(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
オーレオバクテリウム（Ａｕｒｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌株ＡＡ１（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８６９８）を培養し、培養物から黄色色素を分離することを特徴とする黄色色素の製造方法。
【請求項２】
プシコースを添加した固体培地又は液体培地を用いて培養する請求項１記載の黄色色素の製造方法。
【請求項３】
黄色色素がデカプレノキサンチンを主要成分とするヒドロキシル基含有カロチノイド系黄色色素である請求項１又は２記載の黄色色素の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、食品添加剤、特に健康食品用添加剤として有用なヒドロキシル基含有カロチノイド系黄色色素の新規な製造方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
近年、長寿の原因としての生体内における各種物質の機能が明らかにされるとともに、天然の有用成分を利用したいろいろの健康食品が提案されている。この中の１つとして、カロチノイド系黄色色素類は、生体に悪影響を与える活性酸素の除去作用や抗ガン作用を有する物質として注目されているほか、老化防止剤としての効用も期待されている。
【０００３】
他方、カロチノイド系黄色色素の中でヒドロキシル基をもつ色素群は、ほうれんそう、パプリカ、オレンジ、マリーゴールドなどの植物や、卵黄、ヒトの目の網膜などの動物組織中に存在することが知られているが、ヒトの場合、体内で生産できないため、外部からの摂取が必要とされる。このため、このものの不足を補うために、カロチノイド類を添加した食品が市販されている。
【０００４】
このヒドロキシル基含有カロチノイド系黄色色素の１種であるデカプレノキサンチンは、セルロモナス属細菌により生産されること［「ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，）」，第１４１巻，第１２７２〜１２７８ページ（１９８０）］や、ルテインが緑藻類により生産されること（特開平８−８９２７９号公報）は知られている。
【０００５】
ところで、健康食品などに添加されるカロチノイド系黄色色素類は、一般に野菜、花卉、果実などの植物原料から有機溶剤により抽出されているが、近年、環境汚染、衛生面の点で有機溶剤の使用は制限される傾向にある上、植物を原料とするには、所要の植物の栽培、採種、乾燥、抽出、精製など多大の労力とコストをかけなければならないため、これに代わるべき供給源が要望されていた。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、このような事情のもとで、ヒドロキシル基をもつカロチノイド系黄色色素を、植物以外の供給源を開発することにより労力及びコストを低減し、安価にかつ多量に生産することを目的としてなされたものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ヒドロキシル基をもつカロチノイド系黄色色素を植物組織以外の原料を用いて製造する方法について種々研究を重ねた結果、オーレオバクテリウム（Ａｕｒｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）に属するある種の菌が、デカプレノキサンチンを主成分とする黄色色素を生産することを見出し、この知見に基づいて本発明をなすに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は、オーレオバクテリウム（Ａｕｒｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌株ＡＡ１（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８６９８）を培養し、培養物から黄色色素を分離することを特徴とする黄色色素の製造方法を提供するものである。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明方法において培養に用いるオーレオバクテリウム（Ａｕｒｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌株ＡＡ１は独立行政法人産業技術総合研究所特許微生物寄託センターにＦＥＲＭ  Ｐ−１８６９８として寄託されている。
