(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記のアミノ酸配列（配列番号：１）：
【化１】
0003740499.tif 000009
からなる抗菌性ペプチド。
【請求項２】
下記のアミノ酸配列（配列番号２）：
【化２】
0003740499.tif 000010
からなる、請求項１の抗菌性ペプチドの前駆ペプチド。
【請求項３】
請求項１のペプチドをコードすることを特徴とするDNA。
【請求項４】
請求項２のペプチドをコードすることを特徴とするDNA。
【請求項５】
下記のヌクレオチド配列（配列番号３）：
【化３】
0003740499.tif 000011
からなる請求項４のDNA。
【請求項６】
請求項１の抗菌性ペプチドを産生するラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus  lactis）61-14菌株（FERM BP-08492）。
【請求項７】
請求項１の抗菌性ペプチドを有効成分として含有する食品保存剤。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、食品の保存等の目的に利用することのできる抗菌性物質の技術分野に属し、特に、新規な乳酸菌株と該菌株によって産生される新規な抗菌性ペプチドに関する。
背景技術
乳酸菌が産生する抗菌物質としては、乳酸などの有機酸、過酸化水素、ジアセチル等の低分子がすでに知られている。その他、ペプチドから成る抗菌性物質の存在も知られており、例えば、ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）が産生するナイシンA（J.Am.Chem.Soc.1971 Sep 8;93(18):4634-5）、ナイシンZ（Eur.J.Biochem.1991 Nov 1;201(3):581-4）などが挙げられる。しかし、ナイシン類はナイシンＡ，Zのみが自然界に存在するという報告しかなされていない。
乳酸菌が生産する抗菌性物質を食品の変敗や腐敗の防止に用いることは、品質劣化させることなく食品を保存して安全な食品を提供する観点から重要な技術である。このような抗菌性物質は耐性菌との戦いであると言える。すなわち、多様化する食品の種類に応じて出現する広範な菌種に対して、その増殖を有効に抑制することのできる新規な抗菌性物質の開発が絶えず求められている。
本発明の目的は、従来より知られた抗菌剤とは抗菌性スペクトル（増殖抑制対象の複数の菌種への抗菌力の違い）が異なる、食品の保存等に有用な新たな抗菌性物質を提供することにある。
発明の開示
本発明者は、乳酸菌が産生する抗菌性物質に着目し研究を重ねた結果、バチルス（Bacillus）属、ミクロコッカス（Micrococcus）属、リステリア（Listeria）属、ペディオコッカス（Pediococcus）属、エンテロコッカス（Enterococcus）属、ラクトコッカス（Lactococcus）属、ラクトバチルス（Lactobacillus）属、ロイコノストック（Leuconostoc）属に属する、食品劣化の原因微生物に対して抗菌性を有する（すなわち、感受性グラム陽性細菌に対する阻害活性を有する）物質を産生する新規な乳酸菌株ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）を見出し、該抗菌性物質（ペプチド）の精製・同定、その一次構造の解明、および高次構造の推定を行い、本発明を導き出した。
かくして、本発明は、下記のアミノ酸配列（配列番号１）から成る一次構造を有する抗菌性ペプチドを提供するものである：
0003740499.tif 000002
さらに、本発明に従えば、上記の抗菌性ペプチドの前駆ペプチドであって、下記のアミノ酸配列（配列番号２）から成るペプチドが提供される：
0003740499.tif 000003
また、本発明に従えば、上述の各ペプチドをコードするDNAが提供される。特に、上述した前駆ペプチドをコードするDNAの好ましい例は、下記のヌクレオチド配列（配列番号４）から成るものである：
0003740499.tif 000004
さらに、本発明に従えば、上記の抗菌性ペプチドを産生するラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）新規菌株、すなわち、61−14菌株（FERM BP-08492）が提供される。
本発明は、さらに、上記の抗菌性ペプチドを有効成分として含有する食品保存剤を提供する。
【図面の簡単な説明】
第１図は、本発明の抗菌性ペプチド（ナイシンＱ）の一次アミノ酸配列を、従来より既知のナイシンＺの一次アミノ酸配列と対比して示す。
第２図は、本発明の抗菌性ペプチド（ナイシンＱ）が食品保存剤として利用し得ることを調べるために行なった実験結果の１例を示す。
発明を実施するための最良の形態
