(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
酸化代謝のサポートに適した培地中で、
細胞または組織サンプルを、慢性血管痙攣／血管収縮と関連する病気を持つ疑いのある患者由来の標本と共にインキュベートし、該サンプルは平滑筋細胞を含み；
該細胞または組織サンプルの酸化代謝のマーカーを測定し；及び
ATPに対する収縮性要求に貢献できない酸化代謝の増大を検出することを含む方法で、上記酸化代謝の増大は平滑筋細胞における酸化代謝の増大を引き起こしうる物質の患者における存在の示唆である方法。
【請求項２】
ATPに対する収縮性要求に貢献できない平滑筋細胞における酸化代謝の増大によって特徴づけられる異常な代謝状態の検出または予想のための請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記サンプルが血管平滑筋細胞を含み、上記異常な代謝状態が慢性血管痙攣／血管収縮と関連する請求項２記載の方法。
【請求項４】
上記物質の存在が、患者が血管基底の慢性血管痙攣／血管収縮を持つ、または将来持つであろうことを指摘する請求項１から３のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
該平滑筋細胞が血管基底の血管痙攣／血管収縮の存在を疑うまたは予想することに関与するものの代表物である請求項１から４のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
前子癇、アルツハイマー病または慢性大脳血管痙攣から選択される医療的病気の検出、予後、予想及び／または定量に関する使用のための請求項１から５のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
医療的病気が前子癇であり、血管平滑筋細胞が子宮または胎盤血管基底から、あるいはへその緒動脈から由来する請求項６記載の方法。
【請求項８】
医療的病気がアルツハイマー病または慢性大脳血管痙攣であり、血管平滑筋細胞が大脳血管基底から由来する請求項６記載の方法。
【請求項９】
血管平滑筋細胞が頸動脈または基底動脈から由来する請求項８記載の方法。
【請求項１０】
頸動脈または基底動脈がブタ起源のものである請求項９記載の方法。
【請求項１１】
ATPに対する収縮性要求に貢献できない平滑筋細胞における酸化代謝の増大を引き起こすことが可能な物質の同定での利用法で、該方法は酸化代謝のサポートに適した培地中で、
血管平滑筋細胞を含む細胞または組織サンプルを上記物質を含むと考えられる標本と共にインキュベートし；
該細胞または組織サンプルの酸化代謝のマーカーを測定し；及び
ATPに対する収縮性要求に貢献できない酸化代謝の増大を検出することを含む方法で、上記酸化代謝の増大は該標本における上記物質の存在の示唆である方法。
【請求項１２】
該標本が患者由来のサンプルの画分を含む請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
上記細胞または組織サンプルが血管平滑筋細胞を含む請求項１１または請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
請求項１１から１３のいずれか一項記載の方法に引き続き、上記物質を含む液体標本の同定の方法で、該方法は該物質が天然で関連している生物学的分子から実質的にフリーであるように、上記物質を精製及び分離することを含む方法。
【請求項１５】
請求項１１から１３のいずれか一項記載の方法に引き続き、上記物質を含む液体標本の同定の方法で、該方法は上記物質を特性指摘することを含む方法。
【請求項１６】
請求項１４または請求項１５記載の方法に引き続き、その生物学的活性を実質的に維持する上記物質の合成バージョンまたは誘導体の調製を含む方法。
【請求項１７】
治療上の試薬としての潜在的な効力に対する化合物のスクリーニング法で、該方法は酸化代謝のサポートに適した培地中で、
平滑筋細胞を含む細胞または組織サンプルを(a）ATPに対する収縮性要求に貢献できない細胞または組織サンプルの酸化代謝の増大に影響することが知られた標本または物質；及び(b）試験化合物と共にインキュベートし；
酸化代謝のマーカーを測定し；及び
通常該標本または物質によって影響される、ATPに対する収縮性要求に貢献できない酸化代謝の増大の不存在または減少を検出することを含む方法で、上記不存在または減少は試験化合物が治療上の試薬として潜在的な効力を持つ示唆である方法。
【請求項１８】
細胞または組織サンプルが血管平滑筋細胞を含む請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
請求項１７または請求項１８記載の方法に引き続いて、治療上の試薬としての潜在的な効力を持つ試験化合物の同定法で、該方法は試験化合物の生物学的活性を実質的に維持する試験化合物の合成バージョンまたは誘導体の調製を含む方法。
【請求項２０】
請求項１７または請求項１８記載の方法に引き続いて、治療上の試薬としての潜在的な効力を持つ試験化合物の同定法、または請求項１９記載の方法に引き続いて、試験化合物の合成バージョンまたは誘導体の調製法で、該方法は治療上の有効量で試験化合物またはその誘導体を持つ医薬品の調製を含む方法。
【請求項２１】
患者に投与される治療の効果をモニターする方法で、該方法は請求項１から１０項のいずれか一項記載の方法を実施し、ATPに対する収縮性の要求に対して貢献できない酸化代謝の増大の改変を検出するために、一つ以上の適切に選択された時間間隔で上記方法を繰り返すことを含み、そしてその場合該増大の減少が該治療は治療上有利であることを示唆する方法。
【請求項２２】
該標本が脳脊髄液（CSF）；血液、血清及び血漿より選択される請求項１から２１のいずれか一項記載の方法。
【請求項２３】
酸化代謝のマーカーが該細胞または組織サンプルにおける酸素消費割合、ATPアーゼ活性、キナーゼ活性、ミオシンのリン酸化状態またはADP濃度より選択される請求項１から２２のいずれか一項記載の方法。
【請求項２４】
上記培地が11mMのグルコース及び／または5mMのピルビン酸塩を含むKrebs、または11mMのグルコース及び／または5mMのピルビン酸塩と共に0.5mM KH2PO4を含むKrebs-Hensleitバッファーを含む請求項１から２３のいずれか一項記載の方法。
【請求項２５】
上記培地が生存可能な微生物からフリーである請求項１から２４のいずれか一項記載の方法。
【請求項２６】
該インキュベーションが95% O2及び5% CO2を用いて空気を与えられる請求項１から２５のいずれか一項記載の方法。
【請求項２７】
該インキュベーションが細胞または組織サンプルの酸化代謝をサポートするpHで実施される請求項１から２６のいずれか一項記載の方法。
【請求項２８】
該インキュベーションが実質的にpH7.4で実施される請求項１から２７のいずれか一項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は平滑筋細胞における酸化代謝、及びそれに関する方法と物質に関する。特に本発明は例えば、
(i)   慢性血管痙攣／血管収縮の存在または開始の診断
(ii)  慢性血管痙攣／血管収縮の治療のモニター
(iii) 慢性血管痙攣／血管収縮の治療に効果的な新たな薬剤の同定
(iv)  慢性血管痙攣／血管収縮を引き起こす試薬（「スパスミノーゲン」）の解明
に関する方法と物質に関する。
血管痙攣／血管収縮は、死亡率及び死の重要な直接提示される原因を表す。血管平滑筋(VSM)は、低エネルギー消費量で拡大された期間に対する筋張力を維持することができる（該現象は「ラッチ」として知られている）。これは、酸素等に対する血液流の自律的及び継続的調節に不可欠である。しかしながら、血管痙攣／血管収縮においては、弛緩に対する減少した能力を持つ血管と結びついた血管層への血管の異常な収縮が存在する。これは血液流を制限し、引き続き酸素の供給を制限する。例えば心臓、腸間膜、胎盤、子宮、及び大脳を含む様々な血管層が、器官損傷、発作、死亡、または流産のような結果として生じる重大な臨床上の関係に影響しうる(Rajani,R.M.,B.V.Dalvi,S.A.D'Silva,Y.Y.Lokhandwali及びP.A Kale(1991）Postgrad.Medical Journal 67（783）78-80そしてGewertz B.L.及びC.K.Zarins（1991）J.Vasc.Surg.14 382-385)。
「血管痙攣」なる語は一般的に、脳と特に関連する血管の収縮に関して用いられる。対照的に、「血管収縮」なる語は一般的に、脳以外の器官と関連する血管の収縮に関して用いられる。以後ではもしそのような説明書きが存在しなければ、血管痙攣なる語が用いられる場合、単に脳と関連する血管の痙攣を意味するものとしてのみ説明されるべきではない。
