(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
急性骨髄性白血病患者の骨髄細胞に由来し、ミエロペルオキシダーゼを産生し、染色体の（８；２１）転座を有し、１７番染色体の一方が欠失しており、ｐ５３遺伝子のコドン２４８位及びコドン３６８位にミスセンス突然変異を有し、ＦＥＲＭ  Ｐ−１５０７１の受託番号で寄託されているヒト骨髄細胞由来セルライン。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規なヒト骨髄細胞由来セルラインに関する。
【０００２】
【従来の技術】
ミエロペルオキシダーゼ（以下、「ＭＰＯ」と言うことがある）は、顆粒球−マクロファージ系譜の細胞で特異的に発現するライソゾーム酵素である。ＭＰＯは、そのペルオキシダーゼ活性の故に抗菌作用及び抗ウイルス作用を有する。従来、ＭＰＯとしては、末梢血由来のものが市販されているが、血液を原料とするので、原料の確保に難があり、また、ロット間のバラツキや病原体の混入等の虞もある。さらに、末梢血由来のＭＰＯは、アデノウイルスに対しては抗ウイルス作用を示さない。ＭＰＯを安定供給し、ロット間のバラツキをなくすためには、血液を原料とするよりも、大量培養可能なセルラインにＭＰＯを生産させる方が好ましい。
【０００３】
本願出願人は先に、急性骨髄性白血病患者の白血球に由来し、ミエロペルオキシダーゼを産生するセルラインを出願した（特開平５−１７６７６０号公報）。ＭＰＯを高率に分泌するセルラインは従来、該公開公報に記載されたセルライン以外には全く知られていない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
ＭＰＯは上記のように抗菌作用や抗ウイルス作用を有する重要な酵素であるので、ＭＰＯの生産の技術や抗菌及び抗ウイルス作用をさらに研究する上で、新規なＭＰＯ産生セルラインを提供することが望まれる。
【０００５】
従って、本発明の目的は、ＭＰＯ生産能を有する新規なセルラインを提供することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本願発明者らは、鋭意研究の結果、急性骨髄性白血病患者の骨髄細胞から、ＭＰＯ生産能を有する新規なセルラインを確立することに成功し、本発明を完成した。
【０００７】
すなわち、本発明は、急性骨髄性白血病患者の骨髄細胞に由来し、ミエロペルオキシダーゼを産生し、染色体の（８；２１）転座を有し、１７番染色体の一方が欠失しており、ｐ５３遺伝子のコドン２４８位及びコドン３６８位にミスセンス突然変異を有し、ＦＥＲＭ  Ｐ−１５０７１の受託番号で寄託されているヒト骨髄細胞由来セルラインを提供する。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明のセルラインは、下記実施例に詳述するように、急性骨髄性白血病患者の骨髄細胞を採取し、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）及び２０％牛胎児血清（ＦＢＳ）を含むＲＰＭＩ−１６４０培地で３７℃で５％ＣＯ2 で継代培養することにより得られた。
【０００９】
本発明のセルラインは、下記実施例に詳述するように、ＭＰＯを産生し、染色体の（８；２１）転座（２１番染色体上に８番染色体上の遺伝子が転座すること）を有し、１７番染色体の一方が欠失しており、ｐ５３遺伝子のコドン２４８位及びコドン３６８位にミスセンス突然変異を有する。これらの性質のうち、ＭＰＯを産生すること以外は全て特開平５−１７６７６０号公報記載のセルラインが有さない性質であり、また、由来も異なっているので、本発明のセルラインは特開平５−１７６７６０号公報記載のセルラインとは明らかに異なるものである。
【００１０】
本発明のセルラインはＭＰＯを産生するために用いることができる。また、本発明のセルラインは、染色体の（８；２１）転座を有するので、染色体の（８；２１）転座の検出方法におけるポジティブコントロールとしての用途も有する。
【００１１】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００１２】
(1) ＣＭＣ−１セルラインの確立
