(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
a.モリブデン酸塩の溶液を酸性条件下でホスフェート加水分解酵素反応混合物に添加してリンモリブデン酸塩を生成する工程、及び
b.前記リンモリブデン酸塩をシンチラント疎水性表面と接触させる工程
を含み、それにより前記表面へのリンモリブデン酸塩の結合が放射能標識ホスフェートに充分な近接を与えてオルトホスフェートの量と相関関係があるシンチラントの測定可能なシンチレーションを誘発することを特徴とするホスフェート加水分解酵素反応混合物中の放射能標識オルトホスフェート(Pi)の検出かつ測定方法。
【請求項２】
前記モリブデン酸塩溶液及び疎水性表面を前記反応混合物に同時に添加する請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項３】
c.CsClの溶液をシンチレーションの測定の前に前記反応混合物に添加する工程を更に含む請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項４】
d.クエン酸の溶液をシンチレーションの測定の前に前記CsClを含む混合物に添加する工程を更に含む請求の範囲第３項記載の方法。
【請求項５】
前記CsCl及びクエン酸を反応混合物に同時に添加する請求の範囲第４項記載の方法。
【請求項６】
前記モリブデン酸塩が、前記反応混合物中、0.05％〜0.3％w/vの最終濃度である請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項７】
前記モリブデン酸アンモニウムが、前記反応混合物中、0.1％〜0.2％w/vの最終濃度である請求の範囲第６項記載の方法。
【請求項８】
前記モリブデン酸アンモニウムが、前記反応混合物中、0.17％w/vの最終濃度である請求の範囲第７項記載の方法。
【請求項９】
前記疎水性表面がポリビニルトルエン(PVT)、セファデックス、ラテックス、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、アクリルアミド、アガロース、ポリプロピレン、ポリカーボネート、及びセファロースからなる群から選ばれる請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項１０】
前記表面がポリビニルトルエンビーズである請求の範囲第９項記載の方法。
【請求項１１】
前記CsClが、前記反応混合物中、1Mより高い最終濃度である請求の範囲第３項記載の方法。
【請求項１２】
前記CsClが、前記反応混合物中、2M〜4Mの範囲の最終濃度である請求の範囲第１１項記載の方法。
【請求項１３】
前記CsClが、前記反応混合物中、3.5Mの最終濃度である請求の範囲第１２項記載の方法。
【請求項１４】
前記クエン酸が、前記反応混合物中、0.05M〜0.2Mの範囲の最終濃度である請求の範囲第４項記載の方法。
【請求項１５】
前記クエン酸が、前記反応混合物中、0.1Mの最終濃度である請求の範囲第１４項記載の方法。
【請求項１６】
a.放射能標識〔γ-33P〕ATPをATP加水分解酵素と混合する工程、
b.反応混合物を充分な時間インキュベートして加水分解から放出されるオルトホスフェートを得る工程、
c.モリブデン酸塩の溶液を前記反応混合物に添加してリンモリブデン酸塩を生成する工程、
d.前記リンモリブデン酸塩をシンチラント疎水性表面と接触させる工程、及び
e.前記オルトホスフェートの量を計算する手段として前記シンチラントのシンチレーションを測定する工程
を含むことを特徴とするATPase活性の測定方法。
【請求項１７】
前記ATP加水分解酵素がヒトパピローマウイルスからのE1ヘリカーゼタンパク質である請求の範囲第１６項記載の方法。
【請求項１８】
前記モリブデン酸塩溶液及び疎水性表面を前記反応混合物に同時に添加する請求の範囲第１６項記載の方法。
【請求項１９】
f.CsClの溶液をシンチレーションの測定の前に前記反応混合物に添加する工程を更に含む請求の範囲第１６項記載の方法。
【請求項２０】
g.クエン酸の溶液をシンチレーションの測定の前に前記CsClを含む混合物に添加する工程を更に含む請求の範囲第１９項記載の方法。
【請求項２１】
前記CsCl及びクエン酸を反応混合物に同時に添加する請求の範囲第２０項記載の方法。
【請求項２２】
前記モリブデン酸塩が、前記反応混合物中、0.05％〜0.3％w/vの最終濃度である請求の範囲第１６項記載の方法。
【請求項２３】
前記モリブデン酸アンモニウムが、前記反応混合物中、0.1％〜0.2％w/vの最終濃度である請求の範囲第２２項記載の方法。
【請求項２４】
前記モリブデン酸アンモニウムが、前記反応混合物中、0.17％w/vの最終濃度である請求の範囲第２３項記載の方法。
【請求項２５】
前記疎水性表面がポリビニルトルエン(PVT)、セファデックス、ラテックス、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、アクリルアミド、アガロース、ポリプロピレン、ポリカーボネート、及びセファロースからなる群から選ばれる請求の範囲第１６項記載の方法。
【請求項２６】
前記表面がポリビニルトルエンビーズである請求の範囲第２５項記載の方法。
【請求項２７】
前記CsClが、前記反応混合物中、1Mより高い最終濃度である請求の範囲第１９項記載の方法。
【請求項２８】
前記CsClが、前記反応混合物中、2M〜4Mの範囲の最終濃度である請求の範囲第２７項記載の方法。
【請求項２９】
前記CsClが、前記反応混合物中、3.5Mの最終濃度である請求の範囲第２８項記載の方法。
【請求項３０】
前記クエン酸が、前記反応混合物中、0.05M〜0.2Mの範囲の最終濃度である請求の範囲第２０項記載の方法。
【請求項３１】
前記クエン酸が、前記反応混合物中、0.1Mの最終濃度である請求の範囲第３０項記載の方法。
【請求項３２】
候補インヒビターの存在下及び不在下で請求の範囲第１６項記載の方法に従って工程ａ〜ｅを行なう工程、及び夫々の場合にホスフェートの量を比較して抑制のレベルを計算する工程を含むことを特徴とするホスフェート加水分解酵素活性のインヒビターのスクリーニングのアッセイ。
【請求項３３】
候補インヒビターの存在下及び不在下で請求の範囲第２０項記載の方法に従って工程ａ〜ｇを行なう工程、及び夫々の場合にホスフェートの量を比較して抑制のレベルを計算する工程を含むことを特徴とするホスフェート加水分解酵素活性のインヒビターのスクリーニングのアッセイ。
【請求項３４】
前記ホスフェート加水分解酵素がヘリカーゼ、ATPase、及びホスファターゼからなる群から選ばれる請求の範囲第３３項記載のアッセイ。
【請求項３５】
前記酵素がATPaseである請求の範囲第３３項記載のアッセイ。
【請求項３６】
前記ATPaseがヒトパピローマウイルスからのE1ヘリカーゼである請求の範囲第３３項記載のアッセイ。
【請求項３７】
水溶液中の放射能標識オルトホスフェートの測定用キットであって、前記キットが
a.モリブデン酸塩の溶液、及び
b.シンチラント疎水性表面
を含み、前記モリブデン酸塩溶液が前記水溶液に添加されてリンモリブデン酸塩を生成し、前記リンモリブデン酸塩が前記疎水性表面により捕獲されて測定可能なシンチレーションを誘発することを特徴とするキット。
【請求項３８】
CsClの溶液を更に含んでシンチレーションの測定の前のビード浮遊を増進する請求の範囲第３７項記載のキット。
【請求項３９】
クエン酸の溶液を更に含んでシンチレーションシグナルを安定化する請求の範囲第３８項記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は新規なATPアーゼアッセイに関する。特に、本発明はATP又はあらゆるその他のホスフェート含有分子の加水分解により放出されたオルトホスフェートの量の検出かつ測定のための新規な方法に関する。更に特別には、本発明はヒトパピローマウイルス(HPV)からのE1ヘリカーゼ酵素のATPアーゼ活性の新規な測定方法に関する。
【０００２】
（背景技術）
HPV関連疾患
ヒトパピローマウイルス(HPV)は皮膚上皮及び粘膜上皮の細胞を感染する小DNAウイルスである。80種を越える異なるHPV遺伝子型が特性決定されていた。幾つかの型、例えば、HPV-1、-2、-3、-4及び-10がいぼ又はパピローマとして知られている皮膚病変を引き起こす。これらの増殖は良性であり、かつ自己制限性であり、一般集団の7-10％の手足に見られる。肛門道を感染するこれらのHPV型は大いに医療上の関心がある。これらの遺伝子型は悪性進行とのそれらの相関関係に基づいて“低リスク”又は“高リスク”と称される。
