(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト神経栄養因子３（ＮＴ−３）からなる骨代謝疾患の予防、治療剤
【請求項２】
ヒト神経栄養因子３（ＮＴ−３）からなる骨折の予防、治療剤
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、ヒト神経栄養因子３からなる骨代謝疾患の予防および治療剤に関する。さらに詳しくは、本発明は上記ヒト神経栄養因子３を新規な骨芽細胞増殖因子として利用することにより骨形成に関わる疾患、特に骨折の予防および治療剤に関する。
【０００２】
【発明の背景】
骨は局所で骨吸収と骨形成を繰り返し、古い骨を新しい骨に置換することで内骨格としての支持機能を維持し、また種々のメカニカルストレスやミネラルバランスの変化に対し、迅速に反応する準備を整えている。この骨再造形は破骨細胞等の骨吸収系細胞、骨芽細胞等の骨形成系細胞が主体となり、両者のカップリングに基づいて遂行される。近年、骨芽細胞の機能は、単に骨形成に止まらず、破骨細胞の分化・活性化に密接に関連し、細胞連鎖的な骨改造現象におけるコントロールセンターとしてその役割を果している可能性が強いことが判明してきている（Ｉｎｏｕｅ，Ｔ．，Ｍｅｂｉｏ（１９９０），Ｓｐｅｃｉａｌ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ｐ．２〜７）。
【０００３】
骨代謝疾患と総称される疾患の中には，骨粗鬆症（Ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ）、ページェット病（Ｐａｇｅｔ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、骨軟化症、過骨形成症、大理石病等が含まれ、このうち、特に骨粗鬆症は発生頻度が閉経後の女性および老齢人口の約半分を越える程に高く、その診断と有効な治療法が強く望まれている。
【０００４】
骨代謝疾患とは、何らかの骨組織における、細胞レベルでの、骨に特異的な代謝の変調を伴うものであり、骨の代謝に特異的に関与する因子の発見、分離そして同定は、この代謝の異常を明らかにするのに非常に有効である。本発明者等は、これらの骨の代謝に特異的な因子の発見のために鋭意研究し、ついに、本発明を完成させるに至ったものである。
より詳しくは、本発明者等は、特に、骨形成において主要な働きをする骨芽細胞の細胞株を用い、この細胞株により生成されるタンパク質を同定したものである。
【０００５】
【従来の技術】
本発明で提供されるヒト神経栄養因子−３（ヒトニューロトロフィン３、以下ＮＴ−３と称する。）はＨｏｈｎ，Ａ．等およびＭａｉｓｏｎｐｉｅｒｒｅ，Ｐ．Ｃ．等によって発見された（Ｈｏｈｎ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．３４４，ｐ．３３９−３４１，１９９０およびＭａｉｓｏｎｐｉｅｒｒｅ，Ｐ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｖｏｌ．２４７，ｐ．１４４６−１４５１，１９９０）タンパク質であり、これは神経成長を促進する作用を有する。ＮＴ−３は、Ｎ末端にＴｙｒをＣ末端にＴｈｒを有する１１９個のアミノ酸のサブユニットのダイマーからなるタンパク質であり、そのアミノ酸配列は先の文献に示されている。またＮＴ−３はペプロテック（株）（Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ，ＮＨ  ０８５３３，ＵＳＡ）より市販されている（カタログ番号４５０−０３）。先に挙げた文献にはＮＴ−３をコードする遺伝子が記載されており、この記載に基づいて、ＮＴ−３を製造することができる。ＮＴ−３が属する神経成長因子ファミリーは現在、４種類が知られており、ＮＴ−３の他に、神経成長因子（以下ＮＧＦと呼ぶ）、脳由来神経栄養因子（以下ＢＤＮＦと呼ぶ）、および、ヒト神経栄養因子−４（ヒトニューロトロフィン４）がある。これらの機能としては、ＢＤＮＦは海馬の培養系において、アセチルコリンエステラーゼ陽性のニューロン数を増やすこと、およびＮＴ−３はカルシウム結合蛋白（カルビニン）陽性のニューロン数を増やすこと等が知られている（Ｉｐ，Ｎ．Ｙ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ｖｏｌ．１３，ｐ．３３９４−３４０５，１９９３）。さらに、ＮＴ−３は神経堤の前駆細胞の増殖を増加することが報告されている（Ｋａｌｃｈｅｉｍ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，ｖｏｌ．８９，ｐ．１６６１−１６６５，１９９２）。
【０００６】
