(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式(I)を有する化合物。
【化１】
0003754298.tif 000107
[式中、WはNであり、
R21はH、C1-6アルコキシ、ヒドロキシ、又はN(R23)2であり、
ここで、R23は各々独立してC1-6アルキルであり;
R22はH、C1-6アルキル、C3-6シクロアルキル、C1-6ハロアルキル、C1-6チオアルキル、C1-6アルコキシ、C3-6シクロアルコキシ、C2-7アルコキシアルキル、C6アリール又はHetであり、ここで、Hetは窒素、酸素又はイオウより選ばれたヘテロ原子1〜4個を有する5、6、又は7員飽和又は不飽和複素環であり;
前記アリール又はHetはR24で置換されており、
ここで、R24はH、C1-6アルキル、C3-6シクロアルキル、C1-6アルコキシ、C3-6シクロアルコキシ、N(R25)2、NH-C(O)-R25、又はNH-C(O)-NH-R25 (ここで、R25は各々独立してH、C1-6アルキル又はC3-6シクロアルキルである。)であり;
R24はNH-C(O)-OR26 (ここで、R26はC1-6アルキル又はC3-6シクロアルキルである。)でもあり;
R3はヒドロキシ、NH2又は式-NH-R31 (式中、R31は-C(O)-R32、-C(O)-NHR32又は-C(O)-OR32である。)を有する基であり、ここで、R32はC1-6アルキル又はC3-6シクロアルキルであり;
DはO、S、又はN-R41より独立して選ばれたヘテロ原子1〜3個を有していてもよい5〜10原子飽和又は不飽和アルキレン鎖であり、ここで、R41はH、C1-6アルキル、又は-C(O)-R42であり、ここで、R42はC1-6アルキル、又はC6アリールであり;
R4はH又は前記鎖Dの炭素原子の1〜3個の置換基であり、前記置換基は独立してC1-6アルキル、ヒドロキシ、及びオキソからなる群より選ばれ、
Aはカルボン酸又はその薬学的に許容しうる塩又はエステルでもある。]
【請求項２】
前記R1部分が下記構造(i)又は(ii)で表される2つの異なるジアステレオマーより選ばれる、請求項1記載の式Iの化合物。
【化２】
0003754298.tif 000108
Dはアミドに対してsyn(i)、又はDはAに対してsyn(ii)
【請求項３】
式(ii)で表されるようにDがAに対してsynに結合している、請求項2記載の式Iの化合物。
【請求項４】
WがNであり;
R21がH、C1-6アルコキシ、ヒドロキシ、又はN(R23)2であり、ここで、R23がC1-6アルキルであり;
R22がH、C1-6チオアルキル、C1-6アルコキシ、フェニル又は下記構造からなる群より選ばれるHetである、請求項1記載の式Iの化合物。
【化３】
0003754298.tif 000109
[式中、R24はH、C1-6アルキル、NH-R25、NH-C(O)-R25、又はNH-C(O)-NH-R25 (ここで、R25は各々独立してH、C1-6アルキル、又はC3-6シクロアルキルである。)、又はNH-C(O)-OR26 (ここで、R26はC1-6アルキルである。)である。].
【請求項５】
R21がH又はC1-6アルコキシである、請求項4記載の式Iの化合物。
【請求項６】
R22がC1-4アルコキシ、フェニル又は下記構造からなる群より選ばれるHetである、請求項4記載の式Iの化合物。
【化４】
0003754298.tif 000110
[式中、R24はH、C1-6アルキル、NH-R25、又はNH-C(O)-R25 (ここで、R25は各々C1-6アルキル又はC3-6 シクロアルキルである。)、又はNH-C(O)-OR26 (ここで、R26は請求項4で定義した通りである。)である。]
【請求項７】
R21がメトキシである、請求項6記載の式Iの化合物。
【請求項８】
R22がエトキシ、又は下記構造からなる群より選ばれるHetである、請求項7記載の化合物。
【化５】
0003754298.tif 000111
[式中、R24aはNH-R25又はNH-C(O)-R25 (ここで、R25はC1-6アルキルである。)であり; R24aはNH-C(O)-OR26 (ここで、R26はC1-6アルキルである。)でもあり、R24bはH又はC1-6アルキルである。]
【請求項９】
R3が式NH-C(O)R32のアミド又は式NH-C(O)-NH-R32の尿素又は式NH-C(O)-OR32のカルバメートであり、R32がC1-6アルキル、又はC3-6シクロアルキルである、請求項1記載の式Iの化合物。
【請求項１０】
R3が尿素又はカルバメートであり、R32がC1-6アルキル又はC4-6シクロアルキルである、請求項9記載の式Iの化合物。
【請求項１１】
R3がカルバメートであり、R32がtert-ブチル、シクロブチル又はシクロペンチルである、請求項10記載の式Iの化合物。
【請求項１２】
DがO、S又はN-R41 (ここで、R41はH、C1-6アルキル、又はC2-7アシルである。)より独立して選ばれるヘテロ原子1又は2個を有していてもよい6〜8原子飽和又は不飽和アルキレン鎖である、請求項1記載の式Iの化合物。
【請求項１３】
DがNH、又はN-C2-7アシルより選ばれるヘテロ原子1個を有していてもよい、請求項12記載の式Iの化合物。
【請求項１４】
前記ヘテロ原子がNH又はN(Ac)より選ばれる、請求項13記載の化合物。
【請求項１５】
前記D鎖が7原子を有する、請求項13記載の化合物。
【請求項１６】
前記ヘテロ原子が前記D鎖の10位にある、請求項15記載の化合物。
【請求項１７】
前記D鎖が飽和されている、請求項13記載の化合物。
【請求項１８】
DがO、又はSより選ばれるヘテロ原子1個を有していてもよい6〜8原子飽和又は不飽和アルキレン鎖である、請求項12記載の式Iの化合物。
【請求項１９】
前記Dが7原子を有する、請求項18記載の化合物。
【請求項２０】
前記ヘテロ原子が前記D鎖の9位にある、請求項19記載の化合物。
【請求項２１】
前記D鎖が8位にR4で置換されており、ここで、R4がH又はC1-6アルキルである、請求項20記載の化合物。
【請求項２２】
前記R4がH又はメチルである、請求項21記載の化合物。
【請求項２３】
前記R4がH又は8-(S)-Meである、請求項22記載の化合物。
【請求項２４】
前記D鎖が飽和されている、請求項23記載の化合物。
【請求項２５】
前記D鎖が11、12位に二重結合を1つ有する、請求項19記載の化合物。
【請求項２６】
前記二重結合がtransである、請求項25記載の化合物。
【請求項２７】
Dが6〜8原子の飽和又は不飽和のすべて炭素のアルキレン鎖である、請求項12記載の式Iの化合物。
【請求項２８】
Dが7原子鎖である、請求項27記載の式Iの化合物。
【請求項２９】
Dが飽和されている、請求項28記載の式Iの化合物。
【請求項３０】
前記D鎖がR4で置換されており、ここで、R4がH、オキソ、ヒドロキシ、又はアルキルである、請求項29記載の化合物。
【請求項３１】
前記R4がH又はC1-6アルキルである、請求項30記載の化合物。
【請求項３２】
前記R4がH又はメチルである、請求項31記載の化合物。
【請求項３３】
R4がH又は10-(S)-Meである、請求項32記載の化合物。
【請求項３４】
Dが二重結合を1つ有する、請求項28記載の式Iの化合物。
【請求項３５】
前記二重結合が前記D鎖の13、14位にある、請求項34記載の式Iの化合物。
【請求項３６】
前記二重結合がcisである、請求項35記載の式Iの化合物。
【請求項３７】
前記D鎖がR4で置換されており、ここでR4がH、オキソ、ヒドロキシ、又はC1-6アルキルである、請求項36記載の化合物。
【請求項３８】
前記R4がH又はC1-6アルキルである、請求項37記載の化合物。
【請求項３９】
前記R4がH又はメチルである、請求項38記載の化合物。
【請求項４０】
前記R4がH又は10-(S)-Meである、請求項39記載の化合物。
【請求項４１】
Aがカルボン酸である、請求項1記載の式Iの化合物。
【請求項４２】
WがNであり;
R3が式-NH-C(O)-NHR32又は-NH-C(O)-OR32を有する基であり、ここで、R32はC1-4アルキル又はC4-6シクロアルキルであり;
DがO、S又はN-R41 (ここで、R41はH、又はC2-7アシルである。)より独立して選ばれるヘテロ原子1又は2個を有していてもよいAに対してR1がsynに結合した6〜8原子の飽和又は不飽和アルキレン鎖であり;
R4がH、又はヒドロキシ、又はC1-6アルキルより独立して選ばれた1〜3個の置換基であり;
Aがカルボン酸、又はその薬学的に許容しうる塩又はエステルである、請求項1記載の化合物。
【請求項４３】
R21がH又はメトキシであり;
R22がC1-6アルコキシ、又は下記構造
【化６】
0003754298.tif 000112
[式中、R24aはH、C1-6アルキル、NH-R25、NH-C(O)-R25、又はNH-C(O)-NH-R25 (ここで、R25はH、C1-6アルキル又はC3-6シクロアルキルである。)、又はR24aはNH-C(O)-OR26 (ここで、R26はC1-6アルキル又はC3-6シクロアルキルである。)でもあり;
R24bはH又はC1-6アルキルである。]
からなる群より選ばれるHetであり;
R3は式N-C(O)-NHR32の尿素又は式N-C(O)-OR32のカルバメートであり、ここで、R32はC1-6アルキル又はC3-6シクロアルキルであり;
Dは11、12又は13、14位に二重結合を１つ有していてもよい7原子アルキレン鎖であり;
前記D鎖はO、S、NH、N(Me)、又はN(Ac)より独立して選ばれるヘテロ原子1個を有していてもよく;
R4はH又はC1-6アルキルである、請求項42記載の式Iの化合物。
【請求項４４】
R21がメトキシであり、R22がエトキシ又は下記構造
【化７】
0003754298.tif 000113
(式中、R24aはNH-(C1-4アルキル)、NH-C(O)-(C1-4アルキル)、NH-C(O)-O-(C1-4アルキル)、又はNH-C(O)-NH-(C1-4アルキル)である。)
であり;
Dが飽和された又は13、14位にcis二重結合を有するC7すべて炭素鎖である、請求項43記載の式Iの化合物。
【請求項４５】
下記式を有し、R1に単一の立体異性体を含んでいる化合物。
【化８】
0003754298.tif 000114
(式中、前記二重結合、D-R1結合立体化学及びR22は次の通り定義される。
【表１】
0003754298.tif 000115
【請求項４６】
下記式を有し、R1に単一の立体異性体を含んでいる化合物。
【化９】
0003754298.tif 000116
(式中、R3、R4、前記二重結合位置、D-R1結合立体化学、R21及びR22は次の通り定義される。)
【表２】
0003754298.tif 000117
【表３】
0003754298.tif 000118
【請求項４７】
下記式を有し、R1に単一の立体異性体を含んでいる化合物。
【化１０】
0003754298.tif 000119
(式中、R3、D、D-R1結合立体化学、R21及びR22は次の通り定義される。)
【表４】
0003754298.tif 000120
【表５】
0003754298.tif 000121
【請求項４８】
下記式を有する化合物。
【化１１】
0003754298.tif 000122
(式中、前記D-R1結合は酸に対してsynであり、R4、X9及び前記11、12二重結合は次の通り定義される。)
【表６】
0003754298.tif 000123
【表７】
0003754298.tif 000124
【請求項４９】
下記式を有する化合物。
【化１２】
0003754298.tif 000125
(式中、前記D-R1は酸に対してsynであり、X10、X11、及びX12は次の通り定義される。)
【表８】
0003754298.tif 000126
【請求項５０】
下記式を有する化合物。
【化１３】
0003754298.tif 000127
(式中、前記D-R1結合は酸に対してsynであり、R21及びR22は次の通りである。
【表９】
0003754298.tif 000128
【表１０】
0003754298.tif 000129
【請求項５１】
下記式を有する化合物。
【化１４】
0003754298.tif 000130
(式中、前記D-R1結合は酸に対してsynであり、R4、X9、X10、X11、前記13、14二重結合及びR22は次の通り定義される。)
【表１１】
0003754298.tif 000131
【表１２】
0003754298.tif 000132
【表１３】
0003754298.tif 000133
【表１４】
0003754298.tif 000134
【表１５】
0003754298.tif 000135
【請求項５２】
下記式を有する化合物。
【化１５】
0003754298.tif 000136
(式中、前記D-R1結合は酸に対してsynであり、前記13、14二重結合はcisであり、R32、R4及びR22は次の通りである。)
【表１６】
0003754298.tif 000137
【表１７】
0003754298.tif 000138
【表１８】
0003754298.tif 000139
【請求項５３】
下記式を有する化合物。
【化１６】
0003754298.tif 000140
(式中、前記D-R1結合は酸に対してsynであり、R32、R4及びR22は次の通りである。)
【表１９】
0003754298.tif 000141
【表２０】
0003754298.tif 000142
【請求項５４】
請求項1記載の式Iの化合物のC型肝炎ウイルスNS3プロテアーゼ阻害量にウイルスを暴露することによりC型肝炎ウイルスの複製を阻害する方法。
【請求項５５】
請求項1記載の式Iの化合物、又はその治療的に許容しうる塩又はエステルの抗C型肝炎ウイルス的に有効な量を薬学的に許容しうる担体又は補助剤と混合して含む医薬組成物。
【請求項５６】
追加免疫調節剤を更に含んでいる、請求項55記載の医薬組成物。
【請求項５７】
前記追加免疫調節剤がαインターフェロン、βインターフェロン、又はγインターフェロンからなる群より選ばれる、請求項56記載の医薬組成物。
【請求項５８】
抗ウイルス剤を更に含んでいる、請求項55記載の医薬組成物。
【請求項５９】
前記抗ウイルス剤がリバビリン又はアマンタジンからなる群より選ばれる、請求項58記載の医薬組成物。
【請求項６０】
HCVプロテアーゼの他の阻害剤を更に含んでいる、請求項55記載の医薬組成物。
【請求項６１】
HCVライフサイクルにおいて他の標的の阻害剤、例えば、ヘリカーゼ、ポリメラーゼ、又はメタロプロテアーゼを更に含んでいる、請求項55記載の医薬組成物。
【請求項６２】
哺乳動物においてC型肝炎ウイルス感染症を治療する薬剤の製造のための医薬組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、化合物、組成物、その化合物の製法及びC型肝炎ウイルス(HCV)感染症の治療のための方法に関する。特に、本発明は、新規なぺプチド類縁体、その類縁体を含む医薬組成物及びHCV感染症の治療においてその類縁体を用いる方法を提供する。
【０００２】
発明の背景
C型肝炎ウイルス(HCV)は、世界中に広まった輸血後及び院外感染性非A型非B型肝炎の主な病因因子である。世界中で1億7千万人を超える人々がウイルスに感染していると推定される。高い割合の保因者が慢性的に感染し、多くが慢性の肝臓疾患、いわゆる慢性C型肝炎に進行する。このグループは、肝硬変、肝細胞がん、又は死に至る末期肝臓疾患のような深刻な肝臓病の非常に危険な状態にある。  HCVがウイルスの持続を確立しかつ高い割合の慢性肝臓疾患を引き起こすメカニズムは、十分に解明されていない。HCVがどのようにホスト免疫系と相互作用し巧く切り抜けているかは不明である。更に、HCV感染やHCV疾患に対して防御した細胞免疫応答と液素性免疫応答の役割もまだ確立されていない。輸血に関連したウイルス肝炎の予防に免疫グロブリンが報告されたが、疾病管理センターは、現在、このための治療に免疫グロブリンを奨めていない。有効な防御免疫応答がないことがワクチン又は十分な曝露後予防基準の開発を妨げているので、短期的には抗ウイルス介入に望みがかけられていることは確かである。
【０００３】
慢性C型肝炎に罹患した患者においてHCV感染症を効果的に治療することができる薬剤を同定することを目標にして様々な臨床試験が行われた。これらの試験は、インターフェロン-αのみと他の抗ウイルス剤と組合わせた使用を含むものであった。その試験からかなりの数の参加者がこれらの治療に応答しないことが示され、うまく応答した参加者の大部分は治療の終了後再発することがわかった。
数年前まで、インターフェロン(IFN)は、慢性C型肝炎をもつ患者にとって臨床で認可された利点が証明された唯一の利用できる治療法であった。しかしながら、持続した応答速度が遅く、インターフェロン治療は、治療した患者の生活の質を落とす重い副作用(即ち、網膜症、甲状腺炎、急性膵炎、うつ病)も誘発する。リバビリンと併用したインターフェロンは、始めはIFNのみに応答しない患者に認可されたものである。いまは投薬を受けたことのない患者に認可され、現在HCV治療の貴重な標準となっている。しかしながら、IFNによる副作用は、この併用治療においては軽減されていない。
従って、現在の医薬治療の限界を克服するHCV感染症の治療に有効な抗ウイルス材料の開発が求められている。
【０００４】
HCVはフラビウイルス科のエンベローププラス鎖RNAウイルスである。一本鎖HCV RNAゲノムは、長さが約9500ヌクレオチドであり、約3000アミノ酸の単一の大きなポリタンパク質をコードしている単一オープンリーディングフレーム (ORF)を有する。感染細胞においては、このポリタンパク質は細胞プロテアーゼとウイルスプロテアーゼによって多数の部位で切断され、構造タンパク質と非構造(NS)タンパク質を生成する。HCVの場合には、成熟非構造タンパク質(NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、及びNS5B)の生成は、2つのウイルスプロテアーゼによって達成する。まだはっきりしない第1のものはNS2-NS3結合で切断し、第2のものはNS3のN末端内に含まれるセリンプロテアーゼ (以後NS3プロテアーゼと呼ぶ)であり、NS3-NS4A切断部位においては共にcisで、残りのNS4A-NS4B、NS4B-NS5A、NS5A-NS5B部位についてはtransでNS3の後続の切断下流すべてを仲介する。NS4Aタンパク質は、多機能を働くと思われ、NS3プロテアーゼの補因子として作用し、おそらくNS3と他のウイルスのレプリカーゼ成分の膜局在化を援助すると思われる。NS3タンパク質とNS4Aとの複合体形成は、プロセシングの場合に必要なようであり、すべての部位でタンパク質分解効力を高める。NS3タンパク質は、ヌクレオシドトリホスファターゼ活性とRNAヘリカーゼ活性も示す。NS5Bは、HCVの複製に関与するRNA依存性RNAポリメラーゼである。
【０００５】
国際出願第97/06804号には、HCVに対して活性なものとしてヌクレオシド類縁体 シトシン-1,3-オキサチオラン(3TCとしても知られる)の(-)エナンチオマーが記載されている。この化合物は、HIVとHBVに対して以前の臨床試験で安全なものとして報告されたが、HCVに対して安全であることは臨床的に依然として証明されており、ウイルスに対する作用メカニズムも依然として報告されている。
抗ウイルス剤の開発の一般的戦略は、ウイルスの複製に不可欠であるウイルス性にコードされた酵素を不活性化することである。
このように、HCVのNS3プロテアーゼ又はRNAヘリカーゼを阻害する化合物を発見する大変な努力によって次の開示がもたらされた。
米国特許5,633,388号には、HCVに対して活性である複素環置換カルボキシアミド又は類縁体が記載されている。これらの化合物は、ウイルスのNS3タンパク質のヘリカーゼ活性に対向するものであるが臨床試験はまだ報告されていない。
HCV NS3プロテアーゼに対して試験管内で活性を有するフェナトレンキノンがChuら(Tet. Lett., (1996), 7229-7232)によって報告された。この化合物に対する開発は更に報告されていない。
抗ウイルス研究に関する第9回国際会議、裏磐梯、福島県、日本(1996) (Antiviral Research, (1996), 30, 1, A23 (抄録19))で示された論文には、 HCVプロテアーゼに対して阻害的であるチアゾリジン誘導体が報告されている。
【０００６】
いくつかの研究によって、ヒト白血球エラスターゼのような他のセリンプロテアーゼに対して阻害的な化合物が報告されている。国際出願第95/33764号(Hoechst Marion Roussel, 1995)にこれらの化合物のファミリーが報告されている。その出願に開示されたぺプチドは、本発明のぺプチドとは構造的に異なるモルホリニルカルボニルベンゾイルぺプチド類縁体である。
バーテックスファーマスーチカルズ社(Vertex Pharmaceuticals Inc.)の国際出願第98/17679号には、セリンプロテアーゼ、特にC型肝炎ウイルスNS3プロテアーゼインヒビターが開示されている。
ホフマンロッシュ(Hoffman LaRoche)(国際出願第98/22496号; 米国第5,866,684号 & 同第6,018,020号)にも、HCV感染症の治療に抗ウイルス剤として有用なプロテイナーゼインヒビターであるヘキサぺプチドが報告されている。
SteinkuehlerらとIngallinellaらは、NS4A-4B生成物阻害について発表している(Biochemistry (1998), 37, 8899-8905 & 8906-8914)。
スケリングコーポレーション(Schering Corporation)による国際出願第97/43310号には、HCV NS3プロテアーゼに対して活性な20と21のアミノ酸ぺプチド配列が開示されている。
【０００７】
エモリー大学(Emory University)による国際出願第98/46597号には、セリンプロテアーゼに対して試験管内で活性なぺプチドとぺプチドミメチクスが開示されている。
ぺプチドセラピューチクスリミテッド(Peptide Therapeutics Limited)による国際出願第98/46630号には、HCV NS3プロテアーゼを阻害するデプシぺプチド基質が開示されている。
最後に、米国第5,869,253号には、HCV NS3プロテアーゼを阻害するRNA酵素分子が開示されている。
上記先行特許出願はいずれもC型肝炎ウイルスNS3プロテアーゼに対して活性かつ選択的な環状ぺプチドが示唆されていない。
国際出願第99/07733号、同第99/07734号、同第00/09543号及び同第00/09558号には、NS3プロテアーゼを阻害するヘキサぺプチド〜テトラぺプチドやトリぺプチド類縁体が開示されている。しかしながら、これらの開示は、本発明の大環状類縁体の設計を示唆してなく、導いてもいない。
インスティテュートデリチャーチジバイオロジアモレキュラ(Institute de Richerche di Biologia Moleculare (IRBM))から1999年5月5日に発表された国際出願第99/38888号には、HCV NS3プロテアーゼの小ぺプチド阻害剤が開示されている。この開示には、本発明のぺプチドの環状の種類をなにも示唆せず、示してもいない。更に、このPCT出願は、本出願の優先日後に公開されている。
【０００８】
IRBMによる国際出願第99/64442号には、これも本出願の優先日後に公開され、P1にケト酸を有するオリゴぺプチドが開示されている。
バーテックスファーマスーチカルズ(Vertex Pharmaceuticals)(1999年10月7日に公開)による国際出願第99/50230号も本出願の優先日後に公開された。そのときでさえ、本発明の環状ぺプチドを示唆してなく関係は薄い。
本発明の利点は、C型肝炎ウイルスのNS3プロテアーゼに対して阻害的である大環状ぺプチドを提供することである。
本発明の態様の利点は、更に、これらのぺプチドがNS3プロテアーゼを特異的に阻害し、ヒト白血球エラスターゼ(HLE)、ブタ膵臓エラスターゼ(PPE)、又はウシ膵臓キモトリプシンのような他のセリンプロテアーゼ、又はヒト肝臓カテプシンB (Cat B)のようなシステインプロテアーゼに対してほとんど阻害活性を示さないという事実にある。
本発明の利点は、更に、細胞膜を浸透することができかつ細胞培養内でNS3プロテアーゼ活性を阻害する低分子量の小ぺプチドを提供することである。
また、本発明の化合物の利点は、更に、臨床分離物(1a & 1b)に見られる主な両遺伝子型に活性であり、これらの化合物が現在既知のHCVの遺伝子型すべてに対して活性であることを強く示しているという事実にある。
【０００９】
発明の要約
下記式(I)の化合物が本発明の範囲に包含される。
【００１０】
【化１７】
0003754298.tif 000002
【００１１】
[式中、WはCH又はNであり、
R21はH、ハロ、C1-6アルキル、C3-6シクロアルキル、C1-6ハロアルキル、C1-6アルコキシ、C3-6シクロアルコキシ、ヒドロキシ、又はN(R23)2であり、ここで、R23は各々独立してH、C1-6アルキル又はC3-6シクロアルキルであり;
R22はH、ハロ、C1-6アルキル、C3-6シクロアルキル、C1-6ハロアルキル、C1-6チオアルキル、C1-6アルコキシ、C3-6シクロアルコキシ、C2-7アルコキシアルキル、C3-6 シクロアルキル、C6又はC10アリール又はHetであり、ここで、Hetは窒素、酸素又はイオウより選ばれたヘテロ原子1〜4個を有する5、6、又は7員飽和又は不飽和複素環であり;
前記シクロアルキル、アリール又はHetはR24で置換されており、
ここで、R24はH、ハロ、C1-6アルキル、C3-6シクロアルキル、C1-6アルコキシ、C3-6シクロアルコキシ、NO2、N(R25)2、NH-C(O)-R25、又はNH-C(O)-NH-R25 (ここで、R25は各々独立してH、C1-6アルキル又はC3-6シクロアルキルである。)であり;
R24はNH-C(O)-OR26 (ここで、R26はC1-6アルキル又はC3-6シクロアルキルである。)でもあり;
【００１２】
R3はヒドロキシ、NH2又は式-NH-R31 (式中、R31はC6又はC10アリール、ヘテロアリール、-C(O)-R32、-C(O)-OR32又は-C(O)-NHR32である。)を有する基であり、ここで、R32はC1-6アルキル又はC3-6シクロアルキルであり;
DはO、S、又はN-R41より独立して選ばれたヘテロ原子1〜3個を有していてもよい5〜10原子飽和又は不飽和アルキレン鎖であり、ここで、R41はH、C1-6アルキル、C3-6シクロアルキル又は-C(O)-R42であり、ここで、R42はC1-6アルキル、C3-6シクロアルキル又はC6 又はC10アリールであり;
R4はH又は前記鎖Dの炭素原子の1〜3個の置換基であり、前記置換基は独立してC1-6アルキル、C1-6ハロアルキル、C1-6アルコキシ、ヒドロキシ、ハロ、アミノ、オキソ、チオ又はC1-6チオアルキルからなる群より選ばれ、
Aは式-C(O)-NH-R5 (式中、R5はC1-8アルキル、C3-6シクロアルキル、C6又はC10アリール又はC7-16アラルキルからなる群より選ばれる。）を有するアミドであり;
Aはカルボン酸又はその薬学的に許容しうる塩又はエステルでもある。]
【００１３】
式Iの化合物、又はその治療的に許容しうる塩又はエステルの抗C型肝炎ウイルス的に有効な量を薬学的に許容しうる担体又は補助剤を混合して含む医薬組成物が本発明の範囲内に包含される。
本発明の重要な態様は、式Iの化合物、又はその治療的に許容しうる塩又はエステルの抗C型肝炎ウイルス的に有効な量を又は上記組成物を哺乳動物に投与することにより哺乳動物においてC型肝炎ウイルス感染症を治療する方法を含んでいる。
他の重要な態様は、式Iの化合物、又はその治療的に許容しうる塩又はエステルのC型肝炎NS3プロテアーゼ阻害量又は上記組成物をウイルスに曝露することによりC型肝炎ウイルスの複製を阻害する方法を含んでいる。
また、他の態様は、式Iの化合物、又はその治療的に許容しうる塩又はエステルの組合わせの抗C型肝炎ウイルス的に有効な量を投与することにより哺乳動物においてC型肝炎ウイルス感染症を治療する方法を含んでいる。実施態様によれば、本発明の医薬組成物は追加免疫調節剤を含んでいる。追加免疫調節剤の例としては、α-、β-又はδ-インターフェロンが挙げられるこれらに限定されない。
