(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
前駆細胞を樹状突起細胞へと増殖および分化させるための組成物であって、c-ｋｉｔリガンド（ＫＬ）、ＴＮＦα、および造血性因子を含有し、これら各成分の量は、当該組成物が前駆細胞を樹状突起細胞へと増殖および分化させるために有効な量である組成物。
【請求項２】
請求項１に記載の組成物であって、前記造血性因子がＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＩＬ−３およびｐＩＸＹからなる群から選択される組成物。
【請求項３】
請求項１に記載の組成物であって、前記造血性因子がＧＭ−ＣＳＦである組成物。
【請求項４】
請求項１に記載の組成物であって、前記造血性因子がＧ−ＳＣＦである組成物。
【請求項５】
請求項１に記載の組成物であって、前記造血性因子がＭ−ＣＳＦである組成物。
【請求項６】
請求項１に記載の組成物であって、前記造血性因子がＩＬ−３である組成物。
【請求項７】
請求項１に記載の組成物であって、前記造血性因子がｐＩＸＹである組成物。
【請求項８】
前駆体細胞をex-vivoで樹状突起細胞へと増殖および分化させる方法であって、前駆体細胞を、c-ｋｉｔリガンド（ＫＬ）、ＴＮＦαおよび造血性因子を含有する組成物で処置することを具備し、前記組成物の各成分の量は、当該組成物が前駆細胞を樹状突起細胞へと増殖および分化させるために有効な量である方法。
【請求項９】
請求項８に記載の方法であって、前記造血性因子がＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＩＬ−３およびｐＩＸＹからなる群から選択される方法。
【請求項１０】
請求項８に記載の方法であって、前記造血性因子がＧＭ−ＣＳＦである方法。
【請求項１１】
請求項８に記載の方法であって、前記造血性因子がＧ−ＣＳＦである方法。
【請求項１２】
請求項８に記載の方法であって、前記造血性因子がＭ−ＣＳＦである方法。
【請求項１３】
請求項８に記載の方法であって、前記造血性因子がＩＬ−３である方法。
【請求項１４】
請求項８に記載の方法であって、前記造血性因子がｐＩＸＹである方法。
【請求項１５】
抹消血球レベルを増大させるための組成物であって、c-ｋｉｔリガンド(ＫＬ)、ＴＮＦα、および造血性因子を含有し、これら各成分の量は、当該組成物が抹消血球レベルを増大させるために有効な量である組成物。
【請求項１６】
請求項１５に記載の組成物であって、前記造血性因子がＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、ｐＩＸＹおよびＩＬ−１からなる群から選択される組成物。
【請求項１７】
請求項１５に記載の組成物であって、前記造血性因子がＧＭ−ＣＳＦである組成物。
【請求項１８】
請求項１５に記載の組成物であって、前記造血性因子がＧ−ＣＳＦである組成物。
【請求項１９】
請求項１５に記載の組成物であって、前記造血性因子がＭ−ＣＳＦである組成物。
【請求項２０】
請求項１５に記載の組成物であって、前記造血性因子がＩＬ−３である組成物。
【請求項２１】
請求項１５に記載の組成物であって、前記造血性因子がｐＩＸＹである組成物。
【請求項２２】
請求項１５に記載の組成物であって、前記造血性因子がＩＬ−１である組成物。
【請求項２３】
抹消血球レベルをex-vivoで増大させる方法であって、前駆体細胞を、c-ｋｉｔリガンド（ＫＬ）、ＴＮＦαおよび造血性因子を含有する組成物で処置することを具備し、前記組成物の各成分の量は、当該組成物が前駆細胞を樹状突起細胞へと増殖および分化させるために有効な量である方法。
【請求項２４】
請求項２３に記載の方法であって、前記造血性因子がＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、ｐＩＸＹおよびＩＬ−１からなる群から選択される方法。
【請求項２５】
請求項２３に記載の方法であって、前記造血性因子がＧＭ−ＣＳＦである方法。
【請求項２６】
請求項２３に記載の方法であって、前記造血性因子がＧ−ＣＳＦである方法。
【請求項２７】
請求項２３に記載の方法であって、前記造血性因子がＭ−ＣＳＦである方法。
【請求項２８】
請求項２３に記載の方法であって、前記造血性因子がＩＬ−３である方法。
【請求項２９】
請求項２３に記載の方法であって、前記造血性因子がｐＩＸＹである方法。
【請求項３０】
請求項２３に記載の方法であって、前記造血性因子がＩＬ−１である方法。
【発明の詳細な説明】
この出願は、1992年４月23日に出願された米国特許出願第07/873,962号の一部継続出願であり、その内容は参照として本出願に組み込まれる。
ここに記載の発明は、アメリカ合衆国国立健康協会およびアメリカ癌協会から、夫々R01-CA 32926およびACS MV246D号の授与番号で付与された援助の下に行われた。従って、アメリカ合衆国政府は本発明に対して一定の権利を有する。
〔発明の背景〕
この出願の全体を通して、括弧内のアラビア数字によって種々の刊行物が引用される。これら刊行物の完全な目録が、請求の範囲の直前の明細書末尾に列記されている。これら刊行物の開示は、本発明が属する技術の状態をより完全に記述するために、その全体が、参照としてこの出願に組み込まれる。
c-ｋｉｔプロトオンコジーン（癌原遺伝子）は、未同定リガンドのためのトランスメンブランチロシンキナーゼ受容体をコードし、またコロニー刺激因子-1（ＣＳＦ-1）／血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）／ｋｉｔ受容体サブファミリーの一員である（７，４１，５７，２３）。最近になって、c-ｋｉｔはマウスのホワイト-スポッティング（Ｗ）遺伝子座の対立遺伝子であることが示された（９，１７，３５）。Ｗ遺伝子座での突然変異は、発生の際および成人生命体中において、生殖細胞、色素細胞および造血系の異なった細胞集団の増殖および／または移行および分化に影響を及ぼす（４７，５１）。造血機能に対する影響は、幹細胞に対すると同様、赤血球細胞系統および肥満細胞系統に対するものであり、重篤なＷ対立遺伝子の殆どのホモ接合体にとって致命的な大赤血球性貧血（４６）と、結合組織および粘膜肥満細胞の完全な欠如（７２）とをもたらす。Ｗ突然変異は細胞自立的な影響を与え（２８，４６）、この性質に対応して、c-ｋｉｔＲＮＡ転写物がＷ突然変異の標的において発現することが示された（３５）。高レベルのc-ｋｉｔＲＮＡ転写物は、一次骨髄由来の肥満細胞および肥満細胞系で見られた。幾らか低いレベルの転写物が、メラニン細胞および赤血球細胞系において見られた。
c-ｋｉｔに対するリガンドを同定することは、該リガンドが、c-ｋｉｔを発現し且つin vivoでＷ突然変異により影響される異なった細胞型に対して多面発現的な影響を有し得るので、極めて重要かつ興味深いものである。c-ｋｉｔリガンドを産生し得る細胞型に関する重要な洞察は、c-ｋｉｔ／Ｗの機能に関する知識から導かれ得る。Ｗ／ＷVマウスの結合組織および胃腸管粘膜の両者における肥満細胞の欠如によって、肥満細胞の発生におけるc-ｋｉｔの機能が示された。骨髄由来の肥満細胞（ＢＭＭＣ）はインターロイキン３（ＩＬ-3）依存性であり、胃腸管粘膜に見られる肥満細胞（ＭＭＣ）に類似している（９２，９３）。腹腔由来の結合組織肥満細胞（ＣＴＭＣ）は、in vitroにおいて、増殖のためにＩＬ-3およびＩＬ-4の両者を必要とする（７９，７５）。インターロイキンＩＬ-3およびＩＬ-4は、活性化されたＴ細胞および活性化された肥満細胞によって産生される、特性のよく知られた造血性増殖因子(hematopoietic growth factors)である（９２，９４，９５，９６，９７）。また、繊維芽細胞によって産生される、追加の肥満細胞増殖因子の存在が予言されている（４７）。ＩＬ-3の不存在下において、腹腔由来のＢＭＭＣおよびＣＴＭＣは、３Ｔ３繊維芽細胞との共培養(co-culture)によって維持され得る（９８）。しかし、Ｗ／ＷVマウス並びに多くの他のＷ対立遺伝子に関してホモ接合であるマウス由来のＢＭＭＣは、ＩＬ-3の不存在下での繊維芽細胞との共培養系では増殖することができない（９９，１００，３８）。このことは、成熟肥満細胞におけるc-ｋｉｔ受容体の機能を示唆しており、c-ｋｉｔ受容体のリガンドが繊維芽細胞によって産生されることを暗示している。最近、Huffおよび彼の共同研究者等は、NIH 3T3繊維芽細胞から得た濃縮馴らし培地を用いることによって、線虫（Nippostronglyus brasiliensis）に感染したマウスのリンパ節細胞から得た肥満細胞コロニーが刺激されたことを報告した（８４）。短期間の肥満細胞増殖試験が開発されたが、これは繊維芽細胞由来の活性（ＫＬと称する）を精製することを意味する。ＫＬは、ＩＬ-3の不存在下で正常ＢＭＭＣ′sおよび腹腔肥満細胞の増殖を支持するが、Ｗ／ＷVＢＭＭＣ′sの増殖を支持しない。加えて、ＫＬは赤血球バースト（ＢＦＵ−Ｅ）の形成に適していることが示された。ＫＬの生物学的性質は、肥満細胞の生物学および赤血球生成の観点に関して、c-ｋｉｔリガンドに期待される性質に一致している。Ｗ突然変異が及ぼす欠陥は細胞自立性である；この性質に一致して、c-ｋｉｔＲＮＡがＷ突然変異の細胞標的中で発現することの証拠が存在する（３５，３９）。幾つかの突然変異対立遺伝子の分子的病変に関する最近の研究成果によって、これらはc-ｋｉｔ受容体の正常な活性または発現を崩壊させる機能喪失性突然変異（loss-of-function mutations）であることが示された（３５，１００，１０１）。
マウス染色体10上のスチール遺伝子座（Ｓ１）における突然変異は、発現型に関して、Ｗ突然変異を有するマウス見られるのと極めて類似した特徴をもたらす。即ち、造血機能、配偶子形成およびメラニン形成に影響を与える（５，４７，５１）。Ｓ１遺伝子座には多くの対立遺伝子が知られている；これらは半優性な突然変異であって、異なった対立遺伝子は、異なった細胞系統に対するその影響および重篤度において異なるっている（４７，５１）。オリジナルＳ１対立遺伝子は重篤な突然変異である。ＳＩＩＳＩホモ接合は生殖細胞における欠陥であり、コート色素が欠失しており、大赤血球性貧血により周産期に死亡する（５，５０）。Ｓ１対立遺伝子についてホモ接合であるマウスは、生存可能ではあるが重篤な大赤血球性貧血を有し、コート色素を欠失しており、生殖不能である。ＳＩＩ+およびＳｌd／+ヘテロ接合の両者は、稀釈されたコート色および中程度の大赤血球性貧血を有し、生殖腺の大きさは小さいが妊娠可能である。Ｗ突然変異とは対照的に、Ｓ１突然変異は細胞自立性ではなく、その突然変異標的の微小環境における欠陥によって惹起されと思われる（２８，３０，１２）。Ｓ１突然変異のマウスとＷ突然変異のマウスとの相似的かつ相補的特性のために、以前は我々も他の研究者も、Ｓ１遺伝子産物がc-ｋｉｔ受容体であるとの仮説を立てていた（５１，９）。
プロトオンコジーンc-ｋｉｔは、ＨＺ4-フェリン肉腫ウイルスのオンコジーンであるv-ｋｉｔの正常細胞性対応物（normal cellular counterpart)である。c-ｋｉｔはトランスメンブランチロシンキナーゼ受容体をコードしており、該受容体は血小板由来増殖因子受容体ファミリーの一員であり、且つネズミホワイト-スポッティング遺伝子座の遺伝子産物である（９，１７，２３，３５，４１，５７）。c-ｋｉｔのＷ遺伝子座との同一性が示されたことは、胚形成の際および成体動物において、メラニン形成、配偶子形成および造血機能の種々の観点におけるc-ｋｉｔ受容体系の機能を示唆する（４７，５１）。これら予期される機能に合致して、c-ｋｉｔ・ｍＲＮＡはＷ突然変異の細胞標的内において発現される（３，２４，２５，３５，３９）。
肥満細胞におけるc-ｋｉｔ／Ｗの公知の機能に基づいて、最近、c-ｋｉｔ受容体のリガンドであるＫＬが同定され、特性が調べられた。造血機能におけるc-ｋｉｔ受容体の予期された機能に合致して、ＫＬは骨髄由来細胞および結合組織肥満細胞の増殖を刺激する。また、赤血球形成において、ＫＬはエリスロポエチンと共働して、赤血球バーストの形成を促進する（7-14日ＢＦＵ-Ｅ）。更に、ＫＬに関するin vitroでの最近の実験によって、これをエリスロポエチン、ＧＭ-ＣＳＦ、ＧＣＳＦおよびＩＬ-７の夫々と組み合わせて用いると、赤血球前駆体、骨髄細胞前駆体およびリンパ球前駆体の増殖および分化を増大させることが示された。これは、幾つかの造血細胞系統の前駆体において、c-ｋｉｔ受容体系が或る役割を有することを示唆している（２７，３７）。
マウス染色体10上のスチール遺伝子座における突然変異は、Ｗ突然変異をもったマウスに見られる発現型に極めて類似した発現型の特徴をもたらす。即ち、この突然変異は造血機能、配偶子形成およびメラニン形成に対して影響を及ぼす（５，４７，５１）。最近、幾つかの重篤なＳ１対立遺伝子にＫＬ配列の欠如が見出された観察に基づいて、c-ｋｉｔ受容体のリガンドであるＫＬは、ネズミスチール遺伝子座に関する対立遺伝子であることが示された。ＫＬとc-ｋｉｔとの間にリガンドと受容体との関係が存在することに合致して、Ｓ１突然変異はＷ突然変異と同じ細胞標的に影響を与える。しかし、Ｗ突然変異とは対照的に、Ｓ１突然変異は細胞自立的ではなく、またc-ｋｉｔ受容体の微小環境に影響を与える（１２，２８，３０）。スチール遺伝子座における突然変異は半優性な突然変異であり、異なった対立遺伝子は、その異なった細胞系統に対する影響および重篤度において変化する（４７，５１）。オリジナルＳ１対立遺伝子は、重篤なＳ１突然変異の一例である。Ｓ１／Ｓ１ホモ接合は生殖細胞に乏しく、コート色素が欠失しており、大赤血球性貧血によって周産期に死亡する（５，５０）。Ｓ１d対立遺伝子に関してホモ接合であるマウスは、生存可能ではあるが重篤な大赤血球性貧血を有し、コート色素を欠失しており、かつ妊娠不能である（６）。Ｓ１／+およびＳ１d／+のヘテロ接合は、稀釈されたコート色および温和な大赤血球性貧血を有する一方、生殖腺の大きさは小さいが妊娠可能である。ＫＬ・ｃＤＮＡをプローブに用いたＳ１d／+ＤＮＡのサザンブロット分析によってＥcoR1多形が示され、これによって該突然変異はＫＬ遺伝子の欠失、その点突然変異(point mutation)またはそのＤＮＡ再配列の結果であることが示唆された（１１）。
〔発明の概要〕
本発明によれば、出願人によって精製され又は出願人の組換法によって製造されたc-ｋｉｔリガンド（ＫＬ）と、他の増血性因子および薬剤的に許容可能なキャリアとを含有する薬剤組成物が提供され、並びに本発明の薬剤組成物を患者に投与することを具備した患者の治療方法が提供される。本発明は、c-ｋｉｔリガンド（ＫＬ）および精製されたc-ｋｉｔリガンド（ＫＬ）ポリペプチド、またはその可溶性フラグメントと、他の増血性因子とを用いた複合療法を提供する。本発明はまた、単独または複合療法において、ＫＬをex vivoで使用するための方法および組成物を提供する。突然変異されたＫＬ拮抗剤もまた開示される。このような拮抗剤はまた、小分子であり得る。治療剤としての、ＫＬに対するアンチセンス核酸もまた開示される。最後に、生殖細胞、肥満細胞およびメラニン形成細胞におけるＫＬの役割の利点を用いた組成物および方法が開示される。
本発明は、c-ｋｉｔリガンド（ＫＬ）および精製されたc-ｋｉｔリガンド（ＫＬ）ポリペプチドに対応したアミノ酸配列をコードする拡散分子を提供する。
【図面の簡単な説明】
図  １：繊維芽細胞馴らし培地およびＩＬ-3に対する、+/+又はＷ／ＷVＢＭＭＣの増殖応答：
+/+又はＷ／ＷV骨髄由来の肥満細胞が、１％３ＣＭ、10％ＦＣＭ（20×濃度）を含有する培地または培地のみで培養された。培養24-30時間で3Ｈ-チミジンの取り込みを測定した。
図  ２：ＫＬ精製のクロマトグラフィープロファイル：
Ａ．ACA 54ウルトラゲル上でのゲル濾過クロマトグラフィー。280nmの吸光度が破線で示され、バイオ活性が実線で示されている。タンパクサイズマーカの溶出位置がＫＤで示されている。
Ｂ．DEAE-5PWカラム上での陰イオン交換ＦＰＬＣ。点線はＮａＣｌ勾配を示している。
Ｃ．セミ分取型Ｃ18カラム上での分離。1-プロパノール勾配が点線で示されている。
Ｄ．Ｃ18分析カラム上での分離。
図  ３：ＫＬの電気泳動分析。個々の画分からの得た物質をＳＤＳ／ＰＡＧＥ（12％）で分離し、銀で染色した。ＫＬの位置（28-30ＫＤ）が矢印で示されている。対応する画分のＫＬ活性が下に示されている。
Ａ．酢酸アンモニウム緩衝液及び1-プロパノールでＣ18分析カラムから溶出された0.5ml画分の分析。
Ｂ．2-メルカプトエタノール不存在の水性.1％ＴＦＡを用いて、Ｃ18分析カラムから溶出された0.5ml画分の分析。
図  ４：ＫＬに応答した、Ｗ*突然変異肥満細胞の増殖：
肥満細胞は、Ｗ／+とＷ／+との交配こよる個体の胎児肝臓、または野生型、ＷVおよびＷ41ヘテロ接合およびホモ接合の骨髄から誘導された。増殖試験におけるＫＬ濃度を増大させることによって、突然変異肥満細胞の増殖特性が測定された。ホモ接合突然変異肥満細胞は実線で、ヘテロ接合突然変異肥満細胞は破線で、野生型肥満細胞は点線で示されており、Ｗを除いて正常な胎児は+/+またはＷ／+の何れかであり得る。
図  ５：ＢＭＭＣおよび腹腔肥満細胞（ＣＴＭＣ／ＰＭＣ）における、c-ｋｉｔの発現および増殖因子応答性の比較。
Ａ．硫酸ベルベリンを用いた、精製ＰＭＣおよびＢＭＭＣにおけるヘパリンプロテオグリカンの蛍光染色。
Ｂ．c-ｋｉｔ抗体を用いＦＡＣＳによる、ＰＭＣおよびＢＭＭＤにおけるc-ｋｉｔの細胞表面発現の測定。抗c-ｋｉｔ血清は実線で示され、非免疫コントロール血清は点線で示されている。
Ｃ．ＫＬに対するＰＭＣの増殖能力の測定。5000個の細胞が、1000 U/mlのＫＬを含むか又は含まない0.5mlの10％Wehi-3CM若しくは0.5 mlのRPMI-Cの中に撒かれ、２週間後に生存細胞が測定された。
図  ６：ＫＬのバースト促進活性の測定：
骨髄および脾臓細胞がエリスロポエチン（2U/ml）の存在下で撒種され、示された濃度で純粋なＫＬが添加された。培養第７日に、ＢＦＵ-Ｅが測定された。このデータは、夫々がＫＬの濃度当たり２回反復された二つの別の実験の平均を表わしている。
図  ７：Ｗ／Ｗ胎児肝臓からのＫＬ依存性ＢＦＵ-Ｅ形成の測定：
Ｗ／+動物の交配による胎児が、懐胎16.5日に採取された。四体の胎児のうちの一つはＷ／Ｗホモ接合であった。肝臓細胞は、対照培地、ＩＬ-3（50 U/ml）またはＫＬ（2.5 mg/ml）の何れかの存在下に、１０5細胞／mlで撒かれた。全ての培養物はエリスロポエチン（2U/ml）を含んでいる。データはＢＦＵ-Ｅの数／肝臓で表わされ、何れも２回反復された撒種の平均である。+/+またはW/+胎児についてのこのデータは、肝臓が正常な３体の胎児からの平均である。
図  ８：ＫＬのＫ-末端アミノ酸配列およびＰＣＲによる対応核酸配列の推定：
上行；ＫＬのＮ末端アミノ酸配列（残基10-36）。
中間行；101 bpのＰＣＲ生成物をＭ13中にクローニングし、続いて配列決定することによって得られた、三つのｃＤＮＡのヌクレオチド配列。
下行；第一鎖ｃＤＮＡ合成およびＰＣＲに用いられる、縮重センスプライマー及びアンチセンスプライマー(degenerate sense and antisense primers)の配列。このアミノ酸配列は配列認識番号２として同定された。
図  ９：ＰＣＲで生成されたオリゴヌクレヲチドプローブ（単離されたc-ｋｉｔリガンドポリペプチドに対応する）を用いたノーザンブロット分析：
6.5 kbのｍＲＮＡが、ラベルされたプローブで単離された。
図１０：ＫＬのＮ末端アミノ酸10-36に対応したｃＤＮＡの、ＲＴ-ＰＣＲによる誘導：
BALB/c 3％3細胞からの１μｇのポリ（Ａ）+ＲＮＡが、ｃＤＮＡ合成の鋳型として用いられ、また引き続き行われた二つの縮重オリゴヌクレオチドプライマーを組み合わせて用いたＰＣＲ増幅における鋳型として用いられた。101 bpのＰＣＲ生成物のアガロース中での電気泳動分析が示されている。
図１１：1.4k b ＫＬ・ｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列および予想アミノ酸配列：
長いオープン・リーディング・フレームの予想アミノ酸配列が、１文字表記アミノ酸コードを用いてヌクレオチド配列の上に示されている。右側の数字は、メチオニン（ヌクレオチド16-18）の番号を１としたときのアミノ酸の番号である。可能なＮ末端シグナル配列（ＳＰ）およびトランスメンブランドメイン（ＴＭＳ）は前記配列の上にダッシュ線で示され、細胞外のシステイン残基は丸で囲んである。予想されるタンパク構造が下方に示されている。Ｎ-結合されたグリコシル化部位、およびＮ末端ペプチド配列（Pep.Seq）の位置が示されている。この核酸配列はまた、配列認識番号１と称される。
図１２：ノーザンブロット分析による、BALB/c 3T3細胞ＲＮＡにおけるＫＬ特異性ＲＮＡ転写物の同定：
BALB/c 3T3細胞からのポリ（Ａ）+ＲＮＡ（４μｇ）が電気泳動的に分離され、ニトロセルロースに移され、32Ｐラベルされた1.4 kbのＫＬ・ｃＤＮＡとハイブリダイズされた。18Ｓ及び28ＳのリボゾームＲＮＡsの移動が示されている。
図１３：ＫＬのＳＤＳ-ＰＡＧＥ分析：
Ａ．ＫＬの銀染色
Ｂ．125Ｉ-ＫＬのオートラジオグラフ
図１４：肥満細胞およびc-ｋｉｔを発現するψ２細胞に対する125Ｉ-ＫＬの結合：
Ａ．ｐＬＪ・c-ｋｉｔ発現ベクターを含み、高c-ｋｉｔタンパクを高レベルで発現するＮＩＨψ２／c-ｋｉｔ細胞。
Ｂ．+/+若しくはＷ／ＷV生体マウスの骨髄の肥満細胞、またはＷ／Ｗもしくは出産期を合致させたた正常な対照（Ｗ／+または+/+）の胎児肝臓細胞。
図１５：125Ｉ-ＫＬと肥満細胞上のc-ｋｉｔ受容体との架橋および共沈殿。
Ａ．正常ウサギ血清（ＮＲＳ）または二つの抗c-ｋｉｔウサギ抗血清（α-c-ｋｉｔ）との、ＫＬの共沈殿。
Ｂ．ジスクシイミジル基質を用いた、c-ｋｉｔに対するＫＬの架橋。ＳＤＳ-page分析は、12％または7.5％ポリアクリルアミドゲル上で行われた。架橋された種は、ラベルされた「ＫＬ＋ｃＫ」である。
図１６：Ｓ１／+およびＳＩＩＳＩマウス由来のＴagl-消化されたＤＮＡのＲＦＬＰ分析。C3HeB/Fej a/a CaJ S1 Hmマウス由来のＳ１対立遺伝子が、C57B L/6J S1 Hmマウスに導入され、C57BL/6Jバックグラウンドに導入された。また、C57BL/6J S1C3H×S1C3Hクロスの子孫を評価した。
Ａ．1.4 KB ＫＬ・ｃＤＮＡプローブの、二つの非貧血マウス（ＳＩＩ+レーン）及び二つの貧血マウス（ＳＩＩＳＩレーン）由来のＤＮＡに対するハイブリダイゼーション。ＳＩＩＳＩマウス由来のＤＮＡに対するハイブリダイゼーションは検出されなかった。
Ｂ．TIS/Dra/SaI、即ちＳ１に緊密にリンクしたプローブ（後記の詳細な説明を参照のこと）に対するハイブリダイゼーション。このプローブは、ＳＩc3H１Ｓ１c3Hホモ接合体における4kB C3HeB/FeJ誘導対立遺伝子、及び2 kb C57BL/6J対立遺伝子を同定する。
図１７：ＫＬ-1、ＫＬ-2及びＫＬ-Ｓ１dｃＤＮＡのヌクレオチド配列および予想アミノ酸配列：
Balb3T3細胞プラスミドｃＤＮＡライブラリーから得られたＫＬ・ｃＤＮＡのヌクレオチド配列が示されている。異なった組織からのＲＴ-ＰＣＴ生成物およびＳ１d／全ＲＮＡ、ＫＬ-1、ＫＬ-2およびＫＬ-Ｓ１dがサブクローニングされ、配列分析が行われた。白い三角は、ＫＬ-2中にスプライスされるエキソンの5′及び3′境界を示している；黒い三角は、Ｓ１dｃＤＮＡ中の欠失エンドポイントを示している。Ｓ１dｃＤＮＡの67ヌクレオチド挿入配列が、ＫＬ・ｃＤＮＡ配列の上に示されている。矢印は、ＫＬ-1の細胞外領域における推定タンパク分解性開裂部位を示している。シグナルペプチド（ＳＰ）及びトランスメンブランセグメント（ＴＭＳ）は、上に引いた線で示されている。
図１８：パネルＡおよびＢ：正常組織およびＳ１d突然変異繊維芽細胞から得たＫＬ・ｃＤＮＡの、ＲＴ-ＰＣＲクローニングによる同定：
全ＲＮＡを、C57BI6/Jマウスの異なった組織およびＳ１d/+繊維芽細胞から得た。正常組織およびBalb 3T3細胞から得たＲＮＡ（10μｇ）とのＲＴ-ＰＣＲ反応は、プライマー＃１および＃２を用いて行われた。また、+/+及びＳ１d/+繊維芽細胞から得たＲＮＡとの反応は、プライマーの組み合わせ、即ち＃１＋＃２、＃１＋＃３、および＃１＋＃４を用いて行われた。その反応生成物は、0.25μｇ／mlの臭化エチジウムの存在下に、１％NuSieveアガロース中での電気泳動によって分析された。φX174 Hae III-ＤＮＡマーカーが示されている。
図１９：異なったＫＬタンパク生成物のトポロジー：
影を付した領域はＮ末端のシグナルペプチドであり、黒く塗り潰したブロックはトランスメンブランドメインであり、ＹはＮ結合したグリコシル化部位である。点線は選択的にスプライスされたエキソン境界を示しており、また対応するアミノ酸番号が示されている。ＫＬ-Ｓ１dのＣ末端における影線を付した領域は、ＫＬによってコードされないアミノ酸を示す。ＫＬ-Ｓは、ＫＬのタンパク分解による開裂またはＣ末端削除変異により生成したＫＬの可溶形を示す。
図２０：ＲＮaseタンパク試験による、異なった組織でのＫＬ-1およびＫＬ-2転写物の同定：
32Ｐによってラベルされたアンチセンス・リボプローブ（625nt.）が、組織および繊維芽細胞から得た２０μｇの全細胞ＲＮＡとハイブリダイズされた（但し、肺および心臓については10μｇを用いた）。ＲＮase消化の際、反応混合物は４％ポリアクリルアミド／尿素ゲル中での電気泳動によって分析された。ＫＬ-1およびＫＬ-2について、夫々575 nts.及び449 nts.の保護されたフラグメントが得られた。オートラジオグラフの露出は48時間または72時間であった（但し、3T3繊維芽細胞ＲＮＡについては６時間）。
図２１：パネルＡ−Ｃ。ＣＯＳ細胞中におけるＫＬ-1およびＫＬ-2タンパク生成物の生合成的特徴：
ＤＥＡＥデキストラン法を用いて、ＣＯＳ-1細胞が５μｇのＫＬ-1およびＫＬ-2発現プラスミドで形質転換された。72時間後に、細胞は35Ｓ-Ｍetで30分間ラベルされ、次いで完全培地で追跡された。上清および細胞溶解物は抗ＫＬウサギ血清で免疫沈殿された。免疫沈殿物はＳＤＳ−ＰＡＧＥ（12％）によって分析された。分子量マーカーの移動はキロダルトン（kD）で示されている。
図２２：パネルＡ−Ｃ。ＫＬ-1およびＫＬ-2タンパク生成物のＰＭＡ誘導開裂：
ＣＯＳ-1細胞が、５μｇのＫＬ-1およびＫＬ-2発現プラスミドで形質転換された。72時間後、細胞は35Ｓ-Ｍetで30分間ラベルされ、次いでa）血清を含まない培地、b)ホルボールエステル(phorbol ester)ＰＭＡ（１μＭ）を含む培地、c)カルシウムイオノホアであるA23187（１μＭ）を含む培地で追跡された。上清および細胞溶解物は抗ＫＬウサギ血清で免疫沈殿された。免疫沈殿物はＳＤＳ−ＰＡＧＥ（12％）によって分析された。分子量マーカーの移動はキロダルトン（kD）で示されている。
図２３：パネルＡおよびＢ。ＣＯＳ細胞中におけるＫＬ-Ｓ１dおよびＫＬ-Ｓタンパク生成物の生合成的特徴。
図２４：ＣＯＳ細胞上清中における生物学的活性の測定：
ＫＬ-1、ＫＬ-2、ＫＬ-Ｓ１dおよびＫＬ-Ｓの発現プラスミドで形質転換されたＣＯＳ細胞からの上清が、肥満細胞増殖試験における活性について試験された。上清の稀釈系列がＢＭＭＣｓと共にインキュベートされ、培養24-30時間の3Ｈ-チミジンの取込みが測定された。
図２５：ＨＰＰ−ＣＦＵ試験におけるヒト（ｒｈ）ＩＬ−１β（100 U/mL）、ｒｍＫＬ（10-100ng／mL）、並びにｒｈＭ−ＣＳＦ，ｒｈＧ−ＣＳＦおよびｒｍＩＬ−３（全て1,000 U／mL）の間の相乗作用：
