(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
オオムギ染色体ＤＮＡを制限酵素ＤｒａＩで消化して生じたＤＮＡ断片の長さを調べ、
４．３ｋｂのＤＮＡ断片が検出されなかった場合にβ−アミラーゼ活性欠損オオムギ品種であると判断する、β−アミラーゼ活性欠損オオムギ品種の識別方法。
【請求項２】
オオムギ染色体ＤＮＡを鋳型に、配列番号１のＤＮＡと配列番号２のＤＮＡをプライマーとしてポリメラーゼ連鎖反応を行い、
２．２ｋｂのＤＮＡ断片が増幅された場合にβ−アミラーゼ活性欠損オオムギ品種であると判断する、β−アミラーゼ活性欠損オオムギ品種の識別方法。
【請求項３】
請求項２に記載の方法に用いる、配列番号１のＤＮＡと配列番号２のＤＮＡからなるプライマーセット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、β−アミラーゼ活性が欠損したオオムギのβ−アミラーゼ遺伝子に関し、また、このβ−アミラーゼ遺伝子に基づいてβ−アミラーゼ活性が欠損したオオムギ品種を識別し、育種する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ビールなどのオオムギを原料として製造される製品は、原料たるオオムギの品種等により、その品質、香味などが大きく影響される。特に、ビール醸造上では、麦汁の糖組成は、原料オオムギの種子中の炭化水素組成や糖化酵素の働き、その他添加する副原料の種類によって規定されている。
【０００３】
例えば、オオムギの種子中に含まれる主たる糖化酵素の一つとして、β-アミラーゼが存在する。このβ―アミラーゼは、デンプンを代謝して二糖類マルトースを生成する。そのため、麦汁中には、このβ−アミラーゼの作用により多量のマルト-スが含まれ、麦汁の糖組成の多くを占めている。
【０００４】
従って、従来より、このオオムギの有するβ−アミラーゼを改変することにより、麦汁の糖組成を改変することが試みられていた。しかし、β−アミラーゼはオオムギにおいては、デンプンから糖質を生成してエネルギーを作り出すための酵素であり、従来のオオムギの育種方法では、この麦汁の糖組成を大きく改変し得る品種を作り出すことは成功していなかった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
一方、イネやサツマイモなどでは、これまでにβ−アミラーゼ活性を有しない変異体が発見されている。オオムギにおいても、こうしたβ−アミラーゼ活性を有しない変異体を見出し、これを基に育種することができれば、オオムギを原料とする製品の大幅な改変を試みることが可能となる。特に、上記ビール製造においては、麦汁の糖組成を大きく改変することが可能となる。
【０００６】
このような観点から、本願発明者らは、β−アミラーゼ活性を有しないオオムギ変異体を探索し、複数の在来種においてβ−アミラーゼ活性を全く欠いた品種を見出した。
【０００７】
そこで、本発明は上記課題に鑑みてなされたものであり、その目的は、β−アミラーゼ活性を欠損したオオムギ品種を簡易に識別し、育種することを可能にすることである。
【０００８】
本発明のβ−アミラーゼ活性欠損オオムギ品種の識別方法は、オオムギ染色体ＤＮＡを制限酵素ＤｒａＩで消化して生じたＤＮＡ断片の長さを調べ、４．３ｋｂのＤＮＡ断片が検出されなかった場合にβ−アミラーゼ活性欠損オオムギ品種であると判断することを特徴とする。
【０００９】
本発明のβ−アミラーゼ活性欠損オオムギ品種の識別方法は、オオムギ染色体ＤＮＡを鋳型に、配列番号１のＤＮＡと配列番号２のＤＮＡをプライマーとしてポリメラーゼ連鎖反応を行い、２．２ｋｂのＤＮＡ断片が増幅された場合にβ−アミラーゼ活性欠損オオムギ品種であると判断することを特徴とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
