(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
スポットテスト用疎水性担体であって、少なくとも極性液体試料を該スポットテスト用疎水性担体に適用する前の状態において、極性液体試料中の分析対象物または分析対象物複合体に対して親和性を有する物質がそのスポットテスト用疎水性担体の表面に予め固定されている疎水性担体であることを特徴とするスポットテスト用疎水性担体上に、極性液体試料を滴下する工程；
滴下から所定時間経過後、
(1)ピペット又はアスピレーターにより吸い取って除去する、
(2)紙又は不繊布の液体吸収性材料で吸い取って除去する、
あるいは
(3)振とう又は傾斜させることにより担体から液滴を落として除去する
方法で該担体から該液体試料を除去する工程；
および
該担体表面を観察する工程
を含む、極性液体試料中の分析対象物の測定方法。
【請求項２】
該極性液体試料中の分析対象物または分析対象物複合体に対して親和性を有する物質が、分配クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィーの固定相に用いられる物質から選択される、請求項１記載の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、スポットテスト用疎水性担体に関し、特に、加熱による濃縮・乾燥処理が不要であり、これにより試料中の妨害物質の影響を最小限にしうる担体を提供するものである。
【０００２】
【従来の技術】
分析化学分野や臨床検査分野における試料中の微量分析対象物の測定には、吸光分析や発光分析等の機器分析的手法が通常用いられるが、この高価で複雑な機器分析的手法の代替手段として、疎水性担体を用いたスポットテスト法（特開平７−２６０６９３号公報）やこの方法を応用したＲＰ−ＨＰＴＬＣ法等が存在する。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、これらの方法によれば、疎水性担体上にスポットを形成させることを目的とした、液体試料を濃縮・乾燥するための加熱装置が別途必要であり、しかも、この加熱の際に分析対象物の測定を妨げるような物質を生ずる場合がある。特に、液体試料中に含まれている塩化ナトリウム等の塩類が担体上に析出し、微量の分析対象物が多量のこのような塩類に閉じ込められる結果、この分析対象物に由来する発色または蛍光等の測定が著しく困難となる。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明は、極性液体試料中の分析対象物または分析対象物複合体に対して親和性を有する物質をその表面に有するスポットテスト用疎水性担体である。ここで、前記物質は、分配クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィーの固定相に用いられる物質から選択されるものであることが好ましい。
【０００５】
また、本発明は、前記担体上に、極性液体試料を滴下する工程；滴下から所定時間経過後、前記担体から前記液体試料を除去する工程；および、前記担体表面を観察する工程を含む、極性液体試料中の分析対象物の測定方法である。
【０００６】
【発明の実施の形態】
まず、前記スポットテスト用疎水性担体について説明する。なお、極性液体試料、分析対象物および分析対象物複合体の意義については後述する。
【０００７】
本発明に係る疎水性担体は、極性液体試料が滴下される部分（すなわち、液体試料との接触部分）が少なくとも疎水性であるような担体である。疎水性担体を用いることにより、極性液体試料の液滴と担体表面との接触面積がごく小さいものとなる。このような疎水性担体として、例えば、疎水性である、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）プレート、ろ紙またはフィルター等が挙げられる。より具体的には、例えば、シリコン撥水処理セルロース製の疎水性ろ紙等が挙げられる。
【０００８】
