(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルス粒子の集団中の感染性ウイルス粒子の数を決定するための方法であって：
ｉ）細胞集団中の細胞を、約100：１未満〜約0.1：１の総粒子数対細胞数比で感染させて、感染細胞を生成する工程；
ii）該感染細胞中のウイルスにより発現されるポリペプチドを、蛍光タグで標識された抗体と反応させる工程であって、該抗体は該ウイルスによって発現されるポリペプチドに対する特異性を有する、工程；および
iii）工程（ii）の産物における免疫蛍光をフローサイトメトリーにより測定して、該感染細胞の数を決定し、それにより感染性ウイルス粒子の数を決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
前記ウイルスがアデノウイルスである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ウイルスポリペプチドがヘキソンである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞が感染後に培養されて、前記ウイルスポリペプチドの発現を可能にする、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ウイルスが組換えウイルスである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ウイルスポリペプチドが外因性遺伝子によってコードされる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記外因性遺伝子がレポーター遺伝子である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記外因性遺伝子がp53である、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記外因性遺伝子が網膜芽腫である、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記抗体が抗体の混合物である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記抗体がポリクローナルである、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記抗体がモノクローナルである、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記組換えウイルスが複製欠陥性である、請求項５に記載の方法。
【請求項１４】
前記比率が約10：１未満〜約0.1：１である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記比率が約５：１未満〜約0.1：１である、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記比率が約0.1：１である、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
治療的目的のためのウイルスベクターによる遺伝子の送達における特別の挑戦は、臨床的投薬形態の調製および正確な特徴付けである。総粒子測定は、ウイルス調製物の電子顕微鏡検査またはドデシル硫酸ナトリウム（SDS）処理ウイルス懸濁物の260nmでの光学密度による総DNAの測定のような技術によってなされ得る。しかし、ウイルス調製物の感染性、すなわちウイルスの調製物中の感染性ウイルス粒子の数を正確に測定することは、さらに挑戦である。
従来、感染性粒子は、培養物において、プラーク形成単位アッセイ（pfu）によって測定され、これは、ウイルスプラークの数を、希釈の関数として記録する。pfuアッセイに対する代替物は、組織培養感染性用量手順（TCID50）であり、これは、感染性を、直接免疫蛍光による抗原に対する細胞内染色の関数として推定する。これらの方法は、高度のアッセイ間変動を含む制限を被り、そしてウイルス複製の状態、ベクターの特性、およびウイルス−細胞相互作用のような要因によって影響される。
より最近では、フローサイトメトリーまたはFACS（蛍光活性化セルソーター）アッセイが、比較的高い感染多重度で感染される細胞培養物中の感染細胞の数を測定するために使用されている。例えば、
0003851662.tif 000002
