(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
κ−カゼインを有効成分とする動脈硬化防止剤。
【請求項２】
κ−カゼインをビオプラーゼで１０分間加水分解して調製したκ−カゼインの加水分解物、またはκ−カゼインをレイニンで３０分間加水分解して調製したκ−カゼインの加水分解物を有効成分とする動脈硬化防止剤。
【請求項３】
κ−カゼインおよび請求項２のκ−カゼインの加水分解物を有効成分とする動脈硬化防止剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
この発明は、動脈硬化防止剤に関するものである。さらに詳しくは、この発明は、変性低密度リポタンパク質（以下低密度リポタンパク質をＬＤＬと記載する）のマクロファージへの取り込みを阻害することにより、血管壁へのコレステロール沈着を防止し、動脈硬化症を予防またはその進行を防止する動脈硬化防止剤に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
虚血性心疾患および脳梗塞等の動脈硬化症は、動脈壁にコレステロールエステルが蓄積して脂肪層(fatty streak)を形成し、この脂肪層がさらにアテローム性プラークを形成して血管を狭窄、閉塞することが原因とされている。このコレステロールエステルの蓄積は、コレステロールエステルを大量に含む泡沫細胞(foam cell) の集簇によるが、初期の動脈硬化病巣にはマクロファージ由来の泡沫細胞が多く認められることから、マクロファージが動脈硬化発症に重要な役割を果たすことが明らかになってきた［アメリカン・ジャーナル・オブ・パソロジー(American Journal of Pathology) 、第１０３巻、第１８１ページ、１９８１年］。
【０００３】
マクロファージには、正常ＬＤＬを認識して取り込むＬＤＬ受容体はあまり存在せず、生体内で化学修飾を受けた変性ＬＤＬを特異的に認識して取り込むスカベンジャー受容体が発達しており、マクロファージはスカベンジャー受容体を経由して変性ＬＤＬを過剰に取り込むことによりコレステロールエステルを蓄積し泡沫化する［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンスイズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステーツ・オブ・アメリカ(Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America) 、第７６巻、第３３３ページ、１９７９年］。スカベンジャー受容体が認識する変性ＬＤＬとしては、アセチル化ＬＤＬ、マレイル化ＬＤＬ、酸化ＬＤＬ等、特に陰性電荷が増加した変性ＬＤＬを例示できるが、実際の生体内ではフリーラジカルによるＬＤＬの酸化が変性ＬＤＬ生成の主要経路と考えられている［ニュー・イングランド・ジャーナル・オブ・メディシン(New England Journal of Medicine) 、第３２０巻、第９１５ページ、１９８９年］。
【０００４】
一方、高密度リポタンパク質（以下ＨＤＬと記載する）は、一旦形成された泡沫細胞からのコレステロールの汲み出し作用があることが報告されており、ＨＤＬの動脈硬化抑制作用にはこの機構が関与していることが示唆されている［ジャーナル・オブ・リピッド・リサーチ(Journal of Lipid Research) 、第２１巻、第３９１ページ、１９８０年］。
【０００５】
動脈硬化症がこのような機構によって発症することから、動脈硬化症の予防またはその進行の防止には、従来、次のような方策が採用されていた［ザ・リピッド(The Lipid) 、第２巻、第４９４ページ、１９９１年］。
ａ）ＬＤＬコレステロールを低下させる
ｂ）ＬＤＬの変性（特に酸化）を抑制する
ｃ）マクロファージの泡沫化を抑制する
ｄ）泡沫細胞からのコレステロールを汲み出しを促進する
前記ａ）に関しては、食事中のコレステロールの低減、食物繊維および多価不飽和脂肪酸の摂取等による食事療法、コンパクチン等のコレステロール合成阻害剤、イオン交換樹脂等のコレステロール排泄促進剤等による薬物療法が広く実施されている。