本発明によって得られる抗菌性物質は、河川水から新たに単離されたラクトコッカス・ラクティス菌株によって産生される新規なペプチド（バクテリオシン）であり、従来より知られたナイシンＡやナイシンＺとは異なるアミノ酸配列から構成される新しいタイプのナイシン類と考えられる。
以下、新規菌株の単離やその特性分析、該菌株からの抗菌性ペプチドの産生や該ペプチドをコードするDNA配列の測定、および食品に対する保存性試験などに沿って本発明の実施の形態を詳細に説明する。
（１）乳酸菌の単離方法
乳酸菌の天然野生株を調べるために、様々な河川水を分離源として、GYP白亜寒天培地にて混釈平板培養を行った。次に、抗菌活性を指標としたスクリーニングを行なった。すなわち、MRS培地にコロニーを増殖させたのち、上層にバチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）IAM12118で覆い、上層に増殖が抑制された阻止帯が観察された菌株を単離した。
（２）単離菌株の性質分析
スクリーニングした結果、優れた抗菌性を有する菌株を発見した。この菌株は、福岡県田川市の彦山川流域、東大橋にて回収した河川水から分離されたものである。グラム染色、カタラーゼテスト、運動性試験、細胞の形態観察、糖類発酵性試験、生産乳酸量、生産乳酸旋光性、グルコースからのガス発生テストについて調査した。菌株の特性は、通性嫌気性、グラム陽性、カタラーゼ陰性、運動性なし、細胞の形態は楕円、Ｌ乳酸生産菌、ホモ型発酵菌であった。また、D-キシロース資化性、ラクトース資化性、スクロース資化性があった。これらを含む59種類の糖資化性テスト（APIシステム）の結果、ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）であると同定し61−14菌株と命名した。この61−14菌株は特許生物寄託センターに寄託しており、受託番号はFERM BP-08492（FERM P-18994：原寄託日2002年9月4日）である。
（３）抗菌性試験
61−14菌株により抗菌性物質が液体培地中に産生されているか検討するため、MRS液体培地にて１６時間培養後、遠心分離を行い、上清を回収し、pHを６に調整したのち、濾過滅菌した。２倍段階希釈を行い、試験に用いた。指標菌を植菌した寒天培地上に段階希釈液を10μl置いた。抗菌活性は明瞭な阻止円が観察された倍率をＸとすると、Ｘ×1000/10（A.U./ml）とした。試験結果をナイシンＺによる場合と比較して表１に示す。表１に示されるように、61−14菌株によって産生される抗菌性物質の抗菌活性のパターンはナイシンＺのものと明らかに異なっている。なお、本発明に従い、61−14菌株（FERM BP-08492）によって産生される抗菌性物質（抗菌性ペプチド）をここではナイシンＱと称する。
0003740499.tif 000005
（４）抗菌性物質の産生および精製方法
分離株61−14菌株を前培養し、前培養液8mlを1LのMRS（オキソイド）液体培地に植菌し、３０℃で１８時間培養後、遠心分離を行い、上清を回収した。培養上清は1Ｌ回収でき、活性は1.28×104（A.U./ml）であった。上清に2-プロパノールで十分浸漬させたアンバーライトXAD-16（シグマ）を20g加え、3時間振盪させ上清を吸着させた。
これをカラム（200ml容量）に充填し、H2O 100ml、40%エタノール100ml、70% 2-プロパノール100ml（TFA 0.1%）、100% 2-プロパノール50mlで溶出した。最も活性が強く検出された画分は70% 2-プロパノール100ml（TFA 0.1%）であり、溶出画分の活性は1.64×106（A.U./ml）であった。この画分をスピードバックエバポレーターで濃縮し、20mMリン酸ナトリウムバッファーで最終全量を50mlとした。SP−セファロースカチオン交換クロマト樹脂（ファルマシア）をカラム(16ml容量)に充填し、濃縮サンプル50mlを添加し20mMリン酸ナトリウムバッファーで平衡化した。0.25、0.5、0.75、0.1M NaCl含有リン酸ナトリウムバッファーを用い、流速100ml/時間で溶出した。
それぞれの溶出画分の抗菌活性を測定し、最も活性の強かった0.25M NaCl溶出画分の活性は2.62×105(A.U./ml)であった。溶出全量50ml中10mlを逆相HPLC（カラム:ファルマシアPep RPC HR 5/5）に供した。移動相には、アセトニトリルを用い濃度勾配（直線的グラジェント0〜100%）で、1ml/分の流速、１画分当たり１mlで３０分画した。検出器にはUV（UV 220,280nm）を使用した。30の分画サンプルの抗菌活性を測定し抗菌活性の強かった溶出時間１２分〜１３分の画分を濃縮し、再度同じ条件で逆相HPLCに供した。単一のピークおよび強い抗菌活性を持つ溶出時間９〜１１分の画分を取得した。なお、抗菌活性の指標菌は、Bacillus coagulans JCM2257Tを用いた。
