(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１の塩基配列からなる、Desulfovibrio属細菌およびこれと近縁の硫酸還元菌を検出するためのオリゴヌクレオチドプライマー。
【請求項２】
配列番号２の塩基配列からなる、Desulfovibrio属細菌およびこれと近縁の硫酸還元菌を検出するためのオリゴヌクレオチドプライマー。
【請求項３】
請求項１および請求項２記載のオリゴヌクレオチドプライマーからなるオリゴヌクレオチドプライマー対。
【請求項４】
請求項３記載のオリゴヌクレオチドプライマー対を用いてDesulfovibrio属細菌およびこれと近縁の硫酸還元菌を複合生物系試料から培養操作を行うことなく、特異的に検出する方法。
【請求項５】
複合生物系試料が環境サンプルであることを特徴とする、請求項４記載の方法。
【請求項６】
環境サンプルが、土壌または堆積物であることを特徴とする、請求項５記載の方法。
【請求項７】
環境サンプルが、油泥、廃油または備蓄原油であることを特徴とする、請求項５記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、硫酸還元菌の環境サンプル中におけるモニタリングの技術に関し、より詳細には、Desulfovibrio属細菌およびこれと近縁の硫酸還元菌を特異的に検出する技術に関する。
【０００２】
【従来の技術】
硫酸還元菌は、硫酸塩を最終電子受容体として有機物または水素を酸化してエネルギーを獲得して生育する細菌であり、多くの嫌気的環境条件下での硫黄循環において重要な役割を果たしている。また、汚染土壌中の環境汚染物質の生分解、例えば、嫌気条件下土壌中での塩素化芳香族化合物分解、水銀のメチル化に関与することも報告されている（Fauque，G. D.、（1995）Sulfate-reducingbacteria（Barton,L.L.,Ed），pp.217-241 Prenum Press，NewYork，Barton et al.（1995）Sulfate-reducingbacteria（Barton,L.L.,Ed），PP．1-32．Prenum Press，NewYork）。
【０００３】
一方、備蓄原油中には、生物にとっては非常に過酷な条件下であるにもかかわらず、相当数の微生物が生存していることが明らかとなっており、備蓄原油の長期貯蔵の際における品質劣化、備蓄基地設備の腐食などヘの微生物の関与が示唆されている。特に、備蓄基地設備の腐食に関してはカナダやロシアの原油輸送管における硫酸還元菌によるコロージョンが大きな問題となっており、長期貯留を行っている備蓄タンクや移送配管においても同様の問題が生じる可能性が考えられる。したがって、備蓄原油中において硫酸還元菌がどの程度存在しているかを把握することが必要不可欠である。しかし、これまでに、培養操作を行うことなく備蓄原油中の硫酸還元菌を特異的に検出した例は報告されていない。
【０００４】
環境サンプル中の特定の微生物の検出は、培養による方法および非培養系の方法があるが、非培養系での検出は、培養を用いる検出法に比べて、時間、経費等の点で有利である。環境サンプル中、例えば、嫌気条件下土壌や堆積物中からの非培養系での硫酸還元菌の特異的検出はin situハイブリダイゼーション法（例えばFISH）、ポリメラーゼチェーンリアクション（PCR）法などを用いて行われている（Devereyx et al．（1992）Syst. Appl. Microbol. 15:601-609，Ramsing et al.（1996）Appl. Environ. Microbiol. 62：1391-1404，Rooney-Varga et al.（1997）Appl. Environ. Microbiol. 63：3895-3901）。
Desulfovibrio属細菌は、データベース上の16S rRNA遺伝子の塩基配列情報量が豊富であることから、硫酸還元菌のモデルとしてよく研究されており、いくつかのプローブDNAが報告されている（Castro et al.（2000） FEMS Microbiol. Ecol. 31：1-9）。
【０００５】
