(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
非霊長哺乳類のα（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子の一部に、α（１，２）フコシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物が挿入され、高等霊長哺乳類のＨ型抗原を発現するように形質転換されている、非霊長哺乳類の形質転換細胞。
【発明の詳細な説明】
〔技術分野〕
この発明は、外来遺伝子導入により、高等霊長類への移植に適した細胞、組織あるいは臓器等を有する非霊長哺乳類の形質転換動物及びその動物の作出方法に関し、特に、非霊長哺乳類の糖鎖抗原を高等霊長類に特有な形に転換し、その状態を遺伝的に安定化させた形質転換動物及びその作出方法に関するものである。
〔背景技術〕
今日、ヒトの欠損あるいは不完全な組織を、代替物を移植することにより補充する治療法が一般的な治療法の一つとなりつつある。ここで、例えば組織とは、腎臓や肝臓等の臓器から、皮膚、血管、細胞までも含まれ、かかる組織の代替物としては、人工臓器や人工血管に代表される人工材料、自己の組織、さらには同種あるいは異種の動物の組織や細胞までが含まれるものである。
しかし、人工臓器の多くは、いまのところ人工弁の他は移植された動物体内で臓器として充分に機能できるまでには至っておらず、また、人工血管においては、その内部に血栓が生じやすいという欠点があり、とりわけ、人工血管の直径が小さいほど、その傾向が大きいという問題がある。
また、自己の組織を代替物として用いるにあたっては、補充用として利用可能な器官や量に極めて限りがあるし、かかる組織を摘出し、さらに補充するための身体への負担を考慮すれば、実際には不可能なことも多い。
さらに、ヒトに近い高等霊長類から摘出した組織により補充するには、その飼育上の問題から需要に応じ切れないとともに、倫理的観点等からの問題があるため、困難なことが多い。
一方、家畜は、非霊長哺乳類であって、その飼育方法が確立しており、容易に入手でき、倫理的問題も少ないため、代替物の提供体、いわゆるドナーとして有望である。
しかしながら、その反面、かかる哺乳動物から摘出した組織は、ヒトにおいては激しい拒絶反応を引き起こすことが知られ、特に２４時間以内に発生する激しい拒絶反応（以下、超急性拒絶反応ともいう。）が問題となっている。
かかる超急性拒絶反応は、補充したドナー組織の血管をレシピエントの血管とを吻合して血液を灌流する際に、ドナーの組織内の血管内皮細胞で生じる。
この超急性拒絶反応は、ヒトが自然抗体を持つところの種との組み合わせにおいては、２種類あるヒトの補体系の活性化経路のうち、抗原抗体反応によって引き起こされる古典経路が主要な反応であると考えられている。この抗原抗体反応は、以下の原因によるものと考えられている。
まず、第１に、ブタなどの非霊長類哺乳動物の血管内皮細胞膜を含む脈管系細胞及び血球系細胞（以下、単に脈管・血球系細胞ともいう。）上の抗原性がヒト等の高等霊長類のそれと異なるからである。
すなわち、ブタなど非霊長哺乳類は、高等霊長類の持っていない彼ら特有の糖鎖抗原（以下、この抗原をＧ型抗原あるいはＧ型物質という。）をその脈管・血球系細胞膜表面に持っているからである。
第２に、ヒトはブタなどのＧ型抗原に対する自然抗体を生まれながらに持っているからである。
したがって、例えばブタをドナーとする場合に、ブタの血管の中にヒトの血液が流された際、ヒトの血液中の抗Ｇ自然抗体とブタの血管内皮細胞膜上のＧ型抗原との抗原抗体反応が引き起こされ、その結果形成された抗原抗体複合体が補体系を活性化し、ブタの血管内皮細胞が破壊され、補充したドナー組織の破壊につながり、超急性拒絶反応が生ずるのである。
かかる超急性拒絶反応を回避するために、非霊長哺乳類の組織を摘出してヒトに補充する際に、同時にヒト等のレシピエントにおける補体の活性を制限する物質を供給する技術も開示されているが（特表平５−５０３０７４号公報／ＷＯ９１／０５８５５）、そこに示されている補体制限因子を持ったブタの細胞とヒトの血流との関係は、基本的にはいわゆる異型輸血と同じ構造を持った関係となるため、超急性拒絶反応の発生を必ずしも防止できるものではなく、又、ヒトが動物の抗原に感作されるため、いわゆる血清病を誘発する可能性を併せもつという不都合がある。
また、ドナーにおいてＧ型抗原の発現に係わる遺伝子に対するアンチセンスＤＮＡを導入したり、この遺伝子の発現を完全に抑制したりしてドナー組織におけるＧ型抗原の発現を抑制しようとする考えもある（ＷＯ９４／２１７９９）。しかし、この方法だけでは、ドナー組織に、Ｇ型抗原の前駆物質が蓄積されることになる。この前駆物質は、また、いわゆるボンベイ型抗原であるため、依然としてヒトに存する自然抗体による超急性拒絶反応を生じる場合がある。
さらに、同種移植の場合は免疫抑制剤の利用は有効な場合が多いが、異種移植の場合は多剤併用してもなお、今日、超急性拒絶反応を免れていない。
ここで、脈管・血球系細胞におけるＡＢＨ型物質の異種間分布をみると、ＡＢＨ型物質が発現されるのは、本発明にいう、高等霊長類、すなわち、真猿亜目のうち、ヒトやチンパンジー、オランウータン、ヒヒ、日本猿などが属する狭鼻猿類だけであって、他の霊長類や非霊長類哺乳動物では消化管粘膜や嗅覚受容体細胞などでは発現されていることがあるが、脈管・血球系細胞には発現されていない。
一方、非霊長哺乳類が脈管・血球系細胞に有するＧ型物質は、ＡＢＨ型物質の前駆物質（Ｎ−アセチルラクトサミン）に対し、ガラクトースがα１−３構造で結合した物質である。
ＡＢＨ型物質とＧ型物質の合成経路について図１に示す。
図１から明らかなように、本発明にいうＨ型物質（Ｈ型抗原ともいう。）は前駆物質（Ｎ−アセチルラクトサミン）に対して、ＧＤＰ-L-フコース：β-D-ガラクトシド  ２-α-L-フコシルトランスフェラーゼ（以下、単にＦＴあるいはα（１，２）フコシルトランスフェラーゼという。）が作用して生成され、Ｇ型物質は、前述のＨ型物質と同じ前駆物質であるＮ−アセチルラクトサミンに対してＵＤＰガラクトース：β-D-ガラクトシル-1,4-Ｎ-アセチル-D-グルコサミニド  α-1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ（以下、単にＧＴあるいはα（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼという。）が作用して生成されるのである。このように、ヒト等とブタ等における脈管・血球系細胞における抗原型の差異は、前駆物質に作用する酵素の差異、換言すれば、ブタ等に酵素ＧＴが存在し、反対にヒト等に酵素ＧＴが存在せず酵素ＦＴが存在するという差異に基づくものである。このような各種組織におけるＡＢＨ型物質の存否、酵素の存否は、進化に基づくものであると考えられている。
しかしながら、かかる高等霊長類と非霊長類哺乳動物におけるそれぞれ特有の糖鎖抗原の分布と、超急性拒絶反応の主たる場である血管内皮細胞等におけるこれら糖鎖抗原の差異を積極的に利用して、超急性拒絶反応を緩和することについては、従来全く着目されていなかった。
〔発明の開示〕
そこで、本発明は、従来の異種間移植における問題を解決するべく、家畜として広く飼育され入手の容易なブタ等の非霊長類哺乳動物において、従来にない新しい手法により、移植時の超急性拒絶反応を緩和して、非霊長類哺乳動物の組織を高等霊長類への移植に適用することを目的とするものである。
上記目的を達成するため、本発明者は、ブタ等の非霊長類哺乳動物において、遺伝子工学的・発生工学的に、例えばＦＴ等の高等霊長類の糖転移酵素を発現させて、高等霊長類の抗原物質を積極的に生成せしめ、あるいは同時に、例えばＧＴ等の非霊長類哺乳動物の糖転移酵素の発現を抑制して、脈管・血球系細胞を抗原的に高等霊長類型に転換することにより、高等霊長類に非霊長類哺乳動物の組織を移植した際の超急性拒絶反応を緩和できることを見い出し、以下の発明を完成したのである。
なお、異種間移植の超急性拒絶反応を緩和させるために、ドナーにおいてヒト等の高等霊長類とおなじＨ型物質を発現させることは従来考えられていない。すなわち、従来は、自然抗体と抗原との結合後における補体活性化経路の抑制等に着目されていた。また、本発明は、ヒト等の高等霊長類における抗Ｇ自然抗体とＧ型抗原との結合自体を抑制する点で、従来の手法に対し、より本質的な解決手段といえる。
第１の発明は、高等霊長類のＦＴをコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物が導入され、Ｈ型抗原を発現するように形質転換されていることを特徴とする非霊長哺乳類の形質転換動物である。このＤＮＡ建築物が導入された動物では、ＦＴが発現され、このＦＴがＮ−アセチルラクトサミンに作用して、Ｈ型抗原を発現する。このため、非霊長哺乳類にＧＴ遺伝子があっても，ＦＴがＧＴの基質であるＮ−アセチルラクトサミンを消費すると、内在される非霊長哺乳類のＧＴとＮ−アセチルラクトサミンとの結合が抑制され、Ｇ型抗原の発現が抑制される。