「変異β−アミラーゼ遺伝子」とは、β−アミラーゼ活性が欠損するような変異を有していることを意味する。従って、「変異β−アミラーゼ遺伝子」は、必ずしもβ−アミラーゼの構造遺伝子内に変異を有している必要はなく、β−アミラーゼ遺伝子の発現を妨げるような変異を制御配列内に有しているものも含めることができる。また、「β−アミラーゼ遺伝子」は、β−アミラーゼ酵素をコードするβ−アミラーゼ構造遺伝子のみならず、その隣接する領域をも含む。
【００１１】
また、「単離精製」は、遺伝子が天然に存在している状態ではないという意味として用いる。従って、「単離精製」は、当該遺伝子が植物細胞から取り出されたものであれば、側鎖に染色体断片を有しているものであっても、また、そのような断片が取り除かれベクター等にクローニングされた状態のものであってもよい。
【００１２】
また、変異β−アミラーゼ遺伝子は、正常β−アミラーゼ構造遺伝子又はその隣接する領域内に変異を有し、β−アミラーゼ活性欠損形質を示す変異β−アミラーゼ遺伝子であって、前記正常β−アミラーゼ構造遺伝子及びその隣接する領域が、図４に示す制限酵素地図により特定されることを特徴とする。
【００１３】
さらに、変異β−アミラーゼ遺伝子は、β−アミラーゼをコードした構造遺伝子又は隣接する領域、例えば、制御配列等に変異を有し、β−アミラーゼ活性を欠損していることから、この遺伝子は、上記と同様にオオムギなどの植物におけるβ−アミラーゼ活性欠損形質への品種改良に役立たせることができ、また、β−アミラーゼ活性欠損形質を有するオオムギ品種の識別、育種に役立たせることもできる。
【００１４】
なお、上記において「正常β−アミラーゼ遺伝子」又は単に「β−アミラーゼ遺伝子」は、β−アミラーゼ活性を有しているものを意味する。そのため、遺伝子を構成するＤＮＡ配列に若干の相違があってもβ−アミラーゼ活性を有している限りにおいて、上記「正常β−アミラーゼ遺伝子」又は「β−アミラーゼ遺伝子」に含まれる。
【００１６】
β−アミラーゼ活性欠損形質を有するオオムギから単離された変異β−アミラーゼ遺伝子では、β−アミラーゼ構造遺伝子又はその隣接する下流領域における変異を有し、これによりβ−アミラーゼ活性が欠損していることが明らかになった。また、この変異遺伝子は在来種として存在するオオムギ中で検出されたことから、この変異遺伝子を用いて改良されたオオムギは生存可能であることが明らかである。また、この変異遺伝子は、β−アミラーゼ活性欠損形質を有するオオムギ品種を識別し、育種する際の対照としても、有効に利用することが可能となる。
【００１７】
また、変異β−アミラーゼ遺伝子は、β−アミラーゼ活性欠損形質を有する在来種から検出された変異遺伝子の解析から、β−アミラーゼ構造遺伝子を少なくとも一部に含む４．３ｋｂのＤｒａＩ断片が消失するような変異を有することが好ましい。
【００１８】
ここで、「４．３ｋｂのＤｒａＩ断片の消失」は、４．３ｋｂのＤｒａＩ断片自体が消失することを意味し、この断片内に含まれる塩基配列がすべてが消失することを意味するものではない。従って、４．３ｋｂのＤｒａＩ断片自体が消失する場合としては、（１）この４．３ｋｂのＤｒａＩ断片内に挿入変異又は欠失変異が存在する場合、（２）４．３ｋｂのＤｒａＩ断片を生成するいずれか一方のＤｒａＩ認識部位の欠失、置換又は挿入変異が存在する場合等が含まれる。
【００１９】
また、変異β−アミラーゼ遺伝子は、上記と同様にβ−アミラーゼ活性欠損形質を有する在来種から検出された変異遺伝子の解析から、β−アミラーゼ構造遺伝子を少なくとも一部に含む４．３ｋｂのＤｒａＩ断片が消失し、かつβ−アミラーゼ構造遺伝子の一部を含む９．３ｋｂのＤｒａＩ変異断片が形成されるような変異を有することが好ましい。尚、ここで示す断片長は電気泳動時のサイズマーカーに基づいて算出した場合のおよその値である。従って、ここで示す値の上下０．２〜０．３ｋｐｂ以内のものは、本願発明における断片に相当する。
【００２２】
