(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板上の貴金属薄膜表面にプローブＤＮＡを配列する工程、ループ構造を形成している該薄膜表面のプローブＤＮＡに検体ＤＮＡをハイブリダイゼーションする工程、ハイブリダイゼーションの実行中又は実行後のプローブＤＮＡに貴金属コロイド修飾する工程、２本鎖を形成したプローブＤＮＡをＳＰＲ分光法にて検出する工程を有する生化学検体の検出方法。
【請求項２】
基板上の貴金属薄膜表面にプローブＤＮＡを配列する工程、ループ構造を形成している該薄膜表面のプローブＤＮＡに検体ＤＮＡをハイブリダイゼーションする工程、ハイブリダイゼーションの実行中又は実行後のプローブＤＮＡに高分子タンパク修飾する工程、２本鎖を形成したプローブＤＮＡをＳＰＲ分光法にて検出する工程とを有する生化学検体の検出方法。
【請求項３】
プローブＤＮＡの塩基数が６０以上である請求項１又は請求項２に記載の生化学検体の検出方法。
【請求項４】
貴金属薄膜が金であり、貴金属コロイドの粒子がアビジン修飾した金微粒子でかつ平均粒径が１０ｎｍである請求項１に記載の生化学検体の検出方法。
【請求項５】
ハイブリダイゼーション時の温度を３０〜４０℃、貴金属コロイド修飾時の温度を２０〜４０℃に保持した請求項４に記載の生化学検体の検出方法。
【請求項６】
表面に貴金属薄膜を成膜した基板からなり、該薄膜上に配列されたプローブＤＮＡを有し、かつ各プローブＤＮＡがループ構造を形成して標識を修飾可能にした部位が薄膜側にある生化学検体の検出チップ。
【請求項７】
プローブＤＮＡの塩基数が６０以上である請求項６に記載の生化学検体の検出チップ。
【請求項８】
プローブＤＮＡの末端を貴金属コロイド修飾可能にした請求項６に記載の生化学検体の検出チップ。
【請求項９】
プローブＤＮＡの末端を高分子タンパク修飾可能にした請求項６に記載の生化学検体の検出チップ。
【請求項１０】
基板がガラスであり、貴金属薄膜が金であり、膜厚みが６０ｎｍ以下である請求項６に記載の生化学検体の検出チップ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、ＳＰＲ（Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｌａｓｍｏｎ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）分光法を用いた生化学検体の検出方法の改良に係り、ＳＰＲ分光法の本来の利点を損なうことなくＳＰＲ応答を増幅して検出精度を高精度化でき、生化学検体の検出工程を再現性よく簡素化できる生化学検体の検出方法とその検出チップに関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＤＮＡチップの基本原理は、ＤＮＡが相補的な二重螺旋構造を形成することを利用するものである。Ａ（アデニン）とＴ（チミン）、Ｃ（シトシン）とＧ（グアニン）が対をなすことから、例えば、ＡＧＧＴＴＡＣのＤＮＡ配列を持つ遺伝子を検出するには、プローブとしてＴＣＣＡＡＴＧの配列を持つＤＮＡを作成し、サンプリング検体遺伝子中に目的遺伝子が存在すると、ＤＮＡハイブリダイゼーションによって、プローブＤＮＡの配列にＡＧＧＴＴＡＣの配列が結合して二重螺旋構造を取るため、これを検出することで目的ＤＮＡを容易に選別できることになる。
【０００３】
二重螺旋構造のＤＮＡを検出する方法として、検体ＤＮＡ（サンプリング遺伝子ＤＮＡ）に蛍光標識の修飾を施しておき、プローブＤＮＡと前記のＤＮＡハイブリダイゼーション操作を行い、二重螺旋構造を呈したＤＮＡ、すなわち蛍光シグナルを発する物を検出する、蛍光法が知られている。
【０００４】
かかる蛍光法を用いたＤＮＡハイブリダイゼーション検出には、蛍光標識の修飾操作が煩雑であること、蛍光色素の光消失が発生すること、未反応吸着物によるバックグラウンドノイズの上昇で検出精度が低下すること等の問題が指摘されている。
【０００５】
そこで、検体ＤＮＡに蛍光色素の修飾を行わずに二重螺旋構造のＤＮＡを検出する方法として、屈折率変化を検出するＳＰＲ分光法を用いた方法が提案されている。
