(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＥＧＦレセプターに結合し、ＥＧＦの該レセプターへの結合を阻害する能力を有し、軽鎖及び重鎖の各々は、ヒトに由来しない特異的抗原結合領域（ＣＤＲ）、ヒト由来の可変骨格領域（ＦＲ）及びヒト由来の定常領域からなり、
前記軽鎖のＣＤＲ領域は以下のアミノ酸配列：
0003854306.tif 000022
を含み、
前記重鎖のＣＤＲ領域は以下のアミノ酸配列：
0003854306.tif 000023
を含み、
前記軽鎖のＦＲ領域は以下のアミノ酸配列：
0003854306.tif 000024
を含み、
前記重鎖のＦＲ領域は以下のアミノ酸配列：
0003854306.tif 000025
を含み、
Ｘａａ1はＴｙｒまたはＰｈｅ、Ｘａａ2はＴｈｒまたはＳｅｒ、Ｘａａ3はＩｌｅまたはＶａｌ、Ｘａａ4はＬｙｓまたはＡｒｇ、Ｘａａ5はＡｌａまたはＶａｌである
ヒト化モノクローナル抗体。
【請求項２】
Ｘａａ1はＴｙｒ、Ｘａａ2はＴｈｒ、Ｘａａ3はＩｌｅ、Ｘａａ4はＬｙｓ、Ｘａａ5はＡｌａである請求項１に記載のヒト化モノクローナル抗体。
【請求項３】
前記軽鎖の定常領域が、ヒトイムノグロブリンのκ鎖のアミノ酸配列を含む請求項１または２に記載のヒト化モノクローナル抗体。
【請求項４】
前記重鎖の定常領域がヒトイムノグロブリンのγ−１鎖のアミノ酸配列を含む請求項１〜３のいずれかに記載のヒト化モノクローナル抗体。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載のヒト化モノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖の少なくとも一方の可変及び定常領域をコードするＤＮＡ配列を有する発現ベクター。
【請求項６】
ヒトＥＧＦレセプターに結合し、ＥＧＦの該レセプターへの結合を阻害する能力を有する抗体の軽鎖の可変及び定常領域をコードするＤＮＡ配列を有する発現ベクターであって、
寄託番号：ＤＳＭ６３４０でＤＭＳ（ドイツチェ  ザムルング  フォン  ミクロオーガニスメン；Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ）に寄託されているｐＲＶＬ４２５である発現ベクター。
【請求項７】
ヒトＥＧＦレセプターに結合し、ＥＧＦの該レセプターの結合を阻害する能力を有する抗体の重鎖の可変及び定常領域をコードするＤＮＡ配列を有する発現ベクターであって、
登録番号：ＤＳＭ６３３９でＤＭＳ（ドイツチェ  ザムルング  フォン  ミクロオーガニスメン；Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ）に寄託されているｐＲＶＨ４２５である発現ベクター。
【請求項８】
請求項５〜７のいずれかに記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項９】
ヒトＥＧＦレセプターに結合し、ＥＧＦの該レセプターへの結合を阻害する能力を有するヒト化モノクローナル抗体の調製方法であって、
宿主細胞を形質転換して、請求項１〜４のいずれかに記載のヒト化モノクローナル抗体を発現する形質転換された細胞宿主を得る工程と、
培養媒体中で該形質転換細胞を培養する工程と、
発現した抗体タンパク質を精製、単離する工程と、
を有し、
前記宿主細胞の形質転換が、
（ａ）前記ヒト化モノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖の両方の、可変領域及び定常領域をコードするＤＮＡ配列を含む発現ベクター、または
（ｂ）前記ヒト化モノクローナル抗体の重鎖の可変領域及び定常領域をコードするＤＮＡ配列を含む発現ベクターと、前記ヒト化モノクローナル抗体の軽鎖の可変領域及び定常領域をコードするＤＮＡ配列を含む発現ベクターの両方、
により行われるヒト化モノクローナル抗体の調製方法。
【請求項１０】
前記宿主細胞の形質転換が、請求項６及び７に記載の発現ベクターを一緒に用いることにより行われる請求項９に記載のヒト化モノクローナル抗体の調製方法。
【請求項１１】
請求項１〜４のいずれかに記載のヒト化モノクローナル抗体を有効成分として含有し、腫瘍処置用である医薬組成物。
【請求項１２】
請求項１〜４のいずれかに記載のヒト化モノクローナル抗体を用いた、腫瘍に対する医薬品の製造方法。
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は、新規のヒト化（humanized）モノクローナル抗体に関し、これは、ヒト免疫グロブリンのＨ鎖の可変領域中のＦＲに少なくとも人工的に修飾した共通配列を含む。
さらに、本発明は、表皮細胞増殖因子（epidermal growth factor）のエピトープに結合しているヒト化およびキメラモノクローナル抗体に関する。本発明は、このレセプターの応答のための抗原結合部位のアミノ酸配列を開示する。
本発明は、黒色腫、神経膠腫または癌腫のような腫瘍の処置の目的のための上記抗体を含む薬剤組成物に関する。これらの抗体はまた、インビトロまたはインビボにおける前記腫瘍の探索および判断のための診断的な適用にも用いることができる。
本明細書には、次に定義するようないくつかの技術用語が用いられる。
「ヒト化（humanized）」抗体は、ヒト由来のＬおよびＨ鎖に位置するアミノ酸の可変領域のＦＲおよびアミノ酸の定常領域を有し、超可変領域がヒト以外に由来する抗体を意味する。
「キメラ」抗体は、ヒト以外に由来する可変および超可変領域を有し、定常領域がヒト由来である抗体を意味する。
「ＦＲ」は抗体の骨格領域を意味し、可変領域内に見出だされる。この領域において、各抗体間でアミノ酸の変化が生じる。
「ＣＤＲ」は抗体の相補性決定領域あるいは「超可変」領域を意味し、可変領域内に見出だされる。この領域は特異的抗原結合部位を代表し、この部分が各抗体間でのアミノ酸の無限の変化を示す。ＣＤＲは抗原の結合親和性において重要な役割をしている。
「共通配列（consensus sequence）」は、ＬおよびＨ鎖の可変領域としての自然には生じないアミノ酸配列を意味し、自然に存在しているヒト由来ではないＨまたはＬ鎖可変領域の代わりとして用いられる。共通配列は合成物であって、したがって、明確とされているクラスもしくはサブクラス、またはサブグループのヒト免疫グロブリンのＨ鎖またはＬ鎖のそれぞれに最も共通したアミノ酸の人工配列である。
「ＥＧＦ」はおよび「ＥＧＦＲ」は、それぞれ表皮細胞増殖因子およびそのレセプターを意味する。
「ＶL」領域は、Ｌ鎖可変領域を意味する。
「ＶH」領域は、Ｈ鎖可変領域を意味する。
発明の背景
ネズミのモノクローナル抗体４２５（ＭＡｂ４２５）をヒトＡ４３１癌腫細胞株に対して生起させ、それがヒト表皮細胞増殖因子レセプター（ＥＧＦＲ）の外側ドメイン上のポリペプチドエピトープに結合することが見出だされた。またそれがＥＧＦＲの低および高親和性部位の両方における表皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）の結合を阻害することが見出だされた（Murthyら、１９８７）。ＥＧＦＲの増強された発現が種々の由来の悪性腫瘍の組織上で起きることが見出だされたことから、ＭＡｂ４２５のヒト腫瘍の診断および治療の試薬としての可能性が考えられるようになった。実際、ＭＡｂ４２５が腫瘍細胞毒性をインビトロで媒介することおよび類表皮腫および結腸直腸癌腫由来の細胞株の腫瘍細胞増殖をインビトロで抑制することが見出だされた（Rodeckら、１９８７）。また、放射性標識されたＭＡｂ４２５がヒト悪性神経膠腫の異種移植片に結合することもマウスにおいて示された（Takahashiら、１９８７）。
ＥＧＦは、表皮および上皮細胞の分裂促進を行うポリペプチドホルモンである。ＥＧＦが感受性細胞と相互反応するときは、これは膜にあるレセプターと結合する。レセプターＥＧＦ複合体はクラスターを形成し、次いで、エンドサイトーシスにより小胞内に取り込まれる。これは「ダウンレギュレーション（down-regulation）」現象の原因となる。ＥＧＦの結合はレセプター分子のチロシンキナーゼ活性を誘導して、ＤＮＡ合成を誘導する。
ＥＧＦレセプターは、約１７０、０００ダルトンの膜内糖タンパク質である（Cohen、１９８２）。これはｃ−ｅｒｂ−Ｂプロトオンコジーン（癌原遺伝子）の遺伝子産物である（Downwardら、Narure、Vol．307、521-527、1984）。このレセプターは、いわゆる低親和性および高親和性レセプターの二つの運動型で存在する。
Ａ４３１癌腫細胞株は、多数のＥＧＦレセプターをその細胞表面に発現し、したがって、多くの研究で抗−ＥＧＦレセプター抗体を産生させるために用いられてきた。しかし、Ａ４３１上のレセプターは、ポリペプチドに付いている炭水化物部分が他の細胞型のものと異なっている。このように、Ａ４３１の膜に対して生じる各種抗体は、全ての型のレセプター分子に共通ではない炭水化物に対応したものになる（例えば、Schreiber、１９８３）。
別のモノクローナル抗体はＥＧＦレセプターのタンパク質部分と反応する。これら抗体はＥＧＦレセプターへの結合において多様な性質を示し、それは、おそらく、結合したレセプター分子の個々の部分、および抗体のアイソタイプに依存していると思われる。いくつかの抗体はＥＧＦに似た効果を示し（angonist、作動物質）、いくつかの抗体はこの効果を阻害する（antagonist、拮抗物質）。
ＥＧＦレセプターの発現は腫瘍増殖の進行と関係づけられてきた。レセプターの遺伝子はトリウイルスオンコジーンｖ−ｅｒｂ−Ｂの細胞アナログであることが見出だされた（Ulrich、１９８４）。加えて、黒色腫形成の後期とレセプター遺伝子を有するクロモゾームの余分のコピーとの間の関連が検出された（Koprowskiら、Somatic Cell and Molecular Genetics、Vol．11、297-302、1985）。
ＥＧＦレセプターは、それが広範な種類の固形腫瘍上で発現されることから、抗腫瘍療法のための適切な標的を提供する。しかし、この分野においては、適切な抗−レセプター抗体が必要となる。既知の抗体の多くは、抗腫瘍剤として用いた場合に有害となり得る性質を有する。例えば、ＥＧＦの効果を模倣する抗体は、腫瘍の進行を阻止せずにむしろ促進することが考えられる。ＥＧＦはその効果を非結合レセプターを介しても発揮することから、高または低親和性レセプターとのみ結合する他の抗体は、決して最適な効果を与えるものとはいえない。さらに他の抗体は低親和性レセプターを高親和性レセプターに変換し、これによって腫瘍の増殖を阻止しないでむしろ悪化させることが考えられる。このように、この分野において、抗腫瘍療法に好適な抗−ＥＧＦレセプター抗体が必要とされている。
