(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
シトシンヌクレオシド化合物の製造方法において、
リン酸化糖と、シトシンまたはシトシン誘導体とを、シトシンヌクレオシドホスホリラーゼ活性を有する酵素の存在下で反応させて、シトシンヌクレオシド化合物を得る工程を有し、
前記酵素がプリンヌクレオシドホスホリラーゼ活性を有するものである
ことを特徴とするシトシンヌクレオシド化合物の製造方法。
【請求項２】
前記酵素が大腸菌由来である請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記シトシン誘導体が下記式（Ｉ）：
【化１】
0003766040.tif 000029
（上記式（Ｉ）中、Ｘは炭素原子または窒素原子を、Ｙは水素原子、ハロゲン原子または低級アルキル基を示す。）
で表される化合物である請求項１または２に記載の製造方法。
【請求項４】
リン酸化糖が、リボース−１−リン酸、２−デオキシリボース−１−リン酸または２’，３’−ジデオキシリボース１−リン酸、ジオキソラン糖リン酸である請求項１〜３のいずれかに記載の製造方法。
【請求項５】
前記酵素が、シトシンヌクレオシドホスホリラーゼ活性を有する微生物の菌体、あるいは該菌体もしくはその培養液から得られた酵素調製物として供給される請求項１〜４のいずれかに記載の製造方法。
【請求項６】
前記微生物がシトシンヌクレオシドホスホリラーゼ活性を有し、シトシンデアミナーゼ活性および／又はシチジンデアミナーゼ活性および／又はホスファターゼ活性がないことを特徴とする請求項５に記載の製造方法。
【請求項７】
前記菌体または前記酵素調製物のシトシンデアミナーゼ活性および／又はシチジンデアミナーゼ活性が低減化処理によって失活または低下している請求項６に記載の製造方法。
【請求項８】
前記低減化処理された微生物の菌体が、シトシンヌクレオシドホスホリラーゼ活性を有する微生物の菌体を有機溶媒を含む水に接触させて、シトシンデアミナーゼ活性およびシチジンデアミナーゼ活性を選択的に失活または減少させて得られたものである請求項７に記載の製造方法。
【請求項９】
前記の菌体またはその酵素調製物が、以下のａ）からｃ）のいずれかの手段によりシトシンヌクレオシドホスホリラーゼ活性を阻害する物質が除去されている請求項６に記載の製造方法。
ａ）前記酵素調製物から極性溶媒でシトシンヌクレオシドホスホリラーゼを沈殿として得る、
ｂ）前記酵素調製物から塩析によりシトシンヌクレオシドホスホリラーゼを沈殿として得る、
ｃ）前記酵素調製物から樹脂等の適当な担体によりシトシンヌクレオシドホスホリラーゼを分離する。
【請求項１０】
配列番号：４記載のアミノ酸配列に対して、以下の（１）〜（１２）：
（１）１０番目のメチオニンをアラニンに置換、
（２）４２番目のアルギニンをロイシンに置換、
（３）５４番目のリジンをセリンに置換、
（４）６７番目のイソロイシンをロイシンに置換、
（５）１５７番目のアラニンをセリンに置換、
（６）１７８番目のグリシンをアラニンに置換、
（７）１７９番目のバリンをスレオニンに置換、
（８）１８３番目のアラニンをセリンに置換、
（９）１９９番目スレオニンをアラニンに置換、
（１０）２１０番目ヒスチジンをロイシンに置換、
（１１）２２８番目イソロイシンをセリンに置換、及び
（１２）２３３番目のバリンをロイシンに置換
のいずれか１つの置換を行って得られるシトシンヌクレオシドホスホリラーゼ。
【請求項１１】
請求項１０に記載のシトシンヌクレオシドホスホリラーゼをコードする遺伝子を含んでいる組み換えプラスミド。
【請求項１２】
請求項１１に記載の組み換えプラスミドを保持する形質転換株。
【請求項１３】
請求項１２記載の形質転換株を培養し、培養によって得られた形質転換株、培養液、およびそれらの処理物からシトシンヌクレオシドホスホリラーゼを回収することを特徴とするシトシンヌクレオシドホスホリラーゼの生産方法。
【請求項１４】
請求項６〜８の何れか一項に記載の酵素調製物であって、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ活性を有する酵素を含有することを特徴とする酵素調製物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は医薬品等の合成原料として有用なシトシンヌクレオシド化合物の製造方法に関する。さらに詳しくは、シトシンヌクレオシドホスホリラーゼ活性を有する酵素または該酵素活性を有する微生物の菌体、該菌体もしくはその培養液を処理して得られた酵素調製物等を用いてペントース−１−リン酸とシトシンまたはシトシン誘導体からシトシンヌクレオシド化合物を製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヌクレオシドホスホリラーゼはリン酸存在下でヌクレオシドのＮ−グリコシド結合を加リン酸分解する酵素の総称であり、リボヌクレオシドを例にすると次式で表される反応を触媒する。
【０００３】
リボヌクレオシド  ＋  リン酸（塩）  →  核酸塩基  ＋  リボース１−リン酸
プリンヌクレオシドホスホリラーゼとピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼに大別される該酵素は、広く生物界に分布し、哺乳類、鳥類、魚類などの組織、酵母、細菌に存在する。この酵素反応は可逆的であり、逆反応を利用した各種ヌクレオシドの合成が以前より知られている。例えば、２´−デオキシリボース１−リン酸と核酸塩基（チミン、アデニンまたはグアニン）からチミジン（特開平０１−１０４１９０号公報）、２´−デオキシアデノシン（特開平１１−１３７２９０号公報）または２´−デオキシグアノシン（特開平１１−１３７２９０号公報）を製造する方法が知られている。この様にヌクレオシドホスホリラーゼを用いるヌクレオシド化合物の製造は、穏和な条件で位置、立体特異的に製造することが可能であり、多くのヌクレオシド化合物の合成が検討されている。
【０００４】
特開平１−６０３９６号公報ではデオキシリボース−１−リン酸とシトシンから菌体そのものを触媒として用いた反応によりデオキシシチジンを製造する方法が示されている。しかし、該公報の方法は菌体そのものを触媒として用いる反応でありシトシンヌクレオシドホスホリラーゼそのものの存在は確認されていない。例えば、菌体内に蓄積したデオキシシチジンが反応中に菌体内より溶出したものであったり、菌体内のヌクレオシドデオキシリボシルトランスファラーゼにより、基質として添加したシトシンが菌体内のデオキシヌクレオシドの塩基に転移した結果、デオキシシチジンが検出された可能性も考えられる。本発明者らはそれらの点をはっきりさせるため、該公報の実施例で寄託されている７株を取り寄せ実施例と同じ方法でデオキシリボース−１−リン酸とシトシンからデオキシシチジンが生成するかを試験した。その結果、何れの菌株を用いた反応においても反応液中にデオキシシチジンは全く検出されず、菌株そのものにシトシンヌクレオシドホスホリラーゼに相当する活性が存在することは確認されなかった。
【０００５】
一方、特開平３−１２７８６号公報ではプリン塩基とピリミジン塩基の両方に作用する新規なヌクレオシドホスホリラーゼが報告されており、ピリミジン塩基としてデオキシウリジン、デオキシシチジン、デオキシチミジンに作用すると記載されてはいるが、明細書中にはその基質特異性は何ら開示されていない。また、該公報はすでに取り下げられており、その活性を確認することはできないが、該公報の発明者らは、該公報に開示の微生物と同一名の菌株よりヌクレオシドホスホリラーゼを精製し、その特徴をＡｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．５６，ＰＰ３８３０−３８３４，（１９９０）で報告している。該文献においてこの酵素はシトシン、シチジン及びデオキシシチジンに対する活性はないと記載されている。
【０００６】
上記以外ではプリンヌクレオシドホスホリラーゼあるいはピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼの何れにおいても核酸塩基としてシトシンまたはシトシン誘導体が基質となることは報告されておらず、例えば、Ｍｅｔｈｏｄ．Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．５１，ＰＰ４３７〜４４２（１９７８）ではサルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｒａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）のピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼの一種であるチミジンホスホリラーゼにはデオキシシチジンに対する反応性は認められないと記載されている。また、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２４８，Ｎｏ．６，ＰＰ２０４０〜２０４３（１９７３）ではサルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｒａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）のプリンヌクレオシドホスホリラーゼにはピリミジンヌクレオシドへの活性は認められないと記載され、ウリジン、シチジン、デオキシウリジン、デオキシシチジンが例示されている。
