(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
エンドトキシンを含む検体液を測定セルを含む測定回路内に取込み封鎖する手段と、取込み封鎖された検体液を測定回路内で循環させる手段と、循環する検体液に所定量のリムルス試薬を注入して両液を混合させる手段と、測定セルに導入された混合液中に発生する濁度の原因となる微粒子の濃度の経時変化を連続的に測定する微粒子計数手段と、測定後に混合液を測定回路内から排出し、測定回路を洗浄する手段と、からなるエンドトキシン濃度の測定装置であって、上記微粒子計数手段で、計数値が所定変化量に到達する時間又は該変化量の経時変化率を測定することにより検体液中に含まれるエンドトキシンの濃度を算定することを特徴とするエンドトキシン濃度の測定装置。
【請求項２】
エンドトキシンを含む検体液を測定回路内に取込む前に、予め微粒子計数手段が計数する最小径以上の粒子を除去できる濾過手段を設けることを特徴とする請求項１に記載のエンドトキシン濃度の測定装置。
【請求項３】
微粒子計数手段は、計数する微粒子の最小直径を０．１〜０．５μｍとする微粒子計数計と、その計数値から変化量が所定量に到達する時間、または、変化量の経時変化率を算定して、予め作成された検量線と対比して検体液中のエンドトキシン濃度を算定する電子回路からなることを特徴とする請求項１に記載のエンドトキシン濃度の測定装置。
【請求項４】
複数の測定系を検体液の流路に並列に切換え可能に結合して、順繰りに自動的に切換えて、微粒子の測定と、測定セルを含む測定回路の洗浄を並行して行い、１回の測定に要する時間よりも短い間隔で連続測定することを特徴とする請求項１に記載のエンドトキシン濃度の測定装置。
【請求項５】
複数の測定系は、単一の光源とそれに対応する光検出器を固定した回転軸を中心軸とする同心円周上に配置した複数の測定セルを含む測定回路とからなることを特徴とする請求項４に記載のエンドトキシン濃度の測定装置。
【請求項６】
複数の測定系は、一列に並置した複数の測定セルに対して併進往復する単一の光源とそれに対応する光検出器とからなることを特徴とする請求項４に記載のエンドトキシン濃度の測定装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、エンドトキシン濃度の測定装置に関し、更に詳しくは注射液、輸液、透析液などの医薬品と、その中間製品、これらの原料の一部となる精製水中に存在すると、多彩な生物活性を示し弊害があるエンドトキシンの濃度を測定し、医療に使用中、或いは医薬品として製造中、または貯蔵中の注射液、輸液、透析液などの医薬品と、その中間製品、又はこれらの原料の一部となる精製水の品質管理等に役立てるために使用するエンドトキシン濃度の測定装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
エンドトキシンは、グラム陰性細菌の外膜に存在する耐熱性の毒素であり菌体内毒素と言われ、本体はリポ多糖であるとされている。
リポ多糖はリピドＡとよばれる脂質と糖鎖からなるが、エンドトキシンとしての活性中心はリピドＡにあり、分離したリピドＡでほぼすべての活性が再現される。
【０００３】
エンドトキシンは血液凝固線の反応促進、血小板・白血球の減少、血圧の低下、ショックなど循環系への影響、発熱、サイトカインの誘導、免疫系への影響など多彩な生物活性を示す（竹沢真吾編、透析液エンドトキシンがよくわかる本、１５〜２４頁及び４５〜５１頁（１９９５）、東京医学社）。
エンドトキシンを一構成成分としているグラム陰性細菌は、空気中、水中あるいは食品中に存在し、菌体が機械的損傷を受けたり、死菌が溶解したりあるいは菌体の分裂に際してエンドトキシンが溶液中に放出され、溶液中に存在することとなる。
【０００４】
したがって、エンドトキシンは、直接的または間接的に、注射液、輸液、透析液などの医薬品と、その中間製品、これらの原料の一部となる精製水中に混入したり、存在したりすると、上記した多彩な生物活性を示す弊害があるので、エンドトキシンの濃度を測定することは、医療に使用中、或いは医薬品として製造中または貯蔵中の注射液、輸液、透析液などの医薬品と、その中間製品、又はこれらの原料の一部となる精製水の品質管理に必要である。また、エンドトキシンの濃度をモニターすることは、生菌の増殖を早期に検出する手段としても有効である。
しかし、現状ではエンドトキシン濃度をモニターする装置は存在せず、検体液を採取してオフラインでエンドトキシン濃度を測定して、これらの品質管理に役立てている。
【０００５】
エンドトキシンの濃度を定量測定する方法としては、唯一リムルス試験（Ｌｉｍｕｌｕｓ  ｔｅｓｔ）がある。  この方法は、カブトガニ（Ｌｉｍｕｌｕｓ  ｐｏｌｙｐｈｅｍｕｓ）の血球中に存在する前凝固性酵素（Ｐｒｏｃｌｏｔｔｉｎｇ  Ｅｎｚｙｍｅ）をエンドトキシンが活性化し、凝固酵素（Ｃｌｏｔｔｉｎｇ  Ｅｎｚｙｍｅ）とする反応を利用したものであり、カブトガニ血球抽出成分（Ｌｉｍｕｌｕｓ  ａｍｅｂｏｃｙｔｅ  ｌｙｓａｔｅ）を試薬として使用する方法であり、ゲル化法と、高感度測定法として比濁法と比色法との三つの方法がある。
【０００６】
