(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
材料に播種した試験材料を固定するボトムプレートと、
透明材料からなり前記試験材料に近接して配置されるコーンと、
前記コーンを内部に固定し、外周に回転駆動部を備えたコーンホルダーと、
前記回転駆動部を介してコーンホルダーを回転する駆動装置と、
前記コーンホルダーの回転にかかわらず相対的に固定され、前記ボトムプレートを支持する支持部材と、
前記試験材料は、ボトムプレートに載置され、弾性を有する押さえ部材によりボトムプレートに押圧状態に固定され、
前記押さえ部材には、外周から中心の通孔に延び、液体を通孔部分に設けた前記試験材料表面に導入する溝を形成し、
前記ボトムプレートには、前記押さえ部材の溝の外周部に連通する孔を形成して該孔から前記溝に液を導入可能にすると共に、前記支持部材に螺合するねじを備えて前記コーン先端と試験材料表面との間隔調節を可能とし、
前記ボトムプレートを固定すると共に前記コーンホルダーを回転可能に支持する可動型アームにより、コーンを顕微鏡直下とそれ以外の部分との間に揺動自在に支持し、
前記コーンの上部から前記試験材料上の播種細胞等を観察する落射型顕微鏡とを備えたことを特徴とするコーンプレート型細胞剥離装置。
【請求項２】
前記押さえ部材と試験材料との間にはＯリングを備えたことを特徴とする請求項１記載のコーンプレート型細胞剥離装置。
【請求項３】
前記試験材料は透明な材料載置プレートの窪みに載置することを特徴とする請求項１記載のコーンプレート型細胞剥離装置。
【請求項４】
前記コーンホルダーの中心にコーン挿入口を設け、前記コーン挿入口にコーンの小径部を挿入した後、コーン押さえ部材によりコーンの上部を押圧固定したことを特徴とする請求項１記載のコーンプレート型細胞剥離装置。
【請求項５】
前記コーンホルダーの回転駆動部はリングギアであり、前記リングギアを前記駆動装置のギアにより中間ギアを介して回転駆動することを特徴とする請求項１記載のコーンプレート型細胞剥離装置。
【請求項６】
前記試験材料は板状、膜状、３次元担体などの材料に播種した細胞であることを特徴とする請求項１記載のコーンプレート型細胞剥離装置。
【請求項７】
前記コーンの直径は１０ｍｍ程度の小径に設定したことを特徴とする請求項１記載のコーンプレート型細胞剥離装置。
【請求項８】
前記試験材料の直径は１５ｍｍ程度の小径に設定したことを特徴とする請求項１記載のコーンプレート型細胞剥離装置。
【請求項９】
前記コーンと試験材料との間隙を測定するレーザー変位センサーを設けたことを特徴とする請求項１記載のコーンプレート型細胞剥離装置。
【請求項１０】
試験材料表面に顕微鏡の焦点を合わせる移動装置を前記駆動装置部分に設けたことを特徴とする請求項１記載のコーンプレート型細胞剥離装置。
【請求項１１】
前記試験材料表面上の観察部位を変更するｘ−ｙ−ｚ軸方向可動装置を備えたことを特徴とする請求項１記載のコーンプレート型細胞剥離装置。
【請求項１２】
前記顕微鏡は、前記試験材料の表面を上方から観察する超長焦点対物レンズを備えた落射型蛍光顕微鏡であることを特徴とする請求項１記載のコーンプレート型細胞剥離装置。
【請求項１３】
前記顕微鏡は、前記試験材料の表面側から投光する照明装置と、裏側から投光する照明装置とを備えたことを特徴とする請求項１記載のコーンプレート型細胞剥離装置。
【請求項１４】
少なくとも試験材料周辺装置を内部に収容し、内部を一定の温度に制御することができるボックスを備えたことを特徴とする請求項１記載のコーンプレート型細胞剥離装置。
【請求項１５】
少なくとも前記顕微鏡を載置する一体型防振板を備えたことを特徴とする請求項１記載のコーンプレート型細胞剥離装置。
【請求項１６】
前記コーンの回転を制御するコンピュータを備えたことを特徴とする請求項１記載のコーンプレート型細胞剥離装置。
【請求項１７】
前記落射顕微鏡には超高感度カメラを備えたことを特徴とする請求項１記載のコーンプレート型細胞剥離装置。
【請求項１８】
前記落射顕微鏡には画像解析装置を接続したことを特徴とする請求項１記載のコーンプレート型細胞剥離装置。
【請求項１９】
前記落射顕微鏡にはビデオを接続したことを特徴とする請求項１記載のコーンプレート型細胞剥離装置。
【請求項２０】
