(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペルオキシダーゼ酵素標識した抗体もしくは抗原を試料中の測定すべき抗原もしくは抗体またはそれらの凝集物と混合し、抗原抗体反応によりペルオキシダーゼ酵素標識−抗原抗体錯体からなる免疫複合体を生成させ、該免疫複合体に化学発光性物質として下記一般式（１）
【化１】
0003745112.tif 000004
（上記一般式（１）において、Ｒ1 およびＲ2 は、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、フェニル基、またはｍ−クロロフェニル基であり、互いに同一でもまたは異なるものでもよく、Ｒ3 、Ｒ4 、Ｒ5 およびＲ6 は、いずれも水素原子である。Ｘn-は硝酸イオン、ハロゲン化物イオンまたはリン酸イオンであり、ｎは１または２である。）
で表わされるＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の還元処理により得られる反応生成物を添加し、水素受容体の存在下において化学発光させ、その化学発光量を測定することにより試料中の抗原もしくは抗体の含有量を測定することを特徴とする化学発光酵素免疫測定方法。
【請求項２】
前記反応生成物が
下記一般式（２）
【化２】
0003745112.tif 000005
（上記一般式（２）において、Ｒ11およびＲ22は、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、フェニル基、またはｍ−クロロフェニル基であり、互いに同一でもまたは異なるものでもよく、Ｒ33、Ｒ44、Ｒ55およびＲ66は、いずれも水素原子である。）
で表される化合物を含有してなる請求項１記載の化学発光酵素免疫測定方法。
【請求項３】
前記免疫複合体が不溶性担体に固定化した抗体または抗原と反応し該不溶性担体上に捕捉されてなる請求項１に記載の化学発光酵素免疫測定方法。
【請求項４】
前記Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類が、Ｎ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウム塩、Ｎ，Ｎ’−ジエチル−９，９’−ビスアクリジニウム塩、Ｎ，Ｎ’−ジプロピル−９，９’−ビスアクリジニウム塩、Ｎ，Ｎ’−ジブチル−９，９’−ビスアクジニウム塩、Ｎ，Ｎ’−ジペンチル−９，９’−ビスアクリジニウム塩、Ｎ，Ｎ’−ジフェニル−９，９’−ビスアクリジニウム塩、またはＮ，Ｎ’−ジ−ｍ−クロロフェニル−９，９’−ビスアクリジニウム塩である請求項１に記載のペルオキシダーゼ活性の測定方法。
【請求項５】
前記Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類がＮ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウムジナイトレートである請求項１に記載の化学発光酵素免疫測定方法。
【請求項６】
前記水素受容体が過酸化水素である請求項１〜４のいずれかの請求項に記載の化学発光酵素免疫測定方法。
【請求項７】
発光増強剤をさらに含有させてなる請求項１〜５のいずれかの請求項に記載の化学発光酵素免疫測定方法。
【請求項８】
前記発光増強剤がフェノール性化合物である請求項６に記載の化学発光酵素免疫測定方法。
【請求項９】
前記フェノール性化合物がｐ−ヨードフェノール、ｐ−フェニルフェノール、６−ヒドロキシベンゾチアゾールからなる群より選択される少なくとも１種のフェノール性化合物である請求項７に記載の化学発光酵素免疫測定方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、化学発光方法を利用する酵素免疫測定方法に関するものであり、さらに詳しくは、ペルオキシダーゼ酵素を標識物質として用い、特定のアクリジニウム塩類の還元反応生成物を化学発光性物質として用いる抗原または抗体の免疫学的測定方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
