(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくともアミノ酸配列Gly-X1-D-β-Asp-Ala（X1はLeuあるいはValを示す）を認識する抗体を用い、皮膚組織を検体とすることを特徴とする、ヒト老化マーカーの検出方法。
【請求項２】
請求項１に記載された皮膚組織を検体とする検出方法に用いる試薬であって、少なくともアミノ酸配列Gly-X1-D-β-Asp-Ala（X1はLeuあるいはValを示す）を認識する抗体を含むことを特徴とするヒト老化マーカーの検出用試薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、ヒト老化マーカー及びストレスマーカーを認識する抗体を用いるそれらマーカーの検出方法及び検出用試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、老化マーカーあるいはストレスマーカーに対する抗体、およびそれら抗体を利用したマーカーの検出法は存在する。例えば、ヒト老化マーカータンパク質ＳＭＰ30に対する抗体及び抗体を用いるヒトＳＭＰ30の測定方法は、特開平７−９７３９９及び特開平８−３１９２９８に示されている。その場合、老化するほどＳＭＰ30の血中濃度が下がることを利用した老化モニタリング、あるいは肝障害や腎障害でＳＭＰ30の血中濃度が増大することを利用した肝細胞障害モニタリング及び腎細尿管の破壊モニタリングに使用される。
【０００３】
また特開平７−１８１１８０に示されるように、骨格筋由来のストレスタンパク質ｐ20に対する抗体は、例えば、患者血清あるいは血漿中のストレスタンパク質ｐ20の濃度測定を可能にし、生体の受けたストレスの程度を測定することができる。さらには、Biochem. J. (2000) 345, 473-480及びBiochem. J. (2000) 345, 481-485に示されるように、Ｉ型コラーゲンα1鎖Ｃ末端テロペプチド由来の4種類の異性体ペプチド断片  （Asp1211がそれそれ、aL体, aD体, βL体, 及びβD体）に対する抗体は、尿中の各ペプチド断片の定量を可能にし、コラーゲン分子の老化、コラーゲン代謝、骨代謝の測定、及び骨代謝異常の診断に有効である。
【０００４】
本発明者らは、ヒトのレンズに含まれるαAクリスタリンにおいて、老化とともに鎖中Asp の異性体が蓄積することを報告してきた。さらに本発明者らは、Molecular Vision (2000) 6, 1-5に示されるように、Asp151がβD体であるαAクリスタリンに対して特異的な抗体を用いて、その異性体タンパク質が老化したレンズのコア部分に局在することを明らかにした。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、ヒト老化マーカー及びストレスマーカーを認識するAsp151がβD体であるαAクリスタリンに対して特異的な抗体を提供し、この抗体を組織・細胞に適用して、人の老化又は人のストレスのマーカーを検出するための方法及び検出試薬を提供することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは鋭意研究した結果、Asp151がβD体であるαAクリスタリンに対して特異的な抗体が、レンズ以外の組織中に存在する老化マーカーあるいはストレスマーカーに成り得る物質と反応することを見い出した。例えば、老人顔面皮膚内のエラスチン繊維、顔面脂漏性角化症の皮下組織、さらには老人皮膚組織の血管内皮が、本発明の抗体と際立った反応を示すことを明らかにした。さらにこれら抗体を用いた免疫学的検定法、及び免疫学的試薬を開発し本発明を完成した。
【０００７】
すなわち本発明はAsp151がβD体であるαAクリスタリンに対する抗体を用いて、ヒト組織の老化マーカーあるいはストレスマーカーを検出し、組織の老化の度合、ストレス度、及び病的変化をモニターすることができる。
【０００８】
本発明は、
１．下記の群より選ばれるポリペプチド又は該ポリペプチドを有するタンパク質を免疫学的に認識する抗体を用いることを特徴とする、ヒト老化マーカー及びストレスマーカーの検出方法；
▲１▼N末端より151番目のアスパラギン酸がD-β-アスパラギン酸（D-β-Asp）であるaAクリスタリン、
▲２▼N末端より151番目のアスパラギン酸がD-β-アスパラギン酸であるaAクリスタリン由来であるポリペプチド断片、
▲３▼アミノ酸配列がGly-X1-D-β-Asp-Alaを含むポリペプチド（X1は疎水性アミノ酸を示す）、
▲４▼アミノ酸配列がGly-X1-D-β-Asp-Alaを含むポリペプチド（X1はLeuあるいはValを示す）
▲５▼前記▲１▼〜▲４▼のポリペプチドと少なくとも約５０％のアミノ酸配列上の相同性を有するポリペプチド、
▲６▼前記▲１▼〜▲４▼のアミノ酸配列において、１ないし数個のアミノ酸の欠失、置換、付加あるいは挿入といった変異を有するポリペプチド。
２．前項１に記載のいずれか一に記載された検出方法に用いることを特徴とするヒトの老化マーカー又はストレスマーカーの検出用試薬。
