(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１の塩基配列、またはpSAM2の複製性の遊離形態の出現を誘導する能力を有するその変異体の一つにより表されることを特徴とする核酸。
【請求項２】
構成的または調節プロモーターの制御下に、請求項１に記載の配列を含んで成る発現カセット。
【請求項３】
構成的プロモーターがermE遺伝子のプロモーターまたはその変異体、エス．ガハナエンシス（S.ghanaensis）のファージI19のp14プロモーター、またはエス．アンボファシエンス（S.ambofaciens）のリボソームオペロンのプロモーター領域を含む断片から選択されることを特徴とする、請求項２に記載の発現カセット。
【請求項４】
調節プロモーターが、培養培地中に導入される薬剤により特異的に誘導されるプロモーター、例えばチオストレプトン−誘導性プロモーターtipA、またはgroE遺伝子のプロモーターのような熱誘導性プロモーターから選択されることを特徴とする、請求項２に記載の発現カセット。
【請求項５】
調節プロモーターが、放線菌の増殖周期の後期に特異的に活性な放線菌プロモーターから選択されることを特徴とする、請求項２に記載の発現カセット。
【請求項６】
pSAM2に由来し、そして放線菌に組み込まれたベクターの遊離形態の出現を誘導するための、請求項１ないし５のいずれか１項に記載の核酸またはカセットの使用方法。
【請求項７】
核酸またはカセットが、pSAM2由来の組み込みベクターにより保持されていることを特徴とする、請求項６に記載の使用方法。
【請求項８】
核酸またはカセットが、別のベクターに保持されるか、またはそれ自体を直接導入することを特徴とする、請求項６に記載の使用方法。
【請求項９】
放線菌がストレプトミセス、ミコバクテリアおよびバシルスから選択されることを特徴とする、請求項６ないし８のいずれか１項に記載の使用方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は新規核酸配列、それを発現するベクターおよび放線菌の発酵工程におけるその使用に関する。
放線菌（Actinomycetes）は分枝した糸状のグラム（＋）細菌である。放線菌の中でもストレプトミセス（Streptomycetes）は最大の一族を形成している。ストレプトミセスは絶対的な好気条件下で土壌中に天然に生存する胞子−形成糸状菌である。
放線菌、そして特にストレプトミセスは、工業的観点から大変重要である。特に、それらは多種類の２次代謝物を生産するという特徴を持つ（Demain、放線菌の生物学（Biology of Actinomycetes）88、Okami（編集）、東京、ジャパン、サイエンティフィック  ソサイエティーズ出版（Japan scientific societies press）、1988、第19-25頁）。これらの代謝物は大変様々な構造、および生物学的特性を有することができる（除草剤、抗癌剤、駆虫剤、同化作用剤、抗生物質等）。これらの代謝物の中で最も知られているのは抗生物質（微生物により生産される化学物質であり、他の微生物に対して有害な効果を持つ）。ストレプトミセスは現在、工業的に生産されている抗生物質の70％を提供している。合成される抗生物質の構造的多様性は、他のどの細菌属に見いだされていない。すなわちほとんどすべての構造の種類が公開されている：β−ラクタム系（例えばアンピシリン）、ポリペプチド系抗生物質（例えばストレプトグラミン）、アミノグリコシド系抗生物質（例えばストレプトマイシン、カナマイシン等）、マクロライド系（例えばエリスロマイシン、スピラマイシン等）、あるいはサイクリン系（例えばテトラサイクリン）等。
これらの理由により、これらの微生物を遺伝的に操作できる道具（ベクター、プロモーター等）を自由に使えることができれば特に有利である。そのような道具により、実際、これらの代謝物の合成レベルをモディファイでき、あるいはこれら代謝物の合成中間体または誘導体を製造等できるようになるだろう。またそのような道具は遺伝子工学法に従い、これらの微生物が組換え産物、特にヘテロロガスなタンパク質を製造することを可能にするだろう。
