(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
補酵素であるジヒドロニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）、ジヒドロニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスファート（ＮＡＤＰＨ）又はその類似体の電気化学的再生に適した電極であって、その電極表面が、置換若しくは非置換３−メチレン−３Ｈ−フェノチアジン及び３−メチレン−３Ｈ−フェノキサジン化合物からなる群より選択される１個又はそれ以上の仲介化合物からなる仲介機能を有していることを特徴とする電極。
【請求項２】
仲介物質が、式：
【化１】
0003814314.tif 000012
（式中、Ｚは、酸素又は硫黄であり、Ｒは、仲介物質の見掛電位（Ｅ°）若しくは溶解性を調節する目的、又は仲介物質がそれにより他の分子と共有結合できるよう官能基を提供する目的で、芳香族環に結合された置換基であり、そしてＸ及びＹは、電子吸引基である）で示されることを特徴とする、請求項１記載の電極。
【請求項３】
Ｒが、水素、置換若しくは非置換アリール、アルコキシ、アリールオキシ、ハロゲン、ニトロ、置換若しくは非置換アミノ、ケト、カルボキシ、又はアルコキシカルボニルである、請求項２記載の電極。
【請求項４】
アリール基が、フェニル、ナフチル又はピリジルであり；ハロゲンが、フッ素、塩素又は臭素であり、そしてアルコキシ基の炭素数が１〜６である、請求項３記載の電極。
【請求項５】
Ｘ及びＹが、独立して、シアノ、脂肪族若しくは芳香族ケト、脂肪族若しくは芳香族エステル、置換若しくは非置換アミド、トリフルオロメチルスルホニル、トリフルオロメチルケト、ニトロ、低級アルキルスルホニル、トリフルオロメチルスルフィニル、アリールスルホニル、低級アルキルケト、低級アルキルスルフィニル、アリールスルフィニル、ポリハロアルキル、ペルフルオロフェニル、２−ベンゾオキサゾリル、２−ベンゾチアゾリル、又は５−Ｃｌ−テトラゾリルである、請求項３記載の電極。
【請求項６】
Ｘ及びＹが一緒になって、環状１，３−ケトン；環状エステル又は環状アミドを形成する、請求項３記載の電極。
【請求項７】
仲介物質が、式：
【化２】
0003814314.tif 000013
で示される、請求項２記載の電極。
【請求項８】
仲介物質が、式：
【化３】
0003814314.tif 000014
で示される、請求項２記載の電極。
【請求項９】
仲介物質が、式：
【化４】
0003814314.tif 000015
で示される、請求項２記載の電極。
【請求項１０】
仲介物質が、式：
【化５】
0003814314.tif 000016
で示される、請求項２記載の電極。
【請求項１１】
仲介物質が、式：
【化６】
0003814314.tif 000017
で示される、請求項２記載の電極。
【請求項１２】
仲介物質が、式：
【化７】
0003814314.tif 000018
で示される、請求項２記載の電極。
【請求項１３】
仲介物質が、式：
【化８】
0003814314.tif 000019
で示される、請求項２記載の電極。
【請求項１４】
仲介物質が、式：
【化９】
0003814314.tif 000020
で示される、請求項２記載の電極。
【請求項１５】
仲介物質が、式：
【化１０】
0003814314.tif 000021
で示される、請求項２記載の電極。
【請求項１６】
仲介物質が、式：
【化１１】
0003814314.tif 000022
で示される、請求項２記載の電極。
【請求項１７】
電極材料が、黒鉛、熱分解炭素、ガラス状炭素、プラチナ、又は金である、請求項１記載の電極。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、補酵素であるＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ又はその類似体の電気化学的再生に適した電極に関する。
【０００２】
【従来の技術】
酵素の選択性を、電流測定（アンペロメトリー）による検出の感受性と組み合わせた分析法は、診断産業にとっては興味深い方法である。ニコチンアミド補酵素（ＮＡＤ及びＮＡＤＰ）は、デヒドロゲナーゼにより触媒される反応において生成されるため、その還元は、特に重要である。以下の式：
