(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
高分子の構造解析に用いる結晶の結晶品質を評価するための方法であって、複数の結晶の中から任意の一の標準結晶と他の比較結晶とを選択し、それぞれの比較結晶について次式：
【式１】
0003740136.tif 000009
（式中、Y1，k1，B1は、それぞれ比較結晶1のY，尺度因子k，温度因子Bであり；Y2，k2，B2は、それぞれ標準結晶2のY，尺度因子k，温度因子Bであり；θは回折のBragg角であり；そして、λは入射Ｘ線の波長である。）
を用いてWilson Plotを行い、前記比較結晶と前記標準結晶との見掛けの温度因子の差を求め相対的な比較を行うことにより、ｓｉｎ２θ／λ２＜０．０２８の低分解能領域において前記比較結晶の結晶品質を評価することを特徴とする方法。
【請求項２】
高分子が生体高分子である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
高分子が核酸である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
高分子がB形DNA10量体である、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、高分子の結晶構造解析に関するものであり、より具体的には、タンパク質等の生体高分子の結晶構造解析に用いる結晶試料の結晶品質を評価するための方法に関するものである。なお、本発明は、宇宙環境利用に関する公募地上研究による（財）日本宇宙フォーラムからの受託研究として日本原子力研究所が平成14年に実施した「タンパク質結晶成長の分子レベルでの機構解明と微少重力がタンパク質の結晶成長パラメータに及ぼす効果の解析」の研究成果である。
【０００２】
【従来の技術】
高分子、とりわけ近年のバイオテクノロジー分野の発展に伴い、生体高分子について、迅速且つ簡便に結晶構造を解析できる手法を開発する必要が高まっている。高分子の結晶構造解析においては、本質的に、データ量とその解析に要する時間が問題となる。また、Ｘ線回折による構造解析においては、解析精度は用いる結晶の品質、すなわち回折分解能によって左右される。したがって、構造解析の際には、一般的に、高分解能データの得られる結晶が良質とみなされ、構造解析に付随する問題であるデータ量の削減と所要時間の短縮化のためには、いずれの結晶を解析に用いるかを決定するため、結晶品質の予備評価が不可欠である。
【０００３】
ここで、結晶品質とは、本来、分子配列の規則性を意味し、結晶構造解析により明らかとなるものであるが、結晶構造解析に用いる結晶の回折による予備評価を行う際には、大きさの異なる同一品質の結晶が存在すれば、大きい結晶から高分解能データが短時間で得られることは明らかであり、結晶の大きさに依存することなく結晶品質の評価が可能な方法に対する必要性が存在している。
【０００４】
このように結晶品質の評価は、最終的には、結晶構造解析を行わなければ判定不可能であるため、より簡便な方法として、これまで、R-mergeやI/σ、モザイシティといったパラメータを評価対象とする場合が多かった。しかし、R-mergeやI/σは元来実験測定精度の尺度であり、結晶品質評価の尺度として扱うのは不適当である。また、データ還元プログラム（Data Reduction Program）上では、モザイシティを、ブラグ反射が結晶の回転角何度に亘って現れるかに依存して定義している場合があるが、ブラグ反射の出現はビームの広がり等が主要因であるから、結晶の品質に相当するものとはいえない。
【０００５】
一方、本発明者らはこれまでに、DNA、MgCl2、MPD（2-メチル-2,4-ペンタンジオール）の三成分の濃度を変化させてDNA10量体 d(CCATTAATGG)の結晶化の相図を作成し、この相図を基にして、結晶析出境界線近傍（特に、DNA溶解度極小付近）における各成分濃度で大型の結晶が得られることを開示している（特願2002-218424号）が、結晶析出境界線近傍で得られる大型結晶の顕微鏡観察によっては、結晶品質の違いを定量的に評価することは困難であった。
【０００６】
このように、結晶品質を迅速且つ簡便に評価する方法は未だ確立されていない。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、高分子の結晶構造解析に用いる結晶の結晶品質を迅速且つ簡便に評価する方法を開発することをその課題とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するため鋭意研究を重ねた結果、本発明者らは、高分子、特に生体高分子の構造解析に有用な結晶品質を評価するための方法に関する本発明を完成させた。
【０００９】
すなわち、本発明は、高分子の構造解析に用いる結晶の結晶品質を評価するための方法であって、Wilson Plotによる見掛けの温度因子を結晶品質評価の尺度に用いることを特徴とする方法を課題解決手段とするものである。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明は、具体的には、高分子の構造解析に用いる結晶の結晶品質を評価するための方法であって、複数の結晶の中から任意の一の標準結晶と他の比較結晶とを選択し、それぞれの比較結晶について次式：
