(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の特徴を有するプロリンジペプチダーゼ。
（１）精製酵素の２８０ｎｍの吸光度単位当たりのＰｒｏ−Ｈｙｐを加水分解する活性が１４０単位±２０単位である。
（２）Ｐｒｏ−Ｈｙｐを加水分解する活性がＳｅｒ−Ｐｒｏ、Ｔｈｒ−Ｐｒｏ、Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ、Ａｌａ−Ｐｒｏ、Ｌｅｕ−Ｐｒｏを加水分解する活性の２倍以上である。但し、ＨｙｐはＬ−ヒドロキシプロリンである。
（３）加水分解活性がＥＤＴＡによる阻害を受けず、かつＭｎイオンにより活性が賦活されない。
（４）６０℃で３０分の加熱後も９０％以上の活性を保持している。
（５）ｐＨ４〜１０で安定である。
（６）非変性条件下での分子量が４４０，０００±２０，０００であり、サブユニットの分子量が４０，０００±２，０００である。
（７）等電点が４．６±０．２である。
【請求項２】
パラクロロマーキュロ安息香酸およびオルトフェナントロリンにより阻害を受けることを特徴とする請求項１記載のプロリンジペプチダーゼ。
【請求項３】
Ｎ−末端部分のアミノ酸配列が、Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｖａｌであることを特徴とする請求項１または２記載のプロリンジペプチダーゼ。
【請求項４】
オーレオバクテリウム属細菌から生産される請求項１〜３のいずれかに記載のプロリンジペプチダーゼ。
【請求項５】
オーレオバクテリウム属細菌がオーレオバクテリウム エステラロマティカムである請求項４に記載のプロリンジペプチダーゼ。
【請求項６】
請求項１記載のプロリンジペプチダーゼを生産する能力がありかつオーレオバクテリウム属に属する微生物を培地に接種して培養し、該培養物よりプロリンジペプチダーゼを回収することを特徴とするプロリンジペプチダーゼの製造方法。
【請求項７】
請求項１記載のプロリンジペプチダーゼを用いた加水分解工程を有することを特徴とする、コラーゲンまたはゼラチンを含むタンパク質およびペプチドの加水分解方法。
【請求項８】
プロリンジペプチダーゼを用いた加水分解工程の前処理工程および／または後処理工程として、フレーバーザイム（商標）による加水分解工程を有することを特徴とする請求項７記載の加水分解方法。
【請求項９】
プロリンジペプチダーゼを用いた加水分解工程の前処理工程および／または後処理工程として、プロテアーゼおよび／またはペプチダーゼを用いてタンパク質を予め低分子化する工程を行うことを特徴とする請求項７記載の加水分解方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は新規プロリンジペプチダーゼ、該ペプチダーゼの製造方法、および該ペプチダーゼを利用したタンパク質およびペプチドの加水分解方法に関する。タンパク質の加水分解物は調味料および調味料原料として利用される。
【０００２】
【従来の技術】
タンパク質の加水分解は、通常高濃度の塩酸存在下に加熱することにより行われており、この方法により多くのタンパク質原料から調味料、調味料原料および食品素材が製造されている。しかしながらこれらの食品を取り扱う業界では、消費者の天然物嗜好の増大に伴い、化学薬品である塩酸を使用しない方法が望まれるようになりつつある。塩酸加水分解法に代わる方法として、タンパク質分解酵素を用いる加水分解方法が考えられるが、酵素のコストが塩酸に比べて高価であること、また塩酸を用いて加水分解した場合と同程度に加水分解率を高めることは困難であったことから、これまで実用化された例は少ない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、蛋白質の高度加水分解に利用し得る新規ペプチダーゼを見出し、これを用いてタンパク質を高度に加水分解する方法を開発することである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
酵素による加水分解でタンパク質の加水分解率が低い原因の１つとして、タンパク質中のプロリン残基およびヒドロキシプロリン残基の存在があげられる。プロリンおよびヒドロキシプロリンは環状α−イミノ酸であり、他のアミノ酸とは異なる立体構造をしている。蛋白質またはペプチド中のプロリン残基およびヒドロキシプロリン残基のイミノ基やカルボキシル基が関与するペプチド結合は通常のタンパク質分解酵素による加水分解を受けにくい。すなわち、タンパク質を通常のタンパク質分解酵素で加水分解すると、プロリン残基の部分がジペプチドまたはトリペプチドの状態にまで加水分解された時点で反応が終了してしまうことになる。
