(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（a）又は（b）の単離されたポリペプチド：
（a）配列番号：２に示されるアミノ酸配列を持つポリペプチド、及び
（b）（a）のポリペプチドにおいて、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは挿入されたアミノ酸配列を持ち、該ポリペプチドが外因性のＡＴＰ無しでカスパーゼ３を活性化し、そのミトコンドリアからサイトゾルへの移行によってアポトーシスのマーカーを提供するＳｍａｃ（第２のミトコンドリア由来カスパーゼ活性化因子）であるポリペプチド。
【請求項２】
以下の（a）又は（b）の単離されたポリペプチド：
（a）配列番号：２のアミノ酸５６−２１７に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド、及び
（b）（a）のポリペプチドにおいて、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは挿入されたアミノ酸配列を持ち、該ポリペプチドが外因性のＡＴＰ無しでカスパーゼ３を活性化し、そのミトコンドリアからサイトゾルへの移行によってアポトーシスのマーカーを提供するＳｍａｃ（第２のミトコンドリア由来カスパーゼ活性化因子）であるポリペプチド。
【請求項３】
配列番号：２の残基１−８；配列番号：２の残基４−１３；配列番号：２の残基７−１７；配列番号：２の残基１３−２４；配列番号：２の残基１８−２７；配列番号：２の残基３５−４９；配列番号：２の残基４７−５４；配列番号：２の残基７１−７８；配列番号：２の残基８３−９２；配列番号：２の残基１１５−１２４；配列番号：２の残基１４１−１４８；配列番号：２の残基１６６−１７４；配列番号：２の残基１７６−１８４；配列番号：２の残基１８３−１９１；配列番号：２の残基１９２−２００；配列番号：２の残基２０１−２０８；配列番号：２の残基２０９−２１６；配列番号：２の残基２１５−２２２；配列番号：２の残基２２３−２３１；及び配列番号：２の残基２３２−２３９からなる群から選択されるポリペプチド、かつ該ポリペプチドが外因性のＡＴＰ無しでカスパーゼ３を活性化し、そのミトコンドリアからサイトゾルへの移行によってアポトーシスのマーカーを提供するＳｍａｃ（第２のミトコンドリア由来カスパーゼ活性化因子）に対して特異的な抗体を誘発するポリペプチド。
【請求項４】
請求項１ないし３に記載のポリペプチドをコードする組換体ポリヌクレオチド。
【請求項５】
配列番号：１のヌクレオチド１−２３４又は配列番号：１のヌクレオチド５２５−７２０、どちらかの逆相補鎖、又は少なくとも長さ２４ヌクレオチドのいずれかの断片からなる組換体ポリヌクレオチドであって、特異的にＳｍａｃタンパク質コード化ｃＤＮＡ（配列番号：１）とハイブリダイズするポリヌクレオチドで、Ｓｍａｃタンパク質が外因性のＡＴＰ無しでカスパーゼ３を活性化し、そのミトコンドリアからサイトゾルへの移行によってアポトーシスのマーカーを提供する、組換体ポリヌクレオチドからなるプローブ。
【請求項６】
断片が少なくとも長さ３６ヌクレオチドである請求項５に記載のポリヌクレオチドからなるプローブ。
【請求項７】
断片が、：配列番号：１のヌクレオチド１−２４；配列番号：１のヌクレオチド１８−４２；配列番号：１のヌクレオチド４５−６９；配列番号：１のヌクレオチド７５−９２；配列番号：１のヌクレオチド１１６−１４１；配列番号：１のヌクレオチド１６６−１９９；配列番号：１のヌクレオチド２１１−２３４；配列番号：１のヌクレオチド５２５−５４８；配列番号：１のヌクレオチド５７５−５９８；配列番号：１のヌクレオチド６２４−６４８；配列番号：１のヌクレオチド６４４−６６９；配列番号：１のヌクレオチド６４９−６７２；配列番号：１のヌクレオチド６５４−６７７；配列番号：１のヌクレオチド６６５−６８８；配列番号：１のヌクレオチド６８７−７１０；及び配列番号：１のヌクレオチド６９７−７２０からなる群から選択される請求項５に記載のポリヌクレオチドからなるプローブ。
【請求項８】
配列番号：１のヌクレオチド１６６−６５１からなる請求項４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９】
請求項１ないし３に記載のポリペプチドと特異的に結合する相補性決定領域（ＣＤＲ）配列を含んで成る抗体。
【請求項１０】
請求項１ないし３に記載のポリペプチド：又は
請求項４ないし８に記載のポリヌクレオチド又はプローブ：
の配列を検出するステップを含んでなる、特異的な抗体又はポリヌクレオチドプローブを用いて特異的ポリペプチド又はポリヌクレオチドの配列を検出する方法であって、前記配列がＳｍａｃタンパク質又はＳｍａｃタンパク質をコードするｃＤＮＡであり、Ｓｍａｃタンパク質が外因性のＡＴＰ無しでカスパーゼ３を活性化し、そのミトコンドリアからサイトゾルへの移行によってアポトーシスのマーカーを提供するＳｍａｃタンパク質をコードする、特異的ポリペプチド又はポリヌクレオチドの配列を検出する方法。
【請求項１１】
配列番号：２の残基１−７８、又は配列番号：２の残基１７６−２３９、又は少なくとも長さ８アミノ酸のどちらかの断片の少なくとも一つを含んで成るポリペプチド；又は
配列番号：１のヌクレオチド１−２３４、又は配列番号：１のヌクレオチド５２５−７２０、どちらかの逆相補鎖、又は少なくとも長さ２４ヌクレオチドのいずれかの断片の少なくとも一つを含んで成るポリヌクレオチド：
を検出するステップを含んでなる、特異的ポリペプチド又はポリヌクレオチドの配列を検出することを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１ないし３に記載のポリペプチドの結合を調節する薬剤をスクリーニングする方法であって、前記方法が：
請求項１ないし３に記載の単離されたポリペプチドと、前記ポリペプチドの結合標的と、候補薬剤を含んで成る混合物を、前記薬剤が存在しなければ前記ポリペプチドが基準親和性で前記結合標的と特異的に結合する条件下でインキュベートし；
薬剤偏向親和性を決定する前記ポリペプチドと前記結合標的との結合親和性を検出するステップを含んで成り、
薬剤偏向親和性と基準親和性との間の差が、前記薬剤が前記結合標的への前記ポリペプチドの結合を調節することを示す方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
当該出願において実施された研究は、国立予防衛生研究所からの助成金（ＧＭＲＯ１−５７１５８）により一部援助を受けた。政府は当該発明における権利を有し得る。
【０００２】
（序論）
発明の分野
本発明の分野は細胞のアポトーシスに関与する酵素の制御因子である。
背景
アポトーシスに関する重要な制御ステップの一つは、カスパーゼの活性化で、クロマチンの凝縮、ヌクレオソーム断片へのＤＮＡの断片化、核膜崩壊、ホスファチジルセリンの外面化及び直ちに貪食されるアポトーシス小体の形成を含む、アポトーシス細胞に関連する特徴的な形態学的変化を導く（Liu等, 1997 Cell 89, 175-184；Enari等, 1998 Nature 391, 43-50；Sahara等, 1999 Nature 401, 168-173；Lazebnik等, 1995 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 9042-9046；Martin等, 1996 J. Biol. Chem. 271, 28753-28756；Zhang等, 1999 J. Cell Biol. 145, 99-108 ）。
ある主要なアポトーシスカスパーゼ活性化カスケードは、普段はミトコンドリアにおける電子伝達系で機能するタンパク質であるチトクロームｃによって誘発される（Liu等, 1996 Cell 86, 147-157）。生細胞中では、ホロチトクロームｃがミトコンドリアの膜間腔中に排他的に存在し、その結果、サイトゾルにおける致命的（deadly）な相手である、Ａｐａｆ−１（Zou等, 1997 Cell 90, 405-413）から隔離されている。血清の欠乏、細胞表面の死受容体の活性化、及びＤＮＡの過剰なダメージなどのアポトーシス刺激を受けると、ミトコンドリア外膜はチトクロームｃに対して透過性となる（Reed, 1997 Cell 91, 559-562で総説されている）。サイトゾルへ放出されると、チトクロームｃは、Ａｐａｆ−１と２：１のストイキオメトリーで結合し、ｄＡＴＰ又はＡＴＰの存在下でオリゴマーのＡｐａｆ−１／チトクロームｃ複合体を形成する（Purring等, 1999 J. American Chem. Soc. 121, 7435-7436；Zou等, 1999 J. Biol. Chem. 274, 11549-11556）。このオリゴマー化したＡｐａｆ−１／チトクロームｃ複合体は、その後、この経路の尖端のカスパーゼであるプロカスパーゼ−９を補充し、活性化する（Li等, 1997 Cell 91, 479-489；Zou等, 1999）。次にカスパーゼ−９は、アポトーシス細胞における主要なカスパーゼ活性を構成するカスパーゼ−３，−６及び−７などの下流のカスパーゼを活性化する（Li等, 1997；Srinivasa等, 1998 Mol. Cell 1, 949-957；Faleiro等, 1997 EMBO J. 16, 2271-2281）。
【０００３】
ここに、チトクロームｃ／Ａｐａｆ−１依存的カスパーゼの活性化を促進する新規因子の同定、精製、分子クローニング及び性質決定を開示する。チトクロームｃの様に、本タンパク質は普段はミトコンドリア中に位置し、細胞がアポトーシスを起こすとサイトゾルへ放出される。チトクロームｃ後の第二のミトコンドリア由来カスパーゼ活性化因子（the second mitochondria-derived activator of caspase）という理由で、本タンパク質をＳｍａｃと名付けた。Ｓｍａｃをサイトゾル抽出物へ添加するとｄＡＴＰの添加無しでも抽出物中における強いカスパーゼの活性化を引き起こす。また、Ｓｍａｃはカリウム塩の生理的レベルでの存在下においてもカスパーゼの活性化を可能にする。
