(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）異なる色調を有する複数種の直径２〜５ｍｍの着色ビーズに、その色調毎に異なるアレルゲンを結合させる工程；
（２）前記工程（１）で得られたアレルゲン結合着色ビーズと、前記の各アレルゲンとそれぞれ特異的に反応する各免疫グロブリンＥを含む可能性のある被検試料とを、接触させる工程；
（３）前記アレルゲン結合着色ビーズを、その色調毎に単離する工程；
（４）前記工程（３）で単離した各アレルゲン結合着色ビーズと、標識物質で標識化した抗免疫グロブリンＥ抗体とを、それぞれ接触させる工程；及び
（５）各アレルゲン結合着色ビーズと、そのアレルゲンに特異的に反応する免疫グロブリンＥと、標識化抗免疫グロブリンＥ抗体とからなる各免疫複合体に含まれる標識物質に由来する各信号、あるいは、前記各免疫複合体に含まれない未反応の標識化抗免疫グロブリンＥ抗体に含まれる標識物質に由来する各信号を、それぞれ分析する工程
を含むことを特徴とする、アレルゲン特異的免疫グロブリンＥの分析方法。
【請求項２】
（１）異なる色調を有する複数種の直径２〜５ｍｍの着色ビーズに、その色調毎に異なるアレルゲンを結合させる工程；
（２）前記工程（１）で得られたアレルゲン結合着色ビーズと、前記の各アレルゲンとそれぞれ特異的に反応する各免疫グロブリンＥを含む可能性のある被検試料とを、接触させる工程；
（３）前記工程（２）で得られた混合物と、標識物質で標識化した抗免疫グロブリンＥ抗体とを、それぞれ接触させる工程；
（４）前記アレルゲン結合着色ビーズを、その色調毎に単離する工程；及び
（５）前記工程（４）で単離した各アレルゲン結合着色ビーズと、そのアレルゲンに特異的に反応する免疫グロブリンＥと、標識化抗免疫グロブリンＥ抗体とからなる各免疫複合体に含まれる標識物質に由来する各信号を、それぞれ分析する工程
を含むことを特徴とする、アレルゲン特異的免疫グロブリンＥの分析方法。
【請求項３】
（１）異なる色調を有し、しかも、その色調毎に異なるアレルゲンをその表面に担持する複数種の直径２〜５ｍｍの着色ビーズと；
（２）標識物質で標識化した抗免疫グロブリンＥ抗体と
を含むことを特徴とする、前記の各アレルゲンのいずれか１種とのみ特異的に反応する免疫グロブリンＥの分析用キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、アレルゲン特異的免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）の分析方法に関する。なお、本明細書における前記「分析」には、分析対象であるアレルゲン特異的ＩｇＥの量を定量的又は半定量的に決定する「測定」と、分析対象であるアレルゲン特異的ＩｇＥの存在の有無を判定する「検出」との両方が含まれる。
【０００２】
【従来の技術】
免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）は、１９６６年石坂らによって発見された分子量約１９万の抗体分子でＩ型アレルギーに深く関わっていることが知られている。Ｉ型アレルギーの代表的疾患として、例えば、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、気管支喘息、又はじんましんを挙げることができ、これらの疾患において、血清中のＩｇＥ濃度（総ＩｇＥ濃度）はある程度病状を反映していることが知られている。
【０００３】
一方、その抗体分子の特質として、抗原に対して高い特異結合性を有しており、この反応性は疾患の原因抗原（アレルゲン）特定に利用されている。古典的な方法として、皮膚テスト（例えば、スクラッチテスト、プリックテスト、皮内テスト、又はＰｒａｕｓｎｉｔｚ−Ｋｕｓｔｎｅｒテスト）がある。この方法は、アレルゲン溶液を、針で掻いた傷や皮内注射を通して患者の皮膚に入れ、発赤又は膨疹のような生体反応の程度により、原因抗原を推定する方法である。また、アレルゲンと思われる成分を少量吸入又は摂食することにより、病状の度合を観察する誘発試験なども従来より行なわれている。これらの試験は、いずれも患者自身の生体反応を観察するものであり、患者に苦痛を与えるばかりでなく、充分な管理の下に行なわれないと、しばしば危険を伴う。
