(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
腸管出血性大腸菌Ｏ１５７の２３ＳｒＲＮＡに含まれる塩基配列又はその相補鎖塩基配列からなる４０塩基以下の核酸断片であって、下記の配列番号１〜３の塩基配列からなる群から選択された塩基配列からなる核酸断片、その相補鎖塩基配列からなる核酸断片、又は該塩基配列もしくは該相補鎖塩基配列とそれらの配列の３’側又は５’側に隣接する配列とからなる核酸断片。
配列番号１    ACAGAGCAAUCUGU
配列番号２    UUCUUUUAAUCU
配列番号３    CUCUUUUAAUCU
【請求項２】
腸管出血性大腸菌Ｏ１５７の２３ＳｒＲＮＡ遺伝子に含まれる塩基配列又はその相補鎖塩基配列からなる４０塩基以下の核酸断片であって、下記の配列番号４〜６の塩基配列からなる群から選択された塩基配列からなる核酸断片、その相補鎖塩基配列からなる核酸断片、又は該塩基配列もしくは該相補鎖塩基配列とそれらの配列の３’側又は５’側に隣接する配列とからなる核酸断片。
配列番号４    ACAGAGCAATCTGT
配列番号５    TTCTTTTAATCT
配列番号６    CTCTTTTAATCT
【請求項３】
請求項１又は２記載の核酸断片をプローブとして用いてハイブリダイゼーション法を行い腸管出血性大腸菌Ｏ１５７を検出することを特徴とする腸管出血性大腸菌Ｏ１５７の検出方法。
【請求項４】
検体中の腸管出血性大腸菌Ｏ１５７の２３ＳｒＲＮＡを鋳型としてＲＴ−ＰＣＲ法により、配列番号４〜６のいずれかの塩基配列を含むＤＮＡ断片を増幅させて、その後、請求項１又は２記載の核酸断片をプローブとして用いてハイブリダイゼーション法を行い腸管出血性大腸菌Ｏ１５７を検出することを特徴とする腸管出血性大腸菌Ｏ１５７の検出方法。
【請求項５】
検体中の腸管出血性大腸菌Ｏ１５７の２３ＳｒＲＮＡ遺伝子を鋳型としてＰＣＲ法により、配列番号４〜６のいずれかの塩基配列を含むＤＮＡ断片を増幅させて、その後、請求項１又は２記載の核酸断片をプローブとして用いてハイブリダイゼーション法を行い腸管出血性大腸菌Ｏ１５７を検出することを特徴とする腸管出血性大腸菌Ｏ１５７の検出方法。
【請求項６】
請求項１又は２記載の核酸断片をプライマーの一方として用いてＰＣＲ法を行うことを特徴とする請求項４又は５記載の検出方法。
【請求項７】
下記成分を含む、腸管出血性大腸菌Ｏ１５７検出用キット。
(1) 標識物質で標識された請求項１又は２に記載の核酸断片；
(2) 標識物質を検出するための試薬；及び
(3) ハイブリダイゼーション溶液
【請求項８】
下記成分を含む、腸管出血性大腸菌Ｏ１５７検出用キット。
(1) 請求項１又は２に記載の核酸断片を固定した担体；
(2) 腸管出血性大腸菌Ｏ１５７の２３ＳｒＲＮＡ又はその遺伝子上で (1)の核酸断片の3'側もしくは 5' 側でハイブリダイゼーションし得る核酸断片であって、標識物質で標識された核酸断片；
(3) 標識物質を検出するための試薬；及び
(4) ハイブリダイゼーション溶液
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、腸管出血性大腸菌Ｏ１５７（以下、EHEC O157 とも記す）ラージサブユニットリボゾームＲＮＡ（２３ＳｒＲＮＡ）及びその遺伝子(DNA) 部分塩基配列もしくはその相補鎖塩基配列を有する核酸断片、それらを用いるEHEC O157 の検出法・同定法、及びそれら核酸断片を用いるEHEC O157 検出用キットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
食品衛生について、管理法が時代とともに発展することによって食中毒は減少するものと考えられていたが、実際にはわが国でも、依然として毎年多くの食中毒事件が発生している。むしろ１件あたりの患者数は増加し、事件の大型化傾向が見られる。主な食中毒原因菌としては、黄色ブドウ球菌やサルモネラ菌などがよく知られているが、最近特に病原性大腸菌による食中毒が大きな社会問題となってきている。ヒトに食中毒を起こす大腸菌は、現在以下の５つに分類されている。
▲１▼  腸管病原性大腸菌(EPEC)
▲２▼  腸管組織侵入性大腸菌(EIEC)
▲３▼  腸管毒素原性大腸菌(ETEC)
▲４▼  腸管出血性大腸菌(EHEC)
▲５▼  腸管付着性大腸菌(EAEC)
上記▲４▼は病原大腸菌の中でも特に毒性が強く、その代表的な血清型がO157:H7 である。血清型O157のものを腸管出血性大腸菌Ｏ１５７（EHEC O157)と呼んでいる。多くの場合は発症後４〜８日で自然治癒するものの、きわめて重篤な症状（溶血性尿毒症症候群、HUS)に陥るケースがあり、死亡率も高い。EHECはVero毒素と呼ばれる細胞障害性毒素を生産しており、これが血管内皮細胞や腎糸球体細胞などを攻撃することによってHUS が惹起される。HUS の症状としては、溶血性貧血、腎機能低下による尿毒症、血小板破壊による出血が特長で、脳細胞にも傷害を与えると考えられている。
【０００３】
従って、EHECを簡便かつ迅速に検出することは非常に重要な意味を持っている。現在既に市販されている検出システムとしては、(1) O157抗血清を用いた免疫測定、及び(2) PCR 法（ポリメラーゼ・チェーン・リアクション法）を用いた診断、の２つに大別されるが、歴史的な背景から、前者が大部分を占めており、操作も簡単なものが多い。
Ｏ抗原型は所謂大腸菌のLPS の違いを反映しているわけであるが、もともと基本骨格はそれほど変わらないことから、これを対象とした検査法は、特異性という点では問題が多く、実際偽陽性率が極めて高い。
【０００４】
一方、上記(2) のDNA 診断を用いることによって、高感度の検出が可能となる。主たるターゲットは、Vero毒素遺伝子であり、これをPCR 法で検出する技法が多く開発され、実用に供され始めてきている。その他、最近ではβ- グルクロニダーゼ遺伝子をターゲットとしたPCR 法も開発されてきている。前述のように、HUS は、直接にはVero毒素による細胞障害によって惹起されることから、本毒素の検出は非常に重要であるといえる。しかしながら、本毒素はO157血清型、あるいはEHEC以外にも広範囲の血清型の大腸菌からも検出される一方、O157以外の血清型大腸菌では、あまり重篤な症状は惹起されない。実際、Vero毒素遺伝子陽性と判定された大腸菌野外分離株の大部分の血清型はO157ではない。
現在のところ、O157血清型の同定の方がVero毒素遺伝子検出よりも重要であるとされている。その意味で、β- グルクロニダーゼ遺伝子は現在判明している血清型の中で、O157型だけが陰性であることから、より特異的なO157型大腸菌の検出試験のターゲット遺伝子であるといえよう。
