(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
菌体を含むポリ−γ−グルタミン酸の水溶液に無機酸を添加し、ｐＨを１．５〜３．５とした後、精密濾過膜を用いて菌体を除去し、次いで得られた透過液を限外濾過膜を用いて透析処理することを特徴とするポリ−γ−グルタミン酸の単離法。
【請求項２】
限外濾過膜を用いて透析処理して得られた濃縮液をそのまま凍結乾燥または噴霧乾燥することを特徴とする請求項１に記載のポリ−γ−グルタミン酸の単離法。
【請求項３】
精密濾過膜の膜孔径が０．０５〜０．２μｍであり、限外濾過膜の分子量分画が３，０００〜４０、０００であることを特徴とする請求項１または請求項２に記載のポリ−γ−グルタミン酸の単離法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、食品、化成品、医薬等の分野において機能性高分子として有用な高純度のポリ−γ−グルタミン酸（以下、単に「γ−ＰＧＡ」と略記する）を、γ−ＰＧＡ醗酵液から効率よく単離する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
γ−ＰＧＡは微生物を利用した発酵法によって産生されることはよく知られており、一般に数万から数百万の分子量を有している。蓄積量の増大に伴ない培養後の培養液は粘稠性の帯びたものとなり、γ−ＰＧＡの単離操作を困難ならしめる要因となっている。
【０００３】
従来、γ−ＰＧＡの単離法については、古くは銅塩として沈澱する方法〔Ｍ．Ｂｏｖａｒｎｉｃｋ :Ｊ. Ｂｉｏｌ. Ｃｈｅｍ.,１４５, ４１５(１９４２)〕，アルコール沈殿法〔藤井久雄；農化, ３７, ４０７（１９６３）〕，塩類による析出法（永井利影；特公昭５２−８８７２号公報）等が知られている。
【０００４】
しかしながら、いずれの方法に於ても、多量のアルコール・塩類を必要とすること、回分処理であり又、生成するγ−ＰＧＡが粘着性物質のため、器壁等に付着しやすく、スケール上の制約が生じること、更に又、微量のアルコール成分や無機物がγ−ＰＧＡポリマー中に取り込まれ、これらの混入のないγ−ＰＧＡを得ることは難しい等、工業的規模での実施には必ずしも適した方法とは言えない。
【０００５】
最近、分離膜を用いて培養物からγ−ＰＧＡを単離しようとする試みも行われている。例えば、特開平１−１７４３９７号公報には、先ず、遠心分離または微細孔を有するフィルターろ過により菌体を除去し、３〜４倍量のエタノールなどを添加してγ−ＰＧＡを沈殿させ、そして沈殿物を水に溶解させ、不溶物を除去し、低分子物を透析、限外ろ過などにより除去し、有機溶媒による再沈殿を繰り返してγ−ＰＧＡを単離する方法が開示されている。又、特開平７−１３５９９１号公報によれば、共存する糖質の(固定した微生物あるいは酸素による)除去、エタノールによるγ−ＰＧＡの沈殿分離、透析あるいは分離膜による低分子物質の除去、分離γ−ＰＧＡの凍結乾燥を含む方法が提案されている。
【０００６】
しかしながら、特開平１−１７４３９７号公報及び同７−１３５９９１号公報記載の方法でも、やはりエタノール添加によるγ−ＰＧＡの沈殿分離工程を経由するものであり、前述したようにアルコール沈殿の場合には乾燥してもγ−ＰＧＡからアルコールを完全に除去することは困難であったり、菌体分離は遠心分離で行うことができたが、菌体含有液の高い粘度のため、分離膜による菌体分離は困難であった。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、従来法のようにアルコール沈澱や塩析法によらずに、分離膜による効率的なγ−ＰＧＡの単離法を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、発酵液の如く、菌体や培地栄養成分の夾雑物を含有するγ−ＰＧＡ水溶液のｐＨを酸性にすると、該水溶液の粘度が３００センチポイズ（ｃｐ）以下になり、精密濾過膜処理が可能になることを見出した。また、アルコール沈殿法などの沈殿法を用いなくても、精密濾過膜を用いる除菌工程及び限外濾過膜を用いる透析処理工程からなる２段階の膜処理のみによって、高純度のγ−ＰＧＡを高収率で分離取得し得ることも見出した。本発明は、これらの知見に基づいてなされたものである。