【０００３】
【化１２】
0003814314.tif 000002
【０００４】
によりデヒドロゲナーゼにより触媒される反応は、生物細胞及び分析反応において、重要な役割を果たしている。数百もの異なるデヒドロゲナーゼが、異なる基質の生成物への変換を選択的に触媒することが知られている。基質、例えば、グルコースを酸化すると、補酵素ＮＡＤ+ 及び／又はＮＡＤＰ+ は、それぞれＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨに還元される。これらの補酵素は、酵素であるデヒドロゲナーゼと作用して、エネルギー移送酸化還元対を形成する能力を有するため、この反応において、必要な要素である。ピリジン結合デヒドロゲナーゼは、基質から、酸化型ピリジンヌクレオチドに、２還元性当量を、可逆的に移送するが、この２還元性当量のうち一つは、還元されたピリジンヌクレオチドに水素原子として現れ、もう一方は、電子として現れる。基質から除去されたもう一方の水素原子は、媒質中に、遊離のＨ+ として現れる。
【０００５】
補酵素ＮＡＤ+ 及びＮＡＤＰ+ は、高価な化学物質であり、これらを低コストの、使い捨ての分析装置で経済的に使用するためには、これらを再酸化によりその本来の状態に再生することが必須である。ＮＡＤＨは、異なる基礎電極材料において、１ボルトのオーダーの高過電圧により直接酸化される。しかし、ＮＡＤＨから電極への電子移送を仲介する電極の表面に、官能基を固定化することによって、この過電圧を引き下げることができる。このような仲介物質は、代表的には、過剰の過電圧がなくとも電気化学的に再酸化されうるために電気化学的再生の補助システムとして有用である物質から選択される。この目的に適した各種仲介化合物が公知である。米国特許第４，４９０，４６４号（以下、特許’４６４号という）には、背景技術として、フェナジン  メトスルファート（ＰＭＳ）；フェナジン  エトスルファート（ＰＥＳ）；チオニン及び１，２−ベンゾキノンなどの仲介物質が記載されている。この特許は更に、仲介物質として、電極表面に、ヘテロ原子を含んでいても含んでいなくてもよい、少なくとも３、好ましくは４若しくはそれ以上の縮合芳香環からなる縮合芳香環系を付与することによって、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ又はその類似体の酸化を触媒するように改変された電極を記載している。より詳細には、この特許は、アルキルフェナジニウムイオン、フェナジニウムイオン、フェナジノン、フェノキサジニウムイオン、フェノキサジノン、フェノチアジニウムイオン若しくはフェノチアジノンのいずれか１個からなる構造要素による、補酵素又はその類似体との電子交換について記載している。
【０００６】
J. Electroanal. Chem. 287, 61-80 (1990) には、一般式１：
【０００７】
【化１３】
0003814314.tif 000003
【０００８】
で示される３−β−ナフトイル−トルイジンブルー−Ｏが開示されており、これは、特許’４６４号に開示されているフェノチアジニウム仲介物質のうち、最もよく知られたものであろう。
【０００９】
J. Electroanal. Chem. 292, 115-138 (1990) には、特許’４６４号にカバーされる各種仲介物質が比較されている。
【００１０】
特許’４６４号に開示されているフェノキサジニウム及びフェノチアジニウムイオンは、式１の化合物など、正に荷電した種であり、本発明において有用な化合物とはまったく異なる。特許’４６４号において、有用な仲介物質として開示されているフェノキサジノン及びフェノチアジノンは、式Ａ及びＢ：
【００１１】
【化１４】
0003814314.tif 000004
【００１２】
により示される３Ｈ−フェノキサジン（Ａ）及び３Ｈ−フェノチアジン（Ｂ）であり、その３位は、カルボニル酸素基を有している。これらは、Ａ及びＢにおける酸素原子が、２個の電子吸引置換基を有している炭素原子と置き換わっている点で、本発明の仲介物質と構造的に似ているが、これらは化学的にはまったく異なるものであり、式Ａ又はＢの化合物のカルボニル酸素を、置換基を有する炭素原子と置き換えることによって、有効な仲介物質が得られることは示唆されていない。
【００１３】
