(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
溶液中に又はキャリヤーガスとともに、シアン化水素その他のシアン系化合物を本質的に含有しないシアン（Ｃ2Ｎ2）を含む燻蒸剤であって、上記シアンの濃度が0.01mg/l〜160mg/lの範囲内にある前記燻蒸剤。
【請求項２】
前記キャリヤーガスが不活性ガスである、請求項１記載の燻蒸剤。
【請求項３】
前記キャリヤーガスが低酸素濃度を有する、請求項１記載の燻蒸剤。
【請求項４】
前記キャリヤーガスが二酸化炭素を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の燻蒸剤。
【請求項５】
前記燻蒸剤が溶液中に存在する、請求項１記載の燻蒸剤。
【請求項６】
前記溶液が水性溶液である、請求項１記載の燻蒸剤。
【請求項７】
その濃度が0.01mg/1〜160mg/lの範囲内にある気体形態の、シアン化水素その他のシアン系化合物を本質的に含有しないシアン（Ｃ2Ｎ2）を商品及び／又は構造物に適用すること、あるいは閉鎖容器及び／又は構造物の容積に関して平均した場合、その濃度が0.01mg/1〜160mg/lの範囲となるように水性溶液中のシアンを商品及び／又は構造物に適用することを含む燻蒸方法。
【請求項８】
前記商品が穀粒、種子、食肉、果物、野菜、木材、植物、切り花、及び土壌を含む、請求項７に記載の燻蒸方法。
【請求項９】
前記構造物がサイロ、大量の穀粒を収容する構造物、あるいは歯科、医科、科学用又は獣医科用の部屋、家屋又は器具である、請求項７に記載の燻蒸方法。
【請求項１０】
前記燻蒸剤がウイルス、昆虫、クモ、線虫、ダニ、細菌、かび、真菌及びそれらの胞子、並びに齧歯類を含む広範な生物相の内の１以上を防除し得る、請求項７〜９のいずれか１項に記載の燻蒸方法。
【請求項１１】
前記燻蒸剤が二酸化炭素（ＣＯ2）を含有する環境に包含されるか及び／又は適用される、請求項７〜１０のいずれか１項に記載の燻蒸方法。
【請求項１２】
前記燻蒸剤が適用される、環境内の湿度及び／又は圧力が前記燻蒸剤の特徴（例えば毒性増大及び／又は相乗作用）を制御するよう調整される、請求項７〜１１のいずれか１項に記載の燻蒸方法。
【請求項１３】
前記燻蒸が低流量気体燻蒸、低圧気体燻蒸、高圧気体燻蒸、液体燻蒸剤の噴霧、及び／又は液体燻蒸剤中への商品の浸漬を含む、請求項７〜１２のいずれか１項に記載の燻蒸方法。
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は燻蒸剤に関する。さらに本発明は、シアン（Ｃ2Ｎ2）を含む気体としての又は溶液中の燻蒸剤に、並びにこのような気体又は溶解燻蒸剤を用いた燻蒸方法に関する。
発明の背景
燻蒸剤は、粒状商品（例えば穀物）、並びにその他の貯蔵商品（耐久性及び生鮮食品を含む）、多孔質塊状物質（例えば土壌又は木材）及び空間（典型的には、空の建築物）を保護するのに通常必要とされる駆除及び侵入に対する防御のために広く用いられる。理想的燻蒸剤は、昆虫、ダニ、線虫、細菌、真菌及びそれらの胞子、ウイルス及び糸状菌、並びにその他の害虫生物相に対して有毒であるべきである。それは低濃度で有効である必要がある。それは、理想的には、燻蒸化領域内の物質による吸収率が低い。それは、哺乳類に対して低慢性毒性を示し、全く残留しないかもしくは不活性な残留物を残すべきである。さらに、理想的燻蒸剤は安全な取扱に関する限りは難しくあるべきでなく、そして燻蒸される商品又は空間に悪影響を及ぼすべきでない。
これらの「理想的」判定基準のすべてを満たす燻蒸剤はない。穀粒、その他の粒状物質、果物及び木材の燻蒸に最も普通に用いられる２つの燻蒸剤はホスフィンと臭化メチルであるが、これらの燻蒸剤の代替物としてカルボニルスルフィドが近年提唱されている（WIPO公告第93/13659号である国際特許PCT/AU93/00018の明細書を参照）。
ホスフィンは、穀物害虫に有効で且つ残留物（本質的に無害なリン酸塩である）を殆ど残さないため、穀物貯蔵品等のために選択される燻蒸剤である。しかしながら、ホスフィンは、その濃度が相対的に低い値を超える場合は自然発火性であり、許容可能濃度で用いた場合は短期間で昆虫の全段階を屠殺できない。
臭化メチルは短期間の燻蒸に用いた場合は穀物害虫に対してはホスフィンより毒性が高いが、しかし長期燻蒸を実施した場合にはホスフィンのほうが穀物害虫に対して有害である。臭化メチルはホスフィンより易燃性が低いが、しかし臭化メチルがオゾン層を減損させることが最近の研究から示された。したがって、燻蒸剤としての臭化メチルの使用は、モントリオールプロトコールにしたがって現在は漸次廃止されつつある。
カルボニルスルフィドは、現在、広範な試験を受けつつあり、臭化メチル及びホスフィンの両者を上回るいくつかの明らかな利点はあるが、燻蒸剤として用いるには至っていない。穀物害虫に対して用いられているその他の燻蒸剤としては、アクリロニトリル、二硫化炭素、四塩化炭素、クロロピクリン、二臭化エチレン、二塩化エチレン、酸化エチレン、シアン化水素及びフッ化スルフリルが挙げられる。ハロゲンが、どれも「理想的」燻蒸剤特性を有していないこれらの「慣用的」燻蒸剤の多数中に存在することは注目すべきである。
長年、新しい燻蒸剤が絶えることなく探し求められてきたが、燻蒸剤の改良のための探究は恐らく続くであろう。
発明の要約
本発明は、特に昆虫、ダニ、線虫、真菌及びそれらの胞子、細菌、ウイルス、糸状菌、並びにその他の害虫生物相の制御において慣用的燻蒸剤の実行可能な代替物となり得る特性を有する新規の燻蒸剤を提供しようとする。
ある広範な形態で、本発明は、溶液中に又はキャリヤーガスと関連して、シアン（Ｃ2Ｎ2）（本明細書中に定義）を包含し、シアンの濃度が0.01mg/l〜約160mg/lの範囲である燻蒸剤を提供する。
好ましくは、キャリヤーガスは不活性ガスであり、好ましくはキャリヤーガスは酸素濃度が低い。
本発明の好ましい実施態様では、キャリヤーガスは二酸化炭素を含む。
本発明の別の実施態様によれば、燻蒸剤は溶液中、好ましくは水性溶液中に存在する。
さらに広範な形態において、本発明は、濃度が0.01mg/l〜約160mg/lの範囲である気体形態のシアン（Ｃ2Ｎ2−本明細書中に定義）を商品又は構造物に適用すること、あるいは閉鎖容器及び／又は構造物の容積の上で均一にされる場合には、濃度が0.01mg/l〜約160mg/lの範囲であるように水性溶液中のシアンを商品及び／又は構造物に適用することを包含する燻蒸方法を提供する。
好ましい形態では、上記の商品は穀物、種子、食肉、果物、野菜、木材、苗木、切り花及び土壌を含む。
好ましくは、上記の商品としては、多量の穀物（例えばコムギ）を含有するサイロ又は同様の構造物、並びに歯科、医科及び／又は獣医科用の部屋、家屋、器具等を含む。
好ましい実施態様では、上記の燻蒸剤は、ウイルス、昆虫、クモ、ダニ、線虫、細菌、糸状菌、真菌及びそれらの胞子、並びに齧歯類を含めた１つ又はそれ以上の一連の生物相を制御し得る。
本発明の別の実施態様では、上記の燻蒸剤は二酸化炭素（ＣＯ2）を包含し、及び／又は二酸化炭素を含有する環境に適用される。
好ましくは、上記の燻蒸剤が適用される環境内の湿度及び／又は圧力を調整して、上記の燻蒸剤の特性を制御する（例えば毒性及び／又は相乗作用増大）。
種々の好ましい形態において、上記の燻蒸は低流量ガス燻蒸、低圧ガス燻蒸、高圧ガス燻蒸、ガスとして又は溶液中の燻蒸剤の噴霧を包含する。
【図面の簡単な説明】
本発明は、添付の図面と関連させて、本発明人による実験手順を略記した種々の実施例と関連させた後述の好ましい実施態様についての以下の詳細な説明によりさらに十分に理解されるようになるが、本発明はこれらに限定されない。
図１及び２は、気相及び液体中のＣ2Ｎ2の分析結果を示すグラフである。
図３〜７は、ガス流からＣ2Ｎ2の除去に関する種々の手順の結果を示すグラフである。
図８及び９は、ガス抜き又は除去以外の方法による空気又は液体からＣ2Ｎ2を除去するための手順の結果を示す。
図１０（ａ）及び（ｂ）は、コムギ上のＣ2Ｎ2収着を説明する。
図１１、１２及び１３（ａ）〜（ｄ）は、Ｃ2Ｎ2で処理したコムギの効果を示す。
図１４（ａ）〜（ｃ）は、コムギ穀粒中に存在する糸状菌に対するＣ2Ｎ2の毒性を示す。
図１５〜１７は、水を通したＣ2Ｎ2の移動を示す。
図１８〜２３は、コムギ中のＣ2Ｎ2の収着率を示す。
図２４は、水中のＣ2Ｎ2の測定濃度をグラフで示す。
図２５及び２６は、液体として及び気体として付加した場合の、抽出直前に燻蒸剤が付加されたコムギ中のＣ2Ｎ2の残留量を示す。
図２７は、コムギのカラムを通したＣ2Ｎ2及びその他の気体の動きを示す。
図２８〜３０は、Coleopteraの２つの種に対するＣ2Ｎ2の毒性結果を示す。
図３１〜３６は、種々の溶媒中のＣ2Ｎ2の安定性及び相平衡を示す。
図３７〜４１は、ＭｅＢｒの収着と比較した場合の木材によるＣ2Ｎ2の収着を示す。
図４２〜４４は、乾燥木材の３つの種に対するＣ2Ｎ2の毒性を示す。
図４５は、切り花によるＣ2Ｎ2の収着を示す。
図４６は、昆虫におけるＣ2Ｎ2の毒性に及ぼす高圧及び低圧の作用を測定するのに用いられる燻蒸装置を示す。
好ましい実施態様の詳細な説明
本明細書及び請求の範囲においては、本発明に言及するとき、「シアン」という用語は、シアン化水素及びその他のシアン系化合物（即ち、シアン化水素を生じる化合物）を本質的に含有しないシアン（C2N2）の気体（STP下にあるとき）又は溶液と定義される。したがって、本発明のシアンは、評価可能量の他の化学物質、例えば塩化シアン又はシアン化水素が存在しない商業的に調製されるか又は販売されるようなシアンである。
しかしながら、燻蒸用に、シアンの代わりに又はシアンとともに、シアンを遊離し得る他の化学物質種を用いることもできる。
燻蒸剤としてジシアン及びオキサロニトリルとも呼ばれているシアンは、（ＣＮ）2、Ｃ2Ｎ2又はＮＣ−ＣＮと表される。シアンは大気中に自然に生じ、植物により及び稲光の作用により生成される。それは他の銀河系にも存在し、そのスペクトル線は銀河系の相対速度を概算するためにレッドシフト測定に用いられる。
従来技術を再検討した場合に、本発明人は古い科学論文及び特許明細書に用いられた用語の問題に気づいた。この問題とは、古い科学文献においては、シアン化水素を生成し得るあらゆる化合物（非シアン系物質と反応してシアン化水素を生成する物質を含む）が「シアン」と呼ばれているが、一方、今日シアンと呼ばれる化合物は、「ジシアンdicyanogen」又は「ジシアンdicyan」と命名去れていた。この分野の従来技術のあらゆる再検討して、古い用語のこの多義性を知る必要がある。
シアンはヒト及びその他の温血動物に対しては実質的急性毒性を示すが、その慢性毒性は微々たるものである（即ち、ある期間に亘って摂取される小用量は累積的でない）。”The synthesis and chemistry of cyanogen”（Chemical Review, Volume 59, pages 841-883, 1959に発表）という表題の論文において、T. K. BrothertonとJ. W. Lynn（A. B. Elkinsによる初期の研究を参照）は、以下のように述べている：
「シアンは非常に有毒で、シアン化水素に匹敵する毒性を有する。最大許容蒸気濃度は10ppmである」。
1913年頃に、シアンの毒性を報告しているJ. L. Burckhardtは、（ｉ）空気１ｌ当たり（ＣＮ）2  0.1mg未満の用量のみがネコには無害であると考えられる；（ｉｉ）（ＣＮ）2  0.2mg/lはネコに対して２〜３時間で致死性である；がしかし（ｉｉｉ）ウサギは0.4mg/lを十分耐容し、その致死用量は0.6〜0.8mg/lであると推論した。
1921年12月13日付けの米国特許第1,399,829号の明細書中で、J. W. Van Meterは、シアン、塩素及び砒素ガスは「皆、燻蒸剤、殺菌剤、消毒剤、防臭剤として並びに昆虫及び動物の駆除用に別々に用いられて多少の成功をおさめている」と述べている。しかしながら、Van Meterはこの陳述に対する支持をなんら提供しなかったし、本発明人はVan Meterの陳述の真実性を示す過去の参考文献（又はもっと最近の参考文献）を突き止めていない。Van Meterは米国特許第1,399,829号の明細書中で、「シアンガスはアリマキ及び柑橘類及びその他の果樹に好んで住む幼虫にとって致死的に有毒である。・・・それは葉全体に有毒というわけではない」と述べている。彼の発明は、実際には、「上記のガスの組合せ又は混合物」であった。
Van Meterは「シアンを遊離させるために」鉄を含有するシアン化カリウム溶液に限定量の塩素を通すことができると主張したが、しかしこのガスが「空気より軽い」ことを彼は観察しており、このことは、シアンは空気より密度が高いため、実際には彼はシアン化水素を豊富に含むガスを生成していたことを示している。
1924年4月24日付けの英国特許第237,344号は、「シアン燻蒸剤」という表題である。その特許明細書は、シアン化物の分解を防止するために付加される硫酸又はシュウ酸とともに珪藻土又は他の多孔性担体上に分布するシアン化水素（ＨＣＮ）及びその他のシアン誘導体の使用を記載する。しかしながら、シアンそれ自体は、英国特許第237,344号の明細書に列挙された「シアン燻蒸剤」に含まれない。
T. K. Brotherton及びJ. W. Lynnの上記の論文には、シアンに関する燻蒸剤の可能性についての言及がないことも注目される。
従来技術の広範な調査にもかかわらず、本発明人は燻蒸剤としてのシアンの使用の前例を見出せなかった。シアンの特性は、安定性（Ｃ2Ｎ2は水の存在下で容易に分解すると言われている）及び毒性に関しては、シアンが元々燻蒸剤としての使用に適していないという確信に至らしめたと考えられる。
本発明人は、この確信が根拠のないものであり、シアンは、十分注意して取り扱われるならば、気体及び溶液で用いて一般に選択される燻蒸剤を上回る有意の利点を有する燻蒸剤を提供し得る、ということを確認した。特に、
（ａ）シアンは気体燻蒸剤用に他の気体と混合し得るし、燻蒸剤担体が空気又は別の酸素を多く含む気体である場合は、Ｃ2Ｎ2の濃度が6.6パーセント未満であれば爆発の危険はなく、6.6パーセント以上の濃度であっても、酸素／シアン混合物を発火させるには火花又は炎が必要である。
（ｂ）シアンは水（及びその他の溶液）に可溶性で、商品又は構造物に噴霧するか又は単にそれらの上の溶液中に注ぐことにより、低水性濃度で商品又は構造物に適用し得る。
（ｃ）シアンは穀粒、その他の粒子又は貯蔵食品中に極めて容易に吸収される一方、理想的には、担体としての有意レベルのＣＯ2（吸収を低減させる）とともにガスとしてのシアンの使用により、又は急速流量で穀粒に噴霧するか穀粒を通過させる高濃度の燻蒸剤の使用により、多量の穀粒等の迅速な燻蒸に用い得る。
（ｄ）燻蒸に有効な濃度のシアンを用いたコムギ及びその他の種子の燻蒸は、コムギ又はその他の種子の発芽に影響を及ぼさないということが示された（しかし、シアンの濃度が180mg/l又はそれ以上である場合には、燻蒸剤含有ガスはいくつかの種子の発芽を阻害し得る除草剤として作用するということに留意すべきである）。
（ｅ）シアンは主経路でないシアン化物への変換により迅速に分解されるので商品上に極低度の残留物を残すが、これに対比してシアン化水素を含有する燻蒸剤を用いると有意の残留物が残る。
（ｆ）シアンは、粒状商品に空気流を通すことにより、燻蒸期間終了時に粒状商品から洗い流される。
（ｇ）シアンは、単にシアンの液化点以下の温度に空気流を冷却することにより空気流から除去される。
（ｈ）シアンは、昆虫、ダニ、真菌及びそれらの胞子、細菌、ウイルス並びに齧歯類を含めた広範な生物相を制御し得る。
（ｉ）シアン含有燻蒸剤による燻蒸は、腐敗させずに高湿穀粒の長期貯蔵を可能にする。
（ｊ）シアンは植物においては全身性で、したがって昆虫及び植物疾患を制御するのに全身的に用い得る。
（ｋ）シアンは水溶液中で及び気体としてともに活性であり、水を介して移動し得るので、医科、歯科、科学用及び獣医科用建物、並びにこれらの使用に際して用いられる装置に見出されるような広範な状況で、細菌、真菌及びウイルスを制御し得る。
（ｌ）シアンは食肉、並びに果物及び野菜の保存に有用である。
本発明人はさらに、シアンと二酸化炭素の混合物がシアンの毒性を増強することを見出した。シアンと二酸化炭素との混合のこの観察された相乗作用に対する説明は現在はない。しかしながら、本発明人は、二酸化炭素が昆虫及び他の生物相の呼吸数を増大し、これがシアンの害虫呼吸系侵入率を増大すると仮定した。しかしながら、これは確証されていない仮定に過ぎず、観察された相乗作用に関与するかもしれないし、しないかもしれない。
したがって、本発明によれば、シアン及びキャリヤーガスを包含する燻蒸剤が提供され、シアンの濃度は一般的に0.01mg/l〜160mg/lの範囲である。
キャリヤーガスは不活性ガスである。キャリヤーガスは低濃度の酸素を含有するのが便利である（例えばバーナーガス）。好ましくは、キャリヤーガスは二酸化炭素を含有する。
さらに本発明によれば、水（又はその他の液体）溶液中にシアンを包含する燻蒸液が提供される。
本発明はさらに、本発明の気体燻蒸剤又は溶液に溶解した燻蒸剤を必要な燻蒸期間中商品に適用することから成る燻蒸方法を包含する。
本発明の燻蒸方法としては、低流量気体燻蒸、低圧気体燻蒸、高圧気体燻蒸、溶液に溶解した燻蒸剤の噴霧、並びに溶液に溶解した燻蒸剤中に商品を浸漬することなどが挙げられる。これらは全てを網羅しているわけではない。
低流量燻蒸を用いた場合、予定濃度のシアンを含有する空気又は別のキャリヤーガスを、国際特許出願PCT/AU90/00268及びPCT/AU94/00324の明細書に記載されているホスフィン燻蒸法と同様の方法で、粒状商品にゆっくり通す。燻蒸剤含有ガス中のシアンの濃度は収着及び曝露時間に依っているが、好ましくは約0.01mg/l〜約5mg/lの範囲である。上記のように、シアンと二酸化炭素の組合せの毒性増強が燻蒸効能を犠牲にすることなく使用されるシアンの濃度をより低くさせるため、好ましいキャリヤーガスは二酸化炭素を含有する。
貯蔵商品の低圧燻蒸は、本質的に気密室中に商品を貯蔵する場合には、気体シアン燻蒸剤を用いて実施し得る。小室を排気し、又は実質的に排気状態にし、次いでシアン含有ガスを小室全体に分布させて、貯蔵商品を入れるための予定の燻蒸レジメン（毒物学的考察に基づいて）を確立する。低圧燻蒸では、燻蒸剤はＳＴＰ（曝露時間は変える必要があるが）で認められたと同一の毒性終点を達成し、したがって毒性作用を達成するのに必要な燻蒸剤の量を最小にすることを、本発明人は確定した。
本質的に気密な小室に商品を貯蔵する場合には、貯蔵商品の高圧燻蒸も考えられる。小室排気の任意の工程後に、小室中のガス圧が予定ガス圧を超えるまで、シアン含有ガス（好ましくは二酸化炭素を含む）を小室中に導入する。次いで小室を密閉し、小室を開け、シアン含有ガスを小室から洗い流すまで、商品の燻蒸を保持する。
貯蔵商品中の昆虫害虫は、低圧ガス燻蒸を用いた場合より降圧燻蒸を用いた場合のほうがより迅速に屠殺される。高圧燻蒸を確立するのに必要な付加的装置によりこの方法の実施はよりコスト高になるため、それは主に高価な商品の迅速な消毒に用いられる。
上記の各々の気体燻蒸法において、燻蒸された商品を貯蔵する容器又は小室に残る燻蒸剤含有ガスを冷却することにより、又はシアンの化学的分解又は吸収（化学物質、例えばアミン又は吸収剤にシアン含有ガスを通すことを含む）により、燻蒸にもちいられたシアンを捕捉し得る。
水中のシアンの溶解度及び他の液体の選択は、Brotherton及びLynnによる上記の論文の表２に示されている。上記のように商品の液体燻蒸は、予定低濃度（毒物学的考察にしたがって選択される）でシアン含有液体（通常は水）を商品に噴霧することにより実施する。あるいは、シアン含有液体を商品上に注いでそれを覆うか又はそれにより商品に滴らせる。液体燻蒸剤との接触は、商品への液体燻蒸剤の不断の又は断続的（しかし周期的な）適用により保持され、したがってあらゆる必要期間中の商品の燻蒸を保持する。燻蒸期間終了時に、（ａ）水で洗浄し、その後（必要な場合には）清浄空気で乾燥させることにより、又は（ｂ）清浄空気で商品を洗い流すことにより（これにより液体燻蒸剤のキャリヤー液とシアンの両方を捕捉する）、シアン含有液は商品から除去される。
シアンは圧縮Ｃ2Ｎ2のシリンダーに入れて市販されている。シアンのこのようなシリンダーは本発明の又は本発明に用いられる気体及び液体燻蒸剤用のシアンの供給源として用い得る。しかしながら、シアンの供給源としてガスの市販のシリンダーの代わりにシアンの現場発生器を用いてもよい。現場発生器の例としては、（ｉ）窒素と二酸化炭素との混合物を炭素に曝露して、排出し、任意に未反応Ｎ2及びＣＯ2を再循環させるもの；並びに（ｉｉ）窒素雰囲気中で炭素フィラメントを約2,200℃に加熱するものが挙げられる。シアンのその他の代替的供給源としては、シアンと二酸化炭素及び／又は低酸素大気の圧縮混合物、並びに必要な場合に放出されるシアンを含有する溶媒物質を含入するガスシリンダーが挙げられる。
