(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的成分を含有する溶媒中に炭化フッ素系界面活性剤を添加し、目的成分と炭化フッ素系界面活性剤とでイオン対若しくはミセルを形成させた後、核磁気共鳴分析計（ＮＭＲ）に導入して、目的成分の核磁気共鳴分析計（ＮＭＲ）分析を行うことを特徴とする、目的成分の分析方法。
【請求項２】
炭化フッ素系界面活性剤が、パーフルオロオクタン酸、パーフルオロオクタンスルホン酸、パーフルオロ酪酸、パーフルオロペンタン酸、パーフルオロヘキサン酸、パーフルオロヘプタン酸、パーフルオロノナン酸、パーフルオロデカン酸又はパーフルオロドデカン酸である化合物又はその塩であることを特徴とする、請求項１に記載した目的成分の分析方法。
【請求項３】
核磁気共鳴分析計（ＮＭＲ）が、水素核核磁気共鳴分析計（Ｈ−ＮＭＲ）であることを特徴とする、請求項１に記載した目的成分の分析方法。
【請求項４】
分離分析計から得られた分離分取物を、炭化フッ素系界面活性剤とともにトラッピングカラムに導入してトラッピングカラムに捕捉させた後、トラッピングカラムに捕捉された分離分取物を重溶媒で溶出させることを特徴とする、核磁気共鳴分析計（ＮＭＲ）用試料の調製方法。
【請求項５】
炭化フッ素系界面活性剤が、パーフルオロオクタン酸、パーフルオロオクタンスルホン酸、パーフルオロ酪酸、パーフルオロペンタン酸、パーフルオロヘキサン酸、パーフルオロヘプタン酸、パーフルオロノナン酸、パーフルオロデカン酸又はパーフルオロドデカン酸である化合物又はその塩であることを特徴とする、請求項４に記載した核磁気共鳴分析計（ＮＭＲ）用試料の調製方法。
【請求項６】
核磁気共鳴分析計（ＮＭＲ）が、水素核核磁気共鳴分析計（Ｈ−ＮＭＲ）であることを特徴とする、請求項４に記載した核磁気共鳴分析計（ＮＭＲ）用試料の調製方法。
【請求項７】
分離分析計が、高速液体クロマトグラフィー装置（ＨＰＬＣ）、キャピラリー電気泳動装置（ＣＥ）又はゲル電気泳動装置であることを特徴とする、請求項４に記載した核磁気共鳴分析計（ＮＭＲ）用試料の調製方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、核磁気共鳴分析計（ＮＭＲ）に導入する溶媒中に炭化フッ素系界面活性剤を含有させることを特徴とする分析方法及び炭化フッ素系界面活性剤の使用法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
核磁気共鳴分析計（ＮＭＲ）及び質量分析計（ＭＳ）は、試料中の成分の同定にきわめて有効な分析機器である。環境試料、医薬品、工業製品や原材料中に含まれる微量の成分、不純物、分解物などの構造解析には、通常は、高速液体クロマトグラフィー装置（ＨＰＬＣ）や電気泳動分析装置（ＣＥ）などの分離分析法を用いて目的成分を分取精製し、その後に、ＮＭＲ又はＭＳ等による測定を行っている。
また、最近では、ＮＭＲ又はＭＳを、試料中の微量成分の分離分析に汎用されているＨＰＬＣやＣＥに直接に連結して、オンライン分析により成分の分離と同定を同時に行うシステムも検討されている。
例えば、特開平３ー１７５３５５号公報には、高速液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ−ＭＳ）における移動相の変換方法と装置が開示され、高速液体クロマトグラフィーにより試料中の成分を捕捉するとともに、該成分を試料の分離とは異なる質量分析に適した移動相によりＭＳに送ることを特徴とする移動相の変換方法及びその装置が開示されている。
