(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリペプチド中の連続する二つのアミノ酸残基からなるジペプチドの各々のペプチド結合が、該ポリペプチドに外部エネルギーを与えることにより、切断される指向性を算出する方法であって、
（ａ）前記ポリペプチド中の連続する二つのアミノ酸残基からなるジペプチドの各々について、ペプチド結合の結合エネルギーを算出する工程、および、
（ｂ）前記外部エネルギーの値と工程（ａ）で算出された結合エネルギーの値とから、前記ポリペプチド中の連続する二つのアミノ酸残基からなるジペプチドの各々のペプチド結合が前記外部エネルギーにより切断される指向性を算出する工程、
を含む方法。
【請求項２】
工程（ａ）において、ペプチド結合の結合エネルギーを、ab initio 分子軌道計算により算出する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程（ｂ）において、ポリペプチド中の連続する二つのアミノ酸残基からなるジペプチドの各々のペプチド結合が外部エネルギーにより切断される指向性を、分子動力学により算出する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ポリペプチド中の連続する二つのアミノ酸残基からなるジペプチドの各々のペプチド結合が、該ポリペプチドに外部エネルギーを与えることにより、切断される指向性を算出するために、コンピューターを、
（ａ）前記ポリペプチドのアミノ酸配列および前記外部エネルギーの値を入力する入力手段、
（ｂ）前記ポリペプチド中の連続する二つのアミノ酸残基からなるジペプチドの各々について、ペプチド結合の結合エネルギーを算出する演算手段、
（ｃ）前記外部エネルギーの値と演算手段（ｂ）が算出した結合エネルギーの値とから、前記ポリペプチド中の連続する二つのアミノ酸残基からなるジペプチドの各々のペプチド結合が前記外部エネルギーにより切断される指向性を算出する演算手段、および、
（ｄ）算出された指向性を出力する出力手段、
として機能させるためのプログラム。
【請求項５】
請求項４に記載のプログラムを記録したコンピューター読み取り可能な記録媒体。
【請求項６】
ポリペプチド中の連続する二つのアミノ酸残基からなるジペプチドの各々のペプチド結合が、該ポリペプチドに外部エネルギーを与えることにより、切断される指向性を算出する装置であって、
（ａ）前記ポリペプチドのアミノ酸配列および前記外部エネルギーの値を入力する入力手段、
（ｂ）前記ポリペプチド中の連続する二つのアミノ酸残基からなるジペプチドの各々について、ペプチド結合の結合エネルギーを算出する演算手段、
（ｃ）前記外部エネルギーの値と演算手段（ｂ）が算出した結合エネルギーの値とから、前記ポリペプチド中の連続する二つのアミノ酸残基からなるジペプチドの各々のペプチド結合が前記外部エネルギーにより切断される指向性を算出する演算手段、および、
（ｄ）算出された指向性を出力する出力手段、
からなる装置。
【請求項７】
ポリペプチド中の連続する二つのアミノ酸残基からなるジペプチドの各々のペプチド結合を外部エネルギーにより切断することにより得られるペプチド断片を同定する方法であって、
（ａ）前記ポリペプチドを前記外部エネルギーにより切断することにより前記ペプチド断片を得る工程、
（ｂ）工程（ａ）で得られるペプチド断片の質量分布を測定する工程、
（ｃ）前記ポリペプチド中の連続する二つのアミノ酸残基からなるジペプチドの各々のペプチド結合が前記外部エネルギーにより切断される指向性を、請求項１から３のいずれかに記載の方法により算出することにより、前記ペプチド断片の質量分布を算出する工程、
（ｄ）工程（ｂ）で測定した質量分布を、工程（ｃ）で算出した質量分布と比較する工程、
を含み、工程（ｂ）で測定した質量分布における各ピークに対応する第一のペプチド断片の質量が、工程（ｃ）で算出した質量分布における各ピークに対応する第二のペプチド断片の質量と同一である場合に、前記第一のペプチド断片が前記第二のペプチド断片であると判断される方法。
【請求項８】
ポリペプチドを同定する方法であって、
（ａ）前記ポリペプチドを外部エネルギーにより切断することによりペプチド断片を得る工程、
（ｂ）工程（ａ）で得られるペプチド断片の質量分布を測定する工程、
（ｃ）公知のアミノ酸配列を持つ参照ポリペプチド中の全ての連続する二つのアミノ酸残基からなるジペプチドの各々のペプチド結合のうち、以下の（１）に示すデータベースにおける結合エネルギーまたは解離エネルギーの値が 60 Kcal/mol 以下であるペプチド結合でのみ外部エネルギーによる切断が生じるとして、質量分布を算出する工程、
（１）アミノ酸配列 X-Y（ここで、X および Y はそれぞれ、グリシン、アラニン、バリン、フェニルアラニン、プロリン、メチオニン、イソロイシン、ロイシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニン、セリン、スレオニン、チロシン、ヒスチジン、システイン、アスパラギン、グルタミンおよびトリプトファンからなる群より選択されるアミノ酸残基であり、X はアミノ末端側残基を、Y はカルボキシル末端側残基を、- はペプチド結合を表す。）で表されるジペプチドの一部または全部について、ab initio 分子軌道計算により算出したペプチド結合の結合エネルギーまたは解離エネルギーの値を含む、機械に読み取り可能な媒体に保存されたデータベース、
（ｄ）工程（ｂ）で測定した質量分布を、工程（ｃ）で算出した質量分布と比較する工程、
を含み、工程（ｂ）で測定した質量分布における各ピークに対応する第一のペプチド断片の質量が、工程（ｃ）で算出した質量分布における各ピークに対応する第二のペプチド断片の質量と同一である場合に、前記ポリペプチドが参照ポリペプチドであると判断される方法。
【請求項９】
ポリペプチドを同定する方法であって、
（ａ）前記ポリペプチドをアミノ酸配列特異的に切断することによりペプチド断片を得る工程、
（ｂ）工程（ａ）で得られるペプチド断片の質量分布を測定する工程、
（ｃ）工程（ｂ）で測定される質量分布を基に、特定の質量を持つペプチド断片を選択する工程、
（ｄ）工程（ｃ）で選択されるペプチド断片を外部エネルギーにより切断することによって、より短いペプチド断片を得る工程、
（ｅ）工程（ｄ）で得られるペプチド断片の質量分布を測定する工程、
（ｆ）既知のアミノ酸配列を持つ参照ポリペプチドを、工程（ａ）と同様にして、切断した場合に生じるペプチド断片を予測する工程、
（ｇ）工程（ｆ）で予測されたペプチド断片中の全ての連続する二つのアミノ酸残基からなるジペプチドの各々のペプチド結合のうち、以下の（１）に示すデータベースにおける結合エネルギーまたは解離エネルギーの値が 60 Kcal/mol 以下であるペプチド結合でのみ外部エネルギーによる切断が生じるとして、質量分布を算出する工程、
（１）アミノ酸配列 X-Y（ここで、X および Y はそれぞれ、グリシン、アラニン、バリン、フェニルアラニン、プロリン、メチオニン、イソロイシン、ロイシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニン、セリン、スレオニン、チロシン、ヒスチジン、システイン、アスパラギン、グルタミンおよびトリプトファンからなる群より選択されるアミノ酸残基であり、X はアミノ末端側残基を、Y はカルボキシル末端側残基を、- はペプチド結合を表す。）で表されるジペプチドの一部または全部について、ab initio 分子軌道計算により算出したペプチド結合の結合エネルギーまたは解離エネルギーの値を含む、機械に読み取り可能な媒体に保存されたデータベース、
（ｈ）工程（ｅ）で測定した質量分布を、工程（ｇ）で算出した質量分布と比較する工程、
を含み、工程（ｅ）で測定した質量分布における各ピークに対応する第一のペプチド断片の質量が、工程（ｇ）で算出した質量分布における各ピークに対応する第二のペプチド断片の質量と同一である場合に、前記ポリペプチドが参照ポリペプチドであると判断される方法。
【請求項１０】
ペプチド断片の質量分布を質量分析により測定する、請求項７から９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
ポリペプチド中の所望の連続する二つのアミノ酸残基からなるジペプチドのペプチド結合を外部エネルギーにより切断することによりペプチド断片を製造する方法であって、
（ａ）前記ポリペプチド中の連続する二つのアミノ酸残基からなるジペプチドの各々について、ペプチド結合の結合エネルギーを算出する工程、
（ｂ）前記外部エネルギーの値と工程（ａ）で算出された結合エネルギーの値とから、前記所望の連続する二つのアミノ酸残基からなるジペプチドのペプチド結合が前記外部エネルギーにより切断される指向性を算出する工程、