これとの関連で、欧州特許第350,341号明細書は、大変有利な特性を持つプラスミドpSAM2に由来するベクターを記載している。すなわちこれらのベクターは部位−特異的な様式で放線菌のゲノム中に組み込まれることができ、そして広範な種類の宿主および高い安定性を保持している。さらに、それらは核酸を放線菌に転移させ、そしてこれらの核酸をその中で発現させるために使用できる。しかし、これらのベクターは幾つかの欠点を有し、それらは特に細胞あたりのコピー数が低いこと、およびコピー数を制御する手段が無いということにある。すなわち、pSAM2およびその誘導体は、一般的に染色体あたり１つのコピー数に基づき組み込まれる。
本発明は、pSAM2に由来するベクターの工業的使用条件を改善できる道具を提供することにより、この問題を解決するための手段を提供する。本発明は、実際、遺伝子の発現産物が、組み込み状態から複製性のプラスミドpSAM2の遊離形態、またはそれに由来するベクターの出現を導く遺伝子を記載する。これは、遊離形態が細胞あたり高コピー数で存在するので、pSAM2またはその誘導体のコピー数を増加させる効果をもつ。
本発明はこの遺伝子の発現用カセット、それを含むベクター、およびpSAM2の遊離コピーまたはpSAM2に由来する組み込みベクターの出現を誘導するための発現カセットの使用も記載する。
出願人は、実際、複製性のpSAM2の遊離コピーおよびその誘導体の出現を誘導できるプラスミドpSAM2の領域を単離し、配列決定し、そして特性決定した。出願人は、この領域がシス（同じベクターに対して）またはトランス（同じベクターに対してではない）に使用されて、pSAM2またはその誘導体に作用することも示した。この領域の配列を配列番号１に表す。さらに詳細には、この領域およびその機能的役割を、プラスミドpSAM2の変異体を研究することにより示した：一方は遊離形態が観察されないエス．アンボファシエンス（S.ambofaciens）ATCC 15154が起源のpSAM2（B2）、もう一方は遊離形態が組み込み形態と共に観察される他のエス．アンボファシエンス（S.ambofaciens）株を起源とするpSAM2（B3）およびpSAM2（B4）。この研究により、２つの異なる点突然変異を特性決定でき（pSAM2（B3）の２つ、およびpSAM2（B4）の１つ）、両方ともpSAM2遺伝子の発現を制御するプロモーター領域に位置していた（配列番号１を参照されたい）。これらの突然変異はpSAM2（B3）およびpSAM2（B4）の遊離形態の出現を導く。この遺伝子を次にクローン化および配列決定して、そしてpSAM2に由来するプラスミドの遊離形態の出現を、組み込まれたコピーから引き出す能力について測定した。
したがって本発明の第一の主題は、配列番号１の配列の全部または一部、あるいは配列番号１の配列の変異体を含んで成る核酸配列にある。
本発明の目的に関して、変異体と言う用語は遺伝子コードの縮重の結果、配列番号１の配列とは異なる任意の配列、ならびに配列番号１のこれらの配列またはこの配列の断片とハイブリダイズし、かつ産物が言及した活性を有する任意の配列を表す。これらの変異体は配列番号１から、当業者に周知の方法、特に突然変異誘発法、欠失、置換、付加、ハイブリダイゼーション等により得ることができる。ハイブリダイゼーションは従来のストリンジェンシー条件下（Maniatisら、分子生物学の一般的手法を参照にされたい）、あるいは好ましくは高ストリンジェンシー条件下で行うことができる。pSAM2の複製性の遊離形態またはその誘導体の出現を誘導する変異体の能力は、そのようなプラスミドを組み込む状態で含む放線菌株について（例えばATCC 15154株）、発現が可能な条件下で該変異体を転移し、そして遊離形態の出現を評価することにより、測定することができる（実施例を参照にされたい）。
本発明の別の主題は、配列番号１または上記のようなその変異体の発現用の任意のカセットに関し、このカセットは該配列または変異体を構成的または調節プロモーターの制御下に含んで成る。
