(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩＬＫＫＷＰＷＷＰＷＲＲＫ（配列番号１）、ＩＬＰＷＫＫＷＰＷＷＲＷＲＲ（配列番号４）、ＩＬＰＷＫＷＰＷＷＰＷＷＰＷＲＲ（配列番号１１）、ＩＬＫＫＷＰＷＷＰＷＫＷＫＫ（配列番号１８）、ＩＬＰＷＫＷＰＰＷＰＰＷＰＷＲＲ（配列番号２２）、およびＦＦＫＫＦＰＦＦＰＦＲＲＫ（配列番号３６）よりなる群から選ばれるアミノ酸配列からなる、抗微生物活性を有する単離された陽イオン性ペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載のペプチドをコードする単離された核酸。
【請求項３】
細菌または酵母の増殖を抑制するための医薬組成物であって、抑制的に有効な量の、ＩＬＫＫＷＰＷＷＰＷＲＲＫ（配列番号１）、ＩＬＰＷＫＫＷＰＷＷＲＷＲＲ（配列番号４）、ＩＬＰＷＫＷＰＷＷＰＷＷＰＷＲＲ（配列番号１１）、ＩＬＫＫＷＰＷＷＰＷＫＷＫＫ（配列番号１８）、ＩＬＰＷＫＷＰＰＷＰＰＷＰＷＲＲ（配列番号２２）、およびＦＦＫＫＦＰＦＦＰＦＲＲＫ（配列番号３６）よりなる群から選ばれるアミノ酸配列からなるペプチドを含有する、前記医薬組成物。
【請求項４】
該細菌がグラム陽性である、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
該細菌がスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓtaphylococcus aureus）またはＳ．エピデルミディス（Ｓ．epidermidis）である、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
該細菌がグラム陰性である、請求項３に記載の組成物。
【請求項７】
該細菌が、大腸菌（Ｅ．coli）、Ｐ．エルジノーサ（Ｐ．aeruginosa）およびＳ．ティフィムリウム（Ｓ．typhimurium）よりなる群から選ばれる、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
少なくとも１つの抗生物質をさらに含む、請求項３〜７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
該抗生物質がβ-ラクタム、ノボビオシンおよびポリミキシンＢよりなる群から選ばれる、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
該酵母がカンジダ・アルビカンス（Ｃandida albicans）である、請求項３に記載の組成物。
【請求項１１】
該ペプチドがＤ体のＮ末端アミノ酸を有する配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドである、請求項１に記載のペプチド。
【請求項１２】
該ペプチドがカルボキシメチル化されている、請求項１または１１に記載のペプチド。
【請求項１３】
該ペプチドがアミド化されている、請求項１、１１、および１２のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項１４】
該ペプチドがＤ体のＮ末端アミノ酸を有する配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドである、請求項３に記載の組成物。
【請求項１５】
該ペプチドがカルボキシメチル化されている、請求項３または１４に記載の組成物。
【請求項１６】
該ペプチドがアミド化されている、請求項３、１４、および１５のいずれか１項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
１．関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第119条に従い、1995年８月23日付け出願の米国出願第60/002,687号に基づく優先権を主張する。
２．発明の分野
本発明は、抗微生物活性を有するペプチドに関する。
３．発明の背景
病原微生物またはその血中毒素に関連した全身性疾患（例えば、敗血症）は、ヒトの死亡の主要原因である。グラム陰性菌は、そのような疾患に最も一般的に関連している生物であり、病理発生は、多くの場合、内毒素と称される毒性の外膜成分の放出に関連している。しかしながら、グラム陽性菌が致死感染症の原因となる場合が増えつつある。さらに、あらゆるクラスの抗生物質において、抗生物質耐性が大きな問題となりつつあり、新規抗生物質が緊急に必要とされている。
抗微生物活性を有する陽イオン性ペプチドが、多種多様な生物から単離されている。自然界において、そのようなペプチドは、細菌、酵母などの微生物に対する防御機構を付与している。一般に、これらの陽イオン性ペプチドは、細胞膜と相互作用してチャンネルまたは損傷を形成することにより、細菌に対してそれらの抗微生物活性を発現すると考えられている。グラム陰性菌では、それらは、表面リポ多糖（LPS）と相互作用して外膜の透過性を上昇させ、外膜を通過する自己促進性の取込みを引き起こし、細胞膜に接近する。抗微生物性ペプチドとしては、例えば、インドリシジン、デフェンシン、セクロピン、マゲイニンなどが挙げられる。
発明の概要
本発明は、抗微生物活性を有する新規クラスの単離された陽イオン性ペプチドを提供する。本発明のペプチドは、グループとして、以下の式で表すことができる：
0003860838.tif 000002
（式中、
mは１〜５、
nは１または２、
oは２〜５、
rは０〜８、
uは０または１、
X1はイソロイシン、ロイシン、バリン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファンまたはメチオニン、
X2はトリプトファンまたはフェニルアラニン、
X3はアルギニンまたはリシン、
X4はトリプトファンまたはリシン、および
X5はフェニルアラニン、トリプトファン、アルギニン、リシンまたはプロリンである）。
本発明で開示するペプチドの種々の誘導体、類似体、保存的置換体および変異体も、本発明に含まれる。好ましくは、該ペプチドは、アミド化またはカルボキシメチル化されている。本発明のペプチドをコードする単離された核酸も含まれる。好ましいペプチドの具体例には、一文字アミノ酸コードを用いて定義される以下のアミノ酸配列を有するものが含まれる：
0003860838.tif 000003
0003860838.tif 000004
また、本発明は、同時にまたは連続的に使用する本発明の１以上のペプチドの抑制的に有効な量と細菌（単数または複数）とを接触させることにより該細菌の増殖を抑制する方法を提供する。所望により、該ペプチドを、抗生物質と組み合わせて、同時にまたは連続的に使用することができる。そのような併用療法は、ペプチドと抗生物質との間で生じる相乗作用により有益となるかもしれない。
また、本発明は、内毒素血症または敗血症に関連した疾患を有する又は有するおそれのある被験者（例えば、ヒトなどの哺乳動物）における内毒素血症または敗血症に関連した疾患を抑制する方法を提供する。この方法は、本発明のペプチドの治療的に有効な量を患者に投与することを含む。
さらに、本発明は、抗微生物活性を有する陽イオン性ペプチド変異体の製造法を提供する。この方法は、抗微生物活性を有する基準陽イオン性ペプチドのアミノ酸配列を同定し、該基準ペプチドの陽イオン性ペプチド変異体（複数の該変異体のそれぞれは、同定されたアミノ酸配列のアミノ酸の少なくとも１つの置換を含有する）をコードする発現ライブラリーを作製し、複数の宿主細胞中で該ライブラリーを発現させ（それにより、複数のクローンを得）、そして抗微生物活性を有する陽イオン性ペプチド変異体を産生するクローンを単離することを含む。
本発明は、いくつかの利点を提供する。本発明のペプチドは小さく、比較的少数のアミノ酸を有する膜に該ペプチドが広がるのを許容するユニークなポリプロリンII型伸長らせん構造を有する傾向がある。最良のペプチドは、医学的に重要な真菌であるカンジダ・アルビカンス（Candida albicans）に対する活性と共に、抗生物質耐性細菌に対する非常に広いスペクトルの活性を有する。また、これらのペプチドは、しばしば、抗生物質と相乗的に作用する能力を有し、さらに、しばしば、抗内毒素活性も有する。該ペプチドは、組換えＤＮＡおよびタンパク質化学的手段により効率的に製造することができる。また、本発明が提供する方法は、コア構造（例えば、基準タンパク質）突然変異体の合理的に設計されたものおよび半ランダムなものの双方の試験を可能にして、本明細書中に記載されている式に含まれる変異体の製造および試験を可能にする。
【図面の簡単な説明】
図１は、CP-11およびインドリシジンのCDスペクトルを示す。
図2Aは、インドリシジンの構造を示す。
図2Bは、インドリシジン構造の横断面図を示す。
図３は、CP-11についての殺微生物曲線を示す。
図４は、細菌の外膜の透過性を上昇させる抗微生物性ペプチドの能力を示す。
図５は、細菌の内膜の透過性を上昇させる抗微生物性ペプチドの能力を示す。
図６は、インドリシジンについての電圧／電流の関係を示す。
図７は、インドリシジンの電圧符号依存性を示す。
図８は、平面状脂質二重層においてインドリシジンにより生成されたチャンネルコンダクタンスを示す。
図９は、大腸菌（E. coli）0111:B4 LPSで誘導されたTNFに対するペプチドの効果を示す。
図10は、Ｐ．エルジノーサ（P. aeruginosa）LPSで誘導されたTNFに対するペプチドの効果を示す。
図11は、Ｐ．エルジノーサ（P. aeruginosa）により放出されたLPSに対する陽イオン性ペプチドの効果を示す。
図12は、Bort大腸菌（Bort E. coli）により放出されたLPSに対する陽イオン性ペプチドの効果を示す。
発明の詳細な説明
本発明は、抗微生物活性を有する新規クラスの陽イオン性ペプチド（すなわち、ポリペプチド）を提供する。これらのペプチドは、微生物の感染または増殖を抑制したり、内毒素血症の効果を抑制するのに有用である。該ペプチドは、例えば、食品または化粧品の保存剤として使用することができる。本発明のペプチドの多くは、通常の抗生物質と相乗作用し、補助療法として使用することができる。さらに、そのようなペプチドは、抗真菌剤、抗腫瘍剤および／または抗ウイルス剤として有用である。
本発明で用いる「抗微生物」なる語は、該ペプチドが、微生物（例えば、細菌、真菌および／またはウイルス）を破壊したり、あるいは該微生物の成長または増殖を抑制または防止することを意味する。同様に、本発明で用いる「抗ウイルス」なる語は、ペプチドが、ウイルスまたはウイルス感染細胞を破壊したり、あるいはウイルスまたはウイルス感染細胞の成長または増殖を抑制または防止することを意味する。本発明で用いる「抗腫瘍」なる語は、ペプチドが、腫瘍細胞の増殖を防止、抑制したり、あるいは腫瘍細胞を破壊することを意味する。同様に、「抗真菌」なる語は、ペプチドが、真菌の増殖を防止し、妨害しまたは抑制することを意味する。
本発明で用いる「陽イオン性ペプチド」なる語は、５〜50（好ましくは９〜25）アミノ酸長の鎖状アミノ酸を意味する。ペプチドは、それが9.0より大きいpKaを有する場合は、「陽イオン性」である。典型的には、陽イオン性ペプチドの少なくとも４アミノ酸残基は、正に荷電した残基（例えば、リシンおよびアルギニン）である。「正に荷電（した）」とは、pH7.0で正味の正電荷を有するアミノ酸残基の側鎖を意味する。
以下に記載するとおり、本発明者らは、本発明の単離されたペプチドを含む式を案出した。これらのペプチドは、アミノ酸配列：
0003860838.tif 000005
（式中、
mは１〜５、
nは１または２、
oは２〜５、
rは０〜８、
uは０または１、
X1はイソロイシン、ロイシン、バリン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファンまたはメチオニン、
X2はトリプトファンまたはフェニルアラニン、
X3はアルギニンまたはリシン、
X4はトリプトファンまたはリシン、および
X5はフェニルアラニン、トリプトファン、アルギニン、リシンまたはプロリンである）
で表される。
本明細書に用いる「単離された」なる語は、他のタンパク質、脂質および核酸（例えば、in vivoで産生されたペプチドが天然で結合しているかもしれない細胞成分）から実質的に遊離したペプチドを意味する。好ましくは、該ペプチドは、少なくとも70重量％、80重量％、最も好ましくは90重量％の純度である。
また、本発明は、列挙されているポリペプチドの類似体、誘導体、保存的置換体および陽イオン性ペプチド変異体を含む。ただし、該類似体、誘導体、保存的置換体または変異体は、検出可能な抗微生物活性を有する。該類似体、誘導体、置換体または変異体は、該類似体、誘導体、保存的置換体または変異体が由来するペプチドと同じ活性を有する必要はない。