これらの外来ＤＮＡは、ヘテロの状態で保持されていても、ホモの状態で保持されていてもかまわないが、ホモの状態で保持されることが好ましい態様である。
なお、本発明において、高等霊長類とは、霊長類の真猿亜目のうち、ヒトやチンパンジー、オランウータン、ヒヒ、日本猿などが属する狭鼻猿類をいう。また、非高等霊長類とは、霊長類の真猿亜目のうちの広鼻猿類及び原猿亜目をいう。また、非霊長哺乳類あるいは非霊長類哺乳動物とは、霊長類でない哺乳類をいう。
また、第２の発明は、高等霊長類のＦＴをコードするＤＮＡ配列を含む第１のＤＮＡ構築物と、非霊長哺乳類のＧＴ遺伝子に対してアンチセンスであるＤＮＡ配列を含む第２のＤＮＡ構築物とが導入され、高等霊長類のＨ型抗原を発現する一方、非霊長哺乳類のＧ型抗原の発現を低減するように形質転換されていることを特徴とする非霊長哺乳類の形質転換動物である。
第１のＤＮＡ構築物が導入されて形質転換されると、ＦＴが発現され，Ｈ型抗原が発現される。同時にＧ型抗原が低減される。また、第２のＤＮＡ構築物が導入されると、ＧＴの発現が抑制されて、Ｇ型抗原が低減される。
これらの外来ＤＮＡは、ヘテロの状態で保持されていても、ホモの状態で保持されていてもかまわないが、ホモの状態で保持されることが好ましい態様である。
また、第３の発明は、非霊長哺乳類のＧＴ遺伝子の一部に、ＦＴをコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物が相同組換えにより挿入され、非霊長哺乳類のＧ型抗原を発現することなく高等霊長類のＨ型抗原を発現するように形質転換されていることを特徴とする非霊長哺乳類の形質転換動物である。
この発明によると、このＤＮＡ構築物により非霊長哺乳類のＧＴ遺伝子に変異が導入されることになるため、ＧＴは発現されず、Ｇ型抗原は発現されない。一方、同時に、ＦＴが発現され，このＦＴにより、Ｈ型抗原が発現される。また，この発明によれば，非相同組換えにより生ずるとされる形質転換動物への悪影響もない。なお、ＧＴ遺伝子の一部において相同組換えを起こすＤＮＡ構築物は、ＧＴ遺伝子をコードするＤＮＡ配列と相同的な部分を有している。
これらの外来ＤＮＡは、ヘテロの状態で保持されていても、ホモの状態で保持されていてもよいが、ホモの状態で保持されていることが好ましい態様である。
また、第４の発明は、非霊長哺乳類のＧＴ遺伝子の一部に、ＦＴをコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物が相同組換えにより挿入され、非霊長哺乳類のＧ型抗原を発現することなく高等霊長類のＨ型抗原を発現するように形質転換された非霊長哺乳類の形質転換動物から得られた移植用材料である。この形質転換動物から得られた細胞自体、この細胞を構成要素とする組織、臓器、あるいはこれら以外のその他の材料は、幅広く高等霊長類への移植用材料に適用することができる。
なお、これらの発明における形質転換動物の好ましい態様は、前記非霊長類哺乳動物が、ブタであることである。形質転換された動物がブタであると、このブタによって高等霊長哺乳類への移植に適した材料を提供することができる。
さらに、第５の発明は、非霊長哺乳類のＧＴ遺伝子の一部に，ＦＴをコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物を相同組換えにより挿入し、非霊長哺乳類のＧ型抗原を発現することなく高等霊長類のＨ型抗原を発現するように形質転換した非霊長哺乳類の形質転換動物の作出方法である。
この方法によると、このＤＮＡ構築物が導入されて形質転換されると、ＧＴ遺伝子に変異が導入されて，ＧＴは発現されず，代わりにＦＴが発現され，Ｈ型抗原が発現される。
また，第６の発明は、非霊長哺乳類の組織を高等霊長類に移植する際の，高等霊長類の自然抗体と非霊長哺乳類の抗原とによる拒絶反応を回避する方法であって，
非霊長哺乳類のＧＴ遺伝子の一部に，ＦＴをコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物を相同組換えにより挿入して，非霊長哺乳類のＧ型抗原を発現することなく高等霊長類のＨ型抗原を発現するように形質転換した非霊長哺乳類を作出する工程と，
この工程により得られた前記非霊長哺乳類の組織を高等霊長類に移植する工程を含んだ方法である。
この発明によると，非霊長哺乳類の組織においては，Ｇ型抗原でなくＨ型抗原が発現されている。このため，この組織を高等霊長類に移植した際に，高等霊長類の有する抗Ｇ自然抗体により拒絶されない。
【図面の簡単な説明】
図１は、前駆物質（Ｎ−アセチルラクトサミン）からのＡＢＨ型物質とＧ型物質の合成経路を示す図である。
図２は、実施例１のＦＴ遺伝子を有するプラスミドｐＭＡＭ／ＦＴを構築操作する過程図である。
図３は、実施例１のＦＴ遺伝子導入用断片の模式図である。
図４は、実施例２のｐＲＥＰ８／ＡＳ／ＧＴを構築操作する過程図である。る。
図５は、実施例２のＡＳ／ＧＴ遺伝子導入用断片の模式図である。
図６は、実施例３のｐＲＥＰ９／ＧＴ３−４を構築操作する過程図である。
図７は、実施例３のｐＲＥＰ９／ＧＴ３−４／ＦＴ／△ＳｓｐＩ／△ＤｒａＩＩＩを構築操作する過程及び遺伝子断片ＧＴ３−４／ＦＴ／ｐｏｌｙＡの調製過程を図示したものである。
図８は、実施例３のｐＧＴ／ＦＴを構築操作する過程図である。
図９は、51Ｃｒリリースアッセイの結果を示すグラフ図である。
図１０は、ＧＴ遺伝子のエクソン２から３の部分からフラグメントＡを得る方法を示した図である。
図１１は、ＧＴ遺伝子のエクソン４から６の部分からフラグメントＢを得る方法を示した図である。
図１２は、ＦＴ遺伝子のエクソン１から２から得られたｃＤＮＡを含んだプラスミドＤを得る方法を示した図である。
図１３は、フラグメントＢとプラスミドＤからプラスミドＥを得る方法を示した図である。
図１４は、フラグメントＡとプラスミドＥからコンストラクトを得る方法を示した図である。
図１５は、ＧＴ遺伝子とコンストラクトが同所性組換えを起こした場合の差異遺伝子を示した図である。
図１６において、１６ＡはＦＴをサザーンブロッティング法によりＦＴ内配列を検出した図であり、１６ＢはＦＴ遺伝子の上流側の相同部分をＰＣＲにより検出した図であり、１６Ｃは、１６ＣはコンストラクトのＦＴの下流部分が相同組換えを起こしていることＰＣＲで確認したことを示す図であり、１６ＤはノザンブロッティングによりＦＴ遺伝子のｍＲＮＡを検出したことを示す図であり、１６ＥはＬ９２９細胞がＨ抗原を発現していないことをレクチンＵＥＡ１を用いたフローサイトメトリーを示した図であり、１６Ｆは、ＦＴ遺伝子が導入されたＬ９２９細胞のＨ抗原をレクチンＵＥＡ１で検出したことをフローサイトメトリーで検出した図である。
図１７において、１７Ａは、ＦＴ遺伝子をＰＣＲで検出した図であり、１７Ｂは、コンスラクトのＦＴの上流側の相同部分において相同的組換えが行われたことを示すＰＣＲの図であり、１７Ｃは、コンストラクトのＦＴの下流側の相同部分において相同的組換えが行われたことを示すＰＣＲの図であり、１７ＤはＦＴ遺伝子のｍＲＮＡを検出したＲＴ−ＰＣＲの図であり、１７ＥはＬ９２９細胞がＨ抗原を発現していないことをレクチンＵＥＡ１を用いて示したフローサイトメトリーの図であり、１７Ｆは、ＦＴ遺伝子が導入されたＬ９２９細胞のＨ抗原をレクチンＵＥＡ１で検出したことをフローサイトメトリーで示した図である。
〔発明を実施するための最良の形態〕
ＦＴを発現する形質転換動物
ブタ等の非霊長類哺乳動物の脈管・血球系細胞において、ヒトなど高等霊長類だけが持ち、ブタなどの非霊長類哺乳動物が持たない遺伝子あるいはその発現物質であるタンパク質を発現させるには、形質転換動物を作成することが必要になる。
ヒトとヒトとの移植における基本原則の一つとして血液型を合わせることが広く認められているが、いわゆる血液型すなわちＡＢＯ式の分類の基本物質はＨ型物質であって、それは脈管・血球系細胞においては、前述のように前駆物質（Ｎ−アセチルラクトサミン）に糖転移酵素ＦＴが作用して形成される。しかし、ブタなど非霊長類哺乳動物は、ＦＴでなくＧＴを持ち、それによりヒトとは異なった物質（Ｇ型物質）を形成している。
したがって、例えば、Ｈ型物質をその前駆物質から生成する糖転移酵素ＦＴをコードするＦＴ遺伝子を含む外来遺伝子断片をブタ等の受精卵に導入し、この遺伝子断片が染色体上に組み込まれた場合、各細胞でこのＦＴ遺伝子が転写翻訳され、酵素ＦＴが産生されてＨ型物質を発現させることが期待できる。
Ｈ型物質を発現した非霊長哺乳類動物は、組織・血液の抗原型が高等霊長類に近似され、これらの動物の組織等を高等霊長類に移植した際の超急性拒絶反応を緩和することができ、これらの動物の組織等は、高等霊長類への移植に適したものとなる。