前記落射顕微鏡にはモニタを接続したことを特徴とする請求項１記載のコーンプレート型細胞剥離装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は細胞と各種材料との接着力を定量的に評価するために、接着されている材料と細胞を剥離しそのときのデータを得ると共にこれを観察するシステムに関する。
【０００２】
【従来の技術】
血管系の疾患は命に関わるだけでなく、生体の機能不全や四肢の切断など、人々の生活の質を著しく低下させる重大な障害を引き起こすことが知られている。近年、血管系の疾患を患う高齢者は多く、これから本格的な高齢者社会を迎えるにあたり、血管系の疾患の治療方法の確率は重要な課題となっている。これらの血管系の疾患の治療方法として、血管内径が４ｍｍ以下の小口径の人工血管による疾病部位の置換手術が有効である場合が多いが、今までに小口径領域の人工血管で臨床に耐えうるものは開発されていない。
【０００３】
一方、生体内の血管は、血管内皮細胞、血管平滑筋細胞、繊維芽細胞から構成されている。その最内腔面に存在する血管内皮細胞からは、常に血液の血管内皮細胞への粘着を抑制する抗血栓性の物質や血液が血管内皮細胞に粘着した後に形成される血栓を溶かす抗凝固性の物質が放出されることによって、内腔面に血栓が付着しない平滑な状態が一生涯に亘って維持されている。したがって、近年では、血管内皮細胞と材料とのハイブリツド型の人工血管の開発が注目されている。血管内皮細胞と材料とのハイブリツド型の材料は流れのないin vitroの条件下では確かに優れた抗血栓性を発揮することが多くの研究者によって確かめられているが、その血管内皮細胞と材料とのハイブリツド型の材料を生体内に移植すると、今までに試験されてきた材料では材料表面の血管内皮細胞が血流によって容易に剥離し、その結果ハイブリッド型の材料でも十分な抗血栓性を獲得できない。
【０００４】
したがって、抗血栓性に優れた血液適合性材料を開発するためには、血管内皮細胞の底面への接着力が増強する材料、または血管内皮細胞の底面への接着力が増強する培養環境を探索することが重要であると考えられる。また、細胞の担体などへの接着力の向上は血管内皮細胞と材料とのハイブリッド型の人工血管に限った問題ではなく、組織再構築型の人工臓器の設計を目指すいわゆる組繊工学の分野でも重要な課題となっている。最近では組繊工学的手法による人工臓器作製の目標は、人工軟骨、骨、神経、食道、肝臓、腎臓、心臓、膀胱をはじめとするあらゆる臓器に広がりつつあり、上述のあらゆる細胞と材料との接着力を定量的に評価する手段の開発が必要となっている。
【０００５】
血管内皮細胞の底面への接着力が増強する材料、または血管内皮細胞の底面への接着力が増強する培養環境を探索するために、従来は血管内皮細胞を播種した人工血管を実験動物に移植するなどの方法が用いられてきたが、実験材料を実験ごとに血管状に加工しなければならない煩雑さ、実験動物の犠牲、実験スケール、実験期間など多くの問題があった。
【０００６】
最終的には動物実験、臨床治検によって作製した人工血管の性能を評価しなければならないが、in vitroによる評価系が確立されれば詳細な人工血管の設計が可能になる。in vitroの評価方法として、従来は平行平板型チェンバーといわれている２枚の板の間にポンプによって流れを起こし、細胞の材料表面からの剥離の程度を評価する装置も報告されているが、このシステムではポンプで培養液を送り出さなければならないので、大量の培養液が必要であり、さらに回路内から空気を抜く作業が必要である問題がある。
【０００７】
また、マイクロピペットで細胞を一つずつ引っ張って、剥離させる方法も既に報告されているが、一度に大量の材料を簡便に評価する点において問題がある。
【０００８】
磁気ビーズで細胞にツイストと呼ばれる力を負荷させることによって細胞を剥離させる方法も存在するが、生理的な細胞の剥離現象とはかけ離れている問題点があり、今までに報告された装置では簡便に材料への細胞の接着強度を計測できない現状がある。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
血管内皮細胞を有するタイプの人工血管を開発するためには、生理的な条件にできるだけ近い環境下で細胞の接着傾向を定量的に評価する必要がある。本発明では、生体内の環境に酷似している剪断応力による細胞の接着傾向をリアルタイムで定量化できる装置の開発を目的とする。