代替的実施態様によれば、本発明の医薬組成物は、更に、抗ウイルス剤を含むこともできる。抗ウイルス剤の例としては、リバビリン又はアマンタジンが挙げられる。
他の代替的実施態様によれば、本発明の医薬組成物は、更に、他のHCVプロテアーゼインヒビターを含むこともできる。
また他の代替的実施態様によれば、本発明の医薬組成物は、更に、ヘリカーゼ、ポリメラーゼ、メタロプロテアーゼ又はIRESのようなHCV生活環の他の標的の阻害剤を含むこともできる。
【００１４】
好適実施態様の詳細な説明
定義
本明細書に用いられる次の定義は、特にことわらない限りあてはまるものである。
(R)又は(S)が置換基の絶対配置、例えば、式Iの化合物のR4を示すために用いられる例については、呼称は化合物全体の関係で示され、置換基のみの関係ではない。
本明細書に用いられる呼称『P1、P2、及びP』は、ぺプチド類縁体のC末端から開始してN末端に向かって伸長するアミノ酸残基の位置を意味する(即ち、P1はC末端から1位、P2: C末端から第2位等を意味する。) (Berger A. & Schechter I., Transactions of the Royal Society London series B257, 249-264 (1970)を参照されたい。)。
本明細書に用いられる『1-アミノシクロプロピルカルボン酸』(ACCA)という用語は、下記式を有する化合物を意味する。
【００１５】
【化１８】
0003754298.tif 000003
【００１６】
本明細書に用いられる『ビニル-ACCA』という用語は下記式を有する化合物を意味する。
【００１７】
【化１９】
0003754298.tif 000004
【００１８】
本明細書に用いられる『ホモアリル-ACCA』という用語は、下記式を有する化合物を意味する。
【００１９】
【化２０】
0003754298.tif 000005
【００２０】
本明細書に用いられる『ハロ』という用語は、ブロモ、クロロ、フルオロ又はヨードより選ばれるハロゲンを意味する。
本明細書に用いられる『C1-6ハロアルキル』という用語は、単独で又は他の置換基と組合わせて本明細書に用いられ、ブロモ、クロロ、フルオロ又はヨードより選ばれたハロゲンを置換した水素を１個以上有する炭素原子1〜6個を有する非環式直鎖又は分枝鎖アルキル置換基を意味する。
本明細書に用いられる『C1-6チオアルキル』という用語は、単独で又は他の置換基と組合わせて本明細書に用いられ、チオプロピルのようなチオール基を有する非環式直鎖又は分枝鎖アルキル置換基を意味する。
本明細書に用いられる『C1-6アルキル』又は『(低級)アルキル』という用語は、単独で又は他の置換基と組合わせて、炭素原子1〜6個を有する非環式直鎖又は分枝鎖アルキル置換基を意味し、例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ヘキシル、1-メチルエチル、1-メチルプロピル、2-メチルプロピル、1,1-ジメチルエチルが挙げられる。
本明細書に用いられる『C3-6シクロアルキル』という用語は、単独で又は他の置換基と組合わせて、炭素原子3〜6個を有するシクロアルキル置換基を意味し、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、又はシクロヘキシルが挙げられる。
『不飽和シクロアルキル』という用語は、例えば、下記置換基シクロヘキセニルが挙げられる。
【００２１】
【化２１】
0003754298.tif 000006
【００２２】
本明細書に用いられる『飽和又は不飽和アルキレン』という用語は、飽和又は不飽和の直鎖又は分枝鎖脂肪族炭化水素のそれぞれの末端から水素原子1つを除去することにより得られた2価のアルキル置換基を意味し、例えば、-CH2CH2C(CH3)2CH2CH2-、-CH2CH2CH=CHCH2CH2-又は-CH2C≡CCH2CH2-が挙げられる。このアルキル鎖は、酸素のようなヘテロ原子を含んでいてもよい(例えば、CH3-CH2-O-CH2-)。
本明細書に用いられる『C1-6アルコキシ』という用語は、単独で又は他の置換基と組合わせて置換基-O-C1-6アルキル(ここで、アルキルは炭素原子6個までを有する上で定義した通りである。)を意味する。アルコキシとしては、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、1-メチルエトキシ、ブトキシ又は1,1-ジメチルエトキシが挙げられれる。後者の置換基は、tert-ブトキシとして一般に知られる。
本明細書に用いられる『C3-6シクロアルキル』という用語は、単独で又は他の置換基と組合わせて、炭素原子3〜6個を有する置換基-O-C3-6シクロアルキルを意味する。
本明細書に用いられる『C1-6アルコキシアルキル』という用語は、置換基C1-6アルキル-O-C1-6アルキル(ここで、アルキルは炭素原子6個までを有する上で定義した通りである。)を意味する。例えば、メトキシメチルは-CH2-O-CH3を意味する。
【００２３】
本明細書に用いられる『C2-7アシル』という用語は、単独で又は他の置換基と組合わせて、カルボニル基によって結合したC1-6アルキル基、例えば、-C(O)-C1-6アルキルを意味する。
本明細書に用いられる『C6又はC10アリール』という用語は、単独で又は他の置換基と組合わせて、炭素原子6個を有する芳香族単環式系か又は炭素原子10個を有する芳香族二環式系を意味する。例えば、アリールとしては、フェニル又はナフチル環系が挙げられる。
本明細書に用いられる『C7-16アラルキル』という用語は、単独で又は他の置換基と組合わせて、アルキル基によって結合した上で定義したアリールを意味し、ここで、アルキルは炭素原子1〜6個を有する上で定義した通りである。アラルキルとしては、例えば、ベンジル又はブチルフェニルが挙げられる。
本明細書に用いられる『Het』という用語は、単独で又は他の置換基と組合わせて、窒素、酸素又はイオウより選ばれたヘテロ原子1〜4個を有する5、6、又は7員飽和又は不飽和(芳香族を含む)複素環から水素を除去することにより得られた1価の置換基を意味する。適切な複素環の例としては、テトラヒドロフラン、チオフェン、ジアゼピン、イソキサゾール、ピペリジン、ジオキサン、モルホリン、ピリミジン又は下記構造が挙げられる。
【００２４】
【化２２】
0003754298.tif 000007
【００２５】
『Het』という用語は、複素環又は他のサイクルである1つ以上の他のサイクルに縮合した上で定義した複素環である。その例としては、チアゾロ[4,5-b]ピリジンが挙げられる。
『Het』という用語によって総括されるが、本明細書に用いられる『ヘテロアリール』という用語は、二重結合が芳香族系を形成する不飽和複素環を正確に定義している。芳香族複素環結合の適切なれ遺伝子としては、キノリン、インドール、ピリジン、下記構造が挙げられる。
【００２６】
【化２３】
0003754298.tif 000008
【００２７】
本明細書に用いられる『薬学的に許容しうるエステル』という用語は、単独で又は他の置換基と組合わせて、分子のカルボキシ官能基のいずれかが、好ましくはカルボキシ末端が下記アルコキシカルボニル官能基で置き換えられている式Ｉの化合物のエステルを意味する。
【００２８】
【化２４】
0003754298.tif 000009
【００２９】
(式中、エステルのR部分は、アルキル(例えば、メチル、エチル、n-プロピル、t-ブチル、n-ブチル); アルコキシアルキル(例えば、メトキシエチル); アルコキシアシル(例えば、アセトキシメチル); アラルキル(例えば、ベンジル); アリールオキシアルキル(例えば、フェノキシメチル); ハロゲン、C1-4アルキル又はC1-4アルコキシで置換されていてもよいアリール(例えば、フェニル)より選ばれる。)
他の適切なプロドラッグエステルは、Design of prodrugs, Bundgaard, H. Ed. Elsevier (1985)に見られ、この文献の記載は本願明細書に含まれるものとする。 その薬学的に許容しうるエステルは、通常は哺乳動物に注入されたときに生体内で加水分解され、式Iの化合物の酸の形に変換される。
上記エステルに関して、特にことわらない限り、アルキル部分は有利には炭素原子1〜16個、特に炭素原子1〜6個を有する。そのエステルに存在するアリール部分は、有利にはフェニル基を含んでいる。
特に、エステルは、C1-16アルキルエステル、無置換ベンジルエステル又はハロゲン、C1-6アルキル、C1-6アルコキシ、ニトロ又はトリフルオロメチルの少なくとも1つで置換されたベンジルエステルであってもよい。本明細書に用いられる『薬学的に許容しうる塩』という用語は、薬学的に許容しうる塩基から得られたものを含んでいる。適切な塩基の例としては、コリン、エタノールアミン又はエチレンジアミンが挙げられる。Na+塩、K+塩、又はCa++塩も本発明の範囲内であることが企図される(Pharmaceutical salts, Birge, S.M.ら, J. Pharm. Sci., (1977), 66, 1-19を参照されたい。この論文の記載は本願明細書に含まれるものとする。)。
【００３０】
好適実施態様
R1:
本発明の好適実施態様は、R1部分が2つの異なるジアステレオマーより選ばれ、1-炭素中心が下記構造(i)又は(ii)で表されるR配置を有する、上記式Iの化合物を含んでいる。
【００３１】
【化２５】
0003754298.tif 000010
【００３２】
Dはアミドに対してsyn (i)、又はDはAに対してsyn (ii)
更に好ましくは、リンカーDは構造(ii)で表されるAに対してsynの配置でR1に結合されている。
【００３３】
R2:
本発明の好適実施態様は、R2部分が下記構造である上記式Iの化合物を含んでいる。
【００３４】
【化２６】
0003754298.tif 000011
【００３５】
(式中、Wは好ましくはNである。)
好ましくは、R21はH、C1-6アルキル、C1-6アルコキシ、ヒドロキシ、クロロ、又はN(R23)2 (ここで、R23は好ましくはH又はC1-6アルキルである。)  更に好ましくは、R21はH又はC1-6アルコキシである。最も好ましくは、R21はメトキシである。
好ましくは、R22はH、C1-6チオアルキル、C1-6アルコキシ、フェニル又は下記構造からなる群より選ばれたHetである。
【００３６】
【化２７】
0003754298.tif 000012
【００３７】
好ましくは、R24はH、C1-6アルキル、NH-R25、NH-C(O)-R25、又はNH-C(O)-NH-R25、又はNH-C(O)-OR26である。
更に好ましくは、R22はC1-4アルコキシ、フェニル又は下記構造からなる群より選ばれたHetである。
【００３８】
【化２８】
0003754298.tif 000013
【００３９】
更に好ましくは、R24はH、C1-6アルキル、NH-R25、NH-C(O)-R25、又はNH-C(O)-OR26である。
更に好ましくは、R22はエトキシ、又は下記構造からなる群より選ばれたHetである。
【００４０】
【化２９】
0003754298.tif 000014
【００４１】
最も好ましくは、R24aはNH-R25、NH-C(O)-R25、又はNH-C(O)-OR26である。最も好ましくは、R24bはH又はC1-6アルキルである。
好ましくは、R25は各々独立してH、C1-6アルキル、又はC3-6シクロアルキル、である。更に好ましくは、R25はC1-6アルキル又はC3-6シクロアルキルである。更に好ましくは、R25はC1-6アルキルである。好ましくは、R26はC1-6アルキルである。
【００４２】
R3:
本発明の好適実施態様は、R3部分が、好ましくは式NH-C(O)-R32のアミド、式NH-C(O)-NH-R32の尿素、又は式NH-C(O)-OR32のカルバメートである上記式Iの化合物を含んでいる。更に好ましくは、R3はカルバメート又は尿素である。最も好ましくは、R3はカルバメートである。
好ましくは、R32はC1-6アルキル、又はC3-6シクロアルキルである。更に好ましくは、R32はC1-6アルキル、又はC4-6シクロアルキルである。最も好ましくは、R32はtert-ブチル、シクロブチル又はシクロペンチルである。
【００４３】
D:
本発明の好適実施態様は、リンカーDが6〜8原子飽和又は不飽和アルキレン鎖である式Iの化合物を含んでいる。更に好ましくは、Dは７原子鎖である。
好ましくは、D鎖はO、S、NH、N-C1-6アルキル又はN-C2-7アシルより選ばれるヘテロ原子1又は2個を有する。D鎖は、更に好ましくはNH又は N-C2-7アシル、最も好ましくはN(Ac)より選ばれたヘテロ原子1個を有してもよく、鎖の原子10に位置する。更に好ましくは、窒素原子を有する鎖が飽和している。
また、DはO又はSより選ばれたヘテロ原子1個を有する。好ましくは、Dの長さが7原子である場合、O又はS原子は鎖の9位にある。好ましくは、この鎖はR4で置換され、ここで、R4はH又はC1-6アルキルである。更に好ましくは、R4はH又はメチルである。最も好ましくは、R4はH又は8-(S)-Meである。更に最も好ましくは、Dは飽和されている。また、Dは11、12位に二重結合1つを有する。好ましくは、この二重結合はtransである。
また、Dはすべて炭素の飽和又は不飽和アルキレン鎖である。この場合、Dは、好ましくは飽和であり、長さが7原子である。更に好ましくは、DはR4で置換され、ここで、R4はH、オキソ、チオ、ヒドロキシ、チオアルキル、アルコキシ又はアルキルである。更に好ましくは、R4はH又はC1-6アルキルである。最も好ましくは、R4はH又はメチルである。最も好ましくは、R4はH又は10-(S)-Meである。
また、Dは、好ましくは二重結合を1つ有するすべて炭素のアルキレン鎖であり、長さが7原子である。更に好ましくは、この二重結合は、鎖の13、14位にある。最も好ましくは、この二重結合はcisである。好ましくは、このD鎖は R4で置換され、ここで、R4はH、オキソ、ヒドロキシ、アルコキシ又はアルキルである。更に好ましくは、R4はH又はC1-6アルキルである。更に好ましくはR4はH又はメチルである。最も好ましくは、R4はH又は10-(S)-Meである。
【００４４】
A:
本発明の好適実施態様は、Aがカルボン酸である上記式Iの化合物を含んでいる。
【００４５】
個々の実施態様:
本発明の好適実施態様は、R2がキノリン置換基(即ち、WはNである。)であり;
R3が-NHC(O)-NHR32又は-NHC(O)-OR32 (ここで、R32はC1-4アルキル又はC4-6 シクロアルキルである。）を有する基であり;
DがO、S又はN-R41 (ここで、R41はC2-7アシルである。)より独立して選ばれたヘテロ原子1又は2個を有していてもよい、Aに対してsyn配置でR1に結合した6〜8原子飽和又は不飽和アルキレン鎖であり;
R4がH、又はヒドロキシ又はC1-6アルキルより独立して選ばれた置換基1〜3個であり;
Aがカルボン酸、又はその薬学的に許容しうる塩又はエステルである、
上記式Iの化合物を含んでいる。
更に好ましくは、R1が上で定義した通りであり; R21がH又はメトキシであり;R22がC1-6アルコキシ、又は下記構造
【００４６】
【化３０】
0003754298.tif 000015
【００４７】
[式中、R24aはH、C1-6アルキル、NH-R25、NH-C(O)-R25、NH-C(O)-NH-R25 (ここで、
R25はH、C1-6アルキル又はC3-6シクロアルキルである。）であり;
R24aはNH-C(O)-OR26 (ここで、R26はC1-6アルキル又はC3-6シクロアルキルである。)でもあり;
R24bはH又はC1-6アルキルである。]
からなる群より選ばれたHetであり;
R3は式NH-C(O)-NHR32の尿素又は式NH-C(O)-OR32のカルバメートであり、ここで、R32はC1-6アルキル又はC3-6シクロアルキルであり;
Dは11、12位又は13、14位に二重結合1つを有してもよいC7原子飽和又は不飽和アルキレン鎖であり;
前記D鎖はO、S、NH、N(Me)、又はN(Ac)より独立して選ばれたヘテロ原子1個を有してもよい鎖であり;
R4はH又はC1-6アルキルである、
式Iの化合物である。
最も好ましくは、R21がメトキシであり、R22がエトキシ又は下記構造:
【００４８】
【化３１】
0003754298.tif 000016
【００４９】
(ここで、R24aはNH-(C1-4アルキル)、NH-C(O)-(C1-4アルキル)、又はNH-C(O)-O-(C1-4アルキル)ある。)であり;
Dが飽和されているか又は13、14位にcis二重結合を1つ有する、
式Iの化合物である。
最後に、表1〜9に示される式Iの化合物すべてが本発明の範囲内に包含される。
【００５０】
本発明の医薬組成物は、経口、非経口又はレザバーによって投与することができる。経口投与又は注射が好ましい。本発明の医薬組成物は、慣用の非毒性の薬学的に許容しうる担体、補助剤又は賦形剤を含有することができる。ある場合には、製剤のpＨを薬学的に許容しうる酸、塩基又は緩衝液で調整して処方された化合物又はその送達形の安定性を高めることができる。本明細書に用いられる非経口という用語は、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、動脈内、滑液嚢内、胸骨内、鞘内、又は病巣内注射又は注入の方法を含んでいる。
医薬組成物は、滅菌注射用製剤として、例えば、滅菌注射用水性又は油性懸濁液としてもよい。この懸濁液は、適切な分散剤又は湿潤剤(例えば、トゥイーン80)又は沈殿防止剤を用いて当該技術において既知の手法に従って処方することができる。
本発明の医薬組成物は、カプセル剤、錠剤、又は水性懸濁液剤又は液剤を含むがこれらに限定されない経口的に許容しうる剤形で経口投与することができる。経口用の錠剤の場合に、一般に用いられる担体としてはラクトース又はコーンスターチが挙げられる。典型的にはステアリン酸マグネシウムのような滑沢剤が添加される。カプセルとして経口投与する場合、有効な希釈剤としてはラクトース又は乾燥コーンスターチが挙げられる。水性懸濁液を経口投与する場合、有効成分は乳化剤と沈殿防止剤と組合わせられる。所望される場合には、ある種の甘味剤及び／又は芳香剤及び／又は着色剤を添加することができる。
【００５１】
上記製剤や組成物に適した他の賦形剤又は担体は、調剤学の標準テキスト、例えば、『レミントンの薬学』、第19版、マック出版社(Mack Publishing Co.) ペンシルバニア州イートン、1995年に見出され得る。
本明細書に記載されたプロテアーゼインヒビター化合物の1日約0.01〜約100 mg/kg体重、好ましくは1日約0.5〜約75 mg/kg体重の用量レベルがHCV仲介疾患の予防と治療の単独療法に有効である。典型的には、本発明の医薬組成物は、1日約1〜5回か又は連続注入として投与される。その投与は、慢性又は急性治療として使用し得る。単一剤形を与えるために担体材料と混ぜることができる有効成分の量は異なり、治療されるホスト又は具体的な投与方法に左右される。典型的な調合は、約5%〜約95%の活性化合物(w/w)を含有する。好ましくは、その調合は、約20%〜約80%の活性化合物を含有する。
当業者が理解するように、上記の量より少ない又は多い投与量を必要とすることができる。具体的な患者に対する個々の用量と治療法は、用いられる個々の化合物の活性、年齢、体重、全身状態、性別、食事、投与時間、排泄率、薬剤併用、感染症の重さと過程、感染症に対する患者の素質又は治療する医師の判断を含む様々な要因に左右される。一般に、治療はぺプチドpHの最適投与量よりかなり少ない少量で開始する。その後、状況下での最適効果が達成されるまで用量を少しずつ増加させる。一般には、悪いあるいは有害な副作用を引き起こさずに抗ウイルス的に有効な結果をたいてい与える濃度レベルで化合物を投与することが最も望ましい。
【００５２】
本発明の組成物が式Iの化合物と1種以上の追加の治療剤又は予防剤との組合わせを含む場合、化合物と追加剤双方は、単独治療法で通常とされる用量の約10〜100%、好ましくは約10〜80%の用量レベルで存在しなければならない。
これらの化合物又はその薬学的に許容しうる塩が薬学的に許容しうる担体と共に処方される場合、得られた組成物を人のような哺乳動物の生体内に投与してHCV NS3プロテアーゼを阻害することができ、HCVウイルス感染症を治療することもできる。本発明の化合物をα-、β-、又はγ-インターフェロンのような免疫調節剤; リバビリン、アマンタジンのような抗ウイルス剤; 他のHCV NS3プロテアーゼインヒビター; ヘリカーゼ、ポリメラーゼ、メタロプロテアーゼ、又は内部リボソームエントリー部位(IRES)のようなHCV生活環の他の標的の阻害剤; 又はその組合わせを含むがこれらに限定されない薬剤と組合わせて用いてその治療を達成することもできる。追加薬剤を本発明の化合物と組合わせて単一剤形をつくることもできる。また、これらの追加薬剤を多剤形の一部として哺乳動物に別々に投与することもできる。
従って、本発明の他の実施態様は、置換基が上で定義した通りである式Iの化合物を投与することによりHVC NS3プロテアーゼ活性を阻害する方法を提供するものである。
【００５３】
好適実施態様においては、これらの方法は、哺乳動物においてHCV NS3プロテアーゼ活性を低下させるのに有効である。医薬組成物が有効成分として本発明の化合物のみを含む場合には、その方法は、免疫調節剤、抗ウイルス剤、HCVプロテアーゼインヒビター、又はヘリカーゼ、ポリメラーゼ、又はメタロプロテアーゼのようなHCV生活環の他の標的の阻害剤より選ばれた薬剤を前記哺乳動物に投与する段階を更に含むことができる。そのような追加薬剤は、本発明の組成物の投与前に、同時に、又は投与後に哺乳動物に投与することができる。
他の好適実施態様においては、これらの方法は、哺乳動物においてウイルスの複製を阻害するのに有効である。その方法は、HCV疾患の治療又は予防に有効である。医薬組成物が有効成分として本発明の化合物のみを含む場合には、その方法は、免疫調節剤、抗ウイルス剤、HCVプロテアーゼインヒビター、又はHCV生活環の他の標的の阻害剤より選ばれた薬剤を前記哺乳動物に投与する段階を更に含むことができる。そのような追加薬剤は、本発明の組成物の投与前に、同時に、投与後に哺乳動物に投与することができる。
本明細書に示される化合物は、実験試薬として用いることもできる。出願人は、初めて、HCV NS3プロテアーゼに対して極めて活性かつ特異的である低分子量による化合物を提供する。本化合物の一部は、HCV疾患メカニズムの知識を更に高めるウイルス複製分析の設計、動物分析系の確証及び構造生物学研究の研究手段を与える際の手段であってもよい。
本発明の化合物は、また、材料のウイルス汚染を処理又は予防するので、そのような材料(例えば、血液、組織、手術用器具と衣料、実験器具と衣料、又は血液採取又は輸血の装置や材料)と接触する実験又は医療の人々又は患者のウイルス感染の危険を減じるために用いることができる。
【００５４】
方法
式Iの化合物の非環式中間体の合成を行ういくつかの方法が国際出願第00/09543号及び同第00/09558号に開示されている。
本発明の化合物は、スキームI、II及びIII(ここで、PGは適切な保護基である。)に示された一般工程に従って合成される。[下記に示されるすべてのスキームにおいて、D' はDと同じ定義をもつが2〜5原子短い。].
AがN-置換アミドである式Iの化合物を本発明が包含する場合、ビニルACCA又はホモアリルACCA (R1)はP2にカップリングする前に適切なアミンにカップリングする。そのカップリングは、当業者によって容易に認識される。当業者によって認識されるように、そのアミド(A)は保護されず、上で定義された適切な置換基R5をもっている。
閉環反応(大環状化)は、オレフィン複分解(スキームI)によって又はリンカーが窒素原子を有する場合、還元的アミノ化(スキームII)によって、又はぺプチド結合形成(スキームIII)によって行われる。
【００５５】
これらの工程の詳細を次に示す。
A.  オレフィン複分解による大環状化
スキーム I
【００５６】
【化３２】
0003754298.tif 000017
【００５７】
スキーム I:
当業者によって容易に認識され得るようにカップリング順序にはいくつかの方法がある。4-(S)-ヒドロキシプロリンから開始すると、大環状化の前又は後に4-ヒドロキシの置換基が光延反応によって組込まれる(Mitsunobu  Synthesis 1981, Jan., 1-28;   Ranoら Tet. Lett. 1994, 36, 3779-3792; Krchnakら Tet. Lett. 1995, 36, 6193-6196に記載されている)。また、国際出願第00/09543号 & 同第00/09558号の一般方法に開示されているように必要とされる4-(R)-ヒドロキシ置換プロリンによっても構築が行われ得る(これらの断片の個々の例については下記を参照されたい)。
工程A、B、C:  概要としては、P1、P2、及びP3部分は、周知のぺプチドカップリング法によって結合され得、国際出願第00/09543号 & 同第00/09558号に一般的に開示されている。
工程D: 大環状の形成は、Ru系触媒、例えば、Miller, S.J.; Blackwell, H.E.; Grubbs, R.H. J. Am. Chem. Soc. 1996, 118, 9606-9614 (a); Kingsbury, J.S.; Harrity, J.P.A.; Bonitatebus, P.J.; Hoveyda, A.H. J. Am. Chem. Soc. 1999, 121, 791-799 (b)及びHuang, J.; Stevens, E.D.; Nolan, S.P.; Petersen, J.L.; J. Am. Chem. Soc. 1999, 121, 2674-2678 (c)に報告されているものを用いてオレフィン複分解によって行われ得る。また、Moのような他の遷移金属をもつ触媒がこの反応に使用し得ることも認識される。
【００５８】
【化３３】
0003754298.tif 000018
【００５９】
工程E: 任意により、周知の標準水素添加法によって二重結合が還元される。A'が保護カルボン酸である場合、適当に脱保護される。
B.  還元的アミノ化(Nを含むリンカーの場合)
リンカーが窒素原子を含む場合、一般構造IIの阻害剤を得るためにスキームIIに示される還元的アミノ化によって大環状化が達成される。
スキーム II
【００６０】
【化３４】
0003754298.tif 000019
【００６１】
工程 A: ブラウンの方法(H.C. Brown & B.C. Subba Rao, J. Am. Che. Soc. 1959, 81, 6434-6437)よる二重結合のハイドロボレーションに続いて得られたアルコールの酸化(例えば、デス・マルチンペリオジネートによる, J. Am. Chem. Soc. 1991, 113, 7277-7287)により対応するアルデヒドが得られる。
工程 B: 酸の存在下に水素添加することにより、アミノ保護基が除去され、次に還元的アミノ化によって大環状化される。
この合成に用いられるP3単位は、リシン、オルニチン、グルタミン(ホフマン反応後: Ber. 1881, 14, 2725)のような様々なアミノ酸等から容易に得られ、これらの合成の変更は当該技術において周知の方法である。
工程 C: 任意により、リンカーDの第二級アミン(工程D後に形成された)は、当該技術において周知の方法を用いてアルキルハライドでアルキル化されるか又はアルキル又はアリール酸クロリドでアセチル化されて一般構造IIの阻害剤を得る。A'が保護カルボン酸である場合、適切に脱保護される。
C.  ラクタム形成による大環状化
また、一般構造I及びIIを有するこれらの大環状化合物は、他の方法で合成し得る。例えば、P1及びP3は、まず、リンカーDに結合され得、次に、P2にカップリングされ、大環状化は、当業者によって認識され下記スキームIIIに示される2つの可能な方法でラクタム形成され得る。
スキーム III
【００６２】
【化３５】
0003754298.tif 000020
【００６３】
P1の合成
一般構造I及びIIを有する阻害剤の合成には同じP1断片を必要とする。
a) ビニルACCA、その合成及び分割は国際出願第00/09543号 & 同第00/09558号に記載されている、又は
b) ホモアリルACCA (実施例1、化合物1f).