さらに、Ｈ型物質の場合には、酵素ＦＴが前駆物質を消費すれば、それだけ、内在する酵素ＧＴと前駆物質との結合が阻害され、Ｇ型物質の生成が抑制されることも期待できる。なお、ＦＴ遺伝子はブタ染色体にくみこまれた後、安定して子孫に伝達されることが可能である。
さらに、本発明では、ブタ等の非霊長類哺乳動物に内在する糖転移酵素、例えば、Ｇ型物質をその前駆物質から生成する糖転移酵素ＧＴの遺伝子の発現を不活性化する目的で、ＧＴ遺伝子のアンチセンスＤＮＡを含む外来遺伝子断片をブタ受精卵に導入する。この遺伝子断片が、個体の染色体上に組み込まれた場合、各細胞でこのアンチセンスＤＮＡが転写されれば、その転写物は内在性のＧＴ転写産物と対合して、ＧＴ遺伝子の翻訳が抑制されることが期待される。
この結果、個体レベルでは、酵素ＦＴが積極的に発現されるとともに、酵素ＧＴの発現が抑制されて、Ｈ型物質が生成される一方、一層Ｇ型物質の生成が低減されたブタ等を得ることができる。なお、アンチセンスＤＮＡ等の外来遺伝子断片は、染色体に組み込まれた後、安定して子孫に伝達されることが可能である。
なお、一旦、染色体に外来遺伝子が組みこまれた後、交配により外来遺伝子に関してホモの状態にすることが可能であり、高等霊長類の糖転移酵素を発現させる外来遺伝子に関してホモの状態の系と、非霊長哺乳類の糖転移酵素に関してホモの状態の系とを交配させることにより、非霊長哺乳類の酵素を発現するかわりに、高等霊長類の糖転移酵素を発現して、高等霊長類の抗原型を呈した非霊長類哺乳動物の系を得ることができる。
高等霊長類の糖転移酵素
本発明では、高等霊長類として、特にヒトを対象することができる。
高等霊長類の糖転移酵素とは、高等霊長類において見いだされ、非霊長哺乳類の脈管・血球系細胞において見いだされない抗原の生成に関与する糖転移酵素をいう。具体例としては、ＦＴを挙げることができる。特に、ヒトＦＴは〔ＥＣ２．４．１．６９〕で特定される。
高等霊長類の糖転移酵素をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物
高等霊長類の糖転移酵素をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物は、該糖転移酵素の遺伝子のＤＮＡ配列の他、プロモータ、ターミネーター等を有することができる。ＳＶ４０の初期遺伝子のポリＡ付加シグナルに続くターミネーターは付加に適した配列の一つである。一般的にどの遺伝子からとったポリＡシグナルかによって遺伝子の発現のレベルはかなり左右されるが、ＳＶ４０初期遺伝子から取ったポリＡ付加遺伝子が優れている。このシグナルはターミネーターの前に置かれる。ＦＴを発現させることのできる外来遺伝子を形成するには、少なくともＦＴのＤＮＡ配列を知る必要がある。ヒトのＦＴについては、既に報告されている（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，87（1990）,pp6674-6678)。
非霊長哺乳類の糖転移酵素
非霊長哺乳類として、特に、前記高等霊長類に対して異種間移植の対象となる動物を対象とすることができる。さらに、家畜として飼育されるブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ等が好適である。これらの家畜は、飼育が容易で、安定した供給が可能なため、移植用組織の補充に適する。さらに、ブタが、臓器の大きさや、生理学的・生化学的な観点、発育が早い多産である点から好適である。
非霊長哺乳類の糖転移酵素とは、非霊長哺乳類の脈管・血球系細胞において見いだされ高等霊長類において見いだされない抗原の生成に関与する糖転移酵素をいう。具体例としては、ブタやマウスのＧＴを挙げることができる。特に、マウスＧＴは、〔ＥＣ  ２．４．１．１５１〕で特定される。
非霊長哺乳類の糖転移酵素を発現を抑制するＤＮＡ構築物
非霊長哺乳類の糖転移酵素の発現を抑制するＤＮＡ構築物には、該糖転移酵素をコードするＤＮＡ配列に対してアンチセンスであるＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物、あるいは、該糖転移酵素の遺伝子において相同組換えされて、該遺伝子を他の遺伝子で置換したり、該遺伝子に他の遺伝子を挿入したり、変異を導入することにより、該遺伝子を破壊するＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物を用いることができる。
このＤＮＡ構築物を形成するには、少なくとも非霊長哺乳類の糖転移酵素の遺伝子配列を知る必要がある。マウスＧＴ遺伝子は、既に報告されている（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，86（1989）,pp.8227-8231)。また、ブタＧＴ遺伝子も既に報告されている（Ｘｅｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  １９９４；１：pp.81-88）。
例えば、ＧＴのアンチセンスＤＮＡを外来遺伝子とする場合には、ＧＴ遺伝子のｃＤＮＡの一部又は全部をアンチセンス方向に組み込んだＤＮＡ断片をＤＮＡ構築物として形成する。
また、相同組み換えによる場合には、例えばＧＴ遺伝子との相同領域を可及的多く有するように形成するのが好ましい。
なお、非霊長哺乳類の糖転移酵素の発現を抑制するには、外来遺伝子の導入以外に従来公知の方法によることもできる。
相同組換え用ＤＮＡ構築物
また、ＤＮＡ構築物は、染色体における非相同組換えのみならず、相同組換えを目的として構築することもできる。この場合、例えば、ブタのＧＴ遺伝子をターゲットに、ヒトのＦＴ遺伝子を組み換えるようにすれば、ＧＴの発現の抑制と、ＦＴの発現が同時に可能である。
なお、以上説明したようなＤＮＡ構築物については、遺伝子断片が染色体に組み換えられた際に、高率に前記糖転移酵素が発現される手段を用いることができる。例えばｐＭＡＭをベクタープラスミドとして外来遺伝子断片を調製した場合には、ステロイドの投与により高発現が誘導されうる。
ＤＮＡ構築物の導入
非霊長類哺乳動物への外来遺伝子の導入は、レトロウイルスを用いる方法やマイクロインジェクションによる方法等多数あるが、どの方法も採用することができる。子孫を得るという点からは、生殖細胞を形質転換することが望ましい。この場合の形質転換は、非霊長類哺乳動物の胚細胞やＥＳ細胞あるいは、受精卵に対して行うのが望ましい。
形質転換動物
このように、外来遺伝子が導入された非霊長類哺乳動物は、種々の細胞における高等霊長類の糖転移酵素の発現により、あるいは同時に非霊長哺乳類の糖転移酵素の発現の抑制により、組織・血液の抗原型が高等霊長類に近似された動物となる。したがって、これらの動物の組織等を高等霊長類へ移植した際の超急性拒絶反応を緩和することができるようになり、これらの動物の組織等は、高等霊長類への移植に適したものとなる。また、特に、血管内皮細胞で発現された場合には、超急性拒絶反応が大きく緩和される。さらに、赤血球細胞における高等霊長類の糖転移酵素の発現により、血液の抗原型が高等霊長類に近似された動物となり、これらの動物の血液は高等霊長類の代替血液に適したものとなる。
また、高等霊長類の糖転移酵素ＦＴが導入された場合には、非霊長哺乳類の脈管・血球系細胞では、Ｈ型物質が発現されると同時にＧ型物質が低減されることになり、組織・血液の抗原型が高等霊長類に近似された動物となる。加えて、同時にＧＴの発現を抑制する外来遺伝子も導入された場合には、より一層Ｇ型物質が低減され、組織・血液の抗原型が極めて高等霊長類に近似された動物となり、これらの組織・血液は、高等霊長類への移植・代替物により適したものとなる。特に、ＦＴが血管内皮細胞表面に発現されれば、異種間臓器あるいは組織移植における超急性拒絶反応が大きく緩和される。また、赤血球において発現されれば、代替血液により適したものとなる。
また、相同組換えにより、ＧＴのかわりにＦＴが発現するように形質転換された形質転換動物においては、染色体上の１本以上のＧＴ遺伝子座のうち、一本が存在せず、同時にＦＴが少なくとも１本存在するようになるため、交配により染色体上にＧＴが１本も存在せず、その代わりにＦＴが２本存在する個体を得ることができる。こうした個体はドナーとして、レシピエントのＡＢＯ式の血液型のいかんをとわずに、ヒト等の移植に適した移植材料を提供する。
産業上の利用可能性
このように、かかる形質転換された非霊長類哺乳動物は、ヒト等の高等霊長類に移植の可能な組織・血液を有するため、ヒト等の組織等の代替物の提供源となる。また、これらの動物が安定して飼育されることにより、必要時に、必要な組織等を提供可能となり、移植組織等の貯蔵体となる。
