(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
痴呆性疾患と認定された被験者より採取した体液試料中のヒトリポカリン型プロスタグランジンＤ合成酵素（L-PGDS）濃度を測定し、その値が正常者より有意に低い値を示す被験者を正常圧水頭症に起因する痴呆性疾患者であると鑑別する、ことを含む正常圧水頭症に起因する痴呆性疾患者の鑑別方法。
【請求項２】
正常圧水頭症が症候性正常圧水頭症あるいは特発性正常圧水頭症である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
体液が脳脊髄液、血液又は尿である請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
体液試料中のヒトリポカリン型プロスタグランジンＤ合成酵素濃度の測定を、免疫学的測定法により行うことを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
体液試料中のヒトリポカリン型プロスタグランジンＤ合成酵素濃度の測定を、ヒトリポカリン型プロスタグランジンＤ合成酵素に特異的なモノクローナル抗体を用いるサンドイッチELISA法により測定する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ヒトリポカリン型プロスタグランジンＤ合成酵素に特異的なモノクローナル抗体を含む、正常圧水頭症に起因する痴呆性疾患の鑑別用キット。
【請求項７】
ヒトリポカリン型プロスタグランジンＤ合成酵素に特異的なモノクローナル抗体が、ハイブリドーマ細胞株1B7（FERM BP-5709）、7F5（FERM BP-5711）、6F5（FERM BP-5710）、9A6（FERM BP-5712）又は10A3（FERM BP-5713）より産生されるモノクローナル抗体である請求項６に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、痴呆性疾患の鑑別方法に関し、さらに詳しくは、被験者より採取した体液試料中のヒトリポカリン型プロスタグランジンＤ合成酵素（以下においてL-PGDSということもある）濃度を測定することを特徴とする痴呆性疾患の鑑別方法及び前記方法に用いる鑑別用キットに関する。
背景技術
社会の高齢化に伴い、痴呆性疾患患者は増加の一途を辿っている。痴呆性疾患は、非常に多彩な病因により惹起され、正確な鑑別診断は非常に難しく、また多くの痴呆性疾患の治療法もまだ確立されていない。そのような痴呆性疾患の中でも、正常圧水頭症（normal pressure hydrocephalus、以下NPH）は、クモ膜下出血や髄膜炎に続発して発症する症候性正常圧水頭症と、原因不明の特発性正常圧水頭症を含み、外科手術（脳室腹腔短絡術など）により劇的に改善されることが知られている。しかし、アルツハイマー病、パーキンソン病又は脳血管性痴呆等といった高齢者に認められる痴呆性疾患、あるいはびまん性脳損傷の患者においては、脳の萎縮が認められ、脳室も拡大していることから、外科手術による改善を期待することは難しい。そこで外科手術による改善の見込まれるNPHと改善の見込まれない痴呆症とを早期に鑑別する必要があるが、この鑑別はしばしば困難である。
これまで手術適応を確定するために行われてきた診断方法としては、古典的には、腰椎などから脳脊髄腔へドレナージを置き脳脊髄液圧を終日持続測定することにより、脳脊髄液の圧波をみる方法がある（Symon, L., Dorsh, N.W.C, J.Neurosurg., 42:258-273, 1975）。しかし、この方法では、患者のベッド上での安静、清潔な環境、持続測定解析装置等を必要とし、臨床上困難である場合が多い。また、連日脳脊髄液を40〜50ml排除し、症状の改善を見る方法もあるが、確実性に欠け、繰り返し穿刺された部位からの感染等の合併症併発の危険性を伴う。さらに、萎縮を伴うアルツハイマー型老人性痴呆とNPHを鑑別するために脳静脈血のアミロイド関連蛋白（α1-antichymotrypsin）を調べる方法が報告されているが、脳静脈の採血が侵襲を伴う上に、成績もそれほど上がらず、普及しているとはいえない。
