(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）コウチュウ目の害虫に対する活性；
（ｂ）約、δ5.17（d,1H）,4.48（d,1H）,4.1（m,1H）,4.0（dd,1H）,3.92（d,1H）,3.85（m,2H）,3.80（m,1H）,3.65（m,1H）,3.50（m,1H）,3.36（m,1H）,3.1（dd,1H）,2.8（m,1H）,1.27（d,3H）および1.19（m,3-4H）の1ＨＮＭＲシフト；
（ｃ）１２個の炭素；
（ｄ）ＵＶ末端吸収；および
（ｅ）250から500の範囲にある分子量
を有し、
（ｆ）バチルス・スリンジエンシス（Bacillus thuringiensis）EMCC-0080（NRRL B-21093）の培養物から得られ得る、
有害生物に対して農薬活性（殺有害生物活性）を有する物質。
【請求項２】
該物質が水溶性である、請求項１に記載の物質。
【請求項３】
該物質が、約、δ97.8,92.5,71.1,68.1,67.8,63.6,57.8,54.7,52.9,52.7,52.3および19.7の13ＣＮＭＲシフトを有する１２個の炭素を有する、請求項１に記載の物質。
【請求項４】
該物質が、
（ａ）適切な条件下でバチルス(Bacillus)属の菌株を培養すること、
（ｂ）工程（ａ）のバチルス属菌株の培養の上清を回収すること、および
（ｃ）工程（ｂ）の上清から物質を単離すること
により得られる、請求項１に記載の物質。
【請求項５】
バチルス属菌株が、バチルス・スリンジエンシス（Bacillus thuringiensis）菌株である、請求項４に記載の物質。
【請求項６】
バチルス・スリンジエンシス（Bacillus thuringiensis）菌株が、NRRL B-21093の受託番号を有するEMCC-0080の同定特徴を有する菌株である、請求項５に記載の物質。
【請求項７】
害虫がジアブロチカ(Diabrotica)属の害虫である、請求項１に記載の物質。
【請求項８】
害虫がジアブロチカ・ウンデシムプンクタタ（Diabrotica undecimpunctata）である、請求項７に記載の物質。
【請求項９】
（ａ）適切な条件下でバチルス(Bacillus)属の菌株を培養すること、
（ｂ）工程（ａ）のバチルス属菌株の培養の上清を回収すること、および
（ｃ）工程（ｂ）の上清から得た物質を単離して実質的に純粋な物質を得ることを含む、実質的に純粋な請求項１に記載の物質を得る方法。
【請求項１０】
上記物質を上記上清からカラムクロマトグラフィーによって単離する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
（ａ）請求項１に記載の物質および（ｂ）農薬用担体を含み、該物質が有害生物を制御するのに有効な量で存在する、農薬組成物。
【請求項１２】
上記物質が組成物中に約0.001重量％から約60重量％の範囲の量で存在する、請求項１１に記載の農薬組成物。
【請求項１３】
有害生物を、農薬（殺有害生物剤）として有効な量の請求項１１に記載の農薬組成物に暴露することを含む、有害生物を制御する方法。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
発明の分野
本発明は、農薬活性（殺有害生物活性）、特に甲虫目の害虫に対する殺虫活性を有する新規物質に関する。本発明はさらに、該物質を含む農薬組成物および該農薬組成物を使用して有害生物を制御する方法に関する。
関連技術の説明
Bacillus thuringiensisは、自然に広く分布する運動性のグラム陽性桿菌である。Bacillus thuringiensisは、胞子形成中にparasporal結晶封入体を産生し、該封入体は、鱗翅目、双翅目または甲虫目の感受性昆虫の幼虫が摂食すると殺虫性を示す。その封入体の形、数および組成は変化し得るが、大きさが27〜140kDaの範囲である、δ−内毒素と呼ばれる１個以上のタンパク質で構成される。殺虫性δ−内毒素は、一般に、幼虫の消化管でプロテアーゼによってより小さい（先端が切断された）毒性ポリペプチドに変換され、昆虫の中腸を破壊し、そして最後には死を招く。
Bacillus thuringiensis結晶性δ−内毒素は、最も広く使用されている生物農薬である。森、農耕地および公衆衛生の場所に対して、結晶性δ−内毒素を産生するものとして使用されているいくつかのBacillus thuringiensis菌株がある。Bacillus thuringiensis subsp.kurstakiおよびBacillus thuringiensis subsp.aizawaiは、鱗翅目に対して特異的なδ−内毒素を産生する。甲虫目に対して特異的なδ−内毒素は、Bacillus thuringiensis subsp.tenebrionisによって産生される。さらに、Bacillus thuringiensis subsp.israelensisは、双翅目に対して特異的なδ−内毒素を産生する。他のBacillus thuringiensis菌株は、線虫、ダニ、膜翅目、Phthiraptera、扁形動物、同翅類、ゴキブリ類および原生動物に対して農薬活性（殺有害生物活性）のあるδ−内毒素を産生することが報告されている。
Bacillus thuringiensisはまた、農薬活性のある他の水溶性分子も産生することが知られている。例えば、β−外毒素またはスリンジエンシン（thuringiensin）として知られる熱安定農薬活性アデニン−ヌクレオチド類似体が、数種のBacillus thuringiensis菌株によって産生される（Sebestaら、H.D.Burges編、Microbial Control of Pests and Plant Diseases,Academic Press,New York p.249-281,1981）。β−外毒素は、分子量が789であり、アデノシン、グルコースおよびallaric acidで構成される
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その宿主の範囲としては、それらに限定されないが、イエバエ（Musca domestica）、Mamestra configurata Walker、ナミハダニ（Tetranychus urticae）、キイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）およびニセナミハダニ（Tetranychus cinnabarinus）が挙げられる。β−外毒素は、タイプＩまたはタイプIIβ−外毒素として分類することができる（Levinsonら、1990,Journal of Bacteriology 172:3172-3179）。β−外毒素タイプＩは、Bacillus thuringiensis subsp.thuringiensis血清型１、Bacillus thuringiensis subsp.tolworthi血清型９およびBacillus thuringiensis subsp.darmstadiensis血清型１０によって産生されることが分かった。β−外毒素タイプIIは、Bacillus thuringiensis subsp.morrisoni血清型８ａｂによって産生され、Leptinotarsa decemlineataに対して活性であることがわかった。Bacillus Thuringiensisから単離されている他の水溶性物質としては、イエバエ（Musca domestica）の幼虫に対して毒性を有するα−外毒素