本発明に係る疎水性担体は、極性液体試料中の分析対象物または分析対象物複合体に対して親和性を有する物質をその表面に有する。これにより、極性液体試料中の分析対象物または分析対象物複合体は、極性液体試料（液相）と担体表面（固相）との親和性の相違により担体表面に保持され、極性液体試料から分離することができる。
【０００９】
この親和性の相違を利用した分離手法としては、例えば、
▲１▼  極性液体試料（液相）と担体表面（固相）との、分析対象物または分析対象物複合体の溶解性の差による分離〔分配〕、
▲２▼  分析対象物または分析対象物複合体を、担体表面（固相）に吸着させることによる分離〔吸着〕、および
▲３▼  分析対象物または分析対象物複合体を、担体表面のイオン交換体とイオン交換することによる分離〔イオン交換〕
が挙げられる。したがって、これらの分離手法に基づく場合、親和性を有する物質として、それぞれ、分配クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーの固定相（充填剤）に用いられる物質が例示として挙げられる。
【００１０】
具体的に分配クロマトグラフィーや吸着クロマトグラフィーの固定相に用いられる物質を例示すると、逆相系のものとして、オクタデシルシリル（ＯＤＳ）化シリカ、オクチルシリル化シリカ、エチルシリル化シリカ、メチルシリル化シリカ、フェニル化シリカ、フルオロカーボン化シリカやグラファイトカーボン化シリカなどの化学修飾型シリカ、ポリスチレンゲルまたはハイドロキシアパタイト等が挙げられ、また、順相逆相系のものとして、アミノプロピル、シアノプロピル、ジオールまたはキラル等が挙げられる。また、イオン交換クロマトグラフィーの固定相に用いられる物質を例示すると、陽イオン交換体として、−ＳＯ3Ｈまたは−ＣＯＯＨ等を有する樹脂が挙げられ、また、陰イオン交換体として、−Ｎ（ＣＨ3）3Ｃｌ、−Ｎ（ＣＨ2ＣＨ2ＯＨ）（ＣＨ3）2Ｃｌ、−ＮＨ2、−ＮＨＲまたは−ＮＲ2（ここで、Ｒは例えばアルキルなどを表す）等を有する樹脂が挙げられる。
【００１１】
本発明に係る上記担体は、スポットテストに用いられ、極性液体試料中の分析対象物を測定するものである。
【００１２】
ここでいう『スポットテスト』とは、担体上に極性液体試料を滴下し、その後担体上表面を観察することにより、前記試料中の分析対象物を測定する試験をいう。観察は肉眼で行っても機器を用いて行ってもよく、担体からの発色、吸光、蛍光または発光等を測定するものである。これにより、定性分析や定量分析が可能となる。
【００１３】
また、ここでいう『極性液体試料』は、極性液体である限り特に限定されず、試料原液のみならず、試料原液を希釈または濃縮した液体、あるいは固体試料を溶解または分散させた液体をも含む。例えば、極性液体試料は、水等の極性溶媒をその主体とする試料である。具体的には、生体試料（血液、血清、血漿、尿、髄液、精液、唾液、涙などの体液、脳、肝臓、腎臓などの臓器の抽出液、毛髪、爪、皮膚などの組織の抽出液、糞便）、食品（穀物、野菜、果物、魚介類、加工食品）、飲料（水、茶、牛乳、果汁など）および環境分析用試料（飲料水、河川水、湖沼水、海水、土壌など）等が挙げられる。
【００１４】
ここでいう『分析対象物』も特に限定されず、例えば、アルミニウム、コバルト、銅、鉄、マグネシウム、ニッケル、鉛、リチウム、亜鉛、水銀、クロム、マンガン、カドミウム、カルシウム、スズもしくはセレンなどの金属、ソニサミド、クロナゼパム、ニトラゼパム、ジアゼパム、アセタゾールアミド、プロパフェノン、メキシレチン、塩酸ピルジカイニドもしくはプロプラノロールなどの薬剤、または、アドレナリン、ノルアドレナリン、ドーパミン、カテコールアミン、プトレッシン、カダベリン、スペルミジン、スペルミン、Ｌ−ドーパ、バニリルマンデル酸（ＶＭＡ）、ホモバニリン酸（ＨＶＡ）、メタネフリン、ノルメタネフリン、３−メトキシ−４−ヒドロキシフェニルエチレングリコール（ＭＨＰＧ）、セロトニン、５−ヒドロキシインドール−３−酢酸（５−ＨＩＡＡ）、ヘモグロビンＡ1、ヘモグロビンＡ1c 