(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
イヌヘルパーアデノウイルスを用いて動物細胞株をトランスフェくとする工程を含むことを特徴とする、組換えヒトアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）の生産方法。
【請求項２】
イヌヘルパーアデノウイルスが、ＣＡＶ−１およびＣＡＶ−２株中から選択される請求項１記載の方法。
【請求項３】
生産がイヌ細胞株中で実施されることを特徴とする、請求項１もしくは２記載の方法。
【請求項４】
細胞株が、ＭＤＣＫ株もしくはＧＨＫ株であることを特徴とする、請求項３記載の方法。
【請求項５】
細胞株が追加的にＡＡＶカプシド化機能を保持することを特徴とする請求項１〜４のいずれか一つに記載の方法。
【請求項６】
ＡＡＶカプシド化機能が、適切な場合には異種転写調節因子の制御下に置かれているＡＡＶ  ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子からなることを特徴とする、請求項５記載の方法。
【請求項７】
組換えヒトＡＡＶを調製するためのイヌヘルパーアデノウイルスの使用方法。
【発明の詳細な説明】
本発明はアデノ関連性ウイルス（ＡＡＶ）に由来するベクターを調製するための方法、およびこの目的のために用いられる細胞に関する。より具体的には本発明は、動物のヘルパーウイルスを用いて組換えＡＡＶを調節する方法に関する。本発明は更に、特に遺伝子療法および／または細胞療法用に取得された組換えＡＡＶの使用にも関する。
遺伝子療法とは、欠損症もしくは異常（突然変異、異常発現など）を修正すること、あるいは治療目的の蛋白質の発現を確実に行わせることであり、それは関連する細胞もしくは臓器内に遺伝子情報を導入することにより実施される。この遺伝子情報は、インビトロの場合では臓器から抽出された細胞内に改変化させた細胞を用いて組込ませ、そしてその後にその抽出細胞をその生物体に再度導入し直すか、あるいはインビボの場合では直接的に適切な組織内に組み込ませるかのいずれかが可能である。この遺伝子情報の導入のためには多種多様の技術が既に報告されており、それらの技術には多種多様なトランスフェクション技術が含まれ、それはすなわちＤＮＡとＤＥＡＥデキストランとの複合体を必要とする技術（Ｐａｇａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．  １（１９６７）８９１）、ＤＮＡと核蛋白質との複合体を必要とする技術（Ｋａｎｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４３（１９８９）３７５）、ＤＮＡと脂質との複合体を必要とする技術（Ｆｅｌｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、ＰＮＡＳ  ８４（１９８７）７４１３）、およびＤＮＡとポリリシンとの複合体を必要とする技術、リポソームの使用（Ｆｒａｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２５５（１９８０）１０４３１）などである。つい最近では、遺伝子導入のためのベクターとしてのウイルスの使用がこれらの物理化学的トランスフェクション技術に代わる有望な別法として出現してきた。これに関しては多種多様のウイルスについて、所定の細胞集団：特にレトロウイルス（ＲＳＶ、ＨＭＳ、ＭＭＳなど）、ＨＳＶウイルス、アデノウイルス、およびアデノ関連性ウイルスの感染する能力の検査が既に行われている。
これらのウイルスの中でも、アデノ関連性ウイルス（ＡＡＶは「アデノ関連性ウイルス」を表す）は遺伝子導入に利用することに関して好材料となる一定の特性を提供する。ＡＡＶは比較的小サイズのＤＮＡウイルスであり、このウイルスは安定かつ部位特異的様式でそれらのウイルスが感染する細胞のゲノム内に組込まれる。これらのウイルスは細胞成長、細胞の形態、もしくは細胞分化に何等の影響を及ぼすことなく広いスペクトラムの細胞を感染することが可能である。それに加えてそれらのウイルスはヒトの疾患に関わっているようには思えない。
ＡＡＶのゲノムは既にクローン化され、配列決定が行われており、かつ特性も決定されている。そのゲノムは約４，７００塩基を含み、かつ各末端にそのウイルスの複製起点として作用する約１４５塩基の逆方向反復領域（ＩＴＲ）を含む。残りのゲノムはカプシド化機能を保持する２つの主要領域に分割され、それらは：そのゲノムの左側部分（これは、そのウイルスの複製およびウイルス遺伝子の発現に関わるｒｅｐ遺伝子を含む）、および；そのゲノムの右側部分（これは、そのウイルスのカプシド蛋白をコードするｃａｐ遺伝子を含む）、である。インビトロおよびインビボにおける遺伝子導入のためのＡＡＶに由来するベクターの使用が刊行物に記載されている（特に、国際公開第９１／１８０８８号；国際公開第９３／０９２３９号；米国特許第４，７９７，３６８号、米国特許第５，１３９，９４１号、欧州特許第４８８  ５２８号、を参照されたい）。これらの特許出願はＡＡＶに由来する様々な構築物（それらの構築物中ではｒｅｐおよび／またはｃａｐ遺伝子が欠損を生じており、かつ目的の遺伝子による置換が施されている）、ならびにインビトロ（培養物中の細胞に遺伝子導入する場合）もしくはインビボ（生物体に直接的に遺伝子導入する場合）における前記目的の遺伝子導入のための方法を記載している。
それにもかかわらず、遺伝子導入するためのベクターとしてのＡＡＶの治療的使用には現在では制約がかけられており、それは特に、野生型ヘルパーウイルスによる組換えＡＡＶの汚染の危険性、およびその組換えウイルスを産生するための腫瘍形成の可能性を秘めたヒト細胞株の使用が原因となっている。複製を目的とする際にはＡＡＶはヘルパーウイルスの存在を必要とする。用語「ヘルパーウイルス」は、ＡＡＶの複製に必要とされる機能をトランスで供給することが可能であるいずれかのウイルスを意味する。このヘルパーウイルスは特に、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、もしくはワクシニアウイルスであることが可能である。この特性を有するヘルパーウイルスが非存在である場合には、ＡＡＶは感染細胞のゲノム中に潜伏性形態で存在し続けるが、複製することは可能ではなく、そしてそのためウイルス粒子を産生することも可能とはならない。そのため一般的には組換えＡＡＶは、ヒトのヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス）で感染された細胞株中で、２つのＡＡＶ逆方向反復領域（ＩＴＲ）によりフランクされた目的の遺伝子を含むプラスミドならびにＡＡＶカプシド化遺伝子（ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子）を保持するプラスミドとの同時トランスフェクションにより産生される。産生される組換えＡＡＶはその後に通常の技術を用いて精製される。しかしながらこのような様式で取得されたＡＡＶは一般的には野生型ヘルパーウイルスにより汚染されており、このヘルパーウイルスはまたプロデューサー細胞によっても産生される。このヘルパーウイルスの存在はインビボにおいて非常に不利な結果を生じることがあり得、それは例えば病原性的もしくは免疫原性的効果のようなものである。このヘルパーウイルスは更に、組換え現象の原因となるか、あるいはそうでなければ組換えＡＡＶの複製を誘導しそしてそのためそのウイルスの伝染および撒種を誘導することさえも可能である。
