(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
破骨細胞形成抑制因子（Osteoclastogenesis Inhibitory Factor  ;OCIF）、IMR-90細胞（ATCC CCL-186）のポリ（A）+RNAを用いて作成したcDNAライブラリーからOCIFcDNA断片をプローブとするストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション法によって得られるDNAにコードされるOCIF活性を有するOCIF類縁体、またはOCIFcDNAにPCR法あるいは制限酵素による切断により置換あるいは欠失変異を入れたOCIF変異体cDNAによりコードされるOCIF活性を有するOCIF変異体からなる群から選択される一以上の物質と多糖類またはその誘導体とからなる骨代謝異常症治療剤。
【請求項２】
OCIF類縁体が、OCIF2、OCIF3、OCIF4、及びOCIF5からなる群から選択される少なくとも一つである請求項１に記載の骨代謝異常症治療剤。
【請求項３】
OCIFがヒトOCIFである請求の範囲１または２に記載の骨代謝異常症治療剤。
【請求項４】
多糖類がヘパリン、ペクチン、及び／またはカラギーナンである請求の範囲１ないし３のいずれか1項に記載の骨代謝異常症治療剤。
【請求項５】
多糖類誘導体がデキストラン硫酸である請求の範囲１ないし３のいずれか1項に記載の骨代謝異常症治療剤。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、活性及びその持続性が高い新規な骨代謝異常症治療剤に関する。本発明の骨代謝異常症治療剤は、骨粗鬆症、高カルシウム血症、慢性関節リウマチ等の骨代謝異常症に対して優れた治療活性を有し、医薬として有用である。
背景技術
骨は身体の支持能力だけでなく、生体内カルシウムの最大の貯蔵臓器として機能しており、生体に存在するカルシウムの９９％は骨に蓄積されている。しかも、骨は絶えず骨吸収と骨形成という相反する作用を常に受けており、血清カルシウムの恒常性を保つ上で重要な役割を担っている。骨吸収において重要な役割を担っている破骨細胞が活性化されると、骨から過剰なカルシウムが血液中に流出し、血液中のカルシウムの恒常性が崩壊し、高カルシウム血症をきたすことが知られている。高カルシウム血症は癌の骨転移等により発症する疾患で、患者数の増加が予想され、その治療剤の開発が急がれている。現在、このような高カルシウム血症治療剤として、カルシトニン及びその誘導体、あるいはビスホスホネート系化合物が使用されている。しかし、これらの治療効果は満足できるものではなく、これらに代わる新規薬剤の開発が望まれている。
一方、破骨細胞の分化を抑制する蛋白性因子として知られている破骨細胞形成抑制因子（Ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔｏｇｅｎｅｓｉｓ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  Ｆａｃｔｏｒ；ＯＣＩＦ）（ＷＯ９６／２６２１７号公報）が、血清カルシウム低下作用を有することが報告されている（ＢＩＯＣＨＥＭＩＣＡＬ  ＡＮＤ  ＢＩＯＰＨＹＳＩＣＡＬ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ  ＣＯＭＭＵＮＩＣＡＴＩＯＮＳ，Ｖｏｌ．２４５，ｐｐ３８２−３８７（１９９８）；Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１３９，ｐｐ４０１２−４０１５（１９９８））。ＯＣＩＦは、全く新しい高カルシウム血症治療剤として期待できるが、ＯＣＩＦは蛋白質であるため生体内で速やかに代謝される。
そこで、より安定で作用の強いＯＣＩＦの製剤の開発が望まれていた。
発明の開示
