(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉ：
【化１】
0003836873.tif 000013
｛式中、ＲおよびＲ1各々は、C1−C4の置換もしくは未置換アルキルである（ここでアルキル基はハロゲン、硫黄又はニトリルで置換されることができる）か、又は式Ｉの化合物の不斉中心と一緒になってＲとＲ1はC3−C6の置換もしくは未置換環状環構造を形成し（ここで、環構造は、C1−C6アルキル、ハロゲン又はアリールで置換されていてもよい）；但し、Ｒ又はＲ1は少なくとも炭素原子１個だけ他方よりも長く、または相当結合長さである；
ｎは０であり；
Ｒ2はＯ又はCH2であり；そして
Ｒ3はＨ、NHR4（ここで、Ｒ4はＨ、アルキル又はアミノ酸である）、１〜６個の炭素原子を有するアルキル又は１〜６個の炭素原子を有する置換アルキル（ここで、置換基はハロゲン及びCNから成る群から選ばれる）であり、
ＲとＲ1が、式Ｉの化合物の不斉中心と一緒になって３員の置換環状環構造を形成する。｝
で表わされる式Iの化合物の１個又はそれ以上の鏡像体の酵素的分割方法であって、上記分割に好適な条件下、上記プロピオン酸誘導体を、エステルヒドロラーゼ又はプロテアーゼと、反応させて、実質的に純粋なそのＲ又はＳ鏡像体を選択的に分割することを含む、前記方法。
【請求項２】
前記３員の環構造がハロゲンで置換されている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｒ2がＯである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
Ｒ3が１〜６個の炭素原子を有するアルキル又は１〜６個の炭素原子を有するハロゲン化アルキルである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ＲとＲ1が、一緒になって、ジクロロ置換３員環状環を形成し；Ｒ2＝０であり；かつｎは０である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記プロピオン酸誘導体が、（±）エチル・シプロフィブラート（ethyl ciprofibrate）である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
（±）エチル・シプロフィブラートを適当なエステルヒドロラーゼと接触させて、約40％ee超の光学純度を有するシプロフィブラートのＲ（＋）遊離酸を取得することを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記エステルヒドラーゼが、コレステロール・エステラーゼ又はリパーゼである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
コレステロール・エステラーゼが微生物起源から由来し、かつ前記リパーゼが、カンジダ（Candida）菌から由来する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記リパーゼが、カンジダ・シリンドラセア（Candida cylindracea）に由来する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
（±）エチル・シプロフィブラートを適当なプロテアーゼと接触させて、約40％eeの光学純度を有するシプロフィブラートのＳ（−）遊離酸を取得することを含む、請求項６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、置換２−メチル−プロピオン酸誘導体、特にフィブラート（fibrate）関連化合物の酵素的加水分解に関する。更に詳しくは、本発明は選択された酵素およびそのエナンチオ選択性に応じ、（±）−エチル  シプロフィブラートのＳ（−）又はＲ（＋）鏡像体のいずれかを選択的に生成する一定の酵素的分割に関する。
発明の背景
フィブラート関連化合物は、フィブラート構造全体の一部としてα−メチルプロピオン酸を共有する一群の化合物である。フィブラート関連化合物は、脂質および／又はコレステロール還元剤として公知でありそして例えばゲムフィブロジル（gemfibrozil）（Lopid、パーク−ディビスから商業的に入手可能、米国特許第3,674,836号および第4,126,627号）、ナフェノピン（nafenopin）（これは、同様の目的のためチバ−ガイギーにより研究された）、およびシプロフィブラート（ciprofibrate）（スターリング  ウィントロップ社から入手可能なシプロール（ciprol）又はリパノール（Lipanor）、米国特許第3,948,973号）を含む。これらの化合物の構造は下記に示される：
0003836873.tif 000002
