(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
次のＡ及び／又はＢの画分のタンパク質分解酵素を含有することを特徴とする肉軟化剤。
Ａ．ホッコクアカエビの頭胸部に有機溶媒を加え、その後硫安分画に供し、３０〜７０％飽和硫安画分を再溶解した粗抽出液をハイドロキシアパタイトカラムに添加し、１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液で溶出するタンパク質分解活性のある画分
Ｂ．ホッコクアカエビの頭胸部に有機溶媒を加え、その後硫安分画に供し、３０〜７０％飽和硫安画分を再溶解した粗抽出液をハイドロキシアパタイトカラムに添加し、１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液で吸着する画分を、４００ｍＭリン酸カリウム緩衝液で溶出し、濃縮した画分を、Superdex２００(登録商標)カラムで分画し２８０ｎｍの吸光度の指標によって示されるピークトップに対応する３つの分画のうち２番目に溶出する画分
【請求項２】
請求項１記載の肉軟化剤で食肉を処理することを特徴とする食肉の軟化方法。
【請求項３】
真空タンブリングで処理することを特徴とする請求項２記載の食肉の軟化方法。
【請求項４】
コラーゲン又はエラスチンを分解する酵素を含有し、食肉の処理温度が０℃〜５０℃で処理することを特徴とする請求項２記載の食肉の軟化方法。
【請求項５】
食肉の処理温度が４℃〜３５℃で処理することを特徴とする請求項４記載の食肉の軟化方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、エビ、特にホッコクアカエビの頭胸部中のタンパク質分解酵素を用いて、結合組織を多く含む硬い食肉を軟化する食肉軟化剤及び食肉の処理方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
食肉は、種や部位によって硬さが異なっており、軟らかい肉ほど消費者に好まれる傾向にある。
食肉の硬さの要因には、▲１▼筋原繊維タンパク質と▲２▼筋周膜や筋上膜といった膜構造をとっている結合組織との2種類がある。
【０００３】
筋原繊維タンパク質が要因となる硬さは、熟成によって軟化することが知られているが、結合組織は熟成によってはほとんど軟化しない。
また、パパインやブロメラインを用いる方法は、古くから知られているが、これは食肉本来の食感が失われたり、植物性の異味を残す等の欠点があった。
【０００４】
一方、結合組織を特異的に分解する方法として、貝類の中腸腺より抽出した粗酵素を利用する方法がある(特開平10-327810号公報)。しかし、この方法も食肉を粗酵素溶液に37℃で2昼夜漬け込む処理方法で行っているため、実用的な方法とはいえない。
【０００５】
更に、テンダーライザー等の機械的手法による方法もあるが、十分な効果を期待できず、他の方法との併用にならざるを得ない。
従って、硬い肉を容易にかつ効果的に軟らかくする方法の開発が求められているのが現状である。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
硬い肉を容易にかつ効果的に軟らかくする方法の開発を課題とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、上記課題を解決するために鋭意努力した結果、エビ、特にホッコクアカエビの頭胸部中のタンパク質分解酵素を用いることによって解決できることを見出した。
【０００８】
すなわち、本発明は、
(１)エビの頭胸部から抽出したタンパク質分解酵素を含有することを特徴とする肉軟化剤、
(２)エビがホッコクアカエビであることを特徴とする(１)記載の肉軟化剤、
(３)ホッコクアカエビの頭胸部から抽出したタンパク質分解酵素を含有する肉軟化剤で食肉を処理することを特徴とする食肉の軟化方法、
