(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
宿主生物において適当なプラスミドを発現させ、クエン酸リアーゼ活性を有するタンパク質を活性形態で単離することによって該タンパク質を生産する方法であって、該プラスミドが、クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)由来の遺伝子citC、citD、citE、citF、およびcitGをこの順に含み、かつ大腸菌(E.coli)クエン酸リアーゼ遺伝子クラスターのcitFとcitGの間に位置する大腸菌由来のcitXを含む遺伝子クラスターを含有しており、さらに誘導性プロモーターを含有していることを特徴とする、上記方法。
【請求項２】
前記citXが、配列番号３のヌクレオチド番号3877-4426のヌクレオチドを含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記遺伝子citC、citD、citE、citF、およびcitGならびにcitXを含む遺伝子クラスターが、クエン酸リアーゼ活性を有するタンパク質の特定のサブユニットおよび／または完全な酵素の生合成に寄与する成分をコードするものである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法によって取得される、クエン酸リアーゼ活性を有し、分子量が14,000〜15,000ダルトンである可溶性組換えタンパク質。
【請求項５】
下記成分を含んでなるクエン酸測定用の検査キット：
(a)請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法によって取得される、クエン酸リアーゼ活性を有するタンパク質、
(b)水素転位活性を有する少なくとも１種のタンパク質、
(c)ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドまたはその還元形態の誘導体、ならびに
(d)任意成分である適当な安定剤、干渉を回避または低減するための物質および／またはアクチベーター、ならびにバッファー溶液。
【請求項６】
クエン酸を測定するための、請求項１〜３に記載の方法により得られた酵素の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、酵素ホロ-クエン酸リアーゼおよびその組換え産生方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
酵素クエン酸リアーゼ(EC.4.1.3.6)は嫌気性クエン酸分解の鍵酵素であると考えられており、したがって多くの様々な原核細胞から単離され得る。この酵素は、クエン酸の酢酸とオキサロ酢酸への分解を触媒する。さらに、現在までに最も詳細に調べられているクレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)(正式にはクレブシエラ・エーロゲン(Klebsiella aerogenes))由来のクエン酸リアーゼ酵素の酵素複合体は、３つの異なるサブユニット、すなわちα、βおよびγサブユニットのそれぞれの6個のコピーから構成され、分子量が約550,000ダルトンであることが知られている。さらに、その触媒活性中心はαおよびβサブユニットに位置しており、一方γサブユニットは補欠分子族2'-(5"ホスホリボシル)-3'-デホスホCoAに対する結合部位を有するということも知られている。この補欠分子族はホスホジエステル結合を介してセリン残基14に結合する。
【０００３】
主に臨床化学および食品分析についての大部分の用途において、クエン酸リアーゼ酵素は高純度であることが要求される。したがって、組換え法により特定の宿主細胞で活性形態の酵素を過剰に産生させ、これらの細胞から酵素を単離することが目標である。そのような方法は今だ記載されておらず、何ら発表されていない。よって、現在のところ、クエン酸リアーゼは、通常、唯一の炭素およびエネルギー源としてクエン酸を用いて嫌気性条件下で培養されたクレブシエラ・ニューモニエ細胞から単離されている。クレブシエラ・ニューモニエ由来のクエン酸リアーゼ遺伝子はクローニングされ、配列決定されている(M.BottおよびP.Dimroth, Mol. Microbiol. Vol. 14, 347-356(1994))。これらの遺伝子は、5種の遺伝子、citCDEFGからなるcitCオペロンの一部である。citC遺伝子は、アセチルチオエステルの生成を触媒するクエン酸リアーゼリガーゼをコードする。遺伝子citD、citEおよびcitFは、クエン酸リアーゼのγ、βおよびαサブユニットをコードする。citGによりコードされるタンパク質は、補欠分子族の生合成に関与する。さらに、citCオペロンは酸素の不在下かつクエン酸およびNa+イオンの存在下で誘導され、またこの発現はcitA/citB調節系に強く依存していることが知られている(M. Bottら, Mol. Microbiol. Vol.18, 533-546(1995); M. Meyerら, J. Mol. Biol. Vol.269, 719-731(1997))。