【０００４】
（本発明の概要）
本発明は  細胞のアポトーシスに関与する酵素、特にカスパーゼのポリペプチド制御因子（活性化因子及び阻害因子）に関する方法及び組成物を提供する。特別な態様において、本発明はカスパーゼ活性化因子のポリペプチド及びポリヌクレオチド配列診断を提供する。これらの配列及びこれらの配列を具体化するポリペプチド及びポリヌクレオチドは、活性化因子又はカスパーゼ又はこのような活性化因子をコードする遺伝子又は転写物の発現及び／又は機能を検出及び／又は調節することに関与する広範な診断上及び治療上の用途を見いだす。さらに特別な態様において、本発明はカスパーゼの活性化因子に特異的な遺伝学的及び免疫学的プローブを提供する。
アポトーシスの好ましくない活性又は不活性化は、癌、自己免疫疾患及び神経変性疾患などの多くのヒトの疾患に関連しているため、ここで開示されるカスパーゼ制御ポリペプチド及びポリヌクレオチドは、アポトーシスを促進又は阻害する薬剤標的及び制御因子の両方を提供する。また、開示される天然のＳｍａｃタンパク質は、元来、アポトーシスの最中にミトコンドリアからサイトゾルへ移行するため、Ｓｍａｃタンパク質は、例えば、融合タンパク質などの標識化Ｓｍａｃ又は検出可能なＳｍａｃ特異的な結合薬剤を用いることで、正常又は疾病段階でのアポトーシスに対する診断マーカーとして使用され得る。
【０００５】
（本発明の特定の実施態様の詳細な説明）
以下に示す特定の実施態様及び実施例の説明は例示的な方法で提供され、限定されるものではない。他に禁忌を示すか又は注記しな限り、ここでの説明及び本明細書全体を通じて、「ア（ａ）」及び「アン（ａｎ）」なる用語は、一又は複数を意味し、「オアー（ｏｒ）」なる用語は、及び／又はを意味し、ポリヌクレオチド配列は、反対側の鎖並びにここで記述される選択的バックボーンまで包含すると理解される。
対象のポリペプチド配列は多種多様な適用を見いだす。一実施態様において、対象の配列は、プロテオミックマイクロアレイでの使用（例えば、Silzel JW,等 Clin Chem 1998 Sep;44(9):2036-43）、合理的薬剤デザインのモデル、抗体誘発の為の抗原などを含む多くの適用を順次提供するポリペプチドを合成するために使用される。また、ポリペプチド配列は、配列番号：２、又はその断片、特に、配列番号：２、残基１−７８又は配列番号：２、残基１７６−２３９又はこれらの断片又はこのような配列を含むポリペプチドのうち少なくとも一つを含んで成る配列を特異的に検出するためにも使用される。如何なる簡便な配列検出方法も使用可能で、直接的配列検出のためのコンピューターを利用した方法（例えば、BLAST型アルゴリズム、アライメントなど）及びポリマーの推定配列検出のための物理的方法（例えば、質量分光法など）を含む。
また、直接的な合成に加えて、対象のポリペプチドは対応する親ポリヌクレオチド、又は縮重オリゴヌクレオチドプライマー及び対象のポリペプチド配列から創出された（“ＧＣＧ”ソフトウェアー、Genetics Computer Group, Inc, Madison WI）プローブを用いて単離された天然コード化ポリヌクレオチド、又はコンピューターアルゴリズムに従って対象のポリペプチドを逆翻訳（back-translating）することにより作成される選択された発現系に最適化されたポリヌクレオチド（例えば、Holler等 (1993) Gene 136, 323-328；Martin等 (1995) Gene 154, 150-166）などのコード化ポリヌクレオチドから細胞及び無細胞系で発現させることもできる（例えば、Jermutus L,等, Curr Opin Biotechnol. 1998 Oct;9(5):534-48）。
【０００６】
対象のポリペプチドはＳｍａｃ特異的なアミノ酸配列、結合特異性又は機能を有する列挙される配列の断片を含む。好ましい断片は、配列番号：２、特に、少なくとも配列番号：２、残基１−７８又は配列番号：２、残基１７６−２３９の少なくとも８、好ましくは少なくとも１０、好ましくは少なくとも１５、より好ましくは少なくとも２５、より好ましくは少なくとも３５、最も好ましくは少なくとも５０の連続した残基を含み、対応ペプチド特異的抗体結合、誘発、又は結合もしくは誘発阻害活性を持つ。
特異的活性又は機能は、インヴィトロにおける簡便な細胞ベースの又はインヴィボにおけるアッセイなどによって決定される：例えば、インヴィトロ結合アッセイなど。結合アッセイは、結合標的と対象ポリペプチドとの分子相互作用が評価される如何なるアッセイも包含する。結合標的は制御タンパク質などの天然結合標的、又は抗体などの特異的免疫タンパク質、又は後述するスクリーニングアッセイにおいて同定されるような特異的薬剤などの非天然結合標的であってもよい。異種性宿主（例えば、齧歯類又はウサギ）などにおいて特異的抗体を誘発するために、結合特異性は、結合平衡定数（通常、少なくとも約１０７Ｍ−１、好ましくは少なくとも約１０８Ｍ−１、さらに好ましくは少なくとも約１０９Ｍ−１）、カスパーゼの活性化又はアポトーシスアッセイ、対象ポリペプチドが発現細胞内でネガティブ突然変異として機能する能力によってアッセイされる。特別の実施態様において、特にキャリアータンパク質に結合される場合、対象のポリペプチド断片は、特異的な抗原及び／又は免疫原を提供する。例えば、ペプチドはキーホールリンペット抗原（ＫＬＨ）と共有結合的に接合され、接合体は完全フロイトアジュバント中にエマルジョン化される。実験用ウサギは定法に従って免疫化され飼育される。特異的抗体の存在は、固定化された対応ペプチドを用いて固相免疫吸着アッセイによってアッセイされる、例えば、表１を参照のこと。
【０００７】
表１．特異的ウサギポリクローナル抗体を誘発する免疫原性Ｓｍａｃポリペプチド：
ポリペプチド−ＫＬＨ接合体は上述の方法により免疫化された。
ポリペプチド配列 免疫原性
配列番号：２、残基１−８              ＋＋＋
配列番号：２、残基４−１３            ＋＋＋
配列番号：２、残基７−１７            ＋＋＋
配列番号：２、残基１３−２４          ＋＋＋
配列番号：２、残基１８−２７          ＋＋＋
配列番号：２、残基３５−４９          ＋＋＋
配列番号：２、残基４７−５４          ＋＋＋
配列番号：２、残基７１−７８          ＋＋＋
配列番号：２、残基８３−９２          ＋＋＋
配列番号：２、残基１１５−１２４      ＋＋＋
配列番号：２、残基１４１−１４８      ＋＋＋
配列番号：２、残基１６６−１７４      ＋＋＋
配列番号：２、残基１７６−１８４      ＋＋＋
配列番号：２、残基１８３−１９１      ＋＋＋
配列番号：２、残基１９２−２００      ＋＋＋
配列番号：２、残基２０１−２０８      ＋＋＋
配列番号：２、残基２０９−２１６      ＋＋＋
配列番号：２、残基２１５−２２２      ＋＋＋
配列番号：２、残基２２３−２３１      ＋＋＋
配列番号：２、残基２３２−２３９      ＋＋＋
【０００８】
対象のポリペプチド及びその断片は単離され又は純粋である：「単離された」ポリペプチドは天然の状態で付随する物質の少なくとも幾つかを伴わず、好ましくは所定のサンプル中の全ポリペプチド重量の少なくとも０．５％、及びより好ましくは少なくとも約５％を構成し、純粋ポリペプチドは所定のサンプル中の全ポリペプチド重量の少なくとも約９０％、及び好ましくは少なくとも約９９％を構成する。ポリペプチドが合成され、組換え技術によって生産され、又は細胞から精製される。多種多様な分子及び生化学的手法が生化学的合成、分子発現及び対象の成分の精製に対して利用できるが、例えば、Molecular Cloning, A Laboratory Manual(Sambrook,等 Cold Spring Habor Laboratory), Current Protocols in Molecular Biology(Eds. Ausubel,等,Greene Publ. Assoc., terscience, NY)又は当該技術分野で既知の他の文献を参照のこと。
本発明は対象のポリペプチドに特異的な結合薬剤、それら薬剤の同定及び調製方法、及びそれらの使用を提供する。例えば、特異的結合薬剤は種々の診断及び産業上の適用において有用であり、特異的抗体又はＴ細胞抗原レセプターの様な体細胞性の組換えポリペプチドレセプター（例えば、Harlow及びLane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratoryを参照のこと）、１−，２−，３−ハイブリッドスクリーニングなどのアッセイにより同定される細胞内結合薬剤、後述の化学的ライブラリーのスクリーニングにおいて同定される非天然の細胞内結合薬剤などを含む。従って、本発明は相補性決定領域（ＣＤＲ）配列及びこれら配列のライブラリーを提供する。
対象のＣＤＲ配列には多種多様な適用が見いだされる。一実施態様において、対象のＣＤＲ配列はイムノ−マイクロアレイ、アフィニティ試薬などを含む多くの適用を順次提供するポリペプチドを合成するために使用される。また、直接的な合成に加えて、対象のＣＤＲポリペプチドは、対応する親ポリヌクレオチド、又は縮重オリゴヌクレオチドプライマー及び対象のポリペプチド配列から創出された（“ＧＣＧ”ソフトウェアー、Genetics Computer Group, Inc, Madison WI）プローブを用いて単離された天然コード化ポリヌクレオチド、又はコンピューターアルゴリズムに従って対象のポリペプチドを逆翻訳（back-translating）することにより作成される選択された発現系に最適化されたポリヌクレオチド（例えば、Holler等 (1993) Gene 136, 323-328；Martin等 (1995) Gene 154, 150-166）などのコード化ポリヌクレオチドから細胞及び無細胞系で発現させることもできる（例えば、Jermutus L,等, Curr Opin Biotechnol. 1998 Oct;9(5):534-48）。一般に、ＣＤＲポリペプチドはイムノグロブリン又はその断片の結合ドメインとして発現され、使用される。
