(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトインターロイキン２レセプターγ鎖に特異的に結合し、ヒトインターロイキン２の応答を遮断する活性を有し、かつ、配列番号１または配列番号２記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド。
【請求項２】
ポリペプチドが、アミノ酸配列のＮ末端Ｍｅｔが除かれたポリペプチドである請求項1記載のポリペプチド。
【請求項３】
請求項１または請求項２記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ
【請求項４】
ＤＮＡが配列番号１記載の塩基配列を有する請求項３記載のＤＮＡ。
【請求項５】
ＤＮＡが配列番号２記載の塩基配列を有する請求項３記載のＤＮＡ。
【請求項６】
請求項３乃至５記載のＤＮＡを有する組換えＤＮＡ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明はヒトインターロイキン２レセプターγ鎖に特異的に結合して、ヒトインターロイキン２レセプターγ鎖とインターロイキン２レセプターβ鎖との結合を選択的に阻害し、インターロイキン２応答を遮断する活性を有するポリペプチド、該ポリペプチドを含有する免疫抑制剤、該ポリペプチドをコードするＤＮＡ、該遺伝子を有する組換えＤＮＡ、該組換えＤＮＡを有する形質転換体、該形質転換体を培養して目的とするポリペプチドを製造する方法に関する。
本ポリペプチドは、単独、あるいはインターロイキン２のインターロイキン２レセプターへの結合を阻害する物質と併用することにより、インターロイキン２の関与が示唆されている臓器移植時の拒絶反応の予防、アレルギー性疾患や自己免疫疾患などの炎症性疾患の治療薬として有効な薬剤として利用し得る有用な物質である。
以下、「インターロイキン２」を単に「ＩＬ−２」と称することがある。
【０００２】
【従来の技術】
臓器移植の外科的技術が著しく向上した現在、臓器移植手術の成否は術後の移植片拒絶反応をいかにして抑制できるかにポイントが絞られてきている。拒絶反応は、生体が移植片を異物として認識し、それを排除するために一連の免疫反応が惹起されることにより生じる。そこで、従来より拒絶防止薬として、ステロイド剤、アザチオプリン、メトトレキセート、６−メルカプトプリンなどのいわゆる免疫抑制剤と呼ばれている薬剤の投与が行われてきた。しかし、安全域が狭いこと、あるいは効果が弱いことなどの理由で生着率の著しい向上はみられなかった。
ところが、近年開発されたサイクロスポリンＡの登場により、生着率には格段の向上がみられるようになった。しかしながら、サイクロスポリンＡには重篤な腎毒性があることが明らかとなり、その使用の制限を与儀なくされてきている。
したがって、より安全で、かつ効果的な免疫抑制剤の開発が望まれてきている。
【０００３】
さて、ＩＬ−２は、ヘルパーＴ細胞から産生されるタンパク質であり、生体内においてキラーＴ細胞の増殖や分化誘導、Ｂ細胞の分化誘導など、広汎な働きを有している生体防御上非常に重要な因子である。臓器移植や骨髄移植においては、移植片の生着の鍵を握ると考えられている宿主対移植片反応（ＨＶＧ反応）、あるいは移植片対宿主反応（ＧＶＨ反応）に、ＩＬ−２などにより活性化されたキラーＴ細胞が深く関与していることが示されている。
他方、自己免疫疾患は生体内での免疫系のバランスがくずれ、生体自身を攻撃することにより発症すると考えられており、その中でも特にＩＬ−２をはじめとする免疫系に関与する因子の過剰産生、あるいはそれに対する過剰反応などがその大きな一因となっている可能性が高い。
【０００４】
これらのことから、ＩＬ−２応答を選択的かつ効果的に抑制することができれば、臓器移植時の拒絶反応の予防や、自己免疫疾患の治療が可能となるものと考えられるようになった。事実、ＩＬ−２と細胞毒を融合させて、ＩＬ−２を結合する受容体（ＩＬ−２レセプター）を有しているＩＬ−２応答細胞を選択的に傷害することができるポリペプチドを調製し、これを自己免疫疾患の動物モデルの一つであるアジュバント関節炎ラットに投与すると関節炎の発症が遅れ症状も軽くなり、またマウス同種心臓移植時に投与すると移植心の拒絶が抑制されるという報告もある（ Proc. Natl.Acad.Sci.USA、８６巻、１００８頁、1989年）。
しかし、ＩＬ−２と細胞毒を融合させて得られるポリペプチドはその血中半減期が短く、効果をあげるためには大量に投与する必要があり、それに伴う副作用が懸念される。そこで、より安全でかつ有効なＩＬ−２応答を抑制できる薬剤の開発が望まれている。
【０００５】
従来より、ＩＬ−２応答細胞上のＩＬ−２レセプターは、分子量が約５５ｋｄのα鎖と約７５ｋｄのβ鎖の２つの糖蛋白質分子からなることが知られており、それぞれの分子とＩＬ−２との結合の解離定数は、α鎖の場合１０-8Ｍ、β鎖の場合１０-9Ｍであるが、α鎖とβ鎖の両方の分子が接してＩＬ−２との三者の会合体が形成された場合には、解離定数が１０-12Ｍという高親和性の結合となることものと考えられていた。
しかし、マウスの非リンパ球系の細胞にヒトβ鎖ｃＤＮＡを単独に導入してもＩＬ−２の結合は起こらず、また、ヒトα鎖とヒトβ鎖のｃＤＮＡを同時に導入しても、中程度のＩＬ−２の結合は起こるが、高親和性の結合は起こらないことが明らかとなり（Science、２４４巻、５５１頁、１９８９年）、ＩＬ−２の結合を規定するα鎖、β鎖以外の第三の分子の存在が示唆されるようになった。
そして、本発明者らによって、第三のＩＬ−２レセプターの構成分子である６４ｋｄの糖蛋白質分子（以下、ＩＬ−２レセプターγ鎖と称する）をコードする遺伝子がクローニングされることにより（特願平４−１０４９４７・Science、２５７巻、３７９頁、１９９２年）、ＩＬ−２／ＩＬ−２レセプターシステムが完全に解明された。
【０００６】
すなわち、マウスの非リンパ球系の細胞にヒトβ鎖とヒトγ鎖のｃＤＮＡを同時に導入しＩＬ−２の結合を解析すると、当初β鎖単独で生じると考えられていた中親和性の結合が観察されるようになり、また、ヒトα鎖、ヒトβ鎖、及びヒトγ鎖のｃＤＮＡを同時に導入すると、当初α鎖とβ鎖により生じると考えられていた高親和性のＩＬ−２の結合が起こることが明らかとなった。更に、ＩＬ−２のシグナル伝達のトリガーと考えられているＩＬ−２とＩＬ−２レセプター複合体の細胞内への取り込み反応は、β鎖単独、あるいはα鎖とβ鎖の両者の発現細胞においては生じないが、それらの細胞にγ鎖を発現させることにより生じることが示された。従って、本発明者らが世界で初めて見いだすことに成功したＩＬ−２レセプターγ鎖分子は、単にＩＬ−２の結合を規定している分子ではなく、ＩＬ−２のシグナル伝達機構に必須の分子であることが明らかとなった。
【０００７】
ＩＬ−２レセプターγ鎖分子は、ＩＬ−２存在下でＩＬ−２レセプターβ鎖の細胞外領域に結合することが知られている（Science、２５７巻、３７９頁、１９９２年）。従って、β鎖とγ鎖との結合を妨げると、β鎖単独の場合にはＩＬ−２結合そのものが生じず、α鎖とβ鎖の両者に対しては中程度の結合が生じるものの、ＩＬ−２シグナル伝達が遮断されるものと考えられる。すなわち、ＩＬ−２応答細胞上のＩＬ−２レセプターβ鎖とＩＬ−２レセプターγ鎖との結合を阻害することができれば、ＩＬ−２のシグナル伝達が完全に遮断されてＩＬ−２に対して不応答性となり、ＩＬ−２が関与していると考えられる臓器移植時の拒絶反応や、自己免疫疾患等の治療が可能となる。しかし、現在までＩＬ−２レセプターβ鎖とＩＬ−２レセプターγ鎖との結合阻害する活性を有する物質は全く知られていない。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の目的はヒトＩＬ−２レセプターγ鎖に特異的に結合して、ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖とＩＬ−２レセプターβ鎖との結合を選択的に阻害し、ＩＬ−２応答を遮断する活性を有するポリペプチド、該ポリペプチドを含有する免疫抑制剤、該ポリペプチドをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを有する組換えＤＮＡ、該組換えＤＮＡを有する形質転換体、該形質転換体を培養して目的とするポリペプチドを製造する方法を提供することである。
本ポリペプチドは、単独、あるいはＩＬ−２とＩＬ−２レセプターとの結合を阻害する物質と併用することにより、ＩＬ−２の関与が示唆されている臓器移植時の拒絶反応の予防、アレルギー性疾患または自己免疫疾患などの炎症性疾患の治療薬として有効な薬剤として利用し得る。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、後述の方法により、目的とするヒトＩＬ−２レセプターγ鎖に特異的に結合して、ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖とヒトＩＬ−２レセプターβ鎖との結合を選択的に阻害し、ＩＬ−２応答を遮断する活性を有するポリペプチドを見いだし、本発明を完成した。