【０００７】
これらの報告を総合的に勘案すると本発明に係るシトシンヌクレオシドホスホリラーゼに相当する酵素の存在を予測させる知見はあったものの、それらの先行技術文献の何れにおいても、その存在を確認し、実際にこの酵素が取得されたという報告は見当たらない。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
ヌクレオシドホスホリラーゼを用いるヌクレオシド化合物の製造は、穏和な条件で位置、立体特異的にヌクレオシド化合物を製造することが可能であり、種々のヌクレオシド化合物の合成研究が盛んに行われているが、これまでシトシンまたはシトシン誘導体とリン酸化糖を基質としてシトシンヌクレオシド化合物を合成することが可能な単離精製されたヌクレオシドホスホリラーゼは報告されていなかった。
【０００９】
また、本発明者等の検討によると、一般に微生物にはシトシンデアミナーゼ活性およびシチジンデアミナーゼ活性が存在するため、微生物の菌体自体を用いたり、菌体やその培養液から調製された酵素調製物にこれらのデアミナーゼ活性が残存している場合には、基質としてのシトシンまたはシトシン誘導体および反応生成物としてのシトシンヌクレオシド化合物のデアミノ体が合成されてしまい、効率的にシトシンヌクレオシド化合物を蓄積することは困難となる。
【００１０】
すなわち、本発明の目的は、シトシンヌクレオシド化合物の合成が可能なヌクレオシドホスホリラーゼのアミノ酸配列を提供することである。更に該遺伝子のを含む組換えプラスミド、該組換えプラスミドを含む形質転換体、該形質転換菌株を用いた該酵素の産生方法および該形質転換菌株を用いたシトシンヌクレオシド化合物を製造する方法を提供することである。更に、ヌクレオシドホスホリラーゼの活性を維持したままシトシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼの活性を減少させること、あるいは、両酵素を欠損している微生物にシトシンヌクレオシドホスホリラーゼを発現させた微生物を用いることで効率的にシトシンヌクレオシド化合物を製造する方法を提供することにある。
【００１１】
加えて、原料であるリン酸化糖の脱リン酸酵素の活性を減少させること、あるいは、該酵素を欠損している微生物にシトシンヌクレオシドホスホリラーゼを発現させた微生物を用いることで効率的にシトシンヌクレオシド化合物を製造する方法を提供することにある。
【００１２】
シトシンヌクレオシド化合物を製造する場合、特に医薬品の原料として利用する場合は微量の副生物の混入も大変な問題となる。精製工程での副生ヌクレオシドの分離は精製負荷が大きくなるとともに、シトシンヌクレオシド化合物の回収率を低下させることとなり工業的に製造する場合は大きな問題となる。このような目的に使用する場合には、酵素調製物から、シトシンデアミナーゼ活性及びシチジンデアミナーゼ活性をほぼ完全に失活させる必要がある。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明者らはこれらの課題を解決するために鋭意検討した結果、本来プリン塩基を基質とする反応を触媒するプリンヌクレオシドホスホリラーゼが、驚くべきことにピリミジン塩基であるシトシンまたはシトシン誘導体とペントース−１−リン酸からシトシンヌクレオシド化合物を生成する反応を触媒することを見出した。
【００１４】
また、本発明者らによって見出されたこのプリンヌクレオシドホスホリラーゼの存在は、シトシンヌクレオシドホスホリラーゼの存在を示すものである。
【００１５】
一方、本発明者等は、この酵素活性を有する微生物を用いてシトシンまたはシトシン誘導体とペントース−１−リン酸からシトシンヌクレオシド化合物を生成する反応を試みたところ、生成物のほとんどが、シトシンまたはシトシン誘導体とシトシンヌクレオシド化合物のデアミノ体であり、目的物であるシトシンヌクレオシド化合物を効率的に蓄積できなかった。そこで鋭意検討を重ねた結果、このデアミノ体の形成が、デアミナーゼの作用によるものであり、このデアミナーゼ活性を有する菌体を有機溶媒中に攪拌あるいは静置することにより、または、この菌体を加熱することによりシトシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼの活性を失活させることができること、更に、これらの処理は共に処理溶液中にリン酸塩またはリン酸化糖を存在させることで維持すべきシトシンヌクレオシドホスホリラーゼの失活をより効果的に抑制できることを見出した。
【００１６】
上述の方法により、ヌクレオシドホスホリラーゼの活性を維持したまま、基質と生成物の分解活性の両方を特異的に減少させることが可能となり、上記のようなデアミナーゼ活性の失活または低減化処理を施した菌体を用いることで、シトシンまたはシトシン誘導体とリン酸化糖から副生物をほとんど生成せずにシトシンヌクレオシド化合物を製造できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１７】
本発明のデアミナーゼの失活または低減化処理によればシトシンヌクレオシドホスホリラーゼの活性をほぼ完全に維持しつつ、分解活性はほぼ完全に失活させることも可能である。更に本発明者らは、シトシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼの両酵素活性を欠損した微生物に該酵素を発現させることでシトシンヌクレオシド化合物を効率的に製造できることも見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１８】
また、原料であるリン酸化糖を脱リン酸する酵素活性の存在下、反応収率が低下することを見いだした。該酵素活性を有する菌体の細胞破砕物に極性溶媒を添加することで該酵素活性を選択的に除けることを見いだした。また、塩析による分画やイオン交換樹脂などの担体でシトシンヌクレオシドホスホリラーゼを精製することで該酵素活性を除くこともできる。この様な処理物を用いることでシトシンヌクレオシド化合物を効率的に製造できることも見出し、本発明を完成させるに至った。
更に本発明者らは、該酵素活性を欠損した微生物にシトシンヌクレオシドホスホリラーゼを発現させることでシトシンヌクレオシド化合物を効率的に製造できることも見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１９】
本発明によれば、従来達成できなかったシトシンヌクレオシドホスホリラーゼによるシトシンヌクレオシド化合物の効率的な合成方法を提供することができる。
【００２０】
即ち本発明は以下の通りである。
【００２１】
本発明にかかるシトシンヌクレオシド化合物の製造方法は、リン酸化糖と、シトシンまたはシトシン誘導体とを、シトシンヌクレオシドホスホリラーゼ活性を有する酵素の存在下で反応させて、シトシンヌクレオシド化合物を得る工程を有することを特徴とする。
【００２２】
上記の酵素としては、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ活性を有する酵素を用いることができ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ活性を有する酵素を含む酵素調製物は、本発明にかかるシトシンヌクレオシド化合物の製造方法に好適に利用できる。なお、このようなプリンヌクレオシドホスホリラーゼ活性を有する酵素としては、例えば、大腸菌由来の酵素を挙げることができる。
【００２３】
上記のシトシン誘導体としては、下記式（Ｉ）：
【００２４】
【化２】
0003766040.tif 000002
（上記式（Ｉ）中、Ｘは炭素原子または窒素原子を、Ｙは水素原子、ハロゲン原子または低級アルキル基を示す。）
で表される化合物を用いることができる。その具体例としては、例えばアザシトシン及び５−フルオロシトシンを挙げることができる。
【００２５】
更に、上記のシトシンヌクレオシドホスホリラーゼ活性を有する酵素は、この酵素を有する微生物の菌体またはその培養液、あるいはこれらから得られた粗酵素抽出液、粗酵素溶液、粗酵素調製物および精製酵素調製物など酵素調製物の形態で反応系中に供給することができる。
【００２６】
これらの菌体あるいは酵素調製物としては、シトシンデアミナーゼ活性およびシチジンデアミナーゼ活性がないか、あるいは存在していてもシトシンヌクレオシドホスホリラーゼ活性を利用したシトシンヌクレオシド化合物の製造が可能である程度に低いものであることが好ましい。例えば、シトシンデアミナーゼ活性およびシチジンデアミナーゼ活性よりもシトシンヌクレオシドホスホリラーゼ活性が高い菌体及び酵素調製物を好適に用いることができる。
【００２７】