また、非霊長類哺乳動物における高等霊長類特有のＦＴ遺伝子の発現により、異種間移植の場合に超急性拒絶反応を緩和できる動物や材料を提供する方法は、従来にない新規なものであるとともに、異種間移植における超急性拒絶反応の緩和のために、より本質的な解決をもたらすものである。
本発明の非霊長哺乳類の形質転換動物によれば、その組織・血液において、高等霊長類の糖鎖抗原が生成されるため、あるいは同時に非霊長哺乳類の糖鎖抗原の生成が抑制されるため、非霊長類哺乳動物の組織を異種間移植となる高等霊長類に移植した場合に超急性拒絶反応を緩和することができ、従来の人工血管や人工臓器、あるいは同種間で補充される臓器、組織等に代わり得る材料を提供することができる。
なお、本発明により非霊長類哺乳動物を形質転換することは、これらの動物にいかなる被害あるいは虐待を与えることがなく、また、本発明は、形質転換された非霊長類哺乳動物の生存、生殖等に悪影響を及ぼすものではない。さらに、本発明は、ヒトをはじめ他のいかなる動物に対しても悪影響を及ぼすものではない。
以下に本発明の実施例を示す。本発明に於ける外来遺伝子に関して、既に述べた２種類の糖転移酵素、即ちＧＴ遺伝子とＦＴ遺伝子のｃＤＮＡを例示できる。ただし、以下の実施例は、請求の範囲を制限するものではない。
（実施例１）
導入用遺伝子を含むプラスミド（ｐＭＡＭ／ＦＴ）の構築及びその遺伝子導入用断片の調製
（１）ＰＣＲ法によるＦＴ遺伝子断片の調製
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，87（1990）,pp6674-6678に報告されたヒトのＦＴ〔ＥＣ２．４．１．９６〕のＤＮＡ配列に基づいて、そのスタートコドンとストップコドンを含むような形でＰＣＲ用の２種類のプライマーを合成した。なお、その５’側のプライマーには、制限酵素NheIのサイトを付けた、また３’側のプライマーには、制限酵素XhoIのサイトを付けた。
一方、健康な成人の血液より白血球を採取し全ＲＮＡを抽出し、逆転写酵素を用いて、全ＲＮＡに対応するｃＤＮＡを合成した。このｃＤＮＡを鋳型にして、前記のプライマーを用いてＰＣＲを施行した。
本ＰＣＲ施行により得られたｃＤＮＡ断片を１％アガロースゲル電気泳動にかけたところ、約1100bpの長さのバンドを得た。このＰＣＲ産物をｐＧＥＭ−Ｔ（Promega社製）に挿入した上で自動塩基配列読み取り機で塩基配列を読み取ったところ、前記既報の通りのＦＴ遺伝子の塩基配列を有していた。そこでこのｃＤＮＡを０．８％Low Melting Point（以下、ＬＭＰという。）ゲルで電気泳動して精製した後、制限酵素NheIとXhoIで処理し、レジンを用いたPromega社のWizardＤＮＡ精製システム（以下、Wizardシステムという。）により精製・分離した。なお、以下各種ＤＮＡ断片の精製分離は、ＬＭＰゲル電気泳動とWizardシステムとを用いることにより行った。
（２）ｐＭＡＭ／ＦＴの構築
哺乳類発現ベクターの一種であるｐＭＡＭ（CLONETECH社製、Lee,F.（1981）Nature 294:228)のマルチクローニング部位（ＭＣＳ）を制限酵素NheIとXhoIで処理し、この断片をＬＭＰゲル電気泳動及びWizardシステムで精製・分離した。このベクターに精製・分離したＦＴ遺伝子のｃＤＮＡを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼにより挿入させた。このプラスミドＤＮＡによって、コンピテント状態のＪＭ１０９細菌細胞を形質転換させて、得られた形質転換をアンピシリンプレートで選択した。個々のコロニー毎にＬＢ培地（組成；Bacto-tryprone 10g（DIFCO社製）、Bacto-yeast extract 5g（DIFCO社製）、NaCl 10gを水にて1Lとする、以下同じ。）で増殖させ、ミニプラスミド調製を行った。抽出したプラスミドＤＮＡを種々の制限酵素を使って消化した後に電気泳動して、挿入断片のサイズ及び位置方向を調べた。その結果、正しい方向に組み込まれているプラスミドを、ｐＭＡＭ／ＦＴと称した（図２参照）。
（３）遺伝子導入用断片の調製
さらに、遺伝子導入のための直鎖状断片とするために、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＭＡＭ／ＦＴ株をＬＢ培地で大量培養した後に、プラスミド調製を行った。さらに、得られたプラスミドをＣｓＣｌ密度勾配遠心法により調製した。精製したプラスミド１０μｇを、制限酵素ＰｖｕＩとＢａｍＨＩで消化後、この断片を精製・分離し、ＦＴ遺伝子導入用断片とした。この断片の構築模式図を図３に示す。
（実施例２）
導入用遺伝子を含むプラスミド（ｐＲＥＰ８／ＡＳ／ＧＴ）の構築及びその導入用遺伝子断片の調製
（１）アンチセンスＧＴの調製
既報（Ｘｅｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  １９９４；１：pp８１−８８）に報告されたブタＧＴ遺伝子のＤＮＡ配列に基づいて、そのスタートコドンとストップコドンを含むような形で２種類のＰＣＲ用のプライマーを合成した。なお、その５’側のプライマーには、制限酵素XhoIのサイトを付けた、また３’側のプライマーには制限酵素NheIのサイトを付けた。
一方、健康なブタの血液より白血球を採取し、その全ＲＮＡを抽出し、逆転写酵素を用いて全ＲＮＡに対応するｃＤＮＡを合成した。このｃＤＮＡを鋳型にして、前記のプライマーを用いてＰＣＲを施行した。
本ＰＣＲ施行により得られたｃＤＮＡ断片を１％アガロースゲル電気泳動にかけたところ、約1100bpの長さのバンドを得た。このＰＣＲ産物をｐＧＥＭ−Ｔ（Promega社製）に挿入した上で、自動塩基配列読み取り機で塩基配列を読み取ったところ、前記既報の通りのＧＴ遺伝子の塩基配列を有していた。そこでこのｃＤＮＡをＬＭＰゲルで電気泳動して精製した後、制限酵素NheIとXhoIで処理し、Wizardシステムを用いて精製・分離した。
（２）ｐＲＥＰ８／ＡＳ／ＧＴの構築
哺乳類発現ベクターの一種であるｐＲＥＰ８（Invitorogen社製、George,R.,et al,Gene,81,285（1989））のＭＣＳを制限酵素XhoIとNheIで処理し、精製・分離した。このベクターに、Ｔ４ＤＮＡリガーゼにより、精製・分離したＧＴ遺伝子のｃＤＮＡを、挿入した。このプラスミドＤＮＡによって、コンピテント状態のＪＭ１０９細菌細胞を形質転換させて、得られた形質転換体をアンピシリンプレートで選択した。個々のコロニー毎にＬＢ培地で増殖させ、ミニプラスミド調製を行った。抽出したプラスミドＤＮＡを種々の制限酵素を使って消化した後に電気泳動して、挿入断片のサイズ及び位置方向を調べた。その結果、正しくアンチセンス方向に組み込まれているプラスミドを、ｐＲＥＰ８／ＡＳ／ＧＴと称した（図４参照）。
（３）導入用遺伝子断片の調製
さらに、遺伝子導入のための直鎖状断片とするために、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＲＥＰ８／ＡＳ／ＧＴ株をＬＢ培地で大量培養した後に、プラスミド調製を行った。さらに、得られたプラスミドをＣｓＣｌ密度勾配遠心法により精製した。精製したプラスミド１０μｇを、制限酵素ＸｂａＩとＰｓｔＩで消化後、この断片をＬＭＰゲル電気泳動及びWizardシステムで精製・分離し、ＡＳ／ＧＴ遺伝子導入用断片とした。この断片の構築模式図を図５に示す。
（実施例３）
相同組換え用遺伝子を含むプラスミド（ｐＲＥＰ９／ＧＴ／ＦＴ）の構築及び導入用遺伝子断片（ｐＧＴ／ＦＴ）の調製
以下、マウスの例を示すがブタにおいても基本的な考え方は同じである。
（１）ｐＲＥＰ９／ＧＴ３−４の構築
以下、ｐＲＥＰ９／ＧＴ３−４の構築を図６に基づいて説明する。
既報（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，86（1989）,pp.8227-8231）のマウスのＧＴ〔Ｅｃ２．４．１．１５１〕の配列に基づいてエキソン３から４までの部分をＰＣＲ法にて抽出するために、エキソン３内のセンスプライマーとして制限酵素ＫｐｎＩの切断部位をつけたプライマー（ｐ／Ａとする）、又アンチセンスプライマーとしてエキソン４内のスタートコドンの部位に制限酵素ＳｓｐＩの切断部位を含み、その下流に制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩの切断部位をつけたプライマー（ｐ／Ｂ）を合成した。
これらのプライマーｐ／Ａ及びｐ／Ｂを用いてＰＣＲ法を施行し、得られた断片を、制限酵素ＫｐｎＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで切断した後、精製・分離し、これをＧＴ３−４と称した。
