(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式VIの化合物
0003814294.tif 000011
ここで、Ｐは、ペプチド、タンパク質、およびオリゴヌクレオチドからなる群から選択され；Ｒ1は、水素であり；Ｒ2は、脂質基を含む脂質含有部分であり；そしてＲ3は、-OH、脂質基を含む脂質含有部分、あるいは１個または２個のアミノ酸を含み、-CO2Hまたは-COR2で終結するアミノ酸鎖である。
【請求項２】
Ｒ2が脂質基であり、そしてＲ3が-OHである、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｒ2が-CH2CH2CH(NH2)CO2Hまたは-CH2CH2CH(NHCO-脂質)CO-脂質であり、そしてＲ3が-NHCH2CO2Hまたは-NHCH2CO-脂質であり、ここで、Ｒ2およびＲ3の少なくとも１つが脂質基を含む、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
前記脂質基が、約４個〜約26個の炭素原子を含む疎水性置換基である、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
前記脂質基が、約５個〜約19個の炭素原子を含む疎水性置換基である、請求項４に記載の化合物。
【請求項６】
ペプチド、タンパク質、およびオリゴヌクレオチドからなる群から選択される、スルフヒドリル基含有化合物の哺乳動物細胞への吸収を増加させるための薬学的組成物であって、該薬学的組成物が、以下：
一般式VIのスルフヒドリル含有化合物
0003814294.tif 000012
を含有し、ここで、Ｐは、ペプチド、タンパク質、およびオリゴヌクレオチドからなる群から選択されるスルフヒドリル基含有化合物から誘導される部分であり；Ｒ1は水素、低級アルキル、またはアリールであり；Ｒ2は脂質含有部分であり；そしてＲ3は、-OH、脂質含有部分、あるいは１個または２個のアミノ酸を含み、-CO2Hまたは-COR2で終結するアミノ酸鎖である、
薬学的組成物。
【請求項７】
Ｒ2が脂質基であり、そしてＲ3が-OHである、請求項６に記載の薬学的組成物。
【請求項８】
Ｒ2が-CH2CH2CH(NH2)CO2Hまたは-CH2CH2CH(NHCO-脂質)CO-脂質であり、そしてＲ3が-NHCH2CO2Hまたは-NHCH2CO-脂質であり、ここで、Ｒ2およびＲ3の少なくとも１つが脂質基を含む、請求項６に記載の薬学的組成物。
【請求項９】
哺乳動物細胞中でペプチド、タンパク質、およびオリゴヌクレオチドからなる群から選択されるスルフヒドリル基含有化合物の血液および組織の保持を延長するための薬学的組成物であって、該薬学的組成物が、以下：
一般式VIのスルフヒドリル含有化合物
0003814294.tif 000013
を含有し、ここで、Ｐは、ペプチド、タンパク質、およびオリゴヌクレオチドからなる群から選択され；Ｒ1は水素、低級アルキル、またはアリールであり；Ｒ2は脂質含有部分であり；そしてＲ3は、-OH、脂質含有部分、あるいは１個または２個のアミノ酸を含み、-CO2Hまたは-COR2で終結するアミノ酸鎖である、
薬学的組成物。
【請求項１０】
Ｒ2が脂質基であり、そしてＲ3が-OHである、請求項９に記載の薬学的組成物。
【請求項１１】
Ｒ2が-CH2CH2CH(NH2)CO2Hまたは-CH2CH2CH(NHCO-脂質)CO-脂質であり、そしてＲ3が-NHCH2CO2Hまたは-NHCH2CO-脂質であり、ここで、Ｒ2およびＲ3の少なくとも１つが脂質基を含む、請求項９に記載の薬学的組成物。
【請求項１２】
一般式Ｖの化合物
0003814294.tif 000014
ここで、Ａは芳香族活性化残基であり；Ｒ1は水素であり；Ｒ2は脂質基を含む脂質含有部分であり；そして、Ｒ3は、-OH、脂質基を含む脂質含有部分、あるいは１個または２個のアミノ酸を含み、そして-CO2Hまたは-COR2で終結するアミノ酸鎖である。
【請求項１３】
Ａが2-ピリジルまたは4-ニトロフェニルである、請求項１２に記載の化合物。
【請求項１４】
Ｒ2が脂質基であり、そしてＲ3が-OHである、請求項１２に記載の化合物。
【請求項１５】
Ｒ2が-CH2CH2CH(NH2)CO2Hまたは-CH2CH2CH(NHCO-脂質)CO-脂質であり、そしてＲ3が-NHCH2CO2Hまたは-NHCH2CO-脂質であり、ここで、Ｒ2およびＲ3の少なくとも１つが脂質基を含む、請求項１２に記載の化合物。
【請求項１６】
一般式VIの化合物を形成する方法であって、以下の工程：
Ｐがペプチド、タンパク質、およびオリゴヌクレオチドからなる群から選択される一般式PSHの化合物と、一般式Ｖの化合物
0003814294.tif 000015
とを反応させる工程であって、ここで、Ａは芳香族活性化残基であり；Ｒ1は水素であり；Ｒ2は脂質基を含む脂質含有部分であり；そして、Ｒ3は、-OH、脂質基を含む脂質含有部分、あるいは１個または２個のアミノ酸を含み、-CO2Hまたは-COR2で終結するアミノ酸鎖である、工程、
を包含する、方法。
【請求項１７】
Ａが2-ピリジルまたは4-ニトロフェニルである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
Ｒ2が脂質基であり、そしてＲ3が-OHである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
Ｒ2が-CH2CH2CH(NH2)CO2Hまたは-CH2CH2CH(NHCO-脂質)CO-脂質であり、そしてＲ3が-NHCH2CO2Hまたは-NHCH2CO-脂質であり、ここで、Ｒ2およびＲ3の少なくとも１つが脂質基を含む、請求項１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
本出願は、1995年１月25日に出願された出願番号第08/349,717号の一部継続出願である。
本発明は、一般に、生物学および医学の分野に関する。より詳細には、本発明は、哺乳動物において、親水性分子、特にペプチドおよびタンパク質の吸収および保持を増加させるために有用な方法および組成物に関する。
バイオテクノロジーの進歩は、治療的に活性でかつ純粋なタンパク質およびペプチドの大量の製造を可能にした。現在、ほとんどのこれらの薬剤の治療上の効果は、これらが注射のような侵入的経路を介して投与される場合のみに達成され得る。ほとんどのタンパク質は、非常に短い半減期を有するので、これらの薬剤の有効な濃度は、頻繁な注射によって投与される場合にのみ維持され得る。
注射によるタンパク質の投与は、それらのインビボにおける送達の最も効果的な手段であるが、複数の注射に対する患者の耐性は非常に乏しい。さらに、注射経路を介する薬物の投与は、熟練を要する仕事であり、かつ訓練を必要とする；この技術および訓練は、いつも患者に移入可能（transferble）ではあり得ない。タンパク質薬物が救命の役割を果たす場合、注射経路による投与は患者により受容され得る。しかし、タンパク質薬物がいくつかの可能な治療のうちの１つである場合、タンパク質およびペプチドの注射は、患者により受容される見込みはない。従って、タンパク質およびペプチドの送達の他の経路を開発することが必要とされる。
タンパク質およびペプチド送達の他の経路には、頬（buccal）、鼻、口、肺、直腸、および眼の経路が挙げられ得る。これらの経路は、例外なく、投与の非経口的経路よりも非効果的である。しかし、タンパク質およびペプチドの送達のこれらの経路は、依然として、非経口的経路よりもずっと興味を引かれるものである。なぜなら、これらの経路は患者に対する簡便性および制御を提供するからである。経口的経路は、最も簡便で、そして最も患者に受け入れられやすいので、特に関心を集めている。
身体の内部を外部と分離する粘膜バリア（例えば、GI、眼、肺、直腸、および鼻の粘膜）は、分子の輸送を厳密に調節する、堅く結合した細胞の単層の層を含む。バリア中の個々の細胞は、細胞内腔内への侵入を調節する、強い結合で結びつけられている。従って、粘膜は、第１のレベルでの物理的バリアであり、これを通る輸送は、経細胞（transcellular）または近細胞（paracellular）の経路のどちらかに依存する[Lee,V.H.L（1988）CRC. Critical Rev. Ther. Drug Delivery Sys. 5, 69-97]。