構成的プロモーターの使用は、カセットが組み込みプラスミドの遊離形態を誘導するためにトランスに使用される時、特に有利である。この場合、組み込み状態のプラスミドを含む細胞は、発現カセットでトランスフェクトされて複製性の遊離形態の出現を誘導し、例えばプラスミドの単離および／または精製を可能にする。
調節プロモーターの使用は、カセットがシスに使用される時（pSAM2自体に由来するベクターに対して）、特に有利であり、例えば工業的な発酵工程などである。この場合、細胞の全体の増殖および成長期は、本発明の遺伝子が発現すること無く進行し、すなわち染色体あたり１つのプラスミドコピーで進行し、そして生産期（組換え産物の、代謝物の生合成または合成の調節用遺伝子の）に、調節プロモーターが誘導され、プラスミドの幾つかの遊離コピーの出現を生じ、したがって生産活性が増大する。この実施様式は、幾つかのコピー数が存在するヘテロロガスな配列を持つpSAM2に由来するベクターが、細胞に対して毒性であり、かつ／または細胞の成長に影響を及ぼし得るとき、特に有利である。
本発明の内容において使用できる構成的プロモーターの中で、放線菌中で機能的である任意の構成的プロモーターとして特に挙げることができるのは、例えばermE遺伝子のプロモーターまたはその変異体（Bibbら、Gene 41（1986）E357）、エス．ガハナエンシス（S.gahanaensis）のファージI19のp14プロモーター（Labesら、Sixth DFGWT/AFAST,27-30/11/92）、あるいはエス．アンボファシエンス（S.ambofaciens）のリボソームオペロンのプロモーター領域を含む任意の断片（Pernodetら、Gene 79（1989）33）である。
本発明の内容において使用できる調節可能なプロモーターの中で、放線菌中で機能的である任意の調節可能なプロモーターを特に挙げることができる。これらは、培養培地中に導入される薬剤により特異的に誘導されるプロモーター、例えばチオストレプトン−誘導性プロモーターtipA（ムラカミら、J.Bactt.,171（1989）1459）、または例えばgroEL遺伝子のプロモーターのような熱導性プロモーター（Mazodierら、J.Bactt.,173（1991）7382）を含んで成ることができる。それらは放線菌の増殖周期の後期に特異的に活性である放線菌プロモーター、例えば二次代謝の遺伝子の特定のプロモーター（特に抗生物質の生産に関する遺伝子）含んで成ることもできる。
本発明の別の目的は、上記の本発明の配列またはそれらを含むカセットを、pSAM2に由来し、かつ放線菌に組み込まれているベクターの遊離コピーの出現を誘導させるために使用することに関する。
上述のように、この使用はシス（pSAM2に由来する組み込み型ベクターにより保持されている遺伝子またはカセット）あるいはトランス（別のベクターに関するこの遺伝子またはカセット、あるいはそれ自体を直接導入する）に行うことができる。
上述のようなpSAM2に由来する組み込みベクターは、組み込み、取り出し、および複製に必要な少なくとも１つのpSAM2の要素を含んで成る。したがってより詳細には、これらのベクターは少なくとも、欧州特許第350,341号明細書に記載されているattPおよびint領域、Xis遺伝子、repSA遺伝子、および複製起源（ori）を含んで成る。これらの様々な領域を、図１に示すプラスミドpSAM2の地図で表し、その地図上の幾つかの制限部位は、これらの領域を抽出できるようにすることも分かる。
有利には、pSAM2由来の組み込みベクターは、所望の生成物をコードする組換えＤＮＡ配列も含んで成る。所望の生成物は医薬品として、または農業用飼料原料として重要なペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質であることができる。この場合、本発明のシステムで細胞あたりのこの配列のコピー数を増加させることが可能であり、したがってこの生成物の生産レベルが増大し、すなわち製造工程の収量が増加する。この所望の生成物は、問題の放線菌株による代謝物の生合成（合成、分解、輸送または調節）に参加するペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質であることもできる。この場合、本発明のシステムは細胞あたりのこの配列のコピー数を増加させることができ、したがってこの生成物の生産レベルを増大させ、そして代謝物の生産レベルを増大させるか、あるいは代謝物の生合成を遮断するか、あるいは代謝物の誘導体を生産することを可能にする。