本発明のオオムギ品種の識別方法は、β―アミラーゼ遺伝子領域に基づいてβ−アミラーゼ活性が欠損したオオムギ品種を識別する方法であって、β−アミラーゼ構造遺伝子内又はその隣接する下流領域の変異の有無に基づき品種識別を行うことを含むことを特徴とする。
【００２３】
本願発明者らはβ−アミラーゼ活性欠損形質を有するオオムギから採取した変異β−アミラーゼ遺伝子では、β−アミラーゼ構造遺伝子内又はその隣接する下流領域に変異が検出されたことから、β−アミラーゼ構造遺伝子内又はその隣接する下流領域における変異の有無に基づきβ−アミラーゼ活性欠損形質を有するオオムギ品種であるか否かを識別することが可能となる。
【００２４】
その結果、β―アミラーゼ活性を直接測定しなくとも遺伝子レベルの解析で簡易にβ−アミラーゼ活性を欠いたオオムギ品種を識別することができる。特に、酵素活性は、植物個体の生育段階、環境などに影響され、正確な測定が困難な場合があるが、この方法によれば、酵素測定と異なり、環境などに影響されることなく、アミラーゼ活性が欠損したオオムギ品種を識別することができる。さらに、酵素活性を測定するには、種子が実るまで行うことができないが、ＤＮＡ判別は、開花前に行えるため早期に活性欠損形質か否かの判定ができ、また連続戻し交配などにより有効である。
【００２５】
本発明のオオムギ品種識別方法は、上記発明において、β―アミラーゼ遺伝子領域に基づいてβ−アミラーゼ活性が欠損したオオムギ品種を識別する方法であって、上記発明におけるβ−アミラーゼ活性欠損形質を保持する変異βアミラーゼ遺伝子と比較することを含む。
【００２６】
上記発明によれば、β−アミラーゼ活性欠損形質を保持する変異βアミラーゼ遺伝子を比較対照として用いることにより、オオムギ品種を識別の精度を高めることが可能となる。
【００２７】
また、本発明のオオムギ品種識別方法は、上記品種識別方法において、β―アミラーゼ遺伝子領域における制限酵素断片の多型に基づいて、変異を検出することを特徴とする。
【００２８】
上記発明によれば、ＲＦＬＰ（Ristriction Flagment Length Polymorphism）解析により容易にβアミラーゼ活性を欠いた品種を識別することが可能となる。
【００２９】
上記制限酵素断片は、好ましくは、ＤｒａＩ制限酵素断片であることが特徴であり、多型解析においてＤｒａＩ制限酵素を用いた場合、β−アミラーゼ遺伝子を含む４．３ｋｂＤｒａＩ制限酵素断片の欠失又は新たな９．３ｋｂＤｒａＩ制限酵素断片の出現に基づいて判別することができる。
【００３０】
上記発明によれば、上記特定の制限酵素断片の欠失又は出現を指標として簡易にβ−アミラーゼ活性を欠いた品種を識別することが可能となる。
【００３５】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の好適な実施形態を説明する。
【００３６】
１． β−アミラーゼ活性欠損形質を有するオオムギの探索
オオムギのβ−アミラーゼ活性欠損形質を有する品種を探索する。このオオムギのβ−アミラーゼ活性欠損形質を有する品種であれば、特に、生息している地域、生育環境などには限定されない。
【００３７】
また、この探索方法は、後述する遺伝子レベルの探索方法の他、直接β−アミラーゼ活性を測定することにより行うことができる。このβ−アミラーゼ活性の測定方法は、簡便には、例えば、ダイヤカラーＡＭＹ（小野薬品工業社製）のようなβ−アミラーゼ活性測定キットを用いることができる。詳細には、後述するが、この測定キットを用いて複数のチベット在来種のオオムギからβ−アミラーゼ活性欠損形質のオオムギを見出すことができた。
【００３８】
また、選別したオオムギ品種のβ−アミラーゼ活性を確認する手段として、後述する遺伝子レベルでの解析の他、自然交配の結果として得られた自殖種子のβアミラーゼ活性の有無の分配率を解析してもよい。
【００３９】
