(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の式
0003759602.tif 000008
を有するパクリタキセル誘導体。
【請求項２】
次の式４ａ
0003759602.tif 000009
を有し、式４ｂと平衡状態にあるパクリタキセル誘導体。
【請求項３】
活性成分として請求項１又は２のパクリタキセル誘導体の有効量および医薬的に許容できる担体を含む抗新生物（腫瘍）医薬組成物。
【請求項４】
請求項１又は２のパクリタキセル誘導体を含む細胞毒性組成物。
【請求項５】
活性成分として請求項１又は２のパクリタキセル誘導体の有効量および医薬的に許容できる担体を含む癌細胞の増殖を阻止するための医薬組成物。
【請求項６】
方法がセファロマニンをオゾンと接触させることからなり、セファロマニンが構造
0003759602.tif 000010
を有する、セファロマニンを酸化して請求項１又は２の化合物を生成する方法。
【請求項７】
方法が
（ａ）セファロマニンを四酸化オスミウムで酸化してジオール誘導体を生成し、セファロマニンが構造
0003759602.tif 000011
を有し、そして
（ｂ）前記ジオール誘導体をジオール開裂剤と接触させて請求項１又は２の化合物を生成する、
工程を包含する、セファロマニンを酸化して請求項１又は２の化合物を生成する方法。
【請求項８】
前記ジオール開裂剤が過沃素酸塩からなる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
方法がセファロマニンを、過沃素酸塩またはヒドロペルオキシドの存在下にアルケン酸化出来る遷移金属触媒と接触させることを包含し、セファロマニンが構造
0003759602.tif 000012
を有する、セファロマニンを酸化して請求項１又は２の化合物を生成する方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
この発明はタキサン（taxane）誘導体に関する。さらに特定的には、この発明はセファロマニン（cephalomannine）の酸化生成物に関する。他の面において、この発明はセファロマニンからタキソール（taxol）誘導体を製造するための技術に関する。
背景技術
天然に存在しそしてTaxus brevifolia（即ち、太平洋イチイ樹木（the Pacific yew tree））および他のバイオマスから抽出される物質であるタキソール１は有意義なチューブリン（tubulin）結合を有するとして特定化されて来ており（Shiff, P.B.等によるNature第２７７巻第６６５頁〜第６６７頁（１９７９年２月）の“Promotion of Microtubule Assembly in vitro by Taxol”）そして細胞に加えられた場合に第III相治験（臨床試験）により示された細胞毒性活性を有するとして特定化されて来た。タキソールは最近、食品および薬品管理局（the Food and Drug Administration）により難治性卵巣癌の治療のために認可された。生物学的に活性なタキソール類似体がJ.Med.Chem. １９９２第３５巻第４２３０頁〜第４２３７頁に記載されているがしかし本発明のタキソール誘導体はそこには記載されていない。
改良された水溶性を有するタキソールの半合成誘導体であるタキソテレ（taxotere）２は第Ｉ相治験（臨床試験）においてタキソールと比較されて来た。タキソテレはチューブリン重合の促進剤としてやや高い活性があり、マウスマクロファージ様Ｊ７７４．２細胞においてのそしてＰ３８８マウス白血病細胞においての複製の阻止剤として１．５倍高い効能がありそしてタキソール耐性腫瘍細胞において少なくとも５倍高い効能がある（Pazdur R.等によるJournal of the National Cancer Institute  １７８１（１９９２）の“Pnase I Trial of Taxotere: Five-Day Schedule”）。タキソール１とタキソテレ２との間の構造的差は小さく（図１）、なお高められたインビトロチューブリン結合活性がタキソテレについて観察された。
