(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の物理化学的性質を示す新規生理活性物質ＮＡ２２５９８Ｂ１又はその薬理学上許容される塩
１）外観：無色粉末
２）分子量：５３２
３）分子式：Ｃ12Ｈ24Ｎ6 Ｏ5 
４）ＨＲＦＡＢ−ＭＳ：
Ｃ12Ｈ25Ｎ6 Ｏ5 の計算値：５３３．１８８６
実測値：５３３．１８９４
５）溶解性：
易溶：ジメチルスルホキシド、水
可溶：メタノール
不溶：ヘキサン、クロロホルム
６）シリカゲル薄層クロマトグラフィーによるＲｆ値：
ノルマルブタノール−酢酸−水（１２：３：５）の展開溶媒で０．０４を示す。
７）紫外部吸収スペクトル：水溶液中末端吸収を示す。
８）赤外部吸収スペクトル：
臭化カリウム錠剤で測定したスペクトルを図１に示す。
９）水素核磁気共鳴スペクトル（３００ＭＨｚ）：
重水中で測定したスペクトルを図２に示す。
１０）炭素核磁気共鳴スペクトル（７５ＭＨｚ，重水中）：
δ：１７８．６（ｓ），１５７．６（ｓ），１５７．２（ｓ），
７５．４（ｄ），７２．８（ｄ），５９．８（ｄ），５４．５（ｄ），
５２．８（ｄ），５１．７（ｔ），３７．２（ｔ），２９．４（ｔ），
２８．１（ｔ）ｐｐｍ
１１）呈色反応：
陽性：ニンヒドリン、ライドン・スミス
陰性：バニリン硫酸、ヨウ素
１２）塩基性、酸性、中性の区別：塩基性物質
【請求項２】
下記の物理化学的性質を示す新規生理活性物質ＮＡ２２５９８Ｂ２又はその薬理学上許容される塩
１）外観：無色粉末
２）分子量：５４８
３）分子式：Ｃ12Ｈ24Ｎ6 Ｏ6 
４）ＨＲＦＡＢ−ＭＳ：
Ｃ12Ｈ25Ｎ6 Ｏ6 の計算値：５４９．１８３６
実測値：５４９．１８４２
５）溶解性：
易溶：ジメチルスルホキシド、水
可溶：メタノール
不溶：ヘキサン、クロロホルム
６）シリカゲル薄層クロマトグラフィーによるＲｆ値：
ノルマルブタノール−酢酸−水（１２：３：５）の展開溶媒で０．０４を示す。
７）紫外部吸収スペクトル：水溶液中末端吸収を示す。
８）赤外部吸収スペクトル：
臭化カリウム錠剤で測定したスペクトルを図３に示す。
９）水素核磁気共鳴スペクトル（３００ＭＨｚ）：
重水中で測定したスペクトルを図４に示す。
１０）炭素核磁気共鳴スペクトル（７５ＭＨｚ，重水中）：
δ：１７７．７（ｓ），１５７．６（ｓ），１５７．２（ｓ），
７３．２（ｄ），７２．０（ｄ），６８．８（ｄ），５９．９（ｄ），
５７．４（ｄ），５２．８（ｄ），５１．６（ｔ），３７．４（ｔ），
３７．２（ｔ）ｐｐｍ
１１）呈色反応：
陽性：ニンヒドリン、ライドン・スミス
陰性：バニリン硫酸、ヨウ素
１２）塩基性、酸性、中性の区別：塩基性物質
【請求項３】
ストレプトミセス属に属し、請求項１または２項に記載の新規生理活性物質ＮＡ２２５９８Ｂ１又はＢ２を生産する能力を有する微生物を、培養し、培養物中に新規生理活性物質ＮＡ２２５９８Ｂ１又はＢ２を生産、蓄積せしめ、これを採取する事を特徴とする新規生理活性物質ＮＡ２２５９８Ｂ１又はＢ２の製造法。
【請求項４】
請求項１または２項に記載の新規生理活性物質ＮＡ２２５９８Ｂ１、Ｂ２又はそれらの薬理学上許容される塩を有効成分として含有する医薬。
【請求項５】
請求項１または２項に記載のＮＡ２２５９８Ｂ１、Ｂ２又はそれらの薬理学上許容される塩を有効成分とする制癌剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は新規生理活性物質ＮＡ２２５９８Ｂ１、Ｂ２又はそれらの薬理学上許容される塩、その製造法およびそれを有効成分とする医薬並びに制癌剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、制癌剤としては、アドリアマイシン、アクチノマイシン等が使用されている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
従来、使用されている制癌剤は効力、毒性などの点で不十分であり、また耐性などの問題もあり、新しい制癌剤が求められている。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