実施例
本発明の発明人は、燻蒸剤としてのシアン（Ｃ2Ｎ2）の効能を立証するために多数の実験を実施した。多数のこれらの実験を以下の実施例に詳述する。
実施例１
気相中及び液体中のＣ2Ｎ2の分析
目的：目的は空気中のＣ2Ｎ2濃度を測定することであった。
材料と方法
窒素及びリンに関して選択する熱電子特殊検出器を装備したVarian 3300ガスクロマトグラフで気体−液体クロマトグラフィーによりＣ2Ｎ2を測定した。使用したカラムは、内径0.53mmのmegaboreカラム、即ち60℃の恒温のDBwax（J & W 127-7012）又は110℃の恒温のBP624（SGE, 50QC5/BP624）であった。
空気中の標本のための方法
Gow-Macガス密度平衡から確定されるガスの標準物を、Mininert弁を装備し、２個のガラスビーズを含入した120mlフラスコ中に公知の容量を注入することにより希釈した。フラスコを振盪させて混合し、１時間放置後、アリコート（20μl）をガスクロマトグラフ中に注入した。反応を記録し、適用濃度に対してプロットした。
水及びその他の溶媒中の標本のための方法
水（10ml）を、Mininert弁を装備した公知の容量（典型的には11.5ml）のエルレンマイヤーErlenmeyerフラスコ中にピペットで入れた。公知量のガスを気密注射器で水中に注入した。フラスコを25℃で１時間放置した。液体（１μl）及びヘッドスペースガス（20μl）のアリコートをガスクロマトグラフに注入した。反応を記録し、付加濃度に対してプロットした。
結果
ピーク領域（任意の単位）対Ｃ2Ｎ2濃度のプロットを、30μl注入及びDBwaxカラムの場合に関して、図１に示す。曲線は0〜35mg/lの範囲では線状であったが、高濃度に対する曲線を推定すると反応は低く見積もられた。20μg/L（約10ppm，V/V）での信号対ノイズ比は240であった。したがって、本方法は10ppm，V/VのＴＬ  Ｖ値以下を検出するのに十分な感度を有する（Sax and Lewis, 1989）。
Ｃ2Ｎ2の水溶液は、試験領域で線状反応を生じ、DBwax上に1μl注入した場合は0〜8mg/lであった（図２）。この場合、水は燻蒸剤の後にクロマトグラフィー処理した。
要約
水又は空気中のＣ2Ｎ2の測定は特別難しくはなく、ＴＬ  Ｖ値以下を十分測定し得た。
実施例２
空気と二酸化炭素の混合物中のＣ2Ｎ2の効能
目的：Ｃ2Ｎ2が二酸化炭素を含有する混合物中で有効であるか否か、及び二酸化炭素がＣ2Ｎ2を増強するか否かを調べること。
材料及び方法
二酸化炭素（40%.V/V）と空気の混合物をテドラーTedlerバッグ中で作り、水（10μl）を付加して、二酸化炭素供給源の乾燥状態を補償した。Dreschel瓶中で昆虫をこの供給源に接続させ、フロースルー法の項でで考察されるように燻蒸を実施した。
他の実験においては、270mlエルレンマイヤーフラスコを空気中の40%二酸化炭素で溢れさせた。装置は、二酸化炭素空気混合物のためのタップ入口及びガラス出口とのクイックフィット接続から成っていた。フラッシング後、タップを閉め、燻蒸剤Ｃ2Ｎ2の注入のために、及び燻蒸剤の分析用のサンプリングのためにガス出口を隔壁に取り付けた。湿った濾紙をフラスコの外側に付加した。二酸化炭素を付加せずに、空気を満たしたフラスコ中で検定をさらに実施した。投与の全生物検定手順、温度並びに投与と死亡率の査定との間の間隔は同一であったが、唯一の差異は燻蒸小室の大気中の二酸化炭素の割合であった。
被験昆虫は成虫Rhyzopertha dominica(F.)ＣＲＤ２系統であった。
燻蒸剤濃度は、内径0.53mmのDBwaxカラム上での分離後、熱電子特殊検出器を装備したVarian 3300ガスクロマトグラフで測定した。
結果
フロースルー実験では、0.83mg/lでＣ2Ｎ2に１時間曝露すると、曝露終了時と１週間の回復期間後とに査定して、死亡率は100%に達した。しかしながら、低用量では、見かけの急性死亡率は１週間後より低かった。45分間の曝露では、死亡率は5.4%であった。
静止実験では、0.125mg/lに23時間曝露後、48時間の滞留時間を置くと、死亡率はＣＯ2の場合には97%であったが、これに対して空気の場合には1%であった。0.5mg/lに2時間曝露した場合、死亡率はＣＯ2で80%、空気の場合は2.5%であった。全ての場合に、昆虫は、48時間の回復期間後、害を受け、2週間後の死亡率は高くなると思われた。
考察
Ｃ2Ｎ2は、フロースルー法で又は静止条件下でＣＯ2中に用い得る。ＣＯ2との相乗作用が立証された。ＣＯ2との同時使用は、例えばシリンダー中での貯蔵方法に、サイロ中での混合を助けるのに、火災の危険を低減するのに、そして細菌又は糸状菌が水中に存在し得る条件での水のpHの制御に用い得る。
増圧下でのＣＯ2による相乗作用は、実施例４５に示す。
実施例３
粉砕穀粒上のヘッドスペースのサンプリングによるＣ2Ｎ2の残留物の分析
目的：標準手法による燻蒸化コムギ中のＣ2Ｎ2の残留物を測定し、コムギの粉砕中に放出されたと思われる燻蒸剤の量を確認すること。
材料及び方法
Mininertバルブで密封した120ml容器中でコムギ25gに燻蒸剤5mlを付加して、オーストラリア標準白色コムギを高用量の燻蒸剤で慎重に燻蒸した。初期算出ヘッドスペース濃度は4%V/V（40,000ppm，V/V）で、420g/g（420ppm，W/W）の率で燻蒸剤を適用した。密封容器中に30℃で10日間貯蔵後、コムギ（20g）を直ちに密封ブレンダーに移し、20秒間粉砕した。ヘッドスペースガス（50μl）を熱電子特殊検出器を装備したVarian 3300ガスクロマトグラフに注入し、内径0.53mmのDBwaxカラム上で分離した。反応をシアン化水素及びＣ2Ｎ2の場合と比較した。
結果
燻蒸化及び対照コムギからのヘッドスペースのクロマトグラフで２つのピークが観察されたが、いずれもＣ2Ｎ2ではなかった。検出限界は、コムギ中の残留物が穀粒に6x10-11g/g未満というものであった。
ピークの１つをシアン化水素と同時クロマトグラフィー処理した。レベルは、対照コムギでは平均5x10-8g/g及び燻蒸化コムギでは5.6x10-8g/gに相当した。これら２つの値の差は有意ではなかった。
Ｃ2Ｎ2前にクロマトグラフィー処理されたピークは、それがホスフィンより短い保持時間を有することを立証するための他方のピークと同一であると確認されなかった。経験を踏まえた推測は、このピークがシアン酸であるというものである。そうであるならば、そしてシアン化水素と同一の検出器に対する反応を仮定すると、対照及び燻蒸化コムギの両方の残留物は2x10-8g/g〜3x10-8g/gであった。
考察
燻蒸剤の残留物に関して穀粒を試験するのに用いた方法は、広く用いられている。結果は、実施例２６で報告されたものに相当する。即ち、Ｃ2Ｎ2は密封容器内のコムギ上で急速に分解される。420g/gの適用による6x10-11g/g未満という残留物は莫大な損失を示し、損失のこの値は穀粒に適用されたいかなる殺虫剤に関してもこれまで立証されたことはなかった。
粉砕穀粒上の密封容器中のＣ2Ｎ2及びシアン化水素の両方の濃度は、非常に多量のＣ2Ｎ2を適用したにもかかわらず、各々の場合、10ppm,V/VのＴＬＶ値よりかなり低かった。したがって、Ｃ2Ｎ2で予め燻蒸したコムギの製粉中は小麦製粉業者が不法レベルの燻蒸剤に曝露されることはない（取締り当局が確定する差し控え期間に服する）。
実施例４
糸状菌制御におけるＣ2Ｎ2の効能
目的：糸状菌に対するＣ2Ｎ2の効能を測定すること。
材料及び方法
湿コムギ
コムギを水分含量30%，W/Wという条件にして、フラスコ当たりコムギ30gで270mlフラスコ中に入れた。隔壁入口を装備したフラスコを30℃で貯蔵した。Ｃ2Ｎ2を0、20、40及び80mg/lの用量でフラスコに入れた。24時間後、コムギをフラスコから取り出して滅菌壺に入れ、これを濾紙で覆った。各実験を４回繰り返した。
コムギ中に存在する糸状菌を、Food Science and TechnologyのＣＳＩＲＯ部門のAlisa Hocking博士が同定した。穀粒の感染%はAlternaria infectoria 78%、Alternaria alternata 17%、Epicoccum nigrum 4%、Dreschlera sp.、Fusarium sp.及びPenicillium sp.は各々1%であった。
乾コムギ
水分含量11.6%のコムギを前項に記載されているように燻蒸した。24時間燻蒸後、コムギを寒天培地上に置き、25℃で7日間インキュベートした。
結果
湿コムギ
制御壺内のコムギは急速にかびが生えた状態になり、個々の穀粒は堅い塊に癒合した。可視的糸状菌はいかなる燻蒸化商品でも検出されなかった。燻蒸化穀粒を30℃で4週間保持したが、いかなる糸状菌も出現しなかった。
乾コムギ
コムギにはかびが生えなかった。寒天培地上に平板化した場合、対照コムギはかびが生えたが、20、40及び80mg/lの用量では糸状菌は観察されなかった。10mg/l投与からは増殖した糸状菌が観察されたが、しかし対照よりは少なかった。対照コムギで観察された糸状菌はAlternaria sp.及びPenicillium sp.で、これは燻蒸前に認められ、したがって操作の人工物ではなかった。
考察
実施例２１を参照する。本実施例及び実施例２１は本質的には異なる科学者による複製である。実施例２１からの完全に無関係な結果と結びつけて考えたこれらの結果は、Ｃ2Ｎ2が糸状菌の制御に非常に有効であることを示す。この燻蒸剤により生じた長期防御は、それが胞子を殺し、単に制真菌性であるだけではないことを示す。
糸状菌制御のためのＣ2Ｎ2の使用の可能性を考慮に入れるべきである。例えば、それを代替物として用いて穀粒が湿った場合に乾燥させ得るし、又はそれを用いてある期間穀粒を保持し、乾燥剤の有用期間を延ばすことができる。糸状菌制御のためのＣ2Ｎ2の使用は発芽を低減するため、すべてに推奨されるわけではない。しかしながら、一般的に動物飼料用の穀粒上の糸状菌を制御するために制真菌性プロピオン酸が広く用いられている。Ｃ2Ｎ2は、このような場合に使用の可能性を有する。
溶液並びに気体として適用されるＣ2Ｎ2の能力は、糸状菌制御に、例えば食品用建物内の機械類を消毒するために、そして実際には建物それ自体の消毒に際して、糸状菌制御に適用する多数の可能性を有する。
糸状菌は、乾燥及び湿潤コムギの両方で制御された。普通は、乾燥穀粒上のある種の糸状菌に対する乾燥状態に期待する、がしかしいくつかの状況では、予防手段としてサイロの上部のような湿度が移動する傾向がある領域を燻蒸して糸状菌胞子を殺す。高及び低湿度の両方で糸状菌胞子を殺す能力は、建物、機械類等における糸状菌の消毒に有用である。
制御される糸状菌としては、例えばアルテルナリア属Alternaria、フザリウム属Fusarium、ペニシリウム属Penicillium、Dreshslera及びCoelomycete等の主な属が挙げられる。
機械類及び建物における糸状菌の消毒のために、蒸気及び液相デ作用する、そして水を浸透するＣ2Ｎ2の能力は、細菌及び昆虫ヲ制御する能力と同様、非常に有用である。したがって、それは一般殺菌剤である。これに対比して、酸化エチレンは低水溶性であり、ホルムアルデヒドは蒸気圧が低い。さらに、酸化エチレン及びホルムアルデヒドは各々、発癌性が疑われる（Sax and Lewis, 1989）。酸化エチレンのＴＬＶ値は0.1ppmであり、ホルムアルデヒドは「1ppm：発癌物質の疑いあり」（ＡＣＧＩＨ）である。Ｃ2Ｎ2のＴＬＶ値は10ppmである。
実施例５
食肉品質の保存におけるＣ2Ｎ2の効能
目的：食肉の保存におけるＣ2Ｎ2の効能を調べること。
材料及び方法
新鮮な（未凍結）食肉を地方のスーパーマーケットで購入し、スライスした。例えば約20gの仔ヒツジ肝臓のスライスを、隔壁蓋を装備した750ml壺に入れた。Ｃ2Ｎ2を入れて濃度を0、20、40及び80mg/lとした。壺を37℃で48時間、30℃でそれ以上の期間貯蔵した。
結果
対照肝臓は急速に褪色し、しばらくすると腐敗し、悪臭を放つようになった。48時間の期間中には、いかなる燻蒸化肝臓においても可視的影響は観察されなかった。色の変化は、20mg/l燻蒸に関しては２日目に、80mg/l燻蒸に関しては３日目に始まった。最高試験用量での燻蒸後８日目には影響は全く観察されなかった。
考察
高湿度で細菌、糸状菌及び昆虫を制御し、そして急速に衰退させるＣ2Ｎ2の能力は、食肉保存にとって望ましい属性である。食肉保存の潜在能力は考慮に入れるべきである。例えば、プラスチック袋、ガラス容器又はさらに大きな容器内で食肉を滅菌し得るし、細菌汚染を駆除し得る。卸売及び小売り食肉用建物に、並びに冷蔵を利用出来ない場合の使用（例えば軍隊、キャンプ用）に用途が見出される。
引照
実施例４、２１、１９、２８、１６及び６と引照し得る。
実施例６
果物品質の保存におけるＣ2Ｎ2の効能
目的：果物及び野菜の保存におけるＣ2Ｎ2の効能を調べること。
材料及び方法
キーウイフルーツ、マンダリン及びマッシュルームを試験した。各商品のうち２つを、隔壁蓋と各商品用の別々の壺を装備した750mlガラス容器に入れた。燻蒸剤を各容器に注入して濃度を0、10、20、40及び80mg/lとした。商品を37℃で８日間保持した。商品を取り出し、開封時及びさらに２日間25℃で貯蔵後に目で点検して品質を査定した。各処理を二重に実施した。
結果
未処理（対照）キーウイフルーツは柔らかくなった。８及び１０日目に、色が緑色と黄色を混ぜた色に変色し、果物は非常に柔らかくなり、遊離した水分が果物内部からこぼれ出た。10及び20mg/lで燻蒸した果物はこれらの変化のいくつかを示したが、その程度は低かった。40mg/lで燻蒸した果物はその本来の色及び堅さを保持した。しかしながら、最高用量で燻蒸した果物は褐変のいくつかの徴候を示した。
各用量での処理果物は堅いままであった。品質に及ぼすその他の影響は観察されなかった。
未燻蒸マンダリンはカビが生えてきた。８及び１０日後、マンダリン果肉は非常に柔らかくなり、果皮と袋を又は袋同志を分離しにくくなった。２つの最高用量で燻蒸したマンダリンには糸状菌は観察されず、２つの低用量で燻蒸したマンダリンの品質は対照より良かった。しかしながら、果皮の色は全処理で変色したが、果肉の色は影響を受けなかった。40mg/lの用量での果皮の変色に及ぼされた影響は最小度であった。
未燻蒸マッシュルームもカビが生えてきた。８及び１０日後、暗色残存物をマッシュルームであったとは認識し難かった。10mg/lで燻蒸したマッシュルームは、８日後、対照に類似していた。20mg/lで燻蒸したものはその元の形状を保持したが、遊離水がマッシュルームから失われた。２つの高用量のいずれかで燻蒸したものは、マッシュルーム頂上部の白色を含めてその形状及び色を保持した。40又は80mg/lで燻蒸後の処理マッシュルームには可視的糸状菌は観察されなかったが、マッシュルームは多少の遊離水を失った。
考察
果物及び野菜の品質は、糸状菌及び細菌により、並びに昆虫の侵襲により悪変し得る。他の実施例では、Ｃ2Ｎ2が糸状菌、細菌及び昆虫に対して有効であり、果物及び野菜の貯蔵で見出される高湿度で有効であり得ることが示されている。さらに、Ｃ2Ｎ2の主な代謝物質はシュウ酸であり、これは植物界に広く存在する。
結果は、果物及び野菜の保存に際してのＣ2Ｎ2の潜在能力を示す。
果物及び野菜を保存するためのＣ2Ｎ2の使用には、用量を適切に制御する必要があり、低用量及び過剰用量ともに害を生じる。
潜在能力はすこぶる大きく、小売り及び卸売用建物における果物包装、出荷前の果物の燻蒸、並びに冷蔵を利用出来ない場合の包装（例えばキャンプ用、軍隊用等）に用途が見出される。
引照
実施例１９、４、２１、２８、３３及び１５と引照し得る。
実施例７
土壌中のゾウムシに対するＣ2Ｎ2の毒性及び土壌中の収着
目的：土壌燻蒸剤としてのＣ2Ｎ2の効能を調べること、土壌中のその収着を測定すること、及びガスとして及び水溶液で適用した場合にそれが有効であるか否かを試験すること。
材料及び方法
試験した種はゾウムシGraphognatus leucoloma（Boheman）であったが、これは牧草の又はジャガイモのような作物の重篤な土壌害虫である。試験した土壌は、G. leucolamaが主要害虫である西オーストラリアからのものであった。土壌標本及び昆虫は、EntomologyのCSIRO部門のJohn Mathiesson氏に提供して頂いた。
土壌を用いない試験
昆虫に対する試験のために、１齢幼虫50匹を、隔壁入口を備えたエーレンマイヤーフラスコ（容量138.5ml）に入れた。燻蒸剤はガスとして適用し、フラスコを20℃で24時間保持した。次いでフラスコの口を開け、一夜放置後に死亡率を検定した。手順は、臭化メチル及び二硫化炭素を含めた他の燻蒸剤を査定するのに用いたものと同一であった（Mathiesson, Desmarchelier, Vu and Shackleton.未発表結果）。
Ｃ2Ｎ2濃度は、内径0.53mmのDBwaxカラム上での分離後、熱電子特殊検出器を装備したVarian 3300ガスクロマトグラフで測定した。注入１時間後、及び栓を取り外す１時間前に濃度を測定し、平均濃度を表に記録した。平均して、濃度は約22時間の測定期間中、12%だけ低減した。
土壌中での試験
土壌での試験では、１齢幼虫50匹を土壌に加え、これを密封フラスコに入れた。燻蒸剤をガスとして、又は水溶液で適用した。24時間の曝露期間（この間、燻蒸剤を測定した）後、フラスコを一夜空気に曝した。水中に幼虫を浮遊させた後に、顕微鏡下で生存及び死亡幼虫の数を計数し、燻蒸化土壌における死亡率を対照と比較した。動ける昆虫を生存と分類した。
ａ．水中に適用した燻蒸剤
土壌中の昆虫に対する試験のために、容量138.5mlのフラスコの約半分まで土壌（30g）を入れた。１齢幼虫（50匹）を各壺に加えた。燻蒸剤を水溶液（2ml又は4ml）で適用した。
ｂ．ガスとして適用した燻蒸剤
燻蒸剤をガスとして、水中に適用した燻蒸剤で用いたのと同じ充填比でフラスコに入れた。フラスコの容量は29.5mlで、Mininert弁を備えていた。３種類の土壌（6.4g）、即ちPemberton loam、Sadie peat及びMyaluys sandを用いた。
結果
土壌を含有しない小室における毒性
土壌を含有しないエーレンマイヤーフラスコ中で昆虫にガスとして適用した燻蒸剤の毒性を、表１に要約する。完全（100%）死亡率は、平均濃度15.mg/l以上で得られた。そのレベル以下では、死亡率は低減した。平均濃度0.59mg/lでは、死亡率は56%であった。幼虫の95%を殺すための時間生成物による濃度は、約26mg/lで、これは匹敵する試験において記録された臭化メチルに関する数値よりわずかに低い（Mathiesson, Desmarchelier, Vu and Shackleton.未発表結果）。Ｃ2Ｎ2はG. leucolomaに対して、これも土壌燻蒸に広範に用いられる燻蒸剤である二硫化炭素よりかなり毒性が高かった。
水中で適用される燻蒸剤に関する土壌中の毒性
土壌中でのＣ2Ｎ2による燻蒸後の１齢幼虫の死亡率を、適用量及び燻蒸剤付加後約23時間目のヘッドスペースにおけるＣ2Ｎ2の濃度とともに、表２に示す。完全死亡率を得た。
ガスとして付加した燻蒸剤に関する土壌中の毒性
ガスで付加した燻蒸剤に関する毒性を表３に示す。Pemberton loamに関しては、死亡率は100%で、適用23時間後のＣ2Ｎ2のヘッドスペース濃度は平均1.11mg/lであった。Myaluys sandに関しては、死亡率は99%で、適用23時間後のＣ2Ｎ2のヘッドスペース濃度は平均0.89mg/lであった。死亡率はピート土壌では０で、燻蒸剤は適用23時間後には検出されなかった。
考察
燻蒸剤Ｃ2Ｎ2は土壌中の主要害虫に対して有効であることを立証した。ガスとして用いても水溶液で用いても、それは土壌中で有効であった。
臭化メチルを含む土壌燻蒸が大気中へのこのガスの放出の主要原因であるため、土壌中にＣ2Ｎ2を適用できることは重要である。
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実施例８
フロースルー法を用いたＣ2Ｎ2の適用
目的：昆虫に対する空気中のＣ2Ｎ2の連続流の毒性を測定すること。
材料及び方法
４つに分かれた装置を一列につないだ。
その４つとは：
１  −  容量100LのTedlarガス袋
２  −  水槽ポンプ
３  −  ガスメーター／ロタメーター
４  −  Dreschelヘッド及びポリエチレン管を介して相互に連結する試験管（昆虫小室）のバンク
である。
Tedlar袋を通って、次いで昆虫小室を通る空気の流量は、50ml／分であった。