【０００６】
詳述すると、ガラス基板に金属薄膜を形成してこの薄膜上にプローブＤＮＡを固定しておき、これとサンプリング遺伝子をハイブリダイゼーション操作させることにより二重螺旋構造のＤＮＡを形成させ、基板裏面側からの金属薄膜への反射光強度の測定を行い、ハイブリダイゼーション前の金属薄膜の屈折率と二重螺旋構造のＤＮＡを有する場合の屈折率との変化を測定する。すなわち、かかる共鳴角度の変化は、ハイブリダイゼーションした二重螺旋構造のＤＮＡの量に対応するものであるから、反射光強度の測定で蛍光色素の修飾を行わずに二重螺旋構造のＤＮＡを定量的に検出できることになる。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
ＳＰＲ分光法を用いた検出方法は、蛍光法に対して光退色が懸念される蛍光修飾の必要性がないこと、またシンプルな光学系で得られる感度が高く、感度低下を招くことなく検出部位のダウンサイジングが可能であるなどの種々の利点を有している。
【０００８】
このＳＰＲ分光法において、前述したハイブリダイゼーション前後の金属薄膜の屈折率の変化を測定するが、基板裏面側からの金属薄膜への入射角度と反射率との関係として解析する際に、当該変化が僅かであるため、さらに高精度に検体ＤＮＡを検出するには、ＳＰＲ応答の増幅を図るなどの改良を施す必要がある。
【０００９】
この発明は、ＳＰＲ分光法を用いた生化学検体、すなわち二重螺旋構造のＤＮＡの検出方法において、ＳＰＲ分光法の本来の利点を損なうことなくＳＰＲ応答を増幅可能として、検出精度を高精度化し、さらに当該生化学検体の検出工程を再現性よく簡素化でき、測定者に過度の技量を要求することがない、簡単な工程からなる生化学検体の検出方法とＳＰＲ分光法用の検出チップの提供を目的としている。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
発明者らは、ＳＰＲ応答の増幅を目的に種々検討した結果、基板の金属薄膜に金を用い、プローブＤＮＡに貴金属コロイドを修飾することで末端に金微粒子修飾を行うと、検体ＤＮＡとのハイブリダイゼーション後に金微粒子と金薄膜間の光学的相互作用が変化することでＳＰＲ応答の増幅を実現できることを知見した。
【００１１】
また、発明者らは、ＳＰＲ応答の増幅、安定した検出チップの構成を目的にプローブＤＮＡへの金微粒子修飾の有効性、最適化を検討した結果、金薄膜表面に対するプローブＤＮＡの吸着固定量は、ＤＮＡ塩基数（鎖長）によらずほぼ一定であること、金微粒子の修飾部位であるビオチンへの修飾に際してアビジンコート金微粒子の直径に最適値があり、またその修飾量はＤＮＡ塩基数に依存することを知見し、従って、金薄膜表面において、プローブＤＮＡ塩基数の違いによってプローブＤＮＡの立体的構造が変化していることを知見した。
【００１２】
そこで、発明者らは、プローブＤＮＡ鎖長の検討を行い、プローブＤＮＡの塩基数の違いによるＳＰＲ応答、すなわち金微粒子修飾を行ったプローブＤＮＡに対してハイブリダイゼーションを施し、その後のＳＰＲ角度のシフト量についての変化や挙動を検討したところ、塩基数１０では金微粒子修飾量が少なく、塩基数３０では修飾量が増大するが、いずれも該シフト量の増大効果が少ないこと、塩基数６０では金微粒子修飾ができないことを知見した。
【００１３】
さらに、発明者らは、プローブＤＮＡ鎖長の検討、特に塩基数６０以上の長いプローブＤＮＡにおけるＳＰＲ応答の増幅を目的に種々検討した結果、前述のごとく検出チップに吸着固定したプローブＤＮＡに先に金微粒子修飾するのではなく、まず先にサンプルとのハイブリダイゼーションを施すと、検出チップの薄膜上でループ状となって配列していたプローブＤＮＡが伸びて金微粒子修飾が可能となり、ハイブリダイゼーション後に金微粒子修飾を行う工程にて、長いプローブＤＮＡにも修飾が可能となり、ハイブリダイゼーション後の２本鎖を形成したプローブＤＮＡにのみ金微粒子修飾できることから、ＳＰＲ角度のシフト量が増大して二重螺旋構造のＤＮＡの検出精度を著しく高精度にすることが可能であることを知見した。
【００１４】
