(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記に示されるＡＰＰ７７０のアミノ酸配列の１８（Ｌｅｕ）から６８７（Ｌｙｓ）までのペプチドを有効成分とするゼラチナーゼＡ活性阻害剤。
Met Leu Pro Gly Leu Ala Leu Leu Leu Leu Ala Ala Trp Thr Ala Arg Ala Leu
1                                                                  18
Glu Val Pro Thr Asp Gly Asn Ala Gly Leu Leu Ala Glu Pro Gln Ile Ala Met
Phe Cys Gly Arg Leu Asn Met His Met Asn Val Gln Asn Gly Lys Trp Asp Ser
Asp Pro Ser Gly Thr Lys Thr Cys Ile Asp Thr Lys Glu Gly Ile Leu Gln Tyr
Cys Gln Glu Val Tyr Pro Glu Leu Gln Ile Thr Asn Val Val Glu Ala Asn Gln
Pro Val Thr Ile Gln Asn Trp Cys Lys Arg Gly Arg Lys Gln Cys Lys Thr His
100
Pro His Phe Val Ile Pro Tyr Arg Cys Leu Val Gly Glu Phe Val Ser Asp Ala
Leu Leu Val Pro Asp Lys Cys Lys Phe Leu His Gln Glu Arg Met Asp Val Cys
Glu Thr His Leu His Trp His Thr Val Ala Lys Glu Thr Cys Ser Glu Lys Ser
Thr Asn Leu His Asp Tyr Gly Met Leu Leu Pro Cys Gly Ile Asp Lys Phe Arg
Gly Val Glu Phe Val Cys Cys Pro Leu Ala Glu Glu Ser Asp Asn Val Asp Ser
Ala Asp Ala Glu Glu Asp Asp Ser Asp Val Trp Trp Gly Gly Ala Asp Thr Asp
200
Tyr Ala Asp Gly Ser Glu Asp Lys Val Val Glu Val Ala Glu Glu Glu Glu Val
Ala Glu Val Glu Glu Glu Glu Ala Asp Asp Asp Glu Asp Asp Glu Asp Gly Asp
Glu Val Glu Glu Glu Ala Glu Glu Pro Tyr Glu Glu Ala Thr Glu Arg Thr Thr
Ser Ile Ala Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Glu Ser Val Glu Glu Val Val Arg
Glu Val Cys Ser Glu Gln Ala Glu Thr Gly Pro Cys Arg Ala Met Ile Ser Arg
289                                         300
Trp Tyr Phe Asp Val Thr Glu Gly Lys Cys Ala Pro Phe Phe Tyr Gly Gly Cys
Gly Gly Asn Arg Asn Asn Phe Asp Thr Glu Glu Tyr Cys Met Ala Val Cys Gly
Ser Ala Met Ser Gln Ser Leu Leu Lys Thr Thr Gln Glu Pro Leu Ala Arg Asp
345
Pro Val Lys Leu Pro Thr Thr Ala Ala Ser Thr Pro Asp Ala Val Asp Lys Tyr
