(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトから単離された癌組織について、Ｅ１ＡＦ遺伝子の発現産物を検出することを特徴とする癌組織の浸潤能の評価方法。
【請求項２】
発現産物がｍＲＮＡである請求項１記載の癌組織の浸潤能の評価方法。
【請求項３】
発現産物が発現タンパク質Ｅ１ＡＦである請求項１記載の癌組織の浸潤能の評価方法。
【請求項４】
Ｅ１ＡＦタンパク質、転写活性化領域を含まないＤＮＡ結合ドメインを有する改変Ｅ１ＡＦタンパク質、Ｅ１ＡＦ遺伝子、転写活性化領域を含まないＤＮＡ結合ドメインを有する改変Ｅ１ＡＦタンパク質をコードする遺伝子、Ｅ１ＡＦタンパク質発現用ベクター、転写活性化領域を含まないＤＮＡ結合ドメインを有する改変Ｅ１ＡＦタンパク質発現用ベクター、Ｅ１ＡＦ遺伝子のアンチセンスＤＮＡ、Ｅ１ＡＦ遺伝子のアンチセンスＲＮＡ、Ｅ１ＡＦ遺伝子のアンチセンスＲＮＡ発現用ベクター、Ｅ１ＡＦタンパク質のＤＮＡ結合ドメインに結合する結合配列を含むＤＮＡ、Ｅ１ＡＦタンパク質のＤＮＡ結合ドメインに結合する結合配列を含むＤＮＡの発現用ベクター、Ｅ１ＡＦ遺伝子のｍＲＮＡに対するリボザイム、及びＥ１ＡＦ遺伝子のｍＲＮＡに対するリボザイム発現用ベクターからなる群から選ばれる少なくとも１つの成分を構成成分とすることを特徴とする癌細胞浸潤能制御用キット。
【請求項５】
転写活性化領域を含まないＤＮＡ結合ドメインを有する改変Ｅ１ＡＦタンパク質、転写活性化領域を含まないＤＮＡ結合ドメインを有する改変Ｅ１ＡＦタンパク質をコードする遺伝子、転写活性化領域を含まないＤＮＡ結合ドメインを有する改変Ｅ１ＡＦタンパク質発現用ベクター、Ｅ１ＡＦ遺伝子のアンチセンスＤＮＡ、Ｅ１ＡＦ遺伝子のアンチセンスＲＮＡ、Ｅ１ＡＦ遺伝子のアンチセンスＲＮＡ発現用ベクター、Ｅ１ＡＦタンパク質のＤＮＡ結合ドメインに結合する結合配列を含むＤＮＡ、Ｅ１ＡＦタンパク質のＤＮＡ結合ドメインに結合する結合配列を含むＤＮＡの発現用ベクター、Ｅ１ＡＦ遺伝子のｍＲＮＡに対するリボザイム、及びＥ１ＡＦ遺伝子のｍＲＮＡに対するリボザイム発現用ベクターからなる群から選ばれる少なくとも１つを有効成分として含む癌浸潤抑制剤。
【発明の詳細な説明】
発明の技術分野
本発明は、癌の制御、さらに詳しくは、Ｅ１ＡＦ遺伝子の、マトリックスメタロプロテネースの転写活性化機能の制御を利用した癌細胞の浸潤能の制御方法、それを利用する癌の検出方法、癌浸潤能の診断方法およびそれらに用いるキットに関する。
従来の技術
本発明者らは、５型アデノウイルス（adenovirus type ５）のＥ１Ａ遺伝子のエンハンサー領域に結合するＥ１ＡＦタンパク質をコードするＥ１ＡＦ遺伝子をヒト細胞株ヒーラ細胞より単離することに成功した［特開平５−３２８９７５号公報、Nucleic Acids Research, 第２１巻, 第５４７−５５３頁（１９９３）］。Ｅ１ＡＦ遺伝子および該遺伝子の発現タンパク質Ｅ１ＡＦのアミノ酸配列を配列表の配列番号１に示す。
Ｅ１ＡＦ遺伝子は、エッツ（ｅｔｓ）群癌遺伝子（ｅｔｓファミリー癌遺伝子）に属する新しい癌遺伝子であり、マウスより単離されたＰＥＡ３［Xin et al., Genes Dev., 第６巻, 第４８１−４９６頁(１９９２）］のヒトのホモログであることが明らかにされている。
エッツ（ｅｔｓ）群癌遺伝子の発現タンパク質は、約３０種ほど見いだされているが、これらのタンパク質にはエッツ（ＥＴＳ）ドメインと呼ばれる共通の構造をもち、この構造はＤＮＡ結合活性を持つ。エッツ（ｅｔｓ）群癌遺伝子の発現タンパク質は、転写因子として働き、細胞の増殖やトランスホーメーションなどの際の遺伝子発現制御に重要な役割を果たしていると考えられている［Wasylyk et al., Eur. J. Biochem., 第２１１巻, 第７−１８頁（１９９３）］。
しかしながら、Ｅ１ＡＦ遺伝子の機能については明らかではない。
発明の目的
本発明の目的は、Ｅ１ＡＦ遺伝子の機能、特に、マトリックスメタロプロテネースの活性化および癌の浸潤および転移との関連性を明らかにし、Ｅ１ＡＦ遺伝子を制御することによる癌の浸潤転移を制御する方法、Ｅ１ＡＦ遺伝子の発現を検出することによる癌の悪性度を評価する方法およびその方法を実施するため手段を提供することにある。
発明の概要
本発明者らは、Ｅ１ＡＦ遺伝子と、マトリックスメタロプロテネースおよび癌の浸潤転移との関連性について鋭意研究を重ねた結果、Ｅ１ＡＦ遺伝子の発現タンパク質Ｅ１ＡＦが、さまざまなマトリックスメタロプロテネースのプロモーターに作用し、その活性を著しく上昇させ、その結果、癌細胞の浸潤能を高めることを見いだした。また、Ｅ１ＡＦ遺伝子の発現を、遺伝子工学的手法を用いて制御すると癌細胞の浸潤能を制御できることを見いだした。また、Ｅ１ＡＦタンパク質のＤＮＡ結合ドメイン（ＥＴＳドメイン）を遺伝子工学的手法を用いて癌細胞に導入すると癌細胞の浸潤能を制御できることを見いだした。さらに、Ｅ１ＡＦ遺伝子の発現を指標にして癌の検出方法および浸潤能を診断する方法を見いだし、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明を概説すれば、本発明の第１の態様は癌細胞の浸潤能の制御方法に関し、Ｅ１ＡＦ遺伝子の、マトリックスメタロプロテネースの転写活性化機能の制御、特に、Ｅ１ＡＦ遺伝子または発現産物、または機能的同等物を制御することを特徴とする。本発明の第２の態様は癌の検出方法に関し、Ｅ１ＡＦ遺伝子の発現産物を検出することを特徴とする。さらに、本発明の第３態様は癌組織の浸潤能の診断方法に関し、ヒトから単離された癌組織について、Ｅ１ＡＦ遺伝子の発現産物を検出することを特徴とする。本発明の第４の態様は、癌細胞浸潤能制御用キットに関し、Ｅ１ＡＦ遺伝子の、マトリックスメタロプロテネースの転写活性化機能制御物質を構成成分とすることを特徴とする。さらにまた、本発明の第５の態様は、癌検出用キットに関し、Ｅ１ＡＦ遺伝子のｍＲＮＡにハイブリダイズ可能なプローブを構成成分とすることを特徴とする。
発明の詳細な説明
本明細書で言う「機能的同等物」とは、以下のものをいう。
天然に存在するタンパク質にはそれをコードする遺伝子の多形や変異の他に、生成後のタンパク質の生体内及び精製中の修飾反応などによって、そのアミノ酸配列中にアミノ酸の欠失、挿入、付加、置換等の変異が起こりうるが、それにもかかわらず変異を有しないタンパク質と実質的に同等の生理、生物学的活性を示すものがあることが知られている。このように構造的に差異があっても、その機能については大きな違いがみとめられないものを機能的同等物と呼ぶ。
人為的にタンパク質のアミノ酸配列に上記のような変異を導入した場合でも同様であり、この場合はさらに多種多様の変異体を作製することが可能であるが、変異を有しないものと実質的に同等の生理活性を示す限り、これらの変異体は機能的同等物と解釈される。
例えば、大腸菌で発現されたタンパク質のＮ末端に存在するメチオニン残基は、多くの場合、メチオニンアミノペプチダーゼの作用により除去されるとされているが、タンパク質の種類によってはメチオニン残基を持つもの、持たないものの両方が生成される。しかしながら、このメチオニン残基の有無はタンパク質の活性に影響を与えない場合が多い。また、ヒトインターロイキン２（ＩＬ−２）のアミノ酸配列中の、あるシステイン残基をセリンに置換したポリペプチドがインターロイキン２活性を保持することが知られている［Science, 第２２４巻, 第１４３１頁（１９８４）］。
さらに、遺伝子工学的にタンパク質の生産を行う際には、融合タンパク質として発現させることがしばしば行われる。例えば、目的のタンパク質の発現量を増加させるために、目的のタンパク質のＮ末端の他のタンパク質由来のＮ末端ペプチド鎖を付加したり、目的のタンパク質のＮ末端、あるいはＣ末端に適当なペプチド鎖を付加して発現させ、この付加したペプチド鎖に親和性を持つ担体を使用することにより、目的のタンパク質の精製を容易にすることなどが行われている。
また、遺伝子上でアミノ酸を指定するコドン（３つの塩基の組合せ）は、アミノ酸の種類ごとに１〜６種類づつしが存在することが知られている。したがって、アミノ酸配列をコードする遺伝子はそのアミノ酸配列にもよるが、多数存在することができる。遺伝子は自然界において決して安定に存在しているものではなく、その核酸に変異が起こることはまれではない。遺伝子上に起こった変異がコードされるアミノ酸配列には変化を与えない場合（サイレント変異と呼ばれる）もあり、この場合には同じアミノ酸配列をコードする異なる遺伝子が生じたといえる。したがって、ある特定のアミノ酸配列をコードする遺伝子が単離されても、それを含有する生物が継代されていくうちに同じアミノ酸配列をコードする多種類の遺伝子ができていく可能性は否定できない。
さらに、同じアミノ酸配列をコードする多種類の遺伝子を人為的に作製することは、種々の遺伝子工学的手法を用いれば困難なことではない。
