(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
増感剤に共有結合したランタニドキレート化剤を含むランタニドキレートであって、該キレートが、少なくとも１０6Ｍ-1の平衡定数でランタニドと結合出来、該キレートと該ランタニドとの錯体が、ランタニド発光を高める事が出来、前記増感剤が、一般式、
0003814291.tif 000009
（ここで、Ｘは窒素原子である。）
で示され、前記増感剤の第１の位置２又は４の炭素原子が、二重共有結合を介して酸素原子で置換され、第２の位置７の炭素原子が、該増感剤と該キレート化剤とを共有結合する連結基で置換され、
該キレートと、少なくとも１０6Ｍ-1の平衡定数で該キレートと結合出来該ランタニドとの錯体が、該ランタニドである場合よりも、少なくとも５００％大きい発光強度を達成でき、
前記連結基が、アミン基又はカルボキシル基であり、
前記キレート化剤が、ＥＤＴＡ、ＤＴＰＡ、ＤＯＴＡ、ＮＴＡ、ＨＤＴＡ、及び対応するホスホネート同族体ＤＴＰＰ、ＥＤＴＰ、ＨＤＴＰ及びＮＴＰからなる群から選択されることを特徴とするランタニドキレート。
【請求項２】
前記第１の位置及び第２の位置と異なる第３の位置が置換されている請求項１に記載のランタニドキレート。
【請求項３】
該第３の位置の炭素原子が、位置４炭素原子であり、炭化水素又はハロゲン置換炭化水素で置換されている、請求項２記載のキレート。
【請求項４】
該増感剤が、２又は４−キノロンである、請求項１記載のキレート。
【請求項５】
該増感剤が、カルボスチリル１２４（７−アミノ−４−メチル−２−キノロン）である、請求項１記載のランタニドキレート。
【請求項６】
前記キレートと、少なくとも１０8Ｍ-1の平衡定数で該キレートと結合出来るランタニドとの錯体が、前記ランタニドである場合よりも、少なくとも５００％の大きい発光強度を達成できる請求項１に記載のランタニドキレート。
【請求項７】
前記キレートと、少なくとも１０8Ｍ-1の平衡定数で該キレートと結合出来るランタニドとの錯体を含む第一の溶液が、ランタニドを含む第二の溶液よりも、少なくとも５０００％大きい発光強度を達成でき、前記第一及び第二の溶液が、前記第一の溶液における前記キレートの存在と、前記第二の溶液における前記キレートの不存在とを除いて、同一である、請求項１に記載のランタニドキレート。
【請求項８】
前記ランタニドが、テルビウム又はユーロピウムである、請求項１に記載のランタニドキレート。
【請求項９】
前記キレート化剤が、少なくとも１０10Ｍ-1の平衡定数で前記ランタニドと結合出来る、請求項１に記載のランタニドキレート。
【請求項１０】
前記キレート化剤が、ＤＴＰＡである、請求項１に記載のランタニドキレート。
【請求項１１】
前記キレートが、高分子に共有結合されている請求項１に記載のランタニドキレート。
【請求項１２】
ランタニドの発光を増強する方法であって、請求項１記載のランタニドキレートと、少なくとも１０8Ｍ-1の平衡定数で該キレートと結合する事の出来るランタニドとの混合物を形成し、もって、発光ランタニドキレート−ランタニド錯体を形成することを特徴とする方法。
【請求項１３】
試料部分に存在するかも知れない被検体を、発光で検出する方法であって、以下の工程、
（１）試料部分を、請求項１記載のランタニドキレートと、少なくとも１０8Ｍ-1の平衡定数で該キレートと結合する事の出来るランタニドとの発光錯体と接触させる工程であって、該キレートが、該被検体と選択的に結合する事のできる試薬に共有結合されている工程、
（２）該試薬が該被検体と選択的に結合出来る条件下で、該試料部分を培養する工程、
（３）該試料部分を、該キレートに第一の電子転移を誘発する事のできる第１の波長の光に曝露する工程、
（４）該試料部分からの光の発光を、第２の波長で検出する工程であって、該第２の波長が、該第１の波長より長く且つ該キレートでの第２の電子転移から得られる工程、
を含み、光の該発光の検出が、該被検体試料部分の存在と相関関係にあることを特徴とする方法。
【請求項１４】
試料部分において、第１の位置と第２の位置との間の距離を、発光ランタニドキレートドナーと、有機共鳴エネルギーアクセプターとを使用して共鳴エネルギー移動で検出する方法であって、以下の工程、
（１）該第１の位置に配置された該ドナー及び該第２の位置に配置された該アクセプターを含む試料部分を、該ドナーでの第１の電子転移を誘発する事のできる第１の波長の光に曝露する工程であって、該ドナーが、請求項１記載のランタニドキレートと、少なくとも１０8Ｍ-1の平衡定数で該キレートと結合する事の出来るランタニドとの錯体を含み、該ドナーの発光とアクセプターの吸収とのスペクトル重複が、ドナー発光強度又は寿命の検出可能な消滅、又はアクセプター発光強度又は寿命の検出可能な増加によって測定した場合に、該ドナーから該アクセプターへのエネルギー移動を可能とするのに十分である工程、
（２）第２の波長での該試料部分からの光の第１の発光強度であって、該第２の波長が、該第１の波長より長く、該ドナーでの第２の電子転移から得られるものであり、光の該第１の発光強度が、該試料部分の該第１及び第２の位置の間の距離と逆の相関関係にある強度、及び
第３の波長での該試料部分からの光の第２の発光強度であって、該第３の波長が、該第１の波長より長く、該アクセプターでの電子転移から得られるものであり、光の該第２の発光強度が、該試料部分の該第１及び第２の位置の間の距離と相関関係にある強度、の少なくとも１つを検出する工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１５】
ポリメラーゼ連鎖反応の状況を監視するために使用される請求項１４に記載の方法であって、
前記試料部が、（１）第一のストランド部分を有するターゲット核酸ストランドと、（２）前記ドナーに共有結合した第一の原子及び前記アクセプターと共有結合した第二の原子を有する診断核酸ストランドとを有し、前記第一及び第二原子が、第二ストランド部分によって分離されており、前記第一及び第二ストランド部分が、アニーリング条件でハイブリダイズするに十分相補性であり、前記第二ストランド部分が、第一及び第二ストランド部がハイブリダイズしない場合の前記ドナーから前記アクセプターへの総エネルギー移動に比べて、前記第一及び第二ストランド部がハイブリダイズする場合の前記ドナーから前記アクセプターへの総エネルギー移動に検出可能な差を提供するのに十分な長さであり、
前記検出可能な差が、ドナー発光の検出可能な消滅又はアクセプター発光の検出可能な増加の少なくとも１つとして測定され、前記第一及び第二原子間の距離が、前記核酸ストランドがハイブリダイズされたかどうかを示す、
方法。
【発明の詳細な説明】
本出願に関して行われた研究は、保健国民協会及びエネルギー研究所の許可によって一部援助されたものである。政府は、この出願の特許登録権を有する。
序論
発明の分野
本発明の分野は、発光ランタニドキレート化剤である。
背景
発光（蛍光及び燐光を含む）マーカーは、科学、医学及び工学において幅広い用途を持っている。多くの場合、それらのマーカーは、放射性ラベル、クロモゲン、放射性濃縮染料等と競合的に置換される。蛍光器具での改善は、達成可能な感度を増大させ、重量分析を可能とした。
発光マーカーの使用で唯一最も顕著な制約は、許容し得るシグナル／ノイズ比を発生する事である。吸収及び発光最大、ストークスシフト、量子生成等の様なマーカー依存性は、自動又はバックグラウンド蛍光からシグナルを容易に区別するのに有効である。それ故、改良された発光マーカー、特に、長期にわたり発光する発光マーカー及び／又は長波長発光を伴う大きなストークスシフトを用意する事が常に必要とされている。その他の有用且つ望ましい性質としては、容易且つ安価な合成；化学的安定性、特に水性環境における安定性；タンパク質及び核酸を含む広範囲の高分子に対する便利な付着性；通常のレーザーによる効率的励起性；強力な発光が出来る事；良好な発光共鳴−エネルギー移動ドナーとして行動する容量；１００Å以上の分子距離を決定出来る事；及びＸ−線鏡検法で、放射性硬化発蛍光団としての有用性が挙げられる。
関連文献
関連特許としては、米国特許第4,637,988号(1987年)及び第4,837,169号(1989年)が挙げられる。エネルギー移動ドナーとしてランタニドクリプテート(lanthanide cryptate)を使用する特許出願には、米国特許出願07/729,228(1991年7月21日出願）がある。
DTPA-pAS-Tbは、ベイリー等に報告されている(Bailey et al., (1984) Analyst 109, 1449-1450)。その他のランタニドキレート化剤に関するバックグラウンド論文としては、ディアマンディス(Diamandis（1992）Analyst 117, 1879-1884)、キャンフィー等(Canfi et al., 1989, Analyst 114, 1405-1406)、アンドウ等(Ando et al., 1993, Biochimica et Biophysica Acta. 1102, 186-194)、ジョージ及びギャザリアン(Georges and Ghazarian（1993）Analytica Chimica Acta, 276, 401-409)、マチス等(Mathis et al.,（1993）Clin. Chem. 39, 1953)及びデサイ等(Desai et al.,（1993）J. Am. Chem. Soc. 115, 11032)、セベアス等(Seveus et al.,（1992）13, 329-338)、サッベドラ及びピカッツア(Saavedra and Picazza（1989）Analyst 114, 835-838)、フォンブレンドルフ等(von Brenndorf et al.,（1993）in Proceedings, 4th Intnl Conf on X-ray Microscopy, Chernogolovoka, Moscow District, Russia)、クラーク等(Clark et al.,（1993）Analytical Biochemistry 210, 1-6)を参照。
最新の蛍光共鳴エネルギー移動に関しては、セルビン(Selvin（1994）Fluorescence Resonance Energy Transfer, in Biochemical Spectroscopy, a volume of Methods in Enzymology, Academic Press, Ed. Kenneth Sauer)を参照。
