(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）
【化１】
0003764107.tif 000015
（式中、R1は炭素数７〜１９のアルキル、炭素数７〜１９のアルケニル、炭素数７〜２０のアルカノイルまたは炭素数７〜２０のアルケノイルを表し、R1が炭素数７〜１９のアルキルまたは炭素数７〜１９のアルケニルを表す場合、R2はメチルまたはアセチルを表し、R1が炭素数７〜２０のアルカノイルまたは炭素数７〜２０のアルケノイルを表す場合、R2はメチルを表す）で表されるホスファチジン酸を含有することを特徴とする育毛剤。
【請求項２】
R1がオクタデセノイルまたはヘキサデシルであり、R2がメチルである請求項１記載の育毛剤。
【請求項３】
R1がヘキサデシルであり、R2がアセチルである請求項１記載の育毛剤。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載のホスファチジン酸と、プロアントシアニジン、トコフェロール、トコフェロール誘導体、パントテン酸、パントテン酸誘導体、プロテインキナーゼC特異的阻害剤またはその薬理学的に許容される塩、およびビオチンからなる群から選ばれる一つ以上の成分とを有効成分として含有する育毛剤。
【請求項５】
プロアントシアニジンを含有することを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の育毛剤。
【請求項６】
プロアントシアニジンがプロシアニジンB-1、プロシアニジンB-2、プロシアニジンB-3、プロシアニジンC-1およびプロシアニジンC-2からなる群から選ばれる一種または二種以上のプロアントシアニジンである請求項５記載の育毛剤。
【請求項７】
トコフェロールまたはトコフェロール誘導体を含有することを特徴とする請求項１〜３、５または６のいずれかに記載の育毛剤。
【請求項８】
トコフェロールまたはトコフェロール誘導体がdl-α-トコフェロール、d-α-トコフェロール、酢酸dl-α-トコフェロール、酢酸d-α-トコフェロールおよびニコチン酸dl-α-トコフェロールからなる群から選ばれる一種または二種以上のトコフェロールまたはトコフェロール誘導体である請求項７記載の育毛剤。
【請求項９】
パントテン酸またはパントテン酸誘導体を含有することを特徴とする請求項１〜３または５〜８のいずれかに記載の育毛剤。
【請求項１０】
パントテン酸またはパントテン酸誘導体がパントテン酸カルシウム、パントテン酸ナトリウム、D-パントテニルアルコール、DL-パントテニルアルコールおよびパントテニルエチルエーテルからなる群から選ばれる一種または二種以上のパントテン酸またはパントテン酸誘導体である請求項９記載の育毛剤。
【請求項１１】
プロテインキナーゼC特異的阻害剤またはその薬理学的に許容される塩を含有することを特徴とする請求項１〜３または５〜１０のいずれかに記載の育毛剤。
【請求項１２】
プロテインキナーゼC特異的阻害剤がカルフォスチンC、ヘキサデシルホスフォコリン、パルミトイル-DL-カルニチンおよびポリミキシンBから選ばれる一種または二種以上のプロテインキナーゼC阻害剤である請求項１１記載の育毛剤。
【請求項１３】
ビオチンを含有することを特徴とする請求項１〜３または５〜１２のいずれかに記載の育毛剤。
【請求項１４】
実質的にミノキシジルを含有しない請求項１〜１３のいずれかに記載の育毛剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はホスファチジン酸を有効成分として含有することを特徴とする育毛剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ホスファチジン酸を含有する毛髪関連化粧料または医薬品に関する発明としては、奇数直鎖炭素鎖の脂肪酸残基を有するホスファチジン酸、すなわち、式（II）
【０００３】
【化２】
0003764107.tif 000002
【０００４】
（式中、R3およびR4は脂肪族炭化水素基を表し、R3およびR4のうち少なくとも一方は偶数の炭素鎖長を有する直鎖式脂肪族炭化水素基である）で表されるホスファチジン酸を含む養毛剤が知られている（特公昭６３−４１３６３）。また、特開昭６１−７２０５には、２つの分岐鎖脂肪酸残基を有するホスファチジン酸を有効成分とする細胞賦活剤が記載されている。しかしながら、少なくとも一つのエーテル基を有するホスファチジン酸を含む育毛剤は知られていない。また、奇数の炭素鎖長を有する脂肪酸と、ビオチンまたはビタミンB12とを有効成分とする細胞賦活剤が知られている（特開昭６１−１５８０９）。
【０００５】
また、育毛活性成分であるミノキシジルに添加されるリポソーム用製剤基剤として、ホスファチジン酸が用いられることが知られている（ＵＳ ５０３０４４２）。
ホスファチジン酸を含むいくつかのリン脂質の混合物に、脱毛抑制効果があること（ＷＯ ９７／０９９８９）、また、リン脂質混合物を含む育毛剤が知られている（ＤＥ ３２２２０１６、ＤＥ ４１１３３４６）。
【０００６】
プロアントシアニジンを含有する育毛剤が、ＷＯ９６／００５６１に記載されている。また、トコフェロール［毛の医学、283頁（1987年）、文光堂；ヘアサイエンス、80頁（1986年）、社団法人 日本毛髪科学教会］、パントテン酸およびビオチン［フレグランス ジャーナル、95-103頁（1989年）、フレグランス ジャーナル社］、ならびにプロテインキナーゼC特異的阻害剤［スキン ファーマコロジー アンド アプライド スキン フィジオロジー(Skin Pharmacology and Applied Skin Physiology), 13, 133-142 (2000)］がそれぞれ育毛作用を有することが知られている。
【０００７】
また、特開平１１−２６３７１１には、1-O-ヘキサデシル-2-O-メチルグリセロールの育毛活性に関して記載されている。