【００１０】
剪断応力による細胞の接着傾向を定量的に評価するためには、細胞の材料からの剥離現象をリアルタイムで可視化する必要があり、本発明ではそのような性能を有する装置の開発を目的とする。
【００１１】
人工血管用の材料としては板状、膜状、３次元担体など様々な材料が考えられる。本発明ではそのような多様な材料の評価を同一条件下で簡便に行えるようにするために、上述のような材料を簡便に装置に装着できる機構を取り入れた装置の開発を目的とする。
【００１２】
人工血管用の材料への細胞の接着強度やその他の臓器用の材料への一般的な細胞の接着強度を計測するためには、材料の大きさは小さければ小さいほど、細胞、培養液などの実験に要するコストを削減できる。そこで、本システムでは小スケールの細胞剥離システムの開発を目的とする。
【００１３】
できるだけ生体内に近い環境下で細胞の材料への接着傾向を評価するために、３７℃の条件下で実験が行える装置の開発を目的とする。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
器型をしたプレートと逆円錐形のコーンから構成されるコーンプレート型の粘度計が既に存在し、この粘度計はシンプルな構造を有し、従来は液体の粘度を計測するために開発されたものである。コーンプレート型の粘度計では、角速度は中心からの距離が遠くなるに従い速くなるが、コーンは特定の角度を有するために、底面に一様なずり速度、剪断応力を負荷できる優れた特徴がある。そこで、本発明においてはこの点に着目し、コーンプレート型の粘度計を基に、新たな装置を開発することによって、板状、膜状、不職布、ポーラス担体などのあらゆる３次元担体への細胞の接着強度を簡便に定量的に計測できるコーンプレート型細胞剥離装置を開発することにしたものである。
【００１５】
本発明は上記課題を解決するため、請求項１に係る発明は、材料に播種した試験材料を固定するボトムプレートと、透明材料からなり前記試験材料に近接して配置されるコーンと、前記コーンを内部に固定し、外周に回転駆動部を備えたコーンホルダーと、前記回転駆動部を介してコーンホルダーを回転する駆動装置と、前記コーンホルダーの回転にかかわらず相対的に固定され、前記ボトムプレートを支持する支持部材と、前記試験材料は、ボトムプレートに載置され、弾性を有する押さえ部材によりボトムプレートに押圧状態に固定され、前記押さえ部材には、外周から中心の通孔に延び、液体を通孔部分に設けた前記試験材料表面に導入する溝を形成し、前記ボトムプレートには、前記押さえ部材の溝の外周部に連通する孔を形成して該孔から前記溝に液を導入可能にすると共に、前記支持部材に螺合するねじを備えて前記コーン先端と試験材料表面との間隔調節を可能とし、前記ボトムプレートを固定すると共に前記コーンホルダーを回転可能に支持する可動型アームにより、コーンを顕微鏡直下とそれ以外の部分との間に揺動自在に支持し、前記コーンの上部から前記試験材料上の播種細胞等を観察する落射型顕微鏡とを備えたことを特徴とするコーンプレート型細胞剥離装置としたものである。
【００１７】
また、請求項２に係る発明は、前記押さえ部材と試験材料との間にはＯリングを備えたことを特徴とする請求項１記載のコーンプレート型細胞剥離装置としたものである。
【００１８】
また、請求項３に係る発明は、前記試験材料は透明な材料載置プレートの窪みに載置することを特徴とする請求項１記載のコーンプレート型細胞剥離装置としたものである。
【００２１】
また、請求項４に係る発明は、前記コーンホルダーの中心にコーン挿入口を設け、前記コーン挿入口にコーンの小径部を挿入した後、コーン押さえ部材によりコーンの上部を押圧固定したことを特徴とする請求項１記載のコーンプレート型細胞剥離装置としたものである。
【００２２】
また、請求項５に係る発明は、前記コーンホルダーの回転駆動部はリングギアであり、前記リングギアを前記駆動装置のギアにより中間ギアを介して回転駆動することを特徴とする請求項１記載のコーンプレート型細胞剥離装置としたものである。
【００２３】
また、請求項６に係る発明は、前記試験材料は板状、膜状、３次元担体などの材料に播種した細胞であることを特徴とする請求項１記載のコーンプレート型細胞剥離装置としたものである。
【００２５】
