(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列を有し且つジヒドロジピコリネートシンターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項２】
配列表の配列番号５に記載の塩基配列を有するＤＮＡであり、ＤＮＡ−１５８Ｎ配列と命名されるＤＮＡである請求項１に記載のＤＮＡ。
【請求項３】
配列表の配列番号８に記載のアミノ酸配列を有し且つジヒドロジピコリネートシンターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項４】
配列表の配列番号７に記載された塩基配列を有するＤＮＡであり、ＤＮＡ−１６６Ａ配列と命名されるＤＮＡである請求項３に記載のＤＮＡ。
【請求項５】
イネのジヒドロジピコリネートシンターゼ活性を有するタンパク質をコードする請求項１または請求項３に記載のＤＮＡを担持する組換えベクターを導入されて形質転換されたイネ植物細胞を有し、そして導入された前記ＤＮＡが発現可能であることを特徴とする、形質転換イネ植物。
【請求項６】
カリフラワーモザイクウイルス由来であり且つ植物で発現可能なプロモーターと、ＮＯＳターミネーターと、アンピシリン耐性遺伝子とを含有するプラスミドベクターに、前記のプロモーターの支配下に、配列表の配列番号５または配列番号７に記載の１１４３ｂｐの塩基配列を有するＤＮＡ配列を担うＤＮＡ断片を組込んでなる組換えベクター。
【請求項７】
プラスミドベクターがプラスミドベクターｐＢＩ２２１である請求項６に記載の組換えベクター。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は、イネのジヒドロジピコリネートシンターゼの遺伝子と、該遺伝子に関連するＤＮＡに関する。詳しく言えば、本発明はイネ植物のリジンの生合成経路に関与するジヒドロジピコリネートシンターゼをコードする新規なＤＮＡに関する。また、本発明は、ジヒドロジピコリネートシンターゼ活性を有する新規なタンパク質をコードするＤＮＡにも関する。さらに本発明は、それら新規なＤＮＡで形質転換された大腸菌、あるいはそれら新規なＤＮＡで形質転換されたイネ植物とその種子も包含する。
【０００２】
さらに、本発明は、新規なＤＮＡを組込んだ新規な組換えベクターも包含する。
【０００３】
背景技術
イネ、トウモロコシ、コムギなどの穀物種子は、人や家畜等にとって重要な栄養源である。しかし、これらの種子は、必須アミノ酸の一つであるリジン含量が低いことから栄養価が多少とも劣っている。高いリジン含量をもち栄養価に優れた穀物種子を産生できる植物の新品種を作出することが望まれている。
【０００４】
植物体中のリジンの生合成経路であるジアミノピメリン酸経路において、アスパラギン酸−β−セミアルデヒドとピルビン酸とがジヒドロジピコリネートシンターゼ（以下、「ＤＨＤＰＳ」と略すことがある）の作用によって縮合結合することにより、２，３−ジヒドロピコリン酸が生成し、これからさらに５段階の酵素反応によりジアミノピメリン酸を生成し、これを経てリジンが生成することが知られている。（生化学実験講座、第１１巻、５１１頁〜５１７頁、東京化学同人）。従って、ＤＨＤＰＳは、アスパラギン酸−β−セミアルデヒドとピルビン酸とを縮合結合することにより２，３−ジヒドロピコリン酸を生成する活性を有する酵素タンパク質であることが知られている。
【０００５】
ＤＨＤＰＳをコードする遺伝子すなわちＤＨＤＰＳ遺伝子を、トウモロコシ、タバコ、ナタネ、ダイズなどの有用植物体中に導入しその遺伝子の機能を発現させることにより、それら形質転換植物の種子中のリジン含量を向上することが報告されている（ＰＣＴ国際公開ＷＯ９５／１５３９２号公報、特表平７−５０４８２１号、およびＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第１３巻、５７７頁〜５８２頁、１９９５年）。
【０００６】
これまで、ＤＨＤＰＳの遺伝子はコムギ、トウモロコシ、ダイズおよびタバコの植物より取得され、それら遺伝子のＤＮＡの塩基配列が解明されている。例えば次の技術が幾つかの文献に報告されている。
【０００７】
（１）コムギのＤＨＤＰＳのアミノ酸配列の解析とＤＨＤＰＳ遺伝子の単離（特開平３−１２７９８４号公報）。
【０００８】
（２）トウモロコシのＤＨＤＰＳ遺伝子の単離とそのＤＮＡの塩基配列の解析（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、第２２８巻、２８７頁〜２９３頁、１９９１年）。
【０００９】
（３）トウモロコシのＤＨＤＰＳ遺伝子の改変型ＤＮＡを用いるトウモロコシの形質転換と、種子のリジン含量の向上（米国特許５５４５５４５号明細書）。
【００１０】
（４）タバコのＤＨＤＰＳ遺伝子のＤＮＡを改変して、植物体中のリジン含量を高め得るようにＤＮＡでコードされるＤＨＤＰＳのリジンによるフィードバック阻害感受性を解除されてある改変ＤＮＡ（Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ、第８巻、５号、７３３頁〜７４３頁、１９９５年）。
【００１１】
（５）ダイズのＤＨＤＰＳ遺伝子（Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２６巻、９８９頁〜９９３頁、１９９４年）。
【００１２】
（６）細菌例えば大腸菌のＤＨＤＰＳ遺伝子を用いる形質転換により植物の種子のリジン含量を向上させる方法（欧州特許出願公開第０４８５９７０Ａ２号公報）。
【００１３】
しかし、本発明者らの知る限りでは、イネのＤＨＤＰＳのアミノ酸配列を解析したこと、及びイネのＤＨＤＰＳ遺伝子を取得できたことを報告する文献は知られていないし、またイネのＤＨＤＰＳ遺伝子を利用することを報告する文献も知られていない。
【００１４】
本発明の目的の一つは、イネのＤＨＤＰＳ遺伝子をイネ植物から取得して提供することにある。本発明の別の目的は、イネのＤＨＤＰＳタンパク質のＤＨＤＰＳ活性を有するタンパク質をコードできる新規なＤＮＡを提供することである。本発明のさらに別の目的は、ＤＨＤＰＳ活性を有するタンパク質をコードできる新規なＤＮＡによって、トウモロコシ、イネ、ダイズ、コムギ、オオムギなどの有用植物を形質転換することであり、また高いリジン含量をもつ種子を産生できる有用植物の新しい形質転換品種を提供することである。
【００１５】
本発明のその他の目的は、後記の説明から明らかになるであろう。
【００１６】
発明の開示
上記の諸目的を達成するために、本発明者らは一連の種々研究を行った。先づ、イネ植物からＤＨＤＰＳ遺伝子を取得するための研究を行った。この研究の結果、イネの幼植物体の組織、例えば緑色の茎葉の破砕物から全ＲＮＡを遺伝子工学技術で知られる方法により抽出し、その抽出された全ＲＮＡからｍＲＮＡを常法により単離し、そのｍＲＮＡから、市販のｃＤＮＡ合成キットによりｃＤＮＡを収得することに成功した。得られたｃＤＮＡは、λｇｔ１１ファージベクターのＥｃｏＲＩ切断片の末端を仔ウシ小腸由来アルカリホスファターゼで処理したファージベクター（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮ社製の市販品）に連結すると、複製可能な組換えラムダ−ファージを構築できることが多くの試行錯誤の結果により知見された。
【００１７】
その組換えラムダーファージを大腸菌Ｙ１０８８に感染させ、インキュベートすると、多数のプラーク（溶菌斑）として組換えλファージの多数が得られること、また得られた多数のプラークに含まれる組換えλファージ群は、イネ由来のｃＤＮＡを含有する各種多様なファージであってイネのｃＤＮＡライブラリーとして利用できることが知見された。
【００１８】
他方、日本特開平３−１２７９８４号明細書に記載されたコムギのＤＨＤＰＳタンパク質のアミノ酸配列と、これから推認されるＤＨＤＰＳ遺伝子の塩基配列、ならびに文献「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ」２２８巻、２８７〜２９３頁（１９９１年）に記載されたトウモロコシのＤＨＤＰＳ遺伝子の塩基配列を参照しながら、ＰＣＲ法のプライマーとして適すると考えられた２５個のヌクレオチドからなる第１のオリゴヌクレオチドと、２４個のヌクレオチドからなる第２のオリゴヌクレオチドとを本発明者は、化学合成により作製した。
【００１９】
前記の第１のオリゴヌクレオチドと第２のオリゴヌクレオチドと前記のイネのｃＤＮＡライブラリー（すなわち前記の組換えλファージ）との混合物を用いてＰＣＲ法増幅反応を行うと、第１および第２のオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲ法で所要なプライマー（相補的ＤＮＡ）として働くことができ、前記のイネｃＤＮＡライブラリー中のｃＤＮＡがテンプレートとして利用することができ、イネのＤＨＤＰＳ遺伝子由来のｃＤＮＡの一部分を増幅できることが認められた。そしてＰＣＲ増幅反応液からイネＤＨＤＰＳ遺伝子由来のｃＤＮＡの一部分の増幅生成物を、プローブＤＮＡとして回収することに成功した。
【００２０】
このように収得された上記のプローブＤＮＡをスクリーニング材料として用いるファージプラーク−ハイブリダイゼーション法によって、先に得られたイネのｃＤＮＡライブラリー（すなわち前記の組換えλファージの３０万個のプラーク）から、多くの試行錯誤の試験の結果としてイネのＤＨＤＰＳ遺伝子を組込まれた組換えλファージのプラークの４個を単離することに幸にも成功した。それら４個のプラークの組換えλファージを別々に増幅した後に、各々のλファージＤＮＡを常法で単離した。こうして得られた４種類のＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩで切断して得られたＤＮＡ断片は相互に比較すると、同一の塩基配列を有するものであることが認められ、そしてコムギおよびトウモロコシのＤＨＤＰＳ遺伝子のＤＮＡ配列との比較から、イネのＤＨＤＰＳ遺伝子に相当するＤＮＡ配列を含有するＤＮＡ断片であると認定された。
【００２１】
上記のようにして得られた、イネのＤＨＤＰＳ遺伝子に相当すると認められるＤＮＡ配列を含有するＤＮＡ断片を制限酵素ＥｃｏＲＩで切断して得られたＤＮＡ断片は、これを次に、市販の既知のプラスミドベクターｐ Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）のＥｃｏＲＩ切断部位にＤＮＡリゲーションキットにより挿入、連結することができた。こうして得られた組換えプラスミドベクターで大腸菌ＸＬＩ−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’を形質転換することができた。得られた大腸菌形質転換体をインキュベートして多数の菌体を得ることができた。得られた菌体からプラスミドを採取し、得られたプラスミドＤＮＡから、制限酵素でイネ由来のＤＮＡ配列を含有するＤＮＡ断片を切出した。切出されたＤＮＡ断片を、ＤＮＡの塩基配列の解析にかけることによって、このＤＮＡ断片に含有されて且つイネのＤＨＤＰＳ遺伝子に相当すると判定されたＤＮＡ配列の塩基配列は、後記の配列表の配列番号１に記載の塩基配列を有するものであると確認された。
【００２２】
さらに、本発明者らの知る限りでは、配列表の配列番号１に記載の塩基配列を有するＤＮＡは、何れの文献にも記載されていない新規なＤＮＡ配列であると認められた。
【００２３】
配列表の配列番号１の塩基配列を有するＤＮＡでコードされるタンパク質は配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質であると認められ、またこのタンパク質はイネのＤＨＤＰＳを構成するタンパク質であると認められる。
【００２４】
従って、第１の本発明においては、配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列を有するイネのジヒドロジピコリネートシンターゼをコードするＤＮＡが提供される。
【００２５】
第１の本発明によるＤＮＡは、具体的には、配列表の配列番号１に記載の塩基配列を有するＤＮＡであることができる。
【００２６】
第１の本発明のＤＮＡは、イネのＤＨＤＰＳであるタンパク質をコードするＤＮＡである。このＤＮＡは、本発明者らの研究を行うに際しては、前述のように、イネのｃＤＮＡライブラリーから遺伝子工学の技法で取得されたものである。しかし、そのＤＮＡの塩基配列が本発明で明らかにされたので、配列表の配列番号１の塩基配列を参照してヌクレオチドから化学合成によっても取得することができる。また、前記の塩基配列を参照して合成ヌクレオチドをプローブとして作製して用いるか、もしくはその合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いる公知の方法によってイネ染色体のＤＮＡライブラリーから、ポリメラーゼ・チェイン・リアクション（ＰＣＲ）の方法又はハイブリダイゼーションによって第１の本発明のＤＮＡを取得することもできる。
【００２７】
以下に、イネの茎葉から遺伝子工学の技法によって、第１の本発明によるＤＮＡを取得する方法を概略的に説明する。
【００２８】
（１）イネｍＲＮＡの調製およびイネのｃＤＮＡライブラリーの構築
イネ（Ｏｒｉｚａ ｓａｔｉｖａ）の種々な組織、例えば茎葉、根、カルスなどの組織、好ましくは緑色の茎葉から、常法により全ＲＮＡを抽出する。抽出された全ＲＮＡから蛋白質などの夾雑物を除いた後、さらにオリゴｄＴセルロースの充填カラムに通してｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡを精製することによって、イネのｍＲＮＡを得ることができる。
【００２９】
次に、ｍＲＮＡから市販のｃＤＮＡを合成キットによりイネのｃＤＮＡを合成する。合成されたｃＤＮＡをファージベクター、例えばλ ｇｔ１１ベクター又はλ ＺＡＰＩＩベクターなどに組み込み、多数の組換えファージを得る。それら組換えファージを宿主として大腸菌に感染させ、インキュベートすると、プラークとして多数の組換えファージを得ることができる。これら一連の操作は、市販のｃＤＮＡクローニングキットを使用して実施できる。
【００３０】
このように宿主大腸菌の溶菌のプラークとして得られた多数の組換えファージは、イネ由来の全ｃＤＮＡを含有する多種多様のファージから成るものであるから、イネのｃＤＮＡライブラリーとして利用できる。
【００３１】
（２）ＰＣＲ法用のプライマーの構築
コムギのＤＨＤＰＳ遺伝子の既知の塩基配列（例えば、日本特開平３−１２７９８４号明細書に記載されるＤＮＡ配列）と、トウモロコシのＤＨＤＰＳ遺伝子の既知の塩基配列（例えば、前出の「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ」２２８巻、２８７〜２９３頁に記載のＤＮＡ配列）とを相互に比較し且つこれらとの間で共通に保存されている塩基配列があることを本発明者は見出した。このように見出された共通の塩基配列を参照して、本発明者らは２種類のオリゴヌクレオチド（後記の配列表の配列番号３および４のオリゴヌクレオチド）をＰＣＲ法用のプライマー（相補的ＤＮＡ）として化学合成により作製して構築した。
【００３２】
（３）プローブＤＮＡの作製
先に多数の組換えファージからなるプラークとして得られたイネのｃＤＮＡライブラリーの中で、所望のイネＤＨＤＰＳをコードするＤＮＡを選択的に増幅するために、前記の合成オリゴヌクレオチドよりなるプライマーを使用し、それで、ＰＣＲ法によりテンプレートとしてのイネｃＤＮＡライブラリーからイネＤＨＤＰＳ遺伝子の一部分をコードするＤＮＡを増幅する。
【００３３】
増幅反応をＰＣＲ法によって反復した後に、イネＤＨＤＰＳ遺伝子に相当するＤＮＡ配列のうちの一部分であるＤＮＡ断片の増幅生成物を、増幅反応液から、プローブＤＮＡとして採取する。
【００３４】
（４）イネｃＤＮＡライブラリーからのイネＤＨＤＰＳ遺伝子のＤＮＡの選択
先にイネのｃＤＮＡライブラリーとして得られた組換えファージの多数のプラークの中から、上記のプローブＤＮＡをスクリーニング材料として利用するファージプラーク−ハイブリダイゼーション法により、目的のイネＤＨＤＰＳ遺伝子に全体的に対応するＤＮＡ配列を組込まれた組換えファージよりなる数個のプラークを選抜する。
【００３５】
これによって、イネＤＨＤＰＳ遺伝子のＤＮＡに相当する目的のＤＮＡ配列を内部に含有するＤＮＡ断片が該ＤＮＡ断片を組込んでいる組換えファージの形で採取できる。
【００３６】
すなわち、詳しく言えば、上記のようなプラーク・ハイブリダイゼーションで選抜されたプラークのファージを採取して、さらに採取ファージからファージＤＮＡを回収する。回収したファージＤＮＡをジデオキシ法などで処理することにより、イネ由来の挿入ＤＮＡ断片の塩基配列を決定することができる。そのイネ由来の挿入ＤＮＡ配列の塩基配列中のタンパク質コード領域（オープンリーディングフレーム）から規定されるアミノ酸配列を、既知のトウモロコシＤＨＤＰＳやコムギＤＨＤＰＳのタンパク質のアミノ酸配列に対して比較すると、相同性を判定することにより、イネのＤＨＤＰＳの遺伝子に対応するＤＮＡ配列を内部に含有するＤＮＡ断片であることを特定できる。
【００３７】
従って、イネのＤＨＤＰＳの遺伝子に相当するＤＮＡ配列を内部に含有すると判定された挿入ＤＮＡ断片は、上記のように選抜された採取ファージのファージＤＮＡから制限酵素で切出して収得できる。
【００３８】
（５）イネのＤＨＤＰＳ遺伝子に相当するｃＤＮＡのクローニング
