(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＣｇｐ−３９タンパク質及び医薬上許容し得る担体を含む医薬組成物。
【請求項２】
Ｔ細胞媒介軟骨破壊に罹患している患者にＨＣｇｐ−３９自己抗原に対する特異的Ｔ細胞寛容を誘発させる医薬製剤を製造するための、ＨＣｇｐ−３９タンパク質の使用。
【請求項３】
関節炎、より特定的には関節リウマチの罹患患者にＨＣｇｐ−３９自己抗原に対する特異的Ｔ細胞寛容を誘発させる医薬製剤を製造するための、ＨＣｇｐ−３９タンパク質の使用。
【請求項４】
ＨＣｇｐ−３９タンパク質を使用することを特徴とする、非ヒト哺乳動物に臨床的関節炎を誘発させる方法。
【請求項５】
活性化自己反応性Ｔ細胞を検出する方法であって、
（ａ）個体の血液試料から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を分離する段階、
（ｂ）適当な条件下に前記ＰＢＭＣを培養する段階、
（ｃ）ＨＣｇｐ−３９の存在下に、前記ＰＢＭＣをインキュベートする段階、及び
（ｄ）個体中の活性化自己反応性Ｔ細胞の存在を示すＴ細胞の応答を検出する段階
からなる前記方法。
【請求項６】
ＨＣｇｐ−３９を含む、活性化自己反応性Ｔ細胞の検出用テストキット。
【発明の詳細な説明】
本発明は、新規な自己抗原及び該抗原から誘導されたペプチド、自己免疫疾患の関節軟骨の慢性破壊の治療における該ペプチドの使用、該ペプチドを含む医薬組成物、テスト試料中の自己反応性Ｔ細胞を検出するための診断方法及び該方法に用いるテストキットに関する。
免疫系は、生来の自己抗原耐性により達成される、外来抗原（非自己抗原）と自己抗原（個体から誘導される自身の抗原）との識別原理に基づいて確立される。
免疫系は、外来抗原に対して個体を保護し、Ｔ及びＢリンパ球のような特異的細胞の活性化、インターロイキン、抗体及び補体因子のような可溶性因子の産生により外来抗原に対する暴露に反応する。免疫系が反応する抗原は、抗原提示細胞（ＡＰＣｓ）により分解され、該抗原フラグメントが主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスII糖タンパク質を結合した前記細胞表面上で発現する。ＭＨＣ糖タンパク質−抗原フラグメント複合体がＴ細胞に提示され、Ｔ細胞はそのＴ細胞レセプターによって抗原フラグメントと共に該フラグメントに結合したＭＨＣクラスIIタンパク質を認識する。Ｔ細胞は活性化される、即ち、増殖及び／又はインターロイキンを産生し、それによって標的抗原に対する活性化リンパ球が増大する（Ｇｒｅｙら，Ｓｃｉ．Ａｍ．２６１：３８−４６，１９８９）。
自己抗原も連続的にプロセスされ、ＭＨＣ糖蛋白質により抗原フラグメントとしてＴ細胞に提示される（Ｊａｒｄｅｔｓｋｙら．Ｎａｔｕｒｅ  ３５３：３２６−３２９：１９９１）。このように、自己認識は免疫系に本来備わっている。正常条件下には、免疫系は自己抗原耐性を有しており、該自己抗原による免疫応答の活性化が回避される。
自己抗原耐性が失われると、免疫系は１種以上の自己抗原に対して活性化され、その結果、自己反応性Ｔ細胞が活性化され、自己抗体が産生される。この現象は自己免疫と称される。一般に免疫応答は、破壊的、即ち、侵入する外来抗原を破壊するので、自己免疫応答は身体自体の組織の破壊を引き起こし得る。
Ｔ細胞が自己免疫疾患に寄与することはいくつかの実験により実証されている。マウスの場合、実験的自己免疫性悩脊髄炎（ＥＡＥ）は、ＭＨＣクラスII分子と複合したミエリン塩基性タンパク（ＭＢＰ）の単一エピトープに特異的に結合した高度に制限されたＴ細胞群により媒介される。種々の自己免疫疾患に対する高感受性種であるルイスラットの場合、疾患はＴ細胞によって媒介されることが示されている。ヒトの場合、自己免疫疾患は、自己攻撃性Ｔ細胞の発生に係わりがあるとも考えられる。
破壊的自己免疫応答は、関節軟骨の完全性が大量の活性化リンパ球及びＭＨＣクラスII発現細胞の存在に起因する慢性炎症プロセスによって破壊される慢性関節リウマチ（ＲＡ）のような種々の疾患に係わっている。単に軟骨が存在することが局所的炎症性応答の維持に必要であると思われる。軟骨の分解はＲＡにおける軟骨応答自己反応性Ｔ細胞の活性に係わりがあることが示された（Ｓｉｇａｌｌら，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｒｈｅｕｍａｔ．６：５９，１９８８；Ｇｌａｎｔら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．１８：７９６，１９９０；Ｂｕｒｍｅｓｔｅｒら，Ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｓｍｏｌｅｎ，Ｋａｌｄｅｎ，Ｍａｉｎｉ（編）Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ  Ｂｅｒｌｉｎ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，１９９２）。さらに、ＲＡ患者から手術により軟骨を除去すると、炎症性プロセスが低減することが示された〔Ｇ．Ｓ．Ｐａｎａｙｉら，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｒｈｕｍａｔｏｌ．１１（追補８）：Ｓ１−Ｓ８，１９９３〕。従って、軟骨タンパク質は、Ｔ細胞刺激能を有する標的自己抗原であると考えられる。これらの自己反応性Ｔ細胞の活性化により自己免疫疾患が発症する。
軟骨の破壊をもたらす炎症性応答は、例えば、ステロイド剤のような数種の薬剤で治療し得る。しかし、これらの薬剤はしばしば非特異的であり且つ毒性副作用を有する免疫抑制剤である。非特異的免疫抑制療法はその欠点のために、極めて好ましくない療法となっている。
抗原特異的非毒性免疫抑制療法は、非特異的免疫抑制療法に取って代わる極めて魅力的な代替療法である。該抗原特異的療法は、標的自己抗原又は該抗原から誘導された合成Ｔ細胞反応性ペプチドで患者を治療することを含む。これらの合成ペプチドは、自己抗原のＴ細胞エピトープに対応し、該ペプチド及び自己抗原の両者に対する特異的Ｔ細胞耐性の誘発に用いることができる。免疫系を、該系を活性化させる抗原そのもので脱感受性にするというのは矛盾しているようだが、標的（自己）抗原の調節投与は免疫系の脱感受性化に極めて有効であり得る。