所謂低リスクHPVが性器いぼ、又は尖圭コンジロームと関連している。例えば、HPV型６及び11は良性の性器病変の90％以上に見られ、非常に稀に悪性形質転換と関連している。しかしながら、それにもかかわらず、それらは重大な大衆の健康問題を呈する。米国の性的に行動的な成人の約１％が目視できる性器いぼを有するが、更に多くの症例では、その感染は準臨床的である。実際に、15-49才の年齢の人々の更に推定15％がポリメラーゼ連鎖反応(PCR)アッセイにより検出可能なウイルスDNAの形態の、HPV感染症の分子上の証拠を示す。実際に、HPVは米国及び英国で最も普通の性的に伝染されるウイルス物質としてランクされ、その発生率が着実に増大している。
高リスクHPV型、例えば、16、18、31及び33による感染症は肛門性器悪性、最も顕著には子宮頸癌の発生に強く連関していた。実際に、HPV型16及び18は、良性性器病変に稀に見られるが、頸の全ての侵食癌の約70％に検出し得る。HPVと肛門性器癌の連関は良く報告されており、最近の研究は子宮頸癌のほぼ90％がHPV DNAを含むことを見出していた。
【０００３】
現行の療法及びウイルス特異的治療に対する要望
HPV感染症の広がり及びそのおそらく寿命に脅威の結果にもかかわらず、ウイルス特異性インヒビターが未だに記載されていなかった。HPVに関する抗ウイルス薬発見はこうしてそのウイルスを研究所で増殖する際に見られる困難の結果として実に困難と判明していた。
HPV感染症に関する全ての現行の療法は感染した組織の非特異的破壊又は除去に頼る。受け入れられた手術操作はドライアイス、液体窒素、CO2レーザー療法、電気メス又は局所切除の使用を含む。種々の細胞傷害薬、例えば、サリチル酸、トリクロロ酢酸、ポドフィリン、コルチシン、ブレオマイシン及びカンタリジンがまた組織を破壊するのに使用される。
癌のリスクはこれらの操作を高リスクHPVの治療に最も賢明なものにするが、それ程観血的ではない治療が低リスク遺伝子型を処理するのに探求されている。免疫系を刺激する化合物が良性病変でしばしば見られる自然回帰を再生する目標で研究されていた。このような免疫応答変更因子である、イミクイモドが最近臨床試験に合格し、HPV関連性器いぼの治療に認可されていた。
性器いぼを有する患者は手術の如き非特異的治療後に高い再発率、通常30-90％をしばしば経験する。このような不十分な効力はHPV DNAの不完全な排除、又はパピローマに隣接する正常に見える組織中のウイルスの存在の結果である。明らかに、HPV感染症に有効なウイルス特異性療法に対するかなりの要望があり、こうしてこれは大いに満たされないでいた。
【０００４】
ウイルスDNA複製及びE1
半保存的DNA複製は多くの酵素及びアクセサリータンパク質により媒介される複雑なプロセスである。ヘリカーゼはDNA複製中に機能して、複製フォークの前に二重らせんDNAの巻き戻しを触媒作用する酵素である。それらは原核生物細胞及び真核生物細胞だけでなく、殆どのウイルス中で非常に普通である。ヘリカーゼがATPの結合及び加水分解を機械エネルギーに変換してDNAの巻き戻し及び核酸ストランドと一緒のそれら自体の同時の運動を推進する正確なメカニズムは依然として完全には理解されていない。
72 kDa HPV E1タンパク質はシミアンウイルス40のＴ抗原（SV40 Tag）と一緒にヘリカーゼスーパーファミリーIIIの員として分類されており、これとはそれは構造上及び機能上相同である。E1及びTagはウイルスの複製起点(ori)で特定のDNA配列を認識し、結合する能力を有するウイルスDNAヘリカーゼの注目に値するサブグループに属する。また、殆どのDNAヘリカーゼは侵入に一本鎖DNAの領域を必要とするが、これらのタンパク質は、それがoriを含むことを条件として、完全二本鎖DNAからの巻き戻しを開始することができる。
【０００５】
HPV複製起点における分子イベント
ヒトパピローマウイルスは約8kbの二本鎖環状DNAを含む。上皮の基底細胞中で、ゲノムが複製され、細胞当り約20-100コピーの定常状態レベルで染色体外に維持される。細胞が一旦末端分化され、上皮の上層に移動されると、ゲノムの高レベル増幅のみが起こる。
細胞を含まないDNA複製系において、E1タンパク質はDNAポリメラーゼαプライマーゼ酵素を含む宿主複製タンパク質の完全補体を与えられた場合に充分な濃度で起点特異的DNA複製をそれ自体で誘導し得る。しかしながら、複製はウイルスE2タンパク質により大いに刺激され、E1の制限濃度で、in vitro複製が完全にE2依存性になる。これはE1がそのDNA結合部位に対する比較的低いアフィニティーを有することの結果である。E2はアクセサリータンパク質として作用することによりE1を起点に局在化することを助ける。ウイルスoriにおけるE1及びE2結合部位は密に近接し、互いに約100bp以内にある。E2のカルボキシ末端はDNAのパリンドーム部位を結合し、一方、そのアミノ末端はE1を結合し、こうしてE1をその結合部位に運ぶ。
【０００６】
抗ウイルス療法の標的としてのE1
最近、製薬会社は分子生物学の進歩の結果としてそれらの抗ウイルス化合物スクリーニングプログラムを実質的に拡張し、加速することができてきた。今や、ウイルスはウイルスコードされた遺伝子産物の特異的インヒビターを見つけるために分子レベルでルーチン試験される。
数種のウイルスについて、ポリメラーゼ、キナーゼ及びプロテアーゼの如き酵素が抑制の標的であった。対照的に、HPVゲノムによりコードされた約８種の異なるタンパク質のうち、E1ヘリカーゼが酵素活性を有する唯一のものである（Fieldsら, 1996, Fields Virology, 第３編, Lippincott-Raven, Philadelphia, 65章及びその中の文献）。E1はori特異的DNA結合活性、E2結合活性、ATPアーゼ活性、及びDNAヘリカーゼ活性を示す。これらの活性の全てが潜在的インヒビターについて独立にアッセイし得る。加えて、それは全てのパピローマウイルスタンパク質のうちの最も高度に保存されたものであり、こうしてE1のインヒビターがおそらく多種のHPV型に対し有効であろう。
E1のヘリカーゼ活性のインヒビターの発見を可能にする高処理量スクリーンが知られている（WO 99/57283、1999年11月11日）。たとえATPがE1ヘリカーゼ活性を誘導するのに必要とされ、反応に含まれるとしても、このヘリカーゼアッセイはE1 ATPアーゼ機能の競合的インヒビターを同定するのに使用し得ない。これはATPアーゼの非常に低いKm、例えば、HPV-11 E1について約10μM、及びヘリカーゼアッセイが300μM-1mM ATPでルーチンで実験されるという事実の直接の結果である。E1のATP結合部位が抑制について標的とされる場合には、更に感度の良いアッセイが開発される必要がある。
【０００７】
既存のATPアーゼアッセイ
ヘリカーゼ活性は実際には常にヌクレオシドトリホスファターゼ活性と関連している（Matsonら, Ann. Rev. Biochem., 1990, 59, 289）。酵素ATP加水分解は比色反応を含む種々の方法により測定されていた。全ての場合、酵素反応は反応条件が検出操作に依存しない酵素特異的プロトコルに従って行なわれる（放射能標識ATPのとり込みを除く）。検出操作は以下のように異なるアッセイに関して異なる。
TLC：ATPアーゼ反応に関する基質中の〔α-33P〕又は〔γ-33P〕のとり込みは放射能標識ホスフェート又はADPの放出をもたらす。それらの異なる極性のために、〔33P〕標識ATP、ADP及びホスフェートはまた流れている溶媒（例えば、塩化リチウム／ギ酸）中の薄層クロマトグラフィー（Bronnikovら, Anal. Biochem., 1983, 131, 69）により分離し得る。２種が極性移動相及び非極性固相に対するそれらの相対的アフィニティーに基づいてTLCプレートで異なる距離で移動する。結果がシンチレーションカウンティング又はリン光体イメージャー分析により分析される。
放出されたホスフェートの定量のためのTLCアッセイはATPアーゼ活性及び抑制に関する正確なデータを生じるが、それは潜在的インヒビターの大量スクリーニングに適していない。多数のTLCプレートのスポッティング及びランニングは時間を浪費し、労力を要する。ATPアーゼアッセイがHTSフォーマットで実施される場合、96ウェルプレートフォーマット及び迅速な定量に適合する方法が必要とされる。
