(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
カプセル化されたガスの超音波画像化剤用マイクロスフェアであって、
１）親水性基および疎水性基を有する生体適合性物質によりカプセル化されており、
２）該マイクロスフェア中の該ガスの含有量が８５％以上であり、
３）該マイクロスフェアの１ＯＤ懸濁液に０から１０ｐｓｉまで直線状圧力勾配を課したとき、増加する圧力で容積が減少し、勾配の最後で圧力を開放した際にもとの容積に回復するマイクロスフェアであり、かつ
４）該ガスが、六フッ化イオウ、パーフルオロメタン、パーフルオロエタン、パーフルオロプロパン、またはパーフルオロブタンである、
マイクロスフェア。
【請求項２】
前記マイクロスフェアが、０．１〜１０ミクロンの平均直径を有する、請求項１に記載のマイクロスフェア。
【請求項３】
前記生体適合性物質が、前記ガスの周囲に外向きに親水性基および内向きに疎水性基を有するカプセルを形成する能力を有する生体適合性物質である、請求項１または２に記載のマイクロスフェア。
【請求項４】
前記生体適合性物質が、ホモポリマーまたはヘテロポリマーである、請求項１〜３のいずれか１項に記載のマイクロスフェア。
【請求項５】
前記生体適合性物質が、フィルム形成性タンパク質である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のマイクロスフェア。
【請求項６】
前記生体適合性物質が、天然に存在するタンパク質である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のマイクロスフェア。
【請求項７】
前記生体適合性物質が、合成タンパク質である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のマイクロスフェア。
【請求項８】
前記生体適合性物質が、アルブミンである、請求項１〜３のいずれか１項に記載のマイクロスフェア。
【請求項９】
前記生体適合性物質が、ヒト血清アルブミンである、請求項１〜３のいずれか１項に記載のマイクロスフェア。
【請求項１０】
前記ガスが、パーフルオロプロパンまたは六フッ化イオウである、請求項１〜９のいずれか１項に記載のマイクロスフェア。
【請求項１１】
前記生体適合性物質が、ヒト血清アルブミンであり、前記ガスが、パーフルオロプロパンである、請求項１〜３のいずれか１項に記載のマイクロスフェア。
【請求項１２】
前記マイクロスフェアが、前記生体適合性物質の水溶液と前記ガスとの混合物を、酸素ガスの非存在下で超音波キャビテーションまたは機械的キャビテーションに供する工程により生成される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のマイクロスフェア。
【請求項１３】
前記超音波キャビテーションまたは機械的キャビテーションが大気に対して閉鎖されている装置内で起こる、請求項１２に記載のマイクロスフェア。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載のマイクロスフェアを含有する、超音波画像化剤。
【請求項１５】
前記マイクロスフェアの水性懸濁液である、請求項１４に記載の超音波画像化剤。
【請求項１６】
タンパク質の変性温度を変化させる添加剤を含有する、請求項１５に記載の超音波画像化剤。
【請求項１７】
界面活性剤を含有する、請求項１５に記載の超音波画像化剤。
【請求項１８】
カプリル酸ナトリウムを含有する、請求項１５に記載の超音波画像化剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は不溶性のガスをカプセル化したタンパク質性のマイクロスフェアから構成される超音波画像化剤、ならびにその製造および使用のための方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
診断用超音波イメージングは、目的の領域に音波エネルギーの焦点を当て得、そしてその画像を形成するように音波エネルギーを反射させ得るという原理に基づく。超音波スキャナーを、画像化すべき領域に重ねて体表面上に置き、そして音波の形態の超音波エネルギーをその領域に向けて発射する。スキャナーは反射した音波を検出し、そしてこのデータをビデオ画像に変換する。超音波エネルギーが物質を伝播するとき、反射するエネルギーの量は、伝播(transmission)速度およびその物質の音響学的性質に依存する。物質の音響学的性質（例えば、音響的インピーダンス）の変化は、液体−固体または液体−気体のような異なる音響学的密度の界面において最も顕著になる。従って、超音波エネルギーが組織を通って発射されるとき、超音波スキャナーによって検出される音波反射シグナルが器官構造から発生する。これらのシグナルは、造影剤を適切に使用することによって増強され得る。
【０００３】
特に重要な超音波画像化剤(imaging agent)は、ガスの使用を伴う。ガスは超音波の反射体として有効だからである。共鳴する気泡は、同じサイズの固体粒子より千倍も高い効率で音を散乱させる。OphirおよびParkerは２つのタイプのガス含有画像化剤を記載している。これらは、(1)遊離の気泡、および(2)カプセル化された気泡である（Ultrasound in Medicine and Biology15(4):319-333,1989)。しかし、適切なサイズの遊離気泡は、寿命が短すぎてほとんどのインビボ適用について有効ではない(Meltzerら、Ultrasound in Medicine and Biology6:263-269, 1980)。この問題を克服するためにカプセル化された気泡の開発が試みられたことがOphirおよびParkerによって指摘されている。
【０００４】
OphirおよびParkerによって記載されたガス含有超音波造影剤の第２の主要なクラスは、カプセル化微小気泡であり、本明細書中では、「マイクロスフェア」と称する。気泡は、タンパク質または他の生体適合性物質から構成される殻で取り巻かれている。現在市販されているマイクロスフェア造影剤は、 ALBUNEX(登録商標)(Molecular Biosystems, Inc., San Diego, CA)であり、これは、ヒト血清アルブミンでカプセル化された空気のマイクロスフェアから構成される。米国特許第4,572,203号および第4,844,882号を参照のこと。
【０００５】
空気のマイクロスフェアは、インビボヘの注入および循環に際して直面するような150mmHgの圧力がかかると、急速にエコー源性(echogenicity)を失うことが示されている（deJong,N.ら、Ultrasound Med. Biol. 19:279-288、1993）。しかし、本発明のカプセル化技術は、多くの所望される適用のためにインビボで十分に長い間残存する超音波造影剤として適切な材料を製造する。実際、心筋壁のイメージングを可能にする造影剤は、少なくとも250mmHg(約５psig)の一時的な圧力パルス耐えなければならない。
【０００６】