しかしながら、後述する式（I）で表されるホスファチジン酸と、プロアントシアニジン、トコフェロール、トコフェロール誘導体、パントテン酸、パントテン酸誘導体、プロテインキナーゼC特異的阻害剤またはその薬理学的に許容される塩、およびビオチンからなる群から選ばれる一つ以上の成分とを有効成分とする育毛剤；ホスファチジン酸と、プロアントシアニジン、トコフェロール、トコフェロール誘導体、パントテン酸、パントテン酸誘導体およびプロテインキナーゼC特異的阻害剤またはその薬理学的に許容される塩からなる群から選ばれる一つ以上の成分とを有効成分とする育毛剤；ならびに、ホスファチジン酸およびビオチンと、プロアントシアニジン、トコフェロール、トコフェロール誘導体、パントテン酸、パントテン酸誘導体およびプロテインキナーゼC特異的阻害剤またはその薬理学的に許容される塩からなる群から選ばれる一つ以上の成分とを有効成分とする育毛剤については知られていない。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、ホスファチジン酸を活性成分とする、頭髪の育毛・発毛効果に優れた育毛剤を提供し、また、上記ホスファチジン酸と、プロアントシアニジン、トコフェロール、トコフェロール誘導体、パントテン酸、パントテン酸誘導体、プロテインキナーゼC特異的阻害剤またはその薬理学的に許容される塩、およびビオチンからなる群から選ばれる一つ以上の成分とを有効成分として含有することを特徴とする育毛剤等を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明は、以下に関する。
（１）  式（I）
【００１０】
【化３】
0003764107.tif 000003
【００１１】
（式中、R1はアルキル、アルケニル、アルカノイルまたはアルケノイルを表し、R1がアルキルまたはアルケニルを表す場合、R2はアルキル、アルケニル、アルカノイルまたはアルケノイルを表し、R1がアルカノイルまたはアルケノイルを表す場合、R2はアルキルまたはアルケニルを表す）で表されるホスファチジン酸を有効成分として含有することを特徴とする育毛剤。
【００１２】
（２）  R1がアルキルまたはアルケニルであり、R2がメチルである上記（１）記載の育毛剤。
【００１３】
（３）  R1がアルカノイルまたはアルケノイルであり、R2がメチルである上記（１）記載の育毛剤。
【００１４】
（４）  R1がアルキルまたはアルケニルであり、R2がアセチルである上記（１）記載の育毛剤。
【００１５】
（５）  R1がオクタデセノイルまたはヘキサデシルであり、R2がメチルである上記（１）記載の育毛剤。
【００１６】
（６）  R1がヘキサデシルであり、R2がアセチルである上記（１）記載の育毛剤。
【００１７】
（７）  上記（１）〜（６）のいずれかに記載のホスファチジン酸と、プロアントシアニジン、トコフェロール、トコフェロール誘導体、パントテン酸、パントテン酸誘導体、プロテインキナーゼC特異的阻害剤またはその薬理学的に許容される塩、およびビオチンからなる群から選ばれる一つ以上の成分とを有効成分として含有する育毛剤。
【００１８】
（８）  プロアントシアニジンを含有することを特徴とする上記（１）〜（６）のいずれかに記載の育毛剤。
【００１９】
（９）  プロアントシアニジンがプロシアニジンB-１、プロシアニジンB-２、プロシアニジンB-３、プロシアニジンC-１およびプロシアニジンC-２からなる群から選ばれる一種または二種以上のプロアントシアニジンである上記（８）記載の育毛剤。
【００２０】
（１０）  トコフェロールまたはトコフェロール誘導体を含有することを特徴とする上記（１）〜（６）、（８）または（９）のいずれかに記載の育毛剤。
【００２１】
（１１）  トコフェロールまたはトコフェロール誘導体がdl-α-トコフェロール、d-α-トコフェロール、酢酸dl-α-トコフェロール、酢酸d-α-トコフェロールおよびニコチン酸dl-α-トコフェロールからなる群から選ばれる一種または二種以上のトコフェロールまたはトコフェロール誘導体である上記（１０）記載の育毛剤。
【００２２】
（１２）  パントテン酸またはパントテン酸誘導体を含有することを特徴とする上記（１）〜（６）または（８）〜（１１）のいずれかに記載の育毛剤。
（１３）  パントテン酸またはパントテン酸誘導体がパントテン酸カルシウム、パントテン酸ナトリウム、D-パントテニルアルコール、DL-パントテニルアルコールおよびパントテニルエチルエーテルからなる群から選ばれる一種または二種以上のパントテン酸またはパントテン酸誘導体である上記（１２）記載の育毛剤。
【００２３】
（１４）  プロテインキナーゼC特異的阻害剤またはその薬理学的に許容される塩を含有することを特徴とする上記（１）〜（６）または（８）〜（１３）のいずれかに記載の育毛剤。
【００２４】
（１５）  プロテインキナーゼC特異的阻害剤がカルフォスチンC、ヘキサデシルホスフォコリン、パルミトイル-DL-カルニチンおよびポリミキシンBから選ばれる一種または二種以上のプロテインキナーゼC阻害剤である上記（１４）記載の育毛剤。
【００２５】
（１６）  ビオチンを含有することを特徴とする上記（１）〜（６）または（８）〜（１５）のいずれかに記載の育毛剤。
【００２６】
（１７）  実質的にミノキシジルを含有しない上記（１）〜（１６）のいずれかに記載の育毛剤。
【００２７】
（１８）  ホスファチジン酸と、プロアントシアニジン、トコフェロール、トコフェロール誘導体、パントテン酸、パントテン酸誘導体およびプロテインキナーゼC特異的阻害剤またはその薬理学的に許容される塩からなる群から選ばれる一つ以上の成分とを有効成分として含有する育毛剤。
【００２８】
（１９）  ホスファチジン酸およびビオチンと、プロアントシアニジン、トコフェロール、トコフェロール誘導体、パントテン酸、パントテン酸誘導体およびプロテインキナーゼC特異的阻害剤またはその薬理学的に許容される塩からなる群から選ばれる一つ以上の成分とを有効成分として含有する育毛剤。
【００２９】
【発明の実施の形態】
