(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
比較的一定の温度で、試薬を連続的に加えることなく、特定核酸配列を増幅する方法であって、
（Ａ）（ｉ）第１のオリゴヌクレオチドプライマー、
（ii）ＲＮＡポリメラーゼ、
（iii）ＤＮＡポリメラーゼ、
（iv）一本鎖もしくは二本鎖のＲＮＡもしくはＤＮＡを加水分解することなくＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡを加水分解するリボヌクレアーゼ、ならびに
（ｖ）リボヌクレシド三リン酸およびデオキシリボヌクレオシド三リン酸
を有してなる試薬を含む単一の反応媒体を提供する段階；
（Ｂ）前記特定核酸配列に対して相補的な配列、前記ＲＮＡポリメラーゼによって認識されるプロモーターおよび開始部位のマイナスセンス配列、ならびに少なくとも前記開始部位の前記マイナスセンス配列に対して自己相補的である５’末端配列を有してなるＲＮＡ第１鋳型を有してなるＲＮＡを前記反応媒体中に提供する段階であって、
（ｉ）前記第１のオリゴヌクレオチドプライマーが前記ＲＮＡ第１鋳型にハイブリッド形成し、
（ii）前記ＤＮＡポリメラーゼが前記ＲＮＡ第１鋳型を用いて、前記第１のオリゴヌクレオチドプライマーを延長することでＤＮＡ第２鋳型を合成し、それによってＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを形成し、前記ＤＮＡ第２鋳型は前記プロモーターおよび前記開始部位のプラスセンス配列ならびに前記開始部位の前記プラスセンス配列に対して自己相補的である３’末端プライミング配列を有してなるものであり、
（iii）前記リボヌクレアーゼが前記ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを形成するＲＮＡを加水分解し、
（iv）前記ＤＮＡ第２鋳型の前記３’末端プライミング配列が前記開始部位の前記プラスセンス配列にハイブリッド形成し、
（ｖ）前記ＤＮＡポリメラーゼが前記ＤＮＡ第２鋳型を鋳型として用いて、前記ＤＮＡ第２鋳型の延長によって前記プロモーターを合成し、
（vi）前記ＲＮＡポリメラーゼがプロモーターの認識およびＤＮＡ第２鋳型の転写を行うことで、前記ＲＮＡ第１鋳型のコピーを提供する
サイクルが行われるような条件下で行われる前記段階；ならびにそれ以降、
（Ｃ）前記特定核酸配列の所望の増幅を行うのに十分な時間、前記条件を維持する段階
を有してなる方法。
【請求項２】
段階（Ｂ）がさらに、前記反応媒体に、ＤＮＡリガーゼ；前記特定核酸配列に対して相補的な３’末端プライミング配列、前記プロモーターおよび前記開始部位の前記マイナスセンス配列、前記開始部位の前記マイナスセンス配列に対して自己相補的である５’末端配列ならびに５’末端ホスフェート基を有してなる第２のオリゴヌクレオチドプライマーを加える段階と、前記反応媒体中に前記特定核酸配列を有してなる一本鎖ＲＮＡを提供する段階を有することで、
（ｉ）前記第２のオリゴヌクレオチドプライマーが前記一本鎖ＲＮＡにハイブリッド形成し、
（ii）前記ＤＮＡポリメラーゼが前記一本鎖ＲＮＡを鋳型として用いて、前記第２のオリゴヌクレオチドプライマーを延長することで相補的ＤＮＡを合成し、それによってＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを形成し、
（iii）前記リボヌクレアーゼが前記ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを形成するＲＮＡを加水分解し、
（iv）前記第１のオリゴヌクレオチドプライマーが前記相補的ＤＮＡに対してハイブリッド形成し、
（ｖ）前記ＤＮＡポリメラーゼが前記相補的ＤＮＡを鋳型として用いて、前記第１のオリゴヌクレオチドプライマーの延長によって前記第２のオリゴヌクレオチドプライマーを末端とするＤＮＡセグメントを合成し、
（vi）前記ＤＮＡリガーゼが、前記ＤＮＡセグメントと前記第２のオリゴヌクレオチドプライマーとを結合させ、それによってＤＮＡ第２鋳型を形成し、
（vii）前記ＲＮＡポリメラーゼが前記プロモーターの認識および前記ＤＮＡ第２鋳型の転写を行うことで、前記ＲＮＡ第１鋳型のコピーを提供する
ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
段階（Ａ）の前に、最初の反応媒体に、ＤＮＡリガーゼ；前記特定核酸配列に対して相補的な３’末端プライミング配列、前記プロモーターおよび前記開始部位の前記マイナスセンス配列、前記開始部位の前記マイナスセンス配列に対して自己相補的である５’末端配列ならびに５’末端ホスフェート基を有してなる第２のオリゴヌクレオチドプライマーを加え、前記最初の反応媒体中に前記特定核酸配列を有してなる一本鎖ＤＮＡを提供することで、
（ｉ）前記第２のオリゴヌクレオチドプライマーが前記一本鎖ＤＮＡにハイブリッド形成し、
（ii）前記ＤＮＡポリメラーゼが前記一本鎖ＤＮＡを鋳型として用いて、前記第２のオリゴヌクレオチドプライマーを延長することで相補的ＤＮＡを合成し、それによってＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを形成し、
（iii）前記ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドが変性し、
（iv）前記第１のオリゴヌクレオチドプライマーが前記相補的ＤＮＡに対してハイブリッド形成し、
（ｖ）前記ＤＮＡポリメラーゼが前記相補的ＤＮＡを鋳型として用いて、前記第１のオリゴヌクレオチドプライマーの延長によって前記第２のオリゴヌクレオチドプライマーを末端とするＤＮＡセグメントを合成し、
（vi）前記ＤＮＡリガーゼが、前記ＤＮＡセグメントと前記第２のオリゴヌクレオチドプライマーとを結合させ、それによってＤＮＡ第２鋳型を形成し、
（vii）前記ＲＮＡポリメラーゼが前記プロモーターの認識および前記ＤＮＡ第２鋳型の転写を行うことで、段階（Ａ）、段階（Ｂ）および段階（Ｃ）の前記反応媒体用の前記ＲＮＡ第１鋳型のコピーを提供するようにする
ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
段階（Ｂ）がさらに、前記一本鎖ＤＮＡを含む二本鎖ＤＮＡを加える段階を有してなる請求項３に記載の方法。
【請求項５】
段階（Ｂ）がさらに、前記反応媒体に、前記特定核酸配列に対して相補的な３’末端プライミング配列、前記プロモーターおよび前記開始部位の前記マイナスセンス配列、前記開始部位の前記マイナスセンス配列に対して自己相補的である５’末端配列、さらに５’末端オリゴリボヌクレオチドセグメントを有してなる第２のオリゴヌクレオチドプライマーを加える段階と、前記反応媒体中に前記特定核酸配列を有してなる一本鎖ＲＮＡを提供する段階を有することで、
（ｉ）前記第２のオリゴヌクレオチドプライマーが前記一本鎖ＲＮＡにハイブリッド形成し、
（ii）前記ＤＮＡポリメラーゼが前記一本鎖ＲＮＡを鋳型として用いて、前記第２のオリゴヌクレオチドプライマーを延長することで相補的ＤＮＡを合成し、それによってＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを形成し、
（iii）前記リボヌクレアーゼが前記ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを形成するＲＮＡを加水分解し、
（iv）前記第１のオリゴヌクレオチドプライマーが前記相補的ＤＮＡに対してハイブリッド形成し、
（ｖ）前記ＤＮＡポリメラーゼが前記相補的ＤＮＡを鋳型として用いて、ＤＮＡ鎖を合成し、
（vi）前記リボヌクレアーゼが、前記相補的ＤＮＡ内の前記第２プライマーのＲＮＡを加水分解し、
（vii）前記ＤＮＡ鎖の３’末端が前記ＤＮＡ鎖の相補的配列にハイブリッド形成することで、３’−ステムループ構造を形成し、
（viii）前記ＤＮＡポリメラーゼが前記ＤＮＡ鎖の前記３’末端を延長して、前記プロモーターを提供し、
（ix）前記ＲＮＡポリメラーゼが前記プロモーターの認識および前記ＤＮＡ第２鋳型の転写を行うことで、前記ＲＮＡ第１鋳型のコピーを提供する
ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
段階（Ｂ）がさらに、前記反応媒体に、ＤＮＡリガーゼ、ならびに前記特定核酸配列に対して相補的な配列、前記プロモーターと前記開始部位のマイナスセンス配列、前記開始部位の前記マイナスセンス配列に対して自己相補的である５’末端配列および５’末端ホスフェート基を有してなる一本鎖ＤＮＡを加える段階を有することで、
（ｉ）前記第１のオリゴヌクレオチドプライマーが前記一本鎖ＤＮＡにハイブリッド形成し、
（ii）前記ＤＮＡポリメラーゼが前記一本鎖ＤＮＡを鋳型として用いて、前記第１のオリゴヌクレオチドプライマーを延長することで前記５’末端配列を末端とするＤＮＡセグメントを合成し、
（iii）前記ＤＮＡリガーゼが前記ＤＮＡセグメントと前記一本鎖ＤＮＡを結合させることで、ＤＮＡ第２鋳型を形成し、
（iv）前記ＲＮＡポリメラーゼが前記プロモーターの認識および前記ＤＮＡ第２鋳型の転写を行うことで、前記ＲＮＡ第１鋳型のコピーを提供する
ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項７】
段階（Ｂ）がさらに、前記反応媒体に、前記一本鎖ＤＮＡを有してなるＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを加える段階を有することで、前記リボヌクレアーゼが前記ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを形成するＲＮＡを加水分解することを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
比較的一定の温度で、試薬を連続的に加えることなく、特定核酸配列を増幅する方法であって、
（Ａ）（ｉ）ＲＮＡポリメラーゼ、
（ii）ＤＮＡポリメラーゼ、
（iii）一本鎖もしくは二本鎖のＲＮＡもしくはＤＮＡを加水分解することなくＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡを加水分解するリボヌクレアーゼ、ならびに
（iv）リボヌクレシド三リン酸およびデオキシリボヌクレオシド三リン酸
を有してなる試薬を含む単一の反応媒体を提供する段階；
（Ｂ）前記特定核酸配列に対して相補的な配列、前記ＲＮＡポリメラーゼによって認識されるプロモーターおよび開始部位のマイナスセンス配列、少なくとも前記プロモーターおよび開始部位のマイナスセンス配列に対して自己相補的である５’末端配列ならびにＲＮＡ第１鋳型の相補的配列にハイブリッド形成することでＲＮＡ：ＲＮＡステムループを形成する３’末端プライミング配列を有してなるＲＮＡ第１鋳型を有してなるＲＮＡを前記反応媒体に提供する段階であって、
（ｉ）前記ＤＮＡポリメラーゼが前記ＲＮＡ第１鋳型を用いて、前記３’末端プライミング配列を延長することでＤＮＡ第２鋳型を合成し、それによってＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを形成し、前記ＤＮＡ第２鋳型は前記プロモーターおよび前記開始部位のプラスセンス配列ならびに前記開始部位の前記プラスセンス配列に対して自己相補的である３’末端プライミング配列を有してなるものであり、
（ii）前記リボヌクレアーゼが前記ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡを加水分解するが、前記ＲＮＡ−ＲＮＡステムループのＲＮＡは加水分解せず、
（iii）前記ＤＮＡ第２鋳型の前記３’末端プライミング配列が前記開始部位の前記プラスセンス配列にハイブリッド形成し、
（iv）前記ＤＮＡポリメラーゼが前記ＤＮＡ第２鋳型を鋳型として用いて、前記ＤＮＡ第２鋳型の延長によって前記プロモーターを合成し、
（ｖ）前記ＲＮＡポリメラーゼがプロモーターの認識およびＤＮＡ第２鋳型の転写を行うことで、前記ＲＮＡ第１鋳型のコピーを提供する
サイクルが行われるような条件下で行われる前記段階；ならびにそれ以降、
（Ｃ）前記特定核酸配列の所望の増幅を行うのに十分な時間、前記条件を維持する段階
を有してなる前記方法。
【請求項９】
段階（Ｂ）が、５’自己相補的配列を有してなる第１のオリゴヌクレオチドプライマーを提供する段階を含む請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
段階（Ｂ）がさらに、前記反応媒体に、ＤＮＡリガーゼ；５’相補的配列を有してなる第１のオリゴヌクレオチドプライマー；前記特定核酸配列に対して相補的な３’末端プライミング配列、前記プロモーターおよび前記開始部位の前記マイナスセンス配列、前記開始部位の前記マイナスセンス配列に対して自己相補的である５’末端配列ならびに５’末端ホスフェート基を有してなる第２のオリゴヌクレオチドプライマーを加える段階と、前記反応媒体中に前記特定核酸配列を有してなる一本鎖ＲＮＡを提供する段階を有することで、
（ｉ）前記第２のオリゴヌクレオチドプライマーが前記一本鎖ＲＮＡにハイブリッド形成し、
（ii）前記ＤＮＡポリメラーゼが前記一本鎖ＲＮＡを鋳型として用いて、前記第２のオリゴヌクレオチドプライマーを延長することで相補的ＤＮＡを合成し、それによってＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを形成し、
（iii）前記リボヌクレアーゼが前記ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを形成するＲＮＡを加水分解し、
（iv）前記第１のオリゴヌクレオチドプライマーが前記相補的ＤＮＡに対してハイブリッド形成し、
（ｖ）前記ＤＮＡポリメラーゼが前記相補的ＤＮＡを鋳型として用いて、前記第１のオリゴヌクレオチドプライマーの延長によって前記第２のオリゴヌクレオチドプライマーを末端とするＤＮＡセグメントを合成し、
（vi）前記ＤＮＡリガーゼが、前記ＤＮＡセグメントと前記第２のオリゴヌクレオチドプライマーとを結合させ、それによってＤＮＡ第２鋳型を形成し、
（vii）前記ＲＮＡポリメラーゼが前記プロモーターの認識および前記ＤＮＡ第２鋳型の転写を行うことで、前記ＲＮＡ第１鋳型のコピーを提供する
ことを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
段階（Ａ）の前に、最初の反応媒体中に、ＤＮＡリガーゼ；５’相補的配列を有してなる第１のオリゴヌクレオチドプライマー；前記特定核酸配列に対して相補的な３’末端プライミング配列、前記プロモーターおよび前記開始部位の前記マイナスセンス配列、前記開始部位の前記マイナスセンス配列に対して自己相補的である５’末端配列ならびに５’末端ホスフェート基を有してなる第２のオリゴヌクレオチドプライマーを加え、前記最初の反応媒体中に前記特定核酸配列を有してなる一本鎖ＤＮＡを提供することで、
（ｉ）前記第２のオリゴヌクレオチドプライマーが前記一本鎖ＤＮＡにハイブリッド形成し、
（ii）前記ＤＮＡポリメラーゼが前記一本鎖ＤＮＡを鋳型として用いて、前記第２のオリゴヌクレオチドプライマーを延長することで相補的ＤＮＡを合成し、それによってＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを形成し、