すなわち、本発明はヒトＩＬ−２レセプターγ鎖に特異的に結合して、ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖とヒトＩＬ−２レセプターβ鎖との結合を選択的に阻害し、ＩＬ−２応答を遮断する活性を有するポリペプチド、該ポリペプチドを含有する免疫抑制剤、該ポリペプチドをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを有する組換えＤＮＡ、該組換えＤＮＡを有する形質転換体、該形質転換体を培養して目的とするポリペプチドを製造する方法を提供するものである。
詳細には本発明は以下の通りである。
（発明１）ヒトインターロイキン２レセプターγ鎖に特異的に結合し、ヒトインターロイキン２の応答を遮断する活性を有するポリペプチド。
（発明２）ポリペプチドが、マウスモノクローナル抗体である発明１記載のポリペプチド。
（発明３）モノクローナル抗体を産生する細胞が、ＧＰ−２又はＧＰ−４である発明２記載のモノクローナル抗体。
（発明４）モノクローナル抗体を産生する細胞が、ＴＵＧｈ４、ＴＵＧｈ５又はＡＧ１４である発明２記載のモノクローナル抗体。
（発明５）ポリペプチドが、モノクローナル抗体の可変領域のみを含んでなる発明１記載のポリペプチド。
（発明６）ポリペプチドが、配列番号１記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドである発明５記載のポリペプチド。
（発明７）ポリペプチドが、配列番号２記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドである発明５記載のポリペプチド。
（発明８）ポリペプチドが、配列番号１記載のアミノ酸配列のＮ末端Ｍｅｔが除かれたポリペプチドである発明５記載のポリペプチド。
（発明９）ポリペプチドが、配列番号２記載のアミノ酸配列のＮ末端Ｍｅｔが除かれたポリペプチドである発明５記載のポリペプチド。
（発明１０）ポリペプチドが、（１）配列番号１記載のアミノ酸配列の一部を削除、（２）配列番号１記載のアミノ酸配列の一部を他のアミノ酸配列に置換、（３）配列番号１記載のアミノ酸配列にアミノ酸残基もしくはペプチドを付加、または（４）配列番号１記載のアミノ酸配列の一部をアセチル化、アミド化、もしくはポリエチレングリコール付加したものである発明５記載のポリペプチド。
（発明１１）ポリペプチドが、（１）配列番号２記載のアミノ酸配列の一部を削除、（２）配列番号２記載のアミノ酸配列の一部を他のアミノ酸配列に置換、（３）配列番号２記載のアミノ酸配列にアミノ酸残基もしくはペプチドを付加、または（４）配列番号２記載のアミノ酸配列の一部をアセチル化、アミド化、もしくはポリエチレングリコール付加したものである発明５記載のポリペプチド。
（発明１２）ポリペプチドが、マウスモノクローナル抗体の定常領域をヒト抗体の定常領域へと変換した発明１記載のポリペプチド。
（発明１３）ポリペプチドが、マウスモノクローナル抗体の定常領域、及び可変領域の枠組み配列を、各々ヒト抗体の定常領域と枠組み配列へと変換した発明１記載のポリペプチド。
（発明１４）発明１ないし１３記載のポリペプチドを含有してなる免疫抑制剤。
（発明１５）発明１ないし１３記載のポリペプチドと、抗ヒトインターロイキン２レセプターα鎖抗体、及び／又は抗ヒトインターロイキン２レセプターβ鎖抗体とを含有してなる発明１４記載の免疫抑制剤。
（発明１６）発明１ないし１３記載のポリペプチドと、抗ヒトインターロイキン２レセプターα鎖抗体の可変領域を含むポリペプチド、該ポリペプチドの一部を削除したポリペプチド、該ポリペプチドの一部を他のアミノ酸に置換したポリペプチド、もしくは該ポリペプチドの一部に他のアミノ酸残基、ポリペプチドあるいは他の物質を付加したポリペプチド、及び／又は抗ヒトインターロイキン２レセプターβ鎖抗体の可変領域を含むポリペプチド、該ポリペプチドの一部を削除したポリペプチド、該ポリペプチドの一部を他のアミノ酸に置換したポリペプチド、もしくは該ポリペプチドの一部に他のアミノ酸残基、ポリペプチドあるいは他の物質を付加したポリペプチドとを含有してなる発明１４記載の免疫抑制剤。
（発明１７）発明１ないし１３記載のポリペプチドと、ヒト定常領域を有する抗ヒトインターロイキン２レセプターα鎖抗体、及び／又はヒト定常領域を有する抗ヒトインターロイキン２レセプターβ鎖抗体とを含有してなる発明１４記載の免疫抑制剤。
（発明１８）発明１ないし１３記載のポリペプチドと、ヒト定常領域及びヒト可変領域の枠組み配列を有する抗ヒトインターロイキン２レセプターα鎖抗体、及び／又はヒト定常領域及びヒト可変領域の枠組み配列を有する抗ヒトインターロイキン２レセプターβ鎖抗体とを含有してなる発明１４記載の免疫抑制剤。
（発明１９）発明１ないし１３記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ。
（発明２０）ＤＮＡが配列番号１記載の塩基配列を有する発明１９記載のＤＮＡ。
（発明２１）ＤＮＡが配列番号２記載の塩基配列を有する発明１９記載のＤＮＡ。
（発明２２）発明１９ないし２１記載のＤＮＡを有する組換えＤＮＡ。
（発明２３）発明２２記載の組換えＤＮＡを有する形質転換体。
（発明２４）形質転換体が大腸菌、または真核細胞である発明２３記載の形質転換体。
（発明２５）発明２３または２４記載の形質転換体を培養することにより、発明１ないし１３記載のポリペプチドを生産させ、該ポリペプチドを取得することを特徴とする該ポリペプチドの製造方法。
【００１０】
本発明に従えば、ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖に結合し、ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖とヒトＩＬ−２レセプターβ鎖との結合を選択的に阻害し、ＩＬ−２応答を遮断する活性を有するポリペプチドが提供される。
【００１１】
本研究者らはまずヒトＩＬ−２レセプターγ鎖に特異的に結合するマウスモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを多数作成し、その中からヒトＩＬ−２応答を阻害する活性を有するマウスモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマクローンを選択した。以下にマウス抗ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマクローンの調製法を記す。
【００１２】
ハイブリドーマは骨髄腫細胞と抗体産生細胞を融合することにより製造される。抗体産生細胞としては、リコンビナントヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子で免疫されたマウスやラットなどの動物からの脾臓またはリンパ節細胞を用いればよい。なお、免疫する物質としては、リコンビナントヒトＩＬ−２レセプター分子の場合、単独、あるいは他の蛋白質との融合分子、分子の一部のポリペプチド等を用いても差し支えない。その場合、リコンビナントヒトＩＬ−２レセプター分子のうち、細胞外領域のみからなる分子を用いると特に効率的である。また、リコンビナントヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子の代わりに、ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子を発現しているヒト細胞、ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子をコードする遺伝子が導入され、該γ鎖分子を生合成するに至ったマウス細胞等を用いても構わない。また、それらの細胞より精製したγ鎖分子そのものを免疫原として用いてもさしつかえない。
【００１３】
抗体産生細胞と骨髄腫細胞の由来する動物の種は、両細胞が融合可能な限り異なってもよいが、通常同一種の細胞を用いた方が良い結果が得られる。本発明実施のための一つの好ましいハイブリドーマは、ヒトリコンビナントＩＬ−２レセプターγ鎖分子の細胞外領域のみからなるポリペプチドで免疫したマウスの脾臓細胞または同リンパ節細胞と、マウス骨髄腫細胞との間のハイブリドーマである。
例えば、生理食塩水に懸濁したヒトリコンビナントＩＬ−２レセプターγ鎖分子の細胞外領域のみからなるポリペプチドで免疫したBalb/cマウスの脾臓細胞とBalb/cマウスの骨髄腫細胞SP2/0-Ag14の間のハイブリドーマであり、後述の実施例で示されるように優れた結果が得られる。
