(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２のアミノ酸配列を有するシュードモナス・アルカリゲネスのリパーゼまたはシュードモナス・アルカリゲネス（ＣＢＳ４７３．８５）のリパーゼである天然リパーゼの改変機能型である変異リパーゼであって、配列番号２のアミノ酸配列の下記の位置に少なくとも１つのアミノ酸置換を有し、前記天然リパーゼと比較して界面活性剤耐性が高められていることを特徴とする変異リパーゼ：
0003851656.tif 000017
【請求項２】
配列番号２のアミノ酸配列の下記の位置に少なくとも１つのアミノ酸置換を有することを特徴とする請求の範囲第１項記載の変異リパーゼ：
0003851656.tif 000018
【請求項３】
配列番号２のアミノ酸配列中に下記のアミノ酸配列の少なくとも１つを有することを特徴とする請求の範囲第２項記載の変異リパーゼ：
0003851656.tif 000019
【請求項４】
請求の範囲第１項または第２項に記載のアミノ酸位置の１つが改変されていることを特徴とする請求の範囲第１項から第３項何れか１項記載の変異リパーゼ。
【請求項５】
配列番号２のアミノ酸配列のＭｅｔ２１位置に付加的な変異を有することを特徴とする請求の範囲第１項から第４項何れか１項記載の変異リパーゼ。
【請求項６】
請求の範囲第１項から第５項何れか１項記載の変異リパーゼを含有することを特徴とする洗剤組成物。
【請求項７】
請求の範囲第１項から第５項何れか１項記載の変異リパーゼをコードする組換えＤＮＡ分子。
【請求項８】
前記変異リパーゼのコード配列が発現制御配列と操作可能に連結されている発現ベクターの形態であることを特徴とする請求の範囲第７項記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項９】
請求の範囲第７項または第８項記載の組換えＤＮＡを含む宿主細胞。
【請求項１０】
リパーゼ欠損シュードモナス株であることを特徴とする請求の範囲第９項記載の宿主細胞。
【請求項１１】
リパーゼをコードするＤＮＡ中に少なくとも１つの適当なコドン変化を導入するように部位特異的変異が行われることを特徴とする請求の範囲第７項記載の組換えＤＮＡ分子の調製方法。
【請求項１２】
リパーゼの発現を指令可能な組換えＤＮＡを含む請求の範囲第９項または第１０項記載の宿主細胞を、リパーゼが産生され得る条件下で培養する工程を含むことを特徴とする請求の範囲第１項から第５項何れか１項記載の変異リパーゼを調製する方法。
【請求項１３】
リパーゼのアミノ酸配列の適当な変化を達成するために化学修飾が用いられることを特徴とする、請求の範囲第１項から第５項何れか１項記載の変異リパーゼを調製する方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は、リパーゼの安定性を高めるようにリパーゼを改変する方法に関する。特に、界面活性剤に対する改善された耐性を有し、洗剤組成物において用いられるリパーゼに関する。
リパーゼは脂質を加水分解可能な酵素である。それらは脂肪および油のプロセシング、洗浄目的のための洗剤組成物および診断用試薬等、幅広い範囲の用途に於いて用いらている。
細胞外リパーゼ（トリアシルグリセロール  アシルヒドロラーゼ、Ｅ．Ｃ．３．１．１．３）は数多くの種の微生物によって製造されている。単離された微生物リパーゼは、例えば米国特許番号第３９５０２７７号に開示されている。これらのリパーゼは例えばシュードモナス（Pseudomonas）、アスペルギルス（Aspergillus）、ニューモコッカス（Pneumococcus）、スタフィロコッカス（Staphylococcus）、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Mycobacterium tuberculosis）、マイコトルーラ・リポリティカ（Mycotorula lipolytica）およびスクレロチニア（Sclerotinia）等の多様な微生物から得られている。
多様な微生物由来のリパーゼの洗剤組成物中での利用の例は、例えばＥＰ４６３１００（シュードモナス・シュードアルカリゲネス(Pseudomonas pseudoalcaligenes)）、ＥＰ０２１８２７２（シュードモナス・シュードアルカリゲネス）、ＥＰ０２１４７６１（シュードモナス・セパシア(Pseudomonas cepacia)）、ＥＰ０２５８０６８（サーモマイセス(Thermomyces)）およびＥＰ２０６３９０（シュードモナス・クロモバクター(Pseudomonas chromobacter)、シュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)、シュードモナス・フラギ(Pseudomonas fragi)、シュードモナス・ニトロリダクタンス(Pseudomonas nitroreductans)、シュードモナス・グラディオリ(Pseudomonas gladioli)、クロモバクター・ビスコサム(Chromobacter viscosum)）に提供されている。
