(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号１で表わされるアミノ酸配列のペプチドからなり、妊娠した豚が産生するエストロンに対し結合性を有する豚の妊娠検査試薬用ペプチド。
【請求項２】
配列表における配列番号１のアミノ酸配列からなり、妊娠した豚が産生するエストロンとの結合性を有すると共に、そのＮ末端に標識物質を結合させたペプチド誘導体を有効成分とする豚の妊娠検査試薬。
【請求項３】
リジン（Lys）または３、７、１５個のリジンが連結した分岐型リジンの各枝末端に、配列表の配列番号１で表わされるアミノ酸配列からなるペプチドを２、４、８、１６個結合してなる豚の妊娠検査試薬用ペプチド。
【請求項４】
請求項３記載の豚の妊娠検査試薬用ペプチドを必須成分とする豚の妊娠検査試薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、養豚業で繁殖の管理を行うときに雌豚の妊娠検査に用いる豚の妊娠検査試薬用ペプチドおよび豚の妊娠検査試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
豚類（Sus scrafa domesticus及びその他の近縁種、以下に豚と称する。）は、繁殖力が強く、また発育の早い家畜であることから、広く食用または医療用および研究用などに供されている。
【０００３】
因みに、豚は、雌雄ともに生後10ヶ月、体重１１５ｋｇくらいから一年中いつでも繁殖に用いることができるが、日本では気候の良い３月または9月に出産するように5月または11月頃に人工授精による交配をさせることが好ましい。
【０００４】
交配の適時は21日周期の発情期に入ってから約半日ないし1日という短時間であるので、この時期を逃さないで確実に受精をし、さらにその確認を行なうことが肝要である。
【０００５】
従来の受胎の確認は、雄豚の自然繁殖行動を観察する方法であったが、より科学的な手法として超音波診断装置を用いる方法もある。
【０００６】
また、豚の発情ホルモンに関して１９７８年のロバートソンの発表によれば、エストロンサルフェートは非妊娠豚では血液中に発見されず、妊娠した豚の血液中に検出されることが知見されるが、エストロンを検出するには、液体クロマトグラフィーによって、まず硫酸結合型エストロンを検出する手法が一般的であった。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、上記した従来の超音波診断装置を用いる診断方法では、人用の診断装置を転用しているので、設備費が高価になり、またこのような装置を用いた診断作業は煩雑であると共に、熟練した者でなければ正確に判断することは困難であった。
【０００８】
また、上記した従来のエストロンの検出方法は、抽出工程や分画工程に長時間を要し、測定装置その他の設備費用も高額になりがちであり、さらにまた診断の精度も充分に高いとはいえない。
【０００９】
そこで、この発明の課題は、上記した問題点を解決して、比較的簡単な手法によって診断に誤りのない豚の妊娠検査を行なえる試薬用(必須成分)のペプチドを提供すると共に、これを用いて簡便かつ確実に妊娠または非妊娠を診断できる豚の妊娠検査試薬を提供することである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
上記の課題を解決するため、この発明においては、配列表の配列番号１で表わされるアミノ酸配列のペプチドからなり、妊娠した豚が産生するエストロンに対し結合性を有する豚の妊娠検査試薬用ペプチドとしたのである。
【００１１】
上記したように構成されるこの発明のペプチドは、本願の発明者らが特殊なコンピュータソフトウェアを用いて推定するとともに、アミノ酸合成法を利用して作成した６個の特定のアミノ酸配列のショートペプチドからなり、このものは妊娠豚産生エストロンに対する結合性を有するので、この豚の妊娠検査試薬用ペプチドのＣ末端にエストロンを結合させると共に、Ｎ末端に何らかの標識となる物質を結合させることが可能なショートペプチドである。そのため、このようなペプチドとエストロンとの結合反応(凝集反応など)を利用して妊娠した豚が産生するエストロンを容易に発見することが可能になる。
【００１２】
また、この発明のペプチドは、特定のアミノ酸配列からなるショートペプチドを単位としているから、周知の化学合成法等により効率良く生産できるものであり、豚用妊娠検査試薬の材料として工業的な生産性も有している。