５−ＦＵ後４日のネズミ骨髄が、サイトカイン類を含む２mLの0.5％アガロース下地層の上に2.5×１０4個の骨髄細胞を含む１mLの0.36％アガロースを重層した、６０mmのペトリ皿内で培養された。酸素の減少した条件下で１２日間培養した後、直径が0.5mmよりも大きいコロニーから培養物を評価した。
図２６：５−ＦＵ後２４時間のネズミ骨髄の７日間の懸濁培養における、ＧＭ−ＣＳＦ−反応性ＣＦＵ−ＧＭの増大倍数を示す、二次ＣＦＵ−ＧＭまたはデルタ試験：
骨髄細胞（2/5×１０5／mL）が、指定したサイトカインの組合わせ及びＧＭ−ＣＳＦ−刺激コロニー試験において再クローン化された回収細胞と共に、７日間培養された。増大倍数は、ＭＧ−ＣＳＦを用いた一次クローン原性試験で測定されたＣＦＵ−ＧＭのインプット数に対する、二次クローン原性試験で回収されたＣＦＵ−ＧＭ数の比率である。ｒｍＫＬは20 ng/mLで、ｒｈＩＬ−６は50 ng/mLで、ｒｈＩＬ−１βは100 U/mLで、ｒｈＧＭ−ＣＳＦまたはｒｈＩＬ−３は1,000 U/mLで用いられた。
図２７：ＩＬ-1＋ＩＬ-3＋ＫＬの存在下の懸濁液中において、５−ＦＵ後２４時間の骨髄を７日間の培養した際の造血機能の増幅：
細胞（顆粒球およびリンパ球を差し引いて１０4個であり、また一次クローン原性試験ではＩＬ-1＋ＩＬ-3＋ＫＬに対して反応性である2.5％のＨＰＰ−ＣＦＵを含む）は懸濁液中でインキュベートされた。また、全細胞、並びにＩＬ-1＋ＩＬ-3＋ＫＬに対して反応性のＨＰＰ−ＣＦＲ又はｒｍＧＭ−ＣＳＦに対して反応性のＣＦＵ−ＧＭが、二次クローン原性試験において７日後に測定された。その計算は、インプットＨＰＰ−ＣＦＵに対するアウトプット細胞の比率に基づいている。
図２８：正常ネズミ骨髄からのコロニー増殖に対する、ＩＬ-6、ＩＬ-1およびＫＬの単独または組合わせによる効果：
対照培養物は、何等の成長因子も存在しない条件下で増殖された。ＩＬ-6、ＩＬ-1およびＫＬの７つの組合わせが、単独またはＣＳＦ類（Ｇ−ＣＳＦ，Ｍ−ＣＳＦ，ＧＭ−ＣＳＦ）およびＩＬ-3との組合わせて試験された。データは、三回の培養における平均値＋ＥＳとして示されている。
図２９：５−ＦＵパージされた骨髄由来のＨＰＰ−ＳＦＣの刺激における、ＩＬ-6、ＩＬ-1およびＣＳＦ類の間の相乗作用。
骨髄は、５−ＦＵを投与した１−７日後に回収され（上から下）、Ｇ−ＣＳＦ，Ｍ−ＣＳＦ，並びにＩＬ-3±ＩＬ-6、ＩＬ-1またはＩＬ-6＋ＩＬ-1の存在下で増殖された。データは、（d1・5-FU〜d7・5-FU）骨髄細胞１×１０5〜１×１０4個当りの全ＣＦＵ−Ｃ（HPP-CFC＋LPP-CFC）として示されている。このデータは、三回の培養における平均値＋ＥＳとして示されている。
図３０：ＫＬは、他のサイトカイン類との組合わせにより、相乗作用的にＨＰＰ−ＣＦＣを刺激する。
図２８に示したサイトカイン類の４０の組合わせが、５−ＦＵ注入後に回収されたＢＭからのＣＦＵ−Ｃ（HPP-CFC＋LPP-CFC）を刺激する能力について試験された。コロニー数は、１×１０5個のd1 5-FU ＢＭ細胞または１×１０4個のd7 5-FU ＢＭ細胞の３回の培養の平均値＋ＳＥを表している。
図３１：Δ培養における全細胞数の増大には、複数の成長因子による複合刺激が必要とされる。
増殖７日後のΔ培養物中に存在する非粘着性細胞の数が、材料および方法の章で記載したようにして測定された。ダッシュ線は、培養物の接種に用いられた2.5×１０5個のd1 5-FU ＢＭ細胞を表している。回収された細胞の形態学は本文中で議論されている。データは、２〜１５回の実験の平均値＋ＳＥとして示されている。
図３２：ＩＬ-6、ＩＬ-1及びＫＬは、単独でも組合わせた場合でも、Δ培養の際のＬＰＰ−ＣＦＣの増大において、ＣＳＦ類との相乗作用的である。
Ｇ−ＣＳＦ，Ｍ−ＣＳＦ，ＧＭ−ＣＳＦ，ＩＬ-3またはＩＬ-1＋ＩＬ-3の存在下で増殖したＬＰＰ−ＣＦＣについては、材料および方法の章に記載したようにして計算した。Δ値は、３回の一次および二次コロニー計数の平均値から計算された。結果は、２回または３回の実験でプールされた６〜１１のΔ値の平均値±ＳＥとして提示されている。なお、ＬＰＰ−ＣＦＣΔ値は対数スケールである。
図３３：ＩＬ-6、ＩＬ-1及びＫＬは、単独でも組合わせた場合でも、Δ培養の際のＬＰＰ−ＣＦＣの増大において、ＣＳＦ類と共に作用する。
全てのＨＰＰ−ＣＦＣは、ＩＬ-1＋ＩＬ-3の存在下で増殖された。Δ値は、３回の一次および二次コロニー計数の平均値から計算された。結果は、２〜１１の実験の平均値±ＳＥとして提示されている。なお、ＨＰＰ−ＣＦＣΔ値は対数スケールである。
図３４：ＩＬ-1＋ＫＬに反応する親細胞は、Δ培養において増大しなかった。
Δ試験における一次および二次ＨＰＰ−ＣＦＣの刺激効果について、ＩＬ-1＋ＩＬ-3がＩＬ-1＋ＫＬと比較された。Δ値は、３回のＣＦＵ−Ｃ試験の平均値から計算された。示された結果は、１回の実験からの結果を表している。なお、Δ値は対数スケールである。
図３５：ＣＦＵ−Ｓの数は、Δ培養において増大する。
５−ＦＵ投与後のin vitroΔ試験またはin vivo試験において生じる、ＨＰＰ−ＣＦＣ，ＬＰＰ−ＣＦＣおよびＣＦＵ−Ｓの増大に関するΔ値が比較された。５−ＦＵ投与の８日後に観察された大腿当たりの親細胞の数を、５−ＦＵ治療の１日後に観察された数で除することによって、親細胞のin vitro増大に関するΔ値が測定された。データは、１〜３回の実験の平均＋ＳＥを表している。
〔発明の詳細な説明〕
結合実験および交差結合実験に基づいて、今や、c-ｋｉｔ受容体に対するＫＬの関係が決定され、ＫＬはc-ｋｉｔのリガンドであることが示された。ＫＬのＮ末端タンパク配列を用いて、ＫＬ特異性のｃＤＮＡクローンが誘導された。これらｃＤＮＡクローンを用いて、ＫＬ遺伝子のＳ１遺伝子座に対する関係が研究され、ＫＬはＳ１遺伝子座によってコードされることが示された。
最近、BALB/c 3T3繊維芽細胞の馴らし培地から造血性増殖因子ＫＬが精製されたが、これはc-ｋｉｔリガンドに予想される生物学的性質を有していた（３７）。ＩＬ-3の不存在下において、ＫＬは正常マウス由来のＢＭＭＣの増殖を刺激する能力を有するが、Ｗ突然変異マウス由来のＢＭＭＣの増殖は刺激しないので、ＫＬの精製はこれに基づいて行われた。この精製された因子は、ＩＬ-3の不存在下でＢＭＭＣおよびＣＴＭＣの増殖を刺激し、従って成熟肥満細胞において重要な役割を果たすように思える。造血機能におけるc-ｋｉｔの予期される機能に関しいえば、ＫＬは、エリスロポエチンと共働して赤血球バースト（7-14日 BFU-E）の形成を容易にすることが示された。BALB/c 3T3細胞の馴らし培地から単離されたＫＬの可溶性形態は、30 kDの分子量および3.8のｐＩを有している。また、ゲル濾過の際のＫＬの特徴は生理的条件下で非共有結合的に結合した２量体の形成を示すにもかかわらず、ＫＬはジスルヒド結合した２量体ではない。
ｃＤＮＡsの核酸配列から推定されるＫＬの予想アミノ酸配列は、ＫＬが分泌されるタンパクとしてではなく、トランスメンブランタンパクとして合成されることを示している。次いで、膜結合形のＫＬのタンパク分解的開裂によって、可溶形のＫＬが生じる。c-ｋｉｔの最も近い関連体であるＣＳＦ-1受容体のリガンドは、ＫＬのトポロジー的特徴を共有しており、タンパク分解的に開裂して可溶性成長因子を生成することが示されている（４４，４５）。更に、推定されるＫＬの構造的特徴に関する最近の分析によって、アミノ酸の相同性、二次構造およびエキソン配列に基づいて、ＫＬとＣＳＦ-1との関連性が示された。このことは、これら二つの因子の間の進化的関連性を示しており、従ってこの二つの受容体系がお互いから進化したものであるとの見解を強化するものである（４）。
或いは、最近になって、二つの異なった形のＫＬタンパク、即ちＫＬ-1およびＫＬ-2をコードするスプライスされたＫＬ・ｍＲＮＡが報告されている（１５）。ＫＬにコードされたタンパク生成物は、ＫＬ・ｃＤＮＡをトランスフェクトしたＣＯＳ細胞中において同定され、特徴付けられており、フラナガン等(Flanagan et al.)の発見が幾つかの方法で発展されている。上記のように、ＫＬは、タンパク分解的に開裂されて可溶性のＫＬを生じるトランスメンブランタンパクとして合成される。ＫＬ、ＫＬ-2の選択的にスプライスされた転写物（予想されるタンパク分解的開裂部位を欠いている）のタンパク生成物は、ＫＬ-1のそれとは異なった代謝回転特性を呈することが示された。加えて、ＫＬ-1およびＫＬ-2の両者のタンパク分解的開裂は、ＰＭＡおよびカルシウムイオノホアA23187のような薬剤によって調節され得る。広範囲の異なったマウス組織において、相対的に異なった量のＫＬ-1およびＫＬ-2が測定されている。このことは、ＫＬ-1およびＫＬ-2の発現が組織特異的な仕方で制御されることを示している。
また、Ｓ１d対立遺伝子の遺伝子産物も定義されている（１５）。Ｓ１dは、タンパクのトランスメンブランドメインおよび細胞質ドメインをコードする配列を含んだＫＬ内の欠失に起因しており、生物学的に活性な分泌された突然変異ＫＬタンパクをもたらす。c-ｋｉｔの増殖機能および移行機能における可溶形ＫＬおよび細胞結合形ＫＬの夫々の役割は、これら結果の観点において議論される。
本発明は、c-ｋｉｔに対するリガンドに対応した精製された哺乳動物タンパクであって、二つのポリペプチドのホモ二量体を含み、夫々のポリペプチドが約30 kDの分子量および約3.8の等電点を有する精製された哺乳動物タンパクを提供する。ここで用いるられる「c-ｋｉｔリガンド」の語は、幹細胞因子、肥満細胞因子およびスチール因子とも定義されている、ポリペプチドまたはタンパクを意味する。ここで用いられるc-ｋｉｔリガンドタンパク及びc-ｋｉｔリガンドポリペプチドには、天然に存在する形および組換え形の両方が含まれる。組換え形とは、天然に存在するc-ｋｉｔとの充分な同一性を有し、同様の生物学的活性を有する、天然には存在しない形のタンパクおよびポリペプチドである。このようなポリペプチドの例には、ＫＬ-1.4およびＳ-ＫＬと称されるポリペプチドが含まれるが、これらに限定されるものではない。このようなタンパクおよびポリペプチドには、その誘導体および類縁体が含まれる。本発明の一態様おいて、前記精製された哺乳動物タンパクはネズミタンパクである。本発明の他の態様において、前記精製された哺乳動物タンパクはヒトタンパクである。
また、本発明によれば、c-ｋｉｔリガンドに対応する精製された哺乳動物タンパクであって、グリコシル化された精製タンパクが提供される。しかし、本発明には非グリコシル化形の前記タンパクも包含される。本発明にはまた、c-ｋｉｔリガンドに対応した天然に存在する精製された哺乳動物タンパクと同等のグリコシル化を含んだ、精製された哺乳動物タンパクも包含される。このタンパクは、当業者に公知の方法によって、上記二つのホモ二量体ポリペプチドの間にシスチン架橋を導入することにより製造される。
また本発明によれば、c-ｋｉｔリガンドに対応する上記精製された哺乳動物タンパクの有効量と、薬剤的に許容され得るキャリアとを含有する薬剤組成物が提供される。
更に、哺乳動物の白血球減少症を治療するための薬剤組成物であって、有効量の上記薬剤組成物と有効量の造血性因子とを含有し、該造血性因子が哺乳動物の白血球減少症の治療に効果的なＧ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ-3からなる群から選択される薬剤組成物が提供される。
本発明によればまた、哺乳動物の貧血を治療するための薬剤組成物であって、有効量の上記薬剤組成物と、哺乳動物の貧血の治療に効果的な有効量のＥＰＯ（エリスロポエチン）またはＩＬ-3とを含有する薬剤組成物が提供される。貧血には、ダイアモンドブラックファン貧血(Diamond Black fan anemia)および再生不良性貧血が含まれるが、これらに限定されるものではない。しかしながら、ブラックファン貧血および再生不良性貧血の治療のためには、有効量の上記組成物および貧血の治療に効果的な有効量のＧ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦを含有する薬剤組成物が好ましい。更に、本発明によれば、哺乳動物に上記組成物を投与することによって、哺乳動物の貧血を治療する方法が提供される。また、哺乳動物における移植の際の骨髄を増強するために有効な薬剤組成物であって、有効量の上記薬剤組成物と、哺乳動物における移植の際の骨髄のエングラフメント(engraphment）を高めるのに効果的な有効量のＩＬ-1またはＩＬ-6と含有する薬剤組成物が提供される。本発明によれば、放射線、化学物質または化学療法剤により誘導された骨髄形成不全症または骨髄抑制（myelosuppression）の治療において骨髄修復を高めるための薬剤組成物であって、有効量の上記薬剤組成物と、哺乳動物における骨髄修復を高めるのに効果的な有効量のＩＬ-1とを含有する薬剤組成物が提供される。また、本発明によって、患者の後天的免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）を治療するための薬剤組成物であって、有効量の上記薬剤組成物と、患者のＡＩＤＳの治療に効果的な有効量のＡＺＴまたはＧ−ＣＳＦとを含有する薬剤組成物が提供される。
本発明によれば、神経損傷を治療するための組成物であって、哺乳動物における神経損傷を治療するために効果的な、有効量の上記薬剤組成物を含有する組成物が提供される。
また、肺発達不全の症状を呈する乳幼児を治療するための組成物であって、肺発達不全の症状を呈する乳幼児の治療に効果的な有効量の精製された前記哺乳動物タンパクと、薬剤的に許容され得る担体とを含有する組成物が提供される。
更に、対象における脱毛を防止するための組成物であって、対象の脱毛を防止するために効果的な、c-ｋｉｔリガンドに対応する有効量の精製された哺乳動物タンパクと、薬剤的に許容され得る担体とを含有する組成物が提供される。また、本発明によれば、対象の毛髪における色素喪失を阻害するための薬剤組成物であって、対象の毛髪における色素喪失を阻害するのに効果的な、c-ｋｉｔリガンドに対応する有効量の精製された哺乳動物タンパクと、薬剤的に許容され得る担体とを含有する薬剤組成物が提供される。
また、上記に列挙した疾患を治療する方法であって、これら疾患を治療するのに有効な量で、上記有効な組成物を投与することによる方法が提供される。
ここで用いられる「対象」の語は、例えば哺乳動物、動物、ヒト、マウスまたはラットを意味するが、これらに限定されるものではない。「哺乳動物」とは、例えばマウス（ネズミ）またはヒトを意味するが、これらに限定されるものではない。
本発明は、c-ｋｉｔリガンド（ＫＬ）に対応したアミノ酸配列をコードする単離された核酸分子を提供する。このような核酸の例には、ＫＬ 1.4、ＫＬ-1、ＫＬ-2またはＳ−ＫＬと称される核酸が含まれるが、これらに限定されるものではない。本発明にはまた、これらアミノ酸配列をコードする核酸分子とは異なるが、発現型における同じ効果を生じる核酸分子をも包含する。これら異なった分子ではあるが、表現型的には等価な核酸分子を「等価な核酸分子」という。そして、本発明はまた、上記の核酸分子と比較した場合に、生成されるポリペプチドの表現型を変化させないような非コード領域における変化によって特徴付けられる核酸分子をも包含する。本発明は更に、本発明の核酸分子に対してハイブリダイズする核酸分子をも包含する。ここで用いられる「核酸」の語には、一本鎖および二本鎖のＤＮＡおよびｃＤＮＡと同様、ＲＮＡも包含される。加えて、ここで用いられる「ポリペプチド」の語には、天然に存在するその対立遺伝子的変種、並びに人間が作った組換え型が包含される。
本発明の目的において、c-ｋｉｔリガンド（ＫＬ）は、ヒトc-ｋｉｔリガンドまたはネズミc-ｋｉｔリガンド（ＫＬ）である。
また、本発明によれば、c-ｋｉｔリガンド（ＫＬ）に対応したアミノ酸配列をコードする核酸分子を具備するベクターが提供されれる。このベクターには、プラスミドベクター、ウイルスベクターまたはコスミドベクターが含まれ得るが、これらに限定されるものではない。
本発明はまた、ＲＮＡ転写プロモータ並びに他の調節配列に対して機能し得るようにリンクされた、本発明の単離された核酸分子を提供する。ここで用いられる「機能し得るようにリンクされた」とは、該プロモータが、ＲＮＡの転写を指示するように核酸分子から離れて位置付けられることを意味する。このようなプロモータの例としては、ＳＰ6、Ｔ4およびＴ7がある。プロモータおよびクローニング部位の両者を含み、該クローニング部位に挿入されたＤＮＡ片が該プロモータに対して機能し得るようにリンクされるようなベクターが、当該技術分野において知られている。好ましいこれらベクターは、in vitroにおいてＲＮＡ転写ができるものである。このようなベクターの例は、ｐＧＥＭ系列［Promega Biotec,Madison,WI］である。
更に、本発明によれば、c-ｋｉｔリガンド（ＫＬ）ポリペプチドの製造のための宿主ベクター系であって、適切な宿主内に上記ベクターの一つを具備する宿主ベクター系が提供される。本発明の目的にとって好ましい宿主には真核細胞（例えば哺乳動物細胞）、又はバキュロウイルス(baculovirus)発現のための昆虫細胞が含まれるが、これにら限定されるものではない。適切な宿主にはまた、E.coliのようなバクテリア細胞または酵母細胞が含まれる。
E.coli内で発現されたとき蛋白を回収するように、E.coli細胞内に請求の範囲に記載の核酸をトランスフェクトして、c-ｋｉｔリガンド蛋白を発現させる。このE.coliは、異なった二つの培地（ＬＢまたはＴＢ）内での１リットル培養で増殖され、ペレット化される。夫々のバクテリアペレットは、20mlの破壊用緩衝液（下記参照）中で、20,000 lb/in2のフレンチプレッシャ細胞破壊装置に二回通すことによってホモジェナイズされた。高速回転（120k rpm×20分）の後、上清が第二チューブ内に移された。c-ｋｉｔ蛋白またはポリペプチドは特定の画分内に位置する。これは6Mグアニジニウム-ＨＣｌまたは8M尿素を用いて可溶化され、続いて透析または稀釈され得る。
破壊用緩衝液
50 mMヘペス、pH8.0
20％グリセロール
150 mM NaCl
１ mM ＭｇＳｏ4
２ mM ＤＴＴ
５ mM ＥＧＴＡ
20μｇ/ml ＤＮＡseＩ
更に、精製された可溶性c-ｋｉｔリガンド（ＫＬ）ポリペプチド、並びに該精製された可溶性c-ｋｉｔリガンド（ＫＬ）ポリペプチドのフラグメントが本発明によって提供される。
本発明の一態様において、c-ｋｉｔリガンドポリペプチドはアミノ酸1〜約164に対応する。本発明の他の態様において、c-ｋｉｔリガンドポリペプチドはアミノ酸1〜約148、或いは次の融合ポリペプチドに対応する。この融合ポリペプチドは、アミノ酸約165からアミノ酸約202若しくは205に融合されたアミノ酸1〜約148に対応するもの、またアミノ酸177からアミノ酸約202若しくは205に融合されたアミノ酸1〜約164に対応するものである。
本発明の他の態様において、c-ｋｉｔリガンドポリペプチドは、生物学的に活性な結合部位に連結された、アミノ酸1〜約164に対応するポリペプチドを含み得る。このような生物学的に活性な結合部位には、基質細胞、細胞外マトリックス、ヘパリン結合ドメイン、ヘモネクチン(hemonectin)結合部位または細胞付着活性を結合するための付着部位に対応したアミノ酸が含まれ得るが、これらに限定されるものではない。例えば、1986年３月25日、1986年９月30日および1988年12月20日に夫々発行された、米国特許第4,578,079号、同第4,614,517号および同第4,792,525号を参照されたい。
本発明の一態様において、可溶性c-ｋｉｔリガンド（ＫＬ）は画像化剤に結合される。画像化剤は当業者に公知であり、放射性アイソトープ、色素、或いはパーオキシダーゼ若しくはアルカリホスファターゼのような酵素であり得るが、これらに限定されるものではない。適切な放射性アイソトープには125Ｉ、32Ｐおよび35Ｓが含まれるが、これらに限定されるものではない。
これらの結合された複合体ポリペプチドは、in vitroまたはin vivoにおいて、c-ｋｉｔ受容体タンパクを発現する細胞の存在を検出するのに有用である。この検出がin vitroで行われるとき、試験すべき細胞または組織のサンプルは、前記複合体ポリペプチドが細胞または組織の表面に存在するc-ｋｉｔ受容体と結合するような適切な条件下で、複合体ポリペプチドと接触され；次いで未結合の複合体ポリペプチドを除去して、結合された複合体ポリペプチドの存在が検出され；これによってc-ｋｉｔタンパクを発現する細胞または組織が検出される。
或いは、前記複合体ポリペプチドは、例えば静脈内投与によって患者に投与され得る。充分な量の前記複合体ポリペプチドが投与されなければならないが、一般的に、このような量は患者の大きさ、体重および他の特徴に応じて変化する。当業者は、このような量を容易に決定することができる。
投与に続いて、細胞または組織の表面に存在するc-ｋｉｔ受容体に結合した前記複合体ポリペプチドは、細胞内の画像化によって検出される。
本発明の方法において、この細胞内画像化は多くの画像化法の何れかであってよく、放射性アイソトープにより放出される放射線を検出して可視化することが含まれ得る。例えば、アイソトープがヨウ素の放射性アイソトープ（例えば125Ｉ）であるならば、ガンマ線カメラを用いて放射性ヨウ素から放出されるガンマ線を検出することにより、放射線の検出および可視化を行うことができる。
加えて、可溶性のc-ｋｉｔリガンド（ＫＬ）ポリペプチドフラグメントは、毒素、化学療法剤または放射性アイソトープのような治療剤と結合され得る。従って、患者に対してその有効量を投与すれば、この複合体分子は、c-ｋｉｔ受容体を発現する細胞に対して前記治療剤を送給する組織特異性のデリバリーシステムとして作用する。
また、c-ｋｉｔリガンド（ＫＬ）ポリペプチドを製造するための方法であって、c-ｋｉｔリガンド（ＫＬ）ポリペプチドを産生させる適切な条件下で、上記の宿主ベクター系を増殖させることと、得られたc-ｋｉｔリガンド（ＫＬ）ポリペプチドを回収することとを具備した方法も提供される。
本発明はまた、この方法によって製造された、c-ｋｉｔリガンド（ＫＬ）ポリペプチドを提供する。
本発明は更に、ｃ−ｋｉｔリガンド拮抗剤を提供する。これらはｃ−ｋｉｔ受容体に関するスクリーニングによって見出される小分子の拮抗剤であり得る。或いは、これらはリボース又は他の糖骨格に基づくアンチセンス核酸、ＤＮＡ、ＲＮＡであって、糖間のチオホスフェート結合、メチルホスフェート結合、メチルホスホネート結合を伴ったものであり得る。これらのアンチセンス分子は、in vivoにおけるｃ−ｋｉｔリガンドの翻訳を阻害するであろう。
また、可溶性の突然変異型c-ｋｉｔリガンド（ＫＬ）拮抗剤ポリペプチドであって、この突然変異型ポリペプチドはc-ｋｉｔ受容体に結合する能力を保持する一方、該受容体に対する機能的リガンドの結合により媒介される生物学的応答が破壊されるような、突然変異型c-ｋｉｔリガンド（ＫＬ）拮抗剤が提供される。従って、これら突然変異型c-ｋｉｔリガンド（ＫＬ）ポリペプチドは、c-ｋｉｔ受容体への正常な機能性リガンドの結合をブロックすることによって、c-ｋｉｔ受容体のリガンドにより媒介される生物学的機能に対する拮抗剤として作用する。このＫＬ拮抗剤は、ランダムな突然変異生成によって調製され得る。二量体化することができない突然変異型ＫＬ分子または修飾ＫＬ分子は、効果的な拮抗剤であり得る。ＫＬはＭ−ＣＳＦとかなりの相同性を有しており、二量体化にとって重要と思われる幾つかのαヘリックスを含んでいる（１０２）。これらヘリックス領域における部位指向性の突然変異によって、この二量体化の能力は阻害され得る。或いは、突然変異型ＫＬは正常な機能性ＫＬとのヘテロ二量体を形成し得るであろうが、このヘテロ二量体はｃ−ｋｉｔ受容体を活性化することはできないであろう。ｃ−ｋｉｔ受容体自体は、活性なキナーゼになるために二量体化することを必要とされるので、ｃ−ｋｉｔ受容体に結合して該受容体の二量体化を阻害する可溶性の突然変異型ＫＬは、効果的な拮抗剤であろう。
更に、出願人によって精製され、または出願人の組換え法によって製造されたc-ｋｉｔリガンド（ＫＬ）と、薬剤的に許容され得るキャリアとを含有した薬剤組成物が提供される。このc-ｋｉｔリガンドは、本発明の単離された可溶性c-ｋｉｔリガンド、そのフラグメント、または上記の可溶性の突然変異型c-ｋｉｔリガンド（ＫＬ）ポリペプチドを含み得る。ここで用いる「薬剤的に許容され得るキャリア」には、リン酸緩衝生理食塩水、水、油／水もしくは水／油エマルジョンのようなエマルジョン、および種々のタイプの湿潤剤のような、標準的薬剤担体の何れもが包含される。これら薬剤的キャリアには、吸入されるエアロゾル形態が含まれる。
上記のＫＬ拮抗剤は、喘息、アレルギー、アナフラキシー、アレルギー性喘息、リウマチ性関節炎を含む関節炎、乳頭状結膜炎、白血病、メラノーマ、皮膚性アレルギー反応、硬皮症を含む種々の疾患の治療に用いることができる。
本発明は更に、上記のc-ｋｉｔリガンドタンパク、可溶性c-ｋｉｔリガンド（ＫＬ）ポリペプチド又はそのフラグメントと特異的に複合体を形成できる物質を提供する。本発明はまた、c-ｋｉｔリガンド（ＫＬ）受容体タンパクと特異的に複合体を形成できる物質を提供する。本発明の一態様において、この物質はモノクローナル抗体、例えばヒトモノクローナル抗体である。
本発明によれば、c-ｋｉｔ細胞活性に関連した生物学的機能を修飾する方法が提供される。この方法は、その機能が修飾されるべき細胞のサンプルを、該細胞の生物学的機能を修飾するのに効果的な、有効量の上記薬剤組成物と接触させることを具備する。この方法によって修飾され得る生物学的活性には、細胞-細胞相互作用、c-ｋｉｔを発現する細胞の繁殖、およびin vitroでの受精が含まれるが、これに限定されるものではない。この方法は、in vitro又はin vivoにおいて行われ得る。この方法がin vivoで行われるとき、c-ｋｉｔ機能に関連した生物学的機能を修飾するのに効果的な、有効量の上記薬剤組成物が患者に投与される。
本発明の更なる側面は、ex-vivo法と、ex-vivoでの使用に適したキャリア中にＫＬを含有する組成物である。これらの側面には、次の二つが含まれる。
１．遺伝子の増血性前駆細胞へのトランスフェクションを向上させる方法であって、まず初期増血性細胞をＫＬおよび増血性因子を含有する組成物と接触させ、次いで工程（ａ）の培養細胞に遺伝子をトランスフェクトすることによる方法。
２．遺伝子を哺乳動物に導入する方法であって、ａ）初期増血性前駆細胞をＫＬを含有する組成物に接触させることと、ｂ）遺伝子を（ａ）の細胞にトランスフェクトさせることと、ｃ）哺乳動物に（ｂ）のトランスフェクトされた細胞を投与することとを具備する方法。これらの方法において、遺伝子はアンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡであり得る。
ＫＬおよび有効量の一つまたは複数の増血性成長因子を含有する組成物は、ex-vivoで末梢血液レベルを増大させるために使用することができる。増血性成長因子ＩＬ-1、ＩＬ-3、ＩＬ-6、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦまたはこれらの組み合わせは、特に適している（図２６参照）。末梢血液の増大のための方法もまた提供される。血小板レベルまたは他の細胞タイプをブーストするためのＫＬを含有する組成物および方法が提供される。
本発明は更に、細胞をＫＬと接触させることによって、ｃ−ｋｉｔ細胞活性に関連した生物学的機能を修飾する方法が提供される。この細胞は、ｃ−ｋｉｔを発現し、または増血性細胞であり、或いはin vitro受精に含まれるものであり得る。
