(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
膀胱癌マーカーである基底膜成分を、ラテックス凝集反応を用いて測定する際に、非特異的凝集を軽減するための感作コーティングしていないカルボキシル化ラテックス微粒子を、緩衝液に分散させたラテックス試薬を用い、かつ上記ラテックス凝集反応を上記緩衝液によりｐＨが８．０〜１２．０の範囲に規定された反応系で行なうことを特徴とする、基底膜成分の簡易測定方法。
【請求項２】
さらに反応系のｐＨを、上記緩衝液により８．５〜９．０に規定する、特許請求の範囲第１項に記載の簡易測定方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、尿中の基底膜成分といった膀胱癌マーカーを定量的に測定するための方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
膀胱癌のうち侵入型膀胱癌と呼ばれるタイプは、膀胱を覆う粘膜において始まり、基底膜を浸食して筋肉に及ぶ。この侵入型膀胱癌（以下、単に膀胱癌と呼称することもある）を検査する方法として、細胞学的検査や膀胱鏡検査があるが、これら方法はいずれも非常に煩雑で、特に膀胱鏡検査は肉体的危険さえある。また、これらの検査では、たとえ陰性であったとしても、それが即ち膀胱癌の非存在を裏付ける証拠には成り得ないのである。
【０００３】
そういった欠点を有さない、簡易な膀胱癌の検査方法として、種々の腫瘍マーカーの利用が研究され、実用化されて来ている。これら腫瘍マーカー検査は、腫瘍マーカーを免疫学的に測定・検出したり、公知の手法で乾式の試験片に適用させたりしたものであり、スクリーニング検査にも応用できる。
【０００４】
さて、基底膜は、複数の特定の基底膜成分のコラーゲン（例えばタイプＩＶ及びタイプＶ）、ラミニン、細胞接着分子、プロテオグリカン、フィブロネクチンを含む、少なくとも複数の同定された蛋白質及びペプチド誘導体を含む。先述の侵入型膀胱癌は、その浸食作用により、基底膜を尿中へ遊離させ、遊離した基底膜成分及びそのフラグメント（断片）は、さらに細かいフラグメントへと分解される。
【０００５】
特表平４−５０２３６３号に記載の発明は、膀胱癌患者の尿検体中に、上記のような細かなフラグメントの他に、独特の複合体形状を有する基底膜成分が測定可能な濃度で残存していることに着目した発明である。開示された一つの方法として、それら基底膜成分の断片複合物に対する標識か非標識のいずれかのモノクローナル抗体を利用し、凝集反応やサンドイッチ測定法等の、常用の手法で定性的に検出させている。
【０００６】
開示されたもう一つの方法として、上記基底膜成分が、通常のラテックス凝集で用いられるような微粒子の懸濁物を凝集させるという能力特性に基づいて、凝集反応を観察する方法がある。その凝集機構は不明だが、ラテックスの表面に抗基底膜成分抗体を感作させていなくとも、基底膜成分を含む断片複合体が存在する尿サンプルと接触させることで、ラテックス微粒子の凝集が生じるのである。ここで、特表平４−５０２３６３号では、牛血清アルブミンにより微粒子の懸濁液を処理し、粒子の表面上の部位をブロックすることで、非特異的相互作用を軽減化している。さらに、基底膜成分のラテックス凝集活性を改善するために、特表平９−５００９６５号では、ラテックス微粒子の表面をヒト・ガンマ・グロブリン（以下ヒトＩｇＧ）で修飾する方法を開示している。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
上記特表平４−５０２３６３号及び特表平９−５００９６５号に記載の測定方法は、非特異的凝集を軽減するために牛血清アルブミン及びヒトＩｇＧでコーティングなり修飾なりする工程（以下、この作業工程を感作コーティングと呼称する）を必須としているが、これら感作コーティング工程は、測定手順を煩雑にしてしまう。
【０００８】
そこで本発明の目的は、従来よりも簡単な手順であるにもかかわらず、感作コーティングされているラテックス微粒子を用いる手法と遜色ない結果が得られる手法を見出すことにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