Ｔ細胞媒介軟骨破壊の治療に耐性療法を効果的に用いるために、原因となる自己抗原を同定し、炎症性プロセスに係わるＴ細胞を活性化させる自己抗原に対して患者を脱感受性にし得るＴ細胞反応性ペプチドを見いだすことが大いに必要とされている。
本発明の目的は、自己抗原及び該抗原から誘導されたＴ細胞反応性ペプチドを提供することであり、該ペプチドは、Ｔ細胞媒介軟骨破壊に罹患している患者に原因性軟骨抗原に特異的なＴ細胞耐性を誘発させ得る。本発明の別の目的は、関節軟骨の破壊に係わる自己反応性Ｔ細胞の検出方法及び該方法に用いるテストキットを提供することである。
驚くべきことには、ヒト軟骨（Ｈｕｍａｎ  Ｃａｒｔｉｌａｇｅ）糖蛋白質３９（本明細書では以下ＨＣｇｐ−３９と称す）が、ＲＡ患者において、特異的Ｔ細胞を活性化して炎症性プロセスを生起又は媒介する標的自己抗原であることが見いだされた。ＨＣｇｐ−３９由来のペプチドは、主としてＲＡ患者由来の自己反応性Ｔ細胞により認識されたが、健康なドナー由来のＴ細胞によってはほとんど認識されず、これは、ＨＣｇｐ−３９がＲＡの自己抗原であることを示唆している。ＨＣｇｐ−３９の関節炎発症性（Ａｒｔｈｒｉｔｏｇｅｎｉｃ  ｎａｔｕｒｅ）はＢａｌｂ／ｃマウスにおいてさらに実証された。Ｂａｌｂ／ｃマウスに前記タンパク質を１回皮下注射して該動物に関節炎徴候を発生させた。ＨＣｇｐ−３９誘発疾患の経過は、前脚及び／又は後脚に周期的に発生し、軽度の関節炎からより重度の形態へと徐々に進行する再発を特徴としていた。さらに、炎症を起こした関節の対称的分布が、周期的に発生する再発、及び関節炎、特にＲＡにおける疾患の進行を表す小結節の形成を伴って認められた。
さらに驚くべきことには、ＨＣｇｐ−３９を投与することにより、免疫耐性が得られ、より重要なことには、関節炎の発症を遅延及び／又は抑制することが知見された。
ＨＣｇｐ−３９は、患者の血清にも健康な大人の血清にも存在するが、タンパク質の血清濃度は、患者では健康な大人の約２倍である。さらに、ＨＣｇｐ−３９をコードするｍＲＮＡは、ＲＡ患者から得られた滑液又は軟骨には見られるが、手術で得られた健康な大人の軟骨は有意な量の前記ｍＲＮＡを含んでいない。関節の軟骨細胞及び滑液細胞を培養すると、それらの主要分泌物はＨＣｇｐ−３９となる（Ｈａｋａｌａら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２６８巻，３４：２５８０３，１９９３）。ＨＣｇｐ−３９の関節炎発症性は、Ｈａｋａｌａらの刊行物にも他のいずれの刊行物にも記載されていなかった。
本発明の他の目的は、自己抗原ＨＣｇｐ−３９の部分配列（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ）を含むペプチドにより達成され、該ペプチドは、アミノ酸配列、ＦＧＲＳＦＴＬＡＳ（配列番号：１）、ＦＴＬＡＳＳＥＴＧ（配列番号：２）、ＹＤＤＱＥＳＶＫＳ（配列番号：３）及びＦＳＫＩＡＳＮＴＱ（配列番号：４）の中の１つ以上を含むことを特徴とする。
より具体的に言えば、本発明のペプチドは、アミノ酸配列、ＰＴＦＧＲＳＦＴＬＡＳＳＥ（配列番号：５）、ＲＳＦＴＬＡＳＳＥＴＧＶＧ（配列番号：６）、ＶＧＹＤＤＱＥＳＶＫＳＫＶ（配列番号：７）及びＳＱＲＦＳＫＩＡＳＮＴＱＳＲ（配列番号：８）の中の１つ以上を含む。
「部分配列（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ）」とは、「一部」と定義すべきものとし、全タンパク質を包含するものと誤解してはならない。本発明のペプチドは９〜５５個のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有するのが好ましい。本発明のペプチドが、９〜３５個、特に９〜２５個のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有するのがなお好ましい。９〜１５個のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有するペプチドがなお好ましく、例えば、配列番号：５〜８で示されているアミノ酸配列を有するペプチドのような１３又は１４個のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有するペプチドが特に好ましい。
例えば、モノマー配列同士が場合によりスペーサー残基を介して離間されていてもよいダイマー又はトリマーのような本発明ペプチドのマルチマーも本発明の範囲内に包含される。該マルチマーにより、配列番号：１〜８で示されている多くのＴ細胞エピトープが得られる。
本発明ペプチドにおいて、配列番号：１〜８で示されているアミノ酸配列は、ＨＣｇｐ−３９タンパク質又は前記アミノ酸配列が存在する他のタンパク質のアミノ酸配列中の対応アミノ酸に固有の隣接部位に対応し得る隣接領域が側面に位置してもよい。あるいは、該隣接領域は、ランダムなアミノ酸残基からなる非固有のアミノ酸配列であってもよい。これらの非固有の隣接部位を用いて、ペプチドを安定化し、それによって該ペプチドの生物学的利用性を増大させることができる。本発明ペプチドの生物学的利用性を増大させるには、非固有の隣接部位が好ましい。
配列番号：１〜４で示されているアミノ酸配列、より特定的には、配列番号：５〜８で示されている配列は、ＨＣｇｐ−３９上に存在するＭＨＣクラスII制限Ｔ細胞エピトープに類似している。ＨＣｇｐ−３９上のＭＨＣクラスII制限Ｔ細胞エピトープは、ＨＣｇｐ−３９のアミノ酸配列の１０３〜１１６、２５９〜２７１、２６３〜２７５及び３２６〜３３８領域で示される（シグナル配列の場合はメチオニンから出発する。Ｈａｋａｌａら，１９９３参照）。本発明によれば、ペプチドは、上記ＭＨＣクラスII制限Ｔ細胞エピトープを１つ以上含む自己抗原ＨＣｇｐ−３９フラグメントをも包含すると理解してよく、該フラグメントも本発明の範囲内に包含される。
本発明のペプチドはＴ細胞反応性ペプチドであり、該ペプチドは、活性化自己反応性Ｔ細胞により認識され、且つ該細胞を刺激し得る。該自己反応性Ｔ細胞は、ＲＡ患者の血液中には見られるが、健康なドナーにはめったに見られない。