水で満たされた強い結合を通る近細胞輸送は、小さい分子（MW<1kDa）に制限され、そしてそれは、本質的に、粘膜を通過する濃度勾配により駆動される拡散プロセスである[Lee（1988）、前出；Artursson,P.およびMagnusson,C.（1990）J. Pharm. Sci. 79, 595-600]。強い結合は、粘膜の全表面積の0.5％未満を含む[Gonzalez-Mariscal,L.M.ら（1985）J. Membrane. Biol. 86, 113-125；Vetvicka,V.およびLubor,F.（1988）CRC Critical Rev. Ther. Drug. Deliv. Sys. 5, 141-170]；従って、これらは、粘膜を通過するタンパク質薬剤の輸送に小さな役割しか果たしていない。
薬物の生理化学的特性が疎水性細胞バリアを通過する輸送に適切である場合、小さい薬物の経細胞輸送は効果的に生じる。しかし、タンパク質およびペプチドの経細胞輸送は、トランスサイトーシス（transcytosis）のプロセスに制限される[Shen,W.C.ら（1992）Adv. Drug Delivery Rev. 8, 93-113]。トランスサイトーシスは、タンパク質およびペプチドが細胞の一方の側から小胞内に取り込まれ、そして続いて細胞を通って細胞の他方の側に往復する複雑なプロセスであり、ここで、それらは、エンドサイトーシス小胞から放出される[Mostov,K.E.およびSemister,N.E.（1985）Cell 43, 389-390]。粘膜バリアの細胞膜は、タンパク質およびペプチドのような親水性で帯電した高分子に親和性を示さない疎水性の脂質二重層である。さらに、粘膜細胞は、多くの高分子の輸送にバリアとして作用し得るムチンを分泌し得る[Edward,P.（1978）British Med. Bull. 34, 55-56]。従って、タンパク質およびペプチドに対して特異的輸送機構が存在しなければ、粘膜バリアを通過するそれらの固有の輸送はほとんど無視され得る。
タンパク質およびペプチドの輸送に対して、強い物理的バリアを供給することに加えて、粘膜バリアは、タンパク質およびペプチドが粘膜を通過する前、その後、およびその間に、タンパク質およびペプチドを分解し得る酵素を有する。このバリアは、酵素バリアと呼ばれる。酵素バリアは、タンパク質およびペプチドをそれらの末端またはそれらの構造内で切断する、エンドペプチダーゼ酵素およびエクソペプチダーゼ酵素からなる。いくつかの粘膜の酵素活性が研究され、そして、実質的なプロテアーゼ活性は、白子ウサギ（albino rabbit）の頬、鼻、直腸、および膣の粘膜のホモジネート中に存在し、そしてそれらの活性は、腸骨中に存在する活性に相当するという結果が示された[Leeら（1988）、前出]。従って、考慮される粘膜にかかわらず、存在する酵素バリアは、タンパク質およびペプチド分子の分解において大きな役割を果たしている。
ペプチドのＮおよびＣ末端は帯電しており、そして帯電した側鎖の存在は、これらの高分子の親水性を高度に付与する。さらに、帯電した側鎖の存在は、タンパク質およびペプチドが強い水素結合の能力を有することを意味する；このＨ-結合の能力は、細胞膜を通過する小さいペプチドの輸送の阻害において主要な役割を果たすことが示されている[Conradi,R.A.ら（1991）Pharm. Res. 8, 1453-1460]。従って、タンパク質およびペプチドのサイズおよび親水性は組み合わさって、粘膜バリアを通過するそれらの輸送を厳密に制限する。
粘膜バリアの物理的性質を変えるのに使用される１つのアプローチは、浸透増強剤の使用である。浸透増強剤の使用は、低分子量薬剤の使用による細胞バリアの破壊に基づき、その薬剤は細胞膜を流動化し[Kaji,H.ら（1985）Life Sci. 37, 523-530]、強い結合を開裂し[Inagaki,M.ら（1985）Rhinology 23, 213-221]、そして細胞膜中に孔を形成し得る[Gordon,S.ら（1985）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 7419-7423；Lee,V.H.L.ら（1991）Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, CRC Press 8, 91-192]。これらの薬剤の使用は、バリアの完全性の非特異的損失をもたらし、そしてインビボにおいて細胞に対し毒性となり得る種々の大きい分子の吸収をもたらし得る。
プロテアーゼインヒビターは、タンパク質およびペプチドと同時に投与され、インビボにおいてこれらの高分子の吸収の増強においていくらかの制限された活性を示す[Kidron,M.ら（1982）Life Sci. 31, 2837-2841；Takaroi,K.ら（1986）Biochem. Biophys. Res. Comm. 137, 682-687]。このアプローチの安全性および長期間の効果は、依然としてずっと研究されている。
プロドラッグアプローチは、ペプチドを酵素分解および認識から保護するような様式でペプチドを改変することに基づく。これは、ペプチド構造におけるＤ型アミノ酸の置換、アミド化およびアシル化によってペプチド上の攻撃を受けやすい基の封鎖、ペプチドのキラリティーの反転、およびペプチド構造におけるコンホメーション的な制限の導入により達成される。プロドラッグの合成は、活性の容易に同定可能なドメインを有する小さいペプチドのみに適用され得る。
サイズの減少は、タンパク質の輸送能力を高める他の実行可能なアプローチである。しかし、サイズの減少を試み得る前に、タンパク質の活性部分をマッピングする必要がある。一般に、このアプローチは、大部分のタンパク質に適用するのは難しい。
キャリアリガンドは、その特性のために、タンパク質およびペプチドの細胞取り込みおよび輸送特性を改変し得る。このアプローチの本質は、細胞不透過タンパク質またはペプチドを、キャリアに共有結合して、細胞内に高度に輸送するということである。キャリアリガンドがエンドサイトーシスおよびトランスサイトーシスされる機構は、タンパク質およびペプチドの輸送を増強するためのキャリアの適合性を決定するのに重要である。高分子キャリアは親水性であり、そして膜内に分配されない。従って、大きなポリマー性キャリアの細胞内への輸送は、キャリアの細胞膜への親和性により媒介される。一般的に、高分子複合体の取り込みは、細胞膜への結合により始まる。キャリアの細胞への結合は、特異的（例えば、抗体の細胞表面抗原への結合）、非特異的（カチオン性リガンドまたはレクチンの細胞表面糖への結合）、あるいはレセプター媒介（トランスフェリンまたはインシュリンのそれらのレセプターへの結合）であり得る。一旦キャリアが細胞表面に結合すると、それは小胞内に取り込まれる。次いで、これらの小胞は段階的にプロセスされ、そして、いくつかの経路が決められ得る。１つの経路は、小胞が陥入した場所から膜へ小胞をリサイクルすることである。他の経路は、複合体を破壊するもの、すなわちリソソームとの融合である。他の経路、複合体のトランスサイトーシスを引き起こす経路は、小胞が誘導されたのとは反対側にある膜と小胞との融合である。
エンドサイトーシスのプロセスとトランスサイトーシスのプロセスとの間の正確なバランスは、タンパク質複合体の標的への送達を決定する。例えば、エンドサイトーシスは、複合体が標的細胞に取り込まれる程度を決定し得るが、トランスサイトーシスは、複合体が標的に到達するか否かを決定し得る[Shenら（1992）、前出]。GI管を通過する連続的な吸収のために、複合体はGI粘膜の先端（apical）膜に結合し、粘膜細胞内に内在化され、細胞を通過して送達され、そして最終的に基底外側の膜から放出されなければならない。