油泥、廃油または備蓄原油などの微生物細胞を単離するのが困難な試料中の特定微生物を特異的に検出する場合、検出感度などの点でPCR法を用いるのが好ましいが、これらのプローブDNAのほとんどはin situハイブリダイゼーション法に用いるためのものであり、PCR用オリゴヌクレオチドプライマーとしては好ましくないと考えられる。PCR法用に設計されたDesulfovibrio属細菌検出オリゴヌクレオチドプライマーとしてはAmannらにより報告されているSRB38S-Fがあるが（Amann et al.（1990）Appl.Environ. Microbiol．56：1919-1925）、これは、硫酸還元菌以外の細菌も検出してしまい、Desulfovibrio属細菌およびこれと近縁の硫酸還元菌を非培養系で特異的に検出するためにはその検出精度が十分なものではない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、環境サンプル、例えば土壌または堆積物中における有機化合物代謝に重要な役割を果たし、かつ備蓄原油の品質保持上でその存在を把握することが不可欠な硫酸還元菌、特にDesulfovibrio属細菌およびこれと近縁の硫酸還元菌を特異的に検出することのできるPCR用オリゴヌクレオチドプライマーを提供し、さらに該プライマーを用いて、様々な環境サンプルおよび備蓄原油などの人工的な環境サンプル中のDesulfovibrio属細菌およびこれと近縁の硫酸還元菌を特異的に検出する方法を提供することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、Desulfovibrio属細菌およびこれと近縁の硫酸還元菌の16S rRNA遺伝子の塩基配列情報に基づき、該微生物を分子レベルにおいて特異的に検出することを可能にする、Desulfovibrio属細菌およびこれと近縁の硫酸還元菌に共通なオリゴヌクレオチドプライマーを開発して、本発明を完成させるに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は、以下の：
[１]  配列番号1の塩基配列または配列番号１の塩基配列において１若しくは2残基が欠失、置換若しくは付加された配列を有するオリゴヌクレオチド、
[２]  配列番号２の塩基配列または配列番号２の塩基配列において１若しくは2残基が欠失、置換若しくは付加された配列を有するオリゴヌクレオチド、
[３]  上記[１]記載のオリゴヌクレオチドおよび上記[２]記載のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対、
[４]  上記[３]記載のオリゴヌクレオチド対を用いてDesulfovibrio属細菌およびこれと近縁の硫酸還元菌を複合生物系試料から培養操作を行うことなく、特異的に検出する方法、
[５]  複合生物系試料が環境サンプルであることを特徴とする、上記[４]記載の方法、
[６]  環境サンプルが、土壌または堆積物であることを特徴とする、上記[５]記載の方法、および
[７]  環境サンプルが、油泥、廃油または備蓄原油であることを特徴とする、上記[５]記載の方法、に関する。
【０００９】
本明細書中における「複合生物系試料」とは、1種以上の生物を含有しており、かつDesulfovibrio属細菌およびこれと近縁の硫酸還元菌を1種以上含有している可能性のあるあらゆる試料を指す。この場合、該試料は、環境サンプル、環境サンプルを人工的な環境下で処理したもの、または人工的に構築されたサンプルであってもよい。この場合の生物とは、動物、植物および微生物等を含むあらゆる生物を指すが、細菌類または藻類等の微生物が好ましい。
【００１０】
本明細書中における「環境サンプル」とは、土壌、堆積物、鉱物、海水や湖水、河川水、底泥、地下水、間隙水、動植物などの自然環境または人工的な環境から採取された試料を指す。ここで「自然環境」とは、地球上の生物圏を意味し、海洋や湖沼、河川等の水圏、土壌や陸上地下、海底地下等の地圏、地球表層のような気圏、および動植物体およびその死骸等、微生物が生息している地球上全ての環境をいう。また、「人工的な環境」とは、程度の差はあれ人為的に管理された環境のことを意味し、例えば、実験室のフラスコや実証試験装置内の環境、原油備蓄基地設備内(原油輸送管、移送配管、および備蓄タンクを含む)の環境、廃油タンク内の環境、食品や醸造、製薬等の化学・バイオ分野で使用されている発酵槽などの製造タンク内の環境、または水道水、生活・工業利用水、冷却水、循環水、排水、下水などの水の人工的な製造、加工、貯蔵、輸送、利用、廃棄に係わる環境のことをいい、微生物が存在または混入する可能性がある全ての人為的に管理された環境をいう。したがって、備蓄原油、廃油、油泥、貯水槽中の水、建築資材なども環境サンプルであり得る。
【００１１】