（５）Ｎ末端アミノ酸配列決定
上記のようにして得られた抗菌性物質について、エドマン分解法を利用したアミノ酸シーケンサー（SHIMADZU PSQ-1U protein sequener）を用い、Ｎ末端分析を行った。結果として、ペプチド配列のＮ末端はIleと同定されたが、次のアミノ酸は同定出来なかった。Ｎ末端から２番目のアミノ酸は一次構造ではThrであるが、特殊アミノ酸に修飾されていることが示された。
（６）DNA配列決定
分離株FERM BP-08492(Lactococcus lactis)からMagExtractor-Genome-(TOYOBO)を用い全ゲノムDNAを抽出した。濃度は60.5ng/μlであった。次に、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）反応を行なったが、このとき用いたＰＣＲプライマーはナイシンＡおよびナイシンＺ前駆体構造遺伝子周辺のヌクレオチド配列に基づき設計したものであり、以下のデオキシオリゴヌクレオチド配列から成るものである。cgt tcg aag aaa cta caa aat aaa tt（配列番号５）およびcca tgt ctg aac taa caa aat act at（配列番号６）。Premix TaqＤＮＡポリメラーゼ（Ex-Taq TAKARA）を使用し、ＰＣＲを行った。94℃30秒、51℃30秒、72℃60秒で30サイクル伸張反応を行った。
その後、pUC18由来Tベクターを用いTAクローニングを行った。PCR増幅断片とTベクターのライゲーションにはDNA Ligation Kit Ver.2(TAKARA)を使用した。このライゲーション産物を用いて、エレクトロポレーション法によりE.coli JM109を形質転換した。形質転換体をLB培地で8時間培養後MagExtractor-Plasmid-(TOYOBO)を用いプラスミドを抽出した。このプラスミドをシークエンス反応の鋳型とした。シークエンス反応にはThrmo Sequense fluorescent labelled primer cycle sequencing kit（ファルマシア）を使用した。シークエンス反応は95℃  5分インキュベートした後、95℃30秒、55℃30秒、72℃1分で15サイクル行った後、95℃30秒、72℃1分を15サイクル行った。
結果として、配列番号4の塩基配列（ヌクレオチド配列）が得られた。ナイシンZ前駆ペプチドをコードする遺伝子と比較すると、18番塩基のTがCに、24番塩基のGがAに、42番塩基のGがAに、45番塩基のGがAに、47番塩基のAがC、54番塩基のAがTに、57番塩基のTがCに、60番塩基のAがTに、64番塩基のCがAに、69番塩基のCがTに、75番塩基のAがCに、78番塩基のTがCに、87番塩基のAがTに、96番塩基のCがAに、111番塩基のAがTに、113番塩基のCがTに、123番塩基のTがAに、130番塩基のAがCに、156番塩基のTがCに、157番塩基のAがGに異なっていた。
ナイシンＺと対比してペプチド配列に影響が出る塩基の違いは、47番塩基の違いでアミノ酸残基-8番目のLysがThr、64番塩基の違いでアミノ酸残基-2番目のProがThr、113番塩基の違いで、アミノ酸残基15番目のAlaがVal、130番塩基の違いが、アミノ酸残基21番目のMetがLeu、157番塩基の違いでアミノ酸残基30番目のIleがValとなっている（図１参照）。図１において、ナイシンＱとして示しているが、本発明によりFERM P-18994から産生される抗菌性ペプチドの前駆ペプチドのアミノ酸配列（配列番号２）であり、そのうち、Ｉ（イソロイシン：Ile）から始まるＣ末端側の34個のアミノ酸残基から成る部分が、抗菌性ペプチドとして最終的に機能するペプチドの一次構造のアミノ酸配列（配列番号１）であり、Ｎ末端の囲みをつけた部分がリーダーペプチドのアミノ酸配列と成る。このように本発明の抗菌性ペプチド（ナイシンＱ）は、既知のナイシンＺとは全く異なる物質である。
なお、ナイシンＱ（ナイシンＱ前駆ペプチド）をコードするのは配列番号４のDNA配列に限定されず、コドンの縮重を考慮して、配列番号２のアミノ酸配列から成るナイシンＱをコードできるDNA配列をすべて含むものである。
（７）MALDI-TOF MS分析による高次構造の推定
ナイシンＺと比較して、ナイシンＱのDNA配列が類似していること、Ｎ末端付近が特殊構造であることから、ナイシンＱは、ナイシンＺの高次構造と類似している可能性が示唆される。そこで、ナイシンＱの高次構造を次のように推定した。すなわち、下記のアミノ酸配列：
0003740499.tif 000006