本出願の発明は、主にクモ膜下出血の結果として生じる大脳血管痙攣；前子癇及びアルツハイマー病といった、血管痙攣／血管収縮と関連する異常な代謝とリンクした数多くの慢性的な病気に関して開示される。特異的に挙げたもの以外の病気でも、慢性血管痙攣／血管収縮のような平滑筋細胞の慢性的痙攣／収縮と関連するものは、当業者に周知であろう。
大脳血管痙攣は、クモ膜下出血の結果として生じる。外出血は若い成年のほとんどの場合、何の前触れなく襲い、毎年100,000人当たり約16人が受ける。該病気は全ての大脳血管疾患の約10%を数える。
クモ膜層は軟膜層（それは脳を包み、その輪郭に沿っている）と最も外側の硬膜層の間に存在する。それは脳に酸素を供給する血管を含む脳脊髄液(CSF)で満たされた腔である、クモ膜下スペースで分離可能な2のクモ膜を含む。それ故、脳に供給しているこれらの血管は、CSFで浸されている。クモ膜下スペースにおける血管が破損した場合に、クモ膜下出血が生じる。典型的には該破損は動脈瘤から引き起こされる。血液はクモ膜下スペース内の血管らか漏れ、CSFと混合する。
クモ膜下出血患者の30%において、該患者が病院に運ばれる前に、血管についての破損が死を引き起こす。残りの70%は、血管への最初のダメージを生き残り、病院に収容される。これらの収容された患者において、損傷した血管は過剰な血液の損失を妨げるために収縮し、血液流は減少する。該病気の初期の最初の収縮は血管収縮として知られ、通常の血管修復応答過程の一部である。収縮と共に、破壊の修復は塊の形成を始める。ある患者（収容されたものの約60%）では、血管の閉塞に引き続き該血管は結局は再膨張し、血液流はよい臨床上の結果を引き起こして通常に回復し、健康状態を取り戻す。不幸にもかなりの臨床上の努力にも関わらず、他の患者（収容されたものの残りの40%）は悪化する。該悪化は血管の再出血または脳水腫（頭蓋骨における過剰なCSF）の結果であり、該環境においては該患者は手術によって治療され得、生存に関しては比較的よい機会に立たされる。代わりに該悪化は、長期化し非可逆的な血管痙攣（これ以後慢性血管痙攣としていう）の遅れた襲来のためであろう。該病気がその襲来の前に診断され、薬剤治療または手術によって効果的に治療されることがない場合には、それは発作、脳水腫または死を引き起こしうる。
クモ膜下出血患者における慢性血管痙攣の襲来を妨げるために、該疾患に罹患する可能性のある患者を性格に診断することが必要とされている。現在利用可能な診断方法は、クモ膜下出血患者において慢性血管痙攣の襲来する可能性を予測することを可能にするものではない。それは慢性血管痙攣の現実の存在を診断することのみを可能とするものであり、これは出血の原因を決定し、また血管収縮の証拠を探すための血管造影を実施することによって決定される。
最初の出血を生き残り血管造影を受けた患者の70%はのうち、60%が血管痙攣の証拠を示す。これらのうちわずか40%が神経学的悪化が実際に形成されるであろう。しかしながら、ある患者は血管造影による血管痙攣の証拠がないが、減少した血液流が存在する遅れた神経学的悪化を形成しうる。それ故この群の患者においては該データは、血管造影が慢性血管痙攣の襲来を診断する正確な方法ではないことを示唆する。
もし手術がクモ膜下出血の後3から14日の間に実施されても、慢性血管痙攣は実際に増大するので、成功する手術を実施することについては時間差もまた存在する。診断から由来する結果は、手術を実施するのに最適な時間を十分に予想するものではない。
それ故、適切な及び／または必要とされる干渉が大脳出血に引き続く最初の3日以内に開始されうるような、慢性血管痙攣に陥りそうな患者をできるだけ早く予測しうる方法が必要とされている。
適切な診断方法の欠如に加えて、現在では慢性大脳血管痙攣に対する有効な治療が存在しない。現在のところ、該病気は狭窄した動脈に対する血管形成術によって、及びCa2+アンタゴニストであるNimodipine(NimotopR,Bayer)の使用によって治療されている。しかしながら、Nimodipineを用いた治療は、患者に対する臨床上の利益において小さいが(20%)有意な改良を生じるが、血管腔サイズを改良することはなく、それ故大脳血管痙攣の収縮効果を回復するものではないという結果が示されている(Pickard,J.D.,G.D.Murray及びR.Illingworth（1989）Brit.Med.Jornal 298 636-642)。
実際、カルシウムアンタゴニストの使用はカウンター生産性であろう可能性が存在する。今日では以前の技術で、大脳血管痙攣はVSM細胞の代謝欠損の結果であり、ホスホクレアチン及びATPの減少(Kim,P.,J.Jones及びT.M.Sundt（1992）J.Neurosurg. 76 991-996)及びADPの増大に表されているように、CSF内の赤血球細胞の分解産物がVSMのエネルギー代謝を改変しうることが示されている。ADPはVSM架橋を阻害することが示されており(Clark J.F.,Z.Khuchua,A.V Kuznetsov,A.E.Boehm及びR.Ventura-Clapier（1994）J.Musc.Res.Cell motil. 15 432-439及びClark J.F.,G.J.Kemp及びG.K.Radda（1995）J.Theor.Biol. 173 207-211)、それ故上昇したADPは血管平滑筋(VSM)が弛緩することを不可能にするように導くであろう。この示唆は、血管張力を維持するADPがCa2+非依存性であるため、(Nimodipini)のようなCa2+アンタゴニストが収縮性状態を変化し得ないという観察に適合する(Clark等,(1994）上記参照)。それ故ADPの上昇を引き起こす何かの使用は望ましくない。Ca2+アンタゴニストは細胞質Ca2+を減少しうる。Ca2+刺激の欠如によるミトコンドリア機能の減少のため、細胞質カルシウムの減少はADPの上昇を導くであろう。
グルココルチコイドステロイド、抗酸化剤、抗プロスタグランジン試薬、エンドセリンアンタゴニスト及び他の血管拡張薬は全て、最初の奨励される動物実験にも関わらず、いかなる臨床上の利益も提供していない。
それ故、クモ膜下出血に引き続く大脳血管痙攣のような、慢性血管痙攣／血管収縮と関連する臨床上の病気の治療において有効な試薬に対する真の必要性が残ったままである。
クモ膜下出血後のイヌ基底動脈における代謝疾患の生理学的重要性に関する研究により、動脈内のATP,GTP及びPCr存在量が、出血後14日以上で急速に減少することが示され、3日目から有意な減少が見られることが示された(Kim等,(1992）上記参照)。慢性血管痙攣の間のイヌ大脳動脈における抗エネルギーリン酸塩濃度を調べる研究において同じ研究者が、ATP,GTP及びPCrの濃度もまたこれらの痙攣性動脈において減少し、ATP:ADP,GTP:GDP及びPcr:Crの割合は減少することを見出した。さらに、全アデニン及びクレアチン含有量は減少した。
代謝疾患と非可逆的VSM細胞収縮の間の関連は、(i）ATPの減少がVSM細胞において硬直類似の状態を導く；(ii）VSM細胞を250μM細胞内ADPにさらすことは細胞を弛緩性質にできないことを引き起こす(Clark等,(1994)上記参照)；及び(iii）収縮したVSM細胞への細胞内ADPの適用は、量依存的な様式で弛緩することを可能にする能力を害する(Nishye,E.,A.V.Somlyo,K.Torok及びA.P.Somlyo等,(1993）J.Physiol. 460 247-271)という観察によって支持される。
それ故、今日までの以前の分野の研究に基づいた考慮により、ミトコンドリアがATPの生産に必須であり、ATP:ADP比が減少し、及び細胞内ADP濃度の相対的な増大が引き起こされ、酸化代謝の障害となることが明らかである。増大した細胞内ADP濃度は平滑筋細胞の長期化した収縮、及びその弛緩の不能を導く。高エネルギーリン酸塩の減少は、血管痙攣と相関して測定され、慢性血管痙攣の襲来は高エネルギーリン酸塩の欠失と相関することが示された。
しかしながら、上記考慮と反対に、クモ膜下出血に引き続くVSM細胞におけるADP濃度の増大は、ミトコンドリア欠損のためと言うよりはむしろ、酸化代謝経路を通じた流入における増大の結果であるという、予期せぬそして驚くべき発見を本発明者はなした。
VSM細胞が機能している条件下で最大に刺激される場合、酸化代謝は非機能条件で観察される基底の割合のものの２倍になる。ジニトロフェノールのような試薬を用いてミトコンドリアを機能不全にすると、それらはATPを生産することなく酸素を消費するようになる。機能不全ミトコンドリアで観察される酸素消費の最大の割合は、基底の割合の３倍である。
