(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
全反射減衰を利用した測定において用いられる測定チップであって、
光透過性を有する誘電体と、
前記誘電体に形成されている金属薄膜と、
前記金属薄膜を覆うように、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリフェニレンスルフィド、ポリフッ化ビニリデン、ポリビニルクロライド、ポリシクロオレフィン、又は、ＰＭＭＡ（ポリメチルメタクリレート）を含むプラスチックによって形成されている疎水性を有する薄膜と、
を具備する測定チップ。
【請求項２】
前記金属薄膜が金によって形成されている、請求項１記載の測定チップ。
【請求項３】
全反射減衰を利用した測定において用いられる測定チップの製造方法であって、
光透過性を有する誘電体に金属薄膜を形成するステップ（ａ）と、
分子蒸留方式を用いて、ステップ（ａ）において形成された金属薄膜を覆うように疎水性を有する薄膜を形成するステップ（ｂ）と、
を具備する前記製造方法。
【請求項４】
全反射減衰を利用した測定において用いられる測定チップの製造方法であって、
光透過性を有する誘電体に金属薄膜を形成するステップ（ａ）と、
イオンビームスパッタ法を用いて、ステップ（ａ）において形成された金属薄膜を覆うように疎水性を有する薄膜を形成するステップ（ｂ）と、
を具備する前記製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、表面プラズモン共鳴（ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｌａｓｍｏｎ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ：ＳＰＲ）測定に用いられる測定チップ及びその製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、全反射減衰を利用して試料中の物質を定量分析する方法は知られており、特に、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定は、タンパク質等を検出するためのバイオセンサとして広く利用されている。
図１７は、ＳＰＲ測定の原理を説明するための図である。プリズム１０１の表面には、金属薄膜１０２が蒸着等によって形成されている。さらに、金属薄膜１０２の上には、検出対象である物質を含む試料１０３が乗せられている。
【０００３】
このようなプリズム１０１の透明誘電体と金属薄膜１０２との界面で全反射条件となるように、光Ｌ１を様々な入射角でプリズム１０１に入射させる。ここで、光Ｌ１を様々な入射角でプリズム１０１に入射させるようにするためには、細い光ビームを偏向させながらプリズム１０１に入射させても良いし、太い光ビームを収束させながらプリズム１０１に入射させても良い。図１７においては、光源１０４から出射された光を、レンズ１０５によって収束させてプリズム１０１に入射させている。
【０００４】
光Ｌ１を金属薄膜１０２に対して全反射角以上の入射角で入射させると、金属薄膜１０２に接している試料１０３中に電界分布を有するエバネッセント波が生じる。このエバネッセント波により、金属薄膜１０２と試料１０３との界面に、表面プラズモンが励起される。このとき、エバネッセント波と表面プラズモンとの間で波数整合が成立すると共鳴状態となり、エバネッセント波のエネルギが表面プラズモンに移行する。これにより、プリズム１０１と金属薄膜１０２との界面に特定の入射角θ0で入射して全反射された光の強度が、鋭く低下する。このような光の強度の低下は、光検出器１０６により、反射光Ｌ２中の暗線として検出される。なお、このような表面プラズモン共鳴は、入射光がｐ偏光であるときに生じるので、入射光Ｌ１がｐ偏光となるように予め設定しておく。
【０００５】
表面プラズモンの波数ｋSPは、次の式によって決定される。ここで、表面プラズモンの波数をｋSP、真空中での光の波数をｋ0、金属の誘電率をεM、試料の誘電率をεSとする。
【数１】
0003741277.tif 000002
また、エバネッセント波の波数ｋEは、次の式で与えられる。ここで、プリズムの屈折率をｎ0、入射角をθとする。
ｋE＝ｋ0ｎ0ｓｉｎθ      …（２）
【０００６】
エバネッセント波の波数ｋEと、表面プラズモンの波数ｋSPが等しくなるような入射角θ0において表面プラズモン共鳴が起こり、全反射減衰が生じる。従って、全反射減衰が生じる入射角θ0を観測することにより、式（１）及び式（２）に基づいて、全反射減衰が生じるときの誘電率εSを算出することができる。さらに、この誘電率εSから、較正曲線等を利用することにより、試料中の検出対象である物質の濃度を求めることができる。
【０００７】