また、請求項７に係る発明は、前記コーンの直径は１０ｍｍ程度の小径に設定したことを特徴とする請求項１記載のコーンプレート型細胞剥離装置としたものである。
【００２６】
また、請求項８に係る発明は、前記試験材料の直径は１５ｍｍ程度の小径に設定したことを特徴とする請求項１記載のコーンプレート型細胞剥離装置としたものである。
【００２８】
また、請求項９に係る発明は、前記コーンと試験材料との間隙を測定するレーザー変位センサーを設けたことを特徴とする請求項１記載のコーンプレート型細胞剥離装置としたものである。
【００３０】
また、請求項１０に係る発明は、試験材料表面に顕微鏡の焦点を合わせる移動装置を前記駆動装置部分に設けたことを特徴とする請求項１記載のコーンプレート型細胞剥離装置としたものである。
【００３１】
また、請求項１１に係る発明は、前記試験材料表面上の観察部位を変更するｘ−ｙ−ｚ軸方向可動装置を備えたことを特徴とする請求項１記載のコーンプレート型細胞剥離装置としたものである。
【００３２】
また、請求項１２に係る発明は、前記顕微鏡は、前記試験材料の表面を上方から観察する超長焦点対物レンズを備えた落射型蛍光顕微鏡であることを特徴とする請求項１記載のコーンプレート型細胞剥離装置としたものである。
【００３３】
また、請求項１３に係る発明は、前記顕微鏡は、前記試験材料の表面側から投光する照明装置と、裏側から投光する照明装置とを備えたことを特徴とする請求項１記載のコーンプレート型細胞剥離装置としたものである。
【００３４】
また、請求項１４に係る発明は、少なくとも試験材料周辺装置を内部に収容し、内部を一定の温度に制御することができるボックスを備えたことを特徴とする請求項１記載のコーンプレート型細胞剥離装置としたものである。
【００３５】
また、請求項１５に係る発明は、少なくとも前記顕微鏡を載置する一体型防振板を備えたことを特徴とする請求項１記載のコーンプレート型細胞剥離装置としたものである。
【００３６】
また、請求項１６に係る発明は、前記コーンの回転を制御するコンピュータを備えたことを特徴とする請求項１記載のコーンプレート型細胞剥離装置としたものである。
【００３７】
また、請求項１７に係る発明は、前記落射顕微鏡には超高感度カメラを備えたことを特徴とする請求項１記載のコーンプレート型細胞剥離装置としたものである。
【００３８】
また、請求項１８に係る発明は、前記落射顕微鏡には画像解析装置を接続したことを特徴とする請求項１記載のコーンプレート型細胞剥離装置としたものである。
【００３９】
また、請求項１９に係る発明は、前記落射顕微鏡にはビデオを接続したことを特徴とする請求項１記載のコーンプレート型細胞剥離装置としたものである。
【００４０】
また、請求項２０に係る発明は、前記落射顕微鏡にはモニタを接続したことを特徴とする請求項１記載のコーンプレート型細胞剥離装置としたものである。
【００４１】
【発明実施の形態】
発明の実施の形態を実施例に基づき図面を参照して説明する。図１は本発明のシステムの全体構成を簡略化して示したものであり、図２には材料を支持する材料支持部とこの材料に対して先端が近接して回転するコーンプレートを支持するコーンプレート支持部を拡大して示している。また、図３には図２の各部材を組み立てる前の状態を示す分解図を示し、図４〜図６は各部材の一部破断図を含む側面図と平面図を示している。
【００４２】
図２、図３及び図４（ａ）に示されるように、ボトムプレート１は中央に開口２を形成し、その周囲のランド部３にねじ通孔４を備え、また外周には固定壁５を備えており、固定壁５の内周に形成したねじ６により支持部材７の先端にねじ込み固定することができるようにしている。なお、このねじ６のねじ込みにより、後述するようなコーンの先端と材料表面との間隔調節を行うことができ、１００ｎｍの精度で位置の調節が可能となる。
【００４３】
このボトムプレート１に載置する透明なガラスあるいは石英製の材料載置プレート８には図４（ｂ）に示すように、上面の中央部分に窪み９を備えており、この窪み９にはその外周を窪み９の形状に概略合わせて成形した試験材料１０を落とし込んで載置する。なお、この試験材料は任意の大きさに設定することができるが１５ｍｍ程度の大きさとし、窪み９はこの試験材料が入る大きさに設定する。押さえプレート１１は中心部に通孔１２を備え、その通孔１２の周囲にＯリング溝１３を形成し、外周部分には前記ボトムプレート１のねじ通孔４に対応する位置にねじ孔１９を形成している。前記Ｏリング溝には図５（ｂ）に示されるようなＯリング１４を嵌入する。この押さえプレート１１は弾性のあるポリイミド製材料からなり、各種形状の試験材料を確実に固定することができるようになっている。