P2の合成
式Iの化合物の合成に用いられるP2断片の一部は国際出願第00/09543号 & 同第00/09558号に記載されている。
他のP2断片は次のように合成される。
a.  2-『Het』- 4-ヒドロキシ-7-メトキシキノリン誘導体の合成
(i)  対応する『Het』カルボン酸IVbからの方法
スキームIV
【００６４】
【化３６】
0003754298.tif 000021
【００６５】
Liら J. Med. Chem. 1994, 34, 3400-3407の方法を変更して合成が行われる。R21 = OMeである中間体IVa(実施例7、化合物7b)はBrownら J. Med. Chem. 1989, 32, 807-826に記載されているように調製される。
工程 A: 中間体IVaはPOCl3と共に塩基性条件下で複素環式カルボン酸IVbとカップリングしてカルボキシレート基を活性化する。一般構造IVbを有する様々なカルボン酸が阻害剤の調製に用いられる。これらは、市販され、スキームV、VI及びVIIに示されるように合成もされ、個々の実施例に記載される方法を用いて別個に合成もされる。
工程 B: 閉環、続いて脱水は塩基性条件下で達成され、一般構造IVdのキノリンが得られる。
(i.a).  一般式IVbの『Het』カルボン酸の合成
2-(置換)-アミノ-4-カルボキシアミノチアゾール誘導体(Vc)の合成
Berdikhinaら Chem. Heterocycl. Compd. (Engl. Transl.) 1991, 4, 427-433に記載されている方法が変更して用いられる。
スキームV
【００６６】
【化３７】
0003754298.tif 000022
【００６７】
異なるアルキル置換基を有するチオウレア(Va)(R25=アルキル基)と3-ブロモピルビン酸を用いたスキームVに示される一般合成法を用いて様々な2-アルキルアミノチアゾリル-4-カルボン酸、一般構造Vcの化合物がつくられる。
また、2-アミノ置換チアゾール誘導体を有するP2断片も対応2-カルボキシル誘導体からUnangst, P.C.; Connor, D.T. J. Heterocyc. Chem. 29, 5, 1992, 1097-1100の手順に従ってスキームVIに示されるように合成される。
スキームVI
【００６８】
【化３８】
0003754298.tif 000023
【００６９】
この方法の例は、国際出願第00/09543号 & 同第00/09558号に開示されている。
2-カルボキシ-4-置換アミノチアゾール誘導体VIId
スキームVIIに示される一般合成法を用いて様々な4-アルキルチアゾリル-2-カルボン酸、一般構造VIIdの化合物がつくられる。
スキームVII
【００７０】
【化３９】
0003754298.tif 000024
【００７１】
Januszら J. Med. Chem. 1998, 41, 3515-3529に記載されている方法が次のように変更して用いられる。エチルチオオキサメート(VIIa)と一般構造VIIb(R24=アルキル基)のβ-ブロモケトンと反応させて一般構造VIIdのチアゾリルカルボン酸を形成させる。このタイプの縮合反応は当該技術において周知である。
2-カルボキシ(置換)イミダゾール誘導体(VIIIb)の合成
スキームVIIIに示される一般合成法を用いて様々なアルキルイミダゾリル-2-カルボン酸、一般構造VIIIbがつくられる。
スキームVIII
【００７２】
【化４０】
0003754298.tif 000025
【００７３】
Bairdら J. Amer. Chem. Soc. 1996, 118, 6141-6146に記載されている手順を用いた。アルキルイミダゾールを強塩基(例えば、nBuLi)で脱プロトンしてからCO2と反応させてカルボン酸VIIIbを形成する。このタイプの縮合反応は当該技術において周知である。
b.  4-ヒドロキシ-7-メトキシ-2-(イミダゾリル又はピラゾリル)キノリンの合成
スキームIXに示される方法を用いてC2にイミダゾリル又はピラゾリル部分を有する4-ヒドロキシ-7-R21キノリンが一般的に調製される。
スキームIX
【００７４】
【化４１】
0003754298.tif 000026
【００７５】
重要な中間体(ここで、R21 = OMe) 4-ベンジルオキシ-2-クロロ-7-メトキシキノリンIXaの合成は、実施例6 (化合物6e)に詳細に記載されている。
工程 A: 化合物IXaの2-クロロ部分を置き換えて一般構造IXbの化合物を得るために、高温において種々のイミダゾール、アルキル置換イミダゾール、ピラゾール又はアルキル置換ピラゾールが使用され得る。
工程 B: キノリンの4-ヒドロキシ部分からベンジル保護基を除去する際に、一般構造IXcのキノリン誘導体が得られる。
P3の合成
オレフィン複分解によって大環状化に適切なDリンカー伸長を有する様々なP3断片が合成される。一般的には、複分解の末端オレフィンを有するP3単位が下記に示される一般スキーム(スキーム X、XI & XII)に従って合成される。
クラスAにおけるリンカーの合成
この一般合成は、すべて炭素に基づく(ヘテロ原子のない)リンカーをつくるために用いられる (スキーム X).
スキームX
【００７６】
【化４２】
0003754298.tif 000027
【００７７】
合成は、Evansら J. Am. Chem. Soc. 1990, 112, 4011-4030の手順に従って行われる。
出発カルボン酸(Xa)は、市販され、当業者によく知られた既知の文献方法によっても調製される。
工程 A: カルボン酸Xaを塩化ピバロイルで活性化し、次に周知の化学に従ってエバンスのキラル補助アニオン4(S)-4-(フェニルメチル)-2-オキサゾリジノンと反応させ(総説: D.J. Agerら Aldrichimica Acta 1997, 30, 3-11、及びその中の参考文献)て一般構造Xbの化合物を得る。
工程 B: キラルイミドエノレートのトリジルアジドによる立体選択的α-アジ化、例えば、一般構造Xbを有する化合物からKHMDSのような塩基の存在下に形成されるものは当該技術において周知である(総説: D.J. Agerら Aldrichimica Acta 1997, 30, 3-11、及びその中の参考文献)。
工程 C: SnCl2が触媒するα-アジドの還元に続いてt-ブチルカルバメートとして形成されたアミンを保護して一般構造Xcの中間体が得られる。これらの反応も当該技術において周知である。
工程 D: 最後に、キラル補助物質をH2O2とLiOHとの混合物のような塩基性条件下で加水分解して一般構造Xeのアミノ酸型リンカーを製造する。
また、同じ一般構造Xeを有するP3部分は、スキームXIに示されるM.J. Burkら J. Am. Chem. Soc 1998, 120, 657-663に記載されている手順に従って合成される。これらの化合物は、リンカーのメチレン単位(-CH2-)の数(m=1〜5)及びR4のアルキル基の置換で変動したが、ヘテロ原子を含まなかった。
スキームXI
【００７８】
【化４３】
0003754298.tif 000028
【００７９】
工程 A: モノ酸化合物XIbは、市販のジエチル2-アセトアミドマロナートから塩基性条件下で標準エステル加水分解により調製される。
工程 B: 塩基、例えば、ピリジンと酢酸無水物の存在下に一般構造XIcのアルデヒドと化合物XIb間のクネベナゲル型縮合により、図示されたように新たに形成された二重結合にZ立体化学を有するエナミド中間体XIdが形成される。
工程 C: エナミド中間体XIdのアミノ酸中間体XIeへの位置選択的かつエナンチオ選択的接触水素添加は、バーク(Burk)法を用いて達成される。
工程 D: 次に、t-ブチルカルバメート置換基を付加してアセトアミド誘導体XIeの窒素が二保護された後、そのアセテート基、及びエチルエステルが標準塩基性条件下で加水分解されて一般構造XIfのP3部分を得る。
【００８０】
クラスBにおけるリンカーの合成
【００８１】
【化４４】
0003754298.tif 000029
【００８２】
この一般合成は、酸素又はイオウを有するリンカーをつくるために用いられる。
スキームXII
【００８３】
【化４５】
0003754298.tif 000030
【００８４】
工程 A: 適切に保護されたアミノ酸、例えば、Boc-(L)-セリンメチルエステル、Boc-(L)-トレオニンメチルエステル又はBoc-(L)-アロトレオニンメチルエステルをAg2Oの存在下にヨウ化アリルでアルキル化してメチルエステルXIIbを得る。
工程 B: メチルエステルを標準塩基性条件下に加水分解すると一般構造XIIc (X=O)のエーテル型リンカーが得られる。
工程 C: イオウ類縁体は同じ出発アミノ酸XIIa (前のように適切に保護された)から調製され、そのヒドロキシ基は当該技術にいて周知の標準法を用いて良好な脱離基(例えば、トシレート中間体XIId)に変換される。
工程 D: 引き続き、トシル部分をチオアセテートアニオンで置換することにより、β-炭素のキラル中心の転化によりチオエステル中間体XIIeが形成される。
工程 E: 弱い塩基性条件下でチオエステル部分を加水分解すると遊離チオールXIIfが得られる。
工程 F: チオール部分のアルキル化はヨウ化アリルを用いて塩基性条件下で容易に達成される。
工程 G: 最後に、メチルエステルを標準手順を用いて加水分解した後にスルフィド類縁体XIIc (X=S)が得られる。
R3断片の合成:
R3がNH-R31 である断片の合成例は、国際出願第00/09543号に開示されている。
【００８５】
実施例
本発明を、次の限定されない例によって更に具体的に説明する。合成又は分割の他の個々の例は、国際出願第00/09543号及び同第00/09558号に見出される。
温度は摂氏度で示す。特にことわらない限り、溶液％は重量/容量の関係を表し、溶液比は容量/容量の関係を表す。核磁気共鳴(NMR)スペクトルは、ブルカー (Bruker)400 MHz分光計で記録した。ケミカルシフト(δ)は、特にことわらない限り、百万分の1部で記録され、内部重水素化溶媒を基準とする。すべての最終化合物(阻害剤)のNMRスペクトルは、特にことわらない限りTFA塩のDMSO-d6で記録した。フラッシュカラムクロマトグラフィーは、スチルのフラッシュクロマトグラフィー法(W.C. Stillら, J. Org. Chem., 1978, 43, 2923)に従ってシリカゲル(SiO2)について行った。
【００８６】
実施例に用いられる略語としては、Bn: ベンジル; Boc: tert-ブチルオキシカルボニル [Me3COC(O)]; BSA: ウシ血清アルブミン; Cbz: ベンジルオキシカルボニル; CHAPS: 3-[(3-コールアミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-1-プロパンスルホネート; DBU: 1,8-ジアザビシクロ[5.4.0]ウンデカ-7-エン; CH2Cl2= DCM: エンカメチレン; DEAD: ジエチルアゾジカルボキシレート; DIAD: ジイソプロピルアゾジカルボキシレート; DIPEA: ジイソプロピルエチルアミン; DMAP: ジメチルアミノピリジン; DCC: 1,3-ジシクロヘキシルカルボジイミド; DME: 1,2-ジメチオキシエタン; DMF: ジメチルホルムアミド; DMSO: ジメチルスルホキシド; DTT: ジチオトレイトール又はトレオ-1,4-ジメルカプト-2,3-ブタンジオール; DPPA: ジフェニルホスホリルアジド; EDTA: エチレンジアミン四酢酸; Et: エチル; EtOH: エタノール; EtOAc: 酢酸エチル; Et2O: ジエチルエーテル; ESMS: エレクトロスプレーマススペクトロメトリー; HATU: O-(7-アザベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート;  HPLC: 高性能液体クロマトグラフィー; MS: 質量分析; MALDI-TOF: マトリックス援助レーザー脱着イオン化-飛行時間; FAB: 高速原子衝撃; LAH: 水素化アルミニウムリチウム; Me: メチル; MeOH: メタノール; MES: (2-[N-モルホリノ]エタンスルホン酸); NaHMDS: ナトリウムビス(トリメチルシリル)アミド; NMM: N-メチルモルホリン; NMMO: N-メチルモルホリンオキシド; NMP: N-メチルピロリジン; Pr: プロピル; Succ: 3-カルボキシプロパノイル; PNA: 4-ノトロフェニルアミノ又はp-ニトロアニリド; TBAF: テトラ-n-ブチルアンモニウムフルオリド; TBME: tert-ブチルメチルエーテル; tBuOK: カリウムtert-ブトキシド; TBTU: 2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート; TCEP: トリス(2-カルボキシエトル)ホスフィン塩酸塩; TFA: トリフルオロ酢酸; THF: テトラヒドロフラン; TIS: トリイソプロピルシラン; TLC: 薄層クロマトグラフィー; TMSE: トリメチルシリルエチル; トリス/HCl: トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン塩酸塩が含まれる。
【００８７】
P1部分
実施例  1
t-ブチル-(1R,2R)/(1S,2S)-1-アミノ-2-ホモアリルシクロプロピルカルボキシレート(1f)の合成:
【００８８】
【化４６】
0003754298.tif 000031
【００８９】
A.  50% NaOH水溶液 (50 ml)中のベンジルトリエチルアンモニウムクロリド(5.08 g、22.3ミリモル)の懸濁液に1,2-ジブロモ-5-ヘキセン(1b、8.10 g、33.46ミリモル)とジ-t-ブチルマロネート(1a、4.82 g、22.30ミリモル)を連続して添加した。混合液をRTで16時間激しく撹拌してから、H2Oで希釈し、CH2Cl2 (3×50 ml)で抽出した。有機層をH2O (2×50 ml)、食塩水/H2O (2/1、2×50 ml)で更に洗浄し、MgSO4で乾燥し、蒸発させた。粗残留物を溶離剤としてヘキサン中3〜5% EtOAcを用いてシリカゲルによるフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製して化合物1cを38% の収率(2.48 g)で得た。
1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 1.19 (bd, J = 7.9 Hz, 2H), 1.25-1.33 (m, 1H), 1.46 (s, 9H), 1.48 (s, 9H), 1.47-1.60 (m, 1H), 1.75-1.82 (m, 1H), 2.14-2.22 (m, 2H), 4.93-5.50 (m, 2H), 4.96 (dm, J = 10.2 Hz, 1H), 5.18 (dm, J = 17.2 Hz, 1H).  ES(+)MS m/z 297 (M+H)+.
【００９０】
B.  0°において無水ジエチルエーテル(150 ml)中のカリウムt-ブトキシド(5.75 g、51.25ミリモル)の懸濁液にH2Oを添加(203μl、11.27ミリモル)し、反応混合液を0°で10分間撹拌した。化合物1c (2.48 g、10 mlのジエチルエーテル中、10.25ミリモル)のエーテル溶液を添加し、混合液をRTで5時間撹拌した。混合液を氷冷H2Oで希釈し、ジエチルエーテル(3×200 ml)で抽出した。水層を10% クエン酸水溶液でpＨ3.5〜4まで酸性し、EtOAc (3×200 ml)で再抽出した。EtOAc層をH2O (2×100 ml)、食塩水(100 ml)で洗浄し、MgSO4で乾燥し、蒸発させて化合物1dを回収出発物質の量に基づいて85% の収率で得た。
1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ1.51 (s, 9H), 1.64-1.68 (m, 1H), 1.68-1.75 (m, 1H), 1.77-1.88 (m, 1H), 1.96-2.01 (m, 1H), 2.03-2.22 (m, 3H), 5.01 (dm, J = 6.4 Hz, 1H), 5.03 (dm, J = 14.9 Hz, 1H), 5.72-5.83 (m, 1H).
ES(+)MS: m/z 241 (M+H)+.
【００９１】
C.  無水ベンゼン(1.14 g、25 mlベンゼン中、4.74ミリモル)中の酸1dの溶液に、Et3N (800μl、5.68ミリモル)、次に、ジフェニルホスホリルアジド(1.13 ml、5.21ミリモル)を添加し、混合液を3.5時間加熱還流した。続いて、トリメチルシリルエタノール(1.36 ml、9.48ミリモル)を添加し、還流下での撹拌を更に4時間続けた。次に、混合液をRTまで冷却し、最初の量の半分まで蒸発させ、ジエチルエーテル(30 ml)で希釈し、5% NaHCO3水溶液(2×30 ml)、食塩水(50 ml)で洗浄し、MgSO4で乾燥し、蒸発させた。残留油を溶離剤としてヘキサン中10% EtOAcを用いてシリカゲルによりクロマトグラフィー処理して純粋な化合物1eを88% の収率(1.49 g)で得た。
1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ0.03 (s, 9H), 0.91-0.99 (m, 2H), 1.18-1.29 (m, 2H), 1.45 (bs, 11H), 1.56-1.72 (m, 2H), 2.02-2.18 (m, 2H), 4.12 (t, J = 8.3 Hz, 2H), 4.93 (dm, J = 10.2 Hz, 1H), 4.98 (dm, J = 17.2 Hz, 1H), 5.07 (bs, 1H), 5.71-5.83 (m, 1H).
D.  シクロプロピル誘導体1e (1.19 g、3.35ミリモル、30 ml THF中)の溶液にt-Bu4NF (6.7 ml、THF中1M、6.7ミリモル)を添加し、混合液をまずRTで16時間撹拌し、次に15分間加熱還流した。溶媒を低圧で注意して蒸発させた(遊離アミン1fの揮発性が高いため、溶媒蒸発中は注意を払わなければならない。)。粗残留物をEtOAc (100 ml)に再溶解し、H2O (2×50ml)、食塩水(50ml)で洗浄し、MgSO4で乾燥し、再び溶媒を注意して蒸発させた。粗生成物1f (2つのエナンチオマー1f′と1f″の混合物として)を精製せずにP2プロリン誘導体とのカップリングに用いた。P1に所望の立体化学を有するP1P2断片の分離は、フラッシュクロマトグラフィーを用いてこの段階で容易に達成された(実施例21、断片21b)。
【００９２】
P2部分
実施例  2
Boc-4(R)-[(7-メトキシ-4-キノリニル)オキシ]プロリン(2c)の合成:
【００９３】
【化４７】
0003754298.tif 000032
【００９４】
4-ヒドロキシ-7-メトキシキノリン(2b)を、Chun, M.W.; Olmstead, K.K.; Choi, Y.S.; Lee, C.O.; Lee, C.-K.; Kim, J.H.; Lee, J. Bioorg. Med. Chem. Lett. 1997, 7, 789に記載された方法に従って調製した。無水THF中化合物2b (1.88 g、10.73ミリモル)とDEAD (3.4 ml、21.46ミリモル)の溶液を、N2下0°における無水THF (160 ml)中の保護cis-ヒドロキシプロリン2a (2.63 g、10.73ミリモル)とトリフェニルホスフィン(5.63 g、21.46ミリモル)の撹拌溶液に添加した。 反応混合液をRTまで温め、14時間撹拌した。次に、THFを蒸発させ、溶離剤としてEtOAc中5% MeOHを用いてフラッシュカラムクロマトグラフィー処理した後純粋な生成物2cを35% の収率(1.5 g)で分離した。
1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ1.44 (s, 9H), 1.65 (bs, 1H), 2.34-2.43 (m, 1H), 2.63-2.76 (m, 1H), 3.78 (s, 3H), 3.75-3.85 & 3.89-3.99 (2m, 1H, 2回転異性体), 3.95 (s, 3H), 4.51 & 4.60 (2t, J = 8 Hz, 1H, 2回転異性体), 5.15 (bs, 1H), 6.53-6.59 (m, 1H), 7.12-7.18 (dd, J = 8.9 & 2.2 Hz, 1H), 7.36 (d, J = 2.6 Hz, 1H), 8.03 (bd, J = 9.2 Hz, 1H), 8.65 (bd, J = 5.1 Hz, 1H).
【００９５】
実施例  3
2-エトキシ-4-ヒドロキシ-7-メトキシキノリン(3c)の合成
【００９６】
【化４８】
0003754298.tif 000033
【００９７】
メチル-p-メトキシアントラニレート3aの合成をKatzらJ. Org. Chem., 1953, 18, 1380-1400に記載されているように行った。
キノリン誘導体3cの一般合成は、BaccarらIndian Journal of Chemistry, 1995, Sat. B, 330-332の方法の変法である。
A.  メチル-p-メトキシアントラニレート3a (3.069 g、16.96ミリモル)をトリエチルオルトアセテート(4.7 ml、25.4ミリモル)に溶解し、無水HCl (4 N/ジオキサン、50μl、0.6ミリモル)の溶液を添加した。得られた混合液を19時間加熱還流した。次に、減圧下で揮発分を蒸発させて生成物3b (4.92 g、黄色油、定量的収量)を得、そのままで次の工程に用いた。
B.  窒素下-78℃におけるTHF (34 ml)中の基質3b (推測値16.96ミリモル)にLiHMDS (1 M/THF、22 ml、1.3 eq.)を添加した。添加したすぐ後に低温浴を除去し、混合液を周囲温度で1時間撹拌し、その後に別の部分のLiHMDS (16 ml)を添加した。得られた混合液を、TLC (100% EtOAc、イミデートRf = 0.7、生成物Rf = 0.2)で出発物質が完全に消失するまで(1時間)撹拌した。次に、HCl (4 N/ジオキサン、10 ml)を添加し、混合液を減圧下で濃縮した。得られたペーストをEtOAc (10 ml)とNaH2PO4 (1 M、10 ml)水溶液の混合液から摩砕し、音波処理した。豊富な沈殿が生じ、ろ過で集め、水洗し、乾燥して所望の生成物3cをベージュ色の固形物(3.117 g、2 工程の場合84% 、HPLCで純度>99% )として得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d) δ(ppm): 7.88 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 6.98 (br. s, 1H), 6.89 (br. d, J = 8.6 Hz, 1H), 5.94 (br. s, 1H), 4.30 (br. s, 2H), 3.84 (s, 3H), 1.34 (t, J = 7.0 Hz, 3H).
【００９８】
実施例  4
4-ヒドロキシ-7-メトキシ-2(3-メチル-1,2,4-オキサジアゾール-5-イル)キノリン(4d)の合成
【００９９】
【化４９】
0003754298.tif 000034
【０１００】
A.  窒素下のDMF (10 ml)中の2-カルボメトキシ-4-ヒドロキシ-7-メトキシキノリン4a (調製は国際出願第00/09543号及び同第00/09558号に記載されている) (1 g、4.29ミリモル)の溶液にNaH (鉱油中60%、190 mg、4.98ミリモル)を添加した。得られた混合液を周囲温度で1時間撹拌し、次にMEMクロリド(455μl、4.98ミリモル)を滴下し、得られた混合液を周囲温度で更に19.5時間撹拌した。反応混合液をEtOAc (100 ml)で希釈し、H2O (50 ml)、食塩水(50 ml)で洗浄し、MgSO4で乾燥し、減圧下で濃縮して粗反応分離物(1.37 g)を得た。後者をフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製して生成物4b (1.04 g、75% の収率)を無色の油状物として得た。
B.  新たに活性化した4オングストロームモレキュラーシーブ(500 mg)とアセトアミドオキシム(248 mg、3.35ミリモル)の混合物にTHF (3ml)を添加した。得られた混合液を窒素下周囲温度で15分間撹拌してから、NaH (鉱油中60% 、124 mg、3.24ミリモル)を少しずつ添加した。得られた懸濁液を周囲温度で1時間撹拌してから、エステル4b (500 mg、1.56ミリモル)をTHF (5 ml)中の溶液として添加した。得られた混合液を1時間 加熱還流してから、シーライトでろ過し、EtOAc (20 mlずつで3回)ですすぎ、減圧下で濃縮した。得られた粗混合液をフラッシュカラムクロマトグラフィー(100% EtOAc)で精製して生成物4c (352 mg、65% の収率)を白色固形物として得た。
C.  THF (4 ml)中のMEMエーテル4c (170 mg、0.493ミリモル)にHCl水溶液(1 N、1 ml)を添加した。得られた混合液を周囲温度で1時間撹拌してから、NaH2PO4水溶液(1 M、50 ml)で希釈した。生成した固形物をろ過し、EtOAcで摩砕し、ろ過し、乾燥して所望の生成物(4d) (90 mg、収率71%)を白色固形物として得た。  MS (ES+) 258 (M+1), (ES-) 256 (M-1).
1H NMR (400 MHz, DMSO-d) δ(ppm): 8.03 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 7.38 (d, J = 2.2 Hz, 1H), 7.06 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 6.85 (br. s, 1H), 3.88 (s, 3H), 2.64 (s, 3H).
【０１０１】
実施例  5
4-ヒドロキシ-7-メトキシ-2(5-メチル-1,3,4-オキサジアゾール-2-イル)キノリン(5e)の合成
【０１０２】
【化５０】
0003754298.tif 000035
【０１０３】
A.  エタノール(5 ml)中の基質4b (465 mg、1.45ミリモル)に無水ヒドラジン(57μl、1.8 mmoL)を添加した。得られた溶液を4時間加熱還流してから、減圧下で濃縮して生成物5a (704 mg、定量的粗収量)を黄色固形物として得、そのままで次の工程に用いた。
B.  トリエチルオルトアセテート(5 ml)中の化合物5a (推測値1.45ミリモル)を窒素下100-110℃で加熱した。次に、得られた混合液をEtOAc (100 ml)で希釈し、NaHCO3飽和水溶液(50 ml)、食塩水(50 ml)で洗浄し、MgSO4で乾燥し、減圧下で濃縮し、フラッシュカラムクロマトグラフィー(100% EtOAc)で精製した。化合物5b (359 mg、61% 2工程の場合の収率)を黄色油状物として得た。 MS (ES+) 392 (m+1), (ES-) 390 (m-1).
C.  化合物5b (333 mg、0.852ミリモル)を高真空中140℃で8.5時間化合物熱し、フラッシュカラムクロマトグラフィー(100% EtOAc)で精製して5b (116 mg、35%、Rf 0.5)と化合物5c (138 mg、補正した収率72% 、Rf 0.3)の混合物を得た。化合物5c (138 mg、0.4ミリモル)のTHF (4 ml)溶液にHCl水溶液(1 N、1 ml)を添加し、得られた混合液を完結するまで(30 min.)撹拌した。THFを減圧下で蒸発させ、NaH2PO4水溶液(1 M、2 ml)を添加した。得られた懸濁液を音波処理し、ろ過し、固形物を高真空中で乾燥して所望の生成物5d(75 mg、収率73%)をベージュ色の固形物として得た。  MS (ES+) 258 (m+1), (ES-) 256 (m-1). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d):  δ8.03 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 7.39 (d, J = 2.2 Hz, 1H), 7.06 (br. d, J = 8.6 Hz, 1H), 6.85 (br. s, 1H), 3.88 (s, 3H), 2.64 (s, 3H).
【０１０４】
実施例  6
4-ベンジルオキシ-2-(クロロ)-7-メトキシキノリン(6e)の合成
【０１０５】
【化５１】
0003754298.tif 000036
【０１０６】
A.  ジオキサン(80 ml)中の市販のMeta-アニシジン(25 g、0.20 mol)を0℃まで冷却し、HCl水溶液(4 N/ジオキサン、75 ml、0.30モル)を添加した。次に、Et2O (500 ml)を添加し、撹拌を1時間続けた。次に、ベージュ色の固形物をろ過し、減圧下で乾燥して塩6a (31.88 g、収率98%)を得た。
B.  この塩にエチルシアノアセテート(21.3 ml、0.20 mol)を添加し、蒸留ヘッドと収集フラスコを備えたフラスコ中の混合液を280〜300℃まで加熱した。生成したエタノールを集めて反応の発生をモニターした。集めたエタノールが9 ml(理論量11.7 ml)の所で加熱を止め、反応混合液をRTまで下げ、水(200 ml) - EtOAc (200 ml)で希釈してから撹拌し、NaH2PO4 (300 ml)水溶液を添加した。撹拌を更に1時間、ろ過及び乾燥した後、6b(19.06 g、純度84.5%、収率〜50% )を黄色固形物として得、そのままで次の反応に用いた。
【０１０７】
C.  0℃においてDMF (100 ml)中の化合物6b (11.0 g、57.8ミリモル)をNaH (鉱油中60%、2.78 g、115.6ミリモル)に添加した。次に、氷浴を除去し、混合液を周囲温度で1時間撹拌し、次に臭化ベンジル(7.6 ml、63.6ミリモル)を添加し、反応混合液を16時間撹拌した。次に、この溶液をEtOAc (220 ml)-ヘキサン(220 ml)で希釈し、生成した固形物をろ過し、NaHCO3飽和水溶液(110 ml)で摩砕し、水、ヘキサン-EtOAc (1:1比、100 ml)で洗浄し、高真空中で乾燥した。このようにして生成物6c (5.6 g、純度91%、収率35%)を黄色固形物として得た。
酢酸(21 ml)中の化合物6c (2.67 g、9.52ミリモル)に亜硝酸イソアミル(3.8 ml、28.6ミリモル)を添加し、得られた混合液を周囲温度で撹拌し、HPLCでモニターした。2時間後に亜硝酸イソアミル(1.3 ml、9.52ミリモル)を更に添加し、混合液を 90時間以上(HPLC生成物81%、基質3% )撹拌した。得られた懸濁液に水(100 ml)を添加してからろ過した。集めた褐色固形物を高真空中で乾燥し、生成物6d (2.35 g、純度92%、収率72% )を得た。
D.  化合物6d (1.5 g、4.39ミリモル)にオキシ塩化リン(13 ml、141ミリモル)を添加し、得られた混合液を1時間加熱還流してから、EtOAc (150 ml)で希釈し、0℃においてNaOH水溶液(1 N、150 ml)でpＨ9まで徐々に冷却した。2層を分離し、有機層をMgSO4で乾燥し、減圧下で濃縮して褐色固形物を得、これをフラッシュカラムクロマトグラフィー(15 % EtOAc/ヘキサン)で精製した。生成物6e (819 mg純度 > 99%、収率62% )を黄色固形物として得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ8.07 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 7.50-7.40 (m, 5H), 7.29 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 7.12 (dd, J = 9.2, 2.5 Hz, 1H), 6.73 (s, 1H), 5.26 (s, 2H), 3.92 (s, 3H).
【０１０８】
実施例  7
4-ヒドロキシ-2-(1-イミダゾリル)-7-メトキシキノリン(7b); 4-ヒドロキシ-2-(4-メチル-1-イミダゾリル)-7-メトキシキノリン(7d); 4-ヒドロキシ-7-メトキシ-2-(1-ピラゾリル)キノリン(7f); 及び4-ヒドロキシ-2-(3-メチル-1-ピラゾリル)-7-メトキシキノリン(7h)の合成
【０１０９】
【化５２】
0003754298.tif 000037
【０１１０】
A.  化合物6e (423 mg、1.41ミリモル)とイミダゾール(400 mg、5.88ミリモル)を110℃で20時間加熱した。次に、混合液をEtOAcで希釈し、水及び食塩水で洗浄し、MgSO4で乾燥し、減圧下で濃縮して化合物7a (422 mg、純度96%、収率90%)を黄色固形物として得た。エタノール(5 ml)とTHF (5 ml)の混合液中の化合物7a (319 mg、0.963ミリモル)とPd (5%/C、64 mg)とをパージし、1気圧の水素下に置いた。周囲温度で7.5時間後、反応混合液をろ過し、クロロホルム-メタノール混合液ですすぎ、濃縮して7b (130 mg、純度97.7%、収率56%)を黄色固形物として得た。  MS (ES+) 242 (m+1), (ES-) 240 (m-1).
