(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アンドロゲンレセプターをコードする核酸であって、
ａ．ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１に示すヌクレオチド配列；
ｂ．遺伝子コードの縮重の範囲内における、ａ．の配列に対応するヌクレオチド配列；又は
ｃ．ストリンジェント条件下で、ａ．の配列とハイブリダイゼーションするヌクレオチド配列；
を含んで成ることを特徴とする核酸。
【請求項２】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１に示す核酸配列のタンパク質コード部分を含んで成る、請求項１記載の核酸。
【請求項３】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項記載の核酸によりコードされるポリペプチド。
【請求項５】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２に示すアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド。
【請求項６】
アンドロゲンレセプターをコードする核酸であって、
ａ．ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３に示すヌクレオチド配列；
ｂ．遺伝子コードの縮重の範囲内における、ａ．の配列に対応するヌクレオチド配列；又は
ｃ．ストリンジェント条件下で、ａ．の配列とハイブリダイゼーションするヌクレオチド配列；
を含んで成ることを特徴とする核酸。
【請求項７】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３に示す核酸配列のタンパク質コード部分を含んで成る、請求項６記載の核酸。
【請求項８】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸。
【請求項９】
請求項６〜８のいずれか１項記載の核酸によりコードされるポリペプチド。
【請求項１０】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４に示すアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド。
【請求項１１】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５に示す配列を含んで成るペプチド。
【請求項１２】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６に示すアミノ酸配列を含んで成るペプチド。
【請求項１３】
抗体の生産のための請求項４、５、９もしくは１０記載のポリペプチド、又は請求項１１及び／もしくは１２記載のペプチドの使用。
【請求項１４】
請求項４、５、９もしくは１０記載のポリペプチド、又は請求項１１及び／もしくは１２記載のペプチドに対する抗体。
【請求項１５】
腫瘍組織内の請求項４又は５記載のポリペプチドの検出のための請求項１４記載の抗体の使用。
【請求項１６】
腫瘍細胞内の請求項１〜３いずれか１項記載のｍＲＮＡの核酸の存在を検出する試薬の製造のための、請求項１２記載のペプチドをコードする核酸配列と相補性である核酸配列を有するプローブの使用。
【請求項１７】
請求項１〜３又は請求項６〜８のいずれか１項記載の核酸の少なくとも一のコピーを含むベクター。
【請求項１８】
請求項１〜３又は請求項６〜８のいずれか１項記載の核酸又は請求項１７記載のベクターでトランスフィックス（ｔｒａｎｓｆｉｘ）された細胞。
【請求項１９】
ＰＣ−３細胞、ＬＮＣａＰ細胞、ＣＶ−１細胞及びＤｕｎｎｉｎｇ細胞から成る群から選ばれる請求項１８記載の細胞。
【請求項２０】
請求項１〜３又は請求項６〜８のいずれか１項記載の核酸の発現のための請求項１８又は１９記載の細胞の使用。
【請求項２１】
請求項４、５、９もしくは１０記載のポリペプチドのエフェクターを同定するための、
ａ．請求項１〜３又は請求項６〜８のいずれか１項記載の核酸；
ｂ．請求項４、５、９又は１０記載のポリペプチド；
ｃ．ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５に示すアミノ酸配列を有するペプチド；又は
ｄ．請求項１８もしくは１９記載の細胞；
の使用。
【請求項２２】
本発明に係るポリペプチドのエフェクターを検出するための検査システムであって、
ａ．請求項１８又は１９記載の細胞内でリポーター遺伝子を発現させ；そして
ｂ．この細胞を、請求項４、５、９又は１０記載のポリペプチドをわずかに又は全く含まないなら、請求項１７記載のベクターを加えてトランスフィックスさせ；
ｃ．当該細胞を被験物質の存在下又は不在下で培養し；そして
ｄ．前記リポーター遺伝子の発現の改変を測定する；
システム。
【請求項２３】
抗アンドロゲン活性を有する被験物質を検出するための検査システムであって、
ａ．請求項１８又は１９記載の細胞内でリポーター遺伝子を発現させ；そして
ｂ．この細胞を、請求項４又は９記載のポリペプチドをわずかに又は全く含まないなら、請求項１７記載のベクターを加えてトランスフィックスさせ；
ｃ．当該細胞を被験物質の存在下又は不在下で、アンドロゲンの同時存在を伴って培養し；そして
ｄ．前記リポーター遺伝子の発現の改変を測定する；
システム。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はアンドロゲンレセプターの二種類の新規変異体及びそれらの用途に関する。
【０００２】
