(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ルナシンペプチド（配列番号：２、残基２２−６４）をコードする核酸を含んでなる、望ましくない有糸分裂機能を示す標的細胞における有糸分裂機能を選択的に混乱させるための医薬。
【請求項２】
望ましくない有糸分裂機能を示す標的細胞の有糸分裂機能を選択的に混乱させる方法（ヒトを対象とした治療方法を除く）において、
望ましくない有糸分裂機能を示す標的細胞を同定し、
標的細胞にルナシンペプチド（配列番号：２、残基２２−６４）をコードする核酸の有効量を導入する工程を含み、それにより細胞の望ましくない有糸分裂機能を選択的に混乱させる方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願における研究は、部分的にＵＳＤＡ  ＮＲＩＣＧＰ認可＃９４−０２１６７によって支援された。政府は、この出願に発行される特許に権利を有する。
（発明の分野）
本発明は、細胞の有糸分裂機能を混乱させる類のペプチドに関する。
【０００２】
（発明の背景）
被子植物における初期の種子成長は、早い細胞分裂及び分化、それに続く細胞分裂の停止及び細胞膨張の開始を特徴とし、その間にＤＮＡ核内倍加及び貯蔵タンパク質、炭水化物及び脂質の大量合成が内胚乳及びマメ科植物の子葉に起こる（１）。これら初期の現象に横たわる分子機構はあまり理解されていない。種子の発達に見られる水溶性タンパク質の異なったグループである２Ｓアルブミンの一時的発現は、エンドウマメ胚発達において細胞が分裂を停止した後の細胞膨張の開始と一致することがわかった（２）。活性分裂及び非分裂実質細胞を含むArabidopsisに対するインシトゥハイブリッド化実験も、２Ｓアルブミン遺伝子発現及び有糸分裂活性に共通する調節機構の存在の可能性を示唆している（３）。しかしながら、種子発達の間の有糸分裂の調節における２Ｓアルブミンの機能的役割は確立されていない。
【０００３】
（発明の概要）
本発明は、望ましくない有糸分裂機能を示す標的細胞における有糸分裂機能を選択的に変性させる方法及び組成物を提供する。好ましい標的細胞は、哺乳動物、植物及び細菌細胞を含み、これらの細胞はインビトロでもインシトゥでもよい。一般的方法は、標的細胞にＧｍ２Ｓ−１ペプチド及び／又はＡｓｐ又はＧｌｕ等の隣接する酸性アミノ酸を含む有糸分裂機能のモジュレータの有効量を導入し、それにより細胞の望ましくない有糸分裂機能を選択的に変性する。特別な実施態様では、Ｇｍ２Ｓ−１ペプチドは隣接する酸性アミノ酸を含む及び／又は残基３３−４３、残基８５−９１、残基１２３−１２７、残基８５−１２７、配列番号：２の少なくとも１２の隣接する残基、残基１−３５及び／又は配列番号：２を含む。ペプチドは、細胞をそのペプチドをコードする又は配列番号：１を含む核酸又はその断片であってレジデントＧｍ２Ｓ−１ペプチドコード遺伝子又は翻訳物の発現を変性させる断片でトランスフェクトすることにより導入してもよい。
【０００４】
本発明は、主題の方法において使用できる種々の組成物も包含し、それらは有糸分裂機能のモジュレータ、Ｇｍ２Ｓ−１ペプチド、Ｇｍ２Ｓ−１ペプチドコード核酸、抗体等のＧｍ２Ｓ−１ペプチド特異的結合剤、及び配列番号：１の鎖又は特異的にハイブリッド化するのに十分なその断片を含む核酸ハイブリッド化プローブ及びプライマーを含み、それによりＧｍ２Ｓ−１ペプチドコード遺伝子の発現の同定、クローニング、増幅及び／又は変性を促進する。
【０００５】
（発明の好ましい実施態様の説明）
本発明は、望ましくない有糸分裂機能を示す標的細胞の有糸分裂を選択的に混乱させる方法及び組成物を提供する。よって、この方法は、標的細胞の分裂を妨害（例えば、促進、防止又は遅延）するのに使用できる。本発明は、有糸分裂機能が定性的、定量的、空間的、時間的等で望ましくない広範な徴候に適用可能である。例えば、１つの特別な実施態様では、この方法及び組成物は、癌、再狭窄等のヒト新形成における望ましくない細胞成長の抑制に使用される。他の実施態様では、本発明は有害な微生物、例えばMedical Microbiology 4th Ed.(S. Baron, Ed., 1996, UT Med Branch at Galveston)に記載されているような病原菌の正常な分裂を阻止するのに使用される。さらに他の実施態様では、本発明は、ＤＮＡ核内倍加が起こる細胞分裂終結のタイミングを制御することにより植物種子細胞発達を調節するのに使用される。
【０００６】
一般的な方法は、標的細胞に有効量のペプチドモジュレータ、好ましくはディスラプターを導入することを含み、それは、好ましくは少なくとも６、より好ましくは少なくとも７、より好ましくは少なくとも８の、Ａｓｐ又はＧｌｕ等の隣接する酸性アミノ酸を、細胞の有糸分裂機能を変性させるのに十分に含む。ここに示すように、本発明は、経験的に容易に最適化できる広範な好まし方法、量、及びペプチド長及び組成物を包含する。
【０００７】
特別な実施態様では、モジュレーターペプチドはＧｍ２Ｓ−１ペプチドを含み、それは少なくとも５、好ましくは少なくとも６、より好ましくは少なくとも７の隣接する酸性アミノ酸を含んでいる。他の好ましい実施態様では、ペプチドはＧｍ２Ｓ−１ペプチドを含み、それは配列番号：２の少なくとも８、好ましくは少なくとも１０、より好ましくは少なくとも２０残基のドメインを含み、細胞の有糸分裂機能を選択的に変性させるのに十分である。このようなペプチドは、Ｇｍ２Ｓ−１シグナル配列（配列番号：２の残基０１−２１）、ルナシン(lunasin)（配列番号：２の残基２２−６４）Ｇｍ２Ｓ−１リンカーペプチド（配列番号：２の残基６５−８１）又はアリシン(alisin)（配列番号：２、残基８２−１５８）から誘導され得る。他の好ましい実施態様では、ペプチドは、配列番号：２の残基３３−４３、配列番号：２の残基８５−９１、配列番号：２の残基１２３−１２７、配列番号：２の残基８５−１２７及び／又は配列番号：２の残基１−３５の少なくとも１２の隣接する残基を含む。隣接する酸性アミノ酸は、好ましくは、モジュレータのＣ末端の近く（例えば、１２残基以内、好ましくは６残基以内、より好ましくは３残基以内）又はそのＣ末端上にある。モジュレータは、広範な付加的部位、特に酸性アミノ酸に対してＮ末端の部位を含んでいてもよく、それらは、検出、標的化、安定性、タンパク質分解耐性、等を提供する部位を含む。
【０００８】
Ｇｍ２Ｓ−１ペプチドを含む主題のモジュレータは、Ｇｍ２Ｓ−１に特異的な活性又は機能、例えば有糸分裂機能、リガンド／抗体結合又は結合阻害、免疫原性等のＧｍ２Ｓ−１特異的混乱を提供する。Ｇｍ２Ｓ−１ペプチド特異的活性又は機能は、従来のインビトロ、細胞ベース、又はインビボアッセイ：例えば動物におけるインビトロ結合アッセイ、細胞培養アッセイ、（例えば遺伝子治療、トランスジーン等）などによって測定される。結合アッセイは、Ｇｍ２Ｓ−１ペプチドの結合標的との分子相互作用が評価されるアッセイを含む。結合標的は、天然細胞内結合標的、例えばＧｍ２Ｓ−１ペプチド調節タンパク質（たとえばmapmodulin, Ulitzur等, 1997, PNAS 94, 5084-5089)又はＧｍ２Ｓ−１ペプチドの活性又は位置を直接変更させる他のレギュレータ；又は抗体などの特異的免疫タンパク質のような非天然結合標的、又は生物／化学スクリーニングアッセイで同定されるもののようなＧｍ２Ｓ−１特異的剤であってよい。Ｇｍ２Ｓ−１ペプチド結合特異性は、以下に述べる有糸分裂混乱アッセイ、結合平衡定数（通常は少なくとも約１０７Ｍ−１、好ましくは少なくとも約１０８Ｍ−１、より好ましくは少なくとも約１０９Ｍ−１）により、主題ペプチドのＧｍ２Ｓ−１ペプチド発現細胞においてネガティブ変異体として機能する、異種宿主（たとえば齧歯類又はウサギ）においてＧｍ２Ｓ−１ペプチド特異的抗体を誘発する能力により検定することができる。好ましいＧｍ２Ｓ−１ペプチドのＧｍ２Ｓ−１ペプチド結合特異性は、チューブリン、ＭＡＰ及びマップモジュリンとは必然的に区別される。
【０００９】
特別な実施態様では、Ｇｍ２Ｓ−１を含むモジュレータは、単離された又は純粋なものであり：「単離された」ペプチドは、その天然状態では有する少なくとも幾つかの材料を、与えられた試料における全ペプチドの好ましくは少なくとも約０．５％、より好ましくは少なくとも約５重量％を構成する幾つかの材料を伴わず、純粋なペプチドが、与えられた試料の全ペプチドの少なくとも９０％、好ましくは９９重量％を構成する。ペプチドは、合成しても、組み換え技術により生産しても、細胞から精製してもよい。広範な分子及び生化学的方法が、生化学的合成、分子発現及び主題組成物の精製のために利用可能であり、Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Sambrook, 等, Cold Spring Harbor Laboratory)、Current Protocols in Molecular Biology (Eds. Ausubel,等, Greene Publ. Assoc., Wiley-Interscience, NY)又はこの分野で知られた他のものを参照されたい。細菌細胞（たとえば大腸菌）、酵母菌（たとえばS. Cerevisiae）、動物細胞（たとえばＣＨＯ、３Ｔ３、ＢＨＫ、バキュロウイルス適合性昆虫細胞など）における異種組み換えペプチドの発現のための材料及び方法。ペプチドは、他のペプチドに抱合していなくても、広範な非共有結合で抱合していても、結合抱合体、他のＧｍ２Ｓ−１又は非Ｇｍ２Ｓ−１ペプチド配列（同種又は異種キメラペプチド）との共有結合抱合体等であってもよい。
【００１０】
本発明は、基質、アゴニスト、アンタゴニスト、天然細胞内結合標的等を含む、特許請求したモジュレータに特異的な結合剤、そのような剤の同定及び作製方法、及びそれらの診断、治療及び製薬開発での使用を提供する。たとえば、新規なペプチド特異的結合剤は、Ｇｍ２Ｓ−１ペプチド特異的レセプター、たとえば体性組み換えポリペプチドレセプター様特異的抗体又はＴ細胞抗原レセプター（Harlow及びLane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory）及び１-、２-及び３-ハイブリッドスクリーニング等のアッセイで同定される他の天然細胞内結合剤、化学的ライブラリーのスクリーニングで同定される非天然細胞内結合剤等を含む。特に興味深い剤は、Ｇｍ２Ｓ−１ペプチド機能、例えばＧｍ２Ｓ−１ペプチド依存性有糸分裂混乱を変性させる。
【００１１】