ヒトリコンビナントＩＬ−２レセプターγ鎖分子の細胞外領域のみからなるポリペプチドは、同分子をコードする遺伝子を含む発現プラスミドベクターを有する形質転換体を培養することにより得られる。形質転換体としては大腸菌等の原核細胞、ＣＨＯ細胞等の真核細胞などいずれを用いても構わない。
【００１４】
骨髄腫細胞としては、SP2/0-Ag14のほかに、X63-Ag8-6.5.3, P3-X63-Ag8-U1, P3-X63-Ag8, P3-NSI/1-Ag4-1, MPC11-4.5.6.TG.1.7, （以上マウス細胞）、210.RCY.Ag1.2.3 （ラット細胞）、SK0-007,GH15006TG-A12 （以上ヒト細胞）等の８アザグアニン耐性の細胞株を用いてもよい。ハイブリドーマの作成と、更にその中からＩＬ−２レセプターのγ鎖分子に結合し、ＩＬ−２応答を遮断する活性を有するモノクローナル抗体を産生しているハイブリドーマクローンの選択は、例えば次の様にして行える。ポリエチレングリコール、あるいはセンダイウイルスなどを用いて抗体産生細胞と骨髄腫細胞とを融合させる。融合したハイブリドーマのみが、ヒポキサンチン、チミジン、アミノプテリンを含む培地（ＨＡＴ培地）中で生育することができる。得られたハイブリドーマがすべて抗体を産生しているわけではないし、抗体を産生しているハイブリドーマがすべて目的とする抗体を産生しているわけではないので、それらのハイブリドーマクローンの中からＩＬ−２レセプターのγ鎖分子に結合し、ＩＬ−２応答を遮断する活性を有しているモノクローナル抗体を産生しているハイブリドーマクローンを選択しなければならない。
【００１５】
その選択は例えば以下の様な方法を用いて行うことができる。すなわち、ハイブリドーマ培養上清中に産生されている抗体の、ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子をコードする遺伝子が導入され、該ペプチドを発現しているマウスＬ９２９細胞（以下Ｌγ細胞と称する）への結合と、ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖分子をコードする遺伝子が導入され、該ペプチドを発現しているマウスＬ９２９細胞（以下、Ｌβ細胞と称する）への結合を測定し、前者に対して結合量が高く、後者に対して結合量の低いものを選択する。そのような抗体を産生しているハイブリドーマがＩＬ−２レセプターのγ鎖分子に特異的に結合する抗体を産生しているハイブリドーマとなる。
【００１６】
細胞への抗体の結合量の測定は、放射標識された抗マウスイムノグロブリン抗体を用いたラジオイムノアッセイ、蛍光色素標識された抗マウスイムノグロブリン抗体を用いた蛍光イムノアッセイなどいかなる方法を用いてもかまわない。また、スクリーニングに用いる細胞は、ヒトγ鎖を発現している細胞とヒトγ鎖を発現していない細胞との組み合わせである限りいかなる細胞を用いてもかまわない。
【００１７】
ＩＬ−２レセプターのγ鎖分子に特異的に結合する抗体が、すべてＩＬ−２応答を遮断する活性を有する抗体とは限らないので、更に例えば以下のような方法により、ＩＬ−２レセプターのγ鎖分子に対する抗体を産生しているハイブリドーマの中から、ＩＬ−２応答を遮断する活性を有する抗体を産生しているハイブリドーマを選択する。
ハイブリドーマ培養上清を、ヒトＩＬ−２依存的に増殖活性を示すヒト成人Ｔ細胞白血病ウイルス感染Ｔ細胞株ＩＬＴ−Ｍａｔ細胞に加え、ＩＬＴ−Ｍａｔ細胞の増殖阻害活性を測定する（Journal of Experimental Medicine、１６９巻、１３２３頁）。増殖阻害活性を有していれば、そのハイブリドーマが目的とするモノクローナル抗体産生細胞ということになる。なお、ＩＬ−２レセプターのγ鎖分子に対する抗体を産生しているハイブリドーマの中から、ＩＬ−２応答を遮断する活性を有する抗体を産生しているハイブリドーマを選択する方法としては、ＩＬＴ−Ｍａｔ細胞を用いる方法以外にも、ヒト細胞を用いて行うヒトＩＬ−２の生物活性測定法である限り、いかなる方法を用いても構わない。こうして得られたハイブリドーマクローンとして、例えばＧＰ−２（ＦＥＲＭ  Ｐ−１３５７６、ＢＰ−４６４１）、ＧＰ−４（ＦＥＲＭ  Ｐ−１３５７５、ＢＰ−４６４０）、ＴＵＧｈ４（ＦＥＲＭ  Ｐ−１４０１１、ＢＰ−４６４２）、ＴＵＧｈ５（ＦＥＲＭ  Ｐ−１４０１２、ＢＰ−４６４３）および、ＡＧ１４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４６４８）と呼ばれる細胞がある。
【００１８】
モノクローナル抗体の大量調製を行うには、ＧＰ−２細胞（ＦＥＲＭ  Ｐ−１３５７６、ＢＰ−４６４１）、ＧＰ−４細胞（ＦＥＲＭ  Ｐ−１３５７５、ＢＰ−４６４０）、ＴＵＧｈ４細胞（ＦＥＲＭ  Ｐ−１４０１１、ＢＰ−４６４２）、ＴＵＧｈ５細胞（ＦＥＲＭ  Ｐ−１４０１２、ＢＰ−４６４３）あるいは、ＡＧ１４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４６４８）を、組織適合性動物、あるいは胸腺欠損ヌードマウスなどの腹腔内に接種して増殖させ、該動物の腹水中に産生された抗体を回収して、塩析、イオン交換クロマトグラフィーなどの操作により精製すればよい。
【００１９】
次に、ＩＬ−２レセプターγ鎖に結合し、ＩＬ−２応答を遮断する活性を有するモノクローナル抗体のＶ領域からなるポリペプチドは以下のようにして作成することができる。
まず、ＩＬ−２レセプターγ鎖に結合し、ＩＬ−２応答を遮断する活性を有するモノクローナル抗体産生ハイブリドーマクローンよりtotalＲＮＡを抽出し、モノクローナル抗体のＶ領域をコードする遺伝子（ｃＤＮＡ）を取得する。本発明者らはより迅速に目的とするｃＤＮＡを取得する方法を鋭意工夫し、以下の様な方法により抗体のＶ領域をコードするｃＤＮＡを取得した。
【００２０】
すなわち、既に遺伝子の塩基配列が報告されているマウスＩｇＧのＨ鎖、及びＬ鎖の塩基配列を基に、それぞれのＶ領域の遺伝子の５’端、及び３’端に共通性の高い２０〜３０個の塩基配列を有するＤＮＡ分子（プライマーＤＮＡ）４種類を考案する。以降、５’側、３’側とはＨ鎖Ｖ領域遺伝子、及びＬ鎖Ｖ領域遺伝子のセンスストランドを基準としている。５’側プライマーとは、センスストランド上の配列を有するＤＮＡ分子であり、３’側のプライマーとはセンスストランドの３’端に相補的な配列を有するＤＮＡ分子である。
次に考案したＬ鎖Ｖ領域５’側プライマーの５’端に、翻訳開始コドンであるＡＴＧ配列を付加し、Ｈ鎖の３’側プライマーの３’端に翻訳終止コドンを付加する。
もちろん、Ｈ鎖Ｖ領域５’側プライマーの５’端にＡＴＧ配列を付加し、Ｌ鎖Ｖ領域３’側プライマーの３’端に終止コドンを付加しても良い。終止コドンとしてはTAA,TAG,TGAのいずれを用いても良い。尚、本発明の実施例においては、終止コドンとしてTGAを用いた。
なおＨ鎖及びＬ鎖のそれぞれのプライマーＤＮＡの５’端（ここでの５’端とは３’側プライマーにおいては該プライマー分子を基準としたときの５’端である）に、発現ベクターに挿入するための適当な制限酵素サイトを導入しておく。デザインしたプライマーＤＮＡはＤＮＡ合成機などを用いて化学合成する。
【００２１】
次に、得られたハイブリドーマより公知の方法に従ってtotalＲＮＡを抽出し、逆転写酵素と３’側プライマーＤＮＡを用いて一本鎖ｃＤＮＡを作製し、５’側プライマーＤＮＡ及び３’側プライマーＤＮＡを用い、Taqポリメラーゼによる Polymerase Chain Reaction法（ＰＣＲ法、Science, 230巻, 1350頁, 1985年）にて抗体のＨ鎖のＶ領域及びＬ鎖のＶ領域をコードするＤＮＡ断片のみをそれぞれ選択的に増幅し取得する。
【００２２】
Ｈ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子と、Ｌ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子とを大腸菌等で発現させ、機能的な抗体Ｖ領域からなるポリペプチドを調製するには、それぞれの遺伝子を２つのベクターに別個に組み込んで発現させるか、又はそれぞれの遺伝子を１つのベクターに同時に組み込んで発現させ、その後Ｈ鎖Ｖ領域からなるポリペプチドとＬ鎖Ｖ領域からなるポリペプチドをアッセンブリさせてもよいが、その効率は極めて悪いことが知られている（Science, 240巻, 1038頁, 1988年）。
本来抗体は、Ｈ鎖とＬ鎖がＳＳ架橋による共有結合で結合して得られる分子が２つが組み合わさって構成されている。すなわちダイマーの構造をしており、また各分子のＨ鎖同士がＳＳ結合を形成している。Ｈ鎖とＬ鎖のＳＳ架橋の位置はともに定常領域（以下、Ｃ領域と称する）上であり、Ｈ鎖Ｖ領域とＬ鎖Ｖ領域同士は非共有結合で結合している。