特に、シュードモナスのリパーゼは、既知の所望のリパーゼの用途にとって好ましい特徴を有している。シュードモナスの種は、それ故、リパーゼを得るために幅広く用いられてきた。いくつかのシュードモナスのリパーゼはクローン化されており、それによって同種又は異種の宿主中でのこれらのリパーゼの発酵収量を高めることが可能となった。リパーゼ遺伝子のクローン化が報告されているシュードモナスの例としては：シュードモナス・セパシア（ＥＰ３３１３７６）、シュードモナス・グルマエ(Pseudomonas glumae)（ＥＰ４６４９２２）、シュードモナス・アルカリゲネス（ＥＰ３３４４６２）およびシュードモナス・フラギ、（ＥＰ３１８７７５）が挙げられる。洗剤組成物の１成分としての利用のためには、リパーゼは他の全ての成分に対して耐性であることが望ましい。例えば、シュードモナス・グルマエ由来のリパーゼを、メチオニンを他の１９の自然界で生成されうる他のアミノ酸の１つで置換することにより、洗剤組成物中の酸化成分に対して安定化させることが可能であることが示されている（ＥＰ４０７２２５）。
他の文書では、同じリパーゼを、洗剤組成物のプロテアーゼ成分によるタンパク質分解に対して安定化させることが記載されている（Ｆｒｅｎｋｅｎ、Ｌ．Ｇ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ６（１９９３）６３７−６４２）。
他の重要な安定化の問題は、アニオン性、カチオン性もしくは非イオン性界面活性剤分子による変性に対する酵素の感受性である。アニオン性界面活性剤分子（例えばラウリル硫酸、ドデシル硫酸等）は、疎水性脂肪族部分と、例えばスルホン酸基等の負に荷電した親水性部分とを有する両親和性分子である。カチオン性界面活性剤分子は、負に荷電したスルホン酸基の代わりに第４アンモニウム基等の正に荷電した原子団を有し、非イオン性のものにおいては分子の親水性部分は極性ではあるが荷電していないアルコール基等の原子団である。
本発明は、界面活性剤の存在下でのリパーゼの安定性の欠如の問題を解決する。特に、一つの態様においては、本発明は、界面活性剤耐性を高めるため、天然リパーゼもしくはその一部と比較して、表面またはその近傍で１以上のアミノ酸の置換を有する天然リパーゼの改変機能型あるいはその機能性部分を提供する。
界面活性剤が誘導するタンパク質の変性が一般に引き起こされるひとつの機構は、界面活性剤分子の疎水性部分が酵素の疎水性核へと進入することである。この過程はタンパク質の三次構造をほどくことにつながり、それによって触媒活性の不可逆的な喪失という結果となる。
我々はリパーゼにおけるこのような過程の開始部位を、例えば対応する天然ＤＮＡコード配列の部位特異的変異によりもたらされる１または少数のアミノ酸置換により、防御または除去可能であることを発見した。我々は、斯くして、リパーゼの界面活性剤に対する耐性を、他の有用な性質を実質的に変化させることなく高めることが可能であることを発見した。
本発明の改変リパーゼは、強力な洗剤において、そのような組成物中に存在する界面活性剤の量と強烈な活性のため、特に有用である。それらはまた自動皿洗い用洗剤中での利用にも非常に適している。
本発明は、組換えＤＮＡ技術によって生成された変異リパーゼを参照することによってより明確に説明されるが、当業者には、本発明のリパーゼを生成するための必要な１以上のアミノ酸修飾が化学修飾によっても達成されることは明白である。
リパーゼではないタンパク質、特に高アルカリプロテアーゼの耐性を同様に高めるための成功した一つの試みが開示されている（ＤＥ４１０６５２５およびＥＰ−Ａ−０５２５６１０）。高アルカリプロテアーゼの場合には、疎水性側鎖を有するアミノ酸残基を極性もしくは荷電側鎖を有するアミノ酸残基で置換することにより、または小さい側鎖を有するアミノ酸残基をより空間を充填する側鎖を有するアミノ酸残基で置換することにより、アニオン性界面活性剤に対する酵素の安定性の改良につながっている。
しかしながら、このような教示を、リパーゼ等の全く異なるクラスの酵素に移植することは不可能である。アミノ酸配列の変化の導入はしばしば、同時に活性の変化にもつながる。さらには、原子レベルでの界面活性剤のスブチリシンおよびリパーゼに対する反応機構は知られておらず完全に異なることもあり得る。故に、アミノ酸置換によるスブチリシンの界面活性剤耐性の改善の成功が、同じ戦略によるリパーゼの界面活性剤耐性の改善の同様な成功を予測するものではなかった。
スブチリシンはリパーゼと相同性を有してはいないので、スブチリシンについての以前の刊行物から、活性を破壊することなく界面活性剤耐性を改良するために、リパーゼにおいてどの残基を改変すべきかを予測することは不可能である。さらに、酵素活性を実質的に変化させることなく、あるいはその安定性を低下させることなく、洗剤組成物中で用いるためのリパーゼに対してどのような変化を成し得るかということに、洗剤組成物の他の成分が影響することもあり得る。
本発明者らは、Ｘ線結晶解析または分子モデル技術により得られた酵素の三次元構造の表面を視覚的に調査することにより、リパーゼの界面活性剤変性の開始サイトを同定することが可能であることを発見した。例えば、そのような開始サイトとは、界面活性剤がその疎水性部分で最初に付着し、続いて酵素の疎水性核に入り込むことが可能である酵素表面の疎水性部分であってもよい。そのような疎水性部分は、荷電しているか又は極性の側鎖を有するアミノ酸残基を導入することにより除去することが可能である。
リパーゼの他の界面活性剤変性の開始サイトは、酵素の表面の空洞である。界面活性剤分子の疎水性部分が空洞を経由して酵素の疎水性核に入り込むことを可能とするためには、そのような空洞は、少なくとも３０ｎｍの直径を有していなければならない。この型の空洞の界面活性剤分子への接触性は、少なくとも空洞を満たすかまたは入口をカバーする、より多くの空間要求性を有するアミノ酸側鎖を導入することにより減少させることができる。この型の変異は、このように立体障害を通して界面活性剤の疎水性部分による変性を防止する。もし、界面活性剤変性の開始サイトを提供するリパーゼの表面空洞が、主に疎水性側鎖を有するアミノ酸によって取り囲まれている場合は、これらのアミノ酸を極性の又は荷電した側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えることにより、界面活性剤耐性を改善することができる。この型の変異は、酵素の空洞と界面活性剤分子の疎水性部分との間の疎水性接触を弱め、そして、空洞を経由して酵素の疎水性核へ入り込もうとする界面活性剤分子の能力を低下させる。