酵素免疫測定方法は、標識物質に放射性同位元素を使用しないので良好な測定環境を保持することが可能であり、人体に対して危険性の少ない免疫測定方法として開発され、種々の物質の測定系に利用されている。この酵素免疫測定方法において、ぺルオキシダーゼ、アルカリホスファダーゼ、β−ガラクトシダーゼおよびグルコースオキシダーゼ等の種々の酵素が使用されている。これらの酵素を用いた酵素標識抗体または抗原の酵素活性を検出する方法としては、過酸化水素／ｏ−フェニレンジアミン、４−ニトロフェニル−ホスフェ−ト、２−ニトロフェニル−β−ガラクトシド等の酵素基質の酵素による分解反応に伴い生成する発色性物質の発色量を測定して酵素活性を定量し、この酵素活性と相関性を有する抗体または抗原の量を定量する比色法が一般的である。しかしながら、臨床化学分析においてはその測定対象が生体試料（主として血清、尿等）であり、その測定値は病態の診断または経過観察等に用いられることが多く、そのために、さらに高感度および高精度の測定が求められているが、比色法によりこの要求を完全に満足させるのは困難である。そこで、この要求を満たすことを目的として蛍光法が提案されている。蛍光法とは、標識に用いた酵素の触媒活性により、４−ヒドロキシフェニル酢酸、４−メチルウムベリフェリル−β−ガラクトシド、４−メチルウムベリフェリル−ホスフェート等の蛍光基質を分解して蛍光を発生させた後、この蛍光強度を測定して酵素活性を定量し、この酵素活性と相関性を有する抗体または抗原の量を定量する方法である。しかし、蛍光法では、励起光の散乱が存在するため上記の要求を満たすには充分とは云い難い。また、比色法および蛍光法では、キセノンランプ等の光源が必要であり、光源からの光に由来する迷走現象や溶媒に由来するラマン光が原因となり、バックグラウンドのレベルを上昇させてしまうので、比色法および蛍光法による測定の高感度化は原理的に困難である。近年、比色法および蛍光法を上回る高感度の酵素免疫測定方法として、化学発光酵素免疫測定方法（ＣＬＥＩＡ）が開発され、注目されている。
【０００３】
化学発光酵素免疫測定方法は、酵素の触媒活性によって化学発光性物質が中間体を経て励起状態となり、この状態から基底状態に戻る際に放出される発光量を測定して酵素活性を定量し、この酵素活性と相関性を有する抗体または抗原の量を定量する方法であり、化学反応により化学発光性物質を発光させるため光源が不要であり、光源に起因するバックグラウンドの上昇等がないため測定の高感度化が可能である。化学発光酵素免疫測定方法に用いられる酵素としては、ぺルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、デヒドロゲナーゼ等が挙げられるが、取り扱い易さ、入手し易さ等の点でぺルオキシダーゼが好適に用いられ、化学発光性物質にルミノールを用い、発光増強剤にｐ−ヨードフェノールを用いる化学発光方法が開発され、種々の物質が化学発光方法により免疫学的に高感度に定量することが可能になっている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、ペルオキシダーゼ酵素を標識物質とする化学発光酵素免疫測定方法（ＣＬＥＩＡ）においては、測定対象物質の低濃度領域での定量性をさらに高める必要性が生じるケースが多く、ペルオキシダーゼ酵素を標識物質とする化学発光酵素免疫測定方法のさらなる高感度化が望まれていた。本発明は、上記事情に鑑み、測定対象物質をより高感度で測定可能な化学発光方法を利用する新規な酵素免疫測定方法を提供することを課題とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
従って、本発明者らは、上記課題を達成するために鋭意検討を行なった結果、化学発光性物質として、Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の還元処理により得られる反応生成物を用い、水素受容体の存在下において、特に好ましくは発光増強剤として特定のフェノール性化合物を用いる化学発光系が、化学発光性物質としてルミノールを用いる化学発光系より高感度に測定対象物質を免疫学的に定量することが可能なことを見い出し、これらの知見に基いて本発明に到達したものである。
【０００６】
従って、本発明は、ペルオキシダーゼ酵素標識した抗体もしくは抗原を試料中の測定すべき抗原もしくは抗体またはそれらの凝集物と混合し、抗原抗体反応によりペルオキシダーゼ酵素標識−抗原抗体錯体からなる免疫複合体を生成させ、さらに、好ましくは、該免疫複合体を不溶性担体に固定化した抗体もしくは抗原と反応させて該不溶性担体上に捕捉した後、化学発光性物質として