したがって、Ｈ鎖Ｖ領域からなるポリペプチドとＬ鎖Ｖ領域からなるポリペプチドをアッセンブリさせて抗体Ｖ領域のみからなるポリペプチドを調製する場合、両分子の会合は非共有結合のみに頼らなければならないため、機能的な分子の形成効率が悪いものと考えられる。しかし最近になって、Ｈ鎖Ｖ領域からなるポリペプチドとＬ鎖Ｖ領域からなるポリペプチドをリンカーを用いて連結させ、１本鎖の機能的な分子として調製する技術が開発された（Science, 242巻, 423頁, 1988年）。
本発明者らは当該技術を応用して、機能的でかつ１本鎖の抗ＩＬ−２レセプターγ鎖抗体のＶ領域のみからなるポリペプチドを発現させることに成功した。
【００２３】
まず、プロモーター領域を含むＤＮＡ、リボゾーム結合領域を含むＤＮＡ、ＡＴＧ配列を付加した５’側プライマーに導入した制限酵素サイトを含むＤＮＡ、同鎖３’側プライマーに導入した制限酵素サイトを含むＤＮＡ、抗体Ｌ鎖Ｖ領域と抗体Ｈ鎖Ｖ領域とをつなぐための適当な長さのリンカーペプチドをコードするＤＮＡ、ＡＴＧ配列を付加していない５’側プライマーに導入した制限酵素サイトを含むＤＮＡ、同鎖３’側プライマーに導入した制限酵素サイトを含むＤＮＡ、最後にターミネーター領域を含むＤＮＡの順に上流より並べられているＤＮＡを含有する発現ベクターを構築する。
ＰＣＲにより増幅したＨ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡと、Ｌ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡのそれぞれを挿入する場合、リンカーペプチドをコードするＤＮＡ及びＶ領域をコードするＤＮＡの翻訳がずれないように注意する。
【００２４】
さて、本発明においてプロモーターの由来は問うところではなく、例えば大腸菌のtrpプロモーター、tacプロモーター、trcプロモーター、lacプロモーターや、λファージのλＰLプロモーター、λＰRプロモーター、さらには真核細胞のＳＶ４０プロモーター、MoloneyＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーターなどを用いることができる。リボゾーム結合領域は、例えば大腸菌のtrpＬやtrpＥ、lacＺのリボゾーム結合領域や、λファージのＣII蛋白のリボゾーム結合領域を用いることができる。あるいは化学合成したＤＮＡ配列を用いることができる。また、目的とするポリペプチドを大腸菌体内に顆粒状として大量に蓄積させるために、リボゾーム結合領域を２つ以上としてもよい。
【００２５】
Ｈ鎖Ｖ領域からなるポリペプチドとＬ鎖Ｖ領域からなるポリペプチドとを繋ぐためのリンカーペプチドの配列は、得られる抗体Ｖ領域からなるポリペプチドが機能的である限りいかなる配列でもよいが、生体内投与時の副作用を最小限とするためになるべく短く、独自の構造を有しないような配列とした方が望ましい。
ターミネーターとしては、例えば大腸菌のtrpＡターミネーター、rrnBターミネーター、recAターミネーターなどを用いることができる。また、発現プラスミドのコピー数は一般的に多い方が好ましく、複製起点としてpBR系の複製起点よりpUC系の複製起点を用いた方が望ましい。
【００２６】
構築した発現ベクターにＰＣＲにて増幅したＨ鎖Ｖ領域からなるポリペプチドをコードするＤＮＡ及びＬ鎖Ｖ領域からなるポリペプチドをコードするＤＮＡをそれぞれ挿入して組換えＤＮＡを得る。挿入後、この組換えＤＮＡを通常の方法で宿主に導入し、そして組換えＤＮＡ上の遺伝子を発現させれば良い。宿主としては、原核生物及び真核生物の何れであってもよい。原核生物の例としては、大腸菌、枯草菌などを挙げることができる。真核細胞は例えば酵母、ＣＨＯ細胞などを用いれば良い。好ましくは原核細胞、更に好ましくは大腸菌を宿主として用いるのが良い。
組換えＤＮＡをこれらの生物に組み込む方法も公知の方法を利用すればよく、例えば大腸菌では、対数増殖期の細胞を５０ｍＭの塩化カルシウムで氷中約３０分処理することにより、大腸菌の細胞壁の構造を変化させ、続いてプラスミドＤＮＡを注入し約１０分後３０℃〜４２℃で２分間の熱処理を施した後、培地を加え３０℃〜３７℃で約６０分培養することにより、組換えＤＮＡを細胞に組み込むことができる。
【００２７】
目的とするＩＬ−２レセプターγ鎖に対するモノクローナル抗体のＶ領域のみからなるポリペプチドは、組換えＤＮＡで形質転換された細胞を培養することによって当該細胞の体内あるいは培地中に蓄積させることができる。培地は各細胞を培養しうるそれぞれの公知の培地を利用すればよく、培養条件も公知の条件でよい。培養後は、目的とするモノクローナル抗体のＶ領域のみからなるポリペプチドを公知の方法で取得すればよい。
【００２８】
ＩＬ−２レセプターγ鎖に結合し、ＩＬ−２応答を遮断する活性を有するマウスモノクローナル抗体のＣ領域をヒト抗体のＣ領域へと変換したポリペプチド、またはマウスモノクローナル抗体の定常領域、及びＶ領域の枠組み配列（以下、ＦＲと称する）を各々ヒト抗体のＣ領域、ＦＲへと変換したポリペプチドは以下のようにして作成することができる。
まず、抗体のＨ鎖、あるいはＬ鎖のそれぞれのシグナルペプチドをコードする遺伝子の５’端塩基配列に相当する２０〜３０個の長さのＤＮＡを合成する。その際、合成されるＤＮＡの５’端に発現ベクターのプロモーター領域の下流への挿入のための制限酵素サイトを導入しておく。続いて抗体のＨ鎖、あるいはＬ鎖のそれぞれのＶ領域をコードする遺伝子の３’端塩基配列の相補的配列に相当する２０〜３０個の長さのＤＮＡを合成する。同様に該ＤＮＡの３’端に、ヒト抗体のＣ領域ｃＤＮＡを結合させるための制限酵素サイトを配しておく。
ＩＬ−２応答を遮断する活性を有するマウスモノクローナル抗体産生ハイブリドーマより、常法に従ってｔｏｔａｌＲＮＡを調製し、リバーストランスクリプターゼ等を用いて一本鎖ｃＤＮＡを調製後、合成したＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲ反応を行い、抗体のＨ鎖、あるいはＬ鎖のそれぞれのシグナルペプチド及びＶ領域をコードするＤＮＡ断片を取得する。
【００２９】
同様にヒト抗体のＣ領域遺伝子は、抗体を合成しているヒトＢ細胞株やヒト形質細胞株よりｔｏｔａｌＲＮＡを調製して、リバーストランスクリプターゼ等を用いてｃＤＮＡを調製後、あらかじめ合成した抗体のＨ鎖、あるいはＬ鎖のそれぞれのＣ領域の５’端、及び３’端の部分の塩基配列に相当するＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲすることにより得られる。その際、５’側プライマーの５’端の外側には、抗体のＨ鎖、あるいはＬ鎖のそれぞれのシグナルペプチド及びＶ領域をコードするＤＮＡ断片を取得する際用いた３’側プライマーに導入した制限酵素サイトと同じサイトを、また、３’側プライマーの５’端の外側には、発現ベクターのプロモーター領域の下流への挿入のための制限酵素サイトを配しておき、Ｖ領域３’端とＣ領域５’端の繋ぎ目は、フレームがずれないようにデザインする。なお、調製する抗体のクラスあるいはサブクラスは、それぞれのクラスあるいはサブクラスの抗体を産生する細胞よりｔｏｔａｌＲＮＡを調製してＣ領域をコードするＤＮＡを調製することにより、使用目的に応じて自由に決定できる。
【００３０】
得られたマウス抗体のシグナルペプチドとＶ領域とをコードするＤＮＡ断片と、ヒト抗体のＣ領域をコードするＤＮＡ断片とを、それぞれに導入したサイトに当たる制限酵素によりそれぞれを切断した後、それぞれを混合する。ついで、これらのＤＮＡを制限酵素により切断された動物細胞で発現可能な発現ベクターに挿入する。発現ベクターを切断するために用いられる制限酵素は、マウス抗体のシグナルペプチドとＶ領域とをコードするＤＮＡ断片と、ヒト抗体のＣ領域をコードするＤＮＡ断片とにＰＣＲプライマーに由来して導入される制限酵素サイトに一致する切断面を生じるものである。なお、マウス抗体のシグナルペプチドとＶ領域とをコードするＤＮＡ断片がＨ鎖のそれをコードする場合には、ヒト抗体Ｈ鎖のＣ領域をコードするＤＮＡ断片と混合して発現ベクターに挿入しなければならず、同様に、マウス抗体のシグナルペプチドとＶ領域とをコードするＤＮＡ断片がＬ鎖のそれをコードする場合には、ヒト抗体Ｌ鎖のＣ領域をコードするＤＮＡ断片と混合して発現ベクターに挿入しなければならない。
最終的に、マウス抗体のシグナルペプチドとＶ領域とをコードするＤＮＡ断片と、ヒト抗体のＣ領域をコードするＤＮＡ断片とが、発現ベクターに正しい方向に挿入されているものをそれぞれ選択する。
【００３１】
調製したＨ鎖またはＬ鎖のマウス抗体のシグナルペプチド、Ｖ領域、及びヒト抗体のＣ領域をコードする遺伝子を含むそれぞれの発現ベクターを通常の方法により動物細胞に同時に導入する。発現させる宿主は、動物細胞以外でもよいが、その場合は、それぞれの宿主で発現可能なベクターを用いる。