髄液の動態を見る方法は、この疾患群の病態生理からみても合理的な方法といえるが、最近では、髄液の圧波を測定するよりも画像診断の進歩が著しい。腰椎から脳脊髄液腔に造影剤を注入し、RIまたはCT脳槽造影を行い、髄液の循環吸収障害を評価する方法が従来の一般的な方法であったが、この診断方法も、手術予後と必ずしも相関しないことが報告されている。比較的新しい報告としては、MRI画像を利用して、中脳水道の髄液の流れを評価する方法がある（Mase, M. et al, Current Treatment for Hydrocephalus（Tokyo）, 8:13-18, 1998）。これは侵襲を伴わない方法として注目されるが、現状では発展途上であり、また、有効でない症例もある。さらに、この方法を施行できる施設は限られていることから、広く普及するまでには至っていないのが現状である。
最近の研究の成果の中では、脳脊髄液中のneurofilament triplet protein（NFL）、あるいはglial fibrillary acidic protein（GFAP）により神経組織の障害程度を調べることによりNPHを検出する方法も報告されている（Tullberg, M. et al, Neurology 60:1122-1127, 1998）が、未だ実用化されていない。
以上のように、NPHは手術療法が有効であるにも関わらず、早期に手術すべきかどうかを決定するための検出方法がいまだ確定されていないのが現状である。
一方、プロスタグランジンＤ合成酵素（PGDS）には、主として脳に局在するリポカリン型と脾臓やマスト細胞に存在する造血器型があり、脳脊髄液中に見出されるタンパク質のPDGSはリポカリン型であると同定されている。リポカリン型プロスタグランジンＤ合成酵素（L-PGDS）は種々の哺乳動物の中枢神経系（CNS）におけるプロスタグランジンＤ2の生合成を行う酵素である。この酵素は、脳の軟膜（leptomeninges）、クモ膜（arachnoid membrane）で主として産生され、脳脊髄液（cerebrospinal fluid：以下においてCSFということもある）に分泌される。近年、このL-PGDSがCSF中に多量に存在することが知られていたβトレースと同一であることが明らかにされた（Hoffmann A et al., J. Neurochem., 61:451-456, 1993;Zahn M. et al., Neurosci. Let., 154:93-95, 1993;Watababe, K. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 203:1110-1116, 1994）。βトレースはヒトCSFタンパク質の主要な構成成分であるので、様々な中枢神経系疾患におけるこのタンパク質の臨床上の用途が研究されてきた。しかしながら、現在のところ、PGDSあるいはL-PGDSの各種痴呆性疾患への関与及び役割は解明されていない。
本発明の課題は、これまでの種々の検査手段では検出することができなかったか、あるいは確実な検出が困難であった正常圧水頭症を、正確に且つ被験者の負担が少なく鑑別することのできる方法を提供することにある。更に、前記鑑別方法に使用するキットを提供することにある。
発明の開示
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、脳脊髄液、血液、又は尿等の体液中のL-PGDS濃度を測定し、その測定値を指標とすることより、痴呆性疾患の鑑別を行えることを見い出し、本発明を完成させるに至った。
即ち、本発明は、被験者より採取した体液試料中のヒトリポカリン型プロスタグランジンＤ合成酵素濃度を測定することを特徴とする、痴呆性疾患の鑑別方法を提供する。本発明はまた、ヒトリポカリン型プロスタグランジンＤ合成酵素に特異的な抗体を含む痴呆性疾患の鑑別用キットを提供する。
【図面の簡単な説明】
図１は、正常例、クモ膜下出血後NPHおよび特発性NPH、脳血管性痴呆症、パーキンソン病、アルツハイマー病の脳脊髄液中L-PGDS濃度の測定結果を示す図である。
図２は、正常例、若年NPH（y-NPH）および老年NPH（e-NPH）、痴呆症（Dementia）の脳脊髄液中L-PGDS濃度の測定結果を示す図である。
図３は、正常例、若年NPH（y-NPH）および老年NPH（e-NPH）、痴呆症（Dementia）の脳脊髄液中のneuron specific enolase（NSE）濃度の測定結果を示す図である。
図４は、正常例、若年NPH（y-NPH）および老年NPH（e-NPH）、痴呆症（Dementia）の脳脊髄液中のS-100タンパク質濃度の測定結果を示す図である。
発明を実施するための最良の形態