【０００４】
クレブシエラ・ニューモニエ由来のクエン酸リアーゼをコードする遺伝子の発現は、実用的な理由から好ましくは大腸菌(E.coli)などの原核細胞で実施されており、それによって不活性形態であるが可溶性形態である酵素が得られる(M.BottおよびP.Dimroth, Mol. Microbiol. Vol.14, 347-356(1994))。その後、天然補欠分子族2'-(5"-ホスホリボシル)-3'-デホスホCoAのアセチルチオエステルに対する置換基として知られたアセチル補酵素Aを添加することにより組換えアポ-クエン酸リアーゼ酵素を活性化してホロ-酵素を形成し得る。しかしながら、そのような追加的な活性化手段は複雑であり面倒である。さらに、アセチルCoA添加が必要であるということはクエン酸リアーゼまたはそのアポ体を販売する上で不適当である。というのは、かかる物質は4℃で長期間保存した場合分解するからである。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
したがって、本発明の課題は、公知の方法の欠点が排除された可溶性であると同時に活性な組換えホロ-クエン酸リアーゼを提供することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
上記課題は、宿主生物において適当なプラスミドを発現させることによりクエン酸リアーゼ活性を有するタンパク質を生産する方法で達成される。ここで、該プラスミドは、少なくとも6種の遺伝子からなる遺伝子クラスターの情報および誘導性プロモーターを含んでいる。該遺伝子クラスターを含む遺伝子は、クエン酸リアーゼ活性を有するタンパク質の特定のサブユニットおよび／または完全酵素の生合成に関与する成分をコードする。特に、適切なプラスミドは、遺伝子citC、citD、citE、citF、citG、および例えば大腸菌クエン酸リアーゼ遺伝子クラスター上の遺伝子citFとcitGの間に位置する、大腸菌から取得し得るDNA断片を含む。遺伝子citD、citEおよびcitFは、それぞれ酵素のγ、βおよびαサブユニットをコードし、約11,000ダルトン、32,000ダルトンおよび55,000ダルトンの分子量を有する。本発明によれば、前記遺伝子の一つは、モチーフG(A)-R-L-X-D-L(I)-D-Vを含むタンパク質をコードするDNA断片を表すものであることが好ましい。かかるDNA断片としては、約20,000ダルトンの分子量を有するタンパク質をコードするものが特に好ましい。
【０００７】
さらに、遺伝子クラスターを含む遺伝子の第１遺伝子に融合したある１つの遺伝子および任意のさらなる遺伝子が、その他の遺伝子とは異なる生物由来のものである場合に有利であることが判明した。特に、DNA断片citXまたは大腸菌クエン酸リアーゼ遺伝子クラスター上のcitFとcitGとの間に位置するcitXに相同な遺伝子が、大腸菌、クレブシエラ・ニューモニエ、ヘモフィルス・インフルエンザ(Haemophilus influenzae)またはロイコノストック・メゼンテロイデス(Leuconostoc mesenteroides)由来のものである場合、かつその他の遺伝子の１個または数個が、クエン酸リアーゼ活性を有する単離されたタンパク質に特異的な微生物、例えばクレブシエラ・ニューモニエ由来のものである場合に有利であることが判明した。ヘモフィルス・インフルエンザ、ロイコノストック・メゼンテロイデス(S.Bekalら, J. Bacteriol. Vol.180, 647-654(1998))およびロイコノストック・パラメゼンテロイデス(M.Martinら, FEMS Microbiol. Lett. Vol. 174, 231-238(1999))では、遺伝子citXおよびcitGは融合形態で存在する。したがって、そのような融合遺伝子は、2個の遺伝子の情報を含む。得られるタンパク質は、約52,000ダルトンの分子量を有し、大腸菌citXおよびcitGの活性を有するので二元機能性である。citX遺伝子またはcitGに相同な遺伝子または対応citX融合遺伝子の不在下では、クエン酸リアーゼのホロ体(SDS-PAGEによるMW：14,500ダルトン)ではなく低分子量のアポ体(SDS-PAGEによるMW:12,000ダルトン)のみが発現後に検出された。
【０００８】
本発明によれば、真核生物のみならず、原核生物も宿主生物として適していることが判明した。可溶性の活性クエン酸リアーゼが、例えば大腸菌のような原核生物において、追加の活性化手段を用いることなく簡単な手法にて十分な収量で産生し得るという事実が重要な利点である。
【０００９】