高感度測定法の比濁法では、カブトガニ血球中に存在している凝固性蛋白（Ｃｏａｇｇｕｌｏｇｅｎ）に前記凝固酵素が作用して、凝固蛋白（Ｃｏａｇｇｕｌｉｎ）にして、ゲルを形成する（エンドトキシン濃度が低い場合は全体をゲル化させるには至らないが、）過程で発生する濁度変化を光学分析装置により測定する方法であり、これにはエンドポイント法とカイネティック法があり定量的な方法である。エンドポイント法は、一定時間内に到達する濁度（吸光度）がエンドトキシン濃度に比例することに基づく方法である。カイネティック法には、濁度（吸光度）の経時変化率がエンドトキシン濃度に比例することに基づく比濁反応速度法と濁度の変化率が予め設定した閾値に達する時間の対数がエンドトキシン濃度の対数に反比例することに基づく比濁反応時間法がある。カイネティック法が一般に用いられている（竹沢真吾編、透析液エンドトキシンがよくわかる本、３６〜３９頁（１９９５）、東京医学社）。
【０００７】
既存の比濁法によるエンドトキシン濃度測定機器では、濃度１ＥＵ／Ｌまで検出するには９０〜１５０分の反応時間が必要である（竹沢真吾、石崎允監修、南東北水質検討会編集、透析液エンドトキシン実測集、９３頁（１９９７）、（株）メディカ出版）。
エンドトキシン濃度５０ＥＵ／Ｌ以下の低濃度液、特に１０〜＜１ＥＵ／Ｌレベルが要求されるＨＤＦ透析液のエンドトキシン濃度のモニターとしては時間がかかりすぎ不充分であった。
また、測定検体量は、リムルス試薬量（０．１〜０．０５ｃｍ３）と等量の制約から測定セルなどの容積が制限され、まして、混合液を循環することは困難であった。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記の従来技術の問題点に鑑み、注射液、輸液、透析液などの医薬品と、その中間製品、精製水などの検体液の貯蔵タンク又は供給ラインから、検体液の一部をパイプで取込みエンドトキシンの濃度を連続的にモニターすることができ、かつエンドトキシンの濃度が５０ＥＵ／Ｌ以下の低濃度液、特に１０〜＜１ＥＵ／Ｌレベルの極低濃度液であってもモニターでき、しかもエンドトキシンの濃度を短時間にモニターできるエンドトキシン濃度の測定装置の提供を課題とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、上記の課題に鑑み、注射液、輸液、透析液などの医薬品と、その中間製品、精製水などの検体液の貯蔵タンク又は供給ラインから、検体液の一部を取込み、エンドトキシンが低濃度でも測定できる特定の濁度計を採用し、濃度を測定した検体液を排出することを可能とするように、各手段を特定に結合すると、良好な結果が得られることを見出し、本発明を完成させた。
【００１０】
すなわち、本発明の第１の発明によれば、エンドトキシンを含む検体液を測定セルを含む測定回路内に取込み封鎖する手段と、取込み封鎖された検体液を測定回路内で循環させる手段と、循環する検体液に所定量のリムルス試薬を注入して両液を混合させる手段と、測定セルに導入された混合液中に発生する濁度の原因となる微粒子の濃度の経時変化を連続的に測定する微粒子計数手段と、測定後に混合液を測定回路内から排出し、測定回路を洗浄する手段と、からなるエンドトキシン濃度の測定装置であって、
上記微粒子計数手段で、計数値が所定変化量に到達する時間又は該変化量の経時変化率を測定することにより検体液中に含まれるエンドトキシンの濃度を算定することを特徴とするエンドトキシン濃度の測定装置が提供される。
【００１１】
また、本発明の第２の発明によれば、第１の発明において、エンドトキシンを含む検体液を測定回路内に取込む前に、予め微粒子計数手段が計数する最小径以上の粒子を除去できる濾過手段を設けることを特徴とする請求項１に記載のエンドトキシン濃度の測定装置が提供される。
【００１２】
また、本発明の第３の発明によれば、第１の発明において、微粒子計数手段は、計数する微粒子の最小直径を０．１〜０．５μｍとする微粒子計数計と、その計数値から変化量が所定量に到達する時間、または、変化量の経時変化率を算定して、予め作成された検量線と対比して検体液中のエンドトキシン濃度を算定する電子回路からなることを特徴とするエンドトキシン濃度の測定装置が提供される。
【００１３】
さらに、本発明の第４の発明によれば、第１の発明において、複数の測定系を検体液の流路に並列に切換え可能に結合して、順繰りに自動的に切換えて、微粒子の測定と、測定セルを含む測定回路の洗浄を並行して行い、１回の測定に要する時間よりも短い間隔で連続測定することを特徴とするエンドトキシン濃度の測定装置が提供される。
【００１４】
さらに、本発明の第５の発明によれば、第４の発明において、複数の測定系は、単一の光源とそれに対応する光検出器を固定した回転軸を中心軸とする同心円周上に配置した複数の測定セルを含む測定回路とからなることを特徴とする請求項４に記載のエンドトキシン濃度の測定装置が提供される。
【００１５】
さらに、本発明の第６の発明によれば、第４の発明において、複数の測定系は、一列に並置した複数の測定セルに対して併進往復する単一の光源とそれに対応する光検出器とからなることを特徴とする請求項４に記載のエンドトキシン濃度の測定装置が提供される。
【００１７】
【発明の実施の形態】
以下、本発明のエンドトキシン濃度の測定装置について、各項目毎に詳細に説明する。
【００１８】
１．  エンドトキシンを含む検体液を測定セルを含む測定回路内に取込み封鎖する手段
【００１９】
