(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも二組のインレットとアウトレットの組み合わせを有し、少なくとも四つの流路が接続可能なステーターと、
前記インレット及びアウトレットの全ての組み合わせで順次接続する流路を形成するように回転して切替えられるローターとからなる流路切替バルブにおいて、
前記インレットとアウトレットの前記ローターに対向する開口は、前記ローターの回転軸に対して放射状に配設され、
前記ローターは前処理用カラムを備え、
少なくとも一組の前記インレットおよびアウトレットの組み合わせが前記前処理用カラムを介して接続されることを特徴とする流路切替バルブ。
【請求項２】
少なくとも三組のインレットとアウトレットの組み合わせを有し、少なくとも六つの流路が接続可能なステーターと、
前記インレット及びアウトレットの全ての組み合わせで順次接続する流路を形成するように回転して切替えられるローターとからなる流路切替バルブを備え、
前記流路切替えバルブは、前記インレットとアウトレットの前記ローターに対向する開口が前記ローターの回転軸に対して放射状に配設され、
前記ローターは前処理用カラムを備え、
少なくとも一組の前記インレットおよびアウトレットの組み合わせが前記前処理用カラムを介して接続され、
前記流路切替バルブの前記インレットおよびアウトレットの第１の組のインレットに第１の分離カラムに接続される流路を接続し、
前記流路切替バルブの前記インレットおよびアウトレットの第２の組のアウトレットに第２の分離カラムに接続される流路を接続したこと
を特徴とする高速液体クロマトグラフ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する分野】
本発明は、液体中に含まれる成分の分離分析を行う高速液体クロマトグラフ（以下、ＨＰＬＣ装置と呼ぶ）に関する。さらに詳しくは、複雑なマトリックスを有する試料に含まれる特定の目的成分の効率的な分析を行う高速液体クロマトグラフに関する。
【０００２】
【従来の技術】
製薬やライフサイエンス業界においては病気の予防や治療を目的として、特定の病気に作用する化合物の探索、病気のメカニズムを解明するための生体内での反応の研究、将来的に病気を引き起こす可能性を予測するために各人の体内に存在する遺伝子やタンパク・ペプチドなどの同定や定量を行うといった様々な目的で、複雑なマトリックスを有する試料に含まれる微量の目的成分を高精度に測定する必要がある。こうした目的に対応する分析方法のひとつとして高速液体クロマトグラフィー（以下、ＨＰＬＣと呼ぶ）は非常に優れた特性を有しているため広く使われている。
【０００３】
ＨＰＬＣでは、移動相送液ポンプ・試料注入装置・分離カラム・検出器を最小要件として備えたＨＰＬＣ装置が使用される。多くの成分を含んだ複雑なマトリックスを有する試料中の微量目的成分の分析には、近年急速に普及しつつある液体クロマトグラフ質量分析計（以下、ＬＣ／ＭＳと呼ぶ）が極めて有効な分析装置として多用されるようになってきたが、ＬＣ／ＭＳによる分析を行う際にも多くの場合、十分な感度や精度を確保するために、目的成分のクリーンアップ、濃縮、溶媒の脱塩、置換などの高度な前処理や、複数の分離モードでの分離を連続して行う多次元分離をあらかじめ行う必要がある。
【０００４】
分析のスループットの向上、高い精度の確保、省力化などのためには、こうした処理を自動化することが必須であるが、通常こうした工程の自動化には多数の切替バルブを使用した複雑なシステムを必要としていた。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
多数の流路切替バルブを使用した自動化システムは、０．１ｍＬ／ｍｉｎ．以上の比較的高い流量で使用する場合には、システムが複雑化し価格が高くなるという欠点を有するものの、実用的に使用することが可能であると考えられる。しかしながら最近、試料・移動相溶媒の低減に加えてＬＣ／ＭＳにおける感度の飛躍的な向上を目的とした分析サイズのミクロ化が急速に進みつつあり、０．０２ｍＬ／ｍｉｎ．以下、場合によっては数μＬ／ｍｉｎ．から数百ｎＬ／ｍｉｎ．のごく低流量での使用が実用化されている。このようなシステムにおいては、多数の流路切替バルブの使用は流路のデッドボリュームを増加させ、各成分の分離ピークに著しい広がりをもたらし、分離性能低下の原因となる。このため、オンラインで行うことが可能な前処理の内容や多次元分離の自動化が制限されている。
【０００６】
本発明は、上記問題を解決するためになされたものであり、分離性能の低下をもたらすことなく、高度な前処理や多次元分離の自動化を可能とするＨＰＬＣ装置を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
