(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により分子量約１７７ｋＤを示し、下記の性質を有するコナヒョウヒダニ虫体由来の精製ダニアレルゲン、
（１） ０．５％トリトンＸ−１００を含む２０ｍＭリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳＴ）中で、配列番号：１で表される塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を有する組換えダニアレルゲンＭａｇ３に対する抗体を固定化したカラムに吸着され、１５０ｍＭのＮａＣｌを含む０．２Ｍ グリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ２．２５）で溶出され、
（２）スーダンブラックＢで染色されず、リピドを含まず、
（３） ＰＡＳ染色によりグリコシド鎖が検出されず、
（４） 免疫染色上でウサギ抗 Der f１および抗 Der f２と反応せず、
（５） ダニアレルゲン特異的ヒトＩｇＥへの結合頻度および結合能が Der f２と同等であり、
（６） 組換えＭａｇ３と一部交差反応を示し、そして
（７） アレルゲン活性を有する。
【請求項２】
コナヒョウヒダニ虫体抽出物を、配列番号：１で表される塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を有する組換えダニアレルゲンＭａｇ３に対する抗体を固定化したカラムにＰＢＳＴ中で吸着させ、ついで１５０ｍＭのＮａＣｌを含む０．２Ｍ グリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ２．２５）で溶出することを特徴とする請求項１記載の精製ダニアレルゲンの製造方法。
【請求項３】
請求項１記載の精製ダニアレルゲンを有効成分とするダニアレルギー疾患治療剤。
【請求項４】
請求項１記載の精製ダニアレルゲンを有効成分とするダニアレルギー疾患診断薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、ダニアレルゲン活性を有する精製ダニアレルゲン、その製造方法、ダニアレルギー疾患治療剤、およびダニアレルギー疾患診断薬に関するものである。
【０００２】
【従来の技術・発明が解決しようとする課題】
屋内塵性ダニは、アトピー性気管支喘息、通年性鼻炎、アトピー性皮膚炎等のアレルギー疾患の主要な原因として重要であり（Voorhorst R. et al., J. Allergy,  39, 325-339 (1967)) 、２種の近縁のダニ種であるコナヒョウヒダニ（Dermatophagoides farinae）とヤケヒョウヒダニ（Dermatophagoides pteronyssinus）とからヒトに対し感作作用を有するアレルゲンを同定すべく多くの努力が払われてきた（Arlian L.G. et al., J. Allergy Clin. Immunol.,  79, 457-466 (1987)) 。
【０００３】
ダニアレルギー患者のＩｇＥやウサギ抗血清を用いるイミュノブロット上で多数のアレルゲン成分が検出された（Arlian L.G. et al., J. Allergy Clin. Immunol. 79, 457-466 (1987)。中でも、Der 1 （２５ｋＤ）、Der ２（１４ｋＤ）、Der ３（２８／３０ｋＤ）、Der ４（６０ｋＤ）、Der ５（１４ｋＤ）、Der ６（２５ｋＤ）、およびDer ７（２２−２８ｋＤ）グループが主要かつ重要なアレルゲンとしてそれらの特性が明らかにされてきた。本発明者らも、Mag 1 （３９ｋＤ）、Mag 29（hsp 70，６８ｋＤ）、およびMag 44（tropomyosin ，３７ｋＤ）のような種種の新規なコナヒョウヒダニ抗原を対応するアレルゲンとして（Aki T., et al.,Int. Arch. Allergy Immunol. 103, 349-356 (1994)、Aki T., et al.,Int. Arch. Allergy Immunol  103, 357-364 (1994)、Aki T., et al.,J. Biochem.  115, 435-440 (1994))、また低分子量の抗原を喘息誘発性のアレルゲンとして（Yamaguchi T. et al.,Jpn. J. Allergol. 43, 70.-710 (1994)、Yamaguchi T. et al.,Jpn. J. Allergol. 43, 815-824 (1994)) 発見し同定してきた。最近、グルタチオン  Ｓ−トランスフェラーゼと相同な他の抗原がダニ主要アレルゲンとして報告された(O'Neil G.M. et al.p Biochim. Biophys. Acta  1219, 521-528 (1994))。
【０００４】
ダニ虫体および糞の抽出物中の主要かつ重要なアレルゲンの多くが１０−７０ｋＤの分子量の範囲に見いだされている。一部に、高分子量（２４４ｋＤ、１１０ｋＤ以上、１５８ｋＤ以上、および１７５ｋＤ）のアレルゲンが、主にイムノエレクトロホレーシスやイムノブロッティングにより（Stewart G.A. and Turner K.J., Aust. J. Exp. Biol. Med. Sci. 58, 259-274 ,275-288 (1980) 、Baldo B.A., Ford S.A. and Tovey E.R., Adv. Biosci. 74, 13-31 (1989), Wahl R. Meineke D., Maasch H.J. and Schultze-Werninghaus G., Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 90, 224-229 (1989)、 Colloff M.J. Howe C.W. McSharry C. and Smith H.V., Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 97, 44-49 (1992))   検出することが可能となったが、未だ充分に解明されていない。本発明者らは、新規高分子量抗原がマイトゲン活性をもつことを明らかにした。しかし、未知のアレルゲン、殊に高分子量の抗原はいまだ解明されていないのが現状である。