例えば、遺伝子工学的なタンパク質生産において、目的のタンパク質をコードする本来の遺伝子上で使用されているコドンが、使用している宿主中では使用頻度の低いものであった場合、タンパク質の発現量が低いことがある。このような場合には、コードされているアミノ酸配列に変化を与えることなく、コドンを宿主で繁用されているものに人為的に変換することにより、目的のタンパク質の高発現を図ることが行われている。このように特定のアミノ酸配列をコードする遺伝子を、人為的に多種類作成することが可能なことは言うまでもない。したがって、これらの人為的に作成された異なるポリペプチドであっても、本発明に開示されたアミノ酸配列をコードされている限り。本発明に包含されるものである。
さらに、目的のタンパク質のアミノ酸配列に１個もしくは複数個のアミノ酸残基を欠失、付加、挿入、もしくは置換したポリペプチドも目的のタンパク質と機能的に同等の活性を有する場合が少なくないが、このようなポリペプチドをコードする遺伝子も、天然のものであれ人為的に作成されたものであれ、本発明に包含される。
一般に、機能的同等物は、それをコードする遺伝子が相同性を有することが多い。したがって、本発明の遺伝子にハイブリダイズし、機能的に同様に作用するものも本発明に含まれる。
本明細書で言う「標的ＤＮＡ」とは、Ｅ１ＡＦタンパク質のＤＮＡ結合ドメインに結合し、Ｅ１ＡＦ遺伝子の、マトリックスメタロプロテネースの転写活性化機能を抑制するＤＮＡを示す。好ましくは、以下に示すＤＮＡを言う。
Ｅ１ＡＦタンパク質のＤＮＡ結合ドメインに結合するＤＮＡは、5'-MGGAWGT-3'（ＭはＡまたはＣを示し、ＷはＡまたはＴを示す。）であることが知られている［F. Higashino et al., Nucleic Acids Research, 第２１巻, 第５４７−５５３頁（１９９３）］。また、Ｅ１ＡＦタンパク質が属するｅｔｓファミリー癌遺伝子のタンパク質が結合するＤＮＡ保存配列は、5'-MGGAW-3'であることが明らかにされている［B. Wasylyk et al., Eur. J. Biochem., 第２１１巻, 第７−１８頁（１９９３）］。さらに、Ｅ１ＡＦタンパク質により転写活性化されるマトリックスメタロプロテネースのプロモーターあるいはエンハンサー領域には上記のＥ１ＡＦタンパク質のＤＮＡ結合配列が存在する。すなわち、タイプＩコラゲナーゼの−８９領域、ストロメライシンの−２１６および−２０８領域、ストロメライシン２の−１８１領域、および、マトリライシンの−１７０および−１４６領域にＥ１ＡＦ結合配列が認められる［M. Gaire et al., J. Biol. Chem., 第２６９巻, 第２０３２−２０４０頁（１９９４）］。また、９２キロダルトン（ｋＤ）タイプＩＶコラゲナーゼにも−５４１領域（5'-AGGAAG-3'）および−２３０領域［5'-AGGAAA-3'、酵素遺伝子とは逆向きに存在する（以下、マイナス鎖とする。）］にＥ１ＡＦ結合配列が存在する［P. Huhtala et al., J. Biol. Chem., 第２６６巻, 第１６８４５−１６８４９頁（１９９１）］。７２キロダルトン（ｋＤ）タイプＩＶコラゲナーゼにも−３８８領域（5'-AGGAAT-3', マイナス鎖）、−３７８領域（5'-AGGAAC-3', マイナス鎖）、−１４４領域（5'-AGGAAA-3'）にＥ１ＡＦ結合配列が存在する［P. Huhtala et al., J. Biol. Chem., 第２６５巻, 第１１０７７−１１０８２頁, （１９９０）］。
このように、5'-MGGAW-3'の配列を含み、Ｅ１ＡＦ遺伝子の、マトリックスメタロプロテネースの転写活性化機能を抑制するＤＮＡは、本明細書で言う標的ＤＮＡに含まれる。
また、本明細書で言う「デコイ」とは、転写因子の結合タンパク質、転写因子の結合部位の配列または類似の配列を持つＤＮＡを示し、これらを「おとり」として細胞内に導入することで転写因子の作用を抑制するものを言う。特に、Ｅ１ＡＦ遺伝子の、マトリックスメタロプロテネースの転写活性化機能を抑制するものを言う。例えば、Ｅ１ＡＦタンパク質のＤＮＡ結合ドメイン、該ＤＮＡ結合ドメインの機能的同等物またはＥ１ＡＦタンパク質のＤＮＡ結合ドメインの標的ＤＮＡをデコイとして用いることができる。また、遺伝子工学的手法を用いたＥ１ＡＦタンパク質のＤＮＡ結合ドメイン、または該ＤＮＡ結合ドメインの機能的同等物をコードする遺伝子による発現産物もデコイとして用いることができる。
Ｅ１ＡＦ遺伝子の、マトリックスメタロプロテネースの転写活性化機能を効果的に抑制することができるものは本発明のデコイに含まれる。
さらに、本明細書で言う「リボザイム」とは、Ｅ１ＡＦタンパク質のｍＲＮＡあるいはマトリックスメタロプロテネースタンパク質のｍＲＮＡを切断するものをいい、これらのタンパク質の翻訳を阻害し、癌細胞の浸潤能を抑制するものを言う。例えば、ハンマーヘッド型リボザイム5'-NNNNNNNCUGAUGAAGGGUGAUACCCUGAAAC（またはG）N'N'N'N'N'-3'（配列番号２、ＮおよびＮ'は任意の塩基であり、ターゲットｍＲＮＡとハイブリッドを形成する配列である。）を用いることができる［M. Koizumi et al., FEBS Letter, 第２２８巻, 第２２８−２３０頁（１９８８）］。この場合、ターゲットｍＲＮＡとしては、5'-N'N'N'N'N'G（またはハンマーヘッド型リボザイムがＧの場合はＣ）UHNNNNNNN-3'（配列番号３、ＮおよびＮ'は任意の塩基、ＨはＡ、ＣまたはＵ、ただし、ＮおよびＮ'は上記ハンマーヘッド型リボザイムのＮおよびＮ'とハイブリッドを形成する配列である。）の配列が要求される。すなわち、5'-G（またはC）UH-3'の配列が存在しなければならない。
これらの配列より設計したリボザイムもまた、本明細書で言うリボザイムである。また、他のハンマーヘッド型リボザイム、ヘアピン型リボザイム、デルタ型リボザイムなどのリボザイムの種類に関わらず、Ｅ１ＡＦタンパク質のｍＲＮＡあるいはマトリックスメタロプロテネースタンパク質のｍＲＮＡを切断するもので、これらのタンパク質の翻訳を阻害し、癌細胞の浸潤能を抑制するものであれば本明細書で言うリボザイムに含まれる。
Ｅ１ＡＦ遺伝子の発現を促進させることにより、癌の浸潤転移を制御することができる。Ｅ１ＡＦ遺伝子の発現タンパク質Ｅ１ＡＦが、さまざまなマトリックスメタロプロテネースのプロモーターを活性化するかどうかを調べるには、プロモーターの解析に使われるキャット（ＣＡＴ）アッセイを用いることができる。すなわち、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（キャット：ＣＡＴ）レポーター遺伝子の上流にマトリックスメタロプロテネースのプロモーター領域を導入したプラスミドを作製し、Ｅ１ＡＦ遺伝子発現ベクターとともに細胞をトランスフェクションし、キャット活性を測定することにより、マトリックスメタロプロテネースのプロモーターの活性化能を測定することができる。
Ｅ１ＡＦ遺伝子と癌細胞の浸潤能の関係を調べるには、浸潤能の低い癌細胞株をＥ１ＡＦ遺伝子発現ベクターでトランスフェクションした細胞株について、マトリジェル（Matrigel）アッセイ法により、インビトロでの浸潤能の変化で評価することができる。また、動物実験により浸潤能、転移能を測定することができる。
Ｅ１ＡＦ遺伝子の発現を抑制することにより癌の浸潤転移を制御することができる。Ｅ１ＡＦ遺伝子の発現を制御する方法として、アンチセンスＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡおよびトリプルヘリックス技術などを利用することができる。また、デコイを用いることにより癌の浸潤転移を制御することができる。デコイとしては、Ｅ１ＡＦタンパク質のＤＮＡ結合ドメイン、該ＤＮＡ結合ドメインの機能的同等物、Ｅ１ＡＦタンパク質のＤＮＡ結合ドメインをコードする遺伝子による発現産物、該ＤＮＡ結合ドメインの機能的同等物をコードする遺伝子による発現産物およびＥ１ＡＦタンパク質のＤＮＡ結合ドメインの標的ＤＮＡを利用することができる。
Ｅ１ＡＦ遺伝子の発現を指標にして癌検出および浸潤能の診断を行うことができる。Ｅ１ＡＦ遺伝子の発現を調べるには、癌組織よりＲＮＡを調整し、ノザンハイブリダイゼーション法またはＰＣＲ法を用いてｍＲＮＡレベルの発現量を調べることができる。また、Ｅ１ＡＦタンパク質の発現は癌組織についてＥ１ＡＦタンパク質に対する抗体を調べることができる。
かくして、本発明の癌細胞の浸潤能の制御方法においては、Ｅ１ＡＦ遺伝子の、マトリックスメタロプロテネースの転写活性化機能を制御する。
マトリックスメタロプロテネースの転写活性化機能を促進すれば、癌細胞の浸潤能が活性化され、抑制すれば、癌細胞の浸潤能が抑制される。
Ｅ１ＡＦ遺伝子の、マトリックスメタロプロテネースの転写活性化機能を促進する物質、例えば、Ｅ１ＡＦ遺伝子が癌細胞内で発現するように、該遺伝子を細胞内に導入することにより、該細胞の浸潤能が活性化される。