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レシチナーゼ、キチナーゼおよびプロテアーゼなどの種々の酵素であり、その毒性効果は、β−外毒素またはδ−内毒素と組み合わされた場合にのみ発現するγ−外毒素（Forsbergら、1979,Bacillus thuringiensis:Its Effects on Environmental Quality,National Research Council of Canada,NRC Associate Committee on Scientific Criteria for Environmental Quality,Subcommittees on Pesticides and Related Compounds and Biological Phenomena）；構造がβ−外毒素と類似しており、やはりLeptinotarsa decemlineataに対して活性であるσ−外毒素（Argauerら、1991,Journal of Entomological Science 26:206-213）；および無水スリンジエンシン（thuringiensin）（Coll.Czechosslovak Chem.Comm.40,1775,1975）が挙げられる。
Stonardら（1994,Natural and Engineered Pset Management Agents,Paul A.mann,Robert M.Hollingworth編、American Chemical Society,Washington,D.C.,pp.25-36）は、構造：
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［１．Ｒ、Ｒ1、Ｒ2＝Ｈ、Ｒ3＝ＯＨ  Diabroticin A；
２．Ｒ、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3＝Ｈ  Diabroticin B］
を有するジアブロチシン（Diabroticin）を開示している。ジアブロチシン（Diabroticin）は、枯草菌（Bacillus subtilis）から単離され、Diabrotica undecimpunctata、Leptinotarsa decemlineata、ワタミゾウムシ（Anthomus grandis Boheman）,カの幼虫、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）およびMicrococcus luteaに対して活性を有するが、アワノメイガ（European corn borer）、大腸菌（Escherichia coli）、枯草菌（Bacillus subtilis）および緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）に対する活性はなかった。他の有害生物に対する活性は、Stonardらには開示されていなかった。ジアブロチシン（Diabroticin）Aは、Bacillus cereusの発酵ブロスからも単離された。
当業者は、環境に好ましくない化学農薬、または農薬に対して特定の有害性物が耐性を獲得したことにより農薬として効果がない化学農薬の代わりとなる生物農薬を見いだすべく努力している。
本発明の目的は、甲虫目（Coleoptera）の害虫に対して殺虫活性を有する新規物質を提供することである。
発明の要旨
本発明は、バチルス（Bacillus）属菌株の培養ブロスの上清から得られる新規物質に関し、該物質は、甲虫目（Coleoptera）の害虫に対して活性を有し、１Ｈ  ＮＭＲシフトが約δ5.17（d,1H）,4.48（d,1H）,4.1（m,1H）,4.0（dd,1H）,3.92（d,1H）,3.85（m,2H）,3.80（m,1H）,3.65（m,1H）,3.50（m,1H）,3.36（m,1H）,3.1（dd,1H）,2.8（m,1H）,1.27（d,3H）および1.19（m,3-4H）であり；１２炭素であり；ＵＶ末端吸収（UV end absorption）を示す。本発明の物質はまた、例えば、ある有害生物に対する異なるバチルス属関連農薬とともに増強剤または協力剤としても作用し得る。
本発明はまた、バチルス属菌株の突然変異体にも関し、該突然変異体によって産生される上記物質の量は、対応する親菌株によって産生される物質の量よりも多い。本発明はさらに、該突然変異体を得る方法に関し、該方法は、（ａ）バチルス属菌株を変異原で処理し；（ｂ）工程（ａ）の突然変異したバチルス属菌株を、突然変異体菌株を選択するのに適する培地で増殖させ；および（ｃ）工程（ｂ）の突然変異菌株を物質の高められた産生に基づいて選択することを含む。
本発明はまた、本発明の「実質的に純粋な」物質を得る方法に関し、該方法は、（ａ）バチルス属菌株を適切な条件下で培養し；（ｂ）工程（ａ）のバチルス属菌株の培養物の上清を回収し；（ｃ）工程（ｂ）の上清から物質を単離して実質的に純粋な物質を得ることを含む。
本発明はさらに、該物質および農薬用担体を含む農薬組成物ならびに該物質およびバチルス属関連農薬、化学農薬および／または昆虫病原性ウイルスを含む農薬組成物、ならびに該農薬組成物を使用して有害生物を制御する方法に関する。
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明の物質の1Ｈ  ＮＭＲスペクトルである。
図２は、本発明の物質の１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルである。
発明の詳細な説明