【０００９】
本発明は薬剤、化合物又は対象のポリペプチドが結合標的と相互作用する能力を調節する薬剤のためのリード化合物を同定する効率的な方法を提供する。インヴィトロにおける標識されたタンパク質−タンパク質結合アッセイ、イムノアッセイ、カスパーゼ活性化アッセイ、アポトーシスアッセイのような細胞ベースのアッセイなどを含む結合薬剤のための多種多様なアッセイが提供される。本方法は、リード化合物に関する化学的ライブラリーの自動化された、費用効率の良いハイスループットなスクリーニングを受け入れ易い。インヴィトロ結合アッセイは対象ポリペプチドを含む構成成分の混合物を利用し、対象ポリペプチドは、例えば、検出又は固着等のためのタグなどの他のペプチド又はポリペプチドとの融合産物の一部であってもよい。アッセイ混合物は結合標的を含む。特別の実施態様において、結合標的はポリペプチドに特異的な抗体である。天然の結合標的全長が使用される場合、一部分がアッセイにおいて容易に測定可能な対象ポリペプチドに対する結合親和性及び結合活性を提供する限り、その部分を使用することが多くの場合好ましい。また、該アッセイ混合物は候補となる薬理学的薬剤も含む。候補薬剤は多数の化学的分類（class）を含むが、典型的にはそれらは有機化合物であり；好ましくは小有機化合物であって、合成又は天然化合物を含む多種多様な原料から得られる。また、種々の他の試薬が該混合物中に含まれてもよい。これらは塩、バッファー、アルブミンなどの中立的タンパク質、界面活性剤、プロテアーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤、抗菌剤、その他使用される様な試薬を含む。結果的として生じる混合物は、仮に候補の薬理学的薬剤が存在しなければ、ポリペプチドが基準の結合親和性で結合標的、部分又は類似体と特異的に結合する条件下でインキュベートされる。混合物の構成成分は必要とされる結合を提供する如何なる順番でも添加可能であり、インキュベーションは至適な結合を促進する如何なる温度において実施してもよい。同様に、インキュベーション期間は至適な結合のために選択されるが、速やかなハイスループットスクリーニングを促進するために最小限とされる。インキュベーション後、ポリペプチドと一又は複数の結合標的との間における薬剤偏向（biased）結合は、何れか容易な方法によって検出される。種々の方法が、例えば、光学的又は電子的密度、放射性放射、非放射性エネルギー転移などを通じて、又は抗体接合体などで間接的に検出される、標識の性質及び他のアッセイ構成要素に依存する標識を検出するために使用される。薬剤の存在下における結合親和性に対して薬剤の非存在下において比較されるポリペプチドの標的に対する結合親和性の差は、その薬剤が結合標的に対するポリペプチドの結合を調節することを示す。ここで用いられる差とは、統計学的に有意であって、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも９０％の差を表す。
【００１０】
対象のポリヌクレオチド配列は、多種多様な適用を見いだす。例えば、ポリヌクレオチド配列はＳｍａｃ配列、特に配列番号：１、その逆相補鎖又はその断片、好ましくは少なくとも配列番号：１、ヌクレオチド１−２３４又は配列番号：１、ヌクレオチド５２５−７２０、どちらかの逆相補鎖、又はこれら何れかの断片、又はこのような配列を含むポリヌクレオチドのうちの一つを特異的に検出するためにも使用される。簡便な配列検出方法の何れも使用され得る。一実施態様において、候補又は未知の配列が決定され、候補又は未知の配列を分類するために開示された配列と比較される。例えば、ＢＬＡＳＴなどのアルゴリズム（例えば、初期設定値を使用するBuild sol2.5-x86 01:40:37 05-Feb-1998, Copyright(C)1997 Warren R. Gish, Altschul等, Methods in Enzymology, 215:403-410 (1997)）は、コンピューターベースの方法において、Ｓｍａｃ関連性の一又は複数の対象配列診断に対する関連性を定義するために使用されてもよい。
他の実施態様において、開示された配列は合成するために使用され、及び／又は、マイクロアレイベースの方法論、例えばNat Genet 1999 Jan;21(1 Suppl), Debouck C,等 48-50を含めた掲載されている全刊行物を参照のこと；遺伝子発現解析、例えばCarulli JP,等, J Cell Biochem Suppl 1998;30-31:286-96を参照のこと；薬剤標的発見及び設計、例えばJones DA,等, Curr Opin Chem Biol 1999 Feb;3(1):71-6を参照のこと；コンビナトリアルケミストリー、例えばLukas TJ,等, J Med Chem. 1999 Mar 11;42(5):910-919；リボザイム及び治療、例えばRossi JJ, Chem Biol 1999 Feb;6(2):R33-7を参照のこと；マッピング；などを含む多くの適用を順次提供するポリヌクレオチドにおいて具体化される。一実施態様において、候補及び／又は未知のポリヌクレオチドが、例えば開示されたポリヌクレオチドのマイクロアレイ化ライブラリーを用いて、一又は複数の開示されたポリヌクレオチドに対するハイブリダイゼーションにより、単離され、比較され及び／又は分類される（例えば、関連性により）。また、このようなポリヌクレオチドは、天然遺伝子及び転写物を局在化、単離、増幅などさせるためのプローブ及び／又はプライマーとしても使用される。他の実施態様において、開示されたポリヌクレオチド又は断片又はそのようなポリヌクレオチドのライブラリーは、「ｎ」−ハイブリッドシステム、例えばVidal M,等, 1999,Nucleic Acids Res. 27(4):919-929及びProc Natl Acad Sci U S A. 93(19):10315-20及び10321-6を参照のこと；全ゲノムのファージディスプレイライブラリーを用いたタンパク質−リガンド相互作用マッピング、例えばPalzkill T,等, Gene 1998 Oct 9;221(1):79-83；ペプチドリガンドのDNAベースの選択及びスクリーニング、例えばBartoli F,等, Nat Biotechnol 1998 Nov;16(11):1068-73、などを含む多種多様なクローニング、ディスプレイ、発現、その他の適用のために細胞へ形質移入される。
【００１１】
特別の実施態様において、本発明は開示されたポリヌクレオチドのマイクロアレイ及びここで記述され又は引用されるようなそれらの使用を提供する。接触蒸着、例えばUS Pat Nos. 5,807,522;5,770,151, DeRisi JL,等 Curr Opin Oncol 1999 Jan;11(1):76-9, など；フォトリトグラフベースの方法、例えばUS Pat Nos. 5,861,242;5,858,659;5,856,174;5,856,101;5,837,832, Lipshutz RJ,等 Nat Genet 1999 Jan;21(1 Suppl):20-4, など；インクジェット分配技術、例えばLemmo AV,等, Curr Opin Biotechnol 1998 Dec;9(6):615-7；フローパスベースの方法、例えばUS Pat No. 5,384,261；ディップ−ペンナノリトグラフベースの方法、例えばPiner,等, Science Jan 29 1999:661-663, など；等を含む多種多様な材料及び方法が、ガラス、シリコン、プラスチック、ナイロン膜などの基質の分離したエレメントにポリヌクレオチドをアレイ化するために当該技術分野において既知である。
また、本発明は配列番号：１の配列を持つポリヌクレオチド、又はその逆相補鎖に対してハイブリダイズするポリヌクレオチドを提供する。特別の実施態様において、長さが少なくとも３６、好ましくは少なくとも４８、さらに好ましくは少なくとも９６ヌクレオチドの配列であって、表Ａ−Ｃ中で同定され、記述されるような、ハイブリダイゼーション条件＃１、好ましくは＃２、さらに好ましくは＃３及び同様に＃１０までに基づいたハイブリダイゼーション条件下で該配列と第二のポリヌクレオチドが特異的にハイブリダイズするような配列番号：１、好ましくは配列番号：１、ヌクレオチド１−２３４又は配列番号：１、ヌクレオチド５２５−７２０、又はどちらかの逆相補鎖から成る第二のポリヌクレオチドと配列類似性を有する配列を含んで成る組換体の第一のポリヌクレオチドを包含する。従って、例えば、ハイブリダイゼーション条件＃７が好ましい場合、その結果、関連する又は相同なポリヌクレオチドを同定し、分類するために用いられる条件は、４０℃のハイブリダイゼーション温度においてハイブリダイゼーションバッファーＭ、及び５５℃の洗浄温度において洗浄バッファーＥを利用する。条件＃１は、標的ポリヌクレオチド（ここで記述されるように計算された％同一性を持つ）との少なくとも約５０％の配列同一性を持つポリヌクレオチドを同定する。続く各条件により、緊縮性は、単離されるポリヌクレオチドが、次に低い条件番号を用いることにより単離されるものより少なくとも５％高い配列同一性を持つようなものである。従って、例えば、条件＃２は標的ポリヌクレオチドと少なくとも約５５％の配列同一性を持つポリヌクレオチドを同定し、条件＃９及び＃１０は、標的ポリヌクレオチドに対して各々少なくとも約９０％及び９５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを同定する。