（ｃ）外部エネルギーの値を変化させて工程（ｂ）を繰り返す工程、
（ｄ）前記所望の連続する二つのアミノ酸残基からなるジペプチドのペプチド結合が切断される指向性が最も高くなるエネルギーの値を選択する工程、
（ｅ）工程（ｄ）で選択された値の外部エネルギーを前記ポリペプチドに与える工程、
を含む方法。
【請求項１２】
工程（ａ）において、連続する二つのアミノ酸残基からなるジペプチドの各々におけるペプチド結合の結合エネルギーを、ab initio 分子軌道計算により算出する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
工程（ｂ）において、ポリペプチド中の連続する二つのアミノ酸残基からなるジペプチドのペプチド結合が外部エネルギーにより切断される指向性を、分子動力学により算出する、請求項１１または１２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ポリペプチドが外部エネルギーにより切断される部位を予測する方法、ポリペプチドが外部エネルギーにより切断されて得られたペプチド断片を同定する方法、並びに、外部エネルギーによるポリペプチドの切断により所望のペプチド断片を取得する方法に関する。
【従来の技術】
ポリペプチドのタンデム質量分析（tandem mass spectroscopy; 以下、MS/MS）では、まず、一段目の質量分析において、特定の質量電荷比（以下、m/z）を持つポリペプチドイオンを選択する。次に、選択されたポリペプチドイオンを、衝突室において外部からエネルギーを与えることにより、切断する。最後に、このようにして生じたペプチド断片を二段目の質量分析において更に詳しく解析する。このように、ポリペプチドに対して外部からエネルギーを与えることにより、ポリペプチドが切断されることが知られている。MS/MS におけるこのような切断は、衝突誘起解離（collision-induced dissociation; 以下、CID; Hayes, R. N. & Gross, M. L. (1990) Methods Enzymol. 193, 237-263）、赤外多光子解離（infrared multiphoton dissociation; 以下、IRMPD; Little, D. P. et al. (1994) Anal. Chem. 66, 2809-2815）、黒体赤外放射解離（blackbody infrared radiative dissociation; BIRD と略; Price, W. D. et al. (1996) Anal. Chem. 68, 859-866）、表面誘起解離（surface-induced dissociation; SID と略; Tsaprailis, G. et al. (1999) J. Am. Chem. Soc. 121, 5142-5154）、および、紫外光解離（ultraviolet photodissociation; Bowers, W. D. et al. (1984) J. Am. Chem. Soc. 106, 7288-7289; Williams, E. R. et al. (1990) J. Am. Soc. Mass Spectrom. 1, 288-294）等として知られている。例えば、CID では、衝突室にアルゴンなどの不活性なガスを入れておき、そこにポリペプチドイオンを衝突させることにより、ポリペプチドが切断される。CID においては、ポリペプチドイオンの持つ運動エネルギーが不活性ガスとの衝突により、ポリペプチドイオン内の化学結合の振動エネルギーに変換され、その結果、ポリペプチドが切断される。すなわち、ポリペプチドには最終的に熱エネルギーとして外部からエネルギーが与えられる。また、IRMPD では、真空中に送り込んでトラップしたポリペプチドイオンに対して、赤外レーザーを照射することにより、ポリペプチドが切断される。すなわち、ポリペプチドには光エネルギーとして外部からエネルギーが与えられる。上記したような、外部からのエネルギーによるポリペプチドの切断においては、主にペプチド結合が切断され、b 型イオンとy 型イオン（図１）が生じることが知られている。この切断は、全てのペプチド結合で等確率で起こるわけではない。すなわち、アミノ酸配列によって切断されやすいペプチド結合と切断されにくいペプチド結合が存在する。しかし、どのようなアミノ酸配列においてペプチド結合が切断されやすいかの法則性は明らかになっていない。また、ポリペプチドが外部エネルギーにより切断される部位を予測する方法は確立していない。このような方法が確立すれば、アミノ酸配列特異的プロテアーゼ（トリプシンおよびトロンビンなど）および化学物質（臭化シアンおよびヒドロキシルアミンなど）による切断と同様に、エネルギーによるポリペプチドの切断によっても、部位特異的なポリペプチドの切断が可能になることが期待される。最近、注目されはじめているプロテオミクスにおいては、生体において発現している多種多様なタンパク質に関するデータを系統的にかつ網羅的に解析する必要がある。このような解析において、質量分析は有用であるが、質量分析においては質量スペクトルにおけるピークを効率よく、かつ、正確に同定する必要がある。現状では、ペプチドマスフィンガープリンティング法およびシ���クエンスタグ法（Wilm, M. et al. (1996) Nature 379, 466-469）などによりピークの同定が行われている。シークエンスタグ法では、MS/MS とデータベースサーチとを組み合わせてポリペプチドの同定を行う。まず、ポリペプチドを、トリプシンのようなアミノ酸配列特異的なプロテアーゼで切断し、ペプチド断片を得る。これらのペプチド断片を MS/MS にかけ、一段目の質量分析において、特定の m/z を持つペプチド断片を選択する。選択されたペプチド断片を、衝突室において、例えば、CID により外部からエネルギーを与えることにより、切断する。このようにして生じたより短いペプチド断片を二段目の質量分析にかけ、質量スペクトルを得る。この質量スペクトルからは、この、より短いペプチド断片に含まれる部分アミノ酸配列を読みとることができる場合がある。また、部分アミノ酸配列が読みとることができた場合、その部分アミノ酸配列に隣接する N 末端側および C 末端側のアミノ酸配列の質量も読みとることができる。一方、SWISS-PROT（http://www.expasy.ch/sprot/sprot-top.html）などのデータベースに含まれる各アミノ酸配列が上記のプロテアーゼで切断された場合に生じうるペプチド断片のアミノ酸配列を仮想的に生成する。次に、生成したアミノ酸配列に含まれるペプチド結合が外部からのエネルギーにより切断されることにより生じうるより短いペプチド断片おのおのの質量を計算し、実際に得られた質量スペクトルと比較する。その際、MS/MS で読みとられた部分アミノ酸配列、および、隣接する両側のアミノ酸配列の質量を考慮することで、同定の精度を上げることができる。これまでの同定方法は、解析速度および正確さの観点から改良の余地を残している。例えば、シークエンスタグ法では、外部エネルギーによる切断が全てのペプチド結合において等確率で生じることを前提としている。しかし、実際には、このような切断は等確率では起こっていない。そのため、実験的にはほとんど生じえないペプチド断片についても理論的に質量を計算し、実験で得られた質量スペクトルと比較している場合がある。このことは、データベースサーチの速さを低下させる可能性があり、また、同定結果の正確さを低下させるノイズとなる可能性がある。