【００１１】
【式２】
0003740136.tif 000002
【００１２】
（式中、Y1，k1，B1は、それぞれ比較結晶1のY，尺度因子k，温度因子Bであり；Y2，k2，B2は、それぞれ標準結晶2のY，尺度因子k，温度因子Bであり；θは回折のBragg角であり；そして、λは入射Ｘ線の波長である。）
を用いてWilson Plotを行い、前記比較結晶と前記標準結晶との温度因子の差を求め相対的な比較を行うことにより、前記比較結晶の結晶品質を評価することを特徴とする方法に関する発明である。したがって、本発明を実施するにあたっては、評価結果の相対的な差を明確にすることが重要である。
【００１３】
結晶品質の評価対象である結晶についてそれぞれの結晶からの反射強度を用いてWilson Plotを行うと、その勾配から温度因子が求められ、勾配が小さい、即ち温度因子が小さい結晶は、横軸（dの逆数に相当する）を過る位置がdの小さい位置となる。このことは、そのような結晶については高分解能の反射（dの小さい反射）まで観測可能であることを意味し、したがって、見掛けの温度因子が小さければ結晶構造解析に適した良質の結晶であるといえる。このようにして得られる温度因子（Wilson Plotの勾配）は結晶の大きさには依存しない量である。
【００１４】
本発明において評価することができる高分子は特に限定されることはなく、したがって、本発明は、複雑な高次構造を有するDNA等の生体高分子の結晶品質を評価することができる点で有用である。
【００１５】
本発明に用いるＸ線源、回折計は、当技術分野において慣用的に用いられているものを使用することができるが、評価結果の相対的な差を明確にするためには、本発明の実施に亘って同一のものを使用することが好ましい。
【００１６】
本発明を更に詳細に理解するために以下に実施例を記載するが、本実施例は本発明の例示を意図するものであり本発明の範囲を限定するものではない。
【００１７】
【実施例】
本実施例においては、評価試料として、生体高分子であるB形DNA10量体d(CCATTAATGG)を使用した。このDNA配列は、Ｘ線構造解析により精力的な構造化学研究が行われているB形DNAファミリーd(CCAxxxxTGG)に属するものである。
【００１８】
試料の結晶化
本実施例においては、MPD30% v/v及び31.5% v/v存在下の二つの結晶化の相図において、結晶析出境界条件の近傍の条件で得られた4つの結晶の品質を比較評価した。図１に、結晶化の相図と評価に用いた結晶の光学顕微鏡写真を示す。図１中、相図は、上図がMPD31.5%存在下、下図がMPD30.0%存在下におけるDNA10量体の結晶化の相図であり、結晶の析出した条件をプロットで表している。したがって、図１中、曲線（結晶析出境界線）の上方領域のDNA濃度（mM）及びMgCl2濃度（mM）において、DNAが結晶化することを示している。かかる系においては、MPDは沈殿剤として働き、MgCl2はMg2+カチオンの形態で結晶化剤として働く。
【００１９】
なお、結晶析出境界線近傍の結晶に関しては、これまでに本発明者らにより、顕微鏡観察手段によっては結晶品質の違いの定量的評価が困難であることが明らかにされている（特願2002-218424号）。
【００２０】
評価に用いた４つの結晶の結晶化条件及び結晶のサイズを表１に示す。
【００２１】
【表１】
0003740136.tif 000003
【００２２】
これらの結晶は、マイクロバッチ法（液量4μl）を用い、6℃の条件下で1ヶ月の育成期間により調製した。pHは7.0とし、100mMカコジル酸ナトリウムを緩衝液として用いた。
【００２３】
ここで、「マイクロバッチ法」とは、微量試料でも適用可能なように改良されたバッチ法であり、具体的には生体分子、沈殿剤等を目標とする濃度になるように溶液中で混合し、一定温度条件下に静置することにより結晶を育成する方法である。
【００２４】
Ｘ線結晶回折
Ｘ線結晶回折計はDIP2020（マックサイエンス社製）を用いた。評価する結晶を、窒素ガスによる吹き付け低温装置であるクライオストリームクーラ（オックスフォード社製）を用いて233Kに冷却し、Δω=2°毎の振動写真法による測定を行った。各結晶の測定結果を表２に示す。
【００２５】
ここで、Ｘ線結晶回折の際の結晶温度は、用いる結晶の結晶構造が保持できる温度であればよく、本実施例においては、評価対象である試料の結晶化が279Kで行われたことと冷却装置の精度とを鑑み、233Kを選定した。
【００２６】
【表２】
0003740136.tif 000004
【００２７】
表中、Unit Cellは格子定数、Space groupは空間群、Limiting resolutionは反射が測定できた最大の分解能であり、そしてCompletenessは測定された反射の反射総数に対する割合を示す。
【００２８】
Wilson Plot
Wilson Plotによれば、温度因子（またはデバイ−ワラー因子）B及び測定強度Iobs(hkl)を絶対尺度に換算するための尺度因子kを大まかに見積もることができる。単位胞中の全ての原子が同一の等方性熱運動をしていると仮定すると、実験値であるIobs(hkl)と温度因子B、及び尺度因子kの関係は次式で表すことができる。
【００２９】
【式３】
0003740136.tif 000005
【００３０】