２２才の男性の急性骨髄性白血病（Ｍ２型）患者の骨髄から骨髄細胞を採取した。単核細胞をフィコール−ハイパーク勾配上で分離し、２０％ＦＢＳ（オーストラリア国Ｆｌｏｗ  Ｌａｂ．社製）及び１０ｎｇ／ｍｌのヒト組換えＧＭ−ＣＳＦ（シェーリング−プラウ社製）を含むＲＰＭＩ−１６４０培地中で３７℃で５％ＣＯ2 を含む湿潤空気中で培養した。全ての培養において、培地は１週間ごとに交換した。培養開始約１カ月後から細胞の増殖が活発になってきたので６日毎に継代培養を行った。最初の培養開始から約６カ月後に安定な継代培養物を取り、限界希釈法によりクローン化した。そのうちの１つをＣＭＣ−１と命名した。
【００１３】
クローン化したＣＭＣ−１細胞を、ＦＢＳ濃度が１０％であることを除き上記と同じ培地、条件でさらに１年間、６０代にわたり継代培養した。細胞の２倍増殖時間は４８時間ないし７２時間であった。
【００１４】
上記方法により確立されたセルラインＣＭＣ−１は工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ  Ｐ−１５０７１号の受託番号で寄託されている。
【００１５】
(2) ＭＰＯの産生及び分泌
ＣＭＣ−１を３日間又は５日間培養後、細胞内及び培養液中のＭＰＯ活性を公知の方法（Kawaguchi et al., LEUKEMIA, Vol 6, No 12 (December), 1992:pp 1296-1301) により測定した。その結果、細胞１０6 個当たり、３日間培養したもので細胞内に約８．０Ｕ、培養液中に約２．４Ｕ、５日間培養したもので細胞内に約６．４Ｕ、培養液中に約２．０ＵのＭＰＯ活性が認められた。
【００１６】
(3) 染色体の（８，２１）転座
ＣＭＣ−１細胞から常法によりＤＮＡを抽出し、これを制限酵素BamHI で消化し、０．８％アガロースゲル上で電気泳動にかけ分離した。ゲルをニトロセルロース膜に転写後、これをＡＭＬ１遺伝子の一部であるｃＤＮＡプローブＣ６Ｅ６Ｈ２（塩基配列は配列表の配列番号１に記載）とハイブリダイズさせてサザンブロット分析を行った。陰性対照としてのヒト胎盤由来のＤＮＡ及び陽性対照としての染色体（８，２１）転座を有する骨髄性白血病患者からのＤＮＡも同様にしてサザンブロット分析を行った。正常な生殖系列のバンドは２０ｋｂ及び１１ｋｂである（陰性対照）が、ＣＭＣ−１細胞及び陽性対照の細胞では、これらに加えて２２〜２３ｋｂの位置に異常なバンドが認められた。
【００１７】
骨髄性白血病における（８，２１）転座では、２１番染色体上のＡＭＬ１遺伝子に８番染色体上の遺伝子であるＭＴＧ８が転座するので、これらの遺伝子の融合部が存在すれば、（８，２１）転座が起きている直接的な証拠になる（WO 94/08005)。従って、ＲＴ−ＰＣＲにより、ＡＭＬ１−ＭＴＧ８融合転写物がＣＭＣ−１のＤＮＡ中に存在するか否かを調べた。この操作は具体的には次のようにして行った。
【００１８】
(i) 逆転写反応
ＣＭＣ−１細胞から常法により全ｍＲＮＡを抽出し、得られた全ｍＲＮＡを１から５μｇ使用し、逆転写酵素により cDNA を合成した。反応溶液（２０μｇ）の組成は、以下のとおりである。１０mMトリス−塩酸(pH 8.3)、７５mM塩化カリウム、３mM塩化マグネシウム、１mMジチオスレイトール、１mM dATP 、１mM dGTP、  １mM dCTP 、１mM dTTP 、１０ユニットＲＮＡ分解酵素阻害剤、２５pmolランダムヘキサマー、２００ユニットの逆転写酵素、および１〜５μｇ  ＲＮＡ。反応液を室温で１０分間放置し、プライマーを鋳型ＲＮＡにアニールさせた後に、３７℃で１時間反応させた。反応終了後、９９℃で５分間加熱し、逆転写酵素を失活させ、また生成した cDNA を鋳型ＲＮＡより解離させた。
【００１９】
(ii)ＰＣＲ
逆転写反応産物（cDNA）を1/10量（２μｌ）使用し、ＡＭＬ１配列であるプライマーＡＭＬ１−Ｃと、ＭＴＧ８の配列であるプライマーＭＴＧ８−２を用いて、ｔ（８；２１）転写産物上の融合部近傍の配列を、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼにより増幅させた。ＰＣＲ反応溶液（２５μｌ）の組成は以下のとおりである。１０mMトリス−塩酸 (pH 8.3) 、５０mM塩化カリウム、３mM塩化マグネシウム、 0.2mM dATP 、0.2mM dGTP、0.2mM dCTP、0.2mM TTP 、５pmol AML1-C (5'-GAGGGAAAAGCTTCACTCTG-3' ）、5pmol MTG8-2(5'-GCGAACTCTTTCTCCTATC-3') および1.25ユニットのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ。反応溶液の蒸発を防ぐため、流動パラフィンを１滴上層した。反応溶液を初めに、９５℃で２分間熱変性した後に、アニーリングを６２℃３０秒、伸長反応を７２℃１分、熱変性を９５℃２０秒を１サイクルとする反応を、ＰＣＲ自動化装置を用いて、３４サイクル行った。サイクル終了後、更に６２℃３０秒アニーリングを行い、７２℃で７分間伸長させた。