【０００４】
このような不都合を回避するために、近年、抗原抗体反応を応用したＣＡＰ−ＲＡＳＴ（ファルマシア社）又はＡｌａＳＴＡＴ（ＤＰＣ社）をはじめとする、試験管内でアレルゲン特異的なＩｇＥ量を測定する方法（インビトロ検査）が広く行なわれるようになってきている。
すなわち、生体内に発現したＩｇＥを各種アレルゲン（例えば、ダニ、スギ、ダスト、又はミルク等のアレルギー誘発物質）と反応させ、次いで、酵素又は放射性物質等で標識した抗ＩｇＥ抗体と前記複合体とを反応させ、その標識物質由来の信号を検出することで、アレルゲン特異的ＩｇＥ量を測定するものである。
【０００５】
また、同時に多項目のアレルゲン検索を行なう測定系としては、いわゆる、ＭＡＳＴ法（ＭＡＳＴ社）がある。例えば、ＭＡＳＴ法を利用した市販の製品（例えば、ＭＡＳＴ２６；ＭＡＳＴ社）では、異なる２６アレルゲンを、それぞれ別々に固相化したセルロール糸を張った担体が専用反応容器に納められており、患者血清中の対応する特異的ＩｇＥを同時に測定することができる。
【０００６】
ところで、特異的ＩｇＥが関与するＩ型アレルギー疾患の代表的な疾患として、例えば、アトピー性皮膚炎又は気管支喘息を挙げることができる。これらの多くの症例は、生後数ヶ月から学童期を発症年齢としており、ハウスダスト、チリダニ、若しくはカビなどの吸入性抗原、又は卵白、牛乳、若しくは小麦などの食餌性抗原がアレルゲンとして報告されている。自覚症状の充分な伝達能力を持たない年齢層の患者において症状の重篤化及び／又は長期化を避けるためにも、アレルゲンを特定して早期に摂取制限することは治療上極めて重要なことであり、インビトロ検査による血清中のアレルゲン特異的ＩｇＥ濃度の測定は、臨床上重要な意義をもつと考えられる。ところが、従来のインビトロ検査は、最低数十〜数百μＬの血清を必要とするため、小児（特に乳幼児）からこのような大量のサンプルを回収することは困難で、しばしばインビボ検査に頼らざるを得ない状況であった。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の課題は、従来技術の前記の欠点を解消し、少量の被検試料（例えば、血清又は乾燥ろ紙血など）中のアレルゲン特異的ＩｇＥ量を、複数のアレルゲンを対象に、同時且つ高感度に分析（特には測定）する方法を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
前記課題は、本発明による、
（１）異なる色調を有する複数種の直径２〜５ｍｍの着色ビーズに、その色調毎に異なるアレルゲンを結合させる工程（以下、アレルゲン結合工程と称する）；
（２）前記工程（１）で得られたアレルゲン結合着色ビーズと、前記の各アレルゲンとそれぞれ特異的に反応する各免疫グロブリンＥを含む可能性のある被検試料とを、接触させる工程（以下、被検試料接触工程と称する）；
（３）前記アレルゲン結合着色ビーズを、その色調毎に単離する工程（以下、単離工程と称する）；
（４）前記工程（３）で単離した各アレルゲン結合着色ビーズと、標識物質で標識化した抗免疫グロブリンＥ抗体とを、それぞれ接触させる工程（以下、標識化２次抗体接触工程と称する）；及び
（５）各アレルゲン結合着色ビーズと、そのアレルゲンに特異的に反応する免疫グロブリンＥと、標識化抗免疫グロブリンＥ抗体とからなる各免疫複合体に含まれる標識物質に由来する各信号、あるいは、前記各免疫複合体に含まれない未反応の標識化抗免疫グロブリンＥ抗体に含まれる標識物質に由来する各信号を、それぞれ分析する工程（以下、分析工程と称する）
を含むことを特徴とする、アレルゲン特異的免疫グロブリンＥの分析方法によって解決することができる。
また、本発明は、
（１）異なる色調を有する複数種の直径２〜５ｍｍの着色ビーズに、その色調毎に異なるアレルゲンを結合させる工程；
（２）前記工程（１）で得られたアレルゲン結合着色ビーズと、前記の各アレルゲンとそれぞれ特異的に反応する各免疫グロブリンＥを含む可能性のある被検試料とを、接触させる工程；