一方、発現ベクターであるｐＲＥＰ９（Invitrogen社）を制限酵素ＢａｍＨＩで切断し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼによりその断端を平滑にし、Ｔ４ＤＮＡリガーゼによりself−ligationし、制限酵素ＢａｍＨＩの切断部位が欠失した発現ベクターを、ｐＲＥＰ９／△ＢａｍＨＩと称した。
これを更に制限酵素ＤｒａＩＩＩで切断し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼによりその断端を平滑にし、Ｔ４ＤＮＡリガーゼによりself−ligationし、制限酵素ＤｒａＩＩＩの切断部位が欠失した発現ベクターを、ｐＲＥＰ９／△ＢａｍＨＩ／△ＤｒａＩＩＩと称した。このベクターを制限酵素ＫｐｎＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで切断し、上記ＧＴ３−４を挿入したプラスミドをｐＲＥＰ９／ＧＴ３−４と称した。
（２）ｐＲＥＰ９／ＧＴ３−４／ＦＴ／△ＳｓｐＩ／△ＤｒａＩＩＩの構築
以下、ｐＲＥＰ９／ＧＴ３−４／ＦＴ／△ＳｓｐＩ／△ＤｒａＩＩＩの構築を図７に基づいて説明する。
ヒトＦＴ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，87（1990）,pp6674-6678）の配列に基づき、そのスタートコドンとストップコドンを含む発現部位をＰＣＲ法にて抽出するために、スタートコドンを含む５’側センスプライマー（ｐ／Ｃ）には制限酵素ＮｈｅＩとＤｒａＩＩＩ切断部位を、この順で付けた。
一方、ＦＴのストップコドンを含むアンチセンスプライマー（ｐ／Ｄ）にはその３’側に制限酵素ＸｈｏＩ切断部位を付けた。これらのプライマーを用いてＰＣＲ法を施行し、得られた断片を制限酵素ＮｈｅＩ及びＸｈｏＩで切断し、ｐＲＥＰ９／ＧＴ３−４を制限酵素ＮｈｅＩ及びＸｈｏＩで切断したプラスミドに挿入する。これをｐＲＥＰ９／ＧＴ３−４／ＦＴと称した。
このプラスミドｐＲＥＰ／ＧＴ３−４／ＦＴを制限酵素ＳｓｐＩ及びＤｒａＩＩＩで切断すると平滑末端が生成された。
ここでＴ４ＤＮＡリガーゼにて処理するとself−ligationにより両者末端が連結し、ＧＴの発現開始部位にＦＴｃＤＮＡの発現開始部位が位置された。
このプラスミドをｐＲＥＰ９／ＧＴ３−４／ＦＴ／△ＳｓｐＩ／△ＤｒａＩＩＩと称した。以上に於いてこれら制限酵素ＫｐｎＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＳｓｐＩ、ＮｈｅＩ、ＤｒａＩＩＩ、及びＸｈｏＩがいずれもエキソン３からエキソン４までの断片及びＦＴｃＤＮＡの発現部位の断片を切断しないことが既に確かめられている。
（３）導入用遺伝子断片ｐＧＴ／ＦＴの調製
以下、ｐＧＴ／ＦＴの調製について図７及び図８に基づいて説明する。
ｐＲＥＰ９のｐｏｌｙＡの３’側を含みかつ制限酵素ＢａｍＨＩ切断部位を含む形でアンチセンスプライマー（ｐ／Ｅ）を合成し、これとセンスプライマー（ｐ／Ａ）とを用いて、ｐＲＥＰ９／ＧＴ３−４／ＦＴ／△ＳｓｐＩ／△ＤｒａＩＩＩに対し、ＰＣＲ法を施行し、得られた断片を制限酵素ＫｐｎＩ及びＢａｍＨＩで切断して精製・分離し、得られた断片をＧＴ３−４／ＦＴ／ｐｏｌｙＡと称した（図７参照）。
一方、発現ベクターｐＲＥＰ９を制限酵素ＫｐｎＩとＢａｍＨＩで切断し、上記の断片ＧＴ３−４／ＦＴ／ｐｏｌｙＡを挿入した。これをｐＲＥＰ９／ＧＴ３−４／ＦＴ／ｐｏｌｙＡと称した。
ＧＴのエキソン４からエキソン６までの部分を、センスプライマー（ｐ／Ｆ）、アンチセンスプライマー（ｐ／Ｇ）とも制限酵素ＢａｍＨＩの切断部位を付け、ＰＣＲ法にて抽出し、この断片を制限酵素ＢａｍＨＩで切断し、得られた断片を、制限酵素ＢａｍＨＩで開列したプラスミドｐＲＥＰ９／ＧＴ３−４／ＦＴ／ｐｏｌｙＡに挿入した（ＢａｍＨＩが、ＧＴ３−４、ＦＴ、ｐｏｌｙＡ及び４−７を切断しないことは既に確かめられている）。
得られたプラスミドをｐＲＥＰ９／ＧＴ３−４／ＦＴ／ｐｏｌｙＡ／ＧＴ４−６、或いは簡単に、ｐＲＥＰ９／ＧＴ／ＦＴと称した。
このプラスミドに対し、プライマーｐ／Ａ及びｐ／Ｇを用いてＰＣＲ法を施行した。精製後得られた断片を受精卵への導入用断片とし、ＧＴ３−４／ＦＴ／ｐｏｌｙＡ／ＧＴ４−６、或いは簡単にｐＧＴ／ＦＴと称した。
このようにして作成した導入用遺伝子断片は、ＧＴの染色体の遺伝子と相同性が高く、相同組み換えを起こすことが期待される。相同組み換えを起こした場合は、ＧＴの代わりにＦＴが発現するのでその個体（Ｆｏ）はＧＴもＦＴも発現する。しかし交配を１、２世代行うと、メンデルの法則により、ＦＴのみを持った個体を得ることが出来る。この個体こそが、非霊長類哺乳動物に特有な抗原を持たずに高等霊長類特有の抗原を持つに至った、形質転換動物である。マウスのＧＴとブタのＧＴとではホモロジーが高いのでマウスのＧＴに基づいた相同組み換え遺伝子をブタに適用することができる。
（実施例４）
導入用遺伝子断片（ｐＭＡＭ／ＦＴ及びｐＲＥＰ８／ＡＳ／ＧＴ）のブタ受精卵への注入及びその受精卵の移植
（１）導入用遺伝子断片（ｐＭＡＭ／ＦＴ及びｐＲＥＰ８／ＧＴ）のブタ受精卵への注入
実験動物として家畜豚を用いた。受精卵提供用のブタとしてLandraceとWhite Yorkshireの交配豚で、生後約６ヶ月の、まだ自然発情を来す前の雌ブタを用いた。この雌ブタに排卵誘発剤ｐＭＳ（妊馬血清、シグマ社製、G4877）及びｈＣＧ（ヒト絨毛ゴナドトロピン、シグマ社製、CG5）を注射し、Duroc系の成熟雄ブタから採取した精液により人工受精を行い、卵管をＭ２培地で灌流することにより受精卵を採取した。これらの受精卵の前核は脂肪滴に覆われているために直視出来ないため、受精卵を10000gで１０分間遠心することにより、脂肪滴と前核を分離し、微分干渉顕微鏡で直視下においた。
受精卵への遺伝子の注入に於いては、マウス受精卵に於ける遺伝子導入の既報（Hogan, et al., In manipulating the Mouse Embryo., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1986、Pinkert, et al.,Transgenic animal,technology.,Academic press,Inc.1994）に記載されているマイクロインジェクション法を、ブタ受精卵に適用した。即ち、培養液中で受精卵を保持用ガラスピペットで固定後、微小ガラスピペットを用いて導入用遺伝子断片の溶液２ｐｌを雄性前核に注入した。
２種類の遺伝子導入用断片を含む溶液は、これらの導入用断片をＴＥ緩衝液（0.25mM EDTA、5mM Tris（pH7.4））に懸濁して、それぞれ1.0μｇ／ｍｌになるように調製したものを用いた。
（２）遺伝子注入をした受精卵の移植
注入操作後、CO2インキュベーター内にて、Ｍ２培地で２〜３時間培養後、受精卵を発情している雌成熟豚の卵管へ移植した。移植は、全身麻酔下にて開腹後、卵管内移植により行った。卵管移植後分娩満期まで飼育し、産仔を得た。
なお、遺伝子注入した受精卵は、速やかに移植されるのが好ましい。
（実施例５）
遺伝子導入ブタに於ける導入遺伝子の同定
分娩後約１週目に、得られた仔ブタの尾部の先端部分約１cmを切断採取した。
尾部の細胞より高分子ＤＮＡを抽出・精製した後、サザンブロッテイング法及びフイルターハイブリダイゼイション法によって、導入した遺伝子断片がブタの染色体に組み込まれているかを調べた。即ち、制限酵素EcoRIとBamHIで完全に消化させた10μｇの高分子ＤＮＡを１％アガロースゲル電気泳動した後、ナイロンフィルター（HybondN, Amersham）にＤＮＡを転写した。フイルターは風乾後、ＵＶ照射を行いＤＮＡを固定させて、フイルターハイブリダイゼーションに供した。なお、プローブとして、ｐＭＡＭ／ＦＴを制限酵素Cla IとNhe Iで完全に消化させた断片をＦＴ用に用いた。
これらの結果を下記表１に示した。計１９回の実験で５５０個の受精卵に遺伝子注入を行い、同数を１９頭のレシピエントに移植した。この結果７頭が妊娠し、２７頭の仔ブタを分娩した。これらのうち、サザンブロッテイング法及びフイルターハイブリダイゼイション法によって、ＦＴに関して１頭が陽性であった。なお、遺伝子導入していないコントロールブタ１５頭に対しても同様の検索を行ったが、いずれも陰性であった。
【表１】
0003809189.tif 000002
（実施例６）
導入遺伝子の発現の確認
遺伝子導入が確認されている仔ブタの尾部の先端を約１cm切断し、また血液を採取し、導入遺伝子発現の検出の試料とした。採取した尾部よりＡＧＰＣ法（Acid Guanidinium Thiocyanate-Phenol-Chloroform Method）を用いて、全ＲＮＡを分離した。次にこの全ＲＮＡを使ったＲＴ−ＰＣＲ法によって、ＦＴ遺伝子の発現の解析を行った。
