(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
関心の対象であるタンパク質を発現する細胞を選択するための方法において、
ａ）関心の対象であるタンパク質をコードするＤＮＡ配列を有するＤＮＡ Ｉ分子およびエクオリア・ビクトリアの緑色蛍光タンパク質をコードするＤＮＡ配列を有するＤＮＡ ＩＩ分子を細胞に導入する工程と、
ｂ）エクオリア・ビクトリアの緑色蛍光タンパク質および関心の対象であるタンパク質の発現を可能とする条件下において、前記導入された細胞を培養する工程と、
ｃ）エクオリア・ビクトリアの緑色蛍光タンパク質を発現する培養細胞を選択することにより、関心の対象であるタンパク質を発現する細胞を選択する工程とを具備する方法であって、
（ｉ）追加のタンパク質または共因子を細胞に導入せずに光放出を達成し、且つ（ｉｉ）エクオリア・ビクトリアの緑色蛍光タンパク質が非エクオリア・ビクトリア細胞において機能的に発現され得る方法。
【請求項２】
請求項１の方法であって、前記ＤＮＡ Ｉと前記ＤＮＡ ＩＩとを連結する方法。
【請求項３】
請求項１の方法であって、前記細胞が、細菌細胞、酵母細胞、真菌細胞、昆虫細胞、線虫細胞、および植物細胞からなる群より選択されるものである方法。
【請求項４】
請求項１の方法であって、前記細胞が、動物細胞である方法。
【請求項５】
細胞内における、関心の対象であるタンパク質の位置確認をするための方法において、
ａ）エクオリア・ビクトリアの緑色蛍光タンパク質をコードするＤＮＡ配列に連結された関心の対象であるタンパク質をコードするＤＮＡ配列を有するＤＮＡ分子を、該ＤＮＡ分子により産生されたタンパク質が前記エクオリア・ビクトリアの緑色蛍光タンパク質に融合した関心の対象であるタンパク質を有するように、細胞に導入する工程と、
ｂ）該融合タンパク質の発現を可能とする条件下において前記細胞を培養する工程と、
ｃ）エクオリア・ビクトリアの緑色蛍光タンパク質を構成要素とする融合タンパク質の該細胞内の位置を検出することにより、細胞内における関心の対象であるタンパク質の位置確認をする工程とを具備する方法であって、
（ｉ）追加のタンパク質または共因子を細胞に導入せずに光放出を達成し、且つ（ｉｉ）エクオリア・ビクトリアの緑色蛍光タンパク質が非エクオリア・ビクトリア細胞において機能的に発現され得る方法。
【請求項６】
請求項５の方法であって、前記細胞が、関心の対象であるタンパク質を正常に発現する方法。
【請求項７】
細胞において遺伝子の発現を検出するための方法において、
ａ）前記遺伝子の調節要素がエクオリア・ビクトリアの緑色蛍光タンパク質の発現を制御し得るように、エクオリア・ビクトリアの緑色蛍光タンパク質をコードするＤＮＡ配列に連結された、前記遺伝子のＤＮＡ配列を有するＤＮＡ分子を細胞に導入する工程と、
ｂ）前記遺伝子の発現を可能とする条件において細胞を培養する工程と、
ｃ）前記細胞内におけるエクオリア・ビクトリアの緑色蛍光タンパク質の発現を検出することにより、前記細胞内における前記遺伝子の発現が示される工程とを具備する方法であって、
（ｉ）追加のタンパク質または共因子を細胞に導入せずに光放出を達成し、且つ（ｉｉ）エクオリア・ビクトリアの緑色蛍光タンパク質が非エクオリア・ビクトリア細胞において機能的に発現され得る方法。
【請求項８】
対象において、遺伝子の発現を検出するための方法において、
ａ）前記遺伝子の調節要素がエクオリア・ビクトリアの緑色蛍光タンパク質の発現を制御し得るように、エクオリア・ビクトリアの緑色蛍光タンパク質をコードするＤＮＡ配列に連結された前記遺伝子のＤＮＡ配列を有するＤＮＡ分子を対象の細胞に導入する工程と、
ｂ）融合タンパク質の発現を可能とする条件下において細胞を培養する工程と、
ｃ）該細胞内のエクオリア・ビクトリアの緑色蛍光タンパク質の発現を検出することにより、対象の細胞内の遺伝子の発現が示される工程とを具備する方法であって、
（ｉ）追加のタンパク質または共因子を細胞に導入せずに光放出を達成し、且つ（ｉｉ）エクオリア・ビクトリアの緑色蛍光タンパク質が非エクオリア・ビクトリア細胞において機能的に発現され得る方法。
【請求項９】
対象において、ＤＮＡ配列の転写の組織特異性を確認するための方法において、
ａ）エクオリア・ビクトリアの緑色蛍光タンパク質をコードするＤＮＡ配列に連結された前記ＤＮＡ配列を有するＤＮＡ分子を、前記ＤＮＡ配列遺伝子が対象においてエクオリア・ビクトリアの緑色蛍光タンパク質の発現を制御し得るように、対象の細胞に導入する工程と、
ｂ）エクオリア・ビクトリアの緑色蛍光タンパク質の発現を可能とする条件において、前記対象を培養する工程と、
ｃ）該対象の異なる組織中において、エクオリア・ビクトリアの緑色蛍光タンパク質の発現を検出することにより、ＤＮＡ配列の組織特異性を確認する工程とを具備する方法であって、
（ｉ）追加のタンパク質または共因子を細胞に導入せずに光放出を達成し、且つ（ｉｉ）エクオリア・ビクトリアの緑色蛍光タンパク質が非エクオリア・ビクトリア細胞において機能的に発現され得る方法。
【請求項１０】
溶液中の重金属を検出するための方法において、
ａ）緑色蛍光タンパク質をコードする遺伝子以外の遺伝子由来の重金属により活性化されるプロモーターを、エクオリア・ビクトリアの緑色蛍光タンパク質をコードするＤＮＡ配列に動作可能に連結させたＤＮＡ分子を含む細胞を、該溶液中で培養する工程と、
ｂ）エクオリア・ビクトリアの緑色蛍光タンパク質の発現を検出する工程であって、該エクオリア・ビクトリアの緑色蛍光タンパク質の発現によって重金属の存在が示される工程とを具備する方法であって、
（ｉ）追加のタンパク質または共因子を細胞に導入せずに光放出を達成し、且つ（ｉｉ）エクオリア・ビクトリアの緑色蛍光タンパク質が非エクオリア・ビクトリア細胞において機能的に発現され得る方法。
【請求項１１】
溶液中の汚染物質を検出するための方法において、
ａ）緑色蛍光タンパク質をコードする遺伝子以外の遺伝子由来の調節要素であって、（ｉ）重金属によって活性化されるプロモーター、（ｉｉ）Ｐ４５０遺伝子由来のプロモーター、または（ｉｉｉ）ストレスタンパク質をコードする遺伝子由来のプロモーターを、エクオリア・ビクトリアの緑色蛍光タンパク質をコードするＤＮＡ配列に動作可能に連結させたＤＮＡ分子を含む細胞を、該溶液中で培養する工程と、
ｂ）エクオリア・ビクトリアの緑色蛍光タンパク質の発現を検出する工程であって、該エクオリア・ビクトリアの緑色蛍光タンパク質の発現によって汚染物質の存在が示される工程とを具備する方法であって、
（ｉ）追加のタンパク質または共因子を細胞に導入せずに光放出を達成し、且つ（ｉｉ）エクオリア・ビクトリアの緑色蛍光タンパク質が非エクオリア・ビクトリア細胞において機能的に発現され得る方法。
【請求項１２】
請求項１１の方法であって、前記ストレスタンパク質が熱ショックタンパク質である方法。
【請求項１３】
蛍光分子量マーカーを製造するための方法において、
ａ）エクオリア・ビクトリアの緑色蛍光タンパク質をコードするＤＮＡ分子を、同一のリーディング・フレーム内で、既知のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ分子に連結する工程と、
ｂ）工程ａ）で連結されたＤＮＡ分子を、この連結されたＤＮＡ分子によりコードされたエクオリア・ビクトリアの緑色蛍光タンパク質の発現を可能とする発現系内に導入する工程と、
ｃ）発現された工程ｂ）のエクオリア・ビクトリアの緑色蛍光タンパク質の分子量を検出することにより、エクオリア・ビクトリアの緑色蛍光タンパク質の分子量マーカーを製造する工程とを具備する方法であって、
（ｉ）追加のタンパク質または共因子を細胞に導入せずに光放出を達成し、且つ（ｉｉ）エクオリア・ビクトリアの緑色蛍光タンパク質が非エクオリア・ビクトリア細胞において機能的に発現され得る方法。
【請求項１４】
請求項１３の方法であって、発現されたタンパク質を精製する工程をも更に具備する方法。
【発明の詳細な説明】
本出願は、それぞれ、１９９３年９月１０日および１９９４年２月４日に提出された米国特許出願第０８／１１９，６７８号および第０８／１９２，２７４号の一部継続出願であり、それらの内容は、これによって参照として組み込まれる。
