(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
デバイス内の反応チャンバーと検出チャンバーの間で流体サンプルを移送する方法であって、
ａ）流体連通手段によって相互に連結された反応チャンバーと検出チャンバーをもち、かつ前記反応チャンバー内に配置された反応サンプルを有するデバイスであって、推進剤とサンプルが混合されるように又はサンプルが推進剤と流体連通手段の間に位置するように前記反応チャンバー内に推進剤も配置され、更に前記推進剤は熱の刺激により膨張し、蒸発するように誘導可能な蒸発可能な流体である、前記デバイスを準備する段階と、
ｂ）機械的手段を必要とすることなく、また誤った結果につながる汚染を防ぐべく、推進剤を膨張し、蒸発するように誘導してより大きい容積を占有させることにより、サンプルを流体連通手段を介して検出チャンバー内に圧入する段階とを含み、前記蒸発が、前記反応チャンバー中で、蒸発を開始させ且つ局在化させる気泡核形成部位を使用することによって局在化され、該気泡核形成部位は非平滑な凹凸表面を有する、前記方法。
【請求項２】
前記反応チャンバーが細長いチャンバーである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記反応チャンバーが核酸増幅用熱サイクリングチャンバーであり、前記誘導段階が熱サイクリング反応の完了後に実施される請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記蒸発可能な流体が反応サンプル自体である請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記誘導段階が非機械的手段によって実施される請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記反応チャンバーが少なくとも二つの異なる長手方向セグメントをもつ細長いチャンバーであり、前記方法が、更に、
ａ）第１の長手方向セグメントを断続的に加熱して前記熱サイクリング反応を実施することと、
ｂ）別の長手方向セグメントを加熱して前記推進剤の膨張を誘導することにより、前記反応サンプルを前記検出チャンバーに移送することとを含む請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記反応チャンバーが長手方向セグメントをもつ細長いチャンバーであり、前記方法が、更に、
ａ）前記長手方向セグメントに第１の最大量の熱を断続的に加えて前記熱サイクリング反応を実施することと、
ｂ）前記長手方向セグメントに前記第１の最大量を上回る熱を加えて前記推進剤の膨張を誘導することにより、前記反応サンプルを前記検出チャンバーに移送することとを含む請求項３に記載の方法。
【請求項８】
前記熱サイクリング反応がリガーゼ連鎖反応又はポリメラーゼ連鎖反応を含む請求項３に記載の方法。
【請求項９】
標的核酸を含む疑いのあるサンプルからなる推進剤と複数のプライマー又はプローブを反応チャンバー内で反応させて前記標的核酸を増幅する段階であって、前記推進剤は熱の刺激により膨張し、蒸発するように誘導可能な蒸発可能な流体である、前記段階と、前記サンプルを前記反応チャンバーと別個の検出領域に移送し、増幅標的の存在を検出する段階とを含むところの標的核酸の増幅及び検出方法において、機械的手段を必要とすることなく、また誤った結果につながる汚染を防ぐべく、推進剤を膨張し、蒸発するように誘導して、前記サンプルを前記反応チャンバーから前記検出領域に推進するために、熱を使用することによって前記サンプルを検出領域に移送する段階を含み、前記蒸発が、前記反応チャンバー中で、蒸発を開始させ且つ局在化させる気泡核形成部位を使用することによって局在化され、該気泡核形成部位は非平滑な凹凸表面を有する、方法。
【請求項１０】
デバイス内の反応チャンバーと検出チャンバーの間で流体サンプルを移送する方法であって、
ａ）流体連通手段によって相互に連結された反応チャンバーと検出チャンバーをもち、反応サンプルが前記反応チャンバー内にあるデバイスであって、前記反応サンプルは推進剤であり、該推進剤は熱の刺激により膨張し、蒸発するように誘導可能な蒸発可能な流体である、前記デバイスを準備する段階と、
ｂ）機械的手段を必要とすることなく、また誤った結果につながる汚染を防ぐべく、サンプルを膨張、蒸発させ、サンプルを流体連通手段を介して検出チャンバーに圧入する段階とを含み、前記蒸発が、前記反応チャンバー中で、蒸発を開始させ且つ局在化させる気泡核形成部位を使用することによって局在化され、該気泡核形成部位は非平滑な凹凸表面を有する、前記方法。
【請求項１１】
前記反応チャンバーが細長いチャンバーである請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
熱が前記細長い反応チャンバーの局在領域に加えられる請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記反応チャンバーが核酸増幅用熱サイクリングチャンバーであり、前記膨張する段階が熱サイクリング反応の完了後に実施される請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記熱サイクリング反応がリガーゼ連鎖反応又はポリメラーゼ連鎖反応を含む請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は一般には流体移送方法に関し、特に密閉及び密封容器の内側で反応チャンバーから検出チャンバーに増幅核酸を移送する方法に関する。
発明の背景
核酸の増幅は種々の用途で有用である。例えば、核酸増幅法はクローニング及び配列決定の目的で臨床診断やＤＮＡ及びＲＮＡの型別及び定量に用いられている。
核酸増幅反応を実施するための装置は一般に熱サイクリングデバイス又はサーマルサイクラーとして知られている。このようなデバイスの１例は公開ＰＣＴ出願ＷＯ９２／２０７７８に記載されている。このＰＣＴ出願のサイクリングデバイスは種々の方法でＤＮＡ増幅を実施するのに有用である。ＷＯ９２／２０７７８に記載されているデバイスはサンプルを収容するピペット先端を受容するための複数のウェルを備えるリング形ホルダーを含む。サンプルは各先端の開放端をヒートシールすることにより先端の内側に収容される。リングを加熱及び冷却する手段を設け、デバイスがピペット先端に収容されたサンプルを周期的に加熱及び冷却できるようにする。リングを冷却する手段は、リングに冷風を吹き付けるファンと、リングから内側径方向に配置され、リングに冷風を吹き付けるのを助長する冷却フィンを含む。ＰＣＴ出願ＷＯ９２／２０７７８の開示内容全体は参考資料として本発明の一部とする。
核酸配列増幅法は当業者に公知である。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法は「プライマー」と呼ばれる１対のオリゴヌクレオチド配列と熱サイクリング法を使用し、変性、アニーリング及びプライマー伸長の１サイクルで対象の標的核酸を倍増する。ＰＣＲ増幅は米国特許第４，６８３，１９５号及び米国特許第４，６８３，２０２号に詳細に記載されている。これらの２件の特許の開示内容全体は参考資料として本発明の一部とする。
核酸配列を増幅する別の公知方法はリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）である。ＬＣＲでは、ＰＣＲで使用するプライマーの代わりに２個の一次プローブと２個の二次プローブを使用する。ハイブリダイゼーションと連結のサイクルを繰り返すことにより、標的の増幅が達せられる。連結増幅産物は対象の標的核酸又はその相補体と機能的に等価である。この方法はＥＰ−Ａ−３２０３０８に記載され、次いで、ＥＰ−Ａ−３３６−７３１、ＷＯ８９／０９８３５、ＷＯ８９／１２６９６及びＢａｒａｎｙ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８８：１８９−１９３（１９９１）に記載された。ＬＣＲの変法はＥＰ−Ａ−４３９−１８２及びＷＯ９０／０１０６９に記載されている。
等温反応を利用した核酸増幅法も知られている。このような反応の例としては、３ＳＲ（自己持続配列複製）［Ｅ．Ｆａｈｙ，  Ｄ．Ｙ．Ｋｗｏｈ  ＆  Ｔ．Ｒ．Ｇｉｎｇｅｒａｓ，  ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  １：２５（１９９１）］や、ＳＤＡ（鎖置換増幅）［Ｇ．Ｔ．Ｗａｌｋｅｒ，  Ｍ．Ｃ．Ｌｉｔｔｌｅ，  Ｊ．Ｇ．Ｎａｄｅａｕ  ＆  Ｄ．Ｄ．Ｓｈａｎｋ，  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８９：３９２（１９９２）］がある。
このような方法を使用する核酸増幅は通常は、ＷＯ９２／２０７７８に開示されているようなスナップトップバイアルやシーラブルピペットなどの密閉反応容器内で実施される。増幅反応の完了後、反応容器を開き、標準検出法を用いる検出装置に増幅産物を移す。
典型的には、２本鎖増幅産物を変性させ、検出可能な標識と結合した１個以上のハイダリダイジングプローブで変性鎖を処理することにより増幅産物を検出する。通常は、ハイブリダイズしなかった標識プローブをハイブリダイズした標識プローブから分離しなければならず、このためには付加的分離段階が必要である。他の検出法では、臭化エチジウムで染色したゲルによって増幅産物を検出することができる。例えば、32Ｐ追跡、エンザイムイムノアッセイ［Ｋｅｌｌｅｒら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２８：１４１１−６（１９９０）］、蛍光［Ｕｒｄｅａら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１６：４９３７−５６（１９８８）；  Ｓｍｉｔｈら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１３：２３９９−４１２（１９８５）］、及び化学発光アッセイなどを不均一系［ＢｏｒｎｓｔｅｉｎとＶｏｙｔａ，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，３５：１８５６−５７（１９８９）；  Ｂｏｒｎｓｔｅｉｎら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１８０：９５−９８（１９８９）；  Ｔｉｚａｒｄら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，７８：４５１５−１８（１９９０）］又は均一系［Ａｒｎｏｌｄら，米国特許第４，９５０，６１３号；  Ａｒｎｏｌｄら，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，３５：１５８８−１５８９（１９８９）；  ＮｅｌｓｏｎとＫａｃｉａｎ，Ｃｌｉｎｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ，１９４：７３−９０（１９９０）］で実施することができる。
しかしながら、これらの検出法には重大な欠点がある。比較的高濃度の増幅産物を収容する反応容器を開くと、通常は飛沫やエアゾールが形成される。このような飛沫やエアゾールは潜在的汚染源となる恐れがあり、陰性核酸やまだ増幅されていない核酸が汚染され、誤まった結果を生じる恐れがある。
サンプル調製、反応試薬調製、増幅及び反応産物の分析に使用する作業場所及び装置にも汚染に関する同様の問題が生じ得る。接触伝達（運搬）やエアゾール生成によってこのような汚染が生じる場合もある。
更に、これらの公知検出法は時間消費的且つ労働集約的である。プローブハイブリダイゼーション法は典型的には伸長産物を変性させる段階と、プローブをアニールする段階と、場合によって反応混合物から過剰のプローブを分離する段階が必要である。迅速な結果が所望される場合にはゲル電気泳動も非実用的な検出法であるので不利である。
米国特許第５，２２９，２９７号及び対応ＥＰ０３８１５０１Ａ２（Ｋｏｄａｋ）は、汚染の危険を減らすために密閉環境内で核酸材料の増幅及び検出を実施するキュベットを開示している。該キュベットは一連の通路により相互に連結された区画をもつ密閉デバイスである。区画はＤＮＡ鎖を増幅するための反応区画と、増幅したＤＮＡを検出するための検出部位をもつ検出区画に分けられる。試薬を収容する貯蔵区画も備え得る。核酸材料のサンプルは貯蔵区画からの試薬と共に通路を通って反応区画に送られる。貯蔵区画の出口通路は増幅産物が貯蔵区画に逆流しないように逆止め弁を備える。サンプルを反応区画で増幅し、弾性区画壁に外圧を加えて増幅産物を反応区画から通路を介して検出区画内に吸引することにより、相互連結通路を通って検出区画の検出部位まで増幅産物を移送する。あるいは、ピストン装置をキュベットに備え、試薬及び／又は増幅産物を反応区画から検出区画にポンプ輸送してもよい。
ＥＰ０３８１５０１Ａ２（Ｋｏｄａｋ）に開示されているキュベットは密閉反応及び検出環境を提供するが、いくつかの重大な欠点がある。例えば、同出願の図１〜１８に示されるように、多重区画、多重通路、逆止め弁及びポンプ輸送機構は比較的複雑な構造であり、簡単には製造できない。また、ＥＰ０３８１５０１Ａ２に開示されているキュベットの形状と構造は慣用的熱サイクリングデバイスに容易に挿入できない。更に、キュベットにより使用される流体移送法は、弾性側壁に押し付けるローラー装置や小ピストンの排気など機械的外圧源が必要である。このような外圧源を備えるように慣用的熱サイクリングデバイスを改造するのは容易ではない。最後に、この文献に記載されている装置は、開示デバイスの処理量が非常に制限されている。システムは製造に所望される柔軟性を欠いている。
仏国特許公開第２６７２３０１号（Ｌａｒｚｕｌ）は類似のＤＮＡ増幅用気密試験デバイスを開示している。このデバイスも多重区画とサンプル及び／又は試薬の移送用通路を備える。流体輸送用動力源は液圧、磁気移動、受動的毛細管現象、熱勾配、蠕動ポンプ及び機械的に誘導される差圧（例えば圧搾）であると記載されている。
均一増幅及び検出を実施する方法は制限的に記載されている。Ｈｉｇｕｃｈｉら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：４１３−４１７（１９９２）は、密閉反応容器で増幅核酸のＰＣＲ増幅及び検出を実施する方法を記載している。Ｈｉｇｕｃｈｉらは、反応容器及び反応試薬に臭化エチジウムを加えて増幅と検出を同時に実施することを教示している。増幅反応で生成された増幅核酸をその後、ｄｓ−ＤＮＡと結合する臭化エチジウムによって生じた蛍光の増加により検出する。著者らは、熱サイクリングの前、後又はその間に増幅反応容器の壁を通して励起させることにより蛍光を測定すると報告している。
米国特許第５，２１０，０１５号もＰＣＲ増幅反応中に標的の検出を行う標的核酸の増幅及び検出方法を開示している。この文献は、標的にアニールすることが可能な標識オリゴヌクレオチドプローブと非標識オリゴヌクレオチドプライマー配列を反応混合物に加えることを教示している。増幅中に標識オリゴヌクレオチドフラグメントはポリメラーゼの５’→３’ヌクレアーゼ活性によって反応混合物中に放出される。こうして、ハイブリダイズしたデュプレクスから放出される標識フラグメントによってサンプル中の標的の存在を検出する。
１９９２年４月６日付けで出願された本願と同一名義の同時係属出願第０７／８６３，５５３号、発明の名称「内部全反射による核酸又は分析物の検出方法及び装置（Ｍｅｔｈｏｄ  ａｎｄ  Ｄｅｖｉｃｅ  ｆｏｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  ｏｒ  Ａｎａｌｙｔｅ  ｂｙ  Ｔｏｔａｌ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｒｅｆｌｅｃｔａｎｃｅ）」も、増幅と検出を同一容器内で実施する反応容器を開示している。増幅産物は固定捕獲試薬との特異結合によって光学素子上で捕獲される。増幅産物と捕獲試薬が結合すると、光学素子内に生じるエバネッセント波の侵入深さの内側に蛍光標識が生成される。蛍光標識の結合の結果として蛍光が変化し、この変化を検出する。
これらの開示にも拘わらず、密閉反応容器も均一アッセイも未だ商業的に広く利用されていない。従って、従来技術の欠点を解消すると共に、容易に製造される構成で効率的で高信頼性の無菌試験環境を提供する増幅検出システムが必要とされている。
発明の要約
一般に、本発明は流体サンプルを反応領域から検出領域に移送する方法に関する。好適方法では、反応領域は核酸増幅分析用熱サイクリングチャンバーであるが、本発明は多くの他の標的リガンド、アッセイ構成及び／又はチャンバー型に広く適用されることが理解されよう。
１態様において、本発明はデバイスの内側で反応チャンバーと検出チャンバーの間で流体サンプルを移送する方法に関し、該方法は、
ａ）反応チャンバーと検出チャンバーをもつデバイスを準備し、反応チャンバーと検出チャンバーをこれらのチャンバーの間の流体流通手段によって相互に連結し、前記反応チャンバー内に反応サンプルを配置し、推進剤とサンプルが混合するように又はサンプルが推進剤と流体流通手段の間に位置するように前記反応チャンバー内に推進剤も配置し、更に前記推進剤を膨張するように誘導可能にする段階と、
ｂ）推進剤を膨張するように誘導し、より大きい容積を占有させ、流体流通手段を通ってサンプルを検出チャンバーに圧入する段階とを含む。
