(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
プローブを保持するゲルを有し、かつ第１の方向に配置された区画と、
前記区画に配置される第１の電極と、
前記第１の方向に沿って配置される第２の電極と、
前記第１の電極と前記第２の電極との間に配置される第３の電極と、
高周波電界印加手段とを具備し、
前記高周波電界印加手段は、前記第１の電極と前記第２の電極との間、もしくは前記第２の電極と前記第３の電極との間に高周波電界を印加することを特徴とするプローブチップ。
【請求項２】
前記第１の電極と前記第２の電極とは、前記高周波電界印加手段によって高周波電界を印加されることにより、試料を前記区画の中を移動させて、前記ゲルに保持された前記プローブと前記試料とを結合させるものであり、
前記第２の電極と前記第３の電極とは、前記高周波電界印加手段によって高周波電界を印加されることにより、前記ゲルに保持された前記プローブと結合しない前記試料を前記ゲルから移動させるものであることを特徴とする請求項１に記載のプローブチップ。
【請求項３】
前記第１の電極は第１の点電極であり、前記第２の電極は線電極であり、前記第３の電極は第２の点電極であることを特徴とする請求項１に記載のプローブチップ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及び蛋白質等の検査対象に関する種々の検査項目を一度に検査するプローブチップ（多項目センサー）に関し、特に、プローブチップ、プローブチップ作成方法、及びこれを用いる試料検出方法、試料検出装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ゲノム計画の進展とともにＤＮＡレベルで生体を理解し、病気の診断や生命現象の理解をしようとする動きが活発化してきた。生命現象の理解や遺伝子の働きを調べるには遺伝子の発現状況を調べることが有効である。この有力な方法として、固体表面上に数多くのＤＮＡプローブを種類毎に区分けして固定したＤＮＡプローブアレーあるいはＤＮＡチップが用いられ始めている。
【０００３】
このＤＮＡチップの作成には、光化学反応と半導体工業で広く使用されているリソグラフィーを用いて、区画された多数のセルに設計された配列のオリゴマーを一塩基づつ合成する方法（従来技術１：Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５１、７６７−７７３（１９９１））、ＤＮＡプローブを各区画に一つ一つ植え込む方法（従来技術２：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３、４６１３−４９１８（１９９６））等の方法ががある。
【０００４】
チップに固定するプローブ量を多くするために、チップ上にアクリルアミドゲルの膜を形成し、このゲルにプローブを固定する方法も考案されている（従来技術：３Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３、４６１３−４９１８（１９９６））。
【０００５】
ＤＮＡプローブチップに用いられるＤＮＡプローブの固定方法として、ビオチンとアビジンの結合を利用したり、Ａｕ（金）表面にＳＨ基を介して固定する方法（従来技術４：Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ７１、１０７９−１０８６（１９９６））、ガラス表面に固定する方法（従来技術５：Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２４７、９６−１０１（１９９７））、ガラス表面に塗布したアクリルアミドゲルのエレメントマトリックスに固定する方法（従来技術６：Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３、４９１３−４９１８（１９９６））、等が知られている
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
ＤＮＡ又はその誘導体に限らずＲＮＡ又はその誘導体を固体（チップ）表面上に保持することもあるので、以下では、ポリヌクレオチドを固体（チップ）表面上に保持したものをポリヌクレオチドプローブチップと呼ぶことにする。
【０００７】
従来技術１、２の何れのＤＮＡチップの作成方法も制作に手間と時間がかかり、製作費が高価になるという問題があり、特に、プローブアレーが密集した微細な部分からなるＤＮＡチップの製作には一層手間と時間がかかるという問題がある。即ち、一般のユーザーが簡単に作成できない不便さがある。
【０００８】
一般に、ＤＮＡチップを使用する検査では、狭いチップ表面に保持したプローブに多量の溶液を接触させて、溶液中の目的ＤＮＡをプローブと会合させる必要があるため、ハイブリダイゼーションの速度が遅いとういう重大な問題がある。特に、プローブに対して目的とするＤＮＡの長さが長くなると、保持されたプローブに対してＤＮＡが相補になるような配列方向から接近する必要があるため、ハイブリダイゼーションの速度が遅くなる問題がある。
【０００９】
また、固体（チップ）表面の面積が限られているため、保持できるプローブ量は、ｆｍｏｌの桁であり、限界があり、良く似た配列のＤＮＡが多量に存在すると、微量の特定の目的とするＤＮＡを検出する場合の妨害になることが多いという問題がある。プローブ量が少ないと、良く似た配列のＤＮＡが固体表面のプローブを占有してしまう擬陽性ハイブリダイゼーションが起きやくなる問題がある。以上説明した問題のため、従来技術１、２のＤＮＡチップを用いた計測では、長時間を要し、高感度が得られない。
【００１０】
従来技術３では、チップのゲル中の試料ＤＮＡの拡散が、ハイブリダイゼーションの速度の律速段階となるという問題がある。また、従来技術３では、固体（チップ）表面上に形成したゲルを化学処理しプローブが結合できるようする加工して、プローブが均一に保持された作成の再現性の良いポリヌクレオチドプローブチップを一般のユーザーが作るには熟練を要するという問題がある。
【００１１】
従来技術のチップで各区画からの蛍光を同時検出するためには、エキスパンダで広げたレーザービームをカメラ側の同一面から照射する必要がり、各区画に照射されるレーザー光密度が低下するため高出力レーザが必要であった。また、チップ表面で反射し検出器に直接入るレーザー光がバックグランドとなり高感度検出が困難であった。このため、従来技術のチップを使用する場合、レーザー顕微鏡でスキャニングする方法が一般的であり、計測に長時間を必要とする問題があった。更に、従来技術のチップの各区画に捕捉されたＤＮＡを、区画毎に分離しサイズ毎に回収することは、困難であった。
【００１２】
本発明は上記した問題を解決するためになされたもので、本発明の目的は、簡単に、望むポリヌクレオチドプローブチップを密集した状態で作成でき、製造コストも安価なチップの作成方法を提供することにある。また、チップ表面でのハイブリダイゼーション速度を改善し短時間で計測が可能であり、高感度かつ擬陽性ハイブリダイゼーションの少ない、安価なポリヌクレオチドプローブチップ、及び、ポリヌクレオチドプローブチップの各区画に捕捉されたＤＮＡ断片を、区画毎に分離しサイズ毎に回収可能なポリヌクレオチド検出法、ポリヌクレオチド検出装置を提供することにある。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
各々異なるポリヌクレオチドプローブが保持された複数の区画が配置される本発明のポリヌクレオチドプローブチップは以下の特徴を有している。
【００１４】
（Ａ）各区画のポリヌクレオチドプローブがゲルに保持されており、電気泳動により試料ポリヌクレオチドを各区画のゲル中を移動させて、ゲル中のポリヌクレオチドプローブと試料ポリヌクレオチドをハイブリダイズさせ、ポリヌクレオチドプローブと試料ポリヌクレオチドの衝突確立を高めている。これにより、ハイブリダイゼーションの速度を上げている。また、ゲルに保持されるプローブ量を多くできる。
【００１５】
（Ｂ）実際に使用する上では、各々異なるポリヌクレオチドプローブが保持された複数の区画が配置されるポリヌクレオチドプローブチップに、蛍光標識した試料ポリヌクレオチドを添加し各区画のゲル中を電気泳動により移動させ、ゲル中のポリヌクレオチドプローブと特定ポリヌクレオチドをハイブリダイズさせる。ポリヌクレオチドプローブチップの各区画のゲル中に捕捉された蛍光標識ポリヌクレオチドを検出することにより、各区画に捕捉された特定ポリヌクレオチドを検出できる。
【００１６】
試料ポリヌクレオチドを予め標識するのではなく、先ず、ポリヌクレオチドプローブチップに試料ポリヌクレオチドを添加し各区画のゲル中を電気泳動により移動させて、ゲル中のポリヌクレオチドプローブと特定ポリヌクレオチドをハイブリダイズさせ、次に、ポリヌクレオチドプローブチップの各区画のゲル中でポリヌクレオチドがハイブリダイズしたポリヌクレオチドプローブに、ＤＮＡポリメラーゼを用いた伸張反応で螢光標したｄＮＴＰや螢光標したｄｄＮＴＰを取り込ませて標識することにより、各区画に捕捉された特定ポリヌクレオチドを検出できる。