式（I）の各基の定義において、アルキルとしては、例えば炭素数1〜24、好ましくは7〜19のアルキル、より具体的には、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、ヘプタデシル、オクタデシル、ノナデシル、エイコシル、ヘンエイコシル、ドコシル、トリコシル、テトラコシル等があげられる。アルケニルとしては、例えば炭素数2〜24、好ましくは7〜19のアルケニル、より具体的には、ビニル、アリル、ブテニル、2-ペンテニル、4-ペンテニル、ヘキセニル、ヘプテニル、オクテニル、ノネニル、デセニル、ウンデセニル、ドデセニル、トリデセニル、テトラデセニル、ペンタデセニル、ヘキサデセニル、ヘプタデセニル、オクタデセニル、ノナデセニル、エイコセニル、ヘンエイコセニル、ドコセニル、トリコセニル、テトラコセニル等があげられる。アルケニルにおける不飽和結合の個数および位置は特に限定されることはない。アルカノイルとしては、例えば炭素数2〜24、好ましくは7〜20のアルカノイル、より具体的には、アセチル、プロピオニル、ブチリル、バレリル、ヘキサノイル、ヘプタノイル、オクタノイル、ノナノイル、デカノイル、ウンデカノイル、ドデカノイル、トリデカノイル、テトラデカノイル、ペンタデカノイル、ヘキサデカノイル、ヘプタデカノイル、オクタデカノイル、ノナデカノイル、エイコサノイル、ヘンエイコサノイル、ドコサノイル、トリコサノイル、テトラコサノイル等があげられる。アルケノイルとしては、例えば炭素数3〜24、好ましくは7〜20のアルケノイル、より具体的には、プロペノイル、ブテノイル、2-ペンテノイル、4-ペンテノイル、ヘキセノイル、ヘプテノイル、オクテノイル、ノネノイル、デセノイル、ウンデセノイル、ドデセノイル、トリデセノイル、テトラデセノイル、ペンタデセノイル、ヘキサデセノイル、ヘプタデセノイル、シス-9-オクタデセノイル、シス-9-シス-12-オクタデカジエノイル、9,12,15-オクタデカトリエノイル、ノナデセノイル、5,8,11,14-エイコサテトラエノイル、ヘンエイコセノイル、ドコセノイル、トリコセノイル、テトラコセノイル等があげられる。アルケノイルに含まれる不飽和結合の個数および位置は特に限定されることはない。
【００３０】
本発明で用いられるホスファチジン酸は、主に化学合成により得ることができる。すなわち、脂肪酸またはアルコールをグリセリンの１位に導入したのち、グリセリンの２位に脂肪酸またはアルコールを導入、グリセリンの３位をリン酸化することによって得ることができる。なお、各合成ステップでは、必要により、保護基の導入を行う。例えば、目的のホスファチジン酸は、1〜5当量のオキシ塩化リン、1〜5当量のトリエチルアミンおよびヘキサンの混合液に、不活性溶媒中のグリセロール誘導体1〜5当量を滴下し、溶媒の沸点以下、好ましくは氷冷下、10〜20時間攪拌し、さらに精製水を加え、室温で1時間攪拌し、有機層を洗浄し、さらに有機層を減圧濃縮して得られる。不活性溶媒としては、クロロホルムやヘキサン等があげられる。また、脂肪酸残基またはアルコール残基を含むリン脂質誘導体の酵素分解により、例えば、ホスファチジルコリン誘導体を原料とする場合、ホスフォリパーゼD等の酵素を用い、コリンとのリン酸結合を加水分解することで、目的のホスファチジン酸を得ることもできる［奥山治美、脂質の生化学（生化学実験講座3）、日本生化学会編、289頁 (1974年)、東京化学同人］。しかしながら、製造法はこれらに限定されるものではなく、いかなる方法によって得られた上記ホスファチジン酸も本発明で用いることができる。
【００３１】
本発明に用いられるプロアントシアニジンは、式（III）
【００３２】
【化４】
0003764107.tif 000004
【００３３】
（式中、R5およびR6は同一または異なって水素原子または水酸基を表す）等で表されるフラバン-7-オール誘導体を構成単位として重合した化合物群をいう。
フラバン-7-オール誘導体の具体例としては、カテキン、エピカテキン、ガロカテキン、エピガロカテキン、アフゼレチン、エピアフゼレチン等があげられ、これらの光学異性体もすべて含まれるが、本発明では、エピカテキンまたはカテキンを構成単位とするプロアントシアニジンがより好ましく用いられる。
【００３４】
式（III）で表されるフラバン-7-オール誘導体の結合様式としては、いかなるものも含まれるが、例えばフラバン-7-オール誘導体が２個重合した2量体としては、式（IV）
【００３５】
【化５】
0003764107.tif 000005
【００３６】
（式中、R7およびR8ならびにR7aおよびR8aはそれぞれ前記R5およびR6と同義である）で表される結合様式をとるものがあげられ、3量体以上の重合体としては、同一または異なるこれらの結合様式の組み合わせによるものがあげられる。
本発明に用いられるプロアントシアニジンは、フラバン-7-オール誘導体の2量体以上であればよいが、好ましくは2〜10量体、より好ましくは2〜5量体、さらに好ましくは2〜3量体である。フラバン-7-オール誘導体の2量体としては、例えばエピカテキン-(4β→8)-カテキン等のエピカテキンとカテキンの結合体、エピカテキン-(4β→8)-エピカテキン等のエピカテキンの2量体、カテキン-(4α→8)-カテキン等のカテキンの2量体等があげられ、フラバン-７-オール誘導体の3量体としては、例えばエピカテキン-(4β→8)-エピカテキン-(4β→8)-エピカテキン等のエピカテキンの3量体、カテキン-(4α→8)-カテキン-(4α→8)-カテキン等のカテキンの3量体、エピカテキン-(4β→8)-エピカテキン-(4β→8)-カテキン等のエピカテキンとカテキンの混合3量体等があげられる。
【００３７】
また、これらプロアントシアニジンに没食子酸やグルコース、ラムノース等の糖類が付加した化合物も本発明に用いられるプロアントシアニジンに含まれる。プロアントシアニジンは、ブドウ属、リンゴ属、オオムギ属、カキ属、ココヤシ属、カカオ属、マツ属、インゲン属、ナンキンマメ属等に属するブドウ、リンゴ、オオムギ、カキ、ヤシ、カカオ、マツ、アズキ、ピーナッツ等の各種の植物から抽出精製して得られる他、化学合成によっても得ることができる。