本発明はまた、患者における肥満細胞の増殖を刺激する方法であって、患者に対して、患者の肥満細胞の増殖を刺激するのに有効な量で、上記の薬剤組成物を投与することを具備した方法を提供する。この投与方法は当業者に周知のものであり、経口投与、静脈内投与、または非経腸的投与が含まれるが、これらに限定されるものではない。該組成物の投与は、肥満細胞の増殖が刺激されるような投与量で行われる。患者内における該組成物の量が肥満細胞の増殖を刺激するのに効果的であるように、投与は連続的または間欠的に行われればよい。
患者における肥満細胞または赤血球前駆体の分化を誘導する方法であって、肥満細胞または赤血球前駆体の分化を誘導するのに有効な量で、上記の薬剤組成物を患者に投与することを具備した方法もまた、本発明によって提供される。この投与方法は当業者に周知のものであり、経口投与、静脈内投与、または非経腸的投与が含まれるが、これらに限定されるものではない。該組成物の投与は、肥満細胞または赤血球前駆体の分化が誘導されるような投与量で行われる。患者内の該組成物の量が肥満細胞または赤血球前駆体の分化を誘導するのに効果的であるように、投与は連続的または間欠的に行われ得る。
本発明は更に、ｃ−ｋｉｔリガンドを単独または組み合わせて使用する時に、前駆体細胞のレベルをブーストまたは刺激する方法を提供する。特に効果的な組み合わせは、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ-1、ＩＬ-3、ＩＬ-6、ＩＬ-7およびＭＩＰ１αとの組み合わせである。ＫＬに対してＩＬ-1、ＩＬ-3およびＩＬ-6を加える組合わせが最大限に効果的である。しかし、ＩＬ-1、ＩＬ-3、ＩＬ-6及びＧＭ−ＣＳＦは単独でも中程度に効果的である。特に、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）で処理された骨の、高増殖能コロニー形成試験（ＨＰＰ−ＣＦＵ）の成長に示されている通りである。このような組合せは、in vivo、in vitro及びex-vivoで使用することができる。
本発明はまた、患者における骨髄移植または白血病の治療を容易にする方法であって、患者に対し、骨髄移植を容易にし又は白血病を治療するのに効果的な量で、有効量の上記薬剤組成物を投与することを具備した方法を提供する。投与方法は当業者に周知のものであり、経口投与、静脈内投与、または非経腸的投与が含まれるが、これらに限定されるものではない。該組成物の投与は、骨髄移植が容易になるような投与量または白血病が治療されるような投与量で行われる。患者内の該組成物の量が効果的であるように、投与は連続的または間欠的に行われ得る。この方法は特に、急性骨髄性白血病の治療および慢性骨髄性白血病の改善に有用である。このｃ−ｋｉｔリガンドは、白血球細胞の増殖速度を増大することによって、化学療法に対して感受性にさせる。
本発明はまた、患者のメラノーマを治療する方法であって、患者に対して、メラノーマを治療するために効果的な、有効量の上記薬剤組成物を投与することを具備した方法を提供する。投与方法は当業者に周知のものであり、経口投与、静脈内投与、または非経腸的投与が含まれるが、これらに限定されるものではない。該組成物の投与は、メラノーマが治療されるような投与量で行われる。患者内における該組成物の量が効果的であるように、投与は連続的または間欠的に行われ得る。
可溶性のc-ｋｉｔリガンド（ＫＬ）ポリペプチドもまた、そのc-ｋｉｔに結合する能力を維持しつつ、c-ｋｉｔの生物学的活性が破壊されるように、突然変異され得る。従って、本発明は患者のアレルギーを治療する方法であって、患者に対し、アレルギーを治療するのに効果的な量で、上記の可溶性突然変異c-ｋｉｔリガンドの有効量および薬剤的に許容され得る担体を投与することを具備した方法を提供する。このような組成物は、当該突然変異型ｃ−ｋｉｔリガンド拮抗剤の水溶液を噴霧して吸入させるような、エアロゾール形態として投薬され得る。上記のＫＬ拮抗剤はまた、同じくエアロゾールの形態で、アレルギーに対しても有効であり得る。
ｃ−ｋｉｔリガンドの局所的薬剤組成物は、関節炎、リューマチ性関節炎、硬皮症、急性皮膚アレルギー反応について使用する効果的な薬物であろう。このｃ−ｋｉｔリガンド拮抗剤はまた、アレルギー性結膜炎、ポスト・アレルギー性組織損傷に対して効果的であり、或いはアナフラキシーショックに対する予防剤として効果的であり得る。肥満細胞はヒスタミン反応を媒介するから、ｃ−ｋｉｔリガンドに対して相補的なｃ−ｋｉｔ拮抗剤またはアンチセンス分子は、アレルギー及び胃酸分泌を含むヒスタミン媒介反応をブロックするために有効であろう。
メラニン細胞の増殖はＫＬに著しく依存するから、ｃ−ｋｉｔ拮抗剤はメラノーマの治療剤として効果的であろう。同様の仕方で、ＫＬ拮抗剤は白血病の治療に使用され得るであろう。
当業者には周知のように、アレルギーの治療に有効な上記組成物の量は、治療されるべき夫々の患者および治療されるアレルギーに応じて変化する。患者内における該組成物の量が効果的であるように、投与は連続的または間欠的に行われ得る。
更に、本発明はc-ｋｉｔ（ＫＬ）ポリペプチドの生物学的活性を測定する方法であって、正常骨髄肥満細胞の増殖が誘導されるような適切な条件下において、正常骨髄肥満細胞をc-ｋｉｔリガンド（ＫＬ）ポリペプチドのサンプルと共にインキュベートすることと；二重突然変異型骨髄肥満細胞を、適切な条件下でc-ｋｉｔリガンド（ＫＬ）ポリペプチドのサンプルと共にインキュベートすることと；その生成物の夫々を3Ｈ-チミジンと共にインキュベートすることと；正常骨髄肥満細胞および二重突然変異型骨髄肥満細胞のＤＮＡ中に取り込まれたチミジンの量を測定することと；正常骨髄肥満細胞中へのチミジンの取り込み量を、二重突然変異型骨髄肥満細胞中へのチミジンの取り込み量と比較することにより、c-ｋｉｔリガンド（ＫＬ）ポリペプチドの生物学的活性を測定することとを具備した方法を提供する。
この出願を通して、ＤＮＡ分子中の特定のヌクレオチドに関する参照は、ＤＮＡのコーディング鎖に存在するヌクレオチドに対するものである。この明細書の全体を通して、特定のヌクレオチドを示すために、以下の標準的な略号が用いられる。
Ｃ−シトシン        Ａ−アデノシン
Ｔ−チミジン        Ｇ−グアノシン
Ｕ−ウラシル
実験１：ｃ−ｋｉｔリガンドの精製
＜実験材料＞
マウスおよび胎児の同定
ＷＢＢ６+／+およびＷ／Ｗv、Ｃ５７Ｂ１６Ｗv／+およびＷＢＷ／+マウスは、ジャクソン研究所（バーハーバー、ＭＥ）から入手した。ヘテロ接合体Ｗ41／+マウスは、ジャクソン研究所のＪ．ベーカー博士の好意により提供され、兄弟姉妹交配により出願人のコロニーで維持された。肝臓が、妊娠１４〜１５日目に、Ｗ／+動物を交配することにより誘導された胎児から取り出された。Ｗ／Ｗ胎児は、同腹子のうちで、他のＷ／+および+／+胎児に比較して、青白い色と小さい肝臓の大きさによって同定された。それらの同定は、各々の胎児から誘導された肥満細胞におけるｃ−ｋｉｔタンパクの分析によって確認された（３８）。
肥満細胞の培養、腹腔内肥満細胞の調製およびフローサイトメトリー（流動細胞計測法）
肥満細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、ＷＥＨＩ−３Ｂ細胞の馴らし培地、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、および２−メルカプト−エタノールを補充したＲＰＭＩ−１６４０培地（ＲＰＭＩ−完全培地（Ｃ））中において、成熟マウスの骨髄および胎齢１４〜１５日の胎児肝臓細胞から増殖された（６０）。非付着性細胞を集め、１週間毎に培地を変え、７×１０5細胞／ｍｌより少ない細胞密度で維持した。培養液の肥満細胞含量を、１％トルイジンブルー含有メタノールでサイトスピン試料(cytospin preparation)を染色することにより、１週間毎に測定した。４週間後に、培養液は通常９５％以上の肥満細胞を含んでおり、これが増殖測定に使われた。腹腔内肥満細胞は、Ｃ５７Ｂ１／６マウスから、７〜１０ｍｌのＲＰＭＩ−Ｃで腹腔を灌流することによって得られた。肥満細胞は、以前報告されたのと本質的に同様にして（６１）、２２％メトリザミド（Metrizamide;ニコム(Nycomed）、オスロ、ノルウエー）を含有し、Ｃａ++およびＭｇ++を含まないＰＢＳを用いた密度勾配遠心分離によって精製された。肥満細胞を１％トルイジンブルー含有メタノールで５分間染色し、Ｈ2Ｏで５分間洗浄し、標準手順により硫酸ベルベリンで染色した（６２）。肥満細胞は、以前報告されたようにして、c-ｋｉｔの細胞外決定基を認識するｃ−ｋｉｔ特異性ウサギ抗血清で標識され、FACSCAN（ベクトン・ディッキンソン社）で分析された（３８）。
肥満細胞増殖測定
肥満細胞をＲＰＭＩで３回洗浄してＩＬ−３を除去し、これを試験試料の２倍連続希釈系列を含む９６穴プレートにおいて、０．２ｍｌのＲＰＭＩ−Ｃ中で５×１０4ｃ／ｍｌの濃度に培養した。プレートを３７℃で２４時間インキュベートし、１穴当たり２．５μＣの3Ｈ−ＴｄＲを添加し、更に６時間インキュベーションを継続した。細胞をガラス繊維フィルターで集め、ＤＮＡへのチミジンの取り込みを測定した。
繊維芽細胞馴らし培地の調製
Ｂａｌｂ／３Ｔ３細胞（１）を、１０％ウシ血清（ＣＳ）、ペニシリンおよびストレプトマイシンを添加したローラーボトル内のダルベッコ変法ＭＥＭ（ＤＭＥ）中において、集密状態にまで増殖させた。培地を除去し、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄した。ＣＳを含まないＤＭＥを加え、３日後に馴らし培地を回収した。細胞に対して血清を含む培地を１から２日間与え、次いで洗浄して血清を除去し、血清の入っていない培地を与え、そして３日後に第二の馴らし培地を回収した。馴らし培地（ＣＭ）は、細胞を除くために１５分間２５００ｒｐｍで遠心され、０．４５ｕフィルターを通して濾過され、４℃で凍結された。次いで、馴らし培地はペリコン限外濾過装置、続いてアミコン撹拌セル（両方ともカットオフ値が10,000ｋＤの膜を有している）を用いることにより、１００〜２００倍に濃縮された。
カラムクロマトグラフィー
ブルーアガロースカラムクロマトグラフィー（ＢＲＬ社、ガイテルスブルグ(Gaithersburg)、ＭＤ）が、ＰＢＳで平衡化したベッド用量１００ｍｌのカラムを使って行われた。濃縮ＦＣＭの５０−８０ｍｌを該カラムにかけ、１時間平衡化した後に活性物質を含む流出物を集め、透析チューブ内においてＰＥＧ 8000で１５〜２０ｍｌに濃縮した。
ゲル濾過クロマトグラフィーは、ＰＢＳで平衡化したＡＣＡ５４ウルトラゲル（ＬＫＢ社、ロックランド、ＭＤ）のカラム（２．６×９０ｃｍ）で行なわれ、分子量マーカーで検量された；使用された分子量マーカーは、ウシ血清アルブミン（Mr 68,000）、キモトリプシノーゲン（Mr 25,700）、リボヌクレアーゼＡ（Mr 14、300）で、これらは全てＮＪ州ピスカタウエー(Piscataway)のファルマシア社から入手したものである。ブルーアガロースカラムからの濃縮液をゲル濾過カラムに載せ、流速を３７．５ｍｌ／時間に調節し、そして７．５ｍｌ画分を集めた。
陰イオン交換および逆層ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）
高性能液体クロマトグラフィーは、ウォータースＨＰＬＣシステム（Ｗ600Ｅパワーラインコントロラー、490Ｅプログラム可能な多波長検出器、および810ベースラインワークステイション；ウォータース社、ベッドフォード、ＭＡ）を用いて行われた。ゲル濾過からの活性画分を0.05Mトリス−塩酸（pH7.8）で透析し、0.05Ｍトリス−塩酸（pH7.8）で平衡化されたプロテイン−パックDEAE−5PW・HPLCカラム（7.5 mm×7.5 cm、ウォータース社）にかけた。結合したタンパクは、０〜0.05Ｍトリス−塩酸（pH7.8）の直線的な濃度勾配で溶出された。結合したタンパクは、.02Ｍトリス−塩酸（pH7.8）中における０〜0.4Ｍ塩化ナトリウムの直線的な濃度勾配で溶出された。流速は１ｍｌ／分とし、２ｍｌの画分を回収した。
ＲＰ−ＨＰＬＣは、ヴィダック(Vydac）社の半分取用および分析用のサイズＣ18カラムを用いて行った。両カラムに対して、バッファーＡは100 mM酢酸アンモニウム（pH6.0）であり、バッファーＢは１−プロパノールであった。陰イオン交換からの生物活性のある画分を集め、半調整Ｃ18カラムにかけた。結合したタンパクは、最初１０分間は０％〜２３％の１−プロパノール、次の７０分間は２３〜３３％の１−プロパノールを用いた急激な濃度勾配で溶出された。流速は２ｍｌ／分に調節され、２ｍｌ画分が回収された。生物活性のある画分をプールし、バッファーＡで１：１に希釈し、そして分析用Ｃ18逆層カラムにかけた。タンパクは、１０分間は０％〜２６％の１−プロパノールを用いた急激な濃度勾配で溶出され、次いで２６％〜３３％の１−プロパノールを用いた穏やかな濃度勾配で７０分間溶出された。流速は１ｍｌ／分とし、１ｍｌ画分が回収された。分析用のＣ４逆層カラムによる分離は、水溶性０．１％ＴＦＡ中の０〜８０％のアセトニトリルを用いた直線的な濃度勾配で行われた。
等電点電気泳動（ＩＥＦ）
部分的に精製した１ｍｌのＫＬに、２０％(V/V）グリセロールおよびｐＨ３．５〜１０の２％(V/V）アンフォライン（ＬＫＢ社、ガイテルベルグ(Gaithersberg、）ＭＤ）を添加した。２％アンフォライン（ampholine;ｐＨ3.5〜10）を含有する５〜６０％のグリセロール密度勾配を、ＩＥＦカラム（ＬＫＢ8100）に負荷した。試料を勾配の等密度領域にかけ、続いてＩＥＦ（2000Ｖ、２４ｈ、４℃）を行った。５ｍｌ画分を集め、そして各々の画分でｐＨを測定した。これら画分をＲＰＭＩ−Ｃで透析し、生物活性を試験した。
赤血球前駆細胞の測定
成熟骨髄細胞、脾臓細胞および胎齢１４日の胎児肝臓細胞を、１．２の％メチルセルロース、３０％のＦＣＳ、100ｕＭの２−メルカプトエタノール、ヒト組換えエリトロポエチン（２単位／ｍｌ、アムジェン社、サウサンドオークス、ＣＡ）を含有するイスコヴ変法ダルベッコ培地（イスコヴ、1978；ノッカおよびペルス、1987）に、各々１０5、１０6及び１０7細胞／ｍｌで播いた。培養は３７℃で７日間インキュベートされ、ヘモグロビンを含有するコロニー及びバーストが倒立顕微鏡下で記録された。最適な増殖を行なうために、０．１ｍＭヘミン（コダック）を骨髄細胞の培養液中に添加した。精製したＫＬ、ＩＬ−３またはＷＥＨＩ−３ＣＭの何れか（１０％、vol/vol）、或いは組換えマウスＩＬ−３（５０ｕ／ｍｌ、ゲンザイム(Genzyme）、ケンブリッジ）を指示された箇所に添加した。
＜実験方法＞
短期間の肥満細胞の増殖測定は繊維芽細胞由来の活性を検出する
正常の肥満細胞の増殖を促進するが、Ｗ／ＷV肥満細胞の増殖は促進しない繊維芽細胞由来成長因子活性の同定および測定を行うために、ＢＭＭＣをＩＬ−３を含まない培地で洗浄し、２０倍濃縮した繊維芽細胞ならし培地（ＦＣＭ）あるいはＷＥＨＩ−３・ＣＭ（ＩＬ−３）を含む培地で培養した。２４時間培養した後、3Ｈ−チミジンの取り込みを決定した。正常+／+マウスおよび突然変異Ｗ／ＷVマウスに由来するＢＭＭＣは、ＩＬ−３に対する反応が類似していた（図１）；対照的に、２０倍濃縮した繊維芽細胞馴らし培地は+／+肥満細胞の増殖を促進したが、Ｗ／ＷV肥満細胞ではほとんど増殖は促進されなかった。濃縮したＦＣＭはまた、他のＩＬ−３依存細胞の増殖を刺激する能力についても試験された。骨髄性の３２Ｄ細胞は、ｃ−ｋｉｔ遺伝子産物を欠落していることが知られている（３５）。３２Ｄ細胞について、ＷＥＨＩ−３・ＣＭでは正常な増殖が観察されたが、ＦＣＭでの増殖は観察されなかった（結果は示していない）。これらの結果と、ＷおよびＷv対立遺伝子の両方でｃ−ｋｉｔの欠乏が知られているということを併せて考慮すると、ＦＣＭ活性は肥満細胞（ＢＭＭＣ）中の機能的なｃ−ｋｉｔタンパクの発現に依存しており、従ってｃ−ｋｉｔ受容体のリガンドかもしれないということが示唆された。さらに、ＦＣＭ活性はＩＬ−３とは性質が異なる。従って、正常肥満細胞およびＷ突然変異肥満細胞は、繊維芽細胞馴らし培地からの得た推定ｃ−ｋｉｔリガンド（ＫＬ）の精製のための、単純で特異的な測定系を提供する。
肥満細胞刺激活性ＫＬの精製
ＫＬを精製するために、Ｂａｌｂ／３Ｔ３繊維芽細胞の無血清馴らし培地５１を、限外濾過で５０倍に濃縮した。濃縮液をＰＢＳで平衡化したブルーアガロースカラムに通し、肥満細胞刺激活性を含む素通り画分を集め、ポリエチレングリコールで濃縮した。正常肥満細胞を使った生物活性の測定に加えて、精製されたピーク画分は、ほとんど活性が観察されないＷ／Ｗv肥満細胞でも試験された。ブルーアガロースカラムからの物質は、ＡＣＡ・５４カラムを用いたゲル濾過によって分画された（図２Ａ）。生物学的活性は、夫々５５〜７０ｋＤおよび３０ｋＤに対する大ピークおよび小ピークとして溶出した。主要なピークの画分を回収し、透析し、ＮａＣｌ濃度勾配を有するＤＥＡＥ−５ＰＷカラム上でのＦＰＬＣクロマトグラフィーで分画した（図２Ｂ）。活性は、０．１１ＭのＣａＣｌでＦＰＬＣカラムから溶出した。ピーク画分を集め、半分取用Ｃ１８カラムを用いて、酢酸アンモニウム／ｎ−プロパノール濃度勾配でＨＰＬＣクロマトグラフィーを行った（図２Ｃ）。半調製用Ｃ１８カラムから３０％ｎ−プロパノールで溶出された活性物質をバッファーＡで１：１に希釈し、分析用Ｃ１８カラムを使って再びクロマトグラフィーを行った（図２Ｄ）。活性な単一ピークが３０％ｎ−プロパノールで再び溶出され、これは溶出プロファイルにおける吸光度（２８０ｎｍ）の主要ピークに対応した。同様の結果が、溶媒としてＨ2Ｏおよび.１％ＴＦＡを含むアセトニトリルを用いたＣ４カラムによっても得られた（図３Ｂ）。両方の溶媒系による分離からの得られた活性分画のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染色によって、２８〜３０ｋＤの分子量に対応した移動度をもつ１本の主要なバンドが示された。このバンドの存在と量は、生物学的な活性のピークと良く相関していた（図３）。還元条件下および非還元下において、このバンドの移動度に有意な違いはなかった。これは、ＫＬがジスルフィドで結合された二量体ではないことを示している（図３Ｃ）。３本の分離した物質が、還元条件下および非還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥで観察された。これは、精製された物質の大きさが不均一であることを示している。280 nmでの吸光度によって見積もられたタンパクの総量は、参照標準のＢＳＡと比較した銀染色で検出された量と相関していた。表１に示すように、Ｂａｌｂ／３Ｔ３細胞の馴らし培地から得たＫＬの精製は３０００倍以上であり、最初の全活性の４７％の回収率であった。出願人の試験容量０．２ｍｌにおける+／+肥満細胞の最高増殖量の１／２を、５０単位の活性と定義する。これは約０．５ｎｇのタンパクに対応する。部分的に精製した物質（イオン交換の後）の等電点電気泳動は、３．７−３．９のｐＨ領域に活性の主要なピークを示した。これは、ＫＬの等電点が３．７〜３．９であることを示している。
0003750819.tif 000002
異なるｃ−ｋｉｔ／Ｗ突然変異をもった肥満細胞のＫＬに対する増殖反応
精製されたＫＬが、野生型動物、並びにＷ、ＷvおよびＷ41対立遺伝子のホモ接合体およびヘテロ接合体に由来する肥満細胞の増殖を刺激するその能力について試験された。本来のＷ対立遺伝子は非機能的なｃ−ｋｉｔ受容体で特徴付けられ、Ｗ対立遺伝子がホモ接合体の動物は周産期に死亡して重篤な貧血を示し、またＷ／Ｗ胎児から得られた肥満細胞はＢａｌｂ／３Ｔ３繊維芽細胞と共培養したときに増殖しない（６３、３８）。ＷvとＷ41の対立遺伝子はともに、部分的に欠損したｃ−ｋｉｔ受容体で特徴付けられ、ホモ接合体突然変異動物は生存できる（６４、６５、３８）。ホモ接合体Ｗv動物は重篤な大赤血球貧血を有しており、それらの肥満細胞は共培養測定において僅かな反応を示す。また、より重篤でないＷ41対立遺伝子のホモ接合体は中程度の貧血を有し、それらの肥満細胞は共培養測定において中程度の反応を示す。ホモ接合変異体およびヘテロ接合変異体、並びに+／+肥満細胞は、先に記述したように、ＷvおよびとＷ41対立遺伝子については骨髄から、またＷ対立遺伝子については胎齢１４日の胎児肝臓から誘導された。胎児肝臓由来のＷ／Ｗ肥満細胞はＫＬに反応して増殖することはなかったが、ヘテロ接合体（Ｗ／+）および正常（+／+）な肥満細胞は、両者共にＫＬに対する同様の増殖反応を示した（図４）。Ｗv／Ｗvマウスから得た骨髄由来肥満細胞は、ＫＬに対する反応が著しく欠損していたが、１０００Ｕ／ｍｌにおいて或る程度の増殖、すなわち+／+値の１０％の増殖が観察された（図４）。ヘテロ接合体Ｗ／+肥満細胞とは対照的に、Ｗv／+肥満細胞は、この変異の優性遺伝の特徴と一致して中程度の反応（４０％）を示した。Ｗ41／Ｗ41およびＷ41／+肥満細胞もまた、ＷおよびＷv対立遺伝子を有する肥満（細胞）よりは少ない程度であるけれども、ＫＬで増殖する能力を欠損しており、この事実は当該突然変異のｉｎ ｖｉｖｏ表現型と一致している（図４）。これらの結果は、Ｗ、ＷvおよびＷ41の対立遺伝子を持つ肥満（細胞）のＫＬに対する反応性と、これらの突然変異の重篤度およびｉｎ ｖｉｖｏでの特徴との間の相関性を示している。対照的に、ＷＥＨＩ−３ＣＭ（ＩＬ−３）に対する突然変異肥満細胞の増殖反応は、異なるＷ突然変異によって影響されなかった。
ＫＬは腹腔内肥満細胞の増殖を刺激する
腹膜腔内肥満細胞（ＰＭＣ）は既によく特徴付けられており、ＢＭＭＣとは対照的に、結合組織型肥満細胞の代表である（６６）。ＰＭＣはＩＬ−３単独に対する反応においては増殖しないが、それらの成熟した表現型と生存率はＮＩＨ−３Ｔ３繊維芽細胞と共培養することにより維持することが出来る（６７）。従って、ＫＬがＰＭＣの増殖を刺激するかどうかを決定することは興味深い。最初に、ｃ−ｋｉｔがＰＭＣで発現されるかどうか決定するための実験を行った。腹腔肥満細胞をメトリザミド(metrizamide）密度勾配遠心法により精製し、細胞表面でのｃ−ｋｉｔ発現を抗ｃ−ｋｉｔ血清あるいは正常ウサギ血清を用いた免疫螢光法により分析した。ＰＭＣプレパレーションは、トルイジンブルーと硫酸ベルベリンによる染色に基づけば、９０−９８％の純度であった。硫酸ベルベリンは結合組織の肥満細胞の顆粒中のヘパリン・プロテオグリカンを染色し、更にこの色素はＤＡＮを染色することも知られている（図５）（６２）。ＢＭＭＣと粘膜肥満細胞は、ヘパリンプロテオグリカンよりもコンドロイチン硫酸ｄｉ−Ｂ／Ｅプロテオグリカンを優位に含んでおり（６７）、従って硫酸ベルベリンはＢＭＭＣの顆粒を染色しない（図５Ａ）。フローサイトメトリーによるｃ−ｋｉｔ発現の分析によって、実質的にすべてのＰＭＣが、ＢＭＭＣで観察されたｃ−ｋｉｔ発現と同程度でｃ−ｋｉｔを発現することが示された（図５Ｂ）。次に、ＫＬがＰＭＣの生育に影響を与えるか否か、あるいは増殖を刺激するか否かを決定するための実験を行った（図５Ｃ）。ＰＭＣを培地単独の中で培養し、あるいはＢＭＭＣに対する最適濃度のＷＥＨＩ−３ＣＭを添加した培地中で培養すると、ＷＥＨＩ−３ＣＭ中では僅かな細胞が長期間生存したけれども、３−４日間以内でＰＭＣの生存率を失う結果となった。ＫＬの存在下でＰＭＣを培養する生存が持続され、２週間後の細胞数は５０００から６０，０００へ増加した。ＢＭＭＣの数の同様な増加は、ＫＬに対する反応性においても観察された。ＰＭＣのＷＥＨＩ−３ＣＭに対する増殖反応の欠如とは対称的に、ＢＭＭＣは、予期されたようにＷＥＨＩ−３ＣＭで増殖された。培養して１週間後および２週間後に、細胞をトルイジンブルーと硫酸ベルベリンで染色した。硫酸ベルベリン染色は単離された直後のＰＭＣと比較したとき幾らか減少していたけれども、両色素により１００％の細胞が染色され、ＰＭＣの成熟した表現型は培養中にも維持されていた。
ＫＬは赤血球バーストの形成（ＢＦＵ−Ｅ）を刺激する
Ｗ突然変異の重要な側面は、赤血球細胞系統への影響である。ｉｎ ｖｉｖｏでのこの欠損の結果は、最も重篤な対立遺伝子のホモ接合体にとっては致死的な、大赤血球貧血である（４７，６５）。Ｗ／ＷVマウスの骨髄における赤血球前駆細胞集団の分析は、ＢＦＵ−ＥおよびＣＦＵ−Ｅの僅かな減少を示す（６８、６９）。Ｗ／Ｗ胎児の肝臓では、ＢＦＵ−Ｅの数は影響を受けないが、ＣＦＵ−Ｅの数の大きな減少が観察される。これは、赤血球成熟の個別の段階でのｃ−ｋｉｔの役割が、ＣＦＵ−Ｅの段階よりもかなり前であることを示唆している（３５）。造血機能におけるＫＬの役割を評価するために、またｃ−ｋｉｔ受容体への関係をより明らかにするために、ＢＦＵ−Ｅ形成に対するＫＬの影響を測定した。骨髄、脾臓および胎児肝臓の細胞を、標準培地の条件下で、ＫＬ、エリトロポエチンおよびＷＥＨＩ−３ＣＭの存在および非存在下において撒いた。次いで、培養７日目にＢＦＵ−Ｅの数を数えた。エリトロポエチンの非存在下では、ＷＥＨＩ−３ＣＭあるいはＫＬでの赤血球の増殖は観察されなかった。エリトロポエチンの存在下において、脾臓細胞からのＢＦＵ−Ｅは、ＫＬにより濃度依存的に刺激された。即ち、エリトロポエチン単独での１２ＢＦＵ−Ｅ／１０6細胞から、２．５ｎｇのＫＬ／ｍｌによる最高刺激での５０ＢＦＵ−Ｅ／１０6細胞へと刺激された（図６）。ＢＦＵ−Ｅの数に対する効果に加えて、バーストの平均の大きさがＫＬによって劇的に増大した。ＫＬ＋エリトロポエチンを加えた脾臓細胞を使って得られたＢＦＵ−Ｅの数は、ＷＥＨＩ−３ＣＭ＋エリトロポエチンを加えて観察された数と同様であった。これとは対照的に、ＫＬ＋エリトロポエチンは骨髄細胞からのＢＦＵ−Ｅの増大を刺激しなかったが、ＷＥＨＩ−３ＣＭ＋エリトロポエチンは、１０5骨髄細胞から１８のＢＦＵ−Ｅ形成を引き起こした。胎齢１４日の胎児肝臓細胞に対するＫＬの影響も実験したが、脾臓細胞と同様の結果が観察された。胎児肝臓細胞からのＢＦＵ−Ｅの有意な数が、エリトロポエチン単独で観察された；しかし、２．５ｎｇ／ｍｌのＫＬによって、６±２から２０±５へ増加した。ＷＥＨＩ−３ＣＭ＋エリトロポエチンの存在下では、１８±３のＢＦＵ−Ｅが胎児肝臓細胞で観察された。
赤血球系列におけるＫＬのｃ−ｋｉｔに対する関係を更に評価するために、ＫＬが、Ｗ／Ｗマウスの胎児肝臓細胞からの赤血球バースト形成を促進するか否かを評価した。Ｗ／Ｗと、Ｗ／+またが+／+肝臓細胞を、交配したＷ／+マウスの胎齢１６．５日の胎児から調製した。有核細胞の全数は、健康な胎児と比較して、Ｗ／Ｗ突然変異の肝臓では８倍減少していた。Ｗ／Ｗと、Ｗ／+または+／+の胎児肝臓からのＢＦＵ−Ｅの数は、ＩＬ−３＋エリトロポエチンで生育した培養において同様であり、エリトロポエチン単独で生育した培養におけるＢＦＵ−Ｅの低い水準についても同様であった（図７）。Ｗ／Ｗ胎児肝臓細胞に対して、ＫＬはエリトロポエチン単独で観察された水準以上にはＢＦＵ−Ｅを刺激しなかった。ところが、Ｗ／+または+／+肝臓細胞からのＫＬ依存性ＢＦＵ−Ｅの数は、エリトロポエチン＋ＩＬ−３で得られたものと同様であった。この結果は、ＫＬに対する赤血球前駆細胞の反応性がｃ−ｋｉｔ機能に依存しているということを示唆している。
精製ＫＬの結合実験
精製したＫＬを、クロラミンＴ法を用いて、125Ｉで高比活性（例えば２．８×１０5ｃｐｍ／ｎｇ）にラベルした。このラベルしたＫＬを用いて、肥満細胞へのＫＬの特異的結合を検出した。しかし、Ｗ／Ｗ肥満細胞については結合は観察されず、同腹子の肥満細胞へは良好な結合を示した。肥満細胞に結合した後、ＫＬはｃ−ｋｉｔに対する抗血清で共沈殿された。加えて、Ｗ突然変異肥満細胞へのＫＬの結合は、細胞表面でのｃ−ｋｉｔ発現（Ｖ、３７（+）対Ｗ（-）と関係している。