発明の要旨
本発明は、一般式、
0003814291.tif 000002
（ここで、Ｘは周期律５又は６族の原子を含む）の多核異節環芳香族増感剤(sensitizer)に共有結合したランタニドキレート化剤を含むランタニドキレートを提供する。
好ましいキレートでは、増感剤は、二重共有結合を介して、酸素原子で置換された第１の位置２〜８炭素原子、増感剤がキレート化剤に共有的に結合される結合基で置換された、第１の位置２〜８炭素原子とは異なる第２の位置２〜８炭素原子、及び第１及び第２の位置２〜８炭素原子とは異なる置換した第３の位置２〜８炭素原子を有する。しばしば、第１の位置２〜８炭素原子は、位置２又は４炭素原子であり、第２の炭素原子は、位置７の炭素原子であり、増感剤及びキレート化剤はアミン又はカルボキシル基で結合され、及び／又は第３の位置２〜８炭素原子は、位置４炭素原子であり、炭化水素又はハロゲン置換炭化水素で置換される。増感剤の例としては、２又は４−キノロン、２又は４−クマリン、又はそれらの誘導体、例えばカルボスチリル１２４（７−アミノ−４−メチル−２−キノロン）、クマリン１２０（７−アミノ−４−メチル−２−クマリン）、クマリン１２４（７−アミノ−４−（トリフルオロメチル）−２−クマリン）、アミノメチルトリメチルプソラレン等が挙げられる。
キレートは、ランタニド、例えばテルビウム又はユーロピウムと、キレート化剤基、例えばＤＴＰＡを介して高親和性錯体を形成する事が出来る。一般に、キレート化剤は、複数の構造的に自由を制限されたアニオン性基、例えばカルボキシレート又はホスホネート基を含む。キレート−ランタニド錯体の溶液は、強い発光が出来る。キレートは広範囲の化合物と結合して、特定のラベル、プローブ、診断及び／又は治療剤等を形成してもよい。
キレート−ランタニド錯体は、広範囲の用途において、検出ラベルとして有用である。一般に、この方法は、試料部分を発光錯体と接触させる事；キレート中で第１の電子転移を誘発する事のできる第１の波長で、試料部分を光に曝露する事；及び第１の波長より長く、キレート中での第２の電子転移の結果である第２波長で、試料部分からの光の放出を検出する事を含む。試料でも、特別の被検体(analyte)は、被検体を選択的に結合できる試薬にキレートを結合させる事によって検出してもよい。
又、キレートは、キレート−ランタニド錯体と他の発光剤、通常、発光性非金族基体共鳴エネルギーアクセプターとの間の共鳴エネルギー移動でも使用出来る。例えば、キレート−ランタニド錯体ドナーを１つの原子に、そしてアクセプターを第２の原子に結合する事によって、２つの原子間の距離を測定する事ができる。一般に、ドナー発光とアクセプター吸収のスペクトル重複は、寿命のドナー発光強度の検出可能な消滅又はアクセプター発光での検出可能な増加で測定される様な、ドナーからアクセプターへのエネルギー移動を可能とするに十分なものである。
原子が同じ分子上にあれば、この方法は、分子の構造又は確定について有用な情報を提供する。例えば、この方法は、ドナー及びアクセプターを、診断オリゴヌクレオチドの分離された原子に結合する事によって、ポリメラーゼ連鎖反応の状況をモニターするのに使用される。ターゲットＤＮＡの濃度が増加するにつれて、ターゲットＤＮＡに交配又はハイブリダイズした診断オリゴヌクレオチドの割合は、ラベル化原子間の平均距離の増加と共に増加する。この増加した平均距離は、ドナー及びアクセプター間のエネルギー移動の減少として検出される。原子が、異なる分子上に存在する場合は、この方法は、２つの分子の相互反応又は相対的位置関係についての有用な情報を提供する。
【図面の簡単な説明】
図１は、ＴＭＲ又はＤＴＰＡ−ｃｓ１２４−Ｔｂのいずれかでラベル化されたＤＮＡのスペクトルである。点線及び実線は、それぞれＴＭＲの吸収及び発光スペクトルである。円の実線は、ＤＮＡ上のＤＴＰＡ−ｃｓ１２４−Ｔｂの発光スペクトルである。上に示したＴＭＲ発光スペクトルは、定常状態の発光光度計で得られた。テルビウム発光とＴＭＲ吸収間のスペクトル重複は、エネルギー移動を引き起こす事を可能とする。
図２Ａは、ドナーだけでラベル化したｄｓＤＮＡ（円の実線曲線）、ドナー−アクセプターラベル化ｄｓＤＮＡ（実線曲線）、及び異なるスペクトルの発光スペクトル（点線曲線）である。ＤＮＡの長さは、全ての場合で１０ｂｐである。ドナーだけの曲線及びドナー−アクセプター曲線は、５４６ｎｍで正規化される。ドナー−アクセプター錯体では、ドナー−ストランドＤＮＡ／アクセプターストランドの比は、図３の曲線Ｃが、凡そ１２％のドナーストランドが非交配である事を示すが、１より僅かに大きい。シグナルは、９０ｍｓｅｃ遅れ後の、７．５ｍｓｅｃゲートで集められる。１５０ｍｓｅｃ遅れで集められたデータは、非常に類似していた。５７０ｎｍでのドナー−アクセプター曲線のシグナル／バックグラウンド５４：１は、５７０ｎｍでのドナーアクセプターシグナルを、５７０ｎｍでのドナーだけのシグナルで割る事によって計算される。後者は、５４６ｎｍでのドナーだけのシグナルを、２４０で割る事によって計算される。検波器のノイズによるバックグラウンド、直接アクセプター発光又は光子統計は顕著ではない。異なるスペクトルは増感化発光を表示する。期待通り、形状は、ＴＭＲだけでラベル化したＤＮＡ蛍光スペクトルの形状と略同じである。
図２Ｂは、ドナーだけでラベル化された１０ｍｅｒのｓｓＤＮＡに関する５４６ｎｍでのドナー寿命−消滅(quenching)（曲線Ａ）、一連の部分的に交配されたドナー−アクセプター１０ｍｅｒＤＮＡオリゴマー（曲線Ｂ及びＣ）、及び曲線Ｂに相当する５７０ｎｍでの増感化発光シグナル（曲線Ｄ）である。曲線Ｂ及びＣを作成する為に、シグナルストランドドナーだけのＤＮＡ（トップ曲線）を、アクセプター−ラベル化相補体の増加量で滴定し、アニールした。各曲線の実線は、データに適合する２次指数（４つのパラメーター）である。各成分の割合は、それらの偏角を表示し、例えば曲線Ｂは、５５％ドナー−アクセプター錯体及び４５％ドナーだけの錯体を示す、式：ｙ＝５５％ｅｘｐ（−ｔ／３３１ｍｓｅｃ）＋４５％ｅｘｐ（−ｔ／２１２３ｍｓｅｃ）に適合する。全ての場合で、>0.99であり、ドナー消滅曲線に対する残留ｒ2は、構造を示さなかった。増感化発光曲線は、多分、未消滅ドナー種から生起する少量（≦１％）のシグナルの為に、１．５ｍｓｅｃで残留構造を示した。
図３は、ＣＹ−５又はＤＴＰＡ−ｃｓ１２４−Ｅｕのいずれかでラベル化したＤＮＡのスペクトルである。点線及び実線は、それぞれ、ＣＹ−５の吸収と発光スペクトルである。円の実線は、ＤＮＡ上のＤＴＰＡ−ｃｓ１２４−Ｅｕの発光スペクトルである。５４８ｎｍでの小さなシグナルは、異物テルビウムによるものである。示された全てのデータは、５℃で、１０ｍＭTris-HCl、pH8.0、10mM MgCl2、150mM NaCl、D2O中の0.5mMドナーストランド濃度でのデータである。２及び４倍で減少させた濃度でも、同じ結果が出た。発光分光分析は、パルス窒素レーザー、光子含有検波器及び２ｍｓｅｃ時間−解像度を持つ多チャンネルスケーラーを利用する実験室内分光光度計で行った。上で示された、ＣＹ−５発光スペクトルは、定常状態のＳＰＥＸ蛍光光度計で得られた。
図４Ａは、凡そ１：０．６比での、ドナーストランドＤＮＡとアクセプターストランドの混合物の発光スペクトルである。シグナルは、９０ｍｓｅｃ遅れ後の、７．５ｍｓｅｃゲートで集められる。
図４Ｂは、２．５ｍｓｅｃのドナーだけの寿命を示している図３に相当する寿命データ、ドナーだけ及びドナー−アクセプター錯体の混合物に相当する２次指数ドナー消滅、及び殆ど単純指数の増感化発光シグナルである。後者のシグナルは、ドナーだけ又はアクセプターだけの種には不感応である。シグナルストランド及びダブルストランドＤＮＡについてのドナーだけの寿命は、５％未満で異なる。
特定の実施態様の説明
本発明者は、テルビウム及びユーロピウムを含むランタニド元素に結合し、それらを効率的に増感化、例えばそれらを効率的に励起し、次いで効率的に発光させる一連の新規な化学的化合物を合成した。又、この化合物は高分子に便利に結合出来る。本発明者は、これらの化合物を、ランタニドキレートと呼ぶ。
本発明の重要性は数倍である。第１に、本発明のランタニドキレートは、放射性ラベルに対する非アイソトープ代替として使用出来る。第２に、それらは、通常の蛍光染料、特に画像用途において、増加コントラストに対する可能性を伴なって、発光染料の代替物として使用出来る。この増加コントラストは、ランタニド発光が極端に長い（０．６〜２．３ｍｓｅｃ）為に生起する。パルス化励起源及びゲート（時間−解像）検出を使用する場合、強い自動蛍光（バックグラウンド）は、未だ発光するラベルと共に自然崩壊する。その様な自動蛍光は、多くの組織試料の蛍光像を通常防ぐ。第３に、キレートは同じスペクトル領域で全て励起されるので、２色画像が可能である。第４に、ランタニドキレートは、発光エネルギー移動分析で、極めて効率的ドナーとして使用できる。この使用は、通常の蛍光エネルギー移動技術では通常測定出来ない距離であるが、構造的生物学及び医学において重要な、１００Å以上の距離の測定を可能とする。
本発明のキレートは多くの重要な利点を有する：１．それらは、合成が容易であり高分子への付着が容易である；２．それらは、窒素レーザー（３３７ｎｍでの）により効率的に励起される；３．それらの幾つか（例えば、ＤＴＰＡ−ｃｓ１２４）は、テルビウム及びユーロピウム両方を増感化出来る；４．キレートからのランタニド発光は極めて強い；例えば、以下に例示のテルビウムキレートは、３３７ｎｍで励起されると、ＤＴＰＡパラアミノサリシレート（ＤＴＰＡ−ｐＡＳ）より、凡そ６５倍の強度の発光をする；５．それらは、化学的に安定である；６．それらは、自動合成装置（例えば、ＤＮＡ／ＲＮＡ技術又はタンパク質技術でのホスホルアミダイトの合成）で使用される化学的条件下で核酸及びタンパク質をラベル化するのに使用出来る；７．それらは、極めて良好な共鳴エネルギー移動ドナーである。エネルギー移動において、本発明のキレートを有効ならしめている重要な要素は、増感剤の発光とランタニドの発光の間に、非常に僅かなスペクトル又は時間の重複が存在する事実である。反対に、ＤＴＰＡ−ｐＡＳは、非常に顕著な時間及びスペクトルの重複を有し、弱いエネルギー移動ドナーを用意する；そして、８．それらは、Ｘ−線鏡検法において、放射性硬化発蛍光団として有用である。
本発明のランタニドキレートは、一般式、
0003814291.tif 000003