【００１７】
更に、ｍＲＮＡ発現プロファイル計測のように、試料として塩基配列が未知のＤＮＡ（ｃＤＮＡ）断片を検出するには、１０塩基乃至６０塩基からなる実質的に共通な塩基配列からなる部分とその３’末端に断片識別用の任意の２塩基乃至３塩基の組み合わせからなるポリヌクレオチドプローブが保持されたポリヌクレオチドプローブチップを使用する。ポリヌクレオチドプローブチップに試料ポリヌクレオチドを添加し各区画のゲル中を電気泳動により移動させて、ポリヌクレオチドプローブと試料ポリヌクレオチドをハイブリダイズさせハイブリッドを形成する。ハイブリッドの検出は、蛍光標識ｄＮＴＰ、又は蛍光標識ｄｄＮＴＰをＤＮＡポリメラーゼを用いて、ポリヌクレオチドプローブの伸張鎖に取り込むことにより行なう。ポリヌクレオチドプローブの３’末端の識別用の任意の２塩基乃至３塩基とハイブリダイズした試料ポリヌクレオチドのみが、蛍光標識の存在により検出される．あるいは、ポリヌクレオチドプローブにハイブリダイズした試料ヌクレオチドの相補鎖合成をポリヌクレオチドプローブプライマーとして行ない、変性させて１本鎖の伸長相補鎖を得る。次に、１本鎖伸長相補鎖に相補な蛍光標識プローブをハイブリダイズさせ、ハイブリダイズした試料の種類と有無を検出する。
【００１８】
（Ｃ）；各区画のポリヌクレオチドプローブがゲルに保持されており、電気泳動により試料ポリヌクレオチドを各区画のゲル中を移動させて、ゲル中のポリヌクレオチドプローブと試料ポリヌクレオチドをハイブリダイズさせることは、電極をチップに配置する構造によりで可能となる。ハイブリダイゼーションの速度を上げて、特定ポリヌクレオチドの捕捉率を向上させるには、電極を切換えて試料ポリヌクレオチドを複数回にわたり上記の同一ゲル中を移動させてハイブリダイゼーションの効率を向上できる。
【００１９】
（Ｄ）ポリヌクレオチドプローブチップの基板面の各区画の各々に光検出用の素子が配置又は形成されたポリヌクレオチドプローブチップを用いて、基板面に平行な方向から各ゲルをレーザー照射することにより、複数の区画のゲルからの蛍光を同時に検出可能となる。このポリヌクレオチドプローブチップは、微小フォトダイオードアレイが形成された基板から構成され、各フォトダイオードの上部は特定の波長範囲の光（螢光標識から発する螢光）を通過する金属蒸着膜が形成され、金属蒸着膜の上部に絶縁層を介して透明電極が形成されており、透明電極の面にＤＮＡプローブが固定される。ポリヌクレオチドプローブチップの面には、各フォトダイオードに流れる電流を検出する配線が形成される。レーザー光が全反射するように、ポリヌクレオチドプローブチップの上面から反射面を持つ反射板を押し付けて、各区画のゲルの面に反射板が押し付けられた状態で、レーザー光を照射するので、レーザー光は基板面と反射板の間でで全反射を繰り返しながら進み、実質的に基板面に平行な方向から各区画のゲルを照射する。
【００２０】
（Ｅ）ポリヌクレオチドプローブチップの作成方法としては、反応残基を有するゲル前駆体とゲル前駆体の反応残基と結合する残基を有する複数種のポリヌクレオチドプローブからなるプローブセットと、複数の区画を有するチップを予め準備し、ポリヌクレオチドプローブセットから選んだ任意のプローブを種類毎にゲル前駆体と混合し、ポリヌクレオチドプローブチップの異なる区画に添加しゲル化させて調製することにより、カスタムデザインのポリヌクレオチドプローブを保持できる。ゲル前駆体として、アクリルアミド及び誘導体を使用できる。ゲル前駆体の反応残基と結合する残基を有するポリヌクレオチドプローブとして、アクリル基等の活性ビニル基を有するポリヌクレオチドプローブを使用できる。
【００２１】
勿論、一つの区画に保持するポリヌクレオチドプローブは１種である必要はなく分析の目的によっては必要に応じて複数種を組み合わせて一つの区画に保持することも可能である。反応残基を有するゲル前駆体とゲル前駆体の反応残基と結合する残基を有する複数種のポリヌクレオチドプローブからなるプローブセットと、複数種の区画を有するチップを予め準備し、ポリヌクレオチドプローブセットから選んだ複数の任意のプローブからなる複数のプローブグループをグループ毎にゲル前駆体と混合し、ポリヌクレオチドプローブチップの異なる区画に添加しゲル化させて調製することによりカスタムデザインのポリヌクレオチドプローブを簡単に調製できる。これらの調製法を用いれば、予め一定量のプローブを溶液状態で取り扱い、ゲルに保持するので、均一で再現生の高いポリヌクレオチドプローブチップを調製可能である。本発明のポリヌクレオチドプローブのポリヌクレオチドプローブチップへの保持方法は、従来技術４、５、６の方法とは全く異なる。
【００２２】
本発明によれば、用途に応じて必要な種類のポリヌクレオチドプローブを簡単にポリヌクレオチドプローブチップに並べることができる。ゲル前駆体の反応残基と結合する残基を有する各々のポリヌクレオチドプローブは、ＤＮＡ合成機で調製したアミノ基を有するポリヌクレオチドとＮ−アクリロキシスクシイミドとアリルグリシジルエーテルとアクロレインとを反応させ、ゲル濾過法やエタノール沈殿法で反応生成物を回収するだけで調製できるため安価であり、ポリヌクレオチドプローブチップ自身も安価に作成できる。各々のポリヌクレオチドプローブは保存が可能であ。
【００２３】
本発明の一構成を要約すると、反応残基を有するゲル前駆体とゲル前駆体の反応残基と結合する残基を有する複数種のポリヌクレオチドプローブからなるポリヌクレオチドプローブセットから選んだ任意のプローブを種類毎にゲル前駆体と混合し、種類毎にポリヌクレオチドプローブチップ１の異なる小穴に添加しゲル化させて調製し、試料ＤＮＡをゲル内で電気泳動により強制的に移動させる。その後、レーザをチップ側面から入射し、チップ全面から出る蛍光を一括して高感度２次元検出器で検出する。この結果、ハイブリダイゼーション効率が高く、高感度高速にＤＮＡ検出ができるＤＮＡ検出用のポリヌクレオチドプローブチップ及び検査方法を提供できる。
【００２４】
【発明の実施の形態】
以下本発明を図面を参照して実施例を用いて詳細にに説明する。
【００２５】
（第１の実施例）
図１は、本発明によるポリヌクレオチドプローブチップの一例を示し、図１（ａ）はポリヌクレオチドプローブチップの斜視図、図１（ｂ）は一部拡大図である。ポリヌクレオチドプローブチップ１はプラスチックからなり、表面が疎水性処理された疎水性部分５に囲まれ平坦な底面を持つ凹部と、上部及び下部の端が開口する複数の小穴（小穴が形成される区画）２が凹部の底面に格子状に配列して形成される。疎水性部分５と凹部の底面との間には、表面が親水性処理された親水性部分４が形成される。小穴２の上部の開口は０．５ｍｍ×０．５ｍｍ、上部と下部の開口間の距離は１ｍｍである。小穴２の開口部の形状は正方形に限らず、矩形、円形等の任意の形状でも良い。小穴２は０．５ｍｍの隔壁３を介してｘ、ｙ方向に配置され、１６×１６のマトリクスを構成している。即ち、各小穴２の中心は、１ｍｍの間隔をおいて２次元に配置されている。
【００２６】
小穴２の上部の開口の面積は下部の開口の面積より小さくして、ゲルを保持することが可能である。即ち、小穴２には、上部の開口から下部の開口に向けてテーパーをつけてあり、ゲルを形成したときのゲル保持を容易にすることもできる。疎水性部分５と親水性部分４により試料溶液を容易に、ゲルが保持される小穴２を持つ凹部に保持できる。
【００２７】
ポリヌクレオチドプローブチップの側面にはレーザー導入用の光学研磨したレーザー導入部６が形成される。レーザーは各小穴２の側面部を照射する。プラスチックの材質として、４００ｎｍから６５０ｎｍのレーザー光をよく透過し、光学的に透明なポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）を用いる。なお、図１（ａ）に図示しない、レーザーを得るレーザー光源、蛍光標識から発する蛍光を検出する高感度冷却ＣＣＤカメラは図６に示す。
【００２８】
次に、各小穴２の内面（小穴の側面部面）の表面処理について説明する。小穴２の内面は内部にゲルを形成した時に、小穴２の内部にゲルを確実に保持するために、酸素プラズマによるエッチングにより小穴２の内面に分子レベルの凹凸形状を形成してある。
【００２９】
図２は、ポリヌクレオチドプローブチップのゲルが保持される小穴の内面の表面処理を説明する図である。直鎖脂肪属化合物の一部にアクリル基を導入した試薬２２を、各小穴２の内面２１（小穴の側面部面）に塗布して、各小穴２の内面２１に活性アクリル基を導入した状態２３を得る。第１の実施例では、各小穴２にアクリルアミドゲルを保持するが、この時、各小穴２の内面２１に活性アクリル基とアクリルアミドゲルとの間が連結される。試薬２２は、直接プラスチックの表面と化学結合しないが、試薬２２の分子内の直鎖脂肪部分の疎水結合により、試薬２２はプラスチックの表面に固定される。
【００３０】
