(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
シクロ（Val-Val-Xaa-Val-Val-(D)-Ala）（K 5993）、
シクロ（Val-Tyr-Xaa-Val-Tyr-(D)-Ala）（K 0021）、もしくは
シクロ（Tyr-Val-Xaa-Tyr-Val-(D)-Ala）（K 0022）
（式中、XaaはCysおよびTrp以外の天然アミノ酸の残基である）
で示されるシクロヘキサペプチド混合物、または
シクロ（Val-Tyr-Ala-Val-Tyr-(D)-Ala)、
シクロ（Tyr-Val-Ala-Tyr-Val-(D)-Ala)、
シクロ（Tyr-Val-Hyp-Tyr-Val-(D)-Ala)、
シクロ（Tyr-Val-Ile-Tyr-Val-(D)-Ala)、
シクロ（Tyr-Val-Leu-Tyr-Val-(D)-Ala)、
シクロ（Tyr-Val-Arg-Tyr-Val-(D)-Ala)、もしくは
シクロ（Tyr-Val-Thr-Tyr-Val-(D)-Ala)
で示されるシクロヘキサペプチド、またはその生理学的に許容される塩。
【請求項２】
ａ） 適当な保護されたアミノ酸誘導体を固体支持体にカップリングさせ、
ｂ） 側鎖保護基を保持しながら、形成された線状ペプチドを支持体から切断し、
ｃ） その線状ペプチドを溶液中で環化し、
ｄ） その側鎖保護基を除去し、そして適切な場合には、
ｅ） それを生理学的に許容される塩に変える
ことより成る請求項１に記載のシクロヘキサペプチド混合物またはシクロヘキサペプチド、またはその生理学的に許容される塩の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、式Ｉ
シクロ（Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｅ−Ｆ−(Ｄ)−Ａｌａ）      (Ｉ)
（式中、
Ａ、Ｂ、Ｃ、ＥおよびＦは、相互に独立的に同一であっても相異なっていてもよく、そしてシステイン（Ｃｙｓ）およびトリプトファン（Ｔｒｐ）以外の天然アミノ酸の残基であり、従ってアラニン（Ａｌａ）、アルギニン（Ａｒｇ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、グリシン（Ｇｌｙ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、リジン（Ｌｙｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、プロリン（Ｐｒｏ）、セリン（Ｓｅｒ）、トレオニン(Ｔｈｒ）、チロシン(Ｔｙｒ）またはバリン(Ｖａｌ）であってよい)
で示される化合物およびそれらの生理学的に許容し得る塩に関する。
【０００２】
式Ｉ（式中、ＡおよびＢは、相互に独立的に同一であっても相異なってもよく、そしてＩｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、ＰｈｅまたはＴｙｒであり、またＣ、ＤおよびＥは、相互に独立的に、同一であっても相異なってもよく、そしてシステインおよびトリプトファン以外の天然アミノ酸の残基に相当する）の化合物が好ましい。
【０００３】
次のペプチド配列：
シクロ（Val-Val-Xaa-Val-Val-(D)-Ala）、
シクロ（Val-Tyr-Xaa-Val-Tyr-(D)-Ala）、または
シクロ（Tyr-Val-Xaa-Tyr-Val-(D)-Ala）
（式中、ＸａａはＣｙｓおよびＴｒｐ以外の天然アミノ酸の残基である）
を示す式Ｉの化合物が更に好ましい。
【０００４】
天然アミノ酸とは、遊離状態でまたはタンパク質の構造単位として天然に存在する、例えばBell（FEBS Letters 64 (1976) 29-35）などに記載されているような、すべてのα−アミノ酸を意味する。
タンパク質中に天然に存在するアミノ酸の場合には、天然アミノ酸とはＬ−アミノ酸（グリシンは例外である）を意味する。（Ｄ）−ＡｌａはＤ配置のアミノ酸アラニンの残基に相当する。
ペプチドとは、ペプチド結合により相互に連結されたアミノ酸の配列を意味しそしてＮ−末端とＣ−末端を有する。
括弧でくくられたアミノ酸配列は、最初のアミノ酸のＮ−末端（アミノ基）が最後のアミノ酸のＣ−末端（ＣＯＯＨ基）に連結されたシクロペプチドの記述である。
【０００５】
式（Ｉ）の化合物の生理学的に許容される塩とは、Remington's Pharmaceutical Sciences (17版，1418ページ（1985））に記載されているような無機塩および有機塩の両方を意味する。適切な塩は特に、アルカリ金属およびアルカリ土類金属塩、生理学的に許容し得るアミンとの塩および、無機または有機酸、例えばＨＣｌ、ＨＢｒ、Ｈ2ＳＯ4、マレイン酸またはフマール酸、との塩である。
【０００６】
式（Ｉ）で示される前記化合物はペプチド化学において慣用される一般的に知られている方法により合成され得るシクロヘキサペプチドである。それらシクロヘキサペプチドは、例えば