【０００６】
また、前記ｂ）に関しては、プロブコール等の薬剤にＬＤＬの酸化抑制作用があることが明らかになってきている。さらに、前記ｄ）に関しては、その作用を持つＨＤＬを上昇させるために前記ａ）と同類の食事療法、薬物療法が実施されている。ＨＤＬの他、サイログロブリンやカゼインに泡沫細胞からコレステロールを汲み出す作用が見い出されているが［ジャーナル・オブ・リピッド・リサーチ(Journal of Lipid Research) 、第２１巻、第３９１ページ、１９８０年］、実用化には至っていない。なお、この文献に記載のカゼインは全カゼイン画分であり、κ−カゼインに泡沫細胞のコレステロールを汲み出す作用があるか否かは知られていない。
【０００７】
さらに、前記ｃ）に関しては、アシルCoＡ：コレステロールアシルトランスフェラーゼ等のマクロファージ内に存在する泡沫化に関与する酵素の阻害剤にこの作用があることが知られているが、変性ＬＤＬのマクロファージへの取り込みを阻害して泡沫化を抑制することによる動脈硬化症の予防、またはその進行の防止に関してはほとんど検討されておらず、ましてやκ−カゼインおよびその加水分解物に変性ＬＤＬのマクロファージへの取り込みを阻害する作用があることは全く知られていない。
【０００８】
一方、κ−カゼインは、乳汁のカゼイン画分に含有される分子量約１９０００ダルトンの糖蛋白質である。牛乳では全カゼイン画分の約１５％を占め、人乳では全カゼイン画分の約３０％を占める。κ−カゼインは、カゼインミセルの形成およびカードの形成に物理化学的に重要な役割を果たすが、特異的な生理作用に関しては特に顕著な作用は知られていない。κ−カゼインが変性ＬＤＬのマクロファージへの取り込みを阻害することは、従来全く知られておらず、文献が皆無である。
【０００９】
さらに、κ−カゼインの加水分解物については、κ−カゼインからレンネットの作用により得られるグリコマクロペプチドに、ビフィズス菌増殖作用、胃酸分泌抑制作用、病原菌付着防止作用（特開平３−２２０１３０号公報）、感染防御作用（特開昭６３−２８４１３３号公報）、抗歯垢作用および抗齲歯作用（特開昭６３−２３３９１１号公報）等が、その他の潜在性ペプチドにオピオイドアンタゴニスト作用、血小板凝集抑制作用［ミルク総合事典、第１１３ページ、朝倉書店、１９９２年］等が知られているが、変性ＬＤＬのマクロファージへの取り込みを阻害することは、従来全く知られていない。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
この発明の発明者らは、先にラクトフェリンおよび／またはラクトフェリンの加水分解物に動脈硬化症防止作用があることを見い出し、既に特許出願を行った（特願平５−２３０５５号。以下先願と記載する）。
この発明の発明者らは、先願出願後、動脈硬化症防止作用を有する物質についてさらに検索を行った結果、κ−カゼインおよび／またはκ−カゼインの加水分解物が変性ＬＤＬのマクロファージへの取り込みを阻害してマクロファージの泡沫化を抑制すること、さらには全カゼイン画分に比較し、全カゼイン画分からκ−カゼインを精製して用いることによりその活性が顕著に上昇することを見い出した。
【００１１】
この発明は、以上のとおりの新たな知見に基づき、従来の動脈硬化症予防方法、またはその進行防止方法とは異なった新しい動脈硬化症予防、またはその進行防止に有用な薬剤を提供することを目的としている。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
この発明は、前記の課題を解決するものとして、κ−カゼインを有効成分とする動脈硬化防止剤を提供する。
また、この発明は、κ−カゼインの加水分解物を有効成分とする動脈硬化防止剤を提供する。
【００１３】
さらにこの発明は、κ−カゼインおよびκ−カゼインの加水分解物を有効成分とする動脈硬化防止剤をも提供する。
以下、この発明について詳しく説明する。
この発明の動脈硬化防止剤に用いるκ−カゼインは、市販のκ−カゼイン、ヒト、ウシ、ヒツジ、ヤギ等の乳等から常法（例えば、尿素硫酸法）により単離したもの、または遺伝子組換え技術等によって生産されたものであってもよい。
【００１４】
