(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
インビトロでの動物細胞の接着及び成長のための材料であって、式（Ｉ）：
Q-(PFPE-L)n-1-PFPE-Q        (Ｉ)
（式中、
ｎは、少なくとも１．０であり；
それぞれのＰＦＰＥは、同一又は異なっていてもよく、式（II）：
-OCH2CF2O(CF2CF2O)x(CF2O)yCF2CH2O-        (II)
（式中、
ＣＦ2ＣＦ2Ｏ及びＣＦ2Ｏ単位は、鎖を通してランダムか、又はブロックとして分布されていてもよく、
ｘ及びｙは、ペルフルオロポリエーテルの分子量が２４２〜４，０００の範囲であるように、同一又は異なっていてもよい）で示されるペルフルオロ化ポリエーテルであり、
Ｌは、２官能性の結合基であり、そして
マクロモノマーのそれぞれの末端のＱは、同一又は異なっていてもよく、重合しうる基である）で示されるマクロモノマーを含む細胞成長基質ポリマーを含むことを特徴とする材料。
【請求項２】
インビボでの動物細胞の接着及び成長のための材料であって、式（Ｉ）：
Q-(PFPE-L)n-1-PFPE-Q        (Ｉ)
（式中、
ｎは、少なくとも１．０であり；
それぞれのＰＦＰＥは、同一又は異なっていてもよく、式（II）：
-OCH2CF2O(CF2CF2O)x(CF2O)yCF2CH2O-        (II)
（式中、
ＣＦ2ＣＦ2Ｏ及びＣＦ2Ｏ単位は、鎖を通してランダムか、又はブロックとして分布されていてもよく、
ｘ及びｙは、ペルフルオロポリエーテルの分子量が２４２〜４，０００の範囲であるように、同一又は異なっていてもよい）で示されるペルフルオロ化ポリエーテルであり、
Ｌは、２官能性の結合基であり、そして
マクロモノマーのそれぞれの末端のＱは、同一又は異なっていてもよく、重合しうる基である）で示されるマクロモノマーを含む細胞成長基質ポリマーを含むことを特徴とする材料。
【請求項３】
動物細胞の接着及び成長のための材料であって、請求項１又は２記載の細胞成長基質ポリマー及び吸着されたか又は結合された接着糖タンパクを更に含むことを特徴とする材料。
【請求項４】
該接着糖タンパクが、フィブロネクチン、ビトロネクチン、コラーゲン、ラミニン及びトロンボスポンジンから選択される、請求項３記載の材料。
【請求項５】
ｎが、１〜５の範囲である、請求項１〜４のいずれか１項記載の材料。
【請求項６】
ｎが、２〜４の範囲である、請求項１〜５のいずれか１項記載の材料。
【請求項７】
Ｑが、エチレン性不飽和部分を含む、重合しうる基である、請求項１〜６のいずれか１項記載の材料。
【請求項８】
Ｑが、アクリロイル、メタクリロイル、スチリル、アクリルアミド、アクリルアミドアルキル、ウレタンメタクリラート又はそれらの置換された誘導体のいずれかよりなる群から選択される、請求項１〜７のいずれか１項記載の材料。
【請求項９】
Ｌが、ジイソシアナートの２価残基：（−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｒ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−）である、請求項１〜８のいずれか１項記載の材料。
【請求項１０】
２価残基が、トリメチルヘキサメチレンジイソシアナート（ＴＭＨＭＤＩ）、イソホロンジイソシアナート（ＩＰＤＩ）、メチレンジフェニルジイソシアナート（ＭＤＩ）及び１，６−ヘキサメチレンジイソシアナート（ＨＭＤＩ）よりなる群から選択されるジイソシアナートから誘導される、請求項９記載の材料。
【請求項１１】
ｘが、０〜２０の範囲である、請求項１〜１０のいずれか１項記載の材料。
【請求項１２】
ｘが、８〜１２の範囲である、請求項１〜１１のいずれか１項記載の材料。
【請求項１３】
ｙが、０〜２５の範囲である、請求項１〜１２のいずれか１項記載の材料。
【請求項１４】
ｙが、１０〜１４の範囲である、請求項１〜１３のいずれか１項記載の材料。
【請求項１５】
ｎが、２〜５の範囲であり、Ｌが、トリメチルヘキサメチレンジイソシアナート（ＴＭＨＭＤＩ）から誘導される２価残基であり、そしてＱが、イソシアナトエチルメタクリラートから誘導される残基である、請求項１〜１４のいずれか１項記載の材料。
【請求項１６】
インビトロでの動物細胞の接着及び成長のための材料であって、式（III）：
CH2=C(CH3)COOC2H4NHCO-(-PFPE-CONH-R-NHCO-)n-1-PFPE-CONHC2H4OCOC(CH3)=CH2  (III)
（式中、
ＰＦＰＥは、式（II）：
-OCH2CF2O(CF2CF2O)x(CF2O)yCF2CH2O-        (II)
（式中、
ＣＦ2ＣＦ2Ｏ及びＣＦ2Ｏ単位は、鎖を通してランダムか、又はブロックとして分布されていてもよく、
ｘは、８〜１０の範囲であり、そして
ｙは、１０〜１４の範囲である）で示されるペルフルオロ化ポリエーテルであり、
ｎは、少なくとも１．０であり
Ｒは、ＴＭＨＭＤＩのトリメチルヘキサメチレン成分である）で示されるマクロモノマーを含む細胞成長基質ポリマーを含むことを特徴とする材料。
【請求項１７】
インビボでの動物細胞の接着及び成長のための材料であって、式（III）：
CH2=C(CH3)COOC2H4NHCO-(-PFPE-CONH-R-NHCO-)n-1-PFPE-CONHC2H4OCOC(CH3)=CH2  (III)
（式中、
ＰＦＰＥは、式（II）：
-OCH2CF2O(CF2CF2O)x(CF2O)yCF2CH2O-        (II)
（式中、
ＣＦ2ＣＦ2Ｏ及びＣＦ2Ｏ単位は、鎖を通してランダムか、又はブロックとして分布されていてもよく、
ｘは、８〜１０の範囲であり、そして
ｙは、１０〜１４の範囲である）で示されるペルフルオロ化ポリエーテルであり、
ｎは、少なくとも１．０であり
Ｒは、ＴＭＨＭＤＩのトリメチルヘキサメチレン成分である）で示されるマクロモノマーを含む細胞成長基質ポリマーを含むことを特徴とする材料。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれか１項記載の材料から製造される眼科的人工器官。
【請求項１９】
式（Ｉ）：
Q-(PFPE-L)n-1-PFPE-Q        (Ｉ)
（式中、
ｎは、少なくとも１．０であり；
それぞれのＰＦＰＥは、同一又は異なっていてもよく、式（II）：
-OCH2CF2O(CF2CF2O)x(CF2O)yCF2CH2O-        (II)
（式中、
ＣＦ2ＣＦ2Ｏ及びＣＦ2Ｏ単位は、鎖を通してランダムか、又はブロックとして分布されていてもよく、
ｘ及びｙは、ペルフルオロポリエーテルの分子量が２４２〜４，０００の範囲であるように、同一又は異なっていてもよい）で示されるペルフルオロ化ポリエーテルであり、
Ｌは、２官能性の結合基であり、そして
マクロモノマーのそれぞれの末端のＱは、同一又は異なっていてもよく、重合しうる基である）で示されるマクロモノマーを含む細胞成長基質ポリマーから製造されるほ乳類の角膜の上又は中への外科的移植に有用な角膜移植片であって、該移植片が、それを通して視力を提供する光学的特性を有する光学軸領域及び１０，０００ダルトンにより大きい分子量を有する組織液成分をそれを通して通過させるに十分な多孔性を有し、それにより移植片の前の細胞と後ろの細胞の間に組織液の流れを与え、光学軸領域の多孔性は、目の組織の内部成長を排除するが、組織液成分を流れさせるものである、角膜移植片。
【請求項２０】
移植片が、移植片近辺の組織の成長及び／又は移植片への細胞接着を促進する成分の１種又は２種以上で被覆されている、請求項１９記載の角膜移植片。
【請求項２１】
移植片の多孔性が、１０，０００ダルトンより大きい分子量を有する組織液成分を、移植片を通して通過させるに十分であるが、組織の内部成長を排除する寸法を有する複数の孔により与えられる、請求項１９又は２０記載の角膜移植片。
【請求項２２】
該複数の孔が、１５ナノメーター〜０．５マイクロメーターの直径を備える、請求項２１記載の角膜移植片。
【請求項２３】
請求項１〜１７のいずれか１項記載の材料を含むか、又はそれから製造される医学的移植片。
【請求項２４】
請求項１〜１７のいずれか１項記載の材料を含むか、又はそれから製造される人工器官。
【請求項２５】
請求項１〜１７のいずれか１項記載の材料を含むか、又はそれから製造される組織培養装置。
【請求項２６】
請求項１〜１７のいずれか１項記載の材料を含むか、又はそれから製造される生物学的反応器。
【請求項２７】
請求項１〜１７のいずれか１項記載の材料を含むか、又はそれから製造される光学的機器。
【請求項２８】
請求項１〜１７のいずれか１項記載の材料を含むか、又はそれから製造される顕微鏡スライド。
【発明の詳細な説明】
本発明は、生物適合性ポリマー、並びにそれから製造される製品、特に細胞成長材料及びそれから製造される移植片に関する。
文献には、組織細胞及び移植片としての用途を意図している合成ポリマー材料の表面との相互作用についての一般的な知識が記載されている。その知識の多くは、ポリマー表面への組織細胞の強固かつ効果的な接着を支えるようにポリマー表面を設計することを目的とした研究から得られている。そのようなポリマー表面は、経皮的に接触する装置の組織−接触表面のような移植適用へのある種の要求を意図している。別のそのような適用は、小口径の血管移植片の内腔としての用途であり、内皮細胞がポリマー表面を覆うことを意図している。それらの適用において、効果的な移植のためには、合成ポリマーの表面への細胞の強固な結合が必要である。
現在までのこれらの研究において、内皮細胞及び繊維芽細胞のような組織細胞は、疎水性ポリマーの表面（例えば、固着したほぼ９０°又はそれより高い空気−水接触角を有するポリマー表面）に効果的に接着しないことが示されている。組織細胞の効果的な初期接着が生じるためには、疎水性ポリマーの表面がいくらか湿潤性（例えば、８０〜４０°の範囲で固着した空気−水接触角を持つこと）に化学的に改質されることが必要であるとの一般的な現在までの知識が存在している。そのような「湿潤性」ポリマーへの組織細胞の初期接着の生物学的機構は、以前から研究の主題であり、細胞接着は、細胞接着部位を含む糖タンパク質のポリマー表面への吸着に依存することが示されて来ている。そのような糖タンパク質は、フィブロネクチン（これは、血清及び組織の細胞外基質中に見い出されている）、及びビトロネクチン（これは、血清中に見い出されている）に含まれている。したがって、先行技術は、組織細胞の合成ポリマー表面への効果的な初期接着のためには、そのようなポリマーは、表面化学、すなわち「湿潤性」を有し、組織細胞が結合できるある種の糖タンパク質を効果的に吸着すべきである。接続組織（ここでは、組織密度が低く、細胞の強固な結合は実施される移植片には必要としない）に置かれる移植片のような他の移植片においては、疎水性ポリマーも利用することができる。眼内レンズ、又は取り換え膀胱のような移植片のためには、細胞接着は、明らかに不利である。
