(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のアミノ酸配列を有するヒトタンパク質ｈＡＭＳＨ。
【請求項２】
請求項１のヒトタンパク質ｈＡＭＳＨをコードするヒト遺伝子。
【請求項３】
請求項２のヒト遺伝子のｃＤＮＡであって、配列番号２の塩基配列を有するｈＡＭＳＨｃＤＮＡ。
【請求項４】
請求項３のｈＡＭＳＨｃＤＮＡを保有する組換えベクター。
【請求項５】
請求項１のヒトタンパク質ｈＡＭＳＨに対する抗体。
【請求項６】
配列番号３のアミノ酸配列を有するマウスタンパク質ｍＡＭＳＨ。
【請求項７】
請求項６のマウスタンパク質ｍＡＭＳＨをコードするマウス遺伝子。
【請求項８】
請求項７のマウス遺伝子のｃＤＮＡであって、配列番号４の塩基配列を有するｍＡＭＳＨｃＤＮＡ。
【請求項９】
請求項８のｍＡＭＳＨｃＤＮＡを保有する組換えベクター。
【請求項１０】
請求項６のマウスタンパク質ｍＡＭＳＨに対する抗体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この出願は、ヒトおよびマウスのタンパク質ｈＡＭＳＨおよびｍＡＭＳＨと、これらのタンパク質をコードするｃＤＮＡに関するものである。さらに詳しくは、この出願は、ヒトおよびマウス細胞における新規なシグナル伝達分子ＡＭＳＨと、これらのタンパク質をコードするヒトおよびマウス遺伝、それらのｃＤＮＡ、ならびにタンパク質に対する抗体に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
造血、免疫、神経系等の生体高次機能の発現には、機能の異なる多種多様な細胞が共同して作用する必要があり、そのためには細胞間のコミュニケーションが不可欠である。サイトカインは、このような細胞間のコミュニケーションを担うタンパク質であり、インターロイキン（ＩＬ）−１〜１８、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、インターフェロン（ＩＦＮ）、ケモカイン等の各分子が知られている。
【０００３】
サイトカインが細胞膜上の特異的受容体に結合することによって細胞内にシグナルが発生し、このシグナル伝達によって細胞の生存、増殖、分化、機能発現等が制御されている。従って、サイトカイン−受容体−シグナル伝達の一連の作用に機能不全が生じた場合には生体防御に関わる免疫、造血系が破綻し、重症感染症、がん、自己免疫疾患等が惹起される。
【０００４】
このような理由から、サイトカインとその受容体、および細胞内シグナル伝達経路の解明は、細胞の増殖や分化といった基本的な現象を分子レベルで理解するため、そしてさらには各種の疾患の原因解明、診断、治療法等を開発するためにも極めて重要である。
この出願の発明者らは、これまでにサイトカイン受容体の中で、複数のサイトカインに共有される「共有γ鎖」の遺伝子単離を行い、サイトカイン受容体の構造と機能の解明に大きく貢献している。特に、γ鎖がＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７およびＩＬ−９の機能発現に必須の受容体サブユニットであり、ヒトＸ連鎖重症複合免疫不全症においてγ鎖変異がＩＬ−７の機能不全を介してＴ細胞初期発生障害を惹起していることなどを明らかにしている（Science, 262:1874-1877, 1993; Int. Immunol., 6:1451-1454, 1994; Science, 263:1453-1454, 1994; Eur. J. Immunol., 25:3001-3005, 1995）。
【０００５】
最近、この出願の発明者らは、サイトカインによる細胞内増殖シグナル伝達に関与する新たなシグナル分子として「ＳＴＡＭ」を同定し、このＳＴＡＭがＩＬ−２／ＧＭ−ＣＳＦ受容体の下流に存在してＪＡＫ３／２と直接会合し、かつｃ−ｍｙｃ発現とＤＮＡ合成のシグナル伝達に重要な役割を果たしていることを見出している（Immunity, 6:449-457, 1997 ）。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