ＳＰＲ測定をバイオセンサに適用するためには、例えば、金属薄膜１０２の上に、検出対象である物質と特定の反応を起こす媒体（以下、「センシング媒体」という）を固定しておく。特定の反応とは、例えば、抗原抗体反応であり、試料に含まれる抗原を検出する場合に、その抗原に対する抗体をセンシング媒体として用いる。センシング媒体の上に検出対象である物質を含む試料を置くと、金属薄膜１０２上で、試料に含まれる抗原の濃度に応じた抗原抗体反応が起こる。これにより試料１０３の屈折率が変化するので、金属薄膜１０２と試料１０３との界面において生じる表面プラズモンの波数が変化する。これに伴い、上記のような表面プラズモン共鳴が起こる入射角θ0及びその反射角が変化する。従って、光検出器８によって暗線の位置（角度）変化を検出することにより、試料中の特定物質の濃度を間接的に測定することができる。
【０００８】
このようなＳＰＲ測定においては、いかにセンシング媒体を金属薄膜１０２上に固定するかということが、ＳＰＲ測定の感度に関わってくる。ここで、日本国特許出願公開（特開）平１１−２１１７２８号公報には、表面プラズモン共鳴バイオセンサ用の測定チップにおいて、固定するヘモグロビンＡ1抗体が金属膜と強固にかつ容易に結合する手段として、疎水結合或いは静電結合により、金属膜上にヘモグロビンＡ1抗体を固定させることが開示されている。
【０００９】
また、特開２０００−３９４０１号公報には、プラズマ重合膜を介して生理活性物質を固定することにより、固定する生理活性物質が少量であっても、良好な感度が得られる表面プラズモン共鳴バイオセンサ用の測定セルならびに、その測定セルの製造方法及びその測定セルを使用した表面プラズモン共鳴バイオセンサが開示されている。この文献において、測定セルは、金属膜上に形成されたプラズマ重合膜を有している。しかしながら、モノマー原料をプラズマ重合する際には高温（２００℃程度）になるため、プラスチックのように熱に対して変形又は変質する材料は、基材として用いることができない。また、プラズマ重合膜は、３次元的に高密度に架橋された重合膜であり、構造が不規則で光学特性が低く屈折率の変動が大きいため、ＳＰＲ測定には適していない。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
そこで、上記の点に鑑み、本発明は、ＳＰＲ測定等に用いられる測定チップであって、多種類のタンパク質を固定することができると共に光学的に安定な測定チップを提供することを目的とする。また、本発明は、そのような測定チップの製造方法を提供することを目的とする。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
以上の課題を解決するため、本発明に係る測定チップは、全反射減衰を利用した測定において用いられる測定チップであって、光透過性を有する誘電体と、該誘電体に形成されている金属薄膜と、該金属薄膜を覆うように形成されている疎水性を有する薄膜とを具備する。
【００１２】
また、本発明の第１の観点に係る測定チップの製造方法は、全反射減衰を利用した測定において用いられる測定チップの製造方法であって、光透過性を有する誘電体に金属薄膜を形成するステップ（ａ）と、分子蒸留方式を用いて、ステップ（ａ）において形成された金属薄膜を覆うように疎水性を有する薄膜を形成するステップ（ｂ）とを具備する。
【００１３】
さらに、本発明の第２の観点に係る測定チップの製造方法は、全反射減衰を利用した測定において用いられる測定チップの製造方法であって、光透過性を有する誘電体に金属薄膜を形成するステップ（ａ）と、イオンビームスパッタ法を用いて、ステップ（ａ）において形成された金属薄膜を覆うように疎水性を有する薄膜を形成するステップ（ｂ）とを具備する。
【００１４】
本発明によれば、測定チップの金属薄膜上に疎水性を有する薄膜を形成するので、多種類のタンパク質を固定することができ、光学特性が高く安定な測定チップを実現することができる。また、分子蒸留方式等を用いるので、疎水性を有する薄膜が均一に形成された測定チップを製造することができる。
【００１５】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施形態について、図面を参照しつつ詳細に説明する。なお、同一の構成要素には同一の参照番号を付して、説明を省略する。
図１は、本発明の一実施形態に係る測定チップを示す断面図である。測定チップ１は、光透過性を有する誘電体（以下、透明誘電体という）１０と金属薄膜１１と、疎水性薄膜１２とを含んでいる。測定チップ１をＳＰＲ測定に用いる際には、疎水性薄膜１２の上にセンシング媒体が固定され、その上に、タンパク質等の検出対象の物質を含む試料が配置される。
【００１６】
透明誘電体１０は、四角錐台の形状を有しており、その上面には試料が配置される空孔１３が形成されている。なお、透明誘電体１０の形状は四角錐台に限られず、例えば、他の角錐台、円錐台、角柱、円柱、平板等の様々な形状を有する透明誘電体を使用することができる。
【００１７】
