(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（１）
【化１】
0003745113.tif 000009
（上記一般式（１）において、Ｒ1 およびＲ2 は、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、フェニル基、またはｍ−クロロフェニル基であり、互いに同一でもまたは異なるものでもよく、Ｒ3 、Ｒ4 、Ｒ5 およびＲ6 は、いずれも水素原子である。Ｘn-は硝酸イオンまたはハロゲン化物イオンであり、ｎは１または２である。）
で表わされるＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の還元処理により得られる反応生成物を化学発光性物質として用い、水素受容体の存在下においてペルオキシダーゼ酵素活性を測定することを特徴とする化学発光法によるペルオキシダーゼ活性の測定方法。
【請求項２】
下記一般式（１）
【化２】
0003745113.tif 000010
（上記一般式（１）において、Ｒ1 およびＲ2 は、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、フェニル基、またはｍ−クロロフェニル基であり、互いに同一でもまたは異なるものでもよく、Ｒ3 、Ｒ4 、Ｒ5 およびＲ6 は、いずれも水素原子である。Ｘn-は硝酸イオンまたはハロゲン化物イオンであり、ｎは１または２である。）
で表わされるＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の還元処理により得られる反応生成物を化学発光性物質として用い、水素受容体の存在下において、ペルオキシダーゼ酵素活性を測定する際に発光増強剤を用いることを特徴とする化学発光法によるペルオキシダーゼ活性の測定方法。
【請求項３】
前記反応生成物が
下記一般式（２）
【化３】
0003745113.tif 000011
（上記一般式（２）において、Ｒ11およびＲ22は、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、フェニル基、またはｍ−クロロフェニル基であり、互いに同一でもまたは異なるものでもよく、Ｒ33、Ｒ44、Ｒ55およびＲ66は、いずれも水素原子である。）
で表される化合物を含有してなる請求項１または２に記載のペルオキシダーゼ活性の測定方法。
【請求項４】
前記Ｎ，Ｎ'−ジ置換−９，９'−ビスアクリジニウム塩類が、Ｎ，Ｎ'−ジメチル−９，９'−ビスアクリジニウム塩、Ｎ，Ｎ'−ジエチル−９，９'−ビスアクリジニウム塩、Ｎ，Ｎ'−ジプロピル−９，９'−ビスアクリジニウム塩、Ｎ，Ｎ'−ジブチル−９，９'−ビスアクジニウム塩、Ｎ，Ｎ'−ジペンチル−９，９'−ビスアクリジニウム塩、Ｎ，Ｎ'−ジフェニル−９，９'−ビスアクリジニウム塩、またはＮ，Ｎ'−ジ−ｍ−クロロフェニル−９，９'−ビスアクリジニウム塩である請求項１または２に記載のペルオキシダーゼ活性の測定方法。
【請求項５】
前記Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類がＮ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウムジナイトレートである請求項１または２に記載のペルオキシダーゼ活性の測定方法。
【請求項６】
前記水素受容体が過酸化水素である請求項１〜４のいずれかの請求項に記載のペルオキシダーゼ活性の測定方法。
【請求項７】
前記発光増強剤がフェノール性化合物である請求項２〜５のいずれかの請求項に記載のペルオキシダーゼ活性の測定方法。
【請求項８】
前記フェノール性化合物がｐ−ヨードフェノール、ｐ−フェニルフェノールおよび６−ヒドロキシベンゾチアゾールからなる群より選択される少なくとも１種の化合物である請求項６に記載のペルオキジダーゼ活性の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、化学発光法（ケミルミネッセンス）を利用するペルオキシダーゼ活性の測定方法に関するものであり、さらに詳しくは、特定のアクリジニウム塩類の還元生成物を化学発光性物質として用いるペルオキシダーゼ活性の測定方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ペルオキシダーゼは水素受容体の存在下で水素供与体の酸化反応を触媒する酵素である。このような触媒活性は、例えば、ヘモグロビンのような非酵素物質においても観察され、ペルオキシダーゼ活性と総称される。ペルオキシダーゼの触媒活性は微量でも高感度に検出しやすいので、ペルオキシダーゼ酵素活性の検出のみならず、種々の検出対象物質の指標となる分析用試薬として幅広い分野で利用されている。このようにペルオキシダーゼを標識物質として用いる分析方法としては、抗原抗体反応を利用する免疫学的測定法、核酸の相補性を利用する核酸ハイブリダイゼーションアッセイ法、その他アビジン−ビオチン、ホルモン−ホルモン受容体、糖−レクチン等の特異的な親和性を利用する分析方法が挙げられる。