したがって、全体的構造における小さい変化に基づくミクロチューブリン（microtubulin）重合活性についてのタキソール類似体の相対的効能を予言することは難しい。
キングストン（Kingston）の概説の検討（Kingston, D.G.I.によるPharmacology and Therapeutics  ５２第１頁〜第３４頁（１９９１）の“The Chemistry of Taxol”）はタキソール類似体の構造−活性関係の複雑さの全体的観察を提供している。小さい構造的変化がチューブリン結合活性および細胞毒性において主要な変化を生じさせる可能性があることは明らかである。これらの変化は活性を完全に排除させることでさえ可能である。さらに治療薬剤の有効な性質を評価するときに強く考慮しなければならない大きな水溶性および低い毒性のような他の因子が存在する。
本明細書において記載される新規な合成タキソール誘導体はこれまでに記載されたことがなくそしてそのような新しい誘導体がチューブリンアセンブリ（assembly）または有利な細胞毒性を示すだろうことを示唆した文献は存在しない。
発明の開示
タキソールに類似のインビトロチューブリン結合および細胞毒性活性を示す新しい化合物がいまや発見された。新しい抗新生物（腫瘍）タキソール誘導体はセファロマニン３の側鎖のアルケン部分の選択的酸化により誘導される。セファロマニンからのこの新しいタキソール誘導体の形成は今迄に記載されたことはなくそして新しい誘導体を高い収量で提供する。
この発明の目的は例えばミクロチューブリンインビトロのアセンブリを促進することにおいてそしてＢ１６悪性黒色腫細胞に対して細胞毒性活性において予想外に高い活性を示す新しい半合成タキソール誘導体を提供することである。
この発明の他の目的は腫瘍細胞の増殖を阻止するのに有効である製薬組成物を提供することである。
この発明の別の目的は新しいタキソール誘導体を製造するための方法を提供することである。
本発明のその他の目的および利点は以下の詳細な記載および添付図面から明らかになるだろう。
発明を実施するための最良の態様
この発明はタキソールに近接な天然類似体であるセファロマニン３を強い酸化剤、例えばオゾンで処理して良好な収量で新しい誘導体混合物を生成することに関する。セファロマニン出発物質は最近の刊行物（国際公開番号ＷＯ９２／０７８４２のRao,Koppaka V.による“Method for the Isolation and Purification of Taxane Derivatives”）において記載されているような従来の方法で単離されることが出来る。
−７８℃〜室温のセファロマニンのエーテルおよび（または）炭化水素および（または）アルコール性および（または）塩素化溶媒溶液を５〜１０００当量のオゾンで処理し、つぎに不活性ガスでパージすることによりα−ケト−アミド（ピルボアミド（pyruvamide））／α−ケタール−アミド誘導体混合物４ａ、４ｂの形成を生ずる（図２参照）。その転換は側鎖アルケンについて非常に選択的でありそして過剰酸化が避けられることが出来、即ち、もしチグレート（tiglate）アミド官能基（図１の化合物３のためのＲ参照）を完全に酸化するのに十分であり、一方では分子での他の場所の酸化をまた避ける量のオゾンが加えられるならば、環Ａ中のテトラ置換アルケンおよび他の官能基の酸化が防止されることが出来る。正しい化学量論はオゾン発生器を較正することによりそして高圧液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）を用いる反応をモニターすることにより決定される。ＨＰＬＣにより反応をモニターするための方法の記載は下の例の項に含まれる。