１．１  エンドトキシンを含む検体液
本発明においてエンドトキシンを含む検体液とは、注射液、輸液、透析液などの医薬品と、その中間製品、又はこれらの原料の一部となる精製水などであり、検体液は貯糟、タンク、ガラス瓶、プラスチック容器、プラスチックバッグ等の貯蔵手段に貯蔵されており、検体液を本来の目的で使用するときは、貯蔵手段の一部を出発点とするパイプ、管、ホース等の輸送手段（１）で検体液が使用される使用場所や使用機器に送られる。
上記貯蔵手段（図示せず）に貯蔵されている検体液又は上記輸送手段（１）中を流れる検体液の一部を、本発明のエンドトキシン濃度の測定装置に導入しエンドトキシンの濃度を測定するが、サンプリングするためには、上記輸送手段（１）の一部に別のパイプ、管、ホース等の輸送手段（２）（図２の７）を設け、支流として検体液の一部を本発明のエンドトキシン濃度の測定装置の測定回路（図３（Ａ）の１５）内に取込む。
【００２０】
１．２  測定セル
本発明において測定セル（図３（Ｂ）の１６、図４の１６）とは、検体液中のエンドトキシンの濃度を測定するセル（部屋）であり、本発明で使用する微粒子計数計の一部を構成し、エンドトキシンとリムルス試薬が反応して凝固蛋白（微粒子）を発生した混合液に、ここにおいて光源からの光束を照射し微粒子の数を計測する。
測定セルは下記にて詳細に説明する測定回路の一部である。
測定セルの素材としては、光に対する透明性が要求されるので高純度ガラス、石英ガラスなどが好ましい。
【００２１】
１．３  測定回路
本発明において測定回路（図３（Ａ）の１５、図４の１５）とは、検体液をリサイクル（循環）させる回路であり、上記した測定セルを一部に含み、残部は検体液をリサイクルできる構造であれば如何なる構造であってもよいが、円形のパイプ（管）で構成されていることが好ましい。パイプ（管）の材質については、特に限定されないが、ポリ四弗化エチレン（テフロン（Ｒ））、弗素樹脂、ライニングした金属、非ライニング金属、セラミックス等が挙げられ、非吸着性、洗浄性等の観点からポリ四弗化エチレン（テフロン（Ｒ））が特に好ましい。
なお、混合液量は少量に限られるが、本発明においては、測定回路内を循環させることによって微粒子計数計による測定の必要条件である測定セル内の流動状態を継続させることができるとともに、検体液とリムルス試薬の混合と反応を均一にして測定精度を高める効果があり、本発明で始めて提案されたものである。測定回路の一部にスタティックミキサーを設けることによって、混合を早く確実にすることができる。
【００２２】
１．４  取込み手段
本発明において取込みとは、エンドトキシンを含む検体液を測定セルを含む測定回路内に取込むことであり、その手段としては、上記１．１にて説明したパイプ、菅、ホース等の輸送手段（２）（図２の７）である。
輸送手段（２）の構造は、検体液を輸送できる構造であれば如何なる構造であってもよいが、円形のパイプ（管）で構成されていることが好ましい。パイプ（管）の材質については、特に限定されないが、ポリ四弗化エチレン（テフロン（Ｒ））、弗素樹脂、ライニングした金属、非ライニング金属、セラミックス等が挙げられ、非吸着性、洗浄性等の観点からポリ四弗化エチレン（テフロン（Ｒ））が特に好ましい。
なお、検体液の取込みポンプ４は補助的なポンプであり、検体液が圧送されているラインから取込む場合は省略できる。また、検体液の濾過フィルター５は、検体液中の微粒子計数計が計数する最小径以上の微粒子の数が少ない場合は省略することができる。
【００２３】
１．５  封鎖する手段
本発明において封鎖とは、エンドトキシンを含む検体液を測定セルを含む測定回路内に封鎖することであり、測定回路の入口と出口を封鎖し、測定回路を形成させ、エンドトキシンを含む検体液を測定回路内で循環できるようにするものであり、封鎖手段としては、測定回路の入口と出口を封鎖できれば如何なる構造のものであってもよいが、仕切弁（ゲートバルブ）、球形弁（グローブバルブ）、コック（プラグバルブ）、ボールバルブ等が挙げられる。
洗浄液を注入する弁９とリムルス試薬を注入する弁１２は、チェックバルブまたは注射針などの細管による穿孔を、細管を抜去すれば自己閉鎖する能力を持つ仕切りにすることができる。
具体的には、図３において、Ｖ１、Ｖ３、Ｖ４等のバルブ、または、開閉可能な仕切りを閉じた状態にしておけばよい。
Ｖ３の替わりにリスムス試薬注入器１０を設けた場合は、リスムス試薬注入器が閉の状態にしておけばよい。
【００２４】
２．  取込み封鎖された検体液を測定回路内で循環させる手段
本発明において、取込み封鎖された検体液を測定回路内で循環させる手段としては、ポンプ（図３の１７、図４の１７）を使用する。
【００２５】
３．  循環する検体液に所定量のリムルス試薬を注入して両液を混合させる手段本発明において、循環する検体液に所定量のリムルス試薬を注入して両液を混合し混合液をつくる手段としては、ポンプを使用するが、上記の２．に記載したポンプを兼用してもよい。ポンプは洗浄し易いダイヤフラムポンプの使用が好ましい。
なお、測定回路内に、両液の混合を良くするために、ミキサー１８をオプションとして設置してもよい。ミキサー１８としては、各種スタティクミキサー、繊維集合体等がある。