本発明はこの問題に対する有利な解決法を提供する。本出願人は実際に組換えＡＡＶを産生するための方法を開発し、その組換えＡＡＶにより野生型ヒトヘルパーウイルスを含まない組換えＡＡＶの保存物を産生することが可能となる。本発明の方法により更に、腫瘍形成の可能性を秘めたプロデューサー細胞を用いることを回避することも可能になる。本発明の方法は部分的には、組換えＡＡＶは動物起源のヘルパーウイルスを用いることにより産生され得るということの証明に基づいている。本出願人は実際に、驚くべきことに動物起源のウイルスがヒトＡＡＶのトランスコンプレメントを行うことが可能であり、そしてこの理由のためにそのウイルスをヒト組換えＡＡＶを産生するためのヘルパーウイルスとして用いることが可能であるということを証明した。この結果は特に有利なものであり、それはヘルパーウイルスとして用いられる動物ウイルスはヒト細胞中では増殖不可能であるため、そしてヒトの病原体が動物のヘルパーウイルスでの感染後には全く観察されないためである。この理由により、取得される組換えＡＡＶ調製物が例えヘルパーウイルスによる汚染を受けていたとしても、後者はインビボではいずれかの所望されない副作用を生じる可能性はないであろう。それに加えて本発明の方法により、現在入手可能なヒト細胞株においていずれかの既知の腫瘍形成性効果を有することがない動物プロデューサー細胞株を用いることが可能になる。本発明はまた、組換えＡＡＶを産生するのに特に有利である細胞株およびヘルパーウイルスの開発にも基づいている。
従って本発明の主目的は組換えＡＡＶを産生するための方法であり、この方法に従うとその産生は動物ヘルパーウイルスの存在下で実施される。
その産生が動物ヘルパーウイルスで感染された動物細胞株において実施されることが一層好ましい。
本発明は更に、一般的な様式では組換えＡＡＶを調製するための動物ヘルパーウイルスの使用にも関する。
先に示されるように用語「ヘルパーウイルス」は、本発明の意味の範疇ではＡＡＶの複製に必要とされる機能をトランスで供給することが可能ないずれかのウイルスを意味する。本発明の方法において用いることが可能なヘルパーウイルスは、イヌ、ウシ、マウス、ヒツジ、ブタ、鳥類起源のウイルス、もしくはサル起源のウイルスでさえあり得る。ヘルパーウイルスは、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、もしくはワクシニアウイルスの中から選択されることが好ましい。
本発明の範囲内では動物起源のアデノウイルスを用いることが特に有利である。本発明の範囲内で用いることが可能な動物起源のアデノウイルスは多様な起源のものであり得るが、特にイヌ、ウシ、マウス（例えば：Ｍａｖ１、Ｂｅａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７５（１９９０）８１）、ヒツジ、ブタ、鳥類起源のもの、もしくはサル（例えば：ＳＡＶ）起源のものであることさえできる。
より具体的には、鳥類のアデノウイルスの中でもＡＴＣＣから入手可能である血清型１〜１０を引用することが可能であり、これらは例えば、Ｐｈｅｌｐｓ（ＡＴＣＣ  ＶＲ−４３２）、Ｆｏｎｔｅｓ（ＡＴＣＣ  ＶＲ−２８０）、Ｐ７−Ａ（ＡＴＣＣ  ＶＲ−８２７）、ＩＢＨ−２Ａ（ＡＴＣＣ  ＶＲ−８２８）、Ｊ２−Ａ（ＡＴＣＣ  ＶＲ−８２９）、Ｔ８−Ａ（ＡＴＣＣ  ＶＲ−８３０）、およびＫ−１１（ＡＴＣＣ  ＶＲ−９２１）株のようなものであるか、あるいはそうでなければＡＴＣＣ  ＶＲ−８３１〜８３５として表示される株である。
ウシアデノウイルスの中では様々な既知の血清型を用いることが可能であり、それらは特に受託番号ＡＴＣＣ  ＶＲ−３１３、３１４、６３９〜６４２、７６８、および７６９としてＡＴＣＣ（タイプ１〜８）から入手されるものである。
マウスのアデノウイルスＦＬ（ＡＴＣＣ  ＶＲ−５５０）およびＥ２０３０８（ＡＴＣＣ  ＶＲ−５２８）、タイプ５（ＡＴＣＣ  ＶＲ−１３４３）もしくはタイプ６（ＡＴＣＣ  ＶＲ−１３４０）のヒツジアデノウイルス、ブタのアデノウイルス（５３５９）、あるいはサルのアデノウイルス（例えば特に、引用番号ＡＴＣＣ  ＶＲ−５９１−５９４、９４１−９４３、１９５−２０３などのアデノウイルス）を使用することも可能である。
イヌ起源のアデノウイルスを本発明の範囲内でのヘルパーウイルスとして用いることが好ましく、そしてＣＡＶ１およびＣＡＶ２アデノウイルスの全株の使用を実施することが一層好ましい［例えば、Ｍａｎｈａｔｔａｎｎ株もしくはＡ２６／６１（ＡＴＣＣ  ＶＲ−８００）株］。イヌアデノウイルスは既に多数の構造研究の目的となってきた。その結果ＣＡＶ１およびＣＡＶ２アデノウイルスの完璧な制限マップが従来の技術において記載されており（Ｓｐｉｂｅｙ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．  ７０（１９８９）１６５）、かつＥ１ａおよびＥ３遺伝子、ならびにＩＴＲ配列が既にクローン化および配列決定されている
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以下に記載される例では、イヌのアデノウイルスはＡＡＶのトランスコンプレメントに非常に有効であるため、ＡＡＶは複製可能となる。