本発明者らは、上述の状況に鑑み鋭意研究の結果、ＯＣＩＦに多糖類を加えて製剤化することにより、ＯＣＩＦの有する骨代謝異常症に対する効果をさらに増強できることを見出した。従って本発明の課題は、骨代謝異常症に対するＯＣＩＦの効果をさらに増強し、その効果を持続せしめた骨代謝異常症治療剤を提供することにある。
本発明は、破骨細胞形成抑制因子（Ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔｏｇｅｎｅｓｉｓ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  Ｆａｃｔｏｒ；ＯＣＩＦ）、その類縁体、またはその変異体からなる群から選択される一以上の物質と多糖類またはその誘導体とからなる骨代謝異常症治療剤に関する。
本発明において前記多糖類としてヘパリン、また前記多糖類誘導体としてデキストラン硫酸が好ましい。
本発明により、骨粗鬆症、高カルシウム血症、慢性関節リウマチ等の骨代謝異常症に対して優れた活性とその持続性とを有する治療剤が提供され、医薬として有用である。
また、本発明は多糖類またはその誘導体を用いることにより破骨細胞形成抑制因子の活性を高める方法に関する。
本発明で用いるＯＣＩＦは、例えばＷＯ９６／２６２１７号公報に記載された方法により得られる天然型あるいは遺伝子組み換え型のものであり、その由来は特に限定されないが、特に好ましくはヒト型のものである。このような天然型あるいは遺伝子組み換え型ＯＣＩＦとしては、非還元条件下ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおける分子量が約６０ｋＤａのモノマー型、あるいは分子量が約１２０ｋＤａのダイマー型のものがある。
また、本発明ではＯＣＩＦの類縁体あるいは変異体を用いても良い。類縁体としては、ＩＭＲ−９０細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１８６）のポリ（Ａ）＋ＲＮＡを用いて作成したｃＤＮＡライブラリーから、ＯＣＩＦｃＤＮＡ断片をプローブとしてハイブリダイゼーション法により得られるＯＣＩＦ類縁体のｃＤＮＡを発現ベクターに挿入し、そのベクターを通常用いられる宿主に組み込み、宿主で発現させ、常法により精製することにより得られるもの等が挙げられる。より具体的には、ＷＯ９６／２６２１７号公報に記載されたＯＣＩＦ２、ＯＣＩＦ３、ＯＣＩＦ４、またはＯＣＩＦ５が挙げられる。
これらは、ＷＯ９６／２６２１７号公報に記載されるように、ＯＣＩＦ２は、ＯＣＩＦｃＤＮＡの塩基配列の２６５番目のグアニンから２８５番目のグアニンまでの２１ｂｐの欠失があり、アミノ酸配列ではＯＣＩＦのアミノ酸配列の６８番目のグルタミン酸（Ｇｌｕ）から７４番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までの７アミノ酸の欠失があるものである。
ＯＣＩＦ３は、ＯＣＩＦｃＤＮＡの塩基配列の９番目のシチジンがグアニンに変換されていて、アミノ酸配列ではＯＣＩＦのアミノ酸配列の−１９番目のアスパラギン（Ａｓｎ）がリジン（Ｌｙｓ）に変わっている。ただし、この点は、シグナル配列の中のアミノ酸置換であり、分泌されるＯＣＩＦ３には影響しないと思われる。さらに、ＯＣＩＦｃＤＮＡの塩基配列の８７２番目のグアニンから９８８番目のグアニンまでの１１７ｂｐの欠失があり、アミノ酸配列ではＯＣＩＦのアミノ酸配列の２７０番目のスレオニン（Ｔｈｒ）から３０８番目のロイシン（Ｌｅｕ）までの３９アミノ酸の欠失がある。