ネズミＭＡｂｓはヒトにおける治療のために使用されてきたが、免疫応答を引き起こす（Giorgiら、１９８３：Jaffersら、１９８６）。この問題を解決するために、いくつかのグループがネズミ抗体を「ヒト化」することを試みた。これらには二つのアプローチの一つを用いることができる。一つの方法では、ＬおよびＨ鎖両方のネズミ定常領域ドメインをヒト定常領域と置き換えることができる。そのような「キメラ」ネズミ−ヒト抗体が、ヒト腫瘍関連抗原に対するいくつかのネズミ抗体から首尾よく構築された（Sunら、１９８７：Whittleら、１９８７：Liuら、１９８７：GilliesおよびWesolowski、１９９０）。このアプローチではネズミ抗体の抗原結合部位が完全に保たれ、したがって、抗原親和性も保持され、その一方で、ヒトアイソタイプおよびヒトエフェクター機能が付与される。第二のアプローチは、マウス可変領域からの相補性決定領域（ＣＤＲ）のみをＬおよびＨ鎖可変ドメイン（ＶLおよびＶH）両方のヒト骨格領域（ＦＲ）とともに融合させる。これは、この手法によってヒト抗体への抗原結合部位の決定的な主要部分が移されるであろうという理由に基づいている（Jonesら、１９８６）。
ＣＤＲの融合はいくつかの齧歯類モノクローナルに関して行われた（Jonesら、１９８６：Reichmannら、１９８８：Verhoeyenら、１９８８：Queenら、１９８９：Coら、１９９１：Gormanら、１９９１：Maedaら、１９９１：Temptestら、１９９１）。親和性は通常低減したが、全ての場合に抗原との結合能は保持された。ほとんどの場合、ヒト骨格残基（ＦＲ）のあるいくつかのアミノ酸を変えることが必要であるとみなされた。キメラ抗体およびＣＤＲ融合抗体の両方とも、マウス抗体よりも優れていることが臨床的に証明された（Haleら、１９８８：LoBuglioら、１９８９：Mathiesonら、１９９０）。しかし、どのアミノ酸を改変すべきかという一般的な知見は得られておらず、いずれの場合にも完璧な予測は不可能である。
EP 088 994は、予め決定されたリガンドに特異的な免疫グロブリンのＬまたはＨ鎖の可変ドメインをコードするＤＮＡ配列を有する組換えＤＮＡベクターの構築を提言している。この適用は可変ドメインの改変を意図するものではない。
EP 102 634には、ヒトＩｇＧのＨ鎖ポリペプチドの全部または一部分をコードする遺伝子の細菌宿主におけるクローニングおよび発現が記載されているが、これはポリペプチドの配列の改変を意図するものではない。
EP 239 400は、ヒト抗体の抗原結合部位（超可変領域）を、遺伝子工学的方法によって、ヒト以外の、例えばマウスまたはラットの抗体の抗原結合部位で置き換えることによって、ヒト化抗体を得ることができると提言している。
したがって、この知見から、今までのヒト由来の抗体中からは得ることのできなかった特異的抗原結合部位を有するヒトのあるいはヒト化抗体を製造することができる。
キメラ抗体は、ＣＤＲのみならず、ＬおよびＨ鎖の全可変領域を置き換えることによって得られる。ところが、キメラ抗体はなお免疫原性を保持したままである。しかしながら、キメラ抗体は診断への利用や、ヒト化抗体の最適化の操作にきわめて有用である。
抗原結合部位の親和性は、直接にはＣＤＲの部分ではない可変領域中のいくつかの単一アミノ酸の選択的交換によって影響され得ることが示された（Reichmannら、１９８８）。
EP 239 400の方法での最悪の結果においては、抗原結合での親和性は完全に消失することもある。本発明者らは、この事実を、ＥＧＦレセプターのエピトープに向けられたヒト化抗体を構築できなかったことにより示すことができた。
したがって、上述のようなヒト化が成功するかどうかは、使用する可変領域の組成及び構造や、その可変領域と抗原結合部位との相互反応に依存することを考慮しなければならない。すなわち、抗体に抗原との結合能を得るために、あるいは抗原結合能を改善するために、抗体の可変ドメイン中に修飾が必要であるかどうか、あるいはどのような修飾が必要であるかについて完全に予知することは不可能である。
発明の概要
したがって、本発明の目的はヒト化モノクローナル抗体を提供することであり、この抗体は、とくに、ＥＧＦレセプターに対するもので、ヒト由来ではない抗原結合部位およびヒト由来の可変領域のＦＲおよび定常領域を含み、これらは、必要であれば、結合部位の特異性が保存あるいは修復されるように修飾される。
とくに、本発明の目的は、ＥＧＦレセプターに対する抗体の抗原結合部位の超可変領域の特徴づけを行うこと、および上記定義のヒト化モノクローナル抗体内にＣＤＲを提供することである。
この抗体およびそのキメラ型誘導体は、黒色腫、神経膠腫または癌腫などの腫瘍の撲滅のための治療または診断剤として重要な役割を果たすことができる。
効果的で特異的なヒト化モノクローナル抗体は、ヒト免疫グロブリンの少なくともＨ鎖可変領域の共通配列を用いることによって容易に得られることが見出だされた。とくに、これら共通配列の全てが適切であり、その元となったヒト由来でない抗体の可変領域と比較して良好な（少なくとも６０〜７０％、とくに６５〜７０％の）同一性を有する。
さらに、天然に生じるヒト抗体の可変領域を用いてより大幅な修飾を行わねばならないこともあるが、これら共通配列に対する修飾は小範囲に限らなければならないことが見出だされた。良好な特異的な抗原の結合を得るために、本発明によれば、多くの場合、アミノ酸配列の修飾は全くしなくてもよいか、あるいは小数個の修飾ですむ。すなわち、本発明によれば、ＥＧＦレセプターの好ましいヒト化抗体への完全な結合を達成するためには、小数個のアミノ酸のみを置換すればよい。これに対して、EP 239 400の教示に従ってもいかなる結合も得ることはできない。本発明によって必要とされる修飾は、０〜１０％、好ましくは１〜５％の範囲のアミノ酸の交換で示すことができる。
本発明によるヒト化モノクローナル抗体は、次のような特長を有する。
明かとされているクラス、サブクラスまたはサブグループのヒト免疫グロブリン鎖間で違いのある位置に、その位置にもっとも共通に出現するアミノ酸を用いた配列である共通配列の合成は、全体として、あるいは部分的に問題なく行うことができ、個々の抗体あるいは抗体断片に関する詳細な知識あるいはその入手の可能性がどうであるかに左右されることがない。これは、極めて限定された数の共通配列（これは発現ベクターにクローニングされる）を提供することで、広範囲の個々におよび天然に生じている抗体断片がカバーされ得ることを意味する。時に他の抗体（例えば抗−イディオタイプ抗体）のエピトープとなることが知られている個々の天然配列と比較して、共通配列は免疫原性に関してより好ましいものであり得る。
好ましい具体例を一つだけあげたが、本発明によって一般的な原理が教示されている。共通配列に関してここに記述された教示によるＥＧＦレセプターに対するヒト化抗体の構築の成功は、可変および超可変ドメインにおける多数の可能な配列および配列の組み合わせに関しての単なる偶然によるものではない。
さらに、可変ドメインのＨ鎖はそれに対応するＬ鎖よりも、抗原結合部位により大きく貢献することが見出だされた。したがって、共通配列を有するヒト化抗体のＬ鎖を同様にして修飾する必要は必ずしもない。いくつかの既知の天然抗体中のＬ鎖はそれに対応するＨ鎖よりもより重要な役割を果たしていることが知られていることから、これは興味深いことである（Williamsら、１９９０を参照されたい）。
最後に、何にもまして、本発明は、ＥＧＦレセプター（ＭＡｂ４２５）に対するネズミ抗体の抗原結合部位の遺伝子工学による特徴づけ、クローニングおよび増幅を最初に提供するものである。この抗原結合部位をコードするオリゴヌクレオチドや、ヒト化およびキメラモノクローナル抗体の全可変ドメインをコードするオリゴヌクレオチドを合成することが可能である。さらに、本発明は、適当な真核細胞の形質転換のために使用できる効果的な発現ベクターを提供する。
このように、本発明は、ヒト由来ではない抗原結合部位（ＣＤＲ）と、ヒト由来のＬおよびＨ鎖の可変領域のＦＲおよび定常領域を有するヒト化モノクローナル抗体に関し、少なくともＨ鎖の可変領域のＦＲがヒト免疫グロブリンの明確にされているクラスまたはサブグループの可変領域からの共通配列を更に修飾して得た誘導（変異）配列を有することを特徴とする。
とくに、本発明は、共通配列からなるＦＲが抗原結合部位の起源となったヒト由来でない抗体の可変領域のＦＲのアミノ酸配列と比較して少なくとも７０％の相同性を有することを特徴とする、ヒト化モノクローナル抗体に関する。
とくに、本発明は、次のような性質を有する、ヒト化モノクローナル抗体に関する。
（ａ）ヒトＥＧＦレセプターに結合する。
（ｂ）ＥＧＦのＥＧＦレセプターへの結合を阻害する。
（ｃ）ＥＧＦレセプターのＥＧＦ依存性チロシンキナーゼ活性を阻害する。
（ｄ）ＥＧＦ感受性細胞の増殖を阻害する。
とくに、本発明は、抗原結合部位の超可変領域が次のアミノ酸配列を有する、ヒト化モノクローナル抗体に関する。
Ｌ鎖
0003854306.tif 000002
Ｈ鎖
0003854306.tif 000003
とくに、本発明は、抗原結合部位に関連していない可変領域のＦＲが次のアミノ酸配列を有するヒト化モノクローナル抗体に関する。ただし、括弧で示された部分は括弧内のアミノ酸により置換されてもよいものである。
Ｌ鎖
0003854306.tif 000004
Ｈ鎖
0003854306.tif 000005
とくに、本発明は、Ｈ鎖の定常領域がヒト免疫グロブリンのγ−１鎖のアミノ酸配列を含み、Ｌ鎖の定常領域がヒト免疫グロブリンのκ鎖のアミノ酸配列を含む、ヒト化モノクローナル抗体に関する。
とくに、本発明は、可変および定常領域内におけるアミノ酸の欠失、置換、追加または転位による修飾により得られた誘導（変異）アミノ酸配列を含み、かつ抗原への特異的結合の生物学的機能が保持された、ヒト化モノクローナル抗体に関する。
さらに、本発明は、ヒト化抗体のＬおよび／またはＨ鎖の可変および／または定常領域をコードするＤＮＡ配列を有することを特徴とする、宿主細胞の形質転換に適する発現ベクターに関する。
