(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリグルタミン酸に結合したパクリタキセルからなる結合体を含む薬学的組成物。
【請求項２】
前記ポリグルタミン酸が、ポリ（ｄ−グルタミン酸）、ポリ（ｌ−グルタミン酸）、およびポリ（ｄｌ−グルタミン酸）からなる群から選択される、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項３】
前記結合体が３５％のパクリタキセルを含む、請求項１または２に記載の薬学的組成物。
【請求項４】
前記ポリマーが、５，０００〜１００，０００の分子量を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項５】
前記ポリマーが、２０，０００〜８０，０００の分子量を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項６】
前記ポリマーが、３０，０００〜６０，０００の分子量を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項７】
前記水溶性ポリマーが、パクリタキセルの２’−および／または７−ヒドロキシルに結合体化されている、請求項１〜６のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項８】
前記薬学的組成物が、薬学的に許容できるキャリア溶液中に分散されている、請求項１〜７のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項９】
前記薬学的組成物が注射に適している、請求項１〜７のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項１０】
前記薬学的組成物が凍結乾燥されている、請求項１〜７のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項１１】
前記薬学的組成物が癌の処置のためのものである、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項１２】
前記癌が、乳癌、卵巣癌、悪性黒色腫、肺癌、胃癌、結腸癌、頭頚部癌または白血病である、請求項１１に記載の薬学的組成物。
【請求項１３】
パクリタキセルとポリグルタミン酸との結合体であって、該パクリタキセルが該ポリグルタミン酸に、該パクリタキセルの１つ以上の遊離ヒドロキシル基において結合している、結合体。
【請求項１４】
前記ポリマーが、ポリ（ｄ−グルタミン酸）、ポリ（ｌ−グルタミン酸）、およびポリ（ｄｌ−グルタミン酸）からなる群から選択される、請求項１３に記載の結合体。
【請求項１５】
前記パクリタキセルが前記ポリマーに、該パクリタキセルの２’−および／または７−ヒドロキシルに結合体化されている、請求項１３または１４に記載の結合体。
【請求項１６】
前記ポリマーが、５，０００〜１００，０００の分子量を有する、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の結合体。
【請求項１７】
前記ポリマーが、２０，０００〜８０，０００の分子量を有する、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の結合体。
【請求項１８】
前記ポリマーが、３０，０００〜６０，０００の分子量を有する、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の結合体。
【請求項１９】
請求項１３〜１８のいずれか１項に記載の結合体を製造するための方法であって、前記ポリマーを、パクリタキセルと反応させて、エステル結合を形成する、方法。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は一般に、癌、自己免疫疾患および再狭窄の処置に使用する薬剤組成物の分野に関する。本発明はまた、抗癌薬、たとえばパクリタキセル（paclitaxel）（タキソール（Taxol））およびドセタキセル（docetaxel）（タキソテレ（taxotere））の製剤の分野、特にパクリタキセルを水溶性部分に結合させることにより、この薬物を水溶性にすることに関する。
発明の背景
太平洋岸産イチイ（タキサス・ブレビフォリア、Taxus brevifolia）の針葉および樹皮から抽出した微小管形成抑制剤（anti-microtubule agent）であるパクリタキセルは、ヒトの癌に顕著な抗腫瘍効果をもつことがＩ相実験ならびに初期IIおよびIII相試験で示された（Horwitz et al.,1993）。これは主に、進行した卵巣癌および胸部癌において報告された。小細胞性肺癌（small-cell lung cancer）および非小細胞性肺癌、頭頚部癌、ならびに転移性黒色腫において、有意の活性が述べられている。しかし、臨床試験用パクリタキセルを開発する際の主な難点は、それが水に不溶性である点であった。
ドセタキセルは、１０−デアセチルバッカチンIII、すなわちタキサス・バッカタ（Taxus baccata）の針葉から抽出し、化学合成した側鎖でエステル化した非細胞毒性前駆物質から、半合成により製造される（Cortes and Pazdur,1995）。胸部癌、肺癌、卵巣癌、ならびに結腸直腸癌および黒色腫を含めた種々の癌細胞系が、ドセタキセルに反応性であることが示された。臨床試験において、ドセタキセルを用いて胸部癌、卵巣癌、頭頚部癌、および悪性黒色腫において完全または部分的な反応が達成された。
パクリタキセルは一般に、クレモフォア（Cremophor）ＥＬ（ポリオキシエチル化ヒマシ油）および脱水アルコール（５０％  ｖ／ｖ）１ｍｌ当たり６ｍｇのパクリタキセルを含有する濃縮液として配合され、投与前にさらに希釈されなければならない（Goldspiel,1994）。要求量のパクリタキセルを送達するのに必要なクレモフォアＥＬの量は、クレモフォア中に配合される他のいかなる薬物の場合より著しく高い。血管拡張、呼吸困難および血圧低下を含めた幾つかの毒性が、クレモフォアに起因するとされている。このビヒクルは、実験動物およびヒトに重篤な過敏症を起すことも示された（Weiss et al.,1990）。事実、静脈内ボーラス注射によりマウスに投与できるパクリタキセルの最大量は、クレモフォアビヒクルの急性致死毒性により決定される（Eiseman et al.,1994）。さらに、界面活性剤であるクレモフォアＥＬは、ポリ塩化ビニル製のバッグや静脈投与管からフタル酸ジ（２−エチルヘキシル）（ＤＥＨＰ）などのフタレート系可塑剤を滲出させることが知られている。ＤＥＨＰは動物に肝毒性を生じ、げっ歯類において発癌性であることが知られている。このパクリタキセル製剤は、経時的に粒状物を生成することも示されており、したがって投与中にろ過する必要がある（Goldspiel,1994）。したがって患者への安全な薬物送達を保証するためには、パクリタキセル溶液の調製および投与に特別な設備が必要であり、これらの設備は必然的に経費を増大させる。
水溶性パクリタキセルを得るためのこれまでの試みには、２′−ヒドロキシル基または７−ヒドロキシルの位置にスクシネートおよびアミノ酸などの可溶化部分を装入することによりパクリタキセルのプロドラッグを調製することが含まれる（Deutsch et al.,1989;Mathew et al.,1992）。しかしこれらのプロドラッグは、開発に十分なほど化学的に安定ではないことが分かった。たとえばDeutschら（1989）はパクリタキセルの２′−スクシネート誘導体を報告しているが、ナトリウム塩の水溶解度はわずか約０．１％であり、トリエタノールアミン塩およびＮ−メチルグルカミン塩は約１％が溶解しうるにすぎなかった。さらに、アミノ酸エステルは不安定であると報告された。同様な結果をMathewら（1992）が報告した。Greenwaltらは、水溶性の高いタキソール２′および７−ポリエチレングリコールエステルの合成を報告している。（Greenwalt et al.,1994）が、これらの化合物のインビボ抗腫瘍活性に関するデータは全く報告されていない（Greenwalt et al.,1995）。
これらの問題を解決するための他の試みは、パクリタキセルをリポソームおよびナノスフェアの両方にマイクロカプセル封入することを伴うものであった（Bartoni and Boitard,1990）。リポソーム配合物は遊離パクリタキセルと同程度に有効であると報告されたが、２％未満のパクリタキセルを含有するリポソーム配合物のみが物理的に安定であった（Sharma and Staubinger,1994）。残念ながら、ナノスフェア配合物は毒性を示すことが分かった。したがって、有効量のパクリタキセルおよびドセタキセルを、薬物の不溶性に伴う欠点なしに送達しうる水溶性パクリタキセル配合物が、依然として求められている。