上記問題を解決するため、なされた本発明は、少なくとも二組のインレットとアウトレットの組み合わせを有し、少なくとも四つの流路が接続可能なステーターと、前記インレット及びアウトレットの全ての組み合わせで順次接続する流路を形成するように回転して切替えられるローターとからなる流路切替バルブにおいて、前記インレットとアウトレットの前記ローターに対向する開口は、前記ローターの回転軸に対して放射状に配設され、前記ローターは前処理用カラムを備え、少なくとも一組の前記インレットおよびアウトレットの組み合わせが前記前処理用カラムを介して接続されることを特徴とする流路切替バルブである。
【０００８】
また、少なくとも三組のインレットとアウトレットの組み合わせを有し、少なくとも六つの流路が接続可能なステーターと、前記インレット及びアウトレットの全ての組み合わせで順次接続する流路を形成するように回転して切替えられるローターとからなる流路切替バルブを備え、前記流路切替えバルブは、前記インレットとアウトレットの前記ローターに対向する開口が前記ローターの回転軸に対して放射状に配設され、前記ローターは前処理用カラムを備え、少なくとも一組の前記インレットおよびアウトレットの組み合わせが前記前処理用カラムを介して接続され、前記流路切替バルブの前記インレットおよびアウトレットの第１の組のインレットに第１の分離カラムに接続される流路を接続し、前記流路切替バルブの前記インレットおよびアウトレットの第２の組のアウトレットに第２の分離カラムに接続される流路を接続したことを特徴とする高速液体クロマトグラフである。
【０００９】
少なくとも二組のインレットとアウトレットの組み合わせを有した流路切替バルブの一組のインレットとアウトレットには、移動相送液ポンプと試料注入装置を備えた流路と、分離カラムに接続される流路が接続され、他の一組のインレットとアウトレットには前処理用の溶媒およびこの溶媒を送液するポンプを備えた流路と、分離カラムに接続される流路が接続される。これら二組のインレットおよびアウトレットを切替可能とすることにより、一つの流路切替バルブのみで前処理を自動化することが可能となる。これにより、デッドボリュームの増加はほとんどなく、分離性能の低下は起こらない。また、少なくとも三組のインレットとアウトレットの組み合わせを有した流路切替バルブの一組のインレットとアウトレットには、移動相送液ポンプおよび試料注入装置および一次元目の分離カラムを備えた流路と、ドレイン流路が接続され、別の一組のインレットとアウトレットには前処理用の溶媒およびこの溶媒を送液するポンプを備えた流路と、ドレインに接続される流路が接続され、残りの一組のインレットとアウトレットには移動相送液ポンプを備えた流路と、二次元目の分離カラムを備えた流路が接続される。これら三組のインレットおよびアウトレットを切替可能とすることにより、一つの流路切替バルブのみで前処理を自動化可能とした２次元液体クロマトグラフを構成することができる。これにより、複数の分離を並行して行うことができ、分離性能の低下なしに、スループットの向上も同時に可能となる。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態を図を参照しながら詳細に説明する。図１は、本発明の液体クロマトグラフの一実施例の概略構成図であり、移動相１、２、３、４と、送液用のポンプ５、６、７、８と、オートサンプラ９と、流路切替バルブ１０と、トラップカラム１１と、分離カラム１２および検出器１３から構成されている。流路切替バルブ１０は、回転可能なローター２１（外側の円盤）と回転不可能なステータ３１（内側の円盤）を有している。ローター２１はインレット２３とアウトレット２６を有し、インレット２３とアウトレット２６は対になっている。ステータ３１は３つのインレット３３、３４、３５と３つのアウトレット３６、３７、３８を有しており、インレット３３とアウトレット３６、インレット３４とアウトレット３７、インレット３５とアウトレット３８はそれぞれ対になっている。インレット２３およびアウトレット２６にはトラップカラム１１が接続されている。インレット３３には試料注入用の移動相１が接続され、インレット３４にはトラップカラム１１洗浄用の目的成分精製用の移動相２が接続され、インレット３５には分析用の移動相３、４が接続され、アウトレット３８には分離用カラム１２が接続される。
【００１１】