したがって、lac、lac UV5、T5、tacまたはT7プロモーターのような誘導性プロモーターの調節下に大腸菌citCDEFXG遺伝子クラスター全体をクローニングすることによって、クエン酸リアーゼ活性を有する活性酵素を非酸素制限条件下で発現させ得るということを示すことが可能であった。適当な発現プラスミドを含む細胞抽出物は、無細胞抽出物中に約4〜5U/mg(タンパク質)のクエン酸リアーゼ活性を生じさせるが、組換えクエン酸リアーゼを含まない細胞は好気性条件下で増殖させた場合クエン酸リアーゼ活性を持たない。
【００１０】
さらに、本発明は、クレブシエラ・ニューモニエ由来のcitCDEFG遺伝子クラスターと大腸菌から取得し得るcitX遺伝子との同時発現に関する。これにより、原核生物、特に大腸菌においてさえ活性形態のクエン酸リアーゼを得ることができる。
【００１１】
この方法により、好気性増殖条件下で無細胞抽出物中に約8U/mg(総タンパク質)の活性を得ることができた。
【００１２】
ホロ-酵素は、当業者に公知の方法によって精製される。本発明の方法によって、細胞約1g(湿重量)からクエン酸リアーゼ活性を有する可溶性タンパク質を約100〜120μg得ることができる。タンパク質測定は、標準物質としてオボアルブミンを用いてP.K.Smithら, Anal. Biochem. Vol.150, 76-85(1985)にしたがって行った。クエン酸リアーゼの比活性は約70U/ml(タンパク質)である(M.SingleおよびP.A.Srere, J. Biol. Chem. Vol.251(10), 2911-2615(1976))。したがって、本発明の方法によって得られるホロ-酵素の活性は、アセチルCoAおよびアポ-クエン酸リアーゼで得られる活性の約0.5〜3倍である。
【００１３】
よって、本発明の方法は、初めて、可溶性かつ活性であり、クエン酸リアーゼ活性が向上した組換えタンパク質をもたらすものである。
【００１４】
さらに、本発明は、本質的に下記の成分：本発明の方法によって得られる、クエン酸リアーゼ活性を有するタンパク質、水素転移活性を有する少なくとも1種のタンパク質、ニコチンアミド-アデニンジヌクレオチドまたは還元形態の適当な誘導体、ならびに任意成分である適当な安定剤、アクチベーターおよび／または妨害、すなわち実際の反応をマスクまたは妨害する成分または反応を回避または低減するための物質ならびに適当なバッファー溶液、を含んでなるクエン酸の測定用検査キットに関する。特に、L-リンゴ酸デヒドロゲナーゼおよびL-乳酸デヒドロゲナーゼを、水素転移活性を有するタンパク質として考慮に入れる。測定にとって重要な特性または活性の低下を回避するか、少なくとも遅延させるのに役立つ物質、添加剤または手段が基本的に安定剤に適している。特に、サンプル材料がほんの少量しか利用できない場合、またはサンプルが極めて希薄な場合、アクチベーターを添加するのが有利であり得る。
【００１５】
本発明のさらなる主題は、臨床化学において、食品分析において、そして化粧品の純度試験としてクエン酸を測定するための、クエン酸リアーゼ活性を有する可溶性の組換えタンパク質の使用方法である。臨床化学では、かかる酵素的検査は、主に妊娠の検査および腎結石患者の治療におけるモニタリングのために用いられる。食品分析では、最も重要な用途はワインおよび果汁の分析である。
【００１６】
酵素的方法は、Mg2+イオンの存在下で酵素クエン酸リアーゼによりクエン酸を分解してオキサロ酢酸および酢酸を生成させることに基づく。L-リンゴ酸デヒドロゲナーゼおよびL-乳酸デヒドロゲナーゼなどの水素転移酵素の存在下で、オキサロ酢酸およびその脱炭酸反応生成物であるピルビン酸を還元型NADHまたはNADPHで還元してL-リンゴ酸およびL-乳酸を生成させる。NADHまたはNADPHの量はクエン酸の量に比例し、334nm、340nmまたは365nmで測定される。
【００１７】
したがって、本発明は、適当なバッファー溶液のほかに、クエン酸リアーゼ活性を有する組換えタンパク質、1種または数種の水素転移酵素、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドまたはその還元形態の誘導体、および任意成分であるチオール試薬などの適当な安定剤を含む、クエン酸測定用の検査キットにも関する。
【００１８】
【実施例】
本発明を下記の実施例によってさらに説明する。
【００１９】
実施例１
細胞培養