ｃ−ｋｉｔリガンドのペプチド配列の決定
ｃ−ｋｉｔ受容体タンパクを記述したようにして単離し、該タンパクの配列を、当業者に周知の方法で決定した。
該タンパクの、Ｎ−末端からの一文字記号によるアミノ酸配列は下記の通りである：
0003750819.tif 000003
但し：
Ｋ＝リジン；Ｅ＝グルタミン酸；Ｉ＝イソロイシン；Ｘ＝不明；Ｇ＝グリシン；Ｎ＝アスパラギン；Ｐ＝プロリン；Ｖ＝バリン；Ｔ＝スレオニン；Ｄ＝アスパラギン酸；Ｌ＝ロイシン；Ａ＝アラニン；Ｙ＝チロシン；Ｍ＝メチオニン；である。
＜実験の考察＞
Ｗ遺伝子座とｃ−ｋｉｔプロトオンコジーンとが対立遺伝子であるとの発見は、発生過程および成熟動物でのｃ−ｋｉｔの機能について重要な情報を明らかにした。ｃ−ｋｉｔ受容体の機能に関する知見によって、今度はｃ−ｋｉｔ受容体のリガンドを産生する組織および細胞のタイプについての重要な糸口が提供された。ｃ−ｋｉｔリガンドを同定する試みにおいて、Ｂａｌｂ／３Ｔ３繊維芽細胞（ｃ−ｋｉｔリガンドを産生すると推定される一つの細胞タイプ）の馴らし培地から、ＫＬと命名された成長因子が精製された。この成長因子は、肥満細胞の生物学および造血機能に関して、ｃ−ｋｉｔリガンドに期待される生物学的性質を有している。ＫＬは、３０ｋＤの分子量と３．８の等電点を有する。ＫＬは、この特性をもったＣＳＦ−１，ＰＤＧＦ−ＡおよびＰＤＧＦ−Ｂとは対照的に、ジスルフィドで結合された二量体ではない（７０，７１）。けれども、ＰＢＳ中でのゲル濾過の際におけるＫＬの挙動は、５５−７０ｋＤの大きさを示している。このことは、生理的条件下での、非共有結合で結合した二量体の存在と一致する。ＫＬは、ＢＭＭＣ及び精製した腹腔肥満細胞（ＣＴＭＣ）の増殖を刺激する能力を有するが、Ｗ突然変異マウスからのＢＭＭＣｓに対する増殖刺激能力はもたないことに基づけば、肥満細胞に対する影響において、ＩＬ−３およびＩＬ−４のような他の造血性成長因子とは異なっている。Ｂａｌｂ／３Ｔ３繊維芽細胞は、造血性成長因子Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＣＳＦ−１、ＬＩＦおよびＩＬ−６の供給源である；しかし、これらは何れもＫＬの生物活性を持っていない（３５，７１）。さらに、ＫＬのタンパク配列の決定からの予備的な結果は、ＫＬが既知のタンパク配列とは異なることを示している。
Ｗ突然変異マウスには肥満細胞が存在しないので、ｉｎ ｖｉｖｏでの肥満細胞の増殖、分化および／または生存におけるｃ−ｋｉｔおよびそのリガンドの特異的な役割が推論されている（７２、７３）。肥満細胞の分化において、ｃ−ｋｉｔ機能が必要とされる正確な１または２以上の段階は知られていない。ＩＬ−３によって骨髄、胎児肝臓または脾臓からｉｎ ｖｏｔｒｏで誘導された肥満細胞は、最終的に分化した肥満細胞であるＭＭＣおよびＣＴＭＣの両方のタイプの前駆細胞を意味するのではあるが、粘膜の肥満細胞（ＭＭＣ）に似ている（６６）。ＩＬ−３依存性肥満細胞は、正常およびＷ突然変異マウス両方の骨髄あるいは胎児肝臓から同等の効率で発生され得るから、ｃ−ｋｉｔは明らかに、造血性前駆細胞からのＢＭＭＣの発生には必要とされない（６０）。ＢＭＭＣおよびＣＴＭＣ／ＰＭＣにおけるｃ−ｋｉｔ発現と、これに対応したＢＭＭＣおよび成熟ＣＴＭＣ／ＰＭＣのＫＬに対する反応性の証明は、肥満細胞の分化における多数の段階でのｃ−ｋｉｔの役割を示唆している。繊維芽細胞に加えて、ＩＬ−３とＩＬ−４との組み合わせ、ＩＬ−３とＰＭＡとの組み合わせ、またはＩｇＥ受容体の架橋によって、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＣＴＭＣの増殖が刺激され得ることが示されている（７４，７５，７６，７７，７８）。アレルギーおよび炎症応答の媒介物であるこれら生体反応修飾物質とは対称的に、ＦＣＳの存在下において、ＫＬは単独でＣＴＭＣ増殖を刺激する能力を有する。従ってＫＬは、その産生や標的細胞に対する作用のためのこれら免疫応答とは独立した、肥満細胞の増殖および分化活性を有しているかもしれない。
Ｗ突然変異が及ぼす造血機能の欠損は、赤血球細胞の成熟におけるｃ−ｋｉｔの必須な役割を示している（８０，６８，６９）。同腹子と比較した、Ｗ／Ｗ胎児の肝臓における赤血球前駆細胞の分析によって、ｃ−ｋｉｔ機能が存在しない状態では、成熟は正常にＢＦＵ−Ｅ段階へ到達するが、ＣＦＵ−Ｅ段階への進行は抑制されることが示唆された（３５）。ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、この欠損は、エリトロポエチンと共働してＷ／Ｗvおよび+／+骨髄からのＢＦＵ−Ｅの成熟を容易にするのに充分なＩＬ−３を、培養系へ添加することにより克服され得る（７８）。ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、このプロセスでのＩＬ−３の役割は知られておらず、従って、ｃ−ｋｉｔは赤血球分化のこの段階を通る進行において重要な機能を果たし得る。エリトロポエチンと共同して、脾臓および胎児肝臓細胞からの赤血球バーストの形成を刺激するＫＬの能力は、赤血球分化のこの段階で機能するｃ−ｋｉｔと一致する。さらに、Ｗ／ＷのＢＦＵ−Ｅを刺激するＫＬの能力は、ＫＬに媒介されるＢＦＵ−Ｅ形成にｃ−ｋｉｔ機能が必要とされることを示唆している。このことは、ＫＬに媒介される肥満細胞の増殖にｃ−ｋｉｔ機能が必要性とされること似ている。Ｂａｌｂ／３Ｔ３の、胎児肝臓細胞からのＢＦＵ−Ｅの分化に対するバースト促進効果は既に報告されている（７９）。ＫＬは、Ｂａｌｂ／３Ｔ３細胞のバースト促進活性の原因であるらしい。この研究の興味ある発見は、ＫＬが、骨髄細胞からの７日目のＢＦＵ−Ｅを刺激することができないことである。この結果は、胎児肝臓、成人脾臓および成人骨髄中におけるＢＦＵ−Ｅが、成長要求物において異なることを示唆している。最近の実験は、培養液中でより遅い時期に（１４−２０日）出現する骨髄細胞中での初期の赤血球多機能性前駆細胞が、ＫＬによって刺激されるかもしれないことを示している。ＢＦＵ−Ｅ形成におけるＫＬの直接的な影響を示すために、また補助細胞あるいは他の内在成長因子の関わり合いを除外するために、精製した前駆細胞集団による実験を行う必要がある。
造血機能および肥満細胞発生の欠損に加えて、Ｗ突然変異は造血系の幹細胞コンパートメント(compartment）に影響を及ぼすと思われる。影響される集団には、様々な細胞系統に対する長期間のリポピュレイション能力を持つ細胞と同様、致死的な放射線を受けたマウスの脾臓中の骨髄コロニーを産生する脾臓コロニー形成単位（ＣＦＵ−Ｓ）が含まれ得る（８１，４６，４７，８１，８２）。いまや、ｃ−ｋｉｔ／Ｗ遺伝子産物が幹細胞コンパートメント（compartment）で機能する段階を同定するために、ＫＬが、可能であれば他の造血性成長因子と組み合わせて、自己複製あるいは造血系幹細胞集団の分化能力における影響を有しているか否かを決定するのは興味深いことであろう。
マウスのスチール遺伝子座（Ｓｌ）における変異は、Ｗ変異を持つマウスの表現系に類似して、造血系、メラニン形成および配偶子形成における多形質な表現系を産生する（４７，５１）。しかし、Ｗ突然変異とは対照的に、Ｓｌ突然変異は突然変異の細胞内標的の微小環境に影響を与えるが、細胞自律的ではない（４６）。ＷおよびＳｌ変異の相似的および相補的な影響によって、ｃ−ｋｉｔ受容体のリガンドまたは遺伝子産物をコードするＳｌ遺伝子は、産物および／またはリガンドの機能と密接に連結していることが示唆されている（９）。この推測に合致して、Ｓｌ／Ｓｌd胚繊維芽細胞またはＳｌ／Ｓｌd繊維芽細胞の馴らし培地は、夫々、ＢＭＭＣおよび肥満細胞前駆細胞の増殖を援助できないし、多分機能的なＫＬを産生しないであろう（１６，８４）。もし、ＫＬがｃ−ｋｉｔ受容体のリガンドであるとすれば、分子的な分析によって、Ｓｌ遺伝子座の遺伝子産物に関するＫＬの特性を決定することが可能とされるであろう；さらに、Ｓｌ変異をもったマウスへのＫＬの投与によって、少なくともこの突然変異の幾つかの症候が治癒に導かれることが予期されるであろう。
１．４ｋｂのｃＤＮＡクローンが、既述した方法を使ってヒト繊維芽細胞またはヒト胎盤ライブラリーをスクリーニングするために用いられた。ヒトｃ−ｋｉｔリガンドをコードする遺伝子の単離において、遺伝子は既述の方法を使って特徴づけられるであろう。
実験２：核酸配列の単離
＜実験の方法＞
マウスおよび組織培養
ＷＢＢ６+／+、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、Ｃ５７ＢＬ／６７ＷV／+、ＷＢ６Ｗ／+、Ｃ３ＨｅＢ／ＦｅＪ a／a ＣａJＳ１  Ｈｍ、およびＭ．スプレータス(M.spretus）マウスは、ジャクソン・ラボラトリー（バー・ハーバー、ＭＥ）から得られた。種間の交配のために、雌Ｃ５７Ｂ１／６Ｊと雄Ｍ．スプレータス・マウスとを交配させた；この交配の子孫は、以下に述べるようにＣ５７Ｂ１／６ＪまたはＭ．スプレータス対立遺伝子の遺伝を刻み込まれる。（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ×Ｍ．スプレータス）Ｆ１雌オフスプリング(offspring）は、Ｃ５７Ｂ１／６Ｊ雄と戻し交配された。
肥満細胞は、+／+、Ｗv／ＷvおよびＷ／+成体マウスの骨髄および胎齢１４−１５日のＷ／Ｗ胎児の胎児肝臓から、１０％胎児細胞血清（ＦＣＳ）、ＷＥＨＩ−３Ｂ細胞の馴らし培地、非必須アミノ酸、ピルビン酸および２−メルカプトエタノール（ＲＰＭＩ−含有）を添加したＲＰＭＩ１６４０培地中で増殖された（３６、６０）。ＢＡＬＢ／ｃ  ３Ｔ３細胞（１）は、ポール・オッドーネル(Paul O′Donnell)（スローン・ケッタリング・インスティテュート(Sloan-Kettering Institute）ニューヨーク、ニューヨーク）から入手され、１０％ウシ血清、ペニシリン、およびストレプトマイシンを添加したダルベッコ変法ＭＥＭ中で増殖された。
ＫＬの精製とアミノ酸配列決定
他で記載されているように、肥満細胞増殖試験（３７）を使って、ＢＡＬＢ／ｃ  ３Ｔ３細胞の馴らし培地からＫＬを精製した。次いで、ペリコン限外濾過装置およびこれに続いてアミコン撹拌セルを用い、馴らし培地を１００−２００倍に濃縮した。次に、濃縮液はブルーアガロース（ベテスダ・リザーチ・ラボラトリー、ガイテルスブルグ、ＭＤ；BethesdaResearch Laboratories,Gaithersburg, MD）上でのクロマトグラフにかけられ、活性物質を含む流出物がポリエチレングリコール8000の透析膜で濃縮され、ＡＣＡ５４ウルトラゲル（ＬＫＢ社、ロックランド、ＭＤ）カラム上でのゲル濾過クロマトグラフィーによって分画された。生物活性は、５５〜７０ｋｄおよび０ｋｄに夫々対応する大ピークおよび小ピークとして溶出された。大ピークの画分を集めて透析し、ＤＥＡＥ−５ＰＷカラム上でのＦＰＬＣによって、ＮａＣｌ濃度勾配で分画した。活性は、０．１１Ｍ  ＮａＣｌでＨＰＬＣカラムから溶出された。ピーク分画が回収され、半分取型Ｃ１８カラムと酢酸アンモニウム−ｎ−プロパノールの濃度勾配でＨＰＬＣにかけられた。３０％ｎ−プロパノールで半分取型Ｃ１８カラムから溶出した活性物質は、１：１に希釈され、分析用Ｃ１８カラムを使って再びクロマトグラフにかけられた。再び、３０％ｎ−プロパノールで単一のピークが溶出され、それは溶出プロファイルで吸光度（２８０ｎｍ）の大ピークに相当した。同様の結果が、溶媒としてＨ2Ｏと0.1％ＴＦＡを含むアセトニトリルでのＣ４カラムを用いることにより得られた。Ｎ−末端アミノ酸配列を、ＰＴＨアミノ酸分析計を接続したアプライド・バイオシステム４７７Ａを用いて決定した（Hewick et al.,1961）。
ヨード化
ＫＬは、スタンレーとギルバートの方法を改良したクロラミンＴ法（1981）を用いてヨード化された。概略を述べると、標識化反応においては、全量２５μｌの0.25Ｍリン酸バッファー（ｐＨ６．５）中に、200 ngのＫＬ、２nmolのクロラミンＴ、１０％ジメチルスルフォン酸、および0.02％ポリエチレングリコール8000が含有せしめられた。反応は４℃で２分間行い、２nmolのシステインおよび４μＭのＫＩを添加することにより停止された。次に、ＫＬはＰＤ１０カラム（ファルマシア）を用いたゲル濾過により、遊離のＮａＩから分離された。ヨード化されたＫＬは、４℃で２週間保存された。
結合測定
結合バッファーはＲＰＭＩ1640培地、５％ＢＳＡ（シグマ社）、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ7.5）およびＮａＮ3を含有していた。非付着性細胞についての結合実験は、９６穴組織培養皿を用いて、100μｌ量のウエル当り２×１０5細胞で行なった。Ψ２細胞での結合実験は300μｌ両の２４穴皿で行なった。細胞は、詰抗体または標識したＫＬを添加する１５分前に、結合バッファーで平衡化された。非特異的な結合を決定するために、125Ｉ−ＫＬを添加する３０前に、標識していないＫＬまたは抗ｃ−ｋｉｔウサギ血清を１０倍量過剰に添加した。細胞は125Ｉ−ＫＬと共に９０分間インキュベートされ、非付着性細胞が150μｌのＦＣＳによりペレット化された。細胞ペレットは凍結され、計数された。
免疫沈降と架橋結合
ＢＭＭＣを125Ｉ−ＫＬと共に標準結合条件下でインキュベートし、４℃において、ＦＣＳ中で洗浄し次いでＰＢＳ中で洗浄した。以前報告されたようにして（３５）、細胞は１％トライトンＸ−１００、２０ｍＭトリス（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５０ｍＭのＥＤＴＡ、１０％グリセロール、並びにプロテアーゼ阻害剤のフッ化フェニルメチルスルフォニル（１ｍＭ）およびロイペプシン（２０ｇ／ｍｌ）によって溶解された。溶解物はｃ−ｋｉｔ特異的な血清を用いて免疫沈降された。このｃ−ｋｉｔは、正常ウサギ血清を用いて、またはｖ−ｋｉｔチロシンキナーゼドメイン（２３）のフラグメント若しくは組換えワクシニアウイルス（３６）のｃＤＮＡから発現されたマウスｃ−ｋｉｔでウサギを免疫化することにより生成されたものである。共沈殿実験のために、免疫沈降物は洗浄液Ａ（0.1％トライトンＸ−１００、２０ｍＭトリス[pH7.4］、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１０％グリセロール）で３回洗浄され、ＳＤＳサンプルバッファーで可溶化され、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラヂオグラフィーで分析された。架橋実験のために、細胞は４℃で３０分間、ＰＢＳ中のジスクシニミジル基質（0.25ｍｇ／ｍｌ）と共にインキュベートされ、ＰＢＳ洗浄され、そして前述のようにして溶解された。沈殿に続く洗浄条件は次の通りである：洗浄液Ｂで１回（５０ｍＭトリス、５００ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭのＥＤＴＡ、0.2％トライトンX-100）、洗浄液Ｃで３回（５０ｍＭトリス、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．１％トライトンX-100、0.1％−ＳＤＳ、５ｍＭのＥＤＴＡ）そして洗浄液Ｄで１回（50ｍＭトリス、0.1％トライトンX-100）。
ｃＤＮＡ合成、ＰＣＲ増幅（ＲＴ−ＰＣＲ）、および配列決定
ＲＴ−ＰＣＲ増幅は、本質的には先に公表されているのと同様にして行なった（５３）。ｃＤＮＡ合成のために、25μｌの0.05Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ8.3）、0.075Ｍ塩化カリウム、３ｍＭ塩化マグネシウム、10ｍＭジチオトレイトール、200ＭのｄＮＴＰｓおよび25ＵのＲＮＡｓｉｎ（プロメガ社）中で集密培養されたＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３細胞に由来する１μｇのポリ（Ａ）-が、50 pmolアンチセンスプライマーおよび50Ｕのモロニーネズミ白血病ウイルス逆転写酵素と共に、４０℃で３０分間インキュベートされた。更に、５０Ｕの逆転写酵素が添加され、保温は更に３０分間続けられた。ｃＤＮＡは、50ｍＭ塩化カリウム、10ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ8.3）、1.5ｍＭ塩化マグネシウム、0.01％（W/V）ゼラチン、および200μＭのｄＮＴＰｓを含む２５μｌに、５０ｐｍｏｌのセンスプライマー及び2.5ＵのＴａｑ・ＤＮＡポリメラーゼを添加し、反応液を５０μｌに増量して、温度自動制御サイクラー（パーキン−エルマー・シータース社）で２５−３０サイクル増幅することにより増幅された。増幅されたフラグメントは、アガロースゲル電気泳動により精製され、適切な制限酵素で切断され、配列分析を行なうためにＭ１３ｍｐ１８およびＭ１３ｍｐ１９中にサブクローン化された（４９）。
ｃＤＮＡの単離と配列
この実験では、クロンテック社(Clonetech)から得たマウス３Ｔ３繊維芽細胞ラムダｇ11・ｃＤＮＡライブラリーが使用された。スクリーニングは、宿主バクテリアとして大腸菌Ｙ1090を用いて２回行われた（４８）；５′末端をラベルしたオリゴヌクレオチドをプローブとして用いた。ハイブリダイゼーションは、63℃において６倍ＳＳＣ（６×ＳＳＣ）で行ない、フィルターの最後の洗浄は２倍ＳＳＣ、0.2％ＳＤＳを用いて63℃で行なった。組換えファージはＥｃｏＲＩで切断され、配列決定のために、挿入物はＭ１３中にサブクローン化された。これらｃＤＮＡのヌクレオチド配列は、両方の鎖および重なり部分について、ザンガー等のジデオキシチェインターミネーター法（４９）により、合成オリゴデオキシヌクレオチド（17量体）をプライマーに用いて決定した。
ＤＮＡおよびＲＮＡ分析
ゲノムＤＮＡはテイルフラグメントから調製され、制限酵素で切断され、電気泳動で分画され、ナイロン膜に転写された。ハイブリッド形成のために、1.4ｋｂのＫＬ・ｃＤＮＡおよびＴＩＳ・Ｄｒａ／ＳａＩ（トランスジェニック系列ＴＧ．ＥＢ（８５）の導入遺伝子挿入部位から得たプローブ）をプローブに用いた。ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３細胞をグアニジンイソチオシアネートでホモジェナイズし、ＲＮＡをチーウイン(Chirgwin)らの方法（１０）に沿って単離さした。全細胞のＲＮＡ（10ｇ）およびポリ（Ａ）+ＲＮＡは、１％アガロース／ホルムアルデヒドゲルで分画され、ナイロン膜に転写された。プレハイブリダイゼイション及びハイブリダイゼイションは、先に公表されているようにして行なった（８６，３５）。［32Ｐ］リン酸で標識した1.4ｋｂのＫＬ・ｃＤＮＡを、ハイブリダイゼイションのプローブとして使った。
ｃ−ｋｉｔおよびｃ−ｋｉｔリガンドモノクローナル抗体の調製
ヒト・モノクローナル抗体を単離するために、８週齢のＢａｌｂ／ｃマウスの腹膜組織内に、容量比１：１で完全フロイントアジュバント中に含まれる本発明の精製ヒト可溶性ｃ−ｋｉｔリガンド（ＫＬ）ペプチド、またはその可溶性フラグメント50μｇ（上記の通り調製したもの）を注入した。次いで、マウスは１か月の間隔をあけて、不完全フロイントアジュバントと混合した可溶性リガンドポリペプチド又は可溶性リガンドポリペプチドフラグメントで追加免疫され、尾静脈から脱血された。融合させる４日、３日および２日前に、生理食塩水中のポリペプチドあるいはフラグメント50μｇを静脈内に投与することにより、マウスを追加免疫した。次に、本発明の属する技術において公知の方法に従って、脾臓細胞が非分泌性の骨髄腫細胞と融合された。２週間後、既述したようにして、ハイブリドーマ上清はｃ−ｋｉｔ受容体タンパクに対する結合活性についてスクリーニングされた。次いで陽性クローンが単離され、増殖された。
別法として、ｃ−ｋｉｔ受容体に対するモノクローナル抗体を産生するために、マウスに対してｃ−ｋｉｔ受容体タンパクの注射および追加免疫を行うこと除いて、上記の方法が実施された。
或いは、ネズミモノクローナル抗体を単離するためには、スプラーグードーリー(Sprague-Dawley)ラットまたはルイスラットに対してネズミ由来ポリペプチドを注射し、得られた脾細胞がラット・ミエローマ（ｙ３−Ａｇ１．２．３）細胞と融合される。
＜実験結果＞
造血細胞増殖因子ＫＬをコードするネズミｃＤＮＡの単離および定性
既述のアニオン交換クロマトグラフおよび逆相ＨＰＬＣを含む一連のクロマトグラフ工程によって、BALB/C 3T3細胞の馴らし培地からＫＬタンパクを精製した（３７）。先に述べたように、ＫＬのＮ末端の４０個のアミノ酸配列は下記のように決定された：
0003750819.tif 000004
ハイブリッド形成のための非縮重相同性プローブを誘導するために、図８に示すように、アミノ酸１０−１６（センスプライマー）およびアミノ酸３１−３６（アンチセンスプライマー）に対応する、５′末端にエンドヌクレアーゼ認識配列を付与した完全に縮重したオリゴヌクレオチドプライマーを合成した。ポリメラーゼチェインリアクションの逆転写酵素改変法（ＲＴ−ＰＣＲ）を用いることにより、ＫＬのアミノ酸１０−３６を特定するＫＬ・ｍＲＮＡの配列に対応するｃＤＮＡを得た。BALB/C 3T3細胞由来のポリ（Ａ）+ＲＮＡを、縮合オリゴヌクレオチドプライマーと組み合わせて、ｃＤＮＡ合成およびＰＣＲ増幅のテンプレートとして使用した。
増幅されたＤＮＡ断片をＭ１３にサブクローン化し、３つの挿入物の配列を決定した。プライマー間の配列はユニークであり、且つ正しいアミノ酸配列を特定することが分かった（図８参照）。ＰＣＲ増幅物のユニークな配列に対応するオリゴヌクレオチド（49ヌクレオチド）は、次に、λgt11のネズミ繊維芽細胞ライブラリーのスクリーングに使用された。３′側半分においてオープンリーデイングフレームが特定されている1.4kbのクローンが得られた。このオーブンリーディングフレームは、クローンの３′末端にまで広がっており、270のアミノ酸をコードする（図１１参照）。ＫＬアミノ酸配列の最初の25アミノ酸は、シグナル配列の特徴を有している。そのシグナル配列の後には、精製されたタンパクに由来するＮ末端ペプチド（アミノ酸26-65）が続いている。陽性に電荷したアミノ酸がカルボキシル末端に続いている21アミノ酸の疎水性配列（残基217-237）は、トランスメンブラン部位の特徴を有している。シグナルペプチドとトランスメンブレンドメインの間の配列には、４つの潜在的なＮ-リンクされたグリコシル化部位と、４つの不規則に離間されたシステインが存在する。３３アミノ酸のＣ末端部分が、トランスメンブレンドメイン部位に続いているが、終止シグナル（クローン末端）には達していない。従って、ＫＬアミノ酸配列はトランスメンブレンタンパクの特徴、つまりＮ末端シグナルペプチド、細胞外ドメイン、トランスメンブレンドメインおよびＣ末端細胞内セグメントの特徴を有している。
BALB/C 3T3細胞胞においてＫＬに特異的なＲＮＡ転写物を同定するために、ＲＮＡブロット分析を行なった（図１２参照）。1.4kbのＫＬ・ｃＤＮＡをプローブに用いることによって、ポリ（Ａ）+ＲＮＡを含むブロット上に、6.5kbの主要転写物および4.6kbと3.5kbの２つの短い転写物を同定した。Ｎ末端タンパク配列由来の末端ラベルされたオリゴヌクレオチドを用いることによって、同一の転写物が検出された。この結果は、ＫＬが、BALB/C 3T3細胞で多量に発現する大きなｍＲＮＡによってコードされていることを示している。
可溶化型ＫＬはｃ−ｋｉｔ受容体のリガンドである
繊維芽細胞由来の造血細胞増殖因子ＫＬは、一次骨髄肥満細胞および腹腔肥満細胞の増殖を促進し、また赤血球バースト促進活性を示すことが既に示されている。ＫＬタンパクがｃ−ｋｉｔ受容体のリガンドであるか否かを確認するために、まず、高レベルのｃ−ｋｉｔタンパクを発現する細胞：即ちｃ−ｋｉｔ・ｃＤＮＡを発現する肥満細胞（ＢＭＭＣ）およびＮＩＨψ2細胞と、ＫＬとの特異的結合を示すことが考えられた。改変クロラミンＴ法を用いることにより、ＫＬを125Ｉで高比活性にラベルした（８８）。ラベルした物質のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析では、28-30ｋｄ（図１３参照）の単一バンドが表われ、また肥満細胞増殖分析によって、ラベルした物質が生物学的活性を保持していることが示された。
125I-ＫＬの濃度をあげ、ｃ−ｋｉｔ・ｃＤＮＡを発現するＮＩＨψ2細胞、ＮＩＨψ2対象細胞、正常なＢＭＭＣ、並びにＷ／Ｗ，Ｗ／＋およびＷv／ＷvＢＭＭＣに対するＫＬの結合を４℃において測定した。図１４に示した結果によって、ラベルされたＫＬが、ＮＩＨψ2ｃ−ｋｉｔ細胞、並びに＋／＋，Ｗ／＋およびＷv／Ｗv肥満細胞には結合するが、ＮＩＨψ2ｃ−ｋｉｔ対照細胞およびＷ／Ｗ肥満細胞には結合しないことが示される。Ｗv突然変異は、ｃ−ｋｉｔのキナーゼドメインにおけるミスセンス突然変異の結果であって、in-vitroにおけるキナーゼ活性を阻害するが、細胞表面のｃ−ｋｉｔタンパクの発現には影響を与えない（３６）。これとは対照的に、Ｗは、ｃ−ｋｉｔタンパクのトランスメンンブランドメインが除去されるようなスプライス欠陥に起因した欠失によって生じるものであり、従って細胞表面にはｃ−ｋｉｔタンパクが発現されない（３６）。更に、125Ｉ-ＫＬの結合は、非ラベル化ＫＬおよび２種類の抗ｃ−ｋｉｔ抗血清を用いて完了させることができた。これらの結果から、その細胞表面にｃ−ｋｉｔを発現する細胞は、125ＩでラベルされたＫＬと結合することが示された。
ＫＬがｃ−ｋｉｔ受容体のリガンドであることについて、より直接的な証拠を得るために、受容体／リガンドの複合体がｃ−ｋｉｔ抗血清による免疫沈殿によって精製されるか否かを確認した。この実験では、ＫＬ−ｃ−ｋｉｔ複合体が安定で、且つｃ−ｋｉｔ受容体の可溶化に用いる洗浄剤によって影響を受けない事が必要である。受容体−リガンド複合体のこのような性質の先行例は、密接に関連したマクロファージコロニー刺激ファクター（ＣＳＦ−１）受容体およびＰＤＧＦ受容体のシステムから導かれる（８９）。125I-ＫＬは、４℃でインキュベーションすることによって、ＢＭＭＣ上の受容体と結合する。遊離の125Ｉ−ＫＬを洗浄除去する際に、トリトンＸ-100溶菌手法を使用することによって細胞を溶解させ、またプロテインＡ／セファロースに結合した抗ｖ−ｋｉｔおよび抗ｃ−ｋｉｔウサギ血清を用いて沈殿させた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる免疫複合体の分析（図１５Ａ）に示されるように、125Ｉ−ＫＬは、抗ｋｉｔ血清とのインキュベーションによって得られた免疫沈殿中には保持されるが、非免疫コントロールの場合には保持されない。これによって、完全な125I-ＫＬが、抗ｋｉｔ血清との免疫複合体を含むサンプルから回収されることが実証された。
c-ｋｉｔ-ＫＬ受容体−リガンドの複合体を更に特徴づけるために、ＫＬがｃ-ｋｉｔに架橋結合され得るか否かを確認した。ＢＭＭＣを125Ｉ−ＫＬと共にインキュベートし、洗浄し、架橋結合したジサクシンイミジイル基質で処理した。次に、細胞溶解物を抗-v-kit抗血清と共に免疫沈殿させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。オートラジオグラフで次の三つの種が示された。一つは約３０kdの種であり、ｃ−ｋｉｔに架橋結合しないことによって共沈殿したＫＬを示す。一つは180-190 kdの種で、共有結合したｃ−ｋｉｔＫＬの単量体-単量体複合体に対応する。残りの一つは、分離ゲルとスタッキングゲルの間の境界にある高分子構造物である（図１５Ｂ）。細胞溶解物を事前の免疫沈殿なしにＳＤＳ−ＰＡＧＥで直接分離したところ、同様の大きさの分子構造物が観察された。非免疫血清で沈殿を行なった後では、125Ｉラベルされた分子は観察されなかった。高分子構造物の形成は、肥満細胞とＫＬとのインキュベーションに依存しており、架橋結合したＫＬ自身とのインキュベーションでは観察されなかった。これらの結果を一緒に考慮すると、ＫＬはｃ−ｋｉｔ受容体に特異的に結合し、ＫＬがｃ−ｋｉｔのリガンドである証拠が提供される。
