(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a)(i)２，２’−エチレンジオキシジエチルアミン、
(ii)トリエチレングリコール、および
(iii)約２００〜約８，０００の分子量を有するポリエチレングリコール
からなる群から選択される部分を含む化学的に定義された結合手プラットフォーム分子であって、前記部分は分枝基で誘導体化されており、但し、前記化学的に定義された結合手プラットフォーム分子が約２００〜約８，０００の分子量を有するポリエチレングリコールからなる場合、前記分枝基はジアミノ酸、トリアミン、およびアミノ二酸基からなる群から選択される官能性部分から誘導され、前記プラットフォーム分子の結合手は、結合手プラットフォーム分子の末端に位置する４以上の結合部位をもっており、前記結合手プラットフォーム分子は、生物学的に活性な分子のための結合部位の数が分枝基の数によって予め定められるように化学的に定義されている、前記結合手プラットフォーム分子と、
(b)複数の生物学的に活性な分子
との結合によって形成され得る結合体であって、前記複数の生物学的に活性な分子が前記結合部位で結合手プラットフォーム分子と結合している、前記結合体。
【請求項２】
結合手プラットフォーム分子が２，２’−エチレンジオキシジエチルアミンを含んでいる、請求項１に記載の結合体。
【請求項３】
結合手プラットフォーム分子がトリエチレングリコールを含んでいる、請求項１に記載の結合体。
【請求項４】
結合手プラットフォーム分子がポリエチレングリコールを含んでいる、請求項１に記載の結合体。
【請求項５】
分枝基が、ジアミノ酸、トリアミン、およびアミノ二酸基からなる群から選択される官能性部分から誘導される、請求項１〜４のいずれかに記載の結合体。
【請求項６】
結合体が２つの分枝基を含んでいて、全部で４つの生物学的に活性な分子のための結合部位を提供する、請求項１〜５のいずれかに記載の結合体。
【請求項７】
個々の結合部位に、前記生物学的に活性な分子の１つが結合している、請求項１〜６のいずれかに記載の結合体。
【請求項８】
生物学的に活性な分子の数が４である、請求項１〜７のいずれかに記載の結合体。
【請求項９】
４つの生物学的に活性な分子が各々同一である、請求項８に記載の結合体。
【請求項１０】
生物学的に活性な分子が、ポリヌクレオチド、並びに炭水化物、脂質、リポポリサッカライド、タンパク質、ペプチド、リポプロテインおよびグリコプロテインからなる群から選択される免疫原のアナログからなる群から選択される、請求項１〜５のいずれかに記載の結合体。
【請求項１１】
生物学的に活性な分子が一本鎖または二本鎖のポリヌクレオチドである、請求項１０に記載の結合体。
【請求項１２】
ポリヌクレオチドが少なくとも約２０ｂｐの長さを有する二本鎖である、請求項１１に記載の結合体。
【請求項１３】
二本鎖が、ヒト全身性紅斑性狼瘡の抗-dsDNA自己抗体に対して顕著な結合活性を有する、請求項１２に記載の結合体。
【請求項１４】
二本鎖がリンカー分子を介して結合手プラットフォーム分子と結合している、請求項１３に記載の結合体。
【請求項１５】
リンカー分子がHADおよびHADpSからなる群から選択される、請求項１４に記載の結合体。
【請求項１６】
二本鎖の長さが実質的に均一である、請求項１３〜１５のいずれかに記載の結合体。
【請求項１７】
二本鎖のヌクレオチド組成が実質的に均一である、請求項１３〜１６のいずれかに記載の結合体。
【請求項１８】
二本鎖の長さが約20から約50塩基対である、請求項１３〜１７のいずれかに記載の結合体。
【請求項１９】
二本鎖が結合手プラットフォーム分子の一方の端部またはその近傍に結合している、請求項１４に記載の結合体。
【請求項２０】
ポリヌクレオチド二本鎖が(CA)10:(TG)10であり、結合手プラットフォーム分子が誘導体化されたトリエチレングリコールである、請求項１４に記載の結合体。
【請求項２１】
二本鎖と結合手プラットフォーム分子のモル比が2:1から8:1の範囲である、請求項１３〜２０のいずれかに記載の結合体。
【請求項２２】
二本鎖と結合手プラットフォーム分子のモル比が4:1から6:1である、請求項１３〜２０のいずれかに記載の結合体。
【請求項２３】
結合体が、ヒト全身性紅斑性狼瘡の免疫寛容原である、請求項１９に記載の結合体。
【請求項２４】
次式を有する、請求項２０に記載の結合体。
【化１】
0003836888.tif 000052
【請求項２５】
二本鎖と結合手プラットフォーム分子との結合が、一本鎖ポリヌクレオチドを結合手プラットフォーム分子に共有結合させる工程、および相補的な一本鎖を前記結合した一本鎖とアニールして二本鎖を形成する工程を含む、請求項１９、２３および２４のいずれかに記載の結合体。
【請求項２６】
生物学的に活性な分子が免疫原のアナログであり、前記アナログが前記免疫原のＢ細胞エピトープを有し、前記免疫原のＴ細胞エピトープをもたない、請求項１０に記載の結合体。
【請求項２７】
免疫原のアナログがポリペプチドである、請求項２６に記載の結合体。
【請求項２８】
免疫原が外来免疫原である、請求項２６に記載の結合体。
【請求項２９】
外来免疫原が、生物学的薬剤、アレルゲン、Rh溶血性疾患に関連するRh/D免疫原、男性不妊症に関連するα-精子、またはリウマチ熱に関連する炭水化物複合体である、請求項２８に記載の結合体。
【請求項３０】
免疫原が自己免疫原である、請求項２６に記載の結合体。
【請求項３１】
自己免疫原が甲状腺炎、卒中または重症筋無力症に関連する、請求項３０に記載の結合体。
【請求項３２】
免疫原およびアナログが同じ化学種のものである、請求項２６〜３１のいずれかに記載の結合体。
【請求項３３】
免疫原およびアナログが異なる化学種のものである、請求項２６〜３１のいずれかに記載の結合体。
【請求項３４】
生物学的に活性な分子がリンカー分子を介して結合手プラットフォーム分子と結合している、請求項１０に記載の結合体。
【請求項３５】
リンカーがスルフヒドリル部分を含んでおり、結合部位がチオフィリック基を含んでいる、請求項３４に記載の結合体。
【請求項３６】
結合部位がチオフィリック基である、請求項１〜５のいずれかに記載の結合体。
【請求項３７】
チオフィリック基が、ハロアセチル、アルキルハライド、アルキルスルホネート、マレイミド、α，β−不飽和カルボニル、アルキル水銀、スルフヒドリル、およびα，β−不飽和スルホンからなる群から選択される、請求項３６に記載の結合体。
【請求項３８】
結合部位が、マレイミド、α-ハロアセチル基、またはその他のMichael付加受容体から選択される、請求項３６に記載の結合体。
【請求項３９】
結合部位がα-ハロアセチル基である、請求項３８に記載の結合体。
【請求項４０】
α-ハロアセチル基がブロモアセチルである、請求項３９に記載の結合体。
【請求項４１】
生物学的に活性な分子を結合手プラットフォーム分子に共有結合させることにより結合体を形成することを含んでなる、請求項１〜４０のいずれかに記載の結合体の製造方法。
【請求項４２】
(a)少なくとも約20塩基の一本鎖ポリヌクレオチドをリンカー分子に共有結合させる工程、
(b)リンカー分子に結合した複数の前記一本鎖ポリヌクレオチドを結合手プラットフォームに共有結合させる工程、および
(c)少なくとも20塩基の相補的な一本鎖ポリヌクレオチドを、前記結合手プラットフォーム分子に結合した前記一本鎖ポリヌクレオチドにアニールさせて二本鎖を形成する工程
を含んでなる、請求項１９、２３および２４のいずれかに記載の結合体を製造する方法。
【請求項４３】
請求項２６〜３３のいずれかに記載の結合体を含む、抗体が媒介する疾患を治療するための薬剤組成物であって、注射による投与用に処方されている、前記薬剤組成物。
【請求項４４】
該組成物が抗体レベルを低下させるのに適している、請求項４３に記載の薬剤組成物。
【請求項４５】
該組成物が抗体産生を抑制するのに適している、請求項４３に記載の薬剤組成物。
【請求項４６】
ヒト全身性紅斑性狼瘡を治療するための薬剤組成物であって、請求項１１〜２５のいずれかに記載の結合体を含んでおり、該組成物が注射による投与用に処方されている、前記薬剤組成物。
【請求項４７】
治療に有効な量の請求項１１〜２５のいずれかに記載の結合体が薬学的に許容可能なキャリヤーと共に処方されている、ヒト全身性紅斑性狼瘡を治療するための薬剤組成物。
【請求項４８】
請求項１〜４０のいずれかに記載の結合体を含んでおり、さらに薬学的に許容可能なキャリヤーを含む薬剤組成物。
【請求項４９】
薬学的に許容可能なキャリヤーと共に処方された請求項２６〜３３のいずれかに記載の結合体を治療に有効な量含んでなる、抗体が媒介する疾患を治療するための薬剤組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、自己免疫疾患である全身性紅斑性狼瘡(SLE、本明細書では単に「狼瘡」とも呼ぶ)などの病気を治療するために用いる、ポリヌクレオチドなどの生物学的あるいは化学的分子とカップリングさせた、化学的に定義された非ポリマー性の結合手プラットフォーム分子を包含する複合体に関する。本発明はまた化学的に定義された非ポリマー性の結合手プラットフォーム分子自身にも関する。
【０００２】
【従来の技術】
多くの化合物が、生物学的に有用な分子の担体として、免疫寛容性であるとされる複合体の調製に用いられてきた。例えば、Benacerraf、Katzおよび彼等の協同研究者達は、初期の研究で「D-GL」と呼ばれ、本明細書では「D-EK」と呼ぶD-グルタミン酸/D-リジンのランダムな共重合体と、ハプテンおよび種々の抗原との複合体を使用し、特定の免疫寛容の誘起を研究および発表している。米国特許第4,191,668号、および米国特許第4,220,565号参照。
【０００３】
他の研究者は、ヌクレオシドあるいはDNAと、他の担体との複合体を研究している。Borelら(Science (1973) 182:76)は、NZB株の若いマウス中で、同系のマウスのIgG-ヌクレオシド複合体が、変性DNAに対する抗体応答を減少させる能力を評価している。別の独立した研究で、Parkerら(J. Immunol. (1974) 113:292)は、ポリ-D-リジンおよび/あるいはシクロホスファミドと複合させた変性DNAの、NZBマウス中での上記の症候の進行に対する影響を評価した。
【０００４】
後の報文でBorelら(Ann. NY Acad. Sci. (1986) 475:296-306)は、オリゴヌクレオチド-免疫グロブリンの複合体に関して記載している。Borelら(J. Clin. Invest. (1988) 82:1901-1907、および米国特許第4,650,675号)は、DNAに結合させたヒト免疫グロブリンの複合体を用いたin vitroでの研究を記載している。Dintzisらの米国特許第5,126,131号もまた、担体と免疫応答に関与する分子とを含む複合体に関する。
【０００５】
他の参考文献は、非免疫性のポリマーと、免疫原との複合体を記載している。(Saikiら、Scand. J. Immun. (1982) 16:191-200；Sehonの、Prog. Allergy (1982) 32:161-202；Wilkinsonらの、J. Immunol. (1987) 139:326-331；Borelらの、J. Immunol. Methods (1990) 126:159-168を参照。)
本発明者らの、米国特許出願番号第07/914,869号、米国特許第5,162,515号、および米国特許出願番号第07/652,658号には、D-EK、ポリエチレングリコール、ポリ-D-リジン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、等のポリマー性の担体と、免疫グロブリンとからなる複合体が記載されている。
【０００６】
上記の従来技術を要約すると、定義の不明確な化合物、あるいは、多くの非特異な結合部位を有する化合物が、複合体の結合手プラットフォーム分子として使用されているに過ぎないと、本発明者らは考える。この様な化合物の結合手、結合部位の位置、および、結合部位の数が、予想できず、そして大きく変動するために、この様な化合物からなる従来技術の複合体は、再現性良く製造し得ず、そしてその報告された活性は広い変動範囲を示している。
【０００７】
【発明の要旨】
上述の従来技術とは対照的に、本発明者らは、化学的に定義された非ポリマー性の結合手プラットフォーム分子を含む複合体を開発した。プラットフォーム分子の価数は予め定められ、各結合部位は生物学的あるいは化学的分子の結合のために用い得る。本発明の結合手プラットフォーム分子は、化学構造、価数、均一性が定義され、適切な生物学的および/あるいは化学的分子と効率的に結合させるための、定義された官能基を有している。
【０００８】
従って、本発明は１つの局面では、化学的に定義された非ポリマー性の結合手プラットフォーム分子、および、生物学的および/あるいは化学的分子を含む複合体に関している。化学的に定義された非ポリマー性の結合手プラットフォーム分子と結合させ、本発明の複合体を形成するのに適した、生物学的および/あるいは化学的分子の例は、炭水化物、薬剤、脂質、リポポリサッカライド、ペプチド、タンパク質、グリコプロテイン、一本鎖あるいは二本鎖のオリゴヌクレオチドおよびそれらの化学的アナログ、免疫原のアナログ、ハプテン、ミモトープ、アプタマー等である。本発明に用いるのに適した、化学的に定義された非ポリマー性の結合手プラットフォーム分子には、これらにのみ限定はされないが、以下の式の生体適合性で非抗原性の炭素ベースの化合物の誘導体が含まれる。
【０００９】
【化８】
0003836888.tif 000002
【００１０】
あるいは、
【００１１】
【化９】
0003836888.tif 000003
【００１２】
但し、存在する場合、G[1]およびG[2]は各々独立して、C、N、O、Si、PおよびSからなる群から選択される1-2000の、さらに好ましくは1-1000の鎖状原子を含む、直鎖、分枝あるいは複数に分枝した鎖である。
【００１３】
さらに好ましくは、存在する場合、G[2]は、ポリアルコール、ポリアミン、あるいはポリグリコールから誘導される基であり、最も好ましくはG[2]は、qが0から20の-(CH2)q-、rが0から300の-CH2(CH2OCH2)rCH2-、および、sが1から4、さらに好ましくはsが3から4のC(CH20CH2CH2-)s(OH)4-sからなる群から選択される。
【００１４】
T[1]として示されたn[1]個の部分、および、T[2]として示されたp[2]×n[2]個の部分は各々独立して、-NHRSUB(アミン)、-C(=O)NHNHRSUB(ヒドラジド)、-NHNHRSUB(ヒドラジン)、-C(=O)OH(カルボン酸)、-C(=O)ORESTER(活性エステル)、-C(=O)OC(=O)RB(無水物)、-C(=O)X(酸ハライド)、-S(=O)2X(スルホニルハライド)、-C(=NRSUB)ORSUB(イミデートエステル)、-NCO(イソシアネート)、-NCS(イソチオシアネート)、-OC(=O)X(ハロホルメート)、-C(=O)OC(=NRSUB)NHRSUB(カルボジイミド付加体)、-C(=O)H(アルデヒド)、-C(=O)RB(ケトン)、-SH(スルフヒドリル、あるいはチオール)、-OH(アルコール)、-C(=O)CH2X(ハロアセチル)、-RALKX(アルキルハライド)、-S(=O)2ORALKX(アルキルスルホネート)、R1R2が、-C(=O)CH=CHC(=O)-である-NR1R2(マレイミド)、-C(=O)CRB=CRB2(α,β-不飽和カルボニル)、-RALK-Hg-X(アルキル水銀)、および-S(=O)CRB=CRB2(α,β-不飽和スルホン)からなる群から選択される。
【００１５】
さらに好ましくは、T[1]として示されたn[1]個の部分、および、T[2]として示されたp[2]×n[2]個の部分は各々独立して、-NHRSUB(アミン)、-C(=O)CH2X(ハロアセチル)、-RALKX(アルキルハライド)、-S(=O)2ORALKX(アルキルスルホネート)、R1R2が-C(=O)CH=CHC(=O)-である-NR1R2(マレイミド)、-C(=O)CRB=CRB2(α,β-不飽和カルボニル)、-RALK-Hg-X(アルキル水銀)、および-S(=O)CRB=CRB2(α,β-不飽和スルホン)からなる群から選択される。
【００１６】
さらにより好ましくは、T[1]として示されたn[1]個の部分、および、T[2]として示されたp[2]×n[2]個の部分は各々独立して、-NHRSUB(アミン)、-C(=O)CH2X(ハロアセチル)、R1R2が-C(=O)CH=CHC(=O)-である-NR1R2(マレイミド)、および、-C(=O)CRB=CRB2(α,β-不飽和カルボニル)からなる群から選択される。
【００１７】
最も好ましくは、T[1]として示されたn[1]個の部分の全て、および、T[2]として示されたp[2]×n[2]個の部分の全ては、同じである。
【００１８】
式中の、
各Xは独立して、原子番号が16より大きく54未満のハロゲン(Cl=17,Br=35,I=53)、あるいは他の良好な脱離基(すなわち、この状況でハロゲンと同様に振舞う、アルキルあるいはアルキル置換のスルホネートあるいはスルフェート等、アリールあるいはアリール置換のスルホネートあるいはスルフェート等、の弱い塩基)である。
【００１９】
各RALKは独立して直鎖、分枝、あるいは環状の(1-20C)のアルキル基である。
【００２０】
各RSUBは独立して、H、直鎖、分枝、あるいは環状の(1-20C)のアルキル、(6-20C)のアリール、あるいは(7-30C)のアルキルアリールである。
【００２１】
各RESTERは独立して、N-スクシンイミジル、p-ニトロフェニル、ペンタフルオロフェニル、テトラフルオロフェニル、ペンタクロロフェニル、2,4,5-トリクロロフェニル、2,4-ジニトロフェニル、シアノメチル等、あるいは、5-クロロ-8-キノロン-1-イル、1-ピペリジル、N-ベンゾトリアゾリル等、の様なその他の活性化基である。
【００２２】
各RBは独立して、C、H、N、O、Si、PおよびSからなる群から選択される1-50の原子を含む基である。
【００２３】
存在する場合、L[2]で示されるn[2]個の部分は各々独立して、O、NRSUBおよびSからなる群から選択される。
【００２４】
存在する場合、J[2]で示されるn[2]個の部分は各々独立して、C(=O)およびC(=S)からなる群から選択される。
【００２５】
n[1]は、1から32であり、より好ましくはn[1]は2から16であり、さらに好ましくはn[1]は2から8であり、最も好ましくはn[1]は2から4である。
【００２６】
n[2]×p[2]の積が、1より大きくかつ33未満という条件で、
n[2]は、1から32であり、より好ましくはn[2]は1から16であり、さらに好ましくはn[2]は1から8であり、さらにより好ましくはn[2]は1から4であり、最も好ましくはn[2]は1から2である；
p[2]は、1から8であり、より好ましくはp[2]は1から4であり、最も好ましくはp[2]は1から2である。
【００２７】
Z[2]で示されるn[2]個の部分は各々独立して、少なくともp[2]個の官能基のための結合部位をアルキル炭素原子、アルケニル炭素原子、あるいは芳香族炭素原子上に含む、C、H、N、O、Si、PおよびSからなる群から選択される1-200の原子を含む基である。
【００２８】
より好ましくは、Z[2]として示されたn[2]個の部分の全ては、同じである。
【００２９】
さらに好ましくは、Z[2]として示されたn[2]個の部分は各々独立して以下の群から選択される式で記述される。
【００３０】
【化１０】
0003836888.tif 000004
【００３１】
【化１１】
0003836888.tif 000005
【００３２】
あるいは、
【００３３】
【化１２】
0003836888.tif 000006
【００３４】
但し式中、存在する場合、W[3]、W[4]、あるいはW[5]として示されたn[2]個の部分は各々独立して、C、H、N、O、Si、PおよびSからなる群から選択される1-100の原子を含む基である。
【００３５】
Y[3]として示されたn[2]個の部分、Y[4]として示された2×n[2]個の部分、およびY[5]として示された2×n[2]個の部分は各々独立して、少なくともp[2]個の官能基(Y[3]の場合)、あるいは、p[2]/2個の官能基(Y[4]およびY[5]の場合、但しp[2]/2は整数である)のための結合部位をアルキル炭素原子、アルケニル炭素原子、あるいは芳香族炭素原子上に含む、C、H、N、O、Si、PおよびSからなる群から選択される1-100の原子を含む基である。
【００３６】
より好ましくは、存在する場合、W[3]として示されたn[2]個の部分は各々独立して、rが1から10である、(CH2)r、(CH2CH2O)r、NRSUB(CH2CH2O)rCH2CH2、およびNRSUB(CH2)rNRSUBC(=O)である。
【００３７】
さらに好ましくは、Y[3]で示されたn[2]個の部分は各々独立して、直鎖、分枝、あるいは環状の(1-20C)のアルキル、(6-20C)のアリール、あるいは(7-30C)のアルキルアリールである。
【００３８】
最も好ましくは、Y[3]で示されたn[2]個の部分は各々独立して、C6H4(1,4-二置換フェニル)、C6H3(1,3,5,-三置換フェニル)、およびrが1から10である(CH2)rからなる群から選択される。
【００３９】
より好ましくは、存在する場合、W[4]として示されたn[2]個の部分は各々独立して、rが1から10である、(CH2)rC(=O)、および(CH2)rNRSUBC(=O)からなる群から選択される。
【００４０】
より好ましくは、Y[4]として示された2×n[2]個の部分は各々独立して、rが1から10、より好ましくはrが2から6で、qが1から10、より好ましくはqが1から3である、(CH2)r、(CH2)rNRSUBC(=O)(CH2)q、(CH2)rC(=O)NRSUB(CH2)q、(CH2)rNRSUBC(=O)(CH2)qNRSUBC(=O)(CH2)r、(CH2)rC(=O)NRSUB(CH2)qNRSUBC(=O)(CH2)r、(CH2)rNRSUBC(=O)(CH2CH2O)qCH2CH2、および、(CH2)rC(=O)NRSUB(CH2CH2O)qCH2CH2からなる群から選択される。
【００４１】
より好ましくは、存在する場合、W[5]で示されたn[2]個の部分は各々独立して、rが1から10である、(CH2)rC(=O)NRSUB、および(CH2)rNRSUBC(=O)NRSUBからなる群から選択される。
【００４２】
より好ましくは、Y[5]で示された2×n[2]個の部分は各々独立して、rが1から10でqが1から10である、(CH2)r、および(CH2)rC(=O)NRSUB(CH2)qからなる群から選択される。
【００４３】
狼瘡を治療するための、別の好ましい実施態様では、複合体は、化学的に定義された非ポリマー性の結合手プラットフォーム分子、および、該プラットフォーム分子に各々結合し、そして、ヒトSLEの抗dsDNA自己抗体に対して顕著な結合活性を有する、複数の少なくとも約20塩基対のポリヌクレオチド二本鎖を含む。これらの好ましい実施態様では、ポリヌクレオチド二本鎖は、実質的に長さが均一で、そして、二本鎖の一方の一本鎖が、直接に、あるいはリンカー分子を介して、の何れかで結合手プラットフォーム分子と結合されている。一般に、合成ポリヌクレオチドをリンカー分子と結合させ、次いで結合手プラットフォーム分子と結合させる。一般に、鎖中のリンカー分子が結合した位置から、少なくとも約20塩基対のペンダント鎖が各鎖に形成される様に、二本鎖の内のリンカーを含む鎖を、その一端で、あるいは一端の近傍(即ち、約5塩基対以内)で結合させる。次いで、第２の鎖を該第１の鎖にアニールし、二本鎖を形成する。従って、本発明の複合体は、以下の式で一般的に記述し得る：
[(PN)n-リンカー]m-結合手プラットフォーム分子
但し式中、nは少なくとも約20で、mは2-8であり、PNはn個のヌクレオチドを有する二本鎖ポリヌクレオチドである。
【００４４】
本発明に適したリンカー分子の例は、チオ-6炭素鎖ホスフェートであるHADの様な6個の炭素のチオール、およびチオ-6炭素鎖ホスホロチオエートであるHADpSである。本発明の化学的に定義された結合手プラットフォーム分子は、例えば、アミノ修飾したPEGと、3,5-ビス-(ヨードアセトアミド)ベンゾイルクロライド(本明細書では以降「IA-DABAクロライド」と呼ぶ)；3-カルボキシプロピオンアミド-N,N-ビス-[(6'-N'-カルボベンジルオキシアミノヘキシル)アセトアミド] 4"-ニトロフェニルエステル(本明細書では以降「BAHA」と呼ぶ)；3-カルボキシプロピオンアミド-N,N-ビス-[(8'-N'-カルボベンジルオキシアミノ-3',6',-ジオキサオクチル)アセトアミド] 4"-ニトロフェニルエステル(本明細書では以降「BAHAOX」と呼ぶ)とを反応させ；あるいは、PEG-ビス-クロロホルメートと、N,N-ジ[2-(6'-N'-カルボベンジルオキシアミノヘキサノアミド)エチル]アミン(本明細書では以降「AHAB」と呼ぶ)とを反応させることにより形成される。
【００４５】
本発明の複合体の二本鎖のヌクレオチド組成は、実質的に均一であり得る。本発明の複合体の二本鎖の長さは、20から50塩基対であり得る。本発明の複合体の二本鎖は、その端部あるいはその近傍で、結合手プラットフォーム分子に結合し得る。本発明の複合体のポリヌクレオチド二本鎖は、異なる塩基の2マーから4マーの、相補的な繰り返し単位から構成され得る。本発明の複合体のポリヌクレオチド二本鎖は：ポリ(CG):ポリ(CG)；ポリ(TA):ポリ(TA)；ポリ(CI):ポリ(CI)；ポリ(CA):ポリ(TG)；あるいは、ポリ(GA):ポリ(TC)；であり得る。
【００４６】
本発明の複合体においては、ポリヌクレオチド二本鎖は、(CA)10:(TG)10であり得、上記結合手プラットフォーム分子は、誘導体化されたトリエチレングリコールであり得る。この複合体においては、上記二本鎖と、上記結合手プラットフォーム分子との、モル比は、好ましくは2:1から8:1であり、さらに好ましくは4:1である。
【００４７】
本発明の複合体においては、ポリヌクレオチド二本鎖は、(CA)10:(TG)10であり得、上記結合手プラットフォーム分子は、誘導体化された1,2-ビス-(2'-アミノエトキシ)エタンであり得る。この複合体においては、上記二本鎖と、1,2-ビス-(2'-アミノエトキシ)エタンとの、モル比は、好ましくは2:1から8:1であり、さらに好ましくは4:1である。