1H NMR (400 MHz, DMSO-d): δ8.51 (s, 1H), 8.03 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 7.93 (s, 1H), 7.23 (d, J = 1.9 Hz, 1H), 7.15 (s, 1H), 7.12 (dd, J = 9.2, 2.2 Hz, 1H), 6.92 (br. s, 1H), 3.91 (s, 3H).
【０１１１】
B.  化合物6e (251 mg、0.837ミリモル)と4-メチルイミダゾール(344 mg、4.19ミリモル)を110℃で20時間加熱した。次に、混合液をEtOAcで希釈し、水及び食塩水で洗浄し、MgSO4で乾燥し、減圧下で濃縮して4-メチルイミダゾリルと5-メチルイミダゾリル異性体のそれぞれ10:1の混合物を有する粗製物を得た。推測した所望の主異性体、白色固形物(166 mg、純度99%、収率57%)を4-及び5-メチルイミダゾリル異性体の混合物を有する極性の大きい方の第2画分(76 mg、収率23%)からフラッシュカラムクロマトグラフィー(100% EtOAc)により分離した。エタノール(2.4 ml)とTHF (5 ml)の混合液中の化合物7c (163 mg、0.472ミリモル)とPd (5%/C、33 mg)とをパージし、1気圧の水素下に置いた。周囲温度で18時間撹拌した後、反応混合液をろ過し、クロロホルム-メタノール混合液ですすぎ、濃縮して7d (118 mg、純度99%、収率98%)を白色固形物として得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d): δ8.42 (br. s, 1H), 8.01 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 7.64 (br. s, 1H), 7.21 (br. s, 1H), 7.10 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 6.89 (br. s, 1H), 3.90 (s, 3H), 2.20 (s, 3H).
【０１１２】
C.  化合物6e (184 mg、0.614ミリモル)とピラゾール(209 mg、3.07ミリモル)を110℃で17時間加熱した。次に、混合液をEtOAcで希釈し、NaOH水溶液(1 N)及び食塩水で洗浄し、MgSO4で乾燥し、減圧下で濃縮して粗生成物を得、これをフラッシュカラムクロマトグラフィー(2 : 1のヘキサン-EtOAc)で精製して7e (103 mg、収率50%)を薄黄色固形物として得た。エタノール(2 ml)とTHF (2 ml)の混合液中の化合物7e (103 mg、0.311ミリモル)とPd (5%/C、20 mg)とをパージし、1気圧の水素下に置いた。周囲温度で5.5時間撹拌した後、反応混合液をろ過し、クロロホルム-メタノール混合液ですすぎ、濃縮して7f (77 mg、純度99%、収率99%)を黄色固形物として得た。  MS (ES+) 242 (m+1), (ES-) 240 (m-1).
1H NMR (400 MHz, DMSO-d): δ8.72 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 8.31 (s, 1H), 8.00 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 7.83 (br. s, 1H), 7.43 (br. s, 1H), 7.24 (br. s, 1H), 7.10 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 6.59 (br. s, 1H), 3.90 (s, 3H).
D.  化合物6e (217 mg、0.724ミリモル)と4-メチルピラゾール(594 mg、7.24ミリモル)を110℃で23時間加熱した。次に、脱ベンジル化合物7hとベンジル化生成物7gの1:1混合物を示す混合液をEtOAc (2〜3 ml)で希釈し、ろ過して純粋な脱ベンジル化生成物7h (111 mg、純度95%、収率54%)を白色固形物として得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d): δ8.58 (d, J = 2.6 Hz, 1H), 7.98 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 7.25 (br. s, 1H), 7.20 (s, 1H), 7.04 (br. d, J = 9.2 Hz, 1H), 6.38 (s, 1H), 3.89 (s, 3H), 2.30 (s, 3H).
【０１１３】
実施例  8
4-ヒドロキシ-7-メトキシ-2[4(2-イソプロピルアミノチアゾリル)]キノリン(8f)の合成
注: [化合物8bが他のアルキルチオウレアで置き換えられる同じ合成スキームを用いて種々の2-アルキルアミノチアゾリル置換基をつくった。]
【０１１４】
【化５３】
0003754298.tif 000038
【０１１５】
A.  m-アニシジンの8aへの変換に用いられるプロトコールは、 文献: F.J. BrownらJ. Med. Chem. 1989, 32 , 807-826に記載されているものと同じにした。しかしながら、精製手順を変更してクロマトグラフィーによる精製を回避した。所望の生成物を含有するEtOAc相をMgSO4、木炭及び5% w/w(予想質量に基づく)シリカゲルの混合物で処理した。シーライトによるろ過後、生成物をエーテルで摩砕した。化合物8aを薄茶色の固形物として >99% の純度(HPLCで確認した)で得た。
B.  ジオキサン(300 ml、0.1 M)中のイソプロピルチオウレア(8b、3.55 g、30ミリモル)と3-プロモピルビン酸(8c、5 g、1 eq.)を80℃に加熱した。80℃に達したときに溶液が透明になり、次いで生成物が白色固形物として沈殿した。2時間加熱した後、溶液をRTに冷却し、白色沈殿をろ過して化合物8dを高純度(NMRで確認した純度 >98%)で94%の収率(7.51 g)で得た。
C.  ピリジン(150 ml、0.12 M) 中のカルボン酸8d (4.85 g、18.2ミリモル)とアニリン誘導体8a (3 g、1eq.)の混合液を-30℃に冷却した(冷却時に透明な溶液が部分的に懸濁液になった)。次に、オキシ塩化リン(3.56 ml、2.1 eq.)を5分間かけて徐々に添加した。反応液を-30℃で1時間撹拌し、浴を除去し、反応混合液をRTまで上げた。1.5時間後、反応混合液を氷に注入し、3N NaOH水溶液でpＨ11に調整し、CH2Cl2で抽出し、無水MgSO4で乾燥し、ろ過し、減圧下で濃縮した。次に、ベージュ色の固形物をフラッシュクロマトグラフィー(ヘキサン中45% EtOAc)で精製して化合物8eを薄黄色固形物として73% の収率(6.07 g)で得た。
【０１１６】
D.  無水tBuOH (40ml、0.14 M、Mg金属から蒸留)中のtBuOK (2.42 g、21.6ミリモル)の溶液を還流まで加熱した。化合物8e (1.8g、5.4ミリモル) を5分間かけて少しずつ添加し、生成した暗赤色溶液を還流下で更に20分間撹拌した(反応の完結はHPLCでモニターした)。混合液をRTまで冷却し、HClを添加した(4 N、ジオキサン中、1.5 eq.)。次に、混合液を減圧下で濃縮してHClとジオキサンの全部が除去されたことを確かめ、生成物をCH2Cl2で2回再溶解し、減圧下で乾燥して最後に化合物8fのHCl塩をベージュ色の固形物として得た(1.62 g、HPLCにより純度93%)。次に、生成物をリン酸塩緩衝液(1N NaH2PO4、pH=〜4.5)に注入し、音波処理した。ベージュ色の固形物をろ過し、減圧下で乾燥して化合物8f (1.38 g、収率81%)をベージュ色の固形物として得た(HPLCにより純度91%)。
1H NMR (400 MHz, DMSO) δ8.27 (s, 1H), 8.12 (d, 1H, J = 9.2 Hz), 7.97 (br.s, 1H), 7.94 (s, 1H), 7.43 (s, 1H), 7.24 (dd, 1H, J = 9.2, 2.2 Hz), 3.97 (m, 1H), 3.94 (s, 3H), 1.24 (d, 2H, J = 6.4 Hz).
【０１１７】
実施例  9
4-ヒドロキシ-7-メトキシ-2[2(4-イソプロピルチアゾリル)]キノリン(9f)の合成注: 化合物9bがα-ブロモケトンで置き換えられる同じ合成スキームを用いて種々の2-(4-アルキル)チアゾリル置換基をつくった。
【０１１８】
【化５４】
0003754298.tif 000039
【０１１９】
A.  -30℃におけるMeOH (100 ml)中の3-メチルブタン-2-オン(8 g、93ミリモル)の溶液にBr2 (4.79 ml、93ミリモル、1 eq.)を45分間かけて滴下した。次に、得られた混合液をRTで90分間撹拌した。ペンタンを添加し、その溶液を5% NaHCO3水溶液で洗浄し、有機層を無水Na2SO4で乾燥し、ろ過し、減圧下で濃縮した。得られた粗黄色油状物、化合物9bを精製せずに用いた。エチルチオオキサメート(9a、1.8 g、13.5ミリモル)とブロモケトン誘導体9b (13.5ミリモル)の溶液を70℃で15時間撹拌した。次に、混合液を減圧下で濃縮し、続いて溶離剤としてヘキサン中15% EtOAcを用いたフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製して化合物 9c (740 mg、収率28 %)を得た。
B.  THF/MeOH/H2O (3:1:1比、13 ml)中の化合物9c (700 mg、3.5ミリモル)の溶液をLiOH.H2O (148 mg、3.5ミリモル、1eq.)でRTにおいて5時間処理した。次に、0.1N HClでpＨ6に調整し、混合液を減圧下で濃縮乾固して酸13dを得、これを精製せずに直接次の工程で用いた。
【０１２０】
C.  ピリジン(30 ml)中の4-メトキシ-2-アミノアセトフェノン(中間体8a、570 mg、3.45ミリモル)とカルボン酸誘導体9d (590 mg、3.45ミリモル、1eq.)の溶液を-20℃まで冷却した。次に、POCl3 (0.35 ml、3.79ミリモル、1.1 eq.)を5分間かけて滴下した。得られた溶液を-10℃で2時間撹拌した。H2Oを添加して反応液を急冷し、混合液を減圧下で濃縮した。残留物をNaHCO3の飽和水溶液に注入し、EtOAcで抽出した。有機層を無水MgSO4で乾燥し、ろ過し、減圧下で濃縮した。粗生成物を溶離剤としてヘキサン中の25% EtOAcを用いたフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製して化合物9eを白色固形物として得た(740 mg、収率67%)。
D.  tBuOK (518 mg、2.1 eq.)を無水tBuOH (11 ml)中の化合物9e (700 mg、2.2ミリモル)の懸濁液に添加した。得られた混合液を75℃で7.5時間加熱し、その溶液をRTまで下げ、HCl (4N、ジオキサン中、2.5 ml)を添加して酸性にした。混合液を減圧下で濃縮し、得られた残留物を1N NaH2PO4の溶液に注入し、ろ過した。次に、固形物を少量のEtOAcで摩砕し、ろ過し、減圧下で乾燥して化合物9fを薄いベージュ色の固形物として得た(270 mg、収率41%)。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ8.00 (br. s, 1h), 7.60 (br. s, 1H), 7.51 (br. s, 1H), 7.43 (br. s, 1H), 7.29 (br. s, 1H), 7.14 (br. s. 1H), 6.95 (br. a, 1H), 3.90 (s, 3H), 3.15 (m, 1H), 1.33 (d, J=5.4 Hz, 6H).
【０１２１】
実施例  10
4-ヒドロキシ-2(1-メチル-2-イミダゾリル)-7-メトキシキノリン(10d)の合成
【０１２２】
【化５５】
0003754298.tif 000040
【０１２３】
A.  100 ml THF中のN-メチルイミダゾール10a (5g, 61ミリモル)の溶液を-78℃に冷却した。n-BuLi (24.4 mlの2.5M/Et2O溶液、1 eq.)を15分かけて滴下した。得られた混合液を-78℃で90分間撹拌してから過剰量の固体CO2に少しずつ注いだ。不均一な混合液を2時間撹拌し、RTにした。1N HClをpＨ5まで添加し、水層を分離し、凍結乾燥した。このようにして得られた残留物をEtOAcで抽出(塩を除去する)し、乾燥(Na2SO4)し、ろ過し、減圧下で濃縮し、6.2 g (収率80%)の白色固形物10bを得た。
B.  ピリジン(10 ml)中の4-メトキシ-2-アミノアセトフェノン8a (394 mg、2.39ミリモル)とカルボン酸誘導体10b (301 mg、1eq.)の溶液を-20℃まで冷却した。次にPOCl3 (244μl、1.1 eq.)を5分間かけて滴下した。得られた溶液を-10℃で2.5時間撹拌した。次に、水を添加し、混合液を減圧下で濃縮した。残留物をNaHCO3飽和溶液に注入し、EtOAcで抽出した。有機相を乾燥(MgSO4)し、ろ過し、減圧下で濃縮した。生成物をシリカゲル(25% EtOAc/Hex)を用いたクロマトグラフィーで精製し、530 mg (収率81%)の薄黄色固形物10cを得た。
C.  tBuOK (431 mg 2.1 eq.)を8 mlのtBuOH中の基質10c (500 mg、1.8ミリモル)の懸濁液に添加した。次に、得られた混合液を75℃まで7時間加熱した。その溶液を一晩室温にし、2.5 mlのHCl (4N/ジオキサン)を添加した。混合液を減圧下で濃縮し、得られた残留物をEtOAcで希釈した。NaOH 1NをpＨ7が得られるまで添加した。有機相を分離し、乾燥(MgSO4)し、ろ過し、減圧下で濃縮して、145 mgの10d (収率31%)を薄いベージュ色の固形物として得た。 1H NMR (400 MHz, DMSO-d): δ7.99 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 7.49 (s, 1H), 7.37 (s, 1H), 7.18 (s, 1H), 6.92 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 6.31 (s, 1H), 3.87 (s, 3H), 3.84 (s, 3H).
【０１２４】
実施例  11
4-ヒドロキシ-2(1-ピロリル)-7-メトキシキノリン(11b)の合成
【０１２５】
【化５６】
0003754298.tif 000041
【０１２６】
A.  氷酢酸中の基質11a (化合物6cからベンジル基をエタノール-THF中で5% Pd/Cで水素化分解した後に得られる) (1g、5.25ミリモル)と2,5-ジメトキシテトラヒドロフラン(0.68 ml、1 eq.)の溶液を4.5時間還流し、RTにした。次に、混合液を減圧下で濃縮した。残留物をメタノールで希釈し、pＨ7になるまでNaOH(水溶液)1Nを添加した。生成物をシリカゲル(3%MeOH/CH2Cl2、残留物をシリカゲルに予め吸着させた)を用いたクロマトグラフィーで精製した。140 mg (収率13%)の11bを白色固形物として得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d): δ7.98 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 7.64 (s, 2H), 7.18 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 7.05 (br. d, J = 7.9 Hz, 1H), 6.88 (br. s, 1H), 6.32 (s, 2H), 3.90 (s, 3H).
【０１２７】
実施例  12
4-ヒドロキシ-7-メトキシ-2-(6-メチル-2-ピリジル)キノリン(12d)の合成
【０１２８】
【化５７】
0003754298.tif 000042
【０１２９】
A.  6-メチルピコリン酸12a (411 mg、3.0ミリモル)とSOCl2 (0.520 ml、7.2ミリモル、2.4 eq.)をベンゼン(5 ml)中で2時間還流した。反応混合液から溶媒と過剰量の SOCl2を減圧下で除去し、残留物をペンタンで摩砕した。生成した固形物をろ別し、ろ液を濃縮して酸塩化物12b (500 mg、2.6ミリモル)を得た。
B.  0℃におけるCH2Cl2 (5 ml)中の粗酸塩化物12bの溶液に、CH2Cl2 (10 ml)中のアニリン8a (344 mg、2.08ミリモル)、DIPEA (1.45 ml、8.35ミリモル)及びDMAP (61 mg、0.5ミリモル)の溶液を添加した。反応混合液をRTで16時間撹拌した。減圧下で揮発性成分を除去し、残留物をEtOAcに溶解し、その溶液を5% NaHCO3 (2×)、H2O及び食塩水で洗浄した。次に、有機層をMgSO4で乾燥し、減圧下で濃縮した。混合液を溶離剤としてEtOAc/ヘキサン(1:2)を用いたフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製してアミド12c (490 mg、82%)を得た。
C.  t-BuOH (10 ml)中のアミド12c (490 mg、1.71ミリモル)の懸濁液にtBuOK (410 mg、3.43ミリモル)を添加し、混合液を75℃で6時間、次にRTで16時間撹拌した。次に、混合液をリン酸塩緩衝液(175 ml、pH= 7)に注入し、30分間撹拌した。固形物を酢酸エチルで2回摩砕した。有機相を食塩水で洗浄し、MgSO4で乾燥し、減圧下で濃縮した。得られた固形物をEtOAcで摩砕してキノリン誘導体12d (263 mg、58%)を得た。  1H NMR: (CDCl3, 400 MHz): δ2.68 (s, 3 H), 3,94 (s, 3 H), 6.85-6.88 (2d, J= 8.68 & 9.5 Hz, 2 H), 6.94 (dd, J = 8.9 & 2.2 Hz, 1 H), 7.27 (dd, J= 6.7 & 1.9 Hz, 1 H), 7.73-7.79 (m, 2 H), 8.28 (d, J = 8.9 Hz, 1 H), 10.3 (br s, 1 H).
【０１３０】
実施例  13
4-ヒドロキシ-7-メトキシ-2-(5-メトキシ-2-ピリジル)キノリン(13d)の合成
【０１３１】
【化５８】
0003754298.tif 000043
【０１３２】
A.  MeOH中の化合物13a (623 mg、3.73ミリモル)の溶液にNaOH (2M、4.70 ml)を添加し、反応混合液をRTで2時間撹拌した。次に、この溶液をHCl (6N、2.2 ml)で酸性にし、濃縮して化合物13bを得、これを精製せずに次の工程に用いた。
B.  ピリジン(25 ml)中の粗化合物13b (〜3.73ミリモル)の溶液にアニリン8a (500 mg、3.03ミリモル)を添加し、この溶液を-25℃に冷却した後にPOCl3 (0.35 ml、3.73ミリモル)を添加した。反応混合液を-10℃で1時間、次に0℃で2時間撹拌した。次に、混合液をH2Oに注ぎ、EtOAc (2〜3×)で抽出した。合わせた有機層を5% NaHCO3及び食塩水で洗浄し、MgSO4で乾燥し、減圧下で濃縮した。粗製物を溶離剤としてEtOAc/ヘキサン(1:2)を用いたフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製してアミド13c (617 mg、55%)を得た。
C.  無水t-BuOH (10 ml)中のアミド13c (617 mg、2.05ミリモル)の懸濁液にtBuOK (490 mg、4.11ミリモル)を添加し、混合液を75℃で6時間、次にRTで16時間撹拌した。反応混合液をリン酸塩緩衝液(175 ml、pH= 7)に注入し、30分間撹拌した。 生成した固形物をろ過し、EtOAcで摩砕してキノリン誘導体13d (250 mg、43%)を得た。  1H NMR: (DMSO, 400 MHz): δ3.86 (s, 3 H), 3.94 (s, 3 H), 6.72 (bs, 1 H), 6.91 (dd, J = 8.9 & 1.9 Hz, 1 H), 7.54 (d, J = 1.9 Hz, 1 H), 7.60 (dd, J = 8.9 & 2.9 Hz, 1 H), 7.97 (d, J = 8.9 Hz, 1 H), 8.21 (d, J = 8.6 Hz, 1 H), 8.48 (d, J = 1.9 Hz, 1 H).
【０１３３】
実施例  14
4-ヒドロキシ-7-メトキシ-2-(オキサゾール-5-イル)キノリン (14c)の合成:
【０１３４】
【化５９】
0003754298.tif 000044
【０１３５】
A.  実施例 4 (3.8 g、11.8ミリモル)からの保護したキノリン誘導体4bをCH2Cl2 (60 ml)に溶解し、-78℃に冷却した後、水素化ジイソブチルアルミニウム(7.9 ml、1 equiv.、1.5M、トルエン中)を15分間かけて非常にゆっくりと添加した。80分間撹拌した後、追加量のDIBALを添加した(5.5 ml、0.7 equiv.、1.5 M、トルエン中)。-78℃で更に2時間撹拌した後、反応液を-78℃のメタノール(4 ml)で注意して冷却してから、ロシェル塩水溶液(1N酒石酸K-Na)に注入した。濃厚ペーストを透明になるまでCH2Cl2 (300 ml)で2時間撹拌した。相を分離し、有機相を乾燥(MgSO4)し、ろ過し、濃縮して白色固形物を得た。50% EtOAc/ヘキサンを用いたフラッシュクロマトグラフィー(SiO2、230-400メッシュ)で精製してアルデヒド14aを白色固形物として得た(2.5g、73%)。
【０１３６】
B.  MeOH (7 ml)中のK2CO3 (48 mg、0.34ミリモル)の撹拌懸濁液にトルエンスルホニルメチルイソシアニド(66 mg、0.34ミリモル)を添加した。反応液を45℃まで加熱し、アルデヒド14a (0.10 g、0.34ミリモル)を添加した。反応混合液を80℃まで16時間加熱してから、減圧下で濃縮乾固した。精製をフラッシュクロマトグラフィー(SiO2、230-400メッシュ)で行い、所望のオキサゾール14b (0.089 g、80%)を得た。 MS: 331.0 (M + H)+.
C.  MEM保護ヒドロキシキノリン14bをTHF (3 ml)に溶解し、HCl水溶液(1N、1 ml)で処理した。反応液をRTで30分間撹拌した後、減圧下で濃縮乾固した。残留物をリン酸塩緩衝液(3 ml、1 N溶液、pＨ4.5)で処理し、撹拌した後、生成物をろ過し、蒸留水で洗浄し、高真空中で一晩乾燥した(60℃、16時間)。所望のヒドロキシ キノリン 14cを黄褐色の固形物(0.065 g、100%)として得た。 MS: 242.9 (M + H)+.
1H NMR (DMSO-d6): δ8.65 (s, 1H), 8.02 (bs, 1H), 7.97 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 7.19 (s, 1H), 6.93 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 6.42 (bs, 1H), 3.87 (s, 3H). ES (+) MS: m/z  242.9 (M + H)+.
【０１３７】
ぺプチドリンカー部分(P3)
実施例  15
(2S)-N-Boc-アミノノナ-8-エン酸(15g)の合成
【０１３８】
【化６０】
0003754298.tif 000045
【０１３９】
A.  ジオキサン(500 ml)中の市販のジエチル2-アセトアミドマロネート15a (100 g、0.46 mole)の溶液に水酸化ナトリウム水溶液(1 M、1 eq.、460 ml)を 30〜45分間かけて滴下した。得られた混合液を16.5時間撹拌してから、ジオキサンを減圧下で蒸発させ、水溶液を300 mlの酢酸エチル3部で抽出し、濃HClでpＨ1まで酸性にした。この溶液を氷水浴中で結晶化した。数個の結晶が生じた後、混合液を音波処理し、豊富な沈殿が生じた。ろ過し、減圧下で乾燥して化合物15b(62.52 g、収率72%)を白色固形物として得た。
B.  1リットルの丸底フラスコ中の市販の7-オクテン-1,2-ジール15c (25 g、0.173モル)とH2O (100 ml)の磁気的に撹拌したエマルジョンに過ヨウ素酸ナトリウム水溶液(40.7 g、0.190モル、1.1 eq.、475 mlのH2O中)を20分間かけて添加した(わずかに発熱)。得られた混合液を室温で更に1時間撹拌した(反応の完結はTLCで確認した)。次に、混合液を分液漏斗で傾瀉し、水層を有機層から分離した。水溶液をNaClで飽和し、傾瀉し、有機画分から1回以上分離した。2有機画分を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥し、綿栓(パスツールピペット中)でろ過して化合物15d (15.135 g、無色の油状物、収率78%)を得た。水溶液をCH2Cl2で抽出し、無水MgSO4で乾燥し、減圧下で濃縮し(加熱せず、ヘプタナールb.p.153℃)、追加量の化合物15d (1.957 g、無色の油状物、収率10%)を得た。全収率88%。
【０１４０】
C.  固体のエチル2-アセトアミドマロネート15b (7.57 g、40ミリモル)をピリジン(32 ml、10 eq)中の6-ヘプテナール15d (4.48 g、40ミリモル)の溶液を1分間かけて添加した。得られた溶液を10℃浴で冷却し、酢酸無水物(12 ml、3.2 eq.)を4分間かけて添加した。得られた橙色の溶液をRTで3時間撹拌し、別の部分のエチル2-アセトアミドマロネート15b (2.27 g)を添加した。得られた混合液を室温で更に11時間撹拌した。次に、氷(60 ml)を添加し、溶液を1.5時間撹拌してから、混合液を250 mlの水で希釈し、エーテル2部で抽出した。エーテル溶液を1N HCl、NaHCO3飽和液で洗浄し、Na2SO4で乾燥し、濃縮し、フラッシュクロマトグラフィー(EtOAc 40%/ヘキサン)で精製して化合物15e (4.8g、収率50%)を薄黄色の油状物として得た。
D.  乾燥エタノール(70 ml)中のZ-エチル2-アセトアミド-2,8-ノナジエノエート15e (8.38g、35ミリモル)の脱ガス(アルゴンを30分間吹き込む)溶液に(S,S)-Et-DUPHOS Rh(COD)OTf (51 mg、S/C = 496)を添加した。混合液を2 bar(30 psi)の水素下に置き(真空-H2 4サイクル後)、パーシューカーで2時間撹拌した。 得られた混合液を蒸発乾固して粗化合物15fを得、精製せずに次の工程に用いた。
【０１４１】
E.  THF (100 ml)中の粗(S)-エチル2-アセトアミド-8-ノネノエート15f (7.3 g、30.3ミリモル)の溶液に、Boc2O (13.2 g、2 eq.)とDMAP (740 mg、0.2 eq)を添加し、反応混合液を2.5時間加熱還流した。続いて、ほとんどのTHF溶媒を蒸発させ、粗混合物をCH2Cl2で希釈し、1 N HClで洗浄してDMAPを除去した。有機層をNaHCO3飽和水溶液で更に抽出し、無水Na2SO4で乾燥し、減圧下で濃縮した。次に、粗生成物をTHF (50 ml)と水(30 ml)で希釈し、LiOH.H2O (2.54 g、2 eq.)を添加し、得られた混合液をRTで25時間撹拌した(加水分解の完結はTLCで確認した)。反応混合液を減圧下で濃縮してTHF溶媒のほとんどを除去し、CH2Cl2で希釈した。得られた溶液を1 N HClで洗浄し、無水Na2SO4で乾燥し、減圧下で濃縮した。少量の不純物と過剰のBoc2Oを除去するために、粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー(溶離剤として100% ヘキサン〜100% EtOAcの溶媒勾配を用いた)で精製した。標記化合物15gを薄黄色の油状物として高純度で得た(5.82 g、収率71%)。 1H NMR (DMSO, 400 MHz): δ7.01 (d, J = 8 Hz, 1H), 5.79 (tdd, Jt = 6.7 Hz, Jd = 17.0, 10.2 Hz, 1H), 5.00 (md, Jd = 17.0 Hz, 1H), 4.93 (md, Jd = 10.2 Hz, 1H), 3.83 (m, 1H), 2.00 (q, J = 6.9 Hz, 2H), 1.65-1.5 (m, 2H), 1.38 (s, 9H), 1.35-1.21 (m, 6H).
【０１４２】
実施例  15A
(2S)-N-Boc-アミノノナ-8-エン酸(15g)の代替的合成:
【０１４３】
【化６１】
0003754298.tif 000046
【０１４４】
A.  ジブロモエタン(0.1 ml)を含有する乾燥THF (30 ml)中の細かく切ったMgリボン(0.55 g、22.5ミリモル)の撹拌懸濁液に8-ブロモ-1-オクテン(15h、2.52 ml、15ミリモル)を15分間かけて滴下した[反応はわずかに発熱する]。30分後、混合液を38°まで1時間加熱してから-78°に冷却した後、カニューレによって過剰量の固体のCO2に加えた。混合液をジエチルエーテル(100 ml)で希釈し、この溶液を食塩水(2×50 ml)で洗浄し、MgSO4で乾燥し、蒸発させた。粗油状物を得、これを溶離剤としてヘキサン中の15% EtOAcを用いたシリカゲルによるクロマトグラフィーで精製して化合物15iを収率62%で得た(1.44 g)。
1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ1.31-1.42 (m, 6H), 1.60-1.69 (m, 2H), 2.02-2.09 (m, 2H), 2.35 (t, J = 8.3 Hz, 2H), 4.99 (dm, J = 10.0 Hz, 1H), 5.04 (dm, J = 17.0 Hz, 1H), 5.75-5.86 (m, 1H).