【０００８】
木炭：ATPは木炭に結合するが、オルトホスフェートはそれに結合しない（Zimmermanら, J. Biol. Chem. 1961, 236(5), 1480）。こうして反応がγ標識ATPを使用して行われ、木炭が添加される場合、出発物質が吸着されるが、生成物は溶液中に残る。溶液を木炭含有フィルタープレートにより濾過し、フロースルーをカウントすることによりこれを96ウェルプレートアッセイとして行なうことができる。これはおそらく高度に再現性ではなく、ロボットスクリーニングにかけ難い。
共役酵素アッセイ：別の反応が第二酵素によりホスフェート産物について行なわれる幾つかの関連操作がある（Riegerら, 1997, Anal. Biochem. 246, 86及びその中に含まれる文献）。これらのアッセイは速度論研究に非常に有益である。何とならば、吸光度変化がアッセイの経過にわたって連続的に発生され、その結果、反応進行が上記のその他の方法により必要なアリコートを除去しないで監視し得るからである（連続アッセイとストップタイムアッセイの相違）。しかしながら、これらの方法はモリブデン酸塩アッセイ（以下に記載）よりも有意に感度が良くなく、スクリーニング結果が共役酵素のインヒビターである偽陽性の可能性により更に複雑にされるであろう。
【０００９】
モリブデン酸塩：モリブデン酸アンモニウムはホスフェートのみと錯体を生成してリンモリブデン酸塩を生成する。その反応から生じるピロホスフェート、ヌクレオチドトリホスフェート、又はその他のホスフェート含有分子はモリブデン酸化物と相互作用しない。比色反応の殆どは酸溶液中のホスフェートとモリブデン酸塩の錯体の生成、続いて着色された錯体を生成する還元又は色素への結合に基づく。これらの技術についての多くの変化が感度及び着色安定性を増大し、発色インキュベーション中に生じる自然のATP加水分解の量を減少する目標で導入されていた（Gonzalez-Romoら, Anal. Biochem. 1992, 200, 235）。例えば、リンモリブデン酸錯体はアスコルビン酸により還元されて700nmの最大吸光度を有する青色のモリブデン色素原を生成し得る（Hergenrotherら, Anal. Biochem. 1997, 251, 45）。別法は酸媒体中のマラカイトグリーンとの明るい緑色の錯体（これは650nmで最大吸光度を有する）の生成に基づく（Moslenら, Anal. Biochem. 1983, 131, 69）。
【００１０】
実際に、マラカイトグリーンアッセイはE1のATPアーゼ活性に関する潜在的試験として既に評価されたが、不適であることがわかった。何とならば、それが25μMより低いホスフェートの濃度を正確に検出し得なかったからである。これが問題を呈した。何とならば、競合インヒビターの検出が酵素のKm以下の基質濃度で最適であるからである。既に記載されたように、HPV-1 E1 ATPアーゼのKm(ATP)は約10μMであることが示され、こうしてE1 ATPアーゼ反応は1-10μM ATP付近でルーチンで行なわれる。加えて、抑制実験における基質消費は30％以下に保たれ、こうして基質濃度は反応の時間にわたって実質的に一定に留まる。その結果、３μMが放出されるホスフェートの最大濃度であり、マラカイトグリーンアッセイの25μM検出限界を良く下回る。
全てのこれらの比色ATPアーゼアッセイは数百マイクロモルの最低ATP濃度を必要とする。HPV-11 E1に関するKm(ATP)の値は約10μM（DNAの不在下で測定された）であり、こうしてE1 ATPアーゼ活性の競合インヒビターについて有効にスクリーニングするためには、10μM以下の〔ATP〕を使用してアッセイを行なうべきである。
【００１１】
固体担体上のリンモリブデン酸塩の吸着：リンモリブデン酸塩は〔PMo12O40〕3-の化学量論を有する大きいヘテロポリモリブデン酸塩である。その比較的低い電荷のために、それは水溶液から有機溶媒に抽出でき、又はセファデックスビーズもしくはニトロセルロースフィルターの如き疎水性表面に吸着し得る。Ohnishiら（J. Solid-Phase Biochem. 1976, 1(4), 287）及びOhnishi（Anal. Biochem. 1978, 86, 201）はポリビニルポリピロリドン(PVPP)カラムによるアフィニティークロマトグラフィーによる溶液からのリンモリブデン酸錯体の単離方法を開示している。PVPPはPO4とモリブデンの錯生成反応の触媒として作用し、それによりその他のホスフェート含有分子に対し錯体を選択的に吸着する。ホスフェートは放射能標識され、放射能のカウンティングのためにカラムから溶離し得る。この方法は標識ホスフェートがカウンティングの前に反応混合物から分離される必要があるという事実により制限される。高処理量フォーマットにかけやすいホスフェート測定のためのしっかりした方法に対する要望が存する。
Yoshimuraら（Anal. Biochem. 1986, 58, 591）は錯体をセファデックスゲル相に吸着することによるモリブデンブルーの比色微量測定を開示している。この操作は吸着の前の錯体の還元を必要とし、ゲル相中に濃縮されたヘテロポリ酸の直接吸収法によりホスフェート濃度を測定する。この操作は比色法による測定の前に上澄みからのゲルビーズの分離を必要とする。この比色法は低濃度のホスフェートの検出を可能にするが、それは自動化に不適のままである。
【００１２】
シンチレーション近接アッセイ：Hartら（Molec. Immunol. 1979, 16, 265）及びHartら（J. Nucl. Med. 1979, 20, 1062）は“シンチレーション近接アッセイ”と称されるイムノアッセイのための新規な方法を開示している。この技術は研究されている有機反応体を特異的に結合するリガンドで被覆されたシンチラントラテックス粒子を使用した。疎水性ビーズを用いるこの技術の全ての更なる適用は分子に特異的に結合するためのビーズに被覆された特定のリガンドを用意することに頼っていた。
米国特許第4,568,649号は特定のリガンドで被覆されたこのようなビーズを開示し、関係する反応体その他がリガンドではなくビーズに直接結合することを防止するために、ビーズに残っている活性部位がアッセイの前にブロックされる必要があることを明記している。この開示は本発明から離れるように導く。
この技術の発端以降のその広い適用にもかかわらず、同技術がリンモリブデン酸錯体との疎水性相互作用により放射能標識ホスフェートを検出するのに有利に使用し得るという最もわずかな示唆がなかった。ATPアーゼ活性の検出におけるSPA概念の本件出願人の使用は疎水性リンモリブデン酸錯体が疎水性表面、特にポリビニルトルエンSPAビーズの表面に結合し、一方、荷電されたATP分子が結合しないという観察に基づいている。本件出願人はオルトホスフェートをATP又はADPから分離するその性質を使用し、放射性オルトホスフェートの測定のためにシンチラント被覆ビーズを利用する。それ故、本件出願人はオルトホスフェートを検出し、測定するしかっりした方法を提供する。このアッセイは大規模にしやすく、しかも低いナノモル範囲のPiの検出について再現性の良い結果を与える。この方法はまた従来技術のアッセイにより容易に行なわれない速度論分析に適している。
【００１３】
（発明の開示）
本発明はリンモリブデン酸塩が疎水性表面に結合してリンモリブデン酸錯体をその他のホスフェート含有分子から単離するという原理を使用し、更にSPA概念を使用して放射能標識リンモリブデン酸錯体をシンチレーションカウンティングによる測定のためのシンチラントと密に接触させる。
第一の実施態様において、本発明は
a.モリブデン酸塩の溶液を酸性条件下で水性反応混合物に添加してリンモリブデン酸錯体を生成する工程、及び
b.前記リンモリブデン酸錯体をシンチラント疎水性表面と接触させる工程
を含み、それにより表面へのリンモリブデン酸塩の結合が放射能標識ホスフェートに充分な近接を与えてオルトホスフェートの量と相関関係があるシンチラントの測定可能なシンチレーションを誘発することを特徴とする水性反応混合物中の放射能標識オルトホスフェート(Pi)の検出かつ測定方法を提供する。
【００１４】
第二の実施態様において、本発明は
a.放射能標識〔γ-33P〕ATPをATP加水分解酵素と混合する工程、