ＯＣＩＦ４は、ＯＣＩＦｃＤＮＡの塩基配列の９番目のシチジンがグアニンに変換されていて、アミノ酸配列ではＯＣＩＦのアミノ酸配列の−１９番目のアスパラギン（Ａｓｎ）がリジン（Ｌｙｓ）に変わっている。又、２２番目のグアニンがチミジンに変換されていて、アミノ酸配列ではＯＣＩＦのアミノ酸配列の−１４番目のアラニン（Ａｌａ）がセリン（Ｓｅｒ）に変わっている。ただし、これらはシグナル配列の中のアミノ酸置換であり、分泌されるＯＣＩＦ４には影響しないと思われる。さらにＯＣＩＦｃＤＮＡの塩基配列の４００番目と４０１番目の間に約４ｋｂのイントロン２の挿入があり、オープンリーリングフレームがその中で止まる。アミノ酸配列ではＯＣＩＦのアミノ酸配列の１１２番目のアラニン（Ａｌａ）の後に２１アミノ酸からなる新規なアミノ酸配列が付加されているものである。
ＯＣＩＦ５は、ＯＣＩＦｃＤＮＡの塩基配列の９番目のシチジンがグアニンに変換されていて、アミノ酸配列ではＯＣＩＦのアミノ酸配列の−１９番目のアスパラギン（Ａｓｎ）がリジン（Ｌｙｓ）に変わっている。ただし、これはシグナル配列の中のアミノ酸置換であり、分泌されるＯＣＩＦ５には影響しないと思われる。さらに、ＯＣＩＦｃＤＮＡの塩基配列の４００番目と４０１番目の間に約１．８ｋｂのイントロン２の後半部分の挿入があり、オープンリーリングフレームがその中で止まっている。アミノ酸配列ではＯＣＩＦのアミノ酸配列の１１２番目のアラニン（Ａｌａ）の後に１２アミノ酸からなる新規なアミノ酸配列が付加されているものである。
変異体としては、ＯＣＩＦのアミノ酸配列に対し１以上のアミノ酸が挿入、付加、置換、あるいは欠失されたものが挙げられる。より具体的には、ＯＣＩＦｃＤＮＡにＰＣＲ法あるいは制限酵素による切断により置換あるいは欠失変異を入れたＯＣＩＦ変異体ｃＤＮＡを作成し、このｃＤＮＡを発現ベクターに挿入し、そのベクターを通常用いられる宿主に組み込み、宿主で発現させ、常法により精製することにより得られるものが挙げられる。
本発明で用いる多糖類は、単糖がグリコシド結合によって生じた重合体（グルカン）であり、好ましくは構成単糖が２種以上からなるヘテロ多糖（ヘテログリカン）である。具体的には、天然多糖類として例えばヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパラン硫酸、ケラタン硫酸、カラギーナン、ペクチンまたはヘパリンなど、あるいは合成多糖類としては例えばデキストランなど、また、合成多糖類の誘導体としては例えばデキストラン硫酸などが用いられる。特に好ましくはグルカンが硫酸エステル化されたものが用いられ、例えばヘパリンの分子量３，０００〜６，０００のものあるいはデキストラン硫酸の分子量５，０００〜１０，０００のものが用いられる。本発明の骨代謝異常症治療剤は、ＯＣＩＦ、その類縁体、またはその変異体からなる群から選択される一以上の物質、及び多糖類またはその誘導体を、多糖類またはその類縁体がＯＣＩＦ、その類縁体、またはその変異体に対し１〜１００倍量、特に１〜１６倍量の割合で組み合わせるのが好ましい。ＯＣＩＦ、その類縁体、またはその変異体からなる群から選択される一以上の物質と多糖類またはその誘導体とを組み合わせた本発明製剤は、ＯＣＩＦ単独投与に比べて持続性と治療効果が優れた骨代謝異常症治療剤として、例えば骨粗鬆症、高カルシウム血症、慢性関節リウマチ等の骨代謝異常症に対して有効である。
本発明の製剤は、ヒトあるいは動物に対し、医薬として経口的及び非経口的に安全に投与される。非経口的投与としては、例えば静脈注射、筋肉内注射、皮下注射、経鼻投与、口腔内投与、経粘膜投与等が挙げられる。これらの投与経路で投与するための製剤は公知の製剤学的製法に準じ、製剤として薬理学的に許容され得る担体、賦形剤、滑沢剤、着色剤等と共に医薬品組成物として投与される。注射剤を調製する場合は、ＯＣＩＦ及び多糖類の他に、必要に応じｐＨ調整剤、緩衝剤、安定化剤、可溶化剤などを添加して、常法により注射剤とする。その際、ヒト血清アルブミンや界面活性剤等の公知の添加剤を併用してもよい。界面活性剤としては、例えばポリアニオン類や陰イオン性界面活性剤等が挙げられる。注射剤はバイアル瓶に分注し溶液製剤にするか、あるいは凍結乾燥製剤として、用時に適時蒸留水や生理的食塩水等に溶解することによって調製することができる。ＯＣＩＦを３または２４ｍｇ／ｋｇ・ｄａｙの用量で正常ラットに１日１回２週間連続静脈内投与したところ、骨密度と骨量の増大が確認されたが、３８組織における組織病理学的な異常や血球数の変動等は観察されなかった（Ｈ．Ｙａｓｕｄａ  ｅｔ  ａｌ．：Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１３９，ｐｐ１３２９−１３３７（１９９８））。このように、ＯＣＩＦの作用は骨に特異性が高く、安全にヒトに投与できることが期待される。