（J. Viol. Methods 44:99-108（1993））は、組換えウイルスの感染の間に発現される細胞内βガラクトシダーゼの、蛍光原性基質との反応、それに続くフローサイトメトリーにおける陽性細胞の検出による、組換え仮性狂犬病ウイルス変異体により感染された細胞の同定および定量を開示する。Morrisら（Virology 197(1):339-48（1993））は、細胞を免疫染色して、レポーターCAT遺伝子産物を検出することにより、培養細胞中の生産的または非生産的組換えAcMNPV感染のプロセスを研究した。
本発明は、集団中の感染性ウイルス粒子を定量する、より正確な方法に対する必要に取り組む。
発明の要旨
本発明の方法は、低いウイルス対細胞比で感染された細胞のフローサイトメトリー分析が、従来の力価測定方法よりも正確な感染性ウイルス力価の測定を生じるという、予想外のそして驚くべき結果に基づく。
本発明の１つの局面は、ウイルス粒子の集団中の感染性ウイルス粒子の数を決定するための方法である。この方法は以下の工程を包含する：
ｉ）細胞集団中の細胞を、約100：１未満〜約0.1：１の総粒子対細胞比で感染させて、感染細胞を生成する工程；
ii）感染細胞中のウイルスにより発現されるポリペプチドを、蛍光タグで標識された抗体と反応させる工程であって、この抗体はウイルスによって発現されるポリペプチドに対する特異性を有する、工程；および
iii）工程（ii）の産物における免疫蛍光をフローサイトメトリーにより測定して、感染細胞の数を決定し、それにより感染性ウイルス粒子の数を決定する工程。
ウイルスが組換えウイルスである場合、ウイルスポリペプチドは、レポーター遺伝子のような外因性遺伝子によりコードされ得る。本発明のいくつかの実施態様において、外因性遺伝子は、p53または網膜芽腫（RB）のような腫瘍抑制遺伝子である。組換えウイルスは、複製可能、または複製欠陥、欠損、もしくは不能であり得る。
本発明のいくつかの実施態様において、ウイルスはアデノウイルスである。従って、感染細胞が感染後に培養されて、ウイルスポリペプチドの発現を可能にする場合、ウイルスポリペプチドは、ヘキソンのようなアデノウイルスポリペプチドであり得る。
代表的には、ウイルスポリペプチドは、少なくとも１つの抗体と反応されるが、抗体は、抗体の混合物であり得る。抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルであり得る。
本発明の好ましい実施態様において、総粒子対細胞比は、約100：１未満、代表的には約10：１未満、好ましくは約５：１未満、より好ましくは１：１未満である。いくつかの実施態様において、この比率は約0.1：１ほど低くあり得る。
詳細な説明
本発明は、ウイルス粒子の集団中の感染性ウイルス粒子を定量するための方法を提供する。本明細書中で用いられる用語「感染性」は、ウイルスが細胞に入り、そして少なくとも１つの、ウイルスによりコードされるポリペプチドの合成を指向する能力をいうことが意図される。ウイルス核酸を再生する能力は、この定義によって、必要とはされないが、含まれる。
代表的には、調製物中の全てのウイルス粒子が感染性ではない。例えば、粒子は、ウイルスの調製において損傷され得、それにより総粒子数には影響を及ぼさないが、感染可能な粒子の数を減少させる。さらに、空のキャプシドまたはウイルスの不安定性もまた、細胞外で、感染性の減少に寄与し得る。ウイルス調製物における非感染性粒子対感染性粒子の範囲は、１：１〜100：１より上の範囲であり得る。しかし、非感染性ウイルスでさえ、曝露される細胞に対して細胞学的変化または損傷を引き起こし得る。従って、細胞が曝露される非感染性ウイルス粒子の数を最小にするように、集団中の感染性粒子の数の正確な測定を有することは有利である。
DNAウイルス、RNAウイルス、複製可能ウイルス、複製不能ウイルス、組換えウイルス、トランスジーンを有するウイルスなどを含む、本質的に任意のウイルスが、本発明の方法により定量または力価測定され得る。好ましくは、ウイルスは、培養物中の細胞に感染し得る。この技術を受け得るウイルスのいくつかの例は、以下を含むが、それらに限定されない：アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、単純ヘルペスウイルス、パルボウイルス、エプスタイン−バーウイルス、鼻気管炎ウイルス、パラインフルエンザウイルス、ウシ下痢ウイルス、シンドビスウイルス、バキュロウイルス、仮性狂犬病ウイルス、水痘−帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス、HIV、Ａ、Ｂ、およびＣ型肝炎ウイルス、ならびにワクシニア。
