(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
カイロミクロン、高密度リポ蛋白、低密度リポ蛋白、超低密度リポ蛋白のいずれか１種以上を含む試料中のコレステロール量を直接、選択的に測定する方法において、
式（２）で示される単量体を構成成分とする重合体を用いることを特徴とするコレステロールの定量方法。
【化１】
0003829623.tif 000018
｛式中、Ｘは２価の有機残基、Ｙは炭素数１〜６のアルキレンオキシド基、Ｚは水素原子もしくは、Ｒ5−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−、（ただし、Ｒ5は炭素数１〜１０のアルキル基または炭素数１〜１０のヒドロキシアルキル基を示す）を示す。またＲ4は水素原子もしくはメチル基を示す。また、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3は同一または異なる基で、水素原子または炭素数１〜６のアルキル基またはヒドロキシアルキル基を示し、ｍは０または１、ｎは１〜４の整数を示す。｝
【請求項２】
カイロミクロン、高密度リポ蛋白、低密度リポ蛋白、超低密度リポ蛋白のいずれか１種以上を含む試料中のコレステロール量を直接、選択的に測定する方法において、
式（２）で示される単量体を構成成分とする重合体と蛋白可溶化剤を用いることを特徴とするコレステロールの定量方法。
【化２】
0003829623.tif 000019
｛式中、Ｘは２価の有機残基、Ｙは炭素数１〜６のアルキレンオキシド基、Ｚは水素原子もしくは、Ｒ5−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−、（ただし、Ｒ5は炭素数１〜１０のアルキル基または炭素数１〜１０のヒドロキシアルキル基を示す）を示す。またＲ4は水素原子もしくはメチル基を示す。また、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3は同一または異なる基で、水素原子または炭素数１〜６のアルキル基またはヒドロキシアルキル基を示し、ｍは０または１、ｎは１〜４の整数を示す。｝
【請求項３】
蛋白可溶化剤がアニオン系界面活性剤、カチオン系界面活性剤またはノニオン系界面活性剤である請求項２に記載のコレステロールの定量方法。
【請求項４】
試料にコレステロールエステル加水分解酵素とコレステロール酸化酵素またはコレステロール脱水素酵素を作用させ、生成する過酸化水素または還元型補酵素を定量することからなるコレステロール量を測定する方法において、使用する各々の酵素が化学修飾されていないことを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載のコレステロールの定量方法。
【請求項５】
試料にコレステロールエステル加水分解酵素とコレステロール酸化酵素またはコレステロール脱水素酵素を作用させ、生成する過酸化水素または還元型補酵素を定量することからなるコレステロール量を測定する方法において、使用する各々の酵素が化学修飾されていることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載のコレステロールの定量方法。
【請求項６】
コレステロール量を測定する際に１〜３価の金属塩を存在させることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載のコレステロールの定量方法。
【請求項７】
コレステロール量を測定する際に糖化合物を存在させることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載のコレステロールの定量方法。
【請求項８】
ノニオン系界面活性剤が、ポリエチレンオキシド誘導体、ポリプロピレンオキシド誘導体、ポリ（エチレンオキシド−プロピレンオキシド）ブロック誘導体である請求項３〜７のいずれか１項に記載のコレステロールの定量方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、分画操作をしないで各リポ蛋白、例えば、高密度リポ蛋白、低密度リポ蛋白、および超低密度リポ蛋白の各々の中のコレステロールを個別に定量する方法に関する。特に、臨床診断の分野において脂質代謝の面で重要なリポ蛋白中のコレステロールの定量方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
高密度リポ蛋白（ＨＤＬ）は抗動脈硬化作用をもつリポ蛋白として注目されるようになり、低密度リポ蛋白（ＬＤＬ）は末梢細胞にコレステロールを供給する役割を有するとされ、冠動脈硬化症をはじめとする各種動脈硬化症の直接的因子であり、その血中レベルは動脈硬化性疾患の指標となることが知られている。また超低密度リポ蛋白（ＶＬＤＬ）も動脈硬化との関連性が注目されている。
従来のＨＤＬコレステロールの定量方法としては、超遠心法、電気泳動法、換算法などがあり、ＶＬＤＬコレステロールの定量方法としては、超遠心法、電気泳動法がある。超遠心法は基本的定量法として知られており、分離用超遠心器で比重の差によってＨＤＬ、ＬＤＬ、あるいはＶＬＤＬを分離し、そのコレステロール量を測定する（アドバンスト  リピッド  リサーチ、第６巻、１頁、１９６８年）。
しかしながら、定量法、簡便性、経済性等の面で欠点がある。電気泳動法を用いる場合には、セルロースアセテート膜やアガロースゲルなどを支持体として分離しコレステロールを定量する。しかし、これらの定量法は、多数検体処理、迅速定量および臨床検査の分野で多く使用されている自動分析装置には不向きである。
