(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸配列が配列番号２のアミノ酸残基23〜246に少なくとも90％一致するアミノ酸残基の配列を含んでなる単離されたポリペプチドであって、血管内皮細胞上のVCAM-1の発現を阻害するポリペプチド。
【請求項２】
前記ポリペプチドのアミノ酸配列が配列番号２のアミノ酸残基23〜246に少なくとも95％一致する請求項１記載の単離されたポリペプチド。
【請求項３】
前記ポリペプチドが配列番号２のアミノ酸残基23〜246を含んでなる、請求項１記載の単離されたポリペプチド。
【請求項４】
前記ポリペプチドと配列番号２の間の差異が保存的アミノ酸置換によるものである請求項１又は２に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項５】
配列番号１に記載のヌクレオチド配列又はその相補配列からなるポリヌクレオチドに高緊縮洗浄条件後にハイブリッド形成したままで存在するポリヌクレオチドによりコードされ、且つ血管内皮細胞上のVCAM-1の発現を阻害するポリペプチド。
【請求項６】
アフィニティ標識、トキシン、放射性ヌクレオチド、酵素および発蛍光団からなる群より選択される部分にアミノまたはカルボキシル末端で共有結合している請求項１〜５のいずれか１項に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項７】
ペプチド結合により結合した第一部分と第二部分を含んでなる融合タンパク質であって、当該第一部分が、請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリペプチドであり、そして当該第二部分が他のポリペプチドを含んでなる融合タンパク質。
【請求項８】
医薬的に許容しうるビークルと組合わされた、請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項９】
前記項１〜５のいずれか１項に記載のポリペプチドに特異的に結合する抗体または同様に結合する抗体フラグメント。
【請求項１０】
前記抗体が、
ａ）ポリクローナル抗体；
ｂ）マウス・モノクローナル抗体；
ｃ）上記ｂ）から誘導されるヒト型化抗体；および
ｄ）ヒトモノクローナル抗体；
からなる群より選択される請求項９に記載の抗体。
【請求項１１】
前記抗体フラグメントがＦ（ab')、F(ab)、Fab'、Fab、Fv、scFv、および最少認識単位からなる群より選択される請求項９に記載の抗体フラグメント。
【請求項１２】
請求項９に記載の当該抗体に特異的に結合する抗イディオタイプ抗体。
【請求項１３】
アミノ酸配列が配列番号２の残基23〜246に少なくとも90％一致するアミノ酸残基の配列を含んでなり且つ血管内皮細胞上のVCAM-1の発現を阻害するポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１４】
前記ポリペプチドのアミノ酸配列が配列番号２のアミノ酸残基23〜246に少なくとも95％一致する請求項13に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１５】
前記ポリペプチドが配列番号２のアミノ酸残基23〜246を含んでなる、請求項13に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１６】
前記ポリペプチドと配列番号２の間の差異が保存的アミノ酸置換によるものである請求項13〜15のいずれか１項に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１７】
配列番号１のヌクレオチド配列または配列番号１の相補体からなるポリヌクレオチドに高緊縮洗浄条件後にハイブリッド形成したままで存在するポリヌクレオチドであって、血管内皮細胞上のVCAM-1の発現を阻害するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
【請求項１８】
単離されたポリヌクレオチドであって、
ａ）配列番号１のヌクレオチド１ないしヌクレオチド1696のヌクレオチド配列；
ｂ）配列番号１のヌクレオチド69ないしヌクレオチド806のヌクレオチド配列；及び
ｃ）配列番号１のヌクレオチド135ないしヌクレオチド806のヌクレオチド配列；
からなる群より選択される単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１９】
請求項７に記載の融合タンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２０】
作用可能に結合した下記の要素：
転写プロモーター；
請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードするDNAセグメント；および
転写ターミネーター；
を含んでなる発現ベクター。
【請求項２１】
前記DNAセグメントが配列番号２の残基23〜246に少なくとも95％アミノ酸配列が一致するポリペプチドをコードする請求項20に記載の発現ベクター。
【請求項２２】
前記ポリペプチドと配列番号２の間の差異が保存的アミノ酸置換によるものである請求項20又は21に記載の発現ベクター。
【請求項２３】
前記ポリペプチドが配列番号２のアミノ酸残基23〜246を含んでなる、請求項21に記載の発現ベクター。
【請求項２４】
前記DNAセグメントがアフィニティ標識にアミノまたはカルボキシル末端で共有結合したポリペプチドをコードする請求項20〜23のいずれか１項に記載の発現ベクター。
【請求項２５】
前記DNAセグメントが、当該ポリペプチドに作用可能に結合した分泌シグナル配列をさらにコードする請求項20〜24のいずれか１項に記載の発現ベクター。
【請求項２６】
前記分泌シグナル配列が配列番号２の残基１〜22を含んでなる請求項25に記載の発現ベクター。
【請求項２７】
請求項20〜26のいずれか１項に記載の発現ベクターを導入した培養細胞であって、当該細胞が当該DNAセグメントによりコードされた当該ポリペプチドを発現する培養細胞。
【請求項２８】
請求項20〜26のいずれか１項に記載の発現ベクターを導入した細胞を培養し、それによって当該細胞が当該DNAセグメントによりコードされた当該ポリペプチドを発現し、次いで、当該発現ポリペプチドを回収することからなるポリペプチドの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
エネルギーバランス（エネルギー代謝、栄養状態、脂質貯蔵などを含む）は健康にとっての重要な基準である。このエネルギー恒常性は、随意および不随意機能に必要なエネルギーを生じさせるためには、食物の取込みおよび炭水化物と脂質の代謝を必要とする。タンパク質代謝はエネルギーを生成させ得るが、好ましくは筋肉の形成または修復に導く。その他の結果では、エネルギー恒常性の欠如が脂肪細胞の過剰または過少形成を招く。
【０００２】
脂質の形成と貯蔵はインシュリンが制御している。例えば、インシュリンはグルコースの細胞内への輸送を促進し、そこでグルコースはα−グリセロリン酸に代謝され、脂肪酸のエステル化に使用されてトリグリセリドとしてその貯蔵を可能とする。さらに、脂肪細胞（adipocytes）は特定の輸送タンパク質を発現し、それが遊離脂肪酸の脂肪細胞への輸送を上昇させる。
【０００３】
また、脂肪細胞はグルコースと脂質代謝の恒常的コントロールに関わると信じられる数種のタンパク質を分泌する。これらのさらなる脂肪細胞分泌タンパク質は、アジプシン、補体ファクターC3とＢ、腫瘍壊死因子α、ob遺伝子産物およびAcrp30を包含する。また、証拠によると、脂肪細胞にはインシュリン制御分泌経路の存在が示唆される。Scherer et al., J. Biol. Chem. 270(45): 26746-9, 1995。脂肪細胞組織の過剰または過少形成により部分的に衝撃を受けたこれら一部分の過剰または過少分泌が、肥満または食欲不振と直接的または間接的に関連する病状に至らしめる。
【０００４】
Acrp30は専ら脂肪細胞により発現されるアミノ酸247個のポリペプチドである。Acrp30ポリペプチドは、アミノ末端シグナル配列、相同性未知のアミノ酸27個の鎖、22個の完全Gly-Xaa-Proまたは不完全Gly-Xaa-Xaaコラーゲン反復、およびカルボキシ末端球状ドメインから構成される。参照：上記のシェラー（Scherer）ら、および国際特許出願番号WO96/39429。インシュリンにより制御される遍在性ヒト血清タンパク質Acrp30は、補体ファクターC1qおよび冬眠シベリアシマリスの夏期血清タンパク質（Hib27）に、取分けそのカルボキシ末端球状ドメインにおいて構造の類似性を有する。Acrp30の発現は脂肪細胞の分化に際し、100倍以上誘発される。Acrp30はエネルギーバランスの調整において、またテストサンプル中の脂肪細胞同定においての使用が示唆される。
【０００５】
脂肪細胞において専ら産生されると思われるもう一つのタンパク質は、例えば、Maeda et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 221: 286-9 (1996)に記載されたapM1である。4517bpのクローンは244個のアミノ酸のオープンリーディングフレームと長鎖３’非翻訳領域をもっていた。該タンパク質はシグナル配列、アミノ末端非コラーゲン性配列、22個のコラーゲン反復（Gly-Xaa-ProまたはGly-Xaa-Xaa）、およびコラーゲンＸに相同性を有するカルボキシ末端領域、コラーゲンVIIIおよび補体タンパク質C1qを含んでいた。
【０００６】
補体ファクターC1qは３種の関連ポリペプチド（Ａ、ＢおよびＣ鎖）の６コピーからなり、それぞれのポリペプチドは近位アミノ末端コラーゲンドメインとカルボキシ末端球状領域を有する約225個のアミノ酸長である。６個の三重ヘリックス領域はシックスＡ、シックスＢおよびシックスＣ鎖のコラーゲンドメインにより形成され、中心領域と６個のストークを形成する。球状の頭部はＡ鎖、Ｂ鎖およびＣ鎖の球状カルボキシ末端ドメインの会合により形成される。従って、C1qは６個のコラーゲン様ストークを介して中心原繊維領域に結合した６個の球状頭部から構成される。Sellar et al., Biochem. J. 274: 481-90, 1991。この立体配置はしばしば花束という。Acrp30は単一型のポリペプチド鎖から形成される同様の花束構造を有する。
【０００７】
C1qは防御メカニズムを刺激し、また、組織障害の原因となり得る毒性酸素種生成の誘因となることが判明している（Tenner, Behring Inst. Mitt. 93: 241-53, 1993）。C1q結合部位が血小板上に見出されている。さらに、補体とC1qは炎症での役割を演じる。補体の活性化はC1qが免疫グロブリンに結合することで開始される。
C1qと補体経路の阻害剤は、抗炎症応用、補体活性化と血栓活性の阻害に有用となろう。
本発明は、これらの用途と本明細書の教示から当業者にも明らかとなる他の用途に使用し得るかかるポリペプチドを提供する。
【０００８】
（発明の開示）
一側面において、本発明はアミノ酸配列が配列番号２の残基51〜246に少なくとも75％一致するアミノ酸残基の配列を含んでなる単離されたポリペプチドであって、当該配列が：コラーゲンドメインを形成するGly-Xaa-XaaまたはGly-Xaa-Proの反復（ただし、Xaaはいずれかのアミノ酸である）および10個のベータ鎖を含んでなるカルボキシル末端C1qドメインを含んでなる単離されたポリペプチドを提供する。一態様において、当該ポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号２の残基23〜246に少なくとも90％一致する。
【０００９】
他の態様において、該コラーゲンドメインは15個のGly-Xaa-Xaa反復および６個のGly-Xaa-Pro反復からなる。他の態様において、該カルボキシル末端C1qドメインは配列番号10の配列を含んでなる。他の態様において、当該カルボキシル末端C1qドメインは配列番号２のアミノ酸残基119〜123、140〜142、148〜151、155〜158、161〜173、175〜182、190〜197、200〜212、217〜222および236〜241を含んでなる。他の態様において、該ポリペプチドと配列番号２の間の差異は保存的アミノ酸置換によるものである。他の態様において、該ポリペプチドは配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチドと特異的に結合する抗体と特異的に結合する。
【００１０】
さらに他の態様において、該ポリペプチドは配列番号２の残基23〜246を含んでなる。他の態様において、該コラーゲンドメインは配列番号２のアミノ酸残基51〜113からなる。なお他の態様において、該C1qドメインは配列番号２のアミノ酸残基114〜246からなる。他の態様において、該ポリペプチドはアフィニティ標識、トキシン、放射性ヌクレオチド、酵素および発蛍光団からなる群より選択される部分にアミノまたはカルボキシル末端で共有結合している。
【００１１】
さらに提供されるのは、単離されたポリペプチドであって、
ａ）アミノ酸配列が配列番号２のアミノ酸残基51ないしアミノ酸残基113に少なくとも80％一致するアミノ酸残基の配列からなるポリペプチドであって、コラーゲンドメインを形成するGly-Xaa-XaaおよびGly-Xaa-Proの反復からなるポリペプチド；
【００１２】
ｂ）アミノ酸配列が配列番号２のアミノ酸残基114ないしアミノ酸残基246に少なくとも80％一致するアミノ酸残基の配列からなるポリペプチドであって、配列番号５の配列を含んでなるポリペプチド；および
ｃ）アミノ酸配列が配列番号２のアミノ酸残基51ないしアミノ酸残基246に少なくとも80％一致するアミノ酸残基の配列からなるポリペプチドであって、コラーゲンドメインを形成するGly-Xaa-XaaおよびGly-Xaa-Proの反復からなるポリペプチドであり、配列番号５の配列を含んでなるポリペプチド；
からなる群より選択される単離されたポリペプチドである。
【００１３】
他の側面においては、ペプチド結合により結合した第一部分と第二部分を含んでなる融合タンパク質であって、当該第一部分が、
ａ）アミノ酸配列が配列番号２のアミノ酸残基51ないしアミノ酸残基246に少なくとも75％一致するアミノ酸残基の配列を含んでなるポリペプチド；
ｂ）アミノ酸残基１ないしアミノ酸残基246の配列番号２に示したアミノ酸残基の配列を含んでなるポリペプチド；
ｃ）コラーゲン様ドメインまたは二量化もしくはオリゴマー化し得るコラーゲン様ドメインの一部を含んでなる、配列番号２のzacrp3ポリペプチドの部分；
ｄ）C1qドメインまたはC1qドメインの活性部分を含んでなる、配列番号２のzacrp3ポリペプチドの部分；または
【００１４】
ｅ）コラーゲン様ドメインおよびC1qドメインを含んでなる、配列番号２のzacrp3ポリペプチドの部分；からなる群より選択されるポリペプチドからなり、当該第二部分が他のポリペプチドを含んでなる融合タンパク質が提供される。
【００１５】
一態様においては、当該第一部分が、
ａ）配列番号２のアミノ酸残基51ないしアミノ酸残基113の配列からなるポリペプチド；
ｂ）配列番号２のアミノ酸残基114ないしアミノ酸残基246の配列からなるポリペプチド；
ｃ）配列番号２のアミノ酸残基51ないし246の配列からなるポリペプチド；
からなる群より選択される。
また、本発明は医薬的に許容しうるビークルと併合した上記のポリペプチドを提供する。
【００１６】
他の側面において、本発明は上記のポリペプチドに特異的に結合する抗体または抗体フラグメントを提供する。一態様において、該抗体が、
ａ）ポリクローナル抗体；
ｂ）マウス・モノクローナル抗体；
ｃ）上記ｂ）から誘導されるヒト型化抗体；およびｄ）ヒトモノクローナル抗体；からなる群より選択される。他の態様において、該抗体フラグメントはF(ab')、F(ab)、Fab'、Fab、Fv、scFv、および最少認識単位からなる群より選択される。他の態様において提供されるのは、上記抗体に特異的に結合する抗イディオタイプ抗体である。
【００１７】
他の側面において、本発明はアミノ酸配列が配列番号２の残基51〜246に少なくとも75％一致するアミノ酸残基の配列を含んでなるポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドであって、当該配列がコラーゲンドメインを形成するGly-Xaa-XaaまたはGly-Xaa-Proの反復（ただし、Xaaはいずれかのアミノ酸である）；および10個のベータ鎖を含んでなるカルボキシル末端C1qドメイン；を含んでなるポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【００１８】
一態様において、当該ポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号２の残基23〜246に少なくとも90％一致する。他の態様において、当該コラーゲンドメインは15個のGly-Xaa-Xaa反復および６個のGly-Xaa-Pro反復からなる。他の態様において、当該カルボキシル末端C1qドメインが配列番号５の配列を含んでなる。他の態様において、当該カルボキシル末端C1qドメインは配列番号２のアミノ酸残基119〜123、140〜142、148〜151、155〜158、161〜173、175〜182、190〜197、200〜212、217〜222および236〜241を含んでなる。
【００１９】
他の態様において、該ポリペプチドと配列番号２の間の差異は保存的アミノ酸置換によるものである。さらに他の態様において、該ポリペプチドは配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチドと特異的に結合する抗体と特異的に結合する。他の態様において、該ポリペプチドは配列番号２の残基23〜246を含んでなる。他の態様において、該コラーゲンドメインは配列番号２のアミノ酸残基51〜113からなる。さらに他の態様において、該カルボキシル末端C1qドメインは配列番号２のアミノ酸配列114〜246からなる。
【００２０】
さらに提供されるのは、単離されたポリヌクレオチドであって、
ａ）配列番号１のヌクレオチド１ないしヌクレオチド1696のヌクレオチド配列；
ｂ）配列番号１のヌクレオチド69ないしヌクレオチド806のヌクレオチド配列；
ｃ）配列番号１のヌクレオチド135ないしヌクレオチド806のヌクレオチド配列；
ｄ）配列番号１のヌクレオチド219ないしヌクレオチド806のヌクレオチド配列；
【００２１】
ｅ）配列番号１のヌクレオチド408ないしヌクレオチド806のヌクレオチド配列；
ｆ）配列番号１のヌクレオチド69ないしヌクレオチド407のヌクレオチド配列；
ｇ）配列番号１のヌクレオチド135ないしヌクレオチド407のヌクレオチド配列；
ｈ）配列番号１のヌクレオチド219ないしヌクレオチド407のヌクレオチド配列；
【００２２】
ｉ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、該ポリペプチドは配列番号２の残基51ないし113のアミノ酸配列からなるポリペプチドに少なくとも75％一致するアミノ酸残基の配列からなる；
ｊ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、該ポリペプチドが配列番号２の残基114ないし246のアミノ酸配列からなるポリペプチドに少なくとも75％一致するアミノ酸残基の配列からなる；
ｋ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、該ポリペプチドは配列番号２の残基51ないし246のアミノ酸配列からなるポリペプチドに少なくとも75％一致するアミノ酸残基の配列からなる；
【００２３】
ｌ）配列番号２の残基23ないし113のアミノ酸配列からなるポリペプチドに少なくとも75％一致するアミノ酸残基の配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
ｍ）配列番号１のヌクレオチド配列または配列番号１の補体からなるポリヌクレオチドに緊縮洗浄条件後にハイブリッド形成したままで存在するポリヌクレオチド；
ｎ）上記ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、ｅ）、ｆ）、ｇ）、ｈ）、ｉ）、ｊ）、ｋ）、ｌ）またはｍ）に相補的なヌクレオチド配列；および
ｏ）上記ｉ）、ｊ）、ｋ）またはｌ）の縮重ヌクレオチド配列；からなる群より選択される単離されたポリヌクレオチドである。
【００２４】
さらに提供されるのは、ペプチド結合により結合した第一部分と第二部分を含んでなる融合タンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチドであって、当該第一部分が、
ａ）アミノ酸配列が配列番号２のアミノ酸残基51ないし246に少なくとも75％一致するアミノ酸残基の配列を含んでなるポリペプチド；
ｂ）配列番号２のアミノ酸残基１ないし246の配列を含んでなるポリペプチド；
ｃ）配列番号２のアミノ酸残基23ないし246の配列を含んでなるポリペプチド；
ｄ）配列番号２のアミノ酸残基23ないし113の配列を含んでなるポリペプチド；
【００２５】
ｅ）配列番号２のアミノ酸残基１ないし113の配列を含んでなるポリペプチド；
ｆ）コラーゲン様ドメインまたは二量化もしくはオリゴマー化し得るコラーゲン様ドメインの部分を含んでなる、配列番号２のポリペプチドの部分；
ｇ）C1qドメインを含む配列番号２のポリペプチドの一部；または
ｈ）コラーゲン様ドメインおよびC1qドメインを含む、配列番号２のポリペプチドの部分；からなる群より選択され、そして
当該第二部分が他のポリペプチドを含んでなる融合タンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチドである。
【００２６】
さらに提供されるのは、配列番号10のヌクレオチド１ないしヌクレオチド738の配列からなる単離されたポリヌクレオチドである。
他の側面において、本発明は以下の作用可能に結合したエレメント、すなわち、転写プロモーター；上記のポリペプチドをコードするDNAセグメント；および転写ターミネーター；を含んでなる発現ベクターを提供する。一態様において、該DNAセグメントは配列番号２の残基23〜246に少なくとも90％アミノ酸配列が一致するポリペプチドをコードする。他の態様において、該コラーゲンドメインは15個のGly-Xaa-Xaa反復および６個のGly-Xaa-Pro反復からなる。他の態様において、該カルボキシル末端C1qドメインは配列番号10の配列を含んでなる。
【００２７】
他の態様において、該カルボキシル末端C1qドメインは配列番号２のアミノ酸残基119〜123、140〜142、148〜151、155〜158、161〜173、175〜182、190〜197、200〜212、217〜222および236〜241を含んでなる。他の態様において、当該ポリペプチドと配列番号２の間の差異は保存的アミノ酸置換によるものである。なお他の態様において、該ポリペプチドは配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチドと特異的に結合する抗体と特異的に結合する。
【００２８】
さらに他の態様において、該DNAセグメントは配列番号２の残基23〜246を含んでなるポリペプチドをコードする。一態様において、該コラーゲンドメインは配列番号２のアミノ酸残基51〜113からなる。なお他の態様において、該C1qドメインは配列番号２のアミノ酸残基114〜246からなる。なお他の態様において、該DNAセグメントはアフィニティ標識にアミノまたはカルボキシル末端で共有結合したポリペプチドをコードする。他の態様において、該DNAセグメントは当該ポリペプチドに操作可能に結合した分泌シグナル配列をさらにコードする。関連する態様において、当該分泌シグナル配列は配列番号２の残基１〜22を含んでなる。
【００２９】
他の側面において、本発明は、上記の発現ベクターを導入した培養細胞であって、該DNAセグメントによりコードされた当該ポリペプチドを発現する培養細胞を提供する。
他の側面において、本発明は、上記の発現ベクターを導入した細胞を培養し、それによって当該細胞が当該DNAセグメントによりコードされた当該ポリペプチドを発現し、次いで、当該発現ポリペプチドを回収することからなるポリペプチドの製造方法を提供する。
（発明を実施するための最良の形態）
本発明を詳細に説明する前に、以下の用語を定義することが、それを理解する上で役立つであろう。
本明細書にて使用する“アフィニティ標識（タグ）”という用語は、ポリペプチドに付着させて、該ポリペプチドの精製または検出用とするか、または該ポリペプチドが基質に接合する部位を提供するペプチドセグメントを意味する。基本的には、抗体または他の特異結合試薬を利用し得るペプチドまたはタンパク質がアフィニティ標識として使用し得る。
【００３０】
アフィニティ標識としては、ポリヒスチジン系、プロテインＡ（Nilsson et al., EMBO J. 4:1075, 1985; Nilsson et al., Methods Enzymol. 198: 3, 1991）、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（Smith and Johnson, Gene 67: 31, 1988）、サブスタンスＰ、フラッグ（Flag；商標）ペプチド（Hopp et al., Biotechnology 6: 1204-10, 1988; イーストマン・コダック（Eastman Kodak）社（ニューヘブン、コネチカット）より入手可能）、ストレプトアビジン結合ペプチド、またはその他の抗原性エピトープまたは結合ドメインを包含する。全般的参照：Protein Expression and Purification 2: 95-107, 1991。アフィニティ標識をコードするDNA類は民間供給業者（例えば、ファルマシア・バイオテック（Pharmacia Biotech)、ピスカッタウェイ（Piscataway）、ニュージャーシー）から入手し得る。
【００３１】
“対立遺伝子変異体”という用語は同一の染色体座を占める遺伝子の２種以上の代り得る形状を意味する。対立遺伝子変異は突然変異を経て自然に起こり、集団内での表現型多型性を生じる。遺伝子突然変異はサイレントであってもよいし（コードされたポリペプチドに変化なし）、あるいは変化したアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードしていてもよい。対立遺伝子変異体という用語は、本明細書において、遺伝子の対立遺伝子変異体によってコードされたタンパク質を意味するのにも使用する。
【００３２】