また、本発明は、Ｇｍ２Ｓ−１変性可能な細胞機能のレベルにおいて活性剤を同定する有効な方法も提供する。一般に、これらのスクリーニング方法は、Ｇｍ２Ｓ−１ペプチドの天然Ｇｍ２Ｓ−１ペプチド結合標的等との相互作用を変性させる化合物の検定を含む。結合剤についての広範なアッセイは、標識されたインビトロタンパク質−タンパク質結合アッセイ、免疫アッセイ、細胞ベースアッセイ等を含んで提供される。これらの方法は、先行化合物についての化学的ライブラリーの自動化された、コスト効率のよい高いスループットのスクリーニングに適用可能である。Ｇｍ２Ｓ−１ペプチドとそのリガンド／天然結合標的との相互作用を変性させる剤は、例えば、Ｇｍ２Ｓ−１ペプチドを含む細胞をそのような剤に接触させることにより（例えば、そのような細胞を含む患者に投与することにより）Ｇｍ２Ｓ−１ペプチド機能に関連する生物学的プロセスを変性させるのに使用できる。Ｇｍ２Ｓ−１ペプチドに媒介される生物学的プロセスは、Ｇｍ２Ｓ−１ペプチドがリガンドに結合したときに媒介される広範な細胞事象、例えば植物種子成長調節を含む。
【００１２】
主題のペプチドのアミノ酸配列は、選択された発現系について最適化された核酸をコードするペプチドの逆翻訳に使用され（Holler等 (1993) Gene 136, 323-328; Martin等 (1995) Gene 154, 150-166）、又は天然Ｇｍ２Ｓ−１ペプチドをコードする核酸配列の単離においてオリゴヌクレオチドプライマー及びプローブを生成分解するために用いられる（「ＧＣＧ」ソフトウェア, Genetics Computer Group, Inc., Madison WI）。モジュレータペプチドをコードする核酸は、例えば、発現及びスクリーニングのために、例えば、モジュレータペプチドで変性された細胞機能を取り扱うための候補剤の有効性等の機能研究等のために、ペプチド発現ベクターにおいて用いられ、組み換え細胞に導入される。
【００１３】
また、本発明は、配列番号：１の相補的鎖に効率的に特異的なハイブリッド化するのに十分な配列番号：１の鎖の断片を含むＧｍ２Ｓ−１ｃＤＮＡ特異的配列を有するハイブリッド化プローブ及び複製／増幅プライマーを含む（即ち、ダイズ種子中成熟ライブラリーｃＤＮＡライブラリーの存在下で配列番号：１の対応する反対鎖を含む核酸と特異的にハイブリダイズする）Ｇｍ２Ｓ−１核酸も提供する。このようなプライマー又はプローブは、少なくとも１２、好ましくは少なくとも２４、より好ましくは少なくとも３６、最も好ましくは少なくとも９６の塩基長である。特異的ハイブリッド化の提示は、一般に緊縮条件、即ち、（１）洗浄用の低いイオン強度及び高い温度、例えば０．０１５ＭのＮａＣｌ／０．００１５Ｍのナトリウム滴定／０．１％ＳＤＳ、５０℃を用いる、又は（２）ハイブリッド化中に、ホルムアミド等の変性剤、例えば５０％（vol/vol）ホルムアミドとともに０．１％ウシ血清アルブミン、／０．１％フィコール／０．１％ポリビニルピロリドン／５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファーｐＨ６．５及び７５０ｍＭＮａＣｌ、７５ｍＭクエン酸ナトリウム、４２℃を用いる条件を必要とする。他の例は、５０％のホルムアミド、５ｘＳＳＣ（０．７５ＭＮａＣｌ、０．０７５Ｍクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５ｘデンハード溶液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ（５０ｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳ、及び１０％デキストリン硫酸の４２℃での使用であり、４２℃で０．２ｘＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳで洗浄する。またＧｍ２Ｓ−１核酸は、BLASTX (Altschul等, (1990) Basic Local Alignment Search Tool, J. Mol. Biol., 215, 403-410等のアラインメントアルゴリズムを用いて区別される。一実施態様では、主題のＧｍ２Ｓ−１核酸は、配列番号：１の領域をコードするＧｍ２Ｓ−１ペプチドを含む；例えば、Ｇｍ２Ｓ−１シグナルペプチドは、塩基１７−７９、ルナシンペプチドは塩基８０−２０８、ルナシン−アリシンリンカーペプチドは塩基２０９−２５９、アリシンペプチドは塩基２６０−４９０によってコードされる。
【００１４】
主題の核酸は、合成／非天然配列であり及び／又は単離されたものであり、即ち、その天然状態が有する少なくとも幾つかの、好ましくは与えられた分画に存在する全核酸の少なくとも約０．５％、好ましくは少なくとも約５％を構成する材料を伴わず、通常は組み換え物であり、それらが非天然配列又は天然染色体に結合しているもの以外のヌクレオチドに結合した天然配列を含むことを意味する。配列番号：１の核酸配列を含む組み換え核酸、又はその主題とする断片は、そのような配列又は断片を末端、天然染色体に結合したもの以外の配列に直ぐ隣（即ち連続）、又は１０ｋｂ未満、好ましくは２ｋｂ未満で末端又は天然染色体に結合したもの以外の配列の直ぐ隣の天然隣接領域の隣に含む。  核酸は通常ＲＮＡ又はＤＮＡであるが、変性された安定性などを提供するために他の塩基又はヌクレオチド類似物を含む核酸の使用が有利なことも多い。
【００１５】
主題の核酸は、広範な応用があることが見いだされ、それには翻訳可能な翻訳物、ノック-イン／アウトベクター、ハイブリッド化プローブ、ＰＣＲプライマー、診断用核酸、等；Ｇｍ２Ｓ−１遺伝子及び遺伝子翻訳物の存在の検出及び更なるＧｍ２Ｓ−１相同体及び構造類似物をコードする増幅核酸の検出における使用を含む。診断において、Ｇｍ２Ｓ−１ハイブリッド化プローブは、野生型及び変異体Ｇｍ２Ｓ−１対立遺伝子の同定における用途が見いだされた。Ｇｍ２Ｓ−１核酸は、活性Ｇｍ２Ｓ−１の細胞発現又は細胞内濃度又は利用可能性の有効化及び／又は変性に用いられる。主題のモジュレータをコードする遺伝子標的化発現を有効化する方法は、この分野で知られている；例えば、Altenschmidt等, 1997, J. Mol. Med., 75:259-266; Perales等, 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94:6450-6455; Schmidt等, 1997, Gene, 190:211-216; Oldfield等, 1993, Human Gene Therapy, 4:39-46; Asgari等, 1997, Int. J. Cancer, 71:377-382; He D,等, 1997, Cancer Res., 57:1868-1872参照。特別な実施態様では、主題のＧｍ２Ｓ−１ペプチドは、細胞をペプチドをコードする核酸、特に配列番号：１又はその断片を含む核酸でトランスフェクトすることにより導入される。治療滴核酸組成物は、有利には主題化合物以外の他の治療的又は予防的剤と結合され及び／又は組み合わされてもよい。多くの場合、主題組成物と組み合わされた投与は、それらの剤の有効性を向上させる、Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 9版, 1996, McGraw-Hill参照。
【００１６】
さらに説明はしないが、当業者であれば、上記の説明及び以下の例示的実施例を用いて、本発明の化合物を作ることができ、使用することができ、特許請求した方法を実施することができる。従って、以下の作動実施例は、特に本発明の好ましい実施態様を指摘するが、この開示の残りの部分を何ら限定するものではない。他の遺伝子コンフィギュレーションは、当業者には明らかであろう。この明細書に引用した全ての発行物及び特許出願は、個々の出版物又は特許出願が特にそして独立に出典開示して取り込まれると明示されたように参考としてここに取り入れる。
【００１７】
実施例
実施例１：Ｇｍ２Ｓ−１のクローニング
ダイズ種子における内因性のイオウ豊富なタンパク質について、その栄養質を向上させる我々の研究において、中成熟ダイズ種子からのポリ−Ａを用いてラムダｇｔ１１にクローニングされたｃＤＮＡライブラリーからのダイズ（Glycine max, cv Hodgson 78）からの２Ｓアルブミン(4)をコードするコチレドン特異的ｃＤＮＡ（Ｇｍ２Ｓ−１、配列番号：１）をクローニングした。簡潔には、精製された８ｋＤａタンパク質（Revilleza等, 1996）のＮ末端の７内部アミノ酸（ＥＥＧＨＭＱＫ）をベースとするプライマーからのＲＡＣＥプロトコールを用いて５００ｂｐＰＣＲ産物を得た。テンプレートは、中成熟段階ダイズ種子から単離したｍＲＮＡから誘導された二次鎖ｃＤＮＡである。転写開始部位は、ｃＲＡＣＥプロトコール（Maruyama等, 1995）を用いて確立した。クローンＧｍ２Ｓ−１は、７７−ｂｐのオープン読み枠を持ち、それはプローブにハイブリッド化した２．５ｋｂのｃＤＮＡクローンの３’末端近傍の１．５ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ内にある。転写開始部位は、ＡＴＧ開始部位から１７ｂｐ離間している。ポリ−Ａシグナルは停止コドンの９０ｂｐ後ろであり、ポリ−Ａ尾部はポリ−Ａシグナルの１３８ｂｐ下流である。
【００１８】
完全ｃＤＮＡは、２１残基シグナルペプチド及びプロータンパク質を含む読み枠（配列番号：２）をコードし、それは翻訳後に処理された４３アミノ酸の小さいサブユニット（ルナシン）を生じ、それは独特のカルボキシ末端を持ち、細胞接着モチーフＲＧＤを含み、次いで８アスパラギン酸残基(5)、１７アミノ酸リンカーペプチド及び７７アミノ酸（８ｋＤａ）の大きなサブユニット（アリシン）を含み、イオウ（７．８％メチオニン）リシン（１３．０％）及びシステイン（７．８％）に富む。プロタンパク質は、高度に親水性であり、予想されるｐＩは５．６である。発育中のダイズ胚(6)からの全ＲＮＡを用いたノーザン分析は、Ｇｍ２Ｓ−１転写物が開花後３週間に現れ、開花後７週間まで維持され（遅延成熟）るが、成熟種子では全く無くなることを示した。これは子葉のみに見られ、他の組織では見られない。タンパク質は、１−１４Ｃヨウ化酢酸法（de Lumen及びKho, 1987）を用いて開花の４週間後に検出され、成熟するまで子葉に維持された。この発現は、種子発達における細胞膨張相と一致する(7)。
【００１９】
実施例２：細菌における有糸分裂機能の混乱
我々は、細菌発現ベクターを用いたアレルゲン試験のために、ルナシン及びアリシンペプチドを含む精製Ｇｍ２Ｓ−１誘導ペプチドを製造することを試みた。最初に、ルナシン及びルナシン欠失（ルナシン-del）変異体（カルボキシ末端から９のアスパラギン酸が欠失）をコードするＰＣＲ増幅した断片を、ｐＧＥＭ−Ｔ（Promega）ＰＣＲクローニングベクターにクローニングし、次いで、ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで切断してルナシン及びルナシン-del遺伝子断片を放出させ、次いでｐＦＬＡＧ−１細菌発現ベクター（Kodak/IBI）にサブクローニングした。ルナシン及びルナシン-delｐＦＬＡＧ構築物は、競合体ＤＨ５大腸菌を標準的な熱衝撃プロトコールを用いて形質転換するのに用いた。これらの発現実験を通して、我々は、ＤＨ５大腸菌細胞におけるルナシンの基本的発現が、延長された非分離細菌フィラメントの形成をもたらすことを観察した。このフェノタイプは、大きなサブユニットペプチド及びポリアスパラギン酸末端欠失ルナシン（ルナシン-del）をコードする遺伝子がＤＨ５細胞で発現されたときには検出されず、細菌細胞分裂における有糸分裂の混乱にはルナシンのカルボキシ末端が必要であることを示している。