もし例えばクモ膜下出血に苦しんでいる患者のクモ膜下スペース由来のからCSF上清、アルツハイマー病患者由来のCSF上清または前子癇患者由来の血清を、観察される酸素消費におけるいかなる増大も切片の収縮のためではないはずであるように、非加重条件の下でブタ頸動脈の一部（例えば切片またはリング）に適用すると（非加重とはATPに対する収縮性の要求がないことを意味する）、ATPアーゼの増大と共に基底の消費割合と比較して酸素消費の割合において有意な増大（典型的には５倍の増大）が存在するという、予期せぬ発見をなした。酸素消費の割合における増大は、数時間経っても形成されるが、１時間後の遅れだけが明白に明らかであり、５時間以上維持される。
この発見は上記した前分野における教示と反対であり、即ち呼吸系の欠損／機能不全よりもむしろ、流入の増大が存在する。もし前分野の教示のように、ADPの観察された増大が代謝疾患と連続しているのであれば、細胞内酸素消費の増大を見ることは期待できないであろう。
それゆえ本発明者の証拠は、平滑筋細胞の慢性の痙攣／収縮と関連した臨床上の病気において（例えばクモ膜下出血、前子癇及びアルツハイマー病の結果として生じる大脳血管痙攣のような慢性血管痙攣／血管収縮）、CSFまたは血液（大脳出血においては、血液はクモ膜下スペースにおいてCSFと混合する）のような体液内に存在するスパスミノーゲン（この語はATPに対する収縮性要求に起因するものではない平滑筋細胞（慢性血管痙攣／血管収縮を導き血管平滑筋細胞のような）における酸化代謝の増大を引き起こす、試薬または試薬の組み合わせをいうために用いられる）が存在することを示唆する。ミトコンドリアはATPを生産するために増大した量の酸素を消費することによって増大したATPアーゼ活性に応答するが、代謝ホメオスタシスを維持することはできず、それ故ADP濃度が増大する。ADPの増大した濃度は血管の不可逆的な痙攣／収縮の原因であるように思われる。
大脳血管痙攣に関連して、スパスミノーゲンの性質についての研究は現在2の群に分けられる：(a）炎症化合物（プロスタグランジン、トロンボキサン、ロイコトリエン、及び血液分解産物）のような間接的血管活性化化合物；及び(b）Ca2+イオン、アンギオテンシン、及びエンドセリンのような直接的血管活性化化合物。
現在の理論では、大脳血管痙攣においてはスパスミノーゲン（類）が血液からCSFに放出され、VSM細胞の収縮を引き起こす効果を介在することが示唆されている。冠状動脈血管痙攣(Igarashi K.,M.Horimota及びT.Takenaka,（1993）J.Cardiol. 23 257-262;Davies M.G.,M.L.Klyachkin,J.H.Kim及びP.O.Hagen（1993）J.Cardiovasc.Pharmacol. 22 Suppl. 8 S348-S351;Chester A.H.,G.S.O'Neil,S.P.Allen及びT.N.Luu（1992）Eur,J.Clin.Invest. 22 210-213)及び腸間膜動脈血管痙攣(Yoshida M.,a.Suzuki及びT.Itoh（1994）J.Phsiol.Lond. 477 253-265)に関連しているエンドセリン１は、スパスミノーゲンでありそうであると提案されているが、血管痙攣の誘導は複数の化合物によって介在されているという証拠も存在する(Toyo-oka T.,T.Aizawa,N.Suzuki,Y.Hirata,T.Miyauchi,W.S.Chin,M.Yanagisawa,T.Masaki及びT.Sugimoto（1991）Cirsulation 83 476-483)。
ここで前子癇及びアルツハイマー病に話を向ける。
前子癇は、英国では母親の死及び医師が原因である前化膿の最大の原因である。それは子宮内成長遅延、胎児仮死、及び胎児死亡を導く傾向にある。母親症候群の性質は、高血圧症、蛋白尿、異常な凝固、及び複数器官機能不全を含む著しく多様性である。該症候群と関連する大脳病理学には、母親の死亡の最も一般的な原因の一つが含まれる。てんかん様痙攣によって特性指摘される子癇は、病巣大脳虚血、梗塞でさえ引き起こすために、上記強烈な血管収縮から生ずることが考えられる。該病理学の起源は不明瞭であるが、関連する大脳血管痙攣は磁石共振血管造影(Matsuda等, 1995 Gynecol.Obstet.Invest, 40, 249-252)及び断層Ｘ線写真イメージングによって確認される。大脳血管痙攣の間に生じる病理学的血管収縮もまた、高血圧症及び、子癇自体からは離れるが、全て該症候群の特徴である肝機能障害及び胎児疲労を含む前子癇の他の問題の構成要素である。該症候群の多様化した性質は、大変主観的である該病気の診断、及び結果が本質的に非信頼的であることに起因する。生じている病気の可能性または該病気の存在のそれぞれを予想することを可能にするより信頼可能な方法に対する必要性が存在する。
アルツハイマー病は年輩の人々における記憶欠乏及び痴呆の主要な原因である。異常な微細繊維の2のタイプの沈着が、アルツハイマー患者においてみられる脳病変を特徴づける：ペア構造ヘリックス繊維及び細胞外アミロイド繊維より成る主に介在ニューロン性神経原繊維のからまり、そしてτ（タウ）タンパク質のリン酸化である。今日では、アルツハイマー病の確固たる診断が、脳におけるこれらの異常な繊維性構造の数多くが存在することに基づいてなされている。
しかしながら該診断は、侵害的な性質の主要な手術と結びつけてのみ実施されうる。一般的にこの診断は、死後に実施される。それ故あまり侵害的ではない代わりの／付加的な診断法の真の必要性が存在する。
上記議論により、VSM細胞のような平滑筋細胞において酸化代謝の増大を引き起こし、それ故慢性痙攣／収縮（例えば血管痙攣／血管収縮）と関連する異常な代謝状態を引き起こすことが可能な試薬または試薬の組み合わせの存在と関連している、慢性大脳血管痙攣、前子癇及びアルツハイマー病のような特定の医療的病気に関連して改良された診断法及び治療法が必要であることが明らかとなる。
本発明は、平滑筋細胞（例えばVSM細胞）における酸化代謝の増大を引き起こし、それ故平滑筋細胞の痙攣と関連する異常な代謝状態を引き起こしうる試薬または試薬の組み合わせの存在の結果として生じる生理学的病気（クモ膜下出血に引き続く慢性大脳血管痙攣；前子癇、アルツハイマー病）に苦しむ患者の可能性を予測すること、及び上記生理学的病気及び／または異常な代謝状態を持つ患者を診断することの両者の新たな方法を提供する。本発明はまた、(i）慢性痙攣／収縮を誘発することに重要に関与する生物学的サンプルに存在するスパスミノーゲンを同定すること；(ii）上記痙攣／収縮を予防するまたは改善するための新たな薬剤を同定すること；(iii）上記痙攣／収縮を予防するまたは改善することのいずれかのために患者に投与された何らかの治療の有効性をモニターすることの方法をも提供する。
診断的または予防的方法には以下のものが含まれる：酸化代謝のサポートに適した培地中で、患者由来の液体標本と共に細胞または組織サンプルをインキュベートする；該細胞または組織の酸化代謝のマーカーを測定し、ATPに対する収縮性の要求に寄与できない酸化代謝における増大を検出する。上記増大は、ATPに対する収縮性要求に寄与できない平滑筋細胞における酸化代謝の増大を引き起こしうる試薬または試薬の組み合わせが、患者において存在することを示す。
ATPに対する収縮性要求に寄与できない平滑筋細胞における酸化代謝の増大を引き起こしうる試薬または試薬の組み合わせが患者において存在する場合、酸化代謝の増大は普通ではなく／異常であり、重大な重要性を持つであろう。
酸化代謝の増大は有意なものであり維持されうる。それ故酸化代謝の該増大は約３倍以上の酸素消費の増大によって表された濃度を構成する。該増大はおよそ５倍の増大の酸素消費における増大によって表される。酸化代謝の増大は一時間以上、通常数時間、例えば５時間以上維持されうる。
該方法は、ATPに対する収縮性要求に貢献できない平滑筋細胞における酸化代謝の増大によって特性指摘される異常な代謝状態（ADP生産を通じた代謝が平滑筋細胞の収縮性状態を改変するであろうために、該異常な代謝状態は収縮性状態に影響する）を持つ患者の診断、または患者がそれを将来持つであろうことの予測のために用いられ得る。該サンプルには血管平滑筋細胞が含まれ、異常な代謝状態は慢性血管痙攣／血管収縮及びそれらと関連する臨床上の病気と関連するであろう。種類及び血管基底交差はここで完全に可能であり例証的であるが、血管平滑筋細胞は、存在の疑いのあるまたは予想される血管基底の血管痙攣／血管収縮に関与するものの代表物であろう。該方法は前子癇、アルツハイマー病または慢性大脳血管痙攣のような医療上の病気の診断、予後、予測及び／または定量に関連して用いられ得る。
慢性大脳血管痙攣に関して、もし該標本が、ATPに対する収縮性要求に貢献できない酸化代謝の増大を引き起こし（該標本は「ホット」として記載される）、該標本が出血後の最初の３日以内に該患者から得られたものであれば、これは該患者が血管痙攣に陥る高い危険性を持つことを意味する。しかしながら該環境の下でも、血管痙攣の可能性の変化をモニターするために、出血後数週間に例えば毎日または２日に一度一般的に再試験されるであろう。反対にもし該標本が酸化代謝に何の影響も持たなかったならば（該標本は「コールド」として記載される）、これは該患者が血管痙攣に陥る高い危険性が存在しないことを意味する。しかしながら、該環境の下でも、血管痙攣の可能性における変化をモニターするために、出血後２週間に（例えば毎日または２日に一度）該患者は規則的に再試験されることが望ましい。
