(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
支持体の表面Ｓ上で核酸を配列させる方法であって、下記工程を含んでなる方法：
（ａ）表面Ｓを有する支持体を核酸と接触させて、表面Ｓに核酸の一端をつなぎとめる；
（ｂ）溶媒Ａ、表面Ｓ、および媒体Ｂの間の接触から生ずるトリプルラインＳ／Ａ／Ｂ（メニスカス）を形成させる；および
（ｃ）メニスカスが動かされて、表面上で核酸を整列させる。
【請求項２】
メニスカスの移動が溶媒Ａの蒸発による行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
メニスカスの移動が表面Ｓに対するＡ／Ｂ界面の相対的移動による行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
メニスカスを移動させるために、表面Ｓが溶媒Ａから除去されるか、または溶媒Ａが表面Ｓから除去される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
メニスカスが水／空気メニスカスである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
支持体が、少くとも表面で、有機または無機ポリマー、金属、酸化または硫化金属、ケイ素のような半導体元素または半導体元素の酸化物、あるいはそれら組合せの１つからなる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
支持体が、少くとも表面で、ガラス、表面酸化ケイ素、金、グラファイト、硫化モリブデンまたは雲母からなる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
支持体がプレート、ビーズ、繊維または粒子系の形である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
整列される高分子が溶液中にある溶媒Ａが２つの支持体間におかれ、そのうち少くとも一方が表面Ｓの上記支持体に相当し、メニスカスが蒸発により移動される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
高分子の固定が物理化学的相互作用により、特に吸着または共有結合により、表面と高分子とで直接、あるいは表面と上記高分子を認識しおよび／またはそれと相互作用する他の分子とで間接的に行われる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
高分子またはその高分子を認識できる生物活性を有する分子に親和性を有する露出反応基を表面に有した支持体が用いられる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
表面がビニル、アミン、カルボキシル、アルデヒドまたはヒドロキシル基から選択される基でコートされる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
表面が
-支持体上に、少くとも
・支持体に親和性を有する結合基、および
・結合条件下で上記支持体および上記結合基に親和性をほとんどまたは全く有しないが、結合に続く化学的修飾後に高分子または生物活性を有する分子と場合により親和性を有する露出基
を有する長い構造の有機化合物の実質的に単分子の層
を有する、請求項１０または１２に記載の方法。
【請求項１４】
高分子の一部の固定が、表面で吸着により、媒体の既定領域のｐＨまたはイオン含有率で上記高分子を上記表面と接触させることにより、あるいは既定電圧を固定表面に適用することにより行われる、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
固定を行うためのｐＨが、完全吸着の状態に有利なｐＨと、吸着の不存在に有利なｐＨとの間の範囲で選択される、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
核酸またはタンパク質の固定が、媒体の既定領域のｐＨまたはイオン含有率で拡散またはタンパク質を表面と接触させることにより、エチレン性二重結合をもつ基またはアミン基を有した表面への吸着により行われる、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
非官能化ＤＮＡの固定がビニルまたはアミン基で終わる分子でコートされた表面への吸着により行われる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ＤＮＡの固定が、８以下のｐＨでＤＮＡを表面と接触させることにより、エチレン性二重結合を有する基を有する表面においてその末端により行われる、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
反応が５〜６のｐＨで行われ、その後ｐＨ８で停止される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ＤＮＡの固定がポリリジンまたはアミン基で終わるシラン基でコートされた表面でその末端により行われる、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
ＤＮＡの固定が、８〜１０のｐＨでＤＮＡを表面と接触させることにより、アミン基でコートされた表面でその末端により行われる、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
ＤＮＡの固定が、５〜８のｐＨでＤＮＡを表面と接触させることにより、酸浴中で予め処理されたガラス表面でその末端により行われる、請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
請求項１〜２２のいずれか一項に記載された整列方法が用いられ、その場合にサンプル高分子を認識できる生物活性を有する分子が表面Ｓと結合するようになり、検出、分離またはアッセイが結合分子または上記高分子の存在を検出する試薬、蛍光またはその他を用いて行われることを特徴とする、サンプル中における高分子の検出、分離および／またはアッセイ方法。
【請求項２４】
生物活性を有する高分子および分子がタンパク質、核酸、脂質、多糖およびそれらの誘導体から選択される、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
生物活性を有する高分子および分子が抗体、抗原、ＤＮＡ、ＲＮＡ、リガンドまたはそれらのレセプターと、その誘導体から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
結合ＤＮＡが、サンプルから単離されるＤＮＡ配列と相補的な配列を含む、請求項２３〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
結合タンパク質が、サンプルから単離されるタンパク質を特異的に認識して結合することができる、請求項２３〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
生物活性を有する分子がビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、それらの誘導体または抗原-抗体系から選択される、請求項２３〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
表面が低蛍光を示し、試薬が蛍光性である、請求項２３〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
試薬がビーズからなる、請求項２３〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
検出が光学または近視野顕微鏡測定により行われる、請求項２３〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
生物活性を有する分子とサンプルの高分子との反応産物が検出前にミスマッチを壊すためにストレスに付される、請求項２３〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
-高分子が溶液中にある溶媒Ａに相当するサンプルが、ＤＮＡ／ＤＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを形成するかまたはタンパク質／タンパク質反応産物を形成させるための条件下で支持体の表面と接触させられ、
-ハイブリッド、またはハイブリッドまたは反応産物を標識するための高分子が一部分で固定され、残りが溶液中にあり、それがハイブリッドまたは上記標識高分子を配向させるために溶媒と表面との接触で作られるメニスカスの移動により伸長され、こうして配向されたハイブリッドまたは上記標識高分子の測定または観察が行われる、