(４)真空タンブリングで処理することを特徴とする(３)記載の食肉の軟化方法、
(５)コラーゲン又はエラスチンを分解する酵素を含有し、食肉の処理温度が０℃〜５０℃で処理することを特徴とする(３)記載の食肉の軟化方法、
(６)食肉の処理温度が４℃〜３５℃で処理することを特徴とする(５)記載の食肉の軟化方法
に関する。
【０００９】
本発明においては、エビ、例えばサクラエビ、クルマエビ、イセエビ等いずれのものも有効であるが、特に効果的なエビは、ホッコクアカエビ、俗称アマエビである。ホッコクアカエビは、北太平洋、北大西洋に分布し、通常-1.6〜5℃の低温環境下に生息する低温適応種である。
【００１０】
本発明は、従来例のような37℃で処理するのではなく、比較的低温の25℃前後で処理することができるため、経費や装置の面から実用的である。
このことが、低温で生息しているホッコクアカエビが最も本発明に適している理由でもある。
【００１１】
食肉軟化剤で食肉を処理する方法としては、軟化剤を食肉に塗布する方法、水溶液にして浸漬する方法なども採用できるが、真空タンブラーを用いる方法が最も均一性に優れている。
以下、ホッコクアカエビを用いた実施例で本発明を具体的に説明するが、これに限定されるものでないことは言うまでもない。
【００１２】
【発明の実施の形態】
１．食肉軟化剤の調製
冷凍された市販のホッコクアカエビ（ニチレイ）から頭胸部を得て、この頭胸部に2倍量のPBS(リン酸緩衝生理食塩水)を加え、ホモジナイズした。次に、10倍量のアセトン(-20℃)を攪拌しながらゆっくりと加えた。-20℃で30分間放置した後、遠心分離(19,000ｇ、20分間、4℃)して沈殿を回収し、3倍量のｎ−ブタノールに懸濁した。遠心分離(19,000ｇ、20分間、4℃)後沈殿を回収し、真空デシケーター内で乾燥した。これをアセトンパウダーとした。
【００１３】
これを20mM Tris-HCl (pH7.2)に懸濁し、4℃で2時間攪拌後、遠心分離（19,000ｇ、20分間、4℃）して、得られた上清を硫安分画に供した。30〜70％飽和硫安画分を10mMリン酸カリウム緩衝液 (pH6.8)に懸濁後、同緩衝液に対して透析した溶液を粗抽出液とした。この粗抽出液はコラーゲンを25℃で比較的短時間で分解した（図1）。しかし、粗抽出液を食肉に作用させると、好ましくない肉の過剰な分解が認められた。
【００１４】
そこで、粗抽出液をハイドロキシアパタイト（バイオラッド）のカラムに添加し、上記の10ｍＭリン酸カリウム緩衝液で溶出し、分画した。後述の方法でタンパク質分解活性を測定し、活性のある画分を回収して通過画分とした(図3のフラクション4〜8)。
【００１５】
次に、カラムに吸着した画分は400mMリン酸カリウム緩衝液（pH6.8）で溶出し、分画して、同様にタンパク質分解活性のある画分を吸着画分とした(図3のフラクション26〜29)。通過画分はさらにMonoQ（アマシャムファルマシア）イオン交換カラムに添加し、活性画分を回収した。この画分を蒸留水に対して透析後、凍結乾燥して食肉軟化剤Ａとした(図4の21フラクション)。
【００１６】
吸着画分は、濃縮して150mM NaClを含む20mM Tris-HCl緩衝液（pH7.5）に透析後、同緩衝液で平衡化したSuperdex200（アマシャムファルマシア）ゲルろ過カラムに供した。3つの活性ピークが得られ、それぞれを回収した。これらの画分を蒸留水に対して透析後、凍結乾燥して、それぞれ食肉軟化剤B、C、Dとした。食肉軟化剤B、C、Dはそれぞれ図5の11，13，17のフラクションである。
【００１７】
２．酵素活性測定
各画分のコラーゲン分解活性は、酸可溶性Ｉ型コラーゲン（和光純薬）を基質として各食肉軟化剤を加え、25℃で1時間反応後、SDS-PAGE法により定性的に確認した(図７)。
【００１８】