【０００９】
すなわち、本発明は、菌体を含むγ−ＰＧＡの水溶液に無機酸を添加し、ｐＨを１．５〜３．５とした後、精密濾過膜を用いて菌体を除去し、次いで得られた透過液を限外濾過膜を用いて透析処理することを特徴とするγ−ＰＧＡの単離法である。
【００１０】
【発明の実施の形態】
菌体を含むγ−ＰＧＡの水溶液としては、公知の方法により微生物例えばバチルス・ズブチルスに属する納豆菌を培養して得られるγ−ＰＧＡ含有発酵液が挙げられる。該γ−ＰＧＡ含有発酵液に無機酸、例えば塩酸、硫酸等を添加し、ｐＨを３．５以下、好ましくは１．５〜３．５、特に好ましくは２．０〜２．５に調整する。溶液の粘度が一般に約３００ｃｐ以下、特に２００ｃｐ以下になるように添加するのが好ましい。
【００１１】
上記のｐＨに調整した後、精密ろ過膜を用いて除菌する。この際、菌体以外に菌体由来の蛋白質、糖類等の凝集沈殿物も同時に除去される。他方、酸性条件下で溶存するγ−ＰＧＡは無機塩類、単糖、オリゴ糖等の低分子化合物と共に膜を透過する。精密ろ過膜の材質は耐酸性のものであればよく、例えばテフロン、ポリスルホン、ポリ塩化ビニル、ポリイミド、ポリアミド、ポリカーボネート等が好適なものとして挙げられる。また、セラミック膜等の無機材質からなら精密濾過膜も使用に好適である。精密ろ過膜の膜孔径は一般的に０.０１〜０.５μｍ、特に０．０５〜０．２μｍであるのが好ましい。具体例を商品名で示せばグレースジャパン(株)製  Ｈ１５ＭＰ０１−４３、旭化成工業(株)製  ＰＳＰ−０１３等が挙げられる。膜の形状は平膜状、管状、スパイラル状、中空子状等のいずれの形状であってもよい。装置は通常の膜分離装置を用い、循環液の温度は１０〜６０℃、好ましくは３０〜５０℃にコントロールし、圧力は特に制限はないが透過速度を上げるために膜が耐えられるかぎりの圧をかけ膜分離を行う。循環液量が少量になったところで純水を加え、透過液のホールド分を流し出す。次いで、透過液について限外ろ過膜を用いて透析処理を行なう。
【００１２】
限外ろ過膜の材質としては、耐酸性の各種ポリマー膜であればよく、例えば、ポリアミド、ポリスルホン、ポリフッ化ビニリデン、ポリ四フッ化エチレン、ポリエーテルサルホン等が用いられる。具体例を商品名で示せば、ダイセル化学工業(株)製  ＦＵＳ−３０８１、グレースジャパン(株)製  Ｈ１５Ｐ３０−４３、日東電工(株)製 ＮＴＵ−３２５０ Ｃ３Ｒ等が挙げられる。膜の形状としては、平膜状、管状、スパイラル状、中空子状等のいずれの形状であってもよい。使用する限外ろ過膜の分画分子量は一般的に２，０００〜２００，０００、好ましくは３，０００〜４０，０００である。装置は通常の膜分離装置を用い、循環液の温度は１０〜６０℃、好ましくは３０〜５０℃にコントロールし、圧力は特に制限はないが透過速度を上げるために膜が耐えられるかぎりの圧をかけ膜分離を行う。透過液量と同量の純水を循環液に加え、循環液量が常に等量になるようコントロールする。透過液の電導度をチェックし、１０ｍＳ／ｃｍより低くなったところで膜分離を中止する。無機塩類や単糖類、オリゴ糖等の低分子化合物は膜を透過するが、他方、γ−ＰＧＡは膜を透過しないで濃縮されて濃縮液として得られる。得られた濃縮液は、充分高純度であり、エタノール沈殿等の沈殿精製方法を用いることなく、そのまま乾燥することにより、固体化された高純度のγ−ＰＧＡを得ることができる。乾燥法としては、凍結乾燥法、噴霧乾燥法等が適用される。
【００１３】
以下、参考例、実施例により具体的に説明する。
参考例：γ−ＰＧＡの製造
市販の納豆より分離した納豆菌を、３Ｌのミニジャーを用いて、麦芽エキス０．３％、酵母エキス０．３％、ポリペプトン０．５％、グルコース１．０％からなる培養液（ｐＨ６．０）で３２℃、２４時間シード培養した。次に５００Ｌのジャーを用いて、グルコース７．５％、硫安１．５％、硫酸マグネシウム７水和物０．０３５％、硫酸マンガン０．００５％、リン酸水素カリウム０．１５％、グルタミン酸モノナトリウム塩５．０％、塩化ナトリウム１．０％からなる培養液（ｐＨ６．４）にシード培養後の培養液を０．５％接種し、３７℃、４８時間メイン培養した。培養後の培養液についてＧＰＣ法によりγ−ＰＧＡの含量を測定したところ、０．８０ｇ／ｄｌであった。