【００３８】
例えば、プロアントシアニジンの植物からの抽出精製は、次のような公知の方法で行うことができる。
原料である植物の果実、種子、葉、茎、根、根茎等を適当な時期に採取した後、そのまままたは通常空気乾燥等の乾燥工程に付し、抽出原料とする。乾燥した植物体からプロアントシアニジンの抽出を行う場合は、公知の方法［ケミカル アンド ファーマシューティカル ブリテン(Chemical & Pharmaceutical Bulletin), 3, 3218 (1990)および同, 40, 889-898 (1992)］に準じて行うことができる。
【００３９】
すなわち、原料を粉砕もしくは細切した後、溶媒を用いて抽出を行う。抽出溶媒としては、水、エタノール、メタノール、イソプロピルアルコール等のアルコール類、アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類、酢酸メチル、酢酸エチル等のエステル類等の親水性もしくは親油性の溶媒を、単独でもしくは混合溶媒として用いることができる。抽出温度は、通常0〜100℃、好ましくは5〜50℃である。抽出時間は、1時間〜10日間程度であり、溶媒量は、乾燥原料に対して通常1〜30倍重量、好ましくは5〜10倍重量である。抽出操作は、攪拌または浸漬放置により行い、必要に応じて2〜3回繰り返す。
【００４０】
上記の操作で得られた粗抽出液から不溶性残渣を濾過もしくは遠心分離により取り除いた抽出液、または植物の搾汁液や樹液からのプロアントシアニジンの精製方法は、公知の分離精製方法であればどのようなものでもよいが、二相溶媒分配法、カラムクロマトグラフィー法、分取高速液体クロマトグラフィー法等を単独でもしくは組み合わせて用いることが好ましい。例えば二相溶媒分配法としては、前記の抽出液から油溶性成分や色素をn-ヘキサン、石油エーテル等により抽出除去する方法、該抽出液からn-ブタノール、メチルエチルケトン等の溶媒と水との分配により、溶媒相へプロアントシアニジンを回収する方法等があげられる。カラムクロマトグラフィー法としては、順相系シリカゲルを用いる方法、逆相系シリカゲルを用いる方法、担体としてダイヤイオンHP-20、セパビーズSP-207等を用いる吸着カラムクロマトグラフィー法、担体としてセファデックスLH-20等を用いるゲル濾過法等があげられ、これらを単独でもしくは組み合わせて用い、反復して使用することもできる。分取高速液体クロマトグラフィー法としては、オクタデシルシリカ等を用いる逆相系のカラムを用いる方法、シリカゲル等を用いる順相系のカラムを用いる方法等があげられる。
【００４１】
上記精製方法により、前記の抽出液から塩類等水溶性のイオン性物質、糖類・多糖類等の非イオン性物質、油分、色素等を除去し、プロアントシアニジンを精製することができる。
また、ブドウ由来プロアントシアニジンは、アクタ デルマト ベネレオロジカ(Acta Dermato Venereologica), 78, 428-432 (1998)に記載の方法またはその方法に準じて、プロシアニジンB-1［エピカテキン-(4β→8)-カテキン］、プロシアニジンB-2［エピカテキン-(4β→8)-エピカテキン］、プロシアニジンB-3［カテキン-(4α→8)-カテキン］、プロシアニジンC-１［エピカテキン-(4β→8)-エピカテキン-(4β→8)-エピカテキン］およびプロシアニジンC-2［カテキン-(4α→8)-カテキン-(4α→8)-カテキン］は、ジャーナル オブ インヴェスティゲイティブ デルマトロジー（The Journal of Investigative Dermatology）, 112, 310-316 (1999)に記載の方法またはその方法に準じてそれぞれ抽出精製することができる。
【００４２】
プロアントシアニジンの化学合成による製造は、エピカテキンまたはカテキンの2量体の製造方法が記載されているジャーナル オブ ケミカル ソサエティー パーキン トランサクション Ｉ (Journal of Chemical Society, Perkin Transaction I), 1535-1543 (1983)またはフィトケミストリー（Phytochemistry）, 25, 1209-1215 (1986)に記載の方法あるいはそれらに準じた方法により行うことができる。
【００４３】
プロアントシアニジンを本発明の有効成分として用いる場合、プロアントシアニジンは、一種または二種以上混合してもよく、具体的な例としては、ブドウ種子由来プロアントシアニジン、リンゴ由来プロアントシアニジン、大麦由来プロアントシアニジン、マツ由来プロアントシアニジン、精製プロシアニジンオリゴマー、プロシアニジンB-1、プロシアニジンB-2、プロシアニジンB-3、プロシアニジンC-1、プロシアニジンC-2等から選ばれる一種または二種以上があげられ、中でもプロシアニジンB-1、プロシアニジンB-2、プロシアニジンB-3、プロシアニジンC-1およびプロシアニジンC-2から選ばれる一種または二種以上が好ましく用いられる。
【００４４】
本発明に用いられるトコフェロールまたはトコフェロール誘導体としては、例えば市販されている天然由来品、合成品のいずれも用いることができ、また、酢酸エステルやニコチン酸エステル等の誘導体を用いることもできる。具体的には、dl-α-トコフェロール、d-α-トコフェロール、酢酸dl-α-トコフェロール、酢酸d-α-トコフェロール、ニコチン酸dl-α-トコフェロール等があげられる。
【００４５】
本発明に用いられるパントテン酸またはパントテン酸誘導体としては、例えば市販されている天然由来品、合成品のいずれも用いることができ、パントテン酸またはパントテン酸誘導体であればどのようなものでもよく、具体的には、パントテン酸カルシウム、パントテン酸ナトリウム、D-パントテニルアルコール、DL-パントテニルアルコール、パントテニルエチルエーテル等があげられる。