試験した昆虫種は、Rhyzopertha dominica（F）ＣＲＤ２系統、Oryzaephilus surinamensis（L.）ＮＯＳ４０５系統及びTribolium castaneum（Herbst）ＣＴＣ４系統であった。
Tedlar袋に空気を充填し、Ｃ2Ｎ2を隔壁を介して袋中に注入して空気中のＣ2Ｎ2濃度を一定にした（Tedlar袋はちょうど１回充填量／空いた入口及び隔壁シールを有する）。
ガス袋からの管をポンプの入口に繋いだ。ポンプ出口をロタメーター入口と繋いだ。ロタメーター出口を管のバンクに繋いだ。最後の管を外部にガス抜きした。
室温22〜25℃で実験を実施した。曝露期間終了時に、昆虫小室を分断し、直ちに死亡率を査定して「急性」死亡率を出し、さらに30℃で１週間のコムギ上での保持期間後に査定した。
燻蒸剤濃度は、内径0.53mmのDBwaxカラム上での分離後、熱電子特殊検出器を装備したVarian 3300ガスクロマトグラフでのガスクロマトグラフィーにより測定した。
用量算出に用いた濃度は測定濃度であった。
結果
結果を表４に要約する。燻蒸剤は、燻蒸剤を空気流中に適用し、これを大気中にガス抜きするフロースルー法を用いた場合の昆虫殺害に有効であった。
考察
大気にガス抜きされる空気流中の有毒ガスを適用する技法を用いてアンモニア及びホスフィンを穀粒に適用する。この低流量法はＣ2Ｎ2に関しても用い得る。
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実施例９
チャタテムシ（Pscoptera）に対するＣ2Ｎ2の効能
目的：チャタテムシに対するＣ2Ｎ2の毒性を査定すること。
材料及び方法
２種のチャタテムシを試験した。これらは、Liposcelis bostrichophila（Badonnel）及びLiposcelis entomophila（Enderlein）であった。一番目の種は単為生殖性で、キャンベラの家の内に侵入したものを捕らえた。L. entomophilaは有性生殖性で、西オーストラリアで商業用コムギ倉庫に侵入したものを捕らえた。
チャタテムシをガラス小皿に濾紙から払い落とした。それらを傾けて試験小室に払い落として、チャタテムシを計数した。この試験小室とは、ガス注入及びサンプリング用のMininert弁を備えたエーレンマイヤーフラスコ（容量11.5ml）であった。
他の実験では、チャタテムシを紙と一緒に小室に入れ、小室を燻蒸した。チャタテムシは穀粒倉庫及び家屋の害虫であるだけでなく、「本ジラミ」というその一般名が立証するように、図書館、美術館等の害虫でもある。
昆虫の付加及び密封前に、２〜３滴の水をフラスコの上部内面に付加した。
結果
L. Bostrichophilaの死亡率を表５に示す。この種の昆虫は迅速に殺害され、0.25mg時/lの時間生成物により非常に低濃度で100%死亡率を得た。
0.25mg/lのＣ2Ｎ2を１時間曝露すると、成虫L. bostrichophilaの95%が死亡し、0.5mg/lの濃度で１時間曝露すると100%が死亡した。0.5mg/lを２時間曝露した紙上のL. bostrichophilaを制御すると、成虫死亡率は曝露期間終了時及び１日後の最終査定時には100%であった。
0.5、1.0及び1.5mg/lの各々に１時間曝露した場合、曝露期間終了時に査定して、成虫L. entomophilaの死亡率は100%であった。
考察
燻蒸剤Ｃ2Ｎ2は、室小室及び紙を入れた小室といった種々の状況でのチャタテムシの殺害に有効である。したがって、Ｃ2Ｎ2は公共の建物、図書館、美術館、植物標本館等において、並びに耐久商品又は生鮮商品を蓄えておく状況で有効である。チャタテムシは高湿度を好み、このような状況で作用するＣ2Ｎ2の能力は有用である。
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実施例１０
再循環系におけるＣ2Ｎ2の適用及び昆虫に及ぼす作用
目的：Ｃ2Ｎ2を再循環系に適用し得るか否か、及び連続ガス流中に適用したＣ2Ｎ2が静止条件下で適用した場合より高い毒性を有するか否かを調べること。
材料及び方法
ポンプ、ガス溜め（20Lガラス瓶。磁気攪拌器で攪拌）、燻蒸剤の注入のための及びガス濃度サンプリングのための隔壁、並びに各々容量20mlの６本のDreschel試験管から成る再循環系を確立した。昆虫、典型的には成虫20匹を各試験管に入れた。ポンプを動かしながら、燻蒸剤を系に注入した。再循環により濃度が系全体に均一になった後、６つの昆虫小室のうち３つを分断して、直ちに密封した。残りの３小室は再循環中のままであった。分断小室を静止状態に保持し、再循環ガス濃度にした小室を全実験で等期間、同一温度（22〜24℃）で投薬した。
被験昆虫はRhyzopertha dominica（F）ＣＲＤ２系統及びTribolium castaneum（Herbst）ＣＴＣ４系統であった。
曝露期間終了時に死亡率を査定して「急性」死亡率を出し、さらに30℃、相対湿度55%でコムギ上での２週間の保持期間後に査定して「最終」死亡率とした。あらゆる記載項目についてなんの動きも示さない場合には、昆虫は死亡と分類された。
結果及び考察
結果を表６に示す。死亡率は、各々の種に関して流動状態で投与した小室中の方が高かった。しかしながら、再循環及び静止曝露からの結果の間の差は大きくはなかった。
考察
燻蒸剤Ｃ2Ｎ2は、再循環しながら用い得る。結果は、燻蒸剤が空気流中に分布し、強制再循環を停止してもしなくても有毒であることを立証した。したがって、継続でも分断でも、再循環は昆虫及びその他の害虫の制御のために選択できるものを増大する。R. dominicaに対する22時間曝露に関する毒性濃度は、低い0.04mg/l（約20ppm,V/V）であった。これは働きバチに関するＴＬ  Ｖの２倍に過ぎない。したがって、昆虫に対する毒性用量対ＴＬ  Ｖの比は予想外に低い。
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実施例１１
昆虫に対するＣ2Ｎ2の毒性に及ぼす湿度の作用
目的：
１．昆虫に対するＣ2Ｎ2の毒性に及ぼす相対湿度の作用を調べること。
２．Ｃ2Ｎ2が水溶液で、並びにガス形態で有毒であるか否かをみること。
材料及び方法
方法１
昆虫付加前に275mlフラスコ中に種々の湿度を発生させた。次いで、フラスコを隔壁入口で密封し、同一量のＣ2Ｎ2を投与した。保持期間、湿度等について同一条件下で毒性を測定した結果、唯一の変数はフラスコ内の相対湿度であった。
３種類の湿度を発生させた。第一の方法では、フラスコを湿度30%で室温で放置し、第二の方法では、フラスコを湿度60%で室温で放置した。第三の方法では、濾紙（Whatman No.1）の湿片をフラスコの側面に張りつけて、実験中に可視的水分は観察できるが昆虫は水と接触しないようにした。
方法２
この方法では、予め室温空気に対して開けたままにしておいたエーレンマイヤーフラスコ（270ml）中のコムギ（20g）上の昆虫に、２つの方法でＣ2Ｎ2を付加した。一方法では、燻蒸剤をガスとして付加し、第二の方法では、水（0.1ml）の溶液で付加した。全生物検定条件は、適用方法を除いては同一であった。
内径0.53mmのDBwaxカラム上での分離後、熱電子特殊検出器を装備したVarian 3300ガスクロマトグラフを用いたガスクロマトグラフィーにより、適用した燻蒸剤の量を測定した。
被験昆虫はRhyzopertha dominica ＣＲＤ２系統であった。方法１の場合には30℃で穀紛上で２週間の保持期間後に、方法２の場合には１週間の保持期間後に、死亡率を査定した。
結果
方法１
成虫R. dominicaに対するＣ2Ｎ2の毒性に及ぼす相対湿度の作用を表７に示す。燻蒸剤の毒性は高湿度で増大した。この作用は、広範囲の濃度で、そして広範囲の曝露期間に亘って観察された。
方法２
適用方法の影響を表８に示す。燻蒸剤は、ガスとして適用したか溶液で適用したかにかかわらず、有毒であった。
考察
高湿度での燻蒸剤の活性の増強は、特に作用の大きさに関しては、予想外の作用である。高相対湿度は燻蒸剤に相乗作用を及ぼし、水は相乗剤であるとみなされる。
ガスとして並びに水溶液として燻蒸剤を適用できることは、新規のことである。それは、部分的には水中の燻蒸剤の溶解度に依っている。この溶解度は高く、Merck Indexは、１容量の水は約4容量の気体を溶解すると述べている。これは、水１ml当たりＣ2Ｎ2約8mgの水性濃度を生じる。飽和溶液は約0.15Mである。水に適用されたＣ2Ｎ2の毒性も部分的には、ガスが高湿度で毒性を示すという事実に依っている。これは、水中適用が一般的に相対湿度を上げる作用を有するためである。
したがって、２つの例外的作用、即ち水による活性増強及び水中に燻蒸剤を適用できることが認められる。
第一の作用は、多数の領域で、特に相対湿度が高い場合、例えば温室、野菜及び切り花を入れる密閉領域、熱帯気候並びにその他の高湿度の領域で有用である。
水溶液として燻蒸剤を適用できることは、多数の領域で有用である。例えば、耐久又は非耐久商品、植物、滅菌小室及び空小室に燻蒸剤を噴霧し得る。大規模適用にポンプを介して、小規模適用には注射器で適用し得るし、そして、より複雑な手法であるガス容量の測定から明らかなように、他の方法によって液体の容量を測定し得る。
水中のＣ2Ｎ2の高溶解度はさらに、ガスクロマトグラフのような高価な機械類を必要としない化学的手法により、定量を容易にする。
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実施例１２
Bactocera（以前はDacus）tryoni(Froggart)に対するＣ2Ｎ2の毒性
目的：Bactocera tryoni(Froggart)（クイーンズランドミバエ）に関するＣ2Ｎ2の致死用量を測定すること。
方法及び材料
初期幼虫（20匹）をPerspexのストリップで支持された濾紙の湿ストリップ上に置いた。このストリップをすりガラス隔壁シール上蓋で密封するエーレンマイヤーフラスコ内に入れた。Ｃ2Ｎ2ガスを隔壁シールを介してフラスコ内に注入した。曝露後、上蓋を取って、フラスコを空気流で30秒間洗い流し、次いで30分間空気に曝した後、紙で密封した。
結果
結果を表９に示す。
1.5mg/lで2時間投与して、完全制御を達成した。時間による濃度（ＣｘＴ）生成物は低い3mg時/lであった。
考察
クイーンズランドミバエは果物の重要な害虫であり、オーストラリアの一部並びに多数の輸入国における検疫制限の対象である。それは双翅目の代表例でもある。結果は、高湿度の環境におけるＣ2Ｎ2の効力を立証した。
さらに別のデータ及び液体としてのＣ2Ｎ2の適用によるデータを略記した実施例１１に引照し得る。
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実施例１３
ガス流からのＣ2Ｎ2の除去
目的：ガス流からＣ2Ｎ2を除去するための手順を調べること。
材料と方法
三つ首フラスコ（容量500ml）で一つの首は燻蒸剤の注入のための隔壁を備え、一つはガス（例えば窒素）の供給のために結合された。燻蒸剤の排出のための第三の首は、トラップの前のサンプリング隔壁（入口隔壁）、トラップ、及びトラップの後の第二サンプリング隔壁（出口隔壁）を有する内径6mmのガラス管に結合された。
試験したトラップは、内径6mmのガラス管内の粗砕化木炭で、粗砕化木炭の長さは157mm及び530mm、水に溶解したエタノールアミンの5%溶液、ドライアイス及びドライアイスで取り囲まれた化学的トラップを伴わない小（55mm）木炭トラップであった。ドライアイストラップの場合、流出ガスをDreschel瓶中に通し、ドライアイスに包み、サンプリング隔壁をDreschel管の入口及び出口に置いた。
少量の燻蒸剤（典型的には0.5ml。約1mg）を三つ首フラスコに入れた。ガスの標本（50μl）を入口隔壁から採取して、ガスクロマトグラフ中に注入し、出口隔壁での標本に関しても同様の手法を用いた。内径0.53mmのBP624又はDBwaxカラムで分離後、熱電子特殊検出器を装備したVarian 3300ガスクロマトグラフで燻蒸剤濃度を測定した。
結果
長さ157mmの木炭トラップ（図３−粗砕化木炭を含有する短ガラスカラム中でトラップされたＣ2Ｎ2−参照）を用いて、少量の燻蒸剤を出口サンプリング点で検出した。長い方のトラップ（530mm）は全燻蒸剤を吸収した（図４−粗砕化木炭を含有する長ガラスカラム中でトラップされたＣ2Ｎ2−参照）。水に溶解したエタノールアミンの溶液も十分に有効であった（図５−水に溶解したエタノールアミンの5%v/v溶液でトラップされたＣ2Ｎ2−参照）。このトラップを用いた場合、長木炭トラップを用いた場合のように、燻蒸剤は長期パージで検出されなかった。ドライアイストラップは、ドライアイスが存在する間（150分）は、十分有効であった。ドライアイスを除去すると、系は燻蒸剤をトラップしなかった（図６−いかなる化学的トラップも用いずにドライアイスでトラップされたＣ2Ｎ2−参照）。ドライアイスを用いた小木炭トラップは、ドライアイス除去後も十分有効であった（図７−ドライアイスで囲まれた小木炭カラム中でトラップされたＣ2Ｎ2−参照）。しかしながら、ドライアイス及び入口系除去後、いくつかの燻蒸剤はトラップから入口サンプリング点に移動したが、出口サンプリング点へは移動しなかった。
考察
これらのトラッピング結果は予想外ではなく、公知の特性と十分一致した。したがって、ガスは、回収可能な方法で、その沸点以下でトラップされると予測され、化学物質が急速に破壊されるような方法で、Ｃ2Ｎ2がアミン（この場合はエタノールアミン）と迅速に反応することは公知である。木炭でのトラッピングも一般的手法であり、常に収着に関する場合であるので、溶媒の量のような条件は流量、燻蒸剤の量等により状態設定に調整されねばならない。
しかしながら、ガス流中で燻蒸剤をトラップできることは、そして燻蒸剤を破壊するか又は選択により回収され得る方法でそれをトラップできることは有用である。
トラップの一覧表はすべてを網羅するわけではなく、トラッピング法それ自体に関して目新しいことは特許請求されていない。トラップできるのはパッケージの一部である。
実施例１４
空気又は水の除去に関連した方法を除く、燻蒸後の空気中又は水溶液及びその他の溶液中のＣ2Ｎ2の除去方法
目的：ガス抜き又は除去以外の方法による空気又は液体からＣ2Ｎ2を除去するための安全性及び迅速な方法を提供すること。
材料及び方法
燻蒸剤を、Mininert弁を取り付けたフラスコ又は隔壁入口を取り付けたエーレンマイヤーフラスコのような密封フラスコに入れた。これらのフラスコにアンモニア溶液又はエタノールあるいは漂白剤（過酸化水素）のような一般家庭用試薬を付加した。燻蒸剤の減衰を終わりまで測定した。
別の実験では、水（20ml）に溶解したアミンの溶液を隔壁入口を取り付けた270mlフラスコに入れて、磁気攪拌器で攪拌した。燻蒸剤を隔壁を通して注入し、その減衰をモニタリングした。内径0.53mmのDBwaxカラムで分離後、熱電子特殊検出器を装備したVarian 3300ガスクロマトグラフで全測定を実施した。
結果
ヘッドスペースからの燻蒸剤の消失を、投与後の時間に対する燻蒸剤の濃度をプロットした図８で説明する。図９では、この損失を一次減衰（等式１）に関するプロットにしたがってプロットする。垂直尺度は、初期濃度に対するｔ時点での濃度の比の対数を記録する。枯渇はｅ7（約1000）の範囲を包含する。
11.6mg/lの濃度でＣ2Ｎ2に0.5mlの水性アンモニア（31%, w/w）を付加すると、燻蒸剤の急速な損失が生じた。適用濃度Ｃ*の割合としての濃度Ｃは、等式１にしたがって時間ｔ（分）とともに指数関数的に減少し、ｒ2値は0.9966であった。半減期、即ち濃度が半減するのに要する時間は、59秒であった。Ｃ2Ｎ2の濃度は、11分後に10ppmのＴＬ  Ｖ値以下に落ちた。
Ｉｎ（Ｃ／Ｃ0）＝4.4-0.699t  等式１
メタノール中の0.42Mベンジルアミン25mlを含入する120mlフラスコにＣ2Ｎ2ガス（5ml）を付加すると、燻蒸剤の非常に急速な損失が生じて、測定が可能であった時点以前（15秒前）の燻蒸剤損失値の99%以上となった。ガス濃度は8分で約40,000ppm,v/v（理論適用量）から10ppm未満のＴＬ  Ｖ値に低減した。0.2M炭酸ナトリウム（洗濯ソーダ）に関する濃度は26分で同様の量だけ低減した。
ヘッドスペースにおける濃度がＴＬ  Ｖ濃度未満に低減していた場合には、液体中の濃度を測定し、検出できなかった。したがって、ヘッドスペースからの急速な消失は分解によるもので、単に吸収に依るものではない。
水に溶解した過酸化水素（3%, v/v）5mlを2960ppmシアン化水素（v/v）を含入する270mlフラスコに付加すると、ヘッドスペース内のシアン化水素の急速な損失が生じた。減衰はほぼ指数関数的で、半減期は1.8分であった。14.2分後に、濃度は10ppm, v/vのＴＬ  Ｖ値より低くなった。Ｃ2Ｎ2の濃度は過酸化水素に関しては相対的に安定していた。
考察
Ｃ2Ｎ2のアミンとの反応は、生成される生成物の観点から十分研究されている（Brotherton and Lyn, 1959）。そうであっても、反応速度は意外であった。手法の目新しさは、全手順の一部としてそれを用いることにあった。即ち、燻蒸剤を密閉小室に導入し、保持し得るが、しかし濃度は、アンモニアのような化学物質の付加により迅速に消えた。したがって、トラッピングによりＣ2Ｎ2を除去し得る（実施例１３と比較）が、しかしガス抜きの必要なく密閉空間からそれを除去する一般的化学物質の付加によっても除去し得る。
アミンの溶液との反応によるガス相でのＣ2Ｎ2の急速な分解は、ガス流からのＣ2Ｎ2の除去の項でも立証されたが、この場合、エタノールアミンの水溶液中にガスを発泡させる簡単な手法が燻蒸剤を破壊することが示された（実施例１３参照）。
本手法は、多数の領域に用いられる可能性がある。例えば、それは密閉室を燻蒸終了後の短時間にヒトが入っても安全であるようにするために用いうるし、小規模又は大規模燻蒸小室に、温室に、あるいはＣ2Ｎ2濃度を迅速に低減するのが望ましい他の状況に用い得る。
空気流中でのトラッピング以外の方法により、並びにアンモニアのような一般化学物質の付加により燻蒸剤濃度を迅速に破壊できることは新規であり、他のいかなる燻蒸剤にも適用されたことがないが、しかしこのような燻蒸剤はより複雑な手法により破壊され得る。シアン化水素は同様の手法により破壊され得るが、しかし、家庭用化学物質を用いて、臭化メチル又はホスフィンのような燻蒸剤を破壊するための簡単な方法はない。洗濯用ソーダ及びペルオキシドのような試薬の組合せを用いて、Ｃ2Ｎ2及び存在する任意のシアン化水素を除去し、破壊し得る。
実施例１５
シアン及び考え得る代謝生成物の化学作用
シアンの化学作用は、Brotherton and Lyn, 1959により再検討去れている。Brotherton and Lyn, 1959が略記した多数の反応、例えば高温での反応は、穀粒における又は哺乳類系における代謝にほとんど直接関連しないものである。しかしながら、多数の反応は水中で又はエタノールのような水溶性溶媒中で室温で起きる。
１．穀粒における代謝に関連すると思われる化学作用
主な初期反応は、三重結合（ＣＮ結合）による付加である。これは生成物又は中間物質を生じる（Ｉ）。二次付加は、生成物を生じる（ＩＩ）。シアンと反応する化学物質としては、α水素を有する第一及び第二アミン、アルコール、活性水素（例えば、カルボニル基又はエステル基に隣接するもの）及びアルデヒド、即ちエノール形態で反応し得るものが挙げられる。
ＮＣ−Ｃ（Ｒ）＝ＮＨ  （Ｉ）
ＨＮ＝Ｃ（Ｒ）−（ＣＲ）＝ＮＨ  （ＩＩ）
アミン、アルコール又は活性炭素から生成されるＲを有する（Ｉ）及び（ＩＩ）型の化合物は、さらに生物分解性であると予測される。（Ｉ）型の中間生成物はＨＣＮ及び１炭素単位（「ホルメート」誘導体）に切断され、これは希釈水酸化ナトリウム中で起こる（Nauman, 1910）。（ＩＩ）型の中間生成物は２炭素単位（「オキサレート」誘導体）に酸化される。
Mathesonデータシートは、水中で、シアンは、より複雑な化学物質、アズルミン酸の他に、持続的にシュウ酸アンモニウム、ギ酸アンモニウム、シアン化水素及び尿素の混合物に漸次分解する、と述べている。Merck Index（1989）は、それは水溶液中で徐々にシュウ酸及びアンモニアに加水分解される、と述べている。したがって、水中では、分解はホルメート及びオキサレート経路の両方の結果として起こり、後者が優勢である。ギ酸及びシュウ酸は天然構成成分中に広く分布する。例えば、シュウ酸は正常尿の構成成分であって、ヒトが排泄する平均量は20〜50mg／日（Oser, 1966）であるが、しかし尿中シュウ酸はある疾患（シュウ酸塩尿）においては増大する。ギ酸も尿中に存在し（Oser, 1966）、0.1%までの量で乾燥果物及び穀粒中に存在する（我々の研究室からの未発表結果）。ギ酸はほとんどの緑色野菜、特にホウレンソウ（0.0〜0.9%シュウ酸）及びダイオウの葉（1.2%）に存在する。
