(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
二重鎖ＤＮＡ連結方法であって：
a)配列特異的トポイソメラーゼと、その鎖のそれぞれが3'末端近傍に配列特異的なトポイソメラーゼ開裂部位を有する供与体二重鎖ＤＮＡとを、前記トポイソメラーゼが前記供与体ＤＮＡに結合してこれを特異的に開裂させることを可能にする条件下で接触させ、それによりその両端の近傍に共有結合したトポイソメラーゼおよび一重鎖テールを有する前記供与体ＤＮＡを含む複合体を形成する工程と；
b)工程a)で形成された前記ＤＮＡ・トポイソメラーゼ複合体を、該複合体の一重鎖テールに相補的な一重鎖テールを有する5'ヒドロキシで終端した受容体ＤＮＡと接触させて、前記供与体二重鎖ＤＮＡを、該供与体二重鎖ＤＮＡの両端において、前記受容体ＤＮＡに連結させる工程とを具備する方法。
【請求項２】
前記の配列特異的トポイソメラーゼが、ワクシニアトポイソメラーゼ酵素である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記の配列特異的トポイソメラーゼが、修飾済みワクシニアトポイソメラーゼ酵素である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記の開裂部位が5'-(C/T)CCTT開裂部位である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記の開裂部位が、前記ＤＮＡ二重鎖の3'末端の１０bp内にある、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記供与体ＤＮＡがアフィニティーラベルを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記アフィニティーラベルがビオチンである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記供与体ＤＮＡが検出マーカーでラベルされる、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
両方の3'末端に共有結合したトポイソメラーゼを有する直鎖状二重鎖ＤＮＡであって、前記末端は、制限エンドヌクレアーゼを用いた消化により調製されたテールを有する受容体ＤＮＡにハイブリダイズするテールを含んでなる、直鎖状二重鎖ＤＮＡ。
【請求項１０】
ＤＮＡの分子クローニング方法であって：
a)供与体二重鎖ＤＮＡがそれぞれの3'末端に配列特異的なトポイソメラーゼ開裂部位を含むように、それぞれが開裂部位を含むオリゴヌクレオチドプライマ対を用いて供与体二重鎖ＤＮＡをPCRで増幅させることにより、該供与体二重鎖ＤＮＡ基質に、配列特異的トポイソメラーゼ開裂部位を導入する工程と；
b)前記供与体二重鎖ＤＮＡを、配列特異的トポイソメラーゼと共にインキュベーションして、配列特異的トポイソメラーゼ・供与体二重鎖ＤＮＡの複合体を形成させる工程と；
c)上記の配列特異的トポイソメラーゼ・供与体二重鎖ＤＮＡ複合体を、該供与体にコンパチブルは5'張り出し部を有するプラスミドベクタと共にインキュベーションする工程と；
d)上記の配列特異的トポイソメラーゼ・供与体二重鎖ＤＮＡ複合体を、前記プラスミドベクタと共にインキュベーションして、組み換えプラスミドを形成させる工程と；
e)工程d)のプラスミドベクタを宿主細胞へ形質転換する工程とを具備する方法。
【請求項１１】
ＤＮＡの分子クローニング方法であって：
a)配列特異的トポイソメラーゼ開裂部位が逆向きで制限部位のどちらかの側に配置されるように、該制限開裂部位を、プラスミド二重鎖ＤＮＡベクタに導入する工程と；
b)上記のプラスミド二重鎖ＤＮＡベクタを制限酵素と共にインキュベーションして、配列特異的トポイソメラーゼ開裂部位を3'末端のそれぞれに有する直鎖状供与体プラスミドベクタを形成させる工程と；
c)上記の直鎖上供与体プラスミドベクタを配列特異的トポイソメラーゼと共にインキュベーションして、共有結合した二つのトポイソメラーゼ分子を3'末端のそれぞれに含む配列特異的トポイソメラーゼ・供与体プラスミドベクタ複合体を形成させる工程と；
d)上記の配列特異的トポイソメラーゼ・供与体プラスミドベクタ複合体を、5'ヒドロキシ末端を有する相補的な挿入ＤＮＡ受容体とインキュベーションして、該相補的挿入ＤＮＡ受容体を該供与体プラスミドベクタに共有結合させる工程と；
e)工程d)の、共有結合した挿入物を有するプラスミドベクタを、宿主細胞へ形質転換させる工程とを具備した方法。
【請求項１２】
前記の配列特異的トポイソメラーゼがワクシニアトポイソメラーゼ酵素である、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記の配列特異的トポイソメラーゼが、修飾済みワクシニアトポイソメラーゼ酵素である、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記の開裂部位が配列CCCTTである、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記のトポイソメラーゼ開裂部位が、ＤＮＡ二重鎖のそれぞれの鎖の3'末端の１０bp内にある、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１６】
ポリヌクレオチドの合成方法であって：
a)複数のＤＮＡ鎖をアニーリングして、それぞれの3'末端に配列特異的トポイソメラーゼ開裂部位を有している、枝分かれした基質を形成する工程と；
b)配列特異的トポイソメラーゼとインキュベーションすることにより、上記の枝分かれした基質を開裂して、枝分かれしたトポイソメラーゼ複合体を形成する工程と；、
c)上記の枝分かれしたトポイソメラーゼ複合体を、相補的な一価および／または二価のＤＮＡ受容体とインキュベーションする工程とを具備する方法。
【請求項１７】
三つの二重鎖ＤＮＡ鎖を使用する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記の三つのＤＮＡ鎖が、三価のY型に枝分かれした構造を形成する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ゲル精製により、前記のY型に枝分かれした三価の構造から、残留する二価および／または一価のリンカを取り除くことを更に具備する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
沈殿により、上記の工程（b）の枝分かれしたトポイソメラーゼ複合体を精製することを更に具備する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記の配列特異的トポイソメラーゼがワクシニアトポイソメラーゼ酵素である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２２】
前記の配列特異的トポイソメラーゼが、修飾済みのワクシニアトポイソメラーゼ酵素である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２３】
前記の開裂部位が配列CCCTTである、請求項１６に記載の方法。
【請求項２４】
前記のトポイソメラーゼ開裂部位が、前記二重鎖ＤＮＡのそれぞれの鎖の3'末端の１０bp内にある、請求項１６に記載の方法。
【請求項２５】
前記のＤＮＡ鎖の１以上が5'標識されている、請求項１８に記載の方法。
【請求項２６】
前記の標識が放射性化学薬品である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
遺伝子ターゲティング方法であって：