配列表の配列番号１で表されるＥ１ＡＦ遺伝子もしくはその一部は、遺伝子が染色体外に留まるようなベクターの形で導入される。このような状態では、遺伝子は染色体外の位置から細胞によって発現される。Ｅ１ＡＦ遺伝子の一部が細胞に導入され、発現される場合、該導入遺伝子の部分は、細胞の浸潤能の活性化に必要な部分をコードしている必要がある。染色体外保持用ベクターは当該分野において知られており、適切なベクターが用いられる。ＤＮＡを細胞に導入するための方法、例えば、電気穿孔法、リン酸カルシウム共沈法、ウイルス形質導入法などが当該分野においてしられており、どのような方法を選択するかは日常的作業の範囲である。
また、Ｅ１ＡＦ遺伝子またはその一部は、遺伝子が染色体内に組み込まれるようなベクターの形で導入してもよい。このような状態では、遺伝子は染色体中に保持され、細胞によって発現される。染色体組込型ベクターとしては、ウイルスベクターを使用することにより、当該遺伝子を効率よく癌細胞に導入することができる。これらのベクターとしては、レトロウイルス、ワクシニウイルス、アデノウイルス、さらには非増殖性組換ウイルス等を用いることができる。
Ｅ１ＡＦ遺伝子が発現された癌細胞は、細胞の浸潤能の研究のモデル系または癌の浸潤を抑制する治療剤を研究するためのモデル系として有用である。さらには、細胞の転移能の研究のモデル系または癌の転移抑制剤の研究のモデル系としても有用である。モデル系として使用できる細胞は、例えば、ヒト乳癌細胞、ヒト骨肉腫細胞等である。Ｅ１ＡＦ遺伝子が発現された癌細胞にテスト物質を適用した後、細胞の浸潤運動性、ヌードマウスにおける、転移活性等により、テスト物質の転移抑制活性が評価される。テスト物質が癌の転移を抑制する場合、その物質は癌、例えば、乳癌、骨肉腫等の転移抑制剤の候補となる。
Ｅ１ＡＦ遺伝子の発現タンパク質Ｅ１ＡＦまたは機能的同等物を癌細胞に導入することにより、癌細胞の浸潤能が活性化される。発現タンパク質Ｅ１ＡＦの配列は、配列表の配列番号１に示されている。
Ｅ１ＡＦタンパク質または機能的同等物は、例えば、既知の発現ベクターを用いてｃＤＮＡを微生物中で発現させることによって生産される。あるいは、Ｅ１ＡＦタンパク質または機能的同等物を生産する細胞から抽出することもできる。さらに、合成化学の技術を適用してＥ１ＡＦタンパク質または機能的同等物を合成することもできる。このような方法のうちいずれの方法を用いても、本発明のＥ１ＡＦタンパク質または機能的同等物を含む調製物を提供することができる。この調製物は実質的に他のヒトタンパク質を含まない。これは微生物中で、またはインビトロで合成することによって最も容易に達成される。
マイクロインジェクションもしくはリポソーム等を利用することにより、Ｅ１ＡＦタンパク質または機能的同等物を細胞内に導入することができる。あるいは、該タンパク質または機能的同等物をドラグデリバリーシステムもしくは拡散によって細胞に取込ませることもできる。Ｅ１ＡＦタンパク質または機能的同等物を細胞内に導入した癌細胞の浸潤運動能、動物モデルでの転移能を測定することにより、癌細胞の浸潤能、転移能の活性化を評価することができる。Ｅ１ＡＦタンパク質または機能的同等物の導入により、癌細胞の浸潤能が活性化される。
この活性化された癌細胞は、癌浸潤研究のモデル系、癌転移研究モデル系として、また、癌浸潤抑制剤、癌転移抑制剤の開発に有用である。
一方、癌細胞の浸潤能の抑制は、Ｅ１ＡＦ遺伝子の、マトリックスメタロプロテネースの転写活性化機能を抑制する物質、例えば、Ｅ１ＡＦ遺伝子のアンチセンスＤＮＡまたはアンチセンスＲＮＡを癌細胞に導入することにより、該細胞の浸潤能が抑制される。
導入するアンチセンスＤＮＡとしては、Ｅ１ＡＦ遺伝子のアンチセンスＤＮＡもしくはその一部を用いることができる。導入するアンチセンスＲＮＡとしては、Ｅ１ＡＦ遺伝子のアンチセンスＲＮＡもしくはその一部を用いることができる。使用するアンチセンスＤＮＡもしくはアンチセンスＲＮＡとしては、細胞内に導入された後、細胞内でＥ１ＡＦ遺伝子のｍＲＮＡと合会し、その機能を抑制するものであれば良く、これらのアンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡは化学合成法、遺伝子工学的方法等で作製すれば良い。これらのアンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡはマイクロインジェクション法、ポリエチレングリコール法、パーティクルガン法、電気穿孔法、リポソーム法等により、細胞に導入することができる。
また、Ｅ１ＡＦ遺伝子もしくはその一部を、アンチセンスＲＮＡが癌細胞内で発現するように、上記の染色体外保持用ベクターまたは上記染色体組込型ベクターに組込み、癌細胞内に導入することにより、癌細胞内でアンチセンスＲＮＡを発現させることができる。アンチセンスＲＮＡ発現用ベクターの細胞内への導入は、電気穿孔法、リン酸カルシウム共沈法、ウイルス形質導入法等で行うことができる。
アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡの長さ、配列については、アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡの導入後の癌細胞の浸潤能を測定することにより、その抑制効果を評価することができる。Ｅ１ＡＦ遺伝子の発現がアンチセンスＤＮＡまたはアンチセンスＲＮＡにより抑制された癌細胞は、癌細胞の浸潤運動能、転移能研究モデル系として有用である。
Ｅ１ＡＦタンパク質のＤＮＡ結合ドメインまたは機能的同等物を癌細胞に導入することにより、癌細胞の浸潤能が抑制される。
Ｅ１ＡＦタンパク質のＤＮＡ結合ドメインまたは機能的同等物としては、標的ＤＮＡに結合するものであればよく、癌細胞の浸潤能に関与する標的ＤＮＡに結合し、細胞内在性のＥ１ＡＦタンパク質の、マトリックスメタロプロテネースの転写活性化機能を抑制するものであればよい。好ましくは、転写活性化機能を有しておらず、また酸性アミノ酸領域を有していないものが好ましい。Ｅ１ＡＦタンパク質のＤＮＡ結合ドメインは、配列表の配列番号１のアミノ酸番号３１５から３９９のアミノ酸配列で表されている。
Ｅ１ＡＦタンパク質のＤＮＡ結合ドメインまたは機能的同等物は、例えば、既知の発現ベクターを用いてｃＤＮＡを微生物中で発現させることによって生産される。または、合成化学の技術を適用してＥ１ＡＦタンパク質のＤＮＡ結合ドメインまたは機能的同等物を合成することもできる。このような方法のうちいずれの方法を用いても、本発明のＥ１ＡＦタンパク質のＤＮＡ結合ドメインまたは機能的同等物を含む調製物を提供することができる。この調製物は実質的に他のヒトタンパク質を含まない。これは微生物中で、またはインビトロで合成することによって最も容易に達成される。
マイクロインジェクションもしくはリポソーム等を利用することによりＥ１ＡＦタンパク質のＤＮＡ結合ドメインまたは機能的同等物を細胞内に導入することができる。または、該ドメインまたは機能的同等物をドラグデリバリーシステムもしくは拡散によって細胞に取込ませることもできる。
Ｅ１ＡＦタンパク質のＤＮＡ結合ドメインまたは機能的同等物を細胞内に導入した癌細胞の浸潤運動能、動物モデルでの転移能を測定することにより、癌細胞の浸潤能、転移能の抑制を評価することができる。Ｅ１ＡＦタンパク質のＤＮＡ結合ドメインまたは機能的同等物の導入により、癌細胞のＥ１ＡＦタンパク質による浸潤能が活性化が抑制される。
Ｅ１ＡＦタンパク質のＤＮＡ結合ドメインをコードする遺伝子またはＥ１ＡＦタンパク質のＤＮＡ結合ドメインの機能的同等物をコードする遺伝子が癌細胞内で発現するように、該遺伝子を細胞内に導入することにより、該細胞の浸潤能が抑制される。配列表の配列番号１のアミノ酸番号３１５から３９９のアミノ酸配列で表されるＥ１ＡＦタンパク質のＤＮＡ結合ドメインをコードする遺伝子もしくはその一部を含む遺伝子、またはＥ１ＡＦタンパク質のＤＮＡ結合ドメインの機能的同等物をコードする遺伝子もしくはその一部を含む遺伝子は、遺伝子が染色体外に留まるようなベクターの形で導入される。このような状態では、遺伝子は染色体外の位置から細胞によって発現される。Ｅ１ＡＦタンパク質のＤＮＡ結合ドメインをコードする遺伝子の一部またはＥ１ＡＦタンパク質のＤＮＡ結合ドメインの機能的同等物をコードする遺伝子の一部が細胞に導入され、発現される場合、該導入遺伝子の部分は、細胞の浸潤能の抑制に必要なＤＮＡ結合ドメインまたは機能的同等物をコードしている部分を含んでいる必要がある。染色体外保持用ベクターは当該分野において知られており、適切なベクターが用いられる。ＤＮＡを細胞に導入するための方法、例えば、電気穿孔法、リン酸カルシウム共沈法、ウイルス形質導入法などが当該分野においてしられており、どのような方法を選択するかは日常的作業の範囲である。