本発明は、農薬活性（殺有害生物活性）、特に甲虫目（Coleoptera）の害虫に対する殺虫活性を有する物質に関する。「農薬活性（殺有害生物活性）」とは、本明細書では、有害生物を殺し、もしくは有害生物の成長を抑制し、または植物が有害生物に侵襲されるのを防ぐことによる、本発明物質の有害生物に対する活性量の基準として定義する。特定の態様では、本発明物質は、分子量が約250〜約500の範囲にあり；1Ｈ  ＮＭＲシフトが約、δ5.17（d,1H）,4.48（d,1H）,4.1（m,1H）,4.0（dd,1H）,3.92（d,1H）,3.85（m,2H）,3.80（m,1H）,3.65（m,1H）,3.50（m,1H）,3.36（m,1H）,3.1（dd,1H）,2.8（m,1H）,1.27（d,3H）および1.19（m,3-4H）であり；１２炭素であって、13Ｃ  ＮＭＲシフトが約、δ97.8,92.5,71.1,68.1,67.8,63.6,57.8,54.7,52.9,52.7,52.3および19.7であり；ＵＶ末端吸収を示す。別の特定の態様では、本発明物質が水溶性である。
該物質の害虫に対する殺虫活性は、当業者に周知の方法、例えば人工食餌への混入、人工食餌へのオーバーレイ、葉面への塗布、葉浸漬、および葉面への噴霧などの方法を使用して測定することができる。
特定の態様では、本発明物質は、甲虫目（Coleoptera）の害虫に対して殺虫活性を有する。さらに特定の態様では、本発明物質は、甲虫目のDiabrotica属の害虫に対する殺虫活性を有する。最も特定の態様では、本発明物質は、甲虫目のDiabrotica undecimpunctataに対する殺虫活性を有する。
本発明物質は、バチルス属の発酵上清から回収することができる。特定の態様では、本発明物質は、Bacillus thuringiensis菌株の発酵上清から得られる。さらに特定の態様では、本発明物質は、特許出願No.08/212,462および08/404,016（参考として本明細書に組み入れる。）に開示された、NRRL B-21093の同定特徴を有するBacillus thuringiensis菌株EMCC-0080または実質的にEMCC-0080と同じ特性を有するその突然変異株の発酵上清から得られる。
本発明はまた、バチルス属菌株の突然変異体に対し、該突然変異体によって産生される上記物質の量は、対応する親菌株によって産生される物質の量より多い。本発明はさらに、該突然変異体を得るための方法に関する。本明細書で定義する「親菌株」とは、突然変異誘発によって突然変異菌株をもたらす前の元のバチルス属菌株である。
一つの態様では、本発明物質は、バチルス属菌株、特にBacillus thuringiensis菌株の突然変異体から得られ、該物質は、対応する親菌株によって産生される物質の量より多い量で産生される。そのような突然変異体を得るために、親菌株に対し、例えば、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンもしくはメタンスルホン酸エチルなどの化学的手段による、またはγ−線、Ｘ−線もしくはＵＶの照射による変異原処理を行うことができる。特に、バチルス属菌株を突然変異させ、そのような突然変異体を選択する一つの方法は、下記手順を含む：
ｉ）親菌株を変異原で処理する；
ii）こうして得られた推定上の突然変異体を、突然変異体菌株の選択に適する培地で増殖させる；および
iii）突然変異体菌株を、本発明物質の産生量増加に基づいて選択する。
この方法の好ましい態様によれば、選択されたコロニーを、正常な生産培地で増殖させ、該突然変異体の最終選択を行う。
Bacillus thuringiensisは、当業者に周知の培地および発酵法を使用して培養することができる（例えば、Rogoffら、1969,Journal of Invertebrate Pathology 14:122-129;Dulmageら、1971,Journal of Invertebrate Pathology 18:353-358;Dulmageら、Microbial Control of Pests and Plant Diseases,H.D.Burges編、Academic Press,N.Y.,1980参照）。発酵サイクルの完了後、上清は、当業者に周知の手段、例えば遠心分離および／または限外濾過により、発酵ブロスからBacillus thuringiensis胞子および結晶を分離することによって回収できる。本発明物質は、例えば限外濾過、蒸発および噴霧乾燥など、当業者に周知の手段によって回収できる上清に含まれている。
本発明はまた、本発明の「実質的に純粋な」物質を得る方法に関する。「実質的に純粋な」物質は、本明細書では、不純物（例えばδ−内毒素タンパク質）が5%未満である物質として定義される。本発明物質の精製は、当業者に周知の種々の方法、例えば、それらに限定されないが、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティーおよびサイズ排除カラムクロマトグラフィー）、電気泳動法、示差溶解性、抽出または当業者に周知の他の標準的技術（例えば、Protein Purification,J-C.JansonおよびLars Ryden編、VCH Pubishers,New York,1989参照）により行うことができる。特に、実質的に純粋な本発明物質を得るための一つの方法は、下記手順を含む：
ｉ）バチルス属菌株を適切な条件下で培養する；
ii）バチルス属菌株の培養の上清を回収する；および
iii）上記上清から該物質を単離して実質的に純粋な物質を得る。
本発明はさらに、有害生物制御に有効な量の該物質および農薬用担体を含む農薬組成物に関する。「有効な量」とは、有害生物を殺し、もしくは有害生物の成長を制御し、または植物が有害生物に侵襲されるのを防ぐことにより、有害生物を制御するのに十分な物質の量として定義する。当該農薬組成物は、実質的に純粋な形態またはバチルス属菌株の培地全体の上清として乾燥、濃縮もしくは液体形態の本発明物質、および適する農薬用担体（例は下記に示す）を含むことができる。上記物質は、上記組成物中に約0.001%〜約60%（w/w）の濃度で存在させる。
本発明の農薬組成物は、さらに、散布中（例えば、飛行機から噴霧する場合等）に組成物が標的領域からドリフトしたり、いったん付着した植物から吹き飛ばされたりするのを防ぐ助けとなる付着剤（deposition agent）を含むことができる。本発明の組成物における付着剤は、昆虫が好むという付加的利点を有するタンパク質性物質であることが好ましい。この目的には、乾燥形態または液体形態の、動物または植物のどのタンパク質も適する。組成物に便利かつ経済的に添加できる有用なタンパク質源の例としては、それらに限定されないが、大豆タンパク質、馬鈴薯タンパク質、大豆粉、馬鈴薯粉、魚粉、骨粉、イーストエキスおよび血粉（blood meal）が挙げられる。別の付着剤としては、変性セルロース（カルボキシメチルセルロース）、植物性材料（穀物粉、植物基部（ground plant parts）、非フィロケイ酸塩（タルク、バーミキュライト、珪藻土）、天然クレー（アタパルジャイト、ベントナイト、カオリナイト、モントモリロナイト）および合成クレー（ラポナイト（Laponite））が挙げられる。付着剤を使用する場合は、本発明の農薬組成物中に約0.4%w/w〜約50%w/w、好ましくは約1%w/w〜約20%w/wの量で存在させる。