前記のとおり、この出願人の発明者らによって、サイトカインの受容体結合による細胞内シグナル伝達経路の重要な幾つかの機構が明らかにされつつあるが、その全体の構造と機能を解明するためには、さらなる新規分子の同定が不可欠である。シグナル伝達経路は、複数の分子が連続的かつ複合的に関与し、いわゆるカスケードを構成することによって最終的な機能発現に到達すると考えられるからである。
【０００７】
この出願は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであって、この出願の発明者らが見出したシグナル分子ＳＴＡＭのＳＨ３ドメインと相互作用し、ＳＴＡＭより下流のシグナル伝達に必須の作用を及ぼす新規のシグナル伝達分子を提供することを目的としている。
この出願はまた、この新規分子の遺伝子とそのｃＤＮＡ、およびこの新規分子に対する抗体等を提供することを目的としている。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
この出願は、上記の課題を解決する発明として、配列番号１のアミノ酸配列を有するヒトタンパク質ｈＡＭＳＨを提供する。
また、この出願は、上記のヒトタンパク質ｈＡＭＳＨをコードするヒト遺伝子、この遺伝子のｃＤＮＡであって、配列番号２の塩基配列を含むｃＤＮＡ、並びに配列番号２の一部配列からなるＤＮＡ断片を提供する。
【０００９】
さらにまた、この出願は、上記ｃＤＮＡまたはその一部配列を保有する組換えベクター、および上記のヒトタンパク質ｈＡＭＳＨに対する抗体を提供する。
この出願は、また、配列番号３のアミノ酸配列を有するマウスタンパク質ｍＡＭＳＨ、このｍＡＭＳＨをコ−ドするマウス遺伝子、この遺伝子のｃＤＮＡであって、配列番号４の塩基配列を含むｍＡＭＳＨｃＤＮＡ、配列番号４の一部配列からなるＤＮＡ断片、このｃＤＮＡまたはその一部配列を保有する組換えベクター、およびｍＡＭＳＨに対する抗体を提供する。
【００１０】
以下、この発明の実施の形態について詳しく説明する。
【００１１】
【発明の実施の形態】
先ず、この発明のヒトタンパク質ｈＡＭＳＨおよびそのｃＤＮＡについて、取得の経緯および機能について説明する。
この発明のヒトタンパク質ｈＡＭＳＨのｃＤＮＡは、発明者等が既に同定しているＳＴＡＭ遺伝子のＳＨ３ドメインとグルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）とのキメラ遺伝子を用いて、ファーウエスタン法により、ヒトｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによって単離されたヒト遺伝子ｃＤＮＡである。このｃＤＮＡは、配列番号２に示した1910塩基対からなるヌクレオチド配列を有しており、配列番号１にアミノ酸配列を示したタンパク質ｈＡＭＳＨをコードしている。
【００１２】
このタンパク質ｈＡＭＳＨは、分子内に推定核移行シグナルとＪＡＢ１類似構造が確認されたが、タンパク質データベースには対応する分子が存在しないことから、新規分子であるることが確認された。
このタンパク質ｈＡＭＳＨが、サイトカイン受容体の下流においてＳＴＡＭと会合することによって、細胞増殖シグナル伝達に係わっている新規分子であることは、以下によって確認されている。
(1) ｈＡＭＳＨのＣ端半分の領域を欠失したＡＭＳＨ−ｄｃ２がＩＬ−２やＧＭ−ＣＳＦ刺激後のＤＮＡ合成シグナル伝達を抑制すること。
(2) 上記ＡＭＳＨ−ｄｃ２変異体がＩＬ−２やＧＭ−ＣＳＦ刺激後のｃ−ｍｙｃ誘導シグナル伝達を抑制すること。
【００１３】
また、この発明のマウスタンパク質ｍＡＭＳＨのｃＤＮＡは、前記ｈＡＭＳＨｃＤＮＡをプローブとしてマウスｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによって単離されたマウス遺伝子ｃＤＮＡである。このｃＤＮＡは、配列番号４に示した1384塩基対からなるヌクレオチド配列を有しており、配列番号２にアミノ酸配列を示したタンパク質ｍＡＭＳＨをコードしている。