このような菌体及び酵素調製物の一例としては、これらの有するシトシンデアミナーゼ活性およびシチジンデアミナーゼ活性を低減化処理によって低下させたものを挙げることができる。
【００２８】
上記のデアミナーゼ活性の失活または低減化のための処理が施された微生物の菌体は、例えばシトシンヌクレオシドホスホリラーゼ活性を有する微生物の菌体を有機溶媒を含む水に接触させて、シトシンデアミナーゼ活性およびシチジンデアミナーゼ活性を選択的に減少させて得ることができる。この有機溶媒としては、アルコール類などの極性溶媒を利用することができる。この有機溶媒としては、例えばメチルアルコール、エチルアルコール、プロピルアルコール、ブチルアルコール、ジオキサン及びアセトンの中から選ばれる１種以上の有機溶媒が利用できる。
【００２９】
更に、有機溶媒によりシトシンデアミナーゼ活性およびシチジンデアミナーゼ活性を失活または低減化させる際に、水中の有機溶媒濃度を２０容量％以上とすることが好ましい。
【００３０】
一方、デアミナーゼ活性の失活または低減化のための処理が施された微生物の菌体は、シトシンヌクレオシドホスホリラーゼ活性を有する微生物の菌体を水性媒体中でシトシンデアミナーゼ活性およびシチジンデアミナーゼ活性を選択的に減少させる温度で加熱処理して得ることもできる。この加熱処理の条件としては、５０℃以上で１０分間以上４０時間以内の条件を採用することができる。
【００３１】
一方、デアミナーゼ活性の失活または低減化のための処理を行う際に、ペントース−１−リン酸を存在させることで、維持すべきシトシンヌクレオシドホスホリラーゼ活性をより効果的に維持することが可能となる。その際のペントース−１−リン酸の濃度は１ｍＭ以上１００ｍＭ以下とすることが好ましい。
【００３２】
【発明の実施の形態】
本発明においてシトシンヌクレオシドホスホリラーゼとは、シトシンまたはシトシン誘導体を基質としてシトシンヌクレオシド化合物を生成する活性を有する酵素を指しており、この要件を満たす限り動物、植物、微生物の何れの起源であっても構わない。シトシンヌクレオシドホスホリラーゼなる酵素は当該分野においては一般的に知られていない。そのため、本発明においてのみかかる用語を上記の通り規定して用いる。このようなヌクレオシドホスホリラーゼの具体例としては、エシェリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）等のエシェリシア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属に含まれる微生物の従来のプリンヌクレオシドホスホリラーゼとして知られている酵素でシトシンヌクレオシドホスホリラーゼ活性も有するものを好適な例として挙げることができる。具体的な例として、エシェリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）のプリンヌクレオシドホスホリラーゼのＤＮＡ塩基配列を配列番号３に、該塩基配列より翻訳されるアミノ酸配列を配列番号：４に例示した。また、近年の遺伝子工学の進歩により塩基配列の一部を失活、挿入、置換によりアミノ酸配列を改変することが容易となった。かかる技術水準に鑑み、該塩基配列の一部を、所望とする酵素活性に影響を及ぼさない範囲内、例えば酵素活性を維持または向上できる範囲内で、改変してアミノ酸配列を改変したものも本発明のシトシンヌクレオシドホスホリラーゼに包含されるものとする。例えば、配列番号：４に示したアミノ酸配列に、目的とする酵素活性に影響を及ぼさない範囲内で２〜３個のアミノ酸の欠失、置換または付加が行われたものや、配列番号：３の塩基配列に目的とする酵素活性に影響を及ぼさず、かつ、その相補配列がストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る範囲内での欠失、置換または付加等の変異を生じさせた塩基配列によってコードされたアミノ酸配列を有するものを用いることができる。
【００３３】
この様に、プリンヌクレオシドスホリラーゼ活性を有すると、プリン型ヌクレオシド化合物とシトシンヌクレオシド化合物を１種類の酵素で製造することが可能となり、ヌクレオシド類の工業的な製造には大変有利である。
【００３４】
本発明の方法に用いるシトシンヌクレオシドホスホリラーゼ活性を有する酵素は、該酵素を有する微生物の菌体、この菌体またはその培養液から調製された酵素調製物などの形態で反応系に供給することができる。なお、この酵素調製物には、菌体またはその培養液の各種処理物、酵素抽出物、酵素抽出物を用いた粗精製品及び単離精製品などが含まれる。
【００３５】
これらの微生物の菌体や酵素調製物としては、市販のものや各種方法を利用して調製したものを用いることができる。例えば、この酵素活性を有する調製物としては市販の酵素、該酵素活性を有する微生物菌体、及び菌体処理物またはそれらの固定化物などが使用できる。菌体処理物とは、例えばアセトン乾燥菌体や機械的破壊、超音波破砕、凍結融解処理、加圧減圧処理、浸透圧処理、自己消化、細胞壁分解処理、界面活性剤処理などにより調製した菌体破砕物などであり、また、必要に応じて硫安沈殿やアセトン沈殿、カラムクロマトグラフィーにより精製を重ねたものを用いても良い。
【００３６】
なお、シトシンヌクレオシドホスホリラーゼ活性を有する微生物は、シトシンまたはシトシン誘導体を基質としてシトシンヌクレオシド化合物を生成するヌクレオシドホスホリラーゼを発現しているものであれば、特に限定されない。このような微生物は、例えば、一般的なヌクレオシドホスホリラーゼを発現しているものから選択することができる。そのようなヌクレオシドホスホリラーゼを生産する微生物の具体例としては、エシェリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）等のエシェリシア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属に含まれる微生物を好適な例として挙げることができる。
【００３７】
近年の分子生物学および遺伝子工学の進歩により、上述の微生物株のプリンヌクレオシドホスホリラーゼの分子生物学的な性質やアミノ酸配列等を解析することにより、該蛋白質の遺伝子を該微生物株より取得し、該遺伝子および発現に必要な制御領域が挿入された組換えプラスミドを構築し、これを任意の宿主に導入し、該蛋白質を発現させた遺伝子組換え菌を作出することが可能となり、かつ、比較的容易にもなった。かかる技術水準に鑑み、このようなヌクレオシドホスホリラーゼの遺伝子を任意の宿主に導入した遺伝子組換え菌も本発明のヌクレオシドホスホリラーゼを発現している微生物に包含されるものとする。
【００３８】
ここでいう発現に必要な制御領域とは、プロモーター配列（転写を制御するオペレーター配列を含む）・リボゾーム結合配列（ＳＤ配列）・転写終結配列等を示している。プロモーター配列の具体例としては、大腸菌由来のトリプトファンオペロンのｔｒｐプロモーター・ラクトースオペロンのｌａｃプロモーター・ラムダファージ由来のＰＬプロモーター及びＰＲプロモーターや、枯草菌由来のグルコン酸合成酵素プロモーター（ｇｎｔ）・アルカリプロテアーゼプロモーター（ａｐｒ）・中性プロテアーゼプロモーター（ｎｐｒ）・α−アミラーゼプロモーター（ａｍｙ）等が挙げられる。また、ｔａｃプロモーターのように独自に改変・設計された配列も利用できる。リボゾーム結合配列としては、大腸菌由来または枯草菌由来の配列が挙げられるが、大腸菌や枯草菌等の所望の宿主内で機能する配列であれば特に限定されるものではない。たとえば、１６ＳリボゾームＲＮＡの３’末端領域に相補的な配列が４塩基以上連続したコンセンサス配列をＤＮＡ合成により作成してこれを利用してもよい。転写終結配列は必ずしも必要ではないが、ρ因子非依存性のもの、例えばリポプロテインターミネーター・ｔｒｐオペロンターミネーター等が利用できる。これら制御領域の組換えプラスミド上での配列順序は、５’末端側上流からプロモーター配列、リボゾーム結合配列、ヌクレオシドホスホリラーゼをコードする遺伝子、転写終結配列の順に並ぶことが望ましい。
【００３９】
ここでいうプラスミドの具体例としては、大腸菌中での自律複製可能な領域を有しているｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）、ｐＫＫ２２３−３、ｐＳＣ１０１や、枯草菌中での自律複製可能な領域を有しているｐＵＢ１１０、ｐＴＺ４、ｐＣ１９４、ρ１１、φ１、φ１０５等をベクターとして利用することができる。また、２種類以上の宿主内での自律複製が可能なプラスミドの例として、ｐＨＶ１４、ＴＲｐ７、ＹＥｐ７及びｐＢＳ７をベクターとして利用することができる。
【００４０】
ここでいう任意の宿主には、後述の実施例のように大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）が代表例として挙げられるが、とくに大腸菌に限定されるのものではなく枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等のバチルス属菌、酵母や放線菌等の他の微生物菌株も含まれる。
【００４１】