透明誘電体１０は、ポリメチルメタクリレート（ｐｏｌｙ  ｍｅｔｈｙｌ  ｍｅｔｈａ  ｃｒｙｌａｔｅ：ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート、非晶性ポリオレフィン、又は、シクロオレフィンを含む透明プラスチックや、ガラス等によって形成されている。
【００１８】
透明誘電体１０の空孔１３の内底面には、金属薄膜１１が形成されている。金属薄膜１１としては、例えば、金やアルミニウム等が用いられ、本実施形態においては金を用いている。金属薄膜１１は、例えば、蒸着等によって形成される。
【００１９】
金属薄膜１１上には、疎水性薄膜１２が形成されている。ここで、ＳＰＲ測定において金属薄膜に固定されるセンシング媒体は、例えば、タンパク質、グリコタンパク、リボタンパク、ポリサッカライド等であり、これらは、その分子内に多くの疎水性部位を有している。このため、測定チップに形成されている金属表面を疎水性にすれば、多種類のタンパク質を安定して固定することができる。そこで、本実施形態においては、疎水性を有する表面材質を用いて金属薄膜１１を覆っている。
【００２０】
疎水性薄膜１２としては、例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリフェニレンスルフィド、ポリフッ化ビニリデン、ポリビニルクロライド、ポリシクロオレフィン、ポリメチルメタクリレート（ｐｏｌｙ  ｍｅｔｈｙｌ  ｍｅｔｈａ  ｃｒｙｌａｔｅ：ＰＭＭＡ）等を含むプラスチック材料が用いられる。特に、ポリスチレンは、ＥＬＩＳＡ（enzyme linked immuno sorbent assay：エライザ）法等の検査法において広く利用されているので、疎水性薄膜１２の材料としてポリスチレンを用いる場合には、既存の結合プロトコル等を利用することができる。
【００２１】
疎水性薄膜１２は、１ｎｍ〜１００ｎｍ程度の厚さ、望ましくは、１ｎｍ〜５０ｎｍ程度の厚さを有している。ＳＰＲ測定によって検出される信号のＳＮ比は、金属表面と試料との距離、即ち、疎水性薄膜１２の厚さに対して指数関数的に減衰する。このため、検出対象のタンパク質の分子量が小さい場合や、検出対象が極微量の場合等には、ＳＮ比を高くするために、例えば、１ｎｍ〜５ｎｍ程度に膜厚を薄くする。一方、検出対象のタンパク質の分子量が大きい場合、検出対象が大量の場合、或いは、高熱等によってインキュベートするために膜に歪みが加わる場合等には、例えば、５ｎｍ〜５０ｎｍ程度に膜厚を厚くする。しかしながら、疎水性薄膜１２の厚さを１００ｎｍより厚くすると、検出信号において必要なＳＮ比を得ることができないので、実用的でない。従って、本実施形態においては、疎水性薄膜１２の厚さを１００ｎｍ以下としている。
【００２２】
図２は、本実施形態に係る測定チップを使用している状態を示す模式図である。測定チップ１に形成されている疎水性薄膜１２の上には、予めセンシング媒体（タンパク質）１４が疎水結合によって固定され、さらに、検出対象の物質を含む試料が配置される。これにより、センシング媒体と検出対象の物質との間で、例えば、抗原抗体反応が起こり、試料の屈折率が、反応前に比較して変化する。この測定チップ１に、光源１５から発生した光Ｌ１を、透明誘電体１０と金薄膜１１との界面において全反射条件となるように入射させる。これにより、金薄膜１１とタンパク質１４との間において表面プラズモンが励起され、反射光Ｌ２において全反射減衰が生じる。この反射光Ｌ２を光検出器１６によって検出し、検出信号に基づいて較正曲線等を利用することにより、試料に含まれる検出対象の物質の濃度を求めることができる。
【００２３】
次に、本発明の第１の実施形態に係る測定チップの製造方法について説明する。本実施形態に係る製造方法によれば、透明誘電体に形成された金属薄膜の上に、分子蒸留方式を用いて疎水性薄膜を形成する。本実施形態においては、金属薄膜の材料として金を用い、疎水性薄膜の材料としてポリスチレンを用いる。なお、以下において、金薄膜が形成された透明誘電体を材料チップという。
【００２４】
図３は、本実施形態における測定チップの製造方法を示すフローチャートである。まず、ステップＳ１において、例えば、通常の真空蒸着法によって透明誘電体に金薄膜を形成する。次に、ステップＳ２において、金薄膜の表面に付着した汚染物質（例えば、脂肪酸系の有機物等）をアセトンによって洗浄し、乾燥させる。次に、ステップＳ３において、分子蒸留方式を用いて金薄膜の上にポリスチレン薄膜を形成する。
【００２５】
ここで、ステップＳ３において分子蒸留方式を用いる理由を述べる。