最近の報告は、ポリリジン[Shen,W.C.およびRyser,H.J.P.（1981）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 7589-7593]およびレクチン[Broadwell,R.D.ら（1988）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 632-646]のような非特異的キャリア、ならびにトランスフェリン[Wan,Jら（1992）J. Biol. Chem. 267, 13446-13450]、アシアログリコプロテイン[Seth,Rら（1993）J.Infect. Diseases 168, 994-999]のような特異的キャリア、および抗体[Vitetta,E.S.（1990）J. Clin. Immunol. 10, 15S-18S]が、タンパク質の細胞内へのエンドサイトーシスを増強し得ることを示す多くの文献を含む。タンパク質に対するトランスサイトーシスキャリアを扱った報告はほとんどなく、そして、細胞バリアを通過するタンパク質複合体の輸送を定量した研究はほとんどない。コムギ胚芽凝集素[Broadwellら（1988）、前出]と抗トランスフェリン/メトレキセートとの複合体[Friden,P.M.およびWalus,L.R.（1993）Adv. Exp. Med. Biol. 331, 129-136]は、インビボにおいて血液脳関門を通過してトランスサイトーシスされることを示す。また、西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）のポリリジン複合体およびHRPのトランスフェリン複合体は、インビトロにおいて細胞単層を通過してトランスサイトーシスされることを示す[Wan,J.およびShen,W.C.（1991）Pharms. Res. 8, S-5；Taub,M.E.およびShen,W.C.（1992）J. Cell. Physiol. 150, 283-290；Wan,J.ら（1992）J. Biol. Chem. 267, 13446-13450、前出]。
リン脂質の成分としての脂肪酸は、細胞膜の塊を作る。これらは市販されており、そして比較的安価である。それらの脂質性のために、脂肪酸は、無傷害性の方法で、細胞膜内に容易に分配され得、そして相互作用し得る。従って、脂肪酸は、タンパク質およびペプチドの送達のための最も有用なキャリアリガンドの可能性を現わす。タンパク質およびペプチドの送達に脂肪酸を使用し得るストラテジーには、タンパク質およびペプチドの共有結合の改変、ならびに脂肪酸エマルジョンの使用が挙げられる。
いくつかの研究が、インビボにおいてペプチドおよびタンパク質を送達するための脂肪酸エマルジョンの成功した使用を報告している[Yoshikawa,H.ら（1985）Pharm. Res. 2, 249-251；Fix,J.A.ら、Am. J. Physiol. 251, G332-G340]。脂肪酸エマルジョンがタンパク質およびペプチドの吸収を促進し得る機構は、まだ分かっていない。脂肪酸エマルジョンは、強い結合を開裂し得、膜を可溶化し得、タンパク質およびペプチドをGI環境から隠し得、そして吸収の一部として、タンパク質およびペプチドをGI粘膜を通って運び得る[Smith,P.ら（1992）Adv. Drug Delivery Rev. 8, 253-290]。後者の機構が提示されてきたが、それは脂肪吸収の機構についての現在の知識と矛盾する。
GI上皮を通過するタンパク質およびペプチドの送達のためのより論理的なストラテジーは、脂肪酸を非特異的膜吸収薬剤として利用することである。いくつかの研究が、タンパク質に結合する非特異的膜結合薬剤は、インビトロにおいて細胞を通過するタンパク質複合体のトランスサイトーシスを促進し得ることを示している[Wan,J.ら（1990）J. Cell. Physiol. 145, 9-15；TaubおよびShen（1992）、前出]。脂肪酸複合体はまた、細胞膜内へおよび細胞膜を通過する高分子の取り込みを改善することを示している[Letsinger,R.ら（1989）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 6553-6556；Kabanov,A.ら（1989）Protein Eng. 3, 39-42]。それにもかかわらず、脂肪酸をペプチドおよびタンパク質に複合体化するのは困難であり、以下の困難が挙げられる：（１）複合体化反応のための水溶液中での脂肪酸の溶解性がないこと；（２）脂肪酸アシル化後のペプチドおよびタンパク質の生物学的活性の喪失；および（３）水溶液中における、脂肪酸複合体化ペプチドの溶解性がないこと[例えば、Hashimoto,Mら、Pharm. Res. 6, 171-176（1989）；Martins,M.B.F.ら、Biochimie 72, 671-675（1990）；Muranishi,S.ら、Pharm. Res. 8, 649-652（1991）；Robert,S.ら、Biochem. Biophys. Res. Commun. 196, 447-454（1993）]。
本発明の目的は、脂肪酸の親水性分子への複合体化およびペプチドおよびタンパク質の生物利用の改善における使用のための方法および組成物を提供することである。
発明の要旨
本発明によると、ジスルフィド結合を有する脂肪酸複合体化生成物を含む、スルフヒドリル含有化合物の脂肪酸誘導体（例えば、スルフヒドリル基を含むかまたはスルフヒドリル基を含むように改変された、ペプチド、タンパク質、またはオリゴヌクレオチド）は、スルフヒドリル含有化合物の哺乳動物細胞への送達に使用される。この改変は、複合体化されていない化合物の吸収速度と比較して、哺乳動物細胞による化合物の吸収を顕著に増加させ、そして、化合物の血液および組織の保持を延長する。さらに、複合体中のジスルフィド結合は細胞中できわめて不安定であるので、脂肪酸部分に由来するインタクトな化合物の細胞内放出を促進する。脂肪酸誘導体の調製のための薬剤および方法もまた、提供される。
【図面の簡単な説明】
本発明は、添付の図面を参考にすることにより、より良く理解され得る。ここで：
図１は、Caco-2細胞におけるBBI、BBIssPal、およびBBIssOleicの取り込みを示す；
図２は、iv投与後、CF-1マウスの血液、腎臓、肺、および肝臓におけるBBIおよびBBIssPalの生物分布（biodistribution）を示す；
図３は、iv投与後、CF-1マウスの血液、腎臓、肺、および肝臓におけるBBIおよびBBIssOleicの生物分布を示す；
図４は、ip投与後、CF-1マウスにおけるBBIおよびBBIssPalの生物分布を示す；
図５は、Caco-2細胞を通過しCaco-2細胞内へのBBI、BBIssPal(2)、およびBBIssPal(4)のトランスサイトーシスおよび蓄積を示す；そして、
図６は、トランスサイトーシスされたBBI、BBIssPal(2)、およびBBIssPal(4)を含むCaco-2細胞細胞由来の基礎培地におけるG50ゲル濾過分析の結果を示す。
発明の詳細な説明
本発明によると、スルフヒドリル含有化合物（例えば、本明細書中、後に述べる生体高分子）を、可逆的でかつ生分解性のジスルフィド基を介して、脂肪酸誘導体に付加する。このような複合体は、細胞膜の先端側に結合して、膜輸送および折り返し（turnover）の結果としてGI上皮の基底外側膜に到達し、そして、ジスルフィド結合の還元の結果として、間質液内へ放出されることが予想される。
本発明の１つの局面によると、一般式VI
0003814294.tif 000002
の複合体が提供され、ここで、Ｐは、スルフヒドリル含有化合物から誘導される残基であり；Ｒ1は水素、低級アルキル、またはアリールであり；Ｒ2は脂質含有部分（本明細書中、後で定義する）であり；そしてＲ3は、-OH、脂質含有部分あるいは１個または２個のアミノ酸を含み、そして-CO2Hまたは-COR2で終結するアミノ酸鎖である。これらの複合体は、スルフヒドリル含有化合物PSHの吸収を増加させ、そして血液および組織の保持を延長するために、特に有用である。