【００２０】
同様な有糸分裂の混乱が、ルナシン及びアリシン欠失変異ペプチド（ルナシン-del-n及びアリシン-del-n）及びルナシン／アリシン様合成ペプチド（Ｇｍ２Ｓ−１-syn-n）の大きなパネルを用いて観察された。これらの細菌研究（Ｎ→Ｃ命名変換を用いた）における例示的な活性ルナシン-delペプチドは以下の物を含む：
ルナシン-del-1: ＭＲＧ−配列番号:2 の残基57-64融合タンパク質
ルナシン-del-2: ＯｍｐＡ−配列番号:2の残基54-64融合タンパク質
ルナシン-del-3: lacZα−配列番号:2の残基48-63融合タンパク質
ルナシン-del-4: FtsZ−配列番号:2の残基26-64融合タンパク質
ルナシン-del-5: lacI−配列番号:2の残基57-64融合タンパク質
ルナシン-del-6: lacZα-断片−配列番号:2の残基54-64融合タンパク質
ルナシン-del-7: ＯｍｐＡ−配列番号:2の残基44-63融合タンパク質
ルナシン-del-8: ＦＬＡＧＧ−配列番号:2の残基30-64融合タンパク質
ルナシン-del-9: lacZα-断片−配列番号:2の残基57-64融合タンパク質
ルナシン-del-10: FtsZ−配列番号:2の残基54-64融合タンパク質
ルナシン-del-11: MEKIQGRG(配列番号:3)−配列番号:2の残基40-63融合タンパク質
ルナシン-del-12: MEKIQGRG(配列番号:3)−配列番号:2の残基34-64融合タンパク質
【００２１】
これらの細菌研究の例示的活性アリシン-delペプチドは次の物を含む：
アリシン-del-1: ＭＲＧ−配列番号:2の残基84-91融合タンパク質
アリシン-del-2: ＯｍｐＡ−配列番号:2の残基82-92融合タンパク質
アリシン-del-3: lacZα-断片−配列番号:2の残基123-130融合タンパク質
アリシン-del-4: FtsZ−配列番号:2の残基120-132融合タンパク質
アリシン-del-5: lacI−配列番号:2の残基84-91融合タンパク質
アリシン-del-6: lacZα−断片-配列番号:2の残基82-92融合タンパク質
アリシン-del-7: ＯｍｐＡ−配列番号:2の残基123-130融合タンパク質
アリシン-del-8: ＦＬＡＧＧ−配列番号:2の残基120-132融合タンパク質
アリシン-del-9: lacZα-断片−配列番号:2の残基84-91融合タンパク質
アリシン-del-10: FtsZ−配列番号:2の残基82-95融合タンパク質
アリシン-del-11: MEKIQGRG(配列番号:3)−配列番号:2の残基123-130融合タンパク質
アリシン-del-12: MEKIQGRG(配列番号:3)−配列番号:2の残基120-132融合タンパク質
【００２２】
これらの細菌研究の例示的な活性Gm2S-1-synペプチドは次の物を含む：
Gm2S-1-syn-1: MRG-オクタ-アスパラギン酸融合タンパク質
Gm2S-1-syn-2: OmpA-テトラ-アスパラギン酸-テトラ-グルタミン酸融合タンパク質
Gm2S-1-syn-3: lacZα-断片-ノナ-アスパラギン酸融合タンパク質
Gm2S-1-syn-4: FtsZ-デカ-アスパラギン酸融合タンパク質
Gm2S-1-syn-5: lacI-オクタ-グルタミン酸融合タンパク質
Gm2S-1-syn-6: lacZα-断片-ノナ-グルタミン酸融合タンパク質
Gm2S-1-syn-7: OmpA-デカ-グルタミン酸融合タンパク質
Gm2S-1-syn-8: FLAGG-テトラ（アスパラギン酸-グルタミン酸）融合タンパク質
Gm2S-1-syn-9: lacZα-断片-トリ（アスパラギン酸-グルタミン酸-アスパラギン酸）融合タンパク質
Gm2S-1-syn-10: FtsZ-デカ-（グルタミン酸-アスパラギン酸）融合タンパク質
Gm2S-1-syn-11: MEKIQGRG (配列番号:3)-テトラ-グルタミン酸-テトラ-アスパラギン酸融合タンパク質
Gm2S-1-syn-12: MEKIQGRG (配列番号:3)-テトラ（グルタミン酸-アスパラギン酸-グルタミン酸）融合タンパク質
Gm2S-1-syn-13: MRG-トリ-グルタミン酸-ペンタアスパラギン酸融合タンパク質
【００２３】
ペプチドは、直接媒質取り込み、洗浄剤（ＴＷＥＥＮ２０等）、グアナジン塩等を含むカオトロピック(chaotropic)剤、パルス状電場、リポソーム融合などによる取り込みの促進を含む幾つかの代替的導入方法で、有糸分裂の混乱を示した。あるいは、ペプチドは、標的化微生物内での発現により間接的に導入されてもよい。このような発現は、一時的に又は安定的に導入されたペプチドコード遺伝子のアップレギュレーションによって有効化されてもよい。微生物宿主における外因性遺伝子の導入、発現及び／又は安定組み込み促進のための広範な確立された方法が、この分野で知られている。
【００２４】
活性は、広範な他の試験した細菌、特に病原性細菌でも見られた。前記ルナシン-del、アリシン-del及びＧｍ２Ｓ−１-synペプチドを含むペプチドで有糸分裂混乱を示した例示的な細菌。そのような細菌は以下の物を含む：
1: ATCC NO:6357:Chromobacterium vilaceum
2: ATCC NO:25419:Serratia marcescens Bizi
3: ATCC NO:19107:Vibrio sp. Depositors/D
4: ATCC NO:55191:Streptococcus agalactiae
5: ATCC NO:55192:Streptococcus agalactiae
6: ATCC NO:55193:Streptococcus agalactiae
7: ATCC NO:19106:Vibrio tubiashii Hada
8: ATCC NO:19105:Vibrio tubiashii Hada
9: ATCC NO:19108:Vibrio alginolyticus
10: ATCC NO:55194:Streptococcus agalactiae
11: ATCC NO:700024:Vibrio ishthyoenteri
12: ATCC NO:32751:Fusarium sp. Depositors
13: ATCC NO:700023:Vibrio ichthyoenteri
14: ATCC NO:19109:Vibrio tubiashii Hada 等
15: ATCC NO:19310:Pseudomonas syringae sub
16: ATCC NO:15302:Mycoplasma gallisepticum
17: ATCC NO:15310:Burkholderia mallei
18: ATCC NO:43115:Spiroplasma phoeniceum S
19: ATCC NO:24458:Metarhizium anisopliae
20: ATCC NO:62337:Cladosporium tenuissimum
【００２５】
実施例３．植物種子における有糸分裂の混乱
この実施例では、我々は、Ｇｍ２Ｓ−１ペプチドをコードする遺伝子が、子葉及び胚乳パリンヘマトス(parynchematous)細胞の貯蔵実質細胞において、アグロバクテリウム媒介形質転換（バイナリベクター及びｐＢＩＮ１９のｐＰＺＰファミリー）及び植物形質転換の微粒子銃法のための他のクローニングベクター（即ち、クローニングベクターのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ部位及びクローニングベクターのｐＵＣファミリー）のための他のバイナリベクターを用いた過剰発現又は誘発があったとき、非停止（de-arrest）細胞分裂できることを示す。
【００２６】
穀類胚乳及びマメ科植物子葉は種子重量の８５％を構成し、その種子サイズは遺伝子的に少なくとも８０％作物収量に関連している。従って、ルナシン遺伝子発現のインビボの取扱いは、我々に、主要な種子作物の収量を増加させる有効な手段を提供した。特に、発育中の種子におけるパリンヘマトス細胞でのルナシン発現の時間的及び空間的パターンを変更することにより、我々は、細胞膨張相の長さ及び大きさ及びＤＮＡ核内倍加を受ける細胞の数を有意に増加させ、その結果正常な種子より大きくすることができた。これを達成するために、ダイズコングリシニン遺伝子の５’調節領域（子葉特異的発現を与える転写開始部位の２００ヌクレオチド上流側の１７０ｂｐＤＮＡ配列成分（Chen等, 1988, EMBO J., 7:297)）及びコメグルテリン遺伝子（胚乳特異的発現を与える転写開始部位の４３７／３１７ヌクレオチド上流側の１２１ｂｐＤＮＡ配列成分（Yoshihara及びTakaiwa, 1996, Plant Cell Physiol., 37:107)）が、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの-９０位置に挿入され、次いでそれはルナシン及びルナシン-delペプチドの枠内翻訳物をコードするＤＮＡ断片に融合される。ＤＮＡ構築物は、アグロバクテリウム形質転換のためにバイナリベクターｐＫＹＬＸ７１に（Lloyd等, 1992, Science 258:1773）、微粒子銃形質転換のためにｐＧＥＭ-３Ｚｆ(+)ベクター（Promega）に（Cho等, 1995, Plant Mol. Biol. Rept., 13:255）結合される。子葉特異的ＤＮＡ構築物を用いたアグロバクテリウム媒介形質転換は、ほとんどの双子葉類、即ちマメ科植物（ダイズ、エンドウマメ、ピーナッツ及びインゲンマメ）、シロイヌナズナ及びタバコに使用される。穀類、小麦、コメ、大麦、ライ麦及びトウモロコシなどの単子葉類については、胚乳特異的ＤＮＡ構築物を用いた形質転換の微粒子銃法が利用される。これら全ての植物種の発育中の種子のおけるルナシンペプチドの発現は、抗体誘導化のルナシンペプチドのカルボキシ末端エピトープに対する特異性を用いた免疫局在化によって監視される。パリヘマトス細胞の大部分におけるルナシンの過剰発現は、有糸分裂細胞サイクル停止を導き、細胞にＤＮＡ核内倍加の外部サイクルを受けさせ、細胞を大きくし、従って種子サイズを大きくする。
【００２７】