a)供与体二重鎖ＤＮＡ基質を配列特異的トポイソメラーゼと共にインキュベーションすることにより、それぞれの３'末端に配列特異的トポイソメラーゼ開裂部位を有する二価の供与体二重鎖ＤＮＡ基質を開裂させて、トポイソメラーゼ結合型供与体二重鎖ＤＮＡ鎖を形成する工程と；
b)上記のトポイソメラーゼ結合型供与体二重鎖ＤＮＡを細胞へ形質導入する工程とを具備する方法。
【請求項２８】
前記の配列特異的トポイソメラーゼがワクシニアトポイソメラーゼ酵素である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記の配列特異的トポイソメラーゼが、修飾済みのワクシニアトポイソメラーゼ酵素である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記の開裂部位が配列CCCTTである、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
前記のトポイソメラーゼ開裂部位が、前記二重鎖ＤＮＡのそれぞれの鎖の3'末端の１０bp内にある、請求項２７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
本願は、１９９４年１２月１９日出願の合衆国特許出願番号08/358,344の継続出願であり、その内容は、本願で参照することにより本願に組み込む。
本発明は、合衆国ヘルス・アンド・ヒューマン・サービスディパートメント（U.S. Department of Health and Human Services）の国立衛生研究所（National Institute of Health）からの補助金（No.GM-46330）のもとに行なわれた。よって合衆国政府は、本発明に関して一定の権利を有する。
本願を通して、種々の発行物を括弧内のアラビア数字で参照する。これらの発行物の完全な引用は、請求の範囲のすぐ前の、明細書の最後の部分にある。これらの発行物の開示内容は、その全体を本願で引用することにより本願に組み込み、本発明の属する分野の従来技術をより完全に記載する。
発明の背景
in vitroでのキメラＤＮＡ分子の構築は、伝統的には別個のタンパク質成分で触媒される、二つの酵素的工程に依存している。部位特異的制限エンドヌクレアーゼが、ＤＮＡリガーゼの作用により末端で共有結合的に連結されるような、決められた末端を有する直鎖状のＤＮＡを作りだすために使用される。
ワクシニアＤＮＡトポイソメラーゼは、３１４アミノ酸の、ウイルスにコードされた真核性のタイプＩトポイソメラーゼであり[１１]、二重鎖ＤＮＡに結合して一方の鎖のバックボーンであるホスホジエステル結合を開裂させる。この酵素は、高レベルの配列特異性を示し、これは制限エンドヌクレアーゼのものに類似している。開裂は、切断可能な鎖のコンセンサスのペンタピリミジン配列である、5'-（C/T）CCTTでおきる[１２、５、６]。切り込まれる鎖の3'リン酸基と該タンパク質のチロシル残基（Tyr-274）との間での共有結合的付加物の形成により、開裂反応における結合エネルギーは保存される[１０]。ワクシニアトポイソメラーゼは、共有結合的に支えられた鎖を再連結して、元々開裂されたのと同じ結合をつくる（ＤＮＡのリラックス化で起こるように）か、または非相同的受容体ＤＮＡに再結合して、それにより組み換え分子を作りだす[７、８]。
ワクシニアトポイソメラーゼで触媒されるＤＮＡ連結反応のリパートリーは、単一のCCCTT開裂部位を有している、合成のＤＮＡ基質を使用して研究された。切断可能な結合がＤＮＡ二重鎖の3'末端の近くに位置しているような基質の場合には、開裂は、開裂鎖の下流部分の自発的な解離を伴う[４]。得られるトポイソメラーゼ・ＤＮＡ複合体は、5'単一鎖テールを有していて、もし受容体分子において、活性化された供与体複合体のものに対して相補的な5'OHテールを有しているならば、受容体ＤＮＡに再結合する。制限エンドヌクレアーゼ消化により産生した４塩基の張り出した末端を有するプラスミドＤＮＡを使用して、受容体ワクシニアトポイソメラーゼによる粘着末端連結が証明された[８]。
本発明の要約
本発明は、タンパク質−ＤＮＡ複合体を未結合のＤＮＡより精製するのを容易にすることが可能な親和性のタグを有している。修飾済みのワクシニアトポイソメラーゼを提供する。本発明は更に、トポイソメラーゼ酵素に特異的な、修飾済みの配列を提供する。本発明は、二重鎖ＤＮＡを連結する方法、ＤＮＡの分子クローニング方法、ポリヌクレオチドの合成方法、及び遺伝子ターゲティングの方法を提供する。最後に本発明は、配列特異的トポイソメラーゼを使用して生体外で連結してあり、また適切な宿主細胞を形質転換することが可能なＤＮＡの断片からなる組み換えＤＮＡ分子であって、ポリペプチド活性をコードしているＤＮＡを具備していることを特徴とする、上記の組み換えＤＮＡ分子を提供する。
図の簡単な説明
図１A-１C：粘着末端連結
図１A:２４ヌクレオチドの、CCCTT含有ヘアピン基質の、トポイソメラーゼ仲介性開裂を、酵素濃度の関数で分析した。基質の構造を示してある；鎖切断の部位を矢印で示してある。５０mMトリス塩酸（ｐＨ7.5）、32Ｐで標識した０．５pmolのＤＮＡ、及びトポイソメラーゼを含んだ反応混合物（２０ml）を３７℃で５分間インキュベーションした。SDSを1％まで添加して、共有結合した複合体をトラッピングした。次いで試料を０．１％SDS含有１０％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動にかけた。乾燥ゲルをオートラジオグラフィー感光で検出して、放射性標識されたＤＮＡの、トポイソメラーゼポリペプチドへのトランスファーにより、共有結合的複合体の形成を明らかにした。付加物形成の程度は、標識化されたタンパク質を含んでいるゲル切片のシンチレーション計測により定量し、タンパク質へ共有結合的にトランスファーする、インプットの5'32Ｐ標識化オリゴヌクレオチドの割合で示した。
図１B：５０mMのトリス塩酸（pH７．５）、４６０fmolの5'32P標識化ヘアピン基質、及び２pmolのトポイソメラーゼを含有する反応混合物を３７℃で５分間インキュベーションし、次いで直鎖状のpUC18ＤＮＡ受容体（末端に関して３５０fmol）を表示してあるように添加して、室温で更に５分間インキュベーションした。試料を０．２Ｍ NaCl、０．５％SDSに調節して、次いで０．５mg／mlの臭化エチジウム含有TBE（９０mMトリス、９０mMホウ酸塩、２．５mM EDTA）で、１．２％のアガロースゲル電気泳動にかけた。ＤＮＡは、ショートウェーブUV照射下での、染色ゲルの写真撮影で可視化した。
図１C：同じゲルを次いで、乾燥してオートラジオグラフィーにかけた。放射性標識されたトポイソメラーゼ・ＤＮＡ「供与体」複合体、及びpUC鎖トランスファー産物の位置を右に示してある。鎖トランスファーの受容体として使用したpUC１８ＤＮＡは、単一切断制限酵素での消化により、定量的に直鎖状にした。該直鎖状のＤＮＡの5'リン酸塩末端は、該ＤＮＡの末端を子ウシ腸管内ホスファターゼ（CIP）で、表示してあるように処置して、5'OH末端に変換した。それぞれの反応にいれた受容体ＤＮＡをレーンの番号で、明確にした。レーンＭ（左のパネル）には、ＤＮＡサイズマーカが含まれている（l HindIII消化物）。
図２：一価、二価、及び三価の基質
相補的ヘアピンオリゴヌクレオチドS300とＳ301の構造を示してある。5'末端は、アスタリスクで示してある。トポイソメラーゼ開裂のCCCTT認識部位を下線で示してある。S300とS301との間でのアニーリングで形成される、二価のリンカーＤＮＡの構造を真ん中に示してある。下には、オリゴヌクレオチドS300、S304、及びS303のアニーリングで形成された、三価のY型に枝分かれしたリンカの構造を示してある。
図３A−３C：一価、二価、及び三価の基質の、トポイソメラーゼ仲介性開裂