b.反応混合物を充分な時間インキュベートして加水分解から放出されるオルトホスフェートを得る工程、
c.モリブデン酸塩の溶液を前記反応混合物に添加してリンモリブデン酸錯体を生成する工程、
d.前記リンモリブデン酸錯体をシンチラント疎水性表面と接触させる工程、及び
e.前記オルトホスフェートの量を計算する手段として前記シンチラントのシンチレーションを測定する工程
を含むことを特徴とするATPアーゼ活性の測定方法からなる。
必要により、その方法はまたCsClの溶液をカウンティングの前に前記反応混合物に添加する工程f)を含む。更に必要により、その方法はクエン酸の溶液をカウンティングの前に前記CsClを含む混合物に添加する工程g)を含む。
第三の実施態様において、本発明は候補インヒビターの存在下及び不在下で上記方法に従って工程ａ〜ｅ（及び必要により工程ｆ及びｇ）を行なう工程、及び夫々の場合にホスフェートの量を比較して抑制のレベルを計算する工程を含むことを特徴とするホスフェート加水分解酵素活性のインヒビターのスクリーニングのアッセイからなる。
【００１５】
市販のSPAビーズはシンチラントで含浸された顕微鏡的ビーズであり、種々の分子（例えば、ストレプトアビジン、グルタチオン、プロテインＡ）をそれらの表面に付着させて入手し得る。ポリビニルトルエン(PVT)SPAビーズは比較的疎水性の表面を有し、過剰のATPの存在下で反応混合物からリンモリブデン酸塩を選択的に吸着することができる。SPAビーズはそれ自体をそれ程疎水性ではないように処理されるが、疎水性相互作用がSPAプロトコルでビーズを浮遊するのに普通使用される高濃度の塩化セシウムにより増進し得る。水性媒体中で、〔33P〕の如き弱いβ-粒子エミッターはシンチラント分子に物理的に密に近接してそれらに発光させる必要がある。そうしないと、それらのエネルギーが消失され、溶媒中で失われる。こうして、モリブデン酸塩と錯生成され、ビード表面に結合された〔33P〕標識ホスフェートがシンチラントの活性化を生じ、一方、溶液中の遊離の〔33P〕標識ATPは活性化を生じない。サンプルにより放出された光がβシンチレーションカウンターにより測定され、存在するホスフェートの量に比例する。SPAビーズは市販されており、現在その会社によりポリヒドロキシフィルムで処理されてそれ程疎水性ではないようにされている。しかしながら、非処理SPAビーズがこの特別なアッセイに特に適し得ることが本件出願人により意図されている。
【００１６】
本発明の方法及びアッセイは特に基質Kmがナノモル〜低マイクロモルの範囲である場合にHPV E1ヘリカーゼだけでなく、オルトホスフェートを産物として生じるあらゆるATPアーゼ、NTPase、又はあらゆる酵素に有益である。
特に、本発明のアッセイはそのアッセイを基質のnM〜低μMの濃度で行なうことが望ましい場合に種々のATP加水分解酵素のATPアーゼ活性を測定するのに有益である。このような酵素として、ヘリカーゼ（例えば、HPV、HSV、CMV、HCVの如きその他のウイルスからのもの）、その他の感染性物質（例えば、細菌）、又は細胞ヘリカーゼ；その他のエネルギー変換ATPアーゼ（例えば、ミオシン、ダイニン、キネシン）、鉄輸送ATPアーゼ、又はシャペロニン；その他のヌクレオチドホスフェート加水分解酵素（例えば、Ｇプロテイン）；タンパク質又は小分子ホスファターゼ；又は無機ピロホスファターゼが挙げられるが、これらに限定されない。
第四の実施態様において、本発明は
水溶液中の放射能標識オルトホスフェートの測定用キットであって、前記キットが
a.モリブデン酸塩の溶液、及び
b.シンチラント疎水性表面
を含み、前記モリブデン酸塩溶液が前記水溶液に添加されてリンモリブデン酸錯体を生成し、前記錯体が前記疎水性表面により捕獲されて測定可能なシンチレーションを誘発することを特徴とするキットを含む。
本発明のその他の目的、利点及び特徴は添付図面を参照して好ましい実施態様の以下の非限定的記載を読んだ後に明らかになるであろう。その記載は例示であり、本発明の範囲を限定すると解されるべきではない。
【００１７】
（発明を実施するための最良の形態）
定義
本明細書に使用される“シンチラント疎水性表面”という用語はシンチラントで含浸され、組み込まれ、被覆され、又はその他にそれを含む疎水性表面を意味する。
本明細書に使用される“シンチラント”という用語は、それに放射能標識された反応体から放出された放射線エネルギーと密に近接して置かれた場合に、活性化されてシンチレーションカウンターにより検出可能かつ測定可能な光エネルギーを放出する蛍光分子（またフルオレサーと称される）を意味する。
【００１８】
好ましい実施態様
本発明の第一の実施態様によれば、
a.モリブデン酸塩の溶液を酸性条件下で水性反応混合物に添加してリンモリブデン酸錯体を生成する工程、及び
b.前記リンモリブデン酸錯体をシンチラント疎水性表面と接触させる工程
を含み、それにより前記表面へのリンモリブデン酸塩の結合が放射能標識ホスフェートに充分な近接を与えて前記オルトホスフェートの量と相関関係があるシンチラントの測定可能なシンチレーションを誘発することを特徴とする水性反応混合物中の放射能標識オルトホスフェート(Pi)の検出かつ測定方法が提供される。
【００１９】
本発明の第二の実施態様によれば、
a.放射能標識〔γ-33P〕ATPをホスフェート加水分解酵素と混合する工程、
b.反応混合物を充分な時間インキュベートして加水分解から放出されるオルトホスフェートを得る工程、
c.モリブデン酸塩の溶液を前記反応混合物に添加してリンモリブデン酸錯体を生成する工程、
d.前記リンモリブデン酸錯体をシンチラント疎水性表面と接触させる工程、及び
e.前記オルトホスフェートの量を計算する手段として前記シンチラントのシンチレーションを測定する工程
を含むことを特徴とするホスフェート加水分解酵素活性の測定方法が提供される。
必要により、その方法はまたCsClの溶液をカウンティングの前に前記反応混合物に添加する工程f)を含む。更に必要により、その方法はクエン酸の溶液をカウンティングの前に前記CsClを含む混合物に添加する工程g)を含む。
本発明の第三の実施態様によれば、候補インヒビターの存在下及び不在下で上記方法に従って工程ａ〜ｅ（及び必要により工程ｆ及びｇ）を行なう工程、及び抑制のレベルを比較する工程を含むことを特徴とするホスフェート加水分解酵素活性のインヒビターのスクリーニングのアッセイが提供される。
【００２０】
本発明の第四の実施態様によれば、水溶液中の放射能標識オルトホスフェートの測定用キットであって、前記キットが
a.モリブデン酸塩の溶液、及び
b.シンチラント疎水性表面
を含み、前記モリブデン酸塩溶液が前記水溶液に添加されてリンモリブデン酸錯体を生成し、前記錯体が前記疎水性表面により捕獲されて測定可能なシンチレーションを誘発することを特徴とするキットが提供される。
【００２１】
本発明の上記実施態様によれば、モリブデン酸塩溶液及び疎水性表面は反応混合物に同時に添加されることが好ましい。
本発明の実施態様はCsClの溶液をカウンティングの前に反応混合物に添加する工程を更に含むことが好ましい。本発明はクエン酸の溶液をカウンティングの前に前記CsClを含む混合物に添加する工程を更に含むことが更に好ましい。CsCl及びクエン酸は反応混合物に同時に添加されることが最も好ましい。
CsCl及びクエン酸を含む反応混合物はシンチレーションカウンティングの前に１時間より長くインキュベートされることが好ましい。
モリブデン酸アンモニウムは0.05％〜0.3％、更に好ましくは0.1％〜0.2％w/vの最終濃度であることが好ましい。モリブデン酸アンモニウムは約0.17％w/vの最終濃度であることが最も好ましい。
疎水性表面はポリビニルトルエン(PVT)、セファデックス、ラテックス、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、アクリルアミド、アガロース、ポリプロピレン、ポリカーボネート、及びセファロースからなる群から選ばれることが好ましい。疎水性表面はSPAビーズの如きポリビニルトルエンビーズであることが更に好ましい。
【００２２】
CsClは1Mより高い最終濃度であることが好ましい。CsClは2M〜4Mの範囲の最終濃度であることが更に好ましい。CsClは約3.5Mの最終濃度であることが最も好ましい。
クエン酸は0.05M〜0.2Mの範囲の最終濃度であることが好ましい。クエン酸は約0.1Mの最終濃度であることが更に好ましい。
