(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
非欠損性、非生産性のＦ１２−ＨＩＶ変種からのゲノムであって、３’末端の長い末端反復配列（ＬＴＲ）が完全に欠失し、かつレトロウイルス組換えベクターの転写方向に対してアンチセンスの方向に挿入されているゲノムを含むレトロウイルス組換えベクターを、ＨＩＶの重感染に対する抵抗性をヒト細胞に与えるために、ヒト細胞の核ゲノムの少なくとも一部に該ゲノムを安定に組み込ませ、かつ該ゲノムを発現させるのに充分な量で含む組成物。
【請求項２】
非欠損性、非生産性のＨＩＶ変種ゲノムは、ヒト細胞の核ゲノムの少なくとも約１％に組み込まれる、請求の範囲第１項に記載の組成物。
【請求項３】
非欠損性、非生産性のＨＩＶ変種ゲノムは、ヒト細胞の核ゲノムの約１％〜約１０％に組み込まれる、請求の範囲第２項に記載の組成物。
【請求項４】
ヒト細胞はＴ細胞である、請求の範囲第１項から第３項のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
非欠損性、非生産性のＨＩＶ変種からのゲノムはＦ１２−ＨＩＶのゲノムである、請求の範囲第１項から第４項のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
レトロウイルスベクターは、モロニーマウス白血病ウイルスから誘導されるベクターである、請求の範囲第１項から第５項のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
レトロウイルスベクターはＮ２ベクターである、請求の範囲第６項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
本発明は、ＨＩＶによる重感染に対する抵抗性を与える組成物および方法に関する。
さらに詳細には、本発明は、ヒトの細胞（特にＴ細胞）に、レトロウイルス、具体的にはヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）による重感染に対する抵抗力を与える組成物および方法に関する。
インビボでＨＩＶ複製を阻止することを目的としたいくつかの実験方策が提案されている。これまで多くの方策は、抗ＨＩＶ作用機作がよく知られている免疫療法または化学療法的アプローチに基づいていた。しかし、これまで提案されてきた免疫療法および化学療法のアプローチのいずれも、決定的な抗ＨＩＶ療法であることが証明されていない。
さらに最近開発された代替的抗ＨＩＶ実験設計の目標は、細胞内免疫化を誘導して、ＨＩＶ複製に対して標的細胞を抵抗性にすることであった（ボルティモア（Baltimore），Nature 335: 395-396（1988)）。実際、ＨＩＶ重感染の阻害が、ＨＩＶトランス優性（trans-dominant）タンパク質（マリム（Malim）ら，J. Exp. Med. 176: 1197-1201（1192）；グリーン（Green）ら，Cell 58: 215-223（1989）；モデスティ（Modesti）ら，New Biol. 3: 759-768（1991）：トロノ（Trono）ら，Cell 59: 113-120（1989）；リスジュービッツ（Lisziewicz）ら，Annual Meeting, Laboratory of Tumor Cell Biology, Gene Therapy（1993）；ブックシャッチャー（Buchschacher）ら，Hum. Gene Ther. 3: 391-397（1992）；スティーブンソン（Stevenson）ら，Cell 83;483-486（1989）；およびリウ（Liu）ら，Gene Therapy 1: 32-37（1994））、ＨＩＶゲノム指向性リボザイム（ユー（Yu）ら，Gune Therapy 1: 13-26（1994）；ローレンツェン（Lorentzen）ら，Virus Genes 5: 17-23（1991）；シオウド（Sioud）ら，PNAS USA 88: 7303-7307（1991）；ウィーラシンゲ（Weerasinghe）ら，J. Virol. 65: 5531-5534（1991）；およびヤマダ（Yamada）ら，Gene Therapy 1: 38-45（1994））、ｔａｔ／ｒｅｖデコイ（スレンジャー（Sullenger）ら，Cell 63: 601608（1990）；スレンジャー（Sullenger）ら，J. Virol. 65: 6811-6816（1991）；およびスミス（Smith）ら，UCLA/UCI AIDS Symposium: Gene Therapy Approaches to Treatment of HIV Infection（1993））、アンチセンスＲＮＡ（ローズ（Rhodes）ら，J. Gen. Virol. 71: 1965-1974（1990）；ローズ（Rhodes）ら，AIDS 5: 145-151（1991）；スクザキール（Sczakiel）ら，J. Virol. 65: 468-472（1991）；ジョシ（Joshi）ら，J. Virol. 65: 5524-5530（1991）；およびチャッタージー（Chatterjee）ら，Science 258: 1485-1488（1992））を発現する細胞において証明された。さらに、有効な抗ＨＩＶ細胞内免疫化は、ＨＩＶ感受性細胞を抗ｇｐ１６０一本鎖抗体（マラスコ（Marasco）ら，PNAS USA 90: 7889-7893（1993））またはモノクローナル抗ｒｅｖ一本鎖可変領域抗体（デュアン（Duan）ら，Abstract from the 1994 Annual Meeting, Laboratory of Tumor Cell Biology, Sept. 25-Oct. 1, 1994,メリーランド州、米国）のいずれかをコードするＤＮＡでトランスフェクションすることにより達成された。
しかし先行技術の方法は、以下の欠点がある。ＨＩＶ複製の単一工程を標的としうる抗ＨＩＶ化合物が、ＨＩＶ抵抗性変異体の出現を容易に誘導しうるため、上述の方法の多くは実際には正しく働かない。このことは、例えば、抗レトロウイルス性化合物（すなわち、ＡＺＴ、ｄｄＩ）で治療されたＡＩＤＳ患者から単離された、このような薬剤に対して抵抗性のＨＩＶ株により証明されるように、突然変異するＨＩＶの特異な能力を考えると、きわめて一般的な生物学的事象である。従って、多くの研究者は、ＨＩＶの生活環の異なる工程を標的としうる抗ＨＩＶ試薬を合成しようと試みている。さらに、上述の方法のいくつかは、宿主細胞に対して有害であるか、または臨床プロトコールにおいて有効に適用することが困難であることが証明されている。
本発明は、上述の方法の欠点を克服しようとするものである。本発明者らは、少なくともいくつかの細胞の核ゲノム中にＨＩＶの非感染性非生産性ゲノム変種を安定に組み込むことにより、ＨＩＶ重感染に対する抵抗性をヒトの細胞（特に、Ｔ細胞）に与える方法を確立した。ＨＩＶ重感染に対する抵抗性をヒトの細胞に与えるために、本発明は、ＡＩＤＳ治療においてＨＩＶ細胞内免疫化のために使用される組成物を提供する。本発明は、容易な投与方法、非生産性から生産性表現型へのＨＩＶの非欠損性変種の自然復帰の欠如、および重感染に対する良好な抵抗性を与える能力を含む、いくつかの利点を有する。
インビトロ実験により得られた証拠は、Ｆ１２−ＨＩＶ非欠損性非生産性変種の発現が、野生型ＨＩＶの重感染生活環の種々の工程を阻害しうることを示している。実際、本発明者らは、試験したＦ１２−ＨＩＶ発現細胞に依存して、その固有のテトロ転写（tetrotranscrption）の前または後のいずれかに、一群の野生型ＨＩＶの複製を証明した。さらに、Ｆ１２−ＨＩＶゲノムを有するすべての細胞で、生理学的細胞機能に何の修飾も障害もないことが、証明された。