さらに、本発明は、ネズミ由来の抗原結合部位の超可変領域（ＣＤＲ）およびヒトまたはネズミ由来の可変領域のＦＲおよびヒト由来のＬおよびＨ鎖の定常領域を有し、超可変領域が以下に示すアミノ酸配列有することを特徴とし、かつＨ鎖の定常領域がヒト免疫グロブリンのγ−１鎖のアミノ酸配列からなり、Ｌ鎖の定常領域がヒト免疫グロブリンのκ鎖のアミノ酸配列有する、ヒト化またはキメラモノクローナル抗体に関する。
Ｌ鎖
0003854306.tif 000006
Ｈ鎖
0003854306.tif 000007
とくに、本発明は、抗原結合部位に関係しない可変領域中のＦＲがヒト由来であって、次のアミノ酸配列を有する、請求項１２に記載のヒト化モノクローナル抗体に関する。
Ｌ鎖
0003854306.tif 000008
Ｈ鎖
0003854306.tif 000009
とくに、本発明は、抗原結合部位に関係していない可変領域のＦＲがネズミ由来であって、次のアミノ酸配列を有する、請求項１２に記載のキメラモノクローナル抗体に関する。
Ｌ鎖
0003854306.tif 000010
Ｈ鎖
0003854306.tif 000011
さらに、本発明は、ヒト化またはキメラモノクローナル抗体のＬおよび／またはＨ鎖の可変および／または定常領域をコードするＤＮＡ配列を有することを特徴とする、宿主細胞の形質転換に適する発現ベクターに関する。
さらに、本発明は、培地中で形質転換した宿主細胞を培養し、発現された抗体タンパク質を精製分離することによる、ヒト由来ではない抗原結合部位の超可変領域（ＣＤＲ）およびヒト由来のＬおよびＨ鎖の可変領域のＦＲおよび定常領域を有するヒト化モノクローナル抗体の調製法であって、次のように特徴づけられる調製法に関する。
（ａ）ヒト免疫グロブリンのクラスまたはサブグループのＨ鎖の異なる可変領域（ＦＲ−１〜ＦＲ−４）に用いるアミノ酸共通配列をコードするオリゴヌクレオチド配列を合成、部分的に合成、または分離する。ここで、用いる共通配列は、抗原結合部位の起源であるヒト由来でない抗体の可変領域のＦＲのアミノ酸配列と比較して少なくとも７０％の相同性を有し、抗原の超可変領域への結合能を保持するために最高１０％のアミノ酸の改変（変異）によって修飾される。
（ｂ）（ａ）に記載の条件下で、ヒト免疫グロブリンのクラスまたはサブグループのＬ鎖の異なる可変領域（ＦＲ−１〜ＦＲ−４）に用いるアミノ酸共通配列）をコードするオリゴヌクレオチド配列、または天然に生じる対応するアミノ酸配列をコードするオリゴヌクレオチ配列を合成、一部合成または分離する。
（ｃ）それぞれの場合、元となるヒト由来でない抗体の超可変領域に相当するＬおよびＨ鎖の超可変領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列をコードするオリゴヌクレオチド配列を合成、一部合成または分離する。
（ｄ）それぞれの場合、ヒト免疫グロブリンのＬおよびＨ鎖の定常領域のアミノ酸配列をコードするオリゴヌクレオチド配列を合成、一部合成または分離する。
（ｅ）それぞれの場合、少なくともプロモーター、複製開始点および（ａ）〜（ｄ）のコードＤＮＡ配列を有する発現ベクターの１以上を構築する。なお、ＬおよびＨ鎖をコードするＤＮＡ配列は、一つのベクターに一緒に、あるいはその代わりに、二つ以上の異なるベクターに別々に存在させることができる。
そして、最後に、
（ｆ）（ｅ）の一つまたはそれ以上の発現ベクターで宿主細胞を形質転換する。
とくに、本発明は、超可変領域（ＣＤＲ）を代表する次のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を用いる、方法に関する。
Ｌ鎖
0003854306.tif 000012
Ｈ鎖
0003854306.tif 000013
とくに、本発明は、可変領域のＦＲを代表する次のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を用いる、方法に関する。
Ｌ鎖
0003854306.tif 000014
Ｈ鎖
0003854306.tif 000015
さらに、本発明は、形質転換された宿主細胞を培養して発現した抗体蛋白質を精製、分離することにより、ネズミ由来の抗原結合部位の超可変領域（ＣＤＲ）と、ネズミ由来の可変領域のＦＲと、ヒト由来のＬおよびＨ鎖の定常領域を含み、ＥＧＦレセプターのエピトープに結合する生物学的な機能を有するキメラモノクローナル抗体を調製する方法に関し、この方法は、先に挙げた発現ベクターで形質転換を行うことを特徴とする。
さらに、本発明は、ヒト化またはキメラモノクローナル抗体を含む薬剤組成物に関する。
さらに、本発明は、腫瘍に対する医薬物の製造のためのヒト化またはキメラ抗体の使用に関する。
最後に、本発明は、腫瘍増殖の診断的探索および評価のためのヒト化またはキメラ抗体の使用に関する。
要約すれば、本発明は、ヒト免疫グロブリンのクラスまたはサブグループのＨ鎖の可変領域での共通配列を有するモノクローナル抗体に関する。
上記および下記に引用された全ての出願、特許および、出版物、並びに１９９１年３月６日に申請された対応する欧州特許出願91 103 389.2中の全の前述が参考文献としてここに組み入れられている。
本発明に用いられた微生物およびプラスミド
（ａ）ｐＲＶＬ４２５（＝ＨＣＭＶ−ＲＶLｂ４２５−κ）：ブダペスト条約に従って、１９９１年２月１日にDeutsche Sammlung von Mikroorganismen（ＤＳＭ）に受け入れ番号ＤＭＳ６３４０の下に寄託された。この発現ベクターは、ネズミ抗体４２５の超可変領域（ＣＤＲ）およびヒト化抗体のＬ鎖可変領域のＦＲおよび定常（κ）領域の配列を含む。Ｒは「リシェイプ型（改変された（reshaped）型）」を意味する。
（ｂ）ｐＲＶＨ４２５（＝ＨＣＭＶ−ＲＶHｇ４２５−γ）：ブダペスト条約に従って、１９９１年２月１日にDeutsche Sammlung von Mikroorganismen（ＤＳＭ）に受け入れ番号ＤＭＳ６３３９の下に寄託。この発現ベクターは、ネズミ抗体４２５の超可変領域（ＣＤＲ）およびヒト化抗体のＨ鎖可変領域のＦＲおよび定常（γ−１）領域の配列を含む。Ｒは「リシェイプ型」を意味する。
（ｃ）ｐＣＶＬ４２５（＝ＨＣＭＶ−ＣＶL４２５−κ）：ブダペスト条約に従って、１９９１年２月１日にDeutsche Sammlung von Mikroorganismen（ＤＳＭ）に受け入れ番号ＤＭＳ６３３８の下に寄託された。この発現ベクターは、ネズミ抗体４２５のＬ鎖可変領域のＦＲおよび超可変領域（ＣＤＲ）およびヒト免疫グロブリンのＬ鎖の定常（κ）領域の配列を含む。Ｃは「キメラ」を意味する。
（ｄ）ｐＣＶＨ４２５（＝ＨＣＭＶ−ＣＶH４２５−γ）：ブダペスト条約に従って、１９９１年２月１日にDeutsche Sammlung von Mikroorganismen（ＤＳＭ）に受け入れ番号ＤＭＳ６３３７の下に寄託された。この発現ベクターは、ネズミ抗体４２５のＬ鎖可変領域のＦＲおよび超可変領域（ＣＤＲ）およびヒトγ−１免疫グロブリンのＬ鎖の定常領域の配列を含む。Ｃは「キメラ」を意味する。
（ｅ）ハイブリドーマ細胞株４２５：ブダペスト条約に従って、１９８８年１月２６日にAmerican Type Culture Collection（ＡＴＣＣ）に受け入れ番号ＨＢ９６２９の下に寄託された。この細胞株は、ＥＧＦレセプターに対するネズミ抗体４２５を産生する。
他の生物学的材料
本出願中に記述されている他の微生物、細胞株、プラスミド、プロモータ、耐性マーカー、複製開始点または他のベクターの断片は、市販されているか一般に入手できるものである。本出願中においてとくに記載がなければ、それらは例として用いられただけで、本発明に不可欠なものではなく、それぞれ他の適当な手段および生物学的材料によって置き換えることができる。
好ましくは、微生物宿主をＤＮＡ配列の増幅に用いる。これら宿主の例としては、大腸菌（E．coli）またはバチルス（Bacillus）がある。
例えば、ＣＯＳ（ＣＶ１由来のＳＶ４０）細胞またはＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞のような真核細胞、あるいは酵母が、本発明によるヒト化およびキメラ抗体を産生するために好ましい。ＣＯＳおよびＣＨＯ細胞がなかでも好ましい。
製造のための一般的方法
本発明に不可欠な技術に関しては、本明細書に詳細に記述されている。
詳細に述されていない他の技術は、当業者によく知られているか、あるいは引用文献および特許出願および標準的な文献により詳細に詳述されている既知の標準法である。
【図面の簡単な説明】
図１は、キメラおよびリシェイプ型のヒト抗体の発現のために用いられるベクターの構造を表す構成図である。発現プラスミドの構築に用いられる制限酵素切断部位がマークされている。可変領域をコードする配列は黒塗り枠で、定常領域は白抜き枠で、ＨＣＭＶプロモータおよびエンハンサーは斜線枠で、プラスミドｐＳＶｎｅｏからのヌクレオチド断片は斑点枠で示されている。転写の方向は矢印で示されている。
図２は、ｐＵＣ１８にクローニングされたＶH４２５ｃＤＮＡ（Ａ）およびＶL４２５ｃＤＮＡ（Ｂ）のヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列である。リーダー配列となり得るアミノ酸は下線で、ＣＤＲは括弧で示されている。可変領域と定常領域間のスプライシング部位もまた、示されている。キメラ抗体をコードする遺伝子の構築に使用される前方および後方ＰＣＲプライマーおよびそれらがアニール（結合）する部位が示されている。
図３は、リシェイプ型ヒトＶHａ４２５をコードする合成遺伝子断片のヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列である。リーダー配列を下線で、ＣＤＲとなり得る残基を括弧で示す。
図４は、マウスとリシェイプ型ヒトにおける４２５可変領域のアミノ酸配列の比較を示す。パネルＡは、マウスＶL（ＶL４２５）およびリシェイプ型ヒトＶLＳ（ＲＶLａ４２５およびＲＶLｂ４２５）の配列を示す。パネルＢは、マウスＶH（ＶH４２５）およびリシェイプ型ヒトＶHＳ（ＲＶHａ４２５、ＲＶHｂ４２５、ＲＶHｃ４２５、ＲＶHｄ４２５、ＲＶHｅ４２５、ＲＶHｆ４２５、ＲＶHｇ４２５、ＲＶHｈ４２５およびＲＶHｉ４２５）の配列を示す。ＦＲおよびＣＤＲが示されている。アミノ酸はKabatら（１９８７）の方法によって番号が付与されている。
図５は、マウスＭＡｂ４２５可変領域の分子モデルである。