陽イオン性ペプチド「変異体」は、基準とする抗微生物性陽イオン性ペプチドの改変された形態の抗微生物性ペプチドである。例えば、「変異体」なる語は、基準ペプチドのアミノ酸の少なくとも１つが発現ライブラリーにおいて置換される本明細書で開示する方法により製造される抗微生物性陽イオン性ペプチドを含む。「基準」ペプチドなる語は、変異体、誘導体、類似体または保存的置換体が由来する本発明の任意の抗微生物性陽イオン性ペプチド（例えば、前記の式で定義されるもの）を意味する。「誘導体」なる語には、２つの抗微生物性陽イオン性ペプチドのそれぞれの少なくとも一部（例えば、２つの抗微生物性陽イオン性ペプチドのそれぞれの30〜80％）を含むハイブリッドペプチドが含まれる。また、本明細書中に列挙されているペプチドの配列から１以上のアミノ酸が欠失しているペプチドも、該誘導体が抗微生物活性を有する限り、包含される。例えば、抗微生物活性に必要でないペプチドのアミノ末端またはカルボキシル末端のアミノ酸を除去することができる。同様に、抗微生物性ペプチドの抗微生物活性を完全に抑制することなく、、１または数個（例えば、５未満）のアミノ酸を該ペプチドに付加することにより、追加的誘導体を製造することができる。さらに、Ｃ末端誘導体（例えば、Ｃ末端メチルエステル）を製造することも可能であり、それらも本発明に含まれる。
また、本発明は、本明細書中に例示するペプチドの保存的置換体であるペプチドも含む。本発明で用いる「保存的置換体」なる語は、少なくとも１つのアミノ酸が別の生物学的に類似した残基と置換されているポリペプチドを意味する。保存的置換体としては、例えば、１つの疎水性残基（例えば、イソロイシン、バリン、ロイシン、アラニン、システイン、グリシン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、チロシン、ノルロイシンまたはメチオニン）を別の疎水性残基に置換すること、あるいは、１つの極性残基を別の極性残基に置換すること、例えば、アルギニンをリシンに、グルタミン酸をアスパラギン酸に、またはグルタミンをアスパラギンに置換することなどが挙げられる。互いに置換することができる中性の親水性アミノ酸としては、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニンなどが挙げられる。「保存的置換体」なる語はまた、非置換の親アミノ酸の代わりに置換アミノ酸を有するペプチドも含む。好ましくは、該置換ポリペプチドに対して産生させた抗体は、該非置換ポリペプチドにも特異的に結合する。
本発明のペプチドの活性は、本明細書に記載の「最小阻止濃度（MIC）」アッセイ（これは、ODの変化が一定時間全く観察されない最低濃度をMICとして記録するものである）などの当業者に公知の慣用の方法を用いて測定することができる。あるいはまた、「分別阻止濃度（fractional inhibitory concentration）（FIC）」アッセイを用いて、本発明のペプチド同士、または公知の抗生物質と組み合わせた該ペプチドの相乗作用を測定することができる。FICは、例えば、マイクロタイタープレートの一方のディメンション中のペプチドおよびもう一方のディメンション中の抗生物質の交差力価測定により行なうことができる。FICは、一方の抗生物質がもう一方のMICに及ぼす影響（その逆の場合もある）の関数である。FICが１であることは、それらの化合物の影響が付加的であることを示し、FICが１未満であることは、それらの化合物が相乗的に作用することを示す。
本発明のペプチドは、一般的に用いられる方法、例えば、α-アミノ基のt-BOCまたはFMOC保護を含む方法により合成することができる。どちらの方法も、該ペプチドのＣ末端から出発して、単一のアミノ酸を各段階で加える段階的な合成を含む（Coliganら，Current Protocols in Immunology, Wiley Interscience, 1991, Unit 9を参照されたし）。また、本発明のペプチドは、周知の固相ペプチド合成法、例えば、Merrifield（J. Am. Chem. Soc.,85: 2149, 1962）およびStewartおよびYoung（Solid Phase Peptides Synthesis, Freeman, San Francisco, 1962, pp. 27-62）により記載されている方法により、ポリマー１g当たりアミン0.1〜1.0mMolを含有するコポリ（スチレンジビニルベンゼン）を用いて合成することもできる。化学合成が完了したら、液体HF−10％アニソールで０℃で約１/４〜１時間処理することによりペプチドを脱保護しポリマーから切断することができる。試薬を留去した後、ペプチドを１％酢酸溶液でポリマーから抽出し、ついで凍結乾燥して粗製物を得る。このペプチドは、溶媒として５％酢酸を用いるSephadex G-15上でのゲル濾過などの方法により精製することができる。カラム溶出液の適当な画分の凍結乾燥により、均一なペプチドを得、ついでそれを、アミノ酸分析、薄層クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、紫外吸収分光法、モル施光度または溶解度測定などの標準的な技術により特徴決定することができる。所望により、固相エドマン分解によりペプチドを定量することができる。
また、本発明は、本発明のペプチドをコードする単離された核酸（例えば、ＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡ）を含む。本明細書に記載のペプチドの類似体、突然変異体、保存的置換体および変異体をコードする核酸も含まれる。本明細書で用いる「単離された」なる語は、in vivoで産生される核酸が天然で結合しているタンパク質、脂質および他の核酸から実質的に遊離した核酸を意味する。好ましくは、該核酸は、少なくとも70重量％、80重量％、最も好ましくは90重量％の純度であり、in vitroで核酸を合成するための通常の方法をin vivo法の代わりに用いることができる。本発明で用いる「核酸」なる語は、分離した断片の形態での、あるいはより大きな遺伝的構築物（例えば、本発明のペプチドをコードする核酸にプロモーターを作動可能なように結合させることによるもの）の一成分としての、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのポリマーを意味する。多数の遺伝的構築物（例えば、プラスミドおよび他の発現ベクター）が当該技術分野で公知であり、それらを用いて、無細胞系または原核もしくは真核（例えば、酵母、昆虫または哺乳動物）細胞中で本発明のペプチドを製造することができる。当業者であれば、遺伝暗号の縮重を考慮することにより、本発明のポリペプチドをコードする核酸を容易に合成することができる。本発明のペプチドを製造するために、慣用の分子生物学的方法で本発明の核酸を容易に使用することができる。
本発明の陽イオン性ペプチドをコードするＤＮＡは、「発現ベクター」中に挿入することができる。「発現ベクター」なる語は、本発明のポリペプチドをコードする核酸を含有するよう操作することができる当該分野で公知のプラスミド、ウイルスまたは他のベクターなどの遺伝的構築物を意味する。そのような発現ベクターは、好ましくは、宿主細胞中での挿入遺伝子配列の転写を促進するプロモーター配列を含有するプラスミドである。発現ベクターは、典型的には、複製起点、プロモーター、および形質転換細胞の表現型選択を可能にする遺伝子（例えば、抗生物質耐性遺伝子）を含有する。誘導的または構成的プロモーターなどの種々のプロモーターを、本発明で用いることができる。典型的には、発現ベクターは、レプリコン部位および制御配列（宿主細胞に適合した種に由来するもの）を含有する。
本発明の核酸による宿主細胞の形質転換またはトランスフェクションは、当業者に周知慣用の方法を用いて行なうことができる。例えば、宿主が大腸菌（E. coli）である場合、ＤＮＡを取込む能力を有するコンピテント細胞を、当該分野で公知のCaCl2、MgCl2またはRbCl法により調製することができる。別法として、エレクトロポレーション、マイクロインジェクションなどの物理的手段を用いることができる。エレクトロポレーションは、高電圧の電気的衝撃により細胞中へ核酸を導入するのを可能にする。さらに、核酸は、当該分野でよく知られた方法を用いるプロトプラストフュージョンにより宿主細胞中に導入することができる。真核細胞を形質転換する適当な方法（例えば、エレクトロポレーションおよびリポフェクション）も公知である。
本発明に含まれる「宿主細胞」は、本発明の核酸を用いて本発明のポリペプチドを発現する任意の細胞である。また、この用語は、宿主細胞の任意の子孫も含む。本発明の好ましい宿主細胞としては、大腸菌（E. coli）、Ｓ．アウレウス（S. aureus）、Ｐ．エルジノーサ（P. aeruginosa）などが挙げられる。
本発明のペプチドをコードする核酸は、細胞（例えば、培養細胞）から単離することができ、あるいはin vitroで製造することができる。関心のある陽イオン性ペプチドをコードするＤＮＡ配列は、１）ゲノムＤＮＡからの二本鎖ＤＮＡ配列の単離、２）関心のある陽イオン性ペプチドをコードする核酸の化学的製造、または３）ドナー細胞から単離されたｍＲＮＡの逆転写（すなわち、ｃＤＮＡを産生させること）による二本鎖ＤＮＡ配列のin vitro合成により得ることができる。関心のあるｃＤＮＡ配列を単離するための標準的な方法としては、高レベルの遺伝子発現を行なうドナー細胞中のｍＲＮＡの逆転写に由来するｃＤＮＡライブラリーを含有するプラスミドまたはファージの形成が挙げられる。ポリメラーゼ連鎖反応技術と組み合わせると、微量遺伝子産物でさえもクローニングすることができる。
また、本発明は、細菌を本発明のペプチドと抑制的に有効な量で接触させることにより該細菌の増殖を抑制する方法を提供する。「接触」なる語は、ペプチドが細菌を抑制、死滅または溶菌するよう、該細菌を該ペプチドにさらすことを意味する。好ましくは、該ペプチドは、内毒素（LPS）に結合するか、あるいはグラム陰性菌の外膜の透過性を上昇させる能力を有する。接触は、例えば、ペプチドに対する細菌の感受性に関して試験するための細菌培養にペプチドを加えることにより、in vitroで行なうことができる。別法として、接触は、例えば、細菌性疾患（例えば、敗血症性ショック）に苦しむ被験者にペプチドを投与することによりin vivoで行なうことができる。「抑制」または「抑制的に有効な量」とは、静菌または殺菌効果を引き起こすのに十分なペプチドの量を意味する。抑制しうる細菌としては、例えば、大腸菌（E. coli）、Ｐ．エルジノーサ（P. aeruginosa）、Ｅ．クロアケ（E. cloacae）、Ｓ．ティフィムリウム（S. typhimurium）、Ｓ．アウレウス（S. aureus）などが挙げられる。また、細菌の増殖を抑制する方法は、１以上の抗生物質と組み合わされたペプチドと細菌とを接触させることを含む。
本発明のペプチドは、細菌、ウイルスまたは真菌の増殖を抑制するのに有効な量にて、ヒトまたはヒト以外の動物を含む任意の宿主に投与することができる。したがって、該ペプチドは、抗微生物剤、抗ウイルス剤および／または抗真菌剤として有用である。
当該分野で公知の種々のいずれかの方法を用いて、被験者にペプチドを投与することができる。例えば、本発明のペプチドは、注射したり、あるいは時間をかけて徐々に注入することにより、非経口的に投与することができる。該ペプチドは、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、腔内または経皮的に投与することができる。それは、毒性を減少させたり、あるいは生物学的利用能を増加させるためにリポソームに製剤化してもよい。ペプチドを送達するための他の好ましい方法としては、ミクロスフェアまたはプロテイノイド中にペプチドを封入することを含む経口的方法、エアゾール送達（例えば、肺へ）、あるいは経皮送達（例えば、イオン導入または経皮エレクトロポレーションによるもの）などが挙げられる。当業者には、他の投与方法が公知であろう。
本発明のペプチドの非経口投与のための製剤には、無菌の水性または非水性の溶液、懸濁液および乳濁液が含まれる。非水性溶媒としては、例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油（例えば、オリーブ油）、注射用有機エステル（例えば、オレイン酸エチル）などが挙げられる。水性担体としては、水、食塩水および緩衝化媒体、アルコール性／水性溶液、および乳濁液または懸濁液などが挙げられる。非経口用担体としては、例えば、塩化ナトリウム溶液、リンガーデキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸化リンガーおよび不揮発性油などが挙げられる。静脈内用担体としては、流体性の栄養補充物、電解質補充物（例えば、リンガーデキストロースをベースとするもの）などが挙げられる。また、保存剤や他の添加物、例えば他の抗微生物剤、抗酸化剤、キレート剤、不活性ガスなどを含んでいてもよい。