化合物シプロフィブラート（α−２−メチルプロピオン酸）は、スターリング  ウィントロップ社より脂質減少剤として近年開発された。化合物は、（±）−ラセミ化合物として製造される。活性な鏡像体はＲ（＋）酸であることが知られている。化合物はラセミ混合物であるので、望ましいＲ（＋）−鏡像体に対する商業上のスケールアップ収率は低く、加えて不活性Ｓ（−）化合物は未所望の副作用に関連するかもしれない。従って、現在製造されているラセミ混合物と比較して１種又はそれ以上の鏡像体の選択的製造に対する原価高率の高い収率プロセスを有することが望ましい。遊離酸のＳ（−）又はＲ（＋）鏡像体のいずれかを選択的に製造するための酵素的分割方法に対する要求が存在する。
発明の要約
置換２−メチル−プロピオン酸誘導体のラセミ混合物のＳ又はＲ鏡像体のいずれかの選択的分割の方法が提供され、この方法は出発化合物の実質的に純粋な鏡像体を生成するため好適な条件下プロピオン酸誘導体を適当な酵素と反応させ、次いで所望により鏡像体を活性形に変換することを含んでなる。本発明の態様において、プロピオン酸は次式：
0003836873.tif 000003
｛式中、個々に定義されるＲおよびＲ1は、C1−C4の置換もしくは未置換アルキルである（ここでアルキル基はハロゲン、硫黄又はニトリルで置換されることができる）か、又は式Ｉのプロピオン酸誘導体の不斉中心を一緒に有するＲおよびＲ1は置換もしくは未置換の３−６の炭素員環構造を形成し（ここで、環構造は、C1−C6アルキル、ハロゲン又はアリールで置換されることができる）；但し、Ｒ又はＲ1のいずれかは少なくとも１個の炭素原子又は相当結合長さだけ大きさが異なる；
ｎは０ないし６であり；
Ｒ2はＯ又はCH2であり、但しＲ2は（CH2）n鎖のいずれの側上に存在することができ；そして
Ｒ3は加水分解に委ねられる全ての基であることができ、例えば、Ｈ，NHR4（ここで、Ｒ4はＨ、アルキル又はアミノ酸である）、１〜６個の炭素原子を有するアルキル又は１〜６個の炭素原子を有する置換アルキル（ここで、置換基はハロゲンおよびCNであることができる）である｝
を有する。
好ましくは、本発明によって選択的に分解されるべきプロピオン酸誘導体は、キラル化合物例えばナフェノピン又はシプロフィブラートおよびそれらの誘導体である。
本発明の好ましい態様は、（±）−エチル  シプロフィブラートのＳ（−）又はＲ（＋）鏡像体のいずれの選択的分割を含んでなる。
発明の詳細な記載
活性化合物の分割のための酵素的加水分解反応は、当業者に公知である。しかし、驚くべきことに、本発明者等は以下の内容を見出した；すなわち特異的タイプの酵素および／又は異なるＥ価値を有する酵素を用いた、２−メチル−プロピオン酸誘導体（好ましくはモラル誘導体）の一群の化合物の酵素的分割は、他方よりも一方の鏡像体をより選ぶ。この知見は、驚くべきことに、特にシプロフィブラート（ciprofibrate）に関する；何故なら、加水分解されるべき化合物の側鎖と分子の不斉中心間の距離は、非常に大きい（約８個の炭素原子）からである。最も成功した酵素的分割は、不斉中心が反応中心からわずか１又は２個の原子である化合物について行なわれる。本発明において、加水分解されるべき側鎖と不斉炭素中心間の距離は８個までの炭素原子（又は相当結合長さ）離れることができる。
本発明で用いられる如く、酵素の選択性は、その“Ｅ”値によって言及され、これはChem,C.S.等、J.Am,Chem.Soc.1982 104：7274-7299の方程式によって測定され、そして下記の如く与えられる：
Ｅ＝（Ｋcat／Ｋm）R鏡像体／（Ｋcat／Ｋm）S鏡像体
本発明で用いられる如く、生成化合物の光学純度は、そのee値として言及され、これは次の方程式によって測定される：
0003836873.tif 000004
ここで、ＲおよびＳ鏡像体の濃度はモル濃度単位である。
本発明で用いられる如く、「実質的に純粋な」ＲおよびＳは、各々が実質的に他方がないことを意味する。従って、例えば実質的に純粋なＲ鏡像体は、Ｓ鏡像体で殆ど又は全く汚染されていない。殆ど又は全く汚染されていないときは、一般に約20％未満そして好ましくは約10％未満を意味する。
ＲおよびＳ鏡像体の混合物を含有するラセミ化合物は、従って光学的に純粋でなく、製造の見通しからは疑わしい。薬剤として有用なラセミ化合物は、特にめんどうである；何故なら混合物はより劣った生物学的活性をもたらし（そして従ってより高い用量を必要とする）。ラセス化合物の鏡像体の治療活性は、化合物の鏡像体の一つとのみしばしば関連する（例えば、（±）−シプロフィブラートの治療効果は唯一Ｒ（＋）鏡像体と関連している。同様に未所望の副作用が第二の鏡像体と関連し得ることが推測された。
次の議論は、主に（±）−エチル  シプロフィブラートの分解に関するけれども、次のように理解される。すなわち本発明は全てのフィブラート関連化合物、特に２−メチルプロピオン酸誘導体であるフィブラート関連化合物に適用可能である。