上記環境サンプルは、採取後、保存および利用の便宜のために、サンプル中に含まれる生物に由来する核酸が極度に破壊、変性、分解または消失されない条件下で任意の処理(粉砕、分離、濾過など)を施したものであってもよい。
【００１２】
上述のように、上記第二の態様で用いる複合生物系試料の例としては、土壌、堆積物、油泥、廃油および備蓄原油が挙げられるが、これらのうち土壌および堆積物は、微生物細胞の単離が容易であり、そのための方法は当業者には公知であるが、油泥、廃油および備蓄原油は、そこから微生物細胞を単離することは困難である。そのため、備蓄原油試料中の特定微生物を特異的に検出するには、検出感度の高いPCR法に頼らざるを得ない。
PCR法は、当業者には周知の技術であり、試料中の核酸の検出のために日常的に用いられており、そのための装置および試薬は様々なものが市販されている。
【００１３】
【発明の実施の形態】
GenBank（http:/www.ncbi.nim.nih.gov）などのデータベース上に公開されている配列情報からDesulfovibrio属（例えば、Desulfovibrio desulfuricans（AF192154）、D. gracilis（U53464）、D. zosterae（Y18049）、D. africanus（X99236）、D. alcoholovorans（AF053751）、D. burkinabensis（AF053752）、D. bastinii（U53462）、D. fairfieldensis（U42221）、D. fructosovorans（AF050101）、D. intestinalis（Y12254）、D. termitidis（X87409）など）の16S rRNA遺伝子の塩基配列を取得し、これらの塩基配列を、例えばGENETYXソフトウェア（バージョン10；ソフトウェア開発株式会社）などの市販のソフトウェアを用いて該塩基配列を比較して、Desulfovibrio属およびこれと近縁の硫酸還元菌のrRNA遺伝子間で塩基配列が高度に保存されている領域を特定する。「高度に保存されている」とは、Desulfovibrio属およびこれと近縁の硫酸還元菌の対応する塩基配列を比較して、18残基以上からなる連続する塩基配列においてその相同性が79％以上であることをいう。上記の特定は当業者には容易に実施することができる。特定された領域の塩基配列を基に、PCR用プライマー対を設計することができる。PCR用プライマー対に好適な配列とは、各配列の長さが5〜25ヌクレオチドであり、好ましくは10〜20ヌクレオチド、さらに好ましくは15〜20ヌクレオチドからなり、かつDesulfovibrio属細菌以外の生物の遺伝子には両プライマーの配列に完全に一致する配列が存在しないような配列である。
【００１４】
本発明者らは、上記手法により、配列番号1（D. desulfuricansｒRNA配列の435-453 bpに対応、「DSV435F」と命名する）および配列番号2（D. desulfuricansｒRNA配列の1413-1430 bpに対応、「DSV1430R」と命名する）の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーを設計した。これらのオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、Desulfovibrio属細菌およびこれと近縁の硫酸還元菌由来の核酸を含むサンプルを後述のようにPCR反応に供すると、これらのプライマーに挟まれた領域（即ち、例えばD. desulfuricansｒRNA配列の435-1430bpに対応する領域）が特異的に増幅される。即ち、これらのオリゴヌクレオチドプライマー対は、Desulfovibrio属細菌およびこれと近縁の硫酸還元菌のrRNAを増幅させ得るユニバーサルプライマーである。本発明は、配列番号１のオリゴヌクレオチドまたは配列番号２のオリゴヌクレオチドを含む前述の長さのプライマーとして用いることができるオリゴヌクレオチドも包含する。また、配列番号１および配列番号２の配列を有するオリゴヌクレオチドは、その配列中の1または２残基が欠失、置換または付加されていても、上記プライマーとしての機能を有し得る。
オリゴヌクレオチドプライマーは、任意の方法で作製することができるが、例えば自動DNA合成装置を使用して合成することが可能である。
【００１５】