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ポリペプチドが外部エネルギーにより切断される部位を予測する方法を提供することを目的とする。また、本発明は、ポリペプチドが外部エネルギーにより切断されて得られたペプチド断片を同定する方法を提供することを目的とする。更に、本発明は、外部エネルギーによるポリペプチドの切断により所望のペプチド断片を取得する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意研究を行った。まず、本発明者らは、アンジオテンシン II（配列番号：１; 以下、AG II）を赤外多光子解離（infrared multiphoton dissociation; 以下、IRMPD）により切断し、エレクトロスプレーイオン化（electrospray ionization; 以下、ESI）フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴（Fourier-transform ion cyclotron resonance; 以下、FTICR）質量分析（mass spectroscopy; 以下、一部において、MS）で解析した。その結果、AG II が Asp-Arg 間（N 末端から一番目のペプチド結合）、および、His-Pro 間（N 末端から六番目のペプチド結合）において切断されることが明らかとなった。次に、AG II 中の連続する二つのアミノ酸残基からなるジペプチドの各々について、ペプチド結合の結合エネルギーを ab initio 分子軌道計算により計算した。これらの結合エネルギーの値を参考にして、AG II 中の全てのペプチド結合に対して、同一の結合エネルギーを割り当てた。更に、このようにして割り当てた同一の結合エネルギーを用いて、AG II の解離の分子動力学シミュレーションを行った。その結果、AG II が Asp-Arg 間、および、His-Pro 間において切断されやすいことが示された。以上の結果から、計算により求めた切断箇所と実験により求めた切断箇所とが一致することが確認された。このように、本発明者らは、ab initio 分子軌道計算と分子動力学シミュレーションとを用いることにより、ポリペプチドの外部エネルギーによる切断部位を信頼性高く予測することができることを示し、本発明を完成させた。すなわち、本発明は、ポリペプチドが外部エネルギーにより切断される部位を予測する方法、ポリペプチドが外部エネルギーにより切断されて得られたペプチド断片を同定する方法、並びに、外部エネルギーによるポリペプチドの切断により所望のペプチド断片を取得する方法に関し、具体的には、〔１〕  ポリペプチド中の連続する二つのアミノ酸残基からなるジペプチドの各々のペプチド結合が、該ポリペプチドに外部エネルギーを与えることにより、切断される指向性を算出する方法であって、（ａ）前記ポリペプチド中の連続する二つのアミノ酸残基からなるジペプチドの各々について、ペプチド結合の結合エネルギーを算出する工程、および、（ｂ）前記外部エネルギーの値と工程（ａ）で算出された結合エネルギーの値とから、前記ポリペプチド中の連続する二つのアミノ酸残基からなるジペプチドの各々のペプチド結合が前記外部エネルギーにより切断される指向性を算出する工程、を含む方法、〔２〕  工程（ａ）において、ペプチド結合の結合エネルギーを、ab initio 分子軌道計算により算出する、〔１〕に記載の方法、〔３〕  工程（ｂ）において、ポリペプチド中の連続する二つのアミノ酸残基からなるジペプチドの各々のペプチド結合が外部エネルギーにより切断される指向性を、分子動力学により算出する、〔１〕または〔２〕に記載の方法、〔４〕  ポリペプチド中の連続する二つのアミノ酸残基からなるジペプチドの各々のペプチド結合が、該ポリペプチドに外部エネルギーを与えることにより、切断される指向性を算出するために、コンピューターを、（ａ）前記ポリペプチドのアミノ酸配列および前記外部エネルギーの値を入力する入力手段、（ｂ）前記ポリペプチド中の連続する二つのアミノ酸残���からなるジペプチドの各々について、ペプチド結合の結合エネルギーを算出する演算手段、（ｃ）前記外部エネルギーの値と演算手段（ｂ）が算出した結合エネルギーの値とから、前記ポリペプチド中の連続する二つのアミノ酸残基からなるジペプチドの各々のペプチド結合が前記外部エネルギーにより切断される指向性を算出する演算手段、および、（ｄ）算出された指向性を出力する出力手段、 として機能させるためのプログラム、〔５〕  〔４〕に記載のプログラムを記録したコンピューター読み取り可能な記録媒体、〔６〕  ポリペプチド中の連続する二つのアミノ酸残基からなるジペプチドの各々のペプチド結合が、該ポリペプチドに外部エネルギーを与えることにより、切断される指向性を算出する装置であって、（ａ）前記ポリペプチドのアミノ酸配列および前記外部エネルギーの値を入力する入力手段、（ｂ）前記ポリペプチド中の連続する二つのアミノ酸残基からなるジペプチドの各々について、ペプチド結合の結合エネルギーを算出する演算手段、（ｃ）前記外部エネルギーの値と演算手段（ｂ）が算出した結合エネルギーの値とから、前記ポリペプチド中の連続する二つのアミノ酸残基からなるジペプチドの各々のペプチド結合が前記外部エネルギーにより切断される指向性を算出する演算手段、および、（ｄ）算出された指向性を出力する出力手段、からなる装置、〔７〕  ポリペプチド中の連続する二つのアミノ酸残基からなるジペプチドの各々のペプチド結合を外部エネルギーにより切断することにより得られるペプチド断片を同定する方法であって、（ａ）前記ポリペプチドを前記外部エネルギーにより切断することにより前記ペプチド断片を得る工程、（ｂ）工程（ａ）で得られるペプチド断片の質量分布を測定する工程、（ｃ）前記ポリペプチド中の連続する二つのアミノ酸残基からなるジペプチドの各々のペプチド結合が前記外部エネルギーにより切断される指向性を、〔１〕から〔３〕のいずれかに記載の方法により算出することにより、前記ペプチド断片の質量分布を算出する工程、（ｄ）工程（ｂ）で測定した質量分布を、工程（ｃ）で算出した質量分布と比較する工程、を含み、工程（ｂ）で測定した質量分布における各ピークに対応する第一のペプチド断片の質量が、工程（ｃ）で算出した質量分布における各ピークに対応する第二のペプチド断片の質量と同一である場合に、前記第一のペプチド断片が前記第二のペプチド断片であると判断される方法、〔８〕  ポリペプチドを同定する方法であって、（ａ）前記ポリペプチドを外部エネルギーにより切断することによりペプチド断片を得る工程、（ｂ）工程（ａ）で得られるペプチド断片の質量分布を測定する工程、（ｃ）公知のアミノ酸配列を持つ参照ポリペプチド中の全ての連続する二つのアミノ酸残基からなるジペプチドの各々のペプチド結合のうち、以下の（１）に示すデータベースにおける結合エネルギーまたは解離エネルギーの値が 60 Kcal/mol 以下であるペプチド結合でのみ外部エネルギーによる切断が生じるとして、質量分布を算出する工程、（１）アミノ酸配列 X-Y（ここで、X および Y はそれぞれ、グリシン、アラニン、バリン、フェニルアラニン、プロリン、メチオニン、イソロイシン、ロイシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニン、セリン、スレオニン、チロシン、ヒスチジン、システイン、アスパラギン、グルタミンおよびトリプトファンからなる群より選択されるアミノ酸残基であり、X はアミノ末端側残基を、Y はカルボキシル末端側残基を、- はペプチド結合を表す。）で表されるジペプチドの一部または全部について、ab initio 分子軌道計算により算出したペプチド結合の結合エネルギーまたは解離エネルギーの値を含む、機械に読み取り可能な媒体に保存されたデータベース、（ｄ）工程（ｂ）で測定した質量分布を、工程（ｃ）で算出した質量分布と比較する工程、を含み、工程（ｂ）で測定した質量分布における各ピークに対応する第一のペプチド断片の質量が、工程（ｃ）で算出した質量分布における各ピークに対応する第二のペプチド断片の質量と同一である場合に、前記ポリペプチドが参照ポリペプチドであると判断される方法、〔９〕  ポリペプチドを同定する方法であって、（ａ）前記ポリペプチドをアミノ酸配列特異的に切断することによりペプチド断片を得る工程、（ｂ）工程（ａ）で得られるペプチド断片の質量分布を測定する工程、（ｃ）工程（ｂ）で測定される質量分布を基に、特定の質量を持つペプチド断片を選択する工程、（ｄ）工程（ｃ）で選択されるペプチド断片を外部エネルギーにより切断することによって、より短いペプチド断片を得る工程、（ｅ）工程（ｄ）で得られるペプチド断片の質量分布を測定する工程、（ｆ）既知のアミノ酸配列を持つ参照ポリペプチドを、工程（ａ）と同様にして、切断した場合に生じるペプチド断片を予測する工程、（ｇ）工程（ｆ）で予測されたペプチド断片中の全ての連続する二つのアミノ酸残基からなるジペプチドの各々のペプチド結合のうち、以下の（１）に示すデータベースにおける結合エネルギーまたは解離エネルギーの値が 60 Kcal/mol 以下であるペプチド結合でのみ外部エネルギーによる切断が生じるとして、質量分布を算出する工程、（１）アミノ酸配列 X-Y（ここで、X および Y はそれぞれ、グリシン、アラニン、バリン、フェニルアラニン、プロリン、メチオニン、イソロイシン、ロイシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニン、セリン、スレオニン、チロシン、ヒスチジン、システイン、アスパラギン、グルタミンおよびトリプトファンからなる群より選択されるアミノ酸残基であり、X はアミノ末端側残基を、Y はカルボキシル末端側残基を、- はペプチド結合を表す。）