(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号４で示されるヌクレオチド配列及び下記の二次構造（Ｉ）を有し、配列番号４中のヌクレオチド８〜１４およびヌクレオチド７３〜７９の間で水素結合が形成される領域を含むtRNAValの配列に基いて、該領域内にバルジ構造が導入された二次構造を有するように改変されていることを特徴とするＲＮＡ改変体。
0003829176.tif 000004
【請求項２】
配列番号４で示されるヌクレオチド配列中のヌクレオチド７３〜７９の領域の配列の一部または全部を置換することによりバルジ構造が導入されている、請求項１記載のＲＮＡ改変体。
【請求項３】
配列番号１のヌクレオチド配列中のヌクレオチド１〜８０の領域の配列からなる請求項１記載のＲＮＡ改変体。
【請求項４】
配列番号２のヌクレオチド配列中のヌクレオチド１〜８６の領域の配列からなる請求項１記載のＲＮＡ改変体。
【請求項５】
請求項１記載のＲＮＡ改変体の３’末端に任意のＲＮＡ鎖が連結されているＲＮＡ。
【請求項６】
任意のＲＮＡ鎖が、リボザイムまたはアンチセンスＲＮＡである請求項５記載のＲＮＡ。
【請求項７】
配列番号４で示されるヌクレオチド配列中のヌクレオチド８〜１４の領域のいずれかのヌクレオチドと、３’末端に連結されたＲＮＡ鎖のいずれかのヌクレオチドとの塩基対形成によってバルジ構造が形成されている、請求項５記載のＲＮＡ。
【請求項８】
請求項５記載のＲＮＡをコードするＤＮＡを含む発現ベクター。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明はリボザイムおよびその発現系に関する。
【０００２】
背景技術
ハンマーヘッドリボザイムは、最も小さい触媒性ＲＮＡ分子の１つである(Krugerら，1982; Gruerrier-Takadaら，1983)。このリボザイムはサイズが小さく、また抗ウイルス剤として可能性があるので、作用機構の研究 (DahmおよびUhlenbech, 1991, Dahmら，1993; EcksteinおよびLilley, 1996; Pontiusら，1997; Lottら，1998; Zhouら，1996, 1997; ZhouおよびTaira, 1998)およびin vivoにおける利用を目指す研究 (EricksonおよびIzant, 1992; Murray, 1992; Rossi, 1995; EcksteinおよびLilley, 1996; Prisleiら，1997; Turner,1997; Scanlon, 1997)が多数なされてきた。異なる生物における遺伝子発現抑制のためのリボザイムの使用を目指して成功した実験が多数報告されている(Sarverら, 1990; Dropulicら，1992; Ojwangら，1992; Yuら，1993; ZhaoおよびPick, 1993; Inokuchiら，1994; Yamadaら，1994; Ferbeyreら，1996; Fujitaら，1997; Kawasakiら，1998)。しかし、in vitroにおけるリボザイムの効力はin vivoにおける機能的活性と必ずしも相関していない。このin vivoにおける非有効性の理由のいくつかは以下の通りである。ｉ）細胞性タンパク質がリボザイムの標的ＲＮＡへの結合を阻害する、またはリボザイムの活性なコンホメーションを破壊する可能性がある; ii）リボザイムによって媒介される切断にとって不可欠な金属イオンの細胞内濃度が機能的活性に十分でないかもしれない; iii)リボザイムはRNase によって容易に攻撃される。しかし、リボザイムのin vivo活性を決定するパラメーターが現在解明されつつある(BertrandおよびRossi, 1996; Bertrandら，1997; Gebhardら，1997)。in vivoでの研究は、効果的なリボザイム媒介遺伝子不活性化にとって以下の因子が重要であることを示唆した。すなわち、高レベルのリボザイム発現(Yuら，1993）；リボザイムの細胞内安定性（RossiおよびSarver, 1990; EcksteinおよびLilley, 1996）；同一細胞コンパートメント(compartment)内におけるリボザイムとその標的ＲＮＡの共局在（SullengerおよびCech, 1993; Bertrandら，1997);および転写されたリボザイムの切断活性（Thompsonら，1995)である。最近、これらの種々の特徴は、用いられた発現系に依存することがわかった(Bertrandら，1997)。
【０００３】
ｍＲＮＡ分子の転写のために用いられるＲＮＡポリメラーゼII (pol II)系およびｔＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ等の小さいＲＮＡ分子の転写にために用いられるポリメラーゼIII (pol III)系が、リボザイム発現系として使用されてきた(Turner, 1997)。polIIプロモーターによって転写が開始された転写物は、コード領域の他に３’末端および５’末端に余分な配列を有する（例えば、非翻訳領域、キャップ構造、およびポリＡテイル）。これらの余分な配列はin vivoにおける安定性およびｍＲＮＡとしての機能的認識に不可欠である。これらの配列が転写後トリミングされない限り、pol IIプロモーターによって転写が開始されたリボザイム配列を含む転写物は、これらの配列をすべて含んでいる（Tairaら，1991; Ohkawaら，1993)。その結果、ある場合には、リボザイムがその標的を認識する部位が、例えばコード配列の一部によって覆われてしまうことがある。対照的に、pol III 系は短いＲＮＡ分子の発現に適しており、余分な配列は非常に短いものが生成されるのみである。さらに、発現レベルは少なくとも一桁、pol II系のそれよりも高い(CottenおよびBirnstiel, 1989)。したがって、pol III系はリボザイムの発現に非常に有用であろうと示唆された(Yuら，1993; Perrimanら，1995)。しかし、多くの場合、polIII系の明らかに望ましい特徴にもかかわらず、リボザイムの期待される効果は達成されなかった(Ilvesら，1996; Bertrandら，1997) 。
【０００４】
発明の開示
本発明者らは、pol IIIプロモーターであるｔＲＮＡValプロモーターによって転写が開始される、同一のリボザイム配列を有する３種類のリボザイムを設計し、リボザイムのin vivo活性を決定するパラメーターを検討したところ、転写物（ｔＲＮＡValプロモーターの配列が付加されたリボザイム（以下、「ｔＲＮＡVal-リボザイム」と称する。））の全体的な構造がリボザイムの切断活性ばかりでなく細胞内半減期をも決定することを明らかにした。細胞核において転写されたすべてのキメラｔＲＮＡVal-リボザイムは細胞質に輸送され、かくして、リボザイムとその標的は同じ細胞コンパートメント内に存在した。このような条件下で、本発明者らは各ｔＲＮＡVal-リボザイムの細胞内半減期および定常レベルがin vivoにおける機能的活性の主要な決定要素であることを見いだした。さらに、本発明者らは、in vivoにおいて最長の半減期をもつように特に設計したリボザイムを発現する細胞がHIV-1の攻撃に対してほぼ完全に耐性であることを示した。さらに、ｔＲＮＡVal構造のアミノアシルステムの部分に小さなバルジ構造（バルジとは元来”ふくらみ”あるいは”膨張”の意で、RNAがヘアピン構造をとった場合、塩基対が組めずに２本鎖構造が突出している部分のことをさす。）を設けることにより、成熟酵素からの認識を回避でき、その結果、３’側に連結されたリボザイム配列を含む任意のRNA配列をｔＲＮＡValにつながった形で細胞内に存在させることができることも見出した。本発明のｔＲＮＡVal構造の３’側に繋がったリボザイム配列を含む任意のRNAは、tRNA構造の性質により、安定かつ効率よく細胞質に輸送される。このことは、特にリボザイムが細胞内で機能を有するには重要なものである。
【０００５】
本発明の要旨は、以下の通りである。
１．  下記の塩基配列(I) または(II)を持つヌクレオチド配列を含むリボザイム。
0003829176.tif 000002
【０００６】
２．  上記１記載のリボザイムをコードするＤＮＡを含む発現ベクター。
３．  上記１記載のリボザイムをコードするＤＮＡを含む発現ベクターＤＮＡを鋳型として、ＲＮＡに転写することを特徴とする、上記１記載のリボザイムの製造方法。
４．  上記１記載のリボザイムまたは上記２記載の発現ベクターを有効成分として含む医薬組成物。
５．  後天性免疫不全症候群を予防および／または治療するための上記４記載の医薬組成物。
６．  上記１記載のリボザイムを用いて、標的ＲＮＡを特異的に切断する方法。
７．  標的ＲＮＡがHIV-1 ＲＮＡである上記６記載の方法。
８．  下記の二次構造(I)をとるRNA（成熟tRNAVal）の改変体であって、二次構造(I)をとるRNAのヌクレオチド配列のヌクレオチド８〜１４およびヌクレオチド７３〜７９の間で水素結合が形成される領域にバルジ構造が導入されていることを特徴とする前記RNA改変体。
【０００７】
0003829176.tif 000003
【０００８】
９．  二次構造(I)をとるRNAのヌクレオチド配列中のヌクレオチド７３〜７９の領域の配列の一部または全部を置換することにより、バルジ構造が導入されている上記８記載のRNA改変体。
１０．  配列番号１のヌクレオチド配列中のヌクレオチド１〜８０の領域の配列からなる上記８記載のRNA改変体。
１１．  配列番号２のヌクレオチド配列中のヌクレオチド１〜８６の領域の配列からなる上記８記載のRNA改変体。
１２．  上記８記載のRNA改変体の3’末端に任意のRNA鎖が連結されているRNA。
１３．  任意のRNA鎖が、リボザイムまたはアンチセンスRNAである上記１２記載のRNA。
