(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
実質的に培養後期において、発酵槽の気相中の二酸化炭素分圧を約０．１０atm以下に維持しながらセルロース生産菌を培養してセルロース性物質を製造する方法。
【請求項２】
培養液中のセルロース性物質の濃度が約１０g/L以上に増加した生育減衰期及び定常期において、発酵槽の気相中の二酸化炭素分圧を約０．１０atm以下に維持しながらセルロース生産菌を培養してセルロース性物質を製造する方法。
【請求項３】
１０（rad/s）又は１（1/s）における培養液の見かけ粘度が約１０（Pa・S）以上、又はレオロジーがPower lawモデルに従うと見做したときのＫ値（consistency index）が約１０（Pa・Sn）以上に増加した生育減衰期及び定常期において、発酵槽の気相中の二酸化炭素分圧を約０．１０atm以下に維持しながらセルロース生産菌を培養してセルロース性物質を製造する方法。
【請求項４】
培養液の酸素要求量が約３５mmol/L・hr以上に増加した生育減衰期及び定常期において、発酵槽の気相中の二酸化炭素分圧を約０．１０atm以下に維持しながらセルロース生産菌を培養してセルロース性物質を製造する方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、培養の或る段階に於いて、発酵槽の内圧を一定の値以上に維持し、又は気相中の二酸化炭素濃度を一定の値以下に維持しながら、セルロース性物質を生産する能力を有する微生物（以下、「セルロース生産菌」という。）に属する菌体を用いるセルロース性物質（以下、「バクテリアセルロース」又は「ＢＣ」という。）を製造する方法に関する。
背景技術
ＢＣ（バクテリアセルロース）は可食性であり食品分野で利用されるほか水系分散性に優れているので食品、化粧品又は塗料等の粘度の保持、食品原料生地の強化、水分の保持、食品安定性向上、低カロリー添加物又は乳化安定化助剤としての産業上利用価値がある。
ＢＣは木材パルプ等から製造されるセルロースに較べ、フィブリルの断片幅が２ケタ程度も小さいことを特徴とする。
従って、ＢＣの離解物はミクロフィブリルのかかる構造的物理的特徴に基づき高分子、特に水系高分子用補強剤として各種の産業用用途がある。このようなセルロース性離解物を紙状または固型状に固化した物質は高い引張弾性率を示すのでミクロフィブリルの構造的特徴に基づくすぐれた機械特性が期待され、各種産業用素材としての応用がある。
ＢＣの製造方法に関しては、特開昭６２−２６５９９０号、特開昭６３−２０２３９４号及び特公平６−４３４４３号等にＢＣの製造方法に関する記載がある。
セルロース生産菌の培養を行なう際に適当とされている栄養培地としては、炭素源、ペプトン、酵母エキス、燐酸ナトリウム及びクエン酸からなるSchramm／Hestrin培地（Schrammら、J. General Biology, 11, pp.123〜129, 1954）が知られている。また、このような栄養培地に、培地中の特定栄養素によるセルロース生成促進因子である、イノシトール、フィチン酸及びピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）（特公平５−１７１８号公報；高井光男，紙パ技協誌，第４２巻，第３号，第２３７〜２４４頁）等を添加したり、更には、カルボン酸又はその塩（特願平５−１９１４６７号）、インベルターゼ（特願平５−３３１４９１号）及びメチオニン（特願平５−３３５７６４号）を添加することによって、セルロース性物質の生産性が向上することが見い出されている。又、特定の範囲の酸素移動容量係数（ｋLａ）の条件下でセルロース生産菌を培養する方法も提案されている（特願平７−３１７８７号）。
また、従来より、微生物を培養する培養形式としては、静置、振盪もしくは通気攪拌培養等が用いられてきた。また、培養操作法としては、いわゆる回分発酵法、流加回分発酵法、反復回分発酵法及び連続発酵法等が使用されてきた。
尚、攪拌手段としては、例えばインペラー（攪拌羽根）、エアーリフト発酵槽、発酵ブロスのポンプ駆動循環、及びこれら手段の組合せ等が使用されている。
インペラーの種類としては、門型羽根、タービン羽根、ヘリカルリボン羽根及びスクリュー羽根等が知られている。
さて、微生物の培養において発酵槽の内圧を高めることによって、培養液への酸素供給を高めて生産性を改善する方法が一般的に行われている。
これらの効果は内圧の上昇に比例して気相中の酸素分圧が上昇し、その分圧上昇に比例して次式に従って酸素移動が高まるためである。