この後では４ａｂと称される新しい合成的に変性されたタキサン（taxane）誘導体混合物は分光分析により同定された。平衡混合物の1Ｈ−ＮＭＲおよび13Ｃ−ＮＭＲスペクトルはクロロホルム−ｄ（ＣＤＣｌ3）中において４：１の比で存在する４ａおよび４ｂの両方を示す。それらの化合物がメチル−ｄ3アルコール−ｄ（ＣＤ3ＯＤ）中で13Ｃ−ＮＭＲにより分析される場合、その比は約１：１に変化する。ＣＤＣｌ3溶媒中において、１９５．４ｐｐｍでのケトン（６’−４ａ）カルボニル共鳴は１０２．５ｐｐｍおよび１０５．４ｐｐｍ（４ｂについての２つのジアステレオ異性体）でのヘミケタール（６’−４ｂ）炭素共鳴より約４倍大きい。ＣＤ3ＯＤ溶媒中において１９７．２ｐｐｍでのケトン（６’−４ａ）カルボニル共鳴は、９７．９、１０１．９、１０４．２、１０５．１および１０６．５ｐｐｍでのケタール／ヘミケタール炭素共鳴とほぼ同じピーク高さ（非定量的13Ｃ−ＮＭＲ実験）である。ＣＤ3ＯＤにおける５つの異なるケタール／ヘミケタール炭素共鳴は４ｂにおいて表されるジアステレオ異性ケタール炭素、および４ａｂの開いた形態および閉じた形態への溶媒添加に起因する。その２つの形態４ａおよび４ｂは室温で溶液中で迅速に相互転換することがここで強調されるべきである。混合物の化学的変換に頼ることなしに一方の形態を他方の形態からそれだけ単離することは観察されなかった。
新しい合成タキサン誘導体混合物４ａｂは他の新しいタキサン誘導体への化学的転換により同定された。粗製オゾン分解反応混合物はピリジン中で無水酢酸で処理され（図３参照）で図示される２種の化合物（５および６）を生成した。図示されるように両方の化合物において、２’−ＯＨがアセチル化され、その結果出発物質（４ａｂ）についての開いた形態および閉じた形態の間の平衡は不可能である。同様な結果がピリジン中の塩化トリエチルシリルを用いてのシリル化の際に観察された（図４参照）。トリエチルシリル誘導体７は２’−ＯＨが封鎖されているので環化出来ない。本明細書にて記載された化合物のすべては分光学的技術によって同定された（合成法および特徴付けデータについて下の表題の例の項参照）。
新しい合成タキサン誘導体混合物４ａｂは異なる出発物質からの有機化学合成の追加の方法により合成された。図５において示されるようにジオール８は確立された方法論を用いてセファロマニンのジヒドロキシル化を経て手に入れることが出来る（Kingston,D.G.I. 等によるJournal of Natural Products第５５巻第２５９頁〜第２６１頁（１９９２）の“Modified Taxols 7.A Method for the Separation of Taxols and Cephalomannine”）。ジオール８が過沃素酸ナトリウムで処理される場合、（環化形態の４ｂと平衡において）予期された化合物４ａが非常に良好な収量で形成される。８の側鎖部分に類似のビシナルジオール官能基の酸化性開裂は、４ａのケトアミド基に類似のカルボニル化合物を生成することが知られている（SklarzB.によるQuarterly Reviews第３頁〜第２８頁（１９６７）の“Organic Chemistry of Periodates”）。本明細書で記載される方法論は４ａｂの他の構成の証明である。図５において示される合成方法は、オゾンをセファロマニンと反応させることからの生成物混合物（図２参照）と同一のスペクトルおよびクロマトグラフィ分析を有する生成物混合物を提供する。