そこで発明者らは微生物の代謝産物について種々検索した結果、ストレプトミセス属に属する一菌株が新規生理活性物質ＮＡ２２５９８Ｂ１及びＢ２を産生すること及び該生理活性物質が優れた制癌活性を有することを見出した。
本発明は上記知見に基づいて完成されたものである。即ち本発明は新規生理活性物質ＮＡ２２５９８Ｂ１、Ｂ２又はそれらの薬理学上許容される塩及びこれを有効成分とする医薬並びに制癌剤に関するものである。
【０００５】
以下に新規生理活性物質ＮＡ２２５９８Ｂ１及びＢ２の物理化学的性質を示す。
ＮＡ２２５９８Ｂ１
１）外観：無色粉末
２）分子量：５３２
３）分子式：Ｃ12Ｈ24Ｎ6 Ｏ5 
４）ＨＲＦＡＢ−ＭＳ：
Ｃ12Ｈ25Ｎ6 Ｏ5 の計算値：５３３．１８８６
実測値：５３３．１８９４
５）溶解性：
易溶：ジメチルスルホキシド、水
可溶：メタノール
不溶：ヘキサン、クロロホルム
６）シリカゲル薄層クロマトグラフィーによるＲｆ値：
ノルマルブタノール−酢酸−水（１２：３：５）の展開溶媒で０．０４を示す。
７）紫外部吸収スペクトル：水溶液中末端吸収を示す。
８）赤外部吸収スペクトル：
臭化カリウム錠剤で測定したスペクトルを図１に示す。
９）水素核磁気共鳴スペクトル（３００ＭＨｚ）：
重水中で測定したスペクトルを図２に示す。
１０）炭素核磁気共鳴スペクトル（７５ＭＨｚ，重水中）：
δ：１７８．６（ｓ），１５７．６（ｓ），１５７．２（ｓ），
７５．４（ｄ），７２．８（ｄ），５９．８（ｄ），５４．５（ｄ），
５２．８（ｄ），５１．７（ｔ），３７．２（ｔ），２９．４（ｔ），
２８．１（ｔ）ｐｐｍ
１１）呈色反応：
陽性：ニンヒドリン、ライドン・スミス
陰性：バニリン硫酸、ヨウ素
１２）塩基性、酸性、中性の区別：塩基性物質
【０００６】
ＮＡ２２５９８Ｂ２
１）外観：無色粉末
２）分子量：５４８
３）分子式：Ｃ12Ｈ24Ｎ6 Ｏ6 
４）ＨＲＦＡＢ−ＭＳ：
Ｃ12Ｈ25Ｎ6 Ｏ6 の計算値：５４９．１８３６
実測値：５４９．１８４２
５）溶解性：
易溶：ジメチルスルホキシド、水
可溶：メタノール
不溶：ヘキサン、クロロホルム
６）シリカゲル薄層クロマトグラフィーによるＲｆ値：
ノルマルブタノール−酢酸−水（１２：３：５）の展開溶媒で０．０４を示す。
７）紫外部吸収スペクトル：水溶液中末端吸収を示す。
８）赤外部吸収スペクトル：
臭化カリウム錠剤で測定したスペクトルを図３に示す。
９）水素核磁気共鳴スペクトル（３００ＭＨｚ）：
重水中で測定したスペクトルを図４に示す。
１０）炭素核磁気共鳴スペクトル（７５ＭＨｚ，重水中）：
δ：１７７．７（ｓ），１５７．６（ｓ），１５７．２（ｓ），
７３．２（ｄ），７２．０（ｄ），６８．８（ｄ），５９．９（ｄ），
５７．４（ｄ），５２．８（ｄ），５１．６（ｔ），３７．４（ｔ），
３７．２（ｔ）ｐｐｍ
１１）呈色反応：
陽性：ニンヒドリン、ライドン・スミス
陰性：バニリン硫酸、ヨウ素
１２）塩基性、酸性、中性の区別：塩基性物質
【０００７】
本発明において、新規生理活性物質ＮＡ２２５９８Ｂ１及びＢ２はその薬理学上許容される塩としても良く、酸またはアルカリと塩を形成してもよい。かかる塩としては、塩酸、硫酸、硝酸などの無機塩；ｐ−トルエンスルホン酸、クエン酸、コハク酸などの有機酸等との酸付加塩があげられる。またナトリウム、カリウムなどのアルカリ金属；カルシウムなどのアルカリ土類金属との塩があげられる。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明における新規生理活性物質ＮＡ２２５９８Ｂ１及びＢ２は、これを生産する能力を有するストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する微生物を培養し、培養物からこれを採取することにより得ることが出来、例えば本発明者らが分離したストレプトミセス  エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｓｐ．）ＮＡ２２５９８株（工業技術院生命工学工業技術研究所  受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１４６８６）は、本発明に最も有効に使用される菌株の一例である。ストレプトミセスエスピーＮＡ２２５９８株の菌学的性質については特開平０９−０４８７９１号公報に記載されている。
