(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ基にグルタルアルデヒド由来のアルデヒド基が導入されているアミノアルキルシラン、及びアルキルシランとが表面に混在することを特徴とするマイクロチップ用基板。
【請求項２】
アミノアルキルシランの分子鎖長がアルキルシランの分子鎖長より長い請求項１記載のマイクロチップ用基板。
【請求項３】
基板材料がガラスである請求項１又は２記載のマイクロチップ用基板。
【請求項４】
基板材料がプラスチックである請求項１又は２記載のマイクロチップ用基板。
【請求項５】
プラスチックが飽和環状ポリオレフィンである請求項４記載のマイクロチップ用プラスチック基板。
【請求項６】
ガラス基板に、
(１)アミノアルキルシランとアルキルシランを含有する溶液との接触
(２)グルタルアルデヒドを含有する溶液との接触、
を含むマイクロチップ用基板の製造方法
【請求項７】
プラスチック基板に、
（１）表面の酸化処理、
（２）アミノアルキルシランとアルキルシランとを含有する溶液との接触、
（３）グルタルアルデヒドを含有する溶液との接触、
を含むマイクロチップ用基板の製造方法。
【請求項８】
表面の酸化処理が低温プラズマ処理である請求項７記載のマイクロチップ用基板の製造方法。
【請求項９】
プラスチックが飽和環状ポリオレフィン樹脂である請求項７又は８記載のマイクロチップ用基板の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、主にＤＮＡや蛋白などの生体由来物を表面に固定し、これら生体由来物質の測定に用いるマイクロチップ特にＤＮＡチップに用いるマイクロチップ用基板及びその製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
DNA断片の一本鎖の基板への固定の方法には大きく大別して、吸着による方法と、共有結合を形成させる方法とがある。
DNA断片鎖の吸着による基板への固定は、DNAが負電荷を有していることを利用しており、基板表面に正電荷を付与し、電気的引力によりDNA断片を吸着し固定するものである。
このような方法に用いる基板として、ポリリジンを表面にコートしたものが用いられる。しかし、ポリリジンは一般にコート後の安定性が悪く長期にわたる保存が難しい。ポリリジンを基板にコート後時間の経過とともにDNA断片の固定化能が低下してくる。またさらに、DNAを固定化後の保存性も悪く、室温の保存においては２週間程度しか保存することができない。
【０００３】
同じように正電荷を付与する方法として、アミノシランをガラス基板に反応させ、アミノ基を導入する方法がある。
従来からの基板はガラス製が使用されており、ガラスと相性の良いアミノシランが使用されている。ガラス基板へのアミノシランの反応は容易であり、容易にアミノ基をガラス基板表面に導入することができる。
【０００４】
数百から千塩基からなる長鎖のDNAの固定においては、アミノ基を導入しDNA鎖が負電荷を帯びていることを利用し吸着させる方法が有効であり、アミノシランによるアミノ基の導入は、上記ポリリジンコートの代替法として、保存安定性も高く有効な方法である。
【０００５】
しかし、数十程度の塩基からなる、いわゆるオリゴDNAと呼ばれる短いDNA鎖の固定にはアミノ基との電気的吸着を利用した固定は困難である。
なぜならば、短いDNA鎖の場合、単に吸着だけでは安定したDNAの固定化が不可能であり、基板上へのスポッティング後DNAの脱落が生じるほか、ハイブリダイゼーションによるDNAの検出において、ハイブリダイズが効率的に起こらずDNAの検出が不可能であったり、検出強度にばらつきが生じるからである。
【０００６】
そこで、オリゴＤＮＡの固定には共有結合を形成させ基板表面に固定する方法が取られている。
最も知られている方法は、上記のようにアミノ基を導入した固定用基板を用い、一方DNA断片鎖の末端にアミノ基を導入し、グルタルアルデヒドのような架橋剤を用い、共有結合的によりDNA断片鎖を基板表面に固定する方法である。
【０００７】