仲介物質としての有用性がここに開示されている化合物のあるものは、米国特許第４，７１０，５７０号に、ロイコ又は還元型である場合、「感圧性、サーモグラフィー、光サーモグラフィー及び写真造影システムにおける染料形成剤」として有用であると記載されている。
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】
補酵素ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ又はその類似体の電気化学的再生に適した電極を提供する。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
本発明は、補酵素であるジヒドロニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）、ジヒドロニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスファート（ＮＡＤＰＨ）又はその類似体の電気化学的再生に適した電極であって、その電極が、その表面に、置換若しくは非置換３−メチレン−３Ｈ−フェノチアジン及び３−メチレン−３Ｈ−フェノキサジン化合物からなる群より選択される１個又はそれ以上の仲介化合物からなる仲介機能を有している電極に関する。
【００１６】
本発明は、３−メチレン−３Ｈ−フェノチアジン及び３−メチレン−３Ｈ−フェノキサジン化合物が、燃料電池の電極におけるＮＡＤＨの電気化学的再生（酸化）に有用な仲介物質であるとの発見に基づくものである。本発明の仲介物質は、一般式Ｃ及びＤ：
【００１７】
【化１５】
0003814314.tif 000005
【００１８】
（式中、Ｒは、仲介物質の見掛電位（Ｅ°）若しくは溶解性を調節する目的、又は仲介物質がそれにより他の分子と共有結合することができるよう官能基を提供する目的で、芳香族環に結合された置換基であり、そしてＸ及びＹは、電子吸引基である）により示すことができる。より詳細には、Ｒは、水素、置換若しくは非置換アリール（例えば、フェニル、ナフチル、ピリジル）、アルコキシ（好ましくは炭素数１〜６のもの）、アリールオキシ、ハロゲン（例えば、フッ素、塩素、臭素）、ニトロ、置換若しくは非置換アミノ、ケト、カルボキシ、又はアルコキシカルボニルを示すことができる。置換基Ｘ及びＹは、炭素酸又は活性メチレン化合物のフェノチアジン及びフェノキサジンとの酸化的カップリングの化学反応を簡略に示した以下の反応式Ｉ：
【００１９】
【化１６】
0003814314.tif 000006
【００２０】
に基づいて、本発明化合物の調製を可能とするのに十分な電子吸引能を両方で有するように選択される。
【００２１】
Ｘ及びＹの電子吸引特性を合わせても十分に大きくない場合、この合成法により、これらの化合物を調製することはできない。反応式Ｉによると、フェノチアジンは、ヨウ素（Ｉ2)などの酸化剤／電子受容体と反応して、ラジカルカチオンを形成し、これは、アルカリ条件下で、プロトンを失い、フェノチアジンカチオン（右上の構造式）を形成する。これは、共鳴により、３位にδ＋特性を有し、Ｘ−ＣＨ- −Ｙなどの求核剤と反応して、初期付加物を形成し、これが酸化されて（２Ｈを失う）、仲介物質Ｃとなる。フェノキサジン化合物Ｄの調製のための化学反応も、類似している。Thien 特許（米国特許第４，７１０，５７０号）は、これを、酸化性カップリングと述べている。
【００２２】
この反応を起こすには、Ｘ−ＣＨ2 −Ｙのプロトンは、代表的には、メタノール中で酢酸カリウムを使用する反応条件下で、Ｘ−ＣＨ- −Ｙを形成するのに十分に酸性でなければならない。Ｘ−ＣＨ2 −Ｙが十分に酸性でない場合、不安定な二量体が得られるが、これは、Diudea〔Tet. Letters 23, 1367-1370 (1982) 〕により「フェノチアジングリーンカチオン」として特徴づけられ、過塩素酸塩としてTsujino 〔Nippon Kagaku Zasshi 91(11), 1080-5 (1970); Chem. Abs. 74, 125598k (1971) 〕により単離されている。Ｘ−ＣＨ2 −Ｙを省略した場合、又はＸ−ＣＨ2 −Ｙが十分に酸性でない場合、反応式Ｉの条件下で、この物質が高収率で形成される。当業界の技術者であれば、反応式Ｉのカップリング反応を行うことによって、Ｘ及びＹの電子吸引性が、合せても不十分であるかどうかを、容易に決定することができよう。生成物が、フェノチアジニウムグリーンである場合は、Ｘ及びＹは、合せても必要な電子吸引能を有さない。