本発明におけるシトシンヌクレオシド化合物とはリン酸化糖と核酸塩基としてシトシンまたはシトシン誘導体がＮ−グリコシド結合で結合した化合物のことである。その代表例を挙げると、例えばシチジン、デオキシシチジン、ジデオキシシチジン、アザシチジン、デオキシアザシチジン、５−フルオロシチジン及び５−フルオロデオキシシチジンなどを挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００４２】
本発明におけるシトシン誘導体とは、シトシン構造部分を有し、このシトシン構造部分がシトシンヌクレオシドホスホリラーゼ活性の作用によりシトシンヌクレオシド構造に変化し得るものである。このシトシン誘導体の好ましい例としは、前記一般式（Ｉ）で表されるシトシン誘導体を挙げることができる。前記一般式（Ｉ）におけるＹとしての低級アルキル基としては、炭素数１〜４のアルキル基、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｉ−プロピル基、ｎ−ブチル基、sec−ブチル基及びtert−ブチル基を挙げることができる。これらのシトシン誘導体の中では、例えば、アザシトシン、５−フルオロシトシン、５―メチルシトシンなどが特に好ましい。
【００４３】
本発明におけるリン酸化糖とは、ポリヒドロキシアルデヒドまたはポリヒドロキシケトンおよびその誘導体の１位にリン酸がエステル結合したもののことである。その好ましい代表例を挙げると、例えばリボース１−リン酸、２´−デオキシリボース１−リン酸、２´，３´−ジデオキシリボース１−リン酸、アラビノース１−リン酸、ジオキソラン糖−リン酸などが挙げられる。
【００４４】
ここでいうポリヒドロキシアルデヒドまたはポリヒドロキシケトンとは、天然物由来のものとしては、Ｄ−アラビノース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース、Ｌ−リキソーズ、Ｄ−リボースのようなアルドペントース、Ｄ−キシルロース、Ｌ−キシルロース、Ｄ−リブロースのようなケトペントース、Ｄ−２−デオキシリボース、Ｄ−２，３−ジデオキシリボースのようなデオキシ糖類を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
【００４５】
これらリン酸化糖は、ヌクレオシドホスホリラーゼの作用によりヌクレオシド化合物の加リン酸分解反応を行って製造する方法（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ．１８４、４３７、１９５０）や、アノマー選択的な化学合成法等によっても調製することができる。また、ＷＯ  ０１／１４５６６に記載の酵素的なデオキリボースー１−リン酸の合成方法によっても調整することができる。（ロッシュの特許のdRP合成ルートも記載。）
本発明において、シトシンデアミナーゼ活性およびシチジンデアミナーゼ活性の低減化処理とは、ヌクレオシドホスホリラーゼを失活させず、シトシンデアミナーゼ活性およびシチジンデアミナーゼ活性を失活または低減化させることができれば特に限定されないが、例えば該微生物の菌体、培養液またはそれらの処理物を有機溶媒中にさらしたり、加熱処理を施すことを好適な例として挙げることができる。
【００４６】
本発明において、有機溶媒とはシトシンデアミナーゼ活性およびシチジンデアミナーゼ活性を失活させることが可能な溶媒であれば特に限定されないが、具体的にはメチルアルコール、エチルアルコール、プロピルアルコール、ブチルアルコール、ジオキサン、テトラヒドロフラン、メチルエチルケトン及びアセトン等の極性溶媒や１−ヘキサノール、２−メチル−１−ペンタノール、４−メチル−２−ペンタノール、２−エチル−１−ブタノール、１−ヘプタノール、２−ヘプタノール、３−ヘプタノール、１−オクタノール、２−オクタノール、１−ノナノール等のアルコール類、酢酸プロピル、酢酸ブチル、酢酸イソブチル、酢酸sec−ブチル、酢酸ペンチル、酢酸イソペンチル、酢酸シクロヘキシル、酢酸ベンジル等のエステル類、ペンタン、ヘキサン、２−メチルヘキサン、２，２−ジメチルブタン、２，３−ジメチルブタン、シクロヘキサン、メチルシクロヘキサン、ヘプタン、シクロヘプタン、オクタン、シクロオクタン、イソオクタン、ノナン、デカン、ドデカン、石油エーテル、石油ベンジン、リグロイン、工業ガソリン、灯油、ベンゼン、トルエン、キシレン、エチルベンゼン、プロピルベンゼン、クメン、メシチレン、ナフタレン等の炭化水素類、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、ジクロロエタン、クロロベンゼン、ジクロロベンゼン等のハロゲン化炭化水素類、クレゾール、キシレノール等のフェノール類、メチルイソブチルケトン、２−ヘキサノン等のケトン類、ジプロピルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ジフェニルエーテル、ジベンジルエーテル等のエーテル類が挙げられ、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、オクタン、シクロペンタン、シクロヘキサン、シクロヘプタン、シクロオクタン、トルエン、エチルベンゼン等の炭化水素類が挙げられる。また、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルベンズアミド、Ｎ−メチル−２−ピロリドン、Ｎ−メチルホルムアミド、Ｎ−エチルホルムアミド、Ｎ−メチルアセトアミド、ホルムアミド、アセチルアミド、安息香酸アミド等のアミド化合物や、ウレア、Ｎ，Ｎ’−ジメチルウレア、テトラメチルウレア、Ｎ，Ｎ−ジメチルイミダゾリジノン等のウレア化合物が挙げられ、ジメチルスルホキシド、ジエチルスルホキシド、ジフェニルスルホキシド等のスルホキシド化合物が挙げられる。
【００４７】
本発明でいうデアミナーゼ活性の失活または低減化のための有機溶媒処理とは、ヌクレオシドホスホリラーゼを失活させず、シトシンデアミナーゼ活性およびシチジンデアミナーゼ活性を失活または低減化させることができれば特に限定されないが、例えば該微生物の菌体、培養液またはそれらの処理物をｐＨは通常４．０以上１０．０以下であり、好ましくは６．０以上９．０以下で、有機溶媒を水中濃度として、例えば１０容量％以上、好ましくは２０容量％以上、より好ましくは３０容量％以上の濃度で、通常０℃以上の温度、好ましくは２０℃、更には５０℃以上で、８０℃以下の温度で、通常１０分間以上で４０時間以下、より好ましくは１時間以上２０時間以下の時間で静置または懸濁するような方法を挙げることができる。
【００４８】
また、処理液中にリン酸化糖を１ｍＭ以上好ましくは１００ｍＭ以下添加することにより、ヌクレオシドホスホリラーゼをより安定化させることができる。
【００４９】
また、反応液中にこれらの有機溶媒を添加することによっても同様の効果を得ることが可能である。
【００５０】
本発明でいう熱処理とはヌクレオシドホスホリラーゼを失活させず、シトシンデアミナーゼ活性およびシチジンデアミナーゼ活性を失活または低減化させることができれば特に限定されないが、例えば、該微生物の菌体、培養液またはそれらの処理物を水性媒体中でｐＨは通常４．０以上１０．０以下であり、好ましくは６．０以上９．０以下で、温度は通常５０℃以上、好ましくは６０℃以上８０℃以下で１０分間以上、より好ましくは３０分間以上静置または懸濁するような方法を挙げることができる。加熱時間は４０時間以下が更に好ましい。また、処理液中にリン酸化糖を１ｍＭ以上、好ましくは１０ｍＭ以上１００ｍＭ以下添加することにより、ヌクレオシドホスホリラーゼをより安定化させることができる。
【００５１】
本発明でいうシトシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼの両酵素活性を有さない微生物とは、例えばＢａｃｉｌｌｕｓ属細菌ではシチジンデアミナーゼのみ存在し、シトシンデアミナーゼの存在は知られていない。この様にＢａｃｉｌｌｕｓ属細菌のシチジンデアミナーゼ欠損株を用いることが可能である。例えばＢａｃｉｌｌｕｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ（ＢＧＣＳ）より入手が可能なＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｕｓ  １Ａ４７９などが例示できる。このような菌株にヌクレオシドホスホリラーゼを発現させた菌体を用いることも可能である。
【００５２】
本発明でいうホスファターゼの欠損株とは、例えばアルカリホスファターゼの欠損株としては大腸菌Ｋ−１２  ＤＨ５αを例示することができる。この様な菌株に、シトシンヌクレオシドホスホリラーゼを発現させた菌体を用いることも可能である。
【００５３】
この様な菌体を加熱処理する事により酸性ホスファターゼを失活または低減化することが可能であり、更に高い反応収率を達成することができる。例えば、該微生物の菌体、培養液またはそれらの処理物を水性媒体中でｐＨは通常４．０以上１０．０以下であり、好ましくは６．０以上９．０以下で、温度は通常５０℃以上、好ましくは６０℃以上８０℃以下で１０分間以上、より好ましくは３０分間以上静置または懸濁するような方法を挙げることができる。
