(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ビオチンオペロンを含むプラスミドで形質転換した、β−ヒドロキシノルバリン耐性を有するエシェリヒア・コリＦＥＲＭ  ＢＰ−５６６７または５６６８である微生物。
【請求項２】
請求項１記載の微生物を培地で培養し、培養物中にビオチンを生成蓄積せしめ、これを採取することを特徴とするビオチンの製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は新規スレオニンアナログ耐性微生物およびこれを利用するビオチンの製造法に関する。本発明により得られるビオチンは、医薬品、化粧品の原料、飼料添加物等として用いられる。
【０００２】
【従来の技術】
ビオチン(ビタミンＨ)はビタミンＢ群の一種で、カルボキシル化酵素の補酵素として脂肪酸合成や糖代謝に関与している。このビオチンは、医薬品、化粧品の原料または飼料添加物等として化学合成法により、年間約１０トン製造されているが、その工程が複雑なことから、かなり高価である。一方、発酵法によるビオチンの生産は古くから研究されているが、生産性が低いため実用化されていない。
そこで遺伝子組換え技術を用いてビオチンを製造し、安価なビオチンを提供する方法が期待されている。これらの製造方法に用いられる遺伝子工学的に改良した微生物としては、エシェリヒア(Escherichia)属に属するものとしてα−デヒドロビオチン耐性株(例、特開昭６１−１４９０９１号公報等)などが知られている。これらエシェリヒア属に属する微生物以外のものとして以下の微生物が知られている。例えばバチルス(Bacillus)属に属するものとしては、バチルス・スフェリカスを形質転換し、ついでテノイルトリフルオロアセトン耐性を付与した微生物(特開平４−１１８９４号公報)が、あるいは、セラチア(Serratia)属に属するものとしては、セラチア・マルッセンスＳＢ４１１にエチオニン耐性を付与し、次いでＳ−アミノエチルシステイン耐性を付与し、その後ビオチン遺伝子断片を含む組換えプラスミドで形質転換させた微生物(特開平５−１９９８６７号公報)が、同様にビオチン構造類似物質であるアクチチアジン酸または５−(２−チエニル)−n−吉草酸耐性を付与した形質転換体(特開平２−２７９８０号公報)、ニコチン酸アナログ耐性を付与した形質転換体(特願平６−３１１７７８号)などが知られている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、従来のビオチンの生産方法では、ビオチンの工業的製造には不十分なため、ビオチンの生産性をさらに向上させる生産方法が望まれている。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
ピメリルＣoＡからデチオビオチン（ビオチン前駆体）への主合成経路にＳ−アデノシルメチオニンが必要である。本発明者らは、メチオニンの生合成経路を強化することによって、Ｓ−アデノシルメチオニンの供給系が強化され、デチオビオチンおよびビオチンの蓄積量が向上すると予想した。そこで、メチオニンの生合成経路を強化する目的でビオチン生産菌からスレオニンアナログ耐性株を分離し、デチオビオチンおよびビオチン蓄積量が著しく増大した株を取得した。この知見に基づきさらに鋭意検討した結果、本発明を完成した。
すなわち本発明は、
(１)ビオチンオペロンの一部ないし全部を含むプラスミドを有し、スレオニンアナログ耐性を示す微生物、
(２)微生物が、エシェリヒア(Escherichia)属、バチルス(Bacillus)属、またはセラチア(Serratia)属に属する微生物である上記(１)記載の微生物、
(３)スレオニンアナログが、β−ヒドロキシノルバリンである上記(１)記載の微生物、および
(４)上記(１)記載の微生物を培地で培養し、培養物中にビオチンを生成蓄積せしめ、これを採取することを特徴とするビオチンの製造法を提供するものである。
【０００５】
