(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
異常タンパク質とバロシン含有タンパク質との結合を原因とする神経変性疾患の予防薬または治療薬の有効成分となる物質をスクリーニングする方法であって、異常タンパク質、バロシン含有タンパク質、および候補物質を共存させ、異常タンパク質とバロシン含有タンパク質との結合を阻害する物質を神経変性疾患の予防薬または治療薬の有効成分として特定することを特徴とするスクリーニング方法。
【請求項２】
異常タンパク質とバロシン含有タンパク質との結合を原因とする神経変性疾患の予防薬または治療薬の有効成分となる物質をスクリーニングするためのキットであって、少なくともバロシン含有タンパク質固定化担体および標識化された異常タンパク質試薬を有することを特徴とするスクリーニングキット。
【請求項３】
異常タンパク質とバロシン含有タンパク質との結合を原因とする神経変性疾患の予防薬または治療薬の有効成分となる物質をスクリーニングするためのキットであって、少なくとも標識化されたバロシン含有タンパク質試薬および異常タンパク質固定化担体を有することを特徴とするスクリーニングキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この出願の発明は、神経変性疾患の予防薬または治療薬の有効成分となる物質のスクリーニング方法とその方法を用いたスクリーニングキットに関するものである。さらに詳しくは、この出願の発明は、神経変性疾患を引き起こすことで知られる異常タンパク質とバロシン含有タンパク質（ＶＣＰ）の結合を阻害する物質をスクリーニングすることにより、神経変性疾患の予防薬または治療薬の有効成分となる物質をスクリーニングする方法とこの方法を用いたスクリーニングキットにするものである。
【０００２】
【従来の技術とその課題】
パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン舞踏病、マシャドジョセフ病などに代表される神経変性疾患の患者は、単一の疾患について１〜３万人に１人程度の確立で発症、日本国内だけでも１０万人以上（１２００人に１人の割合）の患者が存在することが確認されており（厚生省、国民衛生の動向１９９６年より）、その予防方法、治療方法については多くの研究がなされている（Borlongan C.V., Koutouzis, T.K., Sanberg, P.R., Neurosci. Biobehav. Rev. 21, 289-93 (1997); Parnetti, L., Senin, U., Mecocci, P., The way forward. Drugs. 53, 752-68 (1997); Pasinetti, G.M., Neurobiol. Aging. 17, 707-16 (1996)）。これまでの研究により、これらの神経変性疾患においては、いずれも、共通する表現型があることが明らかにされている。つまり、伸張したグルタミン鎖を有する、コンホメーションの異常が見られる、プロテアーゼレジスタントである、β−シート構造を有する等の特徴を有する異常タンパク質が、神経細胞内での凝集、蓄積、vacuoles形成、細胞死などを起こしていることが確認されているのである（Kakizuka, A., Trends Genet. 14, 396-402 (1998)）。
【０００３】
しかし、このような異常タンパク質の凝集、蓄積、vacuoles形成を誘発している原因物質については、これまで特定されておらず、そのため、神経変性疾患の治療薬や予防薬の研究開発が遅れていたのが実情である。
【０００４】
本願の発明者らは、鋭意研究の結果、これらの神経変性疾患に共通する表現型を誘発する因子を同定することに成功し、この物質がバロシン含有タンパク質（ＶＣＰ）であることをつきとめた。
