(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも部分的に骨の作成のための活性物質複合体によって浸漬コーティングされた外部表面(I)と、当該表面上に前記活性物質複合体が充填された少なくとも１つの空腔(II)とを有するチタン製の移植用プロテーゼを含んでなる、大腿骨用の移植用プロテーゼインプラントであって、前記プロテーゼの表面粗さが０．２〜０．５μｍであり、この活性物質複合体が、１）コラーゲン、エラスチン、及びプロテオグリカンから成る群から選択される少なくとも１つの構造成分、２）走化性ペプチド、アラキドン酸代謝物及びロイコトリエンから成る群から選択される少なくとも１つの補充性成分、３）フィブロネクチン、テナスシン、ラミニン、コラーゲンIV, V, VII型、L-CAM, N-CAM及びインテグリンから成る群から選択される少なくとも１つの接着成分、並びに４）サイトカイン類から成る群から選択される少なくとも１つの増殖性又は成熟性成分を含んでなる、前記移植用プロテーゼインプラント。
【請求項２】
少なくとも部分的に骨の作成のための活性物質複合体によって浸漬コーティングされた外部表面(I)と、当該表面上に前記活性物質複合体が充填された少なくとも１つの空腔(II)とを有する酸化アルミニウム製の移植用プロテーゼを含んでなる、大腿骨用の移植用プロテーゼインプラントであって、前記プロテーゼの表面粗さが０．２〜０．５μｍであり、この活性物質複合体が、１）コラーゲン、エラスチン、及びプロテオグリカンから成る群から選択される少なくとも１つの構造成分、２）走化性ペプチド、アラキドン酸代謝物及びロイコトリエンから成る群から選択される少なくとも１つの補充性成分、３）フィブロネクチン、テナスシン、ラミニン、コラーゲンIV, V, VII型、L-CAM, N-CAM及びインテグリンから成る群から選択される少なくとも１つの接着成分、並びに４）サイトカイン類から成る群から選択される少なくとも１つの増殖性又は成熟性成分を含んでなる、前記移植用プロテーゼインプラント。
【請求項３】
前記活性物質複合体が更に、追加の支持物質と組み合わされている、請求項１又は２に記載の大腿骨用の移植用プロテーゼインプラント。
【請求項４】
免疫原性のコラーゲン以外のコラーゲン、又はポリマーを前記の追加の支持物質として用いる、請求項３に記載の大腿骨用の移植用プロテーゼインプラント。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、生物体の部分、特に、生きた生物体のための器官を作製するためへの活性物質複合体の使用に関する。ただしこの活性物質複合体は、相互に異なり、かつ作製しようとする各生物体の部分に特に適合した成分、すなわち、作製しようとする各生物部分の細胞に特に適合した細胞外物質に基づいた少なくとも１つの構造成分、少なくとも１つの補充性（recruiting）成分、少なくとも１つの接着成分、並びに少なくとも１つの増殖性及び／又は成熟性成分を有するものである。
【０００２】
生物体の部分、特に、生きた生物体のための器官を作製するための、前記成分を有する活性物質複合体は、既に従来技術で知られている。この既知の活性物質複合体では、構造成分は、例えば種々のコラーゲン、エラスチン又はプロテオグリカンから成りうる。この活性物質複合体の補充成分としては、特に走化性因子、例えばN-F-Met-Leu-Phe-などのペプチド、及び／又は、例えばロイコトリエンなどのアラキドン酸代謝物を挙げうる。接着成分の機能は、フィブロネクチン又はラミニン型の蛋白質により、しかしまた細胞接着分子、例えばL-CAM, N-CAMなど、及び基質接着分子、例えばサイトタクチン、テナスシン、コラーゲンIV, V, VII型、合成ペプチド、及び膜貫通型蛋白質、例えばインテグリンなどによっても達成されうる。本文に記載する活性物質複合体のために、接着成分として第一に挙げられる例、すなわちフィブロネクチン及びラミニンは、基質接着分子に分類されるものである。
【０００３】
更に別の成分として、前記活性物質複合体は、少なくとも１つの増殖性及び／又は成熟性成分を、好ましくは１又は複数のサイトカインの形で含んでいる。このサイトカインの例は、血液の生産ではコロニー刺激因子；結合組織の生産では線維芽細胞増殖因子；皮膚の生産では上皮増殖因子；軟骨の生産では軟骨誘導因子；脾臓又はリンパ節の生産ではリンパ球活性化因子及び脾臓ペプチド；胸腺の生産ではＴ細胞増殖因子及び胸腺ペプチド；骨の生産では骨増殖因子及び形質転換性増殖因子；並びに、血管の生産では血管形成誘導因子である。下記のサイトカインも用いられる：インターロイキン、インスリン様増殖因子、腫瘍壊死因子、プロスタグランジン、ロイコトリエン、形質転換性増殖因子、血小板由来増殖因子、インターフェロン、及び血管内皮由来増殖因子。