これは後に詳細に説明するが、上記チベット在来種のβ−アミラーゼ活性欠損形質のオオムギの自然交配雑種系統の自殖種子において、βアミラーゼ活性の有無がそれぞれ３：１の比率で分離されたこと、また、後述するβ−アミラーゼ遺伝子の解析によりこの分離結果とβ−アミラーゼ遺伝子の変異とが一致したことによる。すなわち、β−アミラーゼ活性は、β−アミラーゼ欠失系統の遺伝子（以下、変異遺伝子）パターンをホモ接合体として持つオオムギのみ活性を欠き、正常遺伝子のホモ型又はヘテロ型はβ−アミラーゼ活性を示した。このことから、β−アミラーゼ活性の有無は単一優性遺伝子、すなわち、β−アミラーゼ遺伝子（調節配列などの隣接領域を含む）に支配されることが示された。
【００４０】
従って、上記探索されたβ−アミラーゼ活性欠損形質を有する品種の自然交配により得られた自殖種子において、β−アミラーゼ活性の有無がそれぞれ３：１の比率で分離された場合には、選別されたオオムギ品種では、β−アミラーゼ活性が遺伝的に欠損していることを確認することができる。
【００４１】
２． β−アミラーゼ活性欠損形質を有するオオムギの染色体ＤＮＡの解析
β−アミラーゼ活性欠損形質を有するオオムギは、上述したβ−アミラーゼ活性を指標とすることもできるが、簡便には環境などに左右されない核酸レベルの解析で品種を識別し、選別することが好ましい。そのため、この核酸レベルでの品種識別を可能とするためには、β−アミラーゼ活性欠損形質を有するオオムギ由来のβ−アミラーゼ遺伝子の特徴を知る必要がある。従って、上記において探索されたβ−アミラーゼ活性欠損形質を有するオオムギから染色体ＤＮＡを単離し、その特性を解析する。
【００４２】
オオムギから染色体ＤＮＡを単離精製する方法は、通常、植物から染色体ＤＮＡを採取する際に用いられる一般的な方法を用いることができる。こうした方法は、例えば、「Murray,M.G.and W.F.Thompson(1980)Rapid isolation of high molecular weight plant DNA.Nucleic Acids Res.8:4321-4325.」などに記載されている。
【００４３】
また、オオムギの染色体ＤＮＡを単離するための材料としては、オオムギの葉、種子などのいずれの器官であってもよく、また、成長のいずれの段階でもよいが、好ましくは、磨砕しやすく、多糖類などの不純物が少なく種子から短期間に手に入るとの点から芽生え期の葉を用いることがよい。
【００４４】
また、単離されたＤＮＡを解析する場合には、比較対照として、β−アミラーゼ活性を有するオオムギ由来の染色体ＤＮＡを用いることがよい。こうした対照ＤＮＡと比較することにより、β−アミラーゼ活性欠損形質を特徴付けるＤＮＡ上の変異を決定することができる。なお、この「変異」は、β−アミラーゼ活性欠損形質を生じさせるものであれば、欠失、挿入、置換などのいずれのタイプをも含めることができる。
【００４５】
また、β−アミラーゼ活性は、上述したように自然交配系統の自殖種子におけるβ−アミラーゼ活性の分離結果から、単一遺伝子、すなわち、β−アミラーゼ遺伝子に支配されていることから、このＤＮＡの変異は、β−アミラーゼ遺伝子上に存在する。但し、このβ−アミラーゼ遺伝子は、構造遺伝子に限られず、この遺伝子の発現を調節する調節領域を含めることができる。
【００４６】
上記変異の有無を決定するための手法としては、例えば、対照であるβ−アミラーゼ活性を有するオオムギ由来の染色体ＤＮＡと比較した際の制限酵素断片の数若しくは長さの相違、特定のプライマーを用いＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）により増幅させた増幅断片の有無若しくはその長さの相違、特定のプローブを用いた場合のハイブッド形成の有無、さらには、塩基配列の決定などのいずれかにより、又はその組み合わせにより行うことができる。
【００４７】
上記制限酵素断片を生成させるための制限酵素としては、β−アミラーゼ活性欠損形質を特徴付けるＤＮＡ上の変異を識別し得るような制限酵素断片を生成させる制限酵素であり、例えば、ＤｒａＩなどが含まれる。また、この酵素以外にも、β−アミラーゼ遺伝子内に認識部位を有するものをも好適に用いることができる。但し、β−アミラーゼ遺伝子内に認識部位を有しなくても、β−アミラーゼ遺伝子の近傍に認識部位を有する制限酵素などを好適に用いることができる。
