(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
次式を有する化合物およびその薬学的に許容される塩：
Ａ．
【化１】
0003844277.tif 000026
式中、
Ｒ1はイソプロピル、ｔ−ブチル、Ｂｒ、ＯＨまたはメチルであり、
Ｒ2はＯＨであり、
Ｒ3は２−プロピル、ｔ−ブチル、ＯＨ、Ｈまたはメチルであり、そして
Ｒ4は（Ｅ）１−シアノ−２−［（３，５−ジイソプロピル−４−ヒドロキシ）フェニル］エテニル−スルホニル、シアノメチルスルホニル、（３−アミノ−４−シアノ）ピラゾ−５−イル、（１−フェニル）−ｎ−プロピルアミノチオカルボニル、（Ｅ）［［［４−［１−シアノ−２−（３，４−ジヒドロキシ）フェニル］エテニル］カルボニルアミノ］−ｎ−ブチル］アミノカルボニル、［２−［２−シアノ−２−（３，４−ジヒドロキシフェニルカルボニル）エテニル］スルホニル］またはヒドロキシカルボニルである。
【請求項２】
有効量の下記式：
Ａ．
【化２】
0003844277.tif 000027
式中、
Ｒ1はイソプロピル、ｔ−ブチル、Ｉ、Ｂｒ、ＯＨまたはメチルであり、
Ｒ2はＯＨであり、
Ｒ3は２−プロピル、ｔ−ブチル、ＯＨ、Ｈまたはメチルであり、そして
Ｒ4は（１−フェニル）−ｎ−プロピルアミノカルボニル、（Ｅ）１−シアノ−２−［（３，５−ジイソプロピル−４−ヒドロキシ）フェニル］エテニル−スルホニル、シアノメチルスルホニル、（３−アミノ−４−シアノ）ピラゾ−５−イル、フェニル−ｎ−プロピルアミノカルボニル、（Ｅ）１−シアノ−２−［（５−ブロモ−３，４−ジヒドロキシ）フェニル］エテニルスルホニル、（１−フェニル）−ｎ−プロピルアミノチオカルボニル、シアノ、（Ｅ）［［［４−［１−シアノ−２−（３，４−ジヒドロキシ）フェニル］エテニル］カルボニルアミノ］−ｎ−ブチル］アミノカルボニル、ベンジルアミノカルボニル、［２−［２−シアノ−２−（３，４−ジヒドロキシフェニルカルボニル）エテニル］スルホニル］、［（３，４−ジヒドロキシ）フェニル］カルボニル、（Ｅ）［［［４−［１−シアノ−２−（３，４−ジヒドロキシ）フェニル］エテニル］カルボニルアミノ］エチル］アミノカルボニルまたはヒドロキシカルボニルである；
を有する化合物またはその薬学的に許容される塩を含んでなる、血管形成および／または脈管形成をモジュレートするための医薬組成物。
【請求項３】
有効量の下記式：
Ａ．
【化３】
0003844277.tif 000028
式中、
Ｒ1はイソプロピル、ｔ−ブチル、Ｉ、Ｂｒ、ＯＨまたはメチルであり、
Ｒ2はＯＨであり、
Ｒ3は２−プロピル、ｔ−ブチル、ＯＨ、Ｈまたはメチルであり、そして
Ｒ4は（１−フェニル）−ｎ−プロピルアミノカルボニル、（Ｅ）１−シアノ−２−［（３，５−ジイソプロピル−４−ヒドロキシ）フェニル］エテニル−スルホニル、シアノメチルスルホニル、（３−アミノ−４−シアノ）ピラゾ−５−イル、フェニル−ｎ−プロピルアミノカルボニル、（Ｅ）１−シアノ−２−［（５−ブロモ−３，４−ジヒドロキシ）フェニル］エテニルスルホニル、（１−フェニル）−ｎ−プロピルアミノチオカルボニル、シアノ、（Ｅ）［［［４−［１−シアノ−２−（３，４−ジヒドロキシ）フェニル］エテニル］カルボニルアミノ］−ｎ−ブチル］アミノカルボニル、ベンジルアミノカルボニル、［２−［２−シアノ−２−（３，４−ジヒドロキシフェニルカルボニル）エテニル］スルホニル］、［（３，４−ジヒドロキシ）フェニル］カルボニル、（Ｅ）［［［４−［１−シアノ−２−（３，４−ジヒドロキシ）フェニル］エテニル］カルボニルアミノ］エチル］アミノカルボニルまたはヒドロキシカルボニルである；
を有する化合物またはその薬学的に許容される塩を含んでなる、血管形成および／または脈管形成に関連した疾患を治療するための医薬組成物。
【請求項４】
前記の疾患が糖尿病、糖尿病性網膜症、血管腫、グリオーム（神経膠腫）、メラノーマ（黒色腫）、カポジ肉腫、および卵巣、乳房、肺、膵臓、前立腺、結腸および類表皮のがんより成る群から選ばれる、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
有効量の下記式：
Ａ．
【化４】
0003844277.tif 000029
式中、
Ｒ1はイソプロピル、ｔ−ブチル、Ｉ、Ｂｒ、ＯＨまたはメチルであり、
Ｒ2はＯＨであり、
Ｒ3は２−プロピル、ｔ−ブチル、ＯＨ、Ｈまたはメチルであり、そして
Ｒ4は（１−フェニル）−ｎ−プロピルアミノカルボニル、（Ｅ）１−シアノ−２−［（３，５−ジイソプロピル−４−ヒドロキシ）フェニル］エテニル−スルホニル、シアノメチルスルホニル、（３−アミノ−４−シアノ）ピラゾ−５−イル、フェニル−ｎ−プロピルアミノカルボニル、（Ｅ）１−シアノ−２−［（５−ブロモ−３，４−ジヒドロキシ）フェニル］エテニルスルホニル、（１−フェニル）−ｎ−プロピルアミノチオカルボニル、シアノ、（Ｅ）［［［４−［１−シアノ−２−（３，４−ジヒドロキシ）フェニル］エテニル］カルボニルアミノ］−ｎ−ブチル］アミノカルボニル、ベンジルアミノカルボニル、［２−［２−シアノ−２−（３，４−ジヒドロキシフェニルカルボニル）エテニル］スルホニル］、［（３，４−ジヒドロキシ）フェニル］カルボニル、（Ｅ）［［［４−［１−シアノ−２−（３，４−ジヒドロキシ）フェニル］エテニル］カルボニルアミノ］エチル］アミノカルボニルまたはヒドロキシカルボニルである；
を有する化合物またはその薬学的に許容される塩を含んでなる、固形細胞腫瘍の増殖を抑制するための医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、チロシンキナーゼによるシグナル伝達をモジュレートおよび／または調節することができる新規な化合物に関する。本発明者らは、マウス胎児肝キナーゼ１（fetal liver kinase-1：ＦＬＫ−１）受容体、ならびにヒト・キナーゼインサートドメイン含有受容体（Kinase Insert-Domain-Containing Receptor：ＫＤＲ）を含めたその非マウス同等物がチロシンキナーゼシグナル伝達系において重要な役割を担っていることを実証した。ＫＤＲ／ＦＬＫ−１受容体に対して高い親和性を有する血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）のようなポリペプチド増殖因子は内皮細胞の増殖、とりわけ血管形成および／または脈管形成に関係している。その結果として、ＫＤＲ／ＦＬＫ−１受容体の酵素的機能に影響を与える化合物は、チロシンキナーゼシグナル伝達系ばかりか、血管形成および／または脈管形成のような過程における内皮細胞の増殖をも調節し、モジュレートし、かつ／または抑制するために使用できるかもしれない。従って、本発明はさらに、チロシンキナーゼシグナル伝達系、特にＫＤＲ／ＦＬＫ−１受容体、を含む受容体に結合しかつ／または該受容体の活性をモジュレートする化合物を用いて、血管形成および／または脈管形成に関連した疾患を治療することに向けられる。
【０００２】
【従来の技術】
受容体チロシンキナーゼ
受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）類は多様な生物学的活性を有するポリペプチド増殖因子のための膜貫通受容体の大ファミリーを構成する。ＲＴＫ固有の機能はリガンド結合の際に活性化されて、該受容体および複数の細胞基質のリン酸化を生じさせ、続いて様々な細胞反応を起こす。Ullrich & Schlessinger, 1990, Cell 61:203-212 参照。
【０００３】
本発明者らが先に報告したとおり、ＲＴＫ類、より一般的にはタンパク質チロシンキナーゼ類、は細胞の成長と分化を制御する上で重要な役割を果たしている（Schlessinger & Ullrich, 1992, Neuron 9:383-391参照）。ＲＴＫの異常発現または突然変異は制御不能な細胞増殖（例えば、悪性腫瘍の増殖）か、鍵となる発生過程での欠損かのいずれかへ導くことが分かっている。その結果、生物医学の分野では、ＲＴＫファミリーのメンバーの特異的な生物学的役割、分化過程におけるそれらの機能、腫瘍形成や他の疾病へのそれらの関与、リガンド刺激の際に活性化されるシグナル伝達経路の根底にある生化学的メカニズムを見つけ出して、新規な抗新生物剤を開発するために莫大な資金を投入してきた。
【０００４】
現在、少なくとも１９の異なるＲＴＫサブファミリーが確認されている。１つのＲＴＫサブファミリーはＫＤＲ／ＦＬＫ−１受容体、胎児肝キナーゼ４（ＦＬＫ−４）受容体およびｆｍｓ様チロシン１（ｆｌｔ−１）受容体から成ると考えられる。初期の頃には、これらの受容体はそれぞれが造血増殖因子の受容体であると考えられていた。
【０００５】
ＫＤＲ／ＦＬＫ−１受容体およびＶＥＧＦ
正常な血管形成および脈管形成は、胚発生、外傷治癒、臓器再生、雌性生殖過程（例えば、排卵中の黄体での卵胞の発達や妊娠後の胎盤の成長）など、様々な生理学的過程で重要な役割を担っている。Folkman & Shing, 1992, J. Biological Chem. 267(16):10931-34 参照。制御不能な血管形成および／または脈管形成は、糖尿病のような疾病だけでなく、増殖のために血管新生を必要とする悪性の固形腫瘍にも関連している。Klagsburn & Soker, 1993, Current Biology 3(10):699-702; Folkham, 1991, J. Natl., Cancer Inst. 82:4-6; Weidner ら, 1991, New Engl. J. Med. 324:1-5 参照。
【０００６】
in vitroで内皮細胞の増殖促進活性を有するポリペプチドが数種類同定されている。例を挙げると、酸性および塩基性の繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、胎盤増殖因子などである。ＦＧＦと違って、ＶＥＧＦは内皮細胞に特異的なマイトジェン（分裂促進因子）であることが最近になって報告された。Ferrara & Henzel, 1989, Biochem. Biophys. Res. Comm. 161:851-858; Vaisman ら, 1990, J. Biol. Chem. 265:19461-19566参照。
【０００７】
従って、ＶＥＧＦが結合する特異的受容体を同定することは、内皮細胞増殖の調節を理解する上で重要である。構造的に関連した２種類のＲＴＫが高親和的にＶＥＧＦと結合することが確認された。すなわち、ｆｌｔ−１受容体（Shibuya ら, 1990, Oncogene 5:519-524; De Vriesら, 1992, Science 255:989-991)と本明細書中で論じるＫＤＲ／ＦＬＫ−１受容体である。その結果、ＲＴＫは内皮細胞増殖のモジュレーションおよび調節においてある種の役割を担っていると推測された。
【０００８】
最近予想されたにすぎないが、米国特許出願第08/193,829号、第08/038,596号および第07/975,750号に記載される情報のごとき証拠により、ＶＥＧＦは内皮細胞の増殖に関与するばかりでなく、正常な血管形成と病理学的な血管形成の主な調節物質であることが強く示唆される。一般的には、Klagsburn & Soker, 1993, Current Biology 3(10)699-702; Houckら, 1992, J. Biol. Chem. 267:26031-26037参照。
【０００９】
ＫＤＲ／ＦＬＫ−１受容体に対するアゴニストおよびアンタゴニストの同定
内皮細胞の増殖とおそらくは血管形成および／または脈管形成の制御、調節およびモジュレーションに対するＲＴＫ類の重要性が推測されたことから、ＲＴＫ“阻害剤”を同定しようとする多くの試みが種々の方法を用いて行われた。例えば、こうした方法では、変異型リガンド（米国特許第4,966,849 号）、可溶性の受容体および抗体（国際公開 WO94/10202; Kendall & Thomas, 1994, Proc. Nat'l Acad. Sci. 90:10705-09; Kimら, 1993, Nature 362:841-844) 、ＲＮＡリガンド (Jellinekら, 19, Biochemistry 33:10450-56) 、プロテインキナーゼＣ阻害剤 (Schuchter ら, 1991, Cancer Res. 51:682-687; Takanoら, 1993, Mol. Bio. Cell 4:358A; Kinsella ら, 1992, Exp. Cell Res. 199:56-62; Wrightら, 1992, J. Cellular Phys. 152:448-57) 、チロシンキナーゼ阻害剤 (WO 94/03427; WO 92/21660; WO 91/15495; WO 94/14808; 米国特許第5,330,992 号; Mariani ら, 1994, Proc. Am. Assoc. Cancer Res. 35:2268) などが使用された。
【００１０】