リムルス試薬を注入する手段は、リムルス試薬を注入できる形態であれば、いかなる形態であってもよいが、例えば、マイクロポンプ（吐出口のチェックバルブが弁１２を兼ねても良い）、又はマイクロモーターで位置制御可能な注入針付きマイクロシリンジ（リムルス試薬注入器１０と呼ぶこともある）等が挙げられる。
リムルス試薬注入器１０を用いる場合は、開閉バルブ１２の位置に開閉バルブに替えて注射針などの細管による穿孔を、細管を抜去すれば自己閉鎖する能力を持つ仕切りにする。この場合、リムルス試薬注入パイプ１１は、使用しなくてもよい。
【００２６】
４．  微粒子計数手段
本発明において、微粒子計数手段とは、測定回路に導入された混合液中に発生する濁度の原因となる微粒子の計数値の経時変化を連続的に測定し、その測定値を処理して検体中のエンドトキシン濃度を算定する手段であり、光源（図４の１３、図５の１３）と、光検出器（図４の１４、図５の１４）と、光検出器の出力を演算し、表示、記録する電子回路と、測定セルから構成される。
かかる微粒子計数手段に使用できる微粒子計数計の一例としては、日本特許第３１５１０３６号に記載されている下記の手段が挙げられる。
すなわち、微粒子計数手段はコヒーレント光源１３と、このコヒーレント光源からの光を集光する光学系と、この光学系で集光された光束の焦点の近傍に配置され且つ内部を微粒子を含む流体の流れが通過する測定セル１６と、光束の光路上で且つ測定セル１６に対して光束の光源とは反対側に配置された光検出器１４と、この光検出器１４からの電気信号から流体中の微粒子の個数を計測する電気回路２３とによって構成することができる。コヒーレント光源からの光束の集光はレンズで行うことができる。
【００２７】
測定セルはガラス等の任意の材料で作ることができるが、光束が通過する部分は透明でなければならない。コヒーレント光源としては半導体レーザを用いることができ、光検出器はフォトダイオードにすることができる。
コヒーレント光源はレーザ発振器とコリメータレンズとで構成することができる。レーザー発振器としては任意のものを用いることができるが、発振波長が短ければ短いほど検出感度は向上する。検出方法の特徴は光源に発振出力の小さいレーザー発振器、例えば半導体レーザーを用いることができる点にある。
出力が１ｍＷ以下、具体的には０．２ｍＷの半導体レーザーでも測定が可能である。
【００２８】
集光系と光学レンズ  の焦点距離は検出したい微粒子の大きさによって選択する。例えば粒径が０．２μｍの微粒子を検出する場合にはｆ＝１０ｍｍの焦点距離のレンズを用いることができる。測定セルは、少なくとも集束光の受光面および透過面を透明にする必要がある。この測定セルは迷光を心配する必要がないので、単純な構造にすることができるが、微粒子を含んだ被検流体の流れに乱流が発生しないようにする手段、例えば層流板を光学セル内に設けておくのが好ましい。
実際の装置では、レーザーから出て集束された集束光が測定セルの所定の位置、例えば測定セルの中心に集光されるように光学レンズを配置するための位置調節手段を設けるのが好ましい。
【００２９】
光検出器１４の役目は透過光に隠れている回折像を検出することにあるので、感度はそれほど必要としない。原理的には単一のフォトダイオードを用いることができるが、フォトダイオードアレイを用いるのが好ましい。このフォトダイオードアレイは被検出粒子を含む流れの方向に対しては垂直に配置し且つ光軸に対しても垂直に配置するのが好ましい。
上記の微粒子計数手段を用いて、コヒーレント光源からの光束を集光し、微粒子を含む流体の流れを集束された光束の焦点の近くを通過させ、流体中の微粒子によって回折された回折光を微粒子を含む流体の流れに対して光束の光源とは反対側の光束の光路上に配置した光検出器によって検出して電気信号に変換し、この電気信号から流体中の微粒子の個数を計測することにより最小直径が０．５μｍ以下の微粒子の検出（測定）を行うことができる。
【００３０】
５．  排出する手段
本発明において排出とは、エンドトキシンを含む検体液を測定セルを含む測定回路内に取込み、取込み封鎖された検体液を測定回路内で循環させ、循環する検体液に所定量のリムルス試薬を注入して両液を混合させ、混合液の微粒子の経時変化を連続的に測定後に、該混合液を測定回路内から排出することであり、その手段としては、パイプ、管、ホース等の輸送手段（図３の２０）と、輸送動力源としての循環ポンプである。なお、排出パイプの開閉バルブは、混合液を測定回路内で循環させるときは、閉まった状態になっており、混合液を排出させる場合は、開いた状態になっている。
【００３１】
輸送手段の構造は、検体液を輸送できる構造であれば如何なる構造であってもよいが、円形のパイプ（管）で構成されていることが好ましい。パイプ（管）の材質については、特に限定されない。軟質チューブ（シリコーンゴム、軟質ＰＶＣ）の使用も可能である。
【００３２】
６．  濾過手段
本発明において、濾過手段とは、エンドトキシンを含む検体液を測定回路内に取込む前に、微粒子計数手段が計数する最小径以上の粒子を予め除去できる手段（図２の５、図４の５）であり、検体液中の活性成分を吸着し難いセラミック製マイクロフィルター、弗素樹脂製マイクロフィルター等が特に好ましい。
なお、マイクロフィルターの後に気泡を除去する脱気手段（図示せず）を設けることが好ましい。
この項における手段の説明は、請求項２に対応するものである。
【００３３】
７．  複数測定系の自動切換え連続測定手段
