(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞接着シグナルを現わす最小アミノ酸配列を１分子中に３〜５０個有し、さらにＧＡＧＡＧＳのアミノ酸配列を少なくとも２つ有するポリペプチド（Ａ）と、基材（Ｂ）とからなることを特徴とする創傷被覆材。
【請求項２】
基材（Ｂ）１００重量部に対するポリペプチド（Ａ）の量が０．０００１〜５０重量部である請求項１記載の創傷被覆材。
【請求項３】
細胞接着シグナルを現わす最小アミノ酸配列が、アミノ酸一文字表記で現わされるＲＧＤ配列、ＬＤＶ配列、ＲＥＤＶ配列、ＹＩＧＳＲ配列、ＰＤＳＧＲ配列、ＲＹＶＶＬＰＲ配列、ＬＧＴＩＰＧ配列、ＲＮＩＡＥＩＩＫＤＩ配列、ＩＫＶＡＶ配列、ＬＲＥ配列、ＤＧＥＡ配列及びＨＡＶ配列からなる群から選ばれる１種以上の配列である請求項１又は２記載の創傷被覆材。
【請求項４】
（Ａ）の数平均分子量が、５，０００〜５，０００，０００である請求項１〜３のいずれか記載の創傷被覆材。
【請求項５】
（Ａ）が、遺伝子組換微生物によって合成される請求項１〜４のいずれか記載の創傷被覆材。
【請求項６】
（Ａ）の２５℃の水に対する溶解度が、０又は１０-6〜１，０００ｍｇ／ｌである請求項１〜５のいずれか記載の創傷被覆材。
【請求項７】
（Ｂ）が、セルロース、ポリウレタン、シリコーン樹脂、ポリジエン、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸及びポリアクリル酸塩からなる群から選ばれる少なくとも１種の生物学的非分解性材料（Ｂ１）である請求項１〜６のいずれか記載の創傷被覆材。
【請求項８】
（Ｂ）が、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリグルタミン酸、コラーゲン、ゼラチン、クルコサミノクリカン、ヒアルロン酸、フィブリン、アルギン酸、キチン、キトサン、フィブロイン及びこれらの塩からなる群から選ばれる少なくとも１種の生物学的分解性材料（Ｂ２）である請求項１〜６のいずれか記載の創傷被覆材。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、創傷被覆材に関する。さらに詳しくは、創傷、褥瘡、熱傷、皮膚潰瘍等による皮膚欠損部位に適用され、かかる部位を保護し、肉芽形成・表皮再生や治癒を促進することのできる創傷被覆材に関する。
【０００２】
【従来の技術】
創傷治癒促進効果の向上のために、細胞増殖因子として知られている特定のポリペプチドを従来の創傷被覆材に固定化したものが提案されている（特開平１０−３１６５８１号公報）。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
細胞増殖因子は細胞の増殖には効果があり、基材上では細胞増殖が認められるものの、創傷被覆材として使用した場合は、創傷の治癒促進作用が十分ではない。
本発明の目的は、上記現状に鑑み、創傷の治癒において、細胞の増殖や分化が制御良く行われ、その結果、治癒が十分に促進される創傷被覆材を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
上記の目的を達成すべく本発明者らは鋭意検討した結果、本発明に到達した。すなわち、本発明の創傷被覆材の特徴は、細胞接着シグナルを現わす最小アミノ酸配列を１分子中に３〜５０個有し、さらにＧＡＧＡＧＳのアミノ酸配列を少なくとも２つ有するポリペプチド（Ａ）と、基材（Ｂ）とからなる点である。
【０００５】
本発明において、細胞接着シグナルを現わす最小アミノ酸配列としては、接着シグナルとして働くものであればいずれも使用でき、例えば、株式会社永井出版発行「病態生理」Ｖｏｌ．９  ，Ｎｏ．７  ，１９９０，５２７頁に記載されているものが挙げられる。