（ここで、Ｘは周期律５又は６族の原子を含む）の多核異節環芳香族増感剤を含む。
適当な増感剤は、上記一般式が、増感剤の構造的に少量部分を含む構造を含む、種々の付加的構造を含んでもよい。一般に、位置２〜８炭素原子の少なくとも１つ、好ましくは位置２又は４炭素原子は酸化され、好ましくはカルボニル（即ち酸素原子に対して二重結合した）に酸化される。位置は、位置１のヘテロ原子から反対時計回りに、通常通りに番号付けされる。しばしば、その他の位置２〜８炭素原子、好ましくは他の２又は４位置の炭素原子は、アルキル、ビニル、オキシ（ヒドロキシル、アルコキシ、カルボキシルを含む）、カルボニル又は置換窒素（例えば、ニトロ−、置換アミンを含むアミノ−等）、シアノ、アセテート等の基、又はそれらの誘導体、特にハライド誘導体を含む基で置換（即ち、水素原子が置き替えられる）される。増感剤の例としては、ローダミン５６０、５７５、及び５９０、フルオレスセイン、２又は４−キノロン、２又は４−クマリン、又はそれらの誘導体、例えば、クマリン４４５、４５０、４９０、５００及び５０３、４−トリフルオロメチルクマリン（ＴＦＣ）、７−ジエチル−アミノ−クマリン−３−カルボヒドリジド等、及び特にカルボスチリル１２４（７−アミノ−４−メチル−２−キノロン）、クマリン１２０（７−アミノ−４−メチル−２−クマリン）、クマリン１２４（７−アミノ−４−（トリフルオロメチル）−２−クマリン）、アミノメチルトリメチルプソラレンが挙げられる。
0003814291.tif 000004
上記一般式の広範囲の誘導体は、得られるキレートが、必要とするランタニド結合及び発光増進を用意する限り、増感剤として使用してもよい。増進発光とは、ランタニドと錯体化したキレートの溶液が、或る波長の光に曝露された時に、錯体化ランタニドが、キレートが存在しない同様の試料よりも大きな強度又は寿命の光を発生する事を意味する。増進は、少なくとも１つの設定条件下で（例えば、特定の濃度、溶剤系等）、（例えば、ここに開示の条件を参照）、通常少なくとも５０％、好ましくは少なくとも５００％、更に好ましくは少なくとも５０００％、最も好ましくは少なくとも５０，０００％の強度である。
内在するランタニドを効果的に励起する為に、キレートは、１５０〜７５０ｎｍ、通常２００〜６５０ｎｍ、更に通常は２５０〜５５０ｎｍ、最も通常的には３００〜４５０ｎｍで最大吸収を一般に用意する。一般に、検出される発光は、入射光よりも大きく、少なくとも５０ｎｍ、通常は少なくとも１００ｎｍ、更に通常は少なくとも１５０ｎｍである。例えば、テルビウム及びユーロピウムに対する好ましい検出発光は、それぞれ、４９２と５４６ｎｍ及び６１７と６９５ｎｍである。吸光係数は、一般に、５，０００を越え、通常８，０００、更に通常は１１，０００を越える。
特別のキレート化剤−増感剤の組合せの選択は、使用用途に依存する。選択基準としては、選択されるランタニド、可能なバックグラウンド蛍光源、消滅剤、入射光源等が挙げられる。機能的に、選ばれたランタニドに対する適当なキレートは、候補の増感剤を、ＤＴＰＡの様なキレート化剤に結合させ、ランタニドと錯体形成させ、増進されたランタニド発光の出来る錯体を同定する事によって同定される。アッセイの詳細は以下で述べられる。
キレートは、テルビウム又はユーロピウムの様なランタニドで、高い親和性の錯体を形成する事が出来る。キレートは少なくとも１つのランタニド、好ましくは少なくとも１つのテルビウム及びユーロピウムと、ここに開示される少なくとも１つの設定条件下で、少なくとも１０6Ｍ-1、好ましくは少なくとも１０8Ｍ-1、更に好ましくは少なくとも１０10Ｍ-1の平衡定数で結合する。広範囲の構造部位は、得られるキレートが必要な発光を用意する限り、必要なランタニド結合親和力を用意する為に使用出来る。然しながら、ランタニドは、カルボキシレート又はホスフェート基の様なアニオン性基で通常イオン結合される。
しばしば、キレートは、１つ以上の構造的に区別されるキレート化剤部を含む。一般に、それらのキレート化剤部は、複数の構造的に自由を制限されたアニオン性基、例えば、カルボキシレート又はホスフェート基を含む。好ましい実施態様では、それらの部位は、それ自身が、前述の結合親和力を持つランタニドキレート化剤として機能する事の出来る化合物から選ばれる。例えば、その様なキレート化剤としては、ＥＤＴＡ、ＤＴＰＡ、ＤＯＴＡ、ＮＴＡ、ＨＤＴＡ等、及び、ＤＴＰＰ、ＥＤＴＰ、ＨＤＴＰ、ＮＴＰ等の様なそれらのホスホネート同族体が挙げられる。又、キレートのランタニド親和力は、複数の官能基の相互反応の共同（共働）的結果であってもよい。例えば、キレートの１つ以上のアミノ酸部位、例えば、グリシンは、全体の結合親和力を増進する為に、ランタニドの空いた同等部位に結合する為に、構造的に位置付けする事ができる。
キレートが構造的に区別されるキレート化剤部を含む所では、キレートは、通常、一般に結合基又は連結基を介して増感剤部に共有的に結合する。増感剤とキレート化剤を共有結合出来、必要なランタニド結合及び発光を妨げない結合基を使用してもよい。この様に、結合基は、広範囲の構造を含んでもよい。しばしば、結合基は、窒素、カルボキシル、カルボニル又はアルコール基又は窒素又はカルボキシルの誘導体を含んでもよく、一般式の位置２〜８炭素原子に共有結合する。結合基は、時に、上記の炭素原子、位置２〜８の１つ、しばしば位置７に共有結合する。通常の結合基は、脂肪族及び芳香族アミン（第一級又は第二級であってもよい）、カルボキシル及びスフヒドリルである。キレート化剤及び増感剤は、しばしば、アミド、無水物、ジスルフィド、チオ−尿素、チオエーテル等の結合を介して結合する。
キレートは通常の方法で合成してもよい。多くの開示された増感剤及びキレート化剤増感剤は、市販品として利用できる、その他は、通常の方法により、市販の出発物質から合成又は変性される。この２つは、それらが、ここに開示の官能基を介して、最もしばしば直接に結合されるけれども、通常の化学で結合されてもよい。例えば、幾つかの好ましいキレートは、無水物（例えば、ジエチレントリアミンペンタ酢酸、略してＤＴＰＡ）と増感剤（ＤＴＰＡが、ランタニドをしっかりと結合して、水による非放射性不活性化を防ぐキレート化剤として作用し、有機化合物が、ランタニドの効率的励起を許す増感剤として作用する）との間の反応に基づくものである。これらのキレートは、アミン含有増感剤がpASを置き替えるベイリー等の方法(Bailey et al.,（1984）Analyst 109, 1449-1450)の変更によって造られてもよい。ＤＴＰＡの無水物は、無水有機溶媒、一般に乾燥ジメチルスルホキシドに別々に溶解される。次いで、無水物及び選択された増感剤は混合され、ほぼ１時間反応させる。無水物は、増感剤のアミンと反応して、安定なアミド結合を形成する。
所望ならば、キレートは、通常の方法で、被検体−特定試薬、有機重合体、高分子（特に、核酸及びタンパク質の様な生体分子）に結合させてもよい。例えば、タンパク質（又はその他のアミン含有高分子）への共有結合に対しては、キレートは、ＤＴＰＡの二無水物を使用して基本的に形成できる。増感剤への結合後、混合物は、次いで、有機溶媒又は水性溶媒中でアミン含有高分子に添加される。次いで、第２の二無水物が高分子上のアミンと反応し、別のアミド結合を形成する。アミンの反応性は、この反応が水性媒体中で行うことができる程に十分に大きい（水が無水物との反応と競合するとしても）。
別に、２官能性結合体が、キレート及び高分子を結合するのに使用出来る。例えば、適当な結合体は、チオール反応性基（例えば、マレイミド、アセチルハライド等）及びアミン反応性基（例えば、チオ尿素、イソチオシアネート等）の両方を含んでもよい。例えば、ＤＴＰＡの一無水物は、３−（２−ピリジルジチオ）プロピオニルヒドラジド（ＰＤＰＨ）との反応によってタンパク質に結合させてもよい。
キレート−ランタニド錯体は、広範囲の用途において、検出可能なラベルとして有用である。一般に、この方法は、試料部分を、キレートとランタニドの発光錯体と接触させる事；キレート中で第１の電子転移を誘発する事のできる第１の波長で、試料部分を光に曝露する事；及び第１の波長より長く、キレート中での第２の電子転移の結果である第２波長で、試料部分からの光の発光を、好適には、短い寿命のバックグラウンド発光の検出を最小限とする時間遅れで検出する事を含む。試料部分の特定の被検体は、被検体を選択的に結合できる試薬にキレートを結合させる事によって検出してもよい。
この方法は、生物学的試料及び抽出物（生理学的液体、核酸及び／又はタンパク質溶液、微生物培養等）、環境試料（水源の様な）、工業的、特に化学試薬、生成物及び廃棄物等を含む広範囲の試料に適用出来る。キレートは、溶液中で遊離であってもよく、或いは種々の方法で抑制されていてもよい。例えば、キレートは、固体表面又は膜上に吸着される様に或いはビーズ内に拘束される様にして、１つの相、固体又は液体中に又はその上に、選択的に区分されてもよい。この様に、この方法は、分類（例えば、細胞分類）、クロマトグラフィー、電気泳動、浸透及び遠心分離と共に有用である。熱及び有機安定性キレートは、高温（例えば、蒸留、燃焼等）及び有機抽出を含む用途の為に選択される。
第１の波長（入射光のそれ）は、ランタニド発光の究極のシグナル／ノイズ比を最適にする為に選ばれる。しばしば、入射光は、バックグラウンド吸収を最少とする形態で用意される。有用な光源としては、レーザー（例えば、窒素、ヘリウム−カドミウム、染料レーザー等）及びアークランプ（例えば、高圧、水銀、キセノン、石英等）が挙げられる。窒素レーザーは、それらの３３７ｎｍ発光周波数がランタニド吸収最大に近いので、特に好ましい。同様に、第２の波長は、シグナル／ノイズ比を最適にする為及び利用できる器具の観点から選ばれる。
目的のキレートは、広範囲の化合物に結合させて、特定のラベル、プローブ、診断及び／又は治療剤等を造ってもよい。例としては、タンパク質（抗体、酵素、レセプター等）、核酸（ＲＮＡ、ＤＮＡ、等）、生物活性分子（薬、トキシン等）の様な生体分子；ガラス又は重合性ビーズ、シート、繊維、膜（例えば、ナイロン、ニトロセルロース）、スライド（例えば、ガラス、石英）及びプローブ等の固体基体が挙げられる。