ことを特徴とする、請求項２３〜３２のいずれか一項に記載のサンプル中におけるＤＮＡ配列またはタンパク質からなる高分子の検出方法。
【請求項３４】
結合ＤＮＡおよびサンプルＤＮＡが別々に“着色”され、伸長後にサンプルＤＮＡの末端に対する相補的配列の位置が測定される、請求項２３〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
ＥＬＩＳＡまたはＦＩＳＨ検出法が用いられる、請求項２３〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
サンプルが核酸の酵素増幅の産物または基質である、請求項２３〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
１以上の既定ＤＮＡ配列の位置またはサイズを調べるために、ＤＮＡが伸長され、その後変性され、そして特異的プローブとハイブリッド形成される、請求項２３〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
ＤＮＡが請求項１〜３７のいずれか一項に記載された方法により整列および／または検出される、ゲノムＤＮＡ上における遺伝子の物理的マッピング方法。
【請求項３９】
ゲノムＤＮＡ上における望ましい遺伝子の位置またはサイズが、マッピングされる上記遺伝子に特異的なプローブとのハイブリッド形成により調べられる、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
１以上の所定ＤＮＡ配列の存在または不存在を調べるために、ＤＮＡが伸長され、その後変性され、そして特異的プローブとハイブリッド形成される、請求項３３〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
請求項１〜２６のいずれか一項に記載された方法により整列されたゲノムＤＮＡ上における遺伝子の位置がその遺伝子に特異的なプローブにより同定され、上記遺伝子の配列および／またはそのフランキング配列の酵素増幅が行われ、増幅産物が単離されることを特徴とする、ゲノムＤＮＡからの遺伝子の作製方法。
【請求項４２】
外来遺伝子の標的挿入により真核細胞のゲノム中で遺伝子を置き換える方法に有用なＤＮＡ構築物を作製し、上記外来遺伝子は請求項４１に記載された方法により得られる、請求項４１に記載された方法により得られた遺伝子の使用。
【発明の詳細な説明】
本発明は、ポリマーのような高分子（巨大分子）または生物活性を有する高分子、特にＤＮＡまたはタンパク質を整列させるための方法に関する。本発明は、サンプル中の高分子について検出し、分子内距離を測定し、それを分離および／またはアッセイするためのプロセスにおけるこの方法の適用にも関する。
高分子のコンホメーションをコントロールすることは、例えばセンサーまたはコントロールされる分子アセンブリーの製造、あるいは別に検出および分析の問題において、大きな工業的挑戦である。長い分子コンホメーションを有することは有用なことかもしれない。例えば、ポリマーが基体上でつなぎとめられる（grafted）場合、電場、流動の作用によるかまたはオプティカルツィーザー（optical tweezer）によってそれらを伸長させることが提案された。特に、生物学において、電気泳動（Zimmermann and Cox,Nucl.Acid Res.,22,p.492,1994）、自由流動（Parra and Windle,Nature Genetics,5,p.17,1993およびＷＯ  ９３／２２４６３）による、またはゲル中における（Schwartz et al.,Science,262,p.110,1993およびＵＳＰ  ３３５３１）あるいはオプティカルツィーザー（Perkins et al.,Science,264,p.819,1994およびＵＳＰ  ５０７９１６９）によるＤＮＡの整列は、マッピングまたは病原体の検出で多くの可能性を開く。
これらの方法は一般的に不完全な整列または別に一時的整列を行えるだけであり、即ちストレスが消えると分子の緩和が起きる。オプティカルツィーザーの場合、その方法は高価であり、一度に１分子だけに制限され、無資格者により行うことが困難である。
細胞溶解後に流動によりＤＮＡを整列させ、その後乾燥させる特別な技術が提案された（I.Parra and B.WindleおよびＷＯ  ９３／２２４６３）。得られた並びは非常に不完全で非均一であり、多くの非整列物が観察される。
本発明の主題は、溶媒Ａおよび表面Ｓおよび媒体Ｂ間の接触から生ずるトリプルラインＳ／Ａ／Ｂ（メニスカス）が上記表面Ｓ上で動かされ、高分子が一部、特に一端、を表面Ｓ上につなぎとめ、他の部分、特に他端、が溶媒Ａで溶液中にあることを特徴とする、支持体の表面Ｓ上に高分子を整列させるために新規で簡単な方法である。
一部が基体上につなぎとめられ、分子の残りが溶液中で遊離して存在している分子におけるメニスカスの単なる通過で、移動メニスカスに対して垂直にそれらを均一に整列させることができ、メニスカス後にそれらを表面上に吸着させることが、本発明により観察された。この現象はここでは“分子コーミング”（molecular combing）と呼ばれる。
更に具体的には、分子の遊離部分の伸長は、表面Ｓ、溶媒Ａと、気体（通常空気）でもまたは他の溶媒でもよい媒体Ｂとの間でメニスカスを形成するトリプルラインＳ／Ａ／Ｂの通過により行われる。
具体的態様において、メニスカスは水／空気メニスカスであり、即ち溶媒Ａは水溶液であり、媒体Ｂは空気である。
更に、特に油／水または水／界面活性剤／空気のような他の系に分子を伸長させるために、ここで用いられる空気／水メニスカスを拡張させることが可能である。
メニスカスの移動は、表面Ｓに対する流体ＡおよびＢの相対的移動により行える。一態様において、表面Ｓは溶媒Ａから除去でき、逆に溶媒Ａは表面Ｓから除去できる。
特に、メニスカスは機械的手段、特に気体を吸引または吹込むことによる気圧手段か、あるいは特に溶媒Ａまたは媒体Ｂを押込または吸引することによる液圧手段で動かすことができる。
こうして、メニスカスの移動は溶媒Ａの徐々な蒸発により行える。
メニスカスの移動が機械的に行われるとき、それは界面Ａ／Ｂの並進によるかまたは表面Ｓの並進により行える。
具体的態様において、溶媒は少くとも一方が表面Ｓの支持体に相当する２つの支持体間におかれ、メニスカスは例えば蒸発により動かされる。
“支持体”とは、付着がメニスカスの通過に耐える上で十分なあらゆる基体のことであると本明細書では理解される。
支持体は、少くとも表面で、有機または無機ポリマー、金属、特に金、酸化または硫化金属、半導体元素または半導体元素の酸化物、例えば酸化ケイ素あるいはそれらの組合せ、例えばガラスまたはセラミックからなる。
更に具体的にはガラス、表面酸化ケイ素、グラファイト、雲母および硫化モリブデンが挙げられる。
“支持体”としては、スライド、ビーズ、特にポリマービーズのような単一支持体だけでなく、棒、繊維または構造支持体のような何らかの形態と、粉末、特にシリカ粉末のような粒子が用いられるが、これらは様々なアッセイ技術で知られるように更に磁気、蛍光または着色化できる。
支持体は、有利にはカバースリップの形態である。好ましくは、支持体は蛍光をほとんどまたは全く有しない。
普通ポリマーのような高分子、あるいはＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質のような生体ポリマーは、支持体上に常法で固定することができる。
整列される高分子は、タンパク質、特に抗体、抗原、リガンドまたはそれらのレセプター、核酸、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＰＮＡ、脂質、多糖あるいはそれらの誘導体のような生体高分子から選択することができる。
伸長力は位置的にメニスカスのすぐ付近内で作用することが、本発明により観察された。それは分子の長さ、固定された分子の数と、広範囲にわたるメニスカスの速度と無関係である。これらの特徴は分子を均一かつ再現的に整列させる上で特に重要である。
界面の性質を変える界面活性剤要素を溶媒Ａおよび／または媒体Ｂに加えることは、本発明により可能である。本発明によると、伸長は実際には界面活性剤の添加によるかまたは十分な表面処理によりコントロールできる。
高すぎる表面-高分子間の引力（例えば、過度に高レベルの吸着）はメニスカスによる分子の整列を妨げることがあり、これらの分子は必ずしも伸長されない状態で表面に吸着されたままになる。好ましくは、表面は上記高分子の低吸着速度を示し、そのため固定された分子だけが整列されて、他はメニスカスにより運ばれる。