【００１４】
この発明のタンパク質ｈＡＭＳＨおよびｍＡＭＳＨは、公知の方法、すなわちヒトまたはマウスの臓器、細胞株などから単離する方法、この発明によって提供されるアミノ酸配列に基づき化学合成によってペプチドを調製する方法、あるいはこの発明によって提供されるｃＤＮＡ断片を用いて組換えＤＮＡ技術で生産する方法などにより取得することができる。例えば、組換えＤＮＡ技術によってタンパク質ｈＡＭＳＨを取得する場合には、配列番号２のｃＤＮＡ断片を有するベクターからインビトロ転写によってＲＮＡを調製し、これを鋳型としてインビトロ翻訳を行なうことによりインビトロで発現できる。また翻訳領域を公知の方法により適当な発現ベクターに組換えれば、大腸菌、枯草菌、酵母、動植物細胞等で、ｃＤＮＡがコードしているタンパク質を大量に発現させることができる。
【００１５】
この発明のタンパク質をインビトロ翻訳でＤＮＡを発現させて生産する場合には、前記ｃＤＮＡまたはその翻訳領域をＲＮＡポリメラーゼプロモーターを有するベクターに組換え、プロモーターに対応するＲＮＡポリメラーゼを含むウサギ網状赤血球溶解物や小麦胚芽抽出物などのインビトロ翻訳系に添加すれば、この発明のタンパク質をインビトロで生産することができる。ＲＮＡポリメラーゼプロモーターとしては、Ｔ７、Ｔ３、ＳＰ６などが例示できる。これらのＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含むベクターとしては、ｐＫＡ１、ｐＣＤＭ８、ｐＴ３／Ｔ７  １８、ｐＴ７／３  １９、ｐＢluescript IIなどが例示できる。
【００１６】
この発明のタンパク質を大腸菌などの微生物で生産する場合には、微生物中で複製可能なオリジン、プロモーター、リボソーム結合部位、ｃＤＮＡクローニング部位、ターミネーター等を有する発現ベクターに、この発明のｃＤＮＡまたはその翻訳領域を挿入して発現ベクターを作成し、この発現ベクターで宿主細胞を形質転換したのち、得られた形質転換体を培養すれば、このｃＤＮＡがコードしているタンパク質を微生物内で大量生産することができる。この際、任意の翻訳領域の前後に開始コドンと停止コドンを付加して発現させれば、任意の領域を含むタンパク質分子を得ることができる。あるいは、他のタンパク質との融合蛋白質として発現させ、この融合蛋白質を適当なプロテアーゼで切断することによって目的タンパク質部分のみを取得することもできる。大腸菌用発現ベクターとしては、ｐＵＣ系、ｐＢluescript II、ｐＥＴ発現システム、ｐＧＥＸ発現システムなどが例示できる。
【００１７】
この発明のタンパク質を真核細胞で生産する場合には、このｃＤＮＡまたはその翻訳領域を、プロモーター、スプライシング領域、ポリ（Ａ）付加部位等を有する真核細胞用発現ベクターに挿入し、この組換えベクターを真核細胞内に導入することによって、この発明のタンパク質を動物細胞内で生産することができる。発現ベクターとしては、ｐＫＡ１、ｐＣＤＭ８、ｐＳＶＫ３、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐＢＫ−ＲＳＶ、ＥＢＶベクター、ｐＲＳ、ｐＹＥＳ２などが例示できる。真核細胞としては、サル腎臓細胞ＣＯＳ７、チャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯなどの哺乳動物培養細胞、出芽酵母、分裂酵母、カイコ細胞、アフリカツメガエル卵細胞などが一般に用いられるが、この発明のタンパク質を発現できるものであれば、いかなる真核細胞でもよい。発現ベクターを真核細胞に導入するには、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法など公知の方法を用いることができる。
【００１８】