【００１０】
この菌株ＡＡ１（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８６９８）は熊本県天草郡有明町の海水から分離された文献未載の新菌である。
【００１１】
次に本発明方法で用いる微生物の菌学的性状を説明する。
（１）形態
コロニーの形態は、偏平で丸く、不透明で黄色である集落の周辺細胞の伸長は陰性である。細胞の光学顕微鏡観察に基づく形態は、多形成桿菌で０．４〜０．７μｍの幅を有し、培養の経過により初期の桿菌から対数増殖の終末期には短桿菌〜球菌状に形状が変化し、また、運動性を有していた。グラム染色は陽性で、胞子形成能は認められなかった。
（２）生理学的性質
（ａ）炭素源の発酵性グルコースの酸化分解性は陰性である。
（ｂ）細胞壁のジアミノ酸はオルニチンである。
（ｃ）主要キノン系はＭＫ−１１，ＭＫ−１０，ＭＫ−１２である。
（ｄ）酵素活性
カタラーゼ（ｃａｔａｌａｓｅ）活性は陽性である。オキシダーゼ（ｏｘｉｄａｓｅ）活性は陰性である。
（ｅ）酸素に対する態度は好気的である。
【００１２】
以上の菌学的性質から菌株ＡＡ１は文献を参考に既知菌種を検索したところ、オーレオバクテリウム（Ａｕｒｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌の性状と一致した。
【００１３】
本発明方法により黄色色素を製造するには、上記の菌株、例えばＦＥＲＭ  Ｐ−１８６９８を栄養培地に接種し、好気的に培養する。この菌株の培養方法は、原則的には一般微生物の培養方法に従って行われるが、通常は液体培養による振とう培養、通気撹拌培養などの好気的条件下で行うのが好ましい。
【００１４】
この際、培養に用いることのできる培地としては、オーレオバクテリウム（Ａｕｒｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌株ＡＡ１（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８６９８）が利用できる栄養源を含有する培地であればよく、各種の合成培地、半合成培地、天然培地などいずれも用いることができる。培地組成としては、例えば、炭素源として、グルコース、シュークロース、プシコース、糖みつ、デンプンなどを単独又は組み合わせて使用することができ、窒素源としては、大豆粉、コーンスティープリカー、肉エキス、ペプトン、酵母エキス、硫酸アンモニウムなどを単独又は組み合わせて使用することができる。また必要に応じて、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム、炭酸カルシウム、リン酸塩、金属塩などの無機塩を加えることができる。その他、これらの菌株の生育あるいはグリセロ糖脂質の生産を促進する有機物、例えば、ビタミン類、アミノ酸類を加えることができる。
【００１５】
この培養においてグリセロ糖脂質の生産量を増大するには、炭素源としてプシコースなどの緩慢代謝性の糖類を用いるのが好ましい。
また、この際、栄養源の他、５質量％以下、好ましくは０．５〜３．５質量％の塩化ナトリウムを添加し、液体培地で培養する場合は空気を吹き込むか、空気との接触を保つために振とうするのが好ましい。
【００１６】