【００５４】
本発明でいうシトシンヌクレオシドホスホリラーゼ活性を阻害する物質を低減化または除去するとは、反応を阻害する物質を除去または低減化できれば特に限定されないが、例えば菌体を超音波破砕などにより酵素液を調整し、該酵素液に極性溶媒を加えることでシトシンヌクレオシドホスホリラーゼを沈殿として得る方法や硫酸アンモニウムなどを加える塩析により沈殿として集める方法、或いはイオン交換樹脂等で精製する方法等によりシトシンヌクレオシドホスホリラーゼ活性を阻害する物質を除去または低減化することが可能である。
【００５５】
本発明におけるシトシンヌクレオシド化合物の合成反応は、シトシンまたはシトシン誘導体とリン酸化糖を基質としてシトシンヌクレオシド化合物を合成できるヌクレオシドホスホリラーゼを発現している微生物であって、シトシンまたはシトシン誘導体やシトシンヌクレオシド化合物を分解する活性を失活、あるいは欠損した微生物の菌体、培養液それらの処理物を用い、適切なｐＨや温度などの反応条件を選べばよいが通常はｐＨ４〜１０、温度１０〜８０℃の範囲で行うことができる。反応に使用するリン酸化糖とシトシンまたはシトシン誘導体の濃度は０．１〜１０００ｍＭ程度が適当であり、両者のモル比は添加するシトシンまたはシトシン誘導体の比率をリン酸化糖またはその塩に対して０．１〜１０倍モル量で行える。反応転化率を考えれば０．９５倍モル量程度が好ましい。
【００５６】
また、反応液中に生成するリン酸をトラップする目的でリン酸と難溶性の金属塩類を存在させたり、イオン交換樹脂等の担体を存在させることで反応収率を高めることも可能である。
【００５７】
反応液よりシトシンヌクレオシド化合物を採取する方法は、水等の溶媒に対する溶解度差を利用したり、イオン交換や吸着樹脂を用いる方法で行うことができる。
【００５８】
反応液中に残存する微量のシトシンをシトシンデアミナーゼの発現している微生物を用い、シチジンデアミナーゼの低減化または失活処理を施すか、或いはシチジンデアミナーゼ欠損株にシトシンデアミナーゼを発現させた微生物を用い、反応液中に存在させることで微量のシトシンをウラシルに変換することができる。該反応液を陽イオン交換樹脂に通すことで未反応のシトシンが変換されたウラシルやシトシンヌクレオシド化合物の分解物であるウラシルヌクレオシド化合物は吸着せず、シトシンヌクレオシド化合物のみを吸着させることで容易に精製することができる。
【００５９】
【実施例】
以下に実施例で本発明を説明するが、本発明はこれら実施例によって何等制限されるものではない。
［分析法］
生成したヌクレオシド化合物はすべて高速液体クロマトグラフィーにより定量した。分析条件は以下による。
カラム；Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  ＯＤＳ−ＭＧ−５  ４．６×２５０ｍｍ（野村化学）
カラム温度；４０℃
ポンプ流速；１．０ｍｌ／ｍｉｎ．
検出；ＵＶ２５４ｎｍ、
溶離液；５０ｍＭリン酸１カリウム：メタノール＝８：１（Ｖ／Ｖ）
参考例１（特開平１−６０３９６公報の再現性試験）
特開平１−６０３９６公報の実施例１に従ってデオキシシチジンの合成を検討した。即ち、実施例１記載の菌株２４株の中から表１に示す７寄託株を取り寄せた。酵母エキス０．５ｇ／ｄｌ、ペプトン１．０ｇ／ｄｌ、肉エキス１．０ｇ／ｄｌおよびＮａＣｌ０．５ｇ／ｄｌを含む培地（ｐＨ７．０）５０ｍｌを５００ｍｌ容肩付フラスコに分注し殺菌した。この培地に、ブイヨン寒天培地にて３０℃，１６時間前培養した表１に示す微生物を１白金耳ずつ接種し、３０℃にて１６時間振とう培養した。得られた培養液より菌体を遠心分離により分離した後、０．０５Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．０）で洗浄し、更に遠心分離することにより洗浄菌体を調製した。
【００６０】
上記洗浄菌体を２０ｍＭの２’−デオキシリボース−１−リン酸と２０ｍＭのシトシンを含む０．０５Ｍトリスバッファー（ｐＨ７．２）１０ｍｌに５ｇ／ｄｌになる様に添加し、６０℃，２４時間反応させた。反応液を希釈しＨＰＬＣで分析した結果、何れも基質であるシトシンは分解されほとんど消失されていたが、デオキシシチジンは検出されなかった。
【００６１】
【表１】
0003766040.tif 000003
【００６２】
参考例２（ＰＮＰクローニングと発現株作製、対照菌体の作製）
大腸菌染色体ＤＮＡを次のようにして調製した。
【００６３】
エシェリヒア・コリＫ−１２／ＸＬ−１０株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を５０ｍｌのＬＢ培地に接種し、３７℃で一夜培養した後集菌し、リゾチーム１ｍｇ／ｍｌを含む溶菌液で溶菌した。溶菌液をフェノール処理した後、通常の方法によりエタノール沈殿によりＤＮＡを沈殿させた。生じたＤＮＡの沈殿は、ガラス棒に巻き付けて回収した後、洗浄し、ＰＣＲに用いた。
【００６４】
ＰＣＲ用のプライマーには、エシェリヒア・コリの既知のプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（以下ＰＮＰと表記する）をコードするｄｅｏＤ遺伝子の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  ＡＥ０００５０８（コード領域は塩基番号１１５３１−１２２５０）に基づいて設計した配列番号１及び２に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（北海道システム・サイエンス株式会社に委託して合成した）を用いた。これらのプライマーの５’末端付近及び３’末端付近には、それぞれＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩの制限酵素認識配列を有する。
【００６５】
制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで完全に消化した前記大腸菌染色体ＤＮＡ  ６ｎｇ／μｌ及びプライマー各３μＭを含む０．１ｍｌのＰＣＲ反応液を用いて、変性：９６℃、１分間、アニーリング：５５℃、１分間、伸長反応：７４℃、１分間からなる反応サイクルを、３０サイクルの条件でＰＣＲを行った。
【００６６】
上記反応産物及びプラスミドｐＵＣ１８（宝酒造（株））を、ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ライゲーション・ハイ（東洋紡（株））を用いて連結した後、得られた組換えプラスミドを用いて、エシェリヒア・コリＤＨ５αを形質転換した。形質転換株を、アンピシリン（Ａｍ）５０μｇ／ｍｌ及びＸ−Ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド）を含むＬＢ寒天培地で培養し、Ａｍ耐性で且つ白色コロニーとなった形質転換株を得た。
【００６７】
このようにして得られた形質転換株よりプラスミドを抽出し、目的のＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドを、ｐＵＣ−ＰＮＰ７３と命名した。ｐＵＣ−ＰＮＰ７３に導入されたＤＮＡ断片の塩基配列を通常の塩基配列の決定法に従い塩基配列を確認した。得られた塩基配列を配列番号３に、塩基配列より翻訳されたアミノ酸配列を配列番号４に示した。本酵素のサブユニットの分子量は約２６０００であり、６量体として活性発現していることが知られている。本酵素の至適温度は約７０℃であり、至適ｐＨは約７．０から７．５である。こうして得られた形質転換体を、エシェリヒア・コリ  ＭＴ−１０９０５と名づけた。
【００６８】
エシェリヒア・コリ  ＭＴ−１０９０５株をＡｍ５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地１００ｍＬで３７℃・１晩振とう培養した。培養液を１３０００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心分離し、得られた菌体を２０ｍＬの１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁した。懸濁液を再度１３０００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心分離し、得られた菌体を２ｍＬの１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、１０ｍＭの２´−デオキシリボース１−リン酸ジ（モノシクロヘキシルアンモニウム）塩（ＳＩＧＭＡ製）に懸濁し、−２０℃にて凍結保存した。
【００６９】
