(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
サーモアスカス属、アクレモニウム属またはアスペルギルス属に属する糸状菌をエタノールを炭素源として流加培養し、菌体内及び培養上清中にカタラーゼを生成蓄積せしめ該酵素を採取することを特徴とするカタラーゼの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は産業用酵素であるカタラーゼの製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
カタラーゼは過酸化水素を水と酸素に分解する酸化還元酵素であり、産業的に大量に消費されている酵素である。このような産業用酵素は液体培養または固体培養で生産される。糸状菌のカタラーゼは菌の生育とほぼ連動して生産される。したがって、工業的にカタラーゼを効率よく生産するためには、糸状菌の生育をできる限り長時間にわたって活発に行わせる条件をとることが必要である。糸状菌を液体培養して高収量にカタラーゼを生産する場合には、生産菌の増殖を支持するための培地の炭素源として通常グルコース、蔗糖、デンプンなどの糖質炭素源が使用され、培地中に所定濃度の炭素源を仕込み、これに生産菌の種母を接種して回分培養を行ってカタラーゼを生産、蓄積させる方法で行われる。このような培養において長時間にわたって菌の生育を活発に行わせるためには、培地中の栄養源、特に炭素源の濃度をできる限り高くすることが必要である。しかし、前記のような培養方法においては、培地中に含有させることのできる炭素源の濃度には限度がある。すなわち、例えばグルコースや蔗糖のごとき低分子の炭素源では１００ｇ／Ｌ以上の高濃度にすると浸透圧のために微生物の生育が阻害され、円滑なカタラーゼ生産を行うことができない。また、デンプンのごとき高分子の炭素源の場合には１００ｇ／Ｌ以上の高濃度にすると培地の粘度が著しく高くなり、微生物の生育に必要な酸素の供給に悪影響を及ぼし、この方法もまた円滑にカタラーゼの生産を行うことができない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、従来技術における上記の課題を解決し、円滑に、かつ、効率よくカタラーゼを高収量で製造できる製造方法を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは液体培養でカタラーゼを高収量で生産する方法を鋭意研究したところ、サーモアスカス属、アクレモニウム属又はアスペルギルス属に属する糸状菌がエタノールをよく資化して非常に旺盛に生育し、しかも、グルコースのような糖質炭素源に比べて消費炭素源重量当たりのカタラーゼ生産量が非常に高くなることを見出した。さらに、エタノールを炭素源として流加培養することによって、長期間にわたってカタラーゼの生産を継続して行わせることができ、液体培養でのカタラーゼ生産量を飛躍的に増大させることができることを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成されたものである。すなわち、本発明は、サーモアスカス属、アクレモニウム属またはアスペルギルス属に属する糸状菌をエタノールを炭素源として流加培養し、菌体内及び培地中にカタラーゼを生成蓄積せしめ該酵素を採取することを特徴とするカタラーゼの製造方法である。
【０００５】
【発明の実施の形態】
本発明において使用される糸状菌はサーモアスカス属、アクレモニウム属またはアスペルギルス属に属する糸状菌であり、たとえば、Thermoascus aurantiacus IFO9862 、Thermoascus aurantiacus IFO9748 、Acremonium alabamensis ATCC26796、Aspergillus terreus IFO4100 、Aspergillus terreus IFO6123 などが挙げられる。
【０００６】
本発明において行われる流加培養は、例えば、「生物工学実験書」（日本生物工学会編、３４１−３４３頁、１９９２年、培風館）に記載されているようなそれ自体公知の方法で行われる。すなわち、まず、流加される炭素源（エタノール）以外の成分を含む培地を培養槽に仕込む。この培地には、菌体の増殖に影響を及ぼさない範囲内で、流加される炭素源を添加しておいても良い。エタノールの場合には１０ｇ／Ｌ以下が好ましい濃度である。しかし、エタノールは加熱滅菌によって揮発しやすいので、蒸発による無駄を省くには後述するように、種母を接種する前に所定濃度になるように添加するのが好都合である。蒸気滅菌を終了し、培地を冷却後、培地のｐＨを菌の生育及びカタラーゼの生産に適したｐＨに調整して、別に調製した種母を接種して、通気、攪拌を行って培養を開始する。培養中は、温度及びｐＨを菌の生育及びカタラーゼの生産に適した条件に調節する。