類似の有糸分裂の混乱が、ルナシン及びアリシン欠失変異ペプチド（ルナシン-del-n及びアリシン-del-n）及びルナシン／アリシン様合成ペプチド（Ｇｍ２Ｓ−１-syn-n）を用いて観察された。これらの植物形質転換研究における活性なルナシン-delペプチドの例は次の物を含む：
ルナシン-del-1: ＭＲＧ−配列番号:2の残基57-64融合タンパク質
ルナシン-del-2: α-チューブリン−配列番号:2の残基54-64融合タンパク質
ルナシン-del-3: β-チューブリン−配列番号:2の残基48-63融合タンパク質
ルナシン-del-4: ＭＡＰ２−配列番号:2の残基26-64融合タンパク質
ルナシン-del-5: Mapmodulin−配列番号:2の残基57-64融合タンパク質
ルナシン-del-6: ＧＦＰ−配列番号:2の残基54-64融合タンパク質
ルナシン-del-7: ＭＡＰ４−配列番号:2の残基44-63融合タンパク質
ルナシン-del-8: ＦＬＡＧＧ−配列番号:2の残基30-64融合タンパク質
ルナシン-del-9: α-チューブリン−配列番号:2の残基57-64融合タンパク質
ルナシン-del-10: β-チューブリン−配列番号:2の残基54-64融合タンパク質
ルナシン-del-11: 配列番号:2の残基48-55−配列番号:2の残基40-63融合タンパク質
ルナシン-del-12: 配列番号:2の残基48-55−配列番号:2の残基34-64融合タンパク質
ルナシン-del-13: MRG-オクタ-アスパラギン酸融合タンパク質
ルナシン-del-14: 配列番号:2の残基48-55-オクタ-アスパラギン酸融合タンパク質
ルナシン-del-15: 配列番号:2の残基48-55-MRG-オクタ-アスパラギン酸融合タンパク質
ルナシン-del-16: 配列番号:2の残基48-55−配列番号:2の残基48-55-オクタ-アスパラギン酸融合タンパク質
ルナシン-del-17: MRG-テトラ-アスパラギン酸-テトラ グルタミン酸融合タンパク質
ルナシン-del-18: 配列番号:2の残基48-55-オクタ-グルタミン酸融合タンパク質
ルナシン-del-19: 配列番号:2の残基1-21-MRG-デカ-グルタミン酸融合タンパク質
ルナシン-del-20: 配列番号:2の残基48-55-配列番号:2, 残基48-55-テトラ-アルパラギン酸-テトラ-グルタミン酸融合タンパク質
【００２８】
これらの植物研究の例示的な活性アリシン-delペプチドは次の物を含む：
アリシン-del-1: ＭＲＧ−配列番号:2の残基84-91融合タンパク質
アリシン-del-2: α-チューブリン−配列番号:2の残基82-92融合タンパク質
アリシン-del-3: β-チューブリン−配列番号:2の残基123-130融合タンパク質
アリシン-del-4: ＦＬＡＧＧ−配列番号:2の残基120-132融合タンパク質
アリシン-del-5: ＧＦＰ−配列番号:2の残基84-91融合タンパク質
アリシン-del-6: Mapmodulin−配列番号:2の残基82-92融合タンパク質
アリシン-del-7: ＭＡＰ２−配列番号:2の残基123-130融合タンパク質
アリシン-del-8: ＭＡＰ４−配列番号:2の残基120-132融合タンパク質
アリシン-del-9: α-チューブリン−配列番号:2の残基84-91融合タンパク質
アリシン-del-10: β-チューブリン−配列番号:2の残基82-92融合タンパク質
アリシン-del-11: 配列番号:2の残基48-55−配列番号:2の残基123-130融合タンパク質
アリシン-del-12: 配列番号:2の残基48-55−配列番号:2の残基120-132融合タンパク質
【００２９】
これらの植物研究における例示的な活性Gm2S-1-synタンパク質には以下の物が含まれる：
Gm2S-1-syn-1: MRG-オクタ-アスパラギン酸融合タンパク質
Gm2S-1-syn-2: α-チューブリン-テトラ-アスパラギン酸-テトラ-グルタミン酸融合タンパク質
Gm2S-1-syn-3: β-チューブリン-ノナ-アスパラギン酸融合タンパク質
Gm2S-1-syn-4: FLAGG-デカ-アスパラギン酸融合タンパク質
Gm2S-1-syn-5: GFP-オクタ-グルタミン酸融合タンパク質
Gm2S-1-syn-6: MAP2-ノナ-グルタミン酸融合タンパク質
Gm2S-1-syn-7: Mapmodulin-デカ-グルタミン酸融合タンパク質
Gm2S-1-syn-8: FLAGG-テトラ（アスパラギン酸−グルタミン酸）融合タンパク質
Gm2S-1-syn-9: GFP-トリ（アスパラギン酸-グルタミン酸-アスパラギン酸）融合タンパク質
Gm2S-1-syn-10: MAP2-デカ-（グルタミン酸-アスパラギン酸）融合タンパク質
Gm2S-1-syn-11: α-チューブリン-テトラ-グルタミン酸-テトラ-アスパラギン酸融合タンパク質
Gm2S-1-syn-12: β-チューブリン-テトラ（グルタミン酸-アスパラギン酸-グルタミン酸）融合タンパク質
Gm2S-1-syn-13: MAP4-トリ-グルタミン酸-ペンタアスパラギン酸融合タンパク質
【００３０】
ペプチドは、Ａｔ２Ｓ１、Ａｔ２Ｓ２及びＧｍ２Ｓ−１等の子葉特異的遺伝子；及びＨｔｈ−１、プロラミン、グルテニン−１Ｄ１、ベータ−グルコシダーゼ、グロブリン−１、ゼイン（ｐＭＬ１）等の胚乳特異的遺伝子を含む子葉及び胚乳特異的遺伝子からの５’プロモーター領域を持つコード領域を融合させることにより形質転換されたトランスジェニック植物においてアップレギュレートされたとき有糸分裂の混乱を示した。
【００３１】
実施例４．哺乳動物細胞における有糸分裂機能の混乱
原核生物における中隔形成フェノタイプ無しのフィラメンテーションは、変異によって起こり、それは細菌細胞分裂プレートＦｔｓ−Ｚ（プロトフィラメント）重合を混乱させる(9)。Ｆｔｓ−Ｚは、真核生物チューブリンの進化的前駆体であると仮定されが、これは、それらが構造的に類似し、両者とも分裂において重要な役割を果たすからである(9)。Ｆｔｓ−Ｚ媒介細菌細胞分裂の混乱は、Ｇｍ２Ｓ−１ペプチドによって起こり、植物細胞におけるそれらの活性は、このダイズペプチドが、哺乳動物及びヒトを含む一般的には真核生物細胞、特に形質転換された又は癌細胞の分裂において同様に有効であるという仮説を導いた。
【００３２】
この仮説を最初に証明するために、培養したマウス肝癌細胞（Hepa 1c1c7）を、アミノ末端において緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）でタグされたルナシン遺伝子及びルナシン-del変異体（９のアスパラギン酸残基がマイナス）を含む哺乳動物発現ベクターｐＥＧＦＰ-Ｃ１(10)で一過性トランスフェクトした。ＧＦＰでタグすることにより、我々は、トランスフェクトされた細胞を監視し、蛍光顕微鏡によって細胞変化を観察すること、及びフローサイトメトリーにより細胞サイクル分析をすることができる。これらのデータは、マウス肝癌細胞の活性分裂におけるルナシン及びルナシン-del発現の効果を示す・正常な細胞分裂は、ルナシン-delでトランスフェクトされた細胞において、トランスフェクション後の２４時間、４８時間及び７２時間に起こった。位相差及びＧＦＰ蛍光分析によって示されるように、トランスフェクトされた及びトランスフェクトされない細胞において、モルホロジー変化は観察されなかった。７２時間において、少なくとも３サイクルの細胞分裂により、ルナシン-delの一過性発現の結果として、これらの細胞におけるＧＦＰ蛍光の希釈をもたらした。
【００３３】
欠質変異体対象物において正常な細胞分裂が観察されたのに対し、マウス肝癌細胞におけるルナシンの発現は、４８時間、７２時間及び８０時間後の位相差及び蛍光画像に示されるように全体的なモルホロジー変化をもたらした。４８時間において、細胞は、ルナシン-delでトランスフェクトした細胞に比較してより大きく、一般により明るいＧＦＰ蛍光を示した。低濃度のヨウ化プロピジウム(10)で染色することにより、位相差顕微鏡によって凝集した分裂中期染色体が可視化され、分散した配向を示したが、分裂中期プレートに沿ったアラインメントは正常であった。７２時間において、ルナシンでトランスフェクトした細胞を溶解し、細胞膜の分解及び破裂細胞からの凝集した染色体の娩出を示した。ＧＦＰ蛍光は、染色体断片に結合し、細胞膜の分解後においてもルナシンが染色体に結合することを示している。染色体のさらなる細分化及び続くＧＦＰ蛍光の希釈は、トランスフェクションの８０時間後に観察された。
【００３４】
ルナシンでトランスフェクトされた細胞における４８時間後の分裂中期染色体の異常な配向、大型化細胞モルホロジー及びＧＦＰの非希釈は、有糸分裂停止の発生を示唆している。ルナシンでトランスフェクトされた細胞での有糸分裂段階におけるマウス肝癌細胞の比率の増加があるか否かを測定するために、フローサイトメトリー及び細胞サイクル分析を、ルナシン及びルナシン-delのｐＥＧＦＰ-Ｃ１構築物、及びｐＥＧＦＰ-Ｃ１ベクターのみを用いて、１２の独立したトランスフェクションを行った(11)。電気泳動パラメータを変えることにより、各トランスフェクション実験で異なる細胞密度を用いて、０．３から１５％の範囲の有効性が得られた(11)。Ｇ２／Ｍ相にある細胞の比率を４８時間後に測定した。各トランスフェクション実験について、ルナシンでトランスフェクトされた細胞は、Ｇ２／Ｍ停止についての陽性値で示されるように、２つの対照物ルナシン-del及びｐＥＧＦＰ-Ｎ１トランスフェクト細胞に比較して、Ｇ２／Ｍにある細胞の比率が一貫して高かった。Ｇ２／Ｍ停止は、ルナシンでトランスフェクトされた細胞におけるＧ２／Ｍ細胞の比率と、Ｇ２／Ｍ比率の値が互いに統計的に有意には相違しない２つの対照物の平均値との差として計算した(11)。Ｇ２／Ｍ停止とルナシントランスフェクション効率との間に何らかの関係があるか否かを測定するために、２変数を用いて直線回帰グラフを作成し、ピヤソンのプロダクトモーメント相関を計算した。有糸分裂停止とルナシン遺伝子の有効性有意な正の相関があり、ルナシンの発現が分裂しているマウス肝癌細胞の有糸分裂停止をもたらすことを示唆している。即ち、ルナシン遺伝子を活性に分裂している細胞にトランスフェクションする効率を向上させることにより、有糸分裂において停止する細胞の比率を増加させることができる。
【００３５】