ガラス基板の場合、表面に多くの水酸基を有しており、アミノシランの導入密度も高いものとなる。高い密度のアミノ基の導入は、結合点が多くDNA断片鎖を効率良く固定できるようにも見える。しかしながら、上記のように、グルタルアルデヒドでの架橋による共有結合の形成では、アミノシラン由来のアミノ基の密度が高いと、グルタルアルデヒドを加えるとアミノシランのアミノ基同士が架橋することとなり、DNA鎖側のアミノ基と共有結合を形成することができなくなり、DNA断片鎖の固定化量も減少することになる。
【０００８】
また、シランカップリング剤の濃度を希薄にし、アミノ基の密度を適度に下げることも考えられえるが、シランカップリング剤と反応せずにフリーな状態の水酸基が存在すると表面全体の電荷は負電荷となっており、負電荷を帯びているDNA鎖は表面に接近し難くなり、アミノ基の先端に導入されたアルデヒド基との結合を妨げることになり、十分な量のDNA断片鎖を固定することが困難となる。
【０００９】
さらに、固定したオリゴＤＮＡ断片鎖に対象となるＤＮＡ鎖をハイブリダイズさせ、対応するＤＮＡ鎖が存在をみるが、このハイブリダイゼーションにおいて高い検出感度を確保するために高い効率でＤＮＡを相同させる必要がある。高いハイブリダイズ効率は低いＤＮＡ濃度でも目的とするＤＮＡの検出を可能とし、さらに検出の再現性を高めることが可能となる。しかしながら、現在のガラス基板上ではハイブリダイゼーションにおけるＤＮＡの相同効率は低く、ＤＮＡ検出における再現性の面でも十分なものではなかった。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、DNAチップの作製に用いるための基板として使用するにあたり、DNA断片鎖の固定効率が高く、基板全体でのDNA断片鎖の固定量にばらつきが無く、さらに固定したDNA断片鎖とその対象となるDNA鎖とのハイブリダイゼーションにおけるハイブリダイズ効率が高く、かつ再現性が高いDNA固定用の基板を提供することにある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明は、上記のような従来の問題点を解決するため、ガラス製の基板ではアルキルアミノシランとアルキルシランを混在させたかたちでアミノ基を導入した後、アミノシランのアミノ基にグルタルアルデヒドによりアルデヒド基導入すると、DNA断片の固定効率が高くかつ再現性が高いこことを見出し、さらにプラスチック基板では、酸化処理により表面に水酸基を導入したのちアルキルアミノシランとアルキルシランを混在させたかたちでアミノ基を導入した後、アミノシランのアミノ基にグルタルアルデヒドによりアルデヒド基導入することによりガラス基板同様にDNA断片の固定効率が高くかつ再現性が本発明を完成するに至った。
【００１２】
即ち本発明は、
（１）  アミノ基にグルタルアルデヒド由来のアルデヒド基が導入されているアミノアルキルシラン、及びアルキルシランとが表面に混在マイクロチップ用基板、
（２）  アミノアルキルシランの分子鎖長がアルキルシランの分子鎖長より長い第（１）項記載のマイクロチップ用基板、
（３）基板材料がガラスである第（１）又は（２）項記載のマイクロチップ用基板、
（４）基板材料がプラスチックである第（１）又は（２）項記載のマイクロチップ用基板
（５）プラスチックが飽和環状ポリオレフィンである第（４）項記載のマイクロチップ用プラスチック基板、
（６）ガラス基板に、(１)アミノアルキルシランとアルキルシランを含有する溶液との接触、
(２)グルタルアルデヒドを含有する溶液との接触、
を含むマイクロチップ用基板の製造方法、
（７）  プラスチック基板に
(１)表面の酸化処理、
(２)アミノアルキルシランとアルキルシランを含有する溶液との接触、
（３）グルタルアルデヒドを含有する溶液との接触、
を含むマイクロチップ用基板の製造方法。
（８）表面の酸化処理が低温プラズマ処理である第（７）項記載のマイクロチップ用基板の製造方法、
（９）プラスチックが飽和環状ポリオレフィン樹脂である第（７）又は（８）項記載のマイクロチップ用基板の製造方法、
である。
【００１３】
【発明の実施の形態】
以下、本発明のマイクロチップ用基板（以下、基板と略す）及びその製造方法について詳細に説明する。