ホスフェート加水分解酵素はヘリカーゼ、ATPアーゼ、及びホスファターゼからなる群から選ばれることが好ましい。その酵素はATPアーゼであることが更に好ましい。ATPアーゼはヒトパピローマウイルスからのE1ヘリカーゼであることが最も好ましい。
【００２３】
（実施例）
実施例に使用した略号として、下記のものが挙げられる。
AmMo      モリブデン酸アンモニウム
ATP-γ-S    アデノシン-5'-O-(3-チオトリホスフェート)
cpm        カウント／分
DMSO      ジメチルスルホキシド
DTT        ジチオスレイトール
EDTA      エチレンジアミンテトラ酢酸
HEPES      N-〔2-ヒドロキシエチル〕ピペラジン-N'-〔2-エタンスルホン酸〕
MES        2-〔N-モルホリノ〕エタンスルホン酸
MgOAc      酢酸マグネシウム
PEI        ポリエチレンイミン
Pi          無機オルトホスフェート
PVPP      ポリビニルポリピロリドン
PVT        ポリビニルトルエン
SPA        シンチレーション近接アッセイ
TLC        薄層クロマトグラフィー
物質及び方法
ポリヒスチジン標識HPV-11 E1をWO 99/57283に記載されたようにバキュロウイルス感染昆虫細胞中で発現させ、Niアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。
【００２４】
実施例１
HPV E1を使用するATPアーゼシンチレーション近接アッセイ(SPA)に関するプロトコル
放射能標識〔γ-33P〕ATP(NEN)を反応緩衝液中で100倍に希釈し、それを-80℃で貯蔵することにより、それを入手後に調製した。この方法で貯蔵した物質は１ケ月以上にわたって良好であった。E1 ATPアーゼ反応を20 mM HEPES、pH 7.5、0.05 mM EDTA及び1 mM DTT、及び0.05％イゲパールCA-630（ノニデットP40に相当）からなる緩衝液中で行なった。以下に示される容積及び濃度は代表的であるが、その後に実施例に示されるように、これらは結果に対する最小の効果で若干変化し得る。１μMのATP（アメーシャム・ファーマシア）及び500μMのMgOAcを貯蔵された物質からの100倍希釈（原液からの10,000倍希釈）、又は新鮮な場合には約１nCi/μLの〔γ-33P〕ATPと混合した。〔γ-33P〕ATPにより寄与された実際のATP濃度は約1 nMであった。この量は必要により更に減少し得る。充分な酵素を添加して所望のレベルの変換を得た。例えば、4 nM HPV-6a E1は２時間でその基質の約30％をADP及びホスフェートに変換した。典型的な反応容積は40μLであった。反応を室温で96ウェルプレート、典型的にはオプチプレート（パッカード）中で行なった。
【００２５】
所望の時間で、SPAビード-AmMo混合物20μLを添加することにより40μLの反応を停止した。この混合物は１部の2.4M HCl中の２％(w/v) AmMo対50 mM HEPES＋0.02％ナトリウムアジド中に30mg/mLで懸濁された２部のストレプトアビジンPVT SPAビーズ（ファーマシア・アメーシャム#RPNQ0007）からなっていた。モリブデン酸アンモニウムを通常毎日新たにつくり、一方、SPA懸濁液は１ケ月以上にわたって安定であった。その混合物を数時間先につくり、４℃で貯蔵した場合には数日にわたっても使用し得る。モリブデン酸アンモニウム-ビード混合物を添加した直後に、7Mの塩化セシウム＋0.2Mのクエン酸80μLを添加した。プレートを素早く振とうし、次いでそれを１時間以上にわたって放置した。次いでホスフェート生成の程度をトップカウント（パッカード）を使用するシンチレーションカウンティングにより測定した。所望により、同じ反応に関してTLCにより測定された結果（以下を参照のこと）に対するSPA結果の比較によりcpmをホスフェート濃度に変換し得る。また、結果を、ATPからホスフェート及びADPへの完全な変換を得るためにTLCにより既に確認された大過剰の酵素との反応である、“100％対照”と比較し得る。酵素を含まない以外は同じブランクを平行して行い、引いた。
【００２６】
実施例２
E1 ATPアーゼ TLCアッセイ
ATPアーゼ反応を丁度SPAと同様に行なった。予定した反応時間の終了時に、半分の容積の氷冷500 mM EDTA、pH 8.0を添加することにより反応を停止した。１〜２μLの反応サンプルをポリエチレンイミン被覆セルロースTLCプレート（シグマ）にスポットし、1MのLiCl及び1Mのギ酸の溶液で溶離した。ストーム860リン光体イメージング系（モレキュラー・ダイナミクス）を使用して、〔γ-33P〕ホスフェート及びATPを測定する。ブランクを含む、夫々のサンプルについて、ホスフェート及びATPのスポット強さを定量し、ホスフェート％を以下のように計算した。
0003754367.tif 000002
ブランク値はSPAと同じ範囲、約2-5％であり、夫々の反応に関する値から引いて酵素反応により生成されたホスフェート％の値を得た。
【００２７】
実施例３
シグナル及びブランクに関する検出条件を変えることの効果
20 mM MES、pH 7.0、10％グリセロール、及び0.05 mM EDTAの反応緩衝液を使用して、この節における反応の多くをわずかに異なる条件で行なった。反応を10μMのATP（約1 nMの〔γ-33P〕ATP）、500μMのMgOAc、及び充分なE1を用いて行なって90分間で室温で基質の約20％の変換を得た。実施例１及び２と同様に、反応をパッカード・オプチプレート中で行なった。これらの実験では、典型的にはATPアーゼ反応液20μLを0.05％トゥイーン-20を含む1.2M HCl中２％AmMo20μLと混合することにより検出を行なった。10分後に、ストレプトアビジンSPAビード懸濁液20μLを添加し（50 mM HEPES、pH 7.5＋0.02％NaN3中10mg/mL）、素早い混合後にこれに続いて20μLの7.0M CsClを添加した。混合後に、プレートを１時間放置し、その後に実施例１に記載されたようにトップカウントでカウントした。
【００２８】
SPAビード型：PVT-SPAビーズはそれらの表面に種々の分子を付着して入手し得る。そのアッセイにおける評価のために入手し得た型はストレプトアビジン、小麦胚凝集素、プロテインＡ、抗マウスIgG、及びグルタチオンを含んでいた。リンモリブデン酸塩に対してアフィニティーを有するのはPVTビーズの疎水性であるが、種々の被覆物を試験して、表面の分子の型がSPAシグナルにどのような効果を有するのかを見た。cpmデータを図1Aに示す。対照シグナルとブランクシグナルの比、即ち“シグナル対バックグラウンド”比を図1Bに示す。被覆型に有意な効果はない。同様の結果が銅（His標識結合）ビーズで得られ、実際に、アメーシャム・ファーマシアにより提供された、未被覆PVTビーズがまた均等のシグナルを生じる。ケイ酸イットリウムSPAビーズは、予想されるようにこのアッセイでは作用しない。何とならば、それらが疎水性表面を欠いているからである。
【００２９】
モリブデン酸アンモニウム濃度：停止溶液中のモリブデン酸アンモニウムの機能はATPアーゼ反応で放出されたホスフェートを錯生成することである。停止溶液中のモリブデン酸アンモニウムの試験濃度は１〜４％の範囲であった。cpmに関する効果を図2Aに示し、シグナル対バックグラウンド比を図2Bに示す。〔注：ブランクはAmMoの濃度を増大することにより比較的影響されない。こうして、これらの条件下で、バックグラウンドはATP溶液中に存在するオルトホスフェートを汚染することから生じると思われないが、むしろビーズへのATPの非特異的粘着又は溶液中で〔γ-33P〕ATPにより放出された或る種のβ-粒子放射線の捕獲のためであるかもしれない。〕
【００３０】
HCl濃度：停止溶液中のHClの機能はリンモリブデン酸錯体が生成し得る酸性媒体を与えることである。停止溶液中の０〜2.4Mの範囲のHCl濃度のcpmに関する効果を図3Aに示し、シグナル対バックグラウンド比を図3Bに示す。これらの条件下で、1Mより大きい値が最適であることを測定した。