ａ）  適当に保護されたアミノ酸誘導体を固体支持体にカップリングさせ、
ｂ）  側鎖保護基を保持しながら線状ペプチドを切断し、
ｃ）  そのペプチドを溶液中で環化し、
ｄ）  側鎖保護基を除去する
ことにより合成される。
【０００７】
適当なアミノ酸保護基は、ペプチド合成に慣用的に用いられそして例えばKontakte Merck 3/79, pp. 14-22および1/80, pp. 23-35に記載されているような保護基である。アミノ官能基保護のためのウレタン基の例は、Ｐｙｏｃ、Ｆｍｏｃ、Ｆｃｂｏｃ、Ｚ、Ｂｏｃ、Ｄｄｚ、Ｂｐｏｃ、Ｚ−(ＮＯ2)、Ｄｏｂｚ、Ｍｏｃ、Ｍｂｏｃ、Ｉｂｏｃ、Ａｄｏｃ、Ａｄｐｏｃ、ＭｓｃまたはＰｉｏｃである。これらのアミノ酸保護基は、酸、塩基を用いてまたは還元的に除去される。
グアニジノ基保護のための基の例はＮＯ2、トシル、Ｂｏｃ、Ｚ、メシチレン−２−スルホニル（Ｍｔｓ）などである。それらは、加水分解的にまたは水素添加分解的に除去することができる。
【０００８】
ＣＯＯＨ側鎖官能基は、アルキルエステル、好ましくはメチル、エチルまたはｔｅｒｔ−ブチルエステルとして、またはベンジルエステルまたは修飾されたベンジルエステル（特にｐ−ＮＯ2、ｐ−Ｃｌ、ｐ−Ｂｒ）としてブロックされる。それらはアルカリまたは酸加水分解によりまたは水素添加により脱ブロックされる。
ヒドロキシル保護基の例はｔｅｒｔ−ブチルまたはベンジルである。
【０００９】
本発明は更に、式（Ｉ）のシクロヘキサペプチドの混合物に関する。
前述のシクロヘキサペプチドは、いわゆる「組合せ合成法（combinatorial synthesis techniques）」を用いて混合物の形で合成できる。ＰＣＴ出願ＷＯ ９２／００００９１は容易に「ペプチドライブラリー」の合成に使用できる組合せ合成法を開示している。
【００１０】
式Ｉの化合物の混合物は、前掲ステップａ）〜ｄ）に従って調製され得る。しかしながら、組合せ合成法を用いれば式Ｉのすべての可能なシクロヘキサペプチドを特異的に合成する必要がない（ここに記載のシクロヘキサペプチドの場合、それは結局、ほぼ１９０万（１８5）種類の異なる化合物または合成数である)。そうする代りに、各合成サイクルにつき１８種類の異なるアミノ酸全てを同時に添加することにより、式Ｉのシクロヘキサペプチドの混合物を調製することができる。従来合成法と比べた場合のこの方法の長所は明白である。すなわち、例えば、実際に式Ｉで示される１９０万種類の可能なシクロヘキサペプチド全てを含むペプチド混合物が、各場合に所望のアミノ酸全てを同時使用してわずか５回だけ合成サイクルを経由させた後わずか１回の合成で環化した後に得られる。
【００１１】
しかしながら、今記載した方法とは別の選択肢として、アミノ酸混合物を全ての合成サイクルにおいて添加する必要はない。例えば１回の合成サイクル後に、その上でペプチド混合物が合成された支持体物質を分画しそして以後の別個の合成反応において特定位置に所望のアミノ酸を挿入することができる。
【００１２】
前記方法を用いてペプチド混合物を調製した後、生物活性を有するペプチドを検出する必要があり、またそれらの配列を同定する必要がある。これは、一例として、式Ａ
シクロ（Ｏ1−Ｏ2−Ｘ−Ｘ−Ｘ−（Ｄ）−Ａｌａ）      （Ａ）
で示されるシクロペプチド類含有混合物を用いた後記の反復再合成法を用いて行うことができる。
この混合物は、（ＣｙｓまたはＴｒｐ以外の）全ての天然アミノ酸によって占められた三つの可変位置（Ｘ）を有するシクロヘキサペプチドを含有する。残りの位置は規定されたアミノ酸（Ｏ）によって占められる（これらも同じくＣｙｓおよびＴｒｐ以外の天然アミノ酸である）。一つの位置は常にＤ−Ａｌａである。
【００１３】
シクロペプチドＡの混合物は、前述の如く、１８種全部のアミノ酸の混合物を用いて合成サイクルを３回行い、次いでペプチド混合物を結合させたまま支持体物質を分画し、次いで式Ａのシクロペプチド混合物を３２４（１８×１８）回の別個の合成として調製することにより調製され得る。これら３２４種類の混合物は各々約５８００（１８3）種類の異なるペプチドを含有する。
バイオアッセイ（後記参照）で活性があることがわかった３２４種類の混合物の各々を選び出し、そして更なる規定された位置の新たな挿入を伴う反復再合成によりその複雑さを制限する。反復再合成の各相には１８の新しい合成工程が必要である。最後に得られた規定構造のシクロヘキサペプチドの作用をバイオアッセイでテストすることにより確認する。以下のスキームは今記述したばかりの手順を明確にするものである。
【００１４】
三つの規定位置を有するペプチド：
シクロ（Ｏ1−Ｏ2−Ｘ−Ｘ−Ｘ−（Ｄ）−Ａｌａ）
１．  特異的バイオアッセイ（３２４回のテスト）
２．  活性混合物の同定
３．  四つの規定位置を有するペプチドの合成（１８回）
【００１５】
四つの規定位置を有するペプチド：
シクロ（Ｏ1−Ｏ2−Ｏ3−Ｘ−Ｘ−（Ｄ）−Ａｌａ）
１．  特異的バイオアッセイ（１８回のテスト）
２．  活性混合物の同定