本発明において、複数測定系の自動切換え連続測定手段とは、請求項４の「複数の測定系を検体液の流路に並列に切換え可能に結合して、順繰りに自動切換えて連続測定する手段」であり、２つのケースがあり、請求項５の「複数の測定系は、単一の光源とそれに対応する光検出器を固定した回転軸を中心軸とする同心円周上に配置した複数の測定セルとからなる」ケースと、請求項６の「複数の測定系は、複数の測定セルに対して併進往復する単一の光源とそれに対応する光検出器とからなる」ケースがある。
請求項５のケースは、下記の７．１に、請求項６のケースは、下記の７．２に更に詳細に説明する。
【００３４】
ここにおいて、複数の測定系とは、単数の測定系が２つ以上並列に配置されたものを意味する。
単数の測定系とは、図１の（Ａ）に概念図を示すように、検体液を取込み封鎖する手段１、検体液の測定手段２及び検体液を排出し封鎖する手段３からなる１ユニットのエンドトキシン濃度の測定装置における測定手段２であり、２つの測定系とは図１の（Ｂ）に示すように、１つ（単数）の測定系が２系列あり、並列になっているものであり、これを更に具体的に構成したものを図４に示す。
３つの測定系とは図１の（Ｃ）に示すように、１つ（単数）の測定系が３系列あり、並列になっているものである。
【００３５】
なお、検体液を取込み封鎖する手段１とは、上記した各手段の結合構造であり、図２（Ａ）に示した結合構造であり、検体液取込みパイプ７と、濾過フィルター５、洗剤液注入パイプ８と、検体液開閉バルブ６と、洗剤液開閉バルブ９から構成される。なお、濾過フィルター５の後に、脱気手段（図示せず）を設けてもよい。
検体液の測定手段２とは、図３（Ａ）と、図３（Ｂ）に示した結合構造であり、測定回路１５と、測定セル１６と、光源１３と、検出器１４と、循環ポンプ１７と、リムルス試薬注入パイプ１１と、開閉バルブ１２と、ミキサー１８（オプション）から構成される。検体液を排出し封鎖する手段３とは、図３（Ａ）に示した、排出パイプ２０と、排出パイプの開閉バルブ１９との結合構造である。
【００３６】
なお、複数の測定系の場合、検体液の取込み手段の一部は兼用できるので、図２の（Ｂ）や（Ｃ）のように、濾過フィルター５を含めた部分より上流は、１つの検体液の取込みパイプ７と１つの濾過フィルター５より構成され、これらより下流は兼用できないので、パイプも、２本や３本に分かれている。
複数の測定系にするほど、図６に示すようにエンドトキシンの濃度測定の間隔を短縮することが可能となる効果がある。
【００３７】
７．１  単一の光源とそれに対応する光検出器を固定した回転軸を中心軸とする同心円上に配置した複数の測定セル
本発明においては、原則として１つの測定系（測定セル）に対して、一組の光源と光検出器を用いるが、光源と光検出器は高価格のものであるから、複数の測定系（測定セル）の場合に各測定系（測定セル）に一組の光源と光検出器を付けるとコストアップとなるので、単一の光源とそれに対応する光検出器を測定装置の特定部分に固定し、その特定部分を複数の測定セルに対して回転して各測定系に順次対応させて、測定セル内の微粒子の数を測定する。
コストと濃度測定装置の容積や重量を省き、小型化し、省スペースと持ち運びを容易にし、メインテナンスの回数も減らせる効果がある。
【００３８】
この項における手段の説明は、請求項５に対応するものであり、図５（Ａ）と（Ｂ）に基づき更に詳細に説明する。図５（Ａ）では、１つの測定系（測定セル１６）に対して、一組の光源１３と検出器１４を用いており、この一組１３＋１４を長方形で囲んで表現してある。図５（Ｂ）では、上段に４つの測定系（測定セル１６が（１）（２）（３）（４）と４個並べてある。）が示してあり、中段に固定された回転移動可能な一組の光源１３と光検出器１４があり、１３＋１４を長方形で囲んで表現してある。複数の測定系は、単一の光源とそれに対応する光検出器を固定した回転軸を中心軸とする同心円周上に配置した複数の測定セルを含む測定回路とからなり、上段の左端に固定された一つの測定系（測定セル１６（１））に、中段にある回転移動可能な一組の光源１３と光検出器１４が移動して合体し、下段の（１）の状態になり、微粒子の数が測定される。ついで、上段の左から２番目の固定された一つの測定系（測定セル１６（２））に、中段にある回転移動可能な一組の光源１３と光検出器１４が移動して合体し、下段の（２）の状態になり、微粒子の数が測定される。順次、（３）及び（４）の微粒子の数が測定される。回転軸を固定して、同心円周上に配置した複数の測定セルを含む測定回路を回転させてもよい。
【００３９】
７．２  複数の測定セルに対して併進往復する単一の光源とそれに対応する光検出器
本発明においては、原則として１つの測定系（測定セル）に対して、一組の光源と光検出器を用いるが、光源と光検出器は高価格のものであるから、複数の測定系（測定セル）の場合に各測定系（測定セル）に一組の光源と光検出器を付けるとコストアップとなるので、複数の測定セルに対して併進往復する単一の光源とそれに対応する光検出器を付け、コストダウンと濃度測定装置の容積や重量を省き、小型化し、省スペースと持ち運びを容易にし、メインテナンスの回数も減らせる効果がある。
【００４０】