プラスミドｐＵＣ１８（宝酒造（株））を用いて、エシェリヒア・コリＤＨ５αを形質転換した。形質転換株をｐＵＣ１８／ＤＨ５αと名づけた。ｐＵＣ１８／ＤＨ５α株をＡｍ５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地１００ｍＬで３７℃・１晩振とう培養した。培養液を１３０００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心分離し、得られた菌体を２０ｍＬの１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁した。懸濁液を再度１３０００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心分離し、得られた菌体を２ｍＬの１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、１０ｍＭの２´−デオキシリボース１−リン酸ジ（モノシクロヘキシルアンモニウム）塩（ＳＩＧＭＡ製）に懸濁し、−２０℃にて凍結保存した。
【００７０】
比較例１（ＰＮＰを組換えた大腸菌でのデオキシシチジン合成）
２０ｍＭの２´−デオキシリボース１−リン酸ジ（モノシクロヘキシルアンモニウム）塩（ＳＩＧＭＡ製）、２０ｍＭのシトシン（和光純薬製、特級）、１００ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、参考例２で得られたｐＵＣ１８／ＤＨ５α株の菌体懸濁液０．１ｍＬからなる反応液１．０ｍｌを５０℃で２０時間反応させた。基質を入れずに同様に保温したものを比較例とした。反応液を希釈した後分析したところデオキシシチジンは検出されなかった。図１（Ａ）に比較例、図１（Ｂ）に反応液のＨＰＬＣの分析チャートを示した。
【００７１】
比較例２（ＰＮＰを組み換えていない大腸菌のデオキシシチジン合成）
２０ｍＭの２´−デオキシリボース１−リン酸ジ（モノシクロヘキシルアンモニウム）塩（ＳＩＧＭＡ製）、２０ｍＭのシトシン（和光純薬製、特級）、１００ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、参考例２で得られたＭＴ―１０９０５株の菌体懸濁液０．１ｍＬからなる反応液１．０ｍｌを５０℃で２０時間反応させた。基質を入れずに同様に保温したものを比較例とした。反応液を希釈した後分析したところ、１０ｍＭのデオキシウリヂン、３ｍＭのウラシルが生成していたがデオキシシチジンは検出されなかった。図２（Ａ）に比較例、図２（Ｂ）に反応液のＨＰＬＣの分析チャートを示した。
【００７２】
実施例１（有機溶媒処理）
参考例２のＭＴ−１０９０５株の懸濁液にメタノール（ＭｅＯＨ）を表２に示すような濃度で添加して３０℃にて１時間保温した。以下シチジンデアミナーゼはｃｄｄと表記する。ｃｄｄの活性測定は１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、２０ｍＭシチジンの反応液１．０ｍｌに菌体懸濁液を加えて５０℃で２ｈｒ反応させることにより測定した。上述の菌体懸濁液にＭｅＯＨを添加せずに、３０℃にて１時間保温したものを１００％として相対値で示した。
【００７３】
ＰＮＰの活性は２０ｍＭの２´−デオキシリボース１−リン酸ジ（モノシクロヘキシルアンモニウム）塩（ＳＩＧＭＡ製）、５．４ｍＭのアデニン（和光純薬製、特級）、１００ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）反応液１．０ｍｌに菌体を添加し５０℃で１５分反応させることにより測定した。デオキシアデノシンの生成量が２ｍＭ以下の生成量である菌体量を用い反応を行った。上述の菌体懸濁液にＭｅＯＨを添加せずに３０℃にて１時間保温したものを１００％として相対値で示した。結果を表２に示した通り、ＰＮＰ活性はほとんど低下しなかったが、ｃｄｄ活性はほとんど失活していた。
【００７４】
【表２】
0003766040.tif 000004
【００７５】
実施例２（有機溶媒処理）
参考例２のＭＴ−１０９０５株の懸濁液に表３に示すような有機溶媒を添加し、３０℃にて１時間保温した。結果は表３に示した通り、ＰＮＰの活性はほとんど低下しなかったが、ｃｄｄの活性はほとんど失活していた。
【００７６】
【表３】
0003766040.tif 000005
【００７７】
実施例３（加熱処理）
参考例２のＭＴ−１０９０５株の懸濁液を６０℃にて保温した。以下シトシンデアミナーゼはｃｏｄと表記する。ｃｏｄ活性は１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、２０ｍＭシトシンに菌体懸濁液を添加して５０℃で２ｈｒ反応させることにより測定した。無処理の菌体を添加した時のシトシン分解量を１００％として、残存活性を相対値で表した。結果を表４に示した通り、ＰＮＰの活性はほとんど低下しなかったが、ｃｏｄの活性はほとんど失活していた。
【００７８】
【表４】
0003766040.tif 000006
【００７９】
実施例４（加熱処理＋有機溶媒処理）
実施例３で得た加熱処理２０ｈｒの菌体を実施例１と同じ方法でＭｅＯＨ処理を行った。実施例３の２０ｈｒ処理の菌体活性を１００％としたときの相対値として表示した。結果を表５に示す通り、ＰＮＰの活性はほとんど低下しなかったが、ｃｏｄとｃｄｄの活性はほとんど失活していた。
【００８０】
【表５】
0003766040.tif 000007
【００８１】
実施例５（実施例４の処理を施した組換えＰＮＰ発現菌によるデオキシシチジンの合成）
２０ｍＭの２´−デオキシリボース１−リン酸ジ（モノシクロヘキシルアンモニウム）塩（ＳＩＧＭＡ製）、２０ｍＭのシトシン（和光純薬製、特級）、１００ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、実施例４で得られた５０％ＭｅＯＨでの処理菌体液０．１ｍｌからなる反応液１．０ｍｌを５０℃で２０時間反応させた。反応液を希釈した後分析したところ、１０．７ｍＭのデオキシシチジン、０．２ｍＭのデオキシウリヂン、０．１ｍＭのウラシルが生成していた。その時の反応収率は５３％であった。図２（Ｃ）に反応液のＨＰＬＣの分析チャートを示した。
【００８２】
実施例６（実施例４の処理を施した大腸菌によるデオキシシチジンの合成）
２０ｍＭの２´−デオキシリボース１−リン酸ジ（モノシクロヘキシルアンモニウム）塩（ＳＩＧＭＡ製）、２０ｍＭのシトシン（和光純薬製、特級）、１００ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、参考例２で得られたｐＵＣ１８／ＤＨ５αの菌体懸濁液を実施例４と同様の方法で５０％ＭｅＯＨ処理をした菌体懸濁液０．１ｍｌからなる反応液１．０ｍｌを５０℃で２０時間反応させた。反応液を希釈した後分析したところ、０．１４ｍＭのデオキシシチジン、０．１７ｍＭのデオキシウリヂンが生成していた。その時の反応収率は０．７％であった。図１（Ｃ）に反応液のＨＰＬＣの分析チャートを示した。
【００８３】
実施例７（実施例４の処理を施した組換えＰＮＰ発現菌によるシチジンの合成）
２０ｍＭのリボース１−リン酸ジ（シクロヘキシルアンモニウム）塩（ＳＩＧＭＡ製）、２０ｍＭのシトシン（和光純薬製、特級）、１００ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、実施例４で得られた５０％ＭｅＯＨ処理の菌体懸濁液０．１ｍｌからなる反応液１．０ｍｌを５０℃で２０時間反応させた。反応液を希釈した後分析したところ、５ｍＭのシチジン、０．１ｍＭのウリヂン、０．１ｍＭのウラシルが生成していた。その時の反応収率は２５％であった。
【００８４】
実施例８（ＰＮＰの精製と精製ＰＮＰによるデオキシシチジンの合成）
実施例４で得られた菌体を１０ｍＬの１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁し、超音波破砕機で菌体を破砕した。次いで破砕液を遠心分離により粗酵素液を調整し、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したＤＥＡＥ−トヨパール（トーソー）３ｃｍ×１０ｃｍのカラムに加え、５０ｍＭＮａＣｌから５００ｍＭＮａＣｌのリニアグラジエントで溶出し、活性画分を回収した。溶離液を７０％硫安飽和で沈殿として回収し、１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に対して透析した。１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したハイドロキシアパタイトカラム（３ｃｍ×１５ｃｍ）に透析液を加え、１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）から５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で溶出し、活性画分を回収した。酵素液を７０％硫安飽和で沈殿として回収し、１ｍＬの１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解し、１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に対して透析し精製ＰＮＰを２ｍＬを得た。こうして得た精製ＰＮＰはＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動により単一のバンドであることを確認した。結果を図３に示した。  ２０ｍＭの２´−デオキシリボース１−リン酸ジ（モノシクロヘキシルアンモニウム）塩（ＳＩＧＭＡ製）、２０ｍＭのシトシン（和光純薬製、特級）、１００ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、精製酵素０．１ｍｌからなる反応液１．０ｍｌを５０℃で２０時間反応させた。反応液を希釈した後分析したところ、１１．５ｍＭのデオキシシチジンが生成し、その時の反応収率は５７．５％であった。