【０００４】
この活性物質複合体に関する詳細は、欧州特許0,500,556に記載されている。
その内容を本文に引用する。
この活性物質複合体をより広範な使用に供することが、本発明の目的である。
【０００５】
この目的を、前記活性物質複合体を用いて体内プロテーゼインプラントを作製することによって達成する。通常用いられる、活性物質複合体を有さない体内プロテーゼと比べて、当該体内プロテーゼは、活性物質複合体のために長期間安定となりうる。
本発明に係る使用では、骨の形の生物部分を作製することに適する活性物質複合体が用いられる。この複合体は、相互に異なり、かつ骨の作製に特に適する下記の成分、すなわち、作製しようとする骨の細胞に特に適合した細胞外物質に基づいた少なくとも１つの構造成分、少なくとも１つの補充性成分、少なくとも１つの接着成分、及び少なくとも１つの増殖性及び／又は成熟性成分を有する。
【０００６】
本発明に係るこの使用は、当該活性物質複合体と種々の支持物質、特に金属製支持物質との組合せに関する多数の研究の結果から見いだされた。支持物質と活性物質複合体との組合せは、問題ないことではない。活性物質複合体及びその複合した作用様式に関する従来の経験から、少なくとも、処理しようとする特定の生物部分の形成又は再形成の低下、例えば骨再生の低下が予想されるだろう。組織毒性反応の危険性もまた疑われる。
【０００７】
従ってこの目的の解決は明白ではない。なぜなら、既に説明した通り、活性物質複合体と支持体とを、この場合は体内プロテーゼとを組合せることは、非常に問題であるからであり、なぜなら骨の欠損の場合、活性物質複合体の機能が乱され、又は少なくとも、潜在的な免疫反応により複雑になるからである。
【０００８】
安定化されうる体内プロテーゼは、少なくとも部分的に活性物質複合体によってコーティングされた外表面を有し、そして／又は、活性物質複合体により充填された少なくとも１つの空腔を有する。
【０００９】
活性物質複合体によるコーティング及び／又は充填は、生物体への体内プロテーゼのより迅速かつ永久的な組込みを可能にすることを意図している。移植部位への体内プロテーゼのより早い、しかも改良された組込みにより、体内プロテーゼのより長期間の安定性、及びより大きく且つより早い負荷能が達成される。
【００１０】
別の態様では、当該体内プロテーゼは、活性物質複合体により充填された少なくとも１つの空腔を有し、更にその活性物質複合体は、追加の支持物質に適用される。その様な追加の支持物質として、コラーゲン又は適当なポリマーを用いうる。本文では特にI, IV, V及びVII型コラーゲンが挙げられる。これらのコラーゲンを、例えば網状又はゲル状で用いることができ、しかもこれらは、特に、本来的に良好な免疫適合性を有し、かつ処理しやすい。
【００１１】
使用しうる前記ポリマーは、特に、天然モノマーの重合体、例えばポリアミノ酸（ポリリシン、ポリグルタミン酸など）、及び乳酸重合体である。またコポリマー、例えばポリ乳酸とヒドロキシ酢酸とのコポリマー、も用いることができる。
【００１２】
ポリ乳酸は、下記の化学式：
【化１】
0003860417.tif 000002
を有する乳酸のポリエステルである。
前記単体の直接的な重合により、比較的低分子量のポリマーが形成される。その上限は約20000 Daである。より高分子量のものは、高温、低圧、そして触媒の存在下に環状二量体を架橋することにより得ることができる。乳酸ポリマーは、生物分解性及び生体適合性を有し、水に不溶であり、そして高い強度を特徴とする。
【００１３】
追加の支持物質、例えばコラーゲン又は前記ポリマーを更に使用することにより、活性物質複合体の基本的効果に悪影響を与えることなく、体内プロテーゼの空腔を完全に充填するために必要な活性物質複合体の量を減らすことができる。この様にして、活性物質複合体の使用を経済的により有利にする。
本発明はまた、本発明の使用に係る実施態様の１つに示した通り、前記活性物質複合体によりコーティングされた、又は前記活性物質複合体を含んでなる体内プロテーゼにも関する。