３．  五つの規定位置を有するペプチドの合成（１８回）
【００１６】
五つの規定位置を有するペプチド：
シクロ（Ｏ1−Ｏ2−Ｏ3−Ｏ4−Ｘ−（Ｄ）−Ａｌａ)
１．  特異的バイオアッセイ（１８回のテスト）
２．  活性混合物の同定
３．  六つの規定位置を有するペプチドの合成（１８回）
【００１７】
六つの規定位置を有するペプチド：
シクロ（Ｏ1−Ｏ2−Ｏ3−Ｏ4−Ｏ5−（Ｄ）−Ａｌａ)
１．  特異的バイオアッセイ（１８回のテスト）
２．  活性ペプチドの同定
原則として、シクロペプチドの混合物はまた、慣用の分析方法例えば分取ＨＰＬＣまたはその他のクロマトグラフィー法などにより分画しまたは精製することもできる。
【００１８】
今般、式Ｉのシクロヘキサペプチドまたはそれらの混合物がインターロイキン−４（ＩＬ）のＩＬ−４受容体への結合を特異的に阻害し、そしてＩＬ−４活性を抑制することがわかった。
従って、これら新規物質はＩＬ−４活性の有効な阻害剤である。
これら新規化合物またはそれらの混合物のＩＬ−４阻害作用は細胞不含結合アッセイまたは細胞バイオアッセイで測定することができる。
ドイツ特許出願ＤＥ ４３ ２２ ３３０ Ａ１はＩＬ−４活性の抑制は、ＴＨ２型のＴヘルパー細胞の出現増加に伴う疾病診断、治療提供および／または治療に用いることができることを開示している。
【００１９】
多くのアレルギー性、ウイルス性、寄生虫性および細菌性疾病の治療および予防は依然として大きな課題である。一部の寄生虫性、ウイルス性および細菌性疾病の過程でリンパ球および単球細胞の亜集団に変化が生じることが知られている。これは例えばいわゆる２型Ｔヘルパー細胞（以下においてＴＨ２細胞と記す）が出現増加する場合である。一般的に、Ｔ細胞は表面マーカーに基づき、そしてそれらの機能に基づいて亜集団に細分することができる。すなわち、Ｔヘルパーリンパ球は例えばＣＤ４表面分子を有し、そして活性化された後にサイトカインを分泌する。
【００２０】
健常マウスからの、または同種細胞（allogenic cell）で刺激したマウスからのクローン化Ｔヘルパー細胞のサイトカインパターンを分析したところ、これらのヘルパー細胞はインターロイキン−２、インターロイキン−４、ガンマインターフェロン、インターロイキン−５、インターロイキン−６、インターロイキン−１０およびリンホトキシンを産生することが示された（いわゆるＴＨＯ型のＴヘルパー細胞）。
【００２１】
例えば細菌抗原ブルセラ・アボルツス（Brucella abortus）またはマイコバクテリウム・ツベルクローシス（Mycobacterium tuberculosis）に感染したマウスからのＴヘルパー細胞をクローン化したところ、大部分のクローンはリンホトキシン、ガンマインターフェロンおよびインターロイキン−２を分泌するがインターロイキン−４、インターロイキン−５、インターロイキン−６またはインターロイキン−１０はほとんどまたは全く分泌しないことが判った（いわゆるＴＨ１型のＴヘルパー細胞）。
【００２２】
例えば、リーシュマニア・メジャー（Leishmania major）などの寄生虫病原体に感染した高感受性マウスに由来するＴヘルパー細胞をクローン化したところ、出現したクローンの大部分の、インターロイキン−４、インターロイキン−５およびインターロイキン−１０の生産量は増加したがインターロイキン−２およびガンマインターフェロンの生産量は減少するか検出し得なかった（ＴＨ２型のＴヘルパー細胞）（Mosmann et al. Immunological Review 1991, No. 123, 209-229; S. Romagnani, Immunology Today, 256-257; Vol. 12, No. 8 1991）。
【００２３】
このＴＨ２リンパ球出現の増加は、動物および人間の一部の感染症において既に検出されており（ElseおよびGrenic, Parasitology Today, Vol. 7, No. 11, 1991, pp. 313-316; Parasitology Today, Vol. 7, No. 10, 1991, p. 261）、また二次的パラメータにも反映されている。例えば、リーシュマニア・メジャーに感染したマウスでは一般に、ガンマインターフェロン生産は減少し血清ＩｇＥは激増しそして好酸球増加症を示した。
【００２４】
一般に、例えば癩腫癩、リーシュマニア症または住血吸虫症の患者、またはマイコバクテリウム・ツベルクローシスに感染した患者の血清においては、健常者の血清に認められる濃度に比べＩｇＥ濃度が激増した。寄生虫感染症の場合には、病気の過程で好酸球増加症がしばしば認められる。
このタイプの調節異常は、アトピー性皮膚炎および喘息などの即時型のＩｇＥ介在アレルギー反応の一特徴でもある。例えばアレルギー性皮膚炎患者の生検標本由来の抗原特異的Ｔ細胞クローンは概してＴＨ２型である（Kapsenbelg et al. Immunology Today, Vol. 12, No. 11, 1991, 392-395）。
【００２５】