PCR 法は、非常に高感度な技術であり、かつ、DNA ハイブリダイゼーション法と組合わせることによって、特異性の高い検出試験が可能となる。ただし、酵素反応であるため、例えば培地成分による阻害などを受けやすく、培養液から直接検出するためには、DNA の精製操作が必要となる。また、非特異反応も出やすいため、単純にPCR 増幅DNA を検出するだけでは結果の信頼性が低いケースが多く、その場合ハイブリダイゼーションや塩基配列決定など、往々にしてPCR 増幅断片内部の塩基配列の検出が必要になる。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、 EHEC O157に特異的な核酸を見出し、その特異的な塩基配列を対象とした核酸断片を提供し、またそのような核酸断片を用いて、本菌を簡易に且つ確実に検出・同定する方法を提供し、さらに、そのような核酸断片を用いた EHEC O157検出用キットを提供することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記の目的を達成するためにEHEC、特にO157血清型EHECについて様々な遺伝子の解析を進めた。その中で rRNA 、中でもリボゾームラージサブユニットの構成RNA である23S rRNA遺伝子の全塩基配列を決定し、その結果、EHEC O157 の23S rRNA遺伝子の塩基配列中に、他の大腸菌とは異なる領域があることを見出した。また該遺伝子がコードするEHEC O157 の23S rRNAの塩基配列もまた、他の大腸菌のものと異なる領域を持つ。
【０００７】
従って本発明は、腸管出血性大腸菌Ｏ１５７の２３ＳｒＲＮＡに含まれる塩基配列又はその相補鎖塩基配列を有する１０塩基以上で４０塩基以下の核酸断片であって、下記の配列番号１〜３の塩基配列からなる群から選択された塩基配列又はその相補鎖塩基配列の少なくとも５塩基を含む核酸断片に関する。
配列番号１    ACAGAGCAAUCUGU
配列番号２    UUCUUUUAAUCU
配列番号３    CUCUUUUAAUCU
本発明はまた、上記腸管出血性大腸菌Ｏ１５７の２３ＳｒＲＮＡ遺伝子に含まれる塩基配列又はその相補鎖塩基配列を有する１０塩基以上で４０塩基以下の核酸断片であって、下記の配列番号４〜６の塩基配列からなる群から選択された塩基配列又はその相補鎖塩基配列の少なくとも５塩基を含む核酸断片に関する。
配列番号４    ACAGAGCAATCTGT
配列番号５    TTCTTTTAATCT
配列番号６    CTCTTTTAATCT
【０００８】
本発明はまた、上記核酸断片をプローブとして用いてハイブリダイゼーション法を行い腸管出血性大腸菌Ｏ１５７を検出することを特徴とする腸管出血性大腸菌Ｏ１５７の検出方法に関する。
本発明はさらに、検体中の腸管出血性大腸菌Ｏ１５７の２３ＳｒＲＮＡを鋳型としてＲＴ−ＰＣＲ法により、上記配列番号４〜６のいずれかの塩基配列を含むＤＮＡ断片を増幅させて、その後、上記核酸断片をプローブとして用いてハイブリダイゼーション法を行い腸管出血性大腸菌Ｏ１５７を検出することを特徴とする腸管出血性大腸菌Ｏ１５７の検出方法に関する。
本発明はまた、検体中の腸管出血性大腸菌Ｏ１５７の２３ＳｒＲＮＡ遺伝子を鋳型としてＰＣＲ法により、上記配列番号４〜６のいずれかの塩基配列を含むＤＮＡ断片を増幅させて、その後、上記核酸断片をプローブとして用いてハイブリダイゼーション法を行い腸管出血性大腸菌Ｏ１５７を検出することを特徴とする腸管出血性大腸菌Ｏ１５７の検出方法に関する。
上記の核酸断片は、ＰＣＲ法においてプライマーの一方として用いることができる。
【０００９】
さらに本発明は、下記成分を含む、腸管出血性大腸菌Ｏ１５７検出用キットに関する。
(1) 標識物質で標識された上記核酸断片；
(2) 標識物質を検出するための試薬；及び
(3) ハイブリダイゼーション溶液
本発明はまた、下記成分を含む、腸管出血性大腸菌Ｏ１５７検出用キットに関する。
(1) 上記の核酸断片を固定した担体；
(2) 腸管出血性大腸菌Ｏ１５７の２３ＳｒＲＮＡ又はその遺伝子上で (1)の核酸断片の3'側又は5'側でハイブリダイゼーションし得る核酸断片であって、標識物質で標識された核酸断片；
(3) 標識物質を検出するための試薬；及び
(4) ハイブリダイゼーション溶液
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明者らの研究により、 rRNA 遺伝子全体としては非常に相同性が高いものの、既に公開されている大腸菌 K12株 23S rRNA 遺伝子の5'側から550 番目前後の配列に相当する領域の塩基配列が、EHEC O157 と K12株の間で異なることが判明した。
腸管出血性大腸菌Ｏ１５７の２３ＳｒＲＮＡの塩基配列は、下記配列番号７に示される。なおこの配列の両末端は既知の大腸菌塩基配列から推測して決定したものである。
【００１１】
配列番号７
GGUUAAGCGA CUAAGCGUAC ACGGUGGAUG CCCUGGCAGU CAGAGGCGAU GAAGGACGUG   60
CUAAUCUGCG AUAAGCGUCG GUAAGGUGAU AUGAACCGUU AUAACCGGCG AUUUCCGAAU  120
GGGGAAACCC AGUGUGUUUC GACACACUAU CAUUAACUGA AUCCAUAGGU UAAUGAGGCG  180
AACCGGGGGA ACUGAAACAU CUAAGUACCC CGAGGAAAAG AAAUCAACCG AGAUUCCCCC  240
AGUAGCGGCG AGCGAACGGG GAGGAGCCCA GAGCCUGAAU CAGUGUGUGU GUUAGUGGAA  300
GCGUCUGGAA AGGCGCGCGA UACAGGGUGA CAGCCCCGUA CACAAAAAUG CACAUGCUGU  360
GAGCUCGAUG AGUAGGGCGG GACACGUGGU AUCCUGUCUG AAUAUGGGGG GACCAUCCUC  420
CAAGGCUAAA UACUCCUGAC UGACCGAUAG UGAACCAGUA CCGUGAGGGA AAGGCGAAAA  480
GAACCCCCGG CGRGGGGAGU GAAAAAGAAC CUGAAACCGU GUACGUACAA GCAGUGGGAG  540
CHYMKWKYAA UCUGUGUGAC UGCGUACCUU UUGUAUAAUG GGUCAGCGAC UUAUAUUCUG  600
UAGCAAGGUU AACCGAAUAG GGGAGCCGAA GGGAAACCGA GUCUUAACUG GGCGUUAAGU  660
UGCGGGGUAU ACACCCGAAA CCCGGUGAUC UACCCAUGGG CAUGUAGAGU GUUGGGUAAC  720
ACUAACUGGA GGACCGAACC GACUAAUGUU GAAAAAUUAG CGGAUGACUU GUGGCUGGGG  780
GUGAAAGGCC AAUCAAACCG GGAGAUAGCU GGUUCUCCCC GAAAGCUAUU UAGGUAGCGC  840
CUCGUGAAUU CAUCUCCGGG GGUAGAGCAC UGUUUCGGCA AGGGGGUCAU CCCGACUUAC  900
CAACCCGAUG CAAACUGCGA AUACCGGAGA AUGUUAUCAC GGGAGACACA CGGCGGGUGC  960
UAACGUCCGU CGUGAAGAGG GAAACAACCC AGACCGCCAG CUAAGGUCCC AAAGUCAUGG 1020
UUAAGUGGGA AACGAUGUGG GAAGGCCCAG ACAGCCAGGA UGUUGGCUUA GAAGCAGCCA 1080
UCAUUUAAAG AAAGCGUAAU AGCUCACUGG UCGAGUCGGC CUGCGCGGAA GAUGUAACGG 1140