好ましくは、反応チャンバーは細長形又は管状構造であり、少なくとも１又は２個の長手方向セグメントをもち、一端が閉じ且つ他端に検出チャンバーと連通する開口をもつ。膨張するように誘導可能な任意の物質であり得る推進剤は、反応サンプル自体でもよいし、反応チャンバーの閉鎖端又はその近傍に配置された別の物質でもよい。理想的には、推進剤は光又は熱などの非機械的刺激によって膨張するように誘導し得る。推進剤の膨張は、液圧や変形可能な膜壁などの膨張以外の原因によって生じる機械的昇圧から区別すべきである。
本発明に必須ではないが、推進剤の膨張は液体から気体への蒸発などの相変化を包含し得る。このような場合には、反応チャンバー内で核形成部位を使用することにより蒸発を局在化すると好都合である。このような核形成部位は、沸騰チップ即ち直径約１．０〜０．１ｍｍのガラス又はプラスチックマイクロビーズなどの不活性粒状物質でもよいし、反応チャンバーの内面に溝や稜を形成したり、粗面化してもよい。好ましくは、核形成部位はサンプルを反応チャンバーからより効率的に押し出すように反応サンプルの底部又はその近傍に局在する。
本発明の方法の好適用途は、リガーゼ連鎖反応やポリメラーゼ連鎖反応などの熱サイクリング法によって増幅された核酸を含む反応サンプルを、密封反応／検出ユニットを開かずに検出チャンバーまで移送し、こうして作業場所が増幅核酸によって汚染される可能性をなくすか又は有意に減らすことである。例えば第１の長手方向セグメントを断続的に加熱することによってサイクリング反応を実施することができ、閉鎖端に近い側の第２の長手方向セグメントを加熱することによって移送を実施することができる。２つのセグメントを加熱する手段は同一でも異なってもよい。あるいは、単一長手方向セグメントと単一加熱手段の場合には、第１の最大量の熱を断続的に加えることによってサイクリングを実施することができ、前記第１の最大量を上回る熱を加えて推進剤を「過熱」することによって移送を実施することができる。
【図面の簡単な説明】
図１はブロック図により本発明のシステムの一般要素を示す。
図２Ａ〜２Ｈは組み立て前の反応／検出ユニットの１例の数種の図を示す。図２Ａは図２Ｃのａ−ａ線における部分横断面図であり、上部即ち検出チャンバーを示す。図２Ｂは検出ユニットに挿入するために整列した下部即ち反応チャンバーを示す。図２Ｃは図２Ａのｃ−ｃ線における横断面図である。図２Ｄ及び２Ｅは図２Ｃの夫々ｄ−ｄ及びｅ−ｅ線における横断面図である。図２Ｄは正面向きを示し、図２Ａ及び２Ｅは側面向きを示すことが理解されよう。図２Ｆ、２Ｇ及び２Ｈは反応チャンバーを検出チャンバーに密封可能に係合し、サーマルサイクラーホルダーに挿入した後の反応／検出ユニットを示す。図２Ｆは図２Ａと同様に側面横断面図であり、図２Ｇは正面横断面図であり、キー締め手段の例を示す。図２Ｈは図２Ｆのｈ−ｈ線における横断面図である。
図３Ａ〜３Ｄは本発明による反応／検出ユニットの数種の態様及び変形例を示す。図３Ａ及び３Ｂは反応チャンバーを検出チャンバーに密封可能に係合後の反応／検出ユニットのスナップ嵌め態様を示す。図３Ｃ及び３Ｄは反応／検出ユニットの変形例の横断面図であり、係合手段と検出構成が図３Ａ及び３Ｂと異なる。
図４Ａ〜４Ｄは組立後の反応／検出ユニットの密封可能な係合手段の拡大図を示す。図４Ａは標準摩擦即ちルアー嵌めの横断面図、図４Ｂは爪即ちスナップ嵌めの横断面図、図４Ｃは爪即ちスナップ嵌めの変形例の概略図、図４Ｄはねじ型密封の横断面図を示す。
図５Ａ〜５Ｄは本発明の方法によるユニットの反応チャンバーから検出チャンバーへの増幅反応サンプルの移送を示す。検出チャンバーの各側面図の上に該チャンバーの正面図を示す。
図６は各段を環状リングとして構成した、本発明で用いる２段加熱エレメントの好適態様を示す。
図７は本発明の好適サーマルサイクラーデバイスの部分横断面図を示す。
図８Ａ〜８Ｄは本発明の好適検出システムの択一的態様を示す。図８Ａは電動リングを備える態様を示し、図８Ｂは電動ミラー及びランプを備える固定リングを示し、図８Ｃは反射検出構成を示し、図８Ｄは透過検出構成を示す。
図９Ａ〜９Ｋは本発明により２部分型サーマルサイクラーの加熱エレメントを制御する制御プログラムを示すフローチャートである。
図１０は図１のシステムの種々の相の温度及び時間分布を示す。
図１１Ａ〜１１Ｄは本発明によりビデオ画像を処理するコンピュータプログラムを示すフローチャートである。
図１２Ａ及び１２Ｂは夫々図２Ａ及び３Ａに示すストリップ担体の読取ゾーン部分６８の拡大図である。
図１３及び１４は夫々実施例６及び１２に記載するような６個の反応サンプルの結果のディジタル化写真画像である。各図中、左側の３個のサンプルは標的ＤＮＡを含み、スポット又はバンドが見えるが、右側の３個は標的ＤＮＡを含んでいなかった。
本発明の態様の詳細な説明
詳細な開示の概要
１．システム概説
２．反応／検出ユニット
ａ．反応チャンバー
ｂ．検出チャンバー
ｃ．検出担体
ｄ．密封機構
３．熱サイクリング及び移送デバイス
ａ．サイクラーデバイス
ｂ．移送方法
４．検出システム
５．コンピュータ／回路制御
６．熱制御
ａ．ハードウェア
ｂ．ソフトウェア
７．ビデオ処理
８．核酸増幅及び検出方法
９．本発明のキット
１０．実施例
１１．配列表
１．システム概説
図１は本発明により構成した増幅検出装置の一般化概略図である。装置１０は熱サイクリングデバイス１６を含み、該デバイスは各々下記に詳述する第１及び第２の加熱エレメント段１７及び１８と夫々に付属する熱センサー１２２、１２３、ファンモーター１９並びに検出システム２２を含む。装置１０は更に、熱サイクリングデバイス１６に連結したコンピュータコントローラ２６を含む。一般に、熱サイクリングデバイス１６は、反応サンプル中に存在する標的核酸を増幅及び／又は移送するために、ヒーター段１(１７)及びヒーター段２(１８)の各々に独立信号を送るコンピュータ２６の制御下で、サーマルサイクラーデバイス１６の内側に収容された反応容器の局在セグメントに所定温度を独立して供給することが可能である。デバイス１６のコンピュータ制御の詳細については後節に記載する。
装置１０は更に、複数の反応／検出ユニット２０（図２〜３参照）を含む。ユニット２０は、図２Ａ〜２Ｈ及び３Ａ〜３Ｄに示すように、反応チャンバー３０と検出チャンバー３２を含む２部分型密封可能構造をもつ。反応チャンバー３０は所望の増幅反応を実施するために反応サンプルを収容する。検出チャンバー３２は増幅反応の結果の検出可能な指標を発生する手段を備える。これらの反応／検出ユニット２０の特定態様及び変形例については本開示中で追って詳述する。
増幅反応方法は、反応サンプル３８を所望の増幅試薬と共に反応チャンバー３０に挿入することにより開始する。次に検出チャンバー３２を反応チャンバー３０と結合して密封ユニット２０を形成した後、このユニットを図２Ｆ及び５Ａ〜５Ｄに最良に示すように熱サイクリングデバイス１６の加熱段１７，１８に配置する。反応チャンバー３０と検出チャンバー３２の結合後、ユニット２０は密封状態に保たれ、増幅及び検出の両者を実施するための密閉環境を提供する。
コンピュータ２６は実施する増幅反応の種類に依存して任意の温度サイクルの温度設定及びタイミングを制御する。ＰＣＲ又はＬＣＲなどの増幅反応では、コンピュータ２６は加熱段が高／変性温度とこれに続く低／アニーリング温度のサイクルを１回以上実施するようにプログラムされる。２段式の場合には、コンピュータ２６は上段加熱段１７の温度を下段加熱段１８から独立して制御することができるが、同一プロトコルに従ってもよい。
増幅反応が終了すると、密封反応／検出ユニットを開かずに、反応サンプルは密封ユニット２０の反応チャンバー３０から検出チャンバー３２へと移送される。反応サンプルは好ましくは、反応チャンバー３０内の推進剤を膨張させてサンプルと試薬を検出チャンバーに圧入することにより移送される。
検出チャンバー３２は増幅反応の結果の検出可能な指標を発生する検出手段を含む。一般に、検出手段は反応サンプル３８中に存在する増幅標的核酸を固定及び蓄積する１個以上の捕獲部位７４をもつ担体６０を含む。固定した増幅標的核酸は捕獲部位７４の検出可能な指標と関連付けられ、この指標は検出システム２２及びコンピュータ２６により検出及び分析される。
以下、上記一般概説の複数の変形例を含めて装置１０の種々の要素を各々詳細に説明する。
２．反応／検出ユニット
ａ．反応チャンバー
本発明の反応／検出ユニット２０は図２Ａ〜２Ｅ、３Ａ〜３Ｄ及び他の図面に示す。各ユニット２０は反応チャンバー３０と検出チャンバー３２を含む。ユニット２０は使い捨て式であり得る。
核酸増幅反応は反応チャンバー３０で実施される。反応チャンバー３０は核酸の変性に必要な温度、典型的には８０〜１１０℃に耐えられるガラス又はプラスチックなどの材料から作成される。細長形反応チャンバー３０の下端３４は閉じており、上端３６は反応サンプル３８と必要に応じて増幅反応試薬を受容できるように開いている。このような反応試薬は使用者が反応チャンバー３０に加えてもよいが、好ましくは製造中に加え、除去可能又は破壊可能なシール（図示せず）によって封入し、その場合には使用者は試験サンプルのみを加える。試験サンプルは任意の公知手段によって反応チャンバー３０に挿入できる。例えば、注射器（図示せず）に入れ、シールを除去するか又は中空腔を備える注射器先端でシールを穿孔することによって反応チャンバーに挿入することができる。こうして、反応チャンバー３０内の反応サンプルは試験サンプルと増幅試薬の両者を含む。反応サンプルに更に推進剤４０と検出システムの１種以上の成分を加えてもよい。
チャンバー３０の寸法は比較的少量の反応サンプル３８をかろうじて収容できる程度に選択すべてきである。好ましくは、チャンバー３０は約１０μＬ〜約２００μＬの反応サンプルを収容するような寸法である。より好ましくは、チャンバー３０の容積は約５０μＬ〜約１２０μＬである。反応チャンバー３０は更に、反応チャンバー３０内の表面張力を下げ、加熱中の反応サンプルが発泡しないように適切な寸法とすべきである。更に、反応チャンバー３０は反応サンプルへの熱伝達率を高めるように高い表面積対容積比をもつべきである。好ましくは、反応チャンバー３０は長手方向軸をもつ細長い管状である。１好適態様では、反応チャンバー３０は下端を密封した微量注射器管又は毛細管である。
内壁が滑らかな反応チャンバーは、特に閉じた下端３４において内部に凹凸表面をもつチャンバーよりも性能が劣ることが判明した。例えば、加熱は明らかに内面に凹凸を生じるが、開放微量注射器又は毛細管の一端をヒートシールすると良好に挙動し、閉端毛細管（例えばＶａｒｉｖｅｓｔ，Ｇｒａｓｓ  Ｖａｌｌｅｙ，ＣＡの製品：実施例４参照）は予め融解しない限り性能が不良であった。凹凸表面はサンプルの底部又はその近傍で蒸発を開始するための核形成部位を提供すると仮定される。但し、本願出願人は特定の理論や動作メカニズムに限定又は拘束する意図はない。
管の内部を機械的に研削又は粗面化したり内部に溝や稜を設けても性能が改善する。反応管の底に小型の沸騰チップもしくはスティック又は微粒子ビーズを加えても性能を改善できる。例えば、直径約１．０〜０．１ｍｍの寸法のポリスチレン、ガラス、セラミック、ステンレス鋼又は他の適切な不活性材料のビーズが核形成部位として有用である。粒子が反応チャンバーの内側に入りさえすれば、粒子サイズは特に限定されないと考えられる。このような粒子は反応試薬に対して不活性であるべきであり、反応サンプルよりも稠密であるべきである。
ｂ．検出チャンバー
増幅した標的核酸は図２及び３に示すように検出チャンバー３２で反応サンプルから分離される。検出チャンバー３２はプラスチック又はガラスなどの透明材料から作成され、開放端４８と閉鎖端５４をもつ。反応サンプル３８は開放端４８を通って検出チャンバー３２に流入し、（下記に詳述する）検出担体６０に遭遇する。
好適態様（図２）では、検出チャンバーは反応チャンバーから供給されるサンプル流体を収容するレザーバ３７を含む。これは、サンプル流体を開放端４８に導き、流体が検出チャンバーの側面から流入するように検出チャンバー３２の床面よりも高位にオリフィス３９をもつ流路を通すことにより実現される。あるいは、立管入口によってレザーバを形成してもよい。レザーバ３７は、反応チャンバー３０内で流体サンプルが冷却されて減少しても、検出担体手段６０に反応サンプル流体を供給し続ける（図５Ｃ及び５Ｄ比較。レザーバ内の流体は反応管に戻らずにストリップ６１により吸収される）。レザーバと側面入口オリフィス３９をもつ細長形検出チャンバーでは、山形フィン４３を成形して検出チャンバー全体に強度を付加するのも有用であり得る。
別の好適態様では、検出チャンバーの横断面形状（図２Ｃ）はただ１つの可能な向きにしか加熱段の対応する溝に嵌め込めないような多角形又は非対称である。これは台形受座を示す図２Ｆ及び２Ｈに最良に示される。透過検出構成（下記参照）では、チャンバーの前面と後面を実質的に平行に維持するのが好ましい。台形は固定向きでありながらこの配置を確保する最も簡単な多角形である。他方、他の多角形又は非対称形状も予想できる。反射検出構成（下記参照）では前面と後面が平行である必要はなく、他の多角形が適切である。円形受座構成を使用する場合には、単一向きを伝えるためにカム又は平坦側面を備え得る。受座は光学面と同一構成である必要はない。
検出チャンバー３２（及び／又は反応チャンバー３０）は、熱サイクリングデバイス１６の内側でチャンバーを支持し且つ取り扱いを簡単にするタブ部材５８（図２Ｇ及び７参照）を含み得る。タブ部材５８は更に、加熱段１７に配置されたキー溝９１（図２Ｇ及び７参照）と係合する手段を含み得る。検出システムが加熱段に対して固定されている限り、多角形に代わるこの構成でも加熱段及び検出システム２２に対して検出チャンバー３２を規定の向きに確保できる。
図３Ａ〜３Ｄは図２の好適態様に代わる態様を示す。これらの態様は類似の要素と特徴をもち、これらの要素には図２の態様と同一符号を付す。但し、図３の態様はレザーバを含まない。
ユニット２０は更に、好ましくは検出チャンバー３２に配置されたバーコード（図示せず）を備え得る。バーコードを読取るために熱サイクリングデバイス１６に設けられたバーコードリーダー（図示せず）がコード化情報をコンピュータ２６に送信し得る。バーコードは特定ユニット２０を識別することができ、サンプル及び実施しようとする反応に関する他の関連情報を提供することができる。この情報は、コンピュータ２６により実施されるビデオ処理プログラムに関して本開示中で後述するように患者識別及び／又は捕獲部位７４の構成を含み得る。
ｃ．検出担体
検出チャンバー３２は更に、反応サンプルを受容し、増幅標的ＤＮＡを分離し、増幅反応の結果の可視指標を発生する検出担体手段６０を含む。典型的には、検出担体手段は、不均一アッセイで周知のように、標的の存在を表すシグナルを蓄積することが可能な固体担体を含む。
このような固体担体は、例えばプラスチック、ガラス、天然及び合成ポリマー並びにその誘導体を含み、例えばセルロースエステル、微孔質ナイロン、ポリ二フッ化ビニリデン、紙及び微孔質膜を含む。担体は例えば繊維、ビーズ、スライド、円筒ロッド又はストリップの形状であり得る。好適態様では、検出担体手段６０は毛細管移動を実施可能な微孔質ストリップ６１（図２、３及び５参照）である。より好ましくは、多孔質担体はニトロセルロースであり、例えば約２μｍ〜約２０μｍ、通常は５又は１０μｍの気孔寸法をもつニトロセルロースである。好ましくは、多孔質担体は不活性であるか又は、ブロッキング剤及び／又は輸送助長剤（例えば米国特許第５，１２０，６４３号参照）を使用して不活性にし、一般には反応サンプル中の試薬又は標的核酸と物理的又は化学的に反応しない。輸送助長剤の使用は当該技術分野で公知であり、実施例３に詳述する。多孔質及び微孔質担体は毛細管現象による吸上作用とクロマトグラフィー特性を示すが、本発明は非クロマトグラフィー担体及び非多孔質担体も包含する。
検出担体手段６０は、円形即ちディスク形状又は矩形形状を含む任意の適切な形状であり得る。検出手段６０の寸法は、検出手段６０に固定された増幅標的核酸により発生される可視指標を十分に解像できるように選択すべきである。検出手段６０は好ましくは、固定された標的核酸の検出に必要な時間を短縮し且つ材料使用を最小限にするように小さく及び／又は薄い。当業者は反応サンプル３８の容量、増幅標的の量及び反応チャンバー３０と検出チャンバー３２の寸法を考慮して検出手段６０の寸法を最適化することができよう。検出手段６０を収容するように検出チャンバー３２を構成してもよい。
典型的には、例えば担体の気孔寸法及び厚さに応じて異なる速度で異なる担体材料６０が反応サンプル３８を受容及び輸送する。担体は追って詳述するように、増幅標的核酸と結合するために必要な時間を上回る速度で特異結合対メンバー又は捕獲分子を通り越して反応サンプル３８を輸送しないように選択すべきである。
好適担体６０は、反応サンプルの輸送が開始する第１の端部６２と、反応サンプルの輸送が終了する第２の端部６４と、増幅標的核酸を検出チャンバー３２内で単離させるメカニズムを含む１個以上の領域６６，６８，７０を含むストリップ６１である。
図２Ｄ及び５Ｄに示すように、ストリップ６１は少なくとも２領域を含み、ストリップ６１の第１の端部６２又はその近傍の第１の領域６６は反応サンプル中に存在する増幅標的核酸を標識するように機能し、第２の領域６８は標識した増幅標的核酸をストリップ６１に固定することにより反応サンプルから分離するように機能する。第２の領域６８は１個以上のゾーンを含んでもよく、各ゾーンは標的核酸を固定し、標的核酸が捕獲部位に固定されると可視指標を提供する少なくとも１個の捕獲部位７４を含む。捕獲部位７４は図２Ｄ及び３Ｃに示すように連続バンドとして配置してもよいし、図２Ｇに示すように不連続バンドとして配置してもよいし、図３Ａ及び５Ａ〜５Ｄに示すように独立スポットとして配置してもよい。捕獲領域内の多重捕獲部位及び複製物部位の意義については後述する。