“アミノ末端”および“カルボキシル末端”という用語は、本明細書におい、ポリペプチドおよびタンパク質上の位置を示すために使用する。状況が許す場合、これらの用語はポリペプチドまたはタンパク質の特定配列または部分を参照して、近接位または関連位置を示すために使用する。例えば、タンパク質上の参照配列に対してカルボキシル末端に位置するある配列は、参照配列のカルボキシル末端に隣接した位置にあるが、必ずしも全タンパク質のカルボキシル末端にある訳ではない。
【００３３】
“相補体／抗相補体対”という用語は、適切な条件下で非共有結合により会合した安定な対を形成する非同一部分を意味する。例えば、ビオチンとアビジン（またはストレプトアビジン）は相補体／抗相補体対の原型の一つである。他の代表的な相補体／抗相補体対は、レセプター／リガンドの対、抗体／抗原（またはハプテンもしくはエピトープ）の対、センス／アンチセンス・ポリヌクレオチド対、などである。補体／抗補体対を引続き解離させたい場合は、相補体／抗相補体対の結合親和性を＜109M-1とする。
【００３４】
“ポリヌクレオチド分子の相補体”という用語は、ポリヌクレオチド分子が相補性の塩基配列をもち、その配列が参照配列に比較して逆の配向をもつことを意味する。例えば、5’ATGCACGGG 3’配列は5’CCCGTGCAT3’に相補的である。
【００３５】
“コンティグ”という用語はポリヌクレオチドの同一または相補性配列がもう一つのポリヌクレオチドに重複しつつ連続する鎖をもつことを意味する。重複しつつ連続している配列とはポリヌクレオチド配列の一定の鎖長が“重なり合う”ことをいい、その重なりは該ポリヌクレオチドの全体または一部分の鎖である。例えば、ポリヌクレオチド配列5’-ATGGCTTAGCTT-3’の代表的なコンティグは5’-TAGCTTgagtct-3’と3’-gtcgacTACCGA-5’である。
【００３６】
“縮重ヌクレオチド配列”という用語は１個以上の縮重コドンを含むヌクレオチドの配列を意味する（ポリペプチドをコードする参照ポリヌクレオチド分子に比較して）。縮重コドンは異なるトリプレット・ヌクレオチドを含むが、同じアミノ酸残基をコードする（すなわち、GAUとGACのトリプレットはそれぞれがAspをコードする）。
【００３７】
“発現ベクター”という用語は線状または環状のDNA分子を意味し、対象のポリペプチドをコードするセグメントを含んでなり、該セグメントがその転写のために準備したさらなるセグメントに操作可能に結合している分子である。かかるさらなるセグメントはプロモーターおよびターミネーター配列を含み、任意には１個以上の複製起源、１個以上の選択マーカー、エンハンサー、ポリアデニル化シグナルなどを含んでもよい。発現ベクターは一般にプラスミドまたはウイルスDNA由来であるか、または両方の要素を含んでいてもよい。
【００３８】
“単離された”という用語は、ポリヌクレオチドに適用する場合、そのポリヌクレオチドが天然の遺伝環境から取出したものであり、他の外来性または不所望のコーディング配列を含まず、かつ、遺伝子工学によるタンパク質生産システムでの使用に適した形状にあることを意味する。かかる分離分子とはその自然環境から分離される分子であり、ｃDNAおよびゲノムクローンを含む。本発明の分離分子は当初会合していた他の遺伝子を含まないが、天然に存在するプロモーターやターミネーターなどの５’および３’非翻訳領域は含んでいてもよい。会合領域の確認は当業者にとって明瞭である（参照、例えば、Dynan and Tijan, Nature 316: 774-78, 1985)。
【００３９】
“単離された”ポリペプチドまたはタンパク質とは本来の環境以外の、例えば、血液や動物組織から離れて見出されるポリペプチドまたはタンパク質である。好適な形状の単離されたポリペプチドは、他のポリペプチド、特に動物起源の他のポリペプチドを実質的に含まない。好ましいのは、高純度形状、すなわち、純度95％以上、より好ましくは純度99％を超えるポリペプチドを提供することである。本明細書にて使用する場合、“単離された”という用語は、物理的に代わり得る形状の同じポリペプチド、二量体またはグリコシル化もしくは誘導化体などのものの存在を排除するものではない。
【００４０】
“作用可能に結合”という用語は、DNAセグメントに関していう場合、該セグメントが意図した目的に合致して機能するように、例えば、転写がプロモーターで始まり、コーディングセグメントを経てターミネーターまで進むように配列していることを意味する。
“オーソログ”という用語は一つの種から得られるポリペプチドまたはタンパク質が異なる種からのポリペプチドまたはタンパク質の機能的カウンターパートであることを意味する。オーソログ間の配列異同は種分化の結果である。
“パラログ”とは生体により造られたタンパク質が異なってはいるが、構造的には関連性のあることである。パラログは遺伝子の複製を介して生じると信じられる。例えば、α−グロビン、β−グロビン、およびミオグロビンは互いにパラログである。
【００４１】
“ポリヌクレオチド”という用語は５’末端から３’末端に向かって読取るデオキシリボブクレオチドまたはリボヌクレオチドの一本鎖または二本鎖ポリマーを意味する。ポリヌクレオチドはRNAとDNAを含み、天然資源から単離してもよく、インビトロで合成しても、天然および合成分子の併合により調製してもよい。ポリヌクレオチドのサイズは塩基対（“bp”と略記）で、またはヌクレオチド（“nt”）で、またはキロベース（“kb”）で表される。状況が許すならば、後者二種の用語は一本鎖または二本鎖であるポリヌクレオチドを記述することができる。
【００４２】
この用語を二本鎖分子に適用する場合には、全鎖長を意味するために使用し、“塩基対”という用語に等価であると理解されよう。二本鎖ポリヌクレオチドの二本の鎖はその長さにおいて僅かに異なり得るものであり、またその末端は酵素の切断の結果として互い違いになり得ることを当業者は認知するであろう；従って、二本鎖ポリヌクレオチドのヌクレオチドすべてが対となる訳ではない。かかる非対合末端は一般に20ntを超える長さになることはない。
【００４３】
“ポリペプチド”は天然産であっても合成製造品であってもペプチド結合により結合したアミノ酸残基のポリマーである。アミノ酸残基約10未満のポリペプチドは一般に“ペプチド”という。
【００４４】
本明細書に使用する“プローブおよび／またはプライマー”はRNAまたはDNAである。DNAはcDNAでもゲノムDNAでもよい。ポリヌクレオチドプローブおよびプライマーは一本鎖または二本鎖DNAまたはRNAであり、一般には合成オリゴヌクレオチドであるが、クローン化cDNAまたはゲノム配列またはその補体から生成させてもよい。分析用プローブは一般に少なくともヌクレオチド20個の長さがあるが、幾分短いプローブ（14〜17ヌクレオチド）も使用し得る。PCRプライマーは少なくとも５個のヌクレオチド、好ましくは15個以上のnt、より好ましくは20〜30個のntの鎖長である。
【００４５】
遺伝子の小領域を分析対象とする場合には、短いポリヌクレオチドを使用してもよい。遺伝子の大量分析用には、ポリヌクレオチドプローブが１個以上の全エキソンを含んでいてもよい。プローブは酵素、ビオチン、放射性核種、発蛍光団、化学発光体、常磁性粒子などで検出可能なシグナルを生じるように標識し得るが、これらは多くの供給源、例えば、モレキュラー・プローブ・インク（Molecular Probes, Inc.; ユージン、オレゴン）、およびアマーシャム・コープ（Amersham Corp.; アーリントンハイツ、イリノイ）などから市販品として入手可能であり、技術上周知の技法で使用し得る。
【００４６】
“プロモーター”という用語はRNAポリメラーゼが結合し、転写を開始するためのDNA配列を含む遺伝子の部分を意味する。プロモーター配列は共通ではあるが、常時というものではなく、遺伝子の５’非コーディング領域に見出される。
【００４７】
“レセプター”という用語は生物活性分子（すなわち、リガンド）に結合し、細胞上のリガンドの作用を仲介する細胞会合タンパク質を意味する。膜結合レセプターは細胞外リガンド結合ドメインおよび一般にシグナル変換に関わる細胞内エフェクタードメインを含んでなる複合ドメイン構造により特徴づけられる。リガンドがレセプターに結合すると、細胞内でエフェクタードメインと他の分子関に相互作用を引起すレセプターに立体配座の変化をもたらす。この相互作用はさらに細胞の代謝に変化をもたらす。
【００４８】
レセプター−リガンド相互作用に関与する代謝事象は遺伝子転写、リン酸化、脱リン酸化、サイクリックAMP産生増大、細胞性カルシウムの可動化、膜脂質の可動化、細胞接着、イノシトール脂質の水解とリン脂質の水解を包含する。また、殆どの核レセプターはアミノ末端、トランス活性化ドメイン、DNA結合ドメインおよびリガンド結合ドメインを含む複合ドメイン構造を有する。一般に、レセプターは膜結合性、細胞質ゾルまたは核性であり、単量体性（例えば、甲状腺刺激ホルモンレセプター、β−アドレナリン作動性レセプター）または多量体（例えば、PDGFレセプター、成長ホルモンレセプター、IL-3レセプター、GM-CSFレセプター、G-CSFレセプター、エリトロポイエチンレセプターおよびIL-6レセプター）であってもよい。
【００４９】
“分泌シグナル配列”という用語は、より大きなポリペプチドの一成分として、そのより大きなポリペプチドを合成する細胞の分泌経路を介してそのより大きなポリペプチドに指令するポリペプチド（分泌ぺプチド）をコードするDNA配列を意味する。より大きなペプチドは一般に分泌経路を通過する間に切断されて分泌ペプチドを除去される。
【００５０】
“可溶性レセプター”は細胞膜に結合していないレセプターポリペプチドである。可溶性レセプターは、最も共通には、透過膜と細胞質ドメインを欠くリガンド結合レセプターポリペプチドである。可溶性レセプターはさらなるアミノ酸残基、例えば、ポリペプチドの精製を可能とする、または該ポリペプチドを基質に付着させる部位を備えたアフィニティ標識、または免役グロブリン不変部領域配列などを含んでなる。多くの細胞表面レセプターは、タンパク質分解により産生されるか、または第二のスプライスmRNAから翻訳される天然産の可溶性カウンターパートを有する。レセプターポリペプチドは、膜固定またはシグナル伝達にそれぞれ備わっているこれらセグメントの十分な部分を欠く場合、透過膜と細胞内ポリペプチドセグメントから実質的に遊離していると言われている。
【００５１】
本明細書にて使用される“スプライス変異体”という用語は、遺伝子から転写されるRNAの第二の形状を意味する。スプライス変異体は、天然には、転写されたRNA分子内の第二のスプライス部位を使用することから、あるいはあまり一般的ではないが別々に転写されたRNA分子間で生じ、同じ遺伝子から数種のmRNAが転写されることとなる可能性がある。スプライス変異体はアミノ酸配列の変化したポリペプチドをコードしているかも知れない。本明細書にて使用されるスプライス変異体という用語はまた、一つの遺伝子から転写されたmRNAのスプライス変異体によりコードされたタンパク質をも意味する。
【００５２】
不正確な分析法（例えば、ゲル電気泳動法）により測定された分子量と鎖長は概算値と理解されよう。かかる数値を“約”Ｘまたは“大よそ”Ｘと表す場合、Ｘの表示値は±10％の精度であると理解されよう。
本発明は脂肪細胞補体関連タンパク質（Acrp30）に相同性を有するポリペプチドをコードする新規DNA配列の発見に一部基いている。新規DNA配列はアミノ末端シグナル配列を有するポリペプチド、非相同性の隣接Ｎ−末端領域、21個のGly-Xaa-XaaまたはGly-Xaa-Pro反復からなるコラーゲンドメイン、およびカルボキシ末端球状様C1qドメインとそれに続く長鎖３’非翻訳領域をコードする。
【００５３】
上に説明した全般的ポリペプチド構造はAcrp30およびC1qＣが共有している。整列したタンパク質のカルボキシ末端球状C1qに見出される他の相同性領域は、ここでは、他のファミリーメンバーを検索する有用なプライマーとして同定される。Acrp30およびC1qＣは、例えば、プライマーを使用する検索において同定される。鎖内のジスルフィド結合は配列番号２の残基39、42および43にシステインを包含し得る。
【００５４】
本発明の新規zacrp3ポリペプチドは当初ACRP30の同族体ESTデータベースを検索することで同定し、シグナル配列とコラーゲン様ドメインとC1qドメインにより確認した。これらの検索基準に合致するESTに対応するポリペプチドを既知配列と比較し、ACRP30に相同性を有するタンパク質を同定した。集合したESTクラスターが発見され、分泌されたタンパク質であると予想した。対応するcDNAを同定するために、全コーディング配列を含むと思われるクローンを配列決定に使用した。得られた1696bpの配列を配列番号１に開示する。
【００５５】
最初に誘導したEST配列を配列番号１に示した配列と比較すると、そこには２つのフレームシフトと非スプライスイントロンの存在することを示した。この全長cDNAがコードする新規ポリペプチドは、図に示すように、脂肪細胞補体関連タンパク質Acrp30（配列番号３）および補体成分C1qC（配列番号４）との同族体関連性の確認を可能とした。Zacrp3はACRP30とC1qCとそれぞれアミノ酸レベルで27.5％および25.7％の同一性を共有する。C1qCとACRP30は32.4％の同一性を共有する。C1qドメインにおいて、zacrp3はヒトのACRP30およびC1qCとそれぞれ比較した場合、アミノ酸レベルで26.3％および26％の同一性を共有する。C1qCとACRP30はこの領域全般で38.2％の同一性を共有する。
【００５６】
zacrp3ポリペプチドの全配列はそれを含むと信じられる単一のクローンから入手したが、該クローンは胸壁柔組織ライブラリーから入手した。このメッセージはまた、電子検索を用い、結合組織、消化、骨格、呼吸および神経系の組織、並びに尿路組織のライブラリーにも見出された。
【００５７】
zacrp3のヌクレオチド配列を配列番号１に記載し、その推定アミノ酸配列を配列番号２に記載する。全体像を上に記載したように、zacrp3ポリペプチドはアミノ酸１(Met）からアミノ酸残基22(Cys）の範囲にシグナル配列を含んでいる。従って、成熟ポリペプチドはアミノ酸23(Gln）からアミノ酸246(Lys）までの範囲である。成熟ポリペプチド内には相同性未知のN-末端領域が、配列番号２のアミノ酸残基23(Gln）と50(Arg）の範囲に見出される。さらに、コラーゲン様ドメインがアミノ酸51(Gly）と113(Pro）の間に見出される。
【００５８】
コラーゲン様ドメインには、６個の完全なGly-Xaa-Proおよび15個の不完全Gly-Xaa-Xaa反復が観察される。Acrp30は22個の完全または不完全反復を含んでいる。このドメインにおいて配列番号２のアミノ酸残基56、59、62および113に見出されるプロリン残基はヒドロキシル化されていてもよい。また、zacrp3ポリペプチドは約アミノ酸114(Pro）ないし246(Lys）の領域にカルボキシ末端C1qドメインを含んでいる。そこにはC1qドメイン内に適切な折りたたみを可能とする相当量の保存構造が存在する。
【００５９】
タンパク質（F-X(5)-[ND]-X(4)-[FYWL]-X(6)-F-X(5)-G-X-Y-X-F-X-[FY]（配列番号５）を含むC1qドメインのすべてに見られる芳香性モチーフは配列番号２の残基169と199間に見出される。Ｘはいずれかのアミノ酸残基を表し、括弧（ ）内の数値はアミノ酸残基数を示す。四角括弧［ ］内のアミノ酸残基はアミノ酸残基の選択をその特定の位置に限定する。zacrp3ポリペプチド、ヒトC1qCおよびAcrp30はコラーゲンドメイン内とC1qドメインにおいて相同であると思われるが、成熟ポリペプチドのN-末端部分では相同でない。
【００６０】
本発明の他の側面ではzacrp3ポリペプチドのフラグメントを包含する。好適なフラグメントは配列番号２のアミノ酸1(Met）、23(Gln）または51(Gly）からアミノ酸1113(Pro）までのzacrp3ポリペプチドのコラーゲン様ドメイン、二量化またはオリゴマー化し得るコラーゲン様ドメインまたはコラーゲン様ドメインの一部を含むzacrp3ポリペプチドの一部を含むフラグメントを包含する。
【００６１】
本明細書にて使用する“コラーゲン”または“コラーゲン様ドメイン”という用語は一連の繰返しトリプレットアミノ酸配列をいい、“反復”または“コラーゲン反復”はGly-Xaa-ProまたはGly-Xaa-Xaa（Xaaはいずれかのアミノ酸残基である）のモチーフにより表される。かかるドメインは21個以上ものコラーゲン反復を含むことができる。かかるコラーゲン様ドメインを含むフラグメントまたはタンパク質はホモ体構築物を形成し得る（同一フラグメントまたはタンパク質の二量体またはオリゴマー）。さらに、かかるコラーゲン様ドメインを含むかかるフラグメントまたはタンパク質はヘテロ体構築物、通常、三量体を形成し得る。
【００６２】
これらのフラグメントはコラーゲンの二量化またはオリゴマー化の研究に、または以下により詳しく説明するように融合タンパク質の形成に特に有用である。かかるフラグメントをコードするポリヌクレオチドもまた本発明に包含され、
（ａ）配列番号１に示したヌクレオチド配列のヌクレオチド１、69、135または219からヌクレオチド407までの配列を含んでなるポリヌクレオチド分子；
【００６３】
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列のアミノ酸残基51(Gly）からアミノ酸残基113(Pro）までの配列に少なくとも80％一致するzacrp3ポリペプチドフラグメントをコードするポリヌクレオチド分子；
（ｃ）（ａ）または（ｂ）に相補的な分子；および
（ｄ）zacrp3ポリペプチドコラーゲン様ドメインのフラグメントをコードする縮重ヌクレオチド配列からなる群を包含する。
【００６４】
他の好適なフラグメントは配列番号２のアミノ酸114(Pro）から246(Lys）の範囲にあるzacrp3ポリペプチドの球状C1qドメイン、C1qドメインまたはC1qドメインの活性部分を含むzacrp3ポリペプチドの一部を包含する。その他のC1qドメイン含有タンパク質は、C1qA、BおよびC（Seller et al., ibid., Reid, ibid., and Reid et al., Biochem. J. 203: 559-69, 1982)、シマリス冬眠関連血漿タンパク質HP-20、HP-25およびHP-27（Takamatsu et al., Mol. Cell. Biol. 13: 1516-21, 1993 and Kondo & Kondo, J. Biol. Chem. 267: 473-8, 1992)、ヒトのプレセレベリン（precerebellin; Urade et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 1069-73, 1991)、ヒト内皮細胞マルチメリン（multimerin; Hayward et al., J. Biol. Chem. 270: 18246-51, 1995) および脊椎動物コラーゲンVIII型およびＸ型（Muragaki et al., Eur. J. Biochem. 197: 615-22, 1991) を包含する。
【００６５】
ACRP30の球状C1qドメインは、TNFファミリーと有意な相同性を示す10β鎖“ゼリーロール”トポロジー（Shapiro and Scherer, Curr. Biol. 8: 335-8, 1998) を有することが確認されており、配列番号２により表されるzacrp3配列はこの構造の10β−鎖すべてを含んでいる（配列番号２のアミノ酸残基119-123、140-142、148-151、155-158、161-173、175-182、190-197、200-212、217-222および236-241）。これらの鎖はそれぞれ“Ａ”、“Ａ’”、“Ｂ”、“Ｂ’”、“Ｃ”、“Ｄ”、“Ｅ”、“Ｆ”、“Ｇ”および“Ｈ”と命名されている。
【００６６】
Zacrp3はアミノ酸残基111−139および170−182に２つのレセプター結合ループを有し、他についてはいずれも同様である。コア・レセプター結合領域は配列番号２のアミノ酸残基124-150および181-197を含むと予測される。アミノ酸残基161(Gly）、163(Tyr）、212(Leu）および237(Phe）はCD40、TNFα、ACRP30およびzacrp3を含むスーパーファミリーにまたがって保存されていると思われる。
【００６７】
これらのフラグメントはエネルギーバランスまたは神経伝達、特に、食事またはストレス関連神経伝達の研究または調節に取分け有用である。かかるフラグメントには抗微生物活性の存在する可能性もある。TNFタンパク質との相同性はかかるフラグメントが肥満関連インシュリン抵抗性、免疫調節、炎症性応答、アポトーシスおよび破骨細胞成熟に有用であろうことを示唆している。
【００６８】
かかるフラグメントをコードするポリヌクレオチドも本発明に包含されるが、
（ａ）配列番号１に示したヌクレオチド配列のヌクレオチド408からヌクレオチド806までの配列を含んでなるポリヌクレオチド分子；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列のアミノ酸残基114(Pro）からアミノ酸残基246(Lys）までの配列に少なくとも80％一致するzacrp3ポリペプチド・フラグメントをコードするポリヌクレオチド分子；
（ｃ）（ａ）または（ｂ）に相補的な分子；および
（ｄ）zacrp3ポリペプチドC1qドメインのフラグメントをコードする縮重ヌクレオチド配列；
からなる群を包含する。
【００６９】
本発明の他のzacrp3ポリペプチド・フラグメントは配列番号２のアミノ酸残基51(Gly）ないし806(Lys）の範囲にあるコラーゲン様ドメインとC1qドメイン双方を包含する。かかるフラグメントをコードするポリヌクレオチドも本発明に包含され、（ａ）配列番号１に示したヌクレオチド配列のヌクレオチド291からヌクレオチド806までの配列を含んでなるポリヌクレオチド分子；（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列のアミノ酸残基41(Gly）からアミノ酸残基246(Lys）までの配列に少なくとも80％一致するzacrp3ポリペプチド・フラグメントをコードするポリヌクレオチド分子；（ｃ）（ａ）または（ｂ）に相補的な分子；および（ｄ）zacrp3ポリペプチドのコラーゲン様ドメイン−C1qドメイン・フラグメントをコードする縮重ヌクレオチド配列からなる群を包含する。
【００７０】
高度保存アミノ酸、特にzacrp3ポリペプチドのカルボキシ末端C1qドメインのアミノ酸は新たなファミリーメンバーの同定手段として用いることができる。例えば、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）を使用し、多様な組織源から得られるRNAからの保存モチーフをコードする配列を増幅することができる。取分け、高度縮重プライマーおよび保存配列から設計したその補体はこの目的に有用である。とり分け、以下のプライマーはこの目的に有用である：
【００７１】
配列番号２のアミノ酸残基215〜221
GGN GAN SAR GTN TGG YT（配列番号６）
配列番号２のアミノ酸残基160〜165
SN GNN NTN TAY TWY TTY R（配列番号７）
配列番号２のアミノ酸残基237〜242
TTY DSN GGN TTY YTN HT（配列番号８）
配列番号２のアミノ酸残基147〜153
Y TWY RAY RBN WBN WSN GG（配列番号９）
上に説明したポリヌクレオチドの補体に対応するプローブも包含する。
【００７２】
本発明はまた、本明細書に記載したzacrp3ポリペプチドをコードするDNAおよびRNA分子を含むポリヌクレオチド分子も提供する。遺伝子コードの縮重の観点で、これらポリヌクレオチド分子には少なからぬ配列変化が可能であることは、当業者が容易に認知するであろう。配列番号10は配列番号２のzacrp3ポリペプチドをコードするDNAすべてを包含する縮重DNA配列である。配列番号10の縮重配列はＴをＵに置換えることにより配列番号２をコードするすべてのRNA配列をも提供することは、当業者が認知するであろう。
【００７３】
このように、配列番号10のヌクレオチド１ないしヌクレオチド738を含んでなるzacrp3ポリペプチド−コード・ポリヌクレオチドおよびそのRNAが本発明により期待される。表１は縮重ヌクレオチドの位置を示すための配列番号10に使用される一文字コードを示す。“解析”の項はコード文字で示したヌクレオチドである。“補体”の項は相補性ヌクレオチドのコードを示す。例えば、コードＹはＣまたはＴを示し、その補体ＲはＡまたはＧを示し、ＡはＴに相補的であり、ＧはＣに相補的である。
【００７４】
【表１】
0003754299.tif 000002
【００７５】
【表２】
0003754299.tif 000003
【００７６】
当該技術分野の普通の技術の者は、各アミノ酸をコードしているすべての可能なコドンの代表、縮重コドンの決定において、いくつかのあいまいさが導入されていることがわかるであろう。たとえば、セリン(WSN）の縮重コドンは、ある状況においてはアルギニン(AGR）をコードすることが可能であり、アルギニンの縮重コドン(MGN）は、ある状況においてはセリン(AGY）をコードすることができる。同様の関係が、フェニルアンラニンおよびロイシンをコードしているコドンの間に存在する。このように、縮重配列によって含まれるいくつかのポリペプチドは変異したアミノ酸配列をコードしてよいが、当該技術分野の普通の技術の者は、配列番号２のアミノ酸配列を参照することによりかかる変異配列を容易に同定することができる。変異配列は、本文に述べられたように機能性について容易に検査されることが可能である。
【００７７】
また当該技術分野の普通の技術の者は、異なる種が「優先的なコドンの用法」を示すことが可能であることも理解するであろう。全般的には、Granthamら、Nuc. Acids Res. 8 : 1893 - 912、1980 ；Haasら、Curr. Biol. 6 : 315 - 24、 1996；Wain-Hobsonら、Gene 13 : 355 - 64、 1981 ；GrosjeanおよびFiers、Gene 18 : 199 - 209、1982 ；Holm、Nuc. Acids Res. 14 : 3075 - 87、1986；Ikemura、J. Mol. Biol. 158 : 573 - 97、1982参照のこと。本文において用いられたように、「優先的なコドンの用法」または「優先コドン」という用語は、ある種類の細胞において最も頻繁に用いられるタンパク質翻訳コドンを指している技術用語であり、このように、各々のアミノ酸をコードしている可能なコドンの一つまたは少数の代表物を好む（表２参照）。
【００７８】
たとえば、アミノ酸トレオニン(Thr）は、ACA、ACC、ACG、またはACTによってコードされてよいが、哺乳類細胞においてはACCが最も一般的に使用されるコドンであり；他の種類、たとえば昆虫細胞、酵母、ウイルス、または細菌においては、異なるThrコドンが選好性であってよい。特定の種に対する優先コドンは、当該技術において周知の種々の方法により、本発明のポリヌクレオチドに導入されることが可能である。