その中で好ましいものは、接着する細胞が多いという点で、アミノ酸一文字表記で現わされるＲＧＤ配列、ＬＤＶ配列、ＲＥＤＶ配列、ＹＩＧＳＲ配列、ＰＤＳＧＲ配列、ＲＹＶＶＬＰＲ配列、ＬＧＴＩＰＧ配列、ＲＮＩＡＥＩＩＫＤＩ配列、ＩＫＶＡＶ配列、ＬＲＥ配列、ＤＧＥＡ配列及びＨＡＶ配列であり、さらに好ましいものはＲＧＤ配列、ＹＩＧＳＲ配列、ＰＤＳＧＲ配列、ＬＧＴＩＰＧ配列、ＩＫＶＡＶ配列及びＨＡＶ配列であり、特に好ましいものはＲＧＤ配列、ＩＫＶＡＶ配列及びＨＡＶ配列である。
【０００６】
ポリペプチド（Ａ）中に有する前記最小アミノ酸配列の数は、細胞接着性の観点から、１分子中に少なくとも１個必要であり、好ましくは３〜５０個であり、さらに好ましくは５〜４０、特に好ましくは１０〜３０である。
【０００７】
（Ａ）の数平均分子量は、細胞に対する毒性及び接着性の観点から、通常５，０００〜５，０００，０００であり、好ましくは１０，０００〜１，０００，０００、さらに好ましくは５０，０００〜５００，０００である。
【０００８】
なお、（Ａ）の数平均分子量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法(Ｎａドデシルスルフェイト−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法)で、（Ａ）を水中で分離し、泳動距離を標準物質と比較することによって求められる。
【０００９】
（Ａ）の製造方法は特に制限されず、ペプチドを合成する従来既知の方法と同様にして製造することができ、例えば有機合成法（固相合成法、液相合成法など）、生化学的合成法｛遺伝子組換微生物（酵母、細菌、大腸菌等）｝等によって合成することができる。
【００１０】
有機合成法に関しては、例えば、日本生化学学会編「続生化学実験講座２ タンパク質の化学（下）」６４１〜６９４頁（昭和６２年５月２０日；株式会社東京化学同人発行）等に記載されている。生化学的合成法に関しては、例えば、特表平７−５０１４４３号公報中で例示されている。
【００１１】
高分子量の（Ａ）を容易に合成できる点で、遺伝子組換微生物による生化学的合成法が好ましく、特に遺伝子組換大腸菌を用いて合成する方法が好ましい。
【００１２】
（Ａ）の２５℃の水に対する溶解度は、通常０又は１０-6〜１，０００ｍｇ／ｌであり、好ましくは０又は１０-6〜１０ｍｇ／ｌである。この範囲であると、基材（Ｂ）と結合していなくても体液中に溶出せず、細胞接着因子としての効能が創傷被覆材上あるいは被覆材中で持続する結果、創傷の治癒期間がさらに短縮されるため好ましい。
【００１３】
（Ａ）は、細胞接着シグナルを現わす最小アミノ酸配列以外のアミノ酸をさらに含有してもよい。
これらのアミノ酸としては、疎水性を示すアミノ酸（Ｇ，Ａ，Ｖ，Ｌ，Ｐ，Ｉ，Ｍ，Ｗ，Ｆ）等が使用できる。これらのアミノ酸を使用することにより、（Ａ）が水に対して不溶性となりさらに好ましくなる。
これらのアミノ酸のうち、ＧＡＧＡＧＳのアミノ酸配列を２つ以上有する場合がさらに好ましい。
【００１４】
（Ａ）の好ましい具体例としては、三洋化成工業（株）製プロネクチンＦ｛細胞接着シグナルＲＧＤ配列と（ＧＡＧＡＧＳ）9配列とを１分子中に各々約１３個づつ有する分子量約１１万であるポリペプチド（遺伝子組み換え大腸菌により製造）｝、同プロネクチンＬ｛細胞接着シグナルＩＫＶＡＶ配列と（ＧＡＧＡＧＳ）9配列とを１分子中に各々約１３個づつ有する分子量約１１万であるポリペプチド（遺伝子組み換え大腸菌により製造）｝等が挙げられる。
【００１５】
本発明の創傷被覆材において、基材（Ｂ）としては特に制限はなく、従来から用いられる各種含水（性）ゲル、ハイドロコロイド、固形物（粉末、フィルム、不織布及びスポンジ）等を用いることができる。
（Ｂ）としては、細胞若しくは体液と直接に接していても変化が起こらない生物学的非分解性材料及び細胞若しくは体液と直接に接しているうちに分解吸収されてしまう生物学的分解性材料が使用できる。
【００１６】
生物学的非分解性材料としては、セルロース、ポリウレタン、シリコーン樹脂、ポリジエン、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸及びポリアクリル酸塩等が挙げられる。