課題を解決するために、本発明は、基底膜成分の簡易測定方法において、膀胱癌マーカーである基底膜成分を、ラテックス凝集反応を用いて測定する際に、非特異的凝集を軽減するための感作コーティングしていないラテックス微粒子を、緩衝液に分散させたラテックス試薬を用い、かつ上記ラテックス凝集反応を上記緩衝液によりｐＨが８．０〜１２．０の範囲に規定された反応系で行なうことを特徴としている。
【００１０】
特表平４−５０２３６３号及び特表平９−５００９６５号に記載の、基底膜成分を対象物としたラテックス凝集反応は、牛血清アルブミン及びヒトＩｇＧで感作コーティングを行っている。このように処理することで、微粒子表面に抗基底膜成分抗体が感作されていなくても、基底膜成分が微粒子を凝集させる活性を有するためとされている。
【００１１】
しかし、本発明者らの実験によると、意外にも、牛血清アルブミン及びヒトＩｇＧで感作コーティングされていない、全く未処理のラテックス微粒子でも、基底膜成分により微粒子が凝集されることを見出したのである。しかもその凝集程度は、感作コーティングされたラテックス微粒子を使用して得られた結果と、遜色ない結果を示すことが明らかにされた。
【００１２】
本発明においては、牛血清アルブミン及びヒトＩｇＧで感作コーティングを行わないために、手順の簡素化の他、感作コーティング後に試料中へ漏出する可能性のあるヒトＩｇＧによる非特異的凝集を末然に防ぐことができる。
【００１３】
またさらに、反応系のｐＨをアルカリ性側にすることで、腎糸球体基底膜が損傷した腎疾患患者の症状を例とする、尿中に含まれる可能性のあるヒトＩｇＧの作用による非特異的凝集も抑えることができる。
【００１４】
また同時に、ｐＨがアルカリになればなるほど、ヒトＩｇＧの影響を回避できるが、意外にも測定対象濃度の範囲を拡大することができることが判明し、高濃度の基底膜成分を含む検体試料でも、良好な直線性の下で測定が可能となる。
【００１５】
【発明の実施の形態】
本発明で使用されうるラテックス微粒子は、特表平４−５０２３６３号及び特表平９−５００９６５号に記載の微粒子に準ずればよい。すなわち、微粒子は約０．０１〜５μｍの直径を有し、約０．２５〜０．７μｍが好ましい。
【００１６】
本発明で利用できるラテックス微粒子の材質は、通常の凝集試験で用いられる極めて微細なプラスチック粒子、例えばポリスチレン及びその誘導体が好ましい。もちろん、その他の炭化水素ポリマー及び固形物質、例えばガラス等も（厳密にはラテックスではないが）使用することができる。これら微粒子は非誘導体又は誘導体の状態となることができ、例えばカルボキシル化、又はアミノ化の両者が好ましく使用できる。
【００１７】
ラテックス微粒子を含有するラテックス試薬には、尿試料のｐＨに影響を受けない程度の緩衝液を使用することが望ましく、その濃度は低い方が良い。感作コーティングされていないラテックス微粒子の場合、緩衝液の濃度を上げると、尿中のアルブミン及びヘモグロビンの作用でラテックス微粒子が凝集し始めるので、緩衝液の濃度としては０．１Ｍ程度が望ましい。
【００１８】
本発明において反応系のｐＨをアルカリ性にする場合は、ｐＨ８．０〜１２．０の範囲で使用でき、さらに好ましくはｐＨ８．５〜９．０の範囲である。その際に用いることのできる緩衝液としては、前記ｐＨ範囲において緩衝能を有するものであれば特に限定はされないが、例としてトリス緩衝液、トリエタノールアミン緩衝液、グリシン緩衝液等が好ましく使用できる。また、緩衝液の濃度は、尿試料のｐＨに影響を受けないことを条件に、出来る限り低濃度、即ち０．０１〜０．５Ｍ、好ましくは０．０５〜０．２Ｍが適当である。
【００１９】
【実施例】
（実施例１）
基底膜成分としてヒト由来のＩＶ型コラーゲン（シグマ社製  Ｃ−５５３３）を、５ｍｇ／ｄｌ、１０ｍｇ／ｄｌ、２０ｍｇ／ｄｌの濃度になるように、健常者より採取したプール尿に直接溶解した。また、腎疾患患者の尿中漏洩物質としてヒト由来免疫グロブリンＧ、即ちヒトＩｇＧ（シグマ社製  Ｉ−４５０６）を、５０ｍｇ／ｄｌ及び１００ｍｇ／ｄｌの濃度になるように、健常者より採取したプール尿に直接溶解した。
【００２０】