GGCUAAACCA UGCACCGAAG CUGCGGCAGC GACACUUGUG UGUUGUUGGG UAGGGGAGCG 1200
UUCUGUAAGC CUGUGAAGGU GUGCUGUGAG GCAUGCUGGA GGUAUCAGAA GUGCGAAUGC 1260
UGACAUAAGU AACGAUAAAG CGGGUGAAAA GCCCGCUCGC CGGAAGACCA AGGGUUCCUG 1320
UCCAACGUUA AUCGGGGCAG GGUGAGUCGA CCCCUAAGGC GAGGCCGAAA GGCGUAGUCG 1380
AUGGGAAACA GGUUAAUAUU CCUGUACUUG GUGUUACUGC GAAGGGGGGA CGGAGAAGGC 1440
UAUGUUGGCC GGGCGACGGU UGUCCCGGUU UAAGCGUGUA GGCUGGUUUU CCAGGCAAAU 1500
CCGGAAAAUC AAGGCUGAGG CGUGAUGACG AGGCACUACG GUGCUGAAGC AACAAAUGCC 1560
CUGCUUCCAG GAAAAGCCUC UAAGCAUCAG GUAACAUCAA AUCGUACCCC AAACCGACAC 1620
AGGUGGUCAG GUAGAGAAUA CCAAGGCGCU UGAGAGAACU CGGGUGAAGG AACUAGGCAA 1680
AAUGGUGCCG UAACUUCGGG AGAAGGCACG CUGAUAUGUA GGUGAAGUCC CUCGCGGAUG 1740
GAGCUGAAAU CAGUCGAAGA UACCAGCUGG CUGCAACUGU UUAUUAAAAA CACAGCACUG 1800
UGCAAACACG AAAGUGGACG UAUACGGUGU GACGCCUGCC CGGUGCCGGA AGGUUAAUUG 1860
AUGGGGUCAG CGCAAGCGAA GCUCUUGAUC GAAGCCCCGG UAAACGGCGG CCGUAACUAU 1920
AACGGUCCUA AGGUAGCGAA AUUCCUUGUC GGGUAAGUUC CGACCUGCAC GAAUGGCGUA 1980
AUGAUGGCCA GGCUGUCUCC ACCCGAGACU CAGUGAAAUU GAACUCGCUG UGAAGAUGCA 2040
GUGUACCCGC GGCAAGACGG AAAGACCCCG UGAACCUUUA CUAUAGCUUG ACACUGAACA 2100
UUGAGCCUUG AUGUGUAGGA UAGGUGGGAG GCUUUGAAGU GUGGACGCCA GUCUGCAUGG 2160
AGCCGACCUU GAAAUACCAC CCUUUAAUGU UUGAUGUUCU AACGUGGACC CGUGAUCCGG 2220
GUUGCGGACA GUGUCUGGUG GGUAGUUUGA CUGGGGCGGU CUCCUCCUAA AGAGUAACGG 2280
AGGAGCACGA AGGUUGGCUA AUCCUGGUCG GACAUCAGGA GGUUAGUGCA AUGGCAUAAG 2340
CCAGCUUGAC UGCGAGCGUG ACGGCGCGAG CAGGUGCGAA AGCAGGUCAU AGUGAUCCGG 2400
UGGUUCUGAA UGGAAGGGCC AUCGCUCAAC GGAUAAAAGG UACUCCGGGG AUAACAGGCU 2460
GAUACCGCCC AAGAGUUCAU AUCGACGGCG GUGUUUGGCA CCUCGAUGUC GGCUCAUCAC 2520
AUCCUGGGGC UGAAGUAGGU CCCAAGGGUA UGGCUGUUCG CCAUUUAAAG UGGUACGCGA 2580
GCUGGGUUUA GAACGUCGUG AGACAGUUCG GUCCCUAUCU GCCGUGGGCG CUGGAGAACU 2640
GAGGGGGGCU GCUCCUAGUA CGAGAGGACC GGAGUGGACG CAUCACUGGU GUUCGGGUUG 2700
UCAUGCCAAU GGCACUGCCC GGUAGCUAAA UGCGGAAGAG AUAAGUGCUG AAAGCAUCUA 2760
AGCACGAAAC UUGCCCCGAG AUGAGUUCUC CCUGACCCUU UAAGGGUCCU GAAGGAACGU 2820
UGAAGACGAC GACGUUGAUA GGCCGGGUGU GUAAGCGCAG CGAUGCGUUG AGCUAACCGG 2880
UACUAAUGAA CCGUGAGGCU UAACCUU                                     2907
【００１２】
腸管出血性大腸菌Ｏ１５７の２３ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列は下記配列番号８で示される。なお両末端は、既知の大腸菌塩基配列から推測して決定している。
配列番号８
GGTTAAGCGA CTAAGCGTAC ACGGTGGATG CCCTGGCAGT CAGAGGCGAT GAAGGACGTG   60
CTAATCTGCG ATAAGCGTCG GTAAGGTGAT ATGAACCGTT ATAACCGGCG ATTTCCGAAT  120
GGGGAAACCC AGTGTGTTTC GACACACTAT CATTAACTGA ATCCATAGGT TAATGAGGCG  180
AACCGGGGGA ACTGAAACAT CTAAGTACCC CGAGGAAAAG AAATCAACCG AGATTCCCCC  240
AGTAGCGGCG AGCGAACGGG GAGGAGCCCA GAGCCTGAAT CAGTGTGTGT GTTAGTGGAA  300
GCGTCTGGAA AGGCGCGCGA TACAGGGTGA CAGCCCCGTA CACAAAAATG CACATGCTGT  360
GAGCTCGATG AGTAGGGCGG GACACGTGGT ATCCTGTCTG AATATGGGGG GACCATCCTC  420
CAAGGCTAAA TACTCCTGAC TGACCGATAG TGAACCAGTA CCGTGAGGGA AAGGCGAAAA  480
GAACCCCCGG CGRGGGGAGT GAAAAAGAAC CTGAAACCGT GTACGTACAA GCAGTGGGAG  540
CHYMKWKYAA TCTGTGTGAC TGCGTACCTT TTGTATAATG GGTCAGCGAC TTATATTCTG  600
TAGCAAGGTT AACCGAATAG GGGAGCCGAA GGGAAACCGA GTCTTAACTG GGCGTTAAGT  660
TGCGGGGTAT ACACCCGAAA CCCGGTGATC TACCCATGGG CATGTAGAGT GTTGGGTAAC  720
ACTAACTGGA GGACCGAACC GACTAATGTT GAAAAATTAG CGGATGACTT GTGGCTGGGG  780
GTGAAAGGCC AATCAAACCG GGAGATAGCT GGTTCTCCCC GAAAGCTATT TAGGTAGCGC  840