下記一般式（１）
【０００７】
【化３】
0003745112.tif 000002
（上記一般式（１）において、Ｒ1 およびＲ2 は、アルキル基、アリール基およびハロゲン化アリール基からなる群より選択され、互いに同一でも異なるものでもよく、Ｒ3 、Ｒ4 、Ｒ5 およびＲ6 は、水素原子、アルキル基、アリール基、アルコキシ基、アリーロキシ基およびハロゲン原子からなる群より選択され、互いに同一でもまたは異なるものでもよく、Ｘn-はｎ価の陰イオンであり、ｎは１または２である。）
で表わされるＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の還元処理により得られる反応生成物を添加し、水素受容体の存在下において化学発光させ、その化学発光量を測定することにより試料中の抗原もしくは抗体を測定することを特徴とする化学発光酵素免疫測定方法に関するものである。
【０００８】
【発明の実施の形態】
以下、本発明につきさらに詳しく説明する。
【０００９】
本発明の化学発光酵素免疫測定方法は、抗原抗体反応により測定すべき抗原または抗体をペルオキシダーゼ酵素標識した免疫複合体として捕捉する免疫反応段階と、生成した該免疫複合体をその分子中に存在する標識酵素を用いる化学発光方法により測定する化学発光反応段階とからなる。
【００１０】
免疫反応段階を構成する免疫反応の方法は任意であり、化学発光反応段階において酵素活性の検出・定量に化学発光性物質Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジンニウム塩類の還元処理により得られる反応生成物を用いることができるものであれば、いずれの方法も採用することができる。
【００１１】
例えば、
▲１▼不溶性担体に結合した抗体に試料中の測定すべき抗原を捕捉させると同時または捕捉させた後にペルオキシダーゼ酵素標識抗体を反応させるサンドイッチ法、
▲２▼サンドイッチ法において、不溶性担体に結合した抗体と異なる動物種に由来する抗体を用い、生成したサンドイッチ錯体に対して、さらに、この抗体に対する標識した第二抗体を反応させる二抗体法、
▲３▼不溶性担体に結合した抗体に試料中の測定すべき抗原をペルオキシダーゼ酵素標識抗原の存在下で反応させる競合法、
▲４▼測定すべき抗原または抗体を含有する試料にこれらと特異的に反応する標識した抗体または抗原を作用させて凝集沈殿させた後、遠心分離して分離された免疫複合体中の標識物質を検出する凝集沈殿法
または
▲５▼不溶性担体に結合した抗原に試料中の測定すべき抗体を捕捉させた後にペルオキシダーゼ酵素標識抗ヒトガンマグロブリン抗体を作用させる抗体検出法等の方法、
さらに、ビオチン標識抗体およびペルオキシダーゼ標識アビジン等を利用する方法等を非限定的に用いることができる。
【００１２】
本発明の化学発光酵素免疫測定方法の免疫反応段階において用いられる不溶性担体としては、例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリアクリロニトリル、フッ素樹脂、架橋デキストラン、ポリサッカライド等の高分子化合物、その他、紙、ガラス、金属、磁性粒子およびこれらの組み合わせ等が挙げられる。また、不溶性担体の形状としては、例えば、トレイ状、球状、繊維状、棒状、盤状、容器状、セル、マイクロプレート、試験管等の種々の形状で用いることができる。さらに、これら不溶性担体への抗原、抗体類の固定化方法は任意であるが、物理的吸着法、共有結合法、イオン結合法等を用いることができる。
【００１３】
なお、本発明の化学発光酵素免疫測定方法において用いられる抗体類はモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体のいずれも可能であり、形態は全抗体でもＦ（ａｂ’）2 、Ｆａｂ等の断片を用いることもできる。また、抗体の起源は任意であるが、マウス、ラット、兎、羊、山羊、鶏等に由来する抗体が好適に用いられる。
【００１４】