スレオニンアナログとしては、例えばβ−ヒドロキシノルバリン等が挙げられる。
ビオチンオペロンとしては、例えばエシェリヒア属、バチルス属、セラチア属由来のビオチンオペロン等が挙げられる。エシェリヒア属由来としてはエシェリヒア・コリ(Escherichia coli)由来のビオチンオペロン(特開昭６１−２０２６８６号等)が挙げられる。該ビオチンオペロンには、ビオチン生合成に関与するbioＡ、bioＢ、bioＦ、bioＣ、bioＤの５つの遺伝子がコードされている。また、これらのビオチンオペロンの一部を改変したものも本発明では用いることができ、例えば、エシェリヒア・コリのビオチンオペロンの制御領域およびbioＢ開始コドン近傍のいずれかの塩基配列が野性型に比べて少なくとも１塩基対変異しているもの等が挙げられる。ここでビオチンオペロンの制御領域とは、bioＡとbioＢの間に存在するr鎖を示す配列表の配列番号１、およびより詳細には図１に示す塩基配列のうちbioＢ開始コドンＡＴＧのＡを１として−１番目の塩基対から−８６番目の塩基対までの領域をいい、bioＢ開始コドン近傍とは、bioＢ開始コドンＡＴＧのＡを１として１番目の塩基対から６番目の塩基対までの領域をいう。さらに具体的には、bioＢ開始コドンＡＴＧのＡを１として上流−５３番目、−５番目、下流４番目の少なくともいずれかひとつのＧＣ対がＡＴ対に変異されたもの等が挙げられる(特開平５−２１９９５６号)。
【０００６】
本発明で用いるプラスミドとしては、例えばエシェリヒア属、バチルス属またはセラチア属に属する微生物に保持され、かつ遺伝子が発現できるものが挙げられる。好ましくはエシェリヒア属に属する微生物に保持されているプラスミドである。該プラスミドとしては、例えばpＸＢＡ３１２(エシェリヒア・コリＤＲＫ−３３２３[pＸＢＡ３１２](ＦＥＲＭ  ＢＰ−２１１７)由来、特開平２−５０２０６５号公報)、pＸＢＲＰ３１９[エシェリヒア・コリＭＭ４４／pＸＢＲＰ３１９(ＩＦＯ  １５７２１, ＦＥＲＭ  ＢＰ−４７２４)由来、後述の実施例１参照]、pＡＴ７１(エシェリヒア・コリＨＢ／pＡＴ７１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５６６８）由来)およびそれらの誘導体等が挙げられる。
本発明の微生物としては、ビオチンオペロン生成蓄積能を有する微生物であればよく、例えばエシェリヒア(Escherichia)属、バチルス(Bacillus)属またはセラチア(Serratia)属などに属する微生物が挙げられる。このうちエシェリヒア属に属する微生物が好ましい。該微生物としては、例えばエシェリヒア・コリ(Escherichia coli)などが挙げられ、好ましい例としては後述の実施例で得られたエシェリヒア・コリＨＮＶ１４８／pＸＢＲＰ３１９（ＩＦＯ１５８９４、ＦＥＲＭ  ＢＰ−５６６７）、エシェリヒア・コリＨＢ／pＡＴ７１（ＩＦＯ１５８９５、ＦＥＲＭ  ＢＰ−５６６８）などが挙げられる。
【０００７】
本発明のスレオニンアナログ耐性およびビオチンオペロンの一部ないし全部を含むプラスミドを有する微生物としては、好ましくはスレオニンアナログ耐性およびビオチンオペロンの一部ないし全部を含むプラスミドで形質転換された微生物である。
本発明の微生物は、例えば親株となる微生物にスレオニンアナログ耐性を付与し、得られたスレオニンアナログ耐性株にビオチンオペロンの一部ないし全部を含むプラスミドを導入する、あるいは、親株となる微生物にビオチンオペロンの一部ないし全部を含むプラスミドを導入し、得られた微生物にスレオニンアナログ耐性を付与する、またはビオチンオペロンの一部ないし全部を含むプラスミドを保持している親株となる微生物にスレオニンアナログ耐性を付与することにより得られる。