本発明のいくつかの実施態様において、感染性は、ウイルスによって発現されるポリペプチドに対する抗体により測定される。ポリペプチドは、構造ウイルスポリペプチド、調節ポリペプチド、ポリメラーゼのようなポリペプチドなどであり得る。本発明のいくつかの実施態様において、ポリペプチドは、好ましくは、ウイルス中に組み込まれる外因性遺伝子（例えば、レポーター遺伝子）によって発現される。レポーター遺伝子のいくつかの例は、βガラクトシダーゼおよびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）を含む。本発明のさらなる実施態様において、レポーター遺伝子は、レポーター遺伝子の作用（例えば、酵素の基質に対する作用）の産物に対する抗体によって検出される。本発明のその他の実施態様において、外因性遺伝子は、治療的使用のために意図されるトランスジーンである。いくつかの例は、以下を含むが、それらに限定されない：腫瘍抑制遺伝子（p53または網膜芽腫（RB）を含む）；インターロイキン（IL-2、IL-4、およびIL-10を含む）；インターフェロン（α-、β-、およびγ-インターフェロンを含む）；その他のサイトカイン；チミジンキナーゼ；増殖因子（GCSFおよび成長ホルモンを含む）；第VIII因子；アデノシンデアミナーゼなど。代表的には、トランスジーンによってコードされるポリペプチドの産生は、ポリペプチドに対する抗体によって測定される。
検出のために使用される抗体は、ポリクローナル、モノクローナルであり得るか、またはそのような抗体の混合物を含み得る。代表的には、検出は、ウイルスポリペプチドに対するフルオレセイン結合抗体を使用することによって、直接的に行われる。しかし、間接的アッセイもまた可能であり、ここで、ウイルスポリペプチドに対する抗体は、次いで、フルオレセイン標識抗体と反応される。フローサイトメトリーと適合性の任意の蛍光標識が、使用され得る。
本発明のアッセイを実施するために、代表的には、ウイルス調節物中のウイルス粒子の総数が、まず、任意の多数の従来の技術によって測定される。例えば、ウイルス調製物のアリコートが、0.1％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）を含有する緩衝液中で調製され得、その後、吸光度が260nmにおいて測定される（Maizelら、Virology 36:115-125（1968））。総粒子計数はまた、ウイルス調製物のサンプルを電子顕微鏡検査のために調製し、そして単純に粒子の数を計数することによって得られ得る。粒子計数のためのさらなる技術は、アニオン交換クロマトグラフィーの使用を含み得る（Huygheら、Human Gene Therapy 6:1403-1416（1995））。
次いで、細胞は、ウイルス調製物の希釈物で、約100：１以下、代表的には約10：１未満、好ましくは約５：１未満、より好ましくは１：１未満の総粒子数対細胞数比で感染される。いくつかの実施態様において、この比率は約0.1：１ほど低い。代表的には、少なくとも１つの感染が実施されるが、いくつかの実施態様において、少なくとも２つの平行した感染が、異なる粒子対細胞比で実施される。使用される細胞は、代表的には、ウイルスによる感染に対して感受性であることが知られている。細胞が、ウイルスによる複製を支持することは必要とはされないが、感染は、検出されるべきウイルスポリペプチドの発現を可能にする条件下で実施される。
培養物中の細胞に感染させるために使用されるウイルス調製物の総容量は、代表的には、感染されるべき細胞の総数、ウイルス調製物の粒子濃度、および感染が実施される容器の容量のような要因を考慮することによって、当業者により決定される。好ましくは、感染混合物において細胞に感染させるために使用されるウイルスの粒子濃度は、１mlあたり少なくとも約105粒子、より好ましくは１mlあたり少なくとも約106粒子、最も好ましくは１mlあたり約107粒子である。ウイルス調製物は、代表的には、ウイルスの安定性に好ましい条件下で調製される。感染、および必要に応じて感染後の培養のための条件は、特定のウイルス、および検出のために使用されるウイルス遺伝子またはレポーター遺伝子に依存する。本明細書中で用いられる用語「培養」は、目的の期間の継続した生存を可能にするために、最小の要求が細胞に提供される、任意の形態の細胞培養をいう。