【０００５】
プロリン残基を含むジペプチドを加水分解する酵素としては、Ｐｒｏ−Ｘの構造を有するジペプチドを加水分解するプロリルジペプチダーゼ（別名プロリナーゼ）とＸ−Ｐｒｏの構造を有するジペプチドを加水分解するプロリンジペプチダーゼ（別名プロリダーゼ）とが知られている。ここでＸは通常のＬ−アミノ酸を示す。本発明者らは通常のタンパク質分解酵素による加水分解工程と、プロリンジペプチダーゼおよびプロリルジペプチダーゼを含む酵素剤を用いた加水分解工程を組み合わせることによりタンパク質を高度に加水分解できること見出し、プロリン残基部分を効率よく加水分解することがタンパク質の高度分解にとって大切であることを確認し、平成５年日本国特許出願第２６６４６７号にその内容を開示した。
【０００６】
上記方法は多くのタンパク質の酵素による加水分解に適用可能であるが、コラーゲンやゼラチンのようにヒドロキシプロリンを多量に含むタンパク質の加水分解に適用することには問題がある。多くのプロリルジペプチダーゼはＰｒｏ−Ｘのジペプチドの他にプロリンがヒドロキシプロリンに置き換わったＨｙｐ−Ｘを加水分解できる。逆にプロリンジペプチダーゼの多くはＸ−Ｈｙｐのジペプチドを加水分解できない。哺乳類の小腸由来のプロリンジペプチダーゼはＧｌｙ−Ｈｙｐを加水分解することが報告されているものの（Ｓｊｏｅｓｔｒｏｅｍら、”Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｐｉｇ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｐｒｏｌｉｄａｓｅ”Ｂｉｏｃｈｉｍ・Ｂｉｏｐｈｙｓａｃｔａ  第３２７巻  ４５７〜４７０頁［１９７３］）、Ｇｌｙ−Ｐｒｏを加水分解する場合と比較してその活性は極端に低く、かつ微生物由来の酵素のように大量培養による酵素の工業的な生産は不可能である。現在までに知られている微生物由来のプロリンジペプチダーゼはＸ−Ｈｙｐを加水分解することができないため、これを加水分解できる微生物由来の酵素が望まれていた。
【０００７】
さらに、コラーゲンやゼラチン中のヒドロキシプロリンの多くはプロリンと結合した状態（Ｐｒｏ−Ｈｙｐの状態）で存在しているが（以下、ＨｙｐはＬ−ヒドロキシプロリンを表す。）、Ｐｒｏ−Ｈｙｐのジペプチドを加水分解するペプチダーゼはこれまでに報告がないことから、Ｘ−Ｈｙｐを加水分解できるペプチダーゼの中でもＰｒｏ−Ｈｙｐも加水分解できる酵素が特に望まれていた。
【０００８】
そこで本発明者らは鋭意検討を行った結果、オーレオバクテリウム（Ａｕｒｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する細菌がＰｒｏ−Ｈｙｐの構造を示すジペプチドを加水分解するプロリンジペプチダーゼを生産することを見出し、該ペプチダーゼによる加水分解工程をタンパク質の加水分解に取り入れることによりヒドロキシプロリンを多量に含むタンパク質であっても効率よく加水分解できることを確認し、本発明を完成させるに到った。
すなわち、本発明は、Ｐｒｏ−Ｈｙｐで表されるジペプチドを加水分解するプロリンジペプチダーゼおよびその製造方法、並びに該ペプチダーゼを用いたコラーゲンまたはゼラチンを含むタンパク質およびペプチドの加水分解方法に係わる。
【０００９】
本発明のプロリンジペプチダーゼは以下の特徴を有する。
（１）精製酵素の２８０ｎｍの吸光度単位当たりのＰｒｏ−Ｈｙｐを加水分解する活性が１４０単位±２０単位である。
（２）Ｐｒｏ−Ｈｙｐを加水分解する活性がＳｅｒ−Ｐｒｏ、Ｔｈｒ−Ｐｒｏ、Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ、Ａｌａ−Ｐｒｏ、Ｌｅｕ−Ｐｒｏを加水分解する活性の２倍以上である。
（３）加水分解活性がＥＤＴＡによる阻害を受けず、かつＭｎイオンにより活性が賦活されない。
（４）６０℃で３０分の加熱後も９０％以上の活性を保持している。
好ましくは、上記に加え、非変性条件下での分子量が４４０，０００±２０，０００であり、サブユニットの分子量が４０，０００±２，０００であり、等電点が４．６±０．２であり、パラクロロマーキュロ安息香酸およびオルトフェナントロリンにより阻害を受けることを特徴とするプロリンジペプチダーゼである。
【００１０】
また、本発明のピロリンジペプチダーゼは、Ｎ−末端部分のアミノ酸配列が、Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｖａｌであることが好ましい。