また、高速液体クロマトグラフィーにより試料中の成分を分離し、別の移動相によりトラッピングカラムで成分を捕捉後、重水により軽水を置換し、次いで重溶媒（重水を除く）により該成分をトラッピングカラムより溶出させてＮＭＲに送ることを特徴とする移動相の変換方法及びその装置についても、検討されている。この方法によれば、混合物中の微量成分を単離精製、脱塩、濃縮重水素化置換をオンラインで行い、かつ、高価な重水及び重メタノール等の重溶媒の使用量が極めて少ない高速液体クロマトグラフィー核磁気共鳴分析（ＬＣ/ＮＭＲ）システムを提供することが可能となる。
一般に、ＨＰＬＣやＣＥで分離分析を行う際には、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）などの炭化水素鎖を有する界面活性剤を移動相中に添加することにより、目的成分の分離選択性を調節する手法がしばしば用いられている。
例えば、極性の高いイオン性試料は、逆相系のHPLCカラムには保持されないため、アルキル鎖を有するイオン対試薬を移動相に添加するイオン対クロマトグラフィーが用いられる。また、血清試料の直接分析等には移動相に臨界ミセル濃度(CMC)以上の界面活性剤を添加するミセル液体クロマトグラフィー(MLC)が用いられる。
一方、ＣＥは、分離力が高くかつ必要試料量が超微量（ナノグラムスケール）ですむことから超微量分離分析法として用いられており、界面活性剤はミセル動電クロマトグラフィーの疑似固定相、電気浸透流のコントロール化剤及び/又はSDS-ポリマー溶液によるタンパク質分析剤として不可欠な化合物である。さらに、生体成分の分析時には、前処理として膜タンパクの可溶化を行うことが多いが、この生体成分の可溶化剤として、アルキル糖類などの界面活性剤がよく用いられる。また、タンパク質、ペプチド、核酸などの分析の前処理として、SDSを用いたゲル電気泳動がよく使用されている。
しかし、これらの界面活性剤は、不揮発性であり、また、水素核を分子内に含有している為、分離分析計から得られた分離分取物をそのまま測定したり水素核核磁気共鳴分析計(Ｈ−ＮＭＲ)やＭＳに直接連結した場合には、目的成分由来のシグナルを妨害し、その分析感度を低下させたり検出を困難にすることが多い。
ＭＳに関しては、最近、揮発性のイオン対形成試薬としてヘプタフルオロ酪酸（パーフルオロ酪酸）、ヘプタフルオロプロピオン酸（パーフルオロプロピオン酸）、ノナフルオロ吉草酸（パーフルオロ吉草酸）、ペンタフルオロプロピオン酸（パーフルオロプロピオン酸）、ウンデカフルオロヘキサン酸（パーフルオロヘキサン酸）などの炭化フッ素界面活性剤をＬＣ/ＭＳに適用した例が報告されており、その有用性が明らかにされている（東京化成Chromato  Mail、Ｎｏ６、１９９８年１０月号;  横河アナリティカルシステムズ、ＬＣ/ＭＳセミナー’９８、１９９８年６月２４日）。
しかしながら、ＮＭＲに関しては、界面活性剤を用いる分離分析後又は前処理後の試料を直接にＮＭＲで分析する場合において、その界面活性剤の影響を取り除く方法は、未だ確立されてない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
核磁気共鳴分析計（ＮＭＲ）を用いた化合物の構造確認等の分析評価において、種々の分離分析計からの分離分取物をそのまま測定試料とする手法及び/又は種々の分離分析計との直接連結によるオンライン分析を可能とする手法が、非常に待ち望まれている。具体的には、目的成分をＨＰＬＣやＣＥ等を始めとする種々の分離分析計で分離分取後にＮＭＲに導入して分析する際において、１）種々の分離分析時には、成分の保持能の調節等により良好な分離分析が達成できると共に、２）ＮＭＲでの検出・同定の際には、ＨＰＬＣやＣＥでの分離分析に用いた添加剤の悪影響がほとんどなく良好な感度を有する分析が実現できることが要求されている。