本発明によれば、ＨＣｇｐ−３９タンパク質、又は標的自己抗原ＨＣｇｐ−３９上に存在するＭＨＣクラスII制限Ｔ細胞エピトープに類似の合成ペプチドは、例えば、関節炎、より特定的には関節リウマチのようなＴ細胞媒介軟骨破壊に罹患している患者にＨＣｇｐ−３９に特異的なＴ細胞耐性を誘発させる療法に用いるのに極めて好適である。
ＷＯ９５／０１９９５号及びＷＯ９５／０２１８８号は、ＲＡ用のマーカーとしてのＨＣｇｐ−３９の診断用使用を記載しているが、ＨＣｇｐ−３９の関節炎発症性は開示も示唆もされていない。抗原又はペプチド特異療法において、攻撃下の軟骨にＨＣｇｐ−３９に特異的なＴ細胞耐性を誘発させるために、ＨＣｇｐ−３９、そのフラグメント又は本発明のＴ細胞反応性ペプチドを用いることについては何ら示唆も提案もなされていない。
本発明ペプチドは、ペプチド合成用の公知有機化学法の１つを用いて製造される。ＨＣｇｐ−３９及び本発明ペプチドは組換えＤＮＡ法によっても製造し得る。
ペプチド合成用有機化学法は、ホモジニアス相又はいわゆる固相を用いた縮合反応による要求アミノ酸類の結合を含むものと考えられる。
縮合反応は、以下のように実施し得る：
（ａ）縮合剤の存在下に、遊離カルボキシル基及び保護された他の反応性基を含む化合物（アミノ酸、ペプチド）と、遊離アミノ基及び保護された他の反応性基を含む化合物（アミノ酸、ペプチド）とを縮合する；
（ｂ）活性化カルボキシル基及び遊離又は保護された他の反応性基を含む化合物（アミノ酸、ペプチド）と、遊離アミノ基及び遊離又は保護された他の反応性基を含む化合物（アミノ酸、ペプチド）とを縮合する。
カルボキシル基は、とりわけ、該基を、酸性ハロゲン化物、アジド、酸無水物、イミダゾリド又は活性化エステル、例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール、ｐ−ニトロフェニルエステル、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾールエステル又はペンタフルオロフェノールエステルに変換することにより活性化し得る。
上記縮合反応を実施するための最も一般的な方法は、Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ第１〜３巻（Ｇｒｏｓｓ，Ｅ及びＭｅｉｅｎｈｏｆｅｒ，Ｊ編）１９７９，１９８０，１９８１（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ）に記載のようなカルボジイミド法、アジド法、混合酸無水物法及び活性化エステルを用いる方法である。
「固相」を用いた本発明の上記ペプチドの適当なフラグメントの製造は、例えば、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９（１９６３）及びＩｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．３５：１６１−２１４（１９９０）に記載されている。製造すべきペプチドのアミノ酸の結合は通常カルボキシル末端部位から出発する。該方法の場合、反応性基が存在するか、又は該基を導入し得る固相を必要とする。固相は、例えば、反応性クロロメチル基を有するベンゼン及びジビニルベンゼンのコポリマー、又はヒドロキシメチル若しくはアミン官能基で反応性とした高分子固相であってよい。
特に好ましい固相は、例えば、Ｗａｎｇ（１９７４）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．９５：１３２８により記載のｐ−アルコキシベンジルアルコール樹脂（４−ヒドロキシ−メチルフェノキシ−メチル−コポリスチレン−１％ジビニルベンゼン樹脂）である。
所望のアミノ酸配列を合成した後、例えば、トリイソプロピルシラン、アニソール又はエタンジチオール，チオアニソールのようなスカベンジャーを含むトリフルオロ酢酸を用いて樹脂からペプチドを分離する。
上述のように、縮合反応に関与しない反応性基は、酸、塩基による加水分解又は還元により極めて容易に再除去し得る基によって効果的に保護される。カルボキシル基は、例えば、メタノール、エタノール、第３級ブタノール、ベンジルアルコール又はｐ−ニトロベンジルアルコールによるエステル化及び固体担体に結合したアミンにより効果的に保護し得る。
アミノ基を効果的に保護し得る基は、エトキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニル、ｔ−ブトキシカルボニル（ｔ−ｂｏｃ）若しくはｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル基、又はスルホン酸から誘導された酸性基、例えば、ベンゼンスルホニル若しくはｐ−トルエンスルホニル基であるが、置換若しくは非置換アリール若しくはアラルキル基のような他の基、例えば、ベンジル及びトリフェニルメチル、又はオルトニトロフェニルスルフェニル及び２−ベンゾイル−１−メチルビニルのような基を用いてもよい。特に適当なα−アミノ保護基は、例えば、塩基感受性９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基〔Ｃａｒｐｉｏｎ＆Ｈａｎ（１９７０）Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．９２：５７４８〕である。
使用可能な保護基についてのより包括的な記述は、Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１〜９巻（Ｇｒｏｓｓ，Ｕｄｅｎｆｒｉｅｎｄ及びＭｅｉｅｎｈｏｆｅｒ編）１９７９−１９８７（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）に見ることができる。
保護基は、個々の基の性質に応じて、例えば、トリフルオロ酢酸を用いて種々の慣用法により、又は、例えば、水素及びパラジウム若しくは氷酢酸中のＨＢｒのような触媒を用いた温和な還元により分離し得る。