本明細書中に開示された発明は、米国保健社会福祉省(Department of Health and Human Services)からのＮＩＨ助成金番号第５Ｒ０１ＧＭ３０９９７号の下で政府助成(Government support)を受けてなされた。
〔発明の背景〕
本出願の全体に渡って、括弧内に記載することにより様々の参照文献を参照に用いている。それら刊行物の開示をそれらの全体において、そのようにして本出願に参照として組み込むことにより、本発明に関連を有する現在の技術水準をより完全に説明する。それら参照文献についての完全な書誌的引用は、配列表および請求の範囲の前にある本出願の末尾において見ることができる。
細胞内の遺伝子の活性およびタンパク質の分布をモニターするために、幾つかの方法を利用できる。β−ガラクトシダーゼ（２２）およびルシフェラーゼ（２２）をコードする配列を用いて融合タンパク質を形成することも、その中に含まれる。細胞調製物を固定することか、または外因性基質もしくは補因子を加えることを必要とするために、これらの方法の有用性はしばしば制限される。本発明は、外因性の添加化合物を必要としないで、生存細胞中における遺伝子発現およびタンパク質局在を調べる方法を開示する。
本発明の方法は、クラゲの１種のエクオリア・ビクトリア（Aequorea victoria）（発光オワンクラゲ）（３）由来の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ;=Green fluorescent Protein）をコードするｃＤＮＡを用いる。Ａ．ビクトリアにおいては、ＧＦＰは、カルシウムにより刺激されたエクオリン(aequorin)により産生されたエネルギーを吸収し、緑色光を発する。
近紫外線または青色光により励起されると、原核細胞および真核細胞中において発現されたＧＦＰは、強い緑色蛍光を発光し得ることを、本発明は開示する。この蛍光はＡ．ビクトリアからの付加的な遺伝子産生物を必要としないので、発色団形成は種に特異的ではない。
〔発明の概要〕
本発明は、緑色蛍光タンパク質をコードするＤＮＡ配列に、作動するように連結された、緑色蛍光タンパク質をコードする遺伝子以外の遺伝子由来の調節要素を有するＤＮＡ分子を含む細胞を提供する。また、本発明は、上記の細胞を具備する生物をも提供する。
本発明は、関心の対象であるタンパク質(a protein of interest)を発現する細胞を選択するための方法であって、ａ）関心の対象であるタンパク質をコードするＤＮＡ配列を有するＤＮＡ  Ｉ分子および緑色蛍光タンパク質をコードするＤＮＡ配列を有するＤＮＡ  ＩＩ分子を細胞に導入する工程と、ｂ）緑色蛍光タンパク質および関心の対象であるタンパク質の発現を可能とする条件において、前記の導入された細胞を培養する工程と、ｃ）緑色蛍光タンパク質を発現する培養細胞を選択することにより、関心の対象であるタンパク質を発現する細胞を選択する工程とを具備する方法を提供する。
また、本発明は、細胞内における、関心の対象であるタンパク質の位置確認をするための方法であって、
ａ）緑色蛍光タンパク質をコードするＤＮＡ配列に連結された関心の対象であるタンパク質をコードするＤＮＡ配列を有するＤＮＡ分子を、該ＤＮＡ分子により産生されたタンパク質が前記緑色蛍光タンパク質に融合した関心の対象であるタンパク質を有するように細胞に導入する工程と、
ｂ）該融合タンパク質の発現を可能とする条件において細胞を培養する工程と、
ｃ）融合タンパク質生成物の位置を検出することにより、関心の対象であるタンパク質の位置確認をする工程とによる方法をも提供する。
【図面の簡単な説明】
図１：大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるＧＦＰの発現。この図の右側の細菌は、ＧＦＰ発現プラスミドを有する。携帯型の長波ＵＶ光源により寒天平板を照射しながらこの写真を撮影した。
図２：大腸菌により産生されたＧＦＰ（実線）および精製されたＡ．ビクトリアのＧＦＰ（Ｌ型；点線）の励起および発光のスペクトル。
図３：カエノラブディティス・エレガンス(Caenorhabditis elegans)の第１ステージ幼生におけるＧＦＰの発現。２つの触覚受容器ニューロン(touch receptor neurons)（ＰＬＭＬおよびＡＬＭＬ）並びに１つの機能不明のその他のニューロン（ＡＬＮＬ）を示す。３つの細胞体すべてから突出する突起を見ることができる。矢印は、ＡＬＭＬ細胞からの神経環分枝(the nerve ring branch)（焦点外にある）を指し示す。背景（バックグラウンド）の蛍光は、動物の自己蛍光による。
〔発明の詳細な説明〕
本出願全体に渡って、以下の標準的な略号を用いて特定のヌクレオチドを示す：
Ｃ＝シトシン  Ａ＝アデノシン
Ｔ＝チミジン  Ｇ＝グアノシン。
本発明は、緑色蛍光タンパク質をコードするＤＮＡ配列に、緑色蛍光タンパク質をコードする遺伝子以外の遺伝子由来の調節要素が作動するように連結されたＤＮＡ分子を含む細胞を提供する。
本発明は、緑色蛍光タンパク質をコードするＤＮＡ配列に、緑色蛍光タンパク質をコードする遺伝子以外の遺伝子由来の調節要素が作動するように連結されたＤＮＡ分子を含む細胞であって、本質的に、細菌細胞、酵母細胞、真菌細胞、昆虫細胞、線虫細胞、植物または動物の細胞からなる群より選択された細胞を提供する。
以下に限定されるものではないが、適切な動物細胞には、ベロ(Vero)細胞、ヒーラ(HeLa)細胞、Ｃｏｓ細胞、ＣＶ１細胞、および様々な脊椎動物、無脊椎動物、哺乳動物の細胞が含まれる。
態様の１つにおいて、細菌細胞は大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）である。
本明細書中に用いられるものとして、遺伝子からの「調節要素(a regulatory element)」とは、遺伝子の転写のために必要とされるＤＮＡ配列である。
本発明において、「作動するように連結された(operatively linked)」という術語は、その様な連結の後に前記調節要素が、連結されたタンパク質をコードするＤＮＡ配列の転写を導き得ることを意味する。
抗原ポリペプチドのポリペプチド類似体（アナログ）、断片または誘導体であって、１以上のアミノ酸残基の同一性または位置に関して天然に存在する形態とは異なる（当該タンパク質に特有な残基のすべてよりも少ない数の残基を含む欠失アナログ、１以上の特有の残基がそのほかの残基により置換されている置換アナログ、およびポリペプチドの末端部位もしくは中間部位に１以上のアミノ酸残基が付加されている付加アナログ）と共に、天然に存在する形態が有する特性の幾つか、またはすべてを共有するものをコードするＤＮＡ分子は、緑色蛍光タンパク質をコードする遺伝子に含まれる。
これらのＤＮＡ分子には、選択された哺乳類宿主または非哺乳類宿主による発現のための「好ましい」コドンの組み込み；制限エンドヌクレアーゼ酵素による切断部位の設置；および発現ベクターの構築を容易にする、開始、停止または中間の付加的なＤＮＡ配列の設置が含まれている。
１例として、プラスミドｐＧＦＰ１０．１は、Ａ．ビクトリア由来の天然ＧＦＰにおいて予想されるものであるグルタミンではなく、むしろアルギニンとして第８０番目のアミノ酸残基を有する突然変異ＧＦＰタンパク質をコードする。この突然変異タンパク質は、天然タンパク質のように蛍光を発する特性を保持する。
態様の１つにおいて、調節要素はプロモーターである。さらなる態様において、プロモーターは重金属により活性化される。この様なプロモーターは、当業者に周知である（Ｊ．Ｈ．Ｆｒｅｅｄｍａｎ，Ｌ．Ｗ．Ｓｌｉｃｅ，Ａ．Ｆｉｒｅ，およびＣ．Ｓ．Ｒｕｂｉｎ（１９９３）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６８：２５５４）。
もう１つの態様において、プロモーターは、シトクロムＰ４５０の遺伝子由来のものである。シトクロムＰ４５０は当業者に周知であり、多くのＰ４５０のプロモーターが知られている。