１４．  二次構造(I)をとるRNAのヌクレオチド配列中のヌクレオチド８〜１４の領域のいずれかのヌクレオチドおよび3’末端に連結されたRNA鎖のいずれかのヌクレオチドによってバルジ構造が形成される上記１２記載のRNA。
１５．  上記１２記載のRNAをコードするDNAを含む発現ベクター。
【０００９】
我々はリボザイムの転写量や安定性、転写後の活性を考慮し、その発現系として、ポリメラーゼIII 系であるヒトのｔＲＮＡVal プロモーターを選択し、リボザイムとこのプロモーターとのつなぎ方によって生体内におけるリボザイム効果に差がでないかを検討した。すなわち、生体内において有意なリボザイム効果を得るために重要な要因の一つである、細胞内での安定性、及び転写後の活性に着目し、リボザイムの高次構造とこれらの要因との相関性について明らかにすることを目的とした。
【００１０】
まず、ＨＩＶ−１の比較的保存された配列を標的とするハンマーヘッド型リボザイムを設計し、その遺伝子を様々な配列を介してｔＲＮＡVal プロモーターの下流につなぐことにより４種の発現系を構築した。この発現系を構築するためのベクターとしては、pUC19 (Takara)を用いたが、その他にも、pGREEN LANTERN(ライフテックオリエンタル株式会社製) 、pHaMDR (HUMAN GENE THERAPY6:905-915 (July 1995)) などのベクターを用いてもよい。また、発現系の構築に必要なオリゴヌクレオチドは、DNA/RNA 合成機 (モデル394; AppliedBiosystems, Division of Perkin Elmer Co. (ABI), Foster City, CA) で化学合成することができる。
【００１１】
Zuker 法を用いた予測から、ｔＲＮＡVal プロモーターとハンマーヘッド型リボザイムのつなぎ目の配列の違いはリボザイムの認識部位における２次構造に大きな影響を与えると考えられた（図１参照）。この予測図によると、全体的なリボザイムの２次構造はどれもほぼ同じであるのに対し、基質の結合部位における自由度は大きく異なっていることがわかる。Ｒｚ１は基質結合部位の両方が分子内でステム構造を形成しているのに対し、Ｒｚ２では片方が、Ｒｚ３においては両方の結合部位がきれいにちょうど外側へ突出していることがわかる。Ｒｚ３においては突出した基質結合部位がタンパク質に覆われてしまう恐れもあるが、リボザイムはＲＮＡ酵素であり、基質との結合しやすさが、解離のしやすさと同時に活性における重要な因子となるため、リボザイムの切断能力としてはこれが一番であることが予測された。実際、細胞内において転写されたリボザイムを用いてin vitroの系において［40mM Tris-Cl (pH8.0), 8mM MgCl2 , 5mM DTT, 2mM Spermiidine, 2 U/μl RNase inhibitor, 30μg total RNA ］の条件下で反応を行った。この際total ＲＮＡ中に含まれるリボザイムの含有量は一定に揃えた。In vitroで転写し、放射ラベルした短い基質に対するリボザイムの活性はその認識部位における自由度に依存する結果となった（図２参照）。また、リボザイムの安定性についても検討した。対照となる遺伝子の発現量を一定に揃え、それぞれのリボザイム量を比較検討した。リボザイムの構造における違いは安定性にも影響を与えており、“なぜ全体的にはそれほど差のない構造がこのように影響するのか”理由は明らかではないが、最も安定なものとそうでないものは約25倍もの差を示した（図３Ｂ参照）。
【００１２】
先にも述べたように、いまだ不明であるin vitroの系におけるリボザイムの活性と生体内における効果との相関性についても次に検討した。まず、レポーター遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子を用い、これとpNL4-3（HIV-1 のクローン）の配列の融合遺伝子に対してリボザイムを作用させ、細胞抽出液内のルシフェラーゼ活性を測定することで間接的に細胞内におけるリボザイム効果を評価する系を構築した（図３Ａ参照）。それぞれのリボザイムについて比較して結果、細胞内で安定性の最も高かったものが最も高活性を示したことから、安定性がいかに重要であるかが示唆された（図４参照）。
【００１３】
ここまでの話は培養細胞内においてルシフェラーゼ遺伝子とＨＩＶ−１の配列との人工的な融合遺伝子に対するリボザイム効果の評価となるので、結局のところ、実際の生体内における結果と等しいと判断することは困難である。そこで、実際のＨＩＶ−１に対するリボザイム効果の評価を行った（図５参照）。リボザイム発現系の形質転換体にＨＩＶ−１を感染させ、ウイルスの増殖を血清中における p24 (ウイルスのコアタンパク）の生産量を測定したところ、我々の培養細胞内における評価と同様な傾向を示す結果が得られた。またin vitroで最も安定性の高かったリボザイムはこの場合においても非常に高い抑制効果を示し、 p24の生産を99％抑えていることが明らかとなった（図６Ｃ参照）。一方、in vitroで切断活性の最も高かったリボザイム発現系はウイルスの増殖をほとんど抑制することができなかった。
【００１４】
このように、ウイルスでのリボザイム効果の評価も培養細胞内における人工的な基質における評価と同傾向を示していることが明らかになった。よって、今回我々が行ったような一過的な評価における結果も、生体内におけるリボザイム効果のおおよその目安になると考えられる。またin vitroからウイルスを扱った実験にわたる結果から、リボザイムの細胞内における有意な効果を得るためには活性の高さも大事であるが、それにも増して細胞内における安定性が重要であることが明らかとなった。今回のようにほとんど配列に違いのないリボザイムにおいても、発現系とのつなぎ方一つで、先に述べたような生体内における効果に大きな差が生じるという事実は、これについても十分考慮する必要があり、また発現させるために付加した配列による高次構造の影響も加味し、リボザイムに安定性を持たせるような設計が重要であることが示唆された。
【００１５】
tRNAは、細胞内において、その構造配列内にあるAボックスおよびBボックスと呼ばれる配列からなるプロモーター配列が認識され、５’および３’側に余分な配列がついた形で転写される。ついで、細胞内に存在する複数の成熟酵素の作用により、余分な配列が除去され成熟tRNAとなる。これらの酵素が作用するうえで、アミノアシルステムとよばれる部分の構造が、構造認識の重要な決めての一つとなっている。我々は、この部分に小さなバルジ構造を設けることで、成熟酵素の作用から回避させることが可能であることを見い出した。例えば、図１においてRz1、Rz2、Rz3はいずれもアミノアシルステムに小さなバルジ構造を有しており、結果、転写されたRNAのリボザイム配列部分は除去されていない（図３B、７Aおよび塩基配列決定ずみ）。このような性質は３’側の配列がリボザイムであるからではなく、アミノアシルステムの部分にバルジ構造があるためであり、従って、アンチセンスを含む任意のRNA配列であってもよい。
【００１６】
tRNAは通常、成熟酵素により５’および３’側の余分な配列が除去され、また、イントロンを有するものはスプライシング機構によりそれが除去され、さらに、特定の塩基が修飾を受け、加えて、その3'端に5'-CCA-3'からなる配列が付加され、また、あるものは、そのtRNAに適合するアミノ酸が付加され（アミノアシル化）、といった一連の修飾を受けて初めて核外に輸送される。しかし、本発明のtRNAはこの様な一連の修飾作用のうち、少なくとも、５’および３’側の余分な配列の除去、3'端にCCA配列の付加、およびアミノアシル化の修飾反応を受けずに、核外に積極的に輸送されている（図７A）。これは、アミノアシルステムの部分にバルジを設けたことにより、成熟酵素による作用を受けないがためにCCA配列の付加、それに続くアミノアシル化が起こらないことに加え、全体の構造がもとのtRNAのそれと近いからであると考えられる。このことは、コンピューターを使った構造予測により、tRNA構造が崩れたもの（Rz4）は細胞質には輸送されていないことからも支持される(図７C）。ここでの、核から細胞質へ輸送される性質は、３’側にあるリボザイム配列によるものではないので、当然、アンチセンスRNA等の任意のRNA配列でも同様であると考えられる。
【００１７】
近年アンチセンスRNAやリボザイムRNAは、細胞内で発現させた場合、その細胞内における分布が細胞質であることが、機能を発揮するためには重要であることがわかってきた。このRNAは、このRNAのみで安定なtRNA様構造を形成するため、３’端につなげたRNAの高次構造に大きな影響をおよぼさずに（３’端につなげたRNAがリボザイムやアンチセンスなどの機能性RNAの場合、非常に重要な性質である）、確実に細胞質へ移行する機能をもっている。さらに、このRNAはDNAにした場合プロモーターとして機能し、細胞の種類を選ばずかつ広い宿主域をもつ（もともとはヒト由来であるが、少なくとも哺乳動物全般で発現するであろう）。つまり、アンチセンスRNA、リボザイムRNAの発現系としては最適で、培養細胞を用いた実験や、医学の分野で遺伝子治療用の道具として重要なものとなりうる。また、近年分子進化工学という手法で自然には存在しない機能を有するRNA分子が人為的に作製されている。これが、細胞内において特に細胞質において機能を発揮するものであれば、その発現系としても利用可能である。
【００１８】
本発明のtRNAval-リボザイムを用いて、標的ＲＮＡ、特にHIV-1 ＲＮＡを特異的に切断することができる。
【００１９】
