(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞内分泌経路によって内在的にプロセシングされることができ、細胞障害性Ｔリンパ球に提示されるための傍観標的細胞にトランスファーされる抗原を同定する方法であって：抗原をＭＨＣクラスＩ分子を欠如している供与体に導入し；イン・ビトロで培地中で供与体細胞、該抗原およびＭＨＣクラスＩ分子を発現する細胞に特性を有するプライミングした細胞障害性Ｔリンパ球をインキュベートし、ついで供与体細胞が損なわれないような適当な条件下で検出可能な細胞内マーカーで標識されており、ついで；該インキュベーション培地中に放出された検出可能なマーカーの量を測定することを含む方法。
【請求項２】
該抗原がウイルス、細菌、原生動物または腫瘍抗原である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該抗原が自己抗原または同種抗原である請求項１に記載の方法。
【請求項４】
該抗原がＶＳＶである請求項２に記載の方法。
【請求項５】
該供与体細胞が該抗原をコードする核酸分子でトランスフェクションされている請求項１に記載の方法。
【請求項６】
該供与体細胞がＲ１．Ｅ（Ｈ−２k）またはDaudi細胞である請求項１に記載の方法。
【請求項７】
該検出可能なマーカーが[51]クロムである請求項１に記載の方法。
【請求項８】
細胞分泌経路において内在的にプロセシングされた抗原のプロセシングに影響を及ぼす物質の存在に関する培地のアッセイ方法であって：イン・ビトロで培地中で供与体の分泌経路によって内在的にプロセシングされることができる抗原を有する供与体哺乳類細胞、ＭＨＣクラスＩ分子を発現する標的細胞、検出可能な細胞内マーカーで標識した細胞、該抗原に対しての特異性を有するプライミングされた細胞障害性リンパ球をインキュベートし、ついで；該物質の存在下または不在下で培地に放出された検出可能なマーカーの量を測定することが含まれる方法。
【請求項９】
該供与体細胞がＭＨＣクラスＩ分子を欠如している請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
該抗原がＶＳＶ−Ｎタンパク質および標的細胞がＲＭＡである請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
細胞分泌経路によって内在的にプロセシングされることができる腫瘍またはウイルス抗原を特徴付ける方法であって：哺乳類から腫瘍細胞または腫瘍またはウイルス感染細胞に対する特異性を有するプライミングされた細胞障害性Ｔリンパ球を得て；該腫瘍またはウイルス感染細胞からｃＤＮＡライブラリーを調製し、ついでトランスフェクションした宿主細胞に該ｃＤＮＡライブラリーを発現させ；培地中でトランスフェクションした宿主細胞、ＭＨＣクラスＩ分子を発現し検出可能な細胞内マーカーで標識された標的細胞および該供与体細胞が損なわれないような適切な条件下でプライミングされた細胞障害性リンパ球をインキュベートし、ついで；該培地中に放出された検出可能なマーカーの量を測定し、該標的細胞の溶解を引き起こすことができるトランスフェクションした細胞を同定し、ついでトランスフェクションしたＤＮＡまたは同定されたトランスフェクションした細胞のトランスフェクションしたＤＮＡの発現産物を特徴付けることを含む方法。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、一般的に細胞分泌経路によって内在的にプロセシングされることができる抗原を同定する方法および細胞分泌経路において内在的にプロセシングされた抗原のプロセシングに影響を及ぼす物質の存在に関して培地をアッセイする方法に関する。さらに、本発明は細胞分泌経路によって内在的にプロセシングすることができる細胞障害性Ｔ細胞抗原を特徴付ける方法に関する。
発明の背景
細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答は免疫系の主要な要素であり、感染した細胞または悪性細胞およびその表面に在外抗原を発現する侵入生物体の免疫的監督および破壊において活性である。抗原特異的Ｔリンパ球レセプターのリガンドは８から１０アミノ酸長の在外抗原ペプチド断片からなる複合体であり、ＭＨＣクラスＩ分子の型に提示される。Ｂ細胞のようではなく、Ｔ細胞はそのまま天然に存在する抗原分子を認識しない。一般的に、細胞障害性Ｔ細胞の活性化には、該抗原が内在的にプロセシングされ、かつクラスＩＭＨＣ分子と関連付けた細胞をプロセシングする抗原の表面に提示される特異的なペプチド断片に開裂されることが必要である。
ＭＨＣクラスＩ分子は通常細胞の表面に、４６ｋＤの重鎖、１２Ｋｄのβ2−ミクログロブリン（β2ｍ）と呼ばれる軽鎖および８−１０アミノ酸からなるペプチドにより形成された３者からなる複合体として発現される（バン・ブリーク（van Bleek, G.M.）およびナゼンソン（S.G.Nathenson）、Nature ３４８：２１３，１９９０；ザン（Zhang,W.）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８９：８４０２，１９９２；マツムラ（Matsumura, M.）ら、Science ２５７：９２７，１９９２；およびラトロン（Latoron, F.）ら、Science ２５７：９６４，１９９２）。３者からなる複合体の形成は細胞質内でのタンパク質分解によって産生されるペプチドの小体胞体（ER）の管腔中への輸送に関与すると考えられている（ナッハターン（Nuchtern, J. G.）ら、Nature ３３９：２２３，１９８９；イェウデル（Yewdell, J. W.）およびベニンク（J.R. Bennink）、Science ２４４：１０７２，１９８９；およびコックス（Cox, J.H.）ら、Science ２４７：７１５，１９９０）。細胞表面でのＭＨＣクラスＩ分子の発現の低さについて選択された突然変異細胞株の研究は、高原プロセシングに必要な分子事象への洞察を提供する。これらの研究はＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）ファミリーのタンパク質をコードするＭＨＣ領域に位置する２つの遺伝子の同定を可能にした。ＴＡＰ−１およびＴＡＰ−２と呼ばれるこれらの遺伝子は、細胞質からER内腔中へのペプチド輸送と関係がある（デバーソン（Deverson, E.V.）ら、Nature ３４８：７３８、１９９０；トロウスデール（Trowsdale, J.）ら、Nature ３４８：７４１、１９９０；スピース（Spies, T.）ら、Nature ３４８：７４４、１９９０；モナコ（Monaco, J.J.）ら、Science ２５０：１７２３，１９９０；スピースおよびデマルス（R. DeMars）、Nature ３５１：３２３，１９９１；バーラム（Bahram, S.）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８８：１００９４，１９９１；スピースら、Nature ３５５：６４４、１９９２；ケリー（Kelly, A.）ら、Nature ３５５：６４１，１９９２；ポウィス（Powis, S. H.）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８９：１４６３，１９９２；およびコロンナ（Collonna, M.）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８９：３９３２，１９９２）。他の２つのMHC結合遺伝子、ＬＭＰ−２および−７（モナコおよびマックデビット（McDevitt）、１９８２、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79：３００１）ハプロテアソーム（細胞質性触媒複合性プロテアーゼ複合体（a cytoplasmic multicatalytic protease complex））の成分であり、該プロテアソームは抗原プロセシングのためのタンパク質分解のいくつかの面に関与しているようである（オリッツ−ナバレッテ（Oritiz-Navarette, V.）ら、Nature ３５３：６６２，１９９１；ブラウン（Brown, M.G.）ら、Nature ３５３：３５５、１９９１；グリン（Glynne, R.）ら、Nature ３５３：６６４，１９９１；ケリーら、Nature ３５３，１９９１；ヤン（Yang Y,）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８９：４９２８，１９９２；ゴールドバーグ（Goldberg, A. L.）およびロック（K.L. Rock）、Nature ３５７：３７５，１９９２）。
ＣＴＬは、内在的にプロセシングされた在外タンパク質または変異自己タンパク質を産生するＭＨＣクラスＩを認識し、それによって免疫系が細胞内病原または腫瘍形質転換に応答することができるようにする。ＭＨＣクラスＩ抗原提示の内在性細胞プロセシング経路は、提示細胞の細胞質またはERに抗原が内在的に発現されることを必要とすると考えられている。内在性ペプチドは膜結合ＭＨＣクラスＩ分子と結合し後にそれらはERを残し、ついで最終的にはＭＨＣクラスＩ分子に結合した細胞表面に提示される（イェウデルおよびベニンク、１９８９、Science ２４４：１０７２）。