【０００３】
ＨＤＬ-コレステロール測定法は超遠心法が源法であり、福祉・医療技術振興会ＳＲセンター等での測定が標準法となっている。しかし、一般には標準方法として、アメリカＮＣＥＰと関連して、ＣＤＣ法（超遠心と沈殿法を併用した方法で、ＨＤＬおよびＬＤＬ-コレステロール測定のリファレンス法）が臨床診断検査の該測定項目での基準となっている。しかしながら、このＣＤＣ法も超遠心法と沈殿法を併用した方法であることから、自動分析装置を用いるような実用的な方法ではない。前記したような簡便さとＣＤＣ法との相関性を兼ね備えたような各種方法が検討されている。ＮＣＥＰからは±５％以内のバイアスに収まることが要望されているように、ＣＤＣ法と高い相関性を有することと、実用上、自動分析装置での測定で容易に測定値を得ることが求められている。（ＣＤＣ法については「臨床検査法提要（改訂第３１版）５６７頁、金井編、金原出版（１９９８年）」参照。）
【０００４】
最近、リポ蛋白のコレステロールを直接測定する方法として、デキストラン硫酸等のポリカチオン単独や、２価のカチオンとの組合せによる凝集剤を用いる方法（特開平６−２４２１１０号公報、特開平８−１３１１９７号公報）、界面活性剤を用いる方法（特開昭６２−６９９９号公報、特開昭５８−１６５８００号公報）、蛋白質可溶化剤と硫酸化多糖類を組み合わせる方法（国際公開ＷＯ９６／２９５９９号、特開平７−３０１６３６号公報）等が開示されている。前記のいずれの方法も、リポ蛋白中の特定のリポ蛋白、実質的には主としてＨＤＬ以外のリポ蛋白のみを反応系より除き、ＨＤＬ中のコレステロールを選択的に定量するための方法が考案されている。
しかし、前記のいずれの系もトリグリセライド（ＴＧ）、Ｍ蛋白の高い試料中のリポ蛋白中のコレステロール量測定を正確に行うことはできないなど問題があった。
そこでリン化合物を用いる方法（特開２０００−１１６４００号公報）により、リン酸無機塩を上記従来の測定系などに添加することによってＭ蛋白質を可溶化し、溶液の濁りを抑制するなどによってより精度良く、測定感度を増すことが行われている。また、前記の開示された技術では、前記の多糖類の硫酸無機塩の改良法として、多糖類など有機物のリン酸無機塩を蛋白可溶化剤である界面活性剤との組合せる方法が開示されているが、特にＣＤＣ法などのリファレンス法との相関性について十分ではなく、例えば、前記の技術では、再現試験を行ったところ相関性は０．９８以下であり必ずしも十分でない。さらに、系がより多数成分の混合系になっており、簡便さの点でも再現性の面でも問題となりつつあり、成分の単純化が求められてきているのが現状である。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、試料中の各リポ蛋白中のコレステロールを分画操作することなく、上記従来の技術よりも、簡便に直接定量測定する方法において、相関性に優れ、添加剤の配合系が簡単であるコレステロールの測定方法を提供することにある。特に基準であるＣＤＣ法と相関性に優れ、信頼性に優れた測定値を得られるコレステロールの測定方法を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、前記の問題点に鑑み、鋭意検討した結果、ＨＤＬ、ＬＤＬ、ＶＬＤＬおよびカイロミクロン（ＣＭ）を含有する試料のコレステロールの測定において、特定のリン脂質類似基を有する化合物を測定試薬と共存させて超遠心で分画したＨＤＬ、ＬＤＬ、ＶＬＤＬおよびＣＭである各リポ蛋白を用いて測定したところ、ＨＤＬ、ＬＤＬ、ＶＬＤＬおよびＣＭ中に含まれる各コレステロールの反応性が異なることを見いだし、本発明を完成した。すなわち本発明は、次の［１］〜［８］である。
【０００７】
［１］  カイロミクロン、高密度リポ蛋白、低密度リポ蛋白、超低密度リポ蛋白のいずれか１種以上を含む試料中のコレステロール量を直接、選択的に測定する方法において、式（２）で示される単量体を構成成分とする重合体を用いることを特徴とするコレステロールの定量方法。
【化３】
0003829623.tif 000002
｛式中、Ｘは２価の有機残基、Ｙは炭素数１〜６のアルキレンオキシド基、Ｚは水素原子もしくは、Ｒ5−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−、（ただし、Ｒ5は炭素数１〜１０のアルキル基または炭素数１〜１０のヒドロキシアルキル基を示す）を示す。またＲ4は水素原子もしくはメチル基を示す。また、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3は同一または異なる基で、水素原子または炭素数１〜６のアルキル基またはヒドロキシアルキル基を示し、ｍは０または１、ｎは１〜４の整数を示す。｝
【０００８】
［２］  カイロミクロン、高密度リポ蛋白、低密度リポ蛋白、超低密度リポ蛋白のいずれか１種以上を含む試料中のコレステロール量を直接、選択的に測定する方法において、
式（２）で示される単量体を構成成分とする重合体と蛋白可溶化剤を用いることを特徴とするコレステロールの定量方法。
【化４】
0003829623.tif 000003
｛式中、Ｘは２価の有機残基、Ｙは炭素数１〜６のアルキレンオキシド基、Ｚは水素原子もしくは、Ｒ5−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−、（ただし、Ｒ5は炭素数１〜１０のアルキル基または炭素数１〜１０のヒドロキシアルキル基を示す）を示す。またＲ4は水素原子もしくはメチル基を示す。また、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3は同一または異なる基で、水素原子または炭素数１〜６のアルキル基またはヒドロキシアルキル基を示し、ｍは０または１、ｎは１〜４の整数を示す。｝