流路切替バルブ１０は、回転可能なローター２１と回転不可能なステータ３１を有し、ローター２１を回転させることによりポジションを切替ることができる。図２に回転可能なローター２１と回転不可能なステータ３１とのポジションを示す。図２のポジションＡで、インレット２３とインレット３３およびアウトレット２６とアウトレット３６が接続される。オートサンプラ９から注入された試料は、ポンプ５により送り出される移動相１に乗ってインレット３３に接続されており、インレット３３に接続されたインレット２３からトラップカラム１１に搬送される。トラップカラム１１に試料はトラップされる。次に、ローター２１を回転させ図２のポジションＢに切替る。ポジションＢで、インレット２３とインレット３４およびアウトレット２６とアウトレット３７が接続される。インレット３４には移動相２およびポンプ６が接続されており、トラップカラム１１には、ポンプ６により送り出される目的成分精製用の移動相２がインレット３４からインレット２３を通って流れ、目的成分精製用の移動相２により洗浄され、目的成分はトラップカラム１１に保持されたままの状態で、目的成分より保持の弱い夾雑成分が洗い出され、アウトレット２６を通ってアウトレット３７より排出される。その後、ローター２１を回転させ図２のポジションＣに切替、ポジションＣで、インレット２３とインレット３５およびアウトレット２６とアウトレット３８が接続される。インレット３５には移動相３、４およびポンプ７、８が接続されており、トラップカラム１１には、ポンプ７、８により送り出された分析用の移動相３、４の混合液がインレット３５からインレット２３を通って流れ、トラップカラム１１中の目的成分は分離カラム１２に導入され分離が行われた後、検出器１３で検出される。トラップカラム１１中の目的成分が分離カラム１２に定量的に導入された段階で、流路切替バルブ１０のポジションは図２のポジションＡと点対称の関係にあるポジションに戻り、ポジションＡで、インレット２３とアウトレット３６およびアウトレット２６とインレット３３が接続され、試料注入用の移動相１によりトラップカラム１１を一定時間エージングした後、ローター２１を回転させることにより再びポジションＡにもどり、以後同じ動作が繰り返される。
【００１２】
図３に流路切替バルブ１０の構造を示す。ローター２１のインレット２３およびアウトレット２６とステータ３１のインレット３３、３４、３５およびアウトレット３６、３７、３８はローター２１を回転させることにより、配管３９により必要な組み合わせで接続される。
【００１３】
図２中ポジションＡにおいては、デッドボリュームはインレット２３とインレット３３を接続する配管３９の容量と、アウトレット２６とアウトレット３６を接続する配管３９の容量のみであり、カラム容量と比較するとほとんど無視できる容量であり、分離性能の低下は起こらない。同様に、ポジションＢにおいては、デッドボリュームはインレット２３とインレット３４を接続する配管３９の容量と、アウトレット２６とアウトレット３７を接続する配管３９の容量のみであり、ポジションＣにおいては、デッドボリュームはインレット２３とインレット３５を接続する配管３９の容量と、アウトレット２６とアウトレット３８を接続する配管３９の容量のみであり、いずれも無視し得る容量である。
【００１４】
これにより、前処理操作の自動化と分離カラム１２への接続を流路切替バルブ１０のみを用いることにより簡便かつ自動的に行うことが可能となり、デッドボリュームの増加はほとんどなく、分離性能の低下は起こらない。
【００１５】
図４は、本発明の液体クロマトグラフの第２の実施例の概略構成図であり、２次元ＨＰＬＣ装置への応用である。移動相２、３、４と、送液用のポンプ５、６、７、８と、オートサンプラ９と、流路切替バルブ１０と、トラップカラム１１および検出器１３から構成されている部分は図１における第１の実施例と同様である。また、流路切替バルブ１０の構造も図１における第１の実施例と同様である。試料注入用の移動相には組成の異なる移動相４１、４２、４３、４４が接続され、１次元目の分離カラム４６と２次元目の分離カラム４７から構成されている。
【００１６】
タンパク質、ペプチドを分離するための２次元ＨＰＬＣにおいて、検出器１３にＬＣ／ＭＳを使用する場合、１次元目の分離カラム４６に陽イオン交換カラム、２次元目の分離カラム４７に逆相カラムを用いることが多く、通常陽イオン交換クロマトグラフィーでは高塩濃度の移動相でｐＨを酸性から塩基性に段階的に切替る。このために、試料注入用の移動相には組成の異なる移動相４１、４２、４３、４４が接続されている。試料中のタンパク質、ペプチドは、そのｐＨにおける電荷に応じて、分離カラム４６から順次溶出するので、各分画を２次元目の分離カラム４７に順次導入することにより高い分離能が得られる。
【００１７】