図３A：放射性標識した開裂産物を、TBE中で１００Vで、ネイティブのポリアクリルアミドゲル（７．５％アクリルアミド、０．２％ビスアクリルアミド）の電気泳動にかけた。乾燥ゲルのオートラジオグラムを示してある。レーン１には5'32P46量体の「フリップ」ヘアピン（S300;図２）が含まれている。レーン２には、４６bpの二価の開裂基質が含まれている（図２）。この構造は、5'32P−S３００鎖を３倍過剰のモル比で非標識の46-ntの相補鎖（S301、または「フッロップ」鎖；図２）にアニーリングすることにより、形成された。レーン３には、5'32P-S300を、標識された鎖に対してそれぞれ３倍過剰のモル比で存在させた二つの非標識４６量体のオリゴ（S303及びS304）にアニーリングさせることにより形成させた、三価のY型に枝分かれした基質が含まれている。
図３B:５０mMのトリス塩酸塩（pH7.5）、０．６pmolの5'32P標識ＤＮＡ、及び２０pmolのトポイソメラーゼを含有した、開裂反応混合物（レーン２、４、６、及び８）を、３７℃で５分間インキュベーションした。酵素は対照反応（レーン１、３、５、及び７）では除いた。共有結合複合体は、SDSを１％にまで付加してトラッピングした。（試料は熱変性させなかったことに注意）。標識済開裂産物は、SDS-PAGEにより分解した。フリーのＤＮＡはブロモフェノールブルー色素のフロントとともに移動した。種々の共有結合性のタンパク質-ＤＮＡ複合体の構造は、オートラジオグラムの右側に示してある。プレステインドマーカタンパク質の位置とサイズ（kb）は、左側に示してある。インプットの基質は、オートラジオグラムの下に示してある:*Ｓ300(レーン１及び２);*Ｓ301(レーン３及び４);*Ｓ300/301（レーン５及び６）；Ｓ300/*Ｓ301（レーン７及び８）。
図３Ｃ:０．３６pmolの放射性標識したY型に枝分かれした基質(*Ｓ300/Ｓ303/Ｓ304）、及び２０pmolのトポイソメラーゼを含有する開裂反応(レーン２)。酵素は、対照反応（レーン１）からは除いた。種々の共有結合性タンパク質-ＤＮＡ複合体は、オートラジオグラムの右側に示してある。プレステインドマーカの位置とサイズ（kb）は、左側に示してある。
図４A-４B:二価のリンカによる、二つの末端のトポイソメラーゼ仲介性連結
図４A反応混合物（２０ml）は、５０mMのトリス塩酸塩（pH7.5）、２pmolのトポイソメラーゼ、及び5'32Ｐ標識済みの一価の基質（*Ｓ300、０．６pmol-レーン１及び２）、または5'32Ｐ標識済みの二価のリンカ（０．３pmolの*Ｓ300/301、すなわち０．６pmolの末端-レーン３及び４）の何れかを含んでいた。３７℃、５分間でのインキュベーション後に、上記の反応物に5'OH Hind III切断済みpUC18ＤＮＡ受容体（末端に関して380fmol）を、表示してあるように追加し、更に室温で５分間インキュベーションした。試料は、０．２Ｍ NaCl、及び０．５％SDSに調節して、次いでTBE中で１．２％のアガロースゲル電気泳動にかけた。臭化エチジウムで染色したゲルを左に示してある。マーカＤＮＡ断片（レーンＭ）の位置とサイズ（kbp）は、左側に示してある。
図４B：同じゲルを乾燥してオートラジオグラフィーにかけた。放射性標識したトポイソメラーゼ-ＤＮＡ「供与体」複合体、及び鎖トランスファー産物の位置は、矢印で右側に示してある。
図５A-５D：ワクシニアトポイソメラーゼを使用した、ＤＮＡの分子クローニング
図５A：トポイソメラーゼベースのクローニング用の連結反応は、実験の詳細に記載してあるように行った。このプロトコールを概略的に例示してある。
図５B-５C:プラスミドＤＮＡは、pUC18(親ベクタ、図５Ｂ）、及びpUC-T11(トポイソメラーゼ連結反応に由来する代表的な形質転換体、図５C)を含んだ細菌より調製した。ＤＮＡは、販売人提供の反応緩衝液を使用して、それぞれのレーンの上に特定してある制限エンドヌクレアーゼで消化した。非消化のプラスミドＤＮＡは、レーン「--」に示してある。レーンＭには、ＤＮＡサイズマーカが含まれている。参照用断片の位置とサイズ（kbp）を示してある。
図５Ｄ：４６-bpの二価のリンカの構造を示してある。リンカ内部の特徴的制限部位は、配列の上に示してある。
図６A-６B：三価のリンカによるトポイソメラーゼ仲介性の二つの末端の連結
図６A：三価の基質のそれぞれの鎖（図２）を、5'で標識してゲルで精製した。Y型に枝分かれした基質は、等モル量の３つの鎖（*Ｓ300、*Ｓ303、*Ｓ304）のアニーリングにより作りだされた。アニーリングした産物を、ネイティブな７．５％のポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけて分析した。このゲルのオートラジオグラフを示してある。三価の基質はレーン３にある。成分鎖をパラレルで分析した（レーン１中の*Ｓ303、レーン２中の*Ｓ304）。標識した種の構造は、右側に示してある。
図６B：反応混合物（２０ml）は、５０mMのトリス塩酸塩（pH7.5）、１pmolのトポイソメラーゼ、及び5'32P標識済みの一価基質（*Ｓ304-レーン１及び２）、または5'32P標識済みの*Ｓ300/*Ｓ303/*Ｓ304-レーン３及び４）の何れかを含有していた。それぞれの反応には、３５０fmolのインプットの基質（開裂末端で表示）が含まれていた。３７℃で５分間のインキュベーション後、反応に5'OH Hind III切断pUC18ＤＮＡ受容体を、表示してあるように追加し、更に室温で５分間インキュベーションした。試料を０．２Ｍ NaCl、０．５％SDSに調節し、ついでTBE中で１．２％のアガロースゲル電気泳動にかけた。臭化エチジウムで染色したゲルを示してある。マーカＤＮＡ切断の位置とサイズ（kbp）は、左側に示してある。
図６C：同じゲルを乾燥して、オートラジオグラフィーにかけた。放射性標識されたトポイソメラーゼ-ＤＮＡ「受容体」複合体、及び鎖トランスファー産物の位置は、矢印と括弧で右に示してある。
図７：二価の末端連結で予想される産物
直鎖状のpUC受容体内での、Hind III（Ｈ）、XmnI（X）、SspI（S）、及びAccI（A）に関する制限部位、及び予想される連結産物の位置を矢印で示してある。pUCＤＮＡは、太線で示してある。それぞれの種に由来する、SspI及びXmnI制限断片の予想されるサイズは、左側にリストしてある。放射性標識されたリンカＤＮＡを含むと予想される断片は、アスタリスクで示してある。
図８：三価末端連結の予想される産物
pUCＤＮＡへの三価末端連結で予想される産物を箱の中に示してある。XmnIでの消化により、４つの三価の産物が生成することが予想されるが、この産物は右側に示してある。pUC「アーム」の長さ（kbpで表示）を示してある。
図９A-９C：末端連結反応産物の制限エンドヌクレアーゼ消化
図９A：反応混合物（２０ml）には、５０mMのトリス塩酸塩（pH7.5）、１pmolのトポイソメラーゼ、及び一価の基質（*Ｓ300-レーン１及び２）、二価のリンカ（*Ｓ300/*Ｓ301-レーン３及び４）、または三価のリンカ（*Ｓ300/*Ｓ303/*Ｓ304-レーン５及び６）の何れかが含まれていた。３７℃で５分間のインキュベーション後に、上記反応物に5'OH Hind III切断pUC19「二価」ＤＮＡ受容体（６００fmol直鎖状ＤＮＡ-レーン１、３、及び５）、または5'OH Hind III/5'-P AccI切断pUC19「一価」受容体（５００fmolの直鎖状ＤＮＡ-レーン２、４、及び６）の何れかを追加して、更に室温で５分間インキュベーションした。１０X緩衝液を（NEB2）加え、混合物を、推奨されている反応条件に調節し、該試料をSspI（１０単位；New England BioLabs）で３７℃で６０分間消化した。試料を０．５％SDSに調節して、TBE中で１．２％アガロースゲル電気泳動にかけた。臭化エチジウム染色したゲルを示してある。マーカＤＮＡ断片の位置とサイズ（kbp）を左側に示してある（レーンＭ）。