標識機能はスポット自体で行う必要はなく、反応サンプルの内側を含めて反応サンプルと捕獲部位の間の任意の点で行い得ることが理解されよう。例えば、複合パッドを検出担体の下端に付着し得る。このようなパッドは反応チャンバーの開放端３６、検出チャンバーの開放端４８、又は図２に示す態様のオリフィス３９もしくはレザーバ３７に配置してもよい。複合パッドをストリップに付着しないとしても、少なくともストリップと接触させると好ましいと思われる。
ストリップ６１は、検出システム２２の対照ゾーン又は参照標準として機能する第３の領域７０を含み得る。好ましくは、このような全領域６６，６８，７０は担体６１の空間的に別個の領域である。領域６６，６８，７０の機能については、増幅標的核酸の検出方法に関連して追って詳述する。
担体６１は必要に応じて不活性基板に固定してもよく、このような基板は好ましくは構造支持体を提供するに十分に強固なガラス、プラスチック又はナイロンなどの透明材料から作成される。図２及び５に示す態様では、検出チャンバーはストリップを強固に保持するピン又はフィンガー４１を備える。このようなピン又はフィンガー４１は製造中にチャンバーハウジングに成形できる。担体及び基板は好ましくは検出チャンバー３２の内側に固定位置又は角度に配置されるので、担体６１に固定された増幅標的核酸の検出は、本発明の方法に関連して後述するように、検出システム２２に対して所定位置又は角度で実施することができる。
ｄ．密封機構
検出チャンバー３２は、増幅反応が一旦実施されたら増幅核酸が漏れないように反応チャンバー３０と密封結合するように設計される。このために、反応／検出ユニット２０はチャンバー３０，３２を相互に密封可能に係合する係合手段を含む。係合手段は数種の公知手段の任意のものによって達せられる。係合手段は、チャンバー３０，３２から潜在的に汚染している流体が漏出しないように確実な密封を形成すべきであり、換言するならば温度もしくは圧力上昇条件下又は通常操作及び／又は廃棄条件下で聞いたり、分離すべきでない。
図４Ａ〜４Ｄはユニット２０の２個のチャンバー３０，３２を密封可能に係合又は結合する数種の機構を示す。恐らく、最も簡単な機構は標準ルアー即ち摩擦嵌めである。これは図４Ａ、図２などに拡大して詳細に示す。反応チャンバー３０の開放上端３６はその外周面にベベル面４４を含み、検出チャンバー３２の開放端４８はその内周面にベベル面５０を含む。２面４４，５０のベベル角は、図２Ｅ、２Ｆ、３Ｃ、３Ｄ及び４Ａに示すように２個のチャンバーを相互に圧着したときに緊密な摩擦嵌めが達せられるように組み合わせる。図示しないが、この密封機構の変形例はルアーロックシステムと差込み固定システムを含む。
図４Ｂは第２の密封機構を詳細に示す。これは標準ルアー嵌めのスナップ嵌め又は爪変形例である。上端３６はその外周面にベベル面４４と環状ショルダー又は爪４６を含む。検出チャンバー３２はベベル面５０と環状爪又はショルダー５２を含む。この場合もベベル角は緊密な密封を形成するように組合わせ、環状ショルダー４６，５２はこれらの２部分が分離しないように相互に締め付け合う。スナップ嵌めの別の変形例を図４Ｃに示す。形状は多少異なるが、要素はすべて同様であり、同一符号を付した。スナップ嵌めはショルダー５２が面４４を越えてショルダー４６と係合するように両端を係合させることにより達せられる。
図４Ｄに示す最後の密封機構では、反応チャンバー３０の開放端３６は雄ねじ４７を備える。検出チャンバー３２の開放端４８は内側に同様に対応する雌ねじ４９を備える。反応チャンバーを検出チャンバーにねじ込むことにより、密封反応／検出ユニットが得られる。本発明の範囲内で多数の他の等価密封変形例が可能である。理想的には、密封機構は通常操作条件下で実質的に不可逆的である。
本発明の反応／検出ユニット２０は後述するように１又は２段熱サイクリングデバイスと併用できる。
３．熱サイクリング及び移送デバイス
ａ．サイクラーデバイス
図６及び７は、図１に略示した熱サイクリング及び移送デバイス１６の好適態様の詳細を示す。もっとも、単段及び多段加熱／伝達ユニットのいずれも本発明のデバイス及び方法で使用するのに適していることを理解されたい。即ち、サイクラー１６はコンピュータ２６の制御下で所望の温度を反応チャンバー３０に供給するために少なくとも１個の加熱段１７、場合によっては２個の加熱段１７及び１８を含む。１好適態様では、加熱段は環状下段加熱リング９２から空間的に分離された環状上段加熱リング９０を構成する。加熱リング９０，９２間の空間は絶縁体として機能するが、他の絶縁材料も使用し得る。加熱段は直線、平面又は楔（図示せず）など種々の他の形状でもよい。冷却期間中にリング９０，９２の温度低下を助長するために、典型的には径方向に内側に向かって、離間した１個以上のフィン９３がリング９０，９２上に配置される。冷却フィン９３の下にはファン９４が配置され、冷却期間中にリング９０，９２の温度低下を更に助長する。
加熱リング９０，９２はアルミニウム、銅又は金などの熱伝導材料から作成される。熱は図６に示すように好ましくはリング９０，９２の外周面に沿ってリングに付着された慣用抵抗熱ストリップ９５，９６を介して、又はマニホールドなどの他の公知手段により、又は伝導によってリング９０，９２に供給され得る。多段システムでは、コンピュータ２６は熱ストリップ９５，９６の各々に独立して電力を供給することにより各加熱リング９０，９２の温度を独立して制御することができる。コンピュータは２段を１段であるかのように連動させることもできる。
図７に示すように、ユニット２０は、反応チャンバー３０の第１の長手方向セグメント３３が上段リング９０にさらされ且つ反応チャンバー３０の第２の長手方向セグメント３５が下段リング９２にさらされるように、加熱リング９０，９２の数個のアパーチャ又はウェル９７の内側に配置される。図６及び７に示すように、ウェル９７は各々上段リング９０のアパーチャ９８と下段リング９２のアパーチャ９９の組合わせによって構成される。上段リングアパーチャ９８は上段リング９０を貫通する。ウェル９７に反応／検出ユニット２０を支持する何らかの手段（例えば上記タブ部材５８）が存在するならば、下段リングアパーチャ９９は、図２Ｇ及び７に示すように下段リング９２を貫通し得る。あるいは、下段リング９２の一部のみにアパーチャ９９を形成し、反応チャンバー３０の密閉底３４を下段リング９２に支承させてもよい。
コンピュータ２６（図１参照）は、反応チャンバー３０内の反応サンプル３８を所定の温度にするように上段加熱リング９０、任意下段加熱リング９２及びファン９４を制御する。熱サイクリングデバイス１６の加熱及び冷却サイクルとコンピュータ２６によるその制御については、コンピュータ／回路制御に関する開示中で追って詳述する。増幅反応が完了すると、コンピュータ２６は推進剤４０にその閾値膨張温度以上の温度の熱を供給するように加熱エレメントに指令する。閾値温度に達すると、推進剤４０は膨張して反応サンプル３８を上方の検出チャンバー３２に圧入する。１態様では、下段リング９２を上段リング９０よりも過剰に加熱して推進剤を膨張させる。
ｂ．移送方法
図５Ａ〜５Ｄは単段装置で反応サンプル３８を反応チャンバー３０から検出チャンバー３２へ移送する経緯を示す。ユニット２０は加熱エレメント１６のアパーチャ９７の内側に配置されている。代替２段システムでは、反応チャンバー３０の第１の長手方向セグメント３３（図２Ｂ及び３Ａ）が上段リング９０にさらされ且つ反応チャンバー３０の第２の長手方向セグメント３５（図２Ａ及び３Ａ）が下段リング９２にさらされるように反応チャンバー３０をアパーチャに配置する。
図５Ａでは増幅反応が完了し、加熱エレメント１６は推進剤４０の閾値温度まで上昇しつつある。２段システムでは、増幅反応の完了後に反応サンプル３８を蒸発しにくくするために、上段リング９０を最初に閾値温度よりも低い温度に維持し得る。推進剤４０が増幅反応中に膨張しないように推進剤閾値を最高増幅反応温度よりも高くすると好適である。
本発明で使用する「推進剤」とは、刺激、好ましくは非機械的刺激に応答して膨張する任意物質を意味する。例えば、推進剤４０は気体（例えば空気）、液体又は固体化合物であり得る。液体及び固体推進剤の場合には、一般に蒸発して膨張する。推進剤４０を膨張させる刺激は例えば熱、光、又はその組み合わせであるが、本発明では熱が好ましい。反応サンプル３８自体を推進剤４０として用いてもよい。液圧又は膜壁変形などの機械的圧力では推進剤は膨張しない。
図５Ｂでは加熱エレメント１６は推進剤４０をその閾値温度まで加熱し、推進剤４０は膨張して反応サンプル３８を検出チャンバー３２に向かって上昇させている。この時点で２段システムでは上段加熱リング９０を閾値温度にし、推進剤４０が第１の長手方向セグメント３３を通って上昇しながら膨張するのを助長し得る。図１０に関して後述するように、コンピュータ２６は、下段加熱リング９２の後で上段加熱リング９０を閾値温度まで過熱できるようにプログラム可能な時間遅れを備える。
加熱エレメント（又は上段及び下段リング９０，９２）は、図５Ｂ及び５Ｃに示すように、反応サンプル３８が検出チャンバー３２、好ましくは側面開口３９を通ってそのレザーバ３７に完全に移送されるまで閾値温度を供給し続け、推進剤４０を膨張させる。
図５Ｃでは検出ストリップ６０の第１の領域６６が湿潤し始めている。この領域（又はサンプル経路の先端部分、上記参照）は好ましくはこの領域を通る増幅標的核酸と結合する標識（例えばゾーン６７）を含む。この結合を行う１方法は、核酸に結合したハプテンと抗ハプテン抗体に結合したコロイド粒子を用いる方法である。コロイド金又はセレンや、着色ラテックス粒子が適切な標識である。ハプテン及びハプテン化は当該技術分野において公知であり、特に核酸のＬＣＲ及びＰＣＲ増幅との関連ではビハプテン化法が知られている。例えば、ＥＰ−Ａ３５７０１１及びＥＰ−Ａ−４３９１８２参照。ハプテン化核酸がゾーン６７を通るにつれて標識複合体は反応溶液によって可溶化されて移動し、核酸上のハプテンと結合する。あるいは、ハイブリダイゼーションや、伸長及び連結などの必要な酵素活性を妨げないという条件で検出可能な標識をプローブ／プライマーと直接結合してもよい。
溶液はストリップ６１を上昇するにつれ、領域６８で捕獲部位７４に遭遇し、場合によっては領域７０で対照部位に遭遇する。捕獲部位７４には第２のハプテンに対する第２の抗体が移動しないように固定されている。このハプテンに結合した全核酸はこれらの部位で固定される。固定核酸が増幅され、第１のハプテンも含むならば、複合体が捕獲部位に蓄積し、検出可能になる（図５Ｄ）。本発明の方法によって多重増幅及び検出できるように、各捕獲部位７４に異なるハプテンに対する固定抗体を配置してもよい。あるいは、部位の各々の間で信号を平均できるように、同一ハプテンに対する抗体を多重捕獲部位７４に配置してもよい。
本発明の熱膨張態様による移送は核酸アッセイ又はサーマルサイクラーに制限されないことも理解されたい。移送態様は、反応サンプルを反応位置から検出位置まで移動させることが所望される任意の場合に有用である。（例えば汚染の理由で）密封又は密閉容器の内側で移送することが望ましいような状況で特に有用である。他方、試薬が移送を行うのに必要な熱レベルに耐え得るという条件でイムノアッセイなどの非増幅非核酸アッセイにも使用できる。
４．検出システム
増幅反応の結果は検出システム２２及びコンピュータコントローラ２６によって検出及び分析される。検出可能な標識は好ましくは可視標識であるが、ＵＶ、ＩＲ又は蛍光標識などの他の検出可能な標識でもよい。好適検出システム２２は担体６０のビデオ画像を生成し、ビデオカメラ１００と担体６０を照明する光源１０４（どちらも図７及び８Ａ〜８Ｄに示す）を含む。担体６０の画像は直接又は反射によってカメラ１００に送られ、カメラ１００はコンピュータ２６に送られるビデオ画像を生成する。分かりやすくするために、可視標識については追って詳述する。
検出システム２２には種々の構成が適しており、そのいくつかの例を図８Ａ〜８Ｄに示す。一般に、検出システム２２は検出手段６０を照明する光源１０４と、検出手段６０のビデオ画像を生成するカメラ１００を含むべきである。カメラレンズを検出手段６０に直接照準してもよいし、検出手段６０の画像をカメラレンズに反射するようにミラーを配置してもよい。
図８Ｂに示すように、検出システム２２はカメラ１００、カメラレンズ１０２、光源１０４、ミラー１０６及びミラー１０６に連結したモーター１０８（好ましくはステッパーモーター）を含む。光源１０４は、カメラレンズ１０２が担体６１から反射された比色信号を測定するように配置される。カメラ１００とミラー１０６は加熱リング９０，９２と同軸に配置され、ミラー１０６は多孔質担体６１の画像をカメラレンズ１０２に反射するような角度で配置される。カメラ１００は固定しており、ミラー１０６はコンピュータ制御下にモーター１０８によって回転され、各検出チャンバー３２のストリップ６１の画像をカメラレンズ１０２に順次送る。カメラ１００は各検出チャンバー３２のストリップ６１のビデオ画像を生成し、この画像をコンピュータ２６に送って分析する。この画像を分析するためのソフトウェアについてはビデオ処理の項で後述する。
図８Ａは検出システム２２の別の構成を示す。この検出システムはカメラ１００、カメラレンズ１０２、光源１０４、ミラー１０６、及び加熱リング９０，９２に連結したモーター１０９を含む。光源１０４は、カメラレンズ１０２が担体６１から反射された比色信号を測定するように配置されている。カメラ１００とミラー１０６は加熱リング９０，９２と同軸に配置され、ミラー１０６は担体６１の画像をカメラレンズ１０２に反射するように選択された角度で配置されている。カメラ１００とミラー１０６は固定され、加熱リング９０，９２はコンピュータ制御下でモーター１０９によって回転され、各検出チャンバー３２のストリップ６１の画像をミラー１０６に送るように各検出手段を順次移動させ、ミラーは画像をカメラレンズ１０２に反射する。カメラ１００は各検出チャンバー３２の担体６１のビデオ画像を生成し、この画像をコンピュータ２６に送って分析する。
別の態様では、カメラレンズ１００を担体６１に直接照準し、ミラー１０６の必要を省いてもよい。別の態様では、光源をリングの内側に配置し、カメラをリングの外側に配置してもよいし、その逆に配置してもよい。これらの態様は図８Ｄに関して後述する透過検出を利用する。
図８Ｃの反射蛍光検出システムはカメラ１００、カメラレンズ１０２、光源１０４、励起フィルター１１０及び発光フィルター１１２を備える。光源１０４とカメラ１００は、カメラレンズ１０２が検出チャンバー３２で担体６１から発生される蛍光シグナルを受け取るように配置される。励起フィルター１１０は光源１０４と担体６１の間に配置され、発光フィルター１１２は担体６１とカメラレンズ１０２に間に配置される。
図８Ｄの別の蛍光検出システムはカメラ１００、カメラレンズ１０２、光源１０４、励起フィルター１１０及び発光フィルター１１２を備える。光源１０４とカメラ１００は担体６１が光源１０４とカメラ１００に挟まれるように配置される。こうしてカメラレンズ１０２は担体６１を透過した蛍光シグナルを受け取る。励起フィルター１１０は光源１０４と担体６１の間に配置され、発光フィルター１１２は担体６１とカメラレンズ１０２の間に配置される。透過検出システムは、１９９３年９月２７日に出願された本願と同一名義の同時係属米国特許出願第０８／１２７，３８７号、発明の名称「透過光測定による分析物の定量（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎａｌｙｔｅｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ  Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｙ）」（代理人整理番号５４３５．ＵＳ．０１）に詳述されている。透過検出に適した回路は一般に知られているが、特定回路は同じく１９９３年９月２７日に出願された本願と同一名義の同時係属米国特許出願第０８／１２７，４７０号、発明の名称「光強度検出及び測定回路（Ｌｉｇｈｔ  Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｍｅａｓｕｒｉｎｇ  Ｃｉｒｃｕｉｔ）」（代理人整理番号５３６７．ＵＳ．０１）に記載されている。これら２件の出願の開示内容全体は参考資料として本明細書の一部とする。
検出システムは図８Ｃ及び８Ｄに示す透過又は反射法のどちらを使用してもよく、どちらの方法も検出手段６０の画像を連続的にカメラに供給できると考えられる。特に、検出システムは図８Ｂに示す回転ミラー及びモーターを組み込んでもよいし、（ミラーの有無を問わず）図８Ａに示す回転加熱リング９０，９２及びモーターを組み込んでもよい。
５．コンピュータ／回路制御
図１に示すように、コンピュータコントローラ２６はモニター１１３、キーボード１１４及びデータ記憶手段をもつＩＢＭ  ＡＴ互換パーソナルコンピュータとして実装し得る。コンピュータ２６は画像フレームグラバーカード１１６、１６ビットアナログ／ディジタルＩ／Ｏカード１１８及びカスタムプリント基板（ＰＣＢ）１２０を含む。適切なフレームグラバーカード１１６は、Ｃｏｒｅｃｏ（カナダ、モントリオール）から市販されているＣｏｒｅｃｏ（登録商標）ＯＣ−３００である。適切なアナログ／ディジタルＩ／Ｏカード１１８は、Ｄａｔａ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  Ｃｏｍｐａｎｙの市販品である。
図１のダイヤグラムはフレームグラバーカード１１６、Ｉ／Ｏカード１１８及びＰＣＢ１２０に含まれる回路の簡易図である。フレームグラバーカード１１６はカメラ１００からビデオ信号を受け取って処理及び分析する。Ｉ／Ｏカード１１８とＰＣＢ１２０は、共同して加熱ストリップ９５，９６及びファン１９を制御することにより加熱及び冷却サイクルを制御する。ＰＣＢ１２０は加熱ストリップ９５，９６とファン１９に適当な電力を送ると共に、加熱ストリップ９５，９６の実温度をモニターするために使用される慣用回路を含む。１対のサーミスタ１２２，１２３が加熱リング９０，９２に連結され、リング９０，９２の温度を感知する。サーミスタ１２２，１２３はリング９０，９２の温度を表す出力信号を発生し、この信号はＰＣＢ１２０に戻される。