【００８５】
実施例９（実施例４の処理を施した組換えＰＮＰ発現菌によるアザシチジンの合成）
２０ｍＭのリボース１−リン酸ジ（シクロヘキシルアンモニウム）塩（ＳＩＧＭＡ製）、２０ｍＭのアザシトシン（ＳＩＧＭＡ製）、１００ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、実施例４で得られた５０％ＭｅＯＨ処理の菌体懸濁液０．１ｍｌからなる反応液１．０ｍｌを５０℃で２０時間反応させた。反応液を希釈した後分析したところ、３．２ｍＭのアザシチジンが生成していた。その時の反応収率は１６％であった。
【００８６】
実施例１０（実施例４の処理を施した組換えＰＮＰ発現菌によるフルオロシチジンの合成）
２０ｍＭのリボース１−リン酸ジ（シクロヘキシルアンモニウム）塩（ＳＩＧＭＡ製）、２０ｍＭの５−フルオロシトシン（ＳＩＧＭＡ製）、１００ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、実施例４で得られた５０％ＭｅＯＨ処理の菌体懸濁液０．１ｍｌからなる反応液１．０ｍｌを５０℃で２０時間反応させた。反応液を希釈した後分析したところ、２．４ｍＭの５−フルオロシチジンが生成していた。その時の反応収率は１２％であった。
【００８７】
実施例１１（実施例４の処理を施した組換えＰＮＰ発現菌によるメチルシチジンの合成）
２０ｍＭのリボース１−リン酸ジ（シクロヘキシルアンモニウム）塩（ＳＩＧＭＡ製）、２０ｍＭの５−メチルシトシン（ＳＩＧＭＡ製）、１００ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、実施例４で得られた５０％ＭｅＯＨ処理の菌体懸濁液０．１ｍｌからなる反応液１．０ｍｌを５０℃で２０時間反応させた。反応液を希釈した後分析したところ、２．1ｍＭの５−メチルシチジンが生成していた。その時の反応収率は１０．５％であった。
【００８８】
実施例１２（分解活性欠損株にＰＮＰを組込んだ菌体によりデオキシシチジンを合成）
（１）大腸菌ＰＮＰを枯草菌で発現させる大腸菌‐枯草菌シャトルベクターｐＰＮＰ０４、及びｐＰＮＰ０５の作製
ｐＵＣ−ＰＮＰ７３を鋳型として、配列番号５と配列番号６の合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲ法により大腸菌プリンヌクレオシドホスホリラーゼ遺伝子を増幅し、０．８ｋｂのＤＮＡ断片Ａを得た。次に、特開昭６０−２１０９８６公報に記載のプラスミドｐＮＰ１５０（ＦＥＲＭ  ＢＰ‐４２５）を鋳型として、配列番号７と配列番号８の合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲ法によりバチルス・アミロリキファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）の中性プロテアーゼ由来の転写プロモーター、及び翻訳調節部位を含む領域を増幅し、１．０ｋｂのＤＮＡ断片Ｂを得た。続いて、ＤＮＡ断片ＡとＤＮＡ断片Ｂの重複領域同士を用いてアニーリングし、この生成断片を鋳型として配列番号６、及び配列番号７の合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲ法により増幅し、約１．８ｋｂのＤＮＡ断片Ｃを得た。このＤＮＡ断片Ｃを制限酵素ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、インサートフラグメントとした。ベクターＤＮＡは、枯草菌・大腸菌シャトルベクターｐＲＢ３７３、及びｐＲＢ３７４をＢａｃｉｌｌｕｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ（ＢＧＳＣ；ＯＨ）より入手し、それぞれを制限酵素ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ベクターフラグメントを調製した。このベクターフラグメントを上記インサートフラグメントの過剰量存在下でライゲートし、大腸菌プリンヌクレオシドホスホリラーゼ発現シャトルベクターｐＰＮＰ０４、及びｐＰＮＰ０５を作製した。
（２）枯草菌へのｐＰＮＰ０４、及びｐＰＮＰ０５の導入、および形質転換体を用いたデオキシシチジンの合成
枯草菌としては、シチジンデアミナーゼ活性を有さないバチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）１Ａ４７９株及びバチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）１Ａ４８０株をＢａｃｉｌｌｕｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ（ＢＧＳＣ；ＯＨ）より入手して用いた。
【００８９】
（１）で得られたプラスミドｐＰＮＰ０４、及びｐＰＮＰ０５による形質転換はＣｈａｎｇのプロトプラスト法（Ｃｈａｎｇ．Ｓ  ａｎｄ  Ｃｏｈｅｎ，Ｓ．Ｎ．；Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．  １６８，  １１１（１９７８））に従って実施し、形質転換体１Ａ４８０（ｐＰＮＰ０４）、１Ａ４８０（ｐＰＮＰ０５）及び１Ａ４７９（ｐＰＮＰ０４）及び１Ａ４７９（ｐＰＮＰ０５）を得た。
【００９０】
次に、１Ａ４８０（ｐＰＮＰ０４）株についてデオキシシチジン合成活性を以下のように評価した。
【００９１】
１Ａ４８０（ｐＰＮＰ０４）を２倍濃度のＬ培地２０ｍＬで３５℃、１７時間培養した。この培養液１．５ｍＬを遠心して得られた菌体を−２０℃で凍結保存した。２４ｍＭの２´−デオキシリボース１−リン酸ジ（モノシクロヘキシルアンモニウム）塩（ＳＩＧＭＡ製）、２０ｍＭのシトシン（和光純薬製、特級）、１００ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）よりなる反応液１ｍｌを凍結菌体に加えて５０℃にて振とうした。１．５時間及び１８時間後にサンプリングを行ない、水で２０倍に希釈、遠心して菌体を除去した後に上清をＨＰＬＣにて分析したところ、１．５時間で１．４〜１．５ｍＭ、１８時間で６．４〜７．０ｍＭのデオキシシチジンを蓄積し、基質及び生成物の分解物は認められなかった。
【００９２】
１Ａ４８０（ｐＰＮＰ０５）、１Ａ４７９（ｐＰＮＰ０４）及び１Ａ４７９（ｐＰＮＰ０５）についてもデオキシシチジン合成を測定した結果、１Ａ４８０（ｐＰＮＰ０４）株とほぼ同等のデオキシシチジン合成能力を保持していることが明らかとなった。
【００９３】
実施例１３（シトシンヌクレオシドホスホリラーゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得）
参考例２で得られたｐＵＣ−ＰＮＰ７３のプラスミドＤＮＡを鋳型として、ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社のＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  Site-Directed Mutagenesis Kitを用いて変異を導入した。以降単にキットと呼ぶ。以下の実施例では、基本的にキットの原理および操作方法を踏襲した。
【００９４】
３０ｍｌの試験管に１０ｍｌのＬＢ液体培地を調製し、１２１℃・２０分間のオートクレーブにより滅菌した。この培地に終濃度が１００μｇ／ｍｌとなるようにアンピシリンを添加した後、参考例２で得られたＭＴ−１０９０５株を一白菌耳植菌し、３７℃・３００ｒｐｍにて約２０時間培養した。該培養液１ｍｌを適当な遠心チューブに分取した後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ×５分）により該菌体を分離した。続いてアルカリＳＤＳ抽出法により該菌体よりｐＵＣ−ＰＮＰ７３のプラスミドＤＮＡを調製した。
【００９５】
ｐＵＣ−ＰＮＰ７３のプラスミドＤＮＡを鋳型として配列番号９と１０、１１と１２、１３と１４、１５と１６、１７と１８、１９と２０、２１と２２、２３と２４、２５と２６、２７と２８、２９と３０、３１と３２、３３と３４、３５と３６、３７と３８、３９と４０、４１と４２、４３と４４、４５と４６のＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲを実施した。ＰＣＲ反応液の組成を表６に示した。増幅条件を表７に示した。
【００９６】
