(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
炭素数５〜６のラセミ体の２−アルカノールに、キャンディダ・ボイディニィ（Candida boidinii）ＳＡ０５１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４８９３）の菌体またはその処理物を接触させて、前記ラセミ体の２−アルカノール中の（Ｓ）−２−アルカノールのみを２−アルカノンに酸化させた後、反応物から（Ｒ）−２−アルカノールを分離することを特徴とする（Ｒ）−２−アルカノールの製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、（Ｒ）−２−アルカノールの製造法に関し、詳しくはアルコール酸化能を有するキャンディダ属酵母、特にキャンディダ・ボイディニィ（Candida boidinii）ＳＡ０５１の菌体を用いて、ラセミ体の２−アルカノールを基質として、この中の（Ｓ）−２−アルカノールのみを２−アルカノンに酸化させ、未反応物である（Ｒ）−２−アルカノールを分離することにより、効率よく（Ｒ）−２−アルカノールを製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
光学活性な２−アルカノールは、香料素材として有用であり、液晶の構成材料の一部としても知られている。この物質は、バナナ，ぶどう，キウイなどの果物や、生姜，椎茸などの野菜のほか、チーズ，味噌，酒など多くの食品中に含まれている。
光学活性な２−アルカノールの製造法としては、パン酵母などの微生物による２−アルカノンの不斉還元反応がよく知られているが、この方法では、プレローグの規則に従って主に（Ｓ）−２−アルカノールが得られ、（Ｒ）−２−アルカノールはほとんど得ることができない。
【０００３】
（Ｒ）−２−アルカノールを得る方法としては、オーレオバシディウム（Aureobasidium)属糸状菌を用いて、２−アルカノールのラセミ体中の（Ｓ）−体のみを選択的にケトンに酸化させ、残存する（Ｒ）−２−アルカノールを採取する方法が提案されている（特開平４−３６０６９７号公報）。しかし、この方法は、反応液中の基質濃度が０．１〜０．５ｗ／ｖ％と低く、また反応時間も３〜４日間と長時間を要し、（Ｒ）−２−アルカノールを得るのに効率的な方法であるとは言い難い。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
よって、本発明は、微生物を用いて、ラセミ体の２−アルカノールを基質として、この中の（Ｓ）−２−アルカノールのみを２−アルカノンに酸化させ、未反応物である（Ｒ）−２−アルカノールを分離することにより、（Ｒ）−２−アルカノールを効率よく得ることができる製造法を提供することを課題とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、アルコール酸化能を有する酵母であるキャンディダ・ボイディニィ（Candida boidinii）ＳＡ０５１を用いれば、２−アルカノールのラセミ体中の（Ｓ）−体のみが２−アルカノンに酸化され、反応物から未反応物である（Ｒ）−２−アルカノールを分離すれば、（Ｒ）−２−アルカノールを効率よく得ることができることを見出した。
【０００６】
この方法は、補酵素を必要とせず、培養した菌体と２−アルカノールを好気的条件下で接触させ、酸化反応を行うだけであり、容易に行うことができる。しかも、この酸化反応は、基質濃度が１０ｗ／ｖ％程度までは十分に進行し、さらに反応時間も５〜６時間程度の短時間でかなり進行する。それ故、この方法は、前記した特開平４−３６０６９７号公報記載の方法と比較してかなり優れていると言える。
【０００７】