図９B-９C：放射性標識した二価のリンカ（レーン１及び２）、または三価のリンカ（レーン３-５）を含む開裂反応に、二価のpUC19受容体（レーン１及び３）、または一価のpUC19受容体（レーン２及び４）を追加した。対照反応には、受容体を加えなかった（レーン５）。鎖トランスファー反応産物は、XmnI（４０単位）で３７℃で２時間消化させ、次いでアガロースゲル電気泳動で分析した（図９Ｂ）。マーカＤＮＡ断片の位置とサイズ（kbp）は、写真の左側に示してある（レーンＭ）。同じゲルを乾燥して、オートラジオグラフにかけた（図９C）。放射性標識されたトポイソメラーゼ-ＤＮＡ「供与体」複合体、及び鎖トランスファー産物の位置を、右側に矢印と括弧で示してある。
本発明は、親和性タグを有する、修飾済みのワクシニアトポイソメラーゼ酵素を提供する。この修飾済みワクシニアトポイソメラーゼ酵素は、ワクシニアトポイソメラーゼ・ＤＮＡ複合体の、未結合ＤＮＡからの精製を容易にすることが可能である。本発明はまた、修飾済みの、配列特異的トポイソメラーゼ酵素を提供する。この配列特異的トポイソメラーゼ酵素は、タイプＩの如何なる、部位特異的トポイソメラーゼであってもよい。
トポイソメラーゼは、ＤＮＡ鎖の開裂と再結合により、ＤＮＡのトポロジー的状態を修飾する、一連の酵素である。ワクシニアトポイソメラーゼ酵素は、ワクシニアウイルスにコードされる、真核性のタイプＩトポイソメラーゼである。
一つの態様において、ワクシニアトポイソメラーゼ酵素は、３１４アミノ酸の、ウイルスにコードされたタイプＩトポイソメラーゼである。
別の態様においては、この修飾済みワクシニア酵素は、部位特異的タイプＩトポイソメラーゼである。部位特異的タイプＩトポイソメラーゼには、ポックスウイルストポイソメラーゼのようなウイルス性トポイソメラーゼが含まれるが、これのみには限定されない。ポックスウイルストポイソメラーゼの例には、ショープ線維腫ウイルス、及びORFウイルスが含まれる。その他の部位特異的トポイソメラーゼは、当業者らにはよく知られている。
別の態様において親和性タグは、以下のものを含んでいるが、これらには限定されない：グルタチオン-S-トランスフェラーゼ融合タグ、マルトース結合タンパク質タグ、ヒスチジン若しくはポリヒスチジンタグ。
一つの態様において、ワクシニアトポイソメラーゼ・ＤＮＡ複合体は、ヒスチジンのタグがついたトポイソメラーゼ・ＤＮＡ複合体をニッケルカラムにかけてイミダゾールで基質を溶出することにより、未結合のＤＮＡより精製される。本発明は、二重鎖ＤＮＡ分子、すなわち二本鎖ＤＮＡ分子であって、そのそれぞれの末端に修飾済みのワクシニアトポイソメラーゼ酵素を有しているものを提供する。
ワクシニアトポイソメラーゼは、二重鎖ＤＮＡに結合し、高レベルの配列特異性を提示して、切断される鎖のコンセンサスのペンタピリミジン配列である5'-(C/T)CCTT↓、または関連する配列で開裂して、一方の鎖のホスホジエステルバックボーンを開裂する。一つの態様において、切断可能な結合は二重鎖ＤＮＡの3'末端から2-12bpの範囲に位置している。別の態様において、ワクシニアトポイソメラーゼにより開裂可能な複合体形成には、開裂部位の上流に６つの二重鎖ヌクレオチドと、下流に２つのヌクレオチドが必要である。ワクシニアトポイソメラーゼが開裂させうる配列の例には、+6/-6二重鎖GCCCTTATTCCC、+8/-4二重鎖TCGCCCTTATTC、+10-/-2二重鎖TGTCGCCCTTAT、及び+10/-2二重鎖GTGTCGCCCTTAが含まれるが、これらには限定されない。
本願で使用する、供与体という用語は、3'末端の10bp内に存在するCCCTT開裂部位を含む二重鎖ＤＮＡの意味し、また受容体という用語は5'OH末端を有する二重鎖ＤＮＡを意味する。トポイソメラーゼにより一端、共有結合的に活性化されると供与体は、塩基対を形成する受容体末端にトランスファーされる。
本発明は、修飾済みの、タグを有したワクシニアトポイソメラーゼを利用した、二重鎖ＤＮＡの連結方法を提供する。本方法では、供与体の二重鎖ＤＮＡ基質は二価の供与体二重鎖ＤＮＡ基質であり、すなわちこれは二つのトポイソメラーゼ開裂部位を含んでいる。一つの態様は、配列特異的トポイソメラーゼ開裂部位を含む供与体二重鎖ＤＮＡを開裂させることと、供与体二重鎖ＤＮＡ基質を配列特異的トポイソメラーゼとインキュベーションしてトポイソメラーゼ結合供与体二重鎖ＤＮＡ鎖を形成させることと、更に該トポイソメラーゼ結合供与体二重鎖ＤＮＡ鎖を、5'ヒドロキシル終結のコンパチブル受容体ＤＮＡとインキュベーションして、トポイソメラーゼ-結合供与体二重鎖ＤＮＡ鎖を、ＤＮＡ受容体鎖に連結させるようにすることを具備している。
酵素とインキュベーションしてＤＮＡを開裂させる方法、及びインキュベーションにより連結させる方法は、当業者には知られている。一つの態様において上記の、配列特異的トポイソメラーゼはワクシニアトポイソメラーゼ酵素である。別の態様において配列特異的トポイソメラーゼは、修飾済みのワクシニアトポイソメラーゼ酵素である。ワクシニアの、または修飾済みのワクシニアトポイソメラーゼ酵素を使用する態様において、開裂部位はオリゴピリミジンモチーフの、5'(C/T)CCTT↓である。
一つの態様において、ＤＮＡ連結産物の所望のサブポピュレーションは、供与体二重鎖ＤＮＡの5'末端に親和性標識を導入することにより精製される。好ましい態様において、親和性標識はビオチン部分（モイエティー）であり、精製はビオチンの結合した産物をストレプトアビジンに結合させることにより行なわれる。他の精製方法は、当業者らに知られているものである。
二価の末端連結により、直鎖状のコンカテマーを、コンパチブルな末端を有するポリヌクレオチドから組み立てることが可能になる。リンカが、それぞれの開裂部位において同じ張り出しかたをするように設計されていると、鎖のトランスファー産物は、ヘッド-ヘッド、ヘッド-テイル、およびテール-テール異性体のように、ランダムに向く。反応の制御は、開裂部位において異なった張り出しかたをしている二価のリンカを使用することにより、容易に制御できる；このようにして、二つの異なる制限酵素で調製したＤＮＡ受容体を、厳密にヘッド-テイルの様式で組み立てることが可能である。対称的な二価のリンカを、非対称性の末端を有する受容体ＤＮＡと組み合わせることにより、連結は、ヘッド-ヘッドのみにすることが可能である。
二価の鎖のトランスファーはまた、分子クローニングで利用される性質である、受容体の環状化に帰着する。例えば、挿入部（合成の二価基質）にトポイソメラーゼ開裂部位をおき、開裂したＤＮＡをプラスミドベクタにクローニングするときがそうである。この戦略は、PCRで増幅したＤＮＡ断片のクローニングによく適している。ワクシニアトポイソメラーゼを使用してPCR産物をクローニングするためには、10ヌクレオチドの配列、-5'-XXXXAAGGGC-が、増幅に使用する二つのプライマの5'末端にある必要がある。この5'-XXXX部分は、PCR産物が最終的にクローニングされる制限部位とコンパチブルである、4塩基の如何なる張り出した部分に対応することが可能である。増幅工程により、3'末端の両方において配列-GCCCTT0xxxx-3'(xxxxxはXXXXに対して相補的)を有する二重鎖分子を生成する。PCR産物をトポイソメラーゼとインキュベーションすると、両方の末端での開裂が生じて、共有結合的に活性化したPCR断片の、ベクタＤＮＡへの連結が、図５Aに必須的に記載したようにして起きる。
本発明は更に、ＤＮＡの分子クローニング方法を提供する。一つの態様は、供与体二重鎖ＤＮＡ分子を、配列特異的トポイソメラーゼ開裂部位を含むオリゴヌクレオチドプライマでPCR増幅することにより、該供与体二重鎖ＤＮＡ基質に配列特異的トポイソメラーゼ開裂部位を導入することと、該供与体二重鎖ＤＮＡを配列特異的トポイソメラーゼとインキュベーションすることにより配列特異的トポイソメラーゼ・供与体二重鎖ＤＮＡ複合体の形成を生じさせることと、該配列特異的トポイソメラーゼ・供与体二重鎖ＤＮＡ複合体を、該供与体にコンパチブルな5'張り出し部を有するプラスミドベクタとインキュベーションすることと、該配列特異的トポイソメラーゼ・供与体二重鎖ＤＮＡ複合体を該プラスミドベクタとインキュベーションすることと、インキュベーションされた該プラスミドベクタを宿主細胞内へ形質転換することとを具備している。