さらにもう１つの態様において、プロモーターは、ストレスタンパク質の遺伝子由来のものである。その様なストレスタンパク質は、当業者に周知である（Ｅ．Ｇ．Ｓｔｒｉｎｇｈａｍ，Ｄ．Ｋ．Ｄｉｘｏｎ，Ｄ．ＪｏｎｅｓおよびＥ．Ｄ．Ｃａｎｄｉｄｏ（１９９２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ，３：２２１；並びにＷｉｌｌｉａｍ  Ｊ．Ｗｅｌｃｈ（Ｍａｙ，１９９３），Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ，５６ページ）。さらなる態様において、ストレスタンパク質は熱ショックタンパク質である。
本発明は、緑色蛍光タンパク質をコードするＤＮＡ配列に、緑色蛍光タンパク質をコードする遺伝子以外の遺伝子由来の調節要素が作動するように連結されたＤＮＡ分子を含む細胞であって、そのプロモーターが該細胞の生存を可能とするために必要な遺伝子由来である細胞を提供する。
もう１つの態様において、前記調節要素はエンハンサーである。エンハンサーは、当業者に周知である。
本発明は、緑色蛍光タンパク質をコードするＤＮＡ配列に、緑色蛍光タンパク質をコードする遺伝子以外の遺伝子由来の調節要素が作動するように連結されたＤＮＡ分子を含む細胞であって、該ＤＮＡ配列がエクオリア・ビクトリアの緑色蛍光タンパク質をコードする細胞を提供する。
態様の１つにおいて、エクオリア・ビクトリアの緑色蛍光タンパク質をプラスミド内にクローン化する。このプラスミドはｐＢＳ（＋）（以前はブルースクライブ＋と称した）ベクター（ストラタジーンTM）の改変物であって、その内部にエクオリア・ビクトリアの緑色蛍光タンパク質（ここでは改変されたものも同様である）のｃＤＮＡ配列を含むＥｃｏＲＩ断片を挿入したものである。ＥｃｏＲＩ部位に隣接するプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応[Saiki,R.K.,Gelfand,D.H.,Stoffel,S.,Sharf,S.J.,Higuchi,G.T.,Horn,G.T.,Mullis,K.B.,and Erlich,H.A.(1988)Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase.Science,239:487-491]を用いての増殖と、それに続くＥｃｏＲＩによる消化により、λＧＦＰ１０[Prasher,D.C.,Eckenrode,V.K.,Ward,W.W.,Prendergast,F.G.,and Cormier,M.J.,(1992)Primary structure of the Aequoria victoria green fluorescent protein.Gene,111:229-233]から断片を獲得した。ｐＧＦＰ１０．１におけるｃＤＮＡの配列は、タンパク質の配列においてグルタミンがアルギニンに置き換る変化である、ＣＡＧからＣＧＧへの遺伝暗号配列の第８０番目のコドンの変化により、公開された配列（５）とは異なる。
このｐＧＦＰ１０．１プラスミドを、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の規定に基づいて、アメリカ合衆国メリーランド州ロックビル市パークローン・ドライブ１２３０１（ＺＩＰ番号２０８５２）のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に１９９３年９月１日に寄託した。プラスミドｐＧＦＰ１０．１には、ＡＴＣＣ受付番号７５５４７が付与された。
もう１つの態様において、本発明は、緑色蛍光タンパク質を発現する細菌細胞を提供する。さらなる態様において、該細菌細胞は大腸菌細胞である。その上さらなる態様において、この大腸菌細胞は、ＳＭＣ１と称される（ＡＴＣＣ受付番号６９５５４）。
このＳＭＣ１細菌細胞を、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の規定に基づいて、アメリカ合衆国メリーランド州ロックビル市パークローン・ドライブ１２３０１（ＺＩＰ番号２０８５２）のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に１９９４年２月４日に寄託した。細菌細胞ＳＭＣ１には、ＡＴＣＣ受付番号６９５５４が付与された。
本発明はさらに、緑色蛍光タンパク質をコードするＤＮＡ配列に、緑色蛍光タンパク質をコードする遺伝子以外の遺伝子由来の調節要素が作動するように連結されたＤＮＡ分子を含む上記の細胞から産生された、単離された緑色蛍光タンパク質を提供する。次いで、この単離された緑色蛍光タンパク質を様々に使用するために、インビトロでさらに改変することが可能である。
本発明は、緑色蛍光タンパク質を、多量の該タンパク質が産生され得るように発現させるための効率の良い方法を開示する。発現されたタンパク質を単離するための方法は周知であるので、そのため、緑色蛍光タンパク質を容易に単離できる。
本発明は、緑色蛍光タンパク質をコードするＤＮＡ配列に、緑色蛍光タンパク質をコードする遺伝子以外の遺伝子由来の調節要素が作動するように連結されたＤＮＡ分子を含む細胞を具備する生物を提供する。
もう１つの態様において、生物はヒトである。もう１つの態様において、生物はマウスである。その生物は、他の哺乳類でも良い。加えて、本発明は、他の脊椎動物、無脊椎動物及び生物についても適用可能である。
態様の１つにおいて、生物はＣ．エレガンスである。さらにもう１つの態様において、生物は、ショウジョウバエ、ミノカサゴ(zebra fish)、ウイルスまたはバクテリオファージである。
緑色蛍光タンパク質の遺伝子を有しているバクテリオファージは、特定のタイプの細菌に感染することができる。緑色蛍光タンパク質の発現により、感染を容易に検出し得る。従って、適切なバクテリオファージを用いることにより、その特定のタイプの細菌の存在を検出し得る。
同様に、緑色蛍光タンパク質の遺伝子を有している、真核生物に対するウイルス(a eucaryotic virus)は、特定の細胞タイプに感染し得る。緑色蛍光タンパク質の発現をモニターすることにより、感染を容易に検出し得る。
外因性の遺伝物質を細胞に導入する方法は、当業者に周知である。例えば、リン酸カルシウム沈降法(calcium phosphate precipitation technology)により、外因性のＤＮＡ物質を細胞に導入しうる。レトロウイルス・ベクター技術、電気穿孔法（エレクトロポレーション）、リポフェクション法(lipofection)およびアデノ随伴ウイルス系のような他のウイルス・ベクター系、または微小注射法（マイクロインジェクション）のような、ほかの技術を用いることができる。
調節要素への外的刺激の効果を検出する上で、上記の細胞及び生物は有益である。刺激は、調節要素に直接または間接の効果を有し得る。緑色蛍光タンパク質の発現および産生を誘導することか、または緑色蛍光タンパク質の発現をスイッチ・オフすることかのいずれかを通して、その様な効果が検出されるだろう。
緑色蛍光タンパク質を発現する細胞は、蛍光活性化細胞分別器(a fluorescence-activated cell sorter)により都合よく分離し得る。
血液、尿または唾液のような、様々な種類の生物学的試料中において、異なる分子の存在を検出するためにそれらの細胞及び生物を使用し得る。関心の対象である分子(the molecule of interest)による影響を受ける遺伝子の調節要素を、緑色蛍光タンパク質に、作動するように連結することにより、該分子の存在は調節要素に影響を与え、今度はその調節要素が緑色蛍光タンパク質の発現に影響を与えるであろう。それゆえに、上記の細胞は分子の検出にとって有益である。その様な検出は、診断目的に使用し得る。その様な分子の１例は、ホルモンである。
本発明は、緑色蛍光タンパク質をコードするＤＮＡ配列に、緑色蛍光タンパク質をコードする遺伝子以外の遺伝子由来の調節要素が作動するように連結されたＤＮＡ分子を含む細胞を具備する生物であって、該調節要素がストレスタンパク質のためのものである生物を提供する。
