(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
a)超短光パルスより生成される白色連続スペクトル光パルスを分光器により分光し、
b)分光された各波長光中から、目的蛍光物質の蛍光回復用波長光と観測用多光子励起波長光のみを選択し、
c)上記蛍光回復用波長光と観測用多光子励起波長光に対して互いに異なる光路長を与えることにより両者の間に所定の時間差を与え、
d)上記蛍光回復用波長光と観測用多光子励起波長光を合波器で合成することにより両波長光が時間差をもって存在する回復・観測パルスを生成し、
e)上記回復・観測パルスを試料に照射する、
という工程を含むことを特徴とする多光子励起を用いた蛍光試料観測方法。
【請求項２】
複数の蛍光物質のそれぞれに対応する蛍光回復用波長光と観測用多光子励起波長光とを選択し、時間差を与え、合成して回復・観測パルスを生成することを特徴とする請求項１に記載の蛍光試料観測方法。
【請求項３】
各波長光を互いに異なる長さの光ファイバにそれぞれ通過させることにより異なる光路長を与えることを特徴とする請求項１又は２に記載の蛍光試料観測方法。
【請求項４】
a)超短光パルスより生成される白色連続スペクトル光パルスを分光する分光器と、
b)分光された各波長光中から、目的蛍光物質の蛍光回復用波長光と観測用多光子励起波長光のみを選択する波長選択手段と、
c)上記蛍光回復用波長光と観測用多光子励起波長光に対して互いに異なる光路長を与えることにより両者の間に所定の時間差を与える時間差付与手段と、
d)上記蛍光回復用波長光と観測用多光子励起波長光を合波器で合成することにより両波長光が時間差をもって存在する回復・観測パルスを生成する合波手段と、
e)上記回復・観測パルスを試料に照射する照射手段と、
を備えることを特徴とする多光子励起を用いた蛍光試料観測装置。
【請求項５】
更に、f)上記超短光パルスを繰り返し生成する光源と、
g)上記観測励起パルスにより試料から発する蛍光を検出する蛍光検出手段と、
h)蛍光検出手段の前に設けられ、上記超短光パルスに同期して開閉する電子シャッタと、
を備えることを特徴とする請求項４に記載の蛍光試料観測装置。
【請求項６】
更に、i)上記回復・観測パルスを試料の目的点に集光する集光手段と、
j)上記目的点を試料内で走査する走査手段と、
を備えることを特徴とする請求項４又は５に記載の蛍光試料観測装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、試料に多光子励起光を照射して試料中の蛍光物質を励起し、その蛍光により試料を観測する、蛍光顕微鏡等の蛍光試料観測装置に関する。なお、本明細書では、「多光子」は２光子を（もちろん、３光子以上も）含んだ意味で用いる。
【０００２】
【従来の技術】
タンパク質等の生体中の物質の多くは蛍光物質であるため、生体内物質の動きや作用を観測するために蛍光顕微鏡が用いられている。特に、生細胞組織の時間の経過による変化を追うことは、近年の生化学等の研究上、重要であるため、従来、共焦点顕微鏡や多光子吸収過程を利用した多光子顕微鏡が開発されている。これらの顕微鏡の問題点として、励起レーザ光による蛍光物質の退色があり、同一の試料を継続して観測することのできる時間が制限されていた。
【０００３】
一方、生体内の複雑な現象を解明するためには、複数の物質を同時に且つ継続的に観測する必要がある。同時に複数の蛍光物質を区別して観測しようとする場合、各蛍光物質毎の励起光を試料に照射する必要があるが、この点に関しては、本件出願人は、超短光パルスを用いた分析装置を開発し、特許出願を行っている（特願2001-372570）。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
一部の蛍光物質では、一度退色した蛍光物質に回復パルスを与えることによって蛍光特性が回復することが知られている（Robert M. Dickson, et al."On/off blinking and switching behaviour of single molecules of green fluorescent protein", NATURE, vol.388, 355-358, 1997）従って、観測しながら、回復パルスを送って蛍光を回復させることにより、従来望まれていた観測時間の長時間化を達成することができる。
【０００５】
複数の蛍光物質を継続して観測する場合、励起パルスはもちろん、回復パルスについても各蛍光物質に合わせた波長の光をそれぞれ与えなければならない。
【０００６】
また、回復パルスと観測励起パルスは同期する必要があるが、一般に、観測に用いる励起パルスの繰り返し周波数は50〜100MHzと高速であるため、両者の調整が難しいという問題がある。
【０００７】
本発明はこのような課題を解決するために成されたものであり、その目的とするところは回復パルスと観測励起パルスを同期して試料に与えることにより、試料を継続して観測することのできる蛍光観測装置を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するために成された本発明に係る蛍光試料観測方法は、