本発明で用いる親株となる微生物としては、ビオチン生成蓄積能を有する微生物であればいずれでもよく、例えばエシェリヒア(Escherichia)属、バチルス(Bacillus)属またはセラチア(Serratia)属に属する微生物等が挙げられる。エシェリヒア属に属する微生物としては、例えばエシェリヒア・コリ(Escherichia coli)に属する微生物などが挙げられ、具体的にはエシェリヒア・コリ  ＩＦＯ  １４４１０、エシェリヒア・コリ  Ｗ−３１１０(ＩＦＯ  １２７１３)およびその由来株エシェリヒア・コリ  ＤＲ−８５(特開昭６１−２０２６８６号)、エシェリヒア・コリ  ＤＲ−３３２(特開昭６２−１５５０８１号)、エシェリヒア・コリＤＲＫ−３３２３(特表平２−５０２０６５号)、エシェリヒア・コリ  ＢＭ４０６２(特表昭６４−５０００８１号)、後述の参考例で得られたエシェリヒア・コリ  ＭＳ１０／pＸＢＲＰ３１９(ＩＦＯ  １５５７０, ＦＥＲＭ  ＢＰ−４９２７)、エシェリヒア・コリＡＮＡ９１／pＸＢＲＰ３１９(ＩＦＯ１５７７１，ＦＥＲＭ  ＢＰ−４９２８)などが挙げられる。上記のエシェリヒア・コリ  ＩＦＯ  １４４１０およびエシェリヒア・コリ  ＩＦＯ  １２７１３は、リスト・オブ・カルチャーズ(List of Cultures)第９版、１９９２年(ＩＦＯ発行)にそれぞれ収載されている公知株であり、財団法人発酵研究所から入手することができる。
【０００８】
バチルス属に属する微生物としては、例えばバチルス・スフェリカス(Bacillus sphaericus)に属する微生物などが挙げられ、より具体的にはバチルス・スフェリカスＩＦＯ  ３５２５およびその由来株バチルス・スフェリカスＮＺ−８８０２(特開平４−１１８９４号)など挙げられる。上記のバチルス・スフェリカスＩＦＯ  ３５２５は、リスト・オブ・カルチャーズ(List of Cultures)第９版、１９９２年(ＩＦＯ発行)に収載されている公知株であり、財団法人発酵研究所から入手できる。
セラチア属に属する微生物としては、例えばセラチア・マルセッセンス(Serratia  marcescens)に属する微生物などが挙げられ、具体例としてはセラチア・マルセッセンスＳn ４１およびその由来株セラチア・マルセッセンスＴＡ５０２４(特開平２−２７９８０号)、セラチア・マルセッセンスＳＢ４１１およびその由来株セラチア・マルセッセンスＥＴ２、セラチア・マルセッセンスＥＴＡ２３(特開平５−１９９８６７号)などが挙げられる。
上記した微生物は、そのまま用いてもよいが、さらにこれらの変異株を用いてもよい。これらの微生物の中で、ビオチンオペロンの一部ないし全部を含むプラスミドを保持しないものは、必要に応じ、後工程で、ビオチンオペロンの一部ないし全部を含むプラスミドを導入すればよい。
【０００９】
スレオニンアナログ耐性株を得る方法としては、自体公知の方法、例えばＮ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン(Ｎ−methyl−Ｎ'−nitro−Ｎ−nitrosoguanidine, 以下、ＮＴＧと略すこともある)などの薬剤で処理する方法、紫外線で照射する方法などが挙げられる。
次に変異処理した菌体の懸濁液を適当な濃度、例えば親株が生育できない濃度のスレオニンアナログを含む培地(例、寒天平板培地)にまき、生育するコロニーを分離することにより容易にスレオニンアナログ耐性株を得ることができる。
上記の方法で得られたスレオニンアナログ耐性株を培養し、培養上清中のビオチンを定量することによりビオチンの蓄積量が向上した菌を選ぶことができる。ビオチンオペロンの一部ないし全部を含むプラスミドを導入する方法としては、自体公知の方法に従って行えばよい。