本発明は、緑色蛍光タンパク質をコードするＤＮＡ配列に、緑色蛍光タンパク質をコードする遺伝子以外の遺伝子由来の調節要素が作動するように連結されたＤＮＡ分子を含む細胞を具備する生物であって、前記ストレスタンパク質が熱ショックタンパク質である生物を提供する。
本発明は、緑色蛍光タンパク質を産生する方法であって、ａ）緑色蛍光タンパク質をコードするＤＮＡ配列に、緑色蛍光タンパク質をコードする遺伝子以外の遺伝子由来の調節要素が作動するように連結されたＤＮＡ分子を含む上記細胞を培養する工程と、ｂ）前記細胞から産生された緑色蛍光タンパク質を単離し、精製する工程とを具備する方法を提供する。タンパク質を単離し、精製するための標準的な方法は、当業者に周知である。態様の１つにおいて、緑色蛍光タンパク質の産生に用いられる細胞は、大腸菌細胞である。さらなる態様において、大腸菌細胞は、好気的に培養される。本発明は、緑色蛍光タンパク質を合成する方法であって、ａ）ＳＭＣ１と称する細胞を培養する工程と、ｂ）前記細胞から産生された緑色蛍光タンパク質を単離し、精製する工程とを具備する方法を提供する。
本発明は、関心の対象であるタンパク質を発現する細胞を選択するための方法であって、ａ）関心の対象であるタンパク質をコードするＤＮＡ配列を有するＤＮＡ  Ｉ分子および緑色蛍光タンパク質をコードするＤＮＡ配列を有するＤＮＡ  ＩＩ分子を細胞に導入する工程と、ｂ）緑色蛍光タンパク質および関心の対象であるタンパク質の発現を可能とする条件において、前記の導入された細胞を培養する工程と、ｃ）緑色蛍光タンパク質を発現する培養細胞を選択することにより、関心の対象であるタンパク質を発現する細胞を選択する工程とを具備する方法を提供する。
また、本発明は、前記細胞が、本質的に細菌細胞、酵母細胞、真菌細胞、昆虫細胞、線虫細胞、植物または動物の細胞からなる群より選択された細胞であるような上記の方法も提供する。以下に限定されるものではないが、適切な動物細胞には、ベロ(Vero)細胞、ヒーラ(HeLa)細胞、Ｃｏｓ細胞、ＣＶ１細胞、および様々な下等哺乳動物の細胞(primary mammalian cells)が含まれる。
態様の１つにおいて、ＤＮＡ  ＩとＤＮＡ  ＩＩとは連結される。もう１つの態様において、ＤＮＡはエクオリア・ビクトリアの緑色蛍光タンパク質をコードする。
本発明は、細胞内における、関心の対象であるタンパク質の位置確認をするための方法であって、
ａ）緑色蛍光タンパク質をコードするＤＮＡ配列に連結された関心の対象であるタンパク質をコードするＤＮＡ配列を有するＤＮＡ分子を、該ＤＮＡ分子により産生されるタンパク質が前記緑色蛍光タンパク質に融合した関心の対象であるタンパク質を有するように、細胞に導入する工程と、
ｂ）該融合タンパク質の発現を可能とする条件下において細胞を培養する工程と、
ｃ）細胞内の、緑色蛍光タンパク質から構成される融合タンパク質を検出することにより、細胞内における関心の対象であるタンパク質の位置確認をする工程とを具備する方法を提供する。
発現にとって必要とされる調節要素には、ＲＮＡポリメラーゼに結合するためのプロモーター配列とリボゾームが結合するための翻訳開始配列とが含まれる。例えば、細菌の発現ベクターは、ｌａｃプロモーターのようなプロモーターと、翻訳開始のためのシャイン・ダルガーノ(Shine-Dalgarno)配列及び開始コドンＡＴＧとを含んでいる。同様に、真核性の発現ベクター(a eukaryotic expression vector)は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩのための非相同性もしくは相同性のプロモーター、下流のポリアデニル化信号、開始コドンＡＴＧ、およびリボゾームが分離するための停止コドンを含んでいる。その様なベクターは、商業的に入手可能であるし、または、例えば一般的な、ベクターを構築するための上記方法のような当業者周知の方法により説明される配列からも組み立て得る。
緑色蛍光タンパク質の発現を最大にするために、翻訳開始コドンに隣接する配列を改変することができる［コザック(Kozak)による概説、１９８４），compilation and analysis of sequences upstream from the translation start site in eucaryotic mRNAs.Nucl.Acids.Res.12:857-872］。そのようにして、より多量のＧＦＰタンパク質を産生するように、配列を作成できる。
加えて、人工的なイントロンを導入することによりタンパク質の産生を増加させ得る。
他の特別な標的配列をＧＦＰ遺伝子に挿入することができる。その様な標的配列の１つに、（ＳＶ４０核位置確認信号のような）核位置確認信号(the nuclear localization signal)がある。
上記発現系の宿主細胞は、関心の対象であるタンパク質を標準的に発現する細胞、または、関心の対象であるタンパク質を標準的には発現しない細菌細胞（例えば大腸菌(E.coli)）、酵母細胞、真菌細胞、（バキュロウイルス発現系におけるＳｆ９細胞のような）昆虫細胞、線虫細胞、植物もしくは動物の細胞のような外来細胞からなる群より選択され得る。以下に限定されるものではないが、適切な動物細胞には、ベロ細胞、ヒーラ細胞、Ｃｏｓ細胞、ＣＶ１細胞、および様々な下等哺乳動物の細胞が含まれる。
細胞内における関心の対象であるタンパク質の位置確認をするための方法の態様の１つにおいて、緑色蛍光タンパク質をコードするＤＮＡは、エクオリア・ビクトリア由来である。
本発明は、細胞内における、関心の対象であるタンパク質の位置確認をするための方法であって、
ａ）緑色蛍光タンパク質をコードするＤＮＡ配列に連結された関心の対象であるタンパク質をコードするＤＮＡ配列を有するＤＮＡ分子を、該ＤＮＡ分子により産生されたタンパク質が、前記緑色蛍光タンパク質に融合した関心の対象であるタンパク質を有するように、細胞に導入する工程と、
ｂ）該融合タンパク質の発現を可能とする条件下において細胞を培養する工程と、
ｃ）細胞内の、緑色蛍光タンパク質から構成される融合タンパク質の位置(the location)を検出することにより、該関心の対象であるタンパク質を位置確認する工程とを具備し、前記細胞は正常な状態で関心の対象であるタンパク質を発現するものである方法を提供する。
本発明は、細胞内において遺伝子の発現を検出するための方法であって、
ａ）前記遺伝子の調節要素が緑色蛍光タンパク質の発現を制御し得るように、緑色蛍光タンパク質をコードするＤＮＡ配列に連結された、前記遺伝子のＤＮＡ配列を有するＤＮＡ分子を細胞に導入する工程と、
ｂ）前記遺伝子の発現を可能とする条件において細胞を培養する工程と、
ｃ）前記細胞内における緑色蛍光タンパク質の発現を検出することにより、前記細胞内における前記遺伝子の発現を表示する工程とを具備する方法を提供する。
本発明は、対象における遺伝子の発現を明示するための方法であって、ａ）緑色蛍光タンパク質をコードするＤＮＡ配列に連結された前記遺伝子のＤＮＡ配列を有するＤＮＡ分子を前記遺伝子の調節要素が緑色蛍光タンパク質の発現を制御し得るように、前記対象の細胞に導入する工程と、ｂ）融合タンパク質の発現を可能とする条件において前記細胞を培養する工程と、ｃ）細胞内の、緑色蛍光タンパク質の発現を検出することにより、前記細胞内における該遺伝子の発現を明示する工程とを具備する方法を提供する。
上記方法の態様の１つにおいて、緑色蛍光タンパク質は、エクオリア・ビクトリアの緑色蛍光タンパク質である。
本発明は、対象において、ＤＮＡ配列の転写の組織特異性を確認するための方法であって、
ａ）緑色蛍光タンパク質をコードするＤＮＡ配列に連結された前記ＤＮＡ配列を有するＤＮＡ分子を、前記ＤＮＡ配列が緑色蛍光タンパク質の発現を制御し得るように、対象の細胞に導入する工程と、
ｂ）緑色蛍光タンパク質の発現を可能とする条件において対象を培養する工程と、