【００４４】
また、図５（ａ）に示すように押さえプレート１１の表面には外周から中心の通孔１２に延びる図中２本の溝１５を形成しており、この溝１５はＯリング溝１３より幾分深く形成することによって、Ｏリング１４をＯリング溝１３に嵌入し全てが組み立てられた状態で培養液等を溝１５の外周側から試験材料１０の表面に供給し、また必要に応じてこれを排出することができるようにしている。なお、前記ボトムプレート１のランド部３には、図４（ａ）に示すように貫通孔１６形成しており、この貫通孔１６が前記溝１５の外周端に一致させることにより、嵌通孔１６の下面に結合した連結パイプから前記培養液等を導入し、また排出することができる。
【００４５】
図３に示すように試験材料支持部は上記のような部材で構成され、材料支持プレート８の窪み９に試験材料１０を載置し、これをボトムプレート１に載置すると共にその上からＯリング１４をＯリング溝１３に嵌入した押さえプレート１１を被せ、ねじ１５によりボトムプレート１と押さえプレート１１とを一体的に固定する。その際、押さえプレート１１の下面から突出するＯリング１４により試験材料１０が材料載置プレート８上に押さえ込まれ、固定される。このような試験材料固定手段を用いることにより、板状、膜状、３次元担体などのあらゆる材料を容易に装着することができる。
【００４６】
一方、コーンプレート支持部は図３及び図６から明らかなように、コーンホルダー２０の底板２１には中心にコーン挿入口２２を形成しており、コーン挿入口２２にガラスあるいは石英製の透明材料からなるコーン２３の小径部２４を嵌挿する。この小径部２４は適宜の大きさに設定することができるが、例えば１０ｍｍ程度の大きさに設定する。コーン２３の上部には係止フランジ２５を備え、この係止フランジ２５によりコーンホルダー２０の底板２１に載置される。コーンホルダー２０の内周にはねじ２６を備え、このねじに螺合するコーン押さえ部材２７をコーンホルダー２０にねじ込むことにより、コーン押さえ部材２７の底壁の中心部に設けた通孔２８下面の押さえ溝２９に、コーン２３の係止フランジ２５を上側から押さえることによって、コーン２３をコーンホルダー２０に強固に固定している。また、コーンホルダー２０を用いることによって、コーンとプレートの水平さを正確に合わせることができる。
【００４７】
図１において、上記のようにして組み立てられた試験材料支持部におけるボトムプレート１は支持部材７に固定され、この支持部材７は図示実施例においてはモータ３０のフレームに回動自在に取り付けられた支持プレート３１の先端に設けられている。なお、この支持プレート３１の固定手段としてはその他種々の手段を採用することができる。
【００４８】
モータ３０のギア３２には中間ギア３３が噛み合い、この中間ギア３３には円筒状のコーンホルダー２０のフランジにボルトで固定したリングギア３４が噛み合い、特に中間ギア３３及びコーンホルダー２０が固定されるリングギア３４は支持プレート３１上にベアリングを介して支持されている。なお、これらのベアリングはできる限り駆動抵抗の少ないものが好ましく、例えばベルトベアリング、浮動式のエアベアリング等によって支持することが好ましい。
【００４９】
モータ３０によって回転駆動されるコーンホルダー２０に固定したコーン２３の先端は、支持プレート３１の支持部材７に対してねじ込み固定しているボトムプレート１上の試験材料１０の表面に近接して、図２に示すように配置される。このコーン２３は小さく形成されており、且つそのコーン２３と試験材料１０の表面のなす角度を小さく設定することにより、コーン２３の下面と試験材料１０の上面、及び周囲の壁面とで形成される空間３５を小さなものとし、小さな試験材料と少ない培養液により、培養液が流れている環境を形成し試験を行うことができるようにしている。なお、このときのコーンが培養液に与える剪断力をその駆動力の変化として検出するため、図１のコンピュータ４０によりモータ８のトルクを測定することにより剪断力を演算してモニタ４１に表示することができるようにしている。
【００５０】