コンピュータ２６は加熱ストリップ９５，９６とファン１９を制御することにより加熱リング９０，９２の温度を制御するソフトウェアプログラムを含む。コンピュータ２６は更に、フレームグラバーカード１１６でビデオ信号入力を獲得及び分析するためのソフトウェアプログラムも含む。図９Ａ〜９Ｋは適切な熱制御プログラム２００のフローチャートを示す。図１１Ａ〜１１Ｄは適切なビデオ処理プログラム６００のフローチャートを示す。熱制御プログラム２００及びビデオ処理プログラム６００は、ＢＡＳＩＣ又はＣなどの市販プログラミング言語を用いて実現し得る。
６．熱制御
ａ．ハードウェア
一般に、熱制御プログラム２００はＩ／Ｏカード１１８を介してＰＣＢ１２０に指示を提供する。例えば、ディジタル信号で通信する熱制御プログラム２００は上段及び下段加熱リング９０，９２に所望の「設定」温度を設定する。Ｉ／Ｏカード１１８はＤ／Ａ変換器１２６，１２８でディジタルコンピュータ信号をアナログ信号に変換する。各加熱ストリップ毎に１個のＤ／Ａ変換器を設け、従って２個の加熱ブロックを使用する場合には、各々の温度を別々に制御することができる。Ｄ／Ａ変換器１２６からのアナログ出力は比較器１３０及びソリッドステートリレー１３２を介して上段加熱段１７に送られ、Ｄ／Ａ変換器１２８からのアナログ出力は比較器１３４及びソリッドステートリレー１３６を介して下段加熱段１８に送られる。
一方のリレー１３２からの出力は上段加熱リング９０と連結した上段加熱ストリップ９５に送られる。別のリレー１３６からの出力は下段加熱リング９２と連結した下段加熱ストリップ９６に送られる。リレー１３２，１３６は加熱ストリップ９５，９６を駆動させ、該ストリップは加熱リング９０，９２に熱を供給する。サーミスタ１２２，１２３は加熱リング９０，９２に連結され、加熱リング９０，９２の温度を感知して感知温度に対応する電気信号を発生する。サーミスタ１２２からの信号は演算増幅器１３８を介して比較器１３０に送られ、他方のサーミスタ１２３からの信号は演算増幅器１４０を介して比較器１３４に送られる。更に演算増幅器１３８，１４０からの出力はＩ／Ｏカード１１８上のＡ／Ｄ変換器１４２，１４４に送られ、上段加熱リング９０及び下段加熱リング９２の現在の温度を表すディジタル信号をコンピュータ２６及び熱制御ソフトウェアに提供する。
コンピュータ２６は各段毎に所望又は「設定」温度を表すディジタル信号を発生する。これらの信号はＤ／Ａ変換器１２６，１２８でＰＣＢ１２０によって受け取られ、アナログ信号に変換され、設定温度に達するように加熱ストリップ９５，９６を制御する。比較器１３０，１３４はその２本の入力ライン上の電圧を連続的に比較する。比較器１３０の入力電圧は、（サーミスタ１２２からの）上段加熱リング９０の温度とＤ／Ａ変換器１２６から受け取られた設定温度に対応する。比較器１３４の入力電圧は、（サーミスタ１２３からの）下段リング９２の温度とＤ／Ａ変換器１２８から受信される設定温度に対応する。加熱リング９０，９２のいずれかの感知温度がその設定温度よりも低い場合には、対応する比較器１３０又は１３４はリレー１３２，１３６を介して加熱ストリップ９５，９６に設定温度を出力し続ける。加熱リング９０，９２の感知温度が設定温度を越えると、比較器１３０，１３４は加熱ストリップ９５，９６への出力を遮断する。こうしてプログラムはソリッドステートリレー１３７を介してＰＣＢに指令し、ファンモーター１９をオンにし、逆に冷却期間が完了し、即ち低設定温度に達した場合にはファンモーターをオフにできる。
ｂ．ソフトフェア
図９Ａ〜９Ｋに示すフローチャートは慣用ブロック記号を用いて、熱制御プログラムにより実施される主機能を表す。熱制御プログラム２００は４つの主セクション又はルーチンをもつ。第１のセクションは図９Ａに示す「初期化」セクション２０２であり、ソフトウェア変数及び固定ハードウェアパラメータを従来通りに定義することにより、コンピュータハードウェアがデータを受信できる状態にする。初期化セクション２０２はコンピュータ２６を起動すると実行される。第２のセクションは図９Ｂ〜９Ｄに示す「編集」セクション２０４であり、このセクションにより、オペレータは必要に応じて特定変性プロトコル及び必要に応じてサイクル／過熱プロトコルを定義する種々のパラメータ選択を設定及び／又は変更することができる。第３のセクションは図９Ｅ〜９Ｇに示す「変性」セクション２０６であり、加熱リング９０，９２が変性プロトコルに選択された温度となるようにＰＣＢ１２０に指示する。第４のセクションは図９Ｈ〜９Ｋに示す「サイクル／過熱」セクション２０８であり、加熱リング９０，９２がサイクリングプロトコル及び過熱、又は閾値プロトコルに選択された温度となるようにＰＣＢ１２０に指示する。本明細書中で上述したように、過熱プロトコルは反応チャンバー３０内の推進剤４０を膨張させて反応サンプル３８を反応チャンバ３０から検出チャンバ３２に移送する。プログラム２００は好ましくは所定サイクル数Ｘにわたって高温と低温のサイクルを繰り返した後、過熱サイクルに移る。
図９Ａに示すように、初期化セクション２０２はブロック２１０でプログラム２００を開始した後、ブロック２１２でソフトウェア定数及び変数を初期化する。ブロック２１２はコンピュータハードウェア上の記憶場所を割り当て及び定義し、プログラム変数を規定するなどの慣用ステップを実施する。これらのステップはコンピュータプログラムがコンピュータハードウェアと有効に通信できるようにするために必要である。ブロック２１４，２１６及び２１８でプログラム２００はオペレータに（コンピュータメモリ又はデータ記憶装置に記憶された）所望のプロトコルファイルを指定されるか又は１組のデフォルトプロトコル値を受理させる。プロトコルファイルは、特定サイクリング／過熱プロトコルの特徴を定義する１組のパラメータの値を含む。いずれにせよ、プロトコルパラメータは後記編集セクション２０４でオペレータによって変更できる。熱制御プログラム２００の開示態様では、下記パラメータがプロトコルファイルに含まれ、最右列に示す値を例示値とする。開示プログラム２００では、（オペレーションの終了時のみにファンをオフにするために使用される）遮断温度は編集可能なパラメータではなく、プリセットされている。
0003741439.tif 000002
変性プロトコル、サイクリングプロトコル及び過熱プロトコルを通して加熱リング（従って、反応チャンバー３０）の温度対時間のプロットを示した図１０に基づき、パラメータを説明する。図１０は加熱段が２段存在するが、過熱サイクルまでは同一挙動をとるか又は一方のみを使用すると仮定している。図示するように、加熱リングは時刻Ｔ0で特定温度で始動する。この温度は最後の増幅反応の終了時から維持された温度以下の任意の値である。図示例では、加熱リングはＴ0でほぼ室温である。Ｔ0後に熱制御プログラム２００は、加熱リングを第１の「設定」温度にするようにＰＣＢ１２０に指示し、該温度はこの場合には「変性温度」であり、サンプル及び／又は任意のプローブ又はプライマー試薬中の核酸を変性させるために選択された値である。変性温度は典型的には約８０〜１００℃であり、例示値は９５℃である。すぐに設定温度に達することはできないので、温度は時間Ｔ0→Ｔ1の間に設定温度まで漸増即ち上昇する（傾く）。フィードバックサーミスタを介してプログラム２００は加熱リングが選択された設定温度に到達した時刻を感知し、この温度をＴ1→Ｔ2の所定時間（「変性時間」）維持し、サンプルＤＮＡ及び存在する場合には試薬プローブ又はプライマーを変性させる。
変性時間（Ｔ2）が終了するとプログラムは設定温度を「低サイクリング温度」に再設定し、加熱リングは時間Ｔ2→Ｔ3の間にこの新しい設定温度まで下降し、新しい設定温度は「低サイクリング時間」の間維持される。好ましくは、加熱リングの冷却を助長するようにファン１９をオンにして下降勾配時間（例えばＴ2→Ｔ3及びＴ6→Ｔ7）を最小にする。これらのパラメータの値は、被疑標的又は標的から形成されたアンプリコンにプライマー又はプローブを再アニールする温度及び時間を提供するように選択される。アニール温度は当業者に公知のようにプローブ長とグアノシン及びサイトシン残基の含量に依存し、典型的にはプローブ又はプライマーの予測Ｔmよりも数度低い値に設定される。典型的なプローブ及びプライマー長では低サイクリング温度は約４５〜７０℃であり得、例示値は６０℃に設定する。この時間を図１０ではＴ3→Ｔ4に示す。
次に、プログラムは設定温度を再設定し、図１０でＴ4→Ｔ5及びＴ5→Ｔ6に示すように「高サイクリング温度」まで上昇し、この温度を「高サイクリング時間」にわたって維持する。高サイクリング温度及び高サイクリング時間の値は標的又はアンプリコンからのプローブ又はプライマーを再び変性させるように選択される。一般に、高サイクリング温度はサンプル変性温度よりも僅かに低いが、アンプリコンのＴmよりも高くなければならない。約７０〜９５℃の値が一般的であり、例示値は８０℃である。
高サイクル時間が経過後、プログラムは設定温度を「低サイクリング温度」に再設定し、加熱リングはＴ7まで下降し、プロセスが繰り返される。各サイクルは図１０に示すように高温と低温から構成される。「合計サイクル数」はサイクル数を制御する値をもつパラメータである。サイクル数は実施するアッセイによって大幅に変動する。ＰＣＲ及びＬＣＲでは１０〜７０サイクル、一般に２５〜５０サイクルが妥当である。
合計サイクル数に達した後、プログラムは過熱相に移り、図５Ａ〜５Ｅに関して上述したように反応サンプル３８を反応チャンバー３０から検出チャンバー３２へ移送する。２段システムでは、これは一般に上述の理由で下段をまず最初に過熱し、次に上段を過熱することにより行われる。場合によっては、図１０に示すように上段よりも高い温度まで下段を過熱する。下段ブロック過熱温度及び上段ブロック過熱温度はこれらの過熱段階の間、その値を維持するパラメータである。上述のように、これらの値は推進剤を膨張させ、反応サンプルを検出チャンバーに圧入するように選択される。この温度は一般には変性温度以上であるが、反応チャンバー内の低部（即ち下段の内側）に推進剤を配置し、２段を連動しないようにすれば推進剤を変性温度から保護できるので変性温度以上にする必要がない。分かりやすくするために、水性反応サンプルを推進剤として使用し、過熱温度は一般に約９０〜１２０℃である。
２段システムで「過熱先導時間」は上段加熱リング９０をその過熱温度にする前に下段加熱リング９２をその過熱温度にする選択時間である。過熱先導時間は図１０ではＴs→Ｔuに示す。上記例示値は１５秒である。先導時間の値及び過熱上昇の勾配の傾きに依存して時間（Ｔs→Ｔu）は勾配時間（Ｔs→Ｔp）より長くても等しくても短くてもよく、換言するならばＴuとＴpの相対位置は図と逆でもよい。「総過熱時間」は、上段（単段を使用する場合には単段）がその設定温度（例えば上段ブロック過熱温度）に到達する時刻から開始する過熱段階の時間値に相当する。この時間は図１０ではＴe→Ｔrに示し、十分な容量の反応サンプルを検出チャンバーに移送するために十分な長さであればよい。これは当然サンプル容量及び検出手段に依存するが、簡単な実験によって容易に決定可能である。例示値は３０秒である。但し、全例示時間及び時間範囲は本明細書中で使用する特定態様に適用されるものであり、当業者は他の範囲も容易に使用できることに留意されたい。
「連動」パラメータは、２段加熱エレメントの場合に上段及び下段加熱リング９０，９２の両者が変性プロトコルにサイクリングプロトコルに関与するか否かを判定する。連動パラメータがオンの場合には、両方の加熱リング９０，９２が変性プロトコルとサイクリングプロトコルに関与している。連動パラメータがオフの場合には、加熱リング９０，９２の一方のみが変性プロトコルとサイクリングプロトコルに関与している。
「反応終了時の遮断温度」はプログラム２００が試験プロトコルの終了時に加熱リング９０，９２を冷却するファンモーターをオフにする設定温度であり、図１０ではＴhにより示す。
「画像遅延時間」は単に検出手順を開始する前に指定時間待機するようにコンピュータに指示する。この時間は検出チャンバー内で信号を完全に発生できるようにするために十分な長さとすべきであり、使用する信号及び検出手段の種類に依存して約１〜１０分間以上であり得る。
第１の低サイクル温度の前に高サイクル温度を使用する増幅プロトコルを選択してもよいことが理解されよう。この場合には、低温まで下降し続ける前に選択されたプロトコルによって決定される時間にわたって高サイクリング温度のプラトーを含むように時間Ｔ2→Ｔ3を単に拡張する。
図１０は更に、変性及びサイクル／過熱ルーチンのプログラム状態を示す。これらの状態をソフトウェアに関連して以下に説明する。
再び図９Ａに戻ると、プロトコルファイルを選択した（ブロック２１４，２１６及び２１８）後にプログラム２００はブロック２２０及び２２２でモニター１１３スクリーン上にヘルプテキストと現状プロトコルパラメータを表示する。ブロック２２０はヘルプ情報を提供し、オペレータがプログラム２００を続行するためにどのステップをとるべきかを決定するのを助ける。ブロック２２２のスクリーン見出しは更に、所望の結果を得るためのキーストローク入力に関するプロンプトを提供する。
プログラム２００はブロック２２４でサーミスタルックアップテーブルを初期化する。サーミスタ１２２，１２３の抵抗は温度と共に変化するが、これらの温度変化は非直線的である。従って、サーミスタ１２２，１２３のいずれかから読取値が発生される毎にプログラム２００が温度を再計算する必要がないようにルックアップテーブルを提供する。Ｉ／Ｏカード１１８はブロック２２６で初期化される。これは、プリアンプ段階での利得設定や単極（０Ｖ〜１０Ｖ）又は双極（−５Ｖ〜＋５Ｖ）信号レンジの使用などのようにＩ／Ｏカード１１８で使用される種々の値を設定する。ブロック２２８でプロトコルパラメータは初期化され、Ｉ／Ｏカード１１８は温度をディジタルに変換するように準備される。ブロック２３０でプログラム２００は編集セクション２０４に移る。
プログラム２００の編集セクション２０４を図９Ｂ、９Ｃ及び９Ｄに示す。一般に、編集セクション２０４によってオペレータは初期化セクション２０２のブロック２１６及び２１８で選択したプロトコルパラメータの一部又は全部を変更できる。編集セクション２０４はブロック２３６でキーボード２０４をクリアし、これはキー＝０を設定することに等しく、ブロック２３８で現在のプロトコルパラメータを表示する。プログラム２００は加熱リング９０，９２の現在の温度の連続表示を提供する。これは、上段及び下段加熱リング９０，９２からのアナログ入力を読取り、これらの入力をサーミスタルックアップテーブルで温度値に変換し、モニター１１３に温度を表示することによりブロック２４０及び２４２で行われる。ブロック２４４でプログラム２００は更に、プロトコルパラメータを編集するためのプロンプトをオペレータに提供するパラメータ編集コマンド指示をモニター１１３上に表示する。
次に編集セクション２０４はブロック２４６でキーボード入力を受取るまで待つ。ここでオペレータはブロック２５０，２５６，２６０，２６４，２７０，２８０，２８４，２８８，２９４及び２９８に示すキーのいずれかを押すことによりプロトコルパラメータを編集することができる。ブロック２５０に示す「Ｕ」キーを押すとプログラム２５０はブロック２５１に進み、オペレータは高サイクリング温度と高サイクリング温度の時間を再設定することができる。また、ブロック２５６に示す「Ｌ」キーを押すとプログラム２００はブロック２５８に進み、オペレータは低サイクリング温度と低サイクリング温度の時間を再設定することができる。ブロック２６０に示す「Ｃ」キーを押すとプログラム２００はブロック２６２に進み、オペレータは最大サイクル数を設定することができる。ブロック２６４に示す「Ｗ」キーを押すとプログラム２００はブロック２６６及び２６８に進み、オペレータはコンピュータメモリ内のファイルに編集済みパラメータプロトコルを保存することができる。ブロック２７０に示す「Ｆ」キーを押すとプログラム２００はブロック２７２に進み、オペレータはファン９４をオンにし、所望により加熱リング９０，９２の温度を低下させることができる。ブロック２８０に示す「Ｄ」キーを押すとプログラム２００はブロック２８２に進み、オペレータは変性プロトコルの変性温度と時間を編集することができる。ブロック２８４に示す「Ｈ」キーを押すとプログラム２００はブロック２８６に進み、オペレータは過熱パラメータを編集することができる。過熱パラメータは下段加熱リングの過熱温度、上段加熱リングの過熱ラグタイム、上段加熱リングの過熱温度及び総過熱時間を含む。ブロック２８８に示す「Ｔ」キーを押すとプログラム２００はブロック２９０に進み、オペレータは連動パラメータを編集することができる。プログラム２００がブロック２８８でＴキーをポーリング後、ブロック２９２で変性セクション２０６を開始することを見越してタイマーがセットされる。ブロック２９４に示す「Ｅ」キーを押すとプログラム２００はブロック２９６に進み、プログラム２００を出る。ブロック２９８に示す「Ｓ」キーは「状態」、「サイクル数」、「Ｒ時間」及び「キー」を全て０に設定し（ブロック３００）、プログラム２００をブロック３０４から変性セクション２０６に移す。Ｓキーを押さない場合には、プログラム２００は編集セクション２０４の始点に戻る。