すなわち、発明者らは、例えば塩基数が６０以上のプローブＤＮＡを配列した検出チップでは、先に金微粒子修飾を行う必要がなく、取扱いや準備工程が簡素化されること、又目的遺伝子がない場合にはハイブリダイゼーションも金微粒子修飾もされないことから目的ＤＮＡが存在しないことが明確であり、目的ＤＮＡが存在する場合にはハイブリダイゼーション後の金微粒子修飾によって、ＳＰＲ応答の増幅を図ることが可能で、高精度の検出が実現できること、さらに金微粒子修飾に換えて高分子タンパク修飾も適用可能であることを知見し、この発明を完成した。
【００１５】
この発明は、基板上の貴金属薄膜表面にプローブＤＮＡを配列する工程、標識修飾が可能な部位が基板側に位置するようループ構造を形成している該薄膜表面に配列したプローブＤＮＡに検体ＤＮＡをハイブリダイゼーションする工程、ハイブリダイゼーションの実行中又は実行後のプローブＤＮＡに貴金属コロイド修飾する工程又は高分子タンパク修飾する工程、２本鎖を形成したプローブＤＮＡをＳＰＲ分光法にて検出する工程を有することを特徴とする生化学検体の検出方法である。
【００１６】
また、この発明は、表面に貴金属薄膜を成膜した基板からなり、該薄膜上に配列されたプローブＤＮＡを有し、かつループ構造を形成して貴金属標識を修飾可能にした部位が薄膜側にあることを特徴とする生化学検体の検出チップである。
【００１７】
さらに、発明者らは、上記構成の生化学検体の検出方法において、
プローブＤＮＡの塩基数が６０以上である検出方法、
貴金属薄膜が金であり、貴金属コロイドの粒子がアビジン修飾した金微粒子でかつ平均粒径が１０ｎｍである検出方法、
ハイブリダイゼーション時の温度を３０〜４０℃、貴金属コロイド修飾時の温度を２０〜４０℃に保持した検出方法、を併せて提案する。
【００１８】
【発明の実施の形態】
ＳＰＲ分光法は、貴金属薄膜表面おける屈折率変化を検出するもので、例えばガラス基板上に金薄膜を形成し、金薄膜上にプローブＤＮＡを固定化し、プローブＤＮＡが検体ＤＮＡ中の目的ＤＮＡとのハイブリダイゼーションにより二本鎖を形成すると、金薄膜上の屈折率が変化するためにＳＰＲ角（反射率が最小となる入射角度）がシフトするが、ＳＰＲ角のシフトはハイブリダイゼ一ションした目的ＤＮＡの量と対応するために、ＳＰＲ測定によってＤＮＡハイブリダイゼーションの定量的な解析が可能となる。
【００１９】
この発明は、上記の２本鎖を形成したプローブＤＮＡをＳＰＲ分光法にて検出する生化学検体の検出方法において、貴金属薄膜表面にプローブＤＮＡを配列した際に、特に、ループ構造を形成して解放末端が薄膜側にあるような塩基数が６０以上であるプローブＤＮＡを用い、ハイブリダイゼーションの実行中又は実行後のプローブＤＮＡに貴金属コロイド修飾することを特徴とする。
【００２０】
この発明は、末端に貴金属コロイドへの接着部位を修飾したプローブＤＮＡは、ループ（ヘアピン）構造を取る場合は貴金属コロイドが全く接着できないこと、このループ構造を取るプローブＤＮＡは目的ＤＮＡとのハイブリダイゼーション反応によってＤＮＡ鎖が伸びた状態になることの２つの現象を呈することを利用するものである。
【００２１】
発明者らは、末端に金コロイドの接着部位であるビオチンを修飾した塩基数６０のプローブＤＮＡを金薄膜上に固定化し、検体ＤＮＡ（塩基数６０）とのハイブリダイゼーション反応前後で、金コロイドがプローブＤＮＡ（ＤＮＡ単分子膜）に接着するかどうかをＳＰＲ分光法を用いて検出した結果、ハイブリダイゼーション後の２本鎖を形成したプローブＤＮＡにのみ金コロイドの接着が起こっていること、また、検体ＤＮＡ（塩基数８５６）を用いて同様の実験を行った結果、同様に目的ＤＮＡとハイブリダイゼーションしたプローブＤＮＡにのみ金コロイドの接着が起こっていることを知見し、これを利用することで、前述のＳＰＲ角のシフトを増幅でき、高精度の検出が可能になることを知見した。
【００２２】
この発明において、基板には、ガラス基板、樹脂基板等のＳＰＲ分光法が実施可能な基板であればいずれの材質も採用できる。また、基板に貴金属薄膜を成膜するため、その表面粗度はできるだけ平坦なものが好ましい。洗浄、乾燥方法としては、実施例に示すごとく、半導体ウエーハや各種デバイスを製造する際に採用される、各種溶剤による洗浄、純水中の超音波洗浄、各種酸溶液による洗浄、ブロー乾燥、スピン乾燥など公知の基板の洗浄、乾燥方法を適宜選択、組合せて採用できる。