化合物８におけるジオール官能基の開裂は有効量の酸化剤を用いることにより達成される。有効な酸化剤は過沃素酸およびその塩、四酢酸鉛、ビスマス酸ナトリウム、過沃素酸テトラブチルアンモニウム、二酸化マンガン、クロロクロム酸ピリジニウム及びマンガン酸カリウムを包含するが、しかしそれらに限定されない。列挙された酸化剤は酸化工程を行うことにおける有効性に従って階級付けされない。種々の可能な酸化剤の相対的な有効性は使用される濃度および反応の他の条件に従って左右される。
新しい合成タキサン誘導体混合物４ａｂはまた図５において示される二工程方法についての変更により合成されることが出来る。図６において示されるとおり、二相溶媒システム中の化合物３を過沃素酸ナトリウムおよび三塩化ルテニウム触媒で処理することにより４ａｂに同一のクロマトグラフィおよびスペクトル（紫外線）特徴を有する混合物を生ずる。３の側鎖部分に類似な内部アルケン官能基の過沃素酸ナトリウム／三塩化ルテニウム酸化性開裂は、４ａのケトアミド基に類似のカルボニル化合物を生成することが知られている（Carlsen, P.H.J. 等による、J.Org.Chem．第３９３６頁〜第３９３８頁（１９８１）の“A Greately Improved Procedure for Ruthenium Tetraoxide CatalyzedOxidations of Organic Compounds”）。同様な方法で、過沃素酸塩又はヒドロペルオキシド類のような酸化剤と組み合わせて使用される場合にジオール酸化が可能である他の遷移金属触媒は、セファロマニンの側鎖のアルケン部分の酸化性開裂のために使用されることが出来る。本明細書で記載される三塩化ルテニウム／過沃素酸塩酸化方法論は４ａｂの他の構成の証明を構成しそしてセファロマニン３からの４ａｂの合成のための第３の酸化方法を提供する。
新しい化合物混合物４ａｂはインビトロ試験で良好なチューブリン結合および細胞毒性活性を示す。そのインビトロ試験結果はタキソールについての結果に匹敵出来る。本明細書に記載されるセファロマニンおよび合成誘導体についてのチューブリン結合および細胞毒性のデータは比較のために包含される。チューブリン試験はＨｉｍｅｓにより記載されたとおりにして正確に行われた（Georg,G.I.等によるJ.Med.Chem．第３５巻第４２３０頁（１９９２）の“Synthesis of Biologically Active Tacxol Analogues with Modified Phenylisoserine Side Chains”）。そのデータについては表１参照。タキソールは参考のために表１に包含された。さらに各々のサンプルは、その欄、即ち（チューブリンアセンブリについての）ＥＤ50／ＥＤ50タキソールおよび（Ｂ１６増殖についての）ＥＤ50／ＥＤ50タキソールにおいてタキソールと比較される：タキソールはこれらの欄において約１の値を示す。これらの欄において、１より小さい数はタキソールより大きい活性を示す。これらの欄において１より大きい数はタキソールより低い活性を示す。試験における誤差は、±１０〜２０％であるように思われる。データは、α−ケトアミド−タキサン混合物４ａｂがインビトロチューブリンアセンブリおよびＢ１６増殖試験においてタキソールに匹敵出来るかまたはより優れている活性を有することを明らかに示している。これらの試験は癌の治療のためのタキソール誘導体の有力な効能を測定するためにこの分野における実験者に用いられて来て且つ信頼されて来た。表１におけるデータはまた構造的に類似なタキサン化合物間の活性における劇的な差を示す：例えば化合物４ａｂ、３および８についてのデータ参照。
新しいタキソール誘導体についての合成、同定、およびインビトロ試験方法は以下の例により例示される。
例：
化学