しかしながら、様々な種類の表面上に分子を一部、特にそれらの末端だけで吸着によりつなぎとめ、分子の残りは溶液中に遊離して存在させて、上記のようにメニスカスの通過によりそれらを整列させるために、（特にＤＮＡまたはコラーゲンのような長い分子の場合で）高分子の一部、特にその末端とその他の部分との吸着に様々な差異を設けることが可能である。
表面への高分子の吸着は、媒体のｐＨまたはイオン媒体含有率、あるいは表面上で適用される電圧により容易にコントロールできる。表面電荷と、表面および分子間の静電気（反発または引力）相互作用はこうして変えられ、それにより表面への分子の完全吸着の状態から吸着の全体的不在まで移行させることができる。これら２つの極端なケースの間には、吸着が好ましくは分子の末端で起きて、したがってそれらを表面に固定してから、それらをメニスカスの通過により整列させるために有利に用いられる、ある範囲のコントロールパラメーターが存在する。
整列されると、分子は表面に強く付着する。ＤＮＡの場合には、それらの整列後数ヶ月経て蛍光によりそれらを観察することが可能であった。
したがって、本発明はParraおよびWindleにより提案された方法と非常に異なり、即ち本発明によると分子が表面に固定されてからメニスカスの通過により均一に整列されるのに対して、ParraおよびWindle法では流体力学流動が分子を非均一的に伸長させるために用いられて、分子が表面上に非特異的に吸着されるようになるからである。
他の技術も分子を伸長および整列させることができる。このため、一端に固定された、溶液中における分子の動的配向は、電気泳動または液圧流により得られる。しかしながら、観察された結果は、これらの技術がメニスカスの使用よりもかなり非効率的であることを示している。
表面への高分子の“固定（anchoring）”とは、上記のように、共有結合と、吸着のような物理化学的相互作用に基づく結合のような非共有結合との双方による、化学反応性に基づく結合と理解すべきである。
高分子のこの固定は、表面に（または、と）直接または間接的に、即ち他の分子、特に生物活性を有する他の分子のような結合鎖を介して行われる。つなぎとめが間接的に行われるとき、高分子は上記結合鎖に化学的につなぎとめることができ、あるいは特に上記中間結合鎖が上記高分子を認識してそれと相互作用する生物活性を有する分子であるときには、上記結合鎖と物理化学的に相互作用できる。
一態様において、高分子および上記結合鎖は双方とも、各々抗原および抗体、相補的核酸または脂質のような、相互作用する生物活性を有する分子である。これらの場合において、高分子の非共有結合は抗原-抗体、リガンド-レセプター、相補的核酸断片間のハイブリッド形成、あるいは脂質間の疎水性または親水性相互作用タイプの結合からなる。
このため、ある生物学的反応、特に抗原-抗体反応、ＤＮＡまたはＲＮＡハイブリッド形成反応、タンパク質間反応またはアビジン／ストレプトアビジン／ビオチンタイプ反応、並びにリガンドとのレセプターとの反応の非常に高い特異性および非常に高い選択性を利用する。
このため、表面Ｓで高分子の直接的または間接的固定を行うためには、ある特異性を有した固体表面を用いることが可能である。修飾またはその他が施されたあるタンパク質またはＤＮＡを結合させることができるある前処理表面を用いることが特に可能である。
このような表面は、例えばそれらの表面にＣＯＯＨ、ＮＨ2またはＯＨ基を有した様々な形で市販されている（例えば、Covalink,Costar,Estapor,Bangs,Dynal）。
この場合には、反応基、例えばアミンでＤＮＡを官能化させて、これら表面と反応を行わせることが可能である。しかしながら、これらの方法では結合されるＤＮＡの特異的官能化を要する。
ＤＮＡの事前処理なしに固定する技術も記載されている。この方法はＤＮＡ分子の５′末端で遊離リン酸を表面の二級アミン（ＮＨ Covalink表面）と反応させることからなる。
吸着による固定は、分子の末端とその中間部分との吸着性に差異があるとすれば、媒体のｐＨ、イオン含有率または表面上への電圧の適用により表面電荷をコントロールすることで分子の末端の吸着により行える。本発明によれば、非官能化ＤＮＡ分子は、例えば、ポリリジン分子のようなビニルまたはアミン基で終わる分子でコートされた表面、あるいはビニルまたはアミン基で終わるシランタイプ分子でコートされたガラス、または別に酸浴で予め清浄化されたガラスカバースリップのような様々な表面上にこうして固定された。この後者の場合に、ガラスの表面は実際上ＳｉＯＨ基を有している。
これらすべての場合において、ＤＮＡが固定されるｐＨ範囲は、完全吸着の状態と吸着の不存在との間で選択され、後者はより塩基性のｐＨにおかれたときである。この技術は非常に一般的であり、当業者であれば多くのタイプの表面に拡張できることが理解される。
各々互いに特異的に、即ち例えばＰ1をＰ0と反応させることができる、第二反応基またはタンパク質Ｐ1でコートされた表面と反応させるために、ＤＮＡを第一反応基またはタンパク質Ｐ0で官能化させることも可能である。Ｐ0／Ｐ1ペアには下記タイプのペアがある：例えばビオチン／ストレプトアビジン（Zimmermann and Cox）またはジゴキシゲニン／ジゴキシゲニンに対する抗体（抗ＤＩＧ）（Smith et al.,Science,258,p.1122(1992)）。
好ましくは、固定表面は、特に検出が蛍光で行われるとき、整列後に分子の検出を妨げないように低い蛍光レベルを有する。
本発明によれば、反応条件下で高分子の一部のみと親和性を有する表面を有した固体支持体が、高分子の残りは溶液中で遊離したままで、好ましく用いられる。
一態様において、分子そのものでもあるいはそれを認識しおよび／またはそれと相互作用する分子でもよい、生物活性を有する一のタイプの分子と親和性をもつ露出基を層の外側に有した有機化合物の少くとも１つの層を表面に有する固体支持体が用いられる。
したがって、支持体は反応基または生物活性を有する分子でコートされた表面を有することができる。
“親和性”とはいずれかのタイプの化学反応性と吸着の双方のことであるとここでは理解されるべきであり、これは修飾またはその他が施された露出基への分子の結合の任意条件下におけるものである。
一態様において、表面は本質的にコンパクトであり、即ちそれは内層および／または支持体への生物活性を有する高分子による接近を制限し、これは非特異的相互作用を最少に抑えるためである。
分子の場合により修飾された部分を結合させることができる反応露出基（例えばＮＨ2、ＣＯＯＨ、ＯＨ、ＣＨＯ）または生物活性を有する高分子（例えば、ストレプトアビジンまたは抗体のようなタンパク質、オリゴヌクレオチドのような核酸、脂質、多糖およびそれらの誘導体）でコートされた表面を用いることも可能である。
このため、公知方法（"Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linking",S.C.Wong,CRC Press(1991)）に従いストレプトアビジンまたは抗体でコートされた表面は、特異的部位にビオチンまたは抗原を有した高分子を結合させることができる。
同様に、一本鎖オリゴヌクレオチドを有するように処理された表面は、相補的配列を有するＤＮＡ／ＲＮＡをそれらの上に固定するように働くことができる。
露出反応基を有する表面の中では、露出基が-ＣＯＯＨ、-ＣＨＯ、-ＮＨ2、-ＯＨ基であるか、あるいはそのままで用いられるかまたは特に-ＣＨＯ、-ＣＯＯＨ、-ＮＨ2もしくは-ＯＨ基を与えるように活性化されうる、二重結合-ＣＨ＝ＣＨ2基をもつビニル基であるものが挙げられる。
本発明による高度に特異的な表面をもつ支持体は、様々な方法を用いて得られる。例えば
（Ａ）下記のような反応基を有する、少くとも１ｎｍ厚の場合により分岐された含炭素ポリマー層、および
（Ｂ）固体支持体上に１以上の分子層を沈着させるかまたは固定することにより得られる表面（後者は、非制限例としてLangmuir-Blodgettフィルムのような非共有結合により結合された連続層の形成によるか、または共有結合により結合された層を形成させる分子自己集合により得られる）
が挙げられる。
第一の場合に、表面は、ポリマーの表面で上記露出基を作る少くとも１種のモノマーの重合、上記露出基を作るためのポリマーの表面の部分的解重合、またはポリマーの沈着によって得られる。
この方法において、形成されたポリマーはポリエン誘導体のようなビニル結合、特にポリブタジエン、ポリイソプレンまたは天然ゴムのような合成ゴムタイプの表面を有している。
第二の場合において、高度に特異的な表面は
-支持体上に、少くとも
・支持体に親和性を有する結合基、および
・結合条件下で上記支持体および上記結合基に親和性をほとんどまたは全く有しないが、結合に続く化学的修飾後に一のタイプの生体分子と場合により親和性を有する露出基
を有する長い構造の有機化合物の実質的に単分子の層
を有する。
