(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
多孔質体表面にカルボキシル基または硫酸基を有する化合物を有し、グロブリン特性値が０．２ｍｇ／ｍｌ以上２０ｍｇ／ｍｌ以下である、糖脂質抗体吸着材。
【請求項２】
アニオン性基量が２μｅｑ／ｍｌ以上６０μｅｑ／ｍｌ以下である請求項１記載の糖脂質抗体吸着材。
【請求項３】
グロブリン特性値が３ｍｇ／ｍｌ以上１２ｍｇ／ｍｌ以下である請求項１記載の糖脂質抗体吸着材。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、体液より糖脂質抗体を簡便にしかも効率良く吸着除去するための体外循環治療用の吸着材に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ギラン・バレー症候群、ミラー・フィッシャー症候群等の免疫性神経障害では、糖脂質抗体の内のガングリオシドに対する抗体（抗ガングリオシド抗体）の患者血漿中での量が症状と相関し、血漿交換療法等により糖脂質抗体を除去することが治療上有効であることが報告されている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
抗ガングリオシド抗体の吸着材としてイムソーバＴＲ−３５０、ＰＨ−３５０（いずれも旭メディカル社製）が検討され、ＴＲ−３５０が抗ガングリオシド抗体の吸着能力を有することが報告されている（神経学会（１９９５．５．１７〜１９）、結城による）。しかし一方で、同じイムソーバＴＲ−３５０が抗ガングリオシド抗体はほとんど吸着しなかったとの報告もあり（神経学会（１９９５．５．１７〜１９）、中谷ら）、安定にしかも充分な量の抗ガングリオシド抗体を吸着できるものではなかった。
しかもイムソーバＴＲ−３５０はフィブリノーゲンを非常に高率に吸着することが知られており、加えて本発明者らの研究によると血液凝固第ＸＩＩ因子、高分子量キニノーゲンを非特異的にしかも効率良く吸着することがわかった。実際、ＴＲ−３５０での体外循環施行時には吸着によるタンパクの損失が有り、頻回に使用する場合は蛋白質の補給が必要となる場合があった。このためフィブリノーゲンや血液凝固第ＸＩＩ因子、高分子量キニノーゲンの吸着が少なく、糖脂質抗体の高い吸着能を有する、糖脂質抗体のより選択的な吸着材が求められている。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らはフィブリノーゲンや血液凝固第ＸＩＩ因子、高分子量キニノーゲンの非特異吸着が少なく、安定にしかも充分な量の糖脂質抗体を簡便にしかも効率よく吸着除去するための体外循環治療用の吸着材を得るべく鋭意研究した結果、本発明を成すに至った。
即ち本発明は、多孔質体表面に、アニオン性基を有する化合物を、好ましくは、アニオン性基量で２μｅｑ／ｍｌ以上６０μｅｑ／ｍｌ以下有し、グロブリン特性値が０．２ｍｇ／ｍｌ以上２０ｍｇ／ｍｌ以下である糖脂質抗体吸着材に関するものである。
本発明でいう糖脂質とは、極性基として糖をもつ複合脂質をいう。具体的に例示すると中性スフィンゴ糖脂質、酸性スフィンゴ糖脂質、中性グリセロ糖脂質、酸性グリセロ糖脂質等があげられるがこれらに限定されない。
本発明でいう糖脂質抗体は該糖脂質との結合性を有する抗体をいい、ＩｇＧ、ＩｇＭ等抗体のクラスにはよらない。いずれの糖脂質に対する抗体であっても良いが、臨床上特に酸性スフィンゴ糖脂質、更に特定するならばモノシアロ、ジシアロ、トリシアロ、テトラシアロ等のガングリオシドに対する抗体がより有用である。
