(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記理化学的性質を有する新規なクレアチニンアミドヒドロラーゼ。
作用：クレアチニン＋Ｈ2Ｏ  ←→  クレアチン
至適温度：６０℃
至適ｐＨ：７．５〜８．５
熱安定性：５０℃以下（ｐＨ７．５、３０分間）
ｐＨ安定性：８．０〜１０．０（４℃、１６時間）
分子量：３１，５００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、１２０，０００（ゲル濾過）
等電点：４．８
【請求項２】
配列表・配列番号１に記載のアミノ酸配列を含有する請求項１記載のクレアチニンアミドヒドロラーゼ。
【請求項３】
アルカリゲネス・フェカリス（Alcaligenes faecalis）ＴＥ３５８１（ＦＥＲＭ Ｐ−１４２３７）が産生する酵素である請求項１記載のクレアチニンアミドヒドロラーゼ。
【請求項４】
配列表の配列番号１に記載されるアミノ酸配列または該アミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が付加、欠失または置換されており且つクレアチニンアミノヒドロラーゼの酵素活性をもたらすポリペプチドをコードしている塩基配列を含有することを特徴とするクレアチニンアミドヒドロラーゼをコードする遺伝子。
【請求項５】
配列表の配列番号１に記載されるアミノ酸配列をコードしている塩基配列を含有することを特徴とするクレアチニンアミドヒドロラーゼをコードする遺伝子。
【請求項６】
配列表の配列番号２に記載される塩基配列または該塩基配列において、１もしくは複数の塩基が付加、欠失または置換されており且つクレアチニンアミドヒドロラーゼの酵素活性をもたらすポリペプチドをコードしている塩基配列であることを特徴とするクレアチニンアミドヒドロラーゼをコードする遺伝子。
【請求項７】
配列表の配列番号２に記載される塩基配列を含有することを特徴とするクレアチニンアミドヒドロラーゼをコードする遺伝子。
【請求項８】
請求項４、５、６または７記載のクレアチニンアミドヒドロラーゼをコードする遺伝子を含有することを特徴とする組換えベクター。
【請求項９】
宿主細胞が請求項４、５、６または７記載のクレアチニンアミドヒドロラーゼをコードする遺伝子を含有する組換えベクターにより形質転換された形質転換体。
【請求項１０】
宿主細胞が請求項４、５、６または７記載のクレアチニンアミドヒドロラーゼをコードする遺伝子を含有する組換えベクターにより形質転換された形質転換体を培地で培養し、クレアチニンアミドヒドロラーゼを生成させ、該クレアチニンアミドヒドロラーゼを採取することを特徴とするクレアチニンアミドヒドロラーゼの製造法。
【請求項１１】
誘導物質を培地に添加する必要がないことを特徴とする、請求項１０に記載のクレアチニンアミドヒドロラーゼの製造法。
【請求項１２】
培養時のクレアチニンアミドヒドロラーゼの生産性が、１５．７Ｕ／ｍＬを越えることを特徴とする、請求項１０または１１に記載のクレアチニンアミドヒドロラーゼの製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明はクレアチニンの定量に用いることができるクレアチニンアミドヒドロラーゼ活性を有する新規な酵素、および該酵素をコードする遺伝子ならびに遺伝子工学的技術による該酵素の製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来から、クレアチニンアミドヒドロラーゼ（EC 3.5.2.10)は、筋疾患、腎疾患の診断の指標となっている体液中のクレアチニンの測定用酵素として、例えばクレアチンアミジノヒドロラーゼ、ザルコシンオキシダーゼ、ペルオキシダーゼと組み合わせて使用されている。すなわち、試料中のクレアチニンにクレアチニンアミドヒドロラーゼを作用させ、生成するクレアチンにクレアチンアミジノヒドロラーゼを作用させ、さらに生成するザルコシンにザルコシンオキシダーゼを作用させ、かつ、生成する過酸化水素をペルオキシダーゼおよび発色剤（例えば４−アミノアンチピリンとアニリン誘導体）により発色させ、その発色強度を吸光度測定して、試料中のクレアチニン量を測定する。