Ｓ１遺伝子座に対するＫＬのマッピング
Ｓ１遺伝子座にＫＬがコードされているか否かを試験するために、組換え分析を用いて、Ｓ１と緊密にリンクしている遺伝子座についてＫＬのマッピング位置を決定した。この遺伝子座は、トランスジェニック系のＴＧ．ＥＢにおける導入遺伝子（トランスジーン）の挿入部位である（８５）。この挿入部位からクローニングされた遺伝子配列は、Ｓ１から0.8±0.8ｃＭの地図上にある事が確認された。従って、これはＳ１に対して最至近距離にある公知のマーカーを示している。
トランスジーン挿入部位に関してＫＬをマップするために、c57BL/6Jマウスと、Mus spretus種のマウスとの交配を利用する種間マッピング分析を採用した。この方法は、実験室での異種近親交配系の間よりも異種間において、クローニングされたＤＮＡに制限断片長の多型（RFLPs)が頻繁に見られるとの所見を利用してる（９０）。1.4kbのＫＬ・ｃＤＮＡプローブと、TIS Dra/SaIプローブ（トランスジーンの挿入部位からのプローブ）との結合(linkage）は、これら夫々のc57BL/6JまたはMus spretus 対立遺伝子の遺伝的一致点を数えることによって評価した。これらは、Traql制限酵素消化分解によって明らかになったRFLPsを分析することによって、容易に区別され得る。この結合分析の結果を表２に示す。５３の子孫のうち、ただ一つの組換え体のみが得られた。これは組換率1.9±1.9％と一致する。この値は導入遺伝子の挿入部位とＳ１との間で測定された遺伝距離に極めて近いから、この結果は、ＫＬがＳ１遺伝子座にマップされているという見解と一致する。
0003750819.tif 000005
ＫＬによって同定された遺伝子座については、オリジナルＳ１突然変異を有するマウスでもテストされた（５０）。この目的のために、近親交配系でのトランスジーン挿入部位遺伝子座が多型であるいう所見を、胎児発達期のＳ１における遺伝子タイプを確認するために有利に利用した。交配によって、C3HeB/FeJに保持されたＳ１突然変異を有するC57BL/6Jマウスを産生させ、Ｓ１対立遺伝子を有するＦ１世代を同種交配させた（C57BL/6J  Ｓ１3CH/＋Ｓ１C3H/＋）。この交配より得られるホモ接合体の子孫ＳＩＩＳＩは貧血性であり、トランスジーン挿入部位におけるC3HeB/FeJ由来のRFLPについてホモ接合である（図１６参照）。非貧血性のマウスは、ヘテロ接合であるＳ１Ｉ＋または野生型かの何れかであり、C3HeB/FeJおよびC57BL/6J由来の多型についてヘテロ接合であるか、またはC57BL/6J多型についてホモ接合である。ＳＩＩ＋およびＳＩＩＳＩマウス由来のゲノムＤＮＡを、1.4kbのＫＬ・ｃＤＮＡを使用して分析したところ、ホモ接合体であるＳＩＩＳＩ・ＤＮＡとのハイブリダイゼーションは見られなかった（図１６参照）。従って、Ｓ１突然変異において、ＫＬタンパクをコードする遺伝子座が欠損していることは明らかである。この知見は更に、ＫＬがＳ１遺伝子の産生物であるという見解を支持する。
＜実験考察＞
ｃ−ｋｉｔ-プロトオンコジーンとネズミＷ遺伝子座とが対立遺伝子の関係にあるとの発見によって、発育期の動物および成体動物におけるｃ−ｋｉｔ受容体の多面的作用が明らかになった。更に、この発見によって、哺乳類におけるトランスメンブランチロシンキナーゼ受容体の最初の遺伝子システムが提供された。Ｓ１遺伝子座およびｃ−ｋｉｔ／Ｗ遺伝子座における突然変異は、同じ細胞標的に影響を及ぼす。これらの突然変異が相補的であり、特性が類似しているため、ｃ−ｋｉｔ受容体のリガンドがＳ１遺伝子座によってコードされることが示唆された。
ここでで報告された実験は、Ｓ１遺伝子がｃ−ｋｉｔ受容体のリガンドをコードしていることを実証するものである。この結論の論拠は次の通りである。ＫＬと称するｃ−ｋｉｔ受容体作用の知見に基づき、ｃ−ｋｉｔ受容体の予想リガンド（ＫＬと命名）が同定され、精製された（３７）。また、機能的ｃ−ｋｉｔ受容体を発現する細胞にＫＬが結合し、またＫＬとｃ−ｋｉｔタンパクが安定な複合体を形成することを証拠にして、ｃ−ｋｉｔ受容体にＫＬが特異的に結合することも実証された。ＫＬに特異的なｃＤＮＡクローンが誘導され、またＫＬがマウスの染色体１０上のＳ１遺伝子座にマップされていることが示された。さらに、ＫＬ配列がＳ１マウスのゲノム上で欠損していることも実証された。これらの結果を総合すると、ＫＬはＳ１遺伝子座でコードされること、およびＫＬがｃ−ｋｉｔ受容体のリガンドであることが示唆される。これにより、Ｓ１欠陥のための分子レベルでの根拠が提供される。
ＫＬ・ｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列から推定されるアミノ酸配列によって、ＫＬは一体的なトランスメンンブレンタンパクとして合成されることが示唆される。従って、ＫＬの主要な転写物の構造的特徴は、ＣＳＦ−１の構造的特徴と類似する。ＣＳＦ−１はトランスメンブラン分子として合成され、タンパク加水分解によってプロセッシングされて、分泌される可溶性生成物を形成し得る（９１，４４）。おそらくはＣＳＦと同様に、ＫＬもまた、プロセッシングされて可溶性タンパクを形成し得る細胞表面分子として合成されるのであろう。従って、BALB/C 3T3細胞の馴らし培地から精製されるタンパクは、細胞膜型からタンパク加水分解によって分泌された可溶性型ＫＬであろう。ＫＬタンパクの翻訳後のプロセッシングおよび発現は未だ明らかになっていないが、細胞表面付着型のＫＬが、ｃ−ｋｉｔ／Ｗ受容体システムの増殖機能および移行機能を指示する細胞-細胞間相互作用を媒介するのであろう。ＫＬの細胞膜付着型の所見と一致して、可溶性ｃ−ｋｉｔ受容体とアルカリフォスファターゼの融合タンパクは、BALB/C 3T3細胞の細胞表面に結合するが、Ｓ１Ｉ／Ｓ１マウスに由来する繊維芽細胞には結合しないことが示されている（１４）。
ｃ−ｋｉｔ受容体のリガンドの同定における最も重要な側面は、リガンドの同定が、ｃ−ｋｉｔの多面的機能の研究を容易にするという事実にある。造血システムにおいて、ｃ−ｋｉｔ／Ｗ突然変異は赤血球および肥満細胞系に影響を与え、また幹細胞区画に対する影響も推測されている。ｃ−ｋｉｔ／ＫＬは赤血球の成熟に重要な役割を果たしており、これは突然変異動物の貧血で最も良く観察される。更に、Ｗ／ＷおよびＳＩＩＳＩd動物由来の胎児肝臓においては、ＢＦＵ−Ｅの数が正常なままであるのに対し、ＣＦＵ−Ｅの数は抑制される。このことは、ｃ−ｋｉｔ／ＫＬが、分化のＢＦＵ−Ｅ段階からＣＦＵ−Ｅ段階への進行を促進することを示唆している（９０，３５）。この点に関して、ＫＬは骨髄におけるＢＦＵ−Ｅ（７日目）、並びに培養中に後で現われる初期赤血球多能性前駆細胞の増殖および分化（１４−２０日目）を刺激することが示されている（３７）。
ＷおよびＳ１に突然変異をもつマウスには肥満細胞が存在しないため、in vivoでの肥満細胞の増殖、分化および／または生存ににおいて、ｃ−ｋｉｔ／ＫＬが重要な役割を持つことが推論されている（７２，７３）。肥満細胞の分化において、ｃ−ｋｉｔ／ＫＬが必要とされる段階は正確には分かっていない。ＢＭＭＣは正常およびＷ突然変異体マウスから同等の効率で派生し得るので，骨髄細胞および胎児肝臓からのＢＭＭＣのin vitroでの派生には、ｃ−ｋｉｔ／ＫＬの作用は必要とされない（６０）。ＫＬに応答してＢＭＭＣおよび結合組織タイプの肥満細胞が増殖するという出願人の論証は、アレルギー反応および炎症反応を媒介すると考えられているＩＬ−３およびＩＬ−４に依存しない肥満細胞の増殖および分化の様々な段階における、ｃ−ｋｉｔ／ＫＬの役割を示すものである（６６）。幹細胞区画において、この影響を受ける集団には多分、致命的な放射能照射を受けたマウスの膵臓に骨髄コロニーを作る膵臓コロニー形成ユニット（ＣＦＵ−Ｓ）、並びに様々な細胞系で長期にわたって再集団化可能な細胞が含まれる（８０，８１，８２，８３）。いまや、幹細胞においてｃ−ｋｉｔ／ＫＬがどの段階で働くかを同定するために、in vitroにおける造血幹細胞集団の自己再生または分化の潜在能力に対するＫＬの影響を、できれば他の造血細胞増殖因子と組み合わせて決定することが興味の対象である。ｃ−ｋｉｔの他の作用は、細胞周期性をもたない細胞から細胞周期性を持つ細胞への移行を促進することであろう（３１）。ＳＩＩＳＩdおよびＷ／ｗvマウスの放射線感受性の増加は、幹細胞ダイナミクスにおけるこのような役割を示唆する；更に、関連するＰＤＧＦ受容体は細胞周期（過程）へのエントリーを促進することが知られている。
配偶子形成において、ＷおよびＳ１突然変異体は始原生殖細胞の増殖および生存に影響を与え、またその初期分化期における始原細胞卵黄嚢内臓胚から生殖器隆起への移行に影響する。出生後の配偶子形成においては、ｃ−ｋｉｔ発現が未成熟卵母細胞および成熟卵母細胞、精原細胞ＡおよびＢ、並びに間隙組織にも検出された（３９）。メラニン形成において、ｃ−ｋｉｔ／ＫＬはおそらくは初期発生過程ならび成熟メラニン細胞において、メラニン芽細胞の増殖および神経堤から神経末梢へのメラニン芽細胞の移行に作用すると思われる。ＫＬが入手可能になったことによって、これらの細胞システムにおけるｃ−ｋｉｔ受容体の作用のin vitro研究が促進されるであろう。
ｃ−ｋｉｔ発現細胞の作用する微細環境がＳ１突然変異体マウスには欠けており、この微小環境はｃ−ｋｉｔリガンドが生産される部位と推定される。突然変異の偶発的な性格のために、in vivoでＫＬを産生する細胞タイプはわかっていない。しかしながら、ＷおよびＳ１突然変異体の遺伝的欠損を再産生するin vitroシステムにおいて、この疑問に関心が当てられてきている。長期の骨髄細胞培養システムにおいて、ＳＩＩＳＩd付着細胞には遺伝的欠損があるが、非付着造血細胞には遺伝的欠損はない。また、肥満細胞−繊維芽細胞共培養システムにおいて、ＳＩＩＳＩd繊維芽細胞には遺伝的欠損があるが、肥満細胞では欠損がない（１２，１６）。これらのin vitroシステムでの結果は、造血間質細胞、胚細胞、結合組織繊維芽細胞がＫＬを産生することを示唆する。胚細胞起源のBALB/C 3T3細胞系は、ＫＬをかなりのレベルで発現し、ＫＬ精製のための細胞源とされた。ＫＬを発現する細胞タイプの知見は、ｃ−ｋｉｔ発現が文書報告されている部位（消化管、神経システム、胎盤および脳顔面頭葢構造）において、ｃ−ｋｉｔが作用しているか否かを評価するのに役立ち得る（３５，３９）。Ｓ１、Ｗの表現型がこれらの細胞システムに関連しているか否かは分かっていない。
マウス染色体１０上に、ＫＬ遺伝子（即ちＳ１遺伝子座）とトランスジーン挿入遺伝子座Tg・EBとの間の密接なリンクがあることを立証するために、同一種間の戻し交配を使用した。同様のアプローチが、Ｓ１近傍にあるTg・EB遺伝子座のマップを作るために以前から使用されてきた。しかしながら、ＫＬコード配列がもとのＳ１対立遺伝子で欠損しているという知見は、Ｓ１遺伝子座とＫＬ遺伝子とが同一であることを支持している。現時点では、Ｓ１対立遺伝子の欠損の大きさは分かっていない。それが近隣遺伝子に影響を与えるか否かを確認することが重要であろう。
Ｓ１対立遺伝子にＫＬコード配列が欠損していることは、この対立遺伝子がＫＬゼロ突然変異(null mutation）であることを示している。Ｓ１対立遺伝子がホモ接合のとき、大半のマウスが大赤血球貧血により周産期に死亡し、希に生き残ったマウスもコート色素を欠き、生殖細胞を欠く（５）。この表現型は、ＫＬとｃ−ｋｉｔのリガンド-受容体の関係に合致して、重篤なｃ−ｋｉｔ／Ｗの機能喪失突然変異の表現系と非常に相似する。ＳＩＩＳＩとＷ／Ｗホモ接合とでは異なるが、例えば胚細胞の分化においＳ１はより顕著な影響を与え、造血機能においてＳ１はより重篤な貧血を惹起する。しかし、これらの相違は異種株という背景から来るものなのか、あるいはＳ１欠損が近傍の遺伝子に影響を与えた結果なのかは分からない（５）。
オリジナルなＷ突然変異は、ｃ−ｋｉｔゼロ突然変異の例である（３６）。正常対立遺伝子とのヘテロ接合子のとき、ＷＩ＋マウスは典型的な腹側スポットを有するが、コート色素の稀薄化はなく、また造血細胞および配偶子形成に対する影響もない。ＷＩ+マウスにおける弱いヘテロ接合の表現型は、Ｓ１Ｉ+マウスのヘテロ接合の表現型とは対照的であり、中程度の大赤血球貧血および腹側スポットに加えて、稀薄化したコート色素および小さい生殖腺を有する。このように、５０％のＫＬ遺伝子量は制限的であり、またｃ−ｋｉｔ受容体の正常な作用には不十分であるが、殆どの場合において、５０％のｃ−ｋｉｔ受容体量では制限的であるようにはみえない。
造血機能、配偶子形成機能およびメラニン形成機能において、ｃ−ｋｉｔ受容体システムは、成熟の進んだ細胞タイプと同様、未成熟の前駆細胞集団中でも作用する。重篤なＳ１およびＷ突然変異は、これらの細胞系の発生を阻害する。従って、より成熟した細胞集団におけるｃ−ｋｉｔ受容体の作用は明らかではない。ｃ−ｋｉｔ／ＫＬの作用の一部のみが損なわれているＳ１およびＷ突然変異は、しばしば成熟がより進んだ細胞集団において影響を表わす。多くの弱いＳ１対立遺伝子が知られている。例えば、配偶子形成形成およびメラニン形成におけるそれらの表現型は、ｃ−ｋｉｔ受容体システムの多面的作用を解明する上で重要であろう。
実験３；ＫＬ−１およびＫＬ−２
＜実験材料＞
マウスおよび組織培養
ＷＢＢ６＋／＋、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ及び１２９／Ｓｖ−Ｓｌd／＋マウスをジャクソン・ラボラトリー(Bar Harbor、ME）から入手した。１２９／Ｓｖ−Ｓｌd／＋雄および雌マウスを交配し、胎齢１４日の胎児を得た。これらをTodaroおよびGreenの方法（５４）に従う胚繊維芽細胞の誘導のために用いた。１０％牛胎児血清（ＦＣＳ）、ＷＥＨＩ−３Ｂ細胞からの馴し培地、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウムおよび２−メルカプトエタノールを補充したＲＰＭＩ-1640培地（ＲＰＭＩ−完全（Ｃ））（３６）中で、＋／＋成体マウスの骨髄から肥満細胞を成長させた。１０％牛血清（ＣＳ）、ペニシリン及びストレプトマイシンを補充したダルベルコ改変ＭＥＭ（ＤＭＥ）中で、Ｂａｌｂ／３Ｔ３細胞（１）を成長させた。Dr. Jerrard Hurwitz（ＳＫＩ）からＣＯＳ−１細胞（１８）を入手し、これを１０％牛胎児血清、グルタミン、ペニシリンおよびストレプトマイシンを補充したＤＭＥ中で成長させた。
抗ＫＬ抗体の生成
Ｂａｌｂ３Ｔ３細胞の馴し培地から、肥満細胞増殖反応測定法（３７）を用いて、マウスＫＬが精製された。抗ＫＬ抗体を得るために、１匹のウサギを、完全フロインドアジュバント中に含有させた１μｇのＫＬを皮下注射して免疫感作させた。３週間後、このウサギに対して、不完全フロインドアジュバント中に含ませた１μｇのＫＬを皮下注射して追加免疫を行なった。１週間後に血清を採取し、その後は２週間の間隔で血清を採取した。この目的に用いられた125Ｉ−標識ＫＬは、先に述べたスタンレイおよびギルバートのクロラミンＴ法の改良法によってヨウ素標識された。
ｃＤＮＡライブラリー・スクリーニング
Ｂａｌｂ／ｃ３Ｔ３繊維芽細胞の全ＲＮＡから、オリゴ（ｄＴ）-セルロースクロマトグラフィーによってポリ（Ａ）ＲＮＡが調製された。次に、インビトロゲン社(Invitrogen Inc.）によって、カスタムメイドのｃＤＮＡが調製された。基本的に、二本鎖ｃＤＮＡはオリゴｄＴおよびランダムプライミングによって合成された。非パリンドローム性のＢｓｔＸＩリンカーを鈍端ｃＤＮＡに連結し、ＢｓｔＸＩで消化した後、ｃＤＮＡは発現プラスミドｐｃＤＮＡＩ（インビトロゲン）中にサブクローニングされた。次いで、エレクトロポレーション法によって、ライゲーション反応混合物を用いてE.coli MC1061/P3を形質転換し、プラスミド・ライブラリーを生成させた。当初、このライブラリーは約１０7独立コロニーの大きさであった。このプラスミド・ライブラリーをスクリーニングするために、前述の末端標識オリゴヌクレオチド・プローブが用いられた（３８）。ハイブリダイゼーションは、６倍ＳＳＣ（６Ｘ  ＳＳＣ）中において６３℃で行われ、フィルターの最終洗浄は６３℃において２Ｘ  ＳＳＣおよび０．２％ＳＤＳで行われた。組み換えプラスミドの挿入物は、ＨｉｎｄIIIおよびＸｂａＩでの消化により解放され、次いで配列分析のためにファージＭ１３ｍｐ１８中にサブクローニングされた。
ＰＣＲ増幅（ＲＴ−ＰＣＲ）および配列決定
組織および細胞ラインからの全ＲＮＡを、Chirgwinのグアニジウム・イソチオシアナート／ＣｓＣｌ遠心分離法により作成した（１０）。このＲＴ−ＰＣＲ増幅は基本的に前述のようにして行われた（３８）．以下のプライマーがＲＴ−ＰＣＲのために用いられた。
プライマー＃１：
0003750819.tif 000006
プライマー＃２：
0003750819.tif 000007
プライマー＃３：
0003750819.tif 000008
プライマー＃４：
0003750819.tif 000009
ｃＤＮＡを合成するために、0.05ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ：8.3）、0.75ＭのＫＣｌ、３ｍＭのＭｇＣｌ2、10ｍＭのＤＴＴ、200μＭのｄＮＴＰ′ｓ及び25ＵのＲＮＡｓｉｎ（ＢＲＬ社）を含む５０μｌの溶液中に、細胞ラインまたは組織から得た全ＲＮＡ１０μｇを溶解し、これをアンチセンスプライマー50ｐモルおよび400Ｕのモロネイマウス白血病ウイルス・逆転写酵素（ＢＲＬ）と共に３７℃で１時間インキュベートした。このｃＤＮＡを、1／10容量の３Ｍ・ＮａＯＡｃ（ｐＨ：7.0）および2.5容量部無水エタノールを加えることにより析出させ、50μｌのｄｄＨ2Ｏ中に再懸濁させた。ＰＣＲは、10ｍＭのトリス−ＨＣｌ（pH:8.3）、50ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ2、0.01％（ｗ／ｖ）のゼラチン、200μＭのｄＮＴＰ′ｓ、夫々500ｐモルのセンスおよびアンチセンスプライマー、並びに2.5ＵのＴａｑポリメラーゼ(Perkin-Elmer-Cetus)を含む100μｌの溶液中において３０サイクル行われた。センスプライマー及びアンチセンスプライマー内に、ＨｉｎｄIII部位およびＸｂａＩ部位を夫々配置した。増幅されたＤＮＡフラグメントをアガロース・ゲル電気泳動法で精製し、適当な制限酵素で消化し、配列分析のためにＭ１３ｍｐ１８及びＭ１３ｍｐ１９中にサブクローニングした（４９）。ＫＬ−１、ＫＬ−２、ＫＬ−Ｓ及びＫＬ−ＳｌdのＰＣＲ産物を、ＨｉｎｄIIIおよびＸｂａＩで消化し、次いで発現プラスミドｐＣＤＭ８またはｐｃＤＮＡＩ（インビトロゲン社）中にサブクローニングした。アルカリ溶解法（４８）でミニプレプ(miniprep)プラスミドＤＮＡを調製し、続いてフェノール-クロロホルム抽出およびエタノール析出を行った。ＣＯＳ−１細胞の形質転換に用いられるマキシプレプ(maxiprep)プラスミドＤＮＡは、「Ｑｉａｇｅｎ」クロマトグラフィーカラム法によって調製した。
ＲＮＡｓｅ保護試験
ＫＬ−１含有ｐｃＤＮＡＩプラスミドをＳｐｅＩで線形化することにより、ＲＮＡｓｅ保護検定のためのリボプローブを作製した。次いで、プロメガジェミニ・キット(Promega Gemini kit)に従って、ＳＰ６ポリメラーゼを用いてこのアンチセンスリボプローブを合成した。高い比活性でラベリングされたリボプローブを、４５℃で１晩、８０％ホルムアミドの存在下において、10μｇまたは20μｇの全ＲＮＡに対してハイブリダイズさせた。このハイブリダイゼーション混合物をＲＮＡｓｅ・ＡおよびＴ１(Boehringer-Mannheim）で消化し、プロテイナーゼＫ（４８）で処理し、この保護された標識化ＲＮＡフラグメントを４％尿素／ポリアクリルアミドゲルを用いて分析した。ＲＮＡｓｅ保護試験のオートラジオグラムをデンシトメトリーにより分析し、そのフィルムの一部をより良好な解像のためホスホ画像分析機（モレキュラー・ダイナミックス社）により再構築した。
ＣＯＳ−１細胞における「ＫＬ」ｃＤＮＡｓの一過性発現
「ＫＬ」ｃＤＮＡｓの一過性発現のために、多少の改良を伴って先に説明したＤＥＡＥ−デキストラン法（２０）を用いて、ＣＯＳ−１細胞にトランスフェクトした。簡単に述べると、使用１日前にＣＯＳ１細胞をサブ集密状態にまで増殖させ、次いでトリプシン処理した後、150 mm径のペトリ皿上に、ペトリ皿１個当たり６×１０6細胞の密度で再接種した。２４時間後に細胞は７０％集密状態に達し、この細胞に対して、１０％ＤＥＡＥ−デキストラン（シグマ社）の存在下で６〜１２時間に亘って、５μｇのプラスミドＤＮＡをトランスフェクトした。プラスミドＤＮＡを含む培地を除去し、１０％ＤＭＳＯ／ＰＢＳ++を用いて正確に１分間、細胞に対して化学的なショックを与えた。細胞をＰＢＳ++で洗浄することにより、残留ＤＭＳＯを除去した。トランスフェクトされたＣＯＳ−１細胞を、10％ウシ胎児血清、100ｍｇ／ｍｌのＬ−グルタミンおよび抗生物質を加えたＤＭＥ中で増殖させた。
「ＫＬ」タンパクのパルス追跡および免疫沈降分析
トランスフェクト（形質導入）されたＣＯＳ−１細胞について、形質導入の７２時間後にパルス追跡実験が行なわれた。細胞は、10％の透析ウシ胎児血清を含むメチオニン非含有ＤＭＥと共に30分間インキュベートされ、0.5ｍＣｉ／mLの割合で35Ｓ−メチオニン（ＮＥＮ社）でラベリングされた。このラベリング期間の終点において、ラベリング培地を過剰のメチオニンを含む正規の培地で置換した。ＫＬの蛋白分解開裂に対するフォルボール-12-ミリステート-13-アセテート（ＰＭＡ）およびＡ23187の効果を判定するために、ラベリング培地を正規の培地に置換えた後、ラベリング期間の終点において、形質導入された細胞に対して１μＭのＰＭＡ、または１μＭのＡ23187を添加した。免疫沈降分析のために、指定された時間において、細胞および上清液を別々に回収した。前述のようにして（３５）、１％トリトン-100、20ｍＭトリス（ｐＨ7.5）、150ｍＭのＮａＣｌ、20ｍＭのＥＤＴＡ、１０％グリセロール及びプロテアーゼ阻害剤塩化フェニルメチルスルホニル（１ｍＭ）およびロイペプチン（20μｇ／ｍｌ）中で、細胞溶解産物を調製した。ＫＬタンパク産物の免疫沈降分析のために、抗マウスＫＬウサギ抗血清を用いた。抗ＫＬ血清をプロテインＡセファロース(Pharmacia）に結合させ、洗浄液Ａ（0.1％トリトンＸ-100、20ｍＭのトリス(pH7.5)、150ｍＭのＮａＣｌ、10％グリセロール）で３回洗浄した。抗ＫＬ血清／プロテインＡセファロースの複合体は、４℃で少なくとも２時間、上清液および細胞溶解産物と共にインキュベートされた。この免疫沈殿物を、洗浄液Ｂ（50ｍＭのトリス、500ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、0.2％トリトンＸ-100）で１回洗浄し、洗浄液Ｃ（50ｍＭトリス、500ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％トリトンＸ-100、0.1％ＳＤＳ）で３回洗浄し、さらに洗浄液Ｄ（10ｍＭトリス、0.1％トリトンＸ-100）で１回洗浄した。ゲル分析のために、５分間沸騰させることによって免疫沈殿物をＳＤＳサンプル緩衝液中に溶解させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（12％）およびオートラジオグラフィで分析した。
可溶性ＫＬの生物学的活性の判定
１０％牛胎児血清、ＷＥＨＩ−３Ｂ細胞からの馴し培地、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウムおよび2-メルカプトエタノールで補ったＲＰＭＩ-1640培地（ＲＰＭＩ−完全）（３６）中において、成体ＷＢＢ６＋／＋マウスの骨髄から肥満細胞を増殖させた。非付着細胞を遠心分離により回収し、１週毎に再培養(refed）して、７×１０5細胞／ｍｌ以下の細胞密度に保った。培養物の肥満細胞含量は、サイトスピン試料(cytospin preparation)をメタノール中の１％トルイジンで染色することにより、１週毎に測定された。４週間後の培養物は通常95％以上の肥満細胞を含有しており、これを増殖反応測定のために用いた。形質導入されたＣＯＳ−１細胞からの上清液を、形質導入の４８ないし７２時間後に集めた。この上清液中の可溶性ＫＬの生物学的活性を、ＩＬ−３の非存在下で、ＣＯＳ−１細胞上清液の異なる希釈液を用いてＢＭＭＣを培養することにより測定した。このＢＭＭＣを完全ＲＰＭＩで３回洗浄し、0.2％ＩＬ−３中で増殖させた。次の日に細胞を回収し、完全ＲＰＭＩ（マイナスＩＬ−３）中に懸濁させて、９６ウェルのプレートの100μｌ／ウェル中に１０4個のＢＭＭＣを播種した。同量の希釈上清液を各ウェルに加え、３７℃で２４時インキュベートした。次いで、［3Ｈ］−チミジン２．５μＣｉ／ウェルを加え、さらに６時間インキュベーションを続けた。細胞はガラスファイバーフィルター（ＧＦ／Ｃ・ワットマン社）上に回収され、チミジンの取込みをシンチレーション・カウンター内で測定した。試験は３回行って、その平均値を示した。測定値の標準編差は一般に平均値の１０％を越えることはなかった。
＜実験結果＞
ＫＬの選択的にスプライスされた転写物は、切除短縮されたトランスメンブラン型のＫＬタンパクをコードする
ここでは、マウス３Ｔ３繊維芽細胞ライブラリーから分離され、且つＫＬのコーディング配列（267アミノ酸）の殆どを含んだｃＤＮＡクローンが記載される。6.5ｋｂのＫＬ・ｍＲＮＡに対応する完全なｃＤＮＡ配列を得るために、Ｂａｌｂ／ｃ３Ｔ３繊維芽細胞に由来するポリＡ+ＲＮＡを用いて、プラスミドｃＤＮＡライブラリーを構築した。この目的に用いられたプラスミドベクターｐｃＤＮＡＩは、ｃＤＮＡ挿入物がＣＭＶプロモータから発現される哺乳動物発現ベクターであり、またＣＯＳ細胞（インビトロゲン）における一過性発現のためＳＶ４０複製起源が含まれている。このライブラリーは、ここに記載したＮ末端およびＣ末端のＫＬコーディング配列に対応したオリゴヌクレオチドプローブを用いてスクリーニングされた。その結果、完全なＫＬコーディング配列、並びに５′および３′未翻訳配列を含むｃＤＮＡクローンが得られた。このクローン（図１７）のヌクレオチド配列は、一つの塩基変化を除いて先に公表された配列（２，３８）と一致している。この塩基変化は、664位にいてセリン206がアラニンに置換されたものである。