式中、λは入射Ｘ線の波長（本実施例においては、λ＝1.5418Å）であり、bjは静止原子jの散乱因子であり、Yは単位格子内の原子全体の散乱強度Σjbj2で測定強度の平均値<Iobs(hkl)>を規格化した値であり、θは回折のBragg角である。（式１）の対数をとると（式２）が与えられ、これをプロットした図がWilson Plotとなる。
【００３１】
【式４】
0003740136.tif 000006
【００３２】
Wilson Plotの勾配からは見掛けの温度因子Bが求まり、切片からは尺度因子kが求まる。
【００３３】
ここで、Wilson Plotから温度因子Bを求める場合、一般的には、d〜3Åよりも高分解能（本実施例においては、sin2θ/λ2=0.028以上）の直線領域の勾配が利用される（dは結晶の面間隔である）。したがって、低分解能の反射しか得られていない結晶を評価する場合には、従来の解析法で温度因子Bを見積もることは困難を伴う。換言すれば、従来の解析法では、d〜3Åよりも低分解能の反射は有効に活用されないと言うことができる。
【００３４】
そこで、本発明においては、Ｘ線回折の分解能の高低による影響を受けることなく結晶品質の評価を行うため、高分子結晶について、標準結晶の温度因子を基準とした相対的な温度因子を比較することにより、高分子の構造解析に適した結晶の相対的評価を行う。すなわち、複数の結晶の中から任意の一の標準結晶と他の比較結晶とを選択し、それぞれの比較結晶について下記の（式３）を用いてWilson Plotを行い、比較結晶とその標準結晶の温度因子との差を求めることにより、結晶品質の評価を行う。
【００３５】
【式５】
0003740136.tif 000007
【００３６】
式中、Y1，k1，B1は、それぞれ比較結晶1のY，尺度因子k，温度因子Bであり；Y2，k2，B2は、それぞれ標準結晶2のY，尺度因子k，温度因子Bであり；Yは（式１）と同じであり；θは回折のBragg角であり；そして、λは入射Ｘ線の波長である。
【００３７】
本発明によれば、従来の解析法では不可能であったdの測定範囲全体を利用して、結晶品質の評価を行うことが可能となる。
【００３８】
結晶品質の評価
図２に、本実施例に用いた4つの結晶に関する、（式２）によるWilson Plotを示す。
【００３９】
図２において、結晶Aは4つの結晶の中で最も高分解能のデータが得られた。しかし、従来の方法に従った図２のプロットではデータ点のばらつきが激しく、また、d〜3Åよりも高分解能の領域（sin2θ/λ2=0.028以上）が測定できたのは結晶Aのみである。以上のことから、このプロットから各結晶の温度因子Bを個別に求めるのは困難であると考えられた。
【００４０】
そこで、結晶Aを標準結晶として（式３）を適用し、ln（Y/YA）対(sinθ/λ)2のプロットを行った。結果を図３に示す。各プロットは最小二乗法でフィッティングし、その勾配から結晶Ａを基準として各結晶の温度因子の差を相対的に求めた。表３は、プロットの勾配及び温度因子の差を示す。
【００４１】
【表３】
0003740136.tif 000008
【００４２】
表３中、結晶Aは標準結晶のため、勾配は0となる。一方、標準結晶Aに対して、結晶B，C，Dは負の勾配を示し、A，C，D，Bの順で勾配が増大（すなわち、温度因子が増大）した。すなわち、本実施例において用いた4つの結晶の中では、結晶Aが最も熱的ゆらぎが少ないことが分かる。
【００４３】
結晶Cのプロットは勾配が非常に小さく、結晶A（勾配0）に非常に近い。このことは、結晶Aと結晶Cがほぼ同等の結晶品質を有することを示唆するものである。結晶Cの結晶化条件、すなわちDNA(mM); MPD(%); MgCl2(mM) = 1.0; 30.0; 100においては、これまでに本発明者らにより、1mm2以上の巨大単結晶が育成された実績がある（特願2002-218424号）。この結果は、塩濃度及びDNA濃度が低ければ低いほど（換言すれば、結晶化の相図においてDNA溶解度極小に近づくほど）、結晶の大きさだけでなく品質も向上することを示唆している。
【００４４】
本実施例においては、4つの単結晶について、本発明方法を用いてWilson Plotによる見掛けの温度因子を相対的に比較することにより、結晶品質の簡便且つ迅速な評価を達成することができた。
【００４５】
【発明の効果】
本発明により、結晶品質を迅速且つ簡便に評価する方法が確立された。
【００４６】
本発明にしたがえば、Wilson Plotによる見掛けの温度因子を利用することで、結晶構造解析を行うことなく結晶品質の差を明らかにすることが可能となる。結晶成長機構解明のためには結晶品質評価は必要不可欠であり、本発明は簡便且つ精密な評価法として利用価値は高いといえる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、MPD31.5%及びMPD30.0%存在下におけるDNA10量体の結晶化の相図と、結晶品質評価に使用した4つの結晶のＸ線回折図を示している。
【図２】  図２は、実施例において用いた4つの結晶の式２によるWilson Plotを示している。
【図３】  図３は、実施例において用いた4つの結晶の本発明によるWilson Plotを示している。
【図１】
0003740136.tif 000010
【図２】
0003740136.tif 000011
【図３】
0003740136.tif 000012