【００２３】
適当なＸ及びＹ残基としては、シアノ、脂肪族及び芳香族ケト、脂肪族及び芳香族エステル、置換又は非置換アミド、トリフルオロメチルスルホニル、トリフルオロメチルケト、ニトロ、低級アルキルスルホニル、トリフルオロメチルスルフィニル、アリールスルホニル、低級アルキルケト、低級アルキルスルフィニル、並びにアリールスルフィニルが挙げられるが、これに限定されるわけではない。その他の適当な電子吸引基としては、ポリハロアルキル、ペルフルオロフェニル、２−ベンゾオキサゾリル、２−ベンゾチアゾリル及び５−Ｃｌ−テトラゾリルが挙げられる。Ｘ及びＹが１，３−ジケトンを形成する構造もまた、適当である。例えば、Ｘ及びＹは、インダン−１，３−ジオン若しくは５，５−ジメチル−１，３−シクロヘキサンジオン（ジメドン）などの環状１，３−ジケトン、メルドラム（Meldrum)酸などの環状エステル、又はＮ，Ｎ−ジアルキルバルビツール酸などの環状アミドを形成することができる。
【００２４】
用いるＸ及びＹ置換基の組み合わせが、必要な電子吸引能を有するかどうかを決定するために、日常的な実験が必要であるかもしれないが、Bordwellの論文〔Acc. Chem. Res. 21, 456-463 (1988)及びそこに引用されている参考文献〕には、多くのＸ−ＣＨ2 −Ｙ化合物を含む、各種炭素酸のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）における平衡酸性度が開示されている。Ｘ及びＹの電子吸引性が大きいほど、pKa は小さくなる。一般的には、平衡酸性度が（ＤＭＳＯ中、２５℃で）、≦１３．１である化合物Ｘ−ＣＨ2 −Ｙが良好に反応し；pKa が、約１３．１〜約１５．８の間である化合物は、それほど反応せず、pKa が、≧１５．８である化合物は、まったく反応しないであろう。
【００２５】
化合物Ｃ及びＤは、単一の式Ｅ：
【００２６】
【化１７】
0003814314.tif 000007
【００２７】
（式中、記号Ｚは、酸素又はイオウを示すために用いられる）
によって示すことができる。
【００２８】
これらの化合物の環が、それに結合している脂肪族又は芳香族基と同様に、本発明の範囲を超えることなく、その電子移送特性に悪影響を及ぼさない各種置換基を有することができるのは、明らかである。このような置換基は、当業界における技術者が、所要の電子移送に必要である電気化学的特性を有する安定な化合物を調製する能力によってのみ制限される。
【００２９】
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（酸化型、ＮＡＤ+ ；還元型、ＮＡＤＨ）は、多くのデヒドロゲナーゼ酵素にとって、化学的酸化還元能を提供する補因子である。酵素反応の過程において、基質分子が酸化される際に、この補因子は還元される。基質濃度を測定するための手段としてこれらの酵素を用いる電流測定バイオセンサーは、この濃度と、この補因子が電気化学的に再酸化される際に生じる電流とを関連づけるものである。ＮＡＤＨは、黒鉛、熱分解炭素、ガラス状炭素、プラチナ又は金電極上では、仲介物質がなくとも電気化学的に再酸化されうるが、この反応には、過電圧が大きい、電極が汚れるなど、いくつかの欠点がある。
【００３０】
本発明は、ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨ補酵素又はその誘導体の電気化学的再生に、３−メチレン−３Ｈ−フェノチアジン（Ｃ）及び３−メチレン−３Ｈ−フェノキサジン（Ｄ）を使用することを初めて記載しており、したがって、各種フェノチアジン及びフェノキサジン誘導体を広く包含するものである。本発明の仲介物質は、ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨ誘導体の電気化学的再生にも、使用することができる。補酵素が重合体に結合しているようなＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨ誘導体は、Dolabdjianらにより、Enzyme Engineering Vol. 4, G.B. Brown and G. Manecke, eds., Plenum Press, New York, 1978, pp. 399-400 に記載されており、また、補酵素がデヒドロゲナーゼ酵素に共有結合しているような誘導体は、M. Perssonらにより、Biotechnology 9, pp. 280-284 (1991) に記載されており、また、デヒドロゲナーゼ酵素の補因子として作用する範囲において、そのほかの置換基を有する合成類似体も記載されている。これらの参考文献は、参照によりここに包含されるものとする。