【００１６】
［３］  蛋白可溶化剤がアニオン系界面活性剤、カチオン系界面活性剤またはノニオン系界面活性剤である前記の［２］に記載のコレステロールの定量方法。
【００１７】
［４］  試料にコレステロールエステル加水分解酵素とコレステロール酸化酵素またはコレステロール脱水素酵素を作用させ、生成する過酸化水素または還元型補酵素を定量することからなるコレステロール量を測定する方法において、使用する各々の酵素が化学修飾されていないことを特徴とする前記の［１］〜［３］に記載のコレステロールの定量方法。
【００１８】
［５］  試料にコレステロールエステル加水分解酵素とコレステロール酸化酵素またはコレステロール脱水素酵素を作用させ、生成する過酸化水素または還元型補酵素を定量することからなるコレステロール量を測定する方法において、使用する各々の酵素が化学修飾されていることを特徴とする前記の［１］〜［３］に記載のコレステロールの定量方法。
【００１９】
［６］  コレステロール量を測定する際に１〜３価の金属塩を存在させることを特徴とする前記の［１］〜［５］に記載のコレステロールの定量方法。
【００２０】
［７］  コレステロール量を測定する際に糖化合物を存在させることを特徴とする前記の［１］〜［６］に記載のコレステロールの定量方法。
【００２１】
［８］  ノニオン系界面活性剤が、ポリエチレンオキシド誘導体、ポリプロピレンオキシド誘導体、ポリ（エチレンオキシド−プロピレンオキシド）ブロック誘導体である前記の［３］〜［７］に記載のコレステロールの定量方法。
【００２２】
【発明実施の形態】
本発明は、カイロミクロン、高密度リポ蛋白、低密度リポ蛋白、超低密度リポ蛋白のいずれか１種以上を含む試料中のコレステロール量を直接、選択的に測定する方法において、リン脂質またはリン脂質類似基含有化合物を用いることを特徴とするコレステロールの定量方法である。
特に、リン脂質、リン脂質類似基を含有する化合物の存在下、試料中のＨＤＬ−コレステロール、ＬＤＬ−コレステロール、ＶＬＤＬ−コレステロールまたはＣＭ−コレステロールの定量方法である。
本発明で用いるカイロミクロン（ＣＭ）、高密度リポ蛋白（ＨＤＬ）、低密度リポ蛋白（ＬＤＬ）、超低密度リポ蛋白（ＶＬＤＬ）の少なくとも１種または２種以上を含むコレステロールを含有する試料としては、例えば、血清、尿等が挙げられる。
リポ蛋白を含む試料としては、リポ蛋白が血清中に存在するので、前記の血清や、血液の成分を一部分画して取り出したものが試料として好ましく挙げられる。
【００２３】
本発明に用いるリン脂質としては、例えば具体的には、ホスファチジルコリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン等が挙げられる。
また、本発明に用いるリン脂質類似基含有化合物としては、前記のリン脂質の極性基を有する化合物が挙げられ、特にホスホリルコリン基、ホスホリルイノシトール基、ホスホリルセリン基等を有する化合物が挙げられる。
またさらに、本発明で用いるリン脂質類似基を含有する化合物（以下ＰＣ重合体と略す）としては、下記式（１）
【００２４】
【化５】
0003829623.tif 000004
【００２５】
で示される基を含有する化合物が好ましく挙げられる。
ここで、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3は同一または異なる基で、水素原子または炭素数１〜６のアルキル基またはヒドロキシアルキル基を示し、ｎは１〜４の整数を示す。
前記のＲ1、Ｒ2、Ｒ3が炭素数７以上のアルキル基またはヒドロキシアルキル基の場合およびｎが５以上の整数の場合は、合成が困難なので好ましくない。
【００２６】
また、さらにリン脂質類似基含有化合物は、式（２）
【００２７】
【化６】
0003829623.tif 000005
【００２８】
で示される単量体（ＰＣ単量体と略す）を構成成分とする重合体がより好ましく挙げられる。
ここで、Ｘは２価の有機残基、Ｙは炭素数１〜６のアルキレンオキシ基、Ｚは水素原子もしくは、Ｒ5−Ｏ−(Ｃ＝Ｏ)−、（ただし、Ｒ5は炭素数１〜１０のアルキル基または炭素数１〜１０のヒドロキシアルキル基を示す）を示す。またＲ4は水素原子もしくはメチル基、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3は同一または異なる基で、水素原子または炭素数１〜６のアルキル基またはヒドロキシアルキル基を示し、ｍは０または１、ｎは１〜４の整数を示す、
【００２９】
式（１）中のＸの２価の有機残基としては、例えば、−Ｃ6Ｈ4−、−Ｃ6Ｈ10−、−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−、−Ｏ−、−ＣＨ2−Ｏ−、−（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−、−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−、−Ｃ6Ｈ4−Ｏ−、−Ｃ6Ｈ4−ＣＨ2−Ｏ−、−Ｃ6Ｈ4−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−等の基が挙げられる。
【００３０】
式（１）のＹは、炭素数１〜６のアルキレンオキシ基であり、例えば、メチレンオキシ基、エチレンオキシ基、プロピレンオキシ基、ブチレンオキシ基、ペンチレンオキシ基、ヘキシレンオキシ基等の基が挙げられる。