本発明者らの研究によると、糖脂質抗体の吸着には水不溶性多孔質体表面の化合物のアニオン性基が関与しているのであるが、同時にこのアニオン性基は吸着材表面の親水性度との相互作用により、フィブリノーゲンや血液凝固第ＸＩＩ因子、高分子量キニノーゲンとの結合にも関与しており、これら蛋白等の共存物質の非特異吸着が、抗ガンブリオシド抗体吸着と競合し、抗ガンブリオシド抗体の吸着を阻害する場合があることがわかった。そこでアニオン性基量について詳細に検討した結果、驚くべきことに吸着材表面の親水性度を厳密な範囲に特定した時、糖脂質抗体を充分に吸着しつつ、且つフィブリノーゲンや血液凝固第ＸＩＩ因子、高分子量キニノーゲンの吸着が格段に少ない安定領域が存在することを見いだし、本発明を成すに至った。
【０００５】
アニオン性基の量
多孔質体表面のアニオン性基の量は、吸着材としての容積１ｍｌ当たり３０μｅｑ（以下３０μｅｑ／ｍｌと表す）以下では糖脂質抗体の吸着力が低下し、特にアニオン性基の量が２μｅｑ／ｍｌ未満では吸着能力は極端に低下する。一方アニオン性基の量が５５μｅｑ／ｍｌ以上ではフィブリノーゲンの吸着が大きくなり、血液凝固第ＸＩＩ因子や高分子量キニノーゲンの吸着もまた増加してくる。特にアニオン性基の量が６０μｅｑ／ｍｌを超えるとフィブリノーゲンや血液凝固第ＸＩＩ因子、高分子量キニノーゲンの吸着が非常大きくなり好ましくない。
好ましいアニオン性基の量は、中性塩分解法で測定する時２μｅｑ／ｍｌ以上６０μｅｑ／ｍｌ以下である。更に３０μｅｑ／ｍｌ以上５５μｅｑ／ｍｌ以下であることがより好ましい。
【０００６】
アニオン性基を有する化合物
本発明でいうアニオン性基を有する化合物とは、カルボキシル基、硫酸基、リン酸基等中性の水溶液中で陰性荷電を示す官能基を有する化合物をいい、化合物中のアニオン性基の数はいずれであってもよい。アニオン性基を有する化合物の一部を例示すると、アスパラギン酸、グルタミン酸、チロシン等のアミノ酸、或いはアミノ酸誘導体、タウリン、デキストラン硫酸、コンドロイチン硫酸、ヘパリン等の硫酸基を有する糖類、アクリル酸、スチレンスルフォン酸、エチレンスルフォン酸、等の合成物及びこれらを構成成分として有する高分子体等の合成化合物等が例示できる。また多孔体を構成する高分子鎖に直接アニオン性の官能基を保持せしめたものを含む。
【０００７】
吸着材表面の親水性度
本発明でいう吸着材表面とは、多孔質体表面とアニオン性基を有する化合物、或いは被覆層等を有する場合は被覆層等も含めた、実使用時の吸着材としてフィブリノーゲン等の蛋白質との接触面をいう。吸着材表面の親水性度は、多孔質体表面或いは被覆層等を有する場合は被覆層と、アニオン性基を有する化合物との両者の相乗効果によって決まり、個々に定義することは困難である。
本発明者らの研究によると、吸着材表面の親水性度はグロブリン特性値で表すことができる。グロブリン特性値はヒトγグロブリン（コーンのフラクションＩＩ、ＩＩＩ）水溶液と吸着材とを接触させた時のγグロブリン濃度の変化率より求めることができる。
グロブリン特性値の測定にあたり、まずヒトγグロブリン（コーンフラクションＩＩ、ＩＩＩ、純度約９９％）を精密に量り、ＰＢＳ（−）で３．０ｍｇ／ｍｌ濃度に溶解した液を試験液とする。吸着材１容と試験液１０容とをフラスコ中で、３７℃９０分間浸透下で混和する。３０００ｒｐｍ、５分間遠心分離して上清を回収する。試験液と上清それぞれの２８０ｎｍでの吸光度を測定し、試験液に対する上清の吸光度の低下率を求めて、試験液の濃度より吸着材１ｍｌあたりに吸着したヒトγグロブリン量を計算し、これをグロブリン特性値と定義する。