【００４８】
本発明の複合体は、ヒトSLE(全身性紅斑性狼瘡)の免疫寛容原であり得る。
【００４９】
本発明の複合体のポリヌクレオチド二本鎖は、B-DNAタイプの螺旋構造を有し得、そして、ヒトSLE(全身性紅斑性狼瘡)の抗dsDNA自己抗体に対して顕著な結合活性を有し得る。
【００５０】
本発明によれば、狼瘡の治療のための薬学的組成物は、薬学的に許容可能で注射可能な賦形剤と共に処方された、本発明の複合体を含み得る。狼瘡を患った個体を治療する方法は、治療を必要とする個体に、治療に有効な量のこの組成物を投与する工程を含み得る。
【００５１】
本発明の複合体を製造するための方法は：(a)各々が少なくとも約20塩基対の複数の一本鎖ポリヌクレオチドを、上記結合手プラットフォーム分子上に結合させる工程；および(b)相補的な一本鎖ポリヌクレオチドを、結合手プラットフォーム分子に結合したこの一本鎖ポリヌクレオチドとアニールさせ、上記二本鎖を形成する工程、を含み得る。この方法は、先ず、上記ポリヌクレオチド二本鎖をリンカー分子に結合し、そして次に、このリンカー分子を上記結合手プラットフォーム分子に結合する工程をさらに含み得る。
【００５２】
本発明の複合体の生物学的あるいは化学的分子は、免疫原のアナログであり得、ここで、(a)このアナログは、免疫原が特異的に結合するB細胞に、特異的に結合し、そして(b)この複合体はT細胞のエピトープを欠いているものであり得る。ここで、上記免疫原は、生物学的薬剤、アレルゲン、Rh溶血性疾患に関連したRh/D免疫原、男性不妊症に関連したα-精子、あるいは、リウマチ熱に関連した炭水化物複合体のような外来免疫原であり得る。あるいは、上記免疫原は、甲状腺炎、糖尿病、卒中、あるいは重症筋無力症に関連しているような自己免疫原であり得る。上記免疫原および上記アナログは、同じ化学種、例えば、ポリペプチドであり得る。あるいは、上記免疫原および上記アナログは、異なる化学種であり得る。
【００５３】
本発明によれば、抗体が媒介する疾患の治療のための薬学的組成物は、薬学的に許容可能なキャリアーと組合わされた、治療に有効な量の本発明の複合体を含み得る。
【００５４】
本発明によれば、免疫原に対して特異的なB細胞アネルギーを、個体中に誘起する方法は、有効な量の本発明の複合体を、例えば、上記の薬学的組成物の形態で、個体に投与する工程を含み得る。
【００５５】
本発明によれば、免疫原に対する応答で望ましくない抗体が産生される、抗体が媒介する疾患を有する個体を治療する方法は、治療に有効な量の本発明の複合体を、例えば上記の薬学的組成物の形態で、個体に投与する工程を含み得る。
【００５６】
本発明の複合体を製造する方法は：(a)T細胞のエピトープを欠いている上記の免疫原のアナログを、化学的に定義された上記結合手プラットフォーム分子と共有結合させ、複合体を形成する工程；および(b)この複合体を反応混合物中から回収する工程、を含み得る。ここで、上記免疫原は、生物学的薬剤、アレルゲン、男性不妊症に関連したα-精子、あるいは、Rh溶血性疾患に関連したRh/D免疫原のような外来免疫原であり得る。あるいは、上記免疫原は、甲状腺炎、糖尿病、卒中、重症筋無力症、あるいは、リウマチ熱に関連しているような自己免疫原であり得る。上記免疫原およびアナログは、同じ化学種であり得る。
【００５７】
驚くべきことに、本発明の化学的に定義された、非ポリマー性の結合手プラットフォーム分子と、生物学的あるいは化学的な分子(非ハプテン)とからなる複合体を用いると、従来技術に記載されているポリマー性の担体に比べ、少なくとも約10倍から数100倍以上の免疫抑制という、予期されなかった結果が達成された。例えば、本明細書に記載したように、化学的に定義された、非ポリマー性の結合手プラットフォーム分子を含む本発明の複合体を用いると、従来技術に記載されている定義の不明確な担体に比べ、少なくとも100倍の抗-dsDNA自己抗体の免疫抑制が達成された。
【００５８】
本発明のさらに別の局面は、(a)化学的に定義された非ポリマー性の結合手プラットフォーム分子と、(b)二本鎖の一方の鎖の一端あるいは一端の近傍に位置する官能基により、該結合手プラットフォーム分子に、各々全てが結合された、複数のポリヌクレオチド二本鎖とからなり、ヒトSLEの免疫寛容原である、複合体である。
【００５９】
上記の複合体の薬学的組成物、および、薬学的に許容可能な製薬媒体は、本発明のさらに別の局面である。
【００６０】
本発明の別の局面は、治療を必要とする個体に、有効な量の上記の複合体を投与する工程を含む、SLEを治療する方法である。
【００６１】
本発明のさらに別の局面は、有効な量の上記の複合体を、個体に投与する工程を含む、個体中に、免疫原に対する特異的なB細胞アネルギーを誘起する方法である。
【００６２】
本発明の別の局面は、有効な量の上記の複合体を個体に投与する工程を含む、免疫原に応答して望ましくない抗体が産生される、抗体が媒介する疾患を治療する方法である。
【００６３】
本発明の別の局面は、生物学的あるいは化学的な分子を、化学的に定義された結合手プラットフォーム分子に結合させて、複合体を形成する工程を含む、上記の複合体を製造するための方法である。
【００６４】
本発明の別の局面は、各々が少なくとも約20ヌクレオチドの長さで、そして、化学的に定義された結合手プラットフォーム分子上の官能基と反応する官能基をその一端あるいは一端の近傍に有する、複数の一本鎖ポリヌクレオチドを、反応させて複合体を形成する工程、および、化学的に定義された結合手プラットフォーム分子に結合された一本鎖ポリヌクレオチドと、相補的な一本鎖ポリヌクレオチドとをアニールして、二本鎖DNAのペンダント鎖を形成する工程を含む、上記のSLEを治療するための複合体の製造方法である。
【００６５】
本発明のさらに別の局面は、以下の式の新規な、化学的に定義された非ポリマー性の結合手プラットフォーム分子である：
【００６６】
【化１３】
0003836888.tif 000007
【００６７】
あるいは、
【００６８】
【化１４】
0003836888.tif 000008
【００６９】
但し、存在する場合、G[6]およびG[7]は各々独立して、C、N、O、Si、PおよびSからなる群から選択される1-2000の、より好ましくは1-1000の、鎖状原子を含む、直鎖、分枝あるいは複数に分枝した鎖である。
【００７０】
さらに好ましくは、G[6]およびG[7]は各々、ポリアルコール、ポリアミン、あるいはポリグリコールから誘導される基である。
【００７１】
最も好ましくは、G[6]およびG[7]は各々、qが0から20の-(CH2)q-、rが0から300の-CH2(CH2OCH2)rCH2-、およびsが1から4の、より好ましくはsが3から4の、C(CH20CH2CH2-)s(OH)4-sからなる群から選択される。
【００７２】
T[6]として示されたn[6]×p[6]個の部分、および、T[7]として示されたp[7]×n[7]個の部分は各々独立して、-NHRSUB(アミン)、-C(=O)NHNHRSUB(ヒドラジド)、NHNHRSUB(ヒドラジン)、-C(=O)OH(カルボン酸)、-C(=O)ORESTER(活性エステル)、-C(=O)OC(=O)RB(無水物)、-C(=O)X(酸ハライド)、-S(=O)2X(スルホニルハライド)、-C(=NRSUB)ORSUB(イミデートエステル)、-NCO(イソシアネート)、-NCS(イソチオシアネート)、-OC(=O)X(ハロホルメート)、-C(=O)OC(=NRSUB)NHRSUB(カルボジイミド付加体)、-C(=O)H(アルデヒド)、-C(=O)RB(ケトン)、-SH(スルフヒドリル、あるいはチオール)、-OH(アルコール)、-C(=O)CH2X(ハロアセチル)、-RALKX(アルキルハライド)、-S(=O)2ORALKX(アルキルスルホネート)、R1R2が-C(=O)CH=CHC(=O)-である-NR1R2(マレイミド)、-C(=O)CRB=CRB2(α,β-不飽和カルボニル)、-RALK-Hg-X(アルキル水銀)、および-S(=O)CRB=CRB2(α,β-不飽和スルホン)からなる群から選択される。
【００７３】
より好ましくは、T[6]として示されたn[6]×p[6]個の部分、および、T[7]として示されたn[7]×p[7]個の部分は各々独立して、-NHRSUB(アミン)、-C(=O)CH2X(ハロアセチル)、-RALKX(アルキルハライド)、-S(=O)2ORALKX(アルキルスルホネート)、R1R2が-C(=O)CH=CHC(=O)-である-NR1R2(マレイミド)、-C(=O)CRB=CRB2(α,β-不飽和カルボニル)、-RALK-Hg-X(アルキル水銀)、および-S(=O)CRB=CRB2(α,β-不飽和スルホン)からなる群から選択される。
【００７４】
さらに好ましくは、T[6]として示されたn[6]×p[6]個の部分、および、T[7]として示されたn[7]×p[7]個の部分は各々独立して、-NHRSUB(アミン)、-C(=O)CH2X(ハロアセチル)、R1R2が-C(=O)CH=CHC(=O)-である-NR1R2(マレイミド)、-C(=O)CRB=CRB2(α,β-不飽和カルボニル)からなる群から選択される。
【００７５】
最も好ましくは、T[6]として示されたn[6]×p[6]個の部分の全て、および、T[7]として示されたn[7]×p[7]個の部分の全ては、同じである。
【００７６】
ここで式中、
各Xは、独立して、原子番号が16から54のハロゲン、あるいは良好な脱離基である。
【００７７】
各RALKは独立して、直鎖、分枝あるいは環状の(1-20C)のアルキル基である。
【００７８】
各RSUBは独立して、H、直鎖、分枝、あるいは環状の(1-20C)のアルキル、(6-20C)のアリール、あるいは(7-30C)のアルキルアリールである。
【００７９】
各RESTERは独立して、N-スクシンイミジル、p-ニトロフェニル、ペンタフルオロフェニル、テトラフルオロフェニル、ペンタクロロフェニル、2,4,5-トリクロロフェニル、2,4-ジニトロフェニル、シアノメチル等、あるいは、5-クロロ-8-キノロン-1-イル、1-ピペリジル、N-ベンゾトリアゾリル等、の様なその他の活性化基である。
【００８０】
各RBは独立して、C、H、N、O、Si、PおよびSからなる群から選択される1-50の原子を含む基である。
【００８１】
n[6]×p[6]の積が、1より大きくかつ33未満という条件で、
n[6]は、1から32であり、より好ましくはn[6]は1から16であり、さらに好ましくはn[6]は1から8であり、さらに好ましくはn[6]は1から4であり、最も好ましくはn[6]は1から2である；
p[6]は、1から8であり、より好ましくはp[6]は1から4であり、最も好ましくはp[6]は1から2である。
【００８２】
n[7]×p[7]の積が、1より大きくかつ33未満という条件で、
n[7]は、1から32であり、より好ましくはn[7]は1から16であり、さらに好ましくはn[7]は1から8であり、さらに好ましくはn[7]は1から4であり、最も好ましくはn[7]は1から2である；
p[7]は、1から8であり、より好ましくはp[7]は1から4であり、最も好ましくはp[7]は1から2である。
【００８３】
Q[6]で示されたn[6]個の部分、および、Q[7]で示された2×n[7]個の部分は各々独立して、少なくともp[6]個の(Q[6]の場合)あるいはp[7]/2個の(Q[7]の場合、例えば、だしp[7]/2は整数である)の官能基のための結合部位をアルキル炭素原子、アルケニル炭素原子、あるいは芳香族炭素原子上に含む、C、H、N、O、Si、PおよびSからなる群から選択される1-100の原子を含む基である。
【００８４】
より好ましくは、Q[6]として示されたn[6]個の部分の全ては、同じである。
【００８５】
より好ましくは、Q[7]として示された2×n[7]個の部分の全ては同じである。
【００８６】
より好ましくは、Q[6]として示されたn[6]個の部分は各々独立して、rが1から10でqが1から10である、CH[(CH2)r(結合部位)]2、およびCH[(CH2)rC(=O)NRSUB(CH2)q(結合部位)]2からなる群から選択される。
【００８７】
より好ましくは、Q[7]として示された2×n[7]個の部分は各々独立して、rが1から10、より好ましくはrが2から6であり、qが1から10、より好ましくはqが1から3である、(CH2)r、(CH2)rNRSUBC(=O)(CH2)q、(CH2)rC(=O)NRSUB(CH2)q、(CH2)rNRSUBC(=O)(CH2)qNRSUBC(=O)(CH2)r、(CH2)rC(=O)NRSUB(CH2)qNRSUBC(=O)(CH2)r、(CH2)rNRSUBC(=O)(CH2CH2O)qCH2CH2、および、(CH2)rC(=O)NRSUB(CH2CH2O)qCH2CH2からなる群から選択される。
【００８８】
【発明の構成】
本明細書で使用する用語「結合手プラットフォーム分子」は、別個の多くの生物学的および/あるいは化学的な分子の結合を可能とする複数の部位を有する、化学的に定義された、非ポリマー性の、非免疫原性の分子を意味する。
【００８９】
本明細書で使用する用語「非免疫原性」は、前記結合手プラットフォーム分子の形容詞に用いられ、そして、前記結合手プラットフォーム分子が、単独で個体に投与された時に、免疫応答を実質的に引き起こさないことを意味する。
【００９０】
本明細書で使用する用語「個体」は、多くの哺乳類の種を意味し、ヒト、霊長類、マウス、および、ウシや羊の様な家畜、馬の様な競技用動物、および、犬や猫の様なペット等を含む。
【００９１】
本明細書で使用する用語「免疫原(immunogen)」は、動物に注入した時に、液性免疫応答を誘起する物質である。免疫原は、B細胞エピトープおよびT細胞エピトープの両方を有する。
【００９２】
本明細書で使用する用語、免疫原の「アナログ」は、(a)免疫原が特異的に結合する抗体に特異的に結合し、そして(b)T細胞エピトープを欠く分子の意味である。通常は、アナログは免疫原の断片であるか誘導体であるため、免疫原と同じ化学種に属するが(例えば、免疫原がポリペプチドで、アナログがポリペプチド)、化学的類似性は重要では無い。従って、上記の(a)および(b)の機能的特性を有するという条件で、アナログは免疫原と異なった化学種(例えば、免疫原が炭化水素で、アナログがポリペプチド)であり得る。アナログは、タンパク質、炭水化物、脂質、リポプロテイン、グリコプロテイン、リポポリサッカライド、核酸、あるいは他の化学的あるいは生物学的物質であり得る。
【００９３】
免疫原のアナログには、「ミモトープ」もまた含まれ得る。本明細書で使用する用語「ミモトープ」は、抗体が免疫原と結合するのを競合的に妨げる、合成分子を意味する。抗体と特異的に結合するので、ミモトープは、免疫原の抗原決定部位を模倣していると考えられている。免疫原のアナログと同様に、ミモトープは、(a)免疫原が特異的に結合する抗体に特異的に結合し、そして(b)T細胞エピトープを欠く。
【００９４】
免疫原のアナログには「アプタマー」もまた含まれ得る。本明細書で使用する用語「アプタマー」は、抗体が免疫原と結合するのを競合的に妨げる合成オリゴヌクレオチドを意味する。免疫原のアナログと同様にアプタマーは、(a)免疫原が特異的に結合する抗体に特異的に結合し、そして(b)T細胞エピトープを欠く。
【００９５】
本明細書で使用する用語「B細胞アネルギー」は、抗体の産生および分泌にT細胞の補助を受けることを必要とするB細胞の応答の欠如を意味し、そして、これらに限定されないが、成熟および/あるいは未成熟B細胞のクローン欠損、および/あるいは、B細胞が抗体を産生する能力を欠如すること、を含む。本明細書で使用する用語「応答の欠如」は、免疫原に対する液性応答の治療的に有効な減少を意味する。定量的表現では、(抗体産生の減少で測定される)該減少は、少なくとも50%、好ましくは少なくとも75%、そして最も好ましくは100%である。
【００９６】
本明細書で使用する用語「抗体」は、その産生が、T細胞依存性の抗体を意味する。
【００９７】
本発明の化学的に定義された結合手プラットフォーム分子の価数は、該プラットフォーム分子に導入する分枝した基の数により、予め定め得る。適切な分枝した基は、一般に、ジアミノ酸、トリアミン、およびアミノ二酸から誘導される。ジアミノ酸およびアミノ二酸の例には、以下の式の化合物が含まれる：
【００９８】
【化１５】
0003836888.tif 000009
【００９９】
本発明の複合体は、生物学的に安定である；即ち、数時間、数日、あるいは数カ月のオーダーのin vivoでの排泄半減期を示し、治療効果に寄与する。本発明の化学的に定義された結合手プラットフォーム分子はまた、実質的に非免疫原性であり(即ち、動物に投与した際に免疫原性を示さない、あるいは穏やかな免疫原性のみを示す)、与えた投与量で非毒性であり(即ち、治療薬として有用であるために十分な程度に非毒性)、そして好ましくは、定義された化学構造からなる。これらは、ポリヌクレオチド二本鎖の様な、複数の生物学的あるいは化学的分子が共有結合で結合し得る、非免疫原性で非毒性の多官能性基質を提供する。これらは通常、約200から約200,000の範囲の平均分子量を有し、一般には約200から約20,000である。これらは、分子量が大きく変動する化合物の混合物である従来技術のポリマーに比べ、均一である。特に好適で均一な本発明の結合手プラットフォーム分子の例は、約200から8,000の分子量を有する誘導体化した、2,2'-エチレンジオキシジエチルアミン(EDDA)、トリエチレングリコール(TEG)、およびポリエチレングリコール(PEG)である。
【０１００】
生物学的あるいは化学的な分子の、化学的に定義されたプラットフォーム分子への結合は、多くの方法で行い得る。典型的には、生物学的あるいは化学的な分子、および、結合手プラットフォーム分子の官能基ならびに、1種類あるいはそれ以上の架橋剤を用いて行われる。
【０１０１】
結合手プラットフォーム分子にカップリングされる合成ポリヌクレオチド二本鎖は、少なくとも約20 bp、そして好ましくは20-50 bpからなる。本明細書に記載するポリヌクレオチドは、他にことわりが無い限りデオキシリボヌクレオチドであり、5'から3'方向に記載する。この二本鎖は、実質的に長さが均一であることが好ましい；即ち、母集団中の長さの変動が、塩基対の数で表した平均二本鎖長の約±20%、好ましくは±10%を超えない。ヌクレオチド組成もまた、実質的に均一であることが好ましい；即ち、塩基組成および塩基配列が、各二本鎖の間で約10%以上変動しない。ヌクレオチド組成は、各二本鎖で完全に均一であることが最も好ましい。
【０１０２】
円二色性(CD)スペクトルの解釈に基づくと、本発明の二本鎖は、B-DNAタイプの螺旋構造であると推測される。ただし、本発明がこの推測により限定されることは意図しない。より完全な分析に基づくならば、二本鎖は、Z-DNAおよび/あるいはA-DNAタイプの螺旋構造であるかも知れない。
【０１０３】
これらのポリヌクレオチド二本鎖は、天然のDNAから合成し得、あるいは化学的あるいは組み換えの技法で合成し得る。天然あるいは組み換えで産生されたより長鎖のdsDNAは、消化(例えば、酵素的消化、化学的消化、あるいは機械的剪断)され、そして、(例えば、アガロースゲルあるいはSephadex（登録商標）カラムで)分画されて、目的の長さのポリヌクレオチドを与え得る。
【０１０４】
あるいは、長さが約70塩基迄の相補的な一本鎖ポリヌクレオチド鎖の対は、一般的な手順で、市販されているDNA合成装置を用いて容易に調製され、次いでアニールされて、二本鎖を形成する。より長鎖の合成dsDNAは、化学的に製造した複数の短い鎖の酵素伸張(5'-ホスホリル化し、次にライゲーションする)により入手し得る。
【０１０５】
ポリヌクレオチドは、分子クローニングによっても製造し得る。例えば、目的の長さと配列のポリヌクレオチドは上述の様にして合成される。これらのポリヌクレオチドは、消化され、特定の制限酵素部位へライゲーションで挿入するための適切な末端を有し得る。得られた構築物は、標準的なクローニングベクター中に挿入し、そして該ベクターを形質転換により、適切な微生物/細胞に導入する。形質転換体は、標準マーカーにより確認され、そしてDNA複製に適した条件下で増殖させる。ポリヌクレオチドは、制限酵素での処理、および(例えば、アガロースゲルあるいはSephadex（登録商標）カラムによる)一般的なサイズ分画法により、他の微生物/細胞のDNAから単離し得る。
【０１０６】
あるいは、ポリメラーゼチェーンリアクション(PCR)技術により、ポリヌクレオチドを複製し得る。Saiki, R.K.ら、Science (1985) 230:1350；Sackiら、Science (1988) 239:487、Sambrookら、In Molecular Cloning Techniques: A Laboratory Manual, Vol 12, p 14.1-14.35 Cold Spring Harbor Press (1989)などを参照。
【０１０７】
実施例に記載したアッセイにより、SLE抗血清に対する結合活性で、ポリヌクレオチドをスクリーニングし得る。結合活性をI50(ヌクレオチドのモル濃度で表した、最大の半分の阻害をもたらすポリヌクレオチド濃度)で表現し得る、改変したFarrアッセイは、好適なアッセイである。約500 nM以下、好ましくは50 nM以下のI50を有するポリヌクレオチド二本鎖は、顕著な結合活性を有するとみなされ、それゆえに、本発明の複合体の製造に有用である。
【０１０８】
ポリヌクレオチドは、その抗体結合活性が保持される様な様式で、化学的に定義された結合手プラットフォーム分子に結合される。これは、ポリヌクレオチドを、結合部位から鎖の自由(非結合)端までが少なくとも約20塩基対のペンダント鎖を形成する様に、ポリヌクレオチド鎖上の定められた位置で、結合手プラットフォーム分子と結合させることで行われる。
【０１０９】
特に好適な実施態様では、本発明の複合体のポリヌクレオチドは、その一端で、あるいは一端の近傍でリンカー分子とカップリングされる。このリンカー分子を、次に化学的に定義された結合手プラットフォーム分子とカップリングさせる。例えば以下の様にして、定義された二本鎖PNを結合手プラットフォーム分子と結合し得る。先ず、シトシン(C)とアデノシン(A)が交互に存在する約20の長さのヌクレオチドからなる一本鎖を用意する。次に、トリエチレングリコールの様な誘導体化したプラットフォーム分子上の4つの反応部位に、HADの様なリンカーを介して4本のCA鎖を共有結合させ得る。この結合手プラットフォーム分子は、ブロモアセチルの様な基を含む様に合成されている。この複合化の際、脱離基は硫黄で置換される。次に、チミジン(T)とグアノシン(G)が交互に存在する約20の長さのヌクレオチドからなる第二の一本鎖ヌクレオチド鎖を、前記のCA鎖とアニールさせ、構造式：
[(PN)20-リンカー]4-結合手プラットフォーム分子
の二本鎖鎖PN複合体を形成し得る。
【０１１０】
あるいは、他の好適な実施態様では、モルホリノブリッジを介して、ポリヌクレオチドの3'末端で、このポリヌクレオチドを結合手プラットフォーム分子にカップリングし得る。モルホリノ結合は、ポリヌクレオチドの一方の鎖の酸化された3'末端リボースを、誘導体化したプラットフォーム分子上のフリーのアミノ基と縮合させ、次に、この付加体を還元性の条件に曝すことにより、形成される。このカップリングには、誘導体化した結合手プラットフォーム分子が、少なくともこのプラットフォーム分子に結合させるポリヌクレオチド二本鎖の数と等しい数のアミノ基を有することが必要である。
【０１１１】
この様な複合体の合成は、二段階で行われる。第一の段階は、ポリヌクレオチド二本鎖の1つの鎖を、上記の縮合/還元反応を介して、誘導体化したプラットフォーム分子にカップリングする工程である。一本鎖ポリヌクレオチドを、過ヨウ素酸塩で処理し、3'末端のリボース基を酸化されたリボースに変換することで、酸化された3'末端リボースを形成する。この一本鎖ポリヌクレオチドを次に、pHが約6.0から8.0の誘導体化した結合手プラットフォーム分子の水溶液に、2-8℃で徐々に加える。ポリヌクレオチドとプラットフォーム分子とのモル比は、全ての複合反応で一般に、約2:1から約30:1の範囲、通常は約2:1から約8:1、そして、好ましくは約4:1から6:1である。
【０１１２】
このことと関連して、複合体は、巨大分子の様な非常に大きな分子量を有さないのが好ましい。特に、分子量が200,000よりも大きな繰り返し単位を有する巨大分子は、T-細胞依存性の免疫原であり得る。Dintzisら、J. Immun. (1983) 131:2196；およびJ. Immun. (1989) 143:1239を参照。縮合反応の間(一般に24-48時間の反応時間)あるいは後に、ソジウムシアノボロハイドライドの様な強力な還元剤を加え、モルホリノ基を形成する。次に、二本鎖の相補鎖をこの複合体に加え、そして、混合物を加熱し、そして徐冷し、両鎖をアニールさせる。この複合体は、ゲルパーミエーションクロマトグラフィーで精製し得る。
【０１１３】
上記のリボースを用いた方法に代わる１つの方法は、ポリヌクレオチドの上にアルデヒド基を形成し、そして、これらの基を、プラットフォーム分子の上の反応性官能基を介して、該ポリヌクレオチドとプラットフォーム分子とをカップリングさせるために用いることである。この反応は、ポリヌクレオチドの3'あるいは5'末端に結合させたgem-あるいはvicinal-ジオールは、過ヨウ素酸ナトリウムで酸化してアルデヒドとし得、これをプラットフォーム分子のアミノ官能基と縮合し得ることを利用している。環状部分、例えば5-員環、にジオールが存在する場合、得られる縮合生成物は、窒素を有するヘテロ環式化合物、例えば、6-員のモルホリノあるいはピペリジノ環である。このイミノ縮合生成物は、例えば、ソジウムボロハイドライドあるいはソジウムシアノボロハイドライド等の適切な還元剤で還元することで安定化し得る。ジオールが非環状化合物の場合、得られる酸化生成物は、唯1個のアルデヒド基を有し、そしてこの縮合生成物は第２アミンである。
【０１１４】
他の方法は、アルキルアミノあるいはアルキルスルフヒドリル基を、適切なヌクレオチドの反応(例えば、ホスホアミダイト反応)を用いて、ポリヌクレオチドの3'あるいは5'の何れかの末端に導入する工程を含む。次に、この親核性基を使用して、例えば、アルキルアミン誘導体の場合、ジメチルスベリミデートの様な大過剰のホモ二官能性の架橋試薬と、あるいは、アルキルスルフヒドリル誘導体の場合、例えば、m-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル(MBS)あるいはスクシンイミジル(4-ヨードアセチル)アミノベンゾエート(SIAB)等の、過剰のヘテロ二官能性の架橋試薬と反応させ得る。過剰の架橋試薬を除去した後に、このポリヌクレオチド誘導体をプラットフォーム分子上のアミノ基と反応させる。あるいは、スルフヒドリル基は、マレイミド、あるいはα-ハロアセチル基、あるいは他の適切なMichael付加受容体の様なプラットフォーム分子上の親電子センターと反応させ得る。