本発明を、実施例に基づき、そして添付した図面を参照して、より詳細に説明する。
【００１４】
Ｉ．活性物質複合体の調製
活性物質複合体の調製における主要な過程を以下に述べる。
子ウシ、ヒツジ、ウサギ又はラットから得た管状骨を洗浄し、特に骨髄を取り除き、その骨を凍結した。凍結した骨を、２mm未満の粒子にすりつぶした。そのすりつぶした骨片をアセトン中で脱脂し、そして0.6N塩酸中で脱石灰した。その生成物を凍結乾燥し、そして脱塩した骨基質を得た。これを4Mグアニジウム塩酸溶液中で抽出した。その抽出溶液を蒸留水に対して透析し、それを遠心し、その沈殿物を凍結乾燥することにより活性物質複合体を得た。
【００１５】
この基本調製法を以下にフローチャートとして示す。
0003860417.tif 000003
【００１６】
II.支持物質を用いない場合での活性物質複合体の効果
活性物質複合体自体に有効であることを示すために、最初に、追加の支持物質を含まない活性物質複合体を移植する試験を行う。
【００１７】
１．試験に用いる動物
平均体重3089gの雌のチンチラウサギを用いた。これらに、ウサギ用飼料と、２回オゾン処理し、塩酸でpH 4.5に調整した水道水とを自由に与えた。
ケタミンとキシラジンとの混合物を皮下注射して、前記動物を麻酔した。
【００１８】
２．ウサギの骨欠失の調製
内部冷却式ドリルを用いて、ウサギの膝関節（大腿骨の遠位端）に、直径４mm及び深さ約９mmの移植床を調製した。この様に形成した穿孔に、各ケース毎に、前記Ｉの記載通りに生産した活性物質複合体30mg及び90mgを充填した。各ケースで、別の穿孔を未処理のまま残して、骨新形成のコントロールとして用いた。
【００１９】
図１に、術後28日目での、未処理の孔、及び活性物質複合体を移植した穿孔における骨の新形成、そしてまた、既存の周囲の海綿質の密度を示す（活性物質量毎にｎ＝２）。
【００２０】
この試験の分析から、30mgの活性物質複合体を移植した場合、その穿孔を囲む海綿質の密度は、未処理の孔に比べて45％高いこと、そして90mgの活性物質複合体を移植した場合、未処理の孔に比べて69％高いことが判明した。既存の海綿質の量は、欠失部位の再生に対して全く影響しなかった。なぜなら、活性物質複合体を挿入した後の骨新形成は、その穿孔の周辺から開始されず、代わりに欠失部位の全域に均一に分布したからである。
【００２１】
III.リン酸三石灰(TCP)を用いた場合のヒツジ下顎骨の骨形成
リン酸三石灰は、CaO/P2O5系に基づくリン酸カルシウムセラミックであり、出発材料としての酸化カルシウム(CaO)及び五酸化二リン(P2O5)をプレスし、続いて焼結することにより調製される。あるいは、熱プレス法により調製することもできる。
【００２２】
１．試験に用いた動物
Viehzentrale Sudwest AG(Stuttgart)から入手した成熟した飼育ヒツジを下記の試験に用いた。それらに干し草と水を与え、そして手術三日前からAltromin粒の縣濁液を与えた。
これらの動物に、１mlキシラジン／１mlケタネストを筋注により前投薬した。次にそれらのヒツジをネンブタールで麻酔した。
【００２３】
２．インプラントの調製
10mlの水に溶解した100mgの活性物質複合体の溶液中にリン酸三石灰を縣濁し、それを、一定に撹拌しながら液体窒素により急速凍結した。24時間凍結乾燥し、次にガス滅菌（エチレンオキサイド）した後、この活性物質複合体を添加（ド−プ）したリン酸三石灰を、下記のヒツジの下顎骨の欠失部位に導入した。更に比較のために、別の下顎骨の欠失部位に、オートクレーブにより滅菌した未添加リン酸三石灰を充填した。
【００２４】
３．ヒツジの下顎骨の欠失の調製
ヒツジの下顎を適当に調製し、そして冷却剤として生理食塩水を用い、直径５mmの穿孔器により、その骨から標準的な円柱を切り出した。この様に形成した穿孔の一つに、試験Ｉに記載の活性物質複合体を添加したリン酸三石灰を充填し、そして２つ目の穿孔に未添加のリン酸三石灰を充填した。
【００２５】
明確にするために、下顎骨の欠失部位における骨増殖の結果を図２にグラフとして示す。試験期間は各々26日と41日であった。
活性物質複合体を添加したリン酸三石灰は、ヒツジ811番と86番の両方において、下顎骨の欠失部位の骨再生を、初期相において約100％促進した。41日後、骨再生の促進率は依然10％を維持した。従って骨の治癒は、特に開始時に、活性物質複合体を添加したインプラントによる骨新生効果がない場合に比べて、非常に急速である。