市販の牛肉を購入し、0.25M sucrose、１mM  EDTAを含む50mM Tris-HCl緩衝液(ｐＨ7.6)を10倍量加えて、ホモジナイズ後遠心分離(1,000ｇ、10分間)した。沈殿を5倍量の同緩衝液に懸濁して遠心分離(1,000ｇ、10分間)した。沈殿を1mM EDTAを含む50mM Tris-HCl緩衝液(ｐＨ7.6)に再懸濁した後、篩を通過させて結合組織を除去した。篩を通過させた懸濁液を遠心分離(1,000ｇ、10分間)して沈殿を回収した。沈殿を0.15M KClを含む20mM Tris-HCl緩衝液(ｐＨ7.5)に懸濁し、遠心分離(1,000ｇ、10分間)して沈殿を回収した。これを筋原繊維タンパク質とした。
【００１９】
各画分の筋原繊維タンパク質の分解活性は、上記筋原繊維タンパク質を基質として各食肉軟化剤を加え、25℃で1時間反応させた後、SDS-PAGEにより定性的に確認した(図6)。
エラスチン分解活性は、コンゴ−レッド-エラスチン（シグマ）を基質として反応後、遠心分離して上精の495nmの吸光度から活性を測定した。
【００２０】
さらに、精製過程の酵素活性をゼラチンザイモグラフィーで視覚的にモニタリングした(図4(B)及び図5(B))。0.1％ゼラチンを含む15％ポリアクリルアミドゲルを用いて4℃で電気泳動後、2.5％ TritonX−100で30分間の洗浄を2回繰り返し、ゲルからSDSを除去した。次に、150mM NaClを含む50mM Tris-HCl緩衝液中で、25℃、1時間インキュベーションした。
【００２１】
また、以下に示す合成基質を用いた方法で精製過程の酵素活性を定量的にモニタリングした。トリプシン様酵素、キモトリプシン様酵素、エラスターゼ様酵素及びコラゲナーゼ様酵素の活性を測定する基質として、それぞれ、Bz-DL-Arg-pNA(BAPA)、Bz-Tyr-pNA、Suc-(Ala)3-pNA(STANA)及びDNP-Pro-Gln-Gly-Ile-Ala-Gly-Gln-D-Arg(DNP-ペプチド)（以上すべて、ペプチド研究所）(なお、BzはBenzoilを、pNAはp-Nitroanilideを、SucはSuccinylをそれぞれ表す。)を用いた。
【００２２】
p-ニトロアニリド(-pNA)を含む基質はすべて、ジメチルスルホキシドを用いて50mMの濃度で基質溶液を調製した。各画分の酵素溶液を150mM NaClを含む50mM Tris-HCl緩衝液(pH7.5)に加えてプレインキュベート後、基質溶液を終濃度0.5mMになるように添加して25℃で、5分間反応させ、遊離したp-ニトロアニリンを405nmで比色定量した。Bz-Tyr-pNAは難溶性であるため、終濃度20%でメタノールを添加した。1分間に１μmolの基質を加水分解するときの酵素量を１unitとした。
【００２３】
DNP-ペプチドは150mMNaClを含む50mM Tris-HCl緩衝液(pH7.5)に1mMの濃度で溶解して基質溶液とした。この基質溶液100μlに各画分の酵素溶液を等量加え、25℃で、10分間反応させた。1N HClを0.5ml加えて反応を停止させ、酢酸エチルとn-ブタノールの混液（1：0.15）を加えた後、激しく振盪した。次いで、遠心分離後、上清の吸光度を365nmで測定した。1分間に1nmolの基質を加水分解するときの酵素量を１unitとした。各画分のタンパク質量はBradford法で定量した。
【００２４】
３．食肉軟化剤のタンパク質分解活性
○コラーゲンの分解活性
図7から明らかなように、食肉軟化剤A及びDはコラーゲンをよく分解した。食肉軟化剤Bは若干、分解した。食肉軟化剤Cはコラーゲンを分解しなかった。
また、合成基質を用いた方法では、食肉軟化剤A及びDのコラゲナーゼ様酵素活性が高かった(表1)。
【００２５】
○筋原繊維タンパク質の分解活性
図6から分るように、食肉軟化剤Dは筋原繊維タンパク質をよく分解した。食肉軟化剤AおよびBは若干、分解したが、食肉軟化剤Cは分解しなかった。
【００２６】
○エラスチンの分解活性