これらの特性は、後述の実施例に記載の方法により測定する。
本発明のプロリンジペプチダーゼの例としては、Ａｕｒｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｕ  ｅｓｔｅｒａｒｏｍａｔｉｃｕｍ  ＩＦＯ  ３７５２が生産するペプチダーゼがあげられる。このペプチダーゼの分子量は約４４万であり（図６）、またサブユニットの分子量は約４万である（図７）。約４．６の等電点を示し（図８）、Ｓｅｒ−Ｐｒｏ、Ｌｅｕ−Ｐｒｏ等を加水分解するプロリンジペプチダーゼである。なかでも、Ｐｒｏ−Ｈｙｐ、Ｇｌｙ−ＨｙｐのようにＣ−末端プロリンがヒドロキシプロリンに置き代わったジペプチドに対しても加水分解活性を有し、特にＰｒｏ−Ｈｙｐのジペプチドに対して高い加水分解活性を示す点で新規である（表２）。また微生物由来の既知のプロリンジペプチダーゼが活性の発現にマンガンイオンを要求し、マンガンイオンを添加しない場合には加水分解反応が効率よく進まず、かつＥＤＴＡ等のキレート剤により活性が阻害されるのに対し、本酵素はマンガンイオンの添加を必要とせず、ＥＤＴＡによりその活性が阻害されないことも新規である（表３）。
【００１１】
本発明のプロリンジペプチダーゼは、Ｐｒｏ−Ｈｙｐのジペプチドを加水分解するペプチダーゼを生産する能力のある微生物を培地に接種し、一定時間培養を行った後、培養液より該酵素を抽出することにより製造することができる。そのような能力のある微生物の例として、オーレオバクテリウム  エステラロマティカム（Ａｕｒｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｓｔｅｒａｒｏｍａｔｉｃｕｍ）ＩＦＯ  ３７５２があげられる。この微生物は財団法人発酵研究所が保存する微生物であり、同所に依頼することにより誰でもこの菌株の分譲を受けることができる。Ａｕｒｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｓｔｅｒａｒｏｍａｔｉｃｕｍ  ＩＦＯ  ３７５２の場合には、本菌をグルコース、ペプトン、酵母エキス、コーンスティープリカー（ＣＳＬ）等を含む培地に接種し、２８〜３０℃で１〜３日好気培養することにより該ペプチダーゼが生産される。該ペプチダーゼは培養上清中にも多少蓄積するため、これを濃縮してもよいが、多量の酵素を取得する場合には菌体を遠心分離等により集め、超音波処理、浸透圧ショック処理、リゾチーム処理や界面活性剤処理を行い、菌体内に存在する該ペプチダーゼを抽出することが望ましい。菌体の抽出液より公知の常法、例えば硫安またはアセトンによる分画、疎水クロマトグラフ、イオン交換クロマトグラフ、ゲル濾過クロマトグラフ等を用いることにより、Ｐｒｏ−Ｈｙｐのジペプチドを加水分解する酵素を精製することができる。
【００１２】
本発明のプロリンジペプチダーゼのスクリーニングは、各種微生物の培養液または菌体抽出液をＰｒｏ−Ｈｙｐのジペプチドに作用させ、遊離するプロリンおよびヒドロキシプロリンの量をニンヒドリン反応等により検出することにより行うことが可能である。また別法として、Ｇｌｙ−ＰｒｏやＧｌｙ−Ｈｙｐの様なジペプチドを加水分解することを指標にプロリンジペプチダーゼのスクリーニングを行い、選択されたプロリンジペプチダーゼの中からＰｒｏ−Ｈｙｐにも作用するものを選択しても良い。
【００１３】
本発明のプロリンジペプチダーゼを用いてタンパク質およびペプチドを加水分解する際、必ずしも酵素を精製することは必要ではない。加水分解反応もしくは加水分解物に悪影響を与える因子が混在せず、かつ食品衛生上の問題が無ければ該酵素の粗精製品または培養液からの抽出物をそのまま反応に利用することも可能である。
【００１４】
本発明のプロリンジペプチダーゼを用いたタンパク質およびペプチドを加水分解する方法は公知のペプチダーゼを用いる反応と何等変わりはないが、該ペプチダーゼはアミノ酸数３以上のオリゴペプチドを加水分解することができないため、タンパク質はあらかじめプロテアーゼ等により、該ペプチダーゼが充分作用できる程度に前処理工程により低分子化しておくことが必要である。このようなタンパク質の前処理に用いる酵素の例として、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属またはリゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属由来のプロテアーゼやペプチダーゼがあげられ、既に天野製薬社よりプロテアーゼＡ、プロテアーゼＭ、およびペプチダーゼＲ等の酵素製剤が、また科研製薬社よりアクチナーゼ等がプロテアーゼ製剤が市販されている。