a)超短光パルスより生成される白色連続スペクトル光パルスを分光器により分光し、
b)分光された各波長光中から、目的蛍光物質の蛍光回復用波長光と観測用多光子励起波長光のみを選択し、
c)上記蛍光回復用波長光と観測用多光子励起波長光に対して互いに異なる光路長を与えることにより両者の間に所定の時間差を与え、
d)上記蛍光回復用波長光と観測用多光子励起波長光を合波器で合成することにより両波長光が時間差をもって存在する回復・観測パルスを生成し、
e)上記回復・観測パルスを試料に照射する、
という工程を含むことを特徴とする。
【０００９】
また、上記方法を実施した本発明に係る蛍光試料観測装置は、
a)超短光パルスより生成される白色連続スペクトル光パルスを分光する分光器と、
b)分光された各波長光中から、目的蛍光物質の蛍光回復用波長光と観測用多光子励起波長光のみを選択する波長選択手段と、
c)上記蛍光回復用波長光と観測用多光子励起波長光に対して互いに異なる光路長を与えることにより両者の間に所定の時間差を与える時間差付与手段と、
d)上記蛍光回復用波長光と観測用多光子励起波長光を合波器で合成することにより両波長光が時間差をもって存在する回復・観測パルスを生成する合波手段と、
e)上記回復・観測パルスを試料に照射する照射手段と、
を備えることを特徴とする。
【００１０】
【発明の実施の形態及び発明の効果】
超短光パルスは、継続時間がフェムト秒（10-15秒）オーダーの非常に短いパルスである。超短光パルス光源は、通常、数十MHzの周期で超短光パルスを生成し、アンプ付超短光パルス光源は数kHz程度の周期で増強された超短光パルスを生成する。
【００１１】
超短光パルスを空間的にも収束して物質（水、水晶等）に照射すると、その点におけるエネルギ密度は非常に高いものとなり、超短光パルスとその物質との間で線形及び非線形相互作用が生じる。その結果、各種の現象が生じるが、その一つに白色連続スペクトル光の発生がある。この白色連続スペクトル光は、原パルスと同様の超短パルスでありながら白色連続スペクトルを有する。
【００１２】
こうして生成された白色連続スペクトル光パルスを分光器により分光し、分光された各波長の中から、目的とする蛍光物質の多光子（前記の通り、２光子を含む）励起光の波長と、その蛍光物質の回復光の波長のみを選択する。
【００１３】
次に、選択した蛍光回復用波長光と観測用多光子励起波長光に対して互いに異なる光路長を与えることにより、両者の間に時間差を与える。異なる光路長を与える方法としては、反射鏡を置く位置を別異にしたり、長さの異なる光ファイバを通過させる等の方法をとることができる。こうして時間差を与えた蛍光回復用波長光と観測用多光子励起波長光を合波器で合成することにより、両波長光が時間差をもって存在する回復・観測パルスを生成する。これを試料に照射することにより、試料中に存在する目的蛍光物質が観測用パルスにより多光子励起され、蛍光を発して、それが観測される。また、蛍光回復用パルスによりその蛍光能が回復し、継続的な観測が可能となる。
【００１４】
上記の方法において、分光の際に複数の蛍光物質に対する観測用パルス及び回復用パルスを選択し、時間差を与えた後、合成することにより、試料中の複数の蛍光物質を同時に観測することができるようになる。これにより、生体に含まれる複数の生体物質（タンパク質等）の動き、作用等を同時に且つ独立に観測することができるようになる。
【００１５】
上記の蛍光試料観測装置において、更に、
f)上記超短光パルスを繰り返し生成する光源と、
g)上記観測用多光子励起波長光により試料から発する蛍光を検出する蛍光検出手段と、
h)蛍光検出手段の前に設けられ、上記超短光パルスに同期して開閉する電子シャッタと、
を設けることができる。
【００１６】
電子シャッタを超短光パルスに同期させることにより、蛍光回復用パルスにより試料から発生する蛍光を除去し、目的とする観測用多光子励起パルスからの蛍光のみを検出することができるようになる。すなわち、ノイズに影響されない高感度の観測を行うことができるようになる。
【００１７】
本発明に係る蛍光試料観測装置では更に、
i)上記回復・観測パルスを試料の目的点に集光する集光手段と、
j)上記目的点を試料内で走査する走査手段と、
を設けることもできる。
【００１８】
これにより、試料を２次元的又は３次元的に走査して観測することができ、目的蛍光物質の分布や動きを観測することができるようになる。なお、試料内の走査のためには、回復・観測パルスの集光点を移動させてもよいし、試料を移動させてもよい（或いはその双方でもよい）のはもちろんである。
【００１９】
【実施例】
本発明の一実施例である超短パルス蛍光顕微鏡の概略構成を図１に示す。まず、パルス光源１１の内部構成及びそのパルス生成作用を図３により詳しく説明する。パルス光源１１内の超短光パルス光源２１が数十MHzの周波数で超短光パルスを生成する。超短光パルス光源２１にはErドープ・ファイバレーザ、モードロックTi:サファイアレーザあるいはモードロックCr:フォルステライトレーザ（特開平11-284260）等を用いることができる。なお、光強度増幅アンプを使用する場合には、超短光パルスの生成周波数は数kHz程度となる。