マイクロスフェアが圧力に対して不安定であるという問題を解決するための努力において、最近の教示は、殻の改良に集中している。なぜなら、マイクロスフェアの殻または「膜」は、圧力下において、弱過ぎあるいは脆すぎてその結果、インビボで急速に壊れると考えられているからである。Gibbey(PCT/EP91/01706;PCT92/05806)は、「膜は剛性であるために、マイクロスフェアに与えられ得る突然の圧力変化に耐えられない。例えば、血流中を移動する際の、振動の脈動による変化または圧力である。」と述べている。殻の剛性を克服するために、彼は、高い割合で増粘剤(40％〜80％のポリオール類）を含むタンパク質溶液中で空気を予備乳化させ、これを高速ブレンダー中で機械的剪断に供することを提案してした。適切なサイズの泡が集められ、そしてそれらを軟らかい殻の中に安定化するために適切な界面活性剤で被覆される。
【０００７】
Holmes(PCT WO 92/17213)は、生体適合性の化学架橋剤で殻を強化することによってタンパク質のマイクロスフェアのインビボ安定性を高めることを提案した。
【０００８】
Bichonら(EPA 90/810367)およびSchneiderら(Inv. Radiol.27:134-139,1992)は、多孔性（孔サイズ５〜2000nm）のポリマー性「マイクロバルーン」の製造を記載している。彼らは、この欧州特許出願において「マイクロバルーンの外皮(envelope)の微小多孔性構造は、弾力性の要因である。すなわち、このマイクロスフェアは崩壊せずに、容易に圧力変化を受容し得る。」と報告している。
【０００９】
ErbelおよびZots（米国特許第5,190,982号）は、中に空気を取り込んだ架橋したポリマー性のマイクロカプセルを記載している。
【００１０】
Schneiderら(EPA 554,213）は、カプセル化されるガスのうちの少なくとも一部がSgas/MWgas≦0.0031を有するガスであることで、マイクロスフェアの耐圧性を改善し得ることを示している。ここでSgasはガスの水溶性をリットル／リットルで表したものであり、そしてMWgasはガスの平均分子量をダルトンで表したものである。この参考文献の表１は、この基準に適合するものとしてN2、SF6、CBrF3、およびCF4を列記している。この参考文献は、これらのマイクロスフェアが２つの方法のいずれかで製造され得ることを教示している。第１の方法は２段階法である。この方法では、公知の方法によって空気を含有するマイクロスフェアを調製し、そしてこの空気をガス交換法によって（例えば、空気が充填されたマイクロスフェアを不溶性ガス雰囲気下で適切な時間インキュベートすることによって）不溶性ガスで置換する。
【００１１】
第２の方法は、１段階法である。この方法では、空気の代わりに不溶性ガスを用いて、EPA 324,938の方法(この参考文献の実施例１参照）によってマイクロスフェアを作製する。この方法においては、殻形成材料溶液（例えばアルブミン溶液）にガスを通し、この間、音波発生器(sonicator)のホーンを容器の中に沈め、そして取り出す。
【００１２】
あいにく、これらの方法はいずれも、タンパク質でカプセル化した不溶性ガスのマイクロスフェアの安定な懸濁液を作製するために特に有用ではない。第１の（２段階）方法を用いると、不溶性ガス雰囲気に曝したときに（２段階法の第２工程）、空気が充填されたアルブミンマイクロスフェアのうち残存し得るものはごくわずかの数である。マイクロスフェアから流出する可溶性ガス（空気）がマイクロスフェアに流入する不溶性ガスより多いと、その結果、マイクロスフェアは完全に圧潰し、殻の残骸のみが残る。この影響は特にパーフルオロエタンのような、より不溶性のガスの場合、著しい。第２のプロセスでは、圧力がかかると体積が減少し、そして圧力を取り去った後も回復を示さないマイクロスフェアが製造される。これらの両プロセスで、劣ったマイクロスフェアが製造されるのは、このマイクロスフェアが相当量の空気を含んでおり、しかも形成の際に空気が存在すると、不溶性ガス単独の存在下でマイクロスフェアを製造する利点を低下させ得るからであると考えられる。この点に関して、以前の研究者は、キャビテーションによるマイクロスフェアの作製においては酸素の存在が必須であると考えていたことが注目される。
【００１３】
Suslickは、超音波に関連するキャビテーションは、酸素の存在下においてのみ、マイクロスフェアの製造法として適していると報告した。Suslickらの詳細な研究において（Proc. Natl. Acad. Sci.88:7708-7710, 1991; J. Am. Chem. Soc. 112:7807-7809,1990)、安定なタンパク質殻のために必要とされる、キャビテーションが誘起するジスルフィド結合の分子内再配置に、酸素が関与することが報告された。Suslickは、「我々は、O2が存在しないとマイクロカプセルの形成が強く阻害されることを見いだした。」と述べている。彼はさらに続けて、「反応が不活性雰囲気下（He、Ar、またはN2)で行われると、マイクロカプセルは形成されない。」「実験的には、O2または空気の下で反応を行った場合にのみ、高濃度の微小気泡が合成される。」と述べている。U.S.4,774,958もまた参照のこと。アルブミンマイクロスフェアの形成には空気が必要であるという従来の考えは、Holmes（PCT WO 92/17213)にもまた記述されている。ここでは、種々の低分子量のガスを含むマイクロスフェアの製造が開示された。しかし、超音波によるアルブミンマイクロスフェアの製造を記載する際に、著者は、「ガス含有気泡を生成するための、別の確立された記載された方法は（すなわちUS-A-4,774,958）、空気の存在下における混合物の超音波処理による。」と述べている（下線付記）。
【００１４】
１つの局面において本発明は、酸素不存在下で、不溶性ガスの存在下において超音波または機械的キャビテーションプロセスによって、相対的に不溶性のガスを取り込んだタンパク質性のマイクロスフェアを高濃度で作製し得るという、予期せぬ発見に関する。このようなマイクロスフェアは、印加圧力に対する、非常に向上した驚くほどの安定性および弾性を示し、優れたあるいは同等のエコー源性を有する。タンパク質性の殻は、合体を防ぎ、そして溶解した大気ガスの周囲環境からの拡散に起因する膨張に対して抵抗性がある。
【００１５】
他の局面において、本発明は、剪断力の形態の機械的エネルギーを使用する、タンパク質殻のマイクロスフェアの製造のための新規な手順に関する。これらの力は、液体−気体混合物を機械的に剪断して、微小気泡懸濁液を形成する原因となり、そしてまた流体力学的キャビテーションを引き起こし、このキャビテーションがエネルギーを放出する。このエネルギーは、周囲の液体に吸収されて、局部的なタンパク質の変性をもたらし得、そして気体ー液体界面で分離したマイクロスフェアを形成し得る。エネルギーの放出に至る、液体系に対する圧力変化を生じる方法に基づいて、流体力学的キャビテーションと超音波（音響学的）キャビテーションとは区別され得る。前者においては、圧力変化は、オリフィスを通り、あるいは表面を横切って通過する液体の速い流れによって生じる。他方、後者においては、高周波数の音波のサイクルが急速な局部的圧力変化を生じさせる。（F. Ron Young. 1989Cavitation 4-5頁、McGraw-Hill Book Co. London)。さらに、流体力学的キャビテーションは流動する液体（すなわち、静止した対象物を通過するか横切って流れる液体）中で生じる。対照的に、音響学的キャビテーションは、キャビテーションが現れるに十分な、増加および減少する圧力（陽圧および陰圧）のサイクルの間、定常でなければなければならない液体系で生成される。米国特許第4,957,656号に記載されているような連続流動超音波系においてさえも、音響学的キャビテーションプロセスにおける滞留時間(residence time)は、本発明によって記述されるような真の単一パスの流体力学的キャビテーション系よりも、制御することが困難である。