【従来の技術】
アンドロゲンは男性性ホルモンであり、そして主に睾丸で産生される（Roy, A.K. ら、Vitam. Horm. 1999, 55, 309-352）。これらは男性性別分化を調節し、また精子形成のために必須である。更に、アンドロゲンは第二次性徴及び性的挙動パターンの表現を担う。アンドロゲンは前立腺及び精巣癌の発症及び再発においても本質的な役割を果たしている（Craft, N. and Sawyers, C.L., Cancer Metastatis Rev. 1998-99, 17, 421-427; Rajperts-De Meyts, E. and Skakkabaek, N.E., Eur. Urol. 1993, 23, 54-59）。
【０００３】
アンドロゲンは特異的な核レセプターであるアンドロゲンレセプターに結合することにより作用する。既知のアンドロゲンレセプターはリガンド結合部位、ＤＮＡ結合部位及び複数のトランス作用機能をもったリガンド依存性転写因子である（Lindzey, J. ら、Vitam. Horm. 1994, 49, 383-432）。主たるトランス作用機能はＮ末端側半分にあり、それはアンドロゲンレセプター遺伝子のエキソン１によりコードされる。リガンドたるアンドロゲンが結合すると、レセプターのコンフォメーションは変化する。このコンフォメーション変化により、レセプターは二量体を形成し、そしてステロイド応答要素と呼ばれる特異的な二本鎖ＤＮＡ配列に結合できるようになる。補活性化因子及びその他の転写因子との相互作用により、標的遺伝子の転写が活性化される（Lindzey, J. ら、Vitam. Horm. 1994, 49, 383-432）。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
アンドロゲンはホルモン依存性腫瘍において機能している。従って、例えば前立腺癌は、アンドロゲンレセプターに対する結合を天然アンドロゲンと競合する抗アンドロゲンで処置される。尚、抗アンドロゲンは一定の治療期間経過後は有効でなくなることが往々にして示されている（Crawford, E.D.ら、Urology 1999, 54, 1-7 ）。この治療耐性の原因として、抗アンドロゲン又はエストロゲンもしくはグルココルチコイドによる刺激を可能にするアンドロゲンレセプターの突然変異が考えられている（Brinkmann, A.O. and Trapman, J., Nature Med. 2000, 6, 628-629 ）。しかしながら、このような突然変異はめったに起きない。その他の考えられる原因はアンドロゲンレセプター遺伝子の増幅であり、アンドロゲン耐性患者の約２８％と発表されている（Koivisto, P.ら、Cancer Res. 1997, 57, 314-319 ）。これは全ての症例の説明とはならない。従って、有効な腫瘍治療のためには、治療の別の攻撃点を知ることが所望される。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
この課題はアンドロゲンレセプターの２つの新規変異体の製造により解決される。
【０００６】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２に示すアミノ酸配列を有する本発明に係る第一アンドロゲンレセプターをＡＲ４２と称し、そしてＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４に示すアミノ酸配列を有する本発明に係る第二アンドロゲンレセプターをＡＲ３２と称する。既知のアンドロゲンレセプター（Lubahn, D.B.ら、Seience 1988, 240, 327-330; Chang ら、Seience 1988, 240, 324-326）はＡＲと表記する。ＡＲとＡＲ４２の配列はＤＮＡ結合ドメイン、いわゆる「ヒンジ」ドメイン及びリガンド結合ドメインの範囲内で同一である（図１のエキソン２〜８参照）。それらはＮ末端の範囲において相違する。ＡＲはこの部分では長さが約５３７個のアミノ酸のトランス作用ドメインを有するが、ＡＲ４２はこの部分では７個のアミノ酸の範囲しか有さず、その配列はＡＲのトランス作用ドメインの配列とは相違する。この７個のアミノ酸の範囲は任意の公知のエキソンにおけるゲノム配列に含まれていない。むしろ、それは従前には翻訳されないものと考えられていたＤＮＡ範囲の構成成分である。
【０００７】
ＡＲ３２はＡＲとはＮ末端及びＣ末端で区別される（図１のエキソン１，７及び８参照）。ＡＲ３２はＡＲ４２と同じＮ末端配列を有する。それはＡＲ４２及びＡＲとはＣ末端で区別される。そのＣ末端配列は短く、そしてＡＲ４２及びＡＲと比較して１０個のアミノ酸で相違する。
【０００８】
本発明に係るＡＲ４２及びＡＲ３２は健康なヒトの様々な組織で発現される。ＡＲ４２は心臓で特に強く発現される（図２）。
【０００９】
本発明に係るＡＲ４２及びＡＲ３２はアンドロゲン及びその他のリガンドに結合することができる。リガンドに結合した後、ＡＲ４２及びＡＲ３２はホモ二量体（ＡＲ４２／ＡＲ４２又はＡＲ３２／ＡＲ３２）を形成するか、又はＡＲとヘテロ二量体を形成できる（ＡＲ４２／ＡＲ又はＡＲ３２／ＡＲ）。このホモ二量体はＡＲのステロイド応答要素に結合できる。しかしながら、それらはＡＲを活性化する標的遺伝子の転写を活性化できない。ＡＲ４２及びＡＲ３２は従ってＡＲのレプレッサーとして働く。ＡＲとのヘテロ二量体の形成により、ＡＲの活性は調節されうる。これは標的遺伝子に依存して阻害とも活性化ともなる。発現の活性化は、発現がＡＲとＥｔｓ転写因子との相互作用によりブロッキングされる標的遺伝子内で実行される。このＥｔｓ転写因子はＡＲのＮ末端に結合することによってＡＲの補レプレッサーとして働く（Schneikert, J ら、J. Biol. Chem. 1996, 271, 23907-23913 ）。しかしながら、それらはＡＲ４２又はＡＲ３２には結合できない。その結果、そのブロッキングはなくなり、そして発現は促進される。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明はアンドロゲンレセプターをコードする核酸に関連する。ここで、この核酸は、