パクリタキセルの広範な使用に対する他の障害は、パクリタキセルを生産する供給源が限られており、その結果パクリタキセル療法が高価になることである。たとえば１コースの処置に数千ドルかかる可能性がある。さらに、必ずしもすべての腫瘍がパクリタキセル療法に反応するわけではないという欠点があり、これはパクリタキセルが腫瘍内へ進入しないためであると思われる。したがって、腫瘍、自己免疫疾患、たとえば慢性関節リウマチの処置のための、ならびに血管形成術およびステント挿入（stenting）などの外傷を受ける血管の再狭窄防止のための、血清中半減期の長い水溶性パクリタキセルおよび関連薬物の有効な配合物が早急に求められている。
発明の概要
本発明は、水溶性ポリマー、たとえばポリグルタミン酸もしくはポリアスパラギン酸に、または水溶性の金属キレート剤に結合した、化学療法薬および抗血管形成薬(antiangiogenic drug）、たとえばパクリタキセルまたはドセタキセルを含む組成物の提供により、従来の技術がもつこれらの欠点や他の欠点を克服することを目的とする。これらの組成物は、例示した腫瘍モデルに対し抗腫瘍剤として予想外に有効であることが本明細書において示され、タキサン（taxane）類またはタキソイド(taxoid）類が有効であることが知られているいかなる疾患や状態に対しても、パクリタキセルまたはドセタキセルと少なくとも同程度に有効であると期待される。本発明の組成物は、水溶性タキソイド類を提供してこれらの薬物自体の水不溶性に伴う欠点を克服し、かつ制御放出という利点を備え、このため動物モデルにおいて１回の静脈内投与後に腫瘍が根絶されることが本明細書において示される。
本明細書に記載した方法は、他の療法薬、造影剤および薬物の水溶性ポリマー結合体の製造にも利用できる。これには、エトプシド（etopside）、テニポシド（teniposide）、フルダラビン（fludarabine）、ドキソルビシン、ダウノマイシン、エモジン、５−フルオロウラシル、ＦＵＤＲ、エストラジオール、カンプトテシン（camptothecin）、レチノイン酸、ベラパミル（verapamil）、エポチロン（epothilone）類およびサイクロスポリンが含まれる。特に、遊離ヒドロキシル基をもつ薬剤を、パクリタキセルに関して本明細書に記載したものと同様な化学反応でポリマーに結合させることができるであろう。このような結合は化学技術の当業者が容易になしうるものであり、本発明の範囲に含まれる。それらの薬剤にはエトプシド、テニポシド、カンプトテシンおよびエポチロン類が含まれるが、これらに限定されない。本明細書において用いる、水溶性ポリマーへの結合とは、ポリマーまたはキレート剤への薬物の共有結合を意味する。
また本発明の水溶性結合体は、他の抗腫瘍薬または抗癌薬を含めた他の薬物と組み合わせて投与しうると解釈される。そのような組み合わせは当技術分野で知られている。本発明の水溶性パクリタキセルまたはドセタキセルは、特定の種類の処置においては白金系薬物、抗生物質、たとえばドキソルビシンもしくはダウノルビシン、またはタキソールと併用される他の薬物と組み合わせることができる。
ポリマーへの化学療法薬の結合は、全身毒性を低下させ、治療指数を改善するための魅力的方法である。３０ｋＤａより大きな分子量をもつポリマーは、正常な毛細血管および糸球体内皮を通して容易に拡散することはなく、したがって正常な組織を、薬物が仲介する無関係な毒性から免れさせる（Maeda and Matsumura,1989;Reynolds,1995）。他方、悪性腫瘍がしばしば毛細血管内皮障害を伴い、正常組織の血管より高い透過性を示すことは、十分に確認されている（Maeda and Matsumura,1989;Fidler et al.,1987）。したがって、正常な状態では血管内に留まるポリマー−薬物結合体が血管から腫瘍中へ選択的に漏出し、その結果、有効な療法薬を腫瘍に蓄積させることができる。さらに、ポリマー−薬物結合体は持続放出のための薬物溜めとして作用し、腫瘍細胞を長期間薬物暴露させることができる。最後に、水溶性ポリマーは、他の場合には不溶性である成分を可溶化するほか、薬物を安定化するためにも利用できる。現在、多様な合成ポリマーおよび天然ポリマーにつき、それらが腫瘍特異性薬物送達を高める効力が試験されている（Kopecek,1990;Maeda and Matsumura,1989）。しかし、日本のＳＭＡＮＣＳおよび英国のＨＰＭＡ−Ｄｏｘを含めた数種類につき現在臨床評価が行われているにすぎない（Maeda,1991;Kopecek and Kopeckova,1993）。
本明細書においてタキソイドは、パクリタキセルおよびドセタキセル、ならびにタキセン骨格をもつ他の化学物質を含めた化合物を意味すると解釈され（Cortes and Pazdur,1995）、イチイの木などの天然源もしくは細胞培養物から単離でき、または化学合成した分子であってもよい。好ましいものは一般式Ｃ47Ｈ51ＮＯ14の化合物であり、これには［２ａＲ−［２ａα，４β，４αβ，６β，９α(αＲ*，βＳ*)，１１α，１２α，１２ａα，１２ｂα］］−β−（ベンゾイルアミノ）−α−ヒドロキシベンゼンプロパン酸６，１２ｂ−ビス（アセチルオキシ）−１２−（ベンゾイルオキシ）−２ａ，３，４，４ａ，５，６，９，１０，１１，１２，１２ａ，１２ｂ−ドデカヒドロ−４，１１−ジヒドロキシ−４ａ，８，１３，１３−テトラメチル−５−オキソ−７，１１−メタノ−１Ｈ−シクロデカ［３，４］ベンズ［１，２−ｂ］オキシエト−９−イルエステルが含まれる。パクリタキセルおよびドセタキセルはそれぞれ特定のタイプの腫瘍に対し他の薬剤より有効であり、また本発明の実施に際しては、特定のタキソイドに対しより感受性である腫瘍がこの水溶性タキソイド結合体で処置されると解釈される。
パクリタキセルを水溶性の金属キレート剤に結合させる態様においては、組成物はキレートした金属イオンをさらに含むであろう。本発明のキレートした金属イオンは、アルミニウム、ホウ素、カルシウム、クロム、コバルト、銅、ジスプロシウム、エルビウム、ユーロピウム、ガドリニウム、ガリウム、ゲルマニウム、ホルミウム、インジウム、イリジウム、鉄、マグネシウム、マンガン、ニッケル、白金、レニウム、ルビジウム、ルテニウム、サマリウム、ナトリウム、テクネチウム、タリウム、スズ、イットリウムまたは亜鉛のうちいずれかのイオン形であってもよい。特定の好ましい態様においては、キレートした金属イオンは上記に挙げた金属のうちいずれかの放射性核種、すなわち放射性同位体であろう。好ましい放射性核種には67Ｇａ、68Ｇａ、111Ｉｎ、99mＴｃ、99Ｙ、114mＩｎ、および193mＰｔが含まれるが、これらに限定されない。
本発明を実施する際に用いられる好ましい水溶性キレート剤には以下のものが含まれるが、これらに限定されない：ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ′，Ｎ″，Ｎ′″−テトラアセテート（ＤＯＴＡ）、テトラアザシクロテトラデカン−Ｎ，Ｎ′，Ｎ″，Ｎ′″−四酢酸（ＴＥＴＡ）、ヒドロキシエチリデンジホスホネート（ＨＥＤＰ）、ジメルカプトコハク酸（ＤＭＳＡ）、ジエチレントリアミンテトラメチレンホスホン酸（ＤＴＴＰ）、および１−（ｐ−アミノベンジル）−ＤＴＰＡ、１，６−ジアミノヘキサン−Ｎ，Ｎ′，Ｎ″，Ｎ′″−四酢酸、ＤＰＤＰ、およびエチレンビス（オキシエチレンニトリロ）−四酢酸。ＤＴＰＡが最も好ましい。本発明の好ましい態様は、111Ｉｎ−ＤＴＰＡ−パクリタキセルを含む組成物でもありうる。
本発明の特定の態様においては、パクリタキセルまたはドセタキセルを水溶性ポリマーに結合させ、好ましくはポリマーはパクリタキセルまたはドセタキセルの２′もしくは７−ヒドロキシルまたは両方に結合する。したがって前記のように、薬物とパクリタキセルのＣ２′−ヒドロキシルとの結合のために官能基を用いる場合、有効薬物がポリマー性キャリヤーから確実に放出されるように、分解性結合（この場合はエステル）を用いる。好ましいポリマーには以下のものが含まれるが、これらに限定されない：ポリエチレングリコール、ポリ（ｌ−グルタミン酸）、ポリ（ｄ−グルタミン酸）、ポリ（ｄｌ−グルタミン酸）、ポリ（ｌ−アスパラギン酸）、ポリ（ｄ−アスパラギン酸）、ポリ（ｄｌ−アスパラギン酸）、ポリエチレングリコール、上記に挙げたポリアミノ酸とポリエチレングリコールのコポリマー、ポリカプロラクトン、ポリグリコール酸およびポリ酢酸、ならびにポリアクリル酸、ポリ（２−ヒドロキシエチル−１−グルタミン）、カルボキシメチルデキストラン、ヒアルロン酸、ヒト血清アルブミン、およびアルギン酸。ポリエチレングリコール、ポリアスパラギン酸類およびポリグルタミン酸類が特に好ましい。本発明のポリグルタミン酸類またはポリアスパラギン酸類は、好ましくは約５，０００〜約１００，０００の分子量をもち、約２０，０００〜約８０，０００、さらに約３０，０００〜約６０，０００がより好ましい。