上記のようにイネのＤＨＤＰＳ遺伝子に相当するＤＮＡ配列を内部に含有するＤＮＡ断片として、ファージから切出して収得されたＤＮＡは、これをプラスミドベクターｐ Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）のＥｃｏＲＩ切断部位に挿入、連結して組換えプラスミドベクターを構築する。このように構築された組換えプラスミドベクターで大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’を形質転換する。こうして得られた大腸菌形質転換体を培養して増殖させると、イネＤＨＤＰＳ遺伝子に相当するＤＮＡ配列を含有するＤＮＡ断片を担う前記の組換えプラスミドをクローニングできる。従って、イネＤＨＤＰＳ遺伝子に対応するＤＮＡ配列を含有するＤＮＡ断片がクローニングできる。
【００３９】
（６）クローニングされたＤＮＡのシークエンス解析
上記のクローニングされた組換えプラスミドから適当な制限酵素により遺伝子に該当のＤＮＡ配列を含有するＤＮＡ断片を切り出す。切り出されたＤＮＡ断片を市販の塩基配列決定キットで処理すると、イネＤＨＤＰＳ遺伝子に該当するＤＮＡ配列を内部に含有するＤＮＡの塩基配列を決定できる。このように決定された塩基配列をもち且つイネＤＨＤＰＳ遺伝子をコードするＤＮＡ配列の塩基配列は、後記の配列表の配列番号１に記載されてある。
【００４０】
前記に説明したように収得された第１の本発明のＤＮＡ配列、又はそのＤＮＡ配列を含有するＤＮＡ断片をプローブとして用いると、常法によってイネ染色体自体からもＤＨＤＰＳ遺伝子のＤＮＡを取得し得る。しかし、イネ染色体自体から得たＤＨＤＰＳ遺伝子のＤＮＡは、イントロンを含むことが予想される。このようなイントロンで分断されているＤＮＡも、イネＤＨＤＰＳをコードするＤＮＡである限り、第１の本発明のＤＮＡに含まれると認められる。
【００４１】
なお、後記の実施例１で得られて且つ配列表の配列番号１に記載の塩基配列を有するイネＤＨＤＰＳ遺伝子に相当するＤＮＡ配列を含有するＤＮＡ断片は、ｐ Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（＋）プラスミドベクターに挿入、連結された。このように得られた組換えプラスミドベクターの導入により形質転換された大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’はエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＤＡＰ８−１と命名され、日本の茨城県、つくば市の工業技術院生命工学工業技術研究所に１９９６年１０月１４日に、ＦＥＲＭ Ｐ−１５９０６の受託番号で寄託されている。さらに、エシエリヒア・コリＤＡＰ８−１は、１９９８年３月２６日以降、ブダペスト条約の規約下でＦＥＲＭ ＢＰ−６３１０の受託番号で前記の研究所に寄託されてある。
【００４２】
第１の本発明によるＤＮＡは、本発明で解明された該ＤＮＡの塩基配列を指針として用いることによって、イネのＤＨＤＰＳタンパク質を化学合成により多量に収得たることを可能にしている点で有用であり、そしてイネのＤＨＤＰＳタンパク質の酵素学的研究を進めるのに貢献できるものである。
【００４３】
さらに、第１の本発明によるＤＮＡ配列、またはそのＤＮＡ配列を含有する適当なＤＮＡ断片は、それの末端をＥｃｏＲＩリンカーと連結した後に、市販のプラスミドベクターｐＴＶ１１８Ｎ（宝酒造株式会社製、日本）のＥａｃプロモーターの下流にあるＮｃｏＲＩ切断部位に挿入することにより、組換えベクターを構築できる。このように構築された組換えベクターで形質転換された大腸菌は、培養されると、細胞中にＤＨＤＰＳ活性を有するタンパク質を生産することができると期待される。従って、第１の本発明によるＤＮＡを発現できるように前記の組換えベクターを導入されて形質転換された大腸菌を培養すると、イネＤＨＤＰＳ活性を有するタンパク質を製造できると期待される。
【００４４】
他方、一般的には、生理活性を有するタンパク質を構成するアミノ酸配列中の１個もしくは複数個のアミノ酸が欠失されるか、及び（又は）他のアミノ酸に置換されるか、及び（又は）１個もしくは複数個のアミノ酸が該アミノ酸配列中に付加されたアミノ酸配列でも、元のアミノ酸配列のタンパク質の生理活性が維持される場合があることは当業者において広く認識されている。第１の本発明のＤＮＡは、その塩基配列の一部分又は数部分に修飾が加えられた後にも、ＤＨＤＰＳ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであることが可能である。
【００４５】
換言すれば、第１の本発明によるＤＮＡは、それの塩基配列の中の１個又は複数個の塩基、例えば１、２又は３〜１０個の塩基を別の塩基に改変された後にも、ＤＨＤＰＳ活性を有するタンパク質をコードする能力を保有することができる。
【００４６】
従って、第２の本発明においては、後記の配列表の配列番号６または配列番号８に示されたアミノ酸配列を有するタンパク質であって、ジヒドロジピコリネートシンターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡすなわち、請求項１のＤＮＡまたは請求項３のＤＮＡが提供される。
【００４７】
第２の本発明によるＤＮＡは、第１の本発明によるＤＮＡから改変されたＤＮＡであり、この第２の本発明のＤＮＡは、例えば部位特異的変異法によって、ＤＮＡでコードされるタンパク質の特定の部位のアミノ酸が上記のような仕方で欠失、置換若しくは付加されてなるアミノ酸配列をもつタンパク質をコードするように、第１の本発明のＤＮＡの塩基配列を改変することによって得られる。
【００４８】
また、第１の本発明のＤＮＡを含有するＤＮＡ断片を包有する細胞に変異処理を行い、変異した細胞から、例えば配列表の配列番号１に記載の塩基配列を有するＤＮＡに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるが配列番号１の塩基配列と部分的に異なる塩基配列を有するＤＮＡを選別することによっても、第２の本発明の改変されたＤＮＡを得ることができる。ここでいう「ストリンジェントな条件」とは、第１の本発明のＤＮＡに対するいわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件は、これを明確に数値で特定化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高い２つの核酸同志、高い相同性を有する例えば９８％以上の相同性を有するＤＮＡ同志がハイブリダイズすることを許すが、それより相同性が低い核酸同志がハイブリダイズすることを許さない条件が挙げられる。
【００４９】
従って、第２の本発明によるＤＮＡは、その具体例として、配列表の配列番号１に記載の塩基配列と部分的に異なる塩基配列を有するが、配列番号１に記載の前記の塩基配列に対して高い相同性を示すＤＮＡであって、しかも配列表の配列番号１に記載の塩基配列を有するＤＮＡに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができ、かつ、ジヒドロジピコリネートシンターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであることができる。
【００５０】
第２の本発明によるＤＮＡの具体的な例には、後記の実施例２に記載された方法で作製されて実施例２で改変ＤＮＡ−１５８Ｎと命名されたＤＮＡ配列（請求項２）と、後記の実施例３に記載された方法で作製されて実施例３で改変ＤＮＡ−１６６Ａと命名されたＤＮＡ配列（請求項４）とがある。
【００５１】
その改変ＤＮＡ−１５８Ｎと命名されたＤＮＡ配列（請求項２）は、後記の配列表の配列番号５に記載の塩基配列を有するＤＮＡである。これは配列表の配列番号１に記載の塩基配列を有する第１の本発明ＤＮＡの中にある４７２番目、４７３番目、４７４番目のＡＡＣ配列（アスパラギンをコードするコドン）での４７３番目の塩基Ａ（アデニン）１個をＴ（チミン）１個に置換して、塩基配列の４７２〜４７４番目に配列ＡＴＣ（イソロイシンをコードするコドン）が在るように改変されたＤＮＡに相当する。この改変ＤＮＡ−１５８Ｎ配列は、第１の本発明のＤＮＡに対してストリンジェントな条件でハイブリダイズできる。
【００５２】
この配列番号５の改変ＤＮＡ−１５８Ｎ配列でコードされるタンパク質は、配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列を有するものであり、ＤＨＤＰＳ活性を有する（請求項１、参照）。
【００５３】
さらに、配列番号８のアミノ酸配列をもち且つＤＨＤＰＳ活性をもつタンパク質（請求項３参照）をコードする上記の改変ＤＮＡ−１６６Ａ配列（請求項４、参照）は、配列表の配列番号７に記載された塩基配列を有するＤＮＡである。これは、配列番号１に記載の塩基配列を有する第１の本発明ＤＮＡの中にある４９６番目、４９７番目、４９８番目のＧＣＡ配列（アラニンをコードするコドン）での４９７番目の塩基Ｃ（シトシン）１個をＴ（チミン）１個に置換して、塩基配列の４９６〜４９８番目に配列ＧＴＡ（バリンをコードするコドン）が在るように改変されたＤＮＡに相当する。この改変ＤＮＡ−１６６Ａ配列は、第１の本発明のＤＮＡに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる。
【００５４】
この改変ＤＮＡ−１６６Ａ配列でコードされるタンパク質は、配列表の配列番号８に記載のアミノ酸配列を有するものであり、ＤＨＤＰＳ活性を有する（請求項３、参照）。
【００５５】
第２の本発明による改変ＤＮＡの更に別の例は、配列表の配列番号１に示す塩基配列における、４７３番目のアデニンをチミンに置換し且つ４９７番目のシトシンをチミンに置換して形成された塩基配列を有するＤＮＡ配列であり、このＤＮＡ配列によっては、配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列における１５８番目のアスパラギンをイソロイシンに置換し且つ１６６番目のアラニンをバリンに置換して形成されたアミノ酸配列を有するタンパク質であってジヒドロジピコリネートシンターゼ活性を有するタンパク質がコードされる。
【００５６】
一般的には、ＤＮＡ配列の一部分の領域にある塩基配列を改変する方法として、（Ｋｕｎｋｅｌ法「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」１５４巻３６７号）、およびオリゴヌクレオチド−ダイレクト デュアルアンバー法、さらにその他の方法が知られている。
【００５７】
本発明の本来の目的は、高いリジン含量をもつ種子を産生できるように形質転換された新品種植物を創成することにあることから、リジンの生合成経路に関与するＤＨＤＰＳが生合成生成物としてのリジンによる酵素活性のフィードバック阻害を受けなくなるように酵素活性を改質されたＤＨＤＰＳ、ならびにこの改質ＤＨＤＰＳをコードするＤＮＡが必要とされる。そこでリジンによるフィートバック阻害についての酵素の感受性を解消されたように改質された新規なＤＨＤＰＳをコードできる新規な改変ＤＮＡを第１の本発明のＤＮＡから作製することを目的として、先づ本発明者らは研究を行った。その結果、既知のＫｕｎｋｅｌ法の改良法と、オリゴヌクレオチド−ダイレクト デュアルアンバー法の改良法とを組合せることによって、イネのＤＨＤＰＳをコードする第１の本発明の塩基の配列の一部領域における１個又は２個又はそれ以上の塩基を別の塩基に置換することが可能であることを本発明者らは、知見した。
【００５８】
更に、前記の米国特許第５５４５５４５号明細書に記載されるトウモロコシのＤＨＤＰＳ遺伝子の改変に関する従来技術および前記の「Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ」８巻、５号、７３３〜７４３頁に記載されるタバコのＤＨＤＰＳ遺伝子の改変に関する技術、ならびに欧州特許出願公開第０４８５９７０Ａ２号明細書に記載される細菌のＤＨＤＰＳ遺伝子を用いる植物の形質転換に関する技術を参照しながら、本発明者らは、第１の本発明のＤＮＡの配列表、配列番号１に記載の塩基配列の４７３番目の塩基、アデニン（Ａ）をチミン（Ｔ）に取代えるか又は４９７番目の塩基、シトシン（Ｃ）をチミン（Ｔ）に取代えて得られた改変ＤＮＡが、リジンによるフィードバック阻害を受けない酵素活性を有するように改質された酵素タンパク質であって且つＤＨＤＰＳ活性を維持できる新規なタンパク質をコードできるはずであるとの予想的な着想を今回、得た。
【００５９】
この着想に基づいて、本発明者らは、種々の研究を行ったが、多くの試行錯誤の試験の結果として、第１の本発明の新規ＤＮＡの作製にあたり構築された、イネのＤＨＤＰＳ遺伝子に対応するＤＮＡ配列を含有するＤＮＡ断片〔すなわち、λファージから前記のとおり切出したＤＮＡ断片、すなわち配列表の配列番号１のＤＮＡ配列（これは以下ではＤＨＤＰＳ−ＤＮＡ−１１４３と称す）を含有するＤＮＡ断片〕をプラスミドベクターｐ Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）のＥｃｏＲＩ切断部位とＳａｃ Ｉ切断部位との間にＤＮＡリゲーションキットにより挿入、連結してなる組換えプラスミドベクター（以下、ｐ ＤＡＰ８−１と称する）が目的の新規な改変ＤＮＡの作製のための出発材料として適することを認めた。
【００６０】
また、このような目的の新規な改変ＤＮＡを、前記の出発材料、組換えプラスミドベクターｐ ＤＡＰ８−１がらＰＣＲ法に準じて作製するために適当に使用できるプラマーとして、５種類のプライマー、すなわち、後記の配列表の配列番号９に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドよりなるプラマーＮｏ．３と、配列番号１０に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドよりなるプライマーＮｏ．４と、配列番号１１に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドよりなるプライマーＦＷ−１と、配列番号１２に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドよりなるプライマーＲＶ−１と、配列番号１３に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドよりなるプライマーＢＳ ＫＰＮ−１）を化学合成により本発明者は作製した。
【００６１】
上記のプラスミドベクターｐ ＤＡＰ８−１と、上記の５種の合成オリゴヌクレオチドよりなるプライマーとを利用して、後記に詳述される方法を実施すると、第２の本発明による改変ＤＮＡの具体的な例である配列表、配列番号５に記載のＤＮＡ、すなわち前記の改変ＤＮＡ−１５８Ｎ配列を含有するＤＮＡ断片、ならびに配列番号７に記載のＤＮＡ、すなわち前記の改変ＤＮＡ−１６６Ａ配列を含有するＤＮＡ断片を収得することに成功できたのである。
【００６２】
第１の本発明によるＤＮＡも、また改変ＤＮＡ−１５８Ｎ配列も、改変ＤＮＡ−１６６Ａ配列も、これを組換えベクターに組込んで後記の実施例４又は５に記載される植物体への外来遺伝子の導入方法によりイネ植物に導入されると、その形質転換されたトランスジェニック植物の中で発現することができた。
【００６３】
そして、第１の本発明ＤＮＡ、または第２の本発明による改変ＤＮＡ−１５８Ｎ配列あるいは改変ＤＮＡ−１６６Ａ配列で形質転換されたイネのトランスジェニック植物は、リジン含量を増強されたイネ植物細胞あるいはイネ種子を産生することができることが確認された。
【００６４】
次に、第２の本発明による上記の改変ＤＮＡ−１５８Ｎ配列を含有するＤＮＡ断片を作製するのに、好適に使用でき且つ後記の実施例２において例示される手順よりなるＤＮＡの改変方法を要約的に説明する。
【００６５】
（１）第１の本発明のＤＮＡのクローニング
配列表の配列番号１に記載される１１４３個の塩基からなる第１の本発明のＤＮＡ、すなわち前記のＤＨＤＰＳ−ＤＮＡ−１１４３配列を含有するＤＮＡ断片を、ＤＮＡリゲーション・キットの利用により、ベクターｐ Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）のＥｃｏＲＩ切断部位との間に挿入、連結することによって、前記の組換えプラスミドベクターｐ ＤＡＰ８−１を得る。このベクターｐ ＤＡＰ８−１を大腸菌ＸＬＩ−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ′に導入し、これで得られた形質転換大腸菌を増殖する。増殖された大腸菌細胞から、常法で抽出することにより組換えプラスミドベクターｐ ＤＡＰ８−１を多量に収得する。このベクターは、ＤＨＤＰＳ−ＤＮＡ−１１４３配列を含有するＤＮＡ断片のコピーを多量に含むから、第１の本発明ＤＮＡがクローニングされたことになる。
【００６６】
（２）ＰＣＲ用のプライマーの構築
ＤＮＡ合成装置（Ｍｏｄｅｌ−３９１，アプライド バイオシステムズ社製）を利用して、下記の塩基配列を有する５種類のオリゴヌクレオチドをプライマーとして合成する。
【００６７】
（ａ）プライマーＮｏ．３（配列表の配列番号９に記載され且つ下記される塩基配列をもつプライマー）：５′−ＧＣＣＴＣＴＣＴＴＧＴＴＧＡＧＡＴＡＣＴＡＣＣＴＧＴＧＴＴＧＣＣ−３′
（ｂ）プライマーＮｏ．４（配列表の配列番号１０に記載され且つ下記される塩基配列をもつプライマー）：５′−ＧＣＡＡＡＴＣＣＣＴＧＣＴＣＴＧＴＴＡＣＡＴＧＡＡＴＡＧＣＣ−３′