【０００５】
ＶＣＰは、真正細胞からヒトに至る生物に普遍的に存在するＡＡＡ（ATPase Associated with various cellular Activities）スーパーファミリータンパク質のひとつであり、弱いＡＴＰａｓｅ活性を有し、これまで種々の細胞機能、とくにシグナル伝達等に関与するものであると考えられてきた（Muller, JM., Meyer, H.H., Ruhrberg, C., Stamp, G.W., Warren G., Shima, D.T., J.Biol.Chem. 274, 10154-10162 (1999); Zhang, L., Ashendel, C.L., Becker, G.W., Morre, D.J., J. Cell Biol. 127, 1871-1883 (1994)）。しかし、これまで、このＶＣＰが異常タンパク質と結合することによって神経変性疾患を誘発する因子となっていることは全く知られていなかったのである。
【０００６】
そこで、この新たな知見をもとに、ＶＣＰと異常タンパク質の結合を阻害するような物質を選別する方法が確立されれば、特定の神経変性疾患のみならず、一連の神経変性疾患に共通の治療薬や予防薬として有効な物質を得ることができると期待される。
【０００７】
この出願の発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであり、従来技術の問題点を解消し、神経変性疾患の治療薬や予防薬の有効成分とすることができる物質をスクリーニングする方法を提供することを課題としている。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
したがって、この出願の発明は、上記の課題を解決するものとして、まず第１には、異常タンパク質とバロシン含有タンパク質との結合により誘発される神経変性疾患の予防薬または治療薬の有効成分となる物質をスクリーニングする方法であって、異常タンパク質、バロシン含有タンパク質、および候補物質を共存させ、異常タンパク質とバロシン含有タンパク質との結合を阻害する物質を神経変性疾患の予防薬または治療薬の有効成分として特定することを特徴とするスクリーニング方法を提供する。
【０００９】
また、第２には、この出願の発明は、異常タンパク質とバロシン含有タンパク質との結合により誘発される神経変性疾患の予防薬または治療薬の有効成分となる物質をスクリーニングするためのキットであって、少なくともバロシン含有タンパク質固定化担体および標識化された異常タンパク質試薬を有することを特徴とするスクリーニングキットを提供する。
【００１０】
さらに、この出願の発明は、第３には、異常タンパク質とバロシン含有タンパク質との結合により誘発される神経変性疾患の予防薬または治療薬の有効成分となる物質をスクリーニングするためのキットであって、少なくとも標識化されたバロシン含有タンパク質試薬および異常タンパク質固定化担体を有することを特徴とするスクリーニングキットをも提供する。
【００１１】
【発明の実施の形態】
この出願の発明の神経変性疾患の予防薬または治療薬の有効成分となる物質のスクリーニング方法は、発明者らの鋭意研究により、異常タンパク質が、バロシン含有タンパク質（ＶＣＰ）と結合することにより神経細胞の変性、脱落を生じさせ、神経変性疾患を引き起こすことが明らかになったことからなされたものである。
【００１２】
この出願の発明において、異常タンパク質とは、神経細胞内で凝集、蓄積し、vacuolizationや細胞死を引き起こすタンパク質をいう。例えば、伸張したグルタミン鎖を有するもの、コンホメーションに異常があるもの、プロテアーゼレジスタントであるもの、β−シート構造を有するもの等の種々の異常タンパク質が挙げられる。
【００１３】