本発明の農薬組成物は、さらに、製品の凍結点を低下させ、噴霧するときの蒸発を最少にするのを助け、付着性を維持して製品をより有効かつ適切なものにする、凍結防止／湿潤剤を含むことができる。凍結防止／湿潤剤の例としては、それらに限定されないが、エチレングリコール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、グリセロール、ブチレングリコール、ペンチレングリコールおよびヘキシレングリコールが挙げられる。凍結防止／湿潤剤を使用する場合は、本発明の農薬組成物に約0.5%w/w〜約25%w/w、好ましくは約2%w/w〜約15%w/wの量で存在させる。
本発明の農薬組成物は、さらに、界面活性剤を、乳化剤、湿展剤または分散剤として使用する量で含むことができる。そのような界面活性剤の例としては、カルボキシレート（例えば、長鎖脂肪酸の金属カルボキシレート）；Ｎ−アシルサルコシネート；リン酸と脂肪アルコールエトキシレートとのモノもしくはジ−エステル、または該エステルの塩；ドデシル硫酸ナトリウム、オクタデシル硫酸ナトリウムまたはセチル硫酸ナトリウムなどの脂肪アルコールスルファート；エトキシル化脂肪アルコールスルファート；エトキシル化アルキルフェノールスルファート；リグニンスルホナート；石油スルホナート；アルキルベンゼンスルホナートまたは低級アルキルナフタレンスルホナート（例えば、ブチルナフタレンスルホナート）などのアルキルアリールスルホナート；スルホン化ナフタレン−ホルムアルデヒド縮合物の塩；スルホン化フェノール−ホルムアルデヒド縮合物の塩；およびアミドスルホナート（例えば、オレイン酸とＮ−メチルタウリンとのスルホン化縮合生成物）またはスルホコナク酸ジアルキル（例えば、コハク酸ジオクチルのナトリウムスルホナート）などのより複雑なスルホナートなどの陰イオン界面活性剤が挙げられる。そのような界面活性剤のさらに別の例としては、脂肪酸エステル、脂肪アルコール、脂肪酸アミドまたは脂肪アルキル−もしくはアルケニル−置換フェノールとエチレンオキシドとの縮合生成物、エチレンオキシドとプロピレンオキシドとのブロックコポリマー、２，４，７，９−テトラエチル−５−デシン−４，７−ジオールなどのアセチレン性グリコール、あるいはエトキシル化アセチレン性グリコールなどの非イオン界面活性剤が挙げられる。そのような界面活性剤のさらに別の例としては、酢酸塩、ナフタレン酸塩またはオレイン酸塩としての脂肪族モノ−、ジ−またはポリアミン；ポリオキシエチレンアルキルアミンのアミンオキシドなどの酸素含有アミン；カルボン酸とジ−またはポリアミンとの縮合によって合成されるアミド結合アミン；あるいは第四アンモニウム塩などの陽イオン界面活性剤が挙げられる。界面活性剤を使用する場合は、約0.5%w/w〜約25%w/w、好ましくは約1%w/w〜約8%w/wの量で存在させる。
本発明の農薬組成物はさらに、不活性物質を含むことができる。不活性物質の例としては、珪藻土、カオリン、雲母、石膏、肥料、フィロケイ酸塩、炭酸塩、硫酸塩またはリン酸塩などの無機鉱物；糖、澱粉またはシクロデキストリンなどの有機物質；あるいは木材、コルク、トウモロコシの穂軸の粉末、もみ、落花生外皮およびクルミの殻などの植物性物質が挙げられる。
本発明に係る農薬組成物はさらに、保存剤、摂食刺激剤、誘因剤、被包農薬（encapsulating pesticide）、バインダー、染料、紫外線保護剤、緩衝剤、流動促進剤（flow agent）、または製品の取り扱いおよび特定の標的有害生物に対する施用を容易にする他の成分を含むことができる。
本発明の農薬組成物はさらに、バチルス属関連農薬、特にBacillus thuringiensis生物農薬を含むことができる。Bacillus thuringiensis生物農薬は、それらに限定されないが、Bacillus thuringiensis subsp.aizawai,Bacillus thuringiensis subsp.alesti,Bacillus thuringiensis subsp.canadiensis,Bacillus thuringiensis subsp.colmeri,Bacillus thuringiensis subsp.coreanensis,Bacillus thuringiensis subsp.dakota,Bacillus thuringiensis subsp.darmstadiensis,Bacillus thuringiensis subsp.dendrolimus,Bacillus thuringiensis subsp.entomocidus,Bacillus thuringiensis subsp.finitimus,Bacillus thuringiensis subsp.galleriae,Bacillus thuringiensis subsp.indiana,Bacillus thuringiensis subsp.israelensis,Bacillus thuringiensis subsp.kenyae,Bacillus thuringiensis subsp.kumamotoensis,Bacillus thuringiensis subsp.kurstaki,Bacillus thuringiensis subsp.kyushuensis,Bacillus thuringiensis subsp.japonensis,Bacillus thuringiensis subsp.mexcanensis,Bacillus thuringiensis subsp.morrisoni,Bacillus thuringiensis subsp.neoleonensis,Bacillus thuringiensis subsp.nigeriae,Bacillus thuringiensis subsp.ostriniae,Bacillus thuringiensis subsp.pakistani,Bacillus thuringiensis subsp.pondicheriensis,Bacillus thuringiensis subsp.shandongiensis,Bacillus thuringiensis subsp.silo,Bacillus thuringiensis subsp.sotto,Bacillus thuringiensis subsp.subtoxicus,Bacillus thuringiensis subsp.tenebrionis,Bacillus thuringiensis subsp.thompsoni,Bacillus thuringiensis subsp.tochigiensis,Bacillus thuringiensis subsp.tohokuensis,Bacillus thuringiensis subsp.tolworthi,Bacillus thuringiensis subsp.toumanoffi,Bacillus thuringiensis subsp.wuhanensisまたはBacillus thuringiensis subsp.yunnanensisから誘導できる。本発明の物質は、Bacillus thuringiensis生物農薬製剤製品についての推奨処理量に応じて、Bacillus thuringiensis製品と、タンク混合において、または製剤製品中において混合することができる。