【００１７】
生物学的分解性材料としては、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリグルタミン酸、コラーゲン、ゼラチン、クルコサミノクリカン、ヒアルロン酸、フィブリン、アルギン酸、キチン、キトサン、フィブロイン及びこれらの塩等が挙げられる。
【００１８】
角質層から真皮の途中に至る浅い創に対しては、創傷の被覆が重要な機能であるため、創傷被覆材の基材としては、生物学的非分解性材料が好ましい。
一方、真皮から皮下組織に到達するような深い創に対しては、細胞組織の増殖の足場を提供するのが重要な機能であるため、創傷被覆材の基材としては、生物学的分解性材料が好ましい。
【００１９】
本発明の創傷被覆材において、基材（Ｂ）１００重量部に対するポリペプチド（Ａ）の好ましい量としては、０．０００１〜５０重量部であり、さらに好ましい量としては０．０１〜１重量部である。（Ａ）の量がこの範囲であると、創傷促進効果がさらに発揮できる。
【００２０】
本発明の創傷被覆材は、（Ａ）と（Ｂ）を組合せることによって得られるが、その方法については特に制限はなく、物理的に接触させる方法あるいは化学的に結合させる方法等が挙げられる。
物理的に接触させる方法による場合、例えば、（Ａ）の水または溶剤等の溶液を（Ｂ）に塗工あるいは含浸させた後、乾燥させることによって得られる。  化学的に結合させる場合、例えば、（Ａ）と（Ｂ）をＮ−ヒドロキシコハク酸イミドあるいは水溶性カルボジイミド存在下にエステル化あるいはアミド化した後、洗浄乾燥させることによって得られる。
【００２１】
本発明の創傷被覆材の形状については特に制限はなく、フィルム状、シート状、塊状、粉末状、ペレット状、管状、紐状、繊維状、布帛状及び網状等の形態が可能である。
【００２２】
本発明の創傷被覆材は、擦過創、切創、挫創等の一般外傷；採皮創、削皮創等の手術創；熱傷；潰瘍；褥瘡；前記以外の各種創傷等からなる患部に当てて用いて患部からの滲出液の吸収、該滲出液の保持、患部への菌類の感染や増殖の防止して、患部の治癒促進させるための創傷被覆材として好適である。
さらに、骨等の生体組織の接着促進、骨の補強、軟骨の再生促進、神経の再生促進等の用途にも有効に使用することができる。
【００２３】
【実施例】
以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。
【００２４】
実施例１，２、比較例１，２
（１）アルギン酸共有結合架橋体の製造：
（ｉ） ２．３ｇ（２０ｍｍｏｌ）のＮ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＨＯＳｕ、株式会社ペプチド研究所製）を酢酸エチル１５０ｍｌに溶解し、撹拌しながら１０ｍｌの酢酸エチルに溶解した０．６ｇ（１０ｍｍｏｌ）のエチレンジアミン（ＥＤＡ、和光純薬株式会社製）を室温下に滴下した。
滴下終了後、さらに１時間撹拌を続け、析出した結晶を濾取し、減圧下に乾燥してエチレンジアミン２Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド塩（ＥＤＡ・２ＨＯＳｕ）２．９ｇ（収率約１００％）を得た。
【００２５】
（ii）アルギン酸ナトリウム（和光純薬株式会社製；粘度５００〜６００ｃｐ）の１重量％水溶液５５０ｍｌ（カルボキシル基：２７５ｍｍｏｌ）に、２．４２ｇ（８．５ｍｍｏｌ）の上記（ｉ）で得られたＥＤＡ・２ＨＯＳｕと、１７．６ｇ（９２ｍｍｏｌ）の１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ・ＨＣｌ、株式会社ペプチド研究所製）とを溶解して、１５ｃｍ×２５ｃｍのテフロン被覆アルミ製トレイ４枚に流延し、室温で約５１時間静置し、含水ゲルを得た。