一つの態様において、配列特異的トポイソメラーゼはワクシニアトポイソメラーゼ酵素である。別の態様においては、該配列特異的トポイソメラーゼは修飾済みのワクシニアトポイソメラーゼ酵素である。ワクシニア、または修飾済みのワクシニアトポイソメラーゼ酵素を使用する態様において、開裂部位はオリゴピリミジンモチーフの、5'(C/T)CCTT↓である。
PCR増幅法は、当業者らに知られている。一つの態様において、ワクシニアトポイソメラーゼを利用した、PCR産物のクローニングには、増幅に使用する二つのプライマの5'末端に１０ヌクレオチドの配列である、5'-XXXXAAGGGC-が必要である。5'-XXXX部はPCR産物がクローニングされる制限部位にコンパチブルな、如何なる４塩基の張り出し部に対応していることが可能である。増幅工程により、3'末端の両方に、配列-GCCCTTφxxxx-3'（xxxxはXXXXに相補的）を含む二重鎖分子が生成される。PCR産物をトポイソメラーゼとインキュベーションすると、両末端で開裂が生じ、共有結合的に活性化したPCR断片の、ベクタＤＮＡへの連結が可能になる。
発現に必要な制御配列には、プロモータ、ＲＮＡポリメラーゼが結合するエンハンサ配列や、リボソームの結合のための転写開始配列がある。例えば、細菌性発現ベクタには、lacプロモータのようなプロモータ、及び転写開始のためのシャイン−ダルガーノ配列と開始コドンのAUGが含まれるが、これらには限定されない。同様に、真核性の発言ベクタには、ＲＮＡポリメラーゼII用の非相同的、または相同的なプロモータ、下流のポリアデニレーションシグナル、開始コドンAUG、及びリボソームの解離用の終止コドンが含まれるが、これらには限定されない。このようなベクタは、商業的に入手可能であり、または当該技術分野でよく知られる方法、例えば一般的にベクタを構築するための上記した方法により、既知の配列から組み立てることが可能である。
本発明においては、プラスミドベクタの形質転換は、原核宿主細胞（例えば細菌細胞）に対するものである。好ましい態様においては、宿主細胞は大腸菌（E.coli）である。
トポイソメラーゼに基づくクローニングは、通常のリガーゼに基づくPCR産物のクローニングに対し幾つかの利点を有している。一つ目は、トポイソメラーゼ法は、増幅ＤＮＡの3'末端におけるＤＮＡポリメラーゼによる鋳型に基づかないヌクレオチドの付加に関連した如何なる問題も回避するということである。トポイソメラーゼに基づくクローニングにかけられる、PCR産物の3'末端における鋳型に基づかない如何なる塩基（Ｎ）も、共有結合的付加物形成により自発的に解離し、よってベクタへの連結には何も影響はない。二つ目に、トポイソメラーゼ−仲介性クローニングにおいて、連結されうる唯一の分子は共有結合的に活性化された挿入部であり、またこの挿入部はベクタへトランスファーされるのみであるということである。ベクタ自身の試験管内での共有結合的閉鎖の可能性はなく、これは低バックグラウンドを保証する。挿入部が互いに連結する機会もまた、全くなく（これは5'リン酸塩で終結したPCRプライマを使用することにより保証される）、これによりコンカテマー様反復のクローニングを予め排除できる。三つ目に、PCRプライマを設計する際に、増幅するＤＮＡ配列を考慮する必要が全くないということである。標準的なクローニングでは、制限部位をPCRプライマ内に導入して、PCR産物を制限酵素で開裂させてリガーゼによりベクタへ連結させるのを容易にするのが通例となっている。プライマ間の配列がすでに分かっていない場合には、増幅部内には存在していない部位をプライマに対して選択するのが問題となる。この問題は、PCRの方法論が進歩して、非常に長い標的（10-40kbp）がルーチン的に増幅されるようになるにつれてより関連する。内部のトポイソメラーゼ開裂部位（CCCTT、または関連したペンタピリミジン配列）の問題はトポイソメラーゼに基づくクローニングにとって顕著な障害ではない。これは、内在性部位での開裂-再連結平衡は、非共有結合的結合状態を強く好むからであり、これら開裂される部位では、二重鎖の一つの鎖のみにニックが入るためである。内在性の開裂部位は塩濃度を上昇させることにより再連結を誘導させることが可能であり、これは非共有結合的に結合しているトポイソメラーゼを解離させ、反応の平衡を左に寄らせる。対照的に、3'末端の近くでの開裂は明らかに定量的であり、受容体ＤＮＡが提供されないならば、必然的に不可逆である。
トポイソメラーゼに基づくクローニング戦略は、挿入部の共有結合的な活性化に限定する必要はない。プラスミドポリリンカを、CCCTT部位が制限部位のどちらか一方側で反対向きにおかれるように設計することにより、3'両末端にトポイソメラーゼ部位を有している直鎖状のベクタを生成することができる。一端、トポイソメラーゼにより共有結合的に活性化されると、ベクタ供与体は如何なる相補的な挿入部受容体（これは5'OH末端を有している必要がある）をもクローニングするのに使用することができ、よって挿入部なしのベクタの再連結を予め排除できる。トポイソメラーゼにより3'近傍部位での開裂が起きると形成される供与体複合体は非常に安定である。室温での共有結合性のトポ・ＤＮＡ複合体の長時間のインキュベーション後でも、供与体分子は、ほぼ定量的に相補的受容体へトランスファーすることが可能である。実際に、トポ・リンカ複合体は６ＭグアニジンHClで変性させ、次いでグアニジンの除去により、鎖トランスフェラーゼ活性が完全に回復した自発的な復元が可能である。よって、トポイソメラーゼ活性型のベクタは、大量に調製しておき、分子クローニングに必要である時に何度も使用することができる。
本発明は、ポリヌクレオチドを合成する方法を提供する。一つの態様は、複数の二重鎖ＤＮＡ鎖をアニーリングすることにより、配列特異的トポイソメラーゼ開裂部位を3'両末端に有する枝分かれした基質を形成させる工程と、配列特異的トポイソメラーゼとインキュベーションして、上記の枝分かれした基質を開裂させて枝分かれしたトポイソメラーゼ複合体を形成させる工程と、枝分かれしたトポイソメラーゼ複合体を相補的な、一価及び／または二価のＤＮＡ受容体とインキュベーションする工程とを具備している。このポリヌクレオチド合成方法は、試験管内での末端標識化、リガンドタギング（ligand tagging）、分子クローニングによって有益である。
一つの態様において、配列特異的トポイソメラーゼは、ワクシニアトポイソメラーゼ酵素である。別の態様においては、配列特異的トポイソメラーゼは、修飾済みワクシニアトポイソメラーゼ酵素である。ワクシニア、または修飾済みのワクシニアトポイソメラーゼ酵素を使用する態様において、開裂部位はオリゴピリミジンモチーフである5'(C/T)CCTT↓である。
一つの態様において、二重鎖ＤＮＡ鎖のアニーリングは、ＤＮＡ鎖を混合して、６５℃で５分間加熱して、次いで該混合物を室温まで冷却することにより行なわれる。当業者は、二重鎖ＤＮＡのアニーリングに際して従う方法を知っている。