本発明の組成物を下記の薬剤学的に許容できるキャリヤー溶液に分散させてもよいと解釈される。そのような溶液は滅菌され、または無菌であり、水、緩衝剤、等張化剤、そのほか、対象動物またはヒトに投与した際にアレルギー反応その他の有害な反応を起さない。当業者に既知の成分を含むことができる。したがって本発明は、高分子量水溶性ポリマーまたはキレート剤に結合したパクリタキセルまたはドセタキセルなどの化学療法薬または抗癌薬を含む薬剤組成物であると記載することもできる。この薬剤組成物は、ポリエチレングリコール、ポリグルタミン酸類、ポリアスパラギン酸類、またはキレート剤、好ましくはＤＴＰＡを含有することができる。抗腫瘍薬または薬物として放射性核種を使用でき、また本発明の薬剤組成物は療法に有効な量のキレートした放射性同位体を含有してもよいと解釈される。
特定の態様においては、本発明は腫瘍組織によるパクリタキセルまたはドセタキセルなどの化学療法薬の取込みを測定する方法であると記載することができる。この方法は、キレートした金属イオンを含む、薬物と金属キレート剤の結合体を調製し、腫瘍組織をこの組成物と接触させ、腫瘍組織中のキレートした金属イオン存在を測定することを含みうる。腫瘍組織中にキレートした金属イオンが存在することは、その腫瘍組織が取り込んだことを示す。キレートした金属イオンは放射性核種であってもよく、検出がシンチグラフによるものであってもよい。腫瘍組織は対象動物またはヒトの体内にあってもよく、その場合組成物はその対象に投与される。
本発明は、特定の態様においては対象における癌を処置する方法であると記載することもできる。この方法は、水溶性ポリマーまたはキレート剤に結合させ、かつ薬剤学的に許容できる溶液に分散したパクリタキセルまたはドセタキセルなどの化学療法薬を含む組成物を調製し、この溶液を腫瘍の処置に有効な量で対象に投与することを含む。好ましい組成物は、ポリグルタミン酸類またはポリアスパラギン酸類、より好ましくはポリ（ｌ−グルタミン酸）またはポリ（ｌ−アスパラギン酸）に結合したパクリタキセルまたはドセタキセルを含む。本発明の組成物は、結合していないタキソイドが有効であることが示されているいかなるタイプの癌に対しても有効であると解釈される。これには胸部癌、卵巣癌、悪性黒色腫、肺癌、胃癌、結腸癌、頭頚部癌または白血病が含まれるが、これらに限定されない。
腫瘍の処置方法には、療法に有効な量の薬物またはプロドラッグを投与する前に、腫瘍へのパクリタキセルまたはドセタキセルの取込みをある程度推測することが含まれてもよい。この方法には、パクリタキセル−キレート剤−キレートした金属を対象に投与し、腫瘍中に検出する、前記の造影法がいずれも含まれる。この工程は、薬物が腫瘍に進入しない場合はその腫瘍はＤＴＰＡ−パクリタキセル療法に反応すると期待されないであろうということを判定する、経費的に有効な方法を提供する。造影法を利用してパクリタキセルに対する反応を推測し、反応しないと思われる患者を確認することができれば、その患者にとって多大な出費と重大な時間を節約できると考えられる。妥当な量の化学療法薬が腫瘍中に蓄積しなければ、その薬剤に対する腫瘍の反応は比較的小さいと予想される。
特定の態様において本発明は、対象の身体画像を得る方法であると記載できる。身体画像は、パクリタキセル−キレート剤結合体にキレートした有効量の放射性金属イオンを対象に投与し、放射性金属のシンチグラフ信号を測定して画像を得ることにより得られる。
特定の広義の態様において本発明は、全身性自己免疫疾患の少なくとも１つの症状を軽減する方法であって、全身性自己免疫疾患を伴う対象に、ポリ−ｌ−グルタミン酸またはポリ−ｌ−アスパラギン酸に結合したパクリタキセルまたはドセタキセルを含む有効量の組成物を投与することを含む方法であると記載することもできる。本発明の開示に関して特に重要なものは、標準的クレモフォア配合物（米国特許第5,583,153号）で投与したときタキソールに反応することが若干の症例で知られている、慢性関節リウマチの処置である。腫瘍の処置と同様に、本発明の水溶性タキソイドの有効性は水溶性部分への結合によって低下することはなく、この水溶性プロドラッグは有効薬物を一定期間にわたって放出する制御放出配合物として作用しうると考えられる。したがって本発明の組成物は、たとえば慢性関節リウマチに対しタキソールと同程度に有効であると期待され、ただし制御放出という利点をもたらすであろう。また本発明のタキソイド組成物は、他の薬物、たとえば血管形成阻害薬（ＡＧＭ−１４７０）（Oliver et al.,1994）またはメトトレキセートと併用できると解釈される。
パクリタキセルがバルーン血管形成術後の再狭窄をも阻止するという知見は、本発明の水溶性パクリタキセルおよびドセタキセルが直接的な非経口投与より多様な用途をもつことを示す（国際特許出願公開第WO 9625176号）。たとえば、水溶性パクリタキセルは、植え込み型医療器具、たとえばチューブ、シャント、カテーテル、人工インプラント、ピン、電気的インプラント（たとえばペースメーカー）、特に動脈または静脈ステント（バルーン膨張式ステントを含む）のコーティングとして有用であろう。これらの態様においては、水溶性パクリタキセルを植え込み型医療器具に結合させてもよく、あるいは水溶性パクリタキセルを植え込み型器具の表面に受動的に付着させてもよい。たとえば、ステントをポリマー−薬物溶液に浸漬するか、またはステントにそのような溶液を吹き付けることにより、ステントをポリマー−薬物結合体でコーティングできる。植え込み型器具に適した材料は、生体適合性かつ無毒性でなければならず、ニッケル−チタン合金、鋼などの金属、または生体適合性ポリマー、ヒドロゲル、ポリウレタン、ポリエチレン、エチレン−酢酸ビニルコポリマーなどから選択できる。好ましい態様においては、水溶性パクリタキセル、特にＰＧ−パクリタキセル結合体をバルーン血管形成術後の動脈または静脈に挿入するためのステントにコーティングする。したがって本発明は特定の広義の態様においては、血管外傷を受けた後の動脈再狭窄または動脈閉塞を阻止する方法であって、その必要がある対象に、ポリ−ｌ−グルタミン酸またはポリ−ｌ−アスパラギン酸に結合したパクリタキセルまたはドセタキセルを含む組成物を投与することを含む方法であると記載することができる。本方法の実施に際し、対象はたとえば冠動脈バイパス形成術、血管外科処置、臓器移植、または冠動脈もしくは動脈形成術を受けた患者であり、前記組成物を直接に静脈内投与するか、またはステントにコーティングし、このステントを血管外傷部位に植え込むことができる。
したがって本発明の１態様は、平滑筋細胞の増殖を阻害するのに有効な量の、ポリグルタミン酸類またはポリアスパラギン酸類に結合したパクリタキセルまたはドセタキセルを含む組成物で器具をコーティングした、植え込み型医療器具である。好ましい器具は前記の本発明組成物でコーティングしたステントであり、特に好ましい態様においてステントはバルーン血管形成術後に使用するのに適したものであり、コーティングは再狭窄を阻止するのに有効である。
特定の好ましい態様において本発明は、パクリタキセルの２′もしくは７−ヒドロキシルまたは両方に結合したポリグルタミン酸類を含む組成物、あるいはパクリタキセルの２′もしくは７−ヒドロキシルまたは両方に結合したポリアスパラギン酸類を含む組成物であると記載することができる。本明細書において用いる“ポリグルタミン酸”または“ポリグルタミン酸類”という用語には、ポリ（ｌ−グルタミン酸）、ポリ（ｄ−グルタミン酸）およびポリ（ｄｌ−グルタミン酸）が含まれ、“ポリアスパラギン酸”または“ポリアスパラギン酸類”という用語には、ポリ（ｌ−アスパラギン酸）、ポリ（ｄ−アスパラギン酸）およびポリ（ｄｌ−アスパラギン酸）が含まれる。
別途定義しない限り、本明細書中で用いる技術用語および科学用語はすべて、本発明の属する技術分野の当業者が一般に理解しているものと同じ意味をもつ。本発明の実施または試験に際し本明細書に記載したものと類似または均等であるいかなる方法および材料をも使用できるが、好ましい方法および材料を以下に記載する。
【図面の簡単な説明】
図１Ａ．パクリタキセル、ＰＥＧ−パクリタキセルおよびＤＴＰＡ−パクリタキセルの化学構造。
図１Ｂ．ＰＧ−パクリタキセルの化学構造とその製造のための反応式。
図２．パクリタキセル、ＰＥＧ−パクリタキセルおよびＤＴＰＡ−パクリタキセルがＢ１６黒色腫細胞の増殖に及ぼす影響。
図３．ＤＴＰＡ−パクリタキセルがＭＣａ−４乳房腫瘍に及ぼす抗腫瘍効果。
図４．パクリタキセル、ＤＴＰＡ−パクリタキセルおよびＰＥＧ−パクリタキセルで処置した後に腫瘍直径１２ｍｍに達する中央時間（日）。