本発明のキレートの多くは、本発明者が、発光共鳴エネルギー移動（Luminescence Resonance Energy Transfer）又はＬＲＥＴと名付けるものに特に受入れられるものである。ＬＲＥＴは、蛍光共鳴エネルギー移動(Fluorescent Resonance Energy Transfer)又はＦＲＥＴの普及版であり、ポリマー科学、生化学及び構造生物学で広く使用される技術である。ＦＲＥＴは、蛍光染料でラベル化された、凡そ１０〜７５Å離れた２点間の距離を測定するのに使用出来る。この技術は、生理学的（又はその他の）条件下で、オングトロームに近い解像度と蛍光測定の鋭敏な感度でもって測定が出来るので、価値あるものである。ＦＲＥＴは、１つの蛍光染料（ドナー）から他の吸収又は蛍光染料（アクセプター）へのエネルギーの距離依存性移動に依存する。ドナー及びアクセプターは、その間の距離を測定しようとする２点間に、部位特定的に配置される。ランタニドは蛍光を発しないが、本発明のキレートの使用は、それらを効率的に励起させる。ランタニドの非蛍光量子転移は、適当にして適切に離れているアクセプターへの非放射性エネルギー移動を効果的にする事が出来る。移動を効果的に行う為には、アクセプター吸収は、ランタニド発光と重複しなければならない。キレート−アクセプターペアーは、最適な重複の為に選ばれる。長い距離測定の為には、大きな重複が好ましい。ランタニドは、ミリセカンドのオーダーの寿命を有するので、ＬＲＥＴでのアクセプターの増感化発光のシグナル／ノイズ比は、時間解像(time resolution)(パルス遅れ)又は相変化(phase modulation)による発光検出で改善される。エネルギー移動は、ドナー消滅又は好ましくはアクセプター発光によって検出出来る。
ドナーとして発光ランタニドキレート化剤（通常の染料に代えて）及びアクセプターとして通常の蛍光染料を使用する事によって、本発明者は、凡そ１００倍まで、ＬＲＥＴのシグナル／バックグラウンドを改善した。この改善は、小さな通常の染料を使用しては普通測定出来ない距離の１００Å以上の測定を可能にする。この距離管理方式は、多くの生物学的問題で重要なものである。又、ドナーとしてランタニドキレート化剤を使用する事は、キレート化剤が、エネルギー移動の方向依存性の不確定性を最少にするので、より正確な距離測定とする。又本発明者は、アクセプターの増感化発光の最初の寿命測定、即ち、非特定又は不完全ラベリングに関する問題を無くするＬＲＥＴ測定を証明した。
広範囲のアクセプターが、本発明のキレートドナーと共に有用である。一般に、選ばれるアクセプターは、ドナーキレートの波長より長い、２５ｎｍ〜２５０ｎｍの波長で、吸光度最大を有する。アクセプターの例としては、フルオレスセイン及びローダミンの様なキサンテン染料、クマリン、ベンツイミド染料、フェナンスリジン染料、エチジウム染料、アクリジン染料、チアゾールオレンジ、チアゾールブルー、Cy5、Cy5.5、Cy3等のシアニン染料、カルバゾール染料、フェノキサジン染料、ポルフィリン染料、キノロン染料、ピコビリックタンパク質(pycobillyc protein)、例えば、アロフィコシアニン(allophycocyanin)、Ｒ−フィコエリスリン(phycoerythrin)、Ｂ−フィコエリスリン、ボディピー染料(Bodipy dye)等が挙げられる。アクセプターは、一般に、可視又は赤外範囲で発光する。
ＬＲＥＴは、溶液中の高分子についての構造及び動力学情報を、即時に得るのに特に有用である。例えば、二重末端ラベル化オリゴヌクレオチドは、核酸でタンパク質、例えば、転写因子を結合した時は、検出可能なシグナルを用意する。従って、この方法は、生体分子の構造又は相互反応を変更する可能な治療をスクリーンするのに使用される。例えば、抗ウイルス剤は、ウイルス転写因子−核酸形成で誘発された変質を変更する能力に対してスクリーンされる。
試料部分の第１の位置と第２の位置の間の距離を検出する為の、一般的ＬＲＥＴベースの方法は、第１の位置に配置されたドナーランタニド−キレート錯体と、第２の位置に配置されたアクセプターを含む試料部分を、ドナー中の第１の電子転移を誘発する事のできる第１の波長で光に曝露する事を含む。ドナー発光とアクセプター吸収のスペクトル重複は、ドナー発光強度又は寿命の検出可能な消滅又はアクセプター発光強度又は寿命の検出可能な増加で測定される様な、ドナーからアクセプターへのエネルギー移動を可能とするに十分なものである。次いで、第２の波長での試料部分からの光の第１の発光の強度は、第２の波長が第１の波長よりも長く、ドナー中での第２の電子転移の結果であり、光の第１発光の強度が、第１及び第２の位置間の距離と相関関係を示す所で検出される。換言すれば、位置が近ければ近い程、エネルギー移動は大きくなり、ドナー消滅は大きくなる。別に、第３の波長で、試料部分からの光の第２の発光の強度を検出できる。第３の波長は、第１の波長よりも長く、アクセプター中での電子転移から得られ、光の第２の発光の強度が、試料部分の第１及び第２位置間の距離と相関関係を示す。換言すれば、位置が近ければ近い程、エネルギー移動は大きくなり、アクセプター発光は大きくなる。
この一般的方法は、位置の間の、例えば、２つの原子又は分子の間の静的又は動的距離が重要な場合に広い用途を有する。１つの特定の実施態様では、この方法は、ポリメラーゼ連鎖反応の状況を観察するのに使用される。ここでは、試料部分は、一端の近位にアクセプターで、そして他端の近位にドナーでラベル化された第一ストランド部及び診断核酸ストランドを含むターゲット核酸ストランドを含む（即ち、ドナーに共有結合した第一原子とアクセプターに共有結合した第二原子を含み、第一及び第二原子が、第二ストランド部で分離されている）。
第一及び第二ストランド部は、アニーリング条件下で交配するのに十分に相補的であり、第二ストランド部は、第一及び第二ストランド部が交配されない時の、ドナーからアクセプターへの総エネルギー移動に比べて、第一及び第二ストランド部が交配される時の、ドナーからアクセプターへの総エネルギー移動での検出可能な差を用意するのに十分な長さである。検出可能な差は、少なくとも１つのドナー発光の検出可能な消滅又はアクセプター発光の検出可能な増加として測定され、第一及び第二原子間の距離は、核酸ストランドが交配されたかどうかを示す。この様に、反応が進行するにつれて、ターゲット核酸の量の段階的増加は、エネルギー移動での段階的減少として反映される。
以下の実施例は、例示の為に提供されるものであり、限定の為に提供されるものではない。
実施例
実施例１
この実施例では、本発明者は、ドナーとして発光テルビウムキレート、及びアクセプターとして有機染料、テトラメチルローダミンを導入する事によって、発光共鳴エネルギー移動（ＬＲＥＴ）の技術を例示する。結果は、適切なパラメーターが使用される、エネルギー移動のフェルスター理論(Forster theory)と一致する。ランタニドドナーの使用は、一般に、そしてそのペアーは、特に、唯一有機染料に依存する通常のＦＲＥＴペアーよりも多くの利点を有する。５０％のエネルギー移動が起こる距離（Ｒ0）は、大きく、６５Åである；ドナー寿命は、単純指数で、長く（ミリセカンド）、寿命測定をたやすく且つ正確なものとする；測定距離での不確定性を造り出す配向因子(κ2)の不確定性は、ドナーの多重電子転移及び長い寿命によって最少化される；アクセプターの増感化発光は、殆ど或いは全く障害のないバックグラウンドで測定でき、通常のドナー−アクセプターペアーより、シグナル／バックグラウンドで、＞２５倍の改善を生む。これらの改善は、１００Åより大きい距離の測定が、ＬＲＥＴを介して可能とする事を期待させる。又、本発明者は、全濃度及び不完全なラベリングに対して完全に不感応な測定である、増感化発光寿命の測定を報告する。
ＦＲＥＴでは、蛍光ドナー分子は、非放射性双極子−双極子相互反応を介して、アクセプター分子（通常、蛍光分子である）へエネルギーを移動する。ＦＲＥＴは、１０〜７０Åの範囲の距離を測定する為の標準分光分析技術である。ドナー及びアクセプター間の距離Ｒ-6に依存するエネルギー移動によって、ドナーの寿命及び量子の生成は減少し、アクセプター蛍光は増加又は増感化される（１）。ＦＲＥＴは、しばしば、ポリマー科学及び構造生物学の両方で使用され、近年、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及びタンパク質の高分子錯体の研究に使用されてきた（２−４）。
それらの成功にも拘わらず、ＦＲＥＴは、その実用性を制限する多くの重大な欠点を有していた。第１に、測定出来る最大距離が、多くの生物学的用途にとって最適なものではなかった。第２に、通常使用されるドナー発蛍光団の寿命が短く(一般に、２〜３ナノセカンド)、高次指数であり、寿命測定を困難とし、精度に限界があった。第３に、増感化発光のシグナル／バックグラウンドが、ドナー及びアクセプターの直接励起からの蛍光障害によって低かった。第４に、エネルギー移動の効率が、ドナーとアクセプター間の距離Ｒ-6に依存するばかりでなく、κ2因子で表される様な、それらの相対配向にも依存するので、正確な距離を決定する事が困難であった。（エネルギー移動効率＝１／（１＋Ｒ6/Ｒ06）、ここで、Ｒ0は、κ2の関数である：付録参照）。
発光ランタニド元素、テルビウム及びユーロピウムは、それらが、これらの問題の多くを、可能的に解消するので、魅力的なＦＲＥＴドナーである。ランタニド発光は、一量状態から一量状態への転移を引き起こさないから、ランタニドドナーを使用するエネルギー移動は、より正確に、発光共鳴エネルギー移動（ＬＲＥＴ）と呼ばれる。ランタニドは、主に、拡散増進ＦＲＥＴ（５）(difusion-enhanced FRET)で、カルシウム結合タンパク質での等晶形置換として使用されてきた。更に、マチス(Mathis)は、ユーロピウムクリプテート（cryptate）を、マルチクロモフォリックアロフィコカニン(multichromophoric Allophycocanin)と共に使用して、極めて大きな90ÅのＲ0を達成した（９）。本発明者は、最近、アクセプターとしてＣＹ−５の様な有機染料との関連において、ドナーとしてユーロピウムのポリカルボキシレート−キレートを使用する事の多数の利点を示す結果を提出した（１０）。ここでは、本発明者は、これらの結果を、ドナーとしてテルビウムの使用にまで拡げる。
モデル系として、本発明者は、ドナー及びアクセプターを、種々の長さの、一連のダブルストランドＤＮＡオリゴマーの５′末端に共有的に結合する。その様なモデル系のＤＮＡの使用は、以前に、有機染料間のエネルギー移動測定にとって有効である事が示されている（１１）。
材料及び方法