下記の株およびプラスミドを使用した：大腸菌DH5αまたはBL21(DE3)(F.W.StudiarおよびB.A.Mofatt, J. Mol. Biol. Vol. 189, 113-130(1986))およびpACYC184(A.C.Y.Changら, J. Bacteriol. Vol. 134, 1141-1156(1978))。J.Sambrookら, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York(第2版, 1989)にしたがって、大腸菌細胞をルリア・ベルターニ(Luria Bertani, LB)培地中で37℃にて通常通りに培養した。抗生物質を下記のような最終濃度で加えた：アンピシリン200μg/ml、クロラムフェニコール50μg/mlおよびカナマイシン50μg/ml。大腸菌DH5α株をクローニング用の宿主生物として用いた。lacUV5プロモーターの制御下でファージT7ポリメラーゼ遺伝子を含む大腸菌BL21(DE3)細胞（F.W.StudierおよびB.A.Moffatt、前掲）を、pT7-7およびpET誘導体の標的遺伝子の発現用の宿主として用いた。発現用の培養液は下記のようにして調製した。37℃で一晩インキュベーションした40mlの前培養液を遠心分離(3000g、8分間)した後、細胞を20mlの新鮮なLB培地中に再懸濁した。次に、細胞懸濁液を用いて適当な抗生物質を含む同培地2Lに接種し、培養液を振盪機(180rpm)で37℃にてインキュベーションした。OD600が0.5〜0.8の値になったら、IPTG(イソプロピル-β-D-チオガラクトシド)を最終濃度1mMで加えることにより標的遺伝子の発現を誘導し、培養液をさらに3時間、振盪機(180rpm)で37℃にてインキュベーションした。その後、細胞を遠心分離(3000gで30分間)して回収し、20mlの50mMリン酸カリウム、pH7.0、1mM MgCl2で1回洗浄し、-20℃で保存した。
【００２０】
実施例２
遺伝子および遺伝子クラスターの単離
大腸菌citCDEFXG遺伝子クラスターを含む発現プラスミドの構築のために、大腸菌の染色体DNAから得た6.9kbの断片を、プライマーeccl-for(配列番号1)およびec-citT-rev(配列番号2)を用いたPCRによって、Roche Diagnostics製のExpand High Fidelity PCRシステムを使用して増幅させた。さらにcitT遺伝子を含む6.9kbのPCR断片(K.M.Posら, J. Bacteriol. Vol. 180, 4160-4165(1998))を、制限エンドヌクレアーゼXbalおよびXholで切断し、得られた5.5kbの断片(配列番号3)と、それに対応して線状化された発現ベクター、例えばpKK177-3Hb、pKKT5、pUC18、pT7、pET24bなどをアガロースゲル上で分離し、適切なバンドを単離した(Diagen Company製のQIAEXキット)。次いで、PCR断片とベクター断片とをT4 DNAリガーゼを用いて連結した。この1μl(20ng)のベクター断片および3μl(100ng)のPCR断片に、1μlの10×リガーゼバッファー(Maniatisら, 1989 B.27)、1μlのT4 DNAリガーゼ、4μlの滅菌再蒸留H2Oをピペットで加え、注意深く混合し、16℃で一晩インキュベーションした。PCRで得られたインサートは、citC開始コドンの55bp前から始まり、citG終結コドンの203bp下流で終わる。
【００２１】
大腸菌由来のcitX遺伝子を含む発現プラスミド(配列番号3)の構築のために、citX遺伝子を、プライマーec-citX-for(配列番号4)およびec-citX-rev(配列番号5)を用いて、Pfu DNAポリメラーゼ(Stratagene)を使用して染色体DNAからPCRによって増幅した。開始コドンはNdeI制限エンドヌクレアーゼ切断部位の一部であり、XhoI制限エンドヌクレアーゼ切断部位は終結コドンの直後に位置している。NdeIおよびXhoIでPCR産物を消化切断した後、得られた555bpのDNA断片(配列番号6)を適当に線状化した発現ベクターに連結した(前記同様)。
【００２２】
クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae：肺炎杆菌）のcitCDEFG遺伝子クラスターを含む発現プラスミドの構築は、M.BottおよびP.Dimroth, Molecular Microbiology Vol.14(2), 347-356(1994)に記載されている。citCDEFG遺伝子クラスターの配列を配列番号7に示す。
【００２３】
実施例３
種々の大腸菌発現株における様々な発現プラスミドによる形質転換
種々の大腸菌株のコンピテント細胞をHanahan(J. Mol. Biol. Vol.166, 557ff.(1983))の方法にしたがって調製した。この手法で調製した200μlの細胞を20ngの対応する発現プラスミドと混合した。氷上で30分間インキュベーションした後、熱ショックを行った(42℃で90秒間)。
【００２４】
その後、細胞を1mlのLB培地に移し、表現型発現のために37℃で1時間インキュベーションした。この形質転換混合物のアリコートを、選択マーカーとして適切な抗生物質を含むLBプレート上で平板培養し、37℃で15時間インキュベーションした。