ｃ）該対象の異なる組織中において、緑色蛍光タンパク質の発現を検出することにより、ＤＮＡ配列の発現の組織特異性を測定する工程とを具備する方法を提供する。
本発明は、溶液中の重金属の存在を測定するための方法であって、ａ）緑色蛍光タンパク質をコードするＤＮＡ配列に、緑色蛍光タンパク質以外の遺伝子由来のプロモーターが作動するように連結されているＤＮＡ分子を含む細胞であって、そのプロモーターにおける転写が溶液中の重金属により活性化されるような細胞を培養する工程と；ｂ）重金属の存在を指示する前記緑色蛍光タンパク質の発現を検出する工程とを具備する方法を提供する。
本発明は、溶液中の汚染物質(pollutants)を検出するための方法であって、ａ）緑色蛍光タンパク質をコードするＤＮＡ配列に、緑色蛍光タンパク質以外の遺伝子由来のプロモーターが作動するように連結されたＤＮＡ分子を含む細胞であって、前記プロモーターが溶液中の重金属もしくは毒性有機化合物により活性化されるか、または前記プロモーターが溶液中のストレスタンパク質のためのものであるような細胞を培養する工程と、ｂ）前記緑色蛍光タンパク質の発現を検出する工程であって、該発現が溶液中の汚染物質の存在を指示するものである工程とを具備する方法を提供する。
最後に、本発明は、蛍光性分子量マーカーを製造するための方法であって、ａ）同じリーディング・フレーム内において、既知のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ分子に緑色蛍光タンパク質をコードするＤＮＡ分子を連結する工程と、ｂ）前記工程ａ）で連結されたＤＮＡ分子を、この連結されたＤＮＡ分子によりコードされる蛍光性タンパク質の発現を可能にするような発現系内に導入する工程と、ｃ）前記工程ｂ）で発現された蛍光性タンパク質の分子量を定量することにより蛍光性分子量マーカーを製造する工程とを具備する方法を提供する。
様々な発現系が当業者に知られている。一般的に使用される系の１つである大腸菌発現系が、これに続く欄に記載される。
前記工程ｂ）で発現された蛍光性タンパク質を既知の分子量マーカーと比較することにより、その分子量を定量することができる。あるいは、その連結されたＤＮＡ配列が判っており、それによりコードされるアミノ酸配列も判っていることから、計算により分子量を推測することもできる。態様の１つにおいて、発現された蛍光性タンパク質は精製される。精製された蛍光性タンパク質は分子量マーカーとして用いるのに便利である。
本発明は、以下に続く「実験の詳細」の欄により、より優れた理解が得られるだろう。しかしながら、考察された特定の方法及び結果は、後に添付されている請求の範囲において更に完全に記載されている本発明の例証に過ぎないことを、当業者は容易に正しく認識するであろう。
〔実験の詳細〕
原核細胞（大腸菌Escherichia coli）又は真核細胞（カエノラブディティス・エレガンスCaenorhabditis elegans）中で発現させると、エクオリア・ビクトリア（Aequorea victoria）の緑色蛍光タンパク質（green fluorescent protein,GFP）に対するｃＤＮＡは蛍光性産生物を産生する。この蛍光には、外因性の基質および補因子が必要とされないことから、ＧＦＰの発現は、生体における遺伝子発現およびタンパク質の局在の指標となるものとして使用できる。
発光タンパク質であるエクオリン(aequorin)にカルシウムが結合すると、生物発光クラゲであるエクオリア・ビクトリアは光を発生する（１）。試験管内(in vitro)あるいは異種細胞中では、エクオリンの活性化により青色の光が発生するが、このクラゲは緑色の光を発する。この後者の緑色光は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）であるエクオリン（２）から励起エネルギーを得ているＡ．ビクトリア中の第２のタンパク質によるものである。
精製ＧＦＰは、２３８アミノ酸からなるタンパク質で（３）、青色光を吸収し（３９５ｎｍで最大吸収のピーク、４７０ｎｍで弱い吸収ピークを示す。）、緑色光（５０９ｎｍに発光のピークがあり、５４０ｎｍにショルダーを伴う。）を放射する（２，４）。この蛍光は、極めて安定性が高いので、事実上フォトブリーチング(photobleaching)はみられない（５）。蛍光には、完全なタンパク質(the intact protein)が必要であるが、変性されたタンパク質において見られるのと同様の吸光スペクトル特性が、アミノ酸６４から開始するヘキサペプチドにおいても見られる（６、７）。ＧＦＰの発色団は、１次構造のアミノ酸配列において上記ヘキサペプチド中のＳｅｒ−デヒドロＴｙｒ−Ｃｌｙが環状化することで形成される（７）。デヒドロチロシンを産生し、ポリペプチドを環状化して発色団を形成するメカニズムは不明である。この蛍光タンパク質の生産にとってＡ．ビクトリア由来の付加的因子が必要か否かを確認するために、出願人は非相同系内においてＧＦＰ蛍光を試験した。ここで本出願人は、原核細胞および真核細胞において発現されたＧＦＰは、青色光により励起されると強い緑色蛍光を発しうることを示した。この蛍光にはＡ．ビクトリア由来の付加的遺伝子産生物は必要ないことから、発色団の形成は、種特異的ではなく、偏在的な細胞内構成成分の利用を通してか、または自己触媒作用によってのいずれかにより起こる。
Ｔ７プロモーターの制御下にある大腸菌においてＧＦＰを発現させた結果、対照の細菌においては観察されなかった緑色蛍光が容易に検出された（９）。長波長紫外線光源を用いて照射すると、蛍光細菌が、誘導物質のイソプロピル−β−D−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を含有する寒天平板上に検出された（図１）。この検出された株からＧＦＰを部分精製すると、該部分精製物は、精製された天然タンパク質におけるスペクトルから区別できない蛍光励起スペクトルおよび蛍光放射スペクトルを有することが示された（図２）。組換えＧＦＰのスペクトル特性は、この発光団(chromophore)が、Ａ．ビクトリア由来の他の産生物の非存在下で形成され得ることを示唆する。
線虫のカエノラブディティス・エレガンスの形質転換の結果、蛍光ＧＦＰもまた産生された（１１）（図３）。ｍｅｃ−７遺伝子に対するプロモーターの制御下において、ＧＦＰは少数のニューロン中で発現された。ｍｅｃ−７遺伝子は、β−チューブリンの１つをコードしている（１２）。β−チューブリンは、Ｃ．エレガンスの６触覚受容器ニューロン中に大量に存在し、より量は少ないが他の少数のニューロンにも多量に存在する（１３，１４）。ＧＦＰの発現のパターンは、ＭＥＣ−７抗体によって検出されるパターンまたはｍｅｃ−７ｌａｃＺ融合体から検出されるパターンと同様であった（１３−１５）。一番強い蛍光は、若幼生(younger larvae)の４つの胚由来触覚受容器ニューロン（ＡＬＭＬ、ＡＬＭＲ、ＰＬＭＬ、ＰＬＭＲ）の細胞体中に見られる。上記の細胞からの突起は、神経末端の分枝を含めて、幼虫(larval animals)でしばしば観察された。孵化直後の動物数個体においては、ＰＬＭの突起は短く、突き出してくる成長円錐と見られるものにおいて終結した。日齢の進んだ幼虫においても、残存する触覚細胞(touch cells)（ＡＶＭ及びＰＶＭ）の細胞体が観察できたが、これらの細胞の突起は、より検出することが困難になった。これらの後期胚由来の細胞は、４段階ある幼虫発生の第１段階の時期に生じる（１６）が、その外殖(outgrowth)は次の幼虫の段階において出現し（１７）、第４幼虫段階の間に細胞が機能を持つようになる（１８）。これらの細胞中のＧＦＰによる蛍光は、前述の結果と一致する。すなわち、孵化直後あるいは第１段階後期の幼虫の上記細胞において蛍光は検出されなかったが、しかし、第２段階後期の幼虫では、１０例中４例において、第４段階初期幼虫の９個体では全個体において、若成虫(young adult)では８例中７例において蛍光が検出された（１９）。更に、他の数個のニューロンにおいても、中程度から弱度の(moderate to weak)蛍光が観察された（図３）（２０）。発現パターンの詳細の検討が為された。