合成の疎水性ポリマー基質への細胞の接着は、細胞の接着及び成長を容易にするように特別に改質されるべき合成ポリマーの表面化学又は形態学が必要であると、一般に考えられている。グロー放電、プラズマ重合及び放射グラフトは、そのようなポリマー改質に対して当分野で知られている二三の技術である。合成の疎水性ポリマーの表面への細胞接着は、別の方法として、フィブロネクチン、ビトロネクチン、コラーゲンなどの細胞接着分子の１種若しくは２種以上又はその断片のポリマー表面への吸着又は共有接着により刺激されることができる。
現在まで、角膜組織（すなわち、間質組織）の置き換えのための人工角膜の移植の実務は、角膜の上を切開し、次いで損傷した角膜を取り出すために上皮層の後ろの深いポケットを切る外科的技術を含み；置き換え角膜を、このポケットに入れ、切開口を縫合により閉じる。この場合、移植片上の細胞成長は、必要でもなく、望ましくもない。屈折不正の矯正のための最近提案された方法は、角膜上皮中にレンズを移植することである。そのような上皮内レンズは、典型的には、角膜の角膜上皮細胞層を削ることにより取り除き、次いで合成レンズを直接にかつ角膜組織に密接してその上に置くことにより導入される。合成レンズは、
（ｉ）それを下に置かれた組織に接着させる合成レンズの特性材料によるか、又は
（ii）生物適合性の接着剤の使用によるか、又は
（iii）縫合により、その置いた直後の期間に、その場所に保持される。
実施されるべきそのような上皮内移植のために、移植片の表面及び形態が、角膜上皮組織によるレンズの前表面の初期被覆及び上皮組織の持続性の効果的な接着の両方を支えることが重要である。角膜実質内の移植片は強固な細胞接着を必要とすると考えられないが、上皮内移植片は、外部環境に対する防御の形成及び涙膜のための底質をもたらす角膜上皮の正常な機能が生じるように、角膜上皮細胞及び組織との強固かつ包括的な被覆を必要とする。先行技術から、この要求を満足させるために、疎水性ポリマーは、湿潤性表面を生成させるように化学表面改質か、又は細胞の接着を促進する糖タンパク質又はその断片での処理のどちらかを必要とすることが考えられる。
米国特許4,440,918及び4,818,801は、テレケーリック（telechelic）なペルフルオロ化ポリエーテルモノマー並びに改良された酸素透過性及び汚染抵抗性を有するコンタクトレンズを製造するための組成物及び他の眼科用具が記載されている。米国特許4,440,918及び4,818,801は、主としてコンタクトレンズに向けられており、そこでは、タンパク質又は他の体の構成成分の沈着は視覚を損ない、細胞成長はコンタクトレンズ又は眼内レンズのような他の眼科用具としてのテレケーリックなペルフルオロ化ポリエーテルの用途に有害であると考えられる。それらの材料は、視覚困難の矯正のために眼に挿入される角膜移植片ような他の用途にも提案されている。その時点で知られていたそのような移植片は、眼内レンズ及び角膜実質、特に角膜実質の後部へのレンズの挿入を含んでいた。そのような場合、ポリマーの生物学的適合性は、栄養物及び小分子量化合物に対する移植片の透過性に依存し、移植片は、汚染に対して抵抗性である。角膜実質内の移植片の場合に、強固な細胞接着は期待されないばかりでなく、実施されるべき移植片のためには必要であるとも知られていない。
細胞成長基質としての用途のために最近入手しうる生物適合性ポリマーは、タンパク質様物、炭水化物、及びそのような物質での汚染、移植片状態で使用したときのポリマーの破壊のような劣悪な生物安定性、並びに合成ポリマーが接着、及び細胞の成長を支えることができるための表面改質（ヒトの細胞は、一般的にポリマー材料から製造された製品の表面に均一に成長する傾向を示さないので）のような更なる工程による高い費用のような欠点を有している。
我々は、今や、テレケーリックなペルフルオロ化ポリエーテルポリマーが、更なる工程を必要とせずに、細胞の接着及び成長を容易にすることを見い出した。そのようなポリマーは、内皮化を必要とするタイプの角膜移植片として特に適切である。
したがって、その主要な特徴として、本発明は、重合された式（Ｉ）：
Q-(PFPE-L)n-1-PFPE-Q        (I)
（式中、
ｎは、少なくとも１．０であり；
それぞれのＰＦＰＥは、同一又は異なっていてもよく、式（II）：
-OCH2CF2O(CF2CF2O)x(CF2O)yCF2CH2O-        (II)
（式中、
ＣＦ2ＣＦ2Ｏ及びＣＦ2Ｏ単位は、鎖を通してランダムか、又はブロックとして分布されていてもよく、
ｘ及びｙは、ペルフルオロ化ポリエーテルの分子量が２４２〜４，０００の範囲であるように、同一又は異なっていてもよい）で示されるペルフルオロ化ポリエーテルであり、
Ｌは、２官能性の結合基であり、そして
マクロモノマーのそれぞれの末端のＱは、同一又は異なっていてもよく、重合しうる基である）で示されるマクロモノマーを含む細胞成長基質ポリマーを提供する。
好適には、ｎは、１〜５の範囲、更に好適には１〜４の範囲である。
Ｑは、好適にはエチレン性不飽和部分（これは、重合反応に参加することができる）を含む、重合しうる基である。重合しうる基Ｑは、マクロモノマーのそれぞれの末端において、同一又は異なっていてもよい。好適には、Ｑは、式（Ａ）：
P1-(Y)m-(R'-X1)p-            (A)
（式中、
Ｐ1は、フリーラジカル−重合性基であり；
Ｙは、−ＣＯＮＨＣＯＯ−、−ＣＯＮＨＣＯＮＨ−、−ＯＣＯＮＨＣＯ−、−ＮＨＣＯＮＨＣＯ−、−ＮＨＣＯ−、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯＮＨ−、−ＣＯＯ−、−ＯＣＯ−、−ＮＨＣＯＯ−又は−ＯＣＯＮＨ−であり；
ｍ及びｐは、互いに独立して、０又は１であり；
Ｒ’は、２０個までの炭素原子を有する有機化合物の２価基であり；
Ｘ1は、−ＮＨＣＯ−、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯＮＨ−、−ＣＯＯ−、−ＯＣＯ−、−ＮＨＣＯＯ−又は−ＯＣＯＮＨ−である）で示される基である。
フリーラジカル−重合性基Ｐ1は、例えば２０個までの炭素原子を有する、アルケニル、アルケニルアリール又はアルケニルアリーレンアルキルである。アルケニルの例は、ビニル、アリル、１−プロペン−２−イル、１−ブテン−２−、−３−、及び−４−イル、２−ブテン−３−イル並びにペンテニル、ヘキセニル、オクテニル、デセニル及びウンデセニルの異性体である。アルケニルアリールの例は、ビニルフェニル、ビニルナフチル又はアリルフェニルである。アルケニルアリーレンアルキルの例は、ｏ−、ｍ−又はｐ−ビニルベンジルである。
Ｐ1は、好適には１２個までの炭素原子を有する、アルケニル又はアルケニルアリール、特に好適には８個までの炭素原子を有するアルケニル、特に４個までの炭素原子を有するアルケニルである。
Ｙは、好適には−ＣＯＯ−、−ＯＣＯ−、−ＮＨＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯＯ−、−ＯＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−又は−ＣＯＮＨ−、特に好適には−ＣＯＯ−、−ＯＣＯ−、−ＮＨＣＯ−又は−ＣＯＮＨ−、特に−ＣＯＯ−又は−ＯＣＯ−である。
Ｘ1は、好適には−ＮＨＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯＯ−又は−ＯＣＯＮＨ−、特に好適には−ＮＨＣＯＯ−又は−ＯＣＯＮＨ−である。
好適な実施態様において、指標ｍ及びｐは、同時に０ではない。ｐが０ならば、ｍは、好適には１である。
Ｒ’は、好適にはアルキレン、アリーレン、６〜２０個の炭素原子を有する飽和２価脂環式基、アリーレンアルキレン、アルキレンアリーレン、アルキレンアリーレンアルキレン又はアリーレンアルキレンアリーレンである。
好適には、Ｒ’は、１２個までの炭素原子を有する２価基、特に好適には８個までの炭素原子を有する２価基である。好適な実施態様において、Ｒ’は、更に、１２個までの炭素原子を有する、アルキレン又はアリーレンである。Ｒ’の特に好適な実施態様は、低級アルキレン、特に４個までの炭素原子を有する低級アルキレンである。
Ｑが、アクリロイル、メタクリロイル、スチリル、アクリルアミド、アクリルアミドアルキル、ウレタンメタクリラート又はそれらの置換された誘導体のいずれかよりなる群から選択されることは、特に好適である。最も好適なＱは、Ｐ1が４個までの炭素原子を有するアルケニルであり、Ｙが−ＣＯＯ−であり、Ｒ’が４個までの炭素原子を有するアルキレンであり、Ｘ1が−ＮＨＣＯＯ−であり、そしてｍ及びｐがそれぞれ１である式（Ａ）の化合物である。
適切な置換基は、１０個までの炭素原子を有する、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ハロ、ハロアルキル、ハロアルケニル、ハロアルキニル、ハロアリール、ヒドロキシ、アルコキシ、アルケニルオキシ、アリールオキシ、ハロアルコキシ、ハロアルケニルオキシ、ハロアリールオキシ、アミノ、アルキルアミノ、アルケニルアミノ、アルキニルアミノ、アリールアミノ、アシル、アロイル、アルケニルアシル、アリールアシル、アシルアミノ、アルキルスルホニルオキシ、アリールスルフェニルオキシ、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルオキシ、ヘテロシクリルアミノ、ハロヘテロシクリル、アルコキシカルボニル、アルキルチオ、アルキルスルホニル、アリールチオ、アリールスルホニル、アミノスルホニル、ジアルキルアミノ及びジアルキルスルホニルから選択される。