下記の図式１は、pH７でエステルヒドロラーゼを用い、好ましい化合物、（±）−エチル  シプロフィブラートをＲ（＋）およびＳ（−）鏡像体に酵素的分解することを示す。
0003836873.tif 000005
図式１に示すように、（±）化合物の不斉中心は加水分解されるべき側鎖（C2H5）から実際８個の炭素離れている。次のように理解すべきである；すなわち語句“炭素原子”は、相当結合長さを包含しそして不斉中心および加水分解できる側鎖間の距離を定義するために用いられる。従って、不斉中心および問題の側鎖は、互いから７個の炭素および１個の酸素離れているであろう。これは８個の相当結合長さとして言及される；何故なら酸素−炭素および炭素−炭素結合は、長さの点で類似しているからである。
種々の市場向けの製造業者から入手できるエステルヒドロラーゼ、（エステラーゼ、リパーゼ）およびプロテアーゼを、（±）−エチル  シプロフィブラート基質に対するそれらの加水分解活性を測定するため選別した。しかし、一般に以下の内容が見出された；すなわち幾つかのエステルヒドロラーゼ40％ee超の光学純度を有し定収率でＲ（＋）遊離酸に至るエナンチオ選択性を示した。好ましいエステルヒドロラーゼは、微生物起源例えばカンジダ（Candida）およびシュードモナス（Pseudomonas）由来のコレステロールエステラーゼでありそしてリパーゼは微生物起源、特にカンジダ（Candida）由来のものである。
この議論は、医薬活性化合物である、シプロフィブラートのＲ（＋）鏡像体を選択的に単離するための要求に第一に焦点が当てられているけれども、以下のように理解すべきである；すなわちシプロフィブラートの活性Ｒ（＋）鏡像体を製造するための通常の化学的方法を比較すると、最初に酵素的加水分解により鏡像体を分離し次いで引き続き遊離酸を再結晶しＲ（＋）化合物を生成することが有利であろう。プロセスは以下に例示されそして次のように企図される；すなわちラセミエチルエステルのエナンチオ選択酵素分割およびその後の再結晶は、商業製品のスケールアップ製造において改良された収率と増加せしめられた原価効率を導くであろう。また、薬効および毒性研究に対しＳ（−）異性体を製造することは有利であろう。
エステルヒドロラーゼ（エステラーゼ、リパーゼ）は、エチルシプロフィブラートのＲ−鏡像体を選択的に加水分解する（63％）けれども、本発明者等はプロテアーゼが逆エナンチオ選択性を有することを見出した。すなわち、プロテアーゼはＲ（＋）エチルエステル／アミドおよびＳ（−）遊離酸の製造に対し選択的である。直接Ｒ（＋）遊離酸を選択的に得るか又はＲ（＋）エチルエステル／アミドを単離することおよびけん化によりそれを遊離酸に変換することが望ましい。従って、本発明の一つの面に対し、エステラーゼを用いＲ（＋）遊離酸を得るため（±）−エチル  シプロフィブラートの選択的分割が好ましく、好ましくはコレステロールエステラーゼを用いる。本発明の別の面において、プロテアーゼを用いたＳ（−）エチルエステル又はアミドの選択的加水分解が好ましい。残りのＲ（＋）エステル又はアミドは、遊離酸に変換できる。このような変換は当業者に公知の技術、例えばけん化により容易に達成できる。
本発明に有用なプロテアーゼは、あらゆる起源（微生物、哺乳動物等）から由来し得る。しかし、好ましいプロテアーゼは、バシラス（Bacillus）プロテアーゼ（ズブチリシン）である。
また、以下の内容が見出された；すなわち低選択性（約15未満のＥ値）を有する酵素を用いる加水分解において、Ｒ（＋）鏡像体をＳ（−）酸で汚染させる。この場合において、次のように企図される；すなわちキラルアミンで汚染されたＲ（＋）／Ｓ（−）混合物の沈殿は、Ｒ（＋）結晶化に有利であろう。
リパーゼと比較してプロテアーゼの逆エナンチオ選択性のため、所望の鏡像体のいずれか（Ｒ（＋）又はＳ（−））に関し高い光学純度を達成できる。
以下に説明する実施例は、エステル（±）−エチル  シプロフィブラートに関するものに制限されているけれども、類似の結果が例えばナフェノピン（nafenopin）を含む他のフィブラート関連化合物に関し達成できることが意図される。
実験
例１
好適なリパーゼおよびエステラーゼに対するスクリーニング
５mgの（±）−エチル  シプロフィブラートを、30℃で１mlのホスフェート緩衝液（pH7.0）中で50mgの酵素とインキュベートした。６時間後、クロロホルム−メタノールの１−４混合物１mlを加え次いで溶液を２mlの酢酸エチルで抽出し生成物を単離した。有機相を蒸発させ次いでキラルシクロデキストリンカラムを用いHPLAを介して遊離酸に対し分析した。この方法を用い、52個の酵素調製品を選別した。表１は、加水分解活性を示したこれらのエステルヒドロラーゼのみを示す。
0003836873.tif 000006