一方、神経成長因子の受容体（レセプター）はｔｒｋファミリーであり、これまでｔｒｋＡ、ｔｒｋＢ、ｔｒｋＣの３種類が知られている（Ｓｎｉｄｅｒ，Ｗ．Ｄ．Ｃｅｌｌ．ｖｏｌ．７７，ｐ．６２７−６３８，１９９４）。それぞれＮＧＦはｔｒｋＡに結合し、ＢＤＮＦはｔｒｋＢに結合し、ＮＴ−３はｔｒｋＣに特異的に結合することが知られている。ｔｒｋは結腸癌由来のプロトオンコジーンであり、Ｃ末端側半分のチロシンキナーゼドメインを含む、チロシンキナーゼ型受容体構造を有する。また、このチロシンキナーゼドメインのアミノ酸配列は他のレセプタータイプのチロシンキナーゼと相同性が高い。このチロシンキナーゼの活性としては、例えば、ＮＧＦの受容体であるｔｒｋＡはＮＧＦに応答してチロシンリン酸化を受け、それ自身チロシンキナーゼ活性を示す。このチロシンキナーゼによって、ＭＡＰ２（ｍｉｃｒｏｔｕｂｌｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２，Ｂｏｕｌｔｏｎ，Ｔ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  ｖｏｌ．６５，ｐ．６６３−６７５，１９９１）やホスファリパーゼＣがチロシンリン酸化を受け、その結果カルシウムイオンの流入がおきる。このようなシグナル伝達系によって細胞の増殖シグナルが伝わる（池内俊彦ら、実験医学ｖｏｌ．１０，ｐ．１２６−１３１，１９９２）。このようにｔｒｋＣのようなチロシンキナーゼ型レセプターはリガンドが結合することによりチロシンキナーゼが活性化されシグナル伝達が開始される。リガンドとレセプターの結合によって活性化されるＣａ２＋チャネルはレセプター作動性Ｃａ２＋チャネルと呼ばれており、リンパ球、平滑筋などの種々の細胞で調べられている（久野みゆき、実験医学、ｖｏｌ．７，ｐ．７３−７８，１９８９）。
【０００７】
従来、マウス骨芽細胞様細胞株ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１がＮＴ−３のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を発現していること、また、そのｍＲＮＡの量はＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞をＴＧＦ−βで処理することにより優位に増強することが知られていた（中西徹ら，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．Ｖｏｌ．１９８，ｐ．８９１−８９７，１９９４）。ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞は、小玉博明ら（Ｊｐｎ．Ｊ．Ｏｒａｌ  Ｂｉｏｌ．Ｖｏｌ．２３，ｐ．８９９−９０１，１９８１）が確立した細胞株で、マウスの新生頭蓋冠から樹立された石灰化能をもつ細胞株である。しかし、未だＮＴ−３が骨芽細胞増殖因子として働くことは知られていなかった。
【０００８】
【問題を解決するための手段】
本発明者は、ＰＣＲ（ポリメラーゼチェインリアクション）法（ＰＣＲ  Ｔｅｃｈ−ｎｏｌｏｇｙ，Ｈｅｎｒｙ  Ａ．Ｅｒｌｉｃｈ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ社，１９８９）によりＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞がｔｒｋＣを発現していることを新たに発見した。これらの発見およびｔｒｋＣがＮＴ−３の受容体であることに基づいて、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞はＮＴ−３を分泌し、ＮＴ−３はオートクリンで増殖すると結論付けた。更に、本発明者は、ＮＴ−３をＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞の培養液中に加えると、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を増殖させることおよびＮＴ−３をＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞の培養液中に加えると、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞によるカルシウムの取り込みを増加させることを確認し、ＮＴ−３が骨芽細胞増殖因子として働くと結論付けた。
【０００９】
ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞の細胞増殖は、セルプロリフェレーションアッセイキット（アマーシャム社，ＲＰＮ２０とＲＰＮ２１０）で検出した。ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を細胞密度  ０５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌで細胞培養用ディッシュまたは９６ウエルプレートに蒔き、４日間培養後、種々の濃度（０．２〜１００ｎｇ／ｍｌ）のＮＴ−３（ペプロテック（株），Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ，ＮＨ  ０８５５３，ＵＳＡ，カタログ番号４５０−０３）を培養系に加えた。添加した翌日、アマーシャム社のアッセイキットを用い細胞増殖を調べた。その結果、ＮＴ−３がＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞の増殖を促すことが明らかになった。さらにカルシウム感受性蛍光試薬を使った蛍光強度の測定（Ｇｒｙｎｋｉｅｗｉｃｚ，Ｇ．ｅｔａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．ｖｏｌ．２６０，ｐ．３４４０−３４５０．１９８５）によって、ＮＴ−３がＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞のカルシウムを取り込みを促進することが検出された。
即ち、これらの結果からＮＴ−３がｔｒｋＣと結合し、オートクリンのメカニズムでＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を増殖させていることが明らかになった。
【００１０】
このように、ＮＴ−３が骨芽細胞増殖因子として作用することを本発明者らは見出し、そして骨芽細胞増殖因子が骨代謝に重要な因子であることから、本発明はＮＴ−３からなる骨代謝疾患の予防治療剤、特に骨折の子防治療剤を提供するものである。
本発明の医薬の投与方法としては、種々の方法を用いることができるが、静脈内及び筋肉内投与が好ましい。静脈内投与の場合は通常の静脈内注射の他、点滴静注により投与することもできる。
本発明の医薬の剤型としては、種々の形態のものを使用することができるが、液剤として使用ことが好ましい。注射用製剤としては、例えば注射用粉末製剤とすることができる。その場合は、適当な水溶性賦形剤、例えばマンニトール、ショ糖、乳糖、マルトース、ブドウ糖、フルクトース糖の１種又は２種以上を加えて水で溶解し、バイアル又はアンプルに分注した後、凍結乾燥し、密封して製剤とすることができる。
本発明の医薬の投与量としては、投与法、患者の年齢、体重、症状等によって異なるが、通常は成人１日当たり本ペプチド誘導体として１〜５００ｍｇの範囲が好ましい。
以下に実施例により、本発明を詳述する。なお、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【００１１】
【実施例】
実施例１  ｔｒｋＣの検出
ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を０．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌの細胞密度でシャーレに蒔き、培養を開始した。培養を初めて２、６、１０、１３、１５、２８日後の細胞を回収し、その細胞から常法に従いＲＮＡを抽出した。
抽出したＲＮＡ  ０．２μｇを用い、ｏｌｉｇｏ  ｄ（Ｔ）存在下リバーストランスクリプターゼ（パーキンエルマー社の測定キット／宝酒造社）で処理し、一本鎖ｃＤＮＡを合成した。一本鎖ｃＤＮＡは０．５μＭのｔｒｋｆ（配列表配列番号１、アプライドバイオシステムズ社の機械を用いて合成以下同様）とｔｒｋｒ（配列表配列番号２）のＰＣＲプライマーを用い、通常の条件でアステックＰＣ８００（（株）アステック）を使用しＤＮＡを増幅し、その増幅した溶液を５０倍に希釈し、更にｔｒｋｆとｔｒｋｒ２（配列表配列番号３）で増幅した。このサンプルをアガロースゲル電気泳動にアプライし、３６２ｂｐのＤＮＡフラグメントがｔｒｋＣのバンドとして検出された（図１参照）。