363
Leu Glu Thr Pro Gly Asp Glu Asn Glu His Ala His Phe Gln Lys Ala Lys Glu
Arg Leu Glu Ala Lys His Arg Glu Arg Met Ser Gln Val Met Arg Glu Trp Glu
400
Glu Ala Glu Arg Gln Ala Lys Asn Leu Pro Lys Ala Asp Lys Lys Ala Val Ile
Gln His Phe Gln Glu Lys Val Glu Ser Leu Glu Gln Glu Ala Ala Asn Glu Arg
439
Gln Gln Leu Val Glu Thr His Met Ala Arg Val Glu Ala Met Leu Asn Asp Arg
Arg Arg Leu Ala Leu Glu Asn Tyr Ile Thr Ala Leu Gln Ala Val Pro Pro Arg
500
Pro Arg His Val Phe Asn Met Leu Lys Lys Tyr Val Arg Ala Glu Gln Lys Asp
Arg Gln His Thr Leu Lys His Phe Glu His Val Arg Met Val Asp Pro Lys Lys
Ala Ala Gln Ile Arg Ser Gln Val Met Thr His Leu Arg Val Ile Tyr Glu Arg
Met Asn Gln Ser Leu Ser Leu Leu Tyr Asn Val Pro Ala Val Ala Glu Glu Ile
Gln Asp Glu Val Asp Glu Leu Leu Gln Lys Glu Gln Asn Tyr Ser Asp Asp Val
Leu Ala Asn Met Ile Ser Glu Pro Arg Ile Ser Tyr Gly Asn Asp Ala Leu Met
Pro Ser Leu Thr Glu Thr Lys Thr Thr Val Glu Leu Leu Pro Val Asn Gly Glu
600
Phe Ser Leu Asp Asp Leu Gln Pro Trp His Ser Phe Gly Ala Asp Ser Val Pro
Ala Asn Thr Glu Asn Glu Val Glu Pro Val Asp Ala Arg Pro Ala Ala Asp Arg
Gly Leu Thr Thr Arg Pro Gly Ser Gly Leu Thr Asn Ile Lys Thr Glu Glu Ile
Ser Glu Val Lys Met Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His
His Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile
687                                                 700
Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala Thr Val Ile Val Ile Thr Leu
Val Met Leu Lys Lys Lys Gln Tyr Thr Ser Ile His His Gly Val Val Glu Val
Asp Ala Ala Val Thr Pro Glu Glu Arg His Leu Ser Lys Met Gln Gln Asn Gly
Tyr Glu Asn Pro Thr Tyr Lys Phe Phe Glu Gln Met Gln Asn
770
【請求項２】
請求項１に記載のゼラチナーゼＡ活性阻害剤を用いることを特徴とするゼラチナーゼＡを定性、定量するゼラチナーゼＡ測定試薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、ＡＰＰ（βアミロイド蛋白質前駆体）から得られ、ゼラチナーゼＡ活性阻害の活性最小単位からなるペプチド類縁体もしくはそれを含むペプチド類縁体を有効成分とするゼラチナーゼＡ活性阻害剤に関するものである。