【０００３】
クレアチニンアミドヒドロラーゼは、クレアチニンに作用してクレアチンを生成する可逆的反応を触媒する酵素である。このようなクレアチニンアミドヒドロラーゼは、シュードモナス属（Journal of Biochemistry, Vol.86, 1109-1117(1979)) あるいはアルカリゲネス属（Chemical and Pharmaceutical Bulletin, Vol.34, No.1, 269-274 (1986)）等の細菌が生産することが知られている。このうち、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）PS-7が産生するクレアチニンアミドヒドロラーゼをコードする遺伝子は既に分離され、アミノ酸配列が発表されている（特開平 3-19690号公報）。しかし、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）PS-7のクレアチニンアミドヒドロラーゼの遺伝子工学的技術による生産レベルは、特開平 3-19690号公報に記載によれば、１５．７Ｕ／ｍｌであり、より高い生産性が望まれている。
他方、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）PS-7以外の微生物が産生するクレアチニンアミドヒドロラーゼの遺伝情報および酵素の一次構造は未だ得られていない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明では、従来の酵素に比べて、高純度なクレアチニンアミドヒドロラーゼを提供することを目的とし、新規なクレアチニンアミドヒドロラーゼの単離、および遺伝子工学的技術による該酵素の製造法を確立し、高純度な該酵素の大量供給とクレアチニンの定量への利用を可能とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記目的を達成するために種々検討した結果、クレアチニンアミドヒドロラーゼ生産菌として、アルカリゲネス・フェカリス（Alcaligenes faecalis）ＴＥ３５８１（FERM P-14237）を選び、該菌体より抽出した染色体ＤＮＡからクレアチニンアミドヒドロラーゼをコードする遺伝子を分離することに成功し、該遺伝子より発現される、新規なクレアチニンアミドヒドロラーゼを単離した。さらに該遺伝子の全塩基配列を決定し、該酵素を遺伝子工学的技術により高価なクレアチニンのような誘導物質を培地に添加する必要なしに高生産させることに成功し、高純度な該酵素を安価に大量供給することを可能にした。
【０００６】
すなわち、本発明は下記理化学的性質を有するクレアチニンアミノヒドロラーゼである。
【化２】
0003829950.tif 000002
0003829950.tif 000003
【０００７】
また、本発明は配列表の配列番号１に記載されるアミノ酸配列または該アミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が付加、欠失または置換されており、且つクレアチニンアミドヒドロラーゼの酵素活性をもたらすポリペプチドをコードしている塩基配列を含有することを特徴とするクレアチニンアミドヒドロラーゼをコードする遺伝子である。好ましくは、配列表の配列番号１に記載されるアミノ酸配列をコードしている塩基配列を含有するクレアチニンアミドヒドロラーゼをコードする遺伝子である。
【０００８】
また、本発明は配列表の配列番号２に記載される塩基配列または該塩基配列において、１もしくは複数の塩基が付加、欠失または置換されており且つクレアチニンアミドヒドロラーゼの酵素活性をもたらすポリペプチドをコードしている塩基配列であることを特徴とするクレアチニンアミドヒドロラーゼをコードする遺伝子である。本発明のクレアチニンアミノヒドロラーゼをコードする遺伝子は、好ましくは配列表の配列番号２に記載される塩基配列を含有する遺伝子である。
【０００９】
本発明は上記遺伝子を含有することを特徴とする組換えベクターである。