【００７９】
組換えDNAへの優先コドンの導入は、たとえば、特定の細胞型または種類の中でのタンパク質の翻訳をより効率的にすることにより、当該タンパク質の産生を増強することが可能である。したがって、配列番号10において開示された縮重コドン配列は、当該技術において一般的に用いられかつ本文において開示された種々の細胞型および種類における、ポリヌクレオチドの発現を最適化するための鋳型として役立つ。優先コドンを含んでいる配列は種々の種類における発現のため検査および最適化され、さらに本文において開示されたように機能性について検査されることが可能である。
【００８０】
さらに本発明は、他の種類からの相対物を代表する変異したポリペプチドならびに核酸分子を提供する（オルソログ）。これらの種は、哺乳類、鳥類、両生類、爬虫類、魚類、昆虫、および他の脊椎および無脊椎動物を含むが、これに限定されない。特に興味深いのは、マウス、ブタ、ヒツジ、ウシ、イヌ、ネコ、ウマ、および他の霊長類のポリペプチドを含めた、他の哺乳類の種からのzacrp3ポリペプチドである。マウスのzacrp2相同物（配列番号12）は同定されている。このマウスzacrp2ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、配列番号11に開示されている。
【００８１】
ヒトのzacrp3のオルソログは、本発明により提供される情報ならびに組成物を、通常のクローニング技術と組合せて用いることにより、クローン化されることが可能である。たとえば、cDNAは本文において開示されたようなzacrp3を発現する組織または細胞型から得られるmRNAを用いてクローン化されることが可能である。mRNAの適当な供給源は、本文において開示された配列から設計されたプローブを用いたノーザンブロットをプローブすることにより、同定されることが可能である。次いで、ポジティブな組織または細胞のmRNAから、ライブラリーが作成される。
【００８２】
次いでzacrp3をコードしているcDNAは、ヒトの完全なまたは部分的なcDNAを用いるか、または開示された配列に基づく縮重プローブの一つまたはそれより多いセットを用いたプロービングなどの、種々の方法により単離されることが可能である。またcDNAは、本文において開示された代表的なヒトのzacrp3配列から設計されたプライマーによるポリメラーゼ連鎖反応を用いてクローン化されることが可能である。付加的な方法の範囲内で、宿主細胞をトランスフォームまたはトランスフェクトするべく、cDNAライブラリーが用いられることが可能であり、興味のcDNAの発現は、zacrp3ポリペプチドに対する抗体を用いて検出されることが可能である。また同様の技術が、ゲノムクローンを単離するべく用いられることも可能である。
【００８３】
当業者は、配列番号１に開示された配列がヒトzacrp3の一つのアレルを表していること、およびアレルの変異および代わりのスプライシングが起ることが予期されることを理解するであろう。この配列のアレルの変異は、cDNAかまたは異なる個体からのゲノムライブラリーを標準的な方法によりプローブすることにより、クローン化されることが可能である。配列番号１に示されており、サイレント突然変異を含むものと、突然変異が結果としてアミノ酸配列の変化を生じるものとを含んでいるポリペプチド配列のアレル変異体は、配列番号２のアレル変異体であるタンパク質であるため、本発明の範囲内にある。
【００８４】
二者択一的にスプライスされたmRNAから生成され、zacrp3ポリペプチドの特性を保持しているcDNA分子は、本発明の範囲内に含まれ、かかるcDNAおよびmRNAによりコードされたポリペプチドもそうである。これらの配列のアレル変異体およびスプライス変異体は、cDNAかまたは異なる個体または組織からのゲノムライブラリーを、当該技術において周知の標準的な方法によりプローブすることによってクローン化されることが可能である。
【００８５】
本発明の好ましい態様の範囲内において、単離された核酸分子は、緊縮条件下に、配列番号１のヌクレオチド配列を有する核酸分子か、または配列番号１に対して相補的なヌクレオチド配列を有する核酸分子とハイブリダイズすることが可能である。一般的に、緊縮条件は定められたイオン強度およびpHにおいて、特定の配列についての熱融点（Ｔm）よりも約５℃低くなるように選ばれる。Ｔmは、完全に一致するプローブに対して標的配列の50％がハイブリダイズする温度である（定められたイオン強度およびpH下）。
【００８６】
DNA−DNA、RNA−RNA、およびDNA−RNAといった核酸分子のペアは、もしヌクレオチド配列がある程度の相補性を有していればハイブリダイズすることができる。ハイブリッドは二重らせんにおける不適正塩基対に耐えることができるが、ハイブリッドの安定性は不正対合の程度によって影響される。不正対合されたハイブリッドのＴmは、１〜1.5％の塩基対の不正対合ごとに１℃ずつ低下する。ハイブリダイゼーションの条件の緊縮性を変えることは、ハイブリッドに存在するであろう不正対合の程度についての制御を可能にする。緊縮の程度は、ハイブリダイゼーションの温度が上がるほど、またハイブリダイゼーション緩衝液のイオン強度が下がるほど増加する。
【００８７】
緊縮性のハイブリダイゼーション条件は、ハイブリッドのＴmより約５〜25℃低い温度と、１ＭまでのNa+を有するハイブリダイゼーション緩衝液とを含む。より低い温度におけるより高い緊縮の度合は、緩衝液中の１％ホルムアミドごとにハイブリッドのＴmを約１℃低下させるホルムアミドの添加によって成し遂げられることが可能である。一般的に、かかる緊縮条件は20〜70℃の温度と、６xまでのSSCと０〜50％のホルムアミドとを含んでいるハイブリダイゼーション緩衝液を含む。より高度の緊縮性は、40から70℃の温度において４倍までのSSCと０から50％のホルムアミドとを有する緩衝液を用いて行なわれることが可能である。
【００８８】
高度の緊縮条件は、典型的には１xまでのSSCと０〜50％のホルムアミドとを有するハイブリダイゼーション緩衝液とともに42〜70℃の温度を含む。標的配列に対する最大の特異的結合を遂行するべく、ハイブリダイゼーションおよび洗浄を通じて異なる程度の緊縮性が用いられることが可能である。典型的には、ハイブリダイゼーションに続く洗浄は、ハイブリダイズされた複合体からハイブリダイズされていないポリヌクレオチドプローブを除去するべく、増大された緊縮度において行なわれる。
【００８９】
上記の条件は指標として役立つことを意図したものであり、これらの条件を特定のポリペプチドハイブリッドを用いた用途に適合させることは、当業者の力量の範囲内で充分可能である。特定の標的配列のためのＴmは、完全に適合するプローブ配列に対して標的配列の50％がハイブリダイズするであろう温度である（定められた条件下）。Ｔmに影響する条件は、ポリヌクレオチドプローブの大きさと塩基対含有量、ハイブリダイゼーション溶液のイオン強度、およびハイブリダイゼーション溶液中の不安定化剤の存在を含む。
【００９０】
Ｔmを算定するための多くの方程式がこの技術において周知であり、DNA、RNA、およびDNA−RNAハイブリッド、ならびに長さを変えたポリヌクレオチドプローブ配列に特異的である（たとえば、Sambrookら、Molecular Cloning（分子クローニング）：A Labolatory Manual（ラボラトリーマニュアル）、第２版、（コールド・スプリング・ハーバー・プレス（Cold Spring Harbor Press）1989）；Ausubelら、（共編）、Current Protocols in Molecular Biology（分子生物学の最近のプロトコール（ジョン・ウィリー・アンド・サンズ（John Wiley and Sons）社1987）；Berger およびKimmel（共編）Guide to Molecular Clonig Techniques（分子クローニング技術への手引き）（アカデミックプレス社、1987）；およびWetmur、Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 26 : 227（1990）参照のこと）。
【００９１】
OLIGO 6.0（LSR；ロングレーク、ミネソタ州）およびPrmer Primer 4.0（プライマー・バイオソフト・インターナショナル；パロアルト、カリフォルニア州）といった配列分析ソフトウェア、ならびにインターネット上のサイトは、所与の配列を分析するため、およびユーザー定義基準に基づきＴmを算定するための入手可能な手段である。またかかるプログラムは、所与の配列を被定義条件下に分析し、かつ適当なプローブ配列を同定することも可能である。
【００９２】
典型的には、＞50塩基対の、より長いポリヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションは、算定されたＴmより約20〜25℃低い温度において行なわれる。＜50塩基対の、より小さいプローブについては、ハイブリダイゼーションは典型的にはＴmにおいてか、または５〜10℃下げて行なわれる。このことは、DNA−DNAおよびDNA−RNAハイブリッドのためのハイブリダイゼーションの最大速度を可能にする。
【００９３】
ポリヌクレオチド配列の長さは、ハイブリッド形成の速度ならびに安定性に影響する。＜50塩基対の、より小さいプローブ配列は、すばやく相補配列との平衡に達するが、安定性の小さいハイブリッドを形成してよい。数分から数時間のあたりのインキュベーション時間が用いられることが可能である。より長いプローブはよりゆっくりと平衡に達するが、より低い温度においてであっても、より安定した複合体を形成する。インキュベーションは一晩またはそれより長く続くことが可能である。一般的には、インキュベーションは算定されたコット時間と同じから３倍までに等しい期間にわたり行なわれる。コット時間は、ポリヌクレオチド配列が再結合に要する時間であり、この技術において周知の方法により、特定の配列について算定されることが可能である。
【００９４】
ポリヌクレオチド配列の塩基対組成は、ハイブリッド複合体の熱安定性に影響するであろうし、それによりハイブリダイゼーション温度ならびにハイブリダイゼーション緩衝液のイオン強度の選択に影響を及ぼす。塩化ナトリウムを含んでいる水溶液中では、Ａ−ＴペアはＧ−Ｃペアよりも不安定である。したがって、Ｇ−Ｃ含量が高いほどハイブリッドはより安定している。配列内のＧおよびＣ残基の分布さえも、ハイブリッドの安定性に対してポジティブに寄与する。
【００９５】
さらに、所与の配列のＴmを変えるべく、塩基対組成が操作されることが可能である。たとえば、Ｔmを高めるべく、５−メチルデオキシシチジンはデオキシシチジンに対して置換されることが可能であり、５−ブロモデオキシウリジンはチミジンに対して置換されることができ、一方Ｔmへの依存性を減じるべく、７−deazz−２´−デオキシグアノシンがグアノシンに対して置換されることが可能である。
【００９６】
またハイブリダイゼーション緩衝液のイオン強度も、ハイブリッドの安定性に影響を及ぼす。ハイブリダイゼーション緩衝液は一般的にデンハート溶液（Denhardt’s solution)（シグマケミカル社、ミズーリ州、セントルイス）などの遮断薬、変性サケ精子DNA、tRNA、粉乳（ブロット（BLOTTO）ヘパリンまたはSDS、およびSSC（１xのSSC：0.15Ｍ塩化ナトリウム、15mMクエン酸ナトリウム）またはSSPE（１xのSSPE：1.8M NaCl、10mM NaH2PO4、1mM EDTA，pH7.7）といったNa+の供給源を含む。緩衝液のイオン濃度を減じることにより、ハイブリッドの安定性は増加する。
【００９７】
典型的には、ハイブリダイゼーション緩衝液は10mMから１Ｍの間のNa+を含む。ホルムアミド、テトラルキル（tetralkyl）アンモニウム塩、グアニジニウム陽イオン、またはチオシアネート陽イオンといった不安定化または変性剤の、ハイブリダイゼーション溶液への添加は、ハイブリッドのＴmを変えるであろう。典型的には、ホルムアミドはより使いやすい、より低い温度においてインキュベーションが行なわれるようにするため、50％までの濃度にて用いられる。またホルムアミドは、RNAプローブを用いた場合の非特異的なバックグラウンドを減じるべく作用する。
【００９８】
一つの例として、変異体zacrp3ポリペプチドをコードしている核酸分子は、配列番号１のヌクレオチド配列を有する核酸分子（またはその相補体）と、50％ホルムアミド、５xのSSC（１xのSSC：0.15Ｍ塩化ナトリウム、15mMクエン酸ナトリウム）、50mMリン酸ナトリウム（pH7.6）、５倍のデンハート溶液（100倍のデンハート溶液：２％（w/v）フィコール400、２％（w/v）ポリビニルポリロドン、および２％（w/v）ウシ血清アルブミン）、10％硫酸デキストラン、および20μｇ／mlの変性され、剪断されたサケ精子DNAを含んでいる溶液中で、42℃において一晩ハイブリダイズされることが可能である。
【００９９】
当業者はこれらのハイブリダイゼーション条件のバリエーションを工夫することが可能である。たとえば、ハイブリダイゼーション混合物は、ホルムアミドを含まない溶液中で約65℃というように、より高いかまたはより低い温度において、インキュベートされることが可能である。さらに、予混ハイブリダイゼーション溶液（たとえば、クロンテック（CLONTECH）・ラボラトリーズ社からのEXPRESSHYBハイブリダイゼーションソリューション）が市販されており、製造業者の使用説明書にしたがってハイブリダイゼーションが行なわれることが可能である。
【０１００】
ハイブリダイゼーションに続き、ハイブリダイズしない核酸を除去するべく、核酸分子は緊縮条件下に、あるいは高度の緊縮条件下に洗浄されることが可能である。典型的な緊縮洗浄条件は、0.1％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）を用いた0.5〜２xのSSCの溶液中での洗浄を含む。すなわち、変異体zacrp3ポリペプチドをコードしている核酸分子は、配列番号１のヌクレオチド配列を有する核酸分子（またはその相補体）と緊縮性の洗浄条件下にハイブリダイズされ、その洗浄の緊縮性は、55℃での0.1％SDSを用いた0.5xのSSCか、または65℃での0.1％ SDSを用いたx倍のSSCを含めて、50〜65℃における0.1％ SDSを用いた0.5x〜２xのSSCに等しい。当業者は、たとえば洗浄溶液中のSSCをSSPEに置換することにより、同等の条件を容易に工夫することができる。
【０１０１】
典型的な高度に緊縮性の洗浄条件は、0.1％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）を用いた0.1〜0.2xのSSCの溶液中での50〜60℃における洗浄を含む。言い換えれば、変異体zacrp3ポリペプチドをコードしている核酸分子は、配列番号１のヌクレオチド配列を有する核酸分子（またはその相補体）と、高度に緊縮性の洗浄条件下にハイブリダイズされ、その洗浄の緊縮性は、50℃での0.1％ SDSを用いた0.1xのSSCか、または65℃での0.1％ SDSを用いた0.2xのSSCを含めて、50〜65℃における0.1％ SDSを用いた0.1x〜0.2xのSSCに等しい。
【０１０２】
また本発明は、配列番号２のポリペプチドかまたはそのオルソログと実質的に類似した配列同一性を有する、単離されたzacrp3ポリペプチドも提供する。「実質的に類似した配列同一性」という用語は、本文においては、配列番号２に示された配列か、またはそのオルソログに対し、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、または95％より高い配列同一性を有するポリペプチドを意味するべく用いられる。また本発明は、配列番号２のアミノ酸残基51〜246の配列に対し、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、または95％より高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドも含む。さらに本発明は、かかるポリペプチドをコードする核酸分子を含む。パーセント同一性の測定法は以下に述べられる。
【０１０３】
また本発明は、二つの基準：コードされたポリペプチドと配列番号２のアミノ酸配列との間の類似性の測定と、前文に述べたようなハイブリダイゼーションアッセイとを用いて同定されることが可能なzacrp3変異体核酸も含む。かかるzacrp3変異体は、
（１）配列番号１のヌクレオチド配列を有する核酸分子（またはその相補体）と、緊縮性の洗浄条件下にハイブリダイズし、その洗浄の緊縮性が、50〜65℃における0.1％ SDSを用いた0.5x〜２xSSCに等しく、さらに
（２）配列番号２の配列に対し、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、または95％より高い配列同一性を有するポリペプチドをコードする、核酸分子を含む。
【０１０４】
別法として、zacrp3変異体は
（１）配列番号１のヌクレオチド配列を有する核酸分子（またはその相補体）と、高い緊縮性の洗浄条件下にハイブリダイズし、その洗浄の緊縮性が50〜65℃での0.1％ SDSを用いた0.1x〜0.2xSSCに等しく、さらに
（２）配列番号２のアミノ酸配列に対し、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、または95％より高い配列同一性を有するポリペプチドをコードする、核酸分子として特徴づけられることが可能である。
【０１０５】
配列同一性のパーセントは通常の方法により測定される。たとえば、Altschulら、Bull. Math. Bio. 48 : 603 、 1986、およびHenikoff および Henikoff、Proc. Natl. Acad. Sci. USA  89 : 10915、1992参照。手短に言えば、二つのアミノ酸配列は、ギャップオープニングペナルティ10、ギャップエクステンションペナルティ１、および表３（アミノ酸は標準的な１文字コードによって示されている）に示されたような、Henikoffおよび Henikoff （同書）の「BLOUSUM62」スコアリングマトリックスを用いて、アライメントスコアを最適化するべく配列される。次に同一性のパーセントが計算される：[ 同一の対合総数 ]／[より長い配列の長さ、プラス、二つの配列をアライメントするべく、より長い配列に導入されたギャップの数 ]）（100）。
【０１０６】
【表３】
0003754299.tif 000004
【０１０７】
当業者は、二つのアミノ酸配列をアライメントするための多くの確立されたアルゴリズムがあることを認識している。パーソン・アンド・リップマン（Pearson and Lipman）の「FASTA」相同性検索アルゴリズムは、本文において開示されたアミノ酸配列と推定上の変異体zacrp3のアミノ酸配列とによって共有される、同一性のレベルを検査するために適したタンパク質アライメント法である。FASTAアルゴリズムは、Person および Lipman、Proc. Natl. Acad. Sci. USA  85 : 2444、1988、および Person、Meth. Enzymol. 183 : 63、1990により記述されている。
【０１０８】
手短に言えば、FASTAはまず、最も高密度の同一性か（ktup変数が１であれば）、または同一性のペア（ktup変数が２であれば）のいずれかを有する、疑わしい配列（たとえば配列番号２）と検査配列とによって共有される領域を同定することにより、保存性のアミノ酸置換、挿入、または欠失を考慮することなく、配列の類似性を特徴づける。次いで、最も高密度の同一性をもつ10の領域が、アミノ酸置換マトリックスを用いて、ペアにされた全アミノ酸の類似性を比較することにより再スコアされ、当該領域の末端は「刈込まれ」、最高のスコアに寄与するような残基だけを含むようにする。
【０１０９】
もし「カットオフ」値（配列の長さとｋｔｕｐ値とに基づきあらかじめ定められた式により算定される）よりも大きいスコアをもつ領域がいくつか存在すれば、刈込まれた最初の領域が検査され、当該領域がギャップをもつ隣接したアライメントを形成するべく結合されることが可能かどうかが決定される。最後に、二つのアミノ酸配列の最も高いスコアリング領域が、アミノ酸の挿入および欠失を考慮するニードルマン・ヴンシュ・セラーズ（Needlman-Wunsch-Sellers）アルゴリズム（NeedlemanおよびWunsch、J. Mol. Biol. 48 : 444、1970；Sellers、SIAM J. Appl. Math. 26 : 787、1974）の変法を用いてアライメントされる。
【０１１０】
FASTA分析のための代表的なパラメーターは；ktup＝１、ギャップオープニングペナルティ＝10、ギャップエクステンションペナルティ＝１、および置換マトリックス＝BLOSUM62である。これらのパラメーターは、Person、Meth. Enzymol. 183 : 63、1990の付録２に説明されているように、スコアリングマトリックスファイル（「SMATRIX」）を修正することによってFASTAプログラムに導入されることが可能である。
またFASTAは、前文に開示されたような比を用いて核酸分子の配列同一性を決定するべく用いられることが可能である。ヌクレオチド配列の比較用には、ktup値が１と６の間が可能であり、好ましくは４から６の範囲である。
【０１１１】
本発明は、配列番号２のアミノ酸配列に比較して、一つまたはそれより多い「保存性のアミノ酸置換」を有するポリペプチドをコードする核酸分子を含む。保存性のアミノ酸置換はアミノ酸の化学的性質に基づくことが可能である。すなわち、配列番号２の一つまたはそれより多いアミノ酸の置換を含んでおり、そのアルキルアミノ酸がzacrp3アミノ酸配列の一つのアルキルアミノ酸を置換しているか、芳香族アミノ酸がzacrp3アミノ酸配列の一つの芳香族アミノ酸を置換しているか、含硫アミノ酸がzacrp3アミノ酸配列の一つの含硫アミノ酸を置換しているか、含ヒドロキシアミノ酸がzacrp3アミノ酸配列の一つの含ヒドロキシアミノ酸を置換しているか、酸性アミノ酸がzacrp3アミノ酸配列の一つの酸性アミノ酸を置換しているか、塩基性アミノ酸がzacrp3アミノ酸配列の一つの塩基性アミノ酸を置換しているか、または2塩基１カルボン酸アミノ酸がzacrp3アミノ酸配列の一つの２塩基１カルボン酸アミノ酸を置換している変異体が取得されることが可能である。
【０１１２】
共通なアミノ酸のうち、たとえば「保存性のアミノ酸置換」は、以下の各々の群の中でのアミノ酸の間の置換によって説明される：（１）グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシン、（２）フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン、（３）セリンおよびトレオニン、（４）アスパラギン酸およびグルタミン酸、（５）グルタミンおよびアスパラギン、および（６）リジン、アルギニン、およびヒスチジン。
【０１１３】
BLOUSM62テーブルは、500グループより多い関連タンパク質の、高度に保存された領域を代表している、タンパク質配列セグメントの約2,000の局所の多重アライメントに由来するアミノ酸置換マトリックスである（Henikoff および Henikoff、Proc. Natl. Acad. Sci. USA  89 : 10915、1992）。したがって、BLOUSM62置換頻度は、本発明のアミノ酸配列に導入されてよい保存性のアミノ酸置換を定義するべく用いられることが可能である。化学的性質のみに基づいて（前文に議論したように）アミノ酸置換を設計することは可能であるが、「保存性のアミノ酸置換」という言葉は、好ましくは−１より大きいBLOUSUM62値によって表される置換を指す。
【０１１４】
たとえば、一つのアミノ酸置換は、もし当該アミノ酸置換が０、１、２、または３のBLOUSUM62値によって特徴づけられるなら、保存性である。このシステムによれば、好ましい保存性のアミノ酸置換は、少なくとも１（たとえば１、２、または３）のBLOUSUM62値によって特徴づけられるが、さらに好ましい保存性のアミノ酸置換は、少なくとも２（たとえば２または３）のBLOUSUM62値によって特徴づけられる。
【０１１５】
zacrp3遺伝子における保存性のアミノ酸の変化は、ヌクレオチドを、配列番号１において列挙されたヌクレオチドに対して置換することにより導入されることが可能である。かかる「保存性のアミノ酸」の変異体は、たとえばオリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発、リンカースキャニング突然変異誘発、ポリメラーゼ連鎖反応を用いた突然変異誘発、およびその他により取得可能である（Ausubel（1995）8 - 10〜8 - 22頁；およびMcPherson（編）、Directed Mutagenesis（特異的突然変異誘発）：A Practical Approach（実用的なアプローチ）（IRLプレス  1991）参照）。かかる変異体が、エネルギー均衡の調整または野性型タンパク質の他の性質を促進する能力は、本文において述べられた検定法のような、標準的な方法を用いて測定されることが可能である。別法として、変異体zacrp3ポリペプチドは、抗zacrp3抗体と特異的に結合する能力によって同定されることが可能である。
【０１１６】
また本発明のタンパク質は、非天然性のアミノ酸残基を含むことも可能である。非天然性のアミノ酸は、トランス−３−メチルプロリン、２，４−メタノプロリン、シス−４−ヒドロキシプロリン、トランス−４−ヒドロキシプロリン、Ｎ−メチル−グリシン、アロ−トレオニン、メチルトレオニン、ヒドロキシエチルシステイン、ヒドロキシエチルホモシステイン、ニトログルタミン、ホモグルタミン、ピペコリン酸、チアゾリジンカルボン酸、デヒドロプロリン、３−および４−メチルプロリン、３，３−ジメチルプロリン、ｔｅｒｔ−ロイシン、ノルバリン、２−アザフェニルアラニン、３−アザフェニルアラニン、４−アザフェニルアラニン、および４−フルオロフェニエルアラニンを、制限することなく含む。非自然性に生じるアミノ酸残基をタンパク質に取り込むための、いくつかの方法がこの技術において周知である。
【０１１７】
たとえば、化学的にアミノアシル化されたサプレッサーtRNAを用いてナンセンス突然変異が抑制されるインヴィトロの系が用いられることが可能である。アミノ酸およびアミノアシル化されたtRNAを合成する方法は、この技術において周知である。ナンセンス突然変異を含んでいるプラスミドの転写および翻訳は、典型的には、大腸菌のS30抽出物と、市販の酵素および他の試薬とを含んで成る無細胞系において行なわれる。タンパク質はクロマトグラフィーにより精製される。たとえば、Robertsonら、J. Amer. Chem. Soc. 113 : 2722、1991、Ellmanら、Methods Enzymol. 202 : 301、1991、Chungら、Science 259 : 806 、1993、およびChungら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 : 10145、1993参照。