【０００２】
ゼラチナーゼＡは癌の転移や炎症などに関与する生体内酵素であるが、このゼラチナーゼＡの活性を阻害することができれば、癌の転移や炎症を防ぐことが期待される。
【０００３】
また、本発明に係るゼラチナーゼＡ活性阻害剤はゼラチナーゼＡの定性、定量用の試薬として使用できるものである。
【０００４】
【従来の技術】
従来、ゼラチナーゼＡは生体内の各所にみられ、特に、癌の転移の過程においてＩＶ型コラーゲンを分解する酵素として知られている。
【０００５】
図２に示されるのはＡＰＰ７７０の模式図で、そのアミノ酸配列は図１に示されるようにすでに解明されている。
【０００６】
図２において、１は１Ｍ（Ｍｅｔ）からのシグナル配列を示し、順次７７０ケのアミノ酸から成り立ち、６はゼラチナーゼＡ活性阻害の活性最小単位のペプチドを示すが、ここには２個のＣＨＯで示すように糖が２個所で結合し、糖類結合領域といわれている部分である。
【０００７】
図２において、ドメイン８の部分は細胞の外側の透過膜を貫通し、透過膜に固定された部分に該当している。
【０００８】
図２（Ａ）のＤの部分、即ち図２（Ｄ）ので示す配列の矢印のところでＡＰＰが切断されれば正常であるが、Ｄの部分が切断されずに閉じてドメイン７が全部で１つの黒ぬりの部分として、その両側が切断されると、βアミロイド（βＡＰ）としてドメイン７全体が遊離する。このβアミロイドがニューロンに沈着すると、ニューロンが変性、萎縮してアルツハイマー病を発症すると考えられている。
【０００９】
このようにＡＰＰのドメイン７の部分の切断部位が真中か両わきかによって、アルツハイマー症にならないか、なるか、ということになるものと推測されるのであるが、本発明において（Ｄ）の矢印の位置の切断にゼラチナーゼＡが関与することが明らかにされた。
【００１０】
また、ゼラチナーゼＡは癌細胞等が分泌するマトリックス・メタロプロテアーゼの１つとしても知られている。
【００１１】
そして、癌の浸潤、転移に起る組織の局所的破壊や炎症時の白血球の移動などを促進するものとしてゼラチナーゼＡが存在するものと考えられており、ゼラチナーゼＡの活性を阻害乃至は低下させれば、何らかの改善がみられるのではないかと考えられる。
【００１２】
従来、セラチナーゼＡがβアミロイド蛋白質を分解できること、またゼラチナーゼＡの活性がＡＰＰ又はその部分分解物によって阻害乃至は低下させられるということは全く知られていないことであった。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者は、ゼラチナーゼＡの活性を阻害する方法を見出すために鋭意研究したところ、意外にもヒトの細胞が分泌する分泌型のＡＰＰ（即ち、ＡＰＰの部分分解物）にゼラチナーゼＡの阻害活性があることを確認することができた。更に研究を進めたところ、この分泌型ＡＰＰはＡＰＰ７７０のもので、かつこの分泌型ＡＰＰ７７０の糖結合領域に強いゼラチナーゼＡ活性阻害作用があることを確認し、本発明を成すに至った。
【００１４】
図２（Ａ）におけるドメイン２からドメイン７の半分で図面最下段の（Ｄ）の矢印で切断された位置までが分泌型ＡＰＰ７７０として分離されたもので、この分泌型ＡＰＰ７７０でゼラチナーゼＡ活性阻害活性を有していることを確認することができたのである。
【００１５】
このように分泌型ＡＰＰ７７０とゼラチナーゼＡの活性の阻害と関連づけて、その効果を見出したのは本発明がはじめてである。
【００１６】
また、図２の（Ａ）において、ドメイン６は糖鎖結合領域であるが、ここがゼラチナーゼＡ活性阻害の活性最小単位と考えられる。
【００１７】
本発明では、このゼラチナーゼＡ活性阻害の活性最小単位については、図１におけるＡＰＰ７７０のアミノ酸配列の４３９Ｖから６８７Ｋまでのペプチドで糖の結合したペプチド類縁体とみることができた。
【００１８】