【００２６】
この事実は、特に、活性物質複合体による体内プロテーゼのコーティングにおいて重要である。従って、活性物質複合体によりコーティングされた体内プロテーゼにより、例えば大腿骨頸部の骨折の場合、そのプロテーゼのより急速な組込みが可能となり、従ってその患者の再生及び回復をより早めることができる。従って入院期間が短くなる。
【００２７】
ＩＶ．支持物質としてコラーゲンを用いた試験
体内プロテーゼを組み込むために、前記の既知の活性物質複合体を用いることができる。前記の活性物質複合体の生産では、要求される純度での収量は非常に低い。従って本発明者は、骨形成効果を下げることなく、特定の対象物のために必要とされる活性物質複合体の量を減らすために、その活性物質複合体と組合せることができる支持物質があるかどうかを調べた。
【００２８】
１．活性物質複合体
以下の試験のために用いる活性物質複合体を、正確に前記のＩの記載通りに、子ウシの管状骨から調製した。
２．試験に用いた動物
体重350〜400ｇの雄のWistar系ラットを用いて、空調された動物室で温度23℃、相対湿度約50％で飼育した。これらにラット及びマウス用の飼料を与えた。
【００２９】
各試験動物の腹筋内に、同一の支持物質からなる２つのインプラントを導入した。一方のインプラントは活性物質複合体によりコーティングし、もう一方は未コーティングのままにして、これを比較用インプラントとして用いた。21日後にこれらの動物を殺して、その腹筋内のインプラントにより影響を受ける領域を取り出し、組織学的に評価した。
【００３０】
３．用いた支持物質
この試験において、全て市販されているコラーゲン物質を用いた。コラーゲンＡは、純粋で、無菌で、天然の、再吸収可能なウシ皮膚コラーゲンであり、外来性の添加剤、例えば安定化剤又は殺菌剤を全く含まない。
コラーゲンＢは、精製され、凍結乾燥され、軽度に架橋された、無菌かつ無パイロジェンのウシ皮膚コラーゲンであり、弱い抗原性を有する。このコラーゲンの螺旋構造は維持されている。
コラーゲンＣは、純粋な、天然の、再吸収可能なウシコラーゲン繊維を含んで成る。
【００３１】
使用したこれらの全てのコラーゲンは網状であった。各網状コラーゲンから50mgの切片を切り出し、各々に１mlの活性物質複合体溶液(3 mg/ml)を加えた。対照用インプラントでは、その代わりに１mlの蒸留水を加えた。この様に処理した網状コラーゲン切片を−20℃で凍結し、次に凍結乾燥し、そして直径約10mm、厚さ約５mmのインプラントを作製した。図３は、シクロスポリンＡによって免疫抑制した動物及び免疫抑制していない動物において、活性物質複合体をコーティングした場合及びしない場合で、コラーゲンインプラントＡ、Ｂ及びＣにおける21日後の骨形成の結果を示す。ここでの評価数値(BZ)は、各群毎に６個のインプラントに関して３人の別個の人間から得られた評価数値の相加平均に相当する。
【００３２】
活性物質複合体によりコーティングされたコラーゲンＡは、前記期間の後、免疫抑制動物において骨形成効果を示したが、コラーゲンＢでは、この効果を証明できなかった。しかし対照的に、コラーゲンＣは、非常に顕著な骨形成効果を示した。
従って、この結果は、使用した特定のコラーゲンの調製に依存し、そして支持物質としての適合性を表す。免疫原性を有するコラーゲンは、支持物質としての使用には適当でない。
【００３３】
ＩＶ．支持物質の生体適合性に関する試験
体内プロテーゼの長期安定性の向上に関する試験では、表面の荒さの異なる(100, 20及び0.5μm)チタン製円板、TiAl6V4合金(0.5μm)製の円板、Al2O3製の円板（Friedrichsfeld社）、及びヒドロキシアパタイト製の円板（Feldmuhle AG）を用いた。ヒドロキシアパタイトを、1250℃での水酸化五カルシウム三リン酸粉末の焼成により得る。更に、天然材料、例えば紅藻などの炭酸骨格を用いて、ヒドロキシアパタイトセラミックを作ることもできる。洗浄及び乾燥過程の後、まずその有機成分を約700℃の温度での熱分解により取り除く。その後、より高圧高温でリン酸溶液を添加して、ヒドロキシアパタイトへの変換を行う。
【００３４】
ヒドロキシアパタイトセラミックを生産する別の方法では、珊瑚の天然骨格から開始して、その炭酸カルシウムを、熱水処理により、ヒドロキシアパタイト、又はヒドロキシアパタイトとその他のミネラル構造物との混合体に変換する。この様にして得た物質では、珊瑚質構造体、すなわち、特に、珊瑚の相互に連通する多孔系が保存されている。