図６は、ＥＧＦＲへの結合のＥＬＩＳＡによる検出を示す。抗原結合活性を、トランスフェクトしたＣＯＳ細胞上清の希釈液中で分析し、４５０ｎｍの吸光度をＩｇＧ濃度に対してプロットした（ＥＬＩＳＡによって定量された。材料および方法の項を参照されたい）。リシェイプ型ヒトＶH領域の全ての型は、ＲＶLａ４２５とコートランスフェクトされ、それぞれ次のように表される。ＲＶHａ４２５
0003854306.tif 000016
ＲＶHｂ４２５（◇）、ＲＶHｃ４２５（△）、ＲＶHｄ４２５
0003854306.tif 000017
ＲＶHｅ４２５（□）、ＲＶHｆ４２５
0003854306.tif 000018
ＲＶHｇ４２５（□）、ＲＶHｈ４２５（○）、ＲＶHｉ４２５
0003854306.tif 000019
ＲＶLｂ４２５とコートランスフェクトされたＲＶHｂ４２５は、◆で表される。キメラＶＬ４２５およびＶＨ４２５のコートランスフェクションは、●で表される。
図７は、抗原への結合の競合を示す説明図である。
（Ａ）は、標識されたマウス４２５抗体と、
（１）非標識マウス４２５抗体（＋）との、または
（２）ＨＣＭＶ−ＣＶL４２５−κおよびＨＣＭＶ−ＣＶH４２５−γ−１でのコートランスフェクションの後にＣＯＳ細胞によって産生されたキメラ４２５抗体（●）との間の競合を示す。
（Ｂ）は、標識されたマウス４２５抗体と、
（１）非標識マウス４２５抗体（＋）との、または
（２）ＨＣＭＶ−ＲＶLａ４２５−κおよびＨＣＭＶ−ＲＶHｉ４２５−γ−１のコートランスフェクションの後にＣＯＳ細胞によって産生されたリシェイプ型ヒト４２５抗体（○）との、あるいはＨＣＭＶ−ＲＶLａ４２５−κおよびＨＣＭＶ−ＲＶHｇ４２５−γ−１のコートランスフェクションの後にＣＯＳ細胞によって産生されたリシェイプ型ヒト４２５抗体（□）との間の競合を示す。それぞれの場合、横軸はインヒビターの濃度（ｎｇ／ｍｌ）を表す。縦軸は結合阻害のパーセントを表す。
図８は、種々のリシェイプ型ヒトＶL領域の抗原結合に及ぼす影響を調べた結果を示す。（Ａ）は、ＨＣＭＶ−ＣＶL４２５−κとＨＣＭＶ−ＣＶH４２５−γ−１の組合せ（●）、ＨＣＭＶ−ＲＶLａ４２５−κとＨＣＭＶ−ＲＶHｇ４２５−γ−１の組合せ（□）、ＨＣＭＶ−ＲＶLｂ４２５−κとＨＣＭＶ−ＲＶHｇ４２５−ガンマ−１の組合せ（■）、ＨＣＭＶ−ＲＶLａ４２５−κとＨＣＭＶ−ＲＶHｃ４２５−γ−１の組合せ（△）またはＨＣＭＶ−ＲＶLｂ４２５−カッパとＨＣＭＶ−ＲＶHｃ４２５−γ−１の組合せ（▲）でコートランスフェクトされたＣＯＳ細胞によって産生されたリシェイプ型ヒト４２５抗体による抗原結合を示す。（Ｂ）は、標識されたマウス４２５抗体と、
（１）非標識マウス４２５抗体（＋）との、および
（２）ＨＣＭＶ−ＶLａ４２５−κとＨＣＭＶ−ＶHｇ４２５−γ−１の組合せでコートランスフェクトされたＣＯＳ細胞において産生されたリシェイプ型ヒト４２５抗体（□）との、あるいはＨＣＭＶ−ＶLｂ４２５−κとＨＣＭＶ−ＶHｇ４２５−γ−１との組合せでコートランスフェクトされたＣＯＳ細胞において産生されたリシェイプ型ヒト４２５抗体（■）との間での競合を示す。
（Ａ）において、縦軸は４５０ｎｍでの吸光度（ＯＤ450）を表し、横軸はＩｇＧの濃度（ｎｇ／ｍｌ）を表す。
（Ｂ）において、横軸はインヒビターの濃度（ｎｇ／ｍｌ）を表し、縦軸は結合阻害のパーセントを表す。
図９（Ａ）は、リシェイプ型（レーン１および２）、キメラ（レーン３）およびネズミ（レーン４）のＭＡｂ４２５の非還元条件下（ａ）および還元条件下（ｂ）でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析の結果を示す。リシェイプ型（レーン７および８）、キメラ（レーン９）およびネズミ（レーン１０）。レーン５、６、１１および１２は、ＭＷマーカーである。
図９（Ｂ）は、リシェイプ型ＭＡｂ４２５のスペロース（Superose）１２でのゲル濾過による精製の説明図である。ピーク２はＩｇＧを表す。
第１０図は、ネズミ、キメラおよびリシェイプ型のＭＡｂ４２５のＥＧＦレセプター（ＥＧＦＲ）への競合的結合を示す。縦軸は全ＭＡｂに対する結合ＭＡｂの比をパーセント（％結合／全体）で示す。横軸は抗体の濃度（モル／リットル［ｌｏｇ］）を示す。
▽はネズミＭＡｂ４２５を表す
○はキメラＭＡｂ４２５を表す
●、▼はリシェイプ型ＭＡｂ４２５を表す。
図１１は、ＥＧＦおよび抗体のＥＧＦレセプターへの競合を示す。縦軸は、％結合／全体（ＭＡｂ）を表す。横軸は、抗体の濃度（モル／リットル［ｌｏｇ］）を表す。
○はネズミＭＡｂ４２５を表す。
△、▽、□はリシェイプ型ＭＡｂ４２５を表す。
発明の詳細な説明
ＭＡｂ４２５の可変領域遺伝子のクローニングおよび配列決定
κ鎖プライマーを用いるｃＤＮＡ合成およびクローニングから、好ましくは３００〜４００コロニーをスクリーニングのために取り出す。γ−２ａプライマーを用いるｃＤＮＡ合成およびクローニングから、好ましくは２００〜３００コロニーをスクリーニングのために取り出す。二つのそれぞれのクローニングプライマーを用いるハイブリダイゼーションによるスクリーニングの後に、２０〜３０のＬ鎖コロニーおよび１０〜２０のＨ鎖コロニーが強いシグナルを示す。プラスミドＤＮＡをこれらコロニーから分離して、通常の市販の制限酵素消化物によって分析して、ｃＤＮＡ挿入物のサイズを決定する。ＶLおよびＶHクローニングのために４００〜５００ｂｐまたは５００〜６００ｂｐの挿入物を有すると思われるクローンをそれぞれ配列決定のための候補クローンとして選択する。Ｍ１３ユニバーサルおよび逆配列決定プライマーを用いて、三つのＶLクローンおよび三つのＶHクローンの両鎖の配列決定を行う。配列決定した三つのＶLクローンのうち、一つは完全な可変領域をコードし、残りは無関係のペプチドをコードすると考えられる。ＶHクローンのうちの二つは同一のＶH領域をコードし、残りはリーダー配列となお存在するＦＲ−１の間のイントロンを有するＶH領域をコードすると思われる。三番目のＶHクローンはイントロンの他に、最初の二つのクローンのコード配列と同一の配列を含む。ＶL領域の配列を確認するために、適当なサイズの挿入を含むさらに三つのｃＤＮＡクローンを配列決定する。これらのうちの二つは、最初のＶLクローンと同一の配列を示した。三番目のクローンは無関係のＤＮＡ配列であった。配列決定されたクローンにおいて、用いたプライマーにオリジナルな配列の全部は存在しない。欠失の程度は各クローンによって異なる。おそらくｃＤＮＡ合成およびクローニング中に起きると思われるこれら欠失は、コロニースクリーニングの効率を下げるとも考えられる。
ＭＡｂ４２５のＶLおよびＶH遺伝子を図２に示す。４２５ＶLおよびＶH領域のアミノ酸配列を、Kabatデータベース（Kabatら、１９８７）の他のマウス可変領域と比較する。ＶL領域は、マウスκ鎖可変領域のサブグループＩＶまたはＶＩに分類することができる。ＦＲ内で、４２５ＶL領域は、マウスκサブグループＩＶの共通配列と約８６％の同一性、およびサブグループＶＩと約８９％の同一性を有する。４２５ＶL領域は、ＪＫ４断片を用いていると考えられる。ＶＨ領域を調べることによって、マウスＨ鎖サブグループＩＩ（Ｂ）の共通配列のＦＲと約９８％の同一性が示される。
ヒト免疫グロブリンの適切なクラスまたはサブグループの正しい選択は、ヒト由来でない抗体中のもともと存在する鎖との同一性の程度によって行う。本発明で導き出された共通配列は、元になるヒト由来ではない鎖の配列と比較して６５〜７０％以上の同一性を有するものでなければならない。
Ｈ鎖の共通配列が好ましく、特に、ヒトＨ鎖サブグループＩの共通配列であることが好ましい。しかし、それ以外の抗体の場合には、他のヒトＨ鎖の共通配列が適当である。好ましい共通配列は修飾される。アミノ酸の可能な交換は、本発明によれば、０〜１０％、好ましくは、５〜１０％である。
キメラ４２５抗体の構築および発現
ＶＬおよびＶＨ領域をコードするｃＤＮＡをキメラ４２５抗体の構築に用いる前に、５′末端および３′末端におけるいくつかの修飾を導入する必要がある。これには、可変領域コード配列を適宜にＨＣＭＶ発現ベクターにサブクローニングできるような適切な制限酵素部位を導入することが含まれる。可変領域から定常領域に正しく効果的にスプライシングされるようにドナーのスプライシング部位を３′側の隣接領域に再作出することが必要である。５′側の隣接領域もまた、真核細胞リボソームによる翻訳のための効果的な翻訳開始部位を作出するような配列を含むように修飾される（kozak、１９８７）。これらの修飾は、ＰＣＲプライマーを用いて導入される。用いられるプライマーを表１に示す。
0003854306.tif 000020
0003854306.tif 000021
それぞれの可変領域ｃＤＮＡに関して、二つのプライマーが好ましくはデザインされる。前方プライマーにおいては、プライマーの３′末端の１５塩基はプライマーを鋳型ＤＮＡとハイブリダイズさせるために用いられ、プライマーの５′末端はＨｉｎｄＩＩＩ部位および「Kozak」配列を含む。後方プライマーは、同様のデザインを有し、３′末端の１５塩基はプライマーを鋳型ＤＮＡとハイブリダイズさせるために用いられ、プライマーの５′末端はＢａｍＨＩ部位およびドナースプライシング部位を含む。Ｌ鎖後方プライマーの場合においては、ＶLをコードするｃＤＮＡが内部ＢａｍＨＩ部位を含むことから、ＢａｍＨＩ部位の代わりにＢｇｌＩＩ部位が用いられる（図２）。ＰＣＲ反応は好ましくは実施例に記述のようにして行われる。
ＰＣＲ修飾ＶL領域ＤＮＡは、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢｇｌＩＩ断片としてＨＣＭＶのＬ鎖発現ベクターのＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ部位にクローニングされる。このベクターは、必要なスプライシングアクセプター部位およびポリ（Ａ+）部位とともにヒトゲノムκ定常領域を既に含んでいる。ＰＣＲ修飾全ＶL断片を、発現ベクター中のクローニング部位の両隣接部位にアニーリングする二つのプライマーを用いて配列決定する。配列決定によって、ＰＣＲステップ中にいかなるエラーも入り込まなかったことが確認される。ＰＣＲ修飾ＶHＤＮＡは、ＨＣＭＶのＨ鎖発現ベクターにＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ断片としてクローニングされ、また、ＰＣＲエラーがないことを確認するために配列決定される。ヒトゲノムγ−１定常領域を含むＢａｍＨＩ断片は、ＶH領域の３′側でＨＣＭＶ−ＣＶHベクターに挿入される。この断片は、インビボでＶ−Ｃスプライシングを起こすために必要なスプライシングアクセプター部位および天然に生じるポリ（Ａ+）部位を含む。