本発明の他の改変の戦略は、点変異（ｐｏｉｎｔ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ）によるリパーゼ表面電荷の改変である。アニオン性界面活性剤分子のリパーゼ表面への最初の接近は、恐らくは、酵素表面の正に荷電したアルギニンおよびリジン側鎖と界面活性剤分子の負の部分との吸引的静電気的相互作用によって駆動されると考えられる。酵素表面において、正に荷電したアミノ酸側鎖に近接して疎水性部分が存在する場合は、界面活性剤分子は一旦正に荷電した側鎖に引き寄せられ、容易に酵素へ入り込むことができる。本発明の改善手段は、このような正に荷電した側鎖を点変異により、負に荷電した側鎖又は極性ではあるが荷電していない側鎖を有するアミノ酸と置き換えるものである。
数多くの表面での可能な変異のうちのいくつかは、酵素の触媒効率に対して好ましくない影響を有することもあり得る。１つの同定された空洞は、例えば、酵素の外側表面から活性サイトへ水分子を輸送するために必要な溶媒チャンネルであって、活性サイトにおいて水分子はトリグリセリド加水分解反応の基質の１つとして必要とされている。このような空洞におけるアミノ酸置換は、水輸送機能を妨害しそれによりリパーゼ活性を破壊しうる。しかしながら、改変リパーゼを加水分解活性に関して試験し、顕著な活性の減少を示していないものを選択することは容易に可能である。
一般にリパーゼの触媒機構は、通常はいわゆるリッド（ｌｉｄ）で覆われリパーゼの内部において発見されている活性サイト領域に近づいてゆく、両親媒性基質（トリグリセリド）に依存している。このことは恐らく表面から接触可能な疎水性チャンネルによっても起こりうるであろう。
リパーゼの表面の疎水性部分は、酵素とその基質との相互作用についてもまた重要であろう。例えば、リパーゼの最適な機能には、基質の疎水性部分との接触や特定の配向が必要であるかもしれない。極性のまたは荷電した側鎖を有するアミノ酸の導入によるリパーゼの疎水性パターンの妨害は、このように改変されたリパーゼの観察される活性に影響を与えるであろう。
それ故、本発明者等が、リパーゼ分子の加水分解活性を実質的に低下させることなく界面活性剤耐性を改善するように改変させることができる数多くのサイトを同定したことは驚くべきことである。さらに、本発明の変異リパーゼは、改善された洗浄能力を有することが観察された。洗浄用途での酵素の挙動は未だに予測することができない。洗剤酵素における特定の変異が何故変異酵素のより優れた洗浄能力につながるのかを確認することは現在まで不可能であった。より優れた洗浄能力は、酵素の比活性とも、酸化安定性等の他の酵素の性質の改善とも関連していないことが観察された。それ故に、本発明の改変リパーゼが改善された洗浄能力を有していることが判明したのは予想外であった。
さらには、酵素の熱安定性を改善することが知られている変異はまた、酵素のアニオン性界面活性剤に対する安定性も改善することが判明した。これらは、例えば、タンパク質内部の疎水的相互作用を強化する改変である。このような相互作用の酵素の安定性にとっての重要性はモデルシステムにおいて研究されている（Ｊ．Ｔ．Ｋｅｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３３，７８４−７８６（１９８８））。しかしながら、この型の変異は、他の酵素においてはアニオン性界面活性剤に対する安定性にインパクトを与えることは示されていなかった。一般的な安定化の変異の他の型とは、α−ヘリックス中のモデルシステムにおいて安定化するものである（Ｌ．Ｓｅｒｒａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３５６，４５３−４５５（１９９２），Ｓｅｒｒａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７，５４４−５５９（１９９２））。ここでもまた、これらの変異が、洗剤配合物中の界面活性剤に対する高められた耐性を有する酵素につながることは決して証明されてはいなかった。
本発明者等は、配列番号２のシュードモナス・アルカリゲネスのリパーゼ（シュードモナス・アルカリゲネス  Ｍ１（ＣＢＳ  ４７３．８５）のＭ２１Ｌに相当し、現在Ｌｉｐｏｍａｘ（登録商標）として市販されている）の表面上で、本発明による改変によって有用に改変される、界面活性剤変性の開始サイトに関して適切な位置にある以下の残基を同定した：
0003851656.tif 000002
アミノ酸はそれぞれ、それらの１又は３文字コードで省略してある。コードは以下のとおりである：
0003851656.tif 000003
変異に関して用いられた命名法は、以下のとおりであり、Ｋ１０Ｅとは、位置１０においてリジン（ＬＹＳ）がグルタミン酸（ＧＬＵ）で置き換えられたことを意味する。複数の変異は以下のように命名された。Ｋ１０Ｅ／Ｋ８０Ｒとは、位置１０におけるリジン（ＬＹＳ）のグルタミン酸（ＧＬＵ）による置換に加えて位置８０におけるリジン（ＬＹＳ）のアルギニン（ＡＲＧ）による置換を意味する。
