(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書中でＰＭ−９３１３５と呼称する、次の式
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を有する化合物及びその医薬的に許容可能な塩。
【請求項２】
化合物ＰＭ−９３１３５を製造する方法であって、制御した水中好気的条件下に同化性の炭素及び窒素源を含む水性栄養培地中で化合物ＰＭ−９３１３５を産生し得る微生物株Ｌ−１３−ＡＣＭ２−０９２を培養することを含む方法。
【請求項３】
培養ブイヨンから化合物ＰＭ−９３１３５を単離及び精製することをも含むことを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ＰＭ−９３１３５産生微生物がスペインのバレンシア大学に有る
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から受託番号第ＣＥＣＴ−３３２６号の下に入手可能である、実質的に純粋な培養株Ｌ−１３−ＡＣＭ２−０９２であることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項５】
ミクロモノスポラ科に属し、分類学上ミクロモノスポラ属種として分類されている、海洋ソフトコーラルから単離された実質的に純粋な培養株Ｌ−１３−ＡＣＭ２−０９２。
【請求項６】
化合物ＰＭ−９３１３５を黄色ぶどう球菌、枯草菌及びミクロコックス・ルテウスの中から選択された１種以上のグラム陽性菌株に対して有効な量で含有する抗生医薬組成物。
【請求項７】
ヒト以外の哺乳動物のグラム陽性菌感染を治療する方法であって、そのような治療を必要とする患者に、任意のキャリヤ、稀釈剤または賦形剤中に存在させた化合物ＰＭ−９３１３５またはその医薬的に許容可能な塩を抗グラム陽性菌有効量で投与することを含む方法。
【請求項８】
化合物ＰＭ−９３１３５をＰ−３８８、ＨＴ−２９、Ａ−５４９及びＭＥＬ−２８の中から選択された１種以上のマウス及び／またはヒト腫瘍細胞系に対して有効な量で含有する抗腫瘍医薬組成物。
【請求項９】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及び／または人体以外でのｉｎ  ｖｉｖｏでのＲＮＡ合成を抑制する方法であって、生きた細胞を抑制有効量の化合物ＰＭ−９３１３５と接触させることを含む方法。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
ミクロモノスポラ科に属する新規な海洋細菌株Ｌ−１３−ＡＣＭ２−０９２から新規なデプシペプチドを単離した。本明細書には、制御した条件下での上記株の好気的発酵による上記デプシペプチドの製造、並びにＰＭ−９３１３５の単離及び精製を開示する。本発明の化合物はグラム陽性菌に対して優れた活性を示す。本発明の化合物及び発酵ブイヨンは幾つかの癌細胞系に対しても著しい活性を示す。
発明の背景
一般的な細菌の多くが日増しに多くの抗生物質に対して耐性となりつつある。公表された報告によれば、耐性細菌感染は１９９２年に米国において１９，０００人の入院患者を死亡させ（かつ５８，０００人以上の死亡に関与し）た。例えば、耳感染、髄膜炎、肺炎及び血液感染を惹起する恐れの有る肺炎球菌株は正にこの６年間で、ペニシリン及び他の４種の抗生物質に耐性を示すようになった。約２０％のＴＢ菌は優れた治療薬のイソニアジドに耐性であり、淋菌はペニシリンに耐性である。敗血症を惹起する公知の黄色ぶどう球菌株の過半数はバンコマイシン以外の総てに耐性である。明らかに、新たな抗生物質を恒常的に提供する必要性は尽きない。従って本発明は、本明細書中で便宜上ＰＭ−９３１３５と呼称する新規な抗生物質を提供することを目的の一つとする。
幾つかのヒト癌の治療用に新規な抗腫瘍化合物も必要とされている。従って、本発明は新規な抗腫瘍薬の提供も目的とし、本発明の提供する抗腫瘍薬は即ち化合物ＰＭ−９３１３５である。この化合物は、著しいＲＮＡ合成抑制活性を有するチオデプシペプチドである。
本発明は、本明細書に開示した活性化合物を用いた治療を必要とする患者に投与するための医薬組成物を提供することも目的とする。本発明の活性化合物を、該化合物を産生し得る生物を適当な普通培地中で生物学的に純粋に培養する、条件制御下での好気的発酵により製造すること、及び本発明の活性化合物を発酵ブイヨンから回収して濃縮し、最終的に精製する方法を提供することも本発明の目的である。