キメラ４２５ＶLおよびＶH領域を含む発現ベクターは、適当な真核細胞、好ましくはＣＯＳ細胞にコートランスフェクトされる。約７２時間の暫時発現の後に、細胞培養培地の分析をヒトＩｇＧ産生およびＥＧＦＲタンパク質への結合に関してＥＬＩＳＡによって行う。培地に検出されるヒトＩｇＧの量は、１００〜４００ｎｇ／ｍｌとばらつく。産生されるキメラ抗体は、標準抗原−結合ＥＬＩＳＡにおいてＥＧＦＲタンパク質によく結合しており、これによって正しくマウス可変領域がクローニングされて配列されたことが確認される。
リシェイプ型ヒト４２５ＬおよびＨ鎖の最初のデザイン、構築および発現
リシェイプ型ヒト４２５抗体のデザインにおいて、ＶH領域ドメインが抗原の結合においてしばしばもっとも重要であるからこと（Amitら、１９８６：Verhoeyenら、１９８８）から、この領域に主な重点がおかれる。マウスＣＤＲをその上に融合させるヒトＦＲを選択するために、マウスＭＡｂ４２５ＶH領域のＦＲをヒトＶH領域の全サブグループに対する共通配列からのＦＲと比較する（Kabatら、１９８７）。この比較によって、マウスＭＡｂ４２５ＶHのＦＲはヒトＶHサブグループＩのＦＲにもっとも類似していることが示され、これはＦＲ内で約７３％の同一性および全ＶH領域にわたって約６５％の同一性を示す。
マウス４２５ＶH領域と同じKabatサブグループからの他のマウスＶH領域とのさらなる比較を、ＭＡｂ４２５に特徴的で、そのために抗原結合に関与する可能性を有するＦＲの残基を見出だすために行う。マウスＭＡｂ４２５ＶH領域の位置９４の残基はセリンで、マウスサブグループＩＩ（Ｂ）おいて、またヒトサブグループＩからの他のＶH領域においても残基９４はアルギニンである（Kabatら、１９８７）。位置９４はＣＤＲ−３に隣接していることから、このアミノ酸置換は通常のものではなく、これはきわめて重要な位置を占める。これらの理由から、リシェイプ型ヒト４２５ＶH領域は、好ましくは、マウスＭＡｂ４２５のＣＤＲおよびヒトサブグループＩＦＲにおける共通配列から誘導されるＦＲに基づいてデザインされる（Kabatら（１９８７）の定義による）。ＦＲ−３中の位置９４は、マウスＭＡｂ４２５に見出だされるようにセリンとする。ヒトサブグループＩＦＲの共通配列のなかで単一のアミノ酸を載せることができない位置については、その位置に最もよく見出だされるアミノ酸を選択する。ヒト共通配列において特定の位置に好ましいアミノ酸がない場合には、マウスＭＡｂ４２５ＶHの配列のその位置に見出だされるアミノ酸を選択する。結果として得られるアミノ酸配列は、リシェイプ型ヒト４２５ＶHの最初の型（ａ型）を構成する（図３）。これに続くリシェイプ型ヒト４２５ＶHの型の全ては、この最初の型の修飾（変異）型である。
上記のように、リシェイプ型ヒト４２５ＶH領域をコードする４５４ｂｐのＤＮＡ断片をデザインして、合成する（実施例および図３を参照されたい）。このＤＮＡ断片は、リシェイプ型ヒト４２５ＶH領域のアミノ酸をコードするＤＮＡ配列に加えてヒトリーダー配列をコードする配列も含む。ヒトリーダー配列は、例えば、ヒトＶHサブグループＩ（Kabatら、１９８７）の構成要素である抗体ＨＧ３ＣＬ（Rechaviら、１９８３）から得ることができる。合成ＤＮＡ断片もまた、５′末端に真核細胞翻訳シグナル（Kozakら、１９８７）、３′末端にドナースプライシング部位（Breathnachら、１９７８）およびＨＣＭＶ発現ベクターへのサブクローニングのための５′および３′末端のそれぞれのＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩ部位を含む。
リシェイプ型ヒト４２５ＶL領域のデザインのために同様の操作を行う。マウスＭＡｂ４２５ＶL領域のＦＲをヒトＶL領域の全サブグループに対する共通配列と比較する（Kabatら、１９８７）。ＦＲ内で、マウス４２５ＶLとヒトκＶLサブグループＩＩＩとの間に約７１％の同一性が、ヒトκＶLサブグループＩとの間に約７０％の同一性が見出だされる。ヒトκＶLサブグループＩのヒトＦＲをコードするＤＮＡはリシェイプ型ヒトＤ１．３ＶL領域（EP 239 400、Winter）およびリシェイプ型ヒトＣＡＭＰＡＴＨ−１（Reichmannら、１９８８）から既に入手できる。これら二つのヒト抗体におけるリシェイプ型ヒトＶL領域のデザインは、構造的に解明されているヒト免疫グロブリンＲＥＩタンパク質（Eppら、１９７５）に基づいて行われる。これらの理由から、リシェイプ型ヒトＤ１．３およびＣＡＭＰＡＴＨ−１ＨからのヒトＶLＦＲもまた、リシェイプ型ヒト４２５ＶLにおいて用いる。マウス４２５ＶL領域のＦＲと、同様のサブグループからの他のマウス抗体のＦＲとの比較によって、機能的に重要な位置におけるアミノ酸残基に有意の差がないことが明らかになる。したがって、ヒトＦＲにおける改変が不要である。リシェイプ型ヒト４２５ＶL領域ａ型のアミノ酸配列は図４の通りである。
リシェイプ型ヒト４２５ＶL領域を構築するために、三つのオリゴヌクレオチドがデザインされる。これらはマウス４２５ＶL領域の三つのＣＤＲをコードする内部ＤＮＡを含み、また、リシェイプ型ヒトＤ１．３ＶL領域中のヒトＦＲをコードするＤＮＡ配列とハイブリダイズするようにデザインされた１２塩基を５′および３′末端に含む（表１のオリゴヌクレオチド７〜９を参照されたい）。ＣＤＲ−融合は、実施例に記述の方法で行う。スクリーニングから陽性と推定されたクローンのＤＮＡ配列決定の後に、三点変異体（triple mutant）の全体収量として５〜１５％、好ましくは、９〜１０％が得られる。ＰＣＲエラーを含まないリシェイプ型ヒト４２５ＶL領域をＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ断片としてＬ鎖発現ベクターにクローニングして、プラスミドＨＣＭＶ−ＲＶLａ４２５−κを得る（図１）。
リシェイプ型ヒト４２５ＶLおよびＶH領域を含む二つの発現ベクターを、ここで適切な細胞にコートランスフェクトさせて（上記を参照されたい）、機能的リシェイプ型ヒト４２５抗体の暫時発現を図る。約７２時間の後に、細胞上清を集めて、ヒトＩｇＧの分析をＥＬＩＳＡにより行う。ヒトＩｇＧは１００〜５００ｎｇ／ｍｌの範囲のレベルで検出することができるが、驚くことに、抗原結合に関するＥＬＩＳＡ分析ではＥＧＦＲへの結合は検出できない。細胞がＨＣＭＶ−ＲＶLａ４２５−κ／ＨＣＭＶ−ＣＶH４２５−γ−１でコートランスフェクトされる場合、ヒトＩｇＧが産生されて、これがＥＧＦＲに結合する。しかし、細胞がＨＣＭＶ−ＣＶL４２５−κ／ＨＣＭＶ−ＲＶHａ４２５−γ−１でコートランスフェクトされる場合、ヒトＩｇＧが産生されるが、これは検出可能なレベルではＥＧＦＲに結合しない。これらの予期しない結果から、機能的抗原結合部位を得るためには、リシェイプ型ヒト４２５ＶHのＦＲにおけるさらに工夫された修飾が必要であることが明かである。
リシェイプ型ヒト４２５ＶH領域のＦＲにおける修飾
リシェイプ型ヒト４２５ＶH領域のＦＲにおけるさらなる改変はマウス４２５可変領域ドメインの分子モデルに基づいて行われる。リシェイプ型ヒトＶH領域のＣＤＲループを調べて、Chothiaら（１９８９）によって記述された標準的構造にどれほど一致するかを明らかにする。この分析の結果、ＦＲにおける特定の改変（変異）が行なわれる。ＦＲにおける他の改変は、これもまたサブグループＩからのヒトＦＲに基づいてデザインされた機能的リシェイプ型ヒト抗−Ｔａｃ抗体（Queenら、１９８９）に基づいて行われる。驚いたことに、マウス抗−Ｔａｃ抗体のＶH領域は、約７９％のマウス４２５抗体のＶH領域との一致性を有する。ここで、本発明によって、マウス４２５可変領域の分子モデルが作られる（図５）。このモデルは構造的に解明されている抗体であるＨｙＨＥＬ−５の構造に基づき、この抗体の可変領域はマウス４２５抗体と高度の相同性を示す。上記の分析の結果、リシェイプ型ヒト４２５ＶH領域の位置３０、４８、６７、６８および７１のアミノ酸残基は、マウス４２５ＶH領域におけるこれらの位置にあるアミノ酸と一致するように改変される。これらの改変のそれぞれの影響を詳細に調べるために、これらの変化の種々の組み合わせを構築して、本発明にしたがって試験する。
全部で八つのリシェイプ型ヒト４２５ＶH領域の新型を構築する（図４を参照されたい）。実施例に詳細に記載の方法によって作出された型から、ＤＮＡ小断片を組換えることによって前の型から他の型を作る。一旦全部の所望の型が好ましくはｐＵＣ１８に組み込まれると、リシェイプ型ヒト４２５ＶH領域はＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ断片としてＨＣＭＶ−ＶH発現ベクターに移されて、プラスミドＨＣＭＶ−ＲＶH４２５−γ−１のｂ型からｉ型までが作出される（図４）。
リシェイプ型ヒト４２５ＶL領域のＦＲにおける修飾
リシェイプ型ヒト４２５Ｌ鎖（ａ型）およびキメラ４２５Ｈ鎖を発現するベクターでコートランスフェクトされた細胞がＧＲＦＲに結合する抗体を確かに産生するが、リシェイプ型ヒト４２５Ｌ鎖を有する抗体はキメラ４２５抗体のようにはよく結合しない。マウス４２５のＶL領域およびリシェイプ型ヒト４２５ａ型を調べると、ＣＤＲ−１（Ｌ１）の標準構造（Chothiaら，１９８９）の部分である残基７１がａ型には保持されていないことが明らかにされる。ＰＣＲ−突然変異誘発法（Kammanら、１９８９）は、この位置でＰｈｅのＴｙｒへの変化を導入するために好ましく用いられる。この突然変異誘発によって作出されるＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ断片をＨＣＭＶ−ＶL発現ベクターに導入することによって、ＨＣＭＶ−ＲＶLｂ−４２５−κが得られる（図４）。
リシェイプ型ヒト４２５ＶH領域のリシェイプ型の分析
リシェイプ型ヒトＶHａ型〜ｉ型を含む発現ベクターを、リシェイプ型ヒトＶL領域ａ型を含む発現ベクターを有する上記の特性を有する細胞にコートランスフェクトさせる。約３日間後、細胞上清をヒトＩｇＧ産生に関してＥＬＩＳＡで分析する。産生のレベルは５０〜５００ｎｇ／ｍｌの範囲で変動する。次いで、サンプルをＥＧＦＲへの結合能を有するヒトＩｇＧに関してＥＬＩＳＡで分析する。リシェイプ型ヒトＶH領域の異なる型に応じて広範に異なる抗原結合レベルが示される（図６）。抗原結合に関するこのＥＬＩＳＡ分析において、種々のリシェイプ型ヒト４２５抗体を直接キメラ４２５抗体と比較することができるが、マウス４２５抗体との比較はできない。これは抗原への結合を検出するために用いる抗体が抗ヒトＩｇＧ抗体であるからである。リシェイプ型ヒトＶH領域の九つの型をＥＧＦＲへの結合能によってグループ分けすることができる。リシェイプ型ヒトＶH領域ｇ型およびｉ型はもっとも高レベルの結合能を示し、これにｃ型、ｆ型およびｈ型が続き、さらにｂ型が続く。いくつかの実験において、ｅ型は低いが検出可能なレベルの結合を示す。ａ型およびｄ型は検出可能なレベルの結合を全く示さない。