天然のタンパク質と同様に、大腸菌およびＣ．エレガンスの両方において発現されたＧＦＰは、４５０−４９０ｎｍ波長の光を照射された場合、極めて安定である（少なくとも１０分間は持続する）。しかしながら、細胞が３４０−３９０ｎｍ又は３９５−４４０ｎｍ波長の光で照射された場合は、フォトブリーチング(photobleaching)が起こる（２１）。
細胞内の遺伝子の活性およびタンパク質の分布をモニターするためには、幾つかの方法が利用できる。これらの方法には、β−ガラクトシダーゼ、ホタルのルシフェラーゼ、およびバクテリアのルシフェラーゼをコードする配列を有する融合タンパク質を形成することが含まれる（２２）。そのような方法では、基質又は補因子を外因的に添加する必要があるため、該方法は、生きた組織での使用に限定される。細胞内ＧＦＰの検出には、近紫外光または青色光による照射のみが必要とされ、基質による限定を受けない。このように、ＧＦＰの検出は、生細胞内の遺伝子の発現とタンパク質の位置を調べるための優れた手段を提供するはずである（２３，２４）。また、それは細胞の増殖および機能を妨害しないように見えることから、ＧＦＰは形質転換の便利な標識にもなると共に、蛍光での活性化による細胞選別を用いることにより細胞の分離を可能にする標識としても利用し得る。また、出願人は、ＧＦＰが将来的には、細胞成長（例えば、ニューロンの突起の生成(elaboration)）および細胞挙動を、イン・シチューで追跡できる生体標識として、利用できると考える。これは、特に、Ｃ．エレガンスおよびミノカサゴのような、本質的に透明な動物において用いることができるであろう。比較的小さなサイズのタンパク質は、ニューロンおよびグリアのように、広範囲に分枝した細胞の細胞質を経由して拡散しやすいと考えられる。ＧＦＰの蛍光はホルムアルデヒド処理後にも維持されることから、固定化標本についても試験できる。加えて、ＧＦＰ発現細胞による適当なレーザー光の吸収により、（ルシフェルイエロー含有細胞で行われてきたように）（２５）、細胞を選択的に殺すことができた。
ＧＦＰ発現に関する詳細な実験
緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする配列をｐＥＴ３ａ発現ベクターの内に含むＴＵ＃５８プラスミド（２９）を、既報の手順（２９）を用いることにより大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）株（A.Roca,ウイスコンシン大学：ノボゲン・カタログ(Novogen Catalogue)に記載）に形質転換した。結果として得られた株（ＳＭＣ３）は、宿主における還元組換え(the reduced recombination)のために、ＧＦＰ発現についての安定性が著しく改善していた（アンピシリン含有、ＩＰＴＧ誘発物質非含有の平板（２９）上で、携帯紫外線ランプを用いて観察すると、すべてのコロニーが明るい蛍光を発した）。
第２の構築物（ＴＵ＃１４７）を、ｐＥＴ１１(A.H.Rosenberg,et al.1987)を用いて、ＴＵ＃５８と同様に作製した。このプラスミドからのＢＬＲ（ＤＥ３）株における発現は、より厳重にコントロールされた。その発現は、ＩＰＴＧ添加直後にみられたが、誘導物質非存在下ではある程度時間が経過した後にのみ観察された。
上記ＳＭＣ３株を用いて、蛍光性産生物の産生にとってのバクテリアの好気的増殖の必要性を試験した。製造業者の指示(Becton Dickinson Microbiology System)に基づき、平板試料をガスパック（Ｇａｓ−Ｐａｋ）容器中で嫌気的条件下にて増殖させた。コロニーの増殖は、嫌気的条件下では遅くなり、また、嫌気的条件下での増殖の少なくとも３日後のコロニーは、検出可能な蛍光を発しなかった（携帯紫外線ランプを使用）。しかしながら、１日間の室内の空気への暴露後、コロニーは、蛍光を発するようになった（数時間後でも幾つかの蛍光が観察された。）。
参照文献および脚注
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８．  プラスミドｐＧＦＰ１０．１は、ｐＢＳ（＋）（ストラタジーンTM）中のλｇｆｐ１０（３）からのＧＦＰのｃＤＮＡをコードするＥｃｏＲＩ断片を含む。ＥｃｏＲＩ部位に隣接するプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応［PCR;R.K.Saiki et al.,Science239,487(1988)］による増幅およびこれに続くＥｃｏＲＩでの消化により該断片を得た。ＤＮＡを、マジック・ミニプレップズ(the Magic Minipreps)の手順（プロメガ(Promega)）により調製し、（付加的なエタノール沈殿の後に）コロンビア内科外科大学のＤＮＡ配列決定機関(the DNA Sequencing facility at Columbia College of Physicians and Surgeons)において、アプライド・バイオシステムズ(Applied Biosystems)ＤＮＡシークエンサー(Sequencer)３７０Ａにより配列決定した。ｐＧＦＰ１０．１におけるｃＤＮＡの配列は、グルタミン残基をアルギニンに置き換える変化である、ＣＡＧからＣＧＧへの、コーディング配列の範囲内のコドン８０における変化のために、公開された配列とは異なる［Ｒ．Ｈｅｉｍ，Ｓ．Ｅｍｒ，およびＲ．Ｔｓｉｅｎ（私信）は、第１にこのクローンにおける可能な配列変化に我々の注意を喚起し、同変化についてそれぞれ独立に言及している。］。この置換には、タンパク質のスペクトル特性において検出可能な効果はない（図２）。
翻訳開始位置のＮｈｅＩ部位及びｐＧＦＰ１０．１由来のＧＦＰコード配列の停止信号に対する５′ＥｃｏＲＩ部位とをもった断片を生じさせるようなＰＣＲを用いて、大腸菌発現構築物を作製した。５′プライマーは、ＡＣＡＡＡＧＧＣＴＡＧＣＡＡＡＧＧＡＧＡＡＧＡＡＣ（配列番号１）であり、３′プライマーは、Ｔ３プライマー（ストラタジーンTM(Stratagene)）であった。このＮｈｅＩ−ＥｃｏＲＩ断片を、標準的方法（２６）により、同様に切断されたベクターｐＥＴ３ａ［Ａ．Ｈ．Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ５６，１２５（１９８７）］に連結した。得られた遺伝暗号配列はＧＦＰの開始ＭｅｔをＡｌａに置換しており、そのＭｅｔはポリペプチド中の第２番目のアミノ酸となる。得られたプラスミド（ＴＵ＃５８）により大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）Ｌｙｓ  Ｓ株［F.W.Studier and B.A.Moffat,J.Mol.Biol.189,113(1986)］を形質転換し、３７℃で増殖させた。ｐＥＴ３ａにより対象の細菌を形質転換した。アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）及び０．８ｍＭのＩＰＴＧを含有する栄養平板上で細菌を増殖させた。紫外線により照射されたとき、この形質転換からの形質転換細菌は、緑色蛍光を示す。この細菌の組換えプラスミドを、ここに記載された実験並びに図２における実験および脚注１０における実験のために、用いた。数か月後、出願人は細菌のコロニーを２つのグループに分けられることに着目した。それは、１）強く蛍光を発するもの；及び２）弱く蛍光を発するもの（出願人は、弱く蛍光を発するものは、突然変異したか、無力化した(disabled)か、または部分的にもしくは完全にＴＵ＃５８を欠失してしまったものであろうと考えている。。）である。１つの強力な蛍光コロニーを選んで細菌株ＳＭＣ１（ＡＴＣＣ受付番号６９５５４）を創出した。［出願人のＣ．エレガンス構築物において、同様のＰＣＲで生じた断片（脚注１１参照）を用いた。他の者がｐＧＦＰ１０．１を使い始める際に、出願人は、他の生物において同様のＰＣＲ断片が蛍光性産生物を産生させるのに（R.Heim,S.Emr,and R.Tsien,私信;S.wang and T.Hazelrigg,私信;L.Lanini and F.McKeon,私信;脚注２３参照）、ＥｃｏＲＩ断片はそうではない（R.Heim,S.Emr,and R.Tsien,私信;A.Coxon,J.R.Chaillet,and T.Bestor,私信）という伝聞を得ている。これらの結果は、配列の５′末端での要素または翻訳開始位置での要素は、発現を阻害することを示唆するものである。］