本発明のtRNAval-リボザイムは、医薬、特に、後天性免疫不全症候群を予防および／または治療するための医薬として使用することができる。例えば、本発明のtRNAval-リボザイムをリポソームに封入し、これを生体に投与して、HIV を含む細胞に取り込ませることにより、HIV の転写を阻害することができる。また、本発明のtRNAval-リボザイムをコードするＤＮＡをウイルスなどのベクターに組み込んで、HIV を含む細胞内に導入し、該細胞内でこのベクターを発現させ、本発明のtRNAval-リボザイムを産生させることにより、HIV の転写を阻害することができる。本発明のtRNAval-リボザイムの投与は、疾病の状態の重篤度や生体の応答性などによるが、予防および／または治療の有効性が認められるまで、あるいは疾病状態の軽減が達成されるまでの期間にわたり、適当な用量、投与方法、頻度で行えばよい。
【００２０】
本明細書は、本願の優先権の基礎となる日本国特許出願特願平10-244755号の明細書および図面に記載される内容を包含する。
発明を実施するための最良の形態
本発明を以下の実施例によりさらに具体的に説明する。本発明の範囲は、これらの実施例に限定されることはない。
〔実施例〕
材料および方法
プラスミドの構築
各ｔＲＮＡVal-リボザイムを発現するプラスミド（pUCdt-Rzシリーズ）は以下のように構築した。すなわち、ヒト胎盤ｔＲＮＡVal遺伝子（pHtV1; Arnoldら，1986)に由来するプロモーター領域の配列をコードするセンスおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドリンカーをアニールし、pUC19のEcoRI/SalI部位に連結した。オリゴヌクレオチドリンカーの配列は以下の通りであった：センス 5'-aat tca gga cta gtc ttt tag gtc aaa aag aag aag ctt tgt aac cgt tgg ttt ccg tag tgt agt ggt tat cac gtt cgc cta aca cgc gaa agg tcc ccg gtt cga ag-3'（配列番号６）；アンチセンス 5'-tcg act tcg aac cgg gga cct ttc gcg tgt tag gcg aac gtg ata acc act aca cta cgg aaa cca acg gtt aca aag ctt ctt ctt ctt ttt gac cta aaa gac tag tcc tg-3'（配列番号７）。次に、ターミネーター配列をコードするセンスおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドリンカーをアニールし、プロモーター領域の配列を含むpUC19のNspV/SalI 部位に連結した。オリゴヌクレオチドリンカーの配列は以下の通りであった：センス 5'-cga aac cgg gca ccc ggg gaa tat aac ctc gag cgc ttt ttt tct atc gcg tc-3'（配列番号８）；アンチセンス 5'-tcg acg cga tag aaa aaa agc gct cga ggt tat att ccc cgg gtg ccc ggt ttc-3' （配列番号９）。得られたプラスミド（これはｔＲＮＡValのＡおよびＢボックス、ならびにターミネーターを含んでいた）をpUCdtと名付けた。
【００２１】
pUCdtを鋳型とし、アッパープライマー(5'-cgc cag ggt ttc cca gtc acg ac-3')（配列番号１０）およびリボザイムとターミネーター両方の配列を含むロアープライマー（Ｒｚ１、5'-ctg cag gtc gac gcg ata gaa aaa aag cgc tcg agg tgc ccg ttt cgt cct cac gga ctc atc agt gtt gtg tgg gtg ccc ggt ttc gaa ccg gga cct tt-3' （配列番号１１）; Ｒｚ２、5'-ctg cag gtc gac gcg ata gaa aaa aac cgt ttc cga cgt gcc cgt ttc ggt cct ttc ggt cct cat cag tgt tgt gtt tgt agt gcc cgg ttt cga acc ggg gac ctt t-3' (配列番号１２）;Ｒｚ３、5'-ctg cag gtc gac gcg ata gaa aaa aac cgt ttc cga cgt gcc cgt ttc ggt cct cat cag tgt tgt gtg ttg gtt tgt agt gcc cgg ttt cga acc ggg gac ctt t-3' (配列番号１３）を用いて、各リボザイムおよびｔＲＮＡVal部分の配列をコードするＤＮＡ断片をＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ産物をEcoRI およびSalIで消化した後、各断片をpUC19 のEcoRI/SalI部位に連結し、pUCdt-Rzを得た。pUCdt およびpUCdt-Rzシリーズの配列を直接ヌクレオチド配列決定によって確認した。ｔＲＮＡVal-リボザイム遺伝子に加え参照遺伝子発現カセットをも含む pUC-Rrシリーズのメンバー（図３Ａ参照）は、pUCdt のPvuII 断片を各pUCdt-RzのHincII部位に挿入することによって構築した。制限酵素による消化によって挿入断片の方向を確認した。リボザイム導入HeLa細胞の作製に用いたpHyg dt-Rzシリーズは、pUCdt-Rzシリーズの各PvuII-SalI断片をpHyg (Yatesら，1984)のEcoRV/SalI部位に挿入することによって構築した。オリゴヌクレオチドリンカーおよびＰＣＲプライマーのすべては、ＤＮＡ／ＲＮＡ合成機（392型；PE AppliedBiosystems, Foster市、CA) を用いて合成した。
【００２２】
組換えHIVベクタープラスミドは以下のように構築した。すなわち、pMC1neo由来の細菌性neor 遺伝子カセットをコードする2.0 kbpのBamHI断片 (ThomasおよびCapecchi, 1987)を、HIV-1由来ベクターのSalI部位に挿入した（図５Ａ；Shimadaら，1991)。次に、図５Ｂに示すように、ｔＲＮＡVal-リボザイム発現カセットをTK-neorのすぐ上流でSalI部位にクローン化した。
【００２３】
細胞の培養およびトランスフェクション
HeLaおよびCos細胞は、10% (v/v)ウシ胎児血清(FBS; Gibco BRL)および45
μg/mlゲンタマイシン(Gibco BRL)を添加したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM; Gibco BRL, Gaithersburg, MD)で培養した。リボザイム導入細胞を選択するため、ハイグロマイシンＢを最終濃度300 μg/mlで用いた。Ｈ９細胞は、10% ウシ胎児血清(FCS; Gibco BRL)を添加したRPMI (Gibco BRL)で培養した。
リポフェクチン試薬(Gibco BRL) を製造者のプロトコールにしたがって用いて、細胞をトランスフェクトした。Ｈ９細胞のトランスフェクションは、組換えHIV-1ベクタープラスミド（図５ＢのHIVRib.N）を用いてCaPO4共沈殿法により実施した。
【００２４】
ＲＮＡの調製
グアニジニウムチオシアネートフェノールクロロホルム法により全ＲＮＡを抽出した。細胞質ＲＮＡおよび核ＲＮＡを文献(HuangおよびCarmichael, 1996)に記述された通り分離した。
【００２５】
リボザイムの定常レベルおよび半減期の測定
各リボザイムの定常レベルの測定は以下のように実施した。すなわち、各pUC-Rrを用いてHeLa細胞 (1x106細胞/10 cmプレート）をトランスフェクトした。トランスフェクションの２日後に、これらの細胞から全ＲＮＡを単離した。単離された全ＲＮＡのｔＲＮＡVal-リボザイムの下流に位置する対照ＲＮＡの量を、対照ＲＮＡに特異的なプローブ（5'-aaa tcg cta taa aaa gcg ctc gag gtt atg ctc ccc ggg t-3'）（配列番号１４）を用いたノーザンブロット分析でまず定量した。各サンプル中の対照ＲＮＡの量を一定値に維持した。また、全ＲＮＡのレベルも、必要であればトランスフェクトされていないHeLa細胞から単離したＲＮＡを添加することにより一定に保った。最後に、リボザイムに特異的なプローブ(5'-ctc atc tgt gtt gtg t-3') （配列番号１５）または対照ＲＮＡに特異的なプローブを用いてハイブリダイゼーションを繰り返した（図３Ｂ）。
【００２６】
各リボザイムの半減期は、細胞を文献(HuangおよびCarmichael, 1996) に記述された通りアクチノマイシンＤで処理した後、ノーザンブロット分析によって測定した。すなわち、細胞をアクチノマイシンＤに最終濃度5 μl/mlで０、60、120または180分間さらし、各時点で全ＲＮＡを単離した（図３Ｃ）。単離されたＲＮＡの各調製物中のリボザイムの量をノーザンブロット分析により測定した。
【００２７】
切断アッセイ
各pUCdt-RzまたはpUCdt によってトランスフェクトされたHeLa細胞から全ＲＮＡを抽出した。単離されたＲＮＡの各調製物中のリボザイムの量を、リボザイムに特異的なプローブを用いたノーザンブロッティングにより測定した。次に、トランスフェクトされていないHeLa細胞から単離したＲＮＡを添加することにより各リボザイムの濃度を同じ値になるように調節した。HIV-1のU5 LTR領域をコードする基質ＲＮＡ（図２Ａ）をＴ７転写によって調製し、32Pを用いて放射標識した。50μl の反応混合物[40mM Tris-HCl (pH 8.0), 8 mM MgCl2, 5 mM ジチオトレイトール(DTT)、2 mM スペルミジン、40Uの胎盤RNaseインヒビター、30 μlの全ＲＮＡ、5 kpcmの放射標識した基質ＲＮＡ] 中で37℃で12時間切断反応を進行させた。6%ポリアクリルアミド/7 M尿素ゲルを用いた電気泳動にかけて反応生成物を同定した（図２Ｂ）。