競合結合アッセイ（competition binding assay）を用いて、キメラ４２５抗体と、あるいは、ＶHのｇ型およびｉ型を含むリシェイプ型ヒト４２５と、マウス４２５抗体とを直接比較する（図７）。細胞上清中の抗体は精製されていないが、ＥＬＩＳＡによって定量されているので、競合結合アッセイの結果は親和性の正確な定量測定ではなくむしろ結合の相対的レベルを示すものとみなされる。例えば、ＣＯＳ細胞における四つの実験からのサンプルを用いた競合結合アッセイの結果は、抗原への結合の相対的レベルに関して一致している。キメラ４２５抗体は標識されたマウス４２５抗体とよく競合し、結合阻害の割合（％）は非標識マウス４２５抗体を標識マウス４２５抗体と競合させて得られるものよりもわずかに低いだけである（図７、（Ａ））。ＶLａおよびＶHｇを有するリシェイプ型ヒト抗体はＶLａおよびＶHｉ領域を有するものよりもよい（図７、（Ｂ））。結合曲線の平坦点の比較において、ＶHｇを有するリシェイプ型ヒト抗体は標識されたマウス４２５抗体とは、同じアッセイでの非標識マウス４２５抗体との場合の６０〜８０％の割合で競合することが示される。例えば、ＣＯＳまたはＣＨＯ細胞における四つの別々の実験からのサンプルを用いた場合の結果を平均すると、ＶLａおよびＶHｇを含むリシェイプ型ヒト抗体はマウス４２５抗体の６０〜８０％の結合を示す。
これらの結果に基づいて、ＦＲ中のそれぞれの残基の抗原結合への相対的寄与に関して考察することが可能である。本研究においてもっとも重要な改変をひとつあげるとすれば、それはＬ７１Ｖの改変である。この改変なしでは、驚くべきことに、抗原への結合は全く検出されない（ＶHのａ型とｂ型を比較せよ）。Ｒ６７ＫおよびＶ６８Ａの改変もまた、驚くべきことに結合に重要である（ＶHのｂ型とｃ型を、またｉ型とｈ型を比較せよ）。Ｖ４８ＫＩの改変のみ、およびＶ４８ＩとＳ３０Ｔの同時改変は有意の抗原結合をもたらさないが、これらの位置での改変は抗原結合を促進する。驚いたことに、Ｓ３０Ｔの改変はＶ４８Ｉの改変よりも大きな影響を及ぼす（ＶHのｇ型とｉ型を、およびｆ型とｉ型を比較せよ）。
リシェイプ型ヒト４２５ＶL領域のリシェイプ型の分析
ＲＶLｂ４２５含む発現ベクターを、リシェイプ型ヒトＶH領域ｂ型、ｃ型またはｇ型を含む発現ベクターを有する適切な、好ましくは真核細胞にコートランスフェクトさせた。細胞上清を集めて、ヒトＩｇＧ産生に関して、次いでＥＧＦＲへの結合能を有するヒトＩｇＧに関して分析する（図８、（Ａ））。これらの結果は、リシェイプ型ヒト４２５ＶL領域のｂ型が抗原への結合を増加することを示す。次いで、競合結合アッセイを行い、ＶLａ＋ＶHｇ、またはＶLｂ＋ＶHｇを含むリシェイプ型ヒト４２５抗体を、マウス４２５抗体と比較する。ＶL領域のｂ型を有するヒトＭＡｂ４２５はより強い抗原親和性を有する。このように、ＶL中のＦ７１Ｙ改変は抗原結合を増強する。ＶLｂおよびＶHｇを有するリシェイプ型ヒトＭＡｂ４２５はネズミＭＡｂ４２５の抗原に対する親和性の６０〜８０％を有する。
ＶLｂ＋ＶHｇを含むリシェイプ型ヒト抗体を用いる別の実験（実施例１０、１１）から、ＥＧＦＲへの結合能はキメラ、リシェイプ型およびネズミ抗体で同様であることが明らかにされる。
本発明は、ＦＲ中の残基の比較的中庸の改変が抗原結合に大きく影響することが可能であることを示す。
マウス４２５可変領域の分子モデルによって、ＶH中の位置３０の残基がＣＤＲ−１に近接して分子の表面にあることが明確にされている。事実、ChothiaおよびLesk（１９８７）によって定義されるＨ１は、残基２６から３２に伸びて、位置３０の残基を包含している。ＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈ抗体において位置３０の残基をＳｅｒからＴｈｒに改変すると、これは抗原結合に影響を与えない。リシェイプ型ヒトＶH４２５において位置３０をＳｅｒからＴｈｒに改変すると、抗原への結合は改善される。位置３０のアミノ酸はこの特定の抗体−抗原相互反応における抗原結合で確かに何らかの役割を果たしていると考えられる。Ｓ３０Ｔ改変は抗原結合をほんのわずかしか改善しないこと、また、改変が抗原結合に必須ではないことから、位置３０のＴｈｒは抗原と弱い相互反応を有するだけである。
ＶH中の位置７１の残基の変化は、抗原結合に強く影響する。これは、この位置の試験された二つの残基であるＶａｌとＬｅｕの違いがメチル基一つだけであることから、驚くべきことである。マウス４２５抗体のＨ２は、Chothiaら（１９８９）によって定義されたグループ２標準構造であるＨ２の一つである。ＨｙＨＥＬ−５はＨ２を有し、このＨ２はマウス４２５抗体のＨ２と同様のアミノ酸配列を有する。ＨｙＨＥＬ−５において、ＤＣＲ−２における位置５２ＡのＰｒｏは、ＦＲ中の位置７１の小アミノ酸（Ａｌａ）によってつくられたくぼみに詰め込まれる。マウス４２５可変領域のモデルでは、Ｐｒｏ−５２ＡとＶａｌ−７１の間で同様の相互反応がある。マウス４２５ＶHでは位置５２ＡのＰｒｏは位置７１のＶａｌによってつくられるくぼみに詰め込まれ得るが、位置７１のＶａｌのＬｅｕによる置き換えは分子の不調和を起こし、ＣＤＲ−２ループの構造を変化させ得る。この理由のために、リシェイプ型ヒトＶH４２５中のＶ７１Ｌの変化は、マウス４２５ＶHにおいて起きるようなＣＤＲ−２−ＦＲ相互反応を再び起こす。驚いたことに、これによって、リシェイプ型ヒト４２５抗体の抗原結合の性質が大きく改善される（図６のＶHのａ型とｂ型を有するリシェイプ型ヒト抗体を比較せよ）。
残基７１は、提案されているＬ１の標準構造（ＣＤＲ−１）（Chothiaら、１９８９）の構成員であることから、ＶL中の位置７１の改変はおそらくＣＤＲ構造に影響する。ＣＤＲ−１中の残基２９は埋もれた残基で、ＦＲ中の残基７１との接触を持つ。マウス４２５抗体において、ＶLの残基７１はＴｙｒである。リシェイプ型ヒトＶLを構築するために用いたヒトＦＲにおいては、これはＰｈｅである。Ｐｈｅ中には見出だされずＴｙｒに見出だされる水酸基はＣＤＲ−１の正しい構造を維持するための役割を有すると考えられる。
マウス４２５可変領域の分子モデルから、Ｌｙｓ−６６がＡｓｐ−８６と塩架橋を形成すると考えられる。位置６６へのより大きなＡｒｇ残基の導入は、その構造を壊す。位置６７のＡｌａはＣＤＲ−２と相互反応し、ＶHａ４２５におけるように、残基６６および６７のＡｒｇおよびＶａｌへの同時の改変はＣＤＲ−２に有害な立体的影響を及ぼす可能性がある。位置４８の残基は、埋もれていることが知られており（ChothiaおよびLesk、１９８７）、これはモデルで確認されている。マウス４２５抗体に見出だされるように残基４８を、Ｉｌｅから、サブグループＩのヒトＶH領域において見出だされるようにＶａｌへ変えることで、構造が広く破壊されて抗原結合に影響が出る可能性がある。位置４８のアミノ酸もまたＣＤＲ−２に近く、ＣＤＲ−２ループに微妙な立体的影響を及ぼし得る。
競合結合アッセイによると、最良のリシェイプ型ヒトＶLおよびＶH領域は、ＶLｂおよびＶHｇである。ＶHｇは、上記のＦＲの変化の五つの全てと、リシェイプ型ヒト４２５ＶH領域の最初の型に含まれる位置９４における変化を有する。リシェイプ型ヒト４２５ＶL領域のｂ型のＦＲは、マウス４２５ＶL領域におけるものと７０％の同一性を示す。リシェイプ型ヒト４２５ＶH領域のｇ型のＦＲは、マウスにおけるものと８０％の同一性を示す。
抗体の治療的および診断的使用
本発明による抗体の、ヒト患者への治療または診断のための投与は、既知の方法によって行うことができる。典型的には、抗体または抗体断片を、非経口的に、好ましくは、腹腔内に注射する。しかし、本発明のモノクローナル抗体はまた、静脈注射でも投与できる。
投与する抗体の適当な力価の決定は、当業者に公知の技術範囲である。一般に、本発明のモノクローナル抗体の投与量の範囲は、所望の腫瘍抑制効果を発揮するに充分の量である。望ましくない交差反応、アナフィラキシー反応のような有害な副作用を起こすような多量の投与は行うべきではない。一般に、投与量は、年齢、条件、性別および患者の疾患の程度によって異なり、当業者によって決定できる。投与量は、１投与あたり、個々の医師によって反対適応、免疫寛容、その他の条件の場合には調整することができる。投与量は、１投与あたり、０．１ｍｇ／ｋｇ〜７０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．１ｍｇ／ｋｇ〜５００ｍｇ／ｋｇの範囲で変動し、投与は１日一回またはそれ以上で、１日または数日間行う。
非経口投与のための調製物には、滅菌水性あるいは非水性溶液、懸濁液およびエマルジョンが含まれる。非水性溶媒の例としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油、およびオレイン酸エチルのような注射用有機エステルがあげられる。水性担体には、水、アルコール／水性溶液、生理的食塩水や緩衝液を含むエマルジョンまたは懸濁液が含まれる。非経口基剤には、塩化ナトリウム溶液、リンゲルブドー糖、ブドー糖および塩化ナトリウム、乳酸化リンゲルまたは不揮発性油が含まれる。静脈注射用担体には、液状補給剤、栄養補給剤、リンゲルブドー糖を基にした電解質補給剤などが含まれる。例えば、抗微生物剤、抗酸化剤、キレート剤、不活性ガスなどの保存料やその他の添加物を含めてもよい。
抗体は、リシンサブユニットＡ、ジフテリアトキシンまたは毒性酵素などのトキシンに接合させることもできる。代わりに、当業者に既知の方法で放射性標識することもできる。しかし、本発明の抗体は、トキシンの存在なしで、ヒト単核細胞などのエフェクター細胞の存在下で、優れた細胞毒性を発揮する。
本方法で検出および治療が可能な固形腫瘍には、黒色腫、神経膠腫および癌腫が含まれる。ＥＧＦレセプターを高度に発現しない癌細胞を、リンフォカイン調製物を用いて発現するように誘導することができる。また、リンフォカイン剤は各腫瘍細胞の間でより均質なＥＧＦレセプターの発現を起こし、その結果、より効果的な治療が期待される。