（iii）前記ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドが変性し、
（iv）前記第１のオリゴヌクレオチドプライマーが前記相補的ＤＮＡに対してハイブリッド形成し、
（ｖ）前記ＤＮＡポリメラーゼが前記相補的ＤＮＡを鋳型として用いて、前記第１のオリゴヌクレオチドプライマーの延長によって前記第２のオリゴヌクレオチドプライマーを末端とするＤＮＡセグメントを合成し、
（vi）前記ＤＮＡリガーゼが、前記ＤＮＡセグメントと前記第２のオリゴヌクレオチドプライマーとを結合させ、それによってＤＮＡ第２鋳型を形成し、
（vii）前記ＲＮＡポリメラーゼが前記プロモーターの認識および前記ＤＮＡ第２鋳型の転写を行うことで、段階（Ａ）、段階（Ｂ）および段階（Ｃ）の前記反応媒体用の前記ＲＮＡ第１鋳型のコピーを提供するようにする
ことを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
段階（Ｂ）がさらに、前記反応媒体に、５’相補的配列を有してなる第１のオリゴヌクレオチドプライマー；前記特定核酸配列に対して相補的な３’末端プライミング配列、前記プロモーターおよび前記開始部位の前記マイナスセンス配列、前記開始部位の前記マイナスセンス配列に対して自己相補的である５’末端配列、さらに５’末端オリゴリボヌクレオチドセグメントを有してなる第２のオリゴヌクレオチドプライマーを加える段階と、前記反応媒体中に前記特定核酸配列を有してなる一本鎖ＲＮＡを提供する段階を有することで、
（ｉ）前記第２のオリゴヌクレオチドプライマーが前記一本鎖ＲＮＡにハイブリッド形成し、
（ii）前記ＤＮＡポリメラーゼが前記一本鎖ＲＮＡを鋳型として用いて、前記第２のオリゴヌクレオチドプライマーを延長することで相補的ＤＮＡを合成し、それによってＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを形成し、
（iii）前記リボヌクレアーゼが前記ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを形成するＲＮＡを加水分解し、
（iv）前記第１のオリゴヌクレオチドプライマーが前記相補的ＤＮＡに対してハイブリッド形成し、
（ｖ）前記ＤＮＡポリメラーゼが前記相補的ＤＮＡを鋳型として用いて、ＤＮＡ鎖を合成し、
（vi）前記リボヌクレアーゼが、前記相補的ＤＮＡ内の前記第２プライマーのＲＮＡを加水分解し、
（vii）前記ＤＮＡ鎖の３’末端が前記ＤＮＡの相補的配列にハイブリッド形成することで、３’−ステムループ構造を形成し、
（viii）前記ＤＮＡポリメラーゼが前記ＤＮＡ鎖の前記３’末端を延長して、前記プロモーターを提供し、
（ix）前記ＲＮＡポリメラーゼが前記プロモーターの認識および前記ＤＮＡ第２鋳型の転写を行うことで、前記ＲＮＡ第１鋳型のコピーを提供する
ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＲＮＡポリメラーゼがバクテリオファージＴ７  ＲＮＡポリメラーゼであり、前記開始部位の前記マイナスセンス配列と前記プロモーターの前記マイナスセンス配列が一緒になって
0003745774.tif 000017
に対して相補的なヌクレオチド配列を有してなる請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
段階（Ｂ）がさらに、サンプルがそれによって前記特定核酸配列を有するＲＮＡ第１鋳型を有してなるＲＮＡを提供する場合に、前記サイクルが起こるような条件下で、前記反応媒体にサンプルを加える段階を有してなり、
さらには段階（Ｃ）後に、前記試薬のいずれかの消費または前記サイクルのいずれかの生成物の蓄積について、前記反応媒体をモニタリングする段階（Ｄ）を有してなる
ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記リボヌクレアーゼが仔ウシ胸腺リボヌクレアーゼＨを含む請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＲＮＡポリメラーゼがバクテリオファージＲＮＡポリメラーゼである請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＲＮＡポリメラーゼが、バクテリオファージＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ、バクテリオファージＴ３ポリメラーゼ、バクテリオファージφＩＩポリメラーゼ、サルモネラバクテリオファージｓｐ６ポリメラーゼ、シュードモナスバクテリオファージｇｈ−１ポリメラーゼからなる群から選択されるポリメラーゼである請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＤＮＡポリメラーゼが、レトロウィルス逆転写酵素である請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記レトロウィルス逆転写酵素が、トリ骨髄性白血病ウィルスポリメラーゼ、モロニーマウス白血病ウィルスポリメラーゼからなる群から選択されるものである請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＤＮＡポリメラーゼがエキソヌクレアーゼ活性を持たない請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記反応媒体中の全てのＤＮＡポリメラーゼが、エキソヌクレアーゼ活性およびＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性を持たない請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＤＮＡポリメラーゼが、トリ骨髄性白血病ウィルスポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼもしくはＤＮＡポリメラーゼβ、仔ウシ胸腺ＤＮＡポリメラーゼからなる群から選択されるものである請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
段階（Ｃ）が、３０分間〜４時間の期間、前記条件を維持する段階を有してなる請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記サイクルのＤＮＡ生成物をクローニングベクターに連結する段階および次に前記ＤＮＡ生成物をクローニングする段階をさらに有してなる請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
発現系で前記サイクルの前記ＤＮＡ生成物によってコードされた生成物を発現する段階をさらに有してなる請求項２４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
発明の属する技術分野
本発明は、鋳型内部に別の配列に対して相補的な末端配列を有する鋳型を用いることで、特定核酸配列またはそれの相補体のコピー数を増幅する方法に関する。
発明の背景
サンプル中に核酸が存在するということが、そのサンプルの採取源は疾患、障害または異常な身体状態を有することを示す場合がある。ある種の診断法は、サンプル中に核酸が存在するか否かを測定するものである。これらの診断法はコピー数の問題があることから、必ず核酸の増幅を必要とする。例えばウィルスまたは細胞の場合、特定遺伝子の一つのコピーが存在するのが普通である。遺伝子の特定核酸の増幅を行われなければ、核酸の存在を検出することは困難な場合が多い。
一つの方途は、in vitroの増幅法を用いて、サンプル中に存在する他の配列に優先して、特定配列のコピー数を増加させるものである。「ポリメラーゼ連鎖反応」（ＰＣＲ）は、特定配列を有するＤＮＡ部分のコピー数を選択的に増加させるためのそのような方法の一つである（Mullis, K. et al., Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.52: 263-273(1986), Mullis, K., et al.、米国特許４６８３２０２号）。通常ＰＣＲには、標的ＤＮＡ配列を含むと予想されるサンプルをオリゴヌクレオチドプライマーによって処理して、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによってプライマー延長生成物を合成する段階が関与する。プライマー延長生成物ＤＮＡ鎖は、好ましい実施態様では、熱変性を用いて鋳型鎖から分離される。次に、元の鋳型とプライマー延長生成物の両方が、次およびその後の延長サイクルで鋳型としての役割を果たして、各サイクル終了後にはサンプル中の標的ＤＮＡ配列数はほぼ倍化する。結果的に、複数のサイクルを行うことで、標的核酸配列がほぼ指数関数的に増幅される。ＰＣＲ法の至適な実施においては、温度の急速な変化を行うことができるサーモサイクラー（thermocycler）ならびにＤＮＡ鎖を分離する上で必要な９０℃を超える温度に対する繰り返し曝露によって生じる変性に対して耐性のTaqポリメラーゼ（Saiki et al., Science 239: 487-491(1988)およびSaiki, R. et al.、米国特許４６８３１９５号）などのＤＮＡポリメラーゼを使用する必要がある。
Ｔ７ＲＴ法と称される別のin vitroでの増幅方法（Burg et al.、米国特許５４３７９９０号）は、ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）に加えてＲＮＡポリメラーゼを用いて、増幅サイクル当たりの生成物収量を増加させるものである。その方法には、２個のプライマーの使用が関与し、そのうちの１個は一連のプライマーハイブリッド形成、プライマー延長および生成物変性の段階によってＲＮＡ生成物からの二本鎖ＤＮＡ中間体合成のためのプロモーターを含むものである。その二本鎖ＤＮＡ中間体は、二本鎖ＤＮＡ中間体の追加コピー合成に使用することができるＲＮＡの複数コピーの合成のためのプライマーのうちの１個から誘導されるプロモーターを含むものである。複数のサイクルによって、指数関数的増幅が得られる。増幅サイクル当たりの生成物の収量は、ＰＣＲの収量より少なくとも１桁高いことから、全体的に同レベルの増幅を行うのに必要なサイクルが少なくて済む。Ｔ７ＲＴ法の主要な欠点は、ＲＮＡ生成物からｃＤＮＡ中間体を分離するのに必要であるが、その方法で使用される両方の熱不安定酵素を不活化する固有の熱変性段階である。その結果、各サイクルで熱変性段階後に反応混合物に新鮮な酵素を加えなければならない。
米国特許５４０９８１８号（Cangene Corporation）には、ＮＡＳＢＡ（商標）として知られる別の増幅方法が記載されており、その方法には、２個のプライマーの使用が関与し、そのうちの１個はプロモーターを有し、ＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡおよびＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）およびＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡ鎖を特異的に分解するリボヌクレアーゼ活性（例えば、ＲＮａｓｅ  Ｈまたは逆転写酵素の固有のＲＮａｓｅ  Ｈ活性）という４つの酵素活性を有するものである。その循環プロセスは、全体的に比較的一定の温度で、試薬を連続的に加えることなく行われ、第１のプライマーがＲＮＡ生成物にハイブリッド形成し、逆転写酵素がＲＮＡ生成物を鋳型として用いて第１プライマーの延長によってＤＮＡ生成物を合成し、ＲＮａｓｅ  Ｈが得られたＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡを分解し、第２プライマーとプロモーターとがＤＮＡ生成物にハイブリッド形成し、逆転写酵素が第２プライマーを鋳型として用いてＤＮＡ生成物の延長によって二本鎖プロモーターを合成し、ＲＮＡポリメラーゼがプロモーターとＤＮＡ生成物を用いて同じＲＮＡ生成物の複数のコピーを転写する。
米国特許５１３０２３８号（Cangene Corporation）には、強化ＮＡＳＢＡ（商標）として知られる強化核酸増幅法が記載されている。その方法は、米国特許出願０７／２１１３８４号に記載のものと類似しており、反応混合物にアルキル化スルホキシド（例：ジメチルスルホキシド）およびＢＳＡを加えることで強化されるものである。
ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＣＡ９５／００４２３号には、ＮＡＳＢＡ（商標）のさらなる改良が記載されている。ＤＮＡから増幅サイクルに入る際の熱変性を克服するため、この増幅方法では、ＲＮＡポリメラーゼ、具体的には大腸菌ＲＮＡポリメラーゼを用いて、増幅サイクルに入る際に関与する加熱段階を行わずに済ませる。
これらの増幅方法があるにも拘わらず、増幅方法改良が望まれている。増幅方法において、使用者が行うべき段階および操作が少なければ、好ましいと考えられる。
省略する上で有効であると考えられる一つの段階は、誘導ＤＮＡに対してプロモーター配列を加えてその後の転写を行わせるものである。例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ鋳型からのＤＮＡの合成には、３’−ＯＨ基を有するＤＮＡまたはＲＮＡプライマーが必要であることが知られている。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いるＲＮＡの通常の合成にはＲＮＡが転写される鋳型のすぐ上流に二本鎖ＤＮＡプロモーターが必要である。そのような転写ＲＮＡは、プロモーター配列を持たないと考えられる。そこで、誘導ＤＮＡにそのようなプロモーター配列を加えて、その後の転写ができるようにする必要があろう。ＮＡＳＢＡ（商標）および強化ＮＡＳＢＡ（商標）増幅反応では、これらの基本的要件は、２個のプライマーを提供することで満足され、そのうちの第１のプライマーはＲＮＡ生成物にハイブリッド形成し、第２のプライマーは、Ｔ７プロモーターのプラスセンス配列を有し、ＤＮＡ生成物にハイブリッド形成する。第１プライマーは、鋳型としてＲＮＡ生成物を用いて延長されてＤＮＡ生成物を形成し、そのＤＮＡ生成物はＲＮＡ生成物の転写の鋳型として働く。ＤＮＡ生成物は、第２プライマーを鋳型として用いて延長されて、ＲＮＡ生成物の転写のための二本鎖プロモーターを形成する。
本発明は、ＲＮＡポリメラーゼによって認識されるプロモーターのマイナスセンス配列に隣接する５’末端に逆反復配列を有するＲＮＡを用いることで増幅サイクルにおいて必要なプライマーの数を低減することによって、ＮＡＳＢＡ（商標）および強化ＮＡＳＢＡ（商標）増幅反応を改善するものである。このＲＮＡのｃＤＮＡコピーは、プロモーターのプラスセンス配列に隣接する３’末端に逆反復配列を有する。ＲＮＡ鎖を除去する際、ｃＤＮＡは自己プライミングを行って、ステム−ループの頂点方向に配向した二本鎖プロモーターを含む部分的二本鎖ＤＮＡステム−ループ構造を形成することができる。このＤＮＡの転写により、プロモーターのマイナスセンス配列に隣接する５’末端に逆の反復配列を有する同じＲＮＡの複数コピーが得られる。そこで、転写のＲＮＡ生成物は、ＲＮＡポリメラーゼによって認識されるプロモーター配列のマイナスセンスをコードし、結果的にこのＲＮＡのＤＮＡコピーは転写のための鋳型として十分な機能性を持ち、プロモーターを有するプライマーを加える必要がない。