図３は、ポリヌクレオチドプローブチップにポリヌクレオチドプローブを保持する方法を説明する図である。異なる２５６種類のプローブを準備する。５’末端にアミノ残基３１を持つ各ポリオリゴヌクレオチドプローブ３０をホスホアミダイト法で合成して用いる。各プローブ１０μＭの水溶液にアクロレイン３２を２ｍＭの濃度になるように混合する。３０分間２０°Ｃで反応させた後、セファデックスＧ２５によるゲル濾過で未反応のアクロレインを除去する。この操作でポリヌクレオチドプローブ３０のアミノ残３１とアクロレイン３２のアルデヒド基が反応し、５’末端に活性アクリル基が導入されたポリヌクレオチドプローブ３３が得られる。真空乾燥した後、５’末端にアクリル基が導入されたポリヌクレオチドプローブを１０μＭの濃度の水溶液の状態で、−２０°Ｃ、ヘリウム雰囲気下で保存する。
【００３１】
ゲル前駆体にはアクリルアミドモノマーとＮ、Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドの３９：１の混合液を用いる。０．０１５％過硫酸アンモニウムを含む１．５Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）２．５μＬ（マイクロリットル）、アクリル基を導入したポリヌクレオチドプローブ（１０μＭ）０．５μＬ、１５％のアクリルアミド１．５μＬの混合液に４０ｎＭのＮ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’−テトラメチルエチレンヂアミン０．５μＬを加えて、直ちにチップの小穴２に滴下する。重合反応はヘリウム雰囲気下で行なう。
【００３２】
ラジカル重合反応は、酸素やプラスチック表面そのものが原因で重合阻害を起こす。この重合阻害を防止し、微細な部位に於ける気泡の発生を防ぐため、ヘリウム雰囲気で行なう。ヘリウム置換による重合阻害の完全な防止は不可能であるが、小穴２にはテーパーをつけてあるので小穴２に確実にゲルを保持できる。ヘリウム置換は、小穴内での気泡の発生を防止するためである。
【００３３】
反応液は毛細管現象で一定量、小穴２に充填されゲル化する。Ｎ、Ｎ、Ｎ'、Ｎ'−テトラメチルエチレンヂアミン以外の溶液を全てのプローブについて調製しておき、Ｎ、Ｎ、Ｎ'、Ｎ'−テトラメチルエチレンヂアミンを加えて直ちに小穴２に滴下することにより、効率よくポリヌクレオチドプローブチップを得ることができる。あるいは、Ｎ、Ｎ、Ｎ'、Ｎ'−テトラメチルエチレンヂアミン以外の試薬、即ち、アクリルアミド、Ｎ、Ｎ'−メチレンビスアクリルアミド、及び過硫酸アンモニウムを含むトリス緩衝液と、アクリル基を導入したポリヌクレオチドプローブとを混合した溶液を調製しておき、この溶液をポリヌクレオチドプローブチップ表面に滴下して小穴に充填する。次いで、ガス化又は霧化（ミスト化）したＮ、Ｎ、Ｎ'、Ｎ'−テトラメチルエチレンヂアミンで、ポリヌクレオチドプローブチップを暴露して、重合反応を開始させて、ポリヌクレオチドプローブチップを簡単に作成できる。以上説明した方法により、ポリヌクレオチドプローブ３０は３４に示すように、ポリアクリルアミドゲル鎖（ゲルマトリックス）３５に固定される。ポリアクリルアミドゲル鎖（ゲルマトリックス）３５は、小穴２の内面２１（小穴の側面部面）に固定される。
【００３４】
図４は、ポリヌクレオチドプローブチップと電気泳動電極の位置関係を示す平面図である。図４に示すように、ポリヌクレオチドプローブチップ１の下面（小穴２の下部開口側）は、電極４２が配置される電極槽４１の中に設置される。ポリヌクレオチドプローブチップ１の上面（小穴２の上部開口側）に滴下された試料液面（又は中）にメッシュ状の電極４３が設置される。極性を切換える手段（スウイッチ）４４により極性が選択されて、電極４２と電極４３との間に電圧が印加される。
【００３５】
作製したポリヌクレオチドプローブチップを用いて、実際に各種ＤＮＡ断片の計測に用いた一例について説明する。第１の実施例では、８．７ｋｂのヒトＤＮＡクローンを制限酵素Ｈｓｐ９２ＩＩ（４塩基認識酵素でＣＡＴＧを認識し、ＣＡＴＧの４塩基３’突出末端を形成する）で切断した断片群（以下、８．７ｋｂＤＮＡ断片群と略記）を試料として用い、断片群から種々断片が別々に検出できることを示す。ここでは、以下に示す配列番号１、及び配列番号２のプローブを用いて、配列番号１、及び配列番号２のプローブに相補なＤＮＡ断片を検出した例について説明する。
【００３６】
配列番号１のプローブ：
５’ＴＣＴＣＡＣＡＣＣＡＧＣＴＧＴＣＣＣＡＡＧＡＣＣＧＴＴＴＧＣ３’
配列番号２のプローブ：
５’ＡＡＴＡＣＡＧＧＣＡＴＣＣＴＴＣＡＣＴＡＣＡＴＴＴＴＣＣＣＴ３’
配列番号１、及び配列番号２のプローブはポリヌクレオチドプローブの異なる小穴２に保持される。その他の小穴２には、８．７ｋｂＤＮＡ断片群に相補結合しないプローブが保持される。配列番号１、及び配列番号２のプローブに相補な断片のみが混合物から検出できるか否かでポリヌクレオチドプローブチップの有効性を確認する。以下に具体的な実施内容について説明する。
【００３７】
（試料調製）
モデル試料として８．７ｋｂのヒト由来ＤＮＡクローンを制限酵素で切断して、３’末端に配列番号３の配列を持つＤＮＡ（アダプター）配列を結合したＤＮＡ断片混合物５２を用意する。先ず、この８．７ｋｂのＤＮＡを制限酵素Ｈｓｐ９２ＩＩで切断して、断片の３’両末端に、配列番号３の既知配列を持ち、３’末端が、蛍光体（スルホローダミン１０１（ＳＲ１０１））で標識されたＤＮＡをＤＮＡリガーゼで連結する。
【００３８】
配列番号３のＤＮＡ（アダプター）：
５’−ＡＣＴＧＧＣＣＧＴＣＧＴＴＴ−３’
配列番号３のＤＮＡ（アダプター）の５’末端には、ライゲーション反応用のリン酸基が結合している。即ち、４００ｆｍｏｌのヒト由来ＤＮＡクローンを１０ｎＭのＭｇＣｌ2、１５ｎＭのＫＣｌを含む１０ｎＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）溶液に溶解し、４０ユニットのＨｓｐ９２ＩＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＫ）を加え３７°Ｃ、２時間反応させて完全に切断する。エタノール沈殿でＤＮＡを回収した後、アルカリホスファターゼで５’末端のリン酸基を除去する。蛍光体で３’末端が標識され５’末端にリン酸基を有する配列番号３のアダプター（２０ｐｍｏｌ）と、配列番号３のＤＮＡと相補結合可能な配列番号４の既知配列を持つＤＮＡ（ヘルパーオリゴマー）（２０ｐｍｏｌ）を、４００ｆｍｏｌの切断ＤＮＡ断片混合物に添加し４０μＬとし、ライゲーションハイ（ＴＯＹＯＢＯ）２０μＬを添加して、１６°Ｃで１時間ライゲーション反応を行なう。
【００３９】
配列番号４のＤＮＡ（ヘルパーオリゴマー）：
５’−ＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＣＡＴＧ−３’
配列番号４のＤＮＡ（ヘルパーオリゴマー）の３’末端はリン酸化されている。これにより、各ＤＮＡ断片の３’末端にのみアダプター配列が導入され、同時に各断片の３’末端が蛍光体５３（スルホローダミン１０１）で標識される。
【００４０】
ライゲーション反応は、ＤＮＡ断片の３’末端のＯＨ酸基と、配列番号３のＤＮＡの５’末端のリン酸基との間を連結する反応である。ここで示した方法は、配列番号４のＤＮＡの３’末端は、リン酸基で修飾されているため配列番号３と配列番号４のＤＮＡ間のライゲーションが抑えられる上、ＤＮＡ断片の５’末端のリン酸基を除去してあるためＤＮＡ断片間の再結合を防止できる。このため確実に配列番号３のＤＮＡを導入できる。このようにして調製した蛍光標識ＤＮＡ断片混合物５２を希釈し０〜１ｎＭの各種濃度の試料として用いる。
【００４１】
次に、オリゴヌクレオチドプローブチップによるＤＮＡ断片の検出について述べる。オリゴヌクレオチドプローブチップに試料溶液２５０μＬを滴下すると、約２ｍｍの厚さの液相ができる。
【００４２】
図４に示す電極４２を正極、電極４３を負極として、２０Ｖの電界を印加し、１０秒後に極性を反転させ逆電位を１０秒印加するサイクルを１０回繰り返して、ＤＮＡ断片を各小穴内のゲルに保持したポリヌクレオチドプローブにハイブリダイズさせる。次に、電極４２を正極、電極４３を負極として、２０Ｖの電界を印加してはハイブリダイズしなかったＤＮＡ断片を除去する。
【００４３】
図５は、図１に示すオリゴヌクレオチドプローブチップの動作を説明する図である。矢印を持つ直線５０は電気泳動により蛍光標識ＤＮＡ断片混合物５２が移動する電気泳動方向を示す。隔壁３により仕切られる小穴５４、５５に、各々異なるポリオリゴヌクレオチドプローブ５６（配列番号１のプローブ）、５７（配列番号２のプローブ）が固定される。蛍光標識ＤＮＡ断片混合物５２がポリアクリルアミドゲル中を通過すると、ポリオリゴヌクレオチドプローブ５６に相補な塩基配列５８を持つ蛍光標識ＤＮＡ断片が小穴５４に、ポリオリゴヌクレオチドプローブ５７に相補な塩基配列５９を持つ蛍光標識ＤＮＡ断片が小穴５４に、それぞれ６０に示すように捕捉される。その他の蛍光標識ＤＮＡ断片６１は、小穴５４、５５に捕捉されずに小穴を通り抜ける。
【００４４】