この発明の動脈硬化防止剤に用いるκ−カゼインの加水分解物は、例えば、前記κ−カゼインを酸またはプロテアーゼにより公知の方法で加水分解することにより製造することができる。しかし、低分子化することによりその効果が低下するので、特に制限はないが、分子量１０００ダルトン以上の画分が全体の３０％（重量。以下特に断りのない限り同じ）以上の割合で加水分解を停止するのが望ましい。
【００１５】
この発明においては、κ−カゼインまたはκ−カゼインの加水分解物を単独で用いることも、両者を併用することもできる。ただし、後述するようにカゼイン画分に含有される他のカゼイン、例えばαs −カゼインまたはβ−カゼインとの併用は、その作用を抑制するので、望ましくない。
この発明の動脈硬化防止剤は、経口的に通常の食品、薬品の形態で生体に投与することができる。また、非経口的に静脈内、動脈内、筋肉内、皮下、腹腔内等に投与することができ、例えば、無菌的に生理食塩水等の溶液に溶解して注射剤として投与することができる。非経口的に投与する場合、投与対象となる動物と異種の由来のκ−カゼインを用いるとその抗原性が問題となるので、同種動物由来のκ−カゼインまたはその加水分解物を用いるのが望ましい。
【００１６】
κ−カゼインまたはκ−カゼインの加水分解物の投与量は、動物の種類、年齢および症状によって変動するが、経口投与の場合、通常５ｍｇ〜１０００ｍｇ／ｋｇ体重／日、望ましくは１０ｍｇ〜２００ｍｇ／ｋｇ体重／日であり、非経口投与の場合、通常０．５ｍｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ体重／日、望ましくは１ｍｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ体重／日である。
【００１７】
κ−カゼインまたはκ−カゼインの加水分解物の急性毒性は、後記する試験例３から明らかなように、いずれもＬＤ50は４０００ｍｇ／ｋｇ体重以上であり、毒性は極めて低い。
次に試験例を示してこの発明をさらに詳しく説明する。
（試験例１）
この試験は、マクロファージのスカベンジャー受容体に対する変性ＬＤＬの特異的結合に及ぼすκ−カゼインの影響を調べるために行った。
１）試料の調製
正常ヒト血清から常法（社団法人日本生化学会編、「続生化学実験講座３」、第５９９ページ、東京化学同人、１９８６年）によりＬＤＬを調製し、そのＬＤＬから常法（社団法人日本生化学会編、「続生化学実験講座３」、第６７２ページ、東京化学同人、１９８６年）によりアセチル化ＬＤＬを調製した。
【００１８】
得られたアセチル化ＬＤＬを放射性ヨウ化ナトリウム（Ｎａ125 Ｉ）を用いて常法（社団法人日本生化学会編、「続生化学実験講座３」、第６６７ページ、東京化学同人、１９８６年）により標識し、放射活性４００ｃｐｍ／ｎｇ蛋白質の125 Ｉ−アセチル化ＬＤＬを調製した。
２）試験方法
ウィスター系雄ラット（日本ＳＬＣ社から購入。体重２００ｇ前後）から常法により腹腔マクロファージを採集し、１×１０6 個のマクロファージを１００μl のダルベッコ改変イーグル培地（３％のウシ血清アルブミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含有する。以下この培地を培地Ａと記載する）に懸濁し、１μｇの125 Ｉ−アセチル化ＬＤＬと種々の濃度のアセチル化ＬＤＬまたは常法［ジャーナル・オブ・デイリー・サイエンス(Journal of Dairy Science)、第４６巻、第１１８３ページ、１９６３年］により精製したウシκ−カゼインを添加して、４℃で１時間インキュベートした。遠心分離と１％のウシ血清アルブミンを含有するリン酸緩衝液（以下リン酸緩衝液をＰＢＳと記載する）による洗浄を３回反復し、マクロファージに結合している放射活性をγ−カウンター（アロカ社製）によって測定した。
３）試験結果
この試験の結果は、図１に示すとおりである。図１は、125 Ｉ−アセチル化ＬＤＬのマクロファージへの結合と試料濃度との関係を示し、縦軸および横軸は、それぞれ対照に対する125 Ｉ−アセチル化ＬＤＬのマクロファージへの結合の百分率、および試料濃度を示す。図中○および●は、それぞれアセチル化ＬＤＬおよびウシκ−カゼインを示す。
【００１９】
