(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原遺伝子データのホモ接合性のデータを抗原単位で並べて記憶させる記憶手段と、ＨＬＡ型判別用データを記憶させるデータベースと、２つの塩基配列データを掛け合わせ各々の塩基コードの違った部分はＮＣ−ＩＵＢに従い１文字のコードに置き換える演算手段とを用い、コンピュータを利用したＨＬＡ型判別用データベース作成方法において、
前記コンピュータは、
前記記憶手段に記憶されたデータ列における始端および終端側の塩基配列において、決定されていない部分がないようにアミノ酸単位で、上記塩基配列が決定されていない最大の領域までをすべてのalleleについて同一場所を削除する第１ステップと、
前記第１ステップで作成されたデータ列のうち２つのデータ列を前記演算手段により１文字表現のヘテロ複合体のデータを作成して前記データベースに記憶させる第２ステップとを実行することを特徴としたＨＬＡ型判別用データベース作成方法。
【請求項２】
抗原遺伝子データのホモ接合性のデータを抗原単位で並べて記憶させる記憶手段と、ＨＬＡ型判別用データを記憶させるデータベースと、２つの塩基配列データを掛け合わせ各々の塩基コードの違った部分はＮＣ−ＩＵＢに従い１文字のコードに置き換える演算手段とを用い、コンピュータを利用したＨＬＡ型判別用データベース作成方法において、
前記コンピュータは、
前記記憶手段に記憶されたデータ列における始端および終端側の塩基配列において、決定されていない部分がないようにアミノ酸単位で、上記塩基配列が決定されていない最大の領域までをすべてのalleleについて同一場所を削除する第１ステップと、
前記第１ステップで作成されたデータ列のうち２つのデータ列を前記演算手段により１文字表現のヘテロ複合体のデータを作成して前記データベースに記憶させる第２ステップと、
前記第２ステップによりデータベースに記憶されたデータのうち対象となるＤＮＡシーケンスデータとの相関の高いデータから抽出する第３ステップとを実行することを特徴とするＨＬＡ型判別方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
ヒトの主要組織適合成遺伝子複合体である白血球膜抗原( ＨＬＡ:Human Leukocyte Antigen )遺伝子  は、免疫応答に強く関与していて、臨床的にも臓器移植の際の移植臓器の適合成に深くかかわっている。本発明はこのＨＬＡ Class I , ClassII  の型判定方法ならびに利用するデータベースの作成に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＨＬＡの型判定には従来、血清学的もしくは細胞学的な方法を用いて行われてきた。すなわちHLA Class I 抗原であるA,B およびC 並びにClassII 抗原のうちのDRとDQ抗原は、各抗原に対する特異抗体と補体とを用いた血清学的方法の１つであるリンパ球障害試験法によって判断されてきた。また、ClassII 抗原のうち、DP抗原については、細胞学的方法のうち、培養法の１つであるPrimed Limhocyte Typing(PLT)  法で型判定されてきた。
【０００３】
しかしながら、これらの方法はリンパ球障害試験では特異抗体の維持、供給に問題があり、PLT では判定に時間と手間がかかり、また、判定の精度も必ずしも満足出来るものではなかった。
【０００４】
さらにＨＬＡ遺伝子の同定、さらには遺伝子のクローニングが行われるようになり、遺伝子レベルでのHLA の型判定が行われるようになった。しかし、その多くが遺伝子の制限酵素切断のパターンの違いからＨＬＡ型の判別を行うものである。近年、分子生物学の進歩によりＨＬＡに関与するＤＮＡの配列をダイレクトシーケンスにて求め遺伝子データバンク(DDBJ , EMBL ,Genbank)に登録されているデータベースにホモロジー検索をかけることにより登録されている標準データの類似性の高いものから表示される。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、このデータバンクのなかには登録されているＨＬＡ ClassI ,CLASSII  に関してはホモ接合性のデータと、新しく登録されたへテロ接合性のデータしか入っていない。また、ＨＬＡの型判断に用いたいにもかかわらず、まったく違うデータが検索されてしまうこともある。