本実施形態におけるように、ポリスチレン等のプラスチック薄膜を形成する場合には、プラズマ重合法のように材料が高温になる方法を用いることはできない。プラスチックをその熱分解温度以上に加熱すると、自発的解重合が起こって分解してしまうからである。また、熱分解温度より低い温度でも、薄膜を形成する基板等がプラスチックの場合には、基板が変形したり変質するおそれがある。そのため、基板等に薄膜を形成する際には、真空蒸着法が用いられることが多い。真空蒸着法は、基板等の温度を低温に保ったまま薄膜を形成することができるからである。しかしながら、実際に真空蒸着法を用いて薄膜を形成したところ、膜厚の均一な高分子膜が得られないことが判明した。これは、プラスチックの蒸着分子が、基板等に到達した際にその表面において再凝集するためと考えられる。一方、室温程度の環境において真空蒸着を行うと、蒸着分子が固形化せずにアモルファス状態となってしまい、実用性のある膜にならないことも判明した。これは、蒸着源と基板との距離が、例えば、３００ｍｍ程度離れているため、平均自由工程の長い低分子しか基板等に到達できないためと考えられる。
【００２６】
しかしながら、測定チップの表面（この場合には、ポリスチレン薄膜の表面）が揺らいでいると、ＳＰＲ測定の際に観測される暗線の反射角度が揺らぎのために変動してしまい、反応による暗線の変化との区別がつかなくなってしまう。従って、ＳＰＲ測定においては、このような測定チップを使用することはできない。
【００２７】
そこで、本実施形態においては、分子蒸留方式を用いて様々な条件の下で薄膜形成を行い、作製された蒸着膜の評価を行った。その結果、分子蒸留方式によれば、膜厚が均一なポリスチレン薄膜を形成することができることが明らかになった。
【００２８】
ここで、分子蒸留方式とは、一般に、１０-4Ｔｏｒｒ以下の高真空において分子の蒸留を行い、薄膜材料の蒸発面と凝集面（基板面）との距離を、蒸気となっている分子の平均自由工程以下に近づけ、蒸発面から飛び出した分子を他の分子と衝突することなく凝集面に到達させる方法である。この分子蒸留方式は、特に、熱的に不安定な物質を蒸留する際に用いられており、例えば、脂溶性ビタミン類の濃縮や油脂の生成等のために広く利用されている。本実施形態は、この分子蒸留方式を疎水性薄膜の形成に応用したものである。
【００２９】
図４は、本実施形態において用いられる測定チップの製造装置（成膜装置）の断面図である。成膜装置２は、チップホルダ２１と、マスク２２と、蒸発皿２３と、チャンバ２４と、蒸着源加熱装置２５と、冷却液槽２６と、真空装置２７とを有している。
【００３０】
チップホルダ２１には、所定の大きさの空孔が形成されており、この空孔に材料チップ１７を保持する。材料チップ１７は、予め形成されている金属薄膜が蒸着皿２３の方向を向くように、チップホルダ２１に配置される。
マスク２２は、材料チップ１７の所定の位置にポリスチレン薄膜を形成するために用いられる。即ち、マスク２２は、材料チップ１７に形成されている金属薄膜を除く部分をマスクする。
【００３１】
蒸発皿２３には、蒸着源が配置される。
蒸着源加熱装置２５は、例えば、赤外線ランプによって構成され、蒸発皿２３を所定の温度まで加熱し、その温度に保つ。また、蒸着源加熱装置２５は、温度コントローラを有しており、蒸発皿２３が所定の温度以上に加熱されるのを防ぐ。
【００３２】
冷却液槽２６には、例えば、液体窒素、ドライアイス、冷却水等が注入されており、チップホルダ２１及び材料チップ１７を冷却する。
真空装置２６は、ターボポンプやロータリーポンプ等を含んでおり、チャンバ２４内を排気する。
【００３３】
ここで、図５は、図４に示す成膜装置の一部を示す斜視図である。チップホルダ２１は冷却液槽２６に接続されており、これにより、両者の間において効率良く熱が伝導する。このようなチップホルダ２１に形成されている空孔に、材料チップ１７が所定の向きに挿入され、さらに、マスク２２が配置され、固定具２８によって固定される。
【００３４】
本実施形態においては、以上において説明した製造装置を用いて、次のような条件の下で測定チップを作製し、その評価を行った。
まず、測定チップの作製における条件について説明する。
▲１▼蒸着源：重量平均分子量Ｍｗ≦１．１×１０4、且つ、分子量分布Ｍｗ／Ｍｎ＝１．６のポリスチレンテロマー（Ｍｎは数平均分子量）
▲２▼真空度：１０-2Ｔｏｒｒ
▲３▼蒸着距離（チップ〜蒸着源距離）：４０ｍｍ
▲４▼冷却液：液体窒素
▲５▼蒸着源温度：２００℃〜２５０℃
▲６▼蒸着時間：３分〜１０分
【００３５】
次に、蒸着源について説明する。分子蒸留を行っている際に、ほとんどの蒸発分子は、数個の分子によって構成されるクラスターとなっている。仮に、蒸着源として高分子であるポリスチレンを用いたとしても、長い分子鎖がそのまま空間に飛び出すことは不可能であり、蒸着可能な程度に分解されて飛来する。そこで、予め分子量の比較的小さい分子を多く含む原料を用いることにより、効率的に薄膜形成を行うことができる。この場合に、蒸着可能な分子量はＭｗ≦２０００、望ましくはＭｗ＜１５００である。
本実施形態においては、蒸着可能な分子量成分（Ｍｗ＜１５００）を２０〜３０％程度含むポリスチレンテロマーを合成し、これを蒸着原料として用いた。
【００３６】