変性セクション２０６（図９Ｅ、９Ｆ及び９Ｇ）はブロック３１０で開始し、ブロック３１２で現在のプロトコルパラメータを表示する。ブロック３１４はキーボード入力をクリアし、ブロック３１６は変性温度（ＴＥＭＰ．ＤＥＮ）に入力された値を試験する。変性温度が０に設定されているならば、プログラム２００は変性プロトコルをスキップし、「サイクル数」フラグを１、状態フラグを０に設定（ブロック３１８）した後、ブロック３２０を介してサイクル／過熱ルーチンに移る。ブロック４２０を介してサイクル／過熱セクション２０８に入ると、プログラムはブロック４２２でＳＥＴＴＥＭＰ＝ＴＥＭＰＨＩに設定し、状態フラグを０にしてサイクル／過熱ルーチンに２０８に入ることにより高サイクリング温度の抽出を開始する。
しかし、上記例示値を使用すると、変性温度は０よりも高い値（９５℃）に設定されるので、連動情報の獲得、変性温度の設定、ファン９４をオフにするための数種のサブルーチンを含むブロック３２２でプログラム２００は変性温度と変性時間を初期化する。温度又は時間の「設定」は、温度にＳＥＴＴＥＭＰ、ＳＥＴＴＥＭＰ０又はＳＥＴＴＥＭＰ１、時間にＲＴＩＭＥなどの変数を生成し、上記パラメータの１つから選択される値を変数に割り当てることであり、即ち温度変数にはＴＥＭＰ．ＤＥＮ、ＴＥＭＰＬＯ、ＴＥＭＰＨＩ、ＴＥＭＰＳＵＰＥＲ及びＴＥＭＰＳＵＰＥＲ２を割り当て、時間変数にはＴＩＭＥ．ＤＥＮ、ＴＩＭＥＬＯ、ＴＩＭＥＨＩ、ＴＩＭＥＬＥＡＤ及びＴＩＭＥＳＵＰＥＲを割り当てる。従って、ブロック３２２でＳＥＴＴＥＭＰ変数は変性温度のプロトコルに記憶された値をとる。
ブロック３１１，３２４及び３２６は、変性セクション２０６がオペレータからのパラメータ編集入力のためのキーボード１１４を引き続きをポーリングすることを示す。キーボード入力が受取られると、プログラム２００は編集セクション２０４に移り、オペレータは現在のプロトコルパラメータの任意のものを編集することができる。プログラム２００はブロック３２８及び３３０で温度表示を更新する。
ブロック３３２でプログラム２００は分岐しねプログラム状態フラグ、キーフラグ及びＲ時間の値に依存して温度又は時間のいずれかをボーリングする。Ｒ時間（及び他の変数）はブロック３００で０に設定したので、プログラムはこの最初のループ循環では温度をポーリングし、ブロック３３６に移る。ここでプログラム２００はＴＲＡＣＫ変数を試験し、２段システムの両方のブロックを平行にサイクリングすべきか否かを判定する。ＴＲＡＣＫ＝オンの場合にはブロック３３８はプログラムをブロック３５６に送り、両方のブロックを試験する。ＴＲＡＣＫ＝オフの場合には、ブロック３４０はプログラムに一方のブロック（この例では上段ブロック）のみを試験させる。以下の説明では、ＴＲＡＣＫ＝オフであると仮定するが、当業者はフローチャートのセクションによっては鏡面様性質の場合もあることを容易に理解しよう。当然のことながら、単一加熱エレメントシステムでは、ＴＲＡＣＫ変数は不要であり、ただ１個のブロックのみを試験する。以下の説明は、上段ブロックのみを変性及びサイクリングに使用する２ブロックシステムに関するが、このようなシステムは単なる１態様であることが理解されよう。
変性セクション２０６では、プログラム状態フラグは０〜３の４つの値をとることができる。一般に、プログラム状態フラグが０のとき（ブロック３４４参照）にはプログラム２００は加熱リングを変性温度にするようにＰＣＢ１２０に指示しており、プログラム２００は（ブロック３３２で）Ｉ／Ｏカード１１８上のＡ／Ｄ変換器１４２，１４４をポーリングし、上段加熱リングが変性温度に到達した時刻を判定する（ブロック３４６参照）。上段加熱リングが変性温度にまだ達していない場合には、プログラム２００はブロック３５０，３７２及び３８２を通り、ブロック３１１で始点の近くの主変性ループに戻る。ここからプログラムはブロック３４６に戻り、上段加熱リングが変性温度（９５℃）に達したか否かを再び問合せる。
プログラム２００は上段加熱リング９０が変性温度に達するまでこのループを続行する。今はブロック３４６の答えがイエスであり、プログラム２００はブロック３４８でキーフラグを１に設定する。加熱リング９０，９２が変性温度に達すると、キーフラグはブロック３４８で１に設定され、プログラム状態フラグはブロック３７４で１に増分される。更に、変数Ｒ時間はブロック３７８でパラメータＴＩＭＥ．ＤＥＮ（変性時間）の値をとるように設定され、ブロック３８０でタイマーが始動され、プログラムは主変性ループに戻る（ブロック３８２及び３１１）。
Ｒ時間はここでは所定の値（例示値は１２０秒）をとるので、プログラムはブロック３３２でブロック３９６の「時間チェック」サブルーチンに分岐し、Ｒ時間が時間切れしたか否かを問合せる。特定機能に設定された時間（この場合は１２０秒、変性時間）が経過すると、Ｒ時間は「時間切れ（タイムアウト）する」。この問合せに対する答えがノーであるならば、プログラムは変性セクション２０６の始点を通って帰還し、ブロック３３２及び３３４を介してブロック３９８の時間切れ問合せに戻る。時間切れ問合せに対する答えがイエスであるならば、プログラム２００はブロック４００でプログラム状態フラグを（ここでは２に）増分し、ブロック４０２でキー及びＲ時間をリセットする。次にプログラム２００はＳＥＴＴＥＭＰ変数をパラメータ値ＴＥＭＰＬＯに等しくなるように再設定し（ブロック４０６）、ファンをオンにし（ブロック４０８）、加熱ブロック９０を低サイクリング温度まで下降させる。
プログラム状態フラグを２、Ｒ時間を０にリセットして主変性ループに戻ると（ブロック３１１）、プログラム２００は分岐し、ブロック３３６，３４０，３４２及び３４４を通ってブロック３５０に至り、ブロック３５２で上段加熱ブロック９０を再びポーリングし、ＳＥＴＴＥＭＰ（ここでは低サイクリング温度）に達したか否かを判定する。上段加熱ブロック９０がその設定温度（例示値は６０℃）にまだ達していない場合には、プログラム２００はブロック３７２，３８２，３１１，３３２，３３６，３４０，３４２，３４４及び３５０を通ってブロック３５２に帰還する。低サイクリングＳＥＴＴＥＭＰに達すると、プログラムはキーを１、状態フラグを３に増分し（ブロック３４８及び３７４）、ファンをオフにする（ブロック３９０）。次に、プログラムはキーを１、状態フラグを２に再設定してからサイクル／過熱セクション２０８の主ループに入る（ブロック３９２及び３９４）。変性ルーチン後にサイクル／過熱ルーチン２０８に入る場合にはサイクル／過熱ルーチンは低サイクリング温度で開始し、変性をスキップした場合にはプログラムは高サイクリング温度でサイクル／過熱ルーチンに入ることを理解されたい（上記ブロック３１８，３２０，４２０及び４２２参照）。
本例では、サイクル／過熱セクション２０８（図９Ｈ〜９Ｋ）はブロック４２１で開始し、ＳＥＴＴＥＭＰは既に初期化されている。変性セクション２０６の場合と同様に、サイクル／過熱セクション２０８もパラメータ編集入力のためのキーボード１１４を引き続きポーリングし、適当な入力をキーボード１１４から受け取るとプログラム２００を編集セクション２０４に戻す。加熱ブロック９０，９２の各々の現在の温度はブロック４２８及び４３０でＩ／Ｏカード１１８に供給され、表示される。
ブロック４３２でプログラム２００はＲ時間の値に応じて時間又は温度をチェックすべきかを問合せる。ここではＲ時間が０である（ブロック４０２で最後にリセットされている）ので、プログラムはブロック４３６に分岐し、加熱ブロックの温度をチェックする。連動がオフなので、ブロック４３６の問合せに続き、ブロック４３８の状態問合せ、次いでブロック４６２の状態問合せに進む。サイクル／過熱セクション２０８でプログラム状態フラグは０〜１０の１１個の値をとり得るが、変性セクションを離れると２に設定され（ブロック３９２）、こうしてプログラムはブロック４６４で上段加熱ブロックが６０℃の低サイクリング温度に達したか否かを問合せる。変性セクション２０６の終点でこの温度に達したので、（達していないとしてもブロック３９２でキー＝１にセットするので）この時点でキー＝１となる。次にプログラム２００はブロック４７６，４７８，４８４及び４９０を通ってブロック４９６の問合せに至り、この時点「イエス」であるのでプログラムは「状態変更」サブルーチンに入る。
このプログラム２００ではプログラム状態が０又は偶数のときに加熱ブロックは新しい設定温度まで上昇又は下降しており、プログラムはサーミスタ１２２，１２３から供給される温度情報についてＩ／Ｏカード１１８上のＡ／Ｄ変換器１４２，１４４をポーリングすることが一般に認められる。逆にプログラム状態が奇数であるときには、設定温度に達しているのでプログラムはヒーターブロックが適当な時間にわたって設定温度を維持しているか否かを判定できるようにタイマーをポーリングする。これは図１０からも明らかである。
ブロック５１０の状態変更サブルーチンでは、プログラム状態フラグはブロック５１２で（３まで）増分される。ブロック５１４の答えがノーで且つブロック５１８の答えがイエスであるので、プログラム２００はブロック５２０でＴＩＭＥＬＯ（本例では６０秒の低サイクリング時間）の値をとるようにＲ時間を再設定する。プログラムは更に、ブロック５２２でファンをオフにし、ブロック５３６でタイマーを始動させた後、ブロック４２１でサイクル／過熱セクション２０８の始点に戻る。
プログラム２００はサイクル／過熱セクションの始点を通ってブロック４３２に移る。Ｒ時間はここでは所定の値（６０秒）をとるので、プログラムはブロック４３２から分岐し、ブロック５５０で開始する時間チェックサブルーチンに至る。Ｒ時間がまだ経過していない場合には、プログラムはＲ時間の６０秒が時間切れになるまで主ループに戻る。Ｒ時間が時間切れしている場合には、ブロック５５２の問合せに対する答えはイエスであり、従ってプログラム２００はブロック５５５で状態フラグを４に増分し、Ｒ時間及びキーを０にリセットした後、ブロック５５６を介してブロック５６２に入る。
プログラムが状態４及びブロック５６２に到達すると、サイクル数フラグはブロック５６４で増分される（サイクル数＝０に設定した本例ではブロック３９２及び３９４を介してサイクル／過熱ループ２０８に入ったので１に増分される）。次にプログラムは「サイクル数」フラグについて問合せる。サイクル数フラグがプロトコルパラメータＣＹＣＬＥＭＡＸとして記憶された最大サイクル数をまだ超えていない場合には、プログラム２００はプログラム状態フラグを０にリセットし、変数ＳＥＴＴＥＭＰを高サイクル温度パラメータの値に設定し、次のサイクルを開始するために加熱エレメントをオンにし（ブロック５６８及び５８６）、次いでブロック４２１で主ループに戻る。本例では、ＣＹＣＬＥＭＡＸは８であり、ＴＥＭＰＨＩは８０℃である。従って、プログラムはＳＥＴＴＥＭＰ＝８０でブロック４２１に戻る。
今度は主ループを通ってプログラムはブロック４２４，４２８及び４３０を通り、ブロック４３２のＲ時間試験に達する。Ｒ時間はブロック５５５で０にリセットされたので、プログラムはブロック４３６に分岐し、加熱ブロックの温度をチェックする。連動がオフなので、ブロック４３６の問合せ後にブロック４３８の状態問合せに進み、ここではその答えはイエスである。従ってプログラムはブロック４４０に移り、加熱ブロックが新しい設定温度に到達したか否かを判定する。到達していないならば、プログラムはブロック４４４，４６０，４６２，４７６，４７８，４８４，４９０及び４９６を通って主ループに戻り、ヒーターブロック温度のポーリングを続行する。加熱ブロックが設定温度に達すると、ブロック４４０の答えはブロック４４２でキーフラグを１に増分する。ブロック４４４，４６０，４６２，４７６，４７８，４８４及び４９０を通ってブロック４９６に至り、キー＝１であるのでプログラムは「状態変更」サブルーチンに分岐する。
ブロック５１０の状態変更サブルーチンでは、プログラム状態フラグはブロック５１２で（１まで）増分され、ブロック５１４の答えはイエスなので、プログラム２００はブロック５１６でＴＩＭＥＨＩの値（本例では６０秒の高サイクリング時間）をとるようにＲ時間を再設定する。プログラムは更に、ブロック５３６でタイマーを始動した後、ブロック４２１でサイクル／過熱セクション２０８の始点に戻る。プログラム２００はサイクル／過熱セクション２０８の始点を通ってブロック４３２に移る。Ｒ時間はここでは所定の値（６０秒）をとるので、プログラムはブロック４３２から分岐し、ブロック５５０で開始する時間チェックサブルーチンに移る。Ｒ時間が経過していない場合には、プログラムはＲ時間の６０秒が時間切れするまで主ループに戻る（ブロック５５４）。Ｒ時間が時間切れすると、ブロック５５２の問合せに対する答えはイエスになるので、プログラム２００はブロック５５５で状態フラグを２まで増分し、Ｒ時間及びキーを０にリセットした後、ブロック５５６に移る。
ブロック５５６では答えがイエスであるので、プログラムはブロック５５８で変数ＳＥＴＴＥＭＰを低サイクル温度パラメータ（ＴＥＭＰＬＯ）の値に再設定し、ブロック５６０で加熱ブロックを冷却するようにファンをオンにした後、ブロック４２１で主ループに戻る。
再び主ループに戻り、プログラムはブロック４３２に達し、Ｒ時間は０であるので温度をポーリングするように決定する（ブロック４６４）。これは所望の（ＴＥＭＰＬＯ）温度に達するまで続き、この温度に達すると、ブロック４６６でキーは１に設定される。こうしてプログラムは「状態変更」サブルーチン（ブロック５１０）に戻り、状態フラグは（３まで）増分され、Ｒ時間は加熱ブロックを所望時間にわたってＴＥＭＰＬＯに維持するようにＴＩＭＥＬＯに再設定される。こうしてプログラムはブロック４３２で時間チェックサブルーチン（ブロック５５０）に分岐し、タイマーをポーリングする。上記と同様に、Ｒ時間が時間切れすると、状態フラグはブロック５５５で（４まで）増分され、Ｒ時間とキーは０にリセットされ、サイクル数フラグは再び評価される。プログラム２００はＣＹＣＬＥＭＡＸに達するまで（例えばブロック５６４でサイクル数フラグが９まで増分されるまで）プログラム状態０，１，２及び３を使用して上述のようなサイクルを実行し続ける。
サイクル数フラグが最大サイクル数を越えると（ブロック５６６）、プログラム２００はブロック５７０でＴＥＭＰＳＵＰＥＲの値を試験する。この値が０ならば、過熱部分をスキップし、ブロック５７４でプログラム状態フラグを８に設定する。図示例では、ＴＥＭＰＳＵＰＥＲの値は１１０℃であり、ブロック５７２で変数ＳＥＴＴＥＭＰ１を１１０℃に設定することにより下段リング過熱プロセスを開始した後、４２１で主ループに戻る。ＳＥＴＴＥＭＰ１は下段ブロック単独の設定温度に値をとる変数であり、ＳＥＴＴＥＭＰは連動がオンである場合に上段ブロック又は両方のブロックに適用した。
主ループでは、Ｒ時間が０であるので、プログラムはブロック４３２でもう一度温度をポーリングし、４３８及び４６２の問合せをスキップし、４７８の問合せにイエスで回答する。プログラムはここで、連動がオフだったならば下段加熱ブロックが上段ブロックよりも低温であり、下段ブロックが上段ブロックの温度に達するまで状態４が維持されると仮定する。ブロック４８０の問合せの答えがイエスの場合には、キーフラグは１に設定され、ブロック４９６，５００及び５１０を介して状態変更が行われる。こうして状態フラグを（５まで）増分し、ブロック５２６でＴＩＭＥＬＥＡＤ値を変数Ｒ時間にロードし、ブロック５３６でタイマーを再始動した後、主ループに戻る。ＴＥＭＥＬＥＡＤ値は下段加熱ブロック９２の過熱から上段加熱ブロック９０の過熱が始まるまでの時間である。この例示値は１５秒間であり、図１０にはＴs〜Ｔuの間の時間により示す。
主ループはこうしてブロック４３２で時間チェックサブルーチンに分岐し、Ｒ時間（＝ＴＩＭＥＬＥＡＤ）が時間切れする時刻を判定した後、プログラム２００は状態フラグを（６まで）増分する。状態フラグ＝６のとき、プログラムはブロック５７６で分岐し、ブロック５７８でＴＥＭＰＳＵＰＥＲ２の値を変数ＳＥＴＴＥＭＰ０にロードし、上段ブロックの過熱を可能にする。ＳＥＴＴＥＭＰ０は（連動がオンのときのように）下段ブロック又は両方のブロックと区別して上段ブロック単独の設定温度の値をとる変数である。主ループに戻ると、プログラムはブロック４３２で分岐して温度をポーリングし、ブロック４８４及び４８６に達し、上段ブロックがその設定温度（ＴＥＭＰＳＵＰＥＲ２）に達しているか否かを試験する。達している場合にはキーフラグはブロック４８８で１に変更され、プログラム２００はブロック５１０で状態変更サブルーチンに移る。こうして再びプログラム状態を（７まで）増分し、ブロック５２８を通り、ブロック５３０で変数Ｒ時間をＴＥＭＰＳＵＰＥＲの値にし、ブロック５３６でタイムを再始動する。本例ではＴＥＭＰＳＵＰＥＲは３０秒であり、上段ブロックが過熱温度に維持される時間に相当する。主ループでブロック４３２は時間チェックサブルーチンに分岐し、Ｒ時間（＝ＴＥＭＰＳＵＰＥＲ）が時間切れする時刻を判定する。時間切れすると、プログラム２００は状態フラグを（８まで）増分し、キーフラグ及びＲ時間をリセットし、ブロック５８０に移り、プログラムはブロック５８２で上段及び下段加熱リングへの温度出力をオフにする。冷却に備えて、ブロック５８４でプログラムはファンをオンにし、両方の加熱ブロックのＳＥＴＴＥＭＰ変数をＳＨＵＴＯＦＦの値に再設定する。この値は本例では５０℃であり、ファンが加熱ブロックを室温よりも低温に冷却しようとして絶えず運転しないように選択される。
プログラム状態が８でＲ時間が０にリセットされて主ループに戻ると、プログラムはブロック４３２で分岐し、温度をポーリングする。ブロック４９０の答えはイエスであるので、ブロック４９２でプログラムは上段ブロックの温度をポーリングし、５０℃の設定温度まで冷却しているか否かを判定する。冷却している場合には、ブロック４９４でキーフラグは１に設定され、ブロック４９６，５００，５１０及び５１２を介して状態９への状態変更が行われる。ブロック５３２でプログラムは分岐し、ファンをオフにし（ブロック５３４）、ＴＩＭＥＩＭＡＧＥの値を変数Ｒ時間にロード（ブロック５３５）した後、タイマーを始動し（ブロック５３６）、主ループに戻る。上述のように、ＴＩＭＥＩＭＡＧＥパラメータは、ユニットが検出プロセスを開始する前に信号の発生を完了できるように選択される。主ループでブロック４３２は時間チェックサブルーチンに分岐し、時間切れ後、状態フラグを（１０まで）増分し、プログラムはブロック５８１及び５８３を介して図１１Ａ〜１１Ｄに関して後述する検出手順を開始する。