この項における手段の説明は、請求項６に対応するものであり、図６（Ａ）と（Ｂ）に基づき更に詳細に説明する。図６（Ａ）では、１つの測定系（測定セル１６）に対して、一組の光源１３と光検出器１４を用いており、この一組１３＋１４を長方形で囲んで表現してある。図６（Ｂ）では、上段に移動可能な一組の光源１３と光検出器１４が示してあり、１３＋１４を長方形で囲んで表現してある。矢印で移動を示し、下段にそれぞれ固定されている４個所の測定系（測定セル１６が（１）（２）（３）（４）と４個並べてある。）に合体する。すなわち、移動可能な一組の光源１３と光検出器１４の一組（１３＋１４）が、下段の（１）の状態にある測定系（測定セル１６）に合体し微粒子の数が測定される。次いで、移動可能な一組の光源１３と光検出器１４の一組（１３＋１４）が、下段の（２）の状態にある測定系（測定セル１６）に合体し微粒子の数が測定される。さらに、（３）および（４）の状態にある測定系（測定セル１６）に合体し微粒子の数が測定される。
【００４１】
８．  エンドトキシン濃度の測定装置
本発明のエンドトキシン濃度の測定装置とは、上記した各手段を有機的に結合した構造体である。
上位概念的には、単数の測定系の場合、図１の（Ａ）に概念図を示すように、検体液を取込み封鎖する手段１、検体液の測定手段２及び検体液を排出し封鎖する手段３からなる１ユニットのエンドトキシン濃度の測定装置である。
２つの測定系の場合は、図１の（Ｂ）に示すように、１つ（単数）の測定系が２系列あり、並列になっている２ユニットのエンドトキシン濃度の測定装置である。これを更に具体的に構成したものを図４に示す。
３つの測定系の場合は、図１の（Ｃ）に示すように、１つ（単数）の測定系が３系列あり、並列になっている３ユニットのエンドトキシン濃度の測定装置である。
【００４２】
９．  エンドトキシン濃度の測定方法
本発明において、本発明のエンドトキシン濃度の測定装置をもちいて、下記の方法でエンドトキシンの濃度を測定する。
まず、エンドトキシンを含む検体液（注射液、輸液、透析液などの医薬品と、その中間製品又はこれらの原料の一部となる精製水など）が貯蔵されている貯糟、タンク、ガラス瓶、プラスチック容器、プラスチックバッグ等の貯蔵手段から、または、これらが流れている供給ラインからパイプなどの取込み手段により、検体液を測定セルを含む測定回路にポンプで輸送する。なお、圧送されている供給ラインからの場合は、ポンプは省略できる。
この場合、測定回路内に取込む前に、前記パイプの一部に設けられている濾過器で、微粒子計数手段が計数する最小径以上の粒子を除去する。
次いで、測定回路内に検体液を入れたのち、測定回路の入口と入口のバルブを閉じて測定回路を閉回路とする。
【００４３】
次いで、測定回路内の検体液を循環させる。リムルス試薬注入パイプのバルブを開き、測定回路内の循環している検体液に所定量のリムルス試薬を注入し、検体液とリムルス試薬を循環させ両者の混合液をつくり、ゲル化反応の過程で発生する微粒子の経時変化を連続的に測定する微粒子計数手段で測定してエンドトキシンの濃度を算定する。
測定の終了後、混合液を測定回路内から排出する。そのためには、取入れバルブ６と排出パイプのバルブ１９を開き、新たに取入れる検体液で測定回路内の測定すみ混合液を排出パイプから廃棄する。この場合、測定回路内を洗浄するために、洗浄液パイプのバルブ９を開き、洗浄液を測定回路内に導入し、内部を洗浄し、または、一定時間循環・滞留させた後、測定回路内の混合液を洗浄液と共に流出させ廃棄してもよい。
【００４４】
１０．  検体液中のエンドトキシン濃度が低レベルの場合の測定方法
通常は、検体液量とリムルス試薬量は１：１の比率で両液を混合して得られる０．１〜０．２ｍｌの混合液の濁度を静止状態で測定してエンドトキシンの濃度測定を行う。しかしながら、濁りの原因である微粒子の数（から演算して濃度）を微粒子計数計で測定するためには、混合液を光束を横切って流動させることが必要条件である。しかし、通常の混合液体０．１〜０．２ｍｌでは、循環であっても、そのための余分の容積が必要になって流動させることが非常に困難である。混合液をふやそうとしても、リムルス試薬は非常に高価格のものであるから、検体液量に対して使用量を等量で増やすことは経済的な負担増が非常に大きくなり、微粒子計数計で測定する場合の大きい障害になる。通常量の検体液と混合させたリムルス試薬の大部分は、検体液のエンドトキシン濃度が低い場合はエンドトキシンと反応しないで残ると考えられる。したがって試薬量に対して１０倍量〜１０００倍量の検体液を混合しても、検体液中のエンドトキシンがリムルス試薬と反応する量は等量混合の場合と殆ど変わらないと考えられる。即ち、本発明では、エンドトキシンの濃度が低い検体液を対象として測定するので、検体液量をリムルス試薬量に対して１０倍量〜１０００倍量とした後、両液を混合して得られる混合液を使用することによってしてゲル化反応の過程で発生する微粒子を測定することが、始めて可能となった。
【００４５】
１１．  並列の測定セルが３系列の場合の自動切替えダイアグラム
図１（Ｃ）に示すように、測定セルが３系列の場合には、第１系列、第２系列、及び第３系列が一定の時間の間隔をおいて、順次、微粒子の測定を行い、次いで各系列の洗浄液による洗浄を一定の時間の間隔をおいて、順次行う。洗浄が終われば、また順次微粒子の測定を行う。
並列の測定セルが３系列の場合の自動切替えダイアグラムを図９に示した。