本発明は、炭素数５〜６のラセミ体の２−アルカノールに、キャンディダ・ボイディニィ（Candida boidinii）ＳＡ０５１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４８９３）の菌体またはその処理物を接触させて、前記ラセミ体の２−アルカノール中の（Ｓ）−２−アルカノールのみを２−アルカノンに酸化させた後、反応物から（Ｒ）−２−アルカノールを分離することを特徴とする（Ｒ）−２−アルカノールの製造法に関する。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明に用いる微生物は、アルコール酸化能を有するキャンディダ属酵母であればいずれの菌株でもよいが、特にキャンディダ・ボイディニィ（Candida boidinii）ＳＡ０５１が好適である。このＳＡ０５１株は、メタノールなどの低級アルコールを酸化して、対応する低級アルデヒドを生産すると報告されているキャンディダ・ボイディニィ（Candida boidinii）ＡＯＵ−１の変異株である（Yasuyoshi Sakai ら、Agric. Biol. Chem., 51(8) pp.2177-2184 (1987); Agric. Biol. Chem., 51(9) pp.2617-2620 (1987)) 。ＳＡ０５１株は、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されており、その受託番号はＦＥＲＭ  ＢＰ−４８９３である。
【０００９】
本発明に用いるキャンディダ属酵母は、本出願前から知られている方法で培養することができる。特に好ましくは、キャンディダ・ボイディニィ（Candida boidinii）ＳＡ０５１株の培養は、最終的には炭素源としてメタノールのみを用いて培養するが、前培養または培養途中までは、グルコース，グリセリン，エタノール，キシロース，マンニトールなどの菌体増殖作用を有する物質を含む培地で培養しても差し支えない。炭素源としてメタノールを使用することが好ましい理由は、メタノールを含有しない培地、例えばグルコースのみを炭素源として含有する培地で培養した菌体をそのまま用いると、アルコール酸化能が十分に引き出されていないため、基質が酸化されにくくなることがあるからである。培地中の炭素源の濃度は、上記酵母が生育し得る濃度であればよく、通常は約０．５〜３ｗ／ｗ％程度である。
【００１０】
さらに培地には、塩化アンモニウム，硝酸アンモニウム，リン酸アンモニウム，尿素およびその他の資化性無機および／または有機窒素化合物；リン酸カリウム，リン酸二水素カリウム，リン酸ナトリウム，硫酸マグネシウム，塩化カルシウム，塩化第二鉄，硫酸第二鉄，塩化マンガン，硫酸マンガンのような無機塩類；モリブデン酸ナトリウム，ヨウ化カリウムのような微量無機塩類；エチレンジアミン四酢酸二ナトリウムのような有機塩類；銅，亜鉛，コバルトなどのいわゆる微量元素の塩類；ビオチン，塩酸チアミンのようなビタミン類，ホウ酸のような無機酸などを、適宜一般的な微生物の培養に用いられる濃度で添加する。
なお、酵母エキス，肉エキス，コーンスティープリカーなどの有機物の添加は、アルコール酸化酵素の生成を低下させるので好ましくない。
【００１１】
培地のｐＨは、培養開始時は約４〜７とし、その後ｐＨを約４〜６に維持して、好気的条件下、約２０〜３０℃で約５０〜１８０時間、好ましくはロータリーシェーカー、ジャーファーメンターなどを用いて振とうまたは撹拌培養する。なお、ジャーファーメンターを用いる場合には、あらかじめ培地にポリプロピレングリコールのような消泡剤を添加しておくとよい。
また、炭素源であるメタノールは、培地中に一度に添加してもよいが、酵母の生育状態に応じて数回に分けて添加することが好ましい。具体的には、酵母がメタノールを実質的に資化した後、さらに適量のメタノールの添加を繰り返すことによって、酵母菌体の増殖は直線的に続き、約１００ｇ dry cell weight／リットルの高濃度まで増殖させることが可能である。酵母の増殖により菌体量が増えるに伴い、アルコール酸化酵素の生成量も増加する。
【００１２】