穀粒のシアンの代謝は、結局は、標識化物質を用いて試験しなければならない。しかしながら、（Ｉ）及び（ＩＩ）型の化合物がそれらのさらなる分解生成物とともに生成されるものと思われる。生成されるシアン化物の量はホルメート経路による代謝の量の指標を示し、標準手法を用いて測定し得る。
２．輸送及び貯蔵中の安定性に関連した化学作用
シアンの安定性はWelcher等（1957）により研究されており、彼らはシアンが中等度の温度で急速に分解又は重合せず、安定剤の非存在下でモネルMonel又はステンレススチールシリンダー中に安全に貯蔵されると結論づけた。シアンに関するMathesonデータシートは、ステンレススチール、モネル及びインコネルinconelは65℃までであるので、シアンを運搬又は処理加工するには、ガラス内張り装置が適している。
シアンのシリンダーの輸送は、適切な標識を用いて、米国で承認されている（読者は実施例２３を参照）。
シアンは、アセチレンと同一の大きさの高潜伏性エネルギーを含有し、混合した場合にフッ素のような酸化剤と爆発的に反応し得る。
空気中のシアンの易燃性は6〜32%,v/v(Mathesonデータシート)又は6.6〜32%, v/v（Sax and Lewis, 1989）である。
引照
実施例３７ではベンジルアミン及びシアンを用いてin vitro試験を実施したが、これは、このモデルアミンがシアンを分解し、それ自体は分解されないことを示した。即ち、それは触媒として作用する。非常に高用量での穀粒上での試験は、Ｃ2Ｎ2のシアン化水素への分解が小経路であることを示した（実施例３及び３８）。
実施例１６
密封ガラス容器中のコムギ上のＣ2Ｎ2の収着及び安定性
目的：完全密封系で測定したように、生存力に関する試験に、昆虫毒性に関するいくつかの試験に、並びに残留物の運命に関するいくつかの試験に用いた条件下で、コムギ上のＣ2Ｎ2の収着を測定すること。
材料及び方法
含水量11.6%のオーストラリア標準白色コムギ（20g）を、隔壁を備えた270mlエーレンマイヤーフラスコに入れた。燻蒸剤をこの容器に適用し、コムギを含入しない等価の容器にも入れた。この空のフラスコを用いて適用濃度Ｃ0を算出した。110時間の期間中の計時間隔で、Ｃ2Ｎ2のヘッドスペース濃度を測定した。内径0.53mmのBP-624カラムで分離後、熱電子特殊検出器を装備したVarian 3300ガスクロマトグラフで燻蒸剤を測定した。
適用濃度を各サンプリング間隔に測定し、測定濃度を各サンプリング間隔に調製した等価標準と比較した。
ヘッドスペース内の濃度をサンプリング時間に対してプロットし、ヘッドスペース濃度の損失を収着として表した。
結果
ヘッドスペース内の燻蒸剤の減衰を図１０ａに示すが、この場合、それは適用濃度の比として表される。曲線は、ヘッドスペース濃度の急速な初期低下とその後のほぼ指数関数的な減衰の典型的パターンを示す（図１０ｂ）。この「指数関数的」減衰において、半減期、即ち濃度が半分になる時間は約43時間であった。
対照標本は、100時間を超える期間中燻蒸剤の損失をを示さなかった。したがって、Ｃ2Ｎ2は密封ガラス容器内の空気中では安定である。
考察
収着の形態（即ち、ヘッドスペース濃度の損失）は燻蒸剤に関しては異例ではない。所望により、算出用量を修正してコムギが占める空間を説明し得る。これは、3.7%だけＣ0が増大した影響を示し、半減期にいかなる作用も及ぼさずに一定の作用を生じた。
規定の条件下での空気中のＣ2Ｎ2の安定性は、満足すべき結果である。それは、毒性又は残留物に関する試験の場合を含めた実験手法を確かに容易にする。密封ガラス容器内の空気中の安定性はさらに、コムギ上の収着が漏れ、ガラス上での分解等というよりむしろ商品に依るように推論の結果を正当化する。
制御条件下の燻蒸剤の安定性は、特殊燻蒸手法の適用の可能性を有する。例えば、このような場合は、長期曝露を要する滅菌である。燻蒸剤の分解が起きる状況では、長期曝露はフロースルー法により、あるいは適切な又は望ましい濃度を維持するために付加される燻蒸剤を用いた再循環により達成し得る。他の状況では、空気中の燻蒸剤の安定性は燻蒸、滅菌性維持等に有用な手段である。
その他の収着試験は、コムギ（実施例２６）、土壌（実施例４２）及び木材（実施例３３）に関して報告される。
密封ガラス容器内の空気中のＣ2Ｎ2の安定性は、大気、日光等の中の水を含めた他の化学物質の存在のために、大気中でのその安定性と直接関連しない。
実施例１７
植物上の昆虫侵襲を制御するための浸液としての水性Ｃ2Ｎ2
目的：植物材料上の昆虫を殺すための浸漬液としてのＣ2Ｎ2の効能を査定すること。
材料及び方法
害虫昆虫の天然侵襲を有する下記の２種類の鉢植え植物を地方の種苗園から得た：アリマキ（Aphididae科）及びコナカイガラムシ（Pseudococcidae）が感染したジャーマンアイビーGerman Ivy（Seneciomikanoides）（ＧＩ）、及びコナカイガラムシが感染したChinaDoll（Radermachia sinica）（ＣＤ）。各植物の短い節（約5cm）をそれらが昆虫の代表的標本を包含するように切断した。次に、これらを水道水、水道水とＣ2Ｎ2、水道水と一般的湿潤剤、並びに水道水、湿潤剤とＣ2Ｎ2の溶液中に浸漬した。
２時間後に昆虫死亡率を査定し、細いブラシを用いてコナカイガラムシを注意深く取り出して、それらの足が動いているか否かを見るために検分し、動きに関してにアリマキを簡単に検分し、動きの欠如を査定して死亡を指摘した。
使用した湿潤剤は、水道水400mlに１mlの割合のTeric215（ICI. オーストラリア）であった。容器（約130ml）中の水又は水／湿潤剤溶液40ml中に約80%の濃度のＣ2Ｎ2ガス4mlを発泡させ、そして2分間激しく攪拌しながら、Ｃ2Ｎ2溶液を作った。
結果
植物材料は、種々の処理による病的作用を示さなかった。２つの主要昆虫目からの昆虫を殺害した。水からの制御死亡率は、湿潤剤を用いても用いなくても、ゼロであった。
0003810793.tif 000011
考察
Ｃ2Ｎ2を含有する水溶液は、植物材料上の昆虫を殺害するための浸液としての可能性を有する。必要な濃度はまだ確認されておらず、必要な制御レベルにより、並びに処理される昆虫害虫によって疑いなく変化する。湿潤剤の使用が殺虫剤浸液としてのＣ2Ｎ2の効力を増強するということも明らかである。他の昆虫（例えば実施例３６）の制御との、及び水中に適用される燻蒸剤による制御（例えば実施例７）と引照される。本燻蒸剤は、アリマキ科Aphididae及びコナカイガラムシ科Pseudococcidaeからの昆虫を殺害した。
実施例１８
コムギの発芽に及び液体組成物に及ぼすＣ2Ｎ2の作用
目的：コムギ生存率に及びコムギの液体組成物に及ぼすＣ2Ｎ2の作用を査定すること。
材料及び方法
使用したコムギは殺虫剤不使用オーストラリア標準白色コムギAustralian Standard White（ASW,含水量約11.4%,w/w湿潤基準）であった。適量の水を付加後に、一部を条件調節して平衡させた。25℃±1℃で１週間後、標本は、46.9%、69.3%及び79.6%の平衡相対湿度（e.r.h.）に対応して、11.4%、13.8%及び15.5%の含水量を有することが判明した。含水量（湿潤基準）は、130℃で2時間のオーブン乾燥により粉砕標本の塊の損失から算出した。e.r.h.は、1kgのコムギ標本を含入する閉ループに置いたＭＢＷ冷却鏡露点計で観察された測定平衡露点から算出した。
状態調節コムギ標本（30g）を、隔壁入口を備えた270mlエーレンマイヤーフラスコ（充填率約10%）中に入れた。燻蒸剤をヘッドスペースに注入し、異なる含水量の４つのコムギ標本の各々に関して、並びに25±1℃での３つの異なる曝露期間（24、48及び96時間）に関して、５レベルの燻蒸剤（5、10、20、40及び80mg/l）及び対照を用いた。発芽前に、コムギをペトリ皿に移して、24時間空気に曝した。
International Seed Testing Association Methodsに記載されている原則にしたがって、発芽試験を実施した。50粒の種子に約40mlの蒸留水を含ませて、２枚の巻締縮緬濾紙（各々500x330mm）に包んだ。種子計数板を用いて、種子をシートの上半分（即ち250x330mm）に3cm離して並べ、その下半分を折り畳んでその区画を覆った。二重になったシートの各々に水を含ませて、底面に垂直に、一方の側から他方へ緩く巻いた。次いでそれを輪ゴムで保持して、20℃で発芽キャビネットの上右部分に置いた。4日後（成長力試験）及び8日後（総発芽試験）に、発芽した種子の数を計数した。各実験を４回繰り返した。
液体組成物に及ぼすＣ2Ｎ2の作用を測定するために、40gのオーストラリア標準白色コムギAustralian Standard White（ASW,含水量約11.4%,w/w湿潤基準）を、隔壁を備えたネジ式上蓋付き750mlガラス壺中で100mg/lで48時間燻蒸し、石油エーテル＋ブタノール（２：１v/v）／温水飽和ブタノールで脂質を抽出した。さらに、ヘキサンを用いたSoxlet抽出により抽出したコムギからの脂質及び市販のコムギ胚芽油を非常に高レベルでＣ2Ｎ2で燻蒸し、次いで、2701mlエーレンマイヤーフラスコ内で、00mg/lの燻蒸濃度で１gの油を20℃及び30℃で48時間燻蒸した。紫外線分光分析及びFourier変圧赤外線分光分析により、脂質組成物を測定した。ＵＶに関しては、340nmで吸光度を測定し、ＩＲスペクトルは、四塩化炭素では、1000〜4000波数の範囲に及び、波数1740、2850、2930及び3000で定量された。
結果
成長力に及ぼすＣ2Ｎ2の作用を図１１に要約する。5mg/lの適用濃度では、作用は認められなかった。これは、45mg/kg（コムギ）, w/w、即ちコムギ１kg当たり45mgの燻蒸剤の適用に相当する。10mg/lの高用量適用からは発芽のわずかな低減が認められたが、試験した３つの湿度のうち１つに関して作用が有意であっただけである。
発芽に及ぼすＣ2Ｎ2の作用を図１２に示す。10mg/lの適用濃度では発芽についての影響は認められなかった（図２）。これは、90mg/kg（コムギ）の適用に相当する。40mg/l又はそれ以上（180mg/kg）の濃度は、発芽をかなり損傷した。
図１１及び図１２の結果は、２つの異例の特徴を示す。第一に、24時間から48時間又は96時間への曝露時間の増大は、発芽にほとんど影響を及ぼさなかった。第二に、発芽の損失に及ぼす含水量の作用は予想に反しており、乾燥穀粒より湿潤穀粒に及ぼす影響の方が低かった。
ＵＶ及びＦＴＩＲで査定した場合、コムギ又は油の燻蒸から、脂質組成物に及ぼす影響は観察されなかった（図１３）。油の燻蒸の場合、適用量は油１kg当たり燻蒸剤27,000mgであった。さらに、モノグリセリドとして算出した場合は、脂質１モル当たり約0.1モル、あるいはトリグリセリドとして算出した脂質に関しては、モル比率の約３倍であった。
考察
これらの実験では燻蒸剤の濃度を測定しなかったが、それは同様の条件下で得られたデータから概算し得る。したがって、含水量11.4%、適用濃度10mg/lのコムギでは、濃度時間生成物はほぼ9000mg時/lである。これは、ほとんどの昆虫の種及び段階を殺害するのに必要な用量を数等級上回る量である。したがって、さらに試験したとしても、発芽に関する結果は、穀粒に影響を及ぼさずに燻蒸剤を使用できるということと一致する。
脂質に及ぼすＣ2Ｎ2の作用に関する実験を、より実行可能レベルでのコムギにおける実験が作用を示さなかった後に、非常に高レベルで実施した。非常に高レベルであっても、作用は観察されなかった。
実施例１９
Ｃ2Ｎ2による細菌の制御
目的：細菌、特に医学的に重要な細菌に対するＣ2Ｎ2の効能を調べること、並びにそれが水性及び非水性培地の両方に有効であったか否かを調べること。
材料及び方法
全手法が滅菌装置及び試薬を用いた。
３種類の細菌株を試験した。これらは、バチルス属のバチルス・セレウス（Bacillus cereus）、シュードモナス属の緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）及びブドウ球菌属の黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）であった。菌株は、キャンベラ大学のSchool of Human and Biomedical Scienceからの提供によるもので、感染におけるその重要性、他の手法による制御の難しさ、及びそれらの異なる生息環境のために選択された。
水中での細菌に対する燻蒸剤の効能を試験するために、5ml瓶内の2mlの蒸留水中に接種物を入れた。２本の瓶を、隔壁を備えたネジ式上蓋付きの700mlガラス壺内に入れた。隔壁を通して燻蒸剤を適用し、濃度を0、20、40、80、120及び160mg/lとした。壺を20時間及び40時間、35℃に保持した。次いで蓋を取り外して、容器を4時間空気に曝した後、普通ブイヨン2mlを付加した。ブイヨンを37℃で24時間インキュベート後、生存細菌を査定した。
非水性培地中のＣ2Ｎ2の効能を試験するために、普通寒天7mlを10ml瓶中に入れて、細菌の接種物を坂路表面に載せた。投与手順は、水中の細菌に関して記載された手法と同様であった。
水性培地に関して、以下の３つの方法で、制御測定の効能を試験した：
１）普通ブイヨン付加前の水の色；
２）インキュベーション後の水及びブイヨンの添加物の透明度；
３）ペトリ皿内の寒天上での平板化前の定量的細菌計数。連続希釈を実施した。連続希釈に際しては、元の接種物を一連の希釈管中で希釈した。われわれの実験では、各々の後の希釈管は前の管中の細菌数の10%だけを含入した。即ち、20μlの標本を180μlの滅菌水を含入する試験管に移した。
非水性培地における制御に関しては、第三の手法、即ち寒天上での平板化後の定量的計数のみを用いた。
結果
水性培地
水中の細菌に関しては、緑膿菌Pseudomonas aeruginosaの場合は、普通ブイヨンは対照では曇ったが、全レベルの燻蒸剤に関しては透明で黄色となった。したがって、この菌株は20時間曝露に関しては、20mg/l及びそれ以上の用量で制御された、バチルス属のBacillus cereusに関しては、120mg/l及びそれ以上の用量で、溶液は透明で黄色となった。
普通ブイヨン付加前の視覚的査定は、良好且つ予期せぬ制御レベル表示を提供した。細菌の死亡率が完全であった場合、水性溶液は黄色になり、一方細菌が制御されなかった場合は曇ったままで、黄色くならなかった。
計数後の定量的査定を表１１に示す。
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非水性培地
定量的査定結果を表１２に示す。
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考察
本燻蒸剤は、水性及び非水性培地の両方で、細菌の重要菌株を制御した。これは、空気及び水中で活性である燻蒸剤の能力を反映し、水中の溶解度並びに水及び空気間の相平衡に基づいている。２つの相に作用するこの能力は、実験室、病院、歯科及び獣医科の建物、食品用建物における、並びに細菌が水性培地、非水性培地又は両方の組合せに見出される全状況における滅菌に非常に有用である。
試験した細菌としては、自動性、好気性及びグラム陰性であるシュードモナス属、並びに非自動性、嫌気性及びグラム陽性であるブドウ球菌属が含まれた（Blackston, 1979）。バチルス属のBacilluscereusは「食中毒を引き起こす属」であり、好気性及びグラム陽性である（Miller and Keane, 1983）。MillerとKeaneは、シュードモナス属を「グラム陰性で、全く嫌気性の細菌であり、このうちいくつかの種は植物及び脊椎動物に対して病原性である」と記載している。緑膿菌P. aeruginosaは「青色膿」及び「種々のヒト疾患」を引き起こし、P. malleiは鼻疽を引き起こし、このウマの疾患はヒトに伝染する」（Miller and Keane,1983 , p929）。ブドウ球菌属は、「限局性化膿性感染の最も一般的な原因」である（Miller and Keane,1983 , p1057）。Blackston（1979）によれば、黄色ブドウ球菌S. aureusは「ヒト及び動物における種々の臨床的障害、例えば膿瘍、心内膜炎、肺炎、骨髄炎及び敗血症に関与し」（p1288）、P. aeruginosaは「ヒトにおける種々の化膿性感染の作因である」。
その他の文献における他の研究から、Ｃ2Ｎ2は糸状菌及び無脊椎動物を含めた一般的消毒に用い得る。
引照：食肉の貯蔵に関しては実施例５と、果物の貯蔵に関しては実施例６との引照がなされる。水中で活性である能力は、他の実施例にも包含されており、水を介しての運動（実施例２２）も関連がある。
実施例２０
線虫類に対するＣ2Ｎ2の効能
目的：線虫類に対するＣ2Ｎ2の効能を調べること。
材料及び方法
水２ml中の線虫類を測定容量11.5mlのエーレンマイヤーフラスコに入れ、フラスコにMininert弁を取り付けた。測定濃度の、しかし典型的にはほぼ90%, v/vのＣ2Ｎ2ガス及び遊離シアン化水素（＜0.5%）をフラスコに注入した。あるいは、水溶液（0.2ml）中のＣ2Ｎ2をフラスコに注入した。20℃〜22℃に空調した室内でフラスコを室温で保持した。試験した線虫の種は、Steinernema carpocapsae BWの感染性幼虫であった。
実験１では、BP-624 Megaboreカラムで分離後、熱電子特殊検出器を用いて、水の上の空気中のガス濃度を定期的間隔で測定した。付加後の時間に対して濃度をプロットし、曲線下面積を筆算で測定して、ヘッドスペース内の（濃度x時間）生成物を概算した。
22時間曝露後、フラスコを開けてガスを空気に曝した。燻蒸剤の初期付加後24時間目に、顕微鏡下で死亡率を査定した。
結果
ガス付加後5分のヘッドスペース内のＣ2Ｎ2の濃度は典型的には、水中に全く吸収されないという仮定の上で算出した公称濃度の３分の１に過ぎない。これは、水及び空気間のＣ2Ｎ2の分配に関する他の結果と一致し、このことは水中での強力な収着を示す。例えば、3.46mg/lの公称濃度に関しては、燻蒸剤付加後5分のヘッドスペース濃度は完全反復実験では0.85mg/l及び0.58mg/lであった。濃度は、指数関数的にヘッドスペース内で急速に低減した。例えば、3.48mg/lの公称濃度からの半減期は0.94時間であり、8.7mg/lの公称適用からの半減期は2.7時間で、17.4mg/lの公称適用からの半減期は5.2時間であった。したがって、水上のヘッドスペース濃度及び（濃度x時間）生成物は、予想外の方法で変化する。これを表１３に示す。
線虫類は、表１４に示すように、Ｃ2Ｎ2曝露後、急速に死亡した。例えば、3.48mg/lの公称適用は、S. carpocapsaeの線虫404匹中404匹を殺害したが、これに対して対照の死亡率は5／462に過ぎなかった。
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実施例２１
糸状菌を制御するためのＣ2Ｎ2の適用
目的：コムギ穀粒中に存在する糸状菌に対するＣ2Ｎ2の毒性を測定すること。
材料と方法
含水量16%及び22%の未滅菌コムギRosella変種。
上部襞付きMininert弁を有する120ml瓶にきっちり詰まったガス。
Oxoid普通寒天を含入する滅菌プラスチックペトリ皿。
大型ガラスデシケーター
各含水量に関しては、コムギ20gを計量して各120ml瓶に入れた。瓶をMininert弁で密封して、Ｃ2Ｎ2を投与し、濃度を18、35及び70mg/lとした。燻蒸剤を付加していない対照を同様に密封した。すべての瓶を6時間及び24時間の曝露時間中、25℃で貯蔵した。各処理を２回ずつ実施した。全ての操作を完全に繰り返した。
熱電子特殊検出器、内径0.53mmのDBwaxカラムを装備したVarian 3300ガスクロマトグラフを用いたガスクロマトグラフィーにより、60℃の恒温カラム温度で、燻蒸剤濃度を測定した。曝露完了時に、瓶を開けて、2〜3分間コムギを空気に曝した。次に、各瓶からの10粒の標本を無菌的に寒天平板に移した。これらを、4日間、貯水槽を有するデシケーター中で25℃で貯蔵した。4日後、平板を取り出して、増殖した糸状菌及び穀粒発芽に関して穀粒を査定した。
対照コムギ上に存在する糸状菌は、「コムギ中に存在する真菌及び汚染レベルは、優勢植物相であるアルテルナリア属のAiternaria infectira（マイコトキシン産生者ではない）及びA. alternata（潜在的マイコトキシン産生性）を伴うオーストラリアのコムギの多数の標本に典型的である」ことが確認された。穀粒の汚染%は、A. infectoriaに関しては78%、A. alternataに関しては17%、Epicoccum nigrumに関しては4%及びDrechslera sp.、Cladosporium sp.及びPenicillium sp.の各々に関しては1%であった。