発明の概要
本発明は、次の式Ｉ
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を有する化合物を提供する。
本発明ではＰＭ−９３１３５を得る方法も開示し、この方法は好ましくは、制御した水中好気的条件下に同化性の炭素及び窒素源並びに塩を伴った水性普通培地中でＰＭ−９３１３５を産生し得る微生物株を培養することを含む。培養ブイヨンから化合物ＰＭ−９３１３５を回収及び精製する。
好ましい培養株はＬ−１３−ＡＣＭ２−０９２であり、この株はミクロモノスポラ科に属し、分類学上ミクロモノスポラ属種として分類されている。
先に述べたように、化合物ＰＭ−９３１３５は幾つかのグラム陽性及びグラム陰性菌株に対して有効であることが判明し、また該化合物がＰ−３８８、ＨＴ−２９、Ａ−５４９及びＭＥＬ−２８を含めたマウス及びヒト腫瘍細胞系に対して優れた活性を有することも判明した。化合物ＰＭ−９３１３５はＲＮＡ合成に対する選択的活性を示す。
【図面の簡単な説明】
第１図は精製したＰＭ−９３１３５の赤外線（ＩＲ）スペクトルを示す説明図である。
第２図は精製したＰＭ−９３１３５の紫外線（ＵＶ）スペクトルを示す説明図である。
第３図は精製したＰＭ−９３１３５のプロトン（1Ｈ）ＮＭＲスペクトルを示す説明図である。
第４図は精製したＰＭ−９３１３５の炭素１３（13Ｃ）ＮＭＲスペクトルを示す説明図である。
第５図は精製したＰＭ−９３１３５の質量スペクトルを示す説明図である。
発明の詳細な説明
産生生物：
ＰＭ−９３１３５の製造に用いる微生物は好ましくはミクロモノスポラ属種株Ｌ−１３−ＡＣＭ２−０９２とし、この株の培養物はスペインのバレンシア大学に有る
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に、受託番号第ＣＥＣＴ−３３２６号の下に寄託してある。この寄託はブダペスト条約の条項に基づいて行なったものであり、株Ｌ−１３−ＡＣＭ２−０９２の入手に関して公衆に課せられた制限は総て、本出願に特許が付与されれば最終的に廃止される。
上記生物を、モザンビーク沿岸のインド洋において採集した未同定の海洋ソフトサンゴ（ｍａｒｉｎｅ  ｓｏｆｔ  ｃｏｒａｌ）から単離した。本明細書中に説明した分類学的方法は表１に掲げたとおりである。
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いずれの培養物も２７℃でインキュベートし、結果を１週間おきに２１日後まで記録した。
次に、用いた生物について説明する。
コロニー形態：
２８℃で２１日経過後、ＡＳＷを添加したＩＳＰ−２及び１７２では良好な増殖が観察される。試験した様々な培地上に幾つかのオレンジ色の陰影が認められる。気生菌糸体は形成されない。基底菌糸体は枝分かれする。基底菌糸体全体に分離胞子が発生する。胞子は球形である。これ以外の形成は、少なくとも１４日経過後に幾つかの培地において菌糸体塊が幾分過剰に増殖したことを除けば観察されなかった。
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ACM2-92＝ミクロモノスポラ属種CECT 3326(L-13-ACM2-92); AMCITRE＝Acti-nomadura citrea DSM 43461; AMPDIGIT＝Ampullarella digitata ATCC 15349; AMROSEO＝Actinomadura roseovioplaced DSM 43144; AMYORIE＝Amy-colatopsis orientalis DSM 40040; APRAZIL＝Actinoplanes brazilliensis ATCC 25844; MNCHALC＝Micromonospora chalecea ATCC 31395; MNECHCA＝Micromonospora echinospora calichinensis NRLL 15839; MNFUCA＝Micro-monospora fusca NNRL B-3298; MTFERRU＝Microtetrospora ferruginea DSM 43553; MTROSEO＝Microtetraspora