本発明の配列はこのように任意の放線菌で使用することができ、そのゲノム中にpSAM2ベクターまたはその誘導体を組み込むことができる。特に、これらの配列は放線菌、マイコバクテリア、バシルス等が関与する発酵工程で使用することができる。例としてエス．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespiralis）（ATCC 25486）、エス．アンチバイオチカス（S.antibioticus）（DSM 40868）、エス．ビキニエンシス（S.bikiniensis）（ATCC 11062）、エス．パルブルス（S.parvulus）（ATCC 12434）、エス．グラウセッセンス（S.glaucescens）（ETH 22794）、エス．アクトサス（S.actuosus）（ATCC 25421）、エス．コエリカラー（S.coelicolor）（A3（2））、エス．アンボファシエンス（S.ambofaciens）、エス．リビダンス（S.lividans）、エス．グリオフスカス（S.griseofuscus）、エス．リモサス（S.limosus）等（Smokvinaら、組換えプラスミド、pSAM2、GIM90の応用（Applications of the intergrated plasmid pSAM2,GIM90）、プロシーディングズ（Proceedings）、第１巻、第403-407頁も参照にされたい）を挙げることができる。
上記要素を含むpSAM2由来ベクターは、当業者により、知識および本出願の技術の骨格に基づき構築されることができる（分子生物学の一般的技法も参照にされたい）。
本発明の配列は、特に抗生物質（スピラマイシン系、ストレプトグラミン系、β−ラクタム系等）、欧州特許第346,000号明細書および国際出願/FR93/00923号明細書に記載されている遺伝子の工業的生産に使用するために最も適する。
本発明は以下の実施例により、より完全に記載されるが、この実施例は説明するものであり、制限することを意図していない。
図の説明：
図１：プラスミドpSAM2の制限地図。
図２：ベクターpOS531の制限地図。
図３：ベクターpOS532の制限地図。
図４：ベクターpOS541の制限地図。
図５：ベクターpOS544の制限地図。
図６：ベクターpOS666の制限地図。このベクターはプラスミドpPM927から（Smokvinaら、gene 94（1990）53）、rmf遺伝子（praとも呼ばれる）、およびpSAM2の複製起源：tsr：チオストレプトン耐性遺伝子；stm/spc：ストレプトマイシン／スペクチノマイシン耐性遺伝子；oriR：大腸菌複製起源；oripSAM2：pSAM2の複製起源；ter：転写ターミネーターを挿入することにより構築される。
図７：ベクターの活性
分子生物学の一般的技法
プラスミドＤＮＡの調製的抽出、プラスミドＤＮＡの塩化セシウム勾配遠心、アガロースまたはアクリルアミドゲル電気泳動、電気溶出によるＤＮＡ断片の精製、タンパク質のフェノールまたはフェノール／クロロホルム抽出、塩媒質中でのＤＮＡのエタノールまたはイソプロパノール沈殿、大腸菌の形質転換等の分子生物学で従来から使用されている方法は、当業者にとって周知であり、文献に豊富に記載されている［Maniatisら、“モレキュラークローニング、ア ラボラトリーマニュアル：Molecular Cloning,a Laboratory Manual”コールドスプリングハーバー ラボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory）、コールドスプリングハーバー、N.Y.,（1982）；Ausubel F.M.ら、（編集）、“分子生物学の最新の方法：Current Protocols in Molecular Biology”、ジョン ウィリー アンド サンズ（John Wiley & Sons）、ニューヨーク、1987］。