本発明は、内毒素血症または敗血症性ショック（敗血症）に関連した疾患を抑制する方法であって、そのような疾患を有するか又は有するおそれがある被験者に本発明のペプチドを治療的に有効な量で投与することによる方法を提供する。「抑制」なる語は、疾患（例えば、内毒素血症）の徴候または症状を予防または改善することを意味する。改善することができる疾患徴候としては、例えば、患者の血中TNF濃度の増加、発熱、低血圧、好中球減少、白血球減少、血小板減少、散在性血管内凝固、成人呼吸窮迫症候群、器官不全などが挙げられる。本発明で治療することができる患者としては、例えば、グラム陰性菌感染から生じる内毒素血症、毒物中毒、肝不全などの毒血症のおそれがあるか又はそれに罹患している患者などが挙げられる。他の具体例としては、グラム陽性菌、ウイルスまたは真菌に感染した患者などが挙げられる。特に、本発明は、敗血症の徴候を示す患者、または敗血症の症状を訴える患者を治療するのに有用である。候補患者としては、例えば、大腸菌（E. coli）、インフルエンザウイルスＢ型（Hemophilus influenzaB）、髄膜炎菌（Neisseria meningitides）、ブドウ球菌、肺炎球菌による感染症に罹患した患者などが挙げられる。敗血症のおそれのある他の患者としては、銃創、腎または肝不全、外傷、熱傷、免疫易感染性感染症（例えば、HIV感染症）、造血性新形成、多発性骨髄腫、キャッスルマン病または心臓粘液腫に罹患した患者などが挙げられる。医学分野の当業者であれば、本発明による治療に適当な被験者を同定するための慣用の判定基準を容易に使用することができる。
疾病または疾患に苦しむ患者の治療のために本発明で用いる「治療的に有効な量」とは、該疾病の徴候または症状を改善するのに十分な陽イオン性ペプチドの量を意味する。例えば、治療的に有効な量は、LPSに対する被験者の反応を減少させるか、あるいは敗血症の任意の徴候または症状を緩和するのに十分な量として評価することができる。好ましくは、LPSで誘導された血漿TNFレベルの増加を少なくとも50％、より好ましくは90％または100％減少させるのに十分な量の陽イオン性ペプチドで被験者を治療する。一般に、該ペプチドの最適用量は、疾患や、患者の体重などの因子に左右されるであろう。それにもかかわらず、当業者であれば、適当な用量を容易に決定することができる。所望により、治療の有効性は、典型的には、患者のLPSまたはTNFの濃度をモニターすることにより測定することができる。血清中のLPSおよびTNF濃度の減少は、一般には、その疾患の改善と相関する。典型的には、適当な用量は、体重１kg当たりペプチド0.5〜40mg、好ましくは、体重１kg当たりペプチド１〜８mgである。
適当な治療レジメにおいては、所望により、本発明のペプチドの投与を、TNFの阻害物質、抗生物質またはその両方と組み合わせることができる。例えば、抗TNF抗体および／またはTNFアンタゴニストを使用して、敗血症でのTNFの役割を妨害することにより、直接的または間接的に、敗血症の徴候を予防または改善することができる。TNFに特異的に結合するモノクローナル抗体などの抗TNF抗体（例えば、Traceyら，Nature, 330: 662, 1987に記載されているもの）が特に好ましい。ペプチド、阻害物質および／または抗生物質は、好ましくは同時に投与するが、連続的に投与してもよい。適当な抗生物質としては、アミノグリコシド（例えば、ゲンタマイシン）、β-ラクタム（例えば、ペニシリンおよびセファロスポリン）、キノロン（例えば、シプロフロキサシン）、ノボビオシンなどが挙げられる。一般に、抗生物質は、殺菌量にて投与する。しかしながら、該ペプチドは、細菌の外膜の透過性を上昇させることにより抗生物質活性を増加させる方法を提供し、ペプチドと抑制量未満の量（殺菌量未満の量）の抗生物質とを含む組み合わせの投与が可能となる。好ましくは、陽イオン性ペプチドと抗生物質とを、48時間以内の間隔で、好ましくは２〜８時間の間隔で、最も好ましくは同時に投与する。抗生物質の「殺菌量」とは、治療を受けている被験者において、細菌を殺す血中濃度を得るのに十分な量である。本発明で用いる「抗生物質」とは、その通常の定義に従えば、微生物により産生される化学物質であって、希薄溶液中で他の微生物の増殖を抑制したり、あるいはそれを殺す化学物質である。また、この用語には、当該分野で公知の合成抗生物質（例えば、類似体）も含まれる。
本発明のペプチドは、例えば、微生物またはウイルスの汚染に感受性の物質の防腐剤または滅菌剤として使用することができる。例えば、該ペプチドは、加工食品中の防腐剤として使用することができる（例えば、サルモネラ（Salmonella）、エルシニア（Yersinia）、シゲラ（Shigella）などの生物を抑制するため）。所望により、該ペプチドは、リゾチームなどの抗菌性食品添加物と組み合わせて使用することができる。また、本発明のペプチドは、例えば、シュードモナス（Pseudomonas）もしくはストレプトコッカス（Streptococcus）または致死性臭気を産生する微生物（例えば、ミクロコッカス（Micrococci））を抑制するための局所剤として使用することができる。当業者であれば、与えられた任意の適用のための本発明の陽イオン性ペプチドの最適量を容易に決定することができる。
また、本発明は、抗微生物陽イオン性ペプチド変異体の製造法を提供する。この方法は、抗微生物活性を有する陽イオン性ペプチド（すなわち、基準ペプチド）のアミノ酸配列を同定し、該基準ペプチドのペプチド変異体［その各変異体は、該基準ペプチドにおいて同定されたアミノ酸の少なくとも１つの置換（例えば、ランダムな置換）を含有する］をコードする発現ライブラリーを作製し、複数の宿主細胞中で該ライブラリーを発現させて複数のクローンを得、そして抗微生物活性を有するペプチド変異体を産生するクローンを単離することを含む。また、本発明は、この方法により製造される陽イオン性ペプチド変異体も含む。
この方法では、ランダム化されたヌクレオチド置換を、抗微生物活性を有する基準陽イオン性ペプチドをコードするＤＮＡ中に導入することができる。したがって、アミノ酸置換を有するペプチドを製造することができる。例えば、本明細書に記載する実施例では、抗微生物活性を有する変異体を製造するための公知の抗微生物性ペプチドのランダム化を例示する。
部位特異的突然変異誘発の任意の方法を用いて、陽イオン性ペプチド変異体を製造することができるが、好ましい方法では、各ヌクレオチドストック（例えば、A、T、CおよびG）が残りのヌクレオチドを低い割合で含有するヌクレオチドのセットを用いるＤＮＡ合成を利用する。例えば、アデノシンストックは、チミン、シトシンおよびグアニンのそれぞれの約0.5〜５％を含有する。「混入している」ヌクレオチド（すなわち、この例ではT、CおよびG）の割合が大きくなればなる程、ヌクレオチド置換および対応するアミノ酸置換の数（１ペプチド当たり）も大きくなると理解される。
本発明の陽イオン性ペプチドをコードするオリゴヌクレオチドの特異的領域をランダム化するために、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）法を用いることができる。PCR法は、当該分野でよく知られており、本明細書に開示する実施例においてさらに詳しく説明される。PCR反応産物をプールし、ゲル精製した後、発現ベクター中に連結してライブラリーを作製する。複数の宿主細胞（例えば、細菌株）においてライブラリーを発現させることにより、複数のクローンを得る。抗微生物活性を有する陽イオン性ペプチド変異体を産生するクローンは、通常のアッセイ（例えば、本明細書に記載されており当業者に公知のMICアッセイ）を用いることにより、容易に単離することができる。
変異体陽イオン性ペプチドをコードする核酸を増幅するために使用するPCRプライマーは、典型的には、該変異体陽イオン性ペプチドをコードする配列に隣接する発現ベクターの領域に相補的である。
基準抗微生物性陽イオン性ペプチドをコードする核酸を含有する限り、精製または未精製形態の任意の核酸サンプルを、DNA合成用の核酸鋳型として使用することができる。したがって、該方法は、一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡ（例えば、メッセンジャーＲＮＡ）を使用することができる。ＲＮＡを鋳型として使用する場合には、ＲＮＡ鋳型をＤＮＡに逆転写するための酵素および条件を用いる。所望により、各核酸の一方の鎖を含有するＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを使用することができる。所望により、核酸の混合物を使用することができる。あるいは、本明細書に記載のとおりに前増幅反応で産生された核酸を、同じまたは異なるプライマーと共に使用することができる。増幅すべき核酸が精製形態で存在していることは必ずしも必要でなく、それが、複合混合物の少量の画分を構成していてもよい。
基準タンパク質をコードする核酸が二本鎖である場合は、核酸鋳型を得るために、核酸の鎖を分離することが必要である。この鎖の分離は、当該分野で公知の種々の変性条件（例えば、物理的、化学的または酵素的手段）のいずれかを用いて行なうことができる。核酸鎖を分離する物理的方法の一例としては、核酸を約80〜105℃まで１〜10分間加熱し、ついで急冷することが挙げられる。また、別法として、鎖の分離は、ヘリカーゼとして公知の酵素クラスからの酵素、またはヘリカーゼ活性を有する酵素RecAにより誘導することもできる。ヘリカーゼまたはRecAを用いる核酸の鎖分離に適した反応条件は、当該分野で公知である（Kuhn Hoffmann-Berling CSH-Quantitative Biology, 43: 63, 1978およびRadding, Ann. Rev. Genetics,16: 405-437, 1982）。
増幅すべき配列を含有する核酸が一本鎖の場合は、１つまたは２つのオリゴヌクレオチドプライマーを使用することにより、その相補体を合成することができる。単一のプライマーを用いる場合には、重合剤および４つの一般的なヌクレオチド三リン酸の存在下で、プライマー伸長産物を合成することができる。
核酸の相補鎖を分離する場合には、該核酸がもともと二本鎖であったか一本鎖であったかにかかわらず、その分離された鎖を、追加的な核酸鎖を合成するための鋳型として使用することができる。典型的には、ＤＮＡ合成は、緩衝化水溶液中、好ましくはpH７〜９（最も好ましくは約８）で行なう。好ましくは、その２つのオリゴヌクレオチドプライマーのモル過剰（ゲノム核酸の場合には、プライマー：鋳型が約108：１）を、分離された鋳型鎖を含有する緩衝液に加える。実際には、増幅すべき配列が複雑な長鎖の核酸鎖の混合物中に含有されている場合には、加えるプライマーの量は、一般には、相補鎖（鋳型）の量を上回るモル過剰となるであろう。
典型的には、適量のデオキシリボヌクレオチド三リン酸dATP、dCTP、dGTPおよびdTTPを、プライマーとは別にまたはそれと一緒に合成混合物に加え、得られた溶液を、約90〜100℃まで約１〜10分間、好ましくは１〜４分間加熱する。所望により、一般的なヌクレオチドの代わりにまたはそれに加えて、ヌクレオチド類似体を使用することができる。この加熱時間の後、該溶液を、プライマーハイブリダイゼーションに最適な温度（約42℃）まで冷却する。その冷却混合物に、プライマー伸長反応を行なうための適当な剤（本発明では、「重合剤」と称する）を加え、当該分野で公知の条件下で該合成反応を進行させる。また、重合剤（例えば、耐熱性ポリメラーゼ）を、残りの試薬と一緒に加えてもよい。この合成（または増幅）反応は、重合剤が機能する任意の温度で行なうことができる。
重合剤は、プライマー伸長産物を合成するよう機能する任意の化合物（例えば、酵素）または系であってもよい。この目的に適した酵素としては、例えば、大腸菌（E. coli）ＤＮＡポリメラーゼＩ、大腸菌（E. coli）ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片、T4ＤＮＡポリメラーゼ、ポリメラーゼ突然変異タンパク質、逆転写酵素、および他の酵素、特に耐熱性ポリメラーゼなどが挙げられる。ついで、ＤＮＡ合成から生じる二本鎖分子を変性させ、得られた一本鎖核酸上で前記合成工程を反復することができる。所望により、追加的な重合剤、ヌクレオチドおよびプライマーを加えることができる。所望により、変性およびＤＮＡ合成工程を繰り返してもよい（通常のPCR法の場合と同様）。
本発明の核酸を、溶液中で又は固体支持体に結合させた後、当該分野で公知の任意の方法（例えば、PCR、オリゴマー制限（Saikiら，Bio/Technology, 3: 1008-1012, 1985）、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ASO）プローブ分析（Connerら，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 278, 1983）、オリゴヌクレオチド連結アッセイ（OLAs）（Landegrenら，Science,241: 1077, 1988）、蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）など）により、評価、検出、クローニング、配列決定などに付すことができる。
本発明では、陽イオン性ペプチドまたはペプチド変異体をコードする核酸を、組換え「発現ベクター」中に挿入することができる。「発現ベクター」なる語は、陽イオン性ペプチドまたは変異体をコードする核酸の挿入または取込みにより操作することができる当該分野で公知のプラスミド、ウイルスまたは他のベクターを意味する。典型的には、発現ベクターは、挿入された遺伝子配列の転写を指令するためのプロモーターを含有するプラスミドである。