まず、ビオチンオペロンの一部ないし全部を含むプラスミドを構築する方法としては自体公知の方法、例えば、制限酵素によるＤＮＡの切断、Ｔ４ＤＮＡリガーゼによるＤＮＡの結合などを行い、目的とするプラスミドを構築する方法[モレキュラー・クローニング，ア・ラボラトリー・マニュアル・コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー(Molecular Clonig, A Laboratory Manual, Cold Spring Habor Laboratory)１９８２]等が挙げられる。上記のプラスミドを用いて宿主細菌を形質転換する方法としては、自体公知の方法、例えばエシェリヒア属に属する細菌を宿主とする場合は、上記のモレキュラー・クローニング，ア・ラボラトリー・マニュアル・コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー(Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Habor Laboratory), １９８２に記載されている方法等が挙げられる。上記の方法でスレオニンアナログ耐性微生物が得られるが、これらの微生物はそのまま用いても良いが、さらに変異処理したり、プラスミドを改良したものを用いても良い。
【００１０】
上記の方法により得られた本発明の微生物を培地で培養し、ビオチンを培地に生成させる。
本発明の培養に用いられる培地は、用いられる微生物が利用し得る栄養源を含むものなら、液状でも固状でもよいが、大量に処理するとこには液体培地を用いるのがより適当である。培地には同化し得る炭素源、消化し得る窒素源、無機物質、微量栄養素等が適宜配合される。炭素源としては、例えばブドウ糖、乳糖、ショ糖、麦芽糖、デキストリン、澱粉、マンニトール、ソルビトール、グリセロール、油脂類(例、大豆油、オリーブ油、ヌカ油、ごま油、ラード油、チキン油など)、各種脂肪酸(例、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸など)等が用いられる。窒素源としては、例えば肉エキス、酵母エキス、乾燥酵母、大豆粉、脱脂大豆粉、コーンスチープリカー、ペプトン、綿実粉、癈糖蜜、尿素、チオ尿素、アンモニア、アンモニウム塩類(例、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、酢酸アンモニウムなど)等が用いられる。さらにナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなどを含む塩類、鉄、マンガン、亜鉛、コバルト、ニッケルなどの金属塩類、リン酸、ホウ酸などの塩類、酢酸、プロピオン酸などの有機酸の塩類が適宜用いられる。さらに、アミノ酸(例、グルタミン酸、アスパラギン酸、アラニン、リジン、バリン、メチオニン、プロリン等)、ペプチド(例、ジペプチド、トリペプチド等)、ビタミン類(例、Ｂ1、Ｂ2、ニコチン酸、Ｂ12、Ｃ等)、核酸類(例、プリン、ピリミジンおよびその誘導体)等を用いてもよい。培地のpＨを調節する目的で無機または有機の酸、アルカリ類等を加えてもよく、あるいは消泡の目的で油脂類、表面活性剤等の適量が使用される。培地のpＨは約４〜１０が好ましく、特にpＨ約６〜９が好ましい。
【００１１】
培養の手段としては静置培養、振とう培養、通気撹拌培養のいずれでもよい。大量の培養の際は通気撹拌培養が好ましい。培養の温度は１５〜４２℃、好ましくは３０〜３７℃である。培養時間は培養条件によって適宜選択されるが１〜１０日、好ましくは２〜４日である。
培養方法としては自体公知の方法、例えばバッチ培養、フィード培養などが挙げられる。
得られた培養液を遠心分離し、その上清に蓄積されたビオチンを定量する。ビオチンの定量方法としては、自体公知の方法に従えばよく、例えば、ラクトバチルス・プランタルム(Lactobacillus plantarum)を定量菌とするバイオアッセイ法(「ザ・ビタミンズ」(The Vitamins),  第７巻、３０３頁(１９６７)、「ビタミン学、実験法[ＩＩ]」４７５頁、日本ビタミン学会編(１９８５年)等)等が挙げられる。
上記の方法で微生物を培養し、培養物中にビオチンを生成蓄積させ、次のこの培養物からビオチンを採取する。生成したビオチンは主として培養濾液中に存在するので、培養液を自体公知の方法(例、濾過、遠心分離等)により濾液と菌体を分離し、得られた濾液からビオチンを分離、精製するのが有利である。また、培養液から直接に精製してもよい。