また、Ｅ１ＡＦタンパク質のＤＮＡ結合ドメインをコードする遺伝子もしくはその一部、またはＥ１ＡＦタンパク質のＤＮＡ結合ドメインの機能的同等物をコードする遺伝子もしくはその一部は、遺伝子が染色体内に組み込まれるようなベクターの形で導入してもよい。このような状態では、遺伝子は染色体中に保持され、細胞によって発現される。染色体組込型ベクターとしては、ウイルスベクターを使用することにより、当該遺伝子を効率よく癌細胞に導入することができる。これらのベクターとしては、レトロウイルス、ワクシニウイルス、アデノウイルス、さらには非増殖性組換ウイルス等を用いることができる。
Ｅ１ＡＦタンパク質のＤＮＡ結合ドメインの標的ＤＮＡを細胞内に導入することによって、癌細胞の浸潤能を抑制できる。
Ｅ１ＡＦタンパク質のＤＮＡ結合ドメインの標的ＤＮＡとしては、Ｅ１ＡＦタンパク質のＤＮＡ結合ドメインに結合するＤＮＡを含むものであれば良い。特に5'-MGGAW-3'の配列を含むＤＮＡを用いることができる。該ＤＮＡは、マトリックスメタロプロテネースのＥ１ＡＦタンパク質のＤＮＡ結合ドメインに結合する結合配列を含むプロモーターあるいはエンハンサー領域を用いても良い。これらＤＮＡを既知の発現ベクターを用いて微生物中で増幅させた後、該微生物より抽出、精製したものを用いても良いし、ＰＣＲ法等によりインビトロで増幅させたものでも良い。また、合成ＤＮＡを用いても良い。これらの方法で得られた標的ＤＮＡは、上記の種々の方法で癌細胞に導入しても良いし、ＤＮＡが染色体外に留まるようなベクターの形で導入しても良い。このような状態では、ＤＮＡは染色体外の位置から細胞によって増幅される。染色体外保持用ベクターは当該分野において知られており、適切なベクターが用いられる。ＤＮＡを細胞に導入するための方法、例えば、電気穿孔法、リン酸カルシウム共沈法、ウイルス形質導入法などが当該分野においてしられており、どのような方法を選択するかは日常的作業の範囲である。
Ｅ１ＡＦ遺伝子のｍＲＮＡに対するリボザイムを癌細胞内に導入することにより、癌細胞の浸潤能が抑制される。
リボザイムは、そのリボザイムが癌細胞内で安定して作用するように設計するのは当然のことである。リボザイムがハンマーヘッド型の場合、Ｅ１ＡＦ遺伝子には5'-GUC-3'（配列番号１の塩基番号１０７−１０９）が存在する。この配列よりリボザイムを設計し、合成する。合成したリボザイムは上記の種々の方法で癌細胞に導入してもよいし、上記のベクターに組み込んで癌細胞内に導入し、細胞内の染色体外または染色体中に保持させるようにして発現させても良い。
マトリックスメタロプロテネース遺伝子のｍＲＮＡに対するリボザイムを癌細胞内に導入することにより、癌細胞の浸潤能が抑制される。
リボザイムは、そのリボザイムが癌細胞内で安定して作用するように設計するのは当然のことである。リボザイムがハンマーヘッド型の場合、タイプＩコラゲナーゼ［P. Angel et al., Mol. Cell. Biol., 第７巻, 第２２５６−２２６６頁（１９８７）］には5'-GUC-3'（塩基番号１１４−１１６）が、ストロメライシン［S. E. Whitham et al., Biochem. J., 第２４０巻, 第９１３−９１６頁（１９８６）］には5'-GUC-3'（塩基番号５１−５３）が、ストロメライシン２［D. Muller et al., Biochem. J., 第２５３巻, 第１８７−１９２頁（１９８８）］には5'-GUU-3'（塩基番号４９−５１）が、９２キロダルトン（ｋＤ）タイプＩＶコラゲナーゼ［P. Huhtala et al., J. Biol. Chem., 第２６６巻, 第１６８４５−１６８４９頁（１９９１）］には5'-GUC-3'（塩基番号４１−４３）が、および７２キロダルトン（ｋＤ）タイプＩＶコラゲナーゼ［P. Huhtala et al., J. Biol. Chem., 第２６５巻, 第１１０７７−１１０８２頁（１９９０）］には5'-GUC-3'（塩基番号３４２−３４４）が存在する。この配列よりリボザイムを設計し、合成する。合成したリボザイムは上記の種々の方法で癌細胞に導入してもよいし、上記のベクターに組み込んで癌細胞内に導入し、細胞内の染色体外または染色体中に保持させるようにして発現させても良い。
Ｅ１ＡＦ遺伝子のアンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、Ｅ１ＡＦ遺伝子のｍＲＮＡに対するリボザイム、マトリックスメタロプロテネース遺伝子のｍＲＮＡに対するリボザイムを用いれば癌細胞の浸潤を抑制でき、これらは癌浸潤抑制剤として有用である。
また、デコイ型薬剤としてＥ１ＡＦタンパク質のＤＮＡ結合ドメイン、Ｅ１ＡＦタンパク質のＤＮＡ結合ドメインの機能的同等物、Ｅ１ＡＦタンパク質のＤＮＡ結合ドメインまたはＥ１ＡＦタンパク質のＤＮＡ結合ドメインの機能的同等物をコードする遺伝子による発現産物、Ｅ１ＡＦタンパク質のＤＮＡ結合ドメインの標的ＤＮＡを用いれば癌細胞の浸潤を抑制でき、これらも癌浸潤抑制剤として有用である。
例えば、アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ発現用ベクター、Ｅ１ＡＦタンパク質のＤＮＡ結合ドメイン、Ｅ１ＡＦタンパク質のＤＮＡ結合ドメインの機能的同等物、Ｅ１ＡＦタンパク質のＤＮＡ結合ドメイン発現用ベクター、Ｅ１ＡＦタンパク質のＤＮＡ結合ドメインの機能的同等物発現ベクター、Ｅ１ＡＦタンパク質のＤＮＡ結合ドメインの標的ＤＮＡ、Ｅ１ＡＦタンパク質のＤＮＡ結合ドメインの標的ＤＮＡ発現用ベクター、Ｅ１ＡＦ遺伝子のｍＲＮＡに対するリボザイム、Ｅ１ＡＦ遺伝子のｍＲＮＡに対するリボザイム発現用ベクター、マトリックスメタロプロテネース遺伝子のｍＲＮＡに対するリボザイムまたはマトリックスメタロプロテネース遺伝子のｍＲＮＡに対するリボザイム発現用ベクターは、組織表面の患部には直接注入すれば良く、癌細胞中、また、その周辺組織に注入することにより、効率よく癌の転移を抑制することができる。さらに、組織内部の患部、その周辺組織にも直接注入すれば良いが、ドラグデリバリーシステムを応用しても良い。ドラグデリバリーシステムとしては、癌細胞に特異的なシステムが好ましく、例えば、ガン細胞リセプター、癌特異抗体等を利用した一般的なシステムから選択すれば良い。
かくして、Ｅ１ＡＦ遺伝子のアンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ発現用ベクター、Ｅ１ＡＦタンパク質のＤＮＡ結合ドメイン、Ｅ１ＡＦタンパク質のＤＮＡ結合ドメインの機能的同等物、Ｅ１ＡＦタンパク質のＤＮＡ結合ドメイン発現用ベクター、Ｅ１ＡＦタンパク質のＤＮＡ結合ドメインの機能的同等物発現用ベクター、Ｅ１ＡＦタンパク質のＤＮＡ結合ドメインの標的ＤＮＡ、Ｅ１ＡＦタンパク質のＤＮＡ結合ドメインの標的ＤＮＡ発現用ベクター、Ｅ１ＡＦ遺伝子のｍＲＮＡに対するリボザイム、Ｅ１ＡＦ遺伝子のｍＲＮＡに対するリボザイム発現用ベクター、マトリックスメタロプロテネース遺伝子のｍＲＮＡに対するリボザイムまたはマトリックスメタロプロテネース遺伝子のｍＲＮＡに対するリボザイム発現用ベクターは、それを有効成分とする癌浸潤抑制剤として使用できる。
かかる癌浸潤抑制剤は、アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ発現用ベクター、Ｅ１ＡＦタンパク質のＤＮＡ結合ドメイン、Ｅ１ＡＦタンパク質のＤＮＡ結合ドメインの機能的同等物、Ｅ１ＡＦタンパク質のＤＮＡ結合ドメイン発現用ベクター、Ｅ１ＡＦタンパク質のＤＮＡ結合ドメインの機能的同等物発現用ベクター、Ｅ１ＡＦタンパク質のＤＮＡ結合ドメインの標的ＤＮＡ、Ｅ１ＡＦタンパク質のＤＮＡ結合ドメインの標的ＤＮＡ発現用ベクター、Ｅ１ＡＦ遺伝子のｍＲＮＡに対するリボザイム、Ｅ１ＡＦ遺伝子のｍＲＮＡに対するリボザイム発現用ベクター、マトリックスメタロプロテネース遺伝子のｍＲＮＡに対するリボザイムまたはマトリックスメタロプロテネース遺伝子のｍＲＮＡに対するリボザイム発現用ベクターを医薬として許容される範囲で含有していれば良く、通常の治療剤および遺伝子含有治療剤と同様に製剤化することができ、製剤中には担体、賦形剤、安定化剤、粘稠化剤等が含有されていても良い。
本発明の癌浸潤抑制剤の用量は年令、体重等の患者の状態、患部の程度を考慮して選択できる。
本発明の癌浸潤抑制剤に含有されるアンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡまたはアンチセンスＲＮＡ発現用ベクターは、Ｅ１ＡＦ遺伝子の発現を特異的に抑制する機能を有し、またＥ１ＡＦタンパク質のＤＮＡ結合ドメイン、Ｅ１ＡＦタンパク質のＤＮＡ結合ドメインの機能的同等物、Ｅ１ＡＦタンパク質のＤＮＡ結合ドメイン発現用ベクター、Ｅ１ＡＦタンパク質のＤＮＡ結合ドメインの機能的同等物発現用ベクター、Ｅ１ＡＦタンパク質のＤＮＡ結合ドメインの標的ＤＮＡまたはＥ１ＡＦタンパク質のＤＮＡ結合ドメインの標的ＤＮＡ発現用ベクターは、Ｅ１ＡＦ遺伝子の、マトリックスメタロプロテネースの活性化機能を特異的に抑制する機能を有し、Ｅ１ＡＦ遺伝子のｍＲＮＡに対するリボザイムまたはＥ１ＡＦ遺伝子のｍＲＮＡに対するリボザイム発現用ベクターは、Ｅ１ＡＦタンパク質の翻訳を阻害する機能を有し、マトリックスメタロプロテネース遺伝子のｍＲＮＡに対するリボザイムまたはマトリックスメタロプロテネース遺伝子のｍＲＮＡに対するリボザイム発現用ベクターは、マトリックスメタロプロテネースタンパク質の翻訳を阻害する機能を有するものであり、毒性は無い。