配列番号２の上記のアミノ酸残基に関して考えられる置換とは、例えば、小さい荷電していない脂肪族の側鎖を有するアラニン等のアミノ酸残基と、より大きく非極性側鎖を有するアミノ酸との置換、例えば、アラニンとバリン、ロイシン、またはフェニルアラニンとの置換などである。リパーゼ中の適切に選択された位置において非極性側鎖の大きさを大きくすることが望ましい場合には、側鎖の大きさの増大に基づいて、以下の順序で非極性アミノ酸を考慮する：ａｌａ＜ｐｒｏ＜ｖａｌ＜ｌｅｕ＜ｉｌｅ＜ｍｅｔ＜ｐｈｅ＜ｔｒｐ。このような順序は、Ｓ．Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６（１９８７）６４１−６５６に出版されたようなアミノ酸側鎖の接触可能な領域に基づいている。上記の配列番号２のアミノ酸残基のうちの脂肪族残基は、荷電されていない極性の原子団を有するセリン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン、システインもしくはチロシンのようなアミノ酸残基、または荷電した側鎖を有するリジン、アルギニン、ヒスチジン、グルタミン酸およびアスパラギン酸のようなアミノ酸残基で置換されてもよい。本発明によると、配列番号２の荷電していない極性アミノ酸残基は、ｓｅｒ＜ｔｈｒ＜ｃｙｓ＜ａｓｎ＜ｇｌｎ＜ｔｙｒで順序で大きくなる、より空間を充填する荷電していない極性残基、または、グルタミン酸、アスパラギン酸、ヒスチジン、リジンおよびアルギニンのような荷電したアミノ酸残基で置換されてもよい。ここでもまた、前記の配列番号２のアミノ酸残基に関して、正に荷電した側鎖を有するアルギニン、ヒスチジンおよびリジンのようなアミノ酸残基は、極性原子団を有するセリン、アスパラギン、グルタミン、スレオニンおよびチロシンのようなアミノ酸残基、またはアスパラギン酸およびグルタミン酸のような負に荷電した側鎖を有するアミノ酸残基で置換されていてもよい。
配列番号２におけるこのような置換の考慮は、以下のアミノ酸位置の小グループを特別に考慮するために選択することにつながった：
0003851656.tif 000004
特に好ましい本発明の変異リパーゼは、配列番号２のシュードモナス・アルカリゲネスのリパーゼであって、以下のアミノ酸置換を少なくとも１つ有する変異体である：
0003851656.tif 000005
当業者にとっては、相同性、すなわちシュードモナス・アルカリゲネスのリパーゼに対する７０％以上の相同性を有するリパーゼにおいてもまた、改善された界面活性剤耐性を有する機能的リパーゼを得るためにこれに対応する改変を行うことが可能であることは明白である。このような改変は、例えば、Ｍｉｓｓｅｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ７，５２３−５２９（１９９４）に記載されているように、シュードモナス・アルカリゲネスリパーゼのアミノ酸配列を並列させることに基づいて、行うことができる。
上記のシュードモナス・アルカリゲネスリパーゼの改変に関する教示は、このように、シュードモナス・アエルギノーザ(P. aeruginosa)、シュードモナス・グルマエ、シュードモナス・プランタリイ(P. plantarii)、シュードモナス・シュードアルケリゲネス、およびシュードモナス・セパシアのリパーゼ等の、他のシュードモナス属の仲間によって生成されたリパーゼに容易に拡張することが可能である。本発明はまた、例えば、枯草菌(Bacillus subtilis)、バシルス・プミリス(Bacillus pumilis)、およびフミコラ・ラヌギノーサ(Humicola lanuginosa)のリパーゼの機能性変異体にも拡張が可能である。この本発明の目的のために、上記の教示に従った改変のために選ばれるリパーゼは、完全な天然由来のリパーゼ、酵素的に活性なリパーゼ断片およびその機能性派生体から選択されてもよい。
更なる面においては、本発明は付加的に、前述されたように組換えＤＮＡ技術による改変リパーゼの製造手段を提供する。かくして、本発明は、本発明の改変リパーゼをコードする組換えＤＮＡ、改変リパーゼのコード配列が使用可能に発現制御配列に連結された発現ベクターを含む組換えＤＮＡ、およびそのようなＤＮＡを含む形質転換細胞にも拡張している。
以前に示されたように、部位特異的変異は、本発明の組換えＤＮＡのためのリパーゼをコードしている配列を得るための１つの方法であるが、別の方法もまた当業者には公知であろう。本発明の目的のための部位特異的変異は、多様な公知技術を用いた従来の方法で行われてもよい。
組換え技術分野の当業者は、本発明の変異リパーゼを発現するためのベクターおよび宿主細胞を選択する方法を理解するであろう。このようなリパーゼを発現するためのベクターは、幅広い宿主域ベクターであり、好ましくはＲＳＦ１０１０の派生体、特にｐ２４  Ａ２  ａ（図４を参照）またはその機能的相同体である。本発明のリパーゼを発現するための好適な細胞はシュードモナス細胞であり、好ましくはシュードモナス・アルカリゲネス細胞、特に好適にはリパーゼ欠損シュードモナス・アルカリゲネスの派生体である。シュードモナス・アルカリゲネスのリパーゼ遺伝子は従来の技術で不活性化されてもよい。以下の実施例では、ＰＳ６００と命名された、１つの特定のシュードモナス・アルカリゲネスのリパーゼ欠損株が記載されている。しかしながら、本発明のリパーゼの生産のために宿主として適当な他のリパーゼ欠損シュードモナス株を用意するために同様の戦略が用いられ得ることは理解されている。
