(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
カルミノマイシン４−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（ＣＯＭＴ）酵素のための補因子としての５′−メチルチオアデノシンヌクレオシダーゼの使用。
【請求項２】
カルミノマイシンをＣＯＭＴと共に５′−メチルチオアデノシンヌクレオシダーゼの存在下に処理することから成る、カルミノマイシンをダウノルビシンに変換する方法。
【請求項３】
ダウノルビシン溶液に存在する不要の汚染カルミノマイシンをダウノルビシンに変換する、請求項２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、カルミノマイシン４−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（ＣＯＭＴ酵素）のための補因子としての５′−メチルチオアデノシンヌクレオシダーゼの使用に関する。
【０００２】
ドキソルビシン、カルミノマイシン及びアクラシノマイシン等のダウノルビシン系のアントラサイクリン類は、抗腫瘍治療で最も広く用いられている薬剤に属する［F.Arcamone, Doxorubicin, Academic Press, New York, 1981, pp.12-25; A.Grein, Process Biochem., 16:34 (1981); Taneko, Chimicaoggi May:11 (1988) ］。
【０００３】
【従来の技術】
アントラサイクリンであるドキソルビシンは、酢酸、プロピオン酸及び葡萄糖から、S.peucetius 27952 により作られる。当該反応においては、ε−ロードマイシノン、カルミノマイシン及びダウノルビシンを中間体として経由する旨が確認されている［Grein, Advan.Appl.Microbiol., 32:203 (1987) ］。この経路中の２段階で異なる中間体がＯ−メチル化され、即ち、アルカン酸のアルカン酸メチルへの変換、及びカルミノマイシンのダウノルビシンへの変換である。
【０００４】
中でもこの最終段階は、カルミノマイシン４−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（ＣＯＭＴ）と称する酵素によって触媒される。このＣＯＭＴ酵素、それをコードする遺伝子、及び生変換用途での種々の様式によるその使用については、Madduri らのJ.Bacteriol. 175, 3900-3904,1993; Scotti C. らのBiotechnol.Bioeng.（印刷中）及び本発明者の米国特許第5,364,781 号に記載されている。
【０００５】
【発明が解決すべき課題】
高純度ダウノルビシンの調製に際し、不要の中間体カルミノマイシンの存在をできるだけ少なくするには、下式のカルミノマイシン
【０００６】
【化１】
0003737854.tif 000002
【０００７】
を完全に下式のダウノルビシン
【０００８】
【化２】
0003737854.tif 000003
【０００９】
に変換することを要する。
【００１０】
この酵素反応では下式のＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニン
【００１１】
【化３】
0003737854.tif 000004
【００１２】
を存在させる必要があり、このものがトランスメチル化反応で下式に基づきメチル基供与体となる。
【００１３】
0003737854.tif 000005
式中、ＳＡＭはＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニンであり、ＳＡＨＣは下式のＳ−アデノシル−ホモシステイン
【００１４】
【化４】
0003737854.tif 000006
【００１５】
である。
【００１６】
【課題を解決するための手段】
驚くべきことに、本発明者らはＣＯＭＴ酵素の酵素活性が５′−メチルチオアデノシンヌクレオシダーゼを添加すると、著しく増強されることを見出だした。従って本発明は、５′−メチルチオアデノシンヌクレオシダーゼをＣＯＭＴのための補因子として使用することを提案する。
【００１７】
５′−メチルチオアデノシンヌクレオシダーゼは公知の酵素（E.C. 3.2.2.-）であり、５′−メチルチオアデノシンの分解、Ｓ−アデノシルホモシステインの開裂を触媒するとして、A.J.Ferro らがBiochimica et Biophysica Acta, 438 (1976), p.487-494に記載している。５′−メチルチオアデノシンヌクレオシダーゼの部分精製は、大腸菌菌株又は他の本酵素産生微生物から出発して、イオン交換カラムクロマトグラフィー、次いで硫酸アンモニウム沈澱及びゲル瀘過クロマトグラフィーによりなすことができる。このような部分精製調製物は、Ｓ−アデノシルホモシステインからアデニンの生成を265 nmで分光分析したとき、約0.5-1 μモル・分-1・mg-1の比活性を示した。
【００１８】
本発明の方法では、カルミノマイシンをＣＯＭＴと共に５′−メチルチオアデノシンヌクレオシダーゼの存在下に処理する。典型的には、５′−メチルチオアデノシンヌクレオシダーゼをin vitroでカルミノマイシンメチル化反応混合物と共にインキュベートすると、反応速度が上がり、反応最終収率が増加することが見出だされた。他の適用態様によれば、ダウノルビシン抽出物中に微量汚染成分としてしばしば混在する少量のカルミノマイシンの除去には、５′−メチルチオアデノシンヌクレオシダーゼを存在させれば完全にダウノルビシンに変換することができる。
【００１９】