この出願の発明のスクリーニング方法は、任意の異常タンパク質、ＶＣＰ、および候補物質を共存させ、異常タンパク質とバロシン含有タンパク質の結合が阻害されるか否かを確認することにより、神経変性疾患の予防薬または治療薬の有効成分となる物質をスクリーニングするものである。
【００１４】
このとき、異常タンパク質、ＶＣＰ、候補物質を共存させる方法はとくに限定されない。たとえば、異常タンパク質とＶＣＰを候補物質の存在下で混合し、溶液中で共存させてもよいし、これらを一般的な培地でインキュベートし、共存させてもよい。さらには、異常タンパク質を発現したトランスジェニック動物中において、ＶＣＰを共存させ、候補物質を導入してもよい。このとき、共存させる環境については、温度、濃度、ｐＨ、時間等はとくに限定されず、異常タンパク質とＶＣＰが結合するのに十分で、かつ、候補物質が有効に結合を阻害しうるような条件であればよい。とくに、同一細胞内において、異常蛋白質とＶＣＰを共存させ、候補物質を種々の手法によって細胞内に導入する方法が好ましく例示される。
【００１５】
また、異常タンパク質とＶＣＰの結合が候補物質によって阻害されているか否かを確認する方法もとくに限定されない。例えば、異常タンパク質をＨｉｓやＦｌａｇ等のタグや、35Ｓ等の放射性同位体によって標識し、ＶＣＰを固定化させた担体に異常タンパク質を接触させ、一定時間保持した後、担体上の標識シグナルの有無を確認する方法、標識した異常タンパク質と、ＶＣＰを混合してインキュベートし、ＶＣＰと特異的に結合する物質を固定化したカラムにインキュベート後の混合溶液を通して、カラム上、あるいは流出液中の標識シグナルの有無を確認する方法などが挙げられる。さらに、異常タンパク質を発現する細胞（例えば、ＰＣ１２／Ｑ７９：Yasuda, S., Inoue, K., Hirabayashi, M., Higashiyama, H., Yamamoto, Y., Fuyuhiro, H., Komure, O., Tanaka, F., Sobue, G., Tsuchiya, K., Hamada, K., Sasaki, H., Takeda, K., Ichijo, H., Kakizuka, A., Genes Cells 4, 743-756 (1999)）とＶＣＰと候補物質を共存させ、異常タンパク質とＶＣＰの結合によるvacuolizationが細胞質に生じるかを観察することによって候補物質による結合阻害を確認する方法、抗体によって染色したＶＣＰと異常タンパク質を発現する細胞と候補物質を共存させたときに、vacuolizationの有無や細胞中での異常蛋白質とＶＣＰの局在化によって候補物質の有効性を確認する方法なども例示される。
【００１６】
この出願の発明のスクリーニング方法では、具体的には、ＧＳＴプルダウンアッセイやイースト２ハイブリッド法など、生物化学実験の手法として一般的に知られる方法が適用できる。また、表面プラズモン共鳴の測定により、結合の度合い確認できるＢＩＡＣＯＲＥは、リアルタイムで大量のサンプルのスクリーニングを行う方法として好ましい。しかし、この出願の発明のスクリーニング方法は、異常タンパク質、ＶＣＰ、候補物質を共存させ、異常蛋白質とＶＣＰの結合が候補物質により阻害されるか否かを確認できるものであれば、これらに限定されない。
【００１７】
この出願の発明の神経変性疾患予防薬および治療薬の有効成分となる物質のスクリーニング方法は、以上のとおりに、異常タンパク質、ＶＣＰ、および候補物質を共存させて、異常タンパク質とＶＣＰの結合が阻害されることを確認するものであればよく、上記のとおりに例示される各方法は、どのような細胞、試薬、濃度、温度、ｐＨ等の条件下で行われるものであってもよい。
【００１８】
また、この出願の発明のスクリーニング方法において、スクリーニングされる候補物質は、タンパク質やアミノ酸等の天然物質であってもよいし、人工的に合成されたポリぺプチド等の物質であってもよく、高分子化合物、低分子化合物、公知、新規の種々の物質が適用される。