本発明の骨代謝異常症治療剤を患者に投与する場合の投与量と投与方法は、症状の程度、患者の年齢、健康状態、体重などの条件によって異なるので特に限定されないが、例えば成人１日当たり約０．０１〜１ｍｇ／ｋｇを非経口的に１日１〜数回投与すれば良い。また、本発明製剤の活性は、血清カルシウムの濃度を測定することにより行うことができる。例えば、適当な溶媒を用いて調製したＯＣＩＦ溶液に多糖類を添加したものをラットに静脈内投与し、経時的に採血を行いその血清カルシウム濃度を常法により測定することにより行うことができる。
また、本発明は、多糖類またはその誘導体を用いて破骨細胞形成抑制因子の活性を高める方法に関する。本発明によると、ＯＣＩＦの血中濃度を高め、ＯＣＩＦの血清カルシウム濃度低下作用を増強することができる。
発明を実施するための最良の形態
〔実施例〕
以下の実施例により本発明をより具体的に説明するが、これらは単に具体的に例示したのみであり、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない。
〔実施例１〕
注射剤の製造・１
ＷＯ９６／２６２１７号公報記載の方法に従って得られたヒトＯＣＩＦ５００μｇ及びヘパリン２ｍｇを、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ及び０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０を含む１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）５ｍｌに溶解し、この溶液を０．２２μｍの滅菌フィルター（Ｍｉｌｌｅｘ  ＧＶ，ミリポア社）で滅菌した後、バイアル瓶に充填することにより静注用注射剤を得た。
注射剤の製造・２
ＷＯ９６／２６２１７号公報記載の方法に従って得られたヒトＯＣＩＦ５００μｇ及びデキストラン硫酸２ｍｇを、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ及び０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０を含む１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）５ｍｌで溶解し、この溶液を０．２２μｍの滅菌フィルター（Ｍｉｌｌｅｘ  ＧＶ，ミリポア社）で滅菌した後、バイアル瓶に充填することにより静注用注射剤を得た。
〔実施例２〕
多糖類の添加によるＯＣＩＦの血清カルシウム濃度低下効果・１
ヒトＯＣＩＦ（ダイマー型）（ＷＯ９６／２６２１７号公報記載の方法により得られた遺伝子組換え型ＯＣＩＦ）を、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ及び０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０を含む１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）（以下、溶媒と称す）に溶解して調製したヒトＯＣＩＦ  ０．２５ｍｇ／ｍｌ溶液２ｍｌに、デキストラン硫酸（分子量８０００または１００００：シグマ社、及び分子量５０００または５００００：和光純薬社）あるいはヘパリン（２０７．