ＭＨＣハプロタイプの正確なＭＨＣ結合モチーフの過剰または欠如のためにＭＨＣクラスＩに結合できないペプチドは、したがって、該分野において通常使用される技術によって相当検出しづらく、短命であり退化したものであると推定される（ファルク（Falk）ら、Nature、３４８：２４８−２５１、１９９０；レーツシュク（Rotzschke）ら、Nature、３４８：２５２−２５４，１９９０）。しかし最近の結果（アーノルド（Arnold）ら、J. Exp. Med.、１８２：８８５−８８９、１９９５）はＭＨＣクラスＩ分子に細胞内で結合できないペプチドはgp９６などの熱ショックタンパク質（HSPs）に結合することがわかったと示している。これらの著者らは細胞抗原をウドノ（Udono）およびスリバスタバ（Srivastava）による初期の結果を確実にすることを示したＭＨＣクラスＩと独立してgp９６と結合したペプチドによって代表することを示している（J. Exp. Med.、１７８：１３９１−１３９６、１９９３；J. Immunol.、１５２：５３９８−５４０３，１９９４）。特定の細胞から抽出されたgp９６ハ「クロスプライミング（cross-priming）」を誘発することができる。
フアン（Huang）ら（Science ２６４：９６−９６５、１９９４）は、タンパク質またはペプチドが細胞表面からの放出または抗原プロセシング供与体によって抗原の取り込みに続いて放出された後、供与体から受容体に変換されるであろうメカニズムを解明した。これらの現象は特定の環境下で操作されるが、それらは内在性抗原よりもしろ在外抗原のプロセシングに関する。
自己抗原に対しての免疫応答の誤った指導の結果である自己免疫疾患は宿主組織ダメージとなる。自己免疫疾患は細菌およびウイルス、環境条件およびある薬剤および毒素などの感染性媒体によって引き起こされる。いくつかのメカニズムが提唱され、それはすべての自己免疫の特徴ではないが、そのいくつかを説明することができるでろう。例えば、自己免疫は胸腺自己寛容メカニズムの破壊、病原体タンパク質によって自己タンパク質の模擬および末梢Ｔ細胞寛容の退行から結果されるものであろう。
厳密なメカニズムはそれほど理解されていないが、自己免疫傷害の産生は、自己免疫系を開始する抗原の結合および提示が可能であるＭＨＣ罹患しやすい対立遺伝子を必要とすると考えられている；それらの抗原に特異的な応答性Ｔ細胞および；抗原特異的なＴリンパ球に対するＭＨＣ罹患しやすい対立遺伝子による提示に利用可能である標的抗原（シンハ（Sinha, A.A.）ら、１９９０、Science ２４８：１３８０）。微生物病原体に最初に直接対する免疫応答は自己免疫疾患において示唆されており、自己抗原に特異的である自己抗体は、しばしばウイルスまたは細菌決定因子に関する特異性をも有している。この病原体関連自己免疫傷害の背面のメカニズムは、あまり理解されておらず、病原性感染から結果する自己免疫ダメージ部位はしばしば感染部位から離れた部位で観察される。自己免疫応答の標的抗原の同定は、例えば関連する抗自己Ｔ−リンパ球の解く的名欠失によるなどの自己免疫応答とこれらの抗原の相互作用を阻害するための治療の合理的発達を可能にした。従って、自己免疫応答の産生においてＣＴＬによって認識される標的抗原を同定するために使用されることができるアッセイの必要性がある。
ＣＴＬはまた、細菌、ウイルスおよび微生物および腫瘍細胞などの破壊細胞などＤＮＡの侵入性病原体を破壊するための哺乳類の免疫応答における重要な防御的役割を果たしている。在外病原体のエピトープ、前癌細胞およびＣＴＬによって認識されるであろう癌細胞を同定するのに使用されることができるアッセイの必要がある。合成ペプチドがＣＴＬによって認識されるウイルスおよび腫瘍標的エピトープを同定する試みにおいて、使用されている。しかしながら、誤った指示結果が得られている。というのは、頻繁にＣＴＬが該合成ペプチドの非常に短いセグメントのみを認識するからである。該酸溶出方法はＭＨＣと結合した細胞表面に提示された短いエピトープを同定する試みにおいて使用されている。該エピトープは一度同定されると、Ｔリンパ球媒介自己免疫疾患、病原体感染および腫瘍のための治療法の計画の根本を形成するであろう。特に、該エピトープは特異的にプライミングされたＣＴＬに対するワクチンの根本として有用であることが期待される。
発明の概要
本発明は、抗原が内在的にプロセシングされ、細胞の分泌経路によって分泌されるであろうことを驚くべきことに見出した。該分泌された抗原は、傍観標的細胞の細胞表面ＭＨＣクラスＩ分子と結合することを示した。
本発明者らはウイルス感染した細胞またはウイルス抗原でトランスフェクションした細胞が内在的にプロセシングされたペプチドをイン・ビトロでて維持するための受容体標的細胞へトランスファーされることができ、およびウイルスに特異的であるプライミングされた細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）によって効果的に認識されることができる。重要なことに、本発明者らは、ペプチドトランスファーがウイルス殺傷または感染細胞からのペプチドのＣＴＬ解放、または細胞表面からの膜結合したＭＨＣクラスＩ結合抗原の放出に関与しないことを示した。
ウイルス感染した細胞によるペプチドトランスファーはＴＡＰトランスポーターの存在に依存することがわかっている。驚くべきことに、ペプチドトランスファーはＭＨＣクラスＩ分子の存在と独立していることがわかっており、それによって該トランスファーしたペプチドは膜結合したＭＨＣクラスＩ分子に結合した細胞表面に輸送されないことを示している。ペプチドトランスファーは細胞の分泌経路を介して活発に輸送されることによって起こることが示されており、分泌経路のインヒビターは標的細胞へとのペプチドのトランスファーを阻害することを示している。
それゆえ、本発明は細胞分泌経路によって内在的にプロセシングされることができ、抗原をＭＨＣクラスＩを欠如している供与体細胞に導入し；イン・ビトロで培地中で供与体、供与体細胞が損なわれずにいるような適切な条件下で、プライミングした細胞障害性Ｔリンパ球およびＭＨＣクラスＩ分子を発現する標的細胞および検出可能な細胞内マーカーで標的下標的細胞をインキュベートし、ついで；検出可能なマーカーのインキュベション培地中へ放出された量を測定することを含み、提示される傍観標的細胞へトランスファーされることができることを同定する方法を考慮する。
好ましくは該抗原はウイルス、細菌または腫瘍抗原である。ある態様において、該抗原はＶＳＶ、異種ペプチドまたは自己ペプチドである。
本発明はまた、細胞内経路において内在的にプロセシングされた抗原をプロセシングすることに影響を及ぼす物質の存在に関して培地をアッセイする方法に関し、その方法は：イン・ビトロで供与体細胞が損なわれずにいるような適切な条件下で、培地中で供与体、プライミングした細胞障害性Ｔリンパ球およびＭＨＣクラスＩ分子を発現する標的細胞および検出可能な細胞内マーカーで標的した標的細胞をインキュベートし、ついで；該物質の存在または不在下で検出可能なマーカーのインキュベーション培地中へ放出された量を測定することを含む。
一態様において、供与体細胞はＭＨＣクラスＩ分子を欠如している。ＭＨＣクラスＩ分子を発現する任意の細胞は標的細胞として使用されてよい。特定の態様において、該抗原はＶＳＶであり標的細胞はＲＭＡである。
細胞分泌経路において内在的にプロセシングされた高原のプロセシングに影響を及ぼす物質は免疫応答を刺激または阻害するための免疫モジュレータとして有用であることが期待されている。
本発明はさらに、哺乳類から腫瘍細胞またはウイルス感染細胞および腫瘍細胞またはウイルス感染細胞に特異性を有するプライミングされた細胞毒性Ｔリンパ球を得て；該腫瘍細胞またはウイルス感染細胞からｃＤＮＡライブラリーを調製し、ついでトランスフェクションした宿主細胞に該ｃＤＮＡライブラリーを発現させ；培地中でトンランスフェクションした細胞、ＭＨＣクラスＩ分子を発現した、検出可能な細胞内マーカーおよび供与体細胞が損なわれていないような適当な条件下でプライミングされた細胞障害性リンパ球で標識された標的細胞をインキュベーションし、ついで；培地中に放出された検出可能暗マーカーの量を測定し、標的細胞の溶解を引き起こすことができる感染細胞を同定し、ついでトランスフェクションしたＤＮＡおよび同定されたトランスフェクションされた細胞のトランスフェクションＤＮＡを特徴付けることを含む腫瘍またはウイルス抗原を特徴付ける方法にさらに関する。認識されるであろうように、該方法はまた異種抗原、自己抗原および細菌、原生動物などの他の病原体、または他の微生物または寄生生物の抗原を特徴付けるのに使用することができる。一過性にトランスフェクションしたＣＯＳ細胞は発明の方法において使用されることができる。
本発明はまた、本発明の方法により特徴付けられた抗原をコードする遺伝子のクローニングすることおよび抗原およびエピトープを特徴付けることを含むワクチンをも考慮する。
本発明のこれらおよび他の面は以下の詳細な記載および添付の図面を参照することにより明らかになるであろう。さらに、本明細書において多様な刊行物（その全体を参照のため本明細書に包含する）が参照されている。
【図面の簡単な説明】
本発明は以下の図面を参照することにより一層理解されるであろう：
図１Ａは細胞障害性の特定のパーセンテージを産生するＶＳＶ−Ｎペプチドの濃度を示す棒グラフであり；
図１ＢはＶＳＶ感染細胞（ＲＭＡ＋ＶＳＶ）、合成ペプチドでパルス下細胞（ＲＭＡ＋ｐ）およびコントロール細胞（ＲＭＡ＋−）感染していない、クロム付加、標的細胞をペプチド産生し、かつペプチドをトランスファーすることができる能力を示す棒グラフであり；