図１から明らかなように、アセチル化ＬＤＬの添加により125 Ｉ−アセチル化ＬＤＬのマクロファージへの結合は阻害されるが、この阻害される部分がマクロファージのスカベンジャー受容体に対するアセチル化ＬＤＬの特異的結合である。κ−カゼインは濃度に依存してこの特異的結合を阻害し、高濃度においてはほぼ完全に阻害した。すなわち、κ−カゼインは、変性ＬＤＬがマクロファージのスカベンジャー受容体に特異的に結合するのを阻害することが明らかに認められた。
【００２０】
なお、他の動物由来のκ−カゼインおよびκ−カゼインの加水分解物についてもほぼ同様の結果が得られた。
（試験例２）
この試験は、各種カゼインがマクロファージの泡沫化に与える影響を調べるために行った。
１）試料
▲１▼ウシα−カゼイン（シグマ社製。αs −カゼイン含量約８５％）
▲２▼ウシβ−カゼイン（シグマ社製）
▲３▼ウシκ−カゼイン（シグマ社製）
▲４▼前記▲３▼のウシκ−カゼインをビオプラーゼ（ナガセ生化学工業社製）で１０分間加水分解したウシκ−カゼイン加水分解物
▲５▼前記▲１▼▲２▼▲３▼と同一のα−カゼイン、β−カゼインおよびκ−カゼインを、５０：３５：１５の比率（牛乳のカゼイン中の比率）で混合した混合物
▲６▼ウシ全カゼイン画分［牛乳から常法（津郷友吉著、「牛乳の化学」、第７ページ、地球社、１９７５年）により調製］
２）試験方法
培地Ａに懸濁した３×１０6 個／ｍｌのラット腹腔マクロファージ（試験例１と同一の方法により調製）を、市販の１２穴プレートに１ｍｌずつ播種し、３７℃で２時間培養し、プレートの底面に接着させた。このマクロファージをＰＢＳで３回洗浄した後、１００μｇ／ｍｌのアセチル化ＬＤＬおよび種々の濃度の試料を含む培地Ａ１mlに入れ替え、３７℃で１６時間培養した。０．２％のウシ血清アルブミンを含むＰＢＳおよび含まないＰＢＳを用いて十分洗浄し、細胞内の脂質を抽出し、総コレステロールと遊離コレステロールを酵素法［ジャーナル・オブ・リピッド・リサーチ(Journal of Lipid Research) 、第１９巻、第５１４ページ、１９７８年］により測定し、その差からコレステロールエステルの量を算出した。
３）試験結果
この試験の結果は、図２に示すとおりである。図２は、マクロファージ内に蓄積したコレステロールエステルと試料濃度との関係を示し、縦軸および横軸は、それぞれ対照に対するマクロファージ内に蓄積したコレステロールエステルの百分率、および試料濃度を示す。
【００２１】
図２から明らかなように、α−カゼイン、β−カゼインの作用に比較して、κ−カゼインはマクロファージへのコレステロールエステルの蓄積を顕著に抑制した。また、κ−カゼインの加水分解物にもこの作用が認められた。すなわち、κ−カゼインおよびその加水分解物は、変性ＬＤＬによるマクロファージの泡沫化を特異的に抑制することが明らかになった。
【００２２】
一方、全カゼイン画分ならびにα−カゼイン、β−カゼインおよびκ−カゼインの混合物にもマクロファージへのコレステロールエステルの蓄積を抑制する作用が認められたが、これらの作用はκ−カゼインまたはその加水分解物を単独で用いた場合と比較して極めて弱いものであった。すなわち、変性ＬＤＬによるマクロファージの泡沫化を抑制する作用は、これらに含有されるκ−カゼインの割合（約１５％）から予測される作用よりも弱く、全カゼイン画分からκ−カゼインを精製して用いることによりその活性が顕著に上昇することが明らかになった。κ−カゼインはαs −カゼインおよびβ−カゼインと会合してカゼインミセルを形成していることが知られており（津郷友吉著、「牛乳の化学」、第２０ページ、地球社、１９７５年）、この会合によってκ−カゼインの作用が抑制されているものと推測される。
【００２３】
なお、マクロファージを泡沫化させる変性ＬＤＬとして、アセチル化ＬＤＬの代わりに常法［ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション(Journal of Clinical Investigation) 、第８１巻、第７２０ページ、１９８８年］により調製した酸化ＬＤＬを用いて同様の試験を行ったが、ほぼ同様の結果が得られた。
（試験例３）
この試験は、κ−カゼインおよびκ−カゼインの加水分解物の急性毒性を調べるために行った。
１）試験動物
