(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
リアーゼ活性を有する微生物菌体または該菌体処理物の存在化、フマル酸とエチレンジアミンの混合物からＳ，Ｓ−エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸を酵素反応により製造する方法において、フマル酸およびエチレンジアミンの総仕込み濃度をそれぞれ５００〜２５００ｍＭ及び２５０〜１２５０ｍＭとすること、水酸化アルカリまたはアンモニアにより反応液のｐＨを７．５〜９．５の範囲に調整すること、および反応温度を０〜４５℃の範囲とすることを特徴とするＳ，Ｓ−エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸の製造法。
【請求項２】
フマル酸およびエチレンジアミンの総仕込み濃度が、それぞれ８００〜２０００ｍＭおよび４００〜１０００ｍＭである請求項１記載のＳ，Ｓ−エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸の製造法。
【請求項３】
反応液のｐＨが８〜９の範囲である請求項１記載のＳ，Ｓ−エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸の製造法。
【請求項４】
反応後期における反応温度を０〜３０℃の範囲とする請求項１記載のＳ，Ｓ−エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は微生物の作用によりフマル酸とエチレンジアミンからＳ，Ｓ−エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸を製造する方法に関する。Ｓ，Ｓ−エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸は重金属を補足するという特異な性質を持ち、自然界に放出された後に生分解を受け易く、キレート剤、洗剤用ビルダーや写真用漂白剤などの用途が見込まれる。
【０００２】
【従来の技術】
エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸（以下ＥＤＤＳと略記）の立体異性体混合物（Ｓ，Ｓ−、Ｒ，Ｒ−、ｍｅｓｏ−体）は有機合成的手法によりマレイン酸とエチレンジアミンから〔米国特許第3,158,635 号参照〕、また、その光学活性体であるＳ，Ｓ−体はＬ−アスパラギン酸とジブロムエタンから〔John A. Neal et al. Inorganic Chem. ７, 2405 (1968) 参照〕、各々製造できるとの報告がある。しかし、Ｌ−アスパラギン酸とジブロムエタンからの製法では、製造原料が比較的高価であるため、安価で汎用性のある光学活性体を供給することは困難である。
【０００３】
一方、微生物による製造に関しては、Ｓ，Ｓ−ＥＤＤＳが放線菌ＭＧ４１７−ＣＦ１７株の培養液からホスホリパーゼＣの特異的阻害剤として単離同定されており〔T. Nishikiori et al., J. Antibiotics 37, 426 (1984) 参照〕、これらの放線菌を用いて発酵法によりＳ，Ｓ−ＥＤＤＳを生産する方法が提案されているが〔PCT/EP96/01868号公報参照〕、製造時に微生物の生育を伴うため、生産物の高濃度蓄積が難しく生産性に限界がある。
【０００４】
一方、本発明者らは、先に、微生物由来の酵素反応によりフマル酸と各種ジアミンから効率よく光学活性ジアミノアルキレン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸などを製造する新規な方法を提案した〔特願平8-79404 号明細書、EP 0731171 A公報参照〕。しかしながら、収率の面で必ずしも充分な成果を得るに至らなかった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
この問題を解決する方法として、本発明者らは、既に該反応系にマグネシウム等の多価金属イオンを存在させることにより反応収率を大幅に向上させる方法を見出している〔特願平9-124700および及び同9-31399 号明細書参照〕。
ところで、Ｓ，Ｓ−ＥＤＤＳをキレート剤や洗剤用ビルダーとして使用する際には、ナトリウム等の１価の陽イオンとの塩として用いるのが一般的であるが、上記多価金属イオンを用いる反応においては、鉱酸等を用いて、一旦、Ｓ，Ｓ−ＥＤＤＳを晶析、回収後、水酸化ナトリウム等のアルカリを添加して塩にする必要があり、操作面および晶析後の母液中に含まれる多量の無機塩等の処理の面、さらには使用した多価金属の除去の面で問題があった。
したがって、本発明は、微生物によるＳ，Ｓ−ＥＤＤＳの製造において、反応収率を向上させ、効率的にＳ，Ｓ−ＥＤＤＳならびにそのナトリウム塩等を製造することを課題とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、この課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、反応系の基質を高濃度に仕込み、さらに諸条件を最適化することにより、フマル酸とエチレンジアミンからのＳ，Ｓ−ＥＤＤＳ製造における酵素反応収率を飛躍的に改善し、効率的にＳ，Ｓ−ＥＤＤＳならびにそのナトリウム塩等を製造できることを見い出し本発明に到達した。