この発明のタンパク質を微生物や真核細胞で発現させたのち、培養物から目的タンパク質を単離精製するためには、公知の分離操作を組み合わせて行うことができる。例えば、尿素などの変性剤や界面活性剤による処理、超音波処理、酵素消化、塩析や溶媒沈殿法、透析、遠心分離、限外濾過、ゲル濾過、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーなどが挙げられる。
【００１９】
この発明のタンパク質ｈＡＭＳＨおよびｍＡＭＳＨには、配列番号１および３で各々表されるアミノ酸配列のいかなる部分アミノ酸配列を含むペプチド断片（５アミノ酸残基以上）も含まれる。これらのペプチド断片は抗体を作製するための抗原として用いることができる。また、この発明のタンパク質には、他の任意のタンパク質との融合蛋白質も含まれる。
【００２０】
この発明の遺伝子は、上記タンパク質をコードするヒトの遺伝子であって、例えば、この発明のｃＤＮＡまたはその一部配列をプローブとして、既存のゲノムライブラリーから単離することができる。
この発明のｃＤＮＡは、配列番号２および４の塩基配列に基づいて合成したオリゴヌクレオチドプローブを用いて、各々ヒト細胞またはマウス細胞由来のｃＤＮＡライブラリーを公知のコロニーあるいはプラークハイブリダイゼーションによってスクリーニングすることにより得ることができる。また、ｃＤＮＡ断片の両末端にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを合成し、これをプライマーとして用いて、ヒト細胞またはマウス細胞から単離したｍＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲ法により、この発明のｃＤＮＡ断片を調製することもできる。
【００２１】
一般に動物遺伝子は個体差による多型が頻繁に認められる。従って配列番号２または４において、１または複数個のヌクレオチドの付加、欠失および／または他のヌクレオチドによる置換がなされているｃＤＮＡもこの発明のｃＤＮＡに含まれる。
同様に、これらの変更によって生じる、１または複数個のアミノ酸の付加、欠失および／または他のアミノ酸による置換がなされているタンパク質も、配列番号１または３で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質の活性を有する限り、この発明のタンパク質に含まれる。
【００２２】
この発明のＤＮＡ断片には、配列番号２または４で表される塩基配列のいかなる部分塩基配列を含むｃＤＮＡ断片（１０ｂｐ以上）も含まれる。また、センス鎖およびアンチセンス鎖からなるＤＮＡ断片もこの範疇に入る。これらのＤＮＡ断片は遺伝子診断用のプローブ等として用いることができる。
この発明のタンパク質に対する抗体は、タンパク質それ自体、またはその部分ペプチドを抗原として、公知の方法によりポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体として得ることができる。
【００２３】
【実施例】
ｈＡＭＳＨｃＤＮＡの一部（配列番号２の３８３−５５０：配列番号１のアミノ酸番号１２５−１８０に対応）をＰＣＲにて増幅し、ＧＳＴ融合タンパク質発現ベクターに挿入した。このベクターを宿主大腸菌に導入して形質転換し、この形質転換体をＩＰＴＧにて刺激し、ＧＳＴ融合タンパク質の発現を誘導した。誘導された融合タンパク質をグルタチオンカラムにてアファニティー精製し、純化されたＧＳＴ融合タンパク質を得た。このＧＳＴ融合タンパク質を抗原として家兎に定法により免疫を行い、抗血清を得た。
【００２４】
【発明の効果】
以上詳しく説明したとおり、この発明によって、サイトカイン系シグナル伝達経路に関与する新規のシグナル伝達分子とその遺伝子操作材料が提供される。これらの分子および遺伝子操作材料は、重症感染症、がん、自己免疫疾患等のサイトカイン系シグナル伝達経路の機能障害によるヒト疾患の診断や治療のための方法、薬剤等の開発に有用である。
【００２５】
【配列表】
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