【００１３】
また、前記の課題を解決するため、本願の豚の妊娠検査試薬に係る発明では、配列表における配列番号１のアミノ酸配列からなり、妊娠した豚が産生するエストロンとの結合性を有すると共に、そのＮ末端に標識物質を結合させたペプチド誘導体を有効成分として含有する豚の妊娠検査試薬としたのである。
【００１４】
このペプチド誘導体は、妊娠した豚が産生するエストロンに対する結合性を有すると共に、酵素または発色物質のような標識物質を有するので、これを必須成分とする豚の妊娠検査試薬は、予め設定された適当な標識を識別することによって妊娠した豚が産生したエストロンを含有しているか否かを容易に識別でき、すなわち比較的簡単に妊娠を診断できてその診断に誤りの少ない豚用妊娠診断薬になる。
【００１５】
また、前記の課題を解決するため、本願の豚の妊娠検査試薬用ペプチドに係る発明では、1のリジン（Lys）または２以上のリジン（Lys）が連結した分岐型リジンの末端に、配列表の配列番号１で表わされるアミノ酸配列のペプチドを連結してなる豚の妊娠検査試薬用ペプチドとしたのであり、または上記の豚の妊娠検査試薬用ペプチドを必須成分として含有する豚の妊娠検査試薬としたのである。
【００１６】
上記したように構成されるこの発明のペプチドは、1または２以上のリジン（Lys）が連結した分岐型ペプチドのＮ末端に妊娠豚産生エストロンを結合させるので、２分子以上のエストロンが凝集して妊娠した豚が産生したエストロンの存在を容易に発見できるようになり、このようなペプチドを必須成分とする豚用妊娠診断薬は、比較的簡単に妊娠または非妊娠を診断できて診断に誤りの少ない検査用試薬になる。
【００１７】
【発明の実施の形態】
この発明における配列表の配列番号１で表わされるアミノ酸配列（Ala Leu Asp Tyr Tyr Thr）からなるペプチドは、化学合成法などの周知のペプチド調製方法を用いて製造することができる。具体的には、化学合成、遺伝子組み替えなどの手法で製造することができる。
【００１８】
固相合成法によりペプチドを合成する場合には、架橋ポリスチレンなどの不溶性支持体上に合成すべきペプチドのＣ末端のアミノ酸を固定し、それを起点としてマイクロコンピュータで制御された市販の合成装置でＮ−α−ｔ−ブトキシカルボニル化アミノ酸（Ｂｏｃ−アミノ酸）またはＮ−α−９−フルオレニルメトキシカルボニル化アミノ酸（Ｆｍｏｃ−アミノ酸）に対して、適宜に保護基を除去して順に所要のペプチド鎖を伸長させる。因みに、ペプチド合成機の製造会社または販売会社としては、ファルマシア  バイオテク社、パーキンエルマージャパン社、アロカ社、島津製作所製などがある。
【００１９】
ショートペプチドを製造するには、架橋ポリスチレンなどの不溶性支持体にＢｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）またはＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）を用いてペプチドを合成する。ここで、Ｂｏｃは第三ブチルオキシカルボニル基であり、Ｆｍｏｃはフルオレニルメトキシカルボニル基である。
【００２０】
ペプチドを成長させるには、通常の固相合成法によりペプチドを合成する方法であるＢｏｃ法やＦｍｏｃ法を採用できる。その際に注意すべきことは、反応点が増加するので最初のＬｙｓの含有量を０．１ｍｍｏｌ／ｇ程度に調節すること、ぺプチド鎖を成長させるアミノ酸縮合反応の後、未反応のアミノ基を必ずアセチル化してそれ以後のペプチド鎖の伸長を阻止し、途中のアミノ酸が欠落したペプチドの生成を防ぐようにする。
【００２１】
図１に示す分岐型ペプチドは、前記所定のアミノ酸配列をリジン（Ｌｙｓ）１５個を介して連結したものである。また、1つのリジンに対して配列番号１で表わされるペプチド２組が結合した場合を配列表の配列番号２に示した。
【００２２】
また、２以上のリジンの数に対してそれぞれ所定数のペプチドが連結できるようにするには、リジンを直線または分岐状に連結したものをコアにする。特に、リジンの数ｎ＝１、３、７、１５に対して、それぞれ２、４、８、１６個のペプチドを分岐状に連結できる。
【００２４】