既に上記に示したように、ＨＣｇｐ−３９及び本発明ペプチドは組換えＤＮＡ法によっても製造し得る。このためには、ＨＣｇｐ−３９又は本発明ペプチド若しくは該ペプチドのマルチマーをコードする核酸配列を発現ベクターに挿入する。適当な発現ベクターには、複製及び発現に必要な調節領域を含む、プラスミド、コスミド、ウイルス及びＹＡＣ（Ｙｅａｓｔ  Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ）が含まれる。発現ベクターは、宿主細胞中で発現させてもよい。適当な宿主細胞は、例えば、細菌、酵母細胞及び哺乳動物細胞である。そのような方法は当該分野において周知である（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，１９８９）。
免疫系を該系の活性化に関与する抗原そのもので脱感受性にすることは矛盾しているようであるが、ＨＣｇｐ−３９及び／又はＨＣｇｐ−３９の部分配列からなるペプチドの調節投与は、免疫系の脱感受性化に有効であり得る。本発明により、軟骨が自己応答性Ｔ細胞の攻撃下にある患者をＨＣｇｐ−３９又は本発明の１種以上のペプチド及び医薬上許容し得る担体を含む医薬組成物で治療し、攻撃下にある軟骨に、ＨＣｇｐ−３９及び配列番号１−８で示されるアミノ酸配列の１つを有する同定されたＴ細胞エピトープを有する他の自己抗原に特異的な自己反応性Ｔ細胞耐性を誘発させて炎症性応答を減少させることができる。本発明の医薬組成物用の極めて適当なペプチドは、配列番号５、６、７及び８で示されているアミノ酸配列を有するペプチドである。
本発明の医薬組成物用に極めて適当な他の物質は、ＨＣｇｐ−３９又は本発明の１種以上のペプチドをコードするＤＮＡを含むＤＮＡ（発現）ベクターである。ＤＮＡ（発現）ベクターを送り込むと、発現により、ＨＣｇｐー３９タンパク質又はペプチドを含む医薬組成物の直接投与により達成されるレベルに近いレベルの組換え体ＨＣｇｐ−３９タンパク質又は本発明ペプチドを得ることができる。
自己抗原及び本発明ペプチドは、自己反応性Ｔ細胞に対し特異的耐性化（ｔｏｌｅｒｉｚｉｎｇ）作用を有し、免疫系の他の成分に対しては、免疫抑制ステロイド剤の非特異的抑制作用と異なり何ら悪影響を及ぼさないという利点を有している。自己抗原又は本発明ペプチドによる治療は、安全であり且つ毒性副作用がない。
耐性は、高用量又は低用量の自己抗原又は本発明ペプチドを投与することにより達成し得る。自己抗原又はペプチドの量は、投与経路、投与時間、患者の年齢並びに全身的な健康状態及び治療食に依存する。
一般に、体重１ｋｇ当たり０．０１〜１０００μｇ、好ましくは０．５〜５００μｇ、より好ましくは０．１〜１００μｇの用量のペプチド又はタンパク質を用いることができる。
医薬上許容し得る担体は当業者には周知であり、例えば、滅菌塩水、ラクトース、スクロース、リン酸カルシウム、ゼラチン、デキストリン、寒天、ペクチン、落花生油、オリーブ油、ゴマ油及び水が含まれる。他の担体は、例えば、所望ならリポソームに包埋されたＭＨＣクラスII分子であってよい。
さらに、本発明の医薬組成物は１種以上のアジュバンドを含んでいてもよい。適当なアジュバンドには、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、アンフィゲン、トコフェノール、モノホスフェニル脂質Ａ、ムラミルジペプチド及びＱｕｉｌｌ  Ａのようなサポニンが含まれる。アジュバンドの量は、アジュバンド自体の性質に依存する。
さらに、本発明の医薬組成物は、例えば、ソルビトール、マンニトール、スターチ、スクロースデキストリン及びグルコースを含む炭水化物のような１種以上の安定剤、アルブミン又はカゼインのようなタンパク質、及びアルカリホスフェートのような緩衝剤を含んでいてもよい。
適当な投与経路は、筋肉内注射、皮下注射、静脈注射又は腹腔内注射、経口及び経鼻投与である。経口及び経鼻投与が好ましい投与経路である。
ＨＣｇｐ−３９又は本発明ペプチドは、その関節炎発症性により、非ヒト哺乳動物における臨床的関節炎の誘発に用い得る。少量のＨＣｇｐ−３９又は本発明の１種以上のペプチドを投与すると、前記哺乳動物に関節炎徴候が発生し、関節炎の疾患進行を表す疾患パターンが生じる。Ｂａｌｂ／ｃマウスにＨＣｇｐ−３９タンパク質を皮下注射すると、該マウスに関節炎徴候が発生した。ＨＣｇｐ−３９誘発疾患の経過は、前脚及び／又は後脚に周期的に発生し、軽度の関節炎から重度の形態へと徐々に進行する再発を特徴としていた。さらに、関節炎を起こした関節の対称的分布が、周期的な再発及び関節炎、特にＲＡの疾患進行を表す小結節の形成を伴って認められた。
これらの罹患動物は、関節炎の発症及び進行を引き起こすメカニズムの研究の適当な動物モデルとなる。さらに、該罹患動物は、関節炎治療用の新規な薬剤の研究及び関節炎の進行に及ぼす該薬剤の効果の研究に用いることができる。関節炎、特に関節リウマチ用の動物モデルとしてマウスを用いるのが好ましい。
前記哺乳動物に関節炎を誘発させるためには、適当量のＨＣｇｐ−３９又は本発明の１種以上のペプチドを投与しなければならない。適当量は、体重１ｋｇ当たり０．１〜１０００μｇ、好ましくは１〜１００μｇ、より好ましくは１０〜５０μｇである。ＨＣｇｐ−３９又はペプチドの量は、投与経路、投与時間及び用いる動物の種類に依存する。適当な投与経路は上述の通りである。関節炎誘発作用を誘発させるために、ＨＣｇｐ−３９タンパク質又は本発明ペプチドは上記の１種以上の安定剤又はアジュバンドを含み得る。
ＨＣｇｐ−３９又は本発明ペプチドは、関節軟骨の慢性炎症に係わる活性化自己反応性Ｔ細胞の存在を検出するための診断法に用いるのにも極めて適当である。
本発明の診断法は、以下の段階からなる：
（ａ）患者の血液試料から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を分離する段階、
（ｂ）適当な条件下に前記ＰＢＭＣを培養する段階、
（ｃ）自己抗原又は該抗原由来の本発明の１種以上のペプチドの存在下に前記ＰＢＭＣをインキュベートする段階、及び
（ｄ）患者の活性化自己反応性Ｔ細胞の存在を示すＴ細胞の応答、例えば増殖応答を検出する段階。