【０００５】
一方、ダニアレルギー疾患の診断方法としては、従来、問診を主体とし、屋内塵（ハウスダスト）抽出物およびダニ虫体抽出物の一方または両方を用いる皮内反応試験が殆どであり、まれに、RAST(radio  allergosorbent test)法による血清中のIgE 抗体価（相対値）の測定、吸入誘発試験、鼻粘膜誘発試験を併用する程度であり、ダニアレルギー疾患を直接的に診断するのはかなり困難である。
【０００６】
さらに、ダニアレルギー疾患の治療法、特に屋内塵性ダニを特異抗原とする気管支喘息の減感作治療法には、従来、屋内塵（ハウスダスト）抽出液が用いられてきているが、化学的にはその組成が極めて不明確であり、しかも多種類の不純物を含み、アナフィラキシー誘発の可能性があるために投与量が極度に制限され、治療効果が極めて低いのが現状であり、有効性及び安全性の観点から、有用な減感作治療用抗原の出現が望まれる。
【０００７】
従って、本発明の第一の目的は、ダニ虫体の抽出物から新規な高分子量のダニアレルゲンを単離精製し、この精製ダニアレルゲンを提供することにある。本発明の第２の目的は、この精製ダニアレルゲンの簡易な製造方法を提供することにある。本発明の第３の目的は、新規な高分子量の精製ダニアレルゲンを有効成分とするダニアレルギー疾患治療剤およびダニアレルギー疾患診断薬を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、先に、ダニ生虫体から抽出したｍＲＮＡに対するｃＤＮＡクローンの一つとしてｍａｇ３を単離した。この免疫反応性クローンは、ＤＮＡクロスハイブリダイゼーションにより分類された９群の中の１群の代表的遺伝子である。これはある種のタンパク質の一部しかコードしていないが、その発現物質である組換えＭａｇ３はヒトおよびネズミのＢ細胞に対して顕著なマイトゲン活性を示す。今回このタンパク質の構造と機能の解明のため、ダニ虫体タンパク質成分について組換えＭａｇ３と交差反応性を示すタンパク質を探索したところ、強力なダニアレルゲン活性を有する新規な高分子量ダニアレルゲンを分離精製することに成功した。本発明は、この事実に基づき、更に研究を重ねて完成するに至ったものである。
【０００９】
即ち、本発明の要旨は、
（１）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により分子量約１７７ｋＤを示し、下記の性質を有するコナヒョウヒダニ虫体由来の精製ダニアレルゲン、
(1) ０．５％トリトンＸ−１００を含む２０ｍＭリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳＴ）中で、配列番号：１で表される塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を有する組換えダニアレルゲンＭａｇ３に対する抗体を固定化したカラムに吸着され、１５０ｍＭのＮａＣｌを含む０．２Ｍ グリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ２．２５）で溶出され、
(2) スーダンブラックＢで染色されず、リピドを含まず、
(3) ＰＡＳ染色によりグリコシド鎖が検出されず、
(4) 免疫染色上でウサギ抗 Der f１および抗Der f２と反応せず、
(5) ダニアレルゲン特異的ヒトＩｇＥへの結合頻度および結合能がDer f２と同等であり、
(6) 組換えＭａｇ３と一部交差反応を示し、そして
(7) アレルゲン活性を有する、
（２）コナヒョウヒダニ虫体抽出物を、配列番号：１で表される塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を有する組換えダニアレルゲンＭａｇ３に対する抗体を固定化したカラムにＰＢＳＴ中で吸着させ、ついで１５０ｍＭのＮａＣｌを含む０．２Ｍ グリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ２．２５）で溶出することを特徴とする請求項１記載の精製ダニアレルゲンの製造方法、
（３） 前記（１）記載の精製ダニアレルゲンを有効成分とするダニアレルギー疾患治療剤、並びに
（４） 前記（１）記載の精製ダニアレルゲンを有効成分とするダニアレルギー疾患診断薬、に関する。
【００１０】
以下に本発明について詳細に説明する。
本発明の精製ダニアレルゲンは、ダニ虫体抽出物から、配列番号：１で表される塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を有する組換えダニアレルゲンＭａｇ３に対する抗体を固定化したカラムに一定条件下に吸着し、一定条件下に溶出される成分として得られるものである。ここで用いられるダニは特に限定されるものではないが、屋内塵性ダニであるコナヒョウヒダニやヤケヒョウヒダニ等が好適に用いられる。
【００１１】
ダニ虫体抽出物（Ｄｆｂ）の調製
本発明の精製ダニアレルゲンの調製に用いられるダニ虫体抽出物（Ｄｆｂ）は、コナヒョウヒダニまたはヤケヒョウヒダニのいずれから調製してもよい。これらのダニをダニ培養培地で飼育し、ダニ虫体から粗抗原を抽出処理する。
抽出処理は、飽和食塩水および／またはリン酸緩衝液を加えて攪拌し、室温で３０分間静置した後に、遠心分離（3000  rpｍ、30分）を行い、上清をプールする。プールした上清に浮遊するダニ虫体を濾過して集める。このダニ虫体を抽出し、溶媒とともに磨砕後、遠心分離し、その上清を透析、凍結乾燥してダニ虫体粗抗原とする。この際、抽出溶媒としては、中程度イオン強度の緩衝液であれば何を用いてもよい。例えば、乳酸緩衝液、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、ホウ酸緩衝液等が挙げられる。
【００１２】
組換えダニアレルゲンＭａｇ３の調製
組換えダニアレルゲンＭａｇ３は以下のようにして調製する。
まず、ダニ生虫体からＲＮＡをグアニジンイソチオシアネートで抽出したのち、Fast Track  ｍＲＮＡ単離キット（インビトロゲン, San Diego, CA, USA製) を用いてポリ（Ａ）−ｍＲＮＡを単離する。ついでｃＤＮＡ合成キット（ファルマシア  バイオテク製）およびインビトロパッケージングキット（ストラタジーン製）を用いてλｇｔ１１中にダニｃＤＮＡライブラリーを構築する。得られた組換えファージを大腸菌Ｙ１０９０に感染させた後、ウサギ抗−Ｄｆｂ血清でイムノスクリーニングを行い陽性の溶菌斑を得る。