【００１９】
この出願の発明は、さらに、上記のとおりのスクリーニング方法を用いて、神経変性疾患の予防薬または治療薬の有効成分となる物質をスクリーニングするためのキットをも提供する。このようなスクリーニングキットとしては、種々のものが考えられるが、例えば、ＶＣＰを固定化した担体と標識化された異常タンパク質を含む試薬を有するものが挙げられる。
【００２０】
このようなキットでは、標識化された異常タンパク質試薬とＶＣＰと異常タンパク質の結合を阻害すると考えられる候補物質を混合し、ＶＣＰ固定化担体上に流して一定時間放置した後、溶媒等で担体を洗浄し、担体上の標識シグナルの有無を観察すれば、候補物質が有効に作用するものか否かを確認することができる。つまり、担体から標識シグナルが発せられれば担体上に固定化されたＶＣＰと異常タンパク質が結合したことが示され、スクリーニングした候補物質は、神経変性疾患の予防薬または治療薬として有効ではないものであることが分かる。反対に、担体が標識シグナルを発しなければ、ＶＣＰと異常タンパク質の結合が阻害されたことが示され、候補物質は神経変性疾患の予防薬または治療薬として有効であることが確認できる。
【００２１】
このようなスクリーニングキットにおいては、ＶＣＰ固定化担体は、ＶＣＰが固定化されていればどのようなものであってもよく、ゲル、フィルム、シート、ビーズ、カラム等、様々な材料や形状からなるものが考えられる。また、ＶＣＰはどのような方法で担体に固定化されていてもよく、直接的な化学的結合、タグなどを介した結合、ビーズ等への物理的な包含など、様々な形態が例示される。さらに、異常タンパク質試薬は、ＭＪＤＱ７９（マシャドジョセフ病原因タンパク質）のように伸張したポリグルタミン鎖を有するタンパク質、コンホメーションの異常が確認されるタンパク質などの異常タンパク質を含有するものであればよく、他に、溶媒、緩衝液、添加剤等を含んでいてもよい。また、異常タンパク質の標識も、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）や蛍光蛋白等の種々のタグ、放射性同位体など、どのようなものを用いてもよい。さらに、このようなスクリーニングキットには、ＶＣＰ固定化担体と標識化された異常タンパク質試薬以外に、溶媒、緩衝液、添加剤、種々の機器や器具等が含まれていてもよい。また、ＶＣＰと異常蛋白質の結合を確認する操作は、以上のとおりのものに限定されず、タンパク質合成、融合タンパク質の発現、遠心分離やＨＰＬＣによる精製、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ等による電気泳動測定、ブロッティング等の種々の実験操作を含んでいてもよい。
【００２２】
この出願の発明の神経変性疾患の予防薬または治療薬の有効成分となる物質をスクリーニングするためのスクリーニングキットは、標識化されたＶＣＰ試薬と異常タンパク質を固定化した担体を有するものであってもよい。このようなキットは、上に例示されたキットと同様の操作により、神経変性疾患の予防薬または治療薬の有効成分となる物質をスクリーニングすることができるものである。つまり、標識化されたＶＣＰ試薬とＶＣＰと異常タンパク質の結合を阻害すると考えられる候補物質を混合し、異常タンパク質固定化担体上にこの溶液を流し、一定時間、適当な条件で保持した後に、溶液を洗い流し、標識シグナルの有無を観察することにより担体上でＶＣＰと異常タンパク質が結合しているか否か、つまり、候補物質が神経変性疾患の予防薬または治療薬として有効に作用する物質であるか否かを確認できるのである。
【００２３】