ａ．ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１及び／もしくは３に示すヌクレオチド配列；
ｂ．遺伝子コードの縮重の範囲内でのａ．の配列に対応するヌクレオチド配列、又は
ｃ．ストリンジェント条件下でａ．及び／もしくはｂ．の配列とハイブリダイゼーションするヌクレオチド配列
を含んで成る。
【００１１】
本発明に係る「ストリンジェント条件下でのハイブリダイゼーション」は、Sambrookら（Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 ）により定義されている。ストリンジェントハイブリダイゼーションは、例えば、１×のＳＳＣ及び０．１％のＳＤＳで５０℃にて、好ましくは５５℃にて、特に好ましくは６２℃にて、そして最も好ましくは６８℃にて１時間、特に０．２×のＳＳＣ及び０．１％のＳＤＳで５５℃にて、好ましくは６２℃にて、そして最も好ましくは６８℃にて１時間かけて洗浄した後にハイブリダイゼーションシグナルがまた検出されるなら、存在しているといえる。このような条件下でＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１及び／もしくは３に示す核酸とハイブリダイゼーションする核酸、又は遺伝子コードの縮重範囲内でこの配列に対応するヌクレオチド配列も本発明の範囲に属する。
【００１２】
核酸は一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ、例えばｃＤＮＡ、又はＲＮＡ、例えばｍＲＮＡ，ｃＲＮＡ、又はプレｍＲＮＡを生成できうる。
【００１３】
好適なのはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１及び／又は３に示す核酸配列のタンパク質コード部分を含んで成る核酸である。ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１に示す配列のタンパク質コード部分はＮｏ．１６３〜１３２９のヌクレオチド範囲内にあり、そしてＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３に示す配列のタンパク質コード部分はＮｏ．１６３〜１０４７のヌクレオチド範囲内にある。
【００１４】
本発明の対象はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２及び／又は４に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸でもある。
【００１５】
本発明に係る核酸は哺乳動物、例えば哺乳動物細胞、又はｃＤＮＡライブラリー、又は例えばヒト細胞から獲得されるゲノムライブラリーから獲得できうる。これらはハイブリダイゼーションプローブ又は増幅プライマーとしてＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１及び３に示す核酸配列の短い部分を利用する公知の技術に従って単離できる。特に好適なものはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５又は６に示すペプチド配列をコードする部分である。
【００１６】
更に、本発明は本発明に係る核酸によりコードされるポリペプチドに関連する。このようなポリペプチドはアンドロゲンレセプターの機能を有する。更に、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２又は４に示すアミノ酸配列を含んで成るポリペプチドが本発明の対象である。
【００１７】
本発明に係るポリペプチドは組換ポリペプチド、天然、単離されたポリペプチド、又は合成ポリペプチドであってよい。
【００１８】
本発明は更にＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５に示す配列を含んで成るペプチドに関連する。ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５に示す配列はＡＲ３２のＣ末端（アミノ酸２８５〜２９４）に相当する。
【００１９】
本発明は更にＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６に示すアミノ酸配列を含んで成るペプチドに関連する。ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６に示すアミノ酸配列はＡＲ４２及びＡＲ３２のＮ末端（アミノ酸１〜７）に相当する。
【００２０】
本発明に係るポリペプチド及び本発明に係るペプチドは抗体の生産のために利用できうる。ポリクローナル抗体の生産の場合、ペプチドを例えばＫＬＨ（キーホールリンペットヘモシアニン）に結合させ、そして動物、例えばウサギに施してよい。これらはまたモノクローナル抗体の生産にも利用されうる。抗体の生産のため、本発明に係るペプチド又は本発明に係るペプチドの複数の混合物を利用することができる。この場合、抗体の生産は標準のプロセス、例えばKohler, G. and Milstein, C., Nature 1975, 256, 495-497及びNelson, P.N.らMol. Pathol. 2000, 53, 111-117に記載の通りにして実施する。