図５．111Ｉｎ−ＤＴＰＡ−パクリタキセルおよび111Ｉｎ−ＤＴＰＡを静脈注射した後のＭＣａ−４腫瘍保有マウスのガンマ−シンチグラフ。矢印は腫瘍を示す。
図６．ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中、３７℃で測定したＰＧ−パクリタキセルの加水分解。−□−は可溶性ＰＧに結合して残存するパクリタキセルの％を表し、−△−は放出されたパクリタキセルの％を表し、−○−は生成した代謝産物−１の％を表す。
図７Ａ．ＰＧ−パクリタキセルがネズミ胸部腫瘍（１３７６２Ｆ）を保有するラットに及ぼす抗腫瘍効果。−□−はＰＧ（０．３ｇ／ｋｇ）１回静脈投与に対する反応を表し、−△−はパクリタキセル（４０ｍｇ／ｋｇ）に対する反応を表し、−○−はＰＧ−パクリタキセル（パクリタキセル６０ｍｇ相当／ｋｇ）に対する反応を表す。
図７Ｂ．ＰＧ−パクリタキセルおよびパクリタキセルがＯＣａ−１腫瘍を保有するマウスに及ぼす抗腫瘍効果。−□−はＰＧ（０．８ｇ／ｋｇ）１回静脈投与に対する反応を表し、−△−はパクリタキセル（８０ｍｇ／ｋｇ）に対する反応を表し、−●−はＰＧ−パクリタキセル（パクリタキセル８０ｍｇ相当／ｋｇ）に対する反応を表し、−○−はＰＧ−パクリタキセル（パクリタキセル１６０ｍｇ相当／ｋｇ）に対する反応を表す。
図７Ｃ．ＰＧ−パクリタキセルがＭＣａ−４乳癌腫を保有するマウスに及ぼす抗腫瘍効果。−□−は食塩液１回静脈投与に対する反応を表し、−△−はＰＧ（０．６ｍｇ／ｋｇ）１回静脈投与に対する反応を表し、−◆−はＰＧ−パクリタキセル（４０ｍｇ／ｋｇ）に対する反応を表し、−◇−はＰＧ−パクリタキセル（パクリタキセル６０ｍｇ相当／ｋｇ）に対する反応を表し、−○−はＰＧ−パクリタキセル（１２０ｍｇ／ｋｇ）に対する反応を表す。
図７Ｄ．ＰＧ−パクリタキセルがマウスの軟組織肉腫（ＦＳａ−ＩＩ）に及ぼす抗腫瘍効果。−□−は食塩液１回静脈投与に対する反応を表し、−◇−はＰＧ（０．８ｍｇ／ｋｇ）１回静脈投与に対する反応を表し、−○−はパクリタキセル（８０ｍｇ／ｋｇ）に対する反応を表し、−△−はＰＧ−パクリタキセル（パクリタキセル１６０ｍｇ相当／ｋｇ）に対する反応を表す。
図７Ｅ．ＰＧ−パクリタキセルがマウスの同系肝癌腫（ＨＣａ−１）に及ぼす抗腫瘍効果。−□−は食塩液１回静脈投与に対する反応を表し、--△--はＰＧ（０．８ｍｇ／ｋｇ）１回静脈投与に対する反応を表し、−○−はＰＧ−パクリタキセル（８０ｍｇ／ｋｇ）に対する反応を表し、・・△・・はＰＧ−パクリタキセル（パクリタキセル１６０ｍｇ相当／ｋｇ）に対する反応を表す。
図８．リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中におけるＰＥＧ−パクリタキセルからのパクリタキセルの放出プロフィル。パクリタキセル，−Ｘ−；ＰＥＧ−パクリタキセル，−○−。
図９．ＰＥＧ−パクリタキセルがＭＣａ−４乳房腫瘍に及ぼす抗腫瘍効果。−□−はＰＥＧの食塩溶液（６０ｍｇ／ｍｌ）１回静脈注射に対する反応を表し、−■−はクレモフォア／アルコールビヒクルに対する反応を表し、−○−は４０ｍｇ／ｋｇ（体重）のパクリタキセル１回投与を表し、−●−はパクリタキセル４０ｍｇ相当／ｋｇ（体重）のＰＥＧ−パクリタキセルを表す。
本発明は、パクリタキセルおよびドセタキセルの新規な水溶性配合物、ならびに腫瘍細胞に対するインビボでのこれらの配合物の意外な効果を見出したことに基づく。卵巣癌（ＯＣａ−Ｉ）を保有するマウスに投与したポリ（ｌ−グルタミン酸）結合−パクリタキセル（ＰＧ−パクリタキセル）が、ＰＧを含まない同量のパクリタキセルと比較して有意に腫瘍の増殖を遅延させた。パクリタキセル単独、または遊離パクリタキセルとＰＧの組合わせは、最初は腫瘍の増殖遅延を示したが、１０日後には非処置対照群に匹敵する水準にまで腫瘍が再増殖した。さらに、ＰＧ−パクリタキセル結合体の最大耐容量（ＭＴＤ）（パクリタキセル１６０ｍｇ相当／ｋｇ）では、腫瘍の増殖は完全に抑制され、腫瘍が収縮し、処置後２カ月間観察したマウスが腫瘍のない状態を維持した（ＭＴＤ：１回静脈注射後２週間以内に生じた体重減少が１５％未満である最大用量と定義）。平行した試験で、ラット乳腺癌（１３７６２Ｆ）を伴うラットにおいてＰＧ−パクリタキセルの抗腫瘍活性を調べた。この場合も、パクリタキセル４０〜６０ｍｇ相当／ｋｇのＰＧ−パクリタキセルで完全な腫瘍根絶がみられた。これらの意外な結果は、ポリマー−薬物結合体であるＰＧ−パクリタキセルがマウスとラットの両方において１回静脈注射後に、十分に樹立した充実性腫瘍の根絶に成功したことを証明する。さらに、ｐＨ７．４で４０日の半減期をもつＰＧ−パクリタキセルは、知られているうちでは最も安定な水溶性パクリタキセル誘導体のひとつである（Deutsch et al.,1989;Mathew et al.,1992;Zhao and Kingston,1991）。
ＤＴＰＡ−パクリタキセルがＢ１６黒色腫細胞系を用いたインビトロ抗腫瘍効力検定でパクリタキセルと同程度に有効であることも、本明細書に示される。ＤＴＰＡ−パクリタキセルは、４０ｍｇ／ｋｇ（体重）量の１回注射で、ＭＣａ−４乳房腫瘍に対しパクリタキセルと比較して抗腫瘍効果に有意差を示さなかった。さらに、111インジウム標識ＤＴＰＡ−パクリタキセルは、ガンマシンチグラフィーにより証明されるように、ＭＣａ−４腫瘍に蓄積することが示された。これは、本発明のキレート剤結合した抗腫瘍薬が腫瘍造影に有用かつ有効であることを証明する。
パクリタキセルに基づく抗癌療法の効果を改善するために水溶性パクリタキセルが提案され、本発明の新規な化合物および方法は、水溶性かつ制御放出性のパクリタキセルから誘導された組成物を提供することにより、従来の方法および組成物を越える著しい前進をもたらす。このような組成物では、従来のパクリタキセル組成物にみられた副作用をもたらす溶剤が不必要になる。そのほか、放射性標識パクリタキセルは抗腫瘍活性を保持することが示され、これは腫瘍の造影にも有用であろう。さらに本発明によれば、パクリタキセルが特定の腫瘍に取り込まれるか否かを、シンチグラフィー、単光子放射型コンピューター断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）またはポジトロン放射型コンピューター断層撮影法（ＰＥＴ）により測定できる。次いでこの測定を利用して、抗腫瘍療法の効率を判定できる。この情報は、医師がパクリタキセル療法を行う患者を選択する指針を得るのに有用であろう。
パクリタキセルは２方法で水溶性にすることができる：薬物キャリヤーとして作用する水溶性ポリマーにパクリタキセルを結合させる方法、および水溶性キレート剤で誘導体にする方法。後者の方法は、核造影試験および／または放射線療法のために放射性核種（たとえば111Ｉｎ、90Ｙ、166Ｈｏ、68Ｇａ、99mＴｃ）で標識する機会をも提供する。パクリタキセル、ポリエチレングリコール−パクリタキセル（ＰＥＧ−パクリタキセル）、ポリグルタミン酸−パクリタキセル（ＰＧ−パクリタキセル）およびジエチレントリアミン五酢酸−パクリタキセル（ＤＴＰＡ−パクリタキセル）の構造を図１に示す。
本発明の特定の態様においては、ＤＴＰＡ−パクリタキセルまたは他のパクリタキセル−キレート剤結合体、たとえばＥＤＴＡ−パクリタキセル、ＤＴＴＰ−パクリタキセルまたはＤＯＴＡ−パクリタキセルを、水溶性塩（ナトリウム塩、カリウム塩、テトラブチルアンモニウム塩、カルシウム塩、鉄（III）塩など）の形で製造できる。これらの塩類は、腫瘍処置のための療法薬として有用であろう。第２に、ＤＴＰＡ−パクリタキセルまたは他のパクリタキセル−キレート剤は、診断薬として有用であり、これらを111Ｉｎまたは99mＴｃのような放射性核種で標識すると、核造影法と組み合わせて特定の腫瘍を検知するのに利用できる。パクリタキセル（タキソール）およびドセタキセル（タキソテレ）のほか、他のタキサン誘導体を本発明の組成物および方法に適合させることができ、このような組成物および方法のすべてが請求の範囲に含まれると解釈される。
ＤＴＰＡ−パクリタキセルの毒性試験、薬物動態、および組織内分布は、マウスにおいて１回静脈注射により観察したＤＴＰＡ−パクリタキセルのＬＤ50（５０％致死量）が約１１０ｍｇ／ｋｇ（体重）であることを示した。パクリタキセルの溶解度が限られていることによる用量−容量制限があり、かつ静脈内投与にはビヒクル毒性が伴うので、パクリタキセルとの直接比較を行うのは難しい。しかし化学療法の担当者は、本発明の開示を考慮して、臨床試験で対象者に用いるための有効量および最大耐容量を決定するであろう。