【００１５】
コラーゲンおよびゼラチン等、プロリンやヒドロキシプロリンを多く含むタンパク質を加水分解する場合には、前処理が特に重要であり、より高い加水分解率の達成がこの前処理工程に要求される。すなわち、本発明のプロリンジペプチダーゼによる加水分解は、低分子化工程が終了した時点での加水分解率に強く依存し、この時点での加水分解率が３０％以下（ペプチドの平均アミノ酸数が３以上）では該ペプチダーゼによる加水分解率の増加は僅かであるため、前処理工程終了時点において、好ましくは４０％以上、より好ましくは５０％以上のペプチド結合が加水分解されていることが望ましい。
【００１６】
このような高い加水分解率は、原料タンパク質を複数のプロテアーゼおよびペプチダーゼで処理することにより達成できるが、異なる複数のプロテアーゼ製剤を同時にまたは連続して使用するよりも、複数のプロテアーゼおよびペプチダーゼを同時に含む単一のプロテアーゼ製剤を用いる方が有利であることは言うまでもない。複数のプロテアーゼおよび公知のペプチダーゼを同時に含むプロテアーゼ製剤の例としてはノボ・ノルディスク社（ＮＯＶＯ  ＮＯＲＤＩＳＫ  Ａ／Ｓ、デンマーク）のフレ−バ−ザイム（Ｆｌａｖｏｕｒｚｙｍｅ）があげられる。該プロテアーゼ製剤にはアスペルギルス  オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）由来で、分子量がそれぞれ約２３ｋＤ、約２７ｋＤ、約３１ｋＤ、約３２ｋＤ、約３５ｋＤ、約３８ｋＤ、約４２ｋＤ、約４７ｋＤ、約５３ｋＤ、および約１００ｋＤの中から選ばれる少なくとも５種のプロテアーゼおよびペプチダーゼが含まれている。詳細には、上記の５種のプロテアーゼおよびペプチダーゼの分子量はそれぞれ約２３ｋＤ、約３１ｋＤ、約３５ｋＤ、約３８ｋＤ、約５３ｋＤである。このような酵素製剤によりコラーゲンやゼラチン等、プロリンやヒドロキシプロリンを多く含むタンパク質の前処理を行った場合には、単にこの工程での加水分解率が高いのみならず、本発明のペプチダーゼによる加水分解工程において分解率の増加分がより高くなることが見出された。
【００１７】
本発明のプロリンジペプチダーゼによる加水分解工程は、通常のプロテアーゼ製剤による前処理反応の終了後に行えばよい。但し、添加したプロテアーゼ製剤の残存活性により本発明のペプチダーゼが消化され、その活性が失われることも考えられるため、前処理反応が終了した時点で加熱などによりプロテアーゼを失活させておくことことが必要な場合もある。
【００１８】
本発明のプロリンジペプチダーゼによる加水分解は反応液のｐＨが７〜１０、好ましくは８〜９の範囲で、反応温度は３０〜６０℃、好ましくは４０〜５０℃で行うことが必要である。尚、本発明のプロリンジペプチダーゼはコラーゲンやゼラチン中に多く含まれているＧｌｙ−ＰｒｏやＰｒｏ−Ｈｙｐを加水分解できる。特にＰｒｏ−Ｈｙｐに対する特異性が高く、このジペプチドを加水分解する活性は、Ｓｅｒ−Ｐｒｏ、Ｔｈｒ−ｐｒｏ、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ、Ａｌａ−Ｐｒｏ、Ｌｅｕ−Ｐｒｏを加水分解する活性の２倍以上である。さらに通常のプロリンジペプチダーゼは活性発現に人体に有害なマンガンイオンを必要とするが、本発明のプロリンジペプチダーゼはマンガンイオンを必要としないことから調味料等の食品素材を生産する場合にも適している。
以下に本発明の実施例を示すが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００１９】
【実施例】
以下の実施例で得られた酵素の性質は以下のようにして求めた。
（１）蛋白質量の測定
精製酵素を１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で適宜希釈後、同緩衝液をブランクとして２８０ｎｍの吸光度を島津分光光度計ＵＶ−１６０Ａを用いて測定した。蛋白質量は、２８０ｎｍにおける吸光度１の蛋白質溶液１ｍｌ中に含まれる蛋白質を１単位とする吸光度単位で示した。なお、本精製酵素の１吸光度単位は、約１．８ｍｇの蛋白質量に相当した。
（２）Ｐｒｏ−Ｈｙｐの加水分解活性