本発明の化学発光酵素免疫測定方法の後段の化学発光反応段階を構成する化学発光反応は、化学発光性物質としてＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の還元処理により得られる反応生成物を用いることに特異性がある。さらに、反応系に発光増強剤を存在させることが好ましく、発光増強剤の存在下において水素受容体を作用させて、標識物質であるペルオキシダーゼ酵素の活性を測定することができる。その測定手法は任意であるが、一般に、化学発光性物質および発光増強剤を含有する測定試薬をペルオキシダーゼ酵素標識抗体または抗原を免疫学的に捕捉した不溶性担体に添加し、特定塩基性ｐＨ領域において水素受容体を添加して化学発光反応させ、その化学発光量を発光測定装置で測定する方法等が行なうことができる。
【００１５】
本発明の化学発光酵素免疫測定方法に用いられる化学発光性物質であるＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の還元処理により得られる反応生成物は、前記一般式（１）で表わされる化合物を溶媒中において還元剤を用いて還元処理を行なうことにより得られる反応生成物であり、単一化合物または混合物である。一般式（１）において、Ｒ1 およびＲ2 は、各々、アルキル基、アリール基およびハロゲン化アリール基からなる群より選択され、互いに同一でもまたは異なるものでもよい。アルキル基としては、炭素数１〜２０、好ましくは、１〜１４の直鎖状または分岐状のいずれでも用いることができ、アリール基およびハロゲン化アリール基は、各々、炭素数６〜２０のものであり、炭素数１〜１４のアルキル基で置換されたものでもよいが、特にフェニル基およびハロゲン化フェニル基が好ましい。また、式中、Ｒ3 、Ｒ4 、Ｒ5 およびＲ6 は、各々、水素原子、アルキル基、アルコキシ基、アリーロキシ基およびハロゲン原子からなる群より選択され、互いに同一でも異なるものでもよい。アルキル基、アルコキシ基は炭素数１〜２０、好ましくは、１〜１４の直鎖状または分岐状のものでもよく、アリール基、アリーロキシ基は炭素数６〜２０のものであり、アルキル基で置換されたものでもよい。
【００１６】
前記一般式（１）において、Ｘn-はｎ価の陰イオンであり、ｎは１または２である。陰イオンとしては、特に限定されるものではないが、硝酸イオン（ＮＯ3-）、ハロゲン化物イオン（例えば、塩化物イオン、フッ化物イオン等）、リン酸イオン（ＰＯ3-）等を挙げることができる。これらの陰イオンのなかで特に硝酸イオンが好ましい。
【００１７】
Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の具体例を例示すると、Ｎ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウム塩が好適に用いられるが、その他に、Ｎ，Ｎ’−ジエチル−９，９’−ビスアクリジニウム塩、Ｎ，Ｎ’−ジプロピル−９，９’−ビスアクリジニウム塩、Ｎ，Ｎ’−ジブチル−９，９’−ビスアクリジニウム塩、Ｎ，Ｎ’−ジペンチル−９，９’−ビスアクリジニウム塩、Ｎ，Ｎ’−ジフェニル−９，９’−ビスアクリジニウム塩、Ｎ，Ｎ’−ジ−ｍ−クロロフェニル−９，９’−ビスアクリジニウム塩等を非限定的に挙げることができる。これらのなかで、特に、Ｎ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウムジナイトレートが好適である。
【００１８】
前記還元反応生成物は、Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスジヒドロアクリジン誘導体を含有するものでよく、該誘導体は、例えば、下記一般式（２）で表すことができる。
【００１９】
【化４】
0003745112.tif 000003
一般式（２）において、Ｒ11、およびＲ22は、アルキル基、アリール基およびハロゲン化アリール基からなる群より選択され、互いに同一でもまたは異なるものでもよい。アルキル基としては炭素数１〜２０、好ましくは、１〜１４の直鎖状または分岐状のいずれでも用いることができ、アリール基およびハロゲン化アリール基は、炭素数６〜２０のものであり、各々、炭素数１〜１４のアルキル基で置換されたものでよいが、特に、フェニル基およびハロゲン化フェニル基が好ましい。また、Ｒ33、Ｒ44、Ｒ55およびＲ66は、水素原子、アルキル基、アリール基、アルコキシ基、アリーロキシ基およびハロゲン原子からなる群より選択され、互いに同一でもまたは異なるものでもよい。アルキル基、アルコキシ基は炭素数１〜２０、好ましくは、１〜１４の直鎖状または分岐状のものでよく、アリール基、アリーロキシ基は炭素数６〜２０のものであり、アルキル基で置換されたものでもよい。
【００２０】