、ヘモグロビンＦ、グリコアルブミン、１，５−アンヒドロ−Ｄ−グルシトール（１，５−ＡＧ）、ヒスタミン、ビタミンＫ分画、コプロポルフィリン、ウロポルフィリン、プロトポルフィリン、グアニジノコハク酸、グアニジノ酢酸、グアニジノプロピオン酸、グアニジノ酪酸、グアニジン、メチルグアニジン、ビタミンＡ、ビタミンＡ分画、ビタミンＢ1、ビタミンＢ2、ビタミンＢ6、ピリドキサールリン酸（ＰＬＰ）、アスコルビン酸（ビタミンＣ）、ビタミンＥ、ビタミンＥ分画、ビタミンＫ分画、各種アミノ酸、ハイドロキシプロリン、γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、３−メチルヒスチジン、ピリジノリン、胆汁酸胞合体分画各成分、馬尿酸、メチル馬尿酸、マンデル酸もしくはネオプテリン等が挙げられる。そして、所望の分析対象物に対して親和性を有する適切な物質を選択し、その物質を担体上に固定する。これにより、極性液体試料中の分析対象物が担体上に保持され、分析対象物の測定が可能となる。
なお、この分析対象物に対して親和性を有する物質が予め固定されている担体を使用することもできる。
【００１５】
あるいは、分析対象物の代わりに、分析対象物と検出物質（例えばキレート発色剤やラベル化剤）との複合体（『分析対象物複合体』）に対して親和性を有する適切な物質を選択し、その物質が固定された担体を用いてもよい。例えば、肉眼によりスポットを観察する場合、分析対象物それ自体が無色である場合には、肉眼で分析対象物を観察することは不可能であるが、その分析対象物と検出物質との複合体が呈色や蛍光等を示すならば、分析対象物を複合体の形で肉眼で観察できる。分析対象物と複合体を形成するこのような検出物質としては、例えば、２，２−ジヒドロキシアゾベンゼン〔ＤＨＡＢ〕、ポルフィリン、４−（２−ピリジルアゾ）レゾルシノール、８−キノリノール、１，１０−フェナントロリン、２−ニトロソ−５−（Ｎ−プロピル−Ｎ−スルホプロピルアミノ）−フェノール〔Ｎｉｔｒｏｓｏ−ＰＳＡＰ〕、バソフェナンスロリン、２−（２−チアゾリルアゾ）−４−メチル−５−スルホメチルアミノ安息香酸〔ＴＡＭＳＭＢ〕または４−（３，５−ジブロモ−２−ピリジルアゾ）−Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）アニリンナトリウムなどのキレート発色剤；ダンシルクロリド、ｏ−フタルアルデヒド、フルオレサミン、ナフタレン−２，３−ジカルボキシアルデヒド、２−メトキシ−２，４−ジフェニルフラン−３（２Ｈ）−オン、４−クロロ−７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾール、４−フルオロ−７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾール、９−フルオレニルメチルクロロホルメート、スクシンイミドナフチルカルバメート、３−（７−メトキシクマリン−３−カルボニル）−２−オキサゾロンまたは４−｛〔５−（ジメチルアミノ）−１−ナフチルスルホニル〕アミノ｝フェニルイソチオシアネートなどのアミンやアミノ酸のラベル化剤；５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）、Ｎ−〔４−（２−フタリミジル）−フェニル〕マレイミド、アンモニウム７−フルオロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−スルホネート、４−（アミノスルホニル）−７−フルオロ−２，１，３−ベンゾキサゾールまたは４−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノスルホニル）−７−フルオロ−２，１，３−ベンゾキサゾールなどのチオール基のラベル化剤；４−ブロモメチルメトキシクマリン、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシル−ｏ−（７−メトキシクマリン−４−イル）メチルイソウレア、４−ジアゾメチル