CTCGTGAATT CATCTCCGGG GGTAGAGCAC TGTTTCGGCA AGGGGGTCAT CCCGACTTAC  900
CAACCCGATG CAAACTGCGA ATACCGGAGA ATGTTATCAC GGGAGACACA CGGCGGGTGC  960
TAACGTCCGT CGTGAAGAGG GAAACAACCC AGACCGCCAG CTAAGGTCCC AAAGTCATGG 1020
TTAAGTGGGA AACGATGTGG GAAGGCCCAG ACAGCCAGGA TGTTGGCTTA GAAGCAGCCA 1080
TCATTTAAAG AAAGCGTAAT AGCTCACTGG TCGAGTCGGC CTGCGCGGAA GATGTAACGG 1140
GGCTAAACCA TGCACCGAAG CTGCGGCAGC GACACTTGTG TGTTGTTGGG TAGGGGAGCG 1200
TTCTGTAAGC CTGTGAAGGT GTGCTGTGAG GCATGCTGGA GGTATCAGAA GTGCGAATGC 1260
TGACATAAGT AACGATAAAG CGGGTGAAAA GCCCGCTCGC CGGAAGACCA AGGGTTCCTG 1320
TCCAACGTTA ATCGGGGCAG GGTGAGTCGA CCCCTAAGGC GAGGCCGAAA GGCGTAGTCG 1380
ATGGGAAACA GGTTAATATT CCTGTACTTG GTGTTACTGC GAAGGGGGGA CGGAGAAGGC 1440
TATGTTGGCC GGGCGACGGT TGTCCCGGTT TAAGCGTGTA GGCTGGTTTT CCAGGCAAAT 1500
CCGGAAAATC AAGGCTGAGG CGTGATGACG AGGCACTACG GTGCTGAAGC AACAAATGCC 1560
CTGCTTCCAG GAAAAGCCTC TAAGCATCAG GTAACATCAA ATCGTACCCC AAACCGACAC 1620
AGGTGGTCAG GTAGAGAATA CCAAGGCGCT TGAGAGAACT CGGGTGAAGG AACTAGGCAA 1680
AATGGTGCCG TAACTTCGGG AGAAGGCACG CTGATATGTA GGTGAAGTCC CTCGCGGATG 1740
GAGCTGAAAT CAGTCGAAGA TACCAGCTGG CTGCAACTGT TTATTAAAAA CACAGCACTG 1800
TGCAAACACG AAAGTGGACG TATACGGTGT GACGCCTGCC CGGTGCCGGA AGGTTAATTG 1860
ATGGGGTCAG CGCAAGCGAA GCTCTTGATC GAAGCCCCGG TAAACGGCGG CCGTAACTAT 1920
AACGGTCCTA AGGTAGCGAA ATTCCTTGTC GGGTAAGTTC CGACCTGCAC GAATGGCGTA 1980
ATGATGGCCA GGCTGTCTCC ACCCGAGACT CAGTGAAATT GAACTCGCTG TGAAGATGCA 2040
GTGTACCCGC GGCAAGACGG AAAGACCCCG TGAACCTTTA CTATAGCTTG ACACTGAACA 2100
TTGAGCCTTG ATGTGTAGGA TAGGTGGGAG GCTTTGAAGT GTGGACGCCA GTCTGCATGG 2160
AGCCGACCTT GAAATACCAC CCTTTAATGT TTGATGTTCT AACGTGGACC CGTGATCCGG 2220
GTTGCGGACA GTGTCTGGTG GGTAGTTTGA CTGGGGCGGT CTCCTCCTAA AGAGTAACGG 2280
AGGAGCACGA AGGTTGGCTA ATCCTGGTCG GACATCAGGA GGTTAGTGCA ATGGCATAAG 2340
CCAGCTTGAC TGCGAGCGTG ACGGCGCGAG CAGGTGCGAA AGCAGGTCAT AGTGATCCGG 2400
TGGTTCTGAA TGGAAGGGCC ATCGCTCAAC GGATAAAAGG TACTCCGGGG ATAACAGGCT 2460
GATACCGCCC AAGAGTTCAT ATCGACGGCG GTGTTTGGCA CCTCGATGTC GGCTCATCAC 2520
ATCCTGGGGC TGAAGTAGGT CCCAAGGGTA TGGCTGTTCG CCATTTAAAG TGGTACGCGA 2580
GCTGGGTTTA GAACGTCGTG AGACAGTTCG GTCCCTATCT GCCGTGGGCG CTGGAGAACT 2640
GAGGGGGGCT GCTCCTAGTA CGAGAGGACC GGAGTGGACG CATCACTGGT GTTCGGGTTG 2700
TCATGCCAAT GGCACTGCCC GGTAGCTAAA TGCGGAAGAG ATAAGTGCTG AAAGCATCTA 2760
AGCACGAAAC TTGCCCCGAG ATGAGTTCTC CCTGACCCTT TAAGGGTCCT GAAGGAACGT 2820
TGAAGACGAC GACGTTGATA GGCCGGGTGT GTAAGCGCAG CGATGCGTTG AGCTAACCGG 2880
TACTAATGAA CCGTGAGGCT TAACCTT                                     2907
【００１３】
EHEC O157 の23S rRNA遺伝子の塩基配列中に、他の大腸菌と異なる領域が存在することは、意外な発見であった。というのは、rRNA遺伝子は一般に非常に保存性が高いとされており、種が同じであれば遺伝子構造＝塩基配列はほとんど変わらないと考えられていたからである。勿論、rRNA遺伝子は複数個存在しており、個々の遺伝子間で若干の相違がある、ということは充分考えられることから、同じ菌に於いても、例えば遺伝子データベースに収録されている大腸菌 23S rRNA 遺伝子の塩基配列とは（わずかに）異なる領域があっても不思議ではない。しかしながら、後述の実施例で示すとおり、EHEC O157 の23S rRNAあるいは23S rRNA遺伝子に特異的な塩基配列を対象とした核酸検出を行なうと、他の大腸菌とははっきり区別される。即ち、23S rRNA遺伝子塩基配列中に、EHEC O157 と他の大腸菌の間で異なる配列があり、適切な検出用核酸を用いた核酸検出システムを用いて容易に識別できる、ということが結論される。
【００１４】
このように、rRNAを対象するメリットとしては、以下のような点が挙げられよう。即ち、
(1) 遺伝子構造の保存性が高く、突然変異率が非常に低い。
(2)  rRNA は細胞１個あたり104 分子以上存在しており、rRNAを検出の対象とすることが可能である場合に、高感度で検出が可能となる。
(3)  rRNA の抽出法はいくつかあるが、例えば単純なアルカリ処理による抽出が可能であり、簡単であると同時に、かつ安全性が高い（アルカリ処理によって菌は全て死滅する）。
従って、rRNA及びその遺伝子をEHEC O157 の検出・同定手段として用いることができれば、食中毒検査分野に於ける価値は非常に高いものと言える。
【００１５】
