(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物の傷つけられた管状体内壁面の狭窄を防止するために使用される薬剤組成物であって、
10mg/70kg体重ないし3000mg/70kg体重の投与量のヒアルロン酸と；
10mg/kg体重以下の投与量の非ステロイド系抗炎症剤（NSAID）と；
を含有してなることを特徴とする薬剤組成物。
【請求項２】
上記ヒアルロン酸が分子量750,000ダルトン未満のものである請求項１記載の薬剤組成物。
【請求項３】
該薬剤組成物が静脈注射用の形態である請求項1又は２記載の薬剤組成物。
【請求項４】
上記ヒアルロン酸を200mg/70kg体重以上の投与量で含有してなる請求項１ないし３のいずれかに記載の薬剤組成物。
【請求項５】
該薬剤組成物がバルーン血管形成術後の動脈内壁面の再狭窄を防止するためのものである請求項１ないし４のいずれかに記載の薬剤組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は動物の管状内壁が外傷を受けた後に再狭窄するのを防止することに関する。また、本発明はその１態様としてバルーン血管形成術の後に血管が再狭窄するのを防止することに関する。
【０００２】
【従来の技術】
バルーン血管形成術は、冠状動脈の血栓を開口させる方法として広く用いられている。これに用いられるバルーンカテーテルは１９６０年代の前半に実験的に導入され、１９７０年の後半に臨床的に最初に適用された。それ以来、単一または複合冠状動脈症の治療の主たる方法となっている（バウムガートナー・エイチ・アール、１９６３、Z.Ges.Exp.Med.,137:227）。しかし、患者によってはバルーン血管形成術そのものについては問題がないが、動脈再血栓が生じる場合がある。この場合の動脈の内径（ＩＤ）の縮小は、バルーン血管形成術によってもたらされた刺激区域の内皮細胞の成長（増殖）によるものである。この再血栓はコレストロールの蓄積によるものでなく、動脈の内壁面の内皮細胞の蓄積によるものであり、動脈内壁が減少して梗塞につながる。ヒトにおいて再狭窄病変は全てではないとしても血管平滑筋細胞からなる（グラジア・ジェイ・ジェイ、ウイリアム・エム・ジー、マッデン・エス、リッカード・エイ・エフ、１９９０、J.Roy.Coll.Phys.Lond.,24:292）．この動脈ルーメン内の蓄積は細胞の移動と増殖の結果によるものである。この２つの現象は最初の組織外傷部位でのマクロファージの初期の蓄積により解放された多くの種々のサイトカインの相互作用によるものと思われる。この管内壁径の縮小、または細胞の増殖は冠状動脈に限られていない。これは術後において末梢血管に狭窄を生じさせる場合もある。
【０００３】
この再狭窄を防止するための多くの提案がなされている。米国特許５，０８７，２４４（ウオンスキー等）には小さな孔を有する非弾性バルーンを一端に設けたカテーテルを用い、バルーン血管形成術後にこの孔から濃縮ヘパリン溶液を放出させ、再狭窄を防止することが開示されている。
【０００４】
米国特許５，１１６，８６４（アザウエイ等）には血管切開後の末梢または心臓血管システムの再狭窄を防止するため、光学活性ソラレンを全身投与し、平滑筋細胞の成長抑制可能な血清ソラレンレベルとすることが開示されている。
【０００５】
米国特許５，０９２，８４１（スピアーズ・ジェイ・アール）にはバルーン血管形成術により外傷を受けた動脈壁面の治療として、バルーンカテーテルを留置させている間にこの壁面と血管形成バルーンとの間に生物保護物質を放出させ、この生物保護物質をこの部位に保持させ、動脈壁面の組織に浸透させることが開示されている。
【０００６】
ヨーロッパ特許３５６２７５−Ａ（ペテトー等）にはバルーン血管形成術後の再狭窄を抑制するため、新規なｏ−アシル化グリコサミノ−グルカン誘導体を用いることが開示されている。
【０００７】
J. Am. Coll. Cardiol, 1991, Vol.17#6  サプリメント・Ｂ，ｐｐ１１１Ｂ−１１７Ｂ（バーク・ビー・シー）にはバルーン血管形成術後の再狭窄を抑制するため、ヘパリンおよびグルココルチコイドの薬理学的役割が開示されている。
【０００８】
ＷＯ９２０９５６１（イトー等）には経皮鎮痛用冠状血管形成術後の再狭窄を抑制するため、新規なＡＣＡＴ抑制アミド誘導体の使用が開示されている。
【０００９】
ＷＯ９２０８４７２（スカボロー等）には血管形成術後の再狭窄を抑制するため、ヘビ毒から得られる血小板抗付着性ペプチドの使用が開示されている。
【００１０】
ＷＯ９２０７８５２（ボビー等）には血管形成術後の再狭窄を抑制するため、ある種のビフェニルアルキルキサンチン誘導体の使用が開示されている。
【００１１】
ＷＯ９２０５７８２（ピル・ジェー）には閉塞性血管病変における増殖抑制、すなわち動脈再狭窄防止のための製薬としてスロンボキサン−Ａ２−レセプター拮抗剤（Ｉ）の使用が開示されている。
【００１２】
ＷＯ９１１８６３９（ＧＡｉ等）にはバルーン血管形成術後の動脈再狭窄防止のため、フィブロネクチンを連続的またはボーラス輸液、または血管形成カテーテルを介して狭窄部位に直接的に投与することが開示されている。
【００１３】
カナダ特許公開公報２，０４２，１５９（オンデッチ等）には血管形成術後の再狭窄の危険性を防止ないし抑制するため、ＡＣＥインジビターを経口あるいは非経口投与することが開示されている。
【００１４】
米国特許４，９２９，６０２（ハーカー等）には動脈再狭窄を防止するため、Ｄ−フェニリャラニル−プロリルアルギニル−バロメチルケトンペプチド誘導体、またはそのヒドロラリン酸付加物の使用が開示されている。
【００１５】
米国特許４，８２０，７３２（シェル等）には動脈再狭窄および急性狭窄を抑制するため、プロスタグランジン化合物を含む組成物の使用が開示されている。
【００１６】
その他、バルーン血管形成術後の再狭窄を抑制するため、ヘパリン分解物を開発がグライコムド社（Ｇｌｙｃｏｍｅｄ）で進められていることが知られている。
【００１７】
１９７０年代の後期および１９８０年代の初期における基礎研究においてガンについての免疫療法の役割について可なりの混乱があった。マクロファージの活性化、または「煽り立て）が重要と思われていた。しかし、ガン患者からの腹膜マクロファージについてのローマンおよびフォークの研究において、マクロファージがすでに活性化されていてガン細胞と共存しているのに、細胞の破壊が生じていないという事実が判明した。
【００１８】
また、数人かの別々の研究者によりマクロファージの異常または推測されるブロックはプロスタグランジンの過剰によるもので、これはコルチコステロイド、ＡＳＡ、非ステロイド系抗消炎剤、例えばインドメタシンおよびナプロキセン（Ｎａｐｒｏｓｙｎ、商標）により組織培養で変えることができることが示された。さらに、動物腫瘍において、これらの物質は腫瘍性細胞に対する応答を変えることができ、これらの物質と免疫促進剤との種々の組合わせにより実験的腫瘍の除去に高い信頼性を以て有効であることが実証された。ララ等はインドメタシンとインターロイキン２との組合わせで実験的腫瘍の治療に効果があることを示した。
【００１９】
【発明が解決しようとする課題】
これらの物質を実際にヒトの生体で用いることにおいては引き続き問題があり、その非ステロイド系抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）のすべてが胃腸系、神経系および他の区域において可なりの毒性を示した。したがって、現在のアプローチの基本は一般的状況下でこれらの薬剤のヒトの病気での十分量の使用で、薬剤を病気組織に浸透させプロスタグランジンの局所的生産を治療効果的に変えることである。インドメタシンおよび他の薬剤の静脈投与用製剤もあるが、多くのデータによれば、これらの薬剤単独の使用は生体に対する副作用が多すぎるということである。そのため、不十分な量でしか人体に投与できず、それにより腫瘍に対し少しでも効果を期待するだけであった。
【００２０】
しかし、腫瘍発生のベースおよび免疫監視メカニズムをすり抜ける最初の細胞がプロスタグランジンの生成とどのように関連するかについて考えられる多くの証拠が存在している。いかなる免疫反応、すなわちマクロファージにおいても最初の細胞をブロックアウトするメカニズムを確立するのには、細胞が悪性となったとき細胞により生成されるプロスタグランジン合成量を変えるためのたった１つの突然変異を考えればよい。したがって、腫瘍性病気、過剰のプロスタグランジン合成に起因する他の病気、関節炎等、いわゆる結合組織炎症疾患、自己攻撃性疾患などの病気に対する応答を特に改善することが不可欠となった。
【００２１】
その他の公知例としては以下のこのが挙げられる。
１．プロスタグランジン拮抗剤によるガン患者の免疫高揚、Immunity to Cancer II Alan R. Liss, Inc．；
２．グッドウイン・ジェイ・エス、（１９８１）プロスタグランジン合成インヒビターによる免疫療法のためのプロスタグランジンＥおよびガン成長ポテンシャル、Augmentive Agents in Cancer Therapy, Raven Press, ニューヨーク。
【００２２】
【課題を解決するための手段】
したがって、本発明は例えばバルーン血管形成術による細胞刺激により生じる動脈内壁の内皮細胞増殖によりもたらされる血管の再狭窄を防止する方法、およびその方法に用いられる薬剤組成物を提供することを目的とする。
【００２３】
さらに、本発明は安全で非毒性のヒアルロン酸を用いての血管再狭窄防止方法を提供することを目的とする。
【００２４】
さらに、本発明は例えば末梢血管システムにおける術後の再狭窄を防止、抑制するための治療方法およびその薬剤組成物を提供することを目的とする。