本発明の新規化合物および混合物は、アレルギー症および感染症、特にウイルス性、細菌性および寄生虫性感染症のほか真菌性感染症；とくにヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）、マイコバクテリア、特にマイコバクテリウム・レプレ（Mycobacterium leprae）による、リステリア類による、原虫、特にリーシュマニアおよびプラスモジウム（Plasmodium）属による、蠕虫、特に住血吸虫（Schistosoma）、ニッポストロンギルス（Nippostrongylus）およびヘリグモソモイデス（Heligmosomoides）属による、トリクリダ（Trichurida）、トリキネラ（Trichinella）、条虫（Taenia)（嚢尾虫（Cysticercus））、カンジダ（Candida）およびコウジカビ（Aspergillus）による感染症の治療、予防と診断の両方に適している。しかしながら、即時型のアレルギー反応、特にＩｇＥ・介在反応も診断でき、治療できまたは予防的処置ができる。これらには特にアトピー性皮膚炎および喘息が含まれる。
【００２６】
一般に、投与剤形は病気が異なれば異なる。例えば、一部の病気には局所投与が有益であり得る。例えば、喘息の場合には吸入による投与が有益である一方、結膜炎の場合には点眼剤の形での投与が有益であり、またアトピー性皮膚炎の場合には、特に病理学的ＴＨ２細胞を局所的に検出できるので経皮または皮内投与が有益である。
本発明の新規ペプチド、またはそれらの混合物は、一般に、インターロイキン−４（ＩＬ−４）のＩＬ−４受容体への結合を阻害するための科学的ツールとして用いることもできる。
【００２７】
本発明は更に、式Ｉの化合物またはそれらの混合物を含む薬学的調製物にも関する。それらの医薬は、例えば、経口投与できる薬学的調製物の形で、例えば錠剤、被覆錠剤、硬または軟ゼラチンカプセル、溶液、乳濁液または懸濁液の形で使用してもよい。適切な場合にはタンパク質など更なる成分を含んでいてもよいリポソーム中への医薬封入も同じく適切な投与剤形の一つである。それらはまた直腸経由で、例えば坐薬の形で、あるいは非経腸的に、例えば注射液の形で投与してもよい。薬学的調製物の製造には、これらの化合物を治療的に不活性な有機および無機賦形剤中に配合することができる。錠剤、被覆錠剤および硬ゼラチンカプセルのためのこのような賦形剤の例は、ラクトース、コーンスターチまたはそれらの誘導体、獣脂およびステアリン酸またはそれらの塩である。溶液の調製に適した賦形剤は水、ポリオール、スクロース、転化糖およびグルコースである。注射液に適した賦形剤は水、アルコール、ポリオール、グリセロールおよび植物油である。坐薬に適した賦形剤は植物および硬化油、ろう、脂肪、および半液体ポリオールである。それら薬学的調製物は防腐剤、溶剤、安定化剤、湿潤化剤、乳化剤、甘味剤、色素、香味剤、浸透圧調節用塩、緩衝剤、被覆剤、抗酸化剤および他の治療活性化合物を適切な場合に含むこともできる。
【００２８】
本発明はまた、少なくとも一種類の式（Ｉ）の化合物を、薬学的に適切で生理学的に許容される賦形剤および適切な場合には更なる適切な活性化合物、添加剤および補助物質と共に、投与に適した剤形にすることより成る新規医薬の調製方法にも関する。
好ましい投与形態は、経口および局所投与、例えばカテーテルを用いた局所投与、あるいは注射である。
【００２９】
以下の（調製）例は、本発明をより詳しく説明するためのものであって本発明の範囲をいささかも限定しようとするものではない。以下の省略形を用いた：
省略形：
ＡＡ        アミノ酸
ＢＳＡ      牛血清アルブミン
ＴＬＣ      薄層クロマトグラフィー
ＤＣＭ      ジクロロメタン
ＤＩＣ      ジイソプロピルカルボジイミド
ＤＩＰＥＡ  シイソプロピルエチルアミン
ＤＭＦ      ジメチルホルムアミド
ＤＭＳＯ    ジメチルスルホキシド
ＥＬＩＳＡ  酵素結合免疫吸着剤アッセイ
Ｆｍｏｃ    ９−フルオレニルメチルオキシカルボニル
ＨＯＢｔ    １−ヒドロキシベンゾトリアゾール
ＨＰＬＣ    高圧（性能）液体クロマトグラフィー
ｈｕＩＬ    ヒトインターロイキン
ＩＬ        インターロイキン
ｍｕＩＬ    マウスインターロイキン
ＰＢＳ      リン酸緩衝食塩水
ＰＢＳＡ    ＰＢＳ中牛血清アルブミン
ＴＢＴＵ    ベンゾトリアゾリルテトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート
ＴＦＡ      トリフルオロ酢酸
【００３０】
シクロヘキサペプチドの合成
前述のシクロペプチドは個々のペプチドとしてあるいは混合物として調製される。この合成は、
ａ）  適当に保護されたアミノ酸誘導体を固定支持体にカップリングさせ、
ｂ）  側鎖保護基を保持しながら線状ペプチドを切断し、
ｃ）  そのペプチドを溶液中で環化し、
ｄ）  側鎖保護基を除去する
ことにより行われる。
【００３１】