に関するものである。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明の抗体は、以下のタンパク質又はポリペプチドを免疫原として常法により調製される。▲１▼Asp151がβD体であるαAクリスタリン、▲２▼このαAクリスタリン由来のポリペプチド断片、▲３▼▲４▼アミノ酸配列がGly-X1-D-β-Asp-Alaを含むポリペプチド（X1は疎水性アミノ酸を示し、好ましくはLeuまたはValが例示される）、▲５▼これらポリペプチドと少なくとも約５０％以上、好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、さらに好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するポリペプチド、のアミノ酸配列上の相同性を有するポリペプチド、▲６▼これらポリペプチドのアミノ酸配列において、１ないし数個のアミノ酸の欠失、置換、付加あるいは挿入といった変異を有するポリペプチドが免疫原として例示される。
【００１０】
免疫原として、利用されるポリペプチドは、その最小単位としては少なくともβD体のAsp151部位を保持し、３個以上のアミノ酸、好ましくは４個以上のアミノ酸、より好ましくは６個以上、さらに好ましくは８個以上の連続するアミノ酸で構成されるアミノ酸配列からなり、好ましくは免疫学的に同定しうるポリペプチド又はペプチドを本発明の対象とする。これらのペプチドは、単独又はキャリア（例えば、キーホールリンペイトヘモシアニン又は卵白アルブミン）と結合して使用できるが、これらのように別種のタンパク質又は物質を結合したものも本発明の範囲に包含される。
【００１１】
さらに、このように特定されたポリペプチドは、１以上、例えば１〜１００個、好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１０個で特に好ましくは１ないし数個のアミノ酸の欠失・置換・付加あるいは挿入といった変異を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド又はペプチドも利用可能である。欠失・置換・付加あるいは挿入の手段は自体公知であり、例えば、部位特異的変異導入法、遺伝子相同組換え法、プライマー伸長法又はポリメラーゼ連鎖増幅法（ＰＣＲ）を単独又は適宜組み合わせて、例えば、Molecular Cloning;A Laboratory Manual、第２版、Sambrookら編、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク、1989年；［ラボマニュアル遺伝子工学］、村松正實編、丸善株式会社、1988年；［ＰＣＲテクノロジー、ＤＮＡ増幅の原理と応用］、Ehrlich,HE.編、ストックトンプレス、1989年等の成書に記載の方法に準じて、あるいはそれらの方法を改変して実施することができ、例えばＵｌｍｅｒの技術（Science(1983)219:666）を利用することが出来る。
【００１２】
上記のような免疫原に用いるポリペプチドは、例えば常法に従ったペプチドの化学合成で十分量得ることができる。このうち、より簡単には、固相法による市販のペプチド合成機を用いる方法がある。すなわち、ポリマー性の支持体にペプチド断片のC末端側から、そのアミノ酸残基に対応した保護アミノ酸を縮合させペプチド結合を形成させる。縮合方法としては、例えば、DCC法、酸無水物法、活性エステル法等の方法を使用することができる。αアミノ基の保護基としてはBoc基又はFmoc基が使用できる。例えば、ペプチド自動合成機を用いて合成する時には、その装置のマニュアルに従い適宜アミノ酸の性質を考慮して合成方法を選択するのが好ましい。
【００１３】
抗体を産生するためには、上記ポリペプチドからなる免疫原を、アジュバントの存在又は非存在下で、単独又は担体に結合して、動物に対して体液性応答及び／又は細胞性応答等の免疫誘導をおこなうことによって行われる。担体は、それ自体が宿主に対して有害作用をおこさなければ、特に限定されず例えばセルロース、重合アミノ酸、アルブミン等が例示される。免疫される動物は、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウマ等が好適に用いられる。ポリクローナル抗体は、自体公知の血清からの抗体回収法によって取得される。好ましい手段としては、免疫アフィニティークロマトグラフィー法である。
【００１４】
モノクロ−ナル抗体を生産するためには、上記の免疫手段が施された動物から抗体産生細胞（例えば、脾臓又はリンパ節由来）を回収し、自体公知の永久増殖性細胞（例えば、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８株等のミエローマ株）への形質転換手段を導入することによって行われる。例えば、ペプチド断片をアジュバントと共にマウス、ラット等に注射し、抗体価が高くなった状態で脾臓を摘出し、その脾細胞をポリエチレングリコール等のような融合剤を用いてミエローマ細胞と融合させ、その融合細胞群より当該抗体を産生するクローンを選択し増殖させ、腹腔中あるいは培養液中で大量細胞培養することにより、製造することができる。実例としては、ハイブリドーマ法（Kohler,G. and Milstein,C., Nature(1975)256:495-497）；トリオーマ法（Kozbor et al., Immunology Today(1983)4:72）；及びＥＢＶ−ハイブリドーマ法（Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R Liss,Inc.,(1985):77-96）に記載されるような種々の技法がある。