このように、更なる面においては、本発明は以前に記述されたように、宿主細胞、例えば細胞中で所望のリパーゼの発現を指揮可能な好ましくは発現ベクターである組換えＤＮＡを有するリパーゼ欠損シュードモナス・アルカリゲネス細胞を、リパーゼが生産される条件下で培養することからなる変異リパーゼの調製方法を提供する。
勿論、以前に記述されたように変異リパーゼの洗剤組成物の配合物中での利用およびその結果得られる洗剤組成物それ自体も、本発明の一部分である。このような洗剤組成物は、本発明のリパーゼに加えて、数多くの従来の洗剤組成物成分を含むであろう。粉末洗剤は一般に、ビルダー（例えばゼオライト、リン酸）、界面活性剤（例えばアニオン性、非イオン性）、ポリマー（例えばアクリル性）、漂白剤前駆体（例えばホウ酸）、漂白剤活性剤、構造形成体（ｓｔｒｕｃｔｕｒａｎｔｓ）（例えばケイ酸）およびｐＨ調整組成物（例えばアルカリ）を含有する。液体洗剤は一般に、界面活性剤（例えばアニオン性、非イオン性）、漂白剤前駆体（例えばホウ酸）漂白剤活性剤およびｐＨ調整組成物（例えばアルカリ）を含有する。リパーゼ以外の酵素（例えばプロテアーゼ、アルファアミラーゼ）、有機酸、無機塩および軟化剤を含む他の成分が、このような組成物中に取り込まれてもよい。
【図面の簡単な説明】
図１はシュードモナス・アルカリゲネス由来のＭ２１ＬリパーゼのＤＮＡ配列を示す。本発明に従った置換に好ましいアミノ酸位置は下線がされている。同じ配列が配列番号１および配列番号２にも示されている。
図２は大腸菌(E. coli)においてシュードモナス・アルカリゲネスリパーゼ遺伝子の部位特異的変異を行うために構築されたツインベクターを示す。
図３ａはシュードモナス・アルカリゲネスの染色体へのプラスミドｐＢＲ−ｆｌａｎｋの組込みを示す。
図３ｂはシュードモナス・アルカリゲネスの染色体からのリパーゼ遺伝子を除去する組換え事象を示す。
図４はリパーゼ欠損シュードモナス・アルカリゲネスＰｓ６００株等のシュードモナス・アルカリゲネスリパーゼから派生した本発明の変異リパーゼの発現に好適なベクターを示す。
図５は本発明の改変リパーゼ活性のＨＰＬＣ試験を示す。観察されたトリオレイン、遊離脂肪酸、１，３ジアシルグリセリドおよび１，２ジアシルグリセリドの保持時間はそれぞれ１．２２分、１．６２分、２．４６分および３．６分であった。
図６は１回の洗浄工程の後の口紅の除去へのリパーゼ添加の効果を示す。
実施例
部位特異的変異による変異の導入
ｐＭＡ／Ｃ変異システムを用いて、ＷＯ９１／００３５３に記載されているように変異を導入した。このツインベクターシステム中に、リパーゼ遺伝子及びリパーゼ補助遺伝子を含む２．４ｋｂの断片をクローン化した。上述のベクターに、二次変異の可能性を最小化するために、適当な制限サイトを導入した。その結果生成されたベクターをｐＭＡｌｉｐｏ（図２ａ）およびｐＭＣｌｉｐｏ（図２ｂ）と称した。
多量の変異酵素を生産するため、変異遺伝子はマルチコピープラスミド中にクローン化し、以下に記述するようにＰｓ６００と命名されたシュードモナス・アルカリゲネスリパーゼ欠損株中に形質転換した。
リパーゼ欠損シュードモナス・アルカリゲネス株Ｐｓ６００の構築
シュードモナス・アルカリゲネス中では複製されないが他の微生物中では複製されることが可能な、自殺組込みプラスミドを、シュードモナス・アルカリゲネス染色体中のリパーゼ遺伝子を不活性化するために用いた。
リパーゼ含有遺伝子断片を、プラスミドｐＴＭＰｖ１８から、大腸菌では複製されるがシュードモナス・アルカリゲネスでは複製されないプラスミドｐＢＲ３２２（Ｂｏｌｉｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  Ｇｅｎｅ  ２（１９７７）９５−１１３）ヘサブクローン化した。続いて、プラスミドから内部配列を除いた。その結果得られたプラスミドをｐＢＲｆｌａｎｋと称した。
シュードモナス・アルカリゲネス  Ｍ１（ＣＢＳ  ４７３．８５）を、ｐＢＲｆｌａｎｋで形質転換した。このプラスミドはシュードモナスにおいては複製されないので、テトラサイクリン耐性コロニーは組込みによってのみ得られる。幾つかのテトラサイクリン耐性（５ｍｇ／ｌ）コロニーを選択した。これらの株においては、プラスミドｐＢＲｆｌａｎｋは、細菌染色体中に５’または３’隣接領域での単一組換え事象により組み込まれている。これらの菌株はまだ機能的リパーゼ遺伝子を含んでいるので、それらはリパーゼ生産性でテトラサイクリン耐性表現型を示す。幾つかの菌株をさらなる実験のために選択した。リパーゼ遺伝子およびプラスミドを染色体から除去するために、第２の組換え（切り出し）操作を生じさせなくてはならない。このことは抗生物質の不在条件下でＢＨＩ（Ｂｒａｉｎ  Ｈｅａｒｔ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ）培地中で菌株を数日間増殖させることにより達成される。
続いてこれらの細胞をトリブチリンを含む寒天培地にプレートした。リパーゼ欠損表現型を含む菌株は選択用寒天プレートで生育できないことを確認した。このようにして得られたリパーゼ非生産性株をＰｓ６００と命名した。
この、第２の組換えが後に続く組込み操作の模式図は図３ａおよび３ｂに示されている。
変異リパーゼの製造および単離
菌株をＥＰ０３３４６２に記載されたように増殖させた。リパーゼタンパク質を続いて培養液体培地からＥＰ０３３４６２に記載されたように白色粉末として精製した。
洗浄条件下でのリパーゼ活性の同定のためのアッセイ
洗浄工程におけるアルカリリパーゼ活性を評価するためにＳＬＭ試験を用いた。ＳＬＭ試験はＴ．Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｙｕｋａｇａｋｕ  ３４（１９８５）６０６−６１２によって開発された方法と同じ原理を用いているが、分析時間は顕著に減少されている。