結合基Ｌは、ヒドロキシルと反応することができるどのような２官能基部分の２価残基であってよい。Ｌの適切な前駆体は、α，ω−ジエポキシド、α，ω−ジイソシアナート、α，ω−ジイソチオシアナート、α，ω−ジアシルハライド、α，ω−ジチオアシルハライド、α，ω−ジカルボン酸、α，ω−ジチオカルボン酸、α，ω−ジ無水物、α，ω−ジラクトン、α，ω−ジアルキルエステル、α，ω−ジハライド、α，ω−ジアルキルエーテル、α，ω−ジヒドロキシメチルアミドである。結合基が、ジイソシアナートの２価残基（−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｒ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−）（Ｒは、２０個までの炭素原子を有する２価有機基である）であるのが好適である。
２価基：Ｒは、例えば２０個までの炭素原子を有する、アルキレン、アリーレン、アルキレンアリーレン、アリーレンアルキレン又はアリーレンアルキレンアリーレン、６〜２０個の炭素原子を有する飽和２価脂環式基又は７〜２０個の炭素原子を有するシクロアルキレンアルキレンシクロアルキレンである。
好適な実施態様において、Ｒは、１４個までの炭素原子を有する、アルキレン、アリーレン、アルキレンアリーレン、アリーレンアルキレン若しくはアリーレンアルキレンアリーレン又は６〜１４個の炭素原子を有する飽和２価脂環式基である。特に好適な実施態様において、Ｒは、１２個までの炭素原子を有する、アルキレン若しくはアリーレン又は６〜１４個の炭素原子を有する飽和２価脂環式基である。
好適な実施態様において、Ｒは、１０個までの炭素原子を有する、アルキレン若しくはアリーレン、又は６〜１０個の炭素原子を有する飽和２価脂環式基である。
特に好適な意味において、Ｒは、ジイソシアナートから誘導される基、例えばヘキサン１，６−ジイソシアナート、２，２，４−トリメチルヘキサン１，６−ジイソシアナート、テトラメチレンジイソシアナート、フェニレン１，４−ジイソシアナート、トルエン２，４−ジイソシアナート、トルエン２，６−ジイソシアナート、ｍ−若しくはｐ−テトラメチルキシレンジイソシアナート、イソホロンジイソシアナート又はシクロヘキサン１，４−ジイソシアナートである。
アリールは、炭素環芳香族基（これは、非置換であるか、又は低級アルキル若しくは低級アルコキシで置換されている）である。例は、フェニル、トリル、キシリル、メトキシフェニル、ｔ−ブトキシフェニル、ナフチル及びフェナントリルである。
アリーレンは、好適にはフェニレン若しくはナフチレン（これらは、非置換であるか、又は低級アルキル若しくは低級アルコキシで置換されている）、特に１，３−フェニレン、１，４−フェニレン又はメチル−１，４−フェニレン、１，５−ナフチレン若しくは１，８−ナフチレンである。
飽和２価脂環式基は、好適にはシクロアルキレン、例えばシクロヘキシレン又はシクロヘキシレン（低級アルキレン）、例えばシクロヘキシレンメチレン（これは、非置換であるか、又は低級アルキル、例えばメチル基の１個以上で置換されている）、例えばトリメチルシクロヘキシレンメチレン、例えば２価のイソホロン基である。
本発明の目的のために、基及び化合物に関連する用語「低級」は、別に断らない限り、特に８個までの炭素原子、特に４個までの炭素原子を有する基又は化合物を意味する。
低級アルキルは、特に８個までの炭素原子、好適には４個までの炭素原子を有し、例えばメチル、エチル、プロピル、ブチル、tert−ブチル、ペンチル、ヘキシル又はイソヘキシルである。
アルキレンは、１２個までの炭素原子を有し、直鎖又は分岐であることができる。適切な例は、デシレン、オクチレン、ヘキシレン、ペンチレン、ブチレン、プロピレン、エチレン、メチレン、２−プロピレン、２−ブチレン、３−ペンチレンなどである。
低級アルキレンは、８個までの炭素原子、特に４個までの炭素原子を有するアルキレンである。低級アルキレンの特に好適な意味は、プロピレン、エチレン及びメチレンである。
アルキレンアリーレン又はアリーレンアルキレンのアリーレン単位は、好適にはフェニレン（これは、非置換であるか、又は低級アルキル若しくは低級アルコキシで置換されている）であり、それのアルキレン単位は、好適にはメチレン又はエチレン、特にメチレンのような低級アルキレンである。したがって、それらの基は、好適にはフェニレンメチレン又はメチレンフェニレンである。
低級アルコキシは、特に８個までの炭素原子、好適には４個までの炭素原子を有し、例えばメトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ、tert−ブトキシ又はヘキシルオキシである。
アリーレンアルキレンアリーレンは、アルキレン単位に８個まで、特に４個までの炭素原子を有する、好適にはフェニレン（低級アルキレン）フェニレンであり、例えばフェニレンエチレンフェニレン又はフェニレンメチレンフェニレンである。
それから２価残基が誘導される非常に好適なジイソシアナートのいくつかの例は、トリメチルヘキサメチレンジイソシアナート（ＴＭＨＭＤＩ）、イソホロンジイソシアナート（ＩＰＤＩ）、メチレンジフェニルジイソシアナート（ＭＤＩ）及び１，６−ヘキサメチレンジイソシアナート（ＨＭＤＩ）を含む。
好適には、式（II）のｘが、０〜２０の範囲、更に好適には８〜１２の範囲であり、ｙが、０〜２５の範囲、更に好適には１０〜１４の範囲である。
好適なマクロモノマーは、ｎが１〜４の範囲であり、Ｌがトリメチルヘキサメチレンジイソシアナート（ＴＭＨＭＤＩ）から誘導される２価残基であり、そしてＱがイソシアナトエチルメタクリラートから誘導される残基であるものである。
本発明の好適な実施態様は、重合された式（IV）：
CH2=C(CH3)COOC2H4NHCO-(-PFPE-CONH-R-NHCO-)n-1-PFPE-CONHC2H4OCOC(CH3)=CH2  (IV)
（式中、
ＰＦＰＥは、ここで定義されているように、式（II）（ここで、ｘは、８〜１０の範囲であり、ｙは、１０〜１４の範囲である）のペルフルオロ化ポリエーテルであり、
ｎ＞１．０であり、そして
Ｒは、１２個までの炭素原子を有するアルキレン若しくはアリーレン、又は６〜１４個の炭素原子を有する飽和２価脂環式基である）で示されるマクロモノマーを含む、細胞成長基質ポリマーに向けられている。
本発明の好適な実施態様において、重合された式（III）：
CH2=C(CH3)COOC2H4NHCO-(-PFPE-CONH-R-NHCO-)n-1-PFPE-CONHC2H4OCOC(CH3)=CH2  (III)
（式中、
ＰＦＰＥは、ここで定義した式（II）のペルフルオロ化ポリエーテルであり、
ｎは、少なくとも１．０であり
Ｒは、ＴＭＨＭＤＩのトリメチルヘキサメチレン成分であり、
ｘは、８〜１０の範囲であり、そして
ｙは、１０〜１４の範囲である）で示されるマクロモノマーを含む、細胞成長基質ポリマーを提供する。
我々は、先行技術に記載されているように合成ポリマーへの内皮細胞及び繊維芽細胞の接着と異なり、テレケーリックなペルフルオロ化ポリエーテルポリマーの場合には、角膜内皮細胞の初期接着は、培養培地からの糖タンパク質フィブロネクチン又はビトロネクチンの吸着に依存しないことも見い出している。我々の発見は、テレケーリックなペルフルオロ化ポリエーテルポリマーは、直接に角膜内皮細胞の接着を支えていることを示している。
別の特徴として、本発明は、インビトロ（in vitro）でのヒト又は動物細胞の接着及び成長のための材料（これは、ここで定義したように、細胞成長基質ポリマーを含む）を提供する。
別の特徴として、本発明は、インビボ（in vivo）でのヒト又は動物細胞の接着のための材料（これは、ここで定義したように、細胞成長基質ポリマーを含む）を提供する。
別の特徴として、本発明は、ヒト又は動物細胞の接着のための材料であって、該材料は、ここで定義したように、細胞成長基質ポリマー、及び更に吸着されたか、又は結合された接着糖タンパク質を含む。好適には、接着糖タンパク質は、フィブロネクチン、ビトロネクチン、コラーゲン、ラミニン及びトロンボスポンジンからなる群から選択される。
別の特徴として、本発明は、細胞成長基質ポリマーを製造する方法を提供する。本発明のマクロモノマーを、適切な開始剤の存在下に共重合又は単独重合させ、透明なポリマーを得ることができる。重合を行うための、この分野で公知の標準方法、好適であるフリーラジカル重合が、用いられてよい。フリーラジカル重合は、適切な容器又は入れ物中で、ベンゾインメチルエーテルのようなＵＶ開始剤を含むモノマー混合物を放射（ＵＶ光を用いて）することにより容易に実施することができる。モノマーの間で重合ができるように十分な時間混合物を照射する。別の方法としてアゾビスイソブチロニトリルのような熱開始剤を用いた熱重合を実施することができる。
マクロモノマーを無溶媒又は１種若しくは２種の溶媒中でポリマーへ転換することができる。マクロモノマーの構造が、得られる弾性率に最も重要な影響を有するので、溶媒とコモノマーの選択がまた影響する。有用な溶媒は、エステル類、アルコール類、エーテル類及びハロゲン化溶媒類から選択されるそれらである。フルオロ化溶媒は特に有用であリ、上記の分類からの他の溶媒との組み合わせ（１：９〜９：１で変わる比）での使用が特に望ましい。重合混合物での０〜７０％w/w、特に１０〜５０w/wの溶媒濃度が望ましい。好適な溶媒は、アセタート、特にイソプロピルアセタート及びtert−ブチルアセタート、２−（トリフルオロメチル）−２−プロパノール、クロロフルオロアルカン、特にトリクロロトリフルオロエタン及びペルフルオロ−１，３−ジメチルシクロヘキサンのようなペルフルオロ化アルカンなどを含む。
エチレン性不飽和基（これは、反応に参加しコポリマーを形成することができる）の１種以上を含むコモノマーを、混合することができる。エチレン性不飽和基は、アクリロイル、メタクリロイル、スチリル、アクリルアミド、アクリルアミドアルキル若しくはウレタンメタクリラート又はそれらの置換誘導体のいずれかから選択されることが好適である。
適切なコモノマーは、フルオロ−及びシリコン−含有アルキルアクリラート及び親水コモノマーを含み、当業者にとり、広い範囲の入手しうる材料及びその混合物から選択することができる。