アンダーソン等によるマウスＫＬ・ｃＤＮＡクローンの分析によれば、４８ヌクレオチドのインフレーム欠失を伴うスプライスされたｃＤＮＡが示されており、これはＫＬ発現細胞中における選択的にスプライスされたＫＬ・ＲＮＡ転写物の存在を示唆している（２）。組織および細胞ラインから得たＲＮＡ中における選択的にスプライスされたＫＬ・ＲＮＡ転写物を同定するために、ＲＴ−ＰＣＲ法を用いた。使用したプライマーは、ＫＬ・ｃＤＮＡの５′および３′非翻訳領域に対応しており、ユニークな制限部位を含むように修飾された。図１８に示したＲＴ−ＰＣＴ反応の電気泳動分析は、Ｂａｌｂ／ｃ３Ｔ３細胞および脳からのサンプル中に約870ｂｐの単一の分画を示しているのに対して、脾臓、こう丸および肺からのサンプル中には大きさが約870ｂｐおよび750ｂｐの２つの分画が見られる。更に分析するために、この２つのＰＣＲ反応生成物を哺乳動物発現ベクターｐＣＤＭ８中にサブクローニングした。ＤＮＡ配列分析によって、最初に、大きいＰＣＲ生産物が公知のＫＬ・ｃＤＮＡ配列（ＫＬ−１と呼ぶ）に対応することが示された。しかし、より小さいＰＣＲ生産物では、ＫＬコーディング配列の８４ヌクレオチドの切片が失なわれており、インフレーム欠失が生じていた。欠失の終点はラットおよびヒトＫＬ遺伝子におけるエキソン境界に対応しており、これらの境界はマウス遺伝子中にも保存されていると思われる（２７）。従って、より小さいＰＣＲ生産物は、選択的にスプライスされたＫＬ・ＲＮＡ転写物（ＫＬ−２と称する）に対応するものと思われる。ＫＬ−２におけるエキソンの欠乏は、トランスメンブラン・ドメインに先行する。即ち、それは４つのＮ−結合グリコシル化位置の１つを含んでおり、またＫＬの公知の可溶型におけるＣ末端（Ａｌａ-166及びＡｌａ-167）を含む（５８）。従って、ＫＬ−２は、ＫＬ−１の切除短縮形バージョンをコードすると予測される。なお、このＫＬ−１の切除形バージョンは、トランスメンブランタンパクとして合成されると思われる（図１７、１９）。
ＫＬ−２は組織特異的に発現される
選択的にスプライスされた転写物であるＫＬ−２は、脾臓、こう丸および肺のＲＮＡ中に検出されたが、繊維芽細胞および脳のＲＮＡ中には検出されなかった。このことは、ＫＬ−２の発現が組織特異的な仕方で制御され得ることを示唆している。この問題についてより詳しく言及するため、ＲＮＡ中のＫＬ−１およびＫＬ−２・ＲＮＡ転写物の定常状態レベルを、ＲＮＡｓｅ保護試験を用いて、種々の組織から判定した。ＳＰ６・ＲＮＡポリメラーゼを用いて625ヌクレオチドのＲＮＡハイブリダイゼイションプローブを作るために、ＫＬ−１・ｃＤＮＡを含むｐｃＤＮＡＩプラスミドをＳｐｅＩで線状化した。このプローブは、４０日齢マウスのＢａｌｂ／ｃ３Ｔ３繊維芽細胞、脳、脾臓およびこう丸、並びに成熟マウスの脳、骨髄、小脳、心臓、肺、肝臓、脾臓および腎臓、胎盤（１４日ｐ．ｃ．）からの全ＲＮＡ20μｇとハイブリダイズした。次いで、サンプルをＲＮＳｓｅで消化し、反応生成物を４％尿素／ポリアクリルアミドゲル中で電気泳動により分析した。これらの実験において、ＫＬ−１・ｍＲＮＡは575塩基の単一分画を保護したのに対し、ＫＬ−２・ｍＲＮＡは449および42ヌクレオチドの分画を保護した。図２０に示すように、Ｂａｌｂ／ｃ３Ｔ３繊維芽細胞においてはＫＬ−１が主な転写物であり、ＫＬ−２は殆ど検出できなかった。脳および胸線においてはＫＬ−１が主な転写物であるが、脾臓、こう丸、胎盤、心臓および小脳においてはＫＬ−１およびＫＬ−２の双方の転写物が種々の割合で見られた。組織におけるＫＬ−２に対するＫＬ−１の割合がデンシトメトリーによって判定され、脳では２６：１、骨髄では３：１、脾臓では１．５：１、こう丸（４０日p.n.）では１：2.6であった。これらの結果は、ＫＬ−１およびＫＬ−２の発現が組織特異的に調節されることを示している。
ＣＯＳ細胞におけるＫＬタンパクの生合成的特徴
ＫＬはＢａｌｂ／ｃ３Ｔ３細胞の馴らし培地から精製され、これは可溶性タンパクであるにも拘らず、ＫＬ−１およびＫＬ−２について予測されたアミノ酸配列は、これらタンパクが膜に結合していることを示唆している。ＫＬ−１およびＫＬ−２タンパク物質に対するＫＬ−Ｓの関係を研究するために、これらの生合成的特徴を決定した。ＲＴ−ＰＣＲによって調製されたＫＬ−１およびＫＬ−２のｃＤＮＡｓを、ＣＯＳ−１細胞内における一過性発現のために、発現ベクターであるｐｃＤＮＡＩまたはｐＣＤＭ８のＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩ部位にサブクローニングした。ＫＬ−１およびＫＬ−２タンパク物質の一過性発現を容易にするために、ＣＯＳ−１細胞に、上述のようにＤＥＡＥ-デキストラン／ＤＭＳＯプロトコールを用いて、ＫＬ−１およびＫＬ−２プラスミドを形質導入した。ＣＯＳ−１細胞におけるＫＬタンパク合成は、形質移入の７２ないし９６時間後に最大であることが示された。ＫＬ−１およびＫＬ−２タンパク物質の生合成的特徴を判定するために、パルス追跡実験を行った。トランスフェクションの７２時間後に、培養物を35Ｓ−メチオニン（0.5ｍＣｉ／ｍｌ）で３０分間ラベリングし、ついで通常の培地で追跡した。細胞分解物および上清液を指定された時間に回収し、精製マウスＫＬでウサギを免疫して作製した抗ＫＬ抗血清との免疫沈降のための処理を行い、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２％）で分析した。ラベリング期間の終了時に、ＫＬ−１プラスミドで形質移入された細胞内に、２４、３５、４０および４５ｋＤのＫＬ特異的タンパク生産物が見出だされた（図２１）。これらのタンパクは、おそらく第１次翻訳生産物と、グリコシル化によって徐々に変性処理されたＫＬタンパク生産物であると思われる。次第に時間を長くして追跡することによって、４５ｋＤ形は成熟ＫＬタンパクであり、また該タンパクがＫＬの細胞膜形をであることが明らかになった。３０分後から、２８ｋＤのＫＬタンパク生産物が上清液において見られ、時間が経つにつれて量も増加した。３８ｋＤおよび２４ｋＤの２つの少量生産物も、時間が経つにつれて見出された。これらの結果は、ＫＬ−１が最初に膜結合タンパクとして合成され、ついで多分タンパク分解開裂を介して培地中に解放されるという考えと一致する。
ＫＬ−２プラスミドで形質移入されたＣＯＳ−１細胞のパルス追跡実験を図２０に示す。ＫＬ−２タンパク生産物は効率的にプロセッシングされて、３２ｋＤおよび２８ｋＤの生産物を生成したが、これにはＫＬ−２の予測細胞膜形が含まれると思われる。このＫＬ−２の細胞膜形は５時間以上の半減期を有し、対応するＫＬ−１タンパクより安定している。３時間後、細胞上清液に約２０ｋＤのＫＬ−２の可溶形が見られた。上清液におけるこのＫＬ−２の可溶形の出現および蓄積は、ＫＬ−２の可溶形の出現と比較して遅い。これは、ＫＬ−２タンパク生産物の非効率的なタンパク分解プロセスに合致するものである。ＫＬ−２においては、選択的スプライシングの結果、可溶形ＫＬの公知のＣ末端を含む配列、即ちＫＬ−１の予想開裂部位が欠如していた。従って、ＫＬ−２のタンパク分解開裂には、ＫＬ−１およびＫＬ−２の双方においてＮ末端またはＣ末端に存在する、欠失エキソンによりコードされる配列の第２開裂部位が含まれるものと思われる。上清液に見られる３８ｋＤのＫＬ−１タンパク生産物は、トランスメンブラン・ドメイン近くの開裂部位を含む開裂生産物を表していると思われる（図１９）。
ＣＯＳ細胞におけるＫＬ−１およびＫＬ−２のタンパク分解プロセスは、ＰＭＡおよびカルシウムイオノファＡ２３１８７により調節される
プロテインキナーゼＣ誘導物質ＰＭＡは、ＣＳＦ−１受容体、ｃ−ｋｉｔ受容体およびＴＧＦ−αの例に示されるように、細胞膜タンパクのタンパク分解開裂を促進して、これらのタンパクの細胞外領域の可溶形を生成させることが知られている（１３，４）。ＣＯＳ−１細胞内のＫＬ−１およびＫＬ−２の生合成的特徴に対する、ＰＭＡ処理の効果が測定された。図２２Ｂに示すパルス追跡実験は、ＫＬ−１およびＫＬ−２の双方の急速な開裂が、ＰＭＡによって同様の速度論で誘導されることと、解放されたＫＬ−１およびＫＬ−２タンパク生産物が当該誘導物質の非存在下で得られるものと区別できないことを示している。これらの結果は、ＫＬ−１およびＫＬ−２の双方のタンパク分解開裂の機構が、ＰＭＡによって同様に活性化されることを示している。他方において、この結果は、ＫＬ−１およびＫＬ−２の夫々に対して特異的な異なった２つのプロテアーゼがＰＭＡにより活性化されること、或いは非常に高いレベルで活性化される１つのプロテアーゼが存在し、これがＫＬ−１およびＫＬ−２の双方を異なった速度で開裂することを意味しているかも知れない。ラットＫＬの公知のＣ末端アミノ酸配列に基づくＫＬ−１の主な開裂部位は、アミノ酸ＰＰＶＡ  ＡＳＳＬ（186-193）を含み、エラスターゼ様酵素が関与していると思われる。上記の議論に基づくと、ＫＬ−２における認識配列は、上記の議論に基づけば、欠失されたエキソンのＣ末端に存在するものと思われ、アミノ酸ＲＫＡＡＫＡ（202-34）を含み、ＫＬ−１プロテアーゼと同様の特異生をもった酵素（或いはトリプシン様プロテアーゼであり得る）の関与が考えられる。ＫＬ開裂に対するカルシウムイオノファ（Ａ23187）の効果が判定された。ＫＬ−１およびＫＬ−２の双方の開裂がこの試薬によって促進され、プロテインキナーゼＣの活性が関与しないメカニズムがＫＬ−１およびＫＬ−２の双方のタンパク分解開裂を媒介し得ることが示された（図２２）。
解放されたＫＬタンパク生産物の生物学的活性
解放されたＫＬタンパク生産物の生物学的活性をテストするために、形質導入されたＣＯＳ−１細胞の上清液をトランスフェクションの７２時間後に回収し、肥満細胞増殖測試験におけるその活性を測定した。骨髄由来の肥満細胞（ＢＭＭＣ）を、異なる希釈度の上記上清液と共に２４時間インキュベートし、前述のようにして3Ｈ−チミジンの取込みを測定した（図２３）。その結果、ＫＬ−１形質導入細胞からの上清液は、ＫＬ−２形質導入細胞からの上清よりも３倍〜５倍の高い活性が認められ、これはＫＬ−１およびＫＬ−２からの可溶性ＫＬの解放が異なることと一致している。重要なことは、ＫＬ−１形質導入細胞およびＫＬ−２形質導入細胞の解放されたタンパクが両者共に、肥満細胞増殖測定法において同様の比活性(specific activities）を示しているように観測されたことである。
トランスメンブランドメインおよび細胞質ドメインを含むＣ末端ＫＬをコードする配列の欠失から得られるスチールディッキー対立遺伝子
Ｓｌd対立遺伝子についてホモ接合のマウスは、コート色素を欠いているが、Ｓｌ対立遺伝子についてホモ接合のマウスとは対照的に成育可能であり、また生殖不能で大赤血球性貧血を有している。従って、これらのマウスにおけるｃ−ｋｉｔ受容体システムは、いくらかの残留活性を示すと思われる。Ｓｌd突然変異は３つの細胞系統に同じように影響し、突然変異がＫＬの本質的特性に影響を与えることを示唆している。Ｓｌdの分子レベルでの根拠を調査するために、ＰＣＲクローニング技術を用いて、先ずＫＬコード配列がこの対立遺伝子において最初に特徴づけられた。標準的手法によって、Ｓｌd／＋胎児から第１次胎児繊維芽細胞が誘導された。次いで、Ｓｌd／＋胎児繊維芽細胞から得たＲＮＡおよび異なるプライマーを用いて、ＳｌdＫＬコード化区域を増幅した。その際、Ｓｌdが欠失突然変異である可能性に注意を払った。Ｓｌd／＋全ＲＮＡおよびプライマー１，２を用いたＲＴ−ＰＣＲ増幅によって、１つのＤＮＡフラグメントが生成された。このＤＮＡフラグメントは、＋／＋繊維芽細胞ＲＮＡから得れらる生産物と同等の可動性(mobility)で移動した。また、その配列判定によって、このＤＮＡフラグメントは公知のＫＬ配列と区別し得ないことが示された。従って、この分画は正常な対立遺伝子を表していると推定される。プライマー１及び３、またはプライマー１及び４を用いたときは、より早い移動性をもったＤＮＡフラグメントが同様に増幅された（図１８）。プライマー１＋３、およびプライマー１＋４を用いて得られた850ｂｐおよび1070ｂｐのＤＮＡフラグメントの双方をｐＣＤＭ８中にサブクローニングし、ついで配列決定を行った。ＫＬ−ＳｌdｃＤＮＡでは、野生型配列のヌクレオチド切片660〜902が欠失され、代わりに67ｂｐの配列が挿入されていることが見出された（図１７）。この欠失および挿入によって、終止コドンにおいて５′欠失終点からの３つのアミノ酸をもたらした。ＫＬ−ＳｌdｃＤＮＡの予想アミノ酸配列は、公知のＫＬ配列におけるアミノ酸1-205と、更に３つのアミノ酸からなるものであった（図１７および１９）。このＫＬ−Ｓｌdのアミノ酸配列は、４つの全てのＮ−結合グリコキシル化部位と、ＫＬの可溶性型に含まれる全ての配列を含んでいるが、野生型ＫＬ−１のトランスメンブランドメインおよび細胞質ドメインは欠失されている。結論として、ＫＬ−Ｓｌdタンパク生産物は分泌されたタンパクであり、これは生物学的活性を示す。
ＫＬ−ＳｌdおよびＫＬ−Ｓタンパク生産物の生合成的特徴および生物学的活性
ＫＬ−Ｓｌdタンパク生産物との比較のため、ＫＬ−１の切除短縮形バージョン（ＫＬ−Ｓと命名）を作製した。ここにおいて、終止コードンがアミノ酸位置191（可溶性ＫＬタンパクの推定Ｃ末端）に挿入された。ＣＯＳ−１細胞に対してＫＬ−ＳｌdおよびＫＬ−Ｓプラスミドをトランスフェクトし、パルス追跡実験を行なって、２つのタンパク生産物の生合成的特性の判定を行った。ＫＬ−Ｓｌdタンパク生産物は急速にプロセッシングされ（グリコキシル化によると思われる）、次いで培地中に分泌された。ここでは、追跡時間の３０分後に早くも主たる３０ｋＤ種が見出され、時間の経過に伴って増大した（図２４）。ＫＬ−Ｓタンパク生産物の生合成的特性は、ＫＬ−Ｓｌdのものと非常に類似していた（図２４）。ここでも、時間の経過とともに分泌物質の量の増大が培地中に検出され、逆に細胞に結合したＫＬ−Ｓタンパク生産物は時間とともに減少した。
分泌されたＫＬ−ＳｌdおよびＫＬ−Ｓタンパク生産物の生物学的活性を検査するために、肥満細胞増殖試験を実施した。形質導入されたＣＯＳ−１細胞からの培地を、トランスフェクションの７２時間後に集め、ついで希釈度の異なるこの上清液を用いて、ＩＬ−３の不存在下でのＢＭＭＣに与えられる増殖能力を評価した。双方のサンプルは何れもかなりの生物学的活性を含んでおり、その活性はＫＬ−１を幾分越えるものあった（図２３）。これらの結果を総合すると、ＫＬ−Ｓｌdタンパク生産物は分泌されるものであり、また生物学的活性を有するものであることを、確信的に実証している。
＜実験の考察＞
ｃ−ｋｉｔとマウスＷ座との間に対立遺伝子の関係があることの実証は、発生中、および成熟動物におけるｃ−ｋｉｔ受容体の多面作用を明らかにし、そのリガンドであるＫＬの同定を容易にした。更に、ＫＬとマウススチール座との間の対立遺伝子関係に関する最近の発見は、Ｗ突然変異とＳｌ突然変異との間の関係についての分子的認識を提供した。このことは、これら突然変異の相似的かつ相補的な表現型に基づいて、マウス遺伝学者によって予期されていたものである。この予期されたＫＬのトランスメンブラン構造は、ＫＬの膜結合形および可溶形の双方が、ｃ−ｋｉｔ機能において有用な役割を果たしていることを暗示するものである。本出願では、この推測に関する実験的証拠が提供されている。
第一に、ＫＬの可溶形は、トランスメンブラン形の前駆体、即ちＫＬ−１からの効果的なタンパク分解開裂により発生することを示している。第二に、ＫＬ−１およびＫＬ−２の選択的にスプライスされたバージョン（スプライシングにより主なタンパク開裂部位が除去されたもの）も、効率的には多少劣るが、ＫＬの可溶な生物学的活性形を同様に生成することが示されている。第三に、ＣＯＳ−１細胞におけるＫＬ−１およびＫＬ−２の開裂は、調節することが可能なプロセスである。第四に、ＫＬ−１およびＫＬ−２は組織特異的方法で発現される。更に、生存可能なＳｌd突然変異は、ＫＬコード配列のＣ末端（トランスメンブラン領域を含む）を含む欠失の結果であり、この欠失はＫＬの生物学的に活性な分泌形を生じることが示された。Ｓｌd対立遺伝子を持つマウスの表現形は、ｃ−ｋｉｔ機能における分泌形および細胞膜結合形の双方のＫＬについて、その役割に関する考えをさらに支持するものである。
ｃ−ｋｉｔとＣＳＦ−１Ｒとの進化論的に密接な関係のため、構造およびトポロジーの双方の点に関し、対応する成長因子（ＫＬおよびＣＳＦ−１）の間の関係を予測することは妥当なものと言える。ＣＳＦ−１・ｍＲＮＡｓの選択的にスプライスされた形は、トランスメンブラン領域のＮ末端配列、タンパクのリガンド部分とトランスメンブラン領域との間に位置する298アミノ酸のスペーサセグメントにおいて異なるタンパク生産物をコードすることが知られている（４３）。更に、選択的にスプライスされたＣＳＦ−１・ＲＮＡ転写物は３′非翻訳領域において異なる（２１）。幾つかの組織におけるＫＬ・ＲＮＡ転写物の分析によって、選択的にスプライスされたＫＬ・ＲＮＡが同定された。この場合にも、ＣＳＦ−１における場合と同様に、推測されたリガンド部分とトランスメンブラン領域との間のスペーサが欠失されている。興味深いことに、この選択的にスプライスされたＲＮＡ生成物の発現は、組織特異的な仕方で制御される。ＫＬおよびＣＳＦ−１のリガンド部分についての最近の比較分析では、限定的なアミノ酸ホモロジー、対応するエキソンの比較、並びに「エキソンにコードされた第２次構造」の適合性に基づいて、２つのタンパクの間の構造的類似性が指摘されている（４）。更に、４α−ヘリカル領域と、分子内ジスルフィド結合を形成するシステイン残渣の重複は、ＫＬおよびＣＳＦ−１のリガンド領域についての関連した３次構造を示唆している。また２つのタンパクのＮ末端シグナルペプチド、トランスメンブラン領域および細胞内領域に見られる類似性は、これらの領域が２つのタンパクにおいて重要な関連作用を果たすことを示唆している。これらの結果は、ＫＬとＣＳＦ−１との間の進化的関連および構造的類似性の考えを強くしている。
ＫＬの特異な特徴は、トランスメンブラン・タンパクとしての予測された三部構成構造である。ＫＬ、ＫＬ−１およびＫＬ−２の形は、何れもトランスメンブランタンパクとして合成され、これらはタンパク分解開裂によりプロセッシングされ、可溶性で且つ生物学的活性形のＫＬを放出する。しかし、ＣＯＳ細胞システムで判定されるように、これら２つの形のプロセッシング工程は異なる速度論に従う。ＫＬ−１タンパクの分解開裂は非常に効率的であり、対照的にＫＬ−２タンパクはより安定で、分解開裂に対し抵抗を示す。欠失エキソンによりコードされる配列、即ちアミノ酸174-201には、可溶性ＫＬタンパクのＣ末端およびタンパク分解開裂部位が含まれる（２７）。従って、可溶ＫＬ−２タンパクを発生するためには、おそらく第２の又は別のタンパク分解開裂部位が用いられ、この開裂には他のプロテアーゼが関与するかも知れない。ＣＯＳ−１細胞において、プロテインキナーゼＣ活性化剤ＰＭＡおよびカルシウムイオノファＡ23187によってＫＬ−１およびＫＬ−２のタンパク分解開裂が誘導されることは、異なる細胞型においては、このプロセスが別の調節を受け得ることを示唆している。興味深いことに、可溶性のＫＬ−２タンパクは正常の生物学的活性を示し、これは欠失されたエキソンにコードされる配列は当該活性に関しては必須ではないことを示している。
一方において、膜結合バージョンであるＫＬ−１およびＫＬ−２は、細胞／細胞接触による信号を媒介するように機能し、或いは細胞接着分子として機能得る（１９、２６）。他方、ＫＬの可溶形は拡散性ファクターであり、これは比較的短い距離あるいは長い距離に亘って目標細胞およびその受容体に到達する。しかし、ＫＬの可溶形は又、ＦＧＦ、ＬＩＦまたはｉｎｔ−１と類似した仕方で細胞外マトリクスにも結合し、または該マトリックス中に隠退され得るので、短い距離において膜結合形と同様に機能する（８、３３、４２）。細胞膜結合形であれば、ＫＬは受容体を有する目標細胞との相互反応のための、高濃度の局在化信号を提供ないし維持することができる。これに対して、ＫＬの可溶形はより低い可変濃度で信号を与え得る。ｃ−ｋｉｔは種々の細胞システムにおいて、細胞増殖、細胞移動、細胞生存、後有糸分裂機能を容易にすると思われる。ＣＳＦ−１受容体系との類似性によれば、細胞生存機能および細胞移動は、細胞増殖機能よりも、該因子のより低い濃度を要求すると思われる（５５）。ＫＬの細胞膜結合形および可溶形は、ｃ−ｋｉｔ機能の異なる側面において作用し得る。ＣＳＦ−１受容体およびｃ−ｋｉｔの両者は、夫々の細胞外領域のプロテインキナーゼＣに媒介された分解的解放によって、下方調節され得る（１３）。このプロセスの機能的意義は分かっていない、これら受容体から放出された細胞外領域は、ＣＳＦ−１およびＫＬを中和してこれらの信号を調節するとの仮設が提出されている。何等かの方法で、ＫＬのタンパク分解開裂はｃ−ｋｉｔ機能の下方調節をもたらし、従って、このれらのプロセスは相補的または類似的とみなす事ができる。要約すると、種々の細胞膜結合ＫＬ分子の合成、並びにＫＬの可溶形を生じさせるこれらのタンパク分解開裂は、発生中および成熟動物における種々の細胞形において、ｃ−ｋｉｔ機能を制御ないし調節する手段を与える。
発生期および成熟動物における可溶形ＫＬの役割を評価する独特の機会が、Ｓｌd突然変異の分子ベースでの特徴付けによって提供された。Ｓｌd対立遺伝子はＫＬタンパクの分泌バージョンをコードするが、トランスメンブラン領域およびＫＬのＣ末端を含む欠失の結果、膜結合形をコードしない。従って、Ｓｌd／ＳｌdおよびＳｌ／Ｓｌdマウスの生物学的特徴は、ＫＬの可溶形および膜結合形の役割についての手掛かりを与えるであろう。Ｓｌ対立遺伝子はＫＬゼロ突然変異であるから、Ｓｌ／Ｓｌdマウスは、Ｓｌdタンパクのみ生産する（１１、３８）。これらのマウスは生存可能であり、重篤な大赤血球貧血、組織肥満細胞の欠乏、コート色素の欠如および妊娠不能により特徴づけられる。これらの突然変位株表現型の殆どの特徴は、Ｗ／Ｗvマウスに類似している（４７、５１）。しかし、幾つかの著しい相違が存在する。Ｓｌ／Ｓｌdマウスの貧血は、Ｗ／Ｗvマウスよりも、血中酸素減少に対してより敏感なように見える（４６、４７）。Ｗ／Ｗvマウスにおける配偶子形成に関しては、原始生殖細胞は増殖せず、またその移動も遅い（３２）。Ｓｌ／Ｓｌd胎児においては、Ｗ／Ｗv胎児に類似する原始生殖細胞は増殖しないが、残りの細胞は正しく移動し、発生の適当な時間に生殖腺隆起に到達するように見える（２９、５１）。これらの実験から、ＳｌdＫＬタンパク生産物は細胞移動を維持することができるが細胞増殖はできず、従ってＫＬの細胞膜形はｃ−ｋｉｔの増殖応答に対し重要な役割を果たすであろうとの仮設を立てることができる。更に、Ｓｌ／Ｓｌd繊維芽細胞は、ＩＬ−３の非存在下での骨髄肥満細胞の増殖および繊維を支持せず、これは正常な胎児繊維芽細胞がこのような特性を有することと対照的である（１６）。Ｓｌ／Ｓｌd繊維芽細胞が実際にＳｌdタンパク生産物を合成するとすれば、Ｓｌ／Ｓｌd繊維芽細胞が肥満細胞の増殖を支持できないことは、一方では、これら細胞が放出する可溶性のＫＬ−Ｓｌdタンパクの量が増殖の促進に十分ではないことを意味する。他方、これらの結果は、このプロセスにおける細胞膜結合形ＫＬの重要な役割が存在することを示唆している。
ＩＬ-1、ＩＬ-3、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦとＫＬとの組合せ
我々は正常ネズミ骨髄の培養において、ネズミＫＬ（組換えネズミｃ−ｋｉｔ・リガンド）を用いた。ＫＬ単独の場合は骨髄コロニーの刺激は殆ど観測されなかったが、ＫＬとＧ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＩＬ-3とを組合せた場合には、コロニー数およびサイズの両方で実質的な増加が見られた。しかしながら、ＫＬとＭ−ＣＳＦとの組合せでは、このような増加は見られなかった（１０３）。5-ＦＵ処置後24時間の骨髄を用いたＨＰＰ−ＣＦＣアッセイでは、サイトカイン類の組合せでコロニー刺激の増加が見られた。ＨＰＰ−ＣＦＣの刺激において、ＫＬにＧ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ-3、ＩＬ-7またはＩＬ-6の何れかを加えることは有効であり、３種または４種の因子を組合せることは更に有効であった。ＩＬ-1、ＩＬ-6およびＫＬと組み合わせたＣＳＦ類またはＩＬ-3は最も有効であった。図２５は、5-ＦＵ処置後４日のネズミ骨髄の培養において、サイトカイン類の組合せによって刺激されたＨＰＰ−ＣＦＣを示す。２種のサイトカインの組合せ（ＩＬ-1に対してＧＭ−ＣＳＦまたはＩＬ-3の何れかを加えた組み合わせ）は、ＫＬとＩＬ-1の組み合わせ又はＫＬとＩＬ-3の組み合わせと同様に、多数のＨＰＰ−ＣＦＣを刺激した。しかし、ＩＬ-1とＫＬとの組み合わせに対して、更にＧ−ＣＳＦもしくはＩＬ-3の何れかを加えた３種の因子の組合せが最も有効であった。
初期増血細胞のデルタＣＦＵアッセイまたは二次ＣＦＵアッセイ：ネズミ研究。デルタアッセイは、拘束された前駆体（committed progenitors）に乏しく且つ初期期幹細胞に富む骨髄を、幹細胞の生存、漸増(recruitment）、分化および膨脹(expansion）を促進させる種々のサイトカイン類の存在下で、短期（７日間）の懸濁培養を行うことを包含しており、前駆体細胞は第２クローン原性アッセイにおいて測定される。5-ＦＵ耐性の幹細胞は、単一のＣＳＦ刺激剤を用いた通常のＣＦＵ−ＧＭアッセイの他に、複数のサイトカイン刺激剤を用いた一次ＨＰＰ−ＣＦＣアッセイにおいて検定される。懸濁培養の後、二次ＨＰＰ−ＣＦＣおよびＣＦＵ−ＧＭアッセイが行なわれる。３つのパラメータを型通りに測定する。その第１は、一次培養において単一のＣＳＦ種（例えば、Ｇ−ＣＳＦ）に応答する全ＣＦＵ−ＧＭ（インプット）を、二次培養において同じＣＳＦ種に応答する二次ＣＦＵ−ＧＭの全数で割った値によって決定される、系列限定前駆体の増幅である。第２は、二次アッセイにおけるＣＦＵ−ＧＭ前駆体の全数で割ったＨＰＰ−ＣＦＣインプットの比である。ＣＦＵ−ＧＭは、早期前駆体（即ちＨＰＰ−ＣＦＣ）に由来すると考えられているので、この比は幹細胞の前駆体細胞への分化の指標を与えてくれる。最後に、二次ＨＰＰ−ＣＦＣの全数で割ったＨＰＰ−ＣＦＣインプットの比を決定する。このパラメータは、特に一次培養および二次培養におけるＨＰＰ−ＣＦＣ刺激剤がＩＬ-1、ＩＬ-3およびＫＬの組合せである場合には、幹細胞自己再生（self-renewal）の最良の尺度である。
ＫＬが入手可能になる前の初期の研究においては、単一のＣＳＦ種に応答するＣＦＣ−ＧＭ、並びにＨＰＰ−ＣＦＣ-1および-2の数の様々な程度の膨脹が、ＩＬ-1をＭ−ＣＳＦと組み合わせた場合（20ないし30倍増加）、ＩＬ-1をＧ−ＣＳＦと組み合わせた場合（50ないし100倍増加）およびＩＬ-1をＩＬ-3と組合せた場合（200倍増加）に見られ、またＧＭ−ＣＳＦも限られた程度ではあるが前駆体細胞数の膨脹を示したが、Ｍ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦではそのような膨脹は見られなかった。ＩＬ-6は、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦまたはＧ−ＣＳＦとの相乗作用においてはＩＬ-1よりも有効性に劣っていたが、ＩＬ-3との相乗作用においては同等の有効性を有していた。ＩＬ-1＋ＩＬ-6は、３種のＣＳＦ類およびＩＬ-3との間に、相加的もしくは超相加的（supradditive）な相互作用を示した。ＫＬ（ここに記述された通りに調製され、或いは、1992年1月9日に発行されてImmunex Corporationに譲渡された“肥満細胞成長因子”と題するＰＣＴ国際出願WO 92/00376号、又は1992年4月24日に発行されAmgen Incに譲渡された“幹細胞因子”と題する欧州特許出願423 980に記載されている通りに調製されたもの）が懸濁培養相に存在する場合には、前駆体細胞生成のわずかな増幅のみが生じたが（図２６）、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ-3またはＩＬ-1と組合わされた場合には200〜800倍の増幅が起こった。ＩＬ-1およびＫＬに対して、ＧＭ−ＣＳＦもしくはＩＬ-3の何れかを組合せることは、前駆体の増幅により有効であった。また、ＩＬ-1＋ＫＬ＋ＩＬ-6に対してＩＬ-3もしくはＧＭ−ＣＳＦの何れかを組み合わせた４因子の組合せによって、前駆体細胞は2,500倍にまで増加した。前駆体細胞生成は、ＣＦＵ−ＧＭアウトプットに基づいて計算された。ＨＰＰ−ＣＦＣインプットは、３因子の組合せ（ＩＬ-1＋ＫＬ＋ＩＬ-3もしくはＣＳＦ類）によって6,000〜10,000の比がもたらされ、（ＩＬ-6を含む）４因子の組合せによって8,000〜15,000の比がもたらされることを示した。自己再生の尺度としての、ＨＰＰ−ＣＦＣインプットの比として表わされる二次ＨＰＰ−ＣＦＣ-1の産生は、ＫＬに対してＩＬ-1、ＩＬ-3もしくはＣＦＳ類を組み合わせた２因子の組合せによって50〜700の値に達し、またＩＬ-1＋ＫＬに対してＩＬ-6、ＩＬ-3もしくはＣＳＦ類を組み合わせた３因子の組合せでは700〜1,300の値に達した。