【０１１５】
さらに別の方法では、修飾したヌクレオチドを用いる。標準的なDNA合成反応を用いて、好ましくは5'あるいは3'末端であるポリヌクレオチドの所望の位置に、適切なデオキシヌクレオシド誘導体を組み込み得る。次に、これらのヌクレオシド誘導体を、プラットフォーム分子上のアルキルアミノ基と、特異的にかつ直接反応させ得る。あるいは、アミン触媒のβ-脱離の様な、上記のジアルデヒドの反応で起こる副反応は、結合される鎖の3'末端に適切なヌクレオシド誘導体を導入することで防ぎ得る。この例は、リボースの5'メチレン伸張である；即ち、5'ヒドロキシメチル基の代わりに5' (2-ヒドロキシエチル)基を導入する。別の方法では、ホスホネート結合あるいはホスフィネート結合を、プラットフォーム分子と結合されるポリヌクレオチドの3'末端のジヌクレオチドに用いる。
【０１１６】
＜免疫原のアナログ＞
抗体が媒介する疾患に関与する免疫原は、アレルゲン、男性不妊症のα-精子、リウマチ熱の炭水化物複合体、新生児の溶血性疾患の赤血球Rh/D抗原、（治療用のタンパク質、ペプチド、および抗体、の様な個体にとって異物である天然の生物学的物質を含む）生物学的薬剤等、の様な外来の(個体にとって異物である)免疫原、あるいは、甲状腺炎(サイログロブリン)、卒中(カルジオリピン)、および重症筋無力症(アセチルコリンレセプター)、の様な自己免疫原(自己抗原)であり得る。
【０１１７】
この様な免疫原のアナログは、候補分子をスクリーニングして、これらが(a)免疫原に対する血清抗体に特異的に結合するか否か、および(b)T細胞エピトープを欠いているか否か、を調べることで確認し得る。血清抗体への特異的結合は、従来のイムノアッセイを用いて調べることが出来、そして、T細胞エピトープの存在あるいは欠如は、従来のT細胞活性化試験により調べることが出来る。その意味で、免疫原に対する血清抗体に「特異的に結合する」アナログは、該抗体に対する充分なアフィニティーを有している。さらにその意味で、T細胞エピトープの試験は、治療を意図する個体からのT細胞、あるいは標的の個体集団を代表する種々の患者からのT細胞を用いて、個々の目的に応じて行われることも理解される。T細胞エピトープの存在あるいは欠如は、実施例に記載された3H(トリチル化)チミジン取り込みアッセイを用いて調べ得る。T細胞エピトープの存在はまた、当分野で周知の方法により、T細胞由来のリンホカインの分泌を測定することで調べ得る。バックグラウンド以上に、統計的に有意なチミジンの取り込みを誘起しなかったアナログは、T細胞エピトープを欠くとみなされる。チミジン取り込みの定量的な量は、免疫原毎に異なり得る。一般に、約2-3未満の、さらに一般には約1-2未満の刺激指数(stimulation index)は、T細胞エピトープの欠如を示す。
【０１１８】
有用なアナログを確認するための、通常の第一段階は、スクリーニングされるべき候補の、パネルあるいはライブラリーの調製である。例えば、タンパク質あるいはペプチドのアナログの場合は、Geysenらの、Synthetic Peptides as Antigens; Ciba Symposium (1986) 119:131-149；Devlin らのScience (1990) 249:404-406；Scottらの、Science (1990) 249:386-390；およびCwirlaら、PNAS USA (1990) 87:6378-6382等に記載された様な、合成技術あるいは組み換え法で製造し得る。1つの合成方法では、各ペプチドが隣のペプチドと重複する様に、そして全ての鎖状のエピトープが表現される様に、約5から30アミノ酸のペプチドが合成される。これは、B細胞エピトープに予測される長さよりも1残基少なく、カルボキシル末端およびアミノ末端の両方を重複させることで行われる。例えば、B細胞エピトープの最低要件が6-アミノ酸であると仮定されるならば、各ペプチドは、5-アミノ酸で隣のペプチドに重複しなければならない。この実施態様では、次に各ペプチドを、動物の免疫による、あるいは患者からの何れかの、天然の免疫原に対して製造された抗血清で、B細胞エピトープの存在に関してスクリーニングする。次に実施例に記載した様に、抗体結合活性を有する分子を、T細胞エピトープの存在に関してスクリーニングする。T細胞エピトープを欠く分子は、本発明のアナログとして有用である。
【０１１９】
免疫原の(単数あるいは複数の)T細胞エピトープが、既知であるか、あるいは同定され得るならば、候補アナログのランダムT細胞スクリーニングは不要である。その場合には、その(単数あるいは複数の)T細胞エピトープを、機能しない様に変化させ得る(例えば、そのエピトープの1あるいはそれ以上の成分を化学的に誘導化するかもしくは除去することで)、あるいは、例えばペプチドの場合の様に、合成法あるいは組み換え法等で、完全に除去し得る。
【０１２０】
ミモトープあるいはアプタマーは、従来の方法で合成し得、そして、他の免疫原のアナログと同じ方法でスクリーニングし得る。
【０１２１】
これらのアナログを、非免疫原性の結合手プラットフォーム分子とカップリングし、本発明の複合体を調製する。結合手プラットフォーム分子と、炭水化物、脂質、リポポリサッカライド、タンパク質、グリコプロテイン、薬剤、および目的物のアナログの様な、生物学的に活性な分子とからなる複合体は、本明細書で例示する化学反応を利用して合成される。好ましい合成法は、リンカー分子を生物学的分子上に、適切に選択された周知の方法で、組み込む方法である。
【０１２２】
アドリアマイシン(ドキソルビシン)の様な薬剤を結合手プラットフォーム分子に結合させる場合、糖のリング上のアミノ基が、活性エステルを含むプラットフォーム分子と反応し得る。アドリアマイシンはまた、ハロアセチル化したプラットフォームと結合させるために、チオール基を含む様に修飾し得る(Kaneko, T.ら、Bioconjugate Chemistry, 2:133 (1991))。
【０１２３】
オリゴサッカライドの様な炭水化物は、スルフヒドリルを含むリンカーを含む様に修飾し得る(Wood, S.J. and Wetzel, R.、Bioconjugate Chemistry, 3:391 (1992))。スルフヒドリル基はハロアセチル化プラットフォームに結合させるために用いられる。あるいは、炭水化物を酸化して、アルデヒドを生成し、これをNaCNBH3の存在下に、アミノ化プラットフォームと反応させ得る。
【０１２４】
エタノールアミン基を含むグリコール脂質の様な脂質は、プラットフォーム分子上の活性カルボキシレートと反応させる。糖ユニットを含むリポポリサッカライドは、酸化してアルデヒドを生成し、これをNaCNBH3の存在下にアミノ化プラットフォームと反応させて、還元アミノ化により複合体を形成する。
【０１２５】
Fab'抗体断片の様な別のタンパク質の場合には、タンパク質(Fab')上のスルフヒドリル基は、ハロアセチル基を介して、プラットフォームに結合する。グリコプロテインは、イミノチオレートを用いたチオールリンカーで修飾する。このチオールは、ハロアセチル基を含むプラットフォームと反応する。
【０１２６】
複合体が免疫寛容原として機能する能力、および、抗体の産生を特異的に抑制する能力は、実施例に記載したマウスのモデルで評価し得る。
【０１２７】
この複合体は通常、(例えば、腹腔内、筋肉内、静脈内等)注射で投与する様に処方される。従って、これらは典型的には、生理食塩水、リンゲル液、ブドウ糖溶液等の様な薬学的に許容可能な水性キャリアーと組み合わせられる。複合体は通常、処方の約0.01重量%から10重量%を構成する。複合体は、SLEを引き起こす自己抗原に対する免疫寛容を少なくとも部分的に再確立するために充分な量で、個体に投与される。この様な量は、本明細書では、時に「治療に有効な」量とも呼ぶ。特定の場合の投与管理、即ち投与量、タイミング、および投与回数は、特定の個体、およびその個体の病歴により変化する。通常は、約1から1000 μg複合体/Kg体重で投与される。免疫寛容の状態を達成および/あるいは維持するためには、繰り返し投与が必要であり得る。
【０１２８】
以下の実施例は、本発明、および本発明の従来技術に対する予期されない効果をさらに説明するものである。これらの実施例は、本発明の範囲を制限するものでは無い。
【０１２９】
【実施例】
（実施例１）
以下の反応式は、本発明の誘導体化した化学的に定義された結合手プラットフォーム分子を合成する方法を説明している。この実施例では以下の略号を使用する：
DMTr = 4,4'-ジメトキシトリフェニルメチル；Tr = トリチル；Bz = ベンゾイル；Cp = デオキシシチジンモノホスフェート；CE = シアノエチル；CPG = 制御された有孔ガラス；DMF = ジメチルホルムアミド；DCC = ジシクロヘキシルカルボジイミド；TFA = トリフルオロ酢酸；CDI = カルボニルジイミダゾール；Ts = トシル(p-トルエンスルホニル)；DIPAT = ジイソプロピルアンモニウムテトラアゾリド；TBDMSCl = tert-ブチルジメチルシリルクロライド；TBAF = テトラブチルアンモニウムフルオライド；NMMO = N-メチルモルホリンオキサイド。
【０１３０】
【化１６】
0003836888.tif 000010
【０１３１】
【化１７】
0003836888.tif 000011
【０１３２】
【化１８】
0003836888.tif 000012
【０１３３】
【化１９】
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【０１３４】
【化２０】
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【０１３５】
【化２１】
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【０１３６】
【化２２】
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【０１３７】
【化２３】
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【０１３８】
【化２４】
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【０１３９】
【化２５】
0003836888.tif 000019
【０１４０】
(CA)8、(CA)10、(CA)12および(CA)16を、ジスルフィドリンカーで修飾するために用いられる試薬の合成を、次の反応式１１に記載する。
【０１４１】
【化２６】
0003836888.tif 000020
【０１４２】
(CA)25を、vicinal-ジオールリンカーで修飾するために用いられる試薬の合成を、次の反応式１２に記載する。
【０１４３】
【化２７】
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【０１４４】
【化２８】
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【０１４５】
（実施例２：化学的に定義された結合手プラットフォーム分子）
＜化合物１−[3,5-ビス-(ヨードアセトアミド)安息香酸]＞
ヨード酢酸無水物2.93g(8.28mmol, 2.2当量)をN2雰囲気下で室温にて3,5-ジアミノ安息香酸572mg(3.76mmol)の攪拌されたジオキサン(19mL)懸濁液に加えた。この混合物を攪拌し、20時間ホイルで覆い、そしてEtOAc(50mL)と1N HCl溶液(50mL)とで分けた。EtOAc層をブラインで洗浄し、MgSO4で乾燥し、濾過し、そしてロータリーエバポレーターで濃縮して、褐色の固形物3.3gを得た。この物質をシリカゲルクロマトグラフィー(94/5/1 CH2Cl2/MeOH/HOAc)によって精製して、992mg(54%)の化合物１を白色の固形物として得た：NMR (DMSO) 3.84 (s, 4H), 7.91 (s, 2H), 8.14 (s, 1H), 10.56 (s, 2H)。
【０１４６】
＜化合物２−[3,5-ビス-(ヨードアセトアミド)ベンゾイルクロライド]＞
SOCl2 117μL(1.6mmol, 190mg)を390mg(0.8mmol)の１のTHF(34mL)溶液に加えた。この混合物を、全ての固形物が溶解するまで（およそ30分間）N2雰囲気下で還流し、透明な赤褐色の溶液を得た。この混合物をロータリーエバポレーターで濃縮し、減圧下で静置して粗製の化合物２を泡状固形物として得た。この泡状固形物を次の工程に直接用いた。
【０１４７】
＜化合物３−[α,ω-ビス-(N-2-アミノエチルカルバモイル)ポリエチレングリコールのN,N'-ビス-(3,5-ビス-(ヨードアセトアミド)ベンゾイル)誘導体]＞
α,ω-ビス-(N-2-アミノエチルカルバモイル)ポリエチレングリコール(0.16mmol, 3350g/mol, Sigma)570mgを風袋を量ったフラスコに入れた。トルエン(20mL)を加え、そして共沸蒸留によって水を除去した。残留物を減圧下で乾燥して、固形物549mgを得、そしてジイソプロピルエチルアミン89μL(0.64mmol)と共にTHF 4mLに溶解した。粗製の酸クロライドを無水THF 4mL中に溶解し、そしてN2下で30秒間かけて混合物に加えた。混合物を室温で16時間攪拌し、そして0.1N HCl(25mL)とCH2Cl2(25mL)とで分けた。水層をCH2Cl2で再び抽出し、そして有機層を合わせて、H2O 25mL、次いでNaHCO3溶液50mLで洗浄した。有機層をNa2SO4で乾燥し、濾過し、そして濃縮して、橙色のオイル784mgを得た。シリカゲルクロマトグラフィー(9/1 CH2Cl2/MeOH)により、無色のオイル190mgを得た。このオイルを熱EtOH/Et2Oから結晶化し、N2圧力下で焼結ガラスフィルター上で集め、そして減圧下で乾燥して、177mgの化合物３を白色の固形物として得た：NMR (CDCl3) 3.40 (bd m, 8H), 3.59 (bd s, (CH2CH2O)n, 他の積分値に比べ極端に大きい積分値), 3.91 (s, 8H), 4.21 (m, 4H), 6.04 (bd m, 2H), 7.55 (bd m, 2H), 7.78 (bd s, 4H), 8.10 (bd s, 2H), 9.30 (bd m, 4H)：ヨードアセチル測定法(European Journal of Biochemistry (1984) 140:63-71) ：計算値：0.92mmol/g；実測値：0.96mmol/g。
【０１４８】
＜化合物４−[モノ-N-カルボベンジルオキシ-3,6-ジオキサ-1,8-ジアミノオクタン]＞
ベンジルクロロホルメート14.3mL(17.1g, 100mmol)のCH2Cl2(200mL)溶液を、1,2-ビス-(2'-アミノエトキシ)エタン(Fluka)29.0mL(29.6g, 200mmol)のCH2Cl2(100mL)溶液に、0℃で1時間かけて滴下した。この混合物を室温で24時間攪拌し、そして1N HClを水層が酸性(pH2未満)に留まるまで加えた。水層をCH2Cl2(50mLずつ)で3回洗浄し、そして1N NaOHでpHが13を越えるまで中和した。この塩基性の水層をCH2Cl2(75mLずつ)で5回抽出した。CH2Cl2層を合わせて、乾燥し(MgSO4)、濾過し、そして濃縮して、12.7g(45%)の化合物４を濃厚なオイルとして得た：1H NMR (CDCl3) d 2.82 (bd s, 2H), 3.30-3.60 (m, 12H), 5.10 (s, 2H), 5.75 (bd s, 1H), 7.20-7.40 (m, 5H); 13C NMR (CDCl3) d 41.1, 41.8, 66.5, 70.0, 70.2, 70.4, 73.5, 127.9, 128.0, 128.4, 136.9, 156.4。
【０１４９】
＜化合物５−[N-tert-ブチルオキシカルボニルイミノジ酢酸]＞
Garrigues, B.およびLazraq, E.M.Tetrahedron Letters (1986) 27, 1685-1686による報告と同様の手順で、この化合物を調製した。Et3N 47mL(34.2g, 338mmol)を、イミノジ酢酸22.0g(169mmol)とジ-tert-ブチルジカルボネート36.8g(169mmol)との攪拌された50/50 ジオキサン/H2O(169mL)溶液に、室温にて加えた。この混合物を24時間攪拌し、そして大部分のジオキサンをロータリーエバポレータで除去した。この混合物を1N HCl(350mL)と5つのEtOAc(100mLずつ)とで分けた。このEtOAc層を合わせて、乾燥し(MgSO4)、濾過し、そして濃縮して、白色の固形物を得た。ヘキサン/EtOAcで再結晶して、35.3g(90%)の化合物５を結晶として得た：m.p. 131-132℃ 融解(fused)；1H NMR (DMSO) d 1.35 (s, 9H), 3.87 (s, 2H), 3.91 (s, 2H), 12.6 (bd s, 2H); 13C NMR (DMSO) d 27.9, 49.6, 79.6, 154.8, 171.2。
【０１５０】
＜化合物６＞
ジシクロヘキシルカルボジイミド9.99g(48.5mmol)を、4.52g(19.4mmol)の化合物５とN-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)4.46g(38.8mmol)とのTHF(100mL)溶液に0℃で加えた。この混合物を0℃で3時間攪拌し、そしてEt3N 5.39mL(3.92g, 38.8mmol)と10.9g(38.7mmol)の化合物４とのTHF(83mL)溶液を加え、そしてこの混合物を5℃で17時間攪拌した。混合物を濾過して固形物を除去し、そして濾液を濃縮してオイルを得た。このオイルをEtOAc(400mL)と2つの1N HCl(100mLずつ)とで分けた。このEtOAc層を1N Na2CO3 100mLずつで3回、およびブライン100mLで1回洗浄し、乾燥し(MgSO4)、濾過し、そして濃縮して、14.2g(96%)の化合物６を濃厚なオイルとして得た：1H NMR (CDCl3) d 1.41 (s, 9H), 3.30-3.70 (m, 24H), 3.70-3.90 (m, 4H), 5.10 (s, 4H), 5.50 (bd s, 2H), 7.12 (bd s, 1H), 7.30-7.40 (m, 10H), 8.24 (bd s, 1H)。
【０１５１】
＜化合物７＞
トリフルオロ酢酸26.3mL(38.9g, 156mmol)を、14.2g(18.6mmol)の化合物６のCH2Cl2(111mL)溶液に加え、そしてこの混合物を室温で3時間攪拌した。混合物をロータリーエバポレーターで濃縮して粘稠なオイルを得、そしてこのオイルをTHF 93mLに溶解した。溶液を0℃まで冷却し、そして無水コハク酸3.72g(37.2mmol)を加え、次いでEt3N 5.18mL(3.76g, 37.2mmol)を加えた。冷却浴を除去し、そして混合物を室温で18時間攪拌した。溶媒を減圧下で除去し、そして得られたオイルをCH2Cl2(300mL)と3つのH2O(100mLずつ)とで分けた。このCH2Cl2層を乾燥し(MgSO4)、濾過し、そして濃縮して、オイルを得た。このオイルを、シリカゲルのクロマトグラフィー(9/1/0.1 EtOAc/MeOH/酢酸)で精製して、10.5g(74%)の化合物７を粘稠なオイルとして得た；1H NMR (CDCl3) d 2.50-2.60 (m, 4H), 3.30-3.60 (m, 24H), 3.88 (s, 2H), 4.03 (s, 2H), 5.07 (s, 4H), 5.77 (bd s, 2H), 7.20-7.30 (m, 10H), 7.91 (bd s, 2H), 8.88 (bd s, 1H); 13C (CDCl3) d 27.7, 29.0, 39.4, 41.0, 52.9, 53.8, 66.5, 69.3, 69.8, 70.0, 70.1, 127.8, 128.1, 128.3, 136.7, 156.6, 169.1, 169.6, 173.3, 174.5。
【０１５２】
＜化合物８−[化合物７の4-ニトロフェニルエステル]＞
ジシクロヘキシルカルボジイミド1.61g(7.83mmol)を、3.98g(5.22mmol)の７と800mg(5.75mmol)の4-ニトロフェノールとのCH2Cl2(26mL)溶液に0℃で加えた。この混合物をN2下で室温にて64時間攪拌した。混合物を0℃まで冷却し、HOAc 1mLを加え、そしてこの混合物を0℃で2時間保った。この固形物を濾過により除去し、そして濾液を濃縮した。この残留物をシリカゲルクロマトグラフィー(グラジエント、91/8/1〜84/15/1 CH2Cl2/IPA/HOAc)で精製して、2.58g(56%)の化合物８を粘稠なオイルとして得た：1H NMR (CDCl3) d 2.66 (t, 2H), 2.84 (t, 2H), 3.32-3.68 (m, 24H), 3.90 (bd s, 2H), 4.01 (bd s, 2H), 5.06 (s, 4H), 5.58 (bd m, 2H), 6.91 (bd m, 1H), 7.27 (d, 2H), 7.33 (s, 10H), 8.23 (d, 2H), 9.01 (bd m, 1H)。
＜化合物１０−[4-ニトロフェニルブロモアセテート]＞
ジシクロヘキシルカルボジイミド9.28g(45mmol)を、ブロモ酢酸5.0g(35.9mmol)と4-ニトロフェノール8.50g(61.1mmol)との攪拌されたEtOAc(180mL)溶液に0℃で加えた。この混合物を5℃で16時間攪拌し、そして酢酸1mLを加えた。この混合物を室温で20分間攪拌し、次いで20分間冷凍機中に置いた。この固形物質を濾過によって除去し、そしてこの濾液を濃縮して、粘稠なオイルを得、そしてEt2O/ヘキサンから結晶化して、7.73g(83%)の化合物１０を薄片として得た：m.p. 86-87℃；TLC Rf=0.63 (50/50/1 ヘキサン/EtOAc/HOAc)；1H NMR (CDCl3) d 4.13 (s, 2H), 7.36 (d, J=12Hz, 2H), 8.32 (d, J=12Hz, 2H); 13C NMR (CDCl3) d 24.9, 122.1, 125.3, 155.5, 164.9; 分析値：C8H6BrNO4に対する計算値：C, 36.95;H, 2.33; N, 5.39. 実測値：C, 37.24; H, 2.33; N, 5.42。
【０１５３】
＜化合物９＞
NaHCO3 300mg(3.57mmol)、次いで1,2-ビス-(2'-アミノエトキシ)エタン(Fluka)162mg(1.09mmol)を、2.37g(2.68mmol)の化合物８のジオキサン(15mL)とH2O(8mL)との溶液に加えた。この混合物を室温で24時間攪拌し、そして減圧下で濃縮して、元の容量のおよそ1/2とした。濃縮物をCH2Cl2(40mL)と飽和NaHCO3溶液(40mL)とで分けた。このCH2Cl2層を次に0.5N HClずつで2回洗浄した。このCH2Cl2層を飽和NaCl溶液で洗浄し、乾燥し(MgSO4)、濾過し、そして濃縮して、2.8gのオイルを得た。この粗製の生成物をシリカゲルクロマトグラフィー(3/6/1/ CH2Cl2/THF/MeOH)で精製して、940mg(59%)の化合物９をオイルとして得た：TLC Rf=0.21 (3/6/1 CH2Cl2/THF/MeOH)；1H NMR (CDCl3) d 2.45 (m, 4H), 2.59 (m, 4H), 3.25-3.55 (m, 60H), 3.87 (s, 4H), 4.05 (s, 4H), 5.07 (s, 8H), 5.62 (bd s, 4H), 6.78 (bd s, 2H), 7.34 (bd s, 20H), 8.56 (bd s, 2H); 13C NMR (CDCl3) d 28.1, 30.3, 31.1, 39.4, 41.1, 52.9, 53.9, 66.5, 69.4, 69.7, 69.9, 70.2, 125.3, 127.8, 128.3, 136.8, 156.5, 168.8, 169.4, 172.1, 173.5。
【０１５４】
＜化合物３４＞
10% Pdカーボン 110mgを、281mg(0.175mmol)の化合物９のEtOH(5mL)とシクロヘキセン(2mL)との溶液に窒素下で加え、そして得られる混合物を窒素下で2時間還流した。冷却時、この混合物をケイソウ土を通して濾過し、そして減圧下で濃縮して、170mg(92%)の化合物３４をオイルとして得た。このオイルは、精製せずに次の工程で直接用いた；1H NMR (CDCl3) d 2.45 (m, 4H), 2.53 (m, 4H), 2.62 (m, 4H), 2.86 (m, 8H), 3.42-3.60 (m, 52H), 4.00 (s, 4H), 4.14 (s, 4H); 13C NMR (CDCl3) d 28.2, 30.3, 31.1, 39.4, 41.1, 46.5, 48.6, 52.9, 53.8, 69.4, 69.7, 70.2, 72.4, 168.9, 169.5, 172.3, 173.8。
【０１５５】
＜化合物１１＞
NaHCO3 128mg(1.4mmol)および200mg(0.85mmol)の化合物１０を165mg(0.155mmol)の化合物３４のジオキサン(6mL)とH2O(3mL)との溶液に加えた。得られた混合物を室温で24時間攪拌し、そして減圧下で濃縮した。この濃縮物をSephadex（登録商標） G-10(MeOH)のクロマトグラフィーで精製して、114mg(46%)の化合物１１を粘稠なオイルとして得た。分析試料を分取用HPLC(C18; グラジエント 15/85/0.1〜30/70/0.1 CH3CN/H20/CF3CO2H, 50分, 225nm)で調製した：1H NMR (CDCl3) d 2.58 (m, 4H), 2.65 (m, 4H), 3.43-3.62 (m, 60H), 3.92 (s, 8H), 4.03 (s, 4H), 4.16 (s, 4H); MS (FAB) m/e (相対強度) MNa+ 1605 (100), MH+ 1579 (1), 1581 (5), 1583 (7), 1585 (6), 1587 (2)。