−７−メトキシクマリン、４−ブロモメチル−６，７−ジメトキシクマリン、９−アントリルジアゾメタン、９−ブロモメチルアクリジン、ｐ−（９−アントロイロキシ）フェナシルブロミド、１−ブロモアセチルピレン、１−ピレニルジアゾメタン、フェナントレン−９，１０−ジアミン、９−アミノフェナントレン、ダンシルピペラジン、２−〔ｐ−（５，６−メチレンジオキシ−２Ｈ−ベンゾトリアゾール−２−イル）〕フェネチルアミン、２−（ｐ−アミノメチルフェニル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２Ｈ−ベンゾトリアゾリル−５−アミンまたはモノダンシルカダベリンなどのカルボン酸のラベル化剤；１−アントロイルニトリル、９−アントロイルニトリル、７−〔（クロロカルボニル）メトキシ〕−４−メチルクマリン、７−メトキシクマリン−３−カルボニルアジド、７−メトキシクマリン−３，４−カルボニルアジド、３−（ジフルオロ−１，３，５−トリアジニル）−１−（エチルチオ）−２−ｎ−プロピルベンズ〔ｆ〕イソインドールまたは２−（５−クロロカルボニル−２−オキサゾリル）−５，６−メチレンジオキシベンゾフランなどの水酸基のラベル化剤；ダンシルヒドラジン、アントラセン１−カルボン酸ヒドラジド、アントラセン２−カルボン酸ヒドラジド、ｏ−（１−アントリルメチル）ヒドロキシルアミン、ｏ−（２−アントリルメチル）ヒドロキシルアミン、ｏ−（９−アントリルメチル）ヒドロキシルアミン、１，２−ジアミノ−４，５−ジメトキシベンゼン、１，２−ジアミノ−４，５−メチレンジオキシベンゼン、１，２−ジフェニルエチレンジアミンまたは１，２−ビス−（４−メトキシフェニル）エチレンジアミンなどのカルボニルやα−ケト酸のラベル化剤；３−ブロモメチル−６，７−ジメトキシ−１−メチル−２（１Ｈ）−キノキサリン、３−ブロモメチル−６，７−メチレンジオキシ−１−メチル−２（１Ｈ）−キノキサリン、３−カルボニルクロリド−６，７−ジメトキシ−１−メチル−２（１Ｈ）−キノキサリンまたは３−カルボニルアジド−６，７−ジメトキシ−１−メチル−２（１Ｈ）−キノキサリンなどの蛍光ラベル化剤；（＋）−１−（１−イソシアナトエチル）ナフタレンまたは（＋）−１−（９−フルオレニル）エチルクロロホルメートなどの光学活性ラベル化剤；あるいは、アミドブラックまたはクマジーブリリアントブルーなどのタンパク質染色剤等が挙げられる。なお、分析対象物が金属の場合は、金属と無電荷錯体または荷電錯体を形成するような検出物質が好ましい。
【００１６】
次に、本発明に係る前記担体を用いて、極性液体試料中の分析対象物を測定する方法について説明する。
【００１７】
まず、極性液体試料を準備する。原液をそのまま用いる場合を除き、原液の希釈、原液の濃縮、検出物質の添加等、必要に応じて原液を処理する。なお、極性液体試料中には、例えば、緩衝剤、有機溶媒、酸または塩基、塩、イオン対等の添加剤が含まれていてもよい。
【００１８】
緩衝剤としては、例えば、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、ＨＥＰＥＳ、ＭＯＰＳ、ＭＥＳ、ホウ酸、グリシン等が挙げられる。
【００１９】
有機溶媒の添加により、例えば、担体表面の物質として、前記の分配クロマトグラフィーまたは吸着クロマトグラフィーの固定相（充填剤）として用いられるものを使用する場合に、分析対象物または分析対象物複合体の担体表面へのより短時間での保持が可能となる。
【００２０】
有機溶媒としては、例えば、メチルアルコール、エチルアルコール、アセトニトリル、イソプロパノール、ジオキサンまたはテトラヒドロフラン等が挙げられる。
【００２１】
極性液体試料中の有機溶媒濃度は、あまり高くならない範囲で適宜定めることができる。例えば、有機溶媒としてエチルアルコールを用いる場合は、２５％（Ｖ／Ｖ）以下で含有させるのがよい。
【００２２】
酸または塩基の添加により、例えば、担体表面の物質として前記のイオン交換クロマトグラフィーの固定相（充填剤）として用いられるものを使用する場合に、より高感度での分析対象物の測定が可能となる。