【００１２】
配列番号：１は、天然Ｓｍａｃをコードする天然のヒト転写物に由来する（以下の実施例を参照のこと）。配列番号：１の例示的なより高い緊縮性のハイブリダイゼーションポリヌクレオチド（約９５％の配列番号：１配列との同一性を持つ）は、配列番号：３−５と命名され、配列番号：１の例示的なより低い緊縮性のハイブリダイゼーションポリヌクレオチド（約９０％の配列番号：１配列との同一性を持つ）は、配列リスト中で配列番号：６−８と命名されている。より密接に関連するポリヌクレオチドを分類することが望まれる場合、ハイブリダイゼーション条件は所望の特異性が得られるまで一ずつ増加させることにより上昇させる。好ましくは、各ハイブリダイズポリヌクレオチドは、ここで記述されたハイブリダイズするポリヌクレオチド配列の長さの少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７０％及び最も好ましくは少なくとも９０％の長さを持つ。
表Ａ及びＢ中、ホルムアミドは、１Ｘから６ＸＳＳＣを含んで成る緩衝化希釈液（１ＸＳＳＣは150mM NaCl及び15mM クエン酸ナトリウム；ＳＳＰＥはＳＳＣと置換可能、１ＸＳＳＰＥは150mM NaCl, 10mM NaH2PO4及び1.25mM EDTA, pH7.4）中パーセント（ｖ／ｖ）で表される。ポリヌクレオチドハイブリダイゼーションに関する手順は、当該技術分野において周知である（Ausubel等, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995)；Sambrook等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989；Shilo及びWeinberg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78, 6789-6792；及びPCT公報WO99/01466を参照のこと）。
【００１３】
0003851819.tif 000002
【００１４】
また、本発明は前述の方法で、特に核酸ハイブリダイゼーションプローブ及び複製／増幅プライマーとして用いられる親及び／又はホモログのポリヌクレオチドの断片も提供する。これらの断片は対応する配列番号又はその相補鎖と特異的にハイブリダイズ化するために十分な長さを持ち、通常、対応する配列番号（例えば表２を参照のこと）の少なくとも１２、好ましくは少なくとも２４、より好ましくは少なくとも３６及び最も好ましくは９６の連続するヌクレオチドを含んで成る。
【００１５】
表２．ハイブリダイゼーション条件＃５の条件下で配列番号：１の鎖とハイブリダイズする例示的なＳｍａｃポリヌクレオチド断片。
ポリヌクレオチド断片 ハイブリダイゼーション
配列番号：１、ヌクレオチド１−２４                    ＋
配列番号：１、ヌクレオチド１８−４２                  ＋
配列番号：１、ヌクレオチド４５−６９                  ＋
配列番号：１、ヌクレオチド７５−９２                  ＋
配列番号：１、ヌクレオチド１１６−１４１              ＋
配列番号：１、ヌクレオチド１６６−１９９              ＋
配列番号：１、ヌクレオチド２１１−２３４              ＋
配列番号：１、ヌクレオチド２５５−２９９              ＋
配列番号：１、ヌクレオチド３５９−３８３              ＋
配列番号：１、ヌクレオチド４３６−４６０              ＋
配列番号：１、ヌクレオチド４９１−５１３              ＋
配列番号：１、ヌクレオチド５２５−５４８              ＋
配列番号：１、ヌクレオチド５７５−５９８              ＋
配列番号：１、ヌクレオチド６２４−６４８              ＋
配列番号：１、ヌクレオチド６４４−６６９              ＋
配列番号：１、ヌクレオチド６４９−６７２              ＋
配列番号：１、ヌクレオチド６５４−６７７              ＋
配列番号：１、ヌクレオチド６６５−６８８              ＋
配列番号：１、ヌクレオチド６８７−７１０              ＋
配列番号：１、ヌクレオチド６９７−７２０              ＋
【００１６】
対象のポリヌクレオチドはＳｍａｃ特異的配列を持つ列挙される配列の断片を含む。好ましい断片は、配列番号：１、特に配列番号：１、ヌクレオチド１−２３４又は配列番号：１、ヌクレオチド５２５−７２０、何れかの逆相補鎖のうち少なくとも一つの、少なくとも３４、好ましくは少なくとも３６、好ましくは少なくとも５６、さらに好ましくは少なくとも９６、さらに好ましくは少なくとも１８６の連続的なヌクレオチドを含む。対象のポリヌクレオチド及びその断片は、標識又は他のポリヌクレオチド／ポリペプチド配列（即ち、それらはより長い配列の一部であってもよい）などの他の構成要素と連結されていてもよく、合成／非天然配列であり、及び／又は単離、即ち、天然状態で付随している物質の少なくとも幾つかを伴わず、所定のフラクション中に存在する全核酸重量の少なくとも約０．５％、好ましくは少なくとも約５％を構成し、通常組換体であって、それらが天然の染色体上で連結しているもの以外の核酸と連結される非天然配列又は天然配列を含むことを意味する。対象の配列番号又はそれらの断片を含んで成る組換体ポリヌクレオチドは、終端において天然の染色体上で連結しているもの以外の配列が極近くに隣接し（即ち、連続し）、又は終端にあるか又は天然の染色体上で連結しているもの以外の配列が極近くに隣接する１０ｋｂより短く、好ましくは２ｋｂより短く、さらに好ましくは５００ベースより短く、最も好ましくは１００ベースより短い天然隣接領域によって隣接されるような配列又は断片を含む。通常、核酸がＲＮＡ又はＤＮＡである場合、調節された安定性などを提供するために他の塩基又は核酸アナログを含む核酸を用いることは、しばしば有利である。
【００１７】
実施例
Ｉ．Ｓｍａｃ発現評価のためのＤＮＡマイクロアレイ構成及び使用
マイクロアレイ化されたポリヌクレオチドライブラリーを用いる比較遺伝子発現は、実際にはDeRisi,等 Science 1997 October 24;278:680-686中に記述されるように実施される。マイクロアレイ設計及び構成は、Brown等, Stanford University Department of Biochemistryによるhttp://cmgm.stanford.edu/pbrown/mguide/index.html.における１９９８年８月１０日発行により実施される。特に述べない限り、全ての手順は、室温で複蒸留水を用いて行われる。ソフトウェア：J. DeRisi及びV.Iyer (1999) ArrayMaker v1.5, http://cmgm.stanford.edu/pbrown/mguide/software.html.において１９９９年２月１５日に発行された。
【００１８】
１．スライドの調製
0003851819.tif 000003
１．  スライドラック内にスライドを置く。チャンバー内にラックを置く。
２．  クリーニング溶液を調製する：７０ｇのＮａＯＨを２８０ｍＬのｄｄＨ２Ｏに溶解させる。４２０ｍＬの９５％エタノールを添加する。総量は７００ｍＬ（＝２Ｘ３５０ｍＬ）；完全に混合されるまで撹拌する。溶液が濁ったままの場合はｄｄＨ２Ｏを透明になるまで加える。
３．  溶液をスライドを収納するチャンバーへ注ぎ込む；チャンバーをガラスの蓋で覆う。オービタル（orbital）振盪機で２時間混合する。スライドがきれいになったら、できるだけ空気に曝さないようにする。埃粒子がコーティング及びプリンティングを妨害することになる。
４．  ｄｄＨ２Ｏで満たした新しいチャンバーへラックを速やかに移す。ラックを上下させることにより強めにリンスする。ｄｄＨ２Ｏで４回リンスを繰り返す。ＮａＯＨ−エタノールの全ての痕跡を除去することが重要である。
５．  ポリリジン溶液を調製する：５６０ｍＬ水中に７０ｍＬのポリ−Ｌ−リジン＋７０ｍＬ組織培養ＰＢＳ。プラスチック製のメスシリンダー及びビーカーを使用する。
６．  スライドをポリリジン溶液中へ移し、１５分間−１時間振盪する。
７．  ｄｄＨ２Ｏで満たした新しいチャンバーへラックを移す。リンスのため５回上下させる。
８．  マイクロタイタープレートキャリアー上（液を吸収するためラックの下にペーパータオル置く）でスライドを５００ｒｐｍにて５分間、遠心する。真空オーブンへの移動のためのカバーを有する空のチャンバーへ、スライドラックを移す。
９．  １０分間、４５℃の真空オーブン中でスライドラックを乾燥させる（真空は任意）。
１０．閉じたスライドボックス中でスライドを保存する。
１１．プリンティングアレイ前：疎水性を確認するためにサンプルスライドをチェックする−水滴が玉となって流れ落ちなくてはならない。ポリリジンのコーティングが透明であることを確認する。スライドバッチの品質を判定するためにサンプルスライドをテストプリント、ハイブリ及びスキャンする。
【００１９】
２．ＤＮＡサンプルの調製
親ポリヌクレオチドのクローンは、５’端にアミノ−連結させたプライマーを用いて９６−ウェル形式中でのＰＣＲにより増幅させる。精製されたＰＣＲ産物は、３ＸＳＳＣ中、〜０．５ｍｇ／ｍｌ濃度で懸濁し、各産物の〜５ｎｇが後述の手順の方法によりコートされたガラス上にアレイ化される。１．８ｃｍ四方の領域に全１０，０００エレメントが１７５μｍ離れた間隔を置いてアレイ化される。