本発明の特定の態様においては、ポリマー−パクリタキセル結合体でコーティングしたステントを用いて、再狭窄、すなわちバルーン血管形成術後の動脈閉塞を防止することができる。バルーン膨張式ステントを冠動脈血管形成術に用いた臨床試験での最近の結果は、標準的バルーン血管形成術と比較して、開存性および再狭窄減少において有意の利点を示した（Serruys et al.,1994）。対損傷反応仮説（response-to-injury hypothesis）によれば、細胞増殖に伴って血管内膜新生（neointima formation）が起きる。現在、自然発症性および進行性アテローム性動脈硬化症の両方とも血管病変に至る臨床経過は平滑筋細胞（ＳＭＣ）増殖であるというのが、一般に支持されている考えである（Phillips-Hughes and Kandarpa,1996）。動脈損傷後のＳＭＣ表現型増殖は新生細胞のものと似ているので、抗癌薬が血管内膜新生によるＳＭＣ蓄積を阻止するのに有用となる可能性がある。したがって、これらの薬剤を長期間にわたって十分な濃度で放出しうるポリマー結合−抗増殖薬でコーティングしたステントは、過形成した血管内膜および中膜が内腔中へ増殖侵入するのを阻止し、これにより再狭窄を減少させるであろう。
パクリタキセルはマウスモデルでコラーゲン誘発性関節炎を抑制することが示されているので（Oliver et al.,1994）、本発明の配合物は自己免疫疾患および／または炎症性疾患、たとえば慢性関節リウマチの処置にも有用であると考えられる。パクリタキセルがチューブリンに結合すると、安定な微小管ポリマーの方へ平衡が移行し、この薬物はＧ２有糸分裂後期の細胞をブロックすることにより真核細胞増殖の強力な阻害薬となる。パクリタキセルによる関節炎抑制には幾つかの機構が関与していると思われる。たとえば、パクリタキセルの位相特異性細胞毒性は急速に増殖している炎症細胞に作用するであろう。さらにパクリタキセルは、細胞の有糸分裂、遊走、化学走性、細胞内輸送および好中性Ｈ2Ｏ2を産生を阻害する。さらにパクリタキセルは、内皮細胞遊走協調を遮断することにより、抗血管形成活性をもつであろう（Oliver et al.,1994）。したがって本発明のポリマー結合プロドラッグは、慢性関節リウマチの処置に際し遊離パクリタキセルと同程度に有用であると考えられる。本明細書に開示したポリマー結合配合物はまた、薬物の遅延放出または持続放出および溶解度増大という利点をもたらす。本発明の配合物を関節領域に直接に注入し、または植え込むのも、関節炎処置の１態様である。
注射用に適したパクリタキセルまたはドセタキセルの製剤には、無菌の水性液剤または分散液剤、および無菌の液剤または分散液剤を調製するための無菌散剤が含まれる。注射用としてはすべての場合、製剤は無菌かつ液体でなければならない。それは製造および貯蔵の条件下で安定でなければならず、かつ細菌や真菌などの微生物の汚染作用に対し防腐されていなければならない。キャリヤーは溶剤または分散媒であってもよく、たとえば水、エタノール、ポリオール（たとえばグリセリロール、プロピレングリコールおよび液状ポリエチレングリコールなど）、その適切な混合物、および植物油が含まれる。微生物の作用の防止は、種々の抗菌薬および抗真菌薬、たとえばパラベン類、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどにより行うことができる。多くの場合、等張化剤、たとえば糖類または塩化ナトリウムを含有することが好ましいであろう。
無菌の注射液は、必要量の有効成分を、前記に挙げた他の種々の成分が含まれた適切な溶剤に含有させ、次いで無菌的にろ過することにより調製される。一般に分液散剤は、滅菌した種々の有効成分を、基本的分散媒および前記に挙げたものから選択される他の必要成分が含まれた無菌のビヒクルに含有させることにより調製される。無菌注射液を調製するための無菌散剤の場合、好ましい調製方法は予め無菌的にろ過したその溶液からの真空乾燥法および凍結乾燥法であり、これにより有効成分および他の目的成分を含む散剤が得られる。
本明細書中で用いる“薬剤学的に許容しうるキャリヤー”には、溶剤、分散媒、コーティング、抗菌薬および抗真菌薬、ならびに等張化剤などがいずれもすべて含まれる。薬剤有効物質に対しこのような媒質および薬剤を用いることは、当技術分野で周知である。ただし慣用される媒質または薬剤が有効成分と不適合である場合、それを療法用組成物中に使用することを考慮する。補助的な有効成分を組成物に含有させてもよい。
“薬剤学的に許容しうる”という句は、動物またはヒトに投与した場合にアレルギー反応またはこれに類する有害な反応を生じない分子形態および組成物をも表す。
たとえば水性液剤中において非経口投与するためには、液剤は必要ならば適切に緩衝化すべきであり、液体希釈剤は十分量の食塩水またはグルコースでまず等張にされる。これらの水性液剤は静脈内および腹腔内投与に特に適している。これに関して使用できる無菌の水性媒質は、本発明の開示を考慮すれば当業者に自明であろう。
以下の実施例は本発明の好ましい態様を示すために提示される。以下の実施例に開示した技術は、本発明の実施に際して良好に機能することを本発明者らが見出した技術であり、したがって本発明の好ましい実施態様をなすとみなしうるのは自明である。ただし本発明の開示を考慮して、提示した具体的態様において多くの変更を行い、なおかつ本発明の精神および範囲から逸脱することなく同様な、または類似の結果を得ることができるのは、当業者には自明であろう。
実施例１
ＤＴＰＡ−パクリタキセル
ＤＴＰＡ−パクリタキセルの合成：
無水ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ  Ａ）（２１０ｍｇ、０．５８５ｍｍｏｌ）を、パクリタキセル（１００ｍｇ、０．１１７ｍｍｏｌ）の乾燥ＤＭＦ（２．２ｍｌ）溶液に０℃で添加した。反応混液を４℃で一晩撹拌した。懸濁液を濾過し（０．２μｍミリポアフィルター）、未反応の無水ＤＴＰＡを除去した。濾液を蒸留水に注入し、４℃で２０分間撹拌し、沈殿物を回収した。Ｃ18シリカゲルプレートを用いた分離用ＴＬＣをアセトニトリル／水（１：１）で展開して、粗生成物を精製した。パクリタキセルのＲf値は０．３４であった。パクリタキセルの上部にあるＲf値０．６５から０．７５のバンドをかき取り、アセトニトリル／水（１：１）混液で溶出し、溶媒を除去して１５ｍｇのＤＴＰＡ−パクリタキセルを生成物として得た（収率１０．４％）：ｍｐ；＞２２６℃分解。ＵＶスペクトル（ナトリウム塩の水溶液）は、パクリタキセルにも特徴的である２２８ｎｍに最大吸収を示した。マススペクトル；（ＦＡＢ）ｍ／ｅ  １２２９（Ｍ＋Ｈ）+、１２５１（Ｍ＋Ｎａ）、１２６７（Ｍ＋Ｋ）。1Ｈ  ＮＭ Ｒスペクトル（ＤＭＳＯ−ｄ6）では、ＤＴＰＡのＮＣＨ2ＣＨ2Ｎの共鳴が複雑な一連のシグナルとしてδ２．７１−２．９６ｐｐｍに、そしてＣＨ2ＣＯＯＨの共鳴が多重線としてδ３．４２ｐｐｍに、それぞれ観測された。パクリタキセルの４．１０ｐｐｍにあるＣ７−Ｈの共鳴シグナルは５．５１ｐｐｍにシフトしたが、これは７−位がエステル化されていることを示唆する。残りのスペクトルはパクリタキセルの構造と矛盾しないものであった。
ＤＴＰＡ−パクリタキセルのナトリウム塩は、ＤＴＰＡ−パクリタキセルのエタノール溶液を等量の０．０５Ｍ  ＮａＨＣＯ3に添加し、凍結乾燥をして水溶性の固形粉末（溶解度＞２０ｍｇパクリタキセル相当量／ｍｌ）を生成することによって得られた。
ＤＴＰＡ−パクリタキセルの加水分解に対する安定性：
ＤＴＰＡ−パクリタキセルの加水分解に対する安定性の検討は促進条件下で実施した。すなわち、１ｍｇのＤＴＰＡ−パクリタキセルを１ｍｌの０．５Ｍ  ＮａＨＣＯ3水溶液（ｐＨ９．３）に溶解し、ＨＰＬＣで分析した。ＨＰＬＣの装置は、Waters社１５０ｘ３．９（内径）ｍｍノバパック（Nova-Pac）カラム（Ｃ１８  ４μｍシリカゲルを充填したもの）、Perkin-Elmer社イソクラティックＬＣポンプ、PE社ネルソン９００シリーズインターフェース、Spectra-Physics社ＵＶ−Ｖｉｓ検出器、およびデータステーションからなる。溶離液（アセトニトリル／メタノール／０．０２Ｍ酢酸アンモニウム＝４：１：５）を１．０ｍｌ／ｍｉｎで流し、ＵＶ検出器（２２８ｎｍ）で検出した。ＤＴＰＡ−パクリタキセルおよびパクリタキセルの保持時間は、それぞれ１．３８および８．８３分であった。ピーク面積を定量し、標準曲線と比較して、ＤＴＰＡ−パクリタキセルおよびパクリタキセルの濃度を測定した。ＤＴＰＡ−パクリタキセルの０．５Ｍ  ＮａＨＣＯ3水溶液中での半減期は、室温で約１６日と推定される。
in vitroにおけるマウスのＢ１６黒色腫細胞の増殖に対するＤＴＰＡ−パクリタキセルの効果：