一つの態様において、三価のY型に枝分かれした構造を形成する、３つの二重鎖ＤＮＡ鎖が使用される。Y型に枝分かれした核酸を、三価のリンカを含む鎖トランスファー反応により産生することは、反応産物の診断的制限消化により証明できる。Y型に枝分かれした産物の収量は、残余の二価及び一価のリンカを、基質調製物から除去すること、または三価のリンカが全て、３つの結合したトポイソメラーゼ分子で飽和していることを保証することにより最適化できる。この条件はともに、ゲルによるリンカの精製、及び三価の共有結合的に活性化された種の沈殿による精製により、あわせることが可能である。二価の連結に関して、Y型に枝分かれした産物の向きは、リンカの設計を操作すること、または非対称的な受容体を使用することで制御可能である。ヘッド-ヘッド-ヘッド型の、Ｙ型に枝分かれした、三価の鎖のトランスファー産物は、如何なるものでも理論的には、元の受容体ＤＮＡのテールに対して相補的な、第二の三価供与体複合体を加えることにより、三価の格子へと構成させることが可能である。高次の原子価を有する供与体基質は、トポに基づいて、ＤＮＡから三次元の格子、及び多面体を合成するのに使用することが可能である。トポイソメラーゼに基づく合成により、複雑なバイオポリマーを作る、潜在的に強力な別の戦略が提供される。
一つの態様において、二重鎖ＤＮＡ鎖は、5'が標識されていて、この5'が標識されたＤＮＡ鎖は、二つの二重鎖ＤＮＡ鎖にアニーリングされて、基質の放射化学的精製を可能にする。放射化学的な精製は、当業者らには知られている。
本発明は、遺伝子ターゲティングの方法を提供する。遺伝子ターゲティングには、細胞へのＤＮＡの導入が関わる。このＤＮＡは、トポイソメラーゼ結合性供与体二重鎖ＤＮＡにより染色体ＤＮＡへ取り込まれる。この結合したトポイソメラーゼは、該供与体ＤＮＡを染色体へと封じ込める。一つの態様は、二価の供与体二重鎖ＤＮＡ基質を配列特異的トポイソメラーゼとインキュベーションすることにより、配列特異的トポイソメラーゼ開裂部位を有する二価の供与体二重鎖ＤＮＡ基質を開裂する工程と、上記のトポイソメラーゼが結合した供与体二重鎖ＤＮＡを適切な細胞へ形質転換する工程とを具備している。
一つの態様において、配列特異的トポイソメラーゼは、ワクシニアトポイソメラーゼである。別の態様において、配列特異的トポイソメラーゼは、修飾済みのワクシニアトポイソメラーゼ酵素である。ワクシニア、または修飾済みのワクシニアトポイソメラーゼ酵素を使用する態様において、開裂部位はオリゴピリミジンモチーフの、5'(C/T)CCTT↓である。
形質転換は、当業者に知られるどのような標準的方法でも行うことが可能であり、これらには電気穿孔法、リン酸カルシウムトランスフェクション法や、リポフェクション法があるが、これらには限定されない。
本発明は、配列特異的トポイソメラーゼを使用して、生体外、または試験管内で連結され、また適切な宿主細胞を形質転換することが可能なＤＮＡの断片からなる組み換えＤＮＡ分子であって、ポリペプチド活性をコードしているＤＮＡを具備することを特徴とする、上記の組み換えＤＮＡ分子を提供する。
一つの態様において、配列特異的トポイソメラーゼは、ワクシニアトポイソメラーゼ酵素である。別の態様において、配列特異的トポイソメラーゼは、修飾済みのワクシニアトポイソメラーゼ酵素である。ワクシニア、または修飾済みのワクシニアトポイソメラーゼ酵素を使用する態様において、開裂部位はオリゴピリミジンモチーフの、5'(C/T)CCTT↓である。
本発明は更に、以下の実験の詳細で例示されている。このセクションは本発明の理解を助けるために明示されているが、これは如何なるようにしても以下に続く請求の範囲を限定することを意図するものではなく、またそのように解釈するべきではない。
実験の詳細
I.方法
A)酵素の精製
ワクシニアＤＮＡトポイソメラーゼは、記載してあるようにして[9]、大腸菌（E.coli）で発現して精製した。本研究で使用しているヘパリンアガロース酵素画分は、以前記載された[9]調製物と同じである。該酵素は、SDS-ポリアクリルアミドゲルで決定したところ、３３kDaのトポイソメラーゼポリペプチドに関してほぼ均一であった。タンパク質濃度は、バイオラッド（Biorad）の染料試薬（dye reagent）を使用し、ウシ血清アルブミンを標準として使用して決定した。
B)5'が標識されたオリゴヌクレオチド基質の合成
DMT-シアノエチルホスホラミダイト化学によるＤＮＡオリゴヌクレオチドの合成は、スローン・ケッタリング（Sloan Kettering）微生物学研究室で、アプライド・バイオシステムズのモデル380Ｂまたはモデル394、自動ＤＮＡ合成機を使用して、製造業者指定のプロトコールにしたがって行った。CCCTT開裂モチーフを含むオリゴヌクレオチドは、[g32P]ATP及びT4ポリヌクレオチドキナーゼの存在下での酵素学的リン酸化により、5'末端で標識した。典型的な反応混合物（２５ml）は、５０mMトリス塩酸（ｐＨ8.0）、１０mMジチオスレイトール、10mM MgCl2、０．１mM ATP、１００mCi[g32P]ATP、T4ポリヌクレオチドキナーゼ(２０単位、Bethesda Research Laboratories）、及び５００pmolのＤＮＡオリゴヌクレオチド（ＤＮＡはA260で定量した）を含んでいた。インキュベーションは３７℃で６０分間であった。標識したＤＮＡは、非変性１８％ポリアクリルアミドゲル電気泳動により、タンパク質及び放射性ヌクレオチドを含まなくした。フルサイズの標識済みオリゴヌクレオチドは、ウェットゲルをオートラジオグラフィーにかけることにより位置を決定して、標識済みＤＮＡは、切り出したゲル切片を０．４mlの水に８時間、室温で浸して回収した。標識済みＤＮＡの、相補的オリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションは、０．２Ｍ NaCl中で、７５℃まで加熱し、次いで緩やかに室温まで冷却して行った。アニーリングした基質は４℃で保存した。
C)トポイソメラーゼに基づくクローニング
５０mMのトリス塩酸（pH7.5）、2pmolのトポイソメラーゼ、及び一価のリンカ（０．６pmol）、または二価のリンカ（０．３pmol）の何れかを含んだ反応混合物を、３７℃で５分間インキュベーションした。対照の反応物は、トポイソメラーゼが含まれていたが、ＤＮＡ基質は含まれていなかった。それぞれの混合物を次いで、5'OH hind III切断pUC18 ＤＮＡ受容体（３８０fmol）で補充して、更に室温で５分間インキュベーションした。それぞれの試料の一定量（１ml）を、バイオラッドジーンパルサー電気穿孔装置で使用して、大腸菌（E.coli）ＤＨ５ａを形質転換した。細菌細胞の調製及び電気的形質転換は、製造業者指定の様にして行った。形質転換した細菌の一定量は、０．１mg/mlのアンピシリン含有LBアガー上にまいた。
II.例１  粘着末端連結
ワクシニアトポイソメラーゼは、図１に示すように、潜在的に相補的なわずか２塩基を含む二重鎖ＤＮＡの粘着末端連結を行うことが可能であった。この実験では、「供与体」は、単一のCCCTTモチーフを含む、２４量体のヘアピンオリゴヌクレオチドであって、切断可能な結合が3'の平滑末端より２塩基のところに位置しているものである（図１A）。この基質の開裂の程度は、酵素濃度に比例した（図１A）。トポイソメラーゼ・ＤＮＡ複合体は、ネイティブのアガロースゲル電気泳動中は、別個の種として移動した（図１C）。未標識の5'ヒドロキシル終結CpGテールの直鎖状pUC18ＤＮＡ（pUCをAccIで消化後にアルカリホスファターゼで処理して得られる）の付加により、トポイソメラーゼ結合ＤＮＡ鎖の、直鎖状ＤＮＡ「受容体」へのトランスファーが生じる。鎖トランスファー反応の産物は、ヘアピン末端を含む、放射性標識された２．７kbpの直鎖状の形態であった(図１C、レーン２）。5'リン酸塩末端を有する、AccIで制限したプラスミドＤＮＡは、受容体としては不活性である（図１Ｃ、レーン３）。［5'OH仲介性の受容体の必要条件により、反応産物が、トポイソメラーゼ調製物に混在している通常のＤＮＡリガーゼにより形成される可能性が排除された。]EcoRIでの制限（5'-AATT）、またはHind IIIでの制限（5'-AGCT）で生成する非相補的な5'OHの張り出し部を有する、直鎖状のプラスミドＤＮＡ（図１Ｃ、レーン４及び６）は、SmaIでの制限により生成する5'OH平滑末端の直鎖状ＤＮＡ（レーン５）と同様に、受容体としては無効性であった。