前記のようにモータ３０に対して揺動自在に支持されているコーンホルダー２０とボトムプレート１は、図１に示す状態では正立型落射蛍光顕微鏡４２の観測部に配置され、これらの顕微鏡全体を略密封状態でアクリル等の材料からなるボックス４３に収納できるようにし、ボックス４３内を温度制御装置４４により、例えば生理的な条件である３７℃等の所定の温度に維持することができるようにしている。また、正立型落射蛍光顕微鏡４２はボックス４３内において防振板４４に固定し、外部からの振動を受けることによる画像ノイズの発生を生じることがないようにしている。このとき、モータ３０の支持部分にも防振板を設けることが好ましい。なお、必要に応じて防振板４４と正立型落射蛍光顕微鏡４２の下面との間に微動調整用装置３９を設けても良い。
【００５１】
図示実施例においては支持プレート３１は前記のようにモータ３０のフレームに固定され、モータ３０の駆動軸を中心に９０度程度揺動できるようにしており、試験材料の取り付け、コーンの調整等の作業に際してはボックス４３の蓋４５を開放し、支持プレート３１を手前側に回転して移動させ、その後、図示するような正立型落射蛍光顕微鏡２０の所定の位置に戻し、蓋４５で封鎖することができるようにしている。
【００５２】
モータ３０は圧電素子等を用いた高さ調節装置４６に支持されて顕微鏡の焦点を合わせることができるようにし、これらはＸ−Ｙステージ４７上に固定されており、全体としてＸ−Ｙ−Ｚステージが構成される。Ｘ−Ｙステージ４７はＸ軸方向及びＹ軸方向に移動自在に固定され、それにより顕微鏡で見る位置を自由に調節することができるようにしている。またあらゆる材料とコーンとの間の距離を一定に設定するためにこれを計測する装置としてレーザー変位センサー４８を用いる。それにより試験材料とコーンとの間隙を別途調節し、サブミクロン単位に間隙調節を行うことができる。
【００５３】
モータ３０にはコンピュータ４０が接続され、これによりその回転が所定の状態に制御されると共に、コンピュータ４０はモータ３０のトルクを検出し、コーン２３が回転するときに液体の撹拌によって受ける負荷の状態を検出する。それによりコンピュータ４０は必要に応じて培養液と試験材料との剪断力、あるいは他の試験における剪断力を演算して表示装置に表示し、また印刷出力等を行う。これらの装置により円錐−平板型剪断応力負荷装置４９が構成される。
【００５４】
一方、透明なコーン２３の上部には正立型落射蛍光顕微鏡４２における超長焦点の対物レンズ５１が位置しており、水銀ランプ５２の光をフィルター５３とハーフミラー５４、対物レンズ５１、コーン２３を各々介して試験材料１０に投射することができるようになっている。また、このようにして照明された試験材料１０としての材料の表面に接着した細胞が、流動する培養液中における状態を、対物レンズ５１、ハーフミラー５４を介して高精度のＳＩＴカメラ５６で撮影し、イメージプロセッサ５７によって画像解析及び画像処理し、タイマ５８、ＶＴＲ５９等を備えた画像記録装置に出力して適宜録画し、更にモニタ６０にその状態がリアルタイムに、しかも微弱な細胞の形態の変化も観察することができるようにしている。
【００５５】
この正立型落射蛍光顕微鏡４２はハロゲンランプ６１の光をコンデンサー６２、透明な材料載置プレート８を通して試験材料１０の裏面から照射することができるようにし、必要に応じて倒立型透過顕微鏡として使用できるようにしている。
【００５６】
【発明の効果】
請求項１に係る発明においては、所定の流れによって得られる細胞の剪断応力環境下で材料表面上の播種細胞等の剥離試験を行うことができ、実際の細胞の環境下と同等の条件での定量的な試験を容易に行うことができる。しかもその状態を落射型顕微鏡によってリアルタイムに観察することが可能となる。また、板状、膜状、３次元担体などのあらゆる材料を装置本体に装着できる。その結果、あらゆる材料上の細胞の剪断応力による剥離現象を定量的に解析することが可能である。更に、試験装置を組み立てた後で試験材料とコーンの間の空間に培養液等の液体を導入することが可能となり、使用し易い細胞剥離装置とすることができる。
