(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＴＰ（アデノシン三リン酸）をルシフェラーゼ及び溶存酸素の存在下でルシフェリンと反応させてＡＭＰ（アデノシン一リン酸）及び発光を生成せしめ、生成した発光量を測定することによりＡＴＰを検出する方法において、
被検査物中に存在する微量の汚れ由来ＡＴＰを、ルシフェラーゼ及び溶存酸素の存在下でルシフェリンと反応させてＡＭＰ及び発光を生成せしめる第１反応と、
該第１反応で生成した前記ＡＭＰを、ＡＤＫ（アデニレイトキナーゼ）の存在下で前記ＡＴＰと反応させてＡＤＰ（アデノシン二リン酸）を生成させる第２反応と、
該第２反応で生成した前記ＡＤＰを、ポリリン酸合成酵素であるＰＰＫ（ポリリン酸キナーゼ）の存在下で、化学合成により生成されたポリリン酸化合物であってリン酸基数nが１０〜１００個直鎖状に重合したポリリン酸（polyＰn；n＝１０〜１００）又はバクテリア由来のポリリン酸化合物であってリン酸基数nが１０〜１０００個直鎖状に重合したポリリン酸（polyＰn；n＝１０〜１０００）と反応させてＡＴＰとリン酸基数nが１つ減少したポリリン酸（polyＰn-1）を生成させる第３反応とからなり、
前記第１反応から第３反応を繰り返し実行させることにより、前記第１反応によって消費されたＡＴＰを前記第２反応及び第３反応によって再生させ、前記第１反応による発光量を持続させて該発光量を計測することを特徴とする生物発光によるＡＴＰの検査方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明は、動植物の代謝・成合成系において生成されるＡＴＰの検査方法に関するもので、例えば、生物発光によりＡＴＰ（アデノシン三リン酸）を測定し、食品工場などで目に見えない微生物を検出して清浄度を検査したり、食肉、鮮魚、野菜など食物の鮮度を測定することに応用できるものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来、汚れの指標成分であるＡＴＰと、触媒となる酵素（例えば、ホタルルシフェラーゼ）とを反応させると、蛍光発光することが知られている。
【０００３】
【化１】
0003864044.tif 000002
【０００４】
しかしながら、上記蛍光発光の測定では、発光の安定性が悪く、発光が非常に短時間に消失するという欠点を有しており、感度と精度を獲得するため、反応時間の厳密な制御と、短時間で消失する発光を捕らえるための特別なルミノメータの使用を必要とする問題点がある。
【０００５】
そこで、特開平8-47399号公報には、「ルシフェラーゼにより発生する生物発光を測定する方法において、ポリリン酸化合物又はその塩、及びスルフヒドリル化合物の共存下で生物発光反応を行う」ことを特徴とする技術が開示されている。これにより、生物発光の増強という新規な効果を得られ、一般的なルミノメータの使用により生物発光反応の測定が可能で、普及率が高まるという効果がある。特開平8-47399号でのポリリン酸化合物とは３個程度のリン酸基が結合した化合物である。
【０００６】
しかしながら、上記特開平8-47399に開示される方法は、ＡＴＰの新たな再生系がないため、ＡＴＰが消費されるに従い、経時的に発光が減衰する欠点を有する。従って、発光量をそのまま減衰することがなく安定に持続するためには、基質濃度、酸素濃度、ＰＨ、温度の検討を余儀なくされる。
【０００７】
ところで、特開平9-234099号には、以下の反応式で示される生物発光法によるサイクリックＡＭＰの定量法が開示されている。