動物起源のこれら様々なウイルスを、例えば寄託機関に寄託されている株から取得し、その後にコンピテント細胞株内において増幅させ、そして必要に応じて改変することが可能である。アデノウイルスもしくはヘルペスウイルスを産生、単離、および改変するための技術は既に刊行物に記載されており、そしてそれらの技術を本発明の範囲内で用いることができる［Ａｋｌｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３（１９９３）２２４；Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ  ｅｔ  ａｌ．、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １（１９９０）２４１；欧州特許第１８５  ５７３号、Ｌａｖｒｅｒｏ．ｅｔ  ａｌ．、Ｇｅｎｅ  １０１（１９９１）１９５；Ｌｅ  Ｇａｌ  ｌａ  Ｓａｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９（１９９３）９８８；Ｒｏｅｍｅｒ  ａｎｄ  Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２０８（１９９２）２１１；Ｄｏｂｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｅｕｒｏｎ  ５（１９９０）３５３；Ｃｈｉｏｃｃａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｅｗ  Ｂｉｏｌ．  ２（１９９０）７３９；Ｍｉｙａｎｏｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｅｗ  Ｂｉｏｌ．  ４（１９９２）２３８；国際公開第９１／１８０８８号、国際公開第９０／０９４４１号、国際公開第８８／１０３１１号、国際公開第９１／１１５２５号］。その後にこれらの様々なウイルスを、例えば欠失、置換、添加などにより改変することが可能である。特に、所定の事例においてはこれらのウイルスを、複製における点で欠損を生じるように改変させることが可能である。
先に記述されるように、本発明の方法に従う組換えＡＡＶの産生は、ヘルパーウイルスで感染された動物細胞株において実施されることが好ましい。
一般的には、用いられる細胞株およびヘルパーウイルスは同一種からのものである。この点に関しては、本発明の範囲内において用いることができる様々な動物細胞株が既に刊行物において記載されている。従って、イヌの株の中ではグレイハウンドの腎臓細胞株ＧＨＫ（Ｆｌｏｗ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）もしくはＭＤＣＫ細胞株（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ６２５３号）を有利なものとして引用することができる。これらの細胞を培養するため、およびウイルスもしくはウイルスＤＮＡを調製するための条件が既に刊行物に記載されている（特に、Ｍａｃａｒｔｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ４４（１９８８）９；Ｆｏｗｌｋｅｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．  １３２（１９７９）１６３、を参照されたい）。他の動物株（例えば寄託機関で入手可能なもの）も使用することができる。
有利なことに、本発明の方法は、イヌのアデノウイルスに感染しているイヌ細胞株を利用する。
本発明の方法が、イヌ細胞株としてはＭＤＣＫもしくはＧＨＫ株、あるいはそれらの株の誘導体を用いて実施されることが一層好ましい。得られる株は、それらの株から取得され、かつ適切な条件下で培養、感染、および／またはトランスフェクトされた場合には組換えＡＡＶを産生する能力を保持するいずれかの株を意味することが理解される。得られる株は特に、必要に応じて外因性遺伝子の挿入、突然変異、および／またはサブクローンを選択することにより取得することが可能である。
本発明の好ましい態様では、用いられる細胞株はＡＡＶカプシド化機能も保持している。
先に記載されるように、組換えＡＡＶは一般的にはヘルパーウイルスで感染された細胞株内での、２つのＡＡＶ逆方向反復領域（ＩＴＲ）によりフランクされる目的の遺伝子を含むプラスミドならびにＡＡＶカプシド化機能を保持するプラスミドとの同時トランスフェクションにより産生される。カプシド化機能が組換えＡＡＶから欠失しており、かつあるプラスミドにおいてトランスで供給されるという事実により実際には、標的細胞を感染させた後には感染性ウイルス粒子の産生に欠損を生じている、すなわち産生不可能となる組換えＡＡＶを調製することが可能となる。ＡＡＶカプシド化機能は主に、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子からなるか、あるいはいずれかの機能的相同遺伝子からなる。ｒｅｐ遺伝子はウイルス複製ならびにウイルス遺伝子の発現に関与しており、そしてｃａｐ遺伝子はウイルス（ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３）のエンベロープ蛋白質をコードしている。これらの遺伝子は既に特徴が決定されており、そしてそれらの配列が刊行物に記載されている（Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．  ４５（１９８３）５５５）。機能的相同遺伝子は、ｒｅｐもしくはｃａｐ遺伝子の改変化（突然変異、抑制、添加、など）により取得され、かつ同一の性質の活性を提示するいずれかの遺伝子である。このような機能的相同遺伝子は、ｒｅｐもしくはｃａｐ遺伝子に相当するプローブを用いて核酸バンクからハイブリダイゼーションにより取得される遺伝子であることもでき、これらも同等に良好なものとなる。
欠損組換えＡＡＶを産生することを可能にさせる目的では、細胞株は従って、本発明に従うとＡＡＶカプシド化機能を保持することが有利である。用いられる細胞株がＡＡＶのｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子、あるいは機能的相同遺伝子の一つもしくは複数のコピーを保持することが一層好ましい。
本発明に従うと、ＡＡＶカプシド化機能はカプシド化プラスミドおよび／または動物ヘルパーウイルス（これは、その細胞株のゲノム内で用いられ、および／またはゲノム内に組込まれる）により供給され得る。
本発明の特別な態様では、全カプシド化機能はカプシド化プラスミドと称されるプラスミドにより供給される。この事例では、本発明の方法は有利なことに、動物ヘルパーウイルスによる感染を受けている動物細胞株を、目的の遺伝子および少なくとも一つのＡＡＶ  ＩＴＲを保持するベクター、ならびに前記ＡＡＶカプシド化プラスミドで同時トランスフェクトさせることを含む。ＡＡＶカプシド化プラスミドが少なくともＡＡＶのｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子、あるいは機能的相同遺伝子を保持することが一層好ましい。
本発明の他の特に有利な態様では、カプシド化機能が動物のヘルパーウイルスにより供給され、その動物ヘルパーウイルスは細胞株のゲノムに用いられる、および／または組込まれる。この事例においては、本発明の方法は、目的の遺伝子および少なくとも一つのＡＡＶ  ＩＴＲを保持するベクターを、動物のヘルパーウイルスで感染させ、かつカプシド化機能を含む（そのゲノム内に組み込ませてある、および／またはそのヘルパーウイルスにより保持させてある）細胞内ににトランスフェクトさせることを含んでなる。この態様は特に有利であるが、それはカプシド化プラスミドを用いる必要がないためである。