【００１３】
上で得られた免疫反応性のタンパク質をコードするｃＤＮＡの中から、Ｍａｇ３をコードするｃＤＮＡであるｍａｇ３を選び、プラスミドｐＧＥＸ（ファルマシア  バイオテク製）に組み込む。得られたプラスミドで大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換させる。この形質転換体を２×ＹＴ培地（１．６％  バクトトリプトン、１％  酵母エキス、０．５％  ＮａＣｌ）２リットル中で、ＯＤ660 ０．６になるまで、３７℃において培養する。ＩＰＴＧで３時間誘導させた後、細胞を５ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％の２−メルカプトエタノールおよび１％のトリトンＸ−１００を含む５０ｍＭのトリス−塩酸（ｐＨ７．６）中で徹底的に超音波処理をして、融合タンパク質（ＧＳＴ−Ｍａｇ３）を細胞内の封入体として回収する。この封入体をサンプル緩衝液に溶解し、調製用ディスクゲル電気泳動にかける。電気泳動上で単離された融合タンパク質を５０ｍＭ−トリス−塩酸（ｐＨ８．０）中でヒトトロンビン（シグマ製）で処理して切断する（Smith D.B. and Johnson K.S., Gene 67,31-40,1988 、Frangioni J.V. and Neel B.G.,Anal. Biochem., 210,179-187,1993)。同様に調製用ディスクゲル電気泳動により消化物から組換えＭａｇ３を精製し、水に対し透析後、凍結乾燥して−８０℃で貯蔵する。
【００１４】
得られた組換えダニアレルゲンＭａｇ３の塩基配列は、オートリードシークエンシングキットおよびＡ．Ｌ．Ｆ．ＤＮＡシークエンサー（ファルマシア  バイオテク製）を用い、ジデオキシヌクレオチド  チェイン  ターミネーション法（Sanger F., Nicklen S., and Coulson A.R., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,  74, 5463-5467, 1977)により配列番号：１に記載されるように決定される。
【００１５】
特異的抗組換えＭａｇ３抗体の調製
日本白ウサギに、組換えＭａｇ３の１００μｇをフロイントの完全アジュバントに混ぜ、２週間ごとに４回筋肉内注射した後採血する。
上記のようにして調製したウサギの血清（３０ｍｌ）を、０．５％トリトンＸ−１００を含む２０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳＴ）で１０倍に希釈し、ＣＮＢｒ−活性化セファローズＣＬ−４Ｂ（ファルマシア  バイオテク製）を用いて調製した組換えＭａｇ３固定化セファローズ（５ｍｌ湿容量）カラムにかけ、４℃で１晩還流する。このアフィニティカラムをＰＢＳで充分に洗い、ついで１５０ｍＭのＮａＣｌを含む０．２Ｍグリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ２．２５）で特異的抗組換えＭａｇ３抗体を溶出させる。溶出液を直ちに１．０Ｍトリス−塩酸（ｐＨ８．０）で中和し、使用するまで−８０℃に貯蔵する。
【００１６】
本発明の精製ダニアレルゲンの調製
プロテアーゼインヒビターを含むＰＢＳＴに２００ｍｇのダニ虫体抽出物を溶解し、ＣＮＢｒ−活性化セファローズＣＬ−４Ｂ（ファルマシア  バイオテク製）を用いて調製した特異的抗組換えＭａｇ３抗体固定化セファローズＣＬ−４Ｂカラムにかける。ついで、４℃で１晩還流する。このアフィニティカラムをＰＢＳで充分に洗った後、１５０ｍＭのＮａＣｌを含む０．２Ｍグリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ２．２５）で特異的抗組換えＭａｇ３抗体に結合しているポリペプチドを溶出させる。透析後凍結乾燥して、本発明の精製ダニアレルゲン約２００μｇを得る。
【００１７】
本発明の精製ダニアレルゲンの性質
▲１▼  本発明の精製ダニアレルゲンは、還元または非還元条件下におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、約１７７ｋＤの見かけの分子量の位置に泳動する（図２、レーン２および４）。これは組換えＭａｇ３の約４倍の高分子量である。
【００１８】
▲２▼  組織化学的研究によれば、ウサギ抗組換えＭａｇ３抗体はダニの食道、胃、およびその他の内臓器官の周辺組織に結合することが、ペロオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギ抗体を用いて確認された（図４）。一方、ウサギの正常な血清についてはこのような結合は観察されなかった。この事実より、本発明の精製ダニアレルゲンはダニ虫体の成分であると結論できる。
【００１９】
▲３▼  本発明の精製ダニアレルゲンに対して特異的なヒトＩｇＥレベルをダニアレルギー患者血清（２３例）および健常人血清（４例）についてＥＬＩＳＡ法により調べ、ダニ虫体抽出物およびDer f 2 と比較したところ、ヒトＩｇＥへの結合頻度および結合能は組換えＭａｇ３よりも高く（図５）、Der f 2 と同等である（表１）。
【００２０】
▲４▼  本発明の精製ダニアレルゲンは、組換えＭａｇ３と交差反応をする。抗組換えＭａｇ３抗体と本発明の精製ダニアレルゲンとの結合は、精製組換えＭａｇ３により完全に阻害される（図３）。従って、本発明の精製ダニアレルゲンは精製組換えＭａｇ３と共通のエピトープを有する。
さらに、本発明の精製ダニアレルゲンと組換えＭａｇ３の両方に陽性である患者から調製したヒト血清プールに対する結合の阻害をＥＬＩＳＡ阻害法により測定した。本発明の精製ダニアレルゲンに対するヒト血清（ヒトＩｇＥ抗体）の結合は本発明の精製ダニアレルゲンにより完全に阻止されたが、組換えＭａｇ３によっては僅か３０％しか阻害されなかった（図６の（Ｂ））。この事実は、本発明の精製ダニアレルゲンが組換えＭａｇ３とは別のエピトープをも持つことを示唆する。
【００２１】