７．ビデオ処理
先の項に記載した検出システム２２は、図１１Ａ〜１１Ｄに示す検出プログラム６００などのビデオ処理プログラムを利用する。コンピュータ制御プログラムがプログラム状態＝１０に達すると、制御が検出プログラム６００に送られる。一般に、検出プログラムはディジタルビデオ分析技術を使用して検出システム２２のカメラ１００により発生される検出手段６０（例えばストリップ６１）のビデオ画像を分析する。好ましくは、ビデオ処理プログラムは下記のように増幅反応全体の精度と信頼性を改善するために、複製物捕獲部位から獲得されるディジタルデータを使用する。しかしながら、まず説明で使用する用語を定義するのが重要である。各検出手段６０は図２Ａ、２Ｇ及び５Ａ〜５Ｄに示すように少なくとも１個の読取ゾーン６８を含む。図２Ａ及び５のデバイスの読取ゾーン６８を図１２Ａ及び１２Ｂに拡大して示す。検出手段６０は好ましくは参照バー及び／又は対照ゾーン７０も含む。
上述のように、各読取ゾーン６８は好ましくはアッセイを多重化する目的で多重捕獲部位７４を含む。多重化とは、同時に２個以上の分析物のアッセイを実施することを意味し、例えばクラミジア属の生物と淋菌生物の両者を試験したり、遺伝子中の多重部位又は多重遺伝子における遺伝的突然変異を試験することである。多重化は、陽性及び／又は陰性対照試薬と共に１種の分析物を同時にアッセイすることも意味し得る。これらの多重捕獲部位７４は図２Ａ及び１２Ａには連続バンド又は線として示し、図５及び１２Ｂには「スポット」の対角線アレーとして示す。上述の通り、多重捕獲部位は図２Ｇに示すような不連続バンド又は線でもよい。
これらの多重捕獲部位７４は複製物部位７２又は複製物ゾーンとして以下に記載する部位から区別しなければならない。好ましくは、各個捕獲部位７４の面積は本明細書中に複製物部位又は複製物ゾーンと呼ぶ数個の「読取ウィンド」を含むのに十分な広さである。これは図１２Ａには最上段捕獲部位７４上の四角で囲んだ面積として示し、図１２Ｂにはスポット７４上の多重走査線として示す。図２Ｇでは、不連続バンドは天然複製物ゾーンを形成するが、連続バンドは読取ソフトウェアによって複製物ゾーンを故意に形成する（図１２Ａの四角７２）。捕獲部位７４の各複製物部位又はゾーンは同一分析物に複数の「複製物」アッセイが実施されているかのように同一分析物の付加的データを含むことを理解されたい。複製物部位が複数であるため、統計的「外れ値」を廃棄することができ、信頼性レベルを増し、捕獲部位の画像が正確且つ忠実に評価される。
本発明のビデオ処理構成について説明すると、コンピュータ２６とビデオ処理プログラムは担体６１に固定された増幅標的核酸の存在を検出する。一般に、カメラ１００は、通常は図８に示す構成の１つに従って担体６１の画像を検出する。次いでカメラ１００はコンピュータ２６のフレームグラバーカード１１６にビデオ信号を出力する。フレームグラバーカード１１６はビデオフレームをディジタル化し、ディジタル値をＲＡＭ１２４に記憶する。こうして、ディジタル値をコンピュータ２６にアクセス可能にし、ビデオ処理プログラム６００によって操作することができる。コンピュータ２６は５１２×４８４画素の解像度をもつ８ビットグレースケールを使用する。０が黒色画像を表し、２５５が白色画像を表すように各画素に数値を割り当てる。０〜２５５の値は各々特定のグレー色相を表す。ビデオ信号のディジタル化表現はオペレータに見えるようにコンピュータモニター１１３上に表示され得る。
ビデオ処理プログラム６００は図１１Ａ〜１１Ｄのフローチャートにより示す。フローチャートは慣用記号を使用し、ビデオ処理プログラム６００によって実施される主機能を表す。ビデオ処理プログラム６００は２つの主セクション又はループをもつ。第１のセクションはブロック６０６で開始する「読取」セクションであり、第２のセクションはブロック６３４で開始する「アッセイ」セクションであり、読取セクション６０６のサブルーチンである。読取セクションは各反応／検出ユニット２０毎に１回実行し、アッセイセクションは各ユニット２０の検出手段６０から画像形成された各捕獲部位７４毎に１回実行する。
プログラム６００はブロック６０２で開始し、ブロック６０４で位置カウンタを初期化する。位置カウンタは特定バッチにおける反応及び検出ユニットの数を記録する。開示の２段環状リング態様では、加熱リング９０，９２は反応／検出ユニット２０を収容する４０個のウェル９７を含む。ブロック６０８はモーター１０８又は１０９を次のサンプル読取位置まで前進させる。検出手段６０の画像をカメラレンズ１０２に反射するためにミラー１０６を使用する検出システム２２では、モーター１０８は各検出手段６０の連続画像をカメラ１００に送るためにミラーも回転させる。
反応／検出ユニット２０は好ましくは、反応サンプル３８とユニット２０を識別し、この反応／検出ユニットに実施すべきアッセイに関する情報を含むバーコード（図示せず）を備える。バーコードは好ましくは、対照ゾーン７０、捕獲部位７４及び複製物ゾーン７２の存在、位置及び形状（例えばバンド又はスポット）に関する情報など検出手段６０の構成に関する情報をコンピュータ２６に提供する。好ましくは、このような構成の数は制限され、構成情報はコンピュータのメモリに記憶され、コンピュータは特定構成に関連するバーコード信号を受け取ると、情報を検索できる。あるいは、ただ１個の構成を使用する場合には、単一参照バーで画像分析用参照フレームを提供し得る。
従って、サイクラー１６及び／又はコンピュータ２６はバーコードを読取るためのコードリーダー（図示せず）を備える。プログラム６００はブロック６１０でバーコード情報を読取り、バーコードの読取に成功したか否かをブロック６１２で判定する。読取が不成功の場合には、プログラム６００はブロック６１４でバーコードがこのユニットで読取られなかったことを指示する。捕獲部位の位置及び数を特定するためにバーコード情報を必要とするシステムでは、コンピュータはバーコードの読取が不成功の場合に特定ユニット２０をどのように処理するかわからないので、結果を報告することができず、プログラム２００はブロック６１６に移り、プログラム６００はブロック６７８のサンプル終了ルーチンに移る。読取に成功した場合には、プログラム６００はブロック６１８に移り、ディジタル化画像の獲得及び試験に備えてゾーン構成情報を処理する。
ビデオ画像がカメラ１００からフレームグラバーカード１１６に供給されると、画像はブロック６２０でディジタル化され、ブロック６２２で対照ゾーン７０を走査される。対照ゾーンは典型的には任意の反応サンプルに対して通常は陽性である規定ゾーンである。対照ゾーンは一般に２つの機能を果たす。第１に、増幅反応と検出チャンバーへのサンプルの移送が適正に行われたことをオペレータに指示する。第２に、バーコード化構成情報により規定されるような捕獲部位の位置を決定するための参照点を提供する。ブロック６２４でプログラムは対照ゾーンが検出されたか否かを問合せる。ブロック６２４の問合せに対する答えがノーであるならば、プログラムは現在のサンプルのエラーコードを指示し、ブロック６１６に進み、プログラム６００はブロック６７８のサンプル終了ルーチンに進む。ブロック６２４の問合せに対する答えがイエスであるならば、プログラム６００はブロック６２８に進み、プログラム６００はブロック６３０のアッセイ読取ルーチンに送られる。
アッセイ読取ルーチンはブロック６３２に移り、ユニットバーコード又は他の入力により提供されるゾーン構成情報を用いて、処理する最初の分析物ゾーンを選択する。各分析物ゾーンは各走査線中に複数の画素をもつ複数の走査線に分割される。各画素はブロック６２０のディジタル化手順中にグレースケール数値を割り当てられている。ブロック６３６でプログラム６００は現在の分析物ゾーン中の走査線を試験し、現在の分析物ゾーン中の各走査線毎に画素平均、標準偏差（ＳＤ）及び範囲値を計算する。
次にプログラム６００はブロック６３８に移り、現在の分析物ゾーン中の走査線の任意のものが現在の分析物ゾーン中の他の走査線と統計的に相違するか否かを問合せる。ブロック６３８の問合せに対する答えがノーであるならば、プログラムはブロック６４０に移り、現在の分析物ゾーンについて陰性結果を報告する。次いでプログラム６００はブロック６４０からブロック６４２に移り、プログラム６００はブロック６７０の次ゾーンルーチンに送られる。ブロック６３８の問合せに対する答えがイエスであるならば、プログラムは現在の分析物ゾーンに陽性結果を検出しているのでブロック６４４に移る。
他の走査線と統計的に相違する走査線はシグナル領域を含む筈であり、他の走査線は含まないことが理解されよう。従って、捕獲部位７４と複製物部位７２の構成は部位間に所定のスペースを空けなければならないことが理解されよう。これは図１２Ａ及び１２Ｂではスペース７５によって示す。バンド構成では、バンドはバンド間のスペースを数本の走査線で試験できるように十分離間して配置される。スポット構成では、水平走査線を使用する場合には鉛直スペース７５によって隣接スポットを相互に分離すべきである。このスペース７５が存在せず、全捕獲部位７４が陽性シグナルを生じた場合には、全走査線がシグナルを含み、統計的相違は全く存在しない。
ブロック６４４はバックグラウンド正規化手順を開始し、プログラムは現在の分析物ゾーンの各走査線が何らかの信号を含むか又はバックグラウンドのみかを分類する。プログラム６００は次にバックグラウンドのみとして分類された走査線を用いてブロック６４６で現在の分析物ゾーンのバックグラウンド勾配を設定し、この勾配を使用して照明及び位置のばらつきを表す。バックグラウンド勾配は当業者に公知の導関数や行列分析などの種々の公知方法で設定することができる。ブロック６４８でプログラムはバックグラウンド勾配情報を用いて信号走査線のバックグラウンド調節又は正規化を実施する。バックグラウンド正規化は信号基線を設定してデータ翻訳を改善するために従来使用されており、同様に減算又は水平／鉛直平均減算などの種々の公知方法で実施することができる。プログラムは次にブロック６４８からブロック６５０に移り、プログラム６００はブロック６５２に送られる。
画像処理サブルーチンはブロック６５２で開始する。ブロック６５４でプログラムは輪郭強調を使用して成功複製物部位７２におけるシグナル領域７７の外周を識別する。輪郭強調は特徴抽出に公知のディジタル画像処理法であり、ここでは各複製物部位のシグナル領域の輪郭又は境界を画定するのに利用する。ブロック６５６でプログラムは各複製物部位シグナル領域の外周の内側の全画素の平均、標準偏差及び範囲値を計算する。分析はここでは複製物部位のシグナル領域に集中する。
ブロック６５８でプログラムはある複製物部位上のシグナル領域統計の任意のものが他の複製物部位７２からのシグナル領域統計と有意に相違するか否かを問合せることにより異常結果の有無を識別する。この問合せに対する答えがノーであるならば、全複製物部位７２は同一であると判断され、プログラム６００はブロック６６０で全複製物部位の内側のシグナル領域の平均画素値を計算し、現在の分析物ゾーンの結果として記憶する。ブロック６６０からプログラムはブロック６６２に移り、プログラムはブロック６７０の次ゾーンルーチンに送られる。
ブロック６５８の問合せに対する答えがイエスであるならば、プログラム６００はブロック６６４に移り、統計的「外れ値」と呼ばれる異常結果を除去する。異常結果は多数の方法で統計的に定義することができ、平均から著しく離れた結果を含み、ここで「著しく離れた」とは標準偏差の数又は予め設定した信頼性限界内の統計的有意値によって決定される。ブロック６６６でプログラムは高信頼性試験結果を得るために異常部位を廃棄後に十分許容可能な部位が残存するか否かを判定する。ブロック６６６で上記判定を実施するためには数種の基準の任意のものを使用することができる。例えば、プログラムは識別した複製物部位の一定百分率（例えば少なくとも５０％）が許容可能であることを要求し得る。許容可能な複製物部位の数が設定最小値を上回る場合には、プログラムはブロック６６０に進み、許容可能な複製物部位内のシグナル領域の平均画素値を計算し、この値を現在の分析物ゾーンの結果として記憶する。許容可能な捕獲部位の数が設定最小値以下の場合には、プログラムはブロック６６８に進み、現在の分析物ゾーンの不確定結果フラグを立てる。換言するならば、プログラムはアッセイに関して確実な結末に達するために走査画像内に十分な信頼性をもつデータを検出することができなかった。プログラムは次にブロック６６８からブロック６６２に移り、プログラムはブロック６７０の次ゾーンサブルーチンに送られる。
プログラムは次にブロック６７２に進み、現在のゾーンが最後のゾーンであるか否かを問合せる。ブロック６７２の問合せに対する答えがノーであるならば、プログラムはブロック６７４で次の分析物ゾーンを選択した後、ブロック６７６に移り、プログラムはブロック６３４のアッセイループに戻る。ブロック６７２の問合せに対する答えがイエスであるならば、現在の反応／検出ユニットの決定が完了し、プログラムはブロック６７８で開始するサンプル終了サブルーチンに移る。
ブロック６８０でプログラム６００は全サンプル結果を記憶した後、ブロック６８２で全サンプル結果を表示及び／又は印刷する。あるいは、全データを記憶してランの終了時に印刷するようにプログラムを構成してもよい。次にブロック６８４で位置カウンタは増分され、プログラムはブロック６８６で最後の位置が完了したか否かを問合せる。ブロック６８６の問合せに対する答えがノーであるならば、プログラムはブロック６９０に移り、ブロック６０６の読取ループに戻る。ブロック６８６の問合せに対する答えがイエスであるならば、プログラムはブロック６８８で終了する。
本発明のビデオ画像形成態様の使用は好適２段サイクリングエレメントに限定されず、実際には核酸分析などに限定されないことを理解されたい。それどころかビデオ画像形成態様は、カメラ手段、好ましくは何らかの形態の電磁照射を用いてバックグラウンドから区別できるようなシグナルを発生し得る任意のアッセイ形態（例えばイムノアッセイを含む）で利用できる。
８．核酸増幅及び検出方法
本発明の別の態様によると、核酸増幅及び検出を実施する方法が提供される。発明の背景の項に記載したように、種々の核酸増幅法が当業者に公知である。本発明が意図する増幅反応の非限定的な例はＰＣＲ、ＬＣＲ、３ＳＲ及びＳＤＡである。本発明では増幅反応サンプルは一般に標的核酸、増幅を誘導する少なくとも１種の酵素物質及び緩衝液を含む。本発明が意図する酵素物質の非限定的な例はリガーゼ及びポリメラーゼ並びにその組み合わせである。反応サンプルは後述するプライマー又はプローブを含み得る。好ましくは、プライマー又はプローブは反応サンプル中の標的核酸の量に対してモル過剰量を加える。
当業者に自明の通り、増幅反応の種類に依存して所定の付加的試薬を使用し得る。例えばＰＣＲ増幅反応では反応サンプルは一般にヌクレオチド三リン酸、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰも含む。ＬＣＲ反応サンプルは通常はＮＡＤを含む。反応サンプル中のこのような全試薬の量は当業者が経験によって決定し得る。特定増幅反応に用いる反応サンプルの例については本明細書の実施例４、９及び１１に更に説明する。
増幅すべき目的核酸は標的核酸と呼ばれ、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）でもリボ核酸（ＲＮＡ）でもよく、その天然又は合成類似体、フラグメント及び／又は誘導体でもよい。標的核酸は好ましくは天然に存在するウイルス核酸又は原核もしくは真核起源のＤＮＡである。
本明細書中で使用する「プライマー」及び「プローブ」なる用語は一般に、標的核酸と十分にハイブリダイズすることが可能なオリゴヌクレオチドを意味する。「プライマー」なる用語は典型的にはＰＣＲとの関連で使用し、「プローブ」なる用語は典型的にはＬＣＲとの関連で使用する。「プライマー／プローブ」なる用語は本明細書中ではプライマー及びプローブ配列の両者に一般論を適用できる場合に使用する。
本発明の方法では、プライマー／プローブは好ましくは標的核酸の種々の部分に相補的となるように選択される。プライマー／プローブの長さは、非限定的な例として増幅反応温度、プライマー／プローブの起源、標的核酸の複雑さ及び増幅反応の種類を含む種々の因子に依存する。好ましくは、核プライマー／プローブは所望の特異性をもち且つ反応サンプル中に存在し得るランダム配列とのハイブリダイゼーションを避けるために十分な長さとする。より好ましくは、核プライマー／プローブは約１５〜約１００塩基を含み、更に好ましくは約１５〜約４０塩基を含む。
プライマー／プローブは当業者に公知の方法を使用して化学的に合成することができる。好ましくは、プライマー／プローブは当業者に公知のヌクレオチドホスホラミダイト化学技術及び／又はＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）、ＤｕＰｏｎｔ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）又はＭｉｌｌｉｇｅｎ（Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）から市販されている器具を用いて合成される。