【化２】
0003864044.tif 000003
【０００８】
この方法は、サイクリックＡＭＰをサイクリック３’,５’−ヌクレオチドホスホジエステラ−ゼで加水分解して反応系にＡＭＰを生成せしめる（反応１）と、マグネシウムイオン、アデニレートキナーゼ存在下で、該ＡＭＰを微量のＡＴＰと反応させてＡＤＰに変換せしめる（反応２）と、マグネシウムイオン、ホスホエノールピルビン酸の存在下で、該ＡＤＰをピルビン酸キナーゼと反応させて、ＡＴＰ及びピルビン酸に変換せしめる（反応３）と、ルシフェリン、マグネシウムイオン（又は他の金属イオン）及び溶存酸素の存在下で、ＡＴＰをルシフェラーゼと反応させ発光を生成せしめる（反応４）と、（反応４）で生成した発光量を測定することによりサイクリックＡＭＰを定量する方法（METHODS
IN ENZYMOLOGY 38,62-65;1974）を特徴としている。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、この方法は、サイクリックＡＭＰから変換されたＡＭＰを、ＡＤＰに変換し、さらに該ＡＤＰをホスホエノールピルビン酸の存在下でピルビン酸キナーゼの反応によりＡＴＰとするため、以下のような問題点があった。すなわち、以下の構造式で示されるホスホエノールピルビン酸は、１分子にリン酸基が１個しか含まれておらず、ＡＤＰからＡＴＰへの変換が不十分となり、ＡＴＰを大量に再生するにはホスホエノールピルビン酸を大量に補給しなければならなかった。このようにホスホエノールピルビン酸を大量に補給するのは、不経済であった。
【００１０】
【化３】
0003864044.tif 000004
【００１１】
また、ホスホエノールピルビン酸は熱に非常に弱く分解されやすい性質があり、炊飯工場などで炊きあがったばかりのご飯を被検査物とする場合（例えば、品温が摂氏６０〜７０℃程度の被検査物に対し、耐熱性の酵素を用いて測定するとよい。）、ホスホエノールピルビン酸を含む試薬を被検査物に投与すると、リン酸基が分解されてＡＤＰからＡＴＰへの変換が不十分となることがある。つまり、ＡＴＰによる蛍光発光の安定性が悪く、発光が非常に短時間に消失する虞（おそれ）がある。
【００１２】
さらに、被検査物中には、複数種類の細菌が存在するが、この細菌中にホスホエノールピルビン酸を分解する酵素が存在すると、リン酸基が補給されず、ＡＤＰからＡＴＰへの変換が不十分となる虞がある。
【００１３】
ところで、ＡＴＰの再生反応系を利用して安価にＡＴＰを製造する方法としては、特公昭５３−５７５２や、再公表特許ＷＯ９８／４８０３１に開示されたものが知られている。
【００１４】
特公昭５３−５７５２のＡＴＰの製造法は、ＡＭＰ、ＡＤＰ、ポリリン酸、ポリリン酸キナーゼ（ＰＰＫ）及びアデニル酸キナーゼ（ＡＤＫ）を含有する溶液を反応せしめることを特徴とするものである。
【００１５】
これにより、ＡＤＰ１分子とポリリン酸をＰＰＫの存在下で反応させてＡＴＰ１分子を生成せしめ、該ＡＴＰ１分子とＡＭＰ１分子をＡＤＫの存在下で反応させてＡＤＰ２分子を生成せしめた後、該ＡＤＰ２分子から再びＰＰＫの存在下でポリリン酸との反応によってＡＴＰ２分子を生成せしめることができるというものである。
【００１６】
しかしながら、上記特公昭５３−５７５２の製造法では、少量のＡＤＰが存在して初めてＡＴＰの再生反応系が確立されるものである。つまり、微量のＡＴＰの存在を検出し、清浄度を検査したり、食物の鮮度を測定することに応用できるものではなかった。
【００１７】
