｐ値を以下の表に示した。ｐ＝０．０５を有意性の基準に設定した。
【００５３】
５．２．結果
３種類の濃度で、６つのコントロール培養及び６つの処理培養を試験して、メタノール抽出物Ｉ3 の性質を実証した。抽出物を可溶する賦形剤ＤＭＳＯが、測定パラメーターに対する固有の影響を持たないことを前もって証明した。
ａ．14Ｃ−アスコルビン酸塩輸送に対するＤＭＳＯの影響
アスコルビン酸に対するＤＭＳＯの影響を以下の表２に示す。表２は、14Ｃ−アスコルビン酸塩の細胞内含量を表す。
【００５４】
【表２】
0003828996.tif 000004
【００５５】
結論：０．１％ｖ／ｖのＤＭＳＯは14Ｃ−アスコルビン酸塩の細胞内含量を有意には変更しない。
【００５６】
ｂ．14Ｃ−アスコルビン酸塩輸送に対する抽出物Ｉ3 の影響
以下の表３には抽出物Ｉ3 のＤＭＳＯ溶液で処理した場合の結果を示す。表３は、14Ｃ−アスコルビン酸塩の細胞内含量を表す。
【００５７】
【表３】
0003828996.tif 000005
【００５８】
結論
この実験より、抽出物Ｉ3 で処理した細胞での14Ｃ−アスコルビン酸塩細胞内含量の増加は明らかである（表３）。濃度が１μｇ／ｍｌの時にはこの増加は相当なものであり（＋５５％）、統計的に有意である（ｐ＝０．００５）。抽出物Ｉ3 は濃度が２．５及び５μｇ／ｍｌの場合にも14Ｃ−アスコルビン酸塩細胞内含量を有意に（それぞれｐ＝０．００３とｐ＝０．００１）増加させ（それぞれ５２％と７８％）、最大の効果は５μｇ／ｍｌの時である。
以上から、ベルトレティア抽出物は、繊維芽細胞のビタミンＣ取込みを非常に容易に促進する。
【００５９】
実施例６
皮膚のたるみに効く化粧用ケア組成物
ベルトレティア・エクセルサの木の実の果皮のメタノール抽出物
（実施例２）                                                ０．２ｇ
アシアチコサイド                                            ３ｇ
パルミチン酸ビタミンＡ                                      ０．０１ｇ
パルソールＭＣＸ（Ｐａｒｓｏｌ  ＭＣＸ）（登録商標）        ５ｇ
小麦蛋白質抽出物                                            ２ｇ
Ｏ／Ｗ型乳液の香料含有賦形剤                      合計１００ｇ
この組成物は皮膚のたるみを修正し、張りを回復した。六週間胸部に毎日塗布すると、組織を引き締め魅力的な外観になった。
【００６０】
実施例７
顔用しわ防止引き締めゲル
ベルトレティア・エクセルサ抽出物（実施例１）                ０．３ｇ
パルミチン酸ビタミンＡ                                      ０．０６ｇ
酢酸ビタミンＥ                                              ０．１ｇ
乳酸                                                        １．５ｇ
グリコール酸                                                ０．２ｇ
エタノール                                                  ５ｇ
ゲル状賦形剤                                        合計１００ｇ
このゲルは首と額にマッサージをしながら、完全に浸透するまで局所塗布した。六週間後にはしわが減少し張りを取り戻した。きめが細かくなり顔が明るくなった。
【００６１】
実施例８
基礎化粧品
ベルトレティア・エクセルサの木の実の果皮の水抽出物
（実施例３）                                                ０．３ｇ
センテラ・アシアチカ抽出物                                  ０．２ｇ
小麦セラミド                                                ０．２ｇ
小麦蛋白質                                                  ３ｇ
液状着色賦形剤                                      合計１００ｇ
この基礎化粧品は、即効性の引き締め効果を持ち、緩みがちな部分に深く作用した。
【００６２】
実施例９
皮膚科用乳液
ベルトレティア・エクセルサ抽出物（実施例１）                ０．５ｇ
パルミチン酸アスコルビル                                    ０．５ｇ
香料を含有しない乳化賦形剤                          合計１００ｇ
この皮膚科用調製品は表皮水疱症の治療する部位に局部塗布することができる。臨床的に改善の兆候が明らかに現れた。しかし、この組成物は、処方された場合で、厳格な医療指示下にある場合にのみ使用を限定しなければならなかった。