本発明の方法において、ＡＡＶのｒｅｐ遺伝子もしくはその遺伝子の機能的相同物がその細胞株のゲノム内に組込まれ、かつＡＡＶのｃａｐ遺伝子もしくはその遺伝子の機能的相同物がその動物ヘルパーウイルスにより保持されることが一層好ましい。本発明の実施の他の好ましい変法では、ゲノム内に挿入された状態でＡＡＶのｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子、もしくは機能的相同遺伝子を含む細胞株が用いられる。好ましい態様ではＡＡＶのｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子、もしくはそれらの機能的相同物は単一構築物として取り込まれるか、あるいは遂次的に別々の構築物として取り込まれることができる。これらの様々な態様では、カプシド化機能を、それら自体のプロモーター、異種プロモーター、もしくは人工プロモーターの制御下に置くことが可能である。有利なことにカプシド化機能を誘導性転写調節因子の制御下に置くことで、その状況に応じてカプシド化機能の発現の誘導もしくは抑制を行うことが可能となる。特に有利な態様では、ＡＡＶのｒｅｐ遺伝子もしくは機能定相同遺伝子は、本発明の構築物内のある誘導性プロモーターの調節下に置かれる。
本発明の実施の更に他の好ましい変法では、ＡＡＶのｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子もしくは機能的相同遺伝子をそのゲノム内に含むヘルパーウイルスが用いられる。
本出願人は実際に、カプシド機能もしくはそれらの内の幾つかを、用いられるヘルパーウイルスのゲノム内に直接挿入することが可能であることを証明した。同様に、出願者は更に、カプシド化機能もしくはそれらの内の幾つかを安定様式で、用いられる細胞株のゲノム内に直接挿入することが可能であることをも証明した。
これに関連して、本発明の目的は更に、組換えＡＡＶを産生させる目的でヘルパーウイルスにより感染させることが可能であり、かつそのゲノム内に組込まれた状態でＡＡＶカプシド化機能の全部もしくは幾つかを含むいずれかの動物細胞株でもある。本発明は、ＡＡＶのｒｅｐ遺伝子もしくはその機能的相同遺伝子をそのゲノム内に含むいずれかの動物細胞株に関することが好ましい。他の好ましい態様では本発明は、そのゲノム内に組込まれた状態でＡＡＶのｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子もしくは機能的相同遺伝子を含むいずれかの動物細胞株に関する。
この細胞株は、例えばＭＤＣＫもしくはＧＨＫ株から取得される株のようなものであるイヌの細胞株であることが特に有利である。
本発明の細胞株は、発現シグナルの制御下に置かれるＡＡＶカプシド機能（一つもしくは複数）を保持するＤＮＡ断片を用いるトランスフェクションにより取得することが可能である。このトランスフェクションは、当業者に知られるいずれかの技術により実施されることがある（リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、電気穿孔法、リポソームの使用）など。このトランスフェクションがリン酸カルシウムの存在下で実施されることが好ましい（実施例５を参照されたい）。様々な発現シグナルを、カプシド化機能の発現を制御するのに用いることができる。これらの発現シグナルは、特にｒｅｐもしくはｃａｐ遺伝子の天然のプロモーター、異種プロモーターであるか、もしくは合成プロモーターでもあることが可能である。ある特別に有利な態様では、ＡＡＶカプシド化機能は本発明に従う細胞株内で、誘導性プロモーター（ＬＴＲ−ＭＭＴＶ、Ｔｃ、など）の制御下に置かれる。このタイプのプロモーターの利用は特に有利であり、それはこのことによりｒｅｐ遺伝子の効果を、用いられるヘルパーウイルス上で調節することが特に可能になるためである。従って本発明の目的は、組換えＡＡＶを産生させる目的でヘルパーウイルスにより感染可能であり、かつ一つもしくは複数の誘導性プロモーターの制御下に、そのゲノム内に組込まれた状態でＡＡＶカプシド化機能の全部もしくは幾つかを含むいずれかの細胞株でもある。
ＡＡＶのｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子（もしくは機能的相同物）を含む株の事例においては、これらの遺伝子は、単一の構築物、もしくは逐次的様式においては２つの個別の構築物のいずれか上でトランスフェクトされる。この第二調製法は特に有利であるが、それはこの方法により可能な限り組換え現象が制約されるためである。従ってこの様式において取得される株は特に安定となる。それに加えて、このトランスフェクション用に用いられる構築物は更に有利なことに、形質転換化細胞を選択することを可能にさせる遺伝子、および例えばゲネチシンに対する耐性のための遺伝子をも保持する。この耐性遺伝子は更に、第一断片と共に同時トランスフェクトされる異なるＤＮＡ断片により保持されることもある。
トランスフェクション後にはその形質転換細胞を選択し（例えば、ゲネチシンに対するそれらの耐性を基に）、そしてそれらのＤＮＡをノザンブロット（Ｎｏｔｈｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ）により分析するが、その目的はそのゲノム内へのＤＮＡ断片（一つもしくは複数）（複数の場合には２つの個別の構築物が用いられている）の組込みを確認することにある。得られる細胞がＡＡＶをカプシド化する能力をその後に、前記機能の欠損を生じている組換えＡＡＶでのインフェクションにより検査することができる。
本発明の目的は更に、そのゲノム内に組込まれた状態でＡＡＶカプシド化機能の全部もしくは幾つかを含む組換えＡＡＶを産生するためのいずれかのヘルパーウイルスでもある。本発明が、そのゲノム内に挿入された状態でＡＡＶ  ｒｅｐ遺伝子もしくは機能的相同遺伝子を含む組換えＡＡＶを産生するためのいずれかのヘルパーウイルスに関することが一層好ましい。本発明が、そのゲノム内に組込まれた状態でＡＡＶのｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子もしくは機能的相同遺伝子を含む組換えＡＡＶを産生するためのいずれかのヘルパーウイルスに関することも好ましい。
有利なことに、組換えＡＡＶを産生するためのヘルパーウイルスはアデノウイルスである。本発明に従うＡＡＶカプシド化機能を含むアデノウイルスは、アデノウイルスと、中でも前記カプシド化機能を保持するプラスミドとの間の相同組換えにより調製することが可能である。相同組換えは、前記アデノウイルスとプラスミドとの適切な細胞株中への同時トランスフェクションの後に生じる。細胞株の一例としては、ヒト胎児腎臓細胞株２９３（Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６（１９７７）５９）（この株は特にそのゲノム内に組込まれた状態でＡｄ５アデノウイルスのゲノムの左側部分（１２％）を含む）、あるいはＭＤＣＫ株を挙げることができる。その後には複製されたベクターは分子生物学の通常の技術により回収および精製される。