ａ）  線状ペプチドまたはペプチド混合物の合成
１３.１ｇのＥｍｏｃ−Ｄ−Ａｌａ−トリチル樹脂を１３１mlのジクロロメタン／ジメチルホルムアミド（ＤＣＭ／ＤＭＦ）（２：１）に懸濁し、そして０.４ml（４０mg，０.０３２mmol）の樹脂懸濁液を用意された反応容器にそれぞれピペットで添加する。反応容器はガラスウールで栓がされ、そして自動化多重ペプチド合成用装置の合成ブロックに挿入されたエッポンドルフチップである。必要なＦｍｏｃアミノ酸の０.７Ｍ溶液を添加し、そしてカップリングは、ＤＭＦ／ＤＣＭ（１：２）中１.５Ｍ溶液として５倍過剰で添加されるジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）による系内活性化の後、５倍過剰のＦｍｏｃアミノ酸を用いて行われる。カップリング時間は５０分間である。
規定されたペプチド混合物は個々のペプチドで被覆された支持体（ポリマービーズ）を混合することにより得られる。
【００３２】
【表１】
0003825491.tif 000002
【００３３】
ｂ）  線状ペプチドまたはペプチド混合物の樹脂からの切断
ペプチドまたはペプチド混合物はいわゆるFalconsR 中で樹脂（各々１ｇ）から、３０mlの酢酸／メタノール／ＤＣＭ（２：２：６）を用いて室温で３時間振盪しながら切断する。それら樹脂を切断溶液から濾別し、そして溶媒を３００mbar／４０℃（ＤＣＭ／メタノール）または１mbar／４０℃（酢酸）で真空濃縮装置内で除去する。残留物をｔｅｒｔ−ブチルアルコール／水（４：１）に溶解し、そして（アミノ基に基づいて）２当量の０.２Ｎ ＨＣｌをこの溶液に添加し、そしてその溶液を真空濃縮装置内で再び濃縮する。
【００３４】
ｃ）  線状ペプチドまたはペプチド混合物の環化
０.４mmol量のペプチドまたはペプチド混合物をポリプロピレンフラスコ中で２５０mlのＤＭＦ（０.００１６Ｍ）に溶解し、そして４当量のジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）を添加する。ＤＭＦ中の０.４Ｍ ＨＯＢｔ／ＴＢＴＵ溶液３ml（３当量、１.２mmol）を振盪しながら各々の場合にゆっくり滴加する。反応の進行はＴＬＣで監視し、そして反応は５時間後に止める。溶媒を真空濃縮装置中、１mbar／４０℃で一夜（１５時間）かけて除去し、乾燥残留物をＤＣＭにとり、これら溶液を５％ＫＨＳＯ4、５％ＮａＨＣＯ3溶液および水と共に振盪する（各々３×）ことにより抽出する。有機相をＮａ2ＳＯ4で乾燥し、濾過しそして真空濃縮する。残留物をｔｅｒｔ−ブチルアルコール／水（４：１）に溶解し、そしてこれら溶液を凍結乾燥する。
【００３５】
ｄ）  側鎖保護基の除去
各々の場合に、１００〜２００mgのシクロペプチドまたはシクロペプチド混合物をそれぞれ５mlまたは１０mlの除去溶液（ＴＦＡ／チオアニソール／チオクレゾール、０.９５：０.２５：０.２５）を用い室温で４時間処理して側鎖保護基を除去する。次にシクロペプチドをジエチルエーテル／ｎ−ヘプタン（１：１）中で沈殿させ、遠心分離し、ジエチルエーテル／ｎ−ヘプタンで更に２回洗浄し、そしてｔｅｒｔ−ブチルアルコール／水（４：１）に溶解し、そしてそれら溶液を凍結乾燥する。
【００３６】
実施例１
シクロ（Val-Tyr-Xaa-Val-Tyr-(D)-Ala)(K 0021）の合成
ａ）  線状ペプチド混合物（Val-Tyr-Xaa-Val-Tyr-(D)-Ala）の合成
１８成分（Val-Tyr-Ala-Val-Tyr-(D)-Ala；Val-Tyr-Arg-Val-Tyr-(D)-Ala；Val-Tyr-Asn-Val-Tyr-(D)-Ala；Val-Tyr-Asp-Val-Tyr-(D)-Ala；Val-Tyr-Gln-Val-Tyr-(D)-Ala；Val-Tyr-Glu-Val-Tyr-(D)-Ala；Val-Tyr-Gly-Val-Tyr-(D)-Ala；Val-Tyr-His-Val-Tyr-(D)-Ala；Val-Tyr-Ile-Val-Tyr-(D)-Ala；Val-Tyr-Leu-Val-Tyr-(D)-Ala；Val-Tyr-Lys-Val-Tyr-(D)-Ala；Val-Tyr-Met-Val-Tyr-(D)-Ala；Val-Tyr-Phe-Val-Tyr-(D)-Ala；Val-Tyr-Pro-Val-Tyr-(D)-Ala；Val-Tyr-Ser-Val-Tyr-(D)-Ala；Val-Tyr-Thr-Val-Tyr-(D)-Ala；Val-Tyr-Tyr-Val-Tyr-(D)-Ala；Val-Tyr-Val-Val-Tyr-(D)-Ala）より成る線状ペプチド混合物（Val-Tyr-Xaa-Val-Tyr-(D)-Ala）を合成するために、これら個々のペプチドを多重ペプチド合成用に設計されたロボットを用いて、ポリマー支持体上で合成する。反応容器として、ポリプロピレン濾過カラムに、各々の場合に、４０mg（＝０.０３２mmol）のＦｍｏｃ−Ｄ−Ａｌａ−２−クロロトリチル樹脂を充填する。樹脂量は、乾燥樹脂を秤量添加するかまたはジクロロメタン／ジメチルホルムアミド（２：１）中の樹脂懸濁液をピペットで添加することにより配分する。ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中の等モル量のＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）を含む必要なＦｍｏｃアミノ酸の０.７Ｍ溶液を添加し、そしてカップリングを、ジクロロメタン／ジメチルホルムアミド（２：１）中の１.５Ｍ溶液として、５倍過剰で添加されるＤＩＣによる系内活性化によって５倍過剰のＦｍｏｃアミノ酸を用いて行う。カップリング時間は５０分間である。
