(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生き餌微生物アルテミアを殺菌剤で処理することにより、水産養殖において前記生き餌微生物アルテミアを添加した結果である細菌汚染を減少させるに当たり、
前記生き餌微生物アルテミアを５−クロロ−２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オンおよび２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オンの少なくとも一方を含有する殺菌剤イソチアゾリン誘導体で処理することを特徴とする水産養殖における細菌汚染減少方法。
【請求項２】
前記生き餌微生物アルテミアを増殖培地中で、該増殖培地中における細菌の増殖を減少させるのに有効な濃度の前記殺菌剤イソチアゾリン誘導体の存在下に養殖することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記生き餌微生物アルテミアを、前記殺菌剤イソチアゾリン誘導体が添加されている孵化培地中で、アルテミアの包嚢から発育させることを特徴とする請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記殺菌剤イソチアゾリン誘導体を前記アルテミアの包嚢に、前記孵化培地中において前記有効な濃度を達成する量で付着させることを特徴とする請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記有効な濃度は１〜７ｐｐｍであることを特徴とする請求項２〜４のいずれか一つの項に記載の方法。
【請求項６】
前記有効な濃度は１．５〜４ｐｐｍであることを特徴とする請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記有効な濃度は約２ｐｐｍであることを特徴とする請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記生き餌微生物アルテミアを、前記殺菌剤イソチアゾリン誘導体が富化培地中における細菌の増殖を減少させるのに有効な量で添加されている富化培地中において、さらに富化することを特徴とする請求項２〜７のいずれか一つの項に記載の方法。
【請求項９】
前記殺菌剤イソチアゾリン誘導体を、前記富化培地を製造するための富化用製品中に含有させることを特徴とする請求項８記載の方法。
【請求項１０】
殺菌剤で処理した水産養殖用生き餌微生物アルテミアの包嚢において、
前記アルテミアの包嚢が５−クロロ−２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オンおよび２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オンの少なくとも一方を含有する殺菌剤イソチアゾリン誘導体によって被覆されていることを特徴とする包嚢。
【請求項１１】
前記アルテミアの包嚢が、前記孵化培地中における細菌の増殖を減少させるのに有効なイソチアゾリン誘導体濃度を前記孵化培地中において達成するのに有効な量の前記イソチアゾリン誘導体によって被覆されていることを特徴とする請求項１０記載の包嚢。
【請求項１２】
水産養殖に用いる生き餌微生物アルテミア用の富化培地を製造するための富化用製品において、
前記富化用製品が、前記富化培地中における細菌の増殖を減少させるのに有効な量で、５−クロロ−２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オンおよび２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オンの少なくとも一方を含有する殺菌剤イソチアゾリン誘導体を含有していることを特徴とする富化用製品。
【発明の詳細な説明】
本発明は、生き餌微生物（live food organisms）を殺菌剤で処理することにより、水産養殖において前記生き餌微生物を添加した結果である細菌汚染を減少させる方法に関するものである。
実際に、水産養殖に用いる生き餌微生物として、特に早期の海に棲む幼態動物の飼養の際の生き餌として、例えばクルマムシ（rotifer）が使用され、その後にアルテミア・ノープリウス（Artemia nauplius）が使用されている。特に、これらのアルテミア・ノープリウスは、実際に、孵化プロセス中に大量に発生して湿潤重量基準で１０7個／ｇより多数に達することのある細菌によってひどく汚染される、ことが知られている。この細菌叢は主として魚／小エビの潜在的病原体であるビブリオ属細菌によって構成されているので、アルテミア・ノープリウスは、幼態動物を飼養する際に、特に幼態動物がストレスを受ける場合に、疾病／死亡を起こすことのある病原体細菌の潜在的キャリヤであると考えられる。