本発明の別の局面では、一般式PSHのスルフヒドリル含有化合物の哺乳動物における吸収を増加させるか、または血液および組織の保持を延長する方法が提供され、ここで、一般式VIの複合体をスルフヒドリル含有化合物から形成し、そして次に複合体を（例えば、水溶液または経口用量単位で）哺乳動物に投与する。
本発明のさらに別の局面では、一般式Ｖの化合物
0003814294.tif 000003
が提供され、ここで、Ａは芳香族活性化残基（本明細書中、後で定義する）であり、そしてＲ1、Ｒ2、およびＲ3は、前記の定義の通りである。一般式Ｖの化合物は、一般式PSHのスルフヒドリル含有化合物から一般式VIの複合体を調製するのに、特に有用である。
本発明のさらに別の局面では、一般式PSHのスルフヒドリル含有化合物から一般式VIの複合体を形成する方法が提供される。この方法は、一般式PSHの化合物と一般式Ｖの化合物とを反応させる工程を包含する。この反応は、一般に、過剰な（例えば、２倍〜10倍過剰）の一般式Ｖの化合物と、約１時間〜約24時間の期間、約４℃〜約37℃の温度において、適切な緩衝水溶液（例えば、リン酸、重炭酸塩、およびホウ酸緩衝液）中で行われる。好ましくは、反応は、pH8の重炭酸塩緩衝液中で行われる。
本発明の別の局面では、一般式IIIの化合物
0003814294.tif 000004
が提供され、ここで、Ｒ3'は、-OH、あるいは１個または２個のアミノ酸を含み、そして-CO2Hで終結するアミノ酸鎖であり、そして、ＡおよびＲ1は前記の定義の通りである。一般式IIIの化合物は、一般式Ｖの化合物の調製において有用である。一般式IIIの化合物は、一般式IIの化合物
0003814294.tif 000005
と、一般式A-S-S-AまたはA-S-S-A'の化合物との反応により適切に調製される（ここで、A'は、Aとは異なり、そして芳香族活性化残基である）。これらの反応物は、市販されている[例えば、2,2'-ジチオピリジンおよび5,5'-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸]か、または当業者に周知である日常的な合成手順により調製され得る。
本発明のさらに別の局面では、Ｒ2が脂質基である一般式Ｖの化合物の調製方法が提供され、ここで、一般式IIIの化合物を、一般式X-O2C-BまたはX-OC-Bの活性化脂質基と反応させる（ここで、Xは脂質活性基（本明細書中、後で定義される）であり、そして、Bは脂質基（本明細書中、後で定義される）である）。一般式X-O2C-BまたはX-OC-Bの化合物は、それ自身公知の様式で容易に調製され得る。
一般式IIIの化合物の調製のために、代表的な手順において、一般に、一般式IIの化合物と式A-S-S-AまたはA-S-S-A'の化合物との等モル量が、極性有機溶媒（例えば、エタノール）中で適切に混合され得る。次いで、一般式IIIの生成物を、非極性有機溶媒（例えば、ベンゼン）から結晶化により適切に分離し得る。当然のことながら、他の適切な手順もまた、当業者には明らかである。
X-O2C-BまたはX-OC-Bの調製のために、脂肪酸を、例えば以下のものと反応させ得る：（ａ）N-ヒドロキシスクシンイミド、およびH-ヒドロキシスクシンイミジル活性エステルを形成するためのカルボジイミド試薬；（ｂ）脂肪酸無水物を形成するためのトリフルオロ酢酸無水物；または（ｃ）脂肪酸クロリドを形成するための塩化チオニル。代わりの手順もまた、これらまたは他の脂質活性基を誘導するために、適切に使用され得る。
本発明の目的のために、用語「脂質含有部分」は、脂質基それ自身または脂質基を含む炭化水素ベースの基（特に、１つ以上のアミノ酸）のいずれかを意味する。用語「脂質基」は、約４個〜約26個の炭素原子、好ましくは約５個〜約19個の炭素原子を含む、疎水性置換基を意味する。適切な脂質基には、以下が挙げられるが、これらに限定されない：パルミチル（C15H31）；オレイル（C15H29）；ステアリル（C17H35）；コレート；およびデオキシコレート。
「芳香族活性化残基」は、一般式PSHのスルフヒドリル含有化合物との置換反応に対して、一般式Ｖの化合物のジスルフィド基をより不安定にするように作用する（従って、良好な脱離基として作用する）部分を意味する。ここで好ましい芳香族活性化基は、2-ピリジルである；他の適切な芳香族活性化基には、4-ニトロフェニルが挙げられる。
本発明の目的のために、用語「脂質活性化基」は、一般式IIIの化合物により、付加されるカルボキシ脂質基を活性化する部分を意味する。ここで好ましい脂質活性化基は、N-ヒドロキシスクシンイミジルエステルである；他の適切な脂質活性化基には、酸クロリドおよび酸無水物が挙げられる。
本発明は、スルフヒドリル基を含む広範囲の化合物を含む、一般式VIの複合体の調製および使用を意図しているが、生体高分子を含有する複合体の調製のために、本発明の方法および組成物を使用することは特に有利である。目的の生体高分子は、ペプチド、タンパク質、およびオリゴヌクレオチド（本明細書中、後に定義する）を含む。当業者に容易に明らかなように、スルフヒドリル基を含む生体高分子またはチオール化生体高分子は、構造において一般式VIの複合体と対応する複数の部分を含み得る（すなわち、一般式VIから部分Ｐを除いた化合物の構造を有する基）。
本発明の目的のために、用語「ペプチド」は、２個〜50個のアミノ酸を含むアミノ酸鎖を意味し、そして用語「タンパク質」は、50個より多いアミノ酸を含むアミノ酸鎖を意味する。タンパク質およびペプチドは、天然の供給源から単離され得るか、あるいは組換えDNA技術または固相合成などの当該分野で周知の方法により調製され得る。本発明に従って使用されるペプチドまたはタンパク質は、天然に存在するL-アミノ酸のみ、L-アミノ酸と他のアミノ酸（R-アミノ酸および改変アミノ酸を含む）との組み合わせ、あるいはL-アミノ酸以外のアミノ酸のみを含み得ると意図される。一般式Ｉの複合体を形成するために、ペプチドまたはタンパク質は、少なくとも１つの反応性チオール基を有していなければならない。多くの場合、ペプチドまたはタンパク質は、システイン残基（チオール基を含むアミノ酸）を含む。チオール基を含まないペプチドまたはタンパク質は、当業者に周知な手順により改変され得る；特に、周知のチオール化薬剤[例えば、N-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオ)プロピオネート（SPDP）および2-イミノチオラン（Traut試薬）]が、この目的に日常的に使用され得る。
用語「オリゴヌクレオチド」は、２個以上の天然に存在するかまたは改変された核酸を含む鎖を意味し、例えば、天然に存在するかまたは組換えられたデオキシリボ核酸（DNA）およびリボ核酸（RNA）の配列である。本発明による複合体の形成のために、オリゴヌクレオチドは、脂質含有部分と結合するためのスルフヒドリル基を含むように、チオール化反応によって改変されなければならない。このような改変は、それ自身公知な様式で日常的に行われ得る。例えば、カルボジイミドを用い、続いてジチオスレイトールで還元して遊離のスルフヒドリル基を生成することにより、オリゴヌクレオチドをシスタミンに結合し得る。
一般式VIの化合物の好ましいクラスでは、Ｒ1は水素であり、Ｒ2は脂質部分であり、そしてＲ3は-OHである。このタイプの複合体は、システインから適切に誘導される。本発明による、別の好ましいクラスの複合体では、Ｒ1は水素であり、Ｒ2は-CH2CH2CH(NH2)CO2Hまたは-CH2CH2CH(NHCO-脂質)CO-脂質であり、そしてＲ3は-NHCH2CO2Hまたは-NHCH2CO-脂質であり、ここで、Ｒ2およびＲ3の少なくとも１つは脂質部分を含む。このタイプの複合体は、グルタチオンから適切に誘導される。
一般式VIの代表的な化合物（ここで、Ｐはタンパク質である）の合成を、スキームＩに示す。当然のことながら、種々の代わりの合成スキームが容易に開発され得るということは、当業者に容易に明らかになる。
0003814294.tif 000006