５ｍＭのＰｒｏ−Ｈｙｐを含む１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）２００μｌに、２８０ｎｍの吸光度既知の酵素液（同上の緩衝液で適宜希釈したもの）を１００μｌ添加し、３７℃で１５分間反応させた。反応液に１Ｍの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ２．８）７００μｌを添加して反応を停止させ、１０％ニンヒドリンを含む９５％エタノール溶液１００μｌを加えて７０℃で１０分間ニンヒドリン反を行い、プロリンおよびヒドロキシプロリンに由来する４４０ｎｍの吸光度を測定した。標準液として、基質であるＰｒｏ−Ｈｙｐと、その想定加水分解物（プロリンとニンヒドリンとの等モル混合液）とを適宜混合したものにつき、同上のニンヒドリン反応を行って標準曲線を作成し、これをもとにＰｒｏ−Ｈｙｐの加水分解率を求めた。なお、酵素１単位は３７℃、１分間の反応で１μモルのＰｒｏ−Ｈｙｐを加水分解する酵素量と定義した。
【００２０】
（３）基質特異性
プロリンまたはヒドロキシプロリンを含む各種ペプチドを加水分解する能力について調べた。各種ペプチド５ｍＭを含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液２００μｌに、０．００４〜０．０４単位の酵素活性を含む上記緩衝液１００μｌを加え、３７℃で３０分間反応させた。反応液に１Ｍの酢酸緩衝液（ｐＨ２．８）７００μｌを添加して反応を停止させ、１０％ニンヒドリンを含む９５％エタノール溶液１００μｌを加えて７０℃で１０分間ニンヒドリン反応を行い、プロリンまたはヒドロキシプロリンに由来する４４０ｎｍの吸光度を測定した。一方、プロリン、ヒドロキシプロリンおよびこれらの混合液を用いて作製した標準曲線を基に遊離したプロリンおよびヒドロキシプロリンの量を求め、ペプチド結合の加水分解率を算出し、各種ペプチドに対する加水分解活性を比較した。
【００２１】
（４）阻害剤および金属イオンの影響
阻害剤の酵素に及ぼす効果を以下のように調べた。酵素液に各種阻害剤を一定量添加して１００μｌとし、室温で２０分放置した後、同じ濃度の阻害剤を含む５ｍＭの基質（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）を２００μｌ添加して３７℃で１時間反応させた。その後上記と同様に酢酸酸性下でニンヒドリン反応を行うことにより遊離プロリン量を測定した。また、酵素反応を各種金属イオンの存在下に行い、金属イオンの影響を調べた。
（５）最適温度および熱安定性
酵素を１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を用いて適宜希釈した後、６０℃で一定時間処理し、これらのＰｒｏ−Ｈｙｐを加水分解する酵素活性を測定することにより熱安定性を求めた。また同上の緩衝液中で各種温度で１０分間反応を行い、Ｐｒｏ−Ｈｙｐを加水分解する活性を比較した。
【００２２】
（６）分子量の測定
非変性条件下での分子量の測定は、トーソー（Ｔｏｓｏｈ）社製ＨＰＬＣカラムＧ４０００ＰＷＸＬ（内径７．８ｍｍ×３０ｃｍ）を用いたゲル濾過により行った。０．５ＭのＫＣｌを含む１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）でカラムを平衡化し、精製酵素溶液をアプライした。同緩衝液を１．０ｍｌ／分で流し、溶出液を２８０ｎｍの吸光度でモニターした。次に、分子量マーカーとして、ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）社製ブル−デキストリン（分子量２、０００、０００）、チログロブリン（分子量６６９、０００）、フェリチン（分子量４４０、０００）、アルドラーゼ（分子量１５８、０００）、アルブミン（分子量６７、０００）につき、同上の条件でゲル濾過を行い、得られた校正曲線より分子量を測定した。
【００２３】
酵素のサブユニットの分子量はファルマシア社製ファストシステム（Ｐｈａｓｔ  ｓｙｓｔｅｍ）を用いたＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定した。ゲルは１０−１５％のグラディエントゲルを使用した。分子量マーカーとして、ファルマシア社製ホスホリラーゼｂ（分子量９４、０００）、アルブミン（分子量６７、０００）、オボアルブミン（分子量４３、０００）、カーボニック・アンヒドラーゼＢ（分子量３０、０００）、トリプシンインヒビター（分子量２０、１００）、α−ラクトアルブミン（分子量１４、４００）を用い、これらの泳動位置から求めた校正曲線より分子量を求めた。
【００２４】
（７）等電点の測定
