(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）ＨＢｓ抗原の共通抗原決定基ａに特異的な抗体を含有すると推測される試料に、前記のＨＢｓ抗原の共通抗原決定基ａを有し、かつ全ての亜型抗原決定基が確認されている人工的に調製した第１のＨＢｓ抗原を接触させ、
（２）これと同時に又はこの後に、前記のＨＢｓ抗原の共通抗原決定基ａを有しかつ前記の第１のＨＢｓ抗原が有する対立亜型抗原決定基は有しない、全ての亜型抗原決定基が確認されている人工的に調製した第２のＨＢｓ抗原を更に接触させ、
（３）これにより形成された、「第１のＨＢｓ抗原−抗体−第２のＨＢｓ抗原」の結合を検出する、
ことよりなるＨＢｓ抗原の共通抗原決定基ａに特異的な抗体の測定方法。
【請求項２】
人工的に調製した第１のＨＢｓ抗原が、遺伝子組み換え技術を用いて調製したＨＢｓ抗原である、請求項１記載のＨＢｓ抗原の共通抗原決定基ａに特異的な抗体の測定方法。
【請求項３】
人工的に調製した第１のＨＢｓ抗原が、細胞工学的技術を用いて調製したＨＢｓ抗原である、請求項１記載のＨＢｓ抗原の共通抗原決定基ａに特異的な抗体の測定方法。
【請求項４】
人工的に調製した第２のＨＢｓ抗原が、遺伝子組み換え技術を用いて調製したＨＢｓ抗原である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のＨＢｓ抗原の共通抗原決定基ａに特異的な抗体の測定方法。
【請求項５】
人工的に調製した第２のＨＢｓ抗原が、細胞工学的技術を用いて調製したＨＢｓ抗原である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のＨＢｓ抗原の共通抗原決定基ａに特異的な抗体の測定方法。
【請求項６】
「第１のＨＢｓ抗原−抗体−第２のＨＢｓ抗原」の結合の検出を、第１のＨＢｓ抗原又は第２のＨＢｓ抗原を固定化した粒子担体の凝集を検出することにより行う、請求項１〜５のいずれか１項に記載のＨＢｓ抗原の共通抗原決定基ａに特異的な抗体の測定方法。
【請求項７】
「第１のＨＢｓ抗原−抗体−第２のＨＢｓ抗原」の結合の検出を、第１のＨＢｓ抗原及び／又は第２のＨＢｓ抗原に結合した標識物質を検出することにより行う、請求項１〜５のいずれか１項に記載のＨＢｓ抗原の共通抗原決定基ａに特異的な抗体の測定方法。
【請求項８】
（１）ＨＢｓ抗原の共通抗原決定基ａを有する全ての亜型抗原決定基が確認されている人工的に調製した第１のＨＢｓ抗原、及び
（２）前記のＨＢｓ抗原の共通抗原決定基ａを有しかつ前記の第１のＨＢｓ抗原が有する対立亜型抗原決定基は有しない、全ての亜型抗原決定基が確認されている人工的に調製した第２のＨＢｓ抗原、
を含むＨＢｓ抗原の共通抗原決定基ａに特異的な抗体の測定試薬。
【請求項９】
人工的に調製した第１のＨＢｓ抗原が、遺伝子組み換え技術を用いて調製したＨＢｓ抗原である、請求項８記載のＨＢｓ抗原の共通抗原決定基ａに特異的な抗体の測定試薬。
【請求項１０】
人工的に調製した第１のＨＢｓ抗原が、細胞工学的技術を用いて調製したＨＢｓ抗原である、請求項８記載のＨＢｓ抗原の共通抗原決定基ａに特異的な抗体の測定試薬。
【請求項１１】
人工的に調製した第２のＨＢｓ抗原が、遺伝子組み換え技術を用いて調製したＨＢｓ抗原である、請求項８〜１０のいずれか１項に記載のＨＢｓ抗原の共通抗原決定基ａに特異的な抗体の測定試薬。
【請求項１２】
人工的に調製した第２のＨＢｓ抗原が、細胞工学的技術を用いて調製したＨＢｓ抗原である、請求項８〜１０のいずれか１項に記載のＨＢｓ抗原の共通抗原決定基ａに特異的な抗体の測定試薬。
【請求項１３】
第１のＨＢｓ抗原又は第２のＨＢｓ抗原が粒子担体に固定化されている、請求項８〜１２のいずれか１項に記載のＨＢｓ抗原の共通抗原決定基ａに特異的な抗体の測定試薬。
【請求項１４】
第１のＨＢｓ抗原及び／又は第２のＨＢｓ抗原が標識物質を結合している、請求項８〜１２のいずれか１項に記載のＨＢｓ抗原の共通抗原決定基ａに特異的な抗体の測定試薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＨＢｓ抗原に特異的な種々の抗体のうち、全ての亜型が共通に保有する共通抗原決定基ａに特異的な抗体を選択的に測定する測定方法及び測定試薬に関するものである。
本発明は、特に臨床検査分野における疾病の診断等に有用なものである。
【０００２】
【従来の技術】
ＨＢｓ抗原に特異的な抗体である抗ＨＢｓ抗体はＢ型肝炎診断のマーカーとして、酵素免疫測定法（ＥＩＡ、ＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、赤血球若しくはゼラチン粒子等を用いる粒子凝集反応測定法又はラテックス凝集反応測定法等を原理とする測定試薬により広く測定されている。
また、近年はＢ型肝炎ワクチンの普及により、ワクチンの効果判定の指標として抗ＨＢｓ抗体の測定が行われている。
【０００３】
Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）の表面抗原であるＨＢｓ抗原は、ＨＢｓ抗原の全ての亜型が共通に保有する共通抗原決定基ａと、その亜型により、ｄ又はｙ、そして、ｒ又はｗ、のうちのいずれかの抗原決定基が規定される２組の対立亜型抗原決定基を有し、血清学的に４つの主要亜型（ａｄｒ、ａｄｗ、ａｙｒ及びａｙｗ）に分類されている。
ＨＢｓ抗原のタンパク質は２２６個のアミノ酸からなり、共通抗原決定基ａはＮ末端より１２４−１４７番のアミノ酸が４つのシステインにより立体構造をとることにより規定されている。
また、対立亜型抗原決定基ｄ又はｙは、Ｎ末端より１２２番のアミノ酸がリジンの時にｄと規定され、これがアルギニンの時にｙと規定されている。
そして、対立亜型抗原決定基ｒ又はｗは、Ｎ末端より１６０番のアミノ酸がアルギニンの時にｒと規定され、これがリジンの時にｗと規定されている。〔岡本ら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１４８巻，５００〜５０４頁，１９８７年、岡本ら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，６１巻，３０３０〜３０３４頁，１９８７年〕（図１参照）
【０００４】
［図１］
【０００５】
抗ＨＢｓ抗体は、Ｂ型肝炎ウィルスの中和抗体とされているが、Ｂ型肝炎ウィルスのＨＢｓ抗原の亜型によらずに感染防御能（ｃｒｏｓｓ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）を有するのは、共通抗原決定基ａに対する抗体のみであると考えられている。〔Ｍｕｒｐｈｙら，Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ，３巻，３７８〜３８１頁，１９７４年、Ｓｚｍｕｎｅｓｓら，Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，３０７巻，１４８１〜１４８６頁，１９８２年〕
また、Ｊｉｌｇらは、Ｂ型肝炎ワクチンにより獲得された抗ＨＢｓ抗体中の共通抗原決定基ａに対する抗体の含有率を検討した結果、１２〜９８％（平均４９％）と広く分布して個体差が大きいことを報告し、従って、Ｂ型肝炎ワクチンにより獲得された抗ＨＢｓ抗体による感染防御能の判定には、抗ＨＢｓ抗体の総量よりも、Ｂ型肝炎ウィルスのＨＢｓ抗原の亜型によらずに感染防御能を有する、共通抗原決定基ａに対する抗体の量を知ることがより重要であると記載している。〔Ｊｉｌｇら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１３巻，１７１頁，１９８４年〕
【０００６】
しかし、従来の抗ＨＢｓ抗体測定方法及び測定試薬において、赤血球やゼラチン粒子等を用いた粒子凝集反応やラテックス凝集反応による測定では、粒子担体に固定化したＨＢｓ抗原は１種類（単一の亜型あるいは一定組成の亜型混合物）であり、また放射免疫測定法や酵素免疫測定法による測定でも、固相に固定化したＨＢｓ抗原と検出のための標識を施したＨＢｓ抗原は同一種類（単一の亜型あるいは一定組成の亜型混合物）であった。
従って、ＨＢｓ抗原の共通抗原決定基ａに対する抗体（抗ＨＢｓ・ａ抗体）とともにＨＢｓ抗原の対立亜型抗原決定基（ｄ、ｙ、ｒ又はｗ）に対する抗体（抗ＨＢｓ・ｄ抗体、抗ＨＢｓ・ｙ抗体、抗ＨＢｓ・ｒ抗体又は抗ＨＢｓ・ｗ抗体）もＨＢｓ抗原と結合しうるので、測定された試料中の抗ＨＢｓ抗体量は共通抗原決定基ａに対する抗体と、測定試薬に使用しているＨＢｓ抗原の亜型の対立亜型抗原決定基に対する抗体（例えば、測定試薬に使用しているＨＢｓ抗原の亜型がａｄｒであれば抗ＨＢｓ・ｄ抗体と抗ＨＢｓ・ｒ抗体）の総和を示すことになる。
そのため、従来の抗ＨＢｓ抗体測定方法及び測定試薬では、試料中の抗ＨＢｓ・ａ抗体のみを選択的に測定することができず、測定された抗ＨＢｓ抗体量は必ずしも感染防御能を反映してはいないものであった。（図２参照）