【００２０】
超短光パルス光源２１で生成された超短光パルスは、第１光学系２２により水、水晶、フォトニック・クリスタル・ファイバ、テーパーファイバ等の適宜の透明物質２３中の１点に集光される。この集光点において、物質２３と超短光パルスとの非線形相互作用により白色連続スペクトル光パルスが生成される。生成された白色連続スペクトル光パルスは第２光学系２４（レンズ、反射鏡等を含む）により分光器２５に照射され、そこで分光される。分光された光はコリメート光学系２６により波長選択・遅延導入装置２７に送られる。図３は、小反射鏡を目的波長箇所に配置するとともに、それらを光路方向に異なる位置に置くことにより各分光の光路長を変えるという方法で波長選択及びパルス間遅延を導入する方法を示している。図４に示すように、異なる長さの光ファイバ２８を用いてパルス間の遅延を導入するようにしてもよい。
【００２１】
波長選択及び遅延導入されたパルスは合波器２９で合成され、パルス光源１１の外部に取り出される。なお、合波器２９は図３に示すように分光器２５と共用してもよいし、図４に示すように分光器２５とは別異のものを用いてもよい。
【００２２】
パルス光源１１で生成されたパルス列を模式的に図２に示す。１個の超短光パルスから、波長選択・遅延導入装置２７で目的蛍光物質の回復用波長と観測用多光子励起波長を選択し、それらの間に遅延を設けることにより、図２に示すように１組のパルス列２０が生成される。図２は、２個の蛍光物質の回復用パルスと観測用パルスを含む例を示している。パルス光源１１ではこのようなパルス列２０が数kHz〜数十MHzの周波数で生成され、スキャナ１２に送られる。
【００２３】
図１に戻り、スキャナ１２はパルス光源１１からの同期信号を受け、パルス列をx方向及びy方向に走査して試料１５（又はサンプルセル）を２次元的に走査する。パルス列はハーフミラー１３を透過し、対物レンズ１４により試料１５内の集光点に集光される。対物レンズ１４は図示せぬ駆動機構により上下（z方向）に移動可能となっており、試料１５内を３次元的に走査できるようになっている。なお、対物レンズ１４ではなく、試料１５の方を移動するようにしてもよい。
【００２４】
試料１５の集光点では、目的の蛍光物質が観測用パルスにより多光子励起され、その物質に特有の波長の蛍光を発する。多光子励起過程は光強度の乗数倍の確率で発生するため、励起は対物レンズ１４の焦点近傍でのみ生じ、蛍光もその近傍の目的蛍光物質のみから発生する。試料１５から発せられた蛍光は対物レンズ１４により集光され、前記ハーフミラー１３で反射されて画像観測システム１７に送られる。例えば、目的蛍光物質の励起に２光子励起を用いる場合、パルス光源１１から試料１５に向かう光の波長は目的蛍光物質の励起波長の倍である。従って、ハーフミラー１３には、目的蛍光物質の励起波長（例えば400nm）の倍の波長（800nm)を通過し、その蛍光波長（例えば600nm）を反射するような光学フィルタを使用することができる。
【００２５】
画像観測システムでは、各蛍光波長をフィルタ等で分光し、各波長毎に設けたCCD撮像素子で試料の蛍光イメージを撮影する。これにより、試料１５中の複数の蛍光物質の動きを連続的に観測することができる。
【００２６】
こうして蛍光観測を継続していると蛍光物質が退色してゆくが、本実施例の蛍光顕微鏡では、パルス列２０に回復用パルスが含まれているため、これにより蛍光観測を長時間続けることができる。なお、回復用パルスによる蛍光が画像観測システム１７に入らないようにするため、画像観測システム１７の前に電子シャッタ１６を置き、パルス光源１１からの同期信号により、回復用パルスによる蛍光を遮断する。
【００２７】
なお、やや効率は低下するが、回復用パルスと観測用パルスを同一波長とすることもできる。これにより、パルス光源１１の構成を単純化することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  本発明の一実施例である蛍光顕微鏡の構成図。
【図２】  実施例の蛍光顕微鏡で使用するパルス列の模式図。
【図３】  パルス光源の概略構成図。
【図４】  遅延導入手段の別の例の概略構成図。
【符号の説明】
１１…パルス光源
１２…スキャナ
１３…ハーフミラー
１４…対物レンズ
１５…試料
１６…電子シャッタ
１７…画像観測システム
２０…回復・観測パルス列
２１…超短光パルス光源
２２…第１光学系
２３…白色光生成物質
２４…第２光学系
２５…分光器
２６…コリメート光学系
２７…波長選択・遅延導入装置
２８…同上（光ファイバ）
２９…合波器
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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