この新規なポリマー中の存在するコモノマーは、親水性、疎水性又はその混合物であることができる。適切なコモノマーは、特に、コンタクトレンズ及び生物医学的材料の製造に用いられるそれらである。疎水性モノマーは、典型的には水に不溶性であり、水を１０重量％未満で吸収することができるホモポリマーを与えるモノマーを意味する。同様に、親水性コモノマーは、典型的には水に可溶性であり、水を少なくとも１０重量％吸収することができるホモポリマーを与えるモノマーを意味する。
適切な疎水性コモノマーは、ここで限定なしに、Ｃ1−Ｃ18アルキル及びＣ3−Ｃ18シクロアルキルアクリラート及びメタクリラート、Ｃ3−Ｃ18アルキルアクリルアミド及び−メタクリルアミド、アクリロニトリル、メタクリロニトリル、ビニルＣ1−Ｃ18アルカノアート、Ｃ2−Ｃ18アルカン、Ｃ2−Ｃ18ハロアルカン、スチレン、（低級アルキル）スチレン、低級アルキルビニルエーテル、Ｃ2−Ｃ10ペルフルオロアルキルアクリラート及びメタクリラート及び相当する部分フルオロ化アクリラート及びメタクリラート、Ｃ3−Ｃ12ペルフルオロアルキルエチルチオカルボニルアミノエチルアクリラート及びメタクリラート、アクリルオキシ−及びメタクリルオキシアルキルシロキサン、Ｎ−ビニルカルバゾール、並びにマレイン酸、フマール酸、イタコン酸、メアコン酸などのＣ1−Ｃ12アルキルエステルである。
例えば、アクリロニトリル、３〜５個の炭素原子を有するビニル性不飽和カルボン酸のＣ1−Ｃ4アルキルエステル、又は５個までの炭素原子を有するカルボン酸のビニルエステルが好適である。
適切な疎水性コモノマーの例は、メチルアクリラート、エチルアクリラート、プロピルアクリラート、イソプロピルアクリラート、シクロヘキシルアクリラート、２−エチルヘキシルアクリラート、メチルメタクリラート、エチルメタクリラート、プロピルメタクリラート、ブチルアクリラート、ビニルアセタート、ビニルプロピオナート、ビニルブチラート、ビニルバレラート、スチレン、クロロプレン、ビニルクロリド、ビニリデンクロリド、アクリトニトリル、１−ブテン、ブタジエン、メタクリロニトリル、ビニルトルエン、ビニルエチルエーテル、ペルフルオロヘキシルエチルチオカルボニルアミノエチルメタクリラート、イソボルニルメタクリラート、トリフルオロエチルメタクリラート、ヘキサフルオロイソプロピルメタクリラート、ヘキサフルオロブチルメタクリラート、トリストリメチルシリルオキシシリルプロピルメタクリラート（以後、Trisメタクリラート）、トリストリメチルシリルオキシシリルプロピルアクリラート（以後、Trisアクリラート）、３−メタクリルオキシプロピルペンタメチルジシロキサン及びビス（メタクリルオキシプロピル）テトラメチルジシロキサンである。
疎水性コモノマーの好適な例は、メチルメタクリラート、Trisアクリラート、Trisメタクリラート及びアクリロニトリルである。
適切な親水性コモノマーは、網羅的な表ではないが、ヒドロキシ置換低級アルキルアクリラート及びメタクリラート、アクリルアミド、メタクリルアミド、（低級アルキル）アクリルアミド及び−メタクリルアミド、エトキシル化アクリラート及びメタクリラート、ヒドロキシル−置換（低級アルキル）アクリルアミド及び−メタクリルアミド、ヒドロキシル−置換低級アルキルビニルエーテル、ナトリウムビニルスルホナート、ナトリウムスチレンスルホナート、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸、Ｎ−ビニルピロール、Ｎ−ビニル−２−ピロリドン、２−ビニルオキサゾリン、２−ビニル−４，４’−ジアルキルオキサゾリン−５−オン、２−及び４−ビニルピリジン、全部で３〜５個の炭素原子を有するビニル性不飽和カルボン酸、アミノ（低級アルキル）−（ここで、用語「アミノ」は４級アンモニウムを含む）、モノ（低級アルキルアミノ）（低級アルキル）及びジ（低級アルキルアミノ）（低級アルキル）アクリラート及びメタクリラート、アリルアルコールなどである。例えば、Ｎ−ビニル−２−ピロリドン、アクリルアミド、メタクリルアミド、ヒドロキシ−置換低級アルキルアクリラート及びメタクリラート、ヒドロキシ−置換（低級アルキル）アクリルアミド及び−メタクリルアミド及び全部で３〜５個の炭素原子を有するビニル性不飽和カルボン酸が好適である。
好適な親水性コモノマーの例は、ヒドロキシエチルメタクリラート（ＨＥＭＡ）、ヒドロキシエチルアクリラート、ヒドロキシプロピルアクリラート、トリメチルアンモニウム２−ヒドロキシプロピルメタクリラートヒドロクロリド（Blemer（商標）ＱＡ、例えばNippon Oilから）、ジメチルアミノエチルメタクリラート（ＤＭＡＥＭＡ）、ジメチルアミノエチル（メタ）アクリルアミド、アクリルアミド、メタクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド（ＤＭＡ）、アリルアルコール、ビニルピリジン、グリセロールメタクリラート、Ｎ−（１，１−ジメチル−３−オキソブチル）アクリルアミド、Ｎ−ビニル−２−ピロリドン（ＮＶＰ）、アクリル酸、メタクリル酸などである。
好適な親水性コモノマーは、トリメチルアンモニウム２−ヒドロキシプロピルメタクリラートヒドロクロリド、２−ヒドロキシエチルメタクリラート、ジメチルアミノエチルメタクリラート、トリメチルアンモニウム２−ヒドロキシプロピルメタクリラートヒドロクロリド、Ｎ、Ｎ−ジメチルアクリルアミド及びＮ−ビニル−２−ピロリドンである。
特に好適なコモノマーは、ジヒドロペルフルオロオクチルアクリラート及び１，１−ジヒドロペルフルオロブチルアクリラートのようなジヒドロペルフルオロアルキルアクリラート、トリヒドロペルフルオロアルキルアクリラート、テトラヒドロペルフルオロアルキルアクリラート、トリス（トリメチルシリルオキシ）プロピルメタクリラート又はアクリラート、及びＮ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリラート、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド及びＮ，Ｎ−ジメチルアミノエチル−アクリルアミドのようなアミン−含有コモノマーを含む。配合物へのそれぞれのコモノマーの添加の好適な範囲は、配合物の重量の０〜６０重量％、最も好適には０〜４０重量％である。式（Ｉ）のマクロモノマーの混合物が、他のコモノマーの存在又は非存在下で適切なコポリマーとするために用いられてもよい。
ポリマー網目組織は、所望ならば、架橋剤、例えば多不飽和の架橋しうるコモノマーの添加により強化することができる。この場合、用語「架橋されたポリマー」が用いられる。したがって、本発明は、更に式（Ｉ）のマクロマーの、所望ならばビニル性コモノマーの少なくとも１種及び架橋しうるコモノマーの少なくとも１種との重合生成物を含む架橋されたポリマーに関する。
典型的な架橋しうるコモノマーの例は、アリル（メタ）アクリラート、低級アルキレングリコールジ（メタ）アクリラート、ポリ（低級アルキレン）グリコールジ（メタ）アクリラート、低級アルキレンジ（メタ）アクリラート、ジビニルエーテル、ジビニルスルホン、ジ−及びトリビニルベンゼン、トリメチロールプロパントリ（メタ）アクリラート、ペンタエリスリトールテトラ（メタ）アクリラート、ビスフェノールＡジ（メタ）アクリラート、メチレンビス（メタ）アクリルアミド、トリアリルフタラート並びにジアリルフタラートである。
架橋コモノマーが用いられる場合、用いられる量は、ポリマーの予想された全重量の０．０５〜２０％、好適にはコモノマーは０．１〜１０％の範囲、更に好適には０．１〜２％の範囲である。
例として、そのようなポリマーの細胞成長材料及び移植片の製造において、重合しうるモノマー、溶媒（所望ならば）及び光開始剤の適切な量を一緒に混合し、重合しうる混合物を形成させる。次いで、重合しうる混合物を窒素でフラッシュし、適切な成形用型に必要量を分配する。成形用型を閉じ、クランプし、そのアセンブリを３６５nmＵＶランプを備えたＵＶ照射キャビネット中に置く。必要な時間照射を行い、次いで成形用型の型半分を分離する。重合された材料は、適切な溶媒（例えば、イソプロピル又はtert−ブチルアセタート／フロオロ化溶媒混合物）中で抽出する。溶媒は、次いでアルコール（例えば、イソプロピルアルコール）、続いて食塩水で徹底的に交換し、製造物を製造する。
マクロモノマーは、他の添加剤、例えば補助剤又はフィブロネクチン、ビトロネクチン、コラーゲン、ラミニン及びトロンボスポンジンを含む成長因子と共に重合させて細胞成長基質ポリマーを製造することができる。
当業者に自明であるように、重合は、他の基質の表面又は支持マトリックス内でも行うことができ、それにより、基質はペルフルオロポリエーテルポリマーで被覆される。
本発明の細胞成長基質ポリマーは、多孔性基質を製造するためにも用いることができる。多孔性は、材料の本来の多孔性により提供されることができる。別の方法として、孔は、例えばWO90/07575、WO91/07687、US5,244,799、US5,238,613、US4,799,931及びUS5,213,721に記載されている種々の方法により新規ポリマーに導入することができ、その内容は、参照としてここに組み込まれる。
適切な選択により、得られた細胞成長基質ポリマーは、光学的に透明であり、水性媒体、組織及び培養材料と良好に適合する屈折率を有している。結果として、このポリマーは、角膜アンレー又は移植片のような眼の人工器官としての用途に理想的である。
本発明のポリマーは、当分野で公知の通常の成形方法及び加工方法を用いて他の有用な細胞成長基質にすることができる。
このポリマーは、インビボ（in vivo）又はインビトロ（in vitro）でヒト又は動物細胞の接着及び成長のための材料、医療用移植片（例えば、移植しうる半透過性膜、美容外科のための組織移植片、ホルモン−放出細胞、例えばランゲルハンス島細胞を含む移植片、胸部移植片、又は人工関節）、人工器官、細胞培養機器（例えば、びん、トレー、皿）、生物学的反応器（例えば、細胞培養による種々のタンパク質及び他の成分の製造に使用されるもの）、顕微鏡のスライドのような光学機器などの材料として適切である特性を有している。
角膜移植片のような眼の人工器官は、成形用型の中での重合により製造することができ、場合により、得られたポリマーは、所望の形態に加工又は機械加工することができる。眼の人工器官は、当業者にそれ自体公知の他の方法により製造することができる。多孔性は、上記のように与えられる。