【００３７】
ｂ）  線状ペプチド混合物の樹脂からの切断
ペプチドを樹脂から切断する前に、１８種類の個々のヘキサペプチド樹脂をプール（１８×４０mg＝０.７２ｇのペプチド樹脂）してペプチド混合物（Val-Tyr-Xaa-Val-Tyr-(D)-Ala）を得る。総量で０.７２ｇのペプチド樹脂より成るペプチド混合物を、２０mlの酢酸／メタノール／ジクロロメタン（２：２：６）を用いて室温で３時間振盪しながら切断する。樹脂を切断溶液から濾去し、そして溶媒を回転真空濃縮装置（Beta-RVC，Christ，Osterode）を用い、２００mbar／４０℃（ＤＣＭ／メタノール）または１mbar／４０℃（酢酸）で除去する。残留物をｔｅｒｔ−ブチルアルコール／水（４：１）に溶解し、（アミノ基に基づき）２当量の０.２Ｎ ＨＣｌを添加しそして全体を回転真空濃縮装置で濃縮乾固する。
【００３８】
ｃ）  環化
ペプチド混合物（Val-Tyr-Xaa-Val-Tyr-(D)-Ala）（０.４mmol）をポリプロピレンフラスコ中、２５０mlのＤＭＦに溶解し（０.００１６Ｍ）、４当量のジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）を添加し、次にその混合物をフリーザー内で１時間冷却する。３mlの０.４Ｍ ＨＯＢｔ／ＴＢＴＵ／ＤＭＦ溶液（＝３当量、１.２mmol）を振盪しながらゆっくり滴加する。反応の進行は薄層クロマトグラフィー（移動相：クロロホルム／メタノール／氷酢酸 ８５：１５：２、ＲF生成物＝０.５９）により監視する。反応は３時間後に完了する。溶媒を回転真空濃縮装置中、１mbar／４０℃で除去し、乾燥残留物をジクロロメタンに溶解し、この溶液を５％ＫＨＳＯ4溶液および水と共に振盪することにより抽出する。有機相をＮａ2ＳＯ4で乾燥する。溶媒を真空蒸発させ、そして残留物をｔｅｒｔ−ブチルアルコール／水(４：１）に溶解し、そしてこの溶液を凍結乾燥する。
【００３９】
ｄ）  側鎖保護基の除去
シクロペプチド混合物（Val-Tyr-Xaa-Val-Tyr-(D)-Ala）（１００〜２００mg）を１０mlの除去溶液（ＴＦＡ／チオアニソール／チオクレゾール、０.９５：０.０２５：０.０２５）を用いて室温で４時間処理して側鎖保護基を除去する。その除去溶液をゆっくり撹拌しながらジエチルエーテル／ｎ−ヘプタン（１：１）に添加し、沈殿を遠心分離しそして沈殿を超音波処理によってジエチルエーテル／ｎ−ヘプタンで２回洗浄しそしてｔｅｒｔ−ブチルアルコール／水（４：１）に溶解し、次のこの溶液を凍結乾燥する。
【００４０】
ｅ）  シクロペプチド混合物の分析
シクロペプチド混合物をＨＰＬＣおよびイオンスプレー質量分析により分析する。MS（FAB）：シクロ（Val-Tyr-Xaa-Val-Tyr-(D)-Ala)；Xaa＝Gly：653.8 (M＋H)；Xaa＝Ala：667.8（M＋H)；Xaa＝Ser：683.8 (M＋H)；Xaa＝Pro：693.9 (M＋H)；Xaa＝Val：695.9 (M＋H)；Xaa＝Thr：697.9 (M＋H)；Xaa＝Leu：709.9 (M＋H)；Xaa＝Ile：709.9 (M＋H)；Xaa＝Asn：710.9 (M＋H)；Xaa＝Asp：711.8 (M＋H)；Xaa＝Lys：724.9 (M＋H)；Xaa＝Gln：724.9 (M＋H)；Xaa＝Glu：725.9 (M＋H)；Xaa＝Met：728 (M＋H)；Xaa＝His：733.9 (M＋H)；Xaa＝Phe：743.9 (M＋H)；Xaa＝Arg：752.9 (M＋H)；Xaa＝Tyr：759.9 (M＋H)。
【００４１】
実施例２
シクロ（Val-Val-Xaa-Val-Val-(D)-Ala)(K 5993）の合成
シクロペプチド混合物シクロ（Val-Val-Xaa-Val-Val-(D)-Ala）を適切なアミノ酸を用いて実施例１と同様に合成する。MS(FAB):シクロ(Val-Val-Xaa-Val-Val-(D)-Ala)；Xaa＝Gly:525.7 (M＋H)；Xaa＝Ala：539.7 (M＋H)；Xaa＝Ser：555.7 (M＋H)；Xaa＝Pro：565.8 (M＋H)；Xaa＝Val：567.8 (M＋H)；Xaa＝Thr：569.8 (M＋H)；Xaa＝Leu：581.8 (M＋H)；Xaa＝Ile：581.8 (M＋H)；Xaa＝Asn：582.8 (M＋H)；Xaa＝Asp：583.7 (M＋H)；Xaa＝Lys：596.8 (M＋H)；Xaa＝Gln：596.8 (M＋H)；Xaa＝Glu：597.8 (M＋H)；Xaa＝Met：599.9 (M＋H)；Xaa＝His：605.8 (M＋H)；Xaa＝Phe：615.8 (M＋H)；Xaa＝Arg：624.8 (M＋H)；Xaa＝Tyr：631.8 (M＋H)。