【００１６】
機械的剪断力によって製造される微小気泡懸濁液は、特に造影剤として使用され、あるいはさらなる処理によって、マイクロスフェアとして形成される。例えば、PCT公開番号WO 92/05806は、微小気泡懸濁液の調製を記載している。これは、フィルム形成性(filmogenic)タンパク質の「泡」と呼ばれている。この泡は、増粘剤を含むタンパク質溶液を、タンパク質が変性する温度より低い一定温度でホイップして、粗い泡とすることによって調製される。次いで、得られる泡を、機械的に剪断し、所望の範囲の気泡を形成する。この気泡は、増粘剤の存在によって安定化される。次いで、この気泡を熱変性によって、あるいは気泡を取り巻くタンパク質フィルムを硬化させるための架橋剤の添加によってさらに処理して、マイクロスフェアとし得る。
【００１７】
欧州特許出願公開番号0 450 745 A1は、機械的剪断によって水中油型乳濁液を形成し、そして同時にあるいは次に、界面に析出する水不溶性のポリマーを添加することによってマイクロスフェアを作製するプロセスを記載している。次に、疎水性相を蒸発させ、空気またはガスが充填されたマイクロスフェアを形成する。
【００１８】
従って、本発明はまた、タンパク質溶液を機械的剪断力に供することによって、熱変性可能なタンパク質からマイクロスフェアを作製するための改善された方法に関する。このような力は、微小気泡の懸濁液を形成し、これは、同時にまたは次に、個別の殻でカプセル化される。キャビテーションによる加熱の性質上タンパク質の変性は局部的であり、そして液体−気体界面に析出することによって殻を形成する。この新規な方法は、スケールアップが容易であり、そしてマイクロスフェアを作製するためのいままでの音響学的な方法に比べて製造収率の増加へと至る。
【００１９】
【発明が解決しようとする課題】
上記のように、従来のマイクロスフェアの製造においては、製造管理が困難であり、そして贈粘剤の使用などさらなる処理が必要であった。
【００２０】
本発明は、上記従来のマイクロスフェアの製造法を改良し、安定性および耐圧性に優れたマイクロスフェアの製造法を提供することを目的とする。
【００２１】
【課題を解決するための手段】
本発明の１つの局面は、超音波画像化剤として有用なカプセル化されたガスのマイクロスフェアの製造方法であって、以下の工程を包含する方法である：
a)次に行われる機械的乳化において初期変性温度を達成するに必要な温度で熱変性可能なタンパク質の水溶液を調製する工程、
b)該溶液とガスとを合わせる工程、
c)該タンパク質溶液とガスとの混合物を機械的に剪断し、約0.1ミクロンから約10ミクロンの範囲の平均直径を有するガスの微小気泡からなる懸濁液を形成することにより、該混合物を乳化する工程、および
d)該懸濁液を機械的キャビテーションに供して該タンパク質を変性させ、該ガスと該溶液との界面に析出させることにより、該ガスの微小気泡をカプセル化し、マイクロスフェアを形成する工程。
【００２２】
上記温度は前記溶液を加熱することにより達成され得る。あるいは上記温度は、前記溶液中に前記タンパク質の変性温度を変える添加剤を含めることにより達成され得る。
【００２３】
上記タンパク質は天然に存在するタンパク質であり得、好ましくは、上記タンパク質はヒト血清アルブミンである得る。あるいは上記タンパク質は合成タンパク質であり得る。
【００２４】
上記溶液中の上記タンパク質の濃度は、通常、約0.1〜10％ w/v、好ましくは約１〜５％ w/vの範囲であり、より好ましくは、約１％ w/vである。
【００２５】
通常、上記ガスは不溶性であって、好ましくは上記不溶性ガスは、六フッ化イオウ、パーフルオロメタン、パーフルオロエタン、パーフルオロプロパン、またはパーフルオロブタンである。あるい上記ガスは空気であり得る。
【００２６】
上記タンパク質溶液に対する上記ガスの比は、通常５％〜200％ v/v、好ましくは20％〜100％ v/vの範囲にある。
【００２７】
１つの実施態様において、上記工程(c)および(d)は、上記混合物をミルを通して通過させることにより行われる。
【００２８】
１つの実施態様において、上記初期変性温度は、上記タンパク質の変性温度より約１゜〜５゜低い。
【００２９】
本発明の別の局面は、超音波画像化剤として有用なカプセル化されたガスのマイクロスフェアの製造方法であって、フィルム形成性タンパク質の水溶液と薬学的に受容可能な水不溶性ガスとの混合物を、酸素の非存在下で超音波または機械的キャビテーションに供する工程を包含する方法である。
【００３０】
本発明の別の局面は、超音波画像化剤として有用なカプセル化されたガスのマイクロスフェアの製造方法であって、フィルム形成性タンパク質の水溶液と薬学的に受容可能な水不溶性ガスとの混合物を、大気に対して閉鎖されている装置内で超音波または機械的キャビテーションに供する工程を包含する方法である。
【００３１】
本発明の別の局面は、熱不溶化フィルム形成性タンパク質によりカプセル化されたガスのマイクロスフェアの水性懸濁液を含有する超音波画像化剤組成物であって、該カプセル化されたガスが、完全に薬学的に受容可能な水不溶性ガスである組成物である。
【００３２】
本発明の別の局面は、熱不溶化フィルム形成性タンパク質によりカプセル化されたパーフルオロプロパンガスのマイクロスフェアの水性懸濁液を含有する超音波画像化剤組成物である。
【００３３】
【発明の実施の形態】
本発明の新規マイクロスフェアは、不溶性ガス存在下および実質的に酸素の不在下、すなわち嫌気的（閉鎖系）条件下で、フィルム形成性タンパク質の水溶液の超音波または機械的キャビテーションにより、水性懸濁液中で形成される。マイクロスフェアは、エコー反射性であり、そして10ミクロンより小さく0.1ミクロンより大きい平均直径を有する経肺通過に適切なサイズである。サイズ分布は、より大きいまたはより小さいマイクロスフェア集団への分画化により変化し得る。マイクロスフェアは、過剰の水相の除去により濃縮され得るかまたは濃縮され得ず、あるいは回収されて第２の水溶液中に再懸濁され得るかまたはされ得ない。
【００３４】
これらの新規マイクロスフェアの製造に用いられるガスは、薬学的に受容可能であり、それらが配される水性媒体（すなわち、最初はそれらが製造される媒体、使用されるときは血液中）に不溶性であることのみ必要とされる。水への溶解度は、このような媒体における溶解度の近似値である。「ガス」という用語は、イメージングが行われる温度（代表的には通常の生理学的温度）で気体であるかまたは気体を形成し得る任意の化合物をいう。ガスは、単一の化合物または化合物の混合物から構成され得る。適切なガスには、六フッ化イオウ、パーフルオロエタン、パーフルオロプロパン、パーフルオロメタン、およびパーフルオロブタンなどのフッ素含有ガスが挙げられるが、これらに限定されない。ガスの溶解度は、目的のガスのブンゼン(Bunsen)係数を測定することにより定義され得る。この値は、溶媒の単位容積により吸収されるガスの容積である。（Wen, W-Y、Muccitelli, JA、J. Sol. Chem. 8:225-240 (1979)を参照のこと）。本発明に用いるに適切なガスは、25℃の水において0.01 mL/mL(溶液)より低いブンゼン係数を有するべきである。表１に、数種のガスのブンゼン係数を示す。