担体上に標識シグナルが見られれば、ＶＣＰと異常タンパク質が結合していることが示され、候補物質はこれらの結合を阻害せず、神経変性疾患の予防薬または治療薬の成分として有効でないことが分かる。一方、担体上に標識シグナルが確認されなければ、ＶＣＰと異常タンパク質の結合は、候補物質によって阻害されたこととなり、この物質は、神経変性疾患の予防薬または治療薬の成分として十分に作用するものであることが分かる。
【００２４】
このようなスクリーニングキットにおいても、担体の形状、材質、標識化されたＶＣＰ以外の試薬中の成分等は限定されず、様々なものが考慮される。また、ＶＣＰと異常蛋白質の結合を確認する操作は、以上のとおりのものに限定されず、タンパク質合成、融合タンパク質の発現、遠心分離やＨＰＬＣによる精製、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ等による電気泳動測定、ブロッティング等の種々の実験操作を含んでいてもよい。もちろん、この出願の発明のスクリーニングキットは、これらの操作を実施するために必要な器具、試薬、さらには溶媒等を含むものであってもよい。
【００２５】
以下、添付した図面に沿って実施例を示し、この発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、この発明は以下の例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることは言うまでもない。
【００２６】
【実施例】
＜実施例１＞ ポリグルタミン鎖を有するタンパク質とＶＣＰの結合によるポリグルタミンの凝集
ＰＣ１２細胞を固定し、１次抗体として抗ＶＣＰ抗体を、２次抗体としてＦＩＴＣ標識した抗ウサギ抗体を用いて染色し、蛍光顕微鏡で観察し、内在性ＶＣＰの局在を調べた。図１−１に蛍光顕微鏡像（ａ）及び光学顕微鏡像（ｂ）を示した。これより、ＶＣＰが細胞全体に発現していることが確認された。
【００２７】
次に、ＰＣ１２／Ｑ７９細胞の培地からテトラサイクリンを除去し、ポリグルタミンを発現させた。テトラサイクリン除去後４８時間と９６時間後に細胞を固定し、内在性のＶＣＰとポリグルタミンの局在を観察した。抗ＶＣＰ抗体（２次抗体としてＦＩＴＣ標識抗ウサギ抗体を使用）、抗Ｆｌａｇ抗体（２次抗体としてtexas red標識抗マウス抗体を使用）を用いて染色し、蛍光顕微鏡でＶＣＰとポリグルタミンの発現、局在を観察した。
【００２８】
蛍光顕微鏡像を図１−２（ａ）〜（ｃ）（４８時間後）、および図１−３（ａ）〜（ｃ）（９６時間後）に示した。また、ポリグルタミン発現後のＰＣ１２／Ｑ７９細胞の光学顕微鏡像を図１−２（ｄ）（４８時間後）、および図１−３（ｄ）（９６時間後）に示した。
【００２９】
図１−２より、まず、ポリグルタミンは、発現誘導後、細胞質に凝集体を形成し（図１−２ｂ）、ＶＣＰはポリグルタミンとco-localizeすることが確認された（１−２ｃ）。
【００３０】
また、図１−３より、時間の経過に伴って、ポリグルタミンが徐々に核にも凝集体を形成し（図１−３ｂ）、ＶＣＰは、この核内の凝集体とco-localizeすることが確認された（図１−３ｃ）。
【００３１】
さらに、光学顕微鏡による観察より、ポリグルタミンの発現とともに、細胞質にvacuolizationが認められた（図１−２ｄ、図１−３ｄ）。
＜実施例２＞  異常タンパク質ＭＪＤＱ７９とＶＣＰの結合およびシャペロンタンパク質（Ｈｓｐ７０、ＨＪＤ−２）による結合阻害の確認
（１）  伸張したポリグルタミン鎖を有する異常タンパク質として、マシャドジョセフ病原因タンパク質で、ポリグルタミンの長さが７９個であるＭＪＤＱ７９を選択した。
【００３２】
ＭＪＤＱ７９は、グルタチオンｓトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）の融合タンパク質として大腸菌に発現させた。
【００３３】
ＶＣＰは、in vitroで網状赤血球のライセートを用いて発現させ、35Ｓ標識した。
【００３４】