使用された全ての溶媒および化学剤は、使用されるまえに蒸留されたピリジンおよび無水酢酸以外は製造者から受け取ったとおりのそのまま使用された。反応は０．２０ｍｍのE.M. Industriesシリカゲル６０（アルミニウム支持体）シリカゲルプレートを用いての薄層クロマトグラフィ（“ＴＬＣ”）によりモニターされた。反応はまた高圧液体クロマトグラフィ（“ＨＰＬＣ”）によりモニターされた。ＨＰＬＣ分析のために粗製反応混合物の分別部分が３μｌマイクロピペットを用いて反応器から取り出され、そして（差し込みを有する）ＨＰＬＣサンプル小瓶中で２００μｌに希釈された。ＨＰＬＣ装置はモデルＬ−６２００ポンブ、モデルＡＳ−４０００またはＬ−３０００ＵＶ／ＶＩＳ／ＤＡＤ検出器（Hitachi Instruments, Inc.）からなる。その装置は４０Ｍハードドライブを有するＮＥＣ  ２８６コンピューターおよびLab Manager ＨＰＬＣソフトウェア（Hitachi Instruments, Inc.）を備えていた。使用されたＨＰＬＣカラムは、５μｍジフェニル物質（Supelco, Inc.）を詰めた４．６ｍｍｘ２５０ｍｍのフェニルカラム；４．６ｍｍｘ２５０ｍｍの５μｍ，６０オングストロームペンタフルオロフェニル（ＰＦＰ）カラム（ES Industries）；および４．６ｍｍｘ２５０ｍｍのフェニルガードカラム（Jones Chromatography）を含んだ。使用されたオゾン発生器は、７５ボルト、６０ヘルツ電流、５．５ｐｓｉｇ圧力および２．２ｍｇ／秒でのオゾン濃度を分配する２ＳＬＭＰの流れの操作性を有するPolymetrics Laboratory Ozonator Ｔ−８１６であった。オゾンの流れは製造者により記載された方法を用いて較正された。フラッシュクロマトグラフィのためのシリカゲル（２３０〜４００メッシュ）はScientific Productsにより供給された。参照のために残留非重水素化ＮＭＲ溶媒を用いるテトラメチルシランに対してｐｐｍで報告された化学シフトに関する1Ｈおよび13ＣＮＭＲスペクトルのために、Bruker ＷＰ−２７０及びＡＣＥ−３００、Varian Gemini ４００およびＪＥＯＬ  ＦＸ９０Ｑ分光計が用いられた。収量は、クロマトグラフィ的に純粋な化合物を参照しておりそして最適化されない。生成物の純度は、他のように述べない限り、分光測光的均質性の基準にもとづいて９０％より大であると判断された。質量スペクトルはVG Analitical ２−ＳＥ高視野質量分光計を用いるM-Scan Inc．で測定された。分光分析はXAD-Plus顕微鏡を備えたAnalect Diamond-20 FTIRを用いて測定された。その器具は２００Ｍハードドライブを有するACR Advanced Logic Research ４８６コンピューターおよびAnalect FX ８０ソフトウェアパッケージを備えていた。
例  １：
α−ケトアミド  ４ａ
ＣＨＣｌ3（５ｍｌ）中に溶解したセファロマニン３（１７８ｍｇ）を室温で９０秒間オゾン（２．２ｍｇ／秒）で処理し、次に蒸発させて定量的収量の異性体混合物４ａｂを得た。その主要な異性体についての共鳴が挙げられる。
0003759602.tif 000002
ＣＤＣｌ3中の少量の異性体（４ｂの２種のジアステレオ異性体の炭素６’）についての13Ｃ−ＮＭＲスペクトルにおける識別（診断、diagnostic）シグナルは、１０２．５２および１０５．３５ｐｐｍである。４ａおよび４ｂの両方への溶媒添加（ＣＤ3ＯＤ）を包含する、４ａｂについてのＣＤ3ＯＤ中の識別（診断）シグナルは炭素６’について９７．９、１０１．９、１０４．２、１０５．１および１９７．２ｐｐｍである。
0003759602.tif 000003
質量スペクトル（ＦＡＢ，グリセロール／チオグリセロールマトリックス）ｍ／ｚ  ８２１（Ｍ＋１）+。
例  ２：
２’−アセチル−α−ケトアミド５および２’，７−ビス（アセチル）−α−ケトアミド６