ＩＬ-1＋ＩＬ-3＋ＫＬの組合せに晒された、富化ＨＰＰ−ＣＦＣの7日間培養において産生した全分化細胞に基づいて、図２７は劇的な増殖が得られたことを示す。これには、二次ＨＰＰ−ＣＦＣ-1産生によって測定された自己再生成分、低増殖能力ＣＦＵ−ＧＭによって測定された前駆体細胞産生物、および形態学的に同定可能な分化骨髄細胞が含まれる。単一の前駆体からこれらの細胞を産生するのに要する細胞数倍加時間は、公知の哺乳動物細胞増殖速度の限界に達している。この増殖が、ＨＰＰ−ＣＦＣより早期のより希な細胞によって維持されているならば、必要とされる個体数倍加時間はより短くなるであろう。この短期培養におけるＨＰＰ−ＣＦＣの増幅は、長期の再構築細胞（reconsutituting cells）の比較し得る膨脹には反映されないようであり、また大部分のＨＰＰ−ＣＦＣ、より短い個体数倍加時間が必要となるであろう。ＨＰＰ−ＣＦＣの増幅は長期再構築細胞の比較し得る膨脹には反映されないようであり、産生したＨＰＰ−ＣＦＣの大部分はむしろ幹細胞階層内のより後の段階を表わすようである。また、Ｄ12のＣＦＵ−Ｓアッセイは、ＩＬ-1をＩＬ-3もしくはＫＬと組合わせて用いた７日間の懸濁培養後の数において、絶対的な増加をも示した。他の研究者は、同様の懸濁培養において、ＣＦＵ−ＧＥＭＭの前駆体（恐らく、長期再構築幹細胞）もまた、ＩＬ-1＋ＩＬ-3の存在下では増幅するが、ＩＬ-6とＩＬ-3もしくはＧＭ−ＣＳＦとの組合せでは増幅しないことを示している。
早期増血細胞のデルタアッセイまたは二次ＣＦＵアッセイ：ヒト研究。ヒトにおいて、骨髄の4-ＨＣ処置は、イン・ビトロ・コロニー形成によってＧＭ−ＣＤＦに直接応答できる前駆体の大部分を枯渇させるが、コロニー形成が可能な幹細胞を保持し、かつ骨髄移植の流れの中で造血系再構築が可能な幹細胞を保持することが示されている。基本的な移植研究において、ＣＤ34+選別もまた長期再構築可能な骨髄細胞を増加させた。4-ＨＣ処置と免疫細胞付着によるＣＤ34+細胞の選別とを組み合わせた後、Ｇ−ＣＳＦもしくはＧＭ−ＣＳＦに応答した初期コロニー形成は非常に低かった。しかしながら、7日間の懸濁培養の後にＧＭ−ＣＳＦで二次再クローニングを行なうことによって、処置骨髄細胞を懸濁液中で7日間ＩＬ-1およびＩＬ-3の組合せにさらすと、最大数の二次ＣＦＵ−ＧＭが一貫して産生されることが示された。ＩＬ-3およびＩＬ-6は、ＩＬ-3単独よりも有効性が劣ることはなかったが、他のサイトカインの組合せは有効性がかなり劣っていた。このアッセイにおける二次コロニー形成は、ＩＬ-1とＫＬとの組合わせ、ＫＬとＩＬ-3との組合せで最大限に促進され、３種のサイトカイン全ての組合せは前駆体細胞産生の増幅において最も有効であった。
ｃ−ｋｉｔ・リガンド（ＫＬ）とＩＬ-1βとの間、およびＩＬ-6と他の造血性因子との間の相互作用
5-ＦＵを用いたＢＭのイン・ビトロ・パージングは、静止状態の造血前駆体細胞を殖やすための簡単な技術である。一回投与量の5-ＦＵは、24時間以内に、早期出現ＣＦＵ−Ｓおよびより成熟したＣＦＵ−Ｃ個体群の数を99％を越える率で減少させる一方、ＢＭのより始原的な前駆体を増加させる。後期出現ＣＦＵ−Ｓもまた、5-ＦＵでのＢＭパージングに対して感受性であり、このことは更に、これら細胞が長期ＢＭ再構築に応答し得る幹細胞と同じでないことを示唆している。これとは反対に、ＢＭ再構築幹細胞は、5-ＦＵの細胞毒性効果に対して耐性であることが示されている（１０５）。ブラッドレー及びホジソン(Bradley and Hodgson）は、5-ＦＵでパージしたＢＭを用いて、寒天培養において高度に細胞性の巨大コロニーを形成し得る前駆体細胞分画(compartment）、即ちＨＰＰ−ＣＦＣを同定した。
我々は、始原ネズミ前駆体細胞分画に対する、ＩＬ-1、ＩＬ-6およびＫＬの相互作用を調べた（１０４）。我々は、クローン原性培養を用いて、これらの因子の相互間またはＣＳＦ類との組合せにおける相乗効果および相加効果の証拠を提示する。我々の結果は、ＩＬ-1、ＩＬ-6およびＫＬが、初期造血の刺激において独特の作用をすることを示唆する。クローン原性培養でのこの発見が、以前に記載されている短期液体培養アッセイ、Δ−アッセイを用いて更に実証されている。我々は、ＩＬ-1、ＩＬ-6およびＫＬの能力を示し、初期および後期の造血前駆体分画の膨脹を規定する。
＜材料および方法＞
マウス：  雄および雌(C57BL/6 X DBA/2）Ｆ1（B6D2Ｆ1）マウスを、Jackson laboratory(Bar Harbor, ME)から購入した。該マウスは、層流状態下で飼育され、また酸処理および／またはオートクレーブ処理された飲料水が与えられた。歩哨マウスはコロニーと共に檻に収容され、特異的病原についての観察がなされた。使用されたマウスは全て、少なくとも週齢８週間のものであった。
骨髄調製物および組織培養条件：  正常マウス（ＮＢＭ）または５−ＦＵ処理されたマウスのＢＭは、一回の実験につき少なくとも３匹マウスの大腿骨および時には脛骨より得た。マウスは、１５０ｍｇ／ｋｇ、１５０〜２５０μｌの容量で、５−ＦＵの静脈内注射によるで処理を受けた。ＢＭは、培養前に遠心分離によって二回洗浄された。特に注記しない限り、ＢＭの全ての取扱い及び培養は、２０％ＦＣＳ（HyClone Laboratories Inc., Logan UT）及び0.05％ｍｇ／ｍｌのゲンタマイシン(Gibco）を補充したＩＭＤＭ（Gibco,Grand Island, NY）を含む培養培地中で行われた。ＢＭ細胞はクールター計測器モデルＺＢＩ（coulter Electronics, Hialeah, FL）を使用して数えられた。プラスチック容器は全て組織培養グレードのものであった。
サイトカインおよび抗体：  精製されたｒｈＩＬ−１β、sp act＝1.32×１０7Ｕ／mg（Syntex Laboratories, Inc.,: Palo Alto, CA）を、100Ｕ／ｍｌで使用した。部分的に精製されたｒｈＩＬ−６および精製されたｒｈＩＬ−６は、Steven Gillis（Immunex Corporation, Seattle, WA）の好意によって提供された。この部分的に精製されたＩＬ−６は3000 CESSＵ／ｍｌ、精製されたＩＬ−６は50ｎｇ／ｍｌで使用した。精製ＫＬは、ここに記載のように調整されたか、或いは上記で記載したようにして調整された。精製ｒｈＧ−ＣＳＦ（Amgen Biologicals, Thousand Oaks, CA）は、1000Ｕ／ｍｌ（sp act＝１×１０8Ｕ／ｍｌ）で使用した。精製ｒｈＭ−ＣＳＦは、1000Ｕ／ｍｌ（Immunex）で使用した。ｒｍＩＬ−３を含む馴し培地は一時的にトランスフェクトされたＣＯＳ細胞から調整され、他の成長因子と同様に、最大のＣＦＵ−Ｃ刺激をもたらす濃度で使用された。ラット抗マウスＩＬ−６モノクローナル抗体はGenzyme（Cambridge,MA）から購入した。
ＣＦＵ−Ｃ分析：  ＬＰＰ−ＣＦＣ分析は、サイトカイン類および0.36％アガロース（SeaPlaque; FMC, Rockland, ME）を含む培地中に懸濁された、１ｍｌの５×１０4ＮＢＭを含んだ３５ｍｍペトリ皿中で行なわれた。このような培養物を、３７℃で十分に加湿された５％ＣＯ2雰囲気中で７日間インキュベートした。ＨＰＰ−ＣＦＣ分析は、前述したような二重層アガロース系を使用して行われた。培養培地、サイトカイン類および0.5％のアガロースからなる２ｍｌの下層を含む６０ｍｍペトリ皿に、１日から８日前に５−ＦＵ処置したＢＭ（ｄ１−ｄ８・５−ＦＵ・ＢＭ）１ｍｌを重層し、これを１×１０3〜１×１０5細胞／培地の範囲の細胞濃度におけるＨＰＰ−ＣＦＣについて分析した。二重層培養物を、十分に加湿した５％ＣＯ2雰囲気中および７％Ｏ2の雰囲気中において、３７℃で１２日間生育させた。ペトリ皿は、少なくとも５０細胞を含む低増殖性コロニー（ＬＰＰ−ＣＦＣ）と、少なくとも直径0.5ｍｍの高細胞性高増殖性コロニー（ＨＰＰ−ＣＦＣ）について評価された。全てのＣＦＵ−Ｃは、３回の培養から計数された。
ＣＦＵ−Ｓ分析：  マウスは、約90Ｇｙ／分の照射速度において、137Ｃｓγ−線源からの1250Ｇｙで照射された。この1250Ｇｙは３時間の間隔を明けて二回に別けて照射され、最初は800Ｇｙが照射され、次いで450Ｇｙの照射が行われた。最終照射の２−３時間後に、ＢＭ細胞が静脈内注射された。ＢＭ移植の１２日後に、Bouin′s溶液中に固定された脾臓について、遅れて出現するＣＦＵ−Ｓが計数された。
デルタ（Δ）分析：  懸濁培養は、前述したように行なわれた。2.5×１０5の［ｄ１・５−ＦＵ・ＢＭ細胞］／ｍｌからなる４つΔ培養物１ｍｌを、２４ウエルクラスタープレート中で作成し、これを十分に加湿された５％ＣＯ2雰囲気中において、３７℃で７日間、成長因子の存在下でインキュベートした。一週間たった培養物から、激しいピペット操作を行った後、非付着性細胞を採収した。四つのΔ培養物から再懸濁されたＢＭ細胞を貯蔵し、その１ｍｌは、培養の細胞性(culture cellularity）を決定するために使用された。残りの３ｍｌの細胞は、遠心分離によって洗浄した（５ｍｌの下層のＦＣＳを通して）。洗浄された細胞は、第二次のＬＰＰ−ＣＦＣ，ＨＰＰ−ＣＦＣおよびＣＦＵ−Ｓについて分析された。Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−３に反応する二次ＬＰＰ−ＣＦＣ測定は、７日目のＣＦＵ−Ｃ培養物中で行われた。ＩＬ−１およびＩＬ−３に反応する二次ＨＰＰ−ＣＦＣおよび二次ＬＰＰ−ＣＦＣは、１２日後に、ＨＰＰ−ＣＦＣの増殖について記載した条件下で計数された。二次ＣＦＣ−Ｃの測定のために、Δ培養物からの細胞が20-2000倍に希釈された。一週間増殖させた後のΔ培養物中に存在するＣＦＵ−Ｓの数を、2-200倍に希釈された洗浄細胞をマウスに移植することによって測定した。
Δ培養後における、ＢＭ前駆細胞ポピュレーションの倍増値をΔ値とした。懸濁培養と平行して、出発物である［ｄ１・５−ＦＵ・ＢＭ］ポピュレーション中に存在する一次のＬＰＰ−ＣＦＣ、ＨＰＰ−ＣＦＣおよびＣＦＵ−Ｓの数が測定された。Δ値は、二次のＬＰＰ−ＣＦＣ、ＨＰＰ−ＣＦＣおよびＣＦＵ−Ｓの全アウトプットを、一次のＬＰＰ−ＣＦＣ、ＨＰＰ−ＣＦＣおよびＣＦＵ−Ｓのインプットで割ることによって決定された。
付着性細胞除去後のΔ分析：  ２５ｃｍ2の組織培養フラスコ中において、2.5×１０5［ｄｌ・５−ＦＵ・ＢＭ］細胞／ｍｌのΔ培養物１２．５ｍｌが作成した。培養開始前に、ＢＭを３７℃で４時間、培地中で１回インキュベートすることによって、付着性細胞ポピュレーションを枯渇せしめた。非付着性細胞を２５ｃｍ2の第二フラスコに移して、両方の細胞ポピュレーションをΔ培養のための上記条件下で維持した。
サイトカイン活性分析：  ２５ｃｍ2の組織培養フラスコ内で生育された培養物のΔ培養上澄液を、遠心分離によって採収した。ｄｌ・５−ＦＵ・ＢＭ、付着性細胞を除いたＢＭおよびＢＭ付着性細胞を用いて樹立された培養物から、上澄液が採収された。ＩＬ−６活性は、以前に記載したネズミハイブリドーマＢ９細胞増殖分析を用いて測定された。サイトカイン活性も又、成長因子依存性造血細胞系ＮＦＳ−６０を使用して測定された。成長因子活性に反応したＮＦＳ−６０細胞の増殖は、前述したように測定された。
統計：  有意率は、二方向対スチューデントｔ検定（two-way paired Student′s t-test)を用いて決定された。
＜結果＞
ＮＢＭに対するＩＬ−１、ＩＬ−６およびＫＬの活性
ＮＢＭからのコロニー形成に対する、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−３と、ＩＬ−１、ＩＬ−６およびＫＬとの組み合わせによる影響を図１に示す。ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＫＬおよびＩＬ−１プラスＩＬ−６に反応したコロニー形成は最小であった。ＩＬ−１の刺激をＭ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦまたはＩＬ−４と組合わせた場合には、ＣＳＦ′ｓ単独で観察されるよりもコロニー形成が増大し、最も顕著には、反復研究で一貫してみられたＩＬ−１およびＭ−ＣＳＦ刺激の相加的効果(additive efects）よりも大きかったことである。ＣＳＦを含有培養物にＩＬ−６を追加すると、コロニー形成は相加的に増大した。ＩＬ−１プラスＩＬ−６の組合せは、この組合わせ単独または更にＣＳＦ′ｓを組み合わせた場合にも、相加的増殖より大きくコロニーを増殖させるような顕著な効果は得られなかった。ＩＬ−１、ＩＬ−６、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、またはＩＬ−３を含んた培養にＫＬを添加すると、相乗的にＣＦＵ−Ｃを刺激した。ＫＬは、Ｍ−ＣＳＦとは相乗的に作用しなかった。ＩＬ−１プラスＫＬで刺激された培養物、またはＩＬ−６プラスＫＬで刺激された培養物に対するＣＳＦの添加は、コロニーの相加的増殖またはそれ以下のコロニー増殖がみられた。
ＩＬ−１，ＩＬ−６およびＫＬの、５−ＦＵ・ＢＭに対する活性
マウスに対する１回の５−ＦＵ投与から１〜７日後の、ＨＰＰ−ＣＦＣおよびＬＰＰ−ＣＦＣの回復を図２および３に示す。ＬＰＰ−ＣＦＣ同様に幾つかのＨＰＰ−ＣＦＣが一貫して検出されたが、ＩＬ−１および／またはＩＬ−６刺激に反応して、コロニーは少ししか成長しなかった。系列に限定された(lineage restricted)ＣＳＦ′ｓ（Ｇ−ＣＳＦおよびＭ−ＣＳＦ）は、ＨＰＰ−ＣＦＣを刺激する能力が小さいが、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−３は、ＨＰＰ−ＣＦＣおよびＬＰＰ−ＣＦＣの両方を刺激することが出来た。ＨＰＰ−ＣＦＣを最高に刺激するには、成長因子を組み合わせることが必要であった。
ｋｉｔリガンドは、検出可能なコロニー刺激活性を殆どもたず、１×１０4個のｄ７・５−ＦＵ・ＢＭ細胞から、平均1.3のＨＰＰ−ＣＦＣおよび2.7のＬＰＰ−ＣＦＣのコロニーが刺激されるに過ぎない（図３０）。本研究の殆どにわたって使用されたＫＬの濃度は、２０ｎｇ／ｍｌであった。この濃度のＫＬは、ＩＬ−１およびＩＬ−６の存在下において、高増殖性のコロニー形成を促進する。１ｎｇ／ｍｌのＫＬでは平均6.7コロニーが観察されたが、10-100ｎｇ／ｍｌのＫＬでのコロニー数は、2.5×１０4個のｄ４・５−ＦＵ・ＢＭ細胞当たりで、120-147 ＨＰＰ−ＣＦＣの範囲のプラトー値に達した（データ表示せず）。Ｇ−ＣＳＦ含有培地にＫＬを添加すると、ｄ１およびｄ７の５−ＦＵ・ＢＭポピュレーションは両者共、ＬＰＰ−ＣＦＣの数を増加させたのみならず、ｄ１・５−ＦＵ・ＢＭ・におけるＨＰＰ−ＣＦＣの数を増加させた、ＨＰＰ−ＣＦＣ刺激に対するＫＬとＧ−ＣＳＦとの間の相乗効果は、ｄ４・５−ＦＵ・ＢＭの培養において顕著であった（データ表示せず）。ＫＬプラスＭ−ＣＳＦの組み合わせは、超相加的なコロニー形成を生じなかった。しかしながら、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−３の存在下におけるＨＰＰ−ＣＦＣの刺激において、ＫＬは強い相乗効果を示した。ＩＬ−３プラスＫＬは、ｄ１及びｄ７の５−ＦＵ・ＢＭポピュレーションの両者において、ＩＬ−１プラスＩＬ−３よりも、大コロニーを形成するための刺激剤としてはより効果的であった。ＩＬ−３含有培地にＫＬを添加すると、ｄ１及びｄ７の５−ＦＵ・ＢＭにおいて、夫々、ＨＰＰ−ＣＦＣの数は６倍から３５倍に増加した。
ＩＬ−１，ＩＬ−６またはＫＬは、応用可能なＣＳＦ活性を持たないけれども、ＩＬ−１，ＩＬ−６、またはＩＬ−１プラスＩＬ−６を含有する培養物に対してＫＬを添加すると、ＨＰＰ−ＣＦＣの成長促進において、これら因子間に劇的な相乗効果が生じた（図３０）。ＩＬ−６またはＩＬ−１に対するＫＬの組合せは、夫々、１×１０5個のｄ１・５−ＦＵ・ＢＭ細胞の平均4.0および13.7の高増殖性コロニーを刺激した。更に、３つのサイトカイン類の全てに反応して、１×１０5個の細胞当たりで、平均４２．０のＨＰＰ−ＣＦＣが刺激された。これらの結果は、ＨＰＰ−ＣＦＣのサブポピュレーションが存在し、このサブポピュレーションは大コロニー形成のためにＩＬ−１、ＩＬ−６プラスＫＬの刺激を必要とすることを明瞭に示している。これら成長因子の組み合わせに対するｄ７・５−ＦＵ・ＢＭの反応は、ｄ１・５−ＦＵ・ＢＭのこれら成長因子の組み合わせに対する反応と類似していた。しかし、ｄ７・５−ＦＵ・ＢＭにおいて、ＩＬ−１、ＩＬ−６プラスＫＬによって刺激されるＨＰＰ−ＣＦＣ割合は、この３つの因子の組み合わせに対して更にＧＭ−ＣＳＦを添加することによって刺激され得るＨＰＰ−ＣＦＣの最大数の１／１０よりも少なかった。ｄ１・５−ＦＵ・ＢＭ細胞ポピュレーションにおいて、この相違は余り劇的ではなく、４つのサイトカインの組合わせによって刺激されたＨＰＰ−ＣＦＣの最大数が、ＩＬ−１、ＩＬ−６プラスＫＬの３つの因子の組合わせによって刺激される数の二倍より僅かに多い程度にすぎなかった。
ＫＬおよびＣＳＦ′ｓの組み合わせを含む培養物に対してＩＬ−６を添加しても、ＩＬ−６、ＫＬおよびＣＳＦの内の二つの因子の組み合わせによる相加的効果と考えられるコロニー数を上回るほどには、大コロニーの形成を増大しなかった（図３０）。例えば、ＩＬ−６，ＫＬプラスＧＭ−ＣＳＦの組み合は、１×１０5個のｄ１・５−ＦＵ・ＢＭ細胞当たり、約３０の高増殖性コロニーを生じさせた。これら３０のＨＰＰ−ＣＦＣのバルクは、ＩＬ−６に刺激された培養と、ＫＬプラスＧＭ−ＣＳＦに刺激された培養とで観察されたコロニー（夫々、４及び２０のＨＰＰ−ＣＦＣ）を合わせたものと考えられる。このことは、ＩＬ−６、ＫＬプラスＣＳＦを組合わせても、更なる追加のＨＰＰ−ＣＦＣを活性化して増殖させることはないということを示唆している。
ＩＬ−６についての上記結果とは対照的に、ＫＬおよびＣＳＦを含む培養に対してＩＬ−１を添加すると、相乗効果を示した（図３０）。この相乗効果は、ＩＬ−１、ＫＬプラスＧ−ＣＳＦの組合わせの中で生育された、ｄ７・５−ＦＵ・ＢＭの培養において最も顕著であった。これら３つのサイトカインるの内の何れの二つの因子の組み合わせても、刺激されたＨＰＰ−ＣＦＣは５以下であった。しかるに、ＩＬ−１、ＫＬプラスＧ−ＣＳＦの組合わせでは、１×１０4個のＢＭ細胞当たりについて、平均100 ＨＰＰ−ＣＦＣが生じた。顕著ではないが、ｄ７・５−ＦＵ・ＢＭの刺激において、ＩＬ−１、ＫＬプラスＧＭ−ＣＳＦ（またはＩＬ−１）間に相乗効果が見られた。また、これらの超相加的効果は、ＩＬ−１，ＫＬプラスＧ−ＣＳＦ（またはＭ−ＣＳＦ）を組み合わせたｄ１・５−ＦＵ・ＢＭ細胞ポピュレーションにおいても明らかであった。しかし、ＩＬ−１，ＫＬプラスＧＭ−ＣＳＦ（またはＩＬ−３）の組み合わせによって刺激されたｄ１・５−ＦＵ・ＢＭ中に存在する多数のＨＰＰ−ＣＦＣは、異なったＨＰＰ−ＣＦＣの細胞ポピュレーションに対してこれら成長因子が付加的に影響した結果であるかもしれない。
上記に述べたように、４つの成長因子の組合せによって多数のＨＰＰ−ＣＦＣが刺激されたが、ＩＬ−１，ＩＬ−６、ＫＬプラスＧＭ−ＣＳＦ（またはＩＬ−３）での刺激が最適であった（図３０）。ＩＬ−１，ＩＬ−、ＫＬプラスＧＭ−ＣＳＦの組み合わせは、３％を越えるｄ７・５−ＦＵ・ＢＭ細胞を刺激して、高増殖性コロニーを形成することができた。ＩＬ−１，ＩＬ−６、ＫＬプラスＭ−ＣＳＦのサイトカイン混合物でのみ、ＨＰＰ−ＣＦＣの増大が観察された。これは、もっと少数のサイトカインの組み合わせでは観察されない追加の大コロニー増殖の促進において、４つの全ての成長因子が相乗効果を奏したことによると思われる。ＩＬ−１＋ＫＬ＋Ｇ−ＣＳＦ（又はＧＭ−ＣＳＦ若しくはＩＬ−３）のサイトカイン類の組合わせに対してＩＬ−６を添加しても、超相加的なコロニーの形成は生じなかった。ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＫＬおよびＧ−ＣＳＦ（又はＧＭ−ＣＳＦ若しくはＩＬ−３）の組合わせによって刺激される高増殖性コロニーの数は、殆どの場合に、ＩＬ−１、ＫＬおよびＧ−ＣＳＦ（又はＧＭ−ＣＳＦ若しくはＩＬ−３）の組み合わせによって刺激されるＨＰＰ−ＣＦＣの数に比較して有意に大きくはなかった。
Δ培養物における５−ＦＵ・ＢＭの膨脹
Δ培養において７日間増殖させた後に回収された非付着性細胞の数は、５−ＦＵ・ＢＭのクローン培養物において種々のサイトカインの組み合わせについて見られる反応パターンを反映していた（図３１）。サイトカインの刺激を受けないｄ１・５−ＦＵ・ＢＭの対照培養は、単球／マクロファージの生存細胞ポピュレーションが優勢になるに従い、培養の細胞性において平均３９％低下した。ＩＬ−１、ＫＬ−６またはＫＬの単独添加によっても、細胞の回収は、インプットのレベルを越えて増加しなかった。ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−３に対する反応において若干増加したことを除けば、多数のサイトカインよって刺激された培養においてのみ、その細胞数は増加した。最大の増殖は、ＩＬ−１、ＫＬプラスＧＭ−ＣＳＦ（またはＩＬ−３）の組合わせによって刺激された培養において得られ、これらの培養に更にＩＬ−６を加えても、細胞回収に著しい増加はなかった。未成熟ミエロイド細胞の出現は、Δ培養で観察された増殖と相関しいた。一つの実験において、ＩＬ−３で刺激された培養物中には、約５０％の成熟分化した好中球およびマクロファージと、２５％のメタ骨髄球と、２０％の骨髄球と、３％の芽細胞を含まれていた。芽細胞のパーセンテージは、ＩＬ−３を含有する培養物に対して、夫々ＩＬ−１（２２％）、ＩＬ−６（１８％）、ＫＬ（２４％）、ＩＬ−１プラスＩＬ−６（１２％）、ＩＬ−１プラスＫＬ（５１％）、ＩＬ−６プラスＫＬ（４３％）、およびＩＬ−１，ＩＬ−６プラスＫＬ（４６％）を添加することにより増加する。全芽細胞の最大数は6.1×１０5個であり、ＩＬ−１、ＫＬ、およびＩＬ−３によって刺激された培養物から回収された。その数は、最初のｄ１・５−ＦＵ・ＢＭ細胞ポピュレーションを２００倍上回るオーダーを示した。
サイトカインを添加せずに生育させた対照Δ培養物では、ＬＰＰ−ＣＦＣの前駆細胞ポピュレーションはインプット値を越えて増加されなかった（図３２）。コロニー刺激因子Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３の添加により増殖がおこった（平均Δ値は、夫々3.4、2.4、23および140）。ＩＬ−１単独で、ＬＰＰ−ＣＦＣは６０倍を越えて刺激された。ＩＬ−１およびＣＳＦ′ｓの刺激を組合わせると、ＬＰＰ−ＣＦＣの相乗的増大がもたらされた。例えば、ＩＬ−１プラスＩＬ−３の平均Δ値は520であったのに対して、推定される相加的Δ値は140（ＩＬ−３）＋63（ＩＬ−１）＝203である。ＩＬ−６での刺激は、小さいが有意なＬＰＰ−ＣＦＣの増大をもたらした（Δ値＝3.4；ｐ＜0.01）。ＩＬ−６プラスＧ−ＣＳＦおよびＩＬ−６プラスＩＬ−３の組み合わせにおいて、相加的効果よりも大きい効果が得られた。ＫＬは、Δ培養物からのＬＰＰ−ＣＦＣの回収を顕著には増加させなかった（ｐ＝0.08）。しかし、すべての場合において、ＫＬとＣＳＦ′ｓの組合せによる刺激の効果は、相加的効果よりも大きかった。ＫＬプラスＩＬ−３の組合せは、ＩＬ−１プラスＩＬ−３と同様、ＬＰＰ−ＣＦＣの増大において効果的であった（夫々の平均Δ値＝485および520；ｐ＝0.21）。ＣＦＣ類と組み合わせたＩＬ−１プラスＩＬ−６で刺激すると、Δ培養は全てのの場合において、ＩＬ−１またはＩＬ−６によって刺激された培養よりも高いΔ値を示した。ＩＬ−１，ＩＬ−６プラスＣＳＦの全ての組合せにおいて、ＬＰＰ−ＣＦＣの増大は相加的であったが、ＩＬ−１、ＩＬ−６プラスＭ−ＣＳＦで刺激された培養は例外であった（Δ値＝300；比較として、ＩＬ−１プラスＭ−ＣＳＦのΔ値＝140、ＩＬ−６プラスＭ−ＣＳＦのΔ値＝2.8）。ＩＬ−６プラスＫＬは、ＬＰＰ−ＣＦＣの増大の刺激において相乗的に作用し、ＬＰＰ−ＣＦＣの増大を200倍にした。しかしながら、ＣＳＦを含有する培養物へこれら二つのサイトカイン類を添加しても、前駆細胞の相加的な増大しかもたらされなかった。ＩＬ−１およびＫＬは、一緒にすると相乗的に刺激し、1000倍を越えるＬＰＰ−ＣＦＣの増大をもたらした。ＩＬ−１プラスＫＬを含有する培養物に対して、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦまたはＩＬ−３を添加すると、ＬＰＰ−ＣＦＣの拡大は更に増加した（夫々の平均Δ値＝1100、1200および1400）。ＩＬ−１，ＩＬ−６，ＫＬプラスＣＳＦ′ｓの組合せによって、最大のＬＰＰ−ＣＦＣの拡大が達成された。ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＫＬプラスＩＬ−３によって刺激されたΔ培養においては、1800倍を越えるＬＰＰ−ＣＦＣの増大が示された。ＩＬ−ＩプラスＫＬを含有する培養物にＩＬ−６を添加すると、Δ値は増加するが、観察される前駆細胞の増殖を有意に増やすことはなかった（ｐ＞０．０５）。
Δ培養物におけるＨＰＰ−ＣＦＣの増大
異なるサイトカイン類の組合による、ＨＰＰ−ＣＦＣの増大を刺激する能力をテストした（図３３）。ＬＰＰ−ＣＦＣの増殖の場合のように、ＩＬ−１，ＫＬプラスＣＳＦの組合せで刺激されたΔ培養物中において、ＨＰＰ−ＣＦＣの最高の増大がみられた。ＣＦＣ類単独による刺激は、ＨＰＰ−ＣＦＣの中程度の増加を刺激されたのみであった。ＩＬ−６は、ＨＰＰ−ＣＦＣを刺激して増加させた。更に、ＩＬ−６プラスＩＬ−３の組み合わせによる刺激は、ＩＬ−３単独よりもＨＰＰ−ＣＦＣ増大により効果があった。ＩＬ−６とは対照的に、ＩＬ−１は４つの全てのＣＳＦ′ｓとの組み合わせにおいて相乗効果を示した。ＫＬもまた、４つの全部のＣＳＦ′ｓとの組み合わせにおいて、相加的増殖よりも大きなＨＰＰ−ＣＦＣの増殖を促した。ＣＳＦ′ｓの有無に関係なく、ＩＬ−１プラスＩＬ−６の組合せは、ＩＬ−１またはＩＬ−６何れか単独の場合よりも、ＨＰＰ−ＣＦＣの増殖により効果があった。ＩＬ−１プラスＩＬ−６を用いて相乗効果が得られた端的な例は、Ｍ−ＣＳＦを組み合わせた場合であった（平均Δ値は、ＩＬ−６プラスＭ−ＣＳＦでは1.0；ＩＬ−１プラスＭ−ＣＳＦでは13.2；ＩＬ−１プラスＩＬ−６プラスＭ−ＣＳＦでは65.7）。ＫＬを含有するΔ培養物に対してＩＬ−ｌまたはＩＬ−６を添加すると、これら組合わせを単独で用いた場合でも、更にＣＳＦ′ｓと組み合わせた場合でも、相加的な増加よりも大きいＨＰＰ−ＣＦＣの増大をもたらした。ＫＬ含有培養物に対して、ＣＳＦ′ｓをＩＬ−２またはＩＬ−６と共に添加しても、夫々の場合にはΔ値を増大させるにも拘らず、ＨＰＰ−ＣＦＣの増大に顕著な増加はなかった。ＩＬ−１、ＩＬ−６プラスＫＬで刺激された培養において、最大のＨＰＰ−ＣＦＣの増大が得られ（Δ値は705）。