自己反応性Ｔ細胞の増殖応答の測定により応答を検出する場合、例えば3Ｈ−チミジンのような放射性同位体の取り込みが増殖の尺度である。ＰＢＭＣに存在する自己反応性Ｔ細胞の応答は、サイトカイン特異的ＥＬＩＳＡによるサイトカインの放出、又は51Ｃｈｒｏｍｉｕｍ放出による細胞毒性の測定によっても検出し得る。別の検出法は、ＦＡＣＳ分析による活性マーカー、例えばII−２Ｒの発現の測定である。本発明の１種以上のペプチド及び適当な検出剤を含む診断用組成物も本発明の一部を構成する。検出剤は、検出のタイプに応じて、放射性同位体、酵素又は細胞表面若しくは活性マーカーに特異的な抗体であってよい。
１種以上の本発明ペプチドを含むテストキットも本発明の範囲内に包含される。該テストキットは、本発明の診断法に用いるのに好適である。
従って、本発明は、ＨＣｇｐ−３９反応性である自己攻撃性Ｔ細胞が、例えば関節炎、特に関節リウマチのようなＴ細胞媒介軟骨破壊に罹患した患者に存在するかどうかを検出する方法を提供する。ＨＣｇｐ−３９特異的Ｔ細胞が存在する場合、ＨＣｇｐ−３９又は本発明ペプチド若しくはその組合わせを含む医薬組成物を用いて該Ｔ細胞を耐性化することにより、関節炎の発症を遅延又は抑制し得る。
以下の実施例は、本発明を例示するものであり、いずれの点においても本発明の範囲を限定するものと解釈してはならない。
図面の説明
図１：ＨＣｇｐ−３９耐性化及び非耐性化Ｂａｌｂ／ｃマウスにおける関節炎の発症及び進行。感作後の罹患動物の１日当たりの総関節炎スコアを前脚と後脚で示す。感作後の１日当たりの罹患動物の数も示す。
実施例１
方法
患者
Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（ＡＲＡ）基準（Ａｒｎｅｔｔら，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．３１：３１５，１９８８）に従って、ＲＡに罹患していると診断された患者から、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を回収した。ＲＡ患者の疾患の重篤度は、レントゲンスコアに従って測定されたＩ〜IV段階の範囲であった。
ＤＲ４Ｄｗ４（ＤＲＢ１＊０４０１）又はＤＲ１特異性を有する健康なドナーからＰＢＭＣを対照として回収した。ＲＡ関連ＤＲ分子を１つも有していない２人の健康なドナーからもＰＢＭＣを回収した。
ＭＨＣタイプの類別
Ｄｙｎａｌ  ＤＲ「低分解度（ｌｏｗ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）」ＳＳＰキットを用い、患者及び健康なドナーのＰＢＭＣ染色体ＤＮＡ抽出物を分析した。Ｄｙｎａｌ  ＤＲＢ１＊０４−ＳＳＰキット（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｒａｄｂｏｕｎｄ  ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｎｉｊｍｅｇｅｎ、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を用い、ＤＲ４のサブタイプを類別した。
ペプチド
本発明ペプチド及び対照ペプチドを固相ペプチド合成により合成した。簡単に言えば、ＰＥＧ−ＰＳ樹脂上のＦｍｏｃ／ｔＢｕ保護活性化エステルを用い、遊離アミノ末端及びカルボキシ末端を有するペプチドを、Ｍｉｌｉｇｅｎ９０５０合成装置上で合成した。開裂及び脱保護した後、分取用ＨＰＬＣによりペプチドを精製し、Ｄｏｗｅｘ  Ａｃ樹脂を用いて酢酸塩又はクロリド塩に変換し、凍結乾燥した。質量分析によりペプチドを調べた。この実験に用いたペプチドを表１に列挙する。Ｎ末端ビオチニル化Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｈａｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎｅ誘導ペプチド（配列番号：９）、第３残基（Ｙ）をＦで置換したビオチン−スペーサー−ＩＨＡ（３０７−３１９）Ｆ、（ビオチン−ＮＨ−（ＣＨ2）5−ＣＯ−ＰＫＦＶＫＱＮＴＬＫＬＡＴ）を、ＤＲ４Ｄｗ４（ＤＲＢ１＊０４０１）との結合実験におけるマーカーペプチドとして用いた。配列番号：９を有する非ビオチニル化ペプチドＩＨＡ（３０７−３１９）Ｆを対照ペプチドとして用いた。
0003755894.tif 000002
精製ＨＬＡ−ＤＲ分子を産生するための細胞培養
２種のＥＢＶ形質転換Ｂ細胞系、ＢＳＭ（Ａ２、Ｂ６２、Ｃｗ３、ＤＲ４Ｄｗ４、ＤＱ８、Ｄｐｗ２）及びＢＭ９２（Ａ２５、Ｂ５１、Ｃｗ１、ＤＲ４Ｄｗ１４、ＤＱ８）は、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｌｅｉｄｅｎ，ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓから恵与された。該細胞を、１０％ＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、１％非必須アミノ酸（ＩＣＩ）、Ｌ−グルタミン、２−ＭＥ及び抗生物質を追加したＤＭＥＭ／ＨＡＭ’ｓ  Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）中で培養した。細胞を１：２の比率で２〜３日ごとに慣用的に継代した。細胞を収穫した後、１ｍＭのＰＭＳＦを含むＰＢＳ（４℃）中で３回洗浄した。細胞ペレットを使用するまで―７０℃で貯蔵した。
ＨＬＡ−ＤＲ分子のアフィニティ精製
ＤＲ複合体（Ｌａｍｐｓｏｎら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２５：２９３，１９８０）上の非多形性決定基に対するモノクローナル抗体Ｌ２４３（ＡＴＣＣ  ＨＢ５５）を用い、細胞溶解物からＨＬＡ−ＤＲ分子をアフィニティ精製した。製造業者の指示に従って、タンパク質Ｇセファロース精製Ｌ２４３をＮＨＳ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  ＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に結合した。