結果
6時間及び24時間曝露の効果を図１４（ａ）及び１４（ｂ）に示す。コムギ20g上の70mg/lの濃度のＣ2Ｎ2は、穀粒中に存在する糸状菌を殺害し、さらに穀粒の発芽可能性を顕著に低減した。35mg/lの濃度のＣ2Ｎ2は、穀粒中に存在する糸状菌の90%以上を殺害したが、しかし発芽可能性はわずかに低減しただけであった。18mg/lの濃度のＣ2Ｎ2は存在する糸状菌の半分以上を殺害したが、穀粒の発芽可能性には作用を及ぼさなかった。16及び22%という異なる含水量は、これらの濃度のＣ2Ｎ2毒性に明らかな作用は及ぼさなかった。6及び24時間の異なる曝露期間も何ら影響を及ぼさなかった。55mg/lの濃度に対する短時間曝露の作用を図１４（ｃ）に示す。
考察
燻蒸剤Ｃ2Ｎ2は、所望の作用により、種々の方法で糸状菌制御に用い得る。したがって、それは湿潤穀粒上の糸状菌を完全に殺害し得るが、しかし発芽低減、又は発芽低減を伴わない糸状菌の大々的抑制の犠牲を払う。ある環境下で各々選択するのが望ましい。例えば、かなりの期間保持される穀粒に関しては、完全抑制は望ましい。目的が、乾燥又は冷却前により長時間穀粒を保持し得るための短期間保存である場合には、部分的糸状菌制御が有用である。
実施例２２
水中のＣ2Ｎ2の動き
目的：例えば、水トラップの一側に燻蒸剤を適用し、他側に動く得るようにＣ2Ｎ2が水中を動くが否かを調べること。
材料及び方法
本装置は、高さ140mm、内径18mmのガラスＵ字管、及びＵ字管の各末端の標本隔壁から成る。水をＵ字管内に30mmの深さに入れて、水が底及び側腕の一部を覆うようにした。
等容量の空気を除去後、Ｃ2Ｎ2（1.5ml、80%）をＵ字管の一方の腕（Ａ−Ｉと呼ぶ）に注入した。Ｕ字管の各腕（Ａ−Ｉ及びＡ−ＩＩ）の上記の各標本隔壁で、定期的間隔で燻蒸剤を測定した。
水40mlを、隔壁入口を備えた270mlエーレンマイヤーフラスコに入れた。Ｃ2Ｎ2（2ml、80%）をヘッドスペースに注入した。燻蒸剤をヘッドスペース及び水の両方で、定期的間隔で測定した。90分後、２つのフラスコ水を100ml容量フラスコに移し、このうち一方を攪拌し、フラスコの底から水標本を採取して、水中の、及びヘッドスペース内のＣ2Ｎ2濃度を測定した。
空調室で、約22℃の平均温度で、実験を実施した。
内径0.53mmのDBwaxカラムで分離後、熱電子特殊検出器を装備したVarian 3300ガスクロマトグラフでのガスクロマトグラフィーにより、燻蒸剤を測定した。
結果
水中のＣ2Ｎ2の動きは迅速であった。約10時間後、系は平衡になった（図１５）。各腕のヘッドスペース内のＣ2Ｎ2の濃度は、平衡状態で27mg/lであった。図１５の結果は、90時間までの曝露期間の増大が濃度に非常にわずかの影響を及ぼしたことを示した。
適用したＣ2Ｎ2の算出量は、2.78mgであった。水中の量は90時間で1.3mgであり、腕のヘッドスペース内の量は90時間で1.1mgであった。したがって、燻蒸剤は蒸留水中では相対的に安定している。
水中のＣ2Ｎ2の分布を図１６に示す。10時間後、系は平衡になった。実験期間中、総回収率は90%より大きかった。
水中のＣ2Ｎ2が容器に迅速に移動する実験では、それは、特に水を攪拌した場合には、水から非常に迅速に放出された（図１７）。
水中の及び水の上のヘッドスペース内のＣ2Ｎ2濃度は、0.2時間攪拌後は非常に低くなり（例えば、ヘッドスペース内、5ppm, v/v未満）、2時間空気に曝した後には、ヘッドスペース内では10ppm, v/vより低くなった。水からの燻蒸剤の放出は、定量的であった（99%以上）。
考察
水の他端の毒性濃度を確立するための水中でのＣ2Ｎ2の動きは、燻蒸剤ガスの適用の新規の方法である。それは水中での燻蒸剤の溶解度及び水中でのその相対的安定性に依っている。これらの項目は、実施例３１で考察される。
適用のこの新規の方法は、査定が困難な場合、特に空気及びガスの動きに対する水遮断壁が存在する場合に重要である。この状況は、水及び下水パイプ中では正常な状況であり、これは典型的にはＵ字管に似た形態ではあるが、通常は腕の長さが等しくないウォータートラップを組み入れる。本方法の目新しさは、水中を移動して燻蒸剤を高濃度にすることができることである。
水中を移動するこの能力は、水及び下水系中の細菌及びウイルスの制御に、そして水遮断壁が存在する場合に特に重要である。これらは注射器及び針を包含し、これはガスの動きに対する水遮断壁、管を含有し得るが、このようなものは透析に、そしてより一般的にはカテーテルに、並びに医科、歯科、獣医科及び科学用装置の全範囲に用いられる。
開放容器内での水からのＣ2Ｎ2の放出は、密封空間中に水中の燻蒸剤を適用するのに用いることができ、燻蒸剤がガスとして放出される。
実施例２３
シアンの哺乳類毒性
シアンの毒性は、Sax and Lewis（1989）に要約されている。さらに十分なデータは、例えば（U.S.A.）National Institute for Occupational Health and Safety（NIOSH: GT 1925000）からの規準文献で入手し得る。
シアンは、米国及びドイツの両国で、10ppm（22mg/m3）の作業員安全限界（閾値限界値）を有する。それは（米国）輸率部門（1026）を有し、これらは一般に世界的に認識されている。
Sax and Lewis（1989）は、毒性を以下のように要約した：「皮下及びおそらくはその他の経路による毒。吸入による中等度の毒物。ヒトの系は吸入による作用を有する：嗅覚神経に対する損傷、及び結膜の刺激」。目の刺激はシアン曝露の最初の症候であると考えられ、16ppmに6分曝露後に、最低作用が観察された。低用量でのこの目の刺激性は警告として十分に有用であるが、しかし唯一安全な方法は、作業空間の濃度がＴＬＶ以下であることである。
シアンに関するＴＬＶはホスフィンのＴＬＶの33倍であるが、しかし正常用量は33倍程高くなく、シアンの曝露期間はホスフィンより非常に短い。作業空間で注意深く点検したと仮定すると、ホスフィンを用いて安全に実施し得る手法は、シアンを用いても安全に実行し得ると思われる。
シアンは高潜熱を含有し、これに関してはアセチレンに似ている。それは強力な酸化剤により爆発的に作用すると思われるので、シリンダーのガスは反応性化学物質と混合すべきでない。しかしながら、空気中のその最低爆発限界は6.6%v/v（約150g／m3）であり、これは燻蒸剤濃度をかなり上回る。
実施例２４
コムギ中のＣ2Ｎ2の収着率
目的：異なる充填速度及び含水量に関して穀粒中のＣ2Ｎ2の収着率を測定すること。
材料及び方法
含水量11.6%（湿重量基準）のオーストラリア標準軟質コムギ（Rosella）を、25%、50%及び95%充填率収着実験に用いた。このコムギを水分調整して含水量10%、12%及び14%ストックとし、これを燻蒸前に最低2週間放置して平衡させた。
Ｃ2Ｎ2を適用して、Mininert弁付き蓋を備えた120ml瓶中の充填率25%、50%及び95%のそれぞれに関して6.73mg/l、13.38mg/l及び12.62mg/lの濃度とした。含水量10%、12%及び14%標本に関してはそれぞれ13.94mg/l、13.46mg/l、13.96mg/lの濃度を用いた。収着標本はすべて３つずつ作り、燻蒸剤濃度を頻繁な定期的間隔で測定した。内径0.53mmのDBwaxカラムで分離後、熱電子特殊検出器を装備したVarian 3300ガスクロマトグラフに20μlのアリコートを注入して、燻蒸剤濃度を検出した。
結果
収着率は、時間に対して残存する濃度%の対数として記録した。Ｃ2Ｎ2は、25%充填率標本では適用後24時間でも検出された（図１８）が、その枯渇率は依然として線状であた。50%（図１９）及び95%（図２０）充填率標本におけるＣ2Ｎ2濃度も線状のＣ2Ｎ2枯渇率を示し、充填増大と一致して増大した。95%充填率標本は、燻蒸剤適用の6時間以内に検出限界以下に低下した。
Ｃ2Ｎ2枯渇速度は、コムギの含水量の増大と強く相関している用に思えた。含水量10%のコムギは11時間以上燻蒸後に10倍の低減を示した（図２１）が、一方同様の低減は含水量12%のコムギに関しては2時間以下で達成され（図２２）、含水量14%のコムギに関しては約1時間であった（図２３）。収着の初期速度は全含水量標本に関して線状であったが、この直線性は含水量12%及び14%標本に関しては約2時間後に失われた。
考察
高含水量コムギ標本における急速なＣ2Ｎ2枯渇速度は、水中のＣ2Ｎ2の高溶解度と相関する。しかしながら、Ｃ2Ｎ2を吸着したコムギからのＣ2Ｎ2及びＨＣＮ残留物は、短い保持置換期間後でさえ非常に低いことを立証し、吸着Ｃ2Ｎ2が、対応する平行移動を伴うＣ2Ｎ2収着率に関与し得る急速な化学分解を受けることを意味する。
実施例２５
水中Ｃ2Ｎ2濃度の測定及び算出方法
序論及び目的
Ｃ2Ｎ2は４：１, v/v（Merck Index）の比率で水に溶解する。液体又は気体としてそれを適用し得るのが望ましい。本試験は、クイーンズランドミバエDacus tyroni又はその他の標的種を水に溶解したＣ2Ｎ2とともに投与し、燻蒸剤の気体及び液体濃度を測定するする有効な方法を調べるために実施した。本試験はさらに、水中の燻蒸剤の濃度を測定する方法を査定した。
材料及び方法
1及び4mlの82%Ｃ2Ｎ2を、0.01M塩酸（ＨＣＬ）10mlを含入する２本のMininertネジ蓋付き16mlバイアル中に注入した。これは、それぞれ190mg/l（標本１）及び761mg/l（標本２）に相当する。30分間待って燻蒸剤を溶液中に完全に溶解させた後、0.1mlの各Ｃ2Ｎ2／ＨＣｌ溶液をゴム隔壁を通してネジ式円錐アダプターを装備した別々の275mlエーレンマイヤーフラスコ中に注入した。これはそれぞれ0.069mg/L（標本３）及び0.276mg/L（標本４）に相当する。0.4、0.8及び1.48mg/lの３種類の標準ガス濃度を1.2Lエーレンマイヤーフラスコ中に作って、標本濃度を測定した。
気体及び液体濃度は、電子捕獲検出器及びDBwax megaboreカラムを備えたVarianガスクロマトグラフで測定した。カラム温度は60℃に設定し、注入器温度は100℃、検出器は288℃に設定した。10μlの気体標本を100μl Pressure Lok▲Ｒ▼注射器を用いて注入し、液体標本0.1μlを5μl ＳＧＥ液体注射器で注入した。
結果
各標本及び基準に関しては、10回注射を実施して、領域を平均化した。基準を用いて、注射容量用に採取後、標本の各々における実際濃度を算出した（表１５）。
0003810793.tif 000016
基準面積を濃度に対してプロットして（図２４）、ガスクロマトグラフが濃度範囲の端から端まで線状様式で反応したこと点検した。回帰分析は、反応が線状であったことを示した（Ｒ＝0.99）。
表１５は、気体及び液体標本における測定濃度が算出濃度より21%まで低いことを示す。両液体標本は、ヘッドスペース内に残存し、ＨＣｌ溶液中に溶解しない多少のＣ2Ｎ2によると思われる11%の損失を示した。標本３及び４における算出濃度と測定濃度との間のわずかに高い損失率は、予測液体濃度より低い誤差の和、ＨＣｌ／Ｃ2Ｎ2溶液0.1mlからのＣ2Ｎ2の不完全揮発、及びサンプリングエラーに依るものと思われる。
考察
水性相及び気相間の相平衡により、燻蒸剤を10mlの0.01M  ＨＣｌに溶解した場合に算出されるものより11%低いＣ2Ｎ2濃度が認められる。気相中の総燻蒸剤の比率は、相尺度に並びに液体及び気体の容量に依る。誤差を最小にするために、ＨＣｌ／Ｃ2Ｎ2溶液の標本を、D. tyroni又は他の昆虫に投薬する前にガスクロマトグラフで分析した。これにより、標的濃度をより正確に予測出来るようになる。
本方法は、液相中のＣ2Ｎ2を測定し、用量を正確に算出するのに利用できる。
実施例２６
コムギ中のＣ2Ｎ2の残留物及びＣ2Ｎ2に関する分析方法
目的：残留データを得るために燻蒸化コムギ中のＣ2Ｎ2の残留物を測定すること。
Ｃ2Ｎ2残留物の程度及びＨＣＮへのそれらの変換の程度は、穀粒燻蒸剤としてのＣ2Ｎ2の使用にとって重要である。本発明人は、燻蒸剤残留物を測定するのに用いた方法の殆どについて多少疑問を持っており、したがって、多数の手法により残留物を測定した（例えば、実施例３）。
材料及び方法
含水量11.6%（湿重量基準）のオーストラリア標準白色コムギをMininert弁を備えた120ml瓶中で計量した。３種類の充填率を用いた：25%、50%及び95%：例えばフラスコをコムギ25%、空気75%で充填して、充填率25%とした。
コムギ中のＣ2Ｎ2の分析のために、コムギ20gをMininert弁を備えた120ml瓶中に入れ、分析用等級テトラヒドロフラン20mlを付加した。溶液を一夜放置した。燻蒸剤を液相中で（２μlのアリコートを注入して）及び液体上のヘッドスペース内で（100μlのアリコートを注入して）測定した。内径0.53mmのDBwaxカラムで分離後、熱電子特殊検出器を装備したVarian 3300ガスクロマトグラフで燻蒸剤を検出した。
燻蒸剤を適用して、25%、50%及び95%充填標本のそれぞれに関して6.73mg/l、13.38mg/l及び12.62mg/lの濃度とした。これらがそれぞれ35.1、34.2及び17.3mg/kgの残留物を生じた。適用後定期的間隔で残留物を測定した。残留物測定はすべて３回ずつ実施し、分析手順に関する測定はすべて２回ずつ実施した。
結果
分析方法
図２５においては液体として付加したＣ2Ｎ2の量に対する、そして図２６ではガスとして付加した量に対する機械の反応を記録した。機械反応は適用濃度に関して線状で、再現可能であった。シグナル対ノイズ比の２倍と定義される検出限界を、ヘッドスペース注入及び液体注入から測定した。それは、ヘッドスペース法からは、コムギ穀粒中の残留物4.3x10-3  mg/kg（4.3ppb.w/w）に相当し、液体注入からは0.037mg/kg（37ppb.w/w）に相当した。検出限界のこれらの差の主な理由は、即ちＣ2Ｎ2対応した溶媒中の反応に対する溶媒からの干渉であった。
テトラヒドロフラン中の未燻蒸コムギの抽出は、溶媒中のものからの検出限界を変えなかったが、これは未燻蒸コムギ中のＣ2Ｎ2のレベルがせいぜい極端に低かったことを示した。しかしながら、ヘッドスペース法による検出限界は、0.036mg/kgに相当するレベルに増大した。
残留物
表１６に残留データを略記する。完全密封系における残留物の減少は、実質的であった。それは3日後には平均98%となり、14日後には99%を十分超えた。
35.1mg/kgで投与し、25%充填率で、22℃で14日間保持したコムギに関しては、ヘッドスペース法による残留物は平均して0.081mg/kg、s.d. 0.009mg/kgであった。液体注入法からは、コムギ中の残留物は平均0.21mg/kg、s.d. 0.083mg/kgであった。容器中に95%充填し、17.3mg/kgで投与したコムギに関しては、ヘッドスペース法によるコムギ上の残留物は、3日間の保持期間後、0.52mg/kg、s.d. 0.24mg/kgであった。この場合は、残留物は液体注入によっては測定されなかった。
34.2mg/kgで投与し、22℃で14日間保持したコムギに関しては、３回のうち１回の１ヘッドスペース読取り値は対照標本の場合より低く、シグナル対ノイズ比の２倍と定義される検出限界以下であった。標本読取り値と対照との間の差は、0.003mg/kgのコムギ中残留レベルに相当した。液体注入に関しては、このレベルも、シグナル対ノイズ比の２倍と定義される検出限界以下であった。標本と対照との間の差は、0.0013mg/kg、s.d. 0.005mg/kgのレベルに相当した。したがって、残留レベルは極微量と記載するのが最もよいが、しかし定量的検出限界以下である。
考察
Ｃ2Ｎ2の残留物は低レベルに下がって穀粒中で検出され、ヘッドスペースから、又は液体注入から測定し得る。残留物の低減は、非常に急速である。残留物のこの急速な低減は、実施例３及び４３で報告された他の実験においても認められる。各検出方法でいくつかのシアン化水素が観察されたが、これは別の文献に網羅されている（実施例４３）。
0003810793.tif 000017
実施例２７
Ephestia cautellaの幼虫に対するＣ2Ｎ2の毒性
目的：鱗翅目のEphestia cautella（Walker）からの幼虫に対するＣ2Ｎ2の毒性を評価すること。
材料及び方法
後期齢E.cautella幼虫15匹の２通りの標本及び波形段ボールの薄ストリップを、Mininert弁付き蓋を備えた120mlガラス瓶に入れた。これらを密封し、Ｃ2Ｎ2付加前に適切な容量の空気を除去した。ガスクロマトグラフ分析のためにそれらを短時間取り出した以外は、燻蒸標本を30℃に保持した。
内径0.53mmのDBwaxカラムで分離後、熱電子特殊検出器を装備したVarian 3300ガスクロマトグラフに標本からの20μlのアリコートを注入して、Ｃ2Ｎ2濃度を調べた。ガスクロマトグラフ記録はＣ2Ｎ2を6時間及び24時間曝露に適用して2時間以内に取った。２組目のガスクロマトグラフ記録は24時間曝露に関して燻蒸終了の約2時間前に取った。
結果
燻蒸に関する結果を表１に要約する。
0003810793.tif 000018
考察
Ｃ2Ｎ2は、鱗翅目のEphestia cautellaからの幼虫に対して、2.59mg/lで6時間曝露内に100%死亡率を誘導した。本試験では、幼虫の燻蒸剤に対する曝露時間を増大しても、低容量に関しては、死亡率の実質的増大は生じなかった。
実施例２８
Tedler袋中のＮＦ２の貯蔵
目的：特に小規模使用のために、燻蒸剤を貯蔵する便利な方法を提供するために、Tedler袋及び他のプラスチック容器中にＮＦ２を貯蔵し得るか否かを調べること。
材料及び方法
SKC Inc., 334 Valley View Rd., 84 Pennsylvania, USAから購入した市販のTedlar袋を用いた。これらは、ガスを導入及び回収するための注入系を有するプラスチック袋である。袋は、購入時には、本質的には空気が入っていない。気密注射器を用いて、燻蒸剤ＮＦ２を袋に注入した。Gow-Mac気体密度秤を装備したTracor MT150ガスクロマトグラフィーで、定期的間隔で、ＮＦ２の濃度を測定した。さらに、内径0.53mmのDBwaxカラムで分離後、熱電子特殊検出器を装備したVarian 3300ガスクロマトグラフでシアン化水素を測定した。シアン化水素標準はシアン化物塩を酸と反応させて調製し、気体密度秤で濃度を測定し、密封フラスコ中で希釈した。
空気中の希釈濃度のＮＦ２はTedlar袋中で調製し、Varian 3300ガスクロマトグラフで、定期的間隔で濃度を測定した。
光に対する保護のための特別な予防手段を講じることなく、22℃の典型的温度で、袋を空調実験室に放置した。
結果
毎週ガス濃度を測定した4週間の間、Tedlar袋中のＮＦ２の濃度は常に82%〜83% v/vで、見掛けの傾向は認められなかった。シアン化水素の濃度は常に0.35%〜0.45%, v/vで、見掛けの傾向は認められなかった。したがって、燻蒸剤はTedlar袋中で安定である。
低濃度でも、本系では安定であった。例えば、濃度0.66mg/lは、3日間の実験期間中、実験誤差を伴わず、安定であった。
考察
ガラス内及び水中（適切なpHの）、並びに溶媒中のＮＦ２の安定性は、他の項で示されている（例えば、相文献。文献３３；水文献。文献２３）。シリンダー中の安定性は、輸率部門Department of Transport Numberにより網羅されている（安全性文献。文献２４）。Tedlar袋中の安定性は、いくつかの用途に非常に便利な貯蔵及び投薬のもう一つの代替法を提供する。ＮＦ２の蒸気密度は2.3g/lで、したがって、10L袋中に23gの物質（その量の容器の大きさに比例しする）を貯蔵し得る。本貯蔵方法は、診察室、病院の各科等における場合のような、キログラムよりむしろミリグラム又はグラムで測定される量が必要な場合に便利である。必要な装置は、適切な容量の気密注射器と燻蒸剤を含入する袋だけである。有毒ガスの貯蔵方法全てに関するのと同様に、貯蔵のためには適切な安全手法が必要であり、このような手法には、保存量（容器のサイズが種々あるため）及び燻蒸剤の初期濃度が含まれる。容器のその他の変動も考えられる。
実施例２９
コムギのカラムを通るＣ2Ｎ2及びその他の気体の動き
目的：Ｃ2Ｎ2がコムギのカラムを吹き抜け得るか否かを調べること。
材料及び方法