化学療法、特に抗生物質によってこれらの細菌の量を減少させようとするいくつかの研究が行われている。しかし、抗生物質の使用は細菌の耐性という危険性のために避ける必要がある。他方、他の広範囲の化学療法、例えば二酸化塩素による化学療法は、生き餌微生物自体に極めて有害であることが分った。
従って、本発明の目的は、生き餌微生物の増殖を妨害することなく、細菌汚染を有効に減少させることができる新規な方法を提供することにある。
本発明においては、前記生き餌微生物を殺菌剤イソチアゾリン誘導体で処理することを特徴とする細菌汚染減少方法によって、上述の目的を達成する。
本発明においては、殺菌剤イソチアゾリン誘導体を使用することにより、生き餌微生物に悪影響を及ぼすことなく、細菌、特にビブリオ属細菌の数を有意に減少させることができる、ことを見い出した。
本発明方法に使用するイソチアゾリン誘導体は、例えば、醸造所で導管などの殺菌に用いられる殺生物剤として、それ自体既知である。この種の殺菌剤イソチアゾリン誘導体に包含される化合物に関しては、ここに参考として記載するＧＢ−Ａ−１，２２４，６６１；ＵＳ−Ａ−３，５２３，１２１；ＵＳ−Ａ−３，７６１，４８８およびＵＳ−Ａ−４，１５０，０２６を参照されたい。
イソチアゾリン誘導体としては４−イソチアゾリン−３−オンの誘導体が好ましい。
さらに、本発明は、殺菌剤で処理した水産養殖用生き餌微生物の包嚢（cyst）に関するものである。本発明においては、前記包嚢、特にアルテミアの包嚢は殺菌剤イソチアゾリン誘導体で被覆されている。
また、本発明は、水産養殖に用いる生き餌微生物用の富化培地（enrichment medium）を製造するための富化用製品（enrichment product）に関するものである。本発明の富化用製品は、前記増殖培地中に、細菌の増殖を減少させるのに有効な量の殺菌剤イソチアゾリン誘導体を含有している、ことを特徴とする。
本発明の他の利点および詳細は、本発明の方法、包嚢および富化用製品についての若干の特定例に関する下記の記載から明らかである。
本発明方法は、水産養殖における細菌汚染を、生き餌微生物に付随する細菌の数を減少させることにより、抑制するものである。これらの生き餌微生物は例えばクルマムシおよびアルテミアであるが、他の生き餌微生物も考えられる。以下の説明では、特にアルテミアについて述べる。生き餌微生物は、種々の水産養殖、特に甲殻類、軟体動物類および魚の養殖に使用することができる。
本発明においては、生き餌微生物を殺菌剤イソチアゾリン誘導体で処理する。これらのイソチアゾリン誘導体はそれ自体既知である。本発明の特定の適用に関しては、生き餌微生物に付随する細菌に対する効果および生き餌微生物に対する可能性のある効果に基いて、選定する必要がある。
好ましい種類の殺菌剤イソチアゾリン誘導体は、４−イソチアゾリン−３−オン誘導体である。特に好ましいのは、５−クロロ−２−メチル−４−イソチアゾリン−２−オン、２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン、またはこれらの２種の化合物の組合せである。また、例えば、ＵＳ−Ａ−４，１５０，０２６に記載されている金属塩錯体であるイソチアゾリン誘導体を使用することができる。
水産養殖用の生き餌微生物として使用する場合には、アルテミアの包嚢（cyst）として市販されている。これらの包嚢を、孵化培地（hatching medium）、例えば、２８℃の海水中で約２４時間孵化させ、次いで富化培地中でビタミン類、脂肪酸などで富化するのが普通である。次いで、この富化されたアルテミア・ノープリウスを水産養殖用の生き餌微生物として使用することができる。
本発明の方法の好適例では、有効濃度のイソチアゾリン誘導体を増殖培地中、すなわち、孵化培地中、また富化培地を使用する場合には富化培地中に含有させて、これらの培地中における細菌の増殖を減少させる。実際に、細菌は、場合によってはフィブリオ属細菌のような病原体細菌を含めて、これらの培地中で良好に増殖することが、観察されている。
孵化培地中における細菌汚染を抑制するために、殺菌剤イソチアゾリン誘導体を孵化培地に直接添加することができる。
しかし、本発明の好適例においては、イソチアゾリン誘導体を、孵化培地中において所要の有効濃度になる量でアルテミアの包嚢に付着させる。この点に関し、上述のような殺菌操作に使用される包嚢は、孵化能力および抗菌活性に何ら悪影響を及ぼすことなく、数ヶ月間にわたって貯蔵することができる、ことが分った。
富化培地を使用する場合には、富化培地における細菌汚染を抑制するために、生き餌微生物を先ず完全に水洗するのが好ましい。本発明においては、さらに殺菌剤イソチアゾリン誘導体を富化培地中に、該富化培地における細菌の増殖を減少させるのに有効な量で添加する。
本発明の好適例においては、富化培地を製造するための富化用製品中に殺菌剤イソチアゾリン誘導体を含有させる。このような富化用製品は、例えば、ビタミン類および脂肪を含有し、特に濃厚エマルジョンの形態にすることができる。その例は、ベルギー国、アルテミア・システム社（Artemia Systems S.A.）から入手できる市販の富化用エマルジョン「スパーセルコ（商品名，SuperSelco）である。