【０００７】
培養に適した温度は使用する菌株により異なるが、サーモアスカス属菌株の場合には３５〜５５℃、好ましくは４０〜４６℃であり、アクレモニウム属菌株の場合には２６〜５３℃、好ましくは３７〜４５℃であり、アスペルギルス属菌株の場合には２０〜３７℃、好ましくは２９〜３３℃である。培養に適したｐＨは４．０〜８．０、好ましくは５．０〜７．０である。このような条件で好気的に培養するために空気、又は酸素を通気し、かつ酸素を培養液に有効に溶け込ませるために必要に応じて攪拌する。一般的には培養液中の溶存酸素濃度は０．３ｐｐｍ以上になるように通気、攪拌条件を調節することが好ましいが、機械式攪拌槽では必要以上に攪拌速度を上昇させることは菌糸の切断を引き起こし好ましくない。
【０００８】
エタノールの流加方法は、培養液中のエタノール濃度が菌の生育を阻害しない濃度以下で、かつ、ゼロにならないように添加する方法であればどのような方法によっても良いが、例えば、次のような方法を用いることができる。すなわち、培養槽より排出される廃ガス中のエタノール濃度をガスクロマトグラフィーで連続的に測定して、その信号によりエタノール供給ポンプをコントロールして培養液中のエタノール濃度が１０〜３０００ｐｐｍ、好ましくは２００〜２０００ｐｐｍ程度になるように供給する。このようにしてエタノールを流加して培養すれば、カタラーゼ生産は１０日以上にわたってほぼ直線的に継続する。気泡塔型培養槽のごとき菌糸に対する剪断力の弱い培養槽を使用した培養では２０日以上にわたってカタラーゼ生産を行わせることができる。
【０００９】
本発明の培養によればカタラーゼは菌体内のみならず培地中にも生産される。培養で生産されたカタラーゼの回収は常法で行うことができる。菌体内に生産されたカタラーゼは、遠心分離、濾過などの通常の固液分離操作で菌体を回収し、磨砕や自己消化などの方法で菌体を破砕した後、水などで抽出することにより回収される。培地中に生産されたカタラーゼは、前記の固液分離操作で回収される。また、培養液にシクロヘキサンのごとき有機溶剤を加えて攪拌しながら４〜２４時間程度放置し菌体を自己消化させた後、固液分離を行うことによって、菌体内のカタラーゼと培養上清中のカタラーゼを同時に回収することができる。
【００１０】
【実施例】
次に本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明は、これらの実施例に限定されるものではない。
実施例１
サーモアスカス  オーランティアカス（Thermoascus aurantiacus ）IFO9862 を用いて、エタノールを炭素源として流加培養を行った。
工業用水１Ｌ当たり、つぎの組成を有する培地を調製した。
培地組成
ＫＨ2 ＰＯ4                           ６  ｇ
ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2Ｏ                  ２  ｇ
（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4                     ２  ｇ
酵母エキス                        ４００  ｍｇ
ＦｅＣ6 Ｈ5 Ｏ7 ・ｘＨ2 Ｏ        １２０  ｍｇ
ＺｎＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ                ４０  ｍｇ
ＭｎＣｌ2 ・４Ｈ2 Ｏ                ２０  ｍｇ
ＣａＣｌ2 ・２Ｈ2 Ｏ                ８０  ｍｇ
ＣｕＳＯ4 ・５Ｈ2 Ｏ                  ２  ｍｇ
ＫＩ                                  ２  ｍｇ
( ＮＨ4)6 Ｍｏ7 Ｏ24・４Ｈ2 Ｏ        ２  ｍｇ
ＣｏＣｌ2 ・６Ｈ2 Ｏ                  ２  ｍｇ