Bacillus thuringiensis生物農薬、すなわちδ−内毒素タンパク質またはその農薬として活性な断片は、それらに限定されないが、CryI、CryII、CryIII、CryIV、CryVおよびCryVIを含む群から選択できる。特に、Bacillus thuringiensisδ−内毒素タンパク質またはその農薬として活性な断片としては、それらに限定されないが、CryIA（a）、CryIA（b）、CryIA（c）、CryIB、CryIC、CryID、CryIE、CryIF、CryIIA、CryIIB、CryIIIA、CryIIIB、CryIIIC、CryIVA、CryIVB、CryIVC、CryIVD、CryV、CryVIおよびCytAが挙げられる。また、本発明の範囲内として、Bacillus thuringiensis生物農薬は、Bacillus thuringiensis菌株に由来する胞子も含み得る。
あるいは、本発明の農薬組成物におけるBacillus thuringiensis生物農薬は、Bacillus thuringiensisδ−内毒素タンパク質またはその農薬として活性な断片をコードする遺伝子が挿入された細胞から誘導することもできる。さらに、本発明の範囲内として、Bacillus thuringiensis生物農薬またはその農薬として活性な断片は、Bacillus thuringiensisδ−内毒素タンパク質またはその農薬として活性な断片をコードする遺伝子を含むプラスミドが細胞−細胞接合によって転移されたトランス接合菌株（transconjugate strain）から誘導され得る。
本発明の農薬組成物は、本発明物質を、Bacillus thuringiensis生物農薬1gにつき約0.001〜約100gの量で含むことができる。
本発明の農薬組成物は、さらに、当業者に周知の１種以上の協力剤、増強剤、または摂食刺激物質を含むことができる。例えば、WO 94/09630に開示された増強剤またはその農薬として活性な塩を本発明の組成物に使用することができる。
本発明の組成物はさらに、昆虫病原性ウイルスを含むことができる。そのような昆虫病原性ウイルスの例としては、それらに限定されないが、Autographa californica核多角体病ウイルス（ＮＰＶ）、Syngrapha falcifera ＮＰＶ、Cydia pomonellaグラニュローシスウイルス（ＧＶ）、Heliothis zea ＮＰＶ、Lymantria desparＮＰＶ、Orgyia pseudotsugataＮＰＶ、Spodoptera exigua ＮＰＶ、Neodiprion lecontei ＮＰＶ、Neodiprion sertifer ＮＰＶ、Harrisina brillians ＮＰＶおよびEndopiza viteana Clemens ＮＰＶが挙げられる。
本発明の組成物はさらに、化学農薬を含むことができる。そのような化学農薬の例としては、それらに限定されないが、昆虫成長制御剤、カルバメート剤、有機リン剤、ピレスロイド剤、無機フッ素剤、ピラゾール類、ピロール類およびアベルメクチン類が挙げられる。
本発明はさらに、本発明の農薬組成物を植物に施用することを含む、植物に対する有害生物の侵襲を制御する方法に関する。
本発明の農薬組成物は、乾燥または液体形状、例えば懸濁物、溶液、エマルション、散布用粉末、分散性顆粒、湿潤性粉末（水和剤）、乳化性濃縮物（乳剤）、エーロゾルまたは含浸性顆粒、あるいは施用の前に適量の水または他の希釈剤での希釈を必要とする濃縮物または一次組成物の形状で適用できる。該組成物における各成分の濃度は、特定の組成物の性質、特に濃縮物であるか、または直接使用するものであるかどうかによって変わる。組成物は、約1%〜約98%の固体または液体の不活性担体を含み得る。組成物は、好ましくは、市販製品のラベルに示した処理量で投与し、好ましくは、乾燥形態の場合は約0.01ポンド〜5.0ポンド／エーカー、液体形態の場合は約0.01パイント〜25パイント／エーカーである。
本発明の農薬組成物は、例えば、有害生物が植物に現れ始めたとき、または有害生物が現れる前の予防手段として、噴霧または散粉により植物に直接施用できる。農薬組成物は、茎葉散布、うね間施用、広幅散布、「レイ−バイ（lay-by）」または土壌灌注処理により施用できる。本発明の組成物はまた、池、湖、小川、河川、静水、および公衆衛生に関与する有害生物の被害を受けやすい他の場所に直接施用できる。組成物は、噴霧、散粉、少量散布（sprinkling）などにより施用できる。噴霧または散粉は、別の農薬を含むのに便利である。本発明の農薬組成物は、好ましくは、植物に直接施用する。
本発明の農薬組成物は、多くの異なる種類の植物、例えば、それらに限定されないが、禾穀類（小麦、大麦、ライ麦、オート、イネ、モロコシおよび関連作物）、ビート類（テンサイおよび飼料用ビート）、核果類、仁果類および小果樹（リンゴ、西洋ナシ、プラム、モモ、アーモンド、チェリー、イチゴ、ラズベリーおよびブラックベリー）、マメ科植物（アルファルファ、インゲンマメ、ヒラマメ、エンドウ、ダイズ）、油料植物（セイヨウアブラナ、カラシナ、ケシ、オリーブ、ヒマワリ、ココナツ、ヒマ、カカオ豆、ピーナツ）、キュウリ植物（キュウリ、ペポカボチャ、メロン）、繊維料植物（棉、亜麻、麻、ジュート）、柑橘類（オレンジ、レモン、グレープフルーツ、マンダリン）、野菜（ホウレンソウ、レタス、アスパラガス、キャベツおよび他のアブラナ科、ニンジン、タマネギ、トマト、ジャガイモ）、クスノキ科（アボカド、シナモン、ショウノウ）、落葉樹および針葉樹（シナノキ、イチイ、オーク、ハンノキ、ポプラ、カンバ、モミ、カラマツ、マツ）、またはトウモロコシ、芝草、タバコ、ナッツ、コーヒー、サトウキビ、茶、ブドウ、ホップ、バナナおよび天然ゴム植物ならびに観賞植物などの植物を保護するために施用することができる。
本発明はさらに、本発明物質を、Bacillus thuringiensis生物農薬をコードする遺伝子を含むトランスジェニック植物に施用する方法に関する。