ガラス基板としては、公知のホウケイ酸ガラス等が利用でき、厚みは厚いほうが取り扱いやすいが、いずれの厚みのものも利用できる。
【００２３】
この発明において、ＳＰＲ分光法を実施するため、またプローブＤＮＡの配列を容易にするため、基板上に金、白金、銀などの貴金属薄膜を設ける。また、成膜方法としては膜厚みを一定に制御するため、スパッタリング、イオンプレーティング、ＣＶＤ等の公知の気相成長による方法が好ましい。なお、基板と薄膜との密着性を向上させるために下地層を適宜成膜することができる。例えば、ガラス基板、石英基板にＣｒ層を設けたり、シラン化合物によって表面改質するなどの手段を採用できる。
また、ＳＰＲ分光法において、前述のＳＰＲ角のシフトを良好に観察するためには、ガラス基板に金薄膜を設ける条件では、膜厚みは６０ｎｍ以下、さらには４５〜５５ｎｍが好ましい。
【００２４】
この発明において、基板上の貴金属薄膜表面にプローブＤＮＡを配列する工程は、特に限定されるものでなく、公知のいずれの方法も採用でき、例えば薄膜上を酸や純水で洗浄後、プローブＤＮＡと緩衝液を用いて飽和水蒸気雰囲気中で配列させることができる。
また、緩衝液としては、例えばＫＨ2ＰＯ4とＫ2ＨＰＯ4を配合して所要ｐＨにした溶液が採用できる。他には、ＰＳＢや、ＮａＣｌとＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ＮａＣｌとＴｒｉｓ−ＨＣｌとＥＤＴＡを用いるなど、所要ｐＨにするため公知の薬液を選定配合した溶液等も採用できる。
【００２５】
この発明において、プローブＤＮＡは、その末端を一方は貴金属薄膜に固定し、他方端は貴金属コロイド修飾するために、各々の前記末端を前記基板の貴金属薄膜表面あるいは前記貴金属標識と接合可能な物質で修飾しておくことが望ましく、例えば、実施例に示すごとく、貴金属薄膜側をチオール基、他方をビオチン修飾することができる。
【００２６】
この発明において、該貴金属薄膜表面に配列したプローブＤＮＡに検体ＤＮＡをハイブリダイゼーションする工程は、特に限定されるものでなく、公知のいずれの方法も採用でき、例えば基板の洗浄後に検体ＤＮＡと緩衝溶液を用いてハイブリダイゼーションさせることができる。
緩衝溶液としては、例えばＮａＣｌとＴｒｉｓ−ＨＣｌを配合して所要ｐＨに保持した溶液が採用できる。
また、ガラス基板に金薄膜を設ける場合では、ハイブリダイゼーション時の温度を３０〜４０℃に保持することが好ましい。
【００２７】
この発明において、ハイブリダイゼーションの実行中又は実行後のプローブＤＮＡに貴金属コロイド修飾する工程は、粒径が５〜２００ｎｍ程度の範囲の金や白金、銀等の貴金属微粒子をコロイダル化して用いる。溶液組成は用いる貴金属種とその粒径や量等に応じて適宜選定するとよい。
また、貴金属コロイド修飾時の温度は、特に限定しないが、ガラス基板に金薄膜を設けて後述の金コロイド修飾する条件では、２０〜４０℃に保持することが好ましい。
【００２８】
貴金属コロイド粒子として、金微粒子を用いた場合、金微粒子にアビジン修飾して、ビオチン修飾したプローブＤＮＡの末端に標識可能にしておくことができ、実施例に示すごとく、この金微粒子には平均粒径が１０ｎｍ程度のものが好ましい。
【００２９】
この発明において、ハイブリダイゼーションの実行中又は実行後のプローブＤＮＡに高分子タンパク修飾する工程は、前述のプローブＤＮＡの末端の処理方法に準ずるもので、例えば、高分子タンパクとして、ストレプトアビジン、プロテインＡ等を用いることが可能である。
【００３０】
この発明において、ハイブリダイゼーション後に２本鎖を形成したプローブＤＮＡをＳＰＲ分光法にて検出する工程は、液中あるいは大気中のいずれも可能である。図１Ａに示すようにレーザー光をプリズムを介し金薄膜基板の裏面に照射し、その反射光を検出するもので、例えば金薄膜に光を入射すると、反射率が最少となる入射角が存在し、その角度をＳＰＲ角といい、この角度は金薄膜近傍の屈折率変化に非常に鋭敏であり、膜上にプローブＤＮＡのみの場合、２本鎖を形成したプローブＤＮＡの場合ごとく、図１ＢのようにＳＰＲ角のシフトが観測される。