他の研究者らが、核酸増幅方法において転写を行うことができる逆反復すなわち「ヘアピン」を有するプライマーの使用を報告している（Dattagupta, N., EP 0427073A2およびEP 0427074A2；いずれも１９９１年５月１５日公開）。しかしながら、これらのヘアピンプライマーはプロモーター自体の配列を生成物中に組み入れずに、標的配列の転写を行うことを目的とするプラスセンスのプロモーターをコードするものである。そこで、これらの特許に記載の方法は、ＮＡＳＢＡ（商標）および強化ＮＡＳＢＡ（商標）の転写段階を単に模倣したものである。さらにこれらの方法は、使用者による操作または機械的介入を必要とする方法の場合を除き、循環、すなわち生成物からの鋳型の形成を提供するものではなく、従って増幅の範囲が限られている。
リボヌクレアーゼＨの使用を組み入れて、循環を起こすことができるようにした以外は本質的に同じ方法が、ＷＯ９１／１８１５５号（Berniger, M., et al.、１９９１年１１月２８日公開）に記載されている。しかし、この図式で得られる転写生成物はプロモーター配列を持たないことから、循環を行うには、２個のプライマーの存在が必要であり、第１のプライマーがプロモーターのプラスセンス鎖とマイナスセンス鎖の両方をコードしなければならないという欠点がある。それとは対照的に、ＮＡＳＢＡ（商標）および強化ＮＡＳＢＡ（商標）における第１のプライマーは、プラスセンス鎖をコードするのみであり、ＮＡＳＢＡ（商標）方法は、マイナス鎖を供給するＤＮＡ合成を提供するものである。
そこで、（１）誘導ＤＮＡにプロモーター配列を加えてその後の転写を可能とする段階を省略し、（２）その方法に関与する段階の数を低減し、（３）使用者の介入および操作を減らす増幅方法が望まれている。
発明の概要
本発明は、比較的一定の温度で、試薬を連続的に加えることなく、特定核酸配列を増幅する方法である。この方法は、段階（Ａ）〜（Ｃ）を有してなり、それらの段階によって、増幅が容易になり、使用者による介入および操作の必要性が低下する。
段階（Ａ）では、ＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、一本鎖もしくは二本鎖のＲＮＡもしくはＤＮＡを加水分解することなくＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡを加水分解するリボヌクレアーゼ、ならびにリボヌクレシド三リン酸およびデオキシリボヌクレオシド三リン酸を有してなる試薬を含む単一の反応媒体が提供される。本発明による方法で使用することができる酵素の中には、２以上の酵素活性を持つものもある。例えば、酵素である逆転写酵素は、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性とＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有している。例えばリボヌクレアーゼのように、ＲＮａｓｅ  Ｈを用いることができるが、逆転写酵素の固有のリボヌクレアーゼ活性を代わりに用いることができる。従って、例えば、ＤＮＡポリメラーゼおよびリボヌクレアーゼについて言及する場合は必ず（あたかもそれが２つの異なる酵素であるかのように）、両方の活性を有するただ一つの酵素の利用も含まれるものであることは注意すべき点である。
段階（Ｂ）では、反応媒体にＲＮＡ第１鋳型が提供される。ＲＮＡ第１鋳型は、特定核酸配列に対して相補的な配列、ＲＮＡポリメラーゼによって認識されるプロモーターおよび開始部位のためのマイナスセンス配列、ならびに開始部位のマイナスセンス配列に対して相補的である５’末端配列を有してなるものである。ＲＮＡ第１鋳型を用いて、プロモーターおよび開始部位のプラスセンス配列ならびに開始部位のプラスセンス配列に対して相補的である３’末端プライミング配列を有してなるＤＮＡ第２鋳型を合成する。そうして、ＤＮＡ第２鋳型は、逆反復配列を有し、その配列は、自己プライミングのための３’末端ステム−ループ構造中に折り畳むことができると考えられる。ＤＮＡ第２鋳型は変換されて、ステム−ループ構造の頂点方向に配向した二本鎖プロモーターを含む形となる。二本鎖プロモーターを有するＤＮＡ第２鋳型の形を用いて、元のＲＮＡ第１鋳型のコピーを合成する。
その後、循環（サイクル）が起こり、ＤＮＡポリメラーゼがＲＮＡ第１鋳型を用いてＤＮＡ第２鋳型を合成し、リボヌクレアーゼがＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡを加水分解し、３’末端プライミング配列が前記開始部位の前記プラスセンス配列にハイブリッド形成し、ＤＮＡポリメラーゼがＤＮＡ第２鋳型を用いて二本鎖プロモーターを合成し、ＲＮＡポリメラーゼがプロモーターの認識およびＤＮＡ第２鋳型の転写を行い、それによってＲＮＡ第１鋳型のコピーが得られる。
段階（Ｃ）では、特定核酸配列の所望の増幅を行うに十分な時間、反応のための条件を維持する。
本発明の第１の実施態様においては、反応媒体およびサイクルはさらに、ＲＮＡ第１鋳型にハイブリッド形成し、ＤＮＡポリメラーゼを用いて延長してＤＮＡ第２鋳型を合成する第１のオリゴヌクレオチドプライマーを有してなるものである（図１Ａ）。本実施態様の１態様においては、第１のオリゴヌクレオチドプライマーはさらに、５’自己相補的配列を有してなることで、ＲＮＡポリメラーゼが第１のオリゴヌクレオチドプライマーの５’自己相補配列を用いて３’自己相補配列を有するＲＮＡ第１鋳型を転写する（図１Ｂ）。
そのサイクルを図１Ａおよび図１Ｂに示してある。図１Ａのサイクルの準備段階となる段階（図２、図３および図４）も用いて、図１Ｂのサイクルのための準備を行うこともできる。ただし、第１のプライマーはその５’末端にステム−ループを有するものと考えられる。
段階（Ｂ）のＲＮＡ第１鋳型を提供するには多くの方法がある。１実施態様においては（図２）、反応媒体中に、特定核酸配列を有してなる一本鎖ＲＮＡを提供するものであり、反応媒体にＤＮＡリガーゼ、第１のオリゴヌクレオチドプライマーおよびさらに５’末端ホスフェートを有する第２のオリゴヌクレオチドプライマーを加えることで、第２のオリゴヌクレオチドプライマーが一本鎖ＲＮＡにハイブリッド形成し；ＤＮＡポリメラーゼが一本鎖ＲＮＡを鋳型として用いて、第２のオリゴヌクレオチドプライマーを延長することで相補的ＤＮＡを合成し、それによってＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを形成し；リボヌクレアーゼがＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドの一部であるＲＮＡを加水分解し；第１のオリゴヌクレオチドプライマーが相補的ＤＮＡにハイブリッド形成し、；ＤＮＡポリメラーゼが相補的ＤＮＡを鋳型として用いて、第１のオリゴヌクレオチドプライマーを延長することで第２のオリゴヌクレオチドプライマーを末端とするＤＮＡ部分（セグメント）を合成し；ＤＮＡリガーゼがＤＮＡ部分（セグメント）を第２のオリゴヌクレオチドプライマーに結合させて、ＤＮＡ第２鋳型を形成し；ＲＮＡポリメラーゼがプロモーターの認識およびＤＮＡ第２鋳型の転写を行うことで、ＲＮＡ第１鋳型のコピーを提供するものである。本実施態様の１態様においては、反応媒体に一本鎖ＲＮＡを加える。本実施態様の別の態様においては、反応媒体に、プロモーターおよび相補的ＤＮＡ鋳型を有してなるＤＮＡを加えることで、ＲＮＡポリメラーゼが相補的ＤＮＡを転写し、それによって一本鎖ＲＮＡのコピーが得られる。
別の実施態様においては、第１のプライマーの５’末端にステム−ループを提供する。
別の実施態様においては、反応媒体にＤＮＡリガーゼ、第１のオリゴヌクレオチドプライマー、ならびに特定核酸配列に対して相補的な配列とさらに５’末端ホスフェートを有してなる５’末端第２オリゴヌクレオチドプライマー配列を有してなる一本鎖ＤＮＡを加えることによって段階（Ｂ）のＲＮＡ第１鋳型を提供して、第１のオリゴヌクレオチドプライマーが一本鎖ＤＮＡにハイブリッド形成し；ＤＮＡポリメラーゼが一本鎖ＤＮＡを鋳型として用いて、第１プライマーを延長することによって一本鎖ＤＮＡのステム−ループ構造の５’末端配列を末端とするＤＮＡセグメント（部分）を合成し；ＤＮＡリガーゼがＤＮＡ部分（セグメント）を一本鎖ＤＮＡの５’末端配列に結合させることで、ＤＮＡ第２鋳型を形成し；ＲＮＡポリメラーゼがプロモーターの認識およびＤＮＡ第２鋳型の転写を行うことで、ＲＮＡ第１鋳型のコピーが得られる。本実施態様の１態様においては、一本鎖ＤＮＡを有してなるＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを加えることで、リボヌクレアーゼがＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドの一部であるＲＮＡを加水分解する。
別の実施態様においては、反応媒体に、特定核酸配列を有してなる一本鎖ＲＮＡ、第１のオリゴヌクレオチドプライマーならびにさらに５’末端オリゴヌクレオチド部分を有してなる第２のオリゴヌクレオチドプライマーを加えることで段階（Ｂ）のＲＮＡ第１鋳型を提供して、第２のオリゴヌクレオチドプライマーが一本鎖ＲＮＡにハイブリッド形成し；ＤＮＡポリメラーゼが一本鎖ＲＮＡを鋳型として用いて第２のオリゴヌクレオチドプライマーを延長することで相補的ＤＮＡを合成し、それによってＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを形成し；リボヌクレアーゼがＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドの一部であるＲＮＡを加水分解し；第１のオリゴヌクレオチドプライマーが相補的ＤＮＡにハイブリッド形成し、ＤＮＡポリメラーゼが相補的ＤＮＡおよび第２プライマーを鋳型として用いて、第１のオリゴヌクレオチドプライマーを延長することでＤＮＡ第２プライマーを合成し、それによって第２プライマーのオリゴヌクレオチドセグメント（部分）にＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを形成し；リボヌクレアーゼが第２プライマーのオリゴリボヌクレオチド部分を加水分解することで、３’末端プライミング配列をＤＮＡ第２鋳型の開始部位のプラスセンス配列にハイブリッド形成させ；ＤＮＡポリメラーゼがＤＮＡ第２鋳型を用いてＤＮＡ第２鋳型を延長することでプロモーターを合成し；ＲＮＡポリメラーゼがプロモーターの認識およびＤＮＡ第２鋳型の転写を行い、それによってＲＮＡ第１鋳型のコピーが得られる。本実施態様の１態様においては、反応媒体に一本鎖ＲＮＡを加える。本実施態様の別の態様においては、反応媒体に、プロモーターおよび相補的ＤＮＡ鋳型を有してなるＤＮＡを加えて、ＲＮＡポリメラーゼが相補的ＤＮＡを転写することで、一本鎖ＲＮＡのコピーが得られる。
別の実施態様においては、反応媒体に、第１のオリゴヌクレオチドプライマーと特定核酸配列に対して相補的な配列およびさらに５’末端オリゴリボヌクレオチド部分を有してなる５’末端第２オリゴヌクレオチドプライマー配列を有してなる一本鎖ＤＮＡを加えることで段階（Ｂ）のＲＮＡ第１鋳型を得て、第１のオリゴヌクレオチドプライマーが一本鎖ＤＮＡにハイブリッド形成し；ＤＮＡポリメラーゼが一本鎖ＤＮＡと第２のオリゴヌクレオチドプライマーを鋳型として用いて、第１のオリゴヌクレオチドプライマーの延長によってＤＮＡ第２鋳型を合成し、それによって第２プライマーの５’末端オリゴリボヌクレオチド部分にＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを形成し；リボヌクレアーゼが第２プライマーのオリゴリボヌクレオチド部分を加水分解することで、３’末端プライミング配列をＤＮＡ第２鋳型における開始部位のプラスセンス配列にハイブリッド形成させ；ＤＮＡポリメラーゼがＤＮＡ第２鋳型を用いてＤＮＡ第２鋳型を延長することでプロモーターを合成し；ＲＮＡポリメラーゼがプロモーターの認識およびＤＮＡ第２鋳型の転写を行い、それによってＲＮＡ第１鋳型のコピーが得られる。本実施態様の１態様においては、一本鎖ＤＮＡを有してなるＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを加えることで、リボヌクレアーゼが、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドの一部であるＲＮＡを加水分解する。
別の実施態様においては、反応媒体に第１のオリゴヌクレオチドプライマーを加え、反応媒体中に、ＲＮＡ第１鋳型を有してなる一本鎖ＲＮＡを提供することによって段階（Ｂ）のＲＮＡ第１鋳型を提供して、第１のオリゴヌクレオチドプライマーが一本鎖ＲＮＡにハイブリッド形成し；ＤＮＡポリメラーゼが一本鎖ＲＮＡ鋳型を用いて第１のオリゴヌクレオチドプライマーの延長によってＤＮＡ第２鋳型を合成することで、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを形成し；リボヌクレアーゼがＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを形成するＲＮＡを加水分解することで、３’末端プライミング配列がＤＮＡ第２鋳型中の開始部位のプラスセンス配列にハイブリッド形成することができ；ＤＮＡポリメラーゼがＤＮＡ第２鋳型を用いて、ＤＮＡ第２鋳型を延長することによってプロモーターを合成し；ＲＮＡポリメラーゼがプロモーターの認識およびＤＮＡ第２鋳型の転写を行うことで、ＲＮＡ第１鋳型のコピーが得られる
別の実施態様においては、反応媒体に、ＤＮＡ第２鋳型を有してなる特定核酸配列を有してなる一本鎖ＤＮＡを加えることで段階（Ｂ）のＲＮＡ第１鋳型を提供して、３’末端プライミング配列が一本鎖ＤＮＡの開始部位のプラスセンス配列にハイブリッド形成し；ＤＮＡポリメラーゼが鋳型として一本鎖ＤＮＡを用いてその３’末端から延長することによってプロモーターを合成し；ＲＮＡポリメラーゼがプロモーターの認識と一本鎖ＤＮＡの転写を行うことで、ＲＮＡ第１鋳型のコピーが得られる。
別の実施態様において、本発明の方法は、反応で使用された試薬の消費または増幅サイクルの生成物蓄積について反応媒体をモニタリングする段階（Ｄ）を有してなるものである。
別の実施態様においては、段階（Ｄ）において、そのサイクルの試薬消費もしくは生成物蓄積を、特定核酸配列またはその相補体が不在である対照サイクルの場合と比較する。
定義
本願においては、文脈的に別の意味となる場合を除き、以下の定義を用いる。
「ＡＭＶ」＝トリ骨髄性白血病ウィルス
「ＡＴＰ」＝アデノシン三リン酸
「ＣＴＰ」＝シトシン三リン酸
「相補的」＝２個の核酸が、所定のイオン強度および温度条件下にハイブリッド形成することができること
「自己相補的」＝単一配列内で相補的であること
「ｄＡＴＰ」＝デオキシアデノシン三リン酸
「ｄＣＴＰ」＝デオキシシトシン三リン酸
「ｄＧＴＰ」＝デオキシグアノシン三リン酸
「ｄＴＴＰ］＝デオキシチミン三リン酸
「ＧＴＰ」＝グアノシン三リン酸
「ＩＴＰ」＝イノシン三リン酸
「ＫＣｌ」＝塩化カリウム
「ＭｇＣｌ2」＝塩化マグネシウム
「ＮＡＳＢＡ（商標）」＝米国特許出願０７／２１１３８４号ならびに対応する特許および特許出願に記載のような核酸に基づく増幅
「強化ＮＡＳＢＡ（商標）」＝米国特許５１３０２３８号ならびに対応する特許および特許出願に記載のような強化核酸増幅