一方、再公表特許ＷＯ９８／４８０３１のＡＴＰの製造法は、ＡＭＰにＰＰＫ、ＡＤＫ及びポリリン酸を作用せしめることを特徴とするものである。
【００１８】
これにより、ＡＴＰを使用する酵素反応系において、高価なＡＴＰを添加するのではなく、安価なＡＭＰからＡＴＰが製造され、或いは、消費されたＡＴＰを効率的に再生されるものである。
【００１９】
このＡＴＰの製造法においては、ＡＴＰの添加の有無に関わらず、安価なＡＭＰからＡＴＰが製造されるという反応であるので、微量ＡＴＰの存在を検出し、清浄度を検査したり、食物の鮮度を測定することに応用できるものではない。
【００２０】
本発明は、上記問題点にかんがみ、ＡＴＰの再生反応系を利用して微量ＡＴＰの存在を検出し、食品工場などで目に見えない微生物を検出して清浄度を検査したり、食肉、鮮魚、野菜など食物の鮮度を測定することに応用できる生物発光によるアデニンヌクレオチドの検出方法を提供することを技術的課題とする。
【００２１】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するため本発明は、ＡＴＰ（アデノシン三リン酸）をルシフェラーゼ及び溶存酸素の存在下でルシフェリンと反応させてＡＭＰ（アデノシン一リン酸）及び発光を生成せしめ、生成した発光量を測定することによりＡＴＰを検出する方法において、被検査物中に存在する微量の汚れ由来ＡＴＰを、ルシフェラーゼ及び溶存酸素の存在下でルシフェリンと反応させてＡＭＰ及び発光を生成せしめる第１反応と、該第１反応で生成した前記ＡＭＰを、ＡＤＫ（アデニレイトキナーゼ）の存在下で前記ＡＴＰと反応させてＡＤＰ（アデノシン二リン酸）を生成させる第２反応と、該第２反応で生成した前記ＡＤＰを、ポリリン酸合成酵素であるＰＰＫ（ポリリン酸キナーゼ）の存在下で、化学合成により生成されたポリリン酸化合物であってリン酸基数nが１０〜１００個直鎖状に重合したポリリン酸（polyＰn；n＝１０〜１００）又はバクテリア由来のポリリン酸化合物であってリン酸基数nが１０〜１０００個直鎖状に重合したポリリン酸（polyＰn；n＝１０〜１０００）と反応させてＡＴＰとリン酸基数ｎが１つ減少したポリリン酸（polyＰn-1）を生成させる第３反応とからなり、前記第１反応から第３反応を繰り返し実行させることにより、前記第１反応によって消費されたＡＴＰを前記第２反応及び第３反応によって再生させ、前記第１反応による発光量を持続させて該発光量を計測するものである。
【００２２】
これにより、ＡＤＰからＡＴＰに変換せしめるＡＴＰの再生反応系においてポリリン酸化合物及びポリリン酸合成酵素（下記[化４]に示すようにポリリン酸とＡＤＰが存在する場合ＡＴＰを合成し、ＡＤＰが存在せずにＡＴＰが過剰に存在する場合ポリリン酸を合成する性質をもつ。）を添加して反応させるので、ＡＴＰの再生反応系を利用して生物発光の光量の増強効果を得るとともに、発光時間を持続させるので、微量のＡＴＰであってもその存在を検出し、食品工場などで目に見えない微生物を検出して清浄度を検査したり、食肉、鮮魚、野菜など食物の鮮度を測定することに応用できる生物発光によるＡＴＰの検査方法の提供が可能となる。
【００２３】
また、前記ポリリン酸化合物は、化学合成により生成されたポリリン酸化合物であって、少なくとも１０〜１００個のリン酸基（ＰＯ３基）が直鎖状に重合したものを用いるとよい。これにより、ポリリン酸化合物の１分子中にリン酸基が少なくとも１０〜１００個含まれているので、ＡＤＰからＡＴＰへの変換が容易に行われ、ＡＴＰを再生する際の補給が少量となり経済的になる。さらに、ポリリン酸化合物が熱にさらされた場合であっても、リン酸基が直鎖状に重合しているので、耐熱性があり、品温が摂氏６０〜７０℃程度の被検査物に対しても測定が可能となる。そして、リン酸基が直鎖状に重合しているため、細菌中に存在する酵素によっても分解されにくい。