また、ＮＭＲを用いた生体成分の分析において、その検出感度に影響を及ぼさない前処理法としての生体高分子の可溶化剤（例えば、膜蛋白等の可溶化剤など）の開発も切望されている。
以上のような状況に鑑み、本発明者らは鋭意検討を行った結果、以下に示す構成により所期の目的を達成できることを見いだし、本発明を完成した。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明は、核磁気共鳴分析計（ＮＭＲ）に導入する溶媒中に炭化フッ素系界面活性剤を含有させることを特徴とする分析方法である。
また、本発明は、核磁気共鳴分析計（ＮＭＲ）に導入する溶媒中に、分離分析計から得られた分離分取物の直接導入を可能とする添加剤、分離分析計との直接連結によるオンライン分析を可能とする添加剤及び/又は生体高分子の可溶化剤として、炭化フッ素系界面活性剤を含有させることを特徴とする分析方法である。
さらに、本発明は、核磁気共鳴分析計（ＮＭＲ）による分析において、分離分析計から得られた分離分取物の直接導入を可能とする添加剤、分離分析計との直接連結によるオンライン分析を可能とする添加剤及び/又は生体高分子の可溶化剤としての炭化フッ素系界面活性剤の使用法でもある。ここで、炭化フッ素系界面活性剤とは、例えば、パーフルオロオクタン酸、パーフルオロオクタンスルホン酸、パーフルオロ酪酸、パーフルオロペンタン酸、パーフルオロヘキサン酸、パーフルオロヘプタン酸、パーフルオロノナン酸、パーフルオロデカン酸又はパーフルオロドデカン酸である化合物又はその塩である。また、核磁気共鳴分析計（ＮＭＲ）とは、一般的には、水素核核磁気共鳴分析計（Ｈ−ＮＭＲ）などが用いられる。さらに、核磁気共鳴分析計（ＮＭＲ）による分析において、目的成分の分離分取物を得るために用いる分離分析計とは、例えば、高速液体クロマトグラフィー装置（ＨＰＬＣ）、キャピラリー電気泳動装置（ＣＥ）、ゲル電気泳動装などである。また、分離分析計との直接連結によるオンライン分析は、例えば、高速液体クロマトグラフィー核磁気共鳴分析（ＬＣ/ＮＭＲ）又はキャピラリー電気泳動核磁気共鳴分析（ＣＥ/ＮＭＲ）などによって行われる。
【０００５】
本発明における炭化フッ素鎖を有する界面活性剤（炭化フッ素系界面活性剤）は、溶媒中で目的成分であるイオン解離性化合物とイオン対を形成したり、臨界ミセル濃度(CMC)以上でミセルを形成する。これらの炭化フッ素系界面活性剤の特性としては、相互の分子間引力が弱いため表面張力が低く揮発しやすいことや、通常使用される炭化水素系界面活性剤と異なり分子内に水素核をほとんど有していないことなどが挙げられる。
したがって、核磁気共鳴分析計（ＮＭＲ）、特にＨ−ＮＭＲにおけるイオン解離性化合物の検出・評価において、ＨＰＬＣ、ＣＥ又はゲル電気泳動の移動相中に炭化フッ素系界面活性剤を添加することにより、その分離分取物のＮＭＲへの直接導入が可能となる。即ち、ＨＰＬＣやＣＥでの分離分析の際に移動相中に添加した炭化フッ素系界面活性剤は、分子内に水素核をほとんど有していない為、その添加によるＮＭＲでの分析感度の低下などの悪影響をほとんど受けない。
また、種々の分離分析計との直接連結によるオンライン分析、例えば、高速液体クロマトグラフィー核磁気共鳴分析（ＬＣ/ＮＭＲ）又はキャピラリー電気泳動核磁気共鳴分析（ＣＥ/ＮＭＲ）を用いても、ＮＭＲの分析感度の低下を伴うことなく目的成分を測定することが可能となる。
さらに、炭化フッ素系界面活性剤は、ＭＳ，ＮＭＲによる生体成分の微量分析においてペプチド・タンパク質等の生体高分子の可溶化剤、凝集抑制剤として、また蛋白質、ペプチド又は核酸などの生体高分子の前処理法に用いるゲル電気泳動の添加剤として、ＭＳ，ＮＭＲでの検出感度の低下や測定の妨害を生じることなく使用できる。