両増殖培地中、すなわち孵化培地中および富化培地中に、イソチアゾリン誘導体を濃度が１〜７ｐｐｍに達するまで添加するのが好ましい。この濃度は１．５〜４ｐｐｍであるのが特に好ましく、濃度が約２ｐｐｍの場合に特に良好な結果が得られる。しかし、クルマムシの場合には、極めて低い濃度を使用することが必要になることがある。
下記の実施例は、本発明方法により、特に本発明の包嚢および富化用製品を使用することにより達成することができる、生き餌微生物の細菌汚染に対する効果を示す。
実施例
１０００ｇのアルテミアの包嚢（ＧＳＬ系統（ＧＳＬ−strain））を、エス．エー．ソプラ社（S.A. SOPURA N.V.）から入手でき、５−クロロ−２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン（１０．４％）と２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン（３．５％）との混合物を含有するパストセプト（Pastosept，商品名）７．５ｇで被覆した。水分５〜８％まで乾燥した後に、包嚢を真空包装し、４℃で貯蔵した。同じバッチの包嚢を対照試料とした。
種々の時間間隔で、すなわちそれぞれ２，４，８および１２週間後に、処理した包嚢および対照包嚢の両者を、標準条件で、すなわち２８℃の海水中で２４時間孵化させた。２ｇの包嚢を１リットルの海水に添加した。２４時間後にノープリウスを収穫し、孵化培地および洗浄したノープリウスの試料を、マリーン寒天（ＭＡ，Difco）においては全数を、ＴＣＢＳ（Oxoid）においてはビブリオ属細菌を測定するために採取した。また、孵化効率（１ｇ当りのノープリウスの数）を測定した。
富化中の抗菌活性を試験するために、殺菌した群および対照群の孵化したノープリウスを富化タンクに移し、市販の富化用エマルジョン・スーパーセルコ（SuperSelco，商品名）（ベルギー国，アルテミア・システム社）によって富化した。この処理されたセルコ（Selco）は３０ｇ／１のパストセプト（Pastosept，商品名）を含有し、これを2000倍に希釈して富化培地とした。２４時間後にノープリウスを洗浄し、細菌学的分析および脂質分析のために試料を採取した。
0003822236.tif 000002
殺菌処理を行ったアルテミアの包嚢は、対照ノープリウスと比較して汚染程度の極めて低いノープリウスに孵化した。２４時間後に対照ノープリウスは１０6〜１０7個／ｇまでの細菌を含有していたが、殺菌処理したノープリウスの場合には全細菌数は１０3〜１０4個／ｇの細菌まで減少した。ビブリオ属細菌の減少も極めて顕著であった（表１）。
また、この相違は孵化水において肉眼で明瞭に見ることができた。すなわち、孵化水は２４時間孵化後に細菌の増殖のためにある程度の濁りを生じたが、殺菌処理を行った場合には孵化水は完全に清浄であった。
時間の関数としての細菌数の変化を検討した場合に、４℃で３ケ月間貯蔵中に細菌数に大きな変化は生じないことが明らかになった。抗菌活性は、図１に見ることができるように、前記期間の経過後でもなお存在していた。図１は、細菌数の変化を、殺菌処理および４℃における貯蔵期間の関数として示す。対照と殺菌処理した包嚢との間には孵化効率に有意差が認められなかった。また、富化中に殺菌処理を行った場合にも、同様な細菌数の減少が観察された。２４時間富化後に、ノープリウスにおいて１／１００〜１／１０００への減小が達成された（表１）。この相違は富化水において一層顕著であった。この結果、タンク壁に粘泥を形成することなく、著しく「清浄な」富化が行われた。
脂質分析によって、高度に不飽和の脂肪酸を使用した場合の富化レベルは、殺菌処理したアルテミアおよび対照アルテミアの両者において同じである、ことが分かった。この例から、アルテミアの孵化中および富化中に殺菌処理を用いると、ノープリウスの細菌汚染（特にビブリオ属細菌による汚染）が有意に減少する、と結論することができる。これは、魚の潜在的病原体が生き餌を経由して移動する機会も減少した、ことを意味する。
このような殺菌処理を受けた包嚢は、孵化効率および抗菌活性に全く悪影響を生じることなく、数ヶ月間貯蔵することができた。幼態のシーバス（seabass）に餌を与える予備的実験において、殺菌されたアルテミアに餌を与えた効果を、生存率、発育状態およびストレス抵抗性を基準として評価した。悪影響は全く認められなかった。
本発明は上述の具体例に限定されるものではなく、本発明の範囲を逸脱することなく上述の具体例にいくつかの変更を加えることができるのは明らかである。
この点に関し、ある場合には、殺菌剤イソチアゾリン誘導体を富化培地のみに添加し、従ってアルテミアの包嚢を前記殺菌剤で被覆しないのが好ましいことがある。
【図１】
0003822236.tif 000003