ＨＬＡ−ＤＲ発現細胞を、ＰＢＳ、１％ＮＰ−４０、１ｍＭのＡＥＢＳＦ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）中、氷上で３０分間解凍・溶解した。溶解物を３０分間１５，０００ｒｐｍで遠心（Ｓｏｒｖａｌｌ，ＳＳ３４ローター）して清澄化した。上清を０．４５μｍのフィルターに通し、Ｌ２４３−ＮＨＳ−セファロースビーズに加えた。一晩インキュベートした後、ビーズをカラムに移し、５容量のＰＢＳ、１％ＮＰ−４０；５容量のＢＰＳ、０．５％ＮＯ−４０；１５容量のＰＢＳ、０．５％ＮＰ−４０、０．１％ＳＤＳ；５容量のＰＢＳ、０．０５％ＮＰ−４０；５容量のＰＢＳ、１％ｎ−オクチルグルコシド（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＵＳＡ）及び５容量の５０ｍＭジエチルアミン（Ｆｌｕｋａ）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％ｎ−オクチルグルコシド；ｐＨ８．０で洗浄した。ＨＬＡ−ＤＲ分子を、５０ｍＭジエチルアミン、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％ｎ−オクチルグルコシド、ｐＨ１１で溶離した。回収直後に、画分を２Ｍのグリシン（ｐＨ４．８）で中和した。回収した画分を、非還元条件下にＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分析した後、銀染色した。精製されたＨＬＡ−ＤＲを含む画分を３０ｋＤカットオフメンブラン上で限外濾過して濃縮した。
ＨＬＡ−ＤＲペプチド結合アッセイ
既に記載（Ｊｏｏｓｔｅｎら，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：７５１，１９９４）の改良型半定量結合アッセイを用い、ペプチド結合実験を行った。精製ＨＬＡ−ＤＲ分子（０．５〜５００ｎＭ）を、最終容量２５μｌの結合緩衝液（ＰＢＳ、１ｍＭのＡＥＢＳＦ、１ｍＭのＮ−エチルマレイミド、８ｍＭのＥＤＴＡ、１０μＭのペプスタチンＡ、０．０１％のＮａＮ3、０．０５％のＮＰ−４０及び５％のＤＭＳＯ）中、５０ｎＭのビオチニル化マーカーペプチド〔ビオチン−スペーサー−ＩＨＡ（３０７−３１９）Ｆ〕及び一定濃度範囲のコンペティターペプチド〔ペプチド１〜４及び対照ペプチドとしてＩＨＡ（３０７〜３１９）Ｆ〕と共に、ｐＨ５．０でインキュベートした。
室温で約４５時間インキュベートした後、結合及び非結合マーカーペプチドを、ニトロセルロースフィルター（ＢｉｏＲａｄ）上のブロッティングと組み合わせたＳＤＳ−ＰＡＧＥ、又はニトロセルロースフィルター（ＢｉｏＲａｄ）及び９６ウエルＨｙｂｒｙ  Ｄｏｔ装置（ＢＲＬ）を用いる真空ＤＯＴブロッティングにより分離した。ブロットを、０．１Ｍのマレイン酸（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭのＮａＣｌ中０．５％ＤＮＡブロキング試薬（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）でブロックした。３０分後、ブロットを、ＰＢＳ、０．０２％のＴｗｅｅｎ２０（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＵＳＡ）中で洗浄し、それぞれ１：４０，００又は１：５，０００希釈したＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ＨＲＰＯ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）と共にインキュベートした。製造業者の指示に従って、Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔ  ＥＣＬキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｕ．Ｋ．）を用いる増強化学ルミネセンスにより、ＤＲ結合したビオチニル化マーカーペプチドを検出した。予備フラッシュしたフィルム（ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ−ＥＣＬ，Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｕ．Ｋ．）を１０分間露出した。所与のペプチドの相対結合新和力はマーカーペプチドとの競合に関連していた。この相対親和力をシグナルが５０％に減少するペプチド濃度（RＩＣ50）と規定した。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥの場合、RＩＣ50値は、視覚的検査により測定した。コンピュータ計算方式のデンシトメーター（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ，ＵＳＡ）と、Ｉｍａｇｅ  Ｑｕａｎｔ及びＥｘｃｅｌソフトウエアを用い、ＤＯＴ  Ｂｌｏｔスポットの密度を分析した。
血液単核細胞の増殖応答
ＨＣｇｐ−３９内のペプチド配列に対するＴ細胞の反応性を同定するために、ペプチド１〜４を、ＲＡ患者からのＰＢＭＣ対健康なＤＲ１又はＤＲ４対照における該ペプチドの増殖応答誘発能についてテストした。
ヘパリン処理した静脈末梢血から得たＰＢＭＣを、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ勾配上で標準遠心により分離した。細胞を、平底マイクロタイタープレート中の１０％加熱失活自己血漿、Ｌ−グルタミン、２−ＭＥ及び抗生物質を追加した培地中、１．５×１０5細胞／ウエルの濃度で、３倍又は４倍に培養した。Ｃａｎａｄｉｄａ  Ａｌｂｉｃａｎｓ抽出物（リコール抗原）（１μｇ／ｍｌ、０．１μｇ／ｍｌ）又はペプチド１〜４の中の１種を１００μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌ又は１０μｇ／ｍｌの濃度で含む、培地のみ、又はＰＨＡ（２．５μｇ／ｍｌ）若しくは抗原の存在下の培地中で細胞をインキュベートした。５％ＣＯ2湿潤雰囲気下に３７℃で７日間、培養物を総量２１０μｌでインキュベートした。最後の１８時間の間に培養物に０．２５μＣｉ3Ｈ−チミジンを与えた。
定義
テストした少なくとも１種のペプチドの両濃度のものに対して応答した患者を高応答患者（ＨＲ）に、またテストした少なくとも１種のペプチドの少なくとも一方の濃度のものに応答した患者は応答患者（Ｒ）にそれぞれ分類した。従って、テストしたいずれのペプチドにも応答しなかった患者は非応答患者（ＮＲ）とした。