III.例２  供与体としての二価のリンカ
４６量体ＤＮＡ鎖二つをアニールして、3'末端から4ヌクレオチドにトポイソメラーゼ開裂部位を有する、「二価」の４６bp基質を形成した（図２）。構成する鎖のアニーリングがうまくいったことは、ネイティブのゲル電気泳動で二重鎖分子の泳動度（図３A、レーン２）が、ヘアピンＤＮＡのもの（図３A、レーン１）と比較して減少したことにより証明した。「フリップ」、または「フロップ」の一価のヘアピンは、ワクシニアトポイソメラーゼにより容易に開裂し、SDS-PAGEでは４３kDaで移動する（図３B、レーン２及び４）、共有結合的なタンパク質−ＤＮＡ付加物が生じた。トポイソメラーゼを二価の二重鎖基質とインキュベーションすると４６kDaと７２kDaの二つの複合体が生じたが、４６kDaの種はCCCTT開裂部位の一つに共有結合的に単一のトポイソメラーゼが結合したものを現わしていて、７２kDaの複合体は、同じＤＮＡ分枝状の両方の部位で開裂することにより生じる（図３B、レーン６及び８）。
一価のヘアピンＤＮＡを、相補的な5'-OH-AGCT張り出し部を有している直鎖状pUCＤＮＡに対して、実質的に定量的にトランスファーした（図４A-4B、レーン２）。二価のトポイソメラーゼ−ＤＮＡ複合体を同じ受容体でインキュベーションすると、二価のリンカが直鎖状pUC受容体の二つの相補的末端に連結して生じる、複雑な産物の組みが生じた（図４A-４B、レーン４）。これらには、環状pUC及び直鎖状pUCのコンカテマーが含まれていた。EtBr染色ＤＮＡ産物の分布において有意なpUC受容体分子の画分を、二価の末端結合にかけた（図４A、レーン４）。連結イベント全ては、反応産物に組み込まれる放射性標識済みのリンカＤＮＡで行った（図４B、レーン４）。
IV.例３  ワクシニアトポイソメラーゼを利用したＤＮＡの分子クローニング
直鎖状ＤＮＡの両末端を相補的な受容体へ連結するというトポイソメラーゼの能力により、分子クローニングにおける別のアプローチが示唆された。図５に示した概略において、「挿入部」は、3'両末端にCCCTTを含む二価の４６bpリンカであった。リンカの配列には、エンドヌクレアーゼNdeI、BglII、EcoRVに対する制限部位が含まれていた。トポイソメラーゼによる二価のリンカの開裂により、Hind III制限部位に相補的な4塩基の張り出し部が生じた。「ベクタ」は、Hind IIIで開裂してアルカリホスファターゼで脱リン酸化したpUCＤＮＡであった。ベクタを二価のトポイソメラーゼ−ＤＮＡ供与体複合体へ加えると、該挿入部の該ベクタへの共有結合的連結が生じるはずである。大腸菌（E.coli）へ形質転換すると、これらの環状化された分子はアンピシリン抵抗性のコロニーになることが可能なはずである。直鎖状pUCと二価のリンカとを含んだトポイソメラーゼ反応混合物で形質転換した細菌に由来する、アンピシリン抵抗性コロニーは、直鎖状pUCと一価のリンカ、または直鎖状pUCとリンカなしの何れかを含んだ、対照のトポイソメラーゼ反応物で形質転換した細菌で観察されたものと比較すると、１１０倍高かった。
プラスミドＤＮＡを６つの別個の形質転換体の培養より回収して、pUC18プラスミドＤＮＡとパラレルで、制限エンドヌクレアーゼ消化により分析した（図５B）。［図５Ｃに示した組み換えクロンpUC-T11の制限パターンは、他の、ここでは示していない５つのクローンとは区別がつかなかった]。開始pUC１８プラスミドにはEcoRVやBglIIに対する部位は全くないが、一方組み換えクローンにはそれぞれの酵素に対して単一の部位が含まれているが、これは３つの制限部位を有する二価のリンカの挿入によるものである。同様に開始プラスミドには単一のNdeI部位が含まれ、一方組み換えクローンにはリンカ挿入部内に二番目のNdeI部位が含まれている。pUC-T11中の新規のNdeI断片のサイズは、該リンカＤＮＡが、予想したようにpUCポリリンカ内に挿入されたことを示した。これは、組み換えプラスミドが、トポイソメラーゼによるHind III張り出し部の鎖トランスファーで、元のHind III部位を喪失したという発見により確認された（鎖トランスファー反応は、プラスミド-挿入体結合部に、Hind IIIでは開裂できないAAGCTA及びTAGCTT配列を生じさせるはずである）。SphIに対する制限部位は、ポリリンカ内のHind IIIのすぐ隣に位置しているが、これは組換え体全てにおいて保持されていて（データは非掲載）、これはHind III部位の喪失が鎖トランスファー中に起こる欠失によるものではないことを示している。よって、二価のリンカＤＮＡは、単純な方法、すなわち細菌の形質転換工程を排除した方法で、たった１０分間でpUC１８ベクタ内にうまくクローニングすることができる。
V.例４  供与体としての三価のリンカ
４６量体のＤＮＡ鎖３つをアニーリングして、3'末端のそれぞれより4ヌクレオチドのところにトポイソメラーゼ開裂部位を有する、「三価」のY型に枝分かれした基質を形成した。該基質の放射化学的純度を最適化するために、鎖の一つを5'で放射性標識して、モル過剰で存在している他の鎖へアニーリングした（図３A）。放射性標識されたY型に枝分かれした基質は、、46bpの直鎖状二重鎖分子よりも、ゆっくりと移動した（図３A、レーン３）。Y分子の異常な電気泳動での挙動はまた、SDS-PAGEでも明らかであり、ここでは三価の基質が３９kDaタンパク質と同じ位置で移動した（図３C、レーン１）。Ｙ型に枝分かれした構造は、トポイソメラーゼとインキュベーションすると定量的に開裂し、３つの複合体が分解して、トポポリペプチドが１、２、または３つ共有結合的に結合したＹ分子に対応したものが現れた（図３C）。開裂したＤＮＡのほとんどには、２または３の結合したトポイソメラーゼ分子が含まれていた。
鎖のトランスファーを三価の供与体複合体で試験するために、それぞれが放射性標識された等モル量の構成鎖をアニーリングすることにより、Y型に枝分かれした分子を調製した。３つの鎖のＹ型は、アニーリング反応の優勢な産物を構成したが（図６A、レーン３）、二価のリンカもまた存在していた（３つの分子には、図６に示してあるように、対を形成していない「バブル」が含まれる）。放射性標識した基質を、トポイソメラーゼＤＮＡ供与体複合体より、相補的5'-OH-AGCT張り出し部を有する直鎖状pUC18受容体へ、定量的にトランスファーした(図６Ｃ、レーン３と４とを比較)。複数の連結産物の複雑な組は、EtBr染色及びオートラジオグラフィーにより明らかであった（図６Ｂ−６Ｃ、レーン４）。これらには、環状pUC及び直鎖状pUCコンカテマーはもちろん、高次構造（図６Ｃ中で括弧で示してある種）に含まれていた。コンカテマー及び高次の形態はいずれも、一価のＤＮＡリンカを含む対照の鎖トランスファー反応では観察されなかった(図６Ｂ−６Ｃ、レーン２)。
VI.例５  三価の鎖トランスファー産物の特徴付け
トポイソメラーゼ仲介性末端連結により生じる組み換え分子は、pUC配列内で一度切断する制限エンドヌクレアーゼでの消化により更に分析した。図７では、予想されるトポイソメラーゼによる二価の末端連結が、SspI、及びXmnIでの消化時のそれぞれの予想される制限断片とともに示されている。三価の末端連結の産物は、図８に示されている。鎖トランスファー産物のSspI及びXmnIでの消化後のスペクトラムを示す実験結果は、図９に示されている。この分析において、開裂するとHind III制限部位とコンパチブルなテールのついた供与体複合体を生じるそれぞれのリンカを、二つの受容体分子（一つは二価で一つは一価）で試験した。二価の受容体は、5'-OH Hind III張り出し部を両末端に有する直鎖状のpUC１９であった。多価のリンカの、二価受容体への鎖トランスファーにより、環状及び直鎖状コンカテマーの形成を、図７に示してあるように、ヘッド-ヘッド、テール-テール、またはヘッド-テール様式で行えるようになる。一価の受容体は、5'-OH Hind III部位を一つの末端に有し、5'-リン酸塩AccI部位をもう一方の末端に有するpUC19であった。トポイソメラーゼによるリンカのAccI末端へのトランスファーは、以下の二つにより、前もって排除される：まず、末端は完全ではないため、次にトポイソメラーゼは5'リン酸塩鎖を再連結できないため。一価の受容体はトポイソメラーゼ供与体複合体と、利用可能なコンパチブルな末端で反応するが、環状またはコンカテマー状のものを形成することはできないであろう。よって種々の種の構造は、一価、二価及び三価のリンカが一価、及び二価の受容体と反応させられる反応物の制限消化の直接的比較から推量される。