該試験の結果は、医療的または手術的治療に影響するであろう。概して、該標本が「コールド」を示した場合には、手術は比較的安全であるといえる。
それ故該標本が「コールド」である場合、最初の出血に関連する手術の時期とは無関係に手術しうる（伝統的には手術の前に14日遅れるが、該遅れは該標本がコールドである場合不必要であろう）。
該標本が「ホット」である場合、血管痙攣に患者が陥る危険性が増大している状態にあり、患者が行き届いた観察及び治療に対する強力なケア体制の必要があるという知見のため、「コールド」の標本が得られる時期まで当業者は手術を遅らせ、または手術を続行する。
一般的に、スパスミノーゲン（即ちVSM細胞のような平滑筋細胞において酸化代謝の増大を引き起こすことが可能な試薬または試薬の組み合わせで、ATPに対する収縮性要求に貢献できないもの）を同定する要望が存在する場合、以下のものを含む方法が助けとなる：酸化代謝のサポートに適した培地中で、上記スパスミノーゲンを含むと考えられる標本と共に、平滑筋細胞を含む細胞または組織サンプルをインキュベートし、該細胞または組織の酸化代謝のマーカーを測定し、ATPに対する収縮性の要求に寄与できない酸化代謝における増大を検出する。上記酸化代謝の増大は、該標本において上記スパスミノーゲンが存在することを意味する。
該平滑筋細胞は血管平滑筋細胞である。該血管平滑筋細胞は該スパスミノーゲンによってin vivoで影響することが考えられるものの代表的なタイプである。
生物学的標本には、患者由来の標本の画分が含まれる。画分は相分離、電気泳道、クロマトグラフィー及びマススペクトロメトリーのような周知の代謝産物またはタンパク質の精製法にしたがって調製される。該方法には、本分野で周知のタンパク質精製法及び小分子精製法にしたがって、生物学的サンプルからスパスミノーゲンを精製する付加的な工程が含まれる。
それ故本発明は、ここに記載される方法を用いて容易に精製可能ないかなる新たなスパスミノーゲン（平滑筋細胞（例えば血管平滑筋細胞）における酸化代謝の増大を引き起こしうる試薬または試薬の組み合わせで、ATPの収縮性要求に貢献できないもの）をも提供する。
例えば血管平滑筋細胞といった平滑筋細胞において酸化代謝の増大を引き起こすことが可能であり、ATPに対する収縮性の要求に貢献することができないと同定されたスパスミノーゲンまたは患者由来の標本（たとえば血清）を、スパスミノーゲンの効果をうち砕くまたはブロックするための薬剤として有用な化合物に対するスクリーニングのため、ここで記載された方法で用い得る。
一般的に、治療上の試薬として潜在的な効力についての化合物のスクリーニングを要望する場合、該方法には以下のものが含まれる：酸化代謝のサポートに適した培地中で、(a）ATPの収縮性要求に貢献できない細胞または組織サンプルの酸化代謝の増大に影響することが知られている標本、試薬または試薬の組み合わせと；及び(b）試験化合物と共に平滑筋細胞を含む細胞または組織サンプルをインキュベートし；酸化代謝のマーカーを測定し；そしてATPに対する収縮性の要求に寄与できず、該標本、試薬または試薬の組み合わせによって通常影響される酸化代謝における増大の不存在または減少を検出する。上記酸化代謝の増大の不存在または減少は、治療上の試薬としても潜在的な効力を持つ試験化合物を意味する。
細胞または組織サンプルには血管平滑筋細胞が含まれる。
細胞または組織サンプルは、該標本、試薬または試薬の組み合わせとインキュベートする前に該試験化合物とインキュベートされうる。代わりに、該細胞または組織サンプルを、試験サンプル及び該標本、試薬または試薬の組み合わせと実質的に同時にインキュベートしうる。これらのアプローチのいずれの場合でも、ATPの収縮性の要求に貢献できない酸化代謝の増大の不存在または減少は、コントロール試験との比較によって検出され得、該コントロール試験とは試験化合物が存在しないことを除いて同一の試験である。
代わりに、酸化代謝のサポートに適した培地中で、該細胞または組織サンプルを試験化合物とインキュベートする前に、ATPの収縮性要求に貢献できない酸化代謝の増大を確立するのに十分な時間で、該標本、試薬または試薬の組み合わせと共にインキュベートしうる。それから該試験化合物を加え、通常該標本、試薬または試薬の組み合わせと関連する、ATPの収縮性の要求に貢献できない酸化代謝の増大の減少を検出するために、酸化代謝のマーカーを測定しうる。
それ故本発明はまた、ここに記載されるアプローチの使用に引き続いて同定される新たな化合物及び治療法を提供し、ATPの収縮性の要求に貢献できない平滑筋細胞（たとえな血管平滑筋細胞）における酸化代謝の増大によって特性指摘される異常な代謝または収縮状態の予防または治療のための医薬品の調製における上記薬剤の使用を提供する。該予防／治療は、慢性血管痙攣／血管収縮のためのものである。該予防／治療は、前子癇、アルツハイマー病または慢性大脳血管痙攣に関連している。
慢性痙攣／収縮（例えば慢性血管痙攣／血管収縮）または前子癇、アルツハイマー病または慢性大脳血管痙攣の兆候の異常な代謝状態を予防するまたは改善のいずれかをなすため、患者に対して投与されるいかなる治療でもその有効性をモニターすることを要望する場合、該方法には前記記載した診断方法を実施し、ATPに対する収縮性の要求に貢献できない酸化代謝の増大の改善を検出するために適切に選択された時間間隔で、一度以上該方法を繰り返すことが含まれ、その場合該増大の減少は、該治療が治療上の有効性を持つことを意味する。
該インキュベーションは、酸化代謝のサポートのための適切ないかなる培地においても実施されうる。一つの適切なインキュベーション培地は、11mMグルコース及び／または5mMピルビン酸塩を含むKrebsバッファーである。もう一つは、基質として11mMグルコース及び／または5mMピルビン酸塩のそれぞれと共に0.5mM KH2PO4を含むKrebs-Hensleitバッファーである。該インキュベーションは、95% O2-5% CO2を用いて空気にさらされる。pHは7.4である。ここに記載される方法に適した他の培地及びインキュベーション条件は、周知であり当業者に使用可能である。用いられる細胞または組織は、痙攣に関与するものの代表物であるものである。例えば、もし該痙攣が血管平滑筋のものであれば、該サンプルにはVSM細胞が含まれ、それ故該組織サンプルには、ヒトVSM細胞の適切なカルチャー、または例えばブタ、ギニアピッグまたはヒトの基底動脈、頸動脈、冠状動脈、または腸間膜動脈、あるいはラット大動脈由来の組織切片が含まれる。もし特定の器官と関連する痙攣を測定することを考慮するならば、例えば慢性大脳血管痙攣については頸動脈または基底動脈を選択し、心臓血管痙攣については冠状動脈または大動脈を選択するといった、相当する細胞カルチャーまたは組織を選択しうる。前子癇に関しては、子宮または胎盤血管基底由来の、またはへその緒動脈由来の細胞または組織サンプルを用い得る。
もし非血管平滑筋細胞の痙攣を考慮するのであれば、該サンプルはそれにしたがって選択されるべきであり、該細胞カルチャー／組織は例えば腸、子宮内膜、心筋層または骨格筋の各組織から由来するであろう。細胞カルチャーサンプルとしては、例えば胚ラット大動脈から由来するA7R5 VSM細胞が用いられる(ECACC,PHLS Centre for Applied Microbiology and Research,Salisbury,Wiltshire,United Kingdom SP4 OJG)。
概して、該標本は患者から引き出しうる液体標本（例えばCSF、血液、尿、血清、血漿、腹膜液、心膜液、胸膜液）であり、それらはもし存在するのであればスパスミノーゲンを含有すると予想される。明らかに、分析のための液体標本の選択は、患者の病気の性質によって支配されるが、多くの場合液体サンプルは血液または血清を含む。クモ膜下出血から引き起こされる慢性大脳血管痙攣については、液体標本には、出血の結果としてクモ膜下スペースで血液と混合したCSFが含まれる。