（ｃ）プライマーＦＷ−１（配列表の配列番号１１に記載され且つ下記される塩基配列をもつプライマー）：５′−ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧＡＧ−３′
（ｄ）プライマーＲＶ−１（配列表の配列番号１２に記載され且つ下記される塩基配列をもつプライマー）：５′−ＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧ−３′
（ｅ）プライマーＢＳＫＰＮ−１（配列表の配列番号１３に記載され且つ下記される塩基配列をもつプライマー）：５′−ＴＡＧＧＧＣＧＡＡＴＴＧＴＧＴＧＴＡＣＣＧ−３′
（３）所要なＤＮＡ断片のＰＣＲ法による増幅と回収
所要なＤＮＡ断片を増幅して得るために、ＰＣＲ法の第１回段階として２つの反応、すなわち後記の（Ａ）反応と（Ｂ）反応とを行う。
【００６８】
その（Ａ）反応は、テンプレートとして用いられる前記の組換えプラスミドベクターｐＤＡＰ８−１と、プライマーとして用いられる前記のプライマーＦＷ−１（配列番号１１の合成オリゴヌクレオチド）と、プライマーＮｏ．３（配列番号９の合成オリゴヌクレオチドであり、５′−末端から１５〜１７番目のＧＡＴが−ＤＮＡ−１５８Ｎ配列の改変部ＡＴＣを誘導できる）とを、ＰＣＲ法用の通常の反応液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＫＣｌ、４種のデオキシヌクチオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）、およびＬａＴａｑＤＮＡポリメラーゼを含有）に加え、次いで増幅反応を行うことから成る。この（Ａ）反応によって、前記のＤＨＤＰＳ−ＤＮＡ−１１４３配列のうちの或る領域における塩基配列をもつＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片−Ａと称す）が増幅反応により生成される。
【００６９】
また（Ｂ）反応は、前記のプライマーＲＶ−１（配列番号１２の合成オリゴヌクレオチド）と、プライマーＢＳ ＫＰＮ−１（配列番号１３の合成オリゴヌクレオチドと、テンプレートとして用いられる前記のベクターｐ ＤＡＰ８−１とを、（Ａ）反応で用いたと同じＰＣＲ法用の通常の反応液に加え、次いで増幅反応を行うことから成る。この（Ｂ）反応によって、前記のＤＨＤＰＳ−ＤＮＡ−１１４３配列のうちの或る領域における塩基配列を含有し且つ３′−側にＳａｃＩ切断部位を有する延伸部を含有するＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片−Ｂと称す）が増幅反応により生成される。
【００７０】
ＰＣＲ法による上記の増幅反応は、市販のＰＣＲ反応装置を用いて実施できる。
【００７１】
増幅反応の終了後に、上記の（Ａ）反応の増幅反応液を低融点アガロース電気泳動により分画して、増幅生成物としての４８０ｂｐ（ベースペア）のＤＮＡ断片−Ａを含むバンドをアガロースゲルから切出す。また、上記の（Ｂ）反応の増幅反応液を同様に低融点アガロース電気泳動により分画し、そしてそのアガロースゲルから１２００ｂｐ（ベースペア）のＤＮＡ断片−Ｂを含むバンドを切出す。
【００７２】
次いで、それら２つのゲル切片をＤＮＡ精製キット、例えばＧＥＮＥＣＬＥＡＮ ＩＩキット（フナコシ社製）により精製することにより、ＤＮＡ断片−Ａの精製品と、ＤＮＡ断片−Ｂの精製品とをそれぞれ回収する。
【００７３】
さらに、ＰＣＲ法の第２回段階として、配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうちの４７３番目のアデニンをチアミンに置換してなる塩基配列をもつＤＮＡ配列（すなわち配列番号３の塩基配列をもつ第２の本発明のＤＮＡ−１５８Ｎ断片に相当する配列）を含み且つ該ＤＮＡ配列の５′−末端にＫｐｎＩ切断部位を有する延伸部と３′−末端にＳａｃＩ切断部位を有する延伸部を含有する配列長１２００ｂｐのＤＮＡ断片を作製する工程を行う。このためには、テンプレートとして用いられる前記の（Ａ）反応の増幅生成物であるＤＮＡ断片−Ａの精製品（配列長４８０ｂｐ）と、（Ｂ）反応の増幅生成物であるＤＮＡ断片−Ｂの精製品（配列長１２００ｂｐ）と、前記のプライマーＲＶ−１（配列番号１２の合成オリゴヌクレオチド）と、前記のプライマーＦＷ−１（配列番号１１の合成オリゴヌクレオチド）とを、ＰＣＲ法用の通常の増幅反応液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＫＣｌ、４種のｄＮＴＰ、およびＬａ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼを含有）に加え、次いで増幅反応を行う。その反応終了後に、その反応液を低融点アガロース電気泳動により分画し、そのアガロースゲルから、配列長１２００ｂｐの所期のＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片−Ｃと称す）を含有するバンドを切出す。
【００７４】
そのゲル切片を、ＤＮＡ精製キット、例えばＧＥＮＥＣＬＥＡＮＩＩキット（フナコシ社製）により精製して、ＤＮＡ断片−Ｃの精製品を得る。このＤＮＡ断片−Ｃは、第２の本発明による改変ＤＮＡ−１５８Ｎ断片に相当する塩基配列を内部に含有し且つＤＮＡ配列の５′−末端にＫｐｎＩ切断部位を有する延伸部と３′−末端にＳａｃＩ切断部位を有する延伸部を含有する構造をもつものである。
【００７５】
（４）改変ＤＮＡ−１５８Ｎ配列を含有するＤＮＡ断片のクローニング
次に、上記の（３）項で得られたＤＮＡ断片−Ｃを利用して、目的の改変ＤＮＡ−１５８Ａ配列（第２の本発明による改変型ＤＮＡの第１例）を含有するＤＮＡ断片を収得する。
【００７６】
そのためには、先づ、上記のＤＮＡ断片−Ｃの５′−及び３′−末端における延伸部を、制限酵素ＫｐｎＩと制限酵素ＳａｃＩで処理する。
【００７７】
これによって、ＤＮＡ断片−Ｃから、３′−側にＳａｃＩ切断部位を有する延伸部を含有し、且つ５′−側がＡＴＧから始まる改変ＤＮＡ−１５８Ａ配列を含有するＤＮＡ断片を切取る。
【００７８】
このようにして、目的の改変ＤＮＡ−１５８Ａ配列に相当するＤＮＡ配列を含有するＤＮＡ断片の試料が得られる。次に、プラスミドベクターｐ Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）を制限酵素ＫｐｎＩと制限酵素ＳａｃＩで処理することにより、５′−側の−端にＫｐｎＩ切断部位をもち且つ３′−側の他端にＳａｃＩ切断部位をもつ短縮されたプラスミド（以下では、ｐ Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）−ＫｐｎＩ−ＳａｃＩ−短縮プラスミド称す）を得る。
【００７９】
このＫｐｎ Ｉ−Ｓａｃ Ｉ−短縮プラスミドを前記のＤＮＡ−１５８Ｎ配列を含むＤＮＡ断片試料と混合し、次いでＤＮＡリゲーション・キットで連結反応にかけると、改変ＤＮＡ−１５８Ｎ配列を含有する組換えプラスミド（以下では、ｐ Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＤＮＡ−１５８Ｎプラスミドと称す）を作製できる。
【００８０】
この組換えプラスミドを大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ′に導入して形質転換し、こうして得られた形質転換大腸菌を液体培地中で培養して増殖させる。大量に増殖された大腸菌細胞は、前記の組換えプラスミド、すなわちｐ−Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＤＮＡ−１５８Ｎプラスミドのコッピイを含有する。このようにして、改変ＤＮＡ−１５８Ｎ配列はクローニングできる。その大腸菌培養細胞から、常法により改変ＤＮＡ−１５８Ｎ配列を含有するプラスミドを抽出して取る。
【００８１】
（５）改変ＤＮＡ−１５８Ｎ断片の回収
前項（４）で得られた改変ＤＮＡ−１５８Ｎ配列を含有するプラスミドを、次いで制限酵素ＸｂａＩと制限酵素ＳａｃＩで処理することによって消化する。
【００８２】
これによってＸｂａＩ切断部位に隣接する５′−側端に塩基配列ＡＴＧを有し且つ３′−側端にＳａｃＩ切断部位を有する延伸部を有する改変ＤＮＡ−１５８Ｎ配列を含有するＤＮＡ断片を含有する消化反応液を得ることができる。
【００８３】
この消化反応液を、低融点アガロース電気泳動により分画して、前記のＤＮＡ断片を含むバンドをアガロースゲルから切出す。切出されたアガロースゲル片をＴＥバッファーに溶解し、得られた溶液をフェノールで抽出すると、フェノール抽出液に前記のＤＮＡ断片が回収される。前記のＤＮＡ断片を含むフェノール抽出液を、３Ｍ酢酸ナトリウム水溶液およびエタノールを混合し、その混合物を−２０℃で約６時間放置し、さらに低温で遠心分離すると、前記のＤＮＡ断片が沈澱する。これを減圧下に乾燥すると、目的の改変ＤＮＡ−１５８Ｎ配列を内部に含有するＤＮＡ断片が粉末として得られる。この改変ＤＮＡ−１５８Ｎ配列を含有するＤＮＡ断片の粉末は水に可溶性である。
【００８４】
更に、第２の本発明による前記の改変ＤＮＡ−１６６Ａ配列を含有するＤＮＡ断片を作製するのに好適に使用でき、且つ後記の実施例３で例示されるＤＮＡの改変方法は、前記の改変ＤＮＡ−１５８Ｎ配列を含有するＤＮＡ断片の作製のための先に説明した方法と同様な手順により実施できる。
【００８５】
すなわち、改変ＤＮＡ−１６６Ａ配列を含有するＤＮＡ断片を作製するための好適な作製方法は、先づ改変ＤＮＡ−１５８Ｎ配列を含有するＤＮＡ断片の作製法の（１）項で説明したと同じ手順により、第１の本発明のＤＮＡ（すなわち、ＤＨＤＰＳ−ＤＮＡ−１１４３）を含有する組換えベクターｐ ＤＡＰ８−１を、大腸菌ＸＬＩ−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ′に導入し、大腸菌を増殖することにより成るクローニング工程から始まる。
【００８６】
次に、テンプレートとして用いられるベクターｐ ＤＡＰ８−１と、オリゴヌクレオチドとして合成されたプライマーＦＷ−１と、ブライマーＮｏ．４（配列番号１０の合成オリゴヌクレオチドであり、５′−末端から１８〜２０番目のＴＡＣが改変ＤＮＡ−１６６Ａ配列の改変部ＧＴＡを誘導できる）とを、前記の改変ＤＮＡ−１５８Ｎ配列含有のＤＮＡ断片の製法の（３）項で説明された（Ａ）反応で用いたと同じＰＣＲ法用の通常の反応液に加え、次いで増幅反応を行うことから成る工程が実施される。この際の増幅反応によって、前記のＤＨＤＰＳ−ＤＮＡ−１１４３配列のうちの或る領域における塩基配列をもつＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片−Ｄと称す）が生成される。
【００８７】
次に、改変ＤＮＡ−１５８Ｎ配列含有のＤＮＡ断片の製法の（３）項で説明された手順で行われる（Ｂ）反応と全く同じに、ＰＣＲ法の（Ｂ）反応を行うことから成る工程が実施される。これによって、その（Ｂ）反応から、前記ＤＮＡ断片−Ｂを増幅生成物として得る。
【００８８】
上記のプライマーＦＷ−１とプライマーＮｏ．４を用いる（Ａ）反応によって生成された前記ＤＮＡ断片−Ｄを含む増幅反応液は、これを低融点アガロース電気泳動にかけて分画する。こうして、増幅生成物としての４８０ｂｐのＤＮＡ断片−Ｄを含むバンドをアガロースゲルから切出す。また、（Ｂ）反応によって生成されたＤＮＡ断片−Ｂを含む増幅な反応液も、同様に低融点アガロース電気泳動により分画して、１２００ｂｐのＤＮＡ断片−Ｂを含むバンドをアガロースゲルから切出す。さらに、ＤＮＡ精製キットによりそれらゲル切片を精製すると、ＤＮＡ断片−Ｄ精製品と、ＤＮＡ断片−Ｂの精製品とをそれぞれ回収できる。
【００８９】
さらに、ＰＣＲ法の第２回段階として、配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうちの４９７番目の塩基シトシンをチミンに置換してなる塩基配列をもつＤＮＡ配列（すなわち配列番号７の塩基配列をもつ改変ＤＮＡ−１６６Ａ配列に相当するＤＮＡ配列）を内部に含み且つ該ＤＮＡ配列の５′−末端にＫｐｎＩ切断部位を有する延伸部と３′−末端にＳａｃＩ切断部位を延伸部とを含有する配列長１２００ｂｐのＤＮＡ断片を作製する工程を行う。このためには、テンプレートとして用いられる前記のＤＮＡ断片−Ｄの精製品（配列長４８０ｂｐ）と、ＤＮＡ断片−Ｂの精製品（配列長１２００ｂｐ）と、前記のプライマーＲＶ−１と、プライマーＦＷ−１とをＰＣＲ法用の増幅反応液に加え、次いで増幅反応を行う。その反応終了後に、その反応液を低融点アガロース電気泳動により分画する。そのアガロースゲルから、配列長１２００ｂｐの所期のＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片−Ｅと称す）を含有するバンドを切出す。
【００９０】
そのゲル切片をＤＮＡ精製キットにより精製して、ＤＮＡ断片−Ｅの精製品を得る。このＤＮＡ断片−Ｅは、第２の本発明による改変ＤＮＡ−１６６Ａ配列に相当する塩基配列を内部に含有し且つＤＮＡ配列の５′−末端にＫｐｎＩ切断部位を有する延伸部と３′−末端にＳａｃＩ切断部位を有する延伸部とを含有する構造をもつものである。
【００９１】
このＤＮＡ断片−Ｅを利用して、目的の改変ＤＮＡ−１６６Ａ配列（第２の本発明による改変型ＤＮＡの第２例）を含有するＤＮＡ断片を収得する。そのためには、ＤＮＡ断片−Ｅを制限酵素ＫｐｎＩとＳａｃＩで処理する。これによって、ＤＮＡ断片−Ｅから、３′−側にＳａｃＩ切断部位を有する延伸部を含有し且つ５′側がＡＴＧから始まる改変ＤＮＡ−１６６Ａ配列を含有するＤＮＡ断片を切取る。
【００９２】
このようにして、改変ＤＮＡ−１６６Ａ配列に相当するＤＮＡ配列を含有するＤＮＡ断片の試料が得られる。このＤＮＡ試料を、先に改変ＤＮＡ−１５８Ｎ配列含有のＤＮＡ断片の製法の（４）項に記載と同じ要領でＤＮＡリゲーション・キットの利用により、プラスミドベクターｐ Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）と連結し、得られた組換えベクターで大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ′を形質転換し、さらに増殖することにより、クローニングできる。
【００９３】
さらに、このようにクローニングされた改変ＤＮＡ−１６６Ａ配列を含有するプラスミドを大腸菌の細胞から回収する。次いで該プラスミドを、改変ＤＮＡ−１５８Ｎ配列含有のＤＮＡ断片の製法の（５）項に記載と同じ手順により処理する。このようにすると、１１４３ｂｐのＤＮＡ断片として、目的の改変ＤＮＡ−１６６Ａ配列を含有するＤＮＡ断片を水溶性粉末の形で収得することができる。
【００９４】
以上の説明においては、第２の本発明の第１例による改変ＤＮＡ−１５８Ｎ配列を含有するＤＮＡ断片と、第２の本発明の第２例による改変ＤＮＡ−１６６Ａ配列を含有するＤＮＡ断片は、遺伝工学の技法を利用する方法で作製された。しかしながら、配列表の配列番号５および配列番号７に記載の塩基配列を参照しながら、従来知られるポリヌクレオチド化学合成法によっても製造できる。
【００９５】
なお、第１の本発明のＤＮＡの塩基配列の４７３番目のアデニン又は４９７番目のシトシンを前記のようにチミンに置換する場合について、第２の本発明の具体例を説明した。しかしながら、第１の本発明のＤＮＡをテンプレートとして用い且つ適当に工夫された塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドの数種類を組合せてプライマーとして用いるならば、第１の本発明のＤＮＡの４７３番目又は４９７番目の場所とは別の場所における塩基を別の塩基に置換して形成される塩基配列を有する別例の改変ＤＮＡを作製することが可能である。
【００９６】
更に、本発明者らは別段の研究を進めた。その結果、植物体に外来遺伝子を導入して植物体を形質転換され、得られたトランスジェニック植物体で外来遺伝子を発現させるための従来知られたバイオテクノロジー技法を利用することによって、第１の本発明によるＤＨＤＰＳをコードする新規ＤＮＡも、第２の本発明によるＤＨＤＰＳをコードする新規な改変ＤＮＡも、組換えベクターによる組込んだ後に植物体に導入することができ、しかも植物体内で発現できることが知見された。
【００９７】
従って、第３の本発明（請求項５の発明）においては、イネのジヒドロジピコリネートシンターゼ活性を有するタンパク質をコードする第２の本発明に係る配列番号５または７の塩基配列をもつＤＮＡを担持する組換えベクターを導入されて形質転換されたイネ植物細胞を有し、そして導入された前記ＤＮＡが発現可能であることを特徴とする、形質転換イネ植物が提供される。
【００９８】
しかも、第１の本発明または第２の本発明によるＤＮＡの導入により形質転換された植物体が栽培すると種子を結実できる植物である場合、その植物を通常の条件で栽培して植物の種子を収獲できることが知見された。
【００９９】
従って、第４の本発明においては、イネのジヒドロジピコリネートシンターゼをコードする第１の本発明のＤＮＡを担持する組換えベクターを植物細胞に導入することによって得られ且つ前記のＤＮＡが発現可能である形質転換植物を栽培し、さらにその栽培により結実した植物から採取された種子であることを特徴とする、形質転換植物の種子が提供される。
【０１００】
また、第５の本発明によると、ジヒドロジピコリネートシンターゼ活性を有するタンパク質をコードする第２の本発明によるＤＮＡを担持する組換えベクターを植物細胞に導入することによって得られ且つ前記のＤＮＡが発現可能である形質転換植物を栽培し、さらにその栽培により結実した植物から採取された種子であることを特徴とする、形質転換植物の種子が提供される。