また、ボトムプレートには、前記押さえ部材の溝の外周部に連通する孔を形成して該孔から前記溝に液を導入可能に構成したので、試験装置を組み立てた後で試験材料とコーンの間の空間に培養液等の液体を導入することが容易となる。また、ボトムプレートには、支持部材に螺合するねじを備えて前記コーン先端と試験材料表面との間隔調節を可能としたので、試験材料を固定したボトムプレートを容易にボトムプレート支持部材に固定し、また、コーンと試験材料との間隙の調節を行うことにより、細胞に対する液体の流動を所定状態に設定することができる。また、前記コーンホルダーの回転にかかわらず相対的に固定され、前記ボトムプレートを支持する支持部材と、前記ボトムプレートを固定すると共に、前記コーンホルダーを回転可能に支持する可動型アームにより、コーンを顕微鏡直下とそれ以外の部分との間に揺動自在に支持したので、コーンを顕微鏡直下部分から回転して取り扱いの容易な位置に移動することができ、各種の操作終了後には元の顕微鏡直下部分に戻して顕微鏡による観察を容易に行うことができる。
【００５８】
また、請求項２に係る発明は、前記押さえ部材と試験材料との間にはＯリングを備えたことを特徴とする請求項３記載のコーンプレート型細胞剥離装置としたので、試験材料を押さえ部材により押さる際、材料の表面形状に関わらず確実なシール状態で強固に固定することができる。
【００５９】
また、請求項３に係る発明は、前記試験材料は透明な材料載置プレートの窪みに載置することを特徴とする請求項１記載のコーンプレート型細胞剥離装置としたので、試験材料の装着が容易となり、しかも透明な材料載置プレートを用いているので下方からの光を透過させることができ、透光型顕微鏡によって試験材料の状態を観察することもできる。
【００６２】
また、請求項４に係る発明は、前記コーンホルダーの中心にコーン挿入口を設け、前記コーン挿入口にコーンの小径部を挿入した後、コーン押さえ部材によりコーンの上部を押圧固定したことを特徴とする請求項１記載のコーンプレート型細胞剥離装置としたので、コーンをコーンプレートに確実に固定することができる。
【００６３】
また、請求項５に係る発明は、前記コーンホルダーの回転駆動部はリングギアであり、前記リングギアを前記駆動装置のギアにより中間ギアを介して回転駆動することを特徴とする請求項１記載のコーンプレート型細胞剥離装置としたので、コーンの上方に駆動装置を設けることのないコーンの駆動機構を容易に形成することができる。
【００６４】
また、請求項６に係る発明は、前記試験材料は板状、膜状、３次元担体などの材料に播種した細胞であることを特徴とする請求項１記載のコーンプレート型細胞剥離装置としたので、各種形状の試験材料の表面に播種した血管内皮細胞等が血流によって剥離する状態を定量的に観察することができる。
【００６６】
また、請求項７に係る発明は、前記コーンの直径は１０ｍｍ程度の小径に設定したので、小型試験材料を少量の液体中で細胞の剥離を試験することができ、安価に且つ容易に試験を行うことができる。
【００６７】
また、請求項８に係る発明は、前記試験材料の直径は１５ｍｍ程度の小径に設定したので、小型試験材料を少量の液体中で細胞の剥離を試験することができ、安価に且つ容易に試験を行うことができる。
【００６９】
また、請求項９に係る発明は、前記コーンと試験材料との間隙を測定するレーザー変位センサーを設けたことを特徴とする請求項１記載のコーンプレート型細胞剥離装置としたので、コーンと試験材料との間隙の調節をサブミクロン単位で正確に行うことが可能となり、細胞に対する液体の流動を所定状態に厳密に設定することができる。
【００７１】
また、請求項１０に係る発明は、試験材料表面に顕微鏡の焦点を合わせる移動装置を前記駆動装置部分に設けたことを特徴とする請求項１記載のコーンプレート型細胞剥離装置としたので、顕微鏡における操作を行うことなく容易に顕微鏡の焦点を合わせることができる。
【００７２】
また、請求項１１に係る発明は、前記試験材料表面上の観察部位を変更するｘ−ｙ−ｚ軸方向可動装置を備えたことを特徴とする請求項１記載のコーンプレート型細胞剥離装置としたので、コーンを回転して試験を行っている状態で、顕微鏡で観察する部位を自由に移動することが可能となる。
【００７３】
また、請求項１２に係る発明は、前記顕微鏡は、前記試験材料の表面を上方から観察する超長焦点対物レンズを備えた落射型蛍光顕微鏡であることを特徴とする請求項１記載のコーンプレート型細胞剥離装置としたので、試験材料の表面を顕微鏡により上方から容易に観察することができる。
【００７４】