ｄＣL／ｄｔ＝ｋLａ（Ｃ*−ＣL）＝ＨｋLａ（ＰG−ＰL）
ｄＣL／ｄｔ：  酸素移動速度（mmol／Ｌ・hr）
ｋLａ：  酸素移動容量係数（hr-1）
ＣL  ：  培養液中の溶存酸素濃度（mmol／Ｌ）
Ｃ*  ：  気泡の酸素分圧と平衡な溶存酸素濃度（mmol／Ｌ）
Ｈ   ：  ヘンリー定数
ＰG  ：  気相中の酸素分圧（加圧すると高まる）
ＰL  ：  液相中の酸素分圧
ところが、ＢＣの生産における発酵槽の内圧の効果はこれまで、未だ明らかにされていない。
ＢＣの生産においては、ＢＣ濃度が高まると培養液の粘度が上昇して培養液中への酸素移動が困難になり、所要の酸素供給を確保するためには攪拌速度や通気量を高めるなどの対処が必要となる。しかしこれらの方法では多くの動力が必要となり、経済的でない。そこでこれまで酸素要求量を充足させるために、攪拌羽根の形状の改善、発酵槽形状の改善などが行われて来た（特願平７−３１７８７号）。しかしながら、発酵槽内の加圧によって酸素供給量を確保することができるかどうかに関しては未だ詳細には検討されていない。
本発明者らは、特別な設備を必要とせずに容易に実施できる発酵槽内の加圧による酸素供給の向上を目的として検討した結果、ある特定な条件において加圧することによって、予想外にも、酸素供給を確保するための攪拌に要する所要動力を大幅に低減することが可能なことを見いだした。
又、これまで培養中の二酸化炭素の濃度がＢＣの生産性に与える影響についての報告はなく、今回、本発明者等は、発酵槽の気相中の二酸化炭素の分圧を一定以下の値に維持することによってＢＣの生産速度及び収率が向上することを見出した。
本発明は、これらの知見に基づいてなされたものである。
発明の開示
即ち、本発明は、一般に培養後期（生育減衰期及び定常期）に於いて、即ち、培養液中のセルロース性物質の濃度が約１０ｇ／Ｌ以上、好ましくは約１２ｇ／Ｌ以上に増加した段階、又は１０(rad/s）、または１(1/s）における培養液の見かけ粘度が約１０（Pa・S）以上、またはレオロジーがPower lawモデルに従うと見做したときのＫ値(consistency index）が約１０（Pa・Sn）以上に増加した培養段階、又は培養液の酸素要求量が約３５mmol/L・hr以上の段階に於いて、発酵槽の内圧を約１．１kg/cm2Ａ以上、好ましくは約１．２kg/cm2Ａ以上、より好ましくは約１．５kg/cm2Ａ以上に維持しながらセルロース生産菌を培養してセルロース性物質を製造する方法に係わる。
尚、ここで「発酵槽の内圧」とは、大気圧を１kg/cm2Ａとしたときの発酵槽内の気相部分の圧力である。
本発明において、上記特定の段階に限定せずに、培養の全過程を通して、発酵槽内の圧力を所定の値以上に維持することもできる。
発酵槽の内圧を所定の加圧状態に維持するには、当業者には周知の方法、例えば、排気弁を調整する等の極めて簡便な手段によって実施することができる。
又、本発明は、発酵槽の気相中の二酸化炭素分圧を約０．１０atm以下、好ましくは０．０８atm以下に維持しながらセルロース生産菌を培養してセルロース性物質を製造する方法に係わる。二酸化炭素の分圧を維持する段階は、上述の培養後期が一般に好ましいが、培養の全過程を通して維持することもできる。
二酸化炭素の分圧を一定値以下に維持する具体的な方法としては、例えば、発酵槽への通気量を増加させる方法、及び気相を二酸化炭素の吸収塔に循環させる方法等がある。
更に、発酵槽の内圧を上記一定値以上に維持すると同時に、気相中の二酸化炭素の分圧を上記一定値以下に維持するとより好ましい。
又、本発明方法を実施するに際しては、前述の培養形式・培養操作法に加えて、特願平６−１９２２８７号に記載されている「培養装置と浮上分離装置及びエッジフィルター等の分離装置の間で菌体を含む培養液を循環させるセルロース性物質の製造方法であって、該分離装置に於いて、生産物であるセルロース性物質を菌体及び培養液から分離することを特徴とする、前記方法」を採ることもできる。
本発明において使用されるセルロース生産菌は、例えば、ＢＰＲ２００１株に代表されるアセトバクター・キシリナム・サブスピーシーズ・シュクロファーメンタンス（Acetobacter xylinum subsp. sucrofermentans）、アセトバクター・キシリナム（Acetobacter xylinum）ＡＴＣＣ２３７６８、アセトバクター・キシリナムＡＴＣＣ２３７６９、アセトバクター・パスツリアヌス（A. pasteurianus）ＡＴＣＣ１０２４５、アセトバクター・キシリナムＡＴＣＣ１４８５１、アセトバクター・キシリナムＡＴＣＣ１１１４２及びアセトバクター・キシリナムＡＴＣＣ１０８２１等の酢酸菌、その他に、アグロバクテリウム属、リゾビウム属、サルシナ属、シュードモナス属、アクロモバクター属、アルカリゲネス属、アエロバクター属、アゾトバクター属及びズーグレア属並びにそれらをＮＴＧ（ニトロソグアニジン）等を用いる公知の方法によって変異処理することにより創製される各種変異株である。