反応の終了したポリヌクレオチドプローブチップの光学研磨した面（図１に示すレーザー導入部６）に、５９４ｎｍのＨｅ−Ｎｅレーザーを照射する。レーザーは走査して照射しても良いし、広げて一度の照射しても良い。レーザーは各小穴を照射する。蛍光体５３（スルホローダミン１０１）から発する蛍光を６０５ｎｍ〜６６０ｎｍの光を透過する蒸着フィルターを通して、ポリヌクレオチドプローブチップの上面又は下面から高感度冷却ＣＣＤカメラで計測する。
【００４５】
図６は、ポリヌクレオチドプローブチップ上に検出された蛍光標識ＤＮＡ断片の位置を示す図である。図６に示すように、配列番号１、及び配列番号２のプローブ５６、５７を各々保持した小穴５４、５５で蛍光が検出できる。プローブ５６、５７以外のその他のプローブが固定された小穴６１では、小穴５４、５５での検出される蛍光強度の１／２０以下の蛍光しか検出されない。図６には、図１（ａ）に図示しない、レーザー１２２を得るレーザー光源１２２、高感度冷却ＣＣＤカメラ１２４を示す。
【００４６】
図７は、ポリヌクレオチドプローブチップによるＤＮＡ断片の検量線の例を示す図である。図７は、種々濃度のＤＮＡ断片濃度に対して得られる蛍光強度を測定して得られる。７１は配列番号１のプローブを保持した小穴５６から得られた蛍光強度（相対強度）、７２は配列番号２のプローブを保持した小穴５７から得られた蛍光強度（相対強度）、７３は図６の小穴６１の位置から得られた蛍光強度で非特異吸着由来のバックグランドの蛍光強度（相対強度）を表わす。
【００４７】
（第２の実施例）
本発明のポリヌクレオチドプローブチップの他の形態について述べる。第１の実施例に示した、上下貫通する小穴を持つポリヌクレオチドプローブでは、ポリヌクレオチドプローブを保持するゲルを各小穴に形成するのは簡単であるが、試料ポリヌクレオチドを添加し、各区画のゲル中を電気泳動により移動させるための電極を、別途用意する必要がある。第２の実施例では、電極を基板上に形成する。
【００４８】
図８は第２の実施例のポリヌクレオチドプローブチップ７９の平面図（図８（ａ））、及びＡ−Ａ’断面図（図８（ｂ））である。ポリヌクレオチドプローブチップ７９は、表面が疎水性の部材（疎水性部分８６）により形成される凹部をガラス基板８０の上に有し、凹部内の一方向で表面が疎水性の疎水性部分８６’で仕切られたポリヌクレオチドプローブ保持ゲル８３、凹部内の一方向でポリヌクレオチドプローブ保持ゲル８３を挾み、線状の電極８１、８２、及び親水性部分８４、８５を有している。電極８１、８２、親水性部分８４、８５、ゲルが形成される部分（区画）８７、及び疎水性部分８６’はほぼ同一面にある。ゲルが形成される部分（区画）８７は、疎水性部分８６、８６’により隔離される。区画８７は、例えば、１６区画設けられる。
【００４９】
上記一方向にある、表面が疎水性された部材（疎水性部分８６）には、ポリヌクレオチドプローブ保持ゲル８３に照射するレーザーを導入するレーザー導入用の光学研磨したレーザー導入部６（図８には図示せず）が、第１の実施例と同様に形成される。平坦な底面を持つ凹部が直接ガラス基板８０に形成される場合には、ガラス基板の側面を光学研磨してレーザー導入部を形成する。
【００５０】
各区画８７の大きさは０．５ｍｍ×０．５ｍｍ、疎水性部分８６’のＡ−Ａ’方向に直交する方向の寸法は０．２５ｍｍ、親水性部分８４、８５のＡ−Ａ’方向での寸法は０．２５ｍｍ、電極８１、８２のＡ−Ａ’方向での寸法は０．１５ｍｍである。即ち、１６区画の中心が、０．７５ｍｍの間隔をおいて１次元に配置されている。
【００５１】
ガラス基板８０のゲルが形成される部分８７の部分にメタクリロキシプロピルトリメトキシシランを塗付して、１２０°Ｃで３０分間ベークすることにより表面に２重結合をもった残基を導入してある。金の蒸着により電極８１、８２をガラス基板８０の面を形成する。疎水性部分８６はテフロンの蒸着により形成される。親水性部分８４、８５は最初はテフロンを蒸着してある。
【００５２】
第１の実施例と同様に２重結合をもった残基を導入した基板８７の部分に、ポリヌクレオチドプローブ保持ゲルを形成する。即ち、ゲル前駆体としてアクリルアミドモノマーとＮ、Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドの２９：１の混合液を用意する。０．０１５％過硫酸アンモニウムを含む１．５Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）２．５μＬ、アクリル基を導入したポリヌクレオチドプローブ（０．２ｎＭ）０．５μＬ、１５％のアクリルアミド１．５μＬの混合液に４０ｎＭのＮ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’−テトラメチルエチレンヂアミン０．５μＬを加える。Ｎ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’−テトラメチルエチレンヂアミン以外の溶液を全てのプローブについて調製しておき、Ｎ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’−テトラメチルエチレンヂアミンを加えてすぐに直ちにチップ表面に滴下する。重合反応はヘリウム雰囲気中で行なう。勿論、第１の実施例と同様に、Ｎ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’−テトラメチルエチレンヂアミン以外の試薬、即ち、アクリルアミド、Ｎ、Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド、及び過硫酸アンモニウムを含むトリス緩衝液と、アクリル基を導入したポリヌクレオチドプローブとを混合した溶液を調製しておき、この溶液をポリヌクレオチドプローブチップ表面の区画８７に滴下する。
【００５３】
次いで、ガス化又は霧化（ミスト化）したＮ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’−テトラメチルエチレンヂアミンで、ポリヌクレオチドプローブチップを暴露して、重合反応を開始させても良い。反応液が区画８７からはみ出しても、テフロンを蒸着してある部分はゲル化しない。これは、通常テフロンは酸素を吸蔵しており、ラジカル重合を阻害するためである。吸蔵している酸素は容易には置換されない。電極８１、８２、２重結合を導入した部分８７はゲル化する。テフロンを蒸着していた親水性部分８４、８５は、ゲル８３を形成した後に０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０水溶液で処理して親水性に変える。
【００５４】
図９は、アクリル基を導入したポリヌクレオチドプローブが保持されたポリアルリルアミドゲルを得る方法を説明する図である。５'末端にアミノ酸基１０１を導入したポリヌクレオチドプローブ１００と、Ｎ−アクリロキシスクシンイミド１１２とをｐＨ９で反応させて、ゲル濾過法でアクリロキシポリヌクレオチドプローブ１１３を得る。第１の実施例と同様にして、１１５に示すように、ポリヌクレオチドプローブ１００が固定されたポリアルリルアミドゲル１１４を得ることができる。このポリヌクレオチドプローブ１００が固定されたポリアルリルアミドゲル１１４が、図８に示すポリヌクレオチドプローブチップ７９のポリヌクレオチドプローブ保持ゲル８３である。
【００５５】
この様にして調製したポリヌクレオチドプローブチップ７９を用いて実際にＤＮＡ断片を検出する例について説明する。試料は第１の実施例と同様のものを用いる。即ち、８．７ｋｂのヒトＤＮＡクローンを制限酵素Ｈｓｐ９２ＩＩで切断し蛍光標識した断片群を試料（調製は第１の実施例に従った）として、配列番号１、及び配列番号２のプローブを用いて、これに相補なＤＮＡ断片を検出した例について説明する。
【００５６】
試料溶液１００μＬをチップに滴下すると、疎水性部分８６、８６’、ゲルで表面が覆われ親水性の電極８１、８２、及び親水性部分８４、８５により、図８に示すように、試料溶液は８８のような液だまりとなる。試料溶液とポリヌクレオチド保持ゲル８３は接触していれば良く、ゲル８３が試料溶液に完全に浸蹟してしまうほど液量が多くてもよい。図８に示す電極８２を正極、電極８１を負極として、０．５Ｖの電界を印加し試料液中のＤＮＡ断片を電気泳動によりゲル中に移動させハイブリダイゼーションを行なう。第１の実施例と同様に、５秒おきに電極の極性を複数回切換えて何度も試料液８８中の蛍光標識されたＤＮＡ断片をゲル８３中で移動させる。電極の極性の切換えは、図８に図示しない極性を切換える手段（スウイッチ）により行なう。今回は５秒おきに１０回繰り返えす。
【００５７】
その後、セル全体を洗浄し、更に、電極８２を正極、８１を負極として、０．５Ｖの電界を印加してゲル中の未反応ＤＮＡ断片を電気泳動によりゲルから溶出させ、更に、洗浄してバックグランドの原因となるハイブリダイズしなかったＤＮＡ断片を除去する。反応の終了したポリヌクレオチドプローブチップに５９４ｎｍのＨｅ−Ｎｅレーザーを照射しする。発する蛍光を６０５ｎｍ〜６６０ｎｍの光を透過する蒸着フィルターを通して、ポリヌクレオチドプローブチップの上面から高感度冷却ＣＣＤカメラで計測する。以上の構成により、第１の実施例と同様に目的ＤＮＡ断片を検出できる。