【００１４】
【実施例】
実施例１
参考例で得た培養液２００ｍｌを濃塩酸でｐＨ２．０に調整した。精密ろ過膜を内蔵したＭＦモジュールとして旭化成工業（株）製  ｍｏｄｕｌｅ  ＰＳＰ−０１３(孔径０.１μｍ、膜面積０.０１７ｍ2、モジュール材質はポリスルホン、スパイラルタイプ）を用い、温度３０℃、圧力１．０Ｋｇｆ／ｃｍ2、循環線速０．１２ｍ／ｓｅｃの条件で菌体分離を行った。循環液量が１００ｍｌになったところで水６００ｍｌを加え、再度膜分離を行い、循環液が１００ｍｌ、透過液が７００ｍｌとなったところで膜処理を終了した。培養液のγ−ＰＧＡの９４％が透過液側に移行した。この透過液を今度は旭化成工業(株)製 ＵＦ ｍｏｄｕｌｅ ＳＩＰ−００１３(分子量分画６０００、膜面積０．０１７ｍ2)を用い、透過液量と同量の水を循環液側に加えつつ、温度３０℃、圧力１.０Ｋｇｆ／ｃｍ2、循環線速０．１１ｍ／ｓｅｃの条件で膜処理を行った。差し水量が６００ｍｌになったところで差し水を終了し、循環液を濃縮した。循環液量が６５ｍｌになったところで膜処理を終了した。この濃縮液には培養液のγ−ＰＧＡの９１％が含まれていた。得られた濃縮液を凍結乾燥することにより総収率８７％で固体化したγ−ＰＧＡを１．４ｇ得た。このγ−ＰＧＡ中にはカルシウム０．０４％、糖０．４５％、リン０．０３％含まれていた。
【００１５】
実施例２
参考例と同様の方法で得た培養液１ＫＬを加熱により蛋白を変成させた後、塩酸でｐＨ３に調整し、旭化成工業(株)製  ｍｏｄｕｌｅ  ＭＩＣＲＯＺＡＰＶ−３１３（孔径０．１μｍ、膜面積２．９ｍ2）を用い、温度４０〜５０℃、圧力１．０〜１．２Ｋｇ／ｃｍ2、循環線速１.２ｍ／ｓｅｃの条件で菌体分離を行った。次にこの透過液を日東電工(株）製 ＵＦ ｍｏｄｕｌｅ ＮＴＵ−３０００Ｃ３ＲＸ（分子量分画２０，０００、膜面積３.９ｍ2）を用い、温度４０〜５０℃・圧力１．０〜１．２Ｋｇ／ｃｍ2、循環線速１.１ｍ／ｓｅｃの条件で透析処理を行った後、循環液を１８０Ｌまで濃縮した。得られた濃縮液を凍結乾燥することにより総収率８５％で固体化したγ−ＰＧＡを６．８Ｋｇ得た。
【００１６】
比較例
参考例で得た培養液２００ｍｌを濃塩酸でｐＨ２．０に調整し、遠心分離機により菌体を分離した後、得られた菌体分離液を３倍量のエタノール中に滴下した。生成した沈殿をろ過し粗γ−ＰＧＡを得た。これを２００ｍｌの水に溶解させ、旭化成工業(株)製 ＵＦ ｍｏｄｕｌｅ ＳＩＰ−００１３(分子量分画６０００、膜面積０．０１７ｍ2）を用い、透過液量と同量の水を循環液側に加えつつ、温度３０℃、圧力１.０Ｋｇｆ／ｃｍ2、循環線速０．１１ｍ／ｓｅｃの条件で膜処理を行なった。差し水量が６００ｍｌになったところで差し水を終了し、循環液を濃縮した。循環液量が６５ｍｌになったところで膜処理を終了した。次に、循環液を３倍量のエタノール中に滴下し、精製した沈殿をろ過し、棚段乾燥機で減圧乾燥することにより、総収率５７％でγ−ＰＧＡを０．９１ｇ得た。このγ−ＰＧＡ中にカルシューム０．１０％、糖０．４０％、リン０．１０％が含まれており、また２％の残存エタノールも確認された。
【００１７】
【発明の効果】
以上説明したように本発明の方法により、菌体を含むγ−ＰＧＡの水溶液のｐＨを酸性にすることで精密ろ過膜による菌体分離を可能にすることができるようになり、結果として精密ろ過膜処理と限外ろ過膜処理の２段階の膜処理のみによって高純度のγ−ＰＧＡを高収率に得ることができる。また、本発明の分離膜によるγ−ＰＧＡの単離法は、全ての工程を水媒体で処理することにより、従来行われていたアルコール沈殿や塩析工程での煩雑な粘性固体の分離工程を省略し、効率的でスケールアップが容易であるという利点がある。また単離のために必要な副原料は無機酸のみであり、しかもアルコール等の可燃性有機溶剤は不必要であることから、防災設備の面でも有利である上に、得られるγ−ＰＧＡ中にアルコールが残存することもない。本法では、精製のために膜設備のみで良いため、単離コスト面でも効果的な方法であるといえる。