【００２３】
酸または塩基としては、例えば、陽イオン交換の場合は、硝酸または塩酸等が、陰イオン交換の場合は、炭酸二ナトリウム、炭酸水素ナトリウムまたは水酸化ナトリウム等が挙げられる。
【００２４】
塩としては、例えば塩化ナトリウム、塩化カリウムまたは塩化カルシウム等が挙げられる。
【００２５】
イオン対の添加により、例えば、担体表面の物質として、前記の分配クロマトグラフィーの固定相（充填剤）として用いられるものを使用する場合に、分析対象物または分析対象物複合体の担体表面への保持がコントロール可能となる。
【００２６】
分析対象物が陽イオン性物質の場合は、例えばアルキルスルホン酸塩等を、また陰イオン性物質の場合は、例えばアルキルアンモニウム等を用いてもよい。また、比較的大きな疎水基を有する有機塩を用いてもよい。
【００２７】
イオン対としては、例えば、ＴＢＡ+Ｂｒ-、ＣＨ3ＳＯ3-、Ｃ5Ｈ11ＳＯ3-、ＬｉＣｌＯ4、ＨＣｌＯ4、１，１０−フェナントロリン、ＮｉＳＯ4、ＣｏＳＯ4、ＥＤＴＡ、ＮａＯＡｃ、ＮａＢｒ、ドデシル硫酸ナトリウム、セチルピリジニウム塩または種々の第四級アンモニウムイオン等が挙げられる。
【００２８】
次に、このようにして準備した極性液体試料を、疎水性担体上に滴下する。例えば、１μL〜５００μLの量滴下する。
【００２９】
次に、滴下後、所定時間放置する。分析対象物が極性液体試料と担体上の親和性物質との間で平衡に達する程度の時間を、この所定時間として選択するのが理想的ではあるが、通常１分間放置すれば測定可能となる。
【００３０】
次に、この担体から極性液体試料の液滴を除去する。
【００３１】
本発明に係る測定方法においては、蒸発除去以外の方法で液滴を除去する。例えば、ピペットやアスピレーター等により吸い取って除去してもよく、紙や不繊布等の液体吸収性材料で吸い取って除去してもよく、単に振とうや傾斜させることにより担体から液滴を落として除去してもよい。
【００３２】
次に、担体表面を観察する。具体的には、スポットからの発色、吸光、蛍光または発光を、肉眼によりあるいは機器により測定する。
【００３３】
その結果、スポット状の発色、吸光、蛍光または発光が認められた場合は試料中に分析対象物が存在すると判定でき、逆の場合には分析対象物が存在しないと判定できる。
【００３４】
なお、機器により発色、吸光、蛍光または発光測定する場合、デンシトメータ、分光光度計、吸光度計、蛍光測定装置または発光測定装置をそれぞれについて使用すればよい。
【００３５】
【実施例】
試料中のアルミニウムイオンの測定
アルミニウムイオンを１００nmol/L（３ppb）の濃度で含む０．０１N 塩酸を、テフロンビーカーへ分取し、８０μmol/Lの２，２−ジヒドロキシアゾベンゼン（ＤＨＡＢ）溶液を０．７mL添加した。この溶液に最終濃度が２３wt％となるようにエタノールを添加し、次に０．１mol/LのＭＥＳ緩衝液（pH５．５）を０．２mL添加してpHを調整し、更に蒸留水を加えて全量２．５mLとし、室温で３０分間反応させた。
このアルミニウムイオン−ＤＨＡＢ錯体形成の終了した極性液体試料５０μL を、オクタデシルシリル化シリカＴＬＣプレ−ト（メルク社製；カタログ番号５９１４）上に滴下して、室温で２０分間静置した。
その後、このＴＬＣプレートを傾斜して表面上の液滴を払い落した。
この液滴が存在した表面上の位置にＵＶランプ（スペクトロニクス社製；モデルＱ−１２ＮＦ）を照射したところ、直径約６mmの黄色の円形の蛍光スポットが認められ、試料中にアルミニウムイオンが存在することが確認された。
【００３６】
【発明の効果】
本発明のスポットテスト用疎水性担体及び極性液体試料中の分析対象物の測定方法は、測定に当たり特殊な装置を必要とせず、その操作が簡便であり、加熱による濃縮、乾燥を行わないため測定結果に誤差を生じさせる副反応が生じず、かつ試料中に含まれる塩類等の析出による測定の妨害を受けずに、数ｐｐｂという微量の分析対象物でさえも高感度にかつ正確に測定が行えるという効果を有するものである。