これらはゼラチナーゼＡ活性阻害剤として有用であるが、これはＡＰＰ７７０に限られることなく、すでに知られているＡＰＰ７５１やＡＰＰ６９５においても同じことである。
【００１９】
また、これらゼラチナーゼＡ活性阻害剤は、癌転移防止剤として、又は抗炎症剤として有用なものと考えられる。
【００２０】
一般に分泌型ＡＰＰはグリア芽腫、神経芽腫、ＥＪ−１細胞など多くのヒト癌細胞系から分泌されており、いかなる細胞からも生産させることは可能であるが、本発明ではＪＣＲＢ細胞バンクの分譲株であるＪＣＲＢ−０７１０（保存ヒト膀胱癌細胞株）培養物から容易に単離することができたものである。
【００２１】
ヒト膀胱癌細胞株ＥＪ−１（ＪＣＲＢ細胞バンク保存番号ＪＣＲＢ−０７１０）の培養液から、ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｒｅｄカラムを用いるアフィニティクロマトグラフィと、ＱＡ−８２４カラムを用いる陰イオン交換クロマトグラフィによって分子量１００ｋの分泌型ＡＰＰゼラチナーゼＡ活性阻害活性を有するペプチド類縁体を得ることができた。
【００２２】
これが図１の１８Ｌから６８７Ｋであることも確認できた。すでに図１のＡＰＰ７７０のアミノ酸配列は周知であるが、ゼラチナーゼＡ活性阻害活性の認識は全くなかった。
【００２３】
精製した分泌型ＡＰＰはリジルエンドペプチダーゼで限定分離を行い、その活性断片を単離して、ゼラチナーゼＡ活性阻害活性を確認していったところ、図１の４３９Ｖから６８７Ｋまでのペプチドを主要構成成分とする糖鎖の結合したペプチド類縁体に有効性のあることが確認された。
【００２４】
ここに得られたゼラチナーゼＡ活性阻害活性領域のアミノ酸配列にはすでに知られているゼラチナーゼインヒビターであるＴＩＭＰやＴＩＭＰ−２との構造的類似性は見られなかった。
【００２５】
図３はＥＪ−１細胞から分泌される１００−ｋＤａインヒビター（ゼラチナーゼＡ活性阻害活性）の電気泳動分析を示すものである。ａはＥＪ−１細胞の培養上清のリバースザイモグラフィを示す。大きい三角の矢印は１００−ｋＤａインヒビターを示す。小さい三つの三角の矢印はＴＩＭＰ（２８ｋＤａ）、未確認２２−ｋＤａインヒビターおよびＴＩＭＰ−２（２０ｋＤａ）を示す。陰画（白模様）のバンドは腫瘍細胞により分泌されたゼラチン分解活性を示し、ｂは精製１００−ｋＤａインヒビターの非還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥで、ｃは１００−ｋＤａインヒビター（レーン１，２，４，５）とヒトＴＩＭＰ（レーン３と６）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（レーン１−３）およびリバースザイモグラフィである。また、同量（０．２μｇ／レーン）の蛋白質を還元条件下（レーン２と５）および非還元条件下（レーン１，３，４，６）で分析した。なお、この量では両方の蛋白質がＳＤＳ−ＰＡＧＥ上ではクーマシーブリリアントブルーにより微かに染色されたが、リバースザイモグラフィ上では強く染色されたゼラチンバンド（インヒビターバンド）を示した。ｄはエンドプロテナーゼＬｙｓ−Ｃで処理した後の１００−ｋＤａインヒビターのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（レーン１）およびリバースザイモグラフィ（レーン２）を示す。三角の矢印は２８ｋＤａと３１ｋＤａを有する２種類の活性フラグメントを示す。２Ｍの尿素と１ＭのＮａＣｌを含有する５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）６０μｌの中で３０℃で６０分間、１００−ｋＤａインヒビター（２００μｇ）を０．３μｇのエンドプロテナーゼＬｙｓ−Ｃ（シグマ、セントルイズ、ＭＯ）でインキュベートし、消化物の一部を電気泳動にかけた。この結果、図１のアミノ酸配列の１８Ｌから６８７Ｋのペプチドが得られた。
【００２６】
【製造例】