導入後、細胞をクローニングして、その培養上清中に産生されている抗体のＩＬ−２レセプターγ鎖に対する結合活性を測定することにより、目的とするＩＬ−２レセプターγ鎖に結合し、ＩＬ−２応答を遮断する活性を有するマウスモノクローナル抗体のＣ領域をヒト抗体のＣ領域へと変換したポリペプチドを得ることができる。
【００３２】
マウスモノクローナル抗体のＣ領域、及びＶ領域のＦＲを各々ヒト抗体のＣ領域、ＦＲへと変換したポリペプチドは、以下のようにして調製できる（Medical Immunology、２２巻、６号、６２８頁）。まず、調製したマウスモノクローナル抗体のＶ領域をコードするＤＮＡから導きだしたアミノ酸配列と、既に知られているヒトの抗体のＶ領域アミノ酸配列とのホモロジー検索を行い、最もホモロジーの高い配列をＨ鎖、及びＬ鎖についてそれぞれ選択する。次に、シグナルペプチドとＶ領域のＦＲ部分は選択したヒト抗体のアミノ酸配列となるように、またそれ以外のＶ領域はマウスモノクローナル抗体のアミノ酸配列となるようにデザインして、そのペプチドをコードするＤＮＡ断片をＨ鎖、及びＬ鎖についてそれぞれデザインし合成する。その際、３０〜４０個位の塩基の長さとなるようにＤＮＡ断片を分割し、それぞれの繋ぎ目は５〜７程度重なるようにして、更に一つおきに本来の配列の相補的配列となるように合成する。また、シグナルペプチドの５’端とＶ領域の３’端の外側には、それぞれ発現ベクター、ヒトＣ領域と結合させるための制限酵素サイトを配しておく。それらの合成ＤＮＡ断片を混合してＰＣＲ後、回収した抗体のＨ鎖及びＬ鎖それぞれのシグナルペプチドとＶ領域をコードするＤＮＡ断片を、導入した制限酵素サイトに当たる制限酵素により切断する。上述のマウスモノクローナル抗体のＨ鎖、及びＬ鎖のＣ領域をヒト抗体のＣ領域へと変換したポリペプチドをそれぞれ発現するベクターより、同様の制限酵素を用いてＨ鎖、及びＬ鎖のシグナルペプチドとＶ領域をコードするＤＮＡ断片をそれぞれ切断分離し、調製したシグナルペプチドとＶ領域をコードするＤＮＡ断片へとすげ替える。このようにして構築した組換えＤＮＡを上記と同様の方法により動物細胞へ導入し、同様の方法で発現している細胞を選択することにより、目的とするＩＬ−２レセプターγ鎖に結合し、ＩＬ−２応答を遮断する活性を有するマウスモノクローナル抗体のＣ領域、及びＶ領域のＦＲを各々ヒト抗体のＣ領域、ＦＲへと変換したポリペプチド得ることができる。
【００３３】
本発明のポリペプチドは、ＩＬ−２レセプターγ鎖に特異的に結合して、ＩＬ−２の応答を遮断する活性を有しており、臓器移植時の拒絶反応の予防、自己免疫疾患などの治療に対して有効なものである。
また、本発明のモノクローナル抗体は、ここで得られたハイブリドーマクローンの産生するモノクローナル抗体に限定されるものではなく、ＩＬ−２レセプターγ鎖に結合し、かつＩＬ−２応答を遮断する活性を有する限り本発明のモノクローナル抗体に含まれる。また、本モノクローナル抗体のＣ領域を公知の方法により、ヒトＣ領域へと変換したキメラ抗体、更にＶ領域のＦＲをヒト化した抗体も、ＩＬ−２レセプターγ鎖に結合し、かつＩＬ−２応答を遮断する活性を有する限り本発明のモノクローナル抗体に含まれる。
また、同じく本発明のポリペプチドの構造は、例えば配列表の配列番号１または２記載の配列であるが、これらに限定されるものではなく、ＩＬ−２レセプターγ鎖に結合し、かつＩＬ−２応答を遮断する活性を有する限り本発明のポリペプチドに含まれる。例えば、（１）配列番号１または２記載のポリペプチド構造中の１若しくは複数個のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換した構造を有するポリペプチド、（２）配列番号１または２記載のポリペプチド構造中のＮ末端及び／またはＣ末端より１若しくは複数個のアミノ酸残基が欠損し、かつ連続しているアミノ酸配列を有するポリペプチド、（３）配列番号１又は２記載のポリペプチドのＮ末端及び／またはＣ末端に１若しくは複数個のアミノ酸残基が付加された構造を有するポリペプチド及び（４）配列番号１又は２記載のポリペプチド構造中の１若しくは複数個のアミノ酸残基がアセチル化、アミド化又はポリエチレン付加された構造を有するポリペプチド、等もＩＬ−２レセプターγ鎖に結合し、ＩＬ−２応答を遮断する活性を有する限り本発明のポリペプチドに含まれる。
特に、配列表の配列番号１及び２記載のポリペプチドのＮ末端のMetは微生物を用いて発現する過程又は精製過程において切断され、その結果Ｎ末端がAspとなる場合がある。このポリペプチドも上記活性、即ちヒトＩＬ−２レセプターγ鎖に結合し、ＩＬ−２応答を遮断する活性を有する。また、Ｍｅｔが結合した形で生産させた後、アミノペプチダーゼ等の酵素でＮ末端Ｍｅｔをはずしたものも上記活性を有する。
更に、必要により本発明のモノクローナル抗体、及びポリペプチドに毒素を付加したものを用いても良い。
【００３４】
本発明の免疫抑制剤は上記モノクローナル抗体、あるいはポリペプチドを0.1重量％〜100重量％、好ましくは0.5重量％〜70重量％の割合で含有すればよい。したがって、本発明のモノクローナル抗体、あるいはポリペプチドをそのまま投与してもよいし、また通常製剤用担体と混合して調製した製剤の形で投与される。製剤用担体としては、製剤分野において常用され、かつ本発明のモノクローナル抗体、あるいはポリペプチドと反応しない物質が用いられる。注射剤の場合には、本発明のモノクローナル抗体、あるいはポリペプチドを水に溶解させて調製されるが、必要に応じて生理食塩水又はぶどう糖溶液に溶解させてもよく、また緩衝剤、保存剤、安定化剤又は賦形剤を含有させてもよい。また、これらの製剤は治療上価値のある他の成分を含有していてもよい。
【００３５】
本発明に係る免疫抑制剤の投与方法としては、経口、注射、直腸内などいずれの方法を用いてもかまわないが、注射による投与が好ましい。投与量は、投与方法、患者の症状、年齢などにより異なるが、通常１回0.001〜1000mg、好ましくは0.01〜10mgを１日当り１〜３回投与すればよい。
【００３６】
以下本発明を実施例に基づいて更に詳細に説明する。尚、本発明は実施例に限定されるものではない。
【００３７】
【実施例】
（実施例１、細胞外領域のみからなるリコンビナントヒトＩＬ−２レセプターγ鎖ポリペプチドの調製）
細胞外領域の３’端にｓｔｏｐコドンを持つＩＬ−２レセプターγ鎖ｃＤＮＡを調製するため、内部にＮｄｅＩサイトを有するオリゴマー5'-GGACATATGCTGAACACGACAATTCTG-3'（配列番号：３）と内部にＨｉｎｄIIIサイトを有するオリゴマー5'-GAAAAGCTTCTATTATGAAGTATTGCTCC-3'（配列番号：４）をＤＮＡ合成機３８０Ａにより合成した。両オリゴマーをプライマーとし、ＩＬ−２レセプターγ鎖分子のｃＤＮＡを含むプラスミド（本プラスミドで形質転換された大腸菌は、通産省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−４２００として寄託されている）を鋳型としてサーマルサイクラーを用い、TaqポリメラーゼによるＰＣＲ（変性９４℃、アニール５５℃、合成７２℃、２０サイクル）を行った。
約０．７ｋｂの増幅されたバンドを回収して、ＮｄｅＩとＨｉｎｄIII（宝酒造社製）にて切断後、プラスミドｐＦｖ（ＴＵ２７）−ＤＥ（本プラスミドで形質転換された大腸菌は、通産省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−３９７３として寄託されている）をＮｄｅＩとＨｉｎｄIIIで切断し回収した大きな断片とライゲーションし、ｐＩＬ−２ＲＧＳを構築した（図１）。
ｐＩＬ−２ＲＧＳで形質転換された大腸菌ＨＢ１０１をＭ９−カザミノ酸培地にて培養し、大腸菌の菌体内に顆粒として発現させた。大腸菌を超音波破砕し、３，０００ｘｇで遠心分離する事により顆粒を分離した。更に、顆粒を６Ｍグアニジン塩酸にて溶解した後、最終濃度が３，５Ｍグアニジン塩酸、３０μＭ還元型グルタチオン、３μＭ酸化型グルタチオン存在下、蛋白濃度が５０μｇ／ｍｌの条件で、室温で一晩攪拌することにより巻戻しを行い、１５０ｍＭＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，５）（以下、ＰＢＳと略す）に対して透析する事により、可溶性の細胞外領域のみからなるリコンビナントヒトＩＬ−２レセプターγ鎖ポリペプチドを調製した。
【００３８】
（実施例２、ハイブリドーマの調製）
６〜８週令の雌のBALB/cマウスに、細胞外領域のみからなるリコンビナントヒトＩＬ−２レセプターγ鎖ポリペプチドを１匹あたり１００μｇずつフロインドの完全アジュバント（バクト社製）とともに皮下投与することにより免疫した。３週間おきに同様の操作により２回追加免疫し、マウスの眼窩静脈より採血して、後に述べる方法に従って、細胞外領域のみからなるリコンビナントヒトＩＬ−２レセプターγ鎖ポリペプチドへの結合量を調べることにより抗体価を測定した。抗体価の高かったマウスを更に同様の操作にて最終免疫し、その３日後、脾臓を摘出して脾臓細胞とマウス骨髄腫細胞（SP2/0-Ag14）とを、５０％ポリエチレングリコール＃４０００（ナカライテスク社製）存在下にて、細胞数にして１０：１の割合で混合し細胞融合させた。