方法は、繊維上に固定化されたエマルジョン化されていない脂質またはオイルを試験用の染みとし、洗浄工程で処理した後で１区分を抽出し、そして分析用溶媒で脂質およびリパーゼ活性の結果として生成された脂肪酸を、洗浄工程の後で繊維に残存しているトリグリセリドと同様に抽出した。区分に残された試験生成物の量は、洗浄工程の間のリパーゼの性能のよい尺度であるように思われた。
以下は、ＳＬＭ試験を好ましく行う方法の典型的な例である：
ポリエステルの区分を繊維として用い、トリオレインまたは精製油（ともにシグマ、ＵＳＡの製品）を基質として用いた。トリオレインの加水分解は、溶媒抽出工程の後でクロマトグラフィー的手法により後を追うことができる。
ＳＬＭ試験のために用いられる洗浄工程は好ましくは以下のものである：
１０ｍｇのオリーブオイルを含むｎ−ヘキサン（１２．５％）８０μｌを、ポリエステル区分（３ｘ３ｃｍ）にスポット打ちした。区分は室温で空気乾燥した。１０ｍｌのＳＴＷ（ｓｔａｎｄａｒｄ  ｔａｐ  ｗａｔｅｒ：蒸留水中の２ｍｍ塩化カルシウムおよび０．７ｍＭ塩化マグネシウム）またはＳＴＷに溶解させた洗剤からなる洗浄溶液を、グランドストッパーを有する三角フラスコ（５０ｍｌ）に入れ、振とうウォーターバス中で４０℃で保存した。洗浄工程は、三角フラスコにリパーゼ（４０ＩＬＵ、以下を参照）、その後すぐに続いて染みのついた区分を添加することにより開始した。フラスコは４０分間ウォーターバス中で振とうさせた。対照実験ではリパーゼを添加しなかった。洗浄後、区分をＳＴＷですすぎ、続いて５５℃で乾燥させ、その後第２の洗浄工程を行った。乾燥させた区分を、５ｍｌの、基質と生成物とのクロマトグラフィー分離に用いられた溶出剤と同じ組成を有する溶媒を含むガラス管中で回転させて抽出処理した。
抽出溶液中の脂肪酸および１，２および１，３ジアシルグリセリドの量とともにトリグリセリドの残存量をＨＰＬＣで測定した。
装置と条件：
ポンプ：  ＬＫＢ（モデル２１５０）
検出：  屈折率モニター（Ｊｏｂｉｎ  Ｙｖｏｎ）
注入システム：  パーキンエルマーＩｓｓ−１０１；  １０μｌ
インテグレーター：  スペクトラ・フィジックス（Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｐｈｙｓｉｃｓ）クロムジェット（Ｃｈｒｏｍｊｅｔ）
カラム：  ＣＰマイクロスフェアーＳｉ（ＣＰ−Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒ−Ｓｉ）、（クロムパック；ｃｈｒｏｍｐａｃｋ）、１００ｘ４．６ｍｍ
溶媒：  ｎ−ヘキサン／イソプロピルアルコール／ギ酸：９７５：２５：２．５（Ｖ／Ｖ）、１ｍｌ／ｍｉｎ
温度：  室温（ａｍｂｉｅｎｔ）
これらの条件の下で、トリオレイン、オレイン酸、１，３および１，２ジアシルグリセリドの保持時間（およそ）は、それぞれ１．２、１．６、２．４および３．６分である。ピーク面積及びピークの高さを測定した。それらは、トリオレイン、オレイン酸、１，３および１，２ジアシルグリセリドの区分からの抽出後の収率の尺度である。洗浄されていない区分から抽出したトリグリセリドの回収を１００％とした。上記の条件のもとでオリーブオイル、オレイン酸、１，２および１，３ジアシルグリセリドの間の屈折率反応の比率はピークの高さに基づいて、それぞれ１．００、０．９８、２．１０および１．３０であることが判明した。
リパーゼ活性の決定のためのアッセイ
選択された元のリパーゼおよび本発明の変異体の活性は、ＩＬＵで示されているが、オリーブオイルの加水分解により決定された。加水分解は、２０ｍＭの塩化ナトリウムおよび塩化カルシウムの存在下で０．４ｍＭのｐＨ９のトリスバッファー中に１０％オリーブオイルを含むｐＨスタットを用いて３０℃で測定した。１ＩＬＵは試験条件下で１μｍｏｌｅの脂肪酸を１分間に遊離するために必要な酵素量として定義した。
リパーゼ比活性の決定
野生型および変異リパーゼの比活性を以前に記述されたアッセイ、およびタンパク質含量の定量のための（牛血清アルブミンを標準タンパク質として用いた）Ｐｉｅｒｃｅ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、イリノイ、ＵＳＡ）により商業化されているようなＢＣＡ（ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）タンパク質アッセイを用いて決定した。
安定性試験のための酵素溶液の調整
適量のリパーゼ粉末を、０．１％（ｗ／ｖ）トリトンＸ１００／０．１Ｍ  ＮａＣｌ／１ｍＭ  ＣａＣｌ2に溶解し、約４ｍｇ／ｍｌの酵素の終濃度とした。４℃で２−３時間撹拌したのち、固形沈殿物を遠心分離によって取り除いた。
Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ  ＭＷＣＯ  ３５００膜を用いて、１０１の０．１％（ｗ／ｖ）トリトンＸ−１００／０，１Ｍ  ＮａＣｌ／１ｍＭ  ＣａＣｌ2に対して、２０ｍｌの遠心分離上清を１６−２０時間透析した。この酵素溶液２ｍｌを１８ｍｌのアセトンに溶解し、十分に撹拌し−２０℃で１時間に亘って保存し、酵素を沈殿させた。
溶液を遠心分離し、沈殿を１回１５ｍｌの氷冷アセトンで洗浄した。沈殿を続いて０．１％（Ｗ／Ｖ）トリトンＸ−１００／０．１Ｍ  ＮａＣｌ／１ｍＭ  ＣａＣｌ2に溶解し、酵素の終濃度２ｍｇ／ｍｌとした。
界面活性剤ラウリル硫酸ナトリウム（ＬＡＳ）に対する安定性の決定