培養条件としては、オーレオバクテリウム（Ａｕｒｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌株ＡＡ１（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８６９８）が良好に生育して本発明の黄色色素を生産しうる範囲内で適宜選択すればよい。例えば、培地のｐＨは５〜８程度、通常中性付近とすることが好ましいが、必ずしも調整する必要はない。培養温度は、微生物が良好に生育する温度、通常１０〜４０℃、好ましくは１５〜３５℃に保つのがよい。培養時間は、１〜１４日間程度でよく、好ましくは２〜５日間である。もちろん上述した各種の培養条件は、外部条件などに応じて適宜変更でき、またそれに応じて上記範囲から最適条件を選択、調整できる。その際、培養液中の黄色色素の蓄積量が最大になったときに培養を停止して得た培養液を後続の工程に使用する。
【００１７】
このようにして得た培養液中に蓄積された黄色色素は、培養後、濾過、遠心分離などの一般的固液分離手段によって菌体を分離し、分離した菌体から回収可能である。
【００１８】
黄色色素の分離、精製は、これまで知られている種々の方法を選択、組み合わせて行うことができる。例えば、クロロホルム、酢酸エチル、メチルアルコールなどを用いた溶媒抽出や、シリカゲルやアルミナなどの担体を用いるクロマトグラフィー法を用いることができる。これらの担体から目的物質を溶出させる方法は、担体の種類、性質によって異なるが、一例として、シリカゲル薄層クロマトグラフィーの場合には、展開及び溶出溶媒として、クロロホルムとメチルアルコールの混合溶媒などを用いることができる。さらに展開溶媒としてジエチルエーテルを用いたシリカゲル薄層クロマトグラフィーにより、さらに純度を向上させることができる。また、これらの方法を単独又は適宜組み合わせて、場合によっては反復使用することにより、分離、精製することができる。
【００１９】
このようにして得られた黄色色素は、公知の方法に従い、無水酢酸とピリジンを用いてアセチル化したのち、紫外・可視吸光スペクトル、核磁気共鳴スペクトル及び質量スペクトルにより、炭素数５０、ヒドロキシル基２個をもつカロチノイド類であることが同定された。
【００２０】
また、このものについて、「ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，）」，第１４１巻，１２７２〜１２７８ページに記載されている方法に従い、溶媒としてヘキサンを用いて、紫外・可視吸光スペクトルを測定したところ、図１に示すように６本の吸収極大が４６７，４３７，４１４，３２８，３１４及び２６６ｎｍの位置に認められた。これは上記の文献に記載されたデカプレノキサンチンの吸収にほぼ一致することから、これはデカプレノキサンチンに類似の構造をもつものであると推定される。
【００２１】
次に、この黄色色素のアセチル化試料について同様にスペクトルを測定したところ、吸収極大を示す波長位置に変化は認められなかった。このことから、アセチル化反応を受けるヒドロキシル基は、この黄色色素の色調に変化を生じない位置に結合していることが分る。
【００２２】
また、重水素化クロロホルム溶液に溶解した精製黄色色素を核磁気共鳴法により４００ＭＨｚでプロトンのスペクトルを測定したときの結果を図２に示す。これによると、メチル基のプロトン群、オレフィンのプロトン群、及びヒドロキシル基を有する炭素原子に結合したプロトンのピークが認められる。メチル基のプロトンはδ１．９７０，１．９３３，１．６７３，１．５３０，０．９２９，０．７３８ｐｐｍの６本であり、上記文献に記載のデカプレノキサンチンのメチル基群のケミカルシフト値と一致している。
【００２３】
さらに、精製黄色色素及びその色素のアセチル化物をメタニトロベンジルアルコールをイオン化のマトリックスに用いて高速原子衝撃質量スペクトル分析したときのポジテイブイオン化法による測定結果を図３に示す。精製黄色色素のスペクトルには質量／荷電比７０４．５のプリカーサーイオンがアセチル化物には質量／荷電比７８８．５のプリカーサーイオンピークが認められた。また、ヨウ化ナトリウムを添加して同様に測定したときに、２次精製黄色色素には質量／荷電比７０４．６の他に７２７．５のプリカーサーイオンピークが認められたことから、精製黄色色素の分子量は７０４．５と同定された。アセチル化した黄色色素のプリカーサーイオンは質量／荷電が７８８．５でアセチル化反応によりアセチル基２個が導入されていることが分る。