角膜移植片は、通常の外科的方法、例えば角膜の上皮組織の下、中又は通して、又は角膜実質中、又は角膜の他の組織層中に通常の外科的方法を用いて移植することができる。そのような移植片は、角膜の光学特性（例えば視力不足の矯正）を変えることができ、及び／又は眼の外見、例えば瞳孔の色を変えることができる。角膜移植片は、移植片上で瞳孔を覆いかつ視力を提供する光学軸領域、及び更に光学軸領域の周辺を取り囲む透明性が少ない領域を含むことができる。別の方法として、この移植片は、全領域にわたり同じ視覚特性を有することができる。
高分子量の組織液成分、例えばタンパク質及び糖タンパク質（例えば、成長因子、ペプチド及びタンパク質ホルモン、並びに必須金属の移動に関連しているタンパク質）などの、角膜移植片を通る、すなわち上皮細胞と実質細胞及び内皮層の間、及びそれを超えての流れは、長期間の維持及び角膜移植片に対するに前及後ろでの組織の生存性のために重要であることが見い出されている。したがって、角膜移植片は、好都合には約１０，０００ダルトンより大きい分子量を有する組織液成分を通過させるに十分な多孔性を有するように製造され、それにより低分子量栄養成分（例えば、グルコース、脂肪若しくはアミノ酸）及び移植片の前側及び後ろ側の細胞の間での呼吸ガスに加えて、組織液の成分の流れが保証されている。
好適には、角膜移植片は、１０，０００ダルトンまで、又はそれより大きい分子量、例えば１０，０００〜１，０００，０００ダルトンを有する、タンパク質及び他の生物学的な高分子化合物を通すに十分であるが、角膜アンレーの光学軸領域に細胞及び組織を侵入させるほど十分でない多孔性を有する。
移植片の多孔性が、孔により達成される場合、光学軸領域は、多数の孔を含み、その数は制限されないが、移植片の前部及び後部の間で組織成分の自由な流れを可能にするに十分であるべきである。光学軸領域の中に形成される孔は、好適には視力矯正に関する問題をもたらす範囲に可視光の屈折をもたらさない。上記及び下記で用いられている用語「孔」は、幾何学的制限を持たず、規則的又は不規則形態を有する孔を意味するとされている。孔寸法の意味は、すべての孔が同じ直径をもつことを意味しないと考えられるべきである。
光学軸領域の外において、角膜移植片は、光学軸領域と同じ多孔性をもつことができる。別の方法として、光学軸領域の周辺を取り囲んでいる移植片のこの領域（それは、へりとして参照されている）は、角膜の細胞の内部成長を許し、それにより、眼に対して移植片を固定させる。
へりでの多孔性は、へりが製造される材料の固有の特徴であることができる。これに関して、へりを光学軸領域の材料と同じ材料から製造することができ、そしてそれと共に一体をなすことができることが考えられる。この場合、異なる直径の孔が光学軸領域とへりに形成される。別の方法として、へりは、光学軸領域の材料とは別の材料から製造することができ、その場合、その組織の内部成長をさせるために、その材料は、光学軸領域よりも高い多孔性である。へりは、好適には光学軸領域のそれと同様に光学的に透明なポリマーを含むことができるが、別の方法として、へりは、光学的に透明でない材料を含むか、又は光学的に透明でない多孔性材料から製造することもできる。
本明細書及び請求項を通して、他に断らない限り、用語「含む」は、述べたのものを含むが、それ以外のものを排除するものではない。
本発明は、以下の非制限的実施例により更に説明される。特に断らない限り、すべての部は重量部である。温度は、摂氏度である。マクロマー又はポリマーの分子量、特に断らない限り、数平均分子量である。
実施例１：
この実施例は、式（Ｉ）（ｎ＝２．９）（式中、Ｑは、イソシアナトエチルメタクリラートから誘導される基であり、Ｌは、トリメチルヘキサメチレンジイソシアナート（ＴＭＨＭＤＩ）から誘導される２価の基であり、ｘは、１０であり、そしてｙは１４である）のマクロモノマーの製法を示した。撹拌棒を備えた２５０ml容のフラスコに、市販のヒドロキシル数５５．４の末端がヒドロキシであるＰＦＰＥ（Minnesota Mining and Manufacturing Company,St Paul,Minnesotaの製品、製品番号L-12875）１００ｇを入れ、これに蒸留したトリメチルヘキサメチレンジイソシアナート６．７６ｇを加えた。このフラスコを数分間激しく振盪し、次いでジブチルジラウリルスズ０．０６ｇを加えた。数分間振盪した後、この混合物を一夜撹拌した。最初の３０分間に僅かな発熱が見られた。１６時間後、赤外スペクトルにより、イソシアナートの完全な消火を確認した。次いで、この反応混合物に、新たに蒸留したイソシアナトエチルメタクリラート５．３６ｇを加えた。このフラスコを数分間再び激しく振盪し、この混合物を一夜撹拌した。赤外スペクトルにより、イソシアナートの消失を確認した。
この方法は一般的であり、化学量論量を調整することにより、式（Ｉ）（ｎ＞１）（式中、Ｑは、イソシアナトエチルメタクリラートから誘導される基であり、Ｌは、トリメチルヘキサメチレンジイソシアナート（ＴＭＨＭＤＩ）から誘導される２価の基である）の他のマクロモノマーを製造することができた。
実施例２：
以下に記載する方法を、細胞接着及び成長を評価するために用いた。
直径６mmの円板を、評価するポリマーから切り取り、それぞれが血清を含まないＤＭＥＭ／Ham’sF12（１：１、V/V）培地（ＳＦＭ）の５mlを含む滅菌したバイアルに移し、ＳＦＭを変えて１週に１回、更に新しい培地５mlで３週間洗浄した。洗浄したポリマー及びポリマー条件下（polymer-conditioned）のＳＦＭの両者を、使用するまで４℃で滅菌状態で貯蔵した。
細胞培養：
継代数２〜６の範囲の角膜輪部起源のウシ角膜上皮（ＢＣＥｐ）細胞を種々の検定に使用した。培地は、２０％（V/V）ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、インシュリン５μg/ml、トランスフェリン５μg/ml、亜セレン酸５ng/ml、ペニシリン６０μg/ml及びストレプトマイシン１００μg/mlを補足したＤＭＥＭ／Ham’sF12（１：１）で構成した。５％ＣＯ2を含む空気の湿った雰囲気の中で３７℃で細胞を培養した。２日毎に培地を交換した。いくつかの成長検定には、細胞接着性の血清糖タンパク質のビトロネクチン及びフィブロネクチンを除去したＦＢＳを、そのままの完全なＦＢＳと平行して用いた。
ウシ角膜繊維芽（ＢＣＦ）細胞を、培地に１０％（V/V）ウシ胎児血清を補足したこと以外は、上記の方法で培養した。ＢＣＥｐ細胞をＢＣＦで置き換えて、ＢＣＦ検定を下記の方法で行った。
角膜上皮細胞成長検定：
次のように成長検定を行った。それぞれ直径６mmの円板の４個の同型品を、９６穴組織培養浅皿のそれぞれの穴に入れ、滅菌ＳＦＭ１００μlで洗浄した。次いで、ＢＣＥｐ細胞を８．５×１０3細胞／穴の密度で検体に接種し、６日間培養した。等価の細胞も、また、陽性の対照規準表面として組織培養ポリスチレン（ＴＣＰＳ）穴に接種した。時間単位の同型品を取り出し、適当な時間間隔でホルムアルデヒド生理食塩水で固定し、必要になるまで４℃で貯蔵した。次いで、細胞接着の視覚化及び定量の二つの目的で、固定した細胞をメチレンブルーで染色した。細胞接着をプレート読取り装置で比色的に定量し、吸光度を、組織培養ポリスチレン（ＴＣＰＳ）上の細胞で見たそれの平均（±標準偏差）パーセントとして表した。
角膜上皮増殖検定−外植片増殖検定：
内皮及び９０％以上の実質を除いたウシ角膜組織の直径６mmのボタン（button）を、一対の検体に設定した。外植片（explant）を、ＩＴＳ（インシュリン５μg/ml、トランスフェリン５μg/ml、亜セレン酸５ng/ml）、１％（V/V）非−必須アミノ酸、ペニシリン６０μg/ml及びストレプトマイシン１００μg/mlを補足したＤＭＥＭ／Ham’sF12よりなる培地で、血清を添加せずに培養した。３日目と６日目に培地を変えて、８日間の増殖をモニターし、その後、増殖領域を画像分析（Quantimet 570、LeicaCambridge）によって測定した。移動（migration）の指標は、それぞれの外植片の最終の広がり面積を、最初の組織面積で除して算出した。細胞接着及び成長を最適化するために、コロナ放電によって処理された組織培養ポリスチレン（ＴＣＰＳ）で培養した外植片を比較対照として用いた。
実施例３：
下記の組成物をポリプロピレンの平らな成形用型（厚さ０．５mm）に入れ、３６５nmのＵＶランプで１６時間照射して重合させた。
0003805790.tif 000002
成形用型から取り出した後、得られた平らな円板を、PF5060（Minnesota Mining and Manufacturing Company（３Ｍ））から商業的に入手しうるペルフルオロ化溶媒）中に３時間３７℃、次いでイソプロピルアセタート（ＩＰＡｃ）中に一夜、その後ＩＰＡｃ−イソプロピルアルコール（ＩＰＡ）の５０／５０（V/V）混液中に３時間、そして更に３時間新しいＩＰＡ中に入れて抽出した。この円板を濾紙上に置き真空オーブン中３０℃で一夜乾燥し、次いで、食塩水中で数日間水和した。ポリマーの固着接触角は９４°であった。次いで、実施例２に記載した方法に準じて、角膜細胞接着及び成長について、水和したポリマー円板を試験し、陽性の対照として組織培養ポリスチレン（ＴＣＰＳ）と比較した。
７日間の培養後、ポリマー円板に対するＢＣＥｐ細胞の接着及び成長の相対レベルは、陽性な対照の表面（組織培養ポリスチレン（ＴＣＰＳ））のそれの８０±１０．７％であり、一方、ＢＣＦの接着は、ＴＣＰＳ上のそれの７２．３±８．８％であった。
これは、細胞の接着及び成長の促進に関して、このポリマーが組織培養ポリスチレンに類似の活性を有することを示している。ポリマー表面上の細胞の形態は、良好に広がった細胞であり、組織培養ポリスチレン（ＴＣＰＳ)表面上の細胞と形態学的に類似である。
実施例４：
下記の組成物をポリプロピレンの平らな成形用型（厚さ０．５mm）に入れ、３６５nmのＵＶランプで１６時間照射して重合させた。
0003805790.tif 000003
成形用型から取り出した後、得られた平らな円板を、PF5060（Minnesota Mining and Manufacturing Company（３Ｍ））から商業的に入手しうるペルフルオロ化溶媒）中に室温で３時間、次いでイソプロピルアセタート（ＩＰＡｃ）中に一夜、その後ＩＰＡｃ−イソプロピルアルコール（ＩＰＡ）の５０／５０（V/V）混液中に３時間、そして更に３時間新しいＩＰＡ中に入れて抽出した。この円板を濾紙上に置き真空オーブン中３０℃で一夜乾燥し、次いで、食塩水で数日間水和し、その後、実施例２に記載した方法に準じて、陽性の対照として組織培養ポリスチレン（ＴＣＰＳ）を用い、角膜細胞の接着及び成長を試験した。このポリマーは、１日目に組織培養ポリスチレンのそれに匹敵する優れた細胞接着を示した。６日目に、優れた細胞成長があり、細胞数は組織培養ポリスチレンのそれの約８０％であった。