CsCl濃度：CsClは二つの目的のためにシンチレーションカウンティングの前に添加される。第一の目的は疎水性効果を増進して、SPAビーズへのリンモリブデン酸錯体の結合を強化する高塩媒体を生成することである。第二の目的はウェル中の液体の密度を増大することである。PVT SPAビーズは約1.05g/mLの比重を有し、水溶液中に分散されて留まり、数時間にわたって底にほんのゆっくりと沈降する傾向がある。高モル濃度のCsClの添加は液体の密度を増大し、SPAビーズに表面に浮遊する薄層を形成させ、こうして検出可能なシグナルを増大する。7.0MのCsClは実質的に飽和溶液である。異なる濃度のCsCl20μLを添加することのcpmに関する効果を図4Aに示し、シグナル対バックグラウンド比に関する効果を図4Bに示す。7.0Mの溶液を使用して、最適のシグナル対バックグラウンドを得た。
【００３１】
CsClの添加前のモリブデン酸アンモニウム中のインキュベーション時間：AmMo添加とCsCl添加の間の時間の長さを変えることのcpmに関する効果を図5Aに示し、シグナル対バックグラウンド比に関する効果を図5Bに示す。反応シグナルはほぼ一定であるが、ブランクが時間につれて上昇することが明らかである。こうして、シグナル対バックグラウンドがインキュベーション時間を増大するにつれて減少する。
CsCl添加とシンチレーションカウンティングの間の時間：標準操作では、プレートをCsCl溶液の添加１時間後にカウントする。同プレートを48時間の期間にわたって種々の時間でカウントすることにより得られたcpm及びシグナル対ノイズ比を図6A及び6Bに示す。
【００３２】
シグナルの安定性：図５及び６に示された実験はアッセイシグナルが不安定であることを示す。ブランクは時間につれて着実に増大する。上記濃度のATPとHClの混合はホスフェートへのATPの遅い分解をもたらし、これが観察されたシグナルの増大をほぼ確かに説明することがTLC検出により示された。同じ問題が、例えば、色の変化又は沈殿の形成によりホスフェートを検出するためのリンモリブデン酸塩生成に頼るその他のアッセイで生じる。クエン酸は、AmMoの直後に添加されると、遊離モリブデン酸塩にしっかりと結合し、リンモリブデン酸陰イオンへの続いて放出されたホスフェートのとり込みを阻止することが示された。交換は極めて遅く、こうしてクエン酸塩の添加は数日後でさえも予備生成されたリンモリブデン酸塩の濃度を低下しない。
0.2Mのクエン酸を7MのCsCl溶液に添加することの効果を図７に示す。この実験では、30μLのE1 ATPアーゼ反応を実施例３の最初に記載されたように行なった。この後に、30μLの1MのHCl中２％のAmMoを添加し、直後に30μLの10mg/mLのSPAビーズ次いで30又は90μLの7MのCsCl±0.2Mのクエン酸を添加した。シグナルは１時間のインキュベーション後に約２倍に増進され、クエン酸の添加により有意に安定化され、その結果、変化が３日後でさえも殆ど観察されない。
【００３３】
シグナル及びシグナル安定性に関するAmMo、CsCl、HCl、及びクエン酸の濃度の効果を示す追加の実験を図８に示す。洗剤イゲパール-CA630（シグマ、ノニデット-P40に相当）が一組の反応以外の全てで0.005％で存在し、クエン酸が0.1M、0.2M又は0.4MでCsCl溶液に含まれる以外は、反応をこの実施例の最初に記載されたように行なった。0.05％のトゥイーン-20が一つの場合にモリブデン酸アンモニウム溶液に含まれた。トゥイーン-20はItaya及びUi（Clin Chim Acta, 1966）のアッセイでリンモリブデン酸塩-マラカイトグリーン錯体を安定化することが知られているが、このアッセイでは有益な効果を有しない。アッセイプレートをCsCl/クエン酸の添加後1.5時間、6.5時間、及び20時間で読み取った。シグナルは1.5時間後にほんのわずかに増大し、少なくとも20時間まで安定であった。
【００３４】
対照インヒビターATP-γ-Sを10μMで幾つかのウェルに添加して（データは示されていないが、実施例４を参照のこと）、異なる時点で得られたデータの粗さを確かめた。試験した全ての条件及び時点で、抑制のレベルは63.9％から70.0％へとわずかに変化した。こうして、アッセイの異なる条件下の検出の変化は観察されたcpmに関する効果を有し得るが、酵素反応、抑制された反応、及びブランクの間の相対的シグナルに影響せず、こうしてアッセイの基本的な正確さに影響しない。
HPV-11 E1を使用して行なわれた時間経過の例を図９に示す。この実験を、上記の0.005％の洗剤の存在を除いて図８について上記された条件下で行なった。示されたデータは４回の180μLの反応の平均である。夫々の時点で、30μLを除去し、シンチレーションカウンティングの前に30μLのAmMo/SPAビーズ溶液、続いて90μLの7.0MのCsCl/0.2Mのクエン酸と混合した。
【００３５】
実施例４
ATP-γ-Sによる抑制
下記の溶液を使用してIC50曲線のために45μLの反応を行なった。
−3.0μMのATP、1.5 mM 酢酸Mg、及び0.06μCi〔γ-33P〕ATPからなるATP（反応当り15μL）；
−18 nM HPV-6 E1からなるE1（反応当り15μL）；
−緩衝液＋18％DMSOに溶解されたγ-S-ATPからなるインヒビター溶液（ウェル当り15μL）。
アッセイ緩衝液がまた0.005％のイゲパールCA-630を含んだ以外は、全ての溶液を実施例３に記載されたアッセイ緩衝液中でつくった。反応液を混合する際に、全ての成分を３倍に希釈した。反応体を以下の順序で添加した：a)インヒビター、b)HPV-6 E1、c)ATP。反応液中のインヒビターの濃度範囲は0.2〜100μMであった。75分後に、２部の再懸濁緩衝液中のストレプトアビジンSPAビード（15mg/mLの懸濁液）（実施例２）及び１部の２％のモリブデン酸アンモニウムを含む2.4MのHClからなる混合物45μLを添加することにより、反応を停止した。次いで0.1Mのクエン酸を含む90μLの7MのCsClを添加した。素早く混合した後、プレートを90分間放置し、次いでトップカウントでカウントした。SAS（統計ソフトウェアシステム；SASインスティチュート社、キャリー、N.C.）を使用して、抑制データ（図10を参照のこと）を平均16,000cpmの陽性対照及び平均1300cpmのブランクとともにロジスティックにフィットした。検出がTLCにより行なわれた場合に、同様の結果がまた得られた。
【００３６】
実施例５
ホスフェート検出の線形性及び正確さ
この実験では、一つの大きなATPアーゼ反応を充分なE1を用いて行なって100％のATP加水分解を得た。次いでE1を熱不活化し、反応混合物をE1を含まない反応ブランクと種々の比で混合した。0.005％のイゲパールCA630が存在したが、反応緩衝液が実施例３に記載されたとおりであった以外は、反応緩衝液及びインキュベーション条件は実施例１に記載されたとおりであった。反応-ブランク混合物を2:3、1:5、1:10、及び1:20でつくって40％〜５％の範囲の加水分解を模擬した。上記実験の幾つかについて、モリブデン酸アンモニウム、HCl、及びクエン酸を幾つかの異なる濃度で使用して、SPA検出を行なった。幾つかの条件に関する結果を、TLCに関する結果とともに図11に示す。全ての場合、検出されたシグナル（SPAに関して100％の比として、またTLCに関して観察されたホスフェート濃度として表される）は非常に似ていた。絶対シグナル(cpm)は条件により変化するが、相対的シグナルひいてはアッセイの正確さは一定である。特に、20％の変換はスクリーニング条件下の反応の典型的な程度を模擬し、10％の変換は50％抑制を与える試験化合物について観察されるシグナルに相当する。
【００３７】
実施例６
スクリーニング条件下のアッセイ対照に関する変化
この方法のウェル間の変動を確かめるために、反応を三つの別々の96ウェルプレートの80ウェル中で実施例１に記載されたように行なった。酵素を含まない反応ブランクをその他の16ウェル中で行なった。結果を図12に示す。ウェル間の変動をｚ統計により測定でき、これはシグナルの標準偏差並びに酵素反応及びブランクからのシグナルの分離を考慮する（J-H Zhangら, J. Biomol. Screening, 1999, 4, 67-73）。これらの値は０未満から1.0までの範囲であり得、0.5より大きい値はスクリーニングアッセイに非常に許容し得ると思われた。この実験に関するｚ値は二つの明らかな範囲外が分析から除かれた場合に0.63又は0.75であった。
【００３８】
実施例７
更に高いホスフェート濃度におけるホスフェート検出の線形性