【００２８】
ルシフェラーゼアッセイ
Dual-LuciferaseTM ReporterAssay System (Promega,Madison, WI)を製造者のプロトコールにしたがって用いて、ルシフェラーゼ活性を測定した。pUCdt-Rzおよび標的発現プラスミドによってトランスフェクトされたHeLa細胞（図４Ａ）、または標的発現プラスミドによって形質導入されたリボザイム産生HeLa細胞（図４Ｂ）を150 μlの 1x 受動溶解緩衝液中で15分間溶解し、プレートからこすり取った。遠心分離によって細胞破砕物を除去した。20μl の遠心分離した溶解物を100 μlのルシフェラーゼアッセイ試薬IIに添加した後、発光計(luminometer)(Luminant LB 9501; Berthold,Bad Wildbad, Germany)を用いて発光シグナルを直ちに定量化した。さらに、ホタルルシフェラーゼの活性を標準化するため、我々はホタルルシフェラーゼによって触媒された反応の定量化の直後に100 μlのStop& GloTM試薬をサンプルチューブに加えることによって、ウミシイタケ(Renilla)ルシフェラーゼによって生成された発光シグナルを測定した。ウミシイタケルシフェラーゼの活性を参照して、ホタルルシフェラーゼ活性の記録された数値を標準化した（図４）。
【００２９】
ホタルルシフェラーゼ活性の標準化した各数値を、溶解物中のタンパク質濃度を参照してさらに標準化した。タンパク質はブラドフォード法(Bradford's method)に基づくProtein Assay Kit (Bio-Rad,California, USA)を用いて定量した。
【００３０】
リボザイムを安定に導入されたHeLa細胞
pHyg dtまたはpHyg dt-Rzシリーズのメンバーを用いてHeLa細胞をトランスフェクトし、300 μg/mlのハイグロマイシンＢ（和光純薬、大阪、日本）を含有するDMEM中で選択することにより、リボザイム導入細胞を得た。トランスフェクションの12時間後に培地を増殖培地と交換し、細胞をさらに48時間培養した。細胞を1:5 の希釈で、300μg/mlのハイグロマイシンＢを含有するDMEM（選択培地）で継代培養した。培地は３日ごとに新鮮な培地と交換した。ハイグロマイシンＢに耐性な細胞を、250 μg/mlのハイグロマイシンＢを含有するDMEM中で増殖させた。
【００３１】
ウイルスの作製およびHIV ベクターによるリボザイムの導入
組換えウイルスを含む上清を文献 (Shimada, 1991)に記述されるように作製した。すなわち、Cos細胞(2 x 106細胞/10 cmの皿）を培養し、10μg のパッケージングベクタープラスミドおよび10μg の組換えHIV ベクタープラスミド（図５Ｂに示すHIVRib.N）を用いてトランスフェクトした。48時間後に組換えウイルスを含む上清を採取し、孔径0.22μm のフィルターで濾過した。次に、2 x 106個のＨ９細胞を、6 μg/mlのPolybreneTM (AbbottLaboratories)を含む濾過した上清5 mlと共にインキュベートした。24時間後、培地を10%FCSおよび1 mg/ml G418を添加したRPMIと交換した。細胞をさらに48時間培養し、G418耐性クローンを単離した。RT-PCR分析によってリボザイム遺伝子の導入を確認した。
【００３２】
Ｈ９細胞中に産生されたｔＲＮＡVal-リボザイムの定量
以下のように定量的RT-PCRを実施した(Ozawaら，1990; HambletおよびCastora, 1995)。すなわち、リボザイムを安定に導入したＨ９細胞から全ＲＮＡを抽出した。20μl の反応混合物 [1 μg の全ＲＮＡ、20 mM Tris-HCl (pH 8.3)、50 mM KCl、5 mM MgCl2、1 mM dNTP、1 pmolのプライマー（βアクチン用: 5'-gtg gcc atc tct tgc tcg aa-3'（配列番号１６）; リボザイム用: 5'-gac ctt tcg gtc ctc atc-3' （配列番号１７） )および0.25U/ml モロニーマウス白血病ウイルスRTase（宝酒造、京都、日本)]中で42℃で30分間ｃＤＮＡを合成した。
【００３３】
２個のオリゴヌクレオチドプライマー（アッパー：5'-gac tac ctc atg aag atc ct-3'（配列番号１８）; ロアー: 5'-gtg gcc atc tct tgc tcg aa-3'（配列番号１９）)を用いたＰＣＲによりβアクチンのｃＤＮＡを増幅した。ＰＣＲサイクルは、94℃１分間、60℃１分間および72℃２分間を13、15または17サイクル実施した。２個のオリゴヌクレオチドプライマー（アッパー：5'-gtt atc acg ttc gcc taa-3' （配列番号２０） ;ロアー: 5'-gac ctt tcg gtc ctc atc-3'(配列番号２１） ) を用いたＰＣＲによりリボザイムｃＤＮＡを増幅した。ＰＣＲサイクルは、94℃１分間、55℃１分間および72℃２分間を13、15または17サイクル実施した。
【００３４】
13、15および17サイクル後のＰＣＲ産物を、リボザイムに特異的(5'-acg cga aag gtc ccc ggt-3'（配列番号２２）) またはβアクチンに特異的(5'-gcg gga aaa tcg tgc gtg a-3'（配列番号２３）)な放射標識プローブを用いたサザンブロッティングにより分析した。BAS2000 システム（富士フィルム、東京、日本）を用いて各バンドの放射能（図６Ａおよび６Ｂ）を測定した。
【００３５】
HIV-1チャレンジアッセイ
HIV ベクター(HIVRib.N ）を用いてリボザイムを導入したＨ９細胞およびモックを導入した対照細胞をNL432 と共にm.o.i（感染多重度）0.01で４時間インキュベートした。PBS で２回洗浄した後、これらの細胞を 1x105細胞／mlの密度で、10% FCS を添加したRPMI 1640培地で培養した。ウイルス感染後３、７および11日目に上清を回収した。HIV-1抗原捕獲ELISA テストキット(DAINABOT、東京、日本）を製造者の指示にしたがって用いて、各上清におけるHIV-1のp24 抗原のレベルを測定した。
【００３６】
結果
ｔＲＮＡVal-リボザイムの二次構造およびin vitroにおけるそれらの切断活性
pol IIIによって転写が開始されるリボザイム発現カセットを構築するため、我々はHIV-1 ＲＮＡの５’リーダー配列を標的とするリボザイム配列（Adachiら，1986; Yuら，1993)を、間に３つの短いリンカーを介して、ｔＲＮＡValプロモーターに隣接してクローン化し（図１においてリンカー配列は小文字で、またリボザイム配列は太い大文字で示す）、一組のpUCdt-Rzプラスミドを得た。短いリンカーの挿入は、転写物の全体的構造を変化させ、その結果、リボザイムの認識アーム（arm)（図中、認識アームには下線を付してある）の接近しやすさ(accessibility)に影響を及ぼした。当然ながら、リボザイムが基質ＲＮＡと共にステム(stem)構造（これは次におこる基質の切断を確実にするものである）を形成できるように、リボザイムの５’側および３’側基質認識部位の両方が基質に対して利用可能であることが重要である。構造と機能的活性の関係を明らかにするため、我々は認識アームの利用可能性(availability)の程度を変更するリンカーを選択した。図１はコンピュータモデリング(Mulfold Biocomputing Office, Biology Department, Indiana University, IN, USA)によって予測されるｔＲＮＡVal-リボザイムの二次構造（ＡおよびＢボックスに対応する配列に影をつけてある）を示す。ある場合においては（図１Ａ）、ターミネーター配列の前にリンカーが挿入され、リボザイムの３’側基質認識アームのフレキシビリティーを制限した。さらに、５’側基質認識アームは利用不可能であった。したがってｔＲＮＡVal-リボザイム１（図１ＡのＲｚ１）の場合は、５’側および３’側基質認識アームの両方は殆どらせん構造中に埋没していた。ｔＲＮＡVal-リボザイム２（Ｒｚ２）は、５’側に制限された１つの基質認識アームを有する。対照的に、ｔＲＮＡVal-リボザイム３（Ｒｚ３）は制限された基質認識アームを全くもたず、両方のアームとも基質との結合に利用可能であった。基質認識アームのフレキシビリティーから判断すると、Ｒｚ３の切断活性が最も高く、次にＲｚ２およびＲｚ３がこの順番で続くと予想されよう。なお、Ｒｚ１〜３の塩基配列は、それぞれ、配列表の配列番号３、１、および２に示す。
【００３７】
上記リボザイムがそれらの二次構造（図１）から予想される通りの切断活性を有するかどうかを調べるため、我々はまずin vitroにおける活性を比較した。上記リボザイム（ｔＲＮＡVal-リボザイム）をコードする種々のpUCdt-Rzプラスミドを用いてトランスフェクトしたHeLa細胞から全ＲＮＡを単離した。我々は単離したＲＮＡ中の各リボザイムの一定量（ノーザンブロット分析データに基づく）を放射標識した基質ＲＮＡと混合し、切断反応を開始させた。12時間インキュベートした後、6%ポリアクリルアミド/7 M尿素を含むゲルを用いて各反応の進行をモニターした（図２）。予想した通り、両方の認識アームが利用可能であるＲｚ３の切断活性が最も高く、次にＲｚ２が続き、他方、両方の認識アームが利用できないＲｚ１の切断活性は非常に低かった。したがって、in vitroにおけるｔＲＮＡVal-リボザイムの切断活性は、コンピュータによって作製されたそれらの二次構造から推定できることが明らかであった。
【００３８】
ｔＲＮＡVal-リボザイムの定常レベルおよび半減期