「特定核酸配列」＝増幅が望まれる一本鎖もしくは二本鎖の核酸の配列あるいはそのような配列に対して相補的な配列
「ＴＲＡＭ（商標）」＝末端反復増幅法であって、本発明の方法
「トリスＨＣｌ」＝トリス塩酸塩
「ＵＴＰ」＝ウリジン三リン酸
「末端プライミング配列」＝自己相補的な末端配列
【図面の簡単な説明】
本発明の実施態様を図示する図面において、
図１Ａは、ＲＮＡ第１鋳型と第１プライマーから出発するＴＲＡＭについての循環的増幅プロセスの概略図である。
図１Ｂは、ＲＮＡ第１鋳型から出発し、プライマーとは独立のＴＲＡＭについての循環的増幅プロセスの概略図である。
図２は、デオキシリボヌクレオシドのみを有してなる第１および第２のプライマーを用いる、特定ＲＮＡ配列から出発するＲＮＡ第１鋳型形成に必要な段階を示す概略図である。
図３は、デオキシリボヌクレオシドのみを有してなる第１および第２のプライマーを用いる、二本鎖ＤＮＡ配列から出発するＲＮＡ特異的鋳型形成に必要な段階を示す概略図である。
図４は、デオキシリボヌクレオシドを有してなる第１プライマーとデオキシリボヌクレオシドおよびリボヌクレオシドの混合物を有してなる第２プライマーを用いる、特定ＲＮＡ配列から出発するＲＮＡ第１鋳型形成に必要な段階を示す概略図である。
図５は、増幅された特定核酸配列［ＲＮＡ（配列番号２）およびｃＤＮＡ（配列番号３）］を示す図である。
図６は、ＴＲＡＭ第２プライマー（配列番号４）、ＮＡＳＢＡ（商標）第２プライマー（配列番号５）、ならびにＮＡＳＢＡ（商標）とＴＲＡＭの両方についての第１プライマー（配列番号６）の核酸配列を示す図である。
図７は、ＴＲＡＭでの特異的増幅の有効性に対する、５’リン酸化第２プライマーおよびＤＮＡリガーゼの効果を示す図である。
図８は、ヌクレオチド配列分析によって決定された増幅ＲＮＡの構造に対する５’リン酸化第２プライマーおよびＤＮＡリガーゼの効果を示す図である。
図９および１０は、ＴＲＡＭでの第１プライマー濃度の効果を示す図である。
図１１および図１２は、ＴＲＡＭでの第２プライマー濃度の効果を示す図である。
図１３および１４は、ＴＲＡＭとＮＡＳＢＡ（商標）について至適化されたプライマー濃度を用いての、ＴＲＡＭとＮＡＳＢＡ（商標）との第１の比較の効果を示す図である。
図１５および１６は、ＴＲＡＭ反応生成物の再増幅についての第２プライマーの独立性を示す図である。
図１７および１８は、ＴＲＡＭ反応生成物の再増幅における第１プライマー依存性を示す図である。
図１９は、ヌクレオチド配列分析によって決定された増幅ＲＮＡ生成物の構造に対するＲＮＡ−ＤＮＡ複合体第２プライマーの効果を示す図である。
図２０は、第１プライマー［Ｐ２（配列番号８）］と、５’末端ステム−ループ構造を有する別の第１プライマー２個［Ｐ２．１（配列番号９）およびＰ２．２（配列番号１０）］のヌクレオチド配列を示す図である。
図２１および２２は、プライマー不在下のＴＲＡＭでの循環的増幅における５’末端ステム−ループ構造を有する第１プライマーの使用を示す図である。
好ましい実施態様の詳細な説明
本発明においては、図１Ａおよび図１Ｂに示した循環的プロセスで、ＲＮＡ第１鋳型とＤＮＡ第２鋳型を、一方から他方の合成に交互に使用している。
本発明は、比較的一定の温度で、試薬を連続的に加えずに、特定核酸配列を増幅する方法である。この方法は、段階（Ａ）〜（Ｃ）を有してなり、それらの段階によって、増幅が容易になり、使用者による介入および操作の必要性が低下する。
段階（Ａ）では、ＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、一本鎖もしくは二本鎖のＲＮＡもしくはＤＮＡを加水分解することなくＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡを加水分解するリボヌクレアーゼ、ならびにリボヌクレオシド三リン酸およびデオキシリボヌクレオシド三リン酸を有してなる試薬を含む単一の反応媒体が提供される。
この循環的増幅方法の好ましい実施態様においては、反応媒体はさらに、図１Ａに示したように、第１のＲＮＡ鋳型にハイブリッド形成し、循環的増幅方法で使用される配列を有する１個のプライマー（第１のオリゴヌクレオチドプライマー）を有してなるものである。ＲＮＡ第１プライマーを用いて、第１のオリゴヌクレオチドプライマーをＲＮＡ第１鋳型にハイブリッド形成し、ＤＮＡポリメラーゼを用いる第１のオリゴヌクレオチドプライマーの延長によって相補的ＤＮＡ第２鋳型を合成することによって、ＤＮＡ第２鋳型を合成する。
循環的増幅方法の別の実施態様においては、ＲＮＡ第１鋳型はさらに、図１Ｂに示したように、ＤＮＡポリメラーゼを用いてＤＮＡ第２鋳型を合成することによって延長することができる３’末端プライミング配列を有してなる。
いずれの方法においても、ＤＮＡ第２鋳型は、例えばＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドに特異的なリボヌクレアーゼ（例：リボヌクレアーゼＨ）を用いることによるＲＮＡの加水分解によって、得られるＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡ第１鋳型から分離される。ＤＮＡ第２鋳型は変換されて、その３’末端プライミング配列をＤＮＡ第２鋳型の開始部位のプラスセンス配列にハイブリッド形成し、ＤＮＡポリメラーゼを用いる３’末端配列の延長によるプロモーターのマイナスセンス配列を合成することによって二本鎖プロモーターを含む形とする。二本鎖プロモーターを有するＤＮＡ第２鋳型の形を用いて、ＲＮＡ第１鋳型およびＤＮＡ第２鋳型において決定されているプロモーター部位および転写開始部位を認識するＲＮＡポリメラーゼを用いることによって、ＲＮＡ第１鋳型のコピーを合成する。新たに合成された各ＲＮＡ第１鋳型を用いて、ＤＮＡ第２鋳型を合成することができ、それを用いて、上記サイクルを繰り返すことによってＲＮＡ第１鋳型のさらなるコピーを合成することができる。さらに、サイクルの反復では、使用者の介入や操作は必要ない。
上記増幅方法には、前駆体（プライマー、リボヌクレオシド三リン酸およびデオキシリボヌクレオチド三リン酸）の消費および生成物の正味蓄積（ＲＮＡおよびＤＮＡ）が関与する。ＲＮＡおよびＤＮＡ合成の方法は、十分な濃度の核酸が合成されて検出が可能となるまで、非同時的に進行させることになる。その増幅方法は、例えば標識前駆体からの標識生成物の合成によってモニタリングすることができる。増幅方法の適用に有用な検出の図式は、米国特許５１３０２３８号（Cangene Corporation）に記載されている。
増幅方法は、適切な反応条件下に、好適な鋳型核酸を適切な酵素、プライマーおよび補因子に加えることで開始する。この鋳型核酸は、均一かつ連続的な増幅が可能で、図１Ａおよび図１Ｂに示したサイクルにおける中間体として機能し得る形である。鋳型核酸は、５’末端にＲＮＡ第１鋳型を有してなる一本鎖ＲＮＡまたは３’末端にＤＮＡ第２鋳型を有してなる一本鎖ＤＮＡであると考えられる。加えられる鋳型核酸は、一本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡ鋳型に対する前駆体であることもできる。例えば、反応媒体に、プロモーターとＤＮＡ第２鋳型を有してなるＤＮＡを加えて、ＲＮＡポリメラーゼがＤＮＡ第２鋳型を転写し、それによって５’末端にＲＮＡ第１鋳型を有してなる一本鎖ＲＮＡのコピーを得ることができると考えられる。別法として、一本鎖ＤＮＡを有してなるＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを加えて、リボヌクレアーゼにＲＮＡを加水分解させ、それによって３’末端にＤＮＡ第２鋳型を有してなる一本鎖ＤＮＡのコピーを得ることも考えられる。
反応媒体に加えることができるＤＮＡ第２鋳型は代表的には、プロモーターおよび開始部位のプラスセンス配列と、開始部位にハイブリッド形成する３’末端プライミング配列を有してなるものである。ある種の適用場面では、反応媒体に加えられるＤＮＡは、合成オリゴヌクレオチドの混合物を有してなることができ、その場合、プロモーターのプラスセンス配列を、部分的もしくは完全に変性した配列と部分的または完全に置換することができる。例えば、転写開始部位の前の１７個塩基配列は、４個のブロックされた各デオキシヌクレオシドアミドリン酸の等モル混合物を用いて合成することができる。加えられたＤＮＡ鋳型の混合物から、機能性プロモーターを有するもののみを、機能性プロモーターのマイナスセンス配列を有するＲＮＡ生成物に転写することができる。そのＲＮＡ生成物は、ＤＮＡ生成物への連続的逆転写と、それに続いてＤＮＡのＲＮＡ生成物への転写を行って増幅して、十分なＲＮＡおよびＤＮＡ生成物を合成して配列決定を可能とすることができる。本発明のこの応用によって、所定のＲＮＡポリメラーゼに対する至適なプロモーターを見いだすことができると考えられる。選択されるプロモーター配列は、増幅反応で使用される特定のＲＮＡポリメラーゼによって決まる。ＲＮＡポリメラーゼは、例えばバクテリオファージＴ７、Ｔ３、ｓｐ６、Ｋ１１およびＢＡ１４によってコードされたものなどの天然のものであることができ、あるいは化学的もしくは遺伝的方法によって変化させることができる。本発明のこの応用によって、認識配列が未知であるＲＮＡポリメラーゼあるいは天然のプロモーター認識部位で変化を受けているＲＮＡポリメラーゼについてのプロモーター配列の決定を行うことができるはずである。本発明のこの応用を用いて、ＤＮＡ鋳型中の重要と考えられる部位の変性配列の位置決定を行うことによって、ＴＲＡＭ方法を至適化することもできると考えられる。徹底的な増幅によって、主要生成物として、最も効果的に増幅された配列が得られるはずである。重要と考えられる部位には、プロモーターの上流の配列、プロモーター、開始部位ならびにステムおよびループなどがあると考えられる。
図１Ａに示したように、プライマー依存性増幅方法では、ＲＮＡ第１鋳型は、それ自体の転写に十分な配列情報を有してなるものである。図１Ｂに示したように、プライマー非依存性方法では、ＲＮＡ第１鋳型はさらに、それ自体の複製に十分な配列情報を有してなるものである。この特殊化した配列情報は、増幅したい特定核酸配列には最初は存在しないのが一般的であり、循環的増幅プロセスの前にＲＮＡ第１鋳型に加えなければならない。ＲＮＡ第１鋳型は、例えばＲＮＡ第１鋳型の転写および複製に必要な配列を有してなるオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、特定核酸配列から合成することができると考えられるＤＮＡ第２鋳型を有してなるＤＮＡから転写できるものと考えられる。
図１Ａに示されているような方法の好ましい実施態様で使用される第１のオリゴヌクレオチドプライマーは、特定の長さおよび塩基組成を持つことで、所定のイオン強度および温度の条件下に、ＲＮＡ第１鋳型ＤＮＡへの特異的かつ有効なハイブリッド形成およびＤＮＡ第２鋳型の合成を行うことができる３’末端プライミング配列を有してなる。さらに、同一の第１のオリゴヌクレオチドプライマーは反応媒体でのＲＮＡ第１鋳型提供の好ましい形態で使用され、その場合、第１のオリゴヌクレオチドプライマーは、同一のイオン強度および温度条件下に、特定核酸配列に対して相補的なＤＮＡにハイブリッド形成し、延長してＤＮＡ第２鋳型を合成する。第１のオリゴヌクレオチドプライマーは、部分的または完全に、天然ヌクレオチド以外のヌクレオチドまたはヌクレオチド類縁体から構成することができるものと考えられる。第１のオリゴヌクレオチドプライマーは、特定核酸配列やその相補体とは無関係の５’末端配列を有していても良い。１実施態様においては、５’末端の無関係な配列が、図１Ｂに示したように、３’末端自己相補的配列をさらに有してなるＲＮＡ第１鋳型の転写のための鋳型を提供する。この例では、５’末端配列は同一の第１オリゴヌクレオチドプライマーの別の配列に対して相補的であることで、５’末端ステム−ループ構造を形成することができる。
別法として、５’末端の無関係な配列またはその転写されたＲＮＡ相補体を、固定化可能な核酸、あるいは検出を容易にするためのレポーターなどの有用な非核酸系成分が結合し得る核酸にハイブリッド形成することができる。
鋳型核酸の製造は本増幅方法の一部ではないが、鋳型核酸形成のための図式について説明することは、増幅方法の応用に対して有用なものであり得る。鋳型核酸を得るのに用いることができる図式は、本明細書に記載の選択肢に限定されるものではないことは理解すべき点であり、他の方法を使用できるものと考えられる。
反応媒体中にＲＮＡ第１鋳型を提供する好ましい形態は、特定核酸配列に対して相補的な３’末端プライミング配列、プロモーターのマイナスセンス配列、開始部位のマイナスセンス配列および開始部位のマイナスセンス配列に対して相補的な５’末端配列を有してなる第２のオリゴヌクレオチドプライマーを利用するものである。第２のオリゴヌクレオチドプライマーの３’末端プライミング配列は、特定の長さおよび塩基組成を持つことで、所定のイオン強度および温度条件下で、特定核酸配列への特異的かつ有効なハイブリッド形成および相補的ＤＮＡの合成が可能である。プロモーターのプラスセンス配列の合成のための鋳型として使用する場合のプロモーターおよび開始部位のマイナスセンス配列は、ＲＮＡポリメラーゼの特異的かつ有効な結合および所望の部位での転写の開始を可能とするだけの情報を有する。プロモーター配列は、天然プロモーターおよび開始部位のマイナスセンス鎖から誘導することができる。好ましい実施態様においては、第２のオリゴヌクレオチドプライマーは、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼのための開始部位およびプロモーターのマイナスセンス配列を有する配列
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を有してなる。
別法として、別のファージＲＮＡポリメラーゼのための開始部位およびプロモーターを用いることができる。第２のオリゴヌクレオチドプライマーの５’末端配列は、特定の長さおよび塩基配列を持つことで、誘導ＤＮＡ第２鋳型の３’末端プライミング配列を転写開始部位のプラスセンス配列にハイブリッド形成し、延長して転写プロモーターのマイナスセンス配列を付加することができる。第２のオリゴヌクレオチドプライマーの５’末端配列と開始部位のマイナスセンス配列の間の配列は特定の長さおよび組成を持つことで、所定のイオン強度および温度条件下に、ＤＮＡ第２鋳型を有してなる誘導ＤＮＡからの転写が可能である。さらに、プロモーター機能とは無関係の配列を、プロモーターのマイナスセンス配列と特定核酸配列にハイブリッド形成する３’末端プライミング配列との間で、第２のオリゴヌクレオチドプライマーに含ませることができる。第２プライマーは、天然オリゴヌクレオチド以外のヌクレオチドまたはヌクレオチド類縁体で部分的または完全に構成されていても良いと考えられる。