【００５８】
（第３の実施例）
図１０は、第３の実施例のポリヌクレオチドプローブチップの構成を示す断面図（図８（ａ）のＡ−Ａ’断面に対応する）である。図１０に示す構成では、第２の実施例で説明した図８に示すポリヌクレオチドプローブチップの構成に於いて、ゲルが形成される部分（区画）８７の各区画には、フォトダイオード１２６が形成され、更に、絶縁層（図示せず）を介してフォトダイオード１２６の上部に特定の波長範囲の光（螢光標識から発する螢光）を通過する金属蒸着膜１２８が形成されており、金属蒸着膜１２８の面にポリヌクレオチドプローブ（ＤＮＡプローブ）が固定される。金属蒸着膜１２８は使用される蛍光体の発光波長を通過させるバンドパスフイルターとして作用する。
【００５９】
第２の実施例と同様にして、図１０に示す電極８２を正極、電極８１を負極として、０．５Ｖの電界を印加し試料液８８中のＤＮＡ断片を電気泳動によりゲル８３中に移動させハイブリダイゼーションを行ない、蛍光標識した断片群を各区画に捕捉した後、セル全体を洗浄し、次いで、電極８２を正極、８１を負極として、０．５Ｖの電界を印加してゲル８３中の未反応ＤＮＡ断片を電気泳動によりゲル８３から溶出させ、次いで、洗浄してハイブリダイズしなかったＤＮＡ断片を除去する。なお、電極の極性の切換えは、図１０に図示しない極性を切換える手段（スウイッチ）により行なう。反応の終了したポリヌクレオチドプローブチップに、図６に示す構成と同様にして、５９４ｎｍのＨｅ−Ｎｅレーザーを照射しする。
【００６０】
発する蛍光を各区画の各フォトダイオード１２６により検出し、各フォトダイオードに流れる電流は、ポリヌクレオチドプローブチップの面に形成される配線により、各区画毎に外部に取り出される。スルホローダミン１０１から発する蛍光は、６０５ｎｍ〜６６０ｎｍの光を透過する金属蒸着膜１２８を通して、各フォトダイオード１２６により検出される。以上の構成により、第１の実施例、第２の実施例と同様に目的ＤＮＡ断片を検出できる。
【００６１】
（第４の実施例）
図１１は、第４の実施例のポリヌクレオチドプローブチップの構成を示す断面図（図８（ａ）のＡ−Ａ’断面に対応する）である。図１１に示す構成では、第３の実施例で説明したポリヌクレオチドプローブチップの構成に於いて、金属蒸着膜１２８の上部に、更に、絶縁層（図示せず）を介して透明電極１３０を形成する。透明電極１３０は、蛍光体から発する蛍光を通過させる構成とする。透明電極１３０の面にポリヌクレオチドプローブ（ＤＮＡプローブ）が固定される。
【００６２】
透明電極１３０を負極とし、図１１に示す電極８２、８１を正極として、０．５Ｖの電界を印加し試料液８８中のＤＮＡ断片を電気泳動によりゲル８３中に移動させハイブリダイゼーションを行ない、蛍光標識した断片群を各区画に捕捉した後、セル全体を洗浄し、次いで、透明電極１３０を正極とし、図１１に示す電極８２、８１を負極として、０．５Ｖの電界を印加してゲル８３中の未反応ＤＮＡ断片を電気泳動によりゲル８３から溶出させ、次いで、洗浄してハイブリダイズしなかったＤＮＡ断片を除去する。透明電極１３０、電極（８１、８２）の極性の切換えは、図１１に図示しない極性を切換える手段（スウイッチ）により行なう。
【００６３】
反応の終了したポリヌクレオチドプローブチップに、図６に示す構成と同様にして、５９４ｎｍのＨｅ−Ｎｅレーザーを照射し、発する蛍光を各区画毎に検出することは、第３の実施例と同様である。但し、蛍光は、金属蒸着膜１２８及び透明電極１３０を介して各フォトダイオード１２６により検出される。以上の構成により、第１、第２、第３の実施例と同様に目的ＤＮＡ断片を検出できる。
【００６４】
（第５の実施例）
図１２は第５の実施例のポリヌクレオチドプローブチップ７９の平面図（図１２（ａ））、及びＡ−Ａ’断面図（図１２（ｂ））である。図１２に示す構成では、第２の実施例で説明した図８に示すポリヌクレオチドプローブチップの構成に於いて、更に、ポリアクリルアミドゲル８３が形成される各区画８７の中心部に形成される点電極１５０（面積は０．１５ｍｍ×０．１５ｍｍ）と、各区画８７の外部に形成され点電極１５０を挟む点電極１５２、１６２（寸法はＡ−Ａ’方向で０．１ｍｍ、Ａ−Ａ’方向に直交する方向で０．１５ｍｍ）とが配置される。点電極１５０の中心と、点電極１５２、１６２の各中心とは、Ａ−Ａ’方向で、０．１３ｍｍ離れている。点電極１５０の面積より広い範囲の区画８７にポリアクリルアミドゲル８３が形成されている。
【００６５】
図１２に示す構成では、直流電界を印加する代わりに、高周波電界を印加することにより、試料ＤＮＡをポリアクリルアミド内に導入し、試料ＤＮＡとポリアクリルアミドマトリクスに固定されているポリヌクレオチドプローブとを効率良くハイブリダイズさせる。高周波電界を用いる利点は、電気分解によるガスの発生が無く、長時間の泳動が可能な点にある。第４の実施例に於ける直流電界の印加では、ガスが発生するため、一定方向に電界を印加できず、数秒単位で印加する電界の方向を切り替えるか、又は電気分解が起きないような低電界の印加をしなければならないという問題がある。この問題は高周波電界を用いることにより解決できるが、ＤＮＡ分子を高周波電界の印加により目的の方向に移動させるには、電極配置に工夫が必要である。
【００６６】
試料ＤＮＡ混合溶液をポリヌクレオチドプローブチップ表面に適下して、電極８１、８２、１５２、１６２、及びポリアクリルアミドゲルが、試料ＤＮＡ混合溶液で浸された状態とする。先ず、点電極１５０と線状の電極８１との間、及び点電極１５０と線状の電極８２との間に、２ＭＨｚ、５０Ｖの高周波を印加すると、混合溶液中のＤＮＡ分子は電気力線の勾配方向に電界密度の高い向きに移動する。即ち、ＤＮＡ分子は、電極８１及び電極８２から点電極１５０に向かって移動し、ポリアクリルアミドゲル中を通過することになる。この結果、標的ＤＮＡがゲルマトリックスに固定されているポリヌクレオチドプローブにハイブリダイズする。ＤＮＡ分子の移動速度は、電気力線の勾配とＤＮＡサイズに依存し、大きなＤＮＡ分子程移動しやすい。次に、ポリヌクレオチドプローブとハイブリダイズしないＤＮＡ分子を除去するため、点電極１５２と電極８２との間、又は点電極１６２と電極８１との間に高周波電界を印加する。
【００６７】
電極８２、８１の長さは、それぞれ電極１５２、１６２の長さより長いため、電極８２、８１の近傍よりも電極１５２、１６２の近傍の方で電界密度が高くなり、ゲルマトリックスの中にハイブリダイズしないで保持されているＤＮＡ分子は、電極１５２、１６２の方向に移動して、ポリアクリルアミドゲルから溶出する。
【００６８】
第５の実施例では、Ｍ１３ファージ由来のＤＮＡに相補的な５０塩基長のポリヌクレオチドプローブを固定した各区画８７を用意する。試料としてＭ１３ファージ、及びラムダＤＮＡを使用して、（１）Ｍ１３ファージをＰｓｔＩで切断した後に、３’末端に蛍光色素Ｃｙ−５を標識したｄＵＴＰをターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを用いた伸長反応により取り込み、蛍光標識されたＭ１３ファージと、（２）（１）と同様にして、ラムダＤＮＡをＰｓｔＩで切断した後に、３’末端に蛍光色素Ｃｙ−５を標識したｄＵＴＰをターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを用いた伸長反応により取り込み、蛍光標識されたラムダＤＮＡとを調製して、（１）と（２）とによる調製物の混合物を試料混合溶液とする。
【００６９】
試料混合溶液をポリヌクレオチドプローブチップの表面に滴化し、点電極１５０と線状の電極８１との間、及び点電極１５０と線状の電極８２との間に、２ＭＨｚの電界を２分間印加して、試料ＤＮＡをポリアクリルアミドゲル中に導いた後、電極１６２と電極８１との間に同様に２ＭＨｚの電界を２分間印加する。ポリヌクレオチドプローブチップ表面を洗浄した後、更に、電極８２と電極１５２との間に同様に２ＭＨｚの電界を２分間印加した後に、ポリヌクレオチドプローブチップ表面を洗浄する。
【００７０】
ポリヌクレオチドプローブチップの凹部に洗浄液を満たしたまま、洗浄液の面にカバーガラスを乗せ、図６に示すように、ポリヌクレオチドプローブチップの側面からレーザーを照射し、各区画８７に於けるポリアクリルアミドゲル８３から発生する蛍光を検出する。その結果、Ｍ１３ファージ由来のＤＮＡに相補的な５０塩基長のポリヌクレオチドプローブが固定された区画から検出された蛍光強度は、他の塩基配列を持つポリヌクレオチドプローブが固定された区画から検出された蛍光強度よりも、１００〜３００倍強い蛍光強度で観測される。
【００７１】
図１２に示す電極が配置されたポリヌクレオチドプローブチップを用いれば、高周波電界の印加により、ＤＮＡ分子をポリアクリルアミドゲル中にトラップしたり、ポリヌクレオチドプローブとハイブリダイズしなかったＤＮＡ分子をポリアクリルアミドゲルから溶出させたりする等の、ＤＮＡ分子のハンドリングを容易に行なうことができる。また、電気分解によるガスの発生が無いので、電極表面に直接ポリアクリルアミドゲルを形成する場合も、長時間の電界の印加が可能である。このため、希薄な溶液からポリアクリルアミドゲル中にハイブリダイゼーションにより特定のＤＮＡ分子を濃縮するのにも有効である。