図１Ｃは１２時間感染したＲＭＡ細胞（ＲＭＡ＋ＶＳＶ）、エフェクターの付加直前ＶＳＶで処理した細胞ペプチド産生し、かつペプチドをトランスファーすることができる能力を示す棒グラフであり；
図２Ａは、ＶＳＶによって処理または処理していない（Ｌ＋−）ヒトＴ１またはマウスＬｔｋ−（Ｌ）およびＮＩＨ３Ｔ３（ＮＩＨ）細胞のペプチドを産生しかつ感染していないクロム付加、標的細胞にトランスファーの能力の棒グラフであり；
図２Ｂは、Ｔ１、ＬおよびＮＩＨ３Ｔ３細胞がＶＳＶ特異的Ｋb制限ＣＴＬによって溶解されないことを示す棒グラフであり；
図２Ｃは、ペプチドを産生し、かつ感染していない、クロム付加、標的細胞にペプチドをトランスファーできるＣＭＴ．１−４細胞を発現するＴＡＰ１の能力を示す棒グラフであり；
図３ＡはＶＳＶ感染ヒトＴ２およびマウスＣＭＴ．６４細胞がＶＳＶ特異的Ｋb制限ＣＴＬによって認識されないことを示す棒グラフであり；
図３Ｂは、ＶＳＶ処理のありまたはなしで、β２ｍ欠失Ｒ１Ｅ細胞およびＫb（Ｒ１ＥＤｂ）でトランスフェクションしたＲ１Ｅ細胞およびβ２ｍおよびＫbでトランスフェクションしたＲ１Ｅ（Ｒ１ＥＫｂｂ２）を用いてＭＨＣの重鎖または軽鎖のペプチドトランスファーへ及ぼす影響を示す棒グラフであり；
図４はブレフェルディンＡ（ＢＦＡ）のペプチドトランスファーへ及ぼす影響を示した棒グラフであり；
図５はＶＳＶ感染したＬｔｋ-細胞からの上清がＶＳＶ特異的ＣＴＬによるＲＭＡ細胞の溶解を媒介することを支援す棒グラフであり；
図６は本発明の代理抗原プロセシングおよび分泌経路内の抗原ペプチドの別の運命を支援すダイヤグラムであり；
図７ＡはＶＳＶ−Ｎ ５２−５９ペプチドでパルスされていない脾臓細胞からのＣＴＬコントロールアッセイを示すグラフであり；
図７ＢはＶＳＶ−Ｎ ５２−５９ペプチドでパルスされた脾臓細胞からのＣＴＬアッセイを示すグラフであり；
図７ＣはＶＳＶ−Ｎ ５２−５９ペプチドでパルスされた脾臓細胞からのＣＴＬアッセイを示すグラフであり；
図７ＤはＶＳＶ−Ｎ ５２−５９ペプチドでパルスされた脾臓細胞からのＣＴＬアッセイを示すグラフであり；
図８ＡはＶＳＶ−Ｎ ５２−５９をコードする組換えワクシニアウイルスで感染させた後にペプチドトランスファーが起こり、それがＭＨＣハプロタイプ独立であることを示す棒グラフであり；および
図８Ｂは、ペプチドトランスファーがＴＡＰ依存様式において起こることを示す棒グラフである。
発明の詳細な説明
上記のように、本発明者らは抗原が内在的にプロセシングされ、一つの細胞および複数の細胞の分泌経路によって分泌され、イン・ビトロで提示されるために受容体標的細胞に内在的にプロセシングされたペプチドをトランスファーすることができ、特異的にプライミングされたＣＴＬによって有効に認識されることを示した。
本発明者らはペプチドトランスファーがウイルス殺傷または感染細胞からのペプチドのＣＴＬ解放または該細胞表面からの抗原に結合した膜結合ＭＨＣクラスＩの放出に依存しないことを示した。
ウイルス感染した細胞によるペプチドトランスファーはＴＡＰトランスポーターの存在に依存したことを示した。驚くべきことに、ペプチドトランスファーはＭＨＣクラスＩ分子の存在に独立していることがわかり、それによって膜結合したＭＨＣクラスＩ分子に結合した細胞表面に輸送されていないことが示された。ペプチドトランスファーは該細胞の分泌経路を介する活発な輸送を通して起こり、該分泌経路の阻害は標的細胞へのペプチドトランスファーを阻害することを示した。
したがって、前記のように、本発明は新規細胞分泌経路によって内在的にプロセシングすることができ、細胞障害性Ｔリンパ球に提示されるために観標的細胞にトランスファーして抗原を同定する方法、その方法は抗原をＭＨＣクラスＩ分子を欠如している供与体細胞に導入し；供与体細胞が損なわれないような適当な条件下で検出されることができる細胞内マーカーで標的した供与体細胞、該抗原に特異性を有するプライミングされたＴリンパ球およびＭＨＣクラスＩ分子を発現する標的細胞をイン・ビトロで培地中でインキュベートすることを含む。
ＣＴＬに提示するための内在的プロセシングを必要とする抗原がよく知られている。細胞障害性Ｔリンパ球の多様はクラスＩ主要組織適合分子と結合するＭＨＣクラスＩ制限抗原のエピトープを認識する。そのような抗原を通常はＭＨＣクラスＩ制限抗原という。ＭＨＣクラスＩ制限抗原は内在的な細胞プロセシングを必要とする抗原であり、そのエピトープはＣＴＬによる認識のためにＭＨＣクラスＩ分子によって細胞表面に提示される。
内在的なプロセシングに適している抗原は例えば、正常なタンパク質、ウイルスタンパク質、細菌タンパク質、欠損タンパク質または腫瘍タンパク質など細胞に内在性である任意のタンパク質から由来されるであろう。抗原の内在性プロセシングから得られたペプチドは、提示されるＭＨＣクラスＩ分子と相互作用するための適当なアミノ酸配列を有する。細胞表面で発現して得られたペプチドはＣＴＬによって検出されるであろうし、例えばトリフルオロ酢酸で全細胞を処理することによって細胞から抽出されることができる。ＭＨＣクラスＩ抗原の例は、例えばインフルエンザ核タンパク質、水疱性口内炎ウイルスＮタンパク質（ＶＳＶ−Ｎ）、腫瘍抗原、ＨＳＶ、厳正生物抗原、細菌抗原または寄生生物抗原、異種ペプチド、自己ペプチド、ＨＩＶペプチドおよび内在性ペプチドおよび他のウイルスペプチド供与体どのウイルス抗原を含む。ＭＨＣクラスＩ抗原の例はラメンジー（Rammensee）ら、１９９５（Immunogenetics, ４１：１７８−２２８）において提供される。
内在的にプロセシングしている抗原のための細胞分泌経路は、これまで記載されていなかった。細胞分泌経路によってとは細胞内抗原プロセシングの経路を意味し、それによって内在的抗原は細胞内に退行され、傍観標的細胞のＭＨＣクラスＩ分子の細胞表面との相互作用に適している形態において細胞から分泌されるペプチドにプロセシングされる。細胞分泌経路は内在性抗原プロセシングの既知の経路から区別されるであろうし、細胞内のＭＨＣクラスＩ分子の存在に依存する。というのは細胞分泌経路は抗原プロセシング細胞においてＭＨＣクラスＩ分子の存在に依存しないからである。
細胞分泌経路はさらに該細胞内の機能的なＴＡＰトランスポーターの発現に依存していると特徴付けられ、ブレフェルディンＡ（Brefeldin A）などのタンパク質分泌のインヒビターによって特異的に阻害される。ゴルジ体（Goldi）を分裂させる化合物または分泌タンパク質のエクソサイトーシスと相互作用する化合物は細胞からタンパク質分泌を阻害するであろうことが認識されるであろう。特に、細胞分泌経路はブレフェルディンＡによって阻害され、好ましくはタンパク質分泌を阻害する濃度では細胞の生存には害を全く及ぼさず、その濃度は例えば、１から０μg／ml、より好ましくは３〜６μg／ml、最も好ましくは４〜５μg／mlである。
細胞分泌経路のブレフェルディンＡなどの細胞分泌の特定のインヒビターに対する感受性は、細胞分泌経路を在外抗原をプロセシングするための経路から明瞭に区別し、それによって在外抗原は該細胞表面でのＭＨＣクラスＩ分子と結合することができるであろう。外在抗原のプロセシングは、ブレフェルディンＡによっては影響されない。
本発明の方法における使用のための適切な供与体は、細胞分泌経路によって内在性プロセシングされることができ、かつＣＴＬに提示される傍観標的細胞にトランスファーされる抗原を同定するため、任意の動物細胞、好ましくはＭＨＣクラスＩ分子の細胞表面発現が欠如している哺乳類細胞である。上記のように、ＭＨＣクラスＩ分子の細胞表面発現が欠如している供与体細胞は、本発明の方法において使用されて新規の細胞分泌経路を、ＭＨＣクラスＩ分子の存在に依存し、それによって内在性抗原からプロセシングされたペプチドがＭＨＣクラスＩ分子と結合してのみ細胞表面に輸送される、公知の外在抗原プロセシング経路と区別する。しかしながら、適当なコントロールと共に、ＭＨＣクラスＩ分子を有する細胞は供与体細胞として使用されることができることも期待される。
ＭＨＣクラスＩ分子の細胞表面発現を欠如している哺乳類細胞は当該技術分野において公知の方法によって選択されることができる。適当な細胞はＭＨＣクラスＩ分子をコードする適当な遺伝子が欠損しているかまたは機能的に欠損しており、ＭＨＣ遺伝子座において突然変異を有しており、該細胞表面にＭＨＣクラスＩ分子を輸送することができず、またはＭＨＣクラスＩ分子の発現が欠損しているものであり得る。非哺乳類動物細胞は鳥類、両生類、爬虫類、魚類および昆虫細胞などの供与体細胞として使用されることができることも期待される。
ＭＨＣクラスＩ分子の細胞表面発現において欠失している供与体細胞は、例えばＶＳＶなどの組換えウイルスベクターで細胞を感染させることによって選択され、ＶＳＶ特異的ＣＴＬによる溶解を試験することによって選択されることができるであろう。ＦＡＣＳ分析はまた、推定供与体細胞の表面上のＭＨＣクラスＩ分子を検出するために使用されることもできるであろう。ＭＨＣクラスＩ分子の生合成および細胞内輸送はまた生化学的に特徴付けられる。例えば、ＥＲ内に存在するタンパク質の特徴的な高マンノース形態にある場合のみＮ−結合したオリゴサッカリドを開裂するendo Hおよびシス−ゴルジ体は使用されて細胞内輸送を測定するであろう。パルスチェイス方法論はまた、ＭＨＣクラスＩ分子の細胞表面発現を欠如している供与体細胞を確実にするために利用されるであろう。上記の方法は一部レスティフォ（Restifo, N.P.）ら（１９９３、J. Exp. Mes. １７７：２６５）に例解されている。
ＭＨＣクラスＩ分子の低レベルを発現する細胞の例は、大腸、胸、肺中皮腫および小細胞組織学の肺癌由来の腫瘍細胞である（レスティフォ、上記、１９９３参照）。