本明細書において「ＨＩＶ」は、ＨＩＶ（例えば、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２）、およびＨＴＬＶ（例えば、ＨＴＬＶ−III）のような、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）およびＡＩＤＳ感染複合症（ＡＲＣ）の原因物質として考えられているウイルスに過去および現在指定されている全ての名称を包含するために使用される。「重感染（superinfection）」とは、当業者には知られており理解されていること、すなわち、あるウイルスにすでに感染した細胞を感染させる、特定のウイルスの能力を意味する。「抵抗性」とは、ウイルス（特に、レトロウイルス、具体的にはＨＩＶ）による重感染に抵抗する能力を意味する。「非欠損性」とは、ゲノムが完全であることを意味し、一方「非生産性」とは、ウイルス粒子が生産されないことを意味する。
本発明は、ＨＩＶの重感染に対する抵抗性を細胞（特に、Ｔ細胞）に与えるために、標的細胞の核ゲノムの少なくとも１部に、該非欠損性、非生産性のＨＩＶ変種ゲノムを安定に組み込むのに充分な量で、かつ該標的細胞中で該非欠損性、非生産性のＨＩＶ変種ゲノムを発現するのに充分な量で、非欠損性、非生産性のＨＩＶ変種ゲノムを含むレトロウイルスベクター、を含む組成物を提供する。
好ましくは、非欠損性、非生産性のＨＩＶ変種ゲノムは、細胞の核ゲノムの少なくとも１％に組み込まれる。さらに好ましくは、非欠損性、非生産性のＨＩＶ変種ゲノムは、細胞の核ゲノムの約１％〜約１０％に組み込まれる。好ましくは、非欠損性、非生産性のＨＩＶ変種ゲノムは、ＨＩＶ  Ｆ１２ゲノムである。さらに好ましくは、Ｆ１２−ＨＩＶゲノムの３’ＬＴＲがレトロウイルスベクターへの挿入の前に欠失しており、そしてこのゲノムがアンチセンス方向でレトロウイルスベクターに挿入される。モロニーマウス白血病ウイルスから誘導されるレトロウイルスベクターが、本発明の組成物のために好ましい。
本発明のさらなる面は、レトロウイルスベクターと接触する細胞の核ゲノムの少なくとも１部へ非欠損性、非生産性のＨＩＶ変種ゲノムの安定に組み込むのに充分な量で、かつ該細胞中へ該非欠損性、非生産性のＨＩＶ変種ゲノムを発現するのに充分な量で、非欠損性、非生産性のＨＩＶ変種ゲノムを含むレトロウイルスベクターの使用を提供する。
好ましくは、非欠損性、非生産性のＨＩＶ変種ゲノムは、細胞の核ゲノムの少なくとも１％に組み込まれる。さらに好ましくは、非欠損性、非生産性のＨＩＶ変種ゲノムは、細胞の核ゲノムの約１％〜約１０％に組み込まれる。好ましくは、非欠損性、非生産性のＨＩＶ変種ゲノムは、ＨＩＶ  Ｆ１２ゲノムである。好ましくは、Ｆ１２−ＨＩＶゲノムの３’ＬＴＲがレトロウイルスベクターへの挿入の前に欠失しており、そしてこのゲノムがアンチセンス方向でレトロウイルスベクターに挿入される。モロニーマウス白血病ウイルスから誘導されるレトロウイルスベクターが、本発明の組成物のために好ましい。
あるいは本発明は、ＡＩＤＳ治療用医薬の製造のために使用される、レトロウイルスベクター、非欠損性、非生産性のＨＩＶ変種ゲノムを含む組成物の使用を提供する。
本発明の応用方法は、ヒトから細胞を取り出し；取り出した細胞を、細胞の核ゲノムの少なくとも１部への非欠損性、非生産性のＨＩＶ変種を安定に組み込みおよび発現するのに充分な量の、本発明の組成物に接触させ；そしてこうして処理した細胞を、細胞を取り出したヒトに再導入することにより、ヒト細胞にＨＩＶの重感染に対する抵抗性を与えることである。このようなエクスビボ法は、ジー・フェラーリ（Ferrari G.）、エス・ロッシーニ（Rossini S.）、アール・ジャヴァッツィ（Giavazzi R.）、ディー・マッジョーニ（Maggioni D.）、エヌ・ノビリ（Nobili N.）、エム・ソリダーティ（Soldati M.）、ジー・ウンゲルス（Ungers G.）、エフ・マヴィリオ（Mavilio F.）、イー・ギルボア（Gilboa E.）、シー・ボルディノン（Bordignon C.）の「ヒト重症複合免疫不全症の体細胞遺伝子治療のインビボモデル（An in vivo model of somatic cell gene therapy for human severe combined immunodeficiency）」，Science 251: 1363, 1991に記載されている。
理論的には、非欠損性、非生産性のＨＩＶ変種からの任意のゲノムが、本発明の方法に有用でありうるが、Ｆ１２−ＨＩＶからのゲノム（エム・フェデリコ博士（Dr. M. Federico）、ウイルス学実験室（Laboratory of Virology）、衛生高等研究所（Istituto Superiore di Sanita）、ローマ）。
その配列と性状解析が、カルリーニ（Carlini）ら，J. Virol Disease 1: 40-55（1992）（本明細書にこの全体が組み込まれる）に記載されている、Ｆ１２−ＨＩＶ変種ゲノムは、５０を超える突然変異を特徴とするが、その突然変異の多くは、ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｖｉｆ遺伝子にあり、他のＨＩＶ−１株には存在しないと考えられている。重感染に対する抵抗性の機作は、未知であり、そしてこの抵抗性は、単一の陰性トランス優性遺伝子産物の発現、またはよりありそうなことは２個以上のこのような産物の同時発現のいずれかにより引き起こされると考えられる。Ｆ１２−ＨＩＶ変種ゲノムと、ｐＮＬ４−３と命名された野生型の感染性ＨＩＶ−１分子クローン（エム・マーチン博士（Dr. M. Martin）、エイズ研究および照会プログラム（AIDS Research and Reference Program）、エイズプログラム（AIDS Program）、エヌアイエーアイディー（NIAID）、米国国立衛生研究所（NIH））の間の相同断片の交換、これに続くＨＩＶ感受性ヒト細胞へのトランスフェクションは、Ｆ１２表現型を非生産性から生産性に復帰させるために、ＢｃｌＩとＸｈｏＩ制限部位の間の、ｐｏｌ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｔａｔ、ｒｅｖ、およびｅｎｖ遺伝子を包含する、少なくとも６kbのゲノムを置換することが必要であることを示している。従って、複製欠損種から複製可能種への非欠損性Ｆ１２−ＨＩＶ変種の自然復帰のリスクは、かなり低い。このリスクは、好適なＦ１２−ＨＩＶ変種作成体には、両者とも複製に必要な全３’ＬＴＲおよびｎｅｆ遺伝子の大部分が存在しないことによりさらに低下している。Ｆ１２  ＨＩＶゲノムを均質に発現する細胞集団は、同じＦ１２−ＨＩＶの作用を干渉することにより、混入した複製可能なＨＩＶを阻止するであろう；このことは、完全長Ｆ１２−ＨＩＶプロウイルスを発現するＨＩＶ−１が重感染したＨｅＬａ  ＣＤ４＋細胞において、３ケ月の連続的ＣＥＭｓｓ同時培養にわたり感染性ＨＩＶ−１放出が観察されなかったという証拠と一致する。
突然変異誘発（例えば、未熟な停止コドンの挿入によるか、または欠失）とこれに続くＨＩＶ許容性ヒト細胞への生じた変異体のトランスフェクションのいずれかによる、単独および全ての可能な組合せのＦ１２遺伝子の不活化を行って、どの突然変異が、Ｆ１２ゲノムを重感染に対する抵抗力を与えることができるかを決定することができる。あるいは、Ｆ１２ゲノムの全単一突然変異を野生型に復帰させ、生じた産物をＨＩＶ許容性ヒト細胞にトランスフェクションすることができる。このような方法は、干渉機作に関与する遺伝子の同定を可能にし、そしてこれらの遺伝子のみが、他のＨＩＶゲノムにおいて突然変異することができ、こうして本発明の方法に関連して他のＨＩＶゲノムを使用することが可能になる。
理論的には、任意のレトロウイルスベクターが本発明において使用するのに適しているが、ウイルスの干渉（すなわち、重感染に対する抵抗性）を達成するのに充分に高レベルでＦ１２ゲノムの発現を可能にするレトロウイルスベクターを使用すべきである。さらに、このレトロウイルスベクターは、選択遺伝子（好ましくはＧ４１８抗生物質に対する耐性をコードする遺伝子）を発現すべきである。レトロウイルスベクターの例としては、Ｎ２、ｐＬｊ、ＬＸＳＮ、およびＮＳＶがある。本発明の方法での使用に好ましいレトロウイルスベクターは、Ｎ２である。モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）から誘導されたベクター（イー・ギルボア博士（Dr. E. Gilboa）、スローアン・ケッタリング癌研究所（Sloan-Kettering Institute for Cancer Research）、ニューヨーク、ニューヨーク州）が特に好ましい。