本発明の癌浸潤抑制剤により、転移の危険性の高い癌、例えば繊維肉腫の転移を抑制することができる。
本発明のもう１つの態様として、癌の検出方法が提供される。
癌の検出は、手術や生検で患部組織を摘出した後、組織中より配列表の配列番号１で表されるＥ１ＡＦ遺伝子の発現産物を検出することにより達成される。発現産物の検出は、摘出組織よりＲＮＡを調製し、ノザンハイブリダイゼーション法、ＰＣＲ法等を用いて、Ｅ１ＡＦ遺伝子の発現産物のｍＲＮＡを検出することにより行うことができる。ノザンハイブリダイゼーション法に使用するプローブ、ＰＣＲ法に使用するプライマー、プローブ等は配列表の配列番号１で表されるＥ１ＡＦ遺伝子のＤＮＡ配列に基づいて特定のプローブ、プライマーをデザインすることは当業者にとって容易にできることである。
また、Ｅ１ＡＦ遺伝子の発現タンパク質Ｅ１ＡＦを検出することにより癌を検出することができる。例えば、発現タンパク質Ｅ１ＡＦと免疫反応性の抗体を用いて癌を検出することができる。該抗体はポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体として、Ｅ１ＡＦタンパク質に対して作成することができる。抗体はＥ１ＡＦタンパク質エピトープと免疫反応性でなければならず、エピトープは他のタンパク質に存在しないものが望ましい。本発明の望ましい態様では、抗体は溶液中のＥ１ＡＦタンパク質を免疫沈降させ、かつポリアクリルアミドゲルのウエスタンもしくはイムノブロットのＥ１ＡＦタンパク質とも反応する。別の望ましい態様では、抗体は免疫細胞化学的技術を用い、パラフィンもしくは冷凍組織切片中のタンパク質を検出することができる。抗体を作製し、精製する技術は当該技術分野においてよく知られており、本発明に使用する抗体調製品を得るには、そのような技術のうちどの技術を用いても良い。
本発明の癌の検出方法は、Ｅ１ＡＦ遺伝子が発現しているあらゆる癌に対して適用することができる。すなわち、組織中、細胞中のＥ１ＡＦ遺伝子の発現量が有意に上昇している組織や細胞は癌組織、癌細胞と判定することができる。さらに、Ｅ１ＡＦ遺伝子の発現産物の発現量により癌の悪性度が判断できる。本発明の検出方法が適用される癌の具体例としては繊維肉腫、乳腺癌、骨肉腫、自発性トランスフォーム内皮細胞、肺小細胞癌等である。
本発明のもう１つの態様により、癌組織の浸潤能の診断方法が提供される。
癌組織の浸潤能を診断するためには、手術や生検により癌組織を摘出した後、周囲の正常な組織を含まない組織を単離することが有効である。組織の調製品の癌細胞の濃度を高める方法は当該技術分野において知られている。例えば、組織はパラフィンまたはクリオスタットセクションを用いて単離できる。癌細胞はまた、フローサイトメトリーを用いて正常細胞から分離できる。癌細胞を正常な細胞から分離するためのこれらの、および他の技術は当該分野においてよく知られている。癌組織に正常細胞が多く混入していると、浸潤能の診断が困難になる。
癌組織の浸潤能の診断は、配列表の配列番号１で表されるＥ１ＡＦ遺伝子の発現産物を検出することにより達成される。発現産物の検出は、癌組織よりＲＮＡを調製し、ノザンハイブリダイゼーション法、ＰＣＲ法等を用いて、Ｅ１ＡＦ遺伝子の発現産物のｍＲＮＡを検出することにより行うことができる。また、Ｅ１ＡＦ遺伝子の発現タンパク質Ｅ１ＡＦを検出することにより癌組織の浸潤能を診断することができる。例えば、発現タンパク質Ｅ１ＡＦと免疫反応性の抗体を用いて組織中の発現タンパク質Ｅ１ＡＦを検出することができる。このような免疫学的分析は当該技術分野で知られている適当な方法を用いて行うことができる。これらにはウエスタンブロット、免疫組織化学的分析およびＥＬＩＳＡ分析などが含まれる。
本発明の診断方法はＥ１ＡＦ遺伝子が発現しているあらゆる癌に対して適用することができる。すなわち、Ｅ１ＡＦ遺伝子の発現産物が有意に上昇している癌組織は浸潤能、さらには転移能の高い癌組織と診断することができる。本発明の診断方法が適用される癌の具体例としては繊維肉腫、乳腺癌、骨肉腫、自発性トランスフォーム内皮細胞、肺小細胞癌等である。本発明の診断方法は、臨床医が癌摘出患者の予後の治療方法を決定するのに有用である。
本発明のもう１つ別の態様によれば、Ｅ１ＡＦ遺伝子の、マトリックスメタロプロテネースの転写活性化機能制御物質を構成成分、例えば、上記のような、Ｅ１ＡＦタンパク質、Ｅ１ＡＦタンパク質の機能的同等物、Ｅ１ＡＦ遺伝子、Ｅ１ＡＦタンパク質の機能的同等物をコードする遺伝子、Ｅ１ＡＦ遺伝子のアンチセンスＤＮＡ、Ｅ１ＡＦ遺伝子のアンチセンスＲＮＡ、Ｅ１ＡＦ遺伝子のアンチセンスＲＮＡ発現用ベクター、Ｅ１ＡＦタンパク質のＤＮＡ結合ドメイン、Ｅ１ＡＦタンパク質のＤＮＡ結合ドメインの機能的同等物、Ｅ１ＡＦタンパク質のＤＮＡ結合ドメインをコードする遺伝子、Ｅ１ＡＦタンパク質のＤＮＡ結合ドメインの機能的同等物をコードする遺伝子、Ｅ１ＡＦタンパク質のＤＮＡ結合ドメイン発現用ベクター、Ｅ１ＡＦタンパク質のＤＮＡ結合ドメインの機能的同等物発現用ベクター、Ｅ１ＡＦタンパク質のＤＮＡ結合ドメインの標的ＤＮＡ、Ｅ１ＡＦタンパク質のＤＮＡ結合ドメインの標的ＤＮＡ発現用ベクター、Ｅ１ＡＦ遺伝子のｍＲＮＡに対するリボザイム、Ｅ１ＡＦ遺伝子のｍＲＮＡに対するリボザイム発現用ベクター、マトリックスメタロプロテネース遺伝子のｍＲＮＡに対するリボザイム、マトリックスメタロプロテネース遺伝子のｍＲＮＡに対するリボザイム発現用ベクターからなる群から選ばれる少なくとも１つの成分を構成成分とする癌細胞浸潤能制御用キットが提供される。
キット中のマトリックスメタロプロテネースの転写活性化機能制御物質、例えば、Ｅ１ＡＦタンパク質は溶液でも凍結乾燥物でも良い。Ｅ１ＡＦタンパク質は、配列表の配列番号１に示されているＥ１ＡＦ遺伝子またはその一部を発現ベクターに組み込み、発現させたＥ１ＡＦタンパク質またはＥ１ＡＦタンパク質の一部でも良い。このＥ１ＡＦタンパク質の一部としては、該タンパク質を癌細胞内に導入した時に、癌細胞の浸潤能を活性化するものであれば良い。また、Ｅ１ＡＦタンパク質を生産する細胞から抽出したものでも良い。さらに、合成化学の技術を適用して合成したものでも良い。これらのタンパク質は活性を保持したまま、マイクロインジェクション法で細胞内に導入することができる。
例えば、Ｅ１ＡＦ遺伝子は溶液でも凍結乾燥物でも良い。配列表の配列番号１で表されるＥ１ＡＦ遺伝子は上記の特開平５−３２８９７５号公報、Nucleic Acids Research, 第２１巻, 第５４７−５５３頁（１９９３）記載の方法により調整できる。
これらキットの構成成分の保存状態は、その構成成分の使用用途により使用者が使いやすいようにすることは当然のことであり、特に限定されるものではない。
上記のごとく、Ｅ１ＡＦ遺伝子もしくは該遺伝子により切り出した一部を含む遺伝子、またはＥ１ＡＦタンパク質の機能的同等物をコードする遺伝子もしくは該遺伝子により切り出した一部を含む遺伝子は、癌細胞内での発現用ベクターに組込み、細胞内に導入することにより、癌細胞内で効率よく発現する。Ｅ１ＡＦ遺伝子の一部を含む遺伝子またはＥ１ＡＦタンパク質の機能的同等物をコードする遺伝子の一部が細胞に導入され、発現される場合、該導入遺伝子の部分は細胞の浸潤能の活性化に必要な部分がコードされている。発現用ベクターとしては染色体外保持用ベクターや、レトロウイルスベクターのような染色体組込型ベクターが使用でき、特にウイルスベクターを使って当該遺伝子を含むベクターを効率よく癌細胞に感染させることができる。これらのベクターとしてはレトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、非増殖性組換えウイルスも使用できる。
本発明の該キット中のＥ１ＡＦ遺伝子またはＥ１ＡＦ遺伝子より切り出した遺伝子を、Ｅ１ＡＦ遺伝子のアンチセンスＲＮＡが発現する様に、癌細胞内発現用ベクターに組込み、細胞内に導入することにより、癌細胞内でＥ１ＡＦ遺伝子若しくはＥ１ＡＦ遺伝子の一部に対するアンチセンスＲＮＡが発現する。Ｅ１ＡＦ遺伝子の一部が細胞に導入され、アンチセンスＲＡＮが発現される場合、該導入遺伝子の部分は、細胞内在性のＥ１ＡＦ遺伝子の発現を抑制し、細胞の浸潤能を抑制可能なアンチセンスＲＮＡを発現可能であれば良く、その例としては配列表の配列番号１の塩基番号２６〜１７８３、塩基番号４００〜１１１８にそれぞれ対応するｃＤＮＡを使用することができる。アンチセンスＲＮＡ発現用ベクターとしては、上記のＥ１ＡＦ遺伝子発現用ベクターと同様のベクターを使用できる。