【０００７】
すなわち、本発明は、リアーゼ活性を有する微生物または該処理物の存在下、フマル酸とエチレンジアミンの混合物からＳ，Ｓ−エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸を酵素反応により製造する方法において、フマル酸およびエチレンジアミンの総仕込み濃度をそれぞれ５００〜２５００ｍＭおよび２５０〜１２５０ｍＭとすること、水酸化アルカリまたはアンモニアにより反応液のｐＨを７．５〜９．５の範囲に調整すること、および反応温度を０〜４５℃の範囲とすることを特徴とするＳ，Ｓ−エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸の製造法である。
【０００８】
本発明は、基質の濃度、反応液のｐＨおよび反応温度が、それぞれ上記条件において、化学平衡点を基質側から、より生成物側へ移動させるとの本発明者による実験的知見に基づくものである。
【０００９】
【発明の実施の形態】
上記化学平衡点は、例外なく、触媒の種類に左右されることはない。したがって、諸条件を等しくした場合、本発明における化学平衡点は副反応やその他の反応が関わらない限り、すべての触媒について一様の値を示す。すなわち、本発明の触媒であるリアーゼがいずれの微生物由来であるかは、それがＳ，Ｓ−ＥＤＤＳを生成する能力を有する限り、特に限定されない。
【００１０】
本発明で使用される微生物としては、例えば、バークホルデリア（Burkholderia）属、アシドボラックス（Acidovorax）属、シュードモナス（Pseudomonas)属、パラコッカス（Paracoccus）属、スフィンゴモナス（Sphingomonas）属、ブレブンジモナス（Brevundimonas)属等の細菌を挙げることができる。
【００１１】
具体的には、Burkholderia sp.ＫＫ−５株〔ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４１２〕、同ＫＫ−９株〔ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４１３〕、Acidovorax sp.ＴＮ−５１株〔ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４１６〕、Pseudomonas sp. ＴＮ−１３１株〔ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４１８〕、Paracoccus sp.ＫＫ−６株〔ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４１５〕、Sphingomonas sp.ＴＮ−２８株〔ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４１９〕およびBrevundimonas sp. ＴＮ−３株〔ＦＥＲＭ  ＢＰ−５８８６〕を挙げることができる。
【００１２】
これらの細菌は、本発明者らにより自然界から新たに分離され、上記番号にて通産省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている。本菌の菌学的性質は以下に示す通りである。
【００１３】
0003836952.tif 000002
0003836952.tif 000003
【００１４】
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【００１５】
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【００１６】
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【００１７】
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【００１８】
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0003836952.tif 000011
【００１９】
上記菌学的性質を、Bergey's Manual of Systematic Bacteriology Vol.1(1984)およびBergey's Manual of Determinative Bacteriology 9 版(1994)により分類すると、ＫＫ−５株およびＫＫ−９株はバークホルデリア（Burkholderia）属に、ＴＮ−５１株はアシドボラックス（Acidovorax）属に、ＴＮ−１３１株はシュードモナス（Pseudomonas)属に、Bergey's Manual of Systematic Bacteriology Vol.1(1984)により分類するとＫＫ−６株はパラコッカス（Paracoccus）属に、Bergey's Manual of Determinative Bacteriology 9 版(1994)およびMicrobiol. Immunol. 34, 99(1990)により分類するとＴＮ−２８株はスフィンゴモナス（Sphingomonas）属に、また、Bergey's Manual of Determinative Bacteriology 9 版(1994)およびInt. J. Syst. Bacteriol.44, 499(1994) により分類すると、ＴＮ−３株はブレブンジモナス（Brevundimonas)属に属する細菌と同定された。