細胞は２．５ｘ１０4細胞／ｍｌの濃度で２４穴プレートに播種し、１０％の子牛血清を含有する、ダルベッコの修飾型最少必須培養液（Dulbecco modified minimal essential medium）（ＤＥＭ）およびＦ１２培養液（５０：５０）中で、５．５％のＣＯ2を含有する９７％に加湿した大気中、３７℃で２４時間培養した。その後培養液を、５ｘ１０-9Ｍから７５ｘ１０-9Ｍの濃度域のパクリタキセルもしくはＤＴＰＡ−パクリタキセルを含有する新鮮な培養液に交換した。４０時間後、トリプシン処理により細胞を遊離させ、コールター計数器で計測した。細胞培養液中のＤＭＳＯ（パクリタキセルを溶解するために使用）、および、０．０５Ｍの炭酸水素ナトリウム溶液（ＤＴＰＡ−パクリタキセルを溶解するために使用）の最終濃度は０．０１％より低かった。対照実験で測定したところ、この量の溶媒は、細胞増殖にいかなる影響も及ぼさなかった。
Ｂ１６黒色腫細胞の増殖に対するＤＴＰＡ−パクリタキセルの影響を図２に示す。種々の濃度で４０時間培養した後、ＤＴＰＡ−パクリタキセルおよびパクリタキセルの細胞障害性を比較した。パクリタキセルおよびＤＴＰＡ−パクリタキセルのＩＣ50値は、それぞれ１５ｎＭおよび７．５ｎＭである。
乳ガン（ＭＣａ−４）腫瘍モデルに対する抗腫瘍効果：
メスのＣ３Ｈｆ／Ｋａｍマウスの右腿の筋肉中に、乳ガン（ＭＣａ−４）を接種した（５ｘ１０5細胞／マウス）。腫瘍が８ｍｍに達した時点で（約２週間）、体重１ｋｇあたり１０、２０、および、４０ｍｇパクリタキセル相当量のパクリタキセルもしくはＤＴＰＡ−パクリタキセルを単一投与（single dose）した。対照実験には、生理食塩水、および、無水アルコール／クレモフォア（Chremophor）（５０／５０）を生理食塩水で希釈した溶液（１：４）を使用した。腫瘍の増殖は、３つの直交する腫瘍の直径を計測することにより、経日的に測定した。腫瘍の大きさが直径１２ｍｍに達した時点で、腫瘍の増殖の遅延を算定した。マウスは、腫瘍が約１５ｍｍに達した時点で殺した。
腫瘍の増殖曲線を図３に示す。対照実験に比較し、パクリタキセルおよびＤＴＰＡ−パクリタキセルは共に、４０ｍｇ／ｋｇの投与量で抗腫瘍効果を示した。さらにデータを分析して、腫瘍が直径１２ｍｍに達するのに要する平均日数も測定した。統計学的な解析により、ＤＴＰＡ−パクリタキセルは、４０ｍｇ／ｋｇの投与量で、生理食塩水で処理した対照に比較して有意に腫瘍の増殖を遅延することが明らかとなった（ｐ＜０．０１）。腫瘍が直径１２ｍｍに達するのに要する平均時間は、パクリタキセルで９．４日であるのに比較し、ＤＴＰＡ−パクリタキセルでは１２．１日であった（図４）。
ＤＴＰＡ−パクリタキセルの111Ｉｎ標識：
０．６Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．３）４０μｌ、０．０６Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）４０μｌ、ＤＴＰＡ−パクリタキセルのエタノール溶液（２％  Ｗ／Ｖ）２０μｌ、および、酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）に溶解した111ＩｎＣｌ3溶液（１．０ｍＣｉ）２０μｌを、２ｍｌのＶ−バイアルに逐次添加した。室温で３０分間インキュベートした後、移動相として生理食塩水、次いでエタノールを用いたＣ１８セップパック（Sep-Pac）カートリッジに反応混液を通過させ、標識された111Ｉｎ−ＤＴＰＡ−パクリタキセルを精製した。遊離の111Ｉｎ−ＤＴＰＡ（＜３％）は生理食塩水によって除去され、111Ｉｎ−ＤＴＰＡ−パクリタキセルはエタノール洗浄によって回収された。エタノールを窒素ガス下で蒸発させ、標識された生成物を生理食塩水に再溶解した。放射化学的収率；８４％。
111Ｉｎ−ＤＴＰＡ−パクリタキセルの分析：
ＨＰＬＣを用いて反応混液を分析し、111Ｉｎ−ＤＴＰＡ−パクリタキセルの純度を分析した。装置はＬＤＣバイナリーポンプ、Waters社１００ｘ８．０ｍｍ（内径）カラム（ＯＤＳ  ５μｍシリカゲルを充填したもの）からなる。カラムは、水およびエタノールのグラジエント混液（１５分間で、メタノール０％から８５％へのグラジエント）を用いて、流速１ｍｌ／ｍｉｎで溶出した。グラジエントの系は、ＮａＩ結晶検出器およびSpectra-Physics社ＵＶ／Ｖｉｓ検出器で測定した。ＨＰＬＣの分析により、セップパックカートリッジによる精製で、保持時間が２．７分である111Ｉｎ−ＤＴＰＡのほとんどが除去されることが明らかとなった。111Ｉｎ−ＤＴＰＡは、ＤＴＰＡ−パクリタキセル中の痕跡量の汚染物質であるＤＴＰＡから誘導されたものと考えられる。111Ｉｎ−ＤＴＰＡ−パクリタキセルのラジオクロマトグラムは、そのＵＶクロマトグラムと相関関係があり、１２．３分のピークが標的化合物であることを示唆した。同様のクロマトグラフィーの条件下で、パクリタキセルの保持時間は１７．１分であった。最終調製品の放射化学的な純度は、ＨＰＬＣ分析による測定で、９０％であった。
全身のシンチグラフィー：
メスのＣ３Ｈｆ／Ｋａｍマウスの右腿の筋肉中に乳ガン（ＭＣａ−４）を接種した（５ｘ１０5細胞）。腫瘍が直径１２ｍｍに達した時点で、マウスを２つの群に分離した。Ｉ群では、ペントバルビタールナトリウムを腹膜内に注射してマウスに麻酔をかけ、次いで111Ｉｎ−ＤＴＰＡ−パクリタキセル（１００−２００ｍＣｉ）を尾部の静脈を介して注入した。中間エネルギーコリメーター（medium energy collimator）を搭載したγ−カメラをマウス（群あたり３匹）の上部に設置した。注射後、５、３０、６０、１２０、２４０分、および、２４時間における、一連の５分の捕捉情報（acquisitions）を回収した。II群では、マウスに対照として111Ｉｎ−ＤＴＰＡを注射した以外は、同様の方法を行った。図５に、111Ｉｎ−ＤＴＰＡおよび111Ｉｎ−ＤＴＰＡ−パクリタキセルを注射したマウスのガンマ−シンチグラフを示す。111Ｉｎ−ＤＴＰＡは、血漿から速やかに除去され、腎臓中に最小限しか停留せずに尿中に迅速かつ高度に排泄され、腫瘍、肝臓、腸、および、他の臓器もしくは身体の部位にごくわずかしか停留しないという特徴があった。これと対照的に、111Ｉｎ−ＤＴＰＡ−パクリタキセルはパクリタキセルと類似した薬理学的なプロフィールを示した（Eisemanら，1994）。脳内の放射能はごくわずかであった。肝臓および腎臓は最大の組織：血漿比を有する。放射能で標識したＤＴＰＡ−パクリタキセルもしくはその代謝物の肝胆汁性の排泄は、薬剤が血液中から除去される主な経路の一つであった。パクリタキセルとは異なり、有意な量の111Ｉｎ−ＤＴＰＡ−パクリタキセルが腎臓を通しても排泄されたが、腎臓はパクリタキセルの除去では小さな役割を果たすに過ぎなかった。腫瘍は111Ｉｎ−ＤＴＰＡ−パクリタキセルを有意に取り込んだ。これらの結果から、111Ｉｎ−ＤＴＰＡ−パクリタキセルによる腫瘍の検出、および、111Ｉｎ−ＤＴＰＡ−パクリタキセルの腫瘍への取り込みの定量が可能であり、さらに、パクリタキセル治療の患者を選択するために111Ｉｎ−ＤＴＰＡ−パクリタキセルを使用してもよいことが明らかになった。
実施例２
ポリグルタミン酸−パクリタキセル
本実施例で、パクリタキセルの、水溶性ポリマー、ポリ１−グルタミン酸（ＰＧ）への結合について記載する。薬剤のキャリアーとして使用される水溶性ポリマーの電位は十分に安定している（Kopecek,1990;MaedaおよびMatsumura,1989）。薬剤−ポリマー結合体は、他の不溶性の薬剤を可溶化する能力に加え、薬剤の遊離を制御するために、徐放性デポ（slow-release depot）としての機能も果たす。
ＰＧ−パクリタキセルの合成：
ＰＧは、リソソーム酵素による速やかな分解が可能であり、血漿中で安定であり、さらに、薬剤に付着するための官能基を十分に含有するので、パクリタキセルのキャリアーとして選択した。アドリアマイシン（Van Heeswijkら，1985;Hoesら,1985）、シクロホスファミド（Hiranoら,1979）、およびAra-C（Katoら,1984）を含む抗腫瘍剤がＰＧに結合されてきた。
ＰＧのナトリウム塩（ＭＷ  ３４Ｋ、Sigma社、０．３５ｇ）を水に溶解した。０．２Ｍ  ＨＣｌを用いて水溶液のｐＨを２に調整した。沈殿物を回収し、蒸留水に透析し、凍結乾燥して０．２９ｇのＰＧを得た。
ＰＧ（７５ｍｇ、反復単位ＦＷ  １７０、０．４４ｍｍｏｌ）の乾燥ＤＭＦ（１．５ｍＬ）溶液に、２０ｍｇのパクリタキセル（０．０２３ｍｍｏｌ、モル比ＰＧ／パクリタキセル＝１９）、１５ｍｇのジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）（０．０７３ｍｍｏｌ）、および痕跡量のジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）を添加した。反応は室温で４時間行った。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ、シリカ）は、パクリタキセル（Ｒｆ＝０．５５）が完全にポリマー結合体（Ｒｆ＝０）に転換していることを示した（移動相ＣＨＣｌ3／ＭｅＯＨ＝１０：１）。反応混液をクロロホルムに注入した。生成した沈殿物を回収し、真空乾燥して６５ｍのポリマー−薬剤結合体を得た。出発物質中のＰＧに対するパクリタキセルの重量比を変化させることにより、多様な濃度のパクリタキセルのポリマー結合体を合成することが可能である。