上記の分離、精製する方法としては、例えば、適当な溶媒に対する溶解性および溶解度の差、溶液からの析出法および析出速度の差、種々の吸収親和力の差、イオン交換体によるイオン交換クロマトグラフィーあるいは減圧濃縮、凍結乾燥、結晶化、再結晶、乾燥などの手段が単独あるいは任意の順序に組み合わせて、または反復して利用される。
本発明で得られるビオチンは、医薬品や化粧品の原料、飼料添加物等として使用しうる。
【００１２】
【実施例】
以下に参考例および実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する。培地中の％はＷ／Ｖ％を示す。
下記参考例で得られたエシェリヒア・コリ(Escherichia coli)ＭＳ１０／pＸＢＲＰ３１９およびエシェリヒア・コリ(Escherichia coli)ＡＮＡ９１／pＸＢＲＰ３１９は、１９９４年１２月２日より各々受託番号ＩＦＯ  １５７７０およびＩＦＯ  １５７７１として財団法人発酵研究所(ＩＦＯ)に寄託され、また１９９４年１２月１２日よりブタペスト条約下受託番号  ＦＥＲＭ  ＢＰ−４９２７およびＦＥＲＭ  ＢＰ−４９２８として通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所にそれぞれ寄託されている。
また、下記実施例で得られたエシェリヒア・コリ(Escherichia coli)ＨＮＶ１４８／pＸＢＲＰ３１９およびエシェリヒア・コリ(Escherichia coli)ＨＢ／pＡＴ７１は、１９９５年１０月３０日より、それぞれ受託番号  ＦＥＲＭ  ＢＰ−５６６７およびＦＥＲＭ  ＢＰ−５６６８として通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている。
【００１３】
参考例１
(１)エシェリヒア・コリＤＲＫ−３３２３／pＸＢＡ３１２(ＦＥＲＭ  ＢＰ−２１１７)(特表平２−５０２０６５号)から単離したプラスミドpＸＢＡ３１２(図２参照)を制限酵素ＥcoＲＩで切断した後、ＰstＩで部分分解し、アガロースゲル電気泳動、電気溶出法により完全長のビオチンオペロンを含むＥcoＲＩ−ＰstＩ断片(６.０Ｋbp)を単離した。得られたpＸＢＡ３１２のＥcoＲＩ−ＰstＩ断片とプラスミドpＢＲ３２２のＥcoＲＩ−ＰstＩ断片(３.６Ｋbp)とを連結してプラスミドpＸＢＡ３１９を得た。
プラスミドpＭＷ１１９(ニッポンジーン、日本)を制限酵素ＡatＩＩとＡvaＩで切断後、アガロースゲル電気泳動と電気溶出法により、ＡatＩＩ−ＡvaＩ断片(０.４Ｋbp)を得、次いでブランティングキット(宝酒造、日本)を用いて、ＡatＩＩ−ＡvaＩ断片の両端を平滑化した。得られたＡatＩＩ−ＡvaＩ断片をpＸＢＲ３１９のＳmaＩ部位に連結することによりプラスミドpＸＢＲＰ３１９を得た。
(２)エシェリヒア・コリ  ＩＦＯ  １４４１０[(財)発酵研究所より入手]をＮＴＧで変異処理して得られた優良株に上記(１)で得られたプラスミドpＸＢＲＰ３１９を導入し、さらにＮＴＧで変異処理したのち各種の薬剤耐性株を分離した。この中からビオチン蓄積量が多い菌株を選び、エシェリヒア・コリＭＭ４４／pＸＢＲＰ３１９(ＦＥＲＭ  ＢＰ−４７２４)を得た。
(３)上記(２)で得られたエシェリヒア・コリＭＭ４４／pＸＢＲＰ３１９を２０mlの２xＹＴ培地(酵母エキス１０g／Ｌ、ペプトン１６g／Ｌおよび塩化ナトリウム５g／Ｌ含有)に接種し、３７℃で１６時間振とう培養した。得られた培養液の０.２mlを２０mlの２xＹＴ培地に移し、３７℃で６時間振とう培養した。得られた培養液を遠心分離し、集められた菌体をＴＭ緩衝液(マレイン酸５.０８g／Ｌ、トリス６.０５g／Ｌ、pＨ６.０)で２回洗浄した。この洗浄菌体を２００μg／mlのＮＴＧを含むＴＭ緩衝液に懸濁し、３７℃で２５分間処理した。遠心分離して処理菌体を集め、ＴＭ緩衝液で２回洗浄したのち、同じ緩衝液に懸濁した。得られた懸濁液を、１mg／ml β−クロロ−Ｄ−アラニン、４μg／mlチアミン塩酸塩および２０μg／mlカザミノ酸を含むＭ９最少培地の寒天平板にまき、３７℃で５日間放置することによってβ−クロロ−Ｄ−アラニン耐性株のコロニーが出現し、このうち１株を選び、エシェリヒア・コリＢＤ１０／pＸＢＲＰ３１９(ＦＥＲＭ  ＢＰ−４７２５)を得た。