【００３５】
【表１】
0003809368.tif 000002
マイクロスフェア中に含まれるガスの他の特徴は、ガスの拡散性が25℃の水中で４×10-5cm2/秒よりも低いことである。しかし、拡散定数が異なる溶媒でおよび異なる温度で変化することに留意すべきであるが、ガスの選択の目的では、ガスはこの基準に一致すべきである。
【００３６】
薬学的に受容可能とは、選択したガスが生体適合性であり、そして毒性が最小でなければならないという特性をいう。
【００３７】
パーフルオロプロパンは、(1)製造および使用の温度で凝縮しない、(2)異性体を有さない、(3)優れた耐圧性を示すマイクロスフェアを生成する、そして(4)薬学的に受容可能である、不溶性ガスを提供するので、好適である。
【００３８】
ガス微小気泡は、フィルム形成性タンパク質殻によりカプセル化されている。フィルム形成性という用語は、（熱変性により生じる）タンパク質の不溶化において、タンパク質がトラップしたガスの周囲に外向きに親水性基および内向きに疎水性基を有する殻を形成する能力をいう。タンパク質は、必ず親水性および疎水性の両方のアミノ酸を有する。適切なタンパク質には、アルブミン、γ-グロブリン（ヒト）、アポトランスフェリン（ヒト）、b-ラクトグロブリン、およびウレアーゼのような天然に存在するタンパク質が挙げられる。天然に存在するタンパク質が好適であるが、３次構造を示しそして熱変性を受けやすい合成タンパク質（ホモポリマーまたはヘテロポリマー）が用いられ得る。本発明に特に適切なものはアルブミンであり、そしてさらに特にはヒトアルブミンである。タンパク質は、約0.1〜10％w/vの範囲の濃度で、好適には約１〜５％w/vの範囲の濃度で、最も好適には約１％w/vの濃度で溶液中に存在する。
【００３９】
本発明に適切なタンパク質、または得られるマイクロスフェアは、器官の標的化または免疫原性活性を消去する目的で化学的に改変され得る（例えば、ポリエチレングリコールを用いる改変）。しかし、本発明は、マイクロスフェアの形成の目的のための化学的架橋剤の添加、またはタンパク質の他の改変を包含しない。
【００４０】
本発明のマイクロスフェアは、不溶性ガスの存在下、酸素の非存在下で（すなわち、空気の混入が回避される閉鎖系で）のキャビテーションの結果として、溶液中でタンパク質の一部を不溶化することにより形成される。このようなタンパク質の不溶化は、局部的なタンパク質の変性およびガスコアの周囲での配向により主として特徴づけられ、後者は、不溶性ガスの存在下で増強され得る。
【００４１】
本発明のマイクロスフェアの形成のためにタンパク質を熱不溶化するに用いられる系は、嫌気的、すなわち大気に対して閉じられていなければならず、「閉鎖系」と呼ばれる。比較して、「開放系」とは、大気に対して開かれている系である。このような閉鎖系で製造されたマイクロスフェアにトラップされたガスは、必然的に、その形成に使用された不溶性ガスのみを含む。大気による混入は、Ｏ2電極を用いて、系から流出するＯ2の存在を測定することでモニターし得る。本発明において、マイクロスフェアは、その形成に使用されたガスのみを最初に含むように製造される。しかし、ガス含有物が実験的に測定されるとき、実験手順の間に、大気のガスによるある量の避けがたい混入があり、したがって、測定により得られたガスの量は100％より低い。したがって、ガスの測定値が85％より高いものが、最初のガス含量が完全な不溶性ガスであるマイクロスフェアを示す。
【００４２】
マイクロスフェアの形成後、大気への曝露はパッケージングの間は避けるべきである。例えば、マイクロスフェアは、閉鎖系から取り出された時点から５〜30秒以内にバイアルまたは他の気密容器に封入されなければならない。さらに、バイアルのすべてのヘッドスペースは除去されて、パッケージングの間に形成に用いたガスで置換されなければならない。
【００４３】
不溶性ガスで満たすと、これらのタンパク質マイクロスフェアは、顕著な安定性を示し、約1.0×109マイクロスフェア／mLの濃度で40 psig（＞2000 mmHg）に曝露しても残存する。マイクロスフェアはまた、希釈懸濁液中で弾性を示し、３〜10 psigの圧力下での圧縮を示し、圧力から解放されるともとの容積に回復する。追加の化学的架橋剤は不利である。なぜなら、得られるマイクロスフェアは増強した圧力安定性を示すには構造が剛性になり過ぎるからである。
【００４４】
本発明のマイクロスフェアは、遊離の微小気泡とは異なり、合体および拡散させる膨張に耐性である。空気または酸素飽和溶液中で種々の温度でインキュベートした不溶性ガスを含むマイクロスフェアは、平均直径が増大せず、あるいは総容量が増加しない。タンパク質殻は、圧力をかけると弾性であるが、膨張にあるいはガス拡散またはガス交換による破裂に抵抗するに十分強靭である。タンパク質殻の存在は、合体を抑制し、そして空気充填されたタンパク質マイクロスフェアと同様に、数ヶ月まで小さな個々の気泡でガスを維持する。不溶性ガス充填されたマイクロスフェアが溶媒和された大気ガスでの交換により測定可能に膨張され得ないことは、新規であり、この物質の超音波剤としての使用のための重要な特性である。
【００４５】
不溶性ガスをトラップしたタンパク質マイクロスフェアは、脱気した水溶液に曝露したときの圧潰に抵抗性を示す。遊離の微小気泡または空気充填されたカプセル化したマイクロスフェアとは異なり、不溶性ガス充填されたマイクロスフェアは、真空で脱気した水に加えることができ、高希釈でも一体性を維持し得る。空気充填された物質は、気相の酸素成分の流出のため、血液中で圧潰される。不溶性ガス充填されたマイクロスフェアが、部分的に脱気されまたは加圧された環境で圧潰に抵抗性である能力は、インビボでの超音波コントラストの持続を劇的に増加する。
【００４６】
本発明のマイクロスフェアは、超音波キャビテーションまたは機械的キャビテーションによって製造され得る。空気充填マイクロスフェアの超音波製造方法は、Cerryによって記載されている（米国特許第4,957,656号）。
【００４７】
機械的キャビテーションは、本発明の新規な不溶性ガス充填マイクロスフェアを製造するために好ましい方法である。この方法はまた、空気充填または不溶性ガス（例えば、N2、H2、アルゴン）充填マイクロスフェアを製造するためにも用いられ得る。
【００４８】
本発明の新規な機械的キャビテーション手順においては、熱変性タンパク質の水溶液が、次に行われるこの溶液の機械的乳化において初期変性温度を達成するに必要な温度で提供される。溶液中のタンパク質の変性温度は、通常、50℃〜100℃の範囲であり得る。それは、文献中の熱タンパク質変性の表から、または任意の公知の方法により実験的に得られ得る。例えば、変性温度を実験的に決定するために、タンパク質溶液は、水浴中で撹拌しながら加熱され得る。変性温度は、不溶性物質が最初に観察される温度である。変性温度はタンパク質の性質、純度、および供給源、溶液中のタンパク質濃度、pH、緩衝液、イオン強度、安定剤の存在、および化学変性剤または界面活性剤の存在により影響され得ることに注意されたい。従って、マイクロスフェアの製造に用いられる環境において、タンパク質の変性温度を決定することが必要である。所望であれば、界面活性剤または極性溶媒のような添加剤が、変性が起こる温度を変化させるために用いられ得る。
【００４９】
表２は、上記のように実験的に決定された、いくつかの天然に存在するタンパク質の変性温度を示す：
【００５０】
【表２】
0003809368.tif 000003