【０００７】
［図２］
【０００８】
また、従来の抗ＨＢｓ抗体測定方法及び測定試薬における問題点として、測定試薬間で同等の検出感度を有するにもかかわらず、測定試薬間の判定の不一致が少なからず生じることが指摘されてきたが、これも各測定試薬で使用されているＨＢｓ抗原の亜型が異なることにより、試料中の抗ＨＢｓ・ａ抗体は共通して測定されるものの、対立亜型抗原決定基に対する抗体は測定試薬により測定される場合と測定されない場合があるため、測定され得る総抗ＨＢｓ抗体量に差が生じることが原因と考えられており、現状では避けられないこととされてきた。
【０００９】
一方、特許第２５２４１０１号公報では、ＨＢｓ抗原の共通抗原決定基ａに特異的な抗体を測定する方法が提示されている。この方法では、固相上に固定化したＨＢｓ抗原の亜型と、マーカーで標識化したＨＢｓ抗原の亜型が各々異なるので、ＨＢｓ抗原の共通抗原決定基ａに対する抗体を特異的に測定することができる。
しかし、この方法に使用するＨＢｓ抗原は、Ｂ型肝炎ウィルスの保菌者（キャリア）より集められた血清もしくは血漿より精製されたものである。Ｂ型肝炎ウィルスはＤＮＡウィルスであるが、複製において逆転写過程を経るために、持続感染中に変異が生じる頻度はＲＮＡウィルスに匹敵するとされている。〔岡本ら，Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，５７巻，２３１〜２３６頁，１９８７年〕
従って、このようなＢ型肝炎ウィルス保菌者（キャリア）由来のＨＢｓ抗原は、共通抗原決定基ａ領域及びその周辺に変異の生じたＨＢｓ抗原を含有している可能性が高く、このようなＨＢｓ抗原は、抗ＨＢｓ・ａ抗体との反応性が消失あるいは低下していることが報告されている。〔岡本ら，Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３２巻，２６４〜２６８頁，１９９２年、Ｗａｔｅｒら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，９０巻，２５４３〜２５４７頁，１９９２年、山本ら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，６８巻，２６７１〜２６７６頁，１９９４年、Ｈｏｕら，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，２１巻，２７３〜２７８頁，１９９５年〕
このため、Ｂ型肝炎ウィルス保菌者（キャリア）由来のＨＢｓ抗原は、共通抗原決定基ａの抗原性について、均一でないことが予想される。
また、ＨＢｓ抗原の亜型についても、ａｄまたはａｙとしか示されておらず、ｒ／ｗについては確認されていないため、固相に固定化したＨＢｓ抗原とマーカーで標識化したＨＢｓ抗原が同一の対立亜型抗原決定基（ｒ又はｗ）を含有する可能性があり、抗ＨＢｓ・ａ抗体とともに亜型抗原決定基抗体（抗ＨＢｓ・ｒ抗体又は抗ＨＢｓ・ｗ抗体）が同時に測定されている可能性も否定できない。
以上のことから、抗ＨＢｓ・ａ抗体を特異的に測定する目的で使用するＨＢｓ抗原には、均一性、特異性の点で、さらに改良が必要とされる。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
前記のような現状に鑑みて本発明者らは、複数の亜型が存在するＨＢｓ抗原に対する抗体である抗ＨＢｓ抗体の測定方法及び測定試薬において、下記のような課題を解決することを目的として鋭意研究を行った。
【００１１】
▲１▼  従来の抗ＨＢｓ抗体測定方法及び測定試薬により測定された抗ＨＢｓ抗体量は、ＨＢｓ抗原の共通抗原決定基ａに対する抗体（抗ＨＢｓ・ａ抗体）と、ＨＢｓ抗原の対立亜型抗原決定基に対する抗体の総和を示しており、それぞれの亜型のＨＢｓ抗原を有するＢ型肝炎ウィルスの全てに対して感染防御能を有する抗ＨＢｓ・ａ抗体の単独の量は不明であるので、必ずしも感染防御能を反映しているものではなかった。よって、Ｂ型肝炎ウィルスに対する感染防御能を反映する抗ＨＢｓ・ａ抗体を選択的に測定できるようにする。
【００１２】
▲２▼  Ｂ型肝炎ウィルスに対する感染防御能を知るための抗ＨＢｓ抗体の測定において、従来の抗ＨＢｓ抗体測定方法及び測定試薬がそれぞれ異なる亜型のＨＢｓ抗原を使用していることを原因とする、同等の検出感度を有する抗ＨＢｓ抗体測定試薬間の判定の不一致を解消する。
【００１３】
▲３▼  Ｂ型肝炎ウィルス保菌者（キャリア）由来のＨＢｓ抗原よりも、共通抗原決定基ａの抗原性について均一性が高く、及び、全ての亜型抗原決定基が確認されているＨＢｓ抗原を調製することにより、抗ＨＢｓ・ａ抗体測定の特異性を向上させる。
【００１４】
すなわち、本発明者らは、ＨＢｓ抗原の共通抗原決定基ａに特異的な抗体のみを選択的に測定することができる測定方法及び測定試薬を開発すべく鋭意研究を行ってきた。
その結果、本発明者らは、ＨＢｓ抗原の共通抗原決定基ａを有し、かつ全ての亜型抗原決定基が確認されている人工的に調製した第１のＨＢｓ抗原及び前記のＨＢｓ抗原の共通抗原決定基ａを有しかつ前記の第１のＨＢｓ抗原が有する対立亜型抗原決定基は有しない、全ての亜型抗原決定基が確認されている人工的に調製した第２のＨＢｓ抗原を用いることにより、ＨＢｓ抗原の共通抗原決定基ａに特異的な抗体の選択的な測定が可能となることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
本発明は、以下の発明を提供する。
【００１６】
（ｉ）  （１）ＨＢｓ抗原の共通抗原決定基ａに特異的な抗体を含有すると推測される試料に、前記のＨＢｓ抗原の共通抗原決定基ａを有し、かつ全ての亜型抗原決定基が確認されている人工的に調製した第１のＨＢｓ抗原を接触させ、
（２）これと同時に又はこの後に、前記のＨＢｓ抗原の共通抗原決定基ａを有しかつ前記の第１のＨＢｓ抗原が有する対立亜型抗原決定基は有しない、全ての亜型抗原決定基が確認されている人工的に調製した第２のＨＢｓ抗原を更に接触させ、
（３）これにより形成された、「第１のＨＢｓ抗原−抗体−第２のＨＢｓ抗原」の結合を検出する、
ことよりなるＨＢｓ抗原の共通抗原決定基ａに特異的な抗体の測定方法。
【００１７】
（ｉｉ）  人工的に調製した第１のＨＢｓ抗原が、遺伝子組み換え技術を用いて調製したＨＢｓ抗原である、前記（ｉ）記載のＨＢｓ抗原の共通抗原決定基ａに特異的な抗体の測定方法。
【００１８】
（ｉｉｉ）  人工的に調製した第１のＨＢｓ抗原が、細胞工学的技術を用いて調製したＨＢｓ抗原である、前記（ｉ）記載のＨＢｓ抗原の共通抗原決定基ａに特異的な抗体の測定方法。
【００１９】
（ｉｖ）  人工的に調製した第２のＨＢｓ抗原が、遺伝子組み換え技術を用いて調製したＨＢｓ抗原である、前記（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれかに記載のＨＢｓ抗原の共通抗原決定基ａに特異的な抗体の測定方法。
【００２０】
（ｖ）  人工的に調製した第２のＨＢｓ抗原が、細胞工学的技術を用いて調製したＨＢｓ抗原である、前記（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれかに記載のＨＢｓ抗原の共通抗原決定基ａに特異的な抗体の測定方法。
【００２１】
（ｖｉ）  「第１のＨＢｓ抗原−抗体−第２のＨＢｓ抗原」の結合の検出を、第１のＨＢｓ抗原又は第２のＨＢｓ抗原を固定化した粒子担体の凝集を検出することにより行う、前記（ｉ）〜（ｖ）のいずれかに記載のＨＢｓ抗原の共通抗原決定基ａに特異的な抗体の測定方法。
【００２２】
（ｖｉｉ）  「第１のＨＢｓ抗原−抗体−第２のＨＢｓ抗原」の結合の検出を、第１のＨＢｓ抗原及び／又は第２のＨＢｓ抗原に結合した標識物質を検出することにより行う、前記（ｉ）〜（Ｖ）のいずれかに記載のＨＢｓ抗原の共通抗原決定基ａに特異的な抗体の測定方法。
【００２３】
（ｖｉｉｉ）  （１）ＨＢｓ抗原の共通抗原決定基ａを有する全ての亜型抗原決定基が確認されている人工的に調製した第１のＨＢｓ抗原、及び
（２）前記のＨＢｓ抗原の共通抗原決定基ａを有しかつ前記の第１のＨＢｓ抗原が有する対立亜型抗原決定基は有しない、全ての亜型抗原決定基が確認されている人工的に調製した第２のＨＢｓ抗原、
を含むＨＢｓ抗原の共通抗原決定基ａに特異的な抗体の測定試薬。
【００２４】
（ｉｘ）  人工的に調製した第１のＨＢｓ抗原が、遺伝子組み換え技術を用いて調製したＨＢｓ抗原である、前記（ｖｉｉｉ）記載のＨＢｓ抗原の共通抗原決定基ａに特異的な抗体の測定試薬。
【００２５】
（ｘ）  人工的に調製した第１のＨＢｓ抗原が、細胞工学的技術を用いて調製したＨＢｓ抗原である、前記（ｖｉｉｉ）記載のＨＢｓ抗原の共通抗原決定基ａに特異的な抗体の測定試薬。
【００２６】
（ｘｉ）  人工的に調製した第２のＨＢｓ抗原が、遺伝子組み換え技術を用いて調製したＨＢｓ抗原である、前記（ｖｉｉｉ）〜（ｘ）のいずれかに記載のＨＢｓ抗原の共通抗原決定基ａに特異的な抗体の測定試薬。