【００４６】
本発明に用いられるプロテインキナーゼC特異的阻害剤としては、プロテインキナーゼCを特異的に阻害するものであればいかなるものでも用いられるが、好ましくは、プロテインキナーゼC（PKC）阻害活性とプロテインキナーゼA（PKA）阻害活性を以下に示すPKC阻害活性測定法およびPKA阻害活性測定法で測定したとき、PKAの50％阻害定数（以下、PKA-IC50と略す）とPKCの50％阻害定数（以下、PKC-IC50と略す）の比（以下、PKA-IC50/PKC-IC50と略す）が3以上、好ましくは3〜109、より好ましくは10〜109であるプロテインキナーゼ阻害剤が用いられる。具体的には、カルフォスチンC、ヘキサデシルホスフォコリン、パルミトイル-DL-カルニチンおよびポリミキシンBまたはそれらの薬理学的に許容される塩等から選ばれる一種または二種以上をあげることができる。
【００４７】
これらの薬理学的に許容される塩としては、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩、蟻酸塩、酢酸塩、安息香酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、シュウ酸塩、メタンスルホン酸塩、トルエンスルホン酸塩、アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩等があげられる。
PKC阻害活性測定法およびPKA阻害活性測定法について以下に示す。
【００４８】
（１）PKC阻害活性測定法
PKCの阻害活性の測定は、吉川らの方法［ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー（Journal of Biological Chemistry）, 257, 13341 (1982)］に準じて行うことができる。
【００４９】
2.5μmol酢酸マグネシウム、50μgヒストンタイプIIIS（シグマ社製）、20μgホスファチジルセリン、0.8μgダイオレイン、25nmol塩化カルシウム、5μg粗酵素（吉川らの方法によりラットの脳より部分精製したもの）および5μmolトリス塩酸緩衝液（pH7.5）を含む250μl水溶液に検体を含む前記水溶液（10μl）を加え、30℃で3分間インキュベートする。インキュベート後、1.25nmol［γ-32P］ATP（5〜10×103cpm/nmol）を加え、30℃で3分間リン酸化反応を行い、25％トリクロロ酢酸を加えて反応を停止させる。該反応液を酢酸セルロース膜（ポアサイズ0.45μm）（東洋濾紙社製）で濾過し、5％トリクロロ酢酸で4回洗浄後、該膜上に残った放射活性を測定し検体値とする。また、上記操作を検体を加えないで行い、放射活性を測定し対照値とする。
対照値に対して、50％の検体値を示すときの検体のモル濃度を、PKCの50％阻害定数（PKC-IC50）とする。
【００５０】
（２）PKA阻害活性測定法
PKAの阻害活性の測定は、クオ（Kuo）らの方法［バイオケミストリー（Biochemistry）, 64, 1349 (1969)］に準じて行うことができる。
【００５１】
5μmolトリス塩酸緩衝液（pH6.8）、2.5μmol酢酸マグネシウム、100μgヒストンタイプIIS（シグマ社製）、0.25nmol c-AMPおよび200μg粗酵素［クオ（Kuo）らの方法により子牛の心臓より部分精製したもの］を含む250μlの水溶液に検体を含む前記水溶液（10μl）を加え、30℃で3分間インキュベートする。インキュベート後、1.25nmol［γ-32P］ATP（5〜10×103cpm/nmol）を加え、30℃で3分間リン酸化反応を行い、25％トリクロロ酢酸を加えて反応を停止させる。該反応液を酢酸セルロース膜（ポアササイズ0.45μm）（東洋濾紙社製）で濾過し、5％トリクロロ酢酸で4回洗浄後、該膜上に残った放射活性を測定し検体値とする。また、上記操作を検体を加えないで行い、放射活性を測定し対照値とする。
【００５２】
対照値に対して、50％の検体値を示すときの検体のモル濃度をPKAの50％阻害定数（PKA-IC50）とする。
本発明に用いられるビオチンとしては、例えば市販されている天然由来品、合成品のいずれも用いることができ、D-ビオチンが好ましい。
本発明の育毛剤の剤型としては、式（I）で表されるホスファチジン酸；該ホスファチジン酸と、プロアントシアニジン、トコフェロール、トコフェロール誘導体、パントテン酸、パントテン酸誘導体、プロテインキナーゼC特異的阻害剤またはその薬理学的に許容される塩、およびビオチンからなる群から選ばれる一つ以上の成分；ホスファチジン酸と、プロアントシアニジン、トコフェロール、トコフェロール誘導体、パントテン酸、パントテン酸誘導体およびプロテインキナーゼC特異的阻害剤またはその薬理学的に許容される塩からなる群から選ばれる一つ以上の成分；あるいはホスファチジン酸およびビオチンと、プロアントシアニジン、トコフェロール、トコフェロール誘導体、パントテン酸、パントテン酸誘導体およびプロテインキナーゼC特異的阻害剤またはその薬理学的に許容される塩からなる群から選ばれる一つ以上の成分とを配合しうる剤型であればどのような剤型を用いることもできる。例えば、適当な医薬基剤と配合して液状または固形状の育毛剤として用いることができる。
【００５３】
液状または固形状の育毛剤型としては、ヘヤーリキッド、ヘヤートニック、ヘヤーローション等の液状剤型、軟膏、ヘヤークリーム等の固形状剤型があげられ、各々好適な基剤に式（I）で表されるホスファチジン酸；該ホスファチジン酸と、プロアントシアニジン、トコフェロール、トコフェロール誘導体、パントテン酸、パントテン酸誘導体、プロテインキナーゼC特異的阻害剤またはその薬理学的に許容される塩、およびビオチンからなる群から選ばれる一つ以上の成分；ホスファチジン酸と、プロアントシアニジン、トコフェロール、トコフェロール誘導体、パントテン酸、パントテン酸誘導体およびプロテインキナーゼC特異的阻害剤またはその薬理学的に許容される塩からなる群から選ばれる一つ以上の成分；あるいはホスファチジン酸およびビオチンと、プロアントシアニジン、トコフェロール、トコフェロール誘導体、パントテン酸、パントテン酸誘導体およびプロテインキナーゼC特異的阻害剤またはその薬理学的に許容される塩からなる群から選ばれる一つ以上の成分とを添加し、常法により製造することができる。