【００２４】
そして、前記ポリリン酸化合物として、バクテリア由来のポリリン酸化合物を用いる場合には、少なくとも１０〜１０００個のリン酸基が直鎖状に重合したものを用いると、少なくとも１０〜１０００個のリン酸基が直鎖状に重合しているので、耐熱性、耐菌性が向上する。
【００２５】
さらに、前記ポリリン酸化合物は、ポリリン酸合成酵素の触媒作用により、ＡＴＰから生合成すれば、ポリリン酸化合物の収率を向上して、ポリリン酸化合物を安価に生成することが可能となる。
【００２６】
また、前記ポリリン酸合成酵素は、不純物を除去して精製したもの、特に、酵素に由来するＡＴＰ及びＡＤＰを除去すると、酵素に由来するＡＴＰによるＡＴＰ再生反応系の増幅は除去され、微量の汚れ由来ＡＴＰの存在があって初めてＡＴＰ再生反応系の増幅が行われるので、清浄度検査の精度がより向上する。
【００２７】
【発明の実施の形態】
本発明の実施の形態を説明する。まず、本発明の生物発光反応の測定法は次の反応式で表される。
【００２８】
【化４】
0003864044.tif 000005
【００２９】
上記反応において、（１）のようにＡＴＰ、ルシフェラーゼ、溶存酸素（図示せず）及び酵素の失活抑制を目的としたマグネシウムイオンなど金属イオン（図示せず）に、ルシフェリンを作用させると、ＡＭＰ、ピロリン酸、オキシルルシフェリン、炭酸ガス（図示せず）及び光を生成する第１反応（２）が行われ、このルシフェラーゼにより発生する光を測定することで、汚れの指標成分であるＡＴＰを検出し、食品工場などの清浄度判定をすることができる。
【００３０】
次に、生成されるＡＭＰからＡＴＰへの新たな再生系であるが、汚れ由来ＡＴＰと生成されるＡＭＰとをアデニレートキナーゼ（ＡＤＫ）の存在下で反応させてＡＤＰに変換せしめる第２反応（３）と、酵素の失活抑制を目的としたマグネシウムイオンなど金属イオン（図示せず）、ポリリン酸キナーゼ（ＰＰＫ）の存在下で、前記ＡＤＰをポリリン酸化合物（polyPｎ）と反応させて、ＡＴＰ及びポリリン酸化合物（polyPｎ-１）に変換せしめる第３反応（４）とからなる。
【００３１】
この反応の要点について以下に述べる。まず、反応（１）によりＡＴＰが消費されて、発光し、反応（２）でＡＭＰが生成するが、このＡＭＰは反応（３）によりＡＤＰに変換された後、反応（４）ではＡＤＰがＡＴＰに再生される。そして、このＡＴＰは再び反応（１）に供され、ＡＴＰが消費されて発光する。ＡＴＰのうち、汚れ由来ＡＴＰは反応（３）に供され（５）、ＡＭＰからＡＤＰの変換に利用される。以下、ＡＴＰの消費系となる反応（１）（２）と、ＡＴＰの再生系となる反応（３）（４）（５）とが同時に連続的に繰り返し行われる。このＡＴＰの消費系とＡＴＰの再生系において生成する発光は、生物発光の光量の増強効果を得るとともに、発光時間を持続させることができ、１０分間以上にわたって安定であり、１時間以上経過後も殆ど減衰することなく安定であることが確認されている。
【００３２】
ところで、前記ＡＴＰの再生系となる反応のうち、ＡＤＰからＡＴＰに変換せしめる第３反応（４）においては、ポリリン酸キナーゼ（ＰＰＫ）の存在下で、ポリリン酸化合物（polyPｎ）と前記ＡＤＰとを反応させると、ポリリン酸化合物からリン酸基が１個消費されて、ＡＴＰ及びポリリン酸化合物（polyPｎ-１）に変換せしめる。このとき、ポリリン酸化合物としては、化学合成により生成されたポリリン酸化合物であって、少なくとも１０以上のリン酸基が直鎖状に重合したものでなければ、反応に寄与しない。