【００３１】
ＳＰＲ法の測定システムとしては、公知のいずれの構成も採用可能である。例えば実施例では、光源としＨｅ−Ｎｅレーザー（波長６３２．８ｎｍ）を用い、偏光子によってｐ−偏光としプリズムを介して全反射条件で貴金属薄膜基板に照射し、基板からの反射光をフォトダイオードにより検出し、得られた信号は、光チョッパー、ロックインアンプを用いて外部ノイズを取り除き増幅を行うことができる。なお基板は、屈折率整合剤を介してプリズム上に付着させ回転ステージ上に固定し、この回転ステージを回転させて入射角の変化を得ることができ、また、その際、フォトダイオードも基板を固定した回転ステージと同調させ回転、移動させることができる。
【００３２】
この発明において、プローブＤＮＡの塩基数は特に限定しないが、ハイブリダイゼーション後に、目的ＤＮＡと２本鎖を形成したプローブＤＮＡにのみ標識を修飾するには、チップ基板上にあるプローブＤＮＡはハイブリダイゼーション前にループ構造を形成して解放末端が薄膜側にある必要がある。
【００３３】
この発明において、プローブＤＮＡは、その製造過程中又は製造後にループ構造を形成していて基板に配列されるか、基板に配列する際にループ構造を形成するか、基板に配列後にループ構造を形成するように構成するか、いずれの構成、方法も採用できる。例えば、図２Ａ，Ｂに示すごとく、相補的な二重螺旋構造を形成可能な対をなすＤＮＡの配列を予め形成しておき、ループ構造を形成し得るように構成することが可能であり、塩基数は特に限定しないが、比較的長鎖の構成を有するものが望ましく、好ましくは塩基数が６０以上である。さらに塩基数が１００を超えたり、１０００程度の場合であってもこの発明を適用できる。
【００３４】
この発明による生化学検体の検出チップは、表面に金などの貴金属薄膜を成膜したガラスなどの基板からなり、該薄膜上に配列されたプローブＤＮＡを有し、かつ各プローブＤＮＡがループ構造を形成して解放末端が薄膜側にあることを特徴とし、例えば、プローブＤＮＡの塩基数が６０以上であり、プローブＤＮＡの末端を貴金属コロイド修飾又は高分子タンパク修飾可能にした構成が好ましい。
【００３５】
【実施例】
実施例１
ガラス基板をアセトン、メタノール、超純水中で超音波洗浄した後、１０％フッ酸で表面を２０秒間エッチングを行ない、さらに、アセトン、メタノール、超純水中で超音波洗浄した後、窒素ガスで乾燥させた。
その後、スパッタ装置（ＵＬＶＡＣ）を用いガラス基板にまず約１ｎｍ厚みのＣｒ層を設け、さらに約５０ｎｍ厚みのＡｕ層を設けた。
【００３６】
前記基板を濃硫酸中１〜２時間浸漬後、超純水で洗浄した後、プローブの３’端側をＳＨ（チオール）基で、５’端側をビオチンで修飾したプローブＤＮＡ−Ｄ−ＢＦＲ溶液（ＫＨ2ＰＯ4、Ｋ2ＨＰＯ4、ｐＨ  ７．０）を基板上に滴下し、飽和水蒸気中に約１５時間放置し、プローブＤＮＡをガラス基板の金薄膜上に付着させて検出チップとなした。プローブＤＮＡには日清紡製を使用した。
【００３７】
金コロイド修飾方法は、上記の検出チップをＲ−ＢＦＲ溶液（ＮａＣｌ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ  ７．４）で洗浄後、窒素ガスでおだやかに乾燥させ、表面にアビジンをコートした金コロイド（粒径１０ｎｍ、ＳＩＧＭＡ製）を滴下し１〜３時間、飽和水蒸気中で放置することで、ビオチンとアビジンの特異的結合を利用して修飾させた。
【００３８】
ハイブリダイゼーションは、Ｒ−ＢＦＲ溶液とＨ−ＢＦＲ溶液（ＮａＣｌ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ＥＤＴＡ、ｐＨ  ７．４）で洗浄後乾燥せずに、検体ＤＮＡのＨ−ＢＦＲ溶液を所要濃度となるように滴下し、約１６時間放置して実施した。
【００３９】
ＳＰＲ測定は、検出チップをＲ−ＢＦＲ溶液で洗浄後に窒素ガスで乾燥し速やかにＳＰＲ測定を行なった。
【００４０】
