(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
a)ミコフェノール酸を含むと推測されるサンプルと、有効量のIMP、NADおよびIMPDHとをIMPDH活性に好適な条件下で混合し、それにより反応混合液を得ること、
b)該反応混合液中でNADHの生成を分光光学的にモニターすること、
c)該NADHの生成を、ステップa)およびb）で処理した後の既知量のミコフェノール酸を含むサンプルによるNADHの生成と比較すること、
を含んでなる、体液中のミコフェノール酸の測定方法。
【請求項２】
前記NADHの生成のモニターを自動化された分析装置を用いて実施する、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
a)有効量のIMPDH、IMPおよびバッファーを含む第1の試薬、ならびに、
b)有効量のNADおよびバッファーを含む第2の試薬、
の組合せを、パッケージされた状態で含んでなる、請求項1に記載の方法を実施するためのキット。
【請求項４】
既知量のミコフェノール酸を含むキャリブレーション試薬をさらに含んでなる、請求項3に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、一般的には生物学的サンプル中の治療薬物を測定する分野に関する。より詳細には、生物学的サンプル中のミコフェノール酸および他のIMPDHの阻害剤の酵素的測定方法に関する。
【０００２】
発明の背景
ミコフェノール酸の測定は臨床的に重要である。ミコフェノール酸は、移植された器官の拒絶を防ぐために使用する免疫抑制剤であり、ミコフェノール酸をモニターすることにより、治療効率が改善され、薬物の有害な副作用を最少にすることが示唆されている。
【０００３】
ミコフェノール酸は、いくつかのペニシリウム種の発酵によって産生される。ミコフェノール酸は幅広い活性スペクトル、特異的作用様式を有し、かつ副作用が最少なため大用量を許容し得るものである(Epinetteら、Journal of the American Academy of Dermatology 17(6):962-971(1987))。ミコフェノール酸は、抗腫瘍活性、抗ウイルス活性、抗乾癬(antipsoriatric)活性、免疫抑制活性、および抗炎症活性(Leeら、Pharmaceutical Research 7(2):161-166(1990))、並びに抗細菌活性および抗真菌活性(Nelson, P.H.ら、Journal of Medicinal Chemistry 33(2):833-838 (1990))を有することが示されている。MPAは、プリンヌクレオチドのde novo合成において鍵となる酵素であるイノシン-5’-モノリン酸デヒドロゲナーゼ(IMPDH)を阻害することにより作用する。Tリンパ球およびBリンパ球はこのde novo合成に大きく依存するので、ミコフェノール酸は免疫応答の重大な要素であるリンパ球の増殖を阻害できる。
【０００４】
イノシン-5’-モノリン酸デヒドロゲナーゼ(EC 1.1.1.205)は、イノシン-5’-モノリン酸(IMP)の、キサントシン-5’-モノリン酸(XMP)へのNAD依存性酸化を触媒する(Magasanik, B.ら、J. Biol. Chem. 226:339-350(1957)およびJacksonら、Nature 256:331-333(1975))。この酵素は、基質と補因子の結合、および産物の放出という規則的なBi-Bi反応シーケンスをたどる。最初に、IMPはIMPDHに結合する。引き続いて補因子NADの結合が起こる。続いて還元型補因子であるNADHが産物から放出され、産物であるXMPがこれに続く。この機構は、ランダムな順序で基質が付加するか、または基質に先立ってNADが結合することを要する既知の大多数のNAD依存性デヒドロゲナーゼの機構とは異なるものである。
【０００５】
I型およびII型と称されるヒトIMPDHの2種類のアイソフォームが同定され、配列決定されている(Collartら、J. Biol. Chem. 263:15769-15772 (1988)およびNatsumedaら、J. Biol. Chem. 265:5292-5295(1990))。各アイソフォームは514アミノ酸からなり、双方のアイソフォームは84％の配列同一性を有している。IMPDHのI型およびII型は、サブユニットの分子量が56kDaである活性4量体を溶液中で形成する(Yamadaら、Biochemistry 27:2737-2745(1988))。
【０００６】