用いた手法は、Desmarchelier, 1994に記載されているものと全く同じであった。燻蒸剤は、総容量7.9Lのコムギの1.1mカラムを200ml／分の気流速度で吹き抜けた。カラムの底に、200mlフラスコを介してカラムに燻蒸剤を導入した。試験した燻蒸剤は、ホスフィン、臭化メチル、Ｃ2Ｎ2及びシアン化水素であった。一実験においては、これら４つの燻蒸剤を同時に適用した。別の実験では、他の燻蒸剤を用いずにＣ2Ｎ2を適用し、さらに別の実験ではシアン化水素だけを適用した。
Varian 3300ガスクロマトグラフで燻蒸剤を検出した。ホスフィン及びＣ2Ｎ2は内径0.53mmのBP624カラムで分離後、熱電子特殊検出器で測定した。臭化メチルは、内径0.53mmのGSQカラムで分離後、電子捕獲検出器で検出した。
結果
流出ガス中の燻蒸剤濃度を図２７に示す。燻蒸剤Ｃ2Ｎ2を、２つの最も広く用いられる燻蒸剤であるホスフィン及び臭化メチルと同様の方法で、コムギを通り抜けて移動させた。同時に適用したこれらの燻蒸剤に関する結果は、個別に適用したこれらの燻蒸剤に関する結果（Desmarchelier, 1994）と同様であった。試験条件下では、シアン化水素はコムギを通り抜けることができず、流出物中にシアン化水素は検出されなかった。
考察
Ｃ2Ｎ2は空気流中をコムギを通って移動し得るため、それはフロースルー型の適用及び再循環系に用い得る。各々の種類の状況における昆虫に対するその毒性は、実施例２、８及び１０に示されている。
実施例３０
鞘翅目Coleopteraの２つの種に対するＣ2Ｎ2の毒性
目的：貯蔵物質の鞘翅目害虫２種に対するＣ2Ｎ2の毒性を調べること及びプロビット分析により用量−反応曲線を査定すること。
材料及び方法
被験昆虫はTribolium confusum(du Val)及びRhyzopertha dominica(F)の成虫であった。昆虫（50匹）を相対湿度55%で120mlガラス壺に入れて、25℃で保持した。壺にMininert弁を取り付けて、これを通じて燻蒸剤を注入した。昆虫を6時間曝露した後、含水量12%,w/wの小麦粉を含入する壺に移した。7及び28日の保持期間後に昆虫を計数した。各用量での６回ずつの試験からのデータを用いて、プロビット分析により死亡率を査定した。アボットAbbot式により対照死亡率に関して死亡率を訂正した。
適用量からＣ2Ｎ2の適用濃度を算出し、内径0.53mmのDBwaxカラムで分離後、熱電子特殊検出器を装備したVarian 3300ガスクロマトグラフでの分析により立証した。
結果
初期曝露後、初期「ノックダウン」からの何らかの見掛けの回復が認められた。しかしながら、1〜4週間の期間中、死亡率は増大した。これに関しては、Ｃ2Ｎ2はホスフィンと似ており、何匹かの昆虫が徐々に死亡し、燻蒸後に短い保持期間を置くと、終点死亡率が低く見積もられた。
図２８で、死亡率を濃度に対してプロットした。各昆虫に関する曲線は、典型的「Ｓ字形」曲線であった。
T. confusumに関するプロビット死亡率対対数濃度のプロットを図２９に示す。反応は線状で、反応がプロビット死亡率と対数濃度との間の線状相関の予測パターンにしたがうことを示す。R. dominicaに関する同様のプロットを図３０に示す。
6時間曝露に関しては、T. confusum及びR. dominicaに関するＬＣ50値は、それぞれ1.41及び0.141mg/lであった。
Monro（1969）は、21℃でのR. dominicaに対する5時間又は6時間曝露に関して、９つの燻蒸剤のＬ（ＣxＴ）95値、及び25℃でのT. confusumに対する１０種類の燻蒸剤のＬ（ＣxＴ）99値を列挙している。燻蒸剤Ｃ2Ｎ2は、R. dominicaの場合には、いずれの燻蒸剤よりも有毒であり、T. confusumの場合には、シアン化水素以外のどの燻蒸剤よりも有毒であった。燻蒸剤の一覧表には、二臭化エチレン、クロロピクリン及び臭化メチルが含まれていた。ホスフィンの毒性も記録されたが、27℃で24時間曝露のみであった。
考察
Ｃ2Ｎ2は試験した昆虫に対して非常に毒性が高く、臭化メチレン又は二臭化エチレンよりも有毒で、シアン化水素とほぼ等毒性である。プロビット死亡率と対数濃度との反応の線状性は、必要レベルの死亡率を達成するのに必要な濃度の算出を助ける。
実施例３１
密封容器中の溶媒及び空気間のＣ2Ｎ2の相分布並びに溶媒中の安定性。
目的：種々の溶媒中のＣ2Ｎ2の安定性、並びに液体及び蒸気相間の分布を調べること。これは投薬のために、並びに分析のために有用な情報である。
材料及び方法
溶媒（25ml）を隔壁シールを装備した容量270mlのエーレンマイヤーフラスコに入れた。燻蒸剤（2ml。純度80〜82%,v/v）をフラスコに注入し、これを磁気攪拌器で攪拌した。定期的間隔で、蒸気相からアリコート（50μl）を、液相から1μlのアリコートを取り出した。これらを熱電子特殊検出器を装備したVarian 3300ガスクロマトグラフ中に注入し、Ｃ2Ｎ2を内径0.53mmのDBwaxカラム上で溶媒から分離した。
試験した溶媒はすべて分析用等級であり、水は蒸留した。
毎日新しく調製した標準物を参照して、各相中の濃度を測定した。図に記録した濃度は、３回ずつ測定した平均である。
結果
0.1M塩酸中のＣ2Ｎ2の分布を図３１に示す。投薬後８時間までに相間で安定分布が達成され、この分布は、Ｃ2Ｎ2の総量を加えて、実験期間（70時間）中、ずっと安定であった。別の実験では、Ｃ2Ｎ2は、0.01M塩酸中でも安定であることが示された。
水中（図３２）では、Ｃ2Ｎ2は相対的に安定であった（図３２）が、他の実験では、高pH値（例えば8.0、10.5）で非常に不安定であることが示された。しかしながら、Ｃ2Ｎ2は50%酢酸、50%水中で不安定であった（図３３）。
ジオキサン中（図３４）では、相間の分布及び全体的安定性は約3日間の実験期間中変わらなかった。テトラヒドロフランに関して、同様の結果が得られた。相分布及び全体的安定性は、トルエン（図３５）及びアセトン（図３６）でも優れていた。多残留物分析における溶媒としてアセトンが広く用いられているため、最終結果は、分析化学的見地から特に好ましい。
考察
水性及び非水性溶液中の安定性は、多数の領域で、例えば容易に測定し得る溶液中の燻蒸剤を適切な投薬小室中に提供するのに有用である。
このような安定性は、適切なpHの溶媒、例えばアセトン、トルエン又は水中の商品から燻蒸剤を抽出する分析化学にも非常に有用である。これは液相中の残留物の測定を可能にし、相平衡分布のために、ヘッドスペース内の、即ち蒸気相中の濃度の測定による分析を可能にする。全分析化学においては同様に、標準物及び強化商品の調製には、適切な注意を要する。
Ｃ2Ｎ2の除去の項において、アミン又はアルコールとの反応によりそれが急速に破壊されることが示された。他の項では、それはある種のプラスチック袋中及びガラス中で安定であることが示された。したがって、又は気体としての又は液体としての燻蒸剤の安定性が、必要な場合には保持され、必要な場合には破壊されるのが便利である。
実施例３２
木材中のＣ2Ｎ2の浸透及び木材によるＣ2Ｎ2の吸収
目的：木材によるＣ2Ｎ2の吸収の程度、及びそれが木材に浸透する程度を調べ、したがって木材に対する生物検定データを活用して木材燻蒸剤としてのその適性を査定すること。
材料及び方法
２種の木材から木材キューブ（100 x100mm）を調製した。これらは、軟材種（Oregon）及び熱帯硬木種（Merbein）であった。
収着を測定するために、木材キューブを、隔壁入口を備えた容量2.5Lのデシケーターに入れ、磁気攪拌器で攪拌した。燻蒸前に、木材ブロックを30℃、相対湿度55%で5カ月間放置して、適切な平衡相対湿度を得た。標準的方法（American Standard Test Method, 1983）により測定した含水量は、硬木に関しては11.2%、軟材に関しては10.6%であった。ヘッドスペース内に燻蒸剤を注入した。30mg/lの算出濃度での投与後100時間の期間中に、ヘッドスペース内の濃度を測定した。
内径0.53mmのDBwaxカラムで分離後、熱電子特殊検出器を装備したVarian 3300ガスクロマトグラフで燻蒸剤濃度を測定した。
木材中への浸透を測定するために、木理と平行な木材の側面をシリコーンシーラーで密封し、乾燥し、肉厚層を適用した。次に、キューブをアルミ箔に包んで、末端を重ねて、末端木理面を5mmだけ箔で覆い、シリコーン層で木材に締結した。次いで、ブロックを24時間風乾した。各末端にサンプリング隔壁を有する透明ＰＶＣパネル（200mm x105mm x2mm）を木材ブロックにシリコーンで締結して、各末端に小室を構築した。小室をシリコーンで密封した。燻蒸剤を木材ブロックの一側面の入口隔壁で注入し、出口隔壁でサンプリングした。
結果
軟材及び硬木上のＣ2Ｎ2の収着を、硬木及び軟材の両方の上のヘッドスペース内のＣ2Ｎ2濃度をプロットした図３７に示す。燻蒸剤は、軟材より硬木により迅速に収着された（同様の結果は、臭化メチレンに関しても得られた）。濃度x時間生成物はかなり超過し、各種類の木材に関しては、（Ｃ x  Ｔ）生成物は３つの試験種の乾燥木材シロアリを制御するのに必要であった（実施例３６参照）。
軟材中のＣ2Ｎ2の浸透を図３８に示す。20時間の曝露期間後、各小室の濃度は約10mg/lの濃度で平衡状態になった。硬木中の浸透（図３９）は、あまり迅速でなく、平衡濃度は低かった（2.5mg/l）。
比較条件下で得られた臭化メチルに関するデータを図４０及び４１に示す。硬木及び軟材の両方に関して、燻蒸剤Ｃ2Ｎ2は臭化メチルより迅速に木材に浸透し、蒸気濃度は高かった。さらに、燻蒸剤Ｃ2Ｎ2は乾燥木材シロアリに対して臭化メチルよりも毒性が高かった（実施例３６参照）。
実施例３３
切り花の花瓶中寿命に及ぼすＣ2Ｎ2燻蒸の作用
目的：切り花に対する燻蒸剤としてのＣ2Ｎ2の適性を査定すること。
材料及び方法
路地カーネーションField Carnation及び銀葉樹Leucadendronを地方の卸売花屋から購入した。
Ｃ2Ｎ2（1.8mg/lの濃度で2時間）、臭化メチル（32mg/lで2時間−Australian Quarantine Inspection ServiceによるExport Flower Industryに推奨される用量）、及び燻蒸剤を付加しない対照を用いて、密封した63.5Lドラム中で燻蒸を実施した。
63.5Lドラムのにサンプリング口及びポンプ取付け部品を各々備えつけた。投薬後、ドラムの気体内容物をポンプで15分間循環させると、ドラム全体の燻蒸剤ガスの分布が平均化された。
既定量の空気をドラムから取り出して、同一量の濃縮ガスを導入することにより、燻蒸剤を適切な濃度にし得た。ガスクロマトグラフィーを用いて、標準濃度（「クイックフィット」隔壁上部を有する１Lエーレンマイヤーフラスコ中に調製）に対してドラム中の濃度を立証した。熱電子特殊検出器、DBwaxカラム（直径0.53mm）を装備したVarian 3300ガスクロマトグラフで、Ｃ2Ｎ2を測定し、ガスクロマトグラフィーＱカラム上の20%ＯＶ101を装備したShimadzu 6AMフレームイオン化検出器で臭化メチルを測定した。
各燻蒸剤の濃度を、最初に、１時間後及び燻蒸完了直前に調べた。
2時間後、ドラムを開けて、ヒュームフード内で空気に曝し、花をドラムから取り出して、茎を切り取って、束を水中に入れて、ヒュームフード内に放置して2時間空気に曝した後、冷室に入れた。
結果
達成された燻蒸剤の実際濃度は、30mg/l  ＭｅＢｒ及び1.8mg/l  ＮＦ２であった。２時間燻蒸中に、花によるＣ2Ｎ2の吸収又は分解のためにＣ2Ｎ2の濃度の33%低下が認められた（図４２参照）。これに対比して、ＭｅＢｒの濃度は曝露中ずっと、相対的に変わらなかった。
各々の花及び処理に関して１０のうちから（１０は優秀で１は売れない）１つの値を別々に示すように質問された６名の人のパネルにより、植物毒性を査定した。下記の数字は結果の平均値である。
処理              カーネーション        銀葉樹
対照              ５                    ７
Ｃ2Ｎ2            ３                    ５
ＭｅＢｒ          ３                    ６
考察
Ｃ2Ｎ2は、切り花用燻蒸剤ガスとしてＭｅＢｒに匹敵する。切り花中の昆虫源に対するその効能は、実施例４６に略記されている。
実施例３４
外段階の貯蔵物質鞘翅目Coleopteraに対するＣ2Ｎ2の毒性
目的：種々の貯蔵穀粒鞘翅目害虫の外段階に対するＣ2Ｎ2毒性を調べること。
材料と方法
Ｃ2Ｎ2の調製及び分析
Ｃ2Ｎ2は、ボンベに入れて運送される液化ガスとして市販されている。しかしながら、これらの予備試験のための使用の当日にストック試薬からそれを調製する方法が選ばれる。約50gのＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ（AnalaR）を500mlの蒸留水に付加した。溶液を約90℃に加熱し、直ちにホットプレートから除去した。隔壁蓋を備えたベル型管を溶液に浸漬し、注射器により管から空気を除去した。ベル型管に約10mlの飽和ＫＣＮ溶液を加えた。発生したＣ2Ｎ2を最低30分間放置した後、サンプリングした。
ＧＯＷ−ＭＡＣガス密度検出器（モデル40-001）でＣ2Ｎ2の純度を測定した。純度は典型的には65〜85%で、ＣＯ2が主な不純物であった。ガラス瓶中のＣ2Ｎ2濃度を、熱電子特殊検出器、内径0.53mmのDBwaxカラムを装備したVarian 3300ガスクロマトグラフを用いてモニタリングした。125℃での注入温度、80℃のカラム温度及び300℃の検出器温度を全ガラスサンプリングに用いた。
昆虫種
試験した昆虫種は、Oryzaephilus surinamensis（L）NOS405系統、Rhyzopertha dominica（F）Rd2系統、Sitophilus granarius（L）SG4系統、Sitophilus oryzae（L）CSO418系統、Tribolium castaneum （Herbst）TC4系統、及びTribolium confusum（Duv.）TCO37系統であった。別記しない限り、昆虫はすべて、30℃、相対湿度60%で培養した。
試験した外段階のこれらの種はすべて、全種の成虫、T. castaneum及びT. confusumの蛹、T. castaneum及びT. confusumの幼虫、並びにR. dominica、T. castaneum及びT. confusumの卵であった。
生物検定法
Mininert弁付き蓋を備えた120mlガラス瓶（Alltech Associates）中で、生物検定を実施した。検定は、種々の段階の15〜30匹の昆虫を用いて、２回ずつ実施した。付加されるガスの容量と等しい量の空気を瓶から除去した後に、燻蒸剤を付加した。Ｃ2Ｎ2付加の約1時間後及びその除去の約2時間前に、生物検定瓶をサンプリングした。燻蒸後、少量の適切な培地上に昆虫を載せ、30℃で相対湿度60%で1時間放置後、評価した。
結果
外段階の鞘翅目Coleopteraに対するＣ2Ｎ2の毒性
外段階の６種の鞘翅目に対するＣ2Ｎ2の毒性を、表１８に要約する。
示された最小致死用量は多量で、さらに生物検定実験すればあるいはもっと低い致死用量が示されるかもしれないと思われた。示された濃度x時間生成物（ＣＴ生成物）は実質的には種々の他の燻蒸剤よりも低かった。例えば、R. dominica成虫は、8.82mg/l（6時間、30℃）のＣ2Ｎ2 ＣＴ生成物で制御し得るが、これに比して臭化メチレンに関しては33.0mg/lのＣＴ生成物、二硫化炭素に関しては294.0mg/l、シアン化水素に関しては15.6mg/l、二塩化エチレンに関しては636.0mg/l（Monro, 1967）及び硫化カルボニルに関しては68.7mg/l（Desmarchelier, 1994）であった。
4〜24時間の因子により曝露時間を延長すると、約２（例えば、T.castaneumの幼虫）〜６（例えば、T.confusumの卵）の因子により用量を低くできる。平均因子は、成虫に関しては3.2、幼虫に関しては2.0、蛹に関しては3.0及び卵に関しては3.3であった。
考察
Ｃ2Ｎ2は、試験した鞘翅目Coleopteraの全種の全段階に対して有効であった。昆虫を殺すのに必要な量は、実施例３５において広範囲の曝露時間に亘って示されたように、曝露時間に伴って変化した。
0003810793.tif 000019
実施例３５
短期及び上記曝露に関するＣ2Ｎ2の毒性
目的：短期曝露及び長期曝露に関するＣ2Ｎ2の毒性を調べること。
材料及び方法
昆虫（20匹）を、隔壁入口を備えた275mlエーレンマイヤーフラスコ中で曝露した。燻蒸剤を注入し、昆虫を5分〜14日間の期間、曝露した。曝露後、昆虫をコムギ20gを含入する壺に移し、30℃で相対湿度55%で2週間保持した後、死亡率を査定した。
被験昆虫は、Rhyzopertha dominica（F.）ＣＲＤ２系統、Oryzaephilus surinamensis（L.）ＮＯＳ４０５系統及びTribolium castaneum（Herbs）ＣＴＣ４系統であった。
結果
曝露期間終了時（急性）及び２週間の保持期間後の死亡率を、表１９に示す。有意の死亡率は、５分だけの保持期間後に、100%死は10分間の保持期間後に達成された。これに対比して、低濃度に対する長期曝露は、二酸化炭素濃度が増大する系で100%死を生じた。
考察
燻蒸剤Ｃ2Ｎ2は非常に迅速に殺害し得るし、長期曝露期間中、低用量で殺害し得る。したがって、それは種々の状況に用い得る。急性死亡率（又はノックダウン）と最終死亡率との間に明らかな関係が認められないことを、データは示している（実施例３０参照）。
0003810793.tif 000020
実施例３６
臭化メチレンを参照した場合の乾燥木材シロアリに対するＣ2Ｎ2及びホスフィン毒性の評価
目的：臭化メチルに対して考え得る代替物としての３種の乾燥木材シロアリ、即ちCryptotermes bervis、Cryptotermes cyanocephalos及びCryptotermes domesticusに対するＣ2Ｎ2及びホスフィン毒性を評価すること。
材料及び方法
30℃、相対湿度80%に保持した培養からシロアリを得た。シロアリを、Mininert弁付蓋を備え、プライウッドの削り屑325mgを入れた120ml瓶に移し、相対湿度80%及び30℃に保持しながら密封した。燻蒸はすべて２回ずつ実施し、C. bervisに関しては10〜11匹、C. cyanocephalosに関しては25匹、C. domesticusに関しては22匹の標本を用いた。燻蒸剤付加前に、標本瓶から適切な容量の空気を除去した。投薬標本をガスクロマトグラフで分析して、濃度が予測通りであることを確証した。２組目のガスクロマトグラフ読取りをおこなった後、空気に曝して、燻蒸剤濃度が曝露期間中ずっと変化しなかったことを確証した。燻蒸はすべて、30℃で24時間保持したが、但しガスクロマトグラフ分析中は25℃であった。
内径0.53mmのDBwaxカラムで分離後、熱電子特殊検出器を装備したVarian 3300ガスクロマトグラフでＣ2Ｎ2濃度を測定した。ホスフィン濃度は、炎光光度検出器を装備したShimadzu 6AMで測定した。臭化メチル濃度は、20% ＯＶ−ＩＯ１カラムを有するガスクロマトグラフＱで分離後、フレームイオン化検出器を装備したShimadzu 6AMで測定した。
24時間曝露後、シロアリ及び木材削り屑を、プライウッドの大きなかけらプ各々含入するプラスチックペトリ皿に移した。
結果
C. domesticus、C. bervis、C. cyanocephalosに関する燻蒸結果を、１週間生存を基礎にして、それぞれ図４２〜４４に要約する。
C. domesticusに関する100%死亡率は、0.87mg/lの濃度で適用したＣ2Ｎ2、0.22mg/lの濃度のホスフィン及び4.35mg/lの濃度の臭化メチルで24時間燻蒸後に得られた（図４２）。
C. bervisに関する100%死亡率は、0.43mg/lの濃度で適用したＣ2Ｎ2、0.43mg/lの濃度のホスフィン及び1.74mg/lの濃度の臭化メチルで24時間燻蒸後に得られた（図４３）。
C. cyanocephalosに関する100%死亡率は、1.74mg/lの濃度で適用したＣ2Ｎ2、0.43mg/lの濃度のホスフィン及び3.47mg/lの濃度の臭化メチルで24時間燻蒸後に得られた（図４４）。
考察
本試験は、燻蒸剤Ｃ2Ｎ2及びホスフィンが乾燥木材シロアリの少なくとも３つの種に関して臭化メチルを上回る毒性を有し、乾燥木材シロアリ制御に関して臭化メチルに代わる実際に実行可能な候補であることを立証した。
木材燻蒸のための臭化メチルに対する有力な代替物のうち、ホスフィンは鞘翅目Coleopteraの全段階を制御するには長期曝露を要するが、乾燥木材シロアリの制御には要しない。フッ化スルフリルは試験したほとんどの種の卵に対して相対的に有効でない。これに対比して、他の実施例、特に実施例３４及び実施例３５で示したように、Ｃ2Ｎ2は迅速に作用し、鞘翅目Coleoptera及びその他の目の卵及び他の全段階を殺害し得る。実施例３２は、硬木又は軟材を含入する小室に適用したＣ2Ｎ2の濃度が、シロアリを制御するのに要する濃度を十分超える時間生成物による濃度に達したことを示す。