結合には、まず第一に、Langmuir Blodgettフィルムのような、特に親水性／親水性および疎水性／疎水性タイプの非共有タイプがある（K.B.Blodgett,J.Am.Chem.Soc.,57,1007(1935)）。
この場合に、露出基または結合基は親水性または疎水性のいずれか、特にＣＨ3、ＣＦ3、ＣＨＦ3、ＣＨ2Ｆのようなアルキルまたはハロアルキル基であり、他の基は親水性である。
結合は共有タイプでもよく、結合基はこの場合に支持体と化学反応する。
類似構造のある表面は、特に結合が共有であるときに、電子工学分野で既に挙げられている（L.Netzer and J.Sagiv,J.Am.Chem.Soc.,105,674(1983)およびＵＳ-Ａ-４  ５３９  ０６１）。
結合基の中では、更に具体的には、金属アルコキシドまたは半導体タイプの基、例えばシラン、特にクロロシラン、シラノール、メトキシおよびエトキシシラン、シラザンと、ホスフェート、ヒドロキシル、ヒドラジド、ヒドラジン、アミン、アミド、ジアゾニウム、ピリジン、サルフェート、スルホネート、カルボキレート、ボロネート、ハロゲン、酸ハライド、アルデヒド基が挙げられねばならない。
最も具体的には、結合基として、隣接相当基と交差反応して架橋を作ることができる基が好ましくは用いられる。例えば、それらは金属アルコキシドまたは半導体タイプの誘導体、例えばシラン、特にジクロロシラン、トリクロロシラン、ジメトキシシランまたはジエトキシシランと、トリメトキシまたはトリエトキシシランである。
結合基の選択は明らかに支持体の性質に依存しており、シランタイプ基がガラスおよびシリカ上での共有結合によく適している。
露出基に関して、表面に関係なく、それらは好ましくはエチレン基、アセチレン基または芳香族基、一級、三級または二級アミン、エステル、ニトリル、アルデヒド、ハロゲンから選択される。しかし、それらは最も具体的にはビニル基であり、実際には後者は表面または高分子の化学修飾なしに、例えばカルボキシル基またはカルボキシル基の誘導体、例えばアルコール基、アルデヒド基、ケトン基、酸性基、一級、二級もしくは三級アミンを与えるように、あるいは核酸およびタンパク質のような生体高分子のｐＨ依存的な直接的固定を行えるように、結合後に化学的に修飾させることができる。
好ましくは、露出基を結合基に連結する鎖は、少くとも１つの炭素原子、好ましくは６以上、通常３〜３０の炭素原子をもつ鎖である。
支持体自体に関しては、表面の前処理をしたまたはしていないガラス、表面酸化ケイ素、ポリマーまたは金の使用が通常好ましい。
ガラスまたはシリカの場合には、シラン誘導体を用いた表面官能化に関する公知技術が有利に使用でき、例えばＳｉ-ＯＨ＋Ｃｌ3-Ｓｉ-Ｒ-ＣＨ＝ＣＨ2でＳｉ-Ｏ-Ｓｉ-Ｒ-ＣＨ＝ＣＨ2を得る（Ｒは例えば（ＣＨ2）4からなる）。このような反応は文献で公知であり、超高純度溶媒を用いる。その反応では外部に露出したＣ＝Ｃ末端を表面に有する分子の層を形成する。
金の場合において、これは場合により基体上で薄層の形をとるが、表面官能化について公知の技術ではチオール誘導体を用い、例えばＡｕ＋ＨＳ-Ｒ-ＣＨ＝ＣＨ2でＡｕ-Ｓ-Ｒ-ＣＨ＝ＣＨ2を得る（Ｒは例えば（ＣＨ2）4である）。このような反応は液体媒体で記載されており、先のトリクロロシラン-シリカ反応のように、外側に露出したＣ＝Ｃ末端を表面に有する分子の層を形成する。
勿論、“支持体”という用語は、スライドのような単一表面だけでなく、シリカ粉末またはポリマービーズのような粒子と、更に棒、繊維または構造支持体のような通常の形態も含有しており、これらは様々なアッセイ技術で知られるように更に磁気、蛍光または着色化できる。
好ましくは、支持体は、検出が蛍光で行われるとき、蛍光を全くまたはほとんど有しないように選択される。
上記方法（Ａ）または（Ｂ）に従い得られた表面は、
（ｉ）必要時に非常に低い固有蛍光レベル、即ち検出される単一分子の蛍光シグナルよりも小さい蛍光バックグラウンドノイズ（１００×１００μｍの典型的表面積当たり）
（ii）表面との弱い非特異的相互作用を有する肉眼的マーカーの存在の同定に基づく、以下で記載される高いＳ／Ｎ比を有する様々な技術により可能な、分子の数と無関係なＳ／Ｎ比で単離された分子を検出する可能性
を有している。
こうして得られた表面は、
-タンパク質
-核酸
-脂質
-多糖およびその誘導体
から選択される、生物活性を有する高分子でコートされることが好ましい。
タンパク質の中では、抗原および抗体、リガンド、レセプターだけでなく、アビジンまたはストレプトアビジンタイプの産物と、更にこれら化合物の誘導体が挙げられる。
ＲＮＡおよびＤＮＡの中では、α、β誘導体と、チオ誘導体、およびＰＮＡのような混合化合物も挙げられる。
例えば糖ペプチドおよびリポ多糖のような混合化合物、またはウイルス、特に細胞のような他の要素、またはビオチンのような化学化合物も結合させることができる。
生体高分子の結合は共有でも、あるいは例えば吸着、水素結合、疎水性、イオン相互作用による非共有でもよく、その場合には架橋が公知方法（"Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linking",S.C.Wong,CRC Press(1991)）によりグラフト化された分子で有利に行うことができ、これはそれらの付着性を高めるためである。
上記のように、生物活性を有する分子と直接反応を行う露出基を有することが可能であるが、生体分子の結合前にヒドロキシル、アミン、アルコール、アルデヒド、ケトン、ＣＯＯＨ基またはこれら基の誘導体に上記のように変換されるように、露出基が結合後に処理されることも考えることができる。
このような基が露出されたとき、例えばタンパク質および／またはＤＮＡの結合技術は知られており、それらは実際には生物学的分析に既に用いられた表面、特にCostar表面、Nunc表面または、例えばEstapor,BangsおよびDynalのようなマイクロビーズで行われた反応であり、そこには生物学的対象の分子、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、タンパク質または抗体が固定されている。
露出基が以下で“表面Ｃ＝Ｃ”または“エチレン性結合のある表面”と称される-ＣＨ＝ＣＨ2基である場合には、特にＤＮＡまたはタンパク質の直接固定について述べた文献は存在しない。
本発明の枠組み内で、これらの表面は高度にｐＨ依存的な反応性を有することが証明された。この特徴はｐＨ領域を用いて核酸またはタンパク質を固定することを可能にするが、反応速度はしばしばｐＨでコントロールできる。
ＤＮＡの固定は、８以下のｐＨでＤＮＡを表面と接触させることにより、エチレン性二重結合のある基を有した表面上においてその末端を行える。
特に、反応は５〜６のｐＨで行われ、その後ｐＨ８で停止される。
このため、ｐＨ５．５でＤＮＡの場合、固定反応は（それが拡散で制限されないならば）１時間で完了し、末端を介して生じる。他方ｐＨ８だと、結合は非常に小さい（大きさ５〜６程度で反応速度が小さい）。末端に特異的なこのｐＨ依存性結合効果は、-ＮＨ2と-ＣＯＯＨまたは-ＰＯＯＨとのペプチドまたはホスホルイミド結合を形成するＤＮＡ（ビオチン、ＤＩＧ、ＮＨＳなど）または特異的試薬（カルボジイミド、ジメチルピメリデート）の官能化を要する他の表面と比較したときの改善である。
ポリリジンまたはアミン基で終わるシラン基でコートされた表面上へのその末端だけの吸着によりＤＮＡの固定を行うことも可能である。
アミン基でコートされた表面上へその末端によりＤＮＡの固定を行うために、ＤＮＡは８〜１０のｐＨで表面と接触させられる。
同様に、８〜１０のｐＨでＤＮＡを上記表面と接触させることにより、酸浴中で予め処理されたガラス表面上にその末端でＤＮＡの固定を行うことが可能である。
本発明が同様の目的で生物学的対象のすべての高分子の場合によりｐＨ依存的な結合を行えることは言うまでもない。
同様に、これらの表面はタンパク質（プロテインＡ、抗ＤＩＧ、抗体、ストレプトアビジンなど）を直接固定することができる。（ｉ）分子の活性は保存できて、（ii）作製表面（初めはＣ＝Ｃ）の反応性は対象分子だけの反応性を優先して完全に遮蔽されることが観察された。したがって、比較的高い初期反応性から出発して、非常に高度に特異的な反応性を有する表面、例えばタンパク質上にある特異的部位のものに移行することが可能である。
表面に特異的抗体（例えば抗ＤＩＧ）を固定しておくと、反応性が抗原（例えばＤＩＧ基）に限定された表面が作られる。これは、初期化学基がグラフト化された抗体ですべて遮蔽されていることを示している。
生物活性を有する他の分子、特にウイルスまたは他の成分、特に膜、膜レセプター、多糖、ＰＮＡを反応性（化学的または生化学的）表面上につなぎとめることも可能である。
生物学的対象の反応（例えばＰＣＲ）産物を作製された表面上に結合させることも可能である。