ミコフェノール酸のモルフォリノエチルエステルである、モルフォリノエチルE-6-(1,3-ジヒドロ-4-ヒドロキシ-6-メトキシ-7-メチル-3-オキソ-5-イソベンゾフラニル)-4-メチル-4-ヘキセノエート(MPA-M)は、in vivoでミコフェノール酸へ加水分解される。ミコフェノレートモフェティル(mycophenolate mofetil;MMF)としても知られるこのエステル型のミコフェノール酸の投与は、ミコフェノール酸のバイオアベイラビリティーを大幅に改善する。MPA-Mはこれ以外にも、好ましい製薬上の特徴を多数有する。その特徴には、pH 2〜5での安定性および低pHでの良好な溶解性が含まれるが、これらは胃腸管上部での急速な溶解を示すものである(Leeら、前掲)。
【０００７】
シクロスポリンAと組合わせる治療法において使用された場合には、MPA-MおよびシクロスポリンAは、相乗的作用様式を有し得る。シクロスポリンAはT細胞に対して選択的効果を有するが、B細胞の抗体産生活性は抑制しない。一方、ミコフェノール酸は、T細胞とB細胞の双方に対して抗増殖効果を有する。シクロスポリンA/MPA-Mを組合わせた治療法は、生存期間を延長し、かつシクロスポリンAの用量を減少させてシクロスポリンAに関連する副作用(主に腎毒性)を低減し得る。
【０００８】
ミコフェノール酸は、グルクロン酸との抱合により代謝されミコフェノール酸グルクロニド(MPAG)を形成する。さらに2種類のMPA代謝産物である、MPAの7-O-グルコシド(M-1)、およびMPAのアシルグルクロニド(M-2)が、Schutz,E.ら、Clinical Chemistry 45(3):419-422 (1999)により公表されている。Schutzらは、MPA、MPAG、M-1およびM-2による組換えヒトIMPDH-IIの阻害を、代謝産物の精製調製物を使用して測定し、M-2が、MPAに関して得られた結果に類似した、IMPDH-IIの濃度依存性阻害を示すことを見出した。しかしながら、M-2の別の調製物では、IMPDH-II阻害能は一致しなかった。アシルグルクロニドは生理的pHにおいては分子内転移を受けることが知られているので、代謝物M-2はアイソマーの混合物である可能性が高い。また、アシルグルクロニドは、加水分解されてMPAに戻り得る。M-2アイソマーの混合物は全て同じように抗体と交差反応するが、IMPDHを必ずしも同じように阻害するものではないことに注意されたい。Schutzの発見を考慮すると、本発明の方法を使用したMPAの測定が、HPLCを介して得られる結果と良好に相関していることは驚くにあたらない(r=0.994)。
【０００９】
ミコフェノール酸は強力な生物学的活性物質であるので、そのバイオアベイラビリティーをモニターする際において、効果的なアッセイが有用となる。さらに、治療薬のレベル、即ち、適切な免疫抑制のために必要な最適薬物レベルをモニターするためにも、該アッセイは重要である。MPA-Mはミコフェノール酸へと加水分解されるので、ミコフェノール酸についてのアッセイにより、MPA-M用量のモニターが可能となろう。
【００１０】
ヒト血漿中のミコフェノール酸の濃度を測定するための、高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)の使用が、Jones, C.E.ら、Journal of Chromatography B 708:229-234 (1998)において記述されている。
【００１１】
Jonesら、J. Chem. Soc. (C) 1725-1737 (1970)には、選択された微生物とともにインキュベートされた場合にミコフェノール酸が経る多数の変化が開示されている。
【００１２】
Nelson, P.H.ら、米国特許第4,753,935号(1988)には、ミコフェノール酸のモルフォリノエチルエステル、その製薬上の使用、および投薬後の患者血漿中のミコフェノール酸濃度のHPLCによるモニタリングが記載されている。
【００１３】
ミコフェノール酸に対するモノクローナル抗体を使用するミコフェノール酸についてのイムノアッセイは、Alexander, S.ら、PCT国際公開第WO96/02004号(1996)に記載されている。
【００１４】
イムノアッセイに関する特異性の問題が、Tett, S.E.ら、Clinical Chemistry 44 (6):A96-A97(1998)において論じられている。この文献の著者らは、移植患者について、市販のEMIT(登録商標)イムノアッセイ(Behring Diagnostics)を使用して得た結果と、HPLC-UVから得た結果とを比較すると、中程度の濃度範囲において、該イムノアッセイでは最大95％過大評価されることを見出した。
【００１５】
IMPDHのミコフェノール酸による阻害は、Anderson, J.H.ら、Journal of Biological Chemistry 243(18):4762-4768(1968)によって記述されている。またIMPDHの阻害剤は、米国特許第5,380,879号、同第5,444,072号および同第5,807,876号、およびPCT国際公開第WO94/01105号および同第WO94/12184号にも記載されている。