【００１０】
さらに本発明は上記組換えベクターにより形質転換された形質転換体である。
【００１１】
本発明は上記形質転換体を培地で培養し、クレアチニンアミノヒドロラーゼを生成させ、該クレアチニンアミドヒドロラーゼを採取することを特徴とするクレアチニンアミノヒドロラーゼの製造法である。
【００１２】
なお、アルカリゲネス・フェカリス（Alcaligenes faecalis）ＴＥ３５８１（ＦＥＲＭ  Ｐ−１４２３７）を培地で培養し、クレアチニンアミドヒドロラーゼを生成させ、該クレアチニンアミドヒドロラーゼを採取することも可能である。
【００１３】
【発明の実施態様】
本発明のクレアチニンアミドヒドロラーゼは、クレアチニンアミドヒドロラーゼ生産微生物、例えばアルカリゲネス・フェカリス（Alcaligenes faecalis）ＴＥ３５８１（FERM P-14237）から入手し得るが、好ましくは、これらの微生物からクレアチニンアミドヒドロラーゼをコードする遺伝子を分離し、これにより他の宿主細胞を形質転換して、クレアチニンアミドヒドロラーゼを発現させ、単離することにより、本発明のクレアチニンアミドヒドロラーゼを簡便且つ効率的に入手する。
【００１４】
本発明のクレアチニンアミドヒドロラーゼをコードする遺伝子は、例えばアルカリゲネス・フェカリス（Alcaligenes faecalis）ＴＥ３５８１（FERM P-14237）菌体から抽出しても良く、また化学的に合成することもできる。さらにポリメラーゼチェーンリアクション法 (PCR)の利用により、クレアチニンアミドヒドロラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を得ることも可能である。
【００１５】
上記クレアチニンアミドヒドロラーゼをコードする遺伝子としては、例えば配列表の配列番号１に記載されるアミノ酸配列または該アミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が付加、欠失または置換されており、且つクレアチニンアミノヒドロラーゼの酵素活性をもたらすポリペプチドをコードしている塩基配列が挙げられる。
また、配列表の配列番号２に記載される塩基配列または該塩基配列において、１もしくは複数の塩基が付加、欠失または置換されており且つクレアチニンアミドヒドロラーゼの酵素活性をもたらすポリペプチドをコードしている塩基配列であるクレアチニンアミドヒドロラーゼをコードする遺伝子が挙げられる。
【００１６】
本発明の遺伝子を得る方法としては、例えばアルカリゲネス・フェカリス（Alcaligenes faecalis）ＴＥ３５８１（FERM P-14237）の染色体ＤＮＡを分離、精製した後、超音波破砕、制限酵素処理等を用いてＤＮＡを切断したものと、リニヤーな発現ベクターとを両ＤＮＡの平滑末端または接着末端において、ＤＮＡリガーゼなどにより結合、かつ閉鎖させて組換えベクターを構築する。このようにして得られた組換えベクターは、複製可能な宿主微生物に移入した後、ベクターのマーカーと酵素活性の発現を指標としてスクリーニングして、クレアチニンアミドヒドロラーゼをコードする遺伝子を含有する組換えベクターを保持する微生物を得る。次いで該微生物を培養し、該培養菌体から該組換えベクターを分離・精製し、該組換えベクターからクレアチニンアミドヒドロラーゼ遺伝子を採取すれば良い。
【００１７】
遺伝子供与体であるアルカリゲネス・フェカリス（Alcaligenes faecalis）ＴＥ３５８１（FERM P-14237）の染色体ＤＮＡは、具体的には、以下のようにして採取される。
すなわち、供与微生物を例えば１〜３日間撹拌培養して得られた培養物を遠心分離にて集菌し、次いで、これを溶菌させることによりクレアチニンアミドヒドロラーゼ遺伝子の含有溶菌物を調製する。溶菌の方法としては、例えばリゾチームやβ−グルカナーゼ等の溶菌酵素により処理を施し、必要に応じてプロテアーゼや他の酵素やラウリル硫酸ナトリウム(SDS) 等の界面活性剤が併用され、さらに凍結融解やフレンチプレス処理のような物理的破砕方法と組み合わせても良い。
【００１８】