【００３１】
本発明の仲介化合物は、一般構造式Ｃ及びＤにより示されてもよい。仲介物質として、異なる１０種類の類似体について、黒鉛のロッド状電極を用いて評価を行った。これらの化合物の構造は以下のとおりである。
【００３２】
【化１８】
0003814314.tif 000008
【００３３】
【実施例】
これらの化合物は、以下の実施例により調製した。
【００３４】
実施例Ｉ
仲介物質の合成
化合物２、３、５、６、１０及び１１の合成は、米国特許第４，７１０，５７０号に開示されており、その開示内容は、ここに参照により包含されるものとする。化合物４、７、８及び９は、以下のように調製した。
【００３５】
３−ジシアノメチレン−８−クロロ−３Ｈ−フェノチアジン（４）：
２−クロロフェノチアジン（１．０ｇ；４．２６mmol）及び酢酸カリウム（ＫＯＡｃ）（２．５ｇ）の沸騰メタノール（ＭｅＯＨ）（７０mL）溶液を、４０℃に冷却するまで放置し、次にマロノニトリル（０．４２ｇ；１．５当量）により処理した。この溶液を、Ｉ2 （２．１６ｇ）のＭｅＯＨ（２５mL）溶液により直ちに処理し、周囲温度で３．５時間攪拌した。分離した暗緑色の固体をろ過により集め、ＭｅＯＨにより洗浄し、真空中で乾燥して、化合物４（０．３３ｇ、２６％）を得た。MS (70 eV) m/e（相対強度）295 (100), 260 (26) 。
【００３６】
３−（１，３−ジオキソ−インダニリデン−（２′））−３Ｈ−フェノチアジン（７）：
フェノチアジン（２．０ｇ；１０mmol）及びＫＯＡｃ（４．０ｇ）の沸騰ＭｅＯＨ（６０mL）溶液を、５３℃に冷却するまで放置し、次に１，３−インダンジオン（２．２ｇ；１．５当量）により処理した。この溶液を３０℃に冷却するまで放置し、Ｉ2 （３．０ｇ）のＭｅＯＨ（５０mL）溶液で処理し、周囲温度で１８．５時間攪拌した。分離した暗色の固体をろ過により集め、ＭｅＯＨにより洗浄し、真空中で乾燥して、化合物７（０．１３ｇ、３．８％）を得た。MS (70 eV) m/e（相対強度）341 (100), 284 (36) 。
【００３７】
３−（２，２−ジメチル−４，６−ジオキソ−１，３−ジオキサニリデン−（５′））−３Ｈ−フェノチアジン（８）：
フェノチアジン（１．０２ｇ；５．１３mmol）及びＫＯＡｃ（３．０ｇ）の沸騰ＭｅＯＨ（４０mL）溶液を２４℃に冷却するまで放置し、次に２，２−ジメチル−１，３−ジオキサン−４，６−ジオン（２．０ｇ；２．７当量）により処理した。この溶液を２１℃に冷却するまで放置し、Ｉ2 （２．６ｇ）のＭｅＯＨ（５０mL）溶液で処理し、周囲温度で３時間攪拌した。分離した暗色の固体をろ過により集め、ＭｅＯＨにより洗浄し、真空中で乾燥して、化合物８（０．６２ｇ、３５％）を得た。1H NMR (300 MHz) (CDCl3)δ 8.85-8.95 (m, 2H), 7.95-8.05 (m, 1H), 7.67 (d, J=9.96Hz, 1H), 7.50-7.60 (m,3H), 1.77 (s, 6H); MS (70 eV) m/e （相対強度） 339 (12), 281 (65), 253 (19), 237 (56), 209 (100)。
【００３８】
３−（２，２−ジメチル−４，６−ジオキソ−１，３−ジオキサニリデン−（５′））−３Ｈ−フェノチアジン−８−酢酸（９）：
フェノチアジン−２−酢酸〔J. Org. Chem. 21, 1006 (1956) 記載のMassieらの方法により調製した〕（０．３３ｇ；１．２８mmol）及び酢酸リチウム２水和物（０．６６ｇ、５当量）のＭｅＯＨ（７mL）溶液を、周囲温度で、２，２−ジメチル−１，３−ジオキサン−４，６−ジオン（０．５ｇ；２．７当量）及び追加のＭｅＯＨ（１．５mL）により処理した。この溶液をＩ2 （０．６５ｇ、２当量）のＭｅＯＨ（５mL）溶液で処理し、２．３時間攪拌し、氷浴中で冷却した。分離した暗色の固体を集め、氷冷ＭｅＯＨで洗浄し、真空中で乾燥して、化合物９（６０．８mg、１２％）を得た。1H NMR (300 MHz) (CDCl3)  δ 8.87 (d of d, J1+2.0Hz 及びJ2=9.96Hz, 1H), 8.83 (d, J=2.0Hz, 1H), 7.91 (d, J=1.3Hz, 1H), 7.59 (d, J=9.96Hz, 1H), 7.45-7.55 (M, 2H), 3.80 (s, 2H), 1.77 (s, 6H) 。