*  TRIS ＝  2-アミノ-2-（ヒドロキシメチル）-1,3-プロパンジオール
**  MES ＝  2-（N-モルホリノ）エタンスルホン酸
***  DTT  ＝  ジチオトレイトール
タンパク質溶液／ガス混合物を剪断するために用いられる各装置は、そのタンパク質溶液に加えられる機械的剪断力によって、溶液に特定量のさらなる加熱を生じさせる。その熱は、気−液界面でタンパク質の局所変性を生じさせるに十分でなければならない。従って、タンパク質溶液が装置に導入される温度が、このような局所熱変性を達成するように調整され得るためには、装置により生じる温度上昇量を決定することが重要である。詳細には、装置中の液体の大部分の温度が、キャビテーションの直前に初期変性温度と一致しなければならない。キャビテーション事象は、タンパク質を局所的に変性させるに必要なさらなる熱を生成し得る。初期変性温度は、タンパク質が変性のまぎわにあるが、溶液が変性タンパク質を含有しない温度として定義される。この温度は、変性温度をちょうど下回る、典型的には１〜５℃下回る温度である。必要であれば、出発タンパク質溶液は、装置に導入される前に、初期変性温度が達成され得る温度に予備加熱され得る。
【００５１】
一旦タンパク質溶液の適切な出発温度が達成されると、溶液は、例えば乳化工程前または工程中に、約５％〜200％、好ましくは20％〜100％気体：液体の範囲の体積比でガスをタンパク質溶液中に導入することによって、適切なガスと合わせられる。適切な気体：液体比は、装置の幾何学的形状、気体の物理的特性（溶解度、密度、分子量など）に依存し、そして最適出力に調整され得る。
【００５２】
ガスおよびタンパク質溶液が合わせられた後、この混合物は乳化され、そしてマイクロスフェア製造条件下でキャビテーションに供される。これは、機械的剪断および流体力学キャビテーションが生成され得る装置、例えば、高速ミキサー、ミル、フルイダイザーなど、を用いて達成される。好ましい装置はコロイドミルであり、これは、「高速ロータおよびステータからなり、分散または乳化が対向する面によってなされる装置」として定義される（Advanced Filtration and Separation Technology, p.108-110）。用いられ得る特定のミル装置の例を以下に示す：
【００５３】
【化１】
0003809368.tif 000004
不溶性ガス充填マイクロスフェアを製造するために用いられる場合、コロイドミルは、混合物中へ空気が導入されないように大気に対して閉鎖されるべきである。
【００５４】
図１〜３は、機械的キャビテーションプロセスにおいて用いられ得るミルのいくつかのタイプをさらに詳細に説明する。
【００５５】
図１は、Gaulinミルの必須要素を図示する。これらは、以下の通りである：モーター（図示せず）に作動可能に接続されている回転シャフト（10）；シャフト（10）の端部に固定されたディスクロータ（12）；およびステータ（11）。ステータ（11）は、中央ボア開口部（18）とロータを受容するカウンタボア（16）とを有する。このミルでは、タンパク質溶液およびガスが「Ｔ字管(tee)」（15）を介してミルじゅうに供給される。タンパク質溶液／ガス混合物はロータおよびステータの表面間で乳化およびキャビテーションされる。このミルの「ギャップ」は、ステータカウンタボアの半径方向表面（17）とロータの半径方向表面との間の間隔である。マイクロスフェア生成物の温度は、混合物がステータ（11）を通過して出ていく際に得られる（例えば、熱電対（図示せず）によって）。
【００５６】
図２は、Bematekミルの必須要素を示す。このミルは、図１のGaulinミルに構造および機能が似ている−−主な違いは、ロータおよびステータカウンタボアの配置である。これは、回転シャフト（20）（ネジ状前縁（22）を有する円錐台形ロータ（21）を支持する）、ならびにステータ（23）（中央円筒開口部（25）、およびロータを受容するようにつくられている円錐台形カウンタボア（24）を有する）を備える。タンパク質溶液／ガス混合物は、開口部（25）を介してこのミル中に供給される。ガスおよび溶液は、それらがシャフト上のネジ（22）のそばを通過する際に混合され、そして混合物は、ミルのギャップを通過する際に乳化されキャビテーションにかけられる。ギャップは、ロータおよびステータの台形表面の間の間隔により定義される。
【００５７】
図３は、Silversonミルを示す。このミルの構造は、図１および２のミルの構造とは全く異なる。図示されたSilversonミルは、回転シャフト（30）（パドルブレードロータ（31）を支持する）を有する。このロータは、カップ形多孔スクリーンステータ（32）内に受容される。ステータは、入口継手（34）がとりつけられたハウジング（33）上に備え付けられている。入口継手は、多孔スクリーンステータ（32）の底部中央部で開口しているハウジング（33）中にまで延びている。ハウジングは中央開口部（図示せず）を有する。この中央開口部は、入口継手およびステータの底部の開口部（図示せず）に通じる。このミルでは、溶液／ガスは、入口継手を介してステータの底部に供給され、そしてパドルロータの平面（35）とステータの内部円周表面との間で乳化およびキャビテーションされる。このミルの「ギャップ」は、ロータ（31）とステータ（32）との間の間隔として定義され得るが、このプロセスにおけるギャップサイズの効果はステータの孔（36）のサイズにより影響される。
【００５８】
ミルを通過した後、生成物は、典型的には10〜20℃に冷却され、そして沈澱により、またはマイクロスフェアに不利な影響を及ぼさない消泡剤の添加により消泡され得る。
【００５９】
混合物をこのようなミルまたは等価の装置を通過させることにより、混合物は乳化およびキャビテーションされ、約0.1〜10ミクロン（平均直径）の範囲のマイクロスフェアを形成する。マイクロスフェアサイズは、適切な粒子カウンタ、例えば、Coulter Multisizer II（Coulter Erectronics, Hialeah, Fl）により決定され得る。
【００６０】
図１〜３に記載されるようなミルを用いる場合、ロータ速度、ギャップサイズ、および気体：液体比は、マイクロスフェア生成物の特性（平均サイズ、サイズ分布、およびマイクロスフェア濃度）に影響する主要なプロセスパラメータである。これらのパラメータは、所望の特性を有する生成物を提供するように経験的に調整され得る。いかなる生成物に対しても、その特性は臨床的に定義される。例えば、心筋灌流のために用いられるパーフルオロプロパンマイクロスフェアの推定上の詳細は以下の通りである：平均サイズ、４ミクロン；サイズ分布、10ミクロン以下が90％；濃度、７×108〜２×109マイクロスフェア／mL。
【００６１】
本発明は、以下の実施例によりさらに説明される。これらの実施例は本発明をいかなるようにも限定しない。
【００６２】
【実施例】
（実施例１）機械的キャビテーションプロセスの温度モニタリングおよびヒト血清アルブミンの制御
上述のように、タンパク質溶液は、プロセス温度が初期変性温度に達しそして維持され得るように処理の前に予熱される。
【００６３】
実施の代表的な方法は以下の通りである。
【００６４】
モデル２ 1/2インチBematek Colloid Mill（図２；Bematek Systems、Beverly  MA）を、入口ポートが熱交換器に連結するように配管した。ガス不透過性の管を用いて、熱交換器蛇管の接続部(barb)間をソフトに連結した。