(４)上記(３)で得られたエシェリヒア・コリ  ＢＤ１０／pＸＢＲＰ３１９(ＦＥＲＭ  ＢＰ−４７２５)をＮＴＧで変異処理したのち各種の薬剤耐性株を分離した。この中からビオチン蓄積量が多い菌株を選び、エシェリヒア・コリＭＳ１０／pＸＢＲＰ３１９を得た。
(５)上記(４)で得られたエシェリヒア・コリＭＳ１０／pＸＢＲＰ３１９を２０mlの２xＹＴ培地(酵母エキス１０g／Ｌ、ペプトン１６g／Ｌおよび塩化ナトリウム５g／Ｌ含有)に接種し、３７℃で１６時間振とう培養した。得られた培養液の０.２mlを２０mlの２xＹＴ培地に移し、３７℃で６時間振とう培養した。得られた培養液を遠心分離し、集められた菌体をＴＭ緩衝液(マレイン酸５.０８g／Ｌ、トリス６.０５g／Ｌ、pＨ６.０)で２回洗浄した。この洗浄菌体を２００μg／mlのＮＴＧを含むＴＭ緩衝液に懸濁し、３７℃で２５分間処理した。遠心分離して処理菌体を集め、ＴＭ緩衝液で２回洗浄したのち、同じ緩衝液に懸濁した。得られた懸濁液を、３０μg／ml ６−アミノニコチンアミド、４μg／mlチアミン塩酸塩および２０μg／mlカザミノ酸を含むＭ９最少培地の寒天平板にまき、３７℃で５日間放置することによって６−アミノニコチンアミド耐性株のコロニーが出現した。このうち１株を選び、エシェリヒア・コリＡＮＡ９１／pＸＢＲＰ３１９と命名した。
【００１４】
参考例２
参考例１で得られたエシェリヒア・コリＡＮＡ９１／pＸＢＲＰ３１９をグルコース２％、炭酸カルシウム１％、コーンスティープリカー４％、硫安０.４％、ＫＨ2ＰＯ4 ０.１％、Ｋ2ＨＰＯ4 ０.２％およびＭgＳＯ4・７Ｈ2Ｏ  ０.０１％からなる種培地(pＨ７.１)３０mlを含む２００ml容ひだ付フラスコで３７℃で１６時間振とう培養した。得られた培養液の０.６mlをグルコース５％、コーンスティープリカー５％、硫安０.２％、ＤＬ−アラニン０.３％、ＫＨ2ＰＯ4 ０.１％、Ｋ2ＨＰＯ4 ０.２％、ＭgＳＯ4・７Ｈ2Ｏ  ０.０１％、ＦeＳＯ4・７Ｈ2Ｏ  ０.００１％、ＭnＳＯ4・４〜６Ｈ2Ｏ  ０.００１％およびチアミン塩酸塩０.００２％からなる種培地(pＨ７.１)３０mlを含む２００ml容ひだ付フラスコに移し、３７℃で３０時間振とう(２２０回転／分)培養した。培養後の培養液を遠心分離し、培養上清中のビオチンを定量したところ、１６０mg／mlのビオチンが蓄積していることがわかった。
【００１５】
実施例１
参考例１で得られたエシェリヒア・コリＡＮＡ９１／pＸＢＲＰ３１９を２０mlの２×ＹＴ培地(酵母エキス１０g／Ｌ、ペプトン１６g／Ｌおよび塩化ナトリウム５g／Ｌ含有)に接種し、３７℃で１６時間振とう培養した。得られた培養液の０.２mlを２０mlの２×ＹＴ培地に移し、３７℃で６時間振とう培養した。得られた培養液を遠心分離し、集められた菌体をＴＭ緩衝液(マレイン酸５.０８g／Ｌ、トリス６.０５g／Ｌ、pＨ６.０)で２回洗浄した。この洗浄菌体を２００μg／mlのＮＴＧを含むＴＭ緩衝液に懸濁し、３７℃で２５分間処理した。遠心分離して処理菌体を集め、ＴＭ緩衝液で２回洗浄したのち、同じ緩衝液に懸濁した。得られた懸濁液を、２g／Ｌのβ−ヒドロキシノルバリンを含むＭ９最少培地の寒天平板にまき、３７℃で５日間放置することによってβ−ヒドロキシノルバリン耐性株のコロニーが出現した。このうち１株を選び、エシェリヒア・コリＨＮＶ１４８／pＸＢＲＰ３１９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５６６７、ＩＦＯ１５８９４）と命名した。
【００１６】
実施例２