融合細胞を、１０％牛胎児血清（ギブコ社製）を含むRPMI1640培地（ギブコ社製）にて５Ｘ１０6個／ｍｌとなるように懸濁し、１穴あたり５Ｘ１０5個のマウス胸腺細胞を含有する９６穴平底プレート（コーニング社製）に１００μｌずつ分注した。１日、２日、３日、６日後に培地の半量をヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジンを含む培地（ＨＡＴ培地）と交換し、以後３日ごとに同様の操作を繰り返した。融合より約２週間後、融合した細胞（ハイブリドーマ）の増殖してきた各穴の培養上清に含まれる抗体の、Ｌγ細胞とＬβ細胞への結合量を測定し、Ｌγ細胞にのみ結合するハイブリドーマを、限界希釈法にてクローン化した。
【００３９】
更に同様の方法により、それぞれのハイブリドーマクローンの培養上清中の細胞への結合量を測定して、抗ＩＬ−２レセプターγ鎖抗体産生ハイブリドーマを得た。更に、得られた抗ＩＬ−２レセプターγ鎖抗体産生ハイブリドーマの培養上清について、以下の方法にてＩＬ−２の生理活性の抑制能を調べた。１０％牛胎児血清（ＦＣＳ）を含むRPMI1640培地にて２Ｘ１０5個／ｍｌの濃度となるように懸濁したILT-Mat細胞液を１穴当たり１００μｌずつ９６穴平底マイクロプレートに分注して、サンプルの培養上清を５０μｌ加え、更に１０％ＦＣＳを含むRPMI1640培地にて２００ｕ／ｍｌに調製したヒトリコンビナントＩＬ−２溶液を５０μｌずつ加えて、５％ＣＯ2存在下３７℃にて４８時間培養した。最後の４時間は１μＣｉの3Ｈ−チミジン（デュポン社製）を加えて培養し、細胞内に取り込まれた放射活性量をシンチレーシンカウンター（パッカード社製）にて測定することにより、培養上清によるＩＬ−２の生理活性の阻害能を調べた。このような方法にてＩＬ−２レセプターγ鎖分子に対する抗体を産生するハイブリドーマを調製した。こうして得られたハイブリドーマとしてＧＰ−２（ＦＥＲＭ  Ｐ−１３５７６、ＢＰ−４６４１）、ＧＰ−４（ＦＥＲＭ  Ｐ−１３５７５、ＢＰ−４６４０）、ＴＵＧｈ４（ＦＥＲＭ  Ｐ−１４０１１、ＢＰ−４６４２）、ＴＵＧｈ５（ＦＥＲＭ  Ｐ−１４０１２、ＢＰ−４６４３）および、ＡＧ１４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４６４８）がある。
ハイブリドーマＧＰ−２が産生する抗体をＧＰ−２抗体と呼び、ハイブリドーマＧＰ−４が産生する抗体をＧＰ−４抗体と呼ぶ。ハイブリドーマＴＵＧｈ４が産生する抗体をＴＵＧｈ４抗体と呼び、ハイブリドーマＴＵＧｈ５が産生する抗体をＴＵＧｈ５抗体と呼ぶ。ハイブリドーマＡＧ１４が産生する抗体をＡＧ１４抗体と呼ぶ。
【００４０】
（実施例３、抗体のＶ領域のみをコードするｃＤＮＡの調製）
５Ｘ１０6個のハイブリドーマＧＰ−２、あるいはＧＰ−４をPBSにて洗浄後、guanidine thiocyanate, N-lauryl sarcosine 及び EDTAを含むＲＮＡ抽出用緩衝液（ファルマシア社製）に懸濁した。ハイブリドーマ懸濁液をCesium Cloride溶液（ρ=1.51g/ml,ファルマシア社製）が入ったチューブに重層し、１２５，０００ｘｇにて１６時間遠心した。ハイブリドーマ懸濁液とCesium Cloride溶液は等容量とした。上清を吸い取ったのち、残部に１ｍＭ EDTAを含む１０ｍＭトリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ７．５）を加えて懸濁を行い、懸濁液を新しいチューブに入れ、６５℃で５分間インキュベートした。これに、１／１０容量の２Ｍ Potassium Acetate（ｐＨ５．０）（ファルマシア社製）と３倍容量のエタノール（ナカライテスク社製）を加えて、−２０℃で一晩放置した。５，０００ｘｇにて２０分間の遠心分離を行った後上清を捨て、得られた沈澱を８０％エタノールにて洗浄し、沈澱を乾燥させた。
沈澱を１ｍＭ EDTAを含む１０ｍＭトリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ７．５）にて溶解してtotalＲＮＡ画分溶液とした。
【００４１】
次に、totalＲＮＡ画分溶液に、抗体のＨ鎖のＶ領域の３’側プライマー溶液（最終濃度で１μＭ）、Ｌ鎖のＶ領域の３’側プライマー溶液（最終濃度で１μＭ）、deoxyNTP混合液、ｃＤＮＡ合成用緩衝液（アマシャム社製）、RNAase Inhibitor（宝酒造社製）、及びReverse Transcriptase（宝酒造社製）を加えて４２℃にて１時間反応させｃＤＮＡを合成した。
得られたｃＤＮＡに、抗体Ｈ鎖Ｖ領域のみをコードするｃＤＮＡを増幅するために用いる５’側プライマー及び３’側プライマー（それぞれ最終濃度１μＭ）、及び抗体Ｌ鎖Ｖ領域のみをコードするｃＤＮＡを増幅するために用いる５’側プライマー及び３’側プライマー（それぞれ最終濃度１μＭ）、deoxy ＮＴＰ混合液、ＰＣＲ用緩衝液（シータス社製）及びTaq Polymerase（宝酒造社製）を加えＰＣＲ（シータス社、サーマルサイクラー）を行った。反応は変性３０秒（９４℃）、アニール３０秒（５５℃）、プライマーイクステンション１分（７２℃）にて３０サイクル行い、各サイクル毎にプライマーイクステンションの時間を１５秒ずつ延長させた。
反応後、１ｍＭ EDTAを含む４０ｍＭトリス酢酸緩衝液（ｐＨ８．０）を用いてアガロースゲル電気泳動を行い、該当するｃＤＮＡフラグメントを切り出し、ジーンクリーンキット（バイオ１０１社製）を用いて抽出・精製した。なお、ｃＤＮＡの合成、及びＰＣＲに用いたプライマーの配列を図２に示した（配列番号：５−８）。
【００４２】
（実施例４、発現ベクターの構築）
図４に示すように、まずpT13SNco（本プラスミドを含有する Ｅ． ｃｏｌｉ  ＡＪ−１２４４７は、ＦＥＲＭ  Ｐ−１０７５７、ＢＰ−４６３５ として通産省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている。）［J. Biochem.,１０４巻, ３０頁, １９８８年に記載］を制限酵素ＣｌａＩ及びＢａｍＨＩ（いずれも宝酒造社製）にて切断して得られる大きいＤＮＡ断片と、図３に示された配列を有するＤＮＡ断片（リンカー、配列番号９、１０））とをＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製）を用いて連結した。図３に示された配列を有するＤＮＡ断片はＤＮＡ合成機で作成した。
【００４３】
次に、プラスミドpT13SNcoに由来するＣｌａＩ−ＢａｍＨＩ大断片と合成ＤＮＡ断片を連結して得られるプラスミドを制限酵素ＥｃｏＲＩとＰｖｕII（いずれも宝酒造社製）にて切断し、小さいＤＮＡ断片（便宜的にＡ断片と命名する）を得る。
一方、ｐＵＣ１８（Methods in Enzymology, １０１巻, ２０頁, １９８３年）を制限酵素ＨｉｎｄIIIで切断し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）を用いて切断面を平滑化し、更にＴ４リガーゼを用いて自己連結させて、ＨｉｎｄIIIサイトを消失させる。ＨｉｎｄIIIサイトが消失したｐＵＣ１８を制限酵素ＮｄｅＩで切断し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）を用いて切断面を平滑化し、更にＴ４リガーゼを用いて自己連結させて、ＮｄｅＩサイトを消失させる。
ＨｉｎｄIIIサイトとＮｄｅＩサイトが消失したｐＵＣ１８を、ＥｃｏＲＩとＨｉｎｃII（宝酒造社製）にて切断して得られる大きいＤＮＡ断片と、Ａ断片とをＴ４リガーゼにて連結することにより、複製起点をpUC系のものとするプラスミド pFv-DEを得た。
【００４４】
（実施例５、pFv-DEへの抗体Ｖ領域ｃＤＮＡの組み込み、及びＶ領域のみからなる抗体生産菌の調製）
図５に示すように、まずpFv-DEを制限酵素ＮｄｅＩ及びＳａｌＩ（宝酒造社製）で切断して大きいＤＮＡ断片を得た。この大きいＤＮＡ断片と、実施例３で得られたＧＰ−２のＬ鎖Ｖ領域ｃＤＮＡをＮｄｅＩ及びＳａｌＩで切断した断片とをＴ４リガーゼを用いて連結した。また、同様にして、大きいＤＮＡ断片と、実施例３で得られたＧＰ−４のＬ鎖Ｖ領域ｃＤＮＡをＮｄｅＩ及びＳａｌＩで切断した断片とをＴ４リガーゼを用いて連結した。
こうして得られた２種のプラスミドを、それぞれ制限酵素ＸｈｏＩ及びＨｉｎｄIII（宝酒造社製）で切断して大きいＤＮＡ断片をそれぞれ調製した。