ラベル化ＤＮＡオリゴマーの合成。長さが１０、１２、１４ベースの相補的ＤＮＡを、標準ホスホルアミダイト法(standard phosphoramidite procedure)を使用して合成した。６つの炭素結合体(Glen Research)を介して結合されるアミノ基は、５′末端に導入された。アクセプター配列は、クレッグ等(Clegg et al.)(11)によって使用されたものである：５′−ＣＣＡ−ＣＴＡ−ＴＡＧ−Ｇ−３′（１０ｂｐ）；５′−ＣＣＡ−ＣＴＣ−ＧＣＴ−ＡＧＧ−３′（１２ｂｐ）；５′−ＣＣＡ−ＣＴＧ−ＣＴＧ−ＣＴＡ−ＧＧ−３′（１４ｂｐ）。テトラメチルローダミン−イソチオシアネートの５−異性体（分子プローブ。Ｔ−１４８０：略称：ＴＭＲ）は、標準法で結合され、逆転相ＨＰＬＣで精製された。ＤＮＡに結合したＴＭＲの吸光係数は、ｅ260=33mM-1cm-1及びｅ556=93mM-1cm-1と決められた。ドナーストランドは、テルビウムキレートで５′末端でラベル化された相補的ＤＮＡから構成された。キレートは、レーザー染料、カルボスチリル１２４（ＤＴＰＡ−ｃｓ１２４）に結合されたジエチレントリアミンペンタ酢酸である。ドナーキレート合成の詳細は、どこにででも示される。又、非ラベル化ＤＮＡオリゴマーも合成した。
交配条件：ドナー及びアクセプターストランドは、所望の比で、10mMTris、pH8.0、10mM MgCl2、150mM NaClを含むD2O-ベースバッファー中で混合された。又、実験は、H2Oベースバッファー中でも行った。ドナーストランド濃度は凡そ200nMであった。オリゴマーは、75℃に加熱してアニールし、15分で、最終温度(22℃又は５℃)まで冷却された。
分光分析：吸収測定は、ヒューレットパッカード８４５２Ａ分光分析器で行った。定常状態蛍光測定は、ＳＰＥＸフルオロログ(Fluorolog)蛍光計で行った。時間-解像及びゲート発光測定は、パルスレーザーホトニクスナイトロジェンレーザー(pulsed Laser-Photonics Nitrogen laser)(5nsecパルス幅、40Hz繰り返し速度)で直角検出を利用する実験室内分光計、ガリウム−砒素光子含有検波器Gallium-arsenide photon-counting detector)、ゲート識別器(gated discriminator)(Ortec 584)及び２μｓｅｃの時間−解像の多チャンネルスケーラー(multichannnel scalar)で行った。又、分析器なしで行ったエネルギー移動実験は、分析器を使用するのと同じ結果を与えたが、偏光分析も行った。それ故、分析器は、通常は削除した。温度調節キュベットホルダー及び石英３mm x 3mmキュベットを使用した。寿命は、テーブルカーブソフトウエアー(TableCurve software)(Jandel Scientific)を使用して適合させた。
結果及び検討
ドナーキレート、ＤＴＰＡ−ｃｓ１２４−Ｔｂの構造、及びエネルギー移動の為に使用されたモデル系を以下に示す。
0003814291.tif 000005
ドナーキレートは幾つかの重要な特徴を有する。第１に、キレートは、テルビウム（及びユーロピウム）に極めてしっかりと結合する。１００倍を越えるＥＤＴＡでの滴定(Kb≦1017M-1)は、テルビウムの測定可能な量を置き替える事ができない。これは、他のＤＴＰＡベースキレート化剤と一致するものであり（１２）、遊離のテルビウムが存在しない事を確証するものである。第２に、キレートは、高分子に対するテルビウムの部位特定付着を許す。第３に、D2Oにおけるテルビウム発光の略単一体に対する量子生成の結果となる非放射性脱励起メカニズムからテルビウムを保護する（付録Ｉ参照）。最後に、レーザー染料、カルボスチリル１２４の共有結合は、テルビウムの極めて低い吸収断面(<1M-1cm-1)を解消する。cs124は、光(ε328=11,000M-1cm-1；ε338=8,000M-1cm-1)を吸収し、そして、テルビウムの極めて近い位置の故に、エネルギーをランタニドに移動する（１３、１４）。
図１は、テルビウムキレートと、効率的なエネルギー移動とD2O中で６５Å(H2O中では60Å）の大きなＲ0へ導くテトラメチルローダミンのスペクトル特性を示す。Ｒ0は、標準式（付録参照）から計算される。ここでは、本発明者は、ドナーとしてランタニドキレートを使用する事について２つの独特の観点を述べる：１）エネルギー移動効率は調整が出来るので、Ｒ0は、測定されている特定の系に対して、単純に、溶媒中でH2O/D2Oの比を変える事によって最適化される。H2O/D2O比は、本発明のキレートにおけるランタニド量子生成(qD)(D2O中ではqD≒1、H2O中ではqD≒0.6、付録I参照)を変更する事によってエネルギー移動効率に影響を及ぼす(15)。２）エネルギー移動過程の配向依存性は、テルビウムが、多重、変質電子転移を有し、従って、たとえ不動であっても等方性ドナーである為に最少化される。これは、悪い場合で＋／−１２％の配向効果により、測定される距離での不確定性を最少にする（１６）。
又、図１は、テルビウム発光の高いスパイク性(spike)を示す。ドナー消滅は、４９２ｎｍ及び５４６ｎｍで、アクセプター発光からの妨害なしに測定出来る。同様に、アクセプターの増感化発光は、テルビウムが、５７０ｎｍ近辺では殆ど静かであり、ここではＴＭＲが、その発光最大の７０％にあるので、ドナー発光からの顕著な妨害なしに測定出来る。５７０ｎｍでのテルビウムシグナルは、その最大、５４６ｎｍにおけるより少ない２４０ｘである。
増感化発光を測定する場合、又、本発明者は、一時的な識別によってアクセプターの直接蛍光を分離出来る。本発明者は、パルス励起を使用し、その間に、ローダミンの時間直接蛍光が衰退してしまう、９０μｓｅｃ遅れ後だけのデータを集める。（２〜３ナノセカンドの寿命を持つアクセプター蛍光は、急速に衰退する；又、本発明者は、多分、遅延蛍光か検波器人工物で、９０μｓｅｃ遅れ中に衰退する小さな成分を見出す）。ドナーは、そのミリセカンド寿命の故に、励起されて留まり、遅れ期間の最後でエネルギー移動ができる。従って、遅れ後の５７０ｎｍ付近で生起するシグナルは、増感化発光にのみ依存する、即ちアクセプターの蛍光はエネルギー移動に依存する。
図２Ａは、部分的に交配された１０ｍｅｒＤＮＡのエネルギー移動実験の結果を示す。平均エネルギー移動は７７％である。５７０ｎｍでの増感化発光のシグナル／バックグラウンドは、５４：１である。比較として、同じＤＮＡについてエネルギー移動ペアーとしてフルオレスセイン−ローダミンを使用する時の増感化発光に対するシグナル／バックグラウンドは、凡そ１である。バックグラウンドは、本発明の場合はその様に小さいので、小さなシグナルが測定可能となり、それ故、Ｒ0より大きな距離が可能となる事が期待される。例えば、ホロックス及びブルーノ(Horrocks and Bruno)は、テルビウムエネルギー移動に対して、チロシンのダークバックグラウンド増感化発光を利用して４Ｒ0（Ｒ0＝３．１Å）の距離を測定する能力を示した（６）。
本発明者は、ドナー発光が顕著な領域でさえも、ドナー発光から増感化発光シグナルを単離できる。クレッグ等によって使用されたそれに類似の方法で（１１）、本発明者は、増感化発光シグナルを残しながら、全ての波長において、ドナー発光を減じる事が出来る。移動されるエネルギーの効率は、単純に、全集合面積で割られる集合増感化発光の面積である：
エネルギー移動効率＝(fA/qA)/(fA/qA＋fD)    （１）
ここで、fAは、増感化発光曲線の下の面積、qAは、アクセプターの蛍光量子生成、そしてfDは、ドナー発光曲線の下の面積である。ドナー消滅データとの比較で、アクセプターの量子生成を決める事が出来る。ＴＭＲに対する量子生成を０．１７４として、式（１）は、７７％の平均エネルギー移動となる。
図２Ｂは、一連の１０ｍｅｒＤＮＡオリゴマーについての寿命データを示す。ドナーだけ（シングルストランドＤＮＡ）のシグナルは、２．１４ｍｓｅｃの寿命の単純指数である。（その相補体に交配されたテルビウムラベル化ＤＮＡオリゴマーは、２．８０ｍｓｅｃの寿命の単純指数である。ダブルストランドとシングルストランドテルビウムだけのＤＮＡ間の寿命の相違は、同様に、異なる量子生成よりもむしろ、テルビウムを取り囲んでいる異なる対称から生起する、異なる放射速度に依存する）。アクセプターストランドの増加量での滴定は、２次指数ドナー消滅を示す（曲線Ｂ及びＣ）。長寿命成分は、非交配の、ドナーだけのストランドＤＮＡに相当する；短い成分は、アクセプターストランドで交配されたテルビウムストランドＤＮＡに相当する。期待通りに、アクセプターストランドの量の増加は、それらの寿命を変える事なく、短い成分の幅を増加し、長い成分の幅を減少する（曲線Ｂ及びＣを比較）。長時間成分がドナーだけのシグナルに等しいという事は、分子間エネルギー移動が顕著でない事を示す重要な内部調節である。短い成分の寿命は、ドナー−アクセプター錯体の８８％でのエベルギー移動に相当する（１〜３３１μｓｅｃ／２８０９μｓｅｃ）。比較として、フルオレスセイン−ＴＭＲペアーを使用する、同じ６つの炭素結合体の同じ１０ｍｅｒＤＮＡについてのエネルギー移動は、２３％である（１１）。
増感化発光曲線を基にしたエネルギー移動効率の計算では、これが、アクセプターの直接蛍光から生起する残存シグナルに依存するので、本発明者は、短時間成分を無視する。（このデータに対してゲートは使用されなかった）。多数の実験は、長時間成分が、悪い場合で、１０％以内、通常は、２〜３％以内で繰り返し可能である事を示す。然しながら、短時間成分は、解像出来ない直接蛍光に依る非常に大きく、非常に短いスパイクが存在するので、極めて変化しやすい。
アクセプターストランドの２倍過剰では、未だ１０〜１２％の非交配成分が存在する。類似の現象は、染料ラベル化オリゴマーで見られ（１７）、及び本発明のキレートにおいて置換されたユーロピウムでのＦＲＥＴ実験でも見られる（１０）。本発明の場合では、それは、５℃及び２２℃の両方で存在するので、それが単純溶融温度現象であるかは明らかではない。この理由は研究中である。この残存非消滅ドナーシグナルは、これが、非結合磁気双極子転移、つまり全てのテルビウム（及びユーロピウム）発光が同じ励起状態から生起する為に存在しない状態を必要とするので、基本的ランタニド写真物理現象によるものではなさそうである（１８、１９）。
又、図２Ｂは、２次指数ドナー消滅（曲線Ｂ）に相当する、５７０ｎｍでの増感化発光の寿命を示す。増感化発光の衰退は、式：
ｙ＝３３％ｅｘｐ（−ｔ／４５μｓｅｃ）＋６７％ｅｘｐ（−ｔ／３２６μｓｅｃ）