【００２１】
本発明の対象は本発明に係るポリペプチド又は本発明に係るペプチドに対して特異的な抗体でもある。
【００２２】
本発明に係る抗体は本発明に係るＡＲ４２又はＡＲ３２の検出のために利用できうる。これは、例えば免疫化学により実施できうる。腫瘍組織内、特に前立腺腫瘍の組織内の本発明に係るポリペプチドの検出が好ましい。ホルモン治療耐性が本発明に係るＡＲ４２及び／又はＡＲ３２の改変された発現に帰着しうるかを検討できるようになる。本発明に係る抗体はその他の免疫検査、例えばＥＬＩＳＡ（酵素結合型免疫収着アッセイ）又は放射性免疫検査にも利用されうる。かくして、本発明に係るＡＲ４２及びＡＲ３２の濃度は組織又は細胞抽出物内で検出されうる。
【００２３】
ＡＲ４２又はＡＲ３２の発現の検出は細胞中のｍＲＮＡの検出に介して実施することもできうる。本発明の対象は従って、本発明に従う腫瘍細胞中のｍＲＮＡの存在の検出のための試薬の製造のための、本発明に係るペプチドをコードする核酸配列に相補性である核酸配列を有するプローブの利用でもある。プローブは少なくとも１４ヌクレオチドを有するＤＮＡの短鎖である。本発明に係るプローブは例えばノーザンブロット分析に利用できうる。この方法は例えばSambrook, J.ら1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press に記載されている。ＲＮＡを検出するためのその他の方法はｉｎ−ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ＲＮＡａｓｅ保護アッセイ又はＰＣＲである。
【００２４】
更に、本発明の対象は本発明に係る核酸の少なくとも一のコピーを含むベクターである。ベクターは原核系でも真核系のベクターであってもよい。ベクターの例はｐＰＲＯ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ），ｐＢＡＤ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ），ｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ），ｐＣｌ（Ｐｒｏｍｅｇａ），ｐＩＲＥＳ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ），ｐＢＡＣ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ），ｐＭＥＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ），ｐＢｌｕｅＢａｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）である。本発明に係る核酸は当業者公知の方法によりこのようなベクターの中に挿入させることができる。発現シグナル、例えばプロモーター及びエンハンサーとの関係で、本発明に係る核酸は好適にはベクター内にある。
【００２５】
本発明は更に本発明に係る核酸配列又は本発明に係るベクターでトランスフィックス（又はトランスフェクション又は形質転換又は形質導入）された細胞に関連する。細胞として、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、酵母、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）、Ｓｆ９，ＣＯＳ，ＣＶ−１又はＢＨＫが利用できる。好適なのはＰＣ−３細胞、ＬＮＣａＰ細胞、ＣＶ−１細胞及びＤｕｎｎｉｎｇ細胞から成る群から選ばれた細胞である。このような細胞はＡＲ４２及び／又はＡＲ３２の生産のため、並びに細胞系検出のために利用できうる。
【００２６】
本発明の対象は更に、本発明に係るポリペプチドのエフェクターの同定のための
ａ．本発明に係る核酸；
ｂ．本発明に係るポリペプチド；
ｃ．ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５に示すアミノ酸配列を有するペプチド；又は
ｄ．本発明に係る細胞；
の利用である。エフェクターとは、本発明に係るポリペプチドに対して阻害又は活性化効果を有する物質をいい、そして本発明に係るポリペプチドのアンドロゲンレセプター機能に影響を及ぼすことができるものである。
【００２７】
更に、本発明は本発明に係るポリペプチドのエフェクターを検出するための検査システムに関連する。そのシステムは、
ａ．本発明に係る細胞内でリポーター遺伝子を発現させ；そして
ｂ．これらの細胞を、本発明に係るポリペプチドをわずかに又は全く含まないなら、本発明に係るベクターを加えてトランスフィックスし；
ｃ．被験物質の存在下又は不在下でこれらの細胞を培養し、そして
ｄ．前記リポーター遺伝子の発現の改変を測定する；
ことによる。
【００２８】
本発明は更に抗アンドロゲン活性を有する被験物質を検出するための検査システムに関連する。このシステムは、
ａ．本発明に係る細胞内でリポーター遺伝子を発現させ；そして
ｂ．これらの細胞を、本発明に係るポリペプチドをわずかに又は全く含まないなら、本発明に係るベクターを加えてトランスフィックスし；
ｃ．被験物質の存在下又は不在下で、アンドロゲンの同時存在を伴ってこれらの細胞を培養し、そして
ｄ．前記リポーター遺伝子の発現の改変を測定する；
ことによる。
【００２９】