即ち、全ＲＮＡから逆転写酵素によってｃＤＮＡを合成し、前述のＦＴ遺伝子抽出のために用いたプライマーを用いてＰＣＲ法を施行した。その結果、２７頭中１頭が陽性と判定された。すなわち、導入したＦＴ遺伝子がｍＲＮＡに翻訳され、ＦＴの酵素タンパク質を産生していることを確認した。なお、遺伝子導入していないコントロールブタ１５頭に対しても同様の検索を行ったが、いずれも陰性であった。
（実施例７）
実施例６で陽性と判定された、即ちＦＴの蛋白質を産生していると考えられる仔ブタから血液を採取し、遠心後、血球を分離し、蛍光抗体を使ったＦＩＴＣ法でブタ血球を染色した。一方、コントロールブタ（遺伝子導入していないブタ）からも血液を採取し、同様に染色した。
即ち、一次抗体として抗Ｈ型抗体を、２次抗体として蛍光色素がラベルしてあるマウスγグロブリン（F（ab）2）を用いた。この結果、実施例６の陽性の仔ブタは陽性と判定された。一方、コントロールブタのそれは全て陰性だった。即ち、導入されたＦＴがブタ細胞の中で正しく機能していることが確かめられた。
（実施例８）
ブタの腎由来の細胞系ＰＫ１５にｐＭＡＭ／ＦＴを感染させたコロニーを選択し、51Ｃｒを加えた培養液中にて、一定時間培養し、その後健康な成人ヒト血液（Ａ，Ｂ，Ｏ、ＡＢの４つの血液型を含む）から採取した血漿を加えることにより、51Ｃｒリリースアッセイを行った。
この結果、図９に示すように、２４時間経過の後、放出された51Ｃｒを測定した。その結果、コントロールブタの血液はほぼ１００％細胞が破壊されたのが観察されたが、ＦＴを導入したブタの細胞は２４時間経っても細胞破壊は１０％以下しか観測されなかった。
このように、ブタ細胞にＦＴを導入することによりいわゆる血液型が転換され、その結果ヒトのＯ型と同じＨ型物質が生成されることになり、ヒトが持つブタに対する自然抗体と抗原抗体反応を形成しないか、あるいは抗原抗体反応を形成しても低頻度であることが示された。
（実施例９）
相同組換え用遺伝子を含むプラスミド（pGT/FT-2）の構築及び導入用遺伝子断片（L-GT/FT）の調製
以下、マウスの例を示すがブタにおいても基本的な考え型は同じである。
（１）フラグメントA（fragment A）の構築
以下、フラグメントA（fragment A）の構築を図10に基づいて説明する。
既報（Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 86（1989）, pp.8227-8231）のマウスのGT[EC2.4.1.151]の配列に基づいてエキソン２からエキソン３までの部分をPCR法にて抽出するために、エキソン２の核酸配列に基づいてプライマーA（primer A）[配列番号３]を、又エキソン３の核酸配列に基づいてプライマーB（primer B）[配列番号４]を合成した。これらのプライマーとTaKaRa LA PCR Kit Ver.2（宝酒造；以下、単にLA PCRと略す）とを用いて、エキソン２からエキソン３までの部分のおよそ１０kbpを増幅した。得られた断片を精製分離した後これを鋳型にしてプライマーA（primer A）とプライマー（primer B′）[配列番号５]を用いて同社指定のマニュアルに従ってLA PCRを施行した（以下プラスミドへの組み込みに際しては各製造社指定の方法により行うものとする）。プライマーB′（primer B′）には制限酵素Sal Iの切断部位を含む。得られた断片を精製分離した後、これをプラスミド（pGEM-T; Promega社）に組み込み、これをプラスミドA（plasmid A）と称した。これを制限酵素Sph Iを含む種々の制限酵素で切断して、エキソン３の上流約4.8kbpの部位に制限酵素Sph Iの切断部位が１箇所存在することが判明した。そこでプラスミドAを制限酵素Sph Iと制限酵素Sal Iとで切断し、約4.8kbpの断片を得た。これを精製分離した後、T4 DNA polymerase（宝酒造）を用いて上記断片を平滑末端にした。これを断片A（fragment A）と称した。
（２）フラグメントB（fragment B）の構築
以下、フラグメントB（fragment B）の構築を図11に基づいて説明する。
既報（Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 86（1989）, pp.8227-8231）のマウスのGT[EC2.4.1.151]の配列に基づいてエキソン４からエキソン６までの部分をPCR法にて抽出するために、エキソン４の核酸配列に基づいてプライマーC（primer C）[配列番号６]を、又エキソン６の核酸配列に基づいてプライマーD（primer D）[配列番号７]を合成した。これらのプライマーとLA-PCRとを用いて、エキソン４からエキソン６までの部分およそ７kbpを増幅した。得られた断片を精製分離した後、
これをプラスミドpGEM-T（Promega社）に組み込み、これをプラスミドB（plasmid B）と称した。これを制限酵素Nco Iを含む種々の制限酵素で切断して、上記断片に制限酵素Nco Iの切断部位が一箇所存在することが判明した。又制限酵素Sac IIを含む種々の制限酵素で切断して、も上記断片に制限酵素Sac IIの切断部位が一箇所も存在せず、プラスミドB（plasmid B）に存在する制限酵素Sac IIの切断部位はプラスミドpGEM-T（Promega社）の５′側のクローニング部位のみであることが判明した。そこでプラスミドBを制限酵素Sac IIとNco Iとで切断し、約3.9kbpの断片を得た。これを精製分離した後、T4 DNA polymerase（宝酒造）を用いて上記断片を平滑末端にした。この断片に対し、ヌクレオチドのTで始まるSac IIリンカー（New Enland biolabs, Inc.）付加した。これを断片B（fragment B）と称した。
（２）プラスミドC（plasmid C）の構築
以下、プラスミドC（plasmid C）の構築を図１２に基づいて説明する。
既報（Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 87（1990）, pp.6674-6678）のヒトのFT[EC2.4.1.96]のDNA配列に基づいてエキソン１からエキソン２までの部分cDNAをRT-PCR法にて抽出するために、プライマーE（primer E）[配列番号８]とプライマーF（primer F）[配列番号９]を合成した。このcDNAの合成の方法については上記実施例１に記載した通りである。これらプライマーを用いて施行されたRT-PCR法により得られた断片（これを断片Cと称する）にはFTの発現のためのスタートコドンとストップコドンが含まれている。又スタートコドンの上流には制限酵素Sal Iの切断部位が存在している。
次に、この断片（fragment C）を、発現ベクターpCR3（Invitrogen社）に組み込み、これをプラスミドC（plasmid C）と称した。
（３）プラスミドD（plasmid D）の構築
以下、プラスミドD（plasmid D）の構築を図12に基づいて説明する。
上記発現ベクターpCR3の1113番のヌクレオチドの部位に、即ちpCR3のpoly Aの部位のすぐ下流に制限酵素Afl IIIが唯一存在し、又この制限酵素はFTを含む断片C（fragment C）を切断しないことが確かめられている。そこでプラスミドC（plasmid C）を制限酵素Afl IIIで切断した。これを前記T4 DNA polymerase（宝酒造）を用いて上記断片を平滑末端にした。次にこの断片に前記Sac IIリンカー（New Enland Biolabs, Inc.）を付加した。これを制限酵素Sac IIで切断した後、これを前記T4 DNA ligase（宝酒造）を用いてself-ligation処理した。この結果制限酵素Sac IIのすぐ下流に新たに制限酵素Afl IIIの切断部位が出現する。この断片をプラスミドD（plasmid D）と称した。
（４）プラスミドE（plasmid E）の構築
以下、プラスミドE（plasmid E）の構築を図13に基づいて説明する。
上記プラスミドD（plasmid D）を制限酵素Sac IIで処理し、これを脱リン化酵素（CIAP；宝酒造）で脱リン化処理した後、これに、制限酵素Sac IIで処理した断片B（fragment B）を前記T4 DNA ligase（宝酒造）を用いてligation処理した。これをプラスミドE（plasmid E）と称する。
（５）プラスミドF（plasmid F）の構築
以下、プラスミドF（plasmid F）の構築を図14に基づいて説明する。
前記プラスミドE（plasmid E）を制限酵素Sal Iで切断し平滑化処理した後、前記T4 DNA ligase（宝酒造）を用いて断片A（fragment A）とligation処理した。これをプラスミドF（plasmid F）と称した。