に正確に適合出来る。４５ｍｓｅｃ成分は、アクセプター又は検波器人工物（ゲートによって分離できる）からの直接蛍光に相当する。３２６μｓｅｃ成分は、ドナー−アクセプター錯体においてはエネルギー移動に依存し、３２９〜３３１μｓｅｃのドナー消滅成分と極めて良く一致する。凡そ９０μｓｅｃ後には、増感化発光に貢献する唯一の種は、ドナー−アクセプター錯体であって、ドナーだけ又はアクセプターだけでは貢献しない事に注意されたい。これは、不完全なラベリングの問題を顕著に最少化する。又、増感化発光の寿命シグナルな、全濃度、量子生成、及びドナー消滅の原因となる非エネルギー移動効果に対して不感応である。
表Ｉは、１０、１２、及び１４ｂｐ長のドナー−アクセプターラベル化ＤＮＡ二重型についての寿命及びエネルギー移動データを纏めたものである。
0003814291.tif 000006
種々の実験からのデータは、与えられた長さのＤＮＡのドナー消滅及び増感化発光寿命が１０％以内、通常は２〜３％以内で一致する事を示す。期待通り、距離の増加に伴うエネルギー移動の減少が存在する。比較として、本発明者は、フルオレセイン−ＴＭＲを使用するクレッグ等によって決定された距離（１１）を例示する。両方の結果は、異なる塩状態とドナー寿命が、異なる染料位置、それ故、異なる測定距離へと導くものの、ＤＮＡ二重螺旋形状と一致する。本発明者は、ＤＮＡ螺旋のクレッグ等のモデルを使用して本発明の距離を適合させ、染料を結合した。三点のデータだけでは、そのモデルにおいて、全てのパラメーターを、独特のものに解像する事は不可能であるが、それでも、テルビウムキレート及び／又はアクセプターが、ＤＮＡ螺旋に明らかに接近していると仮定すれば、それらのモデルへの良好な適合は達成される。これは、ＤＮＡの螺旋形状と、それらのドナー及びアクセプターが螺旋から広がっている（それぞれ１９Å及び１３Å）事実の故に生起する、それらのＦＲＥＴデータで見られる変調を減少させる。この相違は、本発明のドナーの長時間寿命が、６つの炭素結合体によって設定された制限内でのドナー及びアクセプターの自由を制限された拡散を許すと期待されるので、そして、電荷反撥作用を最少にする、ここで使用される大きなイオン強度の故に、定性的に合理的である。
要するに、データは、エネルギー移動データが、双極子−双極子フォレスター型メカニズムを基に導かれるならば、二重螺旋ＤＮＡの形状と一致する。発光共鳴エネルギー移動の多くの技術的利点は、これを、生物学的に関心のある高分子についての測定に適合した良好な技術とする。
付録Ｉ
Ｒ0の計算：ドナーの励起状態エネルギーの５０％がアクセプターへ転移される点の距離、Ｒ0は、標準式（１）からの計算される：
Ｒ0＝(8.79 x 10-5J κ2n-4qD)1/6Å            （２）
ここで、ｑDは、アクセプターが存在しない場合のドナー発光に対する発光量子生成であり、Ｊは、ドナー発光（ｆD）とアクセプター吸収(eA)(J=∫fDεAλ4dλ)のスペクトル重複、ｎは、反射率及びκ2は、２つの双極子の相対角度に関する形状因子である。ここに、本発明者は、式(２)の各項を評価しそれらの不確定性を検討する。
反射率、ｎは、水の１．３３〜多くの有機分子の１．３９に変化する。数値積分は、３．８ｘ１０15nm4M-1のＪ重複積分となる。これは、テルビウムの５４６ｎｍピークが、磁気双極子同様に電子双極子転移から生起するかも知れないので、Ｊに対する上限であり（１９）、前者は、エネルギーを顕著に移動しない（１８）。磁気双極子寄与の部分は、理論的に計算出来（２０、２１）、或いはこの問題は、単独に電子双極子転移として知られるテルビウムの４９２ｎｍ線を使用する事によって避けた（２０）。
ＦＲＥＴで有機染料を使用する場合は、κ2は、しばしば不確定性の顕著な元であり、悪い場合には、０〜４に変化する（２２）。然しながら、テルビウムでは、発光は、κ2を制限する（１／３＜κ2＜４／３）多重電子転移から生起する。更に、アクセプターは、ミリセカンドドナー寿命中において回転運動を受ける事が出来る様に思われる。これは、更にκ2を制限し、ドナー寿命内で、急速に回転するランダム配向に相当する、κ2＝２／３と推定する。
テルビウムの発光量子生成、ｑDは、テルビウムの本質的に低い吸光度の故に、正確に決定する事が困難である。然しながら、ｑDは、D2Oでは１に非常に近いように思われる（以下参照）。Ｒ0を計算する場合には、全体のキレートの量子生成ではなく、テルビウム量子生成(D2Oでは、≒１)を使用する事が重要である点に留意されたい。全体のキレートの量子生成は、ランタニド量子生成が、ランタニドへ移動されるcs124によって吸収されたエネルギー部分を定めるのに等しい。
ランタニド発光の量子生成：D2Oでは、ｑD≒１とさせる（直接的）証明についての幾つかの線が存在する。第１に、発光は、溶媒及びキレートによる非放射性脱励起のその他の源から保護されている４ｆ−４ｆ内核電子から生起する。本発明のキレート中のテルビウムの主たる配位球面における１．２H2O分子は、非放射性脱励起の主たる源であるが、それらは、テルビウムを顕著に不活性化しないD2Oによって置き替えられる（１５、２３）。水でないリガンド、カルボキシレート基及びアミン窒素は、励起状態のテルビウムを不活性化する点では極めて非効率的である（２３）。温度の研究を介して（２４）、又本発明者は、ｃｓ１２４の消滅効果を探索し、何も見出さなかった。
D2Oで、ｑD≒１を支持する証明の第２の線は、HDO中で、テルビウム：ＥＤＴＡが１：３の混合物の量子生成を直接測定し、０．５４の値を見出したエルバノウスキー及びその共同研究者(Elbanowski and coworker)の研究から得られる（２５）。この測定は、困難であり、精度が未知であるが、それでも、H2O中でさえも高い量子生成を暗示し、D2Oでの量子生成は、顕著に高い事が期待される。（多分、それらの錯体中のテルビウムに配位した２つの水分子が存在する（２３））。
証明の第３の線は、テルモリシン(thermolysin)ではドナーとして、そして、無脊椎動物のカルモデュリン(invertebrate calmodulin)ではアクセプターとしてテルビウムを使用するエネルギー移動実験からのものであり（８、２６）、この実験では、D2Oでの単一量子生成の仮定（時に、暗示的）が、Ｘ−線結晶学データとの良好な一致を与える。
付録ＩＩ
アクセプターの蛍光量子生成の計算：ドナー消滅寿命データと面積との比較及び式（１）を使用する事により、アクセプターの量子生成を測定する事が可能である。これは、その吸収が、テルビウム（又はユーロピウム）の発光と重複する染料の量子生成を測定する為の一般的且新しい方法である。これは、その試料の対照を比較するというよりもむしろ１つの試料、即ち対象物の正確な試料しか含まない測定である通常の量子生成測定方法より多くの利点を有する。
ＴＭＲの量子生成を評価する為に、本発明者は、式（１）での未知数は、qAであり、そしてエネルギー移動の平均効率は、曲線Ｃ（上の）から７７．６％と仮定する。積分面積（ｆAに対しては６２０、ｆDに対しては１０３２、任意の単位）を基準として、これは、qA＝０．１７４となる。比較として、ホスフェート−バッファー食塩水中での遊離テトラメチルローダミンは、標準測定法で測定して、０．２５の量子生成を有する（２７）。
実施例１の括弧内の引用文献
0003814291.tif 000007
実施例２
この実施例では、本発明者は、ドナーとしてユーロピウムキレート、及びアクセプターとして有機染料、ＣＹ−５を導入する事によって、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）の技術を提示する。ランタニドドナーの使用は、一般に、そしてそのペアーの使用は、特に、唯一有機染料に依存する通常のＦＲＥＴペアーよりも多くの利点を有する。Ｒ0は、大きく、７０Åである；このドナー寿命は、単純指数で、長い（D2O中で、2.5ｍｓｅｃ）；測定距離での不確定性を造りだす配向因子は、ドナーの多重電子転移及び長寿命によって最少化される；アクセプターの増感化発光は、殆ど或いは全く障害のないバックグラウンドで測定でき、通常のドナー−アクセプターペアーより、シグナル／バックグラウンドで、＞５０倍の改善を行う。シグナル／バックグラウンドでのこの改善は、１００Åより大きい距離の測定を可能とする事を期待させる。又、本発明者は、全濃度及び不完全なラベリングについて独立的な測定である、増感化発光寿命を測定する。
本発明者は、ドナーとして発光ユーロピウムキレート及びアクセプターとして有機染料のＣＹ−５を使用した。この発光共鳴エネルギー移動（ＬＲＥＴ）は、通常のＦＲＥＴより幾つかの利点を有する2。エネルギーの５０％が移動する点での距離（Ｒ0）は、大きく７０Åである；ドナー寿命は、単純指数で、長く（H2O中で、0.63ｍｓｅｃ;D2O中で、2.5ｍｓｅｃ）、寿命測定を容易且つ高い精度のものとする；エネルギー移動の配向依存性（κ2）は、悪い場合で＋／−１２％で、配向効果による測定距離での不確定性を限定する、ドナーの多重電子転移及び長寿命によって最少化される3；アクセプターの増感化発光は、殆ど或いは全く障害のないバックグラウンドで測定でき、通常のドナー−アクセプターペアーより、シグナル／バックグラウンドで、＞５０倍の改善を行い、Ｒ0の数倍の距離の測定を可能とする4。又、本発明者は、全濃度及び不完全なラベリングについて独立的である、増感化発光寿命を測定する。
本発明者は、ドナーとしてテルビウム5及びユーロピウムの両方を使用し、ユーロピウムの結果をここに報告する。１つの５′末端にユーロピウムキレートを持ち、他端の５′末端にＣＹ−５を持つダブルストランドＤＮＡを含むドナー−アクセプターモデル系の模式図を以下に示す：
0003814291.tif 000008
ユーロピウムキレート、（ジエチレントリアミンペンタ酢酸−カルボスチリル１２４−Ｅｕ：一般名、ＤＴＰＡ−ｃｓ１２４−Ｅｕ）を、ＤＴＰＡの二無水物（シグマ）、カルボスチリル１２４（アルドリッチ）及び塩基保護された合成ＤＮＡを出発として、そしてラベル化が５′アミノ基でのみ起こる事を確保する為に、カラム上で、ベイリー12の方法で変更によって造った。ｃｓ１２４は、ドナーが、パルス窒素レーザーで励起された337nmで、ユーロピウムの吸収断面を、凡そ８０００Ｍ-1cm-1まで効果的に増加する。ＥＤＴＡの１００倍過剰は、ＤＴＰＡ−ｃｓ１２４キレート化剤から、ユーロピウムの顕著な量を除去しなかった。アクセプターは、標準方法を介してＣＹ−５13(Biological Detection System)で５′ラベル化された。非ラベル化相補的ＤＮＡオリゴマーを対照として造った。全てのＤＮＡは、逆転相ＨＰＬＣで精製を行った。この系では、ダブルストランドＤＮＡオリゴマーは、ユーロピウムドナーとＣＹ−５アクセプター間の定義された距離を確立する為に、硬いつなぎ鎖として働く。ドナー及びアクセプターの結合点は、染料位置が、結合の為に使用される、柔軟な６つの炭素結合体によって限定された変動性を維持するが、４２Åまで分けられる。6,7