所望により、発現ベクターは、典型的には、該ペプチド変異体のアミノ末端を有する融合体として産生される「担体ペプチド」をコードすることができる。好ましくは、担体ペプチドは、該陽イオン性ペプチドが有する正電荷が抑えられ、生じる融合ペプチドが中性または負の正味の電荷を有するのに十分な程度に陰イオン性である。該陰イオン性担体ペプチドは、配列上、天然に存在するタンパク質に対応していてもよいし、あるいは、設計上、完全に人工的であってもよい。機能的には、該担体ペプチドは、該陰イオン性ペプチドの安定化を助け、プロテアーゼからそれを保護するかもしれないが、該担体ペプチドについて、そのような目的を達成することが示されている必要はない。同様に、該担体ペプチドは、融合タンパク質の送達を促進するかもしれない。使用することができる担体ペプチドとしては、例えば、陰イオン性のプレプロペプチド、陰イオン性の外膜ペプチドなどが挙げられる。好ましい担体ペプチドとしては、グルタチオン−S−トランスフェラーゼ（GST）（Smithら，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83: 8703, 1986）、スタヒロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）のプロテインＡ（Nilssonら，EMBO, 4: 1075, 1985; pRIT5（Pharmacia））、プロテインＡの２つの合成IgG-結合ドメイン（ZZ）（Lowenadlerら，Gene, 58: 87, 1987）、シュードモナス・エルジノーサ（Pseudomonas aeruginosa）の外膜プロテインＦ（Ducheneら，J. Bacteriol, 170: 155, 1988）などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。本発明は、担体としてこれらのペプチドを使用することに限定されるものではなく、他の適当な担体ペプチドが当業者に公知である。あるいは、担体ペプチドを完全に省略することができる。
タンパク質の精製のための当該分野で公知の種々の方法のいずれかを用いて、本発明のペプチドを単離することができる。例えば、分取クロマトグラフィー分離および免疫学的分離（例えば、モノクローナルまたはポリクローナル抗体を用いるもの）を用いることができる。担体ペプチドは、本発明のペプチドを含む融合タンパク質の単離を促進することができる。例えば、グルタチオン−S−トランスフェラーゼ（GST）は、グルタチオンアガロースアフィニティーカラムによる精製を可能にする。スタヒロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）由来のプロテインＡまたはZZドメインを担体タンパク質として使用する場合、精製は、IgG−セファロースアフィニティーカラムを用いて一工程で行なうことができる。Ｐ．エルジノーサ（P. aeruginosa）外膜プロテインＦのＮ末端側の半分であるpOprF−ペプチドは、外膜調製物中の主要なタンパク質種であるため、容易に精製することができる。所望により、該融合ペプチドの陽イオン性ペプチドと特異的に反応しうる（例えば、特異的に結合する）試薬を使用することにより、該融合タンパク質を単離することができる。例えば、陽イオン性ペプチドに特異的に結合するモノクローナルまたはポリクローナル抗体を、通常の精製方法で使用することができる。そのような抗体を製造するための方法は、当該分野でよく知られている。
本発明を実施する場合には、発現ベクター中に「スペーサーＤＮＡ配列」を含ませるのが有利な場合もある。本発明で用いる「スペーサーＤＮＡ配列」とは、担体ペプチドをコードする配列と陽イオン性ペプチドをコードする配列との間に位置する任意のコード配列を意味する。特定の理論に拘泥されるものではないが、スペーサーＤＮＡ配列は、翻訳されると、陰イオン性担体ペプチドの負に荷電した残基と本発明の陽イオン性ペプチドの正に荷電した残基との相互作用を可能にし、それにより正の電荷の効果を抑制する「ヒンジ様」領域を産生しうると考えられる。
所望により、スペーサーＤＮＡ配列は、融合ペプチドから担体ペプチドを切断するためのタンパク質認識部位をコードすることができる。そのようなスペーサーＤＮＡ配列としては、例えば、プロテアーゼ切断配列（例えば、Xa因子プロテアーゼについてのもの）、メチオニン、トリプトファンおよびグルタミン酸のコドン配列、プレプロデフェンシン配列などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。Xa因子は、Xa因子プロテアーゼ切断配列におけるタンパク質分解的な切断に使用され、一方、臭化シアン処理による化学切断は、メチオニンまたは関連コドンにおいてペプチドを遊離させる。さらに、融合産物は、トリプトファン（o−ヨードソ安息香酸により切断可能）またはグルタミン酸（スタフィロコッカス（Staphylococcus）プロテアーゼにより切断可能）のコドンを挿入することにより切断することができる。そのようなスペーサーＤＮＡ配列の挿入は、機能的な陽イオン性ペプチドの製造の必要要件ではないが、そのような配列は、融合ペプチドの安定性を増強しうる。プレプロデフェンシン配列は負に荷電している。したがって、負に荷電したペプチドをコードする他のＤＮＡ配列も、融合ペプチドを安定化するためのスペーサーＤＮＡ配列として使用することができると本発明において予想される。
以下の実施例は、本発明を例示するものであり、本発明を限定するものではない。それらの実施例は使用しうる典型例であり、それらの代わりに、当業者に公知の他の方法を用いてもよい。
実施例
実施例Ｉ：陽イオン性ペプチドの合成
本発明の陽イオン性ペプチドは、タンパク質合成の通常のプロトコール（Merrifield, J. Am. Chem. Soc.,85: 2149, 1962; StewartおよびYoung, Solid Phase Peptide Synthesis, Freeman, San Francisco, 1969, pp 27-62）に従い合成することができる。一般に、得られるペプチドは、実質的に純粋（すなわち、少なくとも70％純粋）である。典型的には、得られるペプチドは、少なくとも80％純粋で、より典型的には、少なくとも99％純粋である。例えば、CP-11およびCP-13と称される陽イオン性ペプチド（cationic peptide）は、標準的なタンパク質化学法により合成したところ、少なくとも99％純粋であった。以下に記載する実施例では、インドリシジン（当該分野で公知の抗微生物剤）を対照として使用した。また、インドリシジンは、通常の方法により合成したところ、少なくとも99％純粋であった。ペプチドCP-12は約80％純粋であったが、それは十中八九、その配列が、より多数の正に荷電した残基をトリプトファンの付近に含有していたからである。ペプチドCP-IAおよびCP-AAは、f-moc化学を用いて合成した。ペプチドCP-11およびインドリシジンに対しては、アミノ末端修飾（それぞれ、Ｄ体のＮ末端アミノ酸で合成）を行ない、それによりCP-11Dおよびインドリシジン-Dを得た。さらに、CP-11、CP-11D、インドリシジンおよびインドリシジン-Dのそれぞれを、Ｃ末端でメチルエステル化して、それぞれ、CP-11、CP-11DC、インドリシジン-Cおよびインドリシジン-DCを得た。また、CP-11がアミド化されたＣ末端を含有するよう合成して、CP-11Ｎを得た。Ｎ末端アミノ酸、メチルエステル化されたＣ末端、またはアミド化されたＣ末端を有するペプチドの製造法は、当該分野でよく知られている（StewartおよびYoung,前掲; Kadaba, Synthesis, pp 628-631, 1992）。インドリシジン、CP-11、CP-12およびCP-13の一次アミノ酸配列を、表１に示す。比較のために、有意な抗微生物活性を欠く２つのペプチド（CP-IAおよびCP-AA）も合成した。CP-IAは、抗微生物剤としての抗生物質と相乗的に作用すると予想される。
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実施例II：円二色性分析
ペプチド構造の分析とペプチドの機能（例えば、抗微生物活性）とを組み合わせることにより、本発明者らは、本発明の抗微生物性ペプチドを定義する式を案出した（以下を参照されたし）。当業者であれば、本発明者らの式を用いて、抗微生物性ペプチド（例えば、本明細書中に特定されているペプチド）およびそれらの式に含まれるが本明細書中に特定されていないペプチドを容易に製造することができる。
インドリシジン（対照）およびCP-11の構造解析は、通常の円二色性（CD）分析およびJ-720分光施光計（Jasco,日本）を用いて行なった。CDのための適当な方法は、既に記載されている（HaschmeyerおよびHaschmeyer, Proteins, A Guide to Study by Physical and Chemical Methods, Wiley-Interscience, pp 237-253; 1973を参照されたし）。この場合、CDスペクトルは、10mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.0）中、および1−パルミトイル−2−オレオイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン（POPC）／1−パルミトイル−2−オレオイル−sn−グリセロ−3−ホスホグリセロール（POPG）（7：3）リポソームの存在下または不在下で測定した。標準的な方法（例えば、Mayerら，Biochim. Biophys. Acta 817（1985）193-196を参照されたし）により、多重層リポソームを調製し、押出し装置（Lipex Biomembranes, Vancouver, Canada）を用いて押出して、一枚膜小胞を得た。ペプチドおよびリポソームの濃度は、それぞれ50μMおよび２mMであった。
リポソームの不存在下では、インドリシジンおよびCP-11は、不規則構造に特有のCDスペクトルを示した（図１）。これに対して、リポソームの存在下では（この場合、細胞膜との相互作用に際して、ペプチドの構造を模擬する）、インドリシジンのスペクトルは、ポリ−L−プロリンII伸長らせん構造により生じるスペクトルに特有のものであった。そのスペクトルは、202nmで最小となり、226nmで最大となり、235nmでより低度に最小となることにより特徴付けられた。このスペクトルは、負に荷電したリポソームの存在下でのみ誘導された（すなわち、そのような構造は、POPCリポソームのみの存在下では誘導されなかった）。インドリシジンのプロリン含量が低いためにそのような構造を妨げると予想されていたため、この観察結果は予想外であった。インドリシジンがポリ−L−プロリンIIらせんを形成したという本発明者らの知見は、陽イオン性ペプチドの設計のための式の案出において決定的に重要であった。
円二色性を用いると、CP-11は図１のスペクトルを与えた。CP-11のスペクトルは、インドリシジンと同じ波長で最大値および最小値を有していたが、202および235での最小値が減少し、226での最大値の大きさが増加した点でインドリシジンとは異なっていた。有意な抗微生物活性を欠く２つのペプチド（CP-IAおよびCP-AA）（表１）も、円二色性により分析した。非抗微生物性ペプチド（CP-IAおよびCP-AA）の構造解析により、あるモチーフが、抗微生物性ペプチドの脂質誘導構造に有意に寄与していることが示された。CP-IAおよびCP-AAは共に、リポソームの不存在下、および抗微生物性ペプチド（インドリシジンおよびCP-11）に対する構造を誘導する能力を有するリポソームの存在下の両方において、依然として不規則なままであった。ペプチドIAは、インドリシジンのTrp9、Pro10およびTrp11の代わりにPhe9およびVal10を含有する点でインドリシジンとは異なる。CP-IAおよびCP-AAは共に、インドリシジンより有意に低い抗微生物活性を有する（以下を参照されたし）。この構造解析に基づき、ポリ−L−プロリンIIらせん構造が抗微生物活性に寄与していると予想される。
実施例III：抗微生物性ペプチドのコンピューターに基づくモデリング
InsightII（Biosym. Inc., San Diego, CA）分子モデリングソフトウェアを使用することにより、ポリ−L−プロリンIIらせんに関する座標を用いてインドリシジンをモデル化した。得られた構造を図2Aに示す。これらのデータは、この形態のペプチドが、約40Åの長さであることを示す。また、Trp6、Trp8、Trp9およびTrp11はすべて、同じ平面内に並んでおり（図2B）、これとは対照的に、Trp4は、相対する平面内に並んでいる。CP-11と、ポリ−L−プロリンIIらせんに関する座標とを用いた場合、コンピューターモデリングは、CP-11のトリプトファンがすべて、単一平面内に並んでいることを示した。CP-11は、インドリシジンより強力な抗微生物性ペプチドであるため（以下を参照されたし）、この構造解析と機能分析とから、CP-11のような両親媒性構造の形成が望ましいことが示唆される。
実施例IV：抗微生物活性のアッセイ