【０１４５】
B.  -78°における無水THF (70 ml)中のカルボン酸15i (1.36g、8.7ミリモル)の激しく撹拌している溶液に、新たに蒸留したEt3N (1.6 ml、11.3ミリモル)と塩化ピバロイル(1.18 ml、9.58ミリモル)を無水条件下注射器で添加した。混合液を-78°で15分間、次に0°で45分間撹拌した。混合液を-78°まで再び冷却してから、カニューレで-78°におけるTHF中の4(S)-4-(フェニルメチル)-2-オキサゾリジノンリチウム塩に移した。n-BuLi (2.00 M、ヘキサン中、7.85 ml、15.7ミリモル)を-78°におけるTHF中のオキサゾリジノン(2.78g、15.7ミリモル)のTHF (20 ml)溶液に徐々に添加することによりオキサゾリジノン試薬のリチウム塩を予め調製した。
反応混合液を-78°で15分間、次にRTで1.5時間撹拌した。最後に、重硫酸ナトリウム(100 mlの1 M)の水溶液で急冷し、THFを最初の量の3/4まで蒸発させた。残留物をEtOAc (2×150 ml)で抽出し、混合した有機層を5% NaHCO3 (3×50 ml)、食塩水(2×50 ml)で洗浄し、MgSO4で乾燥し、蒸発させた。得られた粗油状物をヘキサン中の15% EtOAcを用いたシリカゲルによりクロマトグラフィー処理して化合物15jを68%の収率(1.88g)で得た。
1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ1.35-1.47 (m, 6H), 1.67-1.74 (m, 2H), 2.02-2.09 (m, 2H), 2.65 (dd, J = 13.4 & 9.9 Hz, 1H), 2.84-3.02 (m, 2H), 3.31 (dd, J = 13.4 & 3.2 Hz, 1H), 4.13-4.22 (m, 2H), 4.62-4.71 (m, 1H), 4.93 (d, J = 10.2 Hz, 1H), 5.00 (dd, J = 17.2 & 1.6 Hz, 1H), 5.75-5.84 (m, 1H), 7.18-7.38 (m, 5H).
【０１４６】
C.  -78°における乾燥THF (50 ml)中のKHMDS (0.8 M THF、22 ml、17.5ミリモル)の撹拌溶液に-78°における乾燥THF (40 ml)中の酸誘導体15j (3.25g、10.30ミリモル)の溶液をカニューレ添加した。混合液を-78°で45分間撹拌した。この混合液に-78°における乾燥THF (40 ml)中のトリジルアジド(3.67g、11.85ミリモル)の溶液を添加した。混合液を-78°で3分間撹拌してから、酢酸(5 ml)で急冷した。続いて、RTで1時間45分、最後に40°で15分間撹拌した。THFのほとんどが蒸発した。残留物をEtOAc (100 ml)に取り、有機溶液をH2O (50 ml)、5% NaHCO3 (3×50 ml)及び食塩水(50 ml)で洗浄し、乾燥(MgSO4)し、蒸発させた。得られた油状物を溶離剤としてヘキサン/CH2Cl2 (1/1)を用いたシリカゲルによりクロマトグラフィー処理して化合物15k (2.47g、収率67%)を得た。
1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ1.32-1.45 (m, 6H), 1.45-1.6 (m, 1H), 1.75-1.88 (2, 2H, 回転異性体), 2.01-2.11 (m, 2H), 2.82-2.87 (m, 1H), 3.33 (dd, J = 13.4 & 3.2 Hz, 1H), 4.10-4.28 (m, 2H), 4.62-4.72 (m, 1H), 4.90-5.05 (m, 3H), 5.73-5.88 (m, 1H), 7.17-7.38 (m, 5H).
【０１４７】
D.  無水MeOH (80 ml)中の無水SnCl2 (2.61 g、13.8ミリモル)の撹拌溶液にアジド15k (2.45 g、6.9ミリモル)の溶液を無水MeOH (20 ml)中0°でカニューレ添加した。混合液をRTで4時間撹拌した。MeOHを蒸発させ、得られた泡状物をジオキサン/H2O (100μl/20μl)に取り、Boc2O (3.0 g、13.8ミリモル)とNaHCO3 (2.89 g、34.5ミリモル) (必要な場合には更にNaHCO3でpＨ8に調整した)で処理し、混合液をRTで16時間撹拌した。ジオキサンの一部を蒸発させ(〜50%)、残留物をEtOAcで2回抽出した。有機溶液を食塩水(2×50 ml)で洗浄し、乾燥し、蒸発させた。得られた残留物を溶離剤としてヘキサン中の20〜25% EtOAcを用いたシリカゲルによりクロマトグラフィー処理して化合物15l (1.75 g、収率60%)を得た。
1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ1.27-1.53 (m, 6H), 1.46 (s, 9H), 1.80 (m, 1H), 2.00-2.08 (m, 1H), 2.80 (t, J = 12.1 Hz, 1H), 3.34 (d, 14.3 Hz, 1H), 4.17-4.23 (m, 2H), 4.60-4.66 (m, 1H), 4.93 (d, J = 10.2 Hz, 1H), 5.05 (dd, J = 17.2 & 1.9 Hz, 1H), 5.13 (bs, 1H), 5.38-5.43 (m, 1H), 5.74-5.84 (m, 1H), 7.22-7.36 (m, 5H).
【０１４８】
E.  THF/H2O (75 ml/15 ml)中のN-Boc誘導体15l (1.74 g、4.04ミリモル)の90°における撹拌溶液にH2O2 (30% v/w、2.05 ml、16.2ミリモル)とLiOH.H2O (0.34 g、8.1ミリモル)を添加し、この溶液を0°で1時間撹拌した。反応液をNa2SO3 (2.24 g、H2O中、15 ml、17.8ミリモル)で急冷した。10% クエン酸水溶液でpＨ4〜5に調整し、混合液をEtOAcで希釈した。水性画分をEtOAcで1回以上抽出し、有機溶液を食塩水で2回洗浄し、乾燥し、蒸発させた。残留物を溶離剤としてEtOAc中の20% ヘキサンを用いたシリカゲルによりクロマトグラフィー処理して遊離カルボン酸15g (0.76 g、収率70%)を得た。この化合物は、実施例15で得られたものとすべての点で同じであった。
【０１４９】
実施例  16
(2S)-N-Boc-アミノ-5-オキソノナ-8-エン酸メチルエステル(16d)の合成:
【０１５０】
【化６２】
0003754298.tif 000047
【０１５１】
本合成はT. Tsudaら, J. Am. Chem. Soc., 1980, 102, 6381-6384による方法に基づいている。
A.  N2 (20 ml)下-78°における乾燥THF中のマロン酸のモノアリルエステル(1.50 g、10.4ミリモル)の十分に撹拌した溶液にn-Bu2Mg (0.9M/ヘキサン、5.8 ml、5.2ミリモル)を5分間かけて滴下した。次に、重い懸濁液をRTで1時間撹拌し、蒸発乾固(N2下で真空解放)した。固形のMg塩16bを減圧下で1時間乾燥した。
まず、グルタミン酸誘導体16aをTHF中の1,1'-カルボニリジイミダゾール(1.65 g、10.21ミリモル)と混合し、混合液をRTで1時間撹拌して遊離酸部分を活性化した。続いて、活性化グルタミン酸誘導体をMg塩16bの溶液にカニューレ添加し、得られた反応混合液をRTで16時間撹拌した。次に、EtOAcで希釈し、有機溶液を0.5 N氷冷HCl、食塩水で洗浄し、乾燥し、蒸発させた。得られた残留物を溶離剤としてヘキサン中35-40% EtOAcを用いてシリカゲルによりクロマトグラフィー処理して化合物16c (1.85 g、収率53%)を得た。
1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ1.44 (s, 9H), 1.85-1.95 (m, 1H), 2.12-2.22 (m, 1H), 2.58-2.74 (m, 2H), 3.48 (s, 2H), 3.74 (s, 3H), 4.24-4.34 (m, 1H), 4.52 (dm, J = 5.7 Hz, 2H), 5.09 (m, 1H), 5.25 (dm, J = 10.2 Hz, 1H), 5.34 (dm, J = 17.2 Hz, 1H), 5.91 (m, 1H).
【０１５２】
B.  乾燥DMF (7 ml)中のテトラキス(トリフェニルホスフィン) Pd (0) (0.116 g、5 mol %、0.1ミリモルe)の撹拌溶液に乾燥DMF (3 ml)中のジエステル16c (0.687 g、2ミリモル)を添加した(注射器で、N2 雰囲気下)。混合液をRTで3.5時間撹拌した。DMFを減圧下で蒸発させ、残留物をEtOAc (20 ml)で希釈した。EtOAc溶液を0.5 N氷冷HCl (5 ml)、食塩水(10 ml)で洗浄し、乾燥し、蒸発させた。残留物を溶離剤としてヘキサン中15-20% EtOAcを用いてシリカゲルによりクロマトグラフィー処理して化合物16d (0.253 g、収率42%)を得た。
1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 1.44 (s, 9H), 1.84-1.94 (m, 1H), 2.08-2.22 (m, 1H), 2.33 (dd, J = 14.0 & 7.3 Hz, 2H), 2.45-2.55 (m, 4H), 3.74 (s, 3H), 4.28 (bm, 1H), 4.98 (dm, J = 10.2 Hz, 1H), 5.03 (dm, J = 17.2 Hz, 1H), 5.00-5.10 (m, 1H), 5.74-5.85 (m, 1H).
【０１５３】
実施例  17
(2S,5R)-N-Boc-2-アミノ-5-メチルノナ-8-エン酸(17f)の合成
【０１５４】
【化６３】
0003754298.tif 000048
【０１５５】
A、B、C、D.  まず、アルデヒド15dのアミノ酸中間体15fへの変換の実施例15に記載されたものと同じ合成工程に従って市販の(R)-(+)-シトロネラル17aをアミノ酸誘導体17bに変換した。
E.  化合物17b (0.675 g、5.6ミリモル)をtBuOH/アセトン/H2O (1:1:1、18 ml)の混合液に溶解し、氷浴(0℃)に入れた。NMMO (0.789 g、6.74ミリモル、1.2 eq.)とOsO4 (2.5% w/w、tBuOH中、0.7 ml、0.067ミリモル、0.012 eq)を連続して添加し、反応混合液をRTで4時間撹拌した。減圧下で蒸発させてほとんどのアセトンを除去してから、混合液をEtOAcで抽出した。有機層をH2Oと食塩水で更に洗浄し、 無水MgSO4で乾燥し、蒸発乾固した。溶離剤としてEtOAc中の1% EtOHを用いたフラッシュカラムクロマトグラフィー後にジオール17cを高純度で77%の収率(0.575 g)で得た。
F.  THF/H2O (1:1、20 ml)中のジオール17c (0.575 g、1.73ミリモル)の溶液に、NaIO4 (0.48 g、2.25ミリモル、1.3 eq.)を添加し、反応混合液をRTで3.5時間撹拌した。続いて、減圧下で蒸発させてほとんどのTHF溶媒を除去し、残りの混合液をEtOAc (2×100 ml)で抽出した。合わせた有機層を5% クエン酸水溶液(2×20 ml)、5% NaHCO3水溶液(20 ml)及び食塩水(2×50 ml)で洗浄してから、EtOAc溶液を無水MgSO4で乾燥し、減圧下で蒸発乾固した。アルデヒド中間体17d (0.47 gの粗生成物)を精製せずに次の工程で用いた。
【０１５６】
G.  無水トルエン(15 ml)中のPh3PCH3Br (925 mg、2.6ミリモル)の溶液にKHMDS (0.5M、トルエン中、5.2 ml、2.6ミリモル)を添加し、生成した黄色懸濁液をN2下にRTで30分間 撹拌した。その後、懸濁液を、まず0℃に冷却し、アルデヒド17d (0.47 g 1.73ミリモル、15 mlの無水THFに溶解した)の溶液を注射器で添加し、混合液をRTまで温めた。RTで1時間撹拌した後、減圧下で蒸発させてほとんどのTHFを除去し、混合液にEtOAc (100 ml)を添加し、有機層をH2O (30 ml)、5% NaHCO3水溶液(30 ml)及び食塩水(30 ml)で洗浄した。次に、EtOAc溶液を無水MgSO4で乾燥し、減圧下で蒸発乾固した。溶離剤としてヘキサン:EtOAc (3:2)を用いてシリカゲルによるフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製した後に純粋な化合物17eを最後の2工程の収率63%(0.29 g)で単離した。
化合物17fを得るためのエチルエステルの加水分解と中間体17e中のN-アセチル保護基のBocとの同時変換を化合物15fの15gへの変換を示したものと同じ手順を用いて行った(17f、310 mg、定量的)。 1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ0.88 (d, J=6.4 Hz, 3H), 1.18-1.28 (m, 2H), 1.35-1.48 (m, 3H), 1.45 (s, 9H), 1.64-1.74 (m, 1H), 1.81-1.89 (m, 1H), 1.94-2.12 (m, 2H), 4.28 (bd, J=〜3.2 Hz, 1H), 4.93 (dm, J=11.1 Hz, 1H), 5.00 (dm, J=16.8 Hz, 1H), 5.74-5.84 (m, 1H).
【０１５７】
実施例  18
N-Boc-O-アリル-(L)-トレオニン(18d)の合成
【０１５８】
【化６４】
0003754298.tif 000049
【０１５９】
A.  Boc-(L)-トレオニン18a (500 mg、2.28ミリモル)を0℃においてCH2Cl2/MeOH (それぞれ8 ml/0.5 ml)に部分的に溶解した。ジエチルエーテル中のジアゾメタンの溶液を、過剰のジアゾメタンの存在を示す黄色が持続するまで徐々に添加した。溶媒が蒸発したときに、粗メチルエステル18bを濁った白色油状物(0.534 g)を得た。
B.  次に、中間体18b (311 mg、1.33ミリモル)を無水ジエチルエーテル(8 ml)に溶解し、Ag20を添加(341 mg、1.47ミリモル)し、4オングストロームモレキュラーシーブ(1 g)を新たに活性化した。最後に、ヨウ化アリル(134μl、1.47ミリモル)を反応フラスコに加え、混合液を還流下に撹拌した。20時間と30時間後に2部以上のヨウ化アリル(各回45μl、0.50ミリモル)を添加し、合計36時間撹拌を続けた。 次に、混合液をシーライトでろ過し、溶離剤としてEtOAc/ヘキサン(1:4)を用いたシリカゲルによるフラッシュクロマトグラフィーで精製して73 mg (収率27%)の化合物18cを透明な油状物として得た。
1H NMR (CDCl3, 400MHz): δ1.21 (d, J=6.0 Hz, 3H), 1.45 (s, 9H), 3.75 (s, 3H), 3.82-3.87 (m, 1H), 3.99-4.07 (m, 2H), 4.29 (dd, J=9.5 & 2.5 Hz, 1H), 5.14 (dm, J=10.5 Hz, 1H), 5.21 (dm, J=17.2 Hz, 1H), 5.75-5.84 (m, 1H).
C.  エステル化合物18c (99 mg、0.362ミリモル)をTHF/MeOH/H2O (2:1:1、4 ml)の混合液に溶解し、LiOH.H2O (61 mg、1.45ミリモル)を添加した。この溶液をRTで2時間撹拌してから、1N HClでpＨ〜3まで酸性にした後に溶媒を減圧下で除去した。得られた油状物、化合物18dをそのままで大環状阻害剤の合成に用いた。
【０１６０】
実施例  19
(2S, 3S)-N-Boc-2-アミノ-3(メルカプトアリル)ブタン酸(19e)の合成
【０１６１】
【化６５】
0003754298.tif 000050
【０１６２】
f.  化合物19a (9.1ミリモル)をピリジン(5 ml)に溶解し、この溶液を氷浴中で0℃まで冷却し、塩化トシル(2.3 g、11.8ミリモル、1.3 eq.)を少しずつ添加し、反応混合液をRTで24時間撹拌した。その後、反応混合液をジエチルエーテル(300 ml)とH2O (100 ml)に分配した。エーテル層を0.2N HCl (6×100 ml)と食塩水(100 ml)で洗浄し、無水MgSO4で乾燥し、ろ過し、減圧下で濃縮乾固した。粗物質を溶離剤としてヘキサン/EtOAc (勾配8:2〜7:3比)を用いたフラッシュクロマトグラフィーで精製することにより、トシル誘導体19bを収率85% (3.05 g)で単離した。
B.  無水DMF (2.5 ml)中の中間体19b (775 mg、2ミリモル)の溶液にチオ酢酸カリウム(365 mg、3.2ミリモル、1.6 eq.)を添加し、反応混合液をRTで24時間撹拌した。次に、DMFのほとんどを減圧下で蒸発させ、残りの混合液をEtOAcとH2Oに分配した。水層をEtOAcで再抽出し、合わせた有機層を食塩水で洗浄し、無水MgSO4で乾燥し、蒸発乾固した。粗物質を、溶離剤としてヘキサン/EtOAc (4:1比)を用いたフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製して化合物19cを80% の収率(465 mg)で単離した。
【０１６３】
C.  H2O/EtOH (3:5比、8 ml)中のチオエステル19c (465 mg)の溶液に0.2M NaOH (2.4 ml)の水溶液を添加し、混合液をRTで1.5時間撹拌した。次に、ヨウ化アリル(0.292 ml、3.2ミリモル、2 eq.)を添加し、RTで更に30分間撹拌を続けた。反応混合液を最初の半量に濃縮してからEtOAcで抽出した。水層を冷0.5N HCl水溶液でpＨ=〜3まで酸性にし、EtOAcで再抽出した。合わせた有機層を食塩水で洗浄し、無水MgSO4で乾燥し、減圧下で蒸発乾固した。粗反応混合液は、少なくとも4種の生成物を含有した。ヘキサン/EtOAc (勾配9:1〜3:1比)を用いたシリカゲルによりフラッシュカラムクロマトグラフィー処理した後にすべての生成物を単離した。少なくとも極性のある化合物(TLC Rf = 0.68、ヘキサン/EtOAc 4:1中)の構造は、所望の生成物19d (83 mg、収率18%)に対応した。
1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ1.24 (d, J=7.0 Hz, 3H), 1.46 (s, 9H), 3.13-3.19 (m, 2H), 3.24-3.29 (m, 1H), 3.77 (s, 3H), 4.50 (dd, J=8.6 & 3.8 Hz, 1H), 5.12 (d, J=12.4 Hz, 1H), 5.15 (dd, J=18.4 & 1.3 Hz, 1H), 5.22 (bd, J=7.6 Hz, 1H), 5.75-5.85 (m, 1H).
D.  MeOH/H2O (3:1、4 ml)中のメチルエステル19d (83 mg、0.287ミリモル)の溶液をNaOH水溶液(0.2 N、1.3 ml、0.26ミリモル)とRTで24時間及び40℃で1時間混合した。反応混合液を冷HCl水溶液(0.5 N HCl、0℃、pH=4-5)で酸性にし、MeOHを減圧下で除去し、残っている水性混合物をEtOAcで抽出した。有機溶液をMgSO4で乾燥し、蒸発乾固して化合物19eを得た。化合物19eを精製せずに阻害剤の最後の合成に用いた。
【０１６４】
実施例  20
(S)-N-Boc-2-アミノ-3-メチル-3(1-メルカプト-4-ブテニル)ブタン酸(20c)の合成
【０１６５】
【化６６】
0003754298.tif 000051
【０１６６】
A.  L-ペニシルアミン20a (448 mg、3ミリモル)をDMF/DMSO (5:1比、6 ml)に溶解し、4-ブロモペンテン(0.46 ml、4.5ミリモル、1.5 eq.)とCsOH・H20 (1.0g、6ml、2 eq.)を添加し、反応混合液をRTで撹拌した。24時間後、Boc2O (820 mg、3.75ミリモル、1.25 eq.)を混合液に添加し、更に12時間撹拌を続けた。続いてDMFを減圧下で除去し、残っている混合物を冷0.5N HCl水溶液で希釈し、pＨ=〜4-5に調整してから、EtOAc (2×50 ml)で抽出した。有機層を食塩水(2×)で洗浄し、無水MgSO4で乾燥し、蒸発乾固して粗カルボン酸20bを得た。
B.  20bの精製が難しいことがわかったので、粗生成物を、まずジアゾメタンで処理して対応するメチルエステル20cを形成し、次に溶離剤としてヘキサン/EtOAc (9:1)を用いたフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製して190 mg (収率20%)の純粋なメチルエステル20cを得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ1.35 (s, 3H), 1.37 (s, 3H), 1.44 (s, 9H), 1.59-1.67 (m, 2H), 2.11-2.17 (m, 2H), 2.51-2.60 (m, 2H), 3.74 (s, 3H), 4.29 (d, J= 8.6 Hz, 1H), 4.98 (dm, J=10.5 Hz, 1H), 5.03 (dm, J=19 Hz, 1H), 5.35 (bd, J=7 Hz, 1H), 5.72-5.83 (m, 1H).
C.  続いて、エステルをTHF/MeOH/H2O (2:2:1、5ml)に溶解し、LiOH・H2O (50 mg、2.0ミリモル、2 eq.)を添加し、反応混合液を40℃で4時間撹拌して20cを酸20bに加水分解した。反応混合液を0.5N HClでpＨ=4-5に酸性にし、THFとMeOHを蒸発乾固し、残っている水溶液をEtOAcで抽出した。EtOAc層を無水MgSO4で乾燥し、蒸発乾固して化合物20bを得、これを精製せずに次の大環状阻害剤の合成に用いた。
【０１６７】
非環式ジぺプチド及びトリぺプチド中間体
溶液中で行われるカップリング反応の一般手順と個々の実施例は、国際出願第00/09543号及び同第00/09558号に記載されている。
これらの手順を、中間体ジぺプチド26c、30a又はトリぺプチド又はトリぺプチド23a、24a、31a、32a、又は33aの合成に用いた。
実施例  21
非環式トリぺプチド21eの合成
【０１６８】
【化６７】
0003754298.tif 000052
【０１６９】
A.  CH2Cl2 (10 ml)中のプロリン誘導体21a (国際出願00/05543号及び同第00/09558号に記載された市販のBoc-4(R)-ヒドロキシプロリンと4-クロロキノリンから調製) (1.32 g、3.68ミリモル)と粗ホモアリル ACCA 1f (〜3.35ミリモル)の溶液に、NMM (1.21 ml、10.05ミリモル)とHATU (1.53、4.02ミリモル)を連続して添加し、懸濁液をRTで18時間撹拌した。その後、溶媒を蒸発させ、粗反応混合液をEtOAc (30 ml)に再溶解した。その溶液を5% NaHCO3水溶液(2×10 ml)、食塩水(10 ml)で洗浄し、MgSO4で乾燥し、蒸発させた。粗生成物を溶離剤としてEtOAc中の8% ジエチルエーテルを用いたシリカゲルによるクロマトグラフィーで精製して化合物21bの所望のジアステレオマーを20%の収率で得た(絶対立体化学は求めなかった)。
1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ0.93 & 1.01 (t, J = 8.3 Hz, 1H, 3:7比の回転異性体), 1.14-1.35 (m, 2H), 1.44 (s, 9H), 1.45 (s, 9H), 1.50-1.82 (m, 4H), 2.08-2.24 (m, 2H), 2.32 (bs, 0.7H), 2.63 (bs, 0.75H), 2.93 (bs, 0.75H), 3.16 (m, 0.25H), 3.77 (bs, 1.5H), 3.88 (bs, 0.5H), 4.4-4.55 (m, 1H), 4.98 (d, J = 10.2 Hz, 1H), 5.03 (dd, J = 17.2 & 1.6 Hz, 1H), 5.24 (bs, 1H), 5.75-5.88 (m, 1H), 6.57 & 6.78 (2bs, 1H, 2回転異性体), 7.42-7.58 (m, 3H), 7.63-7.73 (m, 2H), 8.04 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 8.11 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 8.74 (d, J = 5.1 Hz, 1H).
【０１７０】
B.  乾燥CH2Cl2ジぺプチド中の21b (137 mg、0.248ミリモル)の溶液にジオキサン(4M、4 ml)中のHClの溶液を添加し、混合液を RTで1.5時間撹拌した。次に、溶媒を蒸発させ、残留物を高真空中で乾燥して遊離アミノ酸を得た。混合液をジエチルエーテル/MeOH (3μｌ/2μｌ)に溶解し、ジエチルエーテルに溶解したわずかに過剰量のジアゾメタンで処理した。30分後、HCl (4M、ジオキサン中)を添加して過剰のジアゾメタンを破壊して化合物21cのHCl塩を得、これを精製せずに次の工程に用いた。
C.  CH2Cl2 (25 ml)中の粗ジぺプチド21c (0.23 g、0.48ミリモル)の撹拌懸濁液に(2S)-N-Boc-アミノヘプタ-6-エン酸21d (0.151 g、0.62ミリモル)、NMM (210μｌ、1.91ミリモル)及びHATU (0.236 g、0.62ミリモル)を連続して添加し、混合液をRTで16時間撹拌した(必要な場合には1時間後にNNMでpＨ〜8に調整した)。CH2Cl2を蒸発させ、残留物をEtOAc (50 ml)に溶解し、有機溶液を5% NaHCO3 (2×20ml)、食塩水(2×20ml)で洗浄し、乾燥し、蒸発させた。得られた粗化合物をシリカゲル(50 ml、2% EtOH/EtOAc)によりクロマトグラフィー処理して化合物21e (0.139 g、収率46%)を得た。
1H NMR (CDCl3, 400 MHz、6:1比の回転異性体)主回転体のケミカルシフトδ1.21-1.27 (m, 1H), 1.36 (s, 9H), 1.45-1.81 (4m, 7H), 2.20-2.22 (m, 4H), 2.28-2.37 (m, 1H), 2.90-2.99 (m, 1H), 3.66 (s, 3H), 3.94-3.98 (m, 1H), 4.29 (bd, J = 9.9 Hz, 1H), 4.46-4.50 (m, 1H), 4.81 (dd, J = 8.3 & 5.4 Hz, 1H), 4.92-5.06 (m, 4H), 5.16 (d, J = 8.3 Hz 1H), 5.37 (m, 1H), 5.70-5.84 (m, 2H), 6.82 (d, J = 5.1 Hz, 1H), 7.47-7.55 (m, 2H), 7.71 (dt, J = 7.0 & 1.3 Hz, 1H), 8.03 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 8.17 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 8.78 (d, J = 5.1 Hz, 1H).
【０１７１】
大環状ぺプチド
実施例  22
オレフィン材料による大環状化の一般手順
すべての場合において、トリぺプチドジエンを0.01Mの濃度でCH2Cl2に溶解し、アルゴンを吹き込むことにより(500 mlの容量について〜1時間)その溶液を脱酸素した。触媒溶液(5-30 mol %、少量の脱ガスCH2Cl2に溶解したもの)の溶液を添加し、すべての出発物質がTLCとHPLCで示される生成物に変換されるまで反応混合液を還流した。続いて、粗反応混合液を乾固近くまで濃縮し、短いパッドのシリカゲルによってまずCH2Cl2でろ過ほとんどの触媒を除去し、次にEtOAcでろ過してすべての大環状生成物を溶離した(そのときのほとんどが単一ジアステレオマー)。各反応からの粗生成物を205 nmにおいて70% H2O + 0.06% TFA  30% CH3CN + 0.06% TFAの均一溶媒混合液を用いたCHIRALCEL OJ-Rカラム(キラルテクノロジー社(Chiral Technologies Inc)から購入、0.46φ×15 cm)によるキラルHPLCで分析した。主大環状生成物を1H、COSY、TOCSY、及びROESY NMRデータで完全に確認して構造と立体化学を確認した。
【０１７２】
実施例  23
大環状中間体(23b)の合成
【０１７３】
【化６８】
0003754298.tif 000053
【０１７４】
Arを2時間吹き込むことにより乾燥CH2Cl2 (800 ml、アルドリッヒ-無水物)中のジエン23a (4.0 g、7.88ミリモル)の溶液を脱酸素化した。次に、ホベイダ触媒(262 mg、0.434ミリモル、5.5 mol %)を固形分として添加し、反応液をArバルーンとして還流した。28時間後、赤色〜橙色溶液を無定形固形分まで蒸発させてから、シリカゲルによるフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製した。最初の溶媒系はCH2Cl2中の10% EtOAcとした。触媒がカラムから溶離されるとすぐに溶媒を純粋なEtOAcに変えた。触媒のカラムからの溶離は、呈色から明らかであった。大環状生成物23bを無色の泡状物として単離し、CH2Cl2/ヘキサン(〜1:2)に再溶解した。溶媒を蒸発させることにより白色粉末(3.362 g、収率89%)を得た。
!H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ1.20-1.50 (m, 6H), 1.43 (s, 9H), 1.53 (dd, J = 9.5 & 5.4, 1H), 1.61-1.70 (m, 1H), 1.76-1.90 (m, 2H), 2.05-2.26 (m, 4H), 2.45 (d, J = 14.3, 1H), 3.67 (s, 3H), 3.71 (d, J = 11.1, 1H), 3.90 (dd, J = 11.1 & 4.3, 1H), 4.43-4.53 (m, 2H), 4.76 (d, J = 8.6, 1H), 4.86 (bd, J = 9.8, 1H), 5.20-5.23 (m, 2H), 5.57 (dt, J  = 7.0 & 9.8, 1H), 7.32 (bs, 1H).