【０１０１】
さらにまた、第６の本発明においては、プラスミドベクターｐ Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）の制限酵素ＥｃｏＲＩによる切断部位に、配列表の配列番号１の塩基配列を有するＤＮＡ配列を含有するＤＮＡ断片をＤＮＡリゲーション・キットにより連結して形成された組換えプラスミドを含み、しかもアンピシリンの存在下でも安定に増殖できることを特徴とする、形質転換された大腸菌が新規な微生物として提供される。
【０１０２】
第６の本発明による形質転換大腸菌は、日本における工業技術院生命工学工業技術研究所にブダペスト条約の規約下に受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６３１０で寄託されてある大腸菌ＤＡＰ８−１であることができる。
【０１０３】
第１の本発明によるＤＮＡ、あるいは第２の本発明によるＤＮＡを外来遺伝子として用いて植物を形質転換する場合には、形質転換できる植物の種類は多種多様であり、また植物の形質転換のために外来遺伝子としての本発明ＤＮＡを植物に導入する方法は、その目的で行われる従来公知のバイオテクノロジーの種々な技法であることができる。
【０１０４】
第１の本発明のＤＮＡまたは第２の本発明のＤＮＡを外来遺伝子としてイネ植物に導入するために好適に実施でき且つ後記の実施例４に例示される方法を以下に要約的に説明する。
【０１０５】
（１）外来遺伝子の導入用の組換えベクターの作成
従来知られるカリフラワー・モザイクウイルスの３５Ｓプロモーターと、ＮＯＳターミネーターと、アンピシリン耐性遺伝子とを含有する既知のプラスミドベクターｐＢＩ２２１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）をバッファー中で制限酵素ＸｂａＩおよび制限酵素ＳａｃＩで処理すると、３５Ｓプロモーターの下流のＸｂａＩ切断部位で切断され且つＮＯＳターミネーターの上流のＳａｃＩ切断部位で切断された約３．８ｋｂのサイズのベクターＤＮＡ断片を得る。
【０１０６】
そのベクターＤＮＡ断片の水溶液を、本発明のＤＮＡの水溶液と混合し、その混合物をＤＮＡリゲーション・キットで処理して連結反応を行う。これによると、ベクターＤＮＡ断片の３５Ｓプロモーター領域とＮＯＳターミネーター領域との間に本発明のＤＮＡが挿入、連結されてある組換えベクターを得る。
【０１０７】
得られた組換えベクターを大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’に導入して、形質転換大腸菌を得る。
【０１０８】
得られた形質転換大腸菌を、抗生物質アンピシリン含有の培地に接種、培養することにより、アンピシリン耐性の大腸菌コロニーの数個を得る。これらのコロニーを更にアンピシリン含有の培地中でそれぞれ別々に増殖させる。
【０１０９】
各コロニーごとの増殖されたアンピシリン耐性の大腸菌から、それぞれにプラスミドを回収する。回収されたプラスミドは、挿入ＤＮＡの向きが相異なる種々なプラスミドを含む。各コロニーごとに回収されたプラスミドを、制限酵素ＸｂａＩとＳａｃＩとで消化して切出された種々のＤＮＡ断片を含む消化反応液をアガロースゲル電気泳動にかけて、それらＤＮＡ断片の大きさ及び塩基配列を解析すると、組換えプラスミドの３５Ｓプロモーターの下流に本発明のＤＮＡを正常な向きで挿入、連結されている適当なプラスミド（約４．９ｋｂのサイズ）を選抜できる。
【０１１０】
第１の本発明のＤＮＡが正常に挿入、連結されている組換えプラスミドをベクターｐ ＤＡＰと称し、第２の本発明による改変ＤＮＡ−１５８Ｎ断片が正常に挿入、連結されている組換えプラスミドをベクターｐ １５８Ｎと称する。また、第２の本発明による改変ＤＮＡ−１６６Ａ断片が正常に挿入、連結している組換えプラスミドを、ベクターｐ １６６Ａと称する。これらのベクターは、何れも、本発明のＤＮＡ断片と３５Ｓプロモーター領域とＮＯＳターミネーター領域とアンピシリン耐性遺伝子（Ａｍｒ）とを含有する。
【０１１１】
（２）イネのカルスの調製
イネの完熟種子から籾殻を除き、得られた外皮付きコメ種子をエタノール溶液で殺菌、次いで次亜塩素酸ナトリウムの希水溶液で殺菌し、さらに滅菌水で洗浄する。
【０１１２】
ＭＳ培地にショ糖、植物ホルモンとしての２，４−ＰＡ、寒天を加えてなる組成のカルス形成用培地に、前の外皮付きコメ種子を置く。２８℃で１日当り１５〜１８時間にわたり、１５００〜２５００ルックスの大陽光を照射しながら４０〜５０日間、培養すると、イネのカルスが形成される。そのカルスを種子の胚乳部分から切取り、さらに篩別により１ｍｍ以下の寸法のカルスを得る。
【０１１３】
（３）遺伝子運搬用のウイスカの調製
チタン酸カリウム製の市販ウイスカ（微細な針状体）の多数を、小型のチューブ状容器内に入れてエタノールで殺菌する。エタノールを完全に蒸発により除去する。このように殺菌されたウイスカを収納している前記のチューブ状容器に滅菌水を入れて洗浄し、該容器から遠心分離により洗液を除去する。洗浄されたウイスカを収容するチューブ状容器にＲ２液体培地を加えて、ウイスカの懸濁液を得る。
【０１１４】
（４）イネ・カルス細胞への外来遺伝子の導入用の材料の調製
前項（１）に記載したように作製された、本発明ＤＮＡを正常に挿入、連結してある組換えベクター（すなわち、前記のベクターｐ ＤＡＰ、ベクターｐ １５８Ｎ、またはベクターｐ １６６Ａ）をＴＥ緩衝液に溶解してベクター溶液を調製する。
【０１１５】
上記のウイスカ懸濁液を収容するチューブ状容器内に、前記の１ｍｍ以下の寸法のカルスを装入する。カルスの細胞量のＰＣＶ１ｍｌあたりウイスカの量が１〜１００ｍｇであるようにする。さらに容器内の混合物を攪拌し、次いで遠心分離にかける。上清を捨てると、イネのカルス細胞とウイスカとの混合物が沈殿として得られる。
【０１１６】
上記のチューブ状容器内で前記のカルス細胞とウイスカとの混合物よりなる沈殿へ、本発明ＤＮＡを含有する組換えベクター（すなわちベクターｐ ＤＡＰ、ベクターｐ １５８Ｎまたはベクターｐ １６６Ａ）の溶液と、除草剤ホスフィノスリシンに耐性の遺伝子を選択マーカーとして含む既知のプラスミドベクターｐ ３５ＳＣ−ＳＳの溶液とを加えて、さらに十分に振り混ぜる。このようにして、カルス細胞とウイスカと、本発明ＤＮＡを含有する組換えベクターと、プラスミドベクターｐ ３５ＳＣ−ＳＳとの均質な混合物を得る。この混合物を遠心分離と振り混ぜる操作とに反復的にかけることにより、より均質な混合物を得る。
【０１１７】
（５）イネのカルスへの外来遺伝子の導入の操作
前項（４）に示されたように調製されたカルス細胞、ウイスカ、本発明ＤＮＡを含有する組換えベクター、およびプラスミドベクターｐ ３５ＳＣ−ＳＳよりなる均質な混合物を超音波照射により処理する。用いる超音波は、１０〜６０ＫＨｚの振動数のものであることができ、照射強度は０．１〜１Ｗ／ｃｍ２であることができる。３０秒〜２分間の時間、超音波処理を行うと、超音波の物理作用とウイスカの助けにより、本発明ＤＮＡを含む組換えベクターと、選抜マーカー用のプラスミドベクターとは、カルスの細胞内に侵入して導入できる。
【０１１８】
（６）導入ベクターで形質転換されたカルス細胞の選抜
上記のように超音波処理された混合物を、Ｒ２液体培地で洗浄し、洗浄された混合物を遠心分離にかけて、ウイスカからカルス細胞を分離する。分離されたカルス細胞は、上記のプラスミドベクターを細胞内に導入されて含有する形質転換細胞である。
【０１１９】
プラスミドベクターを含有するカルス細胞を、Ｒ２培地にショ糖、植物ホルモン２，４−ＰＡを添加してなる植物細胞培養用の培地に入れて、１５００〜２０００ルックスの光を１日当り１５〜２０時間照射しながら２７〜２９℃で振とう培養する。これによって、カルス細胞は細胞分裂を起こして増殖する。
【０１２０】
培養を２〜３日行った後に、得られた分裂した植物細胞の懸濁液を、Ｎ６培地にショ糖、２，４−ＰＡ、ゲルライト及び除草剤ホスフィノスリシンを添加してなる選抜用培地（半固体状である）の上に均一に広げて加える。さらに、１５００〜２０００ルックスの光を１日当り１５〜２０時間照射しながら２７〜２８℃で２５〜３０日間培養する。こうしてホスフィノスリシン耐性であり且つ導入ベクターで形質転換された植物細胞が得られる。
【０１２１】
（７）形質転換植物細胞の再選抜
上記のように得られたホスフィノスリシン耐性の形質転換植物細胞の中から、本発明ＤＮＡを外来遺伝子として十分に有効な量で含有する形質転換植物細胞のみを再選抜する。
【０１２２】
このために、前者の形質転換細胞を、Ｎ６培地にショ糖と、２，４−ＰＡと、ゲルライトと、リジンのアナログ体であるＡＥＣ（すなわちＳ−（２−アミノエチル）システイン）とを添加してなる再選抜用培地上に移植する。
【０１２３】
移植された細胞を、１日当り１５〜１６時間、１８００〜２０００ルックスの光で照射しながら２７〜２８℃で２５〜３０日間培養する。
【０１２４】
本発明ＤＮＡを外来遺伝子として十分に有効な量で含有する形質転換植物細胞は、培地中に細胞増殖阻害剤として作用するＡＥＣが存在していてもＡＥＣ耐性であって、生育できる。ＡＥＣ添加の上記培地で生育できたＡＥＣ耐性の培養植物細胞を選抜する。
【０１２５】
（８）再選抜されたＡＥＣ耐性の形質転換植物細胞からの植物体の再生
上記のように再選抜されたＡＥＣ耐性の培養植物細胞を、植物組織培養用のＭＳ培地にショ糖、植物ホルモンとしてのベンジルアデニン、ナフタレン酢酸、ゲルライトを添加してなる植物体再生用の分化培地に移植する。
【０１２６】
移植された細胞を、１８００〜２０００ルックスの光を１日当り１５〜１６時間照射しながら２７〜２８℃で２５〜３０日間培養する。このようにすると、培養された形質転換植物細胞から、分化により、芽と根が再生できる。
【０１２７】
再生した芽と根を含有する幼芽が長さ１０〜３０ｍｍに生育した後に、その幼芽を、ＭＳ培地にショ糖とゲルライトを添加してなる順化用の培地に移植する。さらに、１日当り１５〜１６時間、１８００〜２０００ルックスの光を照射しながら２７〜２８℃で１８〜２０日間育成する。
【０１２８】
このようにして、形質転換植物が再生できる。こうして得られた植物体は、温室内で土壌に移植して通常の条件下で栽培すると、順長に生育して３〜６ケ月の栽培でイネ種子を結実できる。
【０１２９】
（９）導入した外来遺伝子の確認
上記のように再生された形質転換イネ植物から緑色の葉を採取する。採取された葉を液体窒素で凍結した後に破砕する。その葉破砕物から、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋらの方法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９年に記載）に準じてＤＮＡを抽出する。
【０１３０】
他方、後記の配列表の配列番号１４に記載される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号１５に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを化学合成して、プライマー用に用いる。
【０１３１】
再生イネ植物体から上記のように抽出されたＤＮＡをテンプレートとして用い且つ上記の２種の合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて、公知のＰＣＲ法によって前記ＤＮＡを増幅する。得られた増幅反応液を常法によりアガロース電気泳動にかけて分画し、再生イネ植物から抽出されたＤＮＡの種々のＤＮＡ分画のうちで、導入された外来遺伝子のＤＮＡに相当するＤＮＡ断片を含むゲルバンドを採る。
【０１３２】
このバンドに含有されたＤＮＡ断片の塩基配列を公知のサザン法によって解析すると、本発明ＤＮＡに相当するか否かを確認できる。
【０１３３】
前記においては、本発明ＤＮＡを外来遺伝子としてイネ植物に導入してイネ植物を形質転換することのできる好適な形質転換方法を説明した。しかし、本発明ＤＮＡは、外来遺伝子としてイネ植物のみならず、他の種類の植物に導入して植物の形質転換を行うことに使用できる。従って、本発明ＤＮＡを植物体に外来遺伝子に導入できる方法を次に一般的に説明する。
【０１３４】
本発明のＤＮＡを導入できる植物は、特に限定される種類のものではなく、例えば、イネ、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、およびその他の単子葉植物、ならびにタバコ、ダイズ、ワタ、トマト、ハクサイ、キュウリ、レタスなどの双子葉植物などが挙げられる。先づ、これらの植物から培養細胞を調製し、得られた培養細胞に本発明ＤＮＡを外来遺伝子として導入するのが都合よい。
【０１３５】
本発明のＤＮＡ導入に用いられる培養細胞の作製は、植物由来のいかなる外殖物であってもよく、例えば、胚盤、生長点、花粉、葯、葉身、茎、葉柄、根由来の外殖物を使用できる。
【０１３６】
上記した外殖片を、カルス形成用の培地、例えばＭＳ培地（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅら、「Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉａ Ｐｌａｎｔａｒｕｍ」、１９６２年、第１５巻、４７３頁〜４９７頁）、またはＲ２培地（Ｏｊｉｍａら、「Ｐｌａｎｔ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ」、１９７３年、第１４巻、１１１３〜１１２１頁、あるいはＮ６培地（Ｃｈｕら、１９７８年、「Ｉｎ Ｐｒｏｃ，Ｓｙｍｐ．Ｐｌａｎｔ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｒｅｓｓ Ｐｅｋｉｎｇ」、４３頁〜５０頁などの如く、必須成分としての無機塩成分およびビタミン類を含む植物組織培養用の培地に、植物ホルモンとして、例えば、２，４−ＰＡ（２，４−ｄｉｃｈｉｏｒｏｐｈｅｎｏｘｙａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）０．１〜５ｍｇ／リットル、ならびに、炭素源として、例えば、ショ糖１０〜６０ｇ／リットル、ゲルライト１〜５ｇ／リットルを添加してなる培地に置床して培養することにより得られる培養細胞を用いて、これに本発明ＤＮＡを導入するのが便利である。
【０１３７】
本発明ＤＮＡの導入の対象となる植物細胞は、例えば、カルスや懸濁細胞などの脱分化した培養細胞あるいは不定胚、苗条原基などの培養細胞、もしくは植物組織例えば葉、根、茎、胚、生長点などの細胞から作られたカルス細胞および懸濁細胞であるのが好ましい。
【０１３８】
本発明ＤＮＡの導入用の培養細胞を調製するために、カルス形成用培地に外殖片を置床する場合、本発明ＤＮＡの導入用の培養細胞が得られるまでの培養期間は特に限定されるものではない。しかし、形質転換植物を再生することが必要であるから、当該の培養細胞からの植物体再生が可能であること、つまり、当該植物細胞が植物体再生能力を保有している期間内に得られた培養細胞を用いることが重要である。
【０１３９】
また、本発明ＤＮＡの導入用の培養細胞は、植物体再生能力を保有している培養細胞であれば、液体培地中で培養された懸濁細胞であってもよい。
【０１４０】
本発明ＤＮＡを植物細胞に導入するためには、先づ、本発明ＤＮＡを発現ベクターに組込んだ組換えベクターを調製することが必要である。その組換えベクターは、植物体に導入後の本発明ＤＮＡが植物体中で発現するように、発現プロモーターの下流に本発明ＤＮＡを配し、さらに本発明ＤＮＡの下流にターミネーターを配するように調整された組換えベクターであることを要する。この目的に用いられる組換えベクターは、植物への導入方法の種類に応じて、通常の植物形質転換に利用される各種のベクターであることができる。例えば、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法、ウイスカー法などによる植物細胞への直接的なＤＮＡ導入法を用いる場合は、ｐＵＣ系またはｐＢＲ３２２系などの大腸菌で増殖可能であるプラスミドベクターを利用するのがよく、またアグロバクテリウム法を用いる場合はｐｌａｎ系などのプラスミドベクターを利用するのがよい。
【０１４１】
組換えベクター中で本発明ＤＮＡの上流に配されるプロモーターは、例えばカリフラワーモザイクウイルス由来のＣａＭＶ３５Ｓ「Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ」、第６巻、第３９０１頁〜３９０７頁、１９８７年、または、特開平６−３１５３８１号公報」、トウモロコシのユビキチンプロモーター［特開平２−７９９８３号公報］、ファゼオリンプロモーター「Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ、第１巻、第８３９頁〜８５３頁、１９８９年］であることができる。また、本発明ＤＮＡの下流に配されるターミネーターは、例えばカリフラワーモザイクウイルス由来のターミネーター、あるいはノパリン合成酵素遺伝子由来のターミネーター［Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊ．第６巻、第３９０１頁〜３９０７頁、１９８７年］であるのがよい。しかし、植物体中で機能するプロモーターやターミネーターであれば、何れでもよい。
【０１４２】