従って、例えば、培養は、数分もしくは数時間の期間の、リン酸緩衝化生理食塩水もしくは不完全増殖培地のような適切な緩衝液中の、細胞懸濁物の調製をいい得るか、または適切な完全増殖培地の存在下での、数分から数時間から数週間の、培養ディッシュに接着する細胞をいい得る。代表的には、所望されるウイルスポリペプチドの発現のために十分な培養時間が提供されるが、好ましくは、細胞のさらなる感染を生じる、感染ウイルスの増殖のために十分ではない時間が提供される。従って、「１回」のみの感染が、これらの細胞において生じることが好ましい。いくつかの実施態様において、「培養物中」に置かれる時間の長さは、１時間未満〜数時間である。その他の好ましい実施態様において、時間の長さは、１〜５日間である。
代表的には、細胞は、ウイルスの細胞への吸着に好ましい条件下で感染されるが、より最適でない条件が、いくつかの実施態様において使用され得る。代表的には、ウイルスは、細胞に、１〜12時間吸着させられる。いくつかの実施態様において、細胞は、感染の速度または感染細胞の数を増強するために、濃縮されたウイルスを含む濃縮された懸濁物中で感染され、次いで、細胞またはウイルスの増殖のためにより好ましい濃度に希釈される。本発明のいくつかの実施態様において、未吸着ウイルス、もしくは感染のために使用される培地の成分を除去するために、感染細胞培養物を洗浄するか、または感染細胞を、それらの生存により好ましい培地もしくは増殖条件に曝露することが所望され得る。
ウイルスポリペプチドの発現を可能にするために十分な時間が経過した後、細胞は、代表的には、単一細胞の懸濁物として調製される。細胞が、組織培養物中の接着細胞として感染される場合、培養物は、代表的には、基材から細胞を剥離させるために、トリプシンのような解離剤で処理される。掻き取り（scraping）のような機械的手段もまた、細胞を剥離させるために使用され得る。次いで、細胞は、遠心分離により採集され、そして検出試薬との反応のために、不完全または完全増殖培地のような緩衝液中で調製される。代表的には、細胞は、任意の多数の標準的技術によって、免疫染色のために「固定」される。一般的に使用される固定技術の総説は、BauerおよびJacobberger, Methods in Cell Biology 41:351-376（1994）（本明細書に参考としてその全体が全ての目的のために援用される）によって提供される。ポリペプチドがその活性によって検出される場合、活性の検出を可能にするために、蛍光試薬（例えば、酵素のためのフルオレセイン標識基質）が細胞中に導入され得る。
感染細胞集団は、次いで、標準的なフローサイトメトリーによる（例えば、Shapiro、Practical Flow Cytometry，第３版，John Wiley and Sons（1994）（本明細書に参考としてその全体が全ての目的のために援用される）によって開示される方法による）分析に供される。用語「FACS」は、時々フローサイトメトリーをいうために使用されるが、細胞選択（cell sorting）は、本発明を実施するためには必要とはされない。代表的には、少なくとも約10,000事象が分析において獲得される。死滅細胞は、代表的には、前方／側方散乱ゲート（forward/side scatter gating）、またはPI標識およびPIネガティブ画分に対する電子ウインドウの設定のいずれかによって、分析から排除される。種々の市販ソフトウエアパッケージ（例えば、CellQuestTM）が、データの調製および分析を補助するために利用可能である。
以下の実施例は、本発明を例示することが意図されるが、いかにしても本発明を限定することは意図されない。
実施例
この実施例において、組換え複製欠陥アデノウイルスであるACNRBを、TCID50により、そして本発明の低粒子数対細胞数比（低比率）法により力価測定した。使用した例示的なウイルスは、本質的に、ベクターに挿入された完全長網膜芽腫cDNAを有する、Willsら（Cancer Gene Therapy 2:191-197（1995））により開示されるアデノウイルスベクター骨格を含んだ。
総粒子数を、上記の「SDS/OD260」法およびアニオン交換クロマトグラフィー法により得た。両方のアッセイにおいて、測定された総粒子濃度は、1.0×1012/mlであった。