【００４２】
実施例３
シクロ（Tyr-Val-Xaa-Tyr-Val-(D)-Ala)(K 0022）の合成
シクロペプチド混合物シクロ（Tyr-Val-Xaa-Tyr-Val-(D)-Ala）を適切なアミノ酸を用いて実施例１と同様に合成する。MS(FAB):シクロ(Tyr-Val-Xaa-Tyr-Val-(D)-Ala)；Xaa＝Gly：653.8 (M＋H)；Xaa＝Ala：667.8 (M＋H)；Xaa＝Ser：683.8 (M＋H)；Xaa＝Pro：693.9 (M＋H)；Xaa＝Val：695.9 (M＋H)；Xaa＝Thr：697.9 (M＋H)；Xaa＝Leu：709.9 (M＋H)；Xaa＝Ile：709.9 (M＋H)；Xaa＝Asn：710.9 (M＋H)；Xaa＝Asp：711.8 (M＋H)；Xaa＝Lys：724.9 (M＋H)；Xaa＝Gln：724.9 (M＋H)；Xaa＝Glu：725.9 (M＋H)；Xaa＝Met：728 (M＋H)；Xaa＝His：733.9 (M＋H)；Xaa＝Phe：743.9 (M＋H)；Xaa＝Arg：752.9 (M＋H)；Xaa＝Tyr：759.9 (M＋H)。
【００４３】
【００４４】
実施例４
以下のシクロペプチドまたはシクロペプチド混合物を同様に調製した。
シクロ（Val-Tyr-Ala-Val-Tyr-(D)-Ala）
シクロ（Tyr-Val-Ala-Tyr-Val-(D)-Ala）
シクロ（Tyr-Val-Hyp-Tyr-Val-(D)-Ala）
シクロ（Tyr-Val-Ala-Gly-Xaa-(D)-Ala）
シクロ（Tyr-Val-Ala-Gln-Xaa-(D)-Ala）
シクロ（Tyr-Val-Ala-Lys-Xaa-(D)-Ala）
シクロ（Tyr-Val-Ala-Asn-Xaa-(D)-Ala）
シクロ（Tyr-Val-Ala-Ile-Xaa-(D)-Ala）
シクロ（Tyr-Val-Ala-Leu-Xaa-(D)-Ala）
シクロ（Tyr-Val-Ala-Pro-Xaa-(D)-Ala）
シクロ（Tyr-Val-Ala-Phe-Xaa-(D)-Ala）
シクロ（Tyr-Val-Ala-His-Xaa-(D)-Ala）
シクロ（Tyr-Val-Ala-Ala-Xaa-(D)-Ala）
シクロ（Tyr-Val-Ala-Tyr-Xaa-(D)-Ala）
シクロ（Tyr-Val-Gln-Tyr-Val-(D)-Ala）
シクロ（Tyr-Val-Lys-Tyr-Val-(D)-Ala）
シクロ（Tyr-Val-Glu-Tyr-Val-(D)-Ala）
シクロ（Tyr-Val-Asp-Tyr-Val-(D)-Ala）
シクロ（Tyr-Val-Phe-Tyr-Val-(D)-Ala）
シクロ（Tyr-Val-Gly-Tyr-Val-(D)-Ala）
シクロ（Tyr-Val-His-Tyr-Val-(D)-Ala）
シクロ（Tyr-Val-Ile-Tyr-Val-(D)-Ala）
シクロ（Tyr-Val-Leu-Tyr-Val-(D)-Ala）
シクロ（Tyr-Val-Asn-Tyr-Val-(D)-Ala）
シクロ（Tyr-Val-Pro-Tyr-Val-(D)-Ala）
シクロ（Tyr-Val-Arg-Tyr-Val-(D)-Ala）
シクロ（Tyr-Val-Ser-Tyr-Val-(D)-Ala）
シクロ（Tyr-Val-Thr-Tyr-Val-(D)-Ala）
シクロ（Tyr-Val-Val-Tyr-Val-(D)-Ala）
シクロ（Tyr-Val-Tyr-Tyr-Val-(D)-Ala）
シクロ（Tyr-Val-Met-Tyr-Val-(D)-Ala）
Hypはヒドロキシプロリンである。
【００４５】
バイオアッセイによる生物活性の測定
実施例５
細胞不含結合アッセイにおけるＩＬ−４結合の特異的阻害
EP 488 170 A1は細胞不含結合テストを開示している。それらを行うために、そのカルボキシル末端にヒンジ、ＣＨ2およびＣＨ3領域より成る免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域が融合した通常膜に局在する受容体の細胞外領域より成る組換えキメラタンパク質を用いる。これらのいわゆる受容体／Ｆｃ融合タンパク質は、特異的受容体結合活性を維持しながら、例えばＦｃ部分に対するモノクローナル抗体で予め被覆しておいた固相に結合させることができる。この例として、RNunc Ｂ型 ＥＬＩＳＡプレートを固相として用いた。