血清を含まないＲＰＭＩ１６４０培地で２日間培養したＥＪ−１細胞の培養上清から調製した。ゼラチナーゼＡインヒビターのリバースザイモグラフィはヘロン等の方法に修正を加えた方法で０．１％のＳＤＳと１ｍｇ／ｍｌのゼラチンを含有するポリアクリルアミドのゲル上で行われた。電気泳動と次の再生の後、該ゲルを５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭのＣａＣｌ2、１μｇ／ｍｌのヒトプロゼラチナーゼＡ、１ｍＭのｐ−アミノフェニル第二水銀アセテート（ＡＰＭＡ）の反応混合物４ｍｌ中で３７℃で１８時間インキュベートした後、クーマシーブリリアントブルーで染色した。ＴＩＭＰ−２結合型（＜８５％）、ＴＩＭＰ−２を含まない型（＜１５％）の混合物で、少量の５７−ｋＤａ活性型および４１−ｋＤａ活性型を含有したプロゼラチナーゼＡは前述の方法によりＴ９８Ｇヒトグリオ芽腫細胞系の培養上清から得られた。６リットルのＥＪ−１培養上清をｒｅａｃｔｉｖｅ  ｒｅｄ  ａｇａｒｏｓｅ  ｃｏｌｕｍｎ（シグマ）とショーデックスＱＡ−８２４陰イオン交換ＨＰＬＣカラム（昭和電工、東京）上でクロマトグラフィにより精製して約１．１ｍｇの１００−ｋＤａインヒビターを得た。即ち、両方のカラムを予め２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）／０．００５％Ｂｒｉｊ３５で平衡化しておいてから、カラムに結合した蛋白質をＮａＣｌの濃度を増して溶離した。
【００２７】
図２はＡＰＰ７７０構造および１００−ｋＤａインヒビターの部分的なアミノ酸配列の略図を示す。（Ａ）ＡＰＰ７７０のドメイン構造。１：シグナル配列；２：システインに富んだ領域；３：酸性領域；４：ＫＰＩドメイン；５：１９アミノ酸挿入；６：糖鎖結合領域（本発明で明らかにされたゼラチナーゼインヒビタードメイン）；７：βＡＰ領域；８：膜貫通領域；９：細胞質領域。ＡＰＰ７５１は領域５が欠けておりＡＰＰ６９５は領域４と５の両方が欠けている。（Ｂ）精製１００−ｋＤａインヒビターについて測定されたＮ末端アミノ酸配列。この配列は無傷のＡＰＰの残基１８−２８（ＡＰＰ分子のアミノ酸１８−２８残基）に対応する（図２（Ａ）の矢印Ｂ）。（Ｃ）２８−ｋＤａゼラチナーゼインヒビターフラグメントについて測定されたＮ末端アミノ酸配列。この配列は無傷のＡＰＰ７７０の残基４３９−４４６に対応する（図２（Ａ）の矢印Ｃ）。（Ｄ）ＡＰＰの正常な蛋白質分解処理部位から成る部分的なβＡＰ配列（βＡＰ１０−２０）。この配列は無傷のＡＰＰ７７０の残基６８１−６９１に対応する（図２（Ａ）の棒Ｄ）。たての上向き矢印はゼラチナーゼＡによる切断部位。
【００２８】
蛋白質配列については、精製１００−ｋＤａゼラチナーゼＡインヒビターおよびその２８−ｋＤａ活性フラグメントはＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で別々に操作され、ＳＤＳゲルから二フッ化ポリビニリデン（ＰＶＤＦ）膜上に電気的に転写し、次に自動化気相蛋白質シークエンサーにかけた。
【００２９】
【実施例１】
図４はゼラチナーゼＡのβＡＰペプチド加水分解および１００−ｋＤａＡＰＰによるその阻害活性を示す。βＡＰ１０−２０は処理前（Ｉ）および１００−ｋＤａＡＰＰの非存在下（ＩＩ）または存在下（ＩＩＩ）でＡＰＭＡ／ストロメライシン活性化ゼラチナーゼＡでインキュベートした後に逆相ＨＰＬＣにより分析された。ピーク１はβＡＰ１０−２０である。ピーク２はβＡＰ１０−１６（Ｔｒｙ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ）である。ピーク３はβＡＰ１７−２０（Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ）である。横座標：溶離時間（分）。
【００３０】