我々はリンカー配列の介在によって全体的な構造に小さい変化が生じるであろうと予想した。したがって、リンカーはリボザイムのin vivoにおける安定性にかなりの影響を及ぼすに相違ない。我々は２つの異なるアプローチを用いて、各ｔＲＮＡVal-リボザイムの細胞内安定性を下記のように比較した。すなわち、pUC-Rr (リボザイムをコードする各pUCdt-Rzプラスミドに参照遺伝子の配列を付加してpUC-Rrを作製した；図３Ａ）を用いて一過性にトランスフェクトしたHeLa細胞由来の各転写物の定常レベルをノーザンブロット分析（一過性発現アッセイ）により比較した。参照遺伝子の転写量を調整することにより各ｔＲＮＡVal-リボザイムの発現レベルを標準化した。参照遺伝子は同じプラスミド内にタンデムに連結した（pUC-Rr；図３Ａ）。ｔＲＮＡVal-リボザイムをコードする各プラスミドを用いてトランスフェクトしたHeLa細胞から我々が単離したＲＮＡの全サンプル中に、長さが約150ヌクレオチド（これはキメラｔＲＮＡVal-リボザイムの大きさと一致する）の転写物が検出された。ｔＲＮＡVal-リボザイムの定常レベルは、濃度が30倍の範囲で異なっていた。最も高かったＲｚ２のレベルは最も低いＲｚ１のレベルの約26倍であった。そして、Ｒｚ３のレベルはＲｚ１のレベルの約５倍であった。各リボザイム発現カセットのプロモーター領域には何の改変もしていないので各場合において転写効率は同一であると推定されるため、我々は転写物の定常レベルにおけるこれらの差は各転写物のin vivoにおける安定性の結果であると仮定した。
【００３９】
第２のアプローチとして、また上記の仮説を試験するため、我々はより自然な細胞内条件下で各転写物の安定性を比較しようと試みた。我々は、各ｔＲＮＡVal-リボザイムを産生する安定したHeLa形質転換細胞を確立し、そしてアクチノマイシンＤを用いて細胞性転写を妨げることによって各転写物の細胞内半減期を直接測定した。図３Ｃに示すように、Ｒｚ２の分解速度はＲｚ１およびＲｚ３のそれよりも低かった。Ｒｚ２の半減期（100±10分）は、Ｒｚ１（35±2分）およびＲｚ３（40±15分）の２倍以上であった。これらの結果は一過性発現アッセイの結果と良く一致しており、転写物の定常レベルにおける差は転写効率における何らかの差によるよりも、むしろ各転写物のin vivoにおける安定性による、という我々の仮説を支持した。
【００４０】
ｔＲＮＡVal-リボザイムの細胞内活性
ｔＲＮＡVal-リボザイムの細胞内活性を評価するため、我々は２種類のアッセイを実施した。第１に、各ｔＲＮＡVal-リボザイム発現プラスミド（pUCdt-Rz) およびHIV-1LTR (R-U5 領域)-ルシフェラーゼからなるキメラ遺伝子をコードする標的遺伝子発現プラスミドを用いてHeLa細胞を同時トランスフェクションした。両遺伝子の一過性発現の後、各細胞溶解物においてルシフェラーゼ活性を測定することにより各ｔＲＮＡVal-リボザイムの細胞内活性を評価した。リボザイム発現プラスミドの代わりに最小限のｔＲＮＡValプロモーターおよびターミネーター配列を有する対照プラスミド（pUCdt)を用いた場合に記録されたルシフェラーゼ活性を100%とした。図４Ａに示すように、in vivoにおいて安定性が最も高かったＲｚ２が最も効果的（>60%抑制）であり、Ｒｚ３が次に効果的（>40%抑制）であった。Ｒｚ１は、in vitroにおける低い切断活性（図２Ｂ）およびin vivoにおける低い安定性（図３Ｂおよび３Ｃ）から予測されるように、非常に効果的とは言えなかった（約10% 抑制）。
【００４１】
第２のアッセイにおいては、標的遺伝子発現プラスミドのみを用いて、ほぼ同一レベルのｔＲＮＡVal-リボザイムを発現する安定した形質転換細胞をトランスフェクトした（安定した形質転換HeLa細胞を恣意的にピックアップし、リボザイムをほぼ同一レベルで発現するクローンを試験用に選択した）。各リボザイムに対して２つの独立した、安定な形質転換体を用いたこの実験において（図４Ｂ）、我々は上の段落に記述した傾向に類似した傾向を観察した。しかし、この場合は、おそらく形質転換HeLa細胞がｔＲＮＡVal-リボザイムを構成的に産生したため、すべてのリボザイムの効果はより強かった。Ｒｚ２は標的遺伝子の発現を有意なレベルまで抑制し、ある場合には97%も抑制した。
【００４２】
Ｒｚ３はin vitroにおける切断活性が最も高かったが、細胞環境内ではＲｚ２より効果的に作用することはなかった。これらの結果は、もし転写されたリボザイムが細胞内で十分安定であるならば、極めて高い切断活性がなくてもin vivoにおいて顕著な効果をもちうることを示唆する。
【００４３】
HIV-1の複製を抑制する能力
上記の試験は、Ｒｚ２およびＲｚ３がin vivoにおいてHIV-1の配列に対して有意な切断活性をもつかもしれないことを示したので、我々はHIV-1の複製を抑制するｔＲＮＡVal-リボザイムの能力を比較した。すなわち、HIVベクター（図５；Shimadaら，1991)を用いて、Ｒｚ２またはＲｚ３を発現するＨ９細胞系の安定な形質転換体を得た（上記の試験においてＲｚ１は不活性だったので、Ｒｚ１を産生する安定な形質転換体を単離する試みは行なわなかった）。HIVベクターによって形質導入された、リボザイム発現カセットをもたない細胞（図５Ａ）をモック対照として用いた。以下の分析には２つの独立した細胞系を用いた。その結果、11日間にわたって、リボザイムを産生しない細胞の増殖速度（データはここに示していない）と較べ、それら細胞系の増殖速度に何ら明白な変化は検出されなかった。したがってリボザイムは宿主細胞にとって有害ではなく、おそらく高い特異性をもって標的ＲＮＡのみを切断したのであろう（Kawasakiら，1996, 1998)。
【００４４】
ウイルスチャレンジアッセイに先立って、我々は定量的RT-PCR分析により形質導入Ｈ９細胞における各ｔＲＮＡVal-リボザイムの定常レベルを測定した。図３Ｂに示すHeLa細胞を用いた一過性発現アッセイの結果、すなわち、Ｒｚ２とＲｚ３の定常レベルの差は約５倍であるということが、RT-PCR分析により確認された（図６Ａおよび６Ｂ）。明らかにＲｚ２はin vivoにおいてＲｚ３よりも安定であった。
【００４５】
ｔＲＮＡVal-リボザイムを構成的に産生する安定なＨ９形質転換体をHIV-1ビリオンを用いてチャレンジし、感染の11日後に測定するとＲｚ２は殆ど完全にウイルスの複製を抑制した（約99%)（図６Ｃ）。対照的に、驚くべきことに、Ｒｚ３はこれらの実験条件下でウイルスの複製を全く抑制しなかった。HIV-1チャレンジアッセイにおいては、Ｒｚ２とＲｚ３の効果の差は顕著であった。
【００４６】
ｔＲＮＡVal-リボザイムの細胞内局在
リボザイムがその標的と共局在することがリボザイム効果の明らかに重要な決定要素であるので（SullengerおよびCech, 1993; Bertrandら，1997)、ｔＲＮＡVal-リボザイムの細胞内局在を確認することが不可欠であった。Ｒｚ２発現カセットによって形質導入されたHeLa細胞由来の全ＲＮＡを核画分および細胞質画分に分離した。次に、リボザイムに特異的なプローブを用いてノーザンブロット分析により転写されたＲｚ２を検出した。図７Ａに示すように、Ｒｚ２は主として細胞質画分に見いだされた。そして、核画分では有意なレベルで検出されなかった。他のｔＲＮＡVal-リボザイム（Ｒｚ１およびＲｚ３）もまた細胞質画分に主として局在していた（データはここに示していない）。核内に残留するＵ６ ｓｎＲＮＡは対照としてこれらの試験に含めた（図７Ｂ）。
【００４７】
考察
リボザイムは特定の遺伝子の発現を抑制するための、可能性のある有用な道具である。なぜなら、リボザイムは高い特異性をもって他のＲＮＡ分子に作用するように作製できるからである（Uhlenbeck, 1987; HasseloffおよびGerlach, 1988)。多数の試みが成功をおさめたが(EcksteinおよびLilley, 1996; Turner, 1997; Scalon, 1997)、invivoにおいて使用できる効果的なリボザイム発現系を設計することは依然として困難である。治療剤または遺伝子的作用物質としてのリボザイムおよびアンチセンスＲＮＡの使用に関連する１つの主要な挑戦は、適切な発現ベクターの開発である（JenningsおよびMolloy, 1987; Sullengerら，1990; Bertrandら，1994, 1997; Thompsonら，1995)。序論に述べたように、今日まで２種類の発現系、すなわちpol II系およびpolIII系が用いられてきた。本研究において、我々はpol III系およびリボザイムの転写のためにヒトｔＲＮＡVal遺伝子のプロモーター(Yuら，1993)を用いた。このプロモーターは小さいＲＮＡ分子の転写に適しているばかりでなく、その使用はコンピュータフォールディング（folding)による二次構造の予測を容易にする。より重要なことに、それは転写されたリボザイムの核から細胞質への輸送を可能とし、その結果ｔＲＮＡVal-リボザイムは標的ｍＲＮＡを見つけることができるのである。
【００４８】
発現カセットの設計