ＲＮＡ第１鋳型を提供する好ましい形態には、反応媒体へのＤＮＡリガーゼおよびさらに５’末端ホスフェートを有してなる第２のオリゴヌクレオチドプライマーの添加が関与する。第２のオリゴヌクレオチドプライマーの５’末端ホスフェートは、反応媒体からのＡＴＰを利用して第２のオリゴヌクレオチドプライマーの５’末端をリン酸化する、ポリヌクレオチドキナーゼなどの酵素の反応媒体への添加によって、反応媒体中に提供することができると考えられる。さらに、例えばアデノシン−５’−二リン酸などの他の基を、第２のオリゴヌクレオチドプライマーの５’末端のホスフェートに代えて用いることができると考えられる。実際、式Ａ（５’）ｐｐ（５’）［第２のオリゴヌクレオチドプライマー］を有するオリゴヌクレオチドは、それの基質であるＡＴＰ（またはＮＡＤ）と５’リン酸化された第２のオリゴヌクレオチドプライマーに作用する場合に、ＤＮＡリガーゼによって反応媒体中に提供される予想の中間体である。さらに、Ａ（５’）ｐｐ（５’）［第２のオリゴヌクレオチドプライマー］を、５’リン酸化した第２のオリゴヌクレオチドプライマーより優先的に反応媒体に加えることができると考えられる。ＤＮＡリガーゼは、ＤＮＡ部分の３’末端を第２のオリゴヌクレオチドプライマーの５’末端に結合させることができる酵素であることができる。好ましい態様においては、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼが用いられる。さらに、原核生物細胞または真核生物細胞から選択される他のＤＮＡリガーゼを用いることができる。例えば大腸菌またはThermus aquaticusからのものなどのこれらＤＮＡリガーゼの一部を使用する場合には、ＤＮＡリガーゼの基質として、反応媒体にＮＡＤを加えることが必要となる場合のあることが認められている。
ＲＮＡから始める場合、ＲＮＡ第１鋳型を提供する好ましい形態には、特定核酸配列、ＤＮＡリガーゼおよび５’末端ホスフェートを有する第２のオリゴヌクレオチドプライマーを有してなる一本鎖ＲＮＡの反応媒体への添加が関与するものである（図２）。第２のオリゴヌクレオチドプライマーが一本鎖ＲＮＡにハイブリッド形成し、ＤＮＡポリメラーゼが一本鎖ＲＮＡを鋳型として用いて第２のオリゴヌクレオチドプライマーを延長して相補的ＤＮＡを合成し、それによってＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを形成する。リボヌクレアーゼが、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドの一部であるＲＮＡを加水分解して、一本鎖の相補的ＤＮＡを放出し、そのＤＮＡは、特定核酸配列、５’末端配列が開始部位のマイナスセンス配列に対して自己相補的であるプロモーターおよび開始部位のマイナスセンス配列、ならびに５’末端リン酸を有してなるものである（図２）。
第１のオリゴヌクレオチドプライマーが相補的ＤＮＡにハイブリッド形成し、ＤＮＡポリメラーゼが相補的ＤＮＡを鋳型として用いて、第１のオリゴヌクレオチドプライマーを延長することで第２のオリゴヌクレオチドプライマーを末端とするＤＮＡ部分を合成する。次に、ＤＮＡリガーゼがＤＮＡ部分の３’末端をオリゴヌクレオチドプライマーの５’末端に結合させることで、ＤＮＡ第２鋳型を有してなるＤＮＡを形成する。最後に、ＲＮＡポリメラーゼがプロモーターの認識およびＤＮＡ第２鋳型の転写を行い、それによってＲＮＡ第１鋳型のコピーが得られる（図２）。
ＤＮＡから開始する場合、ＲＮＡ第１鋳型を提供する好ましい形態には、ＤＮＡリガーゼならびに特定核酸配列に対して相補的な配列、プロモーターおよび開始部位のマイナスセンス配列、開始部位のマイナスセンス配列に対して相補的である５’末端配列および５’末端ホスフェートを有してなる一本鎖相補的ＤＮＡの反応媒体への添加が関与する。一本鎖相補的ＤＮＡは、特定核酸配列を有してなる一本鎖ＤＮＡから得ることができる（図３）。独立のプロセスで、まず一本鎖ＤＮＡを熱的もしくは化学的変性によってＤＮＡ二本鎖から分離する。第２のオリゴヌクレオチドプライマーが一本鎖ＤＮＡにハイブリッド形成し、ＤＮＡポリメラーゼが一本鎖ＤＮＡを鋳型として用いて、第２のオリゴヌクレオチドプライマーを延長することで相補的ＤＮＡを合成する。最後に、一本鎖相補的ＤＮＡが熱的もしくは化学的変性によって一本鎖ＤＮＡから分離され、次に、ＤＮＡリガーゼとともに反応媒体に加えられる。反応媒体中では、相補的ＤＮＡが利用されて、ＲＮＡから開始する所定の好ましい形態によってＲＮＡ第１鋳型のコピーが得られる（図３）。
一本鎖相補的ＤＮＡに加えて、ＲＮＡから開始する好ましい形態において指定された他の核酸中間体を反応媒体に加えて、ＲＮＡ第１鋳型を得ることができる。例えば、反応媒体に、ＤＮＡリガーゼおよび一本鎖相補的ＤＮＡを有してなるＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを加えることで、リボヌクレアーゼがＲＮＡを加水分解し、それによって一本鎖相補的ＤＮＡのコピーを得ることができると考えられる。別法として、ＲＮＡから開始する好ましい形態に指定の核酸中間体のいずれかの前駆体を反応媒体に加えて、ＲＮＡ第１鋳型を得ることができる。例えば、反応媒体にプロモーターを有してなるＤＮＡを加えて、ＲＮＡポリメラーゼがプロモーターの認識およびＤＮＡの転写を行い、それによって一本鎖ＲＮＡのコピーを得ることができると考えられる。そのＲＮＡおよびそれの前駆体であるＤＮＡは、例えばＮＡＳＢＡ（商標）などの増幅方法の生成物であることができる。
反応媒体へのＲＮＡ第１鋳型提供の別の形態では、５’末端から好ましくは開始部位のマイナスセンス配列の先までまたはプロモーターのマイナスセンス配列の先まで、あるいは３’末端までのプライマーの全配列をさらに有してなる第２のオリゴヌクレオチドプライマーの添加が関与する。第２のオリゴヌクレオチドはさらに、例えばリボグアノシンに代えてのリボイノシンおよびリボウリジンに変えてのリボシトシンなどのヌクレオシド置換を有することで、５’末端ステム−ループ構造が反応媒体中で不安定であるが、同一条件下で、第２プライマーを鋳型として用いて合成された相補的ＤＮＡの３’末端がそれ自体にハイブリッド形成して、ＮＤＡ合成をプライミングするようにすることができる。
ＲＮＡ第１鋳型は、特定核酸配列および５’末端オリゴリボヌクレオチドセグメント（部分）を有する第２のオリゴヌクレオチドプライマーを有してなる一本鎖ＲＮＡを反応媒体に加えることで得ることができる（図４）。この第２のオリゴヌクレオチドプライマーが一本鎖ＲＮＡにハイブリッド形成し、ＤＮＡポリメラーゼが一本鎖ＲＮＡを鋳型として用いて第２のオリゴヌクレオチドプライマーを延長して相補的ＤＮＡを合成し、それによってＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドが形成される。リボヌクレアーゼが、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドの一部であるＲＮＡを加水分解して、５’末端に第２のオリゴヌクレオチドプライマーを有してなる相補的ＤＮＡを放出する。第１のオリゴヌクレオチドプライマーが相補的ＤＮＡに対してハイブリッド形成し、ＤＮＡポリメラーゼが相補的ＤＮＡを鋳型として用いて、第１のオリゴヌクレオチドプライマーを延長することでＤＮＡ第２鋳型を合成する。リボヌクレアーゼが、第２のＤＮＡ鋳型とともにＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを有してなる第２のオリゴヌクレオチドプライマーのＲＮＡ部分を加水分解する。これによって、３’末端ＤＮＡ配列がＤＮＡ第２鋳型中の開始部位のプラスセンス配列にハイブリッド形成することができる。次に、ＤＮＡポリメラーゼがＤＮＡ第２鋳型を用いて、ＤＮＡ第２鋳型を延長することでプロモーターを合成する。最後に、ＲＮＡポリメラーゼがプロモーターの認識およびＤＮＡ第２鋳型の転写を行い、それによってＲＮＡ第１鋳型のコピーが得られる（図４）。
ＲＮＡ第１鋳型は、特定核酸配列に対して相補的な配列およびオリゴリボヌクレオチド部分を有する５’末端第２オリゴヌクレオチドプライマーを有してなる一本鎖相補的ＤＮＡを反応物に加えることで得ることができる。一本鎖相補的ＤＮＡは、特定核酸配列を有してなる一本鎖ＤＮＡから開始する好ましい形態に記載されてるように別プロセスで得ることができる。その場合、５’末端オリゴリボヌクレオチド部分を有してなる第２のオリゴヌクレオチドプライマーを用いる。相補的ＤＮＡを用いて、特定核酸配列を有してなる一本鎖ＲＮＡから開始する別の形態に記載されている通りにして、ＲＮＡ第１鋳型が得られる。
本発明で用いられる酵素はいずれも、一定の実用上の規格を満足しなければならない。各酵素または酵素調製物は、多くの場合一定のＤＮＡポリメラーゼおよび一本鎖もしくは二本鎖の特異的なエキソヌクレアーゼもしくはエンドヌクレアーゼに関連する５’もしくは３’エキソヌクレアーゼ活性などの有害なデオキシリボヌクレアーゼ（「ＤＮａｓｅ」）活性がないものでなければならない。各酵素または酵素調製物は、ＲＮＡとＤＮＡのハイブリッドに特異的なリボヌクレアーゼ活性（例：リボヌクレアーゼＨ）の好ましい追加以外の有害なリボヌクレアーゼ（「ＲＮａｓｅ」）活性がないものでなければならない。さらに、各酵素は、他の酵素プロセスおよびオリゴヌクレオチドプライマーのＲＮＡもしくはＤＮＡ鋳型へのハイブリッド形成などの非酵素的プロセスに用いられる一般的反応条件下で適正な活性を有するものでなければならない。
本発明で使用されるＲＮＡポリメラーゼは、プロモーターと称される特定のＤＮＡ配列に結合することができ、具体的にはプロモーターに非常に近接している所定の開始部位でＲＮＡ合成を開始することができる酵素であることができる。プロモーターと開始部位の配列は、ＲＮＡ第１鋳型およびＤＮＡ第２鋳型の一部を形成し、第２鋳型の一部として提供することができる。ＲＮＡポリメラーゼは、妥当な時間内に、鋳型の機能性コピーによってＲＮＡのいくつかのコピーを合成することができるものでなければならない。さらに、ＲＮＡポリメラーゼは、バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼ類を特徴づける特徴である比較的小さいプロモーターおよび開始部位を認識しなければならない。好ましい実施態様においては、バクテリオファージＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを使用する。
別の実施態様においては、バクテリオファージＴ３  ＲＮＡポリメラーゼを使用する。さらに、サルモネラファージｓｐ６、ファージＫ１１もしくはファージＢＡ１４などの他のバクテリオファージＲＮＡポリメラーゼを使用することもできる。別法として、別の原核生物または真核生物のＲＮＡポリメラーゼを用いることができる。代替のＲＮＡポリメラーゼを使用する場合、特定のＲＮＡポリメラーゼの鋳型特異性に従って、第２プライマーのプロモーター配列および開始配列に対して必要な変更を行わなければならないことが認められている。
本発明で使用されるＤＮＡポリメラーゼは、オリゴヌクレオチドプライマーおよびＤＮＡ鋳型もしくはＲＮＡ鋳型からＤＮＡを合成することができる酵素であることができる。さらにこの酵素は、ＲＮａｓｅ  Ｈ活性を有することができる。好ましい実施態様においては、トリ骨髄性白血病ウィルスポリメラーゼ（「ＡＭＶ逆転写酵素」）が使用される。さらに、ＤＮＡポリメラーゼは、モロニー（Moloney）マウス白血病ウィルスなどの別のレトロウィルスからのものであっても良いと考えられる。別法として、ＤＮＡポリメラーゼをコードする他の真核生物、原核生物またはウィルスを使用することができると考えられる。
本発明で使用可能と考えられるＲＮａｓｅ  Ｈは、相補的ＤＮＡに対してアニーリングされるＲＮＡを加水分解することができる酵素であることができる。この酵素には、一本鎖および二本鎖のＲＮＡおよびＤＮＡを加水分解する能力があってはならない。好ましい実施態様においては、大腸菌ＲＮａｓｅ  Ｈを用いる。さらに、仔ウシ胸腺ＲＮａｓｅ  Ｈなどの他のＲＮａｓｅ  Ｈ酵素も用いることができると考えられる。ＲＮａｓｅ  ＨはＡＭＶ逆転写酵素の固有の活性であることから、好ましい実施態様においては、大腸菌ＲＮａｓｅ  ＨにＡＭＶ逆転写酵素のＲＮａｓｅ  Ｈを追加する。別法として、ＤＮＡからＲＮＡを分離することができる他の酵素を使用することができると考えられる。
上記の酵素およびプライマーは、ＤＮＡ合成およびＲＮＡ合成の両方に必要な緩衝液および補因子の入った反応容器中で混和する。さらに、イオン条件および反応温度は、当業者には公知のように、ＤＮＡ鋳型およびＲＮＡ鋳型に対するプライマーの特異的ハイブリッド形成に適合性でなければならない。反応混合物には、増幅プロセスを妨害する可能性のある薬剤、具体的には酵素の活性をかなり阻害し得る物質、プライマーおよび鋳型のハイブリッド形成を妨害し得る物質、あるいは核酸の中間体および生成物を非生産的に分解し得る物質を含まないものでなければならない。
米国特許５１３０２３８号に記載のように、反応媒体にＤＭＳＯとＢＳＡの両方を加えることで、上記の増幅方法の感受性および再現性が大幅に上昇する。増幅方法の感受性および再現性を高めるためには、最終濃度範囲０％〜３０％のＤＭＳＯおよび最終濃度範囲５μｇ／ｍＬ〜２５００μｇ／ｍＬのＢＳＡが有用である。
増幅反応媒体でのＤＭＳＯおよびＢＳＡの使用により、ＤＭＳＯおよびＢＳＡを使用しない反応媒体を用いた場合より感受性および再現性が高くなる。しかしながら、標的核酸配列の検出および単離には、その反応媒体のみで十分である。
実施例１：ＴＲＡＭ用のオリゴヌクレオチドプライマーおよびＲＮＡ鋳型の設計および合成
ＤＮＡの消化および連結のための酵素を購入し（New England Biolabs）、供給業者の説明に従って使用した。いずれの形質転換にも、大腸菌株ＨＢ１０１（ＡＴＣＣ３３６９４）を使用した。大腸菌形質転換細胞を、５０μｇ／ｍＬでアンピシリンを含むＹＴ培地（Miller, 1972）で成長させた。急速沸騰法（Holmes and Quigley, 1981）によってプラスミドＤＮＡを精製した。全ての構築に使用されるＤＮＡ断片およびベクターは低融点アガロースでの電気泳動によって分離し、フェノール抽出およびエタノール沈殿（Maniatis et al., 1982）によって溶融アガロースから精製した。ジデオキシ法（Sanger et al, 1977）の変法（Hattori et al., 1985）を用いて、プラスミドＤＮＡの配列決定を行った。−２０万能（universal）プライマー（New England Biolabs）を用いて反応を行った。ＨＩＶ  ＨＸＢ２（遺伝子バンク受け入れ番号Ｋ０３４５５）の１．５ｋｂのプロウィルスＤＮＡ断片をｐＧＥＭ３（Promega）の誘導体にサブクローニングすることによって、モデルＲＮＡ鋳型の転写用に、プラスミドｐＧＥＭ３Ｘ−ＨＩＶ１を構築した。ヌクレオチド１０１５のＳａｕ３ＡＩ部位およびヌクレオチド１１４４のＰｖｕＩＩ部位を用いて、ＨＩＶ  ＨＸＢ２の別のＤＮＡ断片を切り取り、ヌクレオチド１４１４のＰｓｔＩ部位およびヌクレオチド１４４２のＳｐｈＩ部位、ならびに合成アダプターGATCTGCA（Ｓａｕ３ＡＩ末端とＰｓｔＩ末端を結合するため）およびＳｈｐＩリンカーCGCATGCG（ＰｖｕＩＩ末端をＳｐｈＩ末端に変換するため）を用いてｐＧＥＭ３Ｘ−ＨＩＶ１に連結した。得られたプラスミドｐＧＥＭ３Ｘ−ＨＩＶ１−Ｅ２を次のようにＲＮＡ鋳型の転写に用いた。すなわち、ｐＧＥＭ３Ｘ−ＨＩＶ１−Ｅ２約１μｇをＥｃｏ  ＲＩで消化し、エタノールで沈殿させ、水５μＬに溶かし、４０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、１２ｍＭ  ＭｇＣｌ2、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭジチオトレイトール、２ｍＭ  ＡＴＰ、２ｍＭ  ＣＴＰ、２ｍＭ  ＧＴＰ、２ｍＭ  ＵＴＰ、１ｍＭ  ｄＡＴＰ、１ｍＭ  ｄＣＴＰ、１ｍＭ  ｄＧＴＰ、１ｍＭ  ｄＴＴＰ、１２．５単位のＲＮＡガード（RNA-Guard; Pharmacia）および３０単位のＳＰ６を含む反応液２０μＬ（最終容量）ならびにＲＮＡポリメラーゼ（Promega）に加えた。転写反応液を３７℃で１時間インキュベーションし、次に１III（１単位）のＲＱＤＮａｓｅ  Ｉ（Promega）を加え、インキュベーションをさらに１５分間継続した。得られたＲＮＡ生成物ＨＩＶ１−Ｅ２  ＲＮＡをフェノール：クロロホルム（１：１）で２回、クロロホルムで１回抽出し、エタノールで沈殿させ、水に溶かした。既知量のプラスミドＤＮＡとＲＮＡの連続希釈液とを比較することで、スロット−ブロットハイブリッド形成によって、ＨＩＶ１−Ｅ２  ＲＮＡの濃度を測定した。個々の第２プライマーおよび第１プライマーにハイブリッド形成する特定核酸（ＲＮＡ）配列およびそれの相補的ＤＮＡ配列を、図５に開示してある（配列番号２および３）。