【０１１８】
第２の方法においては、翻訳はアフリカツメガエルの卵母細胞内において、突然変異されたmRNAと化学的にアミノアシル化されたサプレッサーtRNAとのマイクロインジェクションにより行なわれる（Turcattiら、J. Biol. Chem. 271 : 19991、1996）。第３の方法においては、大腸菌細胞は置き変えられるべき天然のアミノ酸（たとえば、フェニルアラニン）の不在下に、および所望の非自然性に生じるアミノ酸（たとえば、２−アザフェニルアラニン、３−アザフェニルアラニン、４−アザフェニルアラニン、または４−フルオロフェニエルアラニン）の存在下に、培養される。
【０１１９】
非自然性に生じるアミノ酸は、その天然の対応物の場所において当該タンパク質に取り込まれる。Koideら、Biochem. 33 : 7470、1994参照。天然に生じるアミノ酸残基は、インヴィトロの化学修飾により、非自然性に生じる種類に変えられることが可能である。化学修飾は、置換の範囲をさらに拡大するべく、部位特異的突然変異誘発と結び付けられることが可能である（WynnおよびRichards、Protein Sci. 2 : 395、1993））。
限定された数の非保存性アミノ酸、遺伝コードによってコードされていないアミノ酸、非自然性に生じるアミノ酸、および非自然性アミノ酸が、zacrp3アミノ酸残基用に対して置換されてよい。
【０１２０】
Reidhaar-OlsonおよびSauer（Science 241 : 53、1988）、またはBowieおよびSauer（Proc. Natl. Acad. Sci. USA  86 : 2152、1989）により開示された、突然変異誘発およびスクリーニングといった周知の方法を用いて、多数のアミノ酸置換が作成および検査されることが可能である。手短に言えば、これらの筆者らは、一つのポリペプチドにおける二つまたはそれより多い位置を同時にランダム化し、機能性のポリペプチドを選択し、次いで突然変異誘発されたポリペプチドをシーケンシングして、各位置において許される置換の範囲を決定する方法を開示している。使用可能な他の方法は、ファージディスプレイ（たとえば、Lowmanら、Biochem. 30: 10832、1991、Ladnerら、米国特許第5,223,409号、Huse、国際公開番号  WO92/06204、および部位特異的突然変異誘発（Derbyshireら、Gene 46 : 145、1986、およびNer ら、DNA  7 : 127、1988）を含む。
【０１２１】
また開示されたzacrp3ヌクレオチドおよびポリペプチド配列の変異体は、Stemmer、Nature 370 : 389 、1994、Stemmer、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 : 10747 、1994、および国際公開番号  WO97/20078によって開示されたようなDNAシャフリングを介して生成されることも可能である。手短に言えば、変異体DNA分子は、親のDNAのランダムなフラグメント化とそれに続くPCRを用いた再構築による、インヴィトロの相同組換えによって生成され、結果としてランダムに導入された点突然変異を生じる。
【０１２２】
この技術は、アレル変異体または異なる種からのDNA分子といった、一群の親DNA分子を用いることによって改造されることが可能であり、このプロセスにさらなる変異性が導入される。所望の活性についての選択またはスクリーニングと、それに続く付加的な突然変異誘発ならびに検定は、望ましい突然変異を選択することとともに、好ましくない変化に対して同時に選択することにより、配列の迅速な「進化」を提供する。
【０１２３】
本文に開示されたような突然変異誘発法は、宿主細胞においてクローン化され、突然変異原化されたポリペプチドの活性を検出するべく、自動化されたハイスループットスクリーニング法と結びつけられることが可能である。生物活性のあるポリペプチドか、または抗zacrp3抗体と結合するポリペプチドをコードする突然変異原化されたDNA分子は、宿主細胞から回収され、最新の設備を用いて迅速にシーケンスされることが可能である。これらの方法は、興味のポリペプチドにおける個々のアミノ酸残基の重要性についての迅速な決定を可能にし、また未知の構造をもつポリペプチドに適用されることが可能である。
【０１２４】
本発明のポリペプチドにおける重要なアミノ酸は、部位特異的突然変異誘発かまたはアラニンスキャニング突然変異誘発といった、この技術において周知の方法により同定されることができる（CunninghamおよびWells、Science 244 : 1081、1989、Bassら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 : 4498、1991、CoombsおよびCorey、「Site-Directed Mutagenesis and Protein Engineering（部位特異的突然変異誘発とタンパク質工学）」、Proteins: Analysis and Design（タンパク質：分析と設計）、Angeletti（編）、259 - 311頁（アカデミック・プレス社1998））。
【０１２５】
後者の技術においては、単一のアラニンの突然変異が分子内のすべての残基に導入され、結果として得られた突然変異体分子が、当該分子の活性にとって決定的であるアミノ酸残基を同定するべく、下文に開示されたような生物活性について検査される。またHiltonら、J. Biol. Chem. 271 : 4699、1996、も参照のこと。また当該重要なアミノ酸も、zacrp3を用いたホモロジーの分析から推測されることが可能である。
【０１２６】
zacrp3の受容体結合ドメインの位置は、推定される接触部位のアミノ酸についての突然変異とともに、核磁気共鳴、結晶学、電子回折、または光親和性標識といった技術により測定されるような、物理的分析法により同定されることが可能である。たとえば、de Vosら、Science 255 : 306、1992、Smithら、J. Mol. Biol. 224 : 899、1992、およびWlodaverら、FEBS Lett. 309 : 509、1992参照。さらに、ビオチンまたはFITCで標識されたzacrp3は、zacrp3受容体の発現クローニングに使用されることが可能である。
【０１２７】
また本発明は、本文において開示されたzacrp3ポリペプチドのエピトープをもつ部分を含んでいるポリペプチドフラグメントまたはペプチドも提供する。かかるフラグメントまたはペプチドは、「免疫原性エピトープ」を含んでよく、それはタンパク質全体が免疫原として用いられた場合に、抗体反応を誘起するタンパク質の一部分である。免疫原性エピトープをもつペプチドは、標準的な方法により同定されることが可能である（たとえば、Geysenら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 : 3998、1983参照）。
【０１２８】
対照的に、ポリペプチドフラグメントまたはペプチドは「抗原性エピトープ」を含んでよく、それは抗体が特異的にそこに結合することが可能なタンパク質分子の一領域である。あるエピトープは直鎖かまたは連続した一続きのアミノ酸から成っており、かかるエピトープの抗原性は変性剤によって破壊されない。タンパク質のエピトープを模すことが可能な、比較的短い合成エピトープが、当該タンパク質に対する抗体の産生を刺激するべく用いられることができることは、この技術において周知である（たとえば、Sutcliffeら、Science 219 : 660、1983参照）。したがって、本発明の抗原性エピトープをもつペプチドならびにポリペプチドは、本文において開示されたポリペプチドと結合する抗体を高めるために有用である。
【０１２９】
抗原性エピトープをもつペプチドならびにポリペプチドは、配列番号２の好ましくは少なくとも４〜10個のアミノ酸か、少なくとも10〜15個のアミノ酸か、または約15〜30個のアミノ酸を含む。かかるエピトープをもつペプチドならびにポリペプチドは、zacrp3ポリペプチドのフラグメント化によるか、または本文において開示されたような化学的ペプチド合成により産生されることが可能である。さらに、エピトープはランダムなペプチドライブラリーのファージディスプレイにより選択されることが可能である（たとえば、LaneおよびStephen、Curr. Opin. Immunol. 5 : 268、1993、およびCorteseら、Curr. Opin. Biotechnol. 7 : 616、1996参照）。
【０１３０】
エピトープを同定するため、およびエピトープを含む小さいペプチドから抗体を産生するための方法は、たとえばMoleによる、「Epitope Mapping（エピトープマッピング）、Methods in Molecular Biology、第10巻、Manson（編）、105 - 16頁（ザ・ヒューマン・プレス社1992）、Price、「Production and Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies（合成ペプチド由来の抗体の産生および特徴づけ）」、Monoclonal Antibodies : Production, Engineering, and Clinical Application（モノクローナル抗体：産生、工学、および臨床応用）、Ritter およびLadyman（共編）、60 - 84頁（ケンブリッジ・ユニバーシティ・プレス1995）、およびColiganら、（共編）Current Protocols in Immunology（免疫学における最近のプロトコール）、9.3.1. - 9.3.5.頁および9.4.1 - 9.4.11頁（ジョン・ウィリー＆サンズ(John Wikley &Sons) 1997）に述べられている。
【０１３１】
変異体zacrp3遺伝子の特定のヌクレオチド配列にかかわらず、当該遺伝子は、そのエネルギー平衡調整活性か、または野性型タンパク質の他の活性によるか、あるいは抗zacrp3抗体に対して特異的に結合する能力により特徴づけられるポリペプチドをコードしている。さらに明確には、変異体zacrp3遺伝子は、本文において開示されたヒトzacrp3遺伝子によってコードされているポリペプチドの、少なくとも50％、および好ましくは70、80、または90％より多い活性を示す。
【０１３２】
変異体ならびに融合タンパク質を含めて、いかなるzacrp3ポリペプチドについても、当該技術分野の普通の技術の者は、上記の表１および２に示された情報を用いて、当該変異体をコードしている完全に縮重したポリヌクレオチド配列を容易に生成することができる。さらに、当業者は、本文に述べられたヌクレオチドおよびアミノ酸配列に基づき、標準的なソフトウェアを使用してzacrp3変異体を発明することができる。したがって、本発明は以下の配列の内の少なくとも一つを提供するデータ構造とともにコード化された、コンピューターが読み取り可能な媒体を含む：配列番号１、配列番号２、および配列番号10。
【０１３３】
コンピューターが読み取り可能な媒体の適当な形状は、磁気媒体および光学的に読み取り可能な媒体を含む。磁気媒体の実例は、ハードまたは固定ドライブ、ランダムアクセスメモリー(RAM）チップ、フロッピーディスク、ディジタルリニアテープ（DLT）、ディスクキャッシュ、およびZIPディスクを含む。光学的に読み取り可能な媒体は、コンパクトディスク（たとえば、CD−リードオンリイメモリー(ROM）、CD−リライタブル（書き直し可能）（RW）、およびCD−レコーダブル（記録可能））、およびディジタル  ヴァーサチル（汎用）／ビデオ  ディスク(DVD）によって例示される（たとえば、DVD-ROM、DVD-RAM、およびDVD+RW）。
【０１３４】
また本発明は、zacrp3融合タンパク質も提供する。たとえば、本発明の融合タンパク質は、
（１）（ａ）アミノ酸残基１(Met）、23(Gln）、または51(Gly）から、アミノ酸残基246(Lys）までの、配列番号２に示されたようなアミノ酸残基の配列を含むポリヌクレオチド分子；
（ｂ）配列番号２の、アミノ酸51(Gky）からアミノ酸113(Pro）に及ぶポリペプチド分子、コラーゲン様ドメインか、または２量体化またはオリゴマー化することが可能な当該コラーゲン様ドメインの一部分を含んでいるzacrp3ポリペプチドの一部分；
【０１３５】
（ｃ）配列番号２の、アミノ酸114(Pro）から246(Lys）に及ぶポリペプチド分子、Clqドメインか、またはClqドメインの活性部分を含んでいるzacrp3ポリペプチドの一部分；または
（ｄ）アミノ酸51(Gly）から246(Lys）に及ぶポリペプチド分子、コラーゲン様ドメインとClqドメインとを含んでいるzacrp3ポリペプチドの一部分、より成る群から選ばれるポリペプチド；および
（２）別のポリペプチド、
を含む。
【０１３６】
別のポリペプチドは、代替または付加的なClqドメイン、代替または付加的なコラーゲン様ドメイン、融合タンパク質の分泌を促進するためのシグナルペプチド、またはその他であってよい。zacrp3ポリペプチド、フラグメント、または融合物の球形ドメインは、一つの類似した役割を有してもよい。
【０１３７】
アミノ酸１(Met）からアミノ酸246(Lys）に及ぶ、zacrp3ポリペプチド； アミノ酸23(Gln）からアミノ酸246(Lys）に及ぶ、成熟したzacrp3ポリペプチド、；またはその分泌リーダーフラグメントで、アミノ酸１(Met）からアミノ酸22(Cys）に及ぶフラグメントは、細胞からのタンパク質の分泌の研究において使用されてよい。本発明のこの観点についての好ましい態様においては、成熟したポリペプチドは、推定される分泌シグナル配列との融合タンパク質として形成され；当該融合タンパク質の発現を指示することが可能な調節領域をもつプラスミドが、検査細胞に導入され；さらに、成熟したタンパク質の分泌が監視される。監視は、HPLCなどの当該技術において周知の技術により行なわれてよい。
【０１３８】
完全長のタンパク質、そのフラグメント、および融合タンパク質を含む、本発明のポリペプチドは、通常の技術に従って、遺伝学的に工作された宿主細胞において産生されることが可能である。適当な宿主細胞は、外来性のDNAを用いてトランスフォームまたはトランスフェクトされ、かつ培養において増殖されることが可能な細胞型のものであり、細菌、真菌細胞、および培養された高等な真核細胞を含む。真核細胞、特に多細胞生物の培養細胞が好ましい。クローン化されたDNAを操作するための、および外来性のDNAを種々の宿主細胞へ導入するための技術は、Sambrookら、同書、およびAusubelら、同書により開示されている。
【０１３９】
一般的に、本発明のzacrp3ポリペプチドをコードしているDNA配列は、その発現に必要な、一般的には一つの発現ベクター内に転写プロモーターおよびターミネーターを含む、他の遺伝学的要素に対して、操作可能に結合されている。また当該ベクターは、通常一つまたはそれより多い選択マーカーと、一つまたはそれより多い複製の起点とを含むが、当業者は、ある系においては、選択可能なマーカーが別々のベクター上に供されてよく、また外来性のDNAの複製が宿主細胞のゲノムへの組込みによって供されてもよいことを認識するであろう。プロモーター、ターミネーター、選択マーカー、ベクター、および他の要素の選択は、当該技術分野の普通の技術の者のレベルの範囲内での日常の設計の問題である。多くのかかる要素が文献に述べられており、商業的な供給者を通じて入手される。
【０１４０】
zacrp3ポリペプチドを宿主細胞の分泌経路内に向けるためには、分泌シグナル配列（リーダー配列、シグナル配列、プレプロ配列、またはプレ配列としても知られている）が発現ベクター内に提供される。分泌シグナル配列は、zacrp3ポリペプチドのそれでよく、あるいは別の分泌されたタンパク質（たとえばt-PA）に由来するか、またはドゥノボに合成されてもよい。分泌シグナル配列は、正しい読取り枠において、zacrp3ポリペプチドのDNA配列に結合される。
【０１４１】
一般に分泌シグナル配列は、興味のポリペプチドをコードしているDNA配列の５´に置かれるが、あるシグナル配列は興味のDNA配列内のどこに置かれてもよい（たとえば、Welchら、米国特許第5,037,743号；Hollandら、米国特許第5,413,830号参照）。逆に、zacrp3ポリペプチドのシグナル配列部分（配列番号２のアミノ酸残基１〜22）は、類似した方法によって代替タンパク質の分泌を指示するために用いられてもよい。
【０１４２】
本発明のポリペプチドに含まれる分泌シグナル配列は、他のポリペプチドを分泌経路内に指向させるべく使用されることが可能である。本発明は、かかる融合ポリペプチドに対して必要な手段をもつ。配列番号２のアミノ酸残基１〜22に由来する分泌シグナル配列は、この技術において周知でありかつ本文に開示された方法を用いて、別のポリペプチドに対して操作可能に結合された、シグナル融合ポリペプチドが作成されることが可能である。
【０１４３】
本発明の融合ポリペプチドに含まれている分泌シグナル配列は、好ましくは付加的なペプチドに対しアミノ末端に融合され、当該付加的なペプチドを分泌経路内に向けるようにする。かかる構築物は、この技術において周知の多くの使用法を有する。たとえば、これらの新規な分泌シグナル配列融合構築物は、受容体などの正常には分泌されないタンパク質の活性成分の分泌を指示することができる。かかる融合物は、ペプチドが分泌経路を通るように指向させるべく、インヴィヴォまたはインヴィトロにおいて使用されてよい。
【０１４４】
培養された哺乳類細胞は、本発明の範囲内の適当な宿主である。外来性のDNAを哺乳類の宿主細胞へ導入する方法は、リン酸カルシウムを介するトランスフェクションを含む（Wiglerら、Cell 14 : 725、1978；CorsaroおよびPearson、Somatic Cell Genetics 7 : 603、1981；GrahamおよびVan der Eb、Virology 52 : 456、1973）、電気穿孔（Neumannら、EMBO J. 1 : 841 - 5、1982）、DEAE−デキストラン媒介トランスフェクション（Ausubelら、同書）、およびリポソーム媒介トランスフェクション（Hawley - Nelsonら、Focus 15 : 73、1993；Ciccaroneら、Focus 15 : 80、1993、およびウイルスベクター（MillerおよびRosman、BioTechniques 7 : 980 - 90、1989；WangおよびFiner、Nature Med. 2 : 714- 6、1996）を含む。
【０１４５】
培養哺乳類細胞における組換えポリペプチドの産生は、たとえばLevinsonら、米国特許第4,713,339号；Hagenら、米国特許第4,784,950号；Palmiterら、米国特許第4,579,821号；およびRingold、米国特許第4,656,134号に開示されている。適当な培養哺乳類細胞は、COS-1（ATCC CRL 1650）、COS-7（ATCC CRL 1651）、BHK（ATCC CRL 1632）、BHK570（ATCC CRL 10314）、293（ATCC CRL 1573）；Grahamら、J. Gen. Virol. 36 : 59 - 72、1977）およびチャイニーズハムスター卵巣（たとえばCHO-K1；ATCC CCL 61）細胞系を含む。
【０１４６】
さらなる適当な細胞系はこの技術において周知であり、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、バージニア州、マナサス、などの公の寄託機関から入手可能である。一般に、SV-40またはサイトメガロウイルスからのプロモーターなどの、強力な転写プロモーターが好ましい。たとえば、米国特許第4,956,288号を参照のこと。他の適当なプロモーターは、メタロチオネイン遺伝子（米国特許第4,579,821号および第4,601,978号）、およびアデノウイルスの主要後期プロモーターを含む。
【０１４７】
一般的に薬物選択は、外来性DNAが挿入されている培養哺乳類細胞を選択するために用いられる。かかる細胞は普通「トランスフェクタント」と呼ばれる。選択薬剤の存在下に培養されており、かつ興味の遺伝子をその子孫に渡すことができる細胞は「安定なトランスフェクタント」と呼ばれる。好ましい選択マーカーは、抗生物質ネオマイシンに対する抵抗性をコードしている遺伝子である。選択は、G-418またはその他といったネオマイシン型の薬剤の存在下に行なわれる。また選択系は、「増幅」と呼ばれる興味の遺伝子の発現レベルを増強するプロセスのために用いられてよい。増幅はトランスフェクタントを低レベルの選択薬剤の存在下に培養することと、次に、導入された遺伝子産物を高レベルに産生する細胞を選択するべく、選択薬剤の量を増やすことによって行なわれる。
【０１４８】
好ましい増幅可能な選択可能マーカーは、ジヒドロ葉酸レダクターゼであり、それはメトトレキセートに対する抵抗性を与える。他の薬剤耐性遺伝子（たとえば、ハイグロマイシン耐性、多剤耐性、ピューロマイシンアセチルトランスフェラーゼ）も使用されることが可能である。緑色の蛍光タンパク質か、あるいはCD4、CD8、クラスI MHC、胎盤アルカリ性ホスファターゼといった細胞表面タンパク質などの、別の表現型を導入する代替のマーカーは、FACS選別や磁気ビーズ分離法などの手段により、トランスフェクトされた細胞をトランスフェクトされていない細胞から選別するべく用いられてよい。
【０１４９】
植物細胞、昆虫細胞、および鳥類細胞を含めた、他のより高等な真核細胞も宿主として用いられることが可能である。植物細胞において遺伝子を発現するためのベクターとしてのアグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）の使用は、Sinkarら、J. Biosci.（Bangalore) 11 : 47 - 58、1987によって総説されている。昆虫のトランスフォーメーションおよびそこでの外来性ポリペプチドの産生は、Guarinoら、米国特許第5,162,222号およびWIPO公開  WO94/06463により開示されている。
【０１５０】
昆虫細胞は、一般にオートグラファ核多角体ウイルス(AcNPV）から由来する、組換えバキュロウイルスにより感染されることが可能である。KingおよびPossee、「TheBaculovirus Expression System：A Laboratory Guide（バキュロウイルス発現系：ラボラトリーガイド）」、ロンドン、チャプマン・アンド・ホール（Chapman & Hall）；O’Reillyら、Baculovirus Expression Vectors : A Laboratory Manual（バキュロウイルス発現ベクター：ラボラトリーマニュアル）、ニューヨーク、オックスフォード・ユニバーシティ・プレス、1994；およびRichardson, C. D. 、編、Baculovirus Expression Protocols： Methods in Molecular Biology（バキュロウイルス発現プロトコール：分子生物学における方法）, ニュージャージー州、トトワ、ヒューマナ（Humana）・プレス、1995参照のこと。
【０１５１】
組換えzacrp3バキュロウイルスを作成する第２の方法は、Luckou（Luckowら、J. Virol. 67 : 4566 - 79、1993）によって述べられたトランスポゾンを主体とする系を利用する。転移ベクターを用いるこの系は、Bac-to-BacTMキット（ライフ・テクノロジーズ、メリーランド州、ロックビル）において販売されている。この系は、zacrp3ポリペプチドをコードしているDNAを、「バクミド（Bacmid）」と呼ばれる大きいプラスミドとして大腸菌の中に維持されたバキュロウイルスゲノム内に移動させるための、Tn7トランスポゾンを含んでいるトランスファーベクター、pFastBac1TM（ライフ・テクノロジーズ）を利用している。
【０１５２】
pFastBac1TMトランスファーベクターは、興味の遺伝子、この場合にはzacrp3の発現を駆動するため、AcNPVのポリヘドリンプロモーターを利用する。しかしながら、pFastBac1TMは、かなりの程度まで修正されることが可能である。ポリヘドリンプロモーターは、除去され、バキュロウイルスの塩基性タンパク質プロモーター（Pcor、p6.9、またはMPプロモーター）で置換されること可能であるが、それはバキュロウイルス感染の初期に発現され、かつ分泌タンパク質の発現にとって好都合であることが示されている。Hill-PerkinsおよびPossee、J. Gen. Virol. 71 : 971 - 6、1990；Bonningら、J. Gen. Virol. 75 : 1551 - 6、1994；および、ChazenbalkおよびRapoport、J. Biol. Che. 270 : 1543 - 9、1995参照。
【０１５３】
かかるトランスファーベクター構築物においては、短いかまたは長い型の塩基性タンパク質プロモーターが使用されてよい。さらに、天然のzacrp3分泌シグナル配列を、昆虫タンパク質由来の分泌シグナル配列を用いて置き換えるトランスファーベクターが構築されることが可能である。たとえば、エクジステロイドグルコシルトランスフェラーゼ（EGT）、ミツバチメリチン（インヴィトロジェン、カリフォルニア州、カールズバッド）、またはバキュロウイルスgp67（ファーミンゲン（PharMingen）、カリフォルニア州、サンディエゴ）は、天然のzacrp3分泌シグナル配列を置換するべく、構築物において使用されることが可能である。
【０１５４】
さらに、トランスファーベクターは、発現されたzacrp3ポリペプチドのＣ−またはＮ−末端におけるエピトープタグ、たとえば、Glu-Gluエピトープタグ（Grussenmeyerら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 : 7952 -4、1985）をコードしているDNAとのフレーム内融合を含むことができる。当該技術分野において周知の技術を用いることにより、zacrp3を含んでいるトランスファーベクターは大腸菌内ヘトランスフォームされ、組換えバキュロウイルスの指標である分断されたlacZ遺伝子を含むバクミドについてスクリーンされる。
【０１５５】