投与に適するリンフォカイン調製物には、インターフェロン−γ、腫瘍壊死因子およびこれらの組み合わせが含まれる。これらは静脈注射で投与することができる。適切なリンフォカイン投与量は、１０、０００〜１、０００、０００単位／患者である。
診断的目的のために、抗体を放射性不透明染料に接合させるかまたは放射性標識することができる。好ましい標識法は、ヨードゲン（Iodogen）法（Frakerら、１９７８）である。好ましくは、抗体は診断の目的のためにＦ（ａｂ′）2断片として投与される。これによって優れた結果が得られ、バックグランドの基礎構造部分が不要になる。断片は既知の方法で調製することができる（例えば、Herlynら、１９８３）。一般に、ペプシン消化は酸性ｐＨで行われ、断片は未消化ＩｇＧおよびＨ鎖断片とプロテインＡ−セファロース（登録商標）クロマトグラフィーによって分離される。
本発明によるリシェイプ型ヒト４２５抗体のヒトにおける免疫応答は、マウスまたはキメラ４２５抗体のいずれよりも低い傾向にある。発明の実施のための最良の形態において、リシェイプ型ヒト４２５抗体の最良の型の親和性は、マウスまたはキメラ４２抗体のそれと等しい。最適条件下でのＥＧＦＲへの結合のためのＥＧＦとの競合能は、キメラ、リシェイプ型およびネズミ抗体で同じであることが、競合結合アッセイによって示される。さらに、ヒトにおける治療に用いられた場合、リシェイプ型ヒト４２５抗体はマウスまたはキメラ４２５抗体のいずれよりも効果的である。免疫原性が著しく低減されているために、リシェイプ型ヒト抗体は、より長い半減期をヒトにおいて有し、ヒト患者においていかなる有害な免疫応答をもっとも起こしにくい。
明かにされたＭＡｂ４２５の結果によって、人工的共通配列を有するヒト化モノクロナール抗体は、認識できる最小応答をも行わないことが示される。さらなる利点は上記の発明の概要に記述されている。
このように、本発明による新規抗体の治療および診断目的のための価値はきわめて高い。
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実施例１
分子のクローニングおよび配列決定
全ＲＮＡを、ＭＡｂ４２５を産生する細胞株Ｗ４２５−１５（ACCT HB 9629）から分離した。約９．６×１０7個細胞を用いて、グアニジン−ＣｓＣｌ法（Chirgwinら、１９７９）を用いて全ＲＮＡを産生した。全ＲＮＡ分離に用いた細胞からの上清をＥＬＩＳＡで分析して、細胞が正しいＭＡｂを多量に産生していることを確認した。ポリ（Ａ+）ＲＮＡを調製した（AvivおよびLeder、１９７２）。二本鎖ｃＤＮＡを、マウスκおよびγ−２ａ免疫グロブリン定常領域の５′領域と相同であるプライマー（Levyら、１９８７）を第一鎖合成のプライマーとして用いる以外は本質的にGublerおよびHoffman（１９８３）の方法に従って、合成した。Ｌ鎖プライマーのデザインは、発表されたデータ（Levyら、１９８７：Kaaritenら、１９８３）に基づいてデザインされた２６−ｍｅｒ（オリゴヌクレオチド１、表１）であった。Ｈ鎖プライマーのデザインは、発表されたデータ（Kaaritenら、１９８３：Kabatら、１９８７）に基づいてデザインされた２５−ｍｅｒ（オリゴヌクレオチド２、表１）であった。プライマーはApplied Biosystems  380B DNA Synthesizer上でデザインおよび合成されて、尿素−アクリルアミドゲル上で精製された。第二鎖合成の後、平滑末端にしたｃＤＮＡをＳｍａＩ−消化したｐＵＣ１８（市販されている）にクローニングして、例えばＤＨ５−α（市販されている）などのコンピテントの大腸菌細胞を形質転換した。コロニーを寒天プレート上に付け32Ｐ−標識した第一鎖合成プライマーを用いるハイブリダイゼーションによってスクリーニングした（Carterら、１９８５）。二本鎖プラスミドＤＮＡの配列決定をシーケナーゼ（Sequenase、United States Biochemical Corporation）を用いて行った。
実施例２
キメラ遺伝子の構築
それぞれの可変領域のために、前方５′および後方３′ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマーを合成した（オリゴヌクレオチド３〜６、表１）。ＰＣＲ反応を、クローニングしたｃＤＮＡを含むｐＵＣ１８プラスミドＤＮＡ１ｎｇ、最終濃度各１μＭの前方および後方ＰＣＲプライマー、各２００μＭのｄＮＴＰ、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭのＫＣｌ、１．５ｍＭのＭｇＣｌおよび０．０１％ゼラチン（ｗ／ｖ）を用いて行った。アンプリタク（Amplitaq）ＤＮＡポリメラーゼ（Perkin Elmer Cetus）を１回の分析当たり２．５単位加えた。９４℃で１．５分間の最初の溶解の後、２５サイクルの増幅を９４℃で１分間、４５℃で１分間および７２℃で３分間行った。７２℃における最終の伸長ステップを１０分間行った。ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで消化する前に、ＰＣＲ反応物をフェノール／クロロホルムで２回抽出し、エタノール沈澱させた。次いでＶLまたはＶH領域をコードするＰＣＲ断片を、発現ベクターにクローニングした。このベクターは、ＨＣＭＶ（ヒトサイトメロウイルス）エンハンサーおよびプロモーター、細菌性ｎｅｏ遺伝子およびＳＶ４０複製開始点を含む。ヒトγ−１定常領域をコードするゲノムＤＮＡ（Takahashiら、１９８２）の２．０ＫｂのＢａｍＨＩ断片を正しい位置方向でＶH領域断片の下流に挿入した（第１図のＨＣＭＶ−ＣＶH４２５−γ−１を参照されたい）。定常領域断片の３′末端におけるＢａｍＨＩを除去することによってこのベクターに更に適合化の処理を行い、可変領域を直接にＨ鎖発現ベクターにＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ断片として挿入することを可能にした（Maedaら、１９９１）。ＶL領域をコードする断片を、同様のＨＣＭＶ発現ベクターに挿入した。この場合のベクターは、約２．６Ｋｂの大きさで、ヒトκ定常領域をコードするゲノムＤＮＡのＢａｍＨＩ断片、およびスプライシングアクセプター部位およびポリ（Ａ+）を含む（Rabbittsら、１９８４）（図１のＨＣＭＶ−ＣＶL−４２５−κを参照されたい）。
実施例３
ＭＡｂ４２５ＶLおよびＶHの分子モデル
ネズミＭＡｂ４２５の可変領域の分子モデルを高相同性の抗−リゾチーム抗体、ＨｙＨＥＬ−５（Sheriffら、１９８７）の解明された構造に模して構築した。ＭＡｂ４２５の可変領域およびＨｙＨＥＬ−５は、約９０％の相同性を有する。
モデルは、ＵＮＩＸ作動のシリコングラフィックスアイリス（Silicon Graphics Iris）４Ｄワークステーション上で、分子モデル化既製プログラムの「クオンタ（ＱＵＡＮＴＡ）」（Polygen Corp．）を用いて作出した。骨格構造の同一の残基は保持された。同一でない残基はクオンタのタンパク質モデル化設備に組み入れられた最大オーバーラップ（SnowおよびAmzel、１９８６）を用いて置換した。Ｈ鎖の三つのＮ末端残基の主要鎖構造には、それらの温度因子が異常に高く（バックボーン温度因子から平均＋３×標準偏差よりも大きい）、それらがＶHＣＤＲ−３（Ｈ３）（Martinら、１９９０）のパッキングに影響を及ぼすことから、相同する抗体構造（ＨｙＨＥＬ−１０（Padlanら、１９８９））が用いられた。
ＭＡｂ４２５からのＶL領域のＣＤＲ−１（Ｌ１）およびＣＤＲ−２（Ｌ２）配列およびＶH領域のＣＤＲ−１（Ｈ１）およびＣＤＲ−２（Ｈ２）配列は、Chothiaら（１９８９）によって仮定された標準型に一致していた。これらループの主要鎖ねじれ角度については、ＨｙＨＥＬ−５におけるものが保たれた。ＭＡｂ４２５からのＶL領域のＣＤＲ−３（Ｌ３）配列およびＶH領域のＣＤＲ−３（Ｈ３）は、標準構造に一致しなかった。したがって、このモデルは異なる方法で設計された。Martinら（１９８９）のコンピュータプログラムを、ブルックヘブン（Brookhaven）データバンク（Bernsteinら、１９７７）からループ構造を抽出するために用いた。次いで、ループ構造を配列の類似性、エネルギーおよび構造決定残基に基づいて分類した（Sutcliffe、１９８８）。トップにランクされたループ構造をグラフィック上で調べて、最良のものを肉眼で選択した。Ｈ３は、ウシグルタチオンペルオキシダーゼ（Eppら、１９８３）の残基９２〜９３の領域をモデルにして作られた。Ｌ３は、ネズミＩｇＡ（Ｊ５３９）Ｆａｂ断片（Suhら、１９８６）のＬ鎖の残基８８〜９６の領域をモデルにした作られた。
好ましくない原子接触を取り除き、ファンデルワールスおよび静電気的相互反応を最適なものとするために、モデルに最大勾配降下および抱合勾配エネルギー最小化（steepest descents and conjugate gradients energy minimization）の処理を、ＣＨＡＲｍポテンシャル（Brooksら、１９８３）を用いてＱＵＡＮＴＡで実施したようにして行った。
実施例４
ヒト化抗体遺伝子の構築
リシェイプ型ヒト４２５Ｌ鎖の最初の型の構築を、Reichmannら（１９８８）およびVerhoeyenら（１９８８）による記載のものと同様のＣＤＲ融合アプローチを用いて行った。一本鎖鋳型ＤＮＡを、ヒト抗−リゾチームＶL領域をコードするＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ断片を含むＭ１３ｍｐ１８ベクター（市販されている）から調製した（EP 239 400、G．Winter）。このＬ鎖の各ＦＲは、結晶学的に解明されたＲＥＩタンパク質に由来する。三つのオリゴヌクレオチドがデザインされ、これらはヒトＲＥＩに隣接するＦＲをコードするＤＮＡ配列に相補的なＤＮＡの１２塩基によってそれぞれの末端が占められているマウスＭＡｂ４２５Ｌ鎖ＣＤＲをコードするＤＮＡ配列を有する（オリゴヌクレオチド７〜９、表１）。オリゴヌクレオチドは、前記のようにして合成され、精製された。三つのヌクレオチドは全て燐酸化されて、Ecksteinおよび共同研究者（Taylorら、１９８５：NakamayeおよびEckstein、１９８６：およびSayersら、１９８８）に従ったオリゴヌクレオチド指定のインビトロ突然変異誘発システムにおいて同時に用いられた。このシステムの製造者のインストラクションに従って、エクソヌクレアーゼＩＩＩ消化ステップを行った。次いで、反応物をフェノール／クロロホルム抽出して、エタノール沈澱させて、１００μｌのＴＥに再懸濁させた。１０μｌの量を、最終濃度でそれぞれ０．２μＭのＭ１３ユニバーサルプライマーおよび逆配列プライマーを含む１００μｌのＰＣＲ増幅反応液中で鋳型ＤＮＡとして用いた。緩衝液および温度サイクル条件は、５５℃のアニーリング温度を用いる以外は実施例２に記述と同様であった。ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩによる消化およびｐＵＣ１８へのサブクローニングの前に、ＰＣＲ反応物をフェノール／クロロホルムで２回抽出してエタノール沈澱させた。陽性と推定されたクローンを、32Ｐ−標識突然変異誘発プライマーとのハイブリダイゼーションによって同定した（Carterら、１９８７）。クローンは配列決定によって陽性であると確認された。三つの融合ＣＤＲの全てを含むＶL領域をＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ断片としてＶL発現ベクターにクローニングして、プラスミドＨＣＭＶ−ＲＶLａ４２５−κを得た。