ベクター中の２つの同一の反復配列（すなわち、５’および３’ＬＴＲ）の存在により引き起こされる不安定さを避けるための手段を取るべきである。好適な方法は、Ｆ１２−ＨＩＶゲノムの３’ＬＴＲ（ｎｅｆ遺伝子の一部を含有する）を、レトロウイルスベクターに挿入する前に、欠失させることである。
また、Ｆ１２のＬＴＲとレトロウイルスベクターのＬＴＲとの間に生じうるような、転写干渉を避けるための手段を取るべきである。好適な手段は、Ｆ１２ゲノム（詳細には３’ＬＴＲを欠失させたＦ１２ゲノム）を、レトロウイルスベクター中へアンチセンス方向で挿入することである。
本発明により、上述の非欠損性、非生産性のＨＩＶ変種からのゲノムを含むレトロウイルスベクターからなる組成物は、ヒトに直接投与される。適切な投与方法は、当業者には公知である。使用される組成物および投与法とは無関係に、組換えレトロウイルスベクターは、ヒトの細胞の核ゲノム中の少なくとも１部への非欠損性、非生産性のＨＩＶ変種ゲノムの安定な組み込みおよび発現を達成するのに充分な量で、ヒトに投与すべきである（例えば、フェラーリ（Ferrari）ら，Science 25: 1363（1991）；フェラーリ（Ferrari）ら，Blood 80: 1120（1992）；およびマヴィリオ（Mavilio）ら，Blood 83: 1988（1994）、およびボルネオ（Borneo）ら，Human Gene Therapy 4: 513（1993）に記載されたプロトコールを参照のこと）。
非欠損性、非生産性のＨＩＶ変種ゲノムを含むレトロウイルスベクターは、インビトロで細胞に接触させるのに適切な組成物、または適切な担体または希釈剤（これらも薬剤学的に許容しうるものである）と共にインビボの投与に適した薬剤組成物に製造することができる。ベクターは、適宜、各投与法のための通常の方法で、坐剤、注射剤、吸入剤、およびエーロゾルのような、固体、半固体、液体または気体の剤型の製剤に処方することができる。組成物が目的の細胞に到達するまで組成物の放出および吸収を防止するために、または組成物の特効性放出を確保するために、当該分野で公知の手段を利用することができる。組成物を無効化しない、薬剤学的に許容しうる剤型を使用すべきである。薬剤投与剤型において、組成物は、単独で、または他の薬剤学的に活性な化合物と適切に合わせて、さらには組合せて使用することができる。
本発明の薬剤組成物は、異なる方法により体内の異なる部位へ送達することができる。当業者であれば、投与に２つ以上の方法を使用することができるが、ある特定の方法が別の方法よりもより直接でより有効な効果を提供しうることに気付くであろう。体腔への本組成物の適用またた注入、エーロゾルの吸入またはガス注入を含む投与により、または筋肉内、静脈内、腹腔内、皮下、皮内、さらには局所投与を含む非経口的導入により、局所または全身へ送達することができる。
本発明の組成物は、各投与単位（例えば、茶匙量、錠剤、液剤、または坐剤）が、あらかじめ決められた量の組成物を、単独または他の活性物質との適切な組合せで含有する、単位投与剤型で提供することができる。本明細書で使用される「単位投与剤型」という用語は、ヒトおよび動物被検体のための単一の投与量として適切な物理的に別々の単位を意味し、各単位は、適宜薬剤学的に許容しうる希釈剤、担体、またはビヒクルと一緒に、あらかじめ決められた量の本発明の組成物を、単独で、または目的の効果を得るために充分な量で計算された他の活性物質との組合せで含有している。単位投与剤型のための規格は、治療される特定の個体の特定の薬物動態に依存する。
従って、非欠損性、非生産性のＨＩＶ−１変種ゲノムを含む組換えレトロウイルスベクターは、前述の任意の投与法、または当業者に公知で特定の適用に適切な代替法を使用して、ヒトに投与することができる。投与されるベクターの量は、ヒトの細胞の核ゲノムの少なくとも１部への非欠損性、非生産性のＨＩＶ変種ゲノムの安定な組み込み、およびそこでの非欠損性、非生産性のＨＩＶ変種ゲノムの発現を達成するのに充分な量である。このような組み込みは、例えば、配列決定またはサザンハイブリダイゼーションと共にポリメラーゼチェイン反応を使用して、例えば、ゲノム組み込みの証拠により追跡することができる。
本発明の組成物は、細胞内免疫化を行って、ＨＩＶ感染のリスクのある個体における初期のＨＩＶ感染を防止または少なくとも実質的に阻害するために使用することができる。また、感染を阻止するか、または少なくとも感染の速度を遅らせて、そしてＡＩＤＳまたはＡＲＣの発症を防止するか、または少なくとも遅らせることにより、ＨＩＶ＋の個体の治療に使用することができる。この点で、本組成物は、ヒトの細胞の核ゲノムの少なくとも１部に安定に組み込まれそこで自身を発現する、非欠損性、非生産性のＨＩＶ変種ゲノムの能力に有害な影響を及ぼさないならば、他の抗レトロウイルス剤、詳細には他の抗ＨＩＶ治療と組合せて使用することができる。本組成物はまた、インビトロでも有用であることに注意されたい。例えば、本組成物は、Ｆ１２  ＨＩＶが誘導した干渉に関するさらなる側面（すなわち、インビボモデルのＳＣＩＤマウスにおいて、またはＨＩＶ慢性感染細胞において）の他に、ウイルス複製の非存在下でのエクスビボの細胞（すなわち、末梢血リンパ球、単球、星状細胞）の生理に及ぼす、ＨＩＶがコードしたタンパク質の影響を研究するために使用できる。
以下の実施例は、本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。以下の図面について説明する：
図１は、例１に記載される、センス（ｓ）およびアンチセンス（ａｓ）のｎｅｆ−およびｎｅｆ＋  Ｎ２／Ｆ１２−ＨＩＶ作成体の概略図である；
図２は、例４において使用されるプローブによりカバーされるＮ２／Ｆ１２−ＨＩＶ  ｎｅｆ−（ａｓ）ゲノムの領域の概略図である；
図３は、Ｎ２／Ｆ１２−ＨＩＶ  ｎｅｆ−（ｓ）および（ａｓ）でトランスフェクションしたパッケージング細胞において転写される推定ＲＮＡの概略図である；
図４Ｉ、４IIおよび４IIIは、感染したｎｅｏr細胞集団からの、ＸｈｏＩ消化（ａ）またはＥｃｏＲＩ消化（ｂ）したゲノムＤＮＡ、およびｎｅｆ−（ａｓ）で安定に形質導入された細胞クローンからのＥｃｏＲＩ消化（ｃ）したゲノムＤＮＡのサザンブロットである；
図５ａおよび５ｂは、実際の計数対それぞれＰＡ３１７クローン２番および１２番を発現するＦ１２−ＨＩＶ  ｎｅｆ−（ａｓ）の蛍光強度のグラフである；
図６ａ〜ｄは、ＰＡ３１７クローン２番（図６ｃ）またはＰＡ３１７クローン１２番（図６ｄ）のいずれかと同時培養後のｎｅｏrＣＥＭｓｓ細胞における細胞質内１２−ＨＩＶ  ｇａｇタンパク質の存在のＦＡＣＳ分析である。未感染ＣＥＭｓｓ細胞（図６ａ）およびＨＵＴ−７８／Ｆ１２細胞（図６ｂ）は、それぞれ陰性および陽性対照である。また陽性細胞の百分率を図に示す；
図７ａおよび７ｂは、「生産性」ＰＡ３１７クローン２番または１２番との同時培養により形質導入して、それぞれＦ１２−ＨＩＶゲノムおよびｎｅｏプローブとハイブリダイズさせた、ｎｅｏrＣＥＭｓｓ細胞の制限酵素消化ゲノムＤＮＡのサザンブロットである；
図８は、「生産性」ＰＡ３１７クローン２番または１２番との同時培養により形質導入して、ｎｅｏプローブとハイブリダイズさせた、ｎｅｏrＣＥＭｓｓおよびＨＵＴ−７８細胞からのＨｉｎｄIII消化ゲノムＤＮＡのサザンブロットである；
図９ａ〜ｄは、完全長Ｆ１２−ＨＩＶ（図９ａ）、Ｆ１２−ＨＩＶ  Ｕ３  ＬＴＲ（図９ｂ）、Ｆ１２−ＨＩＶ  ｎｅｆ（図９ｃ）、およびＦ１２−ＨＩＶ  ｅｎｖプローブ（図９ｄ）、すなわち、Ｆ１２−ＨＩＶ−特異的プローブとハイブリダイズさせた、Ｆ１２細胞（レーン１）、親ＣＥＭｓｓ（レーン２）、およびＮ２／Ｆ１２−ＨＩＶ  ｎｅｆ−（ａｓ）で形質導入したＣＥＭｓｓクローン４０（レーン３）からのポリＡ＋  ＲＮＡのノーザンブロットである；
図１０ａ〜ｄは、ｎｅｏ（図１０ａ）、Ｕ３−ＭＬＶ（図１０ｂ）、Ｒ／Ｕ５−ＭＬＶ（図１０ｃ）、およびＭＬＶ（図１０ｄ）Ｎ２−特異的プローブとハイブリダイズさせた、Ｆ１２細胞（レーン１）、二重プロモーターレトロウイルスベクターｐＬｊで形質導入したＣＥＭｓｓ細胞（レーン２、コーマン（Korman）ら，PNAS USA 84: 2150-2154(1987)）、およびＮ２／Ｆ１２−ＨＩＶ  ｎｅｆ−（ａｓ）で形質導入したＣＥＭｓｓクローン４０（レーン３）からのポリＡ＋  ＲＮＡのノーザンブロットである；