尚、ＢＰＲ２００１株は、平成５年２月２４日に通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所特許微生物寄託センターに寄託され（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１３４６６）、その後１９９４年２月７日付で特許手続上の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に基づく寄託（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−４５４５）に移管されている。
ＮＴＧ等の変異剤を用いての化学的変異処理方法には、例えば、Bio Factors, Vol. 1, p.297−302（1988)及びJ. Gen. Microbiol, Vol. 135, p.2917−2929（1989）等に記載されているものがある。従って、当業者であればこれら公知の方法に基づき本発明で用いる変異株を得ることができる。また、本発明で用いる変異株は他の変異方法、例えば放射線照射等によっても得ることができる。
本発明の製造方法に用いる培地の組成物中、炭素源としてはシュクロース、グルコース、フラクトース、マンニトール、ソルビトール、ガラクトース、マルトース、エリスリット、グリセリン、エチレングリコール、エタノール等を単独或いは併用して使用することができる。更にはこれらのものを含有する澱粉水解物、シトラスモラセス、ビートモラセス、ビート搾汁、サトウキビ搾汁、柑橘類を始めとする果汁等をシュクロースに加えて使用することもできる。また、窒素源としては硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩、硝酸塩、尿素等有機或いは無機の窒素源を使用することができ、或いはＰｅｐｔｏｎｅ、Ｓｏｙｔｏｎｅ、Ｙｅａｓｔ−Ｅｘｔｒａｃｔ、大豆加水分解物などの含窒素天然栄養源を使用してもよい。有機微量栄養素としてアミノ酸、ビタミン、脂肪酸、核酸、２，７，９−トリカルボキシ−１Ｈピロロ〔２，３，５〕−キノリン−４，５−ジオン、亜硫酸パルプ廃液、リグニンスルホン酸等を添加してもよい。
生育にアミノ酸等を要求する栄養要求性変異株を使用する場合には、要求される栄養素を補添することが必要である。無機塩類としてはリン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガン塩、コバルト塩、モリブデン酸塩、赤血塩、キレート金属類等が使用される。
更に、前述のセルロース生成促進因子を適宜培地中に添加することもできる。例えば、酢酸菌を生産菌として用いる場合には、培養のｐＨは３ないし７に、好ましくは５付近に制御する。培養温度は１０〜４０℃、好ましくは２５〜３５℃の範囲で行う。培養装置に供給する酸素濃度は１〜１００％、望ましくは２１〜８０％であれば良い。これら培地中の各成分の組成割合及び培地に対する菌体の接種等は培養方法に応じて当業者が適宜選択し得るものである。
本発明の方法によって製造されるＢＣは、菌体をそのまま残して回収してもよく、さらに本物質中に含まれる菌体を含むセルロース性物質以外の不純物を取り除く処理を施すことが出来る。
不純物を取り除くためには、水洗、加圧脱水、希酸洗浄、アルカリ洗浄、次亜塩素酸ソーダ及び過酸化水素などの漂白剤による処理、リゾチームなどの菌体溶解酵素による処理、ラウリル硫酸ソーダ、デオキシコール酸などの界面活性剤による処理、常温から２００℃の範囲の加熱洗浄などを単独及び併用して行い、セルロース性物質から不純物をほぼ完全に除去することができる。
このようにして得られた本発明でいうセルロース性物質とは、セルロース及び、セルロースを主鎖としたヘテロ多糖を含むもの及びβ−１，３、β−１，２等のグルカンを含むものである。ヘテロ多糖の場合のセルロース以外の構成成分はマンノース、フラクトース、ガラクトース、キシロース、アラビノース、ラムノース、グルクロン酸等の六炭糖、五炭糖及び有機酸等である。
尚、これ等の多糖が単一物質である場合もあるし２種以上の多糖が水素結合等により混在してもよい。
粘度の測定方法