グロブリン特性値が吸着材１ｍｌ当たり３ｍｇ（３ｍｇ／ｍｌと表す）以下では糖脂質抗体の吸着能力が低下し、特に０．２ｍｇ／ｍｌ未満ではアニオン性基の量によらず常に糖脂質抗体の吸着性をほとんど示さない。一方グロブリン特性値が１２ｍｇ／ｍｌ以上ではアニオン性基の量によらずに、フィブリノーゲンや血液凝固第ＸＩＩ因子、高分子量キニノーゲンの吸着が大きく好ましくない。更に、グロブリン特性値が２０ｍｇ／ｍｌを超えるとフィブリノーゲンや血液凝固第ＸＩＩ因子、高分子量キニノーゲンをほぼすべて吸着してしまうため好ましくない。
糖脂質抗体の吸着能力を維持したままフィブリノーゲン等の非特異吸着を抑制できる好ましい親水性度は、グロブリン特性値で０．２ｍｇ／ｍｌ以上２０ｍｇ／ｍｌ以下である。特に３ｍｇ／ｍｌ以上１２ｍｇ／ｍｌ以下である時最も好ましい。
【０００８】
多孔質体
本発明でいう多孔質体とは常温の水溶液中で固体状態にある、多数の孔構造を有するものをいい、いずれの形状であってもよい。形状を例示すると球状、粒状、チップ状、繊維状、平膜状、スポンジ状等があり、繊維状のものとしては繊維を単に束ねたものや織布状、不織布状、中空糸状のものなどがあげられる。これらの内、細密充填のしやすさ、アニオン性基を有する化合物を比較的均質に表面に保持させやすい点、実有効表面積を比較的多く確保できる点、及び体液循環時の体液の流通面より、球状及び粒状のものが好ましい。この時球状または粒状の平均粒径は、１０μｍから２５００μｍのものが使いやすいが、２５μｍから１０００μｍの範囲が好ましく、より好ましくは５０μｍから６００μｍである。
多孔質体の孔のサイズは、糖脂質抗体の吸着能力を確保するためには排除限界分子量で表すとき５０万以上であることが望ましい。特にＩｇＭ型の糖脂質抗体を十分に吸着できるためには１００万以上であることがより好ましい。
吸着能力は表面積によって大きく影響する。表面積が大きいと吸着能力は上がり、小さいと下がることは自明である。このため本発明の吸着材は、全細孔表面積が０．５ｍ2 ／ｍｌ以上であることが好ましい。より好ましくは１．０ｍ2 ／ｍｌ以上である。また、多孔質体表面の水酸基密度が多孔質体乾燥重量１ｇあたり６．５ｍｅｑ以上、２０ｍｅｑ以下である時、アニオン性基を有する化合物による影響をあまり受けずに吸着材表面の至適な親水性度を比較的得やすく、好ましい。
多孔質体の材質は、表面にアニオン性基を有する化合物を保持できるものであれば、無機化合物、有機化合物を問わないが、体液との接触時に溶出物が少ないこと、多孔体の細孔の制御がより容易且つ精密にできることより、有機高分子化合物が好ましい。
このような例としては、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリメタクリレートエステル、ポリアクリレートエステル、ポリアクリル酸、ポリビニルアルコール等のビニル系化合物の重合体及び共重合体、ナイロン６或いは６６等のポリアミド系化合物、ポリエチレンテレフタレート等のポリエステル系化合物、セルロース等の植物由来の多糖類系化合物等を例示することができる。
本発明において用いられる多孔質体の材料は、アニオン性基を有する化合物を保持できるものであれば以上に限定されるものではない。例示した中では、重合の容易さ、アニオン性基を有する化合物の導入の容易さより、ビニル系化合物の重合体及び共重合体がより好ましく用いられる。このような例としては、スチレン、酢酸ビニル、ビニルアルコール、アクリル酸、メタクリル酸、或いはこれらの誘導体があげられ、ジビニルベンゼン、トリアリルイソシアヌレート等の架橋性化合物との共重合体が強度的安定性の点より、より好ましい。