本発明のペプチドの特徴づけにおいては、ペプチドの抗微生物活性を測定するための当該分野で公知の任意の方法を用いることができる。これらの実施例では、通常の方法を用いて、液体培地中のペプチドの最小阻止濃度（MIC）を測定した（Amsterdam. Antibiotics in Laboratory Medicine, WilliamsおよびWilkins, Baltimore（1991）72-78）。簡単に言えば、被検生物（以下に記載）の一晩の培養物を希釈して、約104〜105個の該生物を含有する接種物を得た。その接種物のサイズは、該液体培養物と同時に接種された該生物数をプレート上で計数することにより確認した。
ペプチドの濃度は、ポリミキシンBを標準として用いるジニトロフェニル化アッセイにより、遊離アミノ基に関してアッセイすることにより測定した。96ウェルマイクロタイタープレート中、100μｌの容量でペプチドの倍加希釈を行ない（32μg/ml〜0.25μg/ml）、ついで、すべてのウェルに、被検生物の希釈培養物を接種した。37℃24時間インキュベートした後、アッセイの読み取りを行なった。MIC値は、被検生物の増殖が50％抑制されたペプチドの濃度である。前記プレートを37℃で24時間インキュベートした後、培養接種物中の細胞数を平板菌数から算出した。このアッセイにおいて細胞培養および希釈のために使用した培地は、ルリアブロス（LB）であった。各ペプチドを、各生物に対して３回試験した。以下に記載のMIC値は、その３回の実験の平均値である。MICアッセイで用いた被検生物を表２に列挙する。
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該ペプチドのそれぞれについてのMIC値を表３に示す。これらのデータから、グラム陰性菌および酵母カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）に対する抗微生物活性は、インドリシジンより陽イオン性ペプチドCP-11の方が大きかったことが示された。同様に、グラム陰性菌に対する抗微生物活性は、インドリシジンよりCP-13の方が大きいことが示された。トリプトファンの代わりにフェニルアラニンを有する以外はCP-13と同じ配列を有するペプチドであるCP-16は、Ｓ．アウレウス（S. aureus）に対する活性においてこのペプチドと同等であったが、このことは、本発明のペプチドが必ずしもトリプトファンに富む必要がないことを示すものである。さらに、CP-24の最初の２つの残基を疎水性アミノ酸であるフェニルアラニンで置換することにより、Ｓ．アウレウス（S. aureus）に対する活性においてインドリシジンに勝り、またCP-13より優れたペプチドが得られた。
また、インドリシジン、CP-11およびCP-13の種々の誘導体のMIC値を測定した。前記のとおり、インドリシジンおよびCP-11のＣ末端を、メチルエステルに化学的に変換して、インドリシジン-CおよびCP-11Cを得た。CP-11のアミド化誘導体であるCP-11Nは、f-moc化学により製造した。インドリシジンの場合、メチルエステル化により、Ｐ．エルジノーサ（P. aeruginosa）とＣ．アルビカンス（C. albicans）とを除くすべての生物に対するMICが減少した。CP-11の場合、メチルエステル化によりＳ．アウレウス（S. aureus）SAP0017とＣ．アルビカンス（C. albicans）とを除くすべての生物に対するMIC値が減少した。CP-11Cは、グラム陰性生物およびＣ．アルビカンス（C. albicans）に対して、インドリシジンより８倍低いMIC値を与えた。CP-11およびCP-11Cは、Ｐ．エルジノーサ（P. aeruginosa）に対する抗微生物活性を有するため、特に貴重である。これらの結果は、CP-11およびその誘導体の正電荷および疎水性残基の配向の増加に起因するものである。最も強力な抗微生物活性を有するペプチドであるCP-11Cは、被検生物のすべてに対して１〜８μg/mlのMIC値を示した。
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また、インドリシジン、インドリシジンCおよびCP-11を、N末端アミノ酸がD体となるよう合成して、それぞれ、インドリシジン-D、インドリシジン-DCおよびCP-11Cを得た。CP-11のN末端修飾（CP-11Dを与える）により、該ペプチドのMIC値が減少した。CP-11DCのMICは、CP-11DのMICに匹敵した。インドリシジン-Dは、グラム陰性およびグラム陽性の被検生物（Ｐ．エルジノーサ（P. aeruginosa）を除く）に対して、インドリシジンより低い１〜２の希釈因子のMIC値を示した。本実施例では、インドリシジン-DCは、インドリシジン-Cとほぼ同等の活性を有していた。
実施例Ｖ：CP-11による殺微生物
CP-11について、大腸菌（E. coli）、Ｐ．エルジノーサ（P. aeruginosa）、Ｓ．アウレウス（S. aureus）およびＣ．アルビカンス（C. albicans）に対する殺菌曲線（killing curve）を決定した（図３）。このアッセイは、10mM HEPES緩衝液中で行ない、生菌数を用いて生存細胞数を決定した。すべての場合に、CP-11（32μg/ml）は、被検生物を急速に殺した。ペプチドの添加して30分以内に、グラム陰性菌、グラム陽性菌および酵母の生菌数は、少なくとも３ログ（log）のオーダーで減少した。これらのデータは、CP-11が強力な抗微生物性ペプチドであることを示す。
実施例VI：相乗作用の研究
前記のMICアッセイの改変法において、抗生物質または他のペプチドの存在下で該ペプチドの抗微生物効果を測定した。このアッセイは、CP-11およびCP-13が、ポリミキシンB、セフェピム（cefepime）、セフタジジムと相乗作用することを示した。また、CP-11は、ノボビオシンおよびセクロピン／メリチン（CEME）ハイブリッドペプチド（Piers,前掲）と相乗作用した。これらの実験は交差力価測定法（この方法では、相乗作用性ペプチドを96ウェルのマイクロタイタートレー中で一方向に２倍段階で希釈し、抗生物質またはペプチドを該ペプチドに対して直角に希釈する）により行なった。１ウェル当たり104〜105個の細菌を加え、37℃で一晩インキュベートした後、当該分野で公知の方法（LeMan, Antibiotics in Laboratory Medicine,第３版，WilliamsおよびWikins, pp 180-197, 1986）により、分別阻止濃度（FIC）を測定した。0.5のFICは、相乗作用を示す。
実施例VIII：精製されたリポ多糖に対する抗微生物性ペプチドの結合性
リポ多糖に結合するペプチドは、抗内毒素物質として機能する可能性があると考えられる。Ｐ．エルジノーサ（P. aeruginosa）H103リポ多糖（LPS）に対する種々のCPペプチドの結合性を、Mooreら（AAC, 26（1986）496-500）により記載されているダンシルポリミキシンB（DPX）置換アッセイにおいて測定した。簡単に言えば、DPXは、LPSに結合すると、増強された蛍光を示す。DPXのサンプルでLPSを滴定することにより、蛍光が最大に達するまで、精製されたLPSをDPXで飽和させた。蛍光は、Perkin-Elmer 650-10S蛍光分光光度計で測定し、DPXの置換は、抗微生物性ペプチドの添加に際しての蛍光の減少として測定した。
表４は、依然としてLPSに結合しているDPX蛍光の割合を、ペプチド濃度の関数として示す。示されている各ペプチドのI50値は、最大DPXの50％がLPSから追い出された際の濃度である。また、示されているImax値は、LPSの最大の置換を表し、すべての結合DPXが置換された場合を100％とした場合の割合（％）として表されている。
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前記で示されるとおり、CP-11Cは、Ｐ．エルジノーサ（P. aeruginosa）LPSからDPXを追い出すには、インドリシジンより有効であった。CP-11およびCP-11Cの比較的低いI50濃度は、Ｐ．エルジノーサ（P. aeruginosa）H103 LPSに対するこれらの化合物の比較的高い親和性を反映するものである。これらの実験におけるMg2+イオンのI50濃度は、約620μMであった。このイオンは、LPSに通常結合する天然の二価陽イオンである。したがって、被検ペプチドはすべて、そのようなイオンと置換することにより表面LPSに結合する能力を有していた。
実施例VIII：膜透過性の上昇
合成ペプチドによる大腸菌（E. coli）UB1005の外膜の透過性上昇の度合を、１−N−フェニルナフチルアミン（NPN）取込みアッセイ（Lohら，AAC, 26（1984）2311-2316）において測定した。簡単に言えば、NPNは、小さな（200kD）疎水性分子であり、細菌外膜中に分配されると、蛍光の増加を示す。したがって、蛍光分光光度計を用いることにより、ペプチドの存在下で蛍光が増加すれば、該ペプチドが細菌外膜の透過性を上昇させうることが示されたことになる。図４に示すとおり、蛍光を、ペプチドの濃度の関数として測定した。本実施例は、CP-11Cによる大腸菌（E. coli）のNPN透過性の上昇が、CP-11によるものより大きかったことを示す。同様に、インドリシジン-Cによる透過性の上昇は、インドリシジンによるものより大きかった。さらに、CP-11は、大腸菌（E. coli）の外膜の透過性を上昇させる能力が、インドリシジンより実質的に優れていた。
大腸菌（E. coli）内膜の透過性の上昇は、構成的な細胞質β−ガラクトシダーゼ活性を有するラクトース透過酵素欠損株である大腸菌（E. coli）ML-35を用いて測定した（Lehrerら，J. Clin. Invest. 84（1989）553-561）。その内膜の透過性の上昇によるβ−ガラクトシダーゼ活性の「アンマスキング」は、基質ONPG（o−ニトロフェニル−β−D−ガラクトシド）を用いて検出することができる。ONPGの加水分解の後、420nmでの分光光度測定を行なうことができる。図５は、CP-11が、インドリシジンの場合に必要とされた濃度より４倍低いペプチド濃度で、大腸菌（E. coli）の内膜の透過性を上昇させたことを示す。どちらのペプチドも、わずかに遅れてまたは直後に、膜透過性を上昇させた。これらのデータは、内膜がCP-11の推定上の一次標的となることだけでなく、該ペプチドがこの標的に迅速に到達することも示すものである。したがって、外膜の透過もまた、迅速な過程であるにちがいない。
実施例IX：平面状脂質二重層分析
これらの陽イオン性ペプチドが細菌の細胞膜の透過性を上昇させるメカニズムに対する洞察を得るために、平面状脂質二重層に対するペプチドインドリシジンの効果を、黒脂質二重層分析（BenzおよびHancock, Biochim. Biophys. Acta 646（1981）298-308）の標準的な方法により検討した。簡単に言えば、脂質二重層（1.5％（w/v）ホスファチジルコリンおよびホスホチジルセリン（n−デカン中、5：1）から作製）を、KH2PO4でpH7.0に調整した１M KClを含有するテフロンチャンバーを２つの隔室に分離する0.2mm2の穴を横断するよう形成した。塩橋（Metrohm）を介して接続したカロメル電極を各隔室に入れ、一方は電源に、もう一方はKeithleyマルチメーターに接続した。電圧の方向は、ペプチドの添加に関して同じ向きに示し、反対の負のポテンシャルをマイナスの符号で示した。単一減極（single depolarization）事象を検出するために、一方の電極を電流増幅器およびチャートレコーダーに接続した。
巨視的コンダクタンス実験により特徴付けられるインドリシジンの電流−電圧の特性を図６に示す。−70mV未満では、電圧の増加は、インドリシジンによる二重層の透過性の上昇により生じた電流に若干の影響を及ぼしたにすぎない。−70mVを超えると、電流が劇的に増加した。インドリシジンは−70mVを上回る膜貫通ポテンシャルを必要とするため、細胞膜に対する該ペプチドの作用は電圧依存的となる。電圧を−80mVから０mVへ減少させた場合、その減少は直線的であった（図６）。このことは、閾値ポテンシャルは、ペプチドを二重層中に引き入れるためだけに要求される可能性があり、一旦これが生じたなら、チャンネルは比較的安定なまま維持されることを示す。細菌の増殖は、中性pHで−140mVを上回る膜貫通ポテンシャルを有する。ポテンシャルを+70mVに逆転させ、その結果、活性が大きく減少したことにより、活性には70mVの負のポテンシャルが要求されることが確認された（図６）。
インドリシジンにより生じた膜電流の増加の少なくとも一部は、シングルチャンネルの形成によるものであった（図８）。シングルチャンネルコンダクタンスは、0.05〜0.15nSの範囲で変化した。しかしながら、約0.13nSのチャンネルが、何度も認められた。また、CP-11は、同様の次元のチャンネルを形成することが示された。
実施例Ｘ：抗微生物性ペプチドのin vivo効力
CP-11およびCP−11CNのin vivo効力を、免疫抑制マウスのＰ．エルジノーサ（P. aeruginosa）感染モデルで測定した（Cryzら，39:3（1983）1067-1071）。シクロホスファミドの一連の３回の腹腔内（IP）注射により、マウスを白血球減少症にした。０、２および４日目に、CD-1マウスにシクロホスファミドを、マウスの体重1g当たり150μg投与した。４日目に、100個のＰ．エルジノーサ（P. aeruginosa）M2細菌で該マウスを攻撃し、細菌の注射して30分後に、100μlのdH2O中の陽イオン性ペプチド（８mg/kg）を試験群に投与した。１つの実験（表６に要約）では、マウスは、細菌攻撃の17時間後に更に陽イオン性ペプチドの注射を受けた。これらの実験の結果を、表５および６に要約する。