本発明に係る検査システムの場合、適当な細胞、例えばＣＶ−１細胞、ＣＯＳ細胞、又は前立腺に由来する細胞を安定又は過渡的な要領で本発明に係る核酸もしくはその一部で、又はその一部とその他の因子のトランス作用ドメインとの組合せでトランスフィックスする。本発明に係る核酸の一部は例えばリガンド結合ドメイン、トランス作用ドメイン及びＤＮＡ結合ドメインであってよい。その他の因子のトランス作用ドメインは例えばＡＲ又はプロゲステロンドメインのリガンド結合ドメイン、トランス作用ドメイン及びＤＮＡ結合ドメイン、ｇａｌ４−トランス作用ドメイン又はＶＰ１６トランス作用ドメインであってよい。リポータープラスミドを同時トランスフィックスしてよい。後者は１又は複数のステロイド応答要素を含み、それは３塩基対のスペーサーを有するＴＧＴＴＣＴ配列の反転リピートを生成する。更に、かかる応答要素直接リピートは３〜５つの塩基対のスペーサーを有するＴＧＴＴＣＴ配列であってよい。ＴＧＴＴＣＴ配列における偏向が、天然応答要素について記載の通り（Kokontis, J.M. and Liao, S., Vitam. Horm. 1999, 55, 219-307 ）可能である。最小プロモーター（Schenborn, E. and Groskreutz, D., Mol. Biotechnol. 1999, 13, 29-44）及び異種リポーター遺伝子は下流にあり、作用可能式に連結されている。リポータープラスミドは既知のアンドロゲン調節遺伝子のプロモーター又はプロモーター部分も含む。前立腺内でアンドロゲン依存性である遺伝子が好適に発現される。その例はＰＳＡ、プロバシン及びＣ３（１）遺伝子である。リポーター遺伝子は例えばルシフェラーゼ遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子、ウロキナーゼ遺伝子、グリーンフルオレセンスタンパク質遺伝子及びβ−ガラクトシダーゼ遺伝子である。被験物質は好ましくはアンドロゲン誘導体の群から選ばれる。しかしながら、これらの検査システムは大規模な物質ライブラリーをスクリーニングするのにも利用できうる。抗アンドロゲン活性を有する被験物質の検出のための検査システムの場合、例えばＲ１８８１、テストステロン、ジヒドロテストステロン及びテストステロン誘導体が工程ｃにおけるアンドロゲンとして利用できる。
【００３０】
本発明に係る検査システムにおいてリポーター遺伝子の発現を改変するが、ＡＲのエフェクターではない物質が好適である。このような物質がＡＲのエフェクターであるかを検討するため、本発明に係る検査システムと似たように構築された検査システムを利用してよく、それにおいては細胞を本発明に係るベクターの代わりにＡＲの核酸を含むベクターでトランスフィックスする。
【００３１】
本発明に係るポリペプチドとＡＲとのヘテロ二量体の形成により、本発明に係るポリペプチドは活性化するがＡＲは活性化しないエフェクターはＡＲの阻害をもたらす。この阻害作用は実施例５に記載の検査システムにより決定できうる。ＡＲの阻害は全てのアンドロゲン依存性疾患、例えば前立腺腫瘍の治療、そして更には雄動物の産児制限において所望される。雄動物の産児制限においては、例えば成熟精子の形成のために必要な遺伝子の発現がＡＲの阻害によって阻害される。
【００３２】
更に、本発明に係るポリペプチドのホモ二量体又はヘテロ二量体により選択的に調節される遺伝子を同定することができる。このような遺伝子は特異的なノックアウト及びノックイン実験により同定できる。
【００３３】
本発明は更に医薬活性物質の調製のための方法も提供する。この方法は、
ａ．検査すべき物質を本発明に係る検査システムにかける；
ｂ．当該検査システムに対する当該物質の作用を、コントロールとの比較において測定する；そして
ｃ．工程ｂ．において異種ポリペプチドの発現の調節を示す物質を同定する；
ことによる。
【００３４】
本発明は更に薬剤の調製のための方法にも関連する。この方法は、
ａ．検査すべき物質を本発明に係る検査システムにかける；
ｂ．当該検査システムに対する当該物質の作用を、任意的にコントロールとの比較において測定する；
ｃ．工程ｂ．において異種ポリペプチドの発現の調節を示す物質を同定する；そして
ｄ．工程ｃ．で同定された物質を医薬において汎用されている調剤物質と混合する；
ことによる。
【００３５】
本発明は更に、薬剤の調製のための方法を提供する。この方法は、
ａ．物質を本発明に係る検査システムにかける；
ｂ．当該検査システムに対する当該物質の作用を、コントロールとの比較において測定する；
ｃ．工程ｂ．において異種ポリペプチドの発現の調節を示す配列を同定する；
ｄ．工程ｃ．において同定された物質を任意的に最適化する、そして
ｅ．この任意的に最適化された物質を医薬において汎用されている調剤物質と混合する；
ことによる。
【００３６】
好適なのは、本発明に係る検査システムにおいてリポーター遺伝子活性を１０倍以上増強する、又は阻害する物質である。本発明に係る方法によって同定された物質は任意的に代謝安定性、本発明に係る検査システムにおける活性及び／又は生物有用性について最適化が図られうる。これに関し、化学において一般的な方法が利用されうる。
【００３７】
好適な製剤は経口、経腸又は非経口投与に適した分散剤型から成る。かかる分散剤型は例えば錠剤、フィルム錠剤、被覆錠剤、ピル、カプセル、粉末又はデポット剤型、並びに座薬であってよい。対応の錠剤は、例えば活性成分を既知の助剤、例えば不活性希釈剤、例えばデキストロース、糖、ソルビトール、マンニトール、ポリビニルピロリドン、崩壊剤、例えばコーンスターチ又はアルギン酸、結合剤、例えばスターチ又はゼラチン、潤滑剤、例えばカルボキシポリメチレン、カルボキシメチルセルロース、セルロースアセテートフタレート又はポリビニルアセテートと混合することにより得られうる。錠剤は複数の層から成っていてもよい。