【０１７５】
実施例  24
大環状中間体(24b)の合成:
【０１７６】
【化６９】
0003754298.tif 000054
【０１７７】
Arを1.5時間吹き込むことにより無水CH2Cl2 (600 ml、無水物)中のジエン24a (2.76 g、3.82ミリモル)の溶液を脱酸素化した。脱ガスした無水CH2Cl2 (8 ml)中のホベイダ触媒(117 mg、0.19ミリモル、0.05 eq)の溶液をカニューレによって添加し、反応液をArバルーンによって還流下に撹拌した。20時間後、反応混合液を約50% 完結させ、その点で第2部分の触媒を添加(117 mg)し、撹拌を更に 16時間続けた。次に、溶液を〜100 mlに濃縮し、シリカゲルパッド(6×10 cm)の上に加え、触媒をまずCH2Cl2で溶離することにより回収した。化合物24bをEtOAc中の3% MeOHでシリカパッドから洗い流し、EtOAc/ヘキサン(2:1)を用いたフラッシュカラムクロマトグラフィーで再精製して収率70% のわずかにオリーブ色の白色固形物(1.85 g、HPLCにより純度94%)を得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)  δ8.69 (s, 1H), 8.13 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 7.50-7.44 (m, 2H), 7.17 (dd, J = 9.2, 2.2 Hz, 1H), 7.04 (d, J = 6.4 Hz, 1H), 5.60-5.56 (m, 1H), 5.52 (dd, J = 9.2 Hz, 1H), 5.25 (dd, J = 9.2 Hz, 1H), 4.59 (d, J = 11 Hz, 1H), 4.44 (dd, J = 9.2 Hz, 1H), 4.05-3.98 (m, 1H), 3.94 (s, 3H), 3.92 (s, 3H), 3.89-3.82 (m, 1H), 3.55 (s, 3H), 2.64-2.53 (m, 1H), 2.46 (d, J = 7.3 Hz, 1H), 2.40-2.31 (m, 1H), 2.21 (dd, J = 8.9 Hz, 1H), 1.78-1.65 (m, 2H), 1.55 (dd, J = 4.8 Hz, 1H), 1.485 (dd, J = 4.8 Hz, 1H), 1.41-1.30 (m, 7H), 1.16 (s, 9H).  MS; es+: 795.4  (M + H)+.
【０１７８】
実施例  25
化合物202 & 203 (表2)の合成
【０１７９】
【化７０】
0003754298.tif 000055
【０１８０】
A.  CH2Cl2 (60 ml)中のジエン化合物21e (0.130 g、0.205ミリモル)を触媒量のビス(トリシクロヘキシルホスフィン)ベンジリデンルテニウムIVジクロリド(上記グラッブ触媒) (52 mg、0.064ミリモル)を用いて還流下で2時間環化し、シリカゲル(50 ml、3% EtOH/EtOAc)によりクロマトグラフィー処理した後に化合物25a (60.1 mg、収率 48%)を得た。
1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ1.22-1.30 (m, 2H), 1.35 (s, 9H), 1.44-2.35 (m, 13H), 3.07-3.14 & 3.16-3.24 (2m, 1H, 1:3比の回転異性体), 3.69 (s, 3H), 3.96-4.04 (m, 1H0, 4.42-4.50 (m, 1H), 4.95-5.04 (m, 1H), 5.05-5.15 (m, 1H), 5.20-5.30 (m, 1H), 5.55-5.65 (m, 1H), 6.75-6.79 (2d, J = 5.4 Hz, 1H, 1:3比の回転異性体), 7.36 (s, 1H), 7.46-7.50 (m, 1H), 8.03 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 8.13 & 8.17 (2d, J = 8.0 Hz, 1H, 1:3比の回転異性体), 8.77 (d, J = 5.1 Hz, 1H).
【０１８１】
B.  大環状化合物25a (0.0156 g、0.026ミリモル)のエステル部分をTHF/MeOH/H2O (4 ml /2 ml /2 ml )中のLiOH・H2O (8.7 mg、0.206ミリモル)で加水分解した。粗生成物を5% 水性CH3CN〜100% CH3CNの溶媒勾配を用いたワットマン(Partisil 10,0DS3) 50/2.4 cmカラムによるC18逆相HPLCにより精製して純粋な化合物 202を無定形白色固形物(11.8 mg)として得た。
1H NMR (DMSO, 400 MHz): δ1.12 (s, 9H), 1.20-1.24 (m, 2H), 1.32-1.40 (m, 3H), 1.58-1.62 (m, 2H), 1.68-1.78 (m, 3H), 1.95-2.02 (m, 1H), 2.08-2.18 (m, 2H), 2.42-2.59 (m, 2H), 3.97-4.00 (bd, J = 9.8 Hz, 2H), 4.47 (t, J = 8.6 Hz, 1H), 4.58 (d, J = 11.8 Hz, 1H), 5.22-5.29 (m, 1H), 5.46-5.54 (m, 1H), 5.66 (s, 1H), 7.12 (d, J = 6.0 Hz, 1H), 7.49 (d, J = 3.5 Hz, 1H), 7.68 (dd, J = 7.3 Hz, 1H), 7.98 (dd, J = 7.0 Hz, 1H), 8.08 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 8.21 (s, 1H), 8.35 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 9.08 (d, J = 5 Hz, 1H).
【０１８２】
C.  乾燥CH2Cl2 (1 ml)中の大環状化合物25a (20 mg、0.033ミリモル)を4M HCl/ジオキサン(5 ml)の存在下に1時間撹拌した。混合液を注意して蒸発及び乾燥した。残留物をCH2Cl2/DMF (3 ml /1 ml)に再溶解し、NMM (14.5μl、0.132ミリモル)と酢酸無水物(7.0μl、0.073ミリモル) で処理し、RTで14時間撹拌した。混合液を高真空中で蒸発及び乾燥した。次に、残留物をTHF/MeOH/H2O (4 ml/2 ml/2 ml)の混合液に溶解し、LiOH.2H2O (11 mg、0.264ミリモル)で一晩撹拌した。1N氷冷HClでpＨ = 3まで酸性にした後に分離した残留物を0-40% CH3CN水溶液(0.06% TFA)の溶媒勾配を用いたC18 逆相HPLCで精製して純粋な化合物203を無定形の白色固形物(12 mg)として単離した。
1H NMR (50mM Na2PO4緩衝液, pH=6.0, 600 MHz): δ1.22-1.27 (m, 2H), 1.38-1.43 (m, 2H), 1.58-1.64 (m, 2H), 1.67-1.76 (m, 2H), 1.77-1.84 (m, 1H), 1.92-1.99 (m, 1H), 2.22-2.08 (m, 1H), 2.12-2.27 (m, 1H), 2.22-2.27 (m, 1H), 2.60-2.67 (m, 1H, Pro-β'), 2.83-2.89 (m, 1H, Pro-β), 4.32 (dd, J = 12.1 & 3.5 Hz, 1H, Pro-δ'), 4.41 (dd, J = 12.1 & 7.3 Hz, 1H), 4.56 (bd, J = 8.0 Hz, 1H, Pro-δ), 4.62 (dd, J = 8.9 Hz, 1H, Pro-α), 5.40-5.46 (m, 1H), 5.55-5.61 (m, 1H), 5.73 (bs, 1H, Pro-γ), 7.41 (d, J = 6.3 Hz, 1H), 7.64 (bs, 1H, Acca-NH), 7.80 (dd, J = 7.9 Hz, 1H), 8.03 (dd, J = 8.0 Hz, 1H), 8.07 (d, J = 9.5 Hz, 1H), 8.16 (d, J = 7 Hz, 1H, AcNH), 8.36 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 8.90 (d, J = 6.0 Hz, 1H).
【０１８３】
実施例  26
化合物508 (表5)の合成
【０１８４】
【化７１】
0003754298.tif 000056
【０１８５】
A.  EtOAc/CH3CN/H2O (2:2:1、60 ml)中のBoc保護L-グルタミン26a (4.93 g、20ミリモル)とヨードベンゼンジアセテート(7.73 g、24ミリモル、1.2 eq.)の溶液を16℃で1時間及び20℃で3時間撹拌した。次に、反応混合液をH2O (20 ml)で希釈し、EtOAcとCH3CNの溶媒を減圧下で除去し、残っている水性混合液を ジエチルエーテル(3×50 ml)及びEtOAc (50 ml)で抽出してほとんどの不純物を除去した。次に、水層(アミン中間体を含有する)を濃縮乾固し、残っている物質を10% Na2CO3 (30 ml)に再溶解し、氷浴中で0℃まで冷却し、ジオキサン(40 ml)中のベンジルクロロホーメート(3.3 ml、20.4ミリモル、1.02 eq.) を徐々に添加した(〜10分)。反応混合液を0℃で1時間及びRTで2時間撹拌した。次に、混合液をH2O (50 ml)で希釈し、冷(〜5℃)ジエチルエーテル(3×50 ml)で抽出し、4M HClでpＨ=3-4まで酸性にし、EtOAc (3×50 ml)で抽出した。合わせた有機層を無水MgSO4で乾燥し、減圧下で蒸発乾固した。粗物質をEtOAc/ヘキサン/AcOH (7:2.9:0.1)を用いたフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製して化合物26bを全収率43% (3.04 g)で得た。
【０１８６】
B.  ジぺプチド中間体26c (250 mg、0.41ミリモル)、化合物26b (171 mg、0.49ミリモル、1.2 eq.)及びHATU (185 mg、0.49ミリモル、1.2 eq.)をCH2Cl2 (6 ml)に溶解し、DIPEA (0.29 ml、1.62ミリモル、4 eq.)を添加した。反応混合液をRTで14時間撹拌してから、CH2Cl2を減圧下で蒸発させ、粗物質をEtOAcに再溶解した。EtOAc溶液を5% NaHCO3水溶液及び食塩水で洗浄し、無水MgSO4で乾燥し、蒸発乾固した。溶離剤としてEtOAc/ヘキサン(4:1)を用いたフラッシュカラムクロマトグラフィーで粗物質を精製した後に化合物26dを収率98% (338 mg)で得た。
C.  THF (5 ml)中の化合物26d (335 mg、0.394ミリモル) の溶液を0℃に冷却し、ジメチルスルフィド中のBH3の溶液(0.12 mlの10M溶液、1.2ミリモル、3 eq.)を添加した。反応混合液をRTまで加温し、1時間撹拌した。次に、0℃まで冷却した後、NaOHの水溶液(0.8 mlの2.5 M溶液、1.97ミリモル、5 eq)を15分間かけて徐々に添加し、続いてH2O2の水溶液(0.8 mlの8.8 M溶液、6.9ミリモル、17.5 eq.)を徐々に添加した(〜15分間)。反応混合液をRTまで加温し、1時間撹拌した。その後、反応混合液をpＨ〜4まで酸性にして過剰のBH3を急冷し、次にNaHCO3水溶液を添加してpＨ〜9-10に調整し、減圧下でTHFを除去し、粗物質をH2OとEtOAc間に分配した。水層をEtOAcで再抽出し、合わせた有機層を食塩水で洗浄し、無水MgSO4で乾燥し、減圧下で蒸発乾固した。粗物質を溶離剤としてEtOAc/ヘキサン/NH4OH (8:2:0.5)を用いたフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製して純粋な化合物26eを収率57% (192 mg)で得た。
【０１８７】
D.  CH2Cl2 (8 ml)中の化合物26eの溶液にデス・マルチン過ヨウ素酸塩(195 mg、97%、0.33ミリモル、1.5 eq)を添加し、反応混合液をRTで 1.5時間撹拌した。反応液をNa2S2O3水溶液(3 mlの5% 溶液)を添加することにより急冷し、次にNaHCO3 (5 ml)飽和水溶液を添加し、混合液をRTで15分間撹拌した。最後に、反応粗製物をEtOAcで抽出し、有機層を5% NaHCO3水溶液及び食塩水で洗浄し、無水MgSO4で乾燥し、減圧下で蒸発させて188 mgのアルデヒド28fを得、これを精製せずに次の工程に用いた。
E.  エタノール(5 ml)中の化合物26f (188 mg、0.22ミリモル)、CH3CO2H (38μl)及びPd(OH)2 (25 mg)の溶液を大気圧のH2下に16時間RTまで撹拌した。その後、より多くのH2ガス、Pd(OH)2 (180 mg)及び CH3CO2H (154μl)をフラスコに添加し、撹拌を更に24時間続けた。次に、混合液をろ過し、溶媒を蒸発乾固し、粗大環状生成物をCHCl3/MeOH/AcOH (10:2:1)を用いたフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製して化合物26gを収率〜30%(48 mg)で得た。
【０１８８】
F.  CH2Cl2 (5 ml)中の化合物26g (22 mg、0.031ミリモル)、DIPEA (27μl、0.155ミリモル、5 eq.)及び酢酸無水物(8.7μl、0.093ミリモル、3 eq.)の混合液をRTで16時間撹拌した。次に、CH2Cl2を減圧下で除去し、THF/MeOH/H2O (2:2:1、5 ml)とLiOH.2H2O (13 mg、0.31ミリモル、10 eq.)の混合液を添加し、加水分解反応をRTで68時間及び50℃で2時間進行させた。次に、反応混合液を酸性(pH=〜4)にし、逆相HPLCで精製して最終化合物508を得た(〜6 mg、〜26%、最後の2工程の収率)。
508 (COSY、TOCSY及びROESY NMRデータで確認した回転異性体の混合物)の1H NMR (DMSO, 400 MHz): δ1.18 (s, 9H), 1.09-1.85 (重複m, 11H), 1.95 (s, 3H), 2.30 (m, 1H), 2.63 (m, 1H), 3.18-4.14 (重複m, 6H), 3.96 (s, 3H), 4.44 (m, 1H), 4.62 & 4.69 (2d, J =11.8 Hz, 1H, 回転異性体), 5.82 (bs, 1H), 7.20 (m, 2H), 7.53 (bs, 1H), 7.67 (bs, 4H), 8.19 (bs, 3H), 8.61 (s, 1H).
【０１８９】
実施例  27
飽和大環状中間体(27a)の合成
【０１９０】
【化７２】
0003754298.tif 000057
【０１９１】
A.  不飽和大環状中間体23b (3.50 g、7.30ミリモル)をEtOAc (30 ml)に溶解し、700 mg (20% w/w)の5% Rh/アルミナを添加した。混合液を大気圧のH2ガス下、RTで1.5時間撹拌した。その後、HPLC分析により、出発物質の2つの生成物、所望の生成物27aとシクロプロパン環の開環から生成した化合物27bであることが後に同定された少量の生成物(全質量の8%)への完全な変換を確認した。反応混合液をろ過し、濃縮して薄緑色の固形物(3.47 g)を得た。固形物をEtOHで2回共蒸発させてEtOAcを全部除去した(EtOAcの存在は次の工程に妨害になる)。化合物27aの27bからのクロマトグラフィーによる分離が非常に難しいことがわかったので、それぞれのメチルエステル部分の加水分解の相対速度に基づく代替的方法を講じた。
【０１９２】
B.  化合物27aと27b (3.47g)の粗混合物をTHF:MeOH (1:1、20 ml)に溶解し、LiOH・H2O (24 mg、5 ml H2O中、8% eq)の水溶液を添加し、反応混合液をRTで16時間撹拌した(副生成物27bの対応する酸27cへの完全な加水分解はHPLCで確認した)。反応混合液を減圧下で濃縮してほとんどのTHFとMeOHを除去し、H2O (100 ml)とEtOAc (300 ml)間に分配した。有機層を0.5 N NaOH (3×100 ml)、食塩水(100 ml)、10% クエン酸水溶液(2×100 ml)、食塩水(100 ml)で洗浄し、無水MgSO4で乾燥し、ろ過し、濃縮乾固した。所望の生成物27aを高純度(HPLCにより>90%)で薄緑色泡状物として2工程の全収率93%で得た。
1H NMR: (400 MHz, CDCl3): δ 1.1-1.38 (m, 13 H), 1.42 (s, 9 H), 1.51-1.57 (m, 1 H), 1.63-1.67 (dd, J = 8.0 & 5.1 Hz, 1 H), 1.81-1.87 (m, 1 H), 1.92-1.99 (m, 1 H), 2.02-2.08 (m, 1 H), 2.62 (d, J = 14 Hz, 1 H), 3.4 (d, J= 8.3, 1H), 3.65 (s, 3H), 4.01 (dd, J = 10.8 & 4.1 Hz, 1 H), 4.42-4.48 (m, 1 H), 4.51-4.55 (m, 1 H), 4.87 (d, J = 8.6 Hz, 1 H), 5.14 (d, J = 8.6 Hz, 1 H), 7.97 (br s, 1 H).
【０１９３】
実施例  28
化合物 #741 (表7)の合成
【０１９４】
【化７３】
0003754298.tif 000058
【０１９５】
キノリン誘導体8fを、光延反応によって予め生成した大環状化合物23bに結合した。 キノリン誘導体8f (30 mg、0.095ミリモル)をTHFに溶解してから大環状化合物23b (45.6 mg、1 eq.)とPPh3  (49.8 mg、2 eq.)を添加した。得られた混合液を0℃まで冷却した。次に、DIAD (37.4μl、2 eq.)を滴下した。その溶液を0℃で1時間撹拌してから、室温で一晩撹拌した。 次に、混合液をEtOAc (15 ml)で希釈し、NaHCO3飽和溶液(15 ml)、次に食塩水で洗浄した。その溶液をMgSO4で乾燥し、ろ過し、減圧下で濃縮した。202 mgの黄色油状物を得た。生成物をシリカゲル(100% EtOAc)によるフラッシュクロマトグラフィーで精製した。精製後も生成物はDIAD副生成物を含有した。得られた生成物は、55% w/wの所望の生成物を含有したので、収率は62%であった。
【０１９６】
エステル中間体(46 mg、0.06ミリモル)をTHF/MeOH/H2O (2:1:1比、2 ml)の混合液に溶解し、LiOH・H2O (20 mg、0.48ミリモル)を添加し、その溶液をRTで撹拌した。16時間後、HPLCによる反応混合液の分析により加水分解が完了したことが示された。有機溶媒を減圧下で除去し、DMSOに溶解した残っている粗物質をC18逆相HPLCで精製して純粋な阻害剤741を得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ(ppm): 8.67 (s, 1H), 8.29-8.14 (m, 2H), 8.08-7.97 (m, 1H), 7.91-7.78 (m, 1H), 7.74 (s, 1H), 7.31-7.20 (m, 1H), 7.10 (d, J = 5.7 Hz, 1H), 5.82-5.71 (m, 1H), 5.58-5.47 (m, 1H), 5.32-5.23 (m, 1H), 4.74-4.64 (m, 1H), 4.55-4.47 (m, 1H), 4.23-4.06 (m, 1H), 4.04-3.94 (m, 1H), 3.97 (s, 3H), 3.92-3.85 (m, 1H), 2.70-2.55 (m, 2H), 2.53-2.36 (m, 2H), 2.20-2.09 (m, 1H), 1.80-1.62 (m, 2H), 1.56-1.43 (m, 2H), 1.42-1.29 (m, 6H), 1.27 (d, J = 3.2 Hz, 3H), 1.25 (d, J = 2.9 Hz, 3H), 1.12 (s, 9H).
MS: 763.1 (M+1), 761.1 (M-1).
【０１９７】
実施例  29
化合物205 (表2)の合成
【０１９８】
【化７４】
0003754298.tif 000059
【０１９９】
(25a)                      化合物205
0°におけるt-ブタノール/H2O (1.5 ml/1.5 ml)中の大環状化合物25a (21 mg、0.035ミリモル)の溶液にt-ブタノール(0.36 mlの35% w/v、0.035ミリモル)中のOsO4の溶液を添加し、混合液をRTで1時間撹拌した。混合液をEtOAc (20 ml)で希釈し、有機溶液を5% NaHCO3 (2×10 ml)、食塩水(2×10ml)で洗浄し、乾燥し、蒸発乾固した。粗化合物をTHF/MeOH/H2O (3 ml/1.5 ml/1.5 ml)に取り、LiOH・H2O (13 mg、0.28ミリモル)の存在下に16時間撹拌した。混合液を0.5 N氷冷HClでpＨ4まで酸性にし、蒸発させ、H2O (0.06%TFA)〜40% 水性CH3CN (0.06% TFA)の溶媒勾配を用いたC18逆相HPLCにより精製した。synジオール205を高純度で無定形白色固形物として単離した。
化合物 #205: 1H NMR (DMSO, 400 MHz): δ1.01 (s, 9H), 1.06-1.30 (m, 9H), 1.48-1.68 (m, 3H), 1.78-1.88 (m, 1H), 〜2.2-2.5 (2m, 2H), 3.78-3.82 (m, 1H), 3.86-3.90 (m, 1H), 4.39 (t, J = 8.9 Hz, 1H), 4.61 (d, J = 11.4 Hz, 1H), 5.60 (bs, 1H, Pro-γ), 7.03 (d, J = 6.0 Hz, 1H), 7.40 (bs, 1H), 7.58-7.62 (m, 1H), 7.87-7.91 (m, 1H), 8.00 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 8.24 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 8.60 (s, 1H), 8.99 (bs, 1H).
EMS (負のイオン化モード): m/z 625 (M-H)-.
【０２００】
実施例  30
化合物214 & 218 (表2)の合成
【０２０１】
【化７５】
0003754298.tif 000060
【０２０２】
A.  MeOH/H2O (5 ml / 2 ml)中のケトノネノエートエステル16d (0.180 g、0.6ミリモル)の溶液をLiOH・H2O (50 mg、1.2ミリモル)の存在下にRTで1時間撹拌した。 その溶液を0.5 N氷冷HClでpＨ6まで酸性にし、ほとんどのMeOHを蒸発させた。 次に、残留物をEtOAc (30 ml)に溶解し、0.5 N氷冷HCl (10 ml)、食塩水(10 ml)で洗浄し、乾燥し、蒸発させた。次に、粗残留物をCH2Cl2 (10 ml)に再溶解し、HATU (233 mg、0.612ミリモル)とDIPEA (420μｌ、2.4ミリモル)の存在下にP1-P2断片30a (0.337 g、0.6ミリモル)とRTで16時間反応させた。反応混合液を溶離剤としてEtOAc/ヘキサン(1/1)を用いたシリカゲルによりクロマトグラフィー処理して純粋な化合物30b (0.370 g、収率83%、HPLCによる純度 >95%)を単離した。
1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ1.41 (s, 9H), 1.45-1.54 (m, 1H), 1.58-1.62 (m, 1H), 1.73-1.77 (m, 1H), 1.86-1.91 (m, 1H), 2.16 (dd, J = 17.8 & 8.6 Hz, 1H), 2.26-2.43 (2m, 2H), 2.46-2.58 (m, 2H), 2.64-2.81 (m, 1H), 2.85-2.92 & 2.95-3.03 (2m, 1H, 1:3比の回転異性体), 3.67 (s, 3H), 3.95 (s, 3H), 4.10-4.18 (m, 1H), 4.20-4.30 (m, 1H), 4.40-4.55 (m, 1H), 4.80-4.88 (m, 1H), 4.92-5.10 (m, 2H), 5.14 (dd, J = 10.2 & 1.6 Hz, 1H), 5.24-5.38 (m, 4H), 5.42-5.54 (m, 1H), 5.68-5.86 (m, 2H), 7.04-7.14 (m, 2H), 7.42-7.64 (m, 5H), 7.92-8.12 (m, 3H).
【０２０３】
B.  ジエン30b (0.370 g、0.49ミリモル)をCH2Cl2 (CaH2から蒸留し、アルゴンで30分間脱ガスした)中ビス(トリシクロヘキシルホスフィン)ベンジリデンルテニウムIVジクロリド触媒(0.125 mg、0.15ミリモル)の存在下に2時間かけて還流下に環化した。EtOAc/ヘキサン(3/1)を用いたシリカゲルによるフラッシュカラムクロマトグラフィー処理した後化合物を立体異性体の混合物(30cと30d 1:1比)として収率35% (0.124 g)で得た。
混合物30c & 30dの1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ1.44 (s, 4H) & 1.37 (s, 4H), 1.60 (m, 2H), 1.83 (m, 0.5H), 2.01 (m, 1H), 2.09 (m, 1H), 2.42 (m, 5H), 2.73 (m, 2H), 3.26 (m, 0.5H), 3.69 (s, 1.5H), 3.76 (s, 1.5H), 3.96 (s, 3H), 4.10 (m, 1H), 4.24 (m, 0.5H), 4.10 (m, 0.5H), 4.58 (m, 1H), 4.73 (m, 1H), 4.89 (m, 0.5H), 4.97 (m, 0.5H), 5.30 (m, 0.5H), 5.44 (m, 2H), 5.64 (m, 1H), 7.1-7.0 (m, 3H), 7.47 (m, 4H), 8.08-7.98 (m, 3H).
【０２０４】
C,D.  メチルエステル30c及び30d (24 mg、0.033ミリモル)の加水分解をTHF/MeOH/H2O (1 ml/0.5 ml/0.5 ml)中でLiO・H2O (11 mg、0.246ミリモル)を用いてRTで16時間かけて行った。その後、反応混合液をpＨ4〜5まで酸性にし、H2O (0.06% TFA)〜50% CH3CN水溶液(0.06% TFA)の溶媒勾配を用いたC18逆相HPLCカラムによりクロマトグラフィー処理した。2つの化合物の混合物から所望の化合物214及び218を高純度(HPLCにより純度94%)で収率15% (3 mg)で単離した。
化合物214: 1H NMR (DMSO, 400 MHz) δ1.15 (s, 9H), 1.48-1.54 (m, 2H), 1.65-1.74 (m, 1H), 1.77-1.85 (m, 1H), 2.12-2.25 (m, 4H), 2.27-2.34 (m, 1H), 2.61-2.68 (m, 1H), 2.87 (bt, J = 11.5 Hz, 1H), 3.92 (dd, J = 9.2 & 1.5 Hz, 1H, Pro-δ), 3.97 (s, 3H, -OCH3), 4.14-4.20 (m, 1H), 4.52 (t, J = 7.8 Hz, 1H, Pro-α), 4.66 (d, J = 11.8 Hz, 1H, Pro-δ), 5.45 (t, J = 9.9 Hz, 1H), 5.51-5.58 (m, 1H), 5.82 (bs, 1H, Pro-γ), 7.09 (d, J = 6.0 Hz, 1H, BocNH), 7.26 (bs, 1H), 7.53 (s, 1H), 7.67 (bs, 3H), 8.16 (d, J = 2 Hz, 1H), 8.18 (s, 1H), 8.83 (s, 1H, ACCA-NH).
化合物218: 1H NMR(DMSO, 400 MHz): δ1.06-1.10 (m, 1H), 1.18 (s, 9H), 1.52-1.55 (m, 1H), 1.62-1.80 (m, 1H), 2.10-2.68 (重複, 9H), 3.90 (bd, J = 8.3 Hz, 1H), 3.96 (s, 3H, OCH3), 4.20-4.27 (m, 1H), 4.58-4.63 (m, 1H, Pro-δ), 4.66 (dd, J = 8.3 Hz, 1H, Pro-α) 4.88 (dd, J = 10.2 Hz, 1H), 5.18-5.26 (m, 1H), 5.73-5.79 (m, 1H, Pro-γ), 7.01 (d, J = 6.4 Hz, 1H), 7.23 (bs, 1H), 7.50 (bs, 1H), 7.66 (bs, 3H), 8.20 (bs, 2H), 8.53 (s, 1H).
【０２０５】
実施例  31
化合物209 (表2)の合成
【０２０６】
【化７６】
0003754298.tif 000061
【０２０７】
A.  ジエン31a (249 mg、0.330ミリモル)を30 mlの無水CH2Cl2に溶解し、その溶液をアルゴンで15分間脱ガスした。触媒のビス(トリシクロヘキシルホスフィン)ベンジリデンルテニウムIVジクロリド(82 mg、0.100ミリモル)を3 mlの脱ガスした無水CH2Cl2に溶解し、ジエン溶液に添加した。反応混合液をN2下で2時間還流した。その溶液を濃縮し、フラッシュクロマトグラフィーで精製して化合物31bを褐色固形物として収率71% (171 mg)で得た。
1H NMR (CDCl3, 400 MHz):  δ1.22-1.44 (m, 10H), 1.42 (s, 9H), 1.66-1.74 (m, 1H), 1.87-1.97 (m, 2H), 2.13-2.28 (m, 3H), 2.32-2.39 (m, 1H), 3.08-3.16 (m, 1H), 3.41 (s, 3H), 4.07-4.22 (m, 3H), 4.28-4.34 (m, 1H), 4.58-4.64 (m, 1H), 4.95-4.99 (m, 1H), 5.22-5.29 (m, 2H), 5.38-5.43 (m, 1H), 5.48-5.56 (m, 1H), 7.00-7.12 (m, 3H), 7.43-7.55 (m, 4H), 7.97-8.11 (m, 3H).