ラテックス原液として、１０％濃度の粒径２５０ｎｍのカルボキシル化ラテックス（商品名：ＩＭＭＵＴＥＸ、日本合成ゴム製  Ｇ０２０５）を用意した。ラテックス試薬は、ｐＨ７．６及びｐＨ８．６に調製した０．１Ｍトリス緩衝液で、前記ラテックス原液を１０倍に希釈して調製した。
【００２１】
反応の追跡には、汎用自動分析装置であるＣＯＢＡＳ−ＭＩＲＡ（ＲｏｓｈｅＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）を使用し、ラテックス試薬２００μｌに対し、試料５μｌの設定で行った。ラテックス試薬と試料を混合したのち、１０分間の８００ｎｍにおける吸光度の変化を追跡した。その結果を各図に示す。
【００２２】
図１には、ＩＶ型コラーゲン含有試料を測定した場合の吸光度（濁度）の変化を示した。（Ａ）は特表平９−５００９６５号に記載の手順に従いヒトＩｇＧ及び牛血清アルブミンを感作コーティングしたラテックス微粒子を用いた結果を、（Ｂ）には全く何もコーティングしていないラテックス微粒子をそのまま使用した結果を示している。また、（Ａ）（Ｂ）とも縦軸には８００ｎｍにおける吸光度を、横軸には反応時間を採用している。尚、（Ａ）（Ｂ）ともラテックス試薬のｐＨは７．６に設定している。
【００２３】
図１より明らかなように、従来技術の（Ａ）、本発明の（Ｂ）ともに試料中のＩＶ型コラーゲンの存在により吸光度が上昇、即ちラテックス微粒子とＩＶ型コラーゲンとが凝集反応を起こしていることが分かる。これより、ラテックス微粒子表面をヒトＩｇＧ及び牛血清アルブミンで感作コーティングしなくとも、試料中のＩＶ型コラーゲンを測定することが十分に可能であると言える。
【００２４】
次にラテックス微粒子表面に何もコーティングしていないラテックス試薬を用い、ヒトＩｇＧとの非特異的な凝集反応の有無を確認した。その結果を図２に示す。縦軸には８００ｎｍにおける反応液の吸光度を、また横軸には反応時間を採用している。（Ａ）にはラテックス試薬のｐＨが７．６であり、（Ｂ）には前記試薬のｐＨが８．６の条件における結果を示した。
【００２５】
図２（Ａ）（Ｂ）の比較により、ラテックス微粒子とヒトＩｇＧとの非特異的な凝集反応は、用いるラテックス試薬のｐＨを、よりアルカリ側にすることで回避できることが理解できる。これより、ラテックス微粒子表面をヒトＩｇＧ及び牛血清アルブミンで感作コーティングしなくとも、試料中のＩＶ型コラーゲンを十分に、あるいは感作コーティングした場合よりも高感度に、測定することが可能であると言える。
【００２６】
図３には、全く何も感作コーティングしていないラテックス微粒子を使用し、ラテックス試薬のｐＨを変えた場合に、ＩＶ型コラーゲン含有試料を測定した結果を示した。縦軸には反応開始１０分後の８００ｎｍにおける吸光度を、横軸には試料として用いたＩＶ型コラーゲンの濃度を採用し、作成した検量線である。
【００２７】
図３（Ａ）にはｐＨ７．６のラテックス試薬を、（Ｂ）にはｐＨ８．６のラテックス試薬を使用した結果を示した。（Ａ）では約１０ｍｇ／ｄｌまでしか直線領域を確保できないのに対し、（Ｂ）では２０ｍｇ／ｄｌまでは吸光度とＩＶ型コラーゲン濃度との間に直線関係があることが確認できる。これは、何も感作コーティングしていないラテックス微粒子を用いた場合に、アルカリ性の反応系では測定範囲が格段に拡大することを示している。
【００２８】
【発明の効果】
以上のように、本発明を用いると、感作コーティングの手順を踏むことなく、膀胱癌マーカーである基底膜成分を対象物としたラテックス凝集反応を簡易に行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】（Ａ）が従来技術、（Ｂ）が本発明による、ＩＶ型コラーゲンを測定した際のグラフである。
【図２】本発明において（Ａ）がｐＨ７．６、（Ｂ）がｐＨ８．６の条件下でヒトＩｇＧを測定した際のグラフである。
【図３】本発明において（Ａ）がｐＨ７．６、（Ｂ）がｐＨ８．６の条件下でＩＶ型コラーゲンを測定した際の直線性を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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