比較的最近になって、チロシンキナーゼ阻害剤として作用する小型の分子を同定する試みがなされた。例えば、ビス単環式、二環式、または複素環式アリール化合物 (PCT WO 92/20642)、ビニレン−アザインドール誘導体 (PCT WO 94/14808)、および１−シクロプロピル−４−ピリジル−キノロン類（米国特許第5,330,992 号）が一般的にチロシンキナーゼ阻害剤として記述されている。スチリル化合物（米国特許第5,217,999 号）、スチリル置換ピリジル化合物（米国特許第5,302,606 号）、ある種のキナゾリン誘導体 (EP特許出願第0 566 266 A1号) 、セレオインドール類およびセレニド類 (PCT WO 94/03427)、三環式ポリヒドロキシル化合物 (PCT WO 92/21660)、そしてベンジルホスホン酸化合物 (PCT WO 91/15495)はがん治療用のチロシンキナーゼ阻害剤として用いられる化合物であると記述されている。しかしながら、これらの化合物はどれも以前にＫＤＲ／ＦＬＫ−１受容体の酵素的機能と関連づけられたことはなかった。同様に、これらの化合物のどれも血管形成および／または脈管形成の調節と関連づけられたことはなかった。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
かくして、血管形成および／または脈管形成の調節およびモジュレーションのために、ＲＴＫ特にＫＤＲ／ＦＬＫ−１受容体の活性をモジュレートすることによりチロシンキナーゼシグナル伝達を特異的に阻害する有効な小分子を同定することが望まれており、このことが本発明の目的である。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明は、チロシンキナーゼシグナル伝達をモジュレートする能力がある有機分子ならびに血管形成および／または脈管形成を抑制または促進するための前記分子の使用に関するものである。一般に、本発明の化合物はキナゾリン、キノキシリン、置換アニリン、イソキサゾール、アクリロニトリルおよびフェニルアクリロニトリル化合物の誘導体である。さらに特定すると、本発明は、一般に、下記式を有する化合物に向けられる：
Ａ．
【００１３】
【化２８】
0003844277.tif 000002
【００１４】
〔式中、
R1はイソプロピル、t-ブチル、Ｉ、Br、OHまたはメチルであり、
R2はOHであり、
R3は2-プロピル、t-ブチル、OH、Ｈまたはメチルであり、そして
R4は(1- フェニル)-n-プロピルアミノカルボニル、(E) 1-シアノ-2-[(3,5- ジイソプロピル-4- ヒドロキシ) フェニル] エテニルスルホニル、アミノチオカルボニル、シアノメチルスルホニル、(3- アミノ-4- シアノ) ピラゾ-5- イル、フェニル-n- プロピルアミノカルボニル、(E) 1-シアノ-2-[(5- ブロモ-3,4- ジヒドロキシ) フェニル] エテニルスルホニル、(1- フェニル)-n-プロピルアミノチオカルボニル、シアノ、(E) [[[4-[1-シアノ-2-(3,4-ジヒドロキシ) フェニル] エテニル] カルボニルアミノ]-n-ブチル] アミノカルボニル、ベンジルアミノカルボニル、2[[2- シアノ-1-(3,4-ジヒドロキシ) フェニル] エチレニル]]スルホニル、[(3,4-ジヒドロキシ) フェニル] カルボニル、(E) [[[4-[1-シアノ-2(3,4- ジヒドロキシ) フェニル] エテニル] カルボニルアミノ] エチル] アミノカルボニルまたはヒドロキシカルボニルである〕
で表される化合物およびその薬学的に許容される塩；または
Ｂ．
【００１５】
【化２９】
0003844277.tif 000003
【００１６】
〔式中、
R1はCH3 またはＨであり、
R2はCH3 またはＨであり、あるいは
R1とR2はフェニル環 (CHCHCHCH) を形成し、
R3はＨ、ホルミルまたはクロロであり、そして
R4はフェニル、(3,4- ジヒドロキシ) フェニル、(4- ヨードフェニル) アミノ、(3,4- ジクロロフェニル) アミノ、(3- クロロフェニル) アミノ、(4- ブロモフェニル) アミノまたはn-プロピルアミノである〕
で表される化合物およびその薬学的に許容される塩；または
Ｃ．
【００１７】
【化３０】
0003844277.tif 000004
【００１８】
〔式中、
R1はOCH3、CH3 またはＨであり、
R2はOCH3またはＨであり、
R3はＨまたはクロロであり、そして
R4は(3- クロロフェニル) アミノ、(4- メチルフェニル) メルカプト、(4- ヨードフェニル) アミノまたは(3- ヒドロキシフェニル) アミノである〕
で表される化合物およびその薬学的に許容される塩；または
Ｄ．
【００１９】
【化３１】
0003844277.tif 000005
【００２０】
〔式中、
R1は4-ヒドロキシフェニルであり、
R2はベンジルであり、
R3はCH3 である〕
で表される化合物およびその薬学的に許容される塩；または
Ｅ．
【００２１】
【化３２】
0003844277.tif 000006
【００２２】
〔式中、
R1は(3- トリフルオロメチル) フェニルであり、
R2は(2- クロロフェニル) アミノチオカルボニルである〕
で表される化合物およびその薬学的に許容される塩；または
Ｆ．
【００２３】
【化３３】
0003844277.tif 000007
【００２４】
〔式中、
R1はＯであり、
R2は(3,4- ジヒドロキシ) フェニルであり、そして
R3、R4およびR5はＨである〕
で表される化合物およびその薬学的に許容される塩；または
Ｇ．
【００２５】
【化３４】
0003844277.tif 000008
【００２６】
〔式中、
R1は4-(1- ニトロ) チオフェンまたはインドール-3- イルであり、そして
R2はアミノチオカルボニル、(3- アミノ-4- シアノ) ピラゾール-5- イルまたは(3,4- ジヒドロキシフェニル) カルボニルである〕
で表される化合物およびその薬学的に許容される塩；または
Ｈ．
【００２７】
【化３５】
0003844277.tif 000009
【００２８】
〔式中、
R1は2,5-ジヒドロキシベンジルであり、
R2はＨであり、
R3はメトキシカルボニルであり、そして
R4はＨである〕
で表される化合物およびその薬学的に許容される塩；または
Ｉ．
【００２９】
【化３６】
0003844277.tif 000010
【００３０】
〔式中、
R1はＨであり、
R2は(4- トリフルオロメチル) フェニルであり、そして
R3はメチルである〕
で表される化合物およびその薬学的に許容される塩；または
Ｊ．
【００３１】
【化３７】
0003844277.tif 000011
【００３２】
〔式中、R1は(3- クロロ) フェニルアミノである〕
で表される化合物およびその薬学的に許容される塩。
【００３３】
本発明はさらに、医薬として有効な量の上記化合物および製剤学的に許容される担体または賦形剤を含んでなる医薬組成物に向けられる。このような組成物は、とりわけＫＤＲ／ＦＬＫ−１と血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）との相互作用により伝達されるシグナルを阻害することによって、ＫＤＲ／ＦＬＫ−１受容体の酵素活性に影響を及ぼすと考えられ、糖尿病やがんを含めて血管形成および／または脈管形成に関連した疾患を抑制するのに有用でありうる。また、かかる組成物は上記疾患に係わりのある細胞（例えば、腫瘍細胞）に直接作用するかもしれない。さらに特定すると、本発明の組成物は、他にもあるが特に、糖尿病性網膜症、グリオーム（神経膠腫）、メラノーマ（黒色腫）、カポジ肉腫、血管腫、そして卵巣、乳房、肺、膵臓、前立腺、結腸および類表皮のがんを治療する方法において使用される。また、こうした組成物は、血管形成および／または脈管形成の抑制ではなくモジュレーションのために用いる場合は、外傷治癒を促進させるのに有用であろう。
【００３４】
最後に、本発明はまた、糖尿病、糖尿病性網膜症、リウマチ様関節炎、血管腫、がん、特に固形細胞腫瘍の増殖に関係したがん（例えば、グリア芽細胞腫、メラノーマ、カポジ肉腫、および卵巣、肺、乳房、前立腺、膵臓、結腸および類表皮のがん）を含むがこれらに限らない病理学的な血管形成および／または脈管形成に関連した疾患を治療する方法に向けられる。
【００３５】
【発明の実施の形態】
3.1.  定義
「薬学的に許容される酸付加塩」とは、遊離塩基の生物学的有効性および特性を保持し、かつ無機酸（例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸）、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸などとの反応により得られる塩を指す。
【００３６】
「アルキル」とは、飽和または不飽和の分枝鎖状または直鎖状の炭化水素基を指す。代表的なアルキル基としてはメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシルなどがある。
【００３７】
４．発明の詳細な説明
本発明は、血管形成および／または脈管形成を抑制または促進するためにチロシンキナーゼシグナル伝達、さらに特定するとＫＤＲ／ＦＬＫ−１受容体シグナル伝達、を調節しかつ／またはモジュレートすることができる化合物に関する。
【００３８】
本発明は、一部において、ＫＤＲ／ＦＬＫ−１チロシンキナーゼ受容体、より一般的にはＲＴＫ類、が内皮細胞の表面に発現されて、固形細胞腫瘍の増殖を含めた内皮細胞の増殖において一役を担っているという知見に基づくものである。本発明はまた、ＫＤＲ／ＦＬＫ−１の高親和性リガンドとしてのＶＥＧＦの同定ならびに造血受容体としてよりもむしろＲＴＫとしてのＫＤＲ／ＦＬＫ−１の特性づけに基づくものである。従って、血管形成および脈管形成中に内皮細胞の増殖および移動においてＶＥＧＦが果たすと推測される役割は、これらの過程におけるＫＤＲ／ＦＬＫ−１の重要な役割を示唆する。
【００３９】
本発明はさらに、糖尿病（Folkman, 1987, XIth Congress of Thrombosis and Haemostasis (Verstraetaら編) pp. 583-596, Leuven University Press, Leuven) および関節炎などの病気ならびに悪性腫瘍増殖が抑制されない脈管形成によって生じるという知見に基づく。例えば、Folkman, 1971, N. Engl. J. Med. 285:1182-1186 参照。最後に、本発明は、VEGFなどのリガンドによって活性化されると、KDR/FLK-1 によって形質導入されるシグナルを阻害し、阻止し、または妨害する化合物の発見および設計に基づく。従って、本発明の化合物はチロシンキナーゼシグナル形質導入経路に沿って受容体または他の成分に作用すると考えられるが、該化合物はまた、抑制されない脈管形成によって生じる腫瘍細胞に直接作用すると考えられる。
【００４０】
一般的な「flk-1 」受容体のヒトおよびマウスの同等物の呼び名は異なるけれども、本出願の目的に対して、それらは多くの点で入れ換えることができる。マウスの受容体である FLK-1およびヒトの同等物である KDRは、細胞内ドメイン内に 93.4 % の配列相同性を有する。同様に、マウス FLK-1は、ヒト VEGF をマウス VEGF と同じ親和性で結合し、従って、いずれの種に由来するリガンドによっても活性化される。Millauerら, 1993, Cell 72:835-846; Quinnら, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:7533-7537 。FLK-1 はまた、293 細胞 (ヒト胎児の腎臓繊維芽細胞) で共発現されると、チロシンリン酸塩ヒト RTK基質 (例えば、PLC-γまたは p85) と会合する。
【００４１】
従って、FLK-1 受容体に基づくモデルは、KDR 受容体を理解する上で直接適用できる。例えば、シグナル形質導入経路を調節する化合物の同定法におけるマウス FLK-1受容体の使用は、ヒトシグナル形質導入経路および特に KDR受容体に関する活性を調節するために使用できる化合物の同定に直接適用できる。脈管形成は、内皮細胞の非血管新生細胞への侵入を含む非常に複雑な工程である。内皮細胞を取り囲む基底膜の分解、脈管周囲支質への移動ならびに最終的には新しい血管新芽の増殖および生成を含むこの多段階工程を正確に模倣する in vitro モデルは存在しない。すなわち、in vitroで KDR/FLK-1の阻害剤として同定される化学化合物は、適する in vivoモデルで確認される。in vivo のマウスおよびラットの動物モデルは共に、KDR/FLK-1 誘発シグナル形質導入経路に対して作用する物質の臨床的能力の試験に対する評価が優れていることが示された。
【００４２】
要約すると、VEGFが特異的に結合する受容体は、血管形成および／または脈管形成ならびにそのような工程によって引き起こされる異常細胞増殖に関与する種々の重い病気の調節およびモジュレートに対して重要かつ有力な治療標的である。Plowman ら, 1994, DN&P 7(6):334-339 。特に、 KDR/FLK-1受容体は、その新生血管形成における高い特異性および役割のために、血管の抑制されない生成を含む癌および他の病気の治療法に対する非常に独特で有力な標的となる。
【００４３】
本発明は、従って、KDR/FLK-1 受容体の酵素活性に影響を及ぼし、KDR/FLK-1 により形質導入されるシグナルを妨げることにより血管形成および／または脈管形成を調節、モジュレートおよび／または阻害する化合物に関する。特に、本発明は、多くの種類の充実性腫瘍（グリア芽腫、黒色腫およびカポジ肉腫、ならびに卵巣、肺、乳房、前立腺、膵臓、結腸および類表皮癌が挙げられるが、それらに限定されない。）を治療するための方法としての、KDR/FLK-1 仲介シグナル形質導入経路を調節、モジュレートおよび／または阻害する化合物に関する。
【００４４】