９．  出願人は、表面蛍光顕微検鏡を装備した多くの種類の顕微鏡（ツァイス・アクシオフォト(Zeiss Axiophot)、ニコン・マイクロフォト(Nikon Microphot)ＦＸＡ、ならびにオリンパス(Olympus)ＢＨ２−ＲＦＣおよびＢＸ５０）を用いた。通常、フルオレセイン・イソチオシアネート蛍光のためのフィルターセットを用いた（例えば、ＢＰ４５０−４９０励起フィルターと、５１０ｎｍ二色性フィルターと、ＢＰ５１５−５６５発光フィルターかまたはＬＰ５２０発光フィルターのいずれかを用いたツァイスフィルターセット）。しかし、幾つかの実験については、低波長で励起されるフィルターセットを用いた（例えば、ＢＰ３９５−４４０フィルターおよびＬＰ４７０フィルター並びに４６０ｎｍ二色性フィルターを用いるか、またはＢＰ３４０−３９０フィルターおよびＬＰ４００フィルターを３９５ｎｍ二色性フィルターとともに用いるツァイスフィルターセット）。数例においては、４７０ｎｍ付近の光により細胞を照射した際、キセノンランプは、水銀灯よりも、より強力な蛍光を与えるように思われた。しかしながら、通常は同程度の結果であった。信号を強めるための試み（例えば、低強度光カメラを用いることによる）は、いくつかの例においては有益であり得るけれども、このような試みは何もなされなかった。
以前の実験は、天然のタンパク質がグルタルアルデヒド固定後に蛍光性を有することを示した(W.W.Ward,未発表データ)。Ｓ．ワン(Wang)およびＴ．ハーゼルリッグ(Hazelrigg)（私信；２３）は、ドロソフィラ・メラノガスター(Drosophila melanogaster)におけるＧＦＰ融合タンパク質がホルムアルデヒド固定後に蛍光性を有することを発見した。出願人のＣ．エレガンス動物及び大腸菌から単離された組換えＧＦＰについて、ホルムアルデヒド固定後に蛍光が維持されることを、出願人は確認した。しかしながら、しばしばカバ−スリップに封をするために用いられる爪磨き(nail polish)中の化学物質は、Ｃ．エレガンスのＧＦＰの蛍光を鈍らせるように思われた。
１０．  出願人の最初の実験において、ＴＵ＃５８を含むＢＬ２１（ＤＥ３）Ｌｙｓ  Ｓ細菌の２５０ｍｌ培養からＧＦＰを精製した。アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）および０．８ｍＭのＩＰＴＧを含むＬＢブロス（２６）中において細菌を増殖させた。ＩＰＴＧが継続して存在した際に誘発は最大であった。にもかかわらず、細菌株ＳＭＣ１を用いた次の実験は、一定の存在量のＩＰＴＧの下で該細菌を増殖させることができなくても、対数相増殖期(the log phase growth)の間はＩＰＴＧにより誘発させ得ることを示している。蛍光タンパク質の産生は、室温で最大である。細胞を、４ｍｌの１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４），１００ｍＭのＮａＣｌ，１ｍＭのＭｇＣｌ2，及び１０ｍＭのジチオスレイトールで洗浄し［A.Kumagai and W.G.Dunphy,Cell64,903(1991)］、次いで、４ｍｌの、０．１ｍＭのＰＭＳＦ，ペプスタチンＡ（１μｇ／ｍｌ），ロイペプチン（１μｇ／ｍｌ），およびアプロチニン（２μｇ／ｍｌ）を含む同緩衝液中で超音波処理（２×２０秒）し、冷却中で５分間、５，０００ｒｐｍで遠心分離した。上清を２回遠心分離し（１５，０００ｒｐｍで１５分間）、次いで、１０ｍＭのトリス（ｐＨ８．０），１０ｍＭのＥＤＴＡ及び０．０２％のＮａＮ3により７倍希釈した。補正された励起及び発光のスペクトルを、ＳＰＥＸのＦ１Ｔ１１蛍光分光器（スペクトロフルオロメーター）により得て、Ａ．ビクトリア由来のＬイソタンパク質型の精製ＧＦＰと比較した（M.Cutler,A.Roth,and W.W.Ward,未発表データ）。５０９ｎｍの固定発光波長を用いて３００−５００ｎｍの励起スペクトルを測定し、３９５ｎｍの固定励起を用いて４１０−６００ｎｍの発光スペクトルを測定した。１秒積分時間及び１ｎｍ波長増により室温で、信号−参照データ（この参照値は、分離型光電子増倍管によるランプ強度を直接測定したものである）として全スペクトルを記録した。スペクトル全体について、スペクトル帯幅を０．９４ｎｍに調節した。
１１．  野生型および突然変異株のＣ．エレガンス動物を増殖させ、S.Brenner,Genetics77,71(1974)に従って遺伝学的な株(genetic strains)を構築した。
（５′プライマーＧＡＡＴＡＡＡＡＧＣＴＡＧＣＡＡＡＧＡＴＧＡＧＴＡＡＡＧ（配列番号２）と３′Ｔ３プライマーとを用いて、）ＰＣＲのための鋳型としてプラスミドｐＧＦＰ１０．１を用いることにより、５′ＮｈｅＩ部位（翻訳開始位置）と３′ＥｃｏＲＩ部位（停止コドンの３′）とを有する断片を産生させた。このＤＮＡを切断して、プラスミドｐＰＤ１６．５１（１２，２７）に連結されたＮｈｅＩ−ＥｃｏＲＩ断片を作成した。該プラスミドｐＰＤ１６．５１は、Ｃ．エレガンスｍｅｃ−７遺伝子のプロモーターを含むベクターである。このＤＮＡ（ＴＵ＃６４）とプラスミドｐＲＦ４としてのＤＮＡとを、C.M.Mello,J.M.Kramer,D.Stinchcomb,and V.Ambros,EMBO J.10,3959(1991)により記載されたようにして、成虫のＣ．エレガンス生殖腺に一緒に注射することにより、野生型Ｃ．エレガンスを形質転換した。なお、注射したＤＮＡは優性のｒｏｌ−６（ｓｕ１００６）突然変異を含んでいる。比較的安定な細胞系統（ＴＵ１７１０）を単離し、その系統に含まれるＤＮＡをMitani et al.(15)により記載されたように組み込んで、組み込まれた要素(the integrated elements)ｕＩｓ３及びｕＩｓ４（それぞれＴＵ１７５４株およびＴＵ１７５５株において）を作製した。
生きているＣ．エレガンス動物を、しばしば麻酔として１０ｍＭのＮａＮ3（別の線虫麻酔のフェノキシプロパノールは、蛍光を消失させた）を用いて（２８）、文献（１６）に記載のようにして寒天（またはアガロース）パッド上に載せ、ツァイス・ユニバーサル(Zeiss universal)かまたはアクシオフォト(axiophot)顕微鏡のいずれかを用いて検鏡した。Ｃ．エレガンスに対しては、長波長透過型発光フィルター(a long-pass emission filter)が最良に働く。というのは、このフィルターを用いると、（動物が成熟するにつれて増大する）動物の腸の自己蛍光が黄色に見えるようになるからである（バンド透過型フィルター(band-pass filter)を用いると、この自己蛍光が緑色に見えるようになり、ＧＦＰ蛍光を不明瞭にする）。
ｕＩｓ３動物よりもｕＩｓ４動物において、さらにずっと強力な蛍光が見られたので（例えば、水銀灯を用いて動物を照射したときは、ｕＩｓ３動物においてＡＬＭ細胞およびＰＬＭ細胞の突起を観察することはしばしば困難であった）、ｕＩｓ４動物は、ここにおいて報告される観察のために用いられた。細胞体蛍光の一般的なパターンは、上記の両株において、および親の代の非組込み株(the parental,nonintegrated strain)において同一であった（この株においては蛍光は、ｕＩｓ４動物における蛍光と同じくらいの強度であった）。しかしながら、ｕＩｓ４動物は異常な表現型を示した。即ち、ＡＬＭとＰＬＭの両触覚細胞がしばしば前方に変位した(displaced)。偶発的な特別の細胞は異常に突出した突起を有していたが、成熟細胞は通常、正確な位置に突起を有していた。これらの細胞は、触覚受容器細胞と同定することができた。というのは、その蛍光は、触覚細胞の発生運命を特定するホメオボックス遺伝子のｍｅｃ−３に依存したからである（１３，１５，１８，２８）。ｍｅｃ−３遺伝子突然変異体（１３，１５）において、頭部のＡＬＭ触覚細胞中のｍｅｃ−７発現は減衰する（しかし、尾部のＰＬＭ触覚細胞中におけるほど劇的にではない）。出願人は、ｕＩｓ３とｕＩｓ４との両方について、ｍｅｃ−３突然変異体のバックグラウンドにおけるＧＦＰ発現の同様の変化を見出している。このように、ＧＦＰはｍｅｃ−７遺伝子の発現パターンを正確に表す。ｕＩｓ３動物における還元的染色(reduced staining)およびｕＩｓ４動物における位置の狂った細胞(the misplaced cells)は、２次的突然変異かまたは組込まれたＤＮＡの量及び位置のいずれかによるものと思われる。