また、請求項１３に係る発明は、前記顕微鏡は、前記試験材料の表面側から投光する照明装置と、裏側から投光する照明装置とを備えたことを特徴とする請求項１記載のコーンプレート型細胞剥離装置としたので、試験材料の特性に合わせて正立型落射蛍光顕微鏡として、また倒立型透過顕微鏡として使用することができる。
【００７５】
また、請求項１４に係る発明は、少なくとも試験材料周辺装置を内部に収容し、内部を一定の温度に制御することができるボックスを備えたことを特徴とする請求項１記載のコーンプレート型細胞剥離装置としたので、ボックス内において例えば生体の標準環境としての３７℃等に容易に且つ正確に設定することができ、正確な測定及び観察を行うことができる。
【００７６】
また、請求項１５に係る発明は、少なくとも前記顕微鏡を載置する一体型防振板を備えたことを特徴とする請求項１記載のコーンプレート型細胞剥離装置としたので、顕微鏡の振動に対する影響を少なくすることができ、外部から振動を受けることにより発生する画像ノイズを少なくすることができる。
【００７７】
また、請求項１６に係る発明は、前記コーンの回転を制御するコンピュータを備えたことを特徴とする請求項１記載のコーンプレート型細胞剥離装置としたので、コーンの回転を所定の値に確実に制御することができる。
【００７８】
また、請求項１７に係る発明は、前記落射顕微鏡には超高感度カメラを備えたことを特徴とする請求項１記載のコーンプレート型細胞剥離装置としたので、コーンによって撹拌される血液等の状態を正確に撮影することができる。
【００７９】
また、請求項１８に係る発明は、前記落射顕微鏡には画像解析装置を接続したことを特徴とする請求項１記載のコーンプレート型細胞剥離装置としたので、顕微鏡で得られた画像を容易に解析することができ、その画像データを適宜加工することもできる。
【００８０】
また、請求項１９に係る発明は、前記落射顕微鏡にはビデオを接続したことを特徴とする請求項１記載のコーンプレート型細胞剥離装置としたので、顕微鏡により得られた観察画像を長期間記録しておくことができ、必要なときにこれを出力して観察することができる。
【００８１】
また、請求項２０に係る発明は、前記落射顕微鏡にはモニタを接続したことを特徴とする請求項１記載のコーンプレート型細胞剥離装置としたので、顕微鏡により得られた画像をモニタで見ることができ、容易に観察を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明による細胞剥離装置の実施例の全体構成を示すシステム概要図である。
【図２】同実施例のボトムプレート及びコーンホルダー近傍の部品の組立状態を示す断面図である。
【図３】同実施例のボトムプレート及びコーン、コーンホルダー近傍の部品の分解状態を示す断面図である。
【図４】同実施例のボトムプレートと材料載置プレート及び試験材料を示す図であり、（ａ）はボトムプレートの一部断面図及び平面図であり、（ｂ）は材料載置プレートの一部断面図及び平面図、並びに試験材料の平面図を示す。
【図５】同実施例の押さえプレートとＯリングを示す図であり、（ａ）は押さえプレートの断面図及び平面図、（ｂ）はＯリングの断面図及び平面図である。
【図６】同実施例のコーンホルダー及びコーン押さえ部材、並びにコーンを示す図であり、（ａ）はコーンホルダーの一部断面図及び平面図、（ｂ）はコーン押さえ部材の一部断面図及び平面図、（ｃ）はコーンの側面図及び平面図である。
【符号の説明】
１  ボトムプレート
７  支持部材
８  材料載置プレート
１０  試験材料
１１  押さえプレート
１４  Ｏリング
２０  コーンホルダー
２３  コーン
３０  モータ
３１  支持プレート
３２  ギア
３３  中間ギア
３４  リングギア
４０  コンピュータ
４２  正立型落射蛍光顕微鏡
４３  ボックス
４４  温度制御装置
４７  Ｘ−Ｙステージ
４８  レーザー変位センサー
４９  円錐−平板型剪断応力負荷装置
５１  対物レンズ
５２  水銀ランプ
５３  フィルター
５４  ハーフミラー
５６  ＳＩＴカメラ
５７  イメージプロセッサ
５９  ＶＴＲ
６０  モニタ
６１  ハロゲンランプ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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