図１１は、ＨＩＶ＋またはＨＩＶ−血清の混合物により実施した、代表的なＮ２／Ｆ１２−ＨＩＶ  ｎｅｆ−（ａｓ）で形質導入したＣＥＭｓｓクローンによるＲＩＰＡ測定の結果である；
図１２ａ〜ｃは、抗ｇａｇＨＩＶ処理したＨＵＴ７８−Ｆ１２細胞（図１２ａ、陽性対照）、未感染ＰＢＬ（図１２ｂ、陰性対照）、およびＰＡ３１７クローン１２番との同時培養の終了の５日後の新鮮ヒトＰＢＬ（図１２ｃ）のＦＡＣＳ分析を表す、実際の計数対蛍光強度のグラフである；
図１３は、培養上清のcpm/ml×１０-3対感染後（ｐ．ｉ．）日数のグラフである；
図１３ａは、５×１０3ＴＣＩＤ50／１０6細胞で重感染した、代表的Ｎ２／Ｆ１２−ＨＩＶ  ｎｅｆ−（ａｓ）ＣＥＭｓｓで形質導入したクローン（すなわち、１５、４０および４１）の、細胞生存率％対感染後日数のグラフである；
図１４は、培養上清のcpm/ml対感染後（ｐ．ｉ．）日数のグラフである；
図１４ａは、１０5ＴＣＩＤ50／１０6細胞で重感染した、代表的Ｎ２／Ｆ１２−ＨＩＶ  ｎｅｆ−（ａｓ）ＣＥＭｓｓで形質導入したクローン（すなわち、１５、４０および４１）の、細胞生存率％対感染後日数のグラフである。
全ての酵素は、製造業者の推奨のとおりに使用した。ｐＵＣに基づくプラスミドを増幅するために大腸菌ＸＬ−１  Ｂｌｕｅ株を使用したが、一方ｐＢＲに基づくプラスミドを増幅するためには大腸菌ＪＭ１０９株を使用した。細菌の形質転換は、電気穿孔法のためのバイオラッド（Bio-Rad）（リッチモンド、カリホルニア州）のプロトコールにより実施した。両栄養性レトロウイルス調製物の力価は、以前に報告されたようにＮＩＨ  ３Ｔ３細胞でコロニー形成単位（cfu）/mlとして測定した（フェデリコ（Federico）ら，J. Gen. Virol. 74: 2099-2110(1993)）。ＨＴＬＶ−IIIBおよびＨＩＶのＮＬ４−３株は、急速に感染させたＣＥＭｓｓ細胞の上清から得た。１〜３×１０6ＴＣＩＤ50/mlの範囲にあるＨＩＶの力価は、フェデリコ（Federico）ら（1995）（上記文献）により記載されたように連続希釈したウイルス調製物による感染の５日後のＣ８１６６細胞に形成される融合細胞（syncytia）の数を得点にすることにより測定した。重感染後のＨＩＶ放出は、逆転写酵素（ＲＴ）測定によりモニターした（ロッシ（Rossi）ら，Ann. NY Acad. Sci. 511: 390-400(1987)）。
例１  センスおよびアンチセンスＮ２／Ｆ１２−ＨＩＶ  ｎｅｆ−およびＮ２／Ｆ１２−ＨＩＶ  ｎｅｆ＋レトロウイルスベクター作成体の作成
以前に報告されたように、完全長Ｆ１２−ＨＩＶプロウイルスＤＮＡをＨＵＴ−７８／Ｆ１２細胞ゲノムライブラリーからクローン化した（カーリニ（Carlini）ら，J. Viral Diseases 1: 40-55(1992)）。Ｎ２レトロウイルスベクターは、イー・ギルボア（E. Gilboa）により提供された（ケラー（Keller）ら，Nature 318: 149(1985)）。図１に示すように、異なる４つのＮ２／Ｆ１２−ＨＩＶ作成体を得た。図１は、５’および３’の長い末端反復配列、それぞれ５’ＬＴＲおよび３’ＬＴＲの相対位置、制限酵素部位、ネオマイシン耐性マーカー遺伝子（ｎｅｏ）、および５’ＬＴＲ内のヌクレオチド配列ＡＡＣＣＡＡ（配列番号１）の位置を含む、センス（ｓ）およびアンチセンス（ａｓ）のｎｅｆ−およびｎｅｆ＋Ｎ２／Ｆ１２−ＨＩＶ作成体の概略図である。記号「／／」は、提示された作成体マップが、重要な領域を説明する目的のために縮められていることを示すために使用される。Ｎ２／Ｆ１２−ＨＩＶ  ｎｅｆ−は、ｎｅｆ遺伝子の一部の除去後、Ｆ１２−ＨＩＶゲノムが、同じ（すなわち、「センス」または（ｓ））、または反対（すなわち、「アンチセンス」または（ａｓ））の転写方向に、Ｎ２のＸｈｏＩ部位に挿入された作成体を表す。Ｎ２／Ｆ１２−ＨＩＶ  ｎｅｆ＋は、３’ＬＴＲの一部および５’ＬＴＲの負の制御成分（negative regulatory elements）（ＮＲＥ）の除去後、Ｆ１２−ＨＩＶゲノムが、同じまたは反対の転写方向に、Ｎ２のＸｈｏＩ部位に挿入された作成体を表す。
センス作成体中のＮ２  ５’ＬＴＲから転写されたＲＮＡの未熟なポリアデニル化を避けるために、Ｆ１２ＨＩＶ  ５’ＬＴＲのＡＡＴＡＡＡ（配列番号２）コンセンサスをＡＡＣＣＡＡ（配列番号１）に突然変異させた。突然変異誘発は、コンセンサスＡＡＴＡＡＡ（配列番号２）と隣接するＨｉｎｄIII制限部位の両方を包含する、「逆」方向の縮重オリゴマー（５’ＧＧＣＡＡＧＣＴＴＧＧＴＴＧＡＧＧＣＴＴＡＡＧＣＡＧＴ３’、配列番号３）、および５’ＬＴＲ  Ｕ３領域の反対鎖中のＳｍａＩ部位を重複する第２のプライマー（５’ＡＴＧＧＡＴＧＡＣＣＣＧＧＧＧＡＧＡＡＧＡＧＡＡＡＡ３’、配列番号４）を使用して実施した。Ｆ１２−ＨＩＶ  ５’ＬＴＲをサブクローン化した１ngのｐＵＣ１９を増幅するために、ＤＮＡ  ＰＣＲを行った。ＤＮＡ  ＰＣＲ産物は、ＳｍａＩ／ＨｉｎｄIIIで消化して、ｐＵＣポリリンカーのＨｉｎｄIII部位（５’ＨｉｎｄIII突出末端の変換および５’Ｆ１２−ＨＩＶ  ＬＴＲの再挿入後のＨｉｎｄIII／ＨｉｎｄII消化ｐＵＣ１０プラスミドの連結による）、および非変異５’ＬＴＲのＳｍａＩ／ＨｉｎｄIII部分の両方を欠いているｐＵＣ１９／Ｆ１２−ＨＩＶ  ５’ＬＴＲプラスミド中に挿入した。突然変異誘発の成功は、サンガー（Sanger）の配列決定法によりチェックした（シーケナーゼキット（Sequenase kit）、ユービーエス（UBS）、クリーブランド、オハイオ州）。Ｎ２／Ｆ１２−ＨＩＶ  ｎｅｆ−作成体は、全Ｆ１２−ＨＩＶプロウイルス（カーリニ（Carlini）ら、上記文献）を、Ｆ１２−ＨＩＶのリーダー配列の単一部位を認識するＴｈａＩ、両方のＬＴＲのＵ３領域を切断するＳｍａＩで消化することにより得た。次にＴｈａＩ／ＳｍａＩ消化Ｆ１２−ＨＩＶゲノムを、前もってＫｐｎＩで消化し、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ（ビービーアール（BBR）、マンハイム、ドイツ）で平滑末端化して脱リン酸化した突然変異ｐＵＣ１９／Ｆ１２−ＨＩＶ  ５’ＬＴＲと連結した。Ｎ２のＸｈｏＩクローニング部位へのＦ１２−ＨＩＶゲノムの挿入を可能にするために、ＸｈｏＩ部位をＦ１２−ＨＩＶゲノムのユニークなＸｂａＩ部位（ｎｔ１）に添加した。次に、ＸｈｏＩによる消化後、ｎｔ１〜ｎｔ８９３０までのＦ１２−ＨＩＶゲノムを包含するＤＮＡ断片をＮ２ベクターのＸｈｏＩ部位に挿入して、センスおよびアンチセンス作成体の両方を回収した。
Ｎ２／Ｆ１２−ＨＩＶ  ｎｅｆ＋作成体は、報告された（カーリニ（Carlini）ら、上記文献）ようにサブクローン化した突然変異Ｆ１２−ＨＩＶ  ５’ＬＴＲのｐＵＣポリリンカー領域を、５’ＬＴＲをｎｔ２３２および２９５で切断するＡｖａＩ、およびＥｃｏＲＩで消化して、ＡｖａＩ−ＥｃｏＲＩ消化ｐＵＣ１９ベクター中に再挿入するためのＡｖａＩ−ＥｃｏＲＩ断片を作成した。従って、生じた５’ＬＴＲは、負の制御成分（ＮＲＥ）（ルー（Lu）ら，J. Virol. 64: 5226-5229(1990)）の大部分に対応するＵ３領域のｎｔ１〜２９５を欠いていた。次に５’ＬＴＲ作成体は、ＸｂａＩとＫｐｎＩで消化し、ＫｐｎＩ末端で平滑末端化して、ＢｓｓＨII末端（ＢｓｓＨIIとＴｈａＩは、リーダー配列のユニークな隣接する部位を認識する）で平滑末端化したＸｂａＩ−ＢｓｓＨII消化ｐＵＣ１９（ＳａｃＩ−ＳａｃＩ）Ｆ１２−ＨＩＶゲノム（カーリニ（Carlini）ら、上記文献）に挿入した。Ｎ２ベクターへのＦ１２−ＨＩＶ  ｎｅｆ＋ゲノムの挿入を可能にするため、ＮｏｔＩ部位を、ＸｂａＩ（ｎｔ１）とＡａｔII（ｐＵＣ１９ベクター中のＳａｃＩで端を切ったＦ１２−ＨＩＶ  ３’ＬＴＲに対して５７０ｎｔ下流）部位に隣接して作成した。Ｎ２の修飾（上述のとおり）Ｆ１２−ＨＩＶゲノムとのＮｏｔＩ−ＮｏｔＩ連結により、センスおよびアンチセンス両方のｎｅｆ＋作成体を作成した。
例２  細胞培養およびトランスフェクション法。