このようにして得られた溶菌物からＤＮＡを分離、精製するには常法に従う。例えばフェノール処理やプロテアーゼ処理による除蛋白処理や、リボヌクレアーゼ処理、アルコール沈澱処理などの方法を適宜組み合わせることにより行うことができる。
微生物から分離、精製されたＤＮＡを切断する方法は、例えば超音波処理、制限酵素処理などにより行うことができる。好ましくは特定のヌクレオチド配列に作用するII型制限酵素が適している。
【００１９】
ベクターとしては、宿主微生物内で自律的に増殖し得るファージまたはプラスミドから遺伝子組換え用として構築されたものが適している。
ファージとしては、例えばエシェリヒア・コリー（Escherichia coli）を宿主微生物とする場合には、Lambda-gt10 、Lambda-gt11 などが使用できる。
またプラスミドとしては、例えばエシェリヒア・コリー（Escherichia coli）を宿主微生物とする場合には、pBR322、pUC19 、pBluescript 、pLED-M1 （Journal of Fermentation and Bioenzineering, Vol.76, 265-269 (1993)）などが使用できる。
このようなベクターを上記したクレアチニンアミドヒドロラーゼ遺伝子供与体である微生物ＤＮＡの切断に使用した制限酵素で切断してベクター断片を得ることができるが、必ずしも該微生物ＤＮＡの切断に使用した制限酵素と同一の制限酵素を用いる必要はない。微生物ＤＮＡ断片とベクターＤＮＡ断片とを結合させる方法は、公知のＤＮＡリガーゼを用いる方法であれば良く、例えば微生物ＤＮＡ断片の接着末端とベクター断片の接着末端とのアニーリングの後、適当なＤＮＡリガーゼの使用により微生物ＤＮＡ断片とベクターＤＮＡ断片との組換えベクターを作成する。必要なら、アニーリングの後、宿主微生物に移入して生体内のＤＮＡリガーゼを利用し組換えベクターを作成することもできる。
【００２０】
宿主微生物としては、組換えベクターが安定かつ自律増殖可能であり、外来性遺伝子の形質が発現できるものであれば良く、一般的にはエシェリヒア・コリーW3110 、エシェリヒア・コリーC600、エシェリヒア・コリーHB101 、エシェリヒア・コリーJM109 などを用いることができる。
【００２１】
宿主微生物に組換えベクターを移入する方法としては、例えば宿主微生物がエシェリヒア・コリーの場合には、カルシウム処理によるコンピテントセル法やエレクトロポレーション法などが用いることができる
このようにして得られた形質転換体である微生物は、栄養培地で培養されることにより、多量のクレアチニンアミドヒドロラーゼを安定に生産し得る。宿主微生物への目的組換えベクターの移入の有無についての選択は、目的とするＤＮＡを保持するベクターの薬剤耐性マーカーとクレアチニンアミドヒドロラーゼ活性を同時に発現する微生物を同時に発現する微生物を検索すれば良く、例えば薬剤耐性マーカーに基づく選択培地で生育し、かつクレアチニンアミドヒドロラーゼを生成する微生物を選択すれば良い。
【００２２】
上記の方法により得られたクレアチニンアミドヒドロラーゼ遺伝子の塩基配列は、サイエンス（Science, Vol.214, 1205-1210 (1981)）に記載されたジデオキシ法により解読し、またクレアチニンアミドヒドロラーゼのアミノ酸配列は決定した塩基配列より推定した。このようにして一度選択されたクレアチニンアミドヒドロラーゼ遺伝子を保有する組換えベクターは、形質転換微生物から取り出され、他の微生物に移入することも容易に実施することができる。また、クレアチニンアミドヒドロラーゼ遺伝子を保持する組換えベクターから、制限酵素やＰＣＲによりクレアチニンアミドヒドロラーゼ遺伝子であるＤＮＡを回収し、他のベクター断片と結合させ、宿主微生物に移入することも容易に実施できる。
【００２３】