【００２７】
（ｘｉｉ）  人工的に調製した第２のＨＢｓ抗原が、細胞工学的技術を用いて調製したＨＢｓ抗原である、前記（ｖｉｉｉ）〜（ｘ）のいずれかに記載のＨＢｓ抗原の共通抗原決定基ａに特異的な抗体の測定試薬。
【００２８】
（ｘｉｉｉ）  第１のＨＢｓ抗原又は第２のＨＢｓ抗原が粒子担体に固定化されている、前記（ｖｉｉｉ）〜（ｘｉｉ）のいずれかに記載のＨＢｓ抗原の共通抗原決定基ａに特異的な抗体の測定試薬。
【００２９】
（ｘｉｖ）  第１のＨＢｓ抗原及び／又は第２のＨＢｓ抗原が標識物質を結合している、前記（ｖｉｉｉ）〜（ｘｉｉ）のいずれかに記載のＨＢｓ抗原の共通抗原決定基ａに特異的な抗体の測定試薬。
【００３０】
本発明は、ＨＢｓ抗原の共通抗原決定基ａに特異的な抗体を選択的に測定するために、「前記のＨＢｓ抗原の共通抗原決定基ａを有し、かつ全ての亜型抗原決定基が確認されている人工的に調製した第１のＨＢｓ抗原−抗体（前記のＨＢｓ抗原の共通抗原決定基ａに特異的な抗体）−前記の抗原の共通抗原決定基ａを有しかつ第１のＨＢｓ抗原が有する対立亜型抗原決定基は有しない人工的に調製した第２のＨＢｓ抗原」の結合を形成させ、この結合を検出することよりなるＨＢｓ抗原の共通抗原決定基ａに特異的な抗体の測定方法及びこの測定を実施するための測定試薬である。
【００３１】
これは、ＨＢｓ抗原の共通抗原決定基ａに特異的な抗体（以下、抗ＨＢｓ・ａ抗体と略すことがある）のみが、前記のＨＢｓ抗原の共通抗原決定基ａを有し、かつ全ての亜型抗原決定基が確認されている人工的に調製した第１のＨＢｓ抗原（以下、第１のＨＢｓ抗原と略すことがある）と前記のＨＢｓ抗原の共通抗原決定基を有しかつ第１のＨＢｓ抗原が有する対立亜型抗原決定基は有しない、全ての亜型抗原決定基が確認されている人工的に調製した第２のＨＢｓ抗原（以下、第２のＨＢｓ抗原と略すことがある）の両方に結合し、「第１のＨＢｓ抗原−抗体（抗ＨＢｓ・ａ抗体）−第２のＨＢｓ抗原」の結合を形成することができるのに対して、前記のＨＢｓ抗原の対立亜型抗原決定基に特異的な抗体（以下、対立亜型抗原決定基に特異的な抗体と略すことがある）は、結合できたとしても第１のＨＢｓ抗原又は第２のＨＢｓ抗原のどちらか一方にしか結合できず、「第１のＨＢｓ抗原−抗体（対立亜型抗原決定基に特異的な抗体）−第２のＨＢｓ抗原」の結合を形成し得ないという原理によるものである。
つまり、形成された「第１のＨＢｓ抗原−抗体（抗ＨＢｓ・ａ抗体）−第２のＨＢｓ抗原」の結合を検出することにより、試料中の抗ＨＢｓ・ａ抗体の存在を確かめることができるという原理に基づくものである。
これを図３に示した。
【００３２】
［図３］
【００３３】
なお、本発明における第１のＨＢｓ抗原及び第２のＨＢｓ抗原の調製法としては、遺伝子組み換え技術、細胞工学技術又は化学合成技術等の公知の方法を用いることができる。
【００３４】
遺伝子組み換え技術による調製法としては、例えば、宿主に酵母を用いて、ＨＢｓ抗原発現プラスミドを導入し、形質転換させることにより、ＨＢｓ抗原を発現させる方法がある。
【００３５】
また、細胞工学的技術による調製法としては、例えば、ＨＢｓ抗原産生能を有するヒト肝癌由来の細胞株を培養して、その培養上澄液よりＨＢｓ抗原を得る方法がある。
【００３６】
更に、化学合成技術による調製法としては、例えば、液相法及び固相法等のペプチド合成の方法により合成することができ、またペプチド自動合成装置を用いてもよく、日本生化学会編「生化学実験講座１  タンパク質の化学ＩＶ」，東京化学同人，１９７５．、泉屋ら「ペプチド合成の基礎と実験」，丸善，１９８５．、日本生化学会編「続生化学実験講座２  タンパク質の化学下」，東京化学同人，１９８７．等に記載された方法に従い合成することができる。
【００３７】
抗ＨＢｓ・ａ抗体を選択的に測定する場合は、抗ＨＢｓ・ａ抗体を含有すると推測される試料に、ＨＢｓ抗原の４種類の亜型（ａｄｒ、ａｄｗ、ａｙｒ及びａｙｗ）から選択した単一の亜型よりなる人工的に調製した第１のＨＢｓ抗原を接触させ、この接触と同時に又はこの接触の後に、第１のＨＢｓ抗原とはＨＢｓ抗原の２組の対立亜型抗原決定基の両方ともが異なり第１のＨＢｓ抗原が有する対立亜型抗原決定基は有しないＨＢｓ抗原の亜型（例えば、第１のＨＢｓ抗原の亜型がａｙｒであればａｄｗ）よりなる人工的に調製した第２のＨＢｓ抗原を更に接触させ、これにより形成された「第１のＨＢｓ抗原−抗体（抗ＨＢｓ・ａ抗体）−第２のＨＢｓ抗原」の結合を検出することにより、試料中の抗ＨＢｓ・ａ抗体の選択的な測定を実施することができる。
【００３８】
本発明において、形成された「第１のＨＢｓ抗原−抗体（抗ＨＢｓ・ａ抗体）−第２のＨＢｓ抗原」の結合の検出は、公知の方法により行うことができ、第１のＨＢｓ抗原又は第２のＨＢｓ抗原を固定化した粒子担体の凝集を検出することにより、又は第１のＨＢｓ抗原及び／又は第２のＨＢｓ抗原に結合した標識物質を検出することにより行うことができる。
【００３９】
第１のＨＢｓ抗原又は第２のＨＢｓ抗原を固定化した粒子担体の凝集を検出することは、例えば、特開昭６４−６９９５４号公報に記載された、試料中の抗体に対応する抗原を内壁に固定化させた測定容器に試料を加え、同時に又は次いで測定容器に固定化させた抗原と同一の抗原あるいは特異的結合の類縁体を固定化させた不溶性担体粒子を測定容器に加え、これにより発現する測定容器と「抗原−抗体−抗原」の結合を介して結合する不溶性担体粒子の凝集の有無により試料中の抗体の有無を判定する免疫学的測定方法等により行うことができる。
【００４０】
また、第１のＨＢｓ抗原及び／又は第２のＨＢｓ抗原に結合した標識物質を検出することは、例えば、公知の酵素免疫測定法（ＥＩＡ、ＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）又は発光免疫測定法（ＬＩＡ）等により行うことができる。
【００４１】
本発明において、ＨＢｓ抗原の共通抗原決定基ａに特異的な抗体を含有すると推測される試料としては、例えば、ヒト又は動物等の血液、血清、血漿、尿、大便、精液、髄液、唾液、汗、涙、腹水若しくは羊水等の体液、又は細胞、組織若しくは臓器等の抽出液等、抗ＨＢｓ・ａ抗体が含まれる可能性のある試料であれば対象となる。
【００４２】
また、本発明において、ＨＢｓ抗原の共通抗原決定基ａを有し、かつ全ての亜型抗原決定基が確認されている人工的に調製した第１のＨＢｓ抗原は、ＨＢｓ抗原の全ての亜型が共通に保有する共通抗原決定基ａを有する人工的に調製された物質であればよい。
例えば、ＨＢｓ抗原の亜型のうちの任意の人工的に調製したものを用いることができる。なお、これは共通抗原決定基ａさえ含むものであれば、この亜型の抗原の一部分よりなるものであってもよい。
【００４３】
そして、本発明において、ＨＢｓ抗原の共通抗原決定基ａを有しかつ第１のＨＢｓ抗原が有する対立亜型抗原決定基は有しない、全ての亜型抗原決定基が確認されている人工的に調製した第２のＨＢｓ抗原は、
▲１▼ＨＢｓ抗原の全ての亜型が共通に保有する共通抗原決定基ａを有し、
▲２▼第１のＨＢｓ抗原が対立亜型抗原決定基を有する場合には、その第１のＨＢｓ抗原が有する対立亜型抗原決定基は有せず、
▲３▼人工的に調製されている
という３つの条件を満たす物質であればよい。
例えば、ＨＢｓ抗原の抗原決定基のうち共通抗原決定基ａ以外の抗原決定基である対立亜型抗原決定基が第１のＨＢｓ抗原とは全て異なる亜型の人工的に調製したＨＢｓ抗原を用いることができる。なお、これも共通抗原決定基ａさえ含むものであれば、この亜型のＨＢｓ抗原の一部分よりなるものであってもよい。
【００４４】
また、本発明において、第１のＨＢｓ抗原と第２のＨＢｓ抗原の間で同じ対立亜型抗原決定基は有しないという条件を満たすものであれば、第１のＨＢｓ抗原及び／又は第２のＨＢｓ抗原は、複数種類のものの混合物であってもよい。
【００４５】
更に、本発明において、第１のＨＢｓ抗原及び／又は第２のＨＢｓ抗原は、それぞれＨＢｓ抗原の共通抗原決定基ａのみからなるものであってもよい。
例えば、ＨＢｓ抗原の抗原決定基のうち共通抗原決定基ａのみのアミノ酸配列を含む人工的に調製したペプチド等の物質を第１のＨＢｓ抗原及び／又は第２のＨＢｓ抗原として用いて測定を行うこともできる。
【００４６】
本発明における、ＨＢｓ抗原の共通抗原決定基ａに特異的な抗体を測定する場合の第１のＨＢｓ抗原と第２のＨＢｓ抗原の組合せを表１に示した。
【００４７】
【表１】
0003864194.tif 000002
【００４８】
【発明の実施の形態】
本発明において、「第１のＨＢｓ抗原−抗体（抗ＨＢｓ・ａ抗体）−第２のＨＢｓ抗原」の結合の検出を、第１のＨＢｓ抗原又は第２のＨＢｓ抗原を固定化した粒子担体の凝集を検出することにより行う場合について、以下例を挙げて説明を行う。
【００４９】
まず、本発明における第１のＨＢｓ抗原及び第２のＨＢｓ抗原の調製法としては、遺伝子組み換え技術、細胞工学技術、又は化学合成技術等の公知の方法を用いることができる。