ファルマシア社製ファストシステム（Ｐｈａｓｔ  ｓｙｓｔｅｍ）を用いた等電点電気泳動により等電点を求めた。ゲルはＩＥＦ４−６．５を使用し、内部標準として用いた等電点マーカーであるファルマシア社製グルコース・オキシダーゼ（等電点４．１５）、トリプシンインヒビタ−（等電点４．５５）、β−ラクトアルブミン（等電点５．２０）、牛カーボニック・アンヒドラーゼ（等電点５．８５）、人カーボニック・アンヒドラーゼ（等電点６．５５）より校正曲線を求め本発明の酵素の等電点を求めた。
（８）最適ｐＨおよびｐＨ安定性
ｐＨ安定性は、酵素を各種ｐＨの緩衝液中で、室温で１時間放置し、その後ｐＨ８．０での活性を測定することにより求めた。その際、ｐＨ３．５〜５．５は５０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液をｐＨ５．５〜７．０は１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液を、ｐＨ７．０〜９．０は１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液をｐＨ９．０〜１０．５は１０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液を用いた。
【００２５】
酵素の最適反応ｐＨは、Ｐｒｏ−Ｈｙｐを加水分解する反応を上記の緩衝液中で行わせることにより求めた。
（９）Ｎ−末端部分のアミノ酸配列
パーキン・エルマー社製アプライド・バイオシステムズ・プロテインシーケンサーＰＲＯＣＩＳＥ４９２を用いて、精製酵素のエドマン分解とＰＴＨ−アミノ酸の同定を行うことによりＮ−末端部分のアミノ酸配列を決定した。
【００２６】
【実施例１】
オーレオバクテリウム  エステラロマティカム  （Ａｕｒｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｓｔｅｒａｒｏｍａｔｉｃｕｍ）  ＩＦＯ  ３７５２を、グルコース０．５％、ポリペプトン２％、酵母エキス０．５％、ＣＳＬ２％、塩化ナトリウム０．３％、リン酸水素二カリウム０．２％、硫酸マグネシウム・７水和物０．１％よりなる培地６リットルを含む１０リットル容ジャ−ファ−メンタ−に接種し、３０℃で２０時間通気・撹拌培養した。培養液より集菌し、１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で２回洗浄し、８９ｇの湿菌体を得た。これを１０ｍＭのＥＤＴＡを含む同緩衝液４００ｍｌに懸濁させた。これにリゾチームを終濃度０．５ｍｇ／ｍｌとなるように添加し、３７℃で３時間保温した後、１０％のトリトンＸ−１００水溶液４ｍｌを添加した。これを超音波処理し、１５、０００ｇで１０分間遠心分離して上清３５０ｍｌを回収し、粗酵素抽出液とした。
【００２７】
粗酵素抽出液のアセトン分画を以下のように行った。粗酵素抽出液３５０ｍｌに冷アセトン１７５ｍｌを添加して遠心分離（５、０００ｇ、１０分）を行い、上清に更に冷アセトン４５５ｍｌを添加して同上の条件で遠心分離し、沈澱を回収した。沈澱を１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）５０ｍｌに溶かして再度遠心分離（５、０００ｇ、１０分）を行って不溶物を除去した後、マニトールを０．５ｇ添加溶解し、その後凍結乾燥によりアセトン分画粗酵素約１．５ｇを得た。
【００２８】
ファルマシア社製オクチルセファロースＣＬ−４Ｂを充填したカラムを１Ｍの硫安を含む１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化した。粗酵素全量を１Ｍ硫安を含む１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）１００ｍｌに溶解させ、これを上記カラムにアプライし、１→０Ｍの硫安の濃度勾配（総量５００ｍｌ）で酵素を溶出させた。各画分につき２８０ｎｍの吸光度とＰｒｏ−Ｈｙｐを加水分解する活性について測定した結果を図１に示した。活性画分（フラクション３７乃至５４）を混合し、電気伝導度を指標に硫安濃度を１Ｍに調整した。これを上記オクチルセファロ−スカラムに再度アプライし、１→０Ｍの硫安の濃度勾配（総量２００ｍｌ）で溶出させた。その結果を図２に示した。
【００２９】