本発明の脂肪酸複合体は、タンパク質およびペプチドが可溶な緩衝液のほとんどに可溶である。特に、任意の遊離カルボン酸基は中性pHにおいて帯電し、それゆえ、複合体の溶解性を改善する。このことは、タンパク質またはペプチドの患者への経口または他の経路による投与のための、適切な薬学的に受容可能キャリアまたはアジュバントとの複合体の処方を非常に容易にする。
本発明の特定の利点は、脂肪酸部分とペプチドまたはタンパク質との間のジスルフィド結合が、容易に還元され得るということである。従って、活性なペプチドまたはタンパク質分子は、インタクトな形態で、標的組織または細胞内に放出される。さらに、複合体の脂肪酸部分は、哺乳動物（特にヒト）に傷害性のないアミノ酸および脂質分子のみを含む。
本発明は、添付する実施例を参考にすることでより良く理解され得る。実施例は、例示の目的のみを意図するものであって、いかなる意味においても、本明細書に添付の請求の範囲で定義される本発明の範囲を制限すると解釈されるべきではない。
実施例
実施例１
N-パルミチル-2-ピリジルジチオシステイン（Pal-PDC）の合成
エタノール（50ml）中のL-システイン(I)（3.0g）の氷冷溶液を、エタノール（30ml）中の2,2-ジチオピリジン(II)（7.5g）の撹拌溶液に滴下し、そして反応を25℃にて18時間進行させた。全ての沈澱を取り除くためにこの溶液を遠心分離し、そしてロータリーエバポレーターを用いて、上清を40mlの容積まで減少させた。続いて、反応混合物を400mlの氷冷ベンゼンに滴下した。PDC(III)（ベンゼン中で結晶化した）を濾過により単離し、40mlのエタノールに再溶解し、次いで、上記のように400mlの氷冷ベンゼン中で再結晶させた。再結晶した生成物を濾過により単離し、減圧下で一晩乾燥し、そして最後にデシケーター中で-20℃にて保存した。
PDC（100mg）(III)を５mlのDMFに溶解し、100μlのトリエチルアミンと混合し、そして得られた懸濁液を、DMF（５ml）中のパルミチン酸(IV)（250mg）のN-ヒドロキシスクシンイミドエステルと25℃で24時間（この時間の間に懸濁液は透明になった）反応させた。この溶液を40mlの氷冷水（pH3.0）で希釈し、沈殿（これはPal-PDC(V)およびパルミチン酸を含んだ）を1000rpmで30分間遠心分離することにより単離した。Pal-PDC(V)を、水（pH7.0）中の沈澱の懸濁（これはPal-PDC(V)を溶解したが、パルミチン酸を溶解しなかった）によりパルミチン酸から分離した。Pal-PDC(V)を、上記のように２以上の酸沈澱工程をさらに用いて精製した。
実施例２
複合体の合成
他に言及しない限り、複合体化工程に用いる全ての最終試薬（Pal-PDCおよびPDC）は、蛍光指示薬を含有するシリカコートされた薄層クロマトグラフィー（TLC）プレートを用いて分析した。これらのプレートを、全ての分析の前に、加熱により活性化しなかった。合成された試薬の日常的な分析のために、試薬（５mg/ml）を含有する５μlのエタノール性溶液をプレートにのせた。続いて、移動相で平衡化した、溶媒のチャンバー中でプレートを展開した。一旦溶媒の先端が十分な距離を移動すると、プレートを取り出し、乾燥させ、そしてUVランプ下で調べた。スポットの位置をプレート上に迅速に印を付け、そしてプレートおよびスポットの図を作成した。視覚化した各スポットについてRf値を計算し、そして記録した。分析に用いた移動相の組成を調整し、試薬のスポットの最適な分離を行った。
例示の目的のために、BBIの複合体を合成した。BBIは、細胞への低い取り込みを有し、そして経口では生物学的に利用可能でない親水性タンパク質である。さらに、BBIは、GI管中で安定であり、そして腸中の哺乳動物プロテアーゼによる分解に耐性である[Yavelow,Jら、（1983）Cancer. Res. 43, 2454s-2459s]。化学予防法のためのBBIの使用は、BBIの経口的に吸収可能な形態が開発され得る場合にのみ受容され得る。
BBI（20mg）を１mlの重炭酸ナトリウム溶液（0.3M、pH8.0）に溶解し、25℃で２時間、SPDP（５mg/100μlのDMF）と反応させた。Sephadex▲Ｒ▼ G50ゲル濾過クロマトグラフィーを用いてBBI-PDPを精製した後、BBIのPDP誘導体化を、ジチオトレイトール（DTT）を用いてBBI-PDPを還元後、チオピリジン部分の放出を測定することにより評価した。この手順を用いたところ、BBI１分子当たり約４つのアミノ基がSPDPで修飾されていた。反応緩衝液のpHを調整することにより、BBIの誘導体化のレベルを制御し得た；BBIの修飾を、BBI１分子当たり１アミン基（pH7で反応を行った場合）から修飾された4.5アミン基（pH8.5で反応を行った場合）まで調整し得た。
PBS（１ml、pH5.0）中のBBI-PDP（20mg）をDTT（25mM）を用いて30分間還元し、続いてSephadex▲Ｒ▼ G50カラムから溶出した。スルフヒドリル含有BBI画分（カラム空隙容量で溶出された）をElman試薬を用いて同定し、次いで４℃で16時間、PBS（pH7.0）中で３倍（BBIの１スルフヒドリル基当たり）過剰のPal-PDC(V)と反応させた。次いで、反応混合物をHCl（１M）を用いてpH3.0まで酸性化し、そして氷上に30分間置いた。上清をSephadex▲Ｒ▼ G25ゲル濾過カラムを用いて別々に分析した。沈澱（BBIのパルミチルジスルフィド複合体であるBBIssPal(VI)および過剰の試薬を含有した）を遠心分離により単離し、DMF（２ml）に溶解し、そしてDMFを用いるSephadex▲Ｒ▼ LH20カラムから溶出した。BBIssPal(VI)画分（カラム空隙容量で溶出された）を単離し、500倍の容量の水に対して３回透析し、次いで凍結乾燥した。この手順を用いる複合体の収率は約80％（重量）であった。Pal-PDCのBBIへの複合体化を上記と同一の複合体化条件を用いる[3H]-標識Pal-PDC(V)のBBIへの複合体化の後に確認し、そして定量した。また、同一の手順を用いて、オレイン酸複合体化BBI（BBIssOleic）を合成した。
実施例３
複合体の輸送
ヒト結腸ガン腫細胞（Caco-2）を、37℃での0.5mlのトリプシン／EDTA溶液（0.5％トリプシン、5.3mM EDTA）との10分のインキュベーションを用いて25cm2ストック培養フラスコからはがした。次いで、この細胞を５mlのDulbecco最少必須培地（15％ウシ胎児血清（FBS）、L-グルタミン（１％）および必須アミノ酸（１％）を補充した）に懸濁し、そしてコールター計数器を用いて計数した。
1.5mlの培地中に懸濁されたCaco-2細胞を、トランスウェルの頂部チャンバーに、１つのインサート当たり50万細胞の密度で播種した。次いで、2.5mlの培地を各トランスウェルの基底チャンバーに添加した。この細胞を、乱すことなく２日間付着させ、次いで実験が行われるまで１日置きに栄養を供給した。この細胞を実験の前に約14〜20日間保持し、各実験の24時間前に栄養を供給した。細胞の単層は、播種の１週間以内に、約500〜600Ωcm2の経上皮（transepithelial）電気抵抗（TEER）を示し、そして播種後21日目までこの抵抗を保持した。
BBIおよびBBIssPalの放射性ヨウ素化を、クロラミン-T法を用いて行った[McConahey,P.C.およびDixon,F.J.（1980）Meth. Enzymol. 70, 221-247]。コンフルエントな14日齢の細胞単層を、一度無血清Dulbecco培地で洗浄し、次いで37℃にて30分間、無血清Dulbecco培地中でインキュベートした。続いて、このインキュベーション培地を、天然BBIあるいはBBIssPalまたはBBIssOleicのいずれかとして125I-BBI（10μg/ml）を含有する無血清培地で置き換え、そしてこの単層を37℃でさらに60分間インキュベートした。次いで、単層を氷冷PBSで３回洗浄し、次いで37℃で10分間、トリプシン（0.5％、EDTA 5.3mM）に曝露した。はがした細胞を管に移し、遠心分離により単離し、氷冷PBSを用いて３回洗浄し、ガンマカウンターを用いて蓄積された放射能について分析し、そして最後に、公開された方法[Lowry,O.H.ら（1951）J. Biol. Chem. 193, 265-275]を用いて細胞タンパク質についてアッセイした。