【００４８】
また、ＰＣＲにより変異を検出する場合に使用することができるプライマーとしては、増幅産物の長さの相違、又は増幅断片の有無により変異を検出し得るような一種類又は一対からなるプライマーを用いる。こうしたプライマーの一例として、配列番号１の５’側プライマーと配列番号２の３’側プライマーとからなるセットが挙げられる。
【００４９】
３．β−アミラーゼ活性欠損形質のオオムギの識別
上記において、β−アミラーゼ活性欠損形質のオオムギのＤＮＡ上の変異が決定されたら、そのＤＮＡ上の変異を指標として多数のオオムギ品種からβ−アミラーゼ活性欠損形質を識別し、選別することができる。このような核酸レベルの相違に基づいて品種を識別することにより、多数のオオムギ品種を同時に識別することができ、また、発生のいかなる段階であっても精度よく品種識別を行うことができる。この点で、β−アミラーゼの酵素活性の有無を指標とした識別方法よりも簡便かつ有用である。また、β−アミラーゼ活性欠損形質の中でも、遺伝的にさらに区別し得る品種が存在する場合には、この核酸解析によりその品種間をも識別することが可能となる。
【００５０】
上記ＤＮＡ上の特性を指標とした識別方法としては、第一に、上記ＤＮＡ上の特性を識別し得るプライマーを用いたＰＣＲを用いることができる。このＰＣＲ反応の反応条件は、特に限定はなく、周知の条件を適宜用いることができる。また、プライマーとしては、上記β−アミラーゼ欠損形質を特徴付けるＤＮＡ上の特性を認識し得る増幅産物を生成させる一種類又は一対からなるプライマーを用いることができ、例えば、上記プライマー１とプライマー２とのセットを用いることができる。これらプライマーセットを用いた場合には、後述するように増幅断片の有無により変異の有無を識別することができ、より具体的には、増幅断片が生じない場合には、変異が存在すると判定することができる。
【００５１】
なお、上記プライマー１は、配列番号３に示すβ−アミラーゼ活性を有するβ−アミラーゼ遺伝子（配列番号３）の開始コドンから５７０ｂｐを５’末端に有する順向きのプライマーであり、また、プライマー２は、開始コドンから２８４０ｂｐの配列を３’末端に有する逆向きプライマーである。
【００５２】
但し、上記プライマーのセットは一例であり、配列番号３に示された配列より、他のプライマーをデザインすることもできる。特に、上記に示したプライマー１、プライマー２の配列の近傍の配列に基づいて他のプライマーを容易に構築することができる。
【００５３】
第二に、ＲＦＬＰ（Ristriction fragment length polymorphism)を用いた多型解析を用いることができる。このＲＦＬＰは、適当な制限酵素によりオオムギ染色体ＤＮＡを消化し、消化後の断片を電気泳動で分画し、その分画パターンの相違を解析するものである。
【００５４】
このＲＦＬＰは、周知の方法を用いることができ、ここで用いる制限酵素としては、上述したβ−アミラーゼ活性欠損形質に特有の制限酵素断片を生成させ得る制限酵素、例えば、ＤｒａＩ制限酵素などを用いることができる。
【００５５】
このＤｒａＩ制限酵素を用い、その断片の多型性に基づいて品種識別する場合には、β−アミラーゼ遺伝子の一部を含む４．３ｋｂ断片の消失、又はβ−アミラーゼ遺伝子の一部を含む新たな９．３ｋｂ断片の出現を指標とすることができる。
【００５６】
また、必要に応じて、分画パターンの判定を容易にするためにサザンハイブリダイゼーションを組み合わせることができる。すなわち、上記電気泳動後のゲル内のＤＮＡ断片を膜に転写し、例えばβ−アミラーゼの構造遺伝子をプローブとしてハイブリダイゼーションを行う。このサザンハイブリゼーションは、周知の方法を用いることができ、β−アミラーゼ活性欠損形質に特有の制限酵素断片が特定できる限り、反応条件などは特に限定はない。
【００５７】