本発明の対象となる基板の形態は、一般に生物由来物質を固定し測定に用いられる形態に広く適応される。たとえば、免疫分析の分野で広く用いられている免疫分析用のプレート類や、同じくビーズ類が挙げられるが、特にDNAチップとして用いられる板状の形態が最も好適なものである。
【００１４】
基板の材料としては、ガラス又はプラスチックを用いる。ガラスはＤＮＡチップ用基板として従来より用いられている。ＤＮＡチップにおいては蛍光による検出方法が用いられ、広い光波長の範囲で蛍光の発生が低く蛍光を用いる検出系には適した材質である。
【００１５】
プラスチックとしては、良好な成形性、耐水性、耐熱性を有していれば特に制限されるものではないが、蛍光をDNAに修飾してDNAの検出を行なう手法が広く用いられており、蛍光の発生が少ない材質が好ましく、このような樹脂として、飽和環状ポリオレフィン樹脂やフッ素樹脂などが挙げられる。
中でも、飽和環状ポリオレフィン樹脂については、耐熱性が高く、DNAチップにおいて汎用されている蛍光色素であるCy3およびCy5の波長領域で自己蛍光が少なく好適である。フッ素樹脂は広い波長領域において自己蛍光性が低いが、成形において発生するフッ素の除去が必要であり、成形が難しいのが欠点である。
【００１６】
次に、基板へのアルデヒド基の導入手順について記載する。ガラスにおいては水酸基が表面に存在するため酸化処理は必要ないが、プラスチック基材では、まず基板の表面に酸化処理により水酸基を導入する。酸化処理の方法として、低温プラズマ処理、コロナ放電処理やフレーム処理、その他化学的な処理があげられる。樹脂表面に、安定して均一な酸化処理を行なえる方法として、低温プラズマによる処理が好ましく、その際用いるガス種としては、酸素を用いるのが水酸基の安定した導入ができることから好適である。
【００１７】
次に、アミノアルキルシランと接触させ基板表面に導入された水酸基とアミノアルキルシランを反応させアミノ基を導入する。このときアミノアルキルシランとアルキルシランとを混合し、メタノール等の有機溶媒中に溶解した溶液を調製し、表面を酸化処理した基板をこの溶液中に浸漬し放置することにより、基板表面へのアミノ基の導入を行なう。反応後基板を溶液中から取り出し、純水で洗浄を行う。この時点でアミノアルキルシランとアルキルシランが混在したかたちで基板表面に導入される。
【００１８】
次に、導入したアミノアルキルシランのアミノ基にアルデヒド基を導入する。グルタルアルデヒドを溶液中に溶解し、上記アミノ基を導入した担体をこの溶液中に浸漬し放置し、グルタルアルデヒドの一つのアルデヒド基とアミノ基を反応させ、放置後、超純水で洗浄し乾燥させ、最終的にアミノ基にグルタルアルデヒド由来のアルデヒド基が導入されているアミノアルキルシランとアルキルシランが表面に混在したプラスチック基板を得る。
【００１９】
表面を分子レベルでみるとアルデヒド基を先端に有する分子鎖と反応基を有しない分子鎖が基板表面から林立した形となっていると考えられ、アミノアルキルシランとアルキルシランとの混合比を調整することにより、アミノ基同士の距離を十分保ち、グルタルアルデヒドによるアミノ基同士の架橋を防止することにより効率よくアルデヒド基が導入される。
【００２０】
アミノアルキルシランとアルキルシランの混合比は、基板への水酸基の導入量にもよるが、アミノアルキルシラン１００重量部に対してアルキルシランが２０〜４００重量部の範囲が好適である。２０重量部未満では、アルキルシランを混在させることの効果が認められなくなり、４００重量部部を超えるとアルデヒド基の密度が低くなり、ＤＮＡの単位面積あたりの固定化量が少なくなる。
また、最終的にハイブリダイズさせるＤＮＡの長さによりアルキルシランの混在率を調整する。ＤＮＡ長が長い場合はアルキルシランの割合を増やし、短い場合はアルキルシランの混在率を下げた方がハイブリ効率を上げるのに有効である。
【００２１】
アミノアルキルシランおよびアルキルシランの分子鎖は直鎖状のものが好ましく、途中に窒素原子などが存在し屈曲しているものは好ましくない。屈曲した分子鎖のものを用いると、先に述べた、各分子鎖が支えあって林立した状態を形成することができなくなり、ＤＮＡの固定化効率は大きく低下することになる。
【００２２】