組換えバキュロウイルスゲノムを含んでいるバクミドDNAは、一般的な技術を用いて単離され、スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）細胞、たとえばSf9細胞をトランスフェクトするべく用いられる。zacrp3を発現する組換えウイルスが実質的に産生される。組換えウイルスのストックは、この技術（  ）一般的に用いられる方法により作成される。
【０１５６】
組換えウイルスは、宿主細胞、典型的にはフォール・アーミウォーム（fall armyworm、ヨトウムシの一種）、スポドプテラ・フルギペルダ由来の細胞系を感染させるべく用いられる。全般的には、GlickおよびPasternak、Molecular Biotechnology：Principles and Applications of Recombinant DNA（分子生物工学：組換えDNAの原理と応用）、ASMプレス、ワシントン、1994参照のこと。もう一つの適当な細胞系は、トリコロプルシア・ニ（Trochoplusia ni）（米国特許第5,300,435号）由来のHigh FiveOTM細胞系（インヴィトロジェン）である。市販の無血清培地が、当該細胞を増殖ならびに維持するべく用いられる。
【０１５７】
適当な培地は、Sf9細胞用にはSf900 IITM（ライフ・テクノロジーズ）か、またはESF 921TM（エクスプレッション（Expression）・システムズ）であり；またT.ni細胞用にはEX-cellO405TM（JRH  バイオサイエンス、カンザス州、ルネクサ（Lenexa））か、またはExpress FiveOTM（ライフ・テクノロジーズ）である。細胞は約２〜５x105細胞の播種密度から、１〜２x106細胞の密度まで増殖され、この時点で組換えウイルスのストックが、0.1〜10の、さらに典型的にはほぼ３の感染多重度(MOI）で添加される。使用される方法は、全般的に市販のラボラトリーマニュアル（King および Possee、同書；O’Reillyら、同書；Richardson、同書）に述べられている。次に続く、上清からのzacrp3ポリペプチドの精製は、本文に述べられた方法を用いて行なわれることが可能である。
【０１５８】
酵母細胞を含めた真菌細胞も、本発明の範囲内で使用されることができる。この点において特に興味深い酵母の種類は、サッカロミケス・セレビシエ（Saccaromyces cerevisiae）、およびピキア・メタノリカ（Pichia methanolica）を含む。外来性のDNAを用いてＳ．セレビシエ細胞をトランスフォームし、さらにそれより組換えポリペプチドを産生する方法は、たとえば、Kawasaki、米国特許第4,599,311号；Kawasakiら、米国特許第4,931,373号；Brake、米国特許第4,870,008号；Welchら、米国特許第5,037,743号；およびMurraytら、米国特許第4,845,075号によって開示されている。
【０１５９】
トランスフォームされた細胞は、選択可能なマーカー、一般には薬剤耐性かまたは特定の栄養素（たとえば、ロイシン）の不在下に成育する能力、によって決定される表現型により選択される。サッカロミセス・セレビジエにおいて用いるための好ましいベクター系は、Kawasakiら（米国特許第4,931,373号）により開示されたPOT1ベクター系であり、それはトランスフォームされた細胞が、含グルコース培地中での成育によって選ばれることを可能にする。酵母における使用のための、適当なプロモーターおよびターミネーターは、糖分解酵素遺伝子（たとえばKawasaki、米国特許第4,599,311号；Kingsmanら、米国特許第4,615,974号；およびBitter、米国特許第4,977,092号参照）およびアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子からのものを含む。
【０１６０】
また米国特許第4,990,446号、第5,063,154号、第5,139,936号、および第4,661,454号も参照のこと。ハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）、スキゾサッカロミケス・ポンベ（Schizosaccaromyces pombe）、クルイベロミケス・ラクチス（Kluyveromyces lactis）、クルイベロミケス・フラギリス（Kluyveromyces fragilis）、ウスティラゴ・マイディス（Ustilago maydis）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、ピキア・メタノリカ（ Pichia methanolica ）、ピキア・ギルレルモンディー（Pichia guillermondii）、およびカンジダ・マルトサ（Candida maltosa）を含めた他の酵母のためのトランスフォーメーション系は、この技術において周知である。
【０１６１】
たとえば、Gleesonら、J. Gen. Microbiol. 132 : 3459 - 65、1986およびCregg、米国特許第4,882,279号を参照のこと。コウジカビ属の細胞は、McKnightら、米国特許第4,935,349号の方法に従って利用されてよい。アクレモニウム・クリソゲヌム（Acremonium chrysogenum）をトランスフォームする方法は、Suminoら、米国特許第5,162,228号によって開示されている。アカパンカビ属をトランスフォームする方法は、Lambowitz、米国特許第4,486,533号により開示されている。
【０１６２】
組換えタンパク質の産生のための宿主としてのピキア・メタノリカの使用は、WIPO公開、WO97/17450、WO97/17451、WO98/02536、およびWO98/02565に開示されている。Ｐ．メタノリカのトランスフォームに用いるためのDNA分子は、一般に二本鎖の環状プラスミドとして調製されるであろうが、好ましくはトランスフォーメーションに先立ち直鎖化される。Ｐ．メタノリカにおけるポリペプチド産生用には、プラスミド中のプロモーターおよびターミネーターは、 Ｐ．メタノリカのアルコール利用遺伝子（AUG1またはAUG2）などのＰ．メタノリカの遺伝子であることが好ましい。
【０１６３】
他の有用なプロモーターは、ジヒドロキシアセトンシンターゼ（DHAS）、 ギ酸デヒドロゲナーゼ（FMD）、およびカタラーゼ（CAT）遺伝子のそれを含む。宿主染色体へのDNAの組込みを促進するため、両端に宿主DNA配列が隣接された、プラスミドの全発現セグメントを有することが好ましい。ピキア・メタノリカでの使用に好ましい選択可能なマーカーは、Ｐ．メタノリカADE2遺伝子であり、それはアデニンの非存在下にade2宿主細胞の成育を可能にするホスホリボシル-5-アミノイミダゾールカルボキシラーゼ（AIRC;EC4.1.1.21）をコードする。
【０１６４】
メタノールの使用を最小限化することが望ましい大規模の産業用の工程用には、双方のメタノール利用遺伝子（AUG1およびAUG2）が欠失されている宿主細胞を用いることが好ましい。分泌タンパク質の製造用には、液胞型プロテアーゼ遺伝子（PEP4およびPRB1）が欠如した宿主細胞が好ましい。興味のポリペプチドをコードしているDNAを含んでいるプラスミドの、Ｐ．メタノリカ細胞への導入を促進するため、電気穿孔が用いられる。2.5〜4.5kV／cm、好ましくは約3.75kV／cmの電界強度と、１〜40ミリセカンド、最も好ましくは約20ミリセカンドの時定数（τ）とを有する、指数関数的に減退していくパルス電界を用いた電気穿孔により、Ｐ．メタノリカ細胞をトランスフォームすることが好ましい。
【０１６５】
また大腸菌、バチルス属、および他の属の細菌の株を含めた原核性の宿主細胞も、本発明の範囲内の有用な宿主細胞である。これらの宿主細胞をトランスフォームし、かつそこにクローン化された外来性DNA配列を発現する技術は、この技術分野において周知である（Sambrookら、同書参照のこと）。大腸菌などの細菌においてzacrp3ポリペプチドを発現させる場合、当該ポリペプチドは細胞質内に、典型的には不溶性の顆粒として保持されるか、または細菌の分泌配列により細胞周辺腔に指向されてよい。前者の場合には、細胞は溶解され、顆粒は回収され、たとえばグアニジンイソチオシアネートまたは尿素を用いて変性される。
【０１６６】
次いで、変性されたポリペプチドは、尿素と還元および酸化されたグルタチオンとの溶液に対する透析、およびそれに続く緩衝生理食塩水に対する透析によるといった、変性剤の希釈により再生され、二量化されることが可能である。後者の場合には、細胞周辺腔の内容物を放出するべく、細胞を（たとえば超音波処理または浸透圧ショックにより）破壊すること、および当該タンパク質を回収することにより、当該ポリペプチドが可溶性ならびに機能性の形状にて細胞周辺腔より回収され、それにより変性ならびに再生の必要性を除去することができる。
【０１６７】
トランスフォームされるかまたはトランスフェクトされた宿主細胞は、栄養素と、選択された宿主細胞の増殖に必要な他の成分とを含んでいる培養液中にて、通常の方法に従って培養される。合成培地ならびに自然培地を含む、種々の適当な培地は当該技術において周知であり、一般的に炭素源、窒素源、必須アミノ酸、ビタミン、およびミネラルを含む。また培地は、必要に応じて増殖因子または血清を含んでもよい。一般的に増殖培地は、たとえば、薬物選択か、または発現ベクター上にて運ばれるかまたは宿主細胞内へ同時トランスフェクトされる、選択可能なマーカーによって補足される必須栄養素の欠乏により、外来性に添加されたDNAを含んでいる細胞を選択するであろう。
【０１６８】
発現されたzacrp3ポリペプチド（またはキメラzacrp3ポリペプチド）は、分画法および／または通常の精製法および培地を用いて精製されることが可能である。硫酸アンモニウム沈殿法および、酸またはカオトロープ抽出法が、試料の分画用に用いられてよい。代表的な精製工程は、ヒドロキシアパタイト、サイズ排除、FPLC、および逆相高性能液体クロマトグラフィーを含んでよい。適当なクロマトグラフィー用の媒質は、誘導デキストラン、アガロース、セルロース、ポリアクリルアミド、特製シリカ、その他を含む。PEI、DEAE、QAE、およびＱ誘導体が好ましい。
【０１６９】
代表的なクロマトグラフィー用媒質は、フェニル、ブチル、またはオクチル基を用いて誘導された、フェニルセファロース（Phenyl-Sepharose）FF（ファルマシア）、トヨパール（Toyopearl）ブチル650（Toso Haas、ペンシルベニア州、モントゴメリービル）、オクチルセファロース（Octyl-Sepharose）（ファルマシア）などの媒質か；またはアンバークロム（Amberchrom）（Toso Haas）CG71（Toso Haas）およびその他のポリアクリル樹脂を含む。適当な固形支持体は、ガラスビーズ、シリカを主成分とする樹脂、セルロース樹脂、アガロースビーズ、架橋アガロースビーズ、ポリスチレンビーズ、架橋ポリアクリルアミド樹脂、およびその他の、それらが使用される条件下で不溶性であるものを含む。
【０１７０】
このような支持体は、アミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、水酸基、および／または炭水化物部分による、タンパク質の付着を可能にする反応基を用いて修飾されてよい。カップリング化学の実例は、臭化シアン活性化、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド活性化、エポキシド活性化、SH活性化、ヒドラジド活性化、およびカルボジイミドカップリング化学のためのカルボキシルおよびアミノ誘導体を含む。
【０１７１】
これらの、および他の固形媒質は、この技術において周知でありかつ広く用いられており、また商業的な供給者から入手可能である。受容体ポリペプチドの支持媒質への結合は、この技術において周知である。一つの特別の方法の選択は、日常の設計の問題であり、選ばれた支持体の性質によってある程度決定される。たとえば、Affinity Chromatography : Principles & Methods（アフィニティクロマトグラフィー：原理と方法）、ファルマシアLKBバイオテクノロジー、スウェーデン、ウプサラ、1988参照のこと。
【０１７２】
本発明のポリペプチドは、それらの構造または結合特性の開発により単離されることが可能である。たとえば、固定化金属イオン吸着（FMAC）クロマトグラフィーは、ヒスチジンに富むタンパク質か、またはHisタグを有するタンパク質を精製するべく用いられることが可能である。手短に言えば、ゲルはまず２価の金属イオンで満たされてキレートを形成する（Sulkowski、Trends in Biochem. 3 : 1 - 7、1985）。ヒスチジンに富むタンパク質は、用いられた金属イオンに依存して、異なる親和性を以ってこのマトリックスに吸着され、また競合的な溶出、pHの低下、または強力なキレート剤の使用により溶出されるであろう。
【０１７３】
他の精製法は、レクチンアフィニティクロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィーによる、グリコシル化されたタンパク質の精製を含む（Methds in Enzymol. 182巻、「Guide to Protein Purification（タンパク質精製入門）」Deutscher、（編）、アカデミックプレス、サンディエゴ、1990、529 - 39頁）。以下の実施例の部分において非常に詳細に議論されているように、精製を促進するべく、本発明のさらなる好ましい態様の範囲内において、興味のポリペプチドとアフィニテータグ（たとえば、マルトース結合タンパク質、FLAG、Gli-Glu、免疫グロブリンドメイン）との融合物が構築されてよい。
【０１７４】
タンパク質再生（および任意で再酸化）の手法が、都合よく用いられてよい。タンパク質は80％純度まで、さらに好ましくは＞90％純度まで、さらになお好ましくは＞95％まで精製することが好ましく、また特に好ましくは薬剤学的に純粋な状態であって、すなわち高分子、特に他のタンパク質および核酸を汚染するものについては99.9％純度より高く、かつ感染性および発熱性の薬剤を含まない。好ましくは、精製されたタンパク質は実質的に他のタンパク質、特に動物起源の他のタンパク質を含まない。
【０１７５】
またzacrp3ポリペプチドまたはそのフラグメントは、この技術において周知の方法により化学合成を通して調製されてよい。かかるzacrp3ポリペプチドは単量体かまたは多量体でよく；グリコシル化されるかまたはグリコシル化されず；ペジレート（pegylate)されるかまたはペジレートされず；および最初のメチオニンアミノ酸残基を含むか、または含まなくてもよい。
【０１７６】
zacrp3結合ポリペプチドのようなリガンド結合ポリペプチドは、リガンドの精製にも使用可能である。当該ポリペプチドは、アガロースのビーズ、架橋アガロース、ガラス、セルロース樹脂、シリカを主成分とする樹脂、ポリスチレン、架橋ポリアクリルアミド、または使用条件下に安定である同様な物質などの、固形支持体上に固定される。ポリペプチドを固形支持体に結合する方法は、この技術において周知であり、アミン化学、臭化シアン活性化、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド活性化、エポキシ活性化、SH活性化、およびヒドラジド活性化を含む。結果として生じる媒質は、一般にカラムの形状に形成され、リガンドを含んでいる液体は当該カラムを１回またはそれより多く通され、リガンドがリガンド結合ポリペプチドに結合するようにする。次いでリガンドは、リガンドー受容体結合を崩壊させるための、塩類濃度、カオトロピック剤（グアニジンHCl）、またはpHにおける変化を用いて溶出される。
【０１７７】
リガンド結合受容体（または抗体、補体／抗補体対の一員）か、またはその結合フラグメント、および市販の生物測定器具（BIAcoreTM、ファルマシア・ニュージャージー州、ピスカタウェイ）を用いた検定系が都合よく用いられてよい。かかる受容体、抗体、補体／抗補体ペアのメンバーまたはフラグメントは、受容体チップの表面上に固定される。この器具の使用は、Karlsson、J. Immunol. Methods 145 : 229 - 40、1991およびCunninghamおよびWells、J. Mol. Biol. 234 : 554 - 63、1993により開示されている。
【０１７８】
受容体、抗体、メンバーまたはフラグメントは、アミンまたはSH化学を用いて、フローセル内のゴールドフィルムに結合されたデキストランファイバーに共有結合により結合される。検査試料は当該セルを通過する。もしリガンド、エピトープ、または補体／抗補体ペアの対立するメンバーが試料中に存在すれば、それは固定された受容体、抗体またはメンバーに結合し、各々媒質の屈折率に変化を引き起こし、それがゴールドフィルムの表面プラズモン共鳴の変化として検出されるであろう。この系はオンおよびオフ速度の測定を可能にし、それにより結合親和性が算定されることが可能であり、さらに結合の数量評価を可能にする。
【０１７９】
またリガンド結合ポリペプチドは、この技術において周知の他の検定系の中で使用されることが可能である。かかる系は、結合親和性の測定のためのスキャッチャード分析（Scatchard、Ann. NY Acad. Sci. 51 : 660 - 72、1949参照のこと）、および熱量計分析（Cunninghamら、Science 253 : 545- 48、1991；Cunninghamら、Science 245 : 821 - 25、1991）を含む。
【０１８０】
また本発明は抗zacrp3抗体も提供する。zacrp3に対する抗体は、たとえば、zacrp3発現ベクターの産物か、または天然の供給源から単離されたzacrp3を抗原として用いて取得されることが可能である。特に有用な抗zacrp3抗体は、zacrp3と「特異的に結合する」。抗体は、もし当該抗体が、106M-1かそれより大きい、好ましくは107M-1かそれより大きい、さらに好ましくは108M-1かそれより大きい、および最も好ましくは109M-1かそれより大きい結合親和性（Ka）を以ってzacrp3ポリペプチド、ペプチドまたはエピトープに結合すれば、特異的に結合しているとみなされる。抗体の結合親和性は、たとえばスキャッチャード分析（Scatchard、Ann. NY Acad. Sci. 51 : 660、1949）により、当業者にによって容易に測定されることができる。適当な抗体は、zacrp3と特定のドメインにおいて結合する抗体を含む。
【０１８１】
抗zacrp3抗体は、抗zacrp3エピトープをもつペプチドおよびポリペプチドを用いて産生されることが可能である。抗原性のエピトープをもつ本発明のペプチドおよびポリペプチドは、配列番号２に含まれている、少なくとも９個の、好ましくは15から約30個までの間のアミノ酸を含む。しかしながら、30から50個のアミノ酸を含んでいる本発明のアミノ酸配列の、より大きい部分を含んでいるペプチドまたはポリペプチドか、または本発明のポリペプチドの完全なアミノ酸配列を含めたどの長さまでのものもまた、zacrp3と結合する抗体の誘導に有用である。
【０１８２】
エピトープをもつペプチドのアミノ酸配列は、水溶性の溶媒において実質的な可溶性を提供するべく選択されることが望ましい（すなわち、当該配列は相対的に親水性の残基を含むとともに、疎水性の残基は好ましくは避けられる）。親水性のペプチドは、当業者により疎水性プロットから予測されることが可能であり、たとえば、HoppおよびWoods（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 : 3824 - 8、1981）およびKyteおよびDoolittle（J. Mol. Biol. 157 : 105 - 142、1982）を参照のこと。さらに、プロリン残基を含んでいるアミノ酸配列も、抗体産生にとって望ましくてよい。
【０１８３】
組換えzacrp3タンパク質に対しての、あるいは天然の供給源から単離されたzacrp3に対するポリクローナル抗体は、当業者に周知の方法を用いて調製されることが可能である。たとえば、Greenら、「Production of Polyclonal Antisera（ポリクローナル抗血清の産生）」Immunochemical Protocols（免疫化学的プロトコール）（Manson編）、1 - 5頁（ヒュマナ（Humana）・プレス 1992）、およびWilliamsら、「Expression of foreign proteins in E. coli using plasmid vectors and purification of secific polyclonal antibodies（プラスミドベクターを用いた大腸菌における外来性タンパク質の発現）」DNA Cloning （DNAクローニング）2 : Expression Systems（発現系）、第２版、Gloverら（共編）、15頁（オックスフォード・ユニバーシティ・プレス1995）参照のこと。
【０１８４】
zacrp3ポリペプチドの免疫原性は、ミョウバン（水酸化アルミニウム）か、完全または不完全フロイントアジュバントなどの、アジュバントの使用を通して増大されることが可能である。免疫化にとって有用なポリペプチドも、zacrp3またはその一部分と、免疫グロブリンポリペプチドかまたはマルトース結合タンパク質との融合物などの、融合ポリペプチドを含む。ポリペプチド免疫原は完全長の分子か、またはその一部であってよい。もしポリペプチド部分が「ハプテン様」であれば、免疫化用にはかかる部分は高分子担体（キーホールリンペットヘモシニアン(KLH）、ウシ血清アルブミン(BSA）または破傷風トキソイド）などの）に対し、都合よく結合または連結されてよい。
【０１８５】
ポリクローナル抗体は、典型的にはウマ、ウシ、イヌ、ニワトリ、ラット、マウス、ウサギ、ハムスター、モルモット、ヤギ、またはヒツジといった動物において高められるが、類人猿からも得られてよい。診断ならびに治療に有用な抗体をヒヒにおいて高めるための一般的な技術は、たとえばGoldenbergmら、国際特許公開  WO91/11465、およびLosmanら、Int. J. Cancer 46 : 310、1990に見い出されてよい。また抗体は、トランスジェニックヒツジ、ウシ、ヤギ、またはブタといったトランスジェニック動物においても高められることが可能であり、また酵母および真菌においても、哺乳類および昆虫細胞におけるように修正された形状において発現されることが可能である。
【０１８６】
別法として、モノクローナル抗zacrp3抗体が生成されてよい。特定の抗原に対する齧歯動物のモノクローナル抗体は、当業者に周知の方法により取得されてよい（たとえば、Kohlerら、Nature 256 : 495（1975）、Coliganら、（共編）、Current Protocols in Immunology（免疫学における現在のプロトコール）、第１巻、2.5.1 - 2.6.7頁（ジョン・ウィリー＆サンズ1991）、Picksleyら、「Production of monoclonal antibodies against proteins expressed in E. coli（大腸菌において発現されたタンパク質に対するモノクローナル抗体の産生）」DNA Cloning （DNAクローニング）2 : Expression Systems（発現系）、第２版、Gloverら（共編）、93頁（オックスフォード・ユニバーシティ・プレス1995）を参照のこと）。
【０１８７】
手短に言えば、モノクローナル抗体は、zacrp3遺伝子産物を含んで成る組成物をマウスに注射することと、血清試料を取ることにより抗体産生の存在を確かめることと、Ｂリンパ球を得るべく脾臓を取り除くことと、Ｂリンパ球をミエローマ細胞と融合させてハイブリドーマを生じることと、当該ハイブリドーマをクローニングすることと、抗原に対して抗体を産生する陽性クローニングを選択することと、抗原に対して抗体を産生するクローンを培養すること、および当該ハイブリドーマ培養物から抗体を単離すること、により取得されることが可能である。
【０１８８】
さらに、本発明の抗zacrp3抗体は、ヒトのモノクローナル抗体から由来してもよい。ヒトのモノクローナル抗体は、抗原の攻撃に反応して特異的なヒト抗体を産生するべく工作されているトランスジェニックマウスから取得される。この技術においては、ヒトのＨおよびＬ鎖の遺伝子座のエレメントが、内在性のH鎖およびＬ鎖の遺伝子座のターゲットされた破壊を含む胚性幹細胞に由来するマウスの系統に導入される。当該トランスジェニックマウスは、ヒト抗原に特異的なヒト抗体を合成することができ、当該マウスはヒト抗体を分泌するハイブリドーマを製造するべく用いられることが可能である。トランスジェニックマウスからヒト抗体を得るための方法は、たとえば、Greenら、Nature Genet. 7 : 13、1994、Lonbergら、Nature 368 : 856、1994、およびTaylorら、Int. Immun. 6 : 579、1994、により記述されている。
【０１８９】
モノクローナル抗体は、充分に確立された種々の技術により、ハイブリドーマ培養物より単離および精製されることが可能である。かかる単離技術は、プロテインＡセファロース、 サイズ排除クロマトグラフィー、およびイオン交換クロマトグラフィーを用いたアフィニティクロマトグラフィーを含む（たとえば、Coligan、2.7.1 - 2.7.12頁および2.9.1 - 2.9.3頁；Bainesら、「Purification of Immunoglobulin G（IgG）（免疫グロブリンGの精製）」、Methods in Molecular Biology、第10巻、79 - 104頁（ザ・ヒュマナ・プレス社1992）参照のこと）。
【０１９０】
特別の用途のためには、抗zacrp3抗体のフラグメントを調製することが望ましい。かかる抗体フラグメントは、たとえば当該抗体のタンパク質分解性加水分解により取得されることが可能である。抗体フラグメントは、全抗体のペプシンまたはパパイン消化により、通常の方法によって取得されることが可能である。一つの例証として、抗体フラグメントはペプシンを用いた抗体の酵素的切断により産生されることができ、F(ab´)2と表示される5Sのフラグメントを供給する。このフラグメントは、チオール還元剤を用いてさらに切断されることが可能であり、１価の3.5Sfab´フラグメントを産生する。
【０１９１】
任意で、当該切断反応はジスルヒド結合の切断の結果として生じるSH基のための阻害基を用いて行なわれることが可能である。別法として、ペプシンを用いた酵素的切断は２つの１価のFabフラグメントと、一つのFcフラグメントとを直接産生する。これらの方法は、たとえばGoldenberg、米国特許第4,331,647号、Nisonoffら、Arch Biochem. Biophys. 89 : 230、1960、Porter、Biochem. J. 73 : 119、1959、Edelmanら、Methods in Enzymology 第１巻、422頁（アカデミック・プレス1967）、およびColigan（同書）に述べられている。