【０００３】
また、このようなペルオキシダーゼ活性の測定には、過酸化水素を水素受容体として用い水素供与体を酸化し色素を生成させてその発色量を分光光度計等で測定する比色法、または蛍光物質を生成させてその蛍光を蛍光分光光度計で測定する蛍光法等が行なわれている。しかしながら、ペルオキシダーゼ活性の測定に比色法を用いる場合には、ペルオキシダーゼの低濃度領域での定量性に欠けると云う問題点があり、これを解決する目的で蛍光法が開発されたが、低濃度領域での定量性に関しては未だ充分とは言えない。この問題点を解決する目的で、化学発光法によるペルオキシダーゼ活性の測定法が開発されている。化学発光法は、ペルオキシダーゼ酵素の触媒活性によって化学発光性物質が中間体を経て励起状態となり、この状態から基底状態に戻る際に放出される発光量を測定することによりペルオキシダーゼ酵素活性を定量する方法であり、従来、化学発光性物質にルミノールを、水素受容体に過酸化水素を、そして発光増強剤にｐ−ヨードフェノールを用いる化学発光系が開発されており、ペルオキシダーゼ活性を高感度に定量することが可能になっている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、ペルオキシダーゼ酵素活性の測定を酵素免疫測定法に応用する場合には、酵素の低濃度領域での定量性をさらに高める必要性が生じるケースが多く、ペルオキシダーゼ酵素活性測定のさらなる高感度化が望まれていた。従って、本発明は、上記のような開発事情に鑑み、ペルオキシダーゼ活性をさらに高感度で測定可能な化学発光法による新規な測定系を提供することを課題とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を達成するために鋭意検討を行なった結果、化学発光性物質として、Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の還元反応生成物を用い、水素受容体として過酸化水素を、そして、さらに好ましくは発光増強剤として特定のフェノール性化合物を用いる化学発光系が、化学発光性物質にルミノールを用いる化学発光系に比較してさらに高感度でペルオキシダーゼ活性を定量することが可能なことを見い出し本発明の完成に到達したものである。
【０００６】
すなわち、本発明の第一は、
下記一般式（１）
【０００７】
【化４】
0003745113.tif 000002
（上記一般式（１）において、Ｒ1 およびＲ2 は、アルキル基、アリール基およびハロゲン化アリール基からなる群より選択され、互いに同一でもまたは異なるものでもよく、Ｒ3 、Ｒ4 、Ｒ5 およびＲ6 は、水素原子、アルキル基、アリール基、アルコキシ基、アリーロキシ基およびハロゲン原子からなる群より選択され、互いに同一でもまたは異なるものでもよく、Ｘn-はｎ価の陰イオンであり、ｎは１または２である。）
で表わされるＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の還元処理により得られる反応生成物を化学発光性物質として用い、水素受容体の存在下においてペルオキシダーゼ酵素活性を測定することを特徴とするペルオキシダーゼ活性の測定方法に関するものである。
【０００８】
また、本発明の第二は、
下記一般式（１）
【０００９】
【化５】
0003745113.tif 000003
（上記一般式（１）において、Ｒ1 およびＲ2 は、アルキル基、アリール基およびハロゲン化アリール基からなる群より選択され、互いに同一でもまたは異なるものでもよく、Ｒ3 、Ｒ4 、Ｒ5 およびＲ6 は、水素原子、アルキル基、アリール基、アルコキシ基、アリーロキシ基およびハロゲン原子からなる群より選択され、互いに同一でもまたは異なるものでもよく、Ｘn-はｎ価の陰イオンであり、ｎは１または２である。）
で表わされるＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の還元処理により得られる反応生成物を化学発光性物質として用い、水素受容体の存在下においてペルオキシダーゼ酵素活性を測定する際に発光増強剤を用いることを特徴とするペルオキシダーゼ活性の測定方法に関するものである。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明につきさらに詳しく説明する。