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１９．  成虫において、動物のサイズが太くなること及び腸の自己蛍光がより強力になることは、これらの細胞を不明瞭にする傾向を有する。
２０．  これらは、新たに孵化した動物の頭部（ＦＬＰ細胞を含む）及び尾部における幾つかの細胞、並びに咽頭部に対してちょうど後ろにある１対のニューロンであるＢＤＵ細胞を含む。これらの細胞においてｍｅｃ−７の発現を、以前に観察した（１３，１５）。これら非触覚受容器ニューロンの最強の染色物は、前方に向かう突起を有する尾部における１対の細胞であり、当該突起は、背側筋肉線に沿って突き出ている。恐らくそれらは、ＡＬＮ細胞すなわちＰＬＭ触覚細胞に対する姉妹細胞であろう［J.G.White,E.Southgate,J.N.Thomson,and S.Brenner,Philos.Trans.R.Soc.Lond.B Biol.Sci.314,1(1986)］。
２１．  Ｃ．エレガンスの麻酔として用いられるＮａＮ3の１０ｍＭの存在下において、数秒のうちに、３９５−４４０ｎｍの光によりフォトブリーチング(Photobleaching)がさらに加速される（１１）。しかしながら、Ｃ．エレガンス中の細胞がフォトブリーチングされてしまったときには、１０分以内に幾分かの回復が観察された。この回復がＧＦＰの新規の合成(de novo synthesis)を表すものであるか否かを確定するためには、さらなる研究が必要とされる。また、３４０−３９０ｎｍの光によりＣ．エレガンスを照射したときにも、緑色産生物の急速なフォトブリーチング（１分以内に完了する）が観察された。３４０−３９０ｎｍの光または４５０−４９０ｎｍの光により発生された蛍光を消失させる、３９５−４４０ｎｍの光でのフォトブリーチングとは異なり、３４０−３９０ｎｍの光でのフォトブリーチングは、３９５−４９０ｎｍの光または４５０−４９０ｎｍの光により発生された蛍光に影響するようには思われなかった。実際、４５０−４９０ｎｍの光により産生された蛍光は、３４０−３９０ｎｍの光での短時間のフォトブリーチングの後に、より強力になるように見えた。この選択的なフォトブリーチングは、該動物中での２以上の蛍光性産生物の産生を示し得る。大腸菌およびＣ．エレガンスの中でのＧＦＰ蛍光に関するこれらのデータは、単離された天然の（Ｃ．エレガンス）タンパク質及び大腸菌の（組換え）タンパク質が極めて光安定性が高いことを示唆する予備研究とは対照的である。フォトブリーチングについてのこのイン・ビボでの感受性が、クラゲタンパク質の正常な特徴であるか（Ａ．ビクトリア中での蛍光はまだ試験されていない）、またはＡ．ビクトリアに特有な翻訳後の必然的な改変(a necessary posttranslational modification)の欠如もしくは細胞内における非特異的損傷に由来する結果であるかどうかについては、出願人は知らない。
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２３．  酵母（サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)）においてＧＦＰを発現させることにより、毒性を発すること無く、細胞に強力な蛍光性を付与しうることを、Ｒ．Ｈｅｉｍ、Ｓ．ＥｍｒおよびＲ．Ｔｓｉｅｎ（私信）は発見した。S.WangおよびT.Hazelrigg（私信）は、Ｃ末端及びＮ末端のＧＦＰとのタンパク質融合物はともに、ドロソフィラ・メラノガスター(Drosophila malanogaster)において蛍光性を有することを発見した。L.LaniniおよびF.McKeon（私信）は、哺乳類（ＣＯＳ）細胞においてＧＦＰタンパク質融合物を発現させた。E.Macagno（私信）は、ヒルにおいてＧＦＰを発現させようとしている。T.Hughes（私信）は、哺乳類ＨＥＫ２９３細胞においてＧＦＰを発現させようとしている。
２４．  出願人は、研究者にとって有益である幾つかの他のプラスミド構築物を作成した。それらには、翻訳開始に対して５′のＡｇｅＩ部位と停止コドンにおけるＢｓｍＩ部位とをもった、ＧＦＰをコードする、ＫｐｎＩ−ＥｃｏＲＩ断片を含むｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ（＋）誘導体（ＴＵ＃６５）が含まれる。また、ＳＶ４０核局在化信号(nuclear localization signal)を含むＫｐｎＩ断片を欠いていることを除けば、Ｆｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０（２７）により記載された、４つのＣ．エレガンス  ｌａｃＺ発現ベクター（それぞれ、ｐＰＤ１６．４３，ｐＰＤ２１．２８，ｐＰＤ２２．０４およびｐＰＤ２２．１１）のｇｆｐバージョン（ＴＵ＃６０−ＴＵ＃６３）も入手可能である。
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配列表
（1）一般的情報
（i）出願人：ニューヨーク市におけるコロンビア大学の受託者およびウッズ・ホール海洋学研究所
（ii）発明の名称：緑色蛍光タンパク質の使用
（iii）配列の数：２
（iv）郵便あて先：
(A)あて名：クーパー＆ダンハム
(B)通り：３０  ロックフェラープラザ
(C)市：ニューヨーク
(D)州：ニューヨーク
(E)国：アメリカ合衆国
(F)郵便番号：１０１１２
（v）コンピュータ読取り可能な形態：
(A)媒体タイプ：フロッピーディスク
(B)コンピュータ：ＩＢＭ  ＰＣ  コンパチブル
(C)オペレーティングシステム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ
(D)ソフトウエア：ＰａｔｅｎｔＩｎ  リリース＃１．０，バージョン＃１．２５
（vi）現在の出願データ：
(A)出願番号：
(B)出願日：
(C)特許分類：
（viii）弁護士／弁理士  情報：
(A)名称：ホワイト，ジョン  Ｐ
(B)登録番号：２８，６７８
(C)照会／事件  番号：０５７５／４３５５７−Ｂ−ＰＣＴ
（ix）電話連絡情報：
(A)電話番号：(212)977-9550
(B)ファックス番号：(212)664-0525
(C)テレックス番号：422523 COOP UI
（2）配列番号１のための情報：
（i）配列特性：
(A)長さ：２５塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（iii）ハイポセティカル配列：Ｎｏ
（vi）起源：
(A)生物名：大腸菌
（xi）配列の記載：配列番号１：
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（2）配列番号２のための情報：
（i）配列特性：
(A)長さ：２８塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ｃＤＮＡ
（iii）ハイポセティカル配列：Ｎｏ
（vi）起源：
(A)生物名：大腸菌
（xi）配列の記載：配列番号２：
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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