本発明はまた、他の受容体仲介経路（関連の大きい flt-1受容体を含む経路など）による血管形成および脈管形成の阻害に関する。受容体チロシンキナーゼ仲介シグナル形質導入は、特定の増殖因子（リガンド）との細胞外相互作用、次いで受容体の二量化、内因子タンパク質チロシンキナーゼ活性の一時的刺激および自己リン酸化によって開始される。それによって、結合部位が細胞内シグナル形質導入分子に対して作られ、適切な細胞反応を容易にするある範囲の細胞質シグナル化分子との複合体を生成する。（例えば、細胞分割、細胞外ミクロ環境に対する代謝作用) Schlessinger and Ullrich, 1992, Neuron 9:1-20 参照。
【００４５】
KFR/FLK-1 および flt-1などの増殖因子受容体におけるチロシン自己リン酸化部位が、シグナル化分子の SH2 (src 相同体) ドメインに対する高アフィニティー結合部位として機能することが示された。Fantl ら, 1992, Cell 69:413-423; Songyang ら, 1994, Mol. Cell. Biol. 14:2777-2785; Songyang ら, 1993, Cell 72:767-778;および Koch ら, 1991, Science 252:668-678 。受容体チロシンキナーゼと会合するいくつかの細胞内基質タンパク質が同定された。それらは、主に二つのグループに分けることができる。すなわち、(1) 触媒ドメインを有する基質; および (2)そのようなドメインに欠けるが、アダプターとして作用し、触媒的に活性な分子と会合する基質である。Songyangら, 1993, Cell 72:767-778 。KDR/FLK-1 および flt-1などの受容体とそれらの基質の SH2ドメインとの間の相互作用の特異性は、リン酸化チロシン残基のすぐ周囲のアミノ酸残基によって測定される。SH2 ドメインと特定の受容体上のホスホチロシン残基の周囲のアミノ酸配列との間の結合アフィニティーの相違は、それらの基質リン酸化プロフィールにおいて認められる相違と一致する。Songyangら, 1993, Cell 72:767-778 。これらの知見は、各受容体チロシンキナーゼの機能がその発現パターンおよびリガンド利用性のみだけでなく、特定の受容体によって活性化される下流シグナル形質導入経路の配列によっても測定されることを示唆する。すなわち、自己リン酸化は、特異的増殖因子受容体および分化因子受容体によって補充されるシグナル経路の選択性を決定する重要な調整工程を提供する。
【００４６】
KDR/FLK-1 の細胞内領域の、PDGF−β−受容体（50.3 %の相同性）および／または関連性の大きい flt-1受容体との密接な相同性は、重複するシグナル形質導入経路の誘発を示す。例えば、PDGF−β−受容体の場合、src ファミリーのメンバー (Twamley ら, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:7696-7700)、ホスファチジルイノシトール−３’−キナーゼ (Huら, 1992, Mol. Cell. Biol. 12:981-990)、ホスホリパーゼ C−γ (Kashishian & Cooper, 1993, Mol. Cell. Biol. 4:49-51)、ras-GTPase−活性タンパク質 (Kashishianら, 1992, EMBO J. 11:1373-1382) 、PTP-1D/syp (Kazlauskasら, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6939-6943)、Grb2 (Arvidsson ら, 1994, Mol. Cell. Biol. 14:6715-6726)およびアダプター分子 Shcおよび Nck (Nishimura ら, 1993, Mol. Cell. Biol. 13:6889-6896)が、種々の自己リン酸化部位を含む領域に結合することが分かった。一般的には、Claesson-Welsh, 1994, Prog. Growth Factor Res. 5:37-54を参照。すなわち、KDR/FLK-1 によって活性化されるシグナル形質導入経路は、恐らく、ras 経路 (Rozakis ら, 1992, Nature 360:689-692) 、PI-3'-キナーゼ経路ならびに scr仲介および plcγ仲介経路を含む。これらの経路の各々は、内皮細胞でのKDR/FLK-1 の脈管形成および／または血管形成作用において重要な役割を果たすと考えられる。従って、本発明は、脈管形成および血管形成がこれらの経路によって調節されるので、そのようなプロセスを調節するための本明細書に記載する有機化合物の使用にも関する。
【００４７】
4.1.  化合物
本発明は、一般に、下記式を有する化合物および／または該化合物を含む組成物に関する。
Ａ．
【００４８】
【化３８】
0003844277.tif 000012
【００４９】
および薬剤的に許容されうるその塩［式中、Ｒ1 はイソプロピル、ｔ−ブチル、Ｉ、Ｂｒ、ＯＨまたはメチルであり；Ｒ2 はＯＨであり；Ｒ3 は２−プロピル、ｔ−ブチル、ＯＨ、Ｈまたはメチルであり；Ｒ4 は（１−フェニル）−ｎ−プロピルアミノカルボニル、（Ｅ）１−シアノ−２−〔（３，５−ジイソプロピル−４−ヒドロキシ）フェニル〕エテニルスルホニル、アミノチオカルボニル、シアノメチルスルホニル、（３−アミノ−４−シアノ）ピラゾ−５−イル、フェニル−ｎ−プロピルアミノカルボニル、（Ｅ）１−シアノ−２−〔（５−ブロモ−３，４−ジヒドロキシ）フェニル〕エテニルスルホニル、（１−フェニル）−ｎ−プロピルアミノチオカルボニル、シアノ、（Ｅ）〔〔〔４−〔１−シアノ−２−（３，４−ジヒドロキシ）フェニル〕エテニル〕カルボニルアミノ〕−ｎ−ブチル〕アミノカルボニル、ベンジルアミノカルボニル、２−〔〔２−シアノ−１−（３，４−ジヒドロキシ）フェニル〕エチレニル〕〕スルホニル、〔（３，４−ジヒドロキシ）フェニル〕カルボニル、（Ｅ）〔〔〔４−〔１−シアノ−２−（３，４−ジヒドロキシ）フェニル〕エテニル〕カルボニルアミノ〕エチル〕アミノカルボニルまたはヒドロキシカルボニルである。］；または
Ｂ．
【００５０】
【化３９】
0003844277.tif 000013
【００５１】
および薬剤的に許容されうるその塩［式中、Ｒ1 はＣＨ3 またはＨであり；Ｒ2 はＣＨ3 またはＯＨであり；あるいはＲ1 およびＲ2 がフェニル環（ＣＨＣＨＣＨＣＨ）を形成し；Ｒ3 はＨまたはホルミルまたはクロロであり；Ｒ4 はフェニル、（３，４−ジヒドロキシ）フェニル、（４−ヨードフェニル）アミノ、（３，４−ジクロロフェニル）アミノ、（３−クロロフェニル）アミノ、（４−ブロモフェニル）アミノまたはｎ−プロピルアミノである。］；または
Ｃ．
【００５２】
【化４０】
0003844277.tif 000014
【００５３】
および薬剤的に許容されうるその塩［式中、Ｒ1 はＯＣＨ3 、ＣＨ3 またはＨであり；Ｒ2 はＯＣＨ3 またはＨであり；Ｒ3 はＨまたはクロロであり；Ｒ4 は（３−クロロフェニル）アミノ、（４−メチルフェニル）メルカプト、（４−ヨードフェニル）アミノまたは（３−ヒドロキシフェニル）アミノである。］；または
Ｄ．
【００５４】
【化４１】
0003844277.tif 000015
【００５５】
および薬剤的に許容されうるその塩［式中、Ｒ1 は４−ヒドロキシフェニルであり；Ｒ2 はベンジルであり；Ｒ3 はＣＨ3 である。］；または
Ｅ．
【００５６】
【化４２】
0003844277.tif 000016
【００５７】
および薬剤的に許容されうるその塩［式中、Ｒ1 は（３−トリフルオロメチル）フェニルであり；Ｒ2 は（２−クロロフェニル）アミノチオカルボニルである。］；または
Ｆ．
【００５８】
【化４３】
0003844277.tif 000017
【００５９】
および薬剤的に許容されうるその塩［式中、Ｒ1 はＯであり；Ｒ2 は（３，４−ジヒドロキシ）フェニルであり；Ｒ3 、Ｒ4 およびＲ5 はＨである。］；またはＧ．
【００６０】
【化４４】
0003844277.tif 000018
【００６１】
および薬剤的に許容されうるその塩［式中、Ｒ1 は４−（１−ニトロ）チオフェンまたはインドール−３−イルまたはインドール−５−イルであり；Ｒ2 はアミノチオカルボニル、（３−アミノ−４−シアノ）ピラゾール−５−イルまたは（３，４−ジヒドロキシフェニル）カルボニルである。］；または
Ｈ．
【００６２】
【化４５】
0003844277.tif 000019
【００６３】
および薬剤的に許容されうるその塩［式中、Ｒ1 は２，５−ジヒドロキシベンジルであり；Ｒ2 はＨであり；Ｒ3 はメトキシカルボニルであり；Ｒ4 はＨである。］；または
Ｉ．
【００６４】
【化４６】
0003844277.tif 000020
【００６５】
および薬剤的に許容されうるその塩［式中、Ｒ1 はＨであり；Ｒ2 は（４−トリフルオロメチル）フェニルであり；Ｒ3 はメチルである。］；または
Ｊ．
【００６６】
【化４７】
0003844277.tif 000021
【００６７】
および薬剤的に許容されうるその塩［式中、Ｒ1 は（３−クロロ）フェニルアミノである。］。
【００６８】
ここに挙げる化学式は、互変異性現象を示す可能性がある。本明細書中の化学式は、可能な互変異性体の一つのみを表しているので、本発明は、血管形成および／または脈管形成を調節および／またはモジュレートする能力を有するどんな互変異性体も包含するものであり、化学式にあるいずれか一つの互変異性体に限定されるものではないことは理解されるはずである。
【００６９】
上記化合物および薬剤的に許容されうる塩の他に、本発明は、さらに、当てはまるならば、血管形成および／または脈管形成を調節および／またはモジュレートする能力を有する化合物の溶媒和型および非溶媒和型（例えば、水和物型）に関する。
【００７０】
上記化合物は、化学的に関連する化合物の合成に適用できることが知られている方法によって合成できる。適する方法は、下記の代表的な実施例によって説明する。必要な出発物質は、有機化学の標準的方法によって得ることができる。
【００７１】
4.2.  薬剤組成物および投与法
本発明化合物は、ヒトの患者に、それ自体で、または適切な担体または賦形剤と混合した薬剤組成物として、カポジ肉腫、グリア芽腫、および黒色腫、卵巣、肺、乳房、前立腺、膵臓、結腸および類表皮癌、糖尿病、糖尿病性網膜症、血管腫ならびにリューマチ性関節炎などの充実性細胞腫瘍増殖などの種々の疾患を治療または改善するための用量で投与することができる。さらに、治療的に有効な量は、抑制されない血管形成および脈管形成の症状の改善が得られるのに十分な化合物の量を意味する。本発明化合物の製剤および投与法は、"Remington's Pharmaceutrical Sciences," Mack Publishing Co., Easton, PA,  最新版に見ることができる。
【００７２】
4.2.1.  投与法
適する投与法は、例えば、経口、直腸、粘膜、または腸管投与；筋肉内、皮下、骨髄内注射ならびに鞘内、直接心室内、静脈内、腹腔内、鼻腔内または眼内注射などの非経口投与が挙げられる。
【００７３】
あるいは、化合物を全身的方法よりもむしろ局所的に投与することができ、例えば、化合物を充実性腫瘍に直接注入することにより行なわれ、しばしば、デポー製剤または除放性製剤として注入する。
【００７４】
さらに、薬物を標的薬物放出系に入れて投与することができ、例えば、腫瘍に特異的な抗体で被覆したリポゾームに入れて投与する。リポゾームが標的となり、腫瘍によって選択的に吸収される。
【００７５】
4.2.2.  組成物／組成
本発明の薬剤組成物は、自体公知の方法、例えば、通常の混合、溶解、顆粒化、糖衣丸製造、粉末化、乳化、カプセル化、包括化、凍結乾燥法によって製造することができる。
【００７６】
このようにして、本発明に従って使用する薬剤組成物は、活性化合物の薬剤的に使用できる製剤への加工を容易にする賦形剤および補助剤を含む１種以上の生理学的に許容されうる担体を使用して、常法により作ることができる。適切な組成物は、選択する投与法に依存する。
【００７７】
注入の場合、本発明化合物は、水性溶液、好ましくは、ハンクス溶液、リンゲル溶液または生理学的食塩水緩衝液などの生理学的に相溶性のある緩衝液に入れて組成物を作ることができる。粘膜投与の場合、透過すべきバリヤに適する浸透剤を組成物に使用する。そのような浸透剤は、一般に、その分野では公知である。
【００７８】
経口投与の場合、化合物は、活性化合物を、その分野で周知の薬剤的に許容されうる担体と結合することにより容易に組成物にすることができる。そのような担体により、本発明化合物は、治療すべき患者による経口摂取用の錠剤、ピル、糖衣丸、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液などの組成物として作ることができる。
【００７９】
経口用の薬剤組成物は、固体賦形剤を使用して得ることができ、所望により、得られる混合物を粉にし、所望により適切な補助剤を添加した後、顆粒混合物を加工して、錠剤または糖衣丸コアを得る。適する賦形剤は、特に、糖（ラクトース、ショ糖、マンニトールまたはソルビトールなど）などのフィラー；セルロース製剤、例えば、コーンスターチ、小麦澱粉、米澱粉、馬鈴薯澱粉、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル−セルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などである。所望により、架橋ポリビニルピロリドン、寒天またはアルギン酸もしくはそれらの塩（アルギン酸ナトリウムなど）などの崩壊剤を添加することができる。