適当な供与体細胞の例はβ２−ミクログロブリンを欠如している細胞を含み、それは細胞表面にＭＨＣクラスＩ分子の細胞内輸送に必要とされる。β２ミクログロブリンに欠失している細胞の例マウスＲ１Ｅ細胞を含み、ついでヒトダウディ（Daudi）細胞株を含む。細胞表面ＭＨＣクラスＩ分子において欠失している腫瘍細胞もまた使用される。適当な供与体細胞はヒトＴ１（サルター（Salter, R.O.）およびクレスウェル（P.Cresswell）、１９８６、EMBO J. ５：９４３）、マウスＬｔk（Ｈ−２k）、ＮＩＨ３Ｔ３（Ｈ−２d）、Ｒ１Ｅ（ウィリアムズ（Williams）ら、１９８９、J.Immnol. １４２：１７９６）を含む。染色体欠失ＬＣＬ細胞、異種トランスファーのＨＬＡを発現するＴ２細胞およびマウス細胞株は本発明の方法において使用されてよい。
好ましくは、供与体細胞は例えばプロテアソーム成分およびＴＡＰトランスポーターなどの内在性抗原プロセシングの他の面において防御的でなく選択されるべきである。ＭＨＣクラスＩ分子に加えてある種のプロテアソームまたはＴＡＰトランスポーター成分において欠損した細胞はプロテアソームまたはトランスポーター欠失を正すことによって供与体細胞としての使用に適応されるかもしれない。例えば、該細胞がＴＡＰ１またはＴＡＰ２、腫瘍細胞などにおいて欠損しているなら、この欠失は該細胞にＴＡＰ１および／またはＴＡＰ２をコードするヌクレオチド配列を導入することによって修正されるであろう。
細胞分泌経路によってプロセシングされることができ、傍観標的細胞にトランスファーされることができる抗原を同定するための本発明の方法は、適当なコントロールが行われる限りＭＨＣクラスＩの表面発現において欠失しているのは必ずしも必要ない供与体細胞を用いて行うことができる。適当なコントロールは、公知のＭＨＣクラスＩ依存内在性抗原プロセシングの経路は新規の細胞分泌経路と区別するよう機能するものである。そのようなコントロールは供与体細胞の表面にてＭＨＣクラスＩが抗原に結合する可能性を排除するために行われるべきものであり、標的傍観細胞と結合する培地中に放出される。例えば、該細胞は合成ペプチドでパルスされ、ついでその後放出されるかまたはアンチセンスヌクレオチド分子はＭＨＣ発現を阻害するために使用されるであろう。ＶＳＶ感染細胞の上清の使用はＶＳＶ特異的殺傷のための細胞を感受性を高くする。
本発明の方法において同定されるべき抗原は天然に存在する供与体細胞または当該技術分野において公知の方法によって供与体細胞に導入されることができるかもしれない。該抗原はマイクロインジェクションによって細胞に導入されるかもしれない。該抗原はまた、該抗原をコードする核酸分子を供与体細胞におけるの発現を得るための適当な条件下で供与体細胞に導入することによって供与対細胞に導入される。
ある抗原をコードする核酸分子は適当なプロモーター条件下で供与体細胞に導入されるかもしれない。該抗原をコードする核酸は当該技術分野において公知の技術を用いて容易に合成されるであろう。ある抗原をコードする核酸分子は、例えばＲＮＡからｃＤＮＡｓを合成することおよび該抗原に特異的なオリゴヌクレオチドを用いてｃＤＮＡ末端オリゴヌクレオチド急速増幅（ＲＡＣＥ、フローマン（Frohman）ら、１９８８）を使用することによって、単離およびシークエンシングすることができ、ついで増幅後得られたクローンの配列を分析する。害抗原に特異的なオリゴヌクレオチドは該抗原の公知の配列と核酸配列を比較することによって同定されるであろう。該抗原をコードする核酸分子はまた、化学合成および当該技術分野において公知の手法を用いた酵素的ライゲーション反応によっても構築されるであろう。該抗原をコードする配列はまた、組換えＤＮＡ方法を用いて調製されるであろう。
該抗原をコードする配列を有する核酸分子は該抗原またはその一部の明瞭な発現を確実にする適当な発現ベクターに公知の方法によって組み入れられることができる。発現ベクターの可能性のあるベクターには、以下に限るものではないが、該供与体細胞と適合したベクターが使用される限り、コスミド、プラスミドまたは修飾したウイルスが含まれる。
本明細書に記載される核酸分子には転写および挿入されたタンパク質抗原配列の翻訳の不可欠要素を含むと考えられている。適当暗転写要素および翻訳要素は細菌、真菌、ウイルス、哺乳類または昆虫遺伝子を含む多様な源由来であってよい。適当暗転写要素および翻訳要素の選択は、以下に議論するように選択された供与体細胞に依存しており、当業者によって容易に達成されるであろう。そのような要素の例には、翻訳開始シグナルを含む、転写プロモーターおよびエンハンサーまたはＲＮＡポリメラーゼ結合配列、リボソーム結合配列を含む。さらに、選択された供与体細胞および使用したベクターに依存して、複製起点などの他の遺伝的要素および転写の誘発可能性を付与する配列は発現ベクターに導入される。また必要な転写要素および翻訳要素はもともとの抗原をコードする核酸分子によって提供されるであろう。
核酸分子はまた、形質転換した供与体細胞またはトランスフェクションした供与体細胞の選択を容易にするリポーター遺伝子をも含むであろう。リポーター遺伝子の例には、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ホタルルシフェラーゼまたは免疫グロブリン、好ましくはＩｇＧのＦｃタンパク質などの免疫グロブリンまたは一部などのタンパク質をコードする遺伝子である。好ましい態様において、該リポーター遺伝子はlacZである。リポーター遺伝子の転写はβ−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼまたはホタルルシフェラーゼなどのリポータータンパク質の濃度における変化によってモニターされる。これは供与体細胞中で該抗原の可視化および発現に関するアセチルを可能にする。
ある抗原をコードする配列を含む核酸分子は、形質転換、トランスフェクション、感染、エレクトロポレーションなどを介して供与体細胞に導入されることができる。外来ＤＮＡを発現させるために宿主細胞を形質転換、トランスフェクションする方法は、当該技術分野においてよく知られている（例えばイタクラ（Itakura）ら、米国特許第４，７０４，３６２号；ヒンネン（Hinnnen）ら、PNAS USA ７５：１９２９−１９３３、１９７８；ムレイ（Murray）ら、米国特許第４，８０１，５４２号；アプシャル（Upshall）ら、米国特許第４，９３５，３４９号；ハーゲン（Hagen）ら、米国特許第４，７８４，９５０号；アクセル（Axel）ら、米国特許第４，３９９，２１６号；ゲッデル（Goeddel）ら、米国特許第４，７６６，０７５号；およびサンブルックら、モレキュラー・クローニング・ア・ラボラトリー・マニュアル、第２版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Cold Spring Harbor Laboratory Press）、１９８９、すべては参照のため本明細書に包含されている）。
哺乳類供与体細胞において発現を指令するための適当な発現ベクターは一般的には、プロモーターならびに他の転写および翻訳コントロール配列を含む。一般的なプロモーターには、ＳＶ４０、ＭＭＴＶ、メタロチオネイン−１、アデノウイルスＥｌａ、ＣＭＶ、即時初期、免疫グロブリン重鎖プロモーターおよびエンヘンサーおよびＲＳＶ−ＬＴＲを含む。哺乳類細胞のトランスフェクションのプロトコールは当業者によく知られている。代表的な方法には、リン酸カルシウム媒介エレクトロポレーション、レトロウイルス、および原生動物融合媒介トランスフェクション（サンブルックら、上記参照）。
ある態様において、核酸分子はウイルスベクター好ましくはワクシニアウイルスベクター、最も好ましくは弱毒化したベクターにおいて供与体細胞に導入されるであろう。ワクシニアウイルスと共に使用する適当なプロモーターはＰ７．５（コクラン（Cochran,M.A.）ら、１９８５、J.Virol. ５４：３０）、Ｐ１１（ベルトレット（Berthplrt, C.）ら、１９８５、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、８２：２０９６）、ＣＡＥ−１（パテル（Patel, D.D.）ら、１９８８、Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８５：９４３１）を含む。
核酸分子を含むワクシニアウイルスは同種の組換えによって調製されるであろう。一態様において、ＶＳＶペプチドをコードする核酸分子はＰＪＳ５などのワクシニアウイルスシャトルベクターにライゲーションされるであろう。該ベクターはワクシニアウイルスに感染された細胞にトランスフェクションされてよく、その結果ＶＳＶペプチドをコードする核酸分子は同種組換えによってワクシニアウイルスに挿入される。
該核酸分子はワクシニアウイルスベクターの必須ではない部位に挿入されるであろう。そのような必須でない部位はよく知られており、例えばペルカス（Perkus）ら、１９８６、Virology １５２：２８５；ルービー（Hruby）ら、１９８３、Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８０：３４１１および；ヴェール（Weir）およびモス（Moss, B）、１９８３、J. Virol. ４６：５３０に記載されている。該抗原を発現する組換えウイルスは当該技術分野において公知の技術を用いて容易に同定されることができ、ついで例えばモス、１９９２（Curr. Topics Microbiol. Immunol. １５８：２５）において議論されている。