図３は、D2O中で、７０Å（H2O中で５６Å）以上に大きなＲ0となるスペクトル特性を示す。Ｒ0は、計算されたスペクトル重複(Ｊ)の6.55 x 1015M-1nm4、配向係数(κ2)の2/3、反射率の1.33、及び１つのD2O中でのユーロピウム発光の量子生成（H2O中で０．２５）8を基準として、標準式1から決定される。Ｒ0を計算するに当っては、全体のキレートの量子生成ではなく、ランタニド発光の量子生成を使用し、そして、スペクトル重複（Ｊ）計算に、電子双極子であるそれらの転移だけを含ませる事が重要である。ここでは、エネルギー移動の為に使用される６１７ｎｍでのユーロピウム発光は、“強化された”電子双極子9として知られており、従って、エネルギー移動のフェルスター理論が適用可能である。５９６ｎｍでのユーロピウム発光は、それが磁気双極子転移であり、従ってスペクトル重複計算には含まれないので、アクセプターに結合出来ない10。
本発明者は、ドナー発光或いは直接アクセプター蛍光からの顕著な妨害なしにアクセプターの増感化発光を測定出来る。６６８ｎｍでは、ユーロピウムは、殆ど静かであり（６６８ｎｍでのユーロピウム発光は、その６１７ｎｍ最大より１２０倍少ない）、パルス励起を使用する事により、そして検波器を９０ｍｓｅｃ間ゲート開放する事によって、ドナー錯体でのカルボスチリル増感剤及びＣＹ−５の直接蛍光は、ユーロピウムが、励起状態で且つエネルギー移動の出来る状態に留まったままで、完全に分離される11。
図４Ａは、ダークバックグラウンドの増感化発光実験を示す。ここでは、ドナー／アクセプターストランド比は凡そ１：０．６である；本発明者は、異種シグナルを解析するための本発明系の能力を示す為に、ドナーより少ないアクセプターを意識的に添加する。図４Ａでのエネルギー移動の平均部分は５７％である。６６８ｎｍでのシグナルは、ＣＹ−５の増感化発光、即ち、エネルギー移動にのみ依存する蛍光から生起する。本発明者は、６６８ｎｍでのシグナル／バックグラウンドを９４：１と計算する（ここでは、バックグラウンドは、少量のユーロピウム発光による）。これは、同じ１０ｍｅｒに結合した、最良のドナー−アクセプターペアーの１つであるフルオレセイン−ローダミンからの増感化発光よりも、シグナル／バックグラウンドにおいて５０〜１００の改善要因である。
図４Ｂは、図４Ａに相当する寿命データを示す。ドナーだけのシグナルは、２．５２ｍｓｅｃの寿命の単純指数である。ドナー消滅は、極めて良く２次指数に適合する（r2＝0.998）：ｙ＝63％exp(-t/0.22msec)＋37％exp(-t/2.40msec)。長時間成分は、ドナーだけの種に相当する。長時間成分が、ドナーだけの寿命にほぼ等しいということは、分子間エネルギー移動が、多くて５％である事を示す内部調節である。短時間成分は、交配ドナー−アクセプター錯体において、分子間エネルギー移動から生起し、９１％消滅に相当し（１〜０．２２ｍｓｅｃ／２．５２ｍｓｅｃ）、ドナー−アクセプター距離の４６Åに相当する。（Ｃ−６結合体を持つ同じＤＮＡ上のフルオレセイン−ローダミンは、２２％のエネルギー移動を生成する7）。アクセプター濃度を増加しての滴定は、短時間成分の部分を増加するが、期待通り、その寿命を変化させない。アクセプターストランドの２倍過剰では、多分、未交配ドナーストランドにより、ドナーだけのシグナルに相当する成分の１０％が残る。
又、図４Ｂは、増感化発光の寿命を示す。増感化発光の寿命シグナルは、２次指数に適合する（ｒ2=0.999）：ｙ＝40％exp(-t/59μsec)＋60％exp(-t/0.25msec)。短時間成分は、アクセプターの直接蛍光に依存し、検波器をゲートする事によって分離出来る。0.25msec成分は、ドナー消滅の短時間成分と優れて一致し、90％のエネルギー移動に依存する（１〜０．２５ｍｓｅｃ／２．５２ｍｓｅｃ）。非常に小さな短時間成分（≒１％）は、直接ドナー蛍光によって見る事が出来る。
要するに、発光エネルギー移動は、適当なパラメーターが使用される事を仮定するフェルター理論と一致する結果を生む。大きなＲ0を基準に、本発明の寿命測定の容易性及び再現性、及び優れたシグナル／バックグラウンド、１００Åより著しく大きな距離が測定可能である。
実施例２での脚注文献
（１）Cantor and Schimmel, (1980) Biophysical Chemistry, W. H. Freeman and Co., San Francisco, Vol. 2；（２）エネルギー移動でのランタニドが、拡散増加ＦＲＥＴで使用された（Stryer, L., Thomas, D. D., Meares, Ed., C. F. (1982) In Annual Review of Biophysics and Bioengineering, L. J. Mullins, Ed., Annual Reviews, Inc., Palo Alto, CA, 11:203-222）。又、彼等は、マルチクロモフォリックアロフィコカニンを（Mathis, (1993) Clin. Chem. 39:1953）そして、カルシウム結合タンパク質での等晶形置換として使用した（Horrocks et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA (1975), 72:4764;Cronce and Horrocks, (1992) Biochem, 31:7963）；（３）Stryer, (1978) Ann. Rev. Biochem. 47:819-846；（４）増感化発光を使用してＲ0以上のエネルギー移動を測定する能力は、Bruno and Horrocksによって示され。彼等は、アクセプターとしてテルビウムを、ドナーとしてチロシンを使用した。３ÅのＲ0で、彼等は12Åまで測定した。（Bruno et al., (1992) Biochem. 31:7016）；（５）Selvin and Hearst, (1994) Proc. Natl. Acad. Sci., USA（提出済），（６）Cardullo et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci., USA 85:8780；（７）Clegg et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2994；（８）長い寿命及び非放射性脱活性メカニズムの欠如が、量子生成は、D2Oでの生成に近いと思われる様にするけれど、正確な量子生成は、決定する事が困難である。この仮定は、Ｘ−線結晶学研究と一致する距離を与えた（文献４参照）。H2Oでは、本発明のキレートの主たる配位球面上には、1.3H2O分子が存在するので、量子生成は減少する（Horrocks and Sudnick, (1979) J. Am. Chem. Soc. 101:334）；（９）Bunzli, J. C. G. (1989) In Lanthanide Probes on life, Chemical and Earth Sciences, Theory and Practice Luminesent Probes; Bunzli J. C. G. & Choppin, G. R. Ed., Elsevier, New York, pp. 219-293；（10）Dexter, (1953) J. Chem. Phys. 21:836；（11）モリソン（Morrison）は、シグナルを、有機染料で増感化発光のバックグラウンドまで増加する為に、ゲートインテグレイションを使用した（Morrison, (1988) Anal. Biochem. 174:101；（12）Bailey et al., (1984) Analyst 109:1449；（13）Mujumdar et al., (1993) Bioconj. Chem. 4:105。
実施例３：テルビウム−フルオレセインエネルギー移動。
この実施例は、エネルギーをフルオレセインに移動するテルビウムキレート（テルビウム−ジエチレントリアミンペンタ酢酸）を使用した。ドナー及びアクセプターは、５′末端の第１級アミンで変性した。８ｍｅｒＤＮＡ二重オリゴヌクレオチドで分離した。アクセプターは、相補的オリゴヌクレオチドの５′末端に結合された。増感化発光は、５２０ｎｍ近辺で、バックグラウンド無しで測定した。更に、４９２ｎｍドナー発光線とフルオレセイン吸光度との間には、大きなＲ0へと導く、優れた重複が存在する。パルス励起源を使用し、５２０ｎｍでモニターする事によって、任意のシグナルが、増感化発光からのみ生起する。８ｍｅｒオリゴヌクレオチドは、ドナー及びアクセプターを、動かない様に分離する為に使用し、オリゴヌクレオチド濃度が約０．２５μＭ以下に維持される時は、スクロース溶液は、一般には、必要ないが、錯体を、分子間相互反応を分離する為に粘稠なスクロース溶液に浸漬した。５２０ｎｍにおける増感化発光のシグナル／バックグラウンド比は、凡そ４００：１である。ドナー強度消滅及び積分増感化発光面積の両方を基準としたエネルギー移動の範囲は、７０％である。アクセプター無しでの消滅ドナー寿命（１．５ｍｓｅｃ）、及びドナー−アクセプター錯体での増感化発光の寿命（寿命２５０μｓｅｃ）の測定は８５％の消滅を示す。７０％と８５％の間の差は、エネルギーを移動出来ない未交配ドナーラベル化ＤＮＡの少量画分に依存する。
実施例４−酵素（タンパク質加水分解的）活性の為のアッセイ
蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）は、２つのラベル化点間の距離が、活性の関数として変化する様な酵素活性の研究に使用されてきた。一般に、ＦＲＥＴが使用される所では、しばしば顕著な改善を伴ってＬＲＥＴも又使用出来る。例えば、マタヨシ等（Mayayoshi et al., (1990) Science 247:954-958))は、基体ペプチドを、プロテアーゼ結合／切断部位の両側でドナー及びアクセプターでラベル化する事によって、ＨＩＶプロテアーゼ活性を測定する為にＦＲＥＴを使用した。ドナー及びアクセプターの極近位の故に、完全なままのペプチドでのドナー蛍光は、大いに消滅された。プロテアーゼの添加によって、ペプチドは開裂され、ドナー及びアクセプターは互いに拡散分離し、ドナー蛍光は、凡そ４０倍増加した。アッセイの感度は、主に、完全なままのペプチドでのドナー消滅の範囲によって決定される。１００％消滅の欠如は、たとえタンパク質加水分解的活性が存在しなくても、バックグラウンド蛍光の原因となる。著者は、これがそのままのペプチドの、ドナー消滅の増加を助けるので、彼等が、比較的長い寿命（10ナノセカンド）のドナーを使用した事に注目する。（この理由は、ペプチドが柔軟であり、長い寿命が、ペプチド時間を、ドナー及びアクセプターが一緒に近づき、ドナー消滅となる様に柔軟にさせるからである）。