ポリマーは、実施例１のマクロモノマー（６０重量部）、ＤＭＡＥＭＡ（２０部）及びＩＰＡｃ（２０部）の相対割合を保持しながら、ＤＨＰＦＯＡ含量が１０、１５及び２０重量部である上記の方法によっても製造された。
実施例５：
以下の組成物と、０〜２０％（W/W）の範囲のＮ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリラート（ＤＭＡＥＭＡ）含量との配合物を、ポリプロピレンの平らな成形用型（厚さ０．５mm）に入れ、３６５nmのＵＶランプで１６時間照射して重合させた。
0003805790.tif 000004
成形用型から取出した後、実施例４の方法を用い、得られた円板を抽出し、次いで、上記の実施例２に記載の方法に準じて、接着検定のために継代数４のウシ角膜上皮の周辺起源の細胞を用いて、ウシ角膜上皮の接着について評価した。
初期細胞接着を９０分間培養後に調査し、次に、同じ系列のポリマー上での比較的長い２４時間接着を調査した。９０分培養後、すべての試験検体は細胞接着を支持した。５％及び１０％Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリラート（ＤＭＡＥＭＡ）含有のポリマー上での細胞数は、組織培養ポリスチレン（ＴＣＰＳ）対照表面で見られたそれに類似であったが、一方、０％及び２０％Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリラート（ＤＭＡＥＭＡ）含有のポリマーは僅かに減少し、接着の極めて有意な陽性のレベルを有していた。テスト検体上の細胞は、組織培養ポリスチレン（ＴＣＰＳ）表面上の良好な広がりと比較して僅かに劣っていたが、一般に良好に広がり、２０％Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリラート（ＤＭＡＥＭＡ）含有量の群は、組織培養ポリスチレン（ＴＣＰＳ）の組に最も類似した形態を示した。細胞分布は試験ポリマー表面全体にわたって均一であった。２４時間培養後、細胞は試験表面全体に接着し、全部の試験ポリマー上の細胞の相対数は、組織培養ポリスチレン（ＴＣＰＳ）基準表面上のそれに非常に類似していた。１０％Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリラート（ＤＭＡＥＭＡ）含有の検体に見られた形態は、組織培養ポリスチレン（ＴＣＰＳ）上の細胞に類似であるが、５％Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリラート（ＤＭＡＥＭＡ）含有量の組のそれは、０％又は組織培養ポリスチレン（ＴＣＰＳ）の何れかよりも良好な均一分布を示した。２０％Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリラート（ＤＭＡＥＭＡ）含有の検体上の細胞は、一般により均一な分布を表面全体に示して、１０％よりも良好な広がりがあると思われるが、１０％は細胞接着を全般的に支持している。
全体として、細胞接着の割合は、組織培養ポリスチレン（ＴＣＰＳ）上で見られるそれに類似であるように思われる。１０％及び５％Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリラート（ＤＭＡＥＭＡ）含有のポリマーの場合、細胞の形態は、組織培養ポリスチレン（ＴＣＰＳ）表面に接着したウシ角膜上皮細胞のそれと同様である。
別の試験において、成形用型から取り出した後のポリマー円板を、実施例３に記載の方法に準じて抽出し、次いで、上記の実施例２に記載の方法に準じて、ウシ角膜上皮及び繊維芽細胞接着を試験した。７日後の結果は表Ａに示されており、このポリマーがウシ角膜上皮細胞及びウシ角膜実質繊維芽細胞の接着及び成長を支持することを示している。ポリマー表面上での細胞の形態は、良好に広がった細胞であり、組織培養ポリスチレン表面上の細胞に形態学的に類似である。
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実施例６：
実施例３及び４の方法に準じて製造されたポリマーは、実施例２に記載の方法に準じて、そのままの完全なＦＢＳ、又は細胞接着性の血清糖タンパク質のビトロネクチン及びフィブロネクチンを除いたＦＢＳを用い、細胞接着及び成長を試験した。陽性な対照基準として、表面細胞成長及び接着を組織培養ポリスチレン上で検定した。
６日間の培養期間の後、実施例３及び４のポリマーは、驚いたことに、ＢＣＥｐ細胞の接着及び成長を非常に有意な程度で支持した。これらの結果は、以前に他の細胞、例えば内皮細胞及び細胞接着が認められる程度には起こらない疎水性又は親水性のポリマー表面を用いて得られた結果からは全く予想されなかった。角膜上皮細胞の接着及び成長は、外因性のフィブロネクチン又は外因性のビトロネクチンの何れかのポリマー表面への吸着に依存しなかった。これらの結果は、ポリマー表面への細胞の直接結合を含む機構によって、角膜上皮細胞の接着及び成長にポリマーの表面化学が適していることを示している。細胞に結合部位を有するフィブロネクチン及びビトロネクチンのような糖タンパク質のポリマー表面上での吸着又は存在を含む機構によって、ポリマー材料の表面は角膜上皮細胞の接着を支持することができる。
実施例７：
上記の実施例において、この発明のポリマーは、角膜細胞の接着及び成長を支持し、眼の移植片の用途に適切な生物学的材料であることが示された。しかしながら、このポリマーは抽出可能な物質を除くために適切に処理されるのでなければ、長期の細胞成長検定において、このポリマーの性能は次善であることも見い出されている。ポリマーから抽出可能な物質が完全に除かれない場合、ポリマーでの角膜上皮細胞の接着及び成長は阻害される。この実施例は、適切な抽出方法を示している。
実施例１のマクロモノマー（ｎ＝２．９）（６０％W/W）、ジヒドロペルフルオロオクチルアクリラート（２０％W/W）、開始剤（ベンゾインメチルエーテル、０．３％W/W）及び溶媒（イソプロピルアセタート、２０％W/W）よりなるポリマー配合物を、０．２mmの平らな成形用型に注型し、３時間のＵＶ照射（３５０nm）の下で重合させた。硬化完了後、「平らなもの」を成形用型から取り出し、濾紙上に置いて３５℃の真空オーブンで一夜乾燥した。この段階で、重合した平らなものは、それぞれの抽出工程のために５個の平らなものに対して５０mlの溶媒量を用い、以下の異なる抽出方法の一つによって抽出した。
抽出法１：
上記の実施例４の方法に準じて、この平らなものを抽出して水和した。最初の重量の約５．０３％を抽出した。これらのポリマーを表１で「方法１」と称する。
抽出法２：
この平らなものを室温でPF5060中で６時間抽出し、次いでイソプロピルアセタート（ＩＰＡｃ）中に一夜、ＩＰＡｃ／イロプロピルアルコール（ＩＰＡ）の５０／５０（V/V）混液中に３時間、そして更に３時間新しいＩＰＡ中に入れて抽出した。この平らなものを濾紙上に置いて真空オーブン中で一夜乾燥し、その後、数日間食塩水で水和した。最初の重量の約５．２０％を抽出した。これらのポリマーを表１で「方法２」と称する。
抽出法３：
この平らなものを３７℃でPF5060中に３時間、次いでイソプロピルアセタート（ＩＰＡｃ）中に一夜、ＩＰＡｃ／イロプロピルアルコール（ＩＰＡ）の５０／５０（V/V）混液中に３時間、そして更に３時間新しいＩＰＡ中に入れて抽出した。この平らなものを濾紙上に置いて真空オーブン中で一夜乾燥し、その後、数日間食塩水で水和した。最初の重量の約５．４５％を抽出した。これらのポリマーを表１で「方法３」と称する。
抽出法４：
この平らなものを室温でPF5060中に３時間、次いでジイソプロピルエーテル中に一夜、ＩＰＡｃで一夜、次いでＩＰＡｃ／イロプロピルアルコール（ＩＰＡ）の５０／５０（V/V）混液中に３時間、そして更に３時間新しいＩＰＡ中に入れて抽出した。すべてのこれらの抽出工程は室温で行った。この平らなものを濾紙上に置いて真空オーブン中で一夜乾燥し、その後、数日間食塩水で水和した。最初の重量の約５．００％を抽出した。これらのポリマーを表１で「方法４」と称する。
細胞培養及び成長検定：
これらの方法の一つで抽出したポリマーの平らなものを、リン酸緩衝食塩水（pH７．４、ＰＢＳ）を含むマックカートニ瓶に移し、２０分間１２１℃、１０５kPaでオートクレーブ処理した。次いで、直径６mmの円板を、オートクレーブ処理した材料から滅菌した皮膚パンチで切り取り、同型品を９６穴組織培養浅皿のそれぞれの穴に入れた。次いで、ウシ角膜上皮細胞を、それぞれの穴に５×１０4細胞/mlで接種し、４日間培養した。抽出された検体に接着した細胞数を比色的に定量し、対照の組織培養ポリスチレン（ＴＣＰＳ）表面に接着した平均細胞数を平均パーセント（±標準偏差）として表１に示した。
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表１は、上記の４種の抽出法（方法１〜４）の一つによって抽出されたポリマーが、４日間の培養期間に、陽性の対照である組織培養ポリスチレン（ＴＣＰＳ）のそれに等しいか又は僅かに良好なレベルへの角膜上皮細胞の接着及び成長を支持することを示している。これらの４種の抽出法のそれぞれは、コポリマーから浸出される細胞毒性組成物を好結果で除去する。これらの方法による抽出後、ポリマー上のウシ角膜上皮細胞の成長レベルは、血清を含まない培養培地で３週間抽出されたポリマー検体上で見られるレベルである。
実施例８（“Ｚ１．０”）：
式（Ｉ）（ｎ＝１）のマクロモノマーは、Minnesota Mining and Manufacturing Company,St Paul,Minnesota,USAから、製品番号L-9629として入手した。以下の組成物をポリプロピレンの平らな成形用型（厚さ０．５mm）に入れ、３６５nmのＵＶラインで１６時間照射して重合させた。