ＣＥＭｓｓ、ＨＵＴ−７８、Ｈ９／ＨＴＬＶIIIBおよびＣ８１６６細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を補足したＲＰＭＩ１６４０培地で維持培養した。ＨｅＬａ、ＮＩＨ  ３Ｔ３、ＧＰ＋Ｅ８６（マルコビッツ（Markowitz）ら，J. Virol. 62: 1120-1124(1988)）、およびＰＡ３１７（ミラー（Miller）ら，Mol. Cell. Biol. 6: 2895-2902(1986)）細胞を、１０％ＦＣＳを補足したダルベッコー改変最少必須培地（ＭＥＭ）で維持培養した。ＣＥＭｓｓおよびＨＵＴ−７８細胞は、選択のために１mg/mlのＧ４１８（ギブコ社（GIBCO BRL）、ゲーサーズバーグ（Gaithersburg）、メリーランド州、５０％の活性）の存在下で増殖させ、一方パッケージングおよびＮＩＨ  ３Ｔ３細胞は、０．５mg/mlのＧ１４８の存在下で増殖させて、選択は感染サイクルの４８時間後に開始した。
細胞クローニングは、限界希釈法により０．５細胞／ウェルで９６ウェルプレートに接種することにより実施した（フェデリコ（Federico）ら，（1995），上記文献）。以前に報告（ロッシ（Rossi）ら、上記文献）されたように得られたヒト末梢血リンパ球（ＰＢＬ）をフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）で４８時間刺激して、２０％ＦＣＳと５０U/ml組換えヒトＩＬ−２（ｒｈＩＬ−２、ロッッシュ（Roche）、ナトリー（Nutley）、ニュージャージー州）を補足したＲＰＭＩ１６４０で培養した。
細胞単層を、リン酸カルシウム沈殿法（ウィグラー（Wigler）ら，Cell 16: 758-777(1979)）によりトランスフェクションした。簡単に述べると、１０ｇのプラスミドＤＮＡを沈殿させて、直径１０cmのシャーレ中のコンフルエント前の培養物に加えた。４時間後、沈殿物を取り出し、細胞を洗浄して、新鮮な完全培地を補足した。２日後、上清を取り出し、レトロウイルスの供給源として使用した。
４種の異なるＮ２／Ｆ１２−ＨＩＶ作成体のそれぞれを使用して、ＨｅＬａ、ＮＩＨ  ３Ｔ３およびＰＡ３１７細胞で一時的トランスフェクション実験を行い、細胞（１０5）のＦ１２−ＨＩＶ  ｇａｇタンパク質の細胞内存在を２日後に評価した。Ｎ２ベクター単独による細胞トランスフェクションを陰性対照として使用した。結果を表Ｉに示すが、この表は、トランスフェクションの４８時間後およびＧ４１８選択後のＮ２／Ｆ１２−ＨＩＶでトランスフェクションした細胞の細胞質内Ｆ１２−ＨＩＶ  ｇａｇタンパク質の量（pg  ｐ２４  ＨＩＶタンパク質／１０5細胞）を提供する。
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結果は、Ｆ１２−ＨＩＶゲノムで実施した修飾がゲノムの発現に有害な影響を及ぼさなかったことを示す。実際に、ｐＵＣ１０プラスミドに挿入した完全長Ｆ１２−ＨＩＶゲノム（カーリニ（Carlini）ら、上記文献）に比較して４種のレトロウイルス作成体では、ｇａｇタンパク質の産生に有意な差は観察されなかった。トランスフェクションの４８時間後もＧ４１８選択後も、マウス細胞に比較してヒト細胞では著しく大量のｇａｇタンパク質が観察されたのは、おそらくマウスに比較してヒトではＨＩＶプロモーターが強力な活性を持つためであろう（トロノ（Trono）ら，EMBO 9: 4155-4160(1990)）。同様な結果が、安定にトランスフェクションされたＨｅＬａとＮＩＨ  ３Ｔ３でも観察されたが、ｇａｇタンパク質の量は、一時的にトランスフェクションした細胞で観察された量に比較して多かった（表Ｉを参照のこと）。
例３  レトロウイルス作成体は、組換えレトロウイルス粒子を生成することができる
トランスフェクションしたＧＰ＋Ｅ８６およびＰＡ３１７細胞からの上清を使用して、８mg/mlのポリブレン（シグマ（Sygma）、セントルイス、ミズーリ州）で前処理した、それぞれＰＡ３１７（単一サイクルの感染）またはＣＥＭｓｓ（４サイクルの感染）細胞のコンフルエント前の単層を感染させた。ＰＡ３１７生産性細胞クローンにより放出された両栄養性レトロウイルスにより、ＣＥＭｓｓ細胞またはヒトＰＢＬのいずれかを感染させるために、同時培養を実施した。生産性細胞（１０5）をＣＥＭｓｓ細胞（１０5）またはＰＢＬ（１０6）のいずれかを含む１ml培養物に接種した。２４時間後、生産性細胞を完全に排除するためにＰＡ３１７細胞を除去し、培養プレートは、ＣＥＭｓｓでは２４時間毎に、ＰＢＬでは１２時間毎に交換した。トランスフェクションした環境栄養性ＧＰ＋Ｅ８６細胞からの上清による感染後、Ｇ４１８耐性（ｎｅｏr）ＰＡ３１７細胞が回収した。さらに、Ｆ１２−ＨＩＶを発現するｎｅｏrヒトＣＥＭｓｓ細胞が、トランスフェクションした両栄養性ＰＡ３１７細胞からの上清による感染により生成した。
例４  感染細胞のＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質の分析
標準法によりゲノムＤＮＡを調製した（マニアティス（Maniatis）ら、「モレキュラークローニング：実験室マニュアル（Molecular Cloning: A laboratory manual）」、シー・ノロン（Nolon, C.）編、コールドスプリングハーバーラボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory）、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州（１９８９年））。グアニジン−イソチオシアネート法（チアグウィン（Chirgwin）ら，Biochemistry 18: 5294(1979)）により全ＲＮＡを抽出して、オリゴ−ｄＴ結合ダイナビーズ（dynabeads）（ダイナル（Dynal）、オスロ、ノルウェー）により分離してポリＡ＋画分を得た。報告（マニアティス（Maniatis）ら、上記文献）されたようにサザンおよびノーザンブロットを実施した。ランダムプライマー法を使用して０．５〜２×１０9cpm/μg ＤＮＡの比活性で32Ｐによりプローブを放射能標識し、これを、本プローブによりカバーされるＮ２／Ｆ１２−ＨＩＶ  ｎｅｆ−（ａｓ）ゲノムの領域の概略図である図２に示す。Ｆ１２−ＨＩＶゲノムプローブは、Ｎ２／Ｆ１２−ＨＩＶ  ｎｅｆ−作成体からプロウイルスを切り出すことにより得た。完全長Ｔｎ５細菌性トランスポゾンをｎｅｏプローブとして使用した。Ｆ１２−ＨＩＶ  ｅｎｖおよびｎｅｆのＤＮＡは、各遺伝子の開始および停止コドンを部分的に重複するＥｃｏＲＩを最後に付けたオリゴ−プライマーを使用して、ｐＵＣ１９のＥｃｏＲＩ部位にＤＮＡ−ＰＣＲ増幅産物をクローニング後に得た。Ｆ１２−ＨＩＶ  Ｕ３  ＬＴＲプローブは、ｐＵＣ１９にクローン化したＦ１２−ＨＩＶ  ５’ＬＴＲのＸｂａＩ−ＳｍａＩ消化により回収した。Ｎ２特異的なプローブは、ＬＴＲ−Ｕ３プローブについてはＮｈｅＩおよびＳａｃＩによる、ＬＴＲ−Ｒ／Ｕ５プローブについてはＳｍａＩおよびＳｐｅＩによる、そしてＮ２（パッケージング部位）部位特異的なプローブについてはＥｃｏＲＩおよびＳｐｅＩによるＮ２消化後に回収した（図２を参照のこと）。
図４Ｉ〜IIIは、感染したｎｅｏr細胞集団からの、ＸｈｏＩ消化（ａ）またはＥｃｏＲＩ消化（ｂ）されたゲノムＤＮＡ、およびｎｅｆ−（ａｓ）で安定に形質導入した細胞クローンからのＥｃｏＲＩ消化（ｃ）ゲノムＤＮＡのサザンブロットである。図４Ｉおよび４IIでは、ｎｅｏrｎｅｆ−（ａｓ）およびｎｅｆ−（ｓ）で形質導入したＣＥＭｓｓ細胞からのＤＮＡを、それぞれレーンＡおよびＢに示し、一方ｎｅｏrｎｅｆ（ａｓ）、ｎｅｆ−（ｓ）、ｎｅｆ＋（ａｓ）およびｎｅｆ＋（ｓ）で感染させたＰＡ３１７細胞からのＤＮＡを、それぞれレーンＣ〜Ｆに示す。図４IIIでは、ｎｅｆ−（ａｓ）ＰＡ３１７（２と１２）およびＣＥＭｓｓ（４０と４１）細胞クローンからのＤＮＡを示す。未感染ＣＥＭｓｓ（Ｃ−）およびＨ９−ＨＴＬＶIIIB細胞（Ｃ＋）からのＤＮＡは、それぞれ陰性および陽性対照として使用した。ＨｉｎｄIII消化ファージＤＮＡは、分子マーカーとして使用した（左側）。