いくつかの実験において、還元された125I-BBIssPalの細胞への取り込みを決定した。60℃で5分間、続いて37℃でさらに25分間、125I-BBIssPalをDTT（50mM）で還元した。コントロール実験においては、125I-BBIssPalを、DTTに曝露することなく、同じ温度の培地に曝露した。
BSA（脂肪酸を含まない）の存在下での125I-BBIssPalの取り込みを以下のように決定した。細胞単層に添加する前に、125I-BBIssPalを0.1％BSAを含有する培地と、37℃にて30分間インキュベートした。いくつかの取り込み実験において、まず、BSAを３倍モル過剰のパルミチン酸と混合し、次いで実験の前に複合体とインキュベートした。125I-BBIssPalの取り込みをFBSを含有する培地中で決定した実験において、必要量のFBSを含有する培地に複合体を単純に添加した。
コンフルエントな細胞単層を（２〜３週齢、約500Ωcm2のTEER値を有する）、まず37℃で30分間、１％のFBSを含有するDulbeccoMEMとインキュベートした。続いて、インキュベーション培地を除去し、そして1.5mlの培地中の125I-BBI（10μg/ml）複合体をトランスウェルの頂部チャンバーに添加した。基底チャンバーには、2.5mlの培地を添加し、そしてトランスウェルを37℃でインキュベートした。所定時間で、各トランスウェルからの全体の基底チャンバー培地（2.5ml）を取り出し、そしてガンマカウンターを用いて放射能について計数した。各実験において、代表的には７つのサンプルをインキュベーション後１、２、３、４、５、６および24時間で採取した。24時間目のサンプルを採取した後、細胞単層を氷冷PBSで３回リンスし、インサートから切り離し、そしてガンマカウンターを用いて蓄積された放射能を計数した。
単層を横切って輸送された125I-BBI複合体の完全性をSephadex G50ゲル濾過クロマトグラフィーを用いて調べた。簡単に記載すると、基底培地を24時間でサンプリングした後、1.0mlの培地を2000rpmで遠心分離し、次いでPBSを用いてG50カラム（10ml）から溶出し；１ml画分を回収し、そして画分に伴われた放射能をガンマカウンターを用いて決定した。インタクトな複合体はカラム空隙容量で溶出され、そして１kDaより小さなフラグメントはカラム容量以上で溶出された。
異なる量の添加されたPBSの存在下における125I-BBIの取り込みの結果（遊離タンパク質として、またはパルミチン酸に複合体化した形態でのいずれか）を、表１に示す。複合体を無血清培地中で細胞とインキュベートした場合、BBIssPalの取り込みは、BBIの取り込みより約140倍高かった。1％ FBSを含有する培地の存在下では、BBIssPalの内在化は、BBIの内在化に対して35倍増加した。さらに10％まで血清濃度を増加させることは、細胞へのBBIssPalの取り込みを、天然BBIの取り込みより、10倍だけ高いレベルまでさらに減少させた。Caco-2細胞へのBBIssPalの内在化は、1％および10％のFBSをそれぞれ含有する培地について、無血清での値の内在化の14％及び2.3％まで血清の存在下で劇的に減少した。
0003814294.tif 000007
細胞単層を、10μg/mlの125I-標識複合体と37℃で60分間インキュベートした。示した結果は、３つの単層の平均±SEMである。取り込み実験を、添加したFBSの存在下および非存在下にてDulbecco培地中で行った。
細胞へのBBIssPalの取り込みは、複合体上のパルミチン酸リガンドにより媒介されると考えられていたので、DTTを用いる還元の前および後のCaco-2細胞への125I-BBIssPalの取り込みを調べた。インキュベーション培地中の血清の存在は複合体の細胞への取り込みに対して阻害効果を有したので、取り込みを無血清培地で調べた。結果を表２に示す。細胞への未処理125I-BBIssPalの取り込みは125I-BBIの取り込みより80倍高かった。125I-BBIのDTTへの曝露によって、取り込みにおける減少は生じなかった。対照的に、DTTでの125I-BBIssPalの還元は、細胞への複合体の取り込みを約80％減少させた。DTTでのBBIssPalの還元により、複合体からのパルミチン酸の脱離を生じる。よって、125I-BBIssPalの取り込みは、疎水性パルミチン酸リガンドにより媒介された。
0003814294.tif 000008
125I-BBIの細胞取り込み（天然タンパク質として、またはBBIssPalとしてのいずれか）を、60℃で５分間および37℃で25分間のDTT（50mM）での還元の前、および後に決定した。
ウシ血清アルブミン（BSA）は、インビボにおける脂肪酸のキャリアであり、そして脂肪酸に強固に結合し得る疎水性領域を含むことが知られている。125I-BBIssPalの取り込みは血清の存在下で減少したので、BBIssPalがFBS中に存在するBSAに結合する可能性を調べた。脂肪を含まないBSA、または脂肪酸を加えたBSAを含有する培地の存在下での、125I-BBIssPalおよび125I-BBIの細胞取り込みを調べた。その結果を表３に示す。BSAを含まない培地の存在下、細胞への125I-BBIssPalの取り込みは、以前の実験で得られた結果から予想されたように、BBIの取り込みより80倍高かった。脱脂BSA（脂肪酸を含まないBSA）（0.1％）が培地中に存在した場合、125I-BBIssPalの取り込みは82％減少したが、125I-BBIの取り込みは影響されなかった。脂肪酸を添加したBSA（0.1％）（これは、脂肪を含まないBSAを3モル過剰のパルミチン酸でスパイクすることにより生成された）の存在下では、再び、125I-BBIの取り込みは影響されなかった。それゆえ、125I-BBIssPalはBSAに強固に結合し、そしてこの結合は既にBSAに結合している脂肪酸の数に依存する。
0003814294.tif 000009
取り込み実験を、添加された脂肪酸を含まないBSA（BSA）または脂肪酸を加えたBSA（BSA/FA）の存在下、および非存在下にて、Dulbecco培地中で行った。無血清培地の存在下で、Caco-2細胞中の125I-BBI（天然BBIとして、またはパルミチン酸またはオレイン酸に複合体化した形態でのいずれか）の取り込みの研究の結果を図１に示す。この結果を、内在化されたBBIの平均（ng）±SEM（n＝３）として示す。細胞への125I-BBIssPalの取り込みは、125I-BBIの取り込みより約100倍高かった。同様に、細胞への125I-BBIssOleicの取り込みは、125BBIより約108倍高かった。125I-BBIssPalの取り込みと125I-BBIssOleicの取り込みとの間の差は有意でなかった。
実施例４
生物分布アッセイ
実験前の食物および水への自由な接近を有する雌CF-1マウス（２〜３週齢、各々体重20〜25g）を動物実験に用いた。125I-BBI（3mg/kg）（天然BBIとして、あるいはBBIssPalまたはBBIssOleic複合体として）を尾静脈を介して動物に投与した。注入後0.5、3、および24時間に、各実験群からの３匹の動物を屠殺し、そしてその血液（200μl）、腎臓、肺、および肝臓を取り出し、氷冷PBSでリンスし、そして蓄積された放射能についてアッセイした。器官の重量を記録し、そして器官中の複合体の濃度を調整するのに用いた。
ip-生物分布研究において、125I-BBI（３mg/kg）（天然BBIとして、またはBBIssPalとしてのいずれか）を各々の動物の腹部腔の左下四分円に投与した。次いで、この動物をiv.-生物分布研究について記載される方法で処理した。