【００３３】
つまり、ポリリン酸化合物（polyPｎ）として１０≦ｎ≦１００のものを用いると、１分子中にリン酸基が少なくとも１０〜１００個含まれているから、ＡＤＰからＡＴＰへ変換する際に、リン酸基が不足することはなく変換がスムーズに行われる。このため、リン酸基の供給が少量となり経済的になる。
【００３４】
さらに、ポリリン酸化合物が熱にさらされた場合であっても、リン酸基が直鎖状に重合しているので、耐熱性があり、品温が摂氏６０〜７０℃程度の被検査物に対しても測定が可能となる。そして、リン酸基が直鎖状に重合しているため、細菌中に存在する酵素であっても分解されにくい。
【００３５】
例えば、本発明で用いられるポリリン酸化合物（polyPn）は、以下の構造式によって表される。ここで（polyPｎ）は１０≦ｎ≦１００の範囲が好ましい。
【００３６】
【化５】
0003864044.tif 000006
【００３７】
前記ポリリン酸化合物は、バクテリア由来のポリリン酸化合物の場合には、少なくとも１０〜１０００個のリン酸基が直鎖状に重合したものを用いると、１０〜１０００個のリン酸基が重合しているので、耐熱性、耐菌性が向上する。
【００３８】
ポリリン酸合成酵素の触媒作用により、ＡＴＰから生合成すれば、ポリリン酸化合物の収率を向上して、ポリリン酸化合物を安価に生成することが可能となる。例えば、以下の反応式に示すようにポリリン酸化合物を、ＡＴＰから生合成する。
【００３９】
【化６】
0003864044.tif 000007
【００４０】
上記反応式によるポリリン酸化合物の生合成は、例えば、特開平5-153993号公報などに開示された従来のポリリン酸の製造方法を利用すればよい。本実施形態では、ポリリン酸合成酵素を触媒として、ポリリン酸合成酵素とＡＴＰと酵素の失活抑制を目的としたマグネシウムなどの金属イオンとを反応させ、ポリリン酸化合物を生合成する。本実施形態に使用されるポリリン酸合成酵素はポリリン酸化合物を生合成し得るものであればよい。
【００４１】
なお、本実施の形態においては、ＡＴＰの検査方法を主として述べたが、ＡＴＰ単独の検査に限定されることはなく、ＡＤＰやＡＭＰの混合物などの検査方法に応用されるものである。これにより、食肉、鮮魚、野菜など食物の鮮度を測定することにも応用することができる。
【００４２】
【実施例１】
ＡＴＰ再生反応系あり（本発明）と、ＡＴＰ再生反応系なし（従来技術）とを比較するため、以下の条件で発光の経時的変化を調べた。
【００４３】
Ｉ．ＡＴＰ再生反応系ありの場合
（イ）ポリリン酸キナーゼ（ＰＰＫ）1000Ｕ（ユニット）
（ロ）アデニレートキナーゼ（ＡＤＫ）22000Ｕ（ユニット）
（ハ）ポリリン酸化合物（PolyP）260μＭ（濃度）
（ニ）ＡＴＰ1.65μＭ（濃度）
小計 ２５μｌ（容量）
（ホ）バイオルミネエッセンスキット２５μｌ（容量）
（べーリンガーマンハイム社製）
合計 ５０μｌ（容量）
上記（イ）〜（ハ）の再生反応系に必要な試料と、（ニ）の被検査物となるＡＴＰとを容量が２５μｌとなるように混合する。そして、この混合物を、温度３７℃の条件の下、（ホ）のバイオルミネエッセンス（ルシフェリン、ルシフェラーゼを主成分とする生物発光試薬）２５μｌと反応させ、生成する発光量をルミノメータ（アマシャムファルマシアバイオテック社製）にて測定し、発光の経時的変化を調べた。発光量の測定は、反応開始後１００分間にわたって、反応させ、１０分間隔で発光量を測定する方法により行った。