【００２５】
本発明の他の目的は以下の説明から当業者にとって自明であると思われる。
【００２６】
【発明の実施の形態】
ヒアルロナンの種々の形態、またはヒアルロン酸（特にヒアルロン酸またはその塩）が、刺激を受けた管体壁面の内径（ＩＤ）の狭窄、特にバルーン血管形成術等からもたらされる刺激の結果、内皮細胞が増殖することによる血管の再狭窄を防止することに有効であることを本発明者等は見出した。このヒアルロン酸の形成体（特にヒアルロン酸またはその塩）は静脈注射または注射により約１０ｍｇ／７０ｋｇ体重ないし３０００ｍｇ／７０ｋｇ体重（注射の場合は少量）の有効量を外傷の前後または外傷の際に投与する。
【００２７】
ヒアルロナンまたはヒアルロン酸はグリコサミノグリカンであり、これはＮ−アセチル−グリコサミンとグルグロン酸の繰り返し二糖類単位からなり、発展的に保持されたものである（Laurent and Fraser,1991,ファセブ・ジェイ，6:2397）。ヒアルロナンは細胞の接合、運動性、成長、区別化などに影響を与え、これらの作用は組織に応答することによりヒアルロナンレセプターの表現により媒介される。すなわち、ヒアルロナンは白色細胞に存在するレセプターとの相互作用により白色細胞を凝集させることができる（ターキー・イー・エイ、１９９２、Can, Met. Rev., 11:21）。ヒアルロナンは増大したレセプター表現の部位に、または細胞外ヒアルロナン結合たんぱく質の存在下でほとんど選択的に蓄積する。２つの細胞表面関連レセプターは分子的に特徴づけられ。ＣＤ４４とＰＨＡＭＭ［ＨＡ（ヒアルロナン）−媒介運動性のためのレセプター］を含む。ＲＨＡＭＭは、特に外傷に応答するマクロファージおよび平滑筋細胞などの細胞に多く存在する。
【００２８】
したがって、本発明の１つの態様は、傷づけられた管状体内壁面（管状体は例えばバルーン血管形成術後の動脈である）の狭窄を防止する方法であって、ヒアルロン酸および／またはその塩、および／またはヒアルロン酸の同族体、類似化合物、誘導体、錯体、エステル、分画（フラグメント）および／またはサブユニットの治療有効非毒性投与量を動物に投与することからなる方法を提供することである。このヒアルロン酸は有効量を外傷の前後または外傷の際に投与する。好ましいヒアルロン酸の形態はヒアルロン酸またはその塩である。このヒアルロン酸の投与量は約１０ｍｇ／７０ｋｇ体重ないし３０００ｍｇ／７０ｋｇ体重が好ましい。
【００２９】
本発明の他の態様は、ヒトに対するバルーン血管形成術後の動脈狭窄を防止する方法であって、ヒアルロン酸および／またはその塩、および／またはヒアルロン酸の同族体、類似化合物、誘導体、錯体、エステル、分画（フラグメント）および／またはサブユニットの治療有効非毒性投与量をヒトに投与することからなる方法を提供することである。この場合も好ましいヒアルロン酸の形態はヒアルロン酸またはその塩である。このヒアルロン酸の投与量は約１０ｍｇ／７０ｋｇ体重ないし３０００ｍｇ／７０ｋｇ体重が好ましい。このヒアルロン酸はバルーン血管形成術の前、直後、またはその間に投与することができる。
【００３０】
この組成物は液体の形態で静脈注射により投与され、この場合、必要に応じて適当な希釈液または助剤を含ませてもよい。投与は注射により処理される部位にまたはその近傍に施すことができる。
【００３１】
狭窄抑制薬の治療有効量をヒアルロン酸とともに投与してもよい。その薬剤は前述の公知のもの、その他のものであってもよい。その１つはヘパリンであり、他はヘパリン分解物である。
【００３２】
管状体の狭窄を防止するため、ヒアルロン酸の効果を高めるための非ステロイド系抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）の治療有効量をヒアルロン酸とともに投与してもよい。この非ステロイド系抗炎症剤の添加によりヒアルロン酸の活性が高められ、例えば動脈の再狭窄の防止効果を炎症を少なくすることにより高めることができる。このＮＳＡＩＤは目的に応じて適当なＮＳＡＩＤが用いられ、ジクロフェナック、インドメタシン（例えばＮ−メチルグルカミンに溶かしたもの）、ピロキシカム、ケトロラクの（±）トロメタミン塩、アセチルサリチル酸、ナプロキセンなどであってもよい。このＮＳＡＩＤの量は患者に応じて適当量が選ばれる。ある場合には、体重１ｋｇ当たり１０ｍｇまでの量（例えば体重１ｋｇ当たり１ないし２ｍｇ）が適当である。ジクロフェナックの場合はより多くの量が適当である。通常より多くのＮＳＡＩＤＳが用いられた場合、この過剰のＮＳＡＩＤによる副作用を減少させるため、２００ｍｇ／７０ｋｇヒト以上のヒアルロナンまたはヒアルロン酸（ＨＡ）を投与し、胃腸障害、神経異常、うつ病などのＮＳＡＩＤによる副作用を排除するようにしてもよい。
【００３３】
遊離ラジカル除去剤、ビタミンＣなどの抗酸化剤の有効量をこの組成物に加え、投与されたヒアルロナンまたはヒアルロン酸の効果を助長するようにしてもよい。その量はビタミンＣは可溶性であり腎臓により排泄されるから５０〜１００ｇまで添加できるが、通常はより少なく用いられる。他の抗酸化剤、遊離ラジカル除去剤を用いることもできる。１実施例において、この組成物はヒアルロン酸の形成体、特にヒアルロン酸および／またはその塩、ＮＳＡＩＤ、狭窄抑制剤および／またはビタミンＣからなるもので、管状体の壁面の狭窄を防止するのに用いられる（例えば、バルーン血管形成術の後の動脈再狭窄）。この組成物は複数の投与量からなるものであってもよく、その内から１つの投与量が取出され、使用される。なお、各投与量は有効量の各成分を含むものである。
【００３４】
したがって、本発明の他の態様は、傷づけられた動物またはヒトの管状体内壁面の狭窄を防止するための薬剤組成物であって、ヒアルロン酸および／またはその塩、および／またはヒアルロン酸の同族体、類似化合物、誘導体、錯体、エステル、分画（フラグメント）および／またはサブユニットの治療有効非毒性投与量を適当な希釈剤または薬理学的に許容し得るキャリアーまたは助剤とともに用いるものであって、これを外傷が生じる直前または直後に用いる薬剤組成物を提供することである。好ましいヒアルロン酸またはヒアルロナンの形成体はヒアルロン酸およびその塩、例えばヒアルロン酸ナトリウムである。
【００３５】
本発明のさらに他の態様は、ヒトに対するバルーン血管形成術後の動脈狭窄を防止するための薬剤組成物の使用であって、ヒアルロン酸および／またはその塩、および／またはヒアルロン酸の同族体、類似化合物、誘導体、錯体、エステル、分画（フラグメント）および／またはサブユニットの治療有効性非毒性投与量を適当な希釈剤または薬理学的に許容し得るキャリアーまたは助剤とともに用いる薬剤組成物の使用を提供することである。この場合も好ましいヒアルロン酸の形態はヒアルロン酸またはその塩である。このヒアルロン酸の投与量は約１０ｍｇ／７０ｋｇ体重ないし３０００ｍｇ／７０ｋｇ体重が好ましい。
【００３６】
この薬剤組成物の形態の１つとして、これを静脈投与するものであって、外傷を受ける直前（例えばバルーン血管形成術の前）に投与される。他の例として、ヒアルロン酸はバルーン血管形成術の直後に投与することができる。
【００３７】
この発明のさらに他の形態として、この薬剤組成物は、治療有効量の非ステロイド系抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）例えばジクロフェナク、インドメタシン（例えばＮ−メチルグルカミンに溶かしたもの）、ピロキシカム、ケトロラクの（±）トロメタミン塩、アセチルサリチル酸を含み、ヒアルロン酸形成体の狭窄防止効果を向上させるものを提供する。
【００３８】
本発明のさらに他の態様として、バルーン血管形成術後の動脈狭窄を防止するための薬剤組成物の使用であって、ヒアルロン酸および／またはその塩の治療有効非毒性投与量を適当な希釈剤または薬理学的に許容し得るキャリアーまたは助剤とともに用いる薬剤組成物の使用（例えば、静脈投与による）を提供することである。このヒアルロン酸および／またはその塩の投与量は約１０ｍｇ／７０ｋｇ体重ないし３０００ｍｇ／７０ｋｇ体重である。この薬剤組成物は、治療有効量の非ステロイド系抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）を含み、ヒアルロン酸および／またはその塩の狭窄防止効果を向上させるようにしてもよい。このＮＳＡＩＤの量はＮＳＡＩＤの種類に応じて適当量が選ばれる。ある場合には、体重１ｋｇ当たり１０ｍｇまでの量（例えば体重１ｋｇ当たり１ないし２ｍｇ）が適当である。ジクロフェナックの場合はより多くの量が適当である。通常より多くのＮＳＡＩＤＳを用いることが必要な場合、２００ｍｇ／７０ｋｇヒト以上のヒアルロナンまたはヒアルロン酸（ＨＡ）を投与することが好ましい。
【００３９】
この組成物は、さらに治療有効量のビタミンＣ、遊離ラジカル除去剤、抗酸化剤を含め、投与されたヒアルロン酸の効果を助長するようにしてもよい。ビタミンＣは大量（例えば５０〜１００ｇ）に使用可能であるが、これより可なり少ない量でもよい。
この組成物はさらに狭窄抑制薬の有効量を含むものであってもよい。
この組成物はヒアルロン酸および／またはその塩、ＮＳＡＩＤの１つ、ビタミンＣ、遊離ラジカル除去剤、抗酸化剤および狭窄抑制薬を含むものであってもよい。
【００４０】
本発明のさらに他の態様は、ヒアルロン酸および／またはその塩、および／またはヒアルロン酸の同族体、類似化合物、誘導体、錯体、エステル、分画（フラグメント）および／またはサブユニットの治療有効非毒性投与量を使用することである。
【００４１】