iv.-投与後のBBIおよびBBIssPalの生物分布の結果を、図２に、１gの器官当たりの蓄積された用量％±SEMとして示す。この結果は、BBIは高血中レベルに達することなく体から迅速に排出されたが、BBIssPalは相対的に高レベルで血液中に蓄積され、循環から見かけ上よりゆっくりと除去されることを示した。腎臓の生物分布の結果は、BBIは腎臓中に迅速に蓄積されたが、BBIssPalは蓄積されなかったことを示した。肝臓のBBIssPalの蓄積は、BBIの蓄積より約５倍高く、そして肝臓において、BBIssPalのレベルは、注入の24時間後でさえ高いままであった。肺のBBIssPalの蓄積はまた、BBIの蓄積より約２倍高かったが、この結果は摘出後に器官中に存在した残存する血液により生じ得たかもしれない。明らかに、BBIssPalは血液および肝臓において、より長く、そしてより高いレベルで保持された。他方、BBIssPalの腎臓クリアランスは、天然BBIより約４倍低かった。
BBIおよびBBIssOleicのiv-生物分布をまた、CF-1マウスにおいて調べた。この結果を、0.5、３および24時間での１gの器官当たりの蓄積容量％±SEMとして図３に示す（n＝３）。BBIssOleicの生物分布は、BBIssPalに非常に類似していた。BBIssPalについて観察されたように、BBIssOleicはBBIより高い血中レベルを有し、そして見かけ上循環からよりゆっくりと浄化された。BBIssOleicの血中レベルは、同時点で、BBIの血中レベルより約４倍高かった。BBIssOleicの腎臓クリアランスは、天然BBIより約４倍低く、そして肝臓蓄積は、天然BBIより約４倍高かった。肝臓におけるBBIssOleicの保持は、注入後24時間でさえ肝臓中に存在する複合体の有意なレベルを有して延長された。肺のBBIssOleicのレベルは、天然BBIレベルより約２倍高かったが、肺における、より高い残存する血液が、この観察を説明し得る。
CF-1マウスにおける125I-BBIssPalのip-生物分布を、注入後0.5時間（図4A）、3時間（図4B）または24時間（図4C）での、器官当たりの平均用量蓄積％±範囲（棒）として図４に示す。125I-BBIssPalの腎臓蓄積は、0.5時間および３時間の時点について天然125I-BBIの蓄積より４倍低かった。24時間で、125I-BBIssPalのレベルは、腎臓において125I-BBIより高かった。125I-BBIssPalの血中レベルは、0.5時間で125I-BBIのレベルと同様であり、３時間でBBIより1.5倍高く、そして24時間でBBIより約３倍高かった。125I-BBIssPalの肝臓蓄積は、125I-BBIより、0.5時間で1.5倍高く、３時間で2.5倍高く、そして24時間で約４倍高かった。125I-BBIssPalの相対的に多い量が、24時間で肝臓および腎臓に存在した。
実施例５
インビトロ形質転換研究
形質転換アッセイを、出版された推奨[Reznikoff, C.A.ら（1973）Cancer. Res. 33, 3239-3249; Reznikoff, C.A.ら（1973）Cancer. Res. 33, 3231-3238]に従って、C3H 10T1/2(クローン8)細胞を用いて行った。マイコプラズマを含まない細胞のストック培養物を、７日間毎に75cm2フラスコ当たり50,000細胞を継代することにより維持した。このスケジュールを用いて、この細胞をコンフルエントに達する約２日前に常に継代した。ストック培養物を、10％ FBS、ペニシリン（100ユニット）、およびストレプトマイシン（100μg）を補充したEagle基底培地中で増殖させ、そして９〜14の継代で形質転換アッセイのために用いた。ストック細胞をPBS中のトリプシン（0.1％）で５分間処理し、そして５mlの培地でトリプシンを止めることにより細胞を継代した。この手順を、ストック培養物における自発的形質転換を最小にし、そしてペトリ皿における平板効率を最大にするように適応させた。培養で用いられたFBSストックを予備スクリーニングして、血清が形質転換細胞の発現および増殖を支持し得ることを確実にした。
形質転換アッセイのために、C3H 10T1/2細胞（100/皿）を60mmのペトリ皿に播種し、そして10％ FBS、ペニシリン（100ユニット）、およびストレプトマイシン（100μg）を補充したEagle基底培地中で、5％ CO2湿潤雰囲気下で24時間増殖させた。続いて、細胞をアセトン中の3-メチルコラントレン（MCA）ストック溶液（0.25mg/ml）25μlでの処理（最終濃度１μg/mlのMCA（5μg/５ml））によりイニシエーションさせた。細胞を発ガン性物質または溶媒の存在下で24時間増殖させ、次いで、各皿中の培地を、発ガン性物質または溶媒を含有しない新たな培地で置換した。アッセイの最初の２週間については、皿中の培地を１週間に２回置換し、そしてその後アッセイの残りの４週間については１週間に１回置換した。複合体の形質転換阻害活性の決定のために計画された実験において、細胞を、複合体（1μg/ml）を含有する培地中でアッセイの初めの３週間維持し；その後、細胞を添加された複合体を含まない培地中で維持した。
発ガン性物質処理の６週後、細胞を培養皿への付着について顕微鏡下で調べ、そしてPBSで洗浄し、次いで100％メタノール中で固定した。固定した単層を、次いでギムザ染色を用いて染色した。１群当たり20皿を各実験において処理した。試験群に加えて、全ての形質転換アッセイは、少なくとも３つの他の群：ネガティブコントロール（発ガン性物質でも溶媒でも処理していない）、アセトンコントロール（25μlのアセトンで処理した）およびポジティブコントロール[25μlのアセトン中のMCA（１μg/ml）で処理した]を含んだ。プレート中の形質転換されたフォーカス（直径＞３mm）を顕微鏡下で調べ、そして公開されたガイドラインに従って、タイプI、IIまたはIIIとして分類した[Landolph,J.R.（1985）Transfomation assay of established cell lines: Mechanism and Application（Kakunaga,T.およびYamasaki,H.編）IARC Scietific Publications, Lyon, France 185-201頁]。簡単に記載すると、タイプIIIのフォーカスは、ギムザで濃青色に染色された、密な、多層の、好塩基性の細胞増殖領域であり、そして粗い十字型のへりを有した。タイプIIのフォーカスもまた、密な、多層の、細胞増殖領域であったが、ギムザで紫色に染色され、そしてタイプIIIのフォーカスに比べてより滑らかで、より明確なへりを有した。タイプIのフォーカスはアッセイにおいては記録されなかった。
細胞の平板効率（PE）もまた、それぞれの形質転換アッセイを合わせて調べた。異なる処理群における細胞のPEを決定するために、細胞（200細胞／皿）を、１つの実験群当たり３つの60mmペトリ皿に播種し、そして形質転換アッセイ細胞と同じ様式で処理した。これらのアッセイにおける細胞を、10日で終了させ、100％メタノールで固定し、そしてギムザで染色し；次いで、顕微鏡下で見える50細胞以上のコロニーを計数した。平板効率は、（コロニーの数／播種された細胞の数）＊100と定義される。
BBI、BBIssPal、およびBBIssOleicのインビトロ抗形質転換活性を表４に示す。BBI（遊離のタンパク質として、あるいはパルミチン酸またはオレイン酸に複合体化した形態でのいずれか）を、MCA処理後に迅速に開始した形質転換アッセイ期間の、最初の３週間1.0μg/mlで培養物に添加した。MCA処理細胞を、25μlのアセトンに溶解した3-メチルコラントレンに、１μg/mlの濃度で24時間曝露した。アセトン処理細胞を、25μlのアセトンに24時間だけ曝露した。試験群をMCAに24時間曝露し、次いで複合体にアッセイの最初の３週間曝露した。未処理細胞は、MCAにもアセトンにも曝露しなかった。統計的解析（ｘ2）：群４対３、ｐ＜0.05；群５対３、0.05＜ｐ＜0.1；群６対３、ｐ＜0.05。コントロール未処理細胞は、播種後約14日で皿においてコンフルエンスに達し、ウェル付着を形成し、単層を接触阻害した。これらの皿は、アッセイ期間の終わりに形質転換されたフォーカスを含まなかった。アセトン処理細胞はまた、播種後14日でコンフルエンスに達し、そしてウェル付着単層を形成し、そして形質転換されたフォーカスを含まなかった。しかし、MCA処理された皿は形態的に形質転換されたフォーカスを含み；19の皿の内の６つがタイプIIIのフォーカスを含むと記録された。BBI処理群は形質転換フォーカスを含まなかった。このことは、BBIがこれらの細胞においてMCA誘導性形質転換を妨げ得ることを示している。BBIssPal処理細胞は、アッセイで記録された20の皿の内の１つのタイプIIフォーカスを含んだ。BBIssOleic処理細胞は形質転換フォーカスを含まなかった。このアッセイにおける全ての群のPEは20％〜25％の間であった。表４に示すように；BBIssPalとBBIssOleicとの両方はBBIの元々の生物学的活性を保持した。