更に一層具体的には、そのアデノウイルスがヒト起源のアデノウイルスであるか（Ａｄ２およびＡｄ５アデノウイルスから選択されることが好ましい）；あるいは動物起源のものである（イヌのアデノウイルス（ＣＡＶ１およびＣＡＶ２）から選択されることが好ましい）。ＡＡＶカプシド化機能を、本発明のヘルパーウイルスのゲノムの様々な領域内に組み込ませることができる。有利なことにこれらのカプシド化機能は一つの領域内に挿入されるため、そのウイルスがＡＡＶをトランスコンプレメントする能力は破壊されることがない。このヘルパーウイルスのゲノムの機能的領域内にカプシド化機能を挿入することも可能であり、その領域はその後にはプラスミドもしくは用いられる細胞株のいずれかによりトランスで供給される。従ってヒトアデノウイルスＡｄ２もしくはＡｄ５に関しては、例えばｒｅｐ遺伝子、ｃａｐ遺伝子、もしくはｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を挿入することが可能であり、その結果その／それらの遺伝子のＥ１遺伝子との置換（一か所もしくは複数箇所）が生じる。得られるアデノウイルスを、細胞株２９３（これはそのゲノム中にＥ１遺伝子を保持している）中で組換えＡＡＶを産生するためのヘルパーウイルスとして使用することが可能である（実施例６を参照されたい）。
従って本発明の方法により、治療的に用いることが可能な組換えＡＡＶを産生することが可能となる。取得される組換えＡＡＶは、目的の遺伝子を挿入することによりそのゲノムが少なくとも既に改変させられているいずれかのＡＡＶであり得る。先に指摘したように、多種多様のタイプの組換えＡＡＶが従来の技術において既に記載されている（国際公開第９１／１８０８８号；国際公開第９３／０９２３９号；米国特許第４，７９７，３６８号、米国特許第５，１３９，９４１号、欧州特許第４８８  ５２８号）。一般的にはこれらのＡＡＶはｒｅｐおよび／またはｃａｐ遺伝子に部分的もしくは全般的な欠損を含んでおり、これらの欠損の位置に目的の遺伝子が挿入される。これらの組換えＡＡＶは様々なＡＡＶ血清型（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、およびＡＡＶ４）、ならびに好ましくはＡＡＶ２株から調製されることが可能である。目的の遺伝子は、特別な場合では治療用遺伝子であることが可能である。
本発明の意味の範疇では「治療用遺伝子」は主に、治療効果を保持する蛋白質性産物をコードするいずれかの遺伝子を意味することが理解される。このような様式でコードされる蛋白質性産物は、蛋白質、ペプチドなどであることが可能である。この蛋白質性産物は標的細胞に関しては同種であることが可能である（すなわち、標的細胞中で、その標的細胞がいずれの病原性も提示しない場合に正常に発現される産物である）。この事例では蛋白質の発現により、例えば細胞内における不十分な発現を補うか、あるいは改変を受けているかもしくは前記蛋白質の過剰発現を生じていることにさえ起因して不活化されているもしくは活性が弱まっている蛋白質の発現を補うことが可能となる。この治療用遺伝子は更に細胞性蛋白質の突然変異体（その場合にはそのような突然変異体は安定性が増大している）、すなわち改変化活性などをコードすることも可能である。この蛋白質性産物は更に、その標的細胞に関して異種であることも可能である。この場合では発現された蛋白質は、例えば細胞内の欠損性活性を補うもしくは供給することが可能であり、そのことにより後者の細胞は病原性過程に対する抵抗性を示すか、もしくは免疫応答を刺激することさえも可能になる。
本発明の意味の範疇で引用されることができる治療用産物には、特に、酵素、血液産物、ホルモン、リンホカイン：インターロイキン、インターフェロン、ＴＮＦ、など（フランス特許第９２０３１２０号）、成長ホルモン（エリスロポイエチン、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、など）、神経伝達物質もしくはそれらの前駆体、あるいはそれらの合成の原因となる酵素、栄養因子：ＢＤＮＦ、ＣＮＴＦ、ＮＧＦ、ＩＧＦ、ＧＭＦ、ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ、ＮＴ３、ＮＴ５、ＨＡＲＴ／プレイオトロフィン、など；アポリポ蛋白質；ＡｐｏＡＩ、ＡｐｏＡＩＶ、ＡｐｏＥ、など（フランス特許第９３  ０５１２５号）、リポ蛋白質リパーゼ（ＬＰＬ）、ジストロフィンもしくはミニジストロフィン（フランス特許第９１１１９４７号）、嚢胞性線維症に関連するＣＦＴＲ蛋白質、腫瘍抑制性遺伝子：ｐ５３、Ｒｂ、Ｒａｐ１Ａ、ＤＣＣ、ｋ−ｒｅｖ、など（フランス特許第９３  ０４７４５号）、凝血に関与する以下の因子をコードする遺伝子：因子ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＤＮＡの修復に介在する遺伝子、自殺遺伝子（チミジンキナーゼもしくはシトシンデアミナーゼ）、などが含まれる。
この治療用遺伝子は更に、アンチセンス遺伝子、あるいは標的細胞中でのその発現が遺伝子の発現もしくは細胞性ｍＲＮＡの転写を抑制することを可能にする配列であることも可能である。このような配列は例えば、欧州特許第１４０  ３０８号において記載される技術に従って標的細胞内でＲＮＡに転写させることが可能であり、このＲＮＡは細胞性ｍＲＮＡに対して相補的であり、そしてそのため後述の細胞性ｍＲＮＡの蛋白質への翻訳を阻害する。アンチセンス配列も更に、標的ＲＮＡを選択的に破壊することが可能であるリボチームをコードする配列を含む（欧州特許第３２１  ２０１号）。
目的の遺伝子は更に、ヒトもしくは動物における免疫応答を生じることが可能な抗原性ペプチドをコードする一つもしくは複数の配列をも含むことが可能である。本発明のこの特定の態様では、組換えＡＡＶをワクチンを産生するためもしくは免疫治療用処置に使用することが可能であり、これらはヒトもしくは動物に適用可能であり、主には微生物、ウイルス、もしくは癌に対するものである。これらのワクチンもしくは免疫治療用処置は特に抗原性ペプチドであることが可能であり、この抗原性ペプチドはエプスタインバール（Ｅｐｓｔｅｉｎ  Ｂａｒｒ）ウイルス、ＨＩＶウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス（欧州特許第１８５  ５７３号）、仮性狂犬病ウイルスに特異的であるか、そうでなければ腫瘍にさえも特異的である（欧州特許第２５９  ２１２号）。