プライマー／プローブはハイブリダイゼーションを妨げない検出可能な標識と直接結合し得る。あるいは、増幅反応で使用する少なくとも１個のプライマー／プローブに特異結合対メンバーを結合する。好ましくは、増幅反応で使用するプライマー対の各プライマー又は１組のプローブの少なくとも２個のプローブに特異結合対メンバーを結合する。より好ましくは、こうしてプライマー対のプライマー又はプローブ組の少なくとも２個のプローブに結合した特異結合対メンバーは２個の異なる特異結合対メンバーである。後述するように、検出可能な標識と結合したリポーター分子と増幅標的を結合するために、プライマー対又はプローブ組に結合した第１の特異結合対メンバーを使用することができる。その後、第２の特異結合対メンバーを使用して担体６１に固定した捕獲分子に標識増幅標的を結合することができる。好ましくは、２個の特異結合対メンバーは相互に交差反応せず、標識リポーター分子又は担体６１に固定した捕獲分子と交差反応しない。
典型的には、特異結合対メンバーは抗体又は相補的ポリヌクレオチド配列などの別の分子と結合することが可能な抗原、ハプテン、化合物又はポリヌクレオチドを含む。特異結合対メンバーは更に磁性粒子でもよい。本発明で意図する特異結合対メンバーの非限定的な例はビオチン、Ｔ３、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド及び薬剤化合物（例えばテオフィリン、ジゴキシン及びサリチレート）である。このような特異結合対メンバーは当業者に公知であり、市販されている。
特異結合対メンバーをプライマー／プローブに結合する方法も当業者に公知である。例えば、特異結合対メンバーを共有結合又は標準βシアノエチルホスホラミダイト化学技術によってプライマー／プローブと結合することができる。Ｅｎｚｏ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）及びＣｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）もプライマー／プローブ標識法について記載し、市販している。使用する方法は例えば特異結合対メンバーの種類やプライマー／プローブ配列上の結合対メンバーの位置によって異なる。但し、結合対メンバーは増幅反応で使用する温度サイクリングに耐えるように熱安定手段によって結合すべきである。
増幅反応を実施するためには、反応サンプル３８を反応チャンバー３０に入れる。反応サンプルの量は一般に少量であるため、微量注射器ピペット（図示せず）を使用して反応チャンバー３０にサンプル３８を入れるか、又はチャンバーの底にサンプル３８を集めるようにチャンバーを短時間遠心すると好適であり得る。次に反応チャンバー３０と検出チャンバー３２を係合させて密封ユニット２０を形成し、ユニット２０を熱サイクリングデバイス１６、好ましくは図６〜８に示し、本明細書に記載するような熱サイクリングデバイス１６に入れる。次に、反応サンプル中に存在する標的核酸を増幅するのに十分な温度条件に反応サンプル３８を暴露する。ＰＣＲやＬＣＲなどの所定の増幅反応では、反応サンプルを熱サイクリングに暴露する。他方、ＳＤＡや３ＳＲなどの他の増幅反応は等温条件を使用できる。熱サイクリング条件下で反応サンプルを典型的には設定時間にわたって一定範囲の温度に暴露する。ＬＣＲでは、通常は２種の異なる温度で温度サイクリングが行われる。例えば実施例５に記載するように、反応サンプルを８５℃と５５℃でサイクルする。当業者は増幅反応を完了するために必要な適切な温度、サイクリング時間及びサイクル数を不当な実験なしに経験によって決定することができる。適当な温度条件下で反応サンプル中に標的核酸が存在すると、プライマー又はプローブは増幅反応が進行するにつれて標的核酸とハイブリダイズする。
増幅反応が完了したら、反応サンプルを反応チャンバー３０から検出チャンバー３２に移送し、反応サンプル３８を担体６１と接触させる（図５Ａ〜５Ｅ）。反応サンプル３８を検出チャンバー３２に移送する間、ユニット２０は密封状態に保たれる。サンプルの移送は蒸気相の形成や、温度上昇によって生じる流体又は推進剤の膨張などの種々の手段によって行うことができる。
好ましくは、検出チャンバー３２への反応サンプル３８の移送は、反応チャンバー３０の下端で推進剤４０を膨張させて行われる。好適態様では、推進剤４０の膨張はコンピュータ２６によって下段加熱エレメント１８（又は加熱エレメント１７単独）の温度を推進剤の閾値温度よりも上昇させることにより生じる。より特定的には、反応チャンバー３０の第２の長手方向セグメント３５に熱を供給するようにコンピュータ２６から加熱エレメント１７又は１８に指令し、こうして推進剤４０を推進剤の閾値温度よりも高温に暴露する。典型的には、エレメントは＞９５℃、通常は１００℃以上の温度まで過熱される。こうして反応チャンバー３０に供給された熱によって推進剤は膨張し、反応サンプルは検出チャンバー３２に向かって上昇する。推進剤４０を膨張させるために必要な温度は推進剤４０の種類及び組成によって異なる。推進剤４０は増幅反応の過程で推進剤４０が膨張しないように、増幅反応温度よりも高い閾値温度をもつことが好ましい。
好適態様では、担体１６の１つの領域６６は反応サンプル中の増幅標的に結合した第１の特異結合対メンバーと結合することが可能な多重複合体分子を含む。複合体分子は当業者に公知の方法を用いて担体６１に堆積される。例えば、スポッティングと乾燥により複合体分子を担体６１に堆積することができる。好ましくは、カゼインなどの準可溶性タンパク質の存在下で複合体分子を担体６１上で乾燥し、複合体分子の輸送及び再可溶化を助長する。複合体分子は参考資料として本明細書の一部とする米国特許第５，１２０，６４３号に記載されている方法により担体に堆積することもできる。領域６６の複合体分子は担体に固定されず、反応サンプル及び／又は水性溶媒の存在下で再可溶化することができ、毛細管移動によって担体に沿って移動する。上記特異結合対メンバーと結合することが可能な複合体成分の非限定的な例としては、抗ビオチン抗体、抗テオフィリン抗体、アビジン、炭水化物、レクチン、相補的オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド配列、ストレプトアビジン及びプロテインＡが挙げられる。
こうして担体に堆積された複合体分子を標識と結合する。本明細書中で使用する「標識」なる用語は、検出可能なシグナルを発生するために使用可能な分子を意味する。シグナルは視覚的、光学的又は外部光源による励起によって検出できるべきである。適切な標識は当業者に公知であり、ラテックス、着色ラテックス粒子及びコロイド金属（例えば金又はセレン）などである。あるいは、標識はフルオレセイン、ローダミン、アクリジンオレンジ及びテキサスレッドなどの蛍光分子でもよい。本発明で使用可能なその他の標識は米国特許第４，１６６，１０５号、米国特許第４，４５２，８８６号、米国特許第４，９５４，４５２号及び米国特許第５，１２０，６４３号に記載されている。このような標識は当業者に一般に公知の方法によりリポーター分子と結合することができる［例えば米国特許第５，１２０，６４３号、米国特許第４，３１３，７３４号参照］。
反応サンプルが上記のように修飾した担体６１の第１の領域６６と接触するにつれて、特異結合対メンバーと結合した増幅標的核酸は標識リポーター分子と結合する。また、担体上のリポーター分子は再可溶化され、反応サンプル中の増幅標的核酸と共に移動する。上述のように、複合体はストリップ上に存在する必要はなく、検出可能な標識をプライマー／プローブに直接結合する場合には全く不要である。
毛細管移動により、反応サンプルは標識増幅標的と共に担体６１の第２の領域６８に輸送される。担体６１の第２の領域６８は好ましくは、増幅標的核酸に結合した第２の特異結合対メンバーと結合することが可能な複数の捕獲分子（捕獲部位７４）を含む。増幅標的に結合した第２の特異結合対メンバーが磁性粒子である場合には、捕獲分子は磁性吸引によって増幅標的を捕獲及び固定できるように選択すべきである。このような全捕獲分子が担体６１に固定される。捕獲分子を担体６１に固定する方法は当業者に公知であり、吸着、吸収、共有結合及び米国特許第５，１２０，６４３号に記載されている方法などを利用できる。担体６１に固定する捕獲分子の量は例えば特異結合対メンバーに対する結合親和性によって異なる。好ましくは、担体６１に固定される捕獲分子の濃度は増幅標的に対してモル過剰である。
好ましくは、複数の捕獲分子を担体６１上の所定位置又はゾーン（捕獲部位７４）で担体６１に固定する。捕獲分子は対角線、鉛直線もしくは水平線構成、円形又は棒状など任意の所望の幾何学的形状又は構成で固定することができる。増幅反応の結果を適切に検出及び解像できるように、このような円又は棒を空間的に分離できることが更に好ましい。
反応サンプルと標識増幅標的が担体６１の第２の領域６８と接触するにつれて、反応サンプル３８中の標識増幅標的核酸は担体６１上の固定捕獲分子（捕獲部位７４）と結合し、この位置に固定される。捕獲ハプテンをもたないサンプル成分は反応サンプル３８の毛細管移動によって第２の領域６８から担体６１の何らかの付加的ゾーン及び／又は第２の端部６４に除去される。
更に、担体６１は本明細書中で「対照」ゾーン７０と呼ぶ第３の領域も含み得る。対照ゾーン７０は検出方法に対照又は参照標準を提供するように修飾される。好ましくは、対照ゾーン７０は担体６１上の所定の位置で検出可能な標識を捕獲する所定の試薬を含む。担体６１は当然のことながら、別の分析を実施するための付加的領域又はゾーンを含み得る。択一的又は付加的に担体６１は、試薬に対して非反応性であるがカメラによる自動画像形成用参照フレームとして使用される検出可能なシグナルを提供する検出可能な染料を含む参照スポット又はゾーンを含んでもよい。
担体６１に固定された標識増幅標的核酸は可視指標を発生し、この可視指標は検出システム２２とコンピュータ２６により検出及び分析される。こうして発生された可視指標は反応サンプル３８中の増幅標的核酸の存在又は量を表す。増幅標的核酸が反応サンプル３８中に存在しない場合には、標識増幅標的は固定捕獲分子と結合せず、可視指標は測定されない。担体６１上の指標の密度又は強度は任意手段によって光学的に読取ることができる。１態様について本明細書中で記載するように、シグナルは反射ミラー１０６によってビデオカメラレンズ１０２に反射される。ミラー１０６が回転するにつれて、検出チャンバー３２の各々における担体６１の各々を読取ることができる。
上記好適態様以外に、本発明は標的核酸を標識及び固定する別の方法も意図する。例えば、製造中にプライマー／プローブを検出可能な標識と結合してもよい。あるいは、製造中にプライマー／プローブを特異結合対メンバーと結合し、相補的特異結合対メンバーと結合した検出可能な標識と結合させてもよい。相補的特異結合対メンバーの結合は増幅反応中に行ってもよいし、増幅反応後に行ってもよい。従って、検出チャンバー３２に移送する前に反応サンプル中の増幅標的核酸を検出可能な標識に結合できると考えられる。
別の態様では、標識増幅標的核酸を微粒子凝集によって検出チャンバー３２内で検出する。この態様では、製造中に１対のプライマー又は１組のプローブを同一特異結合対メンバーと結合する。次に、相補的特異結合対メンバーと結合した微粒子を検出手段６０の一部として加える。反応サンプル３８が検出チャンバー３８に移送されて検出手段６０と接触するにつれて、反応サンプル３８中に存在する増幅標的は被覆微粒子と結合する。増幅標的が２価であるため、微粒子は凝集する。非増幅プローブ又はプライマーはただ１個の微粒子と結合し、凝集を開始することができない。その後、上述のように検出システム２２によって凝集を検出及び分析することができる。
９．本発明のキット
本発明は核酸を増幅及び検出するキットも提供する。該キットは多重使い捨て反応チャンバー３０と、多重使い捨て検出チャンバー３２と、各反応チャンバー３０を検出チャンバー３２に密封可能に固定する係合手段を含む。使い捨て検出チャンバー３２の各々は増幅標的核酸を固定するように修飾した担体６１を含む。キットは更に増幅反応を実施するための試薬を適切な緩衝液中に含む１個以上の容器を備える。ＰＣＲではこのような試薬はＤＮＡポリメラーゼ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ及び所定の標的核酸に特異的な少なくとも２個のプライマーを含む。ＬＣＲではこのような試薬はＤＮＡリガーゼ、ＮＡＤ及び所定の核酸に特異的な少なくとも４個のプローブを含む。試薬に適切な容器はびん、バイアル、試験管などである。好適態様では、選択した試薬をキットの使い捨て反応チャンバー３２に事前包装し、穿孔可能なシールで密閉する。
１０．実施例
実施例１：サーマルサイクラーの構成
Ａ．外径１０５ｍｍ、内径９５ｍｍ及び高さ１３ｍｍの寸法をもつ２つのアルミニウムリングからデュアルリングサーマルサイクラーを構成した。リング間のギャップは２ｍｍとした。各リングは反応／検出ユニット２０を収容するための整列ウェルを４０個含み、各ウェルは直径約２．３ｍｍとした。図７に示すようにリングの内面に径方向冷却フィンを設けた。粘着性加熱ストリップ（Ｍｉｎｃｏ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を上下リンクの外周に付着した。こうして付着した加熱ストリップは各リングに約３００Ｗの電力を供給することが可能であった。リングの温度は上述のようにエレクトロニクス及びソフトウェアにより制御した。冷却ファンの上方にリングの中心軸に沿って電荷結合デバイス（ＣＣＤ）カメラと可動ミラーを配置した。
Ｂ．外径１０５ｍｍ、内径９４ｍｍ及び高さ３６ｍｍの寸法をもつ単一のアルミニウム環状リングからサーマルサイクラーを構成した。リングは反応管用ウェルを３６個含み、各ウェルは直径３．５ｍｍとした。リングの内面に径方向冷却フィンを設けた。外周に粘着性加熱ストリップ（Ｍｉｎｃｏ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を付着した。リングの温度は上述のように制御エレクトロニクス及びソフトウェアによって制御した。リングの外部にＣＣＤカメラを配置し、中心に光源を配置した。
Ｃ．８４ｍｍ×２５ｍｍ×６ｍｍの寸法をもつ２個の矩形アルミニウムブロックから２段式サーマルサイクラーを構成した。各ブロックは反応／検出ユニット２０を収容するためのウェルを１２個含み、各ウェルは直径約０．３１ｃｍとした。ブロックの片面に冷却フィンを設けた。他方の面には粘着性加熱ストリップ（Ｍｉｎｃｏ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を付着した。ブロックの温度は上述のようにエレクトロニクス及びソフトウェアによって制御した。
実施例２：抗体試薬の調製
Ａ．抗血清：  各ハプテンをＢＳＡに結合してビオチン、アダマンタン、キノリン、ジベンゾフラン、チオフェンカルバゾール及びアクリジンに対する抗血清をウサギで誘起した。アダマンタン、キノリン、ジベンゾフラン、チオフェンカルバゾール及びアクリジンに対する抗体の製造の詳細については、本願と同一名義の同時係属出願第０７／８０８，５０８号、０７／８０８，８３９号、０７／８０８，８３９号、０７／８０８，８３９号及び０７／８５８，９２９号に夫々記載されている。これらの出願は参考資料として本明細書の一部とするが、本発明に必須とはみなさない。標準法を使用してマウスでフルオレセインに対するモノクローナル抗体を誘起した。ダンシルに対する抗血清はペンシルバニア大学から入手したマウスモノクローナルであった（Ｓ−Ｔ．ＦａｎとＦ．Ｋａｒｕｓｈ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｏｎｏｌｏｇｙ，２１，１０２３−１０２９（１９８４））。抗血清をプロテインＡ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）又はプロテインＧ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）に通して精製し、０．１Ｍ  ＴＲＩＳ（ｐＨ７．８）、０．９％ＮａＣｌ、０．１％ＢＳＡ、１％スクロース、１％イソプロパノール及びフェノールレッド微量で希釈した。
Ｂ．複合体：  Ｄ．Ａ．Ｙｏｓｔ他（米国特許第４，９５４，４５２号（１９９０））の方法に従ってコロイド状セレンを調製した。５４５ｎｍで光学濃度＝１６に達するようにコロイドを水で希釈した。この懸濁液１ｍＬに１ｍｇ／ｍＬの抗ビオチン１μＬと１００ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ６０μＬを加えた。この懸濁液を渦流混合器で１分間混合した。この混合物の０．５ｍＬ部分を、４％カゼインを含有する４０ｍＭ  ＴＲＩＳ（ｐＨ７．８）０．５ｍＬで希釈し、１０×１．２５ｃｍガラス繊維を基材とするパッド（Ｌｙｐｏｒｅ  ９２５４，Ｌｙｄａｌｌ  Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）に含浸させた。パッドを凍結乾燥し、６×６ｍｍ切片に切断した。
均一に染色した青色ポリスチレンラテックス粒子（Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｃａｒｍｅｌ，ＩＮ）にも抗ビオチン抗血清を結合した。ラテックス粒子（直径３８０ｎｍ）を水で１：２５に希釈し、０．４％固形分で１ｍＬとし、１ｍｇ／ｍＬの抗ビオチン１０μＬを加えた。懸濁液を渦流混合器で４５秒間混合し、５％カゼインを含有する０．１Ｍ  ＴＲＩＳ（ｐＨ７．８）５μＬを加えた。この混合物の０．５ｍＬ部分を、４％カゼインを含有する４０ｍＭ  ＴＲＩＳ（ｐＨ７．８）０．５ｍＬで希釈し、１０×１．２５ｃｍパッド（Ｌｙｐｏｒｅ  ２５４（登録商標），Ｌｙｄａｌｌ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）に含浸された。パッドを凍結乾燥した。