また、上記ハイブリダイゼーション用プローブとして、β−アミラーゼをコードした塩基配列またはその一部配列を好適に利用することができる。例えば、一部配列としては、上記配列番号１又は２に記載された塩基配列からなるプローブを用いることができる。なお、プローブを作成する際の標識は、特に限定はなく、ラジオアイソトープ標識、蛍光標識、酵素標識等のいずれをも用いることができる。
【００５８】
４．β−アミラーゼ活性欠損形質のオオムギ品種の育種
上記品種識別、選別方法は、β−アミラーゼ活性欠損形質を有するオオムギ品種の育種に用いることができる。この「育種」には、選別されたβ−アミラーゼ活性欠損形質を有するオオムギ品種を維持することの他、選別されたβ−アミラーゼ活性欠損形質を有するオオムギ品種を他の所望の形質を有するオオムギ品種と交配させて新たなβ−アミラーゼ活性欠損形質を有するオオムギ品種を改良育成することが含まれる。
【００５９】
すなわち、上記品種識別方法は、在来種として存在するβ−アミラーゼ活性欠損形質を有するオオムギ品種の識別と維持に、さらには、新たなβ−アミラーゼ活性欠損形質を有するオオムギ品種の創生に役立たせることができる。
【００６０】
特にβーアミラーゼ遺伝子は、優性遺伝子であり、ヘテロ接合体では表現型としてはβ−アミラーゼ活性を有するものとして示され、酵素活性を指標とした場合にはこのヘテロ接合体を識別することができない。しかし、上記品種識別方法によれば、核酸解析により識別することからヘテロ接合体をも識別することが可能となる。こうしたヘテロ接合体同士を交雑させることにより目的のβ−アミラーゼ活性欠損形質を有するホモ接合体を育種することができる。このように上記品種識別方法を用いることにより育種の確実性を高めることができ、育種年限の短縮化、交配作業量の短縮に寄与し得る。
【００６１】
ここで育種されたβ−アミラーゼ活性欠損形質を有するオオムギ品種は、β−アミラーゼ活性がないことから、この品種を原料として用いることにより、製品などの大幅な改良を行うことが可能となる。特に、麦芽を原料とする製品においては、麦汁の糖組成を大幅に改変することが可能となり、新たな品質を有する製品を作り出すことが可能となる。
【００６２】
【実施例】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明は、これに限定されるものではない。
【００６３】
[実施例１]  粗酵素液の抽出
粗酵素液の抽出には、オオムギ完熟種子を材料として用いた。まず２７４のオオムギコレクションをスクリーニングし、このうちチベット在来種に酵素活性の欠損した変異が見られた。そのため、３８６のチベット系統で再びスクリーニングを行った。
【００６４】
３８６のチベット在来種由来の完熟種子の各一拉を１．０ｍＭ  ＤＴＴ（ジチオトレイトール）を含む１ｍｌの５０ｍＭ酢酸緩衝液中（ｐＨ５．５）に添加し、粉砕後、４℃にて一晩振とうした。その後、１５，０００ｒｐｍにて１０分間遠心し、上清を粗酵素液とした。
【００６５】
[実施例２]  β−アミラーゼ活性染色によるβ−アミラーセ活性欠失品種の探索粗酵素液をβ−アミラーゼ活性測定キット「ダイヤカラーＡＭＹ（小野薬品工業社製」を用いてβ−アミラーゼの活性を測定した。この方法によりチベット紫１などの８株のチベット在来種オオムギにおいて、β−アミラーゼ活性欠失形質が見いだされた。
【００６６】
また、ここで見いだしたβ−アミラーゼ活性欠失形質の自然交配雑種（１株）について、その自殖種子におけるβ−アミラーゼ活性を調べた。その結果を図１に示す。図１に示す通り、活性の比率は、有：無が約３：１に分離された。このことから、β−アミラーゼの活性の有無は、単一優性遺伝子支配であることが示唆された。
【００６７】
[実施例３]  ＤＮＡマー力一を用いた選抜技術による多型性調査
（１）ＤＮＡの単離