ＤＮＡ沈殿
１．  ＤＮＡを９６−ウェルＶ底組織培養プレート（Costar）へ移す。
２．  １／１０体積の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）＋同体積のイソプロパノールを加える。−２０℃で数時間保存する。
３．  Sorvall中で３５００ｒｐｍにて４５分間遠心する。
４．  ７０％エタノールでリンスし、再び遠心する。
５．  ホイルでプレートをカバーするか又はペーパータオル上でプレートを逆さまにして、一晩、空気乾燥させる。或いは、スピード−バック（５分間）でプレートを乾燥させる。
５．  ＤＮＡを３０ｕＬの３ＸＳＳＣ中に一晩かけて再懸濁させる。
６．  ７つのプリントプレートセット二組を調製するために４ｕＬ分量を３８４−ウェルプレート（Corning Costar #6557）へ移す。保存のため、アルミニウムホイル（R.S. Hughes #425-3）できっちりとプレートをシールする。長期間の保存のためには、プリントプレートセットを乾燥させ、室温で保存する。使用前に、４ｕＬ ｄＨ２Ｏ中に一晩懸濁させる。
７．  ＤＮＡをポリリジンスライド上へ１６−チップアレイヤーでスポットする。使用したプリントプレートを２回目及び３回目の使用の間の保存のためには乾燥させる。
【００２０】
３．アレイの後処理
その後、マイクロアレイは、後述の手順によるハイブリダイゼーション前に、ＤＮＡをガラス表面上へ固定化させるために後処理される：
0003851819.tif 000004
１．  再水和アレイ：保湿チャンバーの底を１ＸＳＳＣで満たす。アレイの表面を下にして１ＸＳＳＣ中に置き、チャンバーを蓋で覆う。アレイのスポットがきらきらと輝くようになるまで再水和させる。スポットを多少膨潤させても良いが、互いに流れ込ませてはならない。
２．  ７０−８０℃の逆ヒートブロック上で３秒間各アレイをスナップ乾燥（snap-dry）（ＤＮＡの面を上にして）させる。
３．  ダイヤモンドスクライバーを用いてスライドの背面上にアレイの境界をマークする。アレイは後処理の後には見えなくなる。
４．  Stratalinkerセットを用いて６５ｍＪ．（ディスプレイを、６５０ｘ１００ｕＪ．となる「６５０」にセットする）（任意）でＤＮＡをガラスにＵＶクロスリンクさせる。
５．  アレイをスライドラック内に配置する。空のスライドチャンバーをオービタル振盪機上に準備する。
６．  ブロッキング溶液を準備する：５．５ｇの無水コハク酸を３２５ｍＬの１−メチル−２−ピロリジノン中へ溶解させる。無水コハク酸が溶解後すぐに２５ｍＬのホウ酸ナトリウムを添加する。
７．  ホウ酸ナトリウム溶液が混合した後すぐに溶液を空のチャンバー内へ注ぎ込む。溶液中で数回ラックを沈める。オービタル振盪機上で１５−２０分間混合する。その間に〜７００ｍＬの水（スライドラックを覆うために十分な量）を２Ｌビーカー中で９５℃に熱する。
８．  ９５℃の水中に２分間スライドラックをゆっくりと沈める。
９．  ９５％エタノール中へスライドラックを５回沈める。
１０．マイクロタイタープレートキャリアー上（液を吸収するためラックの下にペーパータオル置く）でスライドを５００ｒｐｍにて５分間、遠心する。
１１．アレイはすぐに使用するか、又はスライドボックス中に保存する。最高速度で１分間遠心する。
【００２１】
４．アレイのハイブリダイゼーション
全ての測定はＳｍａｃ−特異的な発現を実証する解析のためにコンピューターデータベース中に保存する。
蛍光ＤＮＡプローブのための指示：
１．  プローブの最終体積は、４ＸＳＳＣ中、競合ＤＮＡなどを含んで１０−１２ｕＬでなくてはならない。
２．  アレイをハイブリダイゼーションチャンバー中にセットする。湿度を保つためスライドの端に１０ｕＬの３ＸＳＳＣを載せる。
３．  ０．３ｕＬの１０％ＳＤＳをプローブに添加する。
４．  プローブを２分間ボイルする。
５．  アレイ上にプローブをピペッティングし、２２ｍｍＸ２２ｍｍのカバースリップをその上にゆっくりと載せる。
６．  ハイブリダイゼーションチャンバーを閉め、６３℃の水浴中へ浸す。
７．  ４−２４時間ハイブリダイズさせる。
８．  ハイブリダイゼーションチャンバーを取り外し、アレイを１ＸＳＳＣ／０．０３％／ＳＤＳ中でリンスする。
９．  アレイを新しいスライドラックへ移し、０．２ＸＳＳＣ中で２回目のリンスする。
１０．０．０５ＸＳＳＣ中で３回リンスする。全てのＳＤＳを除去することが重要である。
１１．マイクロタイタープレートキャリアー上（液を吸収するためラックの下にペーパータオル置く）でスライドを５００ｒｐｍにて５分間、遠心する。
１２．すぐにアレイをスキャンする。
【００２２】
ＩＩ．天然Ｓｍａｃポリペプチド及びポリヌクレオチドの同定及び性質決定
Ｓｍａｃの同定。運良く行った実験において、界面活性剤を含むバッファー中で調製した細胞抽出物には、界面活性剤を含まないバッファー中で調製したものと比較して、非常に多くのカスパーゼ−３を活性化する活性が存在することに気がついた。既知の可溶性因子であるＡｐａｆ−１、チトクロームｃ及びプロカスパーゼ−９に加えてカスパーゼ−３の活性化を促進する膜結合性因子が存在することが推論できるため、界面活性剤中に膜沈殿物を可溶化させ、バッファーに可溶性の抽出物の１００，０００ｘｇ遠心上清（Ｓ−１００）中へ再添加した。界面活性剤で可溶化された膜抽出物（ＳＭＥ）は、それ自体ではカスパーゼ−３を活性化する活性は有しなかったが、Ｓ−１００画分へ添加するとカスパーゼ−３を活性化する活性が有意に刺激された。同量の界面活性剤をＳ−１００へ単に添加するだけでは、カスパーゼ−３の活性化には効果がなかった。本実験は、通常水溶性画分において欠如するカスパーゼ−３活性化促進因子が膜画分中に存在することを示す。
我々が以前調製した生化学的画分及びＳ−１００抽出物にのみ基づく再構成実験により、１ｍＭ ｄＡＴＰの存在下においてカスパーゼ−３活性化反応を再構成するのに必要かつ十分な３つのタンパク質を同定することが可能となった。これらのタンパク質は、シー・エレガンスのＣＥＤ−４タンパク質の哺乳類ホモログである１３０ｋＤａタンパク質、Ａｐａｆ−１（Zou等, 1997；Yuan及びHorvitz 1992 Development 116, 309-320）；プロカスパーゼ−９（Li等, 1997）、及びホモジナイズの段階でＳ−１００へ遊離されるチトクロームｃ（Liu等, 1996）である。界面活性剤で可溶化された膜抽出物が、Ａｐａｆ−１、又はチトクロームｃ、又はプロカスパーゼ−９を代替するタンパク質を含むかどうかを調べるために、最初にこれら３つのタンパク質を各々Ｓ−１００から免疫除去し、界面活性剤で可溶化された膜画分を除去抽出物へ添加した。カスパーゼ−３を活性化する活性はこれらの除去抽出物中には認められなかったため、この因子はＡｆａ−１、チトクロームｃ、又はプロカスパーゼ−９を代替することはできないことを示す。さらに、本因子の活性はＡｐａｆ−１、チトクロームｃ、又はプロカスパーゼ−９に依存する。本因子が通常ミトコンドリアに局在することから、第二ミのトコンドリア由来カスパーゼ活性化因子（second mitochondria-derived activator of caspase）との理由でＳｍａｃと名付けた。
【００２３】
Ｓｍａｃの精製。アッセイとして再構成実験を用いて、０．５％ＣＨＡＰＳ中に可溶化させたＨｅＬａ細胞の大規模培養から膜フラクションを分画した。Ｓｍａｃの活性はＳ−１００中のカスパーゼ−３の活性化を刺激する能力に関してスコア化された。Ｓｍａｃの精製は、６ステップの手順を経て達成された（以下の実験手順を参照のこと）。Ｓｍａｃ活性は、〜２５０ｍＭ ＮａＣｌにおける単一のピークとしてＭｏｎｏＱカラムから溶出された。同一のタンパク質フラクションをＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、その後銀染色を行った。２５ｋＤａの位置に泳動されたタンパク質のバンドはＳｍａｃ活性と相関した。天然のＳｍａｃはゲル濾過カラムでは〜１００ｋＤａに溶出するため、Ｓｍａｃはホモ四量体であることを示す。活性フラクション中に見いだされる５０ｋＤａの夾雑タンパク質は活性のピークと相関しなかった。
Ｓｍａｃの分子クローニング。ＭｏｎｏＱカラムから溶出されたフラクション３及び４由来の２５−ｋＤａのタンパク質のバンドは、トリプシン消化された。その結果生じた４つのペプチドは逆相ＨＰＬＣによって精製され、エドマン分解法により配列決定された。データベースサーチにより、これらのペプチド配列はＥＳＴデータベース（T53449）中の未だ性質決めされていないｃＤＮＡと一致することが明らかとなった。ＥＳＴ配列をプローブとして用いて、ＳｍａｃをコードするｃＤＮＡがＨｅＬａ細胞ｃＤＮＡライブラリーからクローン化された。ｃＤＮＡ及びコードされるアミノ酸配列は配列番号：１及び２として各々開示される。フレームの合ったストップコドンが開始メチオニンの前に見いだされたため、このｃＤＮＡはＳｍａｃの全長コード領域をコードすることを示す。Ｓｍａｃの全長タンパク質配列はタンパク質データベース（GeneBank及びProsite）に対してサーチするために用いられたが、Ｓｍａｃと相同なタンパク質配列又はモチーフは見いだされなかった。
Ｓｍａｃの組織分布を調べるために、複数のヒト成人組織由来のｍＲＮＡブロットを用いてノザンブロット分析が実施された。調べられた全組織中に、〜１．５ｋｂの顕著なｍＲＮＡが検出され、この事はＳｍａｃの偏在性の発現を示めす。ＳｍａｃのｍＲＮＡの発現は成人の精巣で最も高く、心臓、肝臓、腎臓、脾臓、前立腺及び卵巣で高かった。ＳｍａｃのｍＲＮＡの発現は脳、肺、胸腺及び末梢血白血球では低い。
【００２４】