活性画分（フラクション１９乃至２５）を１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に対して透析し、これを同緩衝液で平衡化したファルマシア社製ＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂカラムにアプライし、０→１Ｍの塩化カリウムの濃度勾配（総量２００ｍｌ）により酵素を溶出させた（図３）。活性画分（フラクション２２乃至２５）を集め、１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に対して透析し、これを同緩衝液で平衡化したファルマシア社製Ｑ−セファロ−スＦＦカラムにアプライし、０→１Ｍの塩化カリウムの濃度勾配（総量２００ｍｌ）により酵素を溶出させた（図４）活性画分であるフラクション１４および１５をそれぞれアミコン社製セントリフローＣＦ２５（分画分子量２５、０００）で濃縮した。フラクション１４の濃縮液をファルマシア社製スーパーロース１２  ＨＲ１０／３０カラムを用い、０．５Ｍの塩化カリウムを含む１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を流してゲル濾過を行った（図５Ａ）。またＱ−セファロースフラクション１５の濃縮液も同様にゲル濾過を行った（図５Ｂ）。図５Ａのフラクション３１、３２および図５Ｂのフラクション３０、３１を混合し、セントリフローにて濃縮・脱塩を行って精製酵素液を得た。
本酵素精製のプロフィールを表１に示した。
【００３０】
【表１】
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【００３１】
精製酵素を１０〜１５％のポリアクリルアミドゲル電気泳動（ファルマシア社製ファストシステム）にて解析した結果、純度は９５％以上であることを確認した。精製酵素のＰｒｏ−Ｈｙｐを加水分解する比活性は２８０ｎｍの吸光度単位当たり１４０単位であった。
得られた酵素の分子量は４４０，０００±２０，０００、（図６）、またサブユニットの分子量は４０，０００±２，０００（図７）と推定された。また本酵素の等電点は４．６±０．２と推定された（図８）。
【００３２】
精製酵素を用いて基質特異性を調べた結果を表２に示す。本酵素はＳｅｒ−Ｐｒｏ、Ｔｈｒ−Ｐｒｏ、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ、Ａｌａ−Ｐｒｏ，Ｌｅｕ−Ｐｒｏ等を加水分解するプロリンジペプチダーゼであった。また本酵素はＰｒｏ−Ｐｒｏに対しても比較的強い加水分解活性を示したが、プロリルジペプチダーゼの基質にであるＰｒｏ−ＧｌｙやアミノペプチダーゼＰの基質であるオリゴプロリンには作用しなかった。またＮ−末端修飾ペプチドに対する活性も認められなかった。本酵素はＰｒｏ−Ｈｙｐに対する加水分解活性が特に強く、既知のプロリンジペプチダーゼに基質として知られているＳｅｒ−Ｐｒｏ、Ｔｈｒ−Ｐｒｏ、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ、Ａｌａ−Ｐｒｏ，Ｌｅｕ−Ｐｒｏ等のジペプチドを加水分解する活性の２倍以上であった。さらにＧｌｙ−Ｈｙｐに対しても加水分解活性を示し、Ｇｌｙ−Ｐｒｏに対する活性と同等もしくはそれ以上であった。
【００３３】
【表２】
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【００３４】
本プロリンジペプチダーゼに対する各種阻害剤および金属イオンの影響を調べた結果を表３に示す。通常のプロリンジペプチダーゼはマンガンを活性中心に持つ金属酵素であり、キレート剤であるＥＤＴＡによりその活性が阻害されること、およびマンガンイオンにより活性が賦活されることが特徴である。一方、本発明のプロリンジペプチダーゼはＥＤＴＡでは全く阻害を受けず、かつ、マンガンによる賦活もないことから、既知のプロリンジペプチダーゼとはその特徴が大きく異なる酵素である。さらに、本酵素はＰＣＭＢ（パラクロロマーキュロ安息香酸）により強く阻害されることから、ＳＨ基を活性中心に持つ酵素であると考えられた。
【００３５】
【表３】
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【００３６】
本酵素はｐＨ４乃至１０の範囲で安定であり（図９）、反応の最適ｐＨは９．０であった（図１０）。また本酵素は熱に対しても安定であり、６０℃、３０分の加熱後も９０％以上の活性が保持されていた（図１１）。最適作用温度は４５℃であった（図１２）。
本酵素のＮ−末端部分のアミノ酸配列は、Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｖａｌであった。
【００３７】
【実施例２】
Ａｕｒｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｓｔｅｒａｒｏｍａｔｉｃｕｍ  ＩＦＯ  ３７５２を、グルコース０．５％、ポリペプトン１％、酵母エキス０．５％、脱脂綿実粉０．３％、塩化ナトリウム０．３％リン酸水素二カリウム０．２％、硫酸マグネシウム・７水和物０．１％よりなる培地１リットルに接種し、２８℃で３日間振盪培養した。培養液より集菌し、１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で２回洗浄後、１０ｍＭのＥＤＴＡを含む同緩衝液２００ｍｌに懸濁させた。これにリゾチームを終濃度０．５ｍｇ／ｍｌとなるように添加し、３７℃で１時間保温した。これを超音波処理し、１５、０００ｇで１０分間遠心分離して上清１５０ｍｌを回収し、粗酵素抽出液とした。
【００３８】
ゼラチンの１０％水溶液５００ｍｌに天野製薬社製プロテアーゼＭを１ｇ添加し、ｐＨ５．５、５０℃で２４時間加水分解させた。加水分解液を８５℃で３０分加熱することにより酵素を失活させた後、水酸化ナトリウムでｐＨを８．０に調整した（反応液Ａ）。
２００ｍｌの反応液Ａに上記の粗酵素抽出液２０ｍｌを添加し、５０℃で２４時間加水分解させた（反応液Ｂ）。
反応液ＡおよびＢにつきケルダール法による全窒素（Ｔ−Ｎ）の分析とホルモール滴定法によるホルモール窒素（Ｆ−Ｎ）の分析を行い、両者の比より加水分解率を計算した。その結果、反応液Ｂは反応液Ａに比べて約２０％高い加水分解率を示した（表４）。
【００３９】
【表４】
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【００４０】
【実施例３】
ゼラチンの１０％水溶液５００ｍｌに天野製薬社製プロテアーゼＭを１ｇ添加し、ｐＨ５．５、５０℃で２４時間加水分解させた。加水分解液を８５℃で３０分加熱することにより酵素を失活させた後、水酸化ナトリウムでｐＨを８．０に調整した（反応液Ｃ）。
２００ｍｌの反応液Ｃに、実施例２で得られた粗酵素抽出液５ｍｌを添加し、４０℃で２４時間加水分解させた（反応液Ｄ）。
反応液ＣおよびＤにつきケルダール法による全窒素（Ｔ−Ｎ）の分析とホルモール滴定法によるホルモール窒素（Ｆ−Ｎ）の分析を行い、両者の比より加水分解率を計算した。表４に結果を示した通り、反応液Ｄは反応液Ｃに比べて約１０％高い加水分解率を示した。
【００４１】
【実施例４】
ゼラチンの１０％水溶液５００ｍｌをｐＨ７．０に調整し、ノボ・ノルディスク社製フレーバーザイムを１ｇ添加して５０℃で２４時間加水分解させた。加水分解液を８５℃で３０分加熱することにより酵素を失活させた後、水酸化ナトリウムでｐＨを８．０に調整した（反応液Ｅ）。
２００ｍｌの反応液Ｅに、実施例２で得られた粗酵素抽出液５ｍｌを添加し、４０℃で２４時間加水分解させた（反応液Ｆ）。
反応液ＥおよびＦにつきケルダール法による全窒素（Ｔ−Ｎ）の分析とホルモール滴定法によるホルモール窒素（Ｆ−Ｎ）の分析を行い、両者の比より加水分解率を計算した。その結果、反応液Ｆは反応液Ｅに比べて約２０％高い加水分解率を示した（表４）。
【００４２】
【発明の効果】
Ｐｒｏ−Ｈｙｐのジペプチドを効率的に加水分解するプロリンジペプチダーゼが新たに見出され、これを用いることによりヒドロキシプロリンを含むタンパク質を高度に加水分解できる。
【００４３】
【図面の簡単な説明】
【図１】オクチル−セファロースＣＬ−４Ｂクロマトグラフィーによるプロリンジペプチダーゼの分画パターンである。
【図２】オクチル−セファロースＣＬ−４Ｂクロマトグラフィーによるプロリンジペプチダーゼのリクロマトグラフのパターンである。
【図３】ＤＥＡＥ−セファロースＣＬ−６Ｂクロマトグラフィーによるプロリンジペプチダーゼの分画パターンである。
【図４】Ｑ−セファロースＦＦクロマトグラフィーによるプロリンジペプチダーゼの分画パターンである。
【図５】スーパーロース１２  １０／３０カラムによるゲル濾過クロマトグラフィーによるプロリンジペプチダーゼの分画パターンである。
【図６】ゲル濾過ＨＰＬＣにより求めたプロリンジペプチダーゼの分子量を示す。
【図７】ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により求めたプロリンジペプチダーゼサブユニットの分子量を示す。
【図８】等電点電気泳動により求めたプロリンジペプチダーゼの等電点を示す。
【図９】プロリンジペプチダーゼのｐＨ安定性を示す。
【図１０】プロリンジペプチダーゼのｐＨ特性を示す。
【図１１】プロリンジペプチダーゼの６０℃での熱失活曲線を示す。
【図１２】プロリンジペプチダーゼの温度特性を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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