なお、本発明において、洗浄液は糖脂質と蛋白を溶解するものであって、微量が残留した場合でも、検体液、エンドトキシン、リムルス試薬などに悪影響を及ぼさず、エンドトキシンとリムルス試薬との反応を促進したり阻害しないものであれば、いかなるタイプのものであってもよく、塩酸水溶液や界面活性剤から選択することができる。
【００４６】
１２．  特に好ましい実施の形態
エンドトキシンとリムルス試薬が反応して発生する濁度を測定する比濁法において、エンドトキシン濃度が低い検体液の測定法として、予め設定した濁度に到達する時間を測定する比濁反応時間法、または、濁度の経時変化率を測定する比濁反応速度法がよく用いられる（竹沢真吾編、透析液エンドトキシンがよくわかる本、３７〜３８頁（１９９５）、東京医学社）。
【００４７】
エンドトキシンの濃度が低い場合は、予め設定した濁度に到達する時間の対数がエンドトキシン濃度の対数または２回対数に反比例して長くなるため、設定濁度を測定可能な最低値に設定して測定時間を最短にすることがモニターに要求される。従って、より低い濁度で測定することが重要である。そこで、高感度測定法として、濁度計に替えて微粒子計数計を使用することが考えられる。
【００４８】
しかし、微粒子計数計の光束は細く、その中に微粒子を捕捉する（＝計数する）のは確率的な現象になるので、統計的に信頼できる計数（数十個以上）まで対象液を走査し（光束を固定して液を横断的に流し）、光束を横切った容積（横断流量×時間）で除して濃度を求める。即ち、微粒子の濃度が低くなると測定する容積を逆比例して大きくすることが必要になって、測定時間が一層長くなる。更に、濁度計の測定対象が限られた空間に保持されるのに対して、微粒子計数計の測定対象は光束を横切って流動させることが必須条件なので、測定対象である検体とリムルス試薬を混合した反応液の容積が０．２〜０．１ｃｍ３と少量のため、反応液を測定セルに閉鎖系で循環させるとしても容易ではない。
【００４９】
［実施態様１］
複数の装置を検体の流路に並列に切換え可能に結合して、順繰りに自動切換えて連続測定する方式の基本的な例として、２組の装置（１組の光源と受光器を共用することは可能）を対象液の流路に並列に切換え可能に結合して、順繰りに自動切換えて連続測定する実施態様を図５に示す。
並列の装置が３系列の場合の自動切換え操作ダイアグラムの例を図９に示す。
【００５０】
［実施態様２］
測定する反応液の量は、通常使用する試薬の量と等量の検体を混合して調製するので、０．１〜０．２ｃｍ３と少量である。このため測定セルの内容積を０．１ｃｍ３以下にすることが必要になる。しかし、リムルス試薬は、濃度１０３ＥＵ／Ｌ桁以上のエンドトキシンに対応できる量の活性成分を、通常の使用量０．１〜０．０５ｃｍ３中に含有している筈である。従って、１０１ＥＵ／Ｌ桁のレベルの検体の場合は、通常量の検体液と混合させたリムルス試薬の大部分はエンドトキシンと反応しないで残ると考えられる。試薬量に対して１０倍量〜１０００倍量の検体液を混合しても、検体液中のエンドトキシンがリムルス試薬と反応する量は等量混合の場合と殆ど変わらないと考えられる。
本発明では、エンドトキシンの濃度が低い検体液を対象として測定するので、検体液量をリムルス試薬量に対して１０倍量〜１０００倍量とした後、両液を混合して得られる混合液を使用してゲル化反応の過程で発生する微粒子を測定することが、始めて可能となった。
即ち、混合液量は１〜２０ｃｍ３になり、混合液を測定セルに循環することが混合液量が０．１〜０．２ｃｍ３の場合に比較して格段に容易にできる。
【００５１】
［実施態様３］
濁度計が測定する微粒子の寸法を小さくすることで感度を高くすることが期待される。エンドトキシンとリムルス試薬が反応して濁りの原因である微少な凝固体（微粒子）を発生し、会合して最終的にゲル化する過程で微粒子数は寸法の約三乗に逆比例して減少する。従って、測定する微粒子の寸法を小さく設定することは、光束を細く絞ることによって測定する混合液の容積は減少するが、それ以上に光束を横切る微粒子の頻度が高くなり、結局、測定時間は微粒子数の寸法に略々逆比例して短くなる。また、検出寸法を小さく設定できることはエンドトキシンとリムルス試薬のゲル化反応の過程の早い時期に測定できることになり、測定時間の短縮に貢献することになる。
【００５２】
エンドトキシン濃度が１［ＥＵ／Ｌ］と極低い検体液の凝固体微粒子濃度（計数的濃度）を推定すると、エンドトキシンの重量濃度は０．２［ｎｇ／Ｌ］（Ｅ．ｃｏｌｉ  ０１１３：Ｈ１０由来の場合、既出「透析液ＥＴのよくわかる本」ページ２９）になり、透析液中のエンドトキシンは会合した状態で分子量が約１０６［ｇ／ｍｏｌ］程度なので、１．２ｘ１０８［個／Ｌ］程度の個数濃度になる。他方、分子量が約１０６の両親媒性会合体の直径は約（１〜２）×１０−２［μｍ］と推定され、これらがリムルス試薬との反応で発生した凝固体が段々集合して、微粒子計数計の下限寸法、例えば、直径０．１→０．５→０．１［μｍ］に成長すると、最初の未反応ＥＴの微粒子としての濃度約１．２×１０８［個／Ｌ］は直径比の３乗に逆比例して減少し、微粒子計数計の検出下限、例えば、０．１［μｍ］で１０２〜１０３個／ｍＬ、０．５［μｍ］で１００〜１０１個／ｍＬ、１［μｍ］で１０−２〜１０−１個／ｍＬになる。
【００５３】