本発明において、L-PGDSを測定する試料は、被験者から採取した体液であり、具体的には、脳脊髄液、血液又は尿等が挙げられる。上記試料中のL-PGDS濃度を測定する方法としては、L-PGDS濃度を正確に反映する測定法であれば特に限定はされず、例えば免疫学的測定法、酵素活性測定法が挙げられる。しかしながら、実際の臨床現場において、簡便に且つ多量の試料を同時に測定する必要性の観点から、L-PGDSに特異的なモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を用いたEIA、ELISA、RIA、FIA等の免疫学的測定法によるのが好適である。
上記の免疫学的測定法のうち、特に、L-PGDS特異的モノクローナル抗体を使用したサンドイッチELISA法が好ましく、該モノクロナール抗体としては、具体的には、ハイブリドーマ細胞株1B7（FERM BP-5709）、7F5（FERM BP-5711）、6F5（FERM BP-5710）、9A6（FERM BP-5712）、10A3（FERM BP-5713）より産生される抗体が挙げられる。サンドイッチELISA法による測定に際しては、既に本発明者らにより確立されている、上記モノクローナル抗体を含むL-PGDS検出キットを利用すればよい（WO97/16461）。なお、それぞれの細胞株は、工業技術院生命工学工業技術研究所（日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号）にブダペスト条約に基づく国際寄託として寄託されている。
本発明においては、上記手段で測定されたL-PGDS濃度測定値を指標として、健常者のL-PGDS濃度又はNPH以外の痴呆性疾患（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、血管性痴呆など）のL-PGDS濃度と比較することにより、NPHを鑑別することができる。
本発明の方法により検出され、または鑑別される痴呆性疾患としては、例えば、正常圧水頭症（NPH）であり、これにはクモ膜下出血や髄膜炎に続発して発症する症候性正常圧水頭症と、原因不明の特発性正常圧水頭症が含まれる。本発明の方法を用いることにより、これらのNPHを正常例から鑑別し、あるいは血管性痴呆症、アルツハイマー病又はパーキンソン病といった他の痴呆性疾患と鑑別することができる。
症候性NPHおよび特発性NPH等のNPHは、正常例に比して脳脊髄液中L-PGDS濃度が有意に低値である。また、血管性痴呆症、アルツハイマー病、パーキンソン病といった他の痴呆性疾患との比較においても、NPHの脳脊髄液中L-PGDS濃度が有意に低値である。正常例と血管性痴呆症、パーキンソン病の間では有意差が認められなかった。
また、NPH患者を７０歳未満（若年NPH群）と７０歳以上（老年NPH群）の２群に分けて、各症例のCSF中L-PGDS濃度を測定したところ、老年NPH群は若年NPH群よりも高い値を示したが、正常群、痴呆群（dementia）（NPHを含まない痴呆症であっって、脳血管痴呆症、パーキンソン病、アルツハイマー病を含む）よりも有意に低く、NPHの鑑別が可能であることが示された。また、若年NPH群及び老年NPH群の髄液中のL-PGDS濃度はともに、正常群及び痴呆群のいずれと比べても有意に低かった（ｐ＜０．００５）。
さらに、脳実質障害の指標であるneuron specific enolase（NSE）とS-100タンパク質のCSF中における濃度をそれぞれラジオイムノアッセイ、イムノラジオメトリック・アッセイで測定した。その結果、各症例のCSF中のNSE濃度は、若年NPH群、老年NPH群、正常群、痴呆群の順に高くなっていた。一方、S-100タンパク質濃度は、正常群、痴呆群、若年NPH群、老年NPH群の順に高くなっていた。若年NPH群の髄液中のNSE濃度は、痴呆群と比較して有意に低かったが、その他においては各群間に有意差はなかった。また、髄液中のS-100タンパク質濃度は各群間に有意差はなかった。従って、L-PGDSはNSEやS-100タンパク質よりも痴呆性疾患の鑑別に有用であることが示された。
本発明者は以下の理論に拘束されるものではないが、NPHにおいてL-PGDS産生量が減少するのは以下のような理由によるものであろうと考えている。L-PGDSはクモ膜細胞で産生され、髄液中に分泌されているが、クモ膜下出血後や髄膜炎後のNPHでは、急性期に起こるクモ膜の炎症性変化によりクモ膜細胞の機能低下または細胞数の減少が起こる。その結果として、L-PGDSの産生が正常例に比べ減少していると考えられる。また、他の痴呆性疾患ではクモ膜の障害や髄液の循環障害は認められないため、NPHほどL-PGDSの産生が減少していないと考えられる。