【００４４】
ＩＩ．ＡＴＰ再生反応系なしの場合
再生反応が起こらないように上記（ロ）の試料を除いた試料と、上記（二）の被検査物となるＡＴＰとを容量が２５μｌとなるように混合する。そして、この混合物を、上記（ホ）のバイオルミネエッセンス（ルシフェリン、ルシフェラーゼを主成分とする生物発光試薬）２５μｌと反応させ、生成する発光量をルミノメータ（アマシャムファルマシアバイオテック社製）にて測定し、発光の経時的変化を調べた。発光量の測定は、上記と同様の方法により行った。
【００４５】
上記Ｉ．の結果及びＩＩ．の結果を図１に示す。この結果から、ＡＴＰ再生反応なしの場合、反応の初期に発光量がピークに達し、１０分経過後には１／３に減少し、以下、経時的に徐々に減少する。従って、従来の測定法では精巧なルミノメータが必要となることが分かる。これに対し、ＡＴＰ再生反応系ありの本発明の場合、反応後２０分経過後は発光量が１０倍にも達し、発光量が増強されるとともに、高水準のまま、減衰することなく長時間（３０分以上）安定していることが分かる。従って、本発明では、精巧なルミノメータを用いれば、わずかな量のＡＴＰでも検出することができ、食品検査、衛生検査の精度を向上することが可能である。一方、食品検査、衛生検査において、従来のＡＴＰの検出範囲内で基準を満たしてあれば、高価な高精度ルミノメータを使用するのではなく、安価でかつ簡単なルミノメータによりＡＴＰを検出することができる。
【００４６】
上記ＡＴＰ再生反応の実施例においては、（二）のＡＴＰ（１．６５μＭ濃度）の混入により初めてＡＴＰ酸再生反応が起こることが分かる。つまり、微量の汚れ由来ＡＴＰが存在して初めてＡＴＰ再生反応が起こるのである。しかしながら、上記[化６]に示すように、ポリリン酸合成酵素には、酵素に由来するＡＴＰやＡＤＰが混入されており、ＡＴＰやＡＤＰを除去した純粋なポリリン酸合成酵素であれば、微量の汚れ由来ＡＴＰが存在なくしてはＡＴＰ再生反応が起こらないのである。これを以下の実施例により証明する。
【００４７】
【実施例２】
まず、ポリリン酸合成酵素の精製とＡＤＰの除去を行う。
Ｉ．ポリリン酸合成酵素の精製（ＰＰＫ［１］）工程
(1).まず、大腸菌MV1184(pBC10:ppk)を培養する。
(2).本培養を開始して、2.5時間後にIPTGを0.5mM添加してポリリン酸合成酵素を誘導する。
(3).2時間後集菌して60mlのTris/HCL+sucroseバッファーに懸濁する。
(4).これを-80℃で凍結し、一晩かけて氷上で融解させる。
(5).次に、250μg/lリゾチームを加えて溶菌させる。
(6).超音波処理を行う。
(7).DNase70units/μl，Rnase10mg/lを10μl加える。
(8).高速遠心で未破砕菌体を除去する。
(9).上澄の液量をはかり、それに対して0.2g/lの硫酸アンモニウムを加える。
(10).遠心にて酵素を沈殿させ、リン酸緩衝液を加えて溶解させる。
(11).0.2μmのフィルターで微粒子を除き、疎水クロマトグラフィー（Phenyl Separose HP）、イオン交換クロマトグラフィー（MonoS5/5）にて精製する。
(12).SDS-PAGE上でほぼ単一のバンドが得られる。
【００４８】
ＩＩ．ポリリン酸合成酵素からのＡＤＰの除去（ＰＰＫ［２］）工程
(1).Ｉ．により精製した大腸菌ポリリン酸キナーゼ200μl（５×１０３units,12μg）を0.1mMのポリリン酸と混合し、37℃で10分保温する（酵素に結合しているＡＤＰがＡＴＰへ変換され、遊離する）。