【００２０】
(iii) ＰＣＲ増幅産物の解析
ＰＣＲ反応後に１／５量の６×ローディングバッファー（３０％グリセロール、0.25％ブロムフェノールブルー、0.25キシレンシアノールを含む）を加え、よく攪拌した後に、その半量を３％アガロ−スゲル（２％NuSieve GTG Agarose, FMC BioProducts社製＋１％Agarose S,和光純薬工業社製）電気泳動に用いた。電気泳動は、0.5 μｇ／ｍｌエチジウムブロマイドを含むバッファー溶液中で行い、泳動後、ゲルを紫外線照射し、エチジウムブロマイドにより染色されたＤＮＡ産物を検出した。プライマーとして AML1-C と MTG8-2 を用いた場合、４５７塩基対のＤＮＡが増幅されることが、ｔ（８；２１）転座の有無の指標となった。この方法により、ＣＭＣ−１細胞が（８，２１）転座を有することが証明された。
【００２１】
(4) 染色体異常
常法によりＣＭＣ−１細胞の染色体を観察したところ、１７番染色体の一方が欠失していた。
【００２２】
(5) ｐ５３遺伝子の塩基配列決定
ＣＭＣ−１細胞から常法により全ｍＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲを行った。ＲＴ−ＰＣＲは先ず、上記(ii)と同様にしてｃＤＮＡをＰＣＲにより増幅した後、得られたＰＣＲ増幅産物をさらに、プライマーP53 ORF 1F (5'-CGC TTC CCT GGA TTG GCA GC-3') とプライマーP53 ORF 2R (5'-AAA TGG CAG GGG AGG GAG AG-3') を用いて同様にＰＣＲを行って増幅した。
【００２３】
得られたＰＣＲ産物の塩基配列をジデオキシ法（Sanger et al., Journal of Molecular Biology, 143, 161-178 (1980)) により直接決定した。すなわち、ＰＣＲ産物をpBlueScript ベクター（東洋紡社より市販）に挿入して大腸菌で増やし、プラスミドを精製した後、両側から２つのＭ１３プライマー（5'-GTT TTC CCA GTC ACG AC-3'及び5'-AAC AGC TAT GAC CAT G-3' ）でシークエンスした。もっとも、全長が約１．５ｋｂあるので１回では終わらず、その内側のプライマーを合成して全ての配列を決定した。これらのプライマーがハイブリダイズする領域（配列番号１参照）、プライマー名及びｍＲＮＡ合成の向きを下記表１に示す。
【００２４】
0003843147.tif 000002
【００２５】
得られた塩基配列を配列表の配列番号１に示す。得られた塩基配列をデータベースに登録されている配列（GenBank Accession No. K03199）に記載されたｐ５３遺伝子の塩基配列と比較した。その結果、コドン２４８でＣＧＧ（Ａｒｇ）がＣＡＧ（Ｇｌｎ）に変異しており、また、コドン３６８位でＣＡＣ（Ｈｉｓ）がＣＧＣ（Ａｒｇ）に変異していた。比較のため、特開平５−１７６７６０号公報に記載されたＳＫＭ−１細胞についても同様に調べたところ、ＳＫＭ−１細胞ではコドン３２７位でＴＡＴ（Ｔｙｒ）がＣＡＴ（Ｈｉｓ）に変異していた。
【００２６】
【発明の効果】
本発明により、ＭＰＯを分泌生産する新規なセルラインが提供された。本発明のセルラインは、ＭＰＯの生産の技術や抗菌及び抗ウイルス作用をさらに研究する上で有用であり、また、急性骨髄性白血病における染色体の（８，２１）転座を検出するための対照としても有用である。
【００２７】
【配列表】
配列番号：１
配列の長さ：１７６０
配列の型：核酸
配列
0003843147.tif 000003
0003843147.tif 000004
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