【００５４】
本発明の育毛剤中のホスファチジン酸の含有量は、ホスファチジン酸の種類や物性に由来する経皮吸収性によって大きく異なるが、単独でまたは混合物として通常0.01〜5.0重量％（以下、単に％という）、好ましくは0.01〜3.0％、より好ましくは0.1〜1.0％である。プロアントシアニジンの含有量は、精製度によって異なるが、通常0.01〜10.0％、好ましくは0.1〜5.0％、より好ましくは0.3〜2.0％である。トコフェロールまたはトコフェロール誘導体の含有量は、通常0.01〜2％、好ましくは0.05〜2％、より好ましくは0.05〜1％である。パントテン酸またはパントテン酸誘導体の含有量は、通常0.01〜2％、好ましくは0.05〜1％、より好ましくは0.1〜0.5％である。プロテインキナーゼC阻害剤またはその薬理学的に許容される塩の含有量は、阻害活性の強さや物性に由来する経皮吸収性によって大きく異なるが、単独でまたは混合物として通常0.00001〜1％、好ましくは0.0001〜1％、より好ましくは0.001〜0.1％である。ビオチンの含有量は、通常0.0001〜0.1％、好ましくは0.001〜0.1％、より好ましくは0.001〜0.05％である。
【００５５】
液状剤型に好適な基剤としては、育毛剤に通常使用されているもの、例えば精製水、エチルアルコール、多価アルコール類等があげられ、必要により添加剤を添加してもよい。
多価アルコールとしては、グリセロール、1,3-ブチレングリコール、プロピレングリコール等があげられる。
【００５６】
添加剤としては、界面活性剤、ビタミン類、消炎剤、殺菌剤、ホルモン剤、生薬エキス、チンキ類、清涼剤、保湿剤、酸化防止剤、金属イオン封鎖剤、香料等があげられる。
界面活性剤としては、ポリオキシエチレン（60）硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレン（8）オレイルエーテル、ポリオキシエチレン（10）オレイルエーテル、モノオレイン酸ポリオキシエチレン（10）、ポリオキシエチレン（30）グリセリルモノステアレート、モノステアリン酸ソルビタン、モノオレイン酸ポリオキシエチレン（20）ソルビタン、ショ糖脂肪酸エステル、モノオレイン酸ヘキサグリセリン、モノラウリン酸ヘキサグリセリン、ポリオキシエチレン還元ラノリン、ポリオキシエチレン（20）ラノリンアルコール、ポリオキシエチレン（25）グリセリルピログルタミン酸イソステアリン酸ジエステル、N-アセチルグルタミンイソステアリルエステル等があげられる。
【００５７】
ビタミン類としては、ニコチン酸ベンジル、ニコチン酸アミド、塩酸ピリドキシン、リボフラビン等があげられる。
消炎剤としては、グリチルリチン酸ジカリウム、β-グリチルレチン酸、アラントイン、塩酸ジフェンヒドラミン、グアイアズレン、l-メントール等があげられる。
【００５８】
殺菌剤としては、トリクロロヒドロキシジフェニルエーテル、ヒノキチオール、トリクロサン、クロルヘキシジングルコン酸塩、フェノキシエタノール、レゾルシン、イソプロピルメチルフェノール、アズレン、サリチル酸、ジンクピリチオン、塩化ベンザルコニウム、感光素301号、モノニトログアヤコールナトリウム等があげられる。
【００５９】
ホルモン剤としては、エチニルエストラジオール、エストロン、エストラジオール等があげられる。
生薬エキスとしては、センブリエキス、ニンニクエキス、ニンジンエキス、アロエエキス、キナエキス、冬虫夏草エキス、サフランエキス等があげられる。
チンキ類として、トウガラシチンキ、ショウキョウチンキ、カンタリスチンキ等があげられる。
【００６０】
清涼剤としては、トウガラシチンキ、l-メントール、カンフル等があげられる。
保湿剤としては、L-ピロリドンカルボン酸、ヒアルロン酸ナトリウム、コンドロイチン硫酸等があげられる。
酸化防止剤としては、ブチルヒドロキシアニソール、イソプロピルガレート、没食子酸プロピル、エリソルビン酸等があげられる。
【００６１】
金属イオン封鎖剤としては、エチレンジアミンテトラアセテートまたはその塩等があげられる。
香料としては、オレンジ油、レモン油、ベルガモット油、ライム油、レモングラス油、ラベンダー油等の天然香料およびメントール、ローズオキサイド、リナロール、シトラール、酢酸リナリル等の合成香料があげられる。
【００６２】
上記の液状剤型を噴霧剤として用いるときは、可燃ガス、不燃ガス等を用いることができる。可燃ガスとしては、LPG（液化石油ガス）、ジメチルエーテル等があげられ、不燃ガスとしては、窒素ガス、炭酸ガス等があげられる。
固体状剤型の基剤としては、ワセリン、固形パラフィン、植物油、鉱物油、ラノリン、ろう類、マクロゴール等があげられ、必要により前記の添加剤、エチルアルコール、イソプロピルアルコール等の低級アルコール等を添加してもよい。
【００６３】
本発明の育毛剤の投与量は年齢、体重、症状、治療効果、投与方法、処理時間等により異なるが、成人一人当たり、一回にホスファチジン酸として0.1〜250mg、好ましくは1mg〜100mgが一日一回から数回、経皮投与される。
次に、実施例により本発明を詳細に説明する。
【００６４】
【実施例】
0003764107.tif 000006
上記混合物に精製水を加えて100％とし、これを攪拌しながら均一にして、組成物１を調製した。
上記組成物において、1-O-ヘキサデシル-2-O-メチルグリセリル-3-リン酸の代わりに精製水を加えて、組成物２として調製した。
【００６５】