から成る一次構造を有し、位置２のトレオニンが修飾され2,3-ジデヒドロブチリンとなり、位置5,33のセリンが修飾されそれぞれ2,3-ジデヒドロアラニンとなり、位置３のセリンが修飾されアラニンになり、位置8,13,23,25のトレオニンが修飾されそれぞれ2-アミノ酪酸(Abu)となり、それと同時に、位置３と位置７はAla-S-Cysのチオエーテル結合で結合してランチオニンを形成し、位置８と位置11はAbu-S-Cysのチオエーテル結合して3-メチルランチオニンを形成し、位置13と位置19はAbu-S-Cysのチオエーテル結合して3-メチルランチオニンを形成し、位置23と位置26はAbu-S-Cysのチオエーテル結合して3-メチルランチオニンを形成し、位置25と位置28はAbu-S-Cysのチオエーテル結合して3-メチルランチオニンを形成している（配列番号３）。
上記のように推定した配列番号３のアミノ酸配列から分子量の理論値を計算したところ、値は3327.43であった。そこで、正確な分子量を測定することができるMALDI-TOF MS(PE Biosystems Voyager System 4025)を使用し、分子量を測定した。測定したサンプルにはプロトンを付加して測定するため、実際の分子量より、1Da増加した測定値となる。測定した結果、ナイシンＱに含まれるメチオニンが酸化された物質に対応する3345.890Daのピークと、ナイシンＱの分子量測定値に対応すると考えられる3328.50Daのピークとから成る２つのピークが観察された。この分子量測定値は、理論値3327.43Da+1Da=3328.43Daと0.1％以内であり、理論値とほぼ一致した。この結果よりナイシンＱは推定した構造であることが示唆された。
（８）食品保存剤としての適用性試験
本発明の抗菌性ペプチド（ナイシンＱ）の食品保存剤としての適用性を調べるために、食品中のｐＨ範囲として想定できるｐＨ４〜７でレトルト殺菌処理（110℃、10分）を行った場合の抗菌活性を確認した。
＜ナイシンＱ粗精製＞
ラクトコッカス・ラクティス61−14株（FERM BP-08492）をMRS(Difco)培地10mlにて30℃24時間培養をした。培養菌液をMRS培地（２％炭酸カルシウム含有）100mlに接種し、30℃24時間培養をした。この培養菌液をＭＲＳ培地（２％炭酸カルシウム含有）１Ｌに接種し、１６時間培養後、遠心分離を行い、上清を回収した。上清にアンバーライトXAD-16（シグマ）（２−プロパノールにて十分膨潤したものを蒸留水で洗浄した）を20g加え、１６時間浸せきし、吸着させた。これをカラムに充填し、蒸留水で700ml、40%エタノールで500ml洗い、100% ２−プロパノールで溶出した。溶出した画分をロータリーエバポレーターにて乾固させた。乾固物をBritton-Robinson広域buffer(pH3.94)50mlに１６時間４℃にて溶解した。これを原液とした。
＜抗菌性試験方法＞
指標菌としてLactobacillus sakei subsp.sakei JCM1157Tを用いた。指標菌がサンプル添加後、４×105個/mlの終濃度になるようにＭＲＳ培地に播き、96wellプレート(nunc製)において30℃、24時間静置培養を行った後、630nmの吸光度を測定した。指標菌の増殖が観察されると、吸光度が増加した。
ナイシンＱ粗精製溶液を各ｐＨに調整後、110℃、10分でオートクレーブを行った。各ｐＨサンプルを２倍段階希釈を行い、それぞれの希釈段階で抗菌性試験を行った。
＜結果＞
試験結果を第２図に示す。各ｐＨにおいて、レトルト殺菌条件と同様の条件で検討したところ、希釈を行っても、増殖抑制効果があることから、レトルト程度の加熱処理が想定される食品素材、また非加熱の食品素材においても利用可能であることを確認された。
（９）食品保存性試験
米飯に対する本発明の抗菌性ペプチド（ナイシンＱ）の効果について検討を行った。MRS培地（DIFCO社製）を121℃15分殺菌後、61-14株（FERM BP-08492）を接種し37℃15時間培養後、菌体を除去し凍結乾燥したものを用意した。また、比較として安価で広く利用されている市販日保ち向上剤、食酢製剤及び乳酸を用いた。
米を水洗・吸水後、米由来Bacillus subtilis胞子を100個/g接種し表２の要領でナイシンＱ、食酢製剤、乳酸を添加し炊飯を行った。炊飯後冷却し滅菌カップにいれ、30℃48時間保存試験を行った。各サンプルについて、標準寒天培地（栄研化学株式会社製）を使用し、一般生菌数を測定した。その結果を表３に示す。
0003740499.tif 000007
0003740499.tif 000008
ナイシンＱを添加することにより、良好な日保ち向上効果が得られた。また、官能検査の結果ナイシンＱを添加区は乳酸や食酢添加区と比較して風味、味ともに良好であった。これより、ナイシンＱは食品の品質に影響することなく日保ち向上効果を付与できる事が明らかとなった。
産業上の利用可能性
本発明により、食品の保存剤等として有用な新規抗菌性物質が提供される。
【図１】
0003740499.tif 000012
【図２】
0003740499.tif 000013
【配列表】
0003740499000001.xml