細胞分裂を減弱する殆どの抗-有糸分裂薬とは異なり(12)、ルナシンの一過性発現は、有糸分裂停止のみならず、短時間内での細胞溶解及び凝集染色体の破壊も導く。従って、遅いアポトーシス反応の特徴であるＤＮＡ細分化は、ルナシン及びルナシン-delでトランスフェクトされた細胞において、トランスフェクション後２４時間、４８時間及び７２時間にＴＵＮＥＬアッセイ(13)を用いて測定される。ルナシン-delでトランスフェクトされた細胞は、トランスフェクション後２４時間及び４８時間においてアポトーシス反応を示さなかった。一方、ルナシンでトランスフェクトされた細胞の幾つかは、トランスフェクション後２４時間という早期にアポトーシス（黄色蛍光）となった。アポトーシス細胞は、４８時間において変形した細胞モルホロジーを示し、ガラス表面に接着しなかった。７２時間において、ＴＵＮＥＬ試験によって示されたように、凝集した染色体が位相差によって解体及び細分化が開始されたことが見られた。細胞溶解に際して、位相差及びＴＵＮＥＬアッセイで明らかにされたように、染色体は、より小さなＤＮＡ断片にさらに分解された。
【００３６】
ルナシン発現によって生ずる有糸分裂停止は、分裂中期−分裂後期段階において起こり、抗有糸分裂薬に共通の機構である微小管動態の混乱の結果として紡錘糸アセンブリーにおける変化を含んでいることがわかった(12)。同じ機構がルナシンの抗有糸分裂効果に含まれるか否かを測定するため、ルナシン及びルナシン-delでトランスフェクトしたマウス肝癌細胞において、微小管を間接的免疫蛍光標識化によって微小管形成を可視化した(14)。ルナシン-delでトランスフェクトした活性に分裂している細胞の分裂後期において正常な紡錘糸アセンブリーが存在した。これに対して、ルナシンでトランスフェクトした細胞は、４８時間後に、２つの反対の紡錘体プールから発する紡錘糸の異常な拡張を示した。分裂中期及び分裂後期の始めにおける紡錘糸アセンブリーの正常な紡錘形状は、有糸分裂停止細胞では形成せず、紡錘糸は反対の中心小体から誤整列方向に突出した。トランスフェクション後７２時間において、拡張した紡錘糸はまだ無傷であり、異常に大きな細胞の長さに及ぶことがわかったが、細胞の中間部は既に溶解を開始していた。これら溶解細胞における染色体ＤＮＡを可視化するために、ヨウ化プロピジウムを免疫蛍光標識化反応に添加した(14)。分裂中期段階で停止したルナシンでトランスフェクトされた細胞は、染色体量が一つの中心小体近傍で異方的に局在化するが、幾つかの染色体は反対の極に泳動し、溶解細胞から漏洩することが明らかとなった。
【００３７】
最終的にアポトーシスを導く有糸分裂の間の異常な紡錘糸モルホロジー及び異常な染色体運動は、ルナシンの微小管動態への影響及びその染色体ＤＮＡへの結合に基づいて、ルナシンでトランスフェクトされた細胞における２つのモデルを示唆している。抗有糸分裂及び負に荷電したポリアスパラギン酸カルボキシ末端の欠失に対する細胞毒性効果の喪失は、ルナシンの抗有糸分裂効果が、細胞分裂機構との静電的相互作用を含むことを示唆している。
【００３８】
ビンブラスチン、コルシチン、ノコダゾール及びタキソールなどの抗有糸分裂薬による有糸分裂停止の機構は、これらの化合物の微小管の正末端への結合を含み、紡錘体微小管動態の混乱を導く(12)。ビンブラスチン、コルチシン及びノコダゾールは、高濃度で微小管を脱重合するが、タキソールは重合を促進し、微小管解体を阻害して有糸分裂中の紡錘体機能を阻止する(12)。しかし、これらの化合物とは異なり、高い酸性カルボキシ末端を持つルナシンは、微小管への直接結合は見られないが（即ち、チューブリンの酸性Ｃ末端領域を介する）、その微小管結合タンパク質（ＭＡＰ）との結合を通して間接的に微小管動態に影響しうる。ラット脳微小管でのインビトロ発現は、大きな分子量の合成酸性アミノ酸ポリマーが、静電的相互作用を介して塩基性のチューブリン結合領域に結合できることを示した(15)。非ニューロン哺乳動物細胞ＭＡＰは、有糸分裂運動、ダイニン及びキネシン(16)、並びに微小管アセンブリー及びインビボ安定性を向上させるＭＡＰ４を含むが(17)、そのインビボでの微小管からの離脱は、有糸分裂中の細胞変化を生じない(18)。しかしながら、負に荷電したルナシンのこれら運動タンパク質の正に荷電した微小管結合部位への競合的結合による微小管に結合しているダイニン及びキネシンの可能な阻害(16)は、ルナシンでトランスフェクトされた細胞における有糸分裂中の染色体の異常な動き及び異方的分布によるものであろう。
【００３９】
細胞溶解後のＧＦＰ蛍光画像から、ルナシンがいまだに細分化染色体、最も可能性のあるのは染色体を構成する高度に塩基性のヒストンタンパク質との複合体の形成を通して結合している。この有糸分裂停止のモデルでは、分裂前中期におけるルナシン−クロマチン−ＤＮＡ複合体の形成が、微小管の正末端の染色体への結合、特に動原体の異種染色体化領域での結合を阻害し、よって染色体の分裂中期プレートへの会合を阻害する。また、誤整列した紡錘体配向も、紡錘糸が動原体に双極性結合を形成できず、それにより紡錘体張力(19)及び続いて分裂中期における紡錘糸アセンブリーの正常な紡錘形状(20)の形成が阻害されることを示している。また、観察された拡張した紡錘糸は、紡錘体微小管の動原体への非結合の結果でもあり得る。このことは、分裂中の動原体微小管の正常な動態の混乱によって生ずる連続的な微小管重合及び微小管解体の阻害の結果であり得る。
【００４０】
マウス肝癌細胞におけるルナシン発現による細胞分裂混乱の性質は、その効果が特定の細胞型に特異的である必要はないことを示している。他の活性に分裂する細胞においても同様な抗有糸分裂効果が生ずるか否かを試験するために、ルナシン及びルナシン-delｐＥＧＦＰ-Ｃ１構築物を、ヒト乳癌細胞（ＭＣＦ−７）(22)にトランスフェクトし、ＴＵＮＥＬアッセイを行ってアポトーシスを検出した(13)。ルナシン-delでトランスフェクトされたＭＣＦ−７細胞は、トランスフェクション後４８時間において、異常な細胞分裂もアポトーシスも示さなかった。これに対して、ルナシンでトランスフェクトされた細胞では、トランスフェクション後４８時間において、有糸分裂におけるＤＮＡ細分化及び異常な染色体挙動が観察された。マウス肝癌細胞におけるのと同様に、ヒト乳癌細胞でのルナシン発現も、細胞溶解、染色体細分化及びアポトーシスをもたらした。マウス肝癌細胞及びヒト乳癌細胞でのルナシンの抗有糸分裂効果に関連するアポトーシス反応は、Ｔ４７Ｄ（ヒト乳癌細胞株）のタキソール及びノコダゾールに対する通常は迅速な反応に類似し、この細胞株の有糸分裂紡錘体阻害剤に対する感受性は、動原体におけるヒト有糸分裂チェックポイントタンパク質であるｈｓＭＡＤ２の低下したレベルに帰せられる。
【００４１】
同様な有糸分裂の混乱が、ルナシン及びアリシン欠失変異ペプチド（ルナシン-del-n及びアリシン-del-n）及びルナシン／アリシン様合成ペプチド（Ｇｍ２Ｓ−１-syn-n）の大きなパネルを用いて観察された。これら哺乳動物研究における例示的な活性ルナシン-delペプチドは、以下の物を含む（再び、Ｎ→Ｃ命名反転を用いる）：
ルナシン-del-1: ＭＲＧ−配列番号:2の残基57-64融合タンパク質
ルナシン-del-2: α-チューブリン−配列番号:2の残基54-64融合タンパク質
ルナシン-del-3: β-チューブリン−配列番号:2の残基48-63融合タンパク質
ルナシン-del-4: ＭＡＰ２−配列番号:2の残基26-64融合タンパク質
ルナシン-del-5: Mapmodulin− 配列番号:2の残基57-64融合タンパク質
ルナシン-del-6: ＧＦＰ−配列番号:2の残基54-64融合タンパク質
ルナシン-del-7: ＭＡＰ４−配列番号:2の残基44-63融合タンパク質
ルナシン-del-8: ＦＬＡＧＧ−配列番号:2の残基30-64融合タンパク質
ルナシン-del-9: CYCLIN A−配列番号:2の残基57-64融合タンパク質
ルナシン-del-10: CYCLIN B1-配列番号:2の残基54-64融合タンパク質
ルナシン-del-11: CYCLIN B2-配列番号:2の残基40-63融合タンパク質
ルナシン-del-12: CYCLIN B3-配列番号:2の残基34-64融合タンパク質
ルナシン-del-13: SH2-オクタ−アスパラギン酸融合タンパク質
ルナシン-del-14: SH3-オクタ−アスパラギン酸融合タンパク質
ルナシン-del-15: 配列番号:2の残基48-55-MRG-オクタ-アスパラギン酸融合タンパク質
ルナシン-del-16: 配列番号:2の残基48-55-配列番号:2の残基48-55-オクタ-アスパラギン酸融合タンパク質
ルナシン-del-17: MRG-テトラ-アスパラギン酸-テトラ グルタミン酸融合タンパク質
ルナシン-del-18: 配列番号:2の残基48-55-オクタ-グルタミン酸融合タンパク質
ルナシン-del-19: 配列番号:2の残基1-21-MRG-デカ-グルタミン酸融合タンパク質
ルナシン-del-20: 配列番号:2の残基48-55-配列番号:2, 残基48-55-テトラ-アスパラギン酸-テトラ-グルタミン酸融合タンパク質
【００４２】
これらの哺乳動物研究における活性アリシン-delペプチドの例は以下の物を含む：
アリシン-del-1: ＭＲＧ−配列番号:2の残基84-91融合タンパク質
アリシン-del-2: α-チューブリン−配列番号:2の残基82-92融合タンパク質
アリシン-del-3: β-チューブリン−配列番号:2の残基123-130融合タンパク質
アリシン-del-4: ＦＬＡＧＧ−配列番号:2の残基120-132融合タンパク質
アリシン-del-5: ＧＦＰ−配列番号:2の残基84-91融合タンパク質
アリシン-del-6: Mapmodulin−配列番号:2の残基82-92融合タンパク質
アリシン-del-7: ＭＡＰ２−配列番号:2の残基123-130融合タンパク質
アリシン-del-8: ＭＡＰ４−配列番号:2の残基120-132融合タンパク質
アリシン-del-9: CYCLIN A−配列番号:2の残基84-91融合タンパク質
アリシン-del-10: CYCLIN B1−配列番号:2の残基82-92融合タンパク質
アリシン-del-11: CYCLIN B2−配列番号:2の残基123-130融合タンパク質
アリシン-del-12: CYCLIN B3−配列番号:2の残基120-132融合タンパク質
アリシン-del-13: ＳＨ２−配列番号:2の残基84-91融合タンパク質
アリシン-del-14: ＳＨ３−配列番号:2の残基82-92融合タンパク質
【００４３】
これらの哺乳動物研究の活性なＧｍ２Ｓ−１-synペプチドの例には以下の物が含まれる：
Gm2S-1-syn-1: MRG-オクタ-アスパラギン酸融合タンパク質
Gm2S-1-syn-2: α-チューブリン-テトラ-アスパラギン酸-テトラ-グルタミン酸融合タンパク質
Gm2S-1-syn-3: β-チューブリン-ノナ-アスパラギン酸融合タンパク質
Gm2S-1-syn-4: FLAGG-デカ-アスパラギン酸融合タンパク質
Gm2S-1-syn-5: GFP-オクタ-グルタミン酸融合タンパク質
Gm2S-1-syn-6: MAP2-ノナ-グルタミン酸融合タンパク質
Gm2S-1-syn-7: Mapmodulin-デカ-グルタミン酸融合タンパク質