本発明の癌細胞浸潤能制御キットとしては、合成アンチセンスＤＮＡ、合成アンチセンスＲＮＡを構成成分としても良い。また、癌細胞、例えば、ヒト乳癌細胞株ＭＣＦ−７、インビトロ浸潤アッセイ用具と組合せキットを構築しても良い。本発明の癌細胞浸潤能制御キットを使用することにより、簡便に癌細胞の浸潤能を制御することができる。
さらにまた、本発明のもう１つの別の態様により、癌の検出用キットが提供される。
該キット中にはＥ１ＡＦ遺伝子の発現産物を検出するための物質が含有される。その１例としてはＥ１ＡＦ遺伝子の発現産物であるｍＲＮＡ検出を検出することにより癌を検出するキットであり、Ｅ１ＡＦ遺伝子のｍＲＮＡにハイブリダイズ可能なプローブが含有されている。プローブの１例としては、配列表の配列番号１の塩基番号２７〜１５８６の１．５６ｋｂのＥ１ＡＦｃＤＮＡである。プローブとしてはＥ１ＡＦ遺伝子のｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするものであれば良く、標識されたプローブを用いるのが好ましい。さらに、Ｅ１ＡＦ遺伝子のｍＲＮＡの逆転写用のオリゴヌクレオチドプライマー、逆転写ＤＮＡのＰＣＲ用の１対のプライマーと組合せ使用することにより、感度よくＥ１ＡＦ遺伝子のｍＲＮＡを検出することができる。該癌検出用キットの他の１例としてはＥ１ＡＦ遺伝子の発現タンパク質Ｅ１ＡＦ検出を検出することにより癌を検出するキットであり、該発現タンパク質Ｅ１ＡＦをエピトープとする抗体が含有されており、免疫学的手法により該タンパクを検出する。
癌細胞、例えば、繊維肉腫細胞、乳腺癌細胞、骨肉腫細胞、自発性トランスフォーム内皮細胞、肺小細胞癌細胞等は癌細胞中のＥ１ＡＦ遺伝子の発現産物量が高く、本発明の癌検出用キットを用い、組織中の癌を簡便に検出することができる。また、これらの癌細胞はＥ１ＡＦ遺伝子の発現産物の生成量が高く、該生成量と癌細胞の浸潤能は相関することにより、癌検出用キットは、単離された癌組織の浸潤能の診断用キットとして使用することができる。これらのキットは溶液でも凍結乾燥物でも良い。本発明の癌検出用兼癌組織の浸潤能診断用キットを用いることにより、患部組織中の癌の検出、浸潤能を指標とする癌の悪性度の診断が可能となる。
以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例の範囲のみに限定されるものではない。
実施例１
Ｅ１ＡＦによるマトリックスメタロプロテネースの活性化
クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（キャット：ＣＡＴ）レポーター遺伝子を含むプラスミドｐＡ１０ＣＡＴ２［L. A. Lamins et al., J. Virol., 第４９巻, 第１８３−１８９頁（１９８４）］のＣＡＴレポーター遺伝子の上流に、マトリックスメタロプロテネースであるストロメライシン（Stromelysin）遺伝子のプロモーター配列−７５３-＋２５領域［K. L. Sirum et al., Biochemistry, 第２８巻, 第８６９１−８６９８頁（１９８９）］を、タイプＩコラゲナーゼ（Type I collagenase）遺伝子のプロモーター配列−５１８-＋４５領域［P. Angel et al., Mol. Cell. Biol., 第７巻, 第２２５６−２２６６巻（１９８７）］を、または、９２キロダルトン（ｋＤ）タイプＩＶコラゲナーゼ（Type IV collagenase）遺伝子のプロモーター配列−６７０-＋５３領域［P. Huhtala et al., J. Biol. Chem., 第２６６巻, 第１６４８５−１６４９０頁（１９９１）］を導入したプラスミド（レポータープラスミド）をそれぞれ作製した。
また、Ｅ１ＡＦ遺伝子のｃＤＮＡのＥｃｏ４７ＩＩＩとＸｂａＩ断片１．５６ｋｂ（配列表の配列番号１の塩基番号２７〜１５８６）［F. Higashino et al. , Nucleic Acid Research, 第２１巻, 第５４７−５５３巻（１９９３）］とを、Klenow酵素で平滑化したのち、サイトメガロウイルスプロモーターを有する発現ベクターｐＳＴＣ［Y. Seyerne et al., EMBO J., 第７巻, 第２５０３−２５０９頁（１９８８）］のＳｍａＩサイトに導入した。このプラスミドをｐＣＭＶＥ１Ａ−Ｆと命名した。
５μｇまたは２μｇのレポータープラスミドと０、０．５、２、５または１０μｇのＥ１ＡＦ発現ベクターｐＣＭＶＥ１Ａ−Ｆを用いて、ヒト骨肉腫細胞株ＭＧ６３をカルシウムリン酸法によりコトランスフェクション（co−transfection）した。４８時間培養した後、細胞を回収し、キャット活性を測定した。キャット活性は、常法に従い［Gorman et al., Mol. Cell. Biol., 第２巻, 第１０４４−１０５１頁（１８８２）］、薄層クロマトグラフィーの後、オートラジオグラフィーをとり測定した。
図１にオートラジオグラムの結果を、図２に同様の実験を別々に３回行った平均結果を示す。
図１および図２に示すごとく、３種のレポータープラスミドにおいて、いずれもＥ１ＡＦ発現ベクターｐＣＭＶＥ１Ａ−Ｆをコトランスフェクションすることにより、明らかにキャット活性の上昇が認められた。ストロメライシン遺伝子のプロモーターにおいては、１０μｇのＥ１ＡＦ発現ベクターをコトランスフェクションした時、２０倍キャット活性が上昇した。また、タイプＩコラゲナーゼ遺伝子のプロモーターの場合は１０倍、９２キロダルトン（ｋＤ）タイプＩＶコラゲナーゼ遺伝子のプロモーターの場合は１８倍キャット活性が上昇した。この結果、Ｅ１ＡＦタンパク質は３群に分類されるマトリックスメタロプロテネースのいずれものプロモーターに作用し、その活性を著しく上昇させることが明らかにされた。
実施例２
Ｅ１ＡＦ遺伝子導入による癌細胞の浸潤能の活性化
浸潤転移およびＥ１ＡＦの発現が検出されないヒト乳癌細胞株ＭＣＦ−７を常法に従い、リン酸カルシウム法により実施例１で示したＥ１ＡＦ発現ベクターｐＣＭＶＥ１Ａ−ＦとｐＲＳＶｎｅｏでトランスフェクションした。コントロールとしてＥ１ＡＦ遺伝子を含まないベクターｐＥＶ３Ｓ［P. Matthias et al., Nucleic Acids Research, 第１７巻, 第６４１８頁（１９８９）］とｐＲＳＶｎｅｏでトランスフェクションを行った。ｐＲＳＶｎｅｏはｐＲＳＶｃａｔ［C. M. Gorman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 第７９巻, 第６７７７−６７８１巻（１９８２）］のｃａｔ遺伝子を含むＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩ断片をｐＳＶ２ｎｅｏ［P. J. Southern et al., J. Mol. Appl. Genet., 第１巻, 第３２７（１９８２）］のｎｅｏ遺伝子を含むＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩ断片と置き換えたものである。トランスフェクションした細胞は０．４ｍｇ／ｍｌＧ４１８耐性クローンとして単離した。５クローン（＃６，＃７，＃１３，＃１６，＃２０）トランスフェクタントを単離することができた。これらのクローンについてＲＮＡを調製し、配列表の配列番号１の塩基番号２７〜１５８６のＥｃｏ４７ＶＩＩ−ＸｂａｌＩ断片１．５６ｋｂのＥ１ＡＦｃＤＮＡをプローブに用いてノザンブロットを行った結果、すべてのクローンにおいてＥ１ＡＦ遺伝子の発現が確認された。
上記のクローン細胞についてインビトロ浸潤アッセイをバイオコート・マトリゲル・浸潤チャンバー（Biocoat Matrigel invasion chamber：Collaborative Biomedical Products社製）を用いて行った［A. Albini et al., Cancer Research, 第４７巻, 第３２３９−３２４５巻（１９８７）］。１×１０5の細胞を血清フリーのダルベッコ修飾イーグル培地（Dulbeccos' Modified Eagles medium：ＤＭＥ）に懸濁し、細胞外マトリックス成分であるマトリゲル（Matrigel）マトリックスをコートしたフィルターを敷いた上層チャンバーに入れた。下層チャンバーには１０％ウシ胎児血清（fetal calf serum）および１２．５μｇ／ｍｌフィブロネクチン（fibronectin）を含むＤＭＥを加え、３７℃、６時間、５％ＣＯ2存在下でインキュベーションした。フィルターの上層の細胞を綿棒で完全に除いた後、フィルターをメタノールで固定化し、細胞をギムザ染色した。フィルターの下層に移動した細胞数を顕微鏡下で測定した。
結果を図３に示す。