このような理由により、２以上連結したペプチドのコアに用いるリジンの数は２以上であればよいが、２〜１５個程度のリジンを連結させることが好ましい。１６以上のリジンを連結したペプチドを調製してもそれ以上に鋭敏な反応をする試薬が得られない場合があり、また製造コスト高となって実用性を失する場合があるからである。
【００２５】
【実施例】
自動ペプチド合成機（バイオシステム社製：ＡＢＩ  ４３１Ａ）を用い、J.Am.Chem.,85,2149 (1963) に記載の化学合成法（ｔ−Ｂｏｃ法による固相合成法で縮合剤としてＢＯＰを使用する。）を利用すると共に、バイオケミストリー第８５巻、pp.5409-5413（１９８８年８月発行）に記載のジェームス（ＪＡＭＥＳＰ．ＴＡＭ）の方法に従って、ＭＡＰ（Multiple antigen peptide）型の分岐型ペプチドを製造した。
【００２６】
すなわち、ジビニルベンゼンで架橋したポリスチレン樹脂に官能基を導入した樹脂（ヒドロキシメチルフェニルアセトアミド樹脂（ＰＡＭレジンとも呼ばれる）、または４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂）にＢｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）を使用する自動ペプチド合成機を用いた。
【００２７】
自動ペプチド合成機では、Ｂｏｃ−Ａｌａ−ＰＡＭレジン0.０３ｍｍｏｌ（0.５ｍｍｏｌの１６分の１）とＢｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ0.０９ｍｍｏｌをＯＰでカップリングさせた。次に、Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ0.０９ｍｍｏｌをカップリングさせた後、Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ0.１８ｍｍｏｌをカップリングさせ、同様にＢｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ0.３６ｍｍｏｌ、同0.７２ｍｍｏｌを順にカップリングさせた。このようにして、リジン（Lys）１５個が連結した分岐型ペプチドのコアを合成した。
【００２８】
次に、前記自動ペプチド合成機でアルギニン（Ａｒｇ）を固定し、コアの１６個のＮ末端に、周知のＢｏｃ法によりアミノ酸配列が配列表の配列番号１のショートペプチドを作製し、このショートペプチドを１６単位結合した１６倍体の分岐型ペプチド を製造し、溶媒で保護基の除去およびペプチドの脱離を行なった。
【００２９】
自動ペプチド合成機による固相合成（Ｂｏｃ法、0.５ｍｍｏｌスケール）では、下記の▲１▼〜▲４▼の機械的な操作を繰り返すことで、所定のアミノ酸を樹脂にＣ末端から連結させる。なお、操作中溶液の量は約５〜１０ｍｌである。
【００３０】
▲１▼  脱Ｂｏｃ化    ５０％ＴＦＡ／ジクロロメタン  ５ｍｉｎ  ボルテックス（攪拌）→溶液を排出→５０％ＴＦＡ／ジクロロメタン  ３０ｍｉｎ  ボルテックス→溶液を排出
▲２▼  洗浄  （ジクロロメタン  １ｍｉｎ  ボルテックス→溶液を排出）×３回→（ＤＭＦ  １ｍｉｎ  ボルテックス→溶液を排出）×３回
▲３▼  縮合  Ｂｏｃ−アミノ酸1.５ｍｍｏｌ／ＤＭＦ、ＢＯＰ1.５ｍｍｏｌ／ＤＭＦ、ＤＩＥＡ２ｍｍｏｌ  ４０ｍｉｎ→排出
▲４▼  洗浄  （ＤＭＦ  １ｍｉｎ  ボルテックス→溶液を排出）×３回→（ジクロロメタン  １ｍｉｎ  ボルテックス→溶液を排出）×３回。
【００３１】
次に、樹脂からの切り出しと同時にアミノ酸側鎖の保護基の脱保護をフッ化水素（ＨＦ）で行なった。すなわち、ＨＦ反応管に、樹脂５００ｍｇ、ｍ−クレゾール１ｍｌ、エタンジオール0.７ｍｌ、ジメチルスルフィド0.５ｍｌを入れ、ＨＦ装置に装着した。減圧下、−７８℃に反応管を冷却し、ＨＦ１０ｍｌを反応管に導いた。０℃で１時間攪拌した後、ＨＦを留去した。無水エーテルを加え、残渣をガラスフィルターに移し、エーテルジクロロメタンでよく洗浄した。１０％酢酸水でペプチドを溶解させ、ろ液を凍結乾燥した。
【００３２】
得られたペプチドを逆相カラムを用いた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって精製した。ＨＰＬＣの条件は、粒径５μｍのＣ18シリカゲルを充填した和光純薬社製の内径φ４．６ｍｍ、長さ２５０ｍｍのカラム（Wakosil-２、５Ｃ１８  ＡＲ）を用い、ペプチド溶出の条件は初期溶媒を０．１％テトラフルオロ酢酸（ＴＦＡ）水溶液に５％アセトニトリル（ＣＨ3 ＣＮ）を含ませた混合溶液とし、アセトニトリル濃度を５〜６５％の範囲で経時的に濃度勾配を設けて毎分１．５ｍｌの流量で３０分溶出とした。