Gm2S-1-syn-8: CYCLIN A-テトラ（アスパラギン酸-グルタミン酸）融合タンパク質
Gm2S-1-syn-9: CYCLIN B1-トリ（アスパラギン酸-グルタミン酸-アスパラギン酸）融合タンパク質
Gm2S-1-syn-10: CYCLIN B2-デカ-（グルタミン酸-アスパラギン酸）融合タンパク質
Gm2S-1-syn-11: CYCLIN B3-テトラ-グルタミン酸-テトラ-アスパラギン酸融合タンパク質
Gm2S-1-syn-12: SH2-テトラ-（グルタミン酸-アスパラギン酸-グルタミン酸）融合タンパク質
Gm2S-1-syn-13: SH3-トリ-グルタミン酸-ペンタアスパラギン酸融合タンパク質
【００４４】
ペプチドは、他の幾つかの代替的導入方法で有糸分裂の混乱を示し、それらは、直接媒質取り込み、洗浄剤（例えばＴｗｅｅｎ２０等）、グアニジン塩等を含むカオトロピック剤により促進された取り込み、パルス状の電場、リポソーム融合等を含む。あるいは、ペプチドは、標的細胞内での発現により直接導入される。このような発現は、一過的に又は安定に導入されたペプチドコード遺伝子のアップレギュレーションにより有効化される。
【００４５】
活性は、広範な他の試験した細胞、特に病原細胞型において見られた。ルナシン-del型及びルナシン-syn-1-12を含むペプチドでの有糸分裂混乱を示した細胞の例は以下の物を含む：以下を含む形質転換された哺乳動物細胞：ATCC No: CRL-1435: PC-3; HTB-81: DU 145; HB-11430: 9H10-A4; HB-9119: P25.48; HB-9120: P25.91; CRL-2220: CA-HPV-10; HB-9140: P25.15; CRL-1740: LNCaP クローン; CRL-10995: LNCaP-FGC; HB-8279: T16; CRL-7535: Hs 804.Sk; CRL-2221: PZ-HPV-7; CRL-5813: NCI-H660; CRL-2222: YPEN-1; HB-8428: S27; HB-10494: 7E11C5; HB-8051: F5-A-1/22.8.13; HB-8525: RLSD09; HB-8527: RLSD06 及び CRL-7930: IK-15;以下を含む骨髄腫細胞：ATCC No: TIB-98: RDP 45/20; TIB-157: LS 136; HB-88: Bet-2; HB-43: 1410 KG7; HB-45: 141PF11; HB-100: Bet-1; HB-121: E5BB3IIA2; TIB-132: 80 V 5B4 CRL-1869: 6F4C5; TIB-17: XS63; HB-128: 2E.6; HB-9762: NUH-2; TIB-194: 2F.11.15; TIB-109: N-S.8.1; HB-8478: C-2; HB-8479: LA-5; HB-8480: LA-4; HB-8481: Re-2; HB-8482: Re-1; HB-8705: L21-6;以下を含む肝癌細胞：ATCC No: CRL-7549: Hs 817.T; HB-8065: Hep G2; CRL-7930: IK-15; CRL-7929: IK-6; CRL-7454: Hs 715.K; CRL-6504: VX7; CRL-7721: MB 157; HB-8431: ME 195; HB-8411: MF116; CRL-7369; Hs 607.T; CRL-7758: TE 206.T; CRL-7192: Hs 227.T; HB-8410: MF61; CRL-7335: Hs 566(A).T; CRL-7211: Hs 249.T; CRL-7214: Hs 257.T; CRL-7833: Hs 172.T; CRL-7870: Hs 740.T; CRL-7139: Hs 187.T; CRL-7159: Hs 200.T; 以下を含む結腸癌細胞：ATCC No: CRL-7214: Hs 257.T; CRL-7168: Hs 207.T; CRL-7892: Hs 844.T; CRL-7423: Hs 682.T; CRL-7884: Hs 785.T; CRL-7351: Hs 586.T; CRL-7139: Hs 187.T; CRL-7159: Hs 200.T; CRL-7202: Hs 237.T; CRL-7399: Hs 674.T/cc; CRL-7184: Hs 219.T; CRL-7213: Hs 225.T; CRL-7207: Hs 241.T; CRL-7172: Hs 210.T; CRL-7352: Hs 587.Int; CRL-7376: Hs 614.T; CRL-7179: Hs 217.T; CRL-7456: Hs 722.T; CRL-7435: Hs 698.T; CCL-220: COLO 320DM;以下を含む癌細胞：ATTC No: CRL-7439: Hs 700.Sk; CCL-200: CCD-13Lu; CRL-1677: IA-XsSBR; HB-8779: AS 33; CRL-1837: SU.86.86; HB-8059: 1116-NS-19-9; CRL-1687: BxPC-3; HB-11028: 100-310; CRL-2133: DSL-6B/C1; CRL-2172: SW 1990; CRL-2132: DSL-6A/C1; HTB-134: Hs 766T; HTB-80: Capan-2; CRL-2141: TGP47; CRL-2136: TGP49; CRL-1997: HPAF-II; HTB-79: Capan-1; CRL-1674: ARIP; CRL-1918: CFPAC-1; CCL-91: BF-2;以下を含む白血病細胞：ATTC No: CRL-8012: FL74-UCD-1; TIB-57: T27A; TIB-58: D2N; TIB-55: BB88; TIB-56: D1B; CRL-6070: R2LBLN; CRL-6047: 2LBLN; CRL-6048: 3LBLN; CRL-6049: 5LBLN; CRL-6050: 6LBLN; CRL-6045: 2FLB.Ln n; TIB-192: M1; CRL-6039: FB3.Thy; CRL-6046: LBLN; CRL-6038: FB3.Ln; TIB-59: BC16A; TIB-60: BC3A; CRL-10423: JM1; CRL-6359: JLS-V5; CRL-7739: TE90.Sk;下記を含む骨肉腫細胞：ATTC No: CRL-7134: Hs 184.T; CRL-6114: FC95.Thy; CRL-7780: TO 203.T; CRL-7943: T1-73; CRL-7783: HT 728.T; CRL-7722: マーフィー; CRL-7765: TE 417.T; CRL-7135: Hs 185.T; CRL-7628: Hs 890.T; CRL-7764: TE 415.T; CRL-7766: TE 418.T; CRL-7626: Hs 889.T; CRL-7606: Hs 870.T; CRL-7922: F1-73; CRL-7520: Hs 792(A); CRL-7010: Hs 13.T; CRL-7823: Hs 14.T; CRL-7521: Hs 792(B); CRL-7140: Hs 188.T; CRL-7263: Hs 387.T;以下を含む黒色腫細胞：ATTC No: CRL-1676: WM-266-4; CRL-1585: C32; CRL-1424: G-361; HB-8672: WI-MN-1; CRL-7360: Hs 600.T; HB-9348: NR-ML-06; CRL-7357: Hs 597.T; CRL-7637: Hs 895.T; CRL-1675: WM-115; CRL-7299: Hs 432.T; CRL-9607: HMCB; CCL-53.1: クローン M-3; CRL-7568: Hs 834.T; CRL-7687: Hs 936.T; CRL-7572: Hs 839.T; CRL-1980: COLO 829BL; CRL-7597: Hs 862.T; CRL-7375: Hs 613.Sk; CRL-7686: Hs 936.T; HB-9349: NR-ML-03;以下を含む網膜芽腫細胞：ATTC No: HTB-18: Y79; TIB-198: PI 153/3; HTB-169: WERI-Rb-1; CCL-2: HeLa; HTB-31: C-33 A; CCL-2.3; CRL2207: PA317LXSN6E7; CRL2205: PA317LXSN16E7; CRL-5804: NCI-H187; HTB-32: HT-3; CRL-5811: NCI-H526; CRL-5809: NCI-N417;以下を含む肺癌細胞：ATTC No: HB-10807: 741F8-2B9; HB-10811: 452F2-1B2; CRL-7034: Hs 54.T; HB-8630: ハイブリドーマ 23; CRL-7789: HT 762.T; CRL-7369: Hs 607.T; CRL-7853: Hs 631.T; CRL-7940: SW527; CRL-7335: Hs 566(A); CRL-7368: Hs 606; CRL-7145: Hs 190.T; CRL-7277: Hs 402.T; CRL-7365: Hs 605.T; CRL-7484: Hs 743.T; CRL-7574: Hs 841.T; CRL-7584: Hs 851.T; CRL-7596: Hs 861.T; CRL-7208: Hs 243.T; CRL-7212: Hs 252.T; CRL-7236: Hs 319.T; 以下を含む皮膚癌細胞：ATTC No: CRL-7360: Hs 600.T; CRL-7779: TO 175.T; CRL-7357: Hs 597.T; CRL-7043: Hs 63.T; CRL-7299: Hs 432.T; CRL-7233: Hs 295.T; CRL-7590: Hs 854.T; CRL-7572: Hs 839.T; CRL-7314: Hs 523.Sk; CRL-7597: Hs 862.T; CRL-7781: HT 295.T; CRL-7630: Hs 892.T; CRL-7686: Hs 936.T; CRL-7658: Hs 908.Sk; CRL-7898: A101D; CRL-7762: TE 354.T; CRL-7641: Hs 898.T; CRL-7102: Hs 156.T; CRL-7677: Hs 925.T; CRL-7806: Hs 456.T;以下の癌細胞：ATTC No: CRL-7786: HT 756.Lu; CRL-7588: Hs 853.T; CRL-7380: Hs 618.T; CRL-7194: Hs 229.T; CRL-7209: Hs 246.T; CRL-7621: Hs 887.T; CRL-7455: Hs 717.T; CRL-7619: Hs 887.Lu; CRL-7217: Hs 266.Pe; CRL-7220: Hs 272.Pe; CRL-7796: HT 824.Pe; CRL-7873: Hs 750.T; CCL-199: HLF-a; CRL-7228: Hs 284.Pe; CRL-7906: A427; CRL-1642: LL/2; CRL-1453: KLN 205; CCL-185: A549; CCL-200: CCD-13Lu; HB-8628: L18。