【０００６】
本発明は上記問題点に鑑み、ＨＬＡ型判定法においてダイレクトシーケンスを利用する場合、既知のホモ接合の組み合わせからなるヘテロ複合体のデータベースを作成することを第一の課題とし、ホモロジー検索を行う事によって、ホモ接合、ヘテロ接合の型判定までを行い、正確なＨＬＡの型判断を行うことを第２の課題とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
請求項１の発明にかかるＨＬＡ型判別用データベース作成方法は、抗原遺伝子データのホモ接合性のデータを抗原単位で並べ、始端および終端側の塩基配列において、決定されていない部分がないようにアミノ酸単位で、上記塩基配列が決定されていない最大の領域までをすべてのalleleについて同一場所を削除し、ヘテロ接合を作るために２つのデータを掛け合わせ、各々の塩基コードの違った部分はＮＣ−ＩＵＢに従い１文字のコードに置き換えて１文字表現のヘテロ複合体のデータを作ることを特徴としている。
【０００９】
さらに、請求項２の発明にかかるＨＬＡ型判別方法は、上記方法により作成されたデータの中から対象となるＤＮＡシーケンスデータとの相関の高いものから抽出することによって最適なＨＬＡ型を判別することを特徴としている。
【００１０】
請求項１の発明では、ＨＬＡのタイプがへテロ複合体を含む型での詳細な型認識データであって、コンピュータを用いて検索できる形式のデータを提供でき、多くの種類に分類することができる。
【００１２】
請求項２のＨＬＡ型判別方法では、請求項１の発明により作成されたデータベースを用いてホモロジー検索を行うことで、臓器移植の際には適合性のあるタイプの遺伝子の型であるかどうか正確に抽出できる。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明の実施例を以下、図面を参照しながら説明する。
【００１４】
まず、遺伝子データバンク(DDBJ , EMBL , Genbank等) からHLA ClassI(A,B,C) 及びClassII(DPA ,DPB , DRA ,DRB , DQA , DQB ,DMA ,DMB ）  その他必用な領域にかかわるホモ接合の塩基配列データを入手する。
【００１５】
入手したホモ接合の塩基配列データの一例の始端の一部を示したのが図１であり、ここでＡＧＧ等は塩基配列を、  AGG  GCC  のように塩基配列データの各３個分でアミノ酸単位を示し、左側の列は遺伝子の型（ＨＬＡのタイプ）を示している。
【００１６】
図中で、「−」マークは最上段の配列と同一である事を意味し、「＊」マークは塩基配列が決定していないことを意味する。
【００１７】
次に、塩基配列の始端と終端において塩基配列の決定していない部分がなくなるように（ここでは図１中に＊でマークしてある部分までを）アミノ酸単位で、すべてのalleleについて取り除く。
【００１８】
図１の場合はDPB1*0801 が最大で２１ベースまで決定されていない。したがってアミノ酸では７までが決定されていない事になる。この場合はアミノ酸単位で１〜７までをすべてのデータについて削除し、同様に終端側も同じような処理を行う。
【００１９】
この結果を表示したのが図２であり、DPB1の始端側の一部を示しており、始端側から決定ができない配列部分を取り除いたことがわかる。
【００２０】
この図２の状態からヘテロ接合のデータを合成するために、すべての組み合わせにおいてambiguity を含めた形で、２つの配列の論理和を計算する。このambiguity はNC-IUB(Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry)(下記) に基づきコードの置換を行う。例えば、DPB1*01011のデータは(DPB1*01011) * (DPB1*01012) 、(DPB1*01011) *(DPB1*02011)....とすべての組み合わせで論理和をとり、コードが違った塩基については、ambiguity （複アミノ酸対応：２つ以上の塩基配列が混じってしまう所）とみなし、下記のＮＣ−ＩＵＢに基づいて１文字置換を行う。
【００２１】
ＮＣ−ＩＵＢによる塩基配列コード表現
２もしくは３つの同じ位置の塩基配列データにおいて違いが生じたときには以下の定義にもとずき１文字表現を行う。
【００２２】
R = G and A
Y = T and C
W = A and T
S = G and C