（６）コンストラクトの構築
以下、コンストラクトの構築を図14に基づいて説明する。
上記プラスミドF（plasmid F）を制限酵素Sal I及Afl IIIで切断した。これにより約10kbpの長さの断片を得た。これを前記のように分離精製し、濃度を5.0μg/μlに調整し、遺伝子導入用の遺伝子断片として、L-GT/FTと称した。
（７）コンストラクトの特徴
以下、このコンストラクトの特徴を述べる。
それはまず第一に、このコンストラクトは、GTの遺伝子の翻訳開始コードを含む配列部分を欠失する形で変異配列が挿入されていることである。第２に、この挿入された配列が、FTの遺伝子をコードする翻訳部分（翻訳開始コードおよび翻訳停止コードを含む）をすべて含んでいることである。第３に、前記挿入された配列が、FTの翻訳部分の３’側にターミネーターを含む点である。第４に、前記挿入された配列が、GTの遺伝子の翻訳開始コードの５’側の非翻訳部分と結合していることである。第５に、前記挿入された配列の部分の長さが、内在するGTの遺伝子の欠失する部分の長さとほぼ同じであること、言い替えればコンストラクトの配列の長さが、内在するGTの遺伝子の中の相同組み換えを起こす部分の長さとほぼ同じであることである。
これら特徴の結果、比較的、相同組み換えが起こりやすく、かつ相同組み換えが起きた場合、GTの遺伝子は翻訳開始コードを欠くためにGTが発現せず、かつFTの遺伝子が翻訳され発現することになる。
（実施例１０）
導入用遺伝子断片（L-GT／FT）のマウス細胞への導入
マウスの培養細胞L-９２９を直径３cmの培養皿内でおよそ２mlの血清培地（FCS加RPMI）の中でおよそ1.0x105個の細胞が認められるようになるまで培養し、この日を第１日目とすると、第２日目には無血清培地に替え、約３時間の後に次に述べる溶液を上記培養皿に添加した。即ち、A液として、7μlのDMEM溶液に前記遺伝子断片L-GT/FTを2μl、及び前記pMAMneo（1.0μg/μl）を1μl加えた混合液を用意した。B液として、5μlのDMEM溶液に、遺伝子導入用合成脂質であるリポフェクチン（Gibco社）5μlを加えた混合溶液を用意した。この混合溶液Aを混合溶液Bに加えた。室温にて約１５分培養し、DMEM溶液を30μlに加え、静かに混合した上で、上記マウスの培養細胞L-９２９が培養されている培養皿へ添加した。第３日目の朝には10％FBS加PRMI溶液を1.5ml加え、次の朝まで培養した。第４日目の朝には培養液をすべて2mlの10％FBS加PRMI溶液に置き換え、その後更に２日培養した。第６日目にはパサージュして直径１０cmの培養皿にすべての細胞を移し、皿に１日培養した。第７日目には、G418を最終濃度300μg/mlになるように調整した10％FBS加PRMI溶液１０mlで培養液を置き換えた加えた。この後さらに７日培養し、前記G418加10％FBS加PRMI溶液１０mlで培溶液を置き換えた。
（実施例１１）
遺伝子導入マウス細胞に於ける導入遺伝子の同定
こうした結果、培養皿の中に１８７個のコロニーを得た。
得られたコロニーをパサージュして更に増殖させてから細胞を抽出した。前記方法にてDNAを抽出できた細胞群が１５２個だった。これらのDNAを制限酵素Sph IとBgl IIで切断した。前記方法によりSouthern blottingを行った。probeとしてFTのcDNAを用いたSouthern blotting結果、１４２個の細胞群が陽性だった（図16A）。これらのうち、図15に示す様に本来存在しない外来遺伝子FTの配列の中から選んだプライマーG[配列番号１０]及H[配列番号１１]を用い前記の様にLA-PCRを施行した。即ち、同所性組み換え（homologous recombination）が起こっているときにだけプライマーAとプライマーGによるPCRにおいて約１０kbpの長さのバンド、及プライマーDとプライマーHによるPCRにおいて約７kbpの長さのバンドを得る。実際上記１４２個の細胞群のうち３個の細胞群においてこれらのLA-PCRのおいて陽性だった（図16Bおよび16C）。同所性組み換えが起こっている時以外ではこれらのバンドが検出されないことは明らかである（図16Bおよび16C
（実施例１２）
導入遺伝子の発現の確認
前記の遺伝子導入細胞を更に培養し、全RNAを抽出した。これを基に前記プライマーE及Fを用いてRT-PCRを施行した。この結果、前記３細胞群の内３細胞群に於いてRT-PCR上陽性であった（図16D）。また、蛍光標識がラベルされているレクチン（UEA-I; EY labolatories）を用いて、上記外来遺伝子細胞群および非導入細胞群を染色し、フローサイトメトリーにて前記H抗原の発現を確認した（図16EおよびF）。なお、図16EのL929/Neo/UEA-Iとは、ネオマイシン耐性遺伝子を導入したマウスL929細胞群を前記レクチンUEA-Iを用いてH抗原の発現の程度を測定したことを示す。同様に図16FのL929/FT/UEA-Iとは、前記外来遺伝子L-GT/FTを導入したマウスL929細胞群を前記レクチンUEA-Iを用いてH抗原の発現の程度を測定したことを示す。
これらの結果は明らかに外来導入遺伝子L-GT／FTがマウスの体細胞の中に同所性に組み換えられていること、かつ導入されたFTが発現していることを意味している。このことは、もしこの導入外来用遺伝子L-GT／FTが生殖細胞系列に導入されていれば、しかるべき継代を経て、外来遺伝子L-GT／FTに関してホモの状態になりうること、すなわちG抗原の代わりにH抗原を発現している個体の出現が期待できることを示している。
（実施例１３）
導入用遺伝子断片（pGT/FT）のマウス細胞への導入、その同定およびその発現の確認
導入用遺伝子断片（pGT/FT）のマウス細胞への導入については上記実施例１０に準じて行った。その同定についても上記実施例１１に準じて行った。
こうした結果、培養皿の中に３６１個のコロニーを得た。
得られたコロニーをパサージュして更に増殖させてから細胞を抽出した。前記方法にてDNAを抽出できた細胞群が２８５個だった。これらのDNAを鋳型にしてプライマー（P/C）および（p/D）を用いてPCRを施行した。その結果、１３７個の細胞群が陽性だった（図17A）。これらのうち、本来存在しない外来遺伝子FTの配列の中から選んだプライマーおよび内在するGTにかかわる部分から選んだプライマーを用いてPCRを施行した。
上記１３７個の細胞群のうち１個の細胞群において陽性のバンドを検出した（図17Bおよび17C）。
次にこの細胞群から全RNAを抽出し、RT-PCRを施行した。その結果、陽性のバンドを得た（図17D）。次に前記のレクチンを用いて前記の細胞のH抗原の発現についてフローサイトメトリーを用いて検定し、陽性の結果を得た（図17Eおよび図17F）。
なお、この発明は、その本質的特性から逸脱することなく数多くの形式のものとして具体化することができるから、これらの実施態様はもっぱら説明上のもので制約的なものではない。また、この発明の範囲は、請求の範囲以外の記載によるものでなく、請求の範囲によって限定するものであるから、請求の範囲の要件内のあらゆる変更、またはその要件に対する均等物は請求の範囲に包含されるものである。
配列表
（１）一般情報
（ｉ）出願人：小池  千裕
（ii）発明の名称：外来遺伝子の導入により高等霊長類の抗原型を発現した非霊長哺乳類の形質転換動物及びその作出方法
（iii）配列の数：１１
（iv）連絡先住所：
（Ａ）宛て名：小池  千裕
（Ｂ）通り：八竜町１−３０
（Ｃ）市：名古屋市
（Ｄ）州：愛知県
（Ｅ）国：日本
（Ｆ）郵便番号：４６２
（ｖ）コンピュータ読み取り可能形式
（Ａ）媒体方式：
（Ｂ）コンピュータ：
（Ｃ）動作システム：
（Ｄ）ソフトウェア：
（vi）現行適用データ
（Ａ）適用番号：
（Ｂ）ファイル日：
（Ｃ）分類：
（vii）事前適用データ
（Ａ）適用番号：
（Ｂ）ファイル日：
（Ｃ）分類：
（viii）アトニー／エージェント情報
（Ａ）氏名：
（Ｂ）登録番号：
（Ｃ）参照／事件番号：
（ix）通信手段情報
（Ａ）電話：０５２／９１２−７０６２
（Ｂ）ファクシミリ：０５２／９１２−７０６２
（Ｃ）テレックス：
（２）配列番号１（SEQ ID NO:1）に関する情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１１７４
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ  ｔｏ  ｍＲＮＡ
（Ａ）特徴：α（１，２）フコシルトランスフェラーゼ
（iii）ハイポセティカル：Ｎｏ
（iv）アンチセンス：Ｎｏ
（ｘ）刊行物情報：
（Ａ）著者：Larsen,R.D.
Ernest.L.K.
Nair,R.P.
Lowe,J.B.