【００２５】
実施例４
種々の標的遺伝子の発現
37℃で一晩増殖させた40mlの前培養液を遠心分離(3000g、8分間)した後、細胞ペレットを20mlの新鮮なLB培地に再懸濁した。次に、細胞懸濁液を用いて適当な抗生物質を含む2LのLB培地に接種した。この細胞培養液を振盪機(180rpm)で37℃にてインキュベーションした。1mMのイソプロピル-β-D-チオガラクトシド(IPTG、最終濃度)を加えることにより、標的遺伝子の発現を0.5〜0.8の光学密度(600nmで測定)で誘導し、培養液を37℃、180rpmでさらに3時間インキュベーションした。その後、細胞を遠心分離(3000gで30分間)により回収し、20mlの50mMリン酸カリウム、pH7.0で1回洗浄し、-20℃で凍結させた。
【００２６】
細胞抽出物の調製のために、1gの細胞(含水重量)を4mlの50mM冷リン酸カリウム、1mM MgCl2 pH7.0に再懸濁した。プロテアーゼ阻害剤反応混液(Roche Diagnostics)およびDNAseIを最終濃度25mg/mlになるよう加えた後、細胞をフレンチプレスに108Mpaにて3回通過させることにより溶解した。無傷の細胞および細胞破砕片を遠心分離(27,000gで30分間)により除去した。無細胞上清を超遠心分離(150,000gで1時間)により膜画分から分離した。得られた細胞抽出物は、その後、酵素的研究およびタンパク質精製に直接使用することができる。
【００２７】
実施例５
クエン酸リアーゼ活性試験
クエン酸リアーゼ活性を、Roche Diagnostics製のリンゴ酸デヒドロゲナーゼと組み合せた分光光度試験で25℃で測定した。試験混合物には、最終容量1ml中に、50mMグリシルグリシンpH7.9、5mMのクエン酸カリウム、2mMのZnCl2、0.5mMのNADH、30Uのリンゴ酸デヒドロゲナーゼ(Roche Diagnostics)および10μlまたは20μlの細胞抽出物が含まれていた。NADHの酸化を、分光光度計にて365nmで測定した(ε＝3.4mM-1cm-1)。1酵素単位(単位)は、1分間に酢酸およびオキサロ酢酸に分解される1μmolのクエン酸と定義する。
【００２８】
配列情報
配列番号１
配列の特徴：
(A)  配列の長さ：36塩基対
(B)  配列の型：核酸
(C)  鎖の数：一本鎖
(D)  トポロジー：直鎖状
0003764847.tif 000002
配列番号２
配列の特徴：
(A)  配列の長さ：38塩基対
(B)  配列の型：核酸
(C)  鎖の数：一本鎖
(D)  トポロジー：直鎖状
0003764847.tif 000003
配列番号３
配列の特徴：
(A)  配列の長さ：5484塩基対
(B)  配列の型：核酸
(C)  鎖の数：一本鎖
(D)  トポロジー：直鎖状
0003764847.tif 000004
0003764847.tif 000005
0003764847.tif 000006
配列番号４
配列の特徴：
(A)  配列の長さ：33塩基対
(B)  配列の型：核酸
(C)  鎖の数：一本鎖
(D)  トポロジー：直鎖状
0003764847.tif 000007
配列番号５
配列の特徴：
(A)  配列の長さ：36塩基対
(B)  配列の型：核酸
(C)  鎖の数：一本鎖
(D)  トポロジー：直鎖状
0003764847.tif 000008
配列番号６
配列の特徴：
(A)  配列の長さ：553塩基対
(B)  配列の型：核酸
(C)  鎖の数：一本鎖
(D)  トポロジー：直鎖状
0003764847.tif 000009
配列番号７
配列の特徴：
(A)  配列の長さ：5593塩基対
(B)  配列の型：核酸
(C)  鎖の数：一本鎖
(D)  トポロジー：直鎖状
0003764847.tif 000010
0003764847.tif 000011
0003764847.tif 000012
【００２９】
【配列表】
0003764847.tif 000013
0003764847.tif 000014
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１Ａは、クエン酸リアーゼによって触媒される反応およびクエン酸リアーゼリガーゼによる酵素の活性化における種々のサブユニットの機能を示す図である。HS-Rは、補欠分子族を示す。図１Ｂは、クエン酸リアーゼの補欠分子族2'-(5"-ホスホリボシル)-3'-ホスホ-CoAの構造を示す図である。
【図２】クレブシエラ・ニューモニエ(K.p.)、大腸菌(E.c.)、ヘモフィルス・インフルエンザ(H.i.)およびロイコノストック・メゼンテロイデス(L.m.)由来のクエン酸リアーゼ遺伝子クラスターを示す図である。大腸菌citXに相同な遺伝子配列を、陰影を付して示す。
【図１】
0003764847.tif 000018
【図２】
0003764847.tif 000019