【００８０】
糖衣丸コアは、適切なコーティングを行なう。このためには、濃縮寒天溶液を使用することができ、所望により、アラビアゴム、タルク、ポリピニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコールおよび／または二酸化チタン、ラッカー溶液、ならびに適当な有機溶媒または溶媒混合物を含んでもよい。活性化合物用量の異なる組み合わせを見分けたり、特徴づけるために、錠剤または糖衣丸のコーティングに染料または顔料を添加してもよい。
【００８１】
経口的に使用できる医薬製剤としては、ゼラチンでできたプッシュフィット式カプセルならびにゼラチンおよび可塑剤（グリセロールまたはソルビトールなど）でできた軟質密閉カプセルが挙げられる。プッシュフィット式カプセルは、活性成分をラクトースなどのフィラー、澱粉などのバインダーおよび／またはタルクもしくはステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤、および所望により安定剤と混合して含む。軟質カプセルでは、活性化合物を脂肪油、液体パラフィンまたは液体ポリエチレングリコールなどの適当な液体に溶解または懸濁することができる。さらに、安定剤を添加してもよい。経口投与用の全ての組成物は、そのような投与に適する用量にすべきである。
【００８２】
頬投与の場合、組成物は、常法によって作られる錠剤またはロゼンジの形態にすることができる。
【００８３】
吸入投与の場合、本発明に従って使用する化合物は、通常、加圧パックまたはネブライザーから、適する推進薬、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適当なガスの使用により、エーロゾル噴霧の形で簡単に放出される。加圧エーロゾルの場合、単位用量は、１目盛り分の量を放出するためのバルブを備えることによって決めることができる。吸入器または通気器で使用するための例えばゼラチン製のカプセルおよびカートリッジは、化合物とラクトースまたは澱粉などの適する粉末ベースとの粉末混合物を含んで作ることができる。
【００８４】
化合物は、注入、例えば瞬時注射または連続輸液による非経口投与用に作ることができる。注入用組成物は、例えばアンプルまたは多用量容器に、保存剤の添加とともに、単位用量の形態で提供することができる。その組成物は、油性または水性ビヒクル中で懸濁液、溶液またはエマルジョンなどの形態をとることができ、懸濁剤、安定剤および／または分散剤などの製剤用試薬を含んでもよい。
【００８５】
非経口投与用薬剤組成物は、活性化合物の水性溶液を水溶性の形態で含む。さらに、活性化合物の懸濁液は、適切な油性注入用懸濁液として作ることもできる。適当な親油性溶媒またはビヒクルとしては、ゴマ油などの脂肪油またはオレイン酸エチルもしくはトリグリセリドなどの合成脂肪酸エステルまたはリポゾームが挙げられる。水性注入用懸濁物は、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトールまたはデキストランなどの、懸濁物の粘度を増加させる物質を含んでもよい。所望により、懸濁物はまた、化合物の溶解性を増加してかなり濃厚な溶液を作ることができる、適する安定剤または物質を含んでもよい。
【００８６】
あるいは、活性化合物は、使用前に、適切なビヒクル、例えば発熱物質を含まない滅菌水で液体にするための粉末状であってもよい。
【００８７】
化合物はまた、例えばココアバターまたは他のグリセリドなどの通常の座薬ベースを含む、座剤または停留浣腸剤などの直腸用組成物にすることができる。
【００８８】
化合物は、上記組成物の他に、デポー製剤として作ることもできる。そのような長時間作用する組成物は、植込み（例えば、皮下または筋肉内）または筋肉内注射により投与することができる。従って、化合物は、例えば、適するポリマー物質もしくは疎水性物質（例えば、許容されうる油におけるエマルジョンなど）またはイオン交換樹脂とともに、あるいは、ほんの少し溶解する誘導体として（例えば、ほんの少し溶解する塩として）製剤化することができる。
【００８９】
本発明の疎水性化合物に対する薬剤担体は、ベンジルアルコール、非極性界面活性剤、水と相溶性のある有機ポリマーおよび水相を含む共溶媒系である。共溶媒系は、VPD 共溶媒系であってもよい。VPD は、3 % w/v のベンジルアルコール、8 % w/v の非極性界面活性剤ポリソルベート 80 、および 65 % w/v のポリエチレングリコール 300の無水エタノール溶液である。VPD 共溶媒系 (VPD:5W) は、5 % デキストロース水溶液で 1:1に希釈した VPDから成る。この共溶媒系は、疎水性化合物を十分溶解し、それ自体、全身投与時に低毒性を生じる。当然、共溶媒系の割合は、その溶解性および毒性を損なうことなく、かなり変えることができる。さらに、共溶媒成分の同一性を変えてもよい。例えば、ポリソルベート 80 の代わりに、他の毒性の低い非極性界面活性剤を使用することができ、ポリエチリングリコールの画分の大きさを変えてもよく、ポリエチリングリコールの代わりに他の生物相溶性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドンを使用してもよく、デキストロースの代わりに他の糖または多糖を使用してもよい。
【００９０】
あるいは、疎水性薬剤化合物に対する他の放出系を使用することができる。リポゾームおよびエマルジョンは、疎水性薬物のための放出用ビヒクルまたは担体の周知の例である。ジメチルスルホキシドなどの有機溶媒も使用することができるが、通常は毒性がより大きい。さらに、治療剤を含む固体の疎水性ポリマーの半透過マトリックスなどの徐放系を使用して化合物を放出してもよい。種々の徐放性物質が確立されており、当業者には周知である。徐放性カプセルは、その化学的性質に応じて、化合物を２、３週間〜１００日以上にわたって放出する。治療薬の化学的性質および生物学的安定性に応じて、タンパク質安定化のための方法をさらに使用してもよい。
【００９１】
薬剤組成物は、適当な固相またはゲル相の担体または賦形剤を含むこともできる。そのような担体または賦形剤の例としては、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、種々の糖、澱粉、セルロース誘導体、ゼラチンおよびポリエチレングリコールなどのポリマーが挙げられるが、それらに限定されない。
【００９２】
KDR/FLK-1 受容体をモジュレートする本発明の多くの化合物は、薬剤的に相溶性のある対イオンとの塩として提供することができる。薬剤的に相溶性のある塩は、多くの酸、例えば、それらに限定されないが、塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、マレイン酸、コハク酸などの酸とともに形成することができる。塩は、対応する遊離塩基形よりも水性または他のプロトン性溶媒によく溶解する傾向にある。
【００９３】
4.2.3.  有効用量
本発明での使用に適する薬剤組成物としては、活性化合物がその意図する目的を達成するのに有効な量で含まれている組成物が挙げられる。特に、治療的に有効な量は、治療する患者の目下の症状の進行を防ぎ、または目下の症状を軽減するのに有効な量を意味する。有効量の決定は、特にここに記載する詳細に照らして、当業者の能力の範囲内で十分である。
【００９４】
本発明の方法に使用されるいくつかの化合物に対しては、治療的に有効な用量は、最初に細胞培養アッセイから推定することができる。例えば、細胞培養で測定される IC50 （すなわち、RTK 活性の最大阻害の半分を達成するテスト化合物濃度）を含む流動する濃度範囲を達成する用量を動物モデルで処方することができる。そのような情報を使用すると、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定することができる。
【００９５】
治療的に有効な用量は、患者の症状の改善または延命が得られる化合物の量を意味する。そのような化合物の毒性および治療効力は、細胞培養または実験動物での標準的な薬学的手順、例えば、LD50（集団の 50 % を死に至らしめる用量）および ED50 （集団の 50 % において治療的に有効な用量）を測定する手順によって調べることができる。毒性および治療効果の用量比は治療指数であり、LD50と ED50 との比として表すことができる。治療指数の高い化合物が好ましい。これらの細胞培養アッセイおよび動物研究から得られるデータは、ヒトでの使用に対する用量範囲を作るのに使用できる。該化合物の用量は、好ましくは、 ED50 を含み、毒性はほとんどないかゼロである、変動する濃度範囲内にある。用量は、使用する投与形態および使用する投与方法に応じて、この範囲内で変わりうる。正確な処方、投与方法および用量は、患者の状態を鑑みて、個々の医師により選択することができる。 (例えば、Fingl ら, 1975, in "The Pharmacological Basis of Therapeutics", Ch. 1 pl参照) 。
【００９６】
用量および間隔は、活性部分の血漿レベルがFKL-1 受容体−阻害効果を維持するのに十分になるように、個々に調整することができる。全身投与の場合の通常の患者の用量は、1 〜 2000 mg/ 日、普通は 1〜250 mg/ 日、典型的には 10 〜 150 mg/日の範囲である。患者の体重によって述べると、通常の用量は、0.02〜25 mg/kg/ 日、普通は 0.02 〜 3 mg/kg/ 日、典型的には 0.2〜1.5 mg/kg/日の範囲である。患者の体表面積によって述べると、通常の用量は、0.5 〜 1200 mg/m2 / 日、普通は 0.5〜150 mg/m2 / 日、典型的には 5〜100 mg/m2 / 日である。
【００９７】
用量および間隔は、活性部分の血漿レベルがFKL-1 受容体−阻害効果を維持するのに十分になるように、個々に調整することができる。通常の平均血漿レベルは、50〜5000μg/ml、普通は 50 〜 1000 μg/ml、典型的には 100〜500 μg/ml内に維持すべきである。
【００９８】
局所投与または選択的吸収の場合、薬物の有効な局所濃度は、血漿濃度と関連する必要はない。
【００９９】
投与される組成物の量は、もちろん、治療される患者に依存し、患者の体重、痛みの度合い、投与方法および主治医の判断に依存する。
【０１００】
4.2.4.  包装
組成物は、所望により、活性化合物を含む１個以上の単位用量形態を含むことができるパックまたは投薬装置に入れて提供することができる。パックは、例えば、金属またはプラスチックホイル（ブリスタパックなど）を含むことができる。パックまたは投薬装置には、投与に対する指示を添えることができる。また、相溶性の薬剤担体に入れて作られる本発明化合物を含む組成物は、調合し、適切な容器に入れ、指示した症状の治療用としてラベルすることができる。ラベル上に指示される適切な症状としては、グリオームまたはグリア芽腫などの腫瘍の治療および脈管形成の阻害が挙げられる。
【０１０１】
【実施例】
化合物の合成
5.1.  (E)-2-アミノチオカルボニル-3-(3,5-ジ-t-ブチル-4-ヒドロキシフェニル)アクリロニトリルの合成
(E)-2-アミノチオカルボニル-3-(3,5-ジ-t-ブチル-4-ヒドロキシフェニル)アクリロニトリル（化合物1)の好ましい合成方法は以下の通りである。Ohmichi et al., 1993, Biochemistry 32:4650に概説された方法で化合物を調製した。40 ml のエタノール中の0.47 gの3,5-ジ-tert-ブチル-4-ヒドロキシベンズアルデヒドと0.2 g のチオシアノアセトアミドと30 mgのβ-アラニンとの混合物を6時間還流させた。水及びHClを添加し、反応混合物を酢酸エチルで抽出し、蒸発させると、210℃の融点を有する黄色固体が0.34 g (収率54%)得られた。
【０１０２】
生成物は以下の分析データを示した。
NMR(アセトン-d6)δ 8.47(1H,s,ビニル), 8.02(2H,s), 1.48(18H,s); MS m/e 316(M+,100), 303(35), 301(99), 268(16), 260-(M(CH3)2=C,45), 245(17), 228(22), 219(52), 203(10), 143(11), 129(11)。
【０１０３】
5.2.  (E)-2-シアノ-3-(3-ヨード-4,5-ヒドロキシフェニル)アクリロニトリルの合成
(E)-1-シアノ-3-(3-ヨード-4,5-ヒドロキシフェニル)アクリロニトリル(化合物2)の好ましい合成方法は以下の通りである。Ohmichi et al., 1993, Biochemistry 32:4650に記載された方法で化合物を2段階で調製した。先ず、25 ml のエタノール中の1.4 g の5-ヨードバニリンと0.4 g のマロノニトリルに3滴のピペリジンを添加し4時間還流させることによって3-メトキシ-4-ヒドロキシ-5-ヨードベンジリデンマロノニトリルを調製した。0.8 g(収率49%)の黄色固体が得られた。
【０１０４】
得られた3-メトキシ-4-ヒドロキシ-5-(ヨードベンジリデン)マロノニトリルは以下の分析データを示した。
mp 188℃;NMR(CDCl3) δ 7.76(1H,J=1.8Mz,H6), 7.65(1H,d,J=1.8Hz,H2), 7.56(1H,s, ビニル), 6.85(1H,s,OH), 3.99(3H,S,OCH3); MS m/e 327(13), 326(M+,100), 283(18), 128(35), 101(22)。