（Ｂ）題名：Molecular cloning, sequence, and expression of a Human GDP-L-fucose:-D-galactoside 2-alfa-L-fucosyltransferase cDNA that can form the H blood group antigen.
（Ｃ）雑誌名：Proceedings of the National Academy of Science, USA
（Ｄ）巻数：87
（Ｆ）頁数：6674-6678
（Ｇ）日付：SEP-1990
（xi）配列の記載：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１：
0003809189.tif 000003
0003809189.tif 000004
0003809189.tif 000005
（３）配列番号２（SEQ ID NO:2）に関する情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１４２３
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：cDNA to mRNA
（Ａ）特徴：α（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼ
（iii）ハイポセティカル：Ｎｏ
（iv）アンチセンス：Ｎｏ
（ｘ）刊行物情報：
（Ａ）著者：Mauro S.Sandrin
Paul L.Dabkowski
Margaret M.Henning
Effie Mouhtouris
Ian F.C.Mckenzie
（Ｂ）題名：Characterization of cDNA clones for porcine alfa（1,3）galactosyl transferase :The enzyme generating the Gal alfa（1,3）Gal epitose
（Ｃ）雑誌名：XENOTRANSPLANTATION
（Ｄ）巻数：1994;1
（Ｆ）頁数：81-88
（xi）配列の記載：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２：
0003809189.tif 000006
0003809189.tif 000007
0003809189.tif 000008
（４）配列番号３（SEQ ID NO:3）に関する情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３８
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：その他の核酸
（iii）ハイポセティカル：Ｎｏ
（iv）アンチセンス：Ｎｏ
（vi）配列の記載：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３：
0003809189.tif 000009
（５）配列番号４（SEQ ID NO:4）に関する情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３３
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：その他の核酸
（iii）ハイポセティカル：Ｎｏ
（iv）アンチセンス：Ｎｏ
（vi）配列の記載：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４：
0003809189.tif 000010
（６）配列番号５（SEQ ID NO:5）に関する情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２７
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：その他の核酸
（iii）ハイポセティカル：Ｎｏ
（iv）アンチセンス：Ｎｏ
（vi）配列の記載：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５：
0003809189.tif 000011
（７）配列番号６（SEQ ID NO:6）に関する情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３０
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：その他の核酸
（iii）ハイポセティカル：Ｎｏ
（iv）アンチセンス：Ｎｏ
（vi）配列の記載：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６：
0003809189.tif 000012
（８）配列番号７（SEQ ID NO:7）に関する情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３４
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：その他の核酸
（iii）ハイポセティカル：Ｎｏ
（iv）アンチセンス：Ｎｏ
（vi）配列の記載：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７：
0003809189.tif 000013
（９）配列番号８（SEQ ID NO:8）に関する情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２６
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：その他の核酸
（iii）ハイポセティカル：Ｎｏ
（iv）アンチセンス：Ｎｏ
（vi）配列の記載：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８：
0003809189.tif 000014
（１０）配列番号９（SEQ ID NO:9）に関する情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３３
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：その他の核酸
（iii）ハイポセティカル：Ｎｏ
（iv）アンチセンス：Ｎｏ
（vi）配列の記載：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９：
0003809189.tif 000015
（１１）配列番号１０（SEQ ID NO:10）に関する情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２９
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：その他の核酸
（iii）ハイポセティカル：Ｎｏ
（iv）アンチセンス：Ｎｏ
（vi）配列の記載：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０：
0003809189.tif 000016
（１２）配列番号１１（SEQ ID NO:11）に関する情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３２
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：その他の核酸
（iii）ハイポセティカル：Ｎｏ
（iv）アンチセンス：Ｎｏ
（vi）配列の記載：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１：
0003809189.tif 000017
【図１】
0003809189.tif 000018
【図２】
0003809189.tif 000019
【図３】
0003809189.tif 000020
【図４】
0003809189.tif 000021
【図５】
0003809189.tif 000022
【図６】
0003809189.tif 000023
【図７】
0003809189.tif 000024
【図８】
0003809189.tif 000025
【図９】
0003809189.tif 000026
【図１０】
0003809189.tif 000027
【図１１】
0003809189.tif 000028
【図１２】
0003809189.tif 000029
【図１３】
0003809189.tif 000030
【図１４】
0003809189.tif 000031
【図１５】
0003809189.tif 000032
【図１６】
0003809189.tif 000033
【図１７】
0003809189.tif 000034