目的の遺伝子が更に、所望される細胞もしくは器官内でのそれ自体の発現を可能にさせる配列を含むことも好ましい。これらの配列は、問題となる遺伝子が感染細胞内で機能することが可能である際に天然の状態でその遺伝子の発現の原因となる配列であることが可能である。それらの配列は更に異なる起源を有する配列であることも可能である（他の蛋白質の発現の原因となる配列、あるいは合成配列である場合でさえある）。具体的にはそれらの配列は真核生成物もしくはウイルスの遺伝子のプロモーター配列であることが可能である。例えばそれらの配列は、感染予定の細胞のゲノムに由来するプロモーター配列であることが可能である。同様にそれらの配列は、ウイルスのゲノムに由来するプロモーター配列であることが可能である。これに関連しては、遺伝子Ｅ１Ａ、ＭＬＰ、ＣＭＶ、ＬＴＲ−ＲＳＶなどのプロモーターも例として引用されることがある。それに加えてこれらの発現配列を、目的に遺伝子に、活性化配列、調節配列、もしくは組織特異的発現を付与する配列を添加することにより改変することも可能である。
その上、目的の遺伝子は更に、標的細胞の分泌経路内へ合成治療用産物を輸送するシグナル配列も含むことが可能である。このシグナ配列はその治療用産物の天然のシグナル配列であることが可能であるが、他のいずれかの機能的シグナル配列であることも可能であるし、あるいは人工シグナル配列であることさえも可能である。
本発明に従って調製される組換えＡＡＶは、インビトロ、エックスビボ、もしくはインビボで目的の遺伝子導入を行うのに用いることが可能である。インビトロではそれらのＡＡＶにより、ある遺伝子を、例えば組換え産物を産生させるための目的で細胞株に導入することが可能となる。エックスビボではそれらのＡＡＶを、ある遺伝子を、ある生物体から予め取り出してあり、そして適切な場合には選択および増幅させてさえもある細胞集団に導入するのに用いることができるが、その目的は生物体に細胞を再投与するためにそれらの細胞に所望の特性を付与することにある。インビボでは、それらのＡＡＶを、精製され、かつ適切である場合には一つもしくは複数の薬剤学的賦形剤と組み合わせてある溶液を直接投与することによる遺伝子導入を行うのに用いることが可能である。この後述の事例では、組換えＡＡＶを、局所、皮膚、経口、経腸、経膣、非経口、鼻内、静脈内、筋肉内、皮下、眼内、経皮、などの経路によりそれらを投与する目的のために製剤化することが可能である。それらのＡＡＶを、注射用製剤、特に所望される臓器内への直接注入について許容される薬剤学的賦形剤と組み合わせることが好ましい。これらの製剤は特に、滅菌されているかもしくは等張の溶液であるか、あるいは乾燥、特に凍結乾燥された組成物（これらの製剤により事例次第では、滅菌水もしくは生理学的血清の添加により注射用溶液を構築することが可能となる）であることが可能である。注入に用いられるＡＡＶの用量、ならびに投与回数は様々なパラメーター、具体的には用いられる投与様式、関与する病理形態、発現予定の遺伝子に従って、あるいは治療の所望される期間にさえ従って採択することが可能である。
本発明は従って、治療的に用いることが可能な組換えＡＡＶを調製するための有利な方法、特に疾患を治療するための方法におけるものを提供し、その方法は、前記疾患を治療することが可能な遺伝子を含む組換えＡＡＶのインビボでの投与を含む。より具体的にはこの方法を、蛋白質性もしくは核酸性の産物における欠損症から生じる疾患に適用可能であり、この場合には目的の遺伝子は前記蛋白質産物をコードするか、もしくは前記核酸産物を含む。
本発明は以下に記載される実施例の助けを得て一層詳細に記載されるであろうが、それらの実施例は説明的なものとしてみなされるべきであり、限定的なものとしてみなされるべきではない。
分子生物学の一般技術
分子生物学において通常用いられる方法、例えば、プラスミドＤＮＡの調製的抽出法、塩化セシウム濃度勾配液中でのプラスミドＤＮＡの遠心分離、アガロースもしくはアクリルアミドゲル上での電気泳動、電気溶出によるＤＮＡ断片の精製、フェノールもしくはフェノール／クロロホルムでの蛋白質の抽出、エタノールもしくはイソプロパノールを用いる食塩水媒質中でのＤＮＡの沈殿、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）内への形質転換などは当業者には熟知されており、かつ刊行物中にも豊富な記載がなされている［Ｍａｎｉａｔｉｓ  Ｔ．ｅｔ  ａｌ．、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８２；Ａｕｓｕｂｅｌ  Ｆ．Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ）、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８７］。
ｐＢＲ３２２およびｐＵＣタイプのプラスミド、ならびにＭ１３シリーズのファージは市販の源から取得した（Ｂｅｔｈｅｓｄａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）。
連結用にはＤＮＡ断片を、アガロースもしくはアクリルアミドゲル上での電気泳動によりそれぞれのサイズに従って分離し、フェノールもしくはフェノール／クロロホルム混合物で抽出し、エタノールを用いて沈殿させ、そしてその後に供給元の推奨事項に従ってファージＴ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ社）の存在下でのインキュベーションを行うことが可能である。
突出性５’末端を大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｂｉｏｌａｂｓ社）のクレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）断片を用い、供給元の推奨事項に従って充填することが可能である。突出性３’末端は、製造業社の推奨事項に従って用いられるファージＴ４  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ社）の存在下で除去される。突出性５’末端はＳ１ヌクレアーゼでの慎重な処置により除去される。
合成オリゴデオキシヌクレオチドを用いるインビトロ部位特異的突然変異誘発は、Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．［Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １３（１９８５）  ８７４９−８７６４］により開発された方法に従い、Ａｍｅｒｓｈａｍ社により供給されるキットを用いて実施することが可能である。