【０１０５】
次に、40 ml のジクロロメタン中の(3-メトキシ-4-ヒドロキシ-5-ヨードベンジリデン)マロノニトリル(0.65 g)と0.6 mlの三臭化ホウ素(BBr3)をアルゴン下に室温で1時間撹拌した。水を添加し、反応混合物を酢酸エチルで抽出すると融点105℃の淡赤色固体(溶液は黄色)が0.46 g (収率73%)得られた。
【０１０６】
最終生成物は以下の分析データを示した。
NMR(アセトン-d6) δ 8.03(1H,s,ビニル), 7.88(1H,d,J=2.3Hz,H2), 7.72(1H,d,J=2.3Hz,H6); MS m/e 312(M+,38), 254(74), 185(M-I,27), 158(M-I-HCN,11), 157(64), 130(19), 129(23), 127(100)。
【０１０７】
5.3.  (E)-2-(3-フェニル-n-プロピルアミノカルボニル)-3-(3-ブロモ-4,5-ジヒドロキシフェニル)アクリロニトリルの合成
(E)-2-(3-フェニル-n-プロピルアミノカルボニル)-3-(3-ブロモ-4,5-ジヒドロキシフェニル)アクリロニトリル(化合物3)の好ましい合成方法は以下の通りである。
1.  30 ml のエタノール中の0.69 gの2.5 mMの5-ヨードバニリンと0.5 g のN-3-フェニル-n-プロピルシアノアセトアミドと50 mg のβ-アラニンを5時間還流させた。蒸発によって油状物が得られた。この油状物をベンゼン-ヘキサンですりつぶし(triturate)、濾過すると、83℃の融点を有する淡黄色固体が0.82 g (収率71%)得られた。室内光で保存すると化合物がある程度の経時的劣化を生じることが明らかに観察された。従って化合物を固体状態で光から保護して保存するのが好ましい。生成物は以下の分析データを示した。
NMR(CDCl3)δ 8.12(1H,S), 7.75(1H,d,J=2.0Hz), 7.68(1H,d,J=2.0Hz), 7.30-7.10(5H,m), 3.96(3H,S,OCH3), 3.45(2H,q,J=6.0Hz), 2.70(2H,t,J=6.0Hz), 1.95(2H,quin,J=6.0Hz); MS m/e 462(M+,53), 357(M-(CH2)3Ph,18), 335(M-I,100), 327(M-NH(CH2)3Ph,31)。
2.  次に、30 ml のジクロロメタン中の0.5 g の段階1の化合物(3-メトキシ-4-ヒドロキシ-5-ヨード-α-シス-シンナモン(3'フェニルプロパン)アミド)と0.4 mlのBBr3を室温で1.5時間撹拌した。水を添加し、反応物を酢酸エチルで抽出した。蒸発させ、ベンゼン-ヘキサンですりつぶすと、184℃の融点を有する淡褐色固体が0.3 g(収率63%)得られた。
【０１０８】
生成物は以下の分析データを示した。
NMR(アセトン-d6)δ 8.01(1H,s,ビニル), 7.88(1H,d,J=2.0Hz), 7.66(1H,d,J=2.0Hz), 7.30(5H,m,Ph), 3.42(2H,t,J=6.0Hz), 2.70(2H,t,J=6.0Hz), 1.96(2H,quin,J=6.0Hz); MS m/e 448(M+,3%), 321(M-I,8), 217(21), 201(33), 118(100), m/e。
【０１０９】
5.4.  (E)-2-[(3-アミノ-4-シアノ)ピラゾ-5-イル]-3-(3,5-ジ-t-ブチル-4-ヒドロキシフェニル)アクリロニトリルの合成
(E)-2-[(3-アミノ-4-シアノ)ピラゾ-5-イル]-3-(3,5-ジ-t-ブチル-4-ヒドロキシフェニル)アクリロニトリル(化合物4)の好ましい合成方法は以下の通りである。0.7 g の3,5-ジ-t-ブチル-4-ヒドロキシベンズアルデヒドと0.46 gの3-アミノ-4-シアノ-5-シアノメチルピラゾール(Carboni et al., 1958, J. Chem. Soc., 80: 2838に従って調製)と40 mg のβ-アラニンの混合物を15時間還流させた。冷却し濾過すると、255℃の融点を有する黄色固体が0.5 g(収率46%)得られた。
【０１１０】
生成物は以下の分析データを示した。
NMR(CDCl3)δ 7.92(1H,S,ビニル), 7.80(2H,S), 5.76(1H,S,OH), 3.75(2H,Br,S,NH2), 1.48(18H,S); MS m/e 364(M+1,28), 363(M+,100%), 348(M-CH3,58%), 292(M-56-CH3,31%), 147(41%), m/e。
【０１１１】
5.5.  (E)-2-(3-フェニル-n-プロピルアミノカルボニル)-3-(3-イソプロピル-4-ヒドロキシ-5-(2-プロピルフェニル)アクリロニトリルの合成
(E)-2-(3-フェニル-n-プロピルアミノカルボニル)-3-(3-イソプロピル-4-ヒドロキシ-5-(2-プロピルフェニル)アクリロニトリル(化合物5)の好ましい合成方法は以下の通りである。0.4 g の3,5-ジイソプロピル-6-ヒドロキシ-ベンズアルデヒド(合成手順に関しては5.11の項（段階2)参照)と、0.55 gのN-3-フェニル-n-プロピルシアノアセトアミド(Gazit et al., 1991, J. Med. Chem. 34(6):1896-1907に記載の手順に従って合成)と40 mg のβ-アラニン(20 mlのエタノール中)を5時間還流させた。精製(H2O, HCl, ジクロロメタン)によって油状物が得られた。この油状物は静置すると結晶化した。ベンゼン-ヘキサンですりつぶすと、120℃の融点を有する0.4 g の淡黄色固体が得られた。さらに0.55 gの固体が母液から得られた。総収率は65%であった。
【０１１２】
生成物は以下の分析データを示した。
NMR(CDCl3)δ 8.24(1H,S,ビニル), 7.73(2H,S), 7.23(5H,m), 5.50(1H,S,OH), 3.46(2H,q,J=6.7Hz,NH-CH2), 3.17(2H,Septet,J=7.0Hz), 2.71(2H,t,J=6.7Hz), 1.95(2H,quintet,J=6.7Hz), 1.30(12H,d,J=7.0Hz)。
【０１１３】
5.6.  (E)-2-(ベンジルアミノカルボニル)-3-(3-ヨード-4,5-ジヒドロキシフェニル)アクリロニトリルの合成
(E)-2-(ベンジルアミノカルボニル)-3-(3-ヨード-4,5-ジヒドロキシフェニル)アクリロニトリル(化合物6)の好ましい合成方法は以下の通りである。0.4 g の2-シアノ-3-(4-ヒドロキシ-3-ヨード-5-メトキシ)フェニルアクリロニトリル(4-ヒドロキシ-3-ヨード-5-メトキシベンズアルデヒドとN-ベンジルシアノアセトアミドとの縮合によって調製)と0.5 mlのBBr3との20 ml のジクロロメタン中の混合物を室温で2時間撹拌した。これを精製(H2O,酢酸エチル)すると220℃の融点を有する黄色固体が0.16 g (収率41%)得られた。
【０１１４】
生成物は以下の分析データを示した。
NMR(アセトン-d6) δ 8.05(1H,S,ビニル), 7.85(1H,d,J=2.1Hz), 7.70(1H,d,J=2.1Hz), 7.30(5H,m), 4.6(2H,S)。
【０１１５】
5.7.  (E,E)-2-[[2-[[1-シアノ-2-(3,4-ジヒドロキシフェニル)エテニル] カルボニルアミノ]エチル]アミノカルボニル-3-(3,4-ジヒドロキシフェニル)アクリロニトリルの合成
(E,E)-2-[[2-[[1-シアノ-2-(3,4-ジヒドロキシフェニル)エテニル]カルボニルアミノ]エチル]アミノカルボニル]-3-(3,4-ジヒドロキシフェニル)アクリロニトリル(化合物7)の好ましい合成方法は以下の通りである。20 ml のエタノール中の0.7 g の3,4-ジヒドロキシベンズアルデヒドと0.5 g のN-(シアノメチルカルボニルアミノ-n-プロピル)シアノアセトアミドと4滴のピペリジンとの混合物を4時間還流させた。水を添加し、酢酸エチルで抽出し、蒸発させ、エタノール-ジクロロメタンですりつぶすと、277℃の融点を有する黄色固体が0.34 g(収率32%)で得られた。
【０１１６】
5.8.  (E,E)-2-[[4-[[1-シアノ-2-(3,4-ジヒドロキシフェニル)エテニル] カルボニルアミノ]-n-ブチル]アミノカルボニル]-3-(3,4-ジヒドロキシフェニル)アクリロニトリルの合成
(E,E)-2- [4-[[1-シアノ-2-(3,4-ジヒドロキシフェニル)エテニル] カルボニルアミノ]-n-ブチル]アミノカルボニル]-3-(3,4- ジヒドロキシフェニル)アクリロニトリル(化合物8)の好ましい合成方法は以下の通りである。この化合物は前述の化合物合成手順(前出の5.7の項)に従って調製した。この手順によって283℃の融点を有する黄色固体(収率86%)が得られた。
【０１１７】
生成物は以下の分析データを示した。
NMR(アセトン-d6))δ 8.25(1H,S,ビニル), 7.23(2H,5,H2,6)。
【０１１８】
5.9.  (E,E)-[2-[2-シアノ-2-(3,4-ジヒドロキシフェニルカルボニル)エテニル]スルホニル]-3-(3,4-ジヒドロキシフェニル)アクリロニトリルの合成
(E,E)-[2-[2-シアノ-2-(3,4-ジヒドロキシフェニルカルボニル)エテニル]スルホニル]-3-(3,4-ジヒドロキシフェニル)アクリロニトリル(化合物9)の好ましい合成方法は以下の通りである。30 ml のエタノール中の0.3 g のN-(2-シアノメチルカルボニルアミノエチル)シアノアセトアミドと0.55 gの3,4-ジヒドロキシベンズアルデヒドと30 mg のβ-アラニンの混合物を6時間還流させ、精製した。酢酸エチルを蒸発させ、アセトン-ベンゼンですりつぶすと、融点264℃を有する黄色固体が0.45 g (収率58%)得られた(手が染まる)。
【０１１９】
生成物は以下の分析データを示した。
MS m/e 312(28%), 265(24), 211(100%), 185(15%), 161(44%), 160(M-(化合物構造),80%), 157(35), 129(22), 114(43) m/e; NMR(アセトン-d6)δ 8.15(2H,s, ビニル), 7.77(2H,d,J=2.3Hz,H2), 7.59(2H,dd,J=8.4,2.3Hz,H6), 7.07(2H,d,J=8.4Hz,H5)。
【０１２０】
5.10.  (E)-3-(インドル-5-イル)-2-(3,4-ジヒドロキシフェニルカルボニル)アクリロニトリルの合成
(E)-3-(インドル-5-イル)-2-(3,4-ジヒドロキシフェニルカルボニル)アクリロニトリル(化合物10)の好ましい合成方法は以下の通りである。130 mgの5-ホルミルインドールと180 mgのシアノメチル-(3,4-ジヒドロキシフェニル)ケトン(Gazit et al., 1991, J. Med. Chem. 34:1896-1907 に記載の手順で調製)と30 mg のβ-アラニンとの混合物を3時間還流させた。次いで水を添加し、反応物を酢酸エチルで抽出すると、ある程度のアルデヒドを含有する油状固体が得られた。クロマトグラフィー処理すると、185℃の融点を有する純粋な橙色固体が86 mg(収率28%)得られた。
【０１２１】
生成物は以下の分析データを示した。
MS m/e 304(M+,8%), 177(29), 137(C6H3(OH)2CO+,100), 117(12), 116(インドール+,15), 109(93); NMR(アセトン-d6)δ 8.40(1H,d,J=1.6Hz,H4), 8.18(1H,S,ビニル), 8.03(1H,dd,J=8.6,1.6Hz,H6), 7.63(1H,d,J=8.6Hz,H5), 7.54-7.40(3H,m,H3+H2,6), 7.0(1H,d,J=8.6Hz,HS), 6.69(1H,d,J=3.2Hz,H2)。
【０１２２】
5.11.  (E)-2-[3-フェニル-n-プロピルアミノチオカルボニル]-3-(3,5-ジイソプロピル-4-ヒドロキシフェニル)アクリロニトリルの合成
(E)-2-[3-フェニル-n-プロピルアミノチオカルボニル]-3-(3,5- ジイソプロピル-4-ヒドロキシフェニル)アクリロニトリル(化合物11)の好ましい合成方法は以下の通りである。
1.  6.2 g のN-フェニルプロピルシアノアセトアミド(Gazit et al., 1991, J. Med. Chem. 34(6):1896-1907に記載の手順で調製)と15 gのLawsson試薬の60 ml のトルエン中の混合物を3時間還流させた。クロマトグラフィー処理すると、1.5g(収率22%)のN-フェニルプロピルシアノチオアセトアミドが赤色固体として得られた。生成物は以下の分析データを示した。
NMR(CDCl3)δ 7.3(5H,m), 3.81(2H,S), 3.71(2H,q,J=7.0Hz), 2.74(2H,t,J=7.0Hz), 2.05(2H,quintet,J=7.0Hz)。
2.  60 ml のトリフルオロ酢酸(TFA)中の18 gの2,6-ジイソプロピルフェノールと1.8 g のヘキサメチレントリアミン(HMTA)との混合物を3.5時間還流させた。精製し、クロマトグラフィー処理し、ヘキサンですりつぶすと、103℃の融点を有する白色固体状の3,8-ジイソプロピル-6-ヒドロキシベンズアルデヒドが5.3 g(収率26%)得られた。生成物の分析により以下のデータが得られた。