グルタチオンアガロースビーズに結合したＧＳＴ−ＭＪＤＱ７９と、35Ｓ−ＶＣＰを混合し、４℃以下でゆっくりとインキュベートした後（２時間）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、オートラジオグラフィーを行った。
（２）  シャペロンタンパク質（Ｈｓｐ７０、ＨＪＤ−２）をＶＣＰとともに、ＧＳＴ−ＭＪＤＱ７９に添加し、ＭＪＤＱ７９とＶＣＰとの結合阻害を起こすか否かを確認した。
【００３５】
図２（ａ）にオートラジオグラフィーの結果を示した。Ｉｎｐｕｔで添加した物質の量を１として、各反応系に添加した物質量を示した。
【００３６】
また、図２（ｂ）に図１（ａ）のレーン丸７、丸８、丸９、丸１１、および丸１２（図中▲７▼、▲８▼、▲９▼、・・・と表示：以下同じ）を数値化したグラフを示した。
【００３７】
図２（ａ）に見られるように、ＶＣＰ量を１としたとき、Ｈｓｐ７０の量が０、１、５と増加するに従い、ＶＣＰのバンドが濃くなった（図２（ａ）レーン丸７、丸８、丸９）。また、ＨＪＤ−２の量が０、１、５と増加するに従い、ＶＣＰのバンドが濃くなった（図２（ａ）レーン丸７、丸１１、丸１２）。これらのバンド濃度の上昇は、図２（ｂ）のグラフからも確認できた。つまり、Ｈｓｐ７０とＨＪＤ−２の添加量が増加するに従い、ＧＳＴ−ＭＪＤＱ７９とＶＣＰの相互作用が小さくなることが示された。
【００３８】
以上の結果より、ＶＣＰとＭＪＤＱ７９の結合がＨｓｐ７０およびＨＪＤ−２により阻害されていることが確認された。また、このような阻害は、Ｈｓｐ７０とＨＪＤ−２がそれぞれＧＳＴ−ＭＪＤＱ７９と結合するために生じると示唆された（図２（ａ）レーン丸１０、丸１３）。
（３）  ＭＪＤＱ７９タンパク質を35Ｓ標識し、in vitroで合成した。また、ＶＣＰをＧＳＴとの融合タンパク質として大腸菌に発現させた。
【００３９】
（１）と同様の操作により、ＧＳＴ−ＶＣＰと35Ｓ−ＭＪＤＱ７９の結合を確認した。
【００４０】
図２（ｃ）にオートラジオグラフィーの結果を示した。Ｉｎｐｕｔで添加した物質の量を１として、各反応系に添加した物質量を示した。
【００４１】
また、図２（ｄ）に図２（ｃ）のレーン丸１０、丸１１、および丸１２を数値化したグラフを示した。
【００４２】
図２（ｃ）に見られるように、ＭＪＤＱ７９のみをＧＳＴ−ＶＣＰと共存させたときと比較して、Ｈｓｐ７０を共存させたときのＭＪＤＱ７９のバンドが薄かった（図２（ｃ）レーン丸１０、丸１１）。また、ＭＪＤＱ７９、ＧＳＴ−ＶＣＰ、およびＨＪＤ−２を共存させた場合も、ＭＪＤＱ７９のみをＧＳＴ−ＶＣＰと共存させた場合に比べてバンドが薄くなった（図２（ｃ）レーン丸１０、丸１２）。
【００４３】
これらのバンド濃度の低下は、図２（ｄ）のグラフからも確認できた。つまり、Ｈｓｐ７０とＨＪＤ−２を添加した系では、ＭＪＤＱ７９とＧＳＴ−ＶＣＰの相互作用が小さくなることが示された。
【００４４】
以上の結果より、ＶＣＰとＭＪＤＱ７９の結合がＨｓｐ７０およびＨＪＤ−２により阻害されていることが確認された。また、このような阻害は、Ｈｓｐ７０とＨＪＤ−２がそれぞれＧＳＴ−ＶＣＰと結合するために生じることが示唆された（図２（ｃ）レーン丸１３、丸１４）。
＜実施例３＞  ポリグルタミン由来の神経変性のシャペロンタンパク質（Ｈｓｐ７０、ＨＪＤ−２）による緩和機構
ポリグルタミンによる神経変性は、Ｈｓｐ７０やＨＪＤ−２（Ｈｓｐ４０ファミリー）などのシャペロンタンパク質を過剰に発現させることにより、緩和できることが報告されている（Warrick J.M., Chan, H.Y., Gray-Board, G.L., Chai, Y., Paulson, H.L., Bonini, N.M., Nat. Genet. 23, 425-428 (1999); Kazemi-Esfarijani, P., Benzer, S., Science 287, 1837-1840 (2000); Muchowski, P.J., Schaffar, G., Sittler, A., Wanker, E.E., Hayer-Hartl, M.K., Hartl, F.U., Proc. Natl. Acad. Sci USA 97, 7841-7846 (2000)）が、これまで、これらのタンパク質がどのような機構でポリグルタミンの神経変性を阻害しているのかは、明らかにされていなかった。