次に、蒸着距離については、分子量１５００程度の分子の平均自由工程を５０ｍｍ程度とし、この程度の大きさの分子が、蒸発皿から材料チップに、他の分子と衝突することなく到達できる距離を想定して４０ｍｍに設定した。
【００３７】
本実施形態において、冷却液を用いて材料チップを冷却する理由は、次のとおりである。蒸発分子の末端はラジカル化されているために、蒸着面に到達した分子は再凝集しやすく、これが、蒸着面に均一に薄膜が形成されない原因のひとつになっている。そこで、材料チップを冷却することにより、蒸着面に到達した分子の再凝集を抑制している。
【００３８】
さらに、本実施形態においては、ポリスチレン薄膜の膜厚を制御するために、ポリスチレンの蒸発温度以上、且つ、ポリスチレンが変形及び変性しない範囲で蒸着源温度を変化させると共に、蒸着時間を変化させた。
【００３９】
このように作製された測定チップを、表面反射赤外線吸収スペクトル測定及びＡＦＭ（原子間力顕微鏡）像の観察によって評価した。
まず、ポリスチレン薄膜が形成された測定チップに対して表面反射赤外線吸収スペクトル測定を行い、吸収スペクトルを観察することによりポリスチレン薄膜が形成されていることを確認すると共に、吸光バンド６９５ｃｍ-1における吸光度を換算することにより、ポリスチレン薄膜の膜厚を求めた。図６は、ポリスチレン薄膜の形成において使用した条件と、それによって得られた薄膜の膜厚とを示す表である。また、図７は、比較のために、ポリスチレン薄膜が形成されていない金薄膜に対して行った表面反射赤外線吸収スペクトルを示している。
図６に示すように、蒸着温度２１０℃〜２５０℃の下では、概ね膜厚０．５ｎｍ〜６０ｎｍのポリスチレン薄膜を形成することができた。
【００４０】
図６に示す試料の中から、最も膜厚が薄くなった試料（４）、中程度の厚さとなった試料（２）、及び、最も膜厚が厚くなった試料（６）について、さらに詳しく検討した。
図８の（ａ）は、試料（４）の表面反射赤外線吸収スペクトルを示している。試料（４）におけるポリスチレン薄膜の膜厚は、今回作製した中で膜厚が最も薄い０．５ｎｍ〜１ｎｍであった。しかしながら、図８の（ａ）の矢印に示すように、３０３０ｃｍ-1付近において吸光バンドが観察されたことから、ベンゼン環のＣ−Ｈ収縮振動が起こっていることがわかる。これより、試料において、少なくとも部分的にはポリスチレンが蒸着していると考えられる。
【００４１】
図８の（ｂ）及び（ｃ）は、試料（４）の表面を観察したＡＦＭ像である。図８の（ｂ）は、試料表面の堅さ（粘弾性）の情報、図８の（ｃ）は試料表面の高さの情報をそれぞれ示している。
図８の（ｂ）において、図中の矢印に示すように、金薄膜の凹凸が直接観察された。また、図８の（ｃ）の矢印に示す白い部分は、１０ｎｍ程度の高さを有する粒子状のものであり、ポリスチレンの凝集体と考えられる。これより、試料（４）の表面全体がポリスチレン薄膜によって覆われている可能性は小さい。
【００４２】
ポリスチレン薄膜において、膜厚１ｎｍ以下という長さは分子数個程度に相当する。このため、蒸着条件を最適化しても均一な蒸着層にならずに、蒸着分子が凝集して穴の空いた構造になると考えられる。
【００４３】
図９の（ａ）は、試料（２）の表面反射赤外線吸収スペクトルを示している。試料（２）におけるポリスチレン薄膜の膜厚は、１６ｎｍ〜２０ｎｍであった。図９の（ａ）においては、図中の▲１▼〜▲３▼に示すように、３０３０ｃｍ-1、３０６０ｃｍ-1、３０８０ｃｍ-1の３本の吸収バンドが観察された。これは、ベンゼン環のＣ−Ｈ伸縮振動の特徴であり、これらの吸収バンドは、試料（２）の他にも、１０ｎｍ〜２０ｎｍ程度の膜厚を有する試料において観察された。
【００４４】
また、図９の（ａ）においては、図中の▲４▼及び▲５▼に示すように、吸収バンド２９３０ｃｍ-1及び２８６０ｃｍ-1における吸光度が大きくなっている。これは、ポリスチレン薄膜において主鎖のＣ−Ｈ伸縮振動が起こっていることを示している。さらに、これらの吸光度は、ベンゼン環の吸収バンドよりも大きい。これより、数１０ｎｍ程度の膜厚を有する試料においては、ベンゼン環が金薄膜の表面に向いており、主鎖が試料表面に向いているという選択的配向をしていると考えられる。
【００４５】
図９の（ｂ）及び（ｃ）は、試料（２）の表面を観察したＡＦＭ（原子間力顕微鏡）像である。図９の（ｂ）は、試料表面の堅さ（粘弾性）の情報、図９の（ｃ）は試料表面の高さの情報をそれぞれ示している。図９の（ｂ）及び（ｃ）においては、所々に金薄膜の凹凸が観察されるが、概ね全体に渡ってポリスチレン薄膜が形成されていると観察される。また、図９の（ｂ）において、矢印に示す白い部分は全て金粒子の上に形成されていることから、これらは金薄膜表面の中でも高い位置に蒸着された部分と考えられる。
【００４６】