M = A and C
K = G and T
B = G and T and C
D = G ans A and T
V = G and A and C
H = A and T and C
N = G and A and T and C
ambiguity を含めて２つの配列の論理和の塩基配列を決定したのが図３である。例えば、(DPB1*01011) * (DPB1*02011) では、最初のアミノ酸の部分の論理和では、一番目の塩基の論理和が、G and C となるので、上記表より S  となり、次は、 T and T  で T  となり、３番目は、G and T で K  となり、図３の結果と一致する。
【００２３】
すべてのデータの組み合わせにおいて上記操作を繰り返す。
【００２４】
このようにして決定されたヘテロ接合のデータは、ホモ接合データとともに図４のように塩基配列データをシリアルにつなげてホモロジー検索可能なデータ形式で保存する。
【００２５】
以上の工程により作成されたデータに対し対象となるダイレクトシーケンスデータをホモロジー検索する事により、適合率の高いalleleの番号が表示される。
図５〜図１０まではＦＡＳＴＡを利用して当該データにホモロジー検索を行った例である。
【００２６】
図５においてＯＰＴ値が高いほど相関があることを示している。したがって、このＯＰＴ値が所定の値以上であれば、そのＯＰＴ値に対応するＨＬＡ型（左側に並んでいる１１０１２という値）の適合性が高いという判定が可能となる。
【００２７】
ここで、dpb1と記載されている行に配列されているGTGT....という記号が対象となるＤＮＡダイレクトシーケンスデータを示し、その下の 11012等が記載されている行に配列されているデータがデータベース内の塩基配列データを示す。
【００２８】
11012 の塩基配列データは対象データとまったく一致しているので相関がもっとも高い。次に、(11011 * 11012) は７３列目のデータベース内の塩基配列データが M  で対象となるデータが A  であるので、異なっているものの、 M  は上記ＮＣ−ＩＵＢの法則により、 A  と C  が混在しているものをいうので、対象となるデータとなんらかの相関があるといえるので、全くデータが異なっているものよりは相関値が高いことになる。
【００２９】
その他のデータについても同様の考え方で相関の高低が決定される。
【００３０】
一方、上記のような検索を行う場合には、請求項２で示されるプログラムが記録された記憶媒体を遺伝子データバンクから抗原遺伝子データのホモ接合データ等を入手することができるコンピュータ装置に装填し、ホモ接合データを当該コンピュータに取り込んだ後、この記憶媒体内のプログラムを駆動させれば、ＨＬＡ型判別用データベースを作成することができる。
【００３１】
【発明の効果】
本発明によれば、データベースの中のホモ接合性のデータベースを入手し、ホモ接合のデータの組み合わせをおこない、ヘテロ接合のデータを作るようにしているので、へテロ複合体を含む型での詳細な型認識データを提供でき、当該データベースと検体より求まった塩基配列データをホモロジー検索することによってホモ接合のデータのみでなくへテロ複合体も含めてのＨＬＡ型の分別ができる。これにより従来、ホモ接合と既知の一部のへテロ結合体のみでしか分類が出来なかった型認識がすべてのホモ型の組み合わせからなるへテロ複合体を含む型での詳細な型認識ができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】遺伝子データバンクから入手した塩基配列の始端側の一部を示す図である。
【図２】図１の塩基配列から決定ができない配列部分を取り除いた塩基配列データを示す図である。
【図３】２つの配列の論理和の塩基配列をＮＣ−ＩＵＢにより決定したデータを示す図である。
【図４】図３で構成されたデータをシリアルに並べた状態を示す図である。
【図５】本発明で構成された塩基配列データに対してホモロジー検索を行った結果を示す図である。
【図６】図５からの続き図である。
【図７】図６からの続き図である。
【図８】図７からの続き図である。
【図９】図８からの続き図である。
【図１０】図９からの続き図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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