(2).精製したポリリン酸分解酵素（５×１０５units）を加えて、37℃で10分保温する（残りのポリリン酸を除去する、このステップがないとポリリン酸合成酵素がカラムから溶出されない）。
(3).スマートシステム（MonoS）を使って精製する。
【００４９】
上記の精製されたポリリン酸合成酵素（ＰＰＫ［１］）を用いて、以下の条件でＡＴＰ添加(+ATP)と、ＡＴＰ無添加(-ATP)の発光の経時的変化を調べた（図２(a)参照）。
【００５０】
Ｉ．精製ポリリン酸合成酵素（ＰＰＫ［１］）を使用した場合の条件
（イ）ＰＰＫ［１］120Ｕ（ユニット）
（ロ）ＡＤＫ90Ｕ（ユニット）
（ハ）PolyP900μＭ（濃度）
（ニ）ＡＭＰ600μＭ（濃度）
（ホ）＋ＡＴＰ0.165μＭ（濃度）
【００５１】
図２(a)を参照してＡＴＰ添加(+ATP)と、ＡＴＰ無添加(-ATP)とを比較すると、ＡＴＰ添加(+ATP)のほうが発光強度が強いことが分かる。
【００５２】
さらに、ＡＤＰが除去されたポリリン酸合成酵素（ＰＰＫ［２］）を用いて、以下の条件でＡＴＰ添加(+ATP)と、ＡＴＰ無添加(-ATP)の発光の経時的変化を調べた（図２(b)参照）。
【００５３】
ＩＩ．ＡＤＰが除去された精製ポリリン酸合成酵素（ＰＰＫ［２］）を使用した場合の条件
（イ）ＰＰＫ［２］120Ｕ（ユニット）
（ロ）ＡＤＫ90Ｕ（ユニット）
（ハ）PolyP900μＭ（濃度）
（ニ）ＡＭＰ60μＭ（濃度）
（ホ）＋ＡＴＰ0.165μＭ（濃度）
【００５４】
図２(b)を参照してＡＴＰ添加(+ATP)と、ＡＴＰ無添加(-ATP)とを比較すると、ＡＴＰ添加(+ATP)の方が格段に発光強度が強いことが分かる。
【００５５】
図２(a)及び図２(b)を参照すれば、ＡＴＰ無添加(-ATP)のＡＴＰ再生反応系はポリリン酸合成酵素に由来するＡＴＰにより行われるのであって、反応系が増幅して行われることはない。したがって、ポリリン酸合成酵素から酵素に由来するＡＴＰ及びＡＤＰの混入をできる限り減らし、精製度を向上すれば、ＡＴＰ再生反応系が引き起こされないと推測される。
【００５６】
一方、ポリリン酸合成酵素から酵素に由来するＡＴＰ及びＡＤＰの混入をできる限り減らしても、どこからかＡＴＰが入ってきてＡＴＰ再生反応系の増幅が起こることが考えられる。また、再生反応系に必要なＡＭＰについては、市販のＡＭＰであれば少量のＡＤＰが含まれており、それを予め精製して、取り除いてあるが、それでも不十分である可能性がある。そこで、実施例３では、ＡＤＰが除去された精製ポリリン酸合成酵素（ＰＰＫ［２］）を使用し、ポリリン酸(PolyP)及びＡＭＰの濃度を減少させて、その発光強度を比較してみた。
【００５７】
【実施例３】
ＡＴＰ再生反応系に及ぼす基質濃度の比較
条件Ｉ．（図３(a)参照）
（イ）ＰＰＫ［２］120Ｕ（ユニット）
（ロ）ＡＤＫ90Ｕ（ユニット）
（ハ）PolyP900μＭ（濃度）
（ニ）ＡＭＰ600μＭ（濃度）
（ホ）＋ＡＴＰ0.165μＭ（濃度）
【００５８】
条件ＩＩ．（図３(b)参照）
（イ）ＰＰＫ［２］120Ｕ（ユニット）
（ロ）ＡＤＫ90Ｕ（ユニット）
（ハ）PolyP900μＭ（濃度）
（ニ）ＡＭＰ60μＭ（濃度）
（ホ）＋ＡＴＰ0.165μＭ（濃度）
【００５９】
条件ＩＩＩ．（図３(c)参照）
（イ）ＰＰＫ［２］120Ｕ（ユニット）
（ロ）ＡＤＫ90Ｕ（ユニット）
（ハ）PolyP90μＭ（濃度）
（ニ）ＡＭＰ600μＭ（濃度）
（ホ）＋ＡＴＰ0.165μＭ（濃度）
【００６０】