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成形用型から取り出した後、上記の実施例３に記載した方法に準じて、ポリマー円板を抽出し、１２５°固着接触角を有する透明なポリマーを得、次いで、実施例２に記載した方法に準じて、ウシ角膜上皮及び繊維芽細胞の接着を組織培養のポリスチレンと比較して検討した。結果は表２に示されており、このポリマーがウシ角膜上皮細胞及び角膜実質繊維芽細胞の接着及び成長を支持することを示している。ポリマー表面上の細胞の形態は良好に広がった細胞であり、組織培養ポリスチレン表面上の細胞に形態学的に類似である。表３は、陽性の対照組織培養ポリスチレンと比較して、角膜組織のボタンから角膜組織の増殖を支持するポリマーの相対的能力を示している。外植片成長検定は、８日間の培養期間に行われた。この表は、このポリマーが角膜上皮組織のポリマー中への移動を支持することを示している。
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実施例９（“Ｚ２．０”）：
実施例１に記載の一般法を用いて、式（Ｉ）（ｎ＝２）のマクロモノマーを製造した。以下の組成物をポリプロピレンの平らな成形用型（厚さ０．５mm）に入れ、３６５nmのＵＶランプで１６時間照射して重合させた。
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成形用型から取り出した後、実施例３に記載した方法に準じて、ポリマー円板を抽出し、１０９°固着接触角を有する透明なポリマーを得、次いで、上記の実施例２に記載した方法に準じて、ウシ角膜上皮及び繊維芽細胞の接着を試験した。結果は表２に示されており、このポリマーが角膜上皮細胞及び角膜実質繊維芽細胞の接着及び成長を支持することを示している。ポリマー表面上の細胞の形態は良好に広がった細胞であり、組織培養ポリスチレン表面上の細胞に形態学的に類似である。表３は、陽性な対照の組織培養ポリスチレンと比較して、角膜組織のボタンから角膜組織の増殖を支持するポリマーの相対的能力を示している。外植片成長検定は、８日間の培養期間に行った。表は、このポリマーが角膜上皮組織のポリマー中への移動を支持することを示している。
実施例１０（“Ｚ４．０”）：
実施例１に記載の一般法を用い、式（Ｉ）（ｎ＝４）のマクロモノマーを製造した。以下の組成物をポリプロピレンの平らな成形用型（厚さ０．５mm）に入れ、３６５nmのＵＶランプで１６時間照射して重合させた。
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成形用型から取り出した後、上記の実施例３に記載した方法に準じて、疎水性のポリマー円板を抽出し、１１６°の固着接触角を有する透明なポリマーを得、次いで、上記の実施例２に記載した方法に準じて、ウシ角膜上皮及び繊維芽細胞接着を検討した。結果は表２に示されており、このポリマーが角膜上皮細胞及び角膜実質繊維芽細胞の接着及び成長を支持することを示している。ポリマー表面上の細胞の形態は良好に広がった細胞であり、組織培養ポリスチレン表面上の細胞に形態学的に類似である。表３は、陽性な対照の組織培養ポリスチレンと比較して、角膜組織のボタンから角膜組織の増殖を支持するポリマーの相対的能力を示している。外植片成長検定は８日間の培養期間に行われた。表は、このポリマーが角膜上皮組織のポリマー中への移動を支持することを示している。
実施例１１（“Ｚ１．２”）：多孔性のポリマー円板の製法：
式（Ｉ）（ｎ＝１）のマクロモノマー及びイソプロパノールを含む熱力学的に安定で、透明な均質混合物の重合を開始させる紫外線（ＵＶ）ラジカルによって、微多孔性（microporous）ポリマーを合成した。式（Ｉ）（ｎ＝１）のマクロモノマーは、Minnesota Mining and Manufactureing Company,St Paul,Minnesota,USAから、製品番号L-9629として入手した（L-9626は、二つの重合可能なメタクリラート官能基で末端がキャップされ、約２，０００の分子量を有するペルフルオロポリエーテルである）。これらの円板を製造するのに以下の組成物を用いた：
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マクロモノマー、溶媒及び界面活性剤を、ＰＴＦＥで被覆された磁気撹拌棒を備えたねじぶた付きガラス瓶に加えた。次いで、ガラス瓶を磁気撹拌プレート上に１０分間置いて、３成分を徹底的に撹拌した。フリーラジカル開始剤Darocur1173を加えて、更に５分間混合を続けた。得られた混合物を、窒素の雰囲気下、ポリプロピレンの平らな成形用型に入れ、３６５nmのＵＶランプを照射して３時間重合を行った。
重合完了後、得られた平らなポリマー円板を成形用型から取り出し、イソプロパノールで一夜抽出した（１０個の円板毎に溶媒６０mlを用いた）。次いで、溶媒を上澄みとして注ぎ出し、イソプロピルアセタートで置き換えた。４時間３７℃で放置した後、この溶媒をPF5060で置き換えた。更に４時間３７℃で放置した後、PF5060を上澄みとしてデカントし、過剰のPF5060が蒸発するまで円板を室温に放置した。最後に円板をエタノール中に貯蔵した。
この方法により、実施例８のポリマーを、平らな円板として微多孔性の形態で得た。得られた多孔性円板の「水和した」水分含量（％W/W）は、円板の水和重量と脱水重量を比較して測定した。円板を真空オーブン中３７℃で一夜乾燥してから重さを計量した。水和は、エタノールから、７５％エタノール−水、５０％エタノール−水、２５％エタノール−水、次いで最後に水への傾斜溶媒交換法によって達成した。円板をそれぞれの溶媒中に約５分間置いた。次に、水和した円板を織り交ぜのない目の細かいリント布上に置き、過剰な表面の湿気を軽くたたいて乾燥し、最後に水和した重量として目方を計量した。この方法で測定した水和した円板の水分含量は５２％であった。グルコース（分子量＝１８１）、イヌリン（分子量＝５，５００）及びアルブミン（分子量＝６７，０００）に対する円板の透過性を、以下のように決定した：
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ペルフルオロ化された円板の透過性は、Nuclepore ５０nm及びPoretics ２５nm孔直径の円板を通過するグルコース、イヌリン及びアルブミンの透過性と関連して測定し、PCT/EP94/03680が教示するその多孔性は人工角膜アンレーに適切である。
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これは、この実施例のポリマーがNuleopore及びPoretics膜の中間の多孔性を有し、したがって、角膜アンレーに栄養分及び高分子量のタンパク質の適切な流れを与えるのに適当な多孔性であることを示している。
実施例２に記載の方法に準じて、ウシ角膜上皮及び繊維芽細胞の接着について、多孔性ポリマーを検討した。結果は表２に示されたおり、このポリマーが角膜上皮細胞及び角膜実質繊維芽細胞の接着及び成長を支持することを示している。ポリマー表面上の細胞の形態は、良好に広がった細胞であり、組織培養ポリスチレン表面上の細胞に形態学的に類似である。表３は、陽性な対照の組織培養ポリスチレンと比較して、角膜組織のボタンから角膜組織の増殖を支持するポリマーの相対的能力を示している。移植片成長検定は８日間の培養期間に行われた。表は、このポリマーがポリマー中への角膜上皮組織の移動を支持し、この目的には組織培養ポリスチレンよりも優れていることを示している。
実施例１２（“Ｚ１．３”）：
実施例８のポリマーから、別の微多孔性の円板の形態を製造した。以下の混合物を７×１０ポリプロピレン膜成形用型に注型し、実施例１１のそれと同一のプロトコールを用い、広いスペクトルのＵＶランプを照射して３時間重合させた。
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実施例１１に記載した方法を用い、水分含量は３３％であると決定した。透過性は以下のとおりである：
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実施例２に記載の方法に準じて、ウシ角膜上皮及び繊維芽細胞接着について、多孔性ポリマーを試験した。結果は表２に示されており、このポリマーが角膜上皮細胞及び角膜実質繊維芽細胞の接着及び成長を支持することを示している。ポリマー表面上の細胞の形態は、良好に広がった細胞であり、組織培養ポリスチレン表面上の細胞と形態学的に類似である。表３は、陽性な対照の組織培養ポリスチレンと比較して、角膜組織のボタンからの角膜組織の増殖を支持することを示している。外植片成長検定は８日間の培養期間に行われた。表は、このポリマーがポリマー中への角膜上皮組織の移動を支持し、この目的には組織培養ポリスチレンより優れていることを示している。
実施例１３（“Ｚ１．１”）：
実施例８のポリマーから、別の微多孔性の円板の形態を製造した。以下の混合物を７×１０ポリプロピレン膜成形用型に注型し、実施例１１のそれと同一のプロトコールを用い、広いスペクトルのＵＶランプを照射して３時間重合させた。
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実施例１１に記載した方法を用い、水分含量は５２％であると決定した。透過性は以下のとおりである：
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この多孔性ポリマーは、目での角膜上皮組織の増殖を支持する能力について評価されている。この特殊な目的は、角膜上皮細胞の、初期接着、異常成長及び接着の持続性の支持に関する微小凸レンズの性能を生体内で評価することである。微小凸レンズは、実施例８のポリマー（厚さ０．２mm）を、直径４mmの冠状のこで裁断することによって得られる。
移植の方法及び臨床観察：