【００２０】
生物界に幅広く存在するフマラーゼは、本反応の基質であるフマル酸をリンゴ酸に水和し、収率を低下させる要因となるため、使用する菌株のフマラーゼ活性が弱いか、容易に失活する場合を除いて、除去あるいは阻害するのが望ましい。例えば、フマラーゼの除去、阻害方法としては、菌体破砕液からクロマトグラフィー、塩析、電気泳動等の手法で除去する方法、阻害剤により阻害する方法、菌体のままでフマラーゼを失活させる方法〔I.Umehara et al.,Appl. Microbiol Biotechnol 20,291(1984)および湯川ら農芸化学59.279(1985)〕などが知られている。
【００２１】
本発明で使用される微生物の培養液には何ら特別の制限がなく、資化しうる炭素源、窒素源、無機塩、更に微量の有機栄養物などを適当に含有するものであれば合成培地、天然培地のいずれでもよい。また、培養にあたっては培地へのＥＤＤＳ、エチレンジアミン−Ｎ−モノコハク酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジンなどのアミノ酸やフマル酸等の添加は、目的とする活性の高い菌体が得られることがあり好ましい。培養条件は菌体や培地により異なるが、培地のｐＨは４〜１０、好ましくは６〜９の範囲、培養温度は２０〜４５℃、好ましくは２５〜３５℃の範囲で好気的に行い、活性が最大となるまで１〜１０日間培養すればよい。
【００２２】
Ｓ，Ｓ−ＥＤＤＳ生産反応は、フマル酸とエチレンジアミンを含む水溶液中で、所定の条件下、上記菌体または該菌体処理物（乾燥菌体、菌体の破砕物、粗・精製酵素、固定化菌体・酵素など）を接触させることにより行われるが、菌体培養液に、エチレンジアミンとフマル酸を直接添加しても行うことができる。
【００２３】
基質であるフマル酸およびエチレンジアミンの総仕込み濃度は、それぞれ５００〜２５００ｍＭ、好ましくは８００〜２０００ｍＭおよび２５０〜１２５０ｍＭ、好ましくは４００〜１０００ｍＭであり、これらは反応開始時に一括添加しても、あるいは反応経過と共に逐次添加しても構わない。通常、逐次添加が行われるが、この場合、反応液中のフマル酸濃度は１０ｍＭ〜飽和濃度、好ましくは２０〜１３００ｍＭ、およびエチレンジアミン濃度は１０〜２０００ｍＭ、好ましくは１５〜１０００ｍＭの範囲である。また、フマル酸とエチレンジアミンの仕込みモル比は、通常２：１である。
【００２４】
微生物等の使用量は基質に対する乾燥菌体換算で、通常、０．０１〜５重量％である。
【００２５】
反応液のｐＨ調整は、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア等をフマル酸を含む水溶液に添加することにより行われるが、これらのアルカリとフマル酸からなる塩として添加して行うこともできる。ｐＨは７．５〜９．５、好ましくは８〜９に調整する。
【００２６】
反応温度は、０〜４５℃の範囲であるが、反応収率の向上の面からは低温の方がよく０〜３０℃、好ましくは０〜２０℃である。したがって、反応前期、例えば、基質の転換率が５０％未満、好ましくは８０％未満では反応速度の面で有利な高い温度、例えば、３０〜４５℃で行い、その後は反応温度を０〜３０℃、好ましくは０〜２０℃に下げて行うことが、反応速度および収率の両面で有効である。
【００２７】
反応は回分、連続のいずれの方法でも行うことができる。
また、エチレンジアミン、フマル酸を他化合物から供給し得る反応系を、本反応系に共存させたとしても、本発明の効果が得られる限り差し支えない。
【００２８】
Ｓ，Ｓ−ＥＤＤＳを塩として反応終了液から回収する場合は、除菌、ｐＨ調整、濃縮などの操作により、目的の塩あるいはその水溶液を得ることができる。
一方、反応終了液からＳ，Ｓ−ＥＤＤＳを遊離のアミノ酸として取得するには、除菌後の母液に対し、通常、鉱酸による晶析を行えばよい。晶析ｐＨは１．５〜４．５、好ましくは２〜４の範囲である。
【００２９】
【実施例】
次に、本発明を実施例により具体的に説明する。
【００３０】
実施例１および比較例１
(1) 培養
Brevundimonas sp. ＴＮ−３株、Sphingomonas sp.ＴＮ−２８株、Pseudomonas sp. ＴＮ−１３１株を斜面培地から１白金耳取り、下記の培地に接種し、３０℃、４日間好気的に振とう培養した。
【００３１】
培地組成（ｐＨ７．５，１００ｍｌ）
エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸      ０．２ｇ
グルコース                                  ０．２ｇ
酵母エキス                                  ０．１ｇ
ポリペプトン                                ０．０５ｇ
硫酸マグネシウム・７Ｈ2 Ｏ                  ０．１ｇ