【００７２】
なお、第５の実施例の構成において、第３の実施例と同様にして、各区画８７に、各区画の面積とほぼ同面積を持つフォトダイオードと、絶縁層を介してフォトダイオードの上部に特定の波長範囲の光（螢光標識から発する螢光）を通過する金属蒸着膜１２８とを形成して、第４の実施例と同様にして、更に、金属蒸着膜１２８の上部に、絶縁層を介して透明電極１３０を形成して、透明電極１３０を図１２に示す電極１５０として用いることも可能である。
【００７３】
（第６の実施例）
本発明のポリヌクレオチドプローブチップでは、多量のポリヌクレオチドプローブをゲルマトリックスに固定できるため、ハイブリダイゼーションにより捕捉できるＤＮＡ量が各区画当たりサブｐｍｏｌに達する。このため、各区画に捕捉されたＤＮＡを回収して、更に詳しい分析を行なうことが可能である。第６の実施例では、捕捉されたＤＮＡを複数本のキャピラリーから構成されるキャピラリーアレー電気泳動装置を用いて直接分析する方法について、以下説明する。
【００７４】
図１３は、キャピラリーアレー電気泳動装置と第１の実施例のポリヌクレオチドプローブチップとを組合わせた第６の実施例の装置の構成及び動作を説明する断面図である。第６の実施例では、第１の実施例と同様に、ヒト８．７ｋｂのヒトＤＮＡクローンを制限酵素ＨＳＰ９２ＩＩで切断して得た断片群を試料とする。配列番号１、２のポリヌクレオチドプローブを固定したポリヌクレオチドプローブチップ１（図５）を用いて、配列番号１、２のポリヌクレオチドプローブに相補的な断片を各区画に捕捉する。図１３の上部に示す６０は、各区画に断片が捕捉された状態を示す（図５の下部に示す６０と同じである）。
【００７５】
図１３に示すように、第６の実施例の装置の構成では、ポリヌクレオチドプローブチップ１の各区画５４、５５に、キャピラリー２００の末端を密着させる。複数本のキャピラリー２００は、ポリヌクレオチドプローブチップ１の各区画の配置の形状に合わせて、キャピラリー２００の先端は、１６×１６のマトリックス状に束ねてあり、各区画に１本のキャピラリー２００が対応して接触できるようになっている。即ち、各キャピラリー２００の先端の中心は、１ｍｍの間隔をおいて２次元に配置されている。各キャピラリーの内部には、電気泳動分離担体として、Ｔ＝４．５％、Ｃ＝２．５％の架橋ポリアクリルアミドゲル２０１が形成されている。
【００７６】
各キャピラリーの一端でキャピラリー内部のポリアクリルアミドゲルと、ポリヌクレオチドプローブチップの各区画に形成されたゲルとは、電気的に接触しており、各キャピラリーの他端でキャピラリー内部のポリアクリルアミドゲルと接触する電極２０４と、電極４３との間で電界を印加できる。
【００７７】
ポリヌクレオチドプローブチップに赤外線ランプを用いて赤外線を照射すると、ポリヌクレオチドプローブチップの温度が上昇し、ゲルマトリックス３５に固定されているポリヌクレオチドプローブ５６、５７にハイブリダイズしている配列５８又は５９を持つＤＮＡ断片が遊離する。
【００７８】
電極２０４を正極とし、電極４３を負極として、各キャピラリー内部のゲルとポリヌクレオチドプローブチップの各区画には、１００Ｖ／ｃｍの電界が印加されており、遊離したＤＮＡ断片は各区画毎に別々のキャピラリーに電気泳動的に移動する。連続的に３０分間電界を印加すると、各断片はサイズにより泳動速度が異なるので、電極２０４に近い側で、各キャピラリーにレーザーを照射するか、又は、各キャピラリーの外部の緩衝液中でレーザーを照射して、各断片の螢光標識を励起して発する螢光を検出する、レーザー照射系及び螢光検出系（図１３に図示せず）を用いて、各区画に捕捉されていたＤＮＡ断片のサイズを知ることができる。更に、上記の螢光の検出と同期させて、各区画に捕捉されていたＤＮＡ断片をサイズ毎に、分取して回収できることは言うまでもない。
【００７９】
（第７の実施例）
次に、キャピラリーアレー電気泳動装置と、第２の実施例（図８）、第３の実施例（図１０）、第４の実施例（図１１）、第５の実施例（図１２）の各実施例に示すポリヌクレオチドプローブチップ７９とを組合わせた第７の実施例のＤＮＡ断片を回収する装置の構成及び動作を説明する。
【００８０】
図１４は、キャピラリーアレー電気泳動装置と第５の実施例（図１２）とを組合わせた第７の実施例のＤＮＡ断片を回収する装置の構成及び動作を説明する断面図である。各区画８７のポリヌクレオチドプローブを固定したゲルマトリックス８３には、ポリヌクレオチドプローブに相補的なＤＮＡ断片が捕捉されている。各区画８７の中心と、１６本の各キャピラリーの一方の先端の中心とが、ほぼ一致するように、各キャピラリー２００の先端の中心が０．７５ｍｍの間隔をおいて、溶液８８、及びゲルマトリックス８３に接触して、１次元方向に配置されている。
【００８１】
第６の実施例と同様にして、赤外線ランプを用いてポリヌクレオチドプローブチップ９７の表面を赤外線照射して加熱して、ハイブリダイズしているＤＮＡ断片をポリヌクレオチドプローブから遊離させる。次に、電極１５２、１６２、１５０を負極とし、他端で各キャピラリー内部のポリアクリルアミドゲルと接触する電極２０４’を正極として、５０Ｖ／ｃｍの電界強度を３０秒印加し、ゲルマトリックス８３から遊離したＤＮＡ断片をキャピラリー２００に導入する。試料溶液８８の容量は少なく、このまま電界を印加し続けると溶液のｐＨが変化し、電気泳動に影響が出るので、キャピラリー２００の先端をポリヌクレオチドプローブチップから離し、十分な電解液を含む電極槽に移し、更に、２００Ｖ／ｃｍで泳動を続ける。第６の実施例と同様に、キャピラリーの他の末端側には、レーザー照射系、蛍光検出系が配置してあり、泳動時間からポリヌクレオチドプローブチップに捕捉されたＤＮＡ断片のサイズを測定できる。
【００８２】
図１５は、ポリヌクレオチドチップ７９の１６の各区画にハイブリダイズしたＤＮＡ断片を、各区画から回収して測定したＤＮＡ断片の電気泳動パターンの例を示す。第６の実施例と同様にして、各区画の異なるポリヌクレオチドにハイブリダイズしたＤＮＡ断片をサイズ毎に、分取して回収可能なことがわかる。
【００８３】
以上の説明では、キャピラリーアレー電気泳動装置と第５の実施例（図１２）に示すポリヌクレオチドプローブチップ７９とを組合わせたＤＮＡ断片を回収する装置の構成及び動作を説明したが、第５の実施例（図１２）の代りに、第２の実施例（図８）、第３の実施例（図１０）、第４の実施例（図１１）の各実施例に示すポリヌクレオチドプローブチップ７９と、キャピラリーアレー電気泳動装置とを組合わせても良いことはいうまでもない。第２の実施例（図８）、第３の実施例（図１０）の各ポリヌクレオチドプローブチップを用いる場合には、電極８１、８２を負極とし、第４の実施例（図１１）の各ポリヌクレオチドプローブチップを用いる場合には、透明電極１３０、電極８１、８２を負極とする。
【００８４】
以上説明した各実施例では、十分な量のＤＮＡ断片をポリヌクレオチドプローブチップに捕捉できるので、捕捉したＤＮＡ断片を更に詳しく解析することが可能である。通常、固相に捕捉したＤＮＡを利用する場合には、十分な量のＤＮＡを得るために磁気ビーズや多孔質ビーズ等の非常に広い表面積を持つ担体を利用するのが一般的であり、各実施例で説明した実質平面からなるポリヌクレオチドプローブチップを用いて、分離分取を行なうことは、従来困難であった。
【００８５】
また、従来のビーズを用いる分離では、何らかの形で固相に捕捉したＤＮＡは、一旦溶液中に溶出させて利用するのが一般的であるが、多くの場合、溶出時に希釈され、濃縮が必要である場合が殆どである。本発明の各実施例では、種々の異なるプローブが異なる区画にアレー状に固定されているため、種々のＤＮＡを同時に分取できる多成分同時分取デバイスを実現できる。
【００８６】
更に、本発明の各実施例によれば、各区画から分取したＤＮＡ断片は、溶液に再溶出することなく、直接キャピラリー電気泳動を用いた分離計測したり、分離後に微量体積のまま回収することができる利点がある。
【００８７】
以上説明した各実施例に基づき、本発明の概要を以下に説明する。本発明では、特定のポリヌクレオチドにハイブリダイズしたポリヌクレオチドプローブの存在を、蛍光標識をレーザーで励起して放射される蛍光を光検出器で検出するが、蛍光標識は、予め試料ポリヌクレオチドに結合されるか、あるいは、特定のポリヌクレオチドにハイブリダイズしたポリヌクレオチドプローブに付加（結合）される。
【００８８】
（１）本発明のポリヌクレオチドプローブチップは、各々異なるポリヌクレオチドプローブが保持された複数区画と、各区画に保持されポリヌクレオチドプローブを保持するゲルを有し、試料ポリヌクレオチドを各区画のゲルの中を電気泳動により移動させて、ゲルに保持されたポリヌクレオチドプローブと試料ポリヌクレオチドの中の特定のポリヌクレオチドをハイブリダイズさせる。各ポリヌクレオチドプローブは、１０塩基乃至６０塩基からなる実質的に共通な配列からなる共通部分と、共通部分の３’末端に任意の２塩基乃至３塩基の組み合わせからなる認識部分を有し、認識部分の種類毎に各々異なる区画に保持される。