【００４６】
ルナシンは、その遺伝子がクローニングされた最初の抗有糸分裂ペプチドである。このことは、遺伝子が哺乳動物癌細胞で発現されたときに、その抗有糸分裂及びアポトーシス誘発効果を顕現させ、その結果癌細胞における抗有糸分裂剤の一時的かつ高い局所濃度をもたらす。さらに、それは細胞接着モチーフＲＧＤも含み、それにより、腫瘍細胞が細胞外マトリクスに接着する(24)。このモチーフを含む合成及び組み換えペプチド類似物は、細胞外マトリクスへの競合的接着により腫瘍細胞の転移を防止する(25)。ルナシンは、抗癌原性が見いだされているダイズ種子タンパク質の水溶性及び低分子量分画から単離された(26)。以前のデータと合わせて、このことは、ＲＤＧモチーフを持つルナシンの適当な細胞外適用が転移並びに腫瘍成長を阻害できることを示している。
【００４７】
実施例５．インシトゥにおける前立腺癌細胞有糸分裂機能の混乱：遺伝子治療
ＧＦＰのカルボキシ末端に融合したＧｍ２Ｓ−１ペプチドコード領域を含む哺乳動物発現ベクター、ｐＥＦＧＰ−Ｃ１（Clontech）を、リポフェクトアミンにより、３つの細胞株：ＬＮＣａｐ（ホルモン依存性）。ＰＵＣ−３（ホルモン独立性）及びＡＲＣａｐ（ホルモン抑制性、臨床的前立腺癌の発達形態を表現(Zhau HYE, Chang SM, Chen BQ等, 1996, Androgen-repressed phenotype in human prostate cancer, Proc Natl Acad Sci USA 93: 15152-15157)）にトランスフェクトした。実施例４に記載したように、ルナシン-del、ルナシン-del-1-20、アリシン、アリシン-del-1-14及びＧｍ２Ｓ−１-syn-1-13をコードする核酸を含む類似構築物を同様に構築した。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）タグにより、蛍光及び位相差顕微鏡によって組み換え遺伝子を発現しているトランスフェクトされた細胞を選択した。（植物発生生物学に関するＮＳＦセンター, UC Berkeley）。さらに、反転蛍光顕微鏡により、種々のＧｍ２Ｓ−１ペプチドコード構築物を発現している細胞における実時間でのモルホロジー変化を監視した。ウイルスベクターに比較して、ｐＥＧＦＰ−Ｃ１プラスミドベクターでの遺伝子移入効率は低いが、トランスフェクト細胞を容易に選択及び監視できるので、我々は当初このベクターを用いた。このことにより、我々は、フローサイトメトリー（Cancer Reserch Lab, UC Berkeley）細胞サイクル分析を行うことができた。後期アポトーシスの特徴である染色体細分化を、Clontech(Palo Alto, CA)からのＡｐｏＡｌｅｒｔＤＮＡ細分化アッセイキットを用いたＴＵＮＥＬ（末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴＤＴ）媒介ｄＵＴＰニック末端標識化）アッセイで監視した。
【００４８】
基本的な手法は、Zhau等, 1996（上掲）に記載されている。我々が用いた全てのATCCからの前立腺細胞株（ＬＮＣａｐ、ＰＵＣ−３、ＡＲＣａｐ）は、腫瘍原であることが知られている。無胸腺ＢＡＬＢ／Ｃヌード(nu/nu）マウス（６−８週齢）、類似遺伝子近交系（Charles River Breeding Lab）を宿主として用いた。３つの株細胞各々についての安定した株細胞は、種々のＧｍ２Ｓ−１挿入物を含む高収率テトラサイクリン誘発可能なレトロウイルスベクター（Retro-On Retoroviral tet System Vector, Clontech）を用いて産生した。得られたトランスフォームした細胞は、皮下注入（１部位当たり１００ｍｌのＴ媒質中２ｘ１０６）し、腫瘍を毎週監視した。腫瘍容積は、長さｘ幅ｘ高さで計算した。腫瘍形成の初期及び後期段階におけるテトラサイクリンの皮下注入（Clontech法）により、動物に組み換え遺伝子構築物の発現を誘発した。その後、腫瘍サイズを１日おきに監視した。これらの実験からの結果は、記載した構築物では初期も後期も腫瘍容積の有意な減少を示したが、ルナシン-del構築物ではしないことを示した。
【００４９】
実験の第２の組では、Ｇｍ２Ｓ−１ペプチドコード遺伝子を移植された前立腺腫瘍細胞へ導入するのにアデノウイルスベクター（Quantum Biotechnologies Inc. (QBI, Canada)からのAdeno-Quest）を用いた。このレセプター媒介機構は、上皮由来の細胞への有意な正の向性を与え、非分裂細胞及びインシトゥのウイルス細胞接触を介した組織の両方において有効な遺伝子移動を提供した。腫瘍は、上記のように皮下注入して腫瘍成長を監視した３つの前立腺株細胞の各々で、ヌードマウスにおいて発生した。種々のＧｍ２Ｓ−１挿入物を含む組み換え複製を欠くアデノウイルスベクターは、AdenoquestのｐＱＢＩ-ｐＡｄＢＭ５ベクターで構築され増幅された（Adenovirus Expression System, 1997, Quantum Biotechnologies Inc. Laval, Quebec, Canada）。挿入物は、移植ベクターpBQI-pAdBM5にクローニングし、次いで２９３Ａヒト細胞におけるインビボ同種組み換えによりQBI-アデノウイルスＤＮＡに移された。ウイルス粒子は、ダブル塩化セリウム勾配精製により精製した。精製されたウイルス粒子は、次いで、前立腺腫瘍に腹膜経由の多重注入でで導入された（１部位当たり、１０９ｐｆｕを含むＴ媒質５０ｍｌ）。その後、腫瘍サイズを１日おきに注入前に測定した。これらの実験からの結果も、ルナシン-del構築物以外の前記構築物により初期及び後期段階において腫瘍容積が有意に減少することを示した。
【００５０】
実施例６．Ｇｍ２Ｓ−１は抗変異原ペプチドをコードする
ルナシン、アリシン及びＧｍ２Ｓ−１のプロペプチドのコード領域を、細菌性発現ベクターであるｐＦＬＡＦ−１（Kodak/IBI）に結合させた。ルナシン形質転換体を含む細菌性形質転換体は、異常な細菌成長を示し、２−３Ｘ少ないプラスミド（ｐＤＮＡ）を生じた。ルナシンｐＤＮＡをアガロースゲル上に展開し、臭化エチジウム（ＥｔＢｒ）で染色すると、それらはＵＶ光下では見えず、ＯＤの読みを通してｐＤＮＡの存在が確認された。さらに、プロテイナーゼＫで処理してフェノール−クロロホルムで抽出した場合、ｐＤＮＡの伸長形態は、ＥｔＢｒを含む幾つかの介在物を容易に染色する。最後に、ルナシンの末端の９つのアスパラギン酸残基を取り除くと（ルナシン-del）、このペプチドの遮蔽効果は消失する。これらのデータは、ルナシンペプチドがＤＮＡをそのような介在染料等の変異原から保護できることを示す。類似の効果は、実施例５に列挙した哺乳動物細胞型を含む多くの細胞型において、放射性ヌクレオチド、ポリサイクリック炭化水素、ポリ塩化ビフェノールを含む種々の変異原に対する実施例５のルナシン-del-1-20を含む広範なＧｍ２Ｓ−１欠失変異体で見られた。
【００５１】
実施例７．括弧で挿入した参考文献及び備考
1. L.Schweizerら, Pro. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 7070 (1995); R.V.Kowlesら, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 7010 (1985); D. Spencerら, in Commentaries in Plant Science, H.Smith, 編 (Pergamon Press, New York, 1981), pp.175-189.
2. A.J.Hauxwellら, Developmemt 110, 283 (1990).
3. A. da silva Conceicao, E.Krebbers, Plant J 5, 493 (1994).
4. A.F.Galvez, M.J.R. Revilleza, B.O. de Lumen, Plant Gene Register, PGR97-103 in press (1997); Gm2S-1 cDNAのGenbank受付番号: AF005030.
5. S.Odani, T.Koide, T.Ono, J Biol Chem 262, 10502 (1987).
1. 全ＲＮＡは２００−５００ｍｇの発育中の子葉及び葉組織から単離した。Jepsonら, Plt Mol Biol Rept 9, 131 (1991) 。ノーザンブロットは、  Hybond-N膜（Amersham）R.M. Fourneyら, Focus 10, 5 (1988)を用いて調製し、全長Ｇｍ２Ｓ−１コード領域を含む３２Ｐ標識したＰＣＲ断片及び１８ＳｒＲＮＡｃＤＮＡの３２６ｂｐＰＣＲ断片でプローブし、それは各レーンでの全ＲＮＡお等しい負荷を示す内部対照として用いた。６５℃における１５分間の０．５ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＤＳでの最終洗浄を実施し、次いでブロットを、−８０℃で２時間増感スクリーンを持つHyperfilm-MP（Amersham)に露出した後、フィルムを現像した。
7. R.Goldbergら, Science 266, 605 (1994); J.A.Gatehouseら, Phil Trans R Soc Lond 314, 367 (1986); D.H.Meinkeら, Planta 153, 130 (1981).
9. H.P.Erickson, Trends in Cell Biol 7, 362 (1997); H.P.Ericksonら, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 519 (1996); W.Margolin, R.Wang, M.Kumar, J of Bacteriology 178, 1320 (1996).