流路切替バルブ１０の動作は第１の実施例と同様であり、図２のポジションＡで、インレット２３とインレット３３およびアウトレット２６とアウトレット３６が接続される。オートサンプラ９から注入された試料は、ポンプ５により送り出される移動相４１に乗って、分離カラム４６で分離された後、インレット３３に接続されており、インレット３３に接続されたインレット２３からトラップカラム１１に搬送される。トラップカラム１１に試料はトラップされる。次に、ローター２１を回転させ図２のポジションＢに切替る。ポジションＢで、インレット２３とインレット３４およびアウトレット２６とアウトレット３７が接続される。インレット３４には移動相２およびポンプ６が接続されており、トラップカラム１１には、ポンプ６により送り出される目的成分精製用の移動相２がインレット３４を通ってインレット２３から流れ、目的成分精製用の移動相２により洗浄され、目的成分はトラップカラム１１に保持されたままの状態で、目的成分より保持の弱い夾雑成分が洗い出され、アウトレット２６を通ってアウトレット３７より排出される。この場合の洗い出しは、移動相４１に含まれる塩を脱塩することが主要な目的である。その後、ローター２１を回転させ図２のポジションＣに切替、ポジションＣで、インレット２３とインレット３５およびアウトレット２６とアウトレット３８が接続される。インレット３５には移動相３、４およびポンプ７、８が接続されており、ポンプ７、８により送り出された分析用の移動相３、４の混合液がインレット３５を通ってインレット２３からトラップカラム１１に導入され、トラップカラム１１中の目的成分が２次元目の分離カラム４７に導入され分離が行われた後、検出器１３で検出される。トラップカラム１１中の目的成分が分離カラム４７に定量的に導入された段階で、ポジションＡにもどり、ポンプ５には移動相４２が接続され、以後同じ動作が繰り返される。
【００１８】
第２の実施例においても、図２中ポジションＡにおいては、デッドボリュームはインレット２３とインレット３３を接続する配管３９の容量と、アウトレット２６とアウトレット３６を接続する配管３９の容量のみであり、ポジションＢにおいては、デッドボリュームはインレット２３とインレット３４を接続する配管３９の容量と、アウトレット２６とアウトレット３７を接続する配管３９の容量のみであり、ポジションＣにおいては、デッドボリュームはインレット２３とインレット３５を接続する配管３９の容量と、アウトレット２６とアウトレット３８を接続する配管３９の容量のみであり、いずれも無視し得る容量である。
【００１９】
図５は、本発明の液体クロマトグラフの第３の実施例の概略構成図であり、２次元ＨＰＬＣ装置への応用である。移動相４１、４２、４３、４４、２、３、４と、送液用のポンプ５、６、７、８と、オートサンプラ９と、流路切替バルブ１０と、１次元目の分離カラム４６と２次元目の分離カラム４７および検出器１３から構成されている部分は図１における第１の実施例と同様である。流路切替バルブ１０回転可能なローター２１は４つのインレット５１、５２、５３、５４と４つのアウトレット５５、５６、５７、５８を有し、インレット５１とアウトレット５５、インレット５２とアウトレット５６、インレット５３とアウトレット５７、インレット５４とアウトレット５８はそれぞれ対になっている。ステータ３１は第１および第２の実施例と同様の構造を有している。本実施例においては、４つのトラップカラム６１、６２、６３、６４がそれぞれインレット５１とアウトレット５５、インレット５２とアウトレット５６、インレット５３とアウトレット５７、インレット５４とアウトレット５８に接続されている。インレット３３には試料注入用の移動相４１、４２、４３、４４が接続され、インレット３４にはトラップカラム６１、６２、６３、６４洗浄用の目的成分精製用の移動相２が接続され、インレット３５には分析用の移動相３、４が接続され、アウトレット３８には分析用カラム１２が接続される。
【００２０】
次に動作について説明する。まず、インレット５１とインレット３３およびアウトレット５５とアウトレット３６が接続される。インレット３３には分離カラム４６が接続されており、オートサンプラ９から注入された試料は、ポンプ５により送り出される移動相４１に乗って、分離カラム４６で分離された後、インレット３３を通ってインレット５１からトラップカラム６１に搬送される。トラップカラム６１に試料はトラップされる。ポンプ５により送り出される移動相は、一定時間ごとに移動相４１、４２、４３、４４と切替られる。また、流路切替バルブ１０も一定時間ごとにポジションが切替られ、ローター２１を回転させ、インレット５１とインレット３４およびアウトレット５５とアウトレット３７が接続される。インレット３４には移動相２およびポンプ６が接続されており、トラップカラム６１には、ポンプ６により送り出される目的成分精製用の移動相２が流れ、目的成分精製用の移動相２により洗浄され、目的成分はトラップカラム６１に保持されたままの状態で、目的成分より保持の弱い夾雑成分が洗い出され、アウトレット３７を通ってアウトレット５５より排出される。この場合の洗い出しも、移動相４１に含まれる塩を脱塩することが主要な目的である。この時、同時にインレット５２とインレット３３およびアウトレット５６とアウトレット３６が接続される。インレット３３には分離カラム４６が接続されており、オートサンプラ９から注入された試料は、ポンプ５により送り出される移動相４１、４２、４３あるいは４４に乗って、インレット３３からインレット５２を通って分離カラム４６に達し、分離カラム４２で分離された後、トラップカラム６２に搬送される。トラップカラム６２に試料はトラップされる。