８または１７１．２ｕｎｉｔ／ｍｇ：和光純薬社、及び分子量３０００または６０００：シグマ社）２ｍｇを溶解した後、４℃で一昼夜放置した。同時にヒト型ＯＣＩＦ  ０．２５及び２．５ｍｇ／ｍｌ溶液並びに溶媒についても、４℃で一昼夜放置した。これらの被験試料液を、それぞれＯＣＩＦとデキストラン硫酸投与群（Ｄ群）、ＯＣＩＦとヘパリン投与群（Ｈ群）（Ｄ群及びＨ群はＯＣＩＦ量として０．５ｍｇ／ｋｇ投与）、ＯＣＩＦ単独投与群（ＯＣＩＦ量として０．５ｍｇ／ｋｇ及び５ｍｇ／ｋｇ投与）、及び溶媒投与群として準備した。４週齢の雌性ウィスター系ラットに２ｍｌ／ｋｇの用量で静脈内単回投与した。投与３時間後に眼窩採血を行い血清を調製し、得られた血清中のカルシウム濃度をカルシウムＣテスト（和光純薬社）を用いて測定した。結果を第１図に示す。この結果、種々のデキストラン硫酸あるいはヘパリンを添加した０．５ｍｇ／ｋｇヒトＯＣＩＦ投与により、有意な血清カルシウム濃度低下作用の増強効果が認められた。従って、多糖類の添加により、ヒトＯＣＩＦの血清カルシウム濃度低下作用を増強できることが確認された。
〔実施例３〕
多糖類の添加量によるＯＣＩＦの作用増強効果
実施例２と同様に調製したヒトＯＣＩＦ  ０．２５ｍｇ／ｍｌ溶液２ｍｌに、ヒトＯＣＩＦに対してデキストラン硫酸（分子量５０００：和光純薬社）１，２，４，８，１６倍重量を溶解した後、４℃で一昼夜放置した。同様に、ヘパリン（２０７．８ｕｎｉｔｓ／ｍｇ：和光純薬社）も同じ比率でヒト型ＯＣＩＦ  ０．２５ｍｇ／ｍｌ溶液２ｍｌに溶解し、４℃で一昼夜放置した。
さらに、４ｍｇ／ｍｌに調製したデキストラン硫酸またはヘパリン溶液、０．２５及び２．５ｍｇ／ｍｌに調製したヒトＯＣＩＦ溶液、及び溶媒のみについても、同様に４℃で一昼夜放置した。これらの被験試料液を、４週齢の雌性ウィスター系ラットに２ｍｌ／ｋｇの用量で静脈内単回投与し、投与３時間後に眼窩採血を行い、血清を調製した。得られた血清中のカルシウム濃度を、カルシウムＣテスト（和光純薬社）を用いて測定した。なお、このキットは、キレート法（オルトクレゾールフタレインコンプレキソン（ＯＣＰＣ）法）に８−キノリノールを添加し、マグネシウムの影響を除き、特異性を高めたもので、アルカリ条件下でＯＣＰＣと結合して紫紅色を呈し、その吸光度を測定することにより、カルシウム濃度を測定できるものである。結果を第２図に示す。この結果、デキストラン硫酸を、ヒトＯＣＩＦに対し４倍量以上添加した場合に、有意な血清カルシウム濃度低下作用が認められた。また、ヘパリンを、ヒトＯＣＩＦに対し等量を添加した場合でも、有意な血清カルシウム濃度低下作用が認められた。従って、ヒトＯＣＩＦと多糖類を特定の割合で同時に投与することにより、ＯＣＩＦの血清カルシウム濃度低下作用がさらに増強されることが確認された。
〔実施例４〕
多糖類の添加によるＯＣＩＦの持続性増強効果
溶媒で調製したヒトＯＣＩＦ  ２．５ｍｇ／ｍｌ溶液２ｍｌに、デキストラン硫酸（分子量５０００：和光純薬社）２０ｍｇを溶解した後、４℃で一昼夜放置した。ヘパリン（２０７．８ｕｎｉｔｓ／ｍｇ：和光純薬社）２０ｍｇもヒトＯＣＩＦ  ２．５ｍｇ／ｍｌ溶液２ｍｌに溶解し、同様に４℃で一昼夜放置した。さらに、２．５ｍｇ／ｍｌに調製したヒトＯＣＩＦ溶液及び溶媒についても、４℃で一昼夜放置した。得られた被験試料液を、４週齢の雌性ウィスター系ラットにそれぞれ２ｍｌ／ｋｇ（ＯＣＩＦ量として５ｍｇ／ｋｇ）の用量で静脈内単回投与し、投与３，６，９時間後に眼窩採血を行い、血清を調製した。得られた血清中のカルシウム濃度を、カルシウムＣテスト（和光純薬社）を用いて測定した。結果を第３図に示す。この結果、５ｍｇ／ｋｇヒトＯＣＩＦ溶液単独投与群では、投与３時間後で有意な血清カルシウム濃度の低下は認められたものの、投与６及び９時間には血清カルシウム濃度低下作用は認められなかった。