ＰＧ−パクリタキセル結合体のナトリウム塩は、生成物を０．５Ｍ  ＮａＨＣＯ3に溶解して得た。ＰＧ−パクリタキセルの水溶液を蒸留水に透析し（ＭＷＣＯ  １，０００）、低分子量の汚染物および過剰のＮａＨＣＯ3塩を除去した。透析物を凍結乾燥して白色粉末８８．６ｍｇを得た。このポリマー結合体中のパクリタキセル含有量をＵＶ（後述）で測定したところ、２１％（Ｗ／Ｗ）であった。収率（ポリマー結合型のパクリタキセルへの転換率、ＵＶ）；９３％。単に使用するパクリタキセルのＰＧに対する比率を増加させることによって、より多くのパクリタキセル（３５％まで）を含有するＰＧ−パクリタキセルをこの方法で合成することが可能である。
1Ｈ−ＮＭＲ（ＧＥ社モデルＧＮ  ５００分光計、５００ＭＨｚ、Ｄ2Ｏ中）：δ＝７．７５−７．３６ｐｐｍ（パクリタキセルの芳香族構成部分）；δ＝６．３８ｐｐｍ（Ｃ10−Ｈ）、５．９７ｐｐｍ（Ｃ13−Ｈ）、５．６３および４．７８ｐｐｍ（Ｃ2’−Ｈ）、５．５５−５．３６ｐｐｍ（Ｃ3’−ＨおよびＣ2−Ｈ、ｍ）、５．１０ｐｐｍ（Ｃ5−Ｈ）、４．３９ｐｐｍ（Ｃ7−Ｈ）、４．１０（Ｃ20−Ｈ）、１．９７ｐｐｍ（ＯＣＯＣＨ3）、そして、１．１８−１．２０ｐｐｍ（Ｃ−ＣＨ3）は、パクリタキセルの脂肪族成分にアサインされる。パクリタキセルの他の共鳴シグナルは、ＰＧの共鳴シグナルのために不明確であった。４．２７ｐｐｍ（Ｈ−α）、２．２１ｐｐｍ（Ｈ−γ）、および２．０４ｐｐｍ（Ｈ−β）にあるＰＧの共鳴シグナルは、純粋なＰＧのスペクトルと一致する。ポリマーが結合したパクリタキセルのカップリングは、分離が不十分なため十分な精度で測定することができない。水への溶解度は＞２０ｍｇパクリタキセル／ｍｌであった。
ＰＧ−パクリタキセルの性状決定：
紫外線スペクトル（ＵＶ）は、Beckman社ＤＵ−６４０分光光度計（Fullerton,CA)で得た。水に溶解したポリマー結合体とメタノールに溶解した遊離の薬剤が同じモル吸光係数を有し、かつ、両者がランベルト−ベールの法則に従うと仮定して、メタノールに溶解した既知の濃度のパクリタキセルで作成した標準曲線に基づき、ＰＧに結合したパクリタキセルの含有量をＵＶで測定した。（λ＝２２８ｎｍ）。ＵＶスペクトルに示されるように、ＰＧ−パクリタキセルはパクリタキセルに特徴的な吸収を有し、それは２２８ｎｍから２３０ｎｍにλシフトしていた。水に溶解したポリマー結合体（２３０ｎｍ）とメタノールに溶解した遊離の薬剤（２２８ｎｍ）が同じモル吸光を有し、かつ、両者がランベルト−ベールの法則に従うと仮定して、メタノールに溶解した既知の濃度のパクリタキセルを用いて２２８ｎｍの吸収で作成した標準曲線に基づいて、ＰＧ−パクリタキセル中のパクリタキセルの濃度を定量した。
ＰＧ−パクリタキセルのゲル侵透クロマトグラフィーの検討：
ＰＧ−パクリタキセルの相対分子量はゲル侵透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）により特定した。ＧＰＣの装置は、ＬＤＣグラジエント装置で凍結した２つのＬＤＣモデルIIIポンプ、ＰＬゲルＧＰＣカラム、および、Waters社９９０フォトダイオードアーレイ検出器からなる。溶離液（ＤＭＦ）を１．０ｍｌ／ｍｉｎで流し、ＵＶ検出器を２７０ｎｍに設定した。パクリタキセルがＰＧへ結合することによりＰＧ−パクリタキセルの分子量は増加するが、このことは、ＧＰＣによる分析で保持時間がＰＧの６．４分からＰＧ−パクリタキセル結合体の５．０分に移動することに示される。１５−２５％のパクリタキセル（Ｗ／Ｗ）を含有するＰＧ−パクリタキセルの分子量は、４５−５５ｋＤａの範囲内であると算定される。粗生成物は低分子量の汚染物質（保持時間８．０から１０．０分、および１１．３分）を含有したが、それらはＰＧ−パクリタキセルをそのナトリウム塩に転換した後、透析することによって、効果的に除去できた。
ＰＧ−パクリタキセル結合体の加水分解：
ＰＧ−パクリタキセルを、ｐＨ６．０、ｐＨ７．４、およびｐＨ９．６のリン酸緩衝液（ＰＢＳ、０．０１Ｍ）に溶解し、０．４ｍＭのパクリタキセルに相当する濃度とした。溶液を緩やかに撹拌しながら３７℃でインキュベートした。選定した時間毎に一定画分（１００μｌ）を除去し、等量のメタノールと混合し、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分析した。ＨＰＬＣの装置は、逆相シリカカラム（ノバパック、Waters社、ＣＡ）、メタノール−水（２：１、ｖ／ｖ）の移動相（流速１．０ｍｌ／ｍｉｎ）、およびフォトダイオード検出器からなる。２２８ｎｍにおけるそれぞれのピークのモル吸光係数がパクリタキセルのものと等しいと仮定し、ピーク面積を、別にパクリタキセルで作成した標準曲線と比較して、それぞれのサンプル中の、ＰＧの結合したパクリタキセル、遊離のパクリタキセル、および他の分解生成物の濃度を定量した。最小二乗法により算定した結合体の半減期は、ｐＨ６．０、ｐＨ７．４、およびｐＨ９．６でそれぞれ１３２日、４０日、および４日であった。ＨＰＬＣ分析により、ＰＧ−パクリタキセルをＰＢＳ溶液中でインキュベートすることにより、パクリタキセル、および、パクリタキセルより疎水性の高い物質（代謝物−１）を含む他の物質が生成することが明らかとなった。実際に、１００時間インキュベートした後、ｐＨ７．４のＰＢＳで回収された代謝物−１（７−エピパクリタキセルの可能性が最も高い）の量は、パクリタキセルの量より多かった（図−６）。
in vitroの検討：
ｐＨ７．４のＰＢＳ溶液から得た一定画分を、チューブリン重合アッセイで分析した。チューブリン集合反応は、ＰＥＭ緩衝液（ｐＨ６．９）中、チューブリン（牛の脳、Cytoskeleton社、Boulder,CO）濃度１ｍｇ/ｍｌ（１０μＭ）で、試験サンプル（１．０μＭパクリタキセル相当量）および１．０ｍＭのＧＴＰの存在下、３２℃で行った。チューブリン重合の後、規定時間外に３４０ｎｍで溶液の吸光度を測定した。１５分後、塩化カルシウム（１２５ｍＭ）を添加し、ＣａＣｌ2−誘導による微小管の解重合を測定した。ＰＢＳに溶解したばかりのＰＧ−パクリタキセルは生産型の微小管（producing microtubules）中で不活性であったが、３日間インキュベートしたＰＧ−パクリタキセルの画分はチューブリン重合を引き起こした。微小管はＣａＣｌ2−誘導による解重合に対して安定であった。
細胞増殖に対するＰＧ−パクリタキセルの効果は、テトラゾリウム塩（ＭＴＴ）アッセイでも試験した（Mosmann,1983）。ＭＣＦ−７細胞もしくは１３７６２Ｆ細胞を２ｘ１０4細胞／ｍｌの濃度で９６穴プレートに播種し、２４時間後に種々の濃度のＰＧ−パクリタキセル、パクリタキセル、もしくはＰＧで処理し、さらに７２時間インキュベートした。その後ＭＴＴ溶液（２０μｌ、５ｍｇ／ｍｌ）をそれぞれの穴に添加し、４時間インキュベートした。上清を吸引し、生菌によって代謝的に生成されたＭＴＴホルマザンを、マイクロプレート蛍光リーダーを用いて５９０ｎｍの波長で測定した。３日以上の間、ＰＧ−パクリタキセルは、遊離のパクリタキセルと同程度まで、腫瘍細胞の増殖を阻害した。ヒトの胸部腫瘍の細胞系ＭＣＦ−７で得られたＩＣ50値は、パクリタキセルで０．５９μＭ、ＰＧ−パクリタキセルで０．８２μＭであった（パクリタキセル当量単位で測定）。１３７６２Ｆ細胞系に対しては、ＰＧ−パクリタキセルの感受性（ＩＣ50＝１．８６μＭ）は、パクリタキセルのそれ（ＩＣ50＝６．７９μＭ）に匹敵するものであった。両細胞系で、ＰＧ単独のＩＣ50は共に１００μＭより大きかった。
in vivoにおける抗腫瘍活性：