【００３９】
実施例II
仲介物質としての評価
黒鉛ロッド状電極〔直径３mm、ジョンソン・マセー電子(Johnson Matthey Electronics) 社、ワードヒル（Ward Hill ）、マサチューセッツ〕を、最初に微細なグリット・サンドペーパーを用い、次に、≦１μのアルミナ粒子の懸濁液を用いて、電極表面を研磨することによって調製した。仲介物質の１mMメタノール溶液を調製し、電極をこの溶液に２分間浸した。次に、電極を水ですすぎ、０．２５M リン酸緩衝液（pH＝７）に短時間浸した。この時点で、電流対電圧プロフィールを測定して、陰極及び陽極のピーク位対Ａｇ／ＡｇＣｌ参照電極を求めた。次に、ＮＡＤＨを２０〜２００μM の濃度で含むpH＝７の溶液中、代表的には、酸化ピークよりも１００mV高い電位を用いて電流を測定し、電流対ＮＡＤＨ濃度のデータの最小二乗法により得られた直線の傾きから、各仲介物質の相対的感受性をμA/μM ＮＡＤＨとして求めた。これらの傾きを、試験を行った仲介物質の構造（カラム１）及びその酸化電位（Ｅ°OX）（カラム２）と共に、第１表（カラム４）に示す。傾きが大きければ仲介物質の感受性はより高い。
【００４０】
【表１】
0003814314.tif 000009
【００４１】
【表２】
0003814314.tif 000010
【００４２】
【表３】
0003814314.tif 000011
【００４３】
実施例III
印刷電極上での仲介物質の評価
黒鉛／炭素の作用電極及び銀／塩化銀の参照電極を有する印刷されたセンサーカードからなる印刷電極を用いた実験を行った。黒鉛／炭素電極に用いたインクは、No. 423SS 〔エークソン・コロイド(Acheson Colloids)社、ポート・ヒューロン（Port Huron）、ミシガン〕、及び銀／塩化銀参照電極については、１５〜２５％ＡｇＣｌと混合した、No. 427SS シルバーインク（同じ会社による）であった。電極の表面域は、０．０３cm2 であった。
【００４４】
代表的なグルコースバイオセンサーは、以下のように調製してもよい。２７mMＫＣｌを含む１００mMのＰＩＰＥＳ緩衝液（pH７．０）に４mM化合物９を溶解した溶液を調製し、０．５％ＦＣ−１７０Ｃ界面活性剤〔３Ｍ社；セントポール（St. Paul）、ミネソタ〕１．９６ｇ、ＮＡＤ  ０．１４２ｇ、グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）（東洋紡社；大阪、日本）０．６２６ｇ、１４７mMＫＣｌを含むpH７．０の０．５M ＰＩＰＥＳ緩衝液１．４４ｇ、及びＤＩ  Ｈ2 Ｏ  ５．８３mLからなる溶液の等量により希釈した。混合物３．０μL をセンサー域に適用し、室温で約２０分間乾燥した。電極を、小さい毛細管ギャップを有するフォーマット（型）に組み立て、グルコース水溶液により処理し、電流を２００mVの電位で測定した。これを、０、５０、１００、２００及び５００mg/dL のグルコースを含む試料について行い、電流対グルコース濃度のデータの最小二乗法により得られた直線の傾きを求めたところ、グルコース応答は、０．０１９１８μA/mg dL-1 であった。
【００４５】
図１には、化合物９の、２００mVの電位における電流対グルコース濃度のプロットを示す。これは、異なる濃度のグルコースを測定した完全センサーの、用量応答プロットを示している。図１からは、ここで述べたように組み立てられたセンサーが、生理学的に関連するグルコース範囲にわたって、直線的に応答することを理解することができる。適用電位が低い状態（２００mV）で作用しながらも、グルコースに対する感受性が高いこと（mg/dL 当たり１９μA ）及び切片値が小さいことは、臨床的に有用な機器を組み立てるのに重要である。適当な検量線を用いれば、センサーから測定した電流を、未知の溶液中のグルコース濃度と相関させることが可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１】化合物９の、２００mVの電位における電流対グルコース濃度のプロット。
【図１】
0003814314.tif 000023