【００３８】
被覆錠剤は従って、錠剤と似たようにして作られた核を、被覆錠剤の被膜において汎用されている試薬、例えばポリビニルピロリドン又はシェラック、アラビアゴム、タルク、酸化チタン又は糖により被覆することによって製造できる。この場合、被覆された錠剤シェルも数層から成ってよく、かくして錠剤について上述した助剤が利用されうる。活性成分を含むカプセルは、例えば活性成分を不活性ビヒクル、例えばラクトース又はソルビトールと混合し、ゼラチンカプセルの中に封入することによって製造できる。本発明に係る物質は適当な溶液、例えば生理学的に一般的な塩溶液として、点滴又は注射溶液としても利用できうる。非経口投与の場合、特に油性溶液、例えばゴマ油、カストール油及び綿実油が好ましい。溶解度を高めるため、可溶化剤、例えばベンジルベンゾエート又はベンジルアルコールを加えてよい。入手でき、且つ入手できた物質を本発明に係る方法を介して経皮システムの中に組込み、かくしてそれらを経皮投与することも可能である。
【００３９】
本発明に係る薬剤はアンドロゲン依存性疾患の治療のための医薬品の製造のために利用することができる。かかる疾患は例えば前立腺癌又は精巣腫瘍であってよい。
【００４０】
本発明に係る薬剤は雄動物の産児制限のための医薬品の製造のために利用できる。
【００４１】
アンドロゲン依存性疾患は、一方で、前述の通り、本発明に係るポリペプチドのエフェクターにより影響されうるが、他方で、疾患組織内の本発明に係るポリペプチドの濃度の改変によっても影響されうる。この目的のため、遺伝子治療において汎用されているベクターの助けを借りて本発明に係る核酸を、又は本発明に係るポリペプチドを組織の中に導入してよい。遺伝子治療では、本発明に係る核酸を含むベクターを設計して投与する。その例は、アデノウィルス、アデノウィルス関連ウィルス、ヘルペス単純ウィルス又はＳＶ４０に由来するベクターである。遺伝子治療はGomez-Navarro J.ら（Eur. J. Cancer 1999, 35, 867-885）に記載のプロトコールに従って実施してよい。投与は局部的に、即ち、疾患組織、例えば前立腺腫瘍の中に直接施すか、又は全身的に、即ち、血流を介して施してよい。これは本発明に係るポリペプチドの発現の増強をもたらす。
【００４２】
本発明に係るポリペプチドの投与は融合ポリペプチドの形態で実施してよい。本発明に係るポリペプチドは好ましくは融合されたポリペプチド、例えばＥＧＦ又はトランスフェリンにより、所望の組織、例えば前立腺腫瘍へと輸送される。
【００４３】
【実施例】
本実施例で利用する分子生物学的方法、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ｃＤＮＡの生産、ＤＮＡのクローニング、ＤＮＡの配列決定は公知の教科書、例えばMolecular Cloning, A Laboratory Manual (Sambrook J. ら、1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press ）に記載の通りにして実施した。
【００４４】
実施例１：ＡＲ４２及びＡＲ３２の同定及びクローニング
出発材料はヒト胎盤由来の１μｇの全ＲＮＡとし、それはＳＭＡＲＴ  ＲＡＣＥ増幅キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）によりｃＤＮＡへと変換しておいた。ＰＣＲ増幅のため、Ａｄｖａｎｔａｇｅ−２  ＰＣＲキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）をアンチセンスプライマー
【化１】
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と一緒に用いた。このプライマーはヒトアンドロゲンレセプターのヒンジ領域に対して特異的であり、そしてセンス５′−ＳｍａｒｔIIプライマーを使用する。反応条件は次の通りとした：９４℃で５秒、７２℃で３分（５サイクル）；９４℃で５秒、７０℃で１０秒、７２℃で３分（５サイクル）；９４℃で５秒、６８℃で１０秒、７２℃で３分（２７サイクル）、その結果、約５００塩基対のフラグメントが増幅され、アガロースゲルで精製し、ＰＣＲ−ＴＯＰＯプラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、そして配列決定した。このＤＮＡ配列はアンドロゲンレセプターの完全なＤＮＡ結合ドメインが存在していることを示した（アンドロゲンレセプター遺伝子のエキソン２及び３に相当）。更に、エキソン２の直前に新たな配列が結合していた。エキソン１Ｂと命名するこの部分は約１６０塩基対の非翻訳領域と、７個のアミノ酸をコードする短い新たな配列を含む。完全ｃＤＮＡを単離するため、センスプライマー
【化２】
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（最終濃度０．２μｍ）及び
【化３】
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（最終濃度１μｍ）（新しいエキソン１Ｂ範囲に由来）、並びにアンチセンスプライマー
【化４】