▲５▼  高分子量アレルゲンとしては、２７４ｋＤの見かけの分子量を示すＤｐｔ４が既に報告されている（Stewart G.A. and Turner K.J., Aust. J. Exp. Biol. Med. Sci. 58, 259-274 ,275-288 (1980))。このタンパク質はスーダンブラックＢによって染色されるリポプロテインである（Stewart G.A., Bucher A. and Turner K.J., Int. Arch. Allergy Appl. Immunol., 71, 340-345 (1983)) 。また、類似の分子量を持つ抗原として、１７４ｋＤ（Stewart G.A. and Turner K.J., Aust. J. Exp. Biol. Med. Sci. 58, 259-274 (1980)）および１７０ｋＤ（Abe T. and Ishii A., Mol. Immunol., 19, 339-346 (1982)) が報告されている。しかし、本発明の精製ダニアレルゲンは、スーダンブラックＢによって染色されないことから２７４ｋＤの見かけの分子量を示すＤｐｔ４とは明らかに異なっている。また、過ヨーソ酸塩−シッフ試薬によるＰＡＳ染色によりグリコシド鎖が検出されないことおよび還元状態および非還元状態におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥの挙動に見られるように、本発明の１７７ｋＤはサブユニット構造をとらないが、１７４ｋＤあるいは１７０ｋＤはサブユニット構造をとることから、１７４ｋＤあるいは１７０ｋＤの抗原とも明確に区別できる。
【００２２】
▲６▼  本発明の精製ダニアレルゲンは、イムノブロット法で調べたところ、ウサギ抗Der f 1 および抗Der f 2 とは反応しない。
以上の性質は、本発明の精製ダニアレルゲンが既に知られている高分子量のアレルゲンおよび主要アレルゲンとは全く異なる抗原であることを示すものである。
【００２３】
本発明のダニアレルギー疾患治療剤は前記の精製されたダニアレルゲンを有効成分とするものであり、各種のダニアレルギー疾患の治療剤として用いられる。ここでダニアレルギー疾患とは、アトピー性気管支喘息、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、アトピー性皮膚炎等、ダニの特異抗原が原因となるあらゆるアレルギー疾患をいう。
【００２４】
本発明のダニアレルギー疾患治療剤の調製方法は、特に制限はないが、例えば、前記の方法により精製されたダニアレルゲンを乾燥して粉末状で採取し、ダニアレルギー疾患に対する減感作治療剤として用いられる。本発明のダニアレルギー疾患治療剤は、減感作治療剤として用いられる場合、そのままで、または必要に応じて一般的に用いられるアジュバントや各種の添加剤、例えば安定剤、賦形剤、溶解補助剤、乳濁化剤、緩衝剤、無痛化剤、保存剤、着色剤等を常法により添加した配合剤として用いることができる。例えば、粉末状の精製された組換えダニアレルゲンをフェノールを添加した生理食塩水に溶解し、減感作治療用抗原の原液として用いる。
【００２５】
本発明のダニアレルギー疾患治療剤は、通常の投与経路例えば経皮、経口、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内等の投与方法により行なうことができる。更に、例えば、トローチ、舌下錠、点眼剤、鼻腔内噴霧剤、パップ剤、クリーム剤、ローション剤等の経皮、経粘膜薬としても使用することができる。また、本発明のダニアレルギー疾患治療剤の投与量及び投与回数は、投与経路、症状などに応じて成人１回あたり約20μｇ以下の範囲となるように適宜選択し、毎週１回程度投与される。
【００２６】
また、本発明のダニアレルギー疾患治療剤は、ダニアレルギー疾患に対する治療剤のみならず予防剤としても有用である。また、アナフィラキシー誘発作用もなく、人体に対して安全に用いることができる。
【００２７】
本発明のダニアレルギー疾患診断薬は、ダニアレルギー疾患に対する皮内反応診断試薬及びダニアレルギー診断用滴定試薬として用いられる。
皮内反応診断試薬として用いる場合は、前記の方法により精製されたダニアレルゲンを常法により調製して得るが、例えば精製ダニアレルゲンを乾燥して粉末状とし、これをフェノールを含む生理食塩水で溶解し、希釈して用いる。皮内反応診断試薬として用いる方法は、常法に従って用いられる。
【００２８】
また、ダニアレルギー診断用滴定試薬として用いる場合も同様に常法により調製されるが、例えば、精製ダニアレルゲンをハンクス緩衝液で適当に溶解し、希釈してヒスタミン遊離滴定用試薬として用いる。この方法は通常、以下の操作手順によりなされる。即ち、ダニアレルギー疾患患者の血液及びこの血液から遠心分離により得られた血球画分を緩衝液に懸濁した血球浮遊液の一定量を、精製ダニアレルゲンを滴定試薬として用いて滴定し、アレルゲン刺激により好塩基球（白血球の一種）から遊離するヒスタミン量をHPLCを用いて測定する（アレルギー，37, 725(1988) ）。
【００２９】
このヒスタミン遊離滴定では、最大遊離量の50％量（滴定曲線の変曲点）から遊離されるヒスタミン量を求める。この滴定では、（１）血球浮遊液の滴定値から患者のアレルゲン感受性を直接測定することになる。（２）血漿と組換えダニアレルゲンとを予め反応させた後、その液で血球浮遊液を滴定して得られる値（血液滴定曲線値）は、通常、組換えダニアレルゲンで血球浮遊液を滴定して得られる値（血球浮遊液滴定曲線値）より高い値が得られる。これは、血漿中にアレルゲン中和能を持つIgG 抗体（遮断抗体）が存在するためである。
従って、対血液滴定曲線の、対血球浮遊液滴定曲線からのシフトの大きさから、遮断抗体価が得られる。アレルゲン感受性とこの遮断抗体価から、ダニアレルギーの正確な診断が可能となる。また、このヒスタミン遊離滴定試験は減感作治療効果のモニターとしても有用である。
【００３０】
【実施例】
以下に、実施例、参考例をあげて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれら実施例等に限定されるものではない。