標的ｍＲＮＡの二次構造は、リボザイムによって媒介される切断を受けやすいかどうかを決定する。そして、リボザイムもまた最大活性を得るためには適切な二次および三次構造に折り畳まれなければならない。コンピュータが予測する二次構造が転写後の対応する構造を本当に表しているという保証は全くないが、本研究において予測された構造（図１Ａ〜１Ｃ）は、in vitroにおける切断活性と良く相関していた（図２）。発現カセットにおいては、転写物の３’末端プロセシングをブロックするため、成熟ｔＲＮＡVal（図１Ｅに大文字で示す）の最後の７個の塩基が除去されたが転写に何ら影響はなかった（Adeniyi-Jonesら，1984）。これらの塩基をリンカー（図１に小文字で示す）によって置換し、その後にリボザイム（太い大文字）を続けた。リンカー配列によってｔＲＮＡValの配列（全配列の約２／３をしめた）と組み合わせて安定なステム構造を形成することにより、基質認識アームの自由度または利用可能性を調節した。したがって、コンピュータフォールディングによって各認識アームの二次構造および接近可能性を予測することは比較的容易であった。さらに、基質認識アームの配列が変わっても、全体的二次構造を予測する同じルールを用いる限り、認識アームの接近可能性を予測することは可能である。実際、我々は他の遺伝子の発現を抑制するための類似のリボザイム発現系の構築に成功した（Kawasakiら，1996, 1998)。図１Ａ〜１Ｃに示す我々の発現系は、効果的なリボザイム発現カセットの設計を容易にする。
【００４９】
ｔＲＮＡVal-リボザイムの核から細胞質への輸送
図１Ａ〜１Ｃに示すリボザイム発現カセットは、すべての転写物が細胞質（ここで転写物はその標的を見いだすことができる）に輸送されるのを可能とした（図７Ａ）。そして、リボザイムによる標的分子の発現の有意な抑制が観察された（図４および６Ｃ）。以前の研究（Bertrandら，1997)において、成熟ｔＲＮＡMetの最後の10塩基の欠失は３’末端プロセシングをブロックしただけでなく、転写物の細胞質への輸送を阻害した（Tobianら，1985)。これらの結果は、３’末端プロセシングが細胞質への輸送と結びついている可能性があること、および３’末端が変更された転写物は効率的に輸送されないことを示唆した（CottenおよびBirnstiel, 1989; Boelensら，1995)。しかし、図７に示されるように、成熟ｔＲＮＡValの最後の７塩基の欠失は、転写物の核からの輸送を抑制しなかった。
【００５０】
ｔＲＮＡを核から細胞質へ輸送するExportin(tRNA)と称するタンパク質が最近同定された(Artsら，1998)。Exportin(tRNA)はｔＲＮＡの不在下でRanGTPと結合する。しかし、これはRanGTPの不在下ではｔＲＮＡと結合しない。したがって、下記のｔＲＮＡ輸送モデルが提案された。すなわち、まず核内でExportin(tRNA)がRanGTPと会合し、次にこの複合体が成熟したｔＲＮＡに結合するというものである。この最終的な複合体は、核膜孔複合体をへて細胞質に運ばれる。そこでRan結合GTPは加水分解されてｔＲＮＡを細胞質中に放出し、Exportin(tRNA)を核にもどしてリサイクルさせる(Artsら，1998)。Exportin(tRNA)によって認識されうるｔＲＮＡ中の最小配列または構造はいまだに分かっていない。しかし、図１Ａ〜１Ｃに示すリボザイムは細胞質にうまく輸送されたので、天然のｔＲＮＡの３’末端における欠失および変更にもかかわらず、これらリボザイムがExportin(tRNA)によって認識され、輸送されたということが考えられる。
【００５１】
我々の研究から、３’末端変更ｔＲＮＡ転写物はその二次構造が図１Ａ〜１Ｃに示すものと類似しているならば、細胞質へ効率的に輸送されうることが明らかである。別の種類のリボザイム（図１ＤのＲｚ４（配列番号５））をHeLa細胞で発現させようと同様の実験を行なった際、転写物は核内に残った（図７Ｃ）。転写物Ｒｚ１〜Ｒｚ４においてはＡおよびＢボックスプロモーターエレメント（図１の影をつけてある部分）のみならず、ｔＲＮＡValセグメント内の残りのすべての配列が同一であるという事実にもかかわらず、Ｒｚ４（図１Ｄ）の二次構造は細胞質リボザイムＲｚ１、Ｒｚ２およびＲｚ３のそれと全く異なっている。この観察は、もしExportin(tRNA)が実際にリボザイム転写物を認識できるのであれば、Exportin(tRNA)は特定のヌクレオチド配列を認識するのではなさそうだ、ということを示唆する。Exportin(tRNA)はむしろｔＲＮＡの何らかの特異的高次構造、またはそのような高次構造内の何らかの配列を認識するのかもしれない。
【００５２】
実際、別の目的のために構築した、二次構造がＲｚ４のそれと類似している別のリボザイムは核内にのみ見いだされた（データは示していない）。我々は別の３種類の遺伝子を抑制するために、10種類以上の別のリボザイムを構築した。構築にあたっては、それらが細胞質へ輸送されるように、二次構造を図１のＲｚ１からＲｚ３の二次構造に似たものにしようと留意し、リンカー配列を調節した。これらのリボザイムのすべては、転写後、細胞質中に見いだされた。これらは高い活性（＞95%抑制）のみならず、高い特異性（不活性対照による抑制は＜5%）をも有していた。したがって、図１Ａ〜１Ｃに示す設計に基づく細胞質リボザイムは非常に魅力的に思われる(Kawasakiら，1996, 1998）。核内に残留し、活性がそれほど高くなかった RossiのｔＲＮＡMet-リボザイム(Bertrandら，1997)は、リンカー配列が異なっているため、我々の活性な二次構造とは類似していないということも述べておくべきであろう。それらの構造はＲｚ４のそれに類似している（コンピュータによって予測された構造はここには示していない）。
【００５３】
Ｒｚ４または RossiのｔＲＮＡMet-リボザイムのようなものではなくＲｚ１からＲｚ３のようなリボザイムがRanGTPの存在下で（すなわち、輸送受容体とその貨物の間で複合体の形成が予想されるような条件下で）、Exportin(tRNA)と複合体を形成するかどうかを決定することは興味深いであろう（Artsら，1998)。
【００５４】
in vivoにおけるｔＲＮＡVal-リボザイムの活性
SullengerおよびCech (1993) ならびにRossiのグループ(Bertrandら，1997)は、リボザイムのその標的の細胞内共局在の重要性を明確に示した。１つの特定の発現カセットの場合、リボザイムとその標的ＲＮＡの両方が核内に見いだされ、そしてリボザイムによる標的の特異的切断が検出された(Bertrandら，1994)。したがって、決定的なパラメーターはリボザイム自体の局在ではなく、むしろ標的と共局在するリボザイムの能力である(Bertrandら，1997)。ｍＲＮＡの細胞内プロセシングおよび輸送には種々のタンパク質性因子が関与しているので、そしてそのような因子は転写直後にｍＲＮＡと迅速に結合しうるので、このような因子は核内におけるリボザイムの標的ＲＮＡとの結合を阻害しうるであろう。また細胞質中においても、ポリソームがリボザイムの標的ＲＮＡとの結合を阻害するかもしれない。さらに、核ｔＲＮＡMet-リボザイムは、もとは核内で産生された細胞質ｍＲＮＡを不活性化しなかったので(Bertrandら，1997)、核から細胞質へのｍＲＮＡの輸送は核ｔＲＮＡMet-リボザイムによる攻撃よりもはるかに迅速であるように思われる。in vivoにおけるリボザイムの活性を決定する最も重要な因子の１つは、リボザイムとその標的との会合であると思われる。リボザイムの相当多くの部分が輸送中および標的部位への接近中に分解されるに違いない。このため、リボザイムとその標的が共局在していても、それだけではリボザイムのin vivoにおける効果を保証しない。
【００５５】
in vivoにおいて最も安定であったリボザイムＲｚ２（図３Ｂ、３Ｃ、６Ａおよび６Ｂ）は、in vitroにおいてより高い切断活性を示したＲｚ３（図２）よりも細胞内環境においてより効果的であった（図４）。活性におけるこの差はHIV-1チャレンジにおいて拡大された（図６Ｃ）。より安定なＲｚ２を産生する細胞はHIV-1の感染に対してほぼ完全に耐性であったが、安定性のより低いＲｚ３を産生する他の細胞はHIV-1の感染に対して対照細胞と同程度に感受性であった。Ｒｚ２の半減期はＲｚ３のそれの約２倍であったが、どの構造的特徴がＲｚ２をRNaseに対してより耐性にしているのか、現在のところ不明である。Ｒｚ２に較べて、Ｒｚ３のリンカー内には６個多いヌクレオチドが含まれていた。このことが高次構造に影響を及ぼしたに相違ない。
【００５６】
天然のｔＲＮＡ分子の半減期は50〜60時間であるが(SmithおよびWeinberg, 1981)、Ｒｚ２の半減期は約100分に過ぎなかった。ｔＲＮＡ-リボザイムの半減期を伸ばすことができるならば、より高い抑制効果が期待できるであろう。我々は転写物のin vivoにおける相対的安定性をいまだに予測できないのであるが、図１に示すような二次構造を組み込むことによって細胞質に輸送されうるリボザイムを設計することは可能である。転写物の安定性を正確に予測することができないので、我々は通常数個の構築体を試験する。そして、今日までに試験した種々の遺伝子の場合、我々は興味のある遺伝子の発現を＞95% の効率で不活性化できるカセットを常に得ることができた(Kawasakiら，1996, 1998）。
【００５７】
ｔＲＮＡVal-ベクターは、標的分子が細胞質中に局在するリボザイム以外の機能性ＲＮＡの発現に有用でありうる。我々の掌中で、ｔＲＮＡVal-リボザイムは少なくとも培養細胞中では一貫して高い活性を有する。したがって適切に設計されたｔＲＮＡVal-リボザイムは、分子生物学における道具として、また医学分野においても役に立つ道具として有用である。
【００５８】
産業上の利用の可能性
本発明により、新規なリボザイムおよびその発現系が提供された。本発明のリボザイムはin vivo で安定性が高く、それにより高い活性を呈する。
【００５９】
（参考文献）
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【００７７】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として明細書にとり入れるものとする。
【００７８】
【配列表フリーテキスト】
配列番号１の配列はＲｚ２の塩基配列である。
配列番号２の配列はＲｚ３の塩基配列である。
配列番号３の配列はＲｚ１の塩基配列である。
配列番号４の配列はヒト胎盤ｔＲＮＡVal の転写物の塩基配列である。