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（既知ＡＲのＣ末端をコードする）を合成した。ＳＭＡＲＴ−ＰＣＲのための特別な条件を利用した。これにより、同一のｃＤＮＡ胎盤から約１２００塩基対のフラグメントを増幅及びクローニングすることが可能となる。ＤＮＡ配列決定すると、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１及び３で示す２種類のフラグメントが認められた。共に、エキソン１Ｂに対応する新たな部分が存在していた。ＡＲ４２とＡＲ３２との相違はＣ末端範囲にあり、なぜならＡＲ３２において、エキソン７によりコードされる領域が欠失していたからである。ゲノムデーターベースのサーチは新しいエキソン１Ｂ範囲がアンドロゲンレセプター遺伝子の第１イントロンの中央にあることを示した。それを先行する遺伝子部分の分析はアンドロゲンレセプター遺伝子の第２プロモーターがこの領域の中にある可能性を示した。この部分は基礎転写機構による検出において利用される推定開始領域及び複数の推定ステロイドホルモン応答要素を含む。
【００４５】
実施例２：ＡＲ４２及びＡＲ３２の組織分布
組織分布は半定量ＰＣＲにより決定した。完全ＡＲ４２及びＡＲ３２−ｃＤＮＡ配列（実施例１）の単離のために用いたプライマーをここでも用いた。コントロールにおいて、ベーターアクチンの特異的プライマーを使用した：
センスプライマー：
【化５】
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アンチセンスプライマー：
【化６】
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以下のヒト組織由来の全ＲＮＡを使用した：脳、睾丸、腎臓、肝臓、子宮、前立腺、肺、気管、筋肉、胸部、心臓。第一鎖ｃＤＮＡ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）での転写後、ＰＣＲ分析をＡｄｖａｎｔａｇｅ−２  ＰＣＲキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）で実施した。反応条件は次の通りとした：９４℃で５秒、７２℃で３分（５サイクル）；９４℃で５秒、７０℃で１０秒、７２℃で３分（５サイクル）；９４℃で５秒、６８℃で１０秒、７２℃で３分（２０サイクル）。増幅生成物を１％のアガロースで分離させ、そしてエチジウムブロミドで染色した。その結果が示すには、ＡＲ４２  ＲＮＡは心臓、筋肉、子宮及び前立腺で最もよく発現された。ＡＲ３２  ＲＮＡの量は一般に低く、そして組織間で有意な差は全く示されなかった。
【００４６】
実施例３：ＡＲ４２及びＡＲ３２の発現
全ＡＲ４２又はＡＲ３２の発現のため、バキュロウィルス発現ベクターｐＢｌｕｅＢａｃ４．５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内のコード範囲を導入した。検出及び精製の簡素化のため、Ｈｉｓタグとの融合を実施した。昆虫細胞にＢａｃ−Ｎ−Ｂｌｕｅ  ＤＮＡとの同時トランスフェクションを施し、ＰＣＲプロセスにより同定される組換ウィルスが出来上った。次にファージストックを載せ、そしてＡＲ４２又はＡＲ３２の更なるトランスフェクション及び生産のために大量に用いた。Ｈｉｓ標識タンパク質の精製はニッケルアフィニティーカラムを介して実施した。
【００４７】
実施例４：エフェクターの探索のための検査システム
ＡＲ４２又はＡＲ３２の過渡的な発現のためのベクターをｐＳＧ５プラスミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）の中で構築した。このベクターをＣＶ−１又はＰＣ−３細胞の中にトランスフィックスした。これと平行して、ルシフェラーゼリポーター遺伝子にカップリングしたステロイド応答要素又は特異的アンドロゲン応答要素の１又は複数のコピーを含むリポータープラスミドをトランスフィックスした。ＡＲ４２又はＡＲ３２の特異的なエフェクターを見つけるため、物質のバンクのハイスループットスクリーニングを実施した。１０-6Ｍ以下の濃度でリポーター遺伝子の活性を誘導する物質を更に処理にかけた。リポーターアンタゴニストのサーチは１０-9Ｍのアンドロゲン、例えばＲ１８８１の存在下で実施した。１０-6Ｍ以下の濃度においてアンドロゲン誘導を少なくとも半分にする物質を選定した。
【００４８】
実施例５：ＡＲ４２又はＡＲ３２のトランス抑制活用
ＡＲ４２，ＡＲ３２又はＡＲの過渡的発現のためのベクターをｐＳＧ５プラスミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）の中で構築した。一定量のｐＳＧ５−ＡＲ及び様々な量のｐＳＧ５−ＡＲ４２又はｐＳＧ５−ＡＲ３２をＣＶ−１細胞の中にトランスフィックスした。コントロールにおいては、似たような長さの無関係なｃＤＮＡを含むｐＳＧ５プラスミドをｐＳＧ５−ＡＲで同時トランスフィックスした。更に、ルシフェラーゼリポーター遺伝子にカップリングしたステロイド応答要素又は特異的アンドロゲン応答要素の１又は複数のコピーを含むリポータープラスミドを同時トランスフィックした。アンドロゲンで処理後、リポーター遺伝子活性の上昇が測定された。トランスフィックスしたｐＳＧ５−ＡＲ４２又はｐＳＧ５−ＡＲ３２の量を増やすと、刺激されたＡＲのこのようなトランス作用効果が阻害された。
【００４９】
実施例６：ＡＲ４２タンパク質の発現の検出