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プロシアニジンB-2は、ジャーナル オブ インヴェスティゲイティブ デルマトロジー(The Journal of Investigative Dermatology), 112, 310-316 (1999)に記載の方法に従って製造した。
上記混合物に精製水を加えて100％とし、これを攪拌しながら均一にして、組成物３を調製した。
上記組成物において、1-O-ヘキサデシル-2-O-メチルグリセリル-3-リン酸の代わりに精製水を加えて、組成物４として調製した。
【００６６】
0003764107.tif 000008
上記混合物に精製水を加えて100％とし、これを攪拌しながら均一にして、組成物５を調製した。
上記組成物において、1-O-ヘキサデシル-2-O-メチルグリセリル-3-リン酸の代わりに精製水を加えて組成物６として調製した。
【００６７】
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上記混合物に精製水を加えて100％とし、これを攪拌しながら均一にして、組成物７を調製した。
上記組成物において、1-O-ヘキサデシル-2-O-メチルグリセリル-3-リン酸の代わりに精製水を加えて、組成物８として調製した。
【００６８】
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上記混合物に精製水を加えて100％とし、これを攪拌しながら均一にして、組成物９を調製した。
上記組成物において、1-O-ヘキサデシル-2-O-メチルグリセリル-3-リン酸の代わりに精製水を加えて、組成物１０として調製した。
【００６９】
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上記混合物に精製水を加えて100％とし、これを攪拌しながら均一にして、組成物１１を調製した。
【００７０】
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上記混合物に精製水を加えて100％とし、これを攪拌しながら均一にして、組成物１２を調製した。
【００７１】
参考例１：  1-O-ヘキサデシル-2-O-メチルグリセリル-3-リン酸（1-O-ヘキサデシル-2-O-メチルホスファチジン酸）の合成
ジャーナル オブ メディシナル ケミストリー (Journal of Medicinal Chemistry), 2038-2044 (1986)に記載の方法またはこれに準じた方法で行うことができる。
1-O-ヘキサデシル-2-O-メチルグリセロール（シグマ社）165 mgを10 mLのヘキサンに溶解し、これを、オキシ塩化リン700 μl、トリエチルアミン1000μlおよびヘキサン50 mlの混合溶液に、室温下で攪拌しながら滴下した。15時間攪拌を行った後、精製水10 mlを加え、さらに室温下で１時間攪拌した。有機層を取得し、シリカゲル薄層クロマトグラフィープレートを用い、クロロホルム：メタノール：酢酸：水＝170：25：25：6の移動相で展開したのち、目的物を含むバンドをかきとった。このシリカゲル粉にジエチルエーテルを加え、有機層を取得した。さらにこの有機層を減圧濃縮し、1-O-ヘキサデシル-2-O-メチルグリセリル-3-リン酸を52 mg得た。
【００７２】
参考例２：  1-O-オレオイル-2-O-メチルグリセリル-3-リン酸（1-O-オレオイル-2-O-メチルホスファチジン酸）の合成
アニュアル ニューヨーク アカデミック ソサエティー（Ann. N. Y. Acad. Sci）, 279-281 (2000)またはWO ９９／４７１０１に記載の方法またはこれらに準じた方法で行うことができる。
モノオレイン（キシダ社）1020 mgを出発原料とし、トリフェニルクロロメタンにより、３位のアルコール残基をトリフェニルメチル基で保護したのち、ヨウ化メチルおよび水素化ナトリウムを反応させ、２位アルコール残基にメチル基を導入した。さらに生成した1-O-オレオイル-2-O-メチル-3-O-トリフェニルメチルグリセロールに、酢酸を作用させてトリフェニルメチル基を脱保護し、得られた1-O-オレオイル-2-O-メチルグリセロールに、オキシ塩化リンおよびトリエチルアミンを反応させて、目的物の1-O-オレオイル-2-O-メチルグリセリル-3-リン酸271 mgを得た。
【００７３】
参考例３：  1-O-ヘキサデシル-2-O-アセチルグリセリル-3-リン酸（1-O-ヘキサデシル-2-O-アセチルホスファチジン酸）の合成
ジャーナル オブ メディシナル ケミストリー (Journal of Medicinal Chemistry), 2038-2044 (1986)に記載の方法あるいはこれに準じた方法で行うことができる。
1-O-ヘキサデシル-2-O-アセチルグリセロール（フナコシ社）179 mgを17.9 mlのヘキサンに溶解し、オキシ塩化リン700μl、トリエチルアミン1000μlおよびヘキサン50 mlの混合溶液に、室温下で攪拌しながら滴下した。15時間攪拌を行った後、精製水10 mlを加え、さらに室温下で１時間攪拌した。有機層を取得し、シリカゲル薄層クロマトグラフィープレートを用い、クロロホルム：メタノール：酢酸：水＝170：25：25：6の移動相で展開したのち、目的物を含むバンドをかきとった。このシリカゲル粉にジエチルエーテルを加え、よく混合したのち有機層を取得した。さらにこの有機層を減圧濃縮し、1-O-ヘキサデシル-2-O-アセチルグリセリル-3-リン酸42 mgを得た。
【００７４】
次に、本発明の育毛剤の作用について、試験例により具体的に示す。
試験例１：  マウス毛包上皮細胞培養に対する促進効果
毛包上皮細胞の分離および培養はTanigakiらの方法［アーカイヴズ オブ デルマトロジカル リサーチ（Archives of Dermatological Research）, 284, 290-296 (1992)］を改変して行った。
【００７５】