全ての動物実験は、アンダーソン癌センター医学部門（M.D.Anderson Cancer Center）の動物施設において、施設のガイドラインに従って実施した。放射線腫瘍学実験部門（Department of Experimental Radiation Oncology）においてＣ３Ｈ／Ｋａｍマウスを交配し、病原体のない施設で飼育した。５ｘ１０5のネズミの卵巣ガン細胞（ＯＣａ−Ｉ）、乳ガン（ＭＣａ−４）、肝臓ガン（ＨＣａ−Ｉ）、もしくは線維肉腫（ＦＳａ−II）を注射し、メスのＣ３Ｈ／Ｋａｍマウス（２５−３０ｇ）の右腿の筋肉に孤立性腫瘍を生成した。これと平行した実験で、メスのフィッシャー３４４ラット（１２５−１５０ｇ）に、０．１ｍｌのＰＢＳに溶解した１３７６２Ｆ腫瘍細胞の生菌１．０ｘ１０5を注射した。マウスの腫瘍が５００ｍｍ3（直径１０ｍｍ）に達した時点、あるいは、ラットの腫瘍が２４００ｍｍ3（直径１７ｍｍ）に達した時点で、処理を開始した。生理食塩水に溶解したＰＧ−パクリタキセルもしくはクレモフォアＥＬ媒体（vehicle）に溶解したパクリタキセルを、体重１ｋｇあたり４０から１６０ｍｇパクリタキセル相当量の範囲で投与量を変化させて、単一投与した。対照実験には、生理食塩水、クレモフォア媒体（５０／５０クレモフォア／エタノールを生理食塩水で１：４に希釈）、ＰＧ（ＭＷ  ３８Ｋ）の生理食塩水溶液、およびパクリタキセル／ＰＧ混液を使用した。腫瘍の増殖は、３つの直交する腫瘍の直径を計測することにより、経日的に測定した（図７Ａ、７Ｂ、７Ｃ、７Ｄ、および、７Ｅ）。腫瘍の体積は式（ＡｘＢｘＣ）／２に従って算定した。マウスにおける絶対増殖遅延（absolute growth delay；ＡＧＤ）は、マウスにおいて、種々の薬剤で処理した腫瘍が５００から２０００ｍｍ3に達するのに要する日数から、生理食塩水で処理した対照の腫瘍が５００から２０００ｍｍ3に達するのに要する日数を差し引いたものと定義する。表１に、ラットにおけるＰＧパクリタキセルの急性毒性をパクリタキセル／クレモフォアと比較して要約する。表２に、マウスのＭＣａ−４、ＦＳａ−II、およびＨＣａ−Ｉ腫瘍に対するＰＧ−パクリタキセルの効果に関するデータの概要を示す。データは図７Ａ−図７Ｅにも示す。
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実施例３
ポリエチレングリコール−パクリタキセル
ポリエチレングリコール−パクリタキセル（ＰＥＧ−パクリタキセル）の合成：
合成は２段階で行った。初めに、２’−スクシニル−パクリタキセルを報告されている方法（Deutschら,1989）に従って調製した。パクリタキセル（２００ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）および無水コハク酸（２８８ｍｇ、２．２２ｍｍｏｌ）を、無水ピリジン（６ｍｌ）中、室温で３時間反応させた。その後ピリジンを留去し、残渣を水で処理し、２０分間撹拌して濾過した。沈殿物をアセトンに溶解し、水を徐々に添加し、微細な結晶を回収し、１８０ｍｇの２’−スクシニル−パクリタキセルを得た。ＰＥＧ−パクリタキセルはＮ−エトキシカルボニル−２−エトキシ−１，２−ジヒドロキノリン（ＥＥＤＱ）を介するカップリング反応によって合成した。２’−スクシニル−パクリタキセル（１６０ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ）およびメトキシポリオキシエチレンアミン（ＰＥＧ−ＮＨ2、ＭＷ５０００、９００ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ）の塩化メチレン溶液に、ＥＥＤＱ（１８０ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）を添加した。反応混液を室温で４時間撹拌した。粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィーに付し、酢酸エチル、次いでクロロホルム−メタノール（１０：１）で溶出した。これにより３５０ｍｇの生成物を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）；δ  ２．７６（ｍ、コハク酸、ＣＯＣＨ2ＣＨ2ＣＯ2）、δ  ３．６３（ＰＥＧ、ＯＣＨ2ＣＨ2Ｏ）、δ  ４．４２（Ｃ７−Ｈ）、および、δ  ５．５１（Ｃ２’−Ｈ）。最大ＵＶ吸収は、パクリタキセルにも特徴的な、２８８ｎｍであった。ＰＥＧへの付着により、パクリタキセルの水への溶解度が大幅に向上した（＞２０ｍｇパクリタキセル相当量／ｍｌ水）。
ＰＥＧ−パクリタキセルの加水分解に対する安定性：
ＰＥＧ−パクリタキセルを０．４ｍＭの濃度で種々のｐＨのリン酸緩衝液（０．０１Ｍ）に溶解し、溶液を緩やかに撹拌しながら３７℃でインキュベートした。選定した時間毎に一定画分（２００μｌ）を除去し、凍結乾燥した。生成した乾燥結晶を塩化メチレンに再溶解し、ゲル侵透クロマトグラフィー（ＧＰＣ分析）に付した。ＧＰＣの装置は、Perkin-Elmer社ＰＬゲル混合ベッドカラム、Perkin-Elmer社イソクラティックＬＣポンプ、PE社ネルソン９００シリーズインターフェース、Spectra-Physics社ＵＶ／Ｖｉｓ検出器、およびデータステーションからなる。溶離液（塩化メチル）は１．０ｍｌ／ｍｉｎで流し、ＵＶ検出器は２２８ｎｍに調整した。ＰＥＧ−パクリタキセルおよびパクリタキセルの保持時間は、それぞれ６．１分および８．２分であった。ピーク面積を測定し、残存するＰＥＧ−パクリタキセルおよび遊離したパクリタキセルの百分率を算出した。ＰＥＧ−パクリタキセルの半減期をｐＨ７．４での最小二乗法で算出したところ、５４分であった。ｐＨ９．０での半減期は７．６分であった。ｐＨ７．４でのＰＥＧ−パクリタキセルからのパクリタキセルの遊離図を図８に示す。
in vitroにおけるマウスのＢ１６黒色腫細胞を用いたＰＥＧ−パクリタキセルの細胞障害性の検討：
ＤＴＰＡ−パクリタキセルを用いた細胞障害性の検討で記載した方法に次いで、黒色腫細胞を２．５ｘ１０4細胞／ｍｌの濃度で２４穴プレートに播種し、１０％の子牛血清を含有する、ダルベッコの修飾型最少必須培養液（ＤＭＥ）およびＦ１２培養液（５０：５０）中で、５．５％のＣＯ2を含有する９７％に加湿した大気中、３７℃で２４時間培養した。その後培養液を、５ｘ１０-9Ｍから７５ｘ１０-9Ｍの濃度域のパクリタキセルもしくはその誘導体を含有する新鮮な培養液に交換した。４０時間後、トリプシン処理により細胞を遊離させ、コールター計数器で計測した。細胞培養液中のＤＭＳＯ（パクリタキセルを溶解するために使用）、および、０．０５Ｍの炭酸水素ナトリウム溶液（ＰＥＧ−パクリタキセルを溶解するために使用）の最終濃度は０．０１％より低かった。対照実験で測定したところ、この量の溶媒は，細胞増殖にいかなる影響も及ぼさなかった。さらにＰＥＧについても、５ｘ１０-9Ｍから７５ｘ１０-9Ｍのパクリタキセル相当量の濃度を生成するのに用いられる濃度域では、細胞増殖に影響を及ぼさなかった。
マウスにおけるＭＣａ−４腫瘍に対するＰＥＧ−パクリタキセルの抗腫瘍効果：
胸部の固形腫瘍に対するＰＥＧ−パクリタキセルの抗腫瘍効果を評価するために、ＭＣａ−４細胞（５ｘ１０5）をメスのＣ３Ｈｆ／Ｋａｍマウスの右腿の筋肉に注射した。ＤＴＰＡ−パクリタキセルを用いた実施例１に記載したように、腫瘍が８ｍｍに達した時点（約２週間）で、体重１ｋｇあたり１０、２０、および４０ｍｇのパクリタキセル相当量のパクリタキセルもしくはＰＥＧ−パクリタキセルを単一投与した。まずパクリタキセルを、無水エタノールと等量のクレモフォアとの混合液に溶解した。この貯蔵用溶液を、注射する１５分以内に無菌の生理食塩水でさらに希釈した（容量で１：４）。ＰＥＧ−パクリタキセルは生理食塩水に溶解し（６ｍｇパクリタキセル相当量／ｍｌ）、無菌フィルターで濾過した（ミリポア４．５μｍ）。生理食塩水、パクリタキセル媒体、無水アルコール：クレモフォア（１：１）を生理食塩水で１：４に希釈した溶液、およびＰＥＧの生理食塩水溶液（６００ｍｇ／ｋｇ体重）を対照実験に使用した。腫瘍の増殖は、３つの直交する腫瘍の直径を計測することにより、経日的に測定した。腫瘍の大きさが直径１２ｍｍに達した時点で、腫瘍の増殖の遅延を算定した。
腫瘍の増殖曲線を図９に示す。４０ｍｇ／ｋｇの投与量では、ＰＥＧ−パクリタキセルおよびパクリタキセルは共に、腫瘍の増殖を効果的に遅延した。統計学的に有意な差はないが、パクリタキセルはＰＥＧ−パクリタキセルより効果が高かった。パクリタキセルで処理した腫瘍は直径が１２ｍｍに達するのに９．４日を要したが、ＰＥＧ−パクリタキセルで処理した腫瘍は８．５日であった。それぞれに相当する対照、すなわち、パクリタキセル媒体の６．７日、およびＰＥＧの生理食塩水溶液の６．５日と比較すると、これらの値は統計学的に有意な差があった（ｐ＞０．０５）（図４）。
本発明の内容および方法を好ましい具体例に関して記載したが、ここに記載した内容、方法、および、方法の過程もしくは一連の過程を、本発明の概念、意図、および範囲を逸脱することなく変化させてもよいことは、当該分野の技術者には明白であろう。特に、化学的かつ物理的に関連する試薬をここに記載する試薬の代替として使用してもよく、同様の、あるいは類似の結果が得られるであろうことは、明白であろう。当該分野に精通する者に明らかな、そのような類似する代替物および修飾は全て、添付する請求の範囲に定義する本発明の意図、範囲、および概念の範囲内であると考えられる。
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図８】
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【図９】
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