一方、ヒトＯＣＩＦに対して４倍量のデキストラン硫酸またはヘパリンを添加した２．５ｍｇ／ｍｌヒトＯＣＩＦ溶液は、投与９時間後でも有意な血清カルシウム濃度低下作用を有することが認められた。従って、ヒトＯＣＩＦと多糖類を同時に投与することにより、持続性増強効果が得られることが確認された。
〔実施例５〕
多糖類の添加による血中ＯＣＩＦ濃度の持続効果・１
実施例２と同様に調製したヒトＯＣＩＦ  １ｍｇ／ｍｌ溶液１ｍｌにデキストラン硫酸４ｍｇ／ｍｌ溶液１ｍｌを加え、４℃で一昼夜放置した。この被験試料液を、９週齢の雄性ウィスター系ラットに１ｍｌ／ｋｇの用量で静脈内単回投与し、投与２，５，１０，１５，３０，４５，６０，１２０，２４０，３６０，４８０，６００，７２０，１４４０分後に眼窩採血を行い血清を調製した。得られた血清中のヒトＯＣＩＦ濃度を、ダイマー型ＯＣＩＦを認識するモノクローナル抗体、モノマー型ＯＣＩＦを認識するモノクローナル抗体（ＢＩＯＣＨＥＭＩＣＡＬ  ＡＮＤ  ＢＩＯＰＹＳＩＣＡＬ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ  ＣＯＭＭＵＮＩＣＡＴＩＯＮＳ，Ｖｏｌ．２４５，ｐｐ３８２−３８７（１９９８））を用いて、ＷＯ９６／２６２１７号公報記載のＥＬＩＳＡ法により測定した。尚、全ＯＣＩＦ濃度は、ダイマー型ＯＣＩＦ濃度とモノマー型ＯＣＩＦ濃度の和として求めた。結果を第４図及び第５図に示す。この結果、５００μｇ／ｋｇヒトＯＣＩＦ溶液単独投与群に比べて、ヒトＯＣＩＦに対して４倍量のデキストラン硫酸を添加したヒトＯＣＩＦ溶液投与群は、明らかに高い血中ＯＣＩＦ濃度を維持した（第４図）。また、ダイマー型ＯＣＩＦからモノマー型ＯＣＩＦへの血中で変換が抑制されることが確認された（第５図）。従って、多糖類を添加することにより、ＯＣＩＦ血中濃度、特に血清カルシウム濃度低下活性の高いダイマー型ＯＣＩＦ（ＢＩＯＣＨＥＭＩＣＡＬ  ＡＮＤ  ＢＩＯＰＨＹＳＩＣＡＬ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ  ＣＯＭＭＵＮＩＣＡＴＩＯＮＳ，Ｖｏｌ．２４５，ｐｐ３８２−３８７（１９９８））の血中濃度が持続される。
〔実施例６〕
多糖類の添加による血中ＯＣＩＦ濃度の持続効果・２
実施例２と同様に調製したヒトＯＣＩＦ  ０．２５ｍｇ／ｍｌ溶液２ｍｌに、デキストラン硫酸、リンゴペクチン、又は甘皮類ペクチン（全て和光純薬社）の０．５％溶液（溶媒：０．１５Ｍ  ＮａＣｌ，０．０１％ポリソルベート８０含有１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０））を等量混合し、室温にて４時間放置し、被験試料液を作製した。又、対照として０．２５ｍｇ／ｍｌ  ＯＣＩＦ溶液（２ｍｌ）のみについても、同様に溶媒を等量混合し室温にて４時間放置した。これらの被験試料液を、４週齢の雄性ウィスター系ラットに２ｍｌ／ｋｇの用量で静脈内単回投与し、投与２及び４時間後にエーテル麻酔下で眼窩採血を行い血清を調製した。得られた血清中のヒト型ＯＣＩＦ濃度を、ＷＯ９６／２６２１７号公報記載のＥＬＩＳＡ法を用いて測定した。結果を第６図に示す。
又、前述と同様の方法で、ヒトＯＣＩＦ  ０．２５ｍｇ／ｍｌ溶液２ｍｌに、デキストラン硫酸、リンゴペクチン、又はカラギーナン（ラムダ）（全て和光純薬社）の０．５％溶液を等量混合し、室温にて４時間放置し、被験試料液を調製した。又、対照として０．２５ｍｇ／ｍｌ  ＯＣＩＦ溶液のみについても、同様に溶媒を等量混合し室温にて４時間放置した。これらの被験試料液を、４週齢の雄性ウィスター系ラットに２ｍｌ／ｋｇの用量で静脈内単回投与し、投与２及び４時間後にエーテル麻酔下で眼窩採血を行い血清を調製した。得られた血清中のヒト型ＯＣＩＦ濃度を、ＷＯ９６／２６２１７号公報記載のＥＬＩＳＡ法を用いて測定した。結果を第７図に示す。