で表されるジペプチドの一部または全部について、ab initio 分子軌道計算により算出したペプチド結合の結合エネルギーまたは解離エネルギーの値を含む、機械に読み取り可能な媒体に保存されたデータベース、（ｈ）工程（ｅ）で測定した質量分布を、工程（ｇ）で算出した質量分布と比較する工程、を含み、工程（ｅ）で測定した質量分布における各ピークに対応する第一のペプチド断片の質量が、工程（ｇ）で算出した質量分布における各ピークに対応する第二のペプチド断片の質量と同一である場合に、前記ポリペプチドが参照ポリペプチドであると判断される方法、〔１０〕  ペプチド断片の質量分布を質量分析により測定する、〔７〕から〔９〕のいずれかに記載の方法、〔１１〕  ポリペプチド中の所望の連続する二つのアミノ酸残基からなるジペプチドのペプチド結合を外部エネルギーにより切断することによりペプチド断片を製造する方法であって、（ａ）前記ポリペプチド中の連続する二つのアミノ酸残基からなるジペプチドの各々について、ペプチド結合の結合エネルギーを算出する工程、（ｂ）前記外部エネルギーの値と工程（ａ）で算出された結合エネルギーの値とから、前記所望の連続する二つのアミノ酸残基からなるジペプチドのペプチド結合が前記外部エネルギーにより切断される指向性を算出する工程、（ｃ）外部エネルギーの値を変化させて工程（ｂ）を繰り返す工程、（ｄ）前記所望の連続する二つのアミノ酸残基からなるジペプチドのペプチド結合が切断される指向性が最も高くなるエネルギーの値を選択する工程、（ｅ）工程（ｄ）で選択された値の外部エネルギーを前記ポリペプチドに与える工程、を含む方法、〔１２〕  工程（ａ）において、連続する二つのアミノ酸残基からなるジペプチドのペプチド結合の結合エネルギーを、ab initio 分子軌道計算により算出する、〔１１〕に記載の方法、〔１３〕  工程（ｂ）において、ポリペプチド中の連続する二つのアミノ酸残基からなるジペプチドのペプチド結合が外部エネルギーにより切断される指向性を、分子動力学により算出する、〔１１〕または〔１２〕に記載の方法、を提供する。
【発明の実施の形態】
本発明は、ポリペプチド中のペプチド結合が、該ポリペプチドに外部エネルギーを与えることにより、切断される指向性を算出する方法、すなわち、ポリペプチドが外部エネルギーにより切断される部位を予測する方法を提供する。本明細書において、「ポリペプチド」とは、複数のアミノ酸からなる重合体を意味する。従って、オリゴペプチドおよびタンパク質もポリペプチドに含まれる。また、荷電したポリペプチド、すなわち、「ポリペプチドイオン」も本発明のポリペプチドに含まれる。ポリペプチドは修飾されていてもよい。修飾としては、例えば、アセチル化、メチル化、リン酸化、ジスルフィド結合の形成、糖鎖の付加などが含まれるが、これらに限定されない。また、ポリペプチドはペプチド断片を含む。本明細書において、「ペプチド断片」とは、ポリペプチドが、外部エネルギー（後述）、プロテアーゼ、もしくは、化学物質により切断されることによって生じる、分子量のより小さいポリペプチドを意味する。ポリペプチドと同様に、ペプチド断片は荷電していても修飾されていてもよい。また、ペプチド断片が切断されて生じる断片も、アミノ酸残基数が２以上である限り、ペプチド断片に含まれる。本明細書において、「ポリペプチドに外部エネルギーを与える」とは、ポリペプチドにその外部からエネルギーを与えることを意味する。本明細書において、「外部エネルギー」とは、ポリペプチドにその外部から与えられるエネルギーを意味する。外部エネルギーは、好ましくは、光エネルギー、または、熱エネルギーとして、ポリペプチドに与えられる。外部エネルギーを与えるポリペプチドの形態には特に制限はない。例えば、質量分析装置内においてイオン化されたポリペプチド、溶液中のポリペプチド、ポリアクリルアミドゲルなどのゲル中のポリペプチド、結晶化したポリペプチド、凍結乾燥したポリペプチド、担体に固定したポリペプチド等に対して、外部エネルギーを与えることができる。質量分析装置内においてイオン化されたポリペプチドに対し、光エネルギーとして外部エネルギーを与える方法としては、例えば、赤外多光子解離（infrared multiphoton dissociation; 以下、IRMPD; Little, D. P. et al. (1994) Anal. Chem. 66, 2809-2815）を挙げることができる。IRMPD は、真空中に送り込んでトラップしたポリペプチドイオンに対して、赤外レーザーを照射することにより実行することができる。赤外レーザーとしては、例えば、CO2 赤外レーザーを挙げることができる。また、質量分析装置内においてイオン化されたポリペプチドに対し、熱エネルギーとして外部エネルギーを与える方法としては、例えば、衝突誘起解離（collision-induced dissociation; 以下、CID; Hayes, R. N. & Gross, M. L. (1990) Methods Enzymol. 193, 237-263）を挙げることができる。CID では、質量分析装置の衝突室に不活性なガスを入れておき、そこにポリペプチドイオンを衝突させることにより実行することができる。不活性なガスとしては、例えば、アルゴンガスを挙げることができる。CID においては、ポリペプチドイオンの持つ運動エネルギーが不活性ガスとの衝突により、ポリペプチドイオン内の化学結合の振動エネルギーに変換され、その結果、ポリペプチドが切断される。すなわち、ポリペプチドには最終的に熱エネルギーとして外部からエネル��ーが与えられる。本明細書において、「ポリペプチド中のペプチド結合が切断される指向性」とは、ポリペプチド中のペプチド結合がどれだけ切断されやすいかを意味する。例えば、あるポリペプチドを切断したとき、そのポリペプチド中のあるペプチド結合が切断される指向性を、そのペプチド結合の切断により生成したペプチド断片の量と、生成した全ペプチド断片の量との比として表現することができる。この比が高ければ、そのペプチド結合が切断される指向性が高いと表現することができる。本発明の予測方法においては、まず、ポリペプチド中の連続する二つのアミノ酸残基からなるジペプチドの各々について、ペプチド結合の結合エネルギーを算出する（工程（ａ））。本発明において、ポリペプチド全体について各々のペプチド結合の結合エネルギーを算出しないで、ポリペプチド中の連続する二つのアミノ酸残基からなるジペプチドの各々についてペプチド結合の結合エネルギーを算出するという工程を採用したのは、下記の理由による。例えば、実施例で用いた AG II の場合、原子数は146 個であり、また、振動の自由度は432 である。よって、AG IIに対し、例えば、以下に記載する ab initio 分子軌道計算を行おうとした場合、信頼性のある計算結果を得るまでには莫大な時間を要する。これは、このような計算が実際上は実施可能でないことを示している。そこで、このような困難を克服するために、本発明者らは、ポリペプチド中の連続する二つのアミノ酸残基からなるジペプチドの各々についてペプチド結合の結合エネルギーを算出したところ、合理的な時間で算出することに成功した。本方法において、ジペプチドは、ポリペプチドと同様に、修飾されていてもよい。修飾されたジペプチドとしては、例えば、N 末端側がアセチル化され、C 末端側が N-メチル化されているジペプチドが挙げられる。本工程において、ジペプチドのペプチド結合の結合エネルギーを算出するには、公知の方法を利用することができる。ジペプチドのペプチド結合の結合エネルギーを算出するための好ましい方法としては、例えば、ab initio 分子軌道計算（Hehre, W. J. et al. (1986) "AB Initio Molecular Orbital Theory", Wiley, John & Sons, Incorporated）等の方法を挙げることができる。本明細書において、「ab initio 分子軌道計算」とは、基底関数系を任意に選択する以外は経験的なパラメーターを用いないで分子軌道を計算することを意味する。本発明において、基底関数系としては公知のものを使用することができる。好ましい基底関数系としては、例えば、6-31G* および 6-31+G* などを挙げることができる。本発明において、ab initio 分子軌道計算には、例えば、ab initio 分子軌道法、および、密度汎関数法等の方法を用いることができる。ab initio 分子軌道法は、例えば、ハートリー・フォック（Hartree-Fock）法（HF）により行うことができる。また、密度汎関数法に用いる汎関数には特に制限はなく、例えば、B3LYP および B3P86 等が、好ましくは、B3LYP が用いられる。