６週齢のＣＤ（ＳＤ）系のラットの両性（日本チャールス・リバー社から購入）を、無作為にそれぞれ８群（１群５匹）に分けた。
２）試験方法
ウシκ−カゼイン（試験例１と同一のもの）およびウシκ−カゼイン（試験例１と同一のもの）をビオプラーゼ（ナガセ生化学工業社製）で１０分間加水分解して調製した加水分解物を注射用水（大塚製薬社製）に溶解し、体重１ｋｇ当り１０００、２０００および４０００ｍｇの割合で、金属製玉付き針を用いて単回強制経口投与し、急性毒性を試験した。
３）試験結果
この試験の結果は、表１に示すとおりである。表１から明らかなようにウシκ−カゼインおよびウシκ−カゼイン加水分解物を投与した全例ともに死亡例は認められなかった。従って、ウシκ−カゼインおよびウシκ−カゼイン加水分解物のＬＤ50はともに４０００ｍｇ／ｋｇ以上であった。なお、κ−カゼインおよびκ−カゼイン加水分解物の種類を変更して試験したが、ほぼ同様の結果が得られた。
【００２４】
【表１】
0003805804.tif 000002
【００２５】
次に実施例を示してこの発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、この発明は以下の例に限定されるものではない。
【００２６】
【実施例】
実施例１
１錠当り次の組成からなる錠剤の動脈硬化防止剤を調製した。
ウシκ−カゼイン加水分解物                      ２０．０（ｍｇ）
［ウシκ−カゼイン（試験例１と同一のもの）をビオプラーゼ（ナガセ生化学工業社製）で１０分間加水分解して調製］
乳糖一水和物（和光純薬工業社製）                ３０．０
トウモロコシデンプン（和光純薬工業社製）        １９．８
結晶セルロース（旭化成工業社製）                ２８．０
珪酸マグネシウム五水和物（和光純薬工業社製）      ２．０
ステアリン酸マグネシウム（和光純薬工業社製）      ０．２
ウシκ−カゼイン加水分解物、乳糖一水和物、トウモロコシデンプンおよび結晶セルロースの混合物に滅菌精製水を適宜添加しながら均一に混練し、５０℃で３時間乾燥させ、得られた乾燥物に珪酸マグネシウム五水和物およびステアリン酸マグネシウムを添加して混合し、常法により打錠機で打錠した。
実施例２
注射用水（大塚製薬社製）１ｍｌに、公知の方法［ジャーナル・オブ・バイオケミストリー(Journal of Biochemistry) 、第９０巻、第１００５ページ、１９８１年）で精製したヒトκ−カゼイン１０ｍｇおよびＤ−マンニット（和光純薬工業社製）４９．５ｍｇの割合で溶解し、リン酸緩衝剤粉末（和光純薬工業社製）の水溶液でｐＨを約７に調整し、濾過滅菌し、常法により１０ｍｌずつバイアル瓶に充填し、凍結乾燥し、注射用の凍結乾燥動脈硬化防止剤を調製した。
実施例３
精製したウシκ−カゼイン（試験例１と同一のもの）５０部（重量。以下同じ）、このウシκ−カゼインをレンニン（シグマ社製）で３０分間加水分解して得られた加水分解物３０部に、コーンスターチ（松谷化学工業社製）５０部、しょ糖（東洋精糖社製）５０部およびＬ−アスコルビン酸ナトリウム（日本ロッシュ社製）２０部の割合の原料を充分に混合し、混合物を２ｇずつ袋に詰め、経口摂取用の粉末状動脈硬化防止剤を調製した。
【００２７】
【発明の効果】
以上詳しく説明したとおり、この発明によって、変性ＬＤＬのマクロファージへの取り込みを特異的に阻害することによりマクロファージの泡沫化を抑制する動脈硬化防止剤が提供される。これによって、動脈硬化症の効果的な予防またはその進行防止が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  125Ｉ−アセチル化ＬＤＬのマクロファージへの結合と試料濃度との関係を示す。
【図２】  マクロファージ内に蓄積したコレステロールエステルと試料濃度との関係を示す。四角はそれぞれウシα−カゼインおよびウシβ―カゼインを、三角はそれぞれウシα−、β−、κ−カゼインの混合物およびウシ全カゼインを、丸はそれぞれウシκ−カゼインおよびウシκ−カゼイン加水分解物を示す。
【図１】
0003805804.tif 000003
【図２】
0003805804.tif 000004