配列番号５の配列はＲｚ４の塩基配列である。
配列番号６の配列はセンスオリゴヌクレオチドリンカーの塩基配列である。
配列番号７の配列はアンチセンスオリゴヌクレオチドリンカーの塩基配列である。
配列番号８の配列はセンスオリゴヌクレオチドリンカーの塩基配列である。
配列番号９の配列はアンチセンスオリゴヌクレオチドリンカーの塩基配列である。
配列番号１０の配列はアッパープライマーの塩基配列である。
配列番号１１の配列はＲｚ１とターミネーターの配列を含むロアープライマーの塩基配列である。
配列番号１２の配列はＲｚ２とターミネーターの配列を含むロアープライマーの塩基配列である。
配列番号１３の配列はＲｚ３とターミネーターの配列を含むロアープライマーの塩基配列である。
配列番号１４の配列は参照ＲＮＡに特異的なプローブの塩基配列である。
配列番号１５の配列はリボザイムに特異的なプローブの塩基配列である。
配列番号１６の配列はβ−アクチン用のプライマーの塩基配列である。
配列番号１７の配列はリボザイム用のプライマーの塩基配列である。
配列番号１８の配列はアッパーオリゴヌクレオチドプライマーの塩基配列である。
配列番号１９の配列はロアーオリゴヌクレオチドプライマーの塩基配列である。配列番号２０の配列はアッパーオリゴヌクレオチドプライマーの塩基配列である。
配列番号２１の配列はロアーオリゴヌクレオチドプライマーの塩基配列である。配列番号２２の配列はリボザイムに特異的なプローブの塩基配列である。
配列番号２３の配列はβ−アクチンに特異的なプローブの塩基配列である。
【００７９】
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> Director-General of Agency of Industrial Scienceand Technology
<120> Expression Systems for Transcription of Functional NucleicAcids
<130> 117F0059
<140>
<141>
<160> 23
<170> PatentInVer. 2.0
<210> 1
<211> 135
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:the nucleotide sequenceof Rz2
<400> 1
accguugguu uccguagugu agugguuauc acguucgccu aacacgcgaa agguccccgg 60
uucgaaaccg ggcacuacaa acacaacacu gaugaggacc gaaagguccg aaacgggcac 120
gucggaaacg guuuu                                                  135
<210> 2
<211> 141
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:the nucleotide sequenceof Rz3
<400> 2
accguugguu uccguagugu agugguuauc acguucgccu aacacgcgaa agguccccgg 60
uucgaaaccg ggcacuacaa accaacacac aacacugaug aggaccgaaa gguccgaaac 120
gggcacgucg gaaacgguuu u                                           141
<210> 3
<211> 128
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:the nucleotide sequenceof Rz1
<400> 3
accguugguu uccguagugu agugguuauc acguucgccu aacacgcgaa agguccccgg 60
uucgaaaccg ggcacccaca caacacugau gaguccguga ggacgaaacg ggcaccucga 120
gcgcuuuu                                                          128
<210> 4
<211> 95
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:the nucleotide sequence
of the transcript of human placentaltRNAVal
<400> 4
accguugguu uccguagugu agugguuauc acguucgccu aacacgcgaa agguccccgg 60
uucgaaaccg ggcggaaaca aagacagucg cuuuu                            95
<210> 5
<211> 149
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:the nucleotide sequenceof Rz4
<400> 5
accguugguu uccguagugu agugguuauc acguucgccu aacacgcgaa aggucccccg 60
uucgaaaccg ggcacccggg uggcugucac cggaagugcu uuccggucuc augaguccgu 120
gagggcgaaa cagccacucg agcgcuuuu                                   149
<210> 6
<211> 110
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:the sequence of a sense
oligonucleotide linker
<400> 6
aattcaggac tagtctttta ggtcaaaaag aagaagcttt gtaaccgttg gtttccgtag 60
tgtagtggtt atcacgttcg cctaacacgc gaaaggtccc cggttcgaag            110
<210> 7
<211> 113
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:the sequence of an antisense
oligonucleotide linker
<400> 7
tcgacttcga accggggacc tttcgcgtgt taggcgaacg tgataaccac tacactacgg 60
aaaccaacgg ttacaaagct tcttcttctt tttgacctaa aagactagtc ctg        113
<210> 8
<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:the sequence of a sense
oligonucleotide linker
<400> 8
cgaaaccggg cacccgggga atataacctc gagcgctttt tttctatcgc gtc        53
<210> 9
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:the sequence of an antisense
oligonuclotide linker
<400> 9
tcgacgcgat agaaaaaaag cgctcgaggt tatattcccc gggtgcccgg tttc       54
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:the sequence of an upper primer
<400> 10
cgccagggtt tcccagtcac gac                                         23
<210> 11
<211> 101
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:the sequence of a lower primer
including the sequences of Rz1 and a terminator
<400> 11
ctgcaggtcg acgcgataga aaaaaagcgc tcgaggtgcc cgtttcgtcc tcacggactc 60
atcagtgttg tgtgggtgcc cggtttcgaa ccgggacctt t                     101
<210> 12
<211> 109
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:the sequence of a lower primer
including the sequences of Rz2 and a terminator
<400> 12
ctgcaggtcg acgcgataga aaaaaaccgt ttccgacgtg cccgtttcgg tcctttcggt 60
cctcatcagt gttgtgtttg tagtgcccgg tttcgaaccg gggaccttt             109
<210> 13
<211> 106
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:the sequence of a lower primer
including the sequences of Rz3 and a terminator
<400> 13