【００３１】
式（１）中のＺは、水素原子もしくはＲ5−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−基を示す。ただし、Ｒ5は炭素数１〜１０のアルキル基または炭素数１〜１０のヒドロキシアルキル基を示す。
ここで、炭素数１〜１０のアルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基等が挙げられる。
【００３２】
また、炭素数１〜１０のヒドロキシアルキル基としては、例えば、ヒドロキシメチル基、２−ヒドロキシエチル基、３−ヒドロキシプロピル基、２−ヒドロキシプロピル基、４−ヒドロキシブチル基、２−ヒドロキシブチル基、５−ヒドロキシペンチル基、２−ヒドロキシペンチル基、６−ヒドロキシヘキシル基、２−ヒドロキシヘキシル基、７−ヒドロキシヘプチル基、２−ヒドロキシヘプチル基、８−ヒドロキシオクチル基、２−ヒドロキシオクチル基、９−ヒドロキシノニル基、２−ヒドロキシノニル基、１０−ヒドロキシデシル基、２−ヒドロキシデシル基等が挙げられる。
【００３３】
前記の式（２）で示されるＰＣ単量体の具体例としては、例えば、２−（（メタ）アクリロイルオキシ）エチル−２’−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート、３−（（メタ）アクリオイルオキシ）プロピル−２’−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート、４−（（メタ）アクリオイルオキシ）ブチル−２’−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート、５−（（メタ）アクリオイルオキシ）ペンチル−２’−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート、６−（（メタ）アクリオイルオキシ）ヘキシル−２’−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート、
２−（（メタ）アクリオイルオキシ）エチル−２’−（トリエチルアンモニオ）エチルホスフェート、２−（（メタ）アクリオイルオキシ）エチル−２’−（トリプロピルアンモニオ）エチルホスフェート、２−（（メタ）アクリオイルオキシ）エチル−２’−（トリブチルアンモニオ）エチルホスフェート、２−（（メタ）アクリオイルオキシ）エチル−２’−（トリシクロヘキシルアンモニオ）エチルホスフェート、２−（（メタ）アクリオイルオキシ）エチル−２’−（トリフェニルアンモニオ）エチルホスフェート、
２−（（メタ）アクリオイルオキシ）エチル−２’−（トリメタノールアンモニオ）エチルホスフェート、２−（（メタ）アクリオイルオキシ）プロピル−２’−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート、２−（（メタ）アクリオイルオキシ）ブチル−２’−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート、２−（（メタ）アクリオイルオキシ）ペンチル−２’（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート、２−（（メタ）アクリオイルオキシ）ヘキシル−２’−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート、
２−（ビニルオキシ）エチル−２’−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート、２−（アリルオキシ）エチル−２’−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート、２−（ｐ−ビニルベンジルオキシ）エチル−２’−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート、２−（ｐ−ビニルベンゾイルオキシ）エチル−２’−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート、２−（スチリルオキシ）エチル−２’−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート、２−（ｐ−ビニルベンジル）エチル−２’−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート、２−（ビニルオキシカルボニル）エチル−２’−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート、
２−（アリルオキシカルボニル）エチル−２’−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート、２−（アクリロイルアミノ）エチル−２’−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート、２−（ビニルカルボニルアミノ）エチル−２’−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート、エチル−（２’−トリメチルアンモニオエチルホスホリルエチル）フマレート、ブチル−（２’−トリメチルアンモニオエチルホスホリルエチル）フマレート、ヒドロキシエチル−（２’−トリメチルアンモニオエチルホスホリルエチル）フマレート、
エチル−（２’−トリメチルアンモニオエチルホスホリルエチル）マレート、ブチル−（２’−トリメチルアンモニオエチルホスホリルエチル）マレート、