尚、各実施例において使用した試薬はナカライテスク、片山化学工業、和光純薬などから購入した市販のものを使用した。また、制限酵素などの遺伝子工学用試薬は宝酒造などから購入したものを使用した。また、ウサギ抗Der f 1 および抗Der f 2 血清は、国立相模原病院の安枝浩博士から恵与された。ヒト血清は県立広島病院から恵与された。ダニアレルギー患者血清はダニ抽出物および屋内塵ダニ抽出物に対する皮内反応陽性（平均直径２０ｍｍ以上の紅斑）を示す２３人の喘息患者から採取した。対照の血清は、両抽出物に対し皮内反応陰性の健常人４人から採取した。
【００３１】
参考例１
生ダニ虫体からpoly(A)mＲＮＡ画分の分離：
常法によりコナヒョウヒダニを飼育して得られる生ダニ虫体６g を200 ｍｌの5.5 Ｍイソチアン酸グアニジン (片山化学工業製) 液中で石英砂10ｇとともに乳鉢中ですりつぶし遠心分離(9000rpm、 10分間、４℃）し、その上清を、18Ｇの注射針をつけた50ｍｌ容のシリンジで吸入、射出を繰り返すことにより、ＤＮＡを部分切断した。再度遠心分離した上清を、17ｍｌのトリフルオロ酢酸セシウム溶液 (片山化学工業製) に対して16ｍｌの割合で重層し、85,000×ｇで24時間 (15℃, HITACHI SCP55H swing PRS-27-2)密度勾配遠心分離を行い、管底にペレットを形成する全ＲＮＡ画分を回収した。
次に、Fast Track mRNA isolation kit(インビトロゲン製）を用いて、得られた全ＲＮＡ画分からpoly(A)mＲＮＡ画分を回収した。濃度既知のＲＮＡ溶液希釈系列とともにスポットテストを行なって収量を測定したところ、約２０μｇであった。
【００３２】
参考例２
ダニアレルゲンｃＤＮＡの合成：
次に、このpoly(A)mＲＮＡのうち５μｇを鋳型とし、ｃＤＮＡ合成キット（ファルマシア  バイオテク製) を用いてそのマニュアルに従ってｃＤＮＡを合成し、その両端にNot I 部位を含んだ１３mer のEcoRI リンカーを接続した。
【００３３】
参考例３
ダニアレルゲンｃＤＮＡライブラリーの作製：
このｃＤＮＡのうちの１／１０量を、１μｇのEcoRI 消化λgtll (ストラタジーン製）と混合し、これをエタノールで濃縮した後２００ unitsのT4  ＤＮＡ ligase を加えて12℃で15時間反応させることにより、ｃＤＮＡをλgtllのEcoRI 部位に挿入した。この反応液から、in vitroパッケージングキット (Gigapack PLUS,ストラタジーン製) を用いてそのマニュアルにしたがって、ｃＤＮＡライブラリーを作製した。このライブラリー作製操作を７度行い、最終的に６．６μｇのpoly(A)mＲＮＡから合計１３６，０００ pfu(plaque forming unit) のｃＤＮＡライブラリーを得た。
【００３４】
参考例４
ダニアレルゲンｃＤＮＡのクローニング：
参考例３で得られたｃＤＮＡライブラリーの１００，０００個の組換え体について、ウサギ抗Der f 2 血清を用いてスクリーニングを行った。本参考例で行った免疫スクリーニングの詳しいプロトコールを以下に記載する。
このｃＤＮＡの挿入されたλgtllファージを懸濁したSM (１M Tris-HCl, pH7.5, 0.1M NaCl, 10mM MgSO4, ２％ gelatin) 液と一晩培養した大腸菌Y1090 （ストラタジーン製）とを37℃で30分間振盪培養することにより、宿主にファージを感染させ、これをLB寒天培地 (１％ Bacto tryptone, 0.5％ Bacto yeast extract, 1.5 ％ Bacto agar (Difco社製), 0.5％ NaCl ，ｐＨ７．６）上に、１プレート当り約2,000 個のプラークを形成するように撒いた。42℃で３時間培養後、予め10mMイソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド（IPTG) を浸漬させて乾燥したニトロセルロースメンブレン (Hibond−C,アマシャム製) で培地表面を覆い、さらに37℃で３時間培養して誘導合成されるβ−ガラクトシダーゼ融合蛋白を転写した。
【００３５】
このニトロセルロースメンブレンを２％BSA を含むTBS (10 mM  Tris−HCl, pH 8.0, 0.9％  NaCl) 溶液中で一晩ブロッキングした後、ウサギ抗Der f 2 血清(1000 倍TBS 希釈) 、さらにペロオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギIgG 抗体 (カッペル製, 4000倍TBS 希釈) とそれぞれ１時間ずつ反応させ、発色は0.01％過酸化水素の存在下、0.6 ｍｇ／ｍｌのジアミノベンジジン四塩酸塩 0.3％ NiCl2を含むTBS 溶液中で行なった。黒色を呈したシグナルの位置と合致するプラークをピックアップしてSMに懸濁し、陽性クローンとして保存した。この陽性クローンの中から１株ｍａｇ３を選び以下の実験に使用した。
【００３６】
参考例５
ｍａｇ３の挿入されたλgtllファージＤＮＡの調製：
大腸菌 Y1090の一晩培養物２００μｌおよびｍａｇ３の挿入されたλgtllファージ溶解液（１０5 〜１０7 pfu)１００μｌを３７℃で１５分間インキュベートした。５ｍｌのＬＢ培養液を加えて振盪しながら３７℃で６〜８時間インキュベートした後、４℃、１２，０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離を行なった。
ＤＮａｓｅＩとＲＮａｓｅＡを最終濃度が１μｇ／ｍｌとなるように加えて３７℃で３０分間インキュベートした。等量の２０％ＰＥＧ  ６０００／２Ｍ  ＮａＣｌを加えて４℃で一晩冷却した後、４℃、１２，０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離を行なった。
【００３７】
３５０μｌのＴＥ（１０ｍＭトリス塩酸バッファー（ｐＨ７．５）および１ｍＭのＥＤＴＡ含有）に溶解し、プロティナーゼＫ、ＳＤＳおよびＥＤＴＡを各々の最終濃度が５０μｇ／ｍｌ、０．５％および１２．５ｍＭとなるように加えて５５℃で１５分間インキュベートした後、フェノール／クロロホルム溶液にて抽出し、エタノールで沈澱させた。次いでＴＥに溶解して、ｍａｇ３の挿入されたλgtllファージＤＮＡ溶液を調製した。
【００３８】
参考例６
組換えプラスミドの構築：