上記実施例はホスフェートのSPA検出が低濃度0.1-1μMのホスフェートについて良く作用することを実証する。しかしながら、機械作業を行なうために、ATP濃度を更に広く変化することが必要である。本発明者らは実施例１に概説された操作が全てのオルトホスフェートを定量的に捕獲しなかったことを観察した。何とならば、多量のSPAビーズが添加された場合に、増大されたシグナルが観察されたからである。これらの初期の結果に基づいて、SPAビード滴定実験を以下に記載されるように行なった。
実施例５と同様に、この実験に関して、高濃度のE1を使用して、一つの大きな反応を行なった。この場合、ATP濃度は200μMであった。その反応を室温で４時間行い、次いで37℃で２時間行なって完全な変換を確実にした。サンプルをTLCにより分析して定量的変換を確かめた。次いで反応液を反応緩衝液＋マグネシウムで連続希釈して200μMから0.2μMまでの範囲のホスフェート濃度を得た。希釈反応液45μLをモリブデン酸アンモニウム（2.4MのHCl中２％）15μL及び7.5、15、30、又は60mg/mLのSPAビード懸濁液30μLと合わせることにより、サンプルを分析した。最後に90μLの7MのCsCl＋0.2Mのクエン酸を全てのウェルに添加した。
結果を図13Aに示し、また図13Bにlog-logプロットとして示す。図13Bに最も明らかに見られるように、夫々のSPAビード濃度について、シグナルは約100μMまでホスフェート濃度に直接比例した。しかしながら、絶対シグナルはビード濃度に依存しない。重要なことに、図13B中のラインは平行であり、即ち、SPAビード濃度を増大することにより得られたシグナルの比例増加は約100μMまでの全てのホスフェート濃度で同じである。
【００３９】
実施例８
酵素の不在下でシグナルの源を測定するためのAmMoの存在下及び不在下のATP及びホスフェートの滴定
この実験では、上記反応と同様の大きな反応を行なって10μMのATPをホスフェート及びADPに完全に変換した。完全な変換をTLC（実施例２）により確かめた。平行して、酵素を欠いている同じ混合物を生成した。夫々を上記のように緩衝液中で希釈して10μMから0.5μMまでの範囲のホスフェート濃度又はATP濃度を有する溶液を得た。夫々の二重反復45μLサンプルを実施例１に記載されたAmMo/SPAビード混合物40μL又はAmMoを欠いている同様の混合物（依然としてHClを含む）、続いて80μLのCsCl/クエン酸と混合した。結果を図14Aにグラフ化し、又は図14Bにlog-logプロットとしてグラフ化する。図７に基づいて予想されるように、シグナルは全ての場合に放射能濃度に線形に依存する。AmMoの存在下で、反応ブランク（ATP溶液）は全変換により生成されたホスフェート溶液の約５％に等しいシグナルを生じる。実施例３（図２）の実験と違って、ブランクシグナルの殆どがAmMoに依存し、こうしてこれらの条件下で、ブランクは主として市販ATP溶液中に既に存在する汚染オルトホスフェートのためである。
【００４０】
実施例９
SPA方法及びTLC方法により測定されたHPV-11に関するKm(ATP)の値
HPV-11 E1に関する速度論パラメーターKm(ATP)を測定するために、ATPアーゼ時間経過を異なる濃度のATPで実験した。イゲパールCA630の濃度が0.005％ではなく0.01％であり、実験に特異な変化が以下に記録される以外は、実施例１及び２に示された操作を使用して、反応を両方の実験で同様の条件下で行なった。E1濃度は2nMであり、ATP濃度は3-75μM(TLC)又は2-50μM(SPA)の範囲であり、MgOAc濃度はATP濃度＋0.5mMに等しかった。最高濃度の溶液を0.5mM MgOAcを含む緩衝液で希釈することにより、夫々の濃度のATPの原液を得た。こうして、放射能標識ATP対未標識ATPの一定の比を全ての反応に使用した。10分又は20分から120分までの時点で計ることにより、反応速度を測定した。初速条件を保証するために、20％より大きい変換を示す時点を分析に使用しなかった。
【００４１】
SPA Km実験に関する検出及びデータ処理：全反応溶液は150μLであった。夫々の時点で、反応混合物20μLを除去し、モリブデン酸アンモニウム/SPAビード混合物40μL、続いてCsCl/クエン酸80μLと合わせた。全ての反応を３回反復で行なった。プレートを一夜のインキュベーション後にカウントした。最後の時点で、追加の20μLのアリコートを除去し、10μLの0.5MのEDTAと合わせた。この場合、ホスフェートへのATPの変換をTLCにより定量し、TLCにより測定されたホスフェートの濃度をSPA操作からのcpmと、両方の場合にブランクの減算後に、比較した。ホスフェート濃度とcpmの関係は線形であり、その線の傾斜を使用してSPA検出からのcpm値を生成されたホスフェートの濃度に変換した。プログラムグラフィット（V3.01、R. Leatherbarrow）を使用して、夫々のATP濃度におけるホスフェート生成の速度を非線形回帰によりMichaelis-Menten式にフィットした。結果を図15に示す。
【００４２】
TLC Km実験に関する検出及びデータ処理：上記SPA実験について、150μLの反応を二重反復で行った。夫々の時点で、20μLを除去し、氷冷0.5M EDTA10μLと合わせた。時間経過の完結時に、夫々の時点に関する全放射能濃度がほぼ等しくなるように反応液を希釈した。こうして75μMのATPにおける反応液を25倍に希釈し、３μMのATP反応液を希釈しなかった。希釈緩衝液は２部の500μMの酢酸マグネシウムを含む反応緩衝液と１部の0.5MのEDTAからなった。夫々の希釈反応液１μLをTLC検出のためにスポットした。ホスフェートへのATPの転化率に関する値を実施例２に記載されたように測定し、これらを使用して夫々のATP濃度における反応速度を測定した。次いでこれらの速度を上記のようにMichaelis-Menten式にフィットしてKm(ATP)の値に関する推定値を得た（図16）。
図15と16の比較は二つの技術が同様の結果を生じるが、またデータの質がSPA方法について優れていることを明らかに示す。更に、SPA方法はかなり少ない操作及び更に短いデータ処理時間を必要とする。示された結果は代表例であり、夫々が多くの回数で再現された。
【００４３】
実施例10
SPA方法により測定されたHPV-11に関するKi(ATP-γ-S)の値
ATPのγ-チオホスフェート類似体は競合メカニズムにより多くのATPアーゼを抑制する。インヒビター作用のメカニズムの実験測定は幾つかの基質濃度及びインヒビター濃度に関する初速を測定することを必要とする。この実験に必要とされるデータ点の数（数百）及び必要とされる正確さはTLC検出により実験を行なうことが極めて困難かつ長たらしいことを意味する。しかしながら、SPA操作は良く作用する。この実験について、５、10、20及び40μMのATP濃度を、０、３、６、12及び24μMのインヒビター濃度とともに使用した。反応を実施例９（SPA検出）について記載されたように行なった。データを上記のように処理し、グラフィットを使用して非線形回帰により競合抑制に関する式にフィットした。本発明者らは3.8±0.4μMのKi(ATP-γ-S)に関する値及び6.7±0.7μMのKm(ATP)に関する値を得た。フィットネスを示すLineweaver-Burkeプロットを図17Aに示す。線に関するフィットされたパラメーター及び点に関する実験値を使用してプロットをエクセルで作成した。比較のために、データをまた非競合抑制（酵素及び酵素-基質複合体へのインヒビターの等しい結合）に関する式にフィットした。得られた値はKi(ATP-γ-S)について16±２μM及びKm(ATP)について12±２μMであった。相当する二重逆数プロットを図17Bに示す。得られたデータの質のために、特に一層高いインヒビター濃度における、この第二のメカニズムに関する実験値とフィットされた値の体系的偏差を観察することが可能である。同様の結論が非競合フィットと較べて競合フィットに関する有意に低い低下されたカイ自乗値から導かれる（夫々62及び347）。こうして予想されるように、競合モデルはこのインヒビターに一層適切である。
【００４４】
説明