実施例３７
アミンのＣ2Ｎ2との反応
目的：Ｃ2Ｎ2のアミンとの反応が可逆的であるか否かを調べること。即ちアミンを触媒と考えると、変化せずに回収される。本研究は、リシンのような栄養価を有するアミンの考え得る損失に関連する。
材料及び方法
リシンはＵＶ検出器を用いたＨＰＬＣにより測定できないため、ベンジルアミンを一部モデルアミンとして用いた。
メタノール（20ml）中のベンジルアミン（0.04M）を隔壁入口を有する275mlエーレンマイヤーフラスコ中に入れた。燻蒸剤Ｃ2Ｎ2を注入した（0.5ml）。燻蒸剤付加後に定期的間隔で、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によりベンジルアミンを測定した。次いで、さらに燻蒸剤（5ml）を付加し、操作を繰り返した。
ＨＰＬＣ分析には、Alltech Ultima C18  1250x4.6mmカラム及びShimadzu SCI-61Aシステムコントローラーを用いた。分析は吸光度により、Waters 490Eプログラム作成可能多波長検出器を用いた。移動相は、１ml／分の流量で、20分間で20%アセトニトリル、80%水〜100%アセトニトリルであった。
結果
0.5mlＣ2Ｎ2付加の26時間後のＨＰＬＣスペクトルは、３つの余分のピークを示した。これらは47.5時間後、さらに5.35時間後に消失した。これらの間隔の各々で、「生成物」のスペクトルはベンジルアミンのスペクトルと同一であった。これは、不安定なピークは同じであるがベンジルアミンは回収されなかった、ベンジルアミンと別の燻蒸剤二硫化炭素との反応と対照をなしている。
5mlのＣ2Ｎ2付加後、ベンジルアミンは再び定量的に回収された。
0.5mlのＣ2Ｎ2ガスは2.2x10-5の燻蒸剤を含有し、ベンジルアミンのモル数はこのレベルの36倍であった。この比率は、5mlの燻蒸剤を付加すると、3.6に低減した。2モルのアミンは１モルのベンジルアミンと反応し、使用モル比は非可逆的変化を検出するのに適したもの以上であった。
考察
アミンのＣ2Ｎ2との迅速な反応は、実施例１４及び１５で考察された。アミン（例えばリシン）とＣ2Ｎ2との反応の可逆的性質は、このような生物学的化学物質は破壊されず、したがって栄養的損失を引き起こすということを示す。
実施例３８
切り花を用いるための燻蒸剤としてのＣ2Ｎ2及び関連用途
目的：切り花上に一般に見出される昆虫に対する燻蒸剤として作用するＣ2Ｎ2の能力を査定すること。
材料及び方法
昆虫を新鮮な切り花（ヤマモガシ属Protea及びThryptomene）から採集し、ガラスバイアル（容量約8ml）に入れて、隔壁を有する蓋で密封した。各昆虫属の代表的標本を入れたバイアルを対照として保持し、残りのものに92mg/lの濃度のＣ2Ｎ2 １mlを投与して、最終濃度を約11.5mg/lとした。これらのバイアルを周囲温度（約18℃）で2時間放置した。2時間経過後、生存の徴候に関して昆虫を調べ、次いで空気に曝して、さらに同定のために保存した。
結果
対照バイアルは2時間の期間中に死亡を全く示さなかったが、一方ーＣ2Ｎ2に曝露した昆虫、ダニ及びクモはすべて、2時間曝露後に死亡した。
0003810793.tif 000021
考察
これらの予備的結果は、Ｃ2Ｎ2が切り花、栽培植物及びその他の場所に普通に認められるこれらの昆虫、クモ及びダニを殺害することを示す。制御される昆虫は、総翅目Thysanoptera、鞘翅目Coleptera、弾尾目Colembola、鱗翅目Lepidoptera及び双翅目Dipteraからであった。殺される他の主な目名は、ダニ目Aracina（ダニ）及び真正クモ目Araneida（クモ）であった。鞘翅目（例えば実施例３０、実施例３４）、鱗翅目（実施例２７）、双翅目（実施例１２）及びダニ目（実施例４０）との引照が成される。
実施例３９
異なる大気圧での昆虫に及ぼすＣ2Ｎ2の作用
目的：Ｃ2Ｎ2の毒性に及ぼす高圧及び低圧の作用を調べること。圧力を周囲圧、周囲圧より１気圧高い圧、又は周囲圧の半分の圧に保持したステンレススチール容器中で、２つの異なる貯蔵物質害虫Sitophilus oryzae及びRhyzoprtha dominicaをＣ2Ｎ2で処理した。３つの異なる圧力で、既定量のＣ2Ｎ2に24時間曝露後の2種に関して、終点死亡率を測定した。
材料及び方法
ステンレススチールシリンダー内で燻蒸を実施した。ステンレススチールシリンダー（直径約100mmx353mm）にボルトでしっかり締め付けられる端板を取り付け、ゴム製Ｏリングで密封した。各端板は、三方タップ又はゴム隔壁サンプリング口の接続を可能にする1/4インチ入口（出口）を有した。本装置を図４６に示す。充填されたシリンダー中の水の重量から、シリンダー容量を算出した。
Sitophilus oryzae（ＬＳ２系統）及びRhyzoprtha dominica（ＣＲＤ２系統）の実験室培養から、各齢混合の成虫を取り出した。これらを、細かいステンレススチール網で両端を塞いだ小ガラス管（直径25mmx25mm）中に、１容器20匹入れた。各種について３つの容器（即ち、６容器、120匹）をステンレススチールシリンダー中に入れ、次いで密閉した。大気圧又はそれ以上で投薬されるシリンダーを部分的に評価し（圧力を5〜10mmHgだけ低減）、次いで測定量の燻蒸剤を隔壁を通して注入により導入した。次に、圧力を大気圧と等しくした。必要な圧力になるまで空気のシリンダーに繋いで、圧力を上昇させた。低圧シリンダーを排気させて、必要な圧とし、Ｈｇマノメーターで測定した後、燻蒸剤を注入した。急速な圧力の変化により昆虫が損傷を受けないようにするために、シリンダーに充填した場合又は充填しない場合で、全圧力変化を少なくとも１分間実行した（Ulrichs, 1994; Nakakita and Kawashima, 1994）。使用したＣ2Ｎ2の絶対量は「シリンダーリットル」当たり0.94、0.4、0.2又は0.1mgであった。各処理シリンダーに関して制御を保持した。24時間燻蒸後、ガスクロマトグラフィーによりシリンダー内の燻蒸剤濃度を調べ、昆虫を処理及び対照シリンダーから取り出して、生存者を計数した。終点死亡率が確定されるまで、昆虫を保持した。
結果
結果を表２０に示す。R. dominicaが最もＣ2Ｎ2に感受性で、ほぼ全用量で死亡率が100%に達した。0.1mg/lでは、死亡率は63%であった。低感受性S. oryzaeに対するＣ2Ｎ2の毒性は、ＮＴＰでの用量として表される燻蒸剤の濃度に依ることが判明した。即ち、同用量（mg）／容器に関しては、毒性は高圧で低く、あるいは逆にいえば、燻蒸剤の絶対量に関しては、燻蒸剤の毒性は圧力低下に伴って増大する。他方、用量をＮＴＰでの用量として表した場合、等用量は同一毒性を有することが分かった（表２０参照）。
考察
表２０のデータは、Ｃ2Ｎ2の毒性が燻蒸小室内の空気圧を下げることにより増強されることを示す。この理由は立証されていないが、しかし毒性は用いられたＣ2Ｎ2／Ｏ2比を反映するものと思われる。用量及び圧力をＮＴＰでの用量に修正すると（表１）、等価用量（ＮＴＰでの）はほぼ等価反応を提供するので、圧力それ自体は支配的パラメーターではない。燻蒸剤の絶対用量を一定に保持しながらの大気圧の変化は、Ｃ2Ｎ2／Ｏ2比を有効に変える。即ち、同一用量に関しては、高圧での燻蒸は低圧でよりもＣ2Ｎ2／Ｏ2比が低く、同様に高圧での死亡率は低圧の場合より低い。本結果は、増大酸素レベルへの曝露が昆虫に対するシアン化水素の毒性を増大することを示唆したBond（1962）の結果と対照をなす。
データは、高圧又は低圧でＣ2Ｎ2を使用することができることを説明する。
0003810793.tif 000022
実施例４０
Ｃ2Ｎ2によるダニの制御
目的：ダニに対するＣ2Ｎ2の効能を測定すること。
材料及び方法
ダニを、相対湿度65%に条件調節した少量の食物を含入する270mlエーレンマイヤーフラスコに入れた。食物は有機米泡＋酵母菌であった。隔壁入口を通して燻蒸剤を注入した。
「ノックダウン」死を定期的間隔で観察した。即ち、不動ダニの数を査定した。曝露期間終了時に、ダニ死亡率を査定し、さらに相対湿度65%に条件調節した食物上での保持期間後にも査定した。
試験したダニの種は、無気門亜目Astigmataの、全世界に分布するデトリタス供給者であるTyrophagusputrecentiaeであった。
結果
結果を表２１に要約する。完全ノックダウンは、時間生成物により低濃度で達成された。ダニは、１mg/l曝露により完全に殺された。低曝露、例えば１mg/lへの6時間曝露に関しては、死亡ダニは正常に見えたが、動かなかった。高濃度では、又は長時間曝露期間後では、ダニは縮んだように見えた。
考察
燻蒸小室内でのダニの制御は、ホスフィンが制御を達成できなかった条件下での花燻蒸中のダニの制御（実施例３８参照）と相関する。ダニ及び昆虫の両者を殺す能力は、貯蔵耐久及び生鮮商品、美術館等を含めた多数の領域で重要である。
0003810793.tif 000023
実施例４１
Ｃ2Ｎ2による植物疾患の制御
目的：植物疾患に対するＣ2Ｎ2の効能を調べること。
材料及び方法
植物真菌の増殖のための標準培地、ジャガイモデキストロース寒天プレート＋グルコースを、サンプリング隔壁とのクイックフィット接続を備えた容量275mlのエーレンマイヤーフラスコ中に調製した。上蓋を含めた全装置を、130℃で予め滅菌しておいた。各プレートの中心に植物真菌を接種した。使用した真菌は、麦類立枯病真菌Gauemannomyces graminis（tritici変種）及びRhizoctonia solaniであった。
前者の真菌はコムギの収量減損の主要原因であり、後者真菌は多数の状況における収量減損の一般的原因である。
燻蒸剤Ｃ2Ｎ2をサンプリング隔壁を通してフラスコに付加した。算出適用濃度は、G. graminisを制御するための実験では、対照と同様に、0.6、2.4、6及び15ml/lであった。フラスコを22℃で放置した。24時間後に上蓋を取り除いて、すべての残留燻蒸剤を空気に曝した後、置換した。算出適用濃度は、R. solaniを制御するための実験では、0.78、1.56、3.1及び12.5mg/lであったが、初期測定濃度は0.50、1.0、2.15及び8.7mg/lにすぎなかった。
全実験を２回ずつ実施した。
結果
G. graminis
48時間後、対照においては真菌増殖がはっきり目に見えたが、どの処理にもそれは認められなかった。次の日3日間、対照における増殖は進行したが、いずれの燻蒸真菌においても増殖は観察されなかった。
R. solaniに関しては、投薬時のコロニー直径はすべての場合に10〜12mmであり、直径を記録した。投薬の１日（24時間）後、燻蒸標本におけるコロニー直径は変わりなかったが、一方対照直径は29mmに増大した。72時間後、0.8mg/lの算出濃度で燻蒸した標本に多少の増殖が認められ、平均直径は27.5mmとなったが、一方高濃度で燻蒸した標本においては増殖は認められなかった。対照標本の平均直径は61mmであった。
考察
植物病原体の制御は園芸及び農業の重要な領域であり、土壌に臭化メチルが一般に用いられていることの主な理由である。
引照
実施例７及び４２は、土壌中の収着及び土壌中の効能を考察している。コムギ上の糸状菌の制御（実施例２１及び４１）も関連がある。燻蒸剤は気体として又は溶液で適用し得るし、各々の適用方法は土壌燻蒸のために用いる可能性を有する。
実施例４２
他の燻蒸剤に関する以前の試験（Mathiesson, Desmarchelier, Shakelton and Vu, 未発表結果）から使用された、そしてゾウムシwhitefringedweevilに対するＣ2Ｎ2の毒性の査定（実施例７参照）に用いられた土壌を用いて、土壌中のＣ2Ｎ2の収着を調べること。
材料及び方法
３種類の土壌を試験した。これらはPemberton loam、Myaluys sand及びSadie peatであった。
土壌（50g）を容量138.5mlのエーレンマイヤーフラスコに入れた。フラスコを隔壁入口で密封した。燻蒸剤を２つの方法で適用した。一方法は、1ml又は0.5mlの注入によりガスとしてであった。他の方法は、25mlエーレンマイヤーフラスコフラスコ中の0.01M  ＨＣｌ20mlに燻蒸剤ガス10mlを付加して得られる水溶液中の同量の燻蒸剤の適用であった。
燻蒸剤のヘッドスペース濃度は、内径0.53mmのDBwaxカラム上での分離後、熱電子特殊検出器を装備したVarian 3300ガスクロマトグラフで測定した。
実験は２回ずつ実施し、平均結果を記録した。
結果
結果を表２２に要約する。各方法の適用に関しては、ヘッドスペース内の燻蒸剤の濃度は、ピート土壌中では他の土壌よりも急速に低下した。ヘッドスペース内の燻蒸剤の初期濃度は、ガスとしての燻蒸剤の付加に関しては水溶液でよりも高かった。
考察
これらの結果は、実施例７に略記された結果とともに、ガスとして適用するか液体として適用するかにかかわらず、土壌燻蒸剤としてのＣ2Ｎ2の使用で一貫している。ガスとして、又は液体としてＣ2Ｎ2を適用できることは、この燻蒸剤の独特の特性である。
収着により測定した場合の、土壌のＣ2Ｎ2の損失は、環境へのガスの放出低減の観点から良いことであるが、害虫制御を困難にする。
ローム及び砂上で達成されるＣxＴ生成物は、麦類立枯病真菌を制御するのに必要な量を超える（実施例４１参照）が、これは、生物検定条件の差のため、というだけである。
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実施例４３
コムギ中のＣ2Ｎ2のシアン化水素への変換程度
目的：穀粒中でＣ2Ｎ2がシアン化物に変換される程度を調べること。
序論
実施例１５では、文献データの再検討から、シアンが２つの経路により分解されることが示された。第一は、ホルメート＋シアン化物へという経路で、低又は高pHでは優れており、第二の、シアン化物を伴わないオキサレートへの経路は、中性pHで優れている。
材料及び方法
Vu及びDesmarchelierの方法により、コムギ中のシアン化物を測定した。本方法は、標準手法（American Association of Cereal Chemists,1983）を用いて、水上に蒸留し、希釈アルカリ中でトラッピングして、コムギからシアン化物を除去する。それは、密封されたフラスコ内で脱着シアン化水素を捕獲し、次いで酸性化して、ヘッドスペース内のシアン化水素の測定を可能にする。この方法は、通常に実施される場合、使用条件下で分解されてシアン化物を生じ得る全化合物を測定し、シアン化水素のような化学物質を算出することに留意すべきである。
さらに、５回繰り返した測定値の平均から、異なる穀粒及び豆類中のシアン化物レベルを同一手法により測定した。
含水量11.6%のオーストラリア標準白色コムギを120mlフラスコに入れてコムギ充填率を95%とした。フラスコをMininert弁で密封した。燻蒸剤を注入し、異なる期間、コムギを貯蔵した。さらに、燻蒸化コムギを発芽させて、シアン化水素の残留物に及ぼす発芽の影響を査定した。
シアン化水素及びＣ2Ｎ2をともに、60℃でDBwaxカラムで等温分離後、熱電子特殊検出器を装備したVarian 3300ガスクロマトグラフで測定した。
実験は３回ずつ実施し、平均結果を記録した。
結果
異なる穀粒中のシアン化物の残留物は、平均で、コムギに関しては0.046mg/kg、canolaに関しては0.11mg/kg、フィールドピーに関しては0.058mg/kg、オオムギに関しては0.125mg/kg及びモロコシに関しては1.1mg/kgであった。
Ｃ2Ｎ2による燻蒸後のシアン化物の残留物を表２３に示す。これらの結果は、Ｃ2Ｎ2減損の卓越した方法がシアン化物への分解によるのではなく、このような分解は起きない、ということを示す。変換パーセンテージの実験反復は良好でなく、シアン化物への変換程度はさらに研究を要する。
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考察
シアンはコムギ上でシアン化物に大規模には分解されない。したがって、その効能は、シアン化物への前駆体であるシアンに基づいていない。シアン化水素は実施例３では同定されなかった。
実施例４４
Ｃ2Ｎ2の溶液によるウイルス不活性化
目的：Ｃ2Ｎ2の殺ウイルス活性を査定すること。
序論
Ｃ2Ｎ2の殺ウイルス活性を査定するために、われわれは２つのウイルス宿主系を調べた。これらの最初の系は、核多角体病ウイルス群（ＮＰＶ）及びその鱗翅目宿主Helicoverpa armigeraであり、第二のものはコオロギから最初は単離された小ＲＮＡ含有ウイルス（コオロギ麻痺ウイルス−ＣｒＰＶ）及び任意のキイロショウジョウバエDrosophila melanogaster細胞株（Scotti, 1972）であった。
核多角体病ウイルス群（ＮＰＶ）は、120〜150kbpの領域に環状ゲノムを有する大型二本鎖ＤＮＡウイルスである。それらは、成熟ウイルス粒子が多角形封入体（ＰＩＢ）として公知の大型擬似結晶タンパク質マトリックス中に埋め込まれていることを特徴とする３群の昆虫ウイルス（他の２つは細胞質多角体病ウイルス及び昆虫ポックスウイルスである）の１つである。ＰＩＢは一般的に直径が１ミクロン以上で、そのタンパク質マトリックス中に埋め込まれた20〜数百個のウイルス粒子を含有し得る。普通は、ＮＰＶは、ＰＩＢの取込み後にその昆虫宿主中での感染を開始する。昆虫前腸のアルカリ性条件中で、ＰＩＢは溶解し、ウイルス粒子を放出して、感受性細胞（通常、中腸の先端の基底円柱細胞）における感染を確立する。初期複製後、ウイルスは昆虫宿主中の多数の組織に感染するようになり、結局4〜8日（温度及び初期感染用量に依る）の間に宿主を死に至らしめる。
小ＲＮＡ含有ウイルスコオロギ麻痺ウイルス（ＣｒＰＶ）は、最初はコオロギから単離されたが、実質的には広範囲の昆虫種から単離され、複製されている（Christian and Scotti, 1994）。ＮＰＶに対比して、ＣｒＰＶは約8kbの一本鎖ＲＮＡゲノムを有し、４つの主要構造タンパク質及びレプリカーゼのみをコードする。ＣｒＰＶは、ショウジョウバエ（キイロショウジョウバエ）Drosophila melanogasterから得られる細胞株中で容易に複製することが判明しており（Scotti, 1976）、この任意の細胞系は、ウイルス力価の見積もりにルーチンに用いられる。
材料
１）4℃で保存される1.8x107個の多角形封入体（ＰＩＢ）／mlのHelicoverpa armigera核多角体病ウイルス（ＨａＮＰＶ）ストック懸濁液。
２）コオロギ麻痺ウイルス（ＣｒＰＶVIC／Ｇｍ／Ｄ２2／Ｇｍ／Ｄ２2）（Teleogryllus commodus, Victoria, Australia）（Christian and Scotti, 1994）。−20℃で保存される未滴定ストック。
３）10%ウシ胎仔血清を補充したSchneider昆虫培地（Schneider, 1972）中に保持されるキイロショウジョウバエDrosophila melanogaster系統２（ＤＬ２）細胞。
４）Ｊ２ゼリートレー（Nu-trend Containers, Jacksonville,Fl）中の4mlアリコートに分取される−標準Helicoverpa読取り培地（Shorey and Hale, 1960−ホルマリンを含有しない）。
５）最終濃度2mg/mlの２回蒸留水中のＮＦ２ストック溶液。これは、容量27.5mlガス59mgを水15mlに付加して得た。空気中及び水中の濃度を測定する。
６）２回蒸留した水。
７）ネオプレンシールを有する5ml McCartney瓶。実際測定容量は6.8mlであった。
８）標準96ウエル平底微小滴定プレート（Crown Corning, Corning, NY）。
９）ヒートシール可能なMylarTM（Dupont Australia Ltd., Bayswater, Vic）
方法
ウイルス標本の処理
１）ＨａＮＰＶ又はＣｒＰＶの２つの100μlアリコートを5ml McCartney瓶（実際容量6.8ml）中に分取した。１つのアリコートに900μlの２回蒸留水を付加し（未処理対照）、第二のアリコートには900μlのＣ2Ｎ2ストック溶液を付加した（処理標本）。Ｃ2Ｎ2ブランク（１mlのＣ2Ｎ2溶液）を瓶の５分の１に入れた。
２）すべての瓶をしっかり密封し、4℃で一夜（16時間）置いた。
３）生物検定前に、標本の上のガス相中でＣ2Ｎ2の濃度を測定した。60℃で、内径0.53mmのDBwaxカラムで分離後、熱電子特殊検出器を装備したVarian 3300ガスクロマトグラフでガスを測定した。
ＨａＮＰＶの生物検定