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本実施例は、CP-11およびCP-11CNのそれぞれが、Ｐ．エルジノーサ（P. aeruginosa）による感染の致死的効果を抑制することを示した。さらに、これらのデータは、該抗微生物性ペプチドの複数回の用量が、生存を延長することを示す。
実施例XI：赤血球に対するペプチドの効果
本実施例は、CP-11、CP-11CおよびCP-13のヒト細胞に対する毒性が、インドリシジンの場合より低いことを示す。新たに集めたヒトの血液をヘパリンと混合し、遠心して、軟膜を除去した。得られた赤血球を、0.85％食塩水中で３回洗浄し、４℃で保存した。食塩水での該ペプチドの系列希釈を、丸底マイクロタイタープレート中、100μlの容量を用いて行なった。赤血球を、パック細胞容積の1/25まで食塩水で希釈し、50μlの赤血球を各ウェルに加えた。プレートを、37℃で振とうしながらインキュベートし、細胞の80％以上の赤血球溶解（すなわち、可視溶解）に要したペプチドの濃度を、４および24時間の時点で測定した（表７）。
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これらのデータは、インドリシジンは32μg/mlで赤血球に対し毒性を有するが、CP-11、CP-11CおよびCP-13の赤血球に対する毒性は、それより有意に低いことを示す。更なる実験により、Ｔリンパ球に対する毒性も、CP-11はインドリシジンより低いことが示された（データは示していない）。
実施例XII：追加的な抗微生物性ペプチドの製造
前記で行なったタンパク質の構造決定により、抗微生物性ペプチド（その多くは、抗微生物活性の増加および毒性の減少を示す）の合理的な設計が可能となった。種々の陽イオン性ペプチドの発現および精製については、既に記載されている（参考として本明細書に組込むHancockら，米国出願第08/575,052号およびGene, 134（1993）7-13）。以下に記載の種々の抗微生物性ペプチドを組換え的に発現させるために、それらの種々のペプチドをコードするＤＮＡの両鎖を表すオリゴヌクレオチドを、通常の方法によりApplied Biosystems 392 DNA/RNAシンセサイザー上で合成した。ＤＮＡ鎖のアニーリングの後、得られたＤＮＡ断片を、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphyloccus aereus）発現ベクターpRIT5中にクローニングした。種々のクローンを大腸菌（E. coli）DH5α中に形質転換した後、組換えプラスミドを精製し、配列決定し、ついでＳ．アエレウス（S. aereus）K147中にエレクトロポレーション（Bio Rad Gene Pulser Transfection Apparatus）した。この系内で９個のペプチドを発現させ、サルモネラ・ティフィムリウム（Salmonella typhimurium）14028Sに対する陽イオン性ペプチドの粗調製物の抗微生物MICを測定することにより（Piersら，前掲）、それらの相対的な抗微生物活性を測定した。これらの測定に基づく相対活性を表８に示す。
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プロテインＡ融合タンパク質として陽イオン性の微生物ペプチドを発現させ精製するのに用いた方法は、既に記載されている（Piersら，Gene, 134（1993）7-13）。ここでは、種々の抗微生物性ペプチドを発現するpRIT5を含有する細胞の培養上清を、通常のプロトコールに従いIgGセファロースカラムに通した。ついで、発現されたタンパク質を0.5M酢酸中で溶出して、比較的純粋なサンプルを得た。凍結乾燥後、１M臭化シアンを含有する70％ギ酸にサンプルを再懸濁した。光遮蔽チューブ中で、窒素下で消化を一晩行なった。無菌蒸留水中で10倍希釈することにより、該反応を停止し、サンプルを凍結乾燥した。該サンプルをBio-gel P100ゲルふるいカラムに通すことにより、ペプチドをさらに精製し、280nmのUV吸収および酸−尿素Pageにより画分を分析した。純粋なペプチドを含有する全画分をプールし、凍結乾燥した。該ペプチドを無菌蒸留水に再懸濁し、−80℃で保存した。
MICアッセイでは、ペプチドCP-3R、CP-pM2aおよびCP-pM2bは、インドリシジン-R（すなわち、組換えインドリシジン）と比べて、グラム陰性菌に対する活性が高かった。その他ペプチドは、インドリシジン-Rと比べて、同じかまたは低い活性を有していた。インドリシジン-RおよびCP-3Rを連続的に精製した。そのMICのデータを表９に要約する。CP-3Rは、大腸菌（E. coli）、Ｐ．エルジノーサ（P. aeruginosa）およびＳ．ティフィムリウム（S. typhimurium）に対する活性が増加していた。
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実施例XIII：ペプチドの設計
前記で要約した抗微生物陽イオン性ペプチドの構造および機能の分析に基づき、出願人らは、追加的な陽イオン性ペプチドを得るのに使用することができる式を案出した。以下に示す式（一文字アミノ酸コードを用いて示す；配列番号23〜26）の１つに含まれるアミノ酸配列を有するペプチドは、抗微生物活性を有すると予想される。
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（式中、
mは１〜５、
nは１または２、
oは２〜５、
rは０〜８、
uは０または１、
X1はイソロイシン、ロイシン、バリン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファンまたはメチオニン、
X2はトリプトファンまたはフェニルアラニン、
X3はアルギニンまたはリシン、
X4はトリプトファンまたはリシン、および
X5はフェニルアラニン、トリプトファン、アルギニン、リシンまたはプロリンである）。
前記の式に従い、出願人らは、抗微生物活性を有すると予想される一連の陽イオン性ペプチドを設計した。これらのペプチドを、表10に列挙する。この一覧表は、本発明の抗微生物性ペプチドを網羅しているわけではない。当業者であれば、前記の式に従い、追加的な抗微生物性の陽イオン性ペプチドを容易に合成することができると認識しうるであろう。所望により、そのようなペプチドの抗微生物活性は、通常のアッセイ（例えば、MICアッセイ）で測定することができる。出願人らは、抗微生物活性に必要な構造成分を同定しているため、式に含まれるペプチドの実質的にすべてが、抗微生物活性を有すると予想される。これらのペプチドは、検出可能なレベルの活性（例えば、MICアッセイにおいて）を有する限り、本明細書中で例示するペプチドと同等またはそれより優れた活性を有することは必ずしも必要でない。
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実施例XIV：ペプチド変異体をコードするライブラリーの合成および発現
ペプチド変異体のライブラリーを、発現ベクターpRIT5を用いてＳ．アウレウス（S. aureus）において作製した。インドリシジン変異体をコードするＤＮＡのコンビナトリアル・ライブラリーのＤＮＡ鎖を、Applied Biosystems Canada Incorporated（Ontario, Canada）392 DNA/RNAシンセサイザー上で合成した。これらのオリゴヌクレオチドを３つの断片で構築した。制限エンドヌクレアーゼ部位および停止配列を含有する3'末端である第１断片は、標準的なプロトコール（Applied Biosystems Canada Inc.）を用いて合成した。インドリシジンペプチド配列をコードする第２断片は、ヌクレオチドストック（残りの３つの各ヌクレオチドでドープしたもの）を用いて合成した。ドーピング濃度と突然変異率との関係は、McNeilおよびSmith（Mol. Cell. Biol., 5（1985）3545-3551）により記載されている式により定めた。また、第３断片も、標準的なプロトコール（Applied Biosystems Canada Inc.）に従い合成した。得られたオリゴヌクレオチドは、保存された3'および5'配列に隣接するランダムに突然変異したインドリシジン配列のプールを含有していた。ついで、オリゴヌクレオチドプールを、3'および5'配列とハイブリダイズするよう設計されたプライマーを用いるPCRにより二本鎖とした。PCR反応は、以下に示す条件およびパラメーターを用いて100μl中で行なった。
PCR反応パラメーター
94℃で１分、50℃で１分、72℃で１分。
サイクルを30回反復する。
PCR反応条件
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増幅産物を、ＤＮＡ断片の保存フランキング領域内に位置する制限エンドヌクレアーゼ部位で消化し、該産物を、Mermaid Glassfog（BIO 101, La Jolla, CAUS）ＤＮＡ精製キットを用いてアガロースゲル精製した。該ＤＮＡ断片をpRIT5中にクローニングした後、組換えプラスミドのランダムに突然変異したプールを、Ｓ．アウレウス（S. aureus）K147中にエレクトロポレーションし、該クローンを、ライブラリーとして−80℃で保存した。多数の組換えＳ．アウレウス（S. aureus）株のスクリーニングは、組換え株の75％がプロテインＡ／ペプチド融合産物を発現することを示した。ランダムに選択されたクローンの配列決定は、４〜６個のアミノ酸置換を与える４〜８個の塩基対の変化を示した（以下を参照されたし）。
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この方法を用いて、前もって決定された突然変異率を有するペプチドを発現する組換えペプチドライブラリーを作製することができる。
実施例XV：組換えペプチドライブラリーのスクリーニング
前記のとおり製造したペプチドのランダム変異体を発現するクローンにおける抗微生物活性の増加を検出するために、スクリーニングプロトコールを開発した。このプロトコールにより、多数の組換えクローンをスクリーニングすることが可能となる。
この方法では、100mlのLB高塩ブロス（10μg/mlのクロラムフェニコールを含有）に、候補クローンの一晩培養物１mlを接種した。該培養物を、180rpmで振とうしながら37℃でOD600まで増殖させた。2,500rpmで10分間遠心した後、上清を取り出し、１mlのIgGセファロースカラム（Pharmacia）に通した。該融合タンパク質は、0.5M酢酸（pH3.0）でカラムから溶出した。２番目の１mlのアリコートは、実質的にすべての融合タンパク質を含有していた。
ついで、１mlのアリコートを凍結乾燥し、１M臭化シアンを含有する75μlの70％ギ酸に再懸濁した。該反応を、1.5mlのねじ蓋付き管中、窒素下で光遮断し、一晩回転させた。無菌蒸留水中で10倍希釈した後、該反応を再び凍結乾燥し、200μl無菌蒸留水中で洗浄し、再凍結乾燥し、100μl無塩LBブロスに再懸濁した。
該ペプチド調製物を、96ウェルマイクロタイタープレートを用いる修飾ブロスMICアッセイで使用した。LB無塩ブロスの100μlのアリコートを各ウェルに入れた。100μlのペプチド調製物を第１のウェルに加え、倍加希釈系列を８ウェルで行なった。102〜103個のサルモネラ・ティフィムリウム（Salmonella typhimurium）14028S（デフェンシンに超感受性の突然変異体）の接種物を各ウェルに加え、該プレートを37℃で一晩インキュベートした。
24時間後に、該マイクロタイタープレートを調べた。pRITを含有しインドリシジンインサートを欠くＳ．アウレウス（S. aureus）K418株（Piersら，前掲）からの抽出物は、抗微生物活性を全く示さなかった。しかしながら、インドリシジン-RおよびCP-R3を発現する株は、それぞれ、第１ならびに第１および第２のウェルにおいて、被検生物の増殖を防止した。したがって、0.5より高い希釈率で殺す能力を有するペプチドは、基準タンパク質より高い抗微生物活性を有すると同定することができる。また、この方法を用いて、基準タンパク質と同等またはそれより低い抗微生物活性を有するペプチドを同定することができる。
実施例XVI：RAW264.7マクロファージ細胞におけるTNFの誘導
内毒素がヒトに対してその作用を発現する生理的メカニズムは、炎症性サイトカイン、特に腫瘍壊死因子（TNF）の放出を含む。CP-11がLPSに結合することによりTNFの誘導を阻止する能力に関して、CP-11を試験した。これは、マウスRAW264.7マクロファージ細胞系においてin vitroで、そして、マウス内毒素ショックモデルおよびＰ．エルジノーサ（P. aeruginosa）感染モデルにおいて死を逆転させる能力に関してin vivoで試験した。