Ｍａｇ３・β−ガラクトシダーゼ融合蛋白をコードするｃＤＮＡの挿入されたλgtllファージ・クローンから、そのｃＤＮＡを回収した後Kpn I −Sac I 消化し、その断片（約３．２ｋｂｐ）をプラスミドベクターｐＧＥＸ（ファルマシアバイオテク製）のKpn I −Sac I 部位に連結し、Ｈａｎａｈａｎの方法（ＤＮＡクローニング、ｖｏｌ．１、ｐｐ．１０９−１３６、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９８５））に従って、大腸菌ＪＭ１０９に形質転換した。
【００３９】
参考例７
精製組換えダニアレルゲンＭａｇ３の調製：
形質転換体を２×ＹＴ培地２リットル中で、ＯＤ660 が０．６になるまで３７℃において培養した。ついで、ＩＰＴＧで３時間誘導させた後、細胞を５ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％の２−メルカプトエタノールおよび１％のトリトンＸ−１００を含む５０ｍＭのトリス−塩酸（ｐＨ７．６）中で徹底的に超音波処理をして、融合タンパク質（ＧＳＴ−Ｍａｇ３）を細胞内の封入体として回収した。この封入体をサンプル緩衝液に溶解し、調製用ディスクゲル電気泳動にかけた。電気泳動上で単離された融合タンパク質を５０ｍＭのトリス−塩酸（ｐＨ８．０）中でヒトトロンビン（Sigma 社製）で処理して切断した（Smith D.B. and Johnson K.S., Gene 67,31-40,1988 、Frangioni J.V. and Neel B.G.,Anal. Biochem., 210,179-187,1993)。同様に調製用ディスクゲル電気泳動により消化物から組換えＭａｇ３を精製し、水に対し透析後、凍結乾燥して−８０℃で貯蔵した。
【００４０】
得られた組換えダニアレルゲンＭａｇ３の塩基配列は、オートリードシークエンシングキットおよびＡ．Ｌ．Ｆ．ＤＮＡシークエンサー（ファルマシア社製）を用い、ジデオキシヌクレオチド  チェイン  ターミネーション法により、配列番号：１のように決定した。この塩基配列データは、受託番号Ｄ−１７６８６の基にＤＤＢＪ：ＥＭＢＬ：およびＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａｂａｓｅｓに搭載される。
【００４１】
参考例８
特異的抗組換えＭａｇ３抗体の調製：
日本白ウサギに、組換えＭａｇ３の１００ｍｇをフロイントの完全アジュバントに混ぜ、２週間ごとに４回筋肉内注射した後採血した。
上記のようにして調製したウサギの血清（３０ｍｌ）を、０．５％トリトンＸ−１００を含む２０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳＴ）で１０倍に希釈し、ＣＮＢｒ−活性化セファローズＣＬ−４Ｂ（ファルマシア  バイオテク製）を用いて調製した組換えＭａｇ３固定化セファローズ（５ｍｌ湿容量）カラムにかけ、４℃で１晩還流した。このアフィニティカラムをＰＢＳで充分に洗い、ついで１５０ｍＭのＮａＣｌを含む０．２Ｍグリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ２．２５）で特異的抗組換えＭａｇ３抗体を溶出させた。溶出液を直ちに１．０Ｍ−トリス−塩酸（ｐＨ８．０）で中和し、使用するまで−８０℃に貯蔵した。
【００４２】
実施例１
ダニ虫体抽出物（Ｄｆｂ）の調製
ラット、マウス、ハムスター用飼料Ｍ（オリエンタル酵母社製）中で、温度２６±２℃、湿度７５％ＲＨの環境で、ダニ密度が２〜３万匹／ｇ培地程度になるようにコナヒョウヒダニを飼育したものをダニ培養物とした。これを凍結殺ダニとし、その１２．２ｋｇに質量換算で１０倍量の飽和食塩水を加え、穏やかによく攪拌した。４℃、１時間静置後、４℃、３０００ｒｐｍ、３０分間遠心分離を行い、ダニ虫体を上清表面に浮遊させ、吸引濾過により回収した。次に、得られたダニ虫体１．７ｋｇに重量にして半量のＰＢＳを加え、乳鉢でよくすりつぶし、この磨砕物にさらに最終濃度で２倍量になるようにＰＢＳを加え、ときどき攪拌しながら１時間抽出した。この懸濁液を４℃、８０００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、その上清をイオン交換水に対して透析した後、不溶物を除くため、さらに４℃、８０００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、上清を凍結乾燥することによりダニ虫体粗抗原（Ｄｆｂ）１９．６ｇを得た。
【００４３】
実施例２
本発明の精製ダニアレルゲンの製造：
プロテアーゼインヒビターを含むＰＢＳＴに２００ｍｇのダニ虫体抽出物を溶解し、ＣＮＢｒ−活性化セファローズＣＬ−４Ｂ（ファルマシア  バイオテク製）を用いて調製した特異的抗組換えＭａｇ３抗体固定化セファローズＣＬ−４Ｂカラムにかけた。ついで、４℃で１晩還流した。このアフィニティカラムをＰＢＳで充分に洗った後、１５０ｍＭ−ＮａＣｌを含む０．２Ｍ−グリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ２．２５）で特異的抗組換えＭａｇ３抗体に結合しているポリペプチドを溶出させた。透析後凍結乾燥して、本発明の精製ダニアレルゲン約２００μｇを得た。
【００４４】
実施例３
本発明の精製ダニアレルゲンの見掛けの分子量：
Ｌａｅｍｍｌｉの方法（Laemmli U.K., Nature 227, 680-685 (1970)) に従って、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。分離されたタンパク質を、セミドライブロッティング装置を用いてイムモビロン−Ｐ膜（ミリポア社製）にゲルからイムノブロットした(Tovey E.R. and Baldo B.A., J. Allergy Clin. Immunol. 79, 93-102
(1987))。その結果を図１〜３に示す。
【００４５】
２−メルカプトエタノール（最終濃度１％）の存在下で変性させたタンパク質を１２．５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離し、クマジーブリリアントブルーＲ−２５０で染色した。その結果を図１に示す。