これらの化学発光性物質は、ｐＨ７．５〜１３の塩基性条件下において、過剰の水素受容体の存在下、ペルオキシダーゼの濃度に依存した量で発光する。この発光は特にフェノール性化合物等の発光増強剤によって増強することが認められている。このようなフェノール性化合物としては、ｐ−ヨードフェノール、ｐ−フェニルフェノール、６−ヒドロキシベンゾチアゾールが特に好ましいが、その他にもｐ−ヒドロキシ桂皮酸、ｐ−（４−クロロフェニル）フェノール、ｐ−（４−ブロモフェニル）フェノール、ｐ−（４−ヨードフェニル）フェノール、ｐ−ブロモフェノール、ｐ−クロロフェノール、２−ナフトール、ホタルルシフェリン等がその例として非限定的に挙げられる。
【００２１】
本発明の化学発光酵素免疫測定方法において用いられる化学発光性物質であるＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の還元反応生成物の濃度は、出発物質のＮ，Ｎ’置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類に換算して１０-8〜１Ｍ、好ましくは１０-5〜１０-2Ｍの範囲であり、その使用量としては１０〜５００μｌ、特に、５０〜３００μｌの範囲が好ましい。また、発光増強剤の使用量は還元反応生成物からなる化学発光性物質の０．０１〜１００倍モル、好ましくは０．１〜１０倍モルの範囲であり、濃度は１０-6〜１Ｍ、好ましくは１０-4〜１０-2Ｍの範囲である。
【００２２】
また、化学発光反応に用いられる水素受容体としては、ペルオキシダーゼ酵素の基質となり得るものであれば特に限定されるものではないが、有機過酸化物、無機過酸化物等が任意に用いられるが、過酸化水素が好ましく用いられる。この水素受容体の使用量は化学発光性物質に対して充分に過剰な量で用いることが必要であり、その使用量は化学発光性物質に対して３〜１万倍モル、好ましくは１０〜１０００倍モルの範囲で用いることができる。
【００２３】
化学発光反応に用いる塩基性緩衝液としては、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液等を任意に用いることができる。これらの緩衝液の濃度は１ｍＭ〜１Ｍの範囲で用いるのが好ましい。また、反応時に界面活性剤、キレート剤等の添加剤を任意に用いることができる。
【００２４】
本発明の化学発光反応の発光量の測定は発光光度計を用いて測定することができ、その測定の開始点および積算時間は任意であるが、発光量が安定し且つ発光量の濃度依存性の高い時間を選択するのが望ましい。例えば、測定開始点は試薬混合後０〜１時間、好ましくは０〜３０分、特に好ましくは０〜１５分であり、測定の積算時間は１秒〜１分、好ましくは１〜３０秒、特に好ましくは１〜１０秒である。
【００２５】
本発明の化学発光酵素免疫測定方法に用いられるＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の還元反応生成物の製造方法は任意であるが、前記一般式（１）で表される化合物を還元剤を用いて還元処理することにより容易に製造することができる。用いられる還元剤としては、リチウムアルミニウムハイドライド、リチウムボロンハイドライド、ナトリウムボロンハイドライド等が挙げられるが、リチウムアルミニウムハイドライドが特に好ましく用いられる。還元反応は反応溶媒中で行なうことが好ましいが、反応溶媒としては、反応試薬に対して不活性であり、反応試薬に対する溶解性を有するものであれば、特に限定されるものではなく、テトラヒドロフラン、ジオキサン類等の環状エーテル類等が好ましく用いられる。反応温度は用いられる還元剤および反応溶媒の種類によって異なるが、一般的に、−１０〜＋１５０℃、好ましくは０〜１２０℃、特に好ましくは２０〜９０℃の範囲の温度である。反応時間は１分〜一昼夜、好ましくは１０分〜１２時間、特に好ましくは３０分〜５時間の範囲である。
【００２６】
また、本発明によれば、Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の還元反応生成物からなる化学発光測定用試薬を提供することができ、ペルオキシダーゼ酵素標識物質、化学発光測定用試薬、水素受容体溶液の過酸化水素および発光増強剤のフェノール性化合物等を用いた酵素免疫測定用試薬キットを提供することができる。この測定用試薬またはこれらの測定用試薬キットは効率的な化学発光酵素免疫測定を行なう上で極めて有用である。