【０００９】
本発明に用いるストレプトミセス属に属する菌株は他のストレプトミセス属の菌株と同様、その性状が変化しやすく、例えば、紫外線、エックス線および薬品などを用いる人工的な変異手段で容易に変異しうるものであり、どの様な変異株であっても本発明の対象とする生理活性物質ＮＡ２２５９８Ｂ１及びＢ２の生産能を有するものは、すべて本発明に使用する事ができる。
【００１０】
本発明によりＮＡ２２５９８Ｂ１及びＢ２を製造するには、まず前記菌株を放線菌が利用し得る栄養物を含有する培地で好気的に培養する。栄養源としては、従来から放線菌の培養に利用されている公知のものが使用でき、例えば炭素源としてはグルコース、フラクトース、グリセリン、シュークロース、デキストリン、ガラクトース、有機酸などを単独かまたは組み合わせて用いることができる。
【００１１】
無機および有機窒素源としては塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、尿素、硝酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、乾燥酵母、コーン・スチープ・リカー、大豆粉、綿実油カス、カザミノ酸、バクトソイトン、オートミールなどを単独または組み合わせて用いることができる。
【００１２】
その他必要に応じて塩化ナトリウム、炭酸カルシウム、硫酸マグネシウム、硫酸銅、硫酸鉄、硫酸亜鉛、塩化マンガン、燐酸塩などの無機塩類を加えることができるほか有機物、例えばアミノ酸類、ビタミン類、核酸類や無機物を適当に添加することができる。培養法としては液体培養法、特に深部攪拌培養法が最も適している。培養温度は２０℃〜４５℃、ｐＨは微酸性ないし微アルカリ性で培養を行うことが望ましい。
【００１３】
液体培養では通常３〜５日間培養を行うとＮＡ２２５９８Ｂ１及びＢ２物質が培養液中に生成蓄積される。培養液中の生成量が最大に達したときに培養を停止し、ろ液と菌体とに分離し、ろ液より目的物を精製単離する。ろ液からの本物質の精製単離には一般に微生物代謝産物をその培養ろ液から単離するために用いられる分離精製の方法が利用される。
【００１４】
即ち、培養物をろ過法によりろ液と菌体とに分離する。ろ液を適当な吸着剤、例えば活性炭、Ｓｅｐａｂｅａｓ  ＳＰ−２０７（Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）、Ｄｏｗｅｘ  ５０Ｗｘ８（Ｈ+ ）（Ｄｏｗ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＣＧ−５０（Ｈ+ ）（オルガノ社）への直接吸着によって本物質を培養ろ液から分離できる。ＮＡ２２５９８Ｂ１及びＢ２は、これらの吸着剤から、水、メタノール、アセトン、またはこれらの適当な混合液あるいは、酸性ないしアルカリ性溶液のような移動相を用いて溶出させることができる。
【００１５】
上記の活性溶出液を濃縮し、ＮＡ２２５９８Ｂ１及びＢ２を含む油状物質を得る。この粗物質はさらに水溶性物質の精製に通常用いられる公知の方法、例えば、１）Ｓｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０、またはＧシリーズ（ＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ）により溶出液として水、メタノールまたはこれらの適当な混合液あるいは、酸性ないしアルカリ性溶液を用いたゲルろ過クロマトグラフィー。２）Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＣＧ−５０（ＮＨ4 + ）（オルガノ社）を用い、溶出液をアンモニア水としたイオン交換クロマトグラフィー。