【００１６】
Yatscoff, R.W.ら、Clinical Chemistry 44(2):428-432 (1998)は、患者自身のリンパ球中に存在するIMPDH活性の残存レベルを測定することによる、ヒト血漿中のミコフェノール酸の薬力学的モニタリングを報告している。この手法では、患者自身の薬物に対する生物学的応答を測定する。従ってこの手法は、患者の血漿における薬物を直接定量する方法を提供するものではない。
【００１７】
ヒトIMPDHの大腸菌(E.coli)におけるクローニングおよび発現が、Konno.Y.ら、J. Biol. Chem. 266(1):506-509(1991)において記述されている。また、Collart, F.R.ら、米国特許第5,665,583号(1997)にも、大腸菌におけるヒトIMPDHのクローニングおよび発現が記載されている。
【００１８】
発明の概要
本発明は、ミコフェノール酸(MPA)によるイノシン-5’-モノリン酸デヒドロゲナーゼ(IMPDH)酵素の非競合的阻害に基づくものである。IMPDHは、下記の反応を触媒する：
0003854864.tif 000002
【００１９】
NADH(還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド)の形成速度は、波長340nm(即ち、NADHの特徴的吸収領域)の吸収の変化をモニターし、続いて、この吸収における変化をMPA濃度に相関させることにより測定できる。
【００２０】
ミコフェノール酸はIMPDHの活性部位に結合するが、基質とは競合しない。ミコフェノール酸のアシルグルクロニド代謝物の1つは、ミコフェノール酸と同様にこの反応を阻害する。
【００２１】
本発明によるアッセイでは、血清または血漿サンプル中に存在するミコフェノール酸は上記の反応を阻害し、その程度を波長340nmで分光光学的にモニターし得る。このように、サンプル中のミコフェノール酸の濃度は、NADHの340nmでの吸収に反比例している。
【００２２】
同様に、本発明のアッセイは、Armisteadら、米国特許第5,807,876号(1998)に記載された治療用IMPDHの阻害剤などの、血清または血漿中の他のIMPDHの阻害剤のレベルを測定するためにも使用できる。
【００２３】
本発明の別の態様は、IMPDHおよびIMPを含む第1の試薬組成物、およびNADを含む第2の試薬組成物の、パッケージされた組合わせを含んでなる、ミコフェノール酸測定アッセイを行うためのキットに関する。あるいは、同じものを含むキットは他のIMPDHの阻害剤を測定するアッセイを行うためにも有用である。
【００２４】
使用するために好ましいIMPDH酵素は、ヒトTリンパ球に由来する組換えIMPDH-IIである。
【００２５】
詳細な説明
以下の定義および一般的パラメーターは、本明細書において本発明を記述するために使用した様々な用語の意味と範囲を説明および定義するために述べるものである。
【００２６】
アナライト(被測定物質)を含むと推測されるサンプル：  アナライト(即ちミコフェノール酸または他のIMPDHの阻害剤)を含むと合理的に推測される任意のサンプルを、本発明の方法により分析できる。サンプルは典型的には、宿主に由来する体液(尿、全血、血漿、血清、唾液、精液、糞、痰、大脳液、脊髄液、涙、粘液など)のような水性の溶液であるが、好ましくは血清か血漿である。所望の場合には、サンプルを前処理してもよく、また、アッセイを妨害しない任意の好都合な媒質中にサンプルを調製してもよい。水性媒質が好適である。
【００２７】
ミコフェノール酸の量の測定：  ミコフェノール酸の測定のための、定量的、半定量的、および定性的方法、ならびに他の全ての方法は、ミコフェノール酸の量の測定方法として考慮される。例えば、ミコフェノール酸を含むと推測されるサンプルにおけるミコフェノール酸の存在または不在を単に検出する方法も、本発明の範囲に含まれるものとする。用語「検出」および「測定」、ならびに測定に関する他の一般的類義語は、本発明の範囲内にあるものとする。
【００２８】
本発明によるMPAの測定は、単位時間あたりのNADHの吸収の変化を測定する速度アッセイ法により、または一定時間の経過後に反応を停止させる終点法により実施し得る。本方法は、実験室での分析または臨床上の分析のための自動化された分析装置へ容易に応用できる。NADHを測定するための他の方法（例えば、Babson, A.L.ら、Clinical Chemistry 19(7):766-769(1973)に記載のように、NADの還元を、テトラゾリウム塩である2-p-ニトロフェニル-5-フェニルテトラゾリウムクロリド(INT)の電子伝達媒体として機能するフェナジンメトサルフェートによる還元とカップリングさせる方法）もまた考慮する。