ヒドロキシエチル−（２‘−トリメチルアンモニオエチルホスホリルエチル）マレート等を挙げることができる。
【００３４】
この中でも２−（（メタ）アクリロイルオキシ）エチル−２’−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェートが好ましく、さらに２−（メタクリロイルオキシ）エチル−２’−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート（＝２−（メタクリロイルオキシ）エチルホスホリルコリンともいう、以下、ＭＰＣと略す）が入手性等の点でより好ましい。
【００３５】
前記のＰＣ重合体は、前記の式（２）で示されるＰＣ単量体を含む単量体組成物を重合してなる重合体を主成分とするものが好ましい。ＰＣ単量体を含む単量体組成物は、ＰＣ単量体のみでもよいし、その他の重合可能な他の重合性単量体を含んでもよい。
さらに、前記のＰＣ重合体は、具体的には、Ａ成分としてＰＣ単量体２０〜１００ｍｏｌ％と、Ｂ成分として疎水性単量体０〜８０ｍｏｌ％とからなる単量体組成物を重合してなる重合体を好ましくは挙げることができる。より好ましくは、Ａ成分としてＰＣ単量体４０〜８０ｍｏｌ％と、Ｂ成分として疎水性単量体２０〜６０ｍｏｌ％とからなる単量体組成物である。
【００３６】
Ｂ成分の疎水性単量体が８０ｍｏｌ％より多いとホスホリルコリン類似基（以下、ＰＣ基と略す）の効果を発揮させるのが困難であるので好ましくない。
また更に、前記のＰＣ重合体は、Ａ成分としてＰＣ単量体２０〜１００ｍｏｌ％と、Ｂ成分として疎水性単量体０〜４０ｍｏｌ％および、Ｃ成分として親水性単量体０〜７０ｍｏｌ％の単量体組成物を重合してなる重合体を好ましくは挙げることができる。より好ましくは、Ａ成分としてＰＣ単量体４０〜８０ｍｏｌ％、Ｂ成分として疎水性単量体１０〜３０ｍｏｌ％およびＣ成分として親水性単量体１０〜６０ｍｏｌ％の単量体組成物である。
Ａ成分のＰＣ単量体が２０ｍｏｌ％未満では、ＰＣ基の効果を発揮させるのが困難であるので好ましくない。
【００３７】
ＰＣ単量体を重合する際には、前記のＰＣ単量体の１種を単独で、もしくは２種以上の混合物を用いることができる。
ＰＣ単量体は、公知の方法で製造できる。例えば、特開昭５４−６３０２５号公報、特開昭５８−１５４５９１号公報等に示された公知の方法等に準じて製造することができる。
ＰＣ単量体と共重合するＢ成分の疎水性単量体は、式（３）
【００３８】
【化７】
0003829623.tif 000006
【００３９】
｛ただし、式中、Ｌ1は、−Ｃ6Ｈ4−、−Ｃ6Ｈ10−、−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−、−Ｏ−、−（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−および−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−からなる群より選ばれる基を示し、Ｌ2は、水素原子、−（ＣＨ2）g−Ｌ3および−（（ＣＨ2）p−Ｏ）h−Ｌ3から選ばれる疎水性官能基を示す。（ｇ、ｈは１〜２４、ｐは３〜５の整数を示し、Ｌ3は、水素原子、メチル基、−Ｃ6Ｈ5および−Ｏ−Ｃ6Ｈ5から選ばれる官能基を示す。）｝
で表される単量体である。
【００４０】
Ｂ成分の疎水性単量体としては、具体的に例えば、メチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレート、ブチル（メタ）アクリレート、２−エチルヘキシル（メタ）アクリレート、ラウリル（メタ）アクリレート、ステアリル（メタ）アクリレート等の直鎖または分岐アルキル（メタ）アクリレート；シクロヘキシル（メタ）アクリレート等の環状アルキル（メタ）アクリレート；ベンジル（メタ）アクリレート、フェノキシエチル（メタ）アクリレート等の芳香環（メタ）アクリレート；ポリプロピレングリコール（メタ）アクリレート等のポリアルキレングリコール（メタ）アクリレート；スチレン、メチルスチレン、クロロメチルスチレン等のスチレン系単量体；メチルビニルエーテル、ブチルビニルエーテル等のビニルエーテル系単量体；酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル等のビニルエステル系単量体等が挙げられる。これらの１種または２種以上が用いられる。
【００４１】
Ｃ成分の親水性単量体は、例えば、ヒドロキシ基、カルボキシル基、ヒスホン基、スルホン基、アミド基、アミノ基、ジアルキルアミノ基、トリアルキルアミノ基、トリアルキルホスホニウム塩基およびポリオキシエチレン基からなる群より選ばれる親水性基を有する単量体である。
さらに、具体的には例えば、２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシブチル（メタ）アクリレート、４−ヒドロキシブチル（メタ）アクリレート等の水酸基含有（メタ）アクリレート；アクリル酸、メタクリル酸等のカルボン酸；スチレンスルホン酸、（メタ）アクリロイルオキシホスホン酸、２−ヒドロキシ−３−（メタ）アクリルオキシプロピルトリメチルアンモニウムクロライド等のイオン性基含有単量体；（メタ）アクリルアミド、アミノエチルメタクリレート、ジメチルアミノエチル（メタ）アクリレート等の含窒素単量体；ポリエチレングリコール（メタ）アクリレート等が挙げられる。これらの１種または２種以上が用いられる。
【００４２】