また、本発明ＤＮＡの導入で形質転換された植物細胞を効率的に選択するためには、用いる上記の組換えベクターは、適当な選抜マーカー遺伝子を含有するプラスミドベクターと共に植物細胞に導入されることが好ましい。この目的に使用する選抜マーカー遺伝子は、抗生物質ハイグロマイシンに耐性であるハイグロマイシンフォスフォトランスフェラーゼ遺伝子、あるいはカナマイシン、ゲンタマイシンに耐性であるネオマイシンフォスフォトランスフェラーゼ遺伝子、もしくは除草剤フォスフィノスリシンに耐性であるアセチルトランスフェラーゼ遺伝子［Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ、第６巻、第２５１３頁〜２５１８頁、１９８７年、または特開平２−１７１１８８号公報］であることができる。
【０１４３】
本発明ＤＮＡを外来遺伝子として植物に導入する方法は、アグロバクテリウム法［Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第６巻、第９１５頁〜９２２頁、１９８８年］、エレクトロポレーション法［Ｐｌａｎｔ ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．，第１０巻、第１０６頁〜１１０頁、１９９１年］、パーティクルガン法［Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．，第７９巻、第３３７頁〜３４１頁、１９９０年］、ウイスカー法であることができ、しかし特にこれらに限定されない。
【０１４４】
本発明ＤＮＡを外来遺伝子に導入するのにウイスカ法を用いる場合、好適に使用できるウイスカは、具体的には、直径が０．０１〜１０μｍ、好ましくは、０．５〜１μｍであり、長さが、１〜１００μｍ、好ましくは３〜４０μｍである。ウイスカ材質は、チタン酸カリウム、炭酸カルシウム、ホウ酸アルミニウム、窒化ケイ素、酸化亜鉛、塩基性硫酸マグネシウム、マグネシア、ホウ酸マグネシウム、カーボングラファイト、硫酸カルシウム、サファイア、シリコンカーバイドであるのがよい。好ましくはチタン酸カリウム、炭酸カルシウム、またはホウ酸アルミニウム製ウイスカがよい。
【０１４５】
ここで使用されるウイスカは、表面処理を行わなくとも単独で使用できるが、ウイスカ表面に塩基性官能基を持つウイスカ、好ましくは表面処理剤により表面処理されているウイスカを使用すると、植物細胞の形質転換率を高めることができる。
【０１４６】
ウイスカ表面への塩基性官能基の付与に用いる化合物は、ウイスカ表面と共有結合できる化合物であれば、特に限定されない。好ましくは、シランカップリング剤、より好ましくは塩基性官能基を有するシラン、カップリング剤である。シランカップリング剤としては、３−（２−アミノエトキシルアミノプロピル）−トリメトキシシラン、３−アミノプロピル−トリエトキシシランなどの塩基性シランカップリング剤を使用できる。塩基性官能基を有するシランカップリング剤であれば、何れも使用できる。
【０１４７】
ウイスカと混合される植物細胞の量は適宜に調整される。しかし、ウイスカと混合される植物細胞の容量は、特定の値に限定されるものではない。植物細胞と共に媒質液体中に混合されるウイスカの量は植物細胞の容量に伴い調整されるのがよい。植物細胞量のＰＣＶ１ｍｌ当たり、ウイスカはその量が１〜１００ｍｇ、好ましくは、４〜４０ｍｇになるように添加されるのが好ましい。
【０１４８】
このようにして、媒質液体中に分散させた植物細胞、ウイスカおよび本発明ＤＮＡ含有の組換えベクターの混合物を作る。この混合物を次に遠心分離処理する。
【０１４９】
例えば遠心加速度が３，０００〜５０，０００×ｇ、好ましくは、１０，０００〜３０，０００×ｇで、遠心時間が、１０秒〜４０分、好ましくは、５〜１０分間行う。その後、得られた沈殿を超音波処理にかける。例えば超音波処理は、周波数が１ｋ〜１ＭＨｚ、好ましくは、１０〜６０ｋＨｚで、照射時間が０．２秒〜２０分間、好ましくは、３０秒〜２分間で、強度は、０．０１〜１０Ｗ／ｃｍ２、好ましくは、０．１〜Ｗ／ｃｍ２で超音波の照射を行うのがよい。
【０１５０】
超音波処理された混合物から、遠心分離によって植物細胞を分け取る。得られた植物細胞は、導入された本発明ＤＮＡ含有の組換えベクターおよび選抜マーカー用のプラスミドベクターを含有するものである。
【０１５１】
このようにして得られた外来遺伝子を導入された植物細胞は、液体培地などにより洗浄する。その後に、細胞に導入された選抜マーカー遺伝子の種類に従って適当な選抜用薬剤を含む公知の選抜用培地に置床し培養する。これにより、形質転換された培養植物細胞を得ることができる。
【０１５２】
次に、本発明ＤＮＡを含有する組換えベクターを十分に有効な量で含有する形質転換細胞を効率良く再選抜するために、細胞増殖阻害剤であるリジンアナログを添加した培地上で培養する。リジンアナログとしては、例えばＳ−（２−アミノエチル）−システイン（ＡＥＣ）あるいはＯ−（２−アミノエチル）−セリンを、１０ｍｇ／ｌ〜１０００ｍｇ／ｌ、好ましくは１００ｍｇ／ｌ〜３００ｍｇ／ｌの濃度で再選抜用培地に添加できる。
【０１５３】
前記のように再選抜された本発明ＤＮＡを外来遺伝子として組込まれた組換えベクターと選抜マーカー用のベクターとを含有する形質転換植物細胞から、次に、植物体を再生する。植物体の再生は公知の要領で行うことができる。例えば、前記のように再選抜された形質転換植物細胞を、公知の植物体再生用培地に置床して培養することにより植物体の再生を行うことができる。
【０１５４】
植物体再生用の培地に置床された形質転換細胞は１５〜３０℃、好ましくは、２０〜２８℃の温度で５００〜２０００ルックス、好ましくは、８００〜１０００ルックスの光を照射しながら培養期間２０〜６０日間、好ましくは３０〜４０日間で培養する。
【０１５５】
これによって、個々の植物細胞から本発明ＤＮＡを含む外来遺伝子を担う組換えベクターが導入されて形質転換された植物体が再生できる。
【０１５６】
形質転換細胞から再生された植物体は次に順化用培地で培養する。その後、順化された再生植物体を、温室内で通常の栽培条件下で育成すると、３〜６カ月の栽培で植物体は成熟し結実して種子を得ることができる。
【０１５７】
なお、このように再生され且つ栽培された形質転換植物体中の導入された外来遺伝子の存在は、公知のＰＣＲ法とサザン法（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，「Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，」９８巻５０３−５１７頁、１９７５年）によって、植物体中のＤＮＡの塩基配列を解析することによって確認できる。
【０１５８】
この場合、形質転換植物体からのＤＮＡの抽出は、公知のＪ．Ｓａｍｂｒｏｏｋらの方法（「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９年）に準じて実施できる。
【０１５９】
再生された植物体中に存在する本発明ＤＮＡよりなる外来遺伝子をＰＣＲ法を用いて解析する場合には、上記のように再生植物体から抽出されたＤＮＡを、テンプレートとして用い且つ第１の本発明によるＤＮＡ、あるいは第２の本発明による改変ＤＮＡの塩基配列に従って適当に選択された塩基配列をもつ合成したオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、これらを混合してＰＣＲ法用反応液中に加えて増幅反応を行う。この増幅反応においては、ＤＮＡの変性、アニーリング、伸張反応を数十回繰り返えすと、本発明ＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片の増幅生成物を得ることができる。
【０１６０】
増幅生成物を含む反応液を例えばアガロース電気泳動にかけると、増幅された各種のＤＮＡ断片が分画される。導入した外来遺伝子である本発明ＤＮＡに相当するＤＮＡ配列を含有すると認められるＤＮＡ断片を含むバンドアガロースゲル片を切出す。切出されたゲル片内に含有されるＤＮＡ断片のＤＮＡ配列の塩基配列をサザン法で解析すると、そのＤＮＡ配列が本発明ＤＮＡに対応するか確認できる。
【０１６１】
第７の本発明（請求項６の発明）においては、カリフラワーモザイクウイルス由来であり且つ植物で発現可能なプロモーターと、ＮＯＳターミネーターと、アンピシリン耐性遺伝子とを含有するプラスミドベクターに、前記のプロモーターの支配下に、配列番号５または配列番号７に記載の１１４３ｂｐの塩基配列を有するＤＮＡ配列を担うＤＮＡ断片を組込んでなる組換えベクターが提供される。
【０１６２】
上記のプラスミドベクターがプラスミドベクターｐＢＩ２２１であるのが好ましい（請求項７）。
【０１６３】
発明を実施するための最良の形態
以下に、第１の本発明による配列長１１４３ｂｐのＤＮＡ配列（配列表の配列番号１に示す塩基配列を有するＤＮＡ配列すなわちＤＨＤＰＳ−ＤＮＡ−１１４３配列）を含有するＤＮＡ断片の製造を例示する実施例１を参照して、第１の本発明を具体的に説明する。また、第２の本発明による配列長１１４３ｂｐの改変ＤＮＡ−１５８Ｎ配列（配列表の配列番号５に示す塩基配列を有するＤＮＡ配列）を含有するＤＮＡ断片の製造を例示する実施例２、ならびに第２の本発明による配列長１１４３ｂｐの改変ＤＮＡ−１６６Ａ配列（配列表の配列番号７に示す塩基配列を有するＤＮＡ配列）を含有するＤＮＡ断片の製造を例示する実施例３を参照して、第２の本発明を具体的に説明する。
【０１６４】
さらに、組換えベクターに組込まれた本発明ＤＮＡを外来遺伝子としてイネ植物体に導入してイネ植物を形質転換する方法を例示する実施例４を参照して、第３の本発明を具体的に説明する。
【０１６５】
但し、以下の実施例に記載される実験操作の手順は、特に記述しない限り、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」第２版（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９年）に記載されている方法に従った。
【０１６６】
実施例１
（１）イネｍＲＮＡの調製
イネ（品種：日本晴）の種子を播種した。栽培７日目の幼植物体の茎葉２ｇを液体窒素で凍結した。凍結した茎葉を乳鉢内で粉砕した。その粉砕物から公知のＡＧＰＣ法（Ａｃｉｄ Ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｃ ｐｈｃｎｏｌ−ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍを使用）（実験医学、Ｖｏｌ．９ Ｎｏ．１５（１１月号）１９９１年、９９頁〜１０２頁）に従い、全ＲＮＡ約２ｍｇを抽出した。次に、得られた全ＲＮＡから、ｍＲＮＡを、ｍＲＮＡ精製キット（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製、ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）により単離した。こうしてイネのｍＲＮＡを約３０μｇ得た。
【０１６７】
（２）イネのｃＤＮＡライブラリーの構築
上記（１）で得られたｍＲＮＡから、ｃＤＮＡ合成キット（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製、ＴｉｍｅＳａｖｅｒ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ）によりｃＤＮＡを得た。
【０１６８】
このｃＤＮＡを、ＥｃｏＲＩ切断末端を仔ウシ小腸由来アルカリホスファターゼ処理したλ ｇｔ１１ファージベクター〔ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｎｄ，４９巻（１９８５年）参照；ａｍｂｄａ ｇｔ１１／ＥｃｏＲＩ／ＣｌＡＰ−Ｔｒｅａｔｅｄ Ｖｅｃｔｏｒ Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮ社製）〕に連結して、得られた組換えてファージをイン−ビトロパッケージング・キット（ＧｉｇａｐａｃｋＩＩ Ｇｏｌｄ Ｐａｃｋａｇｉｎｇ Ｅｘｔｒａｃｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製））によりラムダファージにパッケイジングした。
【０１６９】
こうして得られた組換えファージを大腸菌Ｙ１０８８に感染させて増殖させた。大腸菌の溶菌プラークとして多数の組換えファージが得られた。プラーク中のファージは、イネ由来の全ｃＤＮＡを含有する多種多様のファージから成るものであり、イネのｃＤＮＡライブラリーとして利用した。
【０１７０】
（３）ＰＣＲ法用のプライマーの構築
イネＤＨＤＰＳをコードするのｃＤＮＡ断片をクローニングするためのＤＮＡプローブをＰＣＲ法用に作製するために、まずプライマーの設計を行った。そのためには、既知のコムギ及びトウモロコシのＤＨＤＰＳ遺伝子の塩基配列およびＤＨＤＰＳのアミノ酸配列を参考にして、下記の塩基配列を有する２種類のオリゴヌクレオチドをプライマーＮｏ．１とプライマーＮｏ．２として作製した。
【０１７１】
ブライマーＮｏ．１（配列表の配列番号３に示す塩基配列を有す）：５′−ＧＴＡＡＴＡＧＴＴＧＧＡＧＧＡＡＣＡＡＣＡＧＧＡＧ−３′
プライマーＮｏ．２（配列表の配列番号４に示す塩基配列を有す）：５′−ＧＡＧＣＴＧＡＧＣＣＡＧＡＧＣＡＧＴＧＴＴＧＡＧ−３′
上記のオリゴヌクレオチドの作製は、ＤＮＡ合成装置（Ｍｏｄｅｌ３９１、アプライドバイオシステムズ社製）を用いてオリゴヌクレオチドを合成し、さらにイオン交換ＨＰＬＣで精製することにより行った。
【０１７２】
（４）プローブＤＮＡの作製
次に、上記の２種類の合成オリゴヌクレオチドの各１０ｐ．Ｍを第１のプライマー及び第２のプライマーとして用い、上記（２）で得られた組換えファージよりなるｃＤＮＡライブラリーの１μｌをテンプレイトとして用い、これらをＰＣＲ法用の増幅反応液（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、５０ｍＭのＫＣｌ、０．００１％ゼラチン、ｐＨ８．３；４種のヌクレオチドｄＮＴＰの各２．５ｍＭの混合物、およびＤＮＡポリメラーゼＴａｋａｒａ Ｅｘ Ｔａｑ、２．５単位）５０μｌに加えて、増幅反応を行った。ここで使用される増幅反応液は、ＰＣＲキット（ＰＣＲ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（宝酒造（株）社製）により調製した。
【０１７３】
ＰＣＲ法によるＤＮＡの増幅反応は、ＰＣＲ反応装置（ＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ社製、ＤＮＡ、Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ ４８０）を用いて、変性を９４℃、３０秒間、アニーリングを５５℃、１分間、また伸張（ｅｘｔｅｎｔｉｏｎ）を７２℃、２分間行う３つの反応操作を３５回繰り返すことによって実施した。
【０１７４】
上記のようにすると、イネＤＨＤＰＳ遺伝子に相当するＤＮＡ配列のうちの一部分であるＤＮＡ断片の増幅生成物が生成されるから、これをプローブＤＮＡとして採取する。そして、以下のｃＤＮＡライブラリーのクローニングに用いた。
【０１７５】
（５）イネのｃＤＮＡライブラリーからのイネＤＨＤＰＳ遺伝子のＤＮＡの選択
上記（２）で作製したイネのｃＤＮＡライブラリーである組換えファージから、上記（３）で作製したプローブＤＮＡにより、イネＤＨＤＰＳ遺伝子に対応するＤＮＡ配列を組込まれた組換えファージをスクリーニングする。
【０１７６】
この目的のためには、上記（２）で得られたイネｃＤＮＡライブラリーである組換えファージのプラークを１．５％寒天培地上に形成させた。それらプラークをナイロン膜（アマシャム社製）ハイボンドＮに転写した。こうしてナイロン膜に転写されたファージのプラークに含まれているファージＤＮＡは、アルカリ変性液（１．５Ｍ ＮａＣｌ、２．０Ｍ ＮａＯＨ）および中和液（１．０Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ５、２．０Ｍ ＮａＣｌ）でそれぞれ１０分間処理し、その後にＵＶ照射によりナイロン膜上に固定した。
【０１７７】
次に、上記（４）で得られたプローブＤＮＡをジゴキシゲニン（ＤＩＧ）でラベルして得られた標識プローブＤＮＡを、ファージＤＮＡを固定したナイロン膜に対してプラーク・ハイブリダイゼーションさせた。プローブＤＮＡのラベリングはＤＩＧ−ＥＬＩＳＡ ＤＮＡ Ｌａｂｅｌｉｎｇ ＆ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ベーリンガー・マンハイム社製）により行った。
【０１７８】
この場合、ファージＤＮＡの固定されたナイロン膜をハイブリダイゼーション溶液（５００ｍＭ Ｎａ−Ｐｉバッファー、ｐＨ７．２、７％ ＳＤＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に浸し、さらに６５℃、１０分間、浸漬処理を行った。次に前記のＤＩＧラベルした標識プローブＤＮＡ（１０ｎｇ／ｍｌ）を加え、６５℃、１５時間にわたりハイブリダイゼーション反応を行った。
【０１７９】
反応終了後、ナイロン膜を洗浄液（４０ｍＭ Ｎａ−Ｐｉバッファー、ｐＨ７．２、１％ ＳＤＳ）で２０分間ずつ３回洗浄した。その後、上記のＤＩＧ−ＥＬＩＳＡ Ｌａｂｅｌｉｎｇ ＆ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて、目的の組換えファージの検出を行った。ハイブリダイズしＸ線フィルム上で強くシグナルを発している４個の組換えファージプラーク、すなわちＤＨＤＰＳ遺伝子が組み込まれていると思われるファージのプラークを３０万個のファージプラークから、探知することができた。そして、前記の４個の組換えファージプラークを単離選抜できた。