マクロファージにおけるLPS誘導TNFに対するCP-11およびインドリシジンの効果を、LPSに応答してTNFを産生するマウスRAW264.7マクロファージ細胞系を用いて検討した。162cm2の細胞培養フラスコ中に106個の細胞を播き、それを５％CO2中37℃で１週間インキュベートすることにより、該細胞系を増殖させた。ついで、RAW細胞培地［HEPES緩衝液450ml（2.4mM）；L−グルタミン３ml（400mM）；Pen/Strep３ml（104U/mlのPen、１mg/mlのstrep）；および10％熱不活化ウシ胎児血清（FBS）50mlを含有するDulbecco's Modified Eagle Medium］を該細胞培養フラスコから除いた。溶液の10mlのアリコートを各フラスコに加え、37℃で10分間インキュベートした。該細胞をフラスコから取り出し、RAW細胞培地中で希釈し、６分間遠心した。細胞ペレットを５mlの培地／フラスコに再懸濁した。100μlの細胞懸濁液を取り出し、400μlのトリパンブルーに加え、血球計数器を用いて該細胞を計数した。該細胞懸濁液を１×106細胞/mlにまで希釈し、24ウェルプレートの１ウェル当たり１mlの懸濁液を加えた。アッセイで使用するために、24ウェルプレートを５％CO2中37℃で一晩インキュベートした。
一晩のインキュベーションの後、該培地を全ウェルから吸引した。LPSを100ng/100μlで加えた。ペプチドを、所望の濃度/100μlで、指定したウェルに加えた。RAW細胞培地を全ウェルに加えて、１mlの最終容量とした。ついで該プレートを５％CO2中37℃で６時間インキュベートした。ついで上清をウェルから取り出し、４℃で一晩保存した。
また、トランスウェルフィルターシステム（transwell filter system）中で全細菌を用いて、実験を行なった。細菌により放出される産物（例えば、LPS）を細胞と未だ相互作用させるマクロファージ細胞と細菌との直接的な接触を妨げる0.22μmのフィルターインサート中で、生存可能なボルト大腸菌（Bort E. coli）およびＰ．エルジノーサ（P. aeruginosa）をインキュベートした。一晩培養物を、OD600が0.3（約108細胞/ml）になるまでリン酸緩衝溶液中で希釈した。該細菌をさらに１：100に希釈し、計数した。
前記の組織培養実験からの上清を、細胞毒性L929アッセイで使用した。RAW細胞上清を、96ウェルプレート中、３倍希釈系列で希釈した。TNF培地の50μlのアリコートを、第１列のウェルを除く全プレートの全ウェルに加えた。10μlのマウスTNF標準（20ng/ml）および90μlのTNF培地を、該プレートに２回反復して加え、該プレートの第２列から最後の列へ1：2で希釈していった。
TNF感受性のL929マウス繊維芽細胞を、106細胞/162cm2細胞培養フラスコで播き、１週間増殖させた。L929細胞を、10mlのトリプシンEDTA/フラスコでフラスコから取り出し、３〜５分間インキュベートした。細胞懸濁液を希釈し、ついで６分間遠心した。該ペレットを５mlの新鮮なL929培地/フラスコに再懸濁し、計数した（RAW細胞の場合と同じ）。細胞懸濁液を、106細胞/mlまで希釈した。100μを用いて、96ウェルプレートの各ウェルに該上清を播いた（L929増殖培地は、FBSの代わりに50mlの10％熱不活化ウマ血清を使用した以外は、RAW細胞培地と同じであった。TNFアッセイ培地は、４μg/mlアクチノマイシンD以外はRAW細胞培地と同じであった）。該プレートを、37℃、５％CO2で２日間インキュベートした。ついで、該プレートを、690nmの基準フィルターを有するELISAプレートリーダー中、570nmで読み取った。１単位のTNF活性は、L929細胞の50％を殺すのに必要な量と定義した。したがって、単位/mlで表したTNFレベルは、L929細胞を50％殺すのにつながる希釈度の逆数である。ELISA＋プログラムを用いてコンピュータ計測を行なった。
図９は、CP-11またはインドリシジンペプチドのいずれか（それらの量は０、２、５、10、20または50μgと次第に増加させる）と100ngの大腸菌（E. coli）0111:B4 LPSとで６時間処理した後でマクロファージ細胞により産生されたTNFのレベル（U/ml）を示す。そのデータは、両方のペプチドが、マクロファージにおいてLPSにより誘導されるレベルを効率的に、それぞれ70％および71％減少させたことを示す。Ｐ．エルジノーサ（P. aeruginosa）LPSとインドリシジンまたはCP-11との６時間のインキュベーションの結果を、図10に示す。50μgのCP-11およびインドリシジンは、TNF産生を、それぞれ51％および67％減少させた。50μgのインドリシジンおよびPP-11は、100ngボルト大腸菌（Bort E.coli）LPSと共にインキュベートされたマクロファージによるTNF産生を、それぞれ68％および74％減少させた。
もとの無傷の細菌を用いる実験では、該ペプチドは、Ｐ．エルジノーサ（P. aeruginosa）および大腸菌（E.coli）の拡散性産物によるTNFの誘導を有効に減少させる能力を有していた。CP-11およびインドリシジンは、Ｐ．エルジノーサ（P. aeruginosa）により放出されたLPSによるTNFの誘導を、それぞれ97％および91％減少させた（図11）。どちらのペプチドも、ボルト大腸菌（Bort E.coli）によるTNFの誘導を、99％減少させた（図12）。
インドリシジンが、マクロファージ細胞系に直接的に作用しないでLPSに作用することを確認するために、20μgのインドリシジンをRAW細胞に加え、60分間インキュベートし、ついで培地を吸引し、該細胞をHBSS（ハンクス緩衝塩溶液）で３回洗浄した。洗浄されたRAW細胞に100ngのLPSを加えると、高レベルのTNF誘導が生じたが（１ml当たり4168単位のTNF）、このことは、LPSの添加に応答してTNFを誘導するRAW細胞の能力を、インドリシジンが永久には抑制しなかったことを示唆するものである。これに対して、インドリシジンを含有する吸引された培地は、100ngの大腸菌ボルト（E. coli Bort）LPSに応答してTNFを誘導する新鮮なRAW細胞の能力を74％抑制することができた。トリパンブルー排除により評価したところ、50μgまでのCP-11またはインドリシジンは、RAW細胞の生存能力の見掛け上の減少を引き起こさなかった。
実施例XVII：マウス内毒素ショックモデル
LPSにより誘導される内毒素血症を防御するインドリシジンおよび変異体の能力を、in vivoで評価した。Galanos（Galanos, C., M.A., FreudenbergおよびW. Reutter, 1979, Galactosamine sensitization to the lethal effects of endotoxin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA76: 5939）のモデルに従いマウス（８〜10週齢）をLPSに感受性にするために、20mgのD−ガラクトサミン（Dgal）を腹腔内（IP）に注射し、ついで200μgのペプチド（100μl中）を注射した。その直後に、100μl中のLPS（10μg）を注射した。それらのマウスを、注射後24時間観察したところ、生存体が認められた。200μgのインドリシジン-D、CP-11またはCP-11またはCP-11Dの注射は、致死を引き起こさなかった。また、DgalおよびLPSを注射したときは、200μgのインドリシジンが、24時間の時点で、対照における100％から60％にまで死亡率を減少させた。したがって、本実施例は、本発明の陽イオン性ペプチドが、in vivoで抗内毒素活性を有することを示す。
本発明は、現在のところ好ましい実施態様に関して記載されているが、本発明の精神から逸脱することなく、種々の修飾を加えることができると理解されるべきである。したがって、本発明は、以下の請求の範囲のみに限定される。
配列表
（１）一般的情報
（ｉ）出願人：ファラ  ティモシー  ジェイ．他
（ii）発明の名称：抗微生物カチオンペプチド及びそのスクリーニング方法
（iii）配列の数：４４
（iv）住所：
（Ａ）名宛人：フィッシュ  アンド  リチャードソン  ピー．シー．
（Ｂ）通り名：４２２５  エグゼクティブ  スクウェア、１４００番地
（Ｃ）市名：ラホヤ
（Ｄ）州名：カリフォルニア
（Ｅ）国名：アメリカ合衆国
（Ｆ）郵便番号：９２０３７
（ｖ）コンピューター読取り可能形式：
（Ａ）媒体の型：フロッピーディスク
（Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ  ＰＣ互換機
（Ｃ）オペレーティングシステム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ
（Ｄ）ソフトウェア：PatentIn  リリース#1.0，バージョン#1.30
（vi）本出願のデータ：
（Ａ）出願番号：ＵＳ
（Ｂ）出願日：
（Ｃ）分類：
（vii）先の出願のデータ：
（Ａ）出願番号：ＵＳ  60/002,687
（Ｂ）出願日：１９９５年０８月２３日
（viii）代理人の情報：
（Ａ）代理人名：ウェザレル，ジュニア，ジョン  アール．
（Ｂ）登録番号：３１，６７８
（Ｃ）参照／事件番号：０７４２０／０１３００１
（ix）テレコミュニケーションの情報：
（Ａ）電話番号：６１９／６７８−５０７０
（Ｂ）テレファックス：６１９／６７８−５０９９
（２）配列番号：１：
（ｉ）配列の特色
（Ａ）配列の長さ：１３アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：不適切
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：
0003860838.tif 000019
（２）配列番号：２：
（ｉ）配列の特色
（Ａ）配列の長さ：１６アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：不適切
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：
0003860838.tif 000020
（２）配列番号：３：
（ｉ）配列の特色
（Ａ）配列の長さ：１４アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：不適切
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：
0003860838.tif 000021
（２）配列番号：４：
（ｉ）配列の特色
（Ａ）配列の長さ：１４アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：不適切
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：
0003860838.tif 000022
（２）配列番号：５：
（ｉ）配列の特色
（Ａ）配列の長さ：１２アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：不適切
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：
0003860838.tif 000023
（２）配列番号：６：
（ｉ）配列の特色
（Ａ）配列の長さ：１５アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：不適切
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：
0003860838.tif 000024
（２）配列番号：７：
（ｉ）配列の特色
（Ａ）配列の長さ：１５アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：不適切
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：
0003860838.tif 000025
（２）配列番号：８：
（ｉ）配列の特色
（Ａ）配列の長さ：１５アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：不適切
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：
0003860838.tif 000026
（２）配列番号：９：
（ｉ）配列の特色
（Ａ）配列の長さ：１１アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：不適切
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：
0003860838.tif 000027
（２）配列番号：１０：
（ｉ）配列の特色
（Ａ）配列の長さ：１０アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：不適切
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：
0003860838.tif 000028
（２）配列番号：１１：
（ｉ）配列の特色
（Ａ）配列の長さ：１６アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：不適切