上記において得られた自然交配雑種から次の通りＤＮＡの単離を行った。芽生え期のオオムギ緑葉１ｇを液体窒素とともに乳鉢中で粉砕し、１ｍｌの２ＸＣＴＡＢ溶液に懸濁させた。この懸濁液に、１ＸＣＴＡＢ溶液を添加し４ｍｌとして、６０℃、３０分間振とうした。振とう後、２４：１クロロホルムイソアミルアルコール溶液２ｍｌを加え室温で振とうすることにより除蛋白を行い、さらにこの除蛋白操作を操り返した。
【００６８】
除蛋白後のサンプル液に１／１０量の１０％ＣＴＡＢ液と４／３量のＣＴＡＢ沈殿液を添加し、一昼夜放置して核酸を沈殿させた。これを遠心して回収し、沈さを１ＭＮａＣｌ-ＴＥ溶液１ｍｌに再懸濁させ、ＲＮａｓｅ処理を行った。処理後、２−プロパノール（２ｍｌ）を加え、ＤＮＡを沈殿させた。この沈殿したＤＮＡを７０％工タノール（１ｍｌ）で３回洗浄し、最終的に１００ｍｌ滅菌水に懸濁し、サンプルＤＮＡ標品とした。
【００６９】
（２）ＰＣＲによる調査
チベット在来種および通常品種についてβ−アミラーゼ構造遺伝子の配列（配列番号３）から合成したＰＣＲプライマーセットを用いてβ−アミラーゼ遺伝子領域をＰＣＲにより増幅することを試みた。
【００７０】
ここで用いたＰＣＲプライマーセットのうち、５’側の順向きプライマーを、ゲノム遺伝子（配列番号３）の開始コドン（配列番号３における５６〜５８塩基ＡＴＧ）から５７０塩基目（配列番号３の６２５塩基め）を５’末端に有するプライマー１（5'-ATTTTCTACACCGACGGTCA-`3：配列番号１）とし、３’側の逆向きプライマーとして開始コドンから２８３８塩基め（配列番号３における２８９３塩基め）を５’末端として有するプラィマー２（5'-TTCTTCTGGTGCGCTCATC-`3：配列番号２）とした。尚、終示コドンは、配列番号３の３７１１〜３７１３塩基に位置する。
【００７１】
ＰＣＲ反応液の組成は、Ｔａｑポリメラーゼおよぴ添付バッファ（Ｍｇ２＋なし）（ベーリンガマンハイム社製）、ＤＮＡ１μｇ、プライマー１μＭとした。ＰＣＲの反応条件は、変性工程を９４℃、１分、アニーリング工程を５５℃、２分、伸長工程を７２℃、３分とし、この一連の工程を３０サイクル繰り返した。
【００７２】
上記ＰＣＲ反応の結果を図２に示す。図２に示すように、β−アミラーゼ活性を有する品種において増幅断片が生成されたが、一方、他の品種では、断片の増幅は観察されなかった。このことから、β−アミラーゼ構造遺伝子内部もしくは近傍にβ−アミラーゼ活性欠失系統に特有の変異が起こっていることが確認された。
【００７３】
（３）ＲＦＬＰ調査
オオムギ全ＤＮＡ５μｇをＤｒａＩで消化後、アガロースゲル電気泳動により、消化後の断片を分画し、電気泳動後のゲルを陽性ナイロンメンブレン（ベーリンガーマンハイム社製）に密着させ、ゲル中のＤＮＡ断片をアルカリ変性法により前記メンブレンにブロッティングさせた。
【００７４】
一方、このブロッティング後のメンブレンを用いてサザンハイブリダイゼーションを行うためのプローブを調製した。このプローブの作成には、β−アミラーゼ活性を有するオオムギ品種の一つ、「はるな二条」の登熟種子で発現しているβ−アミラーゼの構造遺伝子を用いた。またプローブの作成は、ＤＩＧハイプライム（ベーリンガー社）を用いて行った。
【００７５】
ハイブリダイゼーションの条件は、次の通りとした。先ず、ハイブリダイゼーション温度は４２℃とした。洗浄条件は、２ＸＳＳＣ-１％ＳＤＳを用い５６℃、１５分を２回行い、次に、０．１ＸＳＳＣ-０．１％ＳＤＳにより５６℃、１５分を２回行った。最終的なシグナル検出にはＤＩＧ検出法を用いて行った。サザンハイブリダイゼーションの結果を図３に示す。
【００７６】
図３に示すように、β−アミラーゼ活性を示すチベット在来種が通常品種と同様にサイズマーカーに基づいて算出した値として、７．６ｋｂ、４．３ｋｂ、２．４ｋｂの３本のバンド（ＲＦＬＰ型「Ａ」）を示すのに対し、β−アミラーゼ活性欠損形質を有する在来種では、９．３ｋｂ、７．６ｋｂ、２．４ｋｂの３本のバンド（ＲＦＬＰ型「Ｂ」）が示された。すなわち、β−アミラーゼ活性欠損形質を有する在来種では、通常品種などのβ−アミラーゼを活性を有する品種で観察された４．３ｋｂのバンドが消失し、一方、新たな９．３ｋｂのバンドが出現した。このように、ＲＦＬＰ解析によって、β−アミラーゼ活性欠損形質を特徴付ける変異が示された。尚、図３の左、２レーンについて、４．３ｋｂのバンドと９．３ｋｂのバンドとを矢印で指し示している。