ＭＣＦ−７細胞およびコントロールプラスミドｐＥＶ３Ｓのトランスフェクタントでは浸潤が認められなかった。Ｅ１ＡＦ発現ベクターｐＣＭＶＥ１Ａ−Ｆのトランスフェクタントでは、＃１６のクローンにおいてもコントロールに比べ、有意の浸潤能の増加を認めた。さらに、他の４クローン（＃６，＃７，＃１３，＃２０）については浸潤細胞の著しい増加が認められた。このことにより、発現タンパク質Ｅ１ＡＦが癌細胞の浸潤能を高める機能があることが明らかになった。
さらに、トランス・ウオール・チャンバー（Transwell cell chamber：Coster Corp. 社製）を用いて細胞の運動性（motility）を調べた。上記のＭＣＦ−７細胞およびＥ１ＡＦトランスフェクタントクローン＃６と＃２０について、２×１０４細胞を血清フリーのＤＭＥに懸濁し、マトリゲルマトリックスをコートしていないフィルターを敷いた上層チャンバーに入れた。下層チャンバーには１０％ウシ胎児血清（fetal calf serum）および１２．５μｇ／ｍｌフィブロネクチンを含むＤＭＥを加え、３７℃、６時間、５％ＣＯ2存在下でインキュベーションした。フィルターの上層の細胞を綿棒で完全に除いた後、フィルターを５％グルタルアルデヒドで固定化し、細胞をギムザ染色した。フィルターの下層に移動した細胞数を顕微鏡下測定した。
結果を図４に示す。
ＭＣＦ−７ではほとんど運動性を示さなかったのに比べ、Ｅ１ＡＦトランスフェクタントクローン＃６と＃２０では１０〜２０倍の著しい運動性の上昇が認められた。このことは、発現タンパク質Ｅ１ＡＦにより細胞の運動性が上昇し、細胞の浸潤能が高まったことを示している。
ＭＣＦ−７細胞およびＥ１ＡＦトランスフェクタントについての位相差顕微鏡による細胞の形態変化を観察した。ＭＣＦ−７細胞においては、多角形の細胞形態を示し、細胞同志が凝集した細胞間接触が認められた。これに比べ、Ｅ１ＡＦトランスフェクタント細胞では、細胞が長く伸びた細胞質の突出が認められ、細胞間接着が弱い形態を示した。発現タンパク質Ｅ１ＡＦによる細胞の浸潤性細胞への形態変化が認められた（図５参照）。
さらに、上記細胞につき抗アクチン抗体による蛍光染色を行った。細胞をカバーグラス上で少なくとも２４時間培養し、エタノールで固定化した。固定化した細胞はＰＢＳで洗浄した後、１０％スキムミルクでブロッキングした。抗アクチン抗体を細胞上に加え、１時間インキュベーションした。細胞をＰＢＳで洗浄した後、２次抗体抗マウスＩｇＧのローダミンコンジュゲイトＩｇＧ画分を加え３０分インキュベーションした。この細胞を蛍光顕微鏡で観察した。ＭＣＦ−７細胞においては、細胞の末端にアクチンフィラメントの束が認められたが、Ｅ１ＡＦトランスフェクタント細胞においては、細胞の末端におけるアクチンフィラメントは消失していた。
以上、Ｅ１ＡＦ遺伝子の導入により、癌細胞の浸潤能が活性化された。
実施例３
Ｅ１ＡＦ遺伝子のアンチセンスＲＮＡによる癌細胞の浸潤抑制効果
配列表の配列番号１で示すＥ１ＡＦ遺伝子の塩基番号２６〜１７８３および４００〜１１１８［F. Higashino et al. , Nucleic Acid Research, 第２１巻, 第５４７−５５３頁（１９９３）］のアンチセンス配列をベクターｐＲＶＳＶｎｅｏに導入した。それぞれantiＦ１およびantiＦ２と命名した。高浸潤性でＥ１ＡＦを高発現しているヒト繊維肉腫細胞株ＨＴ１０８０（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１２１）にこれらのアンチセンスＲＮＡ発現プラスミドおよびアンチセンス配列を含まないコントロールプラスミドｐＲＶＳＶｎｅｏをトランスフェクションした。得られたトランスフェクタントについて、実施例２と同様に細胞の運動性を調べた。
結果を図６に示す。
図６に示すごとく、antiＦ１およびantiＦ２のトランスフェクタントにおいて、ＨＴ１０８０およびコントロールのｐＲＶＳＶｎｅｏのトランスフェクタントに比べ、約２倍の運動性の抑制効果を示した。このことにより、Ｅ１ＡＦに対するアンチセンスＲＮＡにより浸潤癌の浸潤能が抑制できることが明らかにされた。
実施例４
Ｅ１ＡＦ遺伝子の発現を指標にした癌細胞の浸潤性の評価
用いた細胞株は、浸潤転移を示さないヒト乳癌細胞株ＭＣＦ−７（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−２２）および浸潤癌細胞としてヒト繊維肉腫細胞株ＨＴ１０８０（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１２１）、ラット乳線癌細胞株ＳＳＴ−２、ヒト骨肉腫細胞株ＭＧ６３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１４２７）、ヒト自発性トランスフォーム内皮細胞ＥＣＶおよびヒト肺小細胞癌細胞株Ａ５４９（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１８５）である。これらの細胞株は培養後、低張液に懸濁し、０．５％ＮＰ−４０により細胞を破壊した。フェノール／クロロホルム抽出を２回行い、細胞質ＲＮＡを精製し、２容量のエタノールで沈澱させた。このＲＮＡ１５μｇを２０ｍＭ  ＭＯＰＳ（ｐＨ７）、８ｍＭ酢酸ナトリウム、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、２．２Ｍホルムアミドを含む緩衝液中で１％アガロースゲル電気泳動をおこなった。泳動したＲＮＡはニトロセルロースフィルター（ＢＡ８５、Ｓ＆Ｓ社製）に移し、ノザンハイブリダイゼーションを行った。プローブとして上記した１．５６ｋｂのＥ１ＡＦｃＤＮＡ［F. Higashino et al. , Nucleic Acid Research, 第２１巻, 第５４７−５５３巻（１９９３）］、９２キロダルトン（ｋＤ）タイプＩＶコラゲナーゼ（Type IV collagenase, ＭＭＰ９）１．２ｋｂｃＤＮＡ［P. Huhtala et al. , J. Biol. Chem., 第２６６巻, 第１６４８５−１６４９０頁（１９９１）］およびコントロールとしてリボゾームタンパクＬ３８ｃＤＮＡ［Y. Kuwano et al., Biochem. Bioph. Res. Com., 第１７５巻, 第５５１−５５５巻（１９９１）］を用いた。プローブはランダムプライマー法により32Ｐラベルし、ハイブリダイゼーションを行った。
ハイブリダイゼーション後、フィルターは２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで室温、２回洗浄し、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで３７℃、ついで５５℃で洗浄した。フィルターはＸ線フィルム（ＲＸフィルム、フジ社製）に感光させた。
結果を図７に示す。
浸潤転移を示さないＭＣＦ−７細胞ではＥ１ＡＦ遺伝子およびＭＭＰ９ともに明らかなｍＲＮＡの発現は認められなかった。一方、浸潤性を示す他の５種の細胞においては、Ｅ１ＡＦ遺伝子およびＭＭＰ９ともに著しいｍＲＮＡの発現が認められた。このことにより、Ｅ１ＡＦ遺伝子の発現上昇によりマトリックスメタロプロテネースが活性化され、細胞の浸潤性が高まることが示された。さらに、Ｅ１ＡＦ遺伝子の発現を本法を用いて調べることにより、癌組織の浸潤能を評価する有効な指標となることが示された。また、組織中のＥ１ＡＦ遺伝子の発現産物を測定することにより、癌、特に、悪性度の高い癌の検出方法が提供された。
実施例５
転写活性化領域を含まないＤＮＡ結合ドメインを有する改変Ｅ１ＡＦ遺伝子を含む発現ベクターの作製
Ｅ１ＡＦタンパク質のＤＮＡ結合ドメインであるＥＴＳ領域（配列表の配列番号１のアミノ酸番号３１５から３９９）を含み、かつ、転写活性化領域である酸性アミノ酸領域（配列表の配列番号１のアミノ酸番号２７から５３）、およびグルタミン残基に富む領域（Ｑrich領域、配列表の配列番号１のアミノ酸番号１２６から２２２）を欠失させた領域に相当する遺伝子領域（配列表の配列番号１の塩基番号９３６から１５８６）をＰＣＲ法により増幅した。
このＤＮＡ配列が正しいことをダイデオキシシークエンシング法を用いて確認した後、実施例１で示したサイトメガロウイルスプロモーターを有する発現ベクターｐＳＴＣ［Y. Seyerne et al., EMBO J., 第７巻, 第２５０３−２５０９巻（１９８８）］のＳｍａＩサイトに上記で調製したＤＮＡを導入し、Ｅ１ＡＦタンパク質のＤＮＡ結合ドメイン発現ベクターを構築した。該発現ベクターをｐＥ１ＡＦｄｌと命名した。
実施例６
発現ベクターｐＥ１ＡＦｄｌの導入発現による癌細胞の浸潤抑制