【００１１】
本発明のペルオキシダーゼ活性の測定方法は、化学発光性物質としてＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の還元処理により得られる反応生成物を用い、水素受容体の存在下において化学発光反応によりペルオキシダーゼ酵素活性を測定するものであり、さらに好ましくは、ペルオキシダーゼ酵素活性を、上記化学発光性物質を用い水素受容体および発光増強剤の存在下において化学発光反応により測定する方法に関するものである。その測定手法は任意であり、一般に、化学発光性物質、発光増強剤およびペルオキシダーゼ酵素を含有する測定試料を混合し、特定塩基性ｐＨ領域において水素受容体を添加して化学発光反応させ、この化学発光量を発光測定装置で測定する方法等を採用することができる。
【００１２】
本発明のペルオキシダーゼ活性の測定方法に用いられる化学発光性物質の出発物質は、Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類であり、一般式（１）
【００１３】
【化６】
0003745113.tif 000004
で表わされる化合物である。一般式（１）において、Ｒ1 およびＲ2 は、各々、アルキル基、アリール基またはハロゲン化アリール基であり、互いに同一でもまたは異なるものでもよい。アルキル基としては炭素数１〜２０、好ましくは、１〜１４の直鎖状または分岐状のいずれでも用いることができ、アリール基およびハロゲン化アリール基は、炭素数６〜２０のものであり、各々、炭素数１〜１４のアルキル基で置換されたものでもよいが、特にフェニル基およびハロゲン化フェニル基が好ましい。また、式中、Ｒ3 、Ｒ4 、Ｒ5 およびＲ6 は、各々、水素原子、アルキル基、アリール基、アルコキシ基、アリーロキシ基またはハロゲン原子であり、互いに同一でも異なるものでもよい。アルキル基、アルコキシ基は炭素数１〜２０、好ましくは、１〜１４の直鎖状または分岐状のものでもよく、アリール基、アリーロキシ基は炭素数６〜２０のものであり、置換基としてアルキル基を有するものでもよい。
【００１４】
前記一般式（１）において、Ｘn-はｎ価の陰イオンであり、ｎは１または２である。陰イオンとしては、特に限定されるものではないが、硝酸イオン（ＮＯ3-）、ハロゲン化物イオン（例えば、塩化物イオン、フッ化物イオン等）等を挙げることができる。これらの陰イオンのなかでは特に硝酸イオンが好ましい。
【００１５】
Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の具体例を例示すると、Ｎ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウム塩、Ｎ，Ｎ’−ジエチル−９，９’−ビスアクリジニウム塩、Ｎ，Ｎ’−ジプロピル−９，９’−ビスアクリジニウム塩、Ｎ，Ｎ’−ジブチル−９，９’−ビスアクジニウム塩、Ｎ，Ｎ’−ジペンチル−９，９’−ビスアクリジニウム塩、Ｎ，Ｎ’−ジフェニル−９，９’−ビスアクリジニウム塩、Ｎ，Ｎ’−ジ−ｍ−クロロフェニル−９，９’−ビスアクリジニウム塩等を挙げることができ、特に、Ｎ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウムジナイトレートが好適である。
【００１６】
Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の還元反応生成物は、Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスジヒドロアクリジン誘導体を含有してもよく、該誘導体は、下記一般式（２）
【００１７】
【化７】
0003745113.tif 000005
で表することができる。
【００１８】
一般式（２）において、Ｒ11、およびＲ22は、アルキル基、アリール基およびハロゲン化アリール基からなる群より選択され、互いに同一でもまたは異なるものでもよい。アルキル基としては炭素数１〜２０、好ましくは、１〜１４の直鎖状または分岐状のいずれでも用いることができ、アリール基およびハロゲン化アリール基は、炭素数６〜２０のものであり、各々、アルキル基で置換されたものでよいが、特に、フェニル基およびハロゲン化フェニル基が好ましい。また、Ｒ33、Ｒ44、Ｒ55およびＲ66は、各々、水素原子、アルキル基、アリール基、アルコキシ基、アリーロキシ基およびハロゲン原子からなる群より選択され、互いに同一でもまたは異なるものでもよい。アルキル基、アルコキシ基は炭素数１〜２０、好ましくは、１〜１４の直鎖状または分岐状のものでよく、アリール基、アリーロキシ基は炭素数６〜２０のものであり、アルキル基で置換されたものでもよい。