酸化代謝のマーカーは酸素消費割合、ATPアーゼ活性（実施例６及びClark,J.F.及びDillon,P.F.,1995 J.Vasc.Res.32,24-30参照）、キナーゼ活性ADP濃度(Fisher,M.J.,及びDillon,P.F.,1988 NMR in Biomed. 1,121-126)が存在し、これら全てが酸化代謝の増大に伴って直線的に増大するであろう。酸化代謝の代わりのマーカーは、ミオシンのリン酸化状態(Dillon,P.F.等,1981 Science 211,495-497)であり、他の適切なマーカーも当業者には明らかであろう。酸化代謝の状態を示す様々なマーカーの測定法は、当業者に周知である。例えば、酸化代謝のマーカーとして酸素消費割合を選択した場合には、該インキュベーションは、インキュベーション溶液の酸素濃度の測定のための酸素センサーを取り込んだ密閉容器において実施されよう。代わりに、細胞または組織サンプルにおけるATPアーゼ活性、モデル細胞または組織におけるADP濃度、細胞または組織におけるミオシンまたはミオシンと関連する他の収縮性タンパク質のリン酸化状態のようなマーカーを、周知の方法に従って、及び上記議論された書類に記載されているように全て測定しうる。
インキュベーション期間は、酸化代謝の増大の減少を許容するのに十分な期間であろう。ここで提供される実施例は、当業者に指針を与えるが、当業者は適切なインキュベーション期間を決定することができるであろう。一般的に、該標本が末梢血液であり、該組織がブタ頸動脈の切片の形態の血液平滑筋である場合、インキュベーション期間は120分より多くが必要であろう。慢性大脳血管痙攣を視野に入れ該標本がCSFである場合、インキュベーション期間はこれより短いであろう。他の詳細でまたは長期にわたる分析には、２時間ほどが必要であろう。もちろん上記述べたように、例示のために用いた例えば血管平滑筋組織といった組織の特異的な形態の代わりとして、本発見及び発明は例えば細胞カルチャー由来の平滑筋細胞を用い得る。
上記したように、ATPに対する収縮性要求に貢献できない酸化代謝のいかなる増大をも探知されている。それ故サンプルの平滑筋細胞は、ATPに対する収縮性の要求が存在しない、即ちそれらは収縮しないであろう。モデル細胞または組織の平滑筋細胞がATPに対する収縮性要求の存在しない場合には、酸化代謝のいかなる増大をもが該標本のスパスミノーゲンが存在することを意味する。基底割合の３倍より多い酸化代謝の増大は、該標本中にスパスミノーゲンが存在する強い示唆を与えるはずである。
代わりのものでは、該サンプルにおける平滑筋細胞は、ATPに対する収縮性要求を持つ。その場合においては、収縮性要求に貢献できない酸化代謝の増大を探知される。これは、液体標本の適用前に、該細胞がATPに対する収縮性要求を持つコントロールインキュベーションと比較してなされうる。それから液体サンプルの添加前後で酸化代謝の増大を比較する。代わりとしては、試験インキュベーションを「分離」コントロールインキュベーションと比較しうる；ここで「分離」とは、液体サンプルの添加を除いて同様に処理される／インキュベーションされる、比較可能なモデル細胞または組織サンプルではなく分離物を含む別のインキュベーションである。
本発明はまた、クモ膜下出血に罹り、慢性血管痙攣に陥る危険のある患者の治療法を提供し、該治療法は患者に以下のものを投与することを含む：(a）収縮状態にVSM細胞を誘導する化合物及び／または(b）スパスミノーゲンの効果をブロックする化合物。
ヒスタミンはVSM細胞を収縮に引き続く脱リン酸化状態（「ラッチされた」状態として知られる）に誘導する化合物の例である。血管平滑筋収縮はミオシンATPアーゼをリン酸化するミオシンライトチェーンキナーゼを必要とし、ミオシンATPアーゼはそれが慎重を産する前にアクチンと相互作用する。しかしながら他の筋肉と比較すると、それは低エネルギーコストで長期的な時間張力を維持しうるので、ユニークである(Dillon,P.F.等1981 Science 211,495-497;Lynch,R.M.及びPaul,R.J. 1987 Am.J.Physiol.256, c328-c334;Hai,C.M.及びMurphy,R.A. 1988 Am.J.Physiol. 254, c99-c106)。増大した細胞内カルシウム（Ca2+）濃度は、ミオシンライトチェーンキナーゼを刺激するのもであるが、張力を維持するためではないが産することが必要とされる(Dillon,P.F.等,1981上記参照)。実際最大近くの張力が、半最大級にミオシンライトチェーンキナーゼを活性化するために必要な濃度以下の、Ca2+濃度を用いて維持されうる(Hai,C.M.及びMurphy,R.A. 1988)。しかしながら、Krebsサイクル酵素のような数多くの他の酵素が、細胞内Ca2+に感受性であり(Drummond,R.M.J.V.等,1995 Biophysics J.68, A230)、ミトコンドリアのカルシウム活性化が高代謝流入の期間必須であることが考えられる。
VSM細胞を「ラッチされた」状態にすることは、スパスミノーゲンと接触させる結果として呼吸流入における増大をVSMに経験させることを妨げるように思われる。
VSM細胞を「ラッチされた」状態にするドブタミンは、スパスミノーゲンの効果をブロックするようである。
それ故本発明は、ヒスタミンとドブタミンの両者に基づく治療方法を提供する。
適した治療には、50mlの通常の生理食塩水に500mgのドブタミンの使用が含まれる。点滴は1mg/時を与えることから始まり、10-15mg/時に上昇する。点滴は望ましい血圧応答(eg120/80)または腎アウトプット応答を与えるのに十分な期間（一般的に24-48時間）継続される。
本発明はまた、慢性大脳血管痙攣の治療のための薬剤の調製における、上記(a)と(b)及びヒスタミンとドブタミンを含む化合物の使用を提供する。
本発明は、試験装置及び細胞または組織サンプルのキットを提供し、そこでは：試験装置には容器、上記容器を密閉するためのふた、及び上記容器中のいかなる溶液の酸素濃度をも測定するための酸素センサーが含まれる；そして該細胞または組織サンプルには、部分的ヒト基底動脈、または血管平滑筋細胞のサンプルが含まれる。
該キットは容器内で攪拌する手段を含む。該キットは容器内での配置のための液体培地を含む。適した培地は前述されている。
上記記載された方法及びキットで用いられるインキュベーション培地は、代謝過程を経験する細胞を含むいかなる物質からもフリーである。それ故それらは細菌のような生存可能な微生物からフリーである。該培地は適切な滅菌法、フィルター（例えば細菌を除去するためのフィルター）、または当業者に周知の他の方法の使用によって生存可能な微生物からフリーにさせられる。
平滑筋細胞の痙攣を誘発するスパスミノーゲンを同定するために上記議論された方法を用いるにおいて、本発明者は、オカダ酸がブタ頸動脈における酸化代謝の増大を刺激するという予期せぬ発見をなした。オカダ酸によって引き起こされる該効果は、クモ膜下出血上清によるものと大変類似する。これをさらに研究する過程において、本発明者は、スパスミノーゲンとして機能するクモ膜下出血上清における物質の物理的性質が、オカダ酸のものと一致するようであるということを示す実験結果を得ている。特異的に両者は酸安定的であり、それらは両方親水性及び疎水性ドメインを持ち、それらは両方分子量が1000ダルトンより小さい。オカダ酸は分子量が805ダルトンであり、脂タンパク質性で、タンパク質親和性である（しかしタンパク質自体ではない）。
オカダ酸はホスファターゼ特異的インヒビターである脂タンパク質性化合物である。それは平滑筋収縮を引き起こすことが知られている。それは元々軟体動物で見出された。ミオシンATPアーゼの脱リン酸化の阻害は、増大されたATPアーゼ活性を引き起こすであろう（この文章で前記参照）。
それ故本発明は以下のことを示唆する：(i）慢性血管痙攣／血管収縮についての生理物理学的機構は、ホスファターゼ阻害またはキナーゼ及び／またはATPアーゼの欠損に関与するようである；そして(ii）スパスミノーゲンはホスファターゼ阻害について実施する分子物を含むようである。代わりにスパスミノーゲンは、タンパク質キナーゼの活性について実施する分子物を持つであろう。タンパク質ホスファターゼ活性の阻害の結果は、リン酸化タンパク質の集団の増大を示す。これはまたタンパク質キナーゼ（例えばプロテインキナーゼＣ”PKC”）が活性化された場合の結果である。実際ホルボール−メリステートのようなホルボールエステルは、血管平滑筋（及び他の組織）においてPKCの有意な活性化を引き起こすであろう。容器内でPKC活性化は、Calponin及びCaldesmonのリン酸化を引き起こす。これらのタンパク質はミオシンATPアーゼの阻害タンパク質であり、リン酸化された場合ミオシンATPアーゼのそれらによる阻害は除去される。それ故Calponin及びCaldesmonミオシンATPアーゼの活性のあるリン酸化はもはや阻害されず、増大した活性を引き起こし、それらはここに記載される観察と同様である。