ab initio 分子軌道計算のためのプログラムには、特に制限はないが、好ましくはガウシアン（Gaussian）98 プログラム（Revision A.9, Frisch, M. J. et al. (1998) Gaussian, Inc., Pittsburgh PA）が使用できる。ab initio 分子軌道計算を利用した場合、ジペプチドのペプチド結合の結合エネルギーを、例えば、以下��ようにして算出することができる。まず、ポリペプチド中の連続する二つのアミノ酸残基からなるジペプチドのエネルギーと、そのジペプチド中のペプチド結合を解離させることにより生じるラジカルのエネルギーとを計算し、その差をとることにより、解離エネルギーを算出する。次に、振動数を計算することによりポテンシャルの深さを得る。構造最適化は HF やB3LYP/6-31+G* にて行い、ゼロ点エネルギー（zero point energy; 以下、ZPE）補正のためにHF/6-31+G* を使用する。また、解離エネルギーをゼロ点エネルギー補正することにより、結合エネルギーを算出する。本発明の予測方法においては、次に、外部エネルギーの値と工程（ａ）で算出された結合エネルギーの値とから、ポリペプチド中のペプチド結合が前記外部エネルギーにより切断される指向性を算出する（工程（ｂ））。本工程において、ポリペプチド中のペプチド結合が外部エネルギーにより切断される指向性を算出するには、公知の方法を利用することができる。ポリペプチド中のペプチド結合が外部エネルギーにより切断される指向性を算出するための好ましい方法としては、例えば、分子動力学（Klein, M. L. (1985) Annu. Rev. Phys. Chem. 36, 525; Hoover, W. G. (1983) Annu. Rev. Phys. Chem. 34, 103）等によるシミュレーションを挙げることができる。分子動力学を利用した場合、ポリペプチド中のペプチド結合が外部エネルギーにより切断される指向性を、例えば、以下のようにして算出することができる。ポリペプチドの断片化が、衝突のない真空条件下において、ペプチド結合における C’-N 結合で生じ、その結果、b 型および y 型の断片が生じると仮定する。また、基底状態のポリペプチドが光子を吸収し、解離が熱的に起こると仮定する。ここで、ペプチドのプロトン化については考慮しないで、電気的に中性なポリペプチドについてシミュレーションを行うものとする。このシミュレーションにおいては、デカルト座標で書かれたハミルトンの運動方程式を数値的に積分することにより、系における各原子の運動量と座標とを時間の関数として計算する。基底状態のペプチドのポテンシャルを次式で表す。
【数１】
0003829186.tif 000002
ここで、D0 はポテンシャルの深さ、R’CN は C’-N 結合の平衡核間距離、α1 はモースレンジパラメーター（Morse range parameter）を表す。θおよびΨ座標に沿ったポテンシャルエネルギーの解離反応座標 RCN 依存性を表すために、指数的切替え関数（exponential switching function）を用いる。ここで α2 および α3 は減衰関数のパラメーターを表す。ペプチド結合および上記の切替え関数以外については、AMBER96 力場を用いる。モースポテンシャルの深さ D0 は、工程（ａ）で算出された結合エネルギーの値を参考にして、全てのペプチド結合に対して、同一の値を割り当てる。D0 の値としては、例えば、60〜100 Kcal/mol、好ましくは 70〜90 Kcal/mol、より好ましくは 90 Kcal/mol が挙げられる。AMBER96 力場よりペプチド結合伸縮の定数は kr = 980 kcal/mol なので、モースレンジパラメーター α1 の値は、
【数２】
α1 = (kr /(2 D0 ))1/2
で計算される。例えば、D0 = 60 Kcal/mol ならば α1 = 2.86 であり、D0 = 100 Kcal/mol ならば α1 = 2.21である。α2 および α3 の値としては、好ましくは 1.0〜4.0 を挙げることができる。分子動力学シミュレーションの初期条件を得るために、まず、温度 298 K にて 100ns の間、一定温度の動力学計算を行う。その際、1 ps ごとに原子座標をメモリに記憶させ、「吸収前」の状態とする。このようにして記憶させた吸収前の状態からランダムに128 個を選択し、分子動力学シミュレーションの初期条件とする。分子動力学計算の実行には、公知のプログラムを利用することができる。例えば、MolTrec（Misoo, K. et al. (2000) "Development of Molecular Dynamics Programs for Protein with a Parallelized Barnes-Hut Code", Proc. the Fourth International Conference on High-Performance Computing in Asia-Pacific Region (HPC-Asia 2000), pp.1103-1111）を用いることができるが、これに制限されない。また、本発明は、本発明の予測方法を実行するためのコンピュータープログラムを提供する。本発明のコンピュータープログラムには、ポリペプチド中のペプチド結合が、該ポリペプチドに外部エネルギーを与えることにより、切断される指向性を算出するために、コンピューターを、（ａ）前記ポリペプチドのアミノ酸配列および前記外部エネルギーの値を入力する入力手段、（ｂ）前記ポリペプチド中の連続する二つのアミノ酸残基からなるジペプチドの各々について、ペプチド結合の結合エネルギーを算出する演算手段、（ｃ）前記外部エネルギーの値と演算手段（ｂ）が算出した結合エネルギーの値とから、前記ポリペプチド中のペプチド結合が前記外部エネルギーにより切断される指向性を算出する演算手段、および、（ｄ）算出された指向性を出力する出力手段、として機能させるためのプログラム、が含まれる。さらに本発明は、上記本発明のコンピュータープログラムを記録したコンピューター読み取り可能な記録媒体を提供する。本発明の記録媒体は、汎用コンピューターが読み取り可能なものであって、本発明のコンピュータープログラムが記録されている。本発明の記録媒体は、可搬型または固定型の両方の媒体が含まれ、例えば、CD-ROM、フレキシブルディスク（FD）、DVD、ハードディスク、半導体メモリ等を挙げることができる。また、本発明のプログラムは、上記可搬型記録媒体にプログラムを格納して売買したり、ネットワークを介して接続されたコンピューターの記録装置に格納しておき、ネットワークを通じて他のコンピューターに転送することもできる。本発明の処理工程を実行するコンピュータープログラムをユーザに提供する提供媒体は、様々な形式のコンピューター読み出し可能媒体として頒布可能であって、本発明は実際の頒布のために使用される特定のタイプの媒体に関係なく適用される。また、本発明は、ポリペプチド中のペプチド結合が、該ポリペプチドに外部エネルギーを与えることにより、切断される指向性を算出する装置を提供する。前記装置は、（ａ）前記ポリペプチドのアミノ酸配列および前記外部エネルギーの値を入力する入力手段、（ｂ）前記ポリペプチド中の連続する二つのアミノ酸残基からなるジペプチドの各々について、ペプチド結合の結合エネルギーを算出する演算手段、（ｃ）前記外部エネルギーの値と演算手段（ｂ）が算出した結合エネルギー��値とから、前記ポリペプチド中のペプチド結合が前記外部エネルギーにより切断される指向性を算出する演算手段、および、（ｄ）算出された指向性を出力する出力手段、からなる。本発明の装置の好ましい態様は、本発明のプログラムがハードディスク装置等の補助記憶装置に格納されたコンピューターである。前記プログラムは、ポリペプチド中のペプチド結合が、該ポリペプチドに外部エネルギーを与えることにより、切断される指向性をコンピューターに算出させるためのプログラム、および、このプログラムを制御するためのプログラムを含む。図２には、本発明の装置のシステム構成図の一例を示す。入力手段１と出力手段２がバス線３に接続されている。一時記憶手段４は、入力されたデータ、および算出された数値データ等を一時的に記憶する。中央処理装置（CPU）５は、本発明のプログラムの命令を受けて各種演算を行う。メインメモリ６には本発明の処理を実行するための各種プログラムが格納されている。このプログラムは、ポリペプチド中のペプチド結合が、該ポリペプチドに外部エネルギーを与えることにより、切断される指向性をコンピューターに算出させるためのプログラム６１、および、このプログラムを制御するためのプログラム６２に大きく分けられる。これらプログラム６１および６２を１つのプログラムにまとめることも可能である。図３は前記装置により実行される処理のフローの一例である。