形質転換体である宿主微生物の培養形態は、宿主の栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択すればよく、通常、多くの場合は液体培養で行うが、工業的には通気撹拌培養を行うのが有利である。培地の栄養源としては微生物の培養に通常用いられるものが広く使用され得る。炭素源としては資化可能な炭素化合物であればよく、例えばグルコ−ス、シュークロース、ラクトース、マルトース、フラクトース、糖蜜、ピルビン酸などが使用される。窒素源としては、利用可能な窒素化合物であればよく、例えばペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物、大豆粕アルカリ抽出物などが使用される。その他、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛などの塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミンなどが必要に応じて使用される。
【００２４】
培養温度は菌が発育し、クレアチニンアミドヒドロラーゼを生産する範囲で適宜変更し得るが、エシェリヒア・コリーの場合、好ましくは２０〜４２℃程度である。培養時間は条件によって多少異なるが、クレアチニンアミドヒドロラーゼが最高収量に達する時期を見計らって、適当時期に培養を終了すればよく、通常は６〜４８時間程度である。培地ｐＨは菌が発育し、クレアチニンアミドヒドロラーゼを生産する範囲で適宜変更し得るが、特に好ましくはｐＨ６．０〜９．０程度である。
【００２５】
培養物中のクレアチニンアミドヒドロラーゼを生産する菌体を含む培養液をそのまま採取し、利用することもできるが、一般には常法に従って、クレアチニンアミドヒドロラーゼが培養液中に存在する場合は、濾過，遠心分離などにより、クレアチニンアミドヒドロラーゼ含有溶液と微生物菌体とを分離した後に利用する。クレアチニンアミドヒドロラーゼが菌体内に存在する場合には、得られた培養物から濾過または遠心分離などの手段により菌体を採取し、次いでこの菌体を機械的方法またはリゾチームなどの酵素的方法で破壊し、また必要に応じてＥＤＴＡ等のキレート剤及びまたは界面活性剤を添加してクレアチニンアミドヒドロラーゼを可溶化し、水溶液として分離採取する。
【００２６】
このようにして得られたクレアチニンアミドヒドロラーゼ含有溶液を、例えば減圧濃縮、膜濃縮、更に硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムなどの塩析処理、或いは親水性有機溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセトンなどによる分別沈澱法により沈澱せしめればよい。また、加熱処理や等電点処理も有効な精製手段である。その後、吸着剤或いはゲル濾過剤などによるゲル濾過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーを行うことにより、精製されたクレアチニンアミノヒドロラーゼを得ることができる。
例えば、セファデックス（Sephadex）Ｇ−２５（ファルマシア  バイオテク）などによるゲルろ過、ＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂ（ファルマシア  バイオテク）、オクチルセファロースＣＬ６−Ｂ（ファルマシア  バイオテク）カラムクロマトグラフィーにより分離、精製し、精製酵素標品を得ることができる。この精製酵素標品は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥＤでほぼ単一のバンドを示す程度に純化されている。
【００２７】
本発明のクレアチニンアミドヒドロラーゼの一例は、以下に示す理化学的性質を有する。
【化３】
0003829950.tif 000004
0003829950.tif 000005
【００２８】
本発明のクレアチニンアミドヒドロラーゼと公知のクレアチニンアミドヒドロラーゼとの性質の比較を下記表１に示す。この表１から、本発明の酵素は従来の酵素に比べて、分子量、サブユニット数、クレアチニンに対するＫｍ値が相違する。
【００２９】
また、本発明のクレアチニンアミドヒドロラーゼのアミノ酸配列と公知であるシュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）PS-7が産生するクレアチニンアミノヒドロラーゼのアミノ酸配列との相同性は６５．５％であり、両者の比較を図１に示す。