０．５ｍｌの調製した酵素溶液を、０．２５ｍｌのトリス／塩酸バッファーｐＨ８．０、０．１５ｍｌの１Ｍ  ＮａＣｌおよび０．６ｍｌのミリＱ水に添加した。この溶液を４０℃で予め保温した。５分後、０．５ｍｌの１０ｍＭ  ＬＡＳを添加し、溶液全体を４０℃で保温した。０．１ｍｌの試料を０、５、１０、２０、３０および４５分間の保温で採取し、０℃で１ｍｌの０．１５Ｍ  トリス／塩酸／２．７ｍＭ  ＣａＣｌ2ｐＨ７．８に添加した。
続いて、残存活性をパラニトロフェニルアセテート法により、Ｖ．Ｋ．Ａｎｔｏｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ  ７０（１９８８），１２３５−１２４４に記載されているように測定した。データを、第１次不可逆変性プロセス（即ちＡ＝Ａ0＊ｅkt）と仮定し、プログラムＧｒａｆｉｔ（Ｌｅａｔｈｅｒｂａｒｒｏｗ，Ｒ．Ｊ．（１９９０）ＧｒａＦｉｔ  バージョン２．０，Ｅｒｉｔｈａｃｕｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｌｔｄ，Ｓｔａｉｎｅｓ  Ｕ．Ｋ．）を用いて暫定的にフィットさせ、このプロセスの比率定数を得た。比率定数から等式ｔ1/2＝ｌｎ２／ｋを用いて半減期を計算した。
酵素の強力液体洗剤（Ｈｅａｖｙ  Ｄｕｔｙ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ；ＨＤＬ）に対する安定性の決定
典型的な酵素を含まないＵＳ型液体洗剤を約４倍に希釈した（１ｇ  ＨＤＬ＋３ｇ  ミリＱ水）。
１．２ｍｌの洗剤希釈液を４０℃で前保温した。５分後に０．３ｍｌの調製した酵素溶液を希釈ＨＤＬに添加した。溶液全体を４０℃で保温した。０．１ｍｌの試料を０、５、１０、２０、３０および４５分間の保温で採取し、０℃で１ｍｌの０．１５Ｍ  トリス／塩酸／２．７ｍＭ  ＣａＣｌ2ｐＨ７．８に添加した。
続いて、残存活性をパラニトロフェニルアセテート法により、Ｖ．Ｋ．Ａｎｔｏｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ  ７０（１９８８），１２３５−１２４４に記載されているように測定した。データを、第１次不可逆変性プロセス（即ちＡ＝Ａ0＊ｅkt）と仮定し、プログラムＧｒａｆｉｔ（Ｌｅａｔｈｅｒｂａｒｒｏｗ，Ｒ．Ｊ．（１９９０）ＧｒａＦｉｔ  バージョン２．０，Ｅｒｉｔｈａｃｕｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｌｔｄ，Ｓｔａｉｎｅｓ  Ｕ．Ｋ．）を用いて暫定的にフィットさせ、このプロセスの比率定数を得た。比率定数から等式ｔ1/2＝ｌｎ２／ｋを用いて半減期を計算した。
実施例１
異なる変異体の比活性の決定
異なる変異リパーゼの比活性を、ここに以前に記述したようにＢＣＡおよびｐＨスタット活性測定法により決定した。
0003851656.tif 000006
表１に見られるように、変異リパーゼの比活性はおよそＬｉｐｏｍａｘ（登録商標）と同程度であった。驚くべきことには、Ｔ２７５ＮおよびＳ２００Ｒ／Ｌ２８６Ｒはより高い比活性を示した。
実施例１、２および３の変異リパーゼとは、配列番号２のシュードモナス・アルカリゲネスリパーゼの派生体である。
実施例２
異なる変異体の半減期の決定
0003851656.tif 000007
変異リパーゼの半減期を以前に記載した方法を用いて決定した。
ほとんどすべての変異体が、これらの条件のもとでは、Ｌｉｐｏｍａｘと比較して改善された、アニオン性界面活性剤に対する耐性を示した。
実施例３
異なる変異体の半減期の決定
0003851656.tif 000008
変異リパーゼの半減期をここに以前に記載した方法を用いて決定した。
ほとんどすべての変異体が、これらの条件のもとでは、Ｌｉｐｏｍａｘと比較して改善された、典型的な商業用液体洗剤に対する耐性を示した。
実施例４
使用条件下でのリパーゼＭ１（ＣＢＳ  ４７３．８５）の変異体のリパーゼ活性（ＳＬＭ試験）
リパーゼＭ１変異体Ｍ２１Ｌ、Ｍ２１Ｌ／Ｋ７８ＥおよびＭ２１Ｌ／Ｖ１９６Ｅを用いたＳＬＭ試験を以前に記載したように行った。以下の条件をこの単一工程洗浄試験において用いた：
−  Ｓｔａｎｄａｒｄ  ｔａｐ  ｗａｔｅｒ（ＳＴＷ）
−  洗剤はＡｒｉｅｌ  Ｕｌｔｒａ（登録商標）（２ｇ／ｌ）
−  リパーゼ使用量は示された通り
Ａｒｉｅｌ  Ｕｌｔｒａ（登録商標）はＰｒｏｃｔｅｒ  ＆  Ｇａｍｂｌｅの製品であり、市販されている。この洗剤はプロテアーゼもリパーゼも含んでいない。
0003851656.tif 000009
この表から、用いられたリパーゼは洗剤の存在下でも繊維上で脂質分解活性を示すように見える。これらの結果は、両方のＬｉｐｏｍａｘ（登録商標）の変異体はＭ２１Ｌリパーゼ（Ｌｉｐｏｍａｘ（登録商標））変異体と比較して、同じ重量を添加した場合に、上記のような使用条件下において、より活性が高いことを明白に示している。
実施例５
ヨーロッパの洗剤を用いたＬａｕｎｄｒ−ｏ−ｍｅｔｅｒ試験による洗浄工程におけるＭ２１ＬおよびＭ２１Ｌ／Ｋ７８Ｅ変異リパーゼの洗浄性能
以下の条件でのＬａｕｎｄｒ−ｏ−ｍｅｔｅｒ試験による洗浄工程における上記の変異リパーゼの洗浄性能を決定した。
−２．５ｍＭ塩化カルシウム水の硬度（ｗａｔｅｒｈａｒｄｎｅｓｓ）
−洗剤はＡｒｉｅｌ  Ｕｌｔｒａ（登録商標）（５ｇ／ｌ）
−０．７５ｍｇ／ｌ  Ｍａｘａｃａｌ（登録商標）
−示された量でのリパーゼ
−洗浄温度は４０℃
−洗浄工程は４０分