これらの結果、ヒト型ＯＣＩＦ溶液単独投与群に比べて、デキストラン硫酸、リンゴペクチン、甘皮類ペクチンを添加したいずれの被験試料投与群でも、明らかに高い血中ＯＣＩＦ濃度を維持した（第６図）。また、カラギーナンを添加した被験試料投与群でも同様に、明らかに高い血中ＯＣＩＦ濃度を維持した（第７図）。よって、これらの多糖類を添加することにより、ＯＣＩＦの血中濃度が持続されることが確認された。
〔実施例７〕
多糖類の添加による血中ＯＣＩＦ濃度の持続効果・３
多糖類としてデキストラン硫酸あるいはリンゴペクチン（和光純薬社）を用いて、投与経路の違いによる血中ＯＣＩＦの持続効果を検討した。溶媒（０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１％ポリソルベート８０含有１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０））でヒトＯＣＩＦを静脈投与用は５０μｇ／ｍｌ、筋肉内投与用は１０００μｇ／ｍｌになるように希釈したＯＣＩＦ溶液を準備し、これに上述の多糖類を加え、それぞれ被験試料液とした。この時、デキストラン硫酸は静脈投与用あるいは筋肉内投与用ＯＣＩＦ溶液に、それぞれ０．１％になるように添加した。又、リンゴペクチンは、溶媒に溶解して３ｍｇ／ｍｌに調製した溶液を、２倍量の静脈投与用あるいは筋肉内投与用ＯＣＩＦ溶液（それぞれ１００μｇ／ｍｌ及び２０００μｇ／ｍｌ  ＯＣＩＦ含有）に等量混合した。それぞれの溶液を４週齢の雄性ウィスター系ラットに１ｍｌ／ｋｇの用量で単回投与した。投与後、静脈内投与は２，５，１０，１５，３０，４５，６０，１２０，２４０，３６０分後に、筋肉内投与は３０分、１，２，３，４，５，６，８，１０，２４時間後に、それぞれエーテル麻酔下で眼窩採血を行い血清を調製した。得られた血清のヒト型ＯＣＩＦ濃度を、ＷＯ９６／２６２１７号公報記載のＥＬＩＳＡ法を用いて測定した。結果を第８図及び第９図に示す。
この結果、デキストラン硫酸あるいはリンゴペクチンを添加したＯＣＩＦ溶液の、静脈内投与（第８図）あるいは筋肉内投与（第９図）において、明らかに高い血中ＯＣＩＦ濃度を維持した。よって、これらの多糖類を添加することにより、ＯＣＩＦの血中濃度が持続されること、及び血中ＯＣＩＦ濃度の持続効果は投与経路にかかわらず観察されることが確認された。
〔実施例８〕
多糖類の添加によるＯＣＩＦの血清カルシウム濃度低下効果・２
実施例２と同様に調製したヒトＯＣＩＦ  ０．２５ｍｇ／ｍｌ溶液２ｍｌに対して、リンゴペクチン（和光純薬社）の０．５％溶液（溶媒：０．１５Ｍ  ＮａＣｌ，０．０１％ポリソルベート含有１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０））を等量混合し、室温にて４時間放置し、被験試料液を調製した。同時に、ＯＣＩＦ溶液（ヒトＯＣＩＦ  ０．２５ｍｇ／ｍｌ溶液２ｍｌ）に溶媒を等量混合したもの、及び溶媒のみを用意した。それぞれの被験試料液を、４週齢の雄性ウィスター系ラットに２ｍｌ／ｋｇの割合で静脈内単回投与した。投与４時間後にエーテル麻酔下で眼窩採血を行い血清を調製し、得られた血清中のカルシウム濃度をカルシウムＣテスト（和光純薬社）を用いて測定した。結果を第１０図に示す。この結果、０．５ｍｇ／ｋｇヒト型ＯＣＩＦ溶液単独投与群では血清カルシウム濃度低下作用は認められなかったが、リンゴペクチンを添加した０．５ｍｇ／ｋｇヒト型ＯＣＩＦ投与群では、有意な血清カルシウム濃度低下作用が認められた。従って、多糖類の添加により、ヒト型ＯＣＩＦの血清カルシウム濃度低下作用を増強できることが確認された。
産業上の利用可能性
本発明により、破骨細胞形成抑制因子、その類縁体、またはその変異体から選択される一以上の物質、及び多糖類またはその誘導体からなる骨代謝異常症治療剤が提供される。本発明により、骨粗鬆症、高カルシウム血症、慢性関節リウマチ等の骨代謝疾患に対して優れた治療効果を有し、その活性を長時間維持できる骨代謝異常症治療剤が提供され、医薬として有用である。