Δ培養物中に産生された二次ＨＰＰ−ＣＦＣは、ＩＬ−１プラスＩＬ−３で刺激されたクローン原性試験において、常法的により分析された（図３３）。ＩＬ−１プラスＧＭ−ＣＳＦ、またはＩＬ−１プラスＭ−ＣＳＦ等のようなサイトカイン類の他の組合せについて、二次ＨＰＰ−ＣＦＣを刺激する能力があるかをテストした。ＩＬ−１プラスＭ−ＣＳＦ（またはＧＭ−ＣＳＦ）の存在下で成長された二次ＨＰＰ−ＣＦＣのカウントは、ＨＰＰ−ＣＦＣ数に比較して、これらサイトカイン類の組合せによって刺激された二次ＬＰＰ−ＣＦＣが大量に存在することによって妨害された。二次ＨＰＰ−ＣＦＣの刺激剤として、ＩＬ−１およびＫＬの有効性もテストされた（図３４）。テストされたサイトカイン類の何れの組合せとも違って、ＩＬ−１プラスＫＬの組合わせに反応する前駆細胞は、ＩＬ−１プラスＩＬ−３に反応性のＨＰＰ−ＣＦＣおよびＬＰＰ−ＣＦＣの増大を刺激するΔ培養においては、劇的には増大しなかった。
Δ培養物中でのＣＦＵ−Ｓの増大
Δ培養の後に出現するＢＭ細胞ポピュレーションを更に特徴づけるため、Δ培養においけるサイトカイン刺激に応答したＣＦＵ−Ｓの増大を調べた（図３５）。ＩＬ−１、ＩＬ−３、ＩＬ−１プラスＩＬ−３、またはＩＬ−１プラスＫＬの存在下で生育された培養物は、図３２および３３に提示した結果と一致して、ＨＰＰ−ＣＦＣおよびＬＰＰ−ＣＦＣの増加を示した。これらの培養はまた、ＨＰＰ−ＣＦＣの増加よりも高いＣＦＵ−Ｓの増加を示した。ＩＬ−１プラスＩＬ−３、およびＩＬ−１プラスＫＬは、遅れて出現するＣＦＵ−Ｓの数の100倍を越える増加を刺激した。これらの結果は、５−ＦＵ処理からの回復期にあるマウスで起こることが知られている、ＨＰＰ−ＣＦＣおよびＣＦＵ−Ｓの増大に匹敵する。in vivo増大（Δin vivo）は、ｄ８・５−ＦＵ・ＢＭにおける全大腿骨のＨＰＰ−ＣＦＣ、ＬＰＰ−ＣＦＣおよびＣＦＵ−Ｓを、ｄ１・５−ＦＵ・ＢＭの大腿骨につき観測される全コロニーで割ることによって測定された。前駆細胞のin vivo増大は、in vitroΔ培養で観察された増大と同様であったが、ＬＰＰ−ＣＦＣのin vivoの増加はin vitroで観測されたものより低かった。
＜考察＞
これらの研究は、ＩＬ−１、ＩＬ−６およびＫＬが、始原造血細胞の調節因子としての役割を有することを実証している。これらのサイトカイン類は、単独の場合には、我々のクローン培養試験においてマウス造血前駆細胞の増殖を刺激する能力に限界がある（図２９−３０）。しかしながら、コロニー成長の刺激において、ＩＬ−１、ＩＬ−６およびＫＬの間の相乗効果が実証された。ＩＬ−１、ＩＬ−６およびＫＬに対してコロニー刺激因子を組合せた系統だった分析によって、我々は、５−ＦＵでパージされたＢＭ中に存在するＨＰＰ−ＣＦＣおよびＬＰＰ−ＣＦＣの細胞ポピュレーションを区別することができた。始原造血細胞によるコロニー形成を調節するというＩＬ−１、ＩＬ−６および／またはＫＬの能力は、ｄ１・５−ＦＵ・ＢＭの短期液体培養を用いた実験によっても裏付けられた。サイトカイン刺激剤に反応する前駆細胞ポピュレーションの束密度(flux)を測定できるΔ試験によって、ＬＰＰ−ＣＦＣおよびＨＰＰ−ＣＦＣの最高増大は、初期造血性前駆細胞に対するＩＬ−１、ＩＬ−６、ＫＬおよびＣＳＦ′ｓの相乗的相互作用に依存することが実証された（図３２−３５）。
初期造血作用における調節因子としてのＩＬ−１の重要性は、ＩＬ−１が、膀胱癌細胞系5637の馴し培地中に存在する相乗作用をもった活性物質（ヘマトポエチン１）として同定されたときから知られていた。以前に報告された結果と一致して、我々は、ＩＬ−１が、ＨＰＰ−ＣＦＣの促進に際してＧ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１またはＫＬと相乗作用を示すことを示した（図２９および３０）。始原造血細胞の増殖を促進するＩＬ−１の能力は、Δ試験でも観察された（図３１−３３）。Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３又はＫＬと組合わせた場合のＩＬ−１の相乗作用活性は、液体培養において全細胞数、骨芽細胞数、ＬＰＰ−ＣＦＣ数およびＨＰＰ−ＣＦＣ数の増大を促進する能力があることから明らである。幾つかの研究によって、ＩＬ−１プラスＩＬ−３、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦのサイトカイン類の組合せが示唆されている。Δ培養において、ＩＬ−１プラスＩＬ−３の刺激は、ＬＰＰ−ＣＦＣおよびＨＰＰ−ＣＦＣを、夫々520倍および83倍にまで増大させることができた。この前駆細胞ポピュレーションの増殖は、ＩＬ−１プラスＧ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦまたはＧＭ−ＣＳＦによって刺激された増大よりも大きかった。しかしながら、ｄ１・５−ＦＵ・ＢＭの増大においては、ＩＬ−１プラスＩＬ−３よりも、ＩＬ−１およびＫＬ間に見られる相乗作用の方がより有効な刺激であった。
ＩＬ−１プラスＫＬで刺激されたΔ培養は、ＬＰＰ−ＣＦＣの数を1000倍を上回って増加させ、またＨＰＰ−ＣＦＣの数を280倍に増加させた。
ＩＬ−６の造血活性は、ＩＬ−１の造血活性と異なることが分った。ＩＬ−６プラスＩＬ−３またはＫＬの組合せは、ｄ１〜ｄ７の５−ＦＵ・ＢＭからのＨＰＰ−ＣＦＣの刺激において相乗効果がある事がわかった（図３０）。ＩＬ−６およびＫＬもまた、ＮＢＭからのＣＦＵ−Ｃの刺激において相乗作用を有していた（図２８）。このΔ試験で、ＬＰＰ−ＣＦＣおよびＨＰＰ−ＣＦＣの増大において、ＩＬ−６とＩＬ−３またはＫＬの何れかとの間の相乗作用が実証された（図５および図６）。ＨＰＰ−ＣＦＣの増大においては、ＩＬ−６プラスＩＬ−３の組み合わせは、ＩＬ−１プラスＩＬ−３の組み合わせほどには効果的でなかった（夫々のΔ値＝40および83）。ＩＬ−１、ＩＬ−６およびＭ−ＣＳＦの３因子の組合せは、ｄ１〜ｄ７の５−ＦＵ・ＢＭからのＨＰＰ−ＣＦＣの刺激において相乗効果がみられた。更に、Δ試験によって、ＩＬ−１、ＩＬ−６プラスＭ−ＣＳＦに応答したＬＰＰ−ＣＦＣおよびＨＰＰ−ＣＦＣ細胞ポピュレーションの増大において、相乗作用がある事が実証された。ＩＬ−１、ＩＬ−６プラスＫＬのサイトカインの組合せは、ｄ１およびｄ７の５−ＦＵ・ＢＭからのＨＰＰ−ＣＦＣの成長促進において、相乗的に作用した。ＩＬ−１、ＩＬ−６プラスＫＬをΔ培養に添加した場合にも、最も大きいＨＰＰ−ＣＦＣ増大が観察された（Δ値＝705）。ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＫＬおよびＣＳＦ′ｓの間のこれら相乗的相互作用のパターンは、多分化能を有する造血前駆細胞の調節にＩＬ−１、ＩＬ−６、およびＫＬがユニークな役割を果たすことを示している。
本研究に見られた初期造血前駆細胞に対するＫＬの刺激効果は、ＫＬ遺伝子のクローニングに役立つ幹細胞増殖活性と一致している。ＩＬ−１、ＩＬ−６、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦまたはＩＬ−１に対するＮＢＭ前駆細胞の応答反応において、ＫＬとの組合せによる相乗作用が示された（図２８）。以前報告したように、ＫＬは、Ｍ−ＣＳＦに応答したＮＢＭからのコロニーの形成を高めはしなかった。同様の反応パターンが、５−ＦＵ・ＢＭを用いて観察された。即ち、ＫＬはＩＬ−１、ＩＬ−６、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、またはＩＬ−３と相乗的に作用する、Ｍ−ＣＳＦとは相乗作用しない（図３０）。ＩＬ−１プラスＫＬについて観察されるＨＰＰ−ＣＦＣ刺激の劇的な相乗効果は、ＣＳＦ′ｓの添加によって更に増大され得るかもしれない。最も顕著な相乗作用は、ｄ１およびｄ７の５−ＦＵ・ＢＭを培養した際に、ＩＬ−１，ＫＬ，およびＧ−ＣＳＦの間に見られる相乗作用であった。ＩＬ−１，ＩＬ−６，ＫＬプラスＣＳＦの４つのサイトカイン類の組合せによって、最適な造血性反応が観測された。このＩＬ−１、ＩＬ−６、ＫＬプラスＭ−ＣＳＦの組合せのみが唯一、ＨＰＰ−ＣＦＣの相乗的４因子増殖刺激であった。ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＫＬプラスＧＭ−ＣＳＦまたはＩＬ−３の組合せは、殆どのＨＰＰ−ＣＦＣを刺激し、Δ培養中においてで最大の細胞増殖をさせ、Δ培養中でＬＰＰ−ＣＦＣの最大の増大をさせた（図３１−３３）。これらの結果は、初期造血細胞の増殖の調整におけるＫＬの重要性を実証している。
ＨＰＰ−ＣＦＣは、その成長因子要求性および／または物理的分離技術に基づいて区別される階層性(hierarchy）を示す。初期造血細胞の二つの区分（ＨＰＰ−ＣＦＣ−１、ＨＰＰ−ＣＦＣ−２）の同定は、ミトコンドリア染色剤ローダミン123の保持に基づく前駆細胞の分離に関係している。ローダミン123に鈍感な細胞は、その細胞増殖にＩＬ−１，ＩＬ−３およびＭ−ＣＳＦの相乗的相互作用を必要とする、より始原的なＨＰＰ−ＣＦＣ−１区分の細胞を示すのに対して、ＨＰＰ−ＣＦＣ−２区分の細胞はＩＬ−１による刺激を必要としない。ＩＬ−１プラスＣＳＦで刺激される前駆細胞のより始原的な性質は、Δ試験の際にのＬＰＰ−ＣＦＣおよびＨＰＰ−ＣＦＣの増大において、ＩＬ−１およびＣＳＦ′ｓが示す相乗的相互作用と一致する（図３２、３３）。更に、始原的造血細胞の調節は、成長因子ＩＬ−６およびＫＬによっても支配される。ＩＬ−６およびＫＬが、Δ培養においてＨＰＰ−ＣＦＣを増殖させ得ることは、ＨＰＰ−ＣＦＣ−１と考えられる前駆細胞の刺激において、これらが果たす役割を示唆するものである。これらのデータは、静止幹細胞（ここでは５−ＦＵパージされたＢＭで代替している）が、その増殖のために多数の成長因子による刺激を必要とするという主張を裏づけている。これら前駆細胞のＨｐｐ−ＣＦＣ−１からＨＰＰ−ＣＦＣ−１への成熟は、複数のサイトカインに刺激された増殖の要求性における制限に従う。ＩＬ−１，ＩＬ−６，ＫＬプラスＧＭ−ＣＳＦの刺激に反応して、３％を越えるｄ７・５−ＦＵ・ＢＭ細胞がＨＰＰ−ＣＦＣを形成することができ（図３０）、この発生率はＢＭ中に存在する分化全能性幹細胞の頻度予想より遥かに高い知見は、ＨＰＰ−ＣＦＣの階層性の概念と一致している。
Δ培養におけるＨＰＰ−ＣＦＣの増加は、多分化が可能な造血前駆細胞の増殖を示唆している。しかしながら、これらΔ培養後のＨＰＰ−ＣＦＣが、ＨＰＰ−ＣＦＣの階層性において占める位置は不明である。Δ培養において観察された遅れて出現するＣＦＵ−Ｓの増加は、多分化可能な造血前駆細胞の数が、Δ試験の条件下において増加すると言う主張を支持するものである（図３５）。精製ローダミン123に対して敏感または鈍感な前駆細胞の、ＩＬ−１プラスＩＬ−３，またはＫＬプラスＩＬ−１，またはＩＬ−３に刺激され懸濁培養に応答して、ＣＦＵ−Ｓは100倍を越えて増加した。我々の結果はまた、ｄ２・５−ＦＵ・ＢＭの液培養がＩＬ−６プラスＩＬ−３あるいはＫＬに刺激されると、ＣＦＵ−Ｓが低下するという報告に反するが、遺伝子治療のプロトコールには有利となろう。我々の結果は、サイトカインＩＬ−１プラスＩＬ−３またはＫＬによる前駆細胞の増殖が、骨髄細胞の移植プロトコールに有益であり得ることを示唆している。ＩＬ−１プラスＫＬに対して反応するＨＰＰ−ＣＦＣは、Δ培養において、ＩＬ−１、ＩＬ−３，ＩＬ−６およびＫＬの成長因子を組み合わせることによって最低限の増殖を示した（図３４）。ＩＬ−１プラスＫＬが、５−ＦＵ・ＢＭからのＨＰＰ−ＣＦＣの成長を促進し、またΔ試験において前駆細胞の大増殖を刺激できることは、ＩＬ−１プラスＫＬが、貯蔵されている前駆細胞または始原的多分化可能な前駆細胞に対して作用できることを示唆している。ＩＬ−１プラスＫＬに反応するＨＰＰ−ＣＦＣの増殖が制限されることは、ＩＬ−１、ＩＬ−３、ＩＬ−６およびＫＬの成長因子が、Δ試験にいて初期造血前駆細胞および幹細胞の自己再生を刺激する能力が限定されていることを示唆している。
ＩＬ−１およびＫＬに誘導された増殖およびＴＧＦβおよびＭＩＰ１αの影響
ＴＧＦβ及びＭＩＰ１αマクロファージ炎症性蛋白１αは、前駆細胞を阻止することが以前に報告されている。この二つの因子は承認された幹細胞試験で直接比較されてはいないが、この報告は、これらサイトカイン類の何れかが、造血幹細胞増殖のネガテイブレギュレータとして作用するのではないかということを示唆している。ネズミＨＰＰコロニー分析では、後発の前駆細胞を５−フルオロウラシルで枯渇させ、高増殖可能性を持つコロニーのみをサイズ（＞0.5mm）で評価してスコアすることによって、幹細胞の特徴が評価される。ＩＬ−１およびＫＬは初期の造血前駆細胞を優先的に刺激する。従って、我々はＩＬ−１およびＫＬによって誘導されるＨＰＰ増殖について、ＴＧＦβおよびＭＩＰ１αの影響を評価することを選択した。下記の表においては、二つの別々の実験（各々同一実験を３回行った）からの結果が、成長因子の組合せによって誘導されるＨＰＰコロニーの数で表わされ、ＧＭ−ＣＳＦ（ＧＭ）単独で誘導される数と対比して示される。
0003750819.tif 000010
これらの結果は、ＴＧＦβは、ＩＬ−１および／またはＫＬがＧＭ−ＣＳＦと共に促進するＨＰＰコロニーの相乗的増殖を損なうのに対して、にＭＩＰ１αは係る効果をもたない事を示している。更に、ＴＧＦβは、ＩＬ−１プラスＫＬによって誘導されるＨＰＰコロニーを排除したのに対して、ＭＩＰ１αは、これらの条件下において、ＨＰＰコロニー形成を実際に促進した。我々は、ＭＩＰ１αではなくＴＧＦβこそが、ここで評価された造血前駆細胞ポピュレーションのネガテイブ調節因子として作用すると結論する。このことは、化学療法保護プロトコールの設計において重要な示唆を有している。
ＩＬ−３，ＥＰＯまたはＧＭ−ＣＳＦと組合たＫＬについての、ヒトにおける研究
全員がプレドニゾン耐性であるか、或いは高い投与を必要とするダイアモンド・ブラックファン貧血の１１人の患者は、ｒｈＥｐｏおよびｒｈＩＬ−３刺激について、低い平均ＢＦＵ−Ｅ頻度を有していた。プレドニゾン感受性である一人の患者を除いて、これらの値は、４人の正常成人骨髄から得られる９５％の信頼限界を下回った。組換ネズミのｃＫｉｔリガンド（ｒｍＫＬ）を追加するか、またはｒｈＩＬ−３に代替すると、全員が、ＢＦＵ−Ｅのサイズおよびヘモグロビン化(hemoglobinization）において著しい増加を示した。更に、ｒｈＥＰＯ、ｒｈＩＬ−３およびｒｍＫＬを組合せると、１１人の患者の内８人の平均ＢＦＵ−Ｅ頻度が少なくとも２倍になった（範囲：２から１６倍）。ＲｈＩＬ−３で誘導される骨髄系コロニーもまた、１１人の患者の内の５人において、＜９５％の信頼限界にまで低下した。ＫＬの添加は、６人の患者において、平均の骨髄系コロニーの頻度を２倍以上に高めた。
ｒｈＥｐｏプラスｒｈＩＬ−３および／またはｒｍＫＬによって刺激されたＢＦＵ−Ｅは、様々な度合いの骨髄不全をともなった６人のファンコニー貧血患者では検出不可能であった。また、骨髄コロニーは４症例において検出不可能であり、２症例においては、ｒｈＩＬ−３またはｒｈＧＭ−ＣＳＦの何れかの刺激で有意に減少した。ｒｍＫＬまたはｒｈＩＬ−３の添加は、後者の場合、平均頻度を増加させた。ＲｈＩＬ−３プラスｒｍＫＬは、ＤＣを有する第三の患者において骨髄コロニーを誘導した。より重篤な形成不全の一人の患者は、ｒｈＩＬ−３またはｒｈＧＭ−ＣＳＦを単独で、またはｒｍＫＬと組み合わせた場合にも、赤血球または骨髄のコロニーは形成されなかった。二番目の患者は、ｒｈＥｐｏおよびｒｈＩＬ−３を用いたときに、低い平均ＢＦＵ−Ｅ頻度であった（正常対照の１３％）。後者の患者からのＢＦＵ−Ｅのサイズ、ヘモグロビン化および数は、添加したｒｍＫＬと共に増加した。ＲｈＩＬ−３またはｒｈＧＭ−ＣＳＦに刺激された骨髄コロニーは僅かに減少し、ＫＬは平均コロニー頻度を適度に増加させた。
ヒト樹状突起前駆細胞および樹状突起細胞の発生における、ｃ−ＫＩＴリガンド（ＫＬ）、ＧＭ−ＣＳＦおよび腫瘍壊死因子αの間の相互作用
樹状突起細胞は、in vivo,及びin vitroにおいて、主要な抗原特異的Ｔ細胞応答を誘導するための最も有力な抗原提示細胞である。in vitroで発生する樹状突起細胞は、ＨＩＶおよび腫瘍に対するワクチン治療の流れにおいて、追加免疫のための抗原パルスの後に使用され得る。我々は、ヒト骨髄、末梢血液および臍帯血液(cord blood)のＣＤ３４+細胞ポピュレーションから、ヒト樹状突起細胞を発生させるためのin vitro系を開発した。ここで、懸濁培養中での樹状突起の分化およびクローン試験には、ＧＭ−ＣＳＦおよびＴＮＦαの存在が必要であり、またｃ−ＫＩＴリガンドは、樹状突起細胞／樹状突起細胞コロニーの数を相乗的に増加させる。表３ａは、樹状突起細胞コロニーの発生のためには、クローン試験において、ヒト成人骨髄ＣＤ３４+細胞と共に、ＧＭ−ＣＳＦおよびＴＮＦαと相乗作用するＫＬが絶対的に必要である事を示している。血液ＣＤ３４+細胞ポピュレーションにおいて、ＧＭ−ＣＳＦプラスＴＮＦαは単独でも樹状突起細胞コロニー形成を誘導するが、ココロニー形成の頻度はＫＬの添加によって増加する（表１ｂ）。種々のサイトカイン類を比較すると、樹状突起コロニー細胞の発生はＫＬ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＴＮＦαの組合せによって最大限に刺激されることがわかる（表１ｃ）。懸濁培養系において、ＩＬ−１プラスＫＬプラスＩＬ−３は、前駆樹状突起細胞を１４日間で100倍を超えて増殖させた。また、ＧＭ−ＣＳＦプラスＫＬプラスＴＮＦの添加では、これらの細胞は、同種異系の混合白血球反応、およびＣＤ３・Ｔリンパ球有糸分裂誘発の流れにおいて抗原提示が可能な樹状突起細胞に分化した。ＫＬは、始原骨髄前駆細胞／幹細胞について、樹状突起前駆細胞および樹状突起細胞を発生させるためのユニークな増幅刺激剤を提供した。
0003750819.tif 000011
0003750819.tif 000012
0003750819.tif 000013
0003750819.tif 000014
0003750819.tif 000015
0003750819.tif 000016
0003750819.tif 000017
0003750819.tif 000018
0003750819.tif 000019
0003750819.tif 000020
0003750819.tif 000021
0003750819.tif 000022
0003750819.tif 000023
0003750819.tif 000024
配列表
（１）一般的情報
(i)出願人：Besmer, Peter
Nocka, Karl
Buck, Jochen
Moore, Malcolm A.S.
(ii)発明の名称：ｃ−ＫＩＴ受容体に対するリガンド及びその使用法
(iii)配列の数：１１
(iv)通信宛先：
(A)名宛人：John P. White-クーパー  ＆  ダンハム
(B)通り：ロックフェラープラザ30
(C)市：ニューヨーク
(D)州：ニューヨーク
(E)国：アメリカ合衆国
(F)郵便番号：10112
(v)コンピュータ読取り可能な形態：
(A)媒体タイプ：フロッピーディスク
(B)コンピュータ：ＩＢＭ・ＰＣコンパチブル
(C)オペレーティングシステム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ
(D)ソフトウエア：ＰａｔｅｎｔＩｎ  リリース＃１．２４
(vi)現在の出願データ：
(A)出願番号：
(B)出願日：１９９３年４月１６日
(C)分類：
(viii)アトニー／エージェント情報
(A)氏名：Ｗｈｉｔｅ，Ｊｏｈｎ  Ｐ．
(B)登録番号：２８，６７８
(C)参照／ドケット番号：３７４５４ｄｐｃ
(ix)電信情報：
(A)電話：（２１２）９７７−９５５０
(B)テレファックス：（２１２）６４４−０５２５
(C)テレックス：４２２５２３  ＣＯＯＰ  ＵＩ
（２）配列認識番号１のための情報：
(i)配列特性：
(A)長さ：３１塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖：不明
(D)トポロジー：不明
(ii)分子の型：ＤＮＡ（ゲノム）
(xi)配列の記載：配列認識番号１：
0003750819.tif 000025
（２）配列認識番号２のための情報：
(i)配列特性：
(A)長さ：６３塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖：不明
(D)トポロジー：不明
(ii)分子の型：ＤＮＡ（ゲノム）
(xi)配列の記載：配列認識番号２：
0003750819.tif 000026
（２）配列認識番号３のための情報：
(i)配列特性：
(A)長さ：７２塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖：不明
(D)トポロジー：不明
(ii)分子の型：ＤＮＡ（ゲノム）
(xi)配列の記載：配列認識番号３：
0003750819.tif 000027
（２）配列認識番号４のための情報：
(i)配列特性：
(A)長さ：６９塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖：不明
(D)トポロジー：不明
(ii)分子の型：ＤＮＡ（ゲノム）
(xi)配列の記載：配列認識番号４：
0003750819.tif 000028
（２）配列認識番号５のための情報：
(i)配列特性：
(A)長さ：６０塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖：不明
(D)トポロジー：不明
(ii)分子の型：ＤＮＡ（ゲノム）
(xi)配列の記載：配列認識番号５：
0003750819.tif 000029
（２）配列認識番号６のための情報：
(i)配列特性：
(A)長さ：１１６塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖：不明
(D)トポロジー：不明
(ii)分子の型：ＤＮＡ（ゲノム）
(xi)配列の記載：配列認識番号６：
0003750819.tif 000030
（２）配列認識番号７のための情報：
(i)配列特性：
(A)長さ：５４塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖：不明
(D)トポロジー：不明
(ii)分子の型：ＤＮＡ（ゲノム）
(xi)配列の記載：配列認識番号７：
0003750819.tif 000031
（２）配列認識番号８のための情報：
(i)配列特性：
(A)長さ：５２塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖：不明
(D)トポロジー：不明
(ii)分子の型：ＤＮＡ（ゲノム）
(xi)配列の記載：配列認識番号８：
0003750819.tif 000032
（２）配列認識番号９のための情報：
(i)配列特性：
(A)長さ：８４９塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖：不明
(D)トポロジー：不明
(ii)分子の型：ＤＮＡ（ゲノム）
(xi)配列の記載：配列認識番号９：
0003750819.tif 000033
（２）配列認識番号１０のための情報：
(i)配列特性：
(A)長さ：１３４４塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖：不明
(D)トポロジー：不明
(ii)分子の型：ＤＮＡ（ゲノム）
(ix)特徴：
（Ａ）名称／キー：ＣＤＳ
（Ｂ）部位：１０６…９２５
（Ｄ）その他の情報：
(xi)配列の記載：配列認識番号１０：
0003750819.tif 000034
0003750819.tif 000035
0003750819.tif 000036
（２）配列認識番号１１のための情報：
(i)配列特性：
(A)長さ：２７３アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)分子の型：タンパク
(xi)配列の記載：配列認識番号１１：
0003750819.tif 000037
0003750819.tif 000038
【図１】
0003750819.tif 000039
【図２Ａ】
0003750819.tif 000040
【図２Ｂ】
0003750819.tif 000041
【図２Ｃ】
0003750819.tif 000042
【図２Ｄ】
0003750819.tif 000043
【図３Ａ】
0003750819.tif 000044
【図３Ｂ】
0003750819.tif 000045
【図３Ｃ】
0003750819.tif 000046
【図４Ａ】
0003750819.tif 000047
【図４Ｂ】
0003750819.tif 000048
【図４Ｃ】
0003750819.tif 000049
【図５】
0003750819.tif 000050
0003750819.tif 000051
0003750819.tif 000052
【図６】
0003750819.tif 000053
【図７】
0003750819.tif 000054
【図８】
0003750819.tif 000055
【図９】
0003750819.tif 000056
【図１０】
0003750819.tif 000057
【図１１Ａ】
0003750819.tif 000058
【図１１Ｂ】
0003750819.tif 000059
【図１１Ｃ】
0003750819.tif 000060
【図１１Ｄ】
0003750819.tif 000061
【図１２】
0003750819.tif 000062
【図１３Ａ】
0003750819.tif 000063
【図１３Ｂ】
0003750819.tif 000064
【図１４Ａ】
0003750819.tif 000065
【図１４Ｂ】
0003750819.tif 000066
【図１５Ａ】
0003750819.tif 000067
【図１５Ｂ】
0003750819.tif 000068
【図１６Ａ】
0003750819.tif 000069
【図１６Ｂ】
0003750819.tif 000070
【図１７】
0003750819.tif 000071
0003750819.tif 000072
0003750819.tif 000073
【図１８Ａ】
0003750819.tif 000074
【図１８Ｂ】
0003750819.tif 000075
【図１９】
0003750819.tif 000076
【図２０】
0003750819.tif 000077
【図２１Ａ】
0003750819.tif 000078
【図２１Ｂ】
0003750819.tif 000079
【図２１Ｃ】
0003750819.tif 000080
【図２２Ａ】
0003750819.tif 000081
【図２２Ｂ】
0003750819.tif 000082
【図２２Ｃ】
0003750819.tif 000083
【図２３Ａ】
0003750819.tif 000084
【図２３Ｂ】
0003750819.tif 000085
【図２４】
0003750819.tif 000086
【図２５】
0003750819.tif 000087
【図２６】
0003750819.tif 000088
【図２７】
0003750819.tif 000089
【図２８】
0003750819.tif 000090
【図２９】
0003750819.tif 000091
0003750819.tif 000092
【図３０Ａ】
0003750819.tif 000093
【図３０Ｂ】
0003750819.tif 000094
【図３１】
0003750819.tif 000095
【図３２】
0003750819.tif 000096
【図３３】
0003750819.tif 000097
【図３４】
0003750819.tif 000098
【図３５】
0003750819.tif 000099