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：
0003860838.tif 000029
（２）配列番号：１２：
（ｉ）配列の特色
（Ａ）配列の長さ：１８アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：不適切
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：
0003860838.tif 000030
（２）配列番号：１３：
（ｉ）配列の特色
（Ａ）配列の長さ：１４アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：不適切
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：
0003860838.tif 000031
（２）配列番号：１４：
（ｉ）配列の特色
（Ａ）配列の長さ：１３アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：不適切
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：
0003860838.tif 000032
（２）配列番号：１５：
（ｉ）配列の特色
（Ａ）配列の長さ：１３アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：不適切
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：
0003860838.tif 000033
（２）配列番号：１６：
（ｉ）配列の特色
（Ａ）配列の長さ：１３アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：不適切
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：
0003860838.tif 000034
（２）配列番号：１７：
（ｉ）配列の特色
（Ａ）配列の長さ：１３アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：不適切
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：
0003860838.tif 000035
（２）配列番号：１８：
（ｉ）配列の特色
（Ａ）配列の長さ：１４アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：不適切
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：
0003860838.tif 000036
（２）配列番号：１９：
（ｉ）配列の特色
（Ａ）配列の長さ：１２アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：不適切
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：
0003860838.tif 000037
（２）配列番号：２０：
（ｉ）配列の特色
（Ａ）配列の長さ：９アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：不適切
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：
0003860838.tif 000038
（２）配列番号：２１：
（ｉ）配列の特色
（Ａ）配列の長さ：１５アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：不適切
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：
0003860838.tif 000039
（２）配列番号：２２：
（ｉ）配列の特色
（Ａ）配列の長さ：１６アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：不適切
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：
0003860838.tif 000040
（２）配列番号：２３：
（ｉ）配列の特色
（Ａ）配列の長さ：１３アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：不適切
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：
0003860838.tif 000041
（２）配列番号：２４：
（ｉ）配列の特色
（Ａ）配列の長さ：１１アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：不適切
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：
0003860838.tif 000042
（２）配列番号：２５：
（ｉ）配列の特色
（Ａ）配列の長さ：１３アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：不適切
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：
0003860838.tif 000043
（２）配列番号：２６：
（ｉ）配列の特色
（Ａ）配列の長さ：１１アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：不適切
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：
0003860838.tif 000044
（２）配列番号：２７：
（ｉ）配列の特色
（Ａ）配列の長さ：１２アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：不適切
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：
0003860838.tif 000045
（２）配列番号：２８：
（ｉ）配列の特色
（Ａ）配列の長さ：１３アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：不適切
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：
0003860838.tif 000046
（２）配列番号：２９：
（ｉ）配列の特色
（Ａ）配列の長さ：１３アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：不適切
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：
0003860838.tif 000047
（２）配列番号：３０：
（ｉ）配列の特色
（Ａ）配列の長さ：１３アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：不適切
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：
0003860838.tif 000048
（２）配列番号：３１：
（ｉ）配列の特色
（Ａ）配列の長さ：１３アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：不適切
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：
0003860838.tif 000049
（２）配列番号：３２：
（ｉ）配列の特色
（Ａ）配列の長さ：１３アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：不適切
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：
0003860838.tif 000050
（２）配列番号：３３：
（ｉ）配列の特色
（Ａ）配列の長さ：１３アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：不適切
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：
0003860838.tif 000051
（２）配列番号：３４：
（ｉ）配列の特色
（Ａ）配列の長さ：１３アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：不適切
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：
0003860838.tif 000052
（２）配列番号：３５：
（ｉ）配列の特色
（Ａ）配列の長さ：１３アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：不適切
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：
0003860838.tif 000053
（２）配列番号：３６：
（ｉ）配列の特色
（Ａ）配列の長さ：１３アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：不適切
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：
0003860838.tif 000054
（２）配列番号：３７：
（ｉ）配列の特色
（Ａ）配列の長さ：１３アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：不適切
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：
0003860838.tif 000055
（２）配列番号：３８：
（ｉ）配列の特色
（Ａ）配列の長さ：１６アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：不適切
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：
0003860838.tif 000056
（２）配列番号：３９：
（ｉ）配列の特色
（Ａ）配列の長さ：１５アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：不適切
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：
0003860838.tif 000057
（２）配列番号：４０：
（ｉ）配列の特色
（Ａ）配列の長さ：１５アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：不適切
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：
0003860838.tif 000058
（２）配列番号：４１：
（ｉ）配列の特色
（Ａ）配列の長さ：１５アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：不適切
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：
0003860838.tif 000059
（２）配列番号：４２：
（ｉ）配列の特色
（Ａ）配列の長さ：１７アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：不適切
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：
0003860838.tif 000060
（２）配列番号：４３：
（ｉ）配列の特色
（Ａ）配列の長さ：１７塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（genomic）
（xi）配列：
0003860838.tif 000061
（２）配列番号：４４：
（ｉ）配列の特色
（Ａ）配列の長さ：１６塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：
0003860838.tif 000062
【図１】
0003860838.tif 000063
【図２Ａ】
0003860838.tif 000064
【図２Ｂ】
0003860838.tif 000065
【図３】
0003860838.tif 000066
【図４】
0003860838.tif 000067
【図５】
0003860838.tif 000068
【図６】
0003860838.tif 000069
【図７】
0003860838.tif 000070
【図８】
0003860838.tif 000071
【図９】
0003860838.tif 000072
【図１０】
0003860838.tif 000073
【図１１】
0003860838.tif 000074
【図１２】
0003860838.tif 000075