３）ＣＭ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｃ−２５（ＮＨ4 + ）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用い、溶出液を塩化アンモニウム水溶液としたイオン交換ゲルクロマトグラフィー。４）ＱＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｃ−２５（Ｃｌ- ）（ＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ）を用い、溶出液を塩化アンモニウム水溶液としたイオン交換ゲルクロマトグラフィーによる精製法を単独あるいは組み合わせることにより精製する。精製に好適な例として、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＣＧ−５０（ＮＨ4 + ）を用い、アンモニア水のグラジエント溶出（０〜０．５Ｎ）を行い、活性画分を濃縮、凍結乾燥する。さらに、ＣＭ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｃ−２５（ＮＨ4 + ）を用い、塩化アンモニウム水溶液のグラジエント溶出（０〜１．０Ｍ）を行い、得られた活性画分を活性炭、あるいはＤｏｗｅｘ  ５０Ｗｘ２（Ｈ+ ）などを用いて脱塩し、凍結乾燥し、ＮＡ２２５９８Ｂ１及びＢ２を無色粉末として得ることができる。
【００１６】
本発明の新規生理活性物質ＮＡ２２５９８Ｂ１及びＢ２並びにそれらの薬理学上許容される塩は、制癌作用を示すので、制癌剤などの医薬として利用できる。
医薬品として使用する場合の製剤化および投与方法は従来公知の種々の方法が適用できる。すなわち、投与方法として注射、経口、直腸投与などが可能である。製剤形態としては注射剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤、座薬などの形態がとりうる。
【００１７】
製剤化の際に新規生理活性物質ＮＡ２２５９８Ｂ１及びＢ２並びにそれらの薬理学上許容される塩に悪影響を与えない限り、医薬用に用いられる種々の補助剤、すなわち、担体やその他の助剤、例えば安定剤、防腐剤、無痛化剤、乳化剤が必要に応じて使用されうる。
製剤において、新規生理活性物質ＮＡ２２５９８Ｂ１及びＢ２並びにそれらの薬理学上許容される塩の含量は製剤形態等により広範囲に変えることが可能であり、一般に新規生理活性物質ＮＡ２２５９８Ｂ１及びＢ２を０．０１〜１００％（重量）、好ましくは０．１０〜７０％（重量）含有し、残りは通常医薬品に使用される担体その他補助剤からなる。
【００１８】
新規生理活性物質ＮＡ２２５９８Ｂ１及びＢ２並びにそれらの塩の投与量は症状等により異なるが、成人１人１日当たり０．０１〜８００ｍｇ程度である。連投を必要とする場合には１日当たり使用量抑えることが望ましい。
【００１９】
【実施例】
以下本発明の実施例を示すが、これは単なる一例示であって何等本発明を限定するものではなく、種々の変法が可能である。
【００２０】
（１）発酵
ロータリー型振盪機用５００ｍｌ容三角フラスコにグリセリン２．０％、アジプロン（味の素社製）２．０％、塩化ナトリウム０．３％の培地（ｐＨ７．０）１００ｍｌを分注し、１２０℃、２０分間オートクレーブ滅菌した。これに新規生理活性物質ＮＡ２２５９８Ｂ１及びＢ２の生産菌であるＮＡ２２５９８株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１４６８６）の１白金耳を接種し、２７℃、２２０回転／分、２日間振盪し、種培養とした。
【００２１】
本培養はロータリー型振盪機用５００ｍｌ容三角フラスコにガラクトース２．０％、デキストリン（赤玉Ｎｏ．３）２．０％、バクトソイトン１．０％、コーン・スチープ・リカー０．５％、硫酸アンモニウム０．２％、炭酸カルシウム０．２％の培地（ｐＨ７．４）１００ｍｌを分注し、１２０℃、２０分間オートクレーブ滅菌したフラスコに前記種培養液１ｍｌを移植し、２７℃、２２０回転／分の条件下で５日振盪培養を行った。培養液を吸引ろ過し、ろ液と菌体とに分別した。