図１０の（ａ）及び（ｂ）は、図９の（ｃ）の中央部分における断面を示している。図１０の（ａ）は、Ａ−Ｂ方向における断面、図１０の（ｂ）は、Ｃ−Ｄ方向における断面をそれぞれ示している。図１０の（ａ）及び（ｂ）においては、揺らぎの振幅が０．５ｎｍ程度、揺らぎの周期は１００ｎｍ〜２００ｎｍ程度になっている。このように、試料（２）においては、Ａ−Ｂ方向及びＣ−Ｄ方向の両方向において同程度の高さ揺らぎになっており、特に顕著な凹凸は観察されない。また、揺らぎの周期である１００ｎｍ〜２００ｎｍは、金粒子の径に相当するものである。これより、蒸着されたポリスチレン薄膜における揺らぎは、１ｎｍ程度であると考えられる。
【００４７】
図１１の（ａ）は、試料（６）の表面反射赤外線吸収スペクトルを示している。試料（６）におけるポリスチレン薄膜の膜厚は、５０ｎｍ〜６０ｎｍであった。図１１の（ａ）に示すように、試料（６）程度の膜厚になると、ベンゼン環のＣ−Ｈ伸縮振動を表す吸光度と、主鎖のＣ−Ｈ伸縮振動を表す吸光度との相対強度がほぼ等しくなる。このことから、ポリスチレン薄膜においては、膜厚が数１０ｎｍ以上の厚さになると、金薄膜に対するポリスチレン分子の選択的な配向がなくなり、ランダムに積層すると考えられる。
【００４８】
図１１の（ｂ）及び（ｃ）は、試料（６）の表面を観察したＡＦＭ（原子間力顕微鏡）像である。図１１の（ｂ）は、試料表面の堅さ（粘弾性）の情報、図１１の（ｃ）は試料表面の高さの情報をそれぞれ示している。図１１の（ｂ）及び（ｃ）に示すように、試料表面において金薄膜の凹凸は観察されずに、全体がポリスチレン薄膜によって覆われている。また、図１１の（ｃ）に示すように、ポリスチレン薄膜の高さ揺らぎは１ｎｍ〜２ｎｍ程度であり、ほぼ均一な表面が形成されていることがわかる。
【００４９】
以上説明したように、分子蒸留方式を用い、最適な蒸着温度及び蒸着時間を設定することにより、金薄膜上に均一なポリスチレン薄膜を形成することが可能であることがわかった。
【００５０】
次に、このようにして作製された測定チップに、タンパク質を固定する実験を行った。実験は、金薄膜の上に膜厚２０ｎｍを有するポリスチレン薄膜が形成された測定チップを用い、図１２に示す手順によって行われた。また、比較のために、ポリスチレン薄膜が形成されていない測定チップについても、同様の実験が行われた。
【００５１】
図１２は、この実験手順を示すフローチャートである。まず、ステップＳ１１において、濃度５０μｇ／ｍｌのアビジン液１００μｌを測定チップに注入する。次に、ステップＳ１２において、バッファ液を用いて測定チップを洗浄する。
【００５２】
次に、ステップＳ１３において、ビオチンによって標識された濃度１μｇ／ｍｌのプロテインＡ（ビオチン化プロテインＡ）１００μｌを測定チップに注入する。これにより、多数の標識分子を含むアビジン・ビオチン複合体が形成される。さらに、ステップＳ１４において、バッファ液を用いて測定チップを洗浄する。
【００５３】
次に、ステップＳ１５において、バッファ液１００μｌを測定チップに注入してＳＰＲ測定を行う。ここで得られた信号値を信号Ｖ１とする。
ステップＳ１６において、バッファ液を取り除き、ステップＳ１７において、濃度の異なるＩｇＧ（免疫グロブリン）１００μｌを測定チップに注入する。この実験においては、ウサギ抗ＢＳＡ（bovine serum albumin）抗体を用いた。
【００５４】
ステップＳ１８において、バッファ液を用いて測定チップを洗浄し、ステップＳ１９において、バッファ液１００μｌを注入してＳＰＲ測定を行う。ここで得られた信号値を信号Ｖ２とする。
【００５５】
ステップＳ２０において、ステップＳ１５において得られた信号Ｖ１と、ステップＳ１９において得られた信号Ｖ２との差を求めることにより、信号ΔＶを算出する。この信号ΔＶが、ＳＰＲ測定におけるＳＰＲ信号を表す。
【００５６】
図１３は、このようにして行われた実験により得られた結果を示している。この実験においては、信号Ｖ１及びＶ２を得るとき以外にもステップＳ１１〜Ｓ１９にわたって随時ＳＰＲ測定を行い、それぞれのステップにおける信号値を得た。図１３の（ａ）は、それらの信号値の変化を示している。
【００５７】
図１３の（ａ）に示すように、ステップＳ１７においてＩｇＧを加えた際に、信号値が大きく変化していることから、プロテインＡとＩｇＧとが反応したと考えられる。さらに、ステップＳ１８においてバッファ液により洗浄した後も信号値があまり変化しないことから、プロテインＡは測定チップに固定されており、ＩｇＧはこのプロテインＡと反応していたことがわかる。
【００５８】
図１３の（ｂ）は、ステップＳ１７において注入したＩｇＧの濃度に対するＳＰＲ信号ΔＶの変化を示している。図１３の（ｂ）に示すように、ＳＰＲ信号ΔＶは、ＩｇＧの濃度に比例して大きくなっている。これは、ＩｇＧが十分に反応したことを示しており、測定チップにプロテインＡが良好に固定されていたことがわかる。
【００５９】