すなわち、4日令のC3Hマウス（日本チャールスリバー）の背部皮膚を採取し、500単位/mlのディスパーゼ（合同酒清）および5%ウシ胎児血清（FCS）を含むMEM培地（Eagle's Minimum Essential Medium）で4℃、16時間処理した。
得られた皮膚切片から表皮を剥離し、真皮層を0.25%コラゲナーゼN-2（新田ゼラチン）および10％FCSを含むDMEM培地（Dulbecco's modified Eagle Medium）で37℃、1時間処理し真皮懸濁液を得た。真皮懸濁液を212ミクロンのナイロンメッシュ（日本理化学機械）で濾過後、濾液を1000 rpmで5分間遠心分離し、毛包組織を含むペレットを得た。ペレットに、カルシウム・マグネシウムフリーPBS（Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline）溶液を加え、ピペットを用いて懸濁後、15分間静置することにより毛包組織を沈降させた。得られた毛包組織を用いて、上記ペレットで行った、カルシウム・マグネシウムフリーPBS溶液の添加、ピペットによる懸濁、15分間静置・沈降操作と同様の操作を3回繰り返した。
【００７６】
得られた毛包組織に0.1％エチレンジアミン四酢酸（EDTA）−0.25％トリプシン液（ギブコ社製）を加え、37℃で5分間処理後、10％FCSを含むDMEM培地を加え、3×105/mlの細胞濃度の毛包組織細胞液を調製した。毛包組織細胞液を24穴コラーゲンコートプレート（イワキガラス社製）へ1ml/ウェルずつ播種し、37℃、5％CO2下で24時間培養を行った。
【００７７】
培養後、MCDB153培地（極東製薬社製）にウシインシュリン（シグマ社製）5mg/L；マウス上皮増殖因子（EGF）（宝酒造社製）5μg/L；ウシ下垂体抽出物（極東製薬社製）40mg/L；ヒトトランスフェリン（シグマ社製）10mg/L；ハイドロコーチゾン（シグマ社製）0.4mg/L；プロゲステロン（コラボラティブ リサーチ社製）0.63μg/L；O-ホスホエタノールアミン（シグマ社製）14mg/L；エタノールアミン（シグマ社製）6.1mg/L；ペニシリン（和光社製）50U/ml；ストレプトマイシン（和光社製）50μg/ml；1-O-ヘキサデシル-2-O-メチルグリセリル-3-リン酸、1-O-オレオイル-2-O-メチルグリセリル-3-リン酸、1-O-ヘキサデシル-2-O-アセチルグリセリル-3-リン酸等のホスファチジン酸、および／またはプロシアニジンB-2もしくはdl-α-トコフェロールを含むDMSO溶液（1/100体積加えた）を添加した培地へ培地交換し、さらに、37℃、5％CO2存在下で5日間培養を行った。なお培地は一日おきに交換した。
【００７８】
なお、上記培地において、ホスファチジン酸、および／またはプロシアニジンB-2またはdl-α-トコフェロールを含むDMSO溶液の代わりにDMSOのみを1/100体積量加えた培地で培養したものを対照群とした。
細胞増殖度の測定は、MTT［3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide］を用いた方法で行った［実験医学別冊  バイオマニュアルUPシリーズ  分子生物学研究のための培養細胞実験法、89-92頁、羊土社（1995年）］。
【００７９】
24穴マイクロプレート（2cm2/ウェル）の各ウェルに培養液1mlに対し1/10体積のMTTのPBS溶液（5mg/ml）を加え、揺らして均一にし、37℃、5%CO2存在下で4時間培養した。4時間後培養液を吸引し、各々のプレートに1mlの0.04mol/L HClイソプロピルアルコール溶液を加え、ウェル中に生成したフォルマザンが完全に溶けるまで混和した。
【００８０】
650nmを対照とし、570nmにおける吸光度を測定し、細胞の増殖度を測定した。
本発明における化合物の増殖促進活性を第１表に示す。
【００８１】
【表１】
0003764107.tif 000013
【００８２】
第１表に示したように、本発明におけるホスファチジン酸は著しいマウス毛包上皮細胞増殖促進活性を示した。また、プロアントシアニジン、トコフェロール各々のマウス毛包上皮細胞増殖促進活性は、前記ホスファチジン酸と混合することによって増強された。
【００８３】
試験例２：  マウスの発毛に対する効果
小川らの方法［ジャーナル オブ デルマトロジー(The Journal of Dermatology), 10, 45-54 (1983)］を参考に、マウスによる発毛効果の試験を行った。
毛周期の休止期にある９週令のC3H/HeSlc雄性マウス（一群4〜5匹）の背部毛を電気バリカンと電気シェーバーで剃毛し、実施例１〜７で作製した組成物１〜１２を一日一回、剃毛部に200μlずつ均一に塗布した。なお、組成物２を対照群とした。
試験塗布開始18日後のマウス背部皮膚を採取し、写真撮影を行った後、画像解析処理装置（アビオニクス社製、スピカII）を用いて背部皮膚全面積に対する発毛部の100分率を求め、被検薬剤群の発毛率の値から対照群の発毛率の値を差し引いた値を増加発毛面積率（％）とした。
【００８４】
結果を第２表に示す。
【００８５】
【表２】
0003764107.tif 000014
【００８６】
第２表に示したように、本発明のホスファチジン酸を含有する育毛剤では、顕著なマウスの発毛促進効果が見られた。また、プロアントシアニジン、トコフェロール、パントテン酸誘導体、ビオチン各々の発毛促進効果は、ホスファチジン酸と混合することによって増強された。
【００８７】
【発明の効果】
本発明によれば、特定の化学構造を有するホスファチジン酸を含有することを特徴とする、頭髪の育毛・発毛効果に優れた育毛剤、また、上記ホスファチジン酸と、プロアントシアニジン、トコフェロール、トコフェロール誘導体、パントテン酸、パントテン酸誘導体、プロテインキナーゼC特異的阻害剤またはその薬理学的に許容される塩、およびビオチンからなる群から選ばれる一つ以上の成分とを有効成分として含有することを特徴とする育毛剤等を提供することができる。