ＣＨ2Ｃｌ2（４ｍｌ）中のセファロマニン３（３２０ｍｇ）を２０５秒間オゾン（２．２ｍｇ／秒）で処理し、窒素でパージしそして蒸発乾燥させた。ＣＨ2Ｃｌ2（１．５ｍｌ）中の酸化されたセファロマニンを０℃に冷却し、無水酢酸（０．１４５ｍｌ）およびピリジン（０．１５６ｍｌ）を順次加えた。反応混合物を２時間０℃でかき混ぜ、次に室温で追加の２１時間かき混ぜた。塩化メチレンで希釈後、その混合物を３Ｎ  ＨＣｌ（３ｘ）、飽和ＮａＨＣＯ3および塩水で洗浄した。溶液をＭｇＳＯ4上で乾燥しそして蒸発させた。シリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィ（４５／５５、５５／４５、７５／２５の酢酸エチル／ヘキサン）は２種の生成物を提供した。第１は５に相当する１９１ｍｇ（５８％、白色、Ｒf＝０．１６、５０／５０酢酸エチル／ヘキサン）であった。
0003759602.tif 000004
質量スペクトル（ＦＡＢ、ｍ−ニトロベンジルアルコールマトリックス）ｍ／ｚ８６３（Ｍ＋１）+  第２は６に相当する９８ｍｇ（２８％、白色、Ｒf＝０．３４、５０／５０の酢酸エチル／ヘキサン）であった。
0003759602.tif 000005
質量スペクトル（ＦＡＢ、ｍ−ニトロベンジルアルコールマトリックス）ｍ／ｚ９０５（Ｍ＋１）+
例  ３：
２’，７−ビス（トリエチルシリル）−α−ケトアミド７
ピリジン（４．６ｍｌ）中に溶解したα−ケトアミド４ａ（７５．５ｍｇ）に塩化トリエチルシリル（０．３１ｍｌ）を加えた。反応混合物を２２時間室温で混合し、次にＣＨ2Ｃｌ2で希釈した。有機相を３Ｎ  ＨＣｌ（２ｘ）、飽和ＮａＨＣＯ3および塩水で順次洗浄した。次にそれをＭｇＳＯ4上で乾燥しそして蒸発させて固体にした。シリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィ（２５／７５の酢酸エチル／ヘキサン）は３９ｍｇ（４１％）の白色固体（Ｒf＝０．２４、２５／７５の酢酸エチル／ヘキサン）を提供した。
0003759602.tif 000006
質量スペクトル（ＦＡＢ、ｍ−ニトロベンジルアルコールマトリックス）ｍ／ｚ１０４９（Ｍ＋１）+
例  ４：
セファロマニンジオール８
セファロマニン３をキングストン（Kingston）により記載されたとおりにして酸化した（化学量論反応）（Kingston,D.G.I. 等によるJournal of Natural Products第５５巻、第２５９頁〜第２６１頁（１９９２）の“Modified Taxols 7. A Method For The Separation of Taxol And Cephalomannine”）。その分光測光分析はキングストンの報告した値に相当する。
例  ５：
ジオール８からのα−ケトアミド４ａ
ジオール８（７９ｍｇ）をＴＨＦ（０．４００ｍｌ）中に溶解し、そして水（０．３４２ｍｌ）およびＮａＩＯ4（５９ｍｇ）を加えた。５分間かき混ぜた後に、白色沈殿が現れそして２０時間の反応時間の後に、ＨＰＬＣによる分析は反応が完了したことを示した。それを回転蒸発器により蒸発させ、ＥｔＯＡｃ／水で元の状態に戻し、そして分離した。水性層をＥｔＯＡｃで再び抽出しそして合併した有機液を飽和Ｎａ2ＳＯ3及び塩水で洗浄した。混合物をＭｇＳＯ4上で乾燥しそして蒸発させて６２ｍｇ（８３％）の白色固体を生成した。このサンプルについてのデータ（1Ｈ−ＮＨＲ、13Ｃ−ＮＭＲ、ＩＲおよびＦＡＢ−ＭＳ）はセファロマニンのオゾン分解により造られた化合物４ａｂについてのデータ（例１参照）と正確に合致した。
例  ６：
ＲｕＣｌ3／過沃素酸塩酸化によるセファロマニン３からのα−ケトアミド４ａ