分子量は左側にキロダルトンで表してある。ＬＭＷは低分子量マーカーを、レーン１は大腸菌ＪＭ１０９形質転換体（培養１００μｌ相当）の全細胞溶解物を、レーン２は精製ＧＳＴ−Ｍａｇ３（２μｇ）を、レーン３はトロンビン（２μｇ）消化物を、レーン４は精製組換えＭａｇ３（２μｇ）をそれぞれ表す。
【００４６】
図２において、レーン１およびレーン２は２−メルカプトエタノール（最終濃度１％）の存在下で変性させたタンパク質を、レーン３およびレーン４は２−メルカプトエタノールの非存在下に変性させたタンパク質を、７．５％ゲル上で分離させ、続いてクマジーブリリアントブルーＲ−２５０で染色したものを表す。ＨＭＷは高分子量マーカーを表し、レーン１とレーン３はＤｆｂ（１００μｇ）を、またレーン２とレーン４は本発明の精製ダニアレルゲン（１０μｇ）を泳動させたものである。
この図から明らかなように、本発明の精製ダニアレルゲンは還元または非還元条件下において見掛けの分子量１７７ｋＤの位置に泳動し、精製組換えＭａｇ３の約４倍の高分子量を示した。
【００４７】
図３において、タンパク質を還元条件下において７．５％ゲル上で分離し、続いてイムノブロッティングに付したものである。膜を抗組換えＭａｇ３抗体（左側）または予め過剰の精製組換えＭａｇ３（０．１μｇ）で前処理された抗組換えＭａｇ３抗体（右側）をプローブとして処理した。レーン１、レーン２およびレーン３はそれぞれＤｆｂ（１００μｇ）、本発明の精製ダニアレルゲン（２μｇ）、および組換えＭａｇ３（０．１μｇ）を泳動させたものである。
図３から、本発明の精製ダニアレルゲンと抗組換えＭａｇ３抗体との結合は精製組換えＭａｇ３によって完全に阻害されたことが分かる。この結果は本発明の精製ダニアレルゲンが組換えＭａｇ３と共通のエピトープを持つことを示す。
【００４８】
実施例４
本発明の精製ダニアレルゲンのダニ虫体内分布：
ダニ生虫体を４℃において１０ｍＭＮａＩＯ4 ：７５ｍＭリジン、および２％パラホルムアルデヒドを含む３７．５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．２）中で一晩固定した。固定化ダニをまずエタノールで脱水処理を行い、つぎにキシレン濃度を増加させながら脱アルコール処理を行い、ついでパラフィン中に包埋した。超薄切片をシラン処理したオブジェクトグラスに付着させ、脱パラフィン処理後染色した。メタノール中の５％Ｈ2 Ｏ2 とインキュベートすることにより内在性ペロオキシダーゼを失活させた。１０％ヤギ正常血清（Dako A/S, Denmark)を含むＰＢＳＴでブロックした後、この切片を精製ウサギ抗Ｍａｇ３抗体に浸漬した。ダニ組織中の特異的な抗体結合部位の検出にはペロオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギイムノグロブリン（Cappel) および３，３’−ジアミノベンジディンを使用した。こうして調製したプレパラートをハンドスタンド型光学顕微鏡（ＩＭＴ−２，オリンパス光学）で観察した。
【００４９】
ダニの表皮層に切片の収縮が観察されたが、内部構造は良く保存されていた。抗組換えＭａｇ３抗体は、食道、胃、およびその他の内部器官の周辺組織に結合した（図４）。このような結合はウサギ正常血清では観察されなかった。この結果は、本発明の精製ダニアレルゲンがダニ虫体の成分であることの直接的証明である。図中のＥｓは食道（esphagus）、Ｃｈは鋏角幹（cheliceral shaft）、Ｂｒは脳（Brain)、ＡＭｇは腹側中腸（anterior midgut)、ＰＭｇは背側中腸（posterior midgut）、Ｃｓはダニ体表面小皮（cuticular layer of mite body surface）を示す。
【００５０】
実施例５
本発明の精製ダニアレルゲンとダニアレルギー患者血清中の特異的ＩｇＥとの結合：
組換えＭａｇ３、本発明の精製ダニアレルゲン、Ｄｆｂ、および Der f 2に対する特異的ＩｇＥ抗体のレベルをＥＬＩＳＡ法によって測定した（Aki T. et  al.,Int. Arch. Allergy Immunol.103, 357-364 (1994))  。
【００５１】
すなわち、ＥＬＩＳＡプレート（Falcon 3912, Becton Dickinson)を組換えＭａｇ３（０．５μｇ）、本発明の精製ダニアレルゲン（１．８μｇ）、Ｄｆｂ（１０μｇ）、またはDer f 2 （０．２μｇ）でコートし、ついで３％デキストランを含むＰＢＳＴでブロックした。ダニアレルギー患者血清をこのプレートに注ぎ、結合したＩｇＥ抗体を、アフィニティ−精製ビオチン結合ヤギ抗ヒトＩｇＥ抗体（Kirkegaard and Perry) 、アフィニティ−精製ペロオキシダーゼ結合ストレプトアビジン（Tago Inc.)そして２，２’−アジノビス（３−エチルベンゾ−チアゾリン−６−スルフェート）とＨ2 Ｏ2 を含む１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ４．２）と順次インキュベートすることにより検出した。検出は、４１５ｎｍの吸光度の測定により行った。
【００５２】
同時に、ＥＬＩＳＡプレートをヒツジ抗ヒトＩｇＥ抗体でコートした。ついで、ブロッキングした後、一連の希釈ヒトＩｇＥ（ヤマサ醤油製）とインキュベートし、結合ＩｇＥ抗体を上記の方法により測定した。ダニアレルギー患者血清中における特異的ＩｇＥ抗体のレベルは使用した標準ＩｇＥの量として表した。
これらの実験の結果を図５に示す。黒丸および薄い破線はそれぞれ個々のダニアレルギー患者の特異的ＩｇＥレベル（２３例）およびカットオフ値を示す。
図５から、本発明の精製ダニアレルゲンと組換えＭａｇ３に対する特異的ＩｇＥレベル間に有意の相関があることが分かる。相関係数は０．６４と計算された。両抗原に有意に応答した患者のスポットはすべて太い破線よりも上に分布した。
【００５３】
また、本発明の精製ダニアレルゲンと組換えＭａｇ３に対する特異的ＩｇＥレベルをダニアレルギー患者血清（２３例；No.1〜23）および健常人血清（４例；No.24 〜27）についてＥＬＩＳＡ法で測定し、ダニ虫体抽出液およびDer f 2 に対する特異的ＩｇＥレベルと比較した。その結果を表１に示す。
【００５４】
【表１】
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【００５５】