まず、入力手段からポリペプチドのアミノ酸配列および外部エネルギーの値（単に「データ」と記載する場合あり）が入力される。この、ポリペプチドのアミノ酸配列および外部エネルギーの値は、キーボード等の入力手段から直接本発明の装置へ入力する以外に、ポリペプチドのアミノ酸配列および外部エネルギーの値が記録された可搬型記録媒体、ハードディスク等の固定型媒体、またはインターネットのデータバンク等の通信ネットワークから、モデム等の受信手段を利用してコンピューターに供給することが可能である。また、予め適当なデータをハードディスク等の固定型媒体に記憶させておき、前記固定型媒体から、適宜ロードして使用することも可能である。入力されたデータはコンピューターのメインメモリまたは一時記憶手段に格納しておくことができる。次いで、入力されたポリペプチドのアミノ酸配列および外部エネルギーの値から、ポリペプチド中のペプチド結合が、該ポリペプチドに外部エネルギーを与えることにより、切断される指向性を前記の方法で算出する。通常、この処理工程は、中央処理装置（CPU）等の演算手段がメインメモリ中の上記プログラム６１の指令を受け、アミノ酸配列および外部エネルギーの値を読み出し、前記指向性の計算を行う。算出された前記指向性の算出結果は、コンピューターの記憶手段または一時記憶手段に格納される。次いで、算出された指向性が出力手段によって出力される。この出力手段には、ディスプレイ・モニタのほか、プリンター等も含まれる。また、本発明は、アミノ酸配列 X-Y（ここで、X および Y はそれぞれ、グリシン、アラニン、バリン、フェニルアラニン、プロリン、メチオニン、イソロイシン、ロイシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニン、セリン、スレオニン、チロシン、ヒスチ��ン、システイン、アスパラギン、グルタミンおよびトリプトファンからなる群より選択されるアミノ酸残基であり、X はアミノ末端側残基を、Y はカルボキシル末端側残基を、- はペプチド結合を表す。）で表されるジペプチドの一部または全部について、ab initio 分子軌道計算により算出したペプチド結合の結合エネルギーまたは解離エネルギーの値を含む、機械に読み取り可能な媒体に保存されたデータベースを提供する。本発明のデータベースは、上記で示されるデータと合わせて、いわゆるデータベーススキーマを含んでいてもよい。「データベーススキーマ」とは、データベースに蓄積されるデータの形式や対応の定義を与えるものであり、一般にデータベース言語により記述される。本発明のデータベースは、CD-ROM 等の記録媒体に載せて配布・販売することもできる。あるいはデータベースが保存および維持されている場所に検索者からオンライン接続によって照会することもできる。ウェブブラウザーを用いたオンライン検索を行えるように、データベースをインターネット上で利用できるようにすることも可能である。例えば、データベースの照会によって得られるハプロタイプ頻度のデータに基づいて、本発明の方法により個人のディプロタイプ分布の算出を行うことができる。また、本発明は、ポリペプチド中のペプチド結合を外部エネルギーにより切断することにより得られるペプチド断片を同定する方法であって、（ａ）前記ポリペプチドを前記外部エネルギーにより切断することにより前記ペプチド断片を得る工程、（ｂ）工程（ａ）で得られるペプチド断片の質量分布を測定する工程、（ｃ）前記ポリペプチド中のペプチド結合が前記外部エネルギーにより切断される指向性を、本発明の予測方法により算出することにより、前記ペプチド断片の質量分布を算出する工程、（ｄ）工程（ｂ）で測定した質量分布を、工程（ｃ）で算出した質量分布と比較する工程、を含み、工程（ｂ）で測定した質量分布における各ピークに対応する第一のペプチド断片の質量が、工程（ｃ）で算出した質量分布における各ピークに対応する第二のペプチド断片の質量と同一である場合に、前記第一のペプチド断片が前記第二のペプチド断片であると判断される方法を提供する。本明細書において、「ペプチド断片の質量分布」とは、ある試料中に存在するペプチド断片の、各分子量における存在量を表す。質量分布の測定には、公知の方法を利用することができる。例えば、質量分析、ゲルろ過、および、SDS ポリアクリルアミドゲル電気泳動などの方法を挙げることができるが、正確な分子量を測定できることから質量分析が好ましい。質量分析の方法としては、絶対的な分子量が得られる方法であれば特に制限はないが、例えば、ESI FTICR MS が好ましい。ESI FTICR MS は、他の質量分析法と比較して、はるかに高い分解能で正確に分子量を得られるという特徴を持つ。本明細書において、実験により測定された質量と計算により算出された質量とが「同一である」とは、互いの誤差の絶対値が、通常は 100 ppm 以下、好ましくは 50 ppm 以下、より好ましくは 25 ppm 以下、さらにより好ましくは 10 ppm 以下、最も好ましくは 5 ppm 以下であることを意味する。本発明はまた、アミノ酸配列特異的プロテアーゼまたは化学物質の代わ��に外部エネルギーを用いたペプチドマスフィンガープリンティング法によるポリペプチドの同定法を提供する。すなわち、本発明は、ポリペプチドを同定する方法であって、（ａ）前記ポリペプチドを外部エネルギーにより切断することによりペプチド断片を得る工程、（ｂ）工程（ａ）で得られるペプチド断片の質量分布を測定する工程、（ｃ）既知のアミノ酸配列を持つ参照ポリペプチド中の全てのペプチド結合のうち、本発明のデータベースにおける結合エネルギーまたは解離エネルギーの値が 60 Kcal/mol 以下であるペプチド結合でのみ外部エネルギーによる切断が生じるとして、質量分布を算出する工程、（ｄ）工程（ｂ）で測定した質量分布を、工程（ｃ）で予測した質量分布と比較する工程、を含み、工程（ｂ）で測定した質量分布における各ピークに対応する第一のペプチド断片の質量が、工程（ｃ）で算出した質量分布における各ピークに対応する第二のペプチド断片の質量と同一である場合に、前記ポリペプチドが参照ポリペプチドであると判断される方法を提供する。本明細書において、「参照ポリペプチド」とは、本発明の同定方法において、同定されるポリペプチドと比較されるポリペプチドを意味し、既知のアミノ酸配列を持つ。参照ポリペプチドのアミノ酸配列は、例えば、SWISS-PROT、PIR などのアミノ酸配列に関するデータベースから取得することができる。また、DDBJ、EMBL あるいは GenBank などの塩基配列に関するデータベースから取得した塩基配列の全てのフレームについて予想したアミノ酸配列を用いることもできる。
これらのデータベースには、例えばインターネットを通じてアクセスすることができる。また、研究室内で独自に決定されたアミノ酸配列を持つポリペプチドであってもよい。更に、本発明は、シークエンスタグ法によるポリペプチドの同定をより効率よく、かつ、より正確に行う方法を提供する。すなわち、本発明は、ポリペプチドを同定する方法であって、（ａ）前記ポリペプチドをアミノ酸配列特異的に切断することによりペプチド断片を得る工程、（ｂ）工程（ａ）で得られるペプチド断片の質量分布を測定する工程、（ｃ）工程（ｂ）で測定される質量分布を基に、特定の質量を持つペプチド断片を選択する工程、（ｄ）工程（ｃ）で選択されるペプチド断片を外部エネルギーにより切断することによって、より短いペプチド断片を得る工程、（ｅ）工程（ｄ）で得られるペプチド断片の質量分布を測定する工程、（ｆ）公知のアミノ酸配列を持つ参照ポリペプチドを、工程（ａ）と同様にして、切断した場合に生じるペプチド断片を予測する工程、（ｇ）工程（ｆ）で予測されたペプチド断片中の全てのペプチド結合のうち、本発明のデータベースにおける結合エネルギーまたは解離エネルギーの値が 60 Kcal/mol 以下であるペプチド結合でのみ外部エネルギーによる切断が生じるとして、質量分布を算出する工程、（ｈ）工程（ｅ）で測定した質量分布を、工程（ｇ）で算出した質量分布と比較する工程、を含み、工程（ｅ）で測定した質量分布における各ピークに対応する第一のペプチド断片の質量が、工程（ｇ）で算出した質量分布における各ピークに対応する第二のペプチド断片の質量と同一である場合に、前記ポリペプチドが参照ポリペプチドであると判断される方法を提供する。本明細書において、「ポリペプチドをアミノ酸配列特異的に切断する」とは、ポリペプチドをアミノ酸配列特異的プロテアーゼ（トリプシンおよびトロンビンなど）、化学物質（臭化シアンおよびヒドロキシルアミンなど）、または、外部エネルギーにより、特定のアミノ酸配列を持つ部位で選択的に切断することを意味する。更に、本発明は、ポリペプチド中の所望のペプチド結合を外部エネルギーにより切断することによりペプチド断片を製造する方法であって、（ａ）前記ポリペプチド中の連続する二つのアミノ酸残基からなるジペプチドの各々について、ペプチド結合の結合エネルギーを算出する工程、（ｂ）前記外部エネルギーの値と工程（ａ）で算出された結合エネルギーの値とから、前記所望のペプチド結合が前記外部エネルギーにより切断される指向性を算出する工程、（ｃ）外部エネルギーの値を変化させて工程（ｂ）を繰り返す工程、（ｄ）前記所望のペプチド結合が切断される指向性が最も高くなるエネルギーの値を選択する工程、（ｅ）工程（ｄ）で選択された値の外部エネルギーを前記ポリペプチドに与える工程、を含む方法を提供する。