【００８９】
（２）本発明のポリヌクレオチドプローブチップの作成法は、各々異なるポリヌクレオチドプローブが保持された複数区画を有するポリヌクレオチドプローブチップの作成法に於いて、反応残基を有するゲル前駆体と反応残基と結合する残基を有する複数種のポリヌクレオチドプローブからなるポリヌクレオチドプローブセットを予め準備する工程と、ポリヌクレオチドプローブセットから選んだ任意のポリヌクレオチドプローブを種類毎にゲル前駆体とそれぞれ混合し、異なる区画に添加してゲル化させる工程とを有する。
【００９０】
（３）本発明のポリヌクレオチドプローブチップの他の作成法は、各々異なるポリヌクレオチドプローブが保持された複数区画を有するポリヌクレオチドプローブチップの作成法に於いて、反応残基を有するゲル前駆体と反応残基と結合する残基を有する複数種のポリヌクレオチドプローブからなるポリヌクレオチドプローブセットを予め準備する工程と、ポリヌクレオチドプローブセットから選んだ複数の任意のプローブからなる複数のポリヌクレオチドプローブグループを、ポリヌクレオチドプローブグループ毎にゲル前駆体と混合し、異なる区画に添加してゲル化させる工程とを有する。
【００９１】
（４）本発明のポリヌクレオチド検出法は、ポリヌクレオチド混合物を蛍光標識する工程と、各々異なるポリヌクレオチドプローブがゲルに保持された複数区画を有するポリヌクレオチドプローブチップに、蛍光標識した試料ポリヌクレオチドを添加して各区画のゲルの中を電気泳動により移動させて、ゲルに保持されたポリヌクレオチドプローブとポリヌクレオチド混合物の中の特定ポリヌクレオチドとをハイブリダイズして捕捉する工程と、各区画のゲルに捕捉された蛍光標識された特定のポリヌクレオチドを検出する工程とを有する。
【００９２】
（５）本発明の他のポリヌクレオチド検出法は、各々異なるポリヌクレオチドプローブがゲルに保持された複数区画を有するポリヌクレオチドプローブチップに試料ポリヌクレオチドを添加して、各区画のゲルの中を電気泳動により移動させて、ゲルに保持されたポリヌクレオチドプローブと試料ポリヌクレオチドの中の特定ポリヌクレオチドとをハイブリダイズして捕捉する工程と、特定のポリヌクレオチドがハイブリダイズしたポリヌクレオチドプローブを蛍光標識する工程と、蛍光標識されたポリヌクレオチドプローブを検出する工程とを有する。
【００９３】
（６）本発明のポリヌクレオチドプローブチップは、各々異なるポリヌクレオチドプローブがゲルに保持された複数区画を有し、ゲルの中で試料ポリヌクレオチドを移動させる第１の電極、及び第２の電極が各区画を挾んで配置される。
【００９４】
（７）本発明の他のポリヌクレオチド検出法は、各々異なるポリヌクレオチドプローブがゲルに保持された複数区画を基板に有するポリヌクレオチドプローブチップに試料ポリヌクレオチドを添加する工程と、各区画を挾んで配置されゲルの中で試料ポリヌクレオチドを移動させる第１の電極、及び第２の電極の極性を複数回切換えて、試料ポリヌクレオチドを各区画のゲルの中で移動させる工程とを有し、ゲルに保持されたポリヌクレオチドプローブと試料ポリヌクレオチドの中の特定ポリヌクレオチドとをハイブリダイズする。
【００９５】
（８）本発明の他のポリヌクレオチドプローブチップは、各々異なるポリヌクレオチドプローブがゲルに保持された複数区画を基板に有するポリヌクレオチドプローブチップの各区画を挾んで配置され、ゲルの中で試料ポリヌクレオチドを移動させる第１の電極、及び第２の電極と、第１の電極、第２の電極の極性を複数回切換えて試料ポリヌクレオチドを各区画のゲルの中で移動させて、ゲルに保持されたポリヌクレオチドプローブと試料ポリヌクレオチドの中の特定ポリヌクレオチドとをハイブリダイズさせる。
【００９６】
（９）本発明のポリヌクレオチド検出装置は、各々異なるポリヌクレオチドプローブがゲルに保持された複数区画を基板に有するポリヌクレオチドプローブチップと、基板の面と平行方向から複数区画のゲルにレーザー照射する手段と、放射される蛍光を基板の面と直角方向から検出する光検出器を有する。
【００９７】
（１０）本発明の他のポリヌクレオチド検出法は、各々異なるポリヌクレオチドプローブがゲルに保持された複数区画を有するポリヌクレオチドプローブチップの複数区画のゲルを、基板の面と平行方向に同時にレーザー照射して、放射される蛍光を基板の面と直角方向から検出する。
【００９８】
（１１）本発明の他のポリヌクレオチドプローブチップは、各々異なるポリヌクレオチドプローブがゲルに保持された複数区画を基板に有し、各区画の各々に光検出素子が配置される。
【００９９】
（１２）本発明の他のポリヌクレオチド検出法は、各々異なるポリヌクレオチドプローブがゲルに保持された複数区画を基板に有するポリヌクレオチドプローブチップの基板の面と平行方向から複数区画のゲルにレーザー照射して、各区画の各々に光検出素子が配置された光検出素子により放射される蛍光を基板の面と直角方向から検出する。
【０１００】
（１３）本発明の他のポリヌクレオチド検出装置は、各々異なるポリヌクレオチドプローブがゲルに保持された複数区画を基板に有し、各区画の各々に光検出素子が配置される光検出素子を有するポリヌクレオチドプローブチップと、基板の面と平行方向から複数区画のゲルにレーザー照射する手段とを有する。
【０１０１】
（１４）本発明の他のポリヌクレオチドプローブチップは、凹部が形成された光学的に透明な基板と、凹部の平坦な底面に基板を貫通して形成されたテーパを持つ側面を有する穴に保持されるゲルと、ゲルに保持される各々異なるポリヌクレオチドプローブと、基板の側面にレーザー光を照射する部位とを有し、電気泳動により試料ポリヌクレオチドを各区画のゲルの中を移動させることにより、ゲルに保持されたポリヌクレオチドプローブと試料ポリヌクレオチドの中の特定のポリヌクレオチドをハイブリダイズさせる。
【０１０２】
（１５）本発明の他のポリヌクレオチドプローブチップは、凹部が形成された基板と、凹部の平坦な底面にゲルを保持する一方向に配列する複数の部位と、複数の部位を挾んで配置される第１の電極、及び第２の電極と、ゲルに保持される各々異なるポリヌクレオチドプローブと、基板の側面にレーザー光を照射する部位とを有し、電気泳動により試料ポリヌクレオチドを各区画のゲルの中を移動させることにより、ゲルに保持されたポリヌクレオチドプローブと試料ポリヌクレオチドの中の特定のポリヌクレオチドをハイブリダイズさせる。
【０１０３】
（１６）本発明の他のポリヌクレオチドプローブチップは、各々異なるポリヌクレオチドプローブがゲルに保持された複数の区画を基板に有し、各区画の各々に光検出素子が配置される光検出素子と、光検出素子の上部に形成されたバンドパスフイルターと、バンドパスフイルターの上部に形成された第１の電極と、各区画を挾んで配置された第２の電極とを有し、第１の電極、第２の電極の極性を複数回切換えて試料ポリヌクレオチドを各区画のゲルの中で電気泳動により移動させて、ゲルに保持されたポリヌクレオチドプローブと試料ポリヌクレオチドの中の特定ポリヌクレオチドとをハイブリダイズさせる。
【０１０４】
（１７）本発明の他のポリヌクレオチド検出装置は、各々異なるポリヌクレオチドプローブがゲルに保持された複数の区画を基板に有し、各区画の各々に光検出素子が配置される光検出素子と、光検出素子の上部に形成されたバンドパスフイルターと、バンドパスフイルターの上部に絶縁層を挾んで形成された第１の電極と、各区画を挾んで配置された第２の電極とを有するポリヌクレオチドプローブチップと、第１の電極、及び第２の電極の極性を切換える手段（スウイッチ）と、基板の面と平行方向から複数の区画のゲルにレーザー照射する手段とを有する。
【０１０５】
（１８）本発明の他のポリヌクレオチドプローブチップは、各々異なるポリヌクレオチドプローブを保持するゲルを有し、第１の方向に配置された複数の区画と、各区画のほぼ中心部に配置される点状の第１の電極と、複数の区画を挟んで第１の方向に沿ってほぼ平行に配置される線状又は帯状の第２の電極とを具備し、第１の電極と第２の電極との間に高周波電界を印加して、試料ポリヌクレオチドを各区画のゲル中を移動させて、ゲルに保持されたポリヌクレオチドプローブと試料ポリヌクレオチドをハイブリダイズさせる。
【０１０６】
（１９）本発明の他のポリヌクレオチドプローブチップは、各々異なるポリヌクレオチドプローブを保持するゲルを有し、第１の方向に配置された複数の区画と、各区画のほぼ中心部に配置される点状の第１の電極と、複数の区画を挟んで第１の方向に沿ってほぼ平行に配置される線状又は帯状の第２の電極と、第１の電極と第２の電極との間に配置される点状の第３の電極とを具備し、第１の電極と第２の電極との間に高周波電界を印加して、試料ポリヌクレオチドを各区画のゲル中を移動させて、ゲルに保持されたポリヌクレオチドプローブと試料ポリヌクレオチドをハイブリダイズさせ、第２の電極と第３の電極との間に高周波電界を印加して、ゲルに保持されたポリヌクレオチドプローブとハイブリダイズしない試料ポリヌクレオチドをゲルから移動させる。
【０１０７】