pBR322型およびpUC型のプラスミドならびにM13シリーズのファージは、市販されているものである（ベセスダリサーチラボラトリーズ：Bethesda Research Laboratories）。
ライゲーションのために、ＤＮＡ断片をその大きさに従いアガロースまたはアクリルアミドゲル電気泳動により分離し、フェノールまたはフェノール／クロロホルム混合物で抽出し、エタノールで沈殿させ、そしてファージT4 DNAリガーゼ（バイオラボズ：Biolabs）の存在下で、供給元の推薦に従いインキュベーションすることができる。
5'突出末端のフィリングは、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片（バイオラボズ）で、供給元の仕様に従い行うことができる。3'突出末端の破壊は、ファージT4 DNAポリメラーゼ（バイオラボズ）の存在下で、製造元の推薦に従い行う。5'突出末端の破壊は、S1ヌクレアーゼで制御された処理により行う。
合成オリゴデオキシヌクレオチドを使用するインビトロ部位−特異的突然変異誘発法は、Taylorらにより開発された方法［Nucleic Acids Res.13（1985）8749-8764］に従い、アマシャム（Amersham）により販売されているキットを使用して行うことができる。
ＤＮＡ断片の酵素的増幅、いわゆるＰＣＲ［Polymerase-catalysed Chain Reaction：ポリメラーゼ−触媒連鎖反応、Saiki R.K.ら、Science 230（1985）1350-1354；Mullis K.B.およびFaloona F.A.,Meth.Enzym.155（1987）335-350］法は、“ＤＮＡサーマルサイクラー”（パーキンエルマーシータス：Perkin Elmer Cetus）を使用して、製造元の仕様に従い行うことができる。
ヌクレオチド配列の確認はSangerらにより開発された方法［Proc.Natl.Acad.Sci.USA,74（1977）5463-5467］により、アマシャムが市販しているキットを使用して行うことができる。
実施例
実施例１：配列番号１の配列のクローニングおよびシークエンシング
pSAM2（B2）の遊離形態は、エス．リビダンス（S.lividans）TK24には観察されず（Hopwoodら、J.Gen.Microbiol.129（1983）2257）、この組み込み形態のみが観察される。pSAM2（B3）で、プラスミドの遊離形態は組み込み形態とともに存在する。ハイブリッドプラスミドを、中の様々な領域がpSAM2（B2）由来の同等な領域に置き換えられているpSAM2（B3）から構築した。これによりpSAM2（B3）が遊離形態で存在することを可能にする突然変異が、2-kbのKpnＩ断片に位置したこと示すことができる。このKpnＩ断片の配列を、pSAM2（B2）およびpSAM2（B3）について決定した。２つの配列間で１つのヌクレオチドが異なる：pSAM2（B2）中のG/C対をpSAM2（B3）中のA/T対で置き換える。配列分析では、この突然変異がKpnIからさらに広がる読み取り枠の上流に生じていることが示された。この読み取り枠の配列を決定した；それを配列番号１に表す。rmfと命名（またはpra）されたこの読み取り枠は、korSAとtraSA遺伝子の間に位置する。この突然変異により、制限酵素ApaLI（認識部位：５’ＧＴＧＣＡＣ３’）に関する認識部位の消失を生じる。この部位はpSAM2（B2）には存在するが、pSAM2（B3）には無い。
配列番号１の配列はコーディング領域の１００ｂｐ上流も含んでなり、これはプロモーターの部分（残基１から１０１）および、特にリボソーム結合部位（ＲＢＳ）を有する5’の非コーディング性であるが転写される領域（残基１０２から１５４）を含んでなる。