本発明では、このようにして得られた培養液のほか、この培養液から分離した菌体の懸濁液を用いる。また、培養液から分離した菌体は、そのまま凍結して保存することが可能であり、これを必要に応じて解凍して用いることもできる。さらに、酵母菌体をホモジナイザーなどの物理的手段で破砕したような菌体処理物を用いることもできる。
【００１３】
本発明の酸化反応に供する酵母の菌体濃度は特に制限されないが、通常は約５〜１００ｇ dry cell weight／リットル（ＯＤ610 ＝約１７〜３３３に相当）、好ましくは約３０〜９０ｇ dry cell weight／リットル（ＯＤ610 ＝約１００〜３００に相当）に調整する。上記したような凍結保存した菌体であれば、使用時に所望の菌体濃度に調整することができ、高濃度にも容易に調整し得る。なお、菌体処理物を用いる場合は、上記菌体濃度に相当する量の菌体の処理物を含有する濃度に調整する。
【００１４】
一方、基質となるラセミ体の２−アルカノールとしては、炭素数９以下のものが用いられ、通常は炭素数５〜７のものが用いられる。具体的には、２−ペンタノール，２−ヘキサノールおよび２−ヘプタノールが用いられ、これらは混合物であってもよい。また、基質濃度は、約０．１〜１０ｗ／ｖ％、好ましくは約１〜３ｗ／ｖ％とする。
【００１５】
本発明の製造法は、上記したキャンディダ属酵母の菌体またはその処理物とラセミ体の２−アルカノールを、好気的条件下、約４〜４０℃、好ましくは約２０〜３０℃で、振とうまたは撹拌するなどの手段によって十分接触させ、酸化反応を行うことよりなる。なお、好気的条件としては、空気または濃縮酸素の存在下が好ましい。
反応液は、中性ないしアルカリ性に保つことが好ましい。反応液のｐＨの調整は、例えば水酸化ナトリウムのようなアルカリを加えるだけでもよいが、リン酸緩衝液のような緩衝液を用いてｐＨを約６〜１０、好ましくは約７〜９に維持するのが最適である。
反応時間は、通常約５〜５０時間であるが、５〜１０時間程度の短時間でも酸化反応はかなり進行する。反応の終点は、基質濃度，菌体濃度等によっても異なるので、ガスクロマトグラフィー（ＧＬＣ）などで追跡し、２−アルカノンの収率が５０％程度まで進行したところとするとよい。
【００１６】
反応後の処理は、目的物である（Ｒ）−２−アルカノールの分離であり、これは常法に従い、酢酸エチルなどの有機溶媒で抽出し、乾燥、濃縮などの操作を経て得られた粗生成物を、シリカゲルや活性アルミナを充填したカラムクロマトグラフィーなどにより、目的物である（Ｒ）−２−アルカノールと、酸化物である２−アルカノンとに分離することによって行われる。
【００１７】
【実施例】
次に、本発明を実施例により詳しく説明するが、本発明はこれらにより制限されるものではない。
参考例１：菌体の培養
７０リットルのジャーファーメンターを使用して、グルコース１２０ｇ，塩化アンモニウム３０５．２ｇ，リン酸二水素カリウム１１２．４ｇ，硫酸マグネシウム２３．６ｇ，塩化カルシウム２．２ｇ, 塩化第二鉄１．５ｇ，エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム１８ｇ，硫酸マンガン０．６８ｇ，硫酸亜鉛０．８８ｇ，硫酸銅０．１６ｇ，塩化コバルト０．１１ｇ，モリブデン酸ナトリウム０．１ｇ，ホウ酸０．１６ｇ，ヨウ化カリウム２４ｍｇ，ビオチン２ｍｇ，塩酸チアミン０．２ｇおよびポリプロピレングリコール１．６ｇをイオン交換水４０リットルに加えて溶解し、８％水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ６．０に調整した。
【００１８】
得られた培地を１２１℃で１０分間滅菌した後、キャンディダ・ボイディニィ（Candida boidinii）ＳＡ０５１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４８９３）の４８時間・前培養液８００ｍｌを接種した。通気２０リットル／分，温度２８℃, 撹拌２００ｒｐｍの条件で培養し、培養開始１６時間後に８％水酸化ナトリウムでｐＨ５．０に調整し、メタノール４００ｍｌを添加した。