【００６５】
プロセスヘッドからの出口ポートを、ステンレス鋼のプロセス後の冷却器に連結した。
【００６６】
溶液温度を３ヶ所（T1、T2、およびT3）でモニターした。T1熱電対を予熱熱交換器とミルヘッドとの間のSwagelokの「Ｔ字管(Tee)」に取り付けて、タンパク質溶液の供給温度を測定した。ガスを導入するための第２の「Ｔ字管」もまた供給ポートに配置した。プロセスの温度が正確に測定され得るようにプロセスヘッドからの出口の内部（ロータから約１cm、そしてシャフトから約２cm）にT2熱電対を配置した。このように、２ヶ所の温度（供給温度(T1)およびプロセス温度(T2)）は独立に測定され得、そして処理の間、溶液の加熱量を決定するために比較される。
【００６７】
本実施例には、U.S.P.アルブミンを通常の生理食塩水で希釈して、１％(w/v)溶液を作製した。記載されたように、変性温度が実験的に78℃であると測定された。脱気した後に、100mL/分（50％ v/v）のパーフルオロプロパンとともに200mL/分でミルに供給した。T1とT2との間には10℃〜15℃の差が認められた。77℃のプロセス温度（変性温度より１℃低い）を得るために、供給温度を62℃〜67℃の範囲に調整した。発生する熱量は異なるミル処理のパラメーターにより変化するので、変性タンパク質の薄い殻でガス微小気泡を首尾良くカプセル化しながら、タンパク質のバルク変性を回避するプロセス温度を目標にするためには、ミル処理のパラメーター（ミルの選択、ミルのセッティング、流速、ガス：液体比など）のそれぞれの変化によるT1とT2との差を測定することが必要である。冷却器出口温度（T3）もまたモニターし、そして最高の結果のために20℃を目標にした。
【００６８】
（実施例２）異なるガスを含有するマイクロスフェアを作製する機械的キャビテーション法
種々のガスを含有するマイクロスフェアを以下のように作製した。５％ヒトアルブミン溶液（USP）を、２時間の連続減圧下で脱気した。排気された容器を目的のガスで充填することにより減圧から開放した。利用される不溶性ガスには、六フッ化イオウ、パーフルオロエタン、およびパーフルオロプロパンが包含される。より可溶性のガス（空気、窒素、酸素、およびアルゴン）を含有するマイクロスフェアもまた作製された。アルゴンの使用は、高分子量のガス（しかし比較的可溶性のガス）の代表であった。アルブミン溶液をインライン熱交換器を経由して68℃に調整し、そして100mL/分で２ 1/2インチコロイドミル（Greerco、Hudson、NH、モデルW250VまたはAF Gaulin、Everett、MA、モデル2F）にポンプで供給した。室温で特定のガスを、120〜220mL/分の流速で入口ポートのすぐ直前の上流の供給液体に加えた。ロータとステータとの間のギャップを2/1000インチ（0.005cm）に調整し、そしてアルブミン溶液を73℃のプロセス温度、約7000rpmで連続的に処理した。
【００６９】
このように形成されたマイクロスフェアの濃厚白色溶液を、直ちに熱交換器で10℃の温度まで冷却し、そしてガラスバイアルに回収した。このバイアルを直ちに密封した。この物質を、コールターカウンター(Coulter Counter)を用いて濃度およびサイズ分布に関して特徴付けした。結果を以下の表３に示す。
【００７０】
【表３】
0003809368.tif 000005
（実施例３）ロータスピードおよびギャップサイズの影響
１％アルブミン溶液（200mL/分）を、ガスの液体に対する比(v/v) 50％でパーフルオロプロパン（100mL/分）と合わせた。マイクロスフェアを、ロータスピードおよびギャップサイズを変えて実施例１に記載の手順により調製した。得られたデータを表４に示す。
【００７１】
【表４】
0003809368.tif 000006
これらの結果は、ロータスピードの増加により濃度が増加しそして平均サイズが減少することを示し、その一方ギャップサイズが増加すると濃度が減少することを示す。
【００７２】
（実施例４）ガスの液体に対する比の影響
0.5％アルブミン溶液（100mL/分）を、約0.012のギャップおよび9950ft/分のロータ先端スピードを有するGaulinミルを用いて20、50、70、または100mL/分（液体に対して20％、50％、70％、または100％(v/v)のガス）のパーフルオロプロパンと合わせた。得られたデータを表５に示す。
【００７３】
【表５】
0003809368.tif 000007
これらの結果は、ガス：液体比の増加とともに濃度および平均サイズの両方が増加することを示す。
【００７４】
（実施例５）音波キャビテーションにより不溶性ガス充填マイクロスフェアを作製する方法
空気、六フッ化イオウ、およびパーフルオロエタンマイクロスフェアを、回分および連続超音波キャビテーションプロセスの両方により調製した。ヒトアルブミンの溶液（５％ USP）を減圧下で脱気し、そして特定のガス雰囲気下で保存した。連続音波処理プロセスを、空気の代わりに不溶性ガスを用いてCerny(米国特許第4,957,656号)に記載されるように行った。回分プロセスを3/4インチの液体処理ホーン（Sonics and Materials、Danbury CT）を利用して行った。プロセス全体で空気を排除するように、ガスをホーンに沿ってアルブミン中に通した。アルブミンを73℃まで加温し、そしてBranson圧電コンバーターおよび電源（Branson Ultrasonics、Danbury CT）を用いて、20KHzで60ミクロンのダブル振幅で５秒間超音波処理した。生成物を直ちにガラスバイアルに移し、そしてガスの下で密封した。
【００７５】
この生成物は、2.5〜3.3ミクロンの平均サイズを有する1.4×108〜1.0×109マイクロスフェア/mL濃度のマイクロスフェアの濃厚な乳状懸濁液であった。
【００７６】
（実施例６）マイクロスフェアの顕微鏡検査
種々のガスを含有するアルブミンマイクロスフェアを、実施例２または５に記載されるように調製した。生成物のマイクロスフェア検査によって、球状マイクロスフェアの単一分散懸濁液であることが明らかになった。このマイクロスフェアは、懸濁液が清澄化されるまでシリンジ中で高圧力を印加することにより圧潰した。全ての場合で、顕微鏡再検査により、崩壊したマイクロスフェア由来の透明な膜状の殻の存在が示された。
【００７７】
（実施例７）マイクロスフェアの耐圧性
種々のガスを含有するアルブミンマイクロスフェアを、実施例２に記載されるように調製した。各懸濁液の10mLを、圧力ゲージを取り付けた10mLの気密ガラスシリンジ（Hamilton、Reno NV）に入れた。全てのヘッドスペースをなくし、そして器具を密封した。40psigの一定圧力を３分間印加した。次いで、コールターカウンターを用いて、サンプル粒子の濃度および分布を測定した。加圧の前後のデータ（図４〜図８）の比較により、40psigまでの不溶性ガスマイクロスフェアの相対耐性が示された。
【００７８】
（実施例８）マイクロスフェアの希釈懸濁液の耐圧性
種々のガスを含有するマイクロスフェアを、実施例２に記載されるように調製した。マイクロスフェアの各サンプルを、リン酸緩衝化生理食塩水(0.15M)１mLあたり等容量のカプセル化されたガスが含まれるまで、約１：60希釈で希釈した。希釈懸濁液は、適切なヘッドスペースを有する密封された容器中で0.5psig〜7.5psigの即時の静的圧力を受けた。図９は、マイクロスフェア濃度に対する圧力の影響を示す。不溶性ガスである、パーフルオロプロパン、パーフルオロエタン、および六フッ化イオウを含有するマイクロスフェアは、同じ濃度および同じサイズ分布の、空気または高分子量のアルゴン充填マイクロスフェアよりもかなり耐圧性がある（図１０）。血流中の生理的圧力は、末梢静脈圧の1.5psigから心筋壁中における2.5psigまでの範囲に及ぶ。