１）ＨａＮＰＶの標本を２回蒸留水で1:10に希釈して、最終推定濃度を1.8x105ＰＩＢ／mlとした。次いで、最終推定ＰＩＢ濃度7.2x104、1.8x104、7.2x103、1.8x103及び7.2x102ＰＩＢ／mlの未処理対照及び処理標本について希釈シリーズを作った。
２）次に、100μlの各ウイルス希釈液を、標準Helicoverpa読取り食餌を含入する4mlのＪ２ゼリートレーの25ウエルの各々に分取し、懸濁液をガラス棒を用いて食餌表面に広げた。ガラス棒は、希釈液毎に炎焼により滅菌した。
３）トレーを15〜30分間風乾後、個々の24時間齢（25℃で保持−中間−初齢）Helicoverpa armigera幼虫を各ウエルに入れ、ウエルをヒートシール可能なMylarTMで密封し、MylarTMに孔を開けてガスが移動できるようにし、トレーを細目金網の介在層と積み重ねた。
４）ウイルスに及ぼすＣ2Ｎ2の作用を昆虫に及ぼすその考えられる作用と分けるために、25匹の昆虫の標本を上記のように、しかしＣ2Ｎ2ストック溶液（ブランク）の1/10希釈液を用いて食事に付加して処理した後、乾燥し、そして50匹の幼虫群は全く処理せずに保持した。
５）昆虫を30℃（相対湿度70%）で保持し、感染後3日目及び感染後10日目に評価した。3日目に死亡した幼虫はＮＰＶ以外の原因により死亡したとみなされ、その後の分析から排除した。
ＣｒＰＶの生物検定
１）1/100の希釈でＤＬ２細胞の融合性単一層から細胞を継代培養した。
２）40μlのこの細胞懸濁液を96ウエル微小滴定プレートの各ウエルに分取して、細胞を1時間付着させた。
３）ＣｒＰＶの標本を蒸留水で1/10に希釈し、机上型遠心分離器で14,000rpmで2時間遠心分離して、大きな細胞屑を除去した。
４）次に、ウシ胎仔血清を補給した滅菌Schneider培地でウイルスの10倍希釈シリーズを作って、50μlの各希釈液を、付着ＤＬ２細胞を含有する微小滴定プレートの８つのウエルの各々にアリコート化した。
５）２つのウイルス標本（未処理対照及び処理標本）の他に、Ｃ2Ｎ2ブランクも同様の方法で滴定した。
６）細胞を27℃で保持し、観察可能な細胞病性作用（Ｃ．Ｐ．Ｅ．）における存在に関して7日後に評価した。
結果
Ｃ2Ｎ2の測定
１瓶に付加するＣ2Ｎ2の理論量は1.8mgであった。分配係数を1.1で測定した。即ち空気中の燻蒸剤の重量（／ml）は、水中のその重量（／ml）の1.1倍であった。したがって、水中の濃度は約0.25mg/mlであった。したがって、水性相中の0.25mg/mlの理論的濃度で、試験した系では、6.8mlバイアル中の1.8mgの質量が結果として生じた。
2mg/mlでの投与前にＣ2Ｎ2のストック溶液中の濃度を概算して、投与の2週間後に測定し、1.6mg/mlという値を得た。この目的のために供されたMcCartney瓶中の濃度も、上部を迅速に除去し、気密注射器でサンプリングし、再密封して、測定した。この分析方法により、付加されたＣ2Ｎ2の量は、ＨａＮＰＶの場合には理論量の25%、ＣｒＰＶの場合には23%に過ぎなかった。この低回収率は、おそらく低用量投与とガスの実際量を低く見積もるサンプリング手法との組合せに依るものと思われる。
ＨａＮＰＶの生物検定
１）ウイルス試験群（未処理対照及び処理標本）で10日目に記録された死亡率を表２４に示す。
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２）表１に示したデータを用いて、コンピュータープログラムＰＯＬＯを用いてプロビット分析を実施した。ウイルスの濃度はＰＩＢ／mm2で表した（Ｊ２トレーの各ウエル中の食餌の表面積は770mm2である）。未処理対照に関して、それぞれ1.094〜1.571ＰＩＢ／mm2の95%以上及び以下の信頼区間で、1.960ＰＩＢ／mm2のＬＣ50概算値を得た。処理標本からはＬＣ50概算値は得られなかった。
３）乾燥前に、0.025mg/mlの濃度のＣ2Ｎ2で処理した食餌上に保持した昆虫と未処理で放置した場合の昆虫との間の観察可能な差は認められなかった。
ＣｒＰＶの生物検定
１）２つのウイルス標本におけるウイルスの力価及び標準偏差を、ReedとMuenchの方法（Davis et al., 1968参照）を用いて概算した。
２）２つの標本の力価を以下に示す：
未処理対照  1.38x108IU*/ml（+/-4.36x107）
処理標本    2.21x105IU/ml（+/-6.98x104）
*IU=感染単位
３）Ｃ2Ｎ2ブランクの滴定からも、水中で0.4mg/mlの濃度でＤＬ２細胞に対してＣ2Ｎ2が強力な毒性を有するが、この量の1/10の濃度では効力は観察されないことが明示された。
考察
溶液中のＣ2Ｎ2によるＨａＮＰＶの不活性化
１）データから、最終濃度0.25mg/mlの溶液中のＣ2Ｎ2は、40℃で16時間後に少なくとも240倍までＨａＮＰＶを不活性化する。即ち、処理標本における最高推定ウイルス濃度（1.8x105ＰＩＢ／ml）は低下して、未処理対照の最低濃度（7.2x102ＰＩＢ／ml）で観察された死亡率を生じた。
ＣｒＰＶの不活性化
１）上記のデータは、0.25mg/mlの濃度の溶液中のＣ2Ｎ2は、4℃で一夜処理後にＣｒＰＶを640倍不活性化した。
考察
ウイルスを制御できるということは、医科、歯科、獣医科及び科学用建物及び装置に関連した多数の領域で大きな重要性を有する。ウイルスのこの制御は、細菌の制御（実施例１９）、糸状菌の制御（実施例２１）及び真菌性疾患制御（実施例４１）に加えらるべきものである。水中を移動する能力（実施例２２）、並びに蒸気相及び溶液中でのその活性は、ヒト及び動物の健康にとって重要なウイルス、細菌及びその他の生物の制御の重要且つ新規の局面である。
実施例４５
Ｃ2Ｎ2の毒性に及ぼす種々の濃度の酸素の作用及び種々の圧力での二酸化炭素の作用
目的：Ｃ2Ｎ2の毒性に及ぼす異なる濃度の酸素及び異なる圧力の二酸化炭素の作用を調べること。
材料及び方法
実施例３９に記載したようなステンレススチールシリンダー中で燻蒸を実施した。酸素レベルを60%、20%又は10%に調整したステンレススチール容器内で、Ｃ2Ｎ2を用いてSitophilus oryzaeの成虫を処理した。同様に、周囲圧より１気圧高い圧で50%及び30%二酸化炭素の存在下で、及び大気圧で30%二酸化炭素中で、Ｃ2Ｎ2を用いてSitophilus oryzaeの成虫を処理した。既定量のＣ2Ｎ2に24時間曝露後に、終点死亡率を測定した。
Sitophilus oryzae（ＬＳ２系統）の実験室培養から、各齢混合の成虫を取り出して、細かいステンレススチール網で両端を塞いだ小ガラス管（直径25mmx25mm）中に、１容器20匹入れた。３つの容器をステンレススチールシリンダー中に入れ、次いで密封した。酸素又は窒素のシリンダーを用いて、必要な酸素比が得られるまでステンレススチールシリンダーを加圧して、異なる酸素レベルを得た後、ガスを大気に放出して圧力を大気圧に戻した。同様の方法で、二酸化炭素レベルを得た。急速な圧力の変化により昆虫が損傷を受けないようにするために、シリンダーに充填した場合又は充填しない場合で、全圧力変化を少なくとも１分間実行した（Ulrichs, 1994; Nakakita and Kawashima, 1994）。使用したＣ2Ｎ2の絶対量は0.94、0.4、0.2又は0.1mg/lであった。各処理シリンダーに関して制御を保持した。24時間燻蒸後、ガスクロマトグラフィーによりシリンダー内の燻蒸剤濃度を調べ、昆虫を処理及び対照シリンダーから取り出して、生存者を計数した。終点死亡率が確定されるまで、昆虫を保持した。
結果
結果を表２５及び２６に示す。酸素レベルの正常レベルを下回る低下（しかし酸素欠乏が予測される場合にはずっとそのレベルより上）は、ほとんど又は全くＣ2Ｎ2の毒性に影響を及ぼさなかった。しかしながら、高酸素レベルが低レベルのＣ2Ｎ2の毒性を低減することを示唆する証拠は認められなかった（表２５）。
二酸化炭素レベルを増大すると、Ｃ2Ｎ2の毒性が増強されることが判明した。周囲圧より１気圧高い圧で30%二酸化炭素を用いた場合、死亡率は75%であった。これは、0.1mg/lのＣ2Ｎ2が存在すると100%に増大した（表２６）。
考察
Ｃ2Ｎ2の毒性は周囲より高い酸素レベルにより低減されるが、しかし低酸素レベルは何ら作用を及ぼさない（酸素レベルは酸素欠乏が生じ得るレベル以上であると仮定する）。二酸化炭素はＣ2Ｎ2の毒性を増強し（実施例２参照）、その作用は圧力を増大することによりさらに増強される（実施例３９と比較）。二酸化炭素の使用及び圧力増大は、加圧燻蒸小室内での高価商品の処理に適している。
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実施例４６
切り花に用いるための燻蒸剤としてのＣ2Ｎ2及び関連用途
目的：切り花上に一般に見出される昆虫に対する燻蒸剤として作用するＣ2Ｎ2の能力を査定すること。
材料及び方法
昆虫を新鮮な切り花（ヤマモガシ属Protea及びThryptomene）から採集し、ガラスバイアル（容量約8ml）に入れて、隔壁を有する蓋で密封した。各昆虫属の代表的標本を入れたバイアルを対照として保持し、残りのものに92mg/lの濃度のＣ2Ｎ2１mlを投与して、最終濃度を約11.5mg/lとした。これらのバイアルを周囲温度（約18℃）で2時間放置した。2時間経過後、生存の徴候に関して昆虫を調べ、次いで空気に曝して、さらに同定のために保存した。
結果
対照バイアルは2時間の期間中に死亡を全く示さなかったが、一方−Ｃ2Ｎ2に曝露した昆虫、ダニ及びクモはすべて、2時間曝露後に死亡した。
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考察
これらの予備的結果は、Ｃ2Ｎ2が切り花、栽培植物及びその他の場所に普通に認められるこれらの昆虫、クモ及びダニを殺害することを示す。制御される昆虫は、総翅目Thysanoptera、鞘翅目Coleoptera、弾尾目Colembola、鱗翅目Lepidoptera及び双翅目Dipteraからであった。殺される他の主な目名は、ダニ目Aracina（ダニ）及び真正クモ目Araneida（クモ）であった。鞘翅目（例えば実施例３０、実施例３４）、鱗翅目（実施例２７）、双翅目（実施例１２）及びダニ目（実施例４０）との引照が成される。
実施例４７
Ｃ2Ｎ2で処理したDacus tryoni（クイーンズランドミバエ）卵の死亡率
目的：双翅目のDacus tryoni（クイーンズランドミバエ）卵に対する水溶液に溶解したＣ2Ｎ2の毒性を調べること、及び曝露期間中のガス濃度を測定して濃度x時間の関係を明示すること。
材料及び方法
D.tyroni卵を、0.01M塩酸（ＨＣｌ）溶液に溶解した７種類の異なる濃度（フラスコ対照を含む）のＣ2Ｎ2で２回ずつ25℃で2時間処理した。10mlの0.01M ＨＣｌを、Mininert気密弁を備えた７つの16mlバイアルに入れ、0、0.45、4.5、9.0、18.0、27.0又は36.0mlの純度72%のＣ2Ｎ2ガスを各バイアルにごくゆっくりと注入した。これは、それぞれ溶液中の0、68、684、1369、2738、4106及び5475mg/l  Ｃ2Ｎ2に相当した。約200（±10）匹の１日齢卵を、14枚の湿らせた7x1cmの濾紙ストリップ上に載せ、濾紙をテープで14個の11x1cmステンレススチールストリップに付着させた。次に、各ストリップを、すりガラス隔壁密封上蓋を備えた275mlエーレンマイヤーフラスコに入れた。0.1mlの各Ｃ2Ｎ2溶液を、Precision Sampling Corp.の液体注射器を用いて、溶液が卵に掛からないよう注意しながら、２つのフラスコに導入した。これは、フラスコ中の約0、0.025、0.25、0.5、1.0、1.5、2.0mg/LのＣ2Ｎ2ガスの濃度に相当した。２回ずつ実施した付加的実験室対照を、飼育培地（乾燥ニンジン、トルラ酵母菌、Nipagin、ＨＣｌ及び水）を充填したペトリ皿上の湿らせた濾紙上に保持し、25℃及び相対湿度59%で制御温度（ＣＴ）室中で、曝露期間中保持した。熱電子特殊検出器及びDBwax Megaboreカラムを装備したVarianガスクロマトグラフで、各フラスコのヘッドスペース内のＣ2Ｎ2ガス濃度を測定した。カラム温度は60℃に、注入器温度は100℃、及び検出器温度は288℃に設定した。1.2Lエーレンマイヤーフラスコ中に作った0.25、0.4及び1.51mg/l  Ｃ2Ｎ2の３つの標準液を用いて、濃度を算出した。その結果から、各標本に関する濃度x時間（ＣＴ）生成物を算出した。
約２時間ガスに曝露後、フラスコをヒュームフード内で空気に曝し、卵を保持している濾紙ストリップを、培地を含入するペトリ皿内の湿らせた直径７cmの円形濾紙上に載せた。次いで、それらを25℃、相対湿度59%で保持した。6日間、毎日残っている卵の数を係数して、死亡率を査定した。
結果
各標本に関する濃度、測定ＣＴ生成物及び%死亡率を表２７に記録する。死亡率は、標本中の未孵化卵数を対照における数と比較して算出した（表２８）。フラスコ及び実験室対照は、未孵化卵200個のうち平均33個で、したがって処理卵の総数はこのために167個に低減された。標本１〜４は、対照より大きい孵化率を示し（平均で、0.025mg/lに関しては183、0.25mg/lに関しては186）、このことは低Ｃ2Ｎ2濃度で、燻蒸剤は有益な作用を有し得ることを示す。これらの標本は、100%生存率を有すると思われる。完全死亡率は1.5mg/l以上の濃度で2時間（ＣＴ生成物2.1mg時/l）で、73%以上死亡率は1.0mg/l（ＣＴ生成物  1.4mg/l）で、5%死亡率は0.5mg/l（ＣＴ生成物  0.8mg時/l）で達成され、0.25mg/l以下では死亡は認められなかった（ＣＴ生成物  0.38mg時/l）。さらに、1.0mg/lでは、対照及び低濃度と比較して、孵化は24時間遅れた。
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考察
D. tyroni卵の完全死亡率は、1.5mg/l以上の燻蒸剤濃度で2時間で、又は2.1mg時/lで達成された。この結果は、この種の幼虫の制御に関して実施例１２に略記されたものと類似している。これらの結果から、以下のように結論づけられる：
Ｃ2Ｎ2は、水溶液中に適用した場合に、有効である。相分布の関連化学知見は、実施例２２及び実施例３１で考察されている。
Ｃ2Ｎ2は、卵に対して、並びに実施例３４に示されているように、他の段階に対しても有効である。
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実施例４８
全身性殺虫剤としてのＣ2Ｎ2の特性
目的：燻蒸剤の水溶液の適用によりＣ2Ｎ2を植物に全身的に適用し得るか否かを調べること。
材料及び方法
地方の苗木屋から購入したフリージア及びサイネリアの苗を経木からガラス壺（60ml）に移植して、土壌表面を溶融パラフィン蝋で密封した。植物を取り出したあとの土の付いた壺２個も蝋で密封した。
84%Ｃ2Ｎ210mlを水道水60ml中に発泡させてＣ2Ｎ2の水溶液を作った。ガラス壺中の各植物及び土壌にこの水溶液5mlで水遣りをした。各壺の土壌中に蝋層を通してそれを注入して水遣りをし、次いでさらに溶融蝋を付加して破れた孔を再密封した。各試験を525mlガラス壺の内側に入れて、隔壁を備えたネジ式上蓋で密封した。２個の空の525壺に5mlのＣ2Ｎ2水溶液を直接注入した。
内径0.53mmのDBwaxカラムで分離後、熱電子特殊検出器を装備したVarian 3300ガスクロマトグラフでヘッドスペース内のＣ2Ｎ2の濃度を測定した。
各試験のヘッドスペース内のＣ2Ｎ2濃度は、対照壺のヘッドスペース内の濃度の百分率として表された（空の壺に付加されるＣ2Ｎ2水溶液）。図４７は、植物がＣ2Ｎ2を土壌からヘッドスペースに移しつつあることを示す。土壌対照（蝋が土壌を密封した）は、蝋シールがＣ2Ｎ2に対して相対的に不透過性で、したがってヘッドスペース内のＣ2Ｎ2の量は植物によるＣ2Ｎ2の全身性輸送に関与し得る、ということを示す。
24時間後、葉を取り除いて計量し、次いでネジ式上蓋を備えた隔壁を有する8mlバイアルに入れた。各バイアルに2mlのテトラヒドロフランを付加してＣ2Ｎ2の量を査定し、次にヘッドスペース内のＣ2Ｎ2の濃度を測定した。比較のために、84%Ｃ2Ｎ25μlを8mlバイアル中の2mlのテトラヒドロフランに付加付加した。葉中に検出された燻蒸剤の量を以下に示す。
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植物の品質に及ぼす燻蒸剤の作用は観察されなかった。
考察
ヘッドスペース中への輸送量及び葉中の化学物質の検出により示されるように、Ｃ2Ｎ2は植物においては全身性である。この全身性活性は、昆虫及び植物疾患の制御に重要である。水中のＣ2Ｎ2の移動に関して、実施例２２と引照される。
実施例４９
コムギにおけるＣ2Ｎ2、ホスフィン及び臭化メチルの行動の比較
目的：コムギにおけるＣ2Ｎ2、ホスフィン及び臭化メチルの収着及び脱着を比較すること。
序論
燻蒸剤は、燻蒸工程中に燻蒸剤に吸収される。処理後、燻蒸剤は商品から脱着し得る。これは、燻蒸剤及び燻蒸化商品の処理及び安全な取扱と関連する。
材料及び方法
コムギ（25g）の標本を公知容量の250ml円錐フラスコに入れた。ゴム隔壁（注入口）を含有する気密栓でフラスコに栓をした。フラスコにＣ2Ｎ2（10mg/l）、ホスフィン（2mg/l）又は臭化メチル（32mg/l）を投与した。24時間後、ガスクロマトグラフィーでヘッドスペース濃度を測定した。次に、各フラスコを開けて、手短にコムギをある容器から別の容器に注ぎ入れてコムギ標本を空気に曝した後、サンプリング口を有する気密Waringブレンダーキャニスター中でコムギ標本を粉砕して残留する収着燻蒸剤を概算し、ヘッドスペース分析により放出された燻蒸剤を測定した。
結果
24時間後のヘッドスペースにおいては、初期ホスフィンの91%、臭化メチルの69%及びＣ2Ｎ2の10%の残留が認められ、ガスクロマトグラフィーは元のＣ2Ｎ2の3%がＨＣＮに変換されたことを示した。コムギ標本中の回収可能な燻蒸剤の量は、最高で11.78ppm（w/w）臭化メチル、0.48ppm(w/w)Ｃ2Ｎ2及び0.05ppm（w/w）ホスフィンであることが判明した。回収されたＣ2Ｎ2に関しては、約1ppm  ＨＣＮが認められた。
考察
使用した用量は、コムギの有効な燻蒸のための推奨量又は有効と思われる量に対応した。結果は、新たに燻蒸された穀粒標本から脱着し得るＣ2Ｎ2の量が燻蒸化商品の安全な取扱における特別な問題を生じるとは思えない（実施例３と比較）。即ち、燻蒸の実施に伴う通常の安全な予防手段は十分である。付加されたＣ2Ｎ2の総量（2500μg）のうち、コムギ中の量は、Ｃ2Ｎ2  10μg及びＨＣＮ  20μgで、これはＨＣＮへの変換が小代謝経路であることを示す。
燻蒸剤の実験的研究、並びにその気体及び液体処方物は、殺虫剤、殺真菌剤、殺細菌剤、除草剤、殺線虫剤、殺ウイルス剤として、及び糸状菌阻害剤としてこれらの燻蒸剤を用い得ることを、最後に特に湿潤穀粒に対する使用を示している。滅菌剤としては、シアンは、幾つかの適用においては、病院、歯科及び獣医科の建物の滅菌に用いられる酸化エチレン及びその他の化学物質に代わる適切な置換物である。本発明の燻蒸剤はさらに、木材及び木材製品、土壌、植物及び切り花を処理するのに有用である。本発明は、貯蔵穀粒、木の実及びその他の貯蔵粒状食品、植物、果物、野菜、食肉の燻蒸に有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０ａ】
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【図１０ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３ａ】
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【図１３ｂ】
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【図１３ｃ】
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【図１３ｄ】
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【図１４ａ】
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【図１４ｂ】
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【図１４ｃ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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