【０１９２】
また、１価のＬ−Ｈ鎖フラグメントを形成するためのＨ鎖の分離、フラグメントのさらなる切断、または他の酵素的、化学的、または遺伝的技術などの、他の抗体切断法も、当該フラグメントが、無傷の抗体によって認識される抗原に対して結合する限り使用されてよい。
たとえば、FvフラグメントはＶHおよびＶL鎖の会合を含む。この会合は、Inbarら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA69 : 2659、1972に述べられているように、非共有結合性である。別法として、可変鎖は分子間のジスルフィド結合により結合されるか、またはグルタールアルデヒドなどの化学薬品により架橋されることが可能である（たとえば、Sadhu、Crit. Rev. Biotech. 12 : 437、1992参照）。
【０１９３】
FvフラグメントはＶHおよびＶL鎖を含んでよく、それらはペプチドリンカーによって連結される。このような単鎖の抗原結合性タンパク質（scFv）は、オリゴヌクレオチドによって連結されている、ＶHおよびＶLドメインをコードしているDNAを含んでいる構造遺伝子を構築することにより調製される。当該構造遺伝子は発現ベクター内に挿入され、それは次に大腸菌などの宿主細胞に導入される。組換え宿主細胞は、二つのＶドメインを架橋しているリンカーペプチドをもつ一本のポリペプチド鎖を合成する。scFvを産生する方法は、たとえば、Whitlowら、Methods : A Companion to Methods in Enzymology 2 : 97、1991により記述されており、またBirdら、Science 242 : 423、1988、Ladnerら、米国特許第4,946,778号、Packら、Bio/Technology 11 : 1271、1993、およびSandhu、同書、も参照のこと。
【０１９４】
一つの実例として、scFvは、リンパ球をzacrp3ペプチドに対してインヴィヴォにおいて暴露すること、およびファージまたは同様のベクターにおける抗体ディスプレイライブラリーを選択することにより（たとえば、固定化または標識されたzacrp3タンパク質またはペプチドの使用を通して）、取得されることが可能である。潜在性のzacrp3ポリペプチド結合ドメインを有するポリペプチドをコードしている遺伝子は、ファージ上（ファージディスプレイ）か、または大腸菌などの細菌上にディスプレイされた、ランダムペプチドライブラリーをスクリーニングすることにより取得されることが可能である。
【０１９５】
当該ポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列は、ランダム突然変異誘発およびランダムポリヌクレオチド合成を通すというような、いくつかの方法で取得されることが可能である。このようなランダムペプチドディスプレイライブラリーは、リガンドまたは受容体、生体または合成高分子、あるいは、有機または無機物質といった、タンパク質またはポリヌクレオチドであることが可能な既知の標的と相互作用するペプチドについてスクリーンするべく用いられることが可能である。
【０１９６】
かかるランダムペプチドディスプレイライブラリーを作成およびスクリーニングするための方法は、当該技術において周知であり（Ladnerら、米国特許第5,223,409号、Ladnerら、米国特許第4,946,778号、Ladnerら、米国特許第5,403,484号、Ladnerら、米国特許第5,571,698号、およびKeyら、Phage Display of Peptides and Proteins（ペプチドおよびタンパク質のファージディスプレイ）（アカデミック・プレス社1996）、またランダムペプチドディスプレイライブラリーおよびかかるライブラリーをスクリーニングするためのキットは、たとえばクロンテック（Clontech）（カリフォルニア州、パロアルト）、インヴィトロジェン（Invitrogen）社（カリフォルニア州、サンディエゴ）、ニュー・イングランド・バイオラブズ（New England Biolabs）社（マサチューセッツ州、ベバリー）、およびファルマシアLKBバイオテクノロジー社（ニュージャージー州、ピスカタウェイ）から市販されている。ランダムペプチドディスプレイライブラリーは、zacrp3に結合するタンパク質を同定するべく、本文において開示されたzacrp3配列を用いてスクリーニングされることが可能である。
【０１９７】
抗体フラグメントのもう一つの形状は、一つの相補性決定領域(CDR）をコードしているペプチドである。CDRペプチド（「最小の認識単位」）は、興味の抗体のCDRをコードしている遺伝子を構築することによって取得されることが可能である。かかる遺伝子は、たとえば、抗体産生細胞のRNAから可変領域を合成するべく、ポリメラーゼ連鎖反応を用いることにより調製される（たとえば、Larrickら、Methods : A Companion to Methods in Enzymology（方法：酵素学の方法への入門書）2 : 106、1991）、Courtenay-Luck、「Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies（モノクローナル抗体の遺伝操作）」、Monoclonal Antibodies : Production, Engineering and Clinical Application（モノクローナル抗体：産生、工学、および臨床応用）、Riterら、（共編）、166頁（ケンブリッジ・ユニバーシティ・プレス1995）、およびWard ら、「Genetic Manipulation and Expression of Antibodies（抗体の遺伝操作と発現）」、Monoclonal Antibodies : Princeples and Applications（モノクローナル抗体：原理と応用）、Birchら、（共編）、137頁（ワイリ・リス（Wiley-Liss）社）参照のこと）。
【０１９８】
別法として、抗zacrp3抗体は、「人化」モノクローナル抗体から由来してよい。人化モノクローナル抗体は、マウス免疫グロブリンＨおよびＬ可変領域からの、マウスの相補性決定領域を、ヒトの可変ドメインへ転移することによって生成される。次いで、ヒト抗体の典型的な残基が、マウスの相対物のフレーム枠領域において置換される。人化モノクローナル抗体由来の抗体成分の使用は、マウスの定常領域の免疫原性と結び付いた潜在性の問題を取り除く。マウス免疫グロブリン可変ドメインをクローニングするための全般的な技術は、たとえば、Orlandiら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 : 3833、1989に述べられている。
【０１９９】
人化モノクローナル抗体を産生するための技術は、たとえば、Jonesら、Nature 321 : 522、1986、Carterら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA89 : 4285、1992、Sandhu、Crit. Rev. Biotech. 12 : 437、1992、Singerら、J. Immun. 150 : 2844、1993、Sudhir（編）、Antibody Engineering Protocols（抗体工学プロトコール）（ヒュマナ・プレス社1995)、Kelley、「 Engineering  Therapeutic Antibodies（治療用抗体のエンジニアリング）」、Protein Engineering : Principles and Practice（タンパク質工学：原理と実践）、Clelandら（共編）、399 - 434頁（ジョン・ウィリー＆サンズ社1996）、およびQueenらによる、米国特許第5,693,762号（1997）に記述されている。
【０２００】
ポリクローナル抗イディオタイプ抗体は、抗zacrp3抗体または抗体フラグメントを用いた、標準的な技術による動物の免疫化によって調製されてよい。たとえば、Greenら、「Production of Polyclonal Antisera（ポリクローナル抗血清の産生）」Methods In Molecular Biology : Immunochemical Protocols（分子生物学の方法：免疫化学プロトコール）、Manson（編）、1 - 12頁（ヒュマナ・プレス1992）参照のこと。また、Coligan（同書）、2.4.1 - 2.4.7頁も参照のこと。
【０２０１】
別法として、モノクローナル抗イディオタイプ抗体は、抗zacrp3抗体または抗体フラグメントを免疫原として用い、前文に述べた技術を用いて調製されることが可能である。もう一つの別法として、人化抗イディオタイプ抗体、または類人猿抗イディオタイプ抗体が、上記の技術を用いて調製されることが可能である。抗イディオタイプ抗体を産生する方法は、たとえば、Irieによる米国特許第5,208,146号、Greeneら、米国特許第5,637,677号、およびVarthakaviおよびMinocha、J. Gen. Virol. 77 : 1875、1996により記述されている。
【０２０２】
潜在性のzacrp3ポリペプチド結合ドメイン、「結合ドメイン」を有するポリペプチドをコードしている遺伝子は、ファージ上（ファージディスプレイ）か、または大腸菌などの細菌上にディスプレイされたランダムまたは定方向ペプチドライブラリーをスクリーニングすることによって取得されることが可能である。当該ポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列は、ランダム突然変異誘発、およびランダムポリペプチド合成といった、いくつかの方法において取得されることが可能である。別法として、連結式の（constrained）ファージディスプレイライブラリーも製造されることが可能である。
【０２０３】
このようなペプチドディスプレイライブラリーは、リガンドまたは受容体、生体または合成高分子、あるいは、有機または無機物質といった、タンパク質またはポリヌクレオチドであることが可能な既知の標的と相互作用するペプチドについてスクリーンするべく用いられることが可能である。かかるペプチドディスプレイライブラリーを作成およびスクリーニングするための技術は、当該技術において周知である（Ladnerら、米国特許第5,223,409号、Ladnerら、米国特許第4,946,778号、Ladnerら、米国特許第5,403,484号、Ladnerら、米国特許第5,571,698号）、またペプチドディスプレイライブラリーおよびかかるライブラリーをスクリーニングするためのキットは、たとえばクロンテック（Clontech）（カリフォルニア州、パロアルト）、インヴィトロジェン（Invitrogen）社（カリフォルニア州、サンディエゴ）、ニュー・イングランド・バイオラブズ（New England Biolabs）社（マサチューセッツ州、ベバリー）、およびファルマシアLKBバイオテクノロジー社（ニュージャージー州、ピスカタウェイ）から市販されている。
【０２０４】
ペプチドディスプレイライブラリーは、zacrp3に結合するタンパク質を同定するべく、本文において開示されたzacrp3配列を用いてスクリーニングされることが可能である。zacrp3ポリペプチドと相互作用するこれらの「結合タンパク質」は、本質的には抗体と同様に用いられることが可能である。
【０２０５】
zacrp3タンパク質またはペプチドに対して特異的に結合する抗体および／または結合タンパク質を検出するべく、当業者には周知の種々の検定が利用されることが可能である。代表的な検定は、Antibodies : A Laboratory Manual、Harlow およびLane（共編）コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、1988に述べられている。かかるアッセイの代表的な実例は：同時免疫電気泳動、ラジオイムノアッセイ、放射免疫沈降、エライサ（ELISA）、ドットブロット法、ウェスタンブロット分析法、阻害または競合部分析法、およびサンドウィッチ分析法を含む。さらに、抗体は野性型対突然変異型のzacrp3タンパク質またはポリペプチドに対する結合について、スクリーンされることが可能である。
【０２０６】
zacrp3に対する抗体および結合タンパク質は、zacrp3を発現する細胞をターゲティングするため；親和精製によりzacrp3を単離するため；zacrp3ポリペプチドの循環レベルを測定するための診断用の分析のため；基礎病理または疾患のマーカーとして、可溶性のzacrp3を検出または定量するため；FACSを用いた分析法において；発現ライブラリーのスクリーニングのため；抗イディオタイプ抗体の生成のため；および精子形成または、インヴィトロおよびインヴィヴォでの同様な活性についてについての、zacrp3ポリペプチドの修飾を阻止するための中和抗体またはアンタゴニストとして使用されてよい。
【０２０７】
適当な直接タグまたは標識は、放射性核種、酵素、基質、補助因子、阻害剤、蛍光標識、化学発光標識、磁気粒子、およびその他を含み；間接タグまたは標識は、ビオチン−アビジンまたは中間体としての他の補体／抗補体の利用法を特色としてよい。さらに、zacrp3またはそのフラグメントに対する抗体は、インヴィトロにおいて、変性したzacrp3またはそのフラグメントを検出するべく、検定、たとえばウェスタンブロットか、または当該技術において周知の他の検定において使用されてよい。
【０２０８】
また本文の抗体またはポリペプチドは、薬剤、毒素、放射性核種、その他に対し、直接または間接的に結合されることも可能であり、このような結合体はインヴィヴォにおける診断または治療用の適用に用いられる。たとえば、本発明のポリペプチドまたは抗体は、対応する抗相補性分子（たとえば、各々受容体または抗原）を発現する組織または器官を、同定または治療するべく用いられることが可能である。さらに具体的には、zacrp3ポリペプチドまたは抗zacrp3抗体か、それらの生物活性フラグメントまたは部分は、検出可能なまたは細胞毒性分子に対して結合され、抗相補性分子を発現する細胞、組織、または器官を有する哺乳類に対して送達されることが可能である。
【０２０９】
本発明のさらなる観点は、前文に開示されたzacrp3ポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストを同定するための方法を提供しており、当該アゴニストまたはアンタゴニストは、本文においてさらに議論される有用性の高い特性を有してよい。一つの態様においては、zacrp3ポリペプチドアゴニストに対して反応性の細胞を提供することと、当該細胞を検査化合物の存在下に培養して、細胞の反応をzacrp3ポリペプチドの存在下に培養された細胞と比較すること、および、それに対する細胞の反応が同じタイプのものである検査化合物を選択することを含む、zacrp3ポリペプチドアゴニストの同定法が提供される。
【０２１０】
もう一つの態様においては、zacrp3ポリペプチドに対して反応性の細胞を提供することと、当該細胞の第１の部分をzacrp3の存在下に培養することと、当該細胞の第２の部分をzacrp3および検査化合物の存在下に培養すること、および細胞の第１の部分に比較して、第２の部分の細胞の細胞性反応の減少を検出することを含む、zacrp3ポリペプチドのアゴニストの同定法が提供される。試料は、本文において開示された検定に加えて、zacrp3活性の阻害について、受容体結合かまたはzacrp3依存性の細胞反応についての刺激／阻害を測定するべく設計された検定法の、多様性の範囲内で検査されることが可能である。
【０２１１】
たとえば、zacrp3反応性の細胞系は、zacrp3刺激性細胞経路に対して反応性のリポーター遺伝子構築物を用いてトランスフェクトされることが可能である。このタイプのリポーター遺伝子構築物は当該技術において周知であり、一般的に、ルシフェラーゼなどの検定可能なタンパク質をコードしている遺伝子に対して操作可能に結合されたzacrp3−DNA反応エレメントを含むであろう。DNA反応エレメントは、サイクリックAMP反応エレエレメント(CRE）、ホルモン反応エレメント(HRE）、インスリン反応エレメント(IRE）（Nasrinら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 : 5273 - 7、1990）、および血清反応エレメント（SRE）（Shawら、Cell 56 : 563 - 72、1989）を含むことが可能であるが、これに制限されない。
【０２１２】
サイクリックAMP反応エレエレメントは、Roestlerら、J. Biol. Chem. 263（13）: 9063 - 6、1988およびHabener、Molec. Endocrinol. 4（8）: 1087 - 94、1990において総説されている。ホルモン反応エレメントは、Beato、Cell 56 : 335 - 44 ; 1989に総説されている。候補化合物、溶液、混合物、または抽出物は、リポーター遺伝子の発現についてのzacrp3による刺激の減少によって立証されるような、標的細胞に対するzacrp3の活性を阻害する能力について検査される。このタイプの検定は、細胞表面の受容体に対するzacrp3の結合を直接阻止する化合物、ならびに受容体−リガンド結合に続く細胞経路における過程を阻止する化合物を検出するであろう。
【０２１３】
別法として、化合物または他の試料は、検出可能な標識（たとえば、125Ｉ、ビオチン、西洋ワサビペルオキシダーゼ、FITC、その他）をタグづけされたzacrp3を用いて、受容体に対するzacrp3の結合についての直接的な阻止について検査されることが可能である。この検定の範囲内では、検査試料の、受容体に対する標識されたzacrp3の結合を阻害する能力は阻害性の活性を暗示するものであって、それは２次検査を通して確認されることが可能である。結合検定において使用される受容体は、細胞の受容体か、または単離され、固定された受容体であってもよい。
【０２１４】
脂肪細胞の補体に関連した他のタンパク質に対する相同性に基づき、zacrp3ポリペプチド、フラグメント、融合物、アゴニスト、またはアンタゴニストは、哺乳類におけるエネルギー均衡を調整するべく、あるいは損傷から内皮細胞を保護するべく、使用されることが可能である。ネルギー均衡の調整に関しては、zacrp3ポリペプチドは細胞の代謝反応を調整する。かかる代謝反応は、脂肪生成、グルコース生成、グリコーゲン生成、脂質生成、グルコースの取り込み、タンパク質合成、熱発生、酸素利用、その他を含む。
【０２１５】
またzacrp3ポリペプチドは、交感神経または副交感神経系と結び付いた組織におけるポリペプチドの発現によって示されるような、神経伝達物質としてまたは神経伝達のモジュレーターとしての用途も見い出してよい。この点については、zacrp3ポリペプチドは、たとえば脳その他における２−デオキシ−グルコースの取り込みによって説明されるような、栄養素の取り込みの調節における効用を見い出してもよい。
【０２１６】
当該技術において周知であるか、または本文において開示された他の方法の中で、哺乳類のエネルギー平衡は、以下の一つまたはそれより多い代謝機能を監視することによって評価されてよい：脂肪生成、グルコース生成、グリコーゲン生成、脂質生成、グルコースの取り込み、タンパク質合成、熱発生、酸素利用、またはその他。これらの代謝機能は、以下にさらに充分に説明されているように、当該技術分野の普通の技術の者が周知の技術（検定または動物モデル）によって監視される。たとえば、インスリンのグルコース調節効果は、主として肝臓、骨格筋、および脂肪組織内に及ぼされる。
【０２１７】
インスリンはこれらの３つの組織においてその細胞受容体に結合して、たとえば、結果としてグルコース産生の阻害とグルコース利用の刺激とを生じる組織特異的な活動を開始する。肝臓においては、インスリンはグルコースの取り込みを刺激し、かつグルコース生成およびグリコーゲン生成を阻害する。骨格筋および脂肪組織においては、インスリンはグルコースの取り込み、貯蔵、および利用を刺激するべく作用する。前文において列挙された代謝機能のすべてを監視するための、技術の認められた方法が存在する。したがって、当該技術分野の普通の技術の者は、zacrp3ポリペプチド、フラグメント、融合タンパク質、抗体、アゴニスト、およびアンタゴニストを、代謝調節機能について評価することができる。代表的な調節技術は以下に説明されている。
【０２１８】
脂肪生成、糖新生およびグリコーゲン分解は哺乳動物エネルギー収支の相互に関係のある構成部分であり、それは、たとえば、ob/obマウスまたはdb/dbマウスを使っている既知技術よって評価することができる。ob/obマウスは、ob（肥満）遺伝子座の不活性化突然変異に関してホモ接合である近交系マウスである。そのようなob/obマウスは、摂食亢進性で、かつ低代謝性であり、循環するOBタンパク質の生成を欠いていると思われる。
【０２１９】
dB/dBマウスは、db（糖尿）遺伝子座の不活性化突然変異に関してホモ接合である近交系マウスである。db/dbマウスは、db/dbマウスが糖尿病性の表現型をも示すことを除いて、ob/obマウスに似た表現型を示す。そのようなdb/dbマウスは、循環するOBタンパク質の作用に抵抗すると信じられている。また、これらのパラメータを評価する種々の試験管内の方法は、本技術において知られている。
【０２２０】
たとえば、インシュリン促進脂質生合成は、トリグリセライドへの14Ｃ-酢酸塩の導入（Mackallら、J.Biol.Chem. 251：6462〜4、1976年）またはトリグリセライド蓄積（Kletzienら、Mol.Pharmacol. 41:393〜8、1992年）を測定することよってモニターすることができる。
【０２２１】
グルコースの取込みは、たとえば、インシュリン促進グルコース輸送のための分析法で評価することができる。トランスフェクションしていない、分化したL6筋管（G418の不在のまま保持された）を、１ｇ／ｌグルコース、0.5または1.0％ BSA、20mM Hepesおよび２mMグルタミンを含むDMEMに入れる。培養の２〜５時間後、培地を、0.5または1.0％のBSA、20mM Hepes、１mM  ピルビン酸塩および２mM  グルタミンを含む新鮮なグルコースフリーのDMEMと置換する。適切な濃度のインシュリンまたはIGF-1、または試験物質の希釈シリーズを添加し、20〜30分間細胞をインキュベートする。3Ｈまたは14Ｃ標識デオキシグルコースを、＝50 1 Ｍ  最終濃度まで添加し、細胞を約10〜30分間インキュベートする。
【０２２２】
その後、細胞を冷たい緩衝液（例えばPBS）ですばやくすすぎ、ついで適当な溶解剤（たとえば、１％ SDS または 1N-NaOH）で溶解させる。ついで、シンチレーションカウンターで細胞溶解物の計数を出す。細胞に関連した放射活性は、サイトカラシンｂ（グルコース輸送のインヒビター）の存在下で細胞をインキュベートすることよって測定される非特異性結合を減じた後にグルコース輸送の尺度として受け取られる。他の方法には、たとえば、Manchesterら（Am.J.Physiol.266（Endocrinol.Metab.29）：E326〜E333、1994年（インシュリン促進グルコース輸送））によって記述されている方法が含まれる。
【０２２３】
タンパク質合成は、たとえば、35Ｓ−メチオニンを入れた試験細胞および、35Ｓ−メチオニンとタンパク質合成の推定モジュレーターとを入れた試験細胞のインキュベーションの後に、35Ｓ−メチオニン標識タンパク質の沈降を比較することによって評価することができる。
【０２２４】
熱発生は、“The Biology of Neuropeptide Y and Related Peptides”（W.ColmersおよびC.Wahlestedt編集、Humana Press、オタワ、1993年 ）457〜509頁におけるB.Stanley；C.Billingtonら（Am.J.Physiol.260:R321、1991年）；N.Zarjevskiら（Endocrinology:1753、1993年）；C.Billingtonら（Am.J.Physiol.266:R1765、1994年）；Hellerら（Am.J.Physiol. 252（4 パート2）：R661〜7、1987年）；およびHellerら（Am.J.Physiol. 245:R32l〜8、1983年）によって記述されているようにして、評価することができる。また、代謝速度（いろいろな技術よって測定することができる）は、熱発生の間接的な測定である。
【０２２５】
酸素利用能は、Hellerら（Pflugers Arch、369：55〜9（1977年））によって述べられるように評価することができる。この方法にも、視床下部温度および代謝熱生成の分析が含まれた。酸素利用能および体温調節は、Haskellら（J.Appl.Physiol. 51：948〜54（1981年））によって記述されているように、ヒトにおいても評価された。
【０２２６】
神経刺激伝達機能は、脳における２−デオキシグルコース取込みをモニターすることよって評価することができる。このパラメータは、本技術において通常の技能を持つ人に知られている技術（動物モデルのアッセイ）、たとえば、オートラジオグラフィーによってモニターされる。有用なモニタリング技術は、たとえば、Kilduffら（J.Neurosci.10:2463〜75、1990年）によって記述されていて、関連技術は、Gerberら、Circulation 94:651〜8、1996年およびFallavollitaら、Circulation 95：1900〜9、1997年に記載された「冬眠している心臓」を評価するのに用いられた。
【０２２７】
さらに、zacrp3  ポリペプチド、フラグメント、融合アゴニストまたはそのアンタゴニストは、抗菌用として治療上有用であることができる。たとえば、補体成分C1qは、バクテリアおよびウイルスのような感染因子に対する宿主防御において役割を果たす。C1qは、特殊化したいくつかの機能を示すと知られている。たとえば、C1qは、結合性抗体またはＣ反応性タンパク質（CRP）との相互作用を通して補体カスケードを誘発する。
【０２２８】
また、C1qは、特定のバクテリア、RNAウイルス、マイコプラズマ、尿酸結晶、細菌内毒素のリピドＡ成分および特定の細胞内小器官のメンブレンと直接的に相互反応する。C1qリセプターに結合しているC1qは、ファゴサイトーシスを促進すると考えられる。C1qは、また宿主防御システムの抗体形成面を強化するようである。たとえば、Johnston、Pediatr.Infect.Dis.J.2（11）：933〜41（1993年）、参照。このように、可溶なC1q様分子は、感染因子の細胞溶解または食菌作用を促進する抗菌剤として有用であろう。
【０２２９】