リシェイプ型ＶLのｂ型を、小修飾を伴うKammannら（１９８９）のＰＣＲ突然変異誘発法を用いて構築した。鋳型ＤＮＡは、ｐＵＣ１８にサブクローニングしたＲＶLａであった。最初のＰＣＲ反応を、全量５０μｌで、１ｎｇの鋳型、最終濃度１μＭのＭ１３逆配列プライマーおよびプライマー１０（表１）、２００μＭのｄＮＴＰｓ、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭのＫＣｌ、１．５ｍＭのＭｇＣｌおよび０．０１％ゼラチン（ｗ／ｖ）を用いて行った。アンプリタクＤＮＡポリメラーゼを１分析当たり１単位の濃度で加えた。反応を３回繰り返した。９４℃で１．５分間溶解した後、反応を１サイクルを９４℃で１分間、３７℃で１分間および７２℃で２分間で、４０サイクル行って、７２℃における伸長ステップを１０分間行った。反応物を集めて、ＴＡＥアガロースゲルからＰＣＲ産生物を分離する前にフェノール／クロロホルムで抽出してエタノール沈澱させた。次いで、最初のＰＣＲ反応物の１０分の１を第二のＰＣＲ反応におけるプライマーの一つとして用いた。第二の反応を、第一反応産生物および２０pmolのＭ１３ユニバーサルプライマーを用いる以外は第一の反応と同様に行った。サイクルはKammannら（１９８９）による記載に従って行った。ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ断片をｐＵＣ１８にクローニングして、配列決定した。所望の変化を有するＤＮＡ断片をＶL発現プラスミドにサブクローニングして、プラスミドＨＣＭＶ−ＲＶLｂ４２５−κを得た。
４２５のリシェイプ型ヒトＶH領域の最初の型（ａ型）を、化学的に合成した。ＤＮＡ配列を所望のアミノ酸配列をコードするように、また必要な隣接領域のＤＮＡ配列を含むようにデザインした（上記を参照されたい）。コドンの使用は、各ＦＲをコードするＤＮＡ配列に遺伝子工学的に組み入れられた有用な制限酵素切断部位によって哺乳動物細胞のために最適化された。４５４ｂｐを合成して、ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片としてｐＵＣ１８にサブクローニングした。次いで、リシェイプ型ヒト化４２５Ｈ鎖をコードするＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ断片をＶH発現ベクターに移入して、プラスミドＨＣＭＶ−ＲＶHａ−４２５−γ−１を得た。
八つの他の型のリシェイプ型ヒト化Ｈ鎖を、変法で構築した。Ｈ鎖のａ型をコードするＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ断片をＭ１３ｍｐ１８に移して、一本鎖ＤＮＡを調製した。オリゴヌクレオチド１１〜１３（表１）を用いて、上記のようなＰＣＲ−適合Ｍ１３突然変異誘発を用いて、ｐＵＣ１８中にリシェイプ型ヒト４２５ＶH領域ｄ型、ｅ型、ｆ型またはｇ型をコードするＤＮＡを作出した。これらの型をＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ断片としてＨ鎖発現ベクターにサブクローニングして、プラスミドＨＣＭＶ−ＲＶHｄ４２５−γ−１、ＨＣＭＶ−ＲＶHｅ４２５−γ−１、ＨＣＭＶ−ＲＶHｆ４２５−γ−１およびＨＣＭＶ−ＲＶHｇ４２５−γ−１を作出した。
リシェイプ型ヒト４２５ＶH領域ｂ型およびｃ型をKammannら（１９８９）のＰＣＲ突然変異誘発法を用いて上記のようにして作出した。鋳型ＤＮＡはｐＵＣ１８にサブクローニングしたリシェイプ型ヒト４２５ＶH領域ａ型であり、最初のＰＣＲ反応に用いた突然変異誘発プライマーはプライマー１３または１４（表１）のいずれかであった。突然変異誘発および配列決定の後に、所望の変化を有する配列をＨ鎖発現プラスミドにサブクローニングして、ＨＣＭＶ−ＲＶHｂ４２５−γ−１およびＨＣＭＶ−ＲＶHｃ４２５−γ−１を得た。
リシェイプ型Ｈ鎖ｈ型およびｉ型をすでに構築した他の型のｐＵＣをベースとしたクローンから構築した。ｅ型からの０．２ＫｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｈｏＩ断片をｂ型またはｃ型のいずれかからの２．８ＫｂのＸｈｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片に連結させて、リシェイプ型のｈ型およびｉ型をそれぞれ作出した。これらの型をコードするＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ断片をＨ鎖発現ベクターにサブクローニングして、ＨＣＭＶ−ＲＶHｈ４２５−γ−１およびＨＣＭＶ−ＲＶHｉ４２５−γ−１を得た。
実施例５
ＣＯＳ細胞へのＤＮＡのトランスフェクション
ＣＯＳ細胞を、Ｈ鎖およびＬ鎖をコードする遺伝子を含む発現ベクターのそれぞれ１０μｇとともにエレクトロポレーション処理した。簡単に説明すれば、プラスミド１０μｇを、１×１０7個細胞／ｍｌのＣＯＳ細胞のＰＢＳ懸濁液の０．８ｍｌに加えた。Bio-Rad（登録商標）Gene Pulserを用いて、静電容量２４μＦで１９００Ｖのパルスをかけた。１０％牛胎児血清を含む８ｍｌのＤＭＥＭにプレートする前に、細胞を回収するために室温で１０分間静置した。７２時間のインキュベーションの後に、培地を集めて、細胞残滓を除去するために遠心分離して、ＥＬＩＳＡによる分析の前に、滅菌条件下で短期間では４℃、長期間では−２０℃で保存した。
実施例６
ＣＨＯ細胞へのＤＮＡのトランスフェクションを実施例５と同様にして行った。
実施例７
ＩｇＧ産生の定量および抗原結合の検出
ＣＯＳ細胞上清に存在するヒトＩｇＧをＥＬＩＳＡによって検出した。ヒトＩｇＧのＥＬＩＳＡ分析において、９６−ウェルのプレートをヤギ抗−ヒトＩｇＧ（全分子）でコートして、アルカリホスファターゼ接合ヤギ抗−ヒトＩｇＧ（γ鎖特異性）を用いて、プレートに結合したサンプル中のＩｇＧを検出した。市販されている精製ヒトＩｇＧを標準として用いた。ＭＡｂ４２５によって認識される抗原に対する結合は、二番目のＥＬＩＳＡで決定された。プレートをＥＧＦＲタンパク質調製物（例えば、Rodeckら（１９８０）の方法で得られる）でコートして、ＥＧＦＲへの抗体の結合を、抗−ヒトＩｇＧ（γ鎖特異性）ペルオキシダーゼ接合物（キメラおよびリシェイプ型ヒト抗体のため）または抗−マウスＩｇＧ（全分子）ペルオキシダーゼ接合物（マウスＭＡｂ４２５抗体のため）（接合物はシグマ製）のいずれかを用いて検出した。精製したネズミＭＡｂ４２５を標準として用いた。
実施例８
競合結合アッセイ
ネズミＭＡｂ４２５を、適合する購入可能なキットを用いてビオチン化（biotinylate）させた。ＥＬＩＳＡプレートを最適希釈のＥＧＦＲタンパク質でコートした。５０μｌのＣＯＳ細胞上清希釈物を５０μｌのビオチン結合ネズミＭＡｂ４２５（ＥＬＩＳＡによる推定で１．７５μｇ／ｍｌ）と混合した。各ＣＯＳ細胞上清の試験は二重に行った。プレートを室温で一晩インキュベートした。結合したビオチン結合ネズミＭＡｂ４２５を、市販のストレプトアビジン・ホースラディッシュペルオキシダーゼ複合体の添加によって検出した。競合物の存在しない対照によって、それぞれのＣＯＳ細胞上清についての阻害すなわちブロックのパーセント値を、次のよう算出した。
１００−［（サンプルのＯＤ450／対照のＯＤ450）×１００］
実施例９
ネズミ、リシェイプ型およびキメラＭＡｂ４２５の異なるプローブを、Laemmliらの方法によるＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって分析した。それぞれのサンプルの２．５μｇを各ウェルに非還元および還元条件で入れた。タンパク質をクマシー染色で可視化した。図９（Ａ）は、サンプルが同様の純度を有することを示す。
抗体の分子量の範囲は、１８０、０００〜２００、０００であった。
実施例１０
リシェイプ型ＭＡｂ４２５を、スパーロース（Superose）１２（登録商標、Pharmacia Corp．、スウェーデン）上でのゲル濾過によって標準法に従って精製した。抗体は、ＰＢＳ（ｐＨ７．４、０．８Ｍ ＮａＣｌ）（０．１Ｍ）で溶出した。単一のピーク（５分）を得ることができた（図９、（Ｂ））。
実施例１１
ビオチン標識したＭＡｂ４２５を用いて、ＥＧＦＲへの結合を非標識ＭＡｂ４２５または誘導体と競合させた。ビオチン標識は標準法によった。ＥＧＦＲを、Ａ４３１膜から標準法によって溶解した。Ａ４３１細胞は市販のものを使用した。検出は、ＰＯＤ接合ストレプトアビジンおよび基質とともにインキュベーションした後に行った。このデータから阻害曲線が作成された（図１０）。曲線によって、種々の抗体の結合が同等であることが示される。
実施例１２
精製したネズミ、キメラおよびリシェイプ型ＭＡｂ４２５の異なるプローブを、ＥＧＦＲへの結合に関してＥＧＦとのそれらの競合能を試験した。試験は、125Ｉ−標識ＥＧＦ（Amersham Corp．、英国）と種々の抗体とをＥＧＦ−レセプター陽性膜（Ａ４３１）への結合に関して競合させることによって行った。試験システムは、ＳＰＡ手法（Amersham）に基づいた。ネズミおよびリシェイプ型抗体（３プローブ）の競合曲線はほぼ一致している（図１１）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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