したがって、  本発明のクレアチニンアミドヒドロラーゼは、同一反応を触媒する公知の酵素とは性質の異なる新規な酵素である。また、本発明のクレアチニンアミドヒドロラーゼのアミノ酸配列に関する情報は、該酵素のアミノ酸レベルでの置換、挿入、欠失による酵素的性質の改善を容易ならしめるものである。
【００３０】
【表１】
0003829950.tif 000006
【００３１】
【実施例】
以下、本発明を実施例により具体的に説明する。
実施例中、クレアチニンアミドヒドロラーゼ活性の測定は、下記試薬を使用し、下記測定条件で行った。
試薬
試薬Ａ：ダイヤカラーCRE   クレアチニン測定試薬（東洋紡製）のＡ溶解液
（酵素試薬Ａバイアルに90mlの溶解液Ａを加えて溶解したもの）
試薬Ｂ：４００ｍＭクレアチニン水溶液
試薬Ｃ：１．５％フェノール水溶液
試薬Ｄ：０．５％４−アミノアンチピリン水溶液
測定条件
まず試薬Ａ、試薬Ｂ、試薬Ｃ、試薬Ｄを３：１：０．０４：０．０４の割合（容量比）で混合し、試薬混液を作成する。この試薬混液 3mlを37℃で、約５分予備加温後、０．１ｍｌの酵素溶液を加え、３７℃で反応を開始し、４分間反応させた後、５００ｎｍにおける１分間当たりの吸光度変化を分光光度計にて測定する。
盲検は酵素溶液の代わりに蒸留水を試薬混液に加えて、以下、同様に吸光度変化を測定する。上記条件で１分間に１マイクロモルのクレアチニンを分解する酵素量を１単位（Ｕ）とする。
【００３２】
実施例１  染色体ＤＮＡの分離
アルカリゲネス・フェカリスＴＥ３５８１(FERM P-14237)の染色体ＤＮＡを次の方法で分離した。該菌株を１５０ｍｌの普通ブイヨン培地で、３０℃で一晩振盪培養した後、遠心分離（8,000rpm、10分間）により集菌した。１０％シュークロース、５０ｍＭトリス塩酸 (pH 8.0) 、５０ｍＭ  ＥＤＴＡを含んだ溶液５ｍｌに懸濁し、１ｍｌのリゾチーム溶液（10mg/ml)を加えて、３７℃、１５分間保温し、次いで１ｍｌの１０％  ＳＤＳ溶液を加えた。この溶液に等量のクロロホルム・フェノール溶液（１：１）を加え、撹拌混合し、10,000rpm、３分間の遠心分離して水層と溶媒層に分離し、水層を分取した。この水層に２倍量のエタノールを静かに重層し、ガラス棒でゆっくり撹拌しながらＤＮＡをガラス棒に巻き付かせて分離した。
これを１ｍＭ  ＥＤＴＡを含んだ１０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ８．０溶液（以下、ＴＥと略記）で溶解した。これを等量のクロロホルム・フェノール溶液で処理後、遠心分離により水層を分取し、２倍量のエタノールを加えて上記方法で、もう一度、ＤＮＡを分離し、２ｍｌのＴＥで溶解した。
【００３３】
実施例２  クレアチニンアミノヒドロラーゼをコードする遺伝子を含有するＤＮＡ断片および該ＤＮＡ断片を有する組換えベクターの調製
実施例１で得たＤＮＡ２０μｇを制限酵素 Sau3AI(東洋紡製）で部分分解し、シュークロース密度勾配遠心分離法により、２〜１０ｋｂｐの断片を回収した。一方、制限酵素 BamHI（東洋紡製）で切断した pBluescriptKS(+) をバクテリアルアルカリホスファターゼ（東洋紡製）により脱リン酸化処理した後、両ＤＮＡをＴ４ＤＮＡリガーゼ（東洋紡製）１単位で１６℃、１２時間反応させ、ＤＮＡを連結した。連結したＤＮＡはエシェリヒア・コリーJM109 のコンピテントセル（東洋紡製）を用いて形質転換し、クレアチニンアミドヒドロラーゼ活性検出用寒天培地［ 1.0％ポリペプトン、 0.5％酵母エキス、 0.5％ＮａＣｌ、 1％クレアチニン、200U/ml クレアチンアミジノヒドロラーゼ（東洋紡製）、10U/mlザルコシンオキシダーゼ（東洋紡製）、5U/ml ペルオキシダーゼ（東洋紡製）、0.01％ o−ジアニシジン、50μg/mlアンピシリン、 1.5％寒天］に塗布した。クレアチニンアミドヒドロラーゼ活性の検出は、上記培地に生育し、且つ茶色に染色されるコロニーを指標に行った。
【００３４】