遊離形態が観察できる突然変異体pSAM2（B4）では、ApaLI部位が未だ存在し、この突然変異がpSAM2（B3）と同じ位置ではないことを示している。対応する領域に関するpSAM2（B4）の配列は、pSAM2（B2）およびpSAM2（B4）の配列が1ヌクレオチド異なることを示した。この突然変異はpSAM2（B3）に検出される突然変異の8ヌクレオチド上流に位置していた。したがって、２つの別個の場合で、組み込み形態も同時に存在するpSAM2（B3）およびpSAM2（B4）の遊離形態の存在は、pSAM2のrmf遺伝子上流の点突然変異によるものである。これら２つの別個の突然変異は、両方とも、この遺伝子のプロモーターを構成するためのメッセンジャーＲＮＡ分析により示された領域に位置している。
実施例２：配列番号１の配列を発現するためのカセットおよびベクターの構築
以下のプロモーターおよびプラスミドを使用して、幾つかの構築を行った：
−改変ermEプロモーター（ermE★）。使用するこの改変ermEプロモーターは、上記Bibbらにより記載されたプロモーターに相当し、３ヌクレオチドの欠失を有する（塩基252-254、上記Bibbらの図２）。この改変プロモーターは強力かつ構成的発現を与える。これは275-bpのKpn-BamHＩ断片の状態で単離された。
−tipAプロモーター。このプロモーター（ムラカミら、同上）は、プラスミドpPM927（Smokvinaら、Gene 94（1990）53）に存在している。これはチオストレプトンの存在により特異的に誘導される。
−プラスミドpIJ486およびpIJ487。これら２つのプラスミドはWardら（Mol.Gen.Genet.203（1986）468）により記載された。これらのプラスミドだけではpSAM2のこの状態（遊離または組み込み）に対して影響を及ぼさない。
２．１ベクターpOS531の構築
ベクターpOS531は、rmf遺伝子（配列番号１の配列の残基155-505）のコーディング部分を、プラスミドpIJ487のBamHＩ-HindIII部位にクローニングすることにより構築した。したがってこのベクターは裸のrmf遺伝子（発現シグナルまたは５’非−コーディング領域無し）を持つ。このベクターの地図を図２に表す。
２．２ベクターpOS532の構築
ベクターpOS532は、改変ermEプロモーターを持つ275-bp断片を、ベクターpOS531のEcoRI-BamHＩ部位にクローニングすることにより構築した。したがってこのベクターは裸のrmf遺伝子を改変ermEプロモーターの制御下に有する（図３）。
２．３ベクターpOS541の構築
このベクターpOS541は２段階で構築した：
−rmf遺伝子のコーディング領域および5'-非コーディング領域を含む断片（配列番号１の配列の残基102-505）を、プラスミドpIJ487のBamHＩ−HindIII部位にクローニングし、
−改変ermEプロモーターを持つ275-bp断片を、上記のように得られたベクターのEcoRI-BamHＩ部位に加える。
したがってこのベクターはrmf遺伝子を持ち、5'非-コーディング領域を改変ermEプロモーターの制御下に提供する（図４）。
２．４ベクターpOS544の構築
ベクターpOS544は、3'部分が欠失した（配列番号１の配列の残基102-276は存在する）rmf遺伝子を持つ。このベクターは、この領域をBamHＩ-BspHＩ断片（大腸菌ＤＮＡポリメラーゼIのクレノー断片で処理したBspHＩ末端）の状態で、プラスミドpIJ487のBamHＩ-HindIII部位（大腸菌ＤＮＡポリメラーゼIのクレノー断片で処理したHindIII末端）にクローニングすることにより構築した。したがってベクターpOS544はrmf遺伝子の5'部分を持ち（５'非-コーディング領域＋5'コーディング領域）、しかしこの部分はそのプロモーターが欠けている。このベクターの地図を図５に表す。
実施例３：rmf遺伝子産物の発現による、pSAM2由来の組み込み型ベクターの複製性遊離形態の出現
この実施例では、配列番号１の遺伝子の過剰発現が、pSAM2の組み込みコピーの遊離形態の出現を引き起こすことができることを示す。