rRNAもしくはその遺伝子を対象とした検出方法としては、核酸ハイブリダイゼーション検出システム、具体的には、サンドイッチ型RNA 検出法、ドットブロットハイブリダイゼーション法、あるいはポリメラーゼ・チェーン・リアクション法(PCR法) と組み合わせたハイブリダイゼーション法などの現在普遍的に用いられている核酸検出方法が採用できる。
EHEC O157 を検出するためのハイブリダイゼーション法において、EHEC O157 23S rRNA又はその遺伝子に特異的な部分塩基配列又はその相補鎖塩基配列を含むプローブが有用である。
EHEC O157 23S rRNAに存在する特異的な部分塩基配列として下記がある。
配列番号１    ACAGAGCAAUCUGU  （配列番号７の5'側から542-555 番目)
配列番号２    UUCUUUUAAUCU     (配列番号７の5'側から542-553 番目)
配列番号３    CUCUUUUAAUCU    （配列番号７の5'側から542-553 番目)
また、EHEC O157 23S rRNA遺伝子の特異的な部分塩基配列として下記がある。
配列番号４    ACAGAGCAATCTGT  （配列番号８の5'側から542-555 番目)
配列番号５    TTCTTTTAATCT    （配列番号８の5'側から542-553 番目)
配列番号６    CTCTTTTAATCT     (配列番号８の5'側から542-553 番目)
【００１６】
EHEC O157 23S rRNA又はその遺伝子に含まれる塩基配列又はその相補鎖塩基配列を有する１０塩基以上で４０塩基以下の核酸断片であって、上記配列番号１〜６のいずれかの塩基配列又はその相補鎖塩基配列の少なくとも５塩基を含む核酸断片を、EHEC O157 検出用のプローブとして使用することができる。
そのような核酸断片の具体例として、以下の塩基配列を有するものがある。
配列番号９    GGAGCACAGAGCAATCTGT （配列番号８の5'側から537-555 番目)
配列番号10    AGATTGCTCTGTGCTCC    (配列番号８の5'側から537-553 番目の相補鎖)
配列番号11    AGATTAAAAGAAGCTCC   （配列番号８の5'側から537-553 番目の相補鎖)
配列番号12    AGATTAAAAGAGGCTCC （配列番号８の5'側から537-553 番目の相補鎖)
さらに具体的には、配列番号９の塩基配列は配列番号４の塩基配列を含み、配列番号10の塩基配列は配列番号４の塩基配列の相補鎖塩基配列を含み、配列番号11の塩基配列は配列番号５の塩基配列の相補鎖塩基配列を含み、及び配列番号12の塩基配列は配列番号６の塩基配列の相補鎖塩基配列を含むものである。
上記のような核酸断片を、EHEC O157 検出用核酸プローブとして用いることによって、 EHEC O157を特異的に検出することが可能となる。
上記核酸断片はＤＮＡ断片でもＲＮＡ断片でもよい。
これらの核酸断片は、通常のDNA 合成機を用いて製造することができる。なお、後述の実施例で使用する核酸断片はDNA 合成機で合成したものである。
【００１７】
さらに具体的には、例えば配列番号９〜12のいずれかで示される塩基配列を有する核酸断片を標識物質で標識して、ハイブリダイゼーション法のプローブとすることができる。標識物質としては、特に限定されるものではないが、例えば▲１▼ビオチン、▲２▼ディゴキシゲニン、▲３▼アルカリフォスファターゼなどの酵素、あるいは▲４▼フルオロエッセインなどの蛍光物質などが用いられる。ビオチンを使用した場合、ビオチン結合性を持った物質であるアビジンとアルカリフォスファターゼなどの酵素の複合体と検体に結合したビオチンの結合反応（ハイブリダイゼーション反応）を行わせた後、酵素反応を指標として検出する。ディゴキシゲニンでは、抗ジゴキシゲニン抗体と酵素の複合体を用いて、ビオチンと同様の手順で検出する。アルカリフォスファターゼなどの酵素では、ハイブリダイゼーションの後、直接酵素反応を行わせることで検出する。ビオチンやディゴキシゲニンに比べて簡便で感度も高いが、酵素自体が若干不安定であるため、取扱いに注意を要する。フルオロエッセインなどの蛍光物質では、ハイブリダイゼーションにより結合した蛍光物質の蛍光強度を測定する。非常に簡便であるが感度が若干劣る。これらの標識物質は状況に応じて適宜使い分けられる。
【００１８】
さらに上記の標識された核酸断片と、捕捉プローブとして EHEC O157 23S rRNA 又はEHEC O157 23S rRNA遺伝子上で上記標識された核酸断片の3'側又は5'側でハイブリダイゼーションし得る核酸断片を使用して、サンドイッチハイブリダイゼーション法を実施することができる。
上記のEHEC O157 23S rRNA又はEHEC O157 23S rRNA遺伝子上で標識された核酸断片の3'側又は5'側でハイブリダイゼーションし得る核酸断片は、好ましくは、EHEC O157 23S rRNA又はEHEC O157 23S rRNA遺伝子上で標識された核酸断片が結合する部位の3'側又は5'側で隣接する部位の10〜40塩基の塩基配列に対して、相補的塩基配列を有する核酸断片である。
また、例えば配列番号９〜12のいずれかで示される塩基配列を有する核酸断片を担体に捕捉させて捕捉用プローブとし、EHEC O157 23S rRNA又はEHEC O157 23S rRNA遺伝子上で捕捉用の核酸断片の3'側又は5'側でハイブリダイゼーションし得る核酸断片を標識して標識プローブとして、サンドイッチハイブリダイゼーション法を実施することができる。
ハイブリダイゼーション法で使用するハイブリダイゼーション溶液、洗浄液、標識物質を検出するための試薬などは、慣用のものから適宜選択することができる。
【００１９】
さらにポリメラーゼ・チェーン・リアクション法（PCR 法) とハイブリダイゼーション法を組み合わせることができる。PCR 法では、ＤＮＡもしくはＲＮＡを鋳型とすることができる。ＲＮＡを鋳型とする場合、逆転写反応とPCR 法を組み合わせた方法（RT-PCR法) を実施することができる。
RT-PCR法又はPCR 法により、検体中のEHEC O157 23S rRNA又はEHEC O157 23S rRNA遺伝子を鋳型として、配列番号１〜６のいずれかの塩基配列を含むＤＮＡ断片を増幅させて、その後、上述のようなハイブリダイゼーション法を行ってEHEC O157 を検出することができる。このようなPCR 法に使用するプライマーの一方として、EHEC O157 23S rRNA又はその遺伝子に含まれる塩基配列又はその相補鎖塩基配列を有する１０塩基以上で４０塩基以下の核酸断片であって、上記配列番号１〜６のいずれかの塩基配列又はその相補鎖塩基配列の少なくとも５塩基を含むＤＮＡ断片を使用することができる。
PCR 法あるいはRT-PCR法の手順、使用する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼと逆転写酵素の両方の酵素活性をもったタンパク質、PCR 反応用バッファー、RT-PCR反応用バッファー、デオキリボヌクレオチド３リン酸混合物などは、常法に従ったものでよい。
また、試験用溶液の調製は、常法に従って、フェノールなどを用いた核酸抽出法に従ってもよいが、それよりも単に培養液は検体の水懸濁液などを数分煮沸処理し、得られた液を直接ＰＣＲ用試験溶液として用いてもよい。