大きいＤＮＡ断片のうちＧＰ−２のＬ鎖Ｖ領域ｃＤＮＡを含むものと、実施例３で得られたＧＰ−２のＨ鎖Ｖ領域ｃＤＮＡをＸｈｏＩ及びＨｉｎｄIIIで切断した断片とをＴ４リガーゼを用いて連結した。また、同様にして、大きいＤＮＡ断片のうちＧＰ−４のＬ鎖Ｖ領域ｃＤＮＡを含むものと、実施例３で得られたＧＰ−４のＨ鎖Ｖ領域ｃＤＮＡをＸｈｏＩ及びＨｉｎｄIIIで切断した断片とをＴ４リガーゼを用いて連結した。
こうして、Ｖ領域のみからなる抗体を発現する２種のプラスミド、すなわち  pFv(GP-2)-DE 及び pFv(GP-4)-DE をそれぞれ取得した。
続いてそれぞれのプラスミドで大腸菌HB101株を形質転換し、Ｖ領域のみからなる抗体を生産する株として、E. coli pFv(GP-2)-DE/HB101（ＡＪ−１２８４４，  ＦＥＲＭ  Ｐ−１３６０７、ＢＰ−４６３６）、及び E. coli pFv(GP-4)-DE/HB101（ＡＪ−１２８４５，  ＦＥＲＭ  Ｐ−１３６０８、ＢＰ−４６３７）を得た。
【００４５】
（実施例６、Ｖ領域のみからなる抗体生産菌より、生産物の取得）
得られた形質転換株  E. coli pFv(GP-2)-DE/HB101（ＡＪ−１２８４４、ＦＥＲＭ  Ｐ−１３６０７、ＢＰ−４６３６）及び E. coli pFv(GP-4)-DE/HB101（ＡＪ−１２８４５，  ＦＥＲＭ  Ｐ−１３６０８、ＢＰ−４６３７）それぞれを、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２ｘＴＹ［１．６％トリプトン、１％酵母エキス、（以上バクト社製）、０．５％NaOH、ｐＨ７．０］５ｍｌ中で３７℃の条件下で一晩生育させた。ついで、その培養懸濁液５ｍｌを１００ｍｌのＭ９−カザミノ酸培地（０．６％Na2HPO4・12H2O、０．３％KH2PO4、０．０５％NaCl、０．１％NH4Cl、０．０５％MgSO4・7H20、０．００１４７％CaCl2、０．２％グルコース、０．２％カザミノ酸、０．０２％L-ロイシン、０．０２％L-プロリン、０．０００２％チアミン塩酸塩、１００μｇ／ｍｌアンピシリン、ｐＨ６．９）へ接種し、３７℃にて３時間培養した。その後、終濃度が２５μｇ／ｍｌとなるように3-インドールアクリル酸（IAA）を添加し、更に３７℃にて２０時間誘導培養した。菌体懸濁液の一部を位相差顕微鏡により約１５００倍に拡大して観察すると、大腸菌体内に顆粒が形成されていることが認められた。
【００４６】
続いて上記の如く培養した菌体懸濁液を遠心分離機にかけ菌体を集め、２倍濃縮となるように、３０ｍＭ NaClを含む２０ｍＭTris-HCl緩衝液（ｐＨ７．５）を添加して懸濁を行った。懸濁液に、１ｍｇ／ｍｌ濃度のリゾチームを含む０．５Ｍ EDTA（ｐＨ８．０）水溶液３７．５ｍｌを添加し、攪はんした後、氷中にて１時間放置した。ついで超音波破砕で菌体を破壊し、６０００ｒｐｍ，５分間の遠心分離を行うことにより顆粒を回収した。この顆粒を６Ｍ塩酸グアニジン溶液中に可溶化し、さらに溶液の濃度の調製を行って目的ポリペプチド濃度が１００μｇ／ｍｌとなるようにし、かつ塩酸グアニジン濃度が３．５Ｍとなるようにした。その後、これに酸化型グルタチオンと還元型グルタチオンを添加し、それぞれの終濃度が３μＭおよび３０μＭとなるようにした。続いて、ｐＨを８．０に調整した後、室温で１０〜１６時間放置した。最後に、ＰＢＳを用いて透析を行い、目的とするＶ領域のみからなる抗体を得た。得られた２種の抗体をそれぞれポリペプチドFv(GP-2)及びポリペプチドFv(GP-4)と命名した。
両ポリペプチドの分子量をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により決定した。その分子量は後述の実施例７に従って推定されたアミノ酸配列から計算される値とそれぞれほぼ一致した。
また、プロテインシークエンサーにてＮ末端側のアミノ酸配列を検定した。両ポリペプチドとも、後述の実施例７で予想されたアミノ酸配列と同一の配列を有することが確認された。
【００４７】
（実施例７、塩基配列の決定、及びアミノ酸配列の推定）
構築したＶ領域のみからなるポリペプチドを発現するプラスミドpFv(GP-2)-DE、及びpFv(GP-4)-DEをアルカリＳＤＳ法にて精製し、市販されているシークエンス用プライマーＭ４、あるいはＲＶ（宝酒造社製）を用い、7-DEAZAシークエンスキット（宝酒造社製）にて塩基配列を決定した。得られた塩基配列よりアミノ酸配列配列を推定した。
なお、配列表の配列番号１にポリペプチドFv(GP-2)をコードするＤＮＡの塩基配列を示した。また、同塩基配列より推定されるアミノ酸配列を併記した。配列表の配列番号２にポリペプチドFv(GP-4)をコードするＤＮＡの塩基配列を示した。また、同塩基配列より推定されるアミノ酸配列を併記した。
配列表の配列番号１に示されるように、ポリペプチドFv(GP-2)はＮ末端にMetを、Ｃ末端にSerを有する２４４個のアミノ酸からなるポリペプチドである。また、ポリペプチドFv(GP-4)はＮ末端にMetを、Ｃ末端にSerを有する２４３個のアミノ酸からなるポリペプチドである。
ＧＰ−２が産生する抗体のＬ鎖Ｖ領域は配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列のうち、２番目から１０９番目に至る配列に当たり、Ｈ鎖Ｖ領域は１２４番目から２４４番目に至る配列に当たる。ＧＰ−４が産生する抗体のＬ鎖Ｖ領域は配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列のうち、２番目から１０８番目に至る配列に当たり、Ｈ鎖Ｖ領域は１２３番目から２４３番目に至る配列に当たる。
【００４８】
（実施例８、抗体ＧＰ−２、抗体ＧＰ−４、ポリペプチドFv(GP-2)、及びポリペプチドFv(GP-4)の活性の検定）
１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地にて２ｘ１０5個／ｍｌの濃度となるように懸濁したILT-Mat細胞液を９６穴平底マイクロプレート上の各穴に分注した。ILT-Mat細胞液の分注量は１穴当たり１００μｌずつとした。そこに各サンプル溶液を添加した。添加するサンプル溶液の容量は５０μｌであり、それぞれに含まれる抗体あるいはポリペプチドの量は、それぞれ４０μｇ／ｍｌであった。
３７℃、３０分間インキュベートし、更に１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地を用いて種々の濃度に調製したヒトリコンビナントＩＬ−２溶液を５０μｌずつ加えて、５％ＣＯ2存在下３７℃にて４８時間培養した。最後の４時間は１μＣｉの3Ｈ−チミジン（デュポン社製）を加えて培養した。
細胞内に取り込まれた放射活性量をシンチレーションカウンター（パッカード社製）にて測定することにより、抗体ＧＰ−２、抗体ＧＰ−４、ポリペプチドFv(GP-2)、及びポリペプチドFv(GP-4)の応答遮断能を調べた。
その結果図６に示す通り、抗体ＧＰ−２、抗体ＧＰ−４、ポリペプチドFv(GP-2)、及びポリペプチドFv(GP-4)は、それぞれILT-Mat細胞のＩＬ−２応答を遮断する活性を有していることが明らかとなった。
【００４９】
（実施例９、抗ＩＬ−２レセプターα鎖抗体、抗ＩＬ−２レセプターβ鎖抗体共存下における、モノクローナル抗体ＧＰ−２のＩＬ−２応答遮断活性の検定）
１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地にて４ｘ１０5個／ｍｌの濃度となるように懸濁したILT-Mat細胞液を９６穴平底マイクロプレート上の各穴に分注した。ILT-Mat細胞液の分注量は１穴当たり１００μｌずつとした。そこに各サンプル溶液を添加した。添加するサンプル溶液の容量は５０μｌであり、それぞれに含まれる抗体ＧＰ−２、抗ＩＬ−２レセプターα鎖抗体および抗ＩＬ−２レセプターβ鎖抗体の量は、それぞれ４０μｇ／ｍｌであった。
３７℃、３０分間インキュベートし、更に１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地を用いて種々の濃度に調製したヒトリコンビナントＩＬ−２溶液を５０μｌずつ加えて、５％ＣＯ2存在下３７℃にて４８時間培養した。最後の４時間は１μＣｉの3Ｈ−チミジン（デュポン社製）を加えて培養した。
細胞内に取り込まれた放射活性量をシンチレーションカウンター（パッカード社製）にて測定することにより、抗ＩＬ−２レセプターα鎖抗体及び／又は抗ＩＬ−２レセプターβ鎖抗体と共存させた場合の抗体ＧＰ−２の応答遮断能を調べた。
その結果図７に示す通り、モノクローナル抗体ＧＰ−２は、抗ＩＬ−２レセプターα鎖抗体及び／又は抗ＩＬ−２レセプターβ鎖抗体を共存することにより、ILT-Mat細胞のＩＬ−２応答をより効果的に遮断することが明らかとなった。
【００５０】
（実施例１０、抗体ＴＵＧｈ４、抗体ＴＵＧｈ５および抗体ＡＧ１４の活性の検定）