【００２９】
キャリブレーション物質とは、測定すべきアナライトを既知の量で含む標準または基準物質の任意のものを意味する。アナライトを含むと推測されるサンプルと、キャリブレーション物質を同じ条件下でアッセイする。続いてアナライトの濃度は、未知の試料について得られた結果を標準について得られた結果と比較することにより算出する。このことは一般に、図３にあるようなキャリブレーション曲線を作製することにより行う。
【００３０】
補助的物質：  本発明によるアッセイにおいては、多様な補助的物質が頻繁に用いられる。例えば、アッセイ媒質中には通常はバッファーが存在し、アッセイ媒質およびアッセイ組成物のための安定剤も存在するであろう。これらの添加物に加えて、付加的なタンパク質(アルブミンなど)、または界面活性剤(特に非イオン性界面活性剤)などがしばしば含まれ得る。
【００３１】
IMPDHとは、イノシン-5’-モノリン酸からのキサントシン-5’-モノリン酸の形成を触媒する酵素であるイノシン-5’-モノリン酸デヒドロゲナーゼ(EC.1.1.1.205)を意味する。本発明は、天然起源または組換え体起源に由来するIMPDHの使用も考慮し、アイソフォームまたはアイソフォーム混合物も使用し得る。
【００３２】
本明細書および特許請求の範囲の全体を通して、「ミコフェノール酸」と言及する場合には、ミコフェノール酸とともに、生物学的に活性であり治療に関しても活性であるミコフェノール酸の代謝産物および誘導体(生物学的な意味でミコフェノール酸のような(即ち、IMPDH阻害を介する)挙動を示すもの)も含む意味であることは理解されるであろう。
【００３３】
本発明の別の態様は、ミコフェノール酸の測定のための本発明のアッセイ法を簡便に行うために有用なキットに関する。本発明の用途を拡大するために、本発明の方法において有用な試薬を組合わせてパッケージし、同じかまたは別の容器中に、溶液としてまたは凍結乾燥状態で提供し、試薬の比率を本方法およびアッセイに関して実質的に最適なものとすることができる。試薬の安定性および交差反応性に応じて、試薬はそれぞれ別々の容器中にあってもよく、また種々の試薬を1以上の容器中で組合わせてもよい。
【００３４】
本発明のキットは、IMPDH酵素、IMP基質およびNAD基質の試薬を含んでなる。IMPDH、IMPおよびNADは一般に、好適なバッファーおよび補助的物質と組み合わされそしてパッケージされる。試薬は液体状態のままでもよく、凍結乾燥されていてもよい。キットにはさらに、他のパッケージされたキャリブレーション物質が含まれてもよい。好ましい実施形態においては、キットはIMPDH、IMP、NADおよびバッファーを含む。
【００３５】
下記の実施例においては、2種類の試薬を調製したが、そのうちの一方はIMPDHを含み、他方はNADを含んでいた。実施例においては、IMPは、基質が酵素に対して有する公知の安定化効果のために、IMPDH試薬と組合わせた。しかし、その代わりに、IMPをNAD試薬中に含ませてもよい。当業者であれば、他の組合せおよび変動(perturbation)も考えられるであろう。
【００３６】
以下の、限定するものではない実施例を参照することにより、本発明のさらに完全な理解が得られるであろう。
【００３７】
実施例
IMPDH試薬の調製
100mlの第1の試薬組成物を以下の通り調製した。約80mlの脱イオン水を容器中に分散させ、3.37gの3-[N-トリス-(ヒドロキシメチル)メチルアミノ]-2-ヒドロキシ-プロパンスルホネート-Na(TAPSO)を添加し、完全に溶解させた。続いて、4.91gの酢酸ナトリウムを容器に添加し溶解させ、0.037gのジチオスレイトール(DTT)、0.019gのイノシンモノリン酸(IMP)、0.134gのNa2EDTA、および0.10gのSUTTOCIDE A(GAF Chemicals Corp.)を添加した。0.1N塩酸(HCl)を使用してpHを8.0に調整した。容量を100mlまで脱イオン水で調節した。最後に、0.034ユニットの高度に精製された組換えヒトIMPDH-IIを添加し、完全に溶解させた。
【００３８】
IMPDH-IIをクローン化し精製するために使用した方法は、Carr,S.F.ら、J. Biological Chemistry 268(36):27286-27290(1993)において記載されており、その内容を参照により本明細書中に組み込むものとする。またIMPDHのクローン化は、Collart,F.R.ら、米国特許第5,665,583号(1997)にも記載されている。天然起源のIMPDHは市販されている。
【００３９】
試薬組成物の有効量は、具体的必要性に応じて変動し得るものであり、特定のアッセイ条件に合致するように、簡単な実験室レベルの実験で調整できる。
【００４０】
NAD試薬の調製