NMR(CDCl3)δ 9.87(1H,S,CHO), 7.63(2H,S), 3.19(2H,septet,J=7.7Hz), 1.30(12H,d,J=7.7Hz)。
3.  0.6 g の段階1の化合物(N-フェニルプロピルシアノチオアセトアミド)と0.6 g の段階2の化合物と40 mg のβ-アラニンとを40 ml のエタノール中で4時間還流させた。蒸発させ、クロマトグラフィー処理すると、0.6 g(収率50%)の化合物11が粘稠油状物として得られた。
NMR(CDCl3)δ 8.76(1H,S,ビニル), 7.78(2H,S,H2,6), 7.25(5H,m), 5.60(1H,S,OH), 3.90(2H,q,J=7.0Hz), 3.17(2H,septet,J=7.0Hz), 2.76(2H,t,J=7.0Hz), 2.11(2H,quintet,J=7.0Hz), 1.29(12H,d,J=7.0Hz); MS m/e 407(M+1,55), 406(M+,70), 373(M-CH3-H2O,100), 363(M-イソプロピル,72), 272(M-NH(CH2)3Ph,20), 259(58), 230(28), 91(28)。
【０１２３】
5.12.  (E)-2-[1-シアノ-2-(5-ブロモ-3,4-ジヒドロキシフェニル)エテニルスルホニル]-3-(3-ブロモ-4,5-ジヒドロキシフェニル)アクリロニトリルの合成
(E)-2-[1-シアノ-2-(5-ブロモ-3,4-ジヒドロキシフェニル)エテニルスルホニル]-3-(3-ブロモ-4,5-ジヒドロキシフェニル)アクリロニトリル(化合物12)の好ましい合成方法は以下の通りである。230 mgの5-ブロモ-3,4-ジヒドロキシベンズアルデヒドと76 mg のジアセトニトリルスルホンと10 mg のβ-アラニンとを含有する10 mlのエタノールを5時間還流させた。冷却し濾過すると、300℃を上回る融点を有する橙色固体が220 mg (収率76%)得られた。
【０１２４】
生成物は以下の分析データを示した。
NMR(アセトン-d6)δ 8.18(2H,S,ビニル), 7.90(2H,d,J=1.6Hz), 7.78(2H,d,J=1.6Hz)。
【０１２５】
5.13.  2-[(4-ヨードフェニル)アミノ]-6,7-ジメチルキノキサリンの合成
2-[(4-ヨードフェニル)アミノ]-6,7-ジメチルキノキサリン(化合物13)の好ましい合成方法は以下の通りである。
1.  30 ml のエタノール中の2 g の4,5-ジメチル-1,2-ジアミノベンゼンと1.5 gのグリオキサル酸水和物との混合物を2時間還流させた。冷却し濾過すると、263℃の融点を有する白色固体が1.2 g(収率46%)得られた。生成物は以下の分析データを示した。
NMR(DMSO d6) δ 60:40混合物
主要 8.07(1H,S), 7.55(1H,S), 7.06(1H,S), 2.30(6H,S)
マイナー 8.02(1H,S), 7.42(1H,S), 7.28(1H,S), 2.28(6H,S)。
2.  1.1 g の段階1の生成物(6,7-ジメチルキノキサロン)と1 mlのオキシ塩化リン(POCl3)と1 mlのジメチルアニリンとを20 ml のトルエン中で2時間還流させた。精製し(NH3,ジクロロメタン)、クロマトグラフィー処理すると、86℃の融点を有する白色固体(2-クロロ-6,7-ジメチルキノキサリン)が0.4 g(収率33%)得られた。生成物は以下の分析データを示した。
NMR(CDCl3)δ 8.68(1H,S,H2), 7.85(1H,S), 7.76(1H,S), 2.50(6H,S)。
3.  10 ml のエタノール中の210 mgの段階2の生成物(2-クロロ-6,7-ジメチルキノキサリン)と0.8 g のp-ヨードアニリンとの混合物を100℃で4時間加熱した。クロマトグラフィー処理すると、228℃の融点を有する淡緑色の固体が245 mg (収率60%)得られた。
【０１２６】
生成物は以下の分析データを示した。
NMR(CDCl3)δ 8.32(1H,S), 7.67(1H,S), 7.64(1H,S), 7.68, 7.56(4H,Abq,JAB=9.0Hz)。
【０１２７】
5.14.  2-(3,4-ジヒドロキシフェニル)-6,7-ジメチル-キノキサリンの合成
2-(3,4-ジヒドロキシフェニル)-6,7-ジメチル-キノキサリン(化合物14)の好ましい合成方法は以下の通りである。1.4 g の4,5-ジメチル-1,2-フェニレンジアミンと1.9 g のα-クロロ-3,4-ジヒドロキシアセトフェノンとを15 ml のジメチルスルホキシド中で100℃で1.5時間加熱した。80 ml のH2Oを添加し、懸濁物を室温で一夜静置し、濾過すると2.5 g(収率67%)の褐色固体が得られた。
【０１２８】
生成物は以下の分析データを示した。
NMR(アセトン-d6)δ 9.28(1H,S,H2), 8.40(Br,S,OH), 7.89(1H,d,J=2.2Hz,H2'), 7.82(2H,S,H55.8), 7.72(1H,dd,J=8.3,2.2Hz,H6'), 7.02(1H,d,J=8.3Hz,H5'), 2.52(6H,S,CH3); DMSO-d6 9.30(1H,S,H2), 7.81(2H,S,H5,8), 7.75(1H,d,J=2.2Hz,H2'), 7.62(1H,dd,J=8.3,2,2Hz,H6'), 6.90(1H,d,J=8.3Hz,H5'), 2.44(6H,S,CH3)。
【０１２９】
2-(3,4-ジヒドロキシ)フェニル-6,7-ジメチル-キノキサリンの第二の合成方法は以下の通りである。各1 g 及び1.9 g の上記試薬を25 ml のエタノール中で2時間還流させた。冷却し濾過すると278℃の融点を有する濃黄色固体が0.76 g (収率18%)HCl塩として得られた。
【０１３０】
5.15.  4-(4-ヨードフェニルアミノ)-6,7-ジメトキシキナゾリンの合成
この化合物(化合物15)の好ましい合成方法は以下の通りである。
1.  7 g の4,5-ジメトキシ-2-アミノ安息香酸と8 mlのホルムアミドとの混合物を170℃で2時間加熱した。冷水を添加し、固体を濾過すると、308℃の融点を有する淡褐色固体(6,7-ジメトキシキナゾロン)が0.9 g(収率12%)得られた。
【０１３１】
生成物は以下の分析データを示した。
NMR(DMSO-d6)δ 8.0(1H,S), 7.43(1H,S), 7.12(1H,S), 3.89(3H,S), 3.85(3H,S)。
2.  0.8 g の段階1の化合物と1 mlのPOCl3と1 mlのジメチルアニリンとを20 ml のトルエン中で3.5時間還流させた。精製しヘキサンですりつぶすと、188℃の融点を有する淡灰色固体が0.5 g(収率57%)得られた。
【０１３２】
生成物は以下の分析データを示した。
NMR(CDCl3)δ 8.88(1H,S), 7.41(1H,S), 7.36(1H,S), 4.09(3H,S), 4.08(3H,S)。
3.  10 ml のエタノール中の300 mgの4-クロロ-6,7-ジメトキシキナゾリンと300 mgの3-ヨードアニリンとの混合物を1時間還流させた。冷却し濾過すると、540 mg (収率93%)の白色固体がHCl塩として得られた。固体は278℃の融点を有していた。
【０１３３】
生成物は以下の分析データを示した。
NMR(DMSO-d6)δ 8.87(1H,S,H2), 8.27(1H,S), 8.13(1H,S), 7.8-7.66(2H,m), 7.33(2H,m), 4.02(3H,S), 4.0(3H,S)。
【０１３４】
5.16.  4-(3-ヒドロキシフェニルアミノ)-6-メチルキナゾリンの合成
4-(3-ヒドロキシフェニルアミノ)-6-メチルキナゾリン(化合物16)の好ましい合成方法は以下の通りである。
1.  8 g の5-メチル-2-アミノ安息香酸と15 ml のホルムアミドとの混合物を170℃で1.5時間加熱した。水を添加し、固体を濾過すると、268℃の融点を有する褐色−白色固体(6-メチルキナゾロン)が7.3 g(収率83%)得られた。
2.  40 ml のトルエン中の5 g の段階1の化合物と5 mlのPOCl3と5 mlのジメチルアニリンとの混合物を3.5時間還流させた。精製(NH3, H2O,酢酸エチル)すると、暗色固体が得られた。クロマトグラフィー処理すると、98℃の融点を有する白色固体(4-クロロ-6-メチル-キナゾリン)が1.61 g (収率29%)得られた。生成物は以下の分析データを示した。
NMR(CDCl3)δ 9.0(1H,S,H2), 8.04(1H,d,J=2.0HzH5), 7.96(1H,d,J=8.8 HzH8), 7.80(1H,dd,J=8.8,2.0Hz,H7), 2.62(3H,S)。
3.  10 ml のエタノール中の230 mgの段階2の化合物と145 mgのm-アミノフェノールとの混合物を50分間還流させた。冷却し、濾過すると300 mg (収率80%)の淡黄色固体がHCl塩として得られた。生成物は262℃の融点を有していた。
【０１３５】
生成物は以下の分析データを示した。
NMR(CDCl3)δ 8.89(1H,S,H2), 8.72(1H,S,H5), 7.90(2H,ABq,J=8.0Hz,H7,8), 7.2(3H,m), 6.75(1H,m), 2.55(3,H,S)。
【０１３６】
5.17.  2-(3,4-ジクロロフェニルアミノ)-6,7-ジメチルキノキサリンの合成
2-(3,4-ジクロロフェニルアミノ)-6,7-ジメチルキノキサリン(化合物17)の好ましい合成方法は以下の通りである。150 mgの2-クロロ-6,7-ジメチルキノキサリン化合物(5.13の項(段階2)の手順で合成し得る)と0.7 g の3,4-ジクロロアニリンとの混合物を100℃で3.5時間加熱した。クロマトグラフィー処理すると、229℃の融点を有する黄褐色固体が80 mg(収率33%)得られた。
【０１３７】
生成物は以下の分析データを示した。
NMR(CDCl3)δ 8.32(1H,S), 8.16(1H,d,J=2.4Hz,H2'), 7.71(1H,Br,S), 7.65(1H,Br,S), 7.57(1H,dd,J=2.4,9.2Hz,H6'), 7.43(1H,d,J=9.2Hz,H5'), 2.48(3H,S), 2.46(3H,S)。
【０１３８】
5.18.  4-(3-ヒドロキシフェニルアミノ)-キナゾリンの合成
4-(3-ヒドロキシフェニルアミノ)-キナゾリン(化合物18)の好ましい合成方法は以下の通りである。
1.  50 ml のトルエン中の4.6 g のキナゾロンと5 mlのPOCl3と5 mlのジメチルアニリンとの混合物を3.5時間還流させた。精製(NH3, H2O 及び酢酸エチル)すると緑色の油状物が得られた。クロマトグラフィー処理すると、淡褐色固体が得られた。160℃(11 mmHg)で昇華させると、72℃の融点を有する白色固体(4-クロロ-キナゾリン)が1.48 g (収率29%)得られた。この生成物は以下の分析データを示した。
NMR(CDCl3)δ 9.05(1H,S), 8.27(1H,m), 8.1-7.9(2H,m), 7.75(1H,m)。
2.  10 ml のエタノール中の0.37 gの段階1の化合物と0.24 gのm-ヒドロキシアニリンとの混合物を1時間還流させた。冷却し、濾過すると0.25 g (収率41%)の淡黄色固体がHCl塩として得られた。一夜静置すると固体が淡緑色に変色した。生成物は268℃の融点を有していた。
【０１３９】
生成物は以下の分析データを示した。
NMR(DMSO-d6)δ 8.99(1H,S), 8.93(2H,S), 8.15-7.81(3H,m), 7.31-7.12(3H,m), 6.77(1H,d,J=7.4Hz)。
【０１４０】
5.19.  2-(n-プロピルアミノ)-3-クロロキノキサリンの合成
2-(n-プロピルアミノ)-3-クロロキノキサリン(化合物19)の好ましい合成方法は以下の通りである。0.8 g の2-フェニル-3,6,7-トリメチルキノキサリンと10 ml のジメチルスルホキシドを90℃で40分間加熱した。精製し、クロマトグラフィー処理すると148℃の融点を有する白色固体が40 mg(収率4%)得られた。生成物は以下の分析データを示した。
NMR(CDCl3)δ 8.03(1H,S), 7.90(1H,S), 7.60(5H,m), 6.96(1H,S,CHBr2), 2.52(6H,S)。
【０１４１】
同じ手順に従って、150℃の融点を有する白色固体が0.3 g(収率47%)得られた。生成物は以下の分析データを示した。
NMR(CDCl3)δ 11.30(1H,S,CHO), 8.05(1H,S), 7.96(1H,S), 7.67(2H,m), 7.55(3H,m), 2.55(6H,S)。
【０１４２】
5.20.  4-[(4-メチルフェニル)メルカプト] キナゾリンの合成
この化合物(化合物20)の好ましい合成方法は以下の通りである。20 ml のCH3CN中で250 mgの4-クロロ-6-メチル-キナゾリンと180 mgのp-チオクレゾールと100 mgの水酸化カリウム(KOH)との混合物を調製し、室温で24時間撹拌する。精製し(H2O、ジクロロメタン)、ヘキサンですりつぶすと96℃の融点を有する淡青色固体が40 mg(収率10%)得られた。
【０１４３】
生成物は以下の分析結果を示した。