【００７７】
図４には、（ａ）通常品種におけるβ−アミラーゼ遺伝子周辺のＤｒａＩ制限酵素地図と、（ｂ）β−アミラーゼ活性欠損形質を有する在来種において推定されるＤｒａＩ制限酵素地図とを示す。なお、図４（ｂ）では、β−アミラーゼ遺伝子中の下流側又はその隣接する領域に変異が存在し、この領域の構成が不明であることから点線として示している。
【００７８】
[実施例４] β−アミラーゼ構造遺伝子ＲＦＬＰ型とβ−アミラーゼ欠失型との関連性
β−アミラーゼ構造遺伝子ＲＦＬＰ型とチベット在来種にみられたβ−アミラーゼ欠損型が一致するかを調査した。すなわち、β−アミラーゼ活性の有無が分離しているチベット在来種自然交雑系統の自殖種子について、胚を含まない半粒を用いて、β−アミラーゼ活性の有無を確認した。残りの胚を含む半粒をろ紙上で発芽させ、芽生えよりＤＮＡを単離しβ−アミラーゼ構造遺伝子のＲＦＬＰ型を判別した。
【００７９】
その結果、調査した３７個体の全てで例外なく、活性欠損在来種のパターンをホモに持つものだけが（ＲＦＬＰ型「Ｂ」）酵素活性の消失が観察され、活性を保持するパターンをホモに有するもの（ＲＦＬＰ型「Ａ」）及び活性を有するパターンと活性欠損形質を示すパターンとをヘテロに有するもの（ＲＦＬＰ型「Ｈ」）では、酵素活性が観察された。このことからもβ−アミラーゼ活性の消失は、対立遺伝子上での両β−アミラーゼ遺伝子領域内の変異と一致した。
【００８０】
なお、図３には、一部の個体に関するβ−アミラーゼ活性の解析結果をＲＦＬＰパターンと対応させて示した。
【００８１】
【配列表】
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【００８２】
【発明の効果】
以上の通り、本発明により、核酸レベルの解析によりβ−アミラーゼ活性欠損形質を有する品種を識別することが可能となる。そのため、生育段階や環境などに左右されることなく確実かつ簡便にβ−アミラーゼ活性欠損形質を有する品種を識別することができる。すなわち、β−アミラーゼ活性を直接測定し得ない段階の個体や器官などにおいてもβ−アミラーゼ活性を有無を判定することが可能となり、著しく育種年限を短縮することができる。
【００８３】
また、特に、本発明によりβ−アミラーゼ活性が単一優性遺伝子に支配されていることが明らかになったが、本品種識別方法によれば、β−アミラーゼ活性の直接測定では識別し得ないヘテロ接合体の識別をも可能となる。これにより、ヘテロ接合体間の交雑により、目的のβ−アミラーゼ活性欠損形質を有するホモ接合体を創生することが可能となる。従って、本品種識別方法によれば、育種年限の短縮、育種作業の軽減などが図られる。
【００８４】
そして、こうして育種されたβ−アミラーゼ活性欠損形質を有する品種を原料として利用することにより、従来では極めて困難であった、糖組成の大幅な改変が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  本実施例２においてβ−アミラーゼ活性欠失形質の自然交配系統の自殖種子のβ−アミラーゼ活性を調べた結果を示す図である。
【図２】  本実施例３におけるβ−アミラーゼ遺伝子領域のＰＣＲ増幅断片の有無を示す電気泳動図である。
【図３】  本実施例４におけるβ−アミラーゼ活性を有する品種と、β−アミラーゼ活性欠損形質を有する品種とのＲＦＬＰパターンを比較した際の電気泳動図である。
【図４】  β−アミラーゼ遺伝子、変異β−アミラーゼ遺伝子の制限酵素地図を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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