Ｎ２／Ｆ１２−ＨＩＶ  ｎｅｆ−（ａｓ）でトランスフェクションしたＰＡ３１７細胞からの上清により感染させたｎｅｏrＣＥＭｓｓ細胞からのＸｈｏＩ消化ＤＮＡのサザンブロットは、全Ｆ１２−ＨＩＶゲノムがＸｈｏＩ消化により作成体から摘出されるため、予想どおり９kbバンドを示し（図４Ｉ、レーンＡ）、さらに恐らくゲノム再編成により誘導された低分子量の追加のシグナルも示された。これとは対照的、ｎｅｆ−（ａｓ）でトランスフェクションしたＧＰ＋Ｅ８６細胞からの上清により感染させたｎｅｏrＰＡ３１７細胞のＸｈｏＩ  ＤＮＡパターンには余分なバンドは検出されなかった（図４II、レーンＡ）が、一方ＰＡ３１７細胞では予期しないシグナルが検出された（図４II、レーンＣ）。
Ｎ２／Ｆ１２−ＨＩＶ  ｎｅｆ−（ｓ）からの上清でトランスフェクションしたＰＡ３１７細胞の上清により感染したｎｅｏrＣＥＭｓｓ細胞からのＸｈｏＩ消化ＤＮＡのサザンブロット（図４Ｉ、レーンＢ）は、恐らくＦ１２−ＨＩＶ  ＲＮＡの３つの主要な形（すなわち、Ｎ２／Ｆ１２−ＨＩＶ  ｎｅｆ−（ｓ）および（ａｓ）でトランスフェクションしたパッケージング細胞中で転写された推定ＲＮＡの概略図である図３に示されるように、スプライシングされていない形、１回および２回スプライシングされた形）に由来する、異なる３つのＦ１２−ＨＩＶ特異的ＤＮＡの組み込みを証明した（フェデリコ（Federico）ら，(1989)，上記文献）。これらのデータはまた、ＥｃｏＲＩ消化により確認された（図４II、レーンＢ）。逆に、トランスフェクションしたｎｅｆ−（ｓ）ＧＰ＋Ｅ８６細胞からの上清で感染したｎｅｏrＰＡ３１７細胞からのゲノムＤＮＡではＦ１２−ＨＩＶ特異的シグナルは検出されなかった（図４Ｉ、レーンＤ）が、このことは、これらの細胞ではＦ１２−ＨＩＶ配列の形質導入が非常に低い効率であったことを示している。
ｎｅｆ＋でトランスフェクションしたＰＡ３１７の上清による感染およびＧ１４８選択後に、ＣＥＭｓｓ細胞を回収する試みは成功しなかった。ｎｅｏrＰＡ３１７細胞からのＸｈｏＩ消化したＤＮＡのサザンブロット分析により、ｎｅｆ＋（ｓ）レトロビリオンにより感染したＰＡ３１７細胞における単一バンドの存在が明らかになった（図４Ｉ、レーンＥ）。このシグナルの分子量（約３kb）は、２回スプライシングされたＦ１２−ＨＩＶ  ＲＮＡ分子だけが、感染性組換えレトロウイルスにパッケージングされたことを示している。逆に、ｎｅｆ＋（ａｓ）レトロビリオンで感染したＰＡ３１７細胞ではバンドが検出されなかった（図４Ｉ、レーンＦ）。
レトロウイルス感染により細胞中に形質導入されたＮ２／Ｆ１２−ＨＩＶ作成体の機能を評価するために、全てのｎｅｏr細胞集団を、Ｆ１２−ＨＩＶがコードするｇａｇタンパク質の細胞質内蓄積について試験した。レトロウイルス感染細胞の細胞内ｐ２４抗原を、０．１％トリトンＸ−１００（シグマ（Sygma）、セントルイス、ミズーリ州）を含有する２００μlのＴＮＥ（トリス−ＨＣｌ  １０mM、ＮａＣｌ  １００mM、ＥＤＴＡ  １mM、ｐＨ７．４）緩衝液に細胞（１０5）を溶解することにより測定した。氷上で５分間インキュベーション後、細胞溶解物を短時間遠心分離して、生じた上清をＥＬＩＳＡ−抗原捕捉測定法（アボット（Abbott）、ノースシカゴ、イリノイ州）により試験した。
ＨＩＶ関連タンパク質は、放射免疫沈降測定法（ＲＩＰＡ、フェデリコ（Federico）ら，(1995)，上記文献）により検出した。ＨＩＶ＋またはＨＩＶ−血清の混合物のいずれかで実施した。代表的Ｎ２／Ｆ１２ＨＩＶ  ｎｅｆ−（ａｓ）で形質導入したＣＥＭｓｓクローンのＲＩＰＡ測定法の結果を図１１に示す。Ｆ１２およびＨ９／ＨＴＬＶIIIB細胞からの細胞溶解物を陽性対照として使用し、一方Ｎ２で形質導入したＣＥＭｓｓ細胞からの細胞溶解物を陰性対照として使用した、14Ｃ標識分子マーカーおよＲＩＰＡで検出可能なＨＩＶタンパク質もマークされる。
上記結果から見て、ｎｅｆ−を発現する細胞のみをＥＬＩＳＡ測定法により分析した。この結果は表IIに示すが、この表は、センス（ｓ）またはアンチセンス（ａｓ）Ｎ２／Ｆ１２−ＨＩＶ組換えレトロウイルスで感染させたｎｅｏr細胞の細胞質内Ｆ１２ＨＩＶ  ｇａｇタンパク質の量（１０5ｎｅｏr細胞集団中のｇａｇタンパク質のピコグラムで表される；異なる４回の実験の平均値±標準偏差）、および全評価細胞クローンの中でＦ１２−ＨＩＶを発現する細胞クローンの数を与える。
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結果は、ｎｅｆ−（ｓ）ビリオンにより感染したｎｅｏrＰＡ３１７細胞では細胞質内Ｆ１２−ＨＩＶ  ｇａｇタンパク質が検出されなかったことを示している。ｎｅｆ−（ｓ）両栄養性レトロウイルスにより感染したｎｅｏrＣＥＭｓｓ細胞では最初に低レベルの細胞質内タンパク質が検出されたが、細胞継代により細胞質内タンパク質は検出されなくなった。
これとは対照的に、ｎｅｆ−（ａｓ）ゲノムを取り込んだＰＡ３１７およびＣＥＭｓｓ細胞では、両方とも高レベルのＦ１２−ＨＩＶ  ｇａｇタンパク質が検出可能であった。これらの陽性の値は、長期、すなわち、１年にわたって安定していた。
安定にＦ１２−ＨＩＶゲノムを安定に発現する細胞の百分率を評価するために、ｎｅｆ−ゲノムを（ｓ）または（ａｓ）方向に組み込んだｎｅｏrＰＡ３１７およびＣＥＭｓｓ組織を限界希釈法によりクローン化した。表IIに示されるように、Ｆ１２−ＨＩＶ発現ｎｅｆ−（ｓ）クローンは、ＰＡ３１７またはＣＥＭｓｓ  ｎｅｏr細胞のいずれからも単離されなかった（後者は、最初ＥＬＩＳＡ試験において陽性であったが）。これとは対照的に、ｎｅｆ−（ａｓ）ゲノムを発現するＰＡ３１７細胞クローンは容易に利用可能であり（約１２％）；さらに、約２３％のＣＥＭｓｓクローンはｇａｇタンパク質を合成することができた。
例５  感染細胞の蛍光活性化細胞ソーター（ＦＡＣＳ）解析
原形質膜のＣＤ４受容体を、間接免疫蛍光法により検出して、タッデオ（Taddeo）らが記載したように細胞蛍光分析機により分析した（Virology 194: 441-452(1993)）。簡単に述べると、細胞（１０6）を適切な濃度の抗ＣＤ４モノクローナル抗体（ｍＡｂ、オーソダイアグノスティック（Ortho Diagnostic）、ラリタン（Raritan）、ニュージャージー州）と共に２．５％ＦＣＳを含有する１００μlのリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中でインキュベートした。氷上で１時間のインキュベーション後、試料をＰＢＳで２回洗浄して、フルオレセインイソチオシアネートと結合した１：２０ヤギ抗マウスＩｇＧ（オーソダイアグノスティック（Ortho Diagnostic）、ラリタン（Raritan）、ニュージャージー州）１００μlと共に氷上でさらに１時間インキュベートした。ＰＢＳで３回洗浄後、試料をホルムアルデヒドの２％v/v溶液で固定して、細胞蛍光分析機（ファックス−スキャン（FAC-scan）、ベクトン・ディッキンソン（Becton-Dickinson）、マウンテンビュー、カリホルニア州）により分析した。
細胞質内ＨＩＶ  ｇａｇ関連タンパク質は、直接免疫蛍光法により検出した。細胞（１０6）を、２．５％ＦＣＳを補足したＰＢＳ緩衝液で３回洗浄し、２００μlのＰＢＳ−ＥＤＴＡに再懸濁した（１０mM）。次にＰＢＳ−ホルムアルデヒド（２％v/v）溶液を加えて、細胞を室温（ＲＴ）で１０分間インキュベートした。ＰＢＳ／ＦＣＳ緩衝液で２回洗浄後、細胞を４０μlの冷ＰＢＳ−ＥＤＴＡに再懸濁した。次に、４００μlの冷メタノールを滴下して加えて、細胞を氷上でさらに１０分間インキュベートした。次に細胞を３回洗浄して、ＲＴで１時間、フィコエリトリン（ＰＥ）と結合したＫＣ５７−ＲＤ１（クールター社（Coulter Corp.）、ヒアルカム（Hialcam）、フロリダ州）抗ｇａｇ  ＨＩＶモノクローナル抗体の１：５０希釈物と共にインキュベートした。最後に、細胞をＰＢＳ−ＦＣＳ緩衝液で３回洗浄して、細胞蛍光分析機により分析した。未感染細胞とＰＥ結合非特異的マウスＩｇＧ１抗体（クールター社（Coulter Corp.））の両方を陰性対照として使用した。
１１個のＦ１２−ＨＩＶ  ｎｅｆ−（ａｓ）発現ＰＡ３１７クローンからの上清をＮＩＨ  ３Ｔ３細胞でcfu/mlとして力価測定した。レトロウイルス力価は、比較的低く、大きなサイズのレトロウイルス作成体、すなわち、約１１kbの場合、４．６×１０2〜４×１０4cfu/mlの範囲であった。