実施例１で得られたエシェリヒア・コリＨＮＶ１４８／pＸＢＲＰ３１９をグルコース２％、炭酸カルシウム１％、コーンスティープリカー４％、硫安０.４％、ＫＨ2ＰＯ4 ０.１％、Ｋ2ＨＰＯ4 ０.２％およびＭgＳＯ4・７Ｈ2Ｏ  ０.０１％からなる種培地(pＨ７.１)３０mlを含む２００ml容ひだ付フラスコで３７℃、２２０回転／分で１６時間振とう(２２０回転／分)培養した。得られた培養液の０.６mlをグルコース５％、コーンスティープリカー５％、炭酸カルシウム２％、硫安０.２％、ＤＬ−アラニン０.３％、ＫＨ2ＰＯ4 ０.１％、Ｋ2ＨＰＯ4 ０.２％、ＭgＳＯ4・７Ｈ2Ｏ  ０.０１％、ＦeＳＯ4・７Ｈ2Ｏ  ０.００３％、ＭnＳＯ4・４〜６Ｈ2Ｏ  ０.００３％およびチアミン塩酸塩０.００２％からなる主培地(pＨ７.１)３０mlを含む２００ml容ひだ付フラスコに移し、３７℃で３０時間振とう(２２０回転／分)培養した。培養後、培養液を遠心分離し、得られた培養上清中のビオチン蓄積量をラクトバチルス・プランタルムＩＦＯ  ３０７０を定量菌としてバイオアッセイ法により定量したところ、１７５mg／Ｌであった。親株を同条件下で培養したところ、１６０mg／Ｌに過ぎなかった。
【００１７】
実施例３
実施例１で得られたエシェリヒア・コリＨＮＶ１４８／pＸＢＲＰ３１９をグルコース２％、炭酸カルシウム１％、コーンスティープリカー４％、硫安０.４％、ＫＨ2ＰＯ4 ０.１％、Ｋ2ＨＰＯ4 ０.２％、ＭgＳＯ4・７Ｈ2Ｏ  ０.０１％、ＦeＳＯ4・７Ｈ2Ｏ  ０.０５％、チアミン塩酸塩０.００２％およびテトラサイクリン塩酸塩０.００１２％からなる種培地(pＨ７.１)１２５mlを含む５００ml容ひだ付フラスコで３７℃、２１０回転／分で１６時間振とう培養した。得られた培養液全量をグルコース３％、コーンスティープリカー６％、硫安０.２％、ＫＨ2ＰＯ4  ０.１％、Ｋ2ＨＰＯ4 ０.２％、ＭgＳＯ4・７Ｈ2Ｏ  ０.０２％、ＤＬ−アラニン０.３％、ＭnＳＯ4・４〜６Ｈ2Ｏ  ０.００３％、ＦeＳＯ4・７Ｈ2Ｏ  ０.００３％、Ｆe2(ＳＯ4)3・nＨ2Ｏ  ０.０２％、チアミン塩酸塩０.００２％、２５％アンモニア水１.６ml／Ｌおよびアクトコール(武田薬品工業(株)製、消泡剤)０.０２％からなる主培地(pＨ７.１)２.５Ｌに移し、５Ｌ容ジャーファーメンタ中で３７℃、通気量２.５Ｌ／分で培養した。撹拌数は菌体量に比例して、５５０回転から８５０回転まで上昇していき、また、グルコース濃度は０.１から０.５％の範囲になるように６６.７％グルコース水溶液を連続添加した。培養中はpＨが６.５から７.０の範囲になるように２５％アンモニア水で制御し、また、泡がたたないように適宜アクトコールを添加した。このようにして、７２時間培養した結果、ビオチン７１０mg／Ｌを含む培養液が得られた。
【００１８】
実施例４
(１)プラスミドpＡＭＰ７２(特開平５−２１９９５６)を制限酵素ＮcoＩとＥcoＴ２２Ｉで完全分解し、ビオチンオペロンのプロモータを含む１kb断片をアガロースゲル電気泳動で分離、回収した。その一方でpＸＢＲＰ３１９を同様にＮcoＩとＥcoＴ２２Ｉで完全消化し、約１０kbの断片を回収し、先の１kb断片と連結することによりプラスミドpＸＢＲＰ７１を作製した。
(２)(１)で作製したプラスミドpＸＢＲＰ７１を制限酵素ＥcoＲＩとＳalＩで完全消化し、アガロースゲル電気泳動後、ビオチンオペロンを含む７kb断片を得た。
その一方で、プラスミドpＢＲ３２２(宝酒造(株)製)を制限酵素ＡvaＩで完全に分解した後、エタノール沈澱し、ブランティングキット(宝酒造(株)製)で平滑化した。熱失活後、制限酵素ＥcoＲＩで完全消化し、アガロースゲル電気泳動で分離し、テトラサイクリン耐性遺伝子を含む１．４kb断片を得た。また、プラスミドpＳＴＶ２８(宝酒造(株)製)を制限酵素ＸmnＩとＳalＩで完全消化し、複製開始点を含む１．１kb断片を得た。以上で得られた３断片を連結し、プラスミドpＡＴ７１を作製した。