本発明による方法では、抗原／抗体および／またはＤＮＡ／ＲＮＡカップリング技術を用いて、生体分子の検出および／または定量と、更には分子内距離の測定、ある生体分子、特にサンプルの分離を行える。
特に、本発明の主題はサンプル中におけるＤＮＡ配列またはタンパク質からなる高分子の検出方法であり、本発明によると、
-上記高分子が溶液中にある溶媒Ａに相当するサンプルが、ＤＮＡ／ＤＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを形成するかまたはタンパク質／タンパク質反応産物を形成するための条件下で支持体の表面と接触させられ、
-ハイブリッドまたは反応産物を標識するためのハイブリッドまたは高分子が一部分で固定されて、残部が溶液中で遊離しており、それはハイブリッドまたは上記標識高分子を配向させるために溶媒と表面との接触で作られるメニスカスの移動により伸長され、こうして配向されたハイブリッドまたは上記標識高分子の測定または観察が行われる
ことで特徴付けられる。
有利には、結合ＤＮＡおよびサンプルのＤＮＡは別々に着色されて、伸長後に、サンプルＤＮＡの末端に対する相補的配列の位置が測定される。
適切には、ＥＬＩＳＡまたはＦＩＳＨ検出法が使用できる。
ＤＮＡサンプルはＰＣＲのようなＤＮＡ酵素増幅の産物でもまたは基質でもよく、即ちＤＮＡの増幅は本発明の方法に従い固定および整列されてから、あるいはその固定またはその整列前に行える。
メニスカスの通過は、ロッドの形で分子を直線的に伸長させることにより、それらが標識されたらそれらをより容易に検出できるようにさせる。更に、これらの伸長された分子は開放空気に安定であり、見掛け上の分解を示すことなく、数か月間後でも観察できる。
再水和中に、ＤＮＡ分子は吸着および伸長させたままにできる。更に、伸長分子でハイブリッド形成を行うことが可能である。
更に、それらの伸長による均一な配向の相関したシグナルを示すために、これらの分子は周辺ノイズと異なる。したがって、特別な空間的相関を有しない不均一性、ダストを無視することは容易である。溶液中で、ランダムコイル形状の分子は熱的にゆらいでいるため、好ましくは視野の浅いところで集められたそれらの蛍光シグナルについて非常に高いバリエーションを生じ、それらの観察を制限してしまうことから、整列も重要である。したがって、本発明では非常に高いシグナル対ノイズ（Ｓ／Ｎ）比で単離された分子の観察を行える。
この比率は固定された分子の数と無関係であることに注目すべきである。１分子の検出により示されたＳ／Ｎ比は、１０，０００に関する場合でも同様である。更に、この伸長技術は様々な長さの分子間で容易に識別することを可能にする。
Ｓ／Ｎ比を更に改善するために、有利には下記段階に進むことが可能である：
-分子は定着されて、その蛍光シグナルは積分することができる。
-顕微鏡観察では減少した視野を与える（×１００液浸レンズで典型的には１００×１００μｍ、Ｎ．Ａ．＝１．２５）。１cm2サンプルの場合には、走査が行われるか、または高い開口数の低倍率レンズ（×１０または×２０）の使用を考えることが可能である。
-ロッドはいつも平行であるため、Ｓ／Ｎ比を更に増加させるために光学空間的ロ過法を考えることが可能である。
-他のグローバルな蛍光法も、欧州特許出願ＥＰ  １０３４２６で記載されたように考えられる。
-分子の直線化は物理化学的固定の枠組み内および免疫タイプ結合（ＤＩＧ／抗ＤＩＧ）の場合の双方で観察される。
-表面が開放空気中にあると、ＤＮＡ分子は安定（それらは数週間後でもそれらの一体性を維持している）かつ蛍光性である。この性質は、この検出が例えばそれに制限されずに蛍光顕微鏡で行われるならば、固定段階および固定された分子の位置決め／計数段階を延期するために有利に用いることができる。このような使用は本発明によりカバーされる。
-二重（またはマルチ）蛍光技術は、Ｓ／Ｎ比を改善するために、あるいは二重官能化を検出するために可能ならば用いることができる。
-伸長分子は、様々な酵素学的方法または他の方法、例えば蛍光によるか、あるいは放射性または非放射性プローブの使用により顕在化させることができる。それらの検出は、グローバルなシグナル（例えば、蛍光）を測定するか、または光学蛍光顕微鏡、電子顕微鏡、局所プローブ法（ＳＴＭ、ＡＦＭなど）による分子の個別観察で行える。
このため、一般的には、本発明では、分子を特異的に結合させうる表面が用いられて、検出、分離またはアッセイが結合分子の存在を検出する試薬、蛍光またはその他を用いて行われるという点で特徴付けられる方法により、サンプル中で分子の検出、分離および／またはアッセイを行う。
試薬の中には、蛍光試薬および非蛍光試薬がある。
蛍光試薬は、有利には０．１μｍ以上のサイズの長い分子となるように選択されて、前処理表面と特異的、直接または間接的に反応する蛍光分子を含有している。例えば、限定する意味ではなく、特に媒体のｐＨまたはイオン含有率の賢い選択、あるいは表面上における電圧の適用により、場合によりビニルまたはアミンタイプ基などを有する表面に１以上の末端を介して直接固定することができる。蛍光プローブ（臭化エチジウム、ＹＯＹＯ、蛍光ヌクレオチドなど）により染色された二本鎖ＤＮＡ分子が挙げられる。
分子（ＤＩＧ、ビオチンなど）の特異的官能化を用いて、相補的部位（抗ＤＩＧ、ストレプトアビジンなど）を有した表面上に１以上の箇所でそれを固定することも可能である。
本発明に従い予め整列された分子の検出を行える非蛍光試薬は、整列分子と特異的、直接または間接的に結合される他の分子を介して固定されたビーズまたは微粒子から特になっていてもよく、表面と弱い非特異的相互作用だけを有する。
例えば、本発明に従い整列されたビオチニル化ＤＮＡに固定できるストレプトアビジンでコートされたDynalビーズが挙げられる。
望ましい分子が蛍光で直接または上記試薬で間接的に検出されるかどうかに応じて、検出は“直接検出”または“フラッグ（flag）検出”として記載される。
極端に遅い反応時間に伴う問題を制限するために、表面への試薬の拡散時間は小さな反応容量を用いて有利に減少させることができる。例えば、限定する意味ではなく、反応条件下において、一方が反応部位を有するように処理されて、他方が不活性であるかまたは反応部位を有しないように処理された２つの表面間のスペースで決定される数μｌの容量で反応を行うことによる。
配列された分子の数の検出は、電子顕微鏡も放射能も必然的なＰＣＲも要しない、低ノイズの肉眼的な物理的試験により少数の分子（典型的には１〜１０００）で行える。
本発明による整列および検出方法は、限定された実験経験のみを有する者により行うことができる。
ある生物学的反応の特異性は制限される。このため、ハイブリッド形成の枠組み内で、ハイブリッドは不完全（他の部位との反応）であり、対合数の減少とひいては結合性質の低下を起こすことがある。本発明は得られる結合性質を試験する段階の使用可能性もカバーしている。この試験では、特に吸着、疎水力、不完全水素結合、不完全ハイブリッド形成により弱く非特異的に対合された産物を解離させることを可能にする。
したがって、本発明は、上記のような検出またはアッセイ法において、生物活性を有する分子とサンプル分子との反応産物が検出前にミスマッチを壊すためにストレスに付される方法にも関する。
この方法では、ミスマッチペアを壊す可能性に加えて、測定または観察を容易にするカップリングの産物を配向させる可能性も提供する。
このため、相補的要素の結合後、
-遠心
-磁気化しうるまたは磁気マイクロビーズを含有するようにされた非蛍光試薬に適用される磁場の勾配
-撹拌
-液流
-メニスカス通過
-電気泳動
-温度差および／または温度勾配
の単独または組合せ使用からなるストレスを表面に適用することが可能である。
次いで完全なままで残ったまたは壊された系の数が、下記低ノイズ検出技術により調べられる。
本発明で記載された整列および検出技術は多数の適用例で使用でき、その中には、限定する意味ではなく、以下のものがある：
-病原体の診断またはゲノムの物理的マップについて有利に使用できるＤＮＡまたはＲＮＡ配列の１以上の要素の同定。特に、上記技術ではクローニング段階の中間使用なしにゲノムＤＮＡで直接物理的マップを得ることができる。コーミング分子は結晶長と比べて伸びているため、比較測定が行われると理解される。このため、整列ＤＮＡでプローブ間の距離を視覚化および測定するために、光学的方法だと２００ｎｍ程度またはＡＦＭもしくはＳＴＭのような近視野法の使用だと１ｎｍ程度の解像度で、ＤＮＡ断片のサイズと断片間の距離を測定することができる。
これにより当然
１）特に遺伝病（例えばDuchenne'sミオパシー）の診断における、ゲノム配列の欠失、付加または転座の検出
２）調節配列と発現される配列との距離を測定することによる様々な遺伝子のプロモーターの同定
３）ＤＮＡに沿うそれらの位置またはそれらの標的配列の位置を確認することによる調節タンパク質の位置決め