（３）前記工程（２）で得られた混合物と、標識物質で標識化した抗免疫グロブリンＥ抗体とを、それぞれ接触させる工程；
（４）前記アレルゲン結合着色ビーズを、その色調毎に単離する工程；及び
（５）前記工程（４）で単離した各アレルゲン結合着色ビーズと、そのアレルゲンに特異的に反応する免疫グロブリンＥと、標識化抗免疫グロブリンＥ抗体とからなる各免疫複合体に含まれる標識物質に由来する各信号を、それぞれ分析する工程
を含むことを特徴とする、アレルゲン特異的免疫グロブリンＥの分析方法に関する。
更に、本発明は、
（１）異なる色調を有し、しかも、その色調毎に異なるアレルゲンをその表面に担持する複数種の直径２〜５ｍｍの着色ビーズと；
（２）標識物質で標識化した抗免疫グロブリンＥ抗体と
を含むことを特徴とする、前記の各アレルゲンのいずれか１種とのみ特異的に反応する免疫グロブリンＥの分析用キットに関する。
【０００９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の分析方法は、（１）アレルゲン結合工程、（２）被検試料接触工程、（３）単離工程、（４）標識化２次抗体接触工程、及び（５）分析工程を含む。本発明の分析方法は、前記工程（１）〜（５）をこの順に実施することもできるし、あるいは、工程（３）及び（４）の順序を逆にし、アレルゲン結合工程、被検試料接触工程、標識化２次抗体接触工程、単離工程、及び分析工程の順に実施することもできる。
本発明の分析方法では、アレルゲンを固相化した複数の着色ビーズを１つの反応チューブ中で被検試料と反応させた後、着色ビーズの色によって個々の反応槽に分け、ビーズ表面で形成されたアレルゲンと特異的ＩｇＥとの免疫複合体を、標識物質で標識された抗ヒトＩｇＥ抗体を使った検出系を利用して、それぞれのアレルゲン特異的ＩｇＥ抗体価を同時に測定することができる。これにより、被検試料の微量化が可能となり、従来乳幼児から充分量の採取が困難であった血清、血液、又はろ紙血などを測定対象とすることができる。
【００１０】
ビーズの着色
本発明の分析方法では、異なる色調を有する複数種の着色したビーズを用いる。多様に着色されたビーズは市販されており、本発明の分析方法では、これらの市販ビーズを用いることができる。
ビーズのサイズは、直径２ｍｍ〜５ｍｍである。これより小粒径だと、分配操作が煩雑になることがある。また、これより大粒径だと、試料の量が多く必要になり、また、反応効率の面からも好ましくない。
材質としては、反応系に不利益を生じさせなければ、無機物質又は有機物質のいずれも使用することができ、特に限定されるものではないが、好ましくは、高分子物質、例えば、ポリスチレンビーズ又はポリプロピレン、あるいは、ガラスなどを挙げることができる。
【００１１】
着色ビーズは、市販品を用いる代わりに、従来公知の方法により調製することもできる。例えば、ビーズとして、ポリスチレンビーズ［イムノビーズＡ２６（直径＝３．２ｍｍ）；イムノケミカル社］を用いる場合には、例えば、適当な色素［例えば、メチルイエロー（Ｍｅｔｈｙｌ  Ｙｅｌｌｏｗ；東京化成工業）、ソルベントブルー３５（Ｓｏｌｖｅｎｔ  Ｂｌｕｅ  ３５；Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ）、オイルオレンジＳＳ（Ｏｉｌ  Ｏｒａｎｇｅ  ＳＳ；東京化成工業）、又はオイルレッドＥＧＮ（Ｏｉｌ  Ｒｅｄ  ＥＧＮ；Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ）等］を５０％アセトン水溶液に溶解した着色液中で撹拌した後、精製水で洗浄することにより、調製することができる。前記色素としては、油溶性染料が使いやすいが、水溶性染料を用いることも可能である。
【００１２】
ビーズへのアレルゲン固相
各アレルゲンを着色ビーズに結合させる方法も、特に限定されるものではなく、従来公知の手段、例えば、いわゆる物理的吸着又は化学結合法等により実施することができる。
例えば、物理的吸着の場合には、着色ビーズを、各アレルゲンの抽出液を適当な濃度に希釈した水溶液中で撹拌した後、緩衝液で洗浄し、乾燥することにより、アレルゲン結合着色ビーズを調製することができる。