上記方法で、１０〜６０の塩基数のプローブＤＮＡをそれぞれ固定した検出チップを作製した。この時、プローブＤＮＡの金薄膜への吸着量をＳＰＲ測定により評価した。プローブＤＮＡの塩基数が大きくなるにつれ、ＳＰＲ角度のシフトが大きくなった。また、ＳＰＲ角度シフトを分子量で割った値は、吸着量に比例するため、これを求めたところ、プローブＤＮＡの吸着効率は、塩基数１０が最もよく、３０、６０では、大きな変化がないこと、さらに塩基数による吸着効率の変化は、１０、１００倍と大きく変化するものではなく、塩基長によらずオーダーとしてほぼ一定であることを確認した。なお、ここでは基板への被覆率約２５％を達成した。
【００４１】
また、１０〜６０の塩基数のプローブＤＮＡをそれぞれ固定した検出チップを作製し、それぞれ上記金コロイド修飾方法により修飾を行い、塩基数による金コロイド修飾量の変化をＡＦＭ（原子間力顕微鏡）で観察したところ、図３〜図５の結果を得た。修飾された金コロイド粒子数を計測したところ、塩基長１０では、約４００個／μｍ2、塩基長３０では、約７００個／μｍ2の金コロイドの修飾が観察されたが、塩基長６０では、金コロイドの修飾が全く観察されなかった。
【００４２】
これを確認するため、ＳＰＲ法を用いｉｎ−ｓｉｔｕでのＤＮＡプローブに対する金コロイド修飾の挙動を観察した。すなわち、検出チップをプリズム上に接着し、基板表面を上述のＲ−ＢＦＲ溶液で満たし、これに、金コロイド溶液を滴下し、ある一定入射角での反射光強度を継時的に観測したところ、金コロイド修飾が行なわれた場合にはＳＰＲ角度がシフトし、反射光強度の上昇が観察されるが、塩基数６０のＤＮＡでは、反射強度の変化が無くＡＦＭでの観察と同様、金コロイドの修飾が行なわれないことを確認した。
【００４３】
検出チップ金薄膜へのプローブＤＮＡの吸着は、プローブＤＮＡの鎖長に依らずオーダー的にほぼ一定であるのに対し、金薄膜に固定化されたプローブＤＮＡに対する金コロイドの修飾効率は、プローブＤＮＡの鎖長に大きく依存することが判明し、塩基数６０のプローブＤＮＡでは、まったく金コロイド修飾が起こらないことを確認した。
【００４４】
比較例１
実施例１の合成によるプローブＤＮＡに換えて、実際のＯ−１９  ｇｙｒＢ遺伝子変異部周辺の８５６ｂｐという長い遺伝子を目的ＤＮＡ（試験遺伝子）とし、これらと相補的に結合する末端３０塩基、中央３０塩基、中央６０塩基の３種類をプローブＤＮＡとし、実施例１と同様の方法で検出チップを作製した。
【００４５】
上記の３種のプローブＤＮＡに対して実施例１に示す金コロイド修飾方法を行い、その後実際の長いＤＮＡ鎖を用いてハイブリダイゼーションを実施した後、ＳＰＲ法によるハイブリダイゼーションの検出を実施した。
【００４６】
表１のプローブＤＮＡ塩基長によるＳＰＲ角度シフトの変化を示す表に明らかなように、３０塩基のプローブＤＮＡでは、末端、中央、共に、ハイブリダイゼーションによる有意差が小さく、また、塩基数６０のプローブＤＮＡでは、全く金コロイドが修飾されず、実際の長い遺伝子を目的遺伝子とした場合、上記の条件では、ＳＰＲ法によるハイブリダイゼーションの検出は困難であることを確認した。
【００４７】
【表１】
0003824309.tif 000002
【００４８】
実施例２
表１のプローブＤＮＡ塩基長によるＳＰＲ角度シフトの変化から、８５６ｂｐの長いＤＮＡを目的遺伝子とした場合、プローブ鎖と比べて、目的遺伝子が約１４〜２８倍長いため、立体的な制約によりプローブＤＮＡと反応する確率が低いと考えられる。従って、ハイブリダイゼーションしたプローブ鎖に金コロイドが修飾される場合と、ハイブリダイゼーションしていないプローブ鎖に金コロイドが修飾される場合とでＳＰＲ角度のシフトにバラツキがみられると推測される。
【００４９】
そこで先の工程、すなわち金コロイド修飾方法を行い、その後ハイブリダイゼーションを実施する工程とは逆に、上記と同じプローブＤＮＡの検出チップに対してハイブリダイゼーションを実施した後、金コロイド修飾方法を行い、その後ＳＰＲ法による前記ハイブリダイゼーションの検出を実施した。
【００５０】