さらに、アミノアルキルシランより分子鎖長の短いアルキルシランを用いることにより、アルデヒド基を有する分子鎖が、アルキルシランの分子鎖に支えられた状態でアルデヒド基を有する分子鎖部分が頭を出した形態をとるため、アルデヒド基とアミノ基を導入したＤＮＡ断片が効率良く反応し、高いＤＮＡ固定化率を得ることができる。さらに、固定化されたＤＮＡ鎖は基板表面から距離を保ち固定化されることにより後のハイブリダイゼーションの過程でＤＮＡ断片の相同が起こりやすくハイブリ効率を高めることができる。
【００２３】
【実施例】
以下実施例により本発明について、具体的に説明する。
（実施例１）
飽和環状ポリオレフィン樹脂を用い、射出成形によりスライドグラス状の基板を得た。この成形物に低温酸素プラズマ処理により表面に親水化処理を施した。次に、γ―アミノプロピルトリエトキシシランとメチルトリエトキシシランを２：１でメタノール中に５％の濃度で溶解させたものをアミノ基導入処理液として調製し、この溶液の中に２時間浸漬の後、基板を溶液から取り出し、超純水中に浸漬し放置後基板を取り出し乾燥した。グルタルアルデヒドをPBS（−）中に２％の濃度で溶解させてグルタルアルデヒド溶液を調製し、アミノアルキルシラン処理を行なった基板をグルタルアルデヒド溶液中に浸漬し、４時間放置した後、基板を取り出して超純水中に浸漬し、洗浄乾燥した。
【００２４】
（実施例２）
ガラス製のスライドガラスを準備し、γ―アミノプロピルトリエトキシシランとメチルトリエトキシシランを１：２でメタノール中に５％の濃度で溶解させたものをアミノ基導入処理液として調製し、この溶液の中に２時間浸漬の後に基板を溶液から取り出し、超純水中に浸漬し放置後基板を取り出し乾燥した。グルタルアルデヒドをPBS（−）中に２％の濃度で溶解させ、グルタルアルデヒド溶液を調製し、アミノシラン処理を行なった基板を、グルタルアルデヒド溶液中に浸漬し、４時間放置した後に基板を取り出し、超純水中に浸漬して洗浄し乾燥した。
【００２５】
（比較例１）
飽和環状ポリオレフィン樹脂を用い、射出成形によりスライドグラス状の基板を得た。この成形物に低温酸素プラズマ処理により表面に親水化処理を施した。次に、γ―アミノプロピルトリエトキシシランをメタノール中に５％の濃度で溶解させたものをアミノ基導入処理液として調製し、この溶液の中に２時間浸漬の後、基板を溶液から取り出し、超純水中に浸漬し放置後基板を取り出し乾燥した。グルタルアルデヒドをPBS（−）中に２％の濃度で溶解させてグルタルアルデヒド溶液を調製し、アミノアルキルシラン処理を行なった基板をグルタルアルデヒド溶液中に浸漬し、４時間放置した後、基板を取り出して超純水中に浸漬し、洗浄乾燥した。
【００２６】
（比較例２）
ガラス製のスライドガラスを準備し、γ―アミノプロピルトリエトキシシランを用い、メタノール中５％の濃度で溶解させたものをアミノ基導入処理液として調製し、この溶液の中に２時間浸漬の後に基板を溶液から取り出し、超純水中に浸漬し放置後基板を取り出し乾燥した。グルタルアルデヒドをPBS（−）中に２％の濃度で溶解させ、グルタルアルデヒド溶液を調製し、アミノシラン処理を行なった基板を、グルタルアルデヒド溶液中に浸漬し、４時間放置した後に基板を取り出し、超純水中に浸漬して洗浄し乾燥した。
【００２７】
（アミノ化オリゴＤＮＡ）
５´−ＴＡＧＡＡＧＣＡＴＴＴＧＣＧＧＴＧＧＡＣＧＡＴＧ−３´(配列番号１)の配列よりなるオリゴＤＮＡの５´末端にアミノ基を導入したオリゴＤＮＡ（以後アミノ化オリゴＤＮＡと称す）を合成した。
【００２８】
（ローダミン標識オリゴＤＮＡ）
上記、アミノ化ＤＮＡの塩基配列と対になる、５´−ＣＡＴＣＧＴＣＣＡＣＣＧＣＡＡＡＴＧＣＴＴＣＴＡ−３´(配列番号２)の配列よりなるオリゴＤＮＡの５´末端にローダミンを標識したオリゴＤＮＡ（以後ローダミン標識オリゴＤＮＡと称す）を合成した。
【００２９】
（Ｃｙ３標識ｃＤＮＡ）
センス
５’ -ＴＧＡＣＧＧＧＧＴＣＡＣＣＣＡＣＡＣＴＧＴＧＣＣ−３’ (配列番号３)
アンチセンス
５´−ＴＡＧＡＡＧＣＡＴＴＴＧＣＧＧＴＧＧＡＣＧＡＴＧ−３´(配列番号１)の配列よりなるプライマーを合成、一方、ＨｅＬａ細胞からｃＤＮＡを調達した。このｃＤＮＡと上記プライマーを用いて、ＰＣＲ法によりＣｙ３を標識した塩基数６６１のβアクチンに対応するｃＤＮＡ（以後Ｃｙ３標識ｃＤＮＡと称す）を合成した。
【００３０】