１０mg／ml ＢＳＡ含有ＰＢＳ（ＰＢＳＡ）に溶解した受容体／Ｆｃ融合タンパク質をこれら前処理プレートに結合させた（ｈｕＩＬ−４Ｒ／Ｆｃ：５００ng／ml；ｍｕＩＬ−４Ｒ／Ｆｃ：２５０ng／ml；ｈｕＩＬ−１Ｒ／Ｆｃ：１２５ng／ml；室温で１時間）。洗浄後に、それらペプチドまたはそれぞれの特異的未標識リガンド（ｈｕＩＬ−４Ｒ／Ｆｃ：ｈｕＩＬ−４；ｍｕＩＬ−４Ｒ／Ｆｃ：ｍｕＩＬ−４；ｈｕＩＬ−１Ｒ／Ｆｃ：ｈｕＩＬ−１ｒａ）を様々な濃度で添加した後、ビオチニル化された形の特異的リガンドを固定濃度（１００ng／ml）で添加した。それらプレートを５％ＤＭＳＯ含有ＰＢＳＡ中、室温で１時間インキュベートした。洗浄後、それらプレートを室温で２０分間ストレプトアビジン／ペルオキシダーゼ（Amersham、ＰＢＳＡ中、１：２０００）と共にインキュベートした。それらプレートをテトラメチルベンジジン基質（Behringwerke）の溶液中で繰り返し洗浄した後、結合したペルオキシダーゼを検出した。プレートを３０分間インキュベートした後、受容体に結合したビオチニル化リガンドの量を直接反映する４５０nmでの吸光度を測定した。図１〜３では、測定された吸光信号を競合剤濃度に対してプロットした（１００％値は競合剤の非存在下に測定された吸光度である）。
【００４６】
図１は、ｈｕＩＬ−４結合テストにおいて、ヒトＩＬ−４受容体への結合を求めて未標識ｈｕＩＬ−４がビオチニル化ｈｕＩＬ−４と競合することを示している。同じことが、対応した形でいうと、ｍｕＩＬ−４とマウスＩＬ−４受容体（図２）、およびｈｕＩＬ−１ｒａとヒトＩＬ−１受容体（図３）についてもいえる。しかしながら、ペプチド混合物Ｋ  ５９９３、Ｋ ００２１およびＫ ００２２は、ビオチニル化ｈｕＩＬ−４およびｍｕＩＬ−４のそれぞれの受容体への結合を阻害する（図１および２）が、ＩＬ−１ｒａ結合アッセイでは有意な作用を全く生じない（図３）。
【００４７】
以下のＩＣ50値が測定された：
0003825491.tif 000003
【００４８】
実施例６
ＩＬ−４誘導増殖に対する作用
式Ｉで示されるシクロヘキサペプチドの、またはそれらの混合物の生物活性をバイオアッセイで測定した。ＩＬ−４は種特異的にＩＬ−４受容体に結合する。それ故に、マウスを起源としそして細胞膜にマウスＩＬ−４受容体を有する細胞系統を用いた。この細胞系統にヒトインターロイキン−４受容体の完全な遺伝子を移入した。この細胞系統は機能的にマウスおよびヒト膜局存受容体を同時に発現し、そしてこの細胞系統はマウスおよびヒトＩＬ−４の両方に依存して増殖する（Mosley et al., Cell, Vol. 59, 335-348, October 20, 1989）。ペプチドの溶解度を向上させるために１％ＤＭＳＯをすべての培地に添加した。
【００４９】
ａ）  ヒトＩＬ−４−誘導増殖に対する作用
図４（標準曲線）に示されるように、細胞系統はヒトＩＬ−４（ｈｕＩＬ−４）に依存して増殖する。一定濃度のｈｕＩＬ−４を用いると、個々に滴定される記載のペプチド混合物の各々は濃度依存的に増殖を阻害する（図４）。
【００５０】
ｂ）  マウスＩＬ−４−誘導増殖に対する作用
図５（標準曲線）に示されるように、細胞系統はマウスＩＬ−４（ｍｕＩＬ−４）に依存して増殖する。一定濃度のｍｕＩＬ−４を用いると、個々に滴定される記載のペプチド混合物の各々は濃度依存的に増殖を阻害する（図５）。
【００５１】
実施例７
ＩＬ−１−誘導増殖に対する作用
ＩＬ−１−依存性Ｔ細胞クローン（D10(N4)M、Hopkins et al., J. of Imm. Methods, 120, 271-276, 1989）を用いた。ペプチドの溶解度を向上させるために１％ＤＭＳＯを培地に添加した。細胞はヒトＩＬ−１ベータ（ｈｕＩＬ−１ベータ）に依存して増殖する（図６、標準曲線）。一定濃度のｈｕＩＬ−１ベータを用いると、個々に滴定される記載のペプチド混合物の各々は所与の濃度範囲において細胞系統の増殖を阻害しない（図６）。
【図面の簡単な説明】
【図１】競合的ｈｕＩＬ−４結合テストの結果を示す。
【図２】競合的ｍｕＩＬ−４結合テストの結果を示す。
【図３】競合的ｈｕＩＬ−１ｒａ結合テストの結果を示す。
【図４】ｈｕＩＬ−４−依存バイオアッセイによるペプチドのテストの結果で、ａは標準曲線ｈｕＩＬ−４（滴定）であり、そしてｂは１ng／ml ｈｕＩＬ−４（一定）へペプチド（滴定）を添加したものを示す。
【図５】ｍｕＩＬ−４依存バイオアッセイによるペプチドのテストの結果で、ａは標準曲線ｍｕＩＬ−４（滴定）を、そしてｂは１ng／ml ｍｕＩＬ−４（一定）へペプチド（滴定）を添加したものを示す。
【図６】ｈｕＩＬ−１ベータ−依存バイオアッセイによるペプチドのテストの結果で、ａは標準曲線ｈｕＩＬ−１ベータ（滴定）を、そしてｂは０.５Ｕ／ml ｈｕＩＬ−１ベータ（一定）へペプチド（滴定）を添加したものを示す。
【図１】
0003825491.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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