本発明の鑑別方法を使用すると、これまでの種々の検査手段では検出することができなかったか、あるいは確実な検出が困難であったNPHを、正確に且つ被験者の負担が少なく鑑別することができ、外科手術の適否を早期に判断することが可能となる。本発明の鑑別方法をその他の診断方法と組み合わせて用いると鑑別をさらに確実なものとすることができる。
本発明はさらに、ヒトリポカリン型プロスタグランジンＤ合成酵素（L-PGDS）に特異的な抗体を含む痴呆性疾患の鑑別用キットを提供する。L-PGDSに特異的な抗体としては、L-PGDSに特異的なモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を使用することができ、好ましくは上述した種々のL-PGDS特異的モノクローナル抗体を用いることができる。
検出法において標識剤として酵素を用いる場合には、本発明のキットは下記の構成試薬を含むことができる。
（１）酵素標識化モノクローナル抗体
（２）基質溶液
また、上記キットの変形としてサンドイッチELISA法を採用すれば、本発明のキットは下記の試薬を含むことができる。
（１）モノクローナル抗体
（２）酵素標識化モノクローナル抗体あるいはポリクローナル抗体
（３）基質溶液
また、上記キットの変形としてビオチン−アビジン法を採用すれば、本発明のキットは下記の試薬を含むことができる。
（１）ビオチン化モノクローナル抗体
（２）酵素標識化アビジン又はストレプトアビジン
（３）基質溶液
また、上記キットの変形としてサンドイッチELISA法及びビオチン−アビジン法を採用すれば、本発明のキットは下記の試薬を含むことができる。
（１）モノクローナル抗体
（２）ビオチン化モノクローナル抗体あるいはポリクローナル抗体
（３）酵素標識化アビジン又はストレプトアビジン
（４）基質溶液
本発明に使用するモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体の詳しい作製方法についてはWO97/16461に記載の方法を参照されたい。
以下本発明を実施例により更に詳細に説明するが、本発明の範囲はこれら実施例に何等限定されるものではない。
実施例
参考例：L-PGDS濃度の測定
体液試料におけるL-PGDS濃度を２抗体サンドイッチELISA法により測定した。
（１）標準曲線の作成はまず、L-PGDSと結合可能な抗L-PGDSモノクローナル抗体（クローン：7F5）を50mM炭酸緩衝液（pH9.6）に4.4μg/mlになるように希釈し、96ウエルマイクロタイタープレートに300μl/ウエルずつ加えて、４℃で一晩放置し固相化した。このプレートをリン酸緩衝生理食塩水（pH7.4、以下PBS）で３回洗浄した後、0.2％カゼインを含むPBS（pH7.4、以下ブロッキング液）を300μl/ウエル加えて30℃で90分インキュベートし、ブロッキングを行った。次いで、ブロッキング後のプレートを0.05％Tween20を含むPBS（T-PBS）で３回洗浄した後、100μlの標準L-PGDS溶液（CSFより純化したL-PGDSをブロッキング液で段階希釈することにより調製）を各ウエルに加え、30℃で90分間インキュベートした。反応後、T-PBSで３回洗浄し、ブロッキング液で0.5μg/mlになるように希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ標識化抗PGDSモノクローナル抗体（クローン：1B7）100μlを各ウエルに加え、30℃で90分間インキュベートした。T-PBSで３回洗浄した後、発色液（ABTS solution：ベーリンガーマンハイム社製）100μlを各ウエルに加え、30℃で30分間インキュベートした後、停止液（1.5％シュウ酸）を100μlずつウエルに加え、プレートミキサーで撹拌して反応を停止させた。市販のプレートリーダー（型番SK601、生化学工業社製）により405nmと490nmにおける吸光度の差（A405nm-A490nm）を測定し、標準曲線を作成した。
上記サンドイッチELISA法に用いたモノクローナル抗体（クローン：1B7、7F5）は、マウス腹腔内にプリスタン1.0mlを注射し、その後２週間目にそれぞれの抗体産生細胞株を１×108個マウスの腹腔内に移植し、２週間後に腹水を採取し、得られた腹水をプロテインＡアフィニティーカラムクロマトグラフィー操作にかけることにより得た（3〜10mg/ml）。尚、上記モノクローナル抗体を産生する細胞株はそれぞれ上記モノクローナル抗体名に一致し、それぞれの細胞株は、工業技術院生命工学工業技術研究所（日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号）に、1B7についてはFERM BP-5709（原寄託日平成７年９月21日）、7F5についてはFERM BP-5711（原寄託日平成８年６月６日）の寄託番号で、ブダペスト条約に基づく国際寄託として寄託されている。