−モニターは、ＷＦＫ−Ｔｅｓｔｇｅｗｅｂｅ，Ｋｒｅｆｅｌｄ，ドイツからのポリエステル／コットン上の口紅の染みＬＳ２
Ａｒｉｅｌ  Ｕｌｔｒａ（登録商標）は、Ｐｒｏｃｔｅｒ＆Ｇａｍｂｌｅより市販されている粉末洗剤である。この用いられた洗剤ベースはプロテアーゼもリパーゼも含んではいない。
図６は、付加的なＫ７８Ｅ変異は、このＬｉｐｏｍａｘ（登録商標）の改善された洗浄性能の原因として把握できることを明白に示している。
実施例６
アメリカの洗剤を用いたＬａｕｎｄｒ−ｏ−ｍｅｔｅｒ試験による洗浄工程におけるＭ２１ＬおよびＭ２１Ｌ／Ｋ７８Ｅ変異リパーゼの洗浄性能
用いられた水の硬化が０．７５ｍＭ塩化カルシウムおよび０．２５ｍＭ塩化マグネシウムであるという唯一の変更を加えて、実施例５で示されたシステムにおいて、Ｔｉｄｅ（登録商標）（含有量１．３ｇ／ｌ）存在下での上述の変異リパーゼの洗浄性能を決定した。
Ｔｉｄｅ（登録商標）は、Ｐｒｏｃｔｅｒ＆Ｇａｍｂｌｅより市販されている粉末洗剤である。この用いられた洗剤ベースはプロテアーゼもリパーゼも含んではいない。
0003851656.tif 000010
この表からも、Ｔｉｄｅ（登録商標）の存在下での、Ｍ２１Ｌ／Ｋ７８Ｅ変異リパーゼの、Ｌｉｐｏｍａｘ（登録商標）を越える改善された洗浄性能特性は明白である。
実施例７
モニターとしてバター脂肪を用いた、Ｌａｕｎｄｒ−ｏ−ｍｅｔｅｒ試験による洗浄工程におけるＭ２１ＬおよびＭ２１Ｌ／Ｋ７８Ｅ変異リパーゼの洗浄性能
上記の変異リパーゼの洗浄性能を、Ａｒｉｅｌ  Ｕｌｔｒａ（登録商標）およびＴｉｄｅ（登録商標）両方の存在下で決定した。用いられた条件は実施例５（Ａｒｉｅｌ  Ｕｌｔｒａ；登録商標）および６（Ｔｉｄｅ；登録商標）に記載されている。ポリエステル上のＬＳ４バター脂肪試験モニターは、試験材料センター（Ｖｌａａｒｄｉｎｇｅｎ、オランダ）より入手した。
0003851656.tif 000011
この表は、モニターとしてバター脂肪を用いても、Ｍ２１Ｌ／Ｋ７８Ｅ変異リパーゼは、Ｍ２１Ｌ変異リパーゼ（Ｌｉｐｏｍａｘ）と比較して、改善された洗浄性能を示すことを表している。
実施例８
モニターとして口紅を用いた、Ｌａｕｎｄｒ−ｏ−ｍｅｔｅｒ試験による洗浄工程におけるＭ２１ＬおよびＭ２１Ｌ／Ｖ１９６Ｅ変異リパーゼの洗浄性能
上記の変異リパーゼの洗浄性能を、Ａｒｉｅｌ  Ｕｌｔｒａ（登録商標）およびＴｉｄｅ（登録商標）両方の存在下で、実施例５（Ａｒｉｅｌ  Ｕｌｔｒａ；登録商標）および６（Ｔｉｄｅ；登録商標）に記載された条件で決定した。
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この表から、２重変異体は単一（Ｍ２１Ｌ）変異リパーゼと比較して、とくにＡｒｉｅｌ  Ｕｌｔｒａ（登録商標）の存在下の高い酵素量において、改善された洗浄性能を有すると結論付けることができる。
配列表
（1）一般的情報
（i）出願人
（A）氏名：Gist-brocades b. v.
（B）通り：Wateringseweg 1
（C）町：Delft
（E）国：オランダ
（F）郵便番号：2611 XT
（ii）発明の名称：改善された界面活性剤耐性を有するリパーゼ
（iii）配列の数：２
（iv）コンピューター解読可能型
（A）媒体の型：フロッピーディスク
（B）コンピューター：IBM PC互換
（C）オペレーティング  システム：PC-DOS/MS-DOS
（D）ソフトウェア：PatentIn Release #1.0, Version #1.25(EPO)
（2）配列番号１の情報
（i）配列の特徴
（A）長さ：942塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖：二本鎖
（D）トポロジー：直線状
（ii）分子型：ＤＮＡ（ゲノム）
（iii）仮説上：いいえ
（iii）アンチセンス：いいえ
（vi）起源：
（A）器官：Preudomonas preudoalcaligenes
（B）株：M1
（C）単離体：CBS473.85
（ix）特徴
（A）名称：CDS
（B）所在／キー：1..942
（ix）特徴
（A）名称：sig peptide
（B）所在／キー：1..72
（ix）特徴
（A）名称：mat_peptide
（B）所在／キー：73..942
（C）同定方法：実験による
（D）その他情報：／機能＝“トリアシルグリセロール  リパーゼ”
／EC_number＝3.1.1.3
／製品＝“LIPOMAX”
／証拠＝実験による
／遺伝子＝“lip”
0003851656.tif 000013
（2）配列番号２の情報
（i）配列の特徴
（A）長さ：313アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直線状
（ii）分子型、タンパク質
（xi）配列の記述：配列番号２
0003851656.tif 000014
（xi）配列の記述：配列番号１
0003851656.tif 000015
0003851656.tif 000016
【図１】
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0003851656.tif 000021
【図２】
0003851656.tif 000022
【図３ａ】
0003851656.tif 000023
【図３ｂ】
0003851656.tif 000024
【図４】
0003851656.tif 000025
【図５】
0003851656.tif 000026
【図６】
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