【００５０】
遺伝子組み換え技術による調製法としては、宿主に酵母を用いて、ＨＢｓ抗原発現プラスミドを導入し、形質転換させることにより、ＨＢｓ抗原を発現させる方法等を挙げることができる。例えば、まず初めに酵母由来の抑制性酸性フォスファターゼ（ｐｈｏ５）プロモーター領域を挿入した、大腸菌と酵母の両方でＤＮＡの複製と選択が可能なシャトルベクター（ｐＡＭ８２）を構築する。次に、このシャトルベクターにＨＢｓ抗原コード領域をｐｈｏ５プロモーター下流に挿入し、ＨＢｓ抗原発現プラスミド（ｐＡＨ３０１）を構築する。このプラスミドを酵母に導入することにより、ＨＢｓ抗原を発現させ、菌体内にＨＢｓ抗原を蓄積させる。菌体内からＨＢｓ抗原を抽出するために、超音波破壊等の方法を用いて酵母を破壊し、硫安塩析を行った後、イオン交換クロマグラフィーを行う。次いで、塩化セシウム及び蔗糖による密度勾配遠心分離を行い、精製ＨＢｓ抗原を得ることができる。〔濱田，バイオサイエンスとインダストリー，４６巻，３１６１〜３１６８頁，１９８８年、濱田，阿蘇シンポジウム記録，１０ｔｈ，８６〜９９頁，１９８７年〕
【００５１】
また、細胞工学的技術による調製法としては、ＨＢｓ抗原産生能を有するヒト肝癌由来の細胞株を培養して、その培養上澄液よりＨＢｓ抗原を得る方法がある。例えば、ヒト肝癌細胞より得られたＨＢｓ抗原産生能の高い細胞株ｈｕＧＫ−１４を培養し、培養液にＨＢｓ抗原を産生させる。以後培養液を回収し、培養上澄液を濃縮、ＤＮａｓｅ処理した後、モノクローナル抗体によるアフィニティカラムクロマグラフィーを行う。次いで、塩化セシウム及び蔗糖による密度勾配遠心分離を行い、精製ＨＢｓ抗原を得ることができる。〔小田ら，肝胆膵，１３巻，５８５〜５９０頁，１９８６年〕
【００５２】
更に、化学合成技術による調製法としては、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のモデル４３０Ａペプチド自動合成装置（Ｍｏｄｅｌ  ４３０Ａ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）により、取扱説明書に従って、ｔ−ブトキシカルボニルアミノ酸固相法でＨＢｓ抗原ペプチドの合成を行うことができる。副反応を抑制するためスカベンジャーとして、ジメチルスルファイド、ｐ−チオクレゾ−ル、ｍ−クレゾール、そしてアニソールの存在下でフッ化水素法により樹脂からの合成したペプチドの脱離を行うことができる。
その後、ジメチルエーテルによりスカベンジャーを抽出し、そして２Ｎ酢酸により合成したペプチドの抽出を行うことができる。
陰イオン交換樹脂であるダウエックス１−Ｘ２（ＤＯＷＥＸ  １−Ｘ２）により陰イオン交換カラムクロマトグラフィーを行い精製をして、オクタデシル（ＯＤＳ）カラムでの高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により、メインピークのパターンの確認を行うことができる。
そして、エバポレーターにより凍結乾燥をして濃縮を行った後、ＨＰＬＣにより精製を行い分取することができる。なお、このＨＰＬＣ精製時の装置及び条件は、山村化学研究所社の逆相ＯＤＳカラムＹＭＣ−Ｄ−ＯＤＳ−５（２０ｍｍ×３００ｍｍ）を用い、日本分光工業社のＴＷＩＮＣＬＥポンプ及び日本分光工業社のＧＰ−Ａ４０型グラジエンターで０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）中アセトニトリルの０％から７０％のグラジエントを流速７．０ｍｌ／分で行い、日本分光工業社製ＵＶＩＤＥＣ−１００Ｖ型検出器（２１０ｎｍ、１．２８ＡＵＦＳ）で検出を行えば良い。
ここで精製分取した合成ペプチドをエバポレーターで凍結乾燥して濃縮することにより精製ＨＢｓ抗原を得ることができる。
【００５３】
次に、この測定の手順の一例を以下に示す。
▲１▼人工的に調製した第１のＨＢｓ抗原を溶液収容部分に固定化した測定容器を用意し、この第１のＨＢｓ抗原を固定化した測定容器の溶液収容部分に一定量の試料を添加して接触させる。
▲２▼この添加・接触と同時に又は一定時間のうちに、人工的に調製した第２のＨＢｓ抗原を固定化した粒子担体の一定量をこの溶液収容部分に添加して接触させる。
▲３▼そして、これをミキサー等で一定時間撹拌した後静置して、試料中にＨＢｓ抗原の共通抗原決定基ａに特異的な抗体が存在する場合には「第１のＨＢｓ抗原−抗体（抗ＨＢｓ・ａ抗体）−第２のＨＢｓ抗原」の結合を形成させる。
▲４▼静置後、一定時間内にこの第２のＨＢｓ抗原を固定化した粒子担体の溶液収容部分内における像を目視により判定又はマイクロプレートリーダー等の測定装置により測定し、凝集像が検出できれば試料中に抗ＨＢｓ・ａ抗体が存在すると判定し、凝集像が検出できなければ試料中に抗ＨＢｓ・ａ抗体は存在しないと判定することにより、試料中の抗ＨＢｓ・ａ抗体の測定を行う。
【００５４】
この測定においては、測定容器の溶液収容部分内壁と粒子担体が試料中の抗ＨＢｓ・ａ抗体を介して、「測定容器溶液収容部分内壁−第１のＨＢｓ抗原−抗体（抗ＨＢｓ・ａ抗体）−第２のＨＢｓ抗原−粒子担体」と結合することにより、第２のＨＢｓ抗原を固定化した粒子担体の凝集像を得ることができるものである。
【００５５】
試料中の抗ＨＢｓ・ａ抗体は、測定容器の溶液収容部分の内壁に固定化された第１のＨＢｓ抗原と、粒子担体に固定化した第２のＨＢｓ抗原の両方に結合するので、前記の結合を形成することができ、試料中の抗ＨＢｓ・ａ抗体の量を反映した凝集像（測定容器の溶液収容部分の内壁面底部に広がった像、陽性像）が得られることになる。
【００５６】
一方、試料中の対立亜型抗原決定基に特異的な抗体は、第１のＨＢｓ抗原と結合することによる測定容器の溶液収容部分内壁への結合〔「測定容器溶液収容部分内壁−第１のＨＢｓ抗原−抗体（対立亜型抗原決定基に特異的な抗体）」〕、又は第２のＨＢｓ抗原と結合することによる粒子担体への結合〔「抗体（対立亜型抗原決定基に特異的な抗体）−第２のＨＢｓ抗原−粒子担体」〕を生ずることはできるが、第１のＨＢｓ抗原と第２のＨＢｓ抗原は同じ対立亜型抗原決定基は有しないので、「第１のＨＢｓ抗原−抗体（対立亜型抗原決定基に特異的な抗体）−第２のＨＢｓ抗原」の結合が形成されることはなく、つまり「測定容器溶液収容部分内壁−第１のＨＢｓ抗原−抗体（対立亜型抗原決定基に特異的な抗体）−第２のＨＢｓ抗原−粒子担体」の結合は形成されないので、第２のＨＢｓ抗原を固定化した粒子担体は測定容器の溶液収容部分内壁面上を転がり（滑り）落ちてしまい、凝集像は得られずに底部に収束した像（陰性像）が生じる。
【００５７】
よって、これにより試料中の抗ＨＢｓ・ａ抗体のみを選択的に測定することができることとなる。
【００５８】
なお、段階的に希釈した試料のそれぞれを測定した時の粒子担体による凝集像が得られる最大の希釈倍数である抗体価を求めることにより、試料中に含まれる抗ＨＢｓ・ａ抗体の量を確かめることができる。
この抗体価の測定は、常法に従って行えばよく、例えば、人工的に調製した第１のＨＢｓ抗原を固定化した測定容器（マイクロプレート等）のウェル等の溶液収容部分に試料を添加し、これを緩衝液等よりなる試料の希釈液で段階的に希釈してその希釈列を作り、次に各溶液収容部分に人工的に調製した第２のＨＢｓ抗原を固定化した粒子担体を添加し、混合撹拌した後、静置してこの第２のＨＢｓ抗原を固定化した粒子担体による凝集の有無を判定又は測定し、凝集像が得られた最大の希釈倍数を抗体価として採用し、求めることができる。
【００５９】
また、予め規定した希釈倍数で希釈した試料を本発明により測定し、この時の凝集の有無から試料中における抗ＨＢｓ・ａ抗体の存在の有無を定性的に測定することもできる。
【００６０】
なお、本発明による試料中の抗ＨＢｓ・ａ抗体の測定においては、人工的に調製した第１のＨＢｓ抗原又は人工的に調製した第２のＨＢｓ抗原を固定化した粒子担体として磁性粒子を用い、この第１のＨＢｓ抗原又は第２のＨＢｓ抗原を固定化した粒子担体に磁力を作用させることにより短時間で凝集像を生じさせることができる、特開平４−２１６４６６号公報及び特開平４−２４２１６７号公報に記載されているような測定方法を適用することもできる。
【００６１】
そして、本発明による試料中の抗ＨＢｓ・ａ抗体の測定においては、まず人工的に調製した第１のＨＢｓ抗原を固定化した粒子担体と試料を混合し接触させ、次いでこれを人工的に調製した第２のＨＢｓ抗原を固定化した測定容器の溶液収容部分に添加して接触させ、「第１のＨＢｓ抗原−抗体（抗ＨＢｓ・ａ抗体）−第２のＨＢｓ抗原」の結合を形成させて、この結合により生じた第１のＨＢｓ抗原を固定化した粒子担体の凝集の凝集像の検出により、試料中の抗ＨＢｓ・ａ抗体の量を測定することもできる。
【００６２】