本発明のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、PCR法により、Desulfovibrio属細菌およびこれと近縁の硫酸還元菌を検出または同定することができる。「Desulfovibrio属細菌と近縁の硫酸還元菌」とは、その表現形質、遺伝子配列の相同性から判断して、Desulfovibrio属細菌と表現形質が非常に類似し、系統分類学的位置が非常に近い硫酸還元菌を指す。本明細書中で用いる場合は、生物の系統分類学の指標として広く用いられる16S rDNAの相同性から判断して、例えばBLAST等を用いて計算したときに（例えば、BLASTのデフォルトすなわち初期条件のパラメーターを用いた場合）、その相同性が85％以上のもの、好ましくは90％以上のものを指す。その例としては、GenBankデータベース上にrRNA配列が記載されている、Desulfovibrio desulfuricans (AF192154)、D. gracilis (U53464)、D. senezii (AFO50100)、D. zosterae (Y18049)、D. africanus (X99236)、D. alcoholovorans(AF053751)、D. burkinabensis (AF053752)、D. bastinii (U53462)、D. fairfieldensis (U42221)、D. fructosovorans (AF050101)、D. intesiinalis (Y12254)、D. termitidis(X87409)等のDesulfovibrio属細菌、Desulfomonaspigra (AF192152)等のDesulfovibrio属細菌と近縁の硫酸還元菌の菌株を挙げることができるが、これらに限定はされない。
【００１６】
配列番号1と配列番号2の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、Desulfovibrio属細菌を検出または同定する方法の一例について、以下に説明する。
前記複合生物系試料から、そこに含有される生物のゲノムDNAを、リゾチーム、プロテイナーゼK、フェノール・クロロフォルム処理またはビーズ破砕法などの種々の公知の方法および/またはFastDNA Spin Kit for soil(BIO101社製)もしくはQIAamp DNA Stool Mini Kit(QIAGEN社製)を初めとする種々の市販のキットを利用することにより、調製することができる。ゲノムDNAの調製方法は該複合生物系試料の組成に応じて種々であるが、場合によっては当業者の経験および知識から容易に想達し得る改変および応用を上記の方法に加えることによって、容易にゲノムDNAを調製することができる。得られたDNAを鋳型とし、上述のオリゴヌクレオチドプライマーを用いてPCRを行う。該PCR反応のために、上記オリゴヌクレオチドプライマー、上記ゲノムDNA、DNAポリメラーゼ酵素および各dNTP混合物(dATP、dGTP、dCTP、dTTPを含む)等をそれぞれ適切な濃度でポリメラーゼ反応に好適なバッファー中に含有するPCR反応混合液を調製する。また、例えばHotStarTaq Master Mix Kit (QIAGEN社製)等の市販のキットを利用して、PCR反応混合液を調製することもできる。PCR反応の条件は、複合生物系試料に含まれる生物種およびその数、ならびに得られたゲノムＤＮＡサンプルの純度などのさまざまな状況に応じて、当業者の通常の経験および知識に基づいて決定することができる。例えば、95℃にて15分間インキュベートした後、94℃1分間、55℃1分間、72℃1分間を35サイクルという条件を用いるとよい。
【００１７】
ポジティブコントロールとしてはDesulfovibrio desulfuricans IFO13699を用い、ネガティブコントロールとしては、Desulfovibrio属細菌およびこれと近縁の硫酸還元菌以外の特定の微生物(例えばE. coli HB101、Rhodococcus erythropolis ATCC53968などが挙げられるが、これらに限定はされない)から調製したゲノムDNAを用いて、上記複合生物系試料と同一の反応に供する。
【００１８】
PCR反応後の反応液はアガロース電気泳動またはポリアクリルアミド電気泳動により解析し、エチジウムブロマイド染色等によりDNA増幅の有無を視覚的に確認することができる。対象とした複合生物系試料中にDesulfovibrio属細菌およびこれと近縁の硫酸還元菌が含まれている場合は、約1kbの増幅DNA断片が認められる。したがって、該複合生物系試料に由来するPCR産物中に約1kbの増幅DNA断片が確認されることで、該試料中のDesulfovibrio属細菌およびこれと近縁の硫酸還元菌の存在を検出することができる。