【０１８０】
これら４個の組換えファージから、λ ＤＮＡ単離キット（Ｌａｍｂｄａ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製））により、それぞれにファージプラークの４個ごとに別々にλ ＤＮＡを単離した。
【０１８１】
この際のλ ＤＮＡの単離は次のようにして行った。すなわち、各々のファージを大量に増殖させた培養液５ｍｌに、ＤＮａｓｅＩ（２０ｍｇ／ｍｌ）５０μｌ、ＲＮａｓｅＡ（２ｍｇ／ｍｌ）２００μｌを加え、室温で１５分間、放置した。得られたファージ増殖溶液を１５０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離した。得られた上清に８０％ＤＥＡＥ−セルロース２５ｍｌ加え、室温で１０分間インキュベートした。このようにインキュベートされた混合液を遠心分離し、得られた上清に０．５Ｍ ＥＤＴＡ２ｍｌ、Ｐｒｏｎａｓｅ（５０ｍｇ／ｍｌ）７７０μｌを加え、３７℃で１５分間放置した。さらに、５％ ＣＴＡＢ溶液（１％ ＣＴＡＢ（Ｃｅｔｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌ−ａｍｍｏｕｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ）、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１０ｍＭ ＥＤＴＡ）１．５ｍｌを加えた。得られた混合物を６５℃、３分間処理した後、氷中で５分間放置した。こうして得られたそれぞれの反応液に１／１０容の３Ｍ酢酸ナトリウム、２倍容のエタノールを加え、−２０℃で約６時間放置し、その後、この溶液を遠心分離し、沈澱したファージＤＮＡを乾燥させ、５ｍｌの水に溶解して保存した。
【０１８２】
上記のようにして単離された４種類のファージＤＮＡの各々５μｌをＨバッファー中で制限酵素ＥｃｏＲＩの１０ユニットで消化して、その消化反応液を分析した。その結果これらファージＤＮＡはいずれも同一のＤＮＡ配列であることが確認された。
【０１８３】
従って、イネのＤＨＤＰＳの遺伝子に相当するＤＮＡ配列を含有すると判定されたファージ中の挿入ＤＮＡ断片は、上記のように選抜された採取ファージのファージＤＮＡから制限酵素ＥｃｏＲＩで切出して収得できた。
【０１８４】
（６）イネのＤＨＤＰＳ遺伝子に相当するＤＮＡ配列を含有するｃＤＮＡのクローニング
上記のようにイネのＤＨＤＰＳ遺伝子に相当するＤＮＡ配列を含有すると判定されたＤＮＡ断片として、ファージから切出して収得されたＤＮＡ断片は、これをプラスミドベクターｐ Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）のＥｃｏＲＩ切断部位にＤＮＡリゲーション・キットにより挿入、連結して組換えプラスミドベクターを構築した。このように構築された組換えプラスミドベクターの導入で大腸菌ＸＬＩ−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ′を形質転換した。
【０１８５】
上記のように、構築された組換えプラスミドベクターを大腸菌ＸＬＴ−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ‘に導入するために、上記で得られた組換えファージＤＮＡの１０μｇを、Ｈバッファー中で、制限酵素ＥｃｏＲＩの１０ユニットで消化して消化反応液を得た。また、プラスミドベクターｐ Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）の１０μｇを同様にＥｃｏＲＩで消化して消化反応液を得た。それぞれの消化反応液に１／１０容の３Ｍ酢酸ナトリウム、２倍容のエタノールを加え、−２０℃で約６時間放置し、その後にそれぞれの得られたＤＮＡ溶液を遠心分離し、沈殿したＤＮＡを乾燥させ、５μｌの水に溶解した。こうして得られたファージ由来のＤＮＡの水溶液とプラスミド由来のＤＮＡ水溶液の各々５μｌを混合し、得られた混合物をＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ（宝酒造（株）製）で処理して、それら２種のＤＮＡを連結させた。得られた連結反応液に１０分の１容量の３Ｍ酢酸ナトリウム、２倍容のエタノールを加え、−２０℃に約６時間放置した。得られた混合液を遠心分離し、沈殿したＤＮＡを乾燥させた。こうして得られた連結ベクターＤＮＡを１０μｌの水に溶解した。
【０１８６】
こうして得られた連結ベクターＤＮＡの水溶液１０μｌ（ＤＮＡ１０ｎｇ）と、市販の大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’コンピテントセル（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）１００μｌとを、１．５ｍｌ容チューブに入れ、氷中で３０分間、４２℃で３０秒間、そして再び氷中で２分間インキュベートした。その後に、インキュベートされた混合物に対してＳＯＣ液体培地（２％ バクト−トリプトン、０．５％ バクト−酵母抽出物、１０ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＳＯ４、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ Ｇｌｕｃｏｓｅを含有）９００μｌを加えてから、３７℃で１時間大腸菌を振とう培養する。
【０１８７】
得られた大腸菌の培養液の１００μｌを、アンピシリンを５０ｍｇ／ｌの濃度、Ｘ−ｇａｌ（５−Ｂｒｏｍｏ−４−Ｃｈｌｏｒｏ−３−Ｉｎｄｏｌｙｌ−ｂ−Ｄ−Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ）を２０ｍｇ／ｌの濃度、ＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−ｂ−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を２０ｍｇ／ｌの濃度で添加されてあるＬＢ寒天培地（１％ バクト−トリプトン、０．５％ バクト−酵母抽出物、０．５％ ＮａＣｌ、０．１％ Ｇｌｕｃｏｓｅ、ｐＨ７．５、寒天１．５％含有）にプレーティングした。３７℃で１６時間、大腸菌を培養後、白色に発色してない大腸菌コロニーから、白色に発色している大腸菌コロニーを、前記の連結ベクターＤＮＡで形質転換された大腸菌として分離した。
【０１８８】
このようにして分離された白色を発色している且つアンピシリン耐性である大腸菌コロニー１０個を、アンピシリン５０ｍｇ／ｌを含む液体培地で増殖させ、さらに増殖された大腸菌から、プラスミド精製キット（ＱＩＡ ｆｉｌｔｅｒ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔ，ＱＩＡＧＥＮ社製）によりプラスミドを分離し且つ精製した。この精製により、上記で得られた耐性コロニーの形質転換大腸菌から５０μｇ（５０μｌ）のプラスミドを得た。
【０１８９】
このようにクローニングされて得られた前記のプラスミドは、イネＤＨＤＰＳ遺伝子に相当するＤＮＡ配列を内部に含有するＤＮＡである目的の組換えプラスミドであり、そして約４．３ｋｂのサイズを有した。
【０１９０】
（７）クローニングされたＤＮＡのシークエンス解析
上記のクローニングされたＤＮＡである組換えプラスミド（約４．３ｋｂのサイズ）を市販の塩基配列決定キットで処理すると、そのＤＮＡ断片の全体の塩基配列を決定できる。そして、そのＤＮＡ断片内部に含有されたイネＤＨＤＰＳ遺伝子に該当するＤＮＡ配列の塩基配列を判定できる。このように判定された塩基配列をもち且つイネＤＨＤＰＳ遺伝子をコードするＤＮＡ配列の塩基配列は、後記の配列表の配列番号１に記載されてある。
【０１９１】
なお、上記のＤＮＡの塩基配列の決定を行うに当っては、塩基配列決定キット（Ａｕｔｏｒｅａｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を用いて、変性処理を行った後に自動ＤＮＡシーケンサＡＬＦ ＤＮＡ ＳｅｑｕｅｎｃｅｒＩＩ（ファルマシア社製）で前記ＤＮＡ断片−αの塩基配列を決定した。
【０１９２】
本発明によって実施例１で得られたＤＮＡ断片−αに含有され且つイネＤＨＤＰＳをコードすると判定されたＤＮＡ配列の塩基配列は、配列表の配列番号１に記載された単一のオープンリーディングフレーム内にある１１４０ｂｐの塩基からなる。また、第１の本発明による配列番号１に記載される塩基配列をもつＤＮＡは、配列番号２に記載の３８０個のアミノ酸残基からなるタンパクをコードしている。この配列番号２のアミノ酸配列を前記のコムギのＤＨＤＰＳのアミノ酸配列（前記の特開平３−１２７９８４号公報）およびトウモロコシのＤＨＤＰＳのアミノ酸配列（前記のＭｏｌｅｃｕｌａｒ ＆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、第２２８巻２８７頁〜２９３頁、１９９１年）と比較すると、それぞれ８２％および７９％の相同性があると認められた。この相同性がある領域より以外のＤＮＡ配列領域では、コムギおよびトウモロコシとは明らかに異なり且つイネに特有であるＤＮＡ配列を、第１の本発明ＤＮＡは有する。
【０１９３】
実施例２
本例は、第２の本発明により得られた改変ＤＮＡ−１５８Ｎと命名されたＤＮＡ配列（すなわち、配列表の配列番号５に記載の塩基配列を有するＤＮＡ配列）を含有するＤＮＡ断片の製造を例示する。
【０１９４】
（１）ＰＣＲ用のプライマーとしての合成オリゴヌクレオチドの構築
ＤＮＡ合成装置（Ｍｏｄｅｌ−３９１，アプライドバイオシステムズ社製）を利用して、配列表の配列番号９に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであるプライマーＮｏ．３と、配列番号１１に記載の塩基配列を有するプライマーＦＷ−１と、配列番号１２に記載の塩基配列を有するプライマーＲＶ−１と、配列番号１３に記載の塩基配列を有するプライマーＢＳＫＰＮ−１とを化学合成により構築した。
【０１９５】
さらに、配列番号１４に記載の塩基配列を有するプライマーと、配列番号１５に記載の塩基配列を有するプライマーも合成した。
【０１９６】
（２）ＰＣＲ法用のテンプレートの作製
実施例１の（６）項において、イネのＤＨＤＰＳ遺伝子に相当するＤＮＡ配列を含有すると判定されるＤＮＡ断片として組換えファージから切出して収得されたＤＮＡ断片は、プラスミドベクターｐ Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）のＥｃｏＲＩ切断部位にＤＮＡリゲーション・キットにより連結されて、組換えプラスミドを構築した。
【０１９７】
上記の組換えプラスミドベクターｐ ＤＡＰ８−１に含まれるＤＮＡ断片に対して、ＰＣＲ法によるＸｂａ Ｉ、Ｓａｃ Ｉ制限酵素切断部位を付与するために、下記の反応を行った。
【０１９８】
ｐ ＤＡＰ８−１の５μｌと、配列番号１４のプライマーおよび配列番号１５のプライマーの１μＭとを増幅反応液（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１ｍＭのＭｇＣｌ２、５０ｍＭのＫＣｌ、４種のヌクレオチドｄＮＴＰの各０．２ｍＭの混合物、ＬＡ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼの２．５ユニットを含有）の１００μｌに加えて、増幅反応を行った。増幅反応は、変性を９４℃，１分、アニーリング６０℃，３０秒、伸張７２℃，１分の３つの反応操作を３０回繰り返すことにより実施した。
【０１９９】
この増幅反応の終了後、その増幅反応液を低融点アガロース電気泳動により分画し、増幅ＤＮＡ生成物として約１１６０ｂｐのバンドをゲルから切出した。このゲル切片からＧＥＮＥＣＬＥＡＮＩＩ Ｋｉｔ（フナコシ社製）により、ＤＨＤＰＳ遺伝子をコードするＤＮＡ配列の５′側にＸｂａ Ｉ部位、３′側にＳａｃ Ｉ部位を持つ、ＤＮＡ断片の精製品（Ｘｂａ Ｉ−ＤＮＡ−Ｓａｃ Ｉ）（ＤＮＡ断片−ＸＳ）を得た。
【０２００】
市販のプラスミドベクターｐＵＣ１９の１０μｇをＭバッファー中でＸｂａ Ｉの１０ユニットとＳａｃ Ｉの１０ユニットで消化した。
【０２０１】
前記のＤＮＡ断片（Ｘｂａ Ｉ−ＤＮＡ−Ｓａｃ Ｉ）とこの切断された線状のプラスミドベクターｐＵＣ１９とを、前記のＤＮＡリゲーション・キットにより連結して環状の組換えプラスミドベクターｐ ＤＡＰ８−１−ＸＳ（約３．９ｋｂ）を得た。
【０２０２】
このプラスミドベクターｐ ＤＡＰ８−１−ＸＳが下記のＰＣＲ法でテンプレートとして利用された。
【０２０３】
（３）所要なＤＮＡ断片のＰＣＲ法による増幅と回収
（ｉ）ＰＣＲ法の第１回段階
所要なＤＮＡ断片をＰＣＲ法による増幅反応により収得するために、ＰＣＲ法の第１回段階として下記の（Ａ）反応と（Ｂ）反応とを行った。
【０２０４】
すなわち、その（Ａ）反応では、テンプレートとして用いられる前記の組換えプラスミドベクターｐＤＡＰ８−１−ＸＳの５μｌと、プライマーＦＷ−１の１μＭと、配列番号９のプライマーＮｏ．３の１μＭとを、増幅反応液（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１ｍＭのＭｇＣｌ２、５０ｍＭのＫＣｌ，４種のヌクレオチドｄＮＴＰの各０．２ｍＭの混合物、ＬＡ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼの２．５ユニットを含有）の１００μｌに加えて、増幅反応を行った。この（Ａ）反応で得られたＤＮＡの増副生成物を、ＤＮＡ断片−Ａと称する。
【０２０５】
また、（Ｂ）反応では、テンプレートとして用いられる前記ベクターｐ ＤＡＰ８−１−ＸＳの５μｌと、プライマーとして用いられる前記のプライマーＲＶ−１の１μＭと、前記のＢＳＫＰＮ−１μＭとを、（Ａ）反応で用いたと同じ組成の増幅反応液に加えて、増幅反応を行った。この（Ｂ）反応で得られたＤＮＡの増幅生成物をＤＮＡ断片−Ｂと称する。
【０２０６】
なお、前記の増幅反応は、ＰＣＲ反応装置（Ｐｒｏｍｒａｍ Ｔｅｍｐ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｓｙｓｔｅｍ ＰＣ−７００（アステック社製））内で、変性を９４℃で３０秒間、アニーリングを５５℃で２分間、伸張を７２℃で２分間行う３つの反応操作を３０回繰り返すことにより実施された。
【０２０７】
増幅反応の終了後、（Ａ）反応の増幅反応液を低融点アガロース電気泳動により分画し、増幅ＤＮＡ生成物としての４８０ｂｐのＤＮＡ断片−Ａを含むバンドをアガロースゲルから切出した。また、（Ｂ）反応の増幅反応液を低融点アガロース電気泳動にかけて分画し、増幅ＤＮＡ生成物としての１２００ｂｐのＤＮＡ断片−Ｂを含むバンドをアガロースゲルから切出した。
【０２０８】
これらのゲル切片から、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ ＩＩ Ｋｉｔ（フナコシ社製）により分離してＤＮＡ断片−Ａの精製品とＤＮＡ断片−Ｂの精製品を得た。
【０２０９】
（ｉｉ）ＰＣＲ法の第２回段階
次に、ＰＣＲ法の第２回段階として、前記のプライマーＲＶ−１の１μｌおよびＦＷ−１の１μｌ、ならびに前記の（Ａ）反応および（Ｂ）反応で増幅したＤＮＡ断片−Ａの１μｌとＤＮＡ断片−Ｂの１μｌを、増幅反応液（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１ｍＭのＭｇＣｌ２、５０ｍＭのＫＣｌ，ｄＮＴＰの各０．２ｍＭの混合物、ＬＡ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼの２．５ユニットを含有）１００μｌに加えて、増幅反応を行った。この場合の増幅反応は、変性を９４℃、３０秒、アニーリングを５５℃、２分、伸張を７２℃、２分行う３つの反応操作を２０回繰り返して実施した。
【０２１０】
この増幅反応の終了後、その増幅反応液を低融点アガロース電気泳動により分画し、増幅ＤＮＡ生成物として１２００ｂｐの所期のＤＮＡ断片−Ｃを含有するバンドをゲルから切出した。このゲル切片からＧＥＮＥＣＬＥＡＮ ＩＩ Ｋｉｔ（フナコシ社製）によりＤＮＡ断片−Ｃを分離して且つＤＮＡ断片−Ｃの精製品を得た。
【０２１１】
このＤＮＡ断片−Ｃは、配列表の配列番号５に示された塩基配列を有するＤＮＡ−１５８Ｎ配列（１１４３ｂｐのサイズ）を内部に含有する約１３５０ｂｐのサイズのＤＮＡ断片であり、しかもＤＮＡ−１５８Ｎ配列の５′−末端の先方にＫｐｎＩ切断部位をもち且つ３′−末端の後方にＳａｃＩ切断部位をもつＤＮＡ断片である。
【０２１２】
（４）改変ＤＮＡ−１５８Ｎ配列を含有するＤＮＡ断片のクローニング
上記で得られたＤＮＡ断片−Ｃを利用して、目的の改変ＤＮＡ−１５８Ｎ配列を含有するＤＮＡ断片をクローニングにより十分な量で収得する操作を次に行う。
【０２１３】
（ｉ）先づ、上記で得られたＤＮＡ断片−Ｃの１０μｇを、Ｌバッファー（宝酒造（株）社製）中で制限酵素Ｋｐｎ Ｉの１０ユニットとＳａｃ Ｉの１０ユニットで消化した。この消化で得られたＤＮＡ断片をＤＮＡ断片−βと称する。他方、プラスミドベクターｐ Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）の１０μｇをＬバッファー（宝酒造（株）社製）中で、Ｋｐｎ Ｉの１０ユニットとＳａｃ Ｉの１０ユニットで消化して短縮プラスミドを得た。ＤＮＡ断片−βを含む消化反応液と、短縮プラスミドを含む消化反応液とにそれぞれに１／１０容の３Ｍ酢酸ナトリウム、２倍容のエタノールを加え、−２０℃に約６時間インキュベートした。その後、インキュベートされた溶液を遠心分離し、沈殿したＤＮＡを乾燥させ、５μｌの水に溶解した。