roseola ATCC 33579; MTRUBRA＝Micro-tetraspora ruba ATCC 27031;MTSALMO＝Microtetraspora salmonea ATCC 33580; NOAFRI＝Nocardiopsis africana DSM 43748; SACCAER＝Saccharoth-rix aerocolonigenes NRRL B-3298; SPAMETH＝Streptosporangium amethys-togenes DSM 43179; SPVIRIDO＝Streptosporangium viriedogriseum ATCC 25242; STALBUS＝Streptomyces albus DSM 40313。
生理特性：
ＩＳＰ−１中では拡散可能な色素は形成されず、固体培地上でも同様である。ＮａＣｌに対する耐性は４％を上回る。最適の増殖温度範囲は２５〜３５℃であるが、用いた生物は４５℃でも十分増殖する。この生物は単独炭素源としてのグルコース、スクロース、ラムノース及びＤ−キシロース上で増殖し得るが、ラフィノース、イノシトール及びα−メリビオース上での増殖は僅かでしかなく、マンニトール、フルクトース及びアラビノース中での増殖は疑わしい。
細胞化学組成：
ＤＡＰ：  株ＣＥＣＴ−３３２６の全細胞加水分解物中にはメソ−２，６−ジアミノピメリン酸が存在する。
脂肪酸：  表２に他の類似株との比較を示す。
糖：  全細胞糖パターンは、セルロースプレート上でのＴＬＣによって解析するとキシロース、リボース及びグルコースの存在を示す。アラビノースは、Ｈａｓｅｇａｗａ等の操作（１９８３）の後に上記技術を用いることによっては検出されない。全細胞糖解析をガスクロマトグラフィーによって行なうと痕跡量のアラビノースが検出され、その結果Ｌｅｃｈｅｖａｌｉｅｒ等（１９７１）のグループＤ（ミクロモノスポラ科に属する細菌に対応するキシロース＋アラビノース含有放線菌）の糖パターンが推定され得る。ガスクロマトグラフィーによって検出される他の重要な糖に、リボース、マンノース、ガラクトース、グルコース、ｍ−イノシトール、グルコサミン及びマンノサミンが有る。マズロース（ｍａｄｕｒｏｓｅ）は細胞成分として検出されない。
上述の諸特徴に基づき、培養物はミクロモノスポラ属の種であり、しかも国際コレクションにおいて入手可能な前記属の公知の種類の株のいずれとも類似しないことが確認された。
ここに示した寄託生物は明らかに好ましいものであるが、本発明はこの特定の株もしくは生物に制限または限定されない。本発明者は、他のＰＭ−９３１３５産生生物、株または突然変異体も本発明の範囲内に含める積もりである。
発酵：
ミクロモノスポラ属種のＣＥＣＴ−３３２６は、適当な普通培地中で制御した条件下に培養すると化合物ＰＭ−９３１３５を産生する。この株は好ましくは、水性普通培地中で好気的及び中温条件下に好ましくは温度２４〜３５℃及びｐＨ６．０〜８．０で増殖させる。この生物の培養にはきわめて様々な液体培地を用い得る。有用な培地は、澱粉、デキストリン、糖蜜（ｓｕｇａｒ  ｍｏｌａｓｓｅｓ）、グリセロール、グルコース、スクロース等といった同化性炭素源と、タンパク質、タンパク質加水分解物、脱脂穀粉、穀物浸漬液（ｃｏｒｎ  ｓｔｅｅｐ）等といった同化性窒素源と、ナトリウム、マグネシウム、カリウム、アンモニウム、硫酸、塩素、リン酸、炭酸等といった有用な無機アニオン及びカチオンとを含有するものである。微量元素を添加することも可能である。通気は、好ましくは発酵培地への空気の供給によって行なう。攪拌は、好ましくは機械的な翼車によって行なう。上記生物の培養には通常の発酵槽で十分適当であることが判明した。産生量を増し、かつ起泡を抑制するために、栄養素及びｐＨ調節剤並びに消泡剤を発酵の様々な段階に添加することが必要であり得る。
好ましい生物にＰＭ−９３１３５を産生させるのに必要なステップは次のとおりである。
凍結させた、または凍結乾燥した菌糸体を出発物質とする。初期細胞を常温で好気的条件下に、上記諸成分のうちの幾つかを含有する培地を入れた振盪フラスコ内で培養して菌糸体塊を得る。このステップは必要に応じて数回繰り返し得、回収した物質は適当な培地を収容した１個以上の発酵槽に接種する接種物として用いる。所望であれば、上記発酵槽内で生成する発酵物も接種物として用いることができ、このステップは必要に応じて数回繰り返し得、あるいはまた必要とされるブイヨン量次第では、前記発酵物を化合物産生段階として用いることも可能である。産生培地は時に、接種物として用いる培地と異なり得る。