この中で特に好ましい例としては、化学的に安定で、且つ容易に官能基を導入できること、球形の５０μｍから１０００μｍ程度の各種粒子径、孔径の多孔体粒子をつくれることより、酢酸ビニルとトリアリルイソシアヌレートとの共重合体や、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体などがあげられる。
【０００９】
多孔質体表面にアニオン性基を有する化合物を保持させる方法
多孔質体表面にアニオン性基を有する化合物を保持させる方法には、アニオン性基を有する化合物を溶解した液中に浸漬、あるいは該液を噴霧することによってコーティングする方法、化学的に或いは放射線や電子線を用いてのグラフト法によって多孔質体表面にアニオン性基を有する化合物を共有結合する方法、或いは化学的方法により多孔質体表面の官能基を介して共有結合する方法などがある。この中でグラフト法、官能基を介しての共有結合法が使用時のアニオン性基を有する化合物の溶出の危険性がなく、好ましい。多孔質体が被覆層を有する場合はその被覆層表面に不溶化することもできる。
多孔質体或いはその被覆層表面に官能基を得る方法の１例としてはハロゲン化シアン法、エピクロルヒドリン法、ビスエポキシド法、ブロモアセチルブロミド法、ハロゲン化アセトアミド法等が知られている。具体的にはアミノ基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、チオール基、酸無水物基、サクシニルイミド基、置換性ハロゲン基、アルデヒド基、アミド基、エポキシ基、トレシル基などがあげられる。
この中で加熱滅菌時の安定性、官能基の導入のしやすさ、アニオン性基を有する化合物の導入時のｐＨや反応温度が比較的温和な条件で行えることより、エピクロルヒドリン法やハロゲン化アセトアミド法が特に好ましい例としてあげられる。
【００１０】
容器形状
本発明の吸着材は、体液の導出入口を備えた容器内に充填保持された吸着器として使用されるのが一般的である。本吸着材を単独で充填しても良く、他の吸着材と混合もしくは、積層してもよい。吸着器の容量は、体外循環に用いる場合１０ｍｌから１０００ｍｌ程度が適当である。
吸着器は使用に先立って一般に滅菌処理することができる。滅菌処理の方法は、湿潤状態での熱滅菌（オートクレーブ）、γ線等による放射線、紫外線或いは電子線による滅菌、或いは活性酸素による滅菌などが例示できいずれの方法であってもよいが、一般に熱滅菌が汎用される。
該吸着器を体外循環で用いる場合には、大略次の二通りの方法がある。１つには、体内から取り出した血液を遠心分離もしくは膜型血漿分離器を使用して、血漿成分と血球成分とに分離して後、血漿成分を吸着器に通過させ浄化した後、血球成分と合わせて体内に戻す方法であり、他の１つは、体内から取り出した血液を直接吸着器に通過させ、浄化する方法である。この内、血漿成分を吸着器に通過させて浄化する血漿浄化法が、吸着器内での流れ抵抗が少なく、総吸着能力も高くできるためより好ましい。また、体液の通過方法としては、使用上の必要に応じ、或いは設備の装置状況に応じて、連続的に通過してもよいし、また断続的に通液してもよい。
【００１１】
【実施例１】
酢酸ビニルとトリアリルイソシアヌレートとを重量％で７５対２５で仕込み、ヘプタノール、リン酸緩衝水溶液中での懸濁重合法により、６０℃１６時間重合反応を行い、ポリ酢酸ビニル製の球状の多孔質体を得た。多孔質体は、平均粒子径９８μｍ、排除限界分子量約１３５万、窒素吸着法（ＢＥＴ法）による表面積が１９．８ｍ2 ／ｍｌであった。また、ケン化後の多孔質体表面の水酸基密度は、多孔質体乾燥重量１ｇあたり７．２ｍｅｑであった。
この多孔質体に、水酸化ナトリウムを含むジメチルスルフォキシド中でエピクロルヒドリンを用いて３０℃５時間反応させてエポキシ基を導入し、活性化多孔質体を得た。