【００２７】
【実施例】
以下、参考例と共に実施例等を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例等に限定されるものではない。なお、参考例および実施例等中の％は重量％を意味する。
【００２８】
［参考例１］
化学発光試薬の製造
ルシゲニン（Ｎ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウムジナイトレート）１ｍｇを試験管に採り、撹拌下に１，４−ジオキサン１ｍｌ中へ加えてルシゲニンを１，４−ジオキサン中に微分散させた。次に、これに水素化リチウムアルミニウム粉末１５０ｍｇを添加して、８０℃で２時間撹拌して還元処理した後、反応生成物を氷冷下に脱イオン水中へ少量ずつ注入して過剰量の水素化リチウムアルミニウムを分解させた。次に、生成した水酸化アルミニウム等の沈殿を濾別してから、濾液のｐＨを１Ｎ塩酸で７．０に調整することによりルシゲニンの還元反応生成物を含有する化学発光試薬を得た。
【００２９】
［参考例２］
不溶性担体固定化ポリクローナル抗体の製造
抗原に特異的反応性を有する兎等の動物由来のポリクローナル抗体を１０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）（ＰＢＳ）に１０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解した溶液を、白色マイクロプレート（ラボシステム社）の各ウェルに０．１ｍｌずつ加え、３７℃の温度で１時間放置した後、ＰＢＳで洗浄してから、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）水溶液を０．３ｍｌずつ加えて３７℃の温度で１時間放置してポストコーティング処理を実施してポリクローナル抗体固定化白色マイクロプレートを得た。
【００３０】
［参考例３］
ペルオキシダーゼ酵素標識モノクローナル抗体の製造
抗原に特異的反応性を有するマウス由来等のモノクローナル抗体を１０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７．４）に１．０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解した溶液１ｍｌに、Ｎ−（ｍ−マレイミド安息香酸）−Ｎ−サクシンイミドエステル（ＭＢＳ）の１０ｍｇ／ｍｌの濃度のジメチルホルムアミド溶液０．１ｍｌを添加し、２５℃の温度で３０分間反応させた。次いで、この反応混合液をセファデックスＧ−２５を充填したカラムを用い、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）でゲル濾過を行ない、マレイミド化モノクローナル抗体と未反応ＭＢＳとを分離した。
【００３１】
一方、ペルオキシダーゼ酵素としてホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の１．０ｍｇ／ｍｌのＰＢＳ溶液に、Ｎ−サクシンイミジル−３−（２−ピリジルチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）の１０ｍｇ／ｍｌの濃度のエタノール溶液を添加し、２５℃の温度で３０分間反応させた。
【００３２】
次いで、この反応混合液をセファデックスＧ−２５を充填したカラムを用い、１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）でゲル濾過して精製、ピリジルジスルフィド化ＨＲＰを含有する画分を採取し、これをコロジオンバック中において氷冷下に約１０倍に濃縮した。次に、これに０．１Ｍジチオスレイトールを含有する０．１Ｍ酢酸緩衝生理食塩水（ｐＨ４．５）１ｍｌを添加して、２５℃の温度で３０分間撹拌してＨＲＰ分子中に導入したピリジルジスルフィド基を還元した後、この反応混合液をセファデックスＧ−２５を充填したカラムを用いてゲル濾過し、チオール化ＨＲＰを含有する画分を得た。
【００３３】
次に、マレイミド化モノクローナル抗体とチオール化ＨＲＰとを混合し、コロジオンバックを用いて氷冷下に４ｍｇ／ｍｌの蛋白質濃度まで濃縮し、４℃で一昼夜放置した後、ウルトロゲルＡｃＡ４４（ＳＥＰＲＡＣＯＲ社）を充填したカラムを用いてゲル濾過し、ペルオキシダーゼ酵素標識モノクローナル抗体を得た。
【００３４】