さらに、本発明は、バルーン血管形成術の結果、外傷を受けた動物の管状内壁面の狭窄を防止するための本発明の薬剤組成物の製造において、ヒアルロン酸および／またはその塩、および／またはヒアルロン酸の同族体、類似化合物、誘導体、錯体、エステル、分画（フラグメント）および／またはサブユニットの治療有効非毒性投与量の使用することであり、これにより例えばバルーン血管形成術後の動脈再狭窄を防止するものである。このヒアルロン酸および／またはその塩の投与形態は液体であり、好ましくはヒアルロン酸形成体の投与量は約１０ｍｇ／７０ｋｇ体重ないし３０００ｍｇ／７０ｋｇ体重であり、より好ましくはヒアルロン酸形成体の投与量は２００ｍｇ／７０ｋｇ体重あるいはそれ以上である。
【００４２】
これらの組成物は複数投与量を含むものであってもよい。
さらに、本発明の１つの態様は、ヒトのバルーン血管形成術後の動脈内壁面の再狭窄を防止するための本発明の薬剤組成物の提供である。この薬剤組成物はバルーン血管形成術の前、あるいは外傷発生の直後に与えることができる。
【００４３】この発明の他の態様によれば、
（１）ヒアルロン酸および／またはその塩、および／またはヒアルロン酸の同族体、類似化合物、誘導体、錯体、エステル、分画（フラグメント）および／またはサブユニットと、
（２）非ステロイド系抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）、狭窄抑制剤、ビタミンＣ、遊離ラジカル除去剤、抗酸化剤、これらの組合わせから選ばれるものと、
が用いられる。
【００４４】
さらに、本発明は、外傷を受けた動物の管状内壁面の狭窄を防止するための薬剤組成物（希釈剤、キャリアーまたは助剤を含む）の製造において、ヒアルロン酸および／またはその塩、および／またはヒアルロン酸の同族体、類似化合物、誘導体、錯体、エステル、分画（フラグメント）および／またはサブユニットの治療有効非毒性投与量を治療有効量の添加剤（２）とともに使用するものであり、この成分（１）の使用が動物の管状内壁面の狭窄を防止するのに十分であり、成分（２）が成分（１）の狭窄防止作用を向上させるものであることを特徴とするものである。この組成物は複数の投与量からなるものであってもよく、その内から１つの投与量が取出され、使用される。
【００４５】
この成分（１）はヒアルロン酸および／またはその塩であり、その投与形態は液体（例えば静脈投与または注射）である。好ましくは成分（１）は約１０ｍｇ／７０ｋｇ体重ないし３０００ｍｇ／７０ｋｇ体重の範囲で用いられ、１例として２００ｍｇ／７０ｋｇ体重あるいはそれ以上で使用される。
【００４６】
成分（２）は成分（１）の効果を促進するのに有効な量を以て用いられる。ビタミンＣは１投与量として５０〜１００ｇの範囲で使用可能であるが、これより可なり少ない量が好ましい。このＮＳＡＩＤの量はＮＳＡＩＤの種類に応じて適当量が選ばれる。ある場合には、体重１ｋｇ当たり１ないし２ｍｇで用いられるが、その他の場合においては体重１ｋｇ当たり１０ｍｇまでの量が用いられ、ジクロフェナックの場合はより多くの量が適当である。通常より多くのＮＳＡＩＤＳを用いることが必要な場合、２００ｍｇ／７０ｋｇヒト以上のヒアルロナンまたはヒアルロン酸（ＨＡ）を投与することが好ましい。ＮＳＡＩＤの適当な例としては、ジクロフェナク、インドメタシン（例えばＮ−メチルグルカミンに溶かしたもの）、ピロキシカム、ケトロラクの（±）トロメタミン塩、アセチルサリチル酸、ナプロキセンである。
【００４７】
さらに、本発明は、外傷を受けた動物の管状内壁面の狭窄を防止するための薬剤組成物（必要に応じて希釈剤を含む）であって、外傷を受けた動物の管状内壁面の狭窄を防止するためのヒアルロン酸および／またはその塩、および／またはヒアルロン酸の同族体、類似化合物、誘導体、錯体、エステル、分画（フラグメント）および／またはサブユニットの治療有効非毒性投与量を治療有効量を含んでなるものを提供する。好ましくは、ヒアルロン酸の形態はヒアルロン酸および／またはその塩であって、その投与形態は液体（例えばI.Vバッグに静脈投与（I.V）の形態で希釈剤、薬理学的に許容し得るキャリアーまたは助剤とともに用いる）である。このヒアルロン酸は約１０ｍｇ／７０ｋｇ体重ないし３０００ｍｇ／７０ｋｇ体重の範囲で用いられ、１例として２００ｍｇ／７０ｋｇ体重あるいはそれ以上で使用される（特にＮＳＡＩＤＳが過剰に用いられたとき）。１具体例として、この薬剤組成物はヒトにおけるバルーン血管形成術後または前に動脈再狭窄防止のため用いられる。この薬剤組成物は複数の投与量からなるものであってもよく、その内から１つの投与量が取出され、使用される。
【００４８】
さらに、本発明の別の態様において、以下の成分からなる薬剤組成物（希釈剤、薬理学的に許容し得るキャリアーまたは助剤とともに）を提供することである。すなわち、この薬剤組成物は、
（１）ヒアルロン酸および／またはその塩、および／またはヒアルロン酸の同族体、類似化合物、誘導体、錯体、エステル、分画（フラグメント）および／またはサブユニットと、
（２）非ステロイド系抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）、狭窄抑制剤、ビタミンＣ、遊離ラジカル除去剤、抗酸化剤、これらの組合わせから選ばれるものと、
からなる。
【００４９】
この薬剤組成物は、外傷を受けた動物の管状内壁面の狭窄を防止するためのものであり、ヒアルロン酸および／またはその塩、および／またはヒアルロン酸の同族体、類似化合物、誘導体、錯体、エステル、分画（フラグメント）および／またはサブユニットの治療有効非毒性投与量を治療有効量の添加剤（２）とともに使用するものであり、この成分（１）の使用量が動物の管状内壁面の狭窄を防止するのに十分であり、成分（２）が成分（１）の狭窄防止作用を向上させるものであることを特徴とするものである。この成分（１）はヒアルロン酸および／またはその塩、例えばナトリウム塩であり、その投与形態は液体、例えば静脈投与用のもの（I.V.バッグ）である。この組成物は複数の投与量からなるものであってもよく、その内から１つの投与量が取出され、使用される。
【００５０】
すなわち、この組成物は複数の投与量をバッグに収容し、必要に応じて取出すものである。成分（１）は約１０ｍｇ／７０ｋｇ体重ないし１０００ｍｇ／７０ｋｇ体重の範囲で用いられ、場合によっては、３０００ｍｇ／７０ｋｇ体重またはそれ以上用いてもよい。成分（２）のＮＳＡＩＤが過剰に用いられた場合は、成分（１）を２００ｍｇ／７０ｋｇ体重あるいはそれ以上で使用することが好ましい。１具体例として、この薬剤組成物はヒトにおけるバルーン血管形成術後または前、あるいはバルーン血管形成術の最中に動脈再狭窄防止のため用いられる。
【００５１】
成分（２）は成分（１）の効果を促進するのに有効な量を以て用いられる。ビタミンＣは１投与量として５０〜１００ｇの範囲で使用可能である。このＮＳＡＩＤの量はＮＳＡＩＤの種類に応じて適当量が選ばれる。通常より多くのＮＳＡＩＤＳを用いることが必要な場合、２００ｍｇ／７０ｋｇヒト以上のヒアルロナンまたはヒアルロン酸（ＨＡ）を投与することが好ましい。ＮＳＡＩＤの適当な例としては、ジクロフェナク、インドメタシン（例えばＮ−メチルグルカミンに溶かしたもの）、ピロキシカム、ケトロラクの（±）トロメタミン塩、アセチルサリチル酸、ナプロキセンである。
【００５２】
この薬剤組成物がＮＳＡＩＤ、狭窄抑制剤、ビタミンＣ、遊離ラジカル除去剤、抗酸化剤、これらの組合わせからなる薬剤を含む場合、ヒアルロン酸および／またはその塩、および／またはヒアルロン酸の同族体、類似化合物、誘導体、錯体、エステル、分画（フラグメント）および／またはサブユニットは、この薬剤の損傷部への移動を容易にし、これによりこの薬剤が細胞内（動脈細胞、内皮細胞）へ浸透させ、これによりヒアルロン酸等とともに例えば動脈再狭窄の防止に役立つようにする。
【００５３】
これら薬剤を所定の部位に容易に移動させることに関して述べると、エチルアルコールをガン腫瘍部位に直接導入し、ソノグラフ（超音波）により評価するとき、エチルアルコールは腫瘍部位全体に分散していない。これに対しエチルアルコールをヒアルロン酸および／またはその塩とともにガン腫瘍部位に直接導入した場合は、エチルアルコールは腫瘍部位全体に分散することが実証された。このヒアルロン酸はこのように薬剤の移送を容易にするが、ヒアルロン酸および／またはその塩、および／またはヒアルロン酸の同族体、類似化合物、誘導体、錯体、エステル、分画（フラグメント）および／またはサブユニットは、ＮＳＡＩＤ、狭窄抑制剤、ビタミンＣ、遊離ラジカル除去剤、抗酸化剤と任意の形態で使用することができる。
【００５４】
このヒアルロン酸および／またはその塩は他の異なる薬剤（例えばＮＳＡＩＤ、狭窄抑制剤、ビタミンＣ等）との組合わせにおいて、人体における分布、作用を変えることができ、損傷または病変組織へのターゲット性を向上させる。これに関連して、アスコルビン酸（ビタミンＣ）を遊離ラジカル除去剤として（５０ｇｍ／日…ビタミンとして治療目的に投与される１日当たりの量の１０００倍）、３００〜５００ｍｇのヒアルロン酸（ナトリウム塩）とともに静脈投与した場合、炎症を減少させることができる。ヒアルロン酸はアスコルビン酸の作用を高め、この高められた作用により遊離ラジカルが除去され、すなわち遊離ガジカル除去剤として働く。
【００５５】
同様のことがＮＳＡＩＤＳとともに使用した場合も言えることである。可溶性インドメタシンの可なりの量が必要な場合、この薬品をｎ−メチルグルカミンを用いて溶かし、メチルグルカミンの５ｍｇ／ｍｌ溶液（ＮＭＧ）とする。この物質を２２ミクロンのミリポアフィルターに通過させて滅菌状態にする。この物質は動物においての治療量の１６倍で非毒性である。この理由によりヒトにも有効に用いることができる。すなわち、ＮＭＧに溶かしたインドシド（商標）を、患者に１０ｍｇ／ｋｇ以下の範囲で変化させて静脈投与する。このインドメタシンの各１投与量はヒアルロン酸（例えば「LifeCore」ヒアルロン酸［ナトリウム塩］）を例えば２００〜１０００ｍｇと組合わされている。これは「LifeCore」とともにインドメタシンおよびＮＭＧに希釈されて用いられ、いかなる経路を介しても安全に投与し得る。他の方法、例えば抽出により製剤されたヒアルロン酸についても同様の研究がなされた。この場合の抽出液は静脈投与に適しているものである。