【００２４】
以上のようにして得られる黄色色素は以下に示す物理化学的性質を有する。
１．黄色色素の物理化学的性質
（１）分子量：７０４．５６
（２）分子式：Ｃ50Ｈ72Ｏ2
（３）図３の高速原子衝撃質量スペクトル（ＦＡＢ−ＭＳ）よりＭ＋として質量／荷電比はｍ／ｚ７０４．６にイオンピークを示した。これは分子式により計算される質量値にほぼ一致した値である。
（４）色及び形状：金属光沢を有する暗赤色粉末。
（５）溶解性：クロロホルム、エーテル、ヘキサンなど有機溶媒に溶け、水にはほとんど溶けない。
（６）薄層クロマトグラフィーのＲｆ値：シリカゲル薄層プレート（メルク社製：１．０５６４１）において０．５１（展開溶媒クロロホルム：メチルアルコール＝１９：１、容積比）を示した。該色素をアセチル化するとＲｆ値は０．７０に上昇した。
【００２５】
【実施例】
次に実施例により本発明をさらに詳細に説明する。
【００２６】
実施例１
寒天［デイフコ（Ｄｉｆｃｏ）社製、「マリンアガー２２１６」］５５．１ｇを水１リットルに溶解し、１２１℃で１５分オートクレーブ滅菌したのち、直径９ｃｍのシャーレに３０ｍｌを分注し、室温まで放冷することにより固形培地を調製した。
次いで、上記の寒天の表面に４質量％プシコース溶液２００μｌを塗布した上に、オーレオバクテリウム（Ａｕｒｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌株ＡＡ１（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８６９８）の菌体を接種し、２０℃の恒温インキュベータ中に静置し、培養した。
７日間培養したのち、菌体を採取し、凍結乾燥することにより、乾燥菌体１９８ｍｇを得た。
【００２７】
次に、この乾燥菌体１９８ｍｇをクロロホルム／メチルアルコール混液（体積比２／１）１５ｍｌを用いて３回抽出し、溶媒をロータリーエバポレーターを用いて濃縮乾固することにより粗黄色色素２８．７ｍｇを得た。次いでこの粗黄色色素をシリカゲル薄層クロマトグラフィー（メルク社製：１．０５６４１）に担持させたのち、クロロホルム／メチルアルコール（体積比１９／１）で展開した。展開終了後、溶媒を蒸発させ、Ｒｆ値０．５１の黄色バンド部分を分取し、クロロホルム／メチルアルコール混液（体積比４／１）で溶出し、溶出液をロータリーエバポレーターで乾固することにより黄色色素０．３ｍｇを得た。
【００２８】
実施例２
トリプトン（デイフコ社製）１．０ｇ、酵母エキス（デイフコ社製）０．５ｇ、塩化ナトリウム１．０ｇ及び純水１００ｍｌを混合し、液体栄養培地（ｐＨ６．５）を調製した
次に、この液体栄養培地１００ｍｌを５００ｍｌ体積の三角フラスコに移し、オートクレーブ殺菌したのち、実施例１と同じ菌体を接取し、ロータリーシェーカーを用い、２０℃、振とう速度１００ｒｐｍの条件下、２日間振とう培養し、種母培養液を調製した。
別に、５００ｍｌ体積三角フラスコ５個を用意し、それぞれに、前記の組成の液体栄養培地１００ｍｌずつを分注し、殺菌処理したのち、前記の種母培養液を１ｍｌずつ接種し、ロータリーシェーカー（１００ｒｐｍ）を用いて２０℃で４日間、振とう培養した。
【００２９】
培養終了後、培養液を遠心分離して菌体を集め少量の純水で洗浄後、凍結乾燥することにより、フラスコ１本当り平均１４１ｍｇの乾燥菌体を得た。
次いで、この乾燥菌体１４１ｍｇをクロロホルム／メチルアルコール混液（体積比２／１）１０ｍｌを用いて３回抽出し溶媒をロータリーエバポレーターにより濃縮乾固させ１１．６ｍｇの粗黄色色素を得た。粗黄色色素をシリカゲル薄層クロマトグラフィー（メルク社製：１．０５６４１）にかけ、クロロホルム／メチルアルコール（１９／１）で展開した。展開終了後溶媒を乾燥させ、Ｒｆ値０．５１の黄色バンド部分を分取し、クロロホルム／メチルアルコール混液（４／１）で溶出後、ロータリーエバポレーターで乾固し黄色色素０．１ｍｇを得た。