【０１５６】
＜化合物１２−[モノ-N-カルボベンジルオキシ-1,6-ジアミノヘキサン]＞
ベンジルクロロホルメート21mL(25.7g, 150mmol)のジオキサン(200mL)溶液を、1,6-ヘキサンジアミン17.49g(150mmol)とKHCO3 19.58g(196mmol)とのジオキサン(100mL)とH2O(300mL)との攪拌された溶液に0℃で滴下した。この混合物を室温で18時間攪拌し、次いで0℃まで冷却した。この混合物を12N HClで酸性化し、そしてEt2O 100mLずつで2回抽出した。水層を10N NaOHで中和し、そしてEt2O 100mLずつで8回抽出した。この塩基性の抽出物を合わせて、乾燥し(Na2SO4)、そして濃縮して、5.03g(13%)の粗製の化合物１２を半固形の残留物として得た：1H NMR (DMSO) d 1.22-1.51 (m, 8H), 2.54 (t, 2H), 3.02 (d of t, 2H), 5.05 (s, 2H), 7.30-7.48 (m, 5H)。
【０１５７】
＜化合物１３＞
ジシクロヘキシルカルボジイミド918mg(4.45mmol)を、417mg(1.78mmol)の化合物５とNHS 409mg(3.56mmol)とのTHF(15mL)溶液に0℃で加えた。この混合物を0℃で4.5時間攪拌し、そして1.02g(4.08mmol)の化合物１２のTHF(4mL)溶液を加えた。この混合物をN2下で5℃にて18時間攪拌した。この濃縮物をEtOAc(30mL)と2つの1N HCl(30mLずつ)とで分けた。EtOAc層を合わせて、H2O(30mL)および飽和NaHCO3溶液(30mL)で連続して洗浄し、乾燥し(MgSO4)、濾過し、そして濃縮して、粘稠な残留物1.48gを得た。シリカゲルのクロマトグラフィー(5/95 MeOH/CH2Cl2)で精製することにより、1.04g(84%)の化合物１３を粘着性の固形物として得た：1H NMR (CDCl3) d 1.33 (m, 8H), 1.43 (s, 9H), 1.51 (m, 8H), 3.18 (m, 4H), 3.26 (m, 4H), 3.81 (s, 2H), 3.85 (s, 2H), 4.90 (bd s, 2H), 5.10 (s, 4H), 6.81 (bd s, 1H), 7.28-7.40 (m, 10H), 8.05 (bd s, 1H)。
【０１５８】
＜化合物１４＞
トリフルオロ酢酸14.9mLを、5.16g(7.45mmol)の化合物１３のCH2Cl2(14.9mL)溶液に加え、そして得られた混合物を室温で3時間攪拌した。この混合物を減圧下で濃縮し、そしてTHF 57mLに再び溶解した。この混合物にEt3N 2.07mL(1.51g, 14.9mmol)を加えた。この混合物に無水コハク酸1.5g(14.9mmol)を加え、次いでこの混合物を18時間攪拌した。混合物を1N HCl(75mL)と4つのCH2Cl2(75mLずつ)とで分けた。CH2Cl2層を合わせて、乾燥し(MgSO4)、濾過し、そして濃縮して、固形物を得た。CH2Cl2/EtOAc/ヘキサンから結晶化して、3.84g(74%)の化合物１４を白色の固形物として得た：m.p. 122℃；1H NMR (MeOH) d 1.32 (m, 8H), 1.48 (m, 8H), 2.56 (m, 4H), 3.10 (t, 4H), 3.23 (m, 4H), 4.00 (s, 2H), 4.18 (s, 2H), 5.05 (s, 4H), 7.33 (m, 10H)。
【０１５９】
＜化合物１５−[化合物１４の4-ニトロフェニルエステル]＞
ジシクロヘキシルカルボジイミド887mg(4.30mmol)を、2.0g(2.87mmol)の化合物１４と4-ニトロフェノール438mg(3.15mmol)とのTHF(15mL)溶液に0℃で加えた。この混合物を室温にして、18時間攪拌し、次いで0℃まで冷却した。次いで、酢酸200μLを加え、そしてこの混合物を0℃で1時間攪拌した。この固形物を濾過によって除去し、そして濾液を濃縮してオイルを得た。シリカゲルのクロマトグラフィー(92/8 CH2Cl2/IPA)によって精製し、そして得られた固形物をCH2Cl2/ヘキサンから再結晶して、1.52g(64%)の化合物１５を白色の固形物として得た：m.p. 65-68℃；1H NMR (CDCl3) d 1.30 (m, 8H), 1.47 (m, 8H), 2.71 (t, 2H), 2.90 (t, 2H), 3.17 (m, 4H), 3.25 (m, 4H), 3.92 (s, 2H), 4.08 (s, 2H), 4.86 (bd t, 1H), 4.95 (bd t, 1H), 5,09 (s, 4H), 6.28 (bd t, 1H), 7.23 (d, J=9Hz, 2H), 7.32 (m, 10H), 8.22 (d, J=9Hz, 2H), 8.95 (bd t, 1H)。
【０１６０】
＜化合物１６＞
830mg(0.99mmol)の化合物１５のジオキサン(7.5mL)溶液を、1,2-ビス-(2'-アミノエトキシ)エタン(Fluka)58μL(59mg, 0.40mmol)とNaHCO3 111mg(1.31mmol)とのH2O(7.5mL)溶液に加えた。この混合物を室温で18時間攪拌した。混合物を1N HCl(50mL)とCH2Cl2(50mL)とで分けた。CH2Cl2層を乾燥し(Na2SO4)、濾過し、そして濃縮して、粘稠なオイル1.28gを得た。シリカゲルクロマトグラフィー(84/15/1 CH2Cl2/MeOH/HOAc)によって精製することにより、670mgの化合物１６をロウ質の固形物として得た：1H NMR (CDCl3) d 1.32 (m, 16H), 1.49 (m, 16H), 2.46 (m, 4H), 2.58 (m, 4H), 3.10-3.23 (m, 16H), 3.34 (m, 4H), 3.48 (m, 4H), 3.53 (s, 4H), 3.85 (s, 4H), 4.02 (s, 4H), 5.05 (s, 8H), 5.07 (重複する bd t, 2H), 5.15 (bd t, 2H), 7.30 (m, 20H), 7.40 (bd t, 2H), 8.60 (bd t, 2H)。
【０１６１】
＜化合物３５＞
613mg(0.41mmol)の化合物１６のEtOH(20.3mL)とシクロヘキセン(10.1mL)との溶液を攪拌し、そして窒素でパージした。10% Pdカーボン(Aldrich) 20mgを加え、そしてこの混合物を85℃の油浴で1.5時間加熱した。冷却時、この混合物を50/50 H2O/アセトンを用いてケイソウ土を通して濾過して、フラスコおよびフィルターをリンスした。この濾液を減圧下で濃縮して、448mg(114%)の化合物３５をロウ質の固形物として得た：1H NMR (D2O) d 1.39 (m, 16H), 1.59 (m, 16H), 2.57 (t, 4H), 2.65 (t, 4H), 2.88 (t, 8H), 3.23 (t, 4H), 3.29 (t, 4H), 3.42 (t, 4H), 3.65 (t, 4H), 3.71 (s, 4H), 4.06 (s, 4H), 4.30 (s, 4H)。
【０１６２】
＜化合物１７＞
NaHCO3 546mg(6.50mmol)を、445mg(0.406mmol)の化合物３５のH2O(9.5mL)溶液に加えた。得られた混合物に、838mg(3.25mmol)の化合物１０のジオキサン(14.4mL)溶液を加えた。この混合物を室温で7時間攪拌し、そして0.1N H2SO4(50mL)とCH2Cl2(50mL)とで分けた。CH2Cl2層を廃棄し、そして水層をCH2Cl2 50mLずつで2回、9/1 CH2Cl2/MeOH 50mLずつで2回、4/1 CH2Cl2/MeOH 50mLで1回、および3/2 CH2Cl2/MeOH 50mLで1回抽出した。抽出物を合わせて、乾燥し(Na2SO4)、濾過し、そして濃縮して、固形物282mgを得た。EtOH/EtOAc/Et2Oから結晶化することにより、143mg(24%)の化合物１７を白色の固形物として得た：1H NMR (CDCl3/MeOH) d 1.33 (m, 16H), 1.55 (m, 16H), 2.55 (m, 8H), 3.21 (m, 16H), 3.39 (m, 4H), 3.55 (m, 4H), 3.81 (s, 8H), 3.95 (s, 4H), 4.12 (s, 4H). 分析値：C54H94N12014Br4に対する計算値：C, 44.57; H, 6.51; N, 11.55; Br, 21.97. 実測値：C, 45.85; H, 6.49; N, 11.37; Br, 19.90。
【０１６３】
＜化合物１８−[1,5-ビス(N-カルボベンジルオキシ-6-アミノヘキサノアミド)-3-アザペンタン]＞
カルボニルジイミダゾール3.09g(19.0mmol)を、N-カルボベンジルオキシ-6-アミノヘキサン酸5.05g(19.0mmol)のEtOAc(25mL)溶液に室温で加えた。この混合物を15時間攪拌し、次いでジエチレントリアミン1.02mL(982mg, 9.52mmol)を加え、次いでEt3N 2.65mL(1.93g, 19.0mmol)を加えた。得られた混合物を4時間攪拌し、そして固形の生成物を濾過により集めた。再結晶(MeOH/EtOAc)により、4.27g(75%)の化合物１８を微細粒固形物として得た：m.p. 132-133℃；1H NMR (CDCl3) d 1.33 (m, 4H), 1.52 (m, 4H), 1.64 (m, 4H), 2.18 (t, 4H), 2.73 (t, 4H), 3.16 (m, 4H), 3.35 (m, 4H), 4.96 (bd s, 2H), 5.09 (s, 4H), 6.13 (bd s, 2H), 7.33 (s, 10H)；分析値：C32H47N506に対する計算値：C, 64.29; H, 7.50; N, 11.72. 実測値：C, 63.54; H, 7.75; N, 11.91。
【０１６４】
＜化合物１９＞
トリエチレングリコール-ビス-クロロホルメート(Aldrich)657μL(880mg, 3.2mmol)を、4.86g(8.1mmol)の化合物１８のピリジン(162mL)溶液に20℃の水浴中で加えた。この混合物は直ちに沈澱物を形成した。この混合物を16時間攪拌し、そして得られた濁った黄色の溶液を減圧下で濃縮した。濃縮物をEtOAc(150mL)と2つの1N HCl(150mLずつ)とで分けた(水層が確実に酸性となるようにした)。水層を合わせて、2番目のEtOAc(150mL)で抽出した。EtOAc層を合わせて、乾燥し(MgSO4)、濾過し、そして濃縮した。得られた残留物を結晶化して(EtOAc/ヘキサン/CHCl3)、1.92g(43%)の化合物１９を微黄色の微細な結晶として得た：m.p. 86-91℃；1H NMR (CDCl3) 1.31 (m, 8H), 1.52 (m, 8H), 1.62 (m, 8H), 2.20 (m, 8H), 3.20 (m, 8H), 3.39 (s, 16H), 3.62 (s, 4H), 3.68 (m, 4H), 4.26 (m, 4H), 5.08 (s, 8H), 5.32 (bd s, 4H), 7.31 (bd s, 4H), 7.37 (s, 20H)；13C NMR (CDCl3) d 25.1, 26.2, 26.4, 29.6, 36.0, 36.2, 38.5, 38.8, 40.8, 64.5, 66.4, 69.1, 70.3, 128.0, 128.4, 136.7, 156.5, 156.9, 173.6；分析値：C72H104N10018に対する計算値：C, 61.87; H, 7.50; N, 10.02. 実測値：C, 61.68; H, 7.63; N, 9.95。
【０１６５】
＜化合物３６＞
シクロヘキセン3.5mLを、800mg(0.57mmol)の化合物１９の無水EtOH(5mL)溶液に加えた。この溶液を窒素下で静置し、10% Pdカーボン500mgを加え、そして得られた混合物を2時間攪拌しながら還流した。冷却時、混合物をケイソウ土を通して濾過し、そして濃縮して、500mg(100%)の化合物３６をオイルとして得た：1H NMR (50/50 CDCl3/CD3OD) d 1.21 (m, 8H), 1.49 (m, 8H), 1.62 (m, 8H), 2.19 (t, J=7.4Hz, 8H), 2.67 (t, J=7.4Hz, 8H), 3.36 (bd s, 16H), 3.67 (s, 4H), 3.71 (m, 4H), 4.21 (m, 4H)。
【０１６６】
＜化合物２０＞
NaHCO3 3.9g(46.4mmol)を5.0g(5.8mmol)の化合物３６のジオキサン(37.5mL)とH2O(12.5mL)との溶液に加えた。この混合物を氷浴中で0℃まで冷却し、そして4-ニトロフェニルブロモアセテート（化合物１０）8.7g(34.8mmol)を加えた。この混合物を0℃で1時間攪拌し、そして1N H2SO4 50mLを穏やかに加えた。混合物をEtOAc(50mLずつ)で3回抽出した。EtOAc抽出物を廃棄し、そして水層を20/80 MeOH/CH2Cl2(50mLずつ)で6回抽出した。MeOH/CH2Cl2層を合わせて、乾燥し(Na2SO4)、濾過し、そして濃縮した。残留物をシリカゲルクロマトグラフィー(ステップグラジエント 9/1 CH2Cl2/MeOH次いで85/15/5 CH2Cl2/MeOH/THF)で精製して、3.62g(46%)の化合物２０を白色の固形物として得た：m.p. 66.0-70.5℃。分析試料を分取用HPLC(C18逆相カラム、グラジエント 25/75/0.1〜35/65/0.1 CH3CN/H2O/CF3CO2H 50分間にわたって、225nm)で調製して、透明のオイルを得た。このオイルを減圧下で静置して白色の固形物を得た：m.p. 87-89℃；1H NMR (CDCl3) d 1.35 (m, 8H), 1.55 (m, 8H), 1.64 (m, 8H), 2.26 (m, 8H), 3.28 (m, 8H), 3.42 (bd s, 16H), 3.66 (s, 4H), 3.70 (m, 4H), 3.89 (s, 8H), 4.19 (m, 4H)；13C NMR (CDCl3) d 25.1, 26.2, 28.8, 29.0, 38.5, 39.1, 40.0, 47.8, 48.3, 64.7, 69.1, 70.3, 157.0, 166.3, 174.9；MS(FAB) m/e (相対強度) MH+ [1341(25), 1343(60), 1345(70), 1347(56), 1349(21)], 705.6(100)；分析値：C48H84N10O14Br4に対する計算値：C, 42.86; H, 6.29; N, 9.27; Br, 23.77. 実測値：C, 42.15; H, 6.28; N, 9.87; Br, 25.33。
【０１６７】
＜化合物２１−[テトラキス-(2-シアノエトキシメチル)メタン]＞
報告された方法(Bruson, H.A., 米国特許第2,401607号;1946年6月4日)と同様にして、この化合物を調製した。アクリロニトリル27.3mL(21.8g, 411mmol)を、ペンタエリスリトール8.0g(58.8mmol)と40%水酸化ベンジルトリメチルアンモニウム水溶液1.76mLとの攪拌されたH2O(50mL)溶液に加えた。還流冷却器を備え付け、そして混合物をN2雰囲気下で攪拌しながら、40℃で16時間、次いで60℃で24時間加熱した。冷却時、混合物を濃HCl 1mLで酸性化し、そして分液ロートに移した。底に沈澱したオイルを集め、そして水層をCH2Cl2 40mLずつで3回抽出した。オイルおよび合わせた抽出物を、乾燥し(MgSO4)、濾過し、そして濃縮して、オイル23.5gを得た。ビスシアノエチルエーテルを、クーゲルロール(Khugelrhor)蒸留によって、110℃で0.25torrで除去した。ポット残留物をH2O 1Lから結晶化して8.43g(41%)の化合物２１を白色の針状結晶として得た：m.p. 42.5℃[(Macromolecules 1991, 24, 1443-1444.)には 39-40℃と報告されている]；1H NMR (CDCl3) d 2.61 (t, J=6Hz, 8H), 3.50 (s, 8H), 3.6 (t, J=6Hz, 8H)。
【０１６８】
＜化合物２２−[テトラキス-(2-カルボキシエトキシメチル)メタン]＞
5.0g(14.35mmol)の化合物２１の濃HCl(21.5mL)溶液を75℃で3時間攪拌した。この間、白色の沈澱が生成した。減圧下でHCl水溶液を除去し、そして混合物をH2O(25mLずつ)から2回濃縮した。得られた固形物質9.68gを、水酸化物の形態のDOW-1-X2樹脂床16.5cmを含有する内径45mmのカラム上に装填し、そしてカラムをH2O 200mL、次いで1N HClで溶出した。TLC (80/20/1 CH3CN/H2O/HOAc)で示される、生成物を含有する画分を濃縮して、1.21g(21%)の２２をオイルとして得た：1H NMR (D2O) d 2.46 (t, J=6Hz, 8H), 3.22 (s, 8H), 3.55 (t, J=6Hz, 8H)。
【０１６９】
＜化合物２３＞
塩化チオニル3.71mL(6.06g, 50.8mmol)を、1.12g(2.85mmol)の化合物２２のTHF(7.0mL)溶液に加えた。この混合物を室温で3時間攪拌し、そして溶媒を減圧下で除去した。粗製の酸クロライドをTHF(7mL)に溶解した。次いで、この溶液にEt3N 2.12mL(1.54g, 15.24mmol)を加えた。この混合物をN2下で攪拌し、そして0℃まで冷却した。3.60g(12.74mmol)の化合物４のTHF(5mL)溶液を1分間かけて加えた。冷却浴を除去し、そして混合物を室温で5.5時間攪拌し、次いで、1N HCl(25mL)と4つのEtOAc(25mLずつ)とで分けた。EtOAc層を合わせ、ブラインで洗浄し、乾燥し(MgSO4)、濾過し、そして濃縮して、粘稠なオイル3.46gを得た。シリカゲルのクロマトグラフィー(95/5 CH2Cl2/MeOH)によって精製することにより、1.26g(30%)の化合物２３を粘稠なオイルとして得た：1H NMR (CDCl3) d 2.40 (t, 8H), 3.29 (s, 8H), 3.35 (m, 16H), 3.48-3.77 (m, 48H), 5.12 (s, 8H), 5.60 (bd, 4H), 6.85 (bd, 4H), 7.34 (s, 20H)。
【０１７０】
＜化合物３７＞
シクロヘキセン 4.0mLおよび10% Pdカーボン 83mgを、N2下で、142mg(0.093mmol)の化合物２３のEtOH(8.4mL)溶液に加えた。この混合物を90℃の油浴で3時間攪拌しながら還流し、そして、冷却時、ケイソウ土を通して濾過してCH2Cl2を用いてフィルターおよびフラスコを洗浄した。濾液を濃縮して70mg(78%)の化合物３７をオイルとして得た：1H NMR (CDCl3) d 2.90 (t, 8H), 3.33 (s, 8H), 3.45 (t, 8H), 3.52-3.73 (m, 48H)。
【０１７１】
＜化合物２４＞
NaHCO3 40mg (0.48mmol)および104mg(0.40mmol)の化合物１０を、70mg(0.098mmol)の化合物３７のジオキサン(2mL)とH2O(0.67mL)との溶液に加えた。この混合物を室温で17時間攪拌し、そして1N H2SO4 0.5mLを加え、pHを4にする。混合物を濃縮し、そして濃縮物をG-10 Sephadex（登録商標）(MeOH)のクロマトグラフィーで精製した。生成物を含有する画分を減圧下で濃縮してオイル91mgを得た。HPLC (C18, グラジエント 20/80/0.1〜35/65/0.1 CH3CN/H2O/CF3CO2H)によって粗製の生成物36mgを精製することにより、19mg(44%)の化合物２４をオイルとして得た：1H NMR (CDCl3) d 2.50 (t, 8H), 3.31 (s, 8H), 3.36-3.72 (m, 56H), 3.91 (s, 8H);13C NMR (CDCl3) d 28.8, 36.5, 39.7, 40.0, 67.2, 69.3, 69.5, 70.3, 166.6, 173.0. MS(FAB) m/e (相対強度) MH+ [1425(15), 1427(63), 1429(75), 1431(64), 1433(12)], 577(100)。
【０１７２】
＜化合物２５ａ−[PEG3350のビス-トシレート]＞
ピリジン6.47mLを、共沸蒸留(トルエン)によって乾燥したポリエチレングリコール(J.T. Baker、平均分子量 1モルあたり3350g) 16.75g(5.0mmol)のCH2Cl2 40mL中の溶液に加えた。溶液を窒素下で静置し、そして0℃まで冷却した。塩化トシル7.63g(40mmol)のCH2Cl2(40mL)溶液を25分間かけて加えた。冷却浴を除去し、そして混合物を室温で16時間攪拌した。混合物を1N HCl 80mLと共に振盪し、そしてエマルジョンを含有するCH2Cl2層をH2O 100mLで洗浄した。CH2Cl2層を、乾燥し(MgSO4)、濾過し、そして濃縮した。この残留物をCH2Cl2/Et2Oから結晶化して、16.82g(92%)の化合物２５ａを白色の固形物として得た：1H NMR (CDCl3) d 2.50 (s, 6H), 3.48 (t, J=5Hz, 4H), 3.55-3.77 (m, 600Hより大きい, 大きすぎて正確ではない積分値), 3.83 (t, J=5Hz, 4H), 7.44 (d, J=7Hz, 4H), 7.94 (d, J=7Hz, 4H)。
【０１７３】
＜化合物２６ａ−[ジアジド-PEG3350]＞
10.83g(2.96mmol)の化合物２５ａとNaN3 1.92g(29.6mmol)とのDMF(30mL)溶液を、N2下で、120℃の油浴中で3時間加熱した。冷却時、この混合物をH2O(100mL)とCH2Cl2(100mL)とで分けた。CH2Cl2層をCH2Cl2を用いて200mLまで希釈し、そして1N HCl 100mLで洗浄し、乾燥し(Na2SO4)、濾過し、そして濃縮した。得られたロウ質の固形物を再結晶(CH2Cl2/Et2O)し、そして得られた固形物をシリカゲルのクロマトグラフィー(グラジエント 98/2〜95/5 CH2Cl2/MeOH)でさらに精製して、4.75g(47%)の化合物２６ａをロウ質の固形物として得た：TLC Rf 0.41 (9/1 CH2Cl2)；1H NMR (CDCl3) d 3.35 (t, J=5Hz, 4H), 3.44 (t, J=5Hz, 2H), 3.54-3.77 (m, およそ300H, 大きすぎて正確ではない積分値), 3.79 (t, J=5Hz, 2H)。
【０１７４】
＜化合物２７ａ−[ジアミノ-PEG3350]＞
10% Pdカーボン(Aldrich)473mgを、4.75g(1.39mmol)の化合物２６ａのEtOH(140mL)溶液に加えた。この混合物を60psiのH2下で30時間振盪した。反応が不完全であった(TLC, 9/1 CH2Cl2/MeOH)ため、さらに10% Pdカーボン473mgを加え、そしてこの混合物を60psiのH2下でさらに5時間振盪した。次いで、混合物をケイソウ土を通して濾過し、減圧下で濃縮し、そして濃縮物を結晶化して(CH2Cl2/Et2O)、4.03g(86%)の化合物２７ａを白色の固形物として得た：1H NMR (CDCl3) d 2.92 (t, 4H), 3.49 (t, 2H), 3.66 (t, 4H), 3.67 (m, およそ300H, 大きすぎて正確ではない積分値), 3.86 (t, 2H)。
【０１７５】
＜化合物２８−[化合物７のN-ヒドロキシスクシンイミジルエステル]＞
ジシクロヘキシルカルボジイミド596mg(2.89mmol)を、1.84g(2.41mmol)の化合物７とNHS 278mg(2.41mmol)とのTHF(12mL)溶液にN2下0℃で加えた。冷却浴を除去し、そして混合物を室温で16時間攪拌した。この混合物に酢酸250μLを加えた。室温で1時間攪拌を続けた。次いで、混合物を冷凍機中に2時間静置した。固形物を濾過によって除去し、そして濾液を濃縮して、2.27g(110%)の粗製の化合物２８を粘稠なオイルとして得た。化合物２８を分解しないように精製することは困難であったので、この化合物２８は、ジアミノ-PEGをアシル化するために直接用いた。
【０１７６】
＜化合物２９ａ＞
900mg(1.05mmol)の化合物２８のジオキサン(4.68mL)溶液を、877mg(0.26mmol)の化合物２７ａとNaHCO3 176mg(2.10mmol)とのH2O(3.12mL)溶液に0℃で加えた。この混合物を2時間攪拌し、次いで1N HCl(25mL)と2つのCH2Cl2(25mLずつ)とで分けた。CH2Cl2層を合わせて、乾燥し(Na2SO4)、濾過し、そして濃縮して、粘稠なオイルを得た。シリカゲルクロマトグラフィー(グラジエント, 95/5〜87/13 CH2Cl2/MeOH)によって精製することにより、695mg(55%)の化合物２９ａをロウ質の固形物として得た：1H NMR (CDCl3) d 2.55 (bd, 8H), 3.39 (m, 16H), 3.44-3.72 (m, およそ432H, 大きすぎて正確ではない積分値), 3.89 (s, 4H), 4.03 (s,
4H), 5.09 (s, 8H), 7.36 (s, 20H)。
【０１７７】
＜化合物３８ａ＞
シクロヘキセン7.1mLを、688mg(0.142mmol)の化合物２９ａのEtOH(14.2mL)溶液にN2下で加えた。10% Pdカーボン284mgを加え、そして得られた混合物を2時間還流した。冷却時、混合物をケイソウ土を通してEtOHで濾過し、そして濾液を減圧下で濃縮して550mg(90%)の化合物３８ａをロウ質の固形物として得た：1H NMR (CDCl3) d 2.58 (m, 8H), 2.93 (m, 8H), 3.38-3.76 (m, およそ550H), 4.00 (s, 4H), 4.13 (s, 4H)。
【０１７８】
＜化合物３０ａ＞