使用したＤＮＡ１μg 当たり約 100,000個の形質転換体のコロニーが得られ、上記スクリーニングの結果、茶色に染色されるコロニーを１株見いだした。この株をＬＢ液体培地（ 1％ポリペプトン、 0.5％酵母エキス、 0.5％ＮａＣｌ、50μg/mlアンピシリン）で培養し、クレアチニンアミドヒドロラーゼ活性を測定したところ、該活性が検出された。
この株の保有するプラスミドには約５ｋｂｐの挿入ＤＮＡ断片が存在しており、このプラスミドをｐＣＮＨＡ１７とした。
次いでｐＣＮＨＡ１７の挿入ＤＮＡを制限酵素 SacIIとPstI（東洋紡製）にて切り出し、同制限酵素で切断した pBluescriptKS(+) に連結して、ｐＣＮＨＡ−１を作成した。これらのｐＣＮＨＡ１７、ｐＣＮＨＡ−１の制限酵素地図を図２に示す。
【００３５】
実施例３  塩基配列の決定
ｐＣＮＨＡ−１の約１．２ｋｂｐの挿入ＤＮＡ断片について、種々の制限酵素にてサブクローンを調製した。種々のサブクローンは常法に従い、Radioactive Sequencing Kit（東洋紡製）を用いて塩基配列を決定した。決定した塩基配列及びアミノ酸配列を配列表に示す。
アミノ酸配列から求められる蛋白質の分子量は、２８，７４４であり、アルカリゲネス・フェカリスＴＥ３５８１のクレアチニンアミノヒドロラーゼの分子量とほぼ一致した。
【００３６】
実施例４  組換えベクターｐＣＮＨＡ−１１の作成
ｐＣＮＨＡ−１の挿入ＤＮＡ断片よりクレアチニンアミノヒドロラーゼ遺伝子以外の部分を除くため、ＰＣＲによる挿入ＤＮＡ断片の小型化を実施した。ＰＣＲは、以下に示す反応液組成および増幅条件にて行った。
反応液組成
Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン製）     5U/100 μl
10倍濃度Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ用バッファー  10μl/100 μl
ｐＣＮＨＡ−１（鋳型ＤＮＡ）                   0.1μg/100 μl
dATP,dTTP,dGTP,dCTP                               各 0.2mM
プライマー                                        各 1μM
（配列表の配列番号３、４に記載）
増幅条件
変性          ９４℃、３０秒間
温度変更        １分、３０秒間
アニーリング  ４５℃、  １秒間
温度変更                １秒間
反応          ７５℃、３０秒間
温度変更                １秒間
（上記サイクルを３０回繰り返す)
【００３７】
増幅ＤＮＡ断片、約０．８ｋｂｐを制限酵素 NdeI と BamHI（東洋紡製）にて処理し、同じ制限酵素で切断したｐＬＥＤ−Ｍ１に連結してｐＣＮＨＡ−１１を作成した。ｐＣＮＨＡ−１１の制限酵素地図を図２に示す。
ｐＣＮＨＡ−１１の挿入ＤＮＡ断片は、クレアチニンアミドヒドロラーゼ遺伝子以外の部分を含まない。すなわち、挿入ＤＮＡ断片の両端には、NdeIとBamHI 制限酵素切断部位がそれぞれ存在し、NdeIはクレアチニンアミドヒドロラーゼ遺伝子の開始コドン(ATG) と重なり、BamHI はクレアチニンアミドヒドロラーゼ遺伝子の終止コドン(TGA) の直後に位置している。
【００３８】
実施例５  形質転換体の作成
エシェリヒア・コリーJM109 のコンピテントセル（東洋紡製）をｐＣＮＨＡ−１１で形質転換し、形質転換体エシェリヒア・コリーJM109(pCNHA-11）を得た。
【００３９】
実施例６  エシェリヒア・コリーJM109(pCNHA-11）からのクレアチニンアミノヒドロラーゼの製造
ＬＢ培地５００ｍｌを２Ｌフラスコに分注し、１２１℃、１５分間オートクレーブを行い、放冷後、別途無菌ろ過した５０ｍｇ／ｍｌアンピシリン（ナカライテスク製）０．５ｍｌ添加した。この培地にＬＢ培地であらかじめ、３０℃、７時間振盪培養したエシェリヒア・コリーJM109(pCNHA-11）の培養液５ｍｌを接種し、３７℃で１８時間通気撹拌培養した。培養終了時のクレアニチンアミドヒドロラーゼ活性は約５０Ｕ／ｍｌであった。