【０２１４】
こうして得られたＤＮＡ断片−βの水溶液の５μｌと、該短縮プラスミドＤＮＡの水溶液の５μｌとを混合し、次に、得られた混合物（１０μｌ）に含まれるＤＮＡを、ＤＮＡＬｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ（宝酒造（株）社製）により連結反応させた。その連結反応液に１／１０容の３Ｍ酢酸ナトリウム、２倍容のエタノールを加え、−２０℃に約６時間インキュベートした。インキュベートされた反応溶液を遠心分離し、沈殿したＤＮＡを乾燥させ、５μｌの水に溶解して水溶液にした。
【０２１５】
この水溶液に含まれるＤＮＡは、前記のＤＮＡ断片−βと、プラスミドベクターｐ Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）のＫｐｎ−１及びＳａｃＩ切断で得られた前記の短縮プラスミドとを連結して作られた２本鎖の組換えプラスミド（前記のｐ Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＤＮＡ−１５８Ｎプラスミドである）であり、その挿入ＤＮＡ領域内に、前記の改変ＤＮＡ−１５８Ｎ配列を含有した。
【０２１６】
（ｉｉ）このｐ Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＤＮＡ−１５８Ｎプラスミドを大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ′に導入することにより大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ′を形質転換した。さらに形質転換された大腸菌細胞を液体培地中で培養した。
【０２１７】
培養された大腸菌細胞から、さらにプラスミドを抽出した。こうして改変ＤＮＡ−１５８Ｎ配列を含有する組換えプラスミドがクローニングできた。
【０２１８】
（５）改変ＤＮＡ−１５８Ｎ配列を含有するＤＮＡ断片の回収
得られたｐ Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＤＮＡ−１５８ＮプラスミドのプラスミドＤＮＡの１０μｌを、Ｍバッファー（宝酒造（株）社製）中でＸｂａＩの１０ユニットとＳａｃＩの１０ユニットで消化した。その消化反応液を低融点アガロース電気泳動により分画した。ＤＮＡ−１５８Ｎ配列（１１４３ｂｐのサイズ）を内部に含有するＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片−β−２と称する）をアガロースから切出した。このＤＮＡ断片−β−２を含有するアガロース切片にＴＥバッファー（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡを含有、ｐＨ８）を等量加え、６８℃、２０分間加温することによりアガロースを溶解した。得られた溶液を飽和フェノールで２回抽出することによりアガロースを除いた。得られたＤＮＡを含むフェノール抽出液に対して、それの１０分の１容の３Ｍ酢酸ナトリウム、２倍容のエタノールを加え、−２０℃に約６時間放置しインキュベートした。インキュベートされた溶液を、１５０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離した。得られたＤＮＡ沈殿を減圧下で乾燥させ、得られたＤＮＡ粉末を１０μｌの水に溶解させた。そのＤＮＡ粉末は、目的の改変ＤＮＡ−１５８Ｎ配列を含有するＤＮＡ断片−β−２からなるものであった。
【０２１９】
実施例３
本例は、第２の本発明により得られた改変ＤＮＡ−１６６Ａ配列と命名されたＤＮＡ配列（すなわち、配列表の配列番号７に記載の塩基配列を有するＤＮＡ配列）を含有するＤＮＡ断片の製造を例示する。
【０２２０】
（１）ＰＣＲ用のプライマーとしての合成オリゴヌクレオチドの構築
ＤＮＡ合成装置（Ｍｏｄｅｌ−３９１、アプライドバイオシステムズ社製）を利用して、配列表の配列番号１０に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであるプライマーＮｏ．４を化学合成により構築した。
【０２２１】
（２）ＰＣＲ法用のテンプレート
実施例２の（２）項に記載されたベクターｐＤＡＰ８−１−ＸＳは、それのＸｂａＩ切断部位とＳａｃＩ切断部位との間に、配列表の配列番号１に記載の塩基配列を有するＤＮＡ配列（すなわち前記のＤＨＰＤＰＳ−ＤＮＡ−１１４３配列）を内部に含有する約１２００ｂｐの配列長をもつＤＮＡ断片を挿入されて有するものである。
【０２２２】
この組換えベクターｐＤＡＰ８−１−ＸＳが本実施例２でも下記のＰＣＲ法でテンプレートとして利用された。
【０２２３】
（３）所要なＤＮＡ断片のＰＣＲ法による増幅と回収
（ｉ）ＰＣＲ法の第１回段階
所要なＤＮＡ断片をＰＣＲ法による増幅反応により収得するために、ＰＣＲ法の第１回段階として下記の（Ａ）反応と（Ｂ）反応とを行った。
【０２２４】
すなわち、その（Ａ）反応では、テンプレートとして用いられる前記の組換えプラスミドベクターｐＤＡＰ８−１−ＸＳの５μｌと、プライマーＦＷ−１の１μＭと、配列番号１０のプライマーＮｏ．４の１μＭとを、増幅反応液（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１ｍＭのＭｇＣｌ２、５０ｍＭのＫＣｌ、４種のヌクレオチドｄＮＴＰの各０．２ｍＭの混合物、ＬＡ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼの２．５ユニットを含有）の１０μｌに加えて、増幅反応を行った。この（Ａ）反応で得られたＤＮＡの増幅生成物を、ＤＮＡ断片−Ｄと称する。
【０２２５】
また、（Ｂ）反応では、実施例２の（３）項に記載と同じく、テンプレートとして用いられる前記ベクターｐＤＡＰ８−１−ＸＳの５μｌと、プライマーとして前記のプライマーＲＶ−１の１μＭと、前記のＢＳＫＰＮ−１の１μＭとを、（Ａ）反応で用いたと同じ組成の増幅反応液に加えて、増幅反応を行った。この（Ｂ）反応で得られたＤＮＡの増幅生成物を、実施例２の（３）項と同じく、ＤＮＡ断片−Ｂと称する。
【０２２６】
なお、前記の増幅反応は、実施例２の（３）項に記載されたと同じく、ＣＲ反応装置（Ｐｒｏｇｒａｍ Ｔｅｍｐ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｓｙｓｔｅｍ ＰＣ−７００（アステック社製）内で、変性を９４℃で３０秒間、アニーリングを５５℃で２分間、伸張を７２℃で２分間行う３つの反応操作を３０回繰り返すことにより実施された。
【０２２７】
増幅反応の終了後、（Ａ）反応の増幅反応液を低融点アガロース電気泳動により分画し、増幅ＤＮＡ生成物としての４８０ｂｐのＤＮＡ断片−Ｄを含むバンドをアガロースゲルから切出した。また、（Ｂ）反応の増幅反応液を低融点アガロース電気泳動にかけて分画し、増幅ＤＮＡ生成物としての１２００ｂｐのＤＮＡ断片−Ｂを含むバンドをアガロースゲルから切出した。
【０２２８】
これらのゲル切片から、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮＩＩ Ｋｉｔ（フナコシ社製）により分離してＤＮＡ断片−Ｄの精製品とＤＮＡ断片−Ｂの精製品を得た。
【０２２９】
（ｉｉ）ＰＣＲ法の第２回段階
次に、ＰＣＲ法の第２回段階として、前記のプライマーＰＶ−１の１μｌおよびプライマーＦＷ−１の１μｌ、ならびに前記の（Ａ）反応および（Ｂ）反応で増幅したＤＮＡ断片−Ｄの１μｌとＤＮＡ断片−Ｂの１μｌを、増幅反応液（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１ｍＭのＭｇＣｌ２、５０ｍＭのＫＣｌ、ｄＮＴＰの各０．２ｍＭの混合物、ＬＡ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼの２．５ユニットを含有）１００μｌに加えて、増幅反応を行った。この場合の増幅反応は、変性を９４℃、３０秒、アニーラングを５５℃、２分、伸張を７２℃、２分行う３つの反応操作を２０回繰り返して実施した。
【０２３０】
この増幅反応の終了後、その増幅反応液を低融点アガロース電気泳動により分画し、増幅ＤＮＡ生成物として１２００ｂｐの所期のＤＮＡ断片−Ｅを含有するバンドをゲルから切出した。このゲル切片からＧＥＮＥＣＬＥＡＮＩＩ Ｋｉｔ（フナコシ社製）によりＤＮＡ断片−Ｅを分離して且つＤＮＡ断片−Ｅの精製品を得た。
【０２３１】
このＤＮＡ断片−Ｅは、配列表の配列番号７に示された塩基配列を有するＤＮＡ−１６６Ａ配列（１１４３ｂｐのサイズ）を内部に含有する約１３５０ｂｐのサイズのＤＮＡ断片であり、しかもＤＮＡ−１６６Ａ配列の５′−末端の先方にＫｐｎ１切断部位をもち且つ３′−末端の後方にＳａｃＩ切断部位をもつＤＮＡ断片である。
【０２３２】
（４）改変ＤＮＡ−１６６Ａ配列を含有するＤＮＡ断片のクローニング
上記で得られたＤＮＡ断片−Ｅを利用して、目的の改変ＤＮＡ−１６６Ａ配列を含有するＤＮＡ断片をクローニングにより十分な量で収得する操作を次に行う。
【０２３３】
（ｉ）先づ、上記で得られたＤＮＡ断片−Ｅの１０μｇをＬバッファー（宝酒造（株）製）中で制限酵素ＫｐｎＩの１０ユニットとＳａｃＩの１０ユニットで消化した。この消化で得られたＤＮＡ断片をＤＮＡ断片−γと称する。他方、プラスミドベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（＋）の１０μｇをＬバッファー（宝酒造（株）製）中で、ＫｐｎＩの１０ユニットとＳａｃＩの１０ユニットで消化して短縮プラスミドを得た。ＤＮＡ断片−γを含む消化反応液と、短縮プラスミドを含む消化反応液とにそれぞれに１／１０容の３Ｍ酢酸ナトリウム、２倍容のエタノールを加え、−２０℃に約６時間インキュベートした。その後、インキュベートされた溶液を遠心分離し、沈殿したＤＮＡを乾燥させ、５μｌの水に溶解した。
【０２３４】
こうして得られたＤＮＡ断片−γの水溶液の５μｌと、該短縮プラスミドＤＮＡの水溶液の５μｌとを混合し、次に、得られた混合物（１０μｌ）に含まれるＤＮＡを、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ（宝酒造（株）製）により連結反応させた。その連結反応液に１／１０容の３Ｍ酢酸ナトリウム、２倍容のエタノールを加え、−２０℃に約６時間インキュベートした。インキュベートされた反応液を遠心分離し、沈殿したＤＮＡを乾燥させ、５μｌの水に溶解して水溶液にした。
【０２３５】
この水溶液に含まれるＤＮＡは、前記のＤＮＡ断片−γと、プラスミドベクターｐ Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）のＫｐｎ−１及びＳａｃＩ切断で得られた前記の短縮プラスミドとを連結して作られた組換えプラスミド（ｐ Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＤＮＡ−１６６Ａプラスミドと称する）であり、その挿入ＤＮＡ領域内に、前記のＤＮＡ−１６６Ａ配列を含有した。
【０２３６】
（ｉｉ）このｐ Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＤＮＡ−１６６Ａプラスミドを大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’に導入することにより大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’を形質転換した。さらに形質転換大腸菌細胞を液体培地中で培養した。
【０２３７】
培養された大腸菌細胞から、さらにプラスミドを抽出した。こうして改変ＤＮＡ−１６６Ａ配列を含有するプラスミドがクローニングできた。
【０２３８】
（５）改変ＤＮＡ−１６６Ａ配列を含有するＤＮＡ断片の回収
得られたｐ Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＤＮＡ−１６６ＡプラスミドのプラスミドＤＮＡの１０μｌを、Ｍバッファー（宝酒造（株）製）中でＸｂａＩの１０ユニットとＳａｃＩの１０ユニットで消化した。その消化反応液を低融点アガロース電気泳動により分画した。ＤＮＡ−１６６Ａ配列（１１４３ｂｐのサイズ）を内部に含有するＤＮＡ断片−γ−２を含有するバンドをアガロースから切出した。このＤＮＡ断片−γ−２を含有するアガロースゲル切片にＴＥバッファー（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡを含有、ｐＨ８）を等量加え、６８℃、２０分間加温することによりアガロースを溶解した。得られた溶液を飽和フェノールで２回抽出することによりアガロースを除いた。得られたＤＮＡを含むフェノール抽出液に対して、それの１０分の１容の３Ｍ酢酸ナトリウム、２倍容のエタノールを加え、−２０℃で約６時間放置インキュベートした。インキュベートされた溶液を、１５０００ｒｐｍ、４℃で１０分遠心分離した。得られたＤＮＡ沈殿を減圧下で乾燥させ得られた粉末と１０μｌの水に溶解させた。このＤＮＡ粉末は、目的の改変ＤＮＡ−１６６Ａ配列を含有する約１２００ｂｐのサイズのＤＮＡ断片−γ−２から成るものであった。
【０２３９】
なお、実施例２の（５）で得られた前記のＤＮＡ断片−β−２を、実施例１の（７）項に記載されたと同様にして、塩基配列決定キットを用いる自動ＤＮＡシーケンサ、ＡＬＦ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｅｒ ＩＩにかけた。ＤＮＡ断片−β−２は配列表の配列番号５に記載の塩基配列をもつ改変ＤＮＡ−１５８Ｎ配列を内部に含有するＤＮＡ断片であると確認できた。
【０２４０】
また、実施例３の（５）で得られたＤＮＡ断片−γ−２も、上記と同様に、塩基配列決定の試験にかけた。ＤＮＡ断片−γ−２は、配列表の配列番号７に記載の塩基配列をもつ改変ＤＮＡ−１６６Ａ配列を内部に含有するＤＮＡ断片であると確認できた。
【０２４１】
実施例４
本例は、第１の本発明によるＤＮＡ配列または第２の本発明による改変ＤＮＡ配列を、外来遺伝子としてイネ植物に導入することからなるイネ植物の形質転換法を例示する。
【０２４２】
（１）外来遺伝子の導入用の組換えベクターの作成
（ｉ）カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーターと、ＮＯＳターミネーターと、アンピシリン耐性遺伝子とを含有する５．７ｋｂのサイズのプラスミドベクターｐＢＩ２２１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）のＤＮＡ（１０μｇ）を、Ｍバッファー（宝酒造（株）製）中で制限酵素ＸｂａＩおよびＳａｃＩの１０ユニットで消化した。その消化反応液からＤＮＡを沈殿させ、遠心分離してから乾燥させた。３５ＳプロモーターおよびＮＯＳターミネーターを保有する約３．８ｋｂのサイズのベクター断片を得た。
【０２４３】
（ｉｉ）得られたベクター断片を５μｌの水に溶解した。そのベクター断片の水溶液の５μｌを、実施例２で得られ且つ第１の本発明による配列番号１に記載のＤＨＤＰＳ−ＤＮＡ−１１４３配列（１１４３ｂｐのサイズ）を内部に含有する約１１４３ｂｐのサイズのＤＮＡであるＤＮＡ断片−ＸＳの水溶液の５μｌと混合した。
【０２４４】
得られた混合物をＤＮＡリゲーション・キット（宝酒造（株）製）で処理して、ＤＮＡの連結反応を行った。こうしてプラスミドベクターｐＢＩ２２１のＸｂａＩ−ＳａｃＩ−切断ベクター断片に対して、前記のＤＮＡ断片−ＸＳを連結してなる環状の組換えベクターを作成した。この組換えベクターをベクターｐＤＡＰと称する。ベクターｐＤＡＰは、３５Ｓプロモーター領域とＮＯＳターミネーター領域との間に、ＤＮＡ断片−ＸＳ領域が挿入、連結されてあり、且つアンピシリン耐性遺伝子（Ａｍｒ）を含有する構造を有し、４．９ｋｂのサイズを有した。
【０２４５】
（ｉｉｉ）実施例２で得られたＤＮＡ断片−ＸＳの代りに、実施例２で得られたＤＮＡ断片−β−２（すなわち、第２の本発明による配列番号５に記載の改変ＤＮＡ−１５８Ｎ配列（１１４３ｂｐのサイズ）を内部に含有する約１１４３ｂｐのサイズのＤＮＡである）を用いて、前記と同様な連結反応により、プラスミドベクターｐＢＩ２２１のＸｂａＩ−ＳａｃＩ−切断−ベクター断片に対して連結した。こうして作成された環状の組換えベクターはベクターｐ１５８Ｎと称する。ベクターｐ１５８Ｎは、３５Ｓプロモーター領域と、ＮＯＳターミネーター領域との間に、ＤＮＡ断片−β−２の領域が挿入、連結された構造を有し、４．９ｋｂのサイズを有した。
【０２４６】
（ｉｖ）さらに、実施例２で得られたＤＮＡ断片−ＸＳの代りに、実施例３で得られたＤＮＡ断片γ−２（すなわち、第２の本発明による配列番号７に記載の改変ＤＮＡ−１６６Ａ配列（１１４３ｂｐのサイズ）を内部に含有する約１１４３ｂｐのサイズのＤＮＡである）を用いて、前記と同様な連結反応により、プラスミドベクターｐＢＩ２２１のＸｂａＩＳａｃＩ−切断−ベクター断片に対して連結した。こうして作成された環状の組換えベクターはベクターｐ１６６Ａと称する。ベクターｐ１６６Ａは、３５Ｓプロモーター領域とＮＯＳターミネーター領域との間に、ＤＮＡ断片−γ−２の領域が挿入、連結されてある構造を有し、また４．９ｋｂのサイズを有した。
【０２４７】
（２）組換えベクターのクローニング