268mg(1.04mmol)の化合物１０のジオキサン(4.65mL)溶液を、550mg(0.13mmol)の化合物３８ａとNaHCO3 175mg(2.08mmol)とのH2O(3.11mL)溶液に0℃で加えた。この混合物を20時間攪拌し、そして1N H2SO4(50mL)と2つのCH2Cl2(50mLずつ)とで分けた。CH2Cl2層を合わせて、乾燥し(Na2SO4)、濾過し、そして濃縮して、オイルを得た。G-10 Sephadex（登録商標）クロマトグラフィー(MeOH)で精製することにより、非晶質の固形物を得た。この固形物を結晶化して(EtOH/Et2O)、378mg(61%)の化合物３０ａを白色の固形物として得た：1H NMR (CDCl3) d 2.59 (bd s, 8H), 3.38-3.82 (m, およそ500H, 大きすぎて正確ではない積分値), 3.88 (s, 8H), 3.98 (s, 4H), 4.10 (s, 4H);ブロモアセチル測定法(European Journal of Biochemistry, 1984, 140, 63-71)：計算値, 0.84mmol/g；実測値, 0.50mmol/g。
【０１７９】
＜化合物２５ｂ−[PEG8000のビス-トシレート]＞
トリエチルアミン2.3mL(16.5mmol)、次いでTsCl 3.15g(16.5mmol)を、共沸蒸留(トルエン)によって乾燥したPEG8000(Aldrich、平均分子量8000g/mmol) 12.0g(1.5mmol)のCH2Cl2 30mL中の溶液に加えた。この混合物を室温で18時間攪拌し、そして1N HCl(50mLずつ)で4回、次いで飽和NaCl溶液(50mL)で1回抽出した。CH2Cl2層を乾燥し(Na2SO4)、濾過し、そして減圧下で濃縮して、ロウ質の固形物を得た。再結晶(CH2Cl2/Et2O)により、11.0g(92%)の化合物２５ｂを白色の固形物として得た：1H NMR (CDCl3) d 2.38 (s, 6H), 3.40-3.89 (m, およそ800H, 大きすぎて正確ではない積分値), 4.14 (m, 4H), 7.34 (d, J=8.2Hz, 4H), 7.79 (d,
J=8.2Hz, 4H)。
【０１８０】
＜化合物２６ｂ−[PEG8000のジアジド]＞
NaN3 1.86g(28.6mmol)を、10.8g(1.3mmol)の化合物２５ｂの乾燥DMF(30mL)溶液に加えた。この混合物をN2下で120℃にて2.5時間加熱した。冷却時、この混合物をCH2Cl2(240mL)と3つの0.5N HCl(50mLずつ)とで分けた。CH2Cl2層を飽和NaCl溶液(50mL)で洗浄し、乾燥し(Na2SO4)、濾過し、そして濃縮して、固形物を得た。シリカゲルのクロマトグラフィー(グラジエント 2/98〜6/94 MeOH/CH2Cl2)で精製し、そして精製した生成物を再結晶(MeOH/Et2O)することにより、6.95g(66%)の化合物２６ｂを白色の固形物として得た：TLC (Rf=0.33, 12/88 MeOH/CH2Cl2)；1H NMR (CDCl3) 3.39-3.86 (m)。
【０１８１】
＜化合物２７ｂ−[ジアミノ-PEG8000]＞
6.9g(0.86mmol)の化合物２６ｂのアンモニアで飽和したMeOH(150mL)溶液を窒素でパージした。10% Pdカーボン 1.5gを加え、そしてこの混合物を65psiのH2下で振盪した。20時間後、TLC分析により、反応が不完全であることが示された。結果として、10% Pdカーボン200mgを加え、そして65psiのH2下でさらに20時間振盪を続けた。この混合物をケイソウ土を通して濾過し、濾液を減圧下で濃縮した。得られたロウ質の固形物を再結晶して(MeOH/Et2O)、6.0g(89%)の化合物２７ｂを白色の固形物として得た：1H NMR (CDCl3) d 2.96 (t, J=5.1Hz, 4H), 3.40-3.89 (m, およそ700H, 大きすぎて正確ではない積分値)。
【０１８２】
＜化合物２９ｂ＞
NaHCO3 221mg(2.63mmol)を、3.0g(0.375mmol)の化合物２７ｂの水(10mL)とジオキサン(3mL)との溶液に加えた。次いで、ジオキサン(10mL)に溶解した1.3g(1.51mmol)の化合物２８を加えた。この混合物を24時間攪拌し、次いで0.5N HCl(40mL)を加えた。この混合物をCH2Cl2(25mLずつ)で4回抽出した。CH2Cl2層を合わせて、乾燥し(MgSO4)、濾過し、そして濃縮して、オイルを得た。MeOH/Et2Oから結晶化することにより、2.0g(58%)の化合物２９ｂを得た：1H NMR (CDCl3) d 2.52 (m, 8H), 3.40-3.64 (m, およそ700H, 大きすぎて正確ではない積分値), 3.89 (s, 4H), 4.02 (s, 4H), 5.09 (s, 8H), 7.35 (s, 20H)。
【０１８３】
＜化合物３８ｂ＞
10% Pdカーボン123mgを、600mg(0.063mmol)の化合物２９ｂの無水EtOH(5mL)とシクロヘキセン(2.5mL)との溶液に、窒素下で加えた。この混合物を窒素下で2時間還流した。この反応混合物をケイソウ土を通して濾過し、エバポレートして549mg(97%)の化合物３８ｂを白色の固形物として得た：1H NMR (CDCl3) d 2.58 (m, 8H), 2.90 (m, 8H), 3.39-3.70 (m, およそ700H, 大きすぎて正確ではない積分値), 4.05 (s, 4H), 4.15 (s, 4H)。
【０１８４】
＜化合物３０ｂ＞
NaHCO3 100mg(1.2mmol)、次いで84mg(0.32mmol)の化合物１０を、529mg(0.059mmol)の化合物３８ｂのジオキサン(2mL)と水(5mL)との溶液に加えた。12時間攪拌後、この反応物を1N H2SO4で酸性化し、そしてCHCl3(40mLずつ)で4回抽出した。CHCl3層を合わせて、乾燥し(MgSO4)、濾過し、そして濃縮して、503mgの半固形の残留物を得た。この残留物を、G-10 Sephadex（登録商標）のクロマトグラフィー(MeOH)で精製し、そして結晶化して(MeOH/Et2O/ヘキサン)、215mg(39%)の化合物３０ｂを白色の固形物として得た：1H NMR (CDCl3) d 2.58 (m, 8H), 3.35-3.70 (m, およそ700H, 大きすぎて正確ではない積分値), 3.89 (s, 8H), 4.01 (s, 4H), 4.16 (s, 4H);ブロモアセチル測定法(European Journal of Biochemistry, 1984, 140, 63-71)：計算値, 0.42mmol/g；実測値, 0.27mmol/g。
【０１８５】
＜化合物３１−[PEG3350-ビス-クロロホルメート]＞
乾燥ピリジン2滴、次いでトリホスゲン125mg(0.418mmol)を、共沸蒸留(トルエン)によって乾燥したポリエチレングリコール(J.T. Baker、平均分子量 1モルあたり3350g) 1.0g(0.249mmol)のCH2Cl2 12mL中の溶液に加えた。この混合物を室温で20時間攪拌し、そして溶媒を減圧下でエバポレートして1.0g(100%)の化合物３１を白色の固形物として得た：1H NMR (CDCl3) d 3.40-3.65 (m, およそ300H,
大きすぎて正確ではない積分値), 3.77 (m, 4H), 4.46 (m, 4H)。
【０１８６】
＜化合物３２＞
1.0g(0.25mmol)の化合物３１の5:1 CH2Cl2/ジオキサン(12mL)溶液を、600mg(1.0mmol)の化合物１８のジオキサン(10mL)とピリジン(1.5mL)との50℃の溶液に滴下した。得られた濁った溶液を72時間攪拌した。CH2Cl2(25mL)を加え、次いでこの混合物を濾過した。濾液をエバポレートし、そして半固形の残留物を、G-10 Sephadex（登録商標）のクロマトグラフィーで精製した。得られた固形物を結晶化して(CH2Cl2/Et2O)、829mg(75%)の化合物３２を微黄色の固形物として得た：1H NMR (CDCl3) d 1.30 (m, 8H), 1.40 (m, 8H), 1.61 (m, 8H), 2.18 (m, 8H), 3.17 (m, 8H), 3.40 (m, 16H), 3.62 (m, およそ300H, 大きすぎて正確ではない積分値), 4.15 (m, 4H), 5.07 (s, 8H), 7.33 (m, 20H)。
【０１８７】
＜化合物３９＞
10% Pdカーボン100mgを、300mg(0.065mmol)の化合物３２の無水EtOH(5mL)とシクロヘキセン(2mL)との溶液に窒素下で加えた。この混合物を窒素下で2時間還流した。この混合物をケイソウ土を通して濾過し、溶媒をエバポレートして237mg(90%)の化合物３９を白色の固形物として得た：1H NMR (CDCl3) d 1.37 (m, 8H), 1.48 (m, 8H), 1.65 (m, 8H), 2.21 (m, 8H), 2.50 (m, 8H), 3.39 (m, 16H), 3.64 (m, およそ300H, 大きすぎて正確ではない積分値), 4.19 (m, 4H)。
【０１８８】
＜化合物３３＞
NaHCO3 125mg(0.67mmol)および115mg(0.44mmol)の化合物１０を、225mg(0.055mmol)の３９のジオキサン(5mL)と水(5mL)との溶液に加えた。得られた黄色の溶液を室温で12時間攪拌した。次いで、この溶液をCH2Cl2(30mLずつ)で3回抽出した。水層を1N H2SO4で酸性化し、そしてCH2Cl2(30mLずつ)で3回抽出した。CH2Cl2層を合わせて、乾燥し(MgSO4)、濾過し、そして濃縮して、黄色のオイルを得た。G-10 Sephadex（登録商標）のクロマトグラフィー(MeOH)で精製し、そして得られたオイルを再結晶して(EtOH/Et2O)、182mg(73%)の化合物３３を白色の固形物として得た：1H NMR (CDCl3) d 1.35 (m, 8H), 1.55 (m, 8H), 1.65 (m, 8H), 2.22 (m, 8H), 3.28 (m, 8H), 3.42 (m, 16H), 3.50-3.64 (m, およそ300H, 大きすぎて正確ではない積分値), 3.87 (s, 8H), 4.18 (m, 4H);ブロモアセチル測定法(European Journal of Biochemistry, 1984, 140, 63-71)：計算値, 0.87mmol/g；実測値, 0.73mmol/g. 分析値：C191H375O87N10Br4に対する計算値：C, 50.84; H, 8.33; N, 3.09; Br, 7.05. 実測値：C, 51.98; H, 8.34; N, 2.45; Br,
10.19。
【０１８９】
＜化合物４０−[4-ニトロフェニルヨードアセテート]＞
ジシクロヘキシルカルボジイミド5.15g(25mmol)と4-ニトロフェノール2.92g(2.92mmol)とのEtOAc(100mL)溶液を、ヨード酢酸3.72g(20mmol)の0℃の溶液に加えた。この混合物を0℃で1時間、および室温で2時間攪拌した。固形物を濾過によって除去し、そして濾液を減圧下で濃縮した。得られた黄色の固形物を再結晶して(EtOAc/ヘキサン/痕跡量のHOAc)、4.82g(78%)の化合物４０を黄褐色の固形物として得た： 1H NMR (CDCl3) d 4.00 (s, 2H), 7.39 (d, 2H), 8.40 (m, 2H)。
【０１９０】
＜化合物４１＞
NaHCO3 103mg(1.22mmol)、次いで211mg(0.692mmol)の化合物４０を、110mg(0.104mmol)の化合物３４のジオキサン(5mL)とH2O(5mL)との溶液に加えた。この混合物を18時間攪拌し、次いで減圧下で濃縮した。Sephadex（登録商標）のクロマトグラフィー(MeOH)で精製することにより、140mg(87%)の化合物４１をオイルとして得た。分析試料を分取用HPLC(C18, グラジエント 20/80/0.1〜25/75/0.1 CH3CN/H2O/TFA 60分間にわたって、225nm)で調製した：1H NMR (CDCl3) d 2.59 (m, 4H), 2.65 (m, 4H), 3.44-3.62 (m, 60H), 3.77 (s, 4H), 3.78 (s, 4H), 4.02 (s, 4H), 4.21 (s, 4H)。
【０１９１】
＜化合物４２＞
N-メトキシカルボニルマレイミド145mg(0.935mmol)を、171mg(0.161mmol)の化合物３４のジオキサン(8mL)と飽和NaHCO3溶液(2mL)とH2O(2mL)との溶液に0℃で、勢いよく攪拌しながら加えた(The Practice of Peptide Synthesis, M. BodanskyおよびA. Bodansky, Springer-Verlag, ニューヨーク, 1984, 29-31頁. Keller, O., Rudinger, J. Helv. Chim, Acta 1975, 58, 531.)。15分後、ジオキサン25mLを加え、冷却浴を除去し、そして室温で45分間攪拌を続けた。この混合物をCHCl3(30mLずつ)で2回抽出し、そしてCHCl3層を合わせて、乾燥し(MgSO4)、濾過し、そして濃縮して、オイルを得た。G-10 Sephadex（登録商標）のクロマトグラフィー(MeOH)で精製することにより、103mg(45%)の化合物４２をオイルとして得た。分析試料を分取用HPLC(C18, グラジエント 20/80/0.1〜25/75/0.1 CH3CN/H2O/TFA 65分間にわたって、225nm)で調製してオイルを得た：1H NMR (CDCl3) d 2.57 (m, 4H), 2.67 (m, 4H), 3.42-3.65 (m, 52H), 3.72 (m, 8H), 4.03 (s, 4H), 4.17 (s, 4H), 6.74 (s, 4H), 6.75 (s, 4H)。
【０１９２】
＜化合物４３−[ヒドロキシメチル-トリス-(2-シアノエトキシメチル)メタン]＞  KOH 0.30g(5.41mmol)、次いでアクリロニトリル23mL(18.6g, 350mmol)を、ペンタエリスリトール6.8g(50mmol)のH2O(50mL)溶液に加えた。この混合物を室温で16時間攪拌し、濃HCl溶液 1.5mLで酸性化し、そしてCH2Cl2(50mLずつ)で2回抽出した。このCH2Cl2層を合わせて、乾燥し(MgSO4)、濾過し、そして濃縮して、16.97gの液体を得た。シリカゲルのクロマトグラフィー(EtOAc)で精製することにより、8.49g(51%)の化合物４３を粘稠なオイルとして得た：TLC, Rf=0.15(EtOAc); 1H NMR (CDCl3) d 2.62 (t, 6H), 3.54 (s, 6H), 3.68 (t, 6H), 3.70 (s, 2H)。
【０１９３】
＜化合物４４−[ヒドロキシメチル-トリス-(2-カルボキシメチルエトキシメチル)メタン]＞
HClで飽和したMeOH溶液78mLを、5.45g(15.6mmol)の化合物４３に加えた。この混合物を1時間還流状態で加熱し、そして冷却時、H2O(100mL)と4つのEt2O(100mLずつ)とで分けた。Et2O層を合わせて、飽和NaHCO3溶液(100mL)および飽和NaCl溶液(100mL)で順次洗浄し、乾燥し(MgSO4)、濾過し、そして濃縮して、4.74gの粘稠な液体を得た。シリカゲルのクロマトグラフィーで精製することにより、3.05g(50%)の化合物４４をオイルとして得た：TLC, Rf=0.27 (80/20 EtOAc/ヘキサン);1H NMR (CDCl3) d 2.58 (t, 6H), 3.43 (s, 6H), 3.61 (s, 2H), 3.69 (t, 6H), 3.70 (s, 9H);13C NMR (CDCl3) d 34.8, 44.9, 51.6, 65.2, 66.9, 71.0, 172.1。
【０１９４】
＜化合物４５＞
560mg(1.4mmol)の化合物４４と1.69g(6.0mmol)の化合物４との混合物を、150℃で4時間窒素下で加熱した。この混合物をEtOAc(50mL)と1N HCl (25mL)とに分け、そしてHCl層をCH2Cl2(25mL)で抽出した。EtOAcおよびCH2Cl2の抽出層を合わせて、飽和NaHCO3溶液で洗浄し、乾燥し(K2CO3)、濾過し、そして濃縮して、粘稠な残留物を得た。シリカゲルのクロマトグラフィー(グラジエント 95/5〜90/10 CH2Cl2/MeOH)で精製することにより、300mg(19%)の化合物４５を粘稠なオイルとして得た：TLC, Rf=0.24 (90/10 CH2Cl2/MeOH); 1H NMR (CDCl3) d 2.40 (t, 6H), 3.38 (s, 6H), 3.39-3.48 (m, 12H), 3.52-3.67 (m, 32H), 5.13 (s, 6H), 5.62 (bd s, 3H), 6.80 (bd s, 3H), 7.40 (s, 15H)。
【０１９５】
＜化合物４６＞
10% Pdカーボン104mgを、308mg(0.269mmol)の化合物４５のEtOH(10.4mL)とシクロヘキセン(5.2mL)との溶液に窒素下で加えた。還流冷却器を取り付け、そしてこの混合物を85℃の油浴中で1.5時間加熱した。冷却時、この混合物をケイソウ土を通して濾過し、そして濾液を濃縮して177mgの残留物を得た。この残留物をジオキサン 5.98mLに一部溶解した。得られた混合物を、386mg(1.49mmol)の化合物１０に加え、次いでこれをNaHCO3 251mg(2.99mmol)のH2O(3.99mL)溶液に加えた。得られた混合物を窒素下で18時間攪拌し、そして1N HCl(25mL)と3つのCH2Cl2(25mLずつ)とで分けた。水層を3/1 CH2Cl2/MeOH(25mLずつ)で3回および1/1 CH2Cl2/MeOH(25mLずつ)で3回抽出した。最初の2回分のCH2Cl2抽出物を廃棄し、そして残りの抽出物を合わせて、乾燥し(Na2SO4)、濾過し、そして濃縮して、102mgの粘稠なオイルを得た。HPLCで(C18, 23/77/0.1 CH3CN/H2O/CF3CO2H, 234nm 検出)で精製することにより、43mg(14%)の化合物４６を粘稠なオイルとして得た：1H NMR (CDCl3) d 2.48 (t, 6H), 3.40 (s, 6H), 3.44-3.54 (m, 14H), 3.56-3.62 (m, 12H), 3.63 (s, 12H), 3.67 (t, 6H), 3.91 (s, 6H), 6.90 (t, 3H), 7.10 (t, 3H); MS (FAB) m/e (相対強度) MH+ [1103(17), 1105(42), 1107(41), 1109(18)], MNa+ [1125(38), 1127(100), 1129(99), 1131(39)]。
【０１９６】
＜化合物４７−[S-(6-ヒドロキシヘキシル)イソチオウロニウムクロライド]＞
チオ尿素11.1g(146mmol)を6-クロロヘキサノール16.6mL(20.0g, 146mmol)のエタノール(49mL)溶液に加え、そしてこの混合物を24時間還流した。混合物を0℃まで冷却し、そして生成物を結晶化した。この結晶を減圧濾過によって集め、そして乾燥して、28.4g(92%)の化合物４７を白色の固形物として得た：mp 122-124℃; 1H NMR (DMSO) d 1.40 (m, 4H), 1.65 (m, 2H), 3.21 (t, 2H), 3.41 (t, 2H), 9.27および9.33 (重複した広幅シングレット, 4H); 分析値：C7H17ClN2OSに対する計算値：C, 39.51; H, 8.06; N, 13.17; S, 15.07. 実測値：C, 39.69; H, 8.00; N, 13.01; S, 15.16。
【０１９７】
＜化合物４８−[6-メルカプトヘキサン-1-オール]＞
NaOHのペレット9.25gを、17.8mg(83.6mmol)の化合物４７のH2O(120mL)とEtOH(120mL)との溶液に加えた。この混合物を4時間還流した。混合物をおよそ75mLになるまで注意深く濃縮し、そして濃縮物を減圧蒸留によって精製して、7.4g(66%)の化合物４８を得た：bp 95-105℃(5mmHg); 1H NMR (CDCl3) 1.41(m, 9H), 2.59 (dt, 2H), 3.69 (brd sと重複したt, 3H); 13C NMR (CDCl3) d 24.5, 25.2, 28.0, 32.5, 33.9, 62.7; 分析値：C6H14OSに対する計算値：C, 53.68; H, 10.51; S, 23.89. 実測値：C, 53.35; H, 10.72; S, 23.60。
【０１９８】
＜化合物４９−[ビス-(6-ヒドロキシヘキシル)ジスルフィド]＞
I2 4.02g(15.8mmol)のMeOH(90mL)溶液を、4.26g(31.7mmol)の化合物４８のMeOH(10mL)とEt3N(13.7mL (9.97g, 98.5mmol))との溶液にN2雰囲気下で10分間かけて滴下し、そして氷浴で冷却した。冷却浴を除去し、そして混合物を雰囲気温度で4時間攪拌した。この混合物をロータリーエバポレーターで濃縮し、そしてシリカゲルクロマトグラフィー(1:1 ヘキサン/EtOAc)で精製して、3.12g(73%)の化合物４９を淡黄色の固形物として得た：TLC Rf 0.18 (1:1 ヘキサン/EtOAc); mp 38-48℃; 1H NMR (CDCl3) 1.15-2.20 (m, 16H), 2.73 (t, 4H), 3.70 (t, 4H);分析値：C12H26S202に対する計算値：C, 54.09; H, 9.84; S, 24.06. 実測値：C, 54.85, H, 9.86; S, 24.11。
【０１９９】
＜化合物５０−[モノ-O-(4',4''-ジメトキシトリフェニルメチル)-ビス-(6-ヒドロキシヘキシル)ジスルフィド]＞
4,4'-ジメトキシトリフェニルメチルクロライド3.97g(11.7mmol)を、3.12g(11.7mmol)の化合物４９のピリジン(45mL)溶液に加えた。この混合物を雰囲気温度で16時間攪拌した。大部分のピリジンをロータリーエバポレーターで除去し、そして残留物を飽和NaHCO3溶液(100mL)とEtOAc(100mL)とで分けた。EtOAc層を飽和NaCl溶液 50mLで洗浄し、乾燥し(Na2SO4)、濾過し、そして濃縮して、オイルを得た。シリカゲルクロマトグラフィー(9:1 CH2Cl2/EtOAc)で精製することにより、2.84g(43%)の化合物５０を粘稠なオイルとして得た：TLC Rf 0.35 (9:1 CH2Cl2/EtOAc); 1H NMR (CDCl3) 1.41 (m, 8H). 1.65 (m, 8H), 2.70 (2つの重複したトリプレット, 4H), 3.08 (t, 2H), 3.65 (t, 2H), 3.81 (s, 6H), 6.85 (d, 4H), 7.32 (m, 7H), 7.47 (d, 2H); HRMS (FAB, M+), C33H4404S2に対する計算値：568.2681. 実測値：568.2665。
【０２００】
＜化合物５１−[O-[14-(4',4''-ジメトキシトリフェニルメトキシ)-7,8-ジチオテトラデシル]-O-(2-シアノエチル)-N,N-ジイソプロピルホスホロアミダイト]＞  O-シアノエチル-N,N,N',N'-テトラ-イソプロピルホスホロジアミダイト458mg(1.52mmol)のCH2Cl2(0.5mL)溶液を、771mg(1.36mmol)の化合物５０とジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド116mg(0.68mmol)のCH2Cl2(6.8mL)溶液にN2雰囲気下で加えた。混合物を4時間攪拌し、そしてNaHCO3(25mL)とCH2Cl2(3×25mL)とで分けた。CH2Cl2層を合わせて、飽和NaCl溶液で洗浄し、乾燥し(Na2CO3)、濾過し、そして濃縮して、オイルを得た。25mmカラム中の塩基性のアルミナ(2"プラグ)を通して濾過し、9:1 CH2Cl2/Et3Nで溶出することによって精製して、831mg(80%)の化合物５１を粘稠なオイルとして得た：1H NMR (CDCl3) d 1.25 (m, 12H), 1.45 (m, 8H), 1.70 (m, 8H), 2.72 (m, 6H), 3.09 (t, 2H), 3.65 (m, 4H), 3.87 (s, 6H), 3.91 (m, 2H), 6.89 (d, 4H), 7.35 (m, 7H), 7.49 (d, 2H); 31P NMR (15% H3PO4を内部標準として有するCDCl3)147,69; HRMS (FAB, MH+), C42H62N2O5PS2に対する計算値：769.3839, 実測値：769.3853。
【０２０１】
＜化合物５２−[トリチル-HADアルコール]＞
塩化トリチル60g(0.21mol)を、57g(0.21mol)の化合物４９のピリジン(60mL)溶液に加えた。この混合物を100℃で19時間攪拌した。この反応混合物を室温まで冷却し、そして濾過した。濾液を塩化メチレン 300mLで希釈し、そして飽和炭酸水素ナトリウム 200mLで抽出した。有機層を、Na2SO4で乾燥し、濾過し、そして濃縮して、オイルを得た。シリカゲルクロマトグラフィー(グラジエント 9:1 ヘキサン：酢酸エチル〜3:1 ヘキサン：酢酸エチル)で精製することにより、55g(50%)の化合物５２を得た：1H NMR (CDCl3) δ 1.38 (m, 8H), 1.63 (m, 8H), 2.66 (m, 4H), 3.04 (t, 2H), 3.62 (t, 2H), 7.25 (m, 9H), 7.42 (m, 6H). HRMS (FAB, M+), C31H40O2Sに対する計算値：508.2470. 実測値：508.2482。
【０２０２】
＜化合物５３−[トリチル HAD ホスホロアミダイト]＞