本発明の農薬組成物は、多くの異なる種類の害虫による侵襲の処理または予防に使用できる。特に、本発明の組成物は、甲虫目（コウチュウ目:Coleoptera）の害虫、例えば、Leptinotarsasp.,インゲンマメゾウムシ（Acanthoscelides obtectus）,アズキゾウム（Callosobruchus chinensis）,Epilachna varivestis,Pyrrhalta luteola,アリモドキゾウムシ（Cylas formicarius elegantulus）,Listronotus oregonensis,Sitophilus sp.,Cyclocephala borealis,Cyclocephala immaculata,Macrodactylus subspinosus,マメコガネ（Popillia japonica）,Rhizotrogus majalis,ガイマイゴミムシダマシ（Alphitobius diaperinus）ヒメコクヌストモドキ（Palorus ratzeburgi）,チャイロコメノゴミムシダマシ（Tenebrio molitor）,コメノゴミムシダマシ（Tenebrio obscurus）,コクヌストモドキ（Tribolium castaneum）,ヒラタコクヌストモドキ（Tribolium confusum）およびTribolius destructorの駆除に使用するのが好ましい。しかし、本発明の農薬組成物は、鱗翅目（チョウ目：Lepidoptera）、例えば、Achroia grisella,Acleris gloverana,Acleris variana,リンゴコカクモンハマキ（Adoxophyes orana）,タマナヤガ（Agrotis ipsilon）,Alabama argillacea,Alsophila pometaria,Amyelois transitella,Anagasta kuehniella,Anarsia lineatella,Anisota senatoria,Antheraea pernyi,Anticarsia gemmatalis,Archips sp.,Argyrotaenia sp.,Athetis mindara,Bombyx mori,Bucculatrix thurberiella,スジマダラメイガ（Cadra cautella）,Choristoneura sp.,Cochylis hospes,Colias eurytheme,Corcyra cephalonica,Cydia latiferreanus,Cydia pomonella,Datana integerrima,Dendrolimus sibercus,Desmia funeralis,Diaphania hyalinata,Diaphnia nitidalis,Diatraea grandiosella,Diatraea saccharalis,Ennomos subsignaria,Eoreuma loftini,チャマダラメイガ（Ephestia elutella）,Erannis tiliaria,Estigmene acrea,Eulia salubricola,ブドウホソハマキ（Eupoecilia ambiguella）,Euproctis chrysorrhoea,Euxoamessoria,ハチノスツヅリガ（Galleria mellonella）,ナシヒメシンクイ（Grapholita molesta）,Harrisina americana,Helicoverpa subflexa,Helicoverpa zea,Heliothis virescens,Hemileuca oliviae,Homoeosoma electellum,アメリカシロヒトリ（Hyphantria cunea）,Keiferia lycopersicella,Lambdina fiscellaria fiscellaria,Lambdina fiscellaria lugubrosa,ヤナギドクガ（Leucoma salicis）,Lobesia botrana,Loxostege sticticalis,マイマイガ（Lymantria dispar）,Macalla thyrsisalis,Malacosoma sp.,ヨトウガ（Mamestra brassicae）,Mamestra configurata,Manduca quinquemaculata,Manduca sexta,Maruca testulalis,Melanchra picta,ナミスジフユナミシャク（Operophtera brumata）,Orgyia sp.,Ostrinia nubilalis,Paleacrita vernata,Papilio cresphontes,ワタアカミムシ（Pectinophora gossypiella）,Phryganidia californica,Phyllonorycter blancardella,Pieris napi,モンシロチョウ（Pieris rapae）,Plathypena scabra,Platynota flouendana,Platynota sultana,Platyptilia carduidactyla,Plodia interpunctella,コナガ（Plutella xylostella）,Pontia protodice,Pseudaletia unipuncta,Pseudoplusia includens,Sabulodes aegrotata,Schizura concinna,バクガ（Sitotroga cerealella）,Spilonota ocellana,Spodoptera sp.,Thaurnstopoea pityocampa,コイガ（Tineola bisselliella）,Trichoplusia ni,Udea rubigalis,Xylomyges curialisおよびYponomeuta padella；双翅目（ハエ目：Diptera）、例えば、Aedes sp.,Andes vittatus,Anastrepha ludens,Anastrepha suspensa,Anopheles barberi,Anopheles quadrimaculatus,Armigeres subalbatus,Calliphora stygian,Calliphora vicina,チチュウカイミバエ（Ceratitis capitata）,Chironomus tentans,Chrysomya rufifacies,Cochliomyia macellaria,Culex sp.,Culiseta inornata,Dacus oleae,タマネギバエ（Delia antiqua）,タネバエ（Delia platura）,Delia radicum,キイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）,Eupeodes corollae,Glossina austeni,Glossina brevipalpis,Glossina fuscipes,Glossina