［実施例１］
同時サンドイッチ法ＣＬＥＩＡによるα−フェトプロテイン（ＡＦＰ）の測定
兎抗ヒトＡＦＰポリクローナル抗体を固定化した白色マイクロプレートに、精製したヒトＡＦＰ（標準物質）を０〜８００ｎｇ／ｍｌの範囲で含有する２％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）５０μｌとペルオキシダーゼ酵素標識マウス抗ヒトＡＦＰモノクローナル抗体を約３μｇ／ｍｌの濃度で含有する２％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）１００μｌとを加え、３７℃の温度で１時間インキュベートした。次に、ウェル内の溶液を吸引除去した後、生理食塩水で洗浄してから、各ウェルに参考例１で調製した化学発光試薬を０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．４）で１０倍に希釈した溶液１０μｌおよびｐ−ヨードフェノールを１０-3Ｍの濃度で含有する０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．４）２４０μｌを加え、これに０．００３４％過酸化水素の０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．４）５０μｌを注入して発光させ、この発光量をルミノメーター（ダイアヤトロン社製ルミナスＣＴ−９０００Ｄ）で０〜５秒間積算して測定し、この値を標準物質濃度に対してプロットすることにより、図１に示される濃度依存性の良い検量線を得た。この検量線を用いて血清検体中のヒトＡＦＰを０．０５ｎｇ／ｍｌの濃度まで測定することが可能であった。
【００３５】
［実施例２］
同時サンドイッチ法ＣＬＥＩＡによるプロラクチン（ＰＲＬ）の測定
兎抗ヒトＰＲＬポリクローナル抗体を固定化した白色マイクロプレートに、精製したヒトＰＲＬ（標準物質）を０〜２００ｎｇ／ｍｌの範囲で含有する２％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）５０μｌとペルオキシダーゼ酵素標識マウス抗ヒトＰＲＬモノクローナル抗体を約２μｇ／ｍｌの濃度で含有する２％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）１００μｌとを加え、３７℃の温度で１時間インキュベートした。次いで、ウェル内の溶液を吸引除去し、生理食塩水で洗浄してから、各ウェルに参考例２で調製したＮ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウム塩の還元反応生成物を０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．４）で１０倍に希釈した溶液１０μｌおよびｐ−ヨードフェノールを１０-3Ｍの濃度で含有する０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．４）２４０μｌを加え、これに０．００３４％過酸化水素の０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．４）５０μｌを注入して発光させ、この発光量をルミノメーター（ダイアヤトロン社製ルミナスＣＴ−９０００Ｄ）で０〜５秒間積算して測定し、この値を標準物質濃度に対してプロットすることにより、図２に示される濃度依存性の良い検量線を得た。この検量線を用いて血清検体中のヒトプロラクチンを０．１ｎｇ／ｍｌの濃度まで測定することが可能であった。
【００３６】
［実施例３］
同時サンドイッチ法ＣＬＥＩＡによるヒト絨毛性ゴナドトロピンβ鎖（βｈＣＧ）の測定
兎抗ヒトｈＣＧポリクローナル抗体を固定化した白色マイクロプレートに、精製したβｈＣＧ（標準物質）を０〜２００ｍＩＵ／ｍｌの範囲で含有する２％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）５０μｌとペルオキシダーゼ酵素標識マウス抗βｈＣＧモノクローナル抗体を約２μｇ／ｍｌの濃度で含有する２％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）１００μｌとを加え、３７℃の温度で１時間インキュベートした。