ＡＲ４２又はＡＲをｉｎ  ｖｉｔｒｏでＴＮＴ  Ｔ７  Ｑｕｉｃｋ  Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ／Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍａｇａ）で翻訳した。その後、ｐＳＧ５−ＡＲ４２又はｐＳＧ５−ＡＲ３２をウサギ網状赤血球リゼート混合物と３０℃で９０分インキュベーションした。フィードストックの一部（１／２５）又は全細胞抽出物（４０ng）を８％のトリス−グリシンゲルで分離させ、そしてＴｏｗｂｉｎバッファーの中でニトロセルロース膜に転写した。この転写膜を５％のミルクの入ったＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎバッファーでブロックした。一次抗体はウサギ由来のポリクローナル抗体とし、それはＡＲのリガンド結合ドメインに特異的である。この抗体を３％のミルクの入ったＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎバッファーで１／５００に希釈した。検出のため、Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＥＣＬキットを使用した。
【００５０】
実施例７：前立腺腫瘍内でのＲＮＡ発現
前立腺腫瘍内でのＡＲ４２又はＡＲ３２の発現を半定量ＰＣＲにより検討した。実施例２に記載のプライマーを使用した。コントロールでは、ヒトリポソームタンパク質Ｓ９に特異的なプライマー
センスプライマー：
【化７】
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アンチセンスプライマー：
【化８】
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並びにＡＲに特異的なプライマー
センスプライマー：
【化９】
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アンチセンスプライマー：
【化１０】
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を使用した。正常前立腺組織又は前立腺腫瘍由来の全ＲＮＡを実施例２と同様にして分析した。バンドの光学密度をＢｉｏｒａｄのＧｅｌ  Ｄｏｃシステム及びＱｕａｎｔｉｔｙ  Ｏｎｅソフトウェアで測定した。
【００５１】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ＡＲ遺伝子のイントロン−エキソン構造並びにＡＲ，ＡＲ４２及びＡＲ３２のドメイン構造を示す。この遺伝子において、プロモーター内の既知の転写開始（ｔｓｐ）及びエキソン１Ｂ由来の推定第２転写開始（？ｔｓｐ）を矢印で示す。新しいエキソン１Ｂには斜線を付した。星印はＡＲ４２及びＡＲ３２のｍＲＮＡの発生を特にもたらすスプライシング現象を示す。このタンパク質において、様々なドメインを示す。ＡＲ遺伝子の択一的なスプライシングによりＡＲ４２及びＡＲ３２に付加される新たな領域に斜線を付した。
【図２】ＡＲ４２及びＡＲ３２  ｍＲＮＡの組織分布を示す。特異的ＡＲ４２及びＡＲ３２エキソンに対して特異的なセンスプライマー、並びに共通Ｃ末端領域に対して特異的なアンチセンスプライマーをＰＣＲ増幅のために使用した。様々なヒト組織から全ＲＮＡを獲得し、そして逆転写酵素で転写した。この第一鎖ｃＤＮＡを鋳型として用いた。ＰＣＲ生成物をアガロースゲルで分離させ、そしてエチジウムブロミドで染色した。ＡＲ４２  ｃＤＮＡは強いバンドとして検出でき、そしてＡＲ３２  ｃＤＮＡはゲル上の極めて弱いバンドとして検出できた。
【図３】ＬＮＣａＰ細胞内でのＡＲ４２タンパク質の発現を示す。ＡＲのリガンド結合ドメインに対して特異的な抗体をウェスタンブロット分析のために用いた。様々な細胞系（ＬＮＣａＰ，ＰＣ−３ＡＲｗｔ，ＰＣ−３，ＣＶ−１）由来の全細胞抽出物を８％のトリス−グリシンゲルに載せた。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳されたＡＲ及びＡＲ４２タンパク質をコントロールとして載せた。ＡＲ４２タンパク質はＬＮＣａＰ細胞内でのみ検出された。１１０kDa のＡＲタンパク質がＬＮＣａＰ及びＰＣ３−ＡＲｗｔにおいて検出された。ＰＣ−３ＡＲｗｔ細胞系はＰＣ−３細胞をＡＲ含有プラスミドでトランスフィックスすることにより得た。
【図４】（ａ）ＡＲ４２がＰＣ−３細胞で任意のトランス作用機能をもたないことを示す。１００ngのｐＳＧ５−ＡＲ４２を、ＭＭＴＶプロモーターを含む１００ngのリポータープラスミドと一緒にＰＣ−３に同時トランスフィックスした。これらの細胞を次に様々なアンドロゲン（Ｒ１８８１：メトリボロン；Ｔ：テストステロン；ＤＨＴ：５α−ジヒドロテストステロン）により、１０-7Ｍの最終濃度で処理した。
（ｂ）ＡＲ４２のトランス抑制活性を示す。１０ngのｐＳＧ５−ＡＲ及び様々な量のｐＳＧ５−ＡＲ４２をＰＣ−３細胞に同時トランスフィックスした。更に、ＭＭＴＶプロモーターを含む１００ngのリポータープラスミドをトランスフィックスした。リポーター遺伝子活性をＲ１８８１による処理後（１０-9Ｍ）に測定した。トランスフィックスされたｐＳＧ５−ＡＲ４２の量を増やすと刺激されたＡＲのトランス作用効果が阻害された。
【図５】前立腺組織内のＡＲ４２  ｍＲＮＡの発現を示す。全前立腺ＲＮＡを正常（Ｎ）又は２人の前立腺癌患者の腫瘍組織（Ｔ）から入手し、そして逆転写酵素で変換させた。特異的ＡＲ４２及びＡＲ３２エキソンに対して特異的なセンスプライマー並びに共通ＡＲ  Ｃ末端領域に対して特異的なアンチセンスプライマーをＰＣＲ増幅のために使用した。ＡＲ及びＳ９  ＤＮＡフラグメントを平行して再増幅させた。Ｓ９  ＤＮＡの量を内部標準として用いた。その結果が示すには、双方の前立腺腫瘍組織内のＡＲ４２−ＲＮＡは正常組織内よりも強く発現された。ＡＲ転写量は同等な変化が全くなかった。表示する×２，×０．５等は腫瘍組織内の対応のバンドが正常組織と比べて何倍強いかを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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