zacrp3  ポリペプチド、融合タンパク、アゴニスト、アンタゴニストまたは抗体と同様にZacrp3  フラグメントは、本技術において知られている手順にしたがって、それらの抗菌性状に関して評価することができる。たとえば、Barsumら、Eur.Respir.J.8(5)：709〜14（1995年）；Sandovsky-Losicaら、J.Med.Vet.Mycol.（英国）28(4)：279〜87（1990年）；Mehenteeら、J.Gen.Microbiol.（英国）135（パート８）：2181〜8（1989年）；SegalおよびSavage、J.Med.Vet.Mycol.24:477〜9（l986年）および類似文献、参照。
【０２３０】
必要ならば、この点に関してのzacrp3のパフォーマンスは、プロリンの豊富なタンパク質、リソチーム、ヒスタチン、ラクトペルオキシダーゼまたは類似物のような、この点に関しては機能的であると知られているタンパク質と比較することができる。さらに、zacrp3  フラグメント、ポリペプチド、融合タンパク、アゴニスト、アンタゴニストまたは抗体は、相乗効果を確認するために一つ以上の抗菌剤と組合せて評価することができる。本技術における通常の技能の人は、zacrp3  ポリペプチド、フラグメント、融合タンパク、アゴニスト、アンタゴニストおよび抗体の抗菌性状が同様に評価されうることを認めるであろう。
【０２３１】
神経伝達物質または神経刺激伝達モジュレーターとして、zacrp3  ポリペプチド、融合タンパク、アゴニスト、アンタゴニストまたは抗体と同様に、本発明のzacrp3  ポリペプチドフラグメントもまた、カルシウムイオン濃度、筋収縮、ホルモン分泌、DNA合成（または細胞成長）、イノシトールリン酸ターンオーバー、アラキドン酸塩放出、ホスホリパーゼＣ活性化、胃内容排出、ヒト好中性の活性化（またはADCC能力）、スーパーオキシドアニオン生産および類似のことを調節することができる。これらの性状の評価は、ここで述べられる方法などの、既知の方法よって行うことができる。
【０２３２】
細胞内のカルシウム濃度に対するzacrp3  ポリペプチド、フラグメント、融合、抗体、アゴニストまたはアンタゴニストの影響は、Dobrzanskiら（Regulatory Peptides 45;341〜52、1993年）などによって記述される方法のような 、本技術において知られている方法よって評価することができる。筋収縮に対するzacrp3  ポリペプチド、フラグメント、融合、アゴニストまたはアンタゴニストの影響は、SmitsおよびLebebvre（J.Auton.Pharmacol. 14：383〜92、1994年）、Belioliら（J.Vet.Pharmacol.Therap. 17：379〜83、1994年）、Maggiら（Regulatory Peptides 53：259〜74、1994年）などによって記述されている方法のような、本技術において知られている方法よって評価することができる。
【０２３３】
ホルモン分泌に対するzacrp3  ポリペプチド、フラグメント、融合、アゴニストまたはアンタゴニストの影響は、Henriksenら（J.Recep.Sig.Transd.Res.15（1〜4）：529〜41、1995年）などによって記述されているプロラクチン放出のための方法のような、本技術において知られている方法よって評価することができる。DNA合成または細胞成長に対するzacrp3  ポリペプチド、フラグメント、融合、アゴニストまたはアンタゴニストの影響は、Dobrzanskiら（Regulatory Petides 45:341〜52、1993年）などによって記述されている方法のような、本技術において知られている方法よって評価することができる。
【０２３４】
イノシトールリン酸ターンオーバーに対するzacrp3  ポリペプチド、フラグメント、融合、アゴニストまたはアンタゴニストの影響は、Dobrzanskiら（Regulatory Peptides 45：341〜52、1953年）などによって記述されている方法のような、本技術において知られている方法よって評価することができる。
【０２３５】
また、アラキドン酸塩放出に対するzacrp3  ポリペプチド、フラグメント、融合、アゴニストまたはアンタゴニストの影響は、Dobrzanskiら（Regulatory Peptides 45:341〜52、1993年）などによって記述されている方法のような、本技術において知られている方法よって評価することできる。ホスホリパーゼＣ活性化に対するzacrp3  ポリペプチド、フラグメント、融合、アゴニストまたはアンタゴニストの影響は、Dobrzanskiら（Regulatory Peptides 45:341〜52、1993年）などによって記述されている方法のような、本技術において知られている方法よって評価することができる。
【０２３６】
胃内容排出に対するzacrp3  ポリペプチド、フラグメント、融合、アゴニストまたはアンタゴニストの影響は、Vargaら（Eur.J.Pharmacol. 286:109〜112、1995年）などによって記述されている方法のような、本技術において知られている方法よって評価することができる。ヒト好中球活性化およびADCC能力に対するzacrp3  ポリペプチド、フラグメント、融合、アゴニストまたはアンタゴニストの影響は、Wozniakら（Immunology 78:629〜34、1993年）などによって記述されている方法のような、本技術において知られている方法よって評価することができる。スーパーオキシドアニオン生成に対するzacrp3  ポリペプチド、フラグメント、融合、アゴニストまたはアンタゴニストの影響は、Wozniakら（Immunology 78:629〜34、1993年）などによって記述されている方法のような、本技術において知られている方法よって評価することができる。
【０２３７】
コラーゲンは、血小板凝集の有力な誘起剤である。これは、血管の傷から回復しつつある患者に危険を引き起こす。コラーゲン起因性血小板凝集のインヒビターは、コラーゲン被覆の表面への血小板の結合をブロックすることおよび関連するコラーゲン起因性血小板凝集を減らすことのために有用である。C1qは、補体経路の構成分であって、組織損傷を引き起こす有毒な酸素種の生成を誘発するとともに、防御機構を刺激することが判明した（Tenner、BehringInst.Mitt.93:241〜53、1993年）。C1q結合部位は、血小板の上にある。
【０２３８】
免疫結合パートナーから独立しているC1qは、血小板附着または形態変化を阻害しないで、血小板凝集を阻害することが判明した。C1qのアミノ末端領域は、コラーゲンと相同性を共有している（PeerschkeおよびGhebrehiwet、J.Immunol.145:2984〜88、1990年）。C1qおよび補体経路の阻害は、SubaおよびCsako、J.Imnunol. 117：304〜9（1976年）において記載されているような、ここに開示されているまたは本技術において知られている方法を使用することによって測定することができる。
【０２３９】
コラーゲンによって媒介される血小板の附着、活性化および凝集に対するzacrp3  ポリペプチド、フラグメント、融合、アゴニストまたはアンタゴニストの影響は、血小板凝集アッセイ（Chiangら、Thrombosis Res.37:605〜12、1985年）および血小板附着アッセイ（PeerschkeおよびGhebrehiwet、J.Immunol.144;221〜25、1990年）のような、ここに開示されているまたは本技術において知られている方法を使用することによって評価することができる。コラーゲンへの血小板附着のためのアッセイおよびコラーゲン誘発血小板凝集の阻害は、Kellerら、J.Biol.Chem.268:5450〜6、1993年；WaxmanおよびConnolly、J.Biol.Chem.268:5445〜9、1993年；Noeske-Jungblutら、J.Biol.Chem.269:5050〜3、1994年またはDeckmynら、Blood 85:712〜9、1995年に記載されている方法を用いて測定することができる。
【０２４０】
大動脈輪の血管拡張に対するzacrp3  ポリペプチド、フラグメント、融合、アゴニストまたはアンタゴニストの影響は、Daintyら（J.Pharmacol.100:767、1990年）およびRheeら（Neurotox.l6:179、1995年）の方法にしたがって測定することができる。
【０２４１】
虚血および再潅流損傷に対するzacrp3  ポリペプチド、フラグメント、融合タンパク、抗体、アゴニストおよびアンタゴニストの影響を評価することのために、種々の試験管内および生体内モデルが利用できる。たとえば、Shandelyaら、Circulation 88:2812〜26、1993年；Weismanら、Science 249:146〜151、1991年；Buerkeら、Circulation 91;393〜402、1995年；Horstickら、Circulation 95:70l〜8、1997年、およびBurkeら、J.Phar.Exp.Therp.286:429〜38、1998年、参照。生体外のハムスター血小板凝集アッセイは、Deckmynら（同上）よって記述されている。ハムスターおよびヒヒの出血時間は、Deckmynら（同上）よって記述されているモデルを用いて、zacrp3  ポリペプチドの注射の後に、測定することができる。
【０２４２】
本発明のタンパク質の投与に応じての血栓の発生は、Deckmynら（同上）によって提供されるハムスター大腿静脈血栓症モデルを用いて測ることができる。zacrp3の投与に続く流動条件下の血小板附着の変化は、Harsfalviら、Blood 85:705〜11、1995年に記載されている方法を用いて測定することができる。
補体阻害および創傷治癒は、zacrp3  ポリペプチド、フラグメント、融合タンパク、抗体、アゴニストまたはアンタゴニストであることができ、単独でまたはコラーゲン誘発血小板活性化および凝集の他の既知インヒビター（たとえば、palldipin、moubatinまたはcalin）と組合せて分析され。
【０２４３】
Zacrp3  ポリペプチド、フラグメント、融合タンパク、抗体、アゴニストまたはアンタゴニストは、たとえば、ブタの真皮層の治癒（Lynchら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:7696〜700、1987年）および遺伝的に糖尿病をもつマウスのフルシックネス皮膚創傷（Greenhalghら、Am.J.Pathol.136:1235〜46、1990年）において記述される方法のような、ここに記載したまたは本技術において知られている方法を用いることによって、評価することができる。本発明のポリペプチドは、単独でまたは、上に記載したような他の既知の補体阻害剤との組合せにおいて分析することができる。
【０２４４】
放射線ハイブリッドマッピングは、哺乳動物クロモソームの高解像度の連続マップを作成することのために開発された体細胞遺伝学的技術である（Coxら、Science 250:245〜50、1990年）。遺伝子の配列についての部分的な、または完全な知識は、染色体の放射線ハイブリッドマッピングパネルを用いた用途に適したPCRプライマーの設計を可能にする。Stanford G3 RhパネルおよびGeneBridge 4RNパネル（Research Genetics,Inc．アラバマ州ハンツヴィル）のような、全てのヒトゲノムをカバーする市販の放射線ハイブリッドマッピングパネルが利用できる。
【０２４５】
これらのパネルは、関心領域の範囲における、遺伝子、配列標識部位（STSs）ならびに非多型および多型マーカーの急速な、PCRをベースとした、染色体上の位置確認および配列を可能にする。これは、新しく発見された関心の遺伝子および以前にマップされたマーカーの間に正比例した物理的距離を確立することを含む。遺伝子の位置についての正確な知識は、以下のことを含めて、多くの方面で有用である：１） 配列が既存のコンティグの部分であるかどうかを決定し、YAC-、SAC-またはcDNAクローンのような種々の形態における、更なる周囲の遺伝子配列を得ること、２）同じ染色体の範囲へのリンケージを示す遺伝性病気のための可能な候補遺伝子を提供すること、そして、３）特定の遺伝子がどんな機能を持ちうるかを決定することを助ける点において有益でありうるマウスのような、モデル生物を相互参照することのために。
【０２４６】
結果は、LODスコア  15.58をもち、かつ、マーカーから０  cR＿10000離れたところに、ヒト５番染色体のフレームワークマーカーSHGC-56588へのZacrp3のリンケージを示した。周辺のマーカーの使用は、総LDBヒト５番染色体の地図上の5p12領域にZacrp3を位置付ける。本発明は、また、診断用途に利用される 試薬を提供する。たとえば、zacrp3遺伝子、zacrp3のDNAまたはRNAを含んでいるプローブ、またはそのサブシーケンスは、zacrp3遺伝子が５番染色体の上に存在するかどうか、あるいは、突然変異が起こったかどうか、を決定するのに使用することができる。
【０２４７】
zacrp3遺伝子座の検出可能な染色体異常には、これらに限定されないが、異数性、遺伝子コピー数変化、挿入、欠失、制限サイト変化および再配列が含まれる。これらの異常は、上流プロモーターおよび制御領域を含む、暗号配列の範囲内で、イントロンの範囲内で、あるいは、隣接配列の範囲内で、起こることができるし、暗号配列内の物理的な変化または遺伝子の現量における変化としての範囲内で表われうる。
【０２４８】
一般に、これらの診断方法は、次のステップから成る：（ａ）患者から遺伝の試料を得ること；（ｂ）最初の反応生成物を生成させるために、ポリヌクレオチドが相補性のポリヌクレオチド配列に融合するような条件下で上記のようなポリヌクレオチドプローブまたはプライマーと遺伝子試料をインキュベートすること；および（iii）最初の反応生成物を対照反応生成物と比較すること。最初の反応生成物および対照生成物の間の相違は、患者における遺伝子異常を示唆する。本発明の範囲内での利用のための遺伝子試料は、ゲノムDNA、cDNAおよびRNAを含む。
【０２４９】
ポリヌクレオチドプローブまたはプライマーは、RNAまたはDNAであることができるし、配列番号：１の一部、配列番号：１の補体またはそのRNA相当物から成る。この点に関する適当な分析方法には、本技術の中の人々に知られている分子の遺伝学的技術、たとえば、制限断片長多型性（RFLP）分析、PCR技術を用いる短時間縦列反復(STR）分析、ライゲーション連鎖反応（Barany、PCR  Methods and Applications 1:5〜16、1991年）、リボヌクレアーゼ保護分析法、および、本技術において知られている他の遺伝子結合解析技術（Sambrookら、同上；Ausubelら、同上;Marian、Chest 108:255〜65、1995年）が含まれる。
【０２５０】
リボヌクレアーゼ保護分析法（たとえば、Ausubelら、同上、第４章）は、患者のRNA試料へのRNAプローブのハイブリダイゼーションから成り、その後、反応生成物（RNA-RNAハイブリッド）はRNアーゼにさらされる。リボゾームリボ核酸のハイブリッド形成領域は、消化作用から保護されている。PCR分析法の範囲内で、患者の遺伝子試料は一対のポリヌクレオチドプライマーとともにインキュベートされ、プライマー間の領域は増幅され、回復される。回復された生成物の大きさまたは量の変化は、患者における突然変異を示唆する。使用することができるPCRをベースとしたもう一つの技術は、一本鎖配座多型（SSCP）分析（Hayashi、PCR Methods and Applications 1:34〜8、1991年）である。
【０２５１】
Zacrp3  ポリペプチドは、哺乳動物のエネルギー効率の分析に使うことができる。血清または組織試料で見つけられるZacrp3  ポリペプチドは、食物を貯蔵する哺乳動物の能力を示しており、より高い能力を持つ哺乳動物ほど 肥満症への傾向がある。さらに特定すれば、本発明は、
前記抗体がzacrp3  ポリペプチドのエピトープに結合している固体担体に付着した抗体に、おそらくzacrp3ポリペプチドを含んでいる試料をさらすこと；
【０２５２】
結合していない不純物を除去するために、前記の固定した抗体-ポリペプチドを洗浄すること；
第二抗体が検出可能な標識と関係している、zacrp3  ポリペプチドの第二エピトープに向けられた第二抗体に、固定された抗体ポリペプチドをさらすこと；および、
検出可能な標識を検出すること、を含むzacrp3  ポリペプチドを検出する方法を意図する。検査試料中のzacrp3  ポリペプチドの濃度は、哺乳動物のエネルギー効率を示すと思われる。
【０２５３】
この知見は、哺乳動物の栄養分析を助けることができる。場合によっては、この知見は、エネルギー不十分な組織を確認することおよび／または目標とすることにおいて有用でありうる。
【０２５４】
本発明の更なる一面は、インシュリンを研究する方法を提供する。本発明のそのような方法は、zacrp3  ポリペプチド、単クローン抗体、アゴニストまたはそのアンタゴニスト±インシュリンを含んでいる培地で、脂肪細胞をインキュベートすること、および、脂肪細胞タンパク質の分泌または分化における変化を観察すること、から成る。
【０２５５】
抗菌保護剤は、直接的にも働くことができるが、間接的にも働くことができる。メンブレン関連または作用の細孔形成性メカニズムを通して働くそのような薬剤は、迷惑を及ぼす微生物に直接付着する。抗菌剤はまた、酵素のメカニズムを通して働き、微生物の保護物質またはそれらの細胞壁／メンブレを破壊する。微生物増殖または作用を抑制すること、あるいは、上で述べたどちらかの機構によって微生物全体を崩壊させる抗菌剤は、抗菌作用に影響されやすい微生物による細胞培養の汚染を防ぐための方法において有用である。そのような技術は、効果的な量の前記zacrp3  ポリペプチド、またはアゴニストかそのアンタゴニストの存在下で細胞を培養することを含む。
【０２５６】
また、zacrp3  ポリペプチドまたはそのアゴニストが、細菌性、ウイルス性または菌類の感染のような外因性微生物感染の試験管内実験での細胞培養試薬として使用しうる。そのような部分は、感染の生体内動物モデルでも使用することができる。
本発明は、哺乳動物細胞の新陳代謝を研究する方法をも提供する。本発明のそのような方法は、研究すべき細胞、たとえば、 ヒト血管内皮細胞、±zacrp3  ポリペプチド、モノクローナル抗体、アゴニストまたはそのアンタゴニスト、をインキュベートすること、および脂肪生成、糖新生、グリコーゲン分解、脂質生合成、グルコース取込み、またはその類似のことの変化を観察することから成る。
【０２５７】
本発明の更なる一面は、二量体化またはオリゴマー化を研究する方法を提供する。本発明のそのような方法は、単独またはコラーゲン様ドメインをもつ他のポリペプチドとの組合せにおいてコラーゲン様ドメインを含む、zacrp3  ポリペプチドまたはフラグメントまたはその融合タンパク質をインキュベートすること、およびコラーゲン様ドメイン間で作られる会合を観察することから成る。そのような会合は、HPLC、円二色性などによって示される。
【０２５８】
本発明のZacrp3  ポリペプチド、フラグメント、融合タンパク、抗体、アゴニストまたはアンタゴニストは、付着し、活性化する 血小板の数および血小板会合物の大きさを減らすことによって、哺乳動物の脈管系内での血流を促進する方法において使用することができる。そのような目的に使われて、Zacrp3は、哺乳動物の急性血管損傷の、前、間、または、後に投与することができる。血管損傷は、これらに限定されないが、血管移植の血管形成術、冠状動脈バイパス移植、微小血管の回復または吻合を含む血管の再構成のせいでありうる。
【０２５９】
外傷、発作または動脈瘤のための血管損傷も、考慮される。他の好ましい方法では、血管損傷は、プラーク破裂、脈管系の劣化、糖尿と関連する合併症およびアテローム性動脈硬化による。冠状動脈でのプラーク破裂は、心臓麻痺を誘発して、大脳動脈でのそれは卒中を誘発する。そのような方法におけるzacrp3  ポリペプチド、フラグメント、融合タンパク、抗体、アゴニストまたはアンタゴニストの使用は、播種性血管内凝固(DIC）およびSIDのような、免疫システムと関連する脈管系の全システム疾病を改善するためにも有用である。その上、活性を抑制する補体は、細動脈硬化症のような非脈管系免疫病を治療するために有用である。
【０２６０】
限局性虚血心筋中のC1qの存在と冠状動脈閉塞症および再潅流に続く白血球の蓄積の間には、相関が見出された。組織損傷に続く細胞の構成分の放出は、心筋障害の主要原因でありうる毒性酸素生成物を結果する補体活性化を誘発する（Rossenら、Circ.Res.62:572〜84、1998年およびTenner、同上）。補体経路をブロックすることが再潅流損傷から虚血心筋を保護することが判明した（Buerkeら、J.Pharm.Exp.Therp.286:429〜38、1998年）。補体阻害およびC1q結合活性を持っているタンパク質は、そのような目的のために有用であろう。
【０２６１】
zacrp3のような脂肪細胞補体関連タンパク質同族体の、コラーゲンおよびC1qの結合能力は、血小板の附着、活性化または凝集、ならびに毒性酸素生成物の放出に導く炎症性プロセスの活性化を抑える損傷を受けた膠原組織をいやすために有用である。補体活性、血栓症の活性および免疫活性化のようなプロセスに対して、露出した組織を不活性にすることによって、虚血および再潅流の有害な影響が減少する。特に、そのような外傷には、トラウマ性外傷虚血、腸絞扼および血流量のプリおよびポスト確立に関連する外傷が含まれる。そのようなポリペプチドは、偶発的または外科手術誘発性の血管傷害とともに、卒中または経皮経管血管形成術のような、心肺バイパスの虚血およびrecesitation、心筋梗塞ならびにポストトラウマ血管痙攣の治療において有用である。
【０２６２】
その上、そのようなコラーゲン結合およびC1q結合ポリペプチドは、補体活性化、血栓形成活性または免疫活性化に対して材料の表面を不活性にするために、補綴生体材料および外科装置を和らげるために有用である。そのような材料には、これらに限定されないが、コラーゲンまたはコラーゲンフラグメント被覆生体材料、ゼラチン被覆生体材料、フィブリン被覆生体材料、フィブロネクチン被覆生体材料、ヘパリン被覆生体材料、コラーゲンおよびゲル被覆ステント、動脈の移植、合成心臓弁、人工臓器または、１×108より大きい割合でzsig37を結合する血液にさらされる、あらゆる補綴物用品が含まれる。そのような材料を被覆することは、本技術において知られている方法を使用してなされうる。たとえば、Rubens、米国特許第5,272、074号、参照。
【０２６３】
補体およびC1qは、炎症において役割を果たす。補体活性化は、免疫グロブリンへのC1qの結合によって始められる（Johnston、Pediatr.Infect.Dis.J.12:933〜41、1993年；WardおよびGhetie、Therap.Immunol.2:77〜94、1995年）。C1qおよび補体のインヒビターは、抗炎症薬として有用である。そのような適用は、感染を防ぐためになされうる。その上、そのようなインヒビターは、補体活性化およびC1qへの免疫複合体の結合によって媒介された炎症に苦しんでいる人に投与することとができる。C1qおよび補体のインヒビターは、傷の修復をもたらす方法において有用であり、損なわれた創傷治癒を克服することによって創傷治癒における進行を促進する。創傷治癒の進行には、たとえば、炎症、繊維芽細胞加入、創傷退縮および感染の減少ような要素が含まれる。
【０２６４】
コラーゲンに結合する腫瘍細胞の能力は、腫瘍の転移の一因となりうる。コラーゲン結合のインヒビターは、腫瘍の接着相互作用および転移による広がりをもたらすために有用である（Noeske-Jungbultら、米国特許第5,723,312号）。
【０２６５】
さらに、zacrp3ポリペプチド、フラグメント、融合アゴニストまたはそのアンタゴニストは、抗菌的適用に対して治療上有用であることができる。たとえば、補体成分C1qは、バクテリアおよびウイルスのような感染因子に対する宿主防御において役割を果たす。C1qは、特殊化したいくつかの機能を示すと知られている。たとえば、C1qは、結合性抗体またはＣ反応性タンパク質(CRP）との相互作用を通して補体カスケードを誘発する。また、C1qは、特定のバクテリア、RNAウイルス、マイコプラズマ、尿酸結晶、細菌内毒素のリピドＡ構成部分および特定の細胞内小器官のメンブレンと直接的に相互作用する。C1qリセプターに結合しているC1qは、食菌作用を促進すると思われる。C1qは、宿主防御システムの抗体形成面を強化するようでもある。 たとえば、Johnston、Pediatr.Infect.Dis.J.12(ll)：933〜4l、1993年を参照。このように、可溶なC1q様分子は、抗菌因子として有用でありえて、感染因子の細胞溶解または食菌作用を促進する。
【０２６６】
プラスの電荷を帯びた、 細胞外の、ヘリックス、C1qおよびマクロファージスカベンジャー受容器のコラーゲンドメインは、配位子結合において役割を演じていることが確定し、ポリアニオンに対する広い結合特異性を持っていることが示された（Actonら、J.Biol.Chem.268:3530〜37、1993年）。リゾリン脂質成育因子（リゾホスファチジン酸、LPA）および他の分裂促進のアニオンは、損害を受けた組織の部位に局所化し、傷の修復を助ける。LPAは、血小板の活性化およびマトリックス会合体の増加機構を含む多くの生体影響を発揮する。LPAは、他の血液凝固因子と相乗作用を示し、創傷治癒を媒介すると考えられる。
【０２６７】
C1qおよびマクロファージスカベンジャー受容器のようなタンパク質のコラーゲンドメインは、LPAのような酸性リン脂質を結合すると知られている。zacrp3  ポリペプチド、フラグメント、融合、アゴニストまたはアンタゴニストの、LPAのような分裂促進のアニオンとの相互作用は、本技術において知られている分析法（たとえば、Actonら、同上、参照）を用いて測定することができる。本発明のポリペプチドおよび抗体による炎症性プロセスの阻害は、創傷部位で感染を防ぐことにおいても有用である 。
【０２６８】
医薬品利用については、本発明のタンパク質は、非経口的、経口的、鼻からの、直腸への、局所的、経皮的投与などのために、調剤上許容できる基剤とともに処方することができる 。好ましい具体例では、投与は血管損傷のサイトで、あるいは、その近くでなされる。一般に、医薬品製剤は、調剤上許容できる賦形剤（例えば塩類溶液、緩衝食塩水、デキストロースの５％水溶液または類似物）と組合せて、zacrp3タンパク質を含有する。製剤は、さらに、１種以上の賦形剤、防腐剤、可溶化剤、緩衝剤、バイアル表面上へのタンパク質の損失を防ぐアルブミン、などを含むことができる。
【０２６９】
製剤の方法は、本技術でよく知られており、たとえば、Remington:The Science and Practice of Pharmacy、Gennaro編、Mack Publishing Co．ペンシルベニア州イーストン、第19版、1995年に開示されている。治療の用量は、一般に、認められた基準にしたがって、治療されるべき容態の性質および重篤度、患者体質、その他を考慮に入れて、臨床医によって決定されるであろう。用量の決定は、本技術の通常の技能レベル内にある。