【図面の簡単な説明】
第１図は、実施例２における、ＯＣＩＦに多糖類を添加した製剤の、投与３時間後の血清カルシウム濃度を示す。
〔符号の説明〕
Ｄ−１：ＯＣＩＦ  ０．５ｍｇ／ｋｇ＋デキストラン硫酸（分子量５，０００）２ｍｇ／ｋｇ
Ｄ−２：ＯＣＩＦ  ０．５ｍｇ／ｋｇ＋デキストラン硫酸（分子量８，０００）２ｍｇ／ｋｇ
Ｄ−３：ＯＣＩＦ  ０．５ｍｇ／ｋｇ＋デキストラン硫酸（分子量１０，０００）２ｍｇ／ｋｇ
Ｈ−１：ＯＣＩＦ  ０．５ｍｇ／ｋｇ＋ヘパリン（２０７．８ｕｎｉｔｓ／ｍｇ）２ｍｇ／ｋｇ
Ｈ−２：ＯＣＩＦ  ０．５ｍｇ／ｋｇ＋ヘパリン（１７１．２ｕｎｉｔｓ／ｍｇ）２ｍｇ／ｋｇ
Ｈ−３：ＯＣＩＦ  ０．５ｍｇ／ｋｇ＋ヘパリン（分子量３，０００）２ｍｇ／ｋｇ
Ｈ−４：ＯＣＩＦ  ０．５ｍｇ／ｋｇ＋ヘパリン（分子量６，０００）２ｍｇ／ｋｇ
＊＊：危険率１％以下で有意差あり
第２図は、実施例３における、ＯＣＩＦと多糖類の混合比を変えて投与した時の、投与３時間後の血清カルシウム濃度を示す。
〔符号の説明〕
＊＊：危険率１％以下で有意差あり
第３図は、実施例４における、ＯＣＩＦに多糖類を添加した製剤を投与した時の、投与３，６，９時間後のそれぞれの血清カルシウム濃度を示す。
〔符号の説明〕
＊＊：危険率１％以下で有意差あり
第４図は、実施例５における、ＯＣＩＦに多糖類を添加した製剤を投与した時の、経時的な血中ＯＣＩＦ濃度の変化を示す。
〔符号の説明〕
Ａ：ダイマー型ＯＣＩＦの血中濃度を示す図。
Ｂ：モノマー型ＯＣＩＦの血中濃度を示す図。
●：ＯＣＩＦ
○：ＯＣＩＦ＋デキストラン硫酸
第５図は、実施例５おける、ＯＣＩＦに多糖類を添加した製剤を投与した時の、モノマー型／ダイマー型ＯＣＩＦの血中における割合の経時変化を示す。
〔符号の説明〕
Ａ：ＯＣＩＦ
Ｂ：ＯＣＩＦ＋デキストラン硫酸
○：ダイマー型ＯＣＩＦ
△：モノマー型ＯＣＩＦ
第６図は、実施例６における、ＯＣＩＦに多糖類（デキストラン硫酸、リンゴペクチン又は甘皮類ペクチン）を添加した製剤の、投与後２及び４時間後の血中ＯＣＩＦ濃度を示す。
［符号の説明］
□：０．５ｍｇ／ｋｇ  ＯＣＩＦ単独投与
◇：０．５ｍｇ／ｋｇ  ＯＣＩＦ＋０．５％デキストラン硫酸
○：０．５ｍｇ／ｋｇ  ＯＣＩＦ＋０．５％リンゴペクチン
△：０．５ｍｇ／ｋｇ  ＯＣＩＦ＋０．５％甘皮類ペクチン
第７図は、実施例６における、ＯＣＩＦに多糖類（デキストラン硫酸、リンゴペクチン又はカラギーナン）を添加した製剤の、投与後２及び４時間後の血中ＯＣＩＦ濃度を示す。
［符号の説明］
□：０．５ｍｇ／ｋｇ  ＯＣＩＦ単独投与
◇：０．５ｍｇ／ｋｇ  ＯＣＩＦ＋０．５％デキストラン硫酸
○：０．５ｍｇ／ｋｇ  ＯＣＩＦ＋０．５％リンゴペクチン
△：０．５ｍｇ／ｋｇ  ＯＣＩＦ＋０．５％カラギーナン（ラムダ）
第８図は、実施例７における、ＯＣＩＦに多糖類（デキストラン硫酸又はリンゴペクチン）を添加した製剤の、静脈内投与後の血中ＯＣＩＦ濃度を示す。
［符号の説明］
○：５０μｇ／ｋｇ  ＯＣＩＦ単独投与
△：５０μｇ／ｋｇ  ＯＣＩＦ＋０．１％デキストラン硫酸
□：５０μｇ／ｋｇ  ＯＣＩＦ＋０．１５％リンゴペクチン
第９図は、実施例７における、ＯＣＩＦに多糖類（デキストラン硫酸又はリンゴペクチン）を添加した製剤の、筋肉内投与後の血中ＯＣＩＦ濃度を示す。
［符号の説明］
○：１ｍｇ／ｋｇ  ＯＣＩＦ単独投与
△：１ｍｇ／ｋｇ  ＯＣＩＦ＋０．１％デキストラン硫酸
：１ｍｇ／ｋｇ  ＯＣＩＦ＋０．１５％リンゴペクチン
第１０図は、実施例８における、ＯＣＩＦに多糖類（リンゴペクチン）を添加した製剤の、投与４時間後の血清カルシウム濃度を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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