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実施例６
単一および複数複合体の輸送
頂部膜結合125I-BBIssPalの輸送に関する研究を、トランスウェルおよび6-ウェルプレートを用いて行った。６-ウェルプレート実験において、125I-BBIまたは125I-BBIssPal（10μg/ml）を、無血清培地中で37℃で１時間Caco-2細胞とインキュベートした。続いて、細胞を氷冷PBSで３回リンスし、次いで２つの群に分けた。第１の群において、複合体の内在化を、細胞のトリプシン処理および単離の後に決定した。第２の群において、細胞を無血清培地と再インキュベートし、そして複合体の細胞からの放出を24時間追跡し；培地を１時間毎に取り出し、そして放射能について計数した。追跡期間の最後に、細胞をトリプシン処理し、単離し、そして蓄積された放射能について計数した。各実験における全計数（培地＋細胞cpm）を決定し、そして異なる時間に放出された全計数の％を決定した。
トランスウェル実験において、１時間37℃で、複合体を細胞の頂部側とインキュベートした。次いで、トランスウェルを氷冷PBSで３回リンスし、次いで無血清培地と再インキュベートした。頂部培地および基底培地への複合体の放出を、異なる時間に全体の基底培地または頂部培地を計数することにより、24時間追跡した。追跡期間の終わりに全計数（トランスウェル＋培地計数を加えた）を得、そして異なる時間での複合体の放出（全体の％）を計算した。24時間でトランスウェルにおいて得られた計数が、細胞中の複合体の存在に起因し、そして非特異的なプラスティックへの結合に起因しなかったことを確実にするために、トランスウェルをトリプシンに10分間暴露し、氷冷pbsで３回リンスし、続いて蓄積された放射能について計数した。
BBIを２または４パルミチン酸で修飾し、そして輸送をトランスウェル中で決定した。Caco-2単層におけるBBI、４パルミチン酸で修飾されたBBI[BBIssPal(4)]、および２パルミチン酸で修飾されたBBI[BBIssPal(2)]の累積的な輸送を図5Aに示す；結果をBBI（ng/単層）±SEM（n＝３）として表す。輸送の程度の順番は、BBIssPal(4)＞BBI＞BBIssPal(2)であった。同じ細胞への複合体の内在化の結果を、単層１つ当たりの内在化されたBBI（ng）として図5Bに示す。予想されたように、BBIssPal(4)は、細胞への最も高い取り込みを有し、続いてBBIssPal(2)およびBBIであった。24時間でトランスウェルから得られた基底培地を、G50カラムを用いて分析し；結果を図６に示す。以前観察されたように、BBIもBBIssPal(4)も単層を横切ってトランスサイトーシスされなかった。しかし、少量であるが、有意な量のBBIssPal(2)の基底培地はインタクトな複合体からなった。この量は、基底培地に存在する全放射能の約10％と約20％との間からなった。
実施例７
BBIssPalの皮膚吸収
新たに調製された無毛のマウスの皮膚を小さなリングに据え付けた（mount）。それぞれの据え付けられた皮膚に、5μlの125I-標識BBIまたはBBIssPalのサンプル（0.5mg/mlの濃度）を0.38cm2の領域に塗布した。２片の皮膚を１回の処理について用いた。この皮膚を室温（23℃）にて湿潤環境下に保持した。30分後、皮膚の表面をまずPBSで注意深くリンスし；続いてこの皮膚をはずして100mlのPBS中に２回浸した。次いでこの皮膚を、濾紙を用いてブロットし、そしてガンマカウンターで計数した。皮膚に保持されたBBIの量を、標識BBIまたはBBIssPalの比放射能を用いて計算した。BBIおよびBBIssPalのマウス皮膚への吸収は、それぞれ0.14および1.6μg/cm2であった。このことは、皮膚へのBBI吸収の10倍以上の増加が、ポリペプチドをPal-PDCを用いて修飾した場合に達成されたことを示す。
実施例８
パルミチル化西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRPssPal）の合成
0.5mlのPBS中の10mgの西洋ワサビペルオキシダーゼ（分子量40,000；Sigma P8375）を、0.1mlのDMF中の２mlのSPDPと25℃で２時間混合した。反応を0.5mlのPBSでの希釈により停止させ、そして500mlのPBS中、4℃で透析した。24時間後、透析チューブ中の溶液を取り出し、50μlの１M DTTの添加により還元し、そしてSephadex G-50カラムを用いて分離した。カラムの空隙容量での画分をプールし、そして、25℃で４時間、ホウ酸塩緩衝液（pH9.6）中で10倍モル過剰のPal-PDCと混合した。次いで、反応混合物を４℃で３日間徹底的に透析し、そして最終生成物を、HRP１分子当たり10パルミチン酸残基を含むと評価した。HRP分子は、元々の酵素活性の約20％を保持していた。
実施例９
HRPssPalの細胞性取り込み
６ウェル培養クラスタープレート中のマウス繊維芽細胞L929細胞のコンフルエントな単層を、30μg/mlのHRP（天然形態として、またはパルミチン酸複合体（HRPssPal）としてのいずれか）を含む無血清培地中でインキュベートした。37℃にて１時間後、単層をPBSで３回洗浄し、次いで１mlの0.05％のTriton-X100に溶解した。細胞に結合したHRPを、各細胞抽出物における酵素活性を測定することにより決定し、そして結果を１つの細胞単層当たりのHRP（ng）に変換した。結果は、HRPおよびHRPssPalの細胞性取り込みは、それぞれ１つの細胞単層当たり7および229ngのHRPであったことを示した。従って、HRPのPal-PDCでの修飾により、細胞取り込みにおける30倍の増加が達成された。
実施例10
オリゴヌクレオチドの脂質化
モノアミンオキシダーゼＢのmRNAに相補的なアンチセンス21merオリゴヌクレオチドを、以下の手順を用いてチオール化する。オリゴヌクレオチドを、水溶性カルボジイミド試薬であるEDCの存在下で２倍モル過剰のシスタミンと混合する。この混合物を25℃で２時間保持し、そしてシスタミンに対して２倍モル過剰のDTTを添加し、ジスルフィド結合を還元する。遊離シスタミンおよびDTTから、Sephadex G-25カラムを用いてオリゴヌクレオチドを分離した後、少量のチオール化オリゴヌクレオチドを、Ellman試薬と反応させ、そしてスルフヒドリル基の濃度を、412nmでの吸光度を用いて決定する（1.36×104M-1のεと仮定）。続いて、オリゴヌクレオチド１分子当たりのスルフヒドリル基の数を決定する。チオール化オリゴヌクレオチドを、重炭酸緩衝液（pH８）中でPal-PDCと、オリゴヌクレオチド中のスルフヒドリル基の数に対して２倍モル過剰で混合する。パルミチル化オリゴヌクレオチドをSephadex G-25カラムを用いて精製する。
先の記載から、当業者は容易に本発明の重要な特徴を確認し得、そして本発明の精神および範囲から逸脱することなく本発明を種々の使用および条件に適応させ得る。形態における変化、および等価物の置換は、環境が便法を示唆し得るかまたは与え得るので意図され、そして本明細書中に用いられる全ての特定の用語は、説明的な意味であり、そして限定の目的のためでないと意図される。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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