上記で得られた組換えベクターｐＤＡＰあるいは組換えベクターｐ１５８Ｎあるいは組換えベクターｐ１６６Ａの水溶液１０μｌ（ＤＮＡの量：１０ｍｇ）と、大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’コンピテントセル１００μｌとを１．５ｍｌ容チューブに入れ、氷中で３０分間、４２℃で３０秒間、そして再び氷中で２分間インキュベートした。その後に、インキュベートされた混合物を実施例１の（６）項で記載されたと同様に処理し且つ大腸菌を振とう培養した。
【０２４８】
得られた大腸菌の培養液を、実施例１の（６）項に記載されたと同様に、アンピシリン及びその他の添加物を添加されたＬＢ寒天培地にプレーティングした。３７℃、１６時間にわたって大腸菌を培養した。
【０２４９】
用いた組換えベクターｐＤＡＰまたは組換えベクター１５８Ｎまたは組換えベクター１６６Ａの導入により形質転換され且つアンピシリン耐性である大腸菌コロニー１０個を得た。これら大腸菌コロニー１０個を、それぞれにアンピシリン５０ｍｇ／ｌを含む液体培地で増殖させた。
【０２５０】
（３）組換えベクターの回収
１０個のコロニーから夫々に増殖した大腸菌細胞から、プラスミド精製キット（ＱＩＡ ｆｉｌｔｅｒ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔ、ＱＩＡＧＥＮ社製）により組換えプラスミドを分離し且つ精製した。
【０２５１】
得られたそれぞれの組換えプラスミドを、制限酵素ＸｂａＩとＳａｃＩとで消化し、得られたＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動により解析した。
【０２５２】
その解析の結果を参照して、得られた組換えプラスミドの中で３５Ｓプロモーターの下流に正常に第１の本発明によるＤＨＤＰＳ−ＤＮＡ−１１４３配列が連結されてある組換えプラスミドを、ベクターｐＤＡＰとして選択して、採取した。
【０２５３】
また、同様にして、組換えプラスミドの中で３５Ｓプロモーターの下流に正常に第２の本発明による改変ＤＮＡ−１５８Ｎ配列が連結されてある組換えプラスミドを、ベクターｐ１５８Ｎとして選択して、採取した。
【０２５４】
さらに、同様にして、組換えプラスミドの中で３５Ｓプロモーターの下流に正常に第２の本発明による改変ＤＮＡ−１６６Ｎ配列が連結されてある組換えプラスミドを、ベクターｐ１６６Ａとして選択して、採取した。
【０２５５】
このように得られた組換えベクターｐ１５８Ｎの導入により形質転換された大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’はエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’／ｐ１５８Ｎと命名され、日本の茨城県、つくば市の工業技術院生命工学工業技術研究所に１９９８年４月１３日以降、ブダペスト条約の規約下でＦＥＲＭ ＢＰ−６３２３の受託番号で前記の研究所に寄託されてある。
【０２５６】
このように得られた組換えベクターｐ１６６Ａの導入により形質転換された大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’はエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’／ｐ１６６Ａと命名され、日本の茨城県、つくば市の工業技術院生命工学工業技術研究所に１９９８年４月１３日以降、ブダペスト条約の規約下でＦＥＲＭ ＢＰ−６３２４の受託番号で前記の研究所に寄託されてある。
【０２５７】
（４）イネのカルスの調製
イネ（品種：日本晴）の完熟種子から籾穀を脱穀した。得られた外皮付きの種子を７０％エタノール溶液に６０秒間、ついで有効塩素約１％の次亜塩素酸ナトリウム溶液に６分間浸漬して種子を殺菌処理した。さらに種子を滅菌水で洗浄した。
【０２５８】
ＭＳ培地の無機成分組成にショ糖３０ｇ／ｌ、植物ホルモンとして２，４−ＰＡ２ｍｇ／ｌ、寒天８ｇ／ｌを添加してなる培地に、上記で殺菌したイネ種子を置床した。２８℃で４５日間、２０００ルックスの光を１日当たり１６時間照明しながらインキュベートした。カルスが形成された。それらカルスを胚乳部分から切り出し、孔１ｍｍのステンレスメッシュの篩を用いて、１ｍｍ以下のカルスをＰＣＶ（Ｐａｃｋｅｄ Ｃｅｌｌ Ｖｏｌｕｍｅ；圧縮細胞量）として３ｍｌの細胞量で得た。
【０２５９】
（５）ウイスカの調製
チタン酸カリウム製ウイスカ（チタン工業（株）製、ＬＳ２０）５ｇを１．５ｍｌ容のチューブに入れ、エタノールを０．５ｍｌ加えて、一晩放置した。エタノールを完全に蒸発させて、殺菌されたウイスカを得た。このウイスカの入ったチューブに滅菌水１ｍｌを入れ、よく攪拌した。ウイスカと滅菌水を遠心分離し、上清の水を捨てた。このようにしてウイスカを洗浄した。このウイスカ洗浄操作を３回行った。その後、同チューブ内にＲ２液体培地の０．５ｍｌを加えてウイスカ懸濁液を得た。
【０２６０】
（６）イネ・カルス細胞への外来遺伝子の導入用の材料の調製
前項（３）に記載するように調製した組換えベクターｐＤＡＰ、またはベクターｐ１５８Ｎ、またはベクターｐ１６６Ａを１ｍｇ／ｍｌの濃度でＴＥ緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ １０ｍＭ，ＥＤＴＡ １ｍＭ，ｐＨ８）に溶解してベクター溶液を得た。
【０２６１】
上記で得られたウイスカ懸濁液の入ったチューブに１ｍｍ以下のカルスを２５０μｌ入れて、攪拌した。得られた混合物を１０００ｒｐｍ／分で１０秒間遠心分離し、カルスとウイスカを沈殿させた。上清を捨てた。カルスとウイスカとの混合物が得られた。
【０２６２】
カルスとウイスカとの混合物を入れたチューブに、組換えベクター（すなわち、ベクターＤＡＰまたはｐ１５８Ｎまたはｐ１６６Ａ）の１０μｌ（ＤＮＡの１０μｇ含有）と、選抜マーカー用として除草剤ホスフィノスリシン耐性遺伝子を含むプラスミドベクターｐ３５ＳＣ−ＳＳ（特開平８−１５４５１３号公報）１０μｌ（１０μｇのＤＮＡを含有）とを加えた。十分振り混ぜた均質な混合物を得た。
【０２６３】
次にこの均質な混合物の入ったチューブを１８０００ｘｇで５分間遠心分離した。遠心分離された混合物を再度振り混ぜた。この遠心分離の操作と再度振り混ぜる操作を３回反復した。
【０２６４】
（７）イネのカルスへの外来遺伝子の導入の操作
上記のようにして得られた、カルス細胞と、ウイスカと、本発明ＤＮＡ配列を含有する組換えベクターと、選択用プラスミドベクターｐ３５ＳＣ−ＳＳとよりなる均質な混合物を収容しているチューブを、超音波発生機の浴槽にチューブが十分浸かるように設置した。周波数４０ｋＨｚの超音波を強度０．２５Ｗ／ｃｍ２で１分間照射した。照射後、３０分間、４℃で超音波処理された混合物をインキュベートした。
【０２６５】
このように超音波処理した混合物をＲ２液体培地で洗浄し、組換えベクターを導入した目的の形質転換カルス細胞を得た。
【０２６６】
（８）導入ベクターで形質転換されたカルス細胞の選抜
上記で組換えベクターを導入された形質転換細胞を有するカルスを、３．５ｃｍのシャーレに入れた。さらにＲ２培地の無機成分組成にショ糖３０ｇ／ｌ、２，４−ＰＡ２ｍｇ／ｌを添加して得た液体培地を３ｍｌ加えた。その後に、２８℃で２０００ルックスの光を１日当たり１６時間照射しながらロータリーシェーカー（５０ｒｐｍ）上でカルス細胞を培養し、分裂細胞を得た。
【０２６７】
培養３日目に、得られた分裂細胞の懸濁液３ｍｌを、Ｎ６培地の無機成分組成に、ショ糖３０ｇ／ｌ、２，４−ＰＡ２ｍｇ／ｌ、ゲルライト３ｇ／ｌ、ホスフィノスリシン３０ｍｇ／ｌを添加してなる培地上に均一に広げた。培地上の細胞を、２８℃で２０００ルックスの光を１日当たり１６時間照射しながら３０日間培養した。ホスフィノスリシン耐性の形質転換カルス細胞を得た。
【０２６８】
（９）ベクターｐ１５８Ｎまたはｐ１６６Ａによる形質転換カルス細胞の再選抜
上記により得たホスフィノスリシン耐性である形質転換カルス培養細胞のうち、第２の本発明によるＤＮＡを外来遺伝子として十分に導入されて形質転換された所期の培養細胞のみを再選抜する。そのためには、形質転換カルス細胞よりなるカルス４００個（直径２ｍｍ）を、Ｎ６培地の無機成分組成にショ糖の３０ｇ／ｌと、２，４−ＰＡの２ｍｇ／ｌと、ゲルライトの３ｇ／ｌと、細胞増殖阻害剤として働くＳ−（２−アミノエチル）システィン（以下、ＡＥＣという）（リジンのアナログ体）の２００ｍｇ／ｌとを添加してなる培地上に移植した。２８℃、２０００ルックスの光を１日当たり１６時間照射しながらカルス細胞を３０日間培養した。前記のＡＥＣ添加培地で生育できたベクターｐ１５８Ｎまたはｐ１６６Ａ含有の形質転換カルス細胞をこのようにして再選抜した。
【０２６９】
（１０）形質転換カルス細胞からの植物体の再生
上記により得たホスフィノスリシン耐性およびＡＥＣ耐性である形質転換カルス培養細胞（直径５ｍｍ）の９８〜１００個を、ＭＳ培地の無機成分組成にショ糖の３０ｇ／ｌ、ベンジルアデニンの２ｍｇ／ｌ、ナフタレン酢酸の１ｍｇ／ｌ、ゲルライトの３ｇ／ｌを添加してなる培地上に移植した。２８℃で２０００ルックスの光を１日当たり１６時間照射しながら３０日間培養した。形質転換カルス細胞よりなるカルスから芽と根が再生できた。再生した芽と根をもつ幼芽（長さ１０〜３０ｍｍに生育した芽）を、ショ糖の３０ｇ／ｌ、ゲルライトの３ｇ／ｌを含むＭＳ培地を入れた試験管（直径４５ｍｍ、長さ２５ｃｍ）に移植した。移植された幼芽を２０日間培養して形質転換したイネ植物を得た。
【０２７０】
上記の方法により、第１の本発明によるＤＨＤＰＳ−ＤＮＡ−１１４３配列を外来遺伝子として含有する形質転換カルス細胞のカルス９８個から、８０個体のイネ植物が再生できた。また、第２の本発明による改変ＤＮＡ−１５８Ｎ配列を外来遺伝子として含有するＡＥＣ耐性の形質転換カルス細胞のカルス１００個から、７６個体のイネ植物が再生できた。
【０２７１】
さらに、第２の本発明による改変ＤＮＡ−１６６Ａ配列を外来遺伝子として含有するＡＥＣ耐性の形質転換カルス細胞のカルス１００個から、７９個体のイネ植物が再生できた。
【０２７２】
（１１）形質転換イネ植物の再生体の遺伝子解析
上記のように再生されたイネ植物体に存在するＤＨＤＰＳをコードするＤＮＡの解析をＰＣＲ法で次の手順により行った。
【０２７３】
（ｉ）前項（１０）で得た再生イネ植物から葉を採取した。その葉５０ｍｇを１．５ｍｌ容のマイクロチューブに入れ、１０ｍＭ ＥＤＴＡを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）３００μｌを添加し、これを磨砕した。磨砕物に２０％ＳＤＳを２０ｍｌ加えて、６５℃で１０分間加温した。得られた混合物に５Ｍ酢酸カリウムを１００μｌ加え、氷中に２０分間置いた後、１，７０００ｘｇの遠心加速度で２０分間遠心分離した。得られた上清にイソプロパノール２００μｌを加え、転倒攪拌し、これを再び１．７０００Ｘｇの遠心加速度で２０分間遠心分離した。得られたＤＮＡの沈殿を減圧下で乾燥した。１００μｌのＴＥ緩衝液にそのＤＮＡを溶解した。
【０２７４】
（ｉｉ）ＰＣＲ用のプライマーとして、配列表の配列番号１４に示す塩基配列を有する前記オリゴヌクレオチドと、配列番号１５に示す塩基配列を有する前記オリゴヌクレオチドとを用いた。
【０２７５】
次に、これら２種類のオリゴヌクレオチドの各１μＭをプライマーとして用い且つ上記再生イネ植物体由来のＤＮＡの５μｌをテンプレイトとして用い、これらを増幅用反応液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１．０ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ ＫＣｌ、０．０１％ゼラチン、ｐＨ８．３、ｄＮＴＰの各０．２ｍＭの混合物およびＴａｑ ＤＮＡポリメタラーゼ２．５ユニットを含有）１００μｌに加えた。そして増幅反応を行った。用いた増幅反応液は、ＰＣＲキット（ＰＣＲ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（宝酒造（株）製）で調製した。
【０２７６】
増幅反応は、ＰＣＲ反応装置（Ｐｒｏｇｒａｍ Ｔｅｍｐ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｓｙｓｔｅｍ ＰＣ−７００（アズテック社製））内で、変性９４℃、１分、アニーリング６０℃、３０秒、伸張（ｅｘｔｅｎｔｉｏｎ）７２℃、１分の３つの反応操作を３０回繰り返すことによって実施した。
【０２７７】
（ｉｉｉ）得られたＰＣＲ反応液を、常法によりアガロース電気泳動にかけて分析したところ、再生イネ植物から抽出したＤＮＡから増幅された各種のＤＮＡのバンドが確認された。
【０２７８】
さらに、それらの各種のＤＮＡ配列を、塩基配列決定キットにより解析したところ、本発明のＤＨＤＰＳ−ＤＮＡ−１１４３配列、改変ＤＮＡ−１５８Ｎ配列または改変ＤＮＡ−１６６Ａ配列に相当するＤＮＡ断片が再生イネ植物から上記のように抽出された各種のＤＮＡ断片の中に存在することが確認できた。
【０２７９】
上記のようにＰＣＲ法による遺伝子解析を行うことにより、導入した外来遺伝子が確認できた再生イネ植物体は、各々を培養土を入れたポットに移植して栽培した。これらの再生イネ植物体は正常に生育したので自殖種子を得ることができた。
【０２８０】
（１２）形質転換イネ植物の再生体中のリジン含量の測定
前項（１１）で得られた、第１の本発明によるＤＨＤＰＳ−ＤＮＡ−１１４３配列を含有する組換えベクターｐＤＡＰを導入された植物細胞を有する再生された形質転換イネ植物体と、第２の本発明によるＤＮＡ−１５８Ｎ配列を含有する組換えベクターｐＤＮＡ−１５８Ｎを導入された植物細胞を有する再生された形質転換イネ植物体と、第２の本発明によるＤＮＡ−１６６Ａ配列を含有する組換えベクターｐＤＮＡ−１６６を導入された植物細胞を有する再生する形質転換イネ植物体とから、夫々に緑色の葉を採取した。
【０２８１】
このようにそれぞれに採取された葉を１ｇづつ取り、それらの葉の１ｇを、１．５ｍｌ容の第１のチューブに入れ、さらに５０％アセトニトリル１ｍｌを添加し、磨砕した。磨砕混合物を新たらしい１．５ｍｌ容の第２のチューブに移し替え、１７０００Ｘｇの遠心加速度で２０分間遠心分離した。得られた上清を、再び新たらしい第３のチューブに移し入れ、その第３のチューブ内に５０％アセトニトリル１ｍｌを加え、十分に転倒攪拌し、再び遠心分離した。得られた上清を第１のチューブに加え、この操作を３回繰り返した。このようにして、葉からリジンを抽出したアセトニトリル抽出液を得た。
【０２８２】
このアセトニトリル抽出液を減圧下で乾固させた後、蒸留水１ｍｌを加えて水溶液を得た。その水溶液を１７０００Ｘｇの遠心加速度で２０分間遠心分離により、上清の０．５ｍｌを得た。その上清のうち１００μｌに５ｍＭ ＤＮＦＢ（２，４−ジニトロ−１−フルオロベンゼン）１００μｌを混合した。得られた混合物を一晩反応させた。この反応液に２００μｌのアセトニトリルを添加し、攪拌した後、１７０００ｘｇの遠心加速度で２０分間遠心分離した。上清液として、リジンの抽出液を得た。これを、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）装置（東ソー（株）製、８０２０型）にかけて遊離リジン含量を測定した。このＨＰＬＣに用いたカラムは、ＣＡＰＣＥＬＬＰＡＫ−Ｃ１８（資生堂（株）製）であり、展開溶媒はアセトニトリル−水をアセトニトリルの６０％〜７２％濃度勾配で用い、流量は０．８ｍｌ／分として、３５０ｎｍの光の吸光度を測定して、リジン含量を評定した。
【０２８３】
対照のイネ植物として、通常のイネ（品種：日本晴）の植物体を用いた。得られた測定結果を次の表１に示す。
【０２８４】
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表１に示された結果から明らかなように、本発明による新規ＤＮＡ配列を外来遺伝子として用い且つ植物細胞中で発現できるプロモーターを有する組換えベクターを利用すると、本発明による新規ＤＮＡ配列を導入することにより、イネ植物体中に生成される遊離リジン含量が増加できることが確認された。
【０２８５】
産業上の利用可能性
以上の説明から明らかなように本発明により、イネのジヒドロジピコリネートシンターゼをコードできる新規なＤＮＡ配列が提供される。当該ＤＮＡ配列を外来遺伝子としてイネ植物体に導入することにより、イネ植物体中の必須アミノ酸、リジンの含量を高めることができた。本発明によるＤＮＡ配列は、従来知られるバイオテクノロジーの技法によって、イネ及びその他の有用植物、例えばトウモロコシ、ダイズ、コムギ、オオムギの植物体にも外来遺伝子として導入できる。従って、本発明で提供されたＤＮＡ配列は、高いリジン含量を有する種子を産生できる新品種の植物を育種するのに有用である。
【図面の簡単な説明】
【０２８６】
第１図は、前記の実施例４においてイネの培養細胞を形質転換するのに用いる外来遺伝子の導入用の組換えベクターであり且つ第２の本発明による改変ＤＮＡ−１５８Ｎ配列を内部に含有するベクターｐ １５８Ｎを、ベクターｐ ＢＩ２２１から作成する手順を図解的に示す。
【０２８７】
第２図は、前記の実施例４においてベクターｐ １５８Ｎと共にイネの培養細胞に導入されるベクターであって、選抜マーカーとしてのホスフィノスリシン遺伝子ＳＳを含有するベクターｐ ３５ＳＣ−ＳＳの構造を図解的に示す。
【０２８８】
[配列表]
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【図１】
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【図２】
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