図９Aにおいて、トポイソメラーゼ鎖トランスファーのSspI消化について考えてみる。一価のリンカを二価のpUC19受容体のどちらかの末端に連結しても、環状化または二量体化は支持されたかった。よって、産物はSspIで開裂して直鎖状の単量体に由来する二つの断片を生じた(図９A、レーン１)(図７参照)。二価のリンカを二価の受容体へ連結すると、更に３つの産物（ヘッド-ヘッド・マルチマーに特徴的な４．１dbp断片；テール-テール連結を示す１．３kbpの断片；及び環状分子に由来する２．７kbp種）が生じた(図９A、レーン３）。二価のリンカと一価の受容体へ連結すると、４．１kbpのヘッド-ヘッド断片を生じたが、テール-テールまたは環状産物を示す断片は全く生じなかった（図９A、レーン３と４とを比較）。これは全く予想したとおりであったが、それはAccI「テール」が鎖トランスファーに対して不活性であるためである。三価のＹ-リンカ及び二価の受容体を含んだ反応では、二つの新規の高分子量産物が生じた（図９A、レーン５）。三価のリンカ及び一価の受容体でも観察されている（図９A、レーン６）、最も大きい産物は（図９Aでは矢印の先で示してある）、ヘッド-ヘッドの様式で連結されているpUC分子を３つ含んでいる、Ｙ型に枝分かれした組換え体に対応しているはずである。それぞれのアームの長さは、２kbpであると予想されている。この種の電気泳動での移動度は、枝分かれしたＤＮＡに対して予想されるように、異常に遅かった。二価の受容体に独特の高次の複合体は、ヘッド-ヘッド、及びヘッド-テール向きの混合した連結のpUC１９ＤＮＡが含まれている、Y型に枝分かれした産物であると想像される。
鎖トランスファー産物をXmnIで消化して、上記の事柄が確認され、また拡張された（図９B−９Ｃ）。標識された二価のリンカと標識されていない二価のpUC受容体を含む反応物の消化により、特徴的な直鎖状の３．７kbp（ヘッド-ヘッドのマルチマー）、１．７kbp（テール-テールマルチマー）、及び２．７kbp（環状）の断片が生じた。これらの産物は、EtBr染色とオートラジオグラフィーで検出された（図９B、レーン１）。テール-テール連結を示す１．７kbpの種は、（末端にタグのついた直鎖状単量体、またはヘッド-テールマルチマーの何れかより由来する）１．８５の断片のすぐ前を移動した。１．７kbpの種は、一価のpUC受容体とで形成した産物の消化では存在していなかった（図９Ｂ、レーン２）。同様に、２．７kbpの種及び放射性標識した０．８kbpの断片（pUCの「テール」末端へ連結に特徴的なもの）は、一価の受容体消化物には存在していなかった（図９Ｂ、レーン２）。
標識した三価のリンカ及び二価のpUC19受容体とで形成した産物のXmnI消化には、二価のリンカでは見られなかった４つのユニークな種が含まれていた（図９Ｂ、レーン３と１とを比較）。これらの分子の３つは、高分子量のEtBr染色バンドより明らかであった。四番目の種はヘッド-ヘッド直鎖状断片のかろうじて先に移動し、オートラジオグラフで最もそれが明らかになる（図９Ｃ、レーン３）。これらの分子は、図８に示してある４つの可能なY型構造に対応する。演繹的には、仮に連結の向きに偏りが全くないのならば、ヘッド-ヘッド-ヘッド、ヘッド-ヘッド-テール、ヘッド-テール-テール、テール-テール-テールのアイソマーの分布は1：3：3：1であると予想される。実際に、これは実験的に観察されたものである（図９Ｂ、レーン３）。Y型に枝分かれした産物の予想した構造と一致して、最も大きい種（ヘッド-ヘッド-ヘッド）のみが、三価のリンカと一価のpUC受容体との反応で検出された。
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配  列  表
（１）一般的情報
（i）出願人：Shuman, Stewart
（ii）発明の名称：ワクシニアＤＮＡトポイソメラーゼを使用した、分子クローニング及びポリヌクレオチド合成のための方法
（iii）配列の数：５
（iv）通信宛先：
(A)名宛人：クーパー  ＆  ダンハム
(B)通り：1185  アベニュー  オブ  アメリカズ
(C)市：ニューヨーク
(D)州：ニューヨーク
(E)国：アメリカ合衆国
(F)郵便番号：10036
（v）コンピュータ読取り可能な形態：
(A)媒体タイプ：フロッピーディスク
(B)コンピュータ：IBM PCコンパチブル
(C)オペレーティングシステム：PC-DOS/MS-DOS
(D)ソフトウエア：PastentInリリース＃1.0  バージョン＃1.30
（vi）現在の出願データ：
(A)出願番号：未定
(B)出願日：未定
(C)分類：
（viii）アトニー／エージェント情報
(A)氏名：White,John P.
(B)登録番号：２８，６７８
(C)参照／ドケット番号：４６２５０-A-PCT
（ix）電信情報：
(A)電話：(212)278-0400
(B)テレファックス：(212)391-0525
（２）配列認識番号1のための情報：
（i）配列特性：
(A)長さ：１２塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：genomic DNA
（iii）ハイポセティカル：ＮＯ
（iv）アンチセンス：ＮＯ
（xi)配列：配列認識番号1
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（２）配列認識番号2のための情報：
（i）配列特性：
(A)長さ：１２塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：genomic DNA
（iii）ハイポセティカル：ＮＯ
（iv）アンチセンス：ＮＯ
（xi)配列：配列認識番号2
0003745375.tif 000004
（２）配列認識番号3のための情報：
（i）配列特性：
(A)長さ：１２塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：genomic DNA
（iii）ハイポセティカル：ＮＯ
（iv）アンチセンス：ＮＯ
（xi)配列：配列認識番号3
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（２）配列認識番号4のための情報：
（i）配列特性：
(A)長さ：１２塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：genomic DNA
（iii）ハイポセティカル：ＮＯ
（iv）アンチセンス：ＮＯ
（xi)配列：配列認識番号4
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（２）配列認識番号5のための情報：
（i）配列特性：
(A)長さ：１０塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：genomic DNA
（iii）ハイポセティカル：ＮＯ
（iv）アンチセンス：ＮＯ
（xi)配列：配列認識番号5
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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