感染性粒子を、Huygheら（Human Gene Therapy 6:1403-1416（1995））によって記載されるTCID50アッセイにより力価測定した。簡潔に記載すると、293細胞を96ウェルマイクロタイタープレート中にプレーティングした：完全MEM（10％仔ウシ血清；１％グルタミン）培地（GIBCO BRL）中、各々のウェルについて５×105細胞/mlを100μl。別のプレートにおいて、１：106に希釈したウイルスサンプルの250μlアリコートを、第１の行に添加し、そしてプレートを横切って２倍段階希釈した。７つの列を、サンプルのために使用した。１つの列を、ネガティブコントロールのために使用した。各々のウェルの100μlアリコートを、293細胞を播種したプレート中のその同一の位置に移し、そして37℃で、加湿した空気／７％CO2インキュベーター中で、２日間インキュベートさせた。次いで、培地を反転により流し出し、そして細胞を50％アセトン／50％メタノールで固定した。PBSで洗浄した後、固定された細胞を、キットの説明書に従って調製したFITC標識抗Ad5抗体（Chemicon International #5016）とともに45分間インキュベートした。PBSで洗浄した後、プレートを蛍光顕微鏡下で検査し（490mm励起、520mm発光）、そして標識の存在について記録した。力価を、Titerprint Analysisプログラム（Lynn, Biotechniques 12:880-881（1992））を使用して決定した。
低比率アッセイを以下のように実施した。１ウェルあたり１×106の293細胞（ヒト胚腎臓細胞、ATCC CRL 1573）を、４つの６ウェルディッシュに播種した。１ウェルあたりの最終容量は１mlであった。約２時間後、各々のウェル中の、５％規定鉄補充仔ウシ血清、２mM L-グルタミン、および１mMピルビン酸ナトリウムを補充した、4500mg/ml D-グルコースを含有する培地（ダルベッコの改変イーグル培地（DME高グルコース））を吸引し、そして希釈したウイルスを含有する培地（無血清）1.1mlで置換した。吸着を60分間生じさせ、その後さらに２mlのウイルス非含有培地を各々のウェルに添加した。約42時間後、感染細胞培養物を、フローサイトメトリー分析のために処理した。
細胞を、トリプシン−EDTA溶液（GIBCO-BRL）を用いてプラスティック基材から剥離させた。剥離した細胞を各々のウェルから採集し、そして約200×ｇで、10分間、室温で遠心分離した。上清を取り出し、そして細胞を、カルシウム塩もマグネシウム塩も含まないダルベッコのリン酸緩衝化生理食塩水（D-PBS）中で洗浄した。次いで、ペレット化された細胞を２mlの冷アセトン：メタノール（１：１）固定液中に再懸濁し、次いで氷上で15分間維持した。カルシウム塩もマグネシウム塩も含まないD-PBS７mlを各々のチューブに添加し、その後細胞を１％（v/v）仔ウシ血清を含むD-PBS中に再懸濁した。これら最後の２つの工程を繰り返した後、細胞を、１％仔ウシ血清を含むD-PBS 50μl中に再懸濁した。2.0ml D-PBS中の、FITCと結合された抗アデノウイルス抗体（Chemicon #5016）70μlを、各々のチューブに添加した。サンプルを37℃で約50分間インキュベートした。次いで、サンプルを、フローサイトメトリー分析チューブに移し、0.5ml D-PBSで少し希釈し、そしてフローサイトメトリーにより分析した。FACStation（MAC QUADRA 650コンピューター、モニター、およびプリンター）を伴うBecton-Dickinson FACScanTM Flow Cytometer System, PN 34011570, 12-00189-01を、CellQuestTMソフトウエアとともに使用した。
結果を表１に示す。従来のTCID50アッセイによると、総粒子数対感染単位比は、63：１であった。表において明らかなように、総粒子数対細胞数比が減少するに従って、算出される総粒子数：感染単位比もまた12：１ほど低くまで減少し、それにより、従来のアッセイより約５倍高い感染力価についての値を提供した。従って、この低比率アッセイは、力価測定のための従来の方法よりも、ウイルス調製物中の感染性粒子の数の、予想外に良い（すなわち、ずっと正確な）計数を提供する。本発明によって判明したこのような正確な測定の結果は、治療的使用のための組換えウイルスの有効用量の算出において、特に重要である。
本明細書中で引用される全ての参考文献は、参考としてその全体が全ての目的のために明示して援用される。
0003851662.tif 000003