【００５６】
このようにＮＳＡＩＤ、例えばインドメタシン（ｎ−メチルグルカミンに溶かして）、または他のＮＳＡＩＤを２００ｍｇ以上のヒアルロン酸とともにＮＳＡＩＤ（１例においては、インドメタシンおよびＮＭＧ）が体重１ｋｇ当たり１ないし２ｍｇとなるようにして投与しても、胃腸障害、神経異常、うつ病などの副作用が生ぜず、また、これ以上の量のインドメタシン（必要に応じ）を与えた場合も同様である。もし、ヒアルロン酸をこの量より少なく与えた場合、このような副作用が生じる虞れがある。さらに、ＮＤＡＩＤ（例えばIndocid、商標）をヒアルロン酸と組合わせて用いることにより応答が良好となり、患部へのターゲット性がこの静脈投与により実証された。すなわち、他の薬剤（例えばビタミンＣ）とともに、５０〜２００ｍｇのＮＳＡＩＤとヒアルロン酸（ナトリウム塩）（例えばインドメタシンとヒアルロン酸）を投与された患者は痛みが急速に改善されることが観測された。すなわち、ＮＳＡＩＤとヒアルロン酸（ナトリウム塩）を投与することにより、マクロファージの機能を妨害するプロスタグランジン合成の酵素的生産が阻止されるものと考えられる。すなわち、ヒアルロン酸（塩、その他の形態）はＮＳＡＩＤの活性を高めるだけでなく、プロスタグランジン合成インヒビターに使用に伴う副作用および毒性を減少させることが確認された。
【００５７】
このヒアルロン酸およびその塩は約１０ｍｇ／７０ｋｇ体重ないし１０００ｍｇ／７０ｋｇ体重の範囲で適宜用いられ、毒性がないので、場合によっては例えば３０００ｍｇ／７０ｋｇ体重の大量を投与しても悪作用は生じない。
【００５８】
本発明に適したヒアルロン酸および／またはその塩（ナトリウム塩）、およびその同族体、類似化合物、誘導体、錯体、エステル、分画（フラグメント）および／またはサブユニットから選ばれる１つの形態のものは、Hyal Pharmaceuticals社から入手できる。このものはヒアルロン酸ナトリウム（２０ｍｇ／ｍｌ）の１５ｍｌビンである（３００ｍｇ／ビン−ロット番号：２Ｆ３）。このヒアルロン酸ナトリウム分画は平均分子量が２２５，０００の２％溶液である。この分画は十分量の水を含み、この水はＵ．Ｓ．Ｐ．に従って注射用に３回蒸留され、滅菌されたものである。ヒアルロン酸および／またはその塩は反応を生じないブチル栓で密封されたホウけい酸硝子ビンに収容されて選ばれる。
【００５９】
ヒアルロン酸および／またはその塩（ナトリウム塩）、およびその同族体、類似化合物、誘導体、錯体、エステル、分画（フラグメント）および／またはサブユニット、好ましくはヒアルロン酸および／またはその塩は以下の特徴を有する。
自然物から得られる精製され、実質的に熱源を含まないヒアルロン酸の分画は以下から選ばれる少なくとも１つの特徴を有する。
i)分子量が１５０，０００〜２２５，０００の範囲内である。
ii)全重量に基づいて硫酸塩化ムコ多糖類を約１．２５％未満含む。
iii)全重量に基づいて０．６％未満のたんぱく質を含む。
iv)全重量に基づいて１５０ｐｐｍ未満の鉄を含む。
V)全重量に基づいて１５ｐｐｍ未満の鉛を含む。
Vi)０．００２５％未満のグルコサミンを含む。
Vii)０．０２５％未満のグルクロン酸を含む。
Viii)０．０２５％未満のＮ−アセチルグルコサミンを含む。
iX)０．００２５％未満のアミノ酸を含む。
X)ＵＶ吸収係数が２５７ｎｍで約０．２７５未満である。
Xi)ＵＶ吸収係数が２８０ｎｍで約０．２５未満である。
Xii)ｐＨが７．３〜７．９の範囲である。
【００６０】
好ましくは、ヒアルロン酸は水と混合され、ヒアルロン酸の分画が１５０，０００〜２５２５，０００の範囲の平均分子量を有するものである。より好ましくは、ヒアルロン酸の分画は下記の特徴の少なくとも１つ有するものである（より好ましくはこれら全ての特徴を有していることである）。
i)全重量に基づいて硫酸塩化ムコ多糖類を約１％未満含む。
ii)全重量に基づいて０．４％未満のたんぱく質を含む。
iii)全重量に基づいて１００ｐｐｍ未満の鉄を含む。
iv)全重量に基づいて１０ｐｐｍ未満の鉛を含む。
V)０．００１６６％未満のグルコサミンを含む。
Vi)０．０１６６％未満のグルクロン酸を含む。
Vii)０．０１６６％未満のＮ−アセチルグルコサミンを含む。
Viii)０．００１６６％未満のアミノ酸を含む。
X)ＵＶ吸収係数が２５７ｎｍで約０．２３未満である。
Xi)ＵＶ吸収係数が２８０ｎｍで約０．１９未満である。
Xii)ｐＨが７．５〜７．７の範囲である。
【００６１】
ヒアルロン酸および／またはその塩（ナトリウム塩）、およびその同族体、類似化合物、誘導体、錯体、エステル、分画（フラグメント）および／またはサブユニットを他のメーカーからのものを選ぶこともできる。
【００６２】
本発明者はLifeCore Biomedical社から製造、販売されていて、以下の特性を有するヒアルロン酸ナトリウムを使用することを提案する。
0003742955.tif 000002
【００６３】
本願発明は、公知のヒアルロン酸の用途を提案する物である。
【００６４】
以下の文献には適当なヒアルロン酸の原料、製造方法、回収方法が記載されている。
【００６５】
米国特許Ｎｏ．４，１４１，９７３には以下の特性を有するヒアルロン酸分画が記載されている。
”（ａ）平均分子量が７５０，０００以上、好ましくは１，２００，０００以上、すなわち極限粘度数が1400ｃｍ3／ｇ、好ましくは約2000ｃｍ3／ｇ以上；
（ｂ）たんぱく質含量が０．５重量％未満；
（ｃ）ヒアルロン酸ナトリウムの１％溶液の紫外線吸収度が２５７ｎｍ波長で３．０未満、２８０ｎｍ波長で２．０未満；
（ｄ）生理学的緩衝液におけるヒアルロン酸ナトリウムの１％溶液の動粘度が約１０００センチストローク以上、好ましくは１０，０００センチストローク以上；
（ｅ）生理学的緩衝液におけるヒアルロン酸ナトリウムの０．１〜０．２％溶液の分子旋光性が２２０ｎｍでの測定において−１１ｘ１０3度−ｃｍ2／モル（二糖類）；
（ｆ）生理学的緩衝液に溶かしたヒアルロン酸ナトリウムの１％溶液の１ｍｌをふくろうモンキーの目の硝子液のほぼ半分を置換するようにして投与したとき、硝子前部チャンバーの細胞浸透は認められない、水様液におけるフレアは認められない、ガラス質における霞みまたはフレアは認められない、角膜、レンズ、光彩、網膜および脈絡膜の病理学的変化は認められない、また、上記ＨＵＡは：
（ｇ）無菌で発熱源はない；
（ｈ）非抗原性のものである。”
【００６６】
米国特許Ｎｏ．４，１４１，９７３を公知技術として挙げているカナダ特許Ｎｏ．１，２０５，０３１は平均分子量が５０，０００〜１００，０００；２５０，０００〜３５０，０００；５００，０００〜７３０，０００のヒアルロン酸分画、およびその製造方法を記載している。
【００６７】
高分子量のヒアルロン酸（塩またはその他の形態でもよい）が用いられる場合は、希釈し投与し易いようにし、凝集が生じないようにするとともに生態機能と干渉しないようにする。
【００６８】
アスコルビン酸（ビタミンＣ）の１つの組成がSteris Laboratories社、フェニクス、アリゾナ、８５０４３、米国で製造されており、これは２２ｍｇ／ｍｌ（アスコルビン酸ナトリウム２５０ｍｇ／ｍｌに相当）からなり、３０ｍｌ、５０ｍｌ、１００ｍｌの容器で販売されている。なお、３０ｍｌの大きさが好ましい。
【００６９】
本発明の具体例を説明するため外科手法が採られ、その結果が図面に示された。
【実施例】
【００７０】
実施例の簡単な説明
以下の実験が行われた。
１０匹のラビットを麻痺させ、バルーン血管形成術を施した。これらのラビットはヒアルロナン（５ｍｇ／ｍｌ）、または緩衝液のみで灌流させ、回復させた。外傷付与後２、２４、４８時間で致死させ、頸動脈を組織研究のために処理し、一連の５〜１０μｍ切片を処理のために切出した。この切片をヘマトキシリンまたは抗ＲＨＡＭＭ抗体で着色させた。各処理について１０個の切片を分析した。
【００７１】
その結果を図を参照して説明する。
図１：損傷させた頸動脈は内皮細胞層の削剥と白色細胞の付着が認められた（図１Ａ）。白色細胞はＩｇＧ背景との関連でＲＨＡＭＭに対し陽性的に着色した（図１Ｂ）。ヒアルロナンに露出させた頸動脈（図１Ｃ）または模擬手術を行った動脈（図１Ｄ）は無傷の内皮細胞層が見られ、また白色細胞の蓄積も認められなかった。
【００７２】
図２：頸動脈によるＲＨＡＭＭ表現のウエスターン・トランスブロット分析。頸動脈を均質化し、解放されたたんぱく質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ上にて電気泳動させ、ＲＨＡＭＭの存在をモノ−特異抗体で検出した。抗体の存在は化学ルミネッセンスで可視化し、結合抗体の相対量は光学密度計で定量した。その結果、手術した動物はＲＨＡＭＭの存在の急激で著しい増加を示した。このＲＨＡＭＭの存在の程度は外傷付与後、５〜６日までに低下した。模擬手術した動物ではＲＨＡＭＭ表現の増加は認められなかった。
【００７３】
図３：外傷４日後の頸動脈の平滑筋細胞におけるＲＡＨＭＭ（図３Ａ）およびヒアルロナン（図３Ｂ）の表現。ＲＡＨＭＭ表現は白色細胞において直ちに高くなった（図１）。他方、平滑筋細胞におけるＲＡＨＭＭ表現は後に運動の開始と同時に増大した。模擬手術した動物の平滑筋細胞ではＲＡＨＭＭ表現について同様の増大を示さなかった（図３Ｃ）。