次に、ウェル内の溶液を吸引除去した後、生理食塩水で洗浄してから、各ウェルに化学発光試薬を０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．４）で１０倍に希釈した溶液１０μｌ、およびｐ−ヨードフェノールを１０-3Ｍの濃度で含有する０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．４）２４０μｌを加え、これに０．００３４％過酸化水素の０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．４）５０μｌを注入して発光させ、この発光量をルミノメーター（ダイアヤトロン社製ルミナスＣＴ−９０００Ｄ）で０〜５秒間積算して測定し、この値を標準物質濃度に対してプロットすることにより、図３に示される濃度依存性の良い検量線を得た。この検量線を用いて血清検体中のβｈＣＧを０．１ｍＩＵ／ｍｌの濃度まで測定することが可能であった。
【００３７】
［比較例１］
ルミノールを用いる同時サンドイッチ法ＣＬＥＩＡによるα−フェトプロティン（ＡＦＰ）の測定
兎抗ヒトＡＦＰポリクローナル抗体を固定化した白色マイクロプレートに、精製したヒトＡＦＰ（標準物質）を０〜８００ｎｇ／ｍの範囲で含有する２％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）５０μｌとペルオキシダーゼ酵素標識マウス抗ヒトＡＦＰモノクローナル抗体を約３μｇ／ｍｌの濃度で含有する２％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）１００μｌとを加え、３７℃の温度で１時間インキュベートした。次に、ウェル内の溶液を吸引除去した後、生理食塩水で洗浄してから、各ウェルにルミノールを５．６×１０-5Ｍ、ｐ−ヨードフェノールを１０-3Ｍの濃度で含有する０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．４）１００μｌを加え、これに０．００３４％過酸化水素の０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．４）５０μｌを注入して発光させ、この発光量をルミノメーター（ダイアヤトロン社製ルミナスＣＴ−９０００Ｄ）で０〜５秒間積算して測定し、この値を標準物質濃度に対してプロットすることにより、図４に示される濃度依存性を有する検量線を得た。この検量線を用いて血清検体中のヒトＡＦＰを２．０ｎｇ／ｍｌの濃度まで測定することが可能であった。
【００３８】
【発明の効果】
本発明の酵素免疫測定方法は、入手が容易であり、取り扱いも比較的に容易なペルオキシダーゼ酵素を標識物質として用い、化学発光性物質としてＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の還元反応生成物を用いる化学発光方法により測定対象物質である種々の抗原または抗体類を免疫学的に高感度に測定することができる。
【００３９】
さらに、ペルオキシダーゼを標識物質として抗原、抗体、核酸等を標識した酵素標識物を用いて、酵素免疫測定方法により抗体、抗原等を、ウェスタンブロット法により蛋白質を、そしてサザーン及びノーザンブロット法により酵素標識核酸プローブを用いてＤＮＡおよびＲＮＡ等の核酸を夫々特異的に、且つ高感度で測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  実施例１記載の反応系を用いて化学発光させた化学発光量をヒトαＡＦＰ（標準物質）の濃度の関数としてプロットして作成したヒトαＡＦＰ測定用の検量線である。
【図２】  実施例２記載の反応系を用いて化学発光させた化学発光量をヒトプロラクチン（標準物質）の濃度の関数としてプロットして作成したヒトプロラクチン測定用の検量線である。
【図３】  実施例３記載の反応系を用いて化学発光させた化学発光量をβｈＣＧ（標準物質）の濃度の関数としてプロットして作成したβｈＣＧ測定用の検量線である。
【図４】  比較例１記載の従来方法による反応系を用いて化学発光させた化学発光量をヒトαＡＦＰ（標準物質）の濃度の関数としてプロットして作成したヒトαＡＦＰ測定用の検量線である。
【図１】
0003745112.tif 000006
【図２】
0003745112.tif 000007
【図３】
0003745112.tif 000008
【図４】
0003745112.tif 000009