【００４５】
前記実施例２の結果より、Ｈｓｐ７０とＨＪＤ−２がそれぞれＶＣＰとポリグルタミンを含むタンパク質にそれぞれ結合し、ＶＣＰと異常蛋白の結合と競合することにより、量依存的にその結合を阻害することが示された。
【００４６】
したがって、シャペロンタンパク質がＶＣＰとポリグルタミンとの結合を阻害することによってポリグルタミンの毒性を緩和するというメカニズムが明らかになった。
【００４７】
以上の結果から、シャペロンタンパク質の量、組み合せを変化させることにより、さらに強い結合阻害が期待できると考えられる。
【００４８】
すなわち、ポリグルタミンの毒性を緩和する薬剤のスクリーニングには、ＶＣＰとポリグルタミンの結合阻害を指標にすることが有効であることが確認された。
＜実施例４＞  アミロイドβタンパク質前駆タンパク質とＶＣＰの結合
アルツハイマー病の原因タンパク質として知られるアミロイドβタンパク質前駆タンパク質（ＡＰＰ：βセクレターゼ切断部位からγセクレターゼ切断部位まで）をin vitroで合成し、35Ｓで標識した。ＧＳＴ−ＶＣＰと35Ｓ−ＡＰＰを混合し、４℃で２時間インキュベートした後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、オートラジオグラフィーを行った。
【００４９】
ポジティブコントロールとして伸張したポリグルタミンを含むタンパク質（ＭＪＤＱ７９）を用い、ネガティブコントロールとしてグルタミン部分のドメインを含まないタンパク質（ＭＪＤΔＱ）を用いた。
【００５０】
図３にオートラジオグラフィーの結果を示した。図中に示されるとおり、各レーンは、左から、Ｉｎｐｕｔ（合成タンパク質）、ＧＳＴのみで泳動させたもの、ＧＳＴ−ＶＣＰで泳動させたものを示す。
【００５１】
実施例１および２と同様に、ポリグルタミンが存在するとき、ＶＣＰとタンパク質の結合が生じるが、ポリグルタミンが存在しないタンパク質は、ＶＣＰと結合しないことが確認された。
【００５２】
同じように、異常タンパク質であるＡＰＰは、ＶＣＰと結合することが確認された。
【００５３】
したがって、伸張したポリグルタミン鎖を含む異常タンパク質以外の異常蛋白質を原因とする神経変性疾患の一つであるアルツハイマー病についても、異常タンパク質（ＡＰＰ）とＶＣＰの結合を阻害する物質をスクリーニングすることによって、その予防薬や治療薬の有効成分となる物質を特定することができることが示唆された。
＜実施例５＞  Ｌｅｗｙ小体を伴う痴呆症（ＤＬＢ: Dementia with Lewy Bodies）におけるＬｅｗｙ小体とＶＣＰの結合
パーキンソン病と同様の脳幹病変に加え、大脳皮質においてもＬｅｗｙ小体が出現し、痴呆を呈する疾患であるＤＬＢの患者から採取されたＬｅｗｙ小体を抗ＶＣＰ抗体で染色した。
【００５４】
図４に示されるように、Ｌｅｗｙ小体は、抗ＶＣＰ抗体により染色された。
【００５５】
これより、ＤＬＢの表現型であるＬｅｗｙ小体とＶＣＰの結合の存在が確認された。したがって、このような結合を阻害する物質をスクリーニングすることにより、ＤＬＢの予防薬または治療薬となりうる物質を特定できることが示唆された。
＜実施例６＞  脊髄小脳変性症におけるのユビキチンポジティブな核内封入体とＶＣＰの結合
幼児期に発症し、急速に進行した脊髄小脳変性症のユビキチンポジティブな核内封入体を抗ユビキチン抗体および抗ＶＣＰ抗体でそれぞれ染色した。