【００２０】
以下、実施例により本発明をより詳しく説明する。
【実施例１】
PCR 法によるEHEC O157 の23S rRNA遺伝子の調製
EHEC O157 ( NIH11530株）からのDNA の調製を、以下の手順で行なった。
寒天培地上の集落をエーゼで集め、10 mM Tris-HCl、pH8.0/0.1M EDTA/100 μg/ml Proteinase K に懸濁する。その後、1/20容の10% SDS を加え、50℃, 30分処理する。当容の10 mM Tris-HCl,pH8.0/1mM EDTA(以下、TEバッファー）飽和フェノールを加え攪拌、10分放置後、再度攪拌し、2,000rpm、５分間、室温で遠心分離する。上層（水層）をとり、当容のTE飽和フェノール／クロロホルム(1:1) を加え攪拌後上記の条件で遠心分離、更に、上層（水層）をとり、当容のTE飽和クロロホルムを加え攪拌後上記の条件で遠心分離する。得られた水層に２倍容のエタノールを加え、氷中で10分放置する。
凝集したDNA をプラスチックチップで注意深く採取し、70% エタノールでリンス後、新たなプラスチックチューブに入れる。乾燥後、100 μg/ml DNaseフリーRNase A に溶解し、37℃,30 分処理を行なう。上記と同様の手順でフェノール処理→フェノール／クロロホルム処理→クロロホルム処理→エタノール沈殿→洗浄→乾燥を行ない、最終的に適当量のTEバッファーに溶解する。
【００２１】
得られたDNA を鋳型として、下記配列番号13、14で表される塩基配列のＤＮＡ断片をプライマーセットとして用いて、表１の反応液組成、表２の反応条件でPCR を行ない、23S rRNA遺伝子を含む増幅DNA 断片を得た。なお、この後記載するPCR 試験は全て表１に記載された組成で行なった。
配列番号13    GGTTAAGCGACTAAGCGTAC
配列番号14    AAGGTTAAGCCTCACGGTTC
【００２２】
【表１】
PCR反応液の組成
─────────────────────────
検体DNA                         0.01〜0.1 μg
プライマーDNA                   各 0.2 pmol
デオキシリボ核酸３リン酸(dNTPs) 各 20 mM
Taq DNA ポリメラーゼ            2 ユニット
20 mM トリス塩酸バッファー, pH8.3
1.5  mM 塩化マグネシウム
25 mM 塩化カリウム
0.5  %ツイーン 20
100 μg/ml牛血清アルブミン
液量                              50μl
─────────────────────────
【００２３】
【表２】
反応条件
0003810162.tif 000002
【００２４】
【実施例２】
EHEC O157 の23S rRNA遺伝子特異的塩基配列の同定
実施例１で得られたEHEC O157 の23S rRNA遺伝子増幅DNA 断片について、DNA シークエンサーを用いて全塩基配列の解析を行なった。尚、5'側から550 塩基前後の領域で、10塩基程度のヘテロな配列が確認された。この領域は配列番号４あるいは配列番号５で示される塩基配列を含む。即ち、ｒＲＮＡ遺伝子は１ゲノムに複数個存在していることが知られているが、 EHEC O157の場合は、これがヘテロであることが示唆された。
決定したEHEC O157 の23S rRNA遺伝子について、塩基配列が解明されている他の各種細菌の23S rRNA遺伝子とコンピューターを用いた比較分析を行なった。その結果、上述のヘテロな領域で、大腸菌及び既知の細菌のものとは異なる配列が確認された。
この違いを特定するため、実施例１で得られたEHEC O157 のDNA から、下記配列番号15、16で表わされるプライマーセットを用いてPCR 反応を行ない、増幅断片を得た。この増幅断片はEHEC O157 の23S r ＲＮＡ遺伝子の一部であり、上述のヘテロな配列を含んでいる。
配列番号15     GGGAGTGAAAAAGAACCTGA （配列番号８の5'側から495-514 番目の配列)
配列番号16     AATTTTTCAACATTAGTCGG
配列番号16は大腸菌 K12株の23S rRNA遺伝子の731-750 番目の位置に相当する配列の相補鎖配列であって、既知の腸内細菌23S rRNA遺伝子で共通配列として見出されるものである。
【００２５】
得られた増幅断片を定法に従い大腸菌プラスミド( pUC118 )に組込み、大腸菌JM109 に形質転換した。得られた形質転換株を独立に10株選択し、定法に従い塩基配列を決定した。
その結果、少なくとも配列番号４、５及び６で表わされる３種類の塩基配列があることが判明した。
配列番号６で表わされる塩基配列は、配列番号５で表される配列と5'側の１塩基だけが異なっている。
配列番号４、５あるいは６で表される塩基配列を含み、かつEHEC O157 の23S rRNA遺伝子で前後に延長した30以下の塩基配列について、既知の細菌の23S rRNA遺伝子全体を対象としてホモロジー検索を行なったところ、通常用いられている核酸結合試験で偽陽性が検出される可能性のある領域は見出されなかった。
以下の実施例では、このEHEC O157 特異領域を対象とした核酸検出法の開発とその結果について記載する。
【００２６】
【実施例３】
EHEC O157 の23S rRNA遺伝子特異的領域をプライマーとして用いたPCR 試験
各種細菌からのDNA の調製は実施例１の方法に従い、各細菌で通常用いられる平板培地上に生育した集落から調製した。PCR 用プライマーは以下の３種類の合成DNA を用いた。
PCR 反応は、(1) 配列番号９及び前記配列番号16、(2) 前記配列番号16及び下記配列番号17で表される２組のプライマーセットを用いて行なった（それぞれセット１、セット２という）。
配列番号17    GGGAGCACGCTTAGG
配列番号17は、大腸菌 K12株の23S rRNA遺伝子のうち、5'側から536-550 番目の位置に相当する配列である。
更に、コントロール用として、下記配列番号18及び配列番号19で表される合成DNA をVero毒素遺伝子検出用プライマーとしてPCR を行なった（セット３）。なお、セット３は、Vero毒素Ｉ型、II型遺伝子の双方を増幅できるプライマーセットである。
配列番号18    GGTTAAGCGACTAAGCGTAC
配列番号19    AAGGTTAAGCCTCACGGTTC
以下の表３にPCR 反応条件を記載する。
【００２７】
【表３】
反応条件
0003810162.tif 000003
【００２８】
上記のPCR 反応により、検体DNA が適切であった場合、いずれのセットも約200 塩基対の２本鎖DNA が得られる。この反応液を 10 μl をとり、2.5 μl の stop bufferを加え、1.5%アガロース／トリスホウ酸バッファー系で電気泳動を行なった後、エチジウムブロマイド染色により、増幅されたVero毒素部分遺伝子の確認を行った。
その結果を表４に示す。表中、＋はVero毒素部分遺伝子が増幅されたものを示し、−はVero毒素部分遺伝子が増幅されされなかったものを示す。
【００２９】
【表４】
0003810162.tif 000004
【００３０】