更に、本発明による試料中の抗ＨＢｓ・ａ抗体の測定においては、人工的に調製した第１のＨＢｓ抗原を固定化した測定容器の溶液収容部分に人工的に調製した第２のＨＢｓ抗原を固定化した粒子担体を存在させておき、この測定容器の溶液収容部分に試料を添加して接触させ、「第１のＨＢｓ抗原−抗体（抗ＨＢｓ・ａ抗体）−第２のＨＢｓ抗原」の結合を形成させて、この結合により生じた第２のＨＢｓ抗原を固定化した粒子担体の凝集の凝集像の検出により、試料中の共通抗原決定基に特異的な抗体の量を測定することもできる。
【００６３】
ところで、理論的には、人工的に調製した第２のＨＢｓ抗原（又は人工的に調製した第１のＨＢｓ抗原）を固定化した粒子担体同士が対立亜型抗原決定基に特異的な抗体を介して結合し、「粒子担体−第２のＨＢｓ抗原（又は第１のＨＢｓ抗原）−抗体（対立亜型抗原決定基に特異的な抗体）−第２のＨＢｓ抗原（又は第１のＨＢｓ抗原）−粒子担体」の結合が形成されることにより、試料中に抗ＨＢｓ・ａ抗体が存在しなくとも対立亜型抗原決定基に特異的な抗体が存在すれば、粒子担体が凝集して凝集像が生じるように考えられるが、実際には凝集像が得られることはない。
この理由は定かではないが、「測定容器溶液収容部分内壁−第１のＨＢｓ抗原（又は第２のＨＢｓ抗原）−抗ＨＢｓ・ａ抗体−第２のＨＢｓ抗原（又は第１の抗原）−粒子担体」の結合に比べて「粒子担体−第２のＨＢｓ抗原（又は第１のＨＢｓ抗原）−対立亜型抗原決定基に特異的な抗体−第２のＨＢｓ抗原（又は第１のＨＢｓ抗原）−粒子担体」の結合の結合親和性、結合安定性又は結合力等が低いため、結果として凝集像が得られることはなく、試料中に抗ＨＢｓ・ａ抗体が存在する場合のみ凝集像が得られるものと推測される。
【００６４】
本発明において、測定容器としては、溶液を収容することができるものであれば、その種類、材質、形状等は特に制限されずに用いることができる。
これは、赤血球やゼラチン粒子等を用いる粒子凝集反応測定法又はラテックス凝集反応測定法等において一般的に測定に用いられている容器については、問題なく用いることができる。
例えば、ガラス、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル又はポリメタクリレートなどからなる試験管、マイクロプレート（マイクロタイタープレート）又はトレイ等を用いることができる。
なお、測定容器の溶液収容部分（マイクロプレートのウェル等）の底面は、Ｕ型、Ｖ型又はＵＶ型等の底面中央から周辺にかけて傾斜をもつ形状であることが望ましい。
【００６５】
粒子担体としては、一般に粒子凝集反応測定法又はラテックス凝集反応測定法等に使用される粒子担体であれば特に制限無く用いることができる。
例えば、ヒツジ赤血球等の動物赤血球、リポソーム、ラテックス、ゼラチン、ポリアクリルアミド、マイクロカプセル若しくはエマルジョン等の有機高分子物質よりなる粒子担体、ガラス、シリカゲル、カーボン若しくはベントナイト等の無機高分子物質よりなる粒子担体又はその他の人工担体等を挙げることができる。  また、前記の高分子粒子担体を強磁性体で被覆又は粒子成型時に強磁性体を分散させて調製した磁性粒子担体等を用いることもできる。
これらの粒子担体は、粒子径が０．０１〜１００μｍの範囲のものが好ましく、特に好ましくは０．５〜１０μｍのものである。
また、これらの粒子担体の比重は、１〜１０の範囲が好ましく、特に好ましくは１〜２である。
【００６６】
測定容器の溶液収容部分の内壁面又は粒子担体に人工的に調製した第１のＨＢｓ抗原又は人工的に調製した第２のＨＢｓ抗原を固定化させる方法は、物理的吸着法又は化学的結合法等の公知の方法を用いることができる。
【００６７】
物理的吸着法による場合は、公知の方法に従い、緩衝液等に溶解した人工的に調製した第１のＨＢｓ抗原若しくは人工的に調製した第２のＨＢｓ抗原を測定容器の溶液収容部分に添加し内壁面に接触させたり、又は人工的に調製した第１のＨＢｓ抗原若しくは人工的に調製した第２のＨＢｓ抗原と粒子担体を緩衝液等の溶液中で混合し接触させることにより行うことができる。例えば、緩衝液等に溶解した人工的に調製した第１のＨＢｓ抗原若しくは人工的に調製した第２のＨＢｓ抗原を測定容器の溶液収容部分に添加し内壁面に接触させ、又は人工的に調製した第１のＨＢｓ抗原若しくは人工的に調製した第２のＨＢｓ抗原と粒子担体を緩衝液等の溶液中で混合し接触させ、これを約２℃〜約４０℃で約１０分〜約１日間行う。
【００６８】
また、化学的結合法により行う場合には、日本臨床病理学会編「臨床病理臨時増刊特集第５３号  臨床検査のためのイムノアッセイ−技術と応用−」，臨床病理刊行会，１９８３年、日本生化学会編「新生化学実験講座１  タンパク質ＩＶ」，東京化学同人，１９９１年等に記載の公知の方法に従い、測定容器の溶液収容部分の内壁面又は粒子担体と人工的に調製した第１のＨＢｓ抗原又は人工的に調製した第２のＨＢｓ抗原をグルタルアルデヒド、カルボジイミド、イミドエステル又はマレイミド等の二価性の架橋試薬と混合、接触させ、測定容器の溶液収容部分の内壁面、粒子担体、第１のＨＢｓ抗原又は第２のＨＢｓ抗原のそれぞれのアミノ基、カルボシキル基、ＳＨ基、アルデヒド基又は水酸基等と反応させることにより固定化を行うことができる。
【００６９】
更に非特異的反応を抑制するために処理を行う必要があれば、人工的に調製した第１のＨＢｓ抗原又は人工的に調製した第２のＨＢｓ抗原を固定化させた測定容器の溶液収容部分内壁面又は粒子担体を、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼイン、ゼラチン、卵白アルブミン若しくはその塩などのタンパク質、界面活性剤又は脱脂粉乳等を接触させ被覆させること等の公知の方法により処理して、ブロッキング処理（マスキング処理）を行ってもよい。
【００７０】
人工的に調製した第１のＨＢｓ抗原若しくは人工的に調製した第２のＨＢｓ抗原を固定化した粒子担体を懸濁させる分散媒、又は試料の希釈液については、各種水系溶媒を用いることができる。
例えば、精製水、生理食塩水又はトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液、リン酸緩衝液若しくはリン酸緩衝生理食塩水などの各種緩衝液等の水系溶媒を用いることができる。なお、この緩衝液のｐＨについては、ｐＨ３〜１２の範囲内にあることが好ましい。
【００７１】
また、人工的に調製した第１のＨＢｓ抗原若しくは人工的に調製した第２のＨＢｓ抗原を固定化した粒子担体を懸濁させる分散媒、又は試料の希釈液には、ＢＳＡ、ヒト血清アルブミン、カゼイン若しくはその塩などのタンパク質、塩化ナトリウムなどの各種塩類、各種糖類、脱脂粉乳、正常ウサギ血清などの各種動物血清、アジ化ナトリウムなどの各種防腐剤又は非イオン性界面活性剤、両イオン性界面活性剤若しくは陰イオン性界面活性剤などの各種界面活性剤等を適宜添加して用いることができる。
そして、これらを添加する際の濃度は特に限定されるものではないが、０．００１〜１０％（Ｗ／Ｖ）が好ましく、特に０．０１〜５％（Ｗ／Ｖ）が好ましい。
【００７２】
なお、この各種界面活性剤としては、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、デカグリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンフィトステロール、フィトスタノール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンヒマシ油、硬化ヒマシ油若しくはポリオキシエチレンラノリンなどの非イオン性界面活性剤、酢酸ベタインなどの両性界面活性剤又はポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩若しくはポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸塩などの陰イオン性界面活性剤等を挙げることができる。
【００７３】
次に、本発明において、「第１のＨＢｓ抗原−抗体（抗ＨＢｓ・ａ抗体）−第２のＨＢｓ抗原」の結合の検出を、第１のＨＢｓ抗原及び／又は第２のＨＢｓ抗原に結合した標識物質を検出することにより行う場合について、以下例を挙げて説明を行う。
【００７４】
この第１のＨＢｓ抗原及び／又は第２のＨＢｓ抗原に結合した標識物質を検出することは、酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法、放射免疫測定法又は発光免疫測定法などの標識物質を用いた免疫測定法のサンドイッチ法又は均一系（ホモジニアス系）等の手法により行うことができる。
【００７５】
これらの免疫測定法により測定を行う場合は、公知の方法の手順に従って行うことができるが、サンドイッチ法により測定を行う場合の一例を以下に示す。
▲１▼人工的に調製した第１のＨＢｓ抗原を固定化した固相担体を用意し、この固相担体の第１のＨＢｓ抗原を固定化した部分に一定量の試料を添加して一定時間接触させる。▲２▼この添加・接触と同時に又は洗浄の後に、酵素等の標識物質を結合した人工的に調製した第２のＨＢｓ抗原の一定量をこの固相担体の第１のＨＢｓ抗原を固定化した部分に添加して一定時間接触させて、試料中に抗ＨＢｓ・ａ抗体が存在する場合には「第１のＨＢｓ抗原−抗体（抗ＨＢｓ・ａ抗体）−第２のＨＢｓ抗原」の結合を形成させる。