【００１９】
本発明のオリゴヌクレオチドプライマーは、複合生物系試料中のDesulfovibrio属細菌およびこれと近縁の硫酸還元菌を特異的に検出することを可能にする。該プライマーを用いる上記検出は、油泥、廃油および備蓄原油などの含有生物の単離が困難である複合生物系試料中に含まれるDesulfovibrio属細菌およびこれと近縁の硫酸還元菌を、培養操作を行うこと無く特異的に検出し得るという点で、有益である。さらに、上記検出は、その他の複合生物系試料を用いる場合でも、従来技術による検出に比べて検出精度を向上させるという点で非常に有益である。
【００２０】
【実施例】
以下、例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの例により限定されるものではない。
［実施例1］  オリゴヌクレオチドプライマーの設計
GenBank（http:/www.ncbi.nim.nih.gov）データベースよりDesulfovibrio desulfuricans（AF192154）、D. gracilis（U53464）、D. zosterae（Y18049）、D. africanus（X99236）、D. alcoholovorans（AF053751）、D. burkinabensis（AF053752）、D. bastinii（U53462）、D. fairfieldensis（U42221）、D. fructosovorans（AF050101）、D. intestinalis（Y12254）、D. termitidis（X87409）の16S rRNA遺伝子の塩基配列を取得した。これらの塩基配列をGENETYXソフトウェア（バージョン10；ソフトウェア開発株式会社）を用いてアライメントを作成し、Desulfovibrio属細菌間で特異的に保存されている遺伝子領域を見いだし、配列番号1（D. desulfuricansの435-453 bpに対応、「DSV435F」と命名する）および配列番号2（D. desulfuricansの1413-1430 bpに対応、「DSV1430R」と命名する）の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーを設計した。
【００２１】
［実施例2］  作製オリゴヌクレオチドプライマーのデータベース検索結果
配列番号1および配列番号2記載の塩基配列をデータベースに検索したところ、属名が決定されている微生物の16S rRNA遺伝子の中でDSV435FおよびDSV1430Rの両方と完全一致するものはDesulfovibrio属細菌およびこれと近縁の硫酸還元菌以外には確認されなかった。このことは、DSV435FおよびDSV1430RをPCR プライマーとして用いた場合に、Desulfovibrio属細菌およびこれらの近縁属を特異的に検出可能であることを示している。
【００２２】
［実施例3］  作製オリゴヌクレオチドプライマーを用いたPCR試験結果
（1）DNA調製
複合生物系試料として産業技術総合研究所敷地内の沼底から採取した沼底堆積物および苫小牧東部石油備蓄株式会社の石油備蓄タンクから採取したウンシャイフ原油を用いた。沼底堆積物からのDNAの抽出にはFastDNA Spin Kit for soil（BIO 101社）を用い、該キットに添付のプロトコールに従い、DNAを調製した。備蓄原油からのDNA抽出は0.1 mm径のZirconia（BIOSPEC社）とQIAamp DNA Stool Mini Kit（QIAGEN社）を用いた物理的菌体破砕法により調製した。すなわち、原油サンプル150 μl、Zirconia 300 mg、ASL buffer（QIAamp DNA Stool Mini Kit添付） 1.0 mlを2.0 mlサンプルチューブに加え、MINI-BEADBEATER（5,000 rpm, 30 sec×2回；BIOSPEC社）にて激しく撹拌した後、QIAamp DNA Stool Mini Kitを用いて、該キットに添付のプロトコールに従いDNAを調製した。
【００２３】
（2）PCR
PCRの反応液調製はHotStarTaq Master Mix Kit（QIAGEN社）を用い、該キットに添付のプロトコールに従った。反応は95℃で15分間インキュベートした後、94℃ 1分間、55℃ 1分間、72℃ 1分間を35サイクル行った。その結果、図1に示すように、沼底堆積物から調製したDNA、備蓄原油から調製したDNAのいずれを用いた場合にもポジティブコントロールのDesulfovibrio desulfuricans IFO13699由来DNAを鋳型とした場合と同様に、約1 kbのDNA増幅断片が確認された。また、この時、ネガティブコントロールとしてE. coli HB101、Rhodococcus erythropolis ATCC53968由来のDNAを鋳型としたPCRも行ったが、いずれにおいてもDNAの増幅は確認されなかった。