工程（ｃ）において、変化させる外部エネルギーの値の範囲は、例えば、下記のようにして決めることができる。外部エネルギーの下限の目安の値を E0 とすると、E0 は
【数３】
E0 = N D0 / (1.5 n kB)
で見積もることができる。ここで、N は、切れるペプチド結合の数、n は、ポリペプチドに含まれる原子数、kB はボルツマン定数を表す。アンジオテンシン II の場合、N = 7、n = 155 であることから、E0 = 2.7 Kcal/molが求まる。E0 程度の外部エネルギーではポリペプチドは切断されないと考えられるので、E0 を下限とすることができる。この計算より、アンジオテンシン II の場合、下限としては、好ましくは 2.7 Kcal/mol 以上を、上限としては 10 Kcal/mol 以下、好ましくは 6.0 Kcal/mol 以下を挙げることができる。また、本発明は、本発明の製造方法により製造されるペプチド断片を提供する。本明細書において引用した全ての特許、特許出願、先行文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
【実施例】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
〔実施例１〕  IRMPD による アンジオテンシン II の切断および生成したペプチドの質量分析 オクタペプチドであるヒト由来のアンジオテンシン II（配列番号：１; 以下、AG II）を IRMPD により切断し、生成したペプチドについて質量分析を行った。AG II のフラグメントイオンの正確な質量の決定には、北陸先端科学技術大学院大学の 7T ESI FTICR 質量分析装置（Bruker Daltonics; BioAPEX70e）を用いた。AG II（モノアイソトピック質量 Mmonoisotopic = 1046.564 Da）は、BACHEM 社から取得し、更なる精製をしないで使用した。40 nmol の AG II を HPLC グレードの50:50 メタノール／水 1 ml に溶かし、その後、一定分量を 4 pmol/μLまで希釈した。ESI への注入はシリンジポンプを使って行い、サンプル溶液は 1 μl/min の流速で分析装置内に導入した。ESI に引き続き、トラップされたイオンに対して、ビームの焦点を合わせないで CO2 赤外レーザー（Synrad; Series 48, 25W）を用いて、IRMPD を行った。波長は 10.6 μm であり、ビームの直径は 3.5 mm であった。AG II の断片化は、0 から 1000 ms までの照射時間で、0 から 6.5 W までの範囲のレーザーパワーを用いて調べた。FTICR MS の構成は、文献（Akashi, S. et al. (1998) Anal. Chem. 71, 4974-4980）に詳しく記載されている。図４は、IRMPD を行わないときの AG II の ESI-FTICR スペクトルを表す。理論的な重量は、各元素のモノアイソトピック質量（Monoisotopic Mass）を用いることによって計算した。親イオン [Mp + H]+ よりも大きいピークは Na および K の混入の存在に相当する。エレクトロスプレーにより生成した最も量の多いイオンは、[Mp + Na + H]2+ に相当する二重に荷電したペプチドイオン（m/z = 534.773 Da）である。フラグメントイオンを以下のように割り当てた。[Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe + H + Na]2+ (477.255 Da)、[Pro-Phe + Na]+ (301.140 Da) および [Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His]+ (784.432 Da)。これらは、Asp-Arg および His-Pro における親ペプチドの切断により生じうる。一連の IRMPD 研究として、本発明者らは、0 から 6.5 W までの範囲のレーザーパワーを用いて、0 から 1000 ms までの照射時間における断片化を調べた。図５は、レーザーパワーを 4.0 W に設定したときの全ての生成物イオンの存在量を、照射時間の関数として示す。この図において、最も特徴的なピークは、y7 型イオン [Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe + H]+ (m/z = 931.507 Da) として観察される。このイオンは、親ペプチドのアミノ酸配列が Asp と Arg との間で切断されることにより生じたペプチドに相当する。照射時間が増加すると生成物イオンが増加する。IRMPD は、より多くの生成物イオンが形成されうるという点で有利となりうる。また、IRMPD は、CID に比べ、親ペプチドおよび親タンパク質に関するより多くの構造情報を提供する。IRMPD を行ったときの AG II のより拡大した質量スペクトルを図６に示す。親ペプチドが Asp-Arg で切断されて生じた断片が y2 型イオン (m/z = 263.139 Da) および b6 型イオン (m/z = 784.432 Da) として、並びに、親ペプチドが His-Pro で切断されて生じた断片が y7 型イオン (m/z = 931.507 Da) として、明瞭に観察できる。親ペプチドが Asp-Arg で切断されて生じた b1 イオンの質量は、測定できる質量の下限の範囲外である。観察されたこれらのピークの存在量は、IRMPD を行わなかったときの存在量と比較して、増加した。他の興味深いピークは、m/z = 1028.530 および 1033.505 Da に観察される。これらは、それぞれ、親イオンから水が中性的に失われて生じたイオン [AG II - H2O + H]+ および親イオンから 13 Da が失われて生じたイオン（おそらく [AG II - CH + H]+）に相当する。これらのピークは、他のレーザーパワーの範囲でのスペクトルにおいても見られる。レーザーパワー = 0.5 および 1.7 W において照射時間の関数としてスペクトルを測定した実験においても、生成物イオンの存在量は、光子のエネルギーが増加したときに有意に増加した。
〔実施例２〕  ab initio 分子軌道計算によるジペプチドの結合エネルギーの計算 基底関数系 6-31G(d) および 6-31+G(d) を用いたハートリー・フォック法（HF）および密度汎関数理論（B3LYP）により見積もったポテンシャルの深さ、解離エネルギー、ゼロ点エネルギー（zero point energy; 以下、ZPE）を表１に要約した。この表においては、始状態と終状態との間のゼロ点振動の差を ZPE として与えた。なお、この計算には、産業技術総合研究所  先端情報計算センター（http://www.aist.go.jp/TACC/index_j.html）の日立 SR8000、IBM SP2 コンピューター、およびTACC Quantum Chemistry GRID/Gaussian Portal システムを用いた。これらの異なる理論的モデルについて、His-Pro のペプチド結合のエネルギーは他のペプチド結合のエネルギーより有意に低い。本発明者らは計算において、His-Pro+H のようなプロトン化したジペプチドを考慮しなかったが、異なるアミド結合間を分子内で転移することができる移動性のプロトンを量子力学的計算により考慮して、荷電したペプチドの解離メカニズムを本発明者らは調べはじめている（Paizs, B. & Suhai, S. (2001) Rapid Commun. Mass Spectrom. 15, 651-663）。
【表１】
0003829186.tif 000003
アンジオテンシン II におけるペプチド結合のポテンシャルの深さ、解離エネルギーおよびゼロ点エネルギー。単位は Kcal/mol。また、アンジオテンシンのアミノ酸配列に含まれるジペプチドだけではなく、タンパク質を構成する２０種類のアミノ酸から生成しうる４００個の組からなるジペプチドについても同様にして、ペプチド結合の解離エネルギーを算出した（表２および図７）。