表４に示される結果より、プライマーセット１では、 EHEC O157の部分遺伝子のみが増幅されていることが判明した。なお、表４に示したプライマーセット１による結果は、O157型特異領域を上流プライマーとして用いたものである。結果は示さないが、O157型特異領域を下流プライマーとして同様の実験を行なったところ、全く同じ結果が得られた。
配列番号９及び配列番号16で表されるDNA をプライマーとして用いてPCR を行なうと、鋳型としてEHEC O157 から調製したDNA を用いた場合にのみ増幅DNA が検出され、他の血清型の大腸菌から調製したDNA では全く検出されない。一方、配列番号17及び配列番号16で表されるDNA をプライマーとして用いてPCR を行なうと、 EHEC O157以外の血清型の大腸菌 DNAでは一様に増幅DNA が検出されたものの、鋳型としてEHEC O157 から調製したDNA を用いた場合、全く検出されなかった。このことは、例えば配列番号４で表される塩基配列がEHEC O157 特異的であり、これを対象とした核酸検出法を用いることによって、 EHEC O157と他の血清型大腸菌が容易に識別可能であることを示唆する。
【００３１】
【実施例４】
PCR 増幅DNA からのEHEC O157 の23S rRNA遺伝子特異的領域の検出
（共通領域をプライマーとしてPCR を行ない、ハイブリダイゼーションによって検出する）
次に、下記配列番号20、21で表わされる塩基配列のDNA をプライマーセットとしてPCR 法を行ない、得られた増幅DNA 中に含まれるEHEC O157 の23S rRNA特異的塩基配列をドットブロットハイブリダイゼーション法を用いて検出する試験を行なった（本セットを用いたPCR で約250 塩基対のDNA が増幅される）。反応条件は表３に示したものと同じである。
配列番号20    ATCCTCCAAGGCTAAATAC （配列番号８の5'側から415-433 番目)
配列番号21    CTGACCCATTATACAAAAG （配列番号８の5'側から568-586 番目の相補鎖)
【００３２】
ステップ１：PCR 反応
PCR 反応は実施例３に記載された方法を用いて行なった。反応液を実施例３と同様の方法で電気泳動を行なったところ、試験に供した菌株のDNA の全てから増幅断片が検出された。
ステップ２：検出用核酸の標識
上記の増幅DNA に含まれると考えられるEHEC O157 の23S rRNA遺伝子に特異的な塩基配列を検出するため、配列番号９で表されるDNA を、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（TdT)を用いて表５に示される組成の反応液でディゴキシゲニン標識した。
【００３３】
【表５】
────────────────────────────
カコジル酸カリウム緩衝液、pH7.2             0.1 M
塩化コバルト                                2 mM
ジチオスレイトール                          0.2 mM
デオキシアデノシン３リン酸ナトリウム         1 mM
ジゴキシゲニン化デオキシウリジン３リン酸     0.2 mM
プローブ用DNA                                1μM
TdT                                         50-100 U
────────────────────────────
【００３４】
37℃, １時間の標識反応後、1/10容の0.2M EDTA 、1/10容の4M LiCl 、３μg のグリコーゲン及び2.5 倍容のエタノールを加え−80℃、一晩放置した。遠心分離により沈殿を集め、70％エタノールで洗浄し乾燥させた後、適量の10mM Tris-HCl,pH8/1mM EDTAに溶かした。
得られた標識プローブの一定量を表１に示すハイブリダイゼーションバッファーと混合した（標識プローブ液）。なお、標識プローブ液は４℃で半年以上安定である。
【００３５】
ステップ３：ドットブロットハイブリダイゼーション
反応液20μl を別のチューブにとり、沸騰水中で10分処理を行ない、軽く遠心操作を行なった後、その10μl を、吸引しながらナイロンメンブレンフィルターにチャージする。定法に従い紫外線照射によってDNA をフィルターに固定する。
DNA を固定したフィルターを表６で表されるプレハイブリダイゼーションバッファー中で、68℃、１時間振盪する。その後、フィルターをビニール袋に入れ、表６のプレハイブリダイゼーションバッファーに、ステップ２で標識したハイブリダイゼーションプローブを適量入れた液を加え、シールする。
【００３６】
【表６】
────────────────────────────
SSC (*)                                         5x
ブロッキング試薬（ベーリンガーマンハイム社)     1%
N-ラウロイルザルコシン                         0.1%
ドデシル硫酸ナトリウム (SDS)                   0.2%
────────────────────────────
(*)0.15M塩化ナトリウム/0.015M クエン酸ナトリウム
【００３７】
69℃, 4-16時間振盪した後、袋からフィルターを取り出し、2xSSC, 0.1% SDS 溶液で２回（室温, ５分）、0.1xSSC, 0.1% SDS 溶液で２回 (68℃, 15分）、0.1M Tris-HCl,pH7.5/0.15M NaCl溶液で１回（室温、１分）、ブロッキング溶液（0.5%ブロッキング試薬-0.1M Tris-HCl,pH7.5/0.15M NaCl ）で１回（室温、15分）、0.1M Tris-HCl,pH7.5/0.15M NaCl溶液で１回（室温、１分）する。フィルターをビニール袋に入れ、アルカリフォスファターゼ標識抗Dig ヒツジ抗体, Fab フラグメント（0.15 U/ml)を含むブロッキング液を加えシールする。１時間放置後、フィルターをシールから取り出し、0.1M Tris-HCl,pH7.5/0.15M NaCl溶液で２回（室温、15分）、0.01M Tris-HCl,pH8.0/1mM EDTA 溶液で１回（室温、２分）洗浄する。
酵素反応による発色を行なうため、直前に調製した発色基質液(0.175 mg/ml 5- ブロモ-4- クロロ-3- インドリル- リン酸/0.45 mg/ml 4-ニトロブルー・テトラゾリウム/10mM Tris-HCl, pH8.0 、1mM EDTA) 10 ml を加え5-15分放置する。袋から取り出し、イオン交換水で充分洗浄し風乾、結果を目視で判定した。
結果を表７に示す。＋はハイブリダイゼーションプローブがＰＣＲ法で増幅された23S rRNA部分遺伝子と結合したものを表し、−は結合しなかったものを表す。
【００３８】
【表７】
0003810162.tif 000005
【００３９】表７に示される結果より、配列番号９で表される塩基配列のDNA をディゴキシゲニンで標識したものを、PCR により増幅された特異的塩基配列検出用のハイブリダイゼーションプローブとして用いることによって、O157型大腸菌のみを特異的に検出することが可能であることが判明した。
【００４０】
【実施例５】
ドットブロットハイブリダイゼーションによる EHEC O157の23S rRNAの検出