Ｓｍａｃはアポトーシスの間にサイトゾルへ放出されるミトコンドリアタンパク質である。細胞内におけるＳｍａｃの正確な位置を特定するために、バクテリアで発現させた組換体Ｓｍａｃ（アミノ酸９５−２３９）に対するポリクローナル抗体を作製し、免疫染色及び生化学的な分画によってＳｍａｃの位置付けをするためにこの抗体を用いた。Ｓｍａｃ抗体による生細胞の免疫染色により、チトクロームｃと共局在する斑点状のミトコンドリアへの局在が明らかにされた。しかしながら、細胞がＵＶによって誘導されたアポトーシスを起こしている場合、Ｓｍａｃ及びチトクロームｃの染色は、斑点状のミトコンドリア局在からより散在生のサイトゾルのパターンへと双方ともに変化した。両タンパク質はＵＶ照射から２時間後に散在生のサイトゾル染色を呈し始め、そのパターンは８時間後により明らかとなった。チトクロームｃとＳｍａｃの最も散在した分布を示す細胞は、ＤＡＰＩ染色により評価するとクロマチンの凝縮も明らかにした。
さらに免疫染色の結果を確認するために、ミトコンドリア及びサイトゾルのフラクションを正常又はＵＶ照射したＨｅＬａ細胞から単離した。生細胞中、Ｓｍａｃ及びチトクロームｃは排他的にミトコンドリアフラクション中に局在した。ＵＶ照射から２時間後、チトクロームｃ及びＳｍａｃは共にサイトゾルフラクション中に観察された。サイトゾルのＳｍａｃ及びチトクロームｃは、対応するミトコンドリアにおける減少と一致して８時間、増加し続けた。
２５−ｋＤａＳｍａｃはカスパーゼ−３活性化刺激活性に対して必要である。２５−ｋＤａＳｍａｃがカスパーゼ−３活性化促進活性に対して絶対的に必要であることを実証するために、界面活性剤可溶化膜粗抽出物（ＳＭＥ）から免疫除去するためにＳｍａｃに対するポリクローナル抗体を使用した。抗Ｓｍａｃ血清を用いた免疫除去によりＳＭＥから２５−ｋＤａタンパク質が定量的に除かれた。２５−ｋＤａタンパク質の存在しない抽出物はＳ−１００中でのカスパーゼ−３活性化を刺激する能力を失ったが、このことは２５−ｋＤａＳｍａｃがそのような活性に必要であることを示す。
【００２５】
Ｓｍａｃの成熟にはそのシグナルペプチドの切断が必要である。さらにＳｍａｃ活性の性質を決定するために、バキュロウィルスの発現系でＳｍａｃをコードする全長ｃＤＮＡを発現させた。組換体Ｓｍａｃは均一に精製された。Ｓｍａｃの全長ｃＤＮＡは分子量２７ｋＤａの２３９アミノ酸からなるオープンリーディングフレームをコードするが、ＨｅＬａ及びＳｆ−２１細胞の双方から精製されたＳｍａｃは約２５−ｋＤａであり全オープンリーディングフレームより小さい。ヘリカルホイール分析によるとＳｍａｃのＮ末端領域は典型的なミトコンドリア標的シグナル配列に類似することが明らかとなった：片側にポジティブ電荷アミノ酸（Ａｒｇ−１０，Ａｒｇ−１７，Ａｒｇ−１９，Ｌｙｓ−３１，Ｌｙｓ−３２，Ａｒｇ−３３，Ａｒｇ−４０）側鎖を持つ両親媒性のα−へリックス（Schatz及びDobberstein, 1996 Science 271, 1519-1526を参照のこと）。直接的配列決定分析は、Ｓｆ−２１細胞から精製された成熟Ｓｍａｃはアミノ酸５６から始まっていることを示した。Ｓｆ−２１細胞中で発現される２５ｋＤａの組換体Ｓｍａｃが完全に活性を持つということは、アミノ酸１−５５は後で切断されたミトコンドリア標的シグナルペプチドであることを示す。シグナルペプチドを有する無傷の全長Ｓｍａｃも、全長Ｓｍａｃを含むバキュロウィルスベクターで感染させたＳｆ−２１細胞でのウェスタンブロット分析によって観察された。全長Ｓｍａｃは如何なる活性も示さず、このことはミトコンドリア内でのシグナルペプチドの切断がＳｍａｃがアポトーシス活性を得るのに必要とされるステップであることを示す。
Ｓｍａｃはインヴィボにおけるアポトーシス刺激に対する細胞の感受性を増大させる。インヴィボにおけるＳｍａｃの役割を研究するために、タンパクのＣ末端にＦＬＡＧタグを融合させた全長Ｓｍａｃを用いてＨｅＬａ細胞を一過的に形質移入した。細胞内で一過的に発現されたＳｍａｃはアポトーシス刺激がないとカスパーゼ−３の活性化及びアポトーシスを誘導しなかった。ＦＬＡＧでタグ化したＳｍａｃはミトコンドリアに排他的に局在した。その後、形質移入された細胞はＵＶランプの下で照射時間の長さを増加させながら照射された。ＵＶ照射２秒後、Ｓｍａｃ形質移入細胞の〜６０％がクロマチン凝縮によって評価されるアポトーシスの徴候を示した。また、活性なカスパーゼ−３もこれらの細胞抽出物中にウェスタンブロット分析及び酵素学的アッセイにより認められた。これに対して、ベクターで形質移入した細胞の〜２０％のみが同じ条件下でアポトーシスの徴候を示し、カスパーゼ−３の活性はほとんど検出されなかった。ＵＶにより長く曝すことによって、より多くのアポトーシス及びカスパーゼ−３活性が認められたがＳｍａｃ及びベクターによる形質移入細胞同士における差はより小さくなった。
【００２６】
Ｓｍａｃはカリウム塩の生理的な濃度の存在下において外来性のｄＡＴＰ無しにカスパーゼ−３の活性化を促進する。カスパーゼ−３の活性化に関する我々のこれまでの生化学的研究により、カスパーゼ−３の活性化に対して必要かつ十分であるＡｐａｆ−１、プロカスパーゼ−９、及びチトクロームｃを同定してきた（Zou等, 1991）。活性化反応には０．１ｍＭ ｄＡＴＰ及び１０ｍＭ ＫＣｌの至適濃度が必要である。しかし、インヴィボにおいてｄＡＴＰ濃度はおよそ１０μＭ であり、カリウム塩は約１５０ｍＭであり、Ａｐａｆ−１、チトクロームｃ及びプロカスパーゼ−９によって触媒されるカスパーゼ−３の活性に対して阻害的な濃度である。Ｓｍａｃの存在がｄＡＴＰ及びカリウム塩の生理的な濃度下においてカスパーゼ−３の活性化を促進するか否か調べるために、バキュロウィルスの発現系から精製された組換体Ｓｍａｃを透析したＳ−１００に添加し、カスパーゼ−３の活性化に関しアッセイした。Ｓｍａｃ非存在下において、カスパーゼ−３の活性化はｄＡＴＰ濃度が０．１ｍＭ及びＫＣｌが１０ｍＭに達したときにも認められた。Ｓｍａｃ存在下では、カスパーゼ−３の活性化は外来性のｄＡＴＰが添加されないときでも認められ、その活性化は１０μＭ ｄＡＴＰでプラトーに達した。また、同様の結果がＡＴＰについても認められた。驚くべきことに、Ｓｍａｃの存在下では、Ｋ＋濃度が１５０ｍＭに達したときでも強いカスパーゼ−９及びカスパーゼ−３の活性化が認められた。増強されたカスパーゼ−３の活性化は、カスパーゼ−３活性化に関し上流のカスパーゼであるカスパーゼ−９の増強された活性化が原因であった。
実験手順：一般的方法及び材料。ヌクレオチドはPharmaciaから；ウマ心臓チトクロームｃはSigmaから；チトクロームｃに対するモノクローム抗体はPharmingenから；放射活性物質はAmershamから及びＳＤＳ−ＰＡＧＥとゲル濾過カラムクロマトグラフィーに対する分子量標準はBio-Radから入手した。タンパク質濃度はブラッドフォード法により決定された；一般的な分子生物学的手法は、Sambrook等, 1989 Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Pressの中の記述に従って使用された。
【００２７】
ＨｅＬａ細胞からのＳ−１００フラクションの調製。ヒトＨｅＬａ Ｓ３細胞は、１５０−ｍｍ組織培養ディッシュで１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を添加したＤＭＥＭ培地（１００Ｕ／ｍｌペニシリン及び１００ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン硫酸塩を含むDulbecco's modified eagle's medium）中にて培養され、３７℃、５％ＣＯ２の環境において単層で生育させた。７０％コンフルエントの細胞は１ｘリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で１回洗浄し、４℃にて８００ｘｇ、５分間遠心して回収した。細胞沈殿物は３倍量のバッファーＡ（２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ，ｐＨ７．５，１０ｍＭ ＫＣｌ，１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２，１ｍＭ ＮａＥＤＴＡ，１ｍＭ ＮａＥＧＴＡ，１ｍＭ ＤＴＴ，及び０．１ｍＭ ＰＭＳＦ）に懸濁させ、細胞抽出物はLiu等, 1996中の記述に従って調製した。抽出物調製の間、ミトコンドリアが無傷に保たれる必要がある場合、細胞沈殿物はYang等, 1997 Science 275, 1129-1132中の記述に従って２５０ｍＭ スクロースを含むバッファーＡ中に溶解させた。
カスパーゼ−３の活性化に関するアッセイ。カスパーゼ−３は既述（Liu等, 1996）のように翻訳され、精製された。インヴィトロで翻訳されたカスパーゼ−３の２μｌ分量が、１ｍＭ ｄＡＴＰ及び１ｍＭ の更なるＭｇＣｌ２の存在下において、バッファーＢで最終体積２０μｌとなるようにして、３０℃、１時間、対象のタンパク質フラクションと共にインキュベートされた。インキュベーションの最後に、７μｌの４ｘＳＤＳサンプルバッファーが各反応混合物に添加された。３分間ボイルした後、各サンプルは１５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）にて泳動された。ゲルをニトロセルロースフィルターにトランスファーさせ、次いでPhosphorimagingプレートに暴露し、Fuji BAS-1500 Phosphorimagerで視覚化した。
可溶化した膜抽出物（ＳＭＥ）の調製。１００リットルの懸濁培養したＨｅｌａ細胞（５ｘ１０６細胞／ｍｌ）からの２５０ｍｌ細胞沈殿物を１リットルのバッファーＡ中に再懸濁させた。細胞をホモジナイズし、Liu等, 1996中の記述に従って核を取り除いた。上清は重い膜フラクションをを沈殿させるために、４℃で３０分間、１０，０００ｘｇで遠心した。その結果得られた膜沈殿物は０．５％（ｗ／ｖ）ＣＨＡＰＳを含む１リットルのバッファーＡ中に再懸濁させ、可溶化した混合物は、Beckman SW 28ローター中、４℃で１時間、１００，０００ｘｇで遠心した。その結果得られた上清（可溶化された膜抽出物、ＳＭＥ）は−８０℃で保存し、タンパク質Ｓｍａｃの精製のための開始材料として用いた。