該抗原はまた、本来供与体細胞に存在する例えば内在性腫瘍抗原などの内在性抗原であることもあると考えられている。細胞内病原体の抗原は、病原体を有する供与体細胞を感染させることによって供与体細胞を導入されてよい。細胞内病原体の例には、例えばＨＩＶ、インフルエンザウイルス、ヘルペスウイルス、パピローマウイルス、レトロウイルスおよびリケッチャおよび細胞内細菌病原体、マラリア、トリパノソーマおよびリーシュマニアなどの原生動物寄生生物などのウイルスを含む。
該抗原に特異性を有するプライミングされたＣＴＬを公知の方法によって得ることができる。特異的にプライミングされた細胞障害性Ｔリンパ球は、細胞内病原体に感染した哺乳類または関心のある抗原を発現する腫瘍を有する哺乳類の脾臓、血液またはリンパ節から得られるかもしれない。
該抗原に対する特異性を有するプライミングされたＣＴＬはまた、該抗原で哺乳類を免疫することによっても得られる。細胞障害性免疫をプライミングするための哺乳類の免疫方法は、例えばロック（Rock, K. L.）ら（１９９３、J.Immunol. １５０：１２４４）およびモス（１９９０、Seminars in Imuunol. ２：３１７）に記載されている。適当な免疫のプロトコールは該抗原またはそのペプチド断片を共にβ−ミクログロブリンと共に投与するか、または該抗原または該抗原のペプチド断片をコードする組換えウイルスベクターを投与することを含む。
本発明の方法における使用に適した標的細胞は、その表面にＭＨＣクラスＩ分子を発現する哺乳類細胞を含む。該標的細胞およびプライミングされたＣＴＬは同じ哺乳類から選択されるであろう。標的細胞が関心のある抗原をそれ自身発現せず、選択されるべきであると認識されている。例えば、関心のある抗原が腫瘍抗原であるかまたは哺乳類の細胞内病原体である場合、適当な標的細胞は哺乳類の非腫瘍細胞または非感染細胞から選択されるであろう。哺乳類以外の細胞もまた例えば、適当なＭＨＣでトランスフェクションされるであろう他の動物からの細胞を使用してもよいと認識されている。
適当なインキュベーション培地およびイン・ビボ培養の間に哺乳類細胞を維持する条件はよく知られている。該標的細胞は検出可能な細胞内マーカーで標識される。該細胞内マーカーは細胞のダメージおよび標的細胞の溶解なしには標的細胞から容易に放出されないものであるべきである。適当な細胞内マーカーには、[51]Ｃｒ、蛍光マーカーまたはベックマン（Beckman）試薬を含む。
細胞分泌経路によって内在的にプロセシングされ、細胞障害性Ｔリンパ球に提示される傍観標的細胞にトランスファーされた抗原は、培地中に検出可能な細胞内標識の放出に基づくか、またはチミダーゼまたはＤＮＡ断片の検出に基づく標的細胞の死の、いくつかの測定に基づくものであってよい。
上記のように、本発明はまた、細胞分泌経路に内在的にプロセシングした抗原のプロセシングに影響を及ぼす物質の存在に関して培地をアッセイする方法を提供し、その方法には、イン・ビトロで培地中で、供与体細胞の分泌経路によって内在的にプロセシングされることができる抗原を有する供与体哺乳類細胞、ＭＨＣクラスＩ分子を発現し、検出可能な細胞内マーカーで標識した標的細胞、および該供与体細胞が損なわれずにいるような適当な条件下で細胞分泌経路において内在的にプロセシングされた抗原のプロセシングに影響を及ぼすと考えられる物質の存在下または不在かで該抗原の特異性を有するプライミングした細胞障害性リンパ球をインキュベートし、ついで；該物質の存在下または不在下で培地に放出された検出可能なマーカーの量を測定することが含まれる。細胞分泌経路において内在的にプロセシングされた抗原のプロセシングを刺激または阻害する物質は本発明の方法において、該物質の不在下で行われるコントロールインキュベートに非アックしてある時間かけて培地に放出されている検出可能なマーカーのおのおのの量の増加または現象という結果となる。
該方法は分泌というよりはむしろ、例えば成長ホルモンなどの供与体細胞から分泌されると知られているタンパク質の分泌に関する物質の影響を同じに決定することにとって細胞分泌経路において内在的にプロセシングされた物質を特異的にアッセイすることによる。
本発明の方法は、したがって、哺乳類にイン・ビボでおよび腫瘍およびウイルスなどの細胞内病原体による感染を治療するための薬剤として有用である細胞分泌経路によって細胞から抗原の分泌を刺激または阻害する物質が免疫調整効果を有する物質を同定するために使用されることができる。
自己免疫疾患、特ＨＬＡ−Ｂ２７などの関連した脊椎関節炎（spondyloarthropathies）、例えば強直性脊椎炎、ライター症候群および応答性関節炎（reactive arthritis）、１型多内分泌退行（type I poryendocrine failure）、多発性硬化症、甲状腺機能低下症、橋本病、グレーブス病および尋常性乾癬、および細胞内病原体の外来抗原に対する過剰な免疫応答から生じる自己免疫疾患を含む自己免疫疾患に関連したＭＨＣクラスＩ関連の疾患の治療に有用である。抗原分泌を阻害する物質もまた、ＣＴＬの消耗および枯渇を防ぐために抗原負荷が高いウイルス感染の治療に有用であり、それによって免疫学的寛容の進展へと導く。抗原分泌を阻害する物質はまた、拒絶を回避するために移植の前に生物体を治療するためおよび免疫拒絶応答を低減させるために移植された組織または器官で治療するために使用されることができる。
抗原分泌を刺激する物質は腫瘍の治療および細胞内病原体の治療に有用であろうし、腫瘍または病原体抗原は一般的に、免疫系からシークエンシングされ、ＭＨＣクラスＩ分子によって細胞の表面には適当に提示されない。
上記のように、該発明はさらになお、細胞分泌経路によって内在的にプロセシングされることができる腫瘍またはウイルスの特徴付けの方法を提供し、その方法は：哺乳類から腫瘍またはウイルス感染した細胞および腫瘍またはウイルスに感染した細胞に対する特異性を有するプライミングした細胞障害性Ｔリンパ球を得て；腫瘍またはウイルス感染した細胞からｃＤＮＡライブラリーを調製し、ついでトランスフェクションした宿主細胞中でｃＤＮＡライブラリーを発現させ；トランスフェクションした宿主細胞、ＭＨＣクラスＩ分子を発現し、供与体が損なわれないような適当な条件下で培地中に放出された検出可能なマーカーおよびプライミングした細胞障害性リンパ球で標識した標的細胞をインキュベートし、ついで；該培地中に放出された検出可能なマーカーの量を測定し、ついで標的細胞の溶解を引き起こすことができるトランスフェクションされた細胞を同定し、かつその同定されたトランスフェクションされた細胞のトランスフェクションしたＤＮＡを特徴付けることを含む。
腫瘍細胞およびプライミングされたＣＴＬが得られる哺乳類は天然に存在する腫瘍または腫瘍発生物質によって誘発された腫瘍を有する哺乳類であってよく、または腫瘍が導入される哺乳類であってよい。該哺乳類は腫瘍を有するヒトであってよく、またヒト腫瘍またはヒト腫瘍細胞株が導入されているヒト以外の哺乳類でもあってよい。ヒト腫瘍細胞株はよく知られており、例えば、レスティフォら、（１９９３）、J. Exp. Med. １７７：２６５などを参照。ｃＤＮＡ発現ライブラリーは既知の技術に従い、腫瘍細胞からのｍＲＮＡを用いて構築されることができる。
細胞分泌経路によってプロセシングされる抗原をコードするｃＤＮＡクローンは同定され、サブクローニングされてついでシークエンシングされてよい。ｃＤＮＡ配列またはその断片は該抗原をコードするゲノムＤＮＡを単離するハイブリダイゼーションプローブとして使用されてよい。それゆえ、本発明は腫瘍抗原をコードする遺伝子をクローニングおよび該抗原を単離するための方法を提供してよい。該抗原の同定および単離は腫瘍に対する細胞障害性Ｔリンパ球の進展における害高原の役割の研究を可能にし、かつ免疫応答のスティミュレーターまたはインヒビターとしての免疫の進展に影響を及ぼす物質の開発を可能にするであろう。ワクチンは例えばレトロウイルスワクチンなどの遺伝子を用いて開発されてよい。発現された抗原は、またワクチンの根本として使用されてよい。該抗原は、腫瘍の免疫認識を援助するための多くの腫瘍に起こるからのＭＨＣ２分子に結合すると考えられている。
腫瘍抗原をコードする核酸分子が単離され、ついでシークエンシングされて該抗原またはその一部の明瞭な発現を確実にする組換え分子に組み入れられるであろう。一般的に本発明の組換え分子は、核酸分子またはそのオリゴヌクレオチド断片、核酸分子に作動可能に結合した発現コントロール配列またはオリゴヌクレオチド断片を含む。本発明の核酸分子、またはそのオリゴヌクレオチド断片は、例えばｐＥＣＥなどのプラスミドベクターに組み入れられることができる。適当な調節要素は細菌、真菌、ウイルス、哺乳類または昆虫遺伝子を含む多様な源から得られるであろう。適当な調節要素の選択は、選択された宿主細胞に依存し、ついで当業者によって容易に達成されるであろう。調節要素の例は、例えば転写プロモーターオリゴヌクレオチドおよびエンヘンサーまたはＲＮＡポリメラーゼ結合配列、翻訳開始シグナルなどのリボソーム結合配列を含む。さらに、選択された宿主細胞および使用されたベクターに依存して、他の遺伝的要素、例えば複製起点、更なるＤＮＡ制限部位、エンヘンサー、転写誘発性を付与する配列および選択可能なマーカーなどは発現ベクターに組み入れられるであろう。