【０２７０】
ここで使われるように、zsig37  ポリペプチド、フラグメント、融合タンパク質、アゴニストまたはアンタゴニストの「調剤上の効果的な量」は、望まれる生物学的な結果を誘導するのに十分な量である。結果は、病気の症候、症状または原因の緩和であり、あるいは、生物学的システムのなんらかの望ましい変化である。たとえば、zacrp3  ポリペプチドの効果的量は、臨床医または他の資格のある立会人よって気づかれるような、症状の自覚的な軽減、あるいは客観的に確認可能な改良を提供する量である。zacrp3  ポリペプチドのそのような効果的量は、たとえば、C1qを含む、コラーゲンで活性化された血小板の活性化および補体経路の阻害、患者の血管内の局所的な血流量の増加および／または、虚血および再潅流の有害な影響の減少をもたらす。
【０２７１】
zacrp3ポリペプチドの効果的量は、治療すべき病気または症状に従い大きく異なってよい。投与されるポリペプチドの量および製剤でのその濃度は、選ばれた賦形剤、投与の経路、特定のポリペプチドの効力、患者の臨床状態、副作用および製剤中の化合物の安定度に依存する。このように、臨床医は、当該の患者との、または類似した患者との臨床的経験に依存して、投与される製剤の量とともに製剤中の適切な濃度を含む適切な製剤を使用する。
【０２７２】
そのような量は、ある程度、治療されるべき特定の容態、年齢、体重および患者の全般的な健康、ならびに本技術に熟練した人には明白な他の因子に依存する。一般的に、用量は、患者の0.01〜100mg/kgの範囲にある。バルーンカテーテルのような適用法では、典型的用量範囲は、患者の0.05〜5mg/kgである。特定の化合物のための用量は、実験動物の研究と組合せた試験管内または生体外の研究から決定される。試験管内で、または生体外で効果的であると判明した化合物の濃度は、動物実験のためのガイダンスを提供し、そこでは、用量は、作用点において同程度の濃度を提供するように計算される。
【０２７３】
zacrp3  ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドは、zacrp3活性を増やすか、抑制するのが望まれる、遺伝子治療適用の範囲内で有用である。哺乳動物が突然変異したか欠失したzacrp3遺伝子を持つ場合、zacrp3遺伝子を、哺乳動物の細胞に導入することができる。１つの具体例では、zacrp3ポリペプチドをコードしている遺伝子は、生体内でウイルスベクターに入れて導入される。そのようなベクターには、たとえば、これらに限定されないが、単純ヘルペスウイルス（HSV））パピローマウイルス、Epstein Barrウイルス（EBV）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（AAV）、などのような弱毒化または欠損DNAウイルスが含まれる。
【０２７４】
完全に、あるいは、ほとんど完全にウイルス遺伝子を欠く欠損ウイルスが好ましい。欠損ウイルスは、細胞への導入の後、伝染力がない。欠損ウイルスのベクターの利用は、ベクターが他の細胞を感染させうるという懸念なしで、特定の、限られた領域の細胞への投与を可能にする。特定のベクターの例には、これらに限定されないが、欠損単純疱疹ウイルス１（HSV1）ベクター（Kaplittら、Molec.Cell.Neurosci.2:320〜30、1991年）；Stratford-Perricaudetら（J.Clin.Invest.90:626〜30、1992年）によって記述されたベクターのような、弱毒化アデノウイルスベクター；および、欠損アデノ随伴ウイルスベクター（Samulskiら、J.Virol.61:3096〜101、1987年；Samulskiら、J.Virol.63:3822〜8、1989年）が含まれる。
【０２７５】
もう一つの具体例では、zacrp3遺伝子は、たとえば、Andersonら（米国特許第5,399,346号；Mannら、Cell 33:153、1983年；Teminら、米国特許第4,650,764号；Teminら、米国特許第4,980,289号；Markowitzら、J.Virol.62:l120、1988年；Teminら、米国特許第5,124,263号；WIPO公表WO 95/07358；および、Kuoら、Blood 82:845、1993年、に記載されているような、レトロウイルスのベクターに導入されうる。
【０２７６】
あるいは、ベクターは、リポソームを使用する生体内リポフェクションよって導入することができる。合成陽イオン脂質を、マーカーをコードしている遺伝子の生体内トランスフェクションのためのリポソームを調製するのに用いることができる（Feignerら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:7413〜7、1987年；Mackeyら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:8027〜31、1988年）。外部性遺伝子を生体内の特定の器官に導入するためのリポフェクションの利用は、いくつかの実際的な利点を持つ。
【０２７７】
特定細胞へのリポソームの分子ターゲッティングは、利点の１つの領域を表す。より詳しくは、特定細胞にトランスフェクションを向けることは、利点の１つの領域を表す。たとえば、特定の細胞型にトランスフェクションを向けることは、特に、膵臓、肝臓、腎臓および脳のような、細胞の異質性をもつ組織において有利である。脂質は、ターゲッティングの目的のために、化学的に他の分子に結びつけることができる。目標とされたペプチド（たとえば、ホルモンまたは神経伝達物質）、抗体のようなタンパク質、または非ペプチド分子は、化学的にリポソームに結びつけることができる。
【０２７８】
身体から標的細胞を除去すること、ベクターを裸のDNAプラスミドに導入すること、ついで、変換された細胞を身体に再インプラントすることが可能である。遺伝子治療のための裸のDNAベクターは、本技術において知られている方法、たとえば、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、トランスダクション、細胞融合、DEAEデキストラン、リン酸カルシウム沈降、遺伝子銃の利用またはDNAベクター輸送体の利用によって、望ましい宿主細胞に導入することができる。たとえば、Wuら、J.Biol.Chem.267:963〜7、1992年；Wuら、J.Biol.Chem.263:l4621〜4、1988年、参照。
【０２７９】
アンチセンスの手法は、生体内の細胞増殖を抑制するためのような、zacrp3遺伝子転写を抑制するのに用いることができる。zacrp3をコードしているポリヌクレオチド（たとえば、配列番号：１に述べられているポリヌクレオチド）のセグメントに補足的である ポリヌクレオチドは、zacrp3をコードしているｍRNAに結合し、そのようなｍRNAの翻訳を抑制するように設計されている。そのようなアンチセンスポリヌクレオチドは、細胞培養あるいは患者におけるzacrp3ポリペプチドをコードしている遺伝子の発現を抑制するのに用いられる。
【０２８０】
zacrp3遺伝子を発現するために設計されたトランスジェニックのマウス、および、「ノックアウトマウス」（Snouwaertら、Science 257:l083、1992年）と呼ばれる、zacrp3遺伝子機能の完全な欠如を示すマウスも生成させることができる（Lowellら、Nature 366:740〜42、l993年）。これらのマウスは、zacrp3遺伝子および生体内のシステムでそれによってコードしたタンパク質の研究に使用することができる。
【０２８１】
本発明を、以下の非制限的な例によってさらに説明する。
例１．Zacrp3の染色体の帰属および配置
Zacrp3は、スタンフォードG3放射線ハイブリッドマッピングパネル（Research Genetics,Inc.  アラバマ州ハンツヴィル）の市販の版を用いることにより、ヒト５番染色体にマップされた。スタンフォードG3  RHパネルは、全ヒトゲノムの83個の放射線ハイブリッドクローンの各々からのPCR可能なDNA、プラス２個のコントロールDNA（RMドナーおよびA3レシピエント）を含む。公的に利用できるWWWサーバー（http://shgc-www. stanford.edu）は、マーカーの染色体の位置確認を許可している。
【０２８２】
スタンフォードG3  RHパネルによるzacrp3のマッピングについては、20μｌの反応液を、96ウェルのミクロタイタープレート（Stratagene、カリフォルニア州ラホーヤ）中に入れ、RoboCycler Gradient96の温熱サイクラー（Stratagene）中で使用した。85個のPCR反応液の各々は、２μｌの10X KlenTaq PCR反応緩衝液（Clontech Laboratories,Inc.カリフォルニア州パロアルト）、1.6μｌのdNTPミックス（それぞれ2.5mM、PERKIN-ELMER、カリフォルニア州フォスターシティー）、１μｌのセンスプライマー、ZC 21,913（配列番号：13）、１μ１のアンチセンスプライマー、ZC 21,914（配列番号：14）、２μｌの  RediLoad（Research Genetics,Inc.）、0.4μｌ 50X Advantage KlenTaq DNAポリメラーゼミックス（Clontech Laboratories,Inc.）、25ngの個々のハイブリッドクローンまたは対照品由来のDNA、および総体積20μｌにするためのddH2Oから構成された。
【０２８３】
反応液は、等量の鉱油で覆い、封じた。PCRサイクラー条件は、次の通りであった：94℃での初期１サイクル５分間の変性、94℃での45秒の変性の35サイクル、62℃での45秒のアニーリングおよび72℃での１分15秒間の延長、さらに72℃で７分間の最終１回の延長。反応液は、２％のアガロースゲル（Life Technologies、メリーランド州ゲイタースバーグ）上での電気泳動によって分離した。
【０２８４】
結果は、15.58のLODスコアおよびマーカーからの０  cR＿10000の距離にヒト５番染色体フレームワークマーカーSHGC-56588へのZacrp3のリンケージを示した。周辺マーカーの利用によって、LDBヒト５番染色体の総合マップ（The Genetic Location Database、Southhamptonの大学、WWWサーバー：http://cedar.genetics.soton.ac.uk/public_html/）の上の5p12領域にZacrp3の位置が定まる 。
【０２８５】
例２．Zacrp3のバキュロウイルス発現
昆虫細胞で、カルボキシ末端のGlu-Glu標識を持っているヒトzacrp3ポリペプチドを発現する発現ベクターpzacrp3ceeを調製した。
Ａ．  pzacrp3ceeの構築
zacrp3（配列番号：１）の配列および、５’および３’末端にそれぞれ、BamHIおよびXba1制限サイトをコードしているポリヌクレオチド配列を含む766bpフラグメントは、プライマーZC23377（配列番号：15）を使ってzacrp3 cDNAを含むプラスミドからのPCR増幅によって生成した。
【０２８６】
PCR反応条件は、次の通りであった：94℃、４分間の１サイクル、続いて、94℃、45秒間、50℃45秒間、および72℃２分間の25サイクル；72℃10分間の１サイクル、続いて、４℃浸漬。フラグメントは、ゲル電気泳動（１％ Seaplaque／１％ NuSieve）によって視覚化した。バンドを切り取り、２mMのMgCl2の入った0.5％アガロースに希釈し、65℃で溶かし、BamHI/Xba1で消化されたバキュロウイルス発現ドナーベクター（pZBV32L）に連結した。pZBV32Lベクターは、pFastBaclTM（Life Technologies）発現ベクターの変種である。
【０２８７】
ここで、多面体促進因子が削除されて、後の活性化塩基性タンパク質促進因子と置換され、そして、終止シグナルと同様にGlu-Glu標識（配列番号：17）のための暗号配列が多重クローン領域の３’末端に挿入される。制限酵素で消化させたzacrp3挿入物約11ナノグラムおよび対応するベクター約23ngを16℃で一夜連結させた。ライゲーションミックスをTE（10mMのトリス-HC1、pH 7.5および1mMのEDTA）中で３倍に希釈し、希釈したライゲーションミックスの４fmolを、メーカーの指示にしたがい、42℃の水槽中での45秒間のヒートショックでDH5αライブラリー効率コンピテント細胞（Life Technologies）に変換した。
【０２８８】
変換したDNAおよび細胞を、SOC培地（２％のBacto Tryptone、0.5％のBacto酵母エキス、10 ml 1M NaC1、1.5mM KC1、10mM MgCl2、10mM MgSO4、および20mM グルコース）450μｌ中に希釈し、100μｇ／mlのアンピシリンを含むLBプレートの上で平板培養した。クローンは制限酵素消化物によって分析し、ポジティブクローンの１μｌを、メーカーの指示に従い、42℃の水槽中、45秒間のヒートショックによって20μｌのDH10Bac最大効率コンピテント細胞（GIBC0-BRL、メリーランド州ゲイタースバーグ）に変換した。
【０２８９】
それから、変換された細胞は、SOC培地（２％  Bacto Tryptone、0.5％  Bacto酵母エキス、1M NaCl 10ml、1.5mM KC1、10mM MgCl2、10 mM MgSO4、および20mM  グルコース）980μｌ中で希釈し、37℃、４時間振とうインキュベーター中で増殖させ、50μｇ／mlのカナマイシン、７μｇ／mlのゲンタミシン、10μｇ／mlのテトラサイクリン、IPTGおよびBluo Galを含むルリア寒天平板上で平板培養した。平板培養した細胞は、37℃で48時間培養した。プラスミド（「bacmid」と呼ぶ）に組み込まれたドナー挿入物をコードしているzacrp3ceeを持っている細胞を確認するのにカラー選抜を用いた。
【０２９０】
それらのコロニー（白色であった）を、分析のために選んだ。Bacmid DNAを、メーカーの指示にしたがい、QiaVac Miniprep8システム（Qiagen）を使用してポジティブコロニーから分離した。プライマーZC447（配列番号：18）およびZC976（配列番号：19）を使用するPCRによるbacmid中の転移性因子へのプライマーを使用することによってDNAを増殖させて、正しい挿入物のためにクローンをスクリーニングした。PCR反応の条件は、次の通りであった：94℃45秒間、50℃45秒間および72℃５分間の35サイクル、72℃10分間の１サイクル、続いて、４℃での浸漬。PCR生成物は、挿入サイズをチェックするために１％のアガロースゲルの上で走らせた。スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）（Sf9）細胞をトランスフェクションさせるのに正しい挿入物を持つ生成物が用いられた。
【０２９１】
Ｂ.  トランスフェクション
Sf9細胞を、35mmのプレートにつき５×106個の細胞の割合で播種し、27℃で１時間付着するに任せた。５マイクロリットルのbacmid DNAを、Sf-900 II SFM（Life Technologies）100μｌで希釈した。６μｌのCellFECTIN試薬（Life Technologies）は、SF-900 II SFM 100μｌで希釈した。bacmid DNAおよび脂質溶液を穏やかに混ぜて、室温で30〜45分間培養した。細胞の１プレートからの培地を吸引し、細胞を新しいSF-900II SFM培地の２mlで１回洗浄した。脂質-DNA混合液にSF-900のII SFMの800マイクロリットルを加えた。洗浄液培地を吸引し、DNA-脂質ミックスを細胞に添加した。細胞は、27℃で４〜５時間培養した。DNA-脂質ミックスを吸引し、Sf-900 II培地の２mlを各プレートに加えた。プレートは、27℃、90％の湿度で96時間培養し、その後、ウイルスを採取した。
【０２９２】
Ｃ.  一次増幅
Sf9細胞は、125mlのシェークフラスコ中Sf-900 II SFM 50ml中で、おおよそ0.41〜0.52×105細胞／mlの密度まで増殖させた。ついで、それらに、上記のウイルス原液150μｌを感染させて、27℃で３日間インキュベートし、その後、本技術において知られている標準的な方法にしたがってウイルスを採取した。
【０２９３】
例３．バキュロウイルス発現Glu-Glu付きzacro3ポリペプチドの精製
特に明記しない限り、全ての操作は、４℃で行った。プロテアーゼインヒビターの混合液を、Ｃ末端にGlu-Glu（EE）を付けたzacrp3バキュロウイルス感染Sf9細胞からの調整培地の２リットルの試料に加え、2.5mM エチレンジアミン四酢酸（EDTA、Sigma Chemical Co．ミズーリ州セントルイス）、0.001mM  ロイペプチン（Boehringer-Mannheim、インディアナ州インディアナポリス）、0.001mM  ペプスタチン（Boehringer-Mannheim）および0.4 mM Pefabloc（Boehringer-Mannheim）という最終濃度にした。
【０２９４】
試料は、細胞断片を除去するために、Beckman Avanti J251遠心機（Beckman Instruments）のBeckmanのJLA-10.5ローター（Beckman Instruments)に入れて、４℃で30分間、10,000rpmで遠心分離した。下記のように調製されたanti-EEセファロースの50.0ml試料を、上清画分に加え、混合液はWheaton（ニュージャージー州Millville）のローラー培養装置の上で、４℃で18.0時間穏やかに振とうした。
【０２９５】
混合液を、5.0×20.0cmのEcono-Column（Bio-Rad Laboratories）へ注ぎ、ゲルをリン酸緩衝生理食塩水（PBS）の30カラム体積で洗った。留まらなかった通過画分は、捨てた。溶出液の280nmの吸光度が0.05未満になると、カラムを通過する流れはゼロになり、アンチEEセファロースゲルを、0.2mg/mlのEEペプチド（AnaSpec、カリフォルニア州サンホゼ）を含んでいるPBSの2.0カラム体積で洗った。使ったペプチドは、配列Glu-Tyr-Met-Pro-Val-Asp（配列番号：20）を持つ。４℃での1.0時間後、流れが再開され、溶出したタンパク質を集めた。この画分を、ペプチド溶出液と名付けた。アンチEEセファロースゲルは、0.1Ｍ グリシン（pH2.5）の2.0カラム体積で洗い、グリシン洗浄液は別に集めた。
【０２９６】
10X PBSの少量の添加によってグリシン溶出画分のpHを7.0に調整して、４℃で保存した。ペプチド溶出液は、メーカーの指示にしたがって、分子量5,000でカットオフする膜濃縮装置（Millipore）を用いることにより、5.0 mlに濃縮した。濃縮されたペプチド溶出液は、BioCad Sprint HPLC（PerSeptive BioSystems）を使用して、1.0ml/mmの流量でPBS中で 平衡化した1.5×50cmのSephadex G-50（Pharmacia）カラム上でクロマトグラフィーによってフリーのペプチドから分離した。２ml画分を集め、280nmの吸光度をモニターした。280nmで吸収し、カラムの空隙体積の近くで溶出する材料の最初のピークを集めた。この材料は、精製されたzacrp3CEEに相当し、明瞭な分子量の２本の主要なバンドからなっていた。
【０２９７】
アンチEEセファロースの調製
タンパク質G-Sepharose（Pharmacia）の100mlベッド体積を、500mlのナルゲン（Nalgene）0.45ミクロン濾過装置を用いて、0.02％アジ化ナトリウムを含むPBSの100mlで洗った。ゲルは、200mMのトリエタノールアミン、pH8.2（TEA、Sigma）の6.0倍量で洗い、900mgの抗体を含んでいるEE抗体溶液の等量を添加した。４℃での一夜のインキュベーションの後、結合していない抗体は、先に述べたように、200mMのTEAの５倍量で洗うことによって除去した。
【０２９８】
樹脂は、２倍量のTEA中に再懸濁し、適当な容器へ移し、そして、dimethylpimilimidate-2 HCl(Pierce）をTEAに溶かして、最終濃度36mg/mlのゲルに加えた。ゲルは、室温で45分間ゆすり、先に述べたようにろ過装置を使って液体を除去した 。ゲルの非特異性部位は、200mM TEA中20mMエタノールアミンの５倍量で、室温で10分間インキュベートすることによってブロックした。ついで、ゲルは、0.02％のアジ化ナトリウムを含むPBSの５倍量で洗い、４℃でこの溶液中に保存した。
【０２９９】
例４．接着分子アッセイ
TNF（腫瘍壊死因子）のような炎症性サイトカインによる刺激で、ヒト微小血管の骨髄細胞（TRBMEC）は、Ｅ−セレクチン（内皮の白血球接着分子）、V-CAM（血管の細胞接着分子）およびI-CAM（細胞間接着分子）を含む、細胞表面接着分子を発現する。
【０３００】
細胞表面接着分子の発現へのzacrp3の効果は、Ouchiら（Circulation 100:2473〜7、1999年）にしたがった、細胞に基づくELISAで、微小血管の骨髄細胞（TRBMEC）を用いて決定した。手短に言うと、TRBMEC細胞を、96ウェルの平底プレート（Costar、カリフォルニア州Pleasanton）中で、融合するまで増殖させた。野生型コントロール培地およびバキュロウイルス発現したzacrp3培地は、テスト（Centricon Centrifugal Filtrationユニット 5,000Kカットオフ、Millipore Corp．マサチューセッツ州ベッドフォード）の前に、メーカーの指示にしたがって10倍に濃縮した。
【０３０１】
各ウェルに、90μｌのzacrp3含有培地またはコントロール培地を添加し、そのプレートを、37℃、５％ CO2で一夜インキュベートした。翌日、試料の半分に、TNFa（10ng/ml、R&D Systems、ミネソタ州ミネアポリス）の10μｌを入れ、基本的形質発現を測定する、他の試料は未処置のままであった。ついで、プレートを、37℃、５％のCO2で４時間インキュベートした。
【０３０２】
インキュベーションの後、培地は、プレートから除去し、50μｌアンチヒトVCAM抗体（原液１mg/mlの１：1000希釈、R&D Systems）50μｌ、アンチヒトICAM-1モノクローナル抗体（原液１mg/mlの１：1000希釈、R&D Systems）50μｌ、またはアンチヒトＥ−セレクチン抗体（原液１mg/mlの１：1000希釈、R&D Systems）50μｌを、３個のウェルに添加し、ついで該プレートを37℃、５％CO2で１時間インキュベートした。
【０３０３】
抗体溶液を除去し、該プレートを、温RPMI＋５％FB中で３回洗浄した。最後の洗浄液に続いて、0.05％のグルタールアルデヒド溶液（PBS中で50％グルタールアルデヒドの１：1000）100μ１／ウェルを添加し、該プレートを、室温で10分間インキュベートした。プレートは、PBSで３回洗浄し、二次抗体（ヤギαマウスIgG全分子HRP複合体、Sigma Chemical Co．ミズーリ州セントルイス）の50μｌ／ウェルを全ウェルに添加した。プレートは、37℃で１時間インキュベートした。
【０３０４】
ついで、プレートを、洗浄緩衝液（PBS＋0.05％Tween 20）で５回洗い、TMB溶液（60mM  酢酸ナトリウム（pH5.0）10mlおよび1.2％ H2O2 100μｌ中に、テトラメチルベンジジン（Sigma）4mg/mlを含むDMSO溶液100μｌ）100μｌ／ウェルを各ウェルに添加した。プレートは、室温で15〜20分間発展するに任せ、その時点で、1MH2S04100μｌ／ウェルを添加することによって、反応を止めた。プレートは、655nmを対照波長として、450nmで読んだ。
【０３０５】
Zacrp3は、ICAM-1発現の上に影響を示さなかった。Zacrp3は、VCAM-l発現の上には影響を示した。最大のTNF反応と比較して、zacrp3で処理した細胞は、約50％の阻害を示した。Zacrp3も、より少ないけれども、影響、Ｅ−セレクチン発現の10％の阻害を示した。
VCAM-1発現は、TRBMEC細胞の直接的アデノウイルス感染症に続いて測定された。手短に言えば、TRBMEC細胞は、アデノウイルス含有zacrp3または親からのアデノウイルス株で直接感染した。ウイルスは、種々の感染多重度（moi 500、1,000および5,000）で添加された。細胞を、37℃、５％のCO2で43時間インキュベートした。感染に続いて、アデノウイルス感染細胞は、TNFαｘ（１ng/ml）による４時間の攻撃を受けた。VCAM発現は、先に述べたようにして測定した。VCAM-1発現の阻害は、moi5000で約13％、moi1000での約５％であり、moi500では、影響は認められなかった。
【０３０６】
アデノウイルスで条件づけた培地は、メーカーの指示にしたがって10倍に濃縮し（Centricon遠心分離機濾過装置5,000 Kのカットオフ、Millipore Corp．マサチューセッツ州ベッドフォード）、その後、56℃で30分の熱失活を行った。濃縮された熱失活試料は、先に述べたように分析した。VCAM-lおよびＥ−セレクチンについては、阻害は100％であった。IL-lまたはLPSが接着分子発現を誘発するために用いられたとき、類似した結果が認められた。ICAM-1については、阻害はほとんどベースラインまで減少した。実験は、zacrp3熱失活したアデノウイルスで条件づけた培地の種々の濃度で繰り返した。５倍濃縮で完全な阻害、2.5倍で50％の阻害が見られ、0.5倍では阻害は認められなかった。
Ouchiら（同上）ならびにCybulskyおよびGimbrone（Science 251:788〜91、1991年）によるTHP-l単核細胞接着分析法は、上のVCAM-1に関して認められたと同じ結果を示した。
【図面の簡単な説明】
図は本発明のzacrp3ポリペプチドと、ヒトACRP30（ACR3）（配列番号３；Maeda et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 221: 286-9, 1996)と、ヒトC1qC（配列番号４；Seller et al., Biochem. J. 274: 481-90, 1991）とを並列に配列して示す。並列配列は既定値設定のクラスタルクス（Clustalx）並列配列ツールを用いて実施した：ブロッサム・シリーズ重量マトリックス、ギャップ・オープニングペナルティ：10.0、ギャップ・エクステンションペナルティ：0.05。
【配列表】
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【図１】
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