【００２８】
ＳＭＥからのＳｍａｃの精製。全ての精製ステップは４℃で実施された。Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（Pharmacia）及びハイドロキシアパタイトカラム（Bio-Rad）のクロマトグラフィーステップは従来の段階的なクロマトグラフィーを用いて実施された。Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｕｐｅｒｏｓｅ，Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００及びＭｏｎｏ−Ｑのクロマトグラフィーステップは、全自動高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）装置（Pharmacia）により実施された。
可溶化された膜フラクション（５ｇの総タンパク質量）の１リットルが、バッファーＡで平衡化させたＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（１００−ｍｌのベッド体積）に添加された。カラムは２００ｍｌのバッファーＡ、次に、１００ｍＭ ＮａＣｌを含むバッファーＡ、５００ｍｌで洗浄された。カラム上に結合した物質は３００ｍＭ ＮａＣｌを含む５００ｍｌのバッファーＡで溶出させた。５０ｍｌのフラクションが集められ、Ｓｍａｃ活性についてアッセイされた。活性なタンパク質フラクションの１５０−ｍｌがプールされ、４０％飽和となるように固体の硫酸アンモニウムを添加することで沈殿させ、タンパク質沈殿物は３５，０００ｘｇ、２０分間の遠心により収集した。その結果得られたタンパク質沈殿物は、１７０ｍｌのバッファーＡ中に溶解させ、バッファーＡで平衡化させたハイドロキシアパタイトカラム（５０−ｍｌのベッド体積）に添加した。カラムは１５０ｍｌのバッファーＡ、次に、１Ｍ ＮａＣｌを含むバッファーＡで洗浄し、その後再度１５０ｍｌのバッファーＡで洗浄した。結合した物質は、１００ｍｌの０．１２Ｍ ＫＰＯ４，ｐＨ７．５で溶出した。１０ｍｌのフラクションが集められて、Ｓｍａｃ活性についてアッセイされた。全部で４０−ｍｌの活性タンパク質フラクションがプールされ、３．１ｇの硫酸アンモニウムが最終濃度０．５Ｍの硫酸アンモニウムを調製するために添加された。タンパク質−硫酸アンモニウム混合物は１時間回転させて平衡化し、その後３５，０００ｘｇ、４０分間の遠心を行った。その結果生じた上清（４４−ｍｌ）は、０．５Ｍ 硫酸アンモニウムを含むバッファーＡで平衡化したＰｈｅｎｙｌ Ｓｕｐｅｒｏｓｅ ５／５(Pharmacia)に添加した。カラムを０．５Ｍの硫酸アンモニウムを含む３０ｍｌのバッファーＡで洗浄し、０．５の硫酸アンモニウムを含むバッファーＡからバッファーＢまで１００ｍｌの線形勾配で溶出させた。５−ｍｌのフラクションが集められて、Ｓｍａｃ活性についてアッセイされた。１３０−１８０ｍＭ 硫酸アンモニウムで溶出された全部で１５ｍｌの活性フラクションを集め、１００ｍＭ ＮａＣｌを含むバッファーＡで平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００(２６／６０)ゲル濾過カラムに２回に分けて通した。カラムは同じバッファーで溶出した。９０−ｍｌの溶出から開始して、４−ｍｌの活性フラクションが集められ、Ｓｍａｃ活性についてアッセイされた。全部で２４−ｍｌの活性フラクションをプールし、１００ｍＭ ＮａＣｌを含むバッファーＡで平衡化したＭｏｎｏ Ｑ(５／５)カラムに添加した。カラムは２００ｍＭ ＮａＣｌを含む１０−ｍｌのバッファーＡで洗浄され、バッファーＡ中の２００ｍＭ ＮａＣｌから５００ｍＭ ＮａＣｌの直線的な濃度勾配によって溶出された。１ｍｌのフラクションが集められ、Ｓｍａｃ活性についてアッセイされた。活性のあるフラクション（２μｇの全タンパク質）がバッファーＡ中の２７０−３００ｍＭ ＮａＣｌにおいて溶出され、２０％グリセロールを添加して分取され、−８０℃で保存された。
【００２９】
Ｓｍａｃのタンパク質配列決定。Ｍｏｎｏ Ｑカラムからの２５−ｋＤａバンド（〜８ｐｍｏｌ）がクマジーブルーで染色された１５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルから切り出された。バンドはトリプシン（Promega）で消化され、生じたペプチドはキャピラー逆相ＦＰＬＣカラム（LC Packing, Inc.）によって分離された。４つの個別のペプチドがApplied Biosystemsシークエンサーで配列決定された。
ＳｍａｃのｃＤＮＡクローニング。４つのポリペプチド配列が得られ、ＥＳＴデータベース（tBlastn）のサーチに用いられた。１つのポジティブＥＳＴクローン（T53449）が同定され、ＨｅＬａ ｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲによりｃＤＮＡクローンを得るためのオリゴヌクレオチドを設計するために鋳型として用いた。１ｍｌ（１０８ｐｆｕ）分量のｌＥｘｌｏｘ ＨｅＬａｃＤＮＡライブラリー（Yokoyama等, 1993 Cell 75, 187-197）は、９４℃、１分間、１サイクル及び９４℃、３０秒間；５５℃、３０秒間；７２℃、１分間、３５サイクルの後、７２℃、１０分間の伸長によるＰＣＲ条件を使用し、プライマーを用いて直接増幅されたＤＮＡを遊離させるために９９℃で１５分間、熱処理された。５５９−ｂｐＰＣＲ産物が得られ、続いてTA cloning kit（Invitrogen）を用いてＰＣＲＩＩへサブクローニングした後、配列決定を行った。５５９−ｂｐＰＣＲ産物は、redi prime II random prime labeling kit(Amersham)を用いてａ−３２Ｐ−ｄＣＴＰで標識され、Rapid-hyb buffer(Amersham)中、４２℃で一晩、二組のフィルターをハイブリダイズすることによりＨｅLａ ｌＥｘｌｏｘ ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするためのプローブとして使用された。フィルターは、１ｘクエン酸食塩水（ＳＳＣ）／０．１％ＳＤＳで１５分間、室温にて２回洗浄し、０．５ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで１０分間、６５℃にて１回洗浄した。スクリーニングされた５ｘ１０５のプラークから、１４のポジティブクローンが同定され配列決定された。７１９−ｂｐの全長ｃＤＮＡが得られた。
【００３０】
Ｓｍａｃポリクローナル抗体の作製。プライマーはプラスミド中のＳｍａｃ  ｃＤＮＡの４３７−ｂｐをＰＣＲ増幅させるために設計された。Ｓｍａｃの９５−２３９アミノ酸をコードする増幅されたＤＮＡ断片は、読み枠が合うようにバクテリア用発現ベクターｐＥＴ−１５ｂ（Novagen）のＸｈｏＩ／ＢａｍＨＩ部位へサブクローン化された。発現プラスミドはバクテリアＢＬ２１（ＤＥ３）中へ形質転換した。典型的なＳｍａｃ標品においては、Ｓｍａｃ発現ベクターを含む５−ｍｌの一晩バクテリア培養物が５００−ｍｌのＬＢ培養液へ添加され、３７℃、２５０ｒｐｍで振盪することにより培養した。培養物の吸収が６００ｎｍで０．８に達した時、イソプロピル−１−チオ−Ｂ−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）が最終濃度１ｍＭになるように添加され、培養物をさらに３時間振盪した。バクテリアは遠心により沈殿させ、１０ｍｌのバッファーＢ（６Ｍ ＧｕＨＣｌ，０．１Ｍ リン酸ナトリウム，０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０）にバクテリア沈殿物を再懸濁させた。１０，０００ｘｇで１５分間遠心後、上清をニッケルアフィニティカラム（４ｍｌ）添加した。カラムは３００ｍｌのバッファーＢで洗浄し、その後３００ｍｌのバッファーＣ（８Ｍ 尿素，０．１Ｍ リン酸ナトリウム，０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０）で洗浄した。カラムは２５０ｍＭ イミダゾールを含むバッファーＣで溶出した。〜１０ｍｇのＳｍａｃタンパク質が５００−ｍｌ培養から精製された。本精製Ｓｍａｃ融合タンパク質はウサギに免疫することによりポリクローナル抗体を生産するために用いられた。
【００３１】
ウェスタンブロット分析。Ａｐａｆ−１、カスパーゼ−９及びチトクロームｃに対するウェスタンブロット分析が既述（Li等, 1997）に従って実施された。抗Ｓｍａｃ抗血清は組換体Ｓｍａｃ融合タンパク質でウサギを免疫することにより作製された（上記を参照のこと）。Ｓｍａｃのイムノブロット分析は西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギイムノグロブリンＧにより、Enhanced Chemiluminescence（ECL）ウェスタンブロッティング検出試薬（Amersham）を用いて行われた。
ノザンブロット分析。複数のヒト成人組織に由来するレーンあたり２μｇのＰｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡを含むＰｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡブロットはClontechから購入した。ブロットは、ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングに用いた２ｘ１０６ｃｐｍ／ｍｌのランダムプライム化した５５９−ｂｐのＳｍａｃＰＣＲ断片（上記を参照のこと）を用いてRapid hyb buffer（Amersham）中、６５℃で一晩ハイブリダイズさせた。フィルターは２ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで６５℃、１５分間洗浄後、１ｘＳＳＣ／０．５％ＳＤＳで６５℃、１５分間洗浄した。その後、同じフィルターからプローブを剥がし、２．０ｋｂβ−アクチンｃＤＮＡプローブを用いて６５℃で２時間ハイブリダイズさせ、その後、フィルターは上述したように洗浄した。増感スクリーンを用い−８０℃でフィルターをＸ線フィルムに暴露した。