【０００６】
炭化フッ素系界面活性剤とは、例えば、パーフルオロオクタン酸、パーフルオロオクタンスルホン酸、パーフルオロ酪酸、パーフルオロペンタン酸、パーフルオロヘキサン酸、パーフルオロヘプタン酸、パーフルオロノナン酸、パーフルオロデカン酸、パーフルオロドデカン酸、C8F17SO2N(C2H5)(C2H4O)14H、[C7F15CONHC3H6N(CH3)3]+OH-、C7F15CONHC3H6N(CH3)2C2H4COOH、C8F17SO2N(C2H5)C2H4OPO(OH)2、(C4F9)3N又は(C5F11)3Nである化合物又はその塩などが挙げられるが、もちろんこれらの化合物に限定されるわけではない。
炭化フッ素系界面活性剤は、ＮＭＲに導入する移動相である有機溶媒、水又は含水有機溶媒中に含有させて使用する。また、ＮＭＲの種類に関しては、例えばＨ−ＮＭＲなどが挙げられるが、もちろんそれらに限定される訳ではない。
【０００７】
【発明の実施の形態】
以下、図面により、本発明による実施の形態の例を説明する。
【０００８】
図１は、本発明にかかる炭化フッ素系界面活性剤を、ＨＰＬＣ移動相中に添加して用いる高速液体クロマトグラフィー核磁気共鳴分析（ＬＣ/ＮＭＲ）装置の一例を示す全体図である。以下に、このＬＣ/ＮＭＲ装置について簡単に説明する。
まず、ポンプ（Ｐ１）を稼動して成分分離用移動相をライン（３０）、（３１）に送り込み、インジェクター（Ｉ）から目的とする成分を含有する試料を注入する。試料は移動相とともに分離カラム（ＰＣ）を通過し、カラム中で試料中に含有される種々の成分に分離され、各成分は検出器（Ｄ１）及びレコーダー（Ｒｅｃ）でモニターされる。目的成分以外はＤＲＡＩＮ（ＤＲ１）より排出される。分離された個々の目的成分は六方バルブ（Ｖ１）を切替えることによりライン（３２）を通り、両端が切替えバルブ（Ｖ２）、（Ｖ３）に連結したサンプリングループ（ＬＯＯＰ）に送り込まれる。各成分は切替えバルブ（Ｖ２）、（Ｖ３）を操作することにより、それぞれ所定のループに蓄積される。この時、成分分離用移動相はライン（３３）、バルブ（Ｖ１）を通ってＤＲＡＩＮ１より排出される。バルブ（Ｖ２）、（Ｖ３）の切替えは、試料中の個々の成分が所定のループに蓄積できるように検出器（Ｄ１）の検出信号に応じて行われる。
以上のようにして、サンプリングループに適当量の目的とする成分が蓄積された後、六方バルブ（Ｖ１）を切替えてライン（３４）と（３２）を連通させ、ポンプ（Ｐ２）を稼動して成分分離用移動相とは異なる組成の移動相（以下トラップ用移動相と称する）をライン（３４）、（３２）、バルブ（Ｖ２）からサンプリングループ（ＬＯＯＰ）に送り込み、ループに蓄積された成分をトラップ用移動相とともに押出して、ライン（３３）、バルブ（Ｖ１）及びライン（３５）、六方バルブ（Ｖ４）、ライン（３６）、六方バルブ（Ｖ５）、ライン（３７）、（３８）を通ってトラッピングカラム（ＴＣ）に送り込み成分を捕捉する。トラップ用移動相はライン（３９）、ミキシングチャンバー（ＭＧ）、ライン（４０）及び六方バルブ（Ｖ４）を通ってＤＲＡＩＮ（ＤＲ２）へ排出される。
この時、副流路（３４’）をライン（３４）に接続し、トラップ用移動相をライン（３４）の流路へ混合することにより、トラッピングカラムに成分が捕捉されやすくなる。即ち、トラッピングカラムに目的成分を捕捉するためには成分分離用移動相とは異なる組成の移動相を流す必要があるが、ループ内に蓄積された成分及び分離用移動相を副流路からの移動相の混合なしにトラップ用移動相により押出すと、一時的に分離用移動相濃度が高くなり、目的成分がトラップされにくい。副流路からトラップ用移動相を混合し分離用移動相を希釈することにより、トラップ効率を高めることができるのである。副流路には、分配バルブ（Ｒ）を設置して流量を調節することができる。