上記操作は放射能標識ホスフェート含有化合物の開裂により生成されたオルトホスフェートの検出のための感度の良い、正確な、しかもしっかりした方法である。それはオルトホスフェートが反応生成物である酵素の活性を測定する仕事、及びこのような活性の抑制の測定に高度に適している。多くのこのような酵素がある。普通の例はヘリカーゼ、ATPアーゼ及びホスファターゼである。それはほんの低い濃度のオルトホスフェート（nM又は低μM）が生成される場合に特に適切である。重要な場合はリン基質にしっかり結合するHPVのE1ヘリカーゼの如きこれらの酵素であろう。この操作はアッセイが競合インヒビターに対する最大感受性に関するKmの値より下の基質濃度で行なわれることを可能にする。その方法は大規模のインヒビタースクリーニングに充分に簡単かつしっかりしている。特に、その方法は多くの普通の人工物、例えば、着色化合物又は蛍光化合物により生じられる明らかな抑制に対し感受性ではなく、しかも生じたシグナルが安定であり、再現性であり、またアッセイ成分の濃度又は容積の小さい変動に対し比較的非感受性である。また、その方法は定量的酵素学研究に適用されるのに充分に正確である。
【００４５】
オルトホスフェートを検出するためのその他の方法が文献に説明されていた。二つの広く報告された方法は放射能標識ATPを使用してATPアーゼ活性を測定する。これらの方法の両方がPEIセルロースによるTLC又は木炭へのATPの選択的吸着を使用して、出発物質からの生成物（例えば、ADP及びPi）の物理的分離を伴う。非常に低い濃度のオルトホスフェートを検出するのに充分に感度が良いが、これらは最新スクリーニング用途に容易に適し得ない古典的方法である。その他のアッセイ方法はオルトホスフェート（又は別の反応生成物）を第二の反応で基質として使用して、吸光度又は蛍光変化を生じる共役酵素に頼る。これらは実に正確であり得るが、放射能をベースとするアッセイより感度が良くない。更に、共役酵素の添加は結果の解読を複雑にする。何とならば、共役酵素アッセイは付加的な人工物にかけられるからである。幾つかのその他の操作はリンモリブデン酸塩の生成、続いて色の変化（これはホスフェート濃度と相関関係があり得る）を生じるための還元又は色素吸収を伴う。
【００４６】
これらの操作をベースとする幾つかの酵素アッセイは化合物スクリーニング努力又は酵素学研究に使用するのに充分に正確かつしっかりしているが、これらの方法を使用して低いμM又はnM濃度のオルトホスフェートを検出することは実用的ではない。幾つかの用途では、大容積の希薄なリンモリブデン酸塩をセファデックス又は関連樹脂で濃縮することによりこれらの方法の感度を高めることが可能である。しかしながら、これはスクリーニング用途に適用し得ないことが判明した。何とならば、ほんの非常に小さい容積が夫々の試験反応に通常使用されるからである。放射能標識ホスフェートをポリビニルポリピロリドン(PVPP)の表面に選択的に吸着し得ることが示されていた。次いで放射能標識又はその他の汚染物質が洗浄して除かれ、残存するホスフェートが上昇したpHで溶離により検出し得る。この特別な方法は酵素研究に非常に実用的ではない。何となれば、それが反応体及び生成物の物理的分離を必要とし、その再現性（これはPVPPカラムからの多種のサンプルの溶離に依存する）が比較的不十分であるからである。著者らは彼らの操作の選択性の重要な成分がリンモリブデン酸塩の生成を触媒作用するポリビニルピロリドンの能力であることを示唆し、それによりその他の疎水性表面が彼らの方法に適さないことを暗示し、こうして本発明から離れて導く。
【図面の簡単な説明】
【図１】  種々のビード型を使用することのSPAシグナルに関する効果。(a)E1反応及びブランクに関するcpm。(b)対照対ブランク比。
【図２】  AmMo濃度を変えることのSPAシグナルに関する効果。示された濃度は反応液への添加の前のHClに溶解されたAmMo％(w/v)である。(a)E1反応（正方形）及びブランク（ダイヤモンド）に関するcpm。(b)対照対ブランク比。
【図３】  AmMo溶液中のHCl濃度を変えることのSPAシグナルに関する効果。(a)E1反応（正方形）及びブランク（ダイヤモンド）に関するcpm。(b)対照対ブランク比。
【図４】  CsCl濃度を変えることのSPAシグナルに関する効果。実施例３に記載されたように反応液に添加された原液について示された濃度。(a)E1反応（正方形）及びブランク（ダイヤモンド）に関するcpm。(b)対照対ブランク比。
【図５】  反応液がSPAビード懸濁液及びCsClの添加の前にAmMoとともにインキュベートされる時間を変えることのSPAシグナルに関する効果。(a)E1反応（正方形）及びブランク（ダイヤモンド）に関するcpm。(b)対照対ブランク比。
【図６】  完全反応混合物がCsClの添加後かつカウンティングの前にインキュベートされる時間を変えることのSPAシグナルに関する効果。(a)E1反応（正方形）及びブランク（ダイヤモンド）に関するcpm。(b)対照対ブランク比。
【図７】  E1反応：ブランク比に関するCsCl容積及び反応液へのクエン酸の添加の効果。示された結果は0.2Mのクエン酸を含み、又は含まない30又は90μLのCsClの添加に関するものである。アッセイプレートをCsClの添加後１時間から74時間までの範囲の時間で読み取った。
【図８】  対照：ブランク比に関するHCl、AmMo、及びクエン酸塩の濃度の効果。結果がCsClの添加後の三つの異なる読み取り時間について示される。マークした結果は好ましい試薬濃度に関するものである。このマークした組み合わせが３回繰り返されて夫々の濃度シリーズ内の比較を促進する。実施例３に記載されたように、結果の最初の二つの組は夫々反応液からのイゲパールCA630の不在及びAmMo溶液へのトゥイーン-20の添加に相当する。
【図９】  実施例３の最後に記載された反応時間経過。E1反応（正方形）及びブランク（ダイヤモンド）に関するcpmが示される。
【図１０】  ATP-γ-SによるHPV-6a ATPアーゼ活性の抑制に関するIC50曲線。非線形回帰は8.0±1.6μMのIC50値を示した。
【図１１】  ホスフェート検出の線形性及び正確さ。示されたラインは理論的基準（観察値＝予想値、ダイヤモンド）；実施例５に記載された1.2MのHCl、２％のAmMo、及び0.2Mのクエン酸塩を使用するSPA結果（正方形）；1.8MのHCl、0.5％のAmMo、及び0.1Mのクエン酸塩を使用するSPA結果（三角形）；1.8MのHCl、１％のAmMo、及び0.1Mのクエン酸塩を使用するSPA結果（十字形）；2.4MのHCl、１％のAmMo、及び0.1Mのクエン酸塩を使用するSPA結果（アステリスク）；及びTLC結果（円形）である。
【図１２】  三つの別々のプレートで行なわれたE1反応（正方形）及びブランク（ダイヤモンド）について得られたシグナル。ｘ軸はウェル数であり、見るためにデータを広げるための任意のスケールである。
【図１３】  0.2〜200μMのホスフェートについて得られたSPAシグナル。結果が四つの異なるSPAビード濃度について示される。(a)線形スケール(b)対数スケール。(b)に示された理論線（アステリスク）は単に基準のための直線である。
【図１４】  0.5〜10μMのホスフェート又はATPについて得られたSPAシグナル。結果がAmMoの存在下のホスフェート（ダイヤモンド）；AmMoの不在下のホスフェート（三角形）；AmMoの存在下のATP（正方形）；及びAmMoの不在下のATP（十字形）について示される。(a)線形スケール(b)対数スケール。
【図１５】  SPA検出により測定されたHPV-11 E1に関するKm(ATP)の値の推定。実験で測定された値が円形として表され、線がMichaelis-Menten式に関して計算された理論的最良フィットを表す。
【図１６】  TLC検出により測定されたHPV-11 E1に関するKm(ATP)の値の推定。実験で測定された値が円形として表され、線がMichaelis-Menten式に関して計算された理論的最良フィットを表す。
【図１７】  実験抑制データを非線形回帰により得られたパラメーターに基づく理論的結果と比較するLineweaver-Burke（二重逆数）プロット。(A)競合抑制モデル。(B)非競合抑制モデル（Ｅ及びESへの等しい結合）。両方のグラフに関して、実験値が24μM（ダイヤモンド）；12μM（アステリスク）；６μM（正方形）；３μM（三角形）；及び０（円形）のインヒビター濃度で点として示される。線は夫々の抑制モデルに関する最良フィットパラメーターに基づく。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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