10g(19.7mmol)の化合物５２とジイソプロピルエチルアミン6.3mL(36.2mmol)との塩化メチレン(90mL)溶液に、アルゴン下で0℃にて、2-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルクロロホスホロアミダイト4.5mL(20.2mmol)をゆっくりと加えた。この混合物を90分間攪拌した後、反応混合物を飽和炭酸水素ナトリウム100mLずつで2回抽出した。この塩化メチレン溶液を、Na2SO4で乾燥し、濾過し、そして濃縮して、オイルを得た。塩基性アルミナクロマトグラフィー(75:24:1, ヘキサン：酢酸エチル：トリエチルアミン)で精製することにより、11.3g(81%)の化合物５３をオイルとして得た：1H NMR (CDCl3) δ 1.18 (m, 12H), 1.37 (m, 8H), 1.62 (m, 8H), 2.6 (m, 6H), 3.04 (t, 2H), 3.60 (m, 4H), 3.82 (m, 2H), 7.26 (m, 6H), 7.44 (m, 9H). HRMS (FAB, MH+), C40H58N2O3PS2に対する計算値：709.3626. 実測値：709.3621。
【０２０３】
＜化合物５４−[O-(tert-ブチルジメチルシリル)-5-ヘキセノール]＞
イミダゾール15.66g(230mmol)とtert-ブチルジメチルシリルクロライド20.0g(130mmol)を、5-ヘキセン-1-オール12.47mL(10.4g, 104mmol)のDMF(104mL)溶液に加えた。この混合物を雰囲気温度で4時間攪拌し、そしてEtOAc(200mL)と飽和NaHCO3溶液(100mL)とで分けた。EtOAc層を飽和NaHCO3溶液100mL、飽和NaCl溶液100mLで洗浄し、乾燥し(MgSO4)、濾過し、そして濃縮して、およそ容量100mLとした。減圧下で蒸留することにより、70.07g(90%)の化合物５４を得た：bp 130-143℃(100mmHg); 1H NMR (CDCl3) 0.11 (s, 6H), 0.95 (s, 9H), 1.48 (m, 2H), 1.57 (m, 2H), 2.11 (dt, 2H), 3.66 (t, 2H), 5.03 (m, 2H), 5.86 (m, 1H); 13C NMR (CDCl3) -5.25, 18.40, 25.21, 26.01, 32.35, 33.60, 63.09, 114.40, 138.92; 分析値：C12H26OSiに対する計算値：C, 67.22; H, 12.22. 実測値：C, 66.96; H, 12.16。
【０２０４】
＜化合物５５−[1-O-(tert-ブチルジメチルシリル)-1,5,6-ヘキサントリオール]＞
9.86g(46.0mmol)の化合物５４のアセトン(92mL)溶液に、N-メチルモルホリンオキサイド6.46g(55.2mmol)のH2O(23mL)溶液を加えた。この混合物に、2.5%のOsO4のtert-ブチルアルコール溶液443μl(溶液360mg, OsO4 9.0mg, 35μmol)および30% H2O2 50μLを加えた。この混合物を16時間攪拌し、そして亜ジチオ酸ナトリウム474mgのH2O(14mL)溶液を加えた。さらに0.5時間後、この混合物をセライトを通して濾過した。濾液をMgSO4で乾燥し、150mLのブフナロート中の1"のシリカゲルを通して濾過し、EtOAc 250mLずつを用いて溶出した。生成物を含有する画分を濃縮して、11.0g(96%)の５５を粘稠なオイルとして得た：TLC Rf 0.2 (1:1 ヘキサン/EtOAc); 1H NMR (CDCl3) 0.05 (s, 6H), 0.89 (s, 9H), 1.25 (m, 4H), 1.55 (m, 2H), 3.41 (dd, 2H), 3.62 (t, 2H), 3.71 (m, 1H); 13C NMR (CDCl3) -5.23, 18.42, 21.91, 26.02, 32.68, 32.81, 63.16, 66.74, 72.24; HRMS (FAB, MH+), C12H29O3Siに対する計算値：249.1886. 実測値：249.1889。
【０２０５】
＜化合物５６−[5,6-(ビス-O-ベンゾイル)-1-O-(tert-ブチルジメチルシリル)-1,5,6-ヘキサントリオール]＞
塩化ベンゾイル6.18mL(7.48g, 53.2mmol)を、5.29g(21.3mmol)の５５のピリジン(106mL)溶液に加えた。この混合物を18時間攪拌し、そしてロータリーエバポレーターで濃縮した。混合物を冷1N HCl(100mL)とEtOAc(100mL)とで分けた。水層のpHを調べて、確実に酸性にした。EtOAc層をH2O 100mLおよび飽和NaCl 100mLで順次洗浄し、乾燥し(MgSO4)、濾過し、そして濃縮して、10.33g(99%)の化合物５６を粘稠な黄色のオイルとして得た：TLC Rf 0.45 (1:4 EtOAc/ヘキサン); 1H NMR (CDCl3) d 0.05 (s, 6H), 0.88 (s, 9H), 1.59 (m, 4H), 1.85 (m, 2H), 3.14 (t, 2H), 4.49 (dd, 1H), 4.59 (dd, 1H), 5.54 (m, 1H), 7.45 (m, 4H), 7.58 (m, 2H), 8.05 (m, 4H)。
【０２０６】
＜化合物５７−[5,6-(ビス-O-ベンゾイル)-1,5,6-ヘキサントリオール]＞
1N フッ化テトラブチルアンモニウム10.7mL(10.7mmol)のTHF溶液を、2.62g(5.36mmol)の５６のTHF(10.9mL)溶液に加えた。この混合物を16時間攪拌した。混合物を飽和NaHCO3溶液(25mL)とEtOAc(3×25mL)とで分けた。EtOAc抽出物を合わせて、飽和NaCl溶液で洗浄し、乾燥し(MgSO4)、濾過し、そして濃縮して、粘稠なオイルを得た。このオイルをシリカゲルクロマトグラフィー(1:1 ヘキサン/EtOAc)で精製して、823mg(41%)の化合物５７を粘稠なオイルとして得た：Rf 0.14 (1:1 ヘキサン/EtOAc);1H NMR (CDCl3) d 1.58 (m, 2H), 1.68 (m, 2H), 1.88 (m, 2H), 3.68 (t, 2H), 4.52 (dd, 1H), 4.62 (dd, 1H), 5.56 (m, 1H), 7.46 (m, 4H), 7.58 (m, 2H), 8.05 (m, 4H); 13C NMR (CDCl3) d 22.08, 31.20, 31.30, 32.88, 62.92, 66.17, 72.63, 128.93, 130.19, 130.57, 133.62, 166.72, 166.86; HRMS (FAB, MH+), C20H23O5に対する計算値：343.1545. 実測値：343.1553。
【０２０７】
＜化合物５８−[O-[5,6-(ビス-O-ベンゾイルオキシ)-ヘキシル]-O-(2-シアノエチル)-N,N-ジイソプロピルホスホロアミダイト]＞
O-シアノエチル-N,N,N',N'-テトライソプロピルホスホロジアミダイト989mg(3.28mmol)のCH2Cl2(2.0mL)溶液を、1.02g(2.98mmol)の５７とジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド255mg(1.49mmol)(ジイソプロピルアミンのアセトニトリル溶液とテトラゾールとを1:1のモル比で混合し、そして濃縮して、白色の固形物として調製した)とのCH2Cl2(14.9mL)溶液に加えた。この混合物を4時間攪拌し、次いでCH2Cl2(25mL)と冷飽和NaHCO3溶液(25mL)とで分けた。CH2Cl2層を飽和NaCl溶液で洗浄し、乾燥し(Na2SO4)、濾過し、そして濃縮した。25mmカラム中の塩基性のアルミナ(2"プラグ)を通して濾過し、9:1 EtOAc/Et3Nで溶出することにより精製して、1.5g(93%)の化合物５８を粘稠なオイルとして得た：1H NMR (CDCl3) d 1.19 (m, 12H), 1.62 (m, 2H), 1.73 (m, 2H), 1.90 (m, 2H), 2.62 (dd, 2H), 3.53-3.92 (m, 6H), 4.53 (dd, 1H), 4.62 (dd, 1H), 5.58 (m, 1H), 7.48 (m, 4H), 7.60 (m, 2H), 8.09 (m, 4H); 31P NMR (15% H3PO4を内部標準として有するCDCl3) d 148.2; HRMS (FAB, MH+), C29H40O6N2Pに対する計算値：543.2624. 実測値：543.2619。
【０２０８】
＜化合物５９−[4(ヨードアセトアミド)安息香酸]＞
Weltman, J.K., 1983 Biotechniques 1:148-152に記載のようにして、この化合物を調製した。簡単に述べると、ヨード酢酸無水物708mg(2.0mmol)を、パラアミノ安息香酸137mg(1.0mmol)のジオキサン(10mL)溶液に加えた。この混合物を暗所で18時間攪拌し、そしてH2O(25mL)とEtOAc(25mL)とで分けた。EtOAc層を飽和NaCl溶液で洗浄し、乾燥し(MgSO4)、濾過し、そして濃縮して、桃色の固形物797mgを得た。ヘキサン/EtOAcから再結晶することにより、4-(ヨードアセトアミド)安息香酸221mg(72%)を白色の固形物として得た：mp 220-230℃; 1H NMR (CDCl3) d 3.86 (s, 2H), 7.68 (d, 2H), 7.91 (d, 2H), 10.60 (s, 1H)。
【０２０９】
＜化合物６０−[α,ω-ビス-(N-2-アミノエチルカルバモイル)ポリエチレングリコールの4-(ヨードアセトアミド)ベンゾイル誘導体]＞
ジシクロヘキシルカルボジイミド188mg(0.909mmol)を、4-(ヨードアセトアミド)安息香酸185mg(0.606mmol)とα,ω-ビス-(N-2-アミノエチルカルバモイル)ポリエチレングリコール(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO., トルエンとの共沸蒸留により乾燥)406mg(0.121mmol)とのTHF(2mL)溶液に加えた。この混合物を2時間攪拌し、次いで酢酸6滴を加えた。CH2Cl2 10mLを加え、そして混合物を30分間冷凍機中に置いた。混合物を濾過して固形物を除去し、そして濾液を濃縮して粘稠な残留物を得た。シリカゲルクロマトグラフィー(グラジエント 99/1〜96/4 CH2Cl2/MeOH)で精製することにより、固形物を得た。この固形物をMeOHを用いて粉砕して微黄白色の固形物292mgを得た：1H NMR (CDCl3) 3.48 (m, 8H), 3.63 (bd s, (CH2CH2O)n, 大きすぎて積分不可能), 3.98 (s, 4H), 4.18 (bd m, 4H), 5.91 (bd m, 2H), 7.48 (bd m, 2H), 7.76 (d, 4H), 7.88 (d, 4H), 9.38 (bd m, 2H):ヨードアセチル測定法(European Journal of Biochemistry 1984, 140,
63-71): 計算値, 0.46mmol/g; 実測値, 0.37mmol/g。
【０２１０】
（実施例３：活性結合手プラットフォーム分子および複合体の調製）
生物学的分子または化学的分子と、結合手プラットフォーム分子との複合体を形成する方法は、多数ある。特定の方法には、生物学的分子または化学的分子に結合したチオールを用いて、結合手プラットフォーム分子上の反応性の「チオフィリック（イオウ親和性）」基と求核反応させて、チオエーテル結合を形成させる方法があるが、プラットフォーム分子上の反応基と、生物学的分子または化学的分子上の反応基との他の組合せも、生物学的分子または化学的分子を結合手プラットフォーム分子に共有結合的に結合させるために用いられ得る。表１に、相互反応基のいくつかの組合せを挙げる。与えられる方法のうちどれが優先的に行われるかは、生物学的分子または化学的分子の性質（溶解度、他の反応性基の存在など）により決定される。
【０２１１】
【表１】
0003836888.tif 000023
【０２１２】
以下に記載の実施例は、種々の結合手プラットフォーム分子の合成方法、および上記分子と生物学的分子または化学的分子とを複合体化する方法を例示する。これらの実施例は、ペプチドおよびオリゴヌクレオチドが、表１中の相互反応基を用いて結合手プラットフォーム分子と複合体化する方法を示している。ペプチドおよびオリゴヌクレオチドの他に、他の生物学的分子（タンパク質、薬剤など）もまた、結合手プラットフォーム分子と複合体化し得る。
【０２１３】
（組合せ１：プラットフォームのチオール−リガンドのチオフィリック基）
【０２１４】
【化２９】
0003836888.tif 000024
【０２１５】
＜化合物Ａ＞
化合物３６（861mg、1.0mmol）およびNaHCO3 252mg（3.0mmol）を、1/1 ジオキサン/H2O 20mLに溶解する。混合物を0℃に冷却し、そしてN-スクシンイミジル-S-アセチルチオアセテート（Prochem Inc.）1.16g（5.0mmol）のジオキサン（40mL）溶液を、この混合物を攪拌しながら加える。1時間後、この混合物をCH2Cl2で抽出する。抽出物全量をMgSO4で乾燥し、濾過し、濃縮する。粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィーにより精製し、Ａを得る。
【０２１６】
＜化合物Ｂ−４つのチオール基を有するプラットフォーム＞
Ａ 732mg（0.55mmol）のDMSO（7.3mL）溶液を、ヘリウムを吹き込んだpH10の緩衝液（100mM 炭酸ナトリウム、10mM NH2OH）55mLに加える。この混合物をN2ガス下におき、1時間攪拌して、約10mMのテトラチオールプラットフォームＢの溶液を得る。
【０２１７】
＜化合物Ｘ−ブロモアセチル化ペプチド＞
FMOC化学法を用いて、Wang(p-アルコキシベンジル)樹脂上で、標準固相法によりペプチドを合成する。FMOC（フルオレニルメトキシカルボニル）で保護されたアミノ酸を、アミノ末端に順次加える。最終工程は、N-ブロモアセチルアミノカプロン酸の結合を包含する。保護基を除去し、ペプチドをトリフルオロ酢酸で樹脂から取り外して、Ｘを得、これを調製用逆相HPLCにより精製する。
【０２１８】
＜ペプチド−プラットフォーム複合体、Ｃ＞
テトラチオールプラットフォームＢの約10mmol溶液（pH10の緩衝液中）に、ブロモアセチル化ペプチドＸのDMSO溶液の過剰量を加える。ペプチド複合体Ｃを調製用逆相HPLCにより精製する。
【０２１９】
（組合せ２：プラットフォームのアミン−ペプチドの活性カルボキシレート）
【０２２０】
【化３０】
0003836888.tif 000025
【０２２１】
＜化合物Ｙ−活性カルボキシレートを有するペプチド＞
TFAに安定な保護基（カルボキシル基にはベンジルエステル、アミノ基にはCBZ）を用いて、Wang(p-アルコキシベンジル)樹脂上で標準固相法によりペプチドを合成する。アミノ末端に、アミノ酸残基を順次加える。ペプチドをTFAにより樹脂から取り外すことにより、カルボキシ末端に１つの遊離カルボキシル基を有し、他の全てのカルボキシルおよびアミンがブロックされているペプチドを得る。保護されたペプチドＹを、逆相HPLCにより精製する。
【０２２２】
＜ペプチド−プラットフォーム複合体Ｄ＞
化合物Ｙ（0.3mmol）をDMF 1mLに溶解し、この溶液に、ジイソプロピルカルボジイミド0.3mmolおよびHOBT（ヒドロキシベンゾトリアゾール） 0.3mmolを加える。この溶液を、テトラアミノプラットフォーム３６ 0.025mmolのDMF（1mL）溶液に加える。反応が完了すると、DMFを減圧下で除去し、粗製の完全に保護された複合体を得る。この複合体をMeOHに溶解し、そしてこの溶液を複合体１グラム当り100mgの10％Pdカーボンと共にParr水素添加装置中に置く。混合物を60psi H2下において振とうし、そして脱保護された複合体Ｄを調製用逆相HPLCにより精製する。
【０２２３】
（組合せ３：プラットフォームのアミン−オリゴヌクレオチドのアルデヒド）
【０２２４】
【化３１】
0003836888.tif 000026
【０２２５】
＜オリゴヌクレオチド−プラットフォーム複合体Ｅ＞
NaIO4（200mM）溶液の500μLアリコート（100μmol）を、ACT改変(CA)25 1.0g（全長400mg、25μmol）のH2O（19.5mL）溶液に、暗所で、0℃で加える。この混合物を0℃で40分間おき、EtOH 50mLを加えた。この混合物を-20℃で30分間おき、2000RPMで５分間遠心分離する。上澄みを捨て、残ったペレットを減圧下で乾燥する。このペレットを、H2O 3.3mLに溶解し、得られた溶液に、4.3mg（0.005mmol）の３６を100mMホウ酸ナトリウム(pH8.0）2.0mLに溶かした溶液を加える。得られた溶液に、ピリジン−ボラン複合体の200mM溶液（MeOH溶液）の250μL（50μmol）を加え、この混合物を37℃で４日間おく。この複合体Ｅは、イオン交換クロマトグラフィーで精製し得る。
【０２２６】
（組合せ４：プラットフォームの活性カルボキシレート−リガンドのアミン）
【０２２７】
【化３２】
0003836888.tif 000027
【０２２８】
＜化合物Ｆ−４つのカルボン酸基を有するプラットフォーム＞
無水コハク酸（1.0g、10mmol）を、３６  861mg（1.0mmol）およびNaHCO3 252mg（3.0mmol）を1/1 ジオキサン/H2O 20mLに溶かした溶液に加え、この混合物を室温で16時間攪拌する。混合物を1N HClで酸性化し、濃縮する。この濃縮物をシリカゲルクロマトグラフィーにより精製し、Ｆを得る。
【０２２９】
＜化合物Ｇ−４つのN-スクシンイミジルエステル基を有するプラットフォーム＞
Ｆ 126mg（0.1mmol）およびN-スクシンイミド46mg（0.4mmol）の無水THF（5mL）溶液を調製する。混合物を0℃に冷却し、ジシクロヘキシルカルボジイミド103mg（0.5mmol）を加える。この混合物が室温になるまで、数時間攪拌する。濾過により固形物を除去し、濾液を濃縮してＧを得る。このＧは、シリカゲルクロマトグラフィーで精製し得る。
【０２３０】
＜化合物Ｚ−アミノ基を有するペプチド＞
Wang(p-アルコキシベンジル)樹脂上で標準固相法によりペプチドを合成する。リジンε−アミンはCBZ基として保護する。FMOC化学法を用いて、アミノ末端に、アミノ酸残基を順次加える。加える最後の残基は、N-FMOC-アミノカプロン酸である。トリフルオロ酢酸で樹脂から切断した後、FMOC基をピペリジンにより脱離し、遊離アミンリンカーを有するペプチドを得る。このペプチドＺを、逆相HPLCにより精製する。
【０２３１】
＜ペプチド−プラットフォーム複合体Ｈ＞
Ｚ 0.05mmolおよびEt3N 0.1mmolのDMF（1mL）溶液を調製する。この溶液に、Ｇ 16.5mg（0.01mmol）のDMF（1mL）溶液を加える。この混合物を、反応が完了するまで攪拌する。保護基を除去するために、この複合体をMeOHに溶解し、そしてこの溶液を複合体1グラム当り100mgの10％Pdカーボンと共にParr水素添加装置中に置く。混合物を60psi H2下において振とうし、脱保護された複合体Ｈを調製用逆相HPLCにより精製する。
【０２３２】
（組合せ５：プラットフォームのイソチオシアネート−リガンドのアミン）
【０２３３】
【化３３】
0003836888.tif 000028
【０２３４】
＜化合物Ｉ−４つのイソチオシアネート基を有するプラットフォーム＞
チオホスゲン（381μL、575mg、5.0mmol）を、３６  861mg（1.0mmol）のTHF（10mL）溶液に加え、この混合物を、室温で、TLCによって反応が完了したことが確認されるまで攪拌する。この混合物を、塩化メチレンと5％NaHCO3溶液との間で分液抽出にかける。この抽出物をMgSO4で乾燥し、濾過し、濃縮する。生成物Ｉをシリカゲルクロマトグラフィーにより精製する。
【０２３５】
＜ペプチド−プラットフォーム複合体Ｊ＞
Ｚ 0.05mmolおよびEt3N 0.1mmolのDMF（1mL）溶液を調製する。この溶液に、Ｉ 10.3mg（0.01mmol）のDMF（1mL）溶液を加える。この混合物を、反応が完了するまで攪拌する。保護基を脱離させるために、この複合体をMeOHに溶解し、そしてこの溶液を複合体1グラム当り100mgの10％Pdカーボンと共にParr水素添加装置中に置く。混合物を60psi H2下において振とうし、脱保護された複合体Ｊを調製用逆相HPLCにより精製する。
【０２３６】
（組合せ６：プラットフォームのクロロホルメート−リガンドのアミン）
【０２３７】
【化３４】
0003836888.tif 000029
【０２３８】
＜化合物Ｋ−４つのヒドロキシル基を有するプラットフォーム＞
トリエチレングリコールビス-クロロホルメート205μL（275mg、1mmol）のCH2Cl2（5mL）溶液を、ジエタノールアミン497μL（525mg、5mmol）およびEt3N 696μL（506mg、5mmol）のCH2Cl2（5mL）溶液に、0℃で加える。この混合物を室温になるまで温め、TLCにより反応が完了したことが示されるまで、これを攪拌する。この混合物を濃縮し、生成物Ｋをシリカゲルクロマトグラフィーにより分離する。
【０２３９】
＜化合物Ｌ−クロロホルメート基を有するプラットフォーム＞
ピリジン（100μL）、次いでトリホスゲン1.19g（4mmol）を、Ｋ  412mg（1mmol）のCH2Cl2（20mL）溶液に加える。この混合物を、室温で20時間攪拌し、溶媒を減圧下でエバポレートして、化合物Ｌを得る。
【０２４０】
＜ペプチド−プラットフォーム複合体Ｍ＞
Ｚ 1mmolのピリジン（10mL）溶液を、Ｌ 132mg（0.2mmol）の1/1 THF/ピリジン（5mL）溶液に加える。この混合物を、反応が完了するまで攪拌する。溶媒を減圧下で除去する。保護基を脱離するために、この複合体をMeOHに溶解し、そしてこの溶液を複合体1グラム当り100mgの10％Pdカーボンと共にParr水素添加装置中に置く。混合物を60psi H2下において振とうし、脱保護された複合体Ｍを調製用逆相HPLCにより精製する。
【０２４１】
（実施例４：２つの異なる生物学的分子を含有する複合体の合成）
１種類よりも多くの生物学的活性基をプラットフォーム分子に複合体化することが有用であり得る。本実施例は、２つのマレイミド基（チオール含有ペプチドと反応する）および２つの活性化エステル基（遊離アミンを含有する薬剤と反応する）を含有するプラットフォームの調製を記載している。得られる複合体は、スキーム２０に示されるように、２つのペプチドおよび２つの薬剤分子を含有する。
【０２４２】
＜ヘテロ活性結合手プラットフォーム分子ベンジル6-アミノカプロン酸トシル酸塩Ｋの調製＞
6-アミノカプロン酸32mmol、p-トルエンスルホン酸51mmol、およびベンジルアルコール40mmolの混合物のトルエン（60mL）溶液を、Dean-Starkトラップを用いて還流し、水を除去する。反応が完了すると、混合物を冷却し、生成物を沈澱させる。濾過により固形物を集め、EtOH/Et20から再結晶化し、化合物Ｋを得る。
【０２４３】
＜化合物Ｌ＞
ジシクロヘキシルカルボジイミド（２当量）を、１当量の化合物５ および２当量のN-ヒドロキシスクシンイミドのTHF溶液に加える。この混合物を４時間攪拌し、化合物Ｋを2.2当量で加える。TLCにより反応が完了したことが示されるまで、この混合物を攪拌する。この混合物を濾過し、濃縮する。生成物をシリカゲルクロマトグラフィーにより精製する。
【０２４４】
＜化合物Ｍ＞
化合物ＬをCH2Cl2で希釈したトリフルオロ酢酸で処理する。反応が完了すると、混合物を減圧下で濃縮し、トリフルオロ酢酸塩として化合物Ｍを得る。
【０２４５】
＜化合物Ｎ＞
化合物（N-tert-ブチルオキシカルボニル-2,2'-ビス-(N-カルボベンジルオキシ-6-アミノヘキサノアミドエチル)アミン）をCH2Cl2で希釈したトリフルオロ酢酸で処理する。反応が完了すると、混合物を減圧下で濃縮し、トリフルオロ酢酸塩として化合物Ｎを得る。
【０２４６】
＜化合物Ｏ＞
トリエチレングリコールビス-クロロクロロホルメート3.2mmolを、化合物Ｍ 4mmolおよび化合物Ｎ 4mmolのピリジン（162mL）溶液に、20℃水浴中で加える。この混合物をTLCによって反応が完了したことが示されるまで攪拌し、減圧下で濃縮する。この濃縮物をCH2Cl2に溶解し、続けて1N HCl溶液、5％NaHCO3溶液、および飽和NaCl溶液の順で洗浄する。CH2Cl2層をMgSO4で乾燥し、濾過し、濃縮する。この濃縮物をEtOH 10mLに溶解し、1M NaOH 10mLを加える。TLCにより反応がさらに起こらないことが示されるまで、この混合物を数時間攪拌する。混合物を1N HClでpH1にまで酸性化し、CH2Cl2で抽出する。CH2Cl2層をMgSO4で乾燥し、濾過し、濃縮する。生成物Ｏをシリカゲルクロマトグラフィーにより分離する。
【０２４７】
＜化合物Ｐ＞
化合物ＯをEtOHに溶解し、そしてParr振とう装置中でＯ １グラム当り100mgの10％Pdカーボンで水素添加する。TLCにより、反応の完了を確認する。反応が完了すると、濾過により触媒を除去し、そして混合物を濃縮して、化合物Ｐを得る。
【０２４８】
＜化合物Ｑ＞
N-メトキシカルボニルマレイミド3mmolを、化合物Ｐ 1mmolをジオキサン20mLおよび飽和NaHCO3 5mLに溶かした溶液に、0℃で加える。この混合物を１時間攪拌し、1N HClで酸性化し、CH2Cl2で抽出する。CH2Cl2層をMgSO4で乾燥し、濾過し、濃縮し、そして生成物をシリカゲルクロマトグラフィーにより精製し、Ｑを得る。
【０２４９】
＜化合物Ｒ＞
DCC 2mmolを、Ｑ 1mmolおよびp-ニトロフェノール2mmolのCH2Cl2溶液に加え、混合物を16時間攪拌する。濾過により固形物を除去し、濾液を濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィーにより精製してＲを得る。
【０２５０】
＜２つのペプチドおよび２つの薬剤分子を有する複合体、化合物Ｓ＞
チオール含有ペプチド２当量余りを、ヘテロ活性化プラットフォームＲ １当量のpH7.5リン酸緩衝液溶液に加える。混合物を1時間攪拌し、アミン含有薬剤２当量余りを加える。この複合体Ｓを、逆相HPLCまたはイオン交換クロマトグラフィー、またはそれらの組合せにより単離する。
【０２５１】
【化３５】
0003836888.tif 000030
【０２５２】
（実施例５：複合体３-IIの合成および試験）
【０２５３】
【化３６】
0003836888.tif 000031
【０２５４】
＜DMTr-5'-改変(CA)10の調製＞