【００５６】
図５より、ユビキチンポジティブな核内封入体は、抗ユビキチン抗体で染色される（図５（ａ））のと同様に、抗ＶＣＰ抗体によっても染色されることが確認された（図５（ｂ））。
【００５７】
これより、脊髄小脳変性症におけるユビキチンポジティブな核内封入体がＶＣＰと結合していることが確認された。したがって、このような結合を阻害する物質をスクリーニングすることにより、脊髄小脳変性症の予防薬または治療薬となりうる物質を特定することが可能となることが示唆された。
【００５８】
【発明の効果】
以上詳しく説明したとおり、この発明によって、神経変性疾患の予防薬や治療薬の有効成分とすることができる物質をスクリーニングする方法と、神経変性疾患の治療薬や予防薬の有効成分とすることができる物質をスクリーニングするためのスクリーニングキットが提供される。この発明のスクリーニング方法やスクリーニングキットを用いることにより、従来困難とされてきた神経変性疾患の予防薬や治療薬の研究、開発、製品化の加速化が大いに期待される。
【図面の簡単な説明】
【図１】この発明の実施例において、テトラサイクリンを除去することによりポリグルタミンを発現するＰＣ１２細胞中のＶＣＰタンパク質と発現されたポリグルタミンの局在を示した蛍光顕微鏡像および光学顕微鏡像である。（１−１）ＰＣ１２細胞の内在性ＶＣＰタンパク質（ａ）蛍光顕微鏡像，（ｂ）光学顕微鏡像；（１−２）テトラサイクリン除去から４８時間後の経過の蛍光顕微鏡像；（１−３）テトラサイクリン除去から９６時間経過後の蛍光顕微鏡像 （ａ）ＰＣ１２／Ｑ７９における、抗ＶＣＰ抗体（２次抗体＝ＦＩＴＣ標識抗ウサギ抗体）で染色した内在性ＶＣＰ，（ｂ）ＰＣ１２／Ｑ７９における、抗Ｆｌａｇ抗体（２次抗体＝texas red標識抗マウス抗体）で染色したポリグルタミンと、ＤＡＰＩ染色した核，（ｃ）ＰＣ１２／Ｑ７９における、抗ＶＣＰ抗体（２次抗体＝ＦＩＴＣ標識抗ウサギ抗体）で染色した内在性ＶＣＰと、抗Ｆｌａｇ抗体（２次抗体＝texas red標識抗マウス抗体）で染色したポリグルタミンの重ね合せ，（ｄ）ＰＣ１２／Ｑ７９の光学顕微鏡像。
【図２】この発明の実施例において、シャペロンタンパク質（Ｈｓｐ７０、ＨＪＤ−２）をＶＣＰとともに、ＧＳＴ−ＭＪＤＱ７９と共存させ、ＭＪＤＱ７９とＶＣＰとの結合阻害を起こすか否かを確認したオートラジオグラフィーの結果を示した図である。（ａ）ＶＣＰ、Ｈｓｐ７０、ＨＪＤ−２のＩｎｐｕｔを１として、ＧＳＴおよびＧＳＴ−ＭＪＤＱ７９と共存させるＨｓｐ７０もしくはＨＪＤ−２の量を変化させたときのＧＳＴ−ＭＪＤＱ７９とＶＣＰの相互作用；（ｂ）図２（ａ）におけるレーン丸７、丸８、丸９、丸１１、および丸１２（図中▲７▼、▲８▼、▲９▼、・・・と表示：以下同じ）を数値化したグラフ（ＧＳＴ−ＭＪＤＱ７９とＶＣＰの相互作用）；（ｃ）ＭＪＤＱ７９、Ｈｓｐ７０、ＨＪＤ−２のＩｎｐｕｔを１とし、ＧＳＴおよびＧＳＴ−ＶＣＰと共存させるＨｓｐ７０もしくはＨＪＤ−２の量を変化させたときのＧＳＴ−ＶＣＰとＭＪＤＱ７９の相互作用、（ｄ）図２（ｃ）におけるレーン丸１０、丸１１、および丸１２を数値化したグラフ（ＧＳＴ−ＶＣＰとＭＪＤＱ７９の相互作用）。
【図３】この発明の実施例において、アミロイドβタンパク質前駆タンパク質とＶＣＰの結合を示すオートラジオグラフィーの結果を示した図である。
【図４】この発明の実施例において、ＤＬＢにおけるＬｅｗｙ小体を抗ＶＣＰ抗体で染色した際の顕微鏡観察像を示した図である。
【図５】この発明の実施例において、ユビキチンポジティブな核内封入体を染色した際の顕微鏡観察像を示した図である。（ａ）抗ユビキチン抗体で染色；（ｂ）抗ＶＣＰ抗体で染色。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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