▲３▼次に、固相担体に結合していない未結合の「標識物質を結合した第２のＨＢｓ抗原」を洗浄分離する。（Ｂ／Ｆ分離）
▲４▼そして、「固相担体−第１のＨＢｓ抗原−抗体（抗ＨＢｓ・ａ抗体）−第２のＨＢｓ抗原−標識物質」の結合により固相担体に結合した標識物質を検出することにより、試料中の共通抗原決定基に特異的な抗体の測定を行う。
【００７６】
この測定においては、固相担体と標識物質が試料中の共通抗原決定基に特異的な抗体を介して、「固相担体−第１のＨＢｓ抗原−抗体（抗ＨＢｓ・ａ抗体）−第２のＨＢｓ抗原−標識物質」と結合するので、固相担体に結合した標識物質の量を測定することにより試料中に含まれていた共通抗原決定基に特異的な抗体の量を測定することができるものである。
【００７７】
試料中の抗ＨＢｓ・ａ抗体は、固相担体に固定化された第１のＨＢｓ抗原と、標識物質を結合した第２のＨＢｓ抗原の両方に結合するので、前記の結合を形成することができ、試料中の抗ＨＢｓ・ａ抗体の量を反映した量の固相担体に結合した標識物質が得られることになる。
【００７８】
一方、試料中の対立亜型抗原決定基に特異的な抗体は、第１のＨＢｓ抗原と結合することによる固相担体への結合〔「固相担体−第１のＨＢｓ抗原−抗体（対立亜型抗原決定基に特異的な抗体）」〕、又は第２のＨＢｓ抗原と結合することによる標識物質への結合〔「抗体（対立亜型抗原決定基に特異的な抗体）−第２のＨＢｓ抗原−標識物質」〕を生ずることはできるが、第１のＨＢｓ抗原と第２のＨＢｓ抗原は同じ対立亜型抗原決定基を有しないので、「第１のＨＢｓ抗原−抗体（対立亜型抗原決定基に特異的な抗体）−第２のＨＢｓ抗原」の結合が形成されることはなく、つまり「固相担体−第１のＨＢｓ抗原−抗体（対立亜型抗原決定基に特異的な抗体）−第２のＨＢｓ抗原−標識物質」の結合は形成されないので、固相担体に結合した標識物質が得られることはない。
【００７９】
よって、これにより試料中の抗ＨＢｓ・ａ抗体のみを選択的に測定することができることとなる。
【００８０】
「第１のＨＢｓ抗原−抗体（抗ＨＢｓ・ａ抗体）−第２のＨＢｓ抗原」の結合により固相担体に結合した標識物質の検出は、測定を酵素免疫測定法により行う場合には、標識酵素にその至適条件下で基質を反応させ、その反応生成物の量を反応生成物の吸光度を測るなどの光学的方法等により測定することにより行う。蛍光免疫測定法により行う場合には、標識蛍光物質による蛍光強度を測定することにより行う。放射免疫測定法により行う場合には、標識放射性物質による放射線量を測定することにより行う。発光免疫測定法により行う場合には、標識物質が係わる発光反応系による発光量を測定することにより行う。
いずれの場合においても、標識物質を用いた免疫測定法の公知の手法に従って、標識物質の検出を行うことができる。
【００８１】
なお、本発明による試料中の抗ＨＢｓ・ａ抗体の測定においては、まず酵素等の標識物質を結合した人工的に調製した第１のＨＢｓ抗原と試料を混合し接触させ、次いでこれを人工的に調製した第２のＨＢｓ抗原を固定化した固相担体の第２のＨＢｓ抗原を固定化した部分に添加して接触させ、「第１のＨＢｓ抗原−抗体（抗ＨＢｓ・ａ抗体）−第２のＨＢｓ抗原」の結合を形成させて、この結合により固相担体に結合した標識物質の量を測定することによって、試料中の抗ＨＢｓ・ａ抗体の量を測定することもできる。
【００８２】
また、本発明による試料中の抗ＨＢｓ・ａ抗体の測定においては、人工的に調製した第１のＨＢｓ抗原を固定化した固相担体上に、酵素等の標識物質を結合させた人工的に調製した第２のＨＢｓ抗原を存在させておき、この固相担体に試料を添加して接触させ、「第１のＨＢｓ抗原−抗体（抗ＨＢｓ・ａ抗体）−第２のＨＢｓ抗原」の結合を形成させて、この結合により固相担体に結合した標識物質の量を測定することにより、試料中の抗ＨＢｓ・ａ抗体の量を測定することもできる。
【００８３】
そして、本発明による試料中の抗ＨＢｓ・ａ抗体の測定は、特開平１−１２３１４８号公報に記載されている、連続する一連の反応を触媒する２種類の酵素をそれぞれ別々に被検物質に対応する特異結合相手と共に不溶性担体に結合した２種類の酵素標識物質を用いて、これらを特異的結合部位を二つ以上有する被検物質を介して近接させ連続した酵素反応により被検物質量を求める、均一系（ホモジニアス系）による特異的結合部位を有する物質の測定法に適用して測定を行うこともできる。
例えば、人工的に調製した第１のＨＢｓ抗原並びにグルコースオキシダーゼを結合したラテックス粒子等の不溶性担体、及び人工的に調製した第２のＨＢｓ抗原並びにパーオキシダーゼを結合したラテックス粒子等の不溶性担体を用意し、これらに抗ＨＢｓ・ａ抗体を含有すると推測される試料及びグルコースを混合し接触させ、抗ＨＢｓ・ａ抗体を介して近接したグルコースオキシダーゼ及びパーオキシダーゼより生じた過酸化水素の量を、４−アミノアンチピリン等及びフェノール誘導体若しくはアニリン誘導体等を用いるトリンダー反応系により測定して、試料中に含まれている抗ＨＢｓ・ａ抗体を均一系（ホモジニアス系）により測定することもできる。
【００８４】
あるいは、本発明による試料中の抗ＨＢｓ・ａ抗体の測定においては、人工的に調製した第１のＨＢｓ抗原を固定化した固相担体、標識物質を結合させていない人工的に調製した第２のＨＢｓ抗原、第２のＨＢｓ抗原の対立亜型抗原決定基に特異的な抗体及び酵素等の標識物質を結合させた“第２のＨＢｓ抗原の対立亜型抗原決定基に特異的な抗体”の由来動物種のイムノグロブリンに特異的な抗体を用いて、「固相担体−第１のＨＢｓ抗原−抗体（抗ＨＢｓ・ａ抗体）−第２のＨＢｓ抗原−第２のＨＢｓ抗原の対立亜型抗原決定基に特異的な抗体−“第２のＨＢｓ抗原の対立亜型抗原決定基に特異的な抗体”の由来動物種のイムノグロブリンに特異的な抗体−標識物質」の結合を形成させて、固相担体に結合した標識物質の量を測定することにより、試料中の抗ＨＢｓ・ａの量を測定することもできる。
【００８５】
更に、酵素等の標識物質を結合させた人工的に調製した第２のＨＢｓ抗原を過剰に添加し、未結合のこの第２のＨＢｓ抗原の量を別に定量することにより、試料中の抗ＨＢｓ・ａ抗体の量を測定することもできる。
【００８６】
また、本発明による試料中の抗ＨＢｓ・ａ抗体の測定においては、固相担体として磁性体よりなる物質又は磁性体を含む物質を用い、これに磁力を作用させて、Ｂ／Ｆ分離を磁気的に行うこともできる。
【００８７】
本発明において、固相担体としては、人工的に調製した第１のＨＢｓ抗原及び人工的に調製した第２のＨＢｓ抗原を固定化することができる担体であれば、その種類、材質、形状等を特に限定することなく使用することができる。
これは、酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法、放射免疫測定法又は発光免疫測定法などの標識物質を用いた免疫測定法等において、一般的に測定に用いられている担体については、問題なく用いることができる。
例えば、ポリスチレン、ポリカーボネイト、ポリビニルトルエン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ナイロン、ポリメタクリレート、ポリアクリルアミド、ラテックス、リポソーム、ゼラチン、アガロース、セルロース、セファロース、ガラス、金属、セラミックス又は磁性体等の材質よりなる粒子、マイクロカプセル、ビーズ、マイクロプレート、試験管、スティック又は試験片等の固相担体を用いることができる。
また、前記の固相担体を強磁性体で被覆又は固相担体成型時に強磁性体を含有させて調製した磁性固相担体等を用いることもできる。
【００８８】
標識物質を人工的に調製した第１のＨＢｓ抗原又は人工的に調製した第２のＨＢｓ抗原に結合させる方法は、化学的結合法等の公知の方法を用いることができる。
この化学的結合法により行う場合には、日本臨床病理学会編「臨床病理臨時増刊特集第５３号  臨床検査のためのイムノアッセイ−技術と応用−」，臨床病理刊行会，１９８３年、日本生化学会編「新生化学実験講座１  タンパク質ＩＶ」，東京化学同人，１９９１年等に記載の公知の方法に従い、酵素、蛍光物質又は放射性物質等の標識物質と人工的に調製した第１のＨＢｓ抗原又は人工的に調製した第２のＨＢｓ抗原をグルタルアルデヒド、カルボジイミド、イミドエステル又はマレイミド等の二価性の架橋試薬と混合、接触させ、標識物質、第１のＨＢｓ抗原又は第２のＨＢｓ抗原のそれぞれのアミノ基、カルボシキル基、ＳＨ基、アルデヒド基又は水酸基等と反応させることにより結合を行うことができる。
【００８９】
固相担体に人工的に調製した第１のＨＢｓ抗原又は人工的に調製した第２のＨＢｓ抗原を固定化させる方法は、物理的吸着法又は化学的結合法等の公知の方法を用いることができる。
【００９０】