所与のペプチドの相対結合親和力は、マーカーペプチドとの競合に関連していた。この相対親和力をシグナルが５０％に減少したペプチド濃度（RＩＣ50）と規定した。
結果
ペプチド１〜４に対するＴ細胞の反応性を測定するために、ＲＡ患者及び健康なドナーのＰＢＭＣ増殖応答を分析した。
今までのところ、殆どのＨＲ又はＲは、ＨＣｇｐ−３９由来ペプチドに対して、ＲＡの発症に対するリスクの増大に関与することが知られているＤＲ１、ＤＲ４Ｄｗ４、ＤＲ４Ｄｗ１４又はＤＲ１０特異性を有していた。ペプチド１〜４とＤＲ４Ｄｗ４及びＤＲ４Ｄｗ１４との結合は表２に示す通りであった。
0003755894.tif 000003
殆どのＲＡ患者は、１種以上の本発明ペプチドに応答した（表３）が、健康なドナーグループでは殆ど応答が認められなかった（表４）。６人のＲＡ患者は、テストしたペプチドのいずれにも応答しないことが判明した（結果は示さず）。
ＲＡ患者の疾患の重篤度を段階Ｉ〜IVに分類した。ここに示されているレントゲンスコアは、関節破壊度の予測値である。ペプチド１〜４に対するＨＲ及びＲが疾患の全段階で認められた。
本発明ペプチドは、自己反応性Ｔ細胞エピトープを表し、該エピトープに対する反応性は、主にＲＡ患者に認められ、健康なドナーにはめったに認められなかった。従って、ＲＡ患者は、自己抗原ＨＣｇｐ−３９を指向する活性化自己反応性Ｔ細胞を有している。自己抗原ＨＣｇｐ−３９がＴ細胞の攻撃下にあり、それによって軟骨に炎症及びＨＣｇｐ−３９抗原の破壊がもたらされたことは明らかである。
0003755894.tif 000004
0003755894.tif 000005
実施例２
方法
ＭＧ６３骨肉腫細胞系からのＨＣｇｐ−３９の精製
ＭＧ６３細胞（ヒト骨肉腫ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １４２７）を、ＤＭＥＭ／ＨＡＭ’ｓ  Ｆ１２無血清培地中、細胞ファクトリーで培養した。ＨＣｇｐ−３９を、ヘパリンアフィニティークロマトグラフィー、次いでスーパーデックス（ｓｕｐｅｒ  ｄｅｘ）７５クロマトグラフィーにより、培養上清から精製した。純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥで検査した。さらに、Ｎ−末端アミノ酸配列分析から、精製されたタンパク質がＨａｋａｌａらにより記載のタンパク質と同一であることを確認した。
Ｂａｌｂ／ｃマウスにおけるＨＣｇｐ−３９の関節炎発症性
不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）中で１：１混合した、１００μｌ容量のＰＢＳ（０．５ＭのＮａＣｌ、０．０１Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．５）中１０μｇ又は５０μｇの精製ＨＣｇｐ−３９を、２×４雌Ｂａｌｂ／ｃマウス（Ｈａｒｌａｎ  ＣＰＢ，Ｚｅｉｓｔ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）の胸部に皮下注射し、４匹の対照にはＰＢＳ（ＩＦＡ中１：１）を注射した。関節炎の臨床的徴候についてマウスを毎日検査した。各脚について０〜３のスコア（Ｇｌａｎｔらによる文献に従って）をつけて関節炎の重篤度を評価した。簡単に言えば、スコア０は変化なし、スコア１は紅斑及びはれ（ｓｗｅｌｌｉｎｇ）、スコア２ははれ及び外観の変形、スコア３は屈曲及び伸長の損失による不動性状態を表す。
ＨＣｇｐ−３９の経鼻投与による耐性の誘発
ＰＴ４５マイクロ導管及びＨａｍｉｌｔｏｎ注射器を用い、１０匹の雌Ｂａｌｂ／ｃマウス（Ｅｎｆｌｕｒａｎｃｅで軽く麻酔した）に、２８μｇのタンパク質を経鼻投与した。関節炎誘発前１５日目、１０日目及び５日目に抗原を投与した。対照（ｎ＝１０）にも同様手順を課したが、ベヒクル（ＰＢＳ）のみを与えた（表５）。
１０μｇのタンパク質を用いて、上記感作後の遅延型過敏性（ＤＴＨ）応答を０日目に測定して免疫耐性を評価した。０日目の感作の後、５０μｇ容量中１０μｇのＨＣｇｐ−３９を８日目に左後脚の肉趾に注射した（チャレンジ）。ＤＴＨ反応を肉趾の増大量（[左のはれ(ｍｍ×１０-3)−右のはれ(ｍｍ×１０-3)]／右のはれ(ｍｍ×１０-3)）×１００％として測定した。企業内で設計したマイクロメーターを用い、チャレンジの０、２４および４８時間後に肉趾のはれを測定した。
次いで、同一マウスにおける関節炎誘発耐性を、感作後３１日目までさらにモニターし、臨床的徴候について毎日マウスを検査した。関節炎の重篤度を上記のように査定した。
0003755894.tif 000006
結果
ＨＣｇｐ−３９の関節炎発症性
ＩＦＡと混合した５０μｇのＨＣｇｐ−３９を１回注射した後、全てのマウスは徐々に重度の関節炎を発症した（表６）。関節炎徴候は、感作後１５〜２０日目に４匹の動物中３匹の前脚に認められた。前脚に何の徴候も示さなかったマウスは、感作後３４日目に後脚に関節炎を発症した。ＨＣｇｐ−３９誘発疾患の経過は、前脚と後脚に周期的に発生し、軽度の関節炎からより重度の関節炎へと徐々に進行していった再発を特徴としていた（疾患の進行を６２日間追跡した）。極めて頻繁に（＞５０％）関節炎を起こした関節の対称的分布が認められ、これは、両前脚又は両後脚が同時に関節炎徴候を示したことを意味する。
同様な方法で、但し５０μｇの代わりに１０μｇのＩＦＡ混合ＨＣｇｐ−３９を用いて関節炎を誘発させた。しかし、関節炎スコアは幾分低かった（データは示さず）。４匹のマウス中３匹が重度の関節炎を発症した。１匹のマウスは、実験期間中には軽度の徴候しか示さなかった。実験の全期間中、対照マウスは関節炎の徴候を全く示さなかった。
全体として、１０μｇと５０μｇのタンパク質のどちらもＢａｌｂ／ｃマウスに進行性関節炎を誘発させるに十分であった。関節の対称的罹患に加えて周期的な再発を特徴とするＨＣｇｐ−３９による関節炎誘発の慢性状態は、関節リウマチ（ＲＡ）の疾患進行を表す。
0003755894.tif 000007
ＤＴＨアッセイで測定した免疫耐性