（DNA固定化効率の比較）
アミノ化オリゴDNAをＡｌｄｅｈｙｄｅ  Ｓｐｏｔｔｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＧＥＮＰＡＫ社製）に０．５ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解し、DNAスポット溶液を調製した。DNAチップ用スポッター（ニチリョー社製）により、各々の基板上にDNAスポット溶液をスポットし、３７℃３０分、８０℃６０分加熱を行い、ブロッキング溶液として、エタノール１３．３ｍｌとＰＢＳ（−）４５ｍｌに０．５ｇのＮａＢＨ４を溶解させ調製し、基板をこのブロッキング溶液中に５分間浸漬したのち純水で洗浄し、さらに沸騰水中で３分間処理した後、氷冷したエタノール中に１分間浸漬し風乾した。
【００３１】
ローダミン標識オリゴDNAを、０．２％SDSを含む５×SSC溶液中に溶解したローダミン標識オリゴDNA溶液を調製し、３分間煮沸処理後、氷冷した後、この溶液をアミノ化オリゴDNAを固定した基板上に８０μｌ滴下しカバーガラスで覆い、保湿下６０℃で１８時間インキュベートし、カバーガラスをとり０．５％SDSを含む２×SSC、０．５×SSC、純水の順で洗浄した後風乾し、DNA固定化量の比較に供した。
【００３２】
DNA固定化量の比較は、ＤＮＡチップ用スキャナー（Microarray Analysis   SystemScanArray) によりローダミンの蛍光像を、各々のスポットについて読み込み、コンピュータ上画像処理により蛍光強度を数値化し、アミノ化オリゴ  DNAの固定化量として比較した。実施例１での各スポットの平均の数値を１００とし、各基板の固定化量およびスポット間の強度のバラツキの比較を行なった。
結果を表１に示す。
【００３３】
（ハイブリダイゼーションにおける検出強度の比較）
アミノ化オリゴDNAをＡｌｄｅｈｙｄｅ  Ｓｐｏｔｔｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＧＥＮＰＡＫ社製）に０．５ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解し、DNAスポット溶液を調製した。DNAチップ用スポッター（ニチリョー社製）により、各々の基板上にDNAスポット溶液をスポットし、３７℃３０分、８０℃６０分加熱を行い、
ブロッキング溶液として、エタノール１３．３ｍｌとＰＢＳ（−）４５ｍｌに０．５ｇのＮａＢＨ４を溶解させ調製し、基板をこのブロッキング溶液中に５分間浸漬した後に純水で洗浄し、さらに沸騰水中で３分間処理した後、氷冷したエタノール中に１分間浸漬した後風乾した。
【００３４】
Ｃｙ５標識ｃDNAを、０．２％SDSを含む５×SSC溶液中に溶解したＣｙ５標識ｃDNA溶液を調製し、３分間煮沸処理後に氷冷した後、この溶液をアミノ化オリゴDNAを固定した基板上に８０μｌ滴下しカバーガラスで覆い、保湿下６０℃で１８時間インキュベートし、カバーガラスをとり０．５％SDSを含む２×SSC、０．５×SSC、純水の順で洗浄した後に風乾し、ｃDNAのハイブリ量の比較に供した。
【００３５】
ｃＤＮＡのハイブリ量の比較は、ＤＮＡチップ用スキャナー（Microarray Analysis System  ScanArray） によりＣｙ５の蛍光像を、読み込み、コンピュータ上画像処理により蛍光強度を数値化し、ｃＤＮＡのハイブリ量として比較した。実施例１での各スポットの平均の蛍光強度数値を１００とし、各基板のスポットの蛍光強度およびスポット間のバラツキの比較を行なった。
結果を表２に示す。
【００３６】
【表１】
0003830839.tif 000002
【００３７】
【表２】
0003830839.tif 000003
【００３８】
【発明の効果】
本発明のマイクロチップ用基板は、DNAのスポッティングによるDNAの固定化において、ＤＮＡの固定化効率が高くまた基板内のDNAの固定量が均一であり、さらにハイブリダイズでDNAのハイブリ効率が高くかつ検出におけるスポットの検出強度のばらつきが少なく、ＤＮＡチップ用基板として好適である。
【配列表】
0003830839.tif 000004
0003830839.tif 000005