（２０）本発明の他のポリヌクレオチド検査装置は、各々異なるポリヌクレオチドプローブが保持された複数の区画と、各区画に保持されポリヌクレオチドプローブを保持するゲルとを具備するポリヌクレオチドプローブチップと、電気泳動により試料ポリヌクレオチドを各区画のゲルの中を移動させ、ゲルに保持されたポリヌクレオチドプローブと試料ポリヌクレオチドをハイブリダイズさせる手段と、試料ポリヌクレオチドがハイブリダイズしたポリヌクレオチドプローブから試料ポリヌクレオチドを遊離させる手段と、各区画に対応してそれぞれ配置され、遊離した試料ポリヌクレオチドを電気泳動分離するキャピラリーを有する。
【０１０８】
（２１）本発明の他のポリヌクレオチド検出法は、各々異なるポリヌクレオチドプローブがゲルに保持され、第１の方向に配置された複数の区画と、各区画のほぼ中心部に配置される点状の第１の電極と、複数の区画を挾んで第１の方向に沿ってほぼ平行に配置される線状又は帯び状の第２の電極とが基板に形成されたポリヌクレオチドプローブチップに、試料ポリヌクレオチドを添加する工程と、第１の電極と第２の電極との間に高周波電界を印加して、試料ポリヌクレオチドを各区画のゲル中を移動させる工程とを有し、ゲルに保持されたポリヌクレオチドプローブと試料ポリヌクレオチドとをハイブリダイズする。
【０１０９】
（２２）本発明の他のポリヌクレオチド検出法は、各々異なるポリヌクレオチドプローブがゲルに保持され、第１の方向に配置された複数の区画と、各区画のほぼ中心部に配置される点状の第１の電極と、複数の区画を挟んで第１の方向に沿ってほぼ平行に配置される線状又は帯び状の第２の電極と、第１の電極と第２の電極との間に配置される点状の第３の電極とが基板に形成されたポリヌクレオチドプローブチップに、試料ポリヌクレオチドを添加する工程と、第１の電極と第２の電極との間に高周波電界を印加して、試料ポリヌクレオチドを各区画のゲル中を移動させて、ゲルに保持されたポリヌクレオチドプローブと試料ポリヌクレオチドをハイブリダイズさせる工程と、第２の電極と第３の電極との間に高周波電界を印加して、ゲルに保持されたポリヌクレオチドプローブとハイブリダイズしない試料ポリヌクレオチドをゲルから移動させる工程とを有する。
【０１１０】
（２３）本発明の他のポリヌクレオチド検出法は、各々異なるポリヌクレオチドプローブがゲルに保持された複数の区画を具備するポリヌクレオチドプローブチップに、試料ポリヌクレオチドを添加する工程と、電気泳動により試料ポリヌクレオチドを各区画のゲルの中を移動させ、ゲルに保持されたポリヌクレオチドプローブと試料ポリヌクレオチドをハイブリダイズさせる工程と、試料ポリヌクレオチドがハイブリダイズしたポリヌクレオチドプローブから試料ポリヌクレオチドを遊離させる工程と、各区画に対応してそれぞれ配置されたキャピラリーを用いて、遊離した試料ポリヌクレオチドを電気泳動分離する工程とを有する。
【０１１１】
【発明の効果】
本発明によれば、任意の種類のプローブを保持したプローブアレーを簡単に、安価に作成できる。また、ゲルに保持したＤＮＡプローブを用い、電気泳動を用いてゲルの中を強制的に試料を移動させるため、ゲルに保持されたプローブと試料ＤＮＡ断片のハイブリダイゼーションを高速、高効率で実行できる。ハイブリダイズしないＤＮＡ断片を電気泳動で除去できるので、従来のゲルを利用したチップに比べバックグランドの低減ができる。本発明では、チップ側面から全ての小穴（又は一列毎の小穴列）内のゲル、又は一列をなす各区画の面のゲルを同時に照射できるので、スキャンに要する時間が不必要になる。レーザを、蛍光を検出する方向と直角な方向から照射するるため、散乱光が検出器に直接入らない配置であり、各小穴（又は各区画）から発する光は２次元カメラで同時計測が可能で、高速、高感度な計測が可能となる利点がある。更に、サブミリワットクラスの半導体レーザでも効率良く、各小穴（又は各区画）を同時照射できる利点がある。
【０１１２】
【配列表】
0003829491.tif 000002
0003829491.tif 000003
配列表フリーテキスト
（１）配列番号１の配列に関する他の関連する情報の記載
ヒトＤＮＡに由来するＤＮＡ断片に相補結合し、５’末端にアクリル残基をもつＤＮＡプローブ。
【０１１３】
DNA probe hybridizing with DNA fragment originated from human DNA。
【０１１４】
（２）配列番号２の配列に関する他の関連する情報の記載
ヒトＤＮＡに由来するＤＮＡ断片に相補結合、５’末端にアクリル残基をもつＤＮＡプローブ。
【０１１５】
（３）配列番号３の配列に関する他の関連する情報の記載
ヒトＤＮＡに由来するＤＮＡ断片の３’末端に連結される３’末端が螢光標識され、５’末端にリン酸基を有するたＤＮＡ。
【０１１６】
（４）配列番号４の配列に関する他の関連する情報の記載
３’末端がリン酸基を有し、配列番号３のＤＮＡと相補結合可能なＤＮＡ。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の第１の実施例のポリヌクレオチドプローブチップの一例を示す図。
【図２】本発明の第１の実施例のポリヌクレオチドプローブチップのゲルが保持される小穴の内面の表面処理を説明する図。
【図３】本発明の第１の実施例のポリヌクレオチドプローブチップにポリヌクレオチドプローブを保持する方法を説明する図。
【図４】本発明の第１の実施例のポリヌクレオチドプローブチップと電気泳動電極の位置関係を示す平面図。
【図５】本発明の第１の実施例のオリゴヌクレオチドプローブチップの動作を説明する図。
【図６】本発明の第１の実施例に於いて、ポリヌクレオチドプローブチップ上に検出された蛍光標識ＤＮＡ断片の位置を示す図。
【図７】本発明の第１の実施例のポリヌクレオチドプローブチップによるＤＮＡ断片の検量線の例を示す図。
【図８】本発明の第２の実施例のポリヌクレオチドプローブチップの構成を示す平面図、及び断面図。
【図９】本発明の第２の実施例の、ポリヌクレオチドプローブが保持されたポリアルリルアミドゲルを得る方法を説明する図。
【図１０】本発明の第３の実施例のポリヌクレオチドプローブチップの構成を示す断面図。
【図１１】本発明の第４の実施例のポリヌクレオチドプローブチップの構成を示す断面図。
【図１２】本発明の第５の実施例のポリヌクレオチドプローブチップの構成を示す平面図、及び断面図。
【図１３】本発明の第６の実施例であり、キャピラリーアレー電気泳動装置と第１の実施例のポリヌクレオチドプローブチップとを組合わせた構成及び動作を説明する断面図。
【図１４】本発明の第７の実施例であり、キャピラリーアレー電気泳動装置と第５の実施例とを組合わせたＤＮＡ断片を回収する装置の構成及び動作を説明する断面図。
【図１５】本発明の第７の実施例に於いて、ポリヌクレオチドチップ７の各区画にハイブリダイズしたＤＮＡ断片を、各区画から回収して測定したＤＮＡ断片の電気泳動パターンの例を示す図。
【符号の説明】
１、７９…ポリヌクレオチドプローブチップ、２…テーパを持つ小穴、３…隔壁、４、８４、８５…親水性部分、５、８６、８６’…疎水性部分、６…レーザー導入部、２１…小穴の内面、２２…直鎖脂肪属化合物の一部にアクリル基を導入した試薬、２３…小穴の内面に活性アクリル基を導入した状態、３０、５６、５７、１００…ポリヌクレオチドプローブ、３２…アクロレイン、３３…活性アクリル基が導入されたポリヌクレオチドプローブ、３４、１１５…ポリヌクレオチドプローブがポリアクリルアミドゲル鎖に固定された状態、３５…ゲルマトリックス、４１…電極槽、４２、４３、８１、８２…電極、４４…スウイッチ、５０…電気泳動方向、５２…ＤＮＡ断片混合物、５３…蛍光体、５４、５５…蛍光が検出された小穴、５８、５９…ポリオリゴヌクレオチドプローブに相補な塩基配列、６０…特定の蛍光標識ＤＮＡ断片が小穴に捕捉された状態、６１…小穴に捕捉されなかった蛍光標識ＤＮＡ断片、６３…その他の小穴、７１、７２…蛍光標識ＤＮＡ断片から検出される蛍光強度、７３…非特異吸着由来のバックグランドの蛍光強度、８０…ガラス基板、８３…ポリヌクレオチドプローブ保持ゲル、８７…ゲルが形成される部分、８８…試料ＤＮＡ溶液、１１２…Ｎ−アクリロキシスクシンイミド、１１３…アクリロキシポリヌクレオチドプローブ、１２２…レーザー、１２２…レーザー光源、１２４…高感度冷却ＣＣＤカメラ、１２６…フォトダイオード、１２８…金属蒸着膜、１３０…透明電極、１５０、１５２、１６２…点電極、２００…キャピラリー、２０１…ポリアクリルアミド、２０４、２０４’…電極。
【図１】
0003829491.tif 000004
【図２】
0003829491.tif 000005
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
0003829491.tif 000014
【図１２】
0003829491.tif 000015
【図１３】
0003829491.tif 000016
【図１４】
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【図１５】
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