ＰＣ重合体は、前記Ａ成分のＰＣ単量体とＢ成分の疎水性単量体との単量体組成物、あるいは、前記Ａ成分のＰＣ単量体とＢ成分の疎水性単量体およびＣ成分の親水性単量体との単量体組成物を重合したものであればよく、通常のラジカル共重合により製造することができる。
【００４３】
ＰＣ重合体の分子量は、重量平均で、５００〜５，０００，０００，０００の範囲がよく、より望ましくは１，０００〜１，０００，０００、さらに好ましくは１０，０００〜５００，０００の範囲である。
重合体の分子量が５００未満では十分に生化学的反応を促進することが困難であり、重合体の分子量が５，０００，０００，０００より大きいとＰＣ重合体の水性溶液の粘性が高くなりすぎて生化学的反応を阻害するおそれがあるため好ましくない。
【００４４】
本発明で用いる蛋白可溶化剤としては、アニオン系界面活性剤、ノニオン系界面活性剤、カチオン系界面活性剤等を用いることができる。
試料中のＨＤＬ、ＬＤＬ、ＶＬＤＬまたはＣＭ中の各コレステロールのうちどの量を測定するかによって蛋白可溶化剤の種類と濃度、あるいは蛋白可溶化剤の数種類の組合せと各々の濃度の組合せを選択すればよい。例えば、試料中のＨＤＬ中のコレステロールを測定する場合はノニオン系界面活性剤のポリ（エチレンオキシド−プロピレンオキシド）ブロック誘導体系が望ましく、試料中のＬＤＬ中のコレステロールを測定する場合はノニオン系界面活性剤のポリエチレンオキシド誘導体とノニオン系界面活性剤のポリ（エチレンオキシド−プロピレンオキシド）誘導体が好ましい。
【００４５】
本発明で用いる金属塩としては、例えば、マグネシウム塩、カルシウム塩、マンガン塩、コバルト塩等が挙げられる。それらの塩の使用量としては、例えば０．００１〜５０モルが挙げられる。
【００４６】
本発明のコレステロールの定量方法は、リン脂質またはリン脂質極性基あるいはリン脂質極性類似基を有する化合物、すなわち特にホスホリルコリン基、ホスホリルイノシトール基、ホスホリルセリン基あるいは各々の類似基を１種以上有する１種以上の化合物、および／または蛋白可溶化剤をリポ蛋白中のコレステロールを測定する試薬中に共存させて直接リポ蛋白中のコレステロールを分別定量する方法であり、コレステロール測定系は酵素的測定系であればいずれの方法でも可能である。
本発明において、コレステロールの測定系自体は既に知られている下記式（４）の反応原理に基づく一般法に従うものである。
【００４７】
【化８】
0003829623.tif 000007
【００４８】
ここで、色素源としては、例えば、一般に用いられる４−アミノアンチピリンとフェノール類との組合せの他、４−アミノアンチピリンとトリンダー試薬として知られている以下の試薬、Ｎ−スルホプロピルアニリン、Ｎ-エチル-Ｎ-(２-ヒドロキシ-３-スルホプロピル)-ｍ-トルイジン（ＴＯＯＳ）、Ｎ-エチル-Ｎ-（２-ヒドロキシ-３-スルホプロピル）-３，５-ジメチルアニリン（ＭＡＯＳ）、Ｎ-(２-ヒドロキシ-３-スルホプロピル)-３，５-ジメトキシアニリン（ＨＤＡＯＳ）、Ｎ-エチル-Ｎ-スルホプロピル-ｍ-トルイジン（ＴＯＰＳ）などのアニリン類、あるいはＮ-エチル-Ｎ-（３-メチルフェニル）-Ｎ’-サクシニルエチレンジアミン（ＥＭＳＥ）などとの組合せが使用できる。
色素源としては、前記の化合物に限定されるものではない。また用いる色素源に最適の測定波長を用いるものとする。
【００４９】
ここで、使用する酵素としては、例えば、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素あるいはコレステロール脱水素酵素として市販されている、微生物または動物由来のコレステロールエステラーゼやリポプロテインリパーゼ、微生物由来のコレステロールオキシダーゼ、微生物または動物由来のコレステロールデヒドロゲナーゼなどが挙げられる。
【００５０】
さらに、前記の酵素の特異性、安定性をさらに上げるためにポリエチレングリコールを主成分をする基、水溶性オリゴ糖残基、スルホプロピル基などで上記の酵素を化学的に修飾したものを用いてもよい。
酵素を修飾するための修飾剤としては、ポリエチレングリコールにアミノ基と結合可能な官能基または分子団を結合させた化合物、例えば、ポリエチレングリコールにＮ-ヒドロキシサクシンイミド基を結合させたサンブライトＶＦＭ４１０１（日本油脂社製）や、ポリアルキレングリコールに酸無水物構造を結合させたサンブライトＡＫＭ（日本油脂社製）などのシリーズの各種の化合物が挙げられる。
【００５１】
上記測定の際にはさらに特異性を上げるために蛋白可溶化剤、２価の金属塩、多糖リン酸塩、多糖硫酸塩を併用することもできる。
前記の蛋白可溶化剤、２価の金属塩または多糖リン酸塩、多糖硫酸塩を１種または２種以上を用いてもよい。
また本発明により、リン脂質またはリン脂質類似基を有する化合物単独、あるいは蛋白可溶化剤を併用することにより、これらを成分とするＨＤＬ、ＬＤＬ、ＶＬＤＬまたはＣＭ中の各コレステロールの定量試薬をつくることができる。
【００５２】
本発明のコレステロールの定量方法は、血液、尿などの試料中のリポ蛋白中コレステロールを分離することなく直接分別測定することができるので、自動分析が可能であり、試料を１度に多数検査するのに適している。
【００５３】
【発明の効果】
本発明のコレステロールの定量方法は、リン化合物、特にリン脂質由来の極性基であるホスホリルコリン基、ホスホリルイノシトール基、ホスホリルセリン基のいずれかを含有する化合物または、リン脂質極性基の類似基を含有する化合物などを用いることにより、血液、尿などの体液試料に含まれるリポ蛋白中のコレステロールを分画しないで直接測定することができる優れたコレステロールの定量方法である。特に従来の超遠心法、分画法、ＣＤＣ法と比べても遜色のない相関性を有する定量性に優れている。