また、トラップ用移動相は、目的成分をトラッピングカラムに捕捉させるとともに、サンプリングループ中に貯留された分離用移動相で用いた緩衝成分を取り除く役割をはたす。トラップ用移動相としては、例えば逆相系では水などが使用でき、順相系ではヘキサン等の炭化水素やクロロホルム等のハロゲン化炭化水素などが使用できる。
次に、六方バルブ（Ｖ５）を切替えてライン（４１）とライン（３８）を連通させ、この状態でポンプ（Ｐ３）を稼動させることにより重水をトラッピングカラムに送り込むことによってトラッピングカラム及びライン（３８、３９、４０）中に存在するトラップ用移動相は重水に置換される。この時、トラッピングカラム中の成分はカラム中に蓄積されたまま溶出されない。
次にバルブ（Ｖ４、Ｖ５）を切替え、ライン（４３）、（４０）、ミキシングチャンバー（ＭＧ）、ライン（３９）、トラッピングカラム（ＴＣ）、ライン（３８）、バルブ（Ｖ５）、ライン（３７）、（３６）、バルブ（Ｖ４）、ライン（４２）、分離カラム（ＡＣ）及び検出器（Ｄ２）を連通させ、ポンプ（Ｐ４）を稼動することにより重メタノールを送出し、トラッピングカラム内に貯留された成分を溶出させる。成分は分離カラム（ＡＣ）により更に分離精製されるとともに、より濃縮された状態となり、検出器（Ｄ２）を通過してＮＭＲ装置で分析される。
この一連の装置で、極性の高いイオン性化合物を分離するには、例えば、ポンプ（Ｐ１）で送液する分離カラム（ＰＣ）には、逆相系分離カラムを使用することが多いが、炭化フッ素系界面活性剤の添加に関しては、ポンプ（Ｐ１）、ポンプ（Ｐ２）、ポンプ（Ｐ３）、ポンプ（Ｐ４）で送液する各々の移動相のすべてに炭化フッ素系界面活性剤を含有させても良いし、いずれかの移動相のうちの任意の１種類、２種類又は３種類に添加しても良い。
【０００９】
【発明の効果】
本発明によると、核磁気共鳴分析計（ＮＭＲ）における目的成分の検出・評価において、ＨＰＬＣ、ＣＥ又はゲル電気泳動の移動相中に炭化フッ素系界面活性剤を添加することにより、その分離分取物の直接導入や種々の分離分析計との直接連結によるオンライン分析法で、ＮＭＲの分析感度の低下を伴うことなく目的成分を測定することが可能となる。
【００１０】
実験例
１）ＮＭＲ又はＬＣ/ＮＭＲにおけるＮＭＲシグナルに及ぼす本願発明に係る炭化フッ素系界面活性剤の添加効果
極性化合物であるアラニン、トレオニンを試料として、前述の図１に示したＬＣ/ＮＭＲ装置を用いて分析を行った。界面活性剤としては、パーフルオロオクタン酸(PFOA)を使用した。尚、対照として、界面活性剤にSDSを用いた実験も行った。
ＨＰＬＣ装置は島津LCー10Aシステムを、分離カラムはL-column ODS (2.1 mm x 150 mm, 化学品検査協会)を用いた。また、ＮＭＲ装置は、JNM-a600 (JEOL)を使用した。
成分分離用移動相には、5 mM パーフルオロオクタン酸（PFOA）を含む水・アセトニトリル混合溶液（4:1）を用い、検出は230 nmでのUV吸収を用いた。一回の試料注入量は10μｌ（各々１.0 mg/mLの溶液を使用)、流速は0.2 mｌ/minで数回分析を行い、成分毎にサンプリングループに蓄積した。次に、トラップ用移動相として5 mM PFOAを含む水溶液を用いてトラッピングカラムに送り込み、目的成分を捕捉した後、5 mM PFOAを含む重水に置換した。その後、重メタノールで目的成分を溶出し、NMR用試料とした。
又、ＮＭＲスペクトル比較の為の比較対照実験として、2 mM SDSを含む重水・重メタノール(1:1)混合溶媒、界面活性剤を含まない重水・重メタノール(1:1)混合溶媒を各々用いて、アラニン、トレオニンの各溶液を調製（NMR用試料）し、ＮＭＲ装置に直接導入した。