物理的吸着法による場合は、公知の方法に従い、緩衝液等に溶解した人工的に調製した第１のＨＢｓ抗原若しくは人工的に調製した第２のＨＢｓ抗原を固相担体の固定化したい部分に添加し接触させたり、又は人工的に調製した第１のＨＢｓ抗原若しくは人工的に調製した第２のＨＢｓ抗原と固相担体を緩衝液等の溶液中で混合し接触させることにより行うことができる。例えば、緩衝液等に溶解した人工的に調製した第１のＨＢｓ抗原若しくは人工的に調製した第２のＨＢｓ抗原を固相担体の固定化したい部分に添加し接触させ、又は人工的に調製した第１のＨＢｓ抗原若しくは人工的に調製した第２のＨＢｓ抗原と固相担体を緩衝液等の溶液中で混合し接触させ、これを約２℃〜約４０℃で約１０分〜約１日間行う。
【００９１】
また、化学的結合法により行う場合には、日本臨床病理学会編「臨床病理臨時増刊特集第５３号  臨床検査のためのイムノアッセイ−技術と応用−」，臨床病理刊行会，１９８３年、日本生化学会編「新生化学実験講座１  タンパク質ＩＶ」，東京化学同人，１９９１年等に記載の公知の方法に従い、固相担体又は固相担体の固定化したい部分と人工的に調製した第１のＨＢｓ抗原又は人工的に調製した第２のＨＢｓ抗原をグルタルアルデヒド、カルボジイミド、イミドエステル又はマレイミド等の二価性の架橋試薬と混合、接触させ、固相担体、固相担体の固定化したい部分、第１のＨＢｓ抗原又は第２のＨＢｓ抗原のそれぞれのアミノ基、カルボシキル基、ＳＨ基、アルデヒド基又は水酸基等と反応させることにより固定化を行うことができる。
【００９２】
更に、非特異的反応を抑制するために処理を行う必要があれば、人工的に調製した第１のＨＢｓ抗原又は人工的に調製した第２のＨＢｓ抗原を固定化させた固相担体の固定化した部分を、ＢＳＡ、カゼイン、ゼラチン、卵白アルブミン若しくはその塩などのタンパク質、界面活性剤又は脱脂粉乳等を接触させ被覆させること等の公知の方法により処理して、ブロッキング処理（マスキング処理）を行ってもよい。
【００９３】
標識物質を結合させた人工的に調製した第１のＨＢｓ抗原若しくは人工的に調製した第２のＨＢｓ抗原を溶解させる溶液、又は試料の希釈液については、各種水系溶媒を用いることができる。
例えば、精製水、生理食塩水又はトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液、リン酸緩衝液若しくはリン酸緩衝生理食塩水などの各種緩衝液等の水系溶媒を用いることができる。なお、この緩衝液のｐＨについては、ｐＨ３〜１２の範囲内にあることが好ましい。
【００９４】
また、標識物質を結合させた人工的に調製した第１のＨＢｓ抗原若しくは人工的に調製した第２のＨＢｓ抗原を溶解させる溶液、又は試料の希釈液には、ＢＳＡ、ヒト血清アルブミン、カゼイン若しくはその塩などのタンパク質、塩化ナトリウムなどの各種塩類、各種糖類、脱脂粉乳、正常ウサギ血清などの各種動物血清、アジ化ナトリウムなどの各種防腐剤又は非イオン性界面活性剤、両イオン性界面活性剤若しくは陰イオン性界面活性剤などの各種界面活性剤等を適宜添加して用いることができる。
そして、これらを添加する際の濃度は特に限定されるものではないが、０．００１〜１０％（Ｗ／Ｖ）が好ましく、特に０．０１〜５％（Ｗ／Ｖ）が好ましい。
【００９５】
なお、この各種界面活性剤としては、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、デカグリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンフィトステロール、フィトスタノール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンヒマシ油、硬化ヒマシ油若しくはポリオキシエチレンラノリンなどの非イオン性界面活性剤、酢酸ベタインなどの両性界面活性剤又はポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩若しくはポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸塩などの陰イオン性界面活性剤等を挙げることができる。
【００９６】
標識物質としては、測定を酵素免疫測定法により行う場合には、パーオキシダーゼ（ＰＯＤ）、アルカリ性ホスファターゼ（ＡＬＰ）、β−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコースオキシダーゼ、乳酸脱水素酵素若しくはα−アミラーゼ等の酵素を、蛍光免疫測定法により行う場合には、フルオレセインイソチオシアネート、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、置換ローダミンイソチオシアネート若しくはジクロロトリアジンイソチオシアネート等の蛍光物質を、そして放射免疫測定法により行う場合には、トリチウム、ヨウ素１２５又はヨウ素１３１等の放射性物質を用いることができる。
【００９７】
また、測定を発光免疫測定法により行う場合には、アクリジニウムエステル、アルカリ性ホスファターゼ、パーオキシダーゼ又はグルコースオキシダーゼ等を標識物質として用い、アクリジニウムエステル系、ジオキセタン化合物系、ルミノール−過酸化水素−ＰＯＤ系又はＮＡＤＨ−ＦＭＮＨ２−ルシフェラーゼ系等により固相担体に結合した標識物質の検出を行うことができる。
【００９８】
【実施例】
以下実施例を挙げて説明するが、本発明はこれにより限定されるものではない。
【００９９】
ＨＢｓ抗原の共通抗原決定基ａに特異的な抗体の測定
（１）  ＨＢｓ抗原固定化マイクロプレートの調製
第１の抗原として、細胞工学的技術を用いて、ＨＢｓ抗原産生能を有するヒト肝癌由来の細胞株を培養し、その培養上澄液より調製された、亜型がａｄｒである精製ＨＢｓ抗原（製造番号０１１Ｄ１−０００３、明治乳業社製）を、０．１％アジ化ナトリウムを含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）にて３μｇ／ｍＬに調製し、測定容器であるＵ型マイクロプレート（梁瀬産業社製）の各ウェル（各穴）に５０μＬずつ分注した。
これを３７℃で３時間反応させて、亜型がａｄｒであるＨＢｓ抗原の固定化を行った。
次に、各ウェルの液を吸引除去し、０．５％カゼイン及び０．１％アジ化ナトリウムを含む２５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を各ウェルに２００μＬずつ分注して、３７℃で３時間反応させて、ブロッキング処理を行った。
その後、各ウェルの液を十分に除去し、亜型がａｄｒであるＨＢｓ抗原を固定化したマイクロプレートを調製した。
また、遺伝子組み換え技術を用いて、酵母を宿主とし、ＨＢｓ抗原発現プラスミドを導入し、形質転換させることにより発現された、亜型がａｙｗである精製ＨＢｓ抗原（メーカーコード番号８ＨＳ７、製造番号９５／０１／ＨＳ７、オリエンタル酵母工業社製）を用い前記と同様にして、亜型がａｙｗであるＨＢｓ抗原を固定化したマイクロプレートを調製した。
【０１００】
（２）  ＨＢｓ抗原固定化粒子担体の調製
第２の抗原として、遺伝子組み換え技術を用いて、酵母を宿主とし、ＨＢｓ抗原発現プラスミドを導入し、形質転換させることにより発現された、亜型がａｙｗである精製ＨＢｓ抗原（メーカーコード番号８ＨＳ７、製造番号９５／０１／ＨＳ７、オリエンタル酵母工業社製）と粒子担体である磁性粒子担体（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ−４５０  ｕｎｃｏａｔｅｄ、ダイナル社製）を、亜型がａｙｗであるＨＢｓ抗原が３０μｇ／ｍＬ、かつ磁性粒子担体が１％の濃度となるように混合し、３７℃で１時間振盪し、反応させた。
次に、この粒子担体を０．５％カゼイン及び０．１％アジ化ナトリウムを含む２５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）にて洗浄し、そして、この０．５％カゼイン及び０．１％アジ化ナトリウムを含む２５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）中において静置してブロッキング処理を行った。
その後、この粒子担体を、０．５％カゼイン及び０．１％アジ化ナトリウムを含む２５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）中にて粒子担体が０．１％となるように分散させ、亜型がａｙｗであるＨＢｓ抗原を固定化した粒子担体の懸濁液を調製した。
また、細胞工学的技術を用いて、ＨＢｓ抗原産生能を有するヒト肝癌由来の細胞株を培養し、その培養上澄液より調製された、亜型がａｄｒである精製ＨＢｓ抗原（製造番号０１１Ｄ１−０００３、明治乳業社製）を用い前記と同様にして、亜型がａｄｒであるＨＢｓ抗原を固定化した粒子担体の懸濁液を調製した。
【０１０１】
（３）  試料としての抗体溶液の調製