ES(+)MS: m/z 727.4 (M+H)+.
【０２０８】
B.  化合物31b (0.117ミリモル)をHCl溶液(1 ml、4N、ジオキサン中)中で30分間撹拌し、濃縮乾固した。固形物をCH2Cl2 (2 ml)に溶解し、Et3N (82μl、0.585ミリモル)とt-ブチルイソシアネート(35 mg、0.351ミリモル)を連続して添加した。RTで20時間撹拌した後、混合液を濃縮乾固し、粗化合物31cを精製せずに最後の加水分解工程に用いた。
D.  化合物31c (85 mg、0.117ミリモル)をTHF/MeOH/H2O (2 ml/1 ml/1 ml)に溶解し、LiOH・H2O (39 mg、0.936ミリモル)を添加し、その溶液をRTで20時間撹拌した。その後、酢酸(1 ml)を添加し、その溶液を濃縮してMeOHとTHFを除去した。 粗製物をC18逆相HPLCで精製した後に純粋な化合物209を単離した(25 mg、〜31%の収率)。
1H NMR (DMSO, 400 MHz): δ1.04 (s, 9H), 1.15-1.24 (m, 2H), 1.30-1.40 (m, 5H), 1.44-1.51 (m, 2H), 1.54-1.68 (m, 1H), 1.75-1.88 (m, 1H), 2.18 (dd, J = 17.2 & 8.5 Hz, 1H), 2.32-2.45 (m, 1H, Pro-β), 2.54-2.62 (m, 1H), 2.65-2.68 (m, 1H, Pro-β), 3.91 (dd, J = 11.1 & 3.5 Hz, 1H, Pro-δ), 3.96 (s, 3H, -OCH3), 4.17-4.23 (m, 1H), 4.47 (dd, J = 8.6, 1H, Pro-α), 4.67 (bd, J = 7.9 Hz, 1H, Pro-δ), 5.30 (dd, J = 9.5 Hz, 1H), 5.52 (bdd, J = 19 & 8.3, 1H), 5.68 (s, 1H), 5.78 (bs, 1H, Pro-γ), 5.94 (bs, 1H), 7.21 (bs, 1H), 7.51 (bs, 1H), 7.66 (bs, 4H), 8.19 (s, 2H), 8.40 (d, J = 7 Hz, 1H), 8.61 (s, 1H, ACCA-NH).
ES(+)MS: m/z 698.3 (M+H)+.
【０２０９】
実施例  32
化合物#404及び#407 (表4)の合成
【０２１０】
【化７７】
0003754298.tif 000062
【０２１１】
A.  ジエン32a (84 mg、0.11ミリモル)を無水CH2Cl2 (11 ml)に溶解し、その溶液をアルゴン流を用いて15分かけて脱ガスした。ビス(トリシクロヘキシルホスフィン)ベンジリデンルテニウムIVジクロリド触媒(19 mg、0.023ミリモル)を、まず、1 mlの脱ガスCH2Cl2に溶解してから、カニューレで反応フラスコに移した。反応混合液を還流下に2時間撹拌した。次に、溶媒を減圧下で除去し、反応混合液を溶離剤としてEtOAc/ヘキサン(1:1)を用いたシリカゲルによるフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製して大環状化合物32bを黄色の油状物として得た(33 mg、収率41%).
B.  エステル中間体32b (33 mg、0.045ミリモル)をTHF/MeOH/H2O (2:1:1比、2 ml)の混合液に溶解し、LiOH・H2O (8 mg、0.18ミリモル)を添加し、その溶液をRTで撹拌した。16時間後、HPLCによる反応混合液の分析は加水分解が不完全であることを示した。従って、LiOH・H2O (4 mg、0.09ミリモル)の追加量を添加し、その溶液をRTで合計36時間撹拌した。最後に、その溶液を少量の酢酸アリコートで酸性にし、有機溶媒を減圧下で除去し、残存している粗物質をC18逆相HPLCで精製して純粋な阻害剤404を得た。
1H NMR (DMSO, 400MHz): δ1.21 (d, J = 6.0 Hz, 3H, Me), 1.36 (s, 9H, Boc), 1.1-1.4 (3m, 3H), 1.66 (m, 1H), 1.80 (m, 1H), 2.10 (m, 2H), 2.57 (m, 2H), 3.90 (m, 4H), 4.47 (bd, J=12.7 Hz, 1H), 4.58 (bd, J=7.3, 1H), 4.66 (dd, J=8.0 Hz, 1H), 5.57 (m, 1H), 5.66 (m, 1H), 5.83 (bs, 1H), 6.18 (bd, J=6.9 Hz, 1H), 7.25 (bd, J=7.3 Hz, 1H), 7.56 (bs, 1H), 7.70 (m, 4H), 8.22 (bd, J=2.9 Hz, 2H), 8.29 (bs, J=9.2 Hz, 1H).
【０２１２】
C.  阻害剤404 (15 mg、0.021ミリモル)をエタノール(2 ml)に溶解し、Pd 10%/C (2 mg)を添加した。混合液を水素下にRTで16時間撹拌した。ろ過後、混合液をC18逆相HPLCで精製して阻害剤407を白色固形物(10 mg、収率66%)を得た。
1H NMR (DMSO, 400MHz): δ1.04 (m, 1H), 1.17 (d, J = 6.0 Hz, 3 H), 1.35 (s, 9H), 1.25-1.75 (m, 12 H), 2.32-2.45 (m, 1 H), 3.40-3.50 (m, 2 H), 3.74-3.83 (m, 1H), 3.85-3.93 (m, 1H), 3.97 (s, 3H), 4.27-4.36 (dd, J = 21.1 & 8.6 Hz, 1H), 4.54 (dd, J = 7.95 & 7.95 Hz, 1H), 5.64 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 5.82 (br s, 1H), 7.27-7.33 (m, 1H), 7.53-7.57 (bs, 1 H), 7.60-7.74 (m, 4 H), 8.13-8.27 (m, 3 H), 8.30-8.35 (br s, 1H).
【０２１３】
実施例  33
化合物#824 (表8)の合成
【０２１４】
【化７８】
0003754298.tif 000063
【０２１５】
A.  化合物33a (〜0.55ミリモル)をCH2Cl2 (100 ml)に溶解し、その溶液を注意して脱ガスした後にホベイダ触媒(17 mg、0.028ミリモル、0.05 eq.)の試料を添加した。次に、その溶液を還流下に5時間撹拌した。反応混合液を濃縮し、CH2Cl2/EtOAc (3:2〜2:3比)の溶媒勾配を用いたフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製して化合物33bを72%の収率(194 mg)で得た。
B.  0℃における無水THF (15 ml)中の化合物33b (70 mg、0.142ミリモル)、2-エトキシ-4-ヒドロキシ-7-メトキシキノリン 3c (63 mg、0.284ミリモル、2 eq.)及びPh3P (186 mg、0.71ミリモル、5 eq.)の溶液にDIAD (140μl、0.71ミリモル、5 eq.)を20分間かけて徐々に添加した。反応混合液を RTまで温め、RTで2.5時間撹拌した。続いて、THFを減圧下で蒸発させ、粗生成物をヘキサン/EtOAc (7:3〜1:1比)の溶媒勾配を用いたフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製した。純粋な化合物33cを73%の収率(72 mg)で単離した。
C.  化合物33c (72 mg、0.104ミリモル)をCH2Cl2 (5 ml)及びジオキサン(5 ml)中の4M HClと混合し、混合液をRTで1.5時間化合物してBoc保護基を切断するとともに中間体33dのHCl塩を得た。粗反応混合液を減圧下で蒸発乾固し、減圧下で乾燥して全HClの除去を確かめ、精製せずに次の工程に用いた。
【０２１６】
D.  THF (10 ml)中のシクロペンタノール(29μl、0.32ミリモル)の溶液に、トルエン中のホスゲン溶液(1.93 M、274μl、0.528ミリモル)を滴下し、混合液をR.T.で2時間乾固してシクロペンチルクロロホーメート試薬を形成した。その後、溶媒の約半分を減圧下で蒸発させることにより除去し、残存している薄黄色溶液をCH2Cl2 (5 ml)を添加することにより希釈し、最初の容量の半分まで再濃縮して過剰量の全ホスゲンの除去を確かめた。シクロペンチルクロロホーメート試薬の上記溶液を、更に、THF (10 ml)で希釈し、0℃まで冷却し、0℃において固体の化合物33d (0.104ミリモル)に添加した。Et3N (75μl、0.534ミリモル、5.2 eq.)を反応混合液に添加し、撹拌を0℃で1.5時間続けた。溶媒を減圧下で除去し、溶離剤としてEtOAc/ヘキサン(1:1)を用いたフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製して化合物33eをほとんどの定量的収量(75 mg)で得た。
【０２１７】
E.  THF/MeOH/H2O (2:2:1比、7.5 ml)中の溶媒混合液中で化合物33e (75 mg、0.11ミリモル)とLiOH.H2O (35 mg、0.84ミリモル、8 eq.)とを50℃で2.5時間反応させることによりメチルエステルの加水分解を達成した。加水分解を完了したときに、混合液をpＨ=4.5まで酸性にし、溶媒を減圧下で蒸発させた。粗生成物を、H2O〜58% CH3CN水溶液(0.06%TFAを含む)の溶媒勾配を用いたC18逆相分取用HPLCで精製して阻害剤 #824を白色無定形固形物(45 mg、収率65%)を得た。
#824のNa+ 塩の1H NMR (DMSO, 400 MHz): δ0.88 (d, J=6.7 Hz, 3H), 0.95-1.70 (重複共鳴, 17H), 1.37 (t, J=7 Hz, 3H), 2.00-2.10 (m, 1H), 2.10-2.33 (m, 3H), 2.38-2.44 (m, 1H), 3.80-3.85 (m, 1H), 3.85 (s, 3H), 4.02-4.08 (m, 1H), 4.42 (q, J=7 Hz, 2H), 4.35-4.44 (m, 1H), 4.50 (d, J=10.8 Hz, 1H), 4.63 (bs, 1H), 5.28 (dd, J=9.5 Hz, 1H), 5.38 (bs, 1H), 5.42-5.49 (m, 1H), 6.37 (s, 1H), 6.87 (dd, J=8.9 & 2.2 Hz, 1H), 7.07 (d, J=2.2 Hz, 1H), 7.28 (d, J=7.0 Hz, 1H), 7.90 (d, J=8.9 Hz, 1H), 8.57 (s, 1H).
【０２１８】
実施例  34
化合物 #812 (表8)の合成
【０２１９】
【化７９】
0003754298.tif 000064
【０２２０】
【化８０】
0003754298.tif 000065
【０２２１】
A.  0℃におけるTHF (450 ml)中の大環状中間体23b (13.05 g、27.2ミリモル、1.0 eq.)、Ph3P (14.28 g、54.4ミリモル、2.0 eq)及び2-カルボキシメトキシ-4-ヒドロキシ-7-メトキシキノリン (国際出願第00/09543号 & 同第00/09558号) (6.67 g、28.6ミリモル、1.05 eq)の溶液に、DIAD (10.75 ml、54.6ミリモル、2.0 eq)を15分間かけて滴下した。次に、氷浴を除去し、反応混合液をRTで3時間撹拌した。出発物質を生成物に完全に変換した後、溶媒を減圧下で蒸発させ、残存している混合液をEtOAcで希釈し、NaHCO3飽和液(2×)及び食塩水(1×)で洗浄し、有機層を無水MgSO4で乾燥し、ろ過し、蒸発乾固した。フラッシュカラムクロマトグラフィー後に純粋な化合物34aを得た; カラムを、まずヘキサン/EtOAc (50:50)、次にCHCl3/EtOAc (95:5)で溶離してPh3POとDIAD副生成物を除去し、不純物を溶離をTLCでモニターした。最後に、CHCl3/EtOAc (70:30)でカラムから所望の生成物34aを溶離した。通常クロマトグラフィー工程は2〜3回繰り返さなければならない。その後、化合物34aが高純度で白色固形物として全収率68%で単離された(12.8 g、HPLCによる純度99.5%)。
【０２２２】
B.  CH2Cl2 (15 ml)中のBoc-保護中間体34a (1.567g)の溶液に、ジオキサン中の4N HCl(12 ml)を添加し、反応混合液をRTで1時間撹拌した。[反応時間の半分で濃いゲルが形成した場合には、10 mlのCH2Cl2を更に添加した。]  脱保護を完了したときに、溶媒を蒸発乾固して黄色固形物とペースト状物質を得た。混合物をCH2Cl2中の約5% MeOHに再溶解し、減圧下で再蒸発乾固して化合物34bを黄色固形物として得、これを精製せずに次の工程に用いた。
C.  THF (15 ml)中のシクロペンタノール(614μｌ、6.76 mmoL)の溶液に、トルエン中のホスゲン溶液(1.93 M、5.96 ml、11.502ミリモル)を滴下し、混合液をR.T.で2時間撹拌してシクロペンチルクロロホーメート試薬(z)を形成した。その時間後、約半量の溶媒を減圧下で蒸発させることにより除去し、残存している薄黄色溶液を、CH2Cl2 (5 ml)を添加して希釈し、最初の量の半分まで濃縮して過剰量のホスゲンの除去を確かめた。シクロペンチルクロロホーメート試薬の上記溶液を、更に、THF (15 ml)で希釈し、アミン-2HCl塩34bに添加した。混合液を氷浴中0℃まで冷却し、Et3Nを添加(滴下)してpＨ〜8.5-9まで調整し、反応混合液を0℃で1時間撹拌した。その後、混合液をEtOAcで希釈し、水(1×)、NaHCO3飽和液(2×)、H2O (2×)及び食塩水(1×)で洗浄した。有機層を無水MgSO4で乾燥し、ろ過し、減圧下で蒸発して黄色〜琥珀色の泡状物を得た。フラッシュカラムクロマトグラフィー(溶離剤としてEtOAc中30% ヘキサン〜20% ヘキサンの溶媒勾配を用いて)で精製した後に化合物34cを白色泡状物として収率80% (1.27 g)、純度 >93%で得た。
【０２２３】
D.  ジメチルエステル34c (1.17g)をTHF/MeOH/H2O (20 ml、2:1:1比)の混合液に溶解し、NaOH (1.8 ml、1N、1 eq.)の水溶液を添加した。反応混合液をRTで1時間撹拌した後、蒸発乾固してナトリウム塩34dを白色固形物(〜1.66ミリモル)を得た。化合物34dを精製せずに次の工程に用いた。
E.  粗ナトリウム塩34d (1.66ミリモル)をTHF (17 ml)に溶解し、Et3Nを添加し、混合液を氷浴中で0℃まで冷却した。イソブチルクロロホーメート(322μl、2.5ミリモル)を滴下し、混合液を0℃で75分間撹拌した。その後、ジアゾメタン(15 ml)を添加し、0℃で30分間、次にRTで更に1時間撹拌を続けた。減圧下でほとんどの溶媒を蒸発乾固し、残存している混合物をEtOAcで希釈し、NaHCO3飽和液(2×)、H2O (2×)及び食塩水(1×)で洗浄し、無水MgSO4で乾燥し、ろ過し、蒸発乾固して化合物34eを薄黄色の泡状物として得た(1.2g、〜1.66ミリモル)。ジアゾケトン中間体34eを精製せずに次の工程に用いた。
F.  THF (17 ml)に溶解したジアゾケトン34e (1.2g、1.66 mmoL)を氷浴中で0℃まで冷却した。HBr水溶液(48%、1.24 ml)を滴下し、反応混合液を0℃で1時間撹拌した。次に、混合液をEtOAcで希釈し、NaHCO3飽和液(2×)、H2O (2×)及び食塩水(1×)で洗浄し、有機層を無水MgSO4で乾燥し、ろ過し、蒸発乾固してβ-ブロモケトン中間体34fを薄黄色泡状物(〜1.657ミリモル)として得た。
【０２２４】
G.  イソプロパノール(5 ml)中のブロモケトン34f (600 mg,0.779ミリモル)の溶液にチオウレア(118 mg、1.55ミリモル)を添加し、反応混合液を75℃に予熱した油浴に入れ、そこで1時間撹拌した。次に、イソプロパノールを減圧下で除去し、生成物をEtOAc (100 ml)に溶解した。その溶液をNaHCO3飽和液と食塩水で洗浄し、有機層を無水Na2SO4で乾燥し、ろ過し、蒸発させて粗生成物34g (522 mg)を赤色〜褐色固形物として得た。この物質を精製せずに最後の工程に用いた。
H.  粗メチルエステル34g (122 mg、0.163ミリモル)をTHF/MeOH/H2O溶液(2:1:1比、4 ml)に溶解し、LiOH・H2O (89 mg、2.14ミリモル)を用いてケン化した。加水分解反応をRTで12〜15時間かけて行った。次に、溶媒を減圧下で除去し、H2O中の10% CH3CN〜100% CH3CNの溶媒勾配を用いたC18逆相HPLCで精製してHCVプロテアーゼインヒビター #812を黄色の固形物として得た(24 mg、中間体34fのインヒビター #812への変換の全収率20%)。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ8.63 (s, 1H), 8.26-8.15 (m, 2H), 7.79 (bs, 1H), 7.72 (bs, 1H), 7.50 (bs, 2H), 7.33-7.25 (m, 2H), 5.77 (bs, 1H), 5.52 (dd, J = 8.3 Hz, 1H), 5.27 (dd, J = 9.2 Hz, 1H), 4.64 (d, J = 10.8 Hz, 1H), 4.50 (dd, J = 8.3 Hz, 1H), 4.39-4.31 (m, 1H), 4.08-3.99 (m, 2H), 3.94 (s, 3H), 3.87 (d, J = 9.5 Hz, 2H), 2.65-2.53 (m, 2H), 2.46-2.36 (m, 2H), 2.20-2.12 (dd, J = 8.6 Hz, 1H), 1.80-1.64 (m, 2H), 1.63-1.06 (m, 14H). MS; es+: 733.2 (M + H)+, es-: 731.2 (M  H)-.
【０２２５】
実施例34A
ブロモケトン34fと市販のN-メチルチオウレアとを反応させる以外は実施例34と同様の手順を用いて# 811 (表8)を得た。
【０２２６】
【化８１】
0003754298.tif 000066
【０２２７】
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ8.63 (s, 1H), 8.20 (s, 1H), 8.18 (s, 1H), 8.12-7.93 (m, 1H) , 7.88-7.69 (m , 2H), 7.32-7.24 (m, 2H), 5.82-5.75 (m, 1H), 5.52 (ddd, J= 8.1 Hz, 1H),  5.28 (dd, J= 9.9 Hz, 1H), 4.67-4.61 (m, 1H),  4.51 (dd , J= 8.8 Hz, 1H),  4.44-4.37 (m, 1H),  4.08-4.00 (m, 1H) ,  3.96 (s, 3H), 3.89 (m, 1H),  3.04 (d, J= 4.1 Hz, 3H),  2.65-2.37 (m, 3H), 2.16 (m, 1H), 1.77-1.65 (m, 2H) ,  1.63-1.11 (m, 17H). MS; es+: 747.2 (M + H)+, es-: 745.3 (M - H)-.
【０２２８】
実施例34B
ブロモケトン34fと市販のN-エチルチオウレアとを反応させる以外は実施例34と同様の手順を用いて# 810 (表8)を得た。
【０２２９】
【化８２】
0003754298.tif 000067
【０２３０】
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ8.63 (s, 1H), 8.27 (bs, 1H), 8.20 (d, J= 9.0 Hz,  1H), 8.13-8.07 (m , 1H), 7.86 (bs , 1H), 7.78 (s, 1H), 7.33-7.25 (m, 2H), 5.81 (bs, 1H), 5.54 (dd, J= 8.8 Hz, 1H), 5.28 (dd, J= 9.7 Hz, 1H), 4.65 (d, J= 12.4 Hz, 1H), 4.51 (dd , J= 8.8 Hz, 1H), 4.38 (bs, 1H), 4.03 (m, 1H), 3.97 (s, 3H), 3.92-3.87 (m, 1H), 3.54-3.46 (m, 2H), 2.68-2.65 (m, 2H), 2.47-2.38 (m, 1H), 2.15 (dd, J= 8.6 Hz, 1H), 1.78-1.65 (m, 2H), 1.60-1.12 (m, 17H), 1.25 (t, J= 7.3Hz, 3H).  MS; es+: 783.2 (M + Na)+, es-: 761.2 (M + H)+.
【０２３１】
実施例34C
ブロモケトン34fと市販のN-イソプロピルチオウレアとを反応させる以外は実施例34と同様の手順を用いて # 822を得た。
【０２３２】
【化８３】
0003754298.tif 000068
【０２３３】
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ8.63 (s, 1H), 8.33-8.23 (bs, 1H), 8.21 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 8.04 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.86 (bs, 1H), 7.77 (s, 1H), 7.35-7.23 (m, 2H), 5.81 (bs, 1H), 5.52 (dd, J = 8.5 Hz, 1H), 5.27 (dd, J = 9.2 Hz, 1H), 4.65 (d, J = 11.8 Hz, 1H), 4.51 (dd, J = 7.6 Hz, 1H), 4.37 (bs, 1H), 4.15 (bs, 1H), 4.07-3.98 (m, 2H), 3.97 (s, 3H), 3.88 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 2.60-2.53 (m, 2H), 2.47-2.37 (m, 2H), 2.19-2.10 (dd, J = 9.2 Hz, 1H), 1.80-1.64 (m, 2H), 1.63-1.29 (m, 13H), 1.27 and 1.25 (2×d, J = 6.5 Hz, 6H), 1.23-1.09 (m, 2H). MS; es+: 775.0 (M + H)+, es-: 772.9 (M - H)-.
【０２３４】
実施例34D
ブロモケトン34fと市販のN-アセチルチオウレアとを反応させる以外は実施例34と同様の手順を用いて # 809を得た。
【０２３５】
【化８４】
0003754298.tif 000069
【０２３６】
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ8.62 (s, 1H), 8.30 (bs, 1H), 8.17 (d, J= 8.9 Hz, 1H), 7.62 (bs , 1H) , 7.52 (bs , 1H), 7.28 (d, J= 6.4Hz, 1H), 7.21 (bs, 1H),  5.63 (bs, 1H), 5.54 (dd, J= 8.1 Hz, 1H),  5.28 (dd, J= 9.5Hz, 1H), 4.62 (d, J= 12.1 Hz, 1H),  4.56-4.46 (m , 2H),  4.11-4.04 (m, 1H), 3.95 (s, 3H) , 3.93-3.88 (m, 1H), 2.62-2.54 (m, 1H), 2.45-2.36 (m, 1H) , 2.22 (s, 3H), 2.21-2.13 (m, 1H), 1.79-1.69 (m, 2H), 1.65-1.30 (m, 16H), 1.26-1.12 (m, 2H).  MS; es+: 775.3 (M + H)+, es-: 773.3 (M - H)-.
【０２３７】
実施例34E
RTにおけるCH2Cl2 (5 ml)中の2-アミノ-4-チアゾリル中間体34g (0.24 g、0.32ミリモル)の撹拌溶液にDIPEA (0.55 ml、3.18ミリモル、10 eq)とメチルクロロホーメート(0.13 ml、1.6ミリモル、5 eq)を添加した。反応混合液を6.5時間撹拌した後に減圧下で濃縮した。次に、単離した粗物質を実施例34に記載される所望のカルボン酸に加水分解して化合物 # 818を得た。
【０２３８】
【化８５】
0003754298.tif 000070
【０２３９】
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ8.61 (s, 1H), 8.21-8.07 (m, 2H), 7.61-7.38 (m, 2H), 7.26 (d, J = 6.4 Hz, 1H), 7.19-7.10 (m, 1H), 5.60-5.47 (m, 2H), 5.27 (dd, J = 9.2 Hz, 1H), 4.63-4.53 (m, 1H), 4.47 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 4.13-4.04 (m, 1H), 3.93 (s, 3H), 3.92-3.87 (m, 2H), 3.79 (s, 3H), 2.42-2.30 (m, 2H), 2.17 (dd, J = 9.2 Hz, 1H), 1.81-1.68 (m, 2H), 1.63-1.29 (m, 16H), 1.23-1.10 (m, 2H). MS; es+: 791.1 (M + H)+, es-: 789.1 (M - H)-.
【０２４０】
実施例34F
イソブチルクロロホーメートを用いた以外は上記実施例 34Eに記載された条件に従って、類似の置換カルバメート中間体を得た。次に、単離した粗物質を所望の化合物 # 819に加水分解した。
【０２４１】
【化８６】
0003754298.tif 000071
【０２４２】
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ8.62 (s, 1H), 8.47-8.27 (bs, 1H), 8.18 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.69-7.60 (m, 1H), 7.60-7.51 (m, 1H), 7.28 (d, J = 6.7 Hz, 1H), 7.28-7.19 (m, 1H), 5.70-5.60 (m, 1H), 5.52 (dd, J = 8.3 Hz, 1H), 5.27 (dd, J = 9.8 Hz, 1H), 4.63 (d, J = 11.8 Hz, 1H), 4.53-4.44 (m, 2H), 4.10-3.99 (m, 1H), 4.04 (d, J = 6.7 Hz, 2H), 3.95 (s, 3H), 3.94-3.87 (m, 1H), 2.65-2.53 (m, 1H), 2.46-2.34 (m, 1H), 2.16 (dd, J = 8.1 Hz, 1H), 2.03-1.91 (m, 1H), 1.79-1.09 (m, 20H), 0.95 (d, J = 6.7 Hz, 6H). MS; es+: 833.2 (M + H)+, es-: 831.2 (M - H)-.
【０２４３】
実施例  35
化合物 #908の合成
誘導体27aから出発し、実施例34と同様の化学を用いて、次の飽和大環状化合物 # 908 (表9)を得た。
【０２４４】
【化８７】
0003754298.tif 000072
【０２４５】
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ8.47 (s, 1H), 8.16 (d, J = 10 Hz, 1H), 8.15-8.07 (m, 1H), 7.82-7.63 (m, 2H), 7.53-7.43 (m, 2H), 7.33-7.22 (m, 1H), 7.13 (d, J = 7 Hz, 1H), 5.77-5.65 (m, 1H), 4.62-4.52 (m, 2H), 4.50-4.4 (m, 1H), 4.20-4.10 (m, 1H), 3.94 (s, 3H), 3.89-3.83 (m, 1H), 2.59-2.53 (m, 1H), 2.48-2.40 (m, 1H), 1.79-1.0 (m, 25H);). MS; es+: 735.2 (M + H)+, es-: 733.2 (M - H)-.
【０２４６】
実施例  35A
化合物 #909の合成
市販のN-アセチルチオウレアを用いた以外は実施例35と同様の手順を用いて化合物 # 909 (表9)を得た。
【０２４７】
【化８８】
0003754298.tif 000073
【０２４８】
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ8.53-8.41 (m, 2H), 8.20 (d, J= 9.2 Hz, 1H), 7.68 (bs , 1H) , 7.68 (bs , 1H), 7.27 (dd, J= 9.2 Hz, 1H), 7.15 (d, J= 6.4 Hz,1H), 5.67 (bs, 1H), 4.65-4.50 (m, 3H), 4.44-4.37 (m, 1H),  4.21-4.13 (m, 1H) ,  3.96 (s, 3H), 3.99-3.86 (m, 1H), 2.62-2.39 (m, 2H), 2.24 (s, 3H), 1.78-1.67 (m, 3H) ,  1.67-1.01 (m, 22H).
MS; es+: 798.0 (M + Na)+, es-: 777.0 (M + H)+.
【０２４９】
実施例  35B
化合物 #910の合成
市販のN-エチルチオウレアを用いた以外は実施例35と同様の手順を用いて 化合物 # 910 (表9)を得た。
【０２５０】
【化８９】
0003754298.tif 000074
【０２５１】
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ8.47 (s, 1H), 8.29 (bs, 1H), 8.20 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 8.09 (bs, 1H), 7.87 (s, 1H), 7.77 (s, 1H), 7.32 (dd, J = 9.2 Hz, 1H), 7.14 (dd, J = 6.7 Hz, 1H), 5.78 (bs, 1H), 4.58 (dd, J = 8.1 Hz, 2H), 4.43 (bs, 1H), 4.18-4.12 (m, 1H), 3.97 (s, 3H), 3.87 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 3.55-3.46 (m, 2H), 2.63-2.53 (m, 1H), 2.47-2.41 (m, 1H), 1.78-1.00 (m, 25H), 1.25 (t, J = 7.3 Hz, 3H). ). MS; es+: 763.1 (M + H)+, es-: 761.1 (M - H)-.