【００３５】
前記の一般的方法により調製した活性物質複合体によるコーティングを、浸漬コーティング法により行った。浸漬コーティング法とは、コーティングする対象物、この場合は前記の円板を、予め決定した希望の濃度のコーティング剤、この場合は活性物質複合体の溶液中に漬けるというコーティング法である。その後、凍結乾燥を行う。薄い皮膜層又は被覆が得られる。前記物質における生体適合性の試験を、特に表面の荒さを基準にして行った（４つの円板につき、各n=20）。
【００３６】
試験対象物質の生体適合性試験から、チタンは、生存細胞数が最高であり、かつ生存細胞対死亡細胞の比率が最良であり、支持物質として非常に適することが分かった。ヒドロキシアパタイトも同様に良い結果を示したが、TiAl6V4はかなり悪かった。
【００３７】
一般的に、表面の荒さに関しては、TiAl6V4を除いて、最も滑らかな表面、すなわち0.2〜0.5μmの孔径を有する表面が最も良い結果を示した。荒さ又は孔径が増すに連れて、生存細胞数、そして生存細胞対死亡細胞の比率も下がる。円板表面に直接に接する生存（骨）組織の割合は、孔径が約0.5μmの場合に最高であった。
【００３８】
0003860417.tif 000004
【００３９】
前記試験の結果を、ここで、活性物質複合体による体内プロテーゼのコーティングに適用することができた。この体内プロテーゼの外観図を図４に示す。
この体内プロテーゼを用いる前に、その外表面(I)を、浸漬コーティング法に従って活性物質複合体によりコーティングした。更に、活性物質複合体を、そのプロテーゼ幹体の表面に開口部を有するその幹体の内部空腔(II)に導入した。このことは、将来その体内プロテーゼが解き放された場合に、多大な労力をかけずに活性物質複合体を適用することができ、それにより骨形成が誘導され、従ってその体内プロテーゼが安定化するという利点を有する。希望する場合には、活性物質複合体によるコーティングを、ねじ接続部位(III)にも適用しうる。
【００４０】
活性物質複合体によってコーティングしたことにより、未コーティング表面に比べてより高い負荷能力が得られることを、ヒドロキシアパタイト(HA)の例を用いて、表２に示す。異なるインプラント物質間の中間面における引張強度を、N/mm2±標準偏差で決定した。熱間静水圧プレス法(HIP)により調製したヒドロキシアパタイトを、活性物質複合体により更にコーティングしたヒドロキシアパタイトと比較した。このインプラント物質を、ウサギの大腿骨の遠位領域に移植し、そして84日後に検査した。実測した引張強度を下記の表に示す。
【００４１】
0003860417.tif 000005
【００４２】
最後に、本発明の目的のために実行した試験は、すべて注意深く企画したモデルによる試験であることを、再度指摘しなければならない。なぜなら、人体に対して前記試験を行うことは容認されなかったであろうことから、実際の対象物、すなわち、例えば大腿骨領域に移植される体内プロテーゼを前記試験に用いることができなかったからである。
更に、本発明は、全ての考え得る体内プロテーゼに適用することができる。大腿骨頸部領域における体内プロテーゼの例の記載は、特徴を説明するためのものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、ウサギにおける新しい骨形成を、活性物質複合体を用いた場合と未処理の場合とを比較して示した図である。
【図２】  図２は、ヒツジにおける新しい骨形成を、支持物質としてのリン酸三石灰を活性物質複合体と共に用いた場合と、純粋なリン酸三石灰を用いた場合とを比較して示した図である。
【図３】  図３は、ラットにおける新しい骨形成を、支持物質としての種々のコラーゲンを活性物質複合体と共に用いた場合と、純粋なコラーゲンを用いた場合とを比較して示した図である。
【図４】  図４ａは、活性物質複合体によりコーティングする体内プロテーゼの側面図を示す。
図４ｂは、図４ａの側面を９０度回転させた、体内プロテーゼの別の側面図を示す。
【図１】
0003860417.tif 000006
【図２】
0003860417.tif 000007
【図３】
0003860417.tif 000008
【図４ａ】
0003860417.tif 000009
【図４ｂ】
0003860417.tif 000010