ctgcaggtcg acgcgataga aaaaaaccgt ttccgacgtg cccgtttcgg tcctcatcag 60
tgttgtgtgt tggtttgtag tgcccggttt cgaaccgggg accttt                106
<210> 14
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:the sequence of a probe
specific for the referenceRNA
<400> 14
aaatcgctat aaaaagcgct cgaggttatg ctccccgggt                       40
<210> 15
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:the sequence of a probe
specific for the ribozyme
<400> 15
ctcatctgtg ttgtgt                                                 16
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:the sequence of a primer
for b-actin
<400> 16
gtggccatct cttgctcgaa                                             20
<210> 17
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:the sequence of a primer
for the ribozyme
<400> 17
gacctttcgg tcctcatc                                               18
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:the sequence of an upper
oilgonucleotide primer
<400> 18
gactacctca tgaagatcct                                             20
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:the sequence of a lower
oligonucleotide primer
<400> 19
gtggccatct cttgctcgaa                                             20
<210> 20
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:the sequence of an upper
oligonucleotide primer
<400> 20
gttatcacgt tcgcctaa                                               18
<210> 21
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:the sequence of a lower
oligonucleotide primer
<400> 21
gacctttcgg tcctcatc                                               18
<210> 22
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:the sequence of a probe
specific for the ribozyme
<400> 22
acgcgaaagg tccccggt                                               18
<210> 23
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:the sequence of a probe
specific for b-actin
<400> 23
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【図面の簡単な説明】
図１は、コンピュータフォールディングによって予測されたｔＲＮＡＶａｌ−リボザイムの二次構造を示す。ハンマーヘッド型リボザイムの配列（太い大文字）を種々のリンカー配列を介してｔＲＮＡＶａｌ配列（大文字）の下流に連結した。７塩基欠失ｔＲＮＡＶａｌの内部プロモーターに対応する配列、すなわちＡおよびＢボックスは影を付けて囲って示してある。図Ａ〜Ｄは、それぞれｔＲＮＡＶａｌ−リボザイム１（Ｒｚ１）、２（Ｒｚ２）、３（Ｒｚ３）および４（Ｒｚ４）の二次構造を示す。リボザイムの認識アームを下線をつけて示す。図Ｅはヒト胎盤ｔＲＮＡＶａｌの転写物の二次構造を示す。ｔＲＮＡは３つの部位（矢じりのマーク）でプロセシングされ、成熟ｔＲＮＡＶａｌ（大文字）を生じる。
図２は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるｔＲＮＡＶａｌ−リボザイムによって媒介される切断を示す。パネルＡは基質ＲＮＡを図式的に表す。（基質ＲＮＡはｐＮＬ４３２のヌクレオチド第５００〜７１１、すなわちＨＩＶ−１  ＲＮＡのＵ５領域に対応する。）この基質ＲＮＡはｔＲＮＡＶａｌ−リボザイムによって２個の断片に切断された（５’切断産物：７０量体；３’切断産物：１５６量体）。パネルＢは切断反応の結果を示すオートラジオグラムである。レーン：Ｍ−マーカー；ベクター−リボザイムをもたないｔＲＮＡＶａｌベクター単独；Ｒｚ１−リボザイム１；Ｒｚ２−リボザイム２；およびＲｚ３−リボザイム３。
図３は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるｔＲＮＡＶａｌ−リボザイムの安定性を示す。パネルＡは、参照遺伝子の使用によりトランスフェクション効率の標準化を可能としたｐＵＣ−Ｒｒを図式的に表す。参照遺伝子はリボザイム発現カセットの下流で発現された。２つの発現カセットにおいて、プロモーターおよびターミネーターの配列はそれぞれ同一であった。パネルＢはｔＲＮＡＶａｌ−リボザイムの発現の定常レベルを示す。図はリボザイムに特異的なプローブ（上）および参照遺伝子に特異的なプローブ（下）を用いたノーザンブロット分析を示す。図Ｃは、安定にリボザイムを導入した細胞におけるｔＲＮＡＶａｌ−リボザイムの半減期を示す。図中、○はｔＲＮＡＶａｌ−リボザイム１（Ｒｚ１）の相対量を示す。□および◇は、それぞれｔＲＮＡＶａｌ−リボザイム２（Ｒｚ２）および３（Ｒｚ３）の相対量を示す。横棒は３回のアッセイによる結果のＳ．Ｅ．を示す。
図４は、ＨｅＬａ細胞におけるＵ５  ＬＴＲ−ルシフェラーゼ融合遺伝子の産生抑制。パネルＡ。ＨｅＬａ細胞における一過性発現。標的発現プラスミドおよびリボザイムをコードするｐＵＣｄｔ−Ｒｚの両方を用いてＨｅＬａ細胞を同時トランスフェクションした。パネルＢ。安定にリボザイムを導入した細胞における一過性発現。各構築物につき、挿入遺伝子（ｔＲＮＡＶａｌまたはｔＲＮＡＶａｌ−リボザイム）の転写物のレベルが類似している２つの独立したクローンを選択した。リボザイム産生ＨｅＬａ細胞のトランスフェクションには、標的発現プラスミドのみを用いた。横棒は５回のアッセイによる結果のＳ．Ｅ．を示す。
図５は、ＨＩＶベクターの図式的表示である。各ｔＲＮＡＶａｌ−リボザイムのための発現カセットを、ＨＩＶ−１由来ベクター（Ａ）のＴＫ−ｎｅｏｒのすぐ上流に位置するＳａｌＩ部位に挿入し、ｔＲＮＡＶａｌ−リボザイムをコードするレトロウイルスベクターＨＩＶＲｉｂｏ．Ｎ（Ｂ）を得た。Ψはパッケージングシグナルを示す。
図６は、安定にリボザイムを導入したＨ９細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞）におけるｔＲＮＡＶａｌ−リボザイム発現の定量化、および上記導入細胞におけるｐ２４産生の抑制を示す。パネルＡ。リボザイム導入Ｈ９細胞の２個の独立したクローン由来のＲＴ−ＰＣＲ増幅リボザイムのサザンブロット分析の結果（図Ｂに示す）の定量化。１３、１５および１７サイクル後のＰＣＲ産物を、３２Ｐ標識オリゴヌクレオチドプローブを用いてサザンブロッティングにより分析した。図中、四角および丸はそれぞれリボザイム２（Ｒｚ２）およびリボザイム３（Ｒｚ３）を導入した細胞を用いた結果を示す。パネルＢ。サザンブロッティングの結果。パネルＣ。ＨＩＶ−１  ＮＬ４３２を感染させた後、細胞を１１日間培養した。３、７および１１日目に各培養物から少量の上清を調製した。ＨＩＶ−１抗原捕獲ＥＬＩＳＡによりｐ２４抗原のレベルを測定した。図中、三角はｔＲＮＡＶａｌ−リボザイム１（Ｒｚ１）の結果を示す。四角および丸はそれぞれリボザイム２（Ｒｚ２）およびリボザイム３（Ｒｚ３）の結果を示す。三角は対照細胞を用いた場合の結果を示す。
図７は、ｔＲＮＡＶａｌ−リボザイムの細胞内局在を示す。各細胞内画分由来のＲＮＡを用いてノーザンブロット分析を実施した。リボザイム遺伝子を安定に導入した細胞（図４Ｂに結果を示す実験に用いたｔＲＮＡＶａｌ−リボザイム産生ＨｅＬａ細胞）から核ＲＮＡおよび細胞質ＲＮＡを別々に調製した。パネルＡおよびＣは、ｔＲＮＡＶａｌ−リボザイムに特異的な３２Ｐ標識プローブを用いて得た結果を示す。ＢおよびＤは対照を示す。天然のＵ６遺伝子の転写物に特異的なプローブを用いて、細胞質画分の汚染を調べた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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