このバンドをゲルから切り出し、フィルターキット（Ｔａｋａｒａ  Ｓｕｐｔｅｃ  ０１および０２、宝酒造社）を用いてＤＮＡを抽出した。次に、ファルマシアシュアークローンキットを使用しＤＮＡ断片を平滑化、リン酸化を行い、脱リン酸化したｐＵＣ１８ベクター（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｙ  Ｐｒｅｓｓ社，１９８９）へ挿入した。このプラスミドを大腸菌ＪＭ１０９株へ形質導入し、コロニーを単離培養後ファルマシアフレキシプレップキットを使用しプラスミドを抽出した。このプラスミドを用いＤＮＡ塩基配列をジデオキシ法（Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．７４，ｐ．５４６３−５４８７，１９７７）により決定した。今回決定されたマウスのｔｒｋＣの断片（配列表配列番号４）と現在知られているラットおよびブタのｔｒｋＣの断片（Ｍｅｒｌｉｏ，Ｊ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，ｖｏｌ．５１，ｐ．５１３−５３２，１９９２およびＬａｍｂａｌｌｅ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，ｖｏｌ．６６，ｐ．９６７−９７９，１９９１）との相異性を比較するとそれぞれ、異なる核酸塩基は１９と２９、アミノ酸残基は１と０であった。
【００１２】
実施例２  ＮＴ−３によるＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞の増殖活性
ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞の細胞増殖は、セルプロリフェレーションアッセイキット（アマーシャム社，ＲＰＮ２０とＲＰＮ２１０）で検出した。ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を細胞密度  ０．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌで細胞培養用ディッシュまたは９６ウエルプレートに蒔き、４日間培養後、種々の濃度（０．２〜１００ｎｇ／ｍｌ）のＮＴ−３（ペプロテック（株），Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ，ＮＨ  ０８５５３，ＵＳＡ，カタログ番号  ４５０−０３）を培養系に加えた。添加した翌日、アマーシャム社のアッセイキットを用い細胞増殖を調べた。このキットでは、ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）が細胞内のＤＮＡに取り込まれ、ＢｒｄＵをマウス抗−ＢｒｄＵ抗体で結合し、２次抗体をパーオキシダーゼを結合した抗マウス抗体を用い、パーオキシダーゼ活性で検出するものである。この結果を表１に示す。値は濃度０μｇ／ｍｌを１．０と表わしたときの相対比活性である。
【００１３】
【表１】
0003738281.tif 000002
【００１４】
実施例３  カルシウム取り込みアッセイ
直径３５ｍｍディッシュにＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を７．５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌで１．５ｍｌ蒔き、種々の濃度のＮＴ−３を含む５％ウシ胎児血清／ａ−ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ社製）の培地で１日間培養した。培養後、ＰＢＳで２回洗浄後ＨＥＰＥＳ緩衝液（１３２ｍＭ  ＮａＣｌ，３５ｍＭ  ＫＣｌ，０．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１ｍＭ  ＣａＣｌ２，９．５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，５ｍＭ  Ｇｌｕｃｏｓｅ，Ｐｈ７．４）に溶かした５ｍＭ  Ｆｕｒａ−２ＡＭ（Ｄｏｊｉｎ社製）を室温で３０分処理した。細胞を洗浄後、３４０ｎｍ／３８０ｎｍの吸光度比を測定し、０．０５ｎｇ／ｍｌのＮＴ−３での処理を１とした時の相対比で表わした。この結果を表２に示す。
【００１５】
【表２】
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【００１６】
ＮＴ−３を培養系に加えることにより、カルシウムの取り込みが起きることが判明した。これは、受容体であるｔｒｋＣを介したシグナルがＣａ２＋チャネルを活性化してカルシウムイオンの流入をもたらしたと考えられる。
【００１７】
【発明の効果】
本発明によって提供されるＮＴ−３は、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞の増殖を促し、かつカルシウム取り込みを増加するので、骨代謝性疾患の予防治療剤、特に骨形成に関わる骨折の予防治療剤として有用である。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  ｔｒｋＣの電気泳動パターンの図である。
【図１】
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