【００７４】
図４：ＩＬ−８に応答する好中球走化性に対するＲＨＡＭＭペプチドの影響。ＲＨＡＭＭのヒアルロナン結合領域に模倣するＲＨＡＭＭペプチドはボイデン・チャンバー・アッセイにおいて好中球走化性（５ａ）を抑制する。
【００７５】
図５：ＲＨＡＭＭペプチドおよび抗体は補体に応答するマクロファージ細胞ライン（Ｓ１，ＷＥＨＩ−３）の走化性を抑制する。熱不活性化されていない補体（５６℃）はマクロファージ細胞ラインの走化性を刺激する。ＲＨＡＭＭのヒアルロナン結合領域に模倣するＲＨＡＭＭペプチドおよび抗ＲＨＡＭＭ抗体は走化性を抑制する。
【００７６】
図６：外傷に応答する平滑筋細胞の運動性を抑制するＲＨＡＭＭペプチド。ＲＨＡＭＭのヒアルロナン結合領域に模倣するＲＨＡＭＭペプチドは外傷平滑菌細胞運動性を抑制する。スクランブルしたペプチドは“センス”ペプチドに対し特異性を示す作用はない。
【００７７】
ＲＨＡＭＭ表現（ＲＨＡＭＭに対するモノ特異的抗体を用いるウエスターン・トランスブロット分析と呼ばれる検出法により決定される）（Turley, e.A., Austin, L., Vandeligt, K.およびClary, C., 1991, J. Cell Biol., 112:1041）はこのレセプターの表現の急激な増大を示し、これは２時間以内に検出された（図２）。この時間帯において白色細胞が対照動物において内皮に付着することが認められた（図２）。［ＲＨＡＭＭについての詳細は文献、“ヒアルロナンレセプターＲＨＡＭＭにおける２つのヒアルロナン結合領域の駅別”、Baihua Yang,Liying Zhang,Eva Ann Turley,ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、Vol.268,No.12,４月２５日発行、pp.8617-8623,1993”を参照のこと］ＲＨＡＭＭはコントララテラル動脈においても増大し、外傷組織からＲＨＡＭＭ表現を規制する可溶性因子を放出を示唆していた。しかし、模擬手術動物においてはＲＨＡＭＭ表現の増大は認められなかった（図２）。実験動物において、このＲＨＡＭＭ表現は数日間維持され、ついでそのレベルが下がった。固定された組織の検査の結果、ＲＨＡＭＭを表現する主細胞は活性化された白色細胞と平滑筋細胞であることが示されていた（図１、３）。白色細胞および平滑筋細胞運動性におけるＲＨＡＭＭの関与は生体外で像分析を用いランダム運動性を測定し、ボイデン・チャンバーを用いて走化性を測定することにより評価した。ＲＨＡＭＭの区域（特にヒアルロナン結合領域）を模倣するペプチド（１００ｎｇ／１プレート）はマクロファージ（図４）、ニューロフィル（図５）、および平滑筋細胞（図６）の移行を可なり抑制する（ｐ＞０．０００１，Student's'T'test）。集約的に、これらの結果はＲＨＡＭＭ、特にそのヒアルロナン結合能は白色細胞および平滑筋細胞の運動性に不可欠なものであり、その表現はラビットにおける実験的バルーンカテーテル使用による外傷部位で高められることを示している。
【００７８】
外傷の直前のラビットのヒアルロナン処理は白色細胞の内皮への付着をなくし、組織学的標準で検出する限り無傷である（図１）。外傷の数日後に頸動脈をヒアルロナン処理したものは対照と同様に無傷の内皮を示している。
【００７９】
これらの結果の理由としては、ヒアルロナンがレセプター、、ＲＨＡＭＭの高いレベルを表す細胞に結合し、これらの細胞と内皮との後の相互作用を防止するためと考えられる。他のヒアルロナンレセプター、ＣＤ４４の表現もまた高められると予測される。
【００８０】
この発明で用いられる用語、表現の説明のため、後述の未公開の文献、「バルーンカテーテル外傷後の新生内膜形成：ヒアルロナンおよびヒアルロナンレセプターＲＨＡＭＭの役割」を参照されたい。
【００８１】
「バルーンカテーテル外傷後の新生内膜形成：ヒアルロナンおよびヒアルロナンレセプターＲＨＡＭＭの役割」
【００８２】
要約
ヒアルロナン（ＨＡ）およびＨＡレセプターＲＨＡＭＭ（ヒアルロン酸媒介運動性についてのレセプター）との相互作用が生体外で平滑筋細胞移行に示唆されているから、我々は平滑筋細胞およびラット頸動脈のバルーンカテーテル脱内皮化に影響を及ぼす外傷の生体外モデルにおけるこれらの分子の表現を調査した。白血球および平滑筋細胞を外傷後ＲＨＡＭＭの表現において一次的に影響を与えた。この外傷、２時間後好中球およびマクロファージを外傷部位に付着させ、ＲＨＡＭＭを強く表現させた。６時間までの中間の平滑筋細胞の減少が認められ、これは内部弾性層に隣接するＲＨＡＭＭの表現の増加を実証するものである。脱内皮化から４８時間後にＲＨＡＭＭおよびＨＡの双方を強く染める平滑筋の層がルーメンの近傍に形成された。外傷７無いし１４日後、この新生内膜層は高いレベルのＲＨＡＭＭを示したがＨＡは中間層と新生内膜層との結合部の細胞に限定された。ＲＨＡＭＭの２つの類似形（６５および８４ｋＤａ）は対照動脈に見られた。外傷動脈でのＲＨＡＭＭおよびＨＡについての染色増大とともに、ＲＨＡＭＭの薄膜を表す７０ｋＤａ類似形が外傷から３６ないし７２時間の間に現れた。好中球およびマクロファージ化走性は抗ＲＨＡＭＭ抗血清およびペプチドコード化ＲＨＡＭＭ  ＨＡ−結合領域により抑制された。生体外外傷ののちの平滑筋細胞の移行もまたこれらの試薬により抑制された。要約すると、これらの結果からＲＨＡＭＭおよびＨＡは血管外傷に応答する細胞移行に有効であることを示唆している。
【００８３】
序文
ラットの頸動脈のバルーンカテーテルによる脱内皮はバルーン血管形成術1の後の再狭窄の一般的モデルである。炎症細胞付着、平滑筋細胞増殖および内膜への移行、過剰の細胞外マトリックス生成の一連の過程が外傷後の血管の狭窄をもたらす1-5。血小板誘起成長ファクター（ＰＤＧＦ）6および転形成長ファクターβ（ＴＧＦ−β）7のような成長ファクター、アンギオテンシン8のようなホルモン、および組織−、およびウロキナーゼ−プラスミノゲン・アクチベータ9のようなプロテアーゼはこのプロセスを規制する。炎症性細胞もまた、ＰＤＧＦ、ＴＧＦ−β1を含む広範な成長ファクターを生成することにより、応答を調節する。外傷時において、中間層内の平滑筋細胞のほんの一部が増殖を行い、新生内膜層が内部弾性層11を介して、これらの細胞の移行により形成される。これらの平滑筋細胞により堆積された過剰の細胞外マトリックスは外傷動脈のルーメンの寸法の減少をもたらす12。生体内外傷により発生する炎症性細胞化走性および平滑筋細胞移行によるメカニズムは依然解明されていない。
【００８４】
我々は先に生体外で、ＲＨＡＭＭ：ＨＡ相互作用がras-転形細胞13および平滑筋細胞の外傷部位への移行に必要であることを示した（サバニ等）。この単一層への外傷は細胞関連ＨＡ、ＲＨＡＭＭの新規な７０ｄＤａ類似形、およびＲＨＡＭＭの細胞表面偏在化の増大を外傷後の運動性の促進とともにもたらす。さらにこのレセプターへのＨＡ結合を妨害するポリクローンＲＨＡＭＭ抗血清剤は外傷に対する移行応答を抑制した（サバニ等）。この研究において、新生内皮の発達の間において、バルーンカテーテルの誘起の外傷ラット頸動脈におけるＲＨＡＭＭおよびＨＡの双方の分布および表現を調査した。さらに、抗ＲＨＡＭＭ抗血清およびＲＨＡＭＭペプチド血管細胞の走化性と移行に対する影響を研究した。
【００８５】
材料と方法
動物
１５週齢、体重３２５〜３５０ｇの雄のスプラグ−ダウレイ・ラット（チャール・リバー）をこの実験全体を通して用いた。
バルーンカテーテル誘起の外傷
８０ｍｇ／ｋｇのケタミン（Ａｖｅｃｏ）と６ｍｇ／ｋｇのキシラジン（ハバー）を筋肉注射してこれら動物を麻酔にかけた。左側頸動脈を露出させ、２Ｆフォガティ・バルーンカテーテル（バックスター、モデル１２−０６０−２Ｆ）をそのルーメン（孔）に導入した。このバルーンを膨らまし、カテーテルを頸動脈に３回移動させ、内皮を除去した。この外傷を受けた動物から頸動脈を採取した。模擬手術した動物の左側頸動脈をカテーテルを通過させることなく露出させ、右側動脈を採取した。
【００８６】
抗ＲＨＡＭＭ抗血清およびＲＨＡＭＭ  ＨＡ結合ペプチド
ポリクローン抗血清（抗ペプチドaa269-288AB，サバニ等）をラビット中でＲＨＡＭＭｃＤＮＡ14にコード化したペプチド（aa269-288）にあげた。この抗血清は損傷後にＨＡ刺激ランダム運動性および平滑筋細胞の移行性を妨害することが示された。さらに、ＲＨＡＭＭに対するＨＡ結合を部分的に妨害することが認められた（サバニ等）。
【００８７】
ＲＨＡＭＭに対するＨＡ結合区域は２つの１０個のアミノ酸領域からなり、この領域はたんぱく質のカルボキシ末端に近接する。領域Ｉ（アミノ酸401-411）に似せたペプチド−ＹＫＱＫＩＫＨＶＶＫＬＫ−および同じアミノ酸をランダムに配列してなる混合ペプチドをManitoba Institute of Cell Biologyで合成した。この双方のペプチドは最終濃度２μｇ／ｍＬで運動性評価に用いた。
【００８８】
免疫細胞化学