ヒト癌細胞としてヒト線維肉腫細胞株ＨＴ１０８０（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１２１）をｐＳＶ２ｃａｔ［DNA Cloning, volume II（a practical approach）, 第１４３−１９０頁, IRL Press １９８６年発行）でトランスフェクションしたＨＴ１０８０ＣＡＴを用いた。ｐＥ１ＡＦｄｌ  ２．５μｇとｐＲＳＶｎｅｏ  ０．２５μｇを実施例２と同様の方法でＨＴ１０８０ＣＡＴにトランスフェクションし、トランスフェクタントｍｔ１およびｍｔ２を得た。コントロールとして、実施例２に示したｐＥＶ３ＳでＨＴ１０８０ＣＡＴをトランスフェクションした細胞を用いた。
上記で得たトランスフェクタントｍｔ１およびｍｔ２について、実施例２と同様の方法でインビトロ浸潤アッセイを行った。９視野をランダムに選び、フィルターの下層に移動した細胞数を顕微鏡下で測定した。統計学的解析には、マン−ホイットニーＵテスト（Mann-Whitney U test）を用い、危険率５％未満を有用性有りと判定した。
その結果を図８に示す。１視野の平均細胞数（Mean. ±S. E. ）は、ＨＴ１０８０ＣＡＴが７３．３±３．９、ｐＥＶ３Ｓが６２．２±１２．４、ｍｔ１が４２．６±７．３、ｍｔ２が１５．１±２．１であった。
図８に示すように、ｐＥ１ＡＦｄｌを導入した細胞に有意な浸潤能の低下が認められた。
実施例７
改変Ｅ１ＡＦによる遺伝子発現制御
発現ベクターｐＥ１ＡＦｄｌにより発現した改変Ｅ１ＡＦによる遺伝子発現制御の解析をするために、コントロールとしてＨＴ１０８０ＣＡＴ、トランスフェクタントｍｔ１およびｍｔ２について、Ｅ１ＡＦ、マトリックスメタロプロテネースである９２ｋＤａタイプＩＶコラゲナーゼ（Type IV collagenase, ＭＭＰ９）、７２ｋＤａタイプＩＶコラゲナーゼ［Type IV collagenase, ＭＭＰ２, P. Huhtala et al. , J. Biol. Chem., 第２６５巻, 第１１０７７−１１０８２頁（１９９０）］、ｕＰＡ［urokinase type plasminogen activator, A. Riccio et al., Nucleic Acids Research, 第１３巻, 第２７５９−２７７１頁（１９８５）］の発現率を実施例４と同様の方法でノザンハイブリダイゼーションにより調べた。
用いたプローブは、以下の通りである。Ｅ１ＡＦは実施例４に示した１．５６ｋｂｃＤＮＡを、ＭＭＰ９は実施例４に示した１．２ｋｂｃＤＮＡを、ランダムプライマー法により32Ｐラベルしたものを用いた。ＭＭＰ２は配列表の配列番号４に示す配列を、ｕＰＡは４０ｍｅｒオリゴプローブ（Oncogene Science社製）を、ＲＮＡ量のマーカーとしてＧ３ＰＤＨ［Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, J. Y. Tso et al., Nucleic Acids Research, 第１３巻, 第２４８５−２５０２頁（１９８５）］の４０ｍｅｒオリゴプローブ（Trevigen社製）をそれぞれ用いた。ＭＭＰ２とｕＰＡとＧ３ＰＤＨのプローブは、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて32Ｐラベルした。
ハイブリダイゼーション後、オートラジオグラフをとり、得られたバンドのシグナル濃度をエヌアイエッチイメージ１．５５（NIH Image 1.55, NIFTY-Serve：QGB01537）に付属のゲルプロッテングマクロス（Gel Plotting Macros）を用いて積分濃度（Integrated Density）を求めた。ＨＴ１０８０ＣＡＴの積分濃度を１００％としてｍｔ１とｍｔ２における各ｍＲＮＡの発現率（％）を求めた。
その結果をＧ３ＰＤＨについては図９、細胞内在性Ｅ１ＡＦについては図１０、ＭＭＰ９については図１１、ＭＭＰ２については図１２、ｕＰＡについては図１３にそれぞれ示す。
図に示されるように、Ｇ３ＰＤＨの発現率は、ｍｔ１で１０７．７％、ｍｔ２で９６．３％であった（図９）。細胞内在性Ｅ１ＡＦの発現率は、ｍｔ１で６０．０％、ｍｔ２で４４．０％であり、いずれもＨＴ１０８０ＣＡＴと比較して発現率の低下が認められた（図１０）。なお、ｍｔ１およびｍｔ２においては、ＨＴ１０８０ＣＡＴには認められない実施例６でトランスフェクションした発現ベクターｐＥ１ＡＦｄｌ由来の改変Ｅ１ＡＦのｍＲＮＡと考えられるバンドが認められ、ｍｔ２ではｍｔ１よりも高い発現量が認められた。ＭＭＰ９の発現率は、ｍｔ１で３６．７％、ｍｔ２で５２．７％であり、いずれもＨＴ１０８０ＣＡＴと比較して発現率の低下が認められた（図１１）。ＭＭＰ２の発現率は、ｍｔ１で５６．６％、ｍｔ２で５７．２％であり、いずれもＨＴ１０８０ＣＡＴと比較して発現率の低下が認められた（図１２）。またｕＰＡの発現率は、ｍｔ１で４３．７％、ｍｔ２で３１．７％であり、いずれもＨＴ１０８０ＣＡＴと比較して発現率の低下が認められた（図１３）。
以上のように、Ｅ１ＡＦタンパク質のＤＮＡ結合ドメインのみを有する改変Ｅ１ＡＦを癌細胞に導入することにより、癌細胞の浸潤能を低下させることができた。また、改変Ｅ１ＡＦの導入により、細胞内在性Ｅ１ＡＦ、ＭＭＰ９，ＭＭＰ２およびｕＰＡの発現低下が認められ、これらの遺伝子の発現低下が浸潤能の低下に関連していることがわかった。
以上記載したとおり、本発明により、Ｅ１ＡＦ遺伝子の機能が明らかとなり、該遺伝子の発現および発現産物を制御することによる癌浸潤能活性化方法および抑制方法が提供され、これらの方法を利用することにより、癌浸潤系モデル、さらには癌転移系モデル、癌浸潤抑制剤、癌転移抑制剤等が提供できる。さらに、本発明により、Ｅ１ＡＦ遺伝子発現産物を検出する癌の検出方法、特に、癌の悪性度の検出方法が提供され、組織中の癌の検出を遺伝子学的または免疫学的に簡便に行うことができる。さらにまた、本発明により癌組織の浸潤能の診断方法が提供され、摘出された癌組織の浸潤能の評価、さらには転移能の評価が可能になり、予後のモニタリング等を簡便に行うことができる。
【図面の簡単な説明】
図１は、キャットアッセイのオートラジオグラフのパターンを示す図面代用写真である。
図２は、Ｅ１ＡＦタンパク質によるマトリックスメタロプロテネースの活性化を示すグラフである。
図３は、浸潤アッセイの結果を示すグラフである。
図４は、運動性アッセイの結果を示すグラフである。
図５は、位相差顕微鏡による細胞の形態を示す図面代用写真である。
図６は、ＨＴ１０８０細胞におけるＥ１ＡＦアンチセンスＲＮＡによる運動性の抑制を示すグラフである。
図７は、ノーザンハイブリダイゼーションによる各種癌細胞におけるＥ１ＡＦ遺伝子の発現の検出結果を示す泳動パターンの図面代用写真である。
図８は、改変Ｅ１ＡＦによるＨＴ１０８０ＣＡＴ細胞における浸潤能の抑制を示すグラフである。
図９は、改変Ｅ１ＡＦを導入したＨＴ１０８０ＣＡＴ細胞におけるＧ３ＰＤＨ遺伝子の発現率を示すグラフである。
図１０は、改変Ｅ１ＡＦを導入したＨＴ１０８０ＣＡＴ細胞における細胞内在性Ｅ１ＡＦ遺伝子の発現率を示すグラフである。
図１１は、改変Ｅ１ＡＦを導入したＨＴ１０８０ＣＡＴ細胞におけるＭＭＰ９遺伝子の発現率を示すグラフである。
図１２は、改変Ｅ１ＡＦを導入したＨＴ１０８０ＣＡＴ細胞におけるＭＭＰ２遺伝子の発現率を示すグラフである。
図１３は、改変Ｅ１ＡＦを導入したＨＴ１０８０ＣＡＴ細胞におけるｕＰＡ遺伝子の発現率を示すグラフである。
配列番号：1
配列の長さ：2064
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：cDNA to mRNA
配列：
0003844501.tif 000002
0003844501.tif 000003
0003844501.tif 000004
0003844501.tif 000005
配列番号：2
配列の長さ：37
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
配列：
0003844501.tif 000006
配列番号：3
配列の長さ：15
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：mRNA
配列：
0003844501.tif 000007
配列番号：4
配列の長さ：40
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：
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【図１】
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【図２】
0003844501.tif 000010
【図３】
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【図４】
0003844501.tif 000012
【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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