表３に、接種物の展開及びＰＭ−９３１３５の産生に用い得る培地の典型例を示す。
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ＰＭ−９３１３５の産生はマウス白血病細胞系Ｐ−３８８に対する全ブイヨンアッセイか、またはＨＰＬＣによって監視し得る。
ＰＭ−９３１３５の単離：
酢酸エチルなどの適当な有機溶媒を用いて、菌糸体塊から抗生物質ＰＭ−９３１３５を単離する。１回以上繰り返した抽出から得られた抽出物を一つに合わせ、真空下に蒸発乾固する。
粗な活性抽出物からのＰＭ−９３１３５の分離及び精製は、公知技術、例えばカラムクロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、分取薄層クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等を適正に組み合わせて用いることにより行ない得る。
分画は抗腫瘍活性に基づいてか、または３６６ｎｍのＵＶ光で可視化するＴＬＣや、ダイオードアレイ検出を伴う解析ＨＰＬＣによって行ない得る。ＨＰＬＣ解析は室温で行ない（移動層として９：１のメタノール／水を流量２ｍｌ／分で用いるＷａｔｅｒｓ  ＲＣＭ  ８×１０，８Ｃ１８  １０カートリッジ）、２５０ｎｍでプロットする。上記条件の下で、ＰＭ−９３１３５の保持時間は２．２５分である。
様々なスペクトル特性の詳細な解析に基づき、純粋な化合物をＰＭ−９３１３５として同定し得る（第１図〜第５図に示したデータ参照）。
ＫＢｒ中での赤外線吸収スペクトルを添付図面の第１図に示す。次の吸収極大（ｃｍ-1）が観察される：  ３３７０、１６５０、１５１５、１０９５。
第２図に示したＵＶスペクトルは、９：１のＭｅＯＨ／Ｈ2Ｏ中での約２２０、２３０、３００及び３６０ｎｍにおける吸収を示す。
第３図及び第４図にそれぞれ示した1Ｈ及び13Ｃ  ＮＭＲスペクトルは表４に列挙したピークを示す。
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第５図に質量スペクトルを示す。主なピークは次のとおりである（第一の数値は比ｍ／ｚ、括弧に入れた第二の数値は相対存在量のパーセンテージ）：
１０４（１００）；２４６．９（５１）；４１５（４３）；４４９（３１）；５４６（１０）；５８０（７）；６１１（７）；６９４（８）；１０２６（１１）；１０９５（２０）；１１０９（１６）；１１５７（２２）。
ＰＭ−９３１３５の生物活性：
化合物ＰＭ−９３１３５の抗微生物活性を、液体Ｍｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ培地にＰＭ−９３１３５と共に添加した試験微生物を３７℃でインキュベートすることにより調べた。ＰＭ−９３１３５と共に２４時間インキュベーション後、インキュベーション培地における濁りの出現によって最低抑制濃度（ＭＩＣ）を決定した。得られた結果を表５に示す。ＰＭ−９３１３５はグラム陽性菌に対して殺菌活性を示す。
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ＰＭ−９３１３５の抗腫瘍活性を、マウス白血病細胞培養物Ｐ−３８８、ヒト肺癌細胞培養物Ａ−５４９、ヒト結腸癌細胞培養物ＨＴ−２９及びヒト黒色腫細胞培養物ＭＥＬ−２８においてｉｎ  ｖｉｔｒｏ測定した。操作はＢｅｒｇｅｒｏｎ等，Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍ．  １２１，  ｐ．８４８，  １９８４及びＳｃｈｒｏｅｄｅｒ等，Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  ２４，  ｐ．１０７８，  １９８１の方法を用いて行なった。得られたＩＣ50はそれぞれ０．００２、０．００２、０．０１及び０．００２５ｇ／ｍｌであった。
ＰＭ−９３１３５は０．００８ｇ／ｍｌのＩＣ50でＲＮＡ合成を抑制することが判明した。ＤＮＡに関して同じレベルの抑制を達成する濃度は５０倍高かった（０．４ｇ／ｍｌ）。これらの試験はＰ−３８８細胞を用いて行ない、また抑制後に、ＤＮＡについては（3Ｈ）チミジン含量、ＲＮＡについては（3Ｈ）ウリジン含量を推定した。