尚、ポンプＰ１〜Ｐ４は下記の条件に設定した。
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図２に、成分分離用移動相を用いてイオン対クロマトグラフィー分離分析を行ったアラニン、トレオニンのクロマトグラムを示した。
また、図３と図４に、アラニンとトレオニンの各々のＮＭＲ分析チャートを示した。アラニンとトレオニンのいずれにおいても、界面活性剤を含まない無添加系（重水・重メタノール(1:1)混合溶媒系）と比較すると、SDS添加系ではSDS由来の妨害シグナルが数種類観測された。一方、PFOA添加系では、界面活性剤由来のシグナルは認められず良好なＮＭＲ分析結果が得られた。
以上から、炭化フッ素系界面活性剤をＮＭＲ用試料溶液に含有させた場合やＬＣ/ＮＭＲの移動相に含有させた場合には、ＳＤＳ等の通常のアルキル添加剤を添加した場合と比べて、ＮＭＲの検出感度に及ぼす悪影響はほとんどないか、又は極めて小さいことは明らかである。
【００１１】
２）ペプチド・タンパク質の可溶化剤及び/又は凝集抑制剤としての炭化フッ素系界面活性剤の効果
人アミロイドβ蛋白（ペプチド研究所）を用いて、ペプチド・タンパク質等の生体高分子の可溶化剤としての炭化フッ素系界面活性剤の効果を検討した。
人アミロイドβ蛋白0.52 mgにジメチルスルホキシドを50μｌ加えて溶解させ、ストック溶液とした。このストック溶液10 mLを取り、50 mMのパーフルオロオクタン酸ナトリウムを含むイオン強度0.05のリン酸塩緩衝液30 mｌを加えて、試料溶液を調製した。また、同様に、ストック溶液10 mLにイオン強度0.05のリン酸塩緩衝液を30 mｌ加えて、対照試料溶液とした。両試料溶液を室温で2時間放置し、その溶液状態を比較した結果を図５に示した。
対照試料溶液では、凝集体が生成し沈殿が認められたが、パーフルオロオクタン酸ナトリウムを添加した試料溶液では、沈殿は認められず均一な溶液状態であった。
実験例１）に示したように、パーフルオロオクタン酸等の炭化フッ素系界面活性剤は、NMR分析に悪影響を及ぼすことなく使用できることから、炭化フッ素系界面活性剤は、ペプチドやタンパク質の高濃度試料溶液が必要なNMR測定においてしばしば認められる沈殿生成を抑制する効果を有する可溶化剤として有用であることは明らかである。
【００１２】
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、本発明にかかる炭化フッ素系界面活性剤を、ＨＰＬＣ移動相中に添加して用いる高速液体クロマトグラフィー核磁気共鳴分析（ＬＣ/ＮＭＲ）装置の一例を示す全体図である。
【００２２】
【図２】図２は、成分分離用移動相を用いてイオン対クロマトグラフィー分離分析を行ったアラニン、トレオニンのクロマトグラムである。
【００２３】
【図３】図３は、ＮＭＲ又はＬＣ/ＮＭＲを用いたアラニンの分析において、ＮＭＲシグナルに及ぼす本願発明に係る炭化フッ素系界面活性剤の添加効果を示したＮＭＲチャートである。
【００２４】
【図４】図４は、ＮＭＲ又はＬＣ/ＮＭＲを用いたトレオニンの分析において、ＮＭＲシグナルに及ぼす本願発明に係る炭化フッ素系界面活性剤の添加効果を示したＮＭＲチャートである。
【００２１】
【図５】図５は、アミロイドβ蛋白に対する炭化フッ素系界面活性剤の可溶化効果及び/又は凝集抑制効果効果を示す写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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