【００３０】
実施例３
実施例２で用いた組成の液体栄養培地１００ｍｌずつを三角フラスコ４個に分取し、それぞれにプシコース、グルコース、ガラクトース又はシュークロース０．５ｇずつ添加したのち殺菌処理した。
次いで、これらに実施例２で調製した種母培養液１ｍｌずつを接種し、ロータリーシェーカーを用いて、２０℃、振とう速度１００ｒｐｍで４日間振とう培養した。
【００３１】
培養終了後、培養液を遠心分離して菌体を集め少量の純水で洗浄後、凍結乾燥し、乾燥菌体を得た。この乾燥菌体をクロロホルム／メチルアルコール混液（体積比２／１）を用いて３回抽出し、この抽出液をロータリーエバポレーターにより濃縮乾固させ、粗黄色色素を得た。
次いで、粗黄色色素をシリカゲル薄層クロマトグラフィー（メルク社製、１．０５６４１）にかけ、クロロホルム／メチルアルコール（体積比１９／１）で展開した。展開終了後、乾燥させ、Ｒｆ値０．５１の黄色バンド部分を分取し、クロロホルム／メチルアルコール混液（体積比４／１）で溶出し、ロータリーエバポレーターを用いて濃縮乾固することにより精製黄色色素を得た。各種の糖を添加したときの乾燥菌体量、粗黄色色素、黄色色素の量を表１に示す。
【００３２】
【表１】
0003796540.tif 000002
【００３３】
実施例４
プシコース０．５質量％、酵母エキス（デイフコ社製）０．５質量％、トリプトン（デイフコ社製）１．０質量％を海水に添加して調製した栄養培地（ｐＨ６．３）５リットルを１０リットル体積のジャーファーメンターに入れ殺菌した。これに実施例２で調製したオーレオバクテリウムＦＥＲＭ  Ｐ−１８６９８の種母培養液を接種し、２０℃で撹拌速度３００ｒｐｍ、通気量毎分２リットルで３日間培養した。培養終了後に培養液３．４８リットルを遠心分離して菌体を集め凍結乾燥し、乾燥菌体６．１ｇを得た。
【００３４】
乾燥菌体６．１ｇをクロロホルム／メチルアルコール混液（体積比２／１）１２０ｍｌを用いて３回抽出し、溶媒をロータリーエバポレーターにより濃縮乾固させ２５９ｍｇの粗黄色色素を得た。粗黄色色素をシリカゲル薄層クロマトグラフィー（メルク社製：Ａｒｔ．１３７９２，２０×２０ｃｍ、１ｍｍ厚）にかけ、クロロホルム／メチルアルコール（体積比１９／１）で展開した。展開終了後、乾燥させ、Ｒｆ値０．５１〜０．５４の黄色バンド部分を分取し、クロロホルム／メチルアルコール混液（体積比４／１）で溶出し、溶出液をロータリーエバポレーターで乾固することにより黄色色素３．８ｍｇを得た。
【００３５】
黄色色素３．８ｍｇをジエチルエーテルに分散し、シリカゲル薄層クロマトグラフィー（メルク社製：１．０５６４１）にかけ、ジエチルエーテルで展開した。展開終了後、乾燥させ、Ｒｆ値０．５４の黄色バンドを分取し、ジエチルエーテルで溶出した。ロータリーエバポレーターで乾固し、精製黄色色素２．５ｍｇを得た。
【００３６】
【発明の効果】
黄色色素の製造においては従来、植物体などより抽出して得ていたために、計画的に大量生産しようとしても設備なども多く要する上、生産される黄色色素製剤の量も植物の生育状況に影響されるという欠点があった。また、植物体における黄色色素の存在は限られた部位であり、含有率が低いために抽出分離に多量の有機溶剤を必要とし、装置も大規模なものが必要であった。
【００３７】
これに対し、本発明方法は、細菌を原料として用いるため、任意かつ計画的な黄色色素の生産を可能にするものである。また、細菌はスケールを変えて培養することが可能であり、培養の条件は任意に制御することが可能であるという利点がある。また、培養槽を大きくすることにより大量製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  精製黄色色素の紫−可視領域の光吸収スペクトル。
【図２】  精製黄色色素の４００ＭＨｚプロトンＮＭＲスペクトル。
【図３】  ポジテイブイオン化法による高速原子衝撃質量スペクトル。
【図１】
0003796540.tif 000003
【図２】
0003796540.tif 000004
【図３】
0003796540.tif 000005