【００１９】
これらの化学発光性物質は、ｐＨ７．５〜１３の塩基性条件下において、過剰の水素受容体、例えば、過酸化水素の存在下、ペルオキシダーゼの濃度に依存した量で発光する。
【００２０】
この発光はフェノール性化合物等の発光増強剤によって増強することが認められている。このようなフェノール性化合物としては、ｐ−ヨードフェノール、ｐ−フェニルフェノール、６−ヒドロキシベンゾチアゾールが特に好ましいが、その他にもｐ−ヒドロキシ桂皮酸、ｐ−（４−クロロフェニル）フェノール、ｐ−（４−ブロモフェニル）フェノール、ｐ−（４−ヨードフェニル）フェノール、ｐ−ブロモフェノール、ｐ−クロロフェノール、２−ナフトール、ホタルルシフェリン等を例示することができる。
【００２１】
本発明のペルオキシダーゼ活性の測定方法において用いられる化学発光性物質の濃度は、還元処理の出発原料であるＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の濃度に換算して、１０-6〜１Ｍ、好ましくは１０-4〜１０-2Ｍの範囲であり、その使用量としては、１０〜５００μｌ、好ましくは５０〜３００μｌの範囲でよい。また、発光増強剤の使用量は化学発光性物質の０．０１〜１００倍モル、好ましくは、０．１〜１０倍モルの範囲であり、濃度は１０-6〜１Ｍ、特に、１０-4〜１０-2Ｍの範囲が好ましい。
【００２２】
また、化学発光反応に用いられる水素受容体としては、ペルオキシダーゼ酵素の基質となり得るものであれば特に限定されるものではなく、有機過酸化物、無機過酸化物等が任意に用いられるが、特に、過酸化水素が好ましい。この水素受容体の使用量は化学発光性物質に対して充分に過剰な量で用いることが必要であり、その使用量は化学発光性物質に対して３〜１万倍モル、特に、１０〜１０００倍モルの範囲で用いることが好ましい。
【００２３】
化学発光反応に用いられる塩基性緩衝液としてはトリス塩酸緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液等を任意に用いることができる。これらの緩衝液の濃度としては１ｍＭ〜１Ｍが好ましい。また、反応時には界面活性剤、キレート剤等の添加剤を任意に用いることもできる。
【００２４】
Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩の還元処理により得られる反応生成物は、ペルオキシダーゼによる過酸化水素の分解反応で生成する発生期の酸素により酸化されてＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム化合物となり、さらに過剰に存在する過酸化水素と反応して励起状態のジオキセタン構造を形成した後、アルカリで分解されてアクリドンを生成して基底状態に戻るときに発光するものと推定される。
【００２５】
本発明の化学発光反応の発光量の測定は発光光度計を用いて測定されるが、その測定の開始点および積算時間は任意であるが、発光量が安定し且つ発光量の濃度依存性の高い時間を選択することが好ましい。例えば、測定開始点は試薬混合後０〜１時間、好ましくは０〜３０分、特に好ましくは０〜１５分であり、測定の積算時間は１秒〜１分、好ましくは１〜３０秒、特に好ましくは１〜１０秒である。
【００２６】
本発明のペルオキシダーゼ活性の測定方法に用いられるＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の還元反応生成物の製造方法は任意であるが、Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類を還元剤を用いて還元処理することにより容易に製造することができる。用いられる還元剤としては、リチウムアルミニウムハイドライド、リチウムボロンハイドライド、ナトリウムボロンハイドライド等が挙げられるが、リチウムアルミニウムハイドライドが特に好ましい。また、還元処理の際に、Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物、例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルベンズアミド等を添加することもできる。
【００２７】
還元反応は反応溶媒中で行なうことが好ましい。反応溶媒としては、反応試薬に対して不活性であり、反応試薬に対する溶解性を有するものであれば、限定されるものではなく、特に、テトラヒドロフラン、ジオキサン類等の環状エーテル類等が好ましく用いられる。反応温度は用いられる還元剤および反応溶媒の種類によって異なるが、一般的に、−１０〜＋１５０℃、好ましくは０〜１２０℃、特に好ましくは２０〜９０℃の範囲の温度である。反応時間は１分〜一昼夜、好ましくは１０分〜１２時間、特に好ましくは３０分〜５時間の範囲である。