該抗原、またはその一部は当該技術分野において公知の方法を用いて適当な宿主細胞における発現によって得られるであろう。適当な宿主細胞には、原核生物、または真核生物または例えば、酵母、大腸菌（E.coli）などの細胞株、宿主細胞として使用されるであろうマウスＮＩＨ３Ｔ３細胞などが含まれる。該タンパク質またはその一部は例えば固相合成法（メリフィールド（Merrifield）1964、J.Am. Chem. Assoc. ８５：２１４９−２１５４）などのタンパク質化学においてよく知られた方法を用いて科学的な合成によって調整されるかまたは同種溶液において合成（ホウベンウェイル（Houbenweyl）、１９８７、Methods of Organic Chemistry、ワンシュ（E. Wansch）編、１５１巻およびシーム（H, Thime）、シュトゥットガルト）されるであろう。
該抗原またはその一部をコードするＤＮＡ配列は、多様な細菌、哺乳類、酵母またはタンパク質の真菌、ウイルス、植物または昆虫細胞を含む原核生物および真核生物細胞によって発現されるであろう。外来ＤＮＡを発現するような細胞を形質転換またはトランスフェクションする方法は当該技術分野においてよく知られている（例えばイタクラら、米国特許第４，７０４，３６２号；ヒンネンら、PNAS USA ７５：１９２９−１９３３、１９７８；ムレイら、米国特許第４，８０１，５４２号；アプシャルら、米国特許第４，９３５，３４９号；ハーゲンら、米国特許第４，７８４，９５０号；アクセルら、米国特許第４，３９９，２１６号；ゲッデルら、米国特許第４，７６６，０７５号；およびサンブルックら、モレキュラー・クローニング・ア・ラボラトリー・マニュアル、第２版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、１９８９、すべては参照のため本明細書に包含されている）。
好ましくは腫瘍抗原は哺乳類細胞に発現される。本発明を行うのに適している哺乳類細胞は、数ある中でもＣＯＳ（例えばＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５０または１６５１号）、ＢＨＫ（例えばＡＴＣＣ ＣＲＬ ６２８１号）、ＣＨＯ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ６１号）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２号）、２９３（ＡＴＣＣ １５７３号）、Ｌ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞およびＮＳ−１細胞が含まれる。哺乳類細胞において発現を指令する適当な発現ベクターは、一般的にプロモーターならびにタンパク質の転写コントロール配列および翻訳コントロール配列が含まれる。一般的プロモーターにはＳＶ４０、ＭＭＴＶ、メタロチオネイン−１、アデノウイルスＥｌａ、ＣＭＶ、即時初期、免疫グロブリン重鎖プロモーターおよびエンヘンサーおよびＲＳＶ−ＬＴＲを含む。哺乳類細胞のトランスフェクションのプロトコールは当業者によく知られている。代表的な方法には、リン酸カルシウム媒介エレクトロポレーション、レトロウイルス、および原生動物融合媒介トランスフェクション（サンブルックら、上記参照）。
該腫瘍抗原は、組換え抗原を発現するため、上記の宿主／ベクターを培養することによって調製されることができる。
本発明の方法は、腫瘍抗原以外の抗原を特徴付けるために使用されることができ、それは細胞分泌経路によって内在的にプロセシングされることができると考えられている。例えば該方法はウイルス、細菌および原生動物などの細胞内病原体の抗原を特徴付けるのも有用であろう。
標的細胞の溶解を引き起こすことができるトランスフェクションした宿主細胞のトランスフェクションＤＮＡの発現産物は直接的に特徴付けられる。溶解は該標的細胞の表面上のＭＨＣクラスＩ分子によって提示される抗原ペプチドのＣＴＬ認識から生じる。したがって、該関連抗原ペプチドと共にＭＨＣクラスＩ分子はインキュベーション培地から単離されるであろうし、ついで記載したように、ヴァン・ブリーク、およびナゼンソン、１９９０、Nature ３４８：２１３；およびラメンジーら、１９９５、Immunogenetics、４１：１７８−２２８に記載されるような既知の方法を用いて抽出された抗原ペプチドから単離される。同定された該抗原ペプチドは該抗原の優性Ｔ細胞エピトープであってよい。
ＭＨＣクラスＩ画分は免疫沈降によってインキュベーション培地から単離されることができ、低分子量ペプチド画分は遠心後、酸変性によって抽出されるであろう。低分子量ペプチド画分は逆相ＨＰＬＣによって分離されるであろう。Ｔ細胞レセプターによって認識された抗原ペプチドに対応する顕著なピークはトランスフェクションしていない供与体細胞でインキュベーションしたコントロール標的細胞から得られた外形と比較することによって、同定されるであろう。該抗原ペプチドに対応する顕著なピークはさらに、例えばマイクロシークエンシングなどによって分析されるであろう。抗原ペプチドはまた、ペプチドスキャン法または欠損分析によって同定されるであろう。
標的細胞の溶解を引き起こすことができる感染細胞のＤＮＡは、また特徴付けられる。一態様において、溶解を引き起こすことができるすべてのトランスフェクションした宿主細胞が貯蔵され、その抽出されたＤＮＡおよび一またはそれ以上のスクリーニングを繰り返す宿主細胞中にトランスフェクションしたＤＮＡが貯蔵される。最終的には、溶解を引き起こすことができる抗原を発現している単独のトランスフェクションしたＤＮＡ配列は同定され、シークエンシングによってさらに特徴付けられるためにシークエンシングおよび発現させられる。
したがって、本発明の方法はＴ細胞レセプターによって認識された腫瘍またはウイルス抗原からの抗原ペプチドまたはエピトープを同定するための方法を提供する。
本明細書に引用されたすべての刊行物、特許および特許出願は各個々の刊行物または特許または特許出願が具体的に全体として参照として引用されていると示されると同程度にその実態において参照によってその全体を本明細書に引用されている。
以下の実施例は例示のために提供するのであって、限定することを意図するものではない。
実施例
実施例１
ウイルス感染ＲＭＡ細胞はペプチドを受容体のクロム標識非感染ＲＭＡ細胞にトランスファーする
代理抗原プロセシングを調べるシステムを、ＭＨＣクラスＩのＫb分子により提示されるＶＳＶ−Ｎタンパク質の免疫優性エピトープ（ＶＳＶ−Ｎ５２−５９）を用いて開発した。
ＶＳＶに特異的なＣＴＬエフェクターを、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの耳および足部にＶＳＶ（部位当たり５×１０6ＴＣＩＤ50）を注入することにより生成した。５日後、水切りしたリンパ節を除去し、リンパ球を４×１０6細胞／ｍｌにて３日間、刺激不在下で培養した。
非放射性標的（Cold target）を以下のようにして調製した：ＲＭＡ細胞をＶＳＶ（ＭＯＩ ２）で１２〜１８時間処理し、その後、３回洗浄した。放射性標的（Hot target）を以下のようにして調製した：ＲＭＡ細胞をＶＳ[51]Ｃｒで２時間処理し、その後、３回洗浄した。
非放射性標的を２×１０5細胞／ウエルから出発して２倍希釈した。各ウエルに１×１０6のエフェクターおよび１×１０4の放射性標的を入れた。エフェクター、非放射性標的および放射性標的をＶ−底９６ウエルプレート中で一緒に４時間インキュベートし、ついで１００μｌの上澄み液を取り、ついでそれから放出される放射能をカウントした。
図１Ａは、特定のパーセントの細胞障害毒性を生じるＶＳＶ−Ｎペプチドの濃度を示す。最大クロム放出の５０％が５０ｐＭのペプチド濃度で得られた。この結果は非常に再現性の高いものであった。
ＲＭＡ用量応答を決定するため、種々の濃度のペプチドＶＳＶ Ｎ５２−５９を適用した熱ＲＭＡ標的細胞に対してエフェクター細胞を試験した。
エフェクター細胞集団を、種々の濃度のペプチドＶＳＶ Ｎ５２−５９を適用した熱ＲＭＡ標的細胞に対して２時間、用量応答で試験した。細胞がペプチドをプロセシングし生成したペプチドを非感染細胞に輸送する能力を、クロムで標識していない細胞を感染させ、ついでこれら細胞をクロム標識非感染標的細胞とともにインキュベートすることにより調べた（図１Ｂ）。野性型のＲＭＡ感染細胞をペプチド供与体として用いた場合には、本発明者らは非感染ＲＭＡ細胞が有効に（２０／１の冷／熱で２５％以上）死滅されることを見出した。本発明者らの標準曲線から、クロム標識標的細胞がＶＳＶ感染細胞からの最小１０〜５０ｐＭのペプチドに曝露されていたことが示唆される。
図１Ｂにおいて、代理細胞に高濃度の合成ペプチドを適用する対照を含めたのは、該ペプチドが傍観者標的上のＴ細胞によって細胞質膜から起動認識へ交換しうるか否かを調べるためであった。飽和濃度の抗原ペプチドを適用した細胞はペプチドを受容体細胞に有効に輸送しえないことがわかった。このことはフアン（A.Y.C.Huang）ら（Science２６４：９６１、１９９４）によって示唆されているように規定時間外では起こるかもしれないが、本発明者らは本発明者らのアッセイにおいてこのことの証拠を見出せなかった。
ＲＭＡ細胞をＣＴＬアッセイの前に１２時間感染させるか（ＲＭＡ＋ＶＳＶ）、またはエフェクターを加える直前にＲＭＡ細胞をＶＳＶで処理した（ＲＭＡ．４＋ＶＳＶ）。標的に対するエフェクター比は１２．５：１〜１００：１の範囲であった。
このアッセイの時間枠（４時間）では、クロム標識細胞をＶＳＶで感染させることも、タンパク質をプロセシングすることも、その後に特異的なＣＴＬにより認識されることもできなかった（図１Ｃ）。さらに、冷標識競合アッセイを用いた本発明者らの結果は、輸送されたタンパク質が免疫優性なＶＳＶ−Ｎ５２−５９ペプチドであったことを示している（データは示していない）。要するに、ウイルス感染ＲＭＡ細胞は、ペプチドを受容体のクロム標識非感染ＲＭＡ細胞へ輸送する点で極めて有効であることが示された。