３．１  rmfにより作動する複製アクチベーターの役割に関する直接的な証拠は、rmfの発現によりpSAM2（B2）の組み込みコピーの遊離形態の出現が引き起こされることにより得られる。pSAM2（B2）がpSAM2（B3）に比べて、さらにApaLI部位を有するという事実から、遊離プラスミドはまさにpSAM2（B2）であるApaLI消化プロフィールの観察により簡単に確認できる。
３．２  配列番号１の配列の活性も、pSAM2（B2）の組み込みコピーを持つエス．リビダンス（S.lividans）を上記の様々なベクターで形質転換し、続いて遊離形態を調査することにより実証された。このために、プラスミドpSAM2（B2）を持つエス．リビダンス（S.lividans）を、実施例２に記載した様々なベクターを用いてプロトプラスト法により形質転換した。プラスミドＤＮＡまたは全細胞ＤＮＡを、形質転換したクローンの定常期培養物から抽出する。このプラスミドＤＮＡを酵素ApaLIで消化し、そして消化断片をアガロースゲル電気泳動で分離する。制限プロフィールの観察から、pSAM2（B2）の遊離コピーが存在するかどうかが明らかになる。これらの結果は、次に全ＤＮＡとpSAM2プローブとのハイブリダイゼーションを含む実験により確認される。
得られた結果を図７に与える。
これらの結果は、改変ermEプロモーター、リボソーム結合部位を持つrmf上流の非翻訳領域、およびrmfコーディング枠を含むpOS541が、pSAM2（B2）の複製性遊離形態の出現を引き起こすことを示す。予想どおり、rmfコーディング部分のみを含むベクター（pOS531）、または改変ermEおよびrmfのコーディング部分を含むがリボソーム結合領域を含まないベクター（pOS532）では効果がない。rmfの3'部分に欠失を持つベクター（pOS544）では効果は観察されない。
同様な種類の効果は、rmfの誘導性発現を可能にするカセットが、遊離形態の出現を引き起こすために望まれるプラスミド中に位置するとき得られる（ベクターpOS666、図６）。
これらの結果を合わせると、本発明の配列がシスまたはトランスで、pSAM2由来のベクターの遊離形態の出現を誘導できることの明らかな証拠を提供している。
配列表
（１）一般情報：
（ｉ）出願人：
（Ａ）名前：ローヌ−プーラン  ローラー  エス．エイ．
（Ｂ）通り：アール．アロン通り、２０
（Ｃ）市：アントニー
（Ｅ）国：仏国
（Ｆ）郵便番号：９２０１６５
（ii）発明の名称：調節核酸配列および使用
（iii）配列の数：１
（iv）コンピューター読み取り先：
（Ａ）媒体の種類：テープ
（Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ  ＰＣ互換型
（Ｃ）操作システム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ
（Ｄ）ソフトウェア：パテントイン  リリース＃１．０
バージョン＃１．２５（ＥＰＯ）
（２）配列番号１の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：８１２塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線
（ii）分子の型：ｃＤＮＡ
（iii）仮定：なし
（iii）アンチ−センス：なし
（ix）特徴：
（Ａ）名前／キー：ＣＤＳ
（Ｂ）位置：１５５．．５０５
（Ｄ）他の情報：／生成物＝“ｒｍｆ遺伝子”
（ix）特徴：
（Ａ）名前／キー：−３５シグナル
（Ｂ）位置：６５．．７０
（ix）特徴：
（Ａ）名前／キー：−１０シグナル
（Ｂ）位置：８９．．９４
（ix）特徴：
（Ａ）名前／キー：プロモーター
（Ｂ）位置：１．．１０１
（ix）特徴：
（Ａ）名前／キー：ＲＢＳ
（Ｂ）位置：１４０．．１４５
（xi）配列の記載：配列番号１：
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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