典型的には本発明の方法は、カルミノマイシン基質、Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン共基質、ＣＯＭＴ及び５′−メチルチオアデノシンヌクレオシダーゼを含む反応混合物を用意することにより実施される。反応混合物には、通常緩衝液をも含む。
【００２０】
５′−メチルチオアデノシンヌクレオシダーゼは、Ｓ−アデノシルホモシステインを基質として分析したとき、通常0.07-7μモル・分-1・mg-1の比活性、例えば約0.7 μモル・分-1・mg-1のものを用いる。ＣＯＭＴは精製組換ＣＯＭＴが好ましく、0.01-1.0 mg ／ml、例えば約0.1 mg／mlの濃度で用いる。本発明は広範囲の基質濃度で実施し得るが、1-10,000μモル、例えば10-1,000μモルのカルミノマイシンの使用が普通である。Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン共基質は、典型的には0.3-30ミリモル、例えば約３ミリモルの濃度で用いられる。
【００２１】
本発明は上記したように、カルミノマイシンを少量のみ含むダウノルビシン抽出物につき、汚染しているカルミノマイシンを所望のダウノルビシンに変換する目的で実施し得る。反応混合物中のダウノルビシンに対するカルミノマイシンのモル比は、1:5 〜1:500 、例えば約1:50とすることができる。
【００２２】
典型的には本発明の方法は、ｐＨ７〜９、例えば８で実施し得る。緩衝液はこのｐＨを保持するように選ばれ、トリシン緩衝液とし得る。
【００２３】
反応は室温（20℃）から40℃の温度で実施し得るが、37℃の温度が好ましい。反応は典型的には、20分から３時間実施されるが、30分から１時間が好ましい。約45分後には、一般に反応は殆ど完結する。
【００２４】
【実施例】
以下の実施例は、本発明を説明するためのものである。
【００２５】
実施例１
精製組換ＣＯＭＴで触媒されるin vitroでのカルミノマイシンのメチル化収率を、５′−メチルチオアデノシンヌクレオシダーゼ部分精製調製物の存在下又は不在下に、以下の要領で検討した。100 μモルのカルミノマイシン基質、３ミリモルのＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニン共基質、0.1 mg／mlの精製組換ＣＯＭＴ、170 ミリモルのトリシン緩衝液（pH 8）を含む反応混合物を、37℃で30分までインキュベートした。
【００２６】
平行して、 0.06 mg／mlの５′−メチルチオアデノシンヌクレオシダーゼ（Ｓ−アデノシルホモシステインを基質として分析したとき、約0.7 μモル・分-1・mg-1の比活性）をさらに含むインキュベーションを実施した。
【００２７】
１，３，６，10，20及び30分後に50μｌずつのサンプルを採取し、酵素反応を50％三塩化酢酸15μｌで停止し、次いで遠心分離して沈澱蛋白性物質を除いた。メチル化された製品ダウノルビシンの基質カルビノマイシンとの分離状況は、各上清につき40μｌずつをPTC-C18 マイクロボアHypersyl（登録商標）カラム（2.1 ×220 mm）における逆相高圧液体クロマトグラフィー（RP-HPLC ）に付して分析した。溶離は流速0.4 ml／分、55％Ａ相／45％Ｂ相から15％Ａ相／85％Ｂ相までの線状勾配であった。移動相Ａの組成は1.2 % ドデシル硫酸ナトリウムを含む15mM燐酸塩緩衝液（pH 2.5）であり、移動相Ｂの組成は95％アセトニトリル−0.07% 三弗化酢酸であった。溶出状況は、485 nmで監視した。ダウノルビシン生成量は、ピーク面積を標準溶液のそれと比較して推定した。
【００２８】
図１に示すように、５′−メチルチオアデノシンヌクレオシダーゼを存在させるとＶmax の値が3.5 ナノモル・分-1・mg-1から35ナノモル・分-1・mg-1に増加し、これは30分の反応時点で生成カルミノマイシンが約３倍増したことに相当する。
【００２９】
実施例２
大過剰のダウノルビシン存在下でのカルミノマイシンのメチル化効率を、部分精製された５′−メチルチオアデノシンヌクレオシダーゼの存在下又は不在下において、以下の要領で検討した。
【００３０】
100 μモルのカルミノマイシン基質、3.8 ミリモルのダウノルビシン、３ミリモルのＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニン、0.3 mg／mlの精製組換ＣＯＭＴ、170 ミリモルのトリシン緩衝液（pH 8）を含む反応混合物を、37℃で40分までインキュベートした。平行して、 0.06 mg／mlの５′−メチルチオアデノシンヌクレオシダーゼ（約0.7 μモル・分-1・mg-1の比活性）をさらに含むインキュベーションを実施した。10，30及び40分後に50μｌずつのサンプルを採取し、酵素反応を実施例１記載のようにRP-HPLC に付して分析した。
【００３１】
図２に示すように、対照反応では当初のカルミノマイシ（2.5 ％）の約半量が変換されたに過ぎなかったが、５′−メチルチオアデノシンヌクレオシダーゼを存在させると、カルミノマイシンの完全なメチル化が認められた。
【図面の簡単な説明】
【図１】組換ＣＯＭＴ触媒による、カルミノマイシンのダウノルビシンへのin vitroメチル化を示す。推定される反応速度定数は、対照実験（黒丸）についてＫm ＝11μＭ及びＶmax ＝3.5 ナノモル・分-1・mg-1であり、５′−メチルチオ−アデノシンヌクレオシダーゼが存在すると（黒角）Ｋm ＝22μＭ及びＶmax ＝35ナノモル・分-1・mg-1であった。
【図２】大過剰（97.5% ）のダウノルビシン存在下の2.5%カルミノマイシンのin vitroメチル化効率を示す。対照実験（黒丸）及び５′−メチルチオ−アデノシンヌクレオシダーゼ存在時（黒角）について示す
【図１】
0003737854.tif 000007
【図２】
0003737854.tif 000008