Ｃ．固体担体：  電動微量注射器を用いて抗ダンシル抗体（１ｍｇ／ｍＬ）をニトロセルロースシート（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｅｌｌ，Ｋｅｅｎ，ＮＨのＭｙｌａｒ（登録商標）にプレキャストした気孔寸法５μｍのもの）に加えた。更に、米国特許第４，８７７，７４５号（Ａｂｂｏｔｔ）に記載されているような試薬噴射によって抗アダマンタン、抗アクリジン、抗キノリン、抗ベンゾフラン、抗チオフェンカルバゾール及び抗フルオレセイン抗体を０．５〜１ｍｇ／ｍＬで別々のニトロセルロースシート（気孔寸法５μｍ、Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｅｌｌ，Ｋｅｅｎ，ＮＨ）に加え、多重捕獲担体を形成した。
実施例３：検出チャンバーの作成
Ａ．管状：  内径約３ｍｍのプレキシグラス管から管状検出チャンバーを構成した。検出チャンバーの上端は閉じ、下端は下記実施例４Ａに記載するマイクロチューブ反応チャンバーを螺着できるようにねじ切りした。
実施例２ＢのＬｙｄａｌｌ抗ビオチン複合体パッドを接着テープで抗ダンシルニトロセルロース担体６１（実施例２Ｃ）の底に張り付けた。次にニトロセルロース−Ｌｙｄａｌｌパッド担体を３×５０ｍｍストリップ状にスライスし、内径約３ｍｍのプレキシグラス管からなる検出チャンバーにＬｙｄａｌｌパッド部分を下向きにして挿入した。
Ｂ．レザーバを備える矩形チャンバー：図２Ａ〜図２Ｅに示す設計のストリップホルダーをポリカーボネートから成形した。反応管からレザーバに通じる底部のオリフィスに実施例２Ｂのセレン抗ビオチン複合体パッドの６×６ｍｍ切片を配置した。抗体を固定した多重捕獲担体ストリップ（実施例２Ｃ）をストリップホルダーに入れた。超音波によってストリップホルダーの底にふたを溶着し、ストリップをピンで固定した。
実施例４：  反応チャンバー作成
Ａ．Ｐ．Ｃ．Ｒ．微量注射器先端をＴｒｉ−Ｃｏｎｔｉｎｅｎｔ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．，Ｇｒａｓｓ  Ｖａｌｌｅｙ，ＣＡから購入し、開放端（底部）をヒートシールした。これらの反応チャンバーはポリプロピレン製で容積１００μＬ、内径１．８ｍｍであった。頂部は図１３に示すようにねじ切りしてあった。
Ｂ．カスタム反応チャンバーはＶａｒｉｖｅｓｔ，Ｉｎｃ．，Ｇｒａｓｓ  Ｖａｌｌｅｙ，ＣＡから取りよせた。これらのチャンバーは容積１００μＬ、外径３．５ｍｍ、内径２ｍｍ及び長さ３．５ｃｍを有するようにポリプロピレン毛細管から構成した。奇異なことに、反応サンプルを単独で推進剤として用いた試験では、これらのチューブは既に密封してあった底部を予め融解し、恐らく密閉下端又はその近傍に表面凹凸を導入しない限り、性能が非常に劣った。
実施例５：  反応サンプル調製、Ｊ３．１１
ＡＢＩ  ＤＮＡ合成器でホスホラミダイト化学によりオリゴヌクレオチドプローブを合成し、指定するようにビオチン又はダンシルハプテンでハプテン化した。配列（下記配列番号１、２、３及び４）を用いて嚢胞性繊維症に漠然と関連付けられるＪ３．１１多型性をコードするヒト染色体７の一部を増幅した。（Ｉ．Ｂａｒｔｅｌｓ他，Ａｍ  Ｊ．Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，３８：２８０−７（１９８６））。配列は下記のように標的（５０塩基合成標的：配列番号５）に整列する。
0003741439.tif 000003
Ｂａｃｋｍａｎ他のヨーロッパ特許出願第４３９１８２号に記載されているような「ダブルギャップ」ＬＣＲを実施するために、反応サンプル混合物は総容量１００μＬ中に、ｐＨ７．８に達するようにＫＯＨで滴定した５０ｍＭ  ＥＰＰＳ、２０ｍＭ  Ｋ+、３０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１０μＭ  ＮＡＤ、１．７μＭ  ｄＧＴＰ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓからのＤＮＡリガーゼ９０００単位、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓからのＤＮＡポリメラーゼ１単位、ニシン精子キャリヤーＤＮＡ１μｇ、各オリゴヌクレオチドプローブ（配列番号１、２、３及び４）４×１０12コピー（６．７ｎｍｏｌ）及び標的ＤＮＡ（配列番号５）１０7コピーを含有するものとした。
反応サンプルを実施例４Ａの反応チャンバーにピペット注入した。次に反応チャンバーを短時間遠心し、反応サンプルをチャンバーの底に集めた。反応チャンバーを実施例３Ａに記載した検出チャンバーに螺着し、密封反応／検出ユニット２０を形成した。
実施例６：  ＤＮＡ増幅及び反応チャンバーから検出チャンバーへの反応サンプルの移送
実施例５の密封反応／検出チャンバーをスプリットリングサーマルサイクラー（実施例１Ａ参照）に挿入した。上段及び下段リングを８２℃５秒間及び５５℃６０秒間の４０サイクルの温度プロトコルにかけ、ＬＣＲ反応を実施した。各サイクルは完了するまでに約２分間を要し、合計ＬＣＲ時間は約８０分間であった。
温度サイクリングの完了後、下段リングを１１０℃まで加熱し、上段リングを１００℃まで加熱した。これらの温度を２５秒間維持した。反応チャンバー内の反応サンプルの熱膨張及び蒸発により、サンプルは反応チャンバーから検出チャンバーに移送され、反応サンプルは標識抗ビオチン複合体を含む担体６１の第１の端部と接触した。標識抗ビオチンは再可溶化し、反応サンプルはクロマトグラフィーによりニトロセルロース担体６１まで上昇した。増幅標的ＤＮＡを含む反応サンプル中で増幅産物は担体６１上の抗ダンシル捕獲部位と結合し、可視呈色が観察された。６個の反応サンプルの結果を図１３に示す。左側の３個のサンプルは標的ＤＮＡを含み、検出スポット上に暗色スポットが見える（矢印参照）。右側の３個のサンプルは標的ＤＮＡを含まず、スポットは見えない。
実施例７：検出画像形成
輝度１４０及びコントラスト１５０のグレースケール設定を用いて実施例６の検出チャンバーをフラットベッドスキャナー（ＳｃａｎＪｅｔ  Ｃ，Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）でＴＩＦＦファイルに走査した。ＴＩＦＦファイルをＩｍａｇｅ（登録商標）（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｂｒａｎｃｈ，ＮＩＨの市販品）にインポートし、生成されたバンドの画像の画素密度を分析した。結果を下表１に示し、表中、最大密度及び最小密度はバンドのすぐ近傍の画像のグレーレベルを表す。
0003741439.tif 000004
実施例８：ビデオ処理
実施例６に記載した呈色反応生成物の写真画像をＣＣＤカメラで撮影した。上述のソフトウェアを使用して画像から生成されたグレースケールデータファイルを分析して担体６１の特定領域中の呈色反応の有無及び量を判定した。
実施例９：アルコール推進剤
１−プロパノール２μＬを反応チャンバーの下端に入れ、反応サンプルと１−プロパノールを約２．５μＬの空気で分離するように反応サンプルをチャンバーに入れた以外は実施例５と同様の反応サンプルを微量注射器筒反応容器で調製した。次に実施例５と同様に反応チャンバーに検出チャンバー３２を密封可能に装着し、密封反応／決定ユニット２０を形成した。上段及び下段リングの両者を１００℃まで加熱した以外は実施例６と同様のＤＮＡ増幅及び後加熱プロトコルを実行した。１−プロパノールを蒸発させ、反応サンプルを上昇させて検出チャンバー内の担体６１と接触させた。その後、実施例７又は８に記載した画像形成検出システムにより担体ストリップ６１上の呈色反応生成物を分析することができる。
実施例１０：推進剤膨脹の核形成
数個のガラスマイクロビーズ（平均直径０．２ｍｍ）（均質化ビーズ、Ｖｉｒｔｉｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｇａｒｄｉｎｅｒ，ＮＹ）を加えた以外は実施例５と同様の反応サンプルを調製した。次いで実施例６及び７に記載したステップを実施した。ガラスビーズは反応チャンバーの下端で沸騰の開始及び局在化のための核として機能し、こうして発生した蒸気は反応サンプルを検出チャンバーに移送するように機能する。その後、実施例７に記載した画像形成検出システム及び手順により担体ストリップ６１上の呈色反応生成物を分析した。
実施例１１：反応サンプル調製、βグロビン
ヒトβグロビン遺伝子（配列番号１０）とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブ（配列番号６、７、８及び９）をＡＢＩ  ＤＮＡ合成器でホスホラミダイト化学によって合成し、ビオチン又はアマダンタンでハプテン化した。
0003741439.tif 000005
Ｂａｃｋｍａｎ他のヨーロッパ特許出願第０４３９１８２号（１９９１）に記載されている所謂「ダブルギャップ」ＬＣＲ法を実施するために、反応サンプル混合物は総容量１００μＬ中の最終濃度で表した場合に、５０ｍＭ  ＥＰＰＳ  ｐＨ７．８、ｐＨ７．８及び２０ｍＭ  Ｋ+に達するようにＫＯＨで滴定したＫＣｌ、３０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１０μＭ  ＮＡＤ、１．７μＭ  ｄＧＴＰ、（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓからの）ＤＮＡリガーゼ９０００単位、（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓからの）ＤＮＡポリメラーゼ１単位、及び各オリゴヌクレオチド（配列番号６、７、８及び９）１×１０12コピー（１．７ｐｍｏｌ）を含有するものとした。標的はヒト胎盤ＤＮＡ２５０ｎｇ（約１０5コピー）であり、配列番号１０又は水を含む。
底部を融解して冷却しておいた実施例４Ｂの１００μＬ容反応チャンバーに反応混合物をピペット注入した。反応チャンバーを短時間遠心して反応混合物を管の底部に集めた。チューブに実施例３Ｂの検出ユニットを装着し、密封反応／検出ユニットを形成した。
実施例１２：ＤＮＡ分析及び反応チャンバーから検出チャンバーへの反応サンプルの移送
実施例１１で組立てた反応／形成ユニットを実施例１Ｂのサーマルサイクラーに挿入し、８８℃１０秒間と５３℃６０秒間の３５サイクルからなる温度シーケンスにかけ、ＬＣＲ反応を実施した。各サイクルを完了するには約２分間を要し、合計ＬＣＲ時間は約８０分間であった。増幅サイクルの完了後、リングを１０４℃まで加熱した。この温度を２５秒間維持した。反応混合物の熱膨張と蒸発により、液体サンプルは各反応エレメントから夫々に装着した検出エレメントに流入し、増幅サンプルは抗ビオチン複合体を含む乾燥パッドに侵入した。パッド中の標識抗体は可溶化し、混合物はクロマトグラフィーによりニトロセルロースストリップまで上昇した。試験サンプル中に適当なＤＮＡ配列が存在する場合には、増幅産物は抗アマダンタン捕獲部位に保持され、可視呈色が観察された。他の抗体部位は呈色しなかった。反応ユニットは図１４に示す。
実施例１３：ビデオ処理
実施例１１及び１２の反応／検出ユニットを実施例７及び８の手順に従って画像形成及び処理した。
実施例１４：多重担体
各々異なるハプテンに対して特異的な複数の抗体結合部位をもつ担体ストリップ６１を実施例３Ｂに記載したように作成した。ストリップは担体上の特定位置にビオチン標識卵アルブミンも含む。ビオチン標識タンパク質は対照又は参照標準として用いる。
実施例１５：多重検出
実施例５又は１１に記載したようにオリゴヌイクレオチドプローブを合成する。
・  実施例１１の４個のプローブはヒトβグロビン遺伝子とハイブリダイズする。プローブの２個は抗ビオチンラテックス複合体と結合できるように末端ビオチン部分を含み、１個は担体ストリップ上の特異結合ゾーンで抗アマダンタンと結合できるように末端アマダンタンを含む。これは陽性対照として用いる。
・  他の４個のプローブは天然には知られていない配列とハイブリダイズする。プローブの２個は抗ビオチチンラテックス複合体と結合できるように末端ビオチン部分を含み、２個は担体ストリップ上の特異結合ゾーンで抗ジベンゾフランと結合できるように末端ジベンゾフランを含む。これは陰性対照として用いる。
・  他の４個のプローブは嚢胞性繊維症のΔＦ508突然変異をコードするヒト染色体７の部分とハイブリダイズする。プローブの２個は抗ビオチンラテックス複合体と結合できるように末端ビオチン部分を含み、２個は担体ストリップ上の特異結合ゾーンで抗フルオレセインと結合できるように末端フルオレセインを含む。
・  他の４個のプローブは嚢胞性繊維症のＧ551Ｄ突然変異をコードするヒト染色体７の部分とハイブリダイズする。プローブの２個は抗ビオチンラテックス複合体と結合できるように末端ビオチン部分を含み、２個は担体ストリップ上の特異結合ゾーンで抗チオフェンカルバゾールと結合できるように末端チオフェンカルバールを含む。
・  他の４個のプローブは嚢胞性繊維症のＧ542Ｘ突然変異をコードするヒト染色体７の部分とハイブリダイズする。プローブの２個は抗ビオチンラテックス複合体と結合できるように末端ビオチン部分を含み、２個は担体ストリップ上の特異結合ゾーンで抗キノリンと結合できるように末端キノリンを含む。
・  他の４個のプローブは嚢胞性繊維症のＷ1282Ｘ突然変異をコードするヒト染色体７の部分とハイブリダイズする。プローブの２個は抗ビオチンラテックス複合体と結合できるように末端ビオチン部分を含み、２個は担体ストリップ上の特異結合ゾーンで抗ダンシルと結合できるように末端ダンシルを含む。
これらの突然変異の各々の周囲のＤＮＡ配列は文献に記載されている。次に実施例５〜６及び１１〜１２の条件を用いてＬＣＲ増幅を実施し、ストリップを展開し、実施例７〜８に記載したようにスポットを視覚化する。
実施例１６：多重ビデオ処理
各抗体（又はビオチン標識タンパク質）がストリップ上の３個以上の特異位置に結合する以外は、実施例１１と同様に担体ストリップ６１を作成する。複数の特異捕獲部位７４又は結合領域により、ビデオ処理プログラム６００は類似スポットからのシグナルを平均し、こうして特定結果の付値の信頼性を増すことができる。更に、類似スポットが呈色しない場合にはスプリアスシグナルを棄却することができる。
以上、本発明の好適態様について説明したが、当業者に自明の通り、本発明の実際の範囲内で構造、構成、組成等の変更が可能である。本発明の保護範囲は添付の請求の範囲により定義される。
配列表
配列番号：１
配列の長さ：１９
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列
0003741439.tif 000006
配列番号：２
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列
0003741439.tif 000007
配列番号：３
配列の長さ：１８
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列
0003741439.tif 000008
配列番号：４
配列の長さ：２１
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列
0003741439.tif 000009
配列番号：５
配列の長さ：５０
配列の型：核酸
鎖の数：２本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ゲノムＤＮＡ
配列
0003741439.tif 000010
配列番号：６
配列の長さ：１８
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列
0003741439.tif 000011
配列番号：７
配列の長さ：１８
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列
0003741439.tif 000012
配列番号：８
配列の長さ：１７
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列
0003741439.tif 000013
配列番号：９
配列の長さ：１９
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列
0003741439.tif 000014
配列番号：１０
配列の長さ：４７
配列の型：核酸
鎖の数：２本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ゲノムＤＮＡ
配列
0003741439.tif 000015
【図１】
0003741439.tif 000016
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図２Ｇ】
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【図２Ｈ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図９Ｇ】
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【図９Ｈ】
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【図９Ｉ】
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【図９Ｊ】
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【図９Ｋ】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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