100mlの第2の試薬組成物を以下の通りに調製した。約80mlの脱イオン水を容器中に分散させ、1.82gのN-[2-アセタミド]-2-アミノエタンスルホン酸(ACES)を添加し、完全に溶解させた。2N水酸化ナトリウム(NaOH)を使用してpHを6.0に調製した。続いて0.166gのニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NAD)を添加し、0.095gのアジ化ナトリウム、0.1gのSUTTOCIDE Aを添加した。容量を脱イオン水で100mlに調整した。
【００４１】
ミコフェノール酸標準物質の調製
ミコフェノール酸標準物質を、市販の物質 (Sigma Chemical) から調製した。MPAは、薄層クロマトグラフィーおよびHPLCによると約98％の純度であり、MPAの正体はNMRによる構造と一致していた。MPA標準物質のセットを、数人の供与者からプールした正常ヒト血漿(カリウム/EDTA)を用いて調製した。MPAを計量し、血漿プール中に0.98μg/ml、4.9μg/ml、9.8μg/mlおよび14.7μg/mlを目標濃度として溶解させた。これらの標準物質を、以下のアッセイにおいて用いる機器をキャリブレーションするために使用した。
【００４２】
ミコフェノール酸のアッセイ
ミコフェノール酸の測定を、HITACHI 717分析器(Roche Diagnostics Corp.,インディアナポリス)を使用して行った。使用した第1の波長は340nm、第2の波長は700nmであった。37℃のウオーターバス中でインキュベートしたキュベットに3μlのサンプルを分配するように、分析器をプログラムした。続いて250μlのIMPDH-II試薬組成物をサンプルに添加し、混合し、5分間インキュベートした。その時間の後、50μlのNAD試薬組成物を添加し混合した。340nmでの吸収の変化を、第2の試薬組成物の最初の添加から、第2の試薬組成物の添加に続く5分間まで計算した。340nmの吸収速度の減少は、サンプル中のミコフェノール酸濃度に反比例する。MPAの濃度は、既知の量のMPAを含む標準物質によるNADHの生成速度と、未知のサンプルによるNADHの生成速度を比較することにより、該装置により算出した。
【００４３】
HPLCとの比較
55人のヒト移植患者のグループからの血漿サンプルを、本発明の方法(方法Y)を用いてミコフェノール酸についてアッセイした。続いてここで得られた結果を、参照方法(方法X)としてのHPLCを使用してミコフェノール酸について患者サンプルをアッセイした場合に得られた結果と比較した。使用した血漿サンプルは、EDTA抗凝固剤を使用して得た。方法Yについて使用した手順は上記の通りである。使用したHPLC法は当業者に知られた通りである(代表的な方法については、Jones,C.E.ら、Journal of Chromatography B 708:229-234(1998)を参照されたい)。2種類の方法により得られた結果を以下に列挙する。また、2種類の方法により得られた値の比較プロットを図２に示す。最小二乗線形回帰分析により、0.994の相関係数とY=0.957X+0.515の等式が得られた。
【００４４】
0003854864.tif 000003
【００４５】
本発明を、その特定の実施形態を参照して記述してきたが、当業者には、本発明の精神と範囲を逸脱することなく、様々な変化を成し得、そして同等物を代用し得ることが理解されるであろう。例えば、アッセイ感度を高めることが望まれる場合には、イムノアッセイ分野の当業者は、酵素サイクリングを用いて第１の酵素反応を増幅し、第1の反応で生成されたNADHを第2の反応の基質として用いることができる。
【００４６】
さらに、これ以外にも、特定の状況、物質、組成物の事情、工程または工程ステップを、本発明の目的、精神および範囲に適応するように改変しうる。これらの改変は全て、本願に添付した特許請求の範囲内にあることが意図されている。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、MPAおよびMPAのグルクロニド代謝産物の構造を示す。
【図２】  図２は、MMFについての代謝的分解経路を図示する。図２(a)はMMFの、MPA、MPAGおよびM1への分解を示し、図２(b)はMMFの、MPA、M1およびM2代謝産物への分解を示す。
【図３】  図３は、ミコフェノール酸の濃度を340nmでの吸収の変化に対してプロットしたものである。
【図４】  図４は、参照方法としてのHPLCに対して本発明の方法を比較した、血漿サンプルにおいて得られた値の比較プロットである。
【図１】
0003854864.tif 000004
【図２】
0003854864.tif 000005
0003854864.tif 000006
【図３】
0003854864.tif 000007
【図４】
0003854864.tif 000008