免疫細胞化学のため採取した動脈を１０％燐酸緩衝ホルマリン液に固定し、パラフィンに埋め込み、処理し、５μｍの切片を得た。組織の非特異性部位を、０．０１Ｍトリス緩衝塩液（ＴＢＳ）に溶かした１．５％ヤギ血清で１時間、ブロックした。これら切片を１．５％のヤギ血清を含む０．０１ＭＴＢＳに溶かした抗ペプチドaa269-288AB（１：１００希釈）で培養してＲＨＡＭＭの検出し、あるいはウシ軟骨から分離したアグレカンのビオチニル化ＨＡ結合領域（１：３００希釈）で培養してＨＡの検出した。ＲＨＡＭＭ染色のための切片はビオチニル化ヤギ抗ラビットＩｇＧ（Vectastain ABパーオキシダーゼ・キット、Vector Labs.,Burlingame,CA,０．０１Ｍ  ＴＢＳ：５μＬ／ｍＬ）で培養した。内因性パーオキシダーゼの活性はメタノール（Mallinckrodt）に溶かした０．６％過酸化水素で室温（ＲＴ）下、３０分間抑制した。ついで、全ての切片をアビジン−ビオチン−パーオキシダーゼ錯体（Vectastain,Vecto Labs.）で室温で１時間、培養した。染色はヂアミノベンザジン（DAB,Sigma,０．０５Ｍ  ＴＢＳ中１０μｇ／ｍＬ）を用いて行い、反応は蒸留水で停止させた。反応生成物の色は０．５％の硫酸銅を０．９％のＮａＣｌに溶かしたもので１０分間処理し高められた。この切片の対比染色を０．２５％メチルグリーンを用いて１５分間行った。ｎ−ブタノールおよびキシリレン中で清浄化したのち、切片をPermount（商標）（Fisher Scientific）に乗せた。ＲＨＡＭＭに対する染色特異性はアフィニティ・クロマトグラフィによりＲＨＡＭＭ抗体を除去した血清を用い、染色を著しく減少させることにより確認された。ＨＡに対する染色特異性は染色前に過剰のＨＡを有するプローブの培養により、または染色前にＨＡを劣化するためStrepromycesヒアルロニダーゼで切片を前処理することにより確認された。正常ラビットＩｇＧ（５μｇ／ｍＬ，Sigma）および抗サイトスケレタル・アクチン抗体（１：１０００希釈，Sigma）をネガチブおよびポジティブ対照としてそれぞれ用いた。
【００８９】
免疫ブロット
頸動脈を液体窒素中でスナップ凍結させ、−８０℃にて分析のため維持した。この組織を溶解緩衝液［２５ｍＭトリスＨＣｌ、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム、１％トリトン  Ｘ−１００、１％デオキシコラート、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、プロテアーゼ・インヒビター・レウペプチン（１μｇ／ｍＬ）、フェニルミチルスルホニルフロリド（２ｍＭ）、ペプスタチンＡ（１μｇ／ｍＬ）、アプロチニン（０．２ＴＩＵ／ｍＬ）および３，４−ジクロロイソコウマリン（２００μＭ）］中で均質化した。たんぱく質濃度はＤＣたんぱく質検定法（BioRad,Richmond,CA）に従い、バックグラウンド判定のための溶解緩衝液と等しいサンプルを用いて行った。各サンプルから５μｇのたんぱく質を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上に分離し、ニトロセルロース膜上にトランスブロットした。別のたんぱく質結合部位はＴＴＢＳ（０．０１Ｍトリス塩基、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４、０．０５％Tween 20,Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO）に溶かした５％脱脂ミルクを用いてブロックされた。各ブロットは一次抗体（抗ペプチドaa269-288AB、ＴＴＢＳに溶かした１％脱脂ミルクにての１：２５０希釈）で４℃で一晩培養した。この一次抗体をホース・ラデッシ・パーオキシダーゼ（Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO）に接合したヤギ抗ラビットＩｇＧ抗体を用いて室温で１時間、培養し検出し、化学発光（ＥＣＬ、Amersham）により、指示書通りに可視化した。
【００９０】
細胞および細胞ライン
前述のラット大動脈17の場合と同様に平滑筋細胞をウシ大動脈から単離し、ズルベコズ・モデファイド・イーグル媒体（ＤＭＥ）（１０％子ウシ血清（ＦＣＳ）および２０ｍＭヘーペス緩衝液が添加されたもの、３７℃、５％ＣＯ2空気中でｐＨ：７．２）中にて維持された。全ての実験は特定した媒体［ＤＭ、ズルベコズ・モデファイド・イーグルズ媒体で２０ｍＭヘーペス緩衝液が添加されたもの、ｐＨ７．２、０．５Ｕ／ｍＬインシュリン（ビーフおよびポーク亜鉛懸濁液、Novo Labs.Ltd.,Willowdale,Ontario）および４μｇ／ｍＬトランスフェリン（Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO）］を用いて行った。この培養媒体はフィルム化する前に２４時間置換された。細胞リフターを用いて単層の半分を除去し外傷を形成し、ついで新たなＤＭを、ＲＨＡＭＭペプチドａａ401-411または上述のように同じ領域の混合ペプチドの存在下で添加した。
【００９１】
マクロファージ細胞ラインＳ１およびＷＥＨＩ−３を用い、抗体および合成ペプチドの内毒活性化マウス血清（ＡＳ）へのマクロファージ走化性に対する影響を分析した。これらの細胞ラインもまた、（ＤＭＥ）（１０％子ウシ血清（ＦＣＳ）および２０ｍＭヘーペス緩衝液が添加されたもの、３７℃、５％ＣＯ2空気中でｐＨ：７．２）中にて維持された。
【００９２】
ヒト好中球をボランテアからの周辺血液サンプルから得、これをＡＣＤ溶液（０．０８５Ｍクエン酸三ナトリウム、０．０６５Ｍクエン酸、２％デキストラーゼ）に混合し、凝血を防止した。５％デキストランを添加し、分離された血漿および白色細胞を除去した。これらの細胞をＰＢＳ，ｐＨ７．２で２回洗浄し、リンパ球を分離するためフィコール（Ficoll）勾配を用いた。単離された好中球を洗浄し、ＰＢＳに再度、懸濁させた。赤血球を低脹液ＰＢＳへ僅かに露出させることにより溶解させた。
【００９３】
タイムラプス・シネミクログラフィ
外傷細胞単層を、ＩＭ  ３５  Ｚｅｉｓｓ倒立顕微鏡を用いて運動性についてモニターした。この顕微鏡にはビデオカメラ（浜松ＣＣＤ（株）、日本）を接続させた。細胞は加熱プラフォーム（ＴＲＺ  ３７００，Ｚｅｉｓｓ、ドイツ国）を用い３７℃に維持した。細胞運動性は像分析（イメージ１、Universal Imaging Corp.,Westchester,PA）を用いて追跡した。このプログラムにより一連のデジタル化像から核置換の定量化を行った。各実験において３０個の細胞の運動性を２４時間、追従し平均速度を時間ごとに計算した。
【００９４】
走化性の評価
走化性は、マクロファージ細胞ラインについてのStevenson et al18によるバクテリア内毒−活性マウス血清（ＡＳ）を用い、あるいは好中球についてのインターロイキン８（ＩＬ−８）を１００ｎｇ／ｍＬを用いて刺激した。熱不活性化血清（５６℃、２０分間）または媒体をネガチブ対照としてそれぞれ用いた。用いられた走化性の評価は当社で開発されたカラー評価であり、別途詳述されている19。簡単に述べると、マイクロ滴定プレート（Neuro Probe,ストック番号MBA96）および５μｍフレームフィルター（Neuro Probe,PED5）を保持するのに十分な大きさの下方窪みを備えた９６−穴走化性チャンバーを使用した。このマイクロ滴定プレートに走化誘引物質および対照物質を満たし、走化性チャンバーの下方窪みに配置した。このフレームフィルターをついで閉じ、ＤＭＥに溶かした細胞懸濁液２００μｌ（２．５ｘ１０5細胞／ｍＬ）を上部プレートの穴に添加した。この走化性チャンバーを３７℃で５％ＣＯ2空気中で４〜６時間培養した。培養後、この穴中の媒体を２０μＭ  ＥＤＴＡを含むＰＢＳ２００μｌで置換し、４℃で３０分間培養した。ポリカーボネート膜の上に残留する細胞をコットンＱ−チップで除去した。このフィルター中を通って移行した細胞を５０ｍｌチューブアダプターを用いて５００Ｇで１０分間遠心分離することにより集め、９６−穴プレートに移した。置き換えた細胞の数を、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェノールテトラゾリウム・ブロマイド（ＭＴＴ）を添加して最終濃度、２５０μｇ／ｍＬとすることにより定量し、ついで３７℃で４時間培養した。ＭＴＴの還元により生成した暗紫色の結晶を酸−イソプロパノール（２ｍＭ  ＨＣｌ）１００μｌと混合することにより溶解させた。このプレートは２時間以内に５４０ｎｍのフィルターを備えたマイクロ滴定プレートＥＬＩＳＡリーダー上で分析した。ＭＴＴ還元の程度は相対細胞数19に対応している。
【００９５】
結果
ＲＨＡＭＭおよびＨＡ表現は頸動脈のバルーンカテーテル外傷により増大する。
無傷のラットから得た頸動脈の内皮および平滑筋細胞はＲＨＡＭＭに関し弱い陽性を示した（図７Ａ）。外傷２時間後、好中球およびマクロファージは剥ぎ取った区域に付着し、ＲＨＡＭＭの強い表現が見られた（図７Ｂ）。しかし、外傷６時間後、平滑筋細胞の部分はＲＨＡＭＭの表現の増大を示した（図７Ｃ）。４８時間までに新生内膜を形成した平滑筋細胞ＲＨＡＭＭについて強く染色した（図１ｄ）。外傷後７日までに、さらに１４日までに新生内膜層の大きさが増大した。この層の細胞ほ引き続き高いレベルのＲＨＡＭＭを表現した（図７Ｅおよび図７Ｆ）。抗−ＲＨＡＭＭ抗体を除去するためにＲＨＡＭＭ−ＧＳＴフュージョン・プロテイン・カラム上でクロマトグラフィ処理した前免疫ＩｇＧまたは抗−ＲＨＡＭＭ抗血清で培養した切片は染色を示さなかった（データは示されていない）。
【００９６】
ＲＨＡＭＭの表現を、さらに外傷および模擬手術した動物からの動脈のウエスターン・ブロット分析を抗−aa269-288ABを用いて行うことによりさらに調査した。無傷の動脈において、ＲＨＡＭＭの２つ類似形、ｍｗ８４および６５ｋＤａの本質的表現が観察された（データは示されていない）。
【００９７】
しかし、外傷動脈においては、ＲＨＡＭＭ８４ｋＤａ類似体の定常的な高い表現が、脱内皮化後２〜２４時間の間に観察され（図８）、その後はこの類似体の表現は減少した図８）。８４ｋＤａ類似体の後の増加が７２時間から１６８時間に亘って見られた（図８）。外傷動脈における６５ｋＤａ類似体の表現は極めて僅かな変化が認められるに過ぎなかった（図８）。興味深いことに、ｍｗ７０ｋＤａの別の類似体が外傷後３６〜７２時間に見られ（図８）、同時に一時的にＲＨＡＭＭおよびＨＡについての強い染色が外傷動脈に見られた（図７）。