１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地にて２ｘ１０5個／ｍｌの濃度となるように懸濁したILT-Mat細胞液を９６穴平底マイクロプレート上の各穴に分注した。ILT-Mat細胞液の分注量は１穴当たり１００μｌずつとした。そこに各サンプル溶液を添加した。添加するサンプル溶液の容量は５０μｌであり、それぞれに含まれる抗体あるいはポリペプチドの量は、それぞれ４０μｇ／ｍｌであった。
３７℃、３０分間インキュベートし、更に１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地を用いて種々の濃度に調製したヒトリコンビナントＩＬ−２溶液を５０μｌずつ加えて、５％ＣＯ2存在下３７℃にて４８時間培養した。最後の４時間は１μＣｉの3Ｈ−チミジン（デュポン社製）を加えて培養した。
細胞内に取り込まれた放射活性量をシンチレーションカウンター（パッカード社製）にて測定することにより、抗体ＴＵＧｈ４、抗体ＴＵＧｈ５および抗体ＡＧ１４それぞれの応答遮断能を調べた。
その結果、抗体ＴＵＧｈ４、抗体ＴＵＧｈ５および抗体ＡＧ１４は、それぞれILT-Mat細胞のＩＬ−２応答を遮断する活性を有していることが明らかとなった。
【００５１】
（参考例、抗体ＴＵＧｍ２の活性の検定）
モノクローナル抗体ＴＵＧｍ２（実施例２の方法に準拠してラットに免疫することにより作成した抗マウスＩＬ−２レセプターγ鎖抗体）及び／又は抗マウスＩＬ−２レセプターβ鎖抗体（ＴＭ−β１；ファーミンジェン社製）を用いて、これらがＣＴＬＬ細胞のＩＬ−２応答性を遮断するかどうかを調べた。
１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地にて１ｘ１０4個／ｍｌの濃度となるように懸濁したＣＴＬＬ−２細胞液を９６穴平底マイクロプレート上の各穴に分注した。ＣＴＬＬ−２細胞液の分注量は１穴当たり５０μｌずつとした。そこに各サンプル溶液を添加した。添加するサンプル溶液の容量は５０μｌであり、それぞれに含まれる抗体の量は、それぞれ４０μｇ／ｍｌであった。
３７℃、３０分間インキュベートし、更に１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地を用いて種々の濃度に調製したヒトリコンビナントＩＬ−２溶液を５０μｌずつ加えた。最終的にそれぞれの穴の中の溶液の容量が２００μｌとなるように１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地を添加した。
次に、５％ＣＯ2存在下３７℃にて４８時間培養した。最後の４時間は１μＣｉの3Ｈ−チミジン（デュポン社製）を加えて培養した。
細胞内に取り込まれた放射活性量をシンチレーションカウンター（パッカード社製）にて測定することにより、モノクローナル抗体ＴＵＧｍ２及び／又は抗マウスＩＬ−２レセプターβ鎖抗体それぞれの応答遮断能を調べた。
その結果図８に示すとおり、モノクローナル抗体ＴＵＧｍ２は、抗マウスＩＬ−２レセプターβ鎖抗体と共存させることにより、ＣＴＬＬ−２細胞のＩＬ−２応答を遮断することが明らかとなった。
【００５２】
【発明の効果】
本発明のヒトＩＬ−２レセプターγ鎖に特異的に結合して、ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖とＩＬ−２レセプターβ鎖との結合を選択的に阻害し、ＩＬ−２応答を遮断する活性を有するポリペプチドは、単独、あるいはＩＬ−２のＩＬ−２レセプターへの結合を阻害する物質と併用することにより、ＩＬ−２の関与が示唆されている臓器移植時の拒絶反応の予防、アレルギー性疾患や自己免疫疾患などの炎症性疾患の治療薬として有効な薬剤として利用し得る有用な物質である。
【００５３】
【配列表】
配列番号：１
配列の長さ：732
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
配列の特徴
特徴を表す記号：CDS
存在位置：1..732
配列
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0003844519.tif 000003
【００５４】
配列番号：２
配列の長さ：729
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の特徴
特徴を表す記号：CDS
存在位置：1..729
配列
0003844519.tif 000004
0003844519.tif 000005
【００５５】
配列番号：３
配列の長さ：27
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
配列
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【００５６】
配列番号：４
配列の長さ：29
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
配列
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【００５７】
配列番号：５
配列の長さ：23
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
配列
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【００５８】
配列番号：６
配列の長さ：32
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
配列
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【００５９】
配列番号：７
配列の長さ：45
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
配列
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【００６０】
配列番号：８
配列の長さ：32
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
配列
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【００６１】
配列番号：９
配列の長さ：87
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
配列
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【００６２】
配列番号：１０
配列の長さ：89
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
配列
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【図面の簡単な説明】
【図１】プラスミドpIL-2RGSの構築工程を示す図面である。
【図２】プライマーの配列を示す。
【図３】Ｌ鎖Ｖ領域とＨ鎖Ｖ領域をつなぐためのリンカーのＤＮＡ配列を示す。
【図４】プラスミドpFv-DEの構築工程を示す図面である。
【図５】プラスミドpFv(GP-2)、及びプラスミドpFv(GP-4)の構築工程を示す図面である。
【図６】モノクローナル抗体ＧＰ−２、ＧＰ−４、Ｆｖ（ＧＰ−２）、及びＦｖ（ＧＰ−４）が、それぞれILT-Mat細胞のＩＬ−２依存的増殖を抑制する活性を有する事を示す図面である。
▲；コントロール抗体添加
■；ＧＰ−２抗体添加
□；Ｆｖ（ＧＰ−２）添加
●；ＧＰ−４添加
○；Ｆｖ（ＧＰ−４）添加
【図７】モノクローナル抗体ＧＰ−２、及びＧＰ−４が、抗ＩＬ−２レセプターα鎖抗体（Ｈ３１）、あるいは抗ＩＬ−２レセプターβ鎖抗体（ＴＵ２５）共存下に、それぞれILT-Mat細胞のＩＬ−２依存的増殖を抑制する活性を有することを示す図面である。
▲；コントロール抗体添加
■；ＧＰ−２抗体添加
□；抗ＩＬ−２Ｒβ鎖抗体添加
△；抗ＩＬ−２Ｒβ鎖抗体＋ＧＰ−２抗体添加
○；抗ＩＬ−２Ｒα鎖抗体添加
●；抗ＩＬ−２Ｒα鎖抗体＋ＧＰ−２抗体添加
◆；抗ＩＬ−２Ｒα鎖抗体＋β鎖抗体＋ＧＰ−２抗体添加
【図８】モノクローナル抗体ＴＵＧｍ２が単独、あるいは抗マウスＩＬ−２レセプターβ鎖抗体と共存させた場合に、それぞれがＣＴＬＬ−２細胞のＩＬ−２依存的増殖を抑制する活性を有することを示す図面である。
●；抗体なし（培地のみ）
○；抗体ＴＵＧｍ２添加
□；抗ＩＬ−２Ｒβ鎖抗体添加
■；ＴＵＧｍ２＋抗ＩＬ−２Ｒβ鎖抗体添加
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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