ＴＲＡＭ第２プライマーを、化学的に結合した５’末端ホスフェートを有する塩基７８個のオリゴデオキシヌクレオチド（図６Ａ、配列番号４）として合成した。それは、１２塩基対二本鎖によってフランキングされる塩基１０個のループ中に折り畳むことができる塩基３４個の５’末端配列を有してなり、さらに、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ開始部位；Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターのマイナスセンス配列を有してなる塩基２２個の内部配列；および分析物の特定核酸配列にアニーリングする塩基２２個の３’末端プライミング配列（配列番号２のヌクレオチド１１３〜１３４；遺伝子バンク受け入れ番号Ｋ０３４５５のヌクレオチド１４９７〜１５１８に対する相補体）を有してなる。対照として、図６Ａに示したように脱リン酸化ＴＲＡＭ第２プライマーを合成した。ただしそれは、化学的に結合した５’末端ホスフェートを持たない。比較のため、ＮＡＳＢＡ（商標）第２プライマーを塩基４８個のオリゴデオキシヌクレオチドとして合成した（図６Ｂ、配列番号５）。それは、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターおよび開始部位のプラスセンス配列を有してなる塩基２６個の５’末端配列；ならびにＴＲＡＭ第２プライマーと同じ分析物の特定核酸配列にアニーリングする塩基２２個の３’末端プライミング配列を有してなる。共通の第１プライマーを、塩基２１個のオリゴデオキシヌクレオチドとして合成した（図６Ｃ、配列番号６）。それは、分析物の特定核酸配列に対して相補的なＤＮＡにアニーリングする配列を有してなる（配列番号２のヌクレオチド１〜２１；遺伝子バンク受け入れ番号Ｋ０３４５５のヌクレオチド１０９１〜１１１１）。ＤＮＡ合成装置（Applied Biosystems 380A DNA synthesizer）を用いてオリゴヌクレオチドを合成した。オリゴヌクレオチド合成に用いたカラム、アミドリン酸類および試薬は、テクニカル・マーケティング・アソシエーツ（Technical Marketing Associates）を介してアプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）から入手した。オリゴヌクレオチドは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動と、それに続くＤＥＡＥセルロースクロマトグラフィーによって精製した。別法として、精製オリゴヌクレオチドを購入した（Synthetic Genetics; San Diego, CA, USA）。
実施例２：特異的増幅の効率に対する５’リン酸化第２プライマーおよびＤＮＡリガーゼの効果
各標準液では、４０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、１２ｍＭ  ＭｇＣｌ2、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭジチオトレイトール、２ｍＭ  ＡＴＰ、２ｍＭ  ＣＴＰ、２ｍＭ  ＧＴＰ、２ｍＭ  ＵＴＰ、１ｍＭ  ｄＡＴＰ、１ｍＭ  ｄＣＴＰ、１ｍＭ  ｄＧＴＰ、１ｍＭ  ｄＴＴＰ、１５％（容量基準）ジメチルスルホキシド、１００μｇ／ｍＬウシ血清アルブミン、８単位のＡＭＶ逆転写酵素（Seikagaku）、０．１〜０．２単位の大腸菌ＲＮａｓｅ  Ｈ（Pharmacia）、２０〜４０単位のＴ７ａｎＲＮＡポリメラーゼ（Pharmacia）および１２．５単位のＲＮＡ−ガード（商標）（Pharmacia）を最終容量２５μＬ中に含ませた。さらに、標準反応液の一部の中には、２ｎＭのリン酸化ＴＲＡＭ第２プライマーおよび２ｎＭの第１プライマーを含有させた。これらのうち、１つの対照組み合わせ（組み合わせＣ）にはリガーゼを含有させず、他の組み合わせ（組み合わせＤおよびＥ）にはそれぞれ、ニューイングランド・バイオラブス（New England Biolabs）からのＴ４  ＤＮＡリガーゼ（４００単位）またはベテスダ・リサーチ・ラボラトリーズ（Bethesda Research Laboratories）からのＤＮＡリガーゼ（１単位）を含有させた。さらに、標準反応液の一つの対照組み合わせ（組み合わせＢ）には、２ｎＭの脱リン酸化ＴＲＡＭ第２プライマーおよび２ｎＭの第１プライマーを含有させた。さらに、標準反応液の一つの対照組み合わせ（組み合わせＡ）（「標準ＮＡＳＢＡ（商標）反応液」と称される）には、２００ｎＭのＮＡＳＢＡ（商標）第２プライマーおよび２００ｎＭの第１プライマーを含有させた。各条件の組み合わせからの２倍反応液には、実施例１の記載に従って得られたＲＮＡ鋳型分子１０4個を含有させた。各組み合わせの条件からの一つの反応液には、追加の鋳型は加えなかった。反応液は４０℃で９０分間インキュベーションした。
３％ヌシーブ（Nusieve；商標）アガロース、１％アガロースおよび０．２μｇ／ｍＬ臭化エチジウムの１×ＴＡＥ（４０ｍＭトリス−酢酸、１ｍＭ  ＥＤＴＡ２ナトリウム塩、ｐＨ８．０）からなるゲルで、使用緩衝液を１×ＴＡＥとして、小分けした反応液（５μＬ）を電気泳動によって分析した。分離した核酸生成物を紫外線透視装置で肉眼観察できるようにした。電気泳動後、ＴＥ４２型移動装置を製造業者（Hoeffer Scientific Instruments）の指示通りに用いて、ナイロン膜（Hybond N；商標）上で核酸を電気ブロッティングした。６００ｍＡで１時間あるいは２０ｍＡで終夜にて、１×ＴＡＥ緩衝液中で移動を行った。膜を乾燥させた後、ＵＶ透視装置で２分間、３００ｎｍにて照射することで、核酸を固定した。
次に、［５’−32Ｐ］オリゴヌクレオチドプローブ
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を用いてハイブリッド形成した。０．９Ｍ  ＮａＣｌ、０．０９Ｍクエン酸ナトリウム、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％ポリビニルピロリドン（４００００）、０．１％フィコール（Ficoll（商標）；４０００００）、２５ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．０５％ピロリン酸ナトリウムおよび０．５％ドデシル硫酸ナトリウムを含むハイブリッド形成溶液１ｍＬ当たり１×１０6ｃｐｍの濃度で、標識プローブを加えた。ハイブリッド形成は、５０℃で最低２時間行った。ハイブリッド形成後、１５ｍＭ  ＮａＣｌ、１．５ｍＭクエン酸ナトリウムおよび０．５％ドデシル硫酸ナトリウムを含む溶液中、最初室温で５分間、次に５０℃で３０分間洗浄した。膜を類似の溶液で１回すすぎ、風乾し、プラスチックのラップで覆った。強化スクリーンを有するコダックＸＡＲ−５フィルムを用いて、−７０℃にて必要な露光を行って、オートラジオグラフィーを行った。
反応生成物のブロットハイブリッド形成分析（図７）から、最も特異的な増幅は、リン酸化ＴＲＡＭ第２プライマーおよびＤＮＡリガーゼの両方を含む反応液（組み合わせＤおよびＥ、列２および３）について認められたことを示している。反応液にＤＮＡリガーゼがないと、生アガロースゲルで異なった移動を行う特定生成物の量にかなりの低下が生じる（組み合わせＣ、列２および３）。脱リン酸化ＴＲＡＭ第２プライマーを含み、ＤＮＡリガーゼを含まない反応液の場合、特定生成物は、ハイブリッド形成によってごくわずかに検出されたのみであった（組み合わせＢ、列２および３）。組み合わせＤまたはＥの反応における特定生成物の蓄積は、ＮＡＳＢＡ（商標）第２プライマーを含む反応液（組み合わせＡ、列２および３）におけるものと同等であった。各組み合わせの条件について、鋳型を加えなかった反応液からは、特定生成物は検出されなかった（組み合わせＡ〜Ｅ、列１）。
図７において、以下の列は次の材料を含むものである。
１−鋳型を加えていない。
２，３−鋳型としてのＨＩＶ−１  Ｅ２  ＲＮＡ分子１０4個
Ａ−ＮＡＳＢＡ（商標）
Ｂ−脱リン酸化第２プライマーを含むＴＲＡＭ反応液
Ｃ−リン酸化第２プライマーを含むＴＲＡＭ反応液
Ｄ−リン酸化第２プライマー＋リガーゼ（４００Ｕ、ＮＥＢ）を含むＴＲＡＭ反応液
Ｅ−リン酸化第２プライマー＋リガーゼ（１Ｕ、ＢＲＬ）を含むＴＲＡＭ反応液
実施例３：増幅ＲＮＡ生成物の構造に対する５’リン酸化第２プライマーおよびＤＮＡリガーゼの効果
実施例２の記載に従って、標準反応液を組み合わせた。さらに、標準反応液の２つの組み合わせに、５００ｆｍｏｌ（２０ｎＭ）の第１プライマー、５０ｆｍｏｌ（２ｎＭ）の脱リン酸化ＴＲＡＭ第２プライマーを含有させ、リガーゼを含有させないか（組み合わせＡ）またはＢＲＬからの１単位のＴ４  ＤＮＡリガーゼを含ませるようにした（組み合わせＢ）。さらに、標準反応液の２つの組み合わせに、５００ｆｍｏｌ（２０ｎＭ）の第１プライマー、５０ｆｍｏｌ（２ｎＭ）のリン酸化ＴＲＡＭ第２プライマーを含有させ、リガーゼを含有させないか（組み合わせＣ）またはＢＲＬからの１単位のＴ４  ＤＮＡリガーゼを含ませるようにした（組み合わせＤ）。さらに、標準反応液の一つの対照組み合わせ（組み合わせＮ）には、２００ｎＭのＮＡＳＢＡ（登録商標）第２プライマーおよび２００ｎＭの第１プライマーを含ませた。各組み合わせの条件からの反応液には、実施例１の記載に従って得られたＲＮＡ鋳型分子１０6個を含有させた。反応液は４０℃で９０分間インキュベーションした。
各反応液のＲＮＡ生成物を、第１プライマーを用いる直接ジデオキシ配列決定によって分析した。グラスウール栓を施し、バイオゲル（Bio-gel；商標）Ｐ６０（Bio-Rad；商標）が４０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．２）および５０ｍＭ  ＮａＣｌに入ったもの５００μＬを充填した微量ピペット先端からなるカラムを用いる遠心脱塩によって、反応液少量ずつ（５〜１０μＬ）を精製した。増幅ＲＮＡ生成物を含むカラム（５μＬ）からの溶離液を、８０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１００ｍＭ  ＫＣｌ、１２ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１０ｍＭジチオトレイトールおよび０．５ｐｍｏｌ［５’−32Ｐ］第１プライマーを含む５μＬ混合物に加えた。得られたプライミング混合物を、５０〜６０℃で５分間インキュベーションし、次に５分間かけて室温まで冷却した。ＡＭＶ逆転写酵素１μＬ（１０〜１５単位）を加えた後、アニーリングしたプライミング混合物を２．２μＬずつに小分けし、それぞれ異なったｄＮＴＰ／ｄｄＮＴＰ混合物２μＬを含む４本の試験管に加えた。得られたジデオキシ配列決定反応液を４８℃で１５分間インキュベーションした。次に各反応液に、チェイス（chase）液（０．５ｍＭの各ｄＮＴＰ）２μＬを加え、４８℃でのインキュベーションをさらに１０分間継続した。それぞれの完了した配列決定反応液に、配列決定染料混合物（９５％ホルムアミド、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０５％ブロモフェノールブルーおよび０．０５％キシレンシアノールＦＦ）４μＬおよびＲＮａｓｅ  Ａ  １μＬ（１単位）を加えた。３７℃で１５分間インキュベーションして過剰のＲＮＡを消化させた後、標識ＤＮＡ配列決定生成物を２分間沸騰させ、氷上で急冷した。各サンプルの少量ずつ（２〜２．５μＬ）を標準７％ポリアクリルアミド配列決定ゲルに塗布し、標準的な電気泳動法を用いて分析した。必要な露光時間でコダックＸＡＲ−５フィルムを用いて、オートラジオグラフィーを行った。
増幅ＲＮＡ生成物の配列決定分析は図８に示してある。
図８において、以下の列は以下の材料を含むものである。
Ｐ−増幅領域のプラスミドＤＮＡの配列
Ｎ−ＮＡＳＢＡ（商標）ＲＮＡ生成物の配列
Ａ−脱リン酸化第２プライマーを用いて増幅されたＴＲＡＭ  ＲＮＡ生成物の配列
Ｂ−脱リン酸化第２プライマー＋リガーゼを用いて増幅されたＴＲＡＭ  ＲＮＡ生成物の配列
Ｃ−リン酸化第２プライマーを用いて増幅されたＴＲＡＭ  ＲＮＡ生成物の配列
Ｄ−リン酸化第２プライマー＋リガーゼを用いて増幅されたＴＲＡＭ  ＲＮＡ生成物の配列
増幅ＲＮＡ生成物はそれぞれ加えた鋳型の特定核酸配列を含有していたが、異なる反応液間では、５’末端構造における変化が認められた。リン酸化ＴＲＡＭ第２プライマーおよびＤＮＡリガーゼの両方を含む反応液（組み合わせＤ）は主として、図８における延長生成物Ｘによって示される予想のＲＮＡ生成物を与えた。このＲＮＡ生成物の配列決定分析からは、ＴＲＡＭ第２プライマーの５’末端の３４個の塩基に対して相補的な配列を有する５’末端ステム−ループ構造（図６Ａ）が示唆される。図８の短い方の延長生成物Ｙによって示されるように、このステム−ループ構造は、脱リン酸化ＴＲＡＭ第２プライマーを含む反応液（組み合わせＡおよびＢ）またはＤＮＡリガーゼを含まない反応液（組み合わせＡおよびＣ）からの増幅ＲＮＡ生成物にはほとんどの場合存在しなかった。これらの短い方のＲＮＡ生成物はやはり、Ｔ７プロモーターのプラスセンス配列を含んでおり、図８の延長生成物Ｚによって示された標準ＮＡＳＢＡ（商標）反応液（組み合わせＮ）のＲＮＡ生成物には存在しなかった。そこで、リン酸化ＴＲＡＭ第２プライマーおよびＤＮＡリガーゼのいずれも、ＴＲＡＭ第２プライマーを循環使用せずに増幅することができるＤＮＡ中間体の効率的形成には必要である。
実施例４：ＴＲＡＭにおける第１プライマー濃度の効果
実施例２の記載に従って、標準反応液を組み合わせた。さらに、標準反応液の３つの組み合わせにＴ４  ＤＮＡリガーゼ（ＢＲＬ）１単位および５０ｆｍｏｌ（２ｎＭ）のリン酸化ＴＲＡＭ第２プライマーを含有させ、組み合わせＢについて５ｐｍｏｌ（２００ｎＭ）、組み合わせＣについて５００ｆｍｏｌ（２０ｎＭ）または組み合わせＣについて５０ｆｍｏｌ（２ｎＭ）の量（最終濃度）で第１プライマーを含有させた。さらに、標準反応液の対照組み合わせ（組み合わせＡ）には、５ｐｍｏｌ（２００ｎＭ）のＮＡＳＢＡ（商標）第２プライマーおよび５ｐｍｏｌ（２００ｎＭ）の第１プライマーを含有させた。条件の各組み合わせからの二重反応液には、実施例１の記載に従って得られたＲＮＡ鋳型分子１０6個、１０4個または１０2個を含有させた。条件の各組み合わせからの一つの反応液においては、鋳型を加えなかった。反応液は４０℃で９０分間インキュベーションした。