４）所定長さの塩基オリゴヌクレオチドに属するハイブリッド形成プローブ間で近視野顕微鏡法（例えばＡＦＭまたはＳＴＭ）を用いて距離を測定する
ことによる一部または完全配列決定
-整列ＤＮＡについてin situ酵素増幅
-少数（おそらく１０００以下）の免疫反応を検出できる可能性がある、ＥＬＩＳＡ技術の感度の改善
このため、物理的マッピングはクローニング段階の中間使用なしにゲノムＤＮＡで直接行える。ゲノムＤＮＡは抽出、精製され、場合により１種以上の制限酵素で開裂され、その後本発明の方法に従い表面でコーミングされる。
次いでゲノムＤＮＡ上にある望ましい遺伝子の位置およびサイズは、特に上記望ましい遺伝子の産物の相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）の一部から抽出された、上記遺伝子に特異的なプローブとのハイブリッド形成により決められる。
同様に、コーミングされ、その後ハイブリッドを位置決めさせる蛍光またはいずれか他のマーカーで標識された全ｃＤＮＡで変性された、ゲノムＤＮＡをハイブリッド形成させることにより、問題の遺伝子のエキソンの位置、サイズおよび数が確認され、そのサイズおよびそのゲノム組織（エキソン、イントロン、調節配列）がそれから求められる。
遺伝子の位置は上記のように決定されるかまたは公知であるため、遺伝子のフランキング配列をハイブリッド形成により同定することが可能である。その場合には、操作は遺伝子のいずれかの側でハイブリッド形成する２以上のプローブを同定するために、例えばオリゴヌクレオチドライブラリーから得られる標識プローブとのハイブリッド形成により有利に行われる。
この決定から、反応にプライマーとして使えるフランキングプローブにより画定された断片を増幅させることが、酵素増幅技術、例えばin situ ＰＣＲ（Nuovo G.J.,PCR in situ hybridization:protocols and applications,Raven Press(1992)）により可能であり、その断片は、組織または成長特異性であって後で単離および精製できる調節領域と共に望ましい遺伝子を含んでいてもよい。
その操作は、Mortimer et al（Yeast,5,321,1989）により言及されたように遺伝子のフランキング領域と相補的なＤＮＡ断片を抽出するために、問題の遺伝子のｃＤＮＡから抽出されたプライマーでin situ重合により行うこともできる。次いでこれらの断片は遺伝子およびそのフランキング配列の酵素増幅プロセス用のプライマーの作製に使える。
相同的組換えによりまたはランダムに公知のエンドヌクレアーゼ特異性部位をゲノムＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ断片中に挿入するための、A.Thierry and B.Dujon(Nucl.Acid Research,20,5625(1992))により引用された方法も用いてよい。このＤＮＡのコーミングでは、上記in situハイブリッド形成法により、対象遺伝子と挿入された特異的部位との同定を行える。この同定から、好ましくは、対象部位が遺伝子に近い対象領域であるならば、それらは問題の遺伝子およびそのフランキング配列の酵素増幅反応（in situなど）用のプライマーとして用いられる。
次いで望ましい遺伝子の増幅は、ｃＤＮＡを構成するエキソンにより達成できるプライマーまたはフランキング配列に相当するプライマーを用いて、上記のような増幅断片でＰＣＲのような公知の酵素増幅技術を用いて進める。
ゲノムＤＮＡなどのコーミングにより、特定近接遺伝子の調節配列の存在または不存在についてハイブリッド形成で決定することも可能であり、そこからこの遺伝子を調節する上で可能なタンパク質ファミリー（例えば、ヘリックス-ループ-ヘリックス、亜鉛-フィンガー、ロイシン-ジッパー）が決められる。
特定ＤＮＡ／ＲＮＡ／ＰＮＡ配列と他の分子（ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質）との特異的反応は、本発明による分子を整列させる前または後に起こせる。
このため、遺伝子診断および物理的マッピングの分野において、ＦＩＳＨの公知方法（Pinkel et al.,Proc.Nat.Acad.Sci.USA,83,2934(1986)）は、標識された一本鎖オリゴヌクレオチドを、最初に整列させてから変性されたＤＮＡとハイブリッド形成させるために有利に用いられる。ハイブリッドの顕在化は、０．２μｍ（光学的）〜１ｎｍ（近視野顕微鏡；ＡＦＭ、ＳＴＭなどによる）におよぶ距離の測定上の解像度で、公知技術（蛍光、マイクロビーズなど）を用いて行われる。
一方、最初に蛍光マーカーＤＮＡを溶液中で一本鎖ＤＮＡとハイブリッド形成させ、その後それを二本鎖ＤＮＡに変換してそれを適切な表面上に固定してからメニスカスの作用によりこの構築物を整列させることが可能である。
病原体の存在について検出する上で本発明を用いることも可能である。例えば、操作は認識反応（ハイブリッド形成、タンパク質の結合）がメニスカスによる整列前または後に起こすかどうかに応じて、２つの異なる方法で行える。
このため、例えば、１つまたはいくつかのオリゴヌクレオチドプローブが表面の１以上の領域で固定される。潜在的病原性ＤＮＡのハイブリッド形成は、ハイブリッド形成分子だけを固定するように、厳格な条件下その場で行われる。それらの検出および定量は本発明によるメニスカスで整列後に行われる。
一方、潜在的病原性ＤＮＡは最初に整列され、その後変性されて、厳格な条件下でオリゴヌクレオチドプローブとハイブリッド形成される。次いでハイブリッドの検出は公知の方法で、特に上記のようなＦＩＳＨ法で行われる。
同様に、タンパク質、脂質、糖または抗原のような少数の分子の存在（または不在）を検出することも可能である。ＥＬＩＳＡ技術のわずかな修正が有利に行われ、通常の検出法は本発明に従い整列されてＥＬＩＳＡ反応の試薬の１つとカップリングされた蛍光分子の検出により置き換えれる。
更に、K.R.Allan et al（ＵＳ  ８４  １１４）により言及されたように、遺伝子マッピングはＤＮＡ断片のサイズを測定することにより行える。上記分子を伸長させるための新規技術（メニスカスによる伸長）で伸長分子の長さを測定できるが、これは非常に小さなサンプル（数千分の１の分子）である。
例えば、限定する意味ではなく、下記手順で操作を行うことが可能である：
ＤＮＡサンプルが（制限酵素により）断片化され、発蛍光団で染色され、その後表面につなぎとめられる。次いで分子はメニスカスにより伸長され、伸長断片のサイズが最大サイズ１０００ｂｐ（０．３μｍ）程度の解像度で光学蛍光顕微鏡により調べられる。
この目的にとり、しかも非常に長い分子
0003741719.tif 000002
を整列させることが望まれるならば、公知技術がそれらの取扱い中に（流体力学的剪断による）長い高分子の分解を制限するために有利に用いられる。
このため、D.C.Schwartzにより言及されたように、分子の縮合がそれらの取扱い中に縮合剤（例えばスペアミントまたはアルコール）により有利に行われる。場合により、それらの脱縮合も溶媒Ａと固定表面Ｓとの接触中に生じる。
メニスカスによる伸長中に高分子の分解を減少させるために、流体力学的剪断を最少に抑えるメニスカス並進技術が用いられる。例えば、限定する意味ではないが、実質的容量
0003741719.tif 000003
の溶媒Ａから表面Ｓを非常にゆっくりと
0003741719.tif 000004
除去することによる。
本発明の主題には、本発明により得られる１タイプ以上の整列高分子を有した表面もある。特に、異方性の光学的または電気的性質を有した表面または多数の表面を得ることが可能である。
本発明の主題は、また、１以上の特異的配列の位置またはサイズを調べるために、ＤＮＡが本発明による整列プロセスで伸長され、その後変性され、特異的プローブとハイブリッド形成される、ＤＮＡを整列および検出するための方法である。
本発明の主題は、また、ＤＮＡが本発明の方法に従い整列または検出される、ゲノムＤＮＡ上における遺伝子の物理的マッピングのための方法である。
特に、ゲノムＤＮＡ上における望ましい遺伝子の位置またはサイズは、マッピングされる上記遺伝子に特異的なプローブとのハイブリッド形成により調べられる。
本発明の主題は、また、
-参照宿主からの全ゲノムＤＮＡからなる、本発明によるマッピング方法を行う上で有用なキット
-本発明の方法に従い患者ＤＮＡの固定および整列を行える表面を有した支持体
-マッピングされる遺伝子に特異的なプローブと、ＤＮＡのハイブリッド形成および検出用の試薬
である。
本発明の主題は、また、上記整列ＤＮＡで１以上のＤＮＡ配列の存在または不存在を調べるために、ＤＮＡが伸長され、その後変性され、特異的プローブとハイブリッド形成される、ＤＮＡを整列および検出するための方法である。