本発明のコレステロールの定量方法は、同時にこれらリン脂質またはリン脂質極性基もしくはリン脂質極性類似基を有する化合物を加えることにより、測定容器、測定分析計に対して、酵素、蛋白質等の吸着を防止し、さらに酵素、蛋白質の安定化の効果もあることから相乗的な効果がある。
【００５４】
【実施例】
次に本発明を具体例に基づいて更に詳細に説明する。
［実施例１］
本発明のＰＣ重合体を用いるＨＤＬコレステロールを直接定量する方法について、標準法として超遠心法、従来法（リンタングステン酸法）として分画法と比較して測定した結果を示す。
＜試薬組成＞
0003829623.tif 000008
【００５５】
本法では、血清試料６μＬを、あらかじめ３７℃で加温した第１試薬３００μＬに加え３７℃で５分間加温し、得られた溶液の５８５ｎｍにおける吸光度を測定した（Ｅ１）。次いで、あらかじめ３７℃に加温した第２試薬１００μＬを添加撹拌し、５分後に同波長における吸光度を測定した（Ｅ２：濃度補正後の値）。ＨＤＬコレステロールの量は、ＨＤＬコレステロール ５０ｍｇ／ｄＬの標準液を用いて同様の操作を行い、（Ｅ２−Ｅ１）の値を比較することにより算出した。
測定操作は血清試料１０検体につき行い、得られたコレステロール値について、本発明の方法と超遠心法の値との直線関係の相関係数を出し、同様に従来の分画法と超遠心法との相関係数との比較を行った。結果を表１に示す。
0003829623.tif 000009
【００５６】
表１に示したように、本発明の方法である実施例１の測定結果は、ＭＰＣ重合体を加えることのみによって目的とするＨＤＬ中のコレステロールのみの測定が可能となったため、従来法である分画法に比べ、分画操作が不要で、簡便で自動分析装置への適用も容易であるため経済性に優れるとともに、源法である超遠心法との相関係数も高くより精密な診断判定が可能となった。
特に超遠心法に対して、分画法での相関係数が０．９５２に比べ、実施例１では相関係数が０.９８８とさらに相関性がよいことがわかる。
【００５７】
［実施例２］
前記実施例１の第１試薬で使用するリン脂質極性類似基を有する化合物をイノシトールリン酸と蛋白可溶化剤に、および第２試薬で使用する酵素を修飾酵素に変更した下記の第１試薬および第２試薬を用いた以外は実施例１と同様にしてコレステロールの定量測定を行った。
【００５８】
＜試薬組成＞
0003829623.tif 000010
【００５９】
実施例２では、それぞれの測定値は自動分析計で取得した結果を表２に示す。
0003829623.tif 000011
【００６０】
表２に示したように、本発明の方法である実施例２の測定結果は、従来の特許に記載の方法であるリン酸化多糖などの有機化合物のリン酸化無機塩が含まれる測定系中に本発明で規定する化合物を加えることによって目的とするＨＤＬ中のコレステロールのみの測定が、従来法である分画法に比べ分画操作が不要で、簡便で自動分析装置への適用も容易であるため経済性に優れるとともに、従来の特許に記載の方法に比べても、源法である超遠心法との相関係数も高くより精密な診断判定が可能であることが分かる。
特に超遠心法に対して、分画法での相関係数が０．９７２に比べ、実施例２では相関係数が０．９８３とさらに相関性がよいことがわかる。
【００６１】
［実施例３］
リン脂質としてホスファチジルセリンを用いて、直接ＬＤＬコレステロールを定量する方法とＣＤＣ法とを比較した。
＜試薬組成＞
0003829623.tif 000012
【００６２】
実施例３では、血清試料６μＬを、あらかじめ３７℃で加温した第１試薬３００μＬに加え３７℃で５分間加温し、得られた溶液の５８５ｎｍにおける吸光度を測定した（Ｅ１）。次いで、あらかじめ３７℃に加温した第２試薬１００μＬを添加撹拌し、５分後に同波長における吸光度を測定した（Ｅ２：濃度補正後の値）。ＬＤＬ-コレステロールの量は、ＬＤＬ-コレステロール ２００μｇ／ｄＬの標準液を用いて同様の操作を行い、（Ｅ２−Ｅ１）の値を比較することにより算出した。
その結果を表３に示す。
0003829623.tif 000013
【００６３】
表３に示したように、本発明の方法である実施例３の測定結果は、従来の特許に記載の方法であるリン酸化多糖などの有機化合物のリン酸化無機塩が含まれる測定系中に本発明で規定する化合物を加えることによって目的とするＬＤＬ中のコレステロールのみの測定が、従来法である分画法に比べ分画操作が不要で、簡便で自動分析装置への適用も容易であるため経済性に優れるとともに、従来の特許に記載の方法に比べても、標準法であるＣＤＣ法との相関係数も高くより精密な診断判定が可能となった。
特に超遠心法に対して、公知の方法（例えば特開２０００−１１６４００号公報）に準じて比較試験を行った。その結果、相関係数が０．９７９に比べ、実施例３では相関係数が０．９８９とさらに相関性がよいことがわかる。
【００６４】
［実施例４］
実施例１の第１試薬で用いた参考例１のポリマーの代わりに後記参考例３および第２試薬で用いた蛋白可溶化剤のポリオキシエチレンモノラウレートの代わりにポリオキシエチレン誘導体（ポリオキシエチレンアルキルエーテル）を用いた以外は実施例３と同様の操作を行い血清試料５検体につき、測定値の比較を行った。
結果を表４に示す。
＜試薬組成＞
0003829623.tif 000014
注１）エマルゲンＬ−４０（花王  商品名、ポリオキシエチレンアルキルエーテル）を用いた。
【００６５】
0003829623.tif 000015
【００６６】