上記ＰＣＲ増幅反応液に制限酵素ＤｐｎＩを４ｕｎｉｔ加え、３７℃にて１ｈｒ保温した。この反応液１μＬを大腸菌Ｋ−１２ＤＨ５αのコンピテントセル（東洋紡）１００μＬに加え、氷中で３０分間保持した。４２℃の恒温水槽に３０秒間浸した後、コンピテントセルに付属するNZY+培地０．９ｍＬを加え３７℃で１時間振とうした。上記培養液をＬＢ寒天培地にアンピシリンを１００μｇ／ｍＬとなるように加えた培地上に塗抹し、３７℃で２０時間保温しコロニーを形成させた。
【００９７】
該コロニーより任意に選別した５クローンを各一白菌耳ずつ植菌し、Ａｍ５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地１００ｍＬで３７℃・１晩振とう培養した。培養液を１３０００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心分離し、得られた菌体を２０ｍＬの１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁した。懸濁液を再度１３０００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心分離し、得られた菌体を２ｍＬの１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、１０ｍＭの２´−デオキシリボース１−リン酸ジ（モノシクロヘキシルアンモニウム）塩（ＳＩＧＭＡ製）に懸濁し、実施例４と同じ方法で菌体の処理を施し、実施例５と同じ方法でデオキシシチジンの合成反応を行った。ＨＰＬＣ分析によりデオキシシチジンを測定した結果、５クローン中４クローンでデオキシシチジンの生成が検出され、シトシンヌクレオシドホスホリラーゼ活性を保持していることが確認された。
【００９８】
シトシンヌクレオシドホスホリラーゼ活性の測定に供した上記培養液の残部１ｍｌより該４クローンの菌体をそれぞれ分離し、アルカリＳＤＳ抽出法により各クローンのプラスミドＤＮＡを調製した。ＤＮＡ断片の塩基配列を通常の塩基配列の決定法に従い塩基配列を確認した。活性は、実施例１と同じ方法で測定した。結果の一覧を表８に示した。
【００９９】
【表６】
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【０１００】
【表７】
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【０１０１】
【表８】
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【０１０２】
参考例３（大腸菌Ｋ―１２  Ｗ３１１０株への形質転換）
参考例２で得たプラスミドｐＵＣ−ＰＮＰ７３を通常の方法に従って大腸菌Ｋ−１２  Ｗ３１１０株（ＡＴＣＣ２７３２５）に形質転換した。得られた形質転換体をＭＴ−１０９４８と名づけた。参考例２と同様の方法で培養した形質転換体の活性は大腸菌Ｋ−１２  ＤＨ５α株への形質転換体の２倍の活性を有していた。
【０１０３】
実施例１４（反応阻害物質の除去：極性溶媒による沈殿）
参考例２と同じ方法で培養したＭＴ−１０９４８菌体を超音波破砕機で破砕した。破砕液と同容量のアセトンを加えて沈殿を遠心分離により沈殿を除いた。次に上記遠心上清液に上記の半分のアセトンを加え沈殿を遠心分離により回収した。回収沈殿は真空乾燥機により乾固した。乾燥沈殿を２ｍＬの１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、１０ｍＭの２´−デオキシリボース１−リン酸ジ（モノシクロヘキシルアンモニウム）塩（ＳＩＧＭＡ製）に溶解し、実施例４と同じ方法で処理した。アセトンで分画した酵素液２ｍＬをシトシン（６．９６ｇ）、２´−デオキシリボース１−リン酸２アンモニウム塩（１８．７ｇ）、水酸化マグネシウム（６．２ｇ）を水（１０５．３ｇ）に加え、５０℃で２４ｈｒ反応した。反応終了後、ＨＰＬＣで分析した所、２'−デオキシシチジンを１１．４ｇ（８０％）得た。比較例としてアセトン処理前の菌体液２ｍＬ上記と同様に反応したところ２'−デオキシシチジンを８．５ｇ（６０％）得た。
【０１０４】
実施例１５（反応阻害物質の除去：硫酸アンモニウムによる沈殿）
参考例２と同じ方法で培養したＭＴ−１０９４８菌体を超音波破砕機で破砕した。破砕液に粉砕した硫酸アンモニウムをゆっくりと加えていき、硫安飽和４０％まで添加した。氷水中で１時間ゆっくり攪拌し、遠心分離により沈殿を除いた。遠心上精液に粉砕した硫酸アンモニウムを硫安飽和７０％まで添加し、同様に氷水中で１時間ゆっくり攪拌し、遠心分離により沈殿を得た。沈殿を２ｍＬの１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、１０ｍＭの２´−デオキシリボース１−リン酸ジ（モノシクロヘキシルアンモニウム）塩（ＳＩＧＭＡ製）に溶解した。実施例４と同じ方法で処理し、実施例１４と同じ方法で反応したところ、２'−デオキシシチジンを１１．０ｇ（８０％）得た。
【０１０５】
実施例１６（反応阻害物質の除去：精製酵素は実施例８の酵素）
実施例８と同様の方法で得た酵素液２ｍＬを用いて実施例１４と同様の反応を行ったところ、２'−デオキシシチジンを１１．０ｇ（８０％）得た。
【０１０６】
実施例１７（ｐｈｏＡ欠損株の効果）
実施例４で得た菌体２ｍｌを用い、実施例１４と同じ反応を行ったところ２'−デオキシシチジンを１１．０ｇ（８０％）得た。一方、ＭＴ−１０９４８株を実施例４と同じ方法で処理したところ活性はＭＴ−１０９０５の２倍検出されたが、実施例１４と同じ反応を行ったところ２'−デオキシシチジンは８．５ｇ（６０％）しか得られなかった。
【０１０７】
実施例１８
シトシン６．９６ｇ（６２．６ｍｍｏｌ）、２´−デオキシリボース１−リン酸２アンモニウム塩１８．７ｇ（７５．４ｍｍｏｌ）、水酸化マグネシウム７．５８ｇ（１３２ｍｍｏｌ）、参考例３で調整した凍結菌体（２．０ｇ）を水（９６．４ｇ）、シクロヘキサン４．８ｇの混合液に加え、酢酸にて反応液のｐＨを８．８にコントロールしながら４５℃で１８ｈｒ反応した。反応終了後、ＨＰＬＣで分析した所、目的物である、２'−デオキシシチジンを１０．０３ｇ（７０．５モル％／シトシン）得た。この時、副生物であるウラシルは０・７３ｇ（１０．４モル％／シトシン）、２'−デオキシウリジンは１．８０ｇ（１２．６モル％／シトシン）であった。
【０１０８】
実施例１９
実施例１８と同様の条件で、菌体処理に用いる溶媒、反応時に添加する溶媒を変えて２'−デオキシシチジンの合成を行なった時の結果を表９及び表１０に示す。
【０１０９】
【表９】
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【０１１０】
【表１０】
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【０１１１】
実施例２０
２´−デオキシシチジンの合成
純水２０ｇに強塩基性アニオン交換樹脂（ＭＰ５００  レバチッド：交換容量１．１ｅｑ／Ｌ）２０ｍｌ（総交換容量  ２４ｍｍｏｌ）と２−デオキシリボース１−リン酸ジ（アンモニウム）塩（４．９６ｇ、２０ｍｍｏｌ）を加え、室温下、３０分間攪拌した。３０分後、実施例４と同じ方法で調整した酵素液（０．５ｍｌ）とシトシン（２．１１ｇ、１９ｍｍｏｌ）加え、攪拌下、５０℃で１０時間反応した。１０時間後に反応マスをＨＰＬＣにて分析した結果、所望の２´−デオキシシチジンを反応収率８０％で得た。
【０１１２】
【発明の効果】
ヌクレオシドホスホリラーゼを用いるヌクレオシド化合物の製造は、穏和な条件で位置、立体特異的にヌクレオシド化合物を製造することが可能であり、工業的な製造法の確立が望まれているがこれまでヌクレオシドホスホリラーゼによる工業的なシトシンヌクレオシド化合物の合成方法は知られていなかった。
【０１１３】
本発明によればシトシンに反応性を有するヌクレオシドホスホリラーゼを用い、ペントース−１−リン酸とシトシンまたはシトシン誘導体からのシトシンヌクレオシド化合物の製造が可能となる。その際、基質あるいは生成物の分解活性を特異的に減少させる方法を提供することで、効率よくシトシンヌクレオシド化合物を製造できる。
【０１１４】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】（Ａ）は比較例１におけるＨＰＬＣの分析チャートであり、（Ｂ）は比較例１の反応液のＨＰＬＣの分析チャートであり、（Ｃ）は実施例６のＨＰＬＣの分析チャートである。
【図２】（Ａ）は比較例２における比較例におけるＨＰＬＣの分析チャートであり、（Ｂ）は比較例２の反応液のＨＰＬＣの分析チャートであり、（Ｃ）は実施例５のＨＰＬＣの分析チャートである。
【図３】実施例８にけるＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動の結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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