図３(a)(b)(c)を参照すれば、図３(b)はＡＴＰ無添加でＡＴＰ再生反応の増幅が起こっていないことが分かる。以上よりポリリン酸合成酵素から酵素に由来するＡＴＰ及びＡＤＰの混入をできる限り減らし、精製度を向上すれば、外部からＡＴＰが添加されなければＡＴＰ再生反応系が引き起こされないことが証明される。
【００６１】
【発明の効果】
以上のように本発明によれば、ＡＭＰを微量の汚れ由来ＡＴＰとＡＤＫ存在下で反応させてＡＤＰに変換せしめ、次いで、該ＡＤＰを、ポリリン酸合成酵素の存在下でポリリン酸化合物と反応させてＡＴＰに変換せしめるＡＴＰの再生反応系を備えるので、従来よりも発光が長く継続する。ＡＴＰのルシフェラーゼ反応の際にポリリン酸化合物を添加させる方法（特開平8-47399）ではポリリン酸合成酵素が存在しないので全くこの効果は得られない。また、特開平8-47399で使われるポリリン酸「３つ程度のリン酸基が結合したもの」では、たとえ酵素が存在しても再生系は成立しない。本発明は、ＡＤＰからＡＴＰに変換せしめるＡＴＰの再生反応系において、ポリリン酸化合物及びポリリン酸合成酵素を添加して反応させるので、生物発光の光量の増強効果を得るとともに、発光時間を持続させることのできる生物発光によるＡＴＰの検査方法を提供することが可能となる。
【００６２】
また、前記ポリリン酸化合物は、化学合成により生成されたポリリン酸化合物であって、少なくとも１０〜１００個のリン酸基が直鎖状に重合したものを用いるとよい。これにより、ポリリン酸化合物の１分子中にリン酸基が少なくとも１０〜１００個含まれているので、ＡＤＰからＡＴＰへの変換が容易に行われ、ＡＴＰを再生する際の補給が少量となり経済的になる。さらに、ポリリン酸化合物が熱にさらされた場合であっても、リン酸基が直鎖状に重合しているので、耐熱性があり、品温が摂氏６０〜７０℃程度の被検査物に対しても測定が可能となる。そして、リン酸基が直鎖状に重合しているため、細菌中に存在する酵素によっても分解されにくい。
【００６３】
そして、前記ポリリン酸化合物は、バクテリア由来のポリリン酸化合物であって、少なくとも１０〜１０００個のリン酸基が直鎖状に重合したものを用いると、少なくとも１０〜１０００個のリン酸基が直鎖状に重合しているので、耐熱性、耐菌性が向上する。
【００６４】
さらに、前記ポリリン酸化合物は、ポリリン酸合成酵素の触媒作用により、ＡＴＰから生合成すれば、ポリリン酸化合物の収率を向上して、ポリリン酸化合物を安価に生成することが可能となる。
【００６５】
また、前記ポリリン酸合成酵素は、不純物を除去して精製したもの、特に、酵素に由来するＡＴＰ及びＡＤＰを除去すると、酵素に由来するＡＴＰによるＡＴＰ再生反応系の増幅は除去され、微量の汚れ由来ＡＴＰの存在があって初めてＡＴＰ再生反応系の増幅が行われるので、清浄度検査の精度がより向上する。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＡＴＰ濃度が1.65μＭの場合における本発明と従来のものとの相対発光量の経時的変化を示す。
【図２】精製されたポリリン酸合成酵素（ＰＰＫ［１］）及びＡＤＰが除去されたポリリン酸合成酵素（ＰＰＫ［２］）を用いて、ＡＴＰ添加(+ATP)と、ＡＴＰ無添加(-ATP)の発光の経時的変化を調べた図である。
【図３】ＡＴＰ再生反応系に及ぼす基質濃度について発光の経時的変化を調べた比較図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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