以下に記載された試験の方法及び実施は、ニューサウスウェールズ大学の動物倫理委員会（Animal Ethics Committee of The University of New South Wales）によって承認されている。年令が２〜４歳の範囲の５頭の成熟したネコを試験に用いた。すべてのネコには、目又は全身性の進行性疾患はなかった。細隙灯評価及び超音波パコメーター（VIDA 55）を用いた角膜厚さの測定を含む、角膜完全性のベースライン測定が行われた。移植に先立ち、全部の動物は両眼の瞬膜を切除した。それぞれのネコの一方の眼は移植のために無作為に選ばれた。以下のプロトコールにより、瞬膜の切除後、最低２週間の間に外科手術を行った。ケタミン１５〜２０mg/kg体重及びキシラジンン０．５〜１mg/kg体重を用い、筋肉内に注射してステージ３〜水準２の深さにネコを麻酔した。中心角膜に、直径４mmの冠状のこ（２０μmの深さに設定）で印を付けた。印を付けた領域内の上皮をビーバーブレーダーで削り切除した。直径２mmの冠状のこ（１００〜１５０μmに設定）を用いて、中心角膜で円形の角膜切開術を行った。角膜のへりに向って伸張する２mm幅の環状の実質ポケットを、刃の鋭い角膜解剖器具を用いて角膜の切開基部に形成した。ポケット上部の切片は、更に３mmほど上部のへりに向って伸張しており、ポケットの上部のへりはポケット口から約５mmであった。ポケット深部での長さ２mmのアーチ状の切開を、ビーバーブレーダーを用いて上端に沿って作成した。平らなスパーテルを用い、この切開を経て実質ポケットに微小凸レンズを入れた。次いで、この切開の切り口を１０−０ナイロン糸の４〜５本の縫合糸で閉じた。ソフラデックス（０．５％フラマイセチン硫酸及び０．５％デキサメタゾンナトリウム）目薬を外科手術を施した目に局所的に投与した。術後処置は、２週間、手術した目にステロイド類及び抗生物質の局所投与（ソフラデックス目薬を１日３回、そして夜には０．５％クロロマイセチン軟膏の適用）であった。この投薬基準は、観察期間の終わりには１日１回に減らされた。外科手術の５週間後に抜糸した。
移植した目の臨床観察は以下のとおりであった。手術した目を、細隙灯で検査し、全身状態又はフルオロセイン染色の両者も検査した。微小凸レンズ表面上の上皮成長は、体系的等級付け法（下記）を用いて定量化した。術後合併症（もしあれば）の重篤度及び移植の完全性も評価した。すべての動物を約９週間評価した。６３日〜６８日後、動物を屠殺し、移植した目及び対照の目の両方を、組織学的に評価した（組織学的方法は下記参照）。
註：角膜潰瘍形成、炎症又は微小凸レンズ突出部との前部実質融解のような、いずれかの重篤な合併症が見られた場合には、ペントバルビトンナトリウムの致死的過量を用いて直ちに動物を屠殺した；しかしながら、この試験に用いた動物にかかる合併症の如何なるものも発症しなかった。
移植した微小凸レンズに対する組織反応を等級付けるのに用いた臨床評価法：
パラメーター：微小凸レンズ被覆する上皮なし：スコア＝０
パラメーター：上皮は微小凸レンズ表面の２５％を被覆する：スコア＝１
パラメーター：上皮は微小凸レンズ表面の５０％を被覆する：スコア＝２
パラメーター：上皮は微小凸レンズ表面の７５％を被覆する：スコア＝３
パラメーター：上皮は微小凸レンズ表面の１００％を被覆する：スコア＝４
パラメーター：十分な厚さの上皮が微小凸レンズ表面の１００％を被覆する：スコア＝５。この得点法を臨床評価に使用した。
５頭のネコに外科的に実施した移植を、６３〜６８日の期間、臨床的に観察した。全例で、角膜上皮組織の異常増殖は外科手術後の最初の３日間以内に始まるのが観察され、上皮による移植の十分な被覆が５〜１８日（１０日の平均値）後に観察された。この最初の被覆後に上皮被覆のいくらかの損傷が見られたが、再生した上皮組織及び被覆が戻った。表５は、上皮被覆の臨床的特徴を記載する。
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移植の免疫組織学評価法：
角膜組織の凍結切片の免疫組織化学評価は、以下の方法によって行われた。新たに摘出した角膜を冷ＰＢＳ中に保存し、形を整え、角膜と接触するようにへりからへりへの細片を準備した。凍結切片のための組織は、抗原部位を保護するために固定せずに用いられる。角膜の細片は、Tissue Tek OCT(Miles,USA)に埋め込まれ、二酸化炭素ガス（ＧＩＧ、Australia）を用いて金属チャック上で急激に凍結する。凍結した横断面は、低温保持装置（SLEE、UK）を用いて−２０℃で７〜８μmに切断する。切片をクロム明礬ゼラチン被覆のガラス顕微鏡スライド上に集め、３７℃で乾燥してから、それぞれホイルに包み−７０℃で貯蔵する。使用に先立ち、切片は室温に１５分間で戻され、包みを解き、３７℃で５分間乾燥する。切片は、非特異的な結合を減らすために、２％（W/V）ウシ血性アルブミン（ＢＳＡ、Boehringer-Mannheim,Germany,の製品Fraction V）のＰＢＳ溶液中で室温で６０分間温置する。封鎖後、切片を１％（w/v）ＢＳＡ中１／１００に希釈し、選ばれた一次抗体（表４参照）で被覆し、室温で３０分間穏やかに動揺し、３７℃で３０分間更に温置する。ＰＢＳ中で３回すすぎを行った後、切片は適当なフルオロセインイソチオシアナート複合二次抗体（表４参照）で被覆され、３０分間室温で穏やかに動揺し、３０分間３７℃で更に温置する。切片は、この温置の間、遮光して保護する。ＰＢＳ中での３回のすすぎ、次いで２回蒸留した水の中で最後のすすぎを行った後、切片をグリセリン／ＰＢＳ中で固定し、同日に染色して観察する。陰性の対照は、抗体染色を含むすべての実験操作で定型的に行われる。これらは、一次抗体の代わりに予め免疫した血清（一次抗体が高められる種に適合させた）の１／１００希釈液中で、角膜組織の同様な切片を温置することによって提供され、次いで蛍光性二次抗体がテスト切片に用いられる。すべての切片は、アルゴンレーザー源（BioRad Laboratories、USAからの製品MRC-500）備えたNikonダイアフォト顕微鏡を用いて観察する。これは、色透過性フィルムを用いて撮影される２相／蛍光性画像を与える。
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移植片の一つの角膜上皮組成被覆は、上皮のサイトケラチン及び接着複合体成分の存在に対する免疫組織化学染色によって評価された。移植片の前部表面上の組織被覆は、ＡＥ５抗血清による陽性の免疫染色により、上皮であることが確認された。更に、移植片の上皮被覆の基部細胞は、水疱性抗血清により陽性の免疫染色を有することが示され、接着複合体成分の存在を示した。接着複合体は、基底にある実質への角膜上皮組織の接着に含まれることが知られており、この結果は、移植に先立って角膜上皮組織は、これらの接着促進成分に類似の発現を有することを示している。
これらの結果は、本発明の大きな多孔の形態（macroporous form）は、角膜上皮組織の初期接着及び増殖を支持して角膜上皮アンレー移植片を被覆する。この材料は、角膜上皮組織被覆の発育を移植後の数日以内に起こさせる。更に、この材料は、正常な角膜上皮に見られる層形成に類似の組織構造を有する組織被覆を伴う、機能性角膜上皮組織被覆の発育、及び基底の上皮細胞層において、接着複合体構造成分の発現を支持することができる。
実施例１４（“Ｚ１．４”）：
実施例８のポリマーの別の微多孔性形態は、実施例１１の方法により、以下の混合物を混合して得られた。
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実施例１１に記載した方法を用い、水分含量は１５％であることが決定された。透過性を以下に示す：
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実施例１５：
この技術分野で既知の方法に準じて、実施例１１、１２、１３及び１４のポリマーをコラーゲンで被覆した。次いで、角膜上皮組織のボタンからの組織増殖を支持する能力について、この材料を評価した。被覆していない材料も検討した。
実施例２に記載した方法に準じて、角膜上皮組織の増殖を支持する材料の能力を測定した。表６は、この材料が、実施例８のポリマーと同程度に角膜上皮組織の増殖を支持することを示している。更に、この材料は、ポリマーがコラーゲン被覆物で予め被覆されている場合にも角膜上皮組織の増殖を支持した。
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実施例１６：
この実施例は、式（Ｉ）（ｎ＝１．０）（式中、Ｑは、メタクリロイルクロリドから誘導される基であり、ｘは、１０であり、そしてｙは、１４である）の製造法を説明している。末端がヒドロキシルであるＰＦＰＥ（ｎ＝１．０）１０７ｇを分液漏斗に入れ、石油スピリット２０mlで洗浄した。ＰＦＰＥ画分を、磁気撹拌棒を備えた丸底フラスコに移し、真空下（０．１mmHg）１０５℃で一夜乾燥した。
冷却して、ＰＦＰＥの２０．０２ｇ（９．９mMol）を、磁気撹拌棒、滴下漏斗、窒素ガス導入管及びガスバブラーを備えた３頚丸底フラスコに入れた。ＰＦＰＥをトリエチルアミン（Aldrich）３．０６ｇ（３０．１mMol）及びトリクロロトリフルオロエタン（ＴＣＴＦＥ）２０mlで希釈し、同時に、メタクリロイルクロリド（Aldrich）３．０６ｇ（２９．３mMol）をＴＣＴＦＥの２０mlで希釈して滴下漏斗に入れた。室温で撹拌しながら、メタクリロイルクロリドをＰＦＰＥ混合物にゆっくり滴下した。滴下終了後、窒素ガス雰囲気下に室温で反応させた。
トリエチルアミン塩酸塩を濾別した。マクロモノマーを含む溶液を分液漏斗に入れて水３０mlで洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥した。乾燥した溶液を濾過し、溶媒を減圧下に留去してＰＦＰＥジメタクリラートを透明な微黄色の油状物として得た。この溶液を冷凍庫に貯蔵し、使用前に濾過した。
実施例１７：
以下の組成物をポリプロピレンの平らな成形用型（厚さ０．２mm）に入れ、３６５nmのＵＶランプを照射して３時間重合させた。
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成形用型から取り出した後、得られた平らな円板を実施例３の方法を用いて抽出した。次いで、実施例２の方法に準じて、ポリマー円板はウシ角膜上皮細胞接着について評価された。そして同一の条件で試験した場合、実施例３のポリマーに類似した細胞密度及び形態学を示した。これは、ポリマーが細胞成長を支持すること示している。
この技術分野に精通している技術者には、ここに記載された発明は、特に記載されたもの以外に、変更及び修正がなされ得ることは明らかである。この発明は、その精神と範囲から逸脱することなく、あらゆるかかる変更及び修正があり得ることが理解されるべきである。この発明は、また、この明細書に引用し又は指示した工程、特徴、組成物及び化合物を、それぞれに又は集合的に含み、該工程又は特徴の二つ以上の如何なるそしてすべての組合せを含むものである。