レトロウイルス力価の最も高い２つのＰＡ３１７クローン（２番と１２番）のＤＮＡ分析は、レトロウイルス作成体が宿主ゲノム中に充分に組み込まれており（図４III）、ノーザンブロット分析により証明されるように、効率的に転写されたことを示している。細胞質内のＦ１２−ＨＩＶ特異的ｇａｇタンパク質の直接免疫蛍光法は、図５ａおよび５ｂに示されるが、これらの図は、実際の計数対それぞれＰＡ３１７クローン２番および１２番を発現するＦ１２−ＨＩＶ  ｎｅｆ−（ａｓ）の蛍光強度のグラフである。両方のグラフで、抗ｇａｇ  ＨＩＶ処理ＰＡ３１７細胞の傾きは、陰性対照として報告される。図５に示すように、両方のクローンは、Ｆ１２−ＨＩＶゲノムを均質に発現することができた。
例６  形質導入したＣＥＭｓｓ細胞とヒトＰＢＬの分子性状解析
Ｆ１２−ＨＩＶゲノムをＨＩＶ感受性細胞に形質導入するために、ＰＡ３１７クローンをＣＥＭｓｓ細胞およびＰＨＡ刺激新鮮ヒトＰＢＬと同時培養した。同時培養の２４時間後、Ｇ４１８をＣＥＭｓｓ細胞に加えて、２０日後にｎｅｏr細胞集団を得た。細胞質内Ｆ１２−ＨＩＶ  ｇａｇタンパク質を発現するｎｅｏr細胞の百分率は、ＦＡＣＳ分析により測定した。結果は図６ａ〜ｄに示すが、これらの図は、未感染ＣＥＭｓｓ細胞（陰性対照、図６ａ）、ＨＵＴ−７８／Ｆ１２細胞（陽性対照、図６ｂ）、ＰＡ３１７クローン２番と同時培養後のｎｅｏrＣＥＭｓｓ細胞（図６ｃ）、およびＰＡ３１７クローン１２番と同時培養後のｎｅｏrＣＥＭｓｓ細胞（図６ｄ）中の細胞質内Ｆ１２−ＨＩＶ  ｇａｇタンパク質の存在のＦＡＣＳ分析を表している。また、それぞれ陽性細胞の百分率も示される。図６ａ〜ｄに示されるように、約３５％のｎｅｏr細胞がＦ１２−ＨＩＶゲノムを発現した。これらのデータは、ＨＵＴ−７８細胞において反復された。さらに、３６／６０個の評価したＣＥＭｓｓ細胞クローン、すなわち５５％が、ＨＩＶ  ｇａｇ特異的ＥＬＩＳＡにより評価するとＦ１２−ＨＩＶゲノムを発現していた。
「生産性」ＰＡ３１７クローン２番または１２番と同時培養により形質導入したｎｅｏrＣＥＭｓｓ細胞の制限酵素消化したゲノムＤＮＡのサザンブロットを、それぞれ図７ａおよび７ｂに示すように、Ｆ１２−ＨＩＶまたはｎｅｏ特異的プローブとハイブリダイズさせた。レーン１は、Ｎ２で形質導入したＣＥＭｓｓ細胞からのＤＮＡを表し、一方レーン２は、クローン化していないＮ２／Ｆ１２−ＨＩＶ  ｎｅｆ−（ａｓ）ＰＡ３１７細胞により形質導入したｎｅｏrＣＥＭｓｓ細胞からのＤＮＡを表し、レーン３および４は、それぞれＰＡ３１７クローン２番またはクローン１２番と同時培養後のｎｅｏrＣＥＭｓｓ細胞を表し、レーン５および６は、それぞれＰＡ３１７クローン２番またはクローン１２番のいずれかとの同時培養後のｎｅｏrＨＵＴ−７８細胞を表し、そしてレーン７は、ＰＡ３１７クローン１２番を表す。ゲノムＤＮＡは、所定の制限酵素で消化して、ＤＮＡ分子マーカーは、図４Ｉ〜IIIと同じものとした。ハイブリダイゼーションにより、Ｆ１２−ＨＩＶゲノムが、明らかなゲノムの再編成なく充分に組み込まれたことが示される。
ＣＥＭｓｓ細胞中の感染発生の頻度を推定するために、ｎｅｏr細胞のクローン性を試験した。「生産性」ＰＡ３１７クローン２番または１２番と同時培養して形質導入したｎｅｏrＣＥＭｓｓまたはＨＵＴ−７８細胞のＨｉｎｄIII消化ゲノムＤＮＡを、図８に示すようにｎｅｏプローブとハイブリダイズさせたが、この図８は、このようなハイブリダイゼーションのサザンブロットである。Ｎ２／Ｆ１２−ＨＩＶ  ｎｅｆ−（ａｓ）作成体のＮ２  ５’ＬＴＲ側から開始して、ＨｉｎｄIII酵素により認識される最初の部位は、Ｎ２  ５’ＬＴＲ末端から約３kbのＦ１２  ｅｎｖ遺伝子に存在する。対照として、ＰＡ３１７クローン１２番（陽性）および親ＣＥＭｓｓ細胞（陰性）からのＤＮＡを使用した。分子量マーカーは、図４Ｉ〜IIIと同じものとした。ｎｅｏプローブとのゲノムＤＮＡのハイブリダイゼーションは、Ｔ細胞を形質導入した培養物が主としてポリクローナルであるため、ｎｅｏr細胞集団が、稀な感染発生により出現する可能性は排除されることを証明した。
比較分子性状解析を実施するために、Ｆ１２−ＨＩＶ  ｎｅｆ−（ａｓ）ゲノムを組み込んで発現する４０個のＣＥＭｓｓクローンを単離して培養した。２つの代表的クローン（４０番と４１番）のＥｃｏＲＩパターンを図４IIIに示す。ＣＥＭｓｓクローンはＨＩＶ  ＲＮＡまたはタンパク質パターンに顕著な差は検出されなかった（組み込み部位の変化により評価するとき）。
ポリＡ＋ＲＮＡは、Ｆ１２−ＨＩＶ特異的なプローブ、すなわち、完全長、Ｕ３−ＬＴＲ、ｎｅｆ、およびｅｎｖ、またはＮ２ベクターの異なる領域を認識する図３に示されるプローブのいずれかとハイブリダイズさせた。図９ａ〜ｄは、完全長Ｆ１２−ＨＩＶ（図９ａ）、Ｆ１２−ＨＩＶ  Ｕ３  ＬＴＲ（図９ｂ）、Ｆ１２−ＨＩＶ  ｎｅｆ（図９ｃ）、およびＦ１２−ＨＩＶ  ｅｎｖプローブ（図９ｄ）、すなわち、Ｆ１２−ＨＩＶ特異的プローブとハイブリダイズさせた、Ｆ１２細胞（レーン１）、親ＣＥＭｓｓ細胞（レーン２）、およびＮ２／Ｆ１２−ＨＩＶ  ｎｅｆ−（ａｓ）で形質導入したＣＥＭｓｓクローン４０（レーン３）からのポリＡ＋  ＲＮＡのノーザンブロットである。Ｆ１２−ＨＩＶの主なＲＮＡ種の分子量は、図の左側に示される。図９に示される各ノーザンブロットについて、５μgのＲＮＡをブロットを作成するために使用したゲルの各レーンに流した。Ｆ１２−ＨＩＶ  ｎｅｆ−を発現するＣＥＭｓｓクローンは、低レベルの２回スプライシングされたＨＩＶ  ＲＮＡ、すなわち、Ｆ１２ＨＩＶを発現するＨｅＬａ  ＣＤ４＋クローン（フェデリコ（Federico）ら，(1995)，上記文献）に報告されたような、調節タンパク質に特異的なメッセンジャーを発現した。これとは対照的に、完全長および１回スプライシングされたＲＮＡは、かなり効率的に転写された。高分子量に明瞭に検出可能な二重線は、Ｆ１２−ＨＩＶおよびＭＬＶ  ５’ＬＴＲにより反対方向に促進された２つの完全長転写物に対応していた。この観察は、同じポリＡ＋  ＲＮＡをＦ１２−ＨＩＶ  ＬＴＲのＵ３領域を部分的に重複するプローブとハイブリダイズさせることにより検出される約１１kbの（二重バンドの代わりに）一重バンド（これは、Ｎ２レトロウイルスベクターをコードするＤＮＡ鎖からのみ転写することができた）により支持された。
図１０ａ〜ｄは、ｎｅｏ（図１０ａ）、Ｕ３−ＭＬＶ（図１０ｂ）、Ｒ／Ｕ５−ＭＬＶ（図１０ｃ）、およびＭＬＶ（図１０ｄ）Ｎ２特異的プローブとハイブリダイズさせた、Ｆ１２細胞（レーン１）、二重に促進されたレトロウイルスベクターｐＬｊで形質導入したＣＥＭｓｓ細胞（レーン２、コーナン（Korrnan）ら，PNAS USA 84: 2150-2154(1987)）、Ｎ２／Ｆ１２−ＨＩＶ  ｎｅｆ−（ａｓ）で形質導入したＣＥＭｓｓクローン４０（レーン３）からのポリＡ＋ＲＮＡのノーザンブロットである。ｐＬｊベクターによりＣＥＭｓｓで産生される主なＲＮＡ種の分子量は、ノーザンブロットの左側に記載されている。ｎｅｏ遺伝子、Ｎ２  ＬＴＲのＵ３およびＲ−Ｕ５領域、およびＮ２部位に特異的なプローブとのポリＡ＋  ＲＮＡのハイブリダイゼーションは、Ｆ１２−ＨＩＶ  ５’ＬＴＲにより促進される１回および２回スプライシングされた転写物が、各プローブにより認識されたことを証明し、このことは、これらのＲＮＡ種が、ＭＬＶ  ５’ＬＴＲのＵ３領域まで転写されたことを示している。Ｎ２部位特異的プローブ（これは、必ずＮ２  ５’ＬＴＲで促進される転写物を認識する）とのハイブリダイゼーション後に得られた単一の高分子量バンドは、スプライシングされていないＦ１２−ＨＩＶ  ＲＮＡが、このような配列を含まないことを示しており、このことは、代わりに１回および２回スプライシングされたＦ１２−ＨＩＶ  ＲＮＡでは起こらなかったスプライシング発生を示唆している。ＭＬＶ  ５’ＬＴＲによって、スプライシングされたＲＮＡは転写されなかった。実際、１０〜１１kbの二重線、および１回および２回スプライシングされたＦ１２−ＨＩＶ  ｍＲＮＡ（これらは、フィルムを露出過剰にした後でさえ容易に見られる）の他には追加のＲＮＡバンドは検出されなかった。従って、図９に示すように、単一の高分子量シグナルは、ＣＥＭｓｓポリＡ＋  ＲＮＡを、Ｎ２  ５’ＬＴＲで促進される転写物のみを認識するＦ１２−ＨＩＶ  Ｕ３／ＬＴＲプローブとハイブリダイズさせることにより検出された。