図５（Ａ）及び（Ｂ）はゼラチナーゼＡによる合成ペプチドβＡＰ１０−２０の分解を示す。コルケンブロックらの方法によるヘパリン親和性クロマトグラフィによりＴＩＭＰ−２結合型からＴＩＭＰ−２を含まないプロゼラチナーゼＡを分離した。プロ酵素（１μｇ）は１ｍＭのＡＰＭＡおよび０．２５μｇのラット・ストロメライシンと共に１０ｍＭのＣａ2+を含有する２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）の中で３７℃で１時間インキュベートすることにより活性化された。次に、活性化された酵素を２０ｎｍｏｌ（２８μｇ）の合成ペプチドβＡＰ１０−２０（図２Ｄ参照）と共に５０μｌのＴｒｉｓ−ＨＣｌ／Ｃａ2+緩衝液中に５μｇの１００−ｋＤａＡＰＰの非存在下または存在下で３７℃で６時間インキュベートし、０．５ｍｌの０．０５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）と混合し、次にコスモシル５Ｃ１８逆相ＨＰＬＣカラム（４．６×１５０ｍｍ）（ナカライテスク、京都、日本）にかけた。装填したカラムを１５ｍｌの０．０５％ＴＦＡ中で０−８０％の直線勾配のアセトニトリルを使用して流速０．５ｍｌ／分で溶出した。シグナルペプチドのアミノ酸配列を蛋白質シークエンサーで分析した。ラット・ストロメライシンは既報のようにプロ酵素型で精製され、ＡＰＭＡにより活性化された。上記条件下ではストロメリシンはほとんどβＡＰ１０−２０を加水分解しなかった。
【００３１】
図５（Ａ）及び（Ｂ）は１００−ｋＤａＡＰＰによるゼラチナーゼＡ活性の抑制の酵素動力学的分析を示す。図５（Ａ）はβＡＰ１０−２０（●）および3Ｈ−ゼラチン（○）の加水分解に及ぼすインヒビター濃度の影響を示す。１００−ｋＤａＡＰＰ（５μｇ／μｌ）の最高濃度は約９１０ｎＭに等しい。図５（Ｂ）は１００−ｋＤａＡＰＰの存在しない場合（●）または１００−ｋＤａＡＰＰが９１ｎＭ（○）存在する場合、１８２ｎＭ（△）存在する場合、または３６４ｎＭ（□）存在する場合のβＡＰ１０−２０加水分解について得られたラインウィーバー・バークプロット（１／ｖ対１／（Ｓ）プロット）を示す。（Ａ）においてゼラチナーゼＡのβＡＰ１０−２０加水分解は、ＡＰＭＡと０．１２５μｇのストロメリシンで活性化された０．５μｇのプロゼラチナーゼＡを５０ｍｌの反応混合物中に０．０−５．０μｇ（０−９１０ｎＭ）の１００−ｋＤａＡＰＰを存在させて０．２ｍＭのβＡＰ１０−２０と共に３０分間反応させた以外は、図４の説明と同様に検定された。βＡＰ１０−２０加水分解はＨＰＬＣのβＡＰ１０−２０ピーク（図４−ＩＩ）の面積から測定された。3Ｈ−ゼラチン加水分解活性は６０℃で１０分間予め変性された3Ｈ標識ヒト胎盤型ＩＶコラーゲン（ＮＥＮ；０．３１ｍＣｉ／ｍｇ）を基質として使用して、リオッタらの方法により検定された。活性化されたゼラチナーゼ（０．５μｇ）を２０ｎＣｉの3Ｈ−ゼラチンと共に５０μｌの反応混合物の中で３７℃で６時間反応させた。ストロメリシンによる3Ｈ−ゼラチン加水分解（全活性の約１０％を占める）は差し引かれた。（Ｂ）において活性化プロゼラチナーゼを１００−ｋＤａＡＰＰの存在下でまたは非存在下で３０−４００μＭのβＡＰ１０−２０と共に反応させた。βＡＰ１０−２０加水分解について１００−ｋＤａＡＰＰのＫ1値（４０ｎＭ）は図５Ａのデータのディクソンプロット（１／ｖ対（Ｉ）プロット）の勾配から得られ、Ｋm（１３０μＭ）およびＶmax（３．９ｎｍｏｌ／ｈ）値は下記の方程式を使って図５Ｂから得られた：
１／ｖ＝１／Ｖmax＋Ｋm（１＋（Ｉ）／Ｋ1）／Ｖmax・（Ｓ）
【図面の簡単な説明】
【図１】ＡＰＰ７７０の１文字標記によるアミノ酸配列を示す。
【図２】ＡＰＰ７７０の模式図である。
【図３】精製した１００−ｋＤａインヒビター（全泌型ＡＰＰ）の性質を示す図である。
【図４】高速液体クロマトグラフィーにおけるゼラチナーゼＡによるβＡＰペプチド分解断片の分離状態を示す図である。
【図５】（Ａ），（Ｂ）ともに精製ＡＰＰによるゼラチナーゼＡ活性阻害状況を示す図である。
【図１】
0003809656.tif 000002
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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