【００２２】
（２）精製
得られたろ液（３５Ｌ）をＤｏｗｅｘ  ５０Ｗｘ８（Ｈ+ ）  ４Ｌに吸着させ、２．８％アンモニア水で溶出した。これを濃縮後、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＣＧ−５０（Ｈ+ ）  ０．８Ｌに吸着し、２．８％アンモニア水で溶出した。これを濃縮、凍結乾燥しメタノールを加え、メタノール可溶物を除き、残ったメタノール不溶物の一部（１０．５ｇ）をＡｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＣＧ−５０（ＮＨ4 + ）１．９Ｌに吸着し、０〜０．５Ｎのアンモニア水（８．５Ｌ）のリニアグラジエント溶出を行い、活性画分を得た。この活性画分（５１９ｍｇ）をＣＭ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｃ−２５（ＮＨ4 + ）  ０．４Ｌに吸着し、０．０５〜１．０Ｍの塩化アンモニウム溶液（３．６Ｌ）のリニアグラジエント溶出を行い、ふたつの粗活性画分（Ｆｒ．１３８〜１４０及びＦｒ．１４６〜１４９）を得た。それぞれをＤｏｗｅｘ  ５０Ｗｘ２（Ｈ+ ）  ４０ｍｌに吸着し、２．８％のアンモニア水で溶出した後、凍結乾燥を行い、ＮＡ２２５９８Ｂ１（８．４ｍｇ），Ｂ２（１１．８ｍｇ）の無色粉末を得た。
【００２３】
これらの新規生理活性物質ＮＡ２２５９８Ｂ１及びＢ２について、それぞれ赤外部吸収スペクトル及び水素核磁気共鳴スペクトルを測定し、図１〜４に示すスペクトルを得た。また、これらの新規生理活性物質は、それぞれ、前記した通りの物理化学的性質を示した。
【００２４】
【作用】
１．細胞増殖抑制活性
新規生理活性物質ＮＡ２２５９８Ｂ１及びＢ２のヒト卵巣癌細胞（Ａ２７８０）に対する増殖抑制活性を検討した。
ヒト卵巣癌細胞を２×１０4 個／ｍｌの割合で９６穴テストプレートに２００μｌ接種し、３７℃、５％  ＣＯ2 インキュベーター内で２４時間培養した後、新規生理活性物質ＮＡ２２５９８Ｂ１及びＢ２をそれぞれ種々の濃度で培養液に添加した。添加７２時間後、生細胞数をＭＴＴ法により測定し、その吸光度から５０％増殖阻害濃度（ＩＣ50）を求めた。
結果を表１に示した。
【００２５】
【表１】
0003819132.tif 000002
【００２６】
２．細胞増殖抑制活性
新規生理活性物質ＮＡ２２５９８Ｂ１及びＢ２のヒト大腸癌細胞（ＤＬＤ１）に対する増殖抑制活性を検討した。
ヒト大腸癌細胞を３．７×１０4 個／ｍｌの割合で９６穴テストプレートに１３５μｌ接種し、３７℃、５％  ＣＯ2 インキュベーター内で数時間培養した後、新規生理活性物質ＮＡ２２５９８Ｂ１及びＢ２をそれぞれ種々の濃度で培養液に添加した。添加９６時間後、生細胞数をＭＴＴ法により測定し、その吸光度から５０％増殖阻害濃度（ＩＣ50）を求めた。
結果を表２に示した。
【００２７】
【表２】
0003819132.tif 000003
【００２８】
【発明の効果】
これらの表１および表２に示した様に、新規生理活性物質ＮＡ２２５９８Ｂ１及びＢ２並びにそれらの塩は、ヒト卵巣癌細胞（Ａ２７８０）およびヒト大腸癌細胞（ＤＬＤ１）に対して強い増殖抑制活性を有し、制癌効果を示し、制癌剤などの医薬として使用できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＮＡ２２５９８Ｂ１の臭化カリウム錠剤で測定した赤外部吸収スペクトル
【図２】ＮＡ２２５９８Ｂ１の重水中（３００ＭＨｚ）で測定した水素核磁気共鳴スペクトル
【図３】ＮＡ２２５９８Ｂ２の臭化カリウム錠剤で測定した赤外部吸収スペクトル
【図４】ＮＡ２２５９８Ｂ２の重水中（３００ＭＨｚ）で測定した水素核磁気共鳴スペクトル
【図１】
0003819132.tif 000004
【図２】
0003819132.tif 000005
【図３】
0003819132.tif 000006
【図４】
0003819132.tif 000007