【００３３】
ＨＰＬＣの結果は、波長２２０ｎｍの紫外線検出器を用いて、吸光度のピークを検出した。なお、その際のピークリポートは以下の通りであり、得られた分岐型ペプチドのアミノ酸配列を図１に示した。
【００３４】
0003738175.tif 000002
上記のようにして得られた分岐型ペプチドを所定割合で希釈して、豚の妊娠検査試薬を調製し、これを用いて以下のように検査を行なって、その効果を確認した。
【００３５】
［豚の妊娠検査実験］
超音波診断法により妊娠豚と非妊娠豚に鑑別した雌豚の各１頭または比較用雄豚１頭のそれぞれの静脈血液を注射器で１０ｍｌづつ無菌的に採取し、これをガラス試験管15ｍｌ用注射器から遠心分離機に移し、３０００回転／分の速度で１５分間遠心分離し、得られた血清を別の試験管に分取した。得られた各豚の血清をｐＨ７．４のリン酸緩衝液（日本水産社製）で希釈して１０倍および１００倍に希釈し、その１ｍｌに前記の実施例で調整したエストロン結合ショートペプチドを滅菌蒸留水で１００μｇ／ｍｌに希釈し、これを３７℃で２４時間放置し、ペプチド結合物による凝集の有無を調べ、この結果を表１に示した。
【００３６】
【表１】
0003738175.tif 000003
【００３７】
表１の結果からも明らかなように、配列表の配列番号１で表わされるアミノ酸配列のペプチドを連結した実施例の豚妊娠検査試薬用ペプチドを１０倍または１００倍のリン酸緩衝液で希釈した豚の妊娠検査試薬は、いずれの希釈倍率のものでも凝集し、確実に診断でき測定誤差のない豚用妊娠診断であった。
【００３８】
【発明の効果】
妊娠豚産生エストロン結合性ペプチドに係る発明は、特定のアミノ酸配列のペプチドからなり、このペプチドのＣ末端にエストロンを結合させると共にＮ末端に何らかの標識となる物質を結合させることが可能なものであるから、これによって妊娠豚産生エストロンを容易に発見することが可能になるという利点がある。
【００３９】
豚用妊娠診断薬に係る発明では、特定のアミノ酸配列からなるペプチドのＮ末端に酵素または発色物質を結合させると共に妊娠豚産生エストロンとの結合性を有するペプチド誘導体を必須成分とする豚用妊娠診断薬としたので、標識に結合した妊娠豚産生エストロンを容易に発見できるようになり、比較的簡単な手法によって確実に診断できる豚用妊娠診断薬であるという利点がある。
【００４０】
また、分岐型ペプチドのＮ末端に特定アミノ酸配列からなるペプチドのＣ末端を連結してなる妊娠豚産生エストロン結合性ペプチドとした発明では、妊娠豚産生エストロンを容易に発見することが可能になるという利点があり、また上記の妊娠豚産生エストロン結合性ペプチドを必須成分とする豚用妊娠診断薬は、比較的簡単な手法によって確実に診断できるものであるという利点がある。
【００４１】
【配列表】
Sequence Listing
<110> Masaru Sakaban, Kazunari Yamano, Koichi Doen
<120> Peptide for use in chemical preparations for the diagnostic of pre
gnancy of swine and chemical preparations for the diagnostic of pregnanc
y of swine.
<130> KPO5492-09
<160> 2
<210> 1
<211> 6
<212> PRT
<213> Sus scrafa domesticus
<400> 1
Ala Leu Asp Tyr Tyr Thr
1                 5
<210> 2
<211> 13
<212> PRT
<213> Sus scrafa domesticus
<400> 2
Ala Leu Asp Tyr Tyr Thr Lys Ala Leu Asp Tyr Tyr Thr
1                 5                         10
【図面の簡単な説明】
【図１】分岐した妊娠豚産生エストロン結合性ペプチドのアミノ酸配列を示す図表
【図１】
0003738175.tif 000004