ＨＢｓ抗原の共通抗原決定基ａに特異的な抗体として、以下の２種類のモノクローナル抗体を用意した。
抗ａ抗体▲１▼：ＨＢｓ抗原の共通抗原決定基ａに特異的なモノクローナル抗体（融合細胞株番号７Ｇ４、自家調製）
抗ａ抗体▲２▼：ＨＢｓ抗原の共通抗原決定基ａに特異的なモノクローナル抗体（融合細胞株番号１Ａ１、自家調製）
また、ＨＢｓ抗原のそれぞれの対立亜型抗原決定基に特異的な抗体として、以下の４種類のモノクローナル抗体を用意した。
抗ｄ抗体：ＨＢｓ抗原の対立亜型抗原決定基ｄに特異的なモノクローナル抗体（融合細胞株番号７Ｃ、自家調製）
抗ｙ抗体：ＨＢｓ抗原の対立亜型抗原決定基ｙに特異的なモノクローナル抗体（メーカーコード番号１０４１、特殊免疫研究所社製）
抗ｒ抗体：ＨＢｓ抗原の対立亜型抗原決定基ｒに特異的なモノクローナル抗体（メーカーコード番号１０２１、特殊免疫研究所社製）
抗ｗ抗体：ＨＢｓ抗原の対立亜型抗原決定基ｗに特異的なモノクローナル抗体（メーカーコード番号１０３１、特殊免疫研究所社製）
なお、前記の抗ａ抗体▲１▼、抗ａ抗体▲２▼及び抗ｄ抗体の３種類の自家調製のモノクローナル抗体は、亜型がａｄｒであるＨＢｓ抗原（明治乳業社製）を免疫原として、Ｋｏｅｈｌｅｒらのモノクローナル抗体作成技術〔Ｋｏｅｈｌｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ，２５６巻，４９５〜４９７頁，１９７５年〕に従って得られたモノクローナル抗体について、ＨＢｓ抗原の４種類の亜型（ａｄｒ、ａｄｗ、ａｙｒ及びａｙｗ）との反応性を比較して、特異性を決定したものである。
これらの前記の抗ａ抗体▲１▼、抗ａ抗体▲２▼、抗ｄ抗体、抗ｙ抗体、抗ｒ抗体及び抗ｗ抗体をそれぞれ０．５％カゼイン及び０．１％アジ化ナトリウムを含む２５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）にて、２５０，０００ｎｇ／ｍＬから０．０２５ｎｇ／ｍＬまで段階的に希釈して、試料としての各濃度の各抗体溶液を調製した。
【０１０２】
（４）ＨＢｓ抗原の共通抗原決定基ａに特異的な抗体及びＨＢｓ抗原の対立亜型抗原決定基に特異的な抗体の測定
前記（１）で調製した亜型がａｄｒであるＨＢｓ抗原を固定化したマイクロプレートの各ウェルに、前記（３）で調製した試料としての各濃度の抗ａ抗体▲１▼、抗ａ抗体▲２▼、抗ｄ抗体、抗ｙ抗体、抗ｒ抗体及び抗ｗ抗体の抗体溶液を２５μＬずつ加え、次に前記（２）で調製した亜型がａｙｗであるＨＢｓ抗原を固定化した粒子担体の懸濁液を各ウェルに２５μＬずつ添加した後、マイクロプレートミキサーで十分に撹拌した。
室温で１時間静置後、マイクロプレートの各ウェルの凝集像の判定を行った。
マイクロプレートのウェル内に広がった凝集像が見られる場合を陽性像とし、ウェルの底面に収束した像が見られる場合を陰性像とし、各抗体溶液の陽性像を呈する最低濃度を検出感度として測定した。
なお、前記（１）で調製した亜型がａｙｗであるＨＢｓ抗原を固定化したマイクロプレートと前記（２）で調製した亜型がａｄｒであるＨＢｓ抗原を固定化した粒子担体を用いて、前記（３）で調製した各濃度の抗ａ抗体▲１▼、抗ａ抗体▲２▼、抗ｄ抗体、抗ｙ抗体、抗ｒ抗体及び抗ｗ抗体の抗体溶液の陽性像を呈する最低濃度を検出感度として前記と同様にして測定した。
また、比較例として、前記（１）で調製した亜型がａｄｒであるＨＢｓ抗原を固定化したマイクロプレートと前記（２）で調製した亜型がａｄｒであるＨＢｓ抗原を固定化した粒子担体を用い、更に前記（１）で調製した亜型がａｙｗであるＨＢｓ抗原を固定化したマイクロプレートと前記（２）で調製した亜型がａｙｗであるＨＢｓ抗原を固定化した粒子担体を用いて、マイクロプレートと粒子担体に固定化したＨＢｓ抗原が同一の亜型である（つまり同じ対立亜型抗原決定基を有する）場合について、前記（３）で調製した各濃度の各抗体溶液の陽性像を呈する最低濃度を検出感度として前記と同様にして測定した。
これらの測定の結果を表２に示した。
【０１０３】
【表２】
0003864194.tif 000003
【０１０４】
この表２より、対立亜型抗原決定基の全てが異なり同じ対立亜型抗原決定基は有しない亜型のＨＢｓ抗原をそれぞれ固定化したマイクロプレートと粒子担体を用いた本発明による測定では、共通抗原決定基ａに対する抗ＨＢｓ・ａ抗体を低濃度まで高感度に検出できるが、対立亜型抗原決定基に対する抗ＨＢｓ・ｄ抗体、抗ＨＢｓ・ｙ抗体、抗ＨＢｓ・ｒ抗体及び抗ＨＢｓ・ｗ抗体はいずれも高濃度のものしか検出できず、その検出感度の差は大変大きいので、ＨＢｓ抗原の共通抗原決定基ａに対する抗体のみを選択的に測定できることがわかる。
【０１０５】
これに対して、同じ対立亜型抗原決定基を有する同一の亜型のＨＢｓ抗原を固定化したマイクロプレートと粒子担体を用いた比較例による測定では、共通抗原決定基ａに対する抗ＨＢｓ・ａ抗体を低濃度まで検出できるものの、対立亜型抗原決定基に対する抗ＨＢｓ・ｄ抗体、抗ＨＢｓ・ｙ抗体、抗ＨＢｓ・ｒ抗体及び抗ＨＢｓ・ｗ抗体をも低濃度のものまで高感度に検出してしまい、その検出感度に差がないので、ＨＢｓ抗原の共通抗原決定基ａに対する抗体（抗ＨＢｓ・ａ抗体）のみを選択的に測定することができないことがわかる。
【０１０６】
よって、本発明の測定においては、抗ＨＢｓ・ａ抗体のみを選択的に測定できることが確かめられた。
【０１０７】
【作用】
本発明の測定においては、ＨＢｓ抗原に特異的な種々の抗体のうち、全ての亜型が共通に保有する共通抗原決定基ａに特異的な抗体（抗ＨＢｓ・ａ抗体）を選択的に測定するために、前記の抗ＨＢｓ・ａ抗体を含有すると推測される試料に前記のＨＢｓ抗原の共通抗原決定基ａを有し、かつ全ての亜型抗原決定基が確認されている人工的に調製した第１の抗原を接触させ、これと同時に又はこの後に前記のＨＢｓ抗原の共通抗原決定基ａを有しかつ第１の抗原が有する対立亜型抗原決定基は有しない、全ての亜型抗原決定基が確認されている人工的に調製した第２の抗原を更に接触させる。
【０１０８】
この時、試料中の抗ＨＢｓ・ａ抗体は、前記の第１のＨＢｓ抗原と第２のＨＢｓ抗原の両方に結合し、「第１のＨＢｓ抗原−抗体（抗ＨＢｓ・ａ抗体）−第２のＨＢｓ抗原」の結合を形成することができるが、これに対して、試料中の前記の抗原の対立亜型抗原決定基に特異的な抗体は、結合できたとしても前記の第１の抗原又は第２の抗原のどちらか一方にしか結合できず、「第１のＨＢｓ抗原−抗体（対立亜型抗原決定基に特異的な抗体）−第２のＨＢｓ抗原」の結合を形成することができない。
【０１０９】
よって、試料、第１のＨＢｓ抗原及び第２のＨＢｓ抗原の接触により形成された「第１のＨＢｓ抗原−抗体（抗ＨＢｓ・ａ抗体）−第２のＨＢｓ抗原」の結合の形成を検出することにより、「第１のＨＢｓ抗原−抗ＨＢｓ・ａ抗体−第２のＨＢｓ抗原」の結合の形成を検出することができ、そして、この結合を検出することによって、試料中の抗ＨＢｓ・ａ抗体の存在の有無及びその量を測定することができる。
【０１１０】
【発明の効果】
本発明の測定方法及び測定試薬は、ＨＢｓ抗原の共通抗原決定基ａの抗原性について均一性が高く、そして全ての亜型抗原決定基が確認されている、ＨＢｓ抗原の共通抗原決定基ａを有する人工的に調製した第１のＨＢｓ抗原及び前記のＨＢｓ抗原の共通抗原決定基ａを有しかつ第１のＨＢｓ抗原が有する対立亜型抗原決定基は有しない人工的に調製した第２のＨＢｓ抗原を用いることにより、ＨＢｓ抗原の共通抗原決定基ａに特異的な抗体（抗ＨＢｓ・ａ抗体）のみを選択的に測定することを可能とすることができた。
【０１１１】
この本発明により、ヒト由来試料中のそれぞれの亜型のＨＢｓ抗原を有するＢ型肝炎ウィルスの全てに対して感染防御能を有する抗ＨＢｓ・ａ抗体の単独の量を測定できるようになり、かつ抗ＨＢｓ抗体測定試薬間の判定の不一致が解消され、更には抗ＨＢｓ・ａ抗体測定の特異性を向上させることができるようになった。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＨＢｓ抗原の構造を示した図である。
【図２】従来の抗ＨＢｓ抗体測定の原理を示した図である。
【図３】本発明による抗ＨＢｓ・ａ抗体測定の原理を示した図である。
【符号の説明】
１  亜型がａｄｒであるＨＢｓ抗原
２  共通抗原決定基ａに特異的な抗体
３  対立亜型抗原決定基ｄに特異的な抗体
４  対立亜型抗原決定基ｒに特異的な抗体
５  標識物質
６  固相
７亜型がａｄｒであるＨＢｓ抗原
８亜型がａｙｗであるＨＢｓ抗原
９  共通抗原決定基ａ
１０  対立亜型抗原決定基ｄ
１１  対立亜型抗原決定基ｒ
１２  対立亜型抗原決定基ｙ
１３  対立亜型抗原決定基ｗ
１４共通抗原決定基ａに特異的な抗体
１５対立亜型抗原決定基ｄに特異的な抗体
１６対立亜型抗原決定基ｒに特異的な抗体
１７対立亜型抗原決定基ｙに特異的な抗体
１８標識物質
１９固相
【図１】
0003864194.tif 000004
【図２】
0003864194.tif 000005
【図３】
0003864194.tif 000006