実施例２
ヒトＴ１（ＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃ）細胞、マウスＬｔｋ−（Ｈ−２k）細胞およびＮＩＨ３Ｔ３（Ｈ−２d）細胞がペプチドを受容体のＲＭＡ細胞へ輸送する能力
輸送を支配しているメカニズムにウイルス殺傷または感染細胞からのペプチドのＣＴＬによる放出が関与しているか否かを調べるため、本発明者らは、ＶＳＶ特異的なＫb制限ＣＴＬによっては認識されないがウイルスによって感染される能力を依然として保持している細胞を研究した。本発明者らは、ヒトＴ１（ソールター（R.D.Salter）およびクレスウエル（P.Cresswell）、ＥＭＢＯ Ｊ．５：９４３，１９８６）細胞、マウスＬｔｋ−（Ｈ−２k）細胞およびＮＩＨ３Ｔ３（Ｈ−２d）細胞がペプチドを受容体の非感染ＲＭＡ（Ｈ−２b）細胞へ輸送する能力を調べた。
ＣＴＬを実施例１の記載に従って生成し、Ｔ１細胞、ＬＴｋ−（Ｌ）細胞、ＮＩＨ３Ｔ３（ＮＩＨ）細胞およびＣＭＴ．１−４細胞をＶＳＶ（ＭＯＩ ２）とともにまたはＶＳＶ（ＭＯＩ ２）なしで１２〜１８時間処理し、その後、３回洗浄した。放射性標的は[51]Ｃｒで２時間処理し、その後、３回洗浄したＲＭＡ細胞であった。その結果を図２Ａおよび図２Ｃに示す。
ＣＴＬがＴ１、Ｌ、およびＮＩＨ＋ＶＳＶに応答するか否かを決定するため、ＶＳＶ感染後にＴ１細胞、ＬＴｋ−（Ｌ）細胞、ＮＩＨ３Ｔ３（ＮＩＨ）細胞をエフェクターに加え、ＶＳＶ特異的なＣＴＬの標的として種々のエフェクター／標的比（Ｅ：Ｔ）で認識されるか否かを調べるため[51]Ｃｒ標識した。偽感染Ｌｔｋ−細胞（Ｌ＋−）を負の対照として用いた。
図２Ｂにおいて本発明者らは、Ｔ１細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞およびＬ細胞がＶＳＶ特異的なＫb制限ＣＴＬによって溶解されないことを示す。しかしながら、これら各細胞型のそれぞれはペプチドをＲＭＡ細胞へ輸送することができる（図２Ａ）。従って、野性型のＴ１細胞はＶＳＶ特異的なＣＴＬによって認識されないがＶＳＶペプチドを輸送することができる。
実施例３
ペプチド輸送におけるＴＡＰトランスポーターおよびＭＨＣクラスＩ分子の役割
ペプチド輸送に対する抗原プロセシング経路の個々の成分の有意さを確立するため、本発明者らは、この経路の１またはそれ以上の要素を欠失する細胞変異体がペプチドを輸送させうるか否かを調べた。ヒトＴ２（ソールターおよびクレスウエル、ＥＭＢＯ Ｊ．５：９４３，１９８６）細胞およびマウスＣＭＴ．６４（Ｈ−２b）細胞（ジェフリーズ（Jefferies W.A.）ら、J.Immunol. １５１：２９７４、１９９３およびガバスラー（Gabathulerら、１９９４））はＴＡＰ−１およびＴＡ−Ｐ−２のいずれをも発現しない。
ペプチド輸送に対するＴＡＰの効果を以下のようにして調べた。ＣＴＬを実施例１の記載に従って生成した。放射性標的は[51]Ｃｒで２時間処理し、その後、３回洗浄したＲＭＡ細胞であった。ペプチド供与体として働く非放射性標的は、ＲＭＡ、ＣＭＴ．６４＋／−ＩＦＮ−γ（それぞれ、ＣＭＴおよびＣＭＴ．ＩＦＮ）、およびラットＴＡＰ１およびＴＡＰ２遺伝子を感染させたＣＭＴ．６４からなっていた。これらの細胞をＶＳＶ（ＭＯＩ ２）で１２〜１８時間処理し、その後、３回洗浄した。エフェクター、非放射性標的および放射性標的をＶ−底９６ウエルプレート中で一緒に４時間インキュベートし、ついで１００μｌの上澄み液を取り、ついでそれから放出される放射能をカウントした。
ＶＳＶ感染後、本発明者らは、Ｔ２またはＣＭＴ．６４細胞株のいずれもＶＳＶ特異的なＫｂ制限ＣＴＬによって認識されず（ジェフリーズら、J.Immunol. １５１：２９７４，１９９３）（データは示していない）、ペプチドを受容体のＲＭＡ細胞に有効に輸送することができないことを見出した（図３Ａ）。上記のように、野性型のＴ１細胞はＶＳＶ特異的なＣＴＬによって認識されないが（図２Ｂ）ＶＳＶペプチドを輸送することはできる（図２Ａ）。ＩＦＮ−γによって誘発されてＴＡＰ−１およびＴＡＰ−２を発現するＣＭＴ．６４細胞はペプチドを輸送することができた（図３Ａ）。さらに、ラットＴＡＰ−１およびＴＡＰ−２遺伝子でトランスフェクションされたＣＭＴ．６４はペプチドをＲＭＡ細胞に輸送することができた（図３Ａ）。これらデータは、ＴＡＰトランスポーターを欠く感染細胞はペプチドを輸送することができないことを示している。これら結果は、ペプチド交換がＴＡＰトランスポーターの発現に依存していることを明らかにしており、輸送するためにはペプチドがＥＲ中に局在化する必要があることを示唆している。
ペプチドの輸送にとってＭＨＣクラスＩ分子との相互作用およびＭＨＣクラスＩ分子による輸送が必要条件であるか否かを調べるため、本発明者らは、β−２ミクログロブリン欠き、それゆえＭＨＣクラスＩ重鎖を輸送しないマウスＲ１．Ｅ（Ｈ−２k）細胞（ウイリアムズ（D.B.Williams）ら、J.Immunol. １４２：２７９６、１９８９）がＶＳＶペプチドをトランスファーすることができるか否かを調べた。
ペプチド輸送に対する重鎖および軽鎖の効果を以下のようにして調べた。ＣＴＬを実施例１の記載に従って生成した。放射性標的は[51]Ｃｒで２時間処理し、その後、３回洗浄したＲＭＡ細胞であった。非放射性標的は、Ｒ１Ｅ細胞およびその誘導体であるＫbでトランスフェクションしたＲ１Ｅ（Ｒ１ＥＫb）、およびβ２ｍとＫbとでトランスフェクションしたＲ１Ｅ（Ｒ１ＥＫｂｂ２）からなっていた。非放射性標的をＶＳＶ（ＭＯＩ ２）とともにまたはＶＳＶ（ＭＯＩ ２）なしで（Ｒ１ＥＫｂｂ２＋−）１２〜１８時間処理し、その後、３回洗浄した。エフェクター、非放射性標的および放射性標的をＶ−底９６ウエルプレート中で一緒に４時間インキュベートし、ついで１００μｌの上澄み液を取り、ついでそれから放出される放射能をカウントした。その結果を図３Ｂに示す。
図３Ｂに示すように、Ｒ１Ｅ細胞はペプチドをＲＭＡ細胞に有効にトランスファーすることができた。Ｋb分子単独およびＫbとβ−２ミクログロブリンとのこのペプチド輸送に対する貢献を、重鎖または重鎖と軽鎖とでトランスフェクションしたＲ１．Ｅ細胞を調べることにより確立した。Ｋb単独の発現およびＫbとベーター２ミクログロブリンとの両者の発現は、トランスフェクションしたＲ１．Ｅ細胞のペプチド輸送の有効性に影響を及ぼさなかった（図３Ｂ）。このことは、ＭＨＣクラスＩ分子のペプチド結合および輸送がペプチドの輸送に必要ではないことを示している。
実施例４
感染細胞からのペプチド分泌に対するブレフェルジンの作用
ペプチドが感染細胞から分泌されるか否かを調べるため、本発明者らはタンパク質分泌の阻害剤であるブレフェルジンＡを用いた。ブレフェルジンＡを、タンパク質の分泌を有効に阻害するが細胞の生存には有害な作用を及ぼさない以前に報告された（ジェフリーズら、J.Immunol. １５１：２９７４、１９９３、ヌクターン（Nuchtern,J.G.）ら、Nature３３９：２２３，１９８９；ユーデル（Yewdell,J.W.）およびベニンク（J.R.Bennink）、Nature３３９：２２３、１９８９）濃度で用いた。
ペプチド輸送に対するＢＦＡの効果を以下のようにして調べた。ＣＴＬを実施例１の記載に従って生成した。放射性標的は[51]Ｃｒで２時間処理し、その後、３回洗浄したＲＭＡ細胞であった。冷ＲＭＡ細胞を、ＲＭＡ．ＢＦＡで、またはブレフェルジンＡ１０μｇ／ｍｌ（ＢＦＡ）なしで、および／またはＶＳＶ（ＭＯＩ ２）で１２〜１８時間処理し、その後、３回洗浄した。ついで、エフェクター、非放射性標的および放射性標的をＶ−底９６ウエルプレート中で一緒に４時間インキュベートし、ついで１００μｌの上澄み液を取り、ついでそれから放出される放射能をカウントした。
本発明者らは、図４に示すようにブレフェルジンＡがペプチド輸送を劇的に阻害することを見出した。このことは、有効な輸送が起こるためにはペプチドが分泌経路により能動輸送されなければならないことを示唆している。このことはまた、ＶＳＶで感染されたＬｔｋ−細胞からウイルス誘発溶菌の前に回収した増殖培地がＣＴＬ認識のために未感染ＲＭＡ細胞を感作しえたという本発明者らの観察によっても確認された。
実施例５
ＶＳＶ感染Ｌｔｋ−細胞からの上澄み液はＶＳＶ特異的なＣＴＬ認識のために受容体の非感染ＲＭＡ細胞を感作する
実施例１に記載のアッセイにおいて非放射性標的をＶＳＶ感染細胞の上澄み液と置換した。ＶＳＶ感染細胞の上澄み液は、感染後１２時間、ウイルス誘発溶解の前に回収し、Ｇ２５カラムで脱塩し、２ｍｌの培地中で再構成する前に凍結乾燥して５×濃度とした。この上澄み液を[51]Ｃｒ標識ＲＭＡ細胞に加え、その結果生じるＣＴＬ媒体溶解を測定した。[51]Ｃｒ放出をＬＫＢ１２８２ＣＳコンピュガンマ（Compugamma）カウンターにより測定し、比[51]Ｃｒ放出を（実験培地対照）／（全培地対照）×１００％として計算した。自発的な放出は最大放出（１．５％トリトンＸ−１００で処理）の２０％を超えることはなかった。
その結果を図５に示す。図５は、ＶＳＶ感染細胞からの上澄み液がＣＴＬ認識のために非感染ＲＭＡ細胞を感作することを示している。これら結果は、ＣＴＬ溶解のための標的細胞の感作に供与体と受容体との間の接触は必要でないことを示している。
実施例６