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表１は、基質に対する加水分解活性を実証する14個のエステルヒドロラーゼを示す。表１に示されるエステルヒドロラーゼの７個（５個のエステラーゼと２個のリパーゼ）は、40％ee超の光学純度を有する遊離酸に至る合理的エナンチオ選択性を示した。全ての場合において、生成した酸は基準試料との相互関係により確認される如く所望の（Ｒ）−（＋）−配置を有していた。
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表２は、例１の方法により選別された14個のリパーゼ調製品を示す。表２に掲げられたリパーゼは、（±）エチル  シプロフィブラートに対する加水分解活性を示さなかった。
例２
29％の光学的に純粋な遊離酸を生成するため表１に示されるコレステロールエステラーゼ等級II（ゲンザイム（Genzyme）より入手可能）を用い、次のスケールアップ実験を行った。3.16ｇ（10mmol）の（±）−エチル  シプロフィブラートを、200mgのコレステロールエステラーゼ（Genzymeから入手可能）の存在下、20mlの0.005Ｍホスフェート緩衝液（pH7.0）中で撹拌した。pH値の重大な降下なしで酵素的加水分解を行うため、反応をpH−スタット条件下で行った。１Ｍの水酸化ナトリウム溶液を、形成したカルボン酸を中和するため反応中自動滴定装置により添加した。変換を直接反映する水酸化ナトリウム溶液の消費を介して反応を開始した。反応は、生成阻害の可能性を示す約27％の変換率を伴って５日後の停止した。水性相を１Ｍ塩酸で酸性化し次いで各々50mlの酢酸エチルで３回抽出した。一緒にした有機相を硫酸ナトリウムで乾燥し次いで溶剤を蒸発させた。粗製混合物をシリカゲルによりカラムクロマトグラフィー（ヘキサン−ジエチルエーテル１−１）により分離した。
収率：710mg（2.46mmol）の（Ｒ）−シプロフィブラチン酸（ciprofibratic acid）、理論値の25％の無色の固体
2.00ｇ（6.30mmol）の（Ｓ）−エチル  シプロフィブラート（ethyl ciprofibrate）、理論値の63％の無色液体
反応の図式を図式２として下記に示すが、この図式はまた例３に記載する追加の工程を示す。
0003836873.tif 000009
例３
（Ｓ）−エチル  シプロフィブラートのけん化
例２からの200mgのＳ（−）−エチルエステルを、室温で12時間10mlの蒸留水および200mgの水酸化ナトリウムと共に撹拌した。溶液を酸性化し次いで酢酸エチルで３回抽出した。有機相を一緒にし、硫酸ナトリウムで乾燥し次いで溶剤を蒸発させた。
収率：160mg（0.55mmol）の（Ｓ）−シプロフィブラチン酸（ciprofibratic acid）、88％の理論値の無色液体は室温で放置すると結晶化する。
例２からのＲ（＋）遊離酸および例３からのＳ（−）遊離酸の２種の得られた酸の分画の光学純度を、キラルHPLC分析を介して測定した。良好に確立された方程式（C.S.Chen,Y.Fujimoto,G.Girdaukas and C.J.Sih,J.Am.Chem.Soc.1982,104：7294-7299；an excellent review is given by C.J.Sin and S.H.Wu,“Resolution via Biocatalysis”in Topics of Stereochemistry,1989,Vol.19,63-125参照）を用い、反応のエナンチオ選択性を計算するためデータを用いた。結果を下記の表３に示す。
0003836873.tif 000010
例４
プロテアーゼのスクリーニング
選択されたプロテアーゼを、（±）−エチル  シプロフィブラートの加水分解に対するそれらの活性に対し選別した。次のスクリーニング法を用いそしてスクリーニングの結果を表４に要約する。
317mg（1.0mmol）の（±）−エチル  シプロフィブラートを、10mlの緩衝液（pH8.0）および100mgの所望のプロテアーゼと撹拌した。１日後、500μｌのサンプルを採取し、２滴の１Ｍ塩酸を添加し次いで水性相を500μｌの酢酸エチルで抽出した。得られた有機相を直接用い、HPLCを用いて加水分解速度を測定した。
0003836873.tif 000011
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表４に示される結果に基づき、幾つかのプロテアーゼ、特にプロテアーゼ899は、この方法に対し良好な候補物であると思われる。
例５
再結晶による光学純度の改善
110mgのＲ−（＋）−シプロフィブラート（74％ee）を、1.6mlのｎ−ヘキサンおよび0.2mlのトルエンから再結晶する。冷却後、混合物を室温に冷却した後、沈殿した酸を濾過により回収する。
収率：60mgの無色の結晶質化合物、85％ee