反応液少量ずつ（５μＬ）を、実施例２の記載に従って、アガロースゲル電気泳動およびブロットハイブリッド形成によって分析した。臭化エチジウム染色生成物を肉眼で観察できるようにすることで（図９）、蓄積された生成物の濃度は反応液中の第１プライマーの量によって決まることが明らかである。
第１プライマーの濃度はさらに、ＸおよびＹによってそれぞれ示されるＲＮＡ生成物およびＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド生成物の相対的蓄積量にも影響する。５ｐｍｏｌ（２０ｎＭ）の第１プライマーを含有する反応液（組み合わせＢ）では豊富なＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドは、５００ｆｍｏｌ（２０ｎＭ）の第１プライマー（組み合わせＣ）を含む反応液では消失していた。ＲＮＡ生成物の濃度はこれらの第１プライマー濃度のいずれによっても影響されなかったが、第１プライマー濃度をさらに低下させて２ｎＭとした場合（組み合わせＤ）、蓄積ＲＮＡ生成物の濃度にそれに比例した低下が生じた。
反応液の一部（例：組み合わせＢ、列１、４、５、６および７；ならびに組み合わせＣ、列１、６および７）には他の生成物が含有されており、それらはＲＮＡ生成物より小さく、オリゴヌクレオチドプローブに対してハイブリッド形成しなかった。これらの非特定生成物は、第１プライマー濃度が相対的に高い反応液または加えた鋳型の濃度が相対的に低い反応液において主要生成物となっていた。例えば、加えた鋳型分子が１０4個である反応液（列４および５）では、非特定生成物は、第１プライマー濃度が２００ｎＭの場合（組み合わせＢ）には支配的であったが、２０ｍＭの場合（組み合わせＣ）ではそうではなかった。同様に、ＮＡＳＢＡ（商標）第２プライマーを含む反応液（組み合わせＡ）における第１プライマー濃度が同じ高さ（２００ｎＭ）である場合、加えた鋳型濃度が分子１０4個以下では（列１、４、５、６および７）非特定生成物が支配的となった。そこで、ＴＲＡＭ第２プライマーとＮＡＳＢＡ（商標）第２プライマーのいずれの場合も、相対的に高い第１プライマー濃度で、非特異的プライマー相互作用が比較的多かった。
非特定生成物と特定生成物の間の競合は、ブロットハイブリッド形成分析からも明らかであった（図１０）。
図９および１０において、以下の列には以下の材料が含まれている。
１−鋳型を加えていない
２，３−鋳型としてのＨＩＶ−１  Ｅ２  ＲＮＡ分子１０6個
４，５−鋳型としてのＨＩＶ−１  Ｅ２  ＲＮＡ分子１０4個
６，７−鋳型としてのＨＩＶ−１  Ｅ２  ＲＮＡ分子１０2個
Ａ−ＮＡＳＢＡ（商標）（第２プライマー＝５ｐｍｏｌ；第１プライマー＝５ｐｍｏｌ）
Ｂ−ＴＲＡＭ（第２プライマー＝５０ｆｍｏｌ；第１プライマー＝５ｐｍｏｌ）
Ｃ−ＴＲＡＭ（第２プライマー＝５０ｆｍｏｌ；第１プライマー＝５００ｆｍｏｌ）
Ｄ−ＴＲＡＭ（第２プライマー＝５０ｆｍｏｌ；第１プライマー＝５０ｆｍｏｌ）
ＮＡＳＢＡ（商標）（組み合わせＡ）とＴＲＡＭ（組み合わせＢ）の両方の第２プライマーにおいて、５ｐｍｏｌ（２００ｎＭ）の第１プライマーを含む反応液では、加えた鋳型分子１０2個はごくわずかに増幅および／または検出されたのみであった。しかしながら、ＴＲＡＭ第２プライマーおよび５００ｆｍｏｌ（２０ｎＭ）の第１プライマー（組み合わせＣ）を含む反応液では、加えた鋳型分子１０2個は、比較的高い信頼性で増幅および／または検出された。第１プライマー濃度をさらに低下させて５０ｆｍｏｌ（２ｎＭ）とすると、生成物収量および感度が低下した（組み合わせＤ）。そこで、５０ｆｍｏｌ（２ｎＭ）のＴＲＡＭ第２プライマーを含有する反応液では、反応液当たり第１プライマーが５００ｆｍｏｌ（２０ｎＭ）の場合に至適な特異的増幅が得られた。
実施例５：ＴＲＡＭにおける第２プライマー濃度の効果
実施例２の記載に従って、標準反応液を組み合わせた。さらに、標準反応液の３つの組み合わせにＴ４  ＤＮＡリガーゼ（ＢＲＬ）１単位および５００ｆｍｏｌ（２０ｎＭ）の第１プライマーを含有させ、組み合わせＢについて５０ｆｍｏｌ（２ｎＭ）、組み合わせＣについて５ｆｍｏｌ（０．２ｎＭ）または組み合わせＣについて０．５ｆｍｏｌ（０．０２ｎＭ）の量でリン酸化ＴＲＡＭ第２プライマーを含有させた。さらに、標準反応液の対照組み合わせ（組み合わせＡ）には、５ｐｍｏｌ（２００ｎＭ）のＮＡＳＢＡ（商標）第２プライマーおよび５ｐｍｏｌ（２００ｎＭ）の第１プライマーを含有させた。条件の各組み合わせからの二重反応液には、実施例１の記載に従って得られたＲＮＡ鋳型分子１０6個、１０4個または１０2個を含有させた。条件の各組み合わせからの一つの反応液においては、鋳型を加えなかった。反応液は４０℃で９０分間インキュベーションした。
反応液少量ずつ（５μＬ）を、実施例２の記載に従って、アガロースゲル電気泳動およびブロットハイブリッド形成によって分析した。臭化エチジウム染色生成物を肉眼で観察できるようにし（図１１）、特異的にハイブリッド形成された生成物のオートラジオグラフィー（図１２）を行うことで、蓄積された生成物の濃度は、反応液中の第２プライマーの量にあまり依存しないことが明らかである。
図１１および１２において、以下の列には以下の材料が含まれている。
１−鋳型を加えていない
２，３−鋳型としてのＨＩＶ−１  Ｅ２  ＲＮＡ分子１０6個
４，５−鋳型としてのＨＩＶ−１  Ｅ２  ＲＮＡ分子１０4個
６，７−鋳型としてのＨＩＶ−１  Ｅ２  ＲＮＡ分子１０2個
Ａ−ＮＡＳＢＡ（商標）（第２プライマー＝５ｐｍｏｌ；第１プライマー＝５ｐｍｏｌ）
Ｂ−ＴＲＡＭ（第２プライマー＝５０ｆｍｏｌ；第１プライマー＝５０ｆｍｏｌ）
Ｃ−ＴＲＡＭ（第２プライマー＝５ｆｍｏｌ；第１プライマー＝５００ｆｍｏｌ）
Ｄ−ＴＲＡＭ（第２プライマー＝０．５ｆｍｏｌ；第１プライマー＝５００ｆｍｏｌ）
５０ｆｍｏｌ（２ｎＭ）のＴＲＡＭ第２プライマーを含む反応液（組み合わせＢ）において最も多くの特定生成物が認められた。加えた鋳型分子が１０2の場合（組み合わせＣ）、ＴＲＡＭ第２プライマーの濃度を低下させて５ｆｍｏｌ（０．２ｎＭ）としても特定生成物の収量および感度で生じた低下はごくわずかであった。しかしながら、０．５ｆｍｏｌ（０．０２ｎＭ）のＴＲＡＭ第２プライマーを含む反応液（組み合わせＣ）では、生成物収量および感度のいずれにも悪影響があった。加えた鋳型分子が１０2個のものに対する増幅および／または検出の感度の低下は、５ｐｍｏｌ（２００ｎＭ）のＮＡＳＢＡ（商標）第２プライマーまたは５０ｆｍｏｌ（２ｎＭ）のＴＲＡＭ第２プライマーを含む反応液（それぞれ組み合わせＡおよび組み合わせＢ）において同様であった。そこで、反応液当たりＴＲＡＭ第２プライマー濃度５０ｍｏｌが最適であり、それとともに、第１プライマーでは５００ｆｍｏｌ（２０ｎＭ）が最適であった。
実施例６：ＴＲＡＭとさらにはＮＡＳＢＡ（商標）に関して至適化されたプライマー濃度を用いた、ＴＲＡＭとＮＡＳＢＡ（商標）との第１の比較の効果
実施例２の記載に従って、標準反応液を組み合わせた。さらに、標準反応液の一つの組み合わせ（「至適化ＴＲＡＭ反応液」と称される）にＴ４  ＤＮＡリガーゼ（ＢＲＬ）１単位と５０ｆｍｏｌ（２０ｎＭ）のリン酸化ＴＲＡＭ第２プライマーおよび５００ｆｍｏｌ（２０ｎＭ）の第１プライマーを含有させた。さらに、標準反応液の別の組み合わせ（組み合わせＡ）には、５０ｆｍｏｌ（２０ｎＭ）のＮＡＳＢＡ（商標）第２プライマーおよび５００ｆｍｏｌ（２０ｎＭ）の第１プライマーを含有させた。条件の各組み合わせからの二重反応液には、実施例１の記載に従って得られたＲＮＡ鋳型分子１０6個、１０4個または１０2個を含有させた。条件の各組み合わせからの一つの反応液においては、鋳型を加えなかった。反応液は４０℃で９０分間インキュベーションした。
反応液少量ずつ（５μＬ）を、実施例２の記載に従って、アガロースゲル電気泳動およびブロットハイブリッド形成によって分析した。臭化エチジウム染色生成物を肉眼で観察できるようにし（図１３）、特異的にハイブリッド形成された生成物のオートラジオグラフィー（図１４）を行うことで、５０ｆｍｏｌ（２０ｎＭ）の第１プライマーを含むＮＡＳＢＡ反応液からは、いかなる添加鋳型濃度でも生成物は検出されなかったことが示される。
図１３および１４において、以下の列には以下の材料が含まれている。
１−鋳型を加えていない
２，３−ＨＩＶ−１  Ｅ２  ＲＮＡ分子１０6個
４，５−ＨＩＶ−１  Ｅ２  ＲＮＡ分子１０4個
６，７−ＨＩＶ−１  Ｅ２  ＲＮＡ分子１０2個
Ａ−ＮＡＳＢＡ（商標）（第２プライマー＝５０ｆｍｏｌ；第１プライマー＝５００ｆｍｏｌ）
Ｂ−ＴＲＡＭ（第２プライマー＝５０ｆｍｏｌ；第１プライマー＝５００ｆｍｏｌ）
逆に、至適化ＴＲＡＭ反応液中でこれら同一プライマー濃度の場合に、添加鋳型分子１０2個に下げても、特定生成物の増幅および検出が生じた。これらの結果は、ＮＡＳＢＡ（商標）法およびＴＲＡＭ法において大きい差のあることを示しており、ＴＲＡＭにおける第２プライマーの特殊な構造の効果が明らかである（図６Ａおよび６Ｂ参照）。
実施例７：ＴＲＡＭ反応生成物の再増幅における第２プライマーの独立性
実施例２および６の記載に従って、それぞれ標準ＮＡＳＢＡ（商標）反応液および至適化ＴＲＡＭ反応液を組み合わせた。各反応液には、実施例１の記載に従って得られたＲＮＡ鋳型分子１０4個を含ませた。反応液は４０℃で９０分間インキュベーションした。インキュベーションした各反応液の一部をＤＮａｓｅ  Ｉで処理して、残留するプライマーを除去した。ＮＡＳＢＡ（商標）反応液およびＴＲＡＭ反応液の両方のＤＮａｓｅ  Ｉ処理部分および未処理部分のいずれについても、１０14までの連続１０倍希釈液を調製した。
実施例２の記載に従って、標準反応液を組み合わせた。さらに標準反応液には、組み合わせＡについて５ｐｍｏｌ（２００ｎＭ）および組み合わせＢについて５００ｆｍｏｌ（２０ｎＭ）という量で、第１プライマーを含有させた。組み合わせＡからの二重反応液には、標準ＮＡＳＢＡ（商標）反応液のＤＮａｓｅ  Ｉ処理部分または未処理部分の１０-11、１０-12、１０-13または１０-14希釈液２μＬずつを含有させた。組み合わせＢからの二重反応液には、至適化ＴＲＡＭ反応液のＤＮａｓｅ  Ｉ処理部分または未処理部分の１０-9、１０-10、１０-11または１０-12希釈液２μＬずつを含有させた。条件の各組み合わせからの一つの反応液においては、鋳型を加えなかった。反応液は４０℃で９０分間インキュベーションした。
反応液少量ずつ（５μＬ）を、実施例２の記載に従って、アガロースゲル電気泳動およびブロットハイブリッド形成によって分析した。臭化エチジウム染色生成物を肉眼で観察できるようにし（図１５）、特異的にハイブリッド形成された生成物のオートラジオグラフィー（図１６）を行うことで、連続希釈およ未処理のＴＲＡＭ生成物は、第１プライマーのみを含有する標準反応液中で増幅され得ることがわかる。
図１５および１６において、以下の列には以下の材料が含まれている。
１−鋳型を加えていない
２，３−鋳型としてのＮＡＳＢＡ（商標）反応液１０-11希釈液２μＬ
４，５−鋳型としてのＮＡＳＢＡ（商標）反応液１０-12希釈液２μＬ
６，７−鋳型としてのＮＡＳＢＡ（商標）反応液１０-13希釈液２μＬ
８，９−鋳型としてのＮＡＳＢＡ（商標）反応液１０-14希釈液２μＬ
１０−鋳型を加えていない
１１，１２−鋳型としてのＴＲＡＭ反応液１０-9希釈液２μＬ
１３，１４−鋳型としてのＴＲＡＭ反応液１０-10希釈液２μＬ
１５，１６−鋳型としてのＴＲＡＭ反応液１０-11希釈液２μＬ
１７，１８−鋳型としてのＴＲＡＭ反応液１０-12希釈液２μＬ
Ａ−第１プライマー５ｐｍｏｌを含み、第２プライマーを含まないＮＡＳＢＡ（商標）反応液
Ｂ−第１プライマー５００ｆｍｏｌを含み、第２プライマーを含まないＴＲＡＭ反応液
Ｐ−陽性ハイブリッド形成対照
特定生成物を、１０-11または１０-12に希釈されていた至適化ＴＲＡＭ反応液の生成物（それぞれ、図１４，組み合わせＢ、列１５および１６；または図１５、組み合わせＢ、列１７および１８）から増幅および検出した。逆に、いずれの希釈液においても、標準ＮＡＳＢＡ（商標）反応液の未処理生成物は、ＮＡＳＢＡ（商標）第２プライマー（組み合わせＡ、列２〜９）がなければ増幅できなかった。ＤＮａｓｅ  Ｉ処理したＮＡＳＢＡ（商標）反応液およびＴＲＡＭ反応液の連続希釈液を用いた場合も、同様の結果が得られた（データは示さなかった）。
ＮＡＳＢＡ（商標）反応液のＲＮＡ生成物は、二本鎖ＤＮＡプロモーターが合成できるプロモーター配列を持たない。むしろ、各サイクルで鋳型として用いて、ＲＮＡ鋳型のＤＮＡ生成物に対する機能的二本鎖プロモーターを再生させなければならない第２プライマーにはプロモーター配列がある。しかしながら、ＴＲＡＭ  ＤＮＡ生成物における末端ステム−ループに関してプロモーターの独特の配置により、プロモーターのマイナスセンス配列を有するＴＲＡＭ  ＲＮＡ生成物の転写が行われる。そのＴＲＡＭ  ＲＮＡ生成物を鋳型として用いて、各サイクルで、プロモーターを含むプライマーを必要とせずに、二本鎖プロモーターを有するＤＮＡ生成物を合成することができる。そこで、増幅の開始によって加えた鋳型から最初のＤＮＡ生成物を形成するには、リン酸化ＴＲＡＭ第２プライマーおよびＤＮＡリガーゼが必要であるが、ＴＲＡＭ反応液のＲＮＡ生成物およびＤＮＡ生成物からの増幅の循環的展開には必要ない。
実施例８：ＴＲＡＭ反応液生成物の再増幅についての第１プライマー依存性
実施例２の記載に従って、標準反応液を組み合わせた。さらに、標準反応液の一つの組み合わせ（組み合わせＢ）には、第１プライマー５００ｆｍｏｌ（２０ｎＭ）を含有させた。標準反応液の別の組み合わせ（組み合わせＡ）には、追加のプライマーは含有させなかった。条件の各組み合わせからの二重反応液には、実施例７の記載に従って得られた至適化ＴＲＡＭ反応液の１０-9、１０-10、１０-11または１０-12希釈液２μＬずつを含有させた。条件の各組み合わせからの一つの反応液においては、鋳型を加えなかった。反応液は４０℃で９０分間インキュベーションした。
反応液少量ずつ（５μＬ）を、実施例２の記載に従って、アガロースゲル電気泳動およびブロットハイブリッド形成によって分析した。臭化エチジウム染色生成物を肉眼で観察できるようにし（図１７）、特異的にハイブリッド形成された生成物のオートラジオグラフィー（図１７）を行うことで、連続希釈ＴＲＡＭ生成物は、プライマーを含まない標準反応液中で増幅できなかったことがわかる（組み合わせＡ、列２〜７）。
図１７および１８において、以下の列には以下の材料が含まれている。
１−鋳型を加えていない
２，３−ＤＮａｓｅ  Ｉ処理ＴＲＡＭ生成物の１０-9希釈液２μＬ
４，５−ＤＮａｓｅ  Ｉ処理ＴＲＡＭ生成物の１０-10希釈液２μＬ
６，７−ＤＮａｓｅ  Ｉ処理ＴＲＡＭ生成物の１０-11希釈液２μＬ
８，９−ＤＮａｓｅ  Ｉ処理ＴＲＡＭ生成物の１０-12希釈液２μＬ
Ａ−第１プライマー５００ｆｍｏｌのみを含むＴＲＡＭ反応液
しかしながら、実施例８で示したように、ＴＲＡＭ反応液の１０-12までの希釈液は、第１プライマーのみを含有する標準反応液中（組み合わせＢ、列２〜７）で効果的に増幅された。そこで、ＴＲＡＭ反応液のＲＮＡ生成物およびＤＮＡ生成物からの増幅の循環的展開には、第１プライマーが必要である。
実施例９：ＴＲＡＭ反応に対するＩＴＰの効果