【００２１】
その後、ローター２１を回転させ、インレット５１とインレット３５およびアウトレット５５とアウトレット３８が接続される。インレット３５には移動相３、４およびポンプ７、８が接続されており、ポンプ７、８により送り出された分析用の移動相３、４の混合液がインレット３５を通ってインレット５１からトラップカラム６１に導入され、トラップカラム６１中の目的成分が移動相３、４の混合液により２次元目の分離カラム４７に導入され分離が行われた後、検出器１３で検出される。この時、同時にインレット５２とインレット３４およびアウトレット５６とアウトレット３７が接続される。インレット３４には移動相２およびポンプ６が接続されており、トラップカラム６２には、ポンプ６により送り出される目的成分精製用の移動相２がインレット３４を通ってインレット５１から流れ、目的成分精製用の移動相２により洗浄され、目的成分はトラップカラム６２に保持されたままの状態で、目的成分より保持の弱い夾雑成分が洗い出され、アウトレット３７を通ってアウトレット５６より排出される。さらに同時にインレット５３とインレット３３およびアウトレット５７とアウトレット３６が接続される。インレット３３には分離カラム４６が接続されており、オートサンプラ９から注入された試料は、ポンプ５により送り出される移動相４１、４２、４３あるいは４４に乗って、分離カラム４６で分離された後、インレット３３を通ってインレット５３からトラップカラム６３に搬送される。トラップカラム６３に試料はトラップされる。以降、インレット３３、３４、３５とインレット５１〜５４およびアウトレット３６、３７、３８とアウトレット５５〜５８が順次接続され、１次元目の分離カラム４６から溶出される各分画成分がトラップカラム６１〜６４にトラップされ、移動相２により洗浄・脱塩が行われ、移動相３、４により２次元目の分離カラム４７により、分離・分析が行われる。
【００２２】
ここでは、１次元目の分離カラム４６からの溶出成分のトラップ、精製・脱塩、２次元目の分離カラム４７による分離・分析を並行して行うことができる。デッドボリュームは実施例１、２と同様に無視し得る容量であり、分離性能の低下なしに、複数の分離を並行して行うことができ、スループットの向上も同時に可能となる。
【００２３】
以上、本発明の実施例を説明したが、本発明は上記実施例に限定されるものではなく、特許請求の範囲に記載された本発明の要旨の範囲内で種々の変更を行うことができる。例えば、第２および第３の実施例において、試料注入用の移動相には組成の異なる移動相４１、４２、４３、４４を接続しているが、この数に制限はない。第２に実施例において、トラップカラム１１による目的成分の保持をより確実にするため、もう１流路足してトラップカラムをもう一つ加え、一方のトラップカラムによるトラップの動作と、他方のトラップカラムのエージング動作を同時に行える構造にしてもよい。また、第３の実施例において、４つのトラップカラム６１、６２、６３、６４を用いているが、この数に制限はない。
【００２４】
【発明の効果】
本発明によれば、１つの切替バルブのみで前処理カラム、分離カラム等の多数の流路の接続切替を簡便かつ自動的に行うことを可能としたので、分離性能の低下をもたらすことなく、高度な前処理や多次元分離を自動化できる液体クロマトグラフを構築することができ、同時にスループットの向上も可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の液体クロマトグラフの一実施例の概略構成図である。
【図２】流路切替バルブにおけるインレットとアウトレットの位置関係を示した図である。
【図３】切替バルブの構造を示した図である。
【図４】本発明の液体クロマトグラフの第２の実施例の概略構成図である。
【図５】本発明の液体クロマトグラフの第３の実施例の概略構成図である。
【符号の説明】
１、２、３、４、４１、４２、４３、４４---移動相
５、６、７、８---ポンプ
９---オートサンプラ
１０---流路切替バルブ
１１---トラップカラム
１２、４６、４７---分離カラム
１３---検出器
２１---ローター
３１---ステータ
３９---配管
【図１】
0003829718.tif 000002
【図２】
0003829718.tif 000003
【図３】
0003829718.tif 000004
【図４】
0003829718.tif 000005
【図５】
0003829718.tif 000006