【００７９】
（実施例９）マイクロスフェアに対する脱気した緩衝液の影響
種々のガスを含有するアルブミンマイクロスフェアを、実施例２に記載されるように調製した。リン酸緩衝化生理食塩水（PBS）を、使用する直前に沸騰させることによって脱気した。熱い緩衝液の0.05mL〜1.5mLのアリコートを、13×100の試験管に入れ、そして１分間水浴で冷却して室温にした。一定容積のマイクロスフェアを各試験管に加えた。混合した後、最終容積をPBSで3.0mLにし、そしてマイクロスフェア濃度を測定した。図１１は、脱気溶液中で改善された残存率が、不溶性ガスであるパーフルオロプロパン、パーフルオロエタン、および六フッ化イオウを含有するマイクロスフェアについて得られたことを示す。
【００８０】
空気、六フッ化イオウ、またはパーフルオロエタンを含有するマイクロスフェアを全血中に希釈した。空気を充填したマイクロスフェアは圧潰を示した。不溶性ガスを充填したマイクロスフェアは、新鮮全血での希釈において残存することを示した。
【００８１】
（実施例１０）弾力性
種々のガスから調製したマイクロスフェアを、実施例２に記載のように調製した。マイクロスフェアを、実施例８に記載のように、リン酸緩衝化生理食塩水中に希釈し、そして顕微鏡のステージ上に置いた透明なセル中に入れた。セルを窒素供給源に接続し、そのことにより、マイクロスフェアに対する生理学的圧力の急速な印加および開放の影響の観察を可能にした。
【００８２】
可溶性ガス含有マイクロスフェアに対する1.5psigまたはそれより大きい圧力の印加の結果は、球形体の完全損失が観察された。マイクロスフェアは、圧力から開放されても再形成せず、不可逆的破壊であることを示した。1.5psigより小さい圧力の印加は、マイクロスフェアの不完全損失を伴う殻の変形およびしわを生じた。球状の外観または集団は印加された圧力からの開放に際し回復され得なかった。
【００８３】
不溶性のパーフルオロカーボンガスを含むマイクロスフェアの懸濁液に対する数psigまでの圧力の印加により、マイクロスフェアの直径が減少した。マイクロスフェアの直径は、圧力からの開放に際しもとの大きさに戻った。
【００８４】
六フッ化イオウのマイクロスフェアはまた、印加された生理学的圧力下で、空気が充填されたマイクロスフェアに比べて増加した弾力性を示したが、パーフルオロカーボンのマイクロスフェアに比べて低い弾性を示した。
【００８５】
これらの観察は、不溶性ガスを含むマイクロスフェアが圧力に対して耐性であっただけではなく、圧力が開放された後も回復したことをも示す。このことは、タンパク質殻が弾力性であることを示す。
【００８６】
（実施例１１）開放系および閉鎖系で作製されたマイクロスフェアの比較処理方法
A)手動音波処理：  開放系(EPA554,213の１段階法に相当する)
米国特許第4,844,882号および欧州特許出願第554,213号に記載された方法を用いてマイクロスフェアを以下のように調製した：
20ccのシリンジ円筒にその先端を通じて挿入したＴ型熱電対をはめ込み、支持スタンド上に設置した。このシリンジに、スイス赤十字(SwissRedCross)５%ヒト血清アルブミンを16ccの印まで満たした。ガス(パーフルオロプロパン(C3F8)または六フッ化イオウ(SF6))をシリンジ円筒の上部に導入し、そして液体表面上に流した。音波ホーンを、液面下の10ccの印まで下げ、そして溶液温度が72.8〜73℃まで上昇するまで(約１分間)、50％の出力で稼働した。ホーンを直ちにメニスカス±１mmまで引き上げ、そして出力レベルを65％まで増加した。音波処理をさらに５秒間続け、温度がさらに1.2〜２℃上昇した。生成物をガラスバイアル中に容量まで注ぎそして密封した。
B)連続音波処理：閉鎖系
米国特許第4,957,656号に記載される方法を使用して以下のようにパーフルオロプロパンおよび六フッ化イオウマイクロスフェアを調製した：
ヒト血清アルブミンを、殺菌生理食塩水を用いて１％W/V溶液まで希釈した。この溶液を約76℃まで加熱して初期変性させた。この系は外部大気に対して閉鎖されており、そしてパーフルオロプロパンまたは六フッ化イオウガスを空気の代わりに液体流(1:1)中に導入した。音波発生器ホーンを通過させて約100ml液体/分でガス/アルブミン混合物を流すことにより生成物が連続的に作製された。生成物を、音波処理チャンバーから出すときに、熱交換器を通過させることにより冷却し、そしてマイクロスフェアのバルク液体懸濁液として収集した。取り扱いと貯蔵条件は、手動で生成したマイクロスフェアについて与えられた条件と同様であった。
C)機械的キャビテーション：閉鎖系
パーフルオロプロパンまたは六フッ化イオウガスを含むアルブミンマイクロスフェアはまた、閉鎖系中で、１％ヒト血清アルブミンとガスとの混合物をミル処理(milling)することにより、実施例２に記載されたように生成された。アルブミン溶液を、所定のミルの機械的キャビテーションによるマイクロスフェア形成を可能にするに十分な温度まで加熱し、1:1(v:v)でガスと混合し、そしてコロイドミル中に導入した。液体流速は、ミルの容量またはサイズに依存し、代表的には100〜500ml/分であった。SilversonL4RミルおよびBematek3インチ製造コロイドミルをこの評価のために使用した。ミルからの流出物を熱交換系を通過させることにより冷却し、そして得られるアルブミンマイクロスフェア懸濁液をバルクで集めた。生成物を、他のプロセスと同様にガラスバイアル中に満たした。
【００８７】
分析方法
A)集団動力学
集団動力学を、50ミクロンの開口度を用いてCoulterMultisizerIIを用いて評価した。「処理方法」の項で記載されたように調製されたアルブミンマイクロスフェアを、Isoton中に１：10,000に希釈し、そして500μlの試料を分析した。もとのマイクロスフェア懸濁液の濃度、平均サイズ、および１mlあたりのカプセル化ガス容量を得た。
B)ガス含有量
「処理方法」の項で記載されたように調製された２つのロットのマイクロスフェア中にトラップされたパーフルオロプロパンの百分率は、HewlettPackard5890によるガスクロマトグラフィーにより測定した。マイクロスフェア懸濁液試料を気密シリンジ中に採った。エタノール中の消泡剤を用いてマイクロスフェアからガスを放出し、そしてトラップされたガスを熱伝導度により検出した。
C)耐圧性
アルブミンマイクロスフェアの耐圧性をSinteticaによる欧州特許出願第554,213号により報告された方法と同様の方法により評価した。マイクロスフェアを、３mlの圧力キュベット中、600nmで約１吸光度単位まで、曝気リン酸緩衝化生理食塩水中に希釈した。首部を圧力供給源に取り付けて、キュベットを記録用分光光度計中に置いた。キュベット中の圧力を、０から５または10psigまで150秒間にわたって直線的に増加させ、その時点で圧力を開放した。圧力勾配は、20psiの圧力供給源(N2タンク)と５リットルのステンレス鋼リザーバーとの間に置いた電磁弁(Honeywell)および圧力トランスデューサー(Omega)を比例動作させることにより生じさせた。キュベットをデジタル圧力計を通じてステンレス鋼リザーバーに接続した。アナログ−デジタルコンバーターおよびデジタル−アナログコンバーターボード(NationalInstruments)を備えたPC型コンピューターが、バルブの開口を制御し、そして圧力トランスデューサーを読み取った。リザーバーおよびキュベットを、所望の圧力が達成されるまで、選択された速度で加圧した。マイクロスフェア懸濁液の光学密度を時間および圧力の関数としてモニターした。データをキュベット中のマイクロスフェアの自然浮上速度に対して補正した。