NMR(CDCl3)δ 8.81(1H,S), 7.96(1H,d,J=2.0Hz,H5), 7.85(1H,d,J=9.0Hz,H8), 7.68(1H,dd,J=9.0,2.0Hz,H7), 7.51, 7.30(4H,ABq,JAB=8.2Hz), 2.56(3H,S), 2.42(3H,S); MS m/e 266 (M+,40%), 265(M-1,100%) m/e。
【０１４４】
5.21.   2-クロロ-4-(3-クロロフェニルアミノ)-6,7-ジメトキシキナゾリンの合成
2-クロロ-4-(3-クロロフェニルアミノ)-6,7-ジメトキシキナゾリン(化合物21)の好ましい合成方法は以下の通りである。
1.  30 ml のトルエン中の8 g の6,7-ジメトキシ-2,4-キナゾリンジオンと23 mlのPOCl3と10 ml のジメチルアニリンとの混合物を5時間還流させた。精製し(H2O、NH3、ジクロロメタン)、ヘキサンですりつぶすと融点156℃を有する淡緑色固体(2,4-ジクロロ-6,7-ジメトキシ-キナゾリン)が7 g(収率75%)得られた。生成物は以下の分析結果を与えた。
NMR(CDCl3)δ 7.36(1H,S), 7.28(1H,S), 4.07(3H,S), 4.06(3H,S)。
2.  20 ml のエタノール中の2.6 g の段階1の化合物と1.3 g のm-クロロアニリンとの混合物を1時間還流させた。混合物を冷却し、濾過すると3.5 g(収率90%)の薄桃色の固体が得られた。
【０１４５】
代替的には、遊離塩基を用いる第二の合成方法を使用した。上記のように調製した3.4 g の材料をNH3-H2Oで処理し、酢酸エチルで抽出した。ベンゼン-ヘキサンから再結晶化させると、222℃の融点を有する白色固体が2.3 g(収率74%)得られた。
【０１４６】
生成物は以下の分析データを示した。
NMR(CDCl3)δ 7.74(1H,t,J=2.2Hz,H2'), 7.63(1H,m), 7.30(1H,m), 7.16(1H,S), 7.12(1H,m), 6.98(1H,t,J=8.0Hz), 4.0(3H,S), 3.97(3H,S)。
【０１４７】
5.22.  (Z)-1-(2-クロロフェニル)-2-[2,2-ジシアノエテニル]ヒドラジンの合成
(Z)-1-(2-クロロフェニル)-2-[2,2-ジシアノエテニル]ヒドラジン(化合物22)の好ましい合成方法は以下の通りである。20 ml の希塩酸及び20 ml のH2O中の4 g のm-クロロ-アニリンに2.4 g の亜硝酸ナトリウム(NaNO2)を添加し、次いで約0.5時間氷冷した。次に混合物を、100 mlのエタノール中の2.2 g のマロノニトリルと10 gの酢酸カリウムの溶液に添加した。0.5時間冷却し、1.5時間室温に維持した後、固体を濾過し、水洗し、乾燥すると、2.4 g(収率37%)の黄色固体が得られた。
【０１４８】
生成物は以下の分析データを示した。
mp-170℃; NMR(CDCl3)δ 7.4-7.2, m。
【０１４９】
5.23.   2-フェニル-1,4-ジアザ-アントラセンの合成
2-フェニル-1,4-ジアザ-アントラセン(化合物23)の好ましい合成方法は以下の通りである。0.47 gの2,3-ジアミノナフタレン及び0.47 gのフェニルグリオキサル水和物を含む20 ml のエタノールを1.5 時間還流させた。冷却及び濾過して、融点が163 ℃の、0.5 g (65%) の淡褐色固体を得た。
【０１５０】
生成物は以下の分析値を示した。
NMR (CDCl3):δ 9.38 (1H, 1.c., H2), 8.71, 8,67, (2H, 2d, H5,10), 8.25, 8.10 (4H, AA'BB'm, H6-9), 7.58 (5H, m, Ph); MS m/e 256 (M+, 100%), 229 (M-CN, 12%), 126(71%) m/e。
【０１５１】
5.24.  N-(2,5-ジヒドロキシルベンジル)-4-メトキシカルボニルアニリンの合成
N-(2,5-ジヒドロキシルベンジル)-4-メトキシカルボニルアニリン(化合物24)の好ましい合成方法は以下の通りである。0.7 g の2,5-ジヒドロキシベンズアルデヒド及び0.75 gの3-アミノメチルベンゾエートを含む40 ml のメタノールを3時間還流させ、冷却した。その後0.5 g のナトリウムシアノボロハイドライド(NaCNBH4) を加えた。室温で12時間置き、精製(H2O,酢酸エチル) 、及びクロマトグラフィー (シリカゲル、ジクロロメタン中5% CH3OHで溶出) の後、0.42 g (31% 収率) の淡黄色固体を得た。
【０１５２】
生成物は以下の分析値を示した。
mp 175℃; NMR (アセトン-d6)δ 7.78, 6.68 (4H, ABq, JAB=8.8 Hz), 6.74 (1H,d,J=3.0 Hz, H6), 6.72 (1H,d,J=8.5 Hz, H3), 6.55 (1H,d,J=8.5,3.0 Hz,H4), 4.34 (2H,s,CH2N), 3.76 (3H,s,COOCH3)。
【０１５３】
5.25.   N-(2-クロロフェニル)-2-シアノ-2-(N-3-トリフルオロフェニルアミノカルボニル)-チオアセタミドの合成
N-(2-クロロフェニル)-2-シアノ-2-(N-3-トリフルオロフェニルアミノカルボニル)-チオアセタミド(化合物25)は以下の通り合成できる。
【０１５４】
680 mgのナトリウムエトキシドを0℃の1.6 g のN-3-トリフルオロメチルフェニルシアノアセタミドを含む20 ml のテトラヒドロフラン溶液に加えた。この混合物を0℃で1時間攪拌し、1.7 g の2-クロロフェニルイソチオシアネートを含む5 mlのテトラヒドロフランに滴下した。添加の後、混合物を室温に温め、50℃で6時間加熱した。冷却し、全てのエタノールを除去し、得られた固体を10 ml の水中に再懸濁した。これを15 ml の0.3 M 水酸化ナトリウム溶液に加え、激しく振盪して50 mlのエチルエーテル中で洗浄した。その後水層を1 N 塩酸でpH 1まで酸性化した。固体を吸引濾過により回収して630 mgのN-2-クロロフェニル(-2-シアノ-2-N-3-トリフルオロフェニルアミノカルボニル)-チオアセタミドを得た。
【０１５５】
5.26.  (E)-2- シアノメチルスルホニル-3-(3-ブロモ-4,5-ジヒドロキシフェニル) アクリロニトリルの合成
(E)-2-シアノメチルスルホニル-3-(3-ブロモ-4,5-ジヒドロキシフェニル) アクリロニトリル(化合物26)の好ましい合成法は以下の通りである。500 mgの5-ブロモ-3,4-ジヒドロキシベンズアルデヒド及び700 mgのスルホニルジアセトニトリルの混合物を含む6 mlのエタノールを２〜３滴のピペリジンとともに4時間還流させた。ロータバップ(rota vap)中でエタノールを除去し、混合物を酢酸エチル、希釈酸及びブラインで精製した。粗生成物の一部をC-18カラム上でHPLCにより精製し、約50 mg の(E)-2-シアノメチルスルホニル-3-(3-ブロモ-4,5-ジヒドロキシフェニル) アクリロニトリルを得た。
【０１５６】
5.27.  (1-ベンジル-2-ヒドロキシフェニル) ピロリド[3,4-b]3,4-ジヒドロ-4-オキソキナゾリンの合成
(1-ベンジル-2-ヒドロキシフェニル) ピロリド[3,4-b]3,4-ジヒドロ-4- オキソキナゾリン(化合物27)の好ましい合成法は以下の通りである。0.01 mol (1.07 g) のベンジルアミンと0.01 mol (1.22 g) の4-ヒドロキシベンズアルデヒドを15 ml のエタノール中で混合し水浴上で15分間還流させた。0.01 mol (3.44 g) の2-(1'-トシルオキシエチル)-キナゾリン-4-オン及び１滴のピリジンを加え、混合物を6時間還流させた。得られた溶液を蒸発させ、炭酸水素ナトリウムの5%の水溶液で抽出した。残った結晶を濾別し、水で洗浄し、イソプロパノールから再結晶させた。217-219 ℃の融点を有する3.40 gの化合物が得られた(89%収率) 。
【０１５７】
生成物(C24H21N3O2)は以下の分析値を示した。
生成物の元素分析[%]
計算値:   C: 75.18,    H: 5.52,    N: 10.96
測定値:   C: 75.26,    H: 5.47,    N: 10.88。
【０１５８】
5.28.  2-(3-クロロフェニルアミノ)-6,7-ジメチルキノキサリンの合成
2-(3-クロロフェニルアミノ)-6,7-ジメチルキノキサリン(化合物28)の好ましい合成法は以下の通りである。200 mgの2-クロロ-6,7-ジメチルキノキサリン及び700 mgのm-クロロアニリンを溶媒なしに100 ℃で2.5時間加熱した。クロマトグラフィーにより、175 ℃の融点を有する100 mgの白色固体(34%収率)を得た。
【０１５９】
生成物は以下の値を示した。
NMR (CDCl3):δ 8.33 (1H,S), 7.97, (1H,m), 7.68 (1H,S), 7.62(1H,S), 7.54(1H,m), 7.27(1H,m), 7.05(1H,m), 2.45(3H,S), 2.43(3H,S); MS m/e 285, 283(M+,29.81%), 248(M-Cl,7)。
【０１６０】
5.29.  (E)-2-(3,4-ジヒドロキシベンゾイル)-3-ジヒドロキシフェニル) アクリロニトリルの合成
(E)-2-(3,4-ジヒドロキシベンゾイル)-3-ジヒドロキシフェニル) アクリロニトリル (化合物29) の好ましい合成方法は以下の通りである。固体シアン化カリウム(KCN)(3 g, 46 mmol) を2-クロロ-3',4'-ジヒドロキシアセトフェノン(6 g)を含む30 ml のジメチルスルホキシドに加えた。反応混合物を100 ℃で2.5時間攪拌した。冷却後、100 mlの1 N塩酸を加え、反応混合物を酢酸エチルで抽出した。乾燥させエバポレートさせることにより赤色油状固体を得、これをシリカゲル上でクロマトグラフィーにより精製した。ジクロロメタン中3%メタノールにより溶出された最初のフラクションをエバポレートさせ、ジクロロメタンですりつぶした。濾過すると、217 ℃の融点を有する淡黄色の固体が1 g (18%収率) 得られた。
【０１６１】
生成物は以下の分析値を示した。
NMR(アセトン-d6)δ 7.51(2H,m,H2,6), 6.97(1H,d,J=8.0 Hz,H5), 4.43(2H,s,CH2CN)。
【０１６２】
5.30.  2-(4-ブロモフェニルアミノ)-6,7-キノキサリンの合成
2-(4-ブロモフェニルアミノ)-6,7-キノキサリン (化合物30) の好ましい合成法は以下の通りである。200 mgの2-クロロ-6,7-ジメチルキノキサリン (5.13の項、段階2のプロトコルにより合成) 及び0.8 g のp-ブロモアニリンを100 ℃で3.5 時間加熱した。クロマトグラフィーの後、235 ℃の融点を有する、淡黄色固体を25 mg (37%収率) 得た。
【０１６３】
生成物は以下の分析値を示した。
NMR (CDCl3):δ 8.32 (1H,S), 7.68 (1H,S), 7.60 (1H,Br,S), 7.68, 7.48(4H,ABq,JAB=8.8Hz), 2.45(3H,S), 2.43(3H,S)。
【０１６４】
6.  実施例: FLK-1/NIH 細胞中のFLK-1 受容体のキナーゼ活性を測定するためのELISA アッセイ
ELISA アッセイを行って、FLK-1 受容体のキナーゼ活性、より具体的には、FLK-1 受容体に対するタンパク質チロシンキナーゼ活性の阻害または活性化を測定した。
【０１６５】
6.1.  材料及び方法
材料: 以下の試薬及び物品を使用した。
a.  Corning 96-ウェルELISA プレート (Corning カタログ番号25805-96)
b.  Cappelヤギ抗ウサギIgG(カタログ番号55641)
c.  PBS (Gibco、カタログ番号450-1300EB)
d.  TBSWバッファー(50 mMトリス(pH 7.2)m 150 mM NaCl 及び0.1% Tween-20)
e.  エタノールアミンストック(10%エタノールアミン(pH 7.0)、4 ℃で保存)
f.  HNTGバッファー(20 mM HEPESバッファー(pH 7.5), 150 mM NaCl, 0.2% Triton X-100及び10% グリセリン)
g.  EDTA (0.5 M (pH 7.0)、100Xストックとして)
h.  オルトバナジン酸ナトリウム (0.5 M 、100Xストックとして)
i.  ピロリン酸ナトリウム (0.2 M 、100Xストックとして)
j.  NUNC 96 ウェルV底ポリプロピレンプレート(Applied Scientific 、カタログ番号AS-72092)
k.  NIH3T3C7#3細胞(FLK-1感染細胞)
l.  1X高グルコースL グルタミンを含むDMEM (カタログ番号11965-050)
m.  FBS, Gibco (カタログ番号16000-028)
n.  L-グルタミン、Gibco(カタログ番号25030-016)
o.  VEGF, PeproTech, Inc.(カタログ番号100-20)(Milli-Q dH2O中に1 μg/100 μl ストックとして保持し-20 ℃で保存)
p.  アフィニティ精製抗-flk-1抗血清、Enzymology Lab, Sugen, Inc.
q.  ホスホチロシンに特異的なUB40モノクローナル抗体、Enzymology Lab, Sugen, Inc.