【００９８】
無傷頸動脈におけるＨＡの分布は内皮および外膜に限られていた（図９Ａ）。外傷２時間後、好中球およびマクロファージの剥ぎ取った区域に付着したものは、ＨＡ染色の僅かな増大を示した（図９Ｂ）。４８時間までに新生内膜を形成した平滑筋細胞はＨＡについて強い陽性を示し（図９Ｃ）、同時にＲＨＡＭＭについての高いレベルの表現を示した（図９Ｄ）。７日ないし１４日の間に、ＨＡについての染色は減少し、中間層と新生内膜の結合部の細胞に限定された（図９Ｄおよび９Ｅ）。ヒアルロニダーゼン酸で前処理され、またはＨＡでビオチニル化されたＨＡ−結合プローブの予備培養された切片は染色されなかった（データは示されていない）。これにより特異性が確認された。
【００９９】
ＲＨＡＭＭ：ＨＡ相互作用が炎症細胞走化性を規制する
頸動脈の外傷区域に付着する炎症細胞においてＲＨＡＭＭの表現が増加するから、好中球およびマクロファージ走化性におけるＲＨＡＭＭ：ＨＡ相互作用の役割について研究がＲＨＡＭＭ（ａａ401-411）14の２つのＨＡ結合領域の１つをコード化するペプチドと、ＲＨＡＭＭへのＨＡ結合を妨害すると先にされた抗−ペプチドaa269-288ABの双方を用いて行われた（Ref.14、サバニ等）。ＩＬ−８に対するヒト好中球走化性はペプチドａａ401-411により可なり抑制された（図１０）。また、ペプチドａａ401-411および抗−ペプチドaa269-288ABは２つのヒトマクロファージ細胞ラインＳ１およびＷＥＨＩ−３の内毒活性化マウス血清への走化性を抑制した（図１１）。
【０１００】
ＲＨＡＭＭ：ＨＡ相互作用が外傷後の平滑筋細胞移行を規制する
抗ＲＨＡＭＭ抗血清が平滑筋細胞単層の損傷部への方向性移行を抑制することを先に示した（サバニ等）。このＲＨＡＭＭ：ＨＡ相互作用の外傷応答における関与を確認するため、ＲＨＡＭＭ（ａａ401-411）14のＨＡ結合領域の１つをコード化するペプチドの作用について調査した。このペプチドは単層の外傷後の平滑筋細胞の転移の速度を可なり減少させる（図１２）。ペプチドａａ401-411と同じアミノ酸を含む混合ペプチドは外傷応答に対する作用を示さなかった（図１２）。
【０１０１】
考察
ヒアルロナン、つまり細胞外マトリックスの１成分は胚形成20,21の間に細胞運動性、腫瘍侵入22、オンコジーンによる転形13、外傷への応答22に関与している。細胞運動性へのＨＡの作用は特異的レセプター13,26、例えばＣＤ４４27およびＲＨＡＭＭ14により媒介されるものと思われる。ＨＡは内皮および平滑筋細胞28-30の移行に関与している。ＲＨＡＭＭは外傷後の胚芽平滑筋細胞31および成人平滑筋細胞の移行に重要であることが示されている（サバニ等）。平滑筋細胞の移行はバルーン血管形成術3後の再狭窄の病因の重要な成分を形成しているから、ＲＨＡＭＭおよびＨＡの表現および分布もまた、生体におけるラット頸動脈のバルーンカテーテル脱内皮化後において役割を果たしていると想像する。
【０１０２】
外傷動脈の剥離部での炎症細胞の初期の蓄積について先に記載したが、我々もこれらの知見を確認している。外傷部位での炎症細胞の蓄積は走化性移行と後の付着を必要としている。付着は選択との相互作用により開始され、これは細胞の血管壁に沿っての滑りをもたらし、ついで特異的血管のインテグリンを介して強固な付着がなされ、その後、外転が生じる（ｒｅｆ．３４参照）。剥離された内皮へ付着する炎症細胞におけるＲＨＡＭＭ表現の増大は幾つかの機能を生じさせる。好中球およびマクロファージ走化性は抗ＲＨＡＭＭ抗血清またはＲＨＡＭＭのＨＡ結合領域の１つに模倣するペプチドを用いることによりブロックできるということは、ＲＨＡＭＭ：ＨＡ相互作用が、走化性を介して外傷部位での炎症細胞の蓄積に寄与し得ることを示唆している。我々はＲＨＡＭＭ；ＨＡ相互作用が外転に必要なプロセスであるフィブロフラストにおける虚足延長を規制することを示した。同様に、ＲＨＡＭＭはマクロファージの外転の間のこのプロセスに役割を果たしている。我々はこの可能性について現在、研究している。
【０１０３】
我々は先に、無活動の平滑筋細胞単層によるＲＨＡＭＭの６５ｋＤａ類似体の本質的表現および外傷後の増大した移行と同時の７０ｋＤａ類似体の発現について述べた。この最後のたんぱく質はＲＨＡＭＭの膜形を表していると予測した。なぜならば、その発現がＦＡＣＳ分析（サバニ等）による膜偏在化ＲＨＡＭＭの免疫蛍光の増大と一致しているからである。現在の研究において、生体外の平滑筋細胞のように、無傷頸動脈が６５ｋＤａＲＨＡＭＭを表し、外傷後、７０ｋＤａ類似体が発現することが我々により証明された。このＲＨＡＭＭ類似体は外傷後３６ないし７２時間の間にのみ現れ、これは平滑筋細胞の外傷部位への平滑筋細胞の移行の時間と一致している1,3。ＲＨＡＭＭ類似体の因果関係的役割が細胞の運動性であるか否かが現在研究されている。８４ｋＤａたんぱく質が生体外で平滑筋細胞により生産されないので、その性質およびそれを表す細胞の型は現在、知られていない。
【０１０４】
我々は先に、外傷後のＨＡの、ＲＨＡＭＭの膜偏在化と一致する平滑筋細胞単層並びに７０ｋＤａ類似体の表現との増大する関連について証明した（サバニ等）。ＨＡの染色の増加は７０ｋＤａＲＨＡＭＭ類似体の最大移行および表現の時間帯において見られる。これらの結果はＲＨＡＭＭ；ＨＡ相互作用が細胞の運動性を規制するという仮定を支持している。生体外でＲＨＡＭＭの機能をブロックする試薬、例えば抗ＲＨＡＭＭ抗血清およびＲＨＡＭＭペプチドの効能はこの仮定と一致している。
【０１０５】
多くの成長ファクター、特にＰＤＧＦ−ＢＢ35およびＴＧＦ−β１36は平滑筋細胞の移行および再狭窄6,7の病因に関与している。接着性血小板および平滑筋細胞自体から得られるＰＤＧＦ−ＢＢは平滑筋細胞の増殖よりも、むしろ平滑筋細胞の移行に大きい作用を与える。ＴＧＦ−β１は外傷部位で平滑筋細胞により作られ、平滑筋細胞の増殖に付与し、再狭窄プロセス7の後の段階において異常細胞外マトリックス堆積に寄与している。成長ファクターはさらに炎症細胞の運動性の調整に関与している。すなわち、ＴＧＦ−β１は単細胞37の走化性を調整に関与している。さらに繊維芽細胞の運動性のＴＧＦ−β１刺激による増加はＲＨＡＭＭ：ＨＡ相互作用により媒介される。そしてＴＧＦ−β１はＲＨＡＭＭの表現と繊維芽細胞38におけるＨＡの合成を調整する。平滑筋細胞におけるＲＨＡＭＭおよびＨＡ表現のＴＧＦ−β１およびＰＤＧＦ−ＢＢの調整については現在、研究中である。
【発明の効果】
【０１０６】
以上、説明したように、ＲＨＡＭＭおよびＨＡ表現の変化が生体の血管外傷後に発生することが実証され、さらにＲＨＡＭＭ；ＨＡ相互作用が生体外において炎症細胞走化性および平滑筋細胞の移行に必要であることが示された。これらのデータは生体内でＲＨＡＭＭ：ＨＡ相互作用をブロックし、バルーンカテーテルによる外傷後の再狭窄の発展を減少させ、または防止し得る薬剤の使用の可能性を提起している。これらの研究は現在も進行している。
【０１０７】
感謝文
この研究はカナダ国医学研究審議会（ＭＲＣ）認可＃１０９４８（ＥＡＴ）およびマニトバ・メデカル・サービス・ファンデーション（ＲＣＳ）の基金のもとで行われたものである。ＥＡＴはChildren's Hospital of Winipeg Research Foundation Scholarshipの受取人である。Elaine GaragonおよびLaurie Langeの優れたご協力に深く感謝する次第である。
【０１０８】
索引
１．Ferns,GAA Sterwart-Lee,ALおよびAnggard,EE:機械的外傷への動脈の応答：バルーンカテーテル脱内皮、アテローム性動脈硬化、1992,92:89-104
２．Ross,R:アテローム性動脈硬化症：１９９０代の展望、Nature,1993,362:801-809
３．Casscells,W:平滑筋および内皮細胞の移行：再狭窄の問題点、Circulation,1992,86(3):723-729
４．Tanaka Y,Adams,DH and Shaw,S:白血球への内皮細胞付着誘起細胞原形質におけるプロテオグリカン：Immunol Today,1993,14(3):111-115
５．Lovqvist,A.Emanuelsson H,Nilsson,J,Lundqvist,H and Carlsson,J:冠状血管形成後の再狭窄の病理学的メカニズム：可能な予防処置、J Int Med,1993,1233:215-226
６．Jawien,A,Bowen-Pope,DE,Lindner,V,Shwartz,SM and Clowes,AW:バルーン血管形成のラットモデルにおける血小板誘起成長ファクターによる促進された平滑筋細胞の移行と内膜厚化：J Clin Invest,1992,89:507-511
７．Majesky,MW,Linder,V,Twardzik,DR,Shwartz,SM and Reidy,MA:動脈外傷の修復時の変形成長ファクターβ１の生産：J Clin Invest,1991,88:904-910
８．Rakugi,H,Jacob,HJ,Krieger,JE,Ingelfinger,JR.and Pratt,RE: 平滑筋および内皮細胞の移行：再狭窄の問題点、Circulation,1992,86(3):723-729
９．Clowes,AW,Clowes,MM,Au,YPT,Reidy,Ma and Belin,D:ラット頸動脈損傷における有糸形成時の平滑筋細胞表現ウロキナーゼおよび組織型プラスミノーゲン・アクテベータの移行：Circ Res,1990,67:61-67