また、化学結合法としては、例えば、ビーズの表面に予めビオチンを固相化しておき、同じくビオチンを結合させたアレルゲンを、アビジンを介して結合させる方法、あるいは、適当な官能基（例えば、カルボキシル基、アミノ基、又はスルフヒドリル基等）の官能基修飾を受けたビーズと、アレルゲンとを、架橋剤（例えば、カルボジイミド又はＮ−ヒドロキシスクシンイミド等）を介して結合させる方法などを挙げることができる。
【００１３】
アレルゲン
本発明の分析方法で用いることのできるアレルゲンとしては、特に限定されるものではないが、例えば、ハウスダスト、チリダニ、食物、花粉、真菌、昆虫、寄生虫、化学物質、又は薬物等、従来公知のアレルゲンを対象とすることができる。各アレルゲンとして、市販品［例えば、グリア（ＧＲＥＥＲ）社などから入手可能］を用いることもできるし、あるいは、所望のアレルゲンを調製することもできる。例えば、原料となる抗原物質をそのまま、あるいは、粉砕処理した後、場合によっては有機溶剤（例えば、エーテル、アセトン、又はヘキサンなど）で脱脂処理を行なった後、緩衝液［例えば、リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）など］中で撹拌抽出し、遠心上清を適当なタンパク濃度に希釈することにより、アレルゲンを調製することができる。
【００１４】
被検試料
本発明の分析方法で分析することのできる被検試料は、前記アレルゲンに特異的に反応するＩｇＥを含む可能性のある試料である限り、特に限定されるものではなく、臨床診断に一般的に用いられる生体由来液、例えば、血清、血液、又はろ紙血などを挙げることができる。
【００１５】
抗ＩｇＥ抗体及び標識物質
抗ＩｇＥ抗体を標識化するのに用いる標識物質としては、公知の標識物質、例えば、酵素（例えば、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、パーオキシダーゼ、又はルシフェラーゼ）、蛍光物質（例えば、ユーロピウム）、発光物質（例えば、アクリジニウム誘導体、又はアダマンタン）、放射性物質（例えば、125Ｉ）等を挙げることができる。また、標識物質に合わせて、例えば、基質液又は発光誘発物質等を適宜選択することができる。また、抗ＩｇＥ抗体としては、分析対象であるＩｇＥと特異的に反応することができる限り、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体のいずれを用いることもできるし、あるいは、その断片、例えば、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はＦｖを用いることもできる。
【００１６】
操作手順
以下、（１）アレルゲン結合工程、（２）被検試料接触工程、（３）単離工程、（４）標識化２次抗体接触工程、及び（５）分析工程をこの順に実施する態様を例にとって、本発明の分析方法を説明する。
本発明の分析方法におけるアレルゲン結合工程では、異なる色調を有する複数種の着色ビーズに、その色調毎に異なるアレルゲンを結合させる。
続く、本発明の分析方法における被検試料接触工程では、前記アレルゲン結合工程で得られたアレルゲン結合着色ビーズと、前記の各アレルゲンとそれぞれ特異的に反応するＩｇＥを含む可能性のある被検試料とを、接触させる。被検試料中に、アレルゲン結合着色ビーズに結合させた或る特定のアレルゲンと特異的に反応するＩｇＥが存在する場合には、前記着色ビーズ上で、前記アレルゲンと前記アレルゲン特異的ＩｇＥとの免疫複合体がそれぞれ形成される。
【００１７】
続いて、本発明の分析方法における単離工程では、前記アレルゲン結合着色ビーズを、その色調毎に単離する。アレルゲン結合着色ビーズを色調毎に単離する方法は、特に限定されるものではないが、例えば、目視により、単離手段（例えば、ピンセット又はアスピレータ）を用いて単離することができる。
各アレルゲン結合着色ビーズを単離した後、次の標識化２次抗体接触工程に移る前に、所望により、各アレルゲン結合着色ビーズの洗浄操作を実施することが好ましい。この洗浄操作により、アレルゲン結合着色ビーズ上に非特異的に残存する未反応物質を除去することができる。