【００２４】
（3）PCR増幅断片の塩基配列解析
PCR増幅DNAはアガロース電気泳動、GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit（アマシャムファルマシアバイオテク社）を用いて精製した。精製したDNAはDNA Ligation Kit ver. 1（TaKaRa社）を用いてpT7Blue vector（Novagen社）にライゲーションした。この反応液を用いてE. coli DH5αを形質転換し、50 μg/mlのアンピシリンナトリウムと40 μg/mlのX-Galを含むLB寒天培地にて37℃で14時間培養した。得られたコロニーの中から白色のものを50 μg/mlのアンピシリンナトリウムを含むLB培地にて37℃で14時間培養し、Flexi Prep Kit（アマシャムファルマシアバイオテク社）を用いてプラスミドDNAを抽出した。得られたプラスミドDNAをBigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit（ABI社）にて塩基配列解析用反応を行い、310 Genetic Analyzer（ABI社）にて塩基配列を解析した。
【００２５】
沼底堆積物および備蓄原油を試料とした場合のそれぞれにおいて得られたクローンをランダムに10個ずつ選択し、塩基配列を解析した。得られた塩基配列はBLASTのアルゴリズムを用い、GenBank DNA データベース上の配列に対してホモロジーサーチを行った。その結果、沼底堆積物では8個のクローンがDesulfovibrio属細菌の16S rRNA遺伝子と最も高い相同性を示し、その他2個のクローンに関してはDesulfonatronovibrio hydrogenovorans、Desulfobacterium anilini由来の16S rRNA遺伝子との相同性が確認された（表1）。また、備蓄原油においても6個のクローンがDesulfovibrio属細菌の16S rRNA遺伝子と相同性を示し、その他4個のクローンに関しては2クローンがThermodesulforhabdus sp. nov. M40/2 CIV-3.2.と、2クローンがThermodesulforhabdus norvegicaの16S rRNA遺伝子と最も高い相同性を示した（表2）。
【００２６】
以上の結果は本発明のオリゴヌクレオチドプライマーを用いたPCR法により、種々の複合生物系試料中におけるDesulfovibrio属細菌およびこれと近縁の硫酸還元菌を特異的に検出できることを示す。
【００２７】
【表１】
0003861140.tif 000002
【００２８】
【表２】
0003861140.tif 000003
【００２９】
【発明の効果】
本発明のオリゴヌクレオチドプライマーを用いると、土壌や河川等の微生物細胞の単離が容易な複合生物系試料および油泥、廃油または備蓄原油などの微生物細胞の単離が困難な複合生物系試料におけるDesulfovibrio属細菌およびこれと近縁の硫酸還元菌を非培養的に分子レベルで高感度に検出することができる。
【００３０】
【配列表】
0003861140.tif 000004
0003861140.tif 000005
【００３１】
【配列表フリーテキスト】
配列番号1は、オリゴヌクレオチドプライマーDSV435Fの塩基配列を示す。
配列番号2は、オリゴヌクレオチドプライマーDSV1430Rの塩基配列を示す。
【図面の簡単な説明】
【図１】図1は、DSV435FとDSV1430Rを用いた16SrRNA遺伝子のPCR反応生成物のアガロースゲル電気泳動の結果を示している。
Lane 1: DNA/HindIII, lane 2: 沼底堆積物由来DNA, lane 3: E. coli DNA, lane 4: R. erythropolis ATCC53968 DNA, lane 5: 備蓄原油由来DNA, lane6: Desulfovibrio desulfuricans IFO13699 DNA
【図１】
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