ＶＳＶ−Ｎに感染したＬｔｋ細胞は受容体の非感染ＲＭＡ細胞にペプチドを輸送する。初回抗原刺激を受けたＣＴＬによる認識のための受容体標的細胞への内生的にプロセシングされたＶＳＶペプチドの輸送が供与体細胞のＶＳＶ感染の効果の結果としての変則ではないことを確認するため、ＶＳＶ−Ｎペプチドを感染した供与体細胞を調製した。マウスＬｔｋ細胞（Ｌ細胞）をＶＳＶ−Ｎで感染させて、抗原の内生的なプロセシングおよび分泌に影響を及ぼす物質のスクリーニングのための一層制御された便利なシステムを得た。
Ｌ細胞の感染は以下のようにして行った。ＶＳＶ−Ｎおよびネオホスホトランスフェラーゼ遺伝子をコードするＤＮＡ（約１．０μｇ）をリポフェクチン（２μｇ）を用いてトランスフェクションした。トランスフェクションした細胞をジェネチシン（Ｇ４１８）１mg／mlで４日間選択し、その後、その半分のＧ４１８濃度で選択した。単離したクローンを選択し、増殖させ、凍結した。細胞がコンフルエンシーに達した後にトランスフェクションしたクローンを回収した。ついで、その上澄み液を、ＶＳＶ特異的ＣＴＬによる認識および溶解のために非感染標的細胞を感作する能力を調べた。以下の結果（ＲＭＡ標的細胞のパーセント溶解として表してある）が７つの異なるクローンから得られた：Ｌ ＶＳＶ−Ｎ １４４％、Ｌ ＶＳＶ−Ｎ ２ ４９％、Ｌ ＶＳＶ−Ｎ ３ ３８％、Ｌ ＶＳＶ−Ｎ ４ ３５％、Ｌ ＶＳＶ−Ｎ ８ ３７％、Ｌ ＶＳＶ−Ｎ １１ ３５％、およびＬ ＶＳＶ−Ｎ １３ ３７％。
ＶＳＶ−ＮのトランスフェクションがＣＴＬ殺傷のために標的細胞を感作するのに充分であることがわかった。トランスフェクションされたＬ細胞はＣ５７Ｂ１／６マウス（Ｈ−２ｂ）においてＣＴＬ殺傷のためにＶＳＶ特異的細胞によって直接認識されることはなかったが、Ｋb分子を発現する標的細胞にＶＳＶ−Ｎペプチドを輸送することはできた。このことから内生的なタンパク質が、分泌され標的細胞に輸送されるペプチドを産生しうることが確認される。
実施例７
最初の刺激後のＣＴＬの反応性
実施例６に記載のＣＴＬアッセイを脾臓細胞を用いて繰り返した。ペプチドの存在下（ｓｐｌ＋）または不在下（ｓｐｌ−）で再刺激する前にＶＳＶを感染させたマウス（Ｃ５７Ｂ１／６）からの脾臓細胞を培地中に保持した。ペプチドは１μＭのＶＳＶ−Ｎ５２−５９であった。ＣＴＬの再刺激は、１μＭの同ペプチドを適用するか（ｓｐｌ−＋、ｓｐｌ＋＋）またはペプチドを適用せずに（ｓｐｌ−−、ｓｐｌ＋−）再刺激のために添加する３０分前に放射線照射した非感染Ｃ５７−Ｂ１／６マウスからの脾臓細胞を用いて行った。ＣＴＬアッセイの標的は、１μＭのＶＳＶ−Ｎ５２−５９ペプチドを適用し[51]Ｃｒで標識したＲＭＡ細胞であった。図７Ａは、ＶＳＶ−Ｎ５２−５９特異的標的を有効に認識するためには脾臓細胞をペプチドで初回抗原刺激しペプチド適用細胞で再刺激しなければならないことを示している。図７Ｂ、７Ｃおよび７Ｄは、ペプチドが再刺激のため、および先行するインキュベーションにおいては特異的なＣＴＬのために必要で存在していなければならないことを示している。
実施例８
ペプチド輸送はＶＳＶ複製経路によるものではない
ＶＳＶの生活環がＶＳＶ−Ｎ５２−５９ペプチドの放出に特異的に導くものではないことを示すため、ＶＳＶ−Ｎ５２−５９ペプチドをコードする組換えワクシニアウイルスを調製した。
ワクシニアウイルス構築物
ＶＳＶ−Ｎ５２−５９ペプチド遺伝子（ＶＶ−Ｎ）を含む組換えワクシニアウイルスの構築を、まずＶＳＶ−Ｎ５２−５９ペプチドをコードする二本鎖合成オリゴヌクレオチドをワクシニアウイルスシャトルベクターｐＪＳ５（モス（Ｂ．Ｍｏｓｓ）博士、ＮＩＨ、ベセスダ、メリーランドより提供）中にライゲートすることにより行った。ｐＪＳ５中へライゲートするためのＳａｃＩおよびＮｈｅＩ突出を含有するオリゴヌクレオチドは以下のとおりである：３'−ｔｃｇａｇ−ｔａｃ−ｔｃｔ−ｃｃｔ−ａｔａ−ｃａｇ−ａｔｇ−ｇｔｔ−ｃｃｇ−ｇａｇ−ａｃｔ−ｃｇａｔｃ−５'で、その相補鎖は５'−ｃ−ａｔｇ−ａｇａ−ｇｇａ−ｔａｔ−ｇｔｃ−ｔａｃ−ｃａａ−ｇｇｃ−ｃｔｃ−ｔｇａ−ｇ−３'。ついで、ワクシニアウイルス（ギラン（S.Gillam）博士、バンクーバー、ブリテイッシュコロンビアより提供されたＷＲ株）を感染させたＣＶ−１細胞中にｐＪＳ５−ＶＳＶＮ５２−５９構築物をトランスフェクションしたときに相同組換えによりＶＶ−Ｎペプチドが調製された。ＶＶ−ＮペプチドをＢＳ−Ｃ−１細胞中で３回プラーク精製し、ついでショ糖勾配（アール（Earl）およびモス、１９９２）上でウイルス精製する前にヒーラＳ３細胞中で増幅させた。挿入を有しないシャトルベクターｐＪＳ５もワクシニアウイルス中にクローニングして（ＶＶ−ｐＪＳ５）ベクターのみの対照を得た。
ワクシニアウイルス感染
非放射性標的のワクシニアウイルス感染を以下のようにして行った。ＶＶ−ＮペプチドおよびＶＶ−ｐＪＳ５を０．１容量２．５ｍｇ／ｍｌトリプシン（ジフコ（（Difco）１：２５０）中、３７℃で３０分間トリプシン処理し、各１０分間攪拌した。ＣＭＴ．６４細胞、ＣＭＴ．１２−１２細胞およびＬ細胞をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した後、２％熱不活化ＦＢＳ、グルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシンおよびＨｅｐｅｓを添加した０．５ｍｌのＲＰＭＩとともに細胞にウイルスを加えた（ＭＯＩ １０）。２％熱不活化ＦＢＳ、グルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシンおよびＨｅｐｅｓを添加した３ｍｌのＲＰＭＩを添加する前に細胞を３７℃で１．５時間インキュベートした。細胞をバーセン（versene）および０．５％トリプシンで除去し、ＣＴＬアッセイに加える前に培地で２回洗浄した。全感染時間は、アッセイ開始まで６時間または指示によりそれより長かった。放射性標的（ＲＭＡ細胞または指示による）を[51]Ｃｒで３７℃にて１時間処理し、その後、洗浄した。[51]Ｃｒを１×１０６細胞当たり１００ｍＣｉで用いた。非放射性標的を、指示されたときに、２０：１の非放射性／放射性標的比にてウエル当たり２×１０5細胞から開始して２倍または３倍に希釈した。各ウエルに１×１０6のエフェクター細胞および１×１０4放射性標的（１００：１比エフェクター：放射性標的）を入れた。エフェクタープラス冷および放射性標的を、放射能放出のためにＶ−底９６−ウエルプレート中で４時間一緒にインキュベートした。いくつかのアッセイにおいては（指示された場合）、非放射性標的をペプチド含有培地またはその逆で置換する。ＶＳＶ感染細胞の上澄み液を、２ｍｌの培地中で再構成して５×濃度とする前に前もってＧ２５カラムで脱塩し、凍結乾燥した。[51]Ｃｒ放出をＬＫＢ１２８２ＣＳコンピュガンマカウンターにより測定し、比[51]Ｃｒ放出を（実験培地対照）／（全培地対照）×１００％として計算した。自発的な放出は最大放出（１．５％トリトンＸ−１００で処理）の２０％を超えることはなかった。
最初の実験において、Ｌｔｋ−（ＩＩ−２k）を感染させ、ＶＳＶ、ワクシニアウイルス（ＶＶ）およびＶＳＶ−ＮＰ５２−５９をコードするワクシニアウイルスがＶＳＶ−Ｎペプチドを受容体細胞に輸送する能力を調べた。その結果（図８Ａに示す）は、ＶＳＶ自体およびＶＶ−Ｎペプチド構築物のみがペプチドをＲＭＡ細胞へ輸送しうることを示している。両ウイルスの活性は滴定可能であり、ＶＳＶの方が組換えＶＶよりもペプチドの輸送においてより効率的であるように思われる。これらの結果は、異種系においてＶＳＶ−Ｎペプチド発現がペプチド輸送となることを示している。これらの結果はまた、ＶＳＶ−Ｎペプチド発現がＨ−２ｂハプロタイプの発現に依存しないことをも示している。さらに、このデータはまた８アミノ酸ペプチドが該活性を輸送しうることをも示している。それゆえ、それは細胞外での開裂事象に依存しない。
異種発現系においてペプチド輸送のＴＡＰ依存性を調べるため、ＣＭＴ．６４細胞またはＴＡＰ−１／２を発現するＣＭＴ．６４（ＣＭＴ．１２−１２）細胞にＶＶ−Ｎペプチドまたは野性型ＶＶを感染させた。その結果（図８Ｂに示す）は、異種系において発現されたＶＳＶ−Ｎペプチドの輸送のＴＡＰ依存性を示している。これらデータにより、ＶＳＶ生活環の特性がペプチド輸送機構に貢献しないことが確認される。
ＶＳＶ−Ｎペプチドエピトープを発現するワクシニアウイルス構築物を用いた結果は、ペプチド輸送がＶＳＶ複製経路の結果ではないことを明らかに示している。ワクシニアウイルスコードペプチド（ＶＳＶ−Ｎ５２−５９）はまた機能性のＴＡＰトランスポーターをも必要とし、通常の抗原ペプチドプロセシング機構が必要であるという見解を強く支持している。さらに、これらデータは、８アミノ酸ペプチド自体が輸送されることができ、それゆえ輸送が細胞外または細胞内での一層大きなフラグメントのタンパク質加水分解開裂に依存しないことを示している。全般的にみて、ペプチド輸送はＶＳＶ感染またはウイルス溶解サイクルに依存しない。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
0003805792.tif 000013
【図７Ｂ】
0003805792.tif 000014
【図７Ｃ】
0003805792.tif 000015
【図７Ｄ】
0003805792.tif 000016
【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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