ＨＣｇｐ−３９を０日目に注射した対照マウスは、強力な抗原特異的ＤＴＨ応答を示したが、これは、ＨＣｇｐ−３９に対する細胞性免疫応答が感作により誘発されたことを示している（表７）。しかし、ＨＣｇｐ−３９を経鼻投与すると、自己抗原でチャレンジしたときにＤＴＨ応答が完全に阻害されたが、これは、ＨＣｇｐ−３９特異的Ｔ細胞が実際に耐性化（ｔｏｌｅｒｉｚｅｄ）されたことを示している。
非耐性化グループの動物１０匹中４匹は、チャレンジ部位に隣接する膝に関節炎を起こしたことが認められた。対照的に、耐性化グループでは、チャレンジ部位に近接した関節に関節炎は発症せず、これは、ＨＣｇｐ−３９免疫耐性が関節炎の発症から保護したことを示している。
0003755894.tif 000008
関節炎の誘発又は進行に対する耐性
次いで、ＨＣｇｐ−３９耐性化及び非耐性化Ｂａｌｂ／ｃマウスを関節炎の発症及び進行についてさらにモニターした。
対照（非耐性化）グループの全てのマウスにおいて、ＨＣｇｐ−３９による感作後に疾患が発症した（表８）。７匹のマウスは徐々に重度の関節炎を発症したが、３匹のマウスは軽度の徴候（最高スコア２）を示したに過ぎなかった。対照的に、ＨＣｇｐ−３９耐性化グループ中の５匹のマウスは、実験期間中に疾患発症から保護された。さらに、耐性化グループ中の２匹の動物は、短期間の間に軽度の徴候を示したに過ぎなかったが、３匹の動物はスコア４というより重度の関節炎を発症した。
興味深いことには、耐性化動物において、関節炎の発症が後脚と前脚でそれぞれ最低７〜９日だけ遅延した（図１）。耐性化グループにおいては関節炎を発症した動物は少なかったが、動物１匹当たりの前脚の関節炎スコアは、非耐性化動物における関節炎スコアに匹敵するものであった。しかし、動物１匹当たりの後脚の関節炎スコアは、耐性化動物の方が幾分低かった（図１）。
0003755894.tif 000009
上記実験は、Ｂａｌｂ／ｃマウスにおけるＨＣｇｐ−３９の関節炎発症性を示している。ＨＣｇｐ−３９誘発疾患の経過は、前脚及び／又は後脚に周期的に発生し、軽度の関節炎からより重度の形態へと徐々に進行する再発を特徴としていた。さらに、関節リウマチの疾患進行を表す周期的な再発と共に、罹患関節の対称的分布が認められた。全ての動物に関節炎徴候を発生させた１０μｇ又は５０μｇのタンパク質を１回皮下注射することにより、ＨＣｇｐ−３９の強い関節炎発症性が示された。ＨＣｇｐ−３９特異的Ｔ細胞が実際にＨＣｇｐ−３９感作に応答して誘発されることが、ＨＣｇｐ−３９特異的ＤＴＨ応答の誘発により示された。これらのデータは、ＨＣｇｐ−３９で肉趾を免疫感作した動物でＨＣｇｐ−３９特異的ｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖応答が示されたことによりさらに確認された（データ示さず）。非耐性化動物が注射部位に近接する膝に関節炎を発症したことは重要であり、これは、関節炎の誘発にＨＣｇｐ−３９特異的Ｔ細胞が係わっていることを確実に示唆している。
ペプチド抗原の経鼻投与を用いて、抗原特異的免疫耐性を誘発させた。該実験により、ＨＣｇｐ−３９の経鼻投与により免疫学的非反応性が得られることが示された。感作後のＤＴＨ応答は、ＨＣｇｐ−３９耐性化マウスでは完全に阻害されたが、対照マウスは抗原特異的なはれを示した。これらの所見は、ＨＣｇｐ−３９の投与により末梢免疫耐性が得られることを示している。
非耐性化動物においては、マウス１０匹中４匹に、ＤＴＨ応答に付随して、膝（チャレンジ部位の近傍）に関節炎が認められた。対照的に、ＨＣｇｐ−３９耐性化動物の膝は実際に完全に保護され、これは、自己反応性Ｔ細胞が効果的に不活性化されたことを示している。ＨＣｇｐ−３９による耐性化が疾患発症から保護するという概念は、耐性化グループの動物１０匹中５匹が実験の全期間中完全に保護されたという所見によりさらに確認された。該グループの他の５匹の動物は臨床的徴候を発生したが、関節炎の発症はかなり遅れた。従って、ＨＣｇｐ−３９特異的Ｔ細胞が関節炎発症性プロセスに係わるということ、及びより重要なことには、本発明の医薬組成物で該Ｔ細胞を耐性化することにより、関節炎の発症が遅延又は抑制され得るとの結論を下すことができる。
〔配列表〕
配列番号：１
配列の長さ：９
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
0003755894.tif 000010
配列番号：２
配列の長さ：９
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
0003755894.tif 000011
配列番号：３
配列の長さ：９
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
0003755894.tif 000012
配列番号：４
配列の長さ：９
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
0003755894.tif 000013
配列番号：５
配列の長さ：１３
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
0003755894.tif 000014
配列番号：６
配列の長さ：１３
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
0003755894.tif 000015
配列番号：７
配列の長さ：１３
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
0003755894.tif 000016
配列番号：８
配列の長さ：１４
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
0003755894.tif 000017
配列番号：９
配列の長さ：１３
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
0003755894.tif 000018
【図１Ａ】
0003755894.tif 000019
【図１Ｂ】
0003755894.tif 000020
【図１Ｃ】
0003755894.tif 000021
【図１Ｄ】
0003755894.tif 000022