それ故スパスミノーゲンは、それ自体がホスファターゼインヒビターまたはタンパク質キナーゼのアクチベーターである分子物を持つであろう。またはそれはホスファターゼのスイッチを印にする、またはホスファターゼインヒビターの生産を刺激する分子物を持つであろう。スパスミノーゲンの効果はホスファターゼを阻害するまたはタンパク質キナーゼを活性化するために同時に機能する化合物の一群によって実施される。それ故、ホスファターゼの阻害を実施する分子物は酸安定的であり、疎水性及び親水性ドメインを持ち、1000ダルトンより小さい分子量を持つ。それ故本発明者は、スパスミノーゲンがホスファターゼ阻害またはタンパク質キナーゼ活性化を実施する分子物（または化合物の群）であることを提供する。該分子物はホスファターゼインヒビターであり、またはホスファターゼインヒビターのスイッチをオンにする分子物であり、またはホスファターゼインヒビターの生産を刺激する分子物であろう。スパスミノーゲンには、ホスファターゼを阻害する機能を同時に持つ化合物の群が含まれる。該分子物または一つ以上の上記化合物の群は、酸安定性であり、疎水性及び親水性ドメインを持ち、1000ダルトンより小さい分子量を持つであろう。該分子物または一つ以上の上記化合物の群は、オカダ酸様化合物であろう。それ故、平滑筋細胞の痙攣の結果として生じる病理学的病気（クモ膜下出血に引き続く慢性大脳血管痙攣のような）に苦しむ可能性のある患者の新たな診断法をさらに提供し、該方法は患者から組織または液体サンプルを得、ホスファターゼのインヒビターまたはタンパク質キナーゼのアクチベーターについて該サンプルを分析することを含む。該分析は、以下の性質の一つ以上を持つホスファターゼインヒビターに対して実施されうる：(a)酸安定性；(b)1000ダルトンより小さい分子量；(c)親水性及び疎水性ドメイン；(d)脂タンパク質ドメイン；(e)タンパク質親和性ドメイン。該分析は、ミオシンATPアーゼの脱リン酸化を阻害するホスファターゼインヒビターについて実施されうる。該分析は、オカダ酸と関連する／オカダ酸と同等な化合物に対して実施される。本分野で周知であり実施可能な方法に従って、ホスファターゼのインヒビターに対して分析される。酸化代謝のマーカーを測定する前記記載された反応容器及び方法は、感度がよく、信頼性がありそして定量的である。それ故それらは、ホスファターゼ阻害に関与する試験の診断及びスクリーニングの目的でさらに一般的な試験として用いられ得る。
さらに平滑筋に対するスパスミノーゲンの効果に対するまたはブロックする薬剤として有用な化合物についてのスクリーニングのための、ホスファターゼインヒビターまたはタンパク質キナーゼアクチベーターの使用が提供される。例えば、ここで前記記載されたスクリーニング法において、インキュベーションのスパスミノーゲン化合物には、オカダ酸のようなホスファターゼインヒビターが含まれる。
さらに、スパスミノーゲン／化合物のスパスミノーゲン群の阻害効果をブロックする化合物の使用に基づいた、例えば血管痙攣／血管収縮といった慢性痙攣収縮と関連する病気に対する治療方法及び薬剤が提供される。それ故該治療化合物は、ホスファターゼインヒビターの阻害効果をブロックし、あるいはそれはホスファターゼインヒビターまたはホスファターゼインヒビターの生産のスイッチをオンにするであろう。該化合物には、ホスファターゼインヒビターに対する特異的な結合パートナーが含まれる。ここでいうところの特異的な結合パートナーとは、インヒビターを「飲み込み」、それによってホスファターゼとの通常の相互作用を減少する、または妨げるという意味である。上記記載に関連して、特異的な結合パートナーには、お互いに対して特に特異性を持つ、及び通常の条件下では他の分子との嗜好性でお互いに結合する数多くの特異的結合ペアが含まれる。特異的結合ペアの例としては、抗原と抗体（例えば上記した例でいえば、ホスファターゼインヒビターがイムノベース特異的結合ペアの意味で抗原である）；リガンドと受容体；リガンドと酵素；酵素と基質；及び相補的なヌクレオチド配列が含まれる。当業者は多くの他の例を考えることができ、ここでそれら全てを掲載する必要はない。さらに「特異的な結合ペア」なる語はまた、構成的なエレメントの一方または両方がより長い分子の部分を含む場合にも応用可能である。
代わりに、該化合物にはホスファターゼに対する別の非機能的（ホスファターゼの通常の触媒機能を阻害しないという意味である）リガンド、即ちインヒビターのまねたもの（「見せかけのもの」）が含まれる。この場合、インヒビターとの相互作用のため利用可能なホスファターゼの結合部位が効果的に減少し、それによって該リガンドの阻害効果における減少が導かれる。見せかけのもの及び構造的類似体（アンタゴニスト的構造的類似体のような）のデザインは、リード化合物に基づく医薬品の開発に対する周知のアプローチである。本発明を明らかに理解するために、実施態様及び実施例が記載され、それらは以下に記載される図面を参考として説明のためのみ記載される。
図１は測定装置（以下では"OxBox"と呼ぶ）の簡単な図面上の説明である。
図２は、５時間以上についてのブタ頸動脈の酸素消費（マイクロモル／分／乾燥状量のｇ）に対する、慢性大脳血管痙攣の患者由来の血液またはクモ膜下CSF上清の効果を示す；A=クモ膜下出血上清のサンプル；B=末梢血液サンプル；C=コントロールサンプル。
図３は、4.5時間以上についてのラット大動脈の酸素消費（マイクロモル／分／乾燥状量のｇ）に対する、慢性大脳血管痙攣の患者由来の血液またはクモ膜下CSF上清の効果を示す；A=クモ膜下出血上清のサンプル；B=末梢血液サンプル。
図４は、７時間以上についてのブタ頸動脈の酸素消費（マイクロモル／分／乾燥状量のｇ）に対する、慢性大脳血管痙攣の患者由来の血液(B)の効果を、慢性大脳血管痙攣を持たない患者由来の血液(C)と比較したものである。
図５は、５時間以上についてのブタ頸動脈の酸素消費（マイクロモル／分／乾燥状量のｇ）に対する、硬膜下出血上清の効果を示す；C=コントロールサンプル；D=硬膜下スペース由来の上清。
図６は、５時間以上についてのブタ頸動脈の酸素消費（マイクロモル／分／乾燥状量のｇ）に対する、脳室内出血上清の効果を示す；C=コントロールサンプル；E=脳室内出血上清。
図７は３時間以上についてのヒト基底動脈の酸素消費（マイクロモル／分／乾燥重量のｇ）に対する、ヒスタミン及びクモ膜下出血上清の効果を示す；A=クモ膜下出血上清のサンプル；F=ヒスタミンを用いた上清；C=コントロールサンプル。
図８は、５時間以上についてのブタ頸動脈の酸素消費（マイクロモル／分／乾燥状量のｇ）に対する、オカダ酸の効果を示す。
図９は、５時間以上についての酸素消費（マイクロモル／分／乾燥状量のｇ）に対する、オカダ酸及び慢性大脳血管痙攣の患者由来のクモ膜下CSF上清の効果を示す。
図１０は、前子癇、通常妊婦及び非妊婦の女性由来の血漿の存在下、及び血漿の不存在下での、ブタ頸動脈による酸素消費（マイクロモル／分／乾燥重量のｇ）の割合を示す。
図１１は、前子癇患者及び彼らに適合した妊婦コントロール由来の血液血清の存在下での、ブタ頸動脈による90分での酸素消費（マイクロモル／分／乾燥重量のｇ）の個々の割合を示す。
図１２は、アルツハイマー病の患者由来のCSFの存在下での、ブタ頸動脈による酸素消費（マイクロモル／分／乾燥重量のｇ）の割合を示す。
図１３は、アルツハイマー病の患者及びコントロール患者由来のCSFの存在下での、ブタ頸動脈による酸素消費（マイクロモル／分／乾燥重量のｇ）の定常状態の割合を説明する。
図１４は、個々のアルツハイマー病の患者及びコントロール患者由来のCSFの存在下での、ブタ頸動脈による現実の酸素消費（マイクロモル／分／乾燥重量のｇ）を示す。*マークは、アルツハイマー病患者由来のCSFを用いる試験において、CSFを洗い流した点である。
ここに記載される実施例及び実施態様は、本発明を説明するのを助けるものであり、その範囲を制限するものではない。
組織または細胞サンプルの酸素消費は、図１に表された単純な装置の使用によって測定し得、それを本発明ではOxBoxと呼ぶ。
ブタ頸動脈のような筋細胞を含む組織サンプル(14)を、例えば近接して殺傷されたブタといったソースから4℃で切断し、周りの組織を除去する。該組織サンプルを、酸化代謝をサポートするために前もって気体を満たした(18)溶液(12)を含む密閉容器(10)において30℃で維持する。該容器(10)は温められ光耐性であるべきであり、それは例えばガラス、パースペックス、プラスチックといった上記性質を提供するいかなる物質で作製されていてもよい。他の物質も当業者に周知である。
研究の下で血管痙攣のタイプに適切であるいかなる組織をも用い得る。例えば、もし大脳血管痙攣の診断が企図されたならば、ブタ頸動脈組織または基底動脈組織を用い得る。もし心臓血管痙攣を診断するのであれば、適した冠状動脈組織が選択される。代わりに、適した筋細胞のカルチャーを用い得る：種類及び血管基底交差は完全に可能であり例示的である。
該組織サンプルの維持及び酸化代謝に適した溶液(12)は、11mMのグルコース及び／または5mMのピルビン酸塩を加えたKrebsバッファーである。代わりの溶液としてはHepesが存在する。用いられる組織または細胞の維持に適した他の溶液は当業者に周知であろう。pHは7.4近くであるべきである。