図１４は、比較のために、ポリスチレン薄膜が形成されていない測定チップについて行った実験結果を示している。図１４の（ａ）は、ステップＳ１〜Ｓ１９にわたって随時行ったＳＰＲ測定の信号値の変化を示している。図１４の（ａ）に示すように、ステップＳ１７においてＩｇＧを加えた際に信号値の変化が見られたが、ステップＳ１８において測定チップを洗浄すると、信号値はステップＳ１７の前のレベルに戻っている。これより、測定チップにプロテインＡは固定されておらず、ステップＳ１７における信号値の変化は、単にＩｇＧを注入したために起こった変化である考えられる。
【００６０】
図１４の（ｂ）は、ステップＳ１７において注入したＩｇＧの濃度に対するＳＰＲ信号ΔＶの変化を示している。また、図１４の（ｂ）に示すように、ＳＰＲ信号ΔＶは、ＩｇＧの濃度に関わらずほぼ一定である。これにより、測定チップに、ＩｇＧと反応するプロテインＡが固定されていなかったことがわかる。
【００６１】
以上述べたように、本実施形態によれば、ＳＰＲ測定に用いられる測定チップにおいて、金属薄膜の上にポリスチレンを含むプラスチック等による疎水性薄膜を形成するので、センシング媒体であるタンパク質等を良好に固定することができる。また、分子蒸留法を用いることにより、そのような疎水性薄膜が均一に形成された測定チップを作製することができる。
【００６２】
本実施形態においては、形成された薄膜を安定化させるために、さらに再重合処理を行っても良い。この場合に、プラズマ重合法のように材料が高温になる方法は使用することができないので、測定チップに形成された薄膜に不活性ガスのイオンビーム、高速電子線、又は、Ｘ線等を照射する方法を用いる。或いは、成膜された測定チップを加熱しても良い。
【００６３】
また、本実施形態においては、蒸着源としてポリスチレンテロマーを用いたが、蒸着源としてポリスチレンモノマーを用い、測定チップに形成された薄膜に対して上記の方法により再重合しても良い。
【００６４】
さらに、本実施形態においては、蒸着膜の構造をより密にすると共に、化学的に安定化するため、蒸着中に飛来する分子の向きを制御し、材料チップにおける分子集合構造を制御しても良い。このためには、例えば、図４に示す成膜装置２において、蒸発皿２３付近に高周波コイルを設け、蒸発分子をイオン化して材料チップにイオンプレーティングしても良い。
【００６５】
次に、本発明の第２の実施形態に係る測定チップの製造方法について、図１５及び図１６を参照しながら説明する。本実施形態は、透明誘電体に形成された金属薄膜の上に、イオンビームスパッタ法を用いて疎水性薄膜を形成する方法である。
【００６６】
図１５は、本実施形態において用いられるイオンビームスパッタ装置を示す模式図である。このイオンビームスパッタ装置３は、真空セル３１を有しており、真空セル３１の内部には、ホルダ３２と、ターゲット３３と、マスク３４とが配置されている。ホルダ３２は、ポリスチレン薄膜が形成される材料チップ１７を所定の向きに保持する。また、ターゲット３３には、薄膜の材料となるポリスチレンが配置されている。さらに、マスク３４は、材料チップ１７の所定の位置にポリスチレン薄膜を形成するために用いられる。
【００６７】
また、このイオンビームスパッタ装置３は、ターゲットに向けてイオンを出射するイオンガン３５と、真空セル３１内の真空度を測定するピラニーゲージ３６及びイオンゲージ３７とを有している。イオンガン３５は、高周波の電磁波を発生させることによって希ガスをイオン化し、さらに、このイオンを高電圧で加速することによりターゲット３３に衝突させる。
【００６８】
さらに、このイオンビームスパッタ装置３は、真空セル３１の内部を排気するためのクライオポンプ３８と、吸着ポンプ３９と、ロータリーポンプ４０とを有している。ここで、クライオポンプ３８とは、極低温面を有し、これにセル内の気体分子を凝縮したり吸着することにより分子を捕捉して排気するポンプであり、これを用いることにより、セル内を超高真空にすることが可能である。
【００６９】
図１６は、本実施形態に係る測定チップの製造方法を示すフローチャートである。まず、ステップＳ３１において、材料チップ１７、ターゲット３３、及び、マスク３４を所定の位置に配置する。
【００７０】
次に、ステップＳ３２において、真空セル３１内を排気する。この際に、真空セル３１内の真空度を一端１０-6Ｔｏｒｒ程度に下げた後に、アルゴンやキセノン等の希ガスを導入して１０-3Ｔｏｒｒ程度にする。
次に、ステップＳ３３において、真空セルに１３．５６ＭＨｚ程度の高周波電力を印加する。これにより、真空セルに導入されている希ガスがイオン化される。
【００７１】
ステップＳ３４において、ターゲット３３側が負極、ホルダ３２側が正極となるように、両者間に直流バイアスをかける。このバイアスによって希ガスイオンが加速され、ターゲットに衝突する。この際に、ターゲットであるポリスチレンの高分子鎖が切断され、ターゲット分子（スチレン分子）がはじき出される。このターゲット分子の切断部はラジカル化されており、ターゲット分子は、ラジカル状態のまま材料チップ１７に到達する。材料チップ１７に到達したターゲット分子は、ラジカル重合に近いプロセスにより、短い分子鎖で互いに再重合する。これにより、材料チップ１７にポリスチレン薄膜が形成される。このように形成されたポリスチレン薄膜は、架橋構造を有しており、安定な性質を示す。