この凝固体濃度を微粒子計数器で測定しようとする場合、透析液中に存在する気泡（予め脱気して除去する）や塵などの微粒子（予め濾過して除去する）の除去しきれなかったものがノイズとして妨害するため、エンドトキシン由来の微粒子の計数がノイズ数のレベルまで低下した状態で測定することは測定値の信頼度を失う。従って、検体のエンドトキシン濃度が低い程、凝固体微粒子径が小さい段階で測定することが必要である。エンドトキシン濃度が１ＥＵ／Ｌの場合は、０．５μｍまで成長した段階で１０１個／ｍＬ以下になると推算され、検体によってはノイズに埋没する場合もあるため、少なくとも０．５μｍ程度以下、好ましくは０．２〜０．１μｍ程度で計数することが微粒子計数型濁度計でエンドトキシン濃度を測定する必須条件になる。この条件は、エンドトキシンとリムルス試薬の反応の早い段階で測定することによって測定時間を短縮する目的にも一致する。
【００５４】
【実施例】
以下に、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００５５】
［実施例１］
検体液取込みパイプ７、開閉バルブ６、洗剤液注入パイプ８（図省略）、開閉バルブ９（図省略）、濾過フィルター５（図省略）、脱気装置（図省略）、リムルス試薬注入パイプ１１、開閉バルブ１２、測定回路１５、測定セル１６、循環ポンプ１７、スタティックミキサー１８（図省略）、開閉バルブ１９、排出パイプ２０、恒温槽２１（図省略）及び移動可能な光源１３と光検出器１４の結合体からなる１系列のエンドトキシン濃度測定装置が、並列に３系列が並び設置されたエンドトキシン濃度測定装置を作成した。これを図７に示す。
【００５６】
［実施例２］
実施例１において、リムルス試薬注入パイプ１１及び開閉バルブ１２に替えて、マイクロモーターで位置制御可能な注入針付きマイクロシリンジ（リムルス試薬注入器１０）を採用した以外は、実施例１の装置と同様な構造のエンドトキシン濃度測定装置を作成した。
【００５７】
【発明の効果】
本発明の装置によれば、注射液、輸液、透析液などの医薬品と、その中間製品、精製水などの検体液の貯蔵タンク又は供給ラインから、検体液の一部をパイプで取込みエンドトキシンの濃度を連続的にモニターすることができ、かつエンドトキシンの濃度が５０ＥＵ／Ｌ以下の低濃度液、特に１０〜＜１ＥＵ／Ｌレベルの極低濃度液であってもモニターでき、しかもエンドトキシンの濃度を短時間にモニターできる効果がある。
【図面の簡単な説明】
【図１】装置の構成を示す概念図である。図（Ａ）は、検体液を取込み封鎖する手段と、検体液の測定手段と、検体液を排出し封鎖する手段が１系列の場合であり、図（Ｂ）は、２系列の場合であり、図（Ｃ）は、３系列の場合である。
【図２】検体液を取込み封鎖する手段の例を示す図である。図（Ａ）は、混合液が測定回路を循環している場合であり、図（Ｂ）は、測定回路の上部の一部は測定セルとなっていることを示す図である。
【図３】検体液の測定手段の例を示す図である。図（Ａ）は、１系列の場合であり、図（Ｂ）は、２系列の場合であり、図（Ｃ）は３系列の場合である。
【図４】複数の装置を並列に設置して、自動切換えて順繰りに連続測定する装置の例を示す図である。
【図５】単一の光源とそれに対応する光検出器を中心として回転する複数の測定セルを示す図である。
【図６】複数の測定セルに対して併進往復する単一の光源とそれに対応する検出器を示す図である。
【図７】複数の測定系は、一列に並置した複数の測定セルに対して併進往復する単一の光源とそれに対応する光検出器とからなり、それを示す装置図である。図（Ａ）は鳥瞰図、図（Ｂ）は側面図、（Ｃ）は平面図である。
【図８】複数の測定系は、単一の光源とそれに対応する光検出器を固定した回転軸を中心軸とする同心円周上に配置した複数の測定セルを含む測定回路とからなり、それを示す装置図である。図（Ａ）は鳥瞰図、図（Ｂ）は側面図、（Ｃ）は平面図である。
【図９】並列の測定セルが３系列の場合の自動切替えダイアグラムを示す図である。
【符号の説明】
１        検体液を取込み封鎖する手段
２        検体液の測定手段
３        検体液を排出し封鎖する手段
４        検体液の取込みポンプ
５        検体液の濾過フィルター
６        検体液取込みパイプの開閉バルブ
７        検体液取込みパイプ
８        洗剤液注入パイプ
９        洗剤液注入パイプの開閉バルブ
１０      リムルス試薬注入器
１１      リムルス試薬注入パイプ
１２      リムルス試薬注入パイプの開閉バルブ、または仕切り
１３      光源
１４      光検出器
１５      測定回路
１５−１  循環混合液入口
１５−２  循環混合液出口
１６      測定セル
１７      循環ポンプ（取込みポンプ、洗浄・排出ポンプを兼ねる）
１８      スタティックミキサー
１９      排出パイプの開閉バルブ
２０      排出パイプ
２１      恒温槽
２２      光束
２３      電気回路（演算部）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
0003814559.tif 000007
【図７】
0003814559.tif 000008
【図８】
0003814559.tif 000009
【図９】
0003814559.tif 000010