すなわち、塩基数６０のプローブＤＮＡでは、ループ構造を形成しているため、金コロイド修飾が行なわれないと推測される。ループ構造をとっている長い１本鎖ＤＮＡはハイブリダイゼーションによりそのループ構造が解消された後に、金コロイド修飾を行なえば金コロイド修飾が可能であると推測される。そこで６０塩基のＤＮＡプローブにおいても同様の手法を用いれば金コロイド修飾が可能であると考えた。図６Ａ，Ｂ参照。
【００５１】
換言すれば、目的遺伝子がない場合には、ハイブリダイゼーションは起こらずかつ金コロイド修飾が行なわれない。これに対して、目的遺伝子がある場合には、ハイブリダイゼーションが起こり、ループ構造が解消されることにより、ハイブリダイゼーションしたＤＮＡプローブにのみ選択的に金コロイド修飾が起こり、ＳＰＲ測定でハイブリダイゼーションによるシフトに金コロイド修飾によるシフトが加わった大きなＳＰＲ角度シフトの差が得られると考えた。
【００５２】
比較例１と同じ実際の長いＤＮＡ鎖を目的遺伝子とした検出チップを用い、実施例１に示す各工程で、プローブＤＮＡの基板への付着、ハイブリダイゼーション、金コロイド修飾を実施し、水溶液中でのＳＰＲ角度シフト並びに空気中でのＳＰＲ角度シフトを測定した。
【００５３】
プローブＤＮＡのみの場合には、金コロイド修飾を行なってもＳＰＲ角度シフトが見られないが、プローブＤＮＡにハイブリダイゼーションが起こった場合には、ＳＰＲ角度が大きくシフトして金コロイド修飾が行われていることが明らかになった。
【００５４】
すなわち、空気中でのＳＰＲ角度シフトの測定結果を表２に示すように、３０塩基のプローブＤＮＡでは、金コロイド修飾によるＳＰＲ角度シフトの増幅作用が小さく、また、サンプル間における偏差も大きかった。それに対して、６０塩基のプローブＤＮＡを用いて、ハイブリダイゼーション後に金コロイド修飾した場合には、金コロイド修飾によるＳＰＲ角度シフトが約４〜５倍増幅され、かつサンプル間における偏差も小さかった。
【００５５】
要するに、ハイブリダイゼーション後に金コロイド修飾を行うことにより、溶液中、空気中ともに、６０塩基プローブＤＮＡの金コロイド修飾が可能となった。また、この発明方法では、６０塩基プローブＤＮＡの立体構造（ループ構造）を利用することにより、ハイブリダイゼーションしたプローブＤＮＡのみに選択的に金コロイド修飾させることが可能であり、その結果、大きなＳＰＲ角度シフトの増幅が可能で、サンプル間の偏差を小さくすることができた。
【００５６】
【表２】
0003824309.tif 000003
【００５７】
実施例３
実施例２の６０塩基プローブＤＮＡを用いて、ハイブリダイゼーションを行う際の温度条件を求めるため、１５℃〜５０℃の範囲で試験を行った。表３に２５℃、３７℃、４２℃の場合におけるＳＰＲ角度シフト増幅の結果を示す。又、３０℃〜４０℃が好ましいことを確認した。
【００５８】
【表３】
0003824309.tif 000004
【００５９】
実施例４
実施例２の６０塩基プローブＤＮＡを用いて、金コロイド修飾の金コロイドの粒径の影響を検討するため、５ｎｍ、１０ｎｍの金コロイドを２種類用い試験を行なった。表４に示すごとく、１０ｎｍの金コロイドの方が、５ｎｍの金コロイドより、ＳＰＲ角度シフトが大きくなり、金コロイドの粒径は、１０ｎｍの方が適していることが分かった。なお、５ｎｍの金コロイドの方が、プローブＤＮＡに対する立体的制約が少ないので、金コロイド修飾の効率が良い可能性があるが、１０ｎｍの金コロイドの方が標識１個当たりとしてのＳＰＲ角度シフト作用が大きいため、１０ｎｍの方が良い結果になったと思われる。
【００６０】
【表４】
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【００６１】
実施例５
各工程における温度制御により、ＳＰＲ角度のシフトに差が出るかを見るため、プローブＤＮＡの固定を３７℃、ハイブリダイゼーションを４２℃、金コロイド修飾を２５℃で実施し、これを全て３７℃で行う場合と比較した。
【００６２】