r.  EIA グレードヤギ抗マウスIgG-POD (BioRad 、カタログ番号172-1011)
s.  2,2-アジド-ビス(3-エチルベンズ-チアゾリン-6-スルホン酸(ABTS)溶液(100 mM クエン酸 (無水), 250 mM Na2HPO4 (pH 4.0), 0.5 mg/ml ABTS(Sigmaカタログ番号A-1888))、溶液は使用まで4 ℃で暗所で保存する。
t.  H2O2 (30%溶液)(Fisherカタログ番号H325)
u.  ABTS/H2O2 (15 ml ABTS 溶液、2 μl H2O2) 、使用の5 分前に製造し室温に置く。
v.  H2O 中の0.2 M HCl ストック
w.  ジメチルスルホキシド(100%)(Sigmaカタログ番号D-8418)
y.  トリプシン-EDTA (Gibco BRLカタログ番号25200-049)
プロトコル: ELISA アッセイを行うのに以下のプロトコルを使用した。
1.  Corning 96-ウェルELISA プレートを、ウェルあたり1.0 μg のCappel抗ウサギIgG 抗体を含む0.1 M Na2CO3 pH 9.6で被覆する。最終容量をウェルあたり150 μl とする。プレートを終夜4℃で被覆する。プレートは4℃で保存すると2週間まで維持できる。
2.  150 mm組織培養皿中で37℃、5% CO2中で、30 ml の増殖培地 (DMEM, 2.0 mM L- グルタミン, 10% FBS)中でコンフレントまで細胞を増殖させる。
3.  トリプシン処理により細胞を回収し、200 μl の増殖培地中に25,000細胞/ウェルでCorning 25850 ポリスチレン96-ウェル丸底細胞プレートに播種する。
【０１６６】
4.  37℃、5% CO2において少なくとも１日細胞を増殖させる。
5.  D-PBS 1Xで細胞を洗浄する。
6.  ウェルあたり200 μl の飢餓培地(DMEM, 2.0 mM L-グルタミン, 0.1% FBS) を加える。37℃、5% CO2で終夜インキュベートする。
【０１６７】
7.  飢餓培地を使用して、ポリプロピレン96ウェルプレート中で化合物/抽出物1:20に希釈する。対照ウェルで使用するためにジメチルスルホキシドを1:20に希釈する。
8.  96ウェル細胞培養プレートから飢餓培地を除去し、各ウェルに162 μl の新鮮飢餓培地を加える。
9.  18μl の1:20希釈の化合物/抽出物希釈液 (段階7からのもの) を各ウェルに加え、対照のウェル(+/- VEGF)に1:20ジメチルスルホキシド希釈物を加え、細胞刺激の後に1:200 の最終希釈度とする。最終的にジメチルスルホキシドは0.5%である。プレートを37℃、5% CO2で2時間インキュベートする。
10. プレートを逆さにして液体を除去することにより非結合抗体をELISA プレートから除去する。TBSW + 0.5% エタノールアミン, pH 7.0により3回洗浄する。プレートをペーパータオルで軽く押さえて余分な液体及び泡を除去する。
11. ウェルあたり150 μl のTBSW + 0.5% エタノールアミン、pH 7.0によりプレートをブロックする。マイクロタイタープレートシェーカー上で振盪しながらプレートを30分間インキュベートする。
12. 段階10で記載したようにしてプレートを3回洗浄する。
13. ウェルあたり0.5 μg のアフィニティ精製抗flk-1 ポリクローナルウサギ抗血清を加える。TBSW + 0.5% エタノールアミン、pH 7.0により最終容量を150 μl/ウェルとする。振盪しながらプレートを30分間インキュベートする。
14. 180 μl の飢餓培地を細胞に加え、20μl/ウェルの10.0 mM オルトバナジン酸ナトリウム及び500 ng/ml VEGFで (ウェルあたり1.0 mMオルトバナジン酸ナトリウム及び50 ng/ml VEGF の最終濃度となる) 、37℃、5% CO2において8分間細胞を刺激する。陰性対照ウェルには飢餓培地だけを与える。
15. 8 分後、細胞から培地を除去し、200 μl/ウェルのPBS で1回洗浄する。
16. 室温で振盪しながら5分間150 μl/ウェルのHNTG中で細胞を溶解する。HNTG配合物はオルトバナジン酸ナトリウム、ピロリン酸ナトリウム及びEDTAを含む。
17. ELISA プレートを段階10に記載したようにして3 回洗浄する。
18. 細胞溶解物を細胞プレートからELISA プレートに移し、2時間振盪しながらインキュベートする。細胞溶解物は、ウェルをこするようにピペットで吸い上げて移す。
19. プレートを段階10に記載したようにして3 回洗浄する。
20. TBSW + 0.5% エタノールアミンに含まれるウェルあたり0.02μg のUB40とともにELISA プレートをインキュベートする。最終容量を150 μl/ウェルとする。振盪しながら30分間インキュベートする。
21. プレートを段階10に記載したようにして3 回洗浄する。
22. TBSW + 0.5% エタノールアミン、pH 7.0中に1:10,000に希釈されたEIA グレードヤギ抗マウスIgG 結合ホースラディッシュペルオキシダーゼとともにELISA プレートをインキュベートする。最終容量を150 μl/ウェルとする。振盪しながら30分間インキュベートする。
23. プレートを段階10に記載したようにして3回洗浄する。
24. 100 μl のABTS/H202 溶液をウェルに加える。振盪しながら10分間インキュベートする。
25. 最終的に0.1 M HClとなるように100 μl の0.2 M HClを加え呈色反応を停止する。室温で1分間振盪する。ゆっくりとした空気流により泡を除去し、ELISA プレートリーダーにより410 nmにおいてELISA プレートを読み取る。
【０１６８】
6.2   実験結果
試験した本発明の化合物について得た結果を表２に示す。
【０１６９】
【表１】
0003844277.tif 000022
【０１７０】
7.  実施例: In Vivo 試験における化合物の効果
本発明の化合物の１つであるレフルノミド（化合物40）の、皮下（SC）異種移植片として樹立された卵巣、メラノーマ、前立腺、肺、乳房の腫瘍細胞株を阻害する能力を調べた。これらの研究は12〜20 mg/kg/日の範囲の投与量を使用して行った。
【０１７１】
7.1.  材料及び方法
腫瘍細胞を、示した系統のマウスに皮下移植した。特に明記しない限り（例えばA375メラノーマ細胞株についてのSCIDマウスの処置は第９日に開始した）、処置は移植後第１日に開始した。各試験群は８〜10匹のマウスからなる。
【０１７２】
具体的説明
動物
雌性無胸腺マウス(BALB/c, nu/nu) 、BALB/cマウス、Wistarラット及びFisher 344ラットはSimonsen Laboratories (Gilroy, CA)から入手した。雌性A/I マウスはJackson Laboratory (Bar Harbor, ME) から入手した。DAラットはB & K Universal, Inc. (Fremont, CA) から入手した。無胸腺R/Nuラット、DBA/2Nマウス、及びBALB/cマウスはHarlan Sprague Dawley (Indianapolis, IN)から入手した。雌性C57BL/6 マウスはTaconic (Germantown, NY)から入手した。全ての動物はAlpha-dri 床を入れたMicro-isolatorケージ中で、クリーンルーム条件下で飼育した。滅菌齧歯動物用食餌と水を自由摂取させた。
【０１７３】
全ての手順はNIH Guide for the Care and Use Of Laboratory Animalsに従って行った。
【０１７４】
皮下異種移植片モデル
細胞株は、記載した(6の項を参照) ような適当な培地中で増殖させた。細胞を0.05% トリプシン-EDTA によりコンフレントあるいはほぼコンフレントで回収し、450 x g で10分間遠心してペレット化した。ペレットを滅菌PBS または培地(FBSを含まない) 中に図の凡例に示した適当な濃度で再懸濁し、細胞をマウスの後横腹に移植した。腫瘍の増殖はベニエノギスを使用して3〜6週間にわたって測定し、腫瘍の体積は特に明記しない限り、長さ×幅×高さの積として計算した。P値はスチューデントt-検定を使用して計算した。50〜100 μl の賦形剤 (ジメチルスルホキシド、PBTE、PBTE6C:D5WあるいはPBTE:D5W) 中のsu101 を図の凡例に示した濃度でIP注射により投与した。
【０１７５】
脳内異種移植片モデル
マウスICモデルについては、ラットC6グリオーマ細胞を回収し、2.5 x 107 細胞/ml の濃度で滅菌PBS 中に懸濁し、氷上に置いた。細胞をBALB/c、nu/nu マウス中に以下のようにして移植した。必要であればマウスの前頭頭頂頭皮の毛を動物用バリカンで剃り、70% のエタノールで拭った。動物をイソフルオランで麻酔し、針を頭蓋骨を通して脳の左大脳半球に挿入した。3 mmだけ貫入する、スリーブに装着した30ゲージ（ga） 1/2インチ針を用いてHamilton気密シリンジから細胞を投与した。細胞懸濁物の4 μl を正確に投与するためにリピーターディスペンサーを使用した。動物の健康状態について毎日モニターし、約40% の体重減少及び／または神経症状を示したときに屠殺した。
【０１７６】
ラットICモデルについては、ラット（Wiastar, Sprague Dawley, Fisher 344 または無胸腺R/Nu; 約200 g)を100 mg/kg のKetaset(ケタミン塩酸塩; Aveco, Fort Dodge, Iowa)及び5 mg/kg のRompun (キシラジン、2%溶液; Bayer,ドイツ) をIP注射することにより麻酔した。麻酔の開始後、頭皮を剃り、動物を定位固定装置(Stoelting, Wood Dale, IL)で固定した。切開部位の皮膚は70% エタノールと10% ポイドン- ヨウ素で交互に３回拭うことにより清浄にした。滅菌外科用メスを用いて頭皮に1.0 〜1.5 cmの正中切開を行った。皮膚をわずかにめくり、側方へ引っ張って頭蓋骨表面の縫合線を露出させた。歯科用ドリル(Stopiting, Wood Dale, IL)を使用して、ブレグマの約1 mm前、2 mm側方に頭蓋骨に小さな(1〜2 mmの直径) のバーホールを形成した。細胞懸濁物を23または25 gの標準斜端針を装着した50μl のHamiltonシリンジに吸い込んだ。シリンジをクモ膜のレベルでバーホールに固定し、針の先端が脳構造の3 mmの深さに達するまで沈め、細胞懸濁物をゆっくりと注入した。細胞を注入した後、1〜2分間、針をバーホールに残し、細胞が完全に到達するようにした。頭蓋骨を清浄にし、2〜3針で皮膚を縫合した。手術及び麻酔からの回復について動物を観察した。実験を通じて、脳内腫瘍の発達に関連する症状の発生について毎日少なくとも２回観察した。進行した症状（もたれかかり、バランスの喪失、脱水、食欲喪失、共調運動喪失、グルーミング活動の停止、及び／または有意な体重減少）を示した動物に苦痛を与えずに屠殺し、対象の臓器及び組織を切除した。
【０１７７】
腹膜内モデル
細胞株を適当な培地中で増殖させた。細胞を回収し、滅菌PBS またはFBS を含まない培地中で洗浄し、適当な濃度で再懸濁し、適当な系統のマウスの腹腔内に注射した。腹水形成の発生についてマウスを毎日観察した。それぞれの動物を、40% 体重が増加したとき、またはIP腫瘍の負荷が動物に過度のストレスや痛みを与え始めたときに屠殺した。
【０１７８】
免疫組織化学
ヒト、ラットまたはマウス腫瘍細胞から得た、未処理異種移植片腫瘍のアセトン固定した5 μm 凍結組織切片を、高度に特異的な受容体抗体を使用して免疫組織化学により分析した。簡単にいうと、第１抗体を適用する前に非特異的結合部位を10% 正常ヤギ血清でブロックした。適当な抗体濃度を使用して所望の感度及び特異性を得た（ウサギ抗ヒトPDGF-B受容体1:400 、及びアフィニティ精製ウサギ抗マウスFLK-1 5.5 μg/ml) 。対象のタンパク質を含むことが既知の組織切片を陽性対照とした。第1抗体と同じタンパク質濃度及びイソタイプの正常ウサギIgG 及びマウス抗ニワトリIgG の適当な陰性対照を使用した。検出法は３段階間接法であり、ビオチン標識第２抗体に結合した第１抗体（ヤギ抗ウサギIgG 1:500)、及びその後にストレプトアビジン結合ホースラディッシュペルオキシダーゼを使用した。ジアミノベンジジン/0.03 % 過酸化水素(1:200)(0.05%)を色原体/基質として使用した。組織切片をヘマトキシリンで対比染色し、エタノールのグレードを上げることにより脱水し、キシレン置換で透明にし、顕微鏡観察のためにPermountでカバーグラスをかけた。“+"から“+++"までの階級付け法を使用して、発現の全体的強度を特定した。１つのプラス(“+") は低い強度を表す。２つのプラス(“++")は中程度の強度を示し、３つのプラス(“+++") は高い強度を示す。下記表４において、“T"は腫瘍細胞特異的染色反応を示すために使用した。下記表４において、“V"は血管内皮細胞特異的染色反応を示すために使用した。“*"は、示した細胞株からサイトスピン(cytospins) を使用して分析を行ったことを示す。“NS"は「非有意」を示し、“NT"は「試験していない」ことを示す。
【０１７９】
7.2.  実験結果
ヒトまたはマウス腫瘍細胞株から誘導された異種移植片腫瘍からのアセトン固定凍結切片を、上記したように高度に特異的な受容体抗体を使用してどの腫瘍細胞株がFLK-1 受容体を発現するかを調べて、免疫組織化学(IHC) により分析した。具体的には、抗体は米国特許出願08/193,829号に記載された方法に従って得た。IHC 分析の結果を表４に示す。
【０１８０】
【表２】
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【０１８１】
そして上記のin vivo 実験を、FLK-1 を発現する腫瘍細胞株を使用して行った。上記のin vivo 実験で得た結果を表４に示す。
【０１８２】
【表３】
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【０１８３】
これらの試験により、化合物40により処置された免疫適格動物において腫瘍増殖が有意に阻害されたことが示されている。具体的には、上記の通り、化合物40は、ヒト卵巣(PA-1)、ヒトメラノーマ(A375)、ヒト前立腺(PC-3)、及びヒト肺(Calu-6)の増殖を有効に阻害した。
【０１８４】
この試験を繰り返して化合物23を含むその他の化合物を研究した。化合物23は、20 mg/kg/日で41% 阻害を示した。より具体的には、観察された結果を表５に示す。
【０１８５】
【表４】
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【０１８６】
試験した化合物のいくつかにおいて阻害が見かけ上なかったことは、必ずしも活性（血管形成及び／または脈管形成の阻害）がないことを示すものではなく、例えば試験した化合物のin vivo における半減期、あるいは実験で投与した量により説明され得る。
【０１８７】
本発明は、本発明の一つの形態を説明することを意図した例示の態様によりその範囲を限定されるものではなく、機能的に等価であるクローン、DNA またはアミノ酸配列はすべて本発明の範囲内にあるものである。実際に、本明細書に記載したものに加えて、本発明の多くの改変がこれまでの記載及び添付の図面から当業者に明らかとなるであろう。そのような改変は添付の請求の範囲内にあることを意図するものである。
【０１８８】
本明細書中で引用した文献は引用によりその全体を本明細書の一部とする。