morsitans centralis,Glossina morsitans morsitans,Glossina moristans submorsitans,Glossina pallidipes,Glossina palpalis gambiensis,Glossina palpalis palpalis,Glossina tachinoides,Haemagogus equinus,Haematobia irritans,Hypoderma bovis,Hypoderma lineatum,Leucopis ninae,Lucilia cuprina,Lucilia sericata,Lutzomyia longlpaipis,Lutzomyia shannoni,Lycoriella mali,Mayetiola destructor,Musca autumnalis,イエバエ（Musca domestica）,Neobellieria sp.,Nephrotoma suturalis,Ophyra aenescens,Phaenicia seriata,Phlebotomus sp.,Phormia regina,Sabethes cyaneus,Sarcophaga bullata,Scatophaga stercoraria,Stomoxys calcitrans,Toxorhynchites amboinensisおよびTripteroides bambusa；ダニ目（Acari）、例えば、Oligonychus pratensis,リンゴハダニ（Panonychus ulmi）,ナミハダニ（Tetranychus urticae）；膜翅目（ハチ目：Hymenoptera）、例えば、Iridomyrmex humilisおよびSolenopsis invicta；等翅目（シロアリ目：Isoptera）、例えば、Reticulitermes hesperus,Reticulitermes flavipes,イエシロアリ（Coptotermes formosanus）,Zootermopsis angusticollis,Neotermes connexus,Incisitermes minorおよびIncsitermes immigrans；隠翅目（ノミ目：Siphonaptera）、例えば、Ceratophyllus gallinae,Ceratophyllus niger,Nosopsyllus fasciatus,Leptopsylla segnis,イヌノミ（Ctenocephalides canis）,Ctenocephalides felis,Echicnophaga gallinacea,Pulex irritans,Xenopsylla cheopis,Xenopsylla vexabilisおよびTunga penetrans；ならびにクキセンチュウ目（Tylenchida）、例えば、アツマイモネコブセンチュウ（Melodidogyne incognita）およびキタネグサレセンチュウ（Pratylenchus penetrans）の害虫に対しても有効である。
本発明を下記実施例によってさらに説明するが、以下の実施例は、本発明の範囲を限定するものではない。
実施例
実施例１：Bacillus thuringiensis EMCC-0080の培養
Bacillus thuringiensis菌株EMCC-0080を、下記組成を有する、ｐＨ7.0に調整した培地中、30℃で24時間増殖させた。
加水分解した澱粉    40g/l
植物タンパク質      40g/l
ＫＨ2ＰＯ4          1.8g/l
Ｋ2ＨＰＯ4          4.5g/l
ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ  0.3g/l
微量金属            0.2ml
細胞および他の不溶物は、遠心分離、次いで得られた上清のセライトおよび0.2μの膜による濾過により、Bacillus thuringiensis菌株EMCC-0080の全培養ブロスから除去する。
次いで、透過物を蒸発により10倍に濃縮する。
実施例２：Diabrotica undecimpunctataバイオアッセイ
20μlのサンプルを、各ウェルに200μlの固化人工昆虫餌を含む96ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに入れた後、風乾する。１匹の新生のDiabrotica undecimpunctataを、小さい絵筆で各ウェルに静かに入れる。次いで、マイクロタイタープレートを、換気用の穴を開けたMylarで密封し、30℃、80%湿度でインキュベートする。５〜６日目に死亡率％の評価を行う。
実施例３：農薬活性（殺有害生物活性）物質の精製
実施例１の10倍に濃縮した透過物から得た農薬活性物質の精製を、３工程精製手順を使用して行った。精製中、活性は、実施例２に記載したDiabrotica undecimpunctata表面バイオアッセイによってモニターする。クロマトグラフィーの工程は全て、特に断らない限り、278nmでの検出を使用する。
第一工程では、10倍に濃縮した透過物を、Pharmacia SP Sepharose Fast Flow（陽イオン交換）カラムクロマトグラフィー（5x23cm）によってまず精製する。カラムを1350mlの脱イオン水、次いで1350mlの20mM酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ5.0）で洗浄する。次いで、カラムを100mlの1M酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ5.0）で洗浄し、サンプルを充填する前に20mMの酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ5.0）で再平衡させる。10倍に濃縮した透過物の425mlのサンプルを脱イオン水で18Lに希釈して、2.01mhoの電導度および4.8のｐＨを得る。希釈したサンプルを17ml/分の速度で、20mMの酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ5.0）で予め平衡させたカラムにローディングする。サンプルをローディングした後、カラムを3Lの20mM酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ5.0）で洗浄する。カラムを、20mM→1.0Mの連続勾配の酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ5.0）5.0Lにより、18ml/分で溶離する。画分を１分ごとに集め、第５画分ごとに、上述したようにDiabrotica undecimpunctataに対してバイオアッセイを行う。バイオアッセイにより、画分25〜95において活性が認められる。活性を有する画分をプールし、凍結乾燥し、50mlの脱イオン水に再溶解する。