実施例２および６の記載に従って、それぞれ標準ＮＡＳＢＡ（商標）反応液および至適化ＴＲＡＭ反応液を組み合わせた。さらに、標準ＮＡＳＢＡ（商標）反応液および至適化ＴＲＡＭ反応液の一つの組み合わせを、標準２ｍＭ  ＧＴＰに代えて１ｍＭ  ＧＴＰおよび１ｍＭ  ＩＴＰの混合物と組み合わせた。各反応液には、ニューイングランド・ニュークレア（New England Nuclear; Cambridge MA）から供給の４０μＣｉ［α32Ｐ］ＣＴＰ（３０００Ｃｉ：／ｍｍｏｌ）および実施例１の記載に従って得られたＲＮＡ鋳型分子１０4個を含ませた。反応液は４０℃で９０分間インキュベーションした。
各反応条件における総ＲＮＡ合成レベルは、各反応液のＴＣＡ不溶性放射能の取り込みを測定することで求めた。増幅反応液少量ずつ（５μＬ）を１０ｍＭ  ＥＤＴＡ  ２０μＬ中で反応停止してから氷に入れ、全時点のサンプルを得るまでそれを行った。反応停止サンプルをガラスフィルター円板に塗布し、直ちに、氷冷した５％トリクロロ酢酸（「ＴＣＡ」）−１％ピロリン酸ナトリウムに入れて、時々攪拌しながら１０分間経過させた。氷冷５％ＴＣＡによる５分間の洗浄を２回と、次に９５％エタノールによる追加の洗浄を２回行って、凍結乾燥した。液体シンチレーションカウンターで、放射能を測定した。
表１にまとめた結果は、標準条件下（２ｍＭ  ＧＴＰ）でのＮＡＳＢＡ（商標）反応液からのＲＮＡの量と比較した、各反応条件下で合成されたＲＮＡの絶対量を示している。ＩＴＰを含まない至適化ＴＲＡＭ反応液からのＲＮＡ合成は、標準ＮＡＳＢＡ（商標）反応液から認められた量のわずか３４．５％であった。１ｍＭ  ＩＴＰを１ｍＭ  ＧＴＰに切り換えても、ＮＡＳＢＡ（商標）反応液では効果はなかったが、ＴＲＡＭ反応液での総ＲＮＡ合成レベルをＮＡＳＢＡ（商標）で認められた値の３４．５％から８４％まで上昇させた。ＴＲＡＭ  ＲＮＡ生成物の５’末端ステム−ループは、ＮＡＳＢＡ（商標）ＲＮＡ生成物との最も顕著な相違であり、ＩＴＰによるＲＮＡ合成の促進における相対的相違を説明し得るものである。ＲＮＡ生成物へのＩＴＰ組み込みにより、５’末端ステム−ループが不安定となり、それがＤＮＡコピーの合成時にＡＭＶ逆転写酵素によるそれの置換を促進するものと考えられる。このことは、ＩＴＰを用いた場合または用いない場合で合成されたＴＲＡＭ  ＲＮＡ生成物からのＰ２−プライミングｃＤＮＡ合成によって実験的に明らかになっている。逆転写酵素は、ＩＴＰを含まないＲＮＡの５’末端に対して相補的な配列で、より容易に減衰した。そこで、ＴＲＡＭ反応液中に、１ｍＭ  ＧＴＰとともに１ｍＭ  ＩＴＰを加えることで、転写レベルはＮＡＳＢＡ（商標）のものと同等となった。
0003745774.tif 000004
実施例１０：増幅ＲＮＡ生成物の構造に対するＲＮＡ−ＤＮＡ複合体第２プライマーの効果
図６Ａに開示し実施例１で説明したＴＲＡＭ第２プライマー（配列番号４）を、４４個のデオキシヌクレオチドの３’末端オリゴヌクレオチドセグメントヘリン酸ジエステル結合を介して結合した３４個のリボヌクレオチドの５’末端オリゴヌクレオチドセグメントを有してなる塩基７８個のＲＮＡ−ＤＮＡ複合体オリゴヌクレオチドとして合成した。この複合体ＴＲＡＭ第２プライマーの５’末端はリン酸化されていなかった。
実施例２の記載に従って、標準反応液を組み合わせた。さらに、標準反応液の２つの組み合わせには、第１プライマー５００ｆｍｏｌ（２０ｎＭ）、リン酸化ＴＲＡＭ第２プライマー５０ｆｍｏｌ（２ｎＭ）を含有させ、リガーゼを含有させないか（組み合わせＡ）またはＢＲＬからのＴ４  ＤＮＡリガーゼ１単位（組み合わせＢ）を含有させた。さらに、標準反応液の第３の組み合わせには、第１プライマー５００ｆｍｏｌ（２０ｎＭ）および複合体ＴＲＡＭ第２プライマー５０ｆｍｏｌ（２ｎＭ）を含有させた。条件の各組み合わせからの反応液には、実施例１の記載に従って得られたＲＮＡ鋳型分子１０6個を含有させた。反応液は４０℃で９０分間インキュベーションした。
各反応液のＲＮＡ生成物は、実施例３の記載に従って直接ジデオキシ配列決定によって分析した。増幅ＲＮＡ生成物の配列決定分析を、ｐＧＥＭ３Ｘ−ＨＩＶ  １  Ｅ２からのプラスミドＤＮＡを用いて得られた配列（組み合わせＰ）との比較で図１９に示した。
図１９において、以下の列は以下の材料を含むものである。
Ｐ−増幅領域でのプラスミドＤＮＡの配列
Ａ−リガーゼを用いずに標準第２プライマーを用いて増幅したＴＲＡＭ  ＲＮＡ生成物の配列
Ｂ−リガーゼを用いて標準第２プライマーを用いて増幅したＴＲＡＭ  ＲＮＡ生成物の配列
Ｃ−リガーゼを用いずにＲＮＡ−ＤＮＡ複合体第２プライマーを用いて増幅したＴＲＡＭ  ＲＮＡ生成物の配列
各増幅ＲＮＡ生成物は加えた鋳型の特定核酸配列およびＴ７プロモーターのプラスセンス配列を有していたが、異なる反応液間で、５’末端構造に相違が認められた。ＤＮＡリガーゼを用いないと、リン酸化ＴＲＡＭ第２プライマーのみを含む反応液（組み合わせＡ）は主として、ＴＲＡＭ第２プライマーの５’末端ステム−ループ配列のない図１９の切断ＲＮＡ生成物Ｙを与えた（図８の組み合わせＣと比較）。リン酸化ＴＲＡＭ第２プライマーおよびＤＮＡリガーゼの両方を含む反応液（組み合わせＢ）は主として、図１９の延長生成物Ｘによって示される予想のＲＮＡ生成物を与えた（図８の組み合わせＤと比較）。このＲＮＡ生成物の配列決定分析は、ＴＲＡＭ第２プライマーの５’末端の塩基３４個に対して相補的な配列を有する５’末端ステム−ループ構造を示唆している（図６Ａ）。複合体ＴＲＡＭ第２プライマーを有する反応液（組み合わせＣ）は、同様の長さのＲＮＡ生成物を与えた。このＲＮＡ生成物の配列分析は、複合体ＴＲＡＭ第２プライマーの５’末端の塩基３４個と同一の配列を有する５’末端ステム−ループ構造を示唆している（図６Ａ）。組み合わせＡおよびＢの反応液は、特定核酸配列に加えて、いくつかのプライマー関連の非特定配列を有する。結果は、５’末端オリゴリボヌクレオチド部分を有するＴＲＡＭ第２プライマーの使用が、ＴＲＡＭ第２プライマーの循環的使用を行わずに増幅できるＲＮＡ生成物形成の実行可能な代替法であることを示している。
実施例１１：プライマー不在下での循環的増幅における５’末端ステム−ループを有する第１プライマーの使用
それぞれが図６Ｃおよび図２０Ａの第１プライマー（Ｐ２）配列と同一の塩基２１個の３’末端プライミング配列（配列番号８）を有してなる２個の代替の第１プライマーを合成した。これら代替プライマーのうちの一つであるＰ２．１は、８塩基対二本鎖(pair duplex）によってフランキングされた塩基７個のループに折り畳まれ得る塩基２３個の５’末端配列をさらに有してなる塩基４４個のオリゴデオキシヌクレオチドである（図２０Ｂ、配列番号９）。これらの代替プライマーの第２のものであるＰ２．２は、４塩基対二本鎖によってフランキングされた塩基１個のループに折り畳まれ得る塩基９個の５’末端配列をさらに有してなる塩基３０個のオリゴデオキシヌクレオチドである（図２０Ｃ、配列番号１０）。
実施例２の記載に従って、標準反応液を組み合わせた。さらに、標準反応液の各組み合わせには、リン酸化ＴＲＡＭ第２プライマー５０ｆｍｏｌ（２ｎＭ）およびＴ４  ＤＮＡリガーゼＢＲＬ  １単位を含有させた。さらに、標準反応液の各組み合わせには、第１プライマーＰ２（組み合わせＡ）、Ｐ２．１（組み合わせＢ）またはＰ２．２（組み合わせＣ）を５００ｆｍｏｌ（２０ｎＭ）を含有させた。条件の各組み合わせからの反応液には、実施例１の記載に従って得られたＲＮＡ鋳型分子１０4個を含有させた。反応液は４０℃で９０分間インキュベーションした。インキュベーションした各反応液の一部をＤＮａｓｅ  Ｉで処理して、残留プライマーを除去した。ＮＡＳＢＡ（商標）反応液およびＴＲＡＭ反応液のＤＮａｓｅ  Ｉ処理部分および未処理部分の両方について、１０8までの連続１００倍希釈液を調製した。
実施例２の記載に従って、標準反応液を組み合わせた。標準反応液には、プライマーは加えなかった。二倍反応液には、ＴＲＡＭ反応液の組み合わせのＤＮａｓｅ  I処理部分または未処理部分の１０4、１０6または１０8希釈液２μＬずつを含有させ、各種第１プライマーを用いて実施した。各組み合わせからの一つの反応液には、鋳型を含有させなかった。反応液は４０℃で９０分間インキュベーションした。
反応液少量ずつ（５μＬ）を、実施例２の記載に従って、アガロースゲル電気泳動およびブロットハイブリッド形成によって分析した。臭化エチジウム染色生成物を肉眼で観察できるようにし（図２１）、特異的にハイブリッド形成された生成物のオートラジオグラフィー（図２２）を行うことで、Ｐ２第１プライマー（組み合わせＡ）を用いて増幅したＴＲＡＭ  ＲＮＡ生成物について、プライマー不在下での再増幅は常に１０-4希釈液でのみ認められたことがわかる（図１７および１８の組み合わせＡ参照）。
図２１および２２において、以下の列には以下の材料が含まれている。
１−鋳型を加えていない
２，３−一次ＴＲＡＭ反応液の１０-4希釈液
４，５−一次ＴＲＡＭ反応液の１０-6希釈液
６，７−一次ＴＲＡＭ反応液の１０-8希釈液
Ａ−第１プライマー（Ｐ２）
Ｂ−第１プライマー（Ｐ２．１）
Ｃ−第１プライマー（Ｐ２．２）
逆に、第１プライマーとしてＰ２．１（組み合わせＢ）またはＰ２．２（組み合わせＣ）のいずれかを用いて増幅したＴＲＡＭ  ＲＮＡ生成物は、１０8希釈までプライマー不在下に再増幅することができた。後者の２個の第１プライマーのうち、小さい方のステム−ループ構造を有するＰ２．２は、プライマー不在下で、より有効に増幅され得るＲＮＡ生成物を形成するように思われる。第１プライマーの５’末端配列についてさらに至適化を行うことで、増幅ＲＮＡ生成物の自己プライミング効率をさらに向上させることができると考えられる。そこで、ステム−ループ構造に折り畳まれ得る５’末端配列を有する第１プライマーを用いて、３’末端プライミング配列を有するＲＮＡ生成物を増幅することができる。いったん形成したら、３’末端プライミング配列を有するこれらのＲＮＡ第１鋳型をプライマーを用いずに循環的プロセスで増幅することができる。
以上、本発明者らによって発見または提案された特定の実施態様によって本発明の実施における好ましい態様を盛り込むことで、本発明を説明した。本発明の開示内容を考慮すれば、本発明の所期の範囲から逸脱しない限りにおいて、例示した特定の実施態様において多くの改良および変更を施すことが可能であることは当業者には明らかである。例えば、コドン過剰を理由として、蛋白配列に影響を与えることなく、基礎となるＤＮＡ配列に変更を加えることが可能である。さらに、生理機能の等価性を考慮して、生理活性の種類や量に影響を与えることなく、蛋白構造を変えることが可能である。そのような改良はいずれも、添付の請求の範囲に含まれるべきものである。
0003745774.tif 000005
0003745774.tif 000006
配  列  表
（１）一般情報
（ｉ）出願人
（Ａ）名称：Akzo Nobel N.V.
（Ｂ）通り：Velperweg 76
（Ｃ）市：Arnhem
（Ｅ）国：オランダ
（Ｆ）郵便番号：6824 BM
（ii）発明の名称：末端反復増幅方法
（iii）配列数：１０
（iv）コンピュータ読み取り可能形式
（Ａ）媒体の種類：フロッピーディスク
（Ｂ）コンピュータ：ＩＢＭ  ＰＣ互換機
（Ｃ）オペレーティングシステム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ
（Ｄ）ソフトウェア：PatentIn Release #1.0、バージョン１．２５（ＥＰＯ）
（ｖ）先行出願データ
（Ａ）出願番号：米国08/345505
（Ｂ）出願日：１９９４年１１月２８日
（２）配列番号１についての情報
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：２３塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
（xi）配列：配列番号１
0003745774.tif 000007
（２）配列番号２についての情報
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：１３４塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の種類：ＲＮＡ（ゲノム）
（xi）配列：配列番号２
0003745774.tif 000008
（２）配列番号３についての情報
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：１３４塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の種類：ｃＤＮＡ
（xi）配列：配列番号３
0003745774.tif 000009
（２）配列番号４についての情報
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：７８塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
（xi）配列：配列番号４
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（２）配列番号５についての情報
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：４８塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
（xi）配列：配列番号５
0003745774.tif 000011
（２）配列番号６についての情報
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：２１塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
（xi）配列：配列番号６
0003745774.tif 000012
（２）配列番号７についての情報
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：２９塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
（xi）配列：配列番号７
0003745774.tif 000013
（２）配列番号８についての情報
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：２１塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
（xi）配列：配列番号８
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（２）配列番号９についての情報
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：４４塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
（xi）配列：配列番号９
0003745774.tif 000015
（２）配列番号１０についての情報
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：３０塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
（xi）配列：配列番号１０
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
0003745774.tif 000021
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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