標準の蛍光ドナーをランタニドキレートで置き替える事は、顕著に減少したバックグラウンドを用意し、従って、より良い感度を用意する。ランタニドキレートは、ペプチドの柔軟性により、大きなドナー消滅へと導く有機発蛍光団より長い>105倍の寿命を有する。さらに、任意の残留ドナー発光は、パルス励起を使用する事により、そして検波器の回転により、パルス後のミリセカンドの幾つかの画分に対して分離出来る。ドナーが完全なままのペプチドで、９０％まで消滅されると、例えば、残る１０％の発光は、未消滅のキレートの１／１０、或いは凡そ１００μｓｅｃの寿命を有する。２〜３００ミリセカンドの為の検波器」をゲート開放する事によって、この残留ドナー発光は、検波器への到達を妨げられ、一方、タンパク質加水分解後に生起し、凡そミリセカンド寿命を有する未消滅発光は、ゲートによっては、相対的に影響を受けない。
最後に、ランタニドキレートからアクセプターへのエネルギー移動の格別な効率は、ドナー及びアクセプターの結合点を、標準染料で可能であるよりも、ペプチド上で更に離れて位置付ける事を許す。これは、酵素の結合部位が大きい時には、重要な要件である。
実施例５−遺伝子及びＤＮＡ配列の検出
ＦＲＥＴは、特定のＤＮＡ配列の検出に使用されてきた（Morrison et al., (19899 Analytical Biochemistry 183:231-244, and Lee et al., (1993) Nuclei Acids Research 21:3761-3766）。この用途でＦＲＥＴを使用する主たる利点は、この技術が極めて敏感であり（即ち、１つ又は２〜３の“ターゲット”ＤＮＡ配列を検出出来る）、均質フォーマットで行う事ができる点である。リー等（Lee et al.）が開示する同じ技術は、“Taq-Man”として知られる、アプライドバイオシステム（Applied Biosystem）から市販されている製品である。この適用で、ターゲットＤＮＡ配列に対するＤＡＮプローブ相補体は、結合したドナー及びアクセプターで造られる。プローブがそのままで、シングルストランドである場合は、ドナーは、アクセプターが極めて接近しているので、素早く消滅する。プローブがターゲットＤＡＮに交配すると、プローブは、特定の内部又は外部ヌクレアーゼによって分解される。次いで、ドナーは、アクセプターから拡散分離する為に、遊離し、ドナー蛍光が増加する。ターゲットＤＮＡが存在しないと、特定の分解が起こらず、ドナー蛍光での特定の増加が起こらない。
又、このシステムは、増幅を開発出来る：多くのプローブＤＡＮＡ分子と時間単位毎の結合が存在し、ダブルストランド生成物中のプローブは、ヌクレアーゼで加水分解され、蛍光が増加する。１つのプローブ分子が分解すやいなや、別のプローブが結合し、酵素はこの過程を繰り返す。それ故、１つのターゲットだけに対して、多くのプローブ分子からの蛍光が発生出来る。種々の外部ヌクレアーゼ及び内部ヌクレアーゼが、増幅に適合する；例えば、アプライドバイオシステムは、５′外部ヌクレアーゼ活性を有するTaq-ポリメラーゼを利用する。プローブがＲＮＡを含む場合は、ＲＮＡａｓｅＨは、増幅を開発するのに使用してもよい。
ＤＮＡ検出の為のこれらのＦＲＥＴベースシステムのいずれにおいても、有機染料ドナーをランタニドキレートで置き替える事が、アッセイを改善する。そのままのシングル−ストランドプローブでのドナー消滅の範囲は、ランタニドの長い寿命と、効率的なエネルギー移動の故に、著しく大きい。いかなる残留ドナー発光も、時間−ゲートで識別出来る。結果は、著しいバックグラウンドの減少である（正確には、上に示したプロテアーゼ実験に類似している）。
実施例６：寿命−仕立て上げ染料
上述の如く、ランタニドは、検鏡及び、一般に検出で、発光ラベルとして使用出来る。パルス励起及び時間−遅れ検出の使用で、ランタニドの長い励起状態寿命（ミリセカンド）は、シグナルを、ナノセカンド期間となる傾向のあるバックグラウンド蛍光からの単離を可能とする。然しながら、長い寿命は、分子当りのシグナル強度が必然的に弱いという欠点を有する：１ｍｓｅｃの励起状態寿命の分子は、多くて１０００光子／秒を発生する。これは、遅い発光分子が飽和する、高い発光速度で、特に顕著である。低い発光速度では、長い寿命は、いずれのランタニドも、寿命の逆数より少ない速度で励起されるので、有害ではない。理想的には、寿命が、最適な時間スケール（バックグラウンドが識別されるに十分長く、シグナル強度が顕著に弱められない程に十分短い）に仕立て上げられる発光ラベルを有する。バックグラウンドは、ナノセカンド寿命を有する傾向があるので、例えば、マイクロセカンドのプローブは、シグナルの時間−識別を可能とする。１０００倍長い寿命を有するが、ミリセカンドランタニドより１０００倍以上の光子／秒の発生を、可能的に出来る。その様な、寿命−仕立て上げ染料は、ランタニドキレート（ドナーとして）と、蛍光アクセプターとの間の発光エネルギー移動を利用する事によって造る事が出来る。シグナルは、エネルギー移動によるアクセプターの発光である。この発光の寿命（τ）は、消滅ドナーの寿命に等しく、
τ＝τ0（1-E）      （１）
である（ここで、τ0は、アクセプターが存在しないときのランタニドキレートの寿命であり、Ｅは、エネルギー移動係数（又は、移動エネルギー効率とも呼ばれる）。与えられたτを達成する為のドナー及びアクセプター間の距離（Ｒ）は、ＬＲＥＴに適用可能である事が示された式で（Selvin et al. (1994) PNAS USA 91: 10024-10028; Selvin et al. J. Amer. Chem. Soc. 116:6029-6030; Selvin et al. (19949 Methods in Enzymology, K Sauer, ed., Academic Press, Orlando）、ＦＲＥＴに対する標準式を使用して容易に計算できる（Cantor et al., (1980) Biophysical Chemistry, WH Freeman and Co. SF）：
Ｅ＝１／［1+（R/R0）6］  （２）
ここで、Ｒ0は、ドナー及びアクセプターのスペクトル特性から計算出来る。式（1）及び（2）を組合せると、ドナー及びアクセプター間の距離の関数としての寿命が得られる：
τ＝τ0/［1+（R0/R）6］  （３）
τ0が１．５ｍｓｅｃとすると、９０％エネルギー移動では、増感化発光は、１５０μｓｅｃの寿命で衰退する。９９％のエネルギー移動では、寿命は１５μｓｅｃである。１５μｓｅｃの寿命の発光ラベルが所望であれば、ドナー及びアクセプターを、９９％のエネルギー移動が起こる様に位置付けるべきである。これは、０．４６５ｘＲ0の距離に相当する。ドナーとしてのＴｂ−キレート及びアクセプターとしてのテトラメチルローダミンに対しては（Selvin et al. 1995,上の）、Ｒ0が60Åで、これは28Åに相当する。1.5μsec寿命のプローブは、99.9%のエネルギー移動に対しては、0.316Ｒ0、又はＴｂ−キレートとテトラメチルローダミンに対しては１９Å離してドナーとアクセプターを置く事によって達成出来る。
寿命仕立て上げ染料は、多くの異なる色を発生する事が出来る点に留意されたい。発光ランタニドキレートからエネルギーを取る事の出来るアクセプターであれば、可能である。アクセプター吸収は、ランタニドの主たる発光線と重複する必要はない；より強度の弱い発光線の重複は、アクセプターが十分近くに置かれる限り、非常に効率的エネルギー移動を生む。３０ÅだけのＲ0を持つドナー／アクセプターペアーは、距離９．５Åで99.9％のエネルギー移動を与える。更に、ドナーランタニドは、発光に対して、比較的少ない量子生成を有するものの、効率的エネルギー移動は生起出来る点に留意されたい。テルビウム及びユーロピウム量子生成は、適当なキレートでは明らかに高くなる傾向にあるが、その他のランタニド及び、顕著に低い量子生成の遷移元素、例えば、Pr、Nd、Sm、Dy、Ho、Er、Tm及びRu、Os及びSmは、同様に、有用なドナーとなる。最後に、エネルギー移動の効率は、一般に、ランタニドから発生された光子、或いはアクセプターで、短時間に発生され補足する、殆どの光子で高い（>90%）。光子において、唯一顕著な損失は、アクセプターの非単一量子生成から生起する。これは、高い量子生成を伴うアクセプターを選択する事によって最少化できる。
広範囲の異なる結合分子は、これらの寿命−仕立て上げ染料を造るのに使用してもよい。一般に、目的とする結合体は、約４〜６０の、好ましくは約９〜約３０Åの隔離距離を用意する。結合体の組成は、用途、例えば、疎水性重合性結合体が、膜浸透性染料を用意する為に使用してもよい様な用途の必要性に基づいて選ばれる。ペプチドは、有用な長さに容易に合成され、それらのＮ−及びＣ−末端は、ドナー及びアクセプターを結合するのに使用できる。内部アミノフェニルアラニン（又はリシン）を導入する事によって、反応性イソチオシアネートが、生体（又はその他の）高分子へ、錯体を結合させる為に発生する。又、ペプチドは、ペプチドの性質が、特定の用途を最適化出来る利点を有する；例えば、ポリプロリンは非常に硬く、疎水性である；ポリリシンは親水性であり、高度に陽性帯電されている；一方、ポリグルタメート又はポリアスパルテートは親水性であり、陰性に帯電されている。その他の結合体としては、優れた溶解性及び反応性を有する多糖、ポリイミド及び核酸が挙げられる。ポリマーは、改善された結合部位、例えば、第１級アミンが、核酸ストランドに挿入出来、高分子への結合の為に、イソチオシアネート基へ転換出来る部位を用意する為に誘導されてもよい。
本明細書に引用される全ての文献及び特許出願は、参照の為に導入されるべく、特別に、そして個々に示される。前述の発明は、理解の明瞭化の目的で、例示及び実施例で幾分詳細に記述されたが、本発明の教示に沿って、或る種の変化及び変更は、添付のクレームの精神又は範囲から逸脱する事なく為される事は、当業者にとって極めて明らかである。