本発明の化合物は、Ｐ−３８８マウス白血病、Ａ−５４９ヒト肺癌、ＨＴ−２９ヒト結腸癌及びＭＥＬ−２８ヒト黒色腫などの哺乳動物腫瘍に対して抗腫瘍活性を示す。本発明は、ＰＭ−９３１３５に感受性である悪性腫瘍に冒された任意の哺乳動物を治療する方法も提供し、この方法は罹患個体にＰＭ−９３１３５かまたはＰＭ−９３１３５を含有する医薬組成物を治療有効量で投与することを含む。
本発明は、活性成分として化合物ＰＭ−９３１３５またはその医薬的に許容可能な酸付加塩を含有する医薬組成物、及び該組成物の調製方法にも係わる。
医薬組成物の例には、適当な組成を有するか、または経口投与、局所投与もしくは非経口投与用である任意の固体（錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤等）または液体（溶液剤、懸濁液剤または乳剤）が含まれ、これらの組成物には上記化合物を純粋な形態でか、または任意のキャリヤや他の薬理活性化合物と組み合わせて含有させ得る。このような組成物は、非経口投与の場合には滅菌を要し得る。
ＰＭ−９３１３５を含有する医薬組成物の適正な投与量は、特定の配合、適用モード、並びに治療する特定の“位置”、患者及び細菌または腫瘍に従って変化する。年齢、体重、性別、食事、投与時間、排出率、患者の状態、薬物の組み合わせ、反応感受性、及び疾患の重篤度など、他の要因も勘案される。投与は、許容される最大投与量以下の量で連続的または周期的に行ない得る。
本発明を、本発明の理解の一助となるが本発明を限定するとは解釈されるべきでない以下の実施例を参照しつつ更に詳述する。実施例において言及したパーセンテージはいずれも、特に断らないかぎり重量に基づく。温度は総て摂氏で示す。インキュベーションは常に２８℃で行ない、その際フラスコを軌道振盪装置において２５０ｒｐｍで振盪する。培地及び容器は総て滅菌し、あらゆる培養プロセスを無菌状態で実施する。
実施例１
ストック培養物：  ミクロモノスポラ属種株Ｌ−１３−ＡＣＭ２−０９２（ＣＥＣＴ−３３２６）の純粋培養物の全ブイヨンを２０％グリセロールに加え、これを凍結保存する。
接種物：  凍結培養物、または十分に増殖させた傾斜培養物（５体積％）を用いて、２５０ｃｃ容の振盪フラスコに入れた１００ｍｌの先に延べた接種培地への接種を行なう。フラスコを４８時間インキュベートする。２ｌ容のエーレンマイヤーフラスコに入れた５００ｍｌの同じ培地に１０％の第１段階接種物を接種する。フラスコを４８時間インキュベートする。
発酵：  ２．５ｌの第２段階接種物を、７５ｌ容の発酵槽に入れた５０ｌの既述の産生培地に接種する。発酵を、４００ｒｐｍで攪拌しながら０．５Ｖ／Ｍ．Ｖ．の空気流の下で９６時間継続させる。
Ｐ−３８８に対する全ブイヨンのアッセイか、またはＨＰＬＣによって二次代謝産物の産生を監視する。
単離：  収穫した全ブイヨン（４５ｌ）を濾過してバイオマスと他の固体とを分離し、菌糸体塊を各回７ｌの酢酸エチルで３回抽出する。抽出物を一つに合わせ、硫酸ナトリウムで脱水し、真空下に蒸発乾固して４ｇの未精製固体を得る。
この固体を、溶離溶媒としてクロロホルムとメタノールとの混合物を用いるシリカゲルカラムクロマトグラフィーに掛ける。９０：１０から８５：１５のクロロホルム／メタノールで溶離した画分３〜４（１．３ｇ）において抗腫瘍活性を検出する。上記画分のアリコート（４００ｍｇ）を分取薄層クロマトグラフィーによって更に精製し、かつクロロホルム／メタノール（体積比９５：５）で展開して１５０ｍｇの純粋なＰＭ−９３１３５を得る。
引用参考文献
本明細書中には以下の文献を引用した。これらの文献は本明細書に参考として含まれる。
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本発明を、その好ましい具体例を含めて詳述した。しかし、当業者は本開示の考慮下に本発明を、次の請求の範囲各項に提示した本発明の範囲及び思想をなお逸脱することなく変形及び／または改良し得ると理解される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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