酸素センサー(16)は、様々な実験条件の下で適した一定時間（例えば１から５時間）酸素消費の測定のために、溶液中に与えられている。
実施例１
ブタ頸動脈のおよそ0.5gのサンプルを、一般的に上記記載のようにOxBoxで用いる。該サンプルを6mlのバッファー溶液中に浸し、0.2μモル／湿潤重量組織のmg／分の制限された酸素消費を用いて、空気（およそ20%の酸素）にさらす。該組織サンプルを30分間これらの条件で維持し、チェンバー内の酸素濃度を非作動条件での酸素消費の該組織の基底の割合を与えるのに十分な一定期間測定する。
慢性大脳血管痙攣の患者由来のクモ膜下出血CSF上清(A)または末梢血液血漿(B)（血液は、クエン酸ナトリウムのような適した凝固試薬を含む回収チューブ内に集める；血清は、1000rpmで20分血液または上清を遠心分離して生産する；ヘパリンは細胞内シグナリング機構を乱すため、抗凝固試薬としてそれを用いることは避けるのが好ましい）のそれぞれの200μｌのサンプルを容器に加え、酸素消費の割合のいかなる変化をも測定するため、300分の期間以上酸素消費を測定する。
適したコントロール(C)を準備する。これらのコントロールはサンプル以外の何者でもない。代わりにそれらは、例えば水頭症であるが血管痙攣していない患者由来の血清またはCSFといったスパスミノーゲンを含まないことが知られた生物学的サンプルを含んでもよい。さもなければ同等な実験条件が用いられる。
図２に示されているように、酸素消費の割合における５倍の増大が、クモ膜下出血上清(A)について観察される。これにはCSFにおける血管痙攣化合物の第一の示唆が含まれる。上記患者由来の末梢血液(B)は、酸素消費の割合の明確で一致する増大を引き起こすのだが、クモ膜下出血上清と同じくらい著しい効果を生み出さない。上記議論のようにコントロール(C)は、酸素消費の効果を持たない。
実施例２
ブタ頸動脈の代わりにラット大動脈を用いる点を除いて、実施例１に対するものと同様に実験を実施する。試験サンプルは上記のように(A)及び(B)である。該結果が図３に示されている。上記実施例１と同様に、酸素消費の割合における５倍の増大が、クモ膜下出血上清(A)に対して観察され、末梢血液(B)と関連する酸素消費の増大は著しくはない。該実験は、図２に示されている結果がブタ頸動脈に特異的なものではないことを示す。
実施例３
今回は、慢性大脳血管痙攣のクモ膜下出血患者由来の末梢血液(B)を、慢性大脳血管痙攣ではない患者由来の末梢血液(C)と比較する点を除いて、実施例１に対するものと同様に実験を実施する。
図４に示されているように、慢性大脳血管痙攣の患者由来の末梢血液は、酸素消費において約２倍の増大を引き起こす一方で、コントロール患者由来の末梢血液は有意なものとはいえないほんのわずかな増大のみを示す。慢性大脳血管痙攣の患者由来の末梢血液によって引き起こされる酸素消費に対する効果をよりよく観察するために、インキュベーション時間を増大することが便利である。これは図２と図４を比較することから見られ得る。
実施例４
今回は、試験サンプルが、脳室内の血管痙攣に引き続く慢性大脳血管痙攣の患者の硬膜下スペース由来の上清(D)または脳室内出血(E)のそれぞれを含むことを除いて、実施例１に対するものと同様に実験を実施する。図５に見られるように、硬膜下スペース由来の上清は酸素消費を増大しない。図６は、脳室内出血上清は酸素消費の増大を引き起こさないが、酸素消費の増大が始まるのに約3.5時間かかるという減弱した効果を持つ。図２から解るように、慢性大脳血管痙攣の患者のクモ膜下スペース由来の上清は、酸素消費の割合において、ほとんどすぐに増大を引き起こす。この結果は、クモ膜下出血血管痙攣において、スパスミノーゲンがクモ膜下スペースの血液及びCSFの混合と関連しているであろうということを示唆する。
実施例５
ヒト基底動脈をブタ頸動脈の代わりに用いるという点を除いて、実施例１のものと同様に実験を実施した。該実験はヒスタミン前処理の効果を調査する。もし該動脈をヒスタミンを用いて前処理すると(F)（１時間OxBoxバッファーの6ml中でヒスタミン濃度は10-4モル）、慢性血管痙攣の患者のクモ膜下スペース由来の上清(a)に応答する酸素消費の大きな増大は消えた。該効果は図７に示されている。
実施例６
ブタ頸動脈を、116mM NaCl,25mM NaHCO3,5.4mM KCl,5mM NH2PO4,1.2mM CaCl2,1.25mM MgSO4及び11mMグルコースを含む氷冷生理食塩水(PSS)に維持する。該動脈を4℃で厚い連結組織に創面切除する。動脈の湿潤重量の2-3gを直径10mmのNMRチューブに置き、11mMグルコースまたは5mMピルビン酸塩を基質として加えた0.5mM KH2PO4を含むKrebs-Henslettバッファーを用いて20ml／分の定常流速で37℃で洗い流し、95%02-5%CO2を用いて空気にさらす。該動脈をコントロール培地で90分潅流させ、それから血管造影的な血管痙攣を持つ４人の患者から回収したクモ膜下出血上清を1に対して30の割合で補ったKrebs-Hensleitバッファーの存在下で潅流した。該頸動脈を、NMRチューブにおいて20分平衡化し、ATPアーゼ流入をBruker分光光度計と接続した400MHzの磁石で測定する。ATPアーゼ流入（ATPをADPにする）は6倍に増大し(0.02-0.12μモル/g/s）、18時間維持される。アデニレートキナーゼ（Pi+ADPをATPにする）はATPアーゼ流入と共にペースを維持せず、それ故ADP濃度が増大する（41から114μモル/L）。
それ故出血性CSFは、ATPアーゼ活性の長い維持された増大を引き起こす；いかなる周知のスパスミノーゲンまたは血管収縮薬以上である。出血性CSFは平滑筋におけるアクチノマイシンATPアーゼを直接刺激するようである。ミトコンドリアは応答するが、代謝ホメオスタシスを維持できず、ADPが増大する。
実施例７
ここに記載されるOxBoxは、慢性大脳血管痙攣または頸動脈血管痙攣のような他の病気の治療をモニターするために用い得る。本実施例はドブタミンを用いる慢性大脳血管痙攣の治療のモニターに関する。クモ膜下出血に引き続く第１日目に、患者由来の血液またはCSFサンプルを、例えばブタ頸動脈が酸素消費を増大するように刺激することが可能か、それ故スパスミノーゲンと比較（実施例１参照）して診断する。上記サンプルは「ホット」であると記載される。該患者は、50mlの通常生理食塩水に例えば500mgのドブタミンのような適切な血管活性化試薬を受け始める。点滴は2.5μg/体重のkg/分で始まり、10μg/体重のkg/分まで上昇する。点滴は10日以上継続される。（ドブタミンは腎機能不全及び高血圧の治療において通常用いられる）。該患者を、該患者から引き出されたサンプルが「コールド」になるまで、即ちもはやブタ頸動脈が酸素消費を増大するように刺激されなくなるまで、例えば第２日目、４日目及び８日目にOx-Boxを用いてモニターする。
典型的には、該サンプルはドブタミンを用いた治療の有効性を示すドブタミン点滴の数時間以内にコールドになるであろう。
実施例８
ここに記載されるOxBoxを、平滑筋細胞の痙攣を引き起こす慢性大脳血管痙攣のような病気を治療するための新たな薬剤についてのスクリーニングに用い得る。実施例５に示されるように、ヒスタミンを用いたヒト基底動脈組織の前処理は、180分以上の期間で測定した場合、クモ膜下出血上清の適用に対するコントロールのものに近い値に、酸素消費の割合を減少する（図７）。ヒスタミンは血管を収縮状態にし、本発明者はこの収縮状態が該上清によって引き起こされるATPアーゼの刺激を保護すると考えている。
それ故ここに記載されるOxBox及び方法は、CSFのスパスミノーゲン効果をブロックする薬剤を探索するために用い得る。図７に示される結果は、慢性大脳血管痙攣を予防するための治療としてのヒスタミンの有効性を示している。
実施例９
ここに記載されるOxBoxは、スパスミノーゲンの解明に用い得る。スパスミノーゲンの疑いのあるものを、例えば実施例１に記載したブタ頸動脈の酸素消費を増大することについて試験しうる。上記試験の一つとして、ブタ頸動脈を1nMのオカダ酸を用いて刺激し、酸素消費割合を約５時間以上の期間で測定した。該結果が図８及び図９に示されている。オカダ酸は、慢性大脳血管痙攣の患者由来のクモ膜下CSF上清によって引き起こされるものときわめて同様な酸素消費の増大を引き起こす。
実施例１０
今回は、前子癇患者から得られた血清を効果を通常妊婦及び非妊婦コントロールから得られた血清と比較する点を除いて、実施例１に示されるように実験を実施する。データ（図１０及び図１１参照）は、前子癇患者由来の血清にさらされた血管における代謝変化は、例えばクモ膜下出血血管痙攣の患者由来のCSF、または2A型ホスファターゼのインヒビターであるオカダ酸にさらされた血管における代謝変化と匹敵することを示す。