(３)実施例１で得たエシェリヒア・コリＨＮＶ１４８／pＸＢＲＰ３１９から継代培養でプラスミドpＸＢＲＰ３１９が脱落した株、ＨＮＶ１４８を得た。得られたＨＮＶ１４８をチアミンを含まないＭ９最少寒天平板培地にまき、３７℃で４日間放置することによって、チアミン非要求性株を得た。このうちの１株を選び、エシェリヒア・コリＨＢと命名した。
(４)(３)で得られたエシェリヒア・コリＨＢ株に(２)で作製したプラスミドpＡＴ７１を導入し、エシェリヒア・コリＨＢ／pＡＴ７１（ＩＦＯ１５８９５）を得た。
【００１９】
実施例５
実施例４で得られたエシェリヒア・コリＨＢ／pＡＴ７１をグルコース２％、炭酸カルシウム１％、コーンスティープリカー４％、硫安０.４％、ＫＨ2ＰＯ4０.１％、Ｋ2ＨＰＯ4 ０.２％およびＭgＳＯ4・７Ｈ2Ｏ  ０.０１％からなる種培地(pＨ７.１)３０mlを含む２００ml容ひだ付フラスコで３７℃、２２０回転／分で１６時間振とう培養した。得られた培養液の０.６mlをグルコース５％、コーンスティープリカー５％、炭酸カルシウム２％、硫安０.２％、ＤＬ−アラニン０.３％、ＫＨ2ＰＯ4 ０.１％、Ｋ2ＨＰＯ4 ０.２％、ＭgＳＯ4・７Ｈ2Ｏ  ０.０１％、ＦeＳＯ4・７Ｈ2Ｏ  ０.００３％、ＭnＳＯ4・４〜６Ｈ2Ｏ  ０.００３％およびチアミン塩酸塩０.００２％からなる主培地(pＨ７.１)３０mlを含む２００ml容ひだ付フラスコに移し、３７℃、２２０回転／分で３０時間振とう培養した。培養後、培養液を遠心分離し、得られた培養上清中のビオチン蓄積量を定量したところ、２００mg／Ｌであった。
【００２０】
実施例６
実施例４で得られたエシェリヒア・コリＨＢ／pＡＴ７１をグルコース２％、炭酸カルシウム１％、コーンスティープリカー４％、硫安０.４％、ＫＨ2ＰＯ4０.１％、Ｋ2ＨＰＯ4 ０.２％、ＭgＳＯ4・７Ｈ2Ｏ  ０.０１％、ＦeＳＯ4・７Ｈ2Ｏ  ０.０５％、チアミン塩酸塩０.００２％およびテトラサイクリン塩酸塩０.００１２％からなる種培地(pＨ７.１)１２５mlを含む５００ml容ひだ付フラスコで３７℃、２１０回転／分で１６時間振とう培養した。得られた培養液全量をグルコース３％、コーンスティープリカー６％、硫安０.２％、ＫＨ2ＰＯ4 ０.１％、Ｋ2ＨＰＯ4 ０.２％、ＭgＳＯ4・７Ｈ2Ｏ  ０.０５％、ＤＬ−アラニン０.３％、ＭnＳＯ4・４〜６Ｈ2Ｏ  ０.００３％、ＦeＳＯ4・７Ｈ2Ｏ  ０.００３％、Ｆe2(ＳＯ4)3・nＨ2Ｏ  ０.１％、クエン酸カルシウム１％、チアミン塩酸塩０.００２％、２５％アンモニア水１.６ml／Ｌおよびアクトコール(武田薬品工業(株)製、消泡剤)０.０２％からなる主培地(pＨ７.１)２.５Ｌに移し、５Ｌ容ジャーファーメンタ中で３７℃、通気量２.５Ｌ／分で培養した。撹拌数は菌体量に比例して、５５０回転から９５０回転まで上昇していき、また、グルコース濃度は０.１から０.５％の範囲になるように６６.７％グルコース水溶液を連続添加した。培養中はpＨが６.５から７.０の範囲になるように２５％アンモニア水と３０％水酸化カリウム水溶液で制御し、また、泡がたたないようにアクトコールを適宜添加した。また、培養２４時間目から７２時間目にかけて、１.２５％のクエン酸第２鉄３００mlをフィードした。このようにして、８２時間培養した結果、９７０mg／Ｌのビオチンが蓄積した。
【００２１】
【発明の効果】
本発明の微生物は優れたビオチン生産能を有しており、この微生物を培養することにより、ビオチンを大量に生産することができる。
【００２２】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  ビオチンオペロンの制御領域およびbioＢ開始コドン近傍の塩基配列を示す。
【図２】  プラスミドpＸＢＡ３１２のＤＮＡ
【図１】
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【図２】
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