次にｐＨ９．８の炭酸緩衝液中で、多孔質体湿潤状態での容積１ｍｌあたり１２ｍｇのトリプトファンを反応させ、トリプトファンのアミノ基と多孔質体のエポキシ基とを結合させて吸着材を得た。この吸着材は中性塩分解法で測定したとき、アニオン性基量は５５μｅｑ／ｍｌであった。
グロブリン特性値の測定にあたり、まずヒトγグロブリン（シグマ社製、製品番号Ｇ４３８６、コーンフラクションＩＩ、ＩＩＩ、純度約９９％）を精密に量り、ダルベッコのＰＢＳ（−）で３．０ｍｇ／ｍｌ濃度に溶解した液を試験液とした。吸着材１容と試験液１０容とをフラスコ中で、３７℃、９０分間浸透下で混和した。３０００ｒｐｍ、５分間遠心分離して上清を回収した。試験液と上清それぞれの２８０ｎｍでの吸光度を測定し、試験液に対する上清の吸光度の低下率を求めて、試験液の濃度より吸着材１ｍｌあたりに吸着したヒトγグロブリン量を計算した。
次にギランバレー症候群患者Ａ、Ｂ、及びＣの３種類のＣＰＤ加血漿（以下血漿Ａ、血漿Ｂ、血漿Ｃ、いずれもＧＭＩ反応性の抗ガングリオシド抗体（ＩｇＧ）を有する）を用いて吸着試験を行った。吸着材１容と血漿３容とをフラスコ中で静かに振盪しながら３７℃で１８分間反応し、反応前後の抗ガングリオシド抗体、フィブリノーゲン、血液凝固第ＸＩＩ因子の濃度を測定した。
抗ガングリオシド抗体濃度の測定は、シグマ社製ウシ脳由来ガングリオシドＧＭＩを抗原、二次抗体をアルカリフォスファターゼ標識抗ヒトＩｇＧヤギ抗体、酵素基質にパラニトロフェニルリン酸（ジシクロヘキシルアンモニウム塩）を用いて４０５ｎｍでの吸光度の変化により求める、一般に行われる酵素免疫測定法により実施した。この時健常人１０名の血漿を陰性対象として同時に測定し、吸光度の平均値＋３標準偏差値を正常範囲の上限とした。各試験液は２倍階段希釈し、吸光度が正常範囲となる希釈倍率を測定した。吸着試験前の血漿の希釈倍率と吸着後の希釈倍率より、吸着試験前濃度を１００とした時の吸着試験後の残存率を求めた。
フィブリノーゲン、血液凝固第ＸＩＩ因子はそれぞれトロンビン凝固時間法、発色性ＡＰＴＴ法によって測定した。吸着試験前濃度を１００とした時の吸着試験前濃度に対する吸着試験後の濃度の低下率を求めて吸着率とした。
結果を表１及び表２に示す。
【００１２】
【実施例２】
実施例１において、多孔質体湿潤状態での容積１ｍｌあたり９ｍｇのトリプトファンを反応させ、他は同様に実施して吸着材を得た。この吸着材は中性塩分解法で測定したとき、アニオン性基量は４３μｅｑ／ｍｌであった。患者血漿による吸着試験は血漿Ａについてのみ実施した。
【００１３】
【実施例３】
実施例１において、多孔質体湿潤状態での容積１ｍｌあたり６ｍｇのトリプトファンを反応させ、他は同様に実施して吸着材を得た。この吸着材は中性塩分解法で測定したとき、アニオン性基量は２７μｅｑ／ｍｌであった。患者血漿による吸着試験は血漿Ａについてのみ実施した。
【００１４】
【実施例４】
実施例１において、多孔質体湿潤状態での容積１ｍｌあたり４ｍｇのトリプトファンを反応させ、他は同様に実施して吸着材を得た。この吸着材は中性塩分解法で測定したとき、アニオン性基量は１６μｅｑ／ｍｌであった。患者血漿による吸着試験は血漿Ａについてのみ実施した。
【００１５】
【実施例５】
実施例１において、多孔質体湿潤状態での容積１ｍｌあたり１４ｍｇのトリプトファンを反応させ、他は同様に実施して吸着材を得た。この吸着材は中性塩分解法で測定したとき、アニオン性基量は６０μｅｑ／ｍｌであった。患者血漿による吸着試験は血漿Ａについてのみ実施した。
【００１６】
【実施例６】