Ｈ3 ＢＯ3                             ２  ｍｇ
ＮａＣｌ                          １００  ｍｇ
ビタミン混合液                      ０．２ｍｌ
消泡剤（Silicone KM-75）            ０．５ｍｌ
前記培地におけるビタミン混合液は以下の組成のものを使用した。
ビタミン混合液組成
ビオチン                          ２０  ｍｇ
パントテン酸カルシウム              ４  ｇ
ピリドキシン・塩酸                  ４  ｇ
チアミン・塩酸                      ４  ｇ
パラアミノ安息香酸                  ２  ｇ
葉酸                              ２０  ｍｇ
イノシトール                      ２０  ｇ
ニコチン酸                          ４  ｇ
リボフラビン                        ２  ｇ
蒸留水                              １  Ｌ
【００１１】
２．６Ｌ容培養槽に前記の培地を１．３Ｌ張り込み、１２０℃で２０分間加熱滅菌し、冷却後、アンモニア水でｐＨ７．０に調整した。次いで、孔径０．２μｍのフィルターを通してエタノール２ｇを培養槽に添加した。これに別に調製した種母  ３０ｍｌを植菌し、空気を通気しつつ４０℃で培養を行った。培養時のｐＨは、２５％アンモニア水で７．０に自動制御した。培養液中のエタノール濃度は、廃ガスをガスクロマトグラフィにより連続的に測定し、５００〜１５００ｐｐｍの範囲になるように供給ポンプを制御して、自動的にエタノールを供給した。攪拌機回転数は菌の生育に応じて２００ｒｐｍから徐々に増加させて溶存酸素濃度がゼロにならないように制御したが、最高回転数は６００ｒｐｍに制限した。通気量は０．５ｖｖｍとした。この条件で培養を継続し、５日目及び１０日目に培養液の菌体濃度及びカタラーゼ活性を測定した。５日目及び１０日目の培養液中の菌体濃度はそれぞれ１．０％及び１．５％であった。カタラーゼ活性は、培養上清カタラーゼ活性と培養液カタラーゼ活性（全カタラーゼ活性：培養上清カタラーゼ活性と菌体内カタラーゼ活性との合計量）とをそれぞれ別々に測定した。培養液を遠心分離して得た上清のカタラーゼ活性を培養上清カタラーゼ活性とし、培養液にシクロヘキサンを１Ｖ／Ｖ％添加して４０℃で１６時間インキュベートした後遠心分離して得た上清の活性を培養液カタラーゼ活性とした。５日目の培養上清カタラーゼ活性及び培養液カタラーゼ活性はそれぞれ１８７０ｕ／ｍｌ、２３００ｕ／ｍｌであり、１０日目の培養上清カタラーゼ活性及び培養液カタラーゼ活性はそれぞれ６０００ｕ／ｍｌ、６１２０ｕ／ｍｌであった。１０日間に供給したエタノールの総量は１９２ｇであり、エタノール１ｇ当たりに生産されたカタラーゼは４２０００ｕであった。さらに、１６日目まで培養を継続したところ、培養上清カタラーゼ活性、培養液カタラーゼ活性とも１０７００ｕ／ｍｌにまで達した。
【００１２】
比較例１
サーモアスカス  オーランティアカス（Thermoascus aurantiacus ）IFO9862 を用いて、溶性デンプンを炭素源として回分培養を行った。
実施例１の培地１Ｌ当たりに溶性デンプン１００ｇを加えた組成の培地１．３Ｌを２．６Ｌ容培養槽に張り込み、実施例１と同様にして蒸気滅菌し、冷却後、アンモニア水でｐＨ７．０に調整した。これに別に調製した種母  ３０ｍｌを植菌し、空気を通気しつつ４０℃で回分培養を行った。培養時のｐＨは、２５％アンモニア水で７．０に自動制御した。攪拌機回転数は菌の生育に応じて２００ｒｐｍから徐々に増加させて溶存酸素濃度がゼロにならないように制御したが、最高回転数は６００ｒｐｍに制限した。通気量は０．５ｖｖｍとした。この条件で培養を継続したところ５日目に培養上清カタラーゼ活性及び培養液カタラーゼ活性はそれぞれ９４０ｕ／ｍｌ、１１１０ｕ／ｍｌとなった。さらに１０日目まで培養を継続したが、培養上清カタラーゼ活性及び培養液カタラーゼ活性はそれぞれ１２３０ｕ／ｍｌ、１３１０ｕ／ｍｌまで増加したにすぎなかった。１０日目の溶性デンプン１ｇ当たりに生産されたカタラーゼは１３１００ｕであった。
【００１３】