表４に示したように、本発明の方法である実施例４の測定結果は、従来の特許に記載の方法であるリン酸化多糖などの有機化合物のリン酸化無機塩が含まれる測定系中に本発明で規定する化合物を加えることによって目的とするＬＤＬ中のコレステロールのみの測定が、従来法である分画法に比べ分画操作が不要で、簡便で自動分析装置への適用も容易であるため経済性に優れるとともに、公知の特許に記載の方法に比べても、標準法であるＣＤＣ法との相関係数も高くより精密な診断判定が可能となった。
特に超遠心法に対して、公知の方法（例えば特開２０００−１１６４００号公報の方法）での相関係数が０．９７６に比べ、実施例４では相関係数が０．９９２とさらに相関性がよいことがわかる。
【００６７】
［実施例５］
実施例５では、実施例３のＰＣ重合体の代わりに後記の参考例４で製造したポリマーを使用し、蛋白可溶化剤をポリ（エチレンオキシド−プロピレンオキシド）ブロック誘導体（ＢＡＳＦ社製、商品名  プルロニックＬ−１２２）に変更し、発色剤を４−アミノアンチピリンにした以外は、実施例３と同様の操作を行い血清試料５検体につき、ＣＤＣ法との測定値の比較を行った。結果を表５に示す。
＜試薬組成＞
0003829623.tif 000016
注）用いた化合物は次のものを示す。
プルロニックＬ−１２２；(PEO-PPO block polymer、HLB=4.0)、BASF Wyandotte Corp.、
エマルゲンＬ−４０；Emulgen(PEO-alkyl ether)、Kao Corp.、
ナイミンＳ−２２０；ジエチレングリコールステアリルアミン、日本油脂社製、商品名。
【００６８】
0003829623.tif 000017
【００６９】
表５に示したように、本発明の方法である実施例５の測定結果は、従来の特許に記載の方法であるリン酸化多糖などの有機化合物のリン酸化無機塩が含まれる測定系中に本発明で規定する化合物を加えることによって目的とするＬＤＬ中のコレステロールのみの測定が、従来法である分画法に比べ分画操作が不要で、簡便で自動分析装置への適用も容易であるため経済性に優れるとともに、従来の特許に記載の方法に比べても、標準法であるＣＤＣ法との相関係数も高くより精密な診断判定が可能となった。
特に超遠心法に対して、前記と同様に従来特許の方法の相関係数が０．９７４に比べ、実施例５では相関係数が０．９９１とさらに相関性がよいことがわかる。
【００７０】
なお前記の用いた試料は次の方法により得たものである。
参考例１；実施例１に用いたＰＣ重合体の合成；
ＭＰＣ５．４ｇ、メタクリル酸３．７１ｇ、開始剤であるパーロイル−ＳＡ（日本油脂社製）０．３５１ｇ、重合溶媒として４２．９１９ｇの蒸留水を重合管にとり均一に溶解した。この溶液にアルゴンガスを１０分間吹き込み封管した後７０℃で６時間重合した。反応終了後室温に冷却し重合管を開封し、次いで溶液を透析膜（スペクトラム・メディカル・インダストリー社製「Spectrum／por membranes Mw CO, 6000〜8000」）に挿入し、重合溶液の１０倍量の蒸留水を用いて透析操作を行った。１回／日の間隔で蒸留水の交換を７日間行い、未反応モノマーなどを除去し精製を行った。ＧＰＣ測定で得られた共重合体の分子量とＨ-ＮＭＲ測定よりもとめた共重合体組成比の結果を下記した。
ＭＰＣ／メタクリル酸＝３．８／６．１（モル比）
分子量Ｍｎ＝１３３０００
Ｍｗ＝２８６０００
【００７１】
参考例２；実施例２で用いた修飾酵素の調製；
なお、実施例２で用いた修飾酵素は、コレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシターゼの酵素の修飾したもので、具体的には、各々酵素を０．１Ｍ（ｐＨ８．０）のグッド緩衝液で５０ｇ／Ｌになるように溶解し、次いでサンブライトＶＦＭ４１０１（日本油脂社製）を０．１５ｇ／酵素１ｇになるように添加後１０〜２０℃で１２時間放置し、ポリエチレングリコールで修飾した各々酵素を調製した。この反応液をそのまま使用した。
【００７２】
参考例３；実施例４に用いたＰＣ重合体の合成
ＭＰＣ３１８．６ｇ、メタクリル酸ステアリル４１．４ｇ、開始剤であるｔ−ブチルパーオキシネオデカエート７．８１ｇ、重合溶媒として１４４０ｇのエタノールを四つ口フラスコにとり均一に溶解した。この溶液に窒素ガスを３０分間吹き込んだ後５０℃で３時間重合し、つづいて６０℃に昇温し更に２時間重合した。反応終了後室温に冷却し、得られた重合液を採取してＧＰＣで重合反応率と分子量を測定した。その結果重合反応率は９８．７％、重量平均分子量は１４００００であった。重合液を８Ｌのジエチルエーテル中に撹拌しながら滴下し、析出した沈殿を濾過し、さらに４８時間室温で真空乾燥してポリマー粉末を調製した。得られたポリマー粉末を１Ｌの蒸留水に溶解し、分画分子量３５００の透析膜（スペクトラポア社製）に仕込み、１０Ｌの蒸留水中に浸漬した。透析液を３回／日の間隔で交換し、計９６時間処理を行い、未反応モノマーなどを除去し精製を行った。Ｈ-ＮＭＲ測定から求めた共重合体組成比の結果を下記した。
ＭＰＣ／メタクリル酸＝９．０／１．０（モル比）
【００７３】
参考例４；実施例５で用いたＰＣ重合体の合成
ＭＰＣ６００ｇ、重合溶媒として９００ｇの蒸留水を四つ口フラスコにとり均一に溶解した。この溶液に窒素ガスを３０分間吹き込んだ後、６０℃に保持して開始剤であるサクシニルパーオキシド１１．７ｇを加え６時間重合した。反応終了後室温に冷却し、得られた重合液を採取してＧＰＣで重合反応率と分子量を測定した。その結果重合反応率は９５．３％、重量平均分子量は１０３００００であった。重合液をイオン交換水１５００ｍＬで希釈し、分画分子量１２０００の透析膜（スペクトラポア社製）に仕込み、１５Ｌの蒸留水中に浸漬した。透析液を３回／日の間隔で交換し、計９６時間処理を行い、未反応モノマーなどを除去し精製を行った。