表１から、ダニアレルギー患者血清中のＩｇＥ結合容量は患者毎に大きく変動することが分かる。有意の応答をカットオフ値以上とみなすと、ＩｇＥ結合の頻度は、本発明の精製ダニアレルゲンに対して７０％（１６／２３）、組換えＭａｇ３に対して３９％（９／２３）であり、本発明の精製ダニアレルゲンはDer f 2 の５７％（１３／２３）とほぼ同等であった。さらに、本発明の精製ダニアレルゲンに対する特異的ＩｇＥのレベルは、Der f 2 に対するＩｇＥレベルと同等であった。
【００５６】
実施例６
本発明の精製ダニアレルゲンと組換えＭａｇ３との交差反応（ＥＬＩＳＡ阻害）：
ＥＬＩＳＡプレートを本発明の精製ダニアレルゲン（１０ｐｍｏｌ）でコートした。ＰＢＳＴ中の３％デキストリンでブロックした後、一連の希釈の組換えＭａｇ３（−○−）、本発明の精製ダニアレルゲン（−●−）、または杉花粉（cedar pollen) （−■−）と共に、ウサギ抗Ｍａｇ３抗体（Ａ）またはダニアレルギー患者血清（ヒトＩｇＥ抗体）（Ｂ）を３７℃で３０分間プリインキュベートした。初期濃度はそれぞれ５００ｐｍｏｌ、５００ｐｍｏｌ、および５０μｇであった。処理後の血清をブロックしたウエル中でインキュベートした。結合した抗体を上と同様な操作により検出した。検出は、４１５ｎｍの吸光度の測定で行った。
【００５７】
この実験の結果を図６に示す。本発明の精製ダニアレルゲンとヒトＩｇＥ抗体の反応は本発明の精製ダニアレルゲンにより完全に阻害されたが、組換えＭａｇ３とヒトＩｇＥ抗体との反応は僅か３０％しか阻害されなかった。本発明の精製ダニアレルゲンとウサギ抗Ｍａｇ３抗体との反応も本発明の精製ダニアレルゲンおよび組換えＭａｇ３の両方で阻害された。これらの結果は、本発明の精製ダニアレルゲンが分子中に組換えＭａｇ３のエピトープと異なる他のエピトープを有することを示す。
【００５８】
実施例７
本発明の精製ダニアレルゲンと anti-Der f 1 および anti-Der f 2 とのイムノブロッティング
精製ダニアレルゲン１０μｇを蒸留水に溶解したものに、最終濃度６２．５ｍＭのトリス−塩酸（ｐＨ６．８）、２％ＳＤＳ、２％メルカプトエタノールを加えて、１００℃、３分間加熱処理した後、７５％アクリルアミドゲルを用いたスラブゲル電気泳動を行った。
ウエスタンブロットは、セミドライブロッティング装置（ATTO社製）を用いてImmobilon-P TM（ミリポア社製）に転写し、以下のプロトコールに従い免疫染色した。
得られた転写膜をＴＢＳＴを用いて１０分間３回洗浄した後、３％デキストランを含むＴＢＳＴと共に室温で１時間以上インキュベートした。これを、大腸菌ライセートで前処理した希釈第一抗体と共にインキュベートした後、ＴＢＳで１０分間、３回洗浄してから希釈第二抗体と共に１時間インキュベートし、次いでＴＢＳで１０分間３回洗浄した。
次に、０．６ｍｇ／ｍｌの３，３’−ジアミノベンジディンテトラヒドロクロリド、０．３％塩化ニッケルおよび０．１％の過酸化水素を含有するＴＢＳ中で酵素反応を行ったが、発色は認められなかった。
【００５９】
実施例８
本発明の精製ダニアレルゲンのスーダンブラックＢによる染色：
上記のようにして得られた転写膜（精製ダニアレルゲン５０μｇに相当）を、スーダンブラックＢ試薬（Methods in Immunology and Immunochemistry, 294-321(1971), Academic Press) を用いて、１５分間染色した。しかし、呈色は認められなかった。
【００６０】
実施例９
本発明の精製ダニアレルゲンのパス染色：
実施例７のようにして得られた転写膜（精製ダニアレルゲン５０μｇに相当）を、１２．５％トリクロロ酢酸溶液に３０分間浸し、１５秒間蒸留水でリンスした。次に、３％酢酸中の１％過ヨウ素酸に浸漬した後、蒸留水で１０分間８回繰り返し洗浄した。暗所で５０分間シッフ試薬に浸漬した。０．５％重亜硫酸テトリウム溶液で３分間洗浄を１０回行った後、蒸留水で洗浄した。しかし、呈色は認められなかった。
【００６１】
実施例１０
本発明の精製ダニアレルゲンの皮内反応試験
本発明の精製ダニアレルゲンのサンプルを０．９％塩化ナトリウム、０．５％フェノール溶液に溶解し、ツベルクリン用注射器で、２０μｌをダニアレルギー患者の前腕、屈側皮内に注射し、約１５分後に現れた紅斑、膨疹の長径、短径を測定し、その平均値で検定を行った。
その結果、被検者１２名のダニアレルギー患者の全員に２０ｍｍ以上の紅斑が認められ、健常人の１０ｍｍと比べて陽性と判断された。
【００６２】
【発明の効果】
本発明により、新規な高分子量の精製ダニアレルゲンを提供することができる。また、この精製ダニアレルゲンを有効成分とするダニアレルギー疾患の治療剤、診断薬を提供することが可能となった。
【００６３】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、精製組換えＭａｇ３、ＧＳＴ−Ｍａｇ３およびそのトロンビン処理物、形質転換体の溶菌液についての還元条件下でのポリアクリルアミドゲル電気泳動を示す写真である。
【図２】  図２は、本発明の精製ダニアレルゲンを還元条件下または非還元条件下において７．５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動した後、クマジーブリリアントブルーＲ−２５０で染色した電気泳動を示す写真である。
【図３】  図３は、本発明の精製ダニアレルゲン、精製組換えＭａｇ３およびダニ虫体抽出物を還元条件下において７．５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動した後、イムノブロッティングに付した電気泳動を示す写真である。
【図４】  図４は、コナヒョウヒダニの免疫組織化学的染色を行った結果得られた顕微鏡写真である。
【図５】図５は本発明の精製ダニアレルゲンと組換えＭａｇ３に対する特異的ＩｇＥレベル間の相関を示す図である。
【図６】図６は、本発明の精製ダニアレルゲンと組換えＭａｇ３との交差反応を示す結果である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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