比較例２
サーモアスカス  オーランティアカス（Thermoascus aurantiacus ）IFO9862 を用いて、グルコースを炭素源として流加培養を行った。
実施例１の培地１Ｌ当たりにグルコース５０ｇを加えた組成の培地１．３Ｌを２．６Ｌ容培養槽に張り込み、実施例１と同様にして蒸気滅菌し、冷却後、アンモニア水でｐＨ７．０に調整した。これに別に調製した種母  ３０ｍｌを植菌し、空気を通気しつつ４０℃で回分培養を行った。培養時のｐＨは、２５％アンモニア水で７．０に自動制御した。５０時間後よりｐＨ調整用２５％アンモニア水の供給と連動して５０％グルコースを流加した。２５％アンモニア水と５０％グルコースの供給量比は１：９に設定した。攪拌機回転数は菌の生育に応じて２００ｒｐｍから徐々に増加させて溶存酸素濃度がゼロにならないように制御したが、最高回転数は６００ｒｐｍに制限した。通気量は０．５ｖｖｍとした。この条件で培養を継続し、５日目及び１０日目に培養液の菌体濃度及びカタラーゼ活性を測定した。５日目及び１０日目の培養液中の菌体濃度はそれぞれ１．５％及び２．２％であった。５日目の培養上清カタラーゼ活性及び培養液カタラーゼ活性はそれぞれ４８０ｕ／ｍｌ、６４０ｕ／ｍｌであり、１０日目の培養上清カタラーゼ活性及び培養液カタラーゼ活性はそれぞれ１３００ｕ／ｍｌ、１３８０ｕ／ｍｌであった。１０日間に供給したグルコースの総量は２１８ｇであり、グルコース１ｇ当たりに生産されたカタラーゼは８２３０ｕであった。この条件でさらに２３日目まで培養を継続したが、培養上清カタラーゼ活性及び培養液カタラーゼ活性はともに２２２０ｕ／ｍｌまで増加したにすぎなかった。
【００１４】
実施例２
アクレモニウム  アラバメンシス（Acremonium alabamensis）ATCC26796を用いて、３８℃で培養を行った他は実施例１と同様に培養を行った。５日目及び１０日目の培養液中の菌体濃度はそれぞれ０．５％及び０．８％であった。５日目の培養上清カタラーゼ活性及び培養液カタラーゼ活性はそれぞれ３１０ｕ／ｍｌ、３８０ｕ／ｍｌであり、１０日目の培養上清カタラーゼ活性及び培養液カタラーゼ活性はそれぞれ１１００ｕ／ｍｌ、１１５０ｕ／ｍｌであった。１０日間に供給したエタノールの総量は１０３ｇであり、エタノール１ｇ当たりに生産されたカタラーゼは１４５００ｕであった。
【００１５】
比較例３
アクレモニウム  アラバメンシス（Acremonium alabamensis）ATCC26796 を用いて、３８℃で培養を行った他は比較例１と同様に培養を行った。５日目及び１０日目の培養液中の菌体濃度はそれぞれ０．８％及び１．０％であった。５日目の培養上清カタラーゼ活性及び培養液カタラーゼ活性はそれぞれ１８０ｕ／ｍｌ、２１０ｕ／ｍｌであり、１０日目の培養上清カタラーゼ活性及び培養液カタラーゼ活性はそれぞれ２８０ｕ／ｍｌ、２９０ｕ／ｍｌであった。１０日目の溶性デンプン１ｇ当たりに生産されたカタラーゼは２９００ｕであった。
【００１６】
実施例３
アスペルギルス  テレウス（Aspergillus terreus ）IFO4100 を用いて３０℃で培養を行った他は実施例１と同様に培養を行った。５日目及び１０日目の培養液中の菌体濃度はそれぞれ０．７％及び１．１％であった。５日目の培養上清カタラーゼ活性及び培養液カタラーゼ活性はそれぞれ６７０ｕ／ｍｌ、７３０ｕ／ｍｌであり、１０日目の培養上清カタラーゼ活性及び培養液カタラーゼ活性はそれぞれ２１６０ｕ／ｍｌ、２２００ｕ／ｍｌであった。１０日間に供給したエタノールの総量は１５４ｇであり、エタノール１ｇ当たりに生産されたカタラーゼは１８６００ｕであった。
【００１７】
比較例４
アスペルギルス  テレウス（Aspergillus terreus ）IFO4100 を用いて３０℃で培養を行った他は比較例１と同様に培養を行った。５日目及び１０日目の培養液中の菌体濃度はそれぞれ１．２％及び１．６％であった。５日目の培養上清カタラーゼ活性及び培養液カタラーゼ活性はそれぞれ３４０ｕ／ｍｌ、４００ｕ／ｍｌであり、１０日目の培養上清カタラーゼ活性及び培養液カタラーゼ活性はそれぞれ４７０ｕ／ｍｌ、４８０ｕ／ｍｌであった。１０日目の溶性デンプン１ｇ当たりに生産されたカタラーゼは１８６００ｕであった。
【００１８】
【発明の効果】
本発明により従来行われてきた糸状菌の液体培養に比べて、はるかに高収量でカタラーゼを製造でき、製造コストを低減することができる。