第二工程では、第一工程で得た50mlのプールを、脱イオン水で予め平衡させたBioRad P2（超微細）サイズ排除カラム（5x100cm）にローディングする。カラムを、脱イオン水により、1ml/分の流速で溶離する。画分を10分毎に集めて、前述したようにバイオアッセイ（第５画分毎）を行う。バイオアッセイにより、画分94〜120において活性が認められ、これらの画分をプールする。
第三工程では、工程２でプールした活性を有する画分の6mlのサンプルを脱イオン水で10mlに希釈して、223mhoの電導度を得る。希釈したサンプルは、TSK SP-5PW HPLCカラム（15cmx21.5mm ID）にローディングした後、225mM→400mMの連続勾配の酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ5.0）120mlを使用して、4ml/分で溶離する。画分は310nmでモニターし、1.5分毎に集めて、前述したようにバイオアッセイ（第５画分毎）を行う。約15分後に、大きいピークが溶離し、次いでショルダーピークが溶離したが、これは、バイオアッセイで測定される活性物質を含んでいた。
実施例４：農薬活性（殺有害生物活性）物質の特徴
実施例３で得た活性物質を解析する。精製物質に対する1Ｈおよび13Ｃ  ＮＭＲ分光分析データを、400MHzのVarian Gemini分光計を使用して得る。精製化合物の1Ｈ  ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ,400MHz）スペクトルを図１に示す。1Ｈシフトは、約、δ5.17（d,1H）,4.48（d,1H）,4.1（m,1H）,4.0（dd,1H）,3.92（d,1H）,3.85（m,2H）,3.80（m,1H）,3.65（m,1H）,3.50（m,1H）,3.36（m,1H）,3.1（dd,1H）,2.8（m,1H）,1.27（d,3H）および1.19（m,3-4H）である。精製化合物の13Ｃ  ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ,100MHz）スペクトルは図２に示す。13Ｃシフトは、約、δ97.8,92.5,71.1,68.1,67.8,63.6,57.8,54.7,52.9,52.7,52.3および19.7である。
精製物質はさらに、Hewlett-Packardダイオードアレイ検出器を使用して、そのＵＶスペクトルに関する解析を行い、ＵＶ末端吸収（UV end absorption）のみを有することが見いだされる。その物質は、メタノールおよび水に可溶である。さらに、その物質は、ニンヒドリンおよびドラーゲンドルフ試薬との反応が両方とも陽性である。
精製した物質は、ＮＭＲデータに基づいて、分子量が約250〜約500の範囲であると推定される。
実施例５：農薬活性（殺有害生物活性）物質のＬＣ50およびＬＣ90の測定
実施例３に記載したTSK SP-5PW HPLC精製工程から得た精製物質を一度凍結乾燥させ、脱イオン水に再溶解して、約3mg/mlの濃度にする。次いで、その物質のDiabrotica undecimpunctataに対するバイオアッセイを行い、ＬＣ50およびＬＣ90を評価する。
人工昆虫餌を、水、寒天、糖、カゼイン、小麦胚芽、メチルパラベン、ソルビン酸、亜麻仁油、セルロース、塩、プロピオン酸、リン酸、ストレプトマイシン、クロロテトラサイクリンおよびビタミン類で構成して調製する。人工の餌には、再水和した粉末および液体から成るサンプルを20% v/vの割合で混入させる。試験サンプルは、マイクロ遠心管（microcentrifuge）で調整して、８〜16の連続希釈とする。液体サンプルを200μl/mlで試験した後、0.1%のTWEENTM20で順次希釈して、100μl/ml、50μl/ml、25μl/ml、12.5μl/ml、6.25μl/ml、3.125μl/ml、1.563μl/mlなどを含むようにする。各サンプルは、溶融した食餌と混合して1mlとする。溶融混合物を攪拌し、96ウェルのマイクロタイタープレートの10個のウェルに0.1mlのアリコートでピペッティングする。0.1%のTWEENTM20を含む対照サンプルは、16個のウェルに分配する。食餌が固化した後、２匹の新生のDiabrotica undecimpunctataの幼虫を各ウェルに添加し、トレイを穴の開いた透明なMylarのシートでカバーする。トレイは、28±2℃、65%相対湿度で５日間インキュベートする。バイオアッセイは、３回繰り返す。
５日後、死亡率を評価する。Mylarシートを取り外し、各ウェルを、解剖顕微鏡を使用して検査する。解剖用の針で突いたときに動かない幼虫は、死亡として計数する。死亡率％を計算し、データをプロビット分析により分析する。ＬＣ50、ＬＣ90、回帰直線の傾きおよび変動係数を評価する。
当該物質は、ＬＣ50が20μl/mlであり、ＬＣ90が172.2μl/mlであり、回帰直線の傾きが1.5であり、変動係数が18.8である。
微生物の寄託
Bacillus thuringiensisの下記菌株は、ブダペスト条約に従って、Agricultural Research Service Patent Culture Collection Northern Regional Research Center（NRRL）,1815 University Street,Peoria,Illinois,61604,USAに寄託されている。
0003755895.tif 000005
その菌株は、培養物の入手が、本特許出願の継続中は、37C.F.R  §1.14および35U.S.C.§122により特許庁長官がその資格があると定める人には可能であるとする条件下で寄託されている。その寄託物は、寄託菌株の実質的に純粋な培養物を表す。寄託物は、その出願の対応出願またはその子出願が行われている国において、その国の特許法の要求に応じて入手可能である。しかし、寄託物の入手可能性は、政府により付与されている特許権が失墜して当該発明の実施を許可するものではないと理解すべきである。
本明細書に開示した特定の態様は、本発明のいくつかを説明するためのものであるので、本明細書に記載し、クレームした発明は、これらの態様によってその範囲が限定されるものではない。同等の態様はいずれも、本発明の範囲内であるとする。実際、本明細書に示し、説明したもの以外の種々の変形は、当業者であれば、上記説明から明らかである。そのような変形も添付したクレームの範囲内であるとする。
種々の参考文献を本明細書で引用したが、それらの開示は、その全体を参考として本明細書に組み入れる。
【図１】
0003755895.tif 000006
【図２】
0003755895.tif 000007