実施例４は23S rRNA遺伝子（DNA)を検出の対象としたものであった。本実施例では、rRNA自身をターゲットとして、ドットブロットハイブリダイゼーションにより検出試験を行なった結果を示す。
検出用核酸プローブとして、配列番号10で表わされる塩基配列のDNA を実施例４の方法に従いディゴキシゲニン標識したものを用いた。配列番号10の相補鎖は実施例２で解明された EHEC O157の 23S rRNA 遺伝子の部分塩基配列である。
配列番号10    AGATTGCTCTGTGCTCC
各細菌をそれぞれの菌で通常用いられる液体培地中で一晩培養し、その培養液を検出試験に供した。培養液 800μl に 0.02ml の2N NaOH を加え撹拌し10分放置後、0.02mlの2N HCl-0.2M リン酸ナトリウム緩衝液，pH7 を加え中和する（溶菌液）。
溶菌液 500μl を、吸引しながらナイロンメンブレンフィルターにチャージする。定法に従い紫外線照射によってRNA をフィルターに固定する。
以下の検出手順は実施例４に記載された方法に従った。
生菌数は段階希釈液を各細菌で通常用いられる平板培地上にまき一晩培養、得られたコロニーをカウントすることによって測定した。結果は示さないが、いずれの培養液からも108/ml以上の菌が検出された。また、アルカリ中和処理液からはいずれの検体からも生菌は検出されなかった。
結果を表８に示す。＋はハイブリダイゼーションプローブが結合したものを表し、−は結合しなかったものを表す。
【００４１】
【表８】
0003810162.tif 000006
【００４２】
表８の結果より、配列番号10で表される塩基配列のDNA をディゴキシゲニンで標識したものを、アルカリ溶菌した検体に含まれるEHEC O157 の23S rRNAに特異的塩基配列検出用プローブとして用いることによって、 EHEC O157のみを特異的に検出することが可能であることが判明した。
また、ドットブロットハイブリダイゼーションに供した細菌のアルカリ中和処理液からいずれも生菌が検出されなかったことから、アルカリ処理によってすべての菌が死滅したことが示唆される。即ち、培養後に生菌を扱うことがないため、本試験法は安全性が極めて高いものとなっていることがわかる。
【００４３】
【実施例６】
サンドイッチハイブリダイゼーションによる EHEC O157型の23S rRNAの検出
実施例５で示したドットブロットハイブリダイゼーションは優れた方法であるものの、(1) 定量性に欠ける；(2) 操作がやや煩雑である；(3) 少数の検体を扱う場合、ロスが多い、などの欠点があり、これを解決するため、本発明者らは、マイクロタイタープレートを用いた検出システムを開発している（特開平７−３９３９８号公報）。このシステムを用いることにより、上記のドットブロットハイブリダイゼーションの欠点は回避され、定量性、再現性の高い検出が可能となる。
本実施例に用いた試験システムは以下のように構築した。
▲１▼ rRNA 検出用プローブ
配列番号10、11、及び12で表される塩基配列のDNA を、実施例４の方法に従いディゴキシゲニン標識したものを用いた。配列番号10、11、12で表わされる塩基配列は、いずれも実施例２で解明された EHEC O157の 23S rRNA 遺伝子の部分塩基配列の相補鎖である。
【００４４】
▲２▼ DNA固定マイクロタイタープレート
下記配列番号22で表されるDNA （捕捉用DNA)を合成する。このDNA の塩基配列は、EHEC O157 の23S rRNAの部分塩基配列に相補的であり、かつ、▲１▼の検出用プローブと隣接した形で、 EHEC O157の23S rRNAの5'側に結合するように設計されている。合成した捕捉用DNA を、0.02μg/μl になるように50mMリン酸ナトリウムバッファー,pH8.0に溶かし、これをマイクロタイタープレート（住友ベークライト製、MS-3608FA)の各wellに50μl 加え、80℃で乾燥させる。紫外線を120mJ/cm2 照射した後、30mMクエン酸ナトリウム／300mM 塩化ナトリウム(2xSSC) 200 μl で３、４回洗浄し乾燥させた。
配列番号22    TACAAAAGGTACGCAGTCACAC  （配列番号８の5'側から554-575 番目の相補鎖)
対象とする菌の培養は実施例５に同じである。培養液 200μl （もしくはその希釈液）に 1 N NaOH を 25 μl 加え混和、37℃で10分放置し、溶菌液とした。
【００４５】
ハイブリダイゼーションとその及び検出は以下のようにして行なった。即ち、溶菌液50μl とディゴキシゲニン標識プローブ液50μl を、▲２▼の方法に従って作製されたマイクロタイタープレートに入れ、37#C、1 時間静置した。0.05%Tween20を含む生理食塩水（洗浄液）で３回洗浄した後、ブロッキング溶液 (1%ブロッキング試薬, 20mM Tris-HCl,pH7.5/0.15M NaCl) で10,000倍に希釈した抗Dig ヒツジ抗体−西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP、ベーリンガーマンハイム社製）を加え37℃、１時間静置後、洗浄液で３回洗浄し、発色基質液(0.04% 3-3'-5-5'- テトラメチルベンジジン/0.16 M 酢酸ナトリウム,pH5/20 % ジメチルホルムアミド/0.0035%過酸化水素/0.1% リン酸) 100 μl を加え5-15分放置した。得られた青色液の吸光度を660nm の波長で測定した。
得られた結果を表９に示す。なお、生菌数の測定は実施例５に同じである。
【００４６】
【表９】
0003810162.tif 000007
生菌数はいずれも108/ml以上であった。
【００４７】
表９の結果から、配列番号10, 11で表わされる塩基配列の核酸を検出用プローブとして用いることによっていずれも特異的検出が可能であるといえる。しかしながら、配列番号11の場合は検出感度が低く、あまり実用的ではない。また、配列番号12の結果は、配列番号11よりも更に感度が悪く、検出値はほぼバックグラウンドレベルである。
この結果は、同じ菌の23S rRNA遺伝子でも、発現量が異なっており、配列番号10で表される塩基配列を含む遺伝子が優先的に発現していることを示唆しているものと思われる。
次に、配列番号10で表される塩基配列を用いて検出感度を調べた結果を表10に示す。
【００４８】
【表１０】
配列番号10で表わされるプローブを用いた感度試験
0003810162.tif 000008
【００４９】
表10の結果から判るように、2.0x104 程度の菌が存在していれば検出されることが示される。0.5mm 径程度のコロニーを液体培地に懸濁した場合、106 以上の菌は普通に得られるので、上記の結果はこのような小さいコロニーでも検出が行なえることを示すものである。
【００５０】
【発明の効果】
本発明によれば、 EHEC O157を簡易に、且つ、特異的・定量的に検出・同定することができる。また、本発明によるEHEC O157 の検出方法は生菌を扱う必要がなく、安全性が高いものである。
【００５１】
【配列表】
0003810162.tif 000009
【００５２】
0003810162.tif 000010
【００５３】
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