【００７２】
ここで、ポリスチレン薄膜の膜厚は、印加する高周波電力や真空セル内に導入する希ガスのガス圧及び流量を設定し、スパッタ時間を変えることによって制御することができる。
【００７３】
本実施形態におけるようなイオンビームスパッタ法によれば、通常の高周波スパッタ法と異なり、イオンガンからＡｒ+等のイオンビームをターゲットに向けて照射して高分子をはじき出すので、多量のラジカルは生成されない。このため、成膜後にラジカルを除去する工程が不要であり、ほとんどラジカルがない薄膜を形成することができる。
本実施形態においては、ターゲットにイオンビームを照射したが、高速電子線やＸ線等を照射しても良い。この場合には、ターゲットにおけるチャージアップの問題も解決される。
【００７４】
【発明の効果】
以上述べたように、本発明によれば、ＳＰＲ測定に用いられる測定チップに疎水性薄膜を形成するので、タンパク質、グリコタンパク、リボタンパク、ポリサッカライド等の疎水性部位を有する種々の高分子材料を疎水結合により良好に固定することができる。これより、タンパク質同士の相互作用や、タンパク質と他の化合物との相互作用等の解析を広く行うことができ、多種多様な物質をＳＰＲ測定によって検出可能になる可能性がある。特に、疎水性薄膜材料としてポリスチレンを用いる場合には、例えば、ＥＬＩＳＡ法において既知の抗原（タンパク質）固定法をそのまま応用することができる。これにより、新薬を開発する場合等において、抗原抗体反応に対してその反応を阻害する低分子化合物を探索する際に、新たなタンパク質固定法やその信頼性の試験を行うための開発期間が不要になり、創薬開発期間を大幅に短縮することが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の一実施形態に係る測定チップを示す断面図である。
【図２】図１に示す測定チップを用いてＳＰＲ測定を行う様子を示す模式図である。
【図３】本発明の第１の実施形態に係る測定チップの製造方法を示すフローチャートである。
【図４】本発明の第１の実施形態に係る測定チップの製造方法において用いられる測定チップ製造装置（成膜装置）を示す断面図である。
【図５】図４に示す成膜装置の一部を示す斜視図である。
【図６】本発明の第１の実施形態に係る測定チップの製造方法を用い、製造条件を変えて測定チップを作製した場合の製造条件とその条件の下で作製された測定チップの膜厚を示す表である。
【図７】金薄膜について測定した表面反射赤外線吸収スペクトルを示す図である。
【図８】図８の（ａ）は、図６に示す試料（４）の表面反射赤外線吸収スペクトルを示す図であり、図８の（ｂ）及び（ｃ）は、試料（４）のＡＦＭ撮像写真である。
【図９】図９の（ａ）は、図６に示す試料（２）の表面反射赤外線吸収スペクトルを示す図であり、図９の（ｂ）及び（ｃ）は、試料（２）のＡＦＭ撮像写真である。
【図１０】図９の（ｃ）に示す試料における表面揺らぎを測定した結果を示す断面図である。
【図１１】図１１の（ａ）は、図６に示す試料（６）の表面反射赤外線吸収スペクトルを示す図であり、図１１の（ｂ）及び（ｃ）は、試料（６）のＡＦＭ撮像写真である。
【図１２】本発明の一実施形態に係る測定チップを評価するための実験手順を示すフローチャートである。
【図１３】本発明の一実施形態に係る測定チップについて行った実験結果を示す図である。
【図１４】比較のために、ポリスチレン薄膜が形成されていない測定チップについて行った実験結果を示す図である。
【図１５】本発明の第２の実施形態に係る測定チップの製造方法において用いられる測定チップの製造装置を示す模式図である。
【図１６】本発明の第２の実施形態に係る測定チップの製造方法を示すフローチャートである。
【図１７】ＳＰＲ測定の原理を説明するための図である。
【符号の説明】
１  測定チップ
２、３  測定チップ製造装置（成膜装置）
１０、１０１  透明誘電体
１１、１０２  金属薄膜（金薄膜）
１２  疎水性薄膜（ポリスチレン薄膜）
１３  空孔
１４  タンパク質
１５、１０４  光源
１６、１０６  光検出器
１７  材料チップ
２１  チップホルダ
２２  マスク
２３  蒸発皿
２４  チャンバ
２５  蒸着源加熱装置
２６  冷却液槽
２７  真空装置
２８  固定具
３１  真空セル
３２  ホルダ
３３  ターゲット
３４  マスク
３５  イオンガン
３６  ピラニーゲージ
３７  イオンゲージ
３８  クライオポンプ
３９  吸着ポンプ
４０  ロータリーポンプ
１０３  試料
１０５  レンズ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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