１０．Miano,JM,Vlasic,N,Tota,RR and Stemerman,MB:血管損傷における平滑筋細胞極初期遺伝子および成長ファクター活性化：オートクリン成長の生体内推定メカニズム：Arterioscler Thromb 1993,13:211-219
１１．Clowes,AW,and Schwartz,SM:ラット頸動脈損傷における無活動平滑筋細胞移行：Circ Res,1985,56:139-
１２．Cloews,AW,Reidy MA and Clowes,MM:動脈損傷における狭窄メカニズム：Lab Invest,1983,49(2):208-2156
１３．Turley,EA,Austen,L,Vandeligt,K and Clary,C:ヒアルロナンおよび細胞関連ヒアルロナン結合たんぱく質による変形細胞の運動性の調整：J Cell Biol,1991,112(5):1041-1047
１４．Hardwick,C,Hoare,K,Owens,R,Hohn,HP,Hook,M,Moore,D,Cripps,V,Austen,L,Nance,DM and Turley,EA:腫瘍細胞運動性を媒介する新規なヒアルロナンレセプターの分子クローニング：J Cell Biol,1992,117(6):1343-1350
１５．Yang,B,Zhang,L,Turley,EA:ヒアルロナンレセプターＲＨＡＭＭにおける２つのヒアルロナン結合領域の識別：J Biol Chem,1993,268:8617-8623
１６．Ripellino,JA,Killinger,MM,Margolis,RU and Margolis,RK:組織切片のヒアルロン酸の偏在化についての特異的プローブとしてのヒアルロン酸結合区域：J Hisotchem Cytochem,1985,33:1066-1086
１７．Majack,RA.and Clowes,AW:ヘパリン様グリコサミノグリカンによる平滑筋細胞移行の抑制：J Cell Physiol,1984,118:253-256
１８．Stevenson,MM,Kongshovn,AL,and Skamen,E:マクロファージ炎症応答によるリステリア単細胞遺伝子に対する遺伝子結合の抵抗：J Immunol,1981,127:402
１９．Shi,Y,Komovski,BS,Savani,RC,and Turley,EA: 走化性のための急速多ウエル・クロメトリック・アッセイ：J Immunol Methods,1993,in press
２０．Laurent,TC,and Fraser,JRE:ヒアルロナンＦ ＡＳＥＢ：Ｊ 1992,6:2397-2404
２１．Toole,BP:ヒアルロン酸塩の発展的役割：Conn Tiss Res 1982,10:93-100
２２．Turley,EA:ヒアルロナンおよび細胞運動性：Canser Met Rev 1992,11:21-30
２３．Waldenstrom,A,Martinussen,HJ,Gerdin,B,and Hallgren,R:実験的心筋梗塞におけるヒアルロナンの蓄積と組織水腫：J Clin Invest,1991,88:1622-1628
２４．Weigel,PH,Fuller,GM and LeBoeuf,RD:炎症応答および治癒の初期におけるヒアルロン酸とフィブリノーゲンの役割のモデル：J Theoret Biol,1986,119:219-234
２５．Bray,BA,Sampson,PM,Osman,M,Giandomenico,A and Turino,GM:ハムスターのブレオマイシン誘起歯槽炎における肺組織ヒアルロナン（ヒアルロン酸）とヒアルロナーゼの初期の変化：Am Rev Resp Dis,1991,143:284-288
２６．Toole,BP:ヒアルロナン、その結合蛋白、ヒアラドヘリンズ：Curr Opn Cell Biol,1990,2:839-844
２７．Haynes,BF,Liao,H-x and Patton,KL:トランスメンブラン・ヒアルロナート・レセプター（ＣＤ４４）：複合機能、複合形態、ガン細胞：Cancer Cell,1991,3(9):347-350
２８．Ausprunk,DH,Boudreau,Cl and Nelson,DA:ミクロ脈管構造におけるプロテオグリカンII：ラビット角膜の増殖キャピラリーにおける組織学的偏在化：Am J Pathol,1981,103:367-375
２９．West,DC and Kumer S:ミクロ脈管構造におけるプロテオグリカンII：ヒアルロナートとそのオリゴ糖の内膜細胞増殖および単層一体化に対する作用：Exp Cell Res,1989,183:179-196
３０．Boudreau,N and Rabinovitch,M:動脈の内皮および平滑筋細胞における細胞外増殖の規制された発達変化が内皮増殖に関連する：Lab Invest,1991,64(2):187-199
３１．Boudreau,N,Turley,EA and Rabinovitch,M:フィブリネクチン、ヒアルロナンおよびヒアルロナン結合たんぱくが動脈の平滑筋細胞移行に寄与する：Develop Biol,1991,143:235-247
３２．Kockx MM,De Meyer,GRY,Jacob,WA,Bult,H and Herman,AG:ラビットのカフされた頸動脈における新生内膜の３相対シーケンス：Arterioscl Thromb,1992,12:1447-1457
３３．Lasky,LA:選択：炎症時の細胞特異的炭水化物形成の翻訳：Science,1992,258:964-969
３４．Dustin,ML and Springer,TA:Annu Rev Immunol,1991,9:27-66
３５．Welsh,CJ,Schmeichel,K and McBride,K:血小板誘導成長ファクターが血管平滑筋細胞におけるホスホリパーゼＤと走化性応答を活性化する：In Vitro Cell Biol,1991,27A:425-431
３６．Merwin,JR,Roberts,A,Kondaiah,P,Tucker,A,and Madri,JA:生体のＴＧＦ−β１に模倣したＴＦＧ−β３への血管細胞応答：Growth Factors,1991,5(149-158)
３７．Wahl,SM,Hunt,DA,Wakefield,LM,McCartney-Francis,N,Wahl,LM,Roberts,AB and Sporn,MB:変形成長ファクター・タイプベータが単細胞走化性と成長ファクター生産を誘起する：Natl Acad Sci,USA 1987,84(1987,August):5788-5792
３８．Samuel,SK,Hurta,RAR,Spearman,MA,Wright,JA,Tueley,EA and Greenberg,HA:細胞運動性のＴＧＦ−β１刺激がヒアルロナンレセプターＲＨＡＭＭおよびヒアルロンにより媒介される：J Cell Biol,1993,in press
【０１０９】
本発明の要旨を逸脱することなく種々の変更が可能であり、ここに記載した物質が単なる説明のためであり、限定を意味するものではない。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は傷つけられ、模擬手術を行った動脈を示す写真図である。
【図２】図２は頸動脈によるＲＨＡＭＭ（ヒアルロン酸媒介運動性についてのレセプター）表現を説明する線図。
【図３】図３は外傷後４日目の頸動脈の平滑筋におけるＲＨＡＭＭとヒアルロン酸を示す写真図。
【図４】図４は補体に対するマクロファージ走化性（５ａ）へのＲＨＡＭＭ、ＨＡ結合［ヒアルロナン−（ヒアルロン酸）−結合］ペプチド（４０１−４１１）およびＲＨＡＭＭ抗体の影響を説明する棒グラフ図。
【図５】図５はＩＬ−８に対する好中球走化性（５ａ）へのＲＨＡＭＭ、ＨＡ結合ペプチド（４０１−４１１）の影響を説明する棒グラフ図。
【図６】図６は外傷５時間後の平滑筋細胞マイグレーションに対するＲＨＡＭＭ、ＨＡ結合ペプチド（４０１−４１１）の影響を説明する棒グラフ図。
【図７】図７ないし１２は第２２頁第２４行目ないし第３６頁３１行目に記載の「バルーンカテーテル外傷後の新生内膜形成：ヒアルロナンおよびヒアルロナンレセプターＲＨＡＭＭの役割」に関する図であり：
図７はテストに用いられた乱切ラットの頸動脈の内皮細胞および平滑筋細胞を示す図。
【図８】図８は所定時間後のＲＨＡＭＭの種々の異形の表現を説明する図。
【図９】図９はヒアルロナンの分布を示す図。
【図１０】図１０はＩＬ−８に対する好中球走化性（５ａ）へのＲＨＡＭＭ、ＨＡ結合ペプチド（４０１−４１１）の影響を説明する棒グラフ図。
【図１１】図１１は補体に対するマクロファージ走化性（５ａ）へのＲＨＡＭＭ、ＨＡ結合［ヒアルロナン−（ヒアルロン酸）−結合］ペプチド（４０１−４１１）およびＲＨＡＭＭ抗体の影響を説明する棒グラフ図。
【図１２】図１２は外傷５時間後の平滑筋細胞マイグレーションに対するＲＨＡＭＭ、ＨＡ結合ペプチド（４０１−４１１）の影響を説明する棒グラフ図。
【図１】
0003742955.tif 000003
【図２】
0003742955.tif 000004
【図３】
0003742955.tif 000005
【図４】
0003742955.tif 000006
【図５】
0003742955.tif 000007
【図６】
0003742955.tif 000008
【図７】
0003742955.tif 000009
【図８】
0003742955.tif 000010
【図９】
0003742955.tif 000011
【図１０】
0003742955.tif 000012
【図１１】
0003742955.tif 000013
【図１２】
0003742955.tif 000014