本発明では、本発明による整列方法が用いられる、病状に特異的なＤＮＡ配列の存在または不存在に関連した病状の診断のための方法の実施を行える。
本発明の主題は、また表面が本発明の方法に従い患者ＤＮＡの固定および整列を行える支持体と、調査病状に関与する遺伝子に特異的なプローブと、ＤＮＡのハイブリッド形成および検出用の試薬と含んでいることで特徴付けられる、本発明による診断方法を行う上で有用なキットである。
本発明の主題は、また、本発明の方法に従い整列されて場合により変性された病状に関与する遺伝子、特に場合により標識された病原ＤＮＡに特異的なプローブを表面が有する支持体と、そのハイブリッド形成のために患者ＤＮＡを作製および標識するための試薬（例えばフォトビオチン、ニックトランスレーションまたはランダムプライミングキット）と、上記のようなin situハイブリッド形成技術によるＤＮＡのハイブリッド形成および検出用の試薬とを含んでいることで特徴付けられる、本発明による診断方法を行う上で有用なキットである。
異なる病原体に関するコーミングプローブは、異なる支持体でもまたは同一の支持体上に存在してもよいことが理解されている。対応病原体の同定は、プローブの事前の差別的標識に基づき、空間的に（異なるプローブは、例えばそれらのコーミング前に光化学的つなぎとめにより、空間的に離される）、または異なるハイブリッドの蛍光スペクトル上の差異により、ハイブリッド形成後に行える。
最後に、本発明の主題は、本発明による方法で整列されたゲノムＤＮＡ上にある遺伝子の位置が上記遺伝子に特異的なプローブにより同定され、上記遺伝子の配列および場合によりそのフランキング配列が酵素増幅、特にin situ ＰＣＲにより増幅される、遺伝子の作製方法である。
したがって、本発明では、上記遺伝子作製方法に従い作製された外来遺伝子を含んだベクターにより、外来遺伝子の標的挿入により真核細胞のゲノムで遺伝子を置き換えるための方法を行うことができる。
標的挿入は、レシピエント遺伝子において望ましい挿入部位付近で２つのゲノム配列に隣接して挿入された上記外来ＤＮＡを含むベクターで真核細胞をトランスフェクトすることにより、ＷＯ  ９０／１１３５４で記載された技術に従い行える。インサートＤＮＡはコード配列または調節配列のいずれを含んでいてもよい。フランキング配列は、相同的組換えにより、場合に応じて、レシピエント遺伝子の調節配列のコントロール下でインサートＤＮＡのコード配列の発現またはインサートＤＮＡの調節配列のコントロール下でレシピエント遺伝子のコード配列の発現を行えるように選択される。
本発明により遺伝子を位置決めする方法を用いて得られたゲノム遺伝子およびｃＤＮＡは、原核、真核またはウイルス宿主細胞中に挿入しうる発現ベクター中に挿入することができる。誘導されたタンパク質、ポリペプチドおよびペプチドは本発明に含まれる。
以下の記載は添付図面を参考にして行われる：
-図１は、固定分子とのハイブリッド形成による蛍光ＤＮＡ分子での病原体の検出について概略的に表している。
-図２は、ＤＮＡの伸長およびマーカーＤＮＡの使用による遺伝子マッピングについて概略的に表している。
-図３は、反応マーカーとして用いられる蛍光ＤＮＡ、“フラッグ”分子による免疫反応（ＥＬＩＳＡ）の検出について概略的に表している。
-図４は、メニスカスの進行によるλファージＤＮＡの伸長について示した蛍光顕微鏡写真であり、メニスカスに平行な蒸発流により伸長された溶液中のＤＮＡ分子は左側にみられ、メニスカスに垂直に伸長された後の開放空気中におけるＤＮＡ分子は右側にみられる。
-図５（ａ）および５（ｂ）は、抗ＤＩＧでコートされた表面上でジゴキシゲニン（ＤＩＧ）で標識されてメニスカスにより伸長されたＤＮＡと、コントロールとして抗ＤＩＧ表面上の未標識ＤＮＡとを各々示した蛍光顕微鏡写真であり、表面の非常に高い特異性と非特異的固定の不存在が注目される。
-図６はメニスカスの通過によるＤＮＡの広がりの概略図を表す。溶液中のＤＮＡは処理表面上に固定される。ＤＮＡ溶液は未処理丸形カバースリップでカバーされる。
-図７は：
ａ）アミン基で終わるシラン分子でコートされ、
ｂ）ポリリジンでコートされ、
ｃ）過酸化水素／硫酸混合物中で清浄化された、
ガラス表面上におけるコーミングλＤＮＡ分子の長さの棒グラフを表す。
-図８はポリリジンでコートされたガラス表面上のコーミングＤＮＡ分子について表す。２つの末端で結合された分子はループを形成していることが注目できる。
-図９はこれら分子の溶液から処理カバースリップの除去によりコーミングされたＹＡＣを表す。
-図１０はin situハイブリッド形成によるＹＡＣ上のコスミドの存在およびサイズの確認について示す。
“診断”方式において、プローブ（“固定（アンカー）”）は（例えば、固定部位として、抗ＤＩＧ抗体またはストレプトアビジンを有する）本発明による表面上に特異的に固定することができる反応基（ＤＩＧ、ビオチンなど）を有している。固定反応の検出は、蛍光分子（臭化エチジウム、ＹＯＹＯ、蛍光ヌクレオチド）により染色されたＤＮＡ分子の蛍光の検出により直接行える（図１）。それは（例えばハイブリッド形成、タンパク質-ＤＮＡ相互作用などにより）ＤＮＡ／ＲＮＡ分子に結合できるが、プローブの固定部位に親和性を有しない試薬、“フラッグ分子”の検出により間接的に行うこともできる。
“マッピング”方式では、in situハイブリッド形成技術（ＦＩＳＨ）も使用できる。例えば本発明による蛍光試薬を有したプローブで溶液中のＤＮＡをハイブリッド形成させることにより、他の技術も考えることができる。プローブの位置の検出は、本発明により分子を整列させた後で行われる。
例１
物質および方法
λＤＮＡおよびモノクローナル抗体（抗ＤＩＧ）はBoehringer-Mannheimから得た。トリクロロシランはRoth-Sochielから得た。蛍光核酸プローブ（ＹＯＹＯ１、ＹＯＹＯ３およびＰＯＰＯ１）はMolecular Probeから得た。超清浄ガラスカバースリップはErie Scientific(ESCO)カバースリップから得た。磁気粒子はDynalから得た。顕微鏡はNIKKONのDiaphot逆相顕微鏡であり、エピ蛍光のためにキセノンランプと視覚化のためにHamamatsu増感ＣＣＤカメラを備えている。
表面処理
ガラスカバースリップを（オゾンの形成により）酸素雰囲気下でＵＶ照射により１時間かけて清浄化させる。次いでそれらをアルゴン流で微量の水が予めパージされたデシケーター中に直ちに入れる。容量約１００〜５００μｌの適切なトリクロロシラン（Ｈ2Ｃ＝ＣＨ-（ＣＨ2）N-ＳｉＣｌ3）をデシケーター中に導入し、そこから表面を約１２時間（ｎ＝６）または１時間（ｎ＝１）後に除去する。取出し後、表面は清潔で非湿潤である。
これら二重結合表面の官能基（Ｈ2Ｃ＝ＣＨ-）は、水１ｌ中２５ｍｇ  ＫＭｎＯ4、７５０ｍｇ  ＮａＩＯ４の溶液で約１０分間にわたり上記のように処理カバースリップを浸漬し、その後それらを超純水で３回すすぐことにより、カルボキシル基（-ＣＯＯＨ）に変換することができる。
こうして官能化されたカバースリップはタンパク質と反応できる。容量３００μｌのタンパク質（プロテインＡ、ストレプトアビジンなど）の水溶液（２０μg/ml）を（Ｈ2Ｃ＝ＣＨ-）基で官能化されたカバースリップに沈着させる。このカバースリップを室温で約２時間インキュベートし、その後超純水で３回すすぐ。こうして処理された表面は清潔で湿潤している。その後、プロテインＡで処理された表面は、抗体２０μg/mlの溶液中でインキュベートすることにより、抗体、例えば抗ＤＩＧ抗体と反応させることができる。
更に、カルボキシル基を有する表面上で、ＭＥＳ（５０ｍＭ、ｐＨ５．５）の溶液２００μｌ、カルボジイミド（１mg/ml）およびアミノ-オリゴヌクレオチド（１０pmol／１４０μｌ）５μｌをカルボキシル化表面上にのせ、室温で８時間インキュベートすることにより、アミン末端（-ＮＨ2）を有するオリゴヌクレオチドをグラフト化することが可能である。カバースリップを最後にＮａＯＨ（０．４Ｍ）で３回、その後超純水で４回すすぐ。こうして作製されたカバースリップは、固定されたオリゴヌクレオチドと相補的なＤＮＡとハイブリッド形成できる。
二重結合表面上への天然ＤＮＡの固定
様々な濃度で異なる緩衝液中の蛍光標識λＤＮＡ（ＹＯＹＯ１、ＰＯＰＯ１またはＹＯＹＯ３、但し特異的末端標識なし）１滴２μｌ（分子総数＜１０7）を前処理カバースリップ（Ｃ＝Ｃ）上に沈着させ、未処理ガラスカバースリップ（径１８ｍｍ）でカバーする。プレパレーションを水蒸気で飽和された雰囲気中室温で約１時間インキュベートする。０．０５Ｍ  ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ＝５．５）では、ＤＮＡ分子の事実上全般的な固定が観察される。逆に、０．０１Ｍ  Tris緩衝液（ｐＨ＝８）だと、固定された分子は実際上ない（比率＞１０6）。この依存性から、ｐＨで（ＤＮＡに関する）表面の活性化／不活化をコントロールすることができる。