ポリヌクレオチドd-[DMTr-(bzCp(CE)bzA)10]を、DNAホスホルアミダイト合成のための製造者のプロトコルに従い、Milligen 8800 Prep Scale DNA合成機で調製した（図６参照）。この合成は、30.0μmol/gでヌクレオシドをローディングした、10gのDMTr-d-bzA-CPG支持体上で行った。最後のDMTrブロック基を、機械的プロトコルを用いて除去した。Milligen活性化剤溶液（Cat.No.MBS5040）45mLおよび化合物５１（反応スキーム１１参照） 0.385gを反応系に加え、この懸濁液をアルゴン吹き込みにより８分間混合した。混合物を通常の機械プロトコルにより酸化し、支持体に結合したポリヌクレオチドを濾過により採集し、空気乾燥し、そして濃アンモニア100mLで16時間、55℃で処理した。温度が下がると、混合物をGelman 10μポリプロピレンフィルターを通して濾過した。NaOHでpH12に調整した2mM NaCl 200mLで、フィルターを洗浄した。次いで、濾液を、初めに3M NaClで、次いで2mM NaClでpH12に平衡化されたQ-Sepharose（Pharmacia）を充填したAmiconクロマトグラフィーカラム（0.45×9.4 cm、150mL）に通した。カラムを直線グラジエント（2mM NaCl、pH12から1.3M NaCl、pH12まで）500mLで溶出し、次いで全てのU.V.吸光物質が現れるまで1.3M NaCl（pH12）で洗浄した。260nm吸光画分をポリアクリルアミド電気泳動によりさらに分析し、純粋生成物を含有する画分をプールする。このプール（120mL）を冷イソプロパノール240mLで処理し、-20℃で30分間保持した。モデルH-6000Aローターを用いるSorvall RC 3B遠心分離器で、3000rpm、４℃で15分間遠心分離を行い、これにより沈澱物を採集し、DMTr-5'-改変(CA)10（14946 A260 ユニット、498mg、62.2μM、20%(300μM CPGヌクレオシドに基づく)）を得た。
【０２５５】
＜Tr-5'-改変(CA)10の合成＞
【０２５６】
【化３７】
0003836888.tif 000032
【０２５７】
Tr-5'-改変(CA)10の合成を、化合物５１を化合物５３（反応スキーム11に記載のように調製）に置き換えることにより、DMTr-5'-改変(CA)10の合成のための上記の記載と同様にして行った。
【０２５８】
＜DMTr-5'-改変ポリヌクレオチドと化合物３(IA-DABA-PEG、反応スキーム１)との複合体化−複合体３-Iの調製＞
以下に示す複合体化の手順において、用いられる全ての緩衝液および溶液に充分なヘリウムを吹き込み、全ての反応容器を使用前にアルゴンでパージした。DMTr-5'-改変(CA)10の11,568 A260 ユニット（48.2μmol、260nmでの推定モル吸光度＝240,000）の水（7.7mL）溶液を、0.1M NaHCO3 1mLおよびトリブチルホスフィン210μL（876μmol、18倍過剰モル）を用いて、室温で0.5時間処理した。この懸濁液をときどき振とうした。懸濁液を3M NaCl 0.8mLおよび冷イソプロパノール16mLで処理した。-20℃で30分おいた後、この物質を3000rpmで20分間遠心分離した。得られたペレットを水2mL、3M NaCl 0.2mLに再び溶解し、イソプロパノール4mLで処理し、再び遠心分離した。ペレットを減圧下で短時間乾燥し、ヘリウムを吹き込んだ水2.8mLおよび0.1N NaHCO3 1mL中に溶解した。化合物３(IA-DABA-PEG) 6.7mgを加え、この混合物を暗所に室温で16時間おいた。最終容量6mLの反応混合物を、Sephacryl 200（Pharmacia）を詰めた 5×91(1800Ml)Pharmaciaカラムに通した。カラムを0.5M NaCl、0.1Mホウ酸ナトリウム（pH8.3）で溶出した。ぜん動性のポンプを用い、流速が約2mL／分になるように設定し、15mlの画分を集めた。この画分の260nmでの吸光度を測定した。さらに、この画分をポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析し、純粋な複合体を含む画分をプールした。
【０２５９】
＜複合体３-Iのハイブリダイゼーション−複合体３-IIの調製＞
上記プールした画分は726 A260ユニットを含む画分であった。当量の(TG)10を加え、チューブを90℃で10分間加熱し、次いで1.5時間かけて室温にまで冷却した。等量のイソプロパノールを加え、この混合物を-20℃で3時間おいた。3000rpmで20分間遠心分離した後、ペレットを0.15 M NaCl、0.01Mクエン酸ナトリウム（pH6.8）に溶解した。53mgのハイブリッドを得た。この物質の一部を上記緩衝液で希釈し、二重らせんの融解温度（Tm）をCarey 3E分光光度計で測定した。この物質は、そのTmが73.4℃であり、濃色性は24.3％であった。生成物の10 A260 ユニットの部分を、上記に記載のように過剰の(TG)10でアニールした。この物質と同様に非アニール複合体および(TG)10標準物とを、Rainin HPLC装置を用いShodex Protein KW 8025カラムでゲルパーミエーションHPLCにより分析した。カラムを、0.05M NaH2PO4（pH6.5）、0.5M NaClでイソクラティックに溶出した。溶出時間は12分であった。生成物の保持時間は6.9分であり、(TG)10は9.2分であった。ピーク面積の比較により、この生成物の98.09％が二本鎖DNAであることが示された。この複合体は、図６の「複合体３-II」を示す構造により表される。
【０２６０】
（実施例６：PN-KLH複合体の調製）
PN-KLH複合体を、以下に示すスキームによって調製した：
【０２６１】
【化３８】
0003836888.tif 000033
【０２６２】
＜ACT-改変(CA)25の合成＞
自動化合成の最終工程として、化合物５８を(CA)25に結合した。30.0μmol/gでヌクレオシドをローディングした、10gのDMT-d-bzA-CPG支持体より出発して、49の逐次工程を、dCおよびdAのホスホロアミダイドを交互に用いて行った。得られたd-[DMTr-(bzCp(CE)bzA)25]からDMTrブロック基を除去し、そして活性化剤溶液（Milligen、Cat. No. MBS5040）40mLおよび化合物５８ 800mgを反応混合物に加えた。懸濁液をアルゴン吹き込みにより8分間混合し、そして通常の酸化工程を行った。支持体に結合したポリヌクレオチドを反応容器から取り出し、空気乾燥し、そして濃アンモニア100mLで40時間、55℃で処理した。温度が下がると、混合物をGelman 10μmポリプロピレンフィルターを通して濾過し、次いで、濾液を通常のイオン交換クロマトグラフィーにより精製した。260nmで吸光度を示す画分をポリアクリルアミド電気泳動によりさらに分析し、純粋な生成物を含有する画分を合わせて、イソプロパノールで沈澱させ、ACT-改変(CA)25 510mg（31.9μmol、10%）を得た。
【０２６３】
＜一本鎖PN-KLH複合体の合成＞
NaIO4処理したACT-改変(CA)25 100mg（2.5μmol）を50mM ホウ酸ナトリウム（pH8.0） 1.33mLに溶かした溶液に、KLH 31.3mg（0.208μmol）およびピリジンーボラン 2.0mg（31.8μmol）を加えた。この混合物を37℃で72時間おき、生成物をS-200でのクロマトグラフィーにより精製した。
【０２６４】
＜一本鎖PN-KLH複合体の(TG)25とのハイブリダイゼーション＞
当量の(TG)25を、一本鎖PN-KLH複合体に加え、チューブを90℃で10分間加熱し、次いで1.5時間かけて室温にまで冷却した。イソプロピルアルコールで沈澱させ、53mgのPN-KLHを得た；Tm（0.15 M NaCl、0.01Mクエン酸ナトリウム、pH6.8）73.4℃、31.1％濃色性；過剰の(TG)10でアニールしたサンプル、非アニール複合体、および非アニール(TG)10からなる標準物質に対するHPLCでの比較により、98％が二本鎖であることが確認された（Shodex Protein KW 8025カラム、0.05M NaH2PO4、pH6.5、0.5M NaCl）。この複合体は以下の式で表し得
KLH-[NH(CH2)5OPO2・O-(CA)25:(TG)25]-5
（KLHの分子量は105であると推定される）、「PN-KLH」と称される。
【０２６５】
＜免疫寛容原としての複合体３-IIの試験＞
複合体３-IIを、免疫原の形態のポリヌクレオチドにより免疫化したマウスに免疫寛容を起こさせる能力について試験した。
【０２６６】
＜材料および方法＞
マウス：C57BL/6の雌マウス（６週齢）をJackson Laboratories（Bar Harbor、ME）から購入した。マウスは、国立衛生研究所(NIH)の改良法により飼育した。  免疫処置：Iversonの方法（Handbook of Experimental Immunology、第２巻のCellular Immunology、（D.M. Weir、L.A. Herzenberg、C. Blackwell、およびA. Herzenberg編、第４版、Blackwell Scientific Publications、Oxford）中のAssay for in vivo Adoptive Immune Response）に従って、ミョウバン沈降させたPN-KLH 100μgと、アジュバントとしてホルマリン固定百日咳菌2×109とを、マウスの腹腔内に注射することにより、マウスを初回免疫した。このマウスを、生理食塩水に溶かした50μgのPN-KLHでブーストした（腹腔内）。
【０２６７】
PNのSRBCへの結合：ヒツジ赤血球細胞(SRBC)のオルシーバー溶液をColorado Serum Co.（Denver、CO）から購入し、２週間以内に用いた。このSRBCを、KippおよびMillerの方法（Selected Methods in Cellular Immunology、(1980)、B.B.MishellおよびS.M. Shiigi編、 W.H. Freeman and Co.（San Francisco）、103ページの「タンパク質複合赤血球細胞のECDIを用いる調製（改変）」）により、(CA)25：(TG)25（CA:GTからなる50マー）で被覆した。簡単に言えば、SRBCを冷生理食塩水で４回洗浄し、カルボジイミド10mgを含む0.01M NaCl、0.35Mマンニトール中のD-EK結合(CA)25：(TG)25 2mgと混合し、４℃で30分間インキュベートした。被覆SRBCを冷平衡塩類溶液で２回洗浄し、10％(v/v)に再懸濁した。
【０２６８】
プラークアッセイ：抗PNプラーク形成細胞(pfc)の数を、カニンガム法（Selected Methods in Cellular Immunology、(1980)、B.B.MishellおよびS.M. Shiigi編、W.H. Freeman and Co.（San Francisco）、86ページの、Marbrook, J.、「液体マトリックス（スライド法）」）を用いて測定した。IgG pfcの数を、Henryによる記載（Selected Methods in Cellular Immunology、(1980)、B.B.MishellおよびS.M. Shiigi編、 W.H. FreemanおよびCo.、San Francisco、91ページの「IgMプラークの除去によるIgG応答の評価」）に基づき、ウサギ抗マウスIgGを用いてIgMプラークを除去することにより測定した。簡単に言えば、脾臓を採取し、単細胞懸濁液を平衡塩類溶液(BSS)中で調製した。ギニアピッグ血清をポリヌクレオチド被覆SRBCに加えて、最終希釈物が1:9ギニアピッグ血清となるようにし、そして充分量のウサギ抗マウスIgGを加えて、最終希釈物が1:100ウサギ抗マウスIgGとなるようにした。SRBC混合物と希釈脾臓細胞とを、マイクロタイターウェル中で等量で混合し、カニンガムチャンバーに移した。各脾臓を個別に３回試験した。チャンバーの端をパラフィンで封じ、チャンバーを37℃で１時間インキュベートした。プラークの数を、倒立顕微鏡下でチャンバーを観察して数えた。
【０２６９】
＜結果＞
アジュバントとしての百日咳（A&P）と一緒にミョウバン沈降PN-KLHでマウスを初回免疫し、７週間後に各グループ３匹ずつに分けた。このマウスを、PN-DABA-PEG、すなわち複合体３−IIの２倍ずつ濃度を変化させた希釈液で処理し（腹腔内）、５日後コントロールを含めてすべてのマウスを、生理食塩水に入れたPN-KLH 50μgでブーストした（腹腔内）。４日後、脾臓を採取し、IgG pfcの数を測定した。表２に示されるように、複合体３-IIを投与した試験体は、pfcの数がコントロールグループに比較して顕著な減少を示した。
【０２７０】
上記と同様の条件により、複合体3-IIおよびD-EK結合(PN)50を用いてマウスを処理し、Farrアッセイにより抗dsPN抗体を測定した。結果を図１４に示す。LJP-105(D-EK結合(PN)50)に比べて、LJP-249AおよびLJP-249B（複合体3-II)は、抗dsPN抗体を減少させる効果が著しく高かった。
【０２７１】
【表２】
0003836888.tif 000034
【０２７２】
（実施例７：複合体２０-IIの調製および試験）
＜5'-改変(CA)10の結合手プラットフォーム分子２０への複合体化−一本鎖複合体２０-Iの調製＞
トリ-n-ブチルホスフィン969μL（789mg、3.89mol）を、5'-改変(CA)10 918mg（0.14mmol）のH2O（30mL）溶液にアルゴンガス下で加えた。この混合物を１時間攪拌し、次いで3M NaCl溶液2.4mLを加え、次にヘリウムを吹き込んで酸素をパージしたイソプロパノール42mLを加えた。混合物を冷凍機中に-20℃で１時間おき、次いで3000rpmで30分間遠心分離した。上澄みを除去し、油状の残留物を、ヘリウムを吹き込んだH2O 15.5mLに溶解した。3M NaCl 1.24mLおよびヘリウムを吹き込んだイソプロパノール21.7mLを、混合物に加えた。次いで、得られた混合物を冷凍機中に-20℃で１時間おき、3000rpmで20分間遠心分離した。得られた油状のペレットを減圧下で18時間乾燥して、固形物を得た。この固形物を、ヘリウムを吹き込んだH2O 6mLに溶解し、全容量は6.4mLとなった。260nmでのUV吸光度測定により、DNA量は863mgであった（pH7.5食塩加リン酸緩衝液での、吸光単位当り0.333mg）。この溶液を、50mL三口フラスコにアルゴンガス下で移した。フラスコの１つの口をアルゴンガスの導入口とし、他の２つには栓をした。ヘリウムを吹き込んだ1Mリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.8）0.87mLとMeOH 0.97mLとH2Oとを加えて、全容量を7.7mLに調整した。化合物２０の17.7mg/mL MeOH溶液1.9mL（33.63mg、0.025mmol）を、混合物に加えた。得られた混合物を、アルゴンガス下で20時間攪拌し、次いで0.1M NaCl、0.05M リン酸ナトリウム（pH7.5）、および10％MeOHを含有する溶液で100mLに希釈した。精製は、Fractogel（登録商標）でのクロマトグラフィーにより行った（平衡：0.1M NaCl、0.05M リン酸ナトリウム、pH7.5、10％MeOH：溶離グラジエント 0.5M NaCl、0.05M リン酸ナトリウム、pH7.5、10％MeOHから0.8M NaCl、0.05M リン酸ナトリウム、pH7.5、10％MeOHまで）。HPLCおよびポリアクリルアミドゲル電気泳動により示される、純粋な複合体２０-Iを含む画分を、232mLの溶離液中に集めた。等量のイソプロパノールを加え、これを冷凍機中に-20℃で１時間おくことにより、生成物および塩を沈澱させた。H2Oに対して透析し（2×100 vol）、335mgの複合体２０-I（濃度10.47mg/mLで32mL、0.033mg/吸光単位(260nm)）を得た。
【０２７３】
＜二本鎖複合体２０-IIを形成するための、複合体２０-Iと(TG)10とのアニーリング＞
複合体２０-I 150mg（0.033mg/吸光単位(260nm)に基づき、濃度10.47mg/mLで  14.33mL）および(TG)10 157.5mg（0.033mg/吸光単位(260nm)に基づき、104.6mg/mLで1.50mL）を、50mLポリプロピレン遠心管に入れた。pH7.2 10×PBSを2.0mLおよびH2Oを2.17mL加えることにより、濃度を15mg/mLに調整した。混合物を、90℃湯浴中におき、そして1.5時間かけて室温にまで冷却した。濃度は、260nmの吸光度（0.050mg/吸光単位）により、17.7mg/mLであると確認された；転移融解温度 67.5℃；濃色性 27％；重量オスモル濃度 346；pH7.2であった。複合体２０-IIの最終の処方のために、pH7.2 1/2 × PBSを7.23mL加え、0.22μフィルターを通して濾過することにより、溶液を最終濃度12.7mg/mLおよび重量オスモル濃度299に希釈した。
【０２７４】
＜5'-改変(CA)10-20の別の複合体化、一本鎖複合体２０-Iの調製＞
10当量のトリ-n-ブチルホスフィンを、5'-改変(CA)10をHe吹き込み100mM酢酸ナトリウム（pH5）に溶かした10mg/mL溶液に加える。この混合物を1時間攪拌し、次いで1.4倍量のイソプロピルアルコール(IPA)で沈澱させる。混合物を冷凍機中に-20℃で1時間おき、次いで3000rpmで20分間遠心分離する。上澄みを除去し、ペレットを、ヘリウムを吹き込んだIPAに10mg/mLで溶解する。混合物を冷凍機中に-20℃で１時間おき、次いで3000rpmで20分間遠心分離する。ペレットを減圧下で18時間乾燥し、固形物を得る。この固形物の50mg/mL溶液を、ヘリウムを吹き込んだ100mMホウ酸ナトリウム緩衝液（pH10）中で調製する。9/1 MeOH/H2O中の40mg/mL溶液として、0.25当量の化合物２０を、この混合物に加える。この混合物を室温で３〜20時間攪拌し、希釈する（0.1M NaCl、0.05M リン酸ナトリウム（pH7.5）、10％MeOH）。Factogelのクロマトグラフィーにより精製を行う。（平衡：0.1M NaCl、0.05M リン酸ナトリウム、pH7.5、10％MeOH：溶離グラジエント 0.5M NaCl、0.05M リン酸ナトリウム、pH7.5、10％MeOHから0.8M NaCl、0.05M リン酸ナトリウム、pH7.5、10％MeOHまで）。HPLCおよびポリアクリルアミドゲル電気泳動により示される、純粋な複合体２０-Iを含む画分を集めた。等量のIPAを加え、これを冷凍機中に-20℃で１時間おくことにより、生成物および塩を沈澱させる。H2Oに対して透析し（2×10 vol）、複合体２０-Iを得る。
【０２７５】
＜二本鎖複合体２０-IIを形成するための、２０-Iの(TG)10-20による別のアニーリング＞
アニーリングを90℃で行う代わりに70℃で行ったこと以外は、上記方法と実質的に同一である。
【０２７６】
＜5'-改変(CA)10-20のさらに別の複合体化、一本鎖複合体２０-Iの調製＞
トリ-n-ブチルホスフィン 4.8mLを、Ar吹き込み100mM酢酸ナトリウム（pH5）104mLに7.75gの5'-改変(CA)10を溶かした溶液にN2ガス下で加えた。この混合物を1時間攪拌し、次いでIPA 232.5mLで沈澱させた。混合物を冷凍機中に-20℃で1.5時間おき、次いで3000rpmで20分間遠心分離し、そして-20℃で24時間おいて凍らせた。上澄みを除去し、ペレットをヘリウム吹き込み0.3M NaCl溶液170mLに溶解した。混合物をAr吹き込みIPA 232mLで再び沈澱させた。次いで混合物を冷凍機中に-20℃で２時間おき、3000rpmで20分間遠心分離し、そして-20℃で11時間おいた。上澄みを除去し、ペレットを減圧下で12時間乾燥し、固形物を得た。この固形物の溶液を、Ar吹き込み100mMホウ酸ナトリウム緩衝液（pH10）110mL中で調製した。9/1 MeOH/H2O（4.4mL）溶液として、406mgの化合物２０を、この混合物に加えた。この混合物を室温で２時間攪拌した。得られた混合物は、高圧イオンクロマトグラフィーにより62％の２０-Iを含有していることが示された。このクロマトグラフィーは、Waters Gen Pak Fax カラム（100×4 mm）、60℃、直線グラジエント 65％Ａ／35％Ｂから18％Ａ／82％Ｂ；Ａ＝0.05M NaH2PO4、pH7.5 1mM EDTA、10％MeOH(v/v)；Ｂ＝0.05M NaH2PO4、pH7.5、1M NaCl、1mM EDTA、10％MeOH(v/v)で行い、２０-Iは19.5分で溶出した。
【０２７７】
＜複合体２０-IIおよび非複合体コントロールの試験＞
C57BL/6マウスを、PN-KLHおよびA&Pで免疫化した。３週間後、マウス５匹/グループのグループに、それぞれ種々の投与量の複合体２０-II、または4.5nM HAD-AHAB-TEG（誘導体化した結合手プラットフォーム分子、AHAB-TEGにリンカーHADを接続、図７参照）、または18nM（4×4.5）(CA)10:(TG)10、または4.5nM HAD-AHAB-TEGと18nM (CA)10:(TG)10との混合物を腹腔内投与した；そして、１つのグループには処理を行わなかった。各グループに注射してブーストし、血清を採集して、実施例６に記載のアッセイを行った。抗PN応答の減少（百分率で表示）を図４に示す。これらのマウスの抗KLH応答は普通であり、図２に示される抗KLH応答とは顕著に異なるものではなかった。本実施例の結果から、抗PN応答は、(i)結合手プラットフォーム分子のみ、(ii)PNのみ、または(iii)この２つの混合物によって影響されなかったことが明らかである。PNは、免疫寛容を誘導するためには、非免疫原の結合手プラットフォーム分子と結合されなければならない。
【０２７８】
＜複合体２０-IIがPN特異性抗体産生細胞の数の減少をもたらすこと＞
C57BL/6マウスを、PN-KLHおよびA&Pで免疫化した。３週間後、マウス３匹/グループのグループを、種々の投与量の複合体２０-IIで、それぞれ腹腔内投与した；そして、１つのグループには処理を行わなかった。 ５日後、全てのマウスに、生理食塩水に入れたPN-KLHを腹腔内注射してブーストし、次いで４日後、それらの脾臓を採取し、溶血プラークアッセイを用いて、PN特異性のIgG産生細胞の数についてアッセイした。結果を表３に示す。この結果から、この複合体によって、PN特異性IgG産生細胞の数が減少したことが明らかである。
【０２７９】
【表３】
0003836888.tif 000035
【０２８０】
（実施例８：複合体の免疫寛容原としての試験）
＜複合体１７-IIの免疫寛容原としての試験＞
C57BL/6マウスを、PN-KLHおよびA&Pで免疫化した。３週間後、マウス５匹/グループのグループに、種々の投与量の複合体１７-IIを、それぞれ腹腔内投与した；そして、１つのグループには処理を行わなかった。 ５日後、全てのマウスに、生理食塩水に入れたPN-KLHを腹腔内注射してブーストし、７日後、このマウスの採血を行った。血清を、PN濃度10-8MでFarrアッセイにより抗PN抗体について分析した。抗PN応答の減少（百分率表示）を図１に示す。また、この血清を、ELISAアッセイを用いて抗KLH抗体についても分析した。この結果を、抗KLH血清の標準プールに比較した抗KLHの百分率として表し、図２に示す。図１中のデータにより、この複合体が抗PN応答を低減したことが示される。これらのマウスはすべて、抗KLH（プラットフォーム分子）応答は普通であった（図２参照）。
【０２８１】
＜種々の11シリーズの複合体の免疫寛容原としての試験＞
C57BL/6マウス/グループのグループを、PN-KLHおよびA&Pで免疫化した。３週間後、２つのグループに対し、それぞれ３つの異なる投与量の複合体１１-IV、複合体１１-II、複合体１１-VI、または複合体１１-VIIIを腹腔内投与し、１つのグループには処理を行わなかった。 これらの複合体は、図６に記載されており、上記の実施例７の方法に従って調製した。５日後、全てのマウスに、生理食塩水に入れたPN-KLHを腹腔内注射してブーストし、７日後、このマウスの採血を行った。血清を、PN濃度10-8MでFarrアッセイにより抗PN抗体について分析した。抗PN応答の減少（百分率表示）を図３に示す。これらのマウスの抗KLH応答は、図２に示される抗KLH応答と顕著に異なるものではなかった。４つの複合体は全て、試験した全ての投与量で、抗PN応答を顕著に減少させた。
【０２８２】
＜複合体１１-IIがPN特異性抗体産生細胞の数の減少をもたらすこと＞
C57BL/6マウスを、PN-KLHおよびA&Pで免疫化した。３週間後、マウス３匹/グループのグループに対し、種々の投与量の複合体１１-IIを腹腔内投与し、１つのグループには処理を行わなかった。５日後、全てのマウスに、生理食塩水に入れたPN-KLHを腹腔内注射してブーストし、次いで４日後、それらの脾臓を採取し、溶血プラークアッセイを用いて、PN特異性のIgG産生細胞の数についてアッセイした。種々の投与量の複合体１１-IIによる実験の結果を表４に示す。この結果から、この複合体により、PN特異性IgG産生細胞の数が減少し、そして抗体力価の減少は、複合体に結合した血清抗体のクリアランスによるものではないことが明らかである。
【０２８３】
【表４】
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【０２８４】
（実施例９：HADpS-(CA)10-複合体２０-IVの調製）
5'末端にリンカーを結合するホスホロチオエートを有する改変ポリヌクレオチドを調製した。20マーの(CA)10の合成およびHADリンカーのポリヌクレオチドへの付加を、以下に記載することを除いて、実施例５の方法に従って行った。最終の酸化工程において、ヨウ素溶液を、3H-1,2-ベンゾジチオール-3-オン 1,1 ジオキシド（Glen Reseach, Sterling, VA）の0.05M アセトニトリル溶液に置き換えた。イオウ化処理は、製造者の指示に従って行った。アンモニア処理および精製は、実施例５と同様にして行った。ポリヌクレオチドのAHAB-TEG結合手プラットフォームへの複合体化は、実施例５の方法に従って行った。
【０２８５】
＜複合体２０-IVの免疫寛容原としての試験＞