実施例１において、ｐＨ９．８の炭酸緩衝液にかえて１０％水酸化ナトリウム水溶液中で多孔質体湿潤状態での容積１ｍｌあたり８２ｍｇのデキストラン硫酸（分子量５，０００、硫黄含量１７．２％）を反応させ、他は同様に実施して吸着材を得た。この吸着材は中性塩分解法で測定したとき、アニオン性基量は３２μｅｑ／ｍｌであった。患者血漿による吸着試験は血漿Ａについてのみ実施した。
【００１７】
【実施例７】
実施例１で得た多孔質体１０ｍｌ（湿潤状態での細密充填時の容積）、蒸留水３０ｍｌ、ポリビニル硫酸カリウム（和光純薬、分子量２４万）１．６ｇをガラス製サンプル瓶に入れた。これに、γ線を照射して重合し、吸着材を得た。この時のγ線照射量の実測値は９．８ｋＧｙであった。この吸着材のアニオン性基量は７２μｅｑ／ｍｌであった。実施例６と同様に血漿Ａを用いて吸着試験を実施した。
【００１８】
【比較例１】
実施例１において酢酸ビニルとトリアリルイソシアヌレートとを重量％で６５対３５で仕込み、懸濁重合することでポリ酢酸ビニル製の球状の多孔質体を得た。多孔質体は、平均粒子径１０１μｍ、排除限界分子量約１５８万、窒素吸着法（ＢＥＴ法）による表面積が２２．１ｍ2 ／ｍｌであった。また、ケン化後の多孔質体表面の水酸基密度は、多孔質体乾燥重量１ｇあたり５．３ｍｅｑであった。  この多孔質体を用いて、多孔質体湿潤状態での容積１ｍｌあたり１０ｍｇのトリプトファンを反応させた他は実施例１と同様にして吸着材を得た。この吸着材は中性塩分解法で測定した時、アニオン性基量は４５μｅｑ／ｍｌであった。患者血漿による吸着試験は血漿Ａ、血漿Ｂ、血漿Ｃについて実施した。
【００１９】
【比較例２】
比較例１において、多孔質体湿潤状態での容積１ｍｌあたり３ｍｇのトリプトファンを反応させ、他は同様に実施して吸着材を得た。この吸着材は中性塩分解法で測定したとき、アニオン性基量は１２μｅｑ／ｍｌであった。患者血漿による吸着試験は血漿Ａについてのみ実施した。
【００２０】
【比較例３】
比較例１において、多孔質体湿潤状態での容積１ｍｌあたり７ｍｇのトリプトファンを反応させ、他は同様に実施して吸着材を得た。この吸着材は中性塩分解法で測定したとき、アニオン性基量は３３μｅｑ／ｍｌであった。患者血漿による吸着試験は血漿Ａについてのみ実施した。
【００２１】
【比較例４】
市販のイムソーバＴＲ−３０５より吸着材を取り出して吸着材を得た。この吸着材は中性塩分解法で測定したとき、アニオン性基量は６５μｅｑ／ｍｌであった。比較例１と同様にして血漿Ａを用いて吸着試験を実施した。
【００２２】
0003748927.tif 000002
表１に示すように、比較例１では患者血漿によって、抗ガングリオシド抗体の吸着性が低くなる（残存率が高くなる）場合があり、フィブリノーゲン濃度による影響を受けていると考えられた。一方、実施例１では患者血漿による抗ガングリオシド抗体の吸着性の変化はあまりなく、フィブリノーゲンによる吸着阻害を受けずに安定した吸着性を示した。
【００２３】
表２に示すように、グロブリン特性値が２０ｍｇ／ｍｌ以下の時、抗ガングリオシド抗体の吸着性を低下させることなく、フィブリノーゲンや血液凝固第ＸＩＩ因子の非特異吸着を抑制できる。一方、グロブリン特性値が２０ｍｇ／ｍｌ以上の時は、アニオン性基の量によらずにフィブリノーゲンや血液凝固第ＸＩＩ因子の非特異吸着は多かった。グロブリン特性値が適正な範囲の吸着材によって初めて、選択的に抗ガングリオシド抗体を吸着できる。
0003748927.tif 000003
【００２４】
【発明の効果】
本発明によれば、糖脂質抗体を簡便に、しかも効率良く吸着除去するための体外循環治療用の吸着材を提供することができる。