分子上におけるメニスカスの作用は、その中間付近に限定される。メニスカスの前にある溶液中の分子部分は自由にゆらぎ、メニスカスの後ろにある表面上と結合して残された部分はメニスカスの方向の変化に非感受性である。したがって、分子の伸長速度は均一で、そのサイズに無関係である。
メニスカスの作用による整列および固定の検出
先のプレパレーションを乾燥雰囲気に移すことにより、溶液は蒸発で表面上に固定されたＤＮＡ分子をメニスカスに垂直に伸長させる。ＤＮＡ分子の毛管力（数十ピコニュートン）は分子を完全に伸長させる上で実際に十分であるが（エントロピー弾性力よりも大きい）、分子の末端と処理表面との結合を壊すには弱すぎる。蛍光標識されたＤＮＡ、伸長分子（全長約２２μｍ）は個別に容易に観察できる。表面とＤＮＡとの固定は末端に制限されているため、λファージ、ＹＡＣまたはE.coliのＤＮＡを伸長させることが可能である（全長４００μｍ以上）。伸長された蛍光性の開放空気中にあるこのＤＮＡプレパレーションは数日間安定であり、エピ蛍光（×１００レンズのNikkon Diaphot逆相顕微鏡、Ｏ．Ｎ．：１．２５）により非分解的方法で観察することができる。
特異的固定および検出
特異的モノクローナル抗体で上記のように表面を処理することにより、それらの特異性を非常に正確にコントロールすることができる。このため、抗ＤＩＧ処理表面の特異性は、Ｃｏｓ末端の一方に相補的なオリゴヌクレオチドとハイブリッド形成してジゴキシゲニン基（ＤＩＧ）を有したλＤＮＡと、非ハイブリッド形成ＤＮＡに関して試験した。第一の場合に、固定分子の事実上全般的な伸長がメニスカスの作用により観察された。第二の場合では、わずかな固定ＤＮＡ分子（＜１０）だけが全サンプルで観察された。したがって、本発明による方法の特異性は１０6以上であると評価される。
λＤＮＡは、上記のようにＣｏｓ末端の一方に相補的なオリゴヌクレオチドとハイブリッド形成して、カルボキシル化表面に結合した。ハイブリッド形成条件（４０℃の純水）は厳密でなかったが、その理由は厳格な条件（高塩分）下でＹＯＹＯ１プローブの蛍光が消失して、ハイブリッド形成したＤＮＡがみえないからである。メニスカスの通過により、こうしてハイブリッド形成されたＤＮＡを整列させることもできた。
検出の感度
メニスカスの伸長により検出方法の感度を調べるために、全部で１０5、１０4および１０００分子を含有した０．０５Ｍ  ＭＥＳ（ｐＨ＝５．５）中λＤＮＡの溶液２．５μｌを二重結合表面上に沈着させた。固定および整列は上記のように行う。次いでカバースリップは、コーミング分子の密度を調べるために、エピ蛍光顕微鏡で観察する。後者は実際に評価すると、全部で１０5ＤＮＡ分子について視野（１００×１００μｍ）当たり約４〜６ＤＮＡ分子に相当する。最低濃度のときには、メニスカスの作用により伸長された約１０分子を観察することができた。この数は全サンプルをカバーする上で必要な多数の視野により本質的に制限され（約２５，０００）、マニュアルサーチを異ならせるが、それはもっと弱いレンズで、但しより大きな視野で自動的に有利に行える。結論として、本発明による方法の感度だと１０００ＤＮＡ分子以下の検出および個別的計測を行える。
表面処理による伸長の依存性
異なる表面上でつなぎとめられ、その後メニスカスの通過で整列されたλＤＮＡの長さの棒グラフではよく規定されたピークを示すが、これは異なる表面だと異なる。このため、ビニル基で終わるシランでコートされた表面上において、ＤＮＡはアミン基（-ＮＨ2）でシラン化された表面だと約２２μｍ以内（上記参照）まで伸長し、棒グラフでは２１μｍ（図７（ａ））および清潔なガラス上だと約１８．５μｍ（図７（ｃ））でピークを有する。
したがって、伸長は表面処理に依存している。
例２
異なる表面上におけるＤＮＡ分子のコーミング
様々な手法で処理されたガラス表面上におけるＤＮＡの分子コーミングを観察した。分子の末端と分子の残りとの吸着上の差異を利用する。ガラス表面上に正荷電ポリマーを吸着させることにより、負荷電ＤＮＡ分子の吸着は高まるが、しかしながらこの荷電が大きいときには、ＤＮＡ分子はその全長にわたり付着して、コーミングは不可能である。しかしながら、ｐＨ条件を変えてグラス上に吸着されるポリマーの荷電を変えることが可能であり、実際に正荷電は例えばＮＨ2基により保有されて、対応塩基のｐＫ以下のｐＨでプロトン化状態ＮＨ3+になる。塩基性ｐＨだと、荷電は消え、表面はもはやＤＮＡを求引しない。ｐＨを細かくコントロールすることにより、溶液中のＤＮＡ分子はそれらが表面に完全に付着した状態から、それらがそれらの末端だけで固定される中間相、その後表面がもはやＤＮＡに親和性を有しない相へと移行することが観察された。中間相でも、分子コーミングは行える。
ＮＨ2基で終わるシランでコートされた表面を研究したが、そのときにはｐＨ＜８で完全付着、８．５＜ｐＨ＜９．５でコーミングが観察される。コーミング分子の数はｐＨ＝８．５で最大であり、ｐＨ＝９で１／２、ｐＨ＝９．５で１／４である。しかも、この表面上での相対的伸長度が１．２６に相当することが図７の棒グラフ２でみられるように決定された。図７は、
ａ）アミン基で終わるシラン分子でコートされ、
ｂ）ポリリジンでコートされ、
ｃ）過酸化水素／硫酸混合物中で清浄化された、
ガラス表面上におけるコーミングλＤＮＡ分子の長さの棒グラフを表す。
ポリリジンでコートされた表面も試験したところ、ｐＨについて類似した結合特徴：コーミング領域８．５と、短い相対的伸長度：１．０８を示すことがわかった。典型例は図８で得られ、そこではポリリジンでコートされたガラス表面上のコーミングＤＮＡ分子を表す。２つの末端で結合された分子がループを形成することも観察できる。
最後に、同様の挙動は過酸化水素／濃硫酸混合物で清浄化されたばかりのガラス表面でみられた。これらの表面は高度に湿潤しており、急速に汚染されるようになる。しかしながら、コーミング領域は５．５＜ｐＨ＜７．４で観察され、一方強い吸着領域はｐＨ＝４．５に位置する。分子の相対的伸長度は１．１２に相当する。
例３
ＹＡＣの均一な指向性整列
ＹＯＹＯ１蛍光プローブによりアガロースプラグ中で予め染色されたＹＡＣ１μｇを６８℃に加熱し、その後ＭＥＳ（５０ｍＭ、ｐＨ５．５）１０ｍｌで希釈する。２枚のシラン化カバースリップ（Ｃ＝Ｃ表面）をこの溶液中で
0003741719.tif 000005
時間インキュベートし、その後約１７０μm/secで除去する。ＹＡＣ分子はすべてカバースリップの除去方向と平行に整列している（図９）。こうして整列された分子の一体性は、２枚のカバースリップ間で沈着後に蒸発によるよりも良い。
コスミドとコーミングＹＡＣとのハイブリッド形成
先に記載されたように染色されたＹＡＣをＣ＝Ｃ表面（２枚のカバースリップ間）につなぎとめ、その後溶液の蒸発時にメニスカスにより整列させる。プローブ（コスミド）をランダムプライミング技術によりビオチニル化ヌクレオチドの組込みで標識する。標識プローブ（１００ｎｇ）および超音波処理サケ精子ＤＮＡ
0003741719.tif 000006
５μｇを酢酸Ｎａおよびエタノール中で沈降により精製し、その後ホルムアミドで変性させる。
コスミドＹＡＣをホットプレート上８０℃で３分間かけて変性溶液（７０％ホルムアミド、２×ＳＳＣ）１２０μｌで２枚のカバースリップ間において変性させる。予め変性されたプローブ（２０ｎｇ）をラバーセメントで密封されたカバースリップでカバーさせたハイブリッド形成溶液（５５％ホルムアミド、２×ＳＳＣ、１０％硫酸デキストラン）中でカバースリップ上に沈着させる。ハイブリッド形成は湿室中３７℃で一夜行う。
ハイブリッドの検出は脱縮合染色体でin situハイブリッド形成について知られた操作に従い行う（D.Pinkel el al.,PNAS USA,83,2934(1986)およびPNAS USA,85,9138(1988)）。
次いで、図１０で示された場合のようなハイブリッド形成セグメントを蛍光顕微鏡で観察する。この例はＤＮＡ分子上にある遺伝子の存在を検出できる可能性について証明しており、診断目的とゲノムの物理的マッピングに用いることができる。
【図１】
0003741719.tif 000007
【図２】
0003741719.tif 000008
【図３】
0003741719.tif 000009
【図４】
0003741719.tif 000010
【図５Ａ】
0003741719.tif 000011
【図５Ｂ】
0003741719.tif 000012
【図６】
0003741719.tif 000013
【図７】
0003741719.tif 000014
【図８】
0003741719.tif 000015
【図９】
0003741719.tif 000016
【図１０】
0003741719.tif 000017