免疫染色。接着性ＨｅＬａ細胞は１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を添加したＤＭＥＭ培養液中、チャンバースライド（Nagle Nunc International）あたり１ｘ１０４細胞となるように播き、５％ＣＯ２環境、３７℃において単層で生育させた。２４時間後、培養液が除去され、ＨｅＬａ細胞はＵＶランプ（５，０００ｍＷ／ｃｍ２，Philips, G36T6L）の下３．５ｃｍで、１５分間照射された。その後、処理した細胞は新しいＤＭＥＭ培養液中で上述したように数時間培養し続けた。細胞培養はＰＢＳで３回洗浄することにより停止させ、その後新しく調製したＰＢＳ中の３％パラホルムアルデヒドで１０分間固定化した。固定した細胞を各々１５分間ＰＢＳ中で３回洗浄し、その後ＰＢＳ中の０．１５％ トリトンＸ−１００で１５分間膜透過性処理を行った。その後細胞をブロッキングバッファー（ＰＢＳ中の２％ウシ血清アルブミン）中で６０分間ブロッキングし、Ｓｍａｃに対する抗血清（１：２００）又はチトクロームｃに対するマウスモノクローナル抗体（１：２００）と共に４時間インキュベーションした。細胞は各々ブロッキングバッファー中で１０分間、３回洗浄し、Ｓｍａｃに対するフルオレセイン結合ヤギ抗ウサギ抗体（１：５００）（Molecular Probe）又はチトクロームｃに対するテキサスレッド標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（１：５００）（Molecular Probe）と共に１時間インキュベーションした。免疫染色した細胞は、各々ＰＢＳ中で１０分間、３回洗浄した後、１μｇ／ｍｌのＤＡＰＩ（Molecular Probe）で染色し、Nicon Eclipsse E800 Fluorescence Microscopeで調べた。
【００３２】
Ｓｍａｃ ｃＤＮＡによるＨｅＬａ細胞の形質移入。Ｓｍａｃの全コード領域を含む７１９−ｂｐのｃＤＮＡ及びカルボキシル末端のＦｌａｇタグは、ｐｃＤＮＡ３．１（−）ベクター（Invitrogen）のＸｈｏＩ／ＥｃｏＲＩ部位へサブクローン化され、該プラスミドはｐｃＤＮＡ−Ｓｍａｃと命名され、Qiagen Midi plasmid kitを用いて調製された。ＨｅＬａ細胞は１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を添加したＤＭＥＭ培養液中で６０−ｍｍディッシュあたり１ｘ１０５で調製し、５％ＣＯ２環境、３７℃において単層で生育させた。２４時間インキュベートした後、各ディッシュはそれぞれ４μｇのｐｃＤＮＡ３．１（−）ベクター又は４μｇのｐｃＤＮＡ−Ｓｍａｃにより、Fugene 6形質転換試薬（Roche）を用いて形質転換した。１６時間後、培養液は除去され、細胞は異なる時間長で上述したようにＵＶ照射した。照射後、形質移入した細胞は、新しいＤＭＥＭ培養液中でさらに６時間培養し、Ｓ-１００抽出物の調製のために０．５％ＣＨＡＰＳの存在下、バッファーＡ中に回収した。全部で２０μｇのタンパク質が１５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動され、ゲルはニトロセルロースフィルターへトランスファーし、続いてＳｍａｃに対するポリクローナル抗体又はヒトカスパーゼ−３に対するモノクローナル抗体（Transaction Laboratories）でブロットした。
バキュロ発現系における組換体Ｓｍａｃタンパク質の生産。カルボキシル末端において９−ヒスチジンタグと融合した全長Ｓｍａｃをコードする７１９−ｂｐｃＤＮＡはバキュロウィルス発現ベクターｐＦａｓｔＢａｃＩ（Life Technologies, Inc）のＢａｍＨＩ／ＮｏｔＩ部位へサブクローンニングされた。発現プラスミドはＤＨ１０Ｂａｃ大腸菌（Life Tecnologies, Inc）へ形質転換された。組換体ウィルスＤＮＡ、バクミドはBac-To-Bac Baculovirus Expression precedureに従って精製され、ＰＣＲ増幅分析によって確認された。その後、ＤＮＡはCellFECTIN試薬（GIBCO-BRL）を用いて昆虫細胞、Ｓｆ−２１に形質移入するために使用された。細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、２．６ｇ／Ｌ リン酸トリプトース、４ｇ／Ｌ Yeastolate、及び０．１％ Pluronic F-68、加えて、ペニシリン（１００ ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００ ｍｇ／ｍｌ）及びファンギゾン（０．２５ ｇ／ｍｌ）を添加したＩＰＬ４１培地で生育させた。組換体Ｓｍａｃの発現はウェスタンブロットによって分析した。ウィルスストックは１００ｍｌに増幅し、密度が２ｘ１０６細胞／ｍｌのＳｆ２１細胞、１リットルに感染させるために用いた。感染後２４時間、細胞は遠心によって回収し、細胞沈殿物は０．５％のＣＨＡＰＳを含む５倍量のバッファーＡ中に再懸濁させた。再懸濁させた細胞はホモジナイズによって溶解させ、細胞溶解物は１０，０００ｘｇ、４℃で１時間遠心した。上清を３−ｍｌのニッケルアフィニティークロマトグラフィーに添加した。カラムは１Ｍ ＮａＣｌ及び１５ｍＭ イミダゾールを含む３００ｍｌのバッファーＡで洗浄後、２０ｍｌのバッファーＡで平衡化した。カラムに結合したＳｍａｃは２５０ｍＭ イミダゾールを含むバッファーＡで溶出した。溶出されたＳｍａｃは複数に分注して−８０℃で保存した。
【００３３】
ＩＩＩ．ハイスループットなポリペプチド−抗体結合干渉アッセイの手順。
Ａ．試薬：
−Neutralite Avidin：ＰＢＳ中、２０μｇ／ｍｌ
−ブロッキングバッファー：ＰＢＳ中、５％ＢＳＡ、０．５％ツイーン２０；室温にて１時間。
−アッセイバッファー：１００ｍＭ ＫＣｌ、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．６、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、１％ グリセロール、０．５％ ＮＰ−４０、５０ｍＭ  ｂ−メルカプトエタノール、１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、プロテアーゼインヒビターのカクテル。
−３３ＰＳｍａｃポリペプチド  １０ｘストック：２００，０００−２５０，０００ｃｐｍの標識ポリペプチド（Beckman counter）を加えた１０−８−１０−６Ｍ「コールド」ポリペプチド。スクリーニングの間、４℃のマイクロフリッジ（microfridge）中に置く。
−プロテアーゼインヒビターカクテル（１０００Ｘ）：１０ｍｌのＰＢＳ中、１０ｍｇ トリプシンインヒビター（BMB#109894）、１０ｍｇ アプロチニン（BMB#236624）、２５ｍＭ ベンザミジン、（Sigma#B-6506）、２５ｍｇ ロイペプチン（BMB#1017128）、１０ｍｇ ＡＰＭＳＦ（BMB#917575）、及び２ｍＭ ＮａＶＯ３（Sigma#S-6508）。
−抗体：ＰＢＳ中、１０−７−１０−５Ｍビオチン化抗体。
Ｂ．アッセイプレートの調製：
−ウェルあたり１２０μｌのN-Avidinで４℃、一晩コートする。
−２００μｌＰＢＳで２回洗浄する。
−１５０μｌのブロッキングバッファーでブロッキングする。
−２００μｌＰＢＳで２回洗浄する。
Ｃ．アッセイ：
−４０μｌアッセイバッファー／ウェルを添加する。
−１０μｌ化合物又は抽出物を添加する。
−１０μｌ３３Ｐ−ポリペプチド（２０−２５，０００ｃｐｍ／０．１−１０ｐｍｏｌｅｓ／ウェル＝１０−９−１０−７Ｍ最終濃度）
−２５℃で１５分間振盪。
−２５℃でさらに４５分間インキュベートする。
−４０μＭビオチン化抗体（アッセイバッファー中、０．１−１０ｐｍｏｌｅｓ／４０ｕｌ）
−室温で１時間インキュベートする。
−２００μＭ ＰＢＳで４回洗浄することにより反応を停止させる。
−１５０μＭ シンチレーションカクテルを添加する。
−トップカウントでカウントする。
Ｄ．全てのアッセイに対するコントロール（各プレートに位置づけられる）
ａ．非特異的結合
ｂ．８０％阻害で可溶性（非ビオチン化抗体）
配列番号：２及びその欠失突然変異体を含む例示的なポリペプチドを用いたアッセイは、これに対する特異的な抗体の検出を提供する。同様に、配列番号：２及びその断片から成る群から選択される配列に対して特異的なＣＤＲｓを含んで成る例示的ポリペプチドを用いる相補性アッセイは、そのような対応配列を含んで成るポリペプチドの検出を提供する。
【００３４】
本明細書中で引用された全ての出版物及び特許明細書及びそれらに引用された全ての引例は、個々の出版物又は特許明細書又は引例が、出典により取り込まれることが特異的及び個別的に示されたものとして、出典により取り込まれている。前述の発明は、理解を明確にする目的で例示及び実施例の方法によりある程度詳細に記述されたが、当業者にとって、本発明を教示するという観点において、ある程度の変更及び修飾は、添付の請求の範囲の理念及び範囲から逸脱する事無く行われることは、容易に明らかであろう。
【配列表】
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