（２）試料中のL-PGDS濃度の測定は、試料をブロッキング液で適宜希釈して、上記のサンドイッチELISA法に従ってL-PGDS濃度を測定した。
実施例１：正常例、クモ膜下出血後NPHおよび特発性NPH、脳血管性痴呆症（Dementia）、パーキンソン病、アルツハイマー病の脳脊髄液中L-PGDS濃度の測定
眼窩内血腫あるいは頭痛等の症状のみで特にその他異常の認められなかった正常例６例、クモ膜下出血後NPH12例、特発性NPH1例、脳血管性痴呆３例、パーキンソン病12例、アルツハイマー病１例について腰椎よりCSFを採取し、CSF中のL-PGDS濃度を測定した。
各症例のCSF中L-PGDS濃度は、正常例で14.58±1.67（μg/ml、mean±SD）、クモ膜下出血後NPHでは8.51±3.20、特発性NPHでは8.12、血管性痴呆症では26.45±5.67、パーキンソン病では44.46±29.08、アルツハイマー病では43.02であった。各症例間で有意差検定を行ったところ、クモ膜下出血後NPHと正常例、クモ膜下出血後NPHと血管性痴呆、およびクモ膜下出血後NPHとパーキンソン病の間に有意差が認められた（p＜0.005、p＜0.0001、p＜0.005）。正常例と血管性痴呆症、パーキンソン病の間では有意差が認められなかった（図１）。
実施例２：正常例、若年NPHおよび老年NPH、痴呆症（Dementia）の脳脊髄液中L-PGDS濃度の測定
正常例（８例）、若年NPH（７０歳未満：７例）、老年NPH（７０歳以：８例）、NPHを含まない痴呆症（脳血管痴呆症４例、パーキンソン病１例、アルツハイマー病２例を含む７例）について腰椎よりCSFを採取し、CSF中のL-PGDS濃度を測定した。
その結果、各症例のCSF中のL-PGDS濃度は、正常群では15.70±2.97（μｇ／ｍｌ、mean±SD）、若年NPH群では7.05±1.69、老年NPH群では10.04±3.73、痴呆群では19.14±4.34であった。図２に示すように、若年NPH群及び老年NPH群の髄液中のL-PGDS濃度はともに、正常群及び痴呆群のいずれと比べても有意に低かった（ｐ＜０．００５）。（図中、y-NPHは若年NPHを、e-NPHは老年NPHを、dementiaはNPHを含まない痴呆症を示す）。
実施例３：正常例、若年NPHおよび老年NPH、痴呆症（Dementia）の脳脊髄液中のneuron specific enolase（NSE）とS-100タンパク質濃度の測定
各症例から採取したCSFサンプルを遠心（１５００ｇ、１０分）し、細胞を含まない上清０．５ｍｌを得て、−２０℃で保存して、脳実質障害の指標であるneuron specific enolase（NSE）とS-100タンパク質を測定した。NSEの測定はNSE測定キット（Eiken, Tokyo, Japan）を用いるラジオイムノアッセイにより、またS-100タンパク質の測定はS-100イムノラジオメトリック・アッセイキット（Sangtec Medical, Sweden）を用いて行った。
その結果、各症例のCSF中のNES濃度は、正常群では9.90±3.19（ｎｇ／ｍｌ、mean±SD）、若年NPH群では6.13±3.01、老年NPH群では7.37±5.42、痴呆群では11.86±4.38であった（図３）。一方、S-100タンパク質濃度は、正常群では0.98±0.38（μｇ／ｍｌ、mean±SD）、若年NPH群では3.27±3.04、老年NPH群では3.68±3.61、痴呆群では1.94±1.06であった（図４）。若年NPH群の髄液中のNSE濃度は、痴呆群と比較して有意に低かったが、その他においては各群間に有意差はなかった。また、髄液中のS-100タンパク質濃度は、各群間に有意差はなかった。
以上の結果から、CSF中L-PGDS濃度を測定することにより、他の指標では検出不能なNPHの検出を正常値との比較から検出できることが明かとなり、更に他の痴呆症とも鑑別できることが明らかになった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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