Ｎ２／Ｆ１２−ＨＩＶ  ｎｅｆ−（ａｓ）で形質導入したＣＥＭｓｓクローンにより産生されるウイルスタンパク質のプロフィールは、Ｆ１２−ＨＩＶでトランスフェクションしたＨｅＬａ  ＣＤ４＋クローンで得られたものと同様であった（フェデリコ（Federico）ら，(1995)，上記文献）。図１４ａは、培養上清のcpm/ml×１０-3対感染後（ｐ．ｉ．）日数のグラフであり、そして図１４ｂは、１０5ＴＣＩＤ５０／１０6細胞で重感染した、代表的Ｎ２／Ｆ１２−ＨＩＶ  ｎｅｆ−（ａｓ）ＣＥＭｓｓで形質導入したクローン（すなわち、１５、４０および４１）に関する、細胞生存率％対感染後日数のグラフである。Ｎ２で形質導入した細胞を対照として使用した。ｇｐ１６０  ｅｎｖ糖タンパク質の切断は検出されなかったが、一方複製能力のあるＨＩＶで感染した細胞に比較して、ｐ５５およびｐ２５  ｇａｇタンパク質の量の低下が観察された。表IIIに示すように、クローン２１を除いて、ＣＤ４発現の顕著な低下は、どのＦ１２−ＨＩＶ  ｎｅｆ−を発現するＣＥＭｓｓクローンでも検出されなかった。
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Ｎ２／Ｆ１２−ＨＩＶ  ｎｅｆ−（ａｓ）作成体もまた、新鮮ヒト末梢血リンパ球（ＰＢＬ）に形質導入した。同時培養の２４時間後、ＥＬＩＳＡにより細胞質内抽出物を試験することにより形質導入効率を評価した。ｇａｇタンパク質は、ＰＡ３１７クローン２番および１２番との同時培養の終了の５日後に１０5ＰＢＬから、それぞれ１５および３９pgの量で得た。従って図１２ａ〜ｃに示すように、ＦＡＣＳ分析から、同時培養により約５％のＰＢＬの形質導入が成功したと推定された。図１２ａ〜ｃは、抗ｇａｇＨＩＶ処理したＨＵＴ７８−Ｆ１２細胞（図１２ａ、陽性対照）、未感染ＰＢＬ（図１２ｂ、陰性対照）、およびＰＡ３１７クローン１２番との同時培養の終了の５日後の新鮮ヒトＰＢＬ（図１２ｃ）のＦＡＣＳ分析を表す、実際の計数対蛍光強度のグラフである。陽性細胞の百分率は、それぞれ９６％、０．７％および５．９５％である。これらのデータは、形質導入したＰＢＬから抽出された高分子量ＤＮＡのサザン分析により支持された。
例７  ＨＩＶで重感染した形質導入したＣＥＭｓｓクローンの分子性状解析
２５個のＣＥＭｓｓクローンを、ＨＩＶ−１（ＨＴＬＶIIIBまたはＮＬ４−３株のいずれか）で感染多重度（ｍ．ｏ．ｉ．）５×１０3または５×１０5ＴＣＩＤ５０／１０6細胞で、重感染させた。ＨＩＶ−１重感染の細胞変性効果（ｃ．ｐ．ｅ．）を融合細胞形成および細胞生存率に関して評点した。さらに、上清の逆転写酵素（ＲＴ）活性を測定した。
どのＨＩＶ重感染ＣＥＭｓｓクローンでも融合細胞形成は検出されなかった。これとは対照的に、野生型ＣＥＭｓｓおよびＮ２ベクターを組み込んだＣＥＭｓｓ細胞の両方とも、急速に大きな融合細胞を形成し、ＨＩＶの重感染の数日後に死滅した。３つの代表的なＣＥＭｓｓクローンのＲＴ活性と細胞生存率の両方の動態を、図１３および１４に示す。図１３ａは、培養上清のcpm/ml×１０-3対感染後（ｐ．ｉ．）日数のグラフであり、そして図１３ｂは、５×１０3ＴＣＩＤ５０／１０6細胞で重感染した、代表的Ｎ２／Ｆ１２−ＨＩＶ  ｎｅｆ−（ａｓ）ＣＥＭｓｓで形質導入したクローン（すなわち、１５、４０および４１）についての、細胞生存率％対感染後日数のグラフである。親ＣＥＭｓｓとＮ２で形質導入したＣＥＭｓｓ細胞の両方を対照として使用した。図１４は、上述のとおりである。
データは、ＨＩＶの重感染が高い感染多重度でさえ、Ｆ１２−ＨＩＶを発現するクローンの増殖に顕著な影響を及ぼさなかったことを示している。より高い感染多重度でクローン１５のＲＴ測定法で検出された陽性点は、同じ感染多重度で重感染された２５個の形質導入したＣＥＭｓｓクローンの中の５個に由来する数少ないＲＴ陽性試料を代表するものであった。しかし、残りのＣＥＭｓｓクローンでは、使用した感染多重度および重感染後の日数にかかわらず、非常に低いか、または陰性のＲＴ値が検出された。
このように、Ｆ１２−ＨＩＶゲノムの発現は、ＣＤ４  ＨＩＶ受容体の暴露に影響を及ぼすことなく、野性型の重感染するＨＩＶの複製を強力に阻害した。この干渉性はまた、ｎｅｆ遺伝子を欠いているＦ１２−ＨＩＶゲノムがＮ２ベクターに挿入されて、組換えレトロウイルス感染により形質導入されるときにも保存された（フェデリコ（Federico）ら，(1995)，上記文献も参照のこと）。
本明細書に記載の特許、特許出願、雑誌の論文および本を含む全ての文献は、その全体が参考のため本明細書に組み込まれる。
本発明を、１つまたはそれ以上の好ましい実施態様を強調して記載したが、当業者には、当該分野における改良から生じる変法を含む変法を利用することができ、本発明を本明細書に具体的に記載されたものと異なる方法で実施することができることは明らかであろう。従って、本発明は、以下の請求の範囲により定義される本発明の精神と範囲に包含される、全てのそのような変法および修飾を含む。
配列表
（１）一般情報：
（i）出願人：
（Ａ）名称：衛生高等研究所（Istituto Superiore di Sanita）
（Ｂ）通り：レジーナエレーナ通り２９９（Viale Regina Elena 299）
（Ｃ）市：ローマ
（Ｅ）国：イタリア
（Ｆ）郵便番号（ＺＩＰ）：００１６１
（Ａ）名称：フォンダチオーネ・チェントロ・サン・ラファエレ・デル・モンテ・デル・ターボル（Fondazione Centro San Raffaele del Monte del Tabor）
（Ｂ）通り：オルゲッティーナ通り６０（Via Olgettina 60）
（Ｃ）市：ミラノ
（Ｅ）国：イタリア
（Ｆ）郵便番号（ＺＩＰ）：２０１３２
（ii）発明の名称：細胞へのＨＩＶ重感染に対する抵抗性を与える組成物および方法
（iii）配列の数：４
（iv）コンピューターで読める形式：
（Ａ）媒体の型：フロッピーディスク
（Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ  ＰＣコンパチブル
（Ｃ）オペレーティング・システム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ
（Ｄ）ソフトウェア：パテントイン・リリース＃１．０（PatentIn Release #1.0）、バージョン＃１，３０（ヨーロッパ特許庁（EPO））
（２）配列番号：１の情報：
（i）配列の特色：
（Ａ）長さ：６塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号：１：
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（２）配列番号：２の情報：
（i）配列の特色：
（Ａ）長さ：６塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号：２：
0003805371.tif 000006
（２）配列番号：３の情報：
（i）配列の特色：
（Ａ）長さ：２７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号：３：
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（２）配列番号：４の情報：
（i）配列の特色：
（Ａ）長さ：２６塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号：４：
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１３ａ】
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【図１４】
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【図１４ａ】
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