【００８８】
結果
A)集団動力学
手動音波処理、連続音波処理および機械的キャビテーションの方法により生成されたアルブミンマイクロスフェアを、製造後24時間以内に、濃度、平均サイズ、カプセル化ガス容量およびサイズ分布について分析した。すべての測定は、最小限２回行い、そして平均として表した。これらの測定の結果を表６中に示す。
【００８９】
【表６】
0003809368.tif 000008
すべての方法により生成されたマイクロスフェアは、本研究の継続期間中、４℃で少なくとも数週間、安定であった。
B)ガス含有量
マイクロスフェアの２つのロット中の、トラップされたパーフルオロプロパンガスの組成分析を、表７に示す。
【００９０】
【表７】
0003809368.tif 000009
*２つのロットの平均の結果。
【００９１】
これらの結果は、手動音波処理を用いて開放系で作製されたマイクロスフェアが、閉鎖系(連続音波処理および機械的キャビテーション)中で作製されたマイクロスフェアに比べ、マイクロスフェアを形成するために用いられたガスのカプセル化がかなり少ないことを示す。閉鎖系で作製されるマイクロスフェアは、酸素電極を用いて測定されるように、酸素の非存在下で作製された。３つのすべての方法により作成されたマイクロスフェアは、取り扱いおよびサンプリングの間、大気に対し同程度に曝された(２つの閉鎖系手順を用いて作製されたマイクロスフェアで測定される100％未満のパーフルオロプロパンガスで説明される)、従って、開放系での形成の間酸素(およびその他の大気ガス)が存在し、そのことがガスカプセル化の効率を小さくする。
C)耐圧性
ガス充填されたマイクロスフェアの懸濁液は、圧力が増大すると、サイズ減少および関連する表面領域の変化により光学密度が減少する。収縮は２つの因子に起因する；気体法則に従った可逆的圧縮、およびヘンリーの法則に従い増加した溶解度による周辺液体へのガスコアの不可逆的損失である。印加圧力の開放に際し、圧縮による容量損失の部分のみが回復し、そしてそれは光学密度の増加により観察され得る。周辺溶液へのトラップガスの損失は、減圧に際しマイクロスフェアに再び入らず、溶液上のヘッドスペースに失われる。
【００９２】
図１２は、手動音波処理(開放系)法、ならびに連続音波処理および機械的キャビテーション(閉鎖系)法によりパーフルオロプロパンガスを用いて調製されたアルブミンマイクロスフェアの１OD懸濁液に関して10psiまでの直線状圧力勾配を課した結果を示す。両方の閉鎖系法は、増加する圧力で圧縮され、勾配の最後で圧力の開放に際し全容積が回復するマイクロスフェアを生じる。周辺溶液へのトラップされたガスの損失は観察されなかった。開放系(手動音波処理法)で調製されたアルブミンマイクロスフェアは、印可された圧力でより大きな圧縮を示し、そしてガスコアの不可逆的損失のために圧力の開放に際し容積は部分的に回復するのみであり、マイクロスフェアの40％が破壊された。
【００９３】
【発明の効果】
改善された耐圧性および安定性を有するカプセル化ガスマイクロスフェアの製造方法が提供される。フィルム形成性タンパク質の水溶液とパーフルオロプロパンのような水不溶性ガスとを混合し、この混合物を、大気に対して閉鎖された装置内で、超音波または機械的キャビテーションに供するので、ガス微小気泡がフィルム形成性タンパク質殻によりカプセル化される。このガス微小気泡は、遊離の微小気泡と異なり、合体および拡散させる膨張に耐性であり、タンパク質殻の存在により、長期間の間、微小な個々の気泡でガス、そしてそれ故優れたエコー反射性を維持する。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の機械的キャビテーションプロセスにおいて使用され得るミルの一例（Gaulinミル）の概略分解図である。
【図２】本発明の機械的キャビテーションプロセスにおいて使用され得るミルの別の例（Bematekミル）の概略分解図である。
【図３】本発明の機械的キャビテーションプロセスにおいて使用され得るミルのさらに別の例（Silversonミル）の概略分解図である。
【図４】空気充填されたアルブミンマイクロスフェアの耐圧性を示すグラフを示す図である。マイクロスフェア懸濁液を注射器内に入れ、40psigで加圧した。加圧前後の粒子分布を示す。
【図５】パーフルオロプロパン充填されたアルブミンマイクロスフェアの耐圧性を示すグラフを示す図である。マイクロスフェア懸濁液を注射器内に入れ、40psigで加圧した。加圧前後の粒子分布を示す。
【図６】パーフルオロエタン充填されたアルブミンマイクロスフェアの耐圧性を示すグラフを示す図である。マイクロスフェア懸濁液を注射器内に入れ、40psigで加圧した。加圧前後の粒子分布を示す。
【図７】六フッ化イオウ充填されたアルブミンマイクロスフェアの耐圧性を示すグラフを示す図である。マイクロスフェア懸濁液を注射器内に入れ、40psigで加圧した。加圧前後の粒子分布を示す。
【図８】アルゴン充填されたアルブミンマイクロスフェアの耐圧性を示すグラフを示す図である。マイクロスフェア懸濁液を注射器内に入れ、40psigで加圧した。加圧前後の粒子分布を示す。
【図９】マイクロスフェア希釈懸濁液の3.0psigでの耐圧性を示すグラフを示す図である。マイクロスフェア希釈懸濁液を１cmキュベット内に入れ、3.0psigでt=30秒間加圧した。パーフルオロエタン、パーフルオロプロパン、六フッ化イオウおよび空気のマイクロスフェアのデータを示す。
【図１０】アルゴンマイクロスフェアの希釈懸濁液の3.0psigでの耐圧性を示すグラフを示す図である。希釈されたアルゴンマイクロスフェアを１cmキュベット内に入れ、3.0psigでt=30秒間加圧した。
【図１１】マイクロスフェアに対する脱気された緩衝液の影響を示すグラフを示す図である。マイクロスフェアを、脱気された緩衝液の増加量に添加し、混合し、そして、この混合物を濃度測定のための一定体積とした。空気、パーフルオロプロパン、パーフルオロエタン、および六フッ化イオウのマイクロスフェアのデータを、脱気された緩衝液の体積に対してプロットしている。
【図１２】後述の実施例11に記載のデータを示すグラフを示す図である。
【符号の説明】
10、20、30  回転シャフト
11、23  ステータ
12  ディスクロータ
15  Ｔ字管
16  カウンタボア
17  半径方向表面
18  中央ボア開口部
21  円錐台形ロータ
22  ネジ状前縁
24  円錐台形カウンタボア
25  中央円筒開口部
31  パドルブレードロータ
32  カップ形多孔スクリーンステータ
33  ハウジング
34  入口継手
35  パドルロータの平面
36  ステータの孔
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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