培地のｐＨを５．０に維持しながら培養を続け、さらにメタノールが完全に消費されてしまう前に１．２ｗ／ｗ％相当量のメタノールの添加を繰り返し、１０５時間の培養で４８．２ｇ dry cell weight／リットルの菌体を得た。遠心分離により集菌した後、ｐＨ６〜９の０．１Ｍリン酸緩衝液で洗浄し、再び集菌して常法により凍結保存した。
【００１９】
実施例１：（Ｒ）−２−ペンタノールの製造
上記参考例１で凍結保存したキャンディダ・ボイディニィ（Candida boidinii）ＳＡ０５１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４８９３）の菌体を解凍し、ＯＤ610 ＝１００（３０ｇ dry cell weight／リットルに相当）となるようにｐＨ７．５の０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液で希釈した。得られた菌体懸濁液２０ｍｌに、２−ペンタノール２００ｍｇを加え、酸素雰囲気下、２７℃で６時間撹拌しながら酸化反応を行った。
酸化反応の終点をＧＬＣ（使用機器はヒューレットパッカード社製５８９０−シリーズII、カラムはジーエルサイエンス株式会社製ＢＣ−ＷＡＸ, ３０ｍ×０．２５ｍｍ，Ｉ．Ｄ．＝０．２５μｍを用い、温度は６０℃から５℃／分で１１０℃まで昇温した）で確認した後、反応液を酢酸エチルで抽出し、得られた有機層を硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧濃縮した。
【００２０】
このようにして得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（固定相はメルク社製シリカゲル６０を用い、移動相はヘキサン：酢酸エチルの混合液を容量比で５０：１〜１０：１に調整した）で精製し、（Ｒ）−２−ペンタノール７９ｍｇおよび２−ペンタノン１１８ｍｇを得た。
得られた（Ｒ）−２−ペンタノールの光学純度は、（−）−カンファン酸エステルに誘導してＧＬＣ（使用機器はヒューレットパッカード社製５８９０−シリーズII、カラムはジーエルサイエンス株式会社製ＢＣ−ＷＡＸ, ３０ｍ×０．２５ｍｍ，Ｉ．Ｄ．＝０．２５μｍを用い、温度は８０℃から５℃／分で２１０℃まで昇温した）で分析した結果、７３％e.e.であった。
【００２１】
実施例２：（Ｒ）−２−ヘキサノールの製造
２−ヘキサノール２００ｍｇを用いて、基質濃度＝１ｗ／ｖ％，菌体濃度＝３０ｇ dry cell weight／リットル（ＯＤ610 ＝１００に相当）の条件で、上記実施例１と同様にして５時間反応を行い、（Ｒ）−２−ヘキサノール１０９ｍｇ（光学純度：７５％e.e.）および２−ヘキサノン８９ｍｇを得た。
【００２２】
参考例２：（Ｒ）−２−ヘプタノールの製造
２−ヘプタノール１ｇを用いて、基質濃度＝１ｗ／ｖ％，菌体濃度＝３０ｇ dry cell weight／リットル（ＯＤ610 ＝１００に相当）の条件で、上記実施例１と同様にして４７時間反応を行い、（Ｒ）−２−ヘプタノール５２８ｍｇ（光学純度：６７％e.e.）および２−ヘプタノン４６４ｍｇを得た。
【００２３】
【発明の効果】
本発明によれば、アルコール酸化能を有するキャンディダ属酵母、特にキャンディダ・ボイディニィ（Candida boidinii）ＳＡ０５１の菌体を用いることによって、ラセミ体の２−アルカノールから、この中の（Ｓ）−２−アルカノールのみを２−アルカノンに酸化させ、未反応物である（Ｒ）−２−アルカノールを分離することにより（Ｒ）−２−アルカノールを効率よく得ることができる。
得られた（Ｒ）−２−アルカノールは、香料素材や液晶の材料、その他の光学活性化合物の合成原料としての用途が期待される。
また、酸化物である２−アルカノンは、常法に従いパン酵母などの微生物による不斉還元反応を行えば、（Ｓ）−２−アルカノールを得ることができ、このものも香料素材や液晶の材料、その他の光学活性化合物の合成原料としての用途が期待されるものである。