得られた含水ゲルを、細胞間質液と同じ濃度（Ｃａイオン５ｍｅｑ．、Ｎａイオン１４３ｍｅｑ．）になるように、ＣａＣｌ2とＮａＣｌを溶解した水溶液（ＥＣＦ）で十分に洗浄した後、純水で十分に洗浄し、次いで凍結乾燥してスポンジ状のアルギン酸共有結合架橋体約５ｇを得た。
【００２６】
（２）細胞接着シグナル含有ポリペプチドとアルギン酸共有結合架橋体の組合せ：
（ｉ） ポリペプチドとして、三洋化成工業（株）製プロネクチンFを使用；
プロネクチンF０.５ｍｇをプロネクチンＦ溶解液（過塩素酸リチウム飽和溶液）０．５ｍｌに溶解し、さらに水で１０倍に希釈した溶液に、上記（１）で得られたアルギン酸共有結合架橋体の１ｇ加え、さらに水を加えて架橋体全体を湿潤させた後、凍結乾燥させて、加熱滅菌（１２０℃、５分間）を施して、実施例１の創傷被覆材１を得た。
【００２７】
（ｉｉ）ポリペプチドとして三洋化成工業（株）製プロネクチンLを使用；
プロネクチンFの代わりにプロネクチンLを用いた以外は上記（ｉ）と全く同様にして実施例２の創傷被覆材２を得た。
【００２８】
（ｉｉｉ）細胞接着シグナル含有ポリペプチドの代わりに、増殖因子ＫＳＩＲＶＡＶＡＰＧを基材に固定化：
プロネクチンＦをアルギン酸共有結合架橋体に組み合わせる代わりに、特開平１０−３１６５８１号公報実施例８と同様の方法で、ＫＳＩＲＶＡＶＡＰＧポリペプチドを固定化させたアルギン酸共有結合架橋体を合成し、比較例１の創傷被覆材３を得た。
（ｉｖ）ポリペプチドを用いず、（１）で得られたアルギン酸共有結合架橋体をそのまま用いて比較例２の創傷被覆材４とした。
【００２９】
実施例３，４、比較例２
（３）細胞接着シグナル含有ポリペプチドとコラーゲンの組合せ：
（ｖ） ポリペプチドとして、三洋化成工業（株）製プロネクチンFを使用；
プロネクチンF０.５mgをプロネクチンＦ溶解液（過塩素酸リチウム飽和溶液）０.５mlに溶解し、さらに水で１０倍に希釈した溶液に、（株）高研製中性コラーゲン溶液の１ｇを加えて均一にした後、凍結乾燥させて、γ線滅菌（２５ｋＧｙ）を施して、実施例３の創傷被覆材５を得た。
【００３０】
（ｖｉ）ポリペプチドとして三洋化成工業（株）製プロネクチンLを使用；
プロネクチンFの代わりにプロネクチンLを用いた以外は上記（ｖ）と全く同様にして実施例４の創傷被覆材６を得た。
【００３１】
（ｖｉｉ）ポリペプチドを用いず、（３）で用いた（株）高研製中性コラーゲン溶液をそのまま凍結乾燥させて、γ線滅菌（２５ｋＧｙ）を施して、比較例３の創傷被覆材７を得た。
【００３２】
試験例１〜７
実施例１〜４及び比較例１〜３で得られた創傷被覆材１〜７から１ｃｍ×１ｃｍの試験片をそれぞれ採取し、その各々を２４穴（２４ウェル）プレートの各ウェルに入れ、正常ヒト皮膚線維芽細胞を１０3個／ウェルの割合で投入し、各ウェルに１０％ＦＣＳ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ＭＥＭ培地１ｍｌを加えて、５容量％の二酸化炭素を含む空気の存在下で３７℃で１４日間培養した。
各ウェルの細胞の状態を光学顕微鏡を用いて観察することによって、各創傷被覆材の細胞増殖活性を以下の基準で判定した。その結果を表１に示す。
【００３３】
＜細胞増殖性の判定基準＞
◎；ｗｅｌｌ全体にびっしりと細胞が広がっており、非常に良好。
○；ｗｅｌｌのほぼ全体に広がっており、良好。
△；細胞の増殖は認められるがｗｅｌｌの一部に留まっており、不良。
×；細胞の増殖は認められず、全く不良。
【００３４】
【表１】
0003755640.tif 000002
【００３５】
本発明の創傷被覆材を用いた場合、正常ヒト皮膚線維芽細胞の増殖が促進されていることが判り、創傷被覆材として、創傷の治癒促進効果が非常に高いことが判る。
【００３６】
【発明の効果】
本発明の創傷被覆材は、創傷の治癒促進のために有効に使用することができる。また、生体組織を修復するための創傷被覆材、生体組織の接着促進材料、骨補強材、軟骨再生材、神経再生材などとして有効に使用することができ、難治性潰瘍などの難治性創傷の治療にも非常に有用である。