【００２８】
また、本発明によれば、ペルオキシダーゼ活性の測定方法に用いられるＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスジヒドロアクリジン塩類の還元反応生成物からなる化学発光測定試薬を提供することができ、Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ヒスアクリジウム塩還元反応生成物、水素受容体の過酸化水素、発光増強剤のフェノール性化合物等との組合せからなるペルオキシダーゼ活性測定用試薬キットを提供することができる。この化学発光測定用試薬キットは効率的な化学発光測定に極めて有用である。
【００２９】
【実施例】
以下、参考例および比較例と共に実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例等に限定されるものではない。なお、実施例中の％は重量％を意味する。
【００３０】
［参考例１］
化学発光試薬の調製
ルシゲニン（Ｎ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウムジナイトレート）１ｍｇを試験管に採り、撹拌しながら１，４−ジオキサン１ｍｌ中へ加えてルシゲニンを１，４−ジオキサン中に微分散させた。次に、これに水素化リチウムアルミニウム粉末１５０ｍｇを添加して、８０℃で２時間撹拌して還元処理した後、反応生成物を氷冷下に脱イオン水中へ少量ずつ注入して過剰量の水素化リチウムアルミニウムを分解させた。次に、生成した水酸化アルミニウム等の沈殿を濾別してから、濾液のｐＨを１Ｎ塩酸で７．０に調整することによりルシゲニンの還元反応生成物を含有する化学発光試薬を得た。
【００３１】
［実施例１］
ペルオキシダーゼ活性の測定
参考例１で調製した化学発光試薬ルシゲニンの還元反応生成物を０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．４）で１０倍に希釈した溶液１０μｌおよびｐ−ヨードフェノールを１０-3Ｍの濃度で含有する０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．４）１００μｌに、種々の濃度水準の西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）水溶液５０μｌを混合し、これに０．００３４重量％過酸化水素水溶液５０μｌを加え、ルミノメーター（ダイアヤトロン社製ルミナスＣＴ−９０００Ｄ）で０〜５秒間発光量を積算した結果、表１に示す如くＨＲＰを５×１０-19 ｍｏｌ／ａｓｓａｙまで測定することが可能であった。
【００３２】
0003745113.tif 000006
【００３３】
［実施例２］
ペルオキシダーゼ活性の測定
参考例１で調製した化学発光試薬ルシゲニンの還元反応生成物および６−ヒドロキシベンゾチアゾールを１０-3Ｍの濃度で含有する０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．４）１００μｌに、種々の濃度水準のＨＲＰ水溶液５０μｌを混合し、これに０．００３４重量％過酸化水素水溶液５０μｌを加えルミノメーター（ダイアヤトロン社製ルミナスＣＴ−９０００Ｄ）で０〜５秒間発光量を積算した結果、表２に示すようにＨＲＰを１０-18 ｍｏｌ／ａｓｓａｙまで測定することが可能であった。
【００３４】
0003745113.tif 000007
【００３５】
［比較例１］
ルミノールを５．６×１０-5Ｍおよびｐ−ヨードフェノールを１０-3Ｍの濃度で含有する０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．４）１００μｌに、種々の濃度水準のＨＲＰ水溶液５０μｌを混合した後、これに０．００３４重量％過酸化水素水溶液５０μｌを加え、ルミノメーター（ダイアヤトロン社製ルミナスＣＴ−９０００Ｄ）で０〜５秒間発光量を積算した結果、表３に示すようにＨＲＰを１０-17 ｍｏｌ／ａｓｓａｙまでは測定できることが認められた。
【００３６】
0003745113.tif 000008
【００３７】
【発明の効果】
本発明のペルオキシダーゼ活性の測定方法により、ペルオキシダーゼ酵素活性を、従来から広く使用されているルミノールを用いる測定系よりも高感度で測定することが可能になり、ペルオキシダーゼを標識物質に用いる酵素免疫測定法により抗原抗体類を、ハイブリダイゼーションアッセイ法により核酸類を各々より高感度に検出することができ、また定量することもできる。