【０２５２】
実施例  35C
化合物 #911の合成
市販のN-イソプロピルチオウレアを用いた以外は実施例35と同様の手順を用いて化合物 # 911 (表9)を得た。
【０２５３】
【化９０】
0003754298.tif 000075
【０２５４】
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ8.47 (s, 1H), 8.29-8.19 (m, 1H), 8.19 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 8.09-8.0 (m, 1H), 7.83 (bs, 1H), 7.74 (bs, 1H), 7.31 (d, J = 8 Hz, 1H), 7.14 (d, J = 6.4 Hz, 1H), 5.76 (bs, 1H), 4.64-4.53 (m, 2H), 4.44 (bs, 1H), 4.22-4.09 (m, 3H), 3.97 (s, 3H), 3.87 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 2.63-2.58 (m, 1H), 2.46-2.41 (m, 1H), 1.79-1.10 (m, 24H), 1.27 and 1.26 (2 x d, J = 6.5 Hz, 6H). MS; es+: 777.0 (M + H)+, es-: 775.0 (M - H)-.
【０２５５】
実施例  36
化合物 #716の合成
【０２５６】
【化９１】
0003754298.tif 000076
【０２５７】
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ(ppm): 8.62 (s, 1H), 8.13 (d, J=9.2 Hz, 1H), 7.64-7.54 (m, 2H), 7.47 (d, J=2.6 Hz, 1H), 7.16 (dd, J=9.2, 2.2 Hz, 1H), 7.03 (d, J=6.0 Hz, 1H), 5.63 (s, 1H), 5.52 (q, J=9.9 Hz, 1H), 5.26 (t, J=8.9 Hz, 1H),4.62 (d, J=11.45, 1H), 4.45 (dd, J=9.2, 8.27 Hz, 1H),4.02 (m, 1H) 3.93 (s, 3H), 3.7 (dd, J=7.6, 1.0 Hz, 1H), 2.66 (s, 3H), 2.55-2.65 (m, 1H), 2.35-2.45 (m, 1H), 2.17 (q, J=8.6 Hz, 1H), 1.65-1.75 (m, 2H), 1.5-1.35 (m, 7H), 1.15 (s, 9H).
MS : 705. (M+1), 703 (M-1)
【０２５８】
実施例  37
化合物 #717の合成
【０２５９】
【化９２】
0003754298.tif 000077
【０２６０】
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ(ppm): 8.62 (s, 1H), 8.15 (d, J=8.9 Hz, 1H), 7.62 (s, 1H), 7.49 (s, 1H), 7.19 (dd, J=9.2, 2.2 Hz, 1H), 7.02 (d, J=5.4 Hz, 1H), 5.64 (s, 1H), 5.52 (q, J=9.9 Hz, 1H), 5.26 (t, J=9.2 Hz, 1H),4.63 (d, J=11.44, 1H), 4.45 (t, J=9.2 Hz, 1H), 3.94 (s, 3H), 3.9-3.8 (m, 1H),2.7-2.55 (m, 1H), 2.4-2.3 (m, 1H), 2.18 (q, J=8.9 Hz, 1H), 1.75-1.65 (m, 2H), 1.5-1.2 (m, 7H), 1.14 (s, 9H).
MS : 705. (M+1), 703 (M-1).
【０２６１】
実施例  38
化合物 #718の合成
【０２６２】
【化９３】
0003754298.tif 000078
【０２６３】
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ(ppm): 9.55 (s, 1H), 8.63 (s, 1H), 8.43 (s, 1H), 8.13 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 7.66 (s, 1H), 7.46 (s, 1H), 7.32 (d, J = 2.6 Hz, 1H), 7.10-7.07 (m, 2H), 5.64-5.54 (m, 1H), 5.59-5.48 (m, 1H), 5.33-5.23 (m, 1H), 4.73-4.61 (m, 1H), 4.45 (dd, J = 7.5, 9.1 Hz, 1H), 4.09-4.00 (m, 1H), 3.92 (s, 3H), 3.93-3.83 (m, 1H), 2.67-2.55 (m, 2H), 2.53-2.43 (m, 1H), 2.42-2.31 (m, 1H), 2.23-2.12 (m,1H), 1.81-1.66 (m, 2H), 1.52-1.42 (m, 2H), 1.42-1.25 (m, 6H), 1.21 (s, 9H).
MS: 689.3 (M+1), 687.3 (M-1)
【０２６４】
実施例  39
化合物 #722の合成
【０２６５】
【化９４】
0003754298.tif 000079
【０２６６】
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ(ppm): 9.70 (s, 1H), 8.64 (s, 1H), 8.26 (s, 1H), 8.14 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 7.45 (s, 1H), 7.30 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 7.14-7.06 (m, 2H), 5.60-5.54 (m, 1H), 5.58-5.48 (m, 1H), 5.31-5.23 (m, 1H), 4.71-4.62 (m, 1H), 4.49-4.40 (m, 1H), 4.08-3.99 (m, 1H), 3.92 (s, 3H), 3.92-3.84 (m, 1H), 2.69-2.54 (m, 2H), 2.53-2.46 (m, 1H), 2.42-2.31 (m, 1H), 2.37 (s, 3H), 2.22-2.13 (m, 1H), 1.81-1.64 (m, 2H), 1.54-1.42 (m, 2H), 1.42-1.27 (m, 6H), 1.22 (s, 9H).
MS: 703.3 (M+1), 701.3 (M-1)
【０２６７】
実施例  40
化合物 #733の合成
【０２６８】
【化９５】
0003754298.tif 000080
【０２６９】
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ(ppm): 8.75 (m, 1H), 8.62 (s, 1H), 8.06 (d, J=9.2 Hz, 1H), 7.88-7.87 (m, 1H), 7.48 (s, 1H), 7.28 (d, J=2.6Hz, 1H), 7.05-7.00 (m, 2H), 6.64-6.63 (m, 1H), 5.62-5.58 (m, 1H), 5.55-5.49 (m, 1H), 5.28-5.24 (m, 1H), 4.64-4.61 (m, 1H), 4.48-4.44 (m, 1H), 4.07-4.03 (m, 1H), 3.91 (s, 3H), 3.92-3.85 (m, 1H), 2.67-2.54 (m, 2H),2.53-2.45 (m, 1H), 2.41-2.34 (m, 1H), 2.20-2.14 (m, 1H), 1.75-1.69 (m, 2H), 1.50-1.43 (m, 2H), 1.41-1.32 (m, 6H), 1.17 (s, 9H).
MS : 689.3 (M+1), 687.2 (M-1)
【０２７０】
実施例  41
化合物 # 703の合成
【０２７１】
【化９６】
0003754298.tif 000081
【０２７２】
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ8.50 (s, 1H), 8.19 (s, 1H), 8.17 (s, 1H), 8.11-8.00 (m, 1H), 7.88-7.77 (m, 1H), 7.73 (s, 1H), 7.25 (d, J = 8.6 Hz,  1H), 6.93 (d, J = 6 Hz,  1H), 5.89-5.68 (m, 1H), 4.62 (d, J = 11 Hz, 1H), 4.53 (dd, J = 8.3 Hz, 1H), 4.16-4.07 (m, 1H), 3.96 (s, 3H), 3.88 (bd, J = 9.5 Hz, 1H), 3.53-3.43 (m, 2H), 2.63-2.51 (m, 1H), 2.46-2.36 (m, 1H), 1.81-1.62 (m, 2H), 1.60-1.01 (m, 15H), 1.24 (t,  J = 7.4 Hz, 3H), 1.17 (s, 9H). MS; es+: 751.1(M + H)+, es-: 749.1- (M - H)-.
【０２７３】
実施例  42
化合物 #734の合成
【０２７４】
【化９７】
0003754298.tif 000082
【０２７５】
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ(ppm): 8.62 (s, 1H), 8.54 (s, 1H), 8.04 (d, J=9.2 Hz, 1H), 7.70 (s, 1H), 7.43 (s, 1H), 7.24 (d, J=2.6Hz, 1H), 7.05-6.98 (m, 2H), 5.57-5.54 (m, 1H), 5.55-5.48 (m, 1H), 5.28-5.24 (m, 1H), 4.63-4.59 (m, 1H), 4.47-4.43 (m, 1H), 4.13-3.99 (m, 1H), 3.90 (s, 3H), 3.92-3.83 (m, 1H), 2.67-2.55 (m, 2H), 2.53-2.46 (m, 1H), 2.43-2.31 (m, 1H), 2.22-2.15 (m, 1H), 2.15 (3H), 1.75-1.70 (m, 2H), 1.51-1.42 (m, 2H), 1.41-1.28 (m, 6H), 1.17 (s, 9H).
MS : 703.2 (M+1), 701.3 (M-1)
【０２７６】
実施例  43
化合物 #738の合成
【０２７７】
【化９８】
0003754298.tif 000083
【０２７８】
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ(ppm): 8.64 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 8.62 (s, 1H), 8.04 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 7.39 (s, 1H), 7.24 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 7.04 (d, J = 6.0 Hz, 1H), 6.99 (dd, J = 2.2, 9.2 Hz, 1H), 6.43 (d, J = 2.2 Hz, 1H), 5.62-5.57 (m, 1H), 5.56-5.47 (m, 1H), 5.31-5.22 (m, 1H), 4.65-4.56 (m, 1H), 4.45 (dd, J = 7.6, 8.9 Hz, 1H), 4.07-4.00 (m, 1H), 3.90 (s, 3H), 3.88-3.84 (m, 1H), 2.68-2.56 (m, 2H), 2.54-2.43 (m, 1H), 2.42-2.31 (m, 1H), 2.34 (s, 3H), 2.24-2.14 (m, 1H), 1.80-1.64 (m, 2H), 1.52-1.43 (m, 2H), 1.43-1.27 (m, 6H), 1.18 (s, 9H).
MS: 703.2 (M+1), 701.2 (M-1)
【０２７９】
実施例  44
化合物 #725の合成
【０２８０】
【化９９】
0003754298.tif 000084
【０２８１】
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ(ppm): 8.62 (s, 1H), 8.10 (d, J=9.2 Hz, 1H), 7.57 (s, 1H), 7.49 (s, 1H), 7.35 (d, J=2.2 Hz, 1H), 7.09-7.03 (m, 2H), 5.65-5.61 (m, 1H), 5.55-5.49 (m, 1H), 5.28-5.24 (m, 1H), 4.62-4.57 (m, 1H), 4.49-4.45 (m, 1H), 4.08-4.01 (m, 1H), 3.93 (s, 3H), 3.92-3.86 (m, 1H), 3.20-3.14 (m, 1H), 2.65-2.56 (s, 1H), 2.53-2.47 (m, 1H) 2.42-2.35 (m, 1H), 2.22-2.15 (m, 1H), 1.79-1.68 (m, 2H), 1.50-1.43 (m, 2H), 1.41-1.28 (m, 12H), 1.18 (s, 9H).
MS : 748.2 (M+1), 746.2 (M-1)
【０２８２】
実施例  45
化合物 #726の合成
【０２８３】
【化１００】
0003754298.tif 000085
【０２８４】
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ(ppm): 8.64 (s, 1H), 8.10 (d, J=9.5 Hz, 1H), 7.83-7.76 (m, 2H), 7.60 (s,  1H), 7.44-7.42 (m, 1H), 7.18-7.01 (m, 2H), 5.56-5.49 (m, 2H), 5.29-5.24 (m, 1H), 4.66-4.63 (m, 1H), 4.47-4.42 (m, 1H), 4.28 (s, 3H), 4.06-4.02 (m, 2H), 3.94 (s, 3H), 3.93-3.86 (m, 1H), 2.66-2.55 (m, 2H), 2.42-2.31 (m, 2H), 2.22-2.14 (m, 1H), 1.79-1.65 (m, 2H), 1.52-1.27 (m, 7H), 1.22 (s, 9H).
MS : 703.2 (M+1), 701.3 (M-1)
【０２８５】
実施例  46
化合物 #906の合成
【０２８６】
【化１０１】
0003754298.tif 000086
【０２８７】
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ(ppm): 8.46 (s, 1H), 8.06 (d, J=9.2 Hz, 1H), 7.57 (s, 1H), 7.49 (s, 1H), 7.34 (m,  1H), 7.14-7.05 (m, 2H), 5.63-5.58 (m, 1H), 4.66-4.61 (m, 1H), 4.54-4.44 (m, 2H), 4.23-4.18 (m, 1H) 3.93 (s, 3H), 3.92-3.88 (m, 1H), 3.21-3.14 (m, 1H), 2.44-2.33 (m, 1H), 1.35 (d, J=7Hz, 6H), 1.73-1.01 (m, 26H)
MS : 762.0 (M+1), 759.9 (M-1)
【０２８８】
実施例  47
化合物 #907の合成
【０２８９】
【化１０２】
0003754298.tif 000087
【０２９０】
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ(ppm): 8.46 (s, 1H), 7.98 (d, J=8.9 Hz, 1H), 7.91-7.89 (m, 2H), 7.23-7.21 (m, 2H), 7.07-7.00 (m, 2H), 6.35-6.32 (m, 2H), 5.64-5.58 (m, 1H), 4.65-4.61 (m, 1H), 4.53-4.47 (m, 2H),4.24-4.19 (m, 1H) 3.90 (s, 3H), 3.86-3.84 (m, 1H), 2.40-2.33 (m, 1H), 1.73-1.01 (m, 26H).
MS : 702.0 (M+1), 699.9 (M-1)
【０２９１】
実施例  48
全長NS3-NS4Aヘテロ二量体タンパク質の蛍光発生的分析
NS2-NS5B-3' 非コード領域を、HCV遺伝子型1b感染個体の血清から抽出されたRNA(ベルナールウィリアムズ博士、セントラック病院、モントリオール、ケベック州、カナダから提供された)を用いてpCR(登録商標)3ベクター(インビトロジェン)の中へRT-PCRでクローン化した。次に、NS3-NS4A領域(NS3-NS4AFL)をpFastBac(登録商標)HTaバキュロウイルス発現ベクター(ギブコ/BRL)の中へPCRでサブクローン化した。ベクター配列は、ヘキサヒスチジンタグを有する28残基N末端配列をコードしている領域を含んでいる。Bac-to-Bac(登録商標)バキュロウイルス発現系(ギブコ/BRL)を用いて組換えバキュロウイルスを作製した。106 Sf21細胞/mlに組換えバキュロウイルスを0.1-0.2の感染多重度で27°において感染させることによりHis-NS3-NS4AFLを発現させた。発現中に標準自己タンパク質分解が起こり、非共有結合の安定なNS3-NS4Aタンパク質複合体(全長“FL”と呼ばれる)を作製した。4°において遠心分離することにより48〜64時間後に感染した培養物を収集した。細胞沈降物をプロテアーゼインヒビターの反応混液の存在下に50mM NaPO4、pH 7.5、40%グリセロール(w/v)、2mMβ-メルカプトエタノール中でホモジェナイズした。次に、細胞溶解物から 1.5% NP-40、0.5% トライトンX-100、0.5M NaCl、及びDNase処理でHis-NS3-NS4AFLを抽出した。超遠心後、可溶性抽出物を4倍に希釈し、ファーマシアハイトラップNiキレートカラムで結合した。50〜400 mMイミダゾール勾配を用いてHis-NS3-NS4AFLを >90%の純粋な形(SDS-PAGEにより判定)で溶離した。His-NS3-NS4AFLを50 mMリン酸ナトリウム、pH 7.5、10% (w/v)グリセロール、0.5 M NaCl、0.25 Mイミダゾール、0.1% NP-40中-80°で貯蔵した。使用直前に氷上で解凍し、希釈した。
【０２９２】
His-NS3-NS4AFLのプロテアーゼ活性を50 mMトリス-HCl、pH 8.0、0.25 Mクエン酸ナトリウム、0.01% (w/v) n-ドデシル-β-D-マルトシド、1 mM TCEP中で分析した。5μMの内部冷却基質アントラニリル-DDIVPAbu[C(O)-O]-AMY(3-NO2)TW-OHを種々の濃度の阻害剤を23°で45分間1.5 nMのHis-NS3-NS4AFLとインキュベートした。最終DMSO濃度は、5.25% を超えなかった。1M MES、pH 5.8を添加して反応を停止させた。N末端産物の蛍光を96ウェルプレートリーダーを備えたパーキン・エルマーLS-50B蛍光光度計でモニターした(励起波長: 325 nm; 発光波長: 423 nm)。
次式から阻害 % を計算した。
100 - [(fluoinh-fluoblank)/(fluoctl-fluoblank)×100]
ヒルモデルによる非直線曲線適合度を阻害濃度データにあてはめ、SASソフトウェア(統計ソフトウェアシステム; SASインスティテュート社、ノースカロライナ州ケアリー)を用いて50% 有効濃度(IC50)を計算した。
【０２９３】
実施例  49
組換えHCV NS3プロテアーゼ放射分析
HCV NS3プロテアーゼ放射分析に用いられる基質、DDIVPC-SMSYTWは、システイン残基とセリン残基の間で酵素により切断されている。配列DDIVPC-SMSYTWは、 NS5A/NS5B自然切断部位に対応し、P2のシステイン残基はプロリンを置換したものである。ぺプチド基質DDIVPC-SMSYTWとトレーサービオチン-DDIVPC-SMS[125I-Y]TWを阻害剤の非存在下又は存在下にインキュベートした。基質の産物からの分離は、アビジン被覆アガロースビーズを分析混合物に添加し、続いてろ過することにより行った。ろ液(阻害剤を含む又は含まない)に見られるSMS[125I-Y]TW産物量は、基質変換％や阻害％の計算を可能にした。
【０２９４】
A. 試薬
トリス及びトリス-HCl (ウルトラピュア)をライフテクノロジーズ(Life Technologies)から入手した。グリセロール(ウルトラピュア)、MES及びBSAをシグマ(Sigma(登録商標))から購入した。TCEPをピアス(Pierce)から、DMSOをアルドリッヒ(Aldrich(登録商標))から、NaOHをアナケミア(Anachemia(登録商標))から入手した。
分析緩衝液: 50 mMトリス-HCl、pH 7.5、30% (w/v)グリセロール、2% (w/v) CHAPS、1 mg/ml BSA、1 mM TCEP (TCEPは水中1 M保存液から使用直前に添加した)。基質: DDIVPC-SMSYTW、最終濃度25μM(酸化を避けるために-20℃で貯蔵した2 mM保存液から)。
トレーサー: 還元モノヨウ化基質(ビオチン-DDIVPC-SMS[125I-Y]TW) (〜1 nM最終濃度)。
HCV NS3プロテアーゼ型1b、25 nM最終濃度(50 mMリン酸ナトリウム、pH 7.5、10% グリセロール、300 mM NaCl、5 mM DTT、0.01% NP-40中の保存液から)。
【０２９５】
B. プロトコール
96ウェルポリプロピレンプレートにおいて分析を行った。各ウェルは下記成分を含有した。
20μlの基質/トレーサー、分析緩衝液中;
10μlの ± 阻害剤、20% DMSO/分析緩衝液中;
10μlのNS3プロテアーゼ1b。
ブランク(阻害剤も酵素も含まない)及び対照(阻害剤を含まない)も同様の分析プレート上で調製した。
酵素溶液を添加することにより酵素反応を開始させ、分析混合物を23℃で60分間弱く撹拌しながらインキュベートした。20μlの0.025 N NaOHを添加して酵素反応を急冷した。
20μlのアビジン被覆アガロースビーズ(Pierce(登録商標)から購入)をミリポア (Millipore(登録商標)) MADP N65ろ過プレートに添加した。急冷した分析混合液をろ過プレートに移し、23℃で60分間弱く撹拌しながらインキュベートした。
【０２９６】
プレートをミリポア(登録商標)マルチスクリーン真空マニホールドろ過装置を用いてろ過し、40μlのろ液を1ウェル当たり60μlのシンチレーション液を含有する不透明な96ウェルプレートに移した。
ろ液を125I-液体プロトコールを1分間用いたパッカード(登録商標)トップカウント装置により計数した。
阻害 % を次式により計算した。
100-[(カウントinh-カウントblank)/(カウントctl-カウントblank) × 100]
ヒルモデルによる非直線適合度を阻害濃度データにあてはめ、50% 有効濃度(IC50)をSASソフトウェア(統計ソフトウェアシステム; SASインスティテュート社、ニューカロライナ州ケアリー)を用いることにより計算した。
【０２９７】
実施例  50
特異性分析
化合物の特異性を様々なセリンプロテアーゼ: ヒト白血球エラスターゼ、ブタ膵臓エラスターゼ及びウシ膵臓α-キモトリプシンと1種のシステインプロテアーゼ: ヒト肝臓カテプシンBに対して求めた。すべての場合において各酵素に特異的な色素原基質を用いた96ウェルプレート式プロトコールを用いた。各分析には、RTにおいて1時間酵素-阻害剤プレインキュベートし、続いて基質を添加し、 UVサーモマックス(Thermomax(登録商標))マイクロプレートリーダー又は蛍光パーキン-エルマー(Perkin-Elmer) LS50Bプレートリーダーで測定した〜30% 変換まで加水分解することが含まれた。基質競合を減少させるために基質濃度をKM に比べてできるだけ低く保持した。化合物濃度は、効力によって 300〜0.06μMに変動した。
各分析の最終条件は次のようにした。
[100μM Succ-AAPF-pNA及び 250 pM α-キモトリプシン]、[133μM Succ-AAA-pNA及び8 nMブタエラスターゼ]、[133μM Succ-AAV-pNA及び8 nM白血球エラスターゼ]; 又は
[100 mM NaHPO4 pH 6、1 mM EDTA、3% DMSO、1mM TCEP、0.01% トゥイーン20、4μM Z-FR-AMC (7-アミノ-4-メチルクマリン)及び0.5 nMカテプシンB (保存酵素を使用前に20 mM TCEPを含有する緩衝液で活性化した。)]を含む
50mMトリス-HCl pH 8、0.5 M Na2SO4、50 mM NaCl、0.1 mM EDTA、3% DMSO、0.01% トゥイーン20。
【０２９８】
ブタ膵臓エラスターゼについての代表例を下記に纏める。
ポリスチレン平底96ウェルプレート(セルウェル、コーニング)にバイオメック液体ハンドラー(ベックマン)を用いて添加した。
40μlの分析緩衝液(50 mMトリス-HCl pH 8、1 M Na2SO4、50 mM NaCl、0.1 mM EDTA);
20μｌの酵素溶液(50 mMトリス-HCl pH 8、50 mM NaCl、0.1 mM EDTA、0.02% トゥイーン20、40 nMブタ膵臓エラスターゼ); 及び
20μｌの阻害剤溶液(50 mMトリス-HCl、pH 8、50 mM NaCl、0.1 mM EDTA、0.02% トゥイーン20、1.5 mM-0.3μM阻害剤、15% v/v DMSO)。
RTで60分間プレインキュベートした後、20μlの基質溶液(50 mMトリス-HCl、pH 8、0.5 M Na2SO4、50 mM NaCl、0.1 mM EDTA、665μM Succ-AAA-pNA)を各ウェルに添加し、反応液をRTで60分間更にインキュベートし、その後、UVサーモマックス(Thermomax(登録商標))プレートリーダーで吸光度を読取った。ウェルの列に対照(阻害剤を含まない)とブランク(阻害剤も酵素も含まない)を割り当てた。
【０２９９】
50 mMトリス-HCl pH 8、50 mM NaCl、0.1 mM EDTA、0.02% トゥイーン20、15% (v/v) DMSOを用いた液体ハンドラーにより別個のプレート上で阻害剤溶液の2倍連続希釈を行った。他の特異性分析もすべて同様の方法で行った。
阻害％を下記式を用いて計算した。
[1-((UVinh-UVblank)/(UVctl-UVblank))] × 100
ヒルモデルによる非直線適合度を阻害濃度データにあてはめ、50% 有効濃度(IC50)をSASソフトウェア(統計ソフトウェアシステム; SASインスティテュート社、ニューカロライナ州ケアリー)を用いることにより計算した。
【０３００】
実施例  51
NS3プロテアーゼ細胞系分析
本分析は、2 DNA構築物:
(NS5B)がNS5Bの6個の最初のアミノ酸を表す次の順序: NS3-NS4A-NS4B-NS5A-(NS5B)tTAにおいてNS5A-NS5B切断部位を介してtTAタンパク質に融合したHCV非構造ポリタンパク質の一方の発現部分(NS3と呼ばれる)
でコトランスフェクトしたHuh-7細胞、肝がん由来のヒト細胞系で行われる。
このポリタンパク質は、CMVプロモーターの制御下に発現し、リポータータンパク質を発現するもう一方(SEAPと呼ばれる)はtTA応答プロモーターの調節下にアルカリ性ホスファターゼ(SEAP)を分泌する。
第1構築物により、種々の成熟タンパク質がNS3プロテアーゼによる切断によって放出されるポリタンパク質の発現が生じる。成熟ウイルスタンパク質は、小胞体の膜に複合体を形成すると思われる。tTAは、Gossen & Bujard (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992): 5547-5551)記載の融合タンパク質であり、DNA結合ドメインと転写アクチベーターを有する。tTAタンパク質の放出には、 NS5Aとそれ自体の間のNS5A-NS5B切断部位にNS3依存性切断が必要である。この最後の切断は、tTAが核に遊走すること及びSEAP遺伝子をトランス活性化することを可能にする。従って、NS3タンパク質分解活性の低下により、tTAの細胞質への閉じ込めとSEAP活性の付随する低下が生じる。
【０３０１】
化合物によるNS3プロテアーゼの阻害以外の細胞活性を制御するために、tTAのみを発現する構築物とSEAP活性がNS3プロテアーゼとは無関係である同様のリポーター構築物で対応するコトランスフェクションを行う。
分析のプロトコール: CHO-SFMII (ライフテクノロジーズ) + 10% FCS (ウシ胎児血清)中で増殖したHuh-7細胞を2つのDNA構築物で次の割合: 4×106 Huh-7細胞当たり7μg NS3+ 500ng SEAP + 800μl FuGENE (ベーリンガーマンハイム)でコトランスフェクトした。37℃で5時間後、細胞を洗浄し、トリプシン処理し、試験すべき化合物の濃度範囲を有する96ウェルプレートに塗布した(80 000細胞/ウェルで)。24時間インキュベートした後、培養液中のSEAP活性をホスファ-ライトキット(Tropix)で測定した。
化合物濃度に関するSEAP活性の阻害％の分析をSASソフトウェアで行い EC50を得た。
【０３０２】
化合物の表
次の表は、本発明の代表的化合物を示すものである。
表1〜9に示される化合物はすべて実施例48に示した酵素分析において活性であることがわかった。星印(*)が付いた番号は、実施例49に示された放射測定分析で得られた酵素活性を示し、IC50は50μMより低い。これらの酵素活性においては、次の類別: A ≧ 1μM; 1μM> B > 0.1μM; 及びC ≦ 0.1μMを用いた。
数種の化合物は、実施例50に示された特異性分析で試験し、NS3プロテアーゼに特異的であることがわかった。一般に、種々の特異性分析からの結果は、次の:  HLE >300μM; PPE >300μM; α-Chym. >300μM; Cat. B >300μMである。これは、化合物がHCV NS3プロテアーゼに非常に特異的であり、深刻な副作用が予想されないことを意味する。
更に、ある種の化合物を実施例51に記載された細胞系分析で試験し、活性を有することがわかり、EC50は10μMより低い。これは、化合物が細胞膜と交差し得ることを強く意味している。特に、表7、8及び9の化合物は、細胞分析で評価されており、結果は最後の欄に示されている。この細胞分析においては、次のコード: A >1μM;  B ≦ 1μMを用いた。
次の表の中に次の略号が用いられる。
MS: エレクトロスプレー質量データ; m/z MH+、但し、星印* = m/z MH- である; Ac: アセチル; Bn: ベンジル; Boc: tert-ブチルオキシカルボニル; Ph: フェニル; Pr: プロピル。
【０３０３】
【表２１】
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【０３０４】
【表２２】
0003754298.tif 000089
【０３０５】
【表２３】
0003754298.tif 000090
【０３０６】
【表２４】
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【０３０７】
【表２５】
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【０３０８】
【表２６】
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【０３０９】
【表２７】
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【０３１０】
【表２８】
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【０３１１】
【表２９】
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【０３１２】
【表３０】
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【０３１３】
【表３１】
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【０３１４】
【表３２】
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【０３１５】
【表３３】
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【０３１６】
【表３４】
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【０３１７】
【表３５】
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【０３１８】
【表３６】
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【０３１９】
【表３７】
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【０３２０】
【表３８】
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【０３２１】
【表３９】
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