【００１８】
本発明の分析方法における標識化２次抗体接触工程では、前記工程で単離した各アレルゲン結合着色ビーズと、標識物質で標識化した抗ＩｇＥ抗体とを、それぞれ接触させる。
次の分析工程に移る前に、所望により、各アレルゲン結合着色ビーズの洗浄操作を実施することが好ましい。この洗浄操作により、アレルゲン結合着色ビーズ上に非特異的に残存する未反応物質を除去することができる。
【００１９】
続く、本発明の分析方法における分析工程では、各アレルゲン結合着色ビーズと、そのアレルゲンに特異的に反応するＩｇＥと、標識化抗ＩｇＥ抗体とからなる各免疫複合体に含まれる標識物質に由来する各信号、あるいは、前記各免疫複合体に含まれない未反応の標識化抗ＩｇＥ抗体に含まれる標識物質に由来する各信号を、それぞれ分析する。標識物質に由来する各信号の分析方法は、使用する標識物質の種類に応じて、適宜選択することができる。
例えば、複数種のアレルゲンの内、第１のアレルゲンを結合させた第１のアレルゲン結合着色ビーズ上に形成される免疫複合体に含まれる標識物質に由来する信号、あるいは、前記免疫複合体に含まれない未反応の標識化抗ＩｇＥ抗体に含まれる標識物質に由来する信号を分析することにより、第１のアレルゲンに特異的に反応するＩｇＥ、すなわち、第１のアレルゲン特異的ＩｇＥ量を決定することができる。同様にして、各アレルゲン結合着色ビーズ上に形成される各免疫複合体に含まれる標識物質に由来する各信号、あるいは、各免疫複合体に含まれない未反応の標識化抗ＩｇＥ抗体に含まれる標識物質に由来する各信号を、それぞれ分析することにより、各アレルゲンに特異的に反応する各ＩｇＥ量を決定することができる。
【００２０】
なお、標識化２次抗体接触工程及び単離工程の順序を逆にし、アレルゲン結合工程、被検試料接触工程、標識化２次抗体接触工程、単離工程、及び分析工程の順に実施する場合には、前記分析工程では、各アレルゲン結合着色ビーズと、そのアレルゲンに特異的に反応するＩｇＥと、標識化抗ＩｇＥ抗体とからなる各免疫複合体に含まれる標識物質に由来する各信号を分析することにより、アレルゲン特異的ＩｇＥ量を決定することができる。
【００２１】
本発明の分析方法は、（１）アレルゲン結合工程、（２）被検試料接触工程、（３）単離工程、（４）標識化２次抗体接触工程、及び（５）分析工程を含む限り、特に限定されるものではないが、より具体的には、例えば、以下の手順に従って、実施することができる。
【００２２】
（アレルゲン結合着色ビーズの調製）
まず、複数種（例えば、７種）の異なるアレルゲンを、色調の異なる複数種（例えば、７種）のビーズにそれぞれ結合させる。
（第１反応）
得られた複数種のアレルゲン結合着色ビーズが各々適当個数（例えば、１個）ずつ入ったサンプルカップに、検体希釈液（兼抽出液）適当量（例えば、２００μＬ）を分注し、被検試料（例えば、血清１０μＬ又は乾燥ろ紙血１パンチ）を加えて、室温で数時間〜一晩の間、撹拌しながらインキュベートする。
（ビーズトランスファー）
単離手段（例えば、ピンセット等）を用い、サンプルカップからマイクロタイタープレート（例えば、９６穴マイクロタイタープレート）に、１ビーズ／ウェルとなるように、アレルゲン結合着色ビーズを分配する。
（第１洗浄）
各ウェル中の未反応物質を除去する。例えば、自動洗浄機により、精製水又はＰＢＳ等（例えば、３００μＬで５回）で洗浄する。
（標識化抗体の添加）
標識物質を結合した抗ＩｇＥ抗体（例えば、アルカリホスファターゼ標識抗ヒトＩｇＥ抗体）を適当量（例えば、１００μＬ／ウェル）添加し、室温で所定時間（例えば、１時間）撹拌しながらインキュベートする。
（第２洗浄）
再度、例えば、自動洗浄機により、精製水又はＰＢＳ等（例えば、３００μＬで５回）で洗浄する。
（発光基質液添加）
所望により、信号誘発物質を添加する。例えば、標識物質としてアルカリホスファターゼを使用する場合には、信号誘発物質として、例えば、アダマンチルジオキセタン誘導体（ＡＭＰＰＤ；例えば、１００μＬ／ウェル）を添加し、室温で所定時間（例えば、３０分間）撹拌しながらインキュベートする。