【００５２】
10. 用いた哺乳動物ベクターはｐＥＧＦＰ-Ｃ１（Clontech）。５’ＨｉｎｄＩＩＩ及び３’ＥｃｏＲＩ部位を持つルナシン及びルナシン-del遺伝子断片を含むＰＣＲ増幅産物は、Ｇｍ２Ｓ−１ｃＤＮＡをテンプレートとして用いたＰＣＲにより作製した。ＰＣＲ産物は、フェノール−クロロホルム抽出を用いて精製し、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩ向性ｐＥＧＦＰベクターにＴ４リガーゼ（Promega）によって結合させる前に、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩで設計した。ｐＥＧＦＰ−Ｃ１構築物は、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ競合細胞の形質転換に用い、ＤＮＡ配列はルナシン及びルナシン-delコード領域のｐＥＧＦＰ−Ｃ１への枠内結合についてのジデオキシ配列（Sequenase）によって確認した。
【００５３】
ネズミ肝癌細胞（Ｈｅｐａ１ｃ１ｃ７）はＡＴＣＣから得た。細胞は、１０ｃｍプレートにコンフルエント（１０７細胞）になるまで完全媒質（ＤＭＥＭ＋１０％ウシ胎児血清）中で成長させた。細胞は、電気泳動を用いたトランスフェクションの前に８０％コンフルエントまで終夜プレートした。細胞は、ＰＢＳ（１．３７ｍＭＮａＣｌ、２．６８ｍＭＫＣｌ、１．４７ｍＭＫＨ２ＰＯ４、８．１ｍＭＮａ２ＨＰＯ４）で洗浄し、３７℃で５分間、１Ｘトリプシン／ＥＤＴＡでのインキュベーションにより収穫し、次いで完全媒質中に４ｘ１０６の密度で再懸濁した。ルナシン及びルナシン-del-ｐＥＧＦＰ-Ｃ１プラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）は、アルカリ性溶解法により単離し、ｐＤＮＡの３０ｇを２０ｌのＰＢＳ中に再懸濁し、０．４ｍｌの細胞懸濁液に添加した。細胞は室温で１０分間インキュベートした後、２ｍｍ間隔の電気泳動キュベットに移した。電気泳動は、電気セルマニピュレータ（ECM 600, Genetronics, Inc.）を用いて、以下のパラメータ：９５０Ｆ容量、７２オーム抵抗及び１３０Ｖ充電圧を使用して行った。フローサイトメトリー分析については、電気泳動パラメータを１００−９５０Ｆ容量、１２０−１５０Ｖ充電圧変化させた。電気泳動した混合物を１５分間インキュベートした後、６０ｍｍプレートにおいて、４ｍｌ完全媒質中の１００ｌをプレートした。ＧＦＰの一過性発現についてアッセイする蛍光顕微鏡については、無菌のカバーガラスをプレート内に配置した。培養時間（４８−８０時間）の最後に、カバーガラスの細胞をＰＢＳで洗浄し、２ｍｌのＰＢＳ／４％パラホルムアルデヒドとともに室温（ＲＴ）で３０分間インキュベートして細胞を固定し、ＰＢＳで２回洗浄した後、カバーガラスを顕微鏡のスライドガラスにＰＢＳ滴とともに置いて観察した。スライド調製において、ＤＮＡ染色用のヨウ化プロピジウム（ＰＩ）をＰＢＳに添加（１０ｎｇ／ｍｌ及び１ｍｇ／ｍｌ）した後、細胞を０．２％ＴritonX-100とともに３０分間氷中でインキュベートして透過性にした。カバーガラスはスライドガラスにゴムセメントで接着した。位相差及び蛍光顕微鏡観察は、ＨＢＯ１００水銀灯及びフルオレセイン（ＦＩＴＣ）（４５０−４９０ｎｍ励起剤）及びテキサスレッド（５３０−５８０ｎｍ励起剤）フィルターキューブを備えたＡｘｉｏｐｈｏｔ顕微鏡（Zeiss）で行った。画像は、Adobe Photoshop及びCanvas(Deneba)ソフトウェアを用いて処理した。
【００５４】
11. ルナシンでトランスフェクトしたネズミ肝癌細胞、及び２つの対照物であるルナシン-del及び電気泳動によるｐＥＧＦＰーＣ１ベクターは、フローサイトメトリー分析のためにトランスフェクション後４８時間に次のようにして調製した：細胞を５０−１００％のコンフルエントでＰＢＳで洗浄し、トリプシン化した。細胞を１．５ｍｌの完全媒質中に再懸濁し、３０００ｒｐｍで３分間遠心分離した。媒質を吸引し、ペレットを１ｍｌの冷ＰＢＳで洗浄した。ペレットを３０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、その後ＰＢＳを吸引により除去した。ペレットは、直ぐに使用しない場合にはー８０℃で貯蔵した。サイトメトリー分析のために、０．５ｍｌのＰＩ溶液（２．５ｍｇヨウ化プロピジウム、５０ｍｇＮａ-クエン酸、５０ｌ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００及び５０ｍｌ蒸留水）をペレットに添加して細胞を再懸濁した。混合物を氷中で３０分間インキュベートし、次いで６ｍｌのポリスチレンチューブ（Falcon, Franklin Lakes, NJ）中の３５ｍ細胞株キャップを通して濾過した。細胞を、Epics XL-MCLフローサイトメーター（Coulter, Miami, FL）でＰＩ及びＧＦＰ染色について分析した。ＰＩ染色についてのフローサイトメトリーのデータは、ＤＮＡ含有量及びマルチサイクルＡＶ（Phoenix Flow Systems）を用いた細胞サイクル分析に用い、細胞分裂のＧ２／Ｍ段階での細胞の比率を測定した。各トランスフェクション実験でのルナシン-del及びｐＥＧＦＰ−Ｃ１でトランスフェクトした細胞におけるＧ２／Ｍでの細胞の比率を、対ｔ−試験（SigmaStat, Jandel）を用いて統計的に比較し、有意な差がないことを見いだした（Ｐ＝０．４４）。各トランスフェクション実験でのルナシンでトランスフェクトした細胞におけるＧ２／Ｍ停止は、次のように計算した：（ＧＦＰ−ルナシンでトランスフェクトした細胞のＧ２／Ｍ）−［(ＧＦＰ−ルナシン-delでトランスフェクトした細胞のＧ２／Ｍ）＋（ｐＥＧＦＰ−Ｃ１でトランスフェクトした細胞のＧ２／Ｍ)］／２。ルナシントランスフェクション効率は、ＧＦＰ蛍光のフローサイトメトリー測定に基づき、蛍光顕微鏡によってトランスフェクトされていない細胞に対するＧＦＰ蛍光細胞の比率を数えることによる。ルナシントランスフェクション効率とＧ２／Ｍ停止との間の線形回帰曲線のフィッティングは、Sigmaplot(Jandel)により作成し、ピアソンのプロダクトモーメント相関係数をSigmaStatを用いて計算した。
【００５５】
12. L.Wilson, M.A.Jordan, in Microtubules, J.Hyams, C.Lloyd, 編. (Wiley-Liss Inc., New York, 1994) pp.59-84; L.Wilson, M.A.Jordan, Curr Biol 2, 569 (1995).
13. ApoAlertＤＮＡ細分化アッセイキット（Clontech）は、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）媒介ｄＵＴＰニック末端標識化（ＴＵＮＥＬ）法 Y. Gavrieliら, J. Cell Biol., 119, 493(1992); A. Facchinettiら, J. Immunol Methods, 136, 1251(1991)に基づく。ＴｄＴは、細分化されたＤＮＡの３’−ヒドロキシ末端にフルオレセイン−ｄＵＴＰを組み込み、蛍光顕微鏡で可視化できる。ルナシン及びルナシン-delでトランスフェクトされたネズミ肝癌細胞は、２４時間−７２時間、プレート中で無菌のカバーガラス内で成長させ、細胞がカバーバラス上まで成長させるようにした。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、次いで４％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳで室温において３０分間固定した。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００とともに氷上で５分間インキュベートして透過性にした。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、次いで１００ｌの平衡バッファー（Clontechキットから）で１０分間室温でカバーした。ＴｄＴ反応混合物をキットに記載されているように調製した。５０ｌのＴｄＴ反応混合物を細胞に加え、暗中、加湿３７℃インキュベータで１時間インキュベートした。２ＸＳＳＣ（２０Ｘ＝３Ｍ ＮａＣｌ、３００ｍＭＮａ−クエン酸）を添加して反応を停止させ、次いでＰＢＳで洗浄した。細胞をＰＩ／ＲＮａｓｅ／ＰＢＳ溶液（０．５ｇ／ｍｌヨウ化プロピジウム、０．５ｇ／ｌＲＮａｓｅ）中で５分間インキュベートして染色した後、カバーガラスをアンチファーデ（１ｍｇ／ｍｌｐ−フェニレンジアミン、１ＸＰＢＳ、９０％グリセロール）を添加することによりスライドガラスに設置し、カバーガラスの縁をゴムセメントで封止した。位相差及び蛍光顕微鏡観察は(10)に記載されているように行った。
【００５６】
14. トランスフェクトしたネズミ肝癌細胞は、(10)に記載されているようにカバーガラスで成長させた。細胞を４％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳで３０分間室温で固定し、ＰＢＳで２回洗浄し、次いで０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００中で氷上で５分間インキュベートして透過性にした。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）／ＰＢＳで３０分間ブロックし、次いで真空除去した。カルボキシ末端チロシン化チューブリンエピトープ（ＹＬ１／２, Sera-lab）に対するラットモノクローナル抗体を１：２００に希釈し、次いで細胞に添加して室温で１時間高湿度でインキュベートした。細胞を３％ＢＳＡ／ＰＢＳで４回洗浄した後、最小交差反応性を持つフルオレセイン標識したロバからの抗ラットＩｇＧ（Jackson Immunoresearch）の１：１００希釈したものを添加し、３０分間インキュベートした。細胞を４回洗浄した後、アンチフェードを持つスライドガラスに設置した。幾つかの細胞調製物は、ＰＩ／ＲＮａｓｅ／ＰＢＳ溶液(13)で５分間染色し、次いで蒸留水で洗浄した後に設置した。蛍光顕微鏡観察は、(10)に記載されているように行った。
【００５７】
15. A.Nakamuraら, J Biochem 106, 93 (1989).
16. G.Woehlkeら, Cell 90, 207 (1997); J.R. McIntosh, in Microtubules, J.Hyams, C.Lloyd, 編. (Wiley-Liss Inc., New York, 1994) pp.413-434.
17. N.Hirokawa, Curr Opin Cell Biol 6, 74 (1994).
18. X.M.Wangら, J Cell Biol 132, 345 (1９９６）．
１９．  Ｒ．Ｂ．Ｎｉｋｌａｓ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７５，  ６３２  （１９９７）．
２０．  Ａ．Ａ．Ｈｙｍａｎ，  Ｅ．Ｋａｒｓｅｎｔｉ，  Ｃｅｌｌ  ８４，  ４０１  （１９９６）．
２１．  Ｌ．Ｄ．Ｂｅｌｍｏｎｔ，  Ｔ．Ｊ．Ｍｉｔｃｈｉｓｏｎ，  Ｃｅｌｌ  ８４，  ６２３  （１９９６）．
２２．  ＊＊＊
２３．  Ｙ．Ｌｉ，  Ｒ．Ｂｅｎｅｚｒａ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７４，  ２４６  （１９９６）．
２４．  Ｅ．Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ，  Ｍ．Ｄ．Ｐｉｅｒｓｃｈｂａｃｈｅｒ，  Ｃｅｌｌ  ４４，  ５１７  （１９８６）；  Ｋ．Ｒ．Ｅｌｙら, Protein Engineering 8, 823 (1995).
25. I.Hardnら, J Cancer 55, 1023 (1993); J.Murata, I.Saiki Jap J Clin Med 53, 1653 (1995); S.K.Akiyamaら, Cancer Metastasis Reviews 14, 173 (1995).
２６．  Ａ．Ｒ．Ｋｅｎｎｅｄｙ，  Ｊ  Ｎｕｔｒ  １２５：  ７３３Ｓ  （１９９５）；  Ｊ．Ｙａｖｅｌｏｗら, Proc Natl Acad Sc
i USA 82, 5395 (1985).
【配列表】
0003818850.tif 000002
0003818850.tif 000003