粘度は平板型回転式粘度計（Fluid spectrometer RFS-II, Rheometrics Co., Ltd.）を用いて動的粘弾性測定法及び静的測定法で測定する。測定範囲は１〜１００(rad/s）及び０．１〜１０(1/s）である。ただし、動的粘弾性測定法における歪み率は１０％である。各剪断条件における応力から見かけ粘度を求め、１０(rad/s）、または１(1/s）における見かけ粘度を代表値とする。また、バクテリアセルロースを含む培養液の粘度特性は測定範囲内でPower lawモデルに従うと見做され、次式で表される。
0003800628.tif 000002
ηap（Pa・S）は見かけ粘度、Ｋはconsistency index（Pa・Sn）、
0003800628.tif 000003
は平均剪断速度、ｎはPower law index（−）である。ｎは各剪断条件におけるＫのバラツキが最小になるように定める。
酸素要求量の測定方法
培養液中の酸素要求量は通気中の酸素濃度と排気中の酸素濃度の差から求められる。すなわち、通気量と酸素濃度差の積から求められる消費量を培養液の容量で割った値が酸素消費量である。培養中は通気中の酸素濃度と培養液中の溶存酸素濃度は一定に制限され、しかも酸素は充足しているため、酸素要求量は酸素消費量と等しい。
発酵槽の内圧及び気相中の二酸化炭素の分圧の測定方法
当該技術分野に於ける常法に従って測定することができる。
例えば、発酵槽の内圧は、槽に直接取り付けられたダイアフラム式圧力計で測定することができる。
また気相中の二酸化炭素濃度は排気中からオンラインで非分散型赤外線吸収方式の測定装置を用いて測定し、これに発酵槽の内圧を乗じて、二酸化炭素分圧を求めることができる。
【図面の簡単な説明】
図１は所要動力とＢＣ蓄積の経時変化を示す。
発明を実施するための最良の形態
以下の実施例により、本発明をさらに詳細に説明する。
実施例１
以下の条件で、本発明の製造方法を実施した。
ＢＰＲ２００１株から得られた変異株であって高重合度セルロース生産菌であるＢＰＲ３００１Ａ株（平成７年６月１２日付寄託済、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１４９８２）を以下の条件で培養した。
培養条件：
培養装置には５０Ｌ容ジャーファーメンターを用い、培地はＣＳＬ−Ｆｒｕ培地をジャーファーメンター内で殺菌して用いた。張り込み液量は３０Ｌ、通気量は１５Ｌ／分である。ルーフラスコやコニカル・フラスコを用いて培養した菌液を植菌し、３０℃に保温しながら約４０時間培養した。培養液の粘度は途中で引き抜いた培養液を用いて、動的粘弾性測定法で測定した。通気中及び排気中の酸素濃度はオンライン酸素濃度計を用いて測定した。所要動力は攪拌モーターのインバーター出力などから求めた。
0003800628.tif 000004
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以上の系から得られた攪拌に要する所要動力とＢＣ蓄積の経時変化を図１に示す。
図１に示す通り、培養２４時間目以降、蓄積１０ｇ／Ｌ以上の条件では、内圧１kg/cm2Ａに比べ１．１kg/cm2Ａでは最大所要動力は約５０％、１．２kg/cm2Ａでは約３８％、１．５kg/cm2Ａでは約２５％に低減することが可能であった。これらの低減率は前記式から予想される割合と比べて予想外に大きいものであった。
実施例２
実施例１と同じ菌株及び同じ培養装置を使用して、攪拌数、通気量、及び内圧を変化させて、気相中の二酸化炭素分圧、ＢＣの生産速度及び収率を夫々求めた。結果を表４に示す。
0003800628.tif 000007
尚、図中、ＢＣ蓄積量（ｇ／Ｌ）は、培養終了後、培養液中の固形物を集積し、水洗して培地成分を除去した後、ＩＮＮａＯＨ水溶液中で８０℃、２０分間処理して菌体を除去した。さらに、洗浄液が中性付近になるまで生成セルロースを水洗した後、８０℃で１２時間真空乾燥して乾燥重量を測定することで求めた。また収率又は消費糖収率（％）は以下のようにして求めた。
消費糖収率（％）の計算
ＹBC＝ＢＣ／（ＲＣMF−ＲＣBF）＊１００
ＹBC  ：消費糖収率（％）
ＢＣ  ：ＢＣ蓄積量（ｇ／Ｌ）
ＲＣMF：培地の糖濃度（ｇ／Ｌ）
ＲＣBF：培養後の培地の糖濃度（ｇ／Ｌ）
産業上の利用可能性
本発明方法によって、ＢＣの生産に於ける培養の際の攪拌に要する所要動力を大幅に低減し、かつ、ＢＣの生産速度及び収率を高めることができる。
【図１】
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