（測光）
自動測光機（例えば、Ｌｕｍｉｎｏｕｓ  ＣＴ−９０００Ｄ；ダイアヤトロン）で各ウェル中のビーズの発光量を測定する。
【００２３】
本発明の分析用キットは、（１）異なる色調を有し、しかも、その色調毎に異なるアレルゲンをその表面に担持する複数種の着色ビーズと、（２）標識物質で標識化した抗ＩｇＥ抗体とを含む。
本発明の分析用キットは、例えば、本発明の分析方法に用いることができる。
【００２４】
【実施例】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例１】
本実施例では、アレルギー疾患をもつ患者１９例より血清を採取し、本発明の分析方法により、以下に示す手順に従って、ヤケヒョウヒダニ、卵白、牛乳、小麦、米、ピーナッツ、及び大豆に対する反応性を測定し、発光量（ｃｐｓ）を観察した。また、対照として、ＡｌａＳＴＡＴマイクロプレート（ＡｌａＳＴＡＴＭｉｃｒｏｐｌａｔｅ；Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）の測定結果（ＩＵ／ｍＬ）との比較を行なった。
【００２５】
直径３．２ｍｍのポリスチレンビーズ７種［イムノビーズ；Ａ−２６、Ａ−２６  ＧＲＥＥＮ、Ａ−２６  ＯＲＡＮＧＥ、Ａ−２６  ＢＬＵＥ、Ａ−２６  ＰＩＮＫ、Ａ−２６  ＲＥＤ、及びＡ−２６  ＹＥＬＬＯＷ；イムノケミカル（株）］を、２０個／ｍＬとなるように、ヤケヒョウヒダニ、卵白、牛乳、小麦、米、ピーナッツ、及び大豆の各アレルゲン固相液にそれぞれ添加し、１８時間撹拌した後、ＰＢＳで洗浄し、吸湿紙上で室温乾燥させた。
前記アレルゲン固相液としては、グリア社より購入したアレルゲン抽出物（Ａｌｌｅｒｇｅｎ  Ｅｘｔｒａｃｔ）、すなわち、ヤケヒョウヒダニ（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ  ｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｎｕｓ）、卵白（Ｅｇｇ，Ｃｈｉｃｋｅｎ，Ｗｈｉｔｅ）、牛乳（Ｍｉｌｋ，Ｃｏｗ）、小麦（Ｗｈｅａｔ）、米（Ｒｉｃｅ）、ピーナッツ（Ｐｅａｎｕｔ）、及び大豆（Ｓｏｙｂｅａｎ）を使用した。
【００２６】
得られた７種類のアレルゲン結合着色ビーズ各１個ずつ（計７ビーズ）を、反応チューブ（エッペンドルフテストチューブ，Ｓａｆｅ−Ｌｏｃｋ，２．０ｍＬ）に、ＰＢＳ［０．８％ＮａＣｌ，０．０２％ＫＣｌ，０．１１５％Ｎａ2ＨＰＯ4，０．０２％ＫＨ2ＰＯ4（ｐＨ７．５）］１９０μＬとともに入れ、患者１９例より採取した各血清１０μＬを添加した後、室温下１８時間撹拌した。
ピンセットを用い、各ビーズを９６穴マイクロタイタープレート（Ｒｏｕｎｄ  ｂｏｔｔｏｍ  ｐｌａｔｅ，＃３７９２；Ｃｏａｓｔｅｒ社）に、１ビーズ／ウェルとなるように分配し、自動洗浄機で洗浄（洗浄液：ＰＢＳ）した後、アルカリホスファターゼ標識抗ヒトＩｇＥモノクローナル抗体（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）溶液（濃度＝０．０５μｇ／ｍＬ）１００μＬ／ウェルを分注して、室温１時間撹拌した。自動洗浄機で洗浄後、発光基質（ＰＰＤ試薬；Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）１００μＬ／ウェルを分注した。３０分室温下撹拌した後、測定機（Ｌｕｍｉｎｏｕｓ  ＣＴ−９０００Ｄ；ダイアヤトロン）で発光量を測定した。
【００２７】
また、前記の本発明の分析方法に用いた１９種類の血清について、従来法（ＡｌａＳＴＡＴ法）により特異的ＩｇＥ濃度測定を実施した。
図１〜図７に、各アレルゲンに対する特異的ＩｇＥ量について、本発明の分析方法で得られた結果と従来法で得られた結果との相関関係を、回帰直線及び相関係数（Ｒ）と共に示す。図１〜図７において、横軸（ｘ軸）は、従来法により得られた特異的ＩｇＥ濃度（単位：ＩＵ／ｍＬ）であり、縦軸（ｙ軸）は、本発明の分析方法により得られた発光量（単位：ｃｐｓ）である。それぞれ、ヤケヒョウヒダニ、卵白、牛乳、小麦、米、ピーナッツ、及び大豆に関する結果である。いずれのアレルゲン及び総アレルゲンについても、本発明の分析方法で得られた結果は、従来法（ＡｌａＳＴＡＴ法）による特異的ＩｇＥ濃度測定結果と良好な相関を示した。