ＰＣＲ［ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ−ｃａｔａｌｙｚｅｄ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ、Ｓａｉｋｉ  Ｒ．Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０（１９８５）  １３５０−１３５４；Ｍｕｌｌｉｓ  Ｋ．Ｂ．  ａｎｄ  Ｆａｌｏｏｎａ  Ｆ．Ａ．、Ｍａｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．１５５（１９８７）  ３３５−３５０］と称される技術によるＤＮＡ断片の酵素的増幅を、ＤＮＡサーマルサイクラー（ｔｈｅｒｍａｌ  ｃｙｃｌｅｒ）（Ｐａｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ社）を用い、製造業社の説明事項に従って実施することが可能である。
ヌクレオチド配列は、Ｓａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、７４（１９７７）  ５４６３−５４６７］により開発された方法により、Ａｍｅｒｓｈａｍ社により供給されるキットを用いて確認することが可能である。
図面に対する説明文
図１：プラスミドｐＲＥＰ−ＣＡＰの概略図。
図２：プラスミドｐＡＡＶ−ＥＰＯ−ＮＥＯの概略図。
図３：プラスミドｐＡｄ−ＲｅｐＣａｐの概略図。
実施例１−カプシド化プラスミドｐＲＥＰ−ＣＡＰの構築
この実施例は、組換えＡＡＶのカプシド化に必要な機能を保持するプラスミド（カプシド化プラスミドと称される）の構築法を記載する。より厳密には、ｐＲＥＰ−ＣＡＰと表示されるこのプラスミドはＡＡＶ２のｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を保持する。
プラスミドｐＲＥＰ−ＣＡＰは以下に記載される様式で構築し、それはすなわち：ＡＡＶ２ゲノム（このゲノムのＩＴＲには予め削除してある）を酵素ＸｂａＩでの消化によりプラスミドｐ２０１から単離した。プラスミドｐ２０１はプラスミドｐＥＭＢＬ８（Ｓａｍｕｌｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．  ６１（１９８７）３０９６）のＰｖｕＩＩ部位内にクローン化された全ＡＡＶ２ゲノムを含む。このようにして取得された断片はｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を保持しており、この断片をその後にＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）のＸｂａＩ部位内にクローン化した。このプラスミドの構造を図１に示す。
実施例２−ＡＡＶプラスミドｐＡＡＶ−ＥＰＯ−ＮＥＯの構築
この実施例は、エリスロポイエチン（標識遺伝子）および２つのＡＡＶ２  ＩＴＲをコードするｃＤＮＡを保持するＡＡＶプラスミドの構築法を記載する。このプラスミドはｐＡＡＶ−ＥＰＯ−ＮＥＯあと表示されている（図２）。
このプラスミドを構築する目的で、ラウス（Ｒｏｕｓ）肉腫ウイルス（ＲＳＶ）のＬＴＲの調節下に存在するエリスロポイエチン（カニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ））をコードするｃＤＮＡ、およびその後に続くＳＶ４０ウイルスの初期プロモーターの制御下に存在する遺伝子ｎｅｏ（ネオマイシンに対する耐性を付与する遺伝子）を含む発現カセットを調製した。このカセットをその後にプラスミドｐ２０１のＳａｃＩＩ／ＫｐｎＩ部以内に挿入して、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を含む対応断片を置換した（図２）。
実施例３−細胞株ＭＤＣＫにおけるイヌアデノウイルスＣＡＶ２の産生
この実施例は、イヌ細胞株ＭＤＣＫにおけるイヌアデノウイルスＣＡＶ２の産生法を記載する。
このＭＤＣＫ細胞を、１０％のウシ血清を捕捉してあるＤＭＥＭ培地中で培養した（追加として、培養条件についてはＭａｃａｒｔｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ４４（１９８９）  ９、を参照されたい）。密集細胞をその後に、ＣＡＶ２ウイルスの懸濁液（約５ｐｆｕ／細胞）で感染させた。感染後３０〜４８時間目にその感染化細胞を回収し、そして遠心分離により濃縮した。取得されたペレットを用いて塩化セシウム上でＣＡＶ２アデノウイルスを精製することが可能である。しかしながら力価が弱すぎる場合にはこのペレットを凍結および解凍周期に供し、そして得られる上清をその後に用いてＣＡＶ２ウイルスを増幅させることが好ましい。この増幅のためには上清を用いて、同一条件下でＭＤＣＫ細胞を再感染させ、そしてウイルスの回収について先に記載されるプロトコールをその後に反復させる。この方法により、組換えＡＡＶを産生するためのヘルパーウイルスとして用いることが可能なＣＡＶ２アデノウイルスの精製溶液を取得することが可能となる。
実施例４−イヌのヘルパーアデノウイルスで感染させたＭＤＣＫ細胞株内にエリスロポイエチン遺伝子を保持する組換えＡＡＶの生産
この実施例はイヌアデノウイルスＣＡＶ２で感染させたＭＤＣＫ細胞株内にエリスロポイエチン遺伝子を保持するＡＡＶ組換え体の生産法を記載する。
ＭＤＣＫ細胞（５０％密集度）を、実施例３の条件下で調製された５〜１０ｐｆｕ／細胞でのＣＡＶ２アデノウイルスで感染させた。感染後４〜６時間目に細胞をリポフェクション（Ｆｅｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、ＰＮＡＳ  ８４（１９８７）７４１３）により、５μｇのプラスミドｐＡＡＶ−ＥＰＯ−ＮＥＯおよび５μｇのプラスミドｐＲＥＰ−ＣＡＰと共に同時トランスフェクトさせた。この後４８〜７２時間目に細胞を回収し、そして数周期の凍結および解凍周期に供した。得られる懸濁物を次には遠心分離にかけ（４０００ｒｐｍで１５分間）、そして組換えＡＡＶを含む上清をその後に回収し、そして３０分間５６℃で加熱した。
感染性およびエリスロポイエチン発現を確認する目的で、その上清の試料を用いてＨｅＬａ細胞を感染させた。このＨｅＬａ細胞はヒト上皮細胞癌腫に由来するものである。この細胞株はＡＴＣＣ（参照番号ＣＣＬ２）から取得することが可能であり、同様にその細胞株を培養するための条件もそこから取得することが可能である。細胞および上清を感染後２４時間目に回収した。これらの細胞中のＡＡＶ−ＥＰＯ組換えゲノムの存在はその後に、Ｈｉｒｔ技術（Ｇｌｕｚｍａｎ  ａｎｄ  ｖａｎ  Ｄｏｒｅｎ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．  ４５（１９８３）９１）により抽出された細胞性ＤＮＡについてのサザンブロットハイブリダイゼーション実験を実施することにより確認した。それに加えて、その上清中のエリスロポイエチンの存在を生物学的検査により証明した。