すなわち、４２℃でハイブリダイゼーションすることにより、ＤＮＡプローブのループ構造を若干解消し、目的遺伝子とＤＮＡプローブが出会う確率を高め、ハイブリダイゼーションするＤＮＡプローブ鎖の割合を上げてやり、その後、室温に戻して、ハイブリダイゼーションしていないＤＮＡプローブのループ構造を再形成した後、金コロイド修飾を行うことによりＳＰＲ角度のシフト増強を期待できるかを確かめた。
【００６３】
表５に上記温度制御によるＳＰＲ角度のシフトへの影響を示すように、ＳＰＲ角度シフト増幅効果は見られるが、３７℃の場合ほどの増幅効果は得られなかった。これは、ハイブリダイゼーションの温度を４２℃に上げることにより、形成した２重鎖が一部再度解けるため、ハイブリダイゼーションの確率とのバランスから増幅効果が見られないと推測される。
【００６４】
しかし、表３〜表５の結果を見るに、これらの結果は、この発明の検出チップは実施例２で想定したようにプローブＤＮＡがループ構造を取っていること、すなわち各プローブＤＮＡが立体的な制約でその解放末端が薄膜側にあるために起こっている現象であることをそれぞれ間接的に示していることが分かる。
【００６５】
【表５】
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【００６６】
実施例６
実施例１に示す６０の塩基数のプローブＤＮＡを固定した検出チップを用いて、実施例２と同様にこの発明の方法を実施する際に、金コロイド修飾と同様方法でストレプトアビジンを修飾したところ、ハイブリダイゼーションしたプローブＤＮＡのみに選択的にストレプトアビジン修飾させることが可能であり、その結果、ＳＰＲ角度シフト増幅が可能であり、ハイブリダイゼーションの検出が可能であることを確認した。
【００６７】
【発明の効果】
この発明は、従来の蛍光法と比較して多数の利点を有しているＳＰＲ分光法による遺伝子などの生化学検体の検出方法において、例えば塩基数が６０以上であるプローブＤＮＡを用いて、検出チップの基板薄膜表面上にループ構造を形成して解放末端が薄膜側にある構成となすことで、大きなＳＰＲ角度シフトの差が得られるこの方法では、先に検体ＤＮＡとハイブリダイゼーションを行なった後、金コロイド、高分子蛋白で修飾することが可能となる。
【００６８】
この発明方法によって、目的遺伝子がない場合には、ハイブリダイゼーションは起こらずかつ金コロイド修飾が行なわれない。これに対して、目的遺伝子がある場合には、ハイブリダイゼーションが起こり、ループ構造が解消されることににより、ハイブリダイゼーションしたＤＮＡプローブにのみ選択的に金コロイド修飾が起こり、ＳＰＲ測定でハイブリダイゼーションによるシフトに金コロイド修飾によるシフトが加わった大きなＳＰＲ角度シフトの差が得られる。
【００６９】
この発明による検出チップは、表面に金薄膜を成膜したガラス基板の該薄膜上にプローブＤＮＡを配列させるに際し、各プローブＤＮＡがループ構造を形成して解放末端が薄膜側にあるように構成するため、先に修飾操作を行う必要がなく、製造が容易であり、ハイブリダイゼーション中またはその後に修飾操作を行うことで目的遺伝子がある場合にのみ、修飾が可能となる利点がある。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＡはＳＰＲ分光法の概略説明であり、Ｂは金薄膜上への有機薄膜形成によるＳＰＲ角度のシフトを示す入射角度と反射率のグラフである。
【図２】Ａ、Ｂはこの発明におけるプローブＤＮＡのループ構造の概念を示す説明図である。
【図３】塩基数１０のプローブＤＮＡへの金コロイド修飾状況をＡＦＭにより観察した写真の模式図であある。
【図４】塩基数３０のプローブＤＮＡへの金コロイド修飾状況をＡＦＭにより観察した写真の模式図である。
【図５】塩基数６０のプローブＤＮＡへの金コロイド修飾状況をＡＦＭにより観察した写真の模式図である。
【図６】この発明におけるハイブリダイゼーションによるループ構造の解消と金コロイド修飾の状況を示す模式図であり、Ａは目的遺伝子がない場合、Ｂは目的遺伝子が有る場合を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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