前子癇患者においては、ブタ頸動脈を前子癇患者の血清にさらした場合、９０分後に呼吸の有意な刺激が存在した（適合するコントロールと比較した場合；図１０；n=17適合したペア）。しばしば酸素消費における５倍の増大が、前子癇患者由来の血清に応答して残った（非収縮）ブタ頸動脈で見られた。
さらに、前子癇及び妊婦コントロールの血清の比較により、呼吸の強い加速化が存在し、それはコントロールより有意に大きい（図１１）。全ての実験は残った、非収縮血管で30℃で実施された。
興味深いことに、前子癇の間の血管を刺激するスパスミノーゲンと大脳血管痙攣を引き起こすスパスミノーゲンは、同じではない。これについては2の差異が指摘される。第一に前子癇刺激は、例えばリンスによって完全に可逆的である一方、大脳血管痙攣刺激はそうではない。第二にもし大脳血管痙攣CSFがエステラーゼで前処理されると、該刺激は妨げられ得る。対照的にエステラーゼ処理は該血管の前子癇血清の刺激には何の効果もなかった。
実施例１１
今回はアルツハイマー病患者から得られたCSFの効果を、該疾患を持たない個人由来のCSFと比較する点を除いて、実施例１に記載されているように実験を実施した。データ（図12,13及び14参照）は、アルツハイマー病患者由来のCSFにさらされた血管における代謝変化が、例えばクモ膜下出血血管痙攣の患者由来のCSFまたは2A型ホスファターゼのインヒビターであるオカダ酸にさらされた血管における代謝変化に匹敵することを示す。
60分後に呼吸に有意な刺激が存在した。図１２は臨床上でアルツハイマー病と診断された患者（Ｇ）及びアルツハイマー病を持たない患者（Ｈ）由来のCSFと接触されたブタ頸動脈に対する酸素消費の割合を示す。CSFは死後の解剖の時に両群から採取した。CSFをブタ頸動脈のサンプルを浸す標準的な溶液に加えた（前記参照）。実施例１にように、１部分（例えば２００μl）のCSFを30部分(6ml)の呼吸溶液に加え、呼吸の割合を少なくとも90分測定した。図１２から解るように、アルツハイマー病由来のCSFは呼吸の迅速で有意な減少と関連する。コントロール患者由来のCSFは、該効果はなかった。エラーバーは標準偏差である。
図１３はアルツハイマー病及びコントロール患者由来のCSFに対するOxBox系における酸素消費の安定状態の割合を表すグラフによる説明である（即ちプロットされた割合が、酸素消費が停滞期に入る時間に得られたものである）。理解されるように、ほとんどのアルツハイマー病患者由来のCSFは、通常患者由来のCSFによって引き起こされるものより有意に高い安定状態の呼吸割合を引き起こした。
図１４は個々のアルツハイマー病及びコントロール患者のそれぞれ由来のCSFにさらされたブタ頸動脈に対する急性の呼吸割合を示す。*印はアルツハイマー病患者由来のCSFを用いた試験において、CSFを洗い流した時点である。アルツハイマー病患者由来のCSFの除去は、急速に下降する呼吸を引き起こし、約30分以内にコントロール患者由来のCSFの割合近くまで到達した。呼吸割合に対するアルツハイマー病CSFの除去のこの効果は、前子癇患者由来の血清を用いた観察と同様であり、クモ膜下出血患者由来のCSFまたは血清を用いて観察される効果と区別される。
上記結果は、アルツハイマー病患者のCSFに存在する血管活性試薬の指摘を提供する。例えばアルツハイマー病に関与している血管収縮試薬といった血管活性剤の以前の示唆は存在していない。
アルツハイマー病患者由来のCSFによって引き起こされる該効果は可逆的であるという事実は、考えられるスパスミノーゲン（類）がその受容体または結合部位から解離しうることを指摘する。OxBox系はまた、スパスミノーゲンに対する受容体／結合部位に結合可能だが、生理効果を刺激しないスパスミノーゲン（例えばその類似体）に構造的に関連する分子物の同定及び工業生産を許容する。いかなる上記分子物も、薬剤として実践的な価値を持つであろう。
例えば類似体といった上記分子物に対するスクリーニングは、生理効果に対するスパスミノーゲンの性質の特異的な知識と共に、またはそれすらなく実施し得る。様々なスクリーニングアプローチが用いられ得る。例えば、ここに記載されるOxBox系をポジティブな呼吸応答、即ち酸素消費の割合における有意な上昇を確立するために、アルツハイマー病患者由来のCSFを用いてセットアップしうる。それから呼吸溶液に分子物を加え、酸素消費の割合を観察する。アルツハイマー病と関連するスパスミノーゲン（類）は、酸素消費の割合における結果とした下降を持つ受容体／結合部位から解離しうるので、呼吸溶液への分子物の添加によって引き起こされる酸素消費の割合の下降は、該分子物がスパスミノーゲン受容体／希有都合部位への結合に対してスパスミノーゲンと競合することが可能である。
該効果を持つ分子物は、治療（予防上の／治療上の）試薬として価値があるであろう。
一つの適したスクリーニングアプローチが上記記載されている。他のアプローチは当業者に明白であろう。
実施された上記スクリーニングは、例えば前子癇といったスパスミノーゲン試薬と関連する他の生理学に関する治療試薬の探索のためにも用い得る。
スパスミノーゲン受容体／結合部位に結合するためのスパスミノーゲンと競合することが可能であると同定された分子物は、性質上ポリペプチド、ペプチドまたは非ペプチドであろう。非ペプチド「小分子」はしばしば多くのin vivoでの製薬学的使用に好ましい。したがって、該物質（特にペプチドであれば）のまねたものは製薬学的使用のためデザインされうる。
周知の製薬学的に活性な化合物についてまねたもの及び構造的類似体（アンタゴニスト的構造的類似体のような）のデザインは、「リード」化合物（例えばOxBox系によって興味あるものと同定された分子物）に基づいた医薬品の開発に対する周知のアプローチがある。これは、活性化合物が合成が困難であるまたは高価である場合、またはそれが投与のための特定の方法に適していない場合、例えばペプチドが食道においてプロテアーゼによって急速に分解される傾向があるため、該ペプチドが経口投与に対して不適切な活性試薬である場合に望ましい。まねをするデザイン、合成及び試験はターゲットの性質を持つ分子の数多くのランダムなスクリーニングを避けるために一般的に用いられる。
与えられたターゲットの性質を持つまねたものまたは構造的類似体（アンタゴニスト的構造的類似体のような）のデザインにおいて一般的に取られるいくつかの工程が存在する。第一にターゲットの性質を決めるにおいて本質的な及び／または重要である化合物の特定の部分は決定する。ペプチドの場合には、これは例えばそれぞれの残基を順番に置換することによって、ペプチド内のアミノ酸残基を系統的に変化することによってなされうる。ペプチドのアラニンスキャンは、上記ペプチドのモチーフを洗練するために一般的に用いられる。化合物の活性領域を構成するこれらの部分または残基は、「ファルマコフォア("pharmacophore")」として周知である。
一度ファルマコフォアが見出されると、その構造は、例えば分光学的方法、X線解析データ及びNMRといったソースの範囲由来のデータを用いて、物理的性質、例えば立体化学、結合、サイズ及びまたは電荷にしたがってモデル化される。コンピューター分析、相同性マッピング（それは原子間の結合よりむしろ、ファルマコフォアの電荷及び／または容量をモデル化する）及び他の方法が、このモデル化工程において用いられ得る。
このアプローチの変異型においては、リガンド及びその結合パートナーの三次元構造がモデル化される。これは、リガンド及び／または結合パートナーが結合において構造を変化する場合に特に有用であり、これがまねたものまたは構造的類似体のデザインにおいて説明することが可能である。
それからテンプレート分子をファルマコフォアが接合し得るようにまねた化学的群において選択する。該テンプレート分子及びそれに対して接合される化学的群は、まねたものが合成しやすく、製薬学的に許容可能であろう、そしてin vivoで分解されないように、一方でリード化合物の生物学的活性を維持するように簡便に選択しうる。代わりに、該まねたものがペプチド性である場合、該ペプチドを凝縮する、その堅さを増大することによってさらなる安定性を成し遂げうる。されからこのアプローチによって見出されるまねたものを、それらがターゲットの性質を持つかどうか、またはそれらがそれをどの程度示すかを見るためにスクリーニングしうる。それからさらなる最適化または修飾を、in vivoまたは臨床試験に対する最終のまねたものの一つ以上に到達するために実施し得る。
上記与えられたものによって、上記して準備され、上記準備されたアプローチによって容易に及びルーチンに入手可能な分子物及び治療試薬、上記分子物／治療試薬を含む医薬品、例えばスクリーニング系における上記分子物／治療試薬の使用、まねたもの及び構造的類似体のデザイン、医薬品の処方及び使用を、本発明は提供する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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