これらの結果により、組換えＡＡＶが動物系内（細胞株およびヘルパーウイルス）で効率よく調製され得ることが明白に示される。
実施例５−ＡＡＶカプシド化機能を含む細胞株の構築
この実施例はＡＡＶカプシド化機能の全部もしくは部分を含む細胞株の構築法を記載する。これらの細胞株により、カプシド化プラスミドの使用を伴うことなく、それらの領域が削除されている本発明に従う組換えＡＡＶの構築が可能となる。これらのウイルスはインビボ組換えにより取得され、そして広域にわたる異種配列を含むことが可能である。
本発明の細胞株は、転写プロモーターおよび停止因子（ポリアデニル化部位）の制御下に、表示遺伝子を保持するＤＮＡ断片を用いて適切な細胞をトランスフェクトすることにより構築される。
トランスフェクションは様々な様式で実施されることがあり、それらは特にリン酸カルシウムの存在中、リポフェクション、電気穿孔法などにより実施される。この実施例ではトランスフェクションはリン酸カルシウムの存在下で実施される。
停止因子は、トランスフェクトさせた遺伝子の天然の停止因子であるか、あるいは異なる停止因子（例えば、ＳＶ４０ウイルスの初期メッセンジャーの停止因子のようなもの）のいずれかであることが可能である。
記載される細胞株中ではｒｅｐおよび／またはｃａｐ遺伝子は誘導性プロモーター；ＭＭＴＶのＬＴＲ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）（これはデキサメサゾンにより誘導される）の制御下に置かれる。他のプロモーターを使用することが可能であることが理解され、それらは特に、例えば異種調節性領域（特にエンハンサー領域）を保持するＭＭＴＶのＬＴＲの変種であるか、あるいはテトラサイクリン（Ｔｃ）プロモーターでさえもあることがある。それに加え、説明文中に記載したように、プロモーターは利用される遺伝子の天然のプロモーターであることも可能である。
有利なことに、そのＤＮＡ断片は形質転換化細胞の選択を可能にさせる遺伝子をも保持する。この遺伝子は特に、例えばゲネチシンに対する耐性をコードする遺伝子のような、抗生物質に対する耐性のための遺伝子であることが可能である。この標識遺伝子は更に、第一断片と共に同時トランスフェクトされる異なるＤＮＡ断片により保持されることも可能である。
トランスフェクション後には形質転換化細胞が選択され（ゲネチシンに対する耐性）、そしてそれらのＤＮＡがノザンブロットにより分析されるが、その目的はＤＮＡ断片（一つもしくは複数）（複数の場合には２つの個別の構築物が用いられる）のゲノム内への組込みを確認することにある。その後に細胞を、組換えＡＡＶをカプシド化する能力について検査し、それに次いで適切なヘルパーウイルスでの感染および適切なＡＡＶプラスミドでのトランスフェクションを実施する。
この技術により、以下に記載される細胞株を取得することが可能となり、それらは：
１．ＭＭＴＶのＬＴＲの制御下にｒｅｐ遺伝子を保持するＭＤＣＫ細胞；
２．ＭＭＴＶのＬＴＲの制御下に同一ＤＮＡ断片上に存在するｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を保持するＭＤＣＫ細胞；
３．ＭＭＴＶのＬＴＲの制御下に２本の個別のＤＮＡ断片上に存在するｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を保持するＭＤＣＫ細胞、
である。
実施例６−ＡＡＶカプシド化機能を含むアデノウイルスの構築
この実施例は、そのゲノム内に挿入されているＡＡＶ  ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を含むアデノウイルスの構築法を記載する。アデノウイルスＡｄ−ＲＳＶ．Ｒｅｐ−Ｃａｐは突然変異体アデノウイルスＡｄ．ｄ１１３２４（Ｔｈｉｍｍａｐｐａｙａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｅｌｌ  ３１（１９８２）５４３）と、ベクターｐＡｄ．ＲＳＶ．Ｒｅｐ−Ｃａｐとの間のインビボ相同組換えにより取得された。
６．１  プラスミドｐＡｄ．ＲＳＶ．Ｒｅｐ−Ｃａｐの構築（図３）
プラスミドｐＡｄ．ＲＳＶ．Ｒｅｐ−Ｃａｐは、プラスミドｐＡｄ．ＲＳＶ．βＧａｌ［Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．  （１９９２）６２６］から、β−ｇａｌ遺伝子の代わりにＡＡＶ  ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を保持するＤＮＡ断片を置換することにより構築された。
これを行う目的で、ＡＡＶ２ゲノム（このＩＴＲは予め削除してある）を含むＸｂａＩ断片をプラスミドｐ２０１から単離した（実施例１を参照されたい）。その後にこの断片をＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミドのＸｂａＩ部以内にサブクローン化させた。その後にこの段階により、ＡＡＶ  ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子をＮｏｔＩ／ＣｌａＩ断片の形態で含む断片を単離することが可能となる。その後にこの断片を、ベクターｐＡｄ．ＲＳＶ．βＧａｌのＸｂａＩ（左側ＩＴＲの下流に位置する）およびＣｌａＩ（Ａｄ５のＰ１Ｘの上流に位置する）部以内にクローン化させ、そのことによりｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子によるβｇａｌ遺伝子の置換が生じる。
６．２  欠損組換えアデノウイルスＡｄ．ＲＳＶ．Ｒｅｐ−Ｃａｐの構築
プラスミドｐＡｄ．ＲＳＶ．Ｒｅｐ−ＣａｐおよびアデノウイルスＡｄ．ｄ１１３２４（酵素ＣｌａＩで直線化させてある）を、相同組換えが生じるのを可能とさせる目的でリン酸カルシウムの存在下で株２９３内に同時トランスフェクトさせた。この様式で作製される組換えアデノウイルスはプラーク精製により選択される。単離後に、組換えアデノウイルスのＤＮＡを細胞株２０３中で増幅させる。
一般的にはウイルス粒子は、既知の方法に従って塩化セシウム濃度勾配液上での遠心分離により精製される（特に、Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５２（１９７３）４５６、を参照されたい）。Ａｄ．ＲＳＶ．Ｒｅｐ−Ｃａｐアデノウイルスは、−８０℃下２０％グリセロール中で保存することが可能である。
同一手法を反復することが可能であると同時に、ｒｅｐ遺伝子もしくはｃａｐ遺伝子の内の一方のみが挿入される。それに加え、この挿入作業はアデノウイルスゲノムの様々な部位で実施され得る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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