硫酸ナトリウム                              ０．２８ｇ
リン酸緩衝液                                ２５ｍＭ
金属塩混合物溶液*                           ０．５ｍｌ
＊金属塩混合物溶液（１００ｍｌ）；  塩化マグネシウム・６Ｈ2 Ｏ  ８ｇ，塩化カルシウム  ０．８ｇ，硫酸マンガン・４Ｈ2 Ｏ  ０．６ｇ，塩化第二鉄・６Ｈ2 Ｏ  ０．１２ｇ，  硫酸亜鉛  ０．０６ｇ
【００３２】
(2) フマラーゼ等を除去した活性画分の取得
菌体培養液２０ｍｌを遠心管に取り１０，０００ｒｐｍ、５℃、１５分間遠心分離し菌体を集めた後、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で２回洗浄した。得られた菌体に対し５０Ｗ、５分間の超音波処理を行い、１０，０００ｒｐｍ、２０分間の遠心分離により粗酵素液を得た。さらに、６０％飽和硫安沈殿、透析による脱塩の後、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化されたＤＥＡＥ−セファセル〔ファルマシア〕に吸着させ、同緩衝液から、０．６Ｍ食塩を含む同緩衝液までの直線勾配法で溶出させた。さらに、必要に応じ、同条件で、ＤＥＡＥ−セファセルの代わりにＨＰＬＣ〔TSK-gel DEAE-5PW（東ソー）〕を用い、フマラーゼ等のフマル酸減少活性をできるだけ除去した画分を得た。
【００３３】
(3) 反応
反応液は、表１に記した濃度のフマル酸、エチレンジアミン、上記活性画分を含み、６Ｎ水酸化ナトリウムによってｐＨ８．５に調整したものを用い、３０℃、１０〜３０日間、Ｓ，Ｓ−ＥＤＤＳの生成がほぼ見られなくなるまで反応させた。また、反応中、１２Ｎ水酸化ナトリウムによりｐＨを８．５に保った。
反応終了液中の生成物であるＳ，Ｓ−ＥＤＤＳの定量は、不溶物を１５，０００ｒｐｍ、５℃で５分間遠心除去した後、WAKOSIL 5C8 （和光純薬）〔溶出液；１０ｍＭ  水酸化テトラ−ｎ−ブチルアンモニウムと０．４ｍＭ  ＣｕＳＯ4 を含む５０ｍＭリン酸（ｐＨ２）〕およびMCI GEL CRS 10W （三菱化学）〔溶出液；１０ｍＭ  ＣｕＳＯ4 〕による液体クロマトグラフィーで行った。
また、Ｓ，Ｓ−ＥＤＤＳの分離精製は、T, Nishikiori et al., J. Antibiotics  37, 426 (1984)に記載のイオン交換樹脂を用いる手法で行い、結晶を取得した後にＮＭＲとマススペクトルによる分析で化学構造の確認を行った。結果を表１に示す。
【００３４】
(4) 結果
0003836952.tif 000012
【００３５】
実施例２
(1) 培養
Brevundimonas sp. ＴＮ−３株を実施例１記載と同様の条件で培養した。
【００３６】
(2) フマラーゼ等を除去した活性画分の取得
実施例１と同様。
【００３７】
(3) 反応
反応液は、１２３２ｍＭフマル酸、６１６ｍＭエチレンジアミン、上記活性画分を含み、表２に記したアルカリ（６Ｎ）によってｐＨ８．５に調整したものを用い、３０℃、１０〜３０日間、Ｓ，Ｓ−ＥＤＤＳの生成がほぼ見られなくなるまで反応させた。また、反応中、表２に記したアルカリ（１２Ｎ）によりｐＨを８．５に保った。
反応終了液中の生成物であるＳ，Ｓ−ＥＤＤＳの定量は、実施例１と同様に行った。結果を表２に示す。
【００３８】
(4) 結果
0003836952.tif 000013
【００３９】
実施例３および比較例２
(1) 培養
実施例２と同様。
【００４０】
(2) フマラーゼ等を除去した活性画分の取得
実施例１と同様。
【００４１】
(3) 反応
反応液は、１２３２ｍＭフマル酸、６１６ｍＭエチレンジアミン、上記活性画分を含み、６Ｎ水酸化ナトリウムによってｐＨ８．５に調整したものを用い、表３に記した温度で、１０〜３０日間、Ｓ，Ｓ−ＥＤＤＳの生成がほぼ見られなくなるまで反応させた。また、反応中１２Ｎ水酸化ナトリウムによりｐＨを８．５に保った。
反応終了液中の生成物であるＳ，Ｓ−ＥＤＤＳの定量は、実施例１と同様に行った。結果を表３に示す。
【００４２】
(4) 結果
0003836952.tif 000014
【００４３】
実施例４および比較例３
(1) 培養
実施例２と同様。
【００４４】
(2) フマラーゼ等を除去した活性画分の取得
実施例１と同様。
【００４５】
(3) 反応
反応液は、６８４ｍＭフマル酸、３４２ｍＭエチレンジアミン、上記活性画分を含み、６Ｎ水酸化ナトリウムによってｐＨ６または８．５に調整したものを用い、３０℃、１０〜３０日間、Ｓ，Ｓ−ＥＤＤＳの生成がほぼ見られなくなるまで反応させ比較した。また、反応中、１２Ｎ水酸化ナトリウムによりｐＨを８．５に保った。
反応終了液中の生成物であるＳ，Ｓ−ＥＤＤＳの定量は、実施例１と同様に行った。結果を表４に示す。
【００４６】
(4) 結果
0003836952.tif 000015
【００４７】
【発明の効果】
反応系の基質を高濃度に仕込み、さらに諸条件を最適化することにより、フマル酸とエチレンジアミンからのＳ，Ｓ−ＥＤＤＳ製造における酵素反応収率を飛躍的に改善し、効率的にＳ，Ｓ−ＥＤＤＳならびにそのナトリウム塩等を製造できる。