PNの5'ホスフェートは酵素分解を受け易いので、末端ホスフェートの酸素分子のうち１つをイオウで置換した（従って、HADpSという名とする）。C57BL/6マウスを、PN-KLHおよびA&Pで免疫化した。３週間後、マウス５匹/グループのグループを、種々の投与量の複合体２０-IVで腹腔内投与し、１つのグループには処理を行わなかった。グループにブースター注射を行い、血清を採集して、上記のアッセイを行った。抗PN応答の減少（百分率表示）を示す結果を図５に示す。これらのマウスの抗KLH応答（データは示さず）は普通であり、図２に示される抗KLH応答と顕著に異なるものではなかった。これらの結果は、この複合体が抗PN応答を顕著に減少させたことを示す。
【０２８６】
＜複合体２０-IVがPN特異性抗体産生細胞の数の減少をもたらすこと＞
C57BL/6マウスを、PN-KLHおよびA&Pで免疫化した。３週間後、マウス３匹/グループのグループに対し、種々の投与量の複合体２０-IVを腹腔内投与し、１つのグループには処理を行わなかった。５日後、全てのマウスに、生理食塩水に入れたPN-KLHを腹腔内注射してブーストし、次いで４日後、それらの脾臓を採取し、溶血プラークアッセイを用いて、PN特異性のIgG産生細胞の数についてアッセイした。この結果を表５に示す。この結果から、この複合体により、PN特異性IgG産生細胞の数が減少したことが明らかである。
【０２８７】
【表５】
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【０２８８】
（実施例10：LJP394、複合体２０−IIでのBXSBマウスの処理）
＜マウス処理プロトコル＞
６〜９週齢の雄BXSBマウス（Jackson Laboratory, Bar Harbor, Me）をLa Jolla Pharmaceutical facilityで飼育した。食物および水は随意に与えた。実験に使用する前に、動物を１週間休ませた。最初の複合体処理を行う前に、初期の血液サンプルを得、そして初期体重を測定した。複合体の処理は７〜９週齢で開始し、59日から150日まで１週間に２回腹腔内投与を行った。動物の採血を定期的に行い、その抗DNA抗体力価を決定した。
【０２８９】
＜IgG抗DNA抗体産生に対するアッセイ＞
各マウスから得た血清サンプルを、抗DNA抗体の存在をELISAにより評価した。Falcon Probind 96ウェルマイクロタイトレーションアッセイプレート（Becton Dickerson, Oxnard, CA）を、50μg/mLの濃度の(PN)50-D-EK（D-グルタミン酸およびD-リジンのコポリマー）100μL／ウェルで、４℃で一晩被覆した。このプレートを、カルシウムおよびマグネシウムを含有しないPBSおよび0.05％Tween20（洗浄緩衝液）で、M96V plate washer（ICN Biomedical, Inc., Irvine, CA）を用いて２回洗浄した。プレートを、１％ゼラチン（Norland Products, Inc, New Brunswick, NJ）を含有するPBSおよび0.05％Tween 20により、室温で1時間遮断した。血清サンプルまたは標準物を加える前に、プレートを洗浄緩衝液で２回洗浄した。血清サンプルおよび標準物を、１％ゼラチンを有するPBS、0.05％Tween 20、および10％ヤギ血清を含む希釈液として調製した。プレートを37℃で60〜90分間、血清サンプルを用いてインキュベートし、次いでウェルを洗浄緩衝液で4回洗浄した。ビオチニル化ヤギ抗マウスIgG（Sigma Chemical Co., St. Louis, MO）を、10％ヤギ血清を含む遮断溶液で1/1000に希釈した。プレートを37℃で１時間インキュベートし、４回洗浄した。基質となるOPD（Sigma Chemical Co.(St. Louis, MO)）を加えた。OD 450nmでのELISAプレートリーダーにより最も高い標準物の最高読み取り値が約１ ODユニットになるまで、プレートを暗所中でインキュベートした（Bio-Tek Instruments, Winooski, VT）。反応を3M HCl 50μLで中断し、プレートを490nmで読み取った。各マイクロタイトレーションプレートにはリファレンスの陽性血清が含まれており、各アッセイからの陽性ウェルはこのリファレンスの時間曲線の95％範囲内の感度であった。後に採血した血液では、陽性サンプルのいくつかがリファレンスカーブを超過した。しかし、ほとんどの希釈マウス血清サンプルは、リファレンスカーブ範囲内にあった。正常のコントロール陰性血清による、顕著な結合は観察されなかった。結果を図１５に示す。
【０２９０】
（実施例11：メリチンペプチドおよび複合体の調製）
メリチン分子は、26のアミノ酸からなり、ミツバチ毒の主成分の１つである。ミツバチ毒感受性個体の３分の１は、メリチン特異性抗体を有する。メリチンは、数種のマウス系統（Balb/c、CAF1）では、高い免疫原性を有する。応答マウス系統のメリチン特異性抗体の多く（＞80％）は、メリチンのC末端の７つのペプチドであるＢ細胞エピトープに結合する。
【０２９１】
＜メリチン＞
【０２９２】
【表６】
0003836888.tif 000038
【０２９３】
＜Ｔ細胞を刺激するメリチンペプチド＞
【０２９４】
【表７】
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【０２９５】
＜ペプチド合成＞
メリチンペプチドは、グリシン樹脂（Advanced ChemTech #SG5130）あるいはその等価物（Advanced ChemTech、2500 Seventh Street Road、Louisville、KY）上で標準的なFmoc化学法により調製した。各結合工程では、2.3M過剰のアミノ酸誘導体を用いた。結合の完了は、ブロモフェノールブルーでモニターし、ニンヒドリンで確認した。
【０２９６】
＜複合体に用いられるメリチンペプチド＞
【０２９７】
【表８】
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【０２９８】
ペプチドをチオエーテル結合により結合手プラットフォーム分子に結合させるために必要なので、システインを加えた。ペプチドを、合成後に逆相HPLCにより精製し、凍結乾燥により乾燥した。次いで、適度な量のペプチドを、各複合体化に対して秤量した。
【０２９９】
＜予め形成されたジスルフィド結合の還元(トリブチルホスフィン法)＞
全ての緩衝液にヘリウムを吹き込んだ。ペプチドを、最少容量（約10〜20mg/mL）の0.05M  NaHCO3（pH8.25）に溶解した。0.7Mトリブチルホスフィン（TBP；MW＝202.32g/モル；d - 0.812g/mL）の1mL溶液は、TBP 174.4μLをイソプロパノール(iPrOH) 825.6μLに加えることにより調製した。次いで、上記のように調製したペプチド溶液に、TBPを(1:1)の当量で加え、充分に混合し、次いで時々攪拌してTBPを溶液中に溶解および／または分散させながら、30分から1時間反応させた。HPLCにより、還元が完了したことを確認した。
【０３００】
＜結合手プラットフォーム分子＃３または＃６０へのペプチドの複合体化＞
全ての緩衝液にヘリウムを吹き込んだ。ポリエチレングリコール(PEG)誘導体＃３または＃６０を、最少容量（約20mg/mL）の0.05M  NaHCO3（pH8.25）に溶解した。PEG誘導体のヨードアセチル基当り、約3当量のペプチドを用いた。p-アミノ安息香酸(PABA) -PEG（ヨードアセチル基２個；MW＝約4100g/モル）では、PABA-PEG各当量について６当量のペプチドを用いた。ジアミノ安息香酸(DABA) -PEG（ヨードアセチル基４個；MW＝約4300g/モル）では、DABA-PEG各当量について12当量のペプチドを用いた。還元したペプチド溶液にPEG溶液を加え、暗所で少なくとも1時間反応させた。ペプチド複合体を調製用HPLCで精製した。プールおよび凍結乾燥を行う前に、15％トリシンゲルを用いる電気泳動により画分を確認した。
【０３０１】
【表９】
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【０３０２】
＜マウスリンパ節増殖アッセイ＞
雌のBalb/cマウス（６〜８週齢；Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine）を得て、La Jolla Pharmaceutical animal facilityで、国立衛生研究所のガイドラインに従って飼育した。食物および水は随意に与えた。Balb/cマウスを、完全フロイントアジュバント(CFA)（Sigma Chemical Co.、St.Louis、MO）に入れたメリチン50μgで、各後ろ足の裏に免疫処置した。7日後、膝窩リンパ節を無菌状態で採取した。50メッシュふるいスクリーンを通して細胞を細かくすることにより、リンパ節を穏やかに分離した。単細胞懸濁物を、グルタミン、ペニシリン、およびストレプトマイシンを含むRPMI-1640（Irvine Scientific、Irvine、CA）中で洗浄した。丸底96ウェルCorningマイクロタイトレーションプレートの４つ組のウェル中で、10％ウシ胎児血清を補充したRPMI培地において、5×105個の細胞を、10、1.0、または0.1μg/mLの、メリチンまたはメリチンペプチドで培養した。陽性コントロールウェルにおける細胞を、100または50 U/mLのマウスインターロイキン２(IL-2)、1μg/mLのPHA（フィトヘマグルチニン）で培養した。陰性コントロールウェルは、RPM-1640および10％FCS中にリンパ節細胞を有した。細胞を、5％CO2の37℃インキュベーター中で、4日間培養した。各ウェルを、1μCiの[3H]チミジン（ICN Biochemicals、Costa Mesa、CA）で、さらに18時間パルスした。半自動式細胞捕集器（Scatron、Sterling、VA）により、グラスファイバーフィルターマット上に、細胞を集めた。[3H]チミジンの取り込みを、液体シンチレーションにより測定した。結果は、1分間当りの平均カウントで表した。
【０３０３】
＜インビボプロトコル＞
Balb/cマウスを、CFA中のメリチン4μgを腹腔内に投与することにより、初回免疫した。１カ月後、潜在免疫寛容原または調合緩衝液を腹腔内投与した。3日後、全てのマウスに対して、不完全フロイントアジュバント(ICF)（Sigma Chemical Co.、St. Louis、MO）に入れたメリチン4μgの腹腔内注射を行った。10日後に、100〜200μLの血液を、後眼窩静脈叢から採集した。血清サンプルを、抗ペプチドまたは抗メリチンIgG抗体についてアッセイした。
【０３０４】
＜IgG抗メリチンまたは全抗メリチン抗体に対するアッセイ＞
個々のマウスの血清サンプルについて、連続して、抗メリチン抗体の存在についてELISAにより評価した。Falcon Probind 96ウェルマイクロタイトレーションプレートを、食塩加リン酸緩衝液(PBS)（pH7.2）に入れたメリチンまたはメリチンペプチド10μg/mLにより、４℃で一晩、予備被覆した。このプレートを、PBS、0.02％Tween-20、および１％ゼラチン（Norland Products Inc., New Brunswick、NJ）を含有する洗浄溶液で２回洗浄した。プレートを、５％ゼラチンを含有するPBS 200μLにより、37℃で１時間遮断した。血清サンプルを、５％ゼラチンを含有するPBSの希釈液として調製した。サンプルを、1:100から1:1000に希釈して試験した。37℃で１時間インキュベートした後、プレートを４回洗浄した。エキストラアビジンパーオキシダーゼ（Sigma Chemical Co.、St.Louis、MO）を、５％ゼラチンを含有するPBSで1:1000で希釈した。このプレートを、37℃で１時間インキュベートし、次いで５回洗浄した。ウェルをο-フェニレンジアミン(OPD)（Sigma Chemical Co.、St Louis、MO）により、暗所で15〜30分間展開させ、反応を3M HClで中断した。光学濃度(OD)を、マイクロプレートリーダー（Bio-tek Instrument、Winooski、VT）上で450nmで測定した。
【０３０５】
＜抗体産生細胞アッセイ＞
セルロースマイクロタイトレーションプレート（Millipore Co.、Bedford、MA）を、IgG抗体(ELISA)アッセイについて上記で示したように調製した。しかし、上記IgG抗体アッセイで血清サンプルをウェルに加える時点で、脾臓細胞（5×105/ウェル）を血清の代わりに加え、一晩インキュベートした。ELISAアッセイの残りの工程は、上記と同様にして行った。
【０３０６】
＜Ｔ細胞エピトープ＞
メリチンで感作したマウスから得たＴ細胞は、全メリチン分子およびC末端メリチンペプチド３、４、および５に応答して、Ｔ細胞増殖を示した（図８）。しかし、C末端ペプチド１および２は、顕著なＴ細胞増殖を誘導しなかった。メリチンペプチド２および５をPEGに複合体化した。メリチンペプチド２と同様に、メリチンペプチド２のPEG複合体もまた、顕著なＴ細胞増殖を誘導しなかった。
【０３０７】
＜メリチンで初回免疫しブーストしたマウスを免疫寛容にするメリチン複合体化ペプチドによる実験＞
上記の複合体（10mg/kg、200μg/マウス）で処理したマウスは、調合緩衝液で処理したコントロールBalb/cマウスに比較して、顕著に低いレベルの抗メリチンペプチド２抗体を有し（図９）、また低いレベルの抗メリチン抗体を有していた（図１０）。緩衝液コントロールまたは上記の複合体で処理したマウス由来の脾臓細胞を、抗メリチン抗体または抗メリチンペプチド２抗体を産生する抗体産生細胞の能力について、可溶性ELISAアッセイでの測定によりアッセイした。図１１に示すように、複合体で処理したグループにおける抗メリチンペプチド２抗体産生細胞のレベルは、調合緩衝液を投与したコントロールグループにおけるレベルよりも、顕著に低い値であった。複合体４（Ｔ細胞エピトープを含むペプチド５の複合体）で処理したマウスは、処理マウスにおいてペプチド５に対する抗体の力価を低下させなかった。従って、Ｔ細胞エピトープを含む複合体は、免疫寛容原ではない（図１２）。事実、応答を低下させるよりもむしろ、抗ペプチド抗体のレベルはわずかに上昇し得る。
【０３０８】
（実施例12：メリチンで初回免疫しブーストしたマウスを免疫寛容にするメリチンペプチド複合体によるさらなる実験）
雌のC57BL/6マウス（５〜８週齢）をThe Jackson Laboratory、Bar Harbor、MEから購入した。国立衛生研究所のガイドラインに従って、動物を維持し、取り扱った。
【０３０９】
＜免疫処置プロトコル＞
ミョウバン沈降メリチン5μgおよびアジュバントとして百日咳菌(B. pertussis)（Michigan Department of Public Health、Lansing、MI）2×109を、マウスに腹腔内注射した。このマウスに対し、PBSに入れたメリチン5μgを腹腔内投与してブーストした。
【０３１０】
＜pfcアッセイ＞
ヒツジ赤血球細胞(SRBC)（Colorado Serum Co.、Denver、Colorado）を、カルボジイミドを用いてメリチンペプチド２と複合体化した。新鮮SRBC（2週齢未満）を、冷生理食塩水で4回およびマンニトール（0.35M マンニトール、0.01M NaCl）で１回洗浄した。このSRBCを、10％(v/v)濃度となるようにマンニトール中に懸濁した。メリチンペプチド＃３ 30μgを含有するマンニトール 100μLを、10％SRBCの1mLアリコートに加え、次いでこれを氷中で10分間インキュベートした。次いで、1-エチル-3(3-ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミド HCl (EDCI)の100mg/mL溶液 100μLを加えて、氷中で30分間インキュベートした。SRBCを平衡塩類溶液(BSS)（Irvine Scientific Co., Irvine、CA）で２回洗浄し、10％(v/v)になるように再懸濁した。凍結乾燥ギニアピッグ補体（GIBCO、New York、NY）をBSSで再構成し、次いでBSSで1:3に希釈した。希釈ギニアピッグ補体 1mLを複合体化SRBC 3mLに加えた。ウサギ抗マウスIgGを加え、ウサギ抗血清の1:100の最終希釈液を得た。この濃度は、IgG pfcの最大数を増加させる一方、全てのIgG pfcを阻害するように予め決定した。この補体／抗マウスIgG／SRBC溶液と、１匹のマウスから採取したマウス脾臓細胞の細胞懸濁液とを、等量で混合した。混合物を各50μLずつ、カニンガムスライドのチャンバー（スライド当り３チャンバー）に移した。次いで、端をパラフィンで封じ、37℃で１時間インキュベートした。チャンバー当りのプラークの数を、解剖顕微鏡を用いて数えた。コントロールとして非複合体化SRBCを用いた、各脾臓懸濁液のアッセイを行った。生細胞の数を、各脾臓細胞懸濁液において測定した。脾臓細胞106個当りのpfcの数を各チャンバーについて測定し、３つ組の平均を算出した。非複合体化SRBCでのpfc数を複合体化SRBCでのpfc数から引いて、ペプチド特異性pfcの数を測定した。
【０３１１】
＜pfc測定のための最適時間の決定＞
マウスをメリチンで初回免疫した。感作マウスのグループ（グループ当りマウス３匹）を、２、４、６、および８日目にメリチンでブーストした。10日目に、マウスを殺し、それらの脾臓を採取した。細胞懸濁液を調製し、ペプチド特異性pfcの数の測定のためにアッセイした。pfcの最適数は、６日後メリチンブーストで得られた。
【０３１２】
＜PEG複合体でのペプチドの方向が免疫寛容を誘導する複合体の能力に影響しないこと＞
PEG複合体のペプチド方向が、免疫寛容を誘導する複合体の能力に影響するかどうかを決定するために、２つの異なる免疫寛容原を構成した。ペプチドを、そのC末端を通じて、結合手プラットフォーム分子３に共有結合させ、メリチン複合体３を生成した。メリチンで初回免疫したマウスのグループ（３／グループ）を、異なる複合体または生理食塩水で腹腔内処理した。５日後、未処理コントロールマウスを含めた全てのマウスを、メリチン5μgでブーストした。６日後、マウスを殺し、それらの脾臓を採取し、ペプチド特異性pfcの数を測定した。表１０に示すように、両方向共に、親タンパク質メリチンで初回免疫しブーストしたマウスにおいて、ペプチド特異性pfc／106脾臓細胞の数を減少させる効果があった。
【０３１３】
【表１０】
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【０３１４】
＜PEG複合体当りのペプチド数が免疫寛容を誘導する複合体の能力に影響すること＞
PEG分子に対してのペプチドの比率が重要であるかどうかを決定するために、３つの異なる複合体（PEG複合体当りのペプチド数がそれぞれ異なる）を構成した。複合体１は、PEG複合体当り２個のペプチドのみを有した。別の複合体は、PEG複合体当り４個のペプチドを有した（複合体２）。３番目の複合体は、PEG複合体当り８個のペプチドを有した（複合体５）。メリチンで初回免疫したマウスのグループ（３／グループ）を、複合体または生理食塩水で腹腔内処理した。５日後、未処理コントロールマウスを含めた全てのマウスを、メリチン5μgでブーストした。６日後、マウスを殺し、それらの脾臓を採取し、ペプチド特異性pfcの数を測定した。表１１に示すように、複合体１（PEG分子当り２個のペプチドを含む）は、親タンパク質メリチンで初回免疫しブーストしたマウスにおいて、ペプチド特異性pfc／106脾臓細胞の数を減少させるのに有効ではなかった。この結果は、メリチン複合体２および５は、ともに免疫寛容原として有効であったことをしめす。しかし、複合体５（８個のペプチドを含む）は、複合体２（結合手プラットフォーム分子当り４個のペプチドを含む）よりも少ない投与量で有効であった。
【０３１５】
【表１１】
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【０３１６】
以上に記載されたように、本発明は、化学的に定義された非ポリマー性の結合手プラットフォーム分子、ならびに、化学的に定義された非ポリマー性の結合手プラットフォーム分子および生物学的または化学的分子を含む複合体を提供する。生物学的分子としては、ヒト狼瘡の抗dsDNA自己抗体に対して著しい結合活性を有する、少なくとも20塩基対からなるポリヌクレオチド二本鎖が含まれる。
【０３１７】
ポリヌクレオチド化学、複合体化学、免疫学、および関連分野の当業者に明らかである、本発明の実施のための上記態様の改変は、添付した特許請求の範囲の範囲内にあることが意図される。
【０３１８】
【配列表】
【０３１９】
【配列番号：１】
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【０３２０】
【配列番号：２】
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【０３２１】
【配列番号：３】
0003836888.tif 000046
【０３２２】
【配列番号：４】
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【０３２３】
【配列番号：５】
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【０３２４】
【配列番号：６】
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【０３２５】
【配列番号：７】
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【０３２６】
【配列番号：８】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、PN-KLHで初回免疫し、図に示した投与量の[(PN)20-BAHA]-EDDA(複合体17-II)で処理し、PN-KLHのブースター注射を行い、そして5日後に採血したマウスの、抗-PN応答を示している。3つの希釈系列の血清を、10-8 Mで放射標識したPNを用いたFarrアッセイで試験し、そしてデータは抗-PN抗体の減少百分率で表した。1グループには、5匹のマウスを用いた。
【図２】図２は、PN-KLHで初回免疫し、図に示した投与量の[(PN)20-BAHA]-EDDA(複合体17-II)で処理し、PN-KLHのブースター注射を行い、そして5日後に採血したマウスの、抗-KLH応答を示している。抗-KLH抗体を、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)で調べた。結果を、抗血清の標準プールの百分率で表した。1グループには、5匹のマウスを用いた。
【図３】図３は、PN-KLHで初回免疫し、図に示した投与量の[(PN)16-BAHAOX]-EDDA(複合体11-IV)、[(PN)20-BAHAOX]-EDDA(複合体11-II)、[(PN)24-BAHAOX]-EDDA(複合体11-VI)、あるいは[(PN)32-BAHAOX]-EDDA(複合体11-VIII)の何れかで処理し、PN-KLHのブースター注射を行い、そして5日後に採血したマウスの、抗-PN応答を示している。血清を、10-8 Mで放射標識したPNを用いたFarrアッセイで試験した。1グループには、5匹のマウスを用いた。
【図４】図４は、PN-KLHで初回免疫し、図に示した投与量の(PN)20-HADp-AHAB-TEG(複合体20-II)で、あるいはHAD-AHABのみで、あるいはPNのみまたは各々の混合物で、処理し、次いでPN-KLHでブースターし、そして5日後に採血したマウスの、抗-PN応答を示している。血清を、10-8 Mで放射標識したPNを用いたFarrアッセイで試験した。減少率百分率を計算し、このデータを示した。1グループには、5匹のマウスを用いた。
【図５】図５は、PN-KLHで初回免疫し、図に示した投与量の(PN)20-HADpS-AHAB-TEG(複合体20-IV)で処理し、次いでPN-KLHでブースターし、そして5日後に採血したマウスの、抗-PN応答を示している。血清を、10-8 Mで放射標識したPNを用いたFarrアッセイで試験した。1グループには、5匹のマウスを用いた。
【図６】図６は、複合体3-I、3-II、11-I、11-II、11-IV、11-VI、11-VIII、17-I、17-II、20-I、20-II、20-III、および20-IVのための、誘導体化した結合手プラットフォーム分子、および、ポリヌクレオチドを該結合手プラットフォーム分子と結合するリンカーの構造を示している。
【図７】図７は、誘導体化した結合手プラットフォーム分子「HAD-AHAB-TEG」の構造を示している。
【図８】図８はメリチンペプチド類で誘起したT細胞増殖のレベルを比較している。
【図９】図９は、メリチンペプチド複合体で処理したマウスと、調合緩衝液で処理した対照マウス中とで産生された、抗-(メリチンペプチド2)抗体のレベルを比較している。
【図１０】図１０は、メリチンペプチド複合体で処理したマウスと、調合緩衝液で処理した対照マウス中とで産生された、抗-(メリチン)抗体のレベルを比較している。
【図１１】図１１は、メリチンペプチド複合体で処理したマウスと、調合緩衝液で処理した対照マウス中との、抗-(メリチンペプチド2)抗体-産生細胞のレベルを比較している。
【図１２】図１２は、T細胞エピトープを含むペプチド#5の複合体であるメリチンペプチド複合体4が、免疫寛容原ではないことを図示している。
【図１３】図１３は、本発明に含まれるメリチン複合体を図示している。
【図１４】図１４は、本発明の複合体(LJP-249AおよびLJP-249B(複合体3-II))で達成された、抗-dsPN抗体の減少百分率の増加と、D-EKおよびポリヌクレオチド(PN)50を含む従来技術の複合体(LJP-105)でのそれとの比較を図示している。
【図１５】図１５は、本発明の複合体LJP-394、複合体20-IIで処理した雄のBXSBマウスの循環血清中の抗-DNA IgG抗体の抑制を示している。ELISAアッセイで、D-EKに結合させた(PN)50に対するIgG抗体を測定した。各グループの各8個体のマウスからの血清を個々にアッセイした。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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