【００２８】
【実施例２】
本実施例では、乾燥ろ紙血サンプルにおける特異的ＩｇＥ回収率について検討した。
健常者及びアレルギー患者７０例から血液を採取し、採血用ろ紙［採血用濾紙ディスク型；東洋濾紙（株）製］に５０μＬずつ滴下した後、室温下１時間放置して乾燥させた。乾燥血部位の中心から直径７．５ｍｍの円形に切り出したサンプルを、ＰＢＳ２００μＬとともにチューブに入れ、以下、実施例１に記載の方法と同様にして、７種のアレルゲン結合着色ビーズとの反応、ビーズの単離、標識化抗ヒトＩｇＥ抗体との反応、及び発光量の測定を実施した。
対照として、同時に採取分離した血清を、実施例１に記載の方法と同様にして測定し、発光量の比較を行なった。
【００２９】
図８〜図１４に、各アレルゲン特異的ＩｇＥ量について、血清サンプルから得られた結果と乾燥ろ紙血サンプルから得られた結果との相関関係を回帰直線及び相関係数（Ｒ）と共に示す。図８〜図１４において、横軸（ｘ軸）は、血清サンプルから得られた発光量（単位：ｃｐｓ）であり、縦軸（ｙ軸）は、乾燥ろ紙血から得られた発光量（単位：ｃｐｓ）である。また、図８〜図１４は、それぞれ、ヤケヒョウヒダニ、卵白、牛乳、小麦、米、ピーナッツ、及び大豆に関する結果である。
いずれのアレルゲン及び総アレルゲンについても、乾燥ろ紙血サンプルより得られた発光量は、血清サンプルから得られたものと良好な相関を示した。
【００３０】
【発明の効果】
本発明の分析方法によれば、通常の測定法では充分に測定することができない特異的ＩｇＥ濃度を、複数の原因アレルゲンを対象として、同時に分析することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ヤケヒョウヒダニアレルゲンについて、本発明の分析方法で得られた結果と従来法で得られた結果との相関関係を示すグラフである。
【図２】卵白アレルゲンについて、本発明の分析方法で得られた結果と従来法で得られた結果との相関関係を示すグラフである。
【図３】牛乳アレルゲンについて、本発明の分析方法で得られた結果と従来法で得られた結果との相関関係を示すグラフである。
【図４】小麦アレルゲンについて、本発明の分析方法で得られた結果と従来法で得られた結果との相関関係を示すグラフである。
【図５】米アレルゲンについて、本発明の分析方法で得られた結果と従来法で得られた結果との相関関係を示すグラフである。
【図６】ピーナッツアレルゲンについて、本発明の分析方法で得られた結果と従来法で得られた結果との相関関係を示すグラフである。
【図７】大豆アレルゲンについて、本発明の分析方法で得られた結果と従来法で得られた結果との相関関係を示すグラフである。
【図８】ヤケヒョウヒダニアレルゲンについて、血清サンプルから得られた結果と乾燥ろ紙血サンプルから得られた結果との相関関係を示すグラフである。
【図９】卵白アレルゲンについて、血清サンプルから得られた結果と乾燥ろ紙血サンプルから得られた結果との相関関係を示すグラフである。
【図１０】牛乳アレルゲンについて、血清サンプルから得られた結果と乾燥ろ紙血サンプルから得られた結果との相関関係を示すグラフである。
【図１１】小麦アレルゲンについて、血清サンプルから得られた結果と乾燥ろ紙血サンプルから得られた結果との相関関係を示すグラフである。
【図１２】米アレルゲンについて、血清サンプルから得られた結果と乾燥ろ紙血サンプルから得られた結果との相関関係を示すグラフである。
【図１３】ピーナッツアレルゲンについて、血清サンプルから得られた結果と乾燥ろ紙血サンプルから得られた結果との相関関係を示すグラフである。
【図１４】大豆アレルゲンについて、血清サンプルから得られた結果と乾燥ろ紙血サンプルから得られた結果との相関関係を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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