上記菌体を遠心分離にて集菌し、５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．８に懸濁した。上記菌体懸濁液をフレンチプレスで破砕し、遠心分離を行い上清液を得た。得られた粗酵素液をポリエチレンイミンによる除核酸処理および硫安分画処理を行った後、Sephadex G-25 （ファルマシア・バイオテク）によるゲルろ過により脱塩し、、DEAEセファロースCL-6B  (ファルマシア  バイオテク）カラムクロマトグラフィー、オクチルセファロースCL6-B （ファルマシア  バイオテク）カラムクロマトグラフィーにより分離・精製し、精製酵素表品を得た。
該方法により得られたクレアチニンアミノヒドロラーゼ標品は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動でほぼ単一なバンドを示し、この時の比活性は８３Ｕ／ｍｇ−タンパクであった。
【００４０】
以下に、上記方法により得られたクレアチニンアミドヒドロラーゼの性質を示す。
【化４】
0003829950.tif 000007
0003829950.tif 000008
【００４１】
【発明の効果】
本発明の酵素は従来公知であるクレアチニアミドヒドロラーゼと比べて、分子量、サブユニット数、クレアチニンに対するＫｍ値において、相違が見られ、新規な酵素である。また、従来の酵素、シュードモナス・プチダPS-7の遺伝子を利用した遺伝子組換え技術によって生産されるクレアチニンアミドヒドロラーゼの生産性が、１５．７Ｕ／ｍｌであるのに対して、本発明の酵素の生産性は５０Ｕ／ｍｌであり、高純度の酵素が生産されうる。
また、本発明のクレアチニンアミドヒドロラーゼのアミノ酸配列に関する情報は、該酵素のアミノ酸レベルでの置換、挿入、欠失による酵素的性質の改善を容易にならしめるという効果がある。
【００４２】
【配列表】
配列番号：１
配列の長さ：258
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：蛋白質
起源
生物名：アルカリゲネス・フェカリス（Alcaligenes faecalis）
株名：TE3581（FERM P-14237）
配列
0003829950.tif 000009
0003829950.tif 000010
【００４３】
配列番号：２
配列の長さ：777
配列の型：核酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ゲノムDNA
起源
生物名：アルカリゲネス・フェカリス（Alcaligenes faecalis）
株名：TE3581（FERM P-14237）
配列
0003829950.tif 000011
0003829950.tif 000012
【００４４】
配列番号：３
配列の長さ：49
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成DNA
配列
0003829950.tif 000013
【００４５】
配列番号：４
配列の長さ：49
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成DNA
配列
0003829950.tif 000014
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のクレアチニンアミドヒドロラーゼのアミノ酸配列とシュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）PS-7が産生するクレアチニンアミドヒドロラーゼのアミノ酸配列との比較を示す。
【図２】ｐＣＮＨＡ１７、ｐＣＮＨＡ−１、ｐＣＮＨＡ−１１の制限酵素地図を示す。
【図１】
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【図２】
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