セファロマニン３（２４．６ｍｇ）を四塩化炭素（０．０６ｍｌ）、アセトニトリル（０．０６ｍｌ）および水（０．０９２ｍｌ）に溶解した。この二相混合物にＮａＩＯ4（２６．３ｍｇ、４．１当量）および三塩化ルテニウム（０．１５ｍｇ；２．２モル％）を加えた。５分間かき混ぜた後に、赤色／褐色沈殿物が現れそして１時間後に反応をストップさせた。それを塩化メチレンで整え、塩水で洗浄しそして無水ＭｇＳＯ4上で乾燥した。濃縮して淡黄色固体にした後に、サンプルをＨＰＬＣにより分析した。サンプルの保持時間、ピーク形状およびＵＶスペクトルが４ａｂの以前に造られていたサンプルと比較された。このサンプルについてのデータはセファロマニンのオゾン分解により造られた化合物４ａｂについてのデータ（例１参照）と正確に合致した。
例  ７：
生物学的試験：Ｂ１６悪性黒色腫細胞増殖
７．５ｘ１０4細胞／井戸状くぼみ（ウエル）で、２４−ウエルのプレートに細胞を種付けしそして５．５％ＣＯ2の９７％湿度の雰囲気中で２４時間３７℃で、１０％子牛血清含有Dulbeccoの修正最小必須培地（ＭＥＭ）にて増殖させた。培地は次にタキソールまたはその誘導体を含有しそしてタキソールおよび他の誘導体について７．５ｘ１０-9Ｍ〜１ｘ１０-7の範囲の濃度にＤＭＳＯ中に溶解された新しい培地と取り換えた。細胞培地におけるＤＭＳＯの最終濃度は０．５％またはそれ以下であった。この量のＤＭＳＯは対照実験から測定されたときに細胞増殖に何らの影響も有しなかった。４０時間後、細胞をトリプシン処理により解離・離散させそしてCoulterカウンターで計数した。
チューブリン製造およびアセンブリ
微小管結合たんぱく質から遊離したチューブリンを以前に記載されたとおりにして牛の悩から精製した（Algaier, J.:Himes, R.H.によるBiochim. Biophys. Acta第９５４巻第２３５頁〜第２４３頁（１９８８）の“The Effect of Dimethyl Sulfoxide on the Kinetics of Tubulin Assembly”）。そのアセンブリ反応はタキソールまたはタキソール類似体及び０．５ｍＭのＧＴＰの存在下に１ｍｇ／ｍｌ（１０μＭ）の蛋白質濃度でＰＥＭ緩衝液（０．１ＭのＰＩＰＥＳ（ピペス）、ｐＨ６．９、１ｍＭのＥＧＴＡ及び１ｍＭのＭｇＳＯ4）中で３７℃で行った。反応は３５０ｎｍでの見掛けの吸光度での増加によりモニターされた。
0003759602.tif 000007
ａ：メタノール（０．５ｍｌ）を各々の小瓶に加えた。吸光係数から濃度が測定された（吸光度は２２７ｎｍでのメタノール中の１％重量／容量（ｍｇ／ｍｌ)溶液のものである）。
ｂ：１ｍｇ／ｍｌでのチューブリンは０．５ｍｌのＰＥＭ緩衝液（０．１ＭのＰＩＰＥＳ（ピペス）、１ｍＭのＥＧＴＡ、１ｍＭのＭｇＳＯ4、ｐＨ６．９）中で１５分間３７℃で種々の濃度の化合物でインキュベートされた。サンプルは遠心分離されそして上澄み液上の蛋白質濃度が測定された。
ｃ：Ｂ１６悪性黒色腫細胞は３７℃で４０時間の間種々の濃度の化合物でインキュベートされた。
ｄ：５０％だけ上澄み液蛋白質濃度を減少させるｎｇ／ｍｌでの濃度。
ｅ：対照に比較して５０％だけ細胞の数を減少させるｎｇ／ｍｌでの濃度。
ｆ：５０％阻害を達成することなしに用いられた最高濃度。
ｇ：アセンブリ検定試験においてタキソールについてのＥＤ50は０．８５μｇ／ｍｌであった。Ｂ１６検定試験において、それは２２．７ｎｇ／ｍｌであった。
ｈ：アセンブリ検定試験においてタキソールについてのＥＤ50は０．８５４μｇ／ｍｌであった。Ｂ１６検定試験についてそれは２２．５ｎｇ／ｍｌであった。
ｉ：アセンブリ検定試験においてタキソールについてのＥＤ50は０．９７μｇ／ｍｌであった。Ｂ１６検定試験においてそれは２２．７ｎｇ／ｍｌであった。
ｊ：５０％阻害を達成することなしに用いられた最も高い濃度は８５４ｎｇ／ｍｌであった。
【図１】
0003759602.tif 000013
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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