【表２】
0003829186.tif 000004
解離エネルギー（HF/6-31G*）。各行のアミノ酸残基は N 末端側のアミノ酸残基を表し、各行のアミノ酸残基は C 末端側のアミノ酸残基を表す。単位は Kcal/mol。
〔実施例３〕  ペプチドの解離の分子動力学シミュレーション
本発明者らの MD シミュレーションは、クーロンおよびファン・デア・ワールス（van der Waals）非共有結合性相互作用のような経験的ポテンシャル関数を用いるので、実施例２でab initio 計算から見積もったポテンシャルの深さを直接、用いることはできない。例えば、荷電したジペプチド Asp-Arg のポテンシャルの深さは表１において最大である。この原因は、負電荷を持ったアスパラギン酸と、正電荷を持ったアルギニンとの間のクーロン相互作用である。側鎖の影響と解離ダイナミクス（dynamics）とを調べるために、本発明者らは全てのペプチド結合についてポテンシャルの深さを 90 Kcal/mol として扱った。解離の過程は、プログラム MolTrec（Misoo, K. et al. (2000) "Development of Molecular Dynamics Programs for Protein with a Parallelized Barnes-Hut Code", Proc. the Fourth International Conference on High-Performance Computing in Asia-Pacific Region (HPC-Asia 2000), pp.1103-1111.）によりハミルトンの方程式を積分することにより計算した。この計算には、産業技術総合研究所  生命情報科学研究センターの NEC EXPRESS5800 CLUSTER を用いた。AG II のシミュレーションにおいて、７つの可能な解離部位が存在する（図８）。解離は、７つのペプチド結合のうち、どれか一つの長さが 10 Åに達した瞬間として定義した。７つの解離部位における切断の、規格化した確率分布を、MD 解離シミュレーションを用いて、計算した。図８は、その結果を、系に与えたエネルギーごとに示す。図８（ａ）において、最も確率の高い生成物は y2 および b6 であり、このことは His-Pro 結合が解離することを示している。図中の各パネルは、系に対する異なる量のエネルギーがどのようにペプチド結合の切断に影響するかを示している。図８（ｄ）に示すように、より多くのエネルギーが利用可能であると、y7 型および b1 型生成物が生成される。この生成物は、Asp-Arg 結合の切断により生じたペプチドに相当する。ポテンシャルのパラメーターに対する切断感受性を調べるため、本発明者らは、ペプチド結合のポテンシャル井戸の深さを 70 および 80 Kcal/mol に設定したモデルについてもシミュレーションした。また、そのペプチド結合の関与する曲げ（bending）やねじれ（torsion）の減衰因子（diminishing factor）パラメーターであるαを変化させたモデルについてもシミュレーションした。その結果、ポテンシャル井戸の深さと減衰因子αとは、最終生成物であるペプチド断片の分布に対してほとんど影響を与えなかった。古典力学においては、エネルギーの流れが、量子力学的モデルにおけるよりも自由に、C-H の伸縮のような高周波モードへ出入りできることが知られている。そこで、本発明者らは、AG II の解離ダイナミクス（dynamics）において C-H の伸縮を固定して調べたが、ペプチド断片の分布にほとんど変化はみられなかった。
【発明の効果】
本発明により、ポリペプチドがエネルギーにより切断される部位を予測する方法が提供された。本発明の予測方法を用いることによって、例えば、レーザーによりポリペプチドを切断しようとするときに、実際に切断をする前に切断部位を予測することが可能になった。このことは、アミノ酸配列特異的プロテアーゼ（トリプシンおよびトロンビンなど）および化学物質（臭化シアンおよびヒドロキシルアミンなど）による切断と同様に、エネルギーによるポリペプチドの切断によっても、部位特異的なポリペプチドの切断が可能になったことを意味する。例えば、生理活性ペプチド等を前駆体の切断により製造する場合に、エネルギーによるポリペプチドの切断を利用することが可能となった。酵素によってポリペプチドを切断するときには、pH などの溶液条件について制約を受けることがある。また、時間とともに酵素の活性は落ちていくので、効率高く切断を行うには、酵素を補充する必要がある。一方、エネルギーによるポリペプチドの切断では、酵素による切断ほどには、溶液の条件について制約を受けない。また、酵素を補充する必要はない。このように、レーザーによる切断は、より容易かつより安価であるという利点を有する。また、本発明により、エネルギーによる切断で生成したペプチド断片の質量スペクトルにおいて、ピークを効率よく、かつ、正確に同定することが可能になった。最近、注目されはじめているプロテオミクスにおいては、生体において発現している多種多様なタンパク質に関するデータを系統的にかつ網羅的に解析する必要がある。このような解析において、質量分析は有用であるが、質量分析においては質量スペクトルにおけるピークを効率よく、かつ、正確に同定する必要がある。本発明はこのような同定を可能にする。
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110>
National Institute of Advanced Industrial Science and Technology
<120> Method for predicting sites at which a
polypeptide is cleaved
with energy
<130> A3-A0202
<140>
<141>
<160> 1
<170> PatentIn Ver. 2.1
<210> 1
<211> 8
<212> PRT
<213> Homo Sapiens
<400> 1
Asp Arg Val Tyr Ile His Pro Phe
1
5
【図面の簡単な説明】
【図１】ポリペプチドの断片化パターンを表す図である。
【図２】本発明の装置のシステム構成図である。
【図３】本発明の装置により実行される処理のフローの一例である。
【図４】IRMPD を行わないときのアンジオテンシン II の ESI-FTICR 質量スペクトルを表す図である。上図は 200 から 1300 Da までの範囲を、下図は 520 から 565 Da までの範囲を表す。計算で求めた質量をかっこ内に示す。
【図５】ESI-FTICR 質量スペクトルの CO2 レーザー照射時間依存性を表す図である。レーザーパワーを 4.0 W に設定した。
【図６】レーザーパワー = 4.0 W にて300 ミリ秒間の CO2 レーザー照射により IRMPD を行ったときのアンジオテンシン II の ESI-FTICR 質量スペクトルを表す図である。上図は 200 から 1200 Da までの範囲を、下図は 920 から 1040 Da までの範囲を表す。計算で求めた質量をかっこ内に示す。
【図７】タンパク質を構成する２０種類のアミノ酸から生成しうる４００個の組からなるジペプチドについて、ab initio 分子軌道計算により算出したペプチド結合の解離エネルギーを表す図である。
【図８】アンジオテンシン II の断片化の MD 解離シミュレーションから得られた、規格化した分布を、初めに系に与えたエネルギーごとに示す図である。図の下部において、解離しうるペプチド結合に番号を割り当てた。(a)、(b)、(c) および (d) において、初めに系に与えたエネルギーはそれぞれ、3.57、3.94、4.97 および 5.96 Kcal/mol である。
【符号の説明】
１  入力手段
２  出力手段
３  バス線
４  一時記憶手段
５  中央処理装置（CPU）
６  メインメモリ
【図１】
0003829186.tif 000005
【図２】
0003829186.tif 000006
【図３】
0003829186.tif 000007
【図４】
0003829186.tif 000008
【図５】
0003829186.tif 000009
【図６】
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【図７】
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【図８】
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