食肉軟化剤Cは、コンゴ−レッド-エラスチンをよく分解した(55U／mg)。食肉軟化剤A、B及びDはほとんど作用しなかった。また、合成基質を用いた方法では、食肉軟化剤Cのエラスターゼ様酵素活性が高かった(表1)。
【００２７】
○合成基質に対する活性を表1に示す。
【表１】
0003830427.tif 000002
【００２８】
４．食肉の処理方法
15x15x30mmの大きさに筋繊維の方向が同一になるようにカットした市販のアメリカ産牛肉外ももに、上述の製法で得た食肉軟化剤A〜Dを牛肉と等量の1xPBSに溶解して添加し、4℃で、2時間、真空タンブリング処理を施した。10℃で1時間放置して反応させた後、90℃、10分間加熱処理した。この加熱で食肉軟化剤の酵素活性は完全に失活した。コントロールとして、食肉軟化剤を含まない1xPBSを食肉に添加して、同様の処理を施した。
【００２９】
５．食肉の硬さの測定
上記の処理を施した牛肉を各試験区10サンプルずつ、さらに10x10x20mmにカットした後、INSTRON  5564のV字型治具を用いたワーナー・ブラッツラー法により最大圧縮荷重を測定した。その測定結果を図2に示す。
【００３０】
上記の食肉軟化剤A,C,Dで処理した牛肉は、コントロールと比べ、有意に最大圧縮荷重が小さくなった(p＜0.01)。食肉軟化剤A及びCでは官能検査においても食肉本来の食感を保持しつつ、軟化が認められた。しかし、筋原繊維タンパク質もよく分解する食肉軟化剤Dでは、肉の過剰な分解が認められ、食肉本来の食感の点でやや劣った。
【００３１】
以上の試験結果から、食肉軟化剤Bは軟化効果が弱く、食肉軟化剤Dは食肉軟化剤A，B，Cに比べて問題はあるものの、ホッコクアカエビの頭胸部から抽出したタンパク質分解酵素よりなる食肉軟化剤は、食肉を低温領域で軟化する作用があることが判明した。
【００３２】
【発明の効果】
エビ、特にホッコクアカエビの頭胸部より抽出した食肉軟化剤を用いることにより、結合組織を多く含む硬い食肉を低温領域でかつ短時間の処理で、食肉本来の食感が失われることなく効果的に軟化することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】粗抽出液によるコラーゲン分解パターンを示した図。
【図２】ワーナー・ブラッツラー法による最大圧縮荷重の測定結果を示した図。＊コントロールと比較して、ｐ＜0.01。
【図３】ハイドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィーの溶出パターンと各フラクションの酵素活性を示した図。挿入図はピークに対応するフラクションのSDS-PAGEパターンを示した図。
【図４】  (Ａ)MonoＱイオン交換カラムクロマトグラフィーの溶出パターンと各フラクションの酵素活性を示した図。挿入図はピークに対応するフラクションのSDS-PAGEパターンを示した図。  (Ｂ)ピークに対応するフラクションのゼラチンザイモグラフィーを示す図。
【図５】  (Ａ)Superdex200ゲルろ過カラムクロマトグラフィーの溶出パターンと各フラクションの酵素活性を示した図。挿入図はピークに対応するフラクションのSDS-PAGEパターンを示した図。  (Ｂ) ピークに対応するフラクションのゼラチンザイモグラフィーを示す図。
【図６】食肉軟化剤A〜Dによる筋原繊維タンパク質の分解パターンを示す図。
【図７】食肉軟化剤A〜Dによるコラーゲンの分解パターンを示す図。
【符号の説明】
LaneＭ；分子量マーカー
LaneＣ；コラーゲン
LaneＥ；各食肉軟化剤
LaneＭｆ；筋原繊維タンパク質
【図１】
0003830427.tif 000003
【図２】
0003830427.tif 000004
【図３】
0003830427.tif 000005
【図４】
0003830427.tif 000006
【図５】
0003830427.tif 000007
【図６】
0003830427.tif 000008
【図７】
0003830427.tif 000009