【００１５】
このようにして得られた抗体又はその抗原結合性フラグメントは、そのままで、あるいは酵素標識、放射標識、蛍光標識等を結合させて、組織中及び体液中に存在する該抗原を検出することに用いることができる。本発明の抗体を用いることにより、ヒト組織の老化マーカーあるいはストレスマーカーを検出し、組織の老化の度合、ストレス度、及び病的変化をモニターすることができる。さらに、本発明の抗体を用いることにより、ヒト組織の老化マーカーあるいはストレスマーカーを検出し、組織の老化の度合、ストレス度、及び病的変化をモニターする免疫学的試薬を得ることができる。
【００１６】
本発明の試薬の検体としては、ヒトの臓器、組織、血液、尿、髄液等を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。組織等の抗原を検出する場合は、常法に従って免疫組織化学の手法が用いられる。すなわちオートプシーされた組織をスライドに固定した後、この抗体を反応させ、さらに例えばパーオキシダーゼ等で標識した抗IgG抗体を反応させる。そして基質液を反応させることにより抗原の存在部位を染色することができる。
【００１７】
また本発明の抗体は、体液中の抗原を検出するために、常法に従って免疫測定法に広く利用することができる。この免疫測定法としては、例えば酵素免疫測定法、放射免疫測定法、蛍光免疫測定法、凝集免疫測定法、免疫比濁測定法、ウェスタンブロット法等を挙げることができ、これらのいずれの測定法を採用しても、該抗原の測定を十分行なうことができる。
【００１８】
【実施例】
以下、本発明を実施例に基づき具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【００１９】
【実施例１】
免疫原の作製
１）Gly-Leu-D-β-Asp-Ala-Thr-Gly-Leu-D-β-Asp-Ala-Thr-Gly-Leu-D-β-Asp-Ala-Thrの合成。
市販のFmoc-Thr(tBu)-Wang樹脂0.2ｇをジメチルホルムアミド（DMF）で膨潤させた後、ペプチド合成機の反応器に入れた。樹脂を20％ピペリジン/DMFで処理しFmoc基を除去してアミノ基を遊離させ、DMFで洗浄した。このアミノ基に次のアミノ酸Fmoc-AlaをHOBt/PyBop法で縮合した。
【００２０】
以後同様に、Fmoc-D-Asp-OtBu, Fmoc-Leu, Fmoc-Gly, Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Ala, Fmoc-D-Asp-OtBu, Fmoc-Leu, Fmoc-Gly, Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Ala, Fmoc-D-Asp-OtBu, Fmoc-Leu, Fmoc-Glyを順次縮合し、反応を完了した。
【００２１】
樹脂を乾燥した後、94%トリフルオロ酢酸（TFA）/5%アニソール/1%エタンジチオールで2時間処理し、ペプチドを樹脂から切り離すとともにペプチドの保護基を除去した。この脱保護ペプチドをジエチルエーテルで洗浄し乾燥した。これを20%アセトニトリル/0.1%TFAに溶解し、C18マイクロボンダスフェアーカラム（ウォータ−ズ社）を装着したＨＰＬＣ装置にてグラジエント溶出し精製した。この精製ペプチド分画を集め凍結乾燥し、白色粉末10.1 mgを得た。
【００２２】
２）上記の合成ペプチドとキーホール・リンペット・ヘモシアニン（ＫＬＨ）との複合体を作製し、免疫原とした。すなわち、ＫＬＨ５mgとペプチド5 mgを各々2.5ｍlの0.1M NaH2CO3溶液に溶解し、両者を混合した。次にジメチルアジピミデート（DMA）10 mgを冷やした純水1 mlに溶かし、その内の0.25 mlを直ちに上記混合物に添加した。室温で3時間振とう反応した後、免疫原とした。
【００２３】
【実施例２】
抗体の作製
実施例１で調製した免疫原を完全フロイントアジュバントと１：１の割合で混合し、ウサギ背部皮内10カ所に注射した（0.4 mg/ウサギ）。2週間後に、免疫原を不完全フロイントアジュバントと１：１の割合で混合し、ウサギ背部皮下10カ所に注射した（0.2 mg/ウサギ）。以降2週間隔で繰り返し、5回目の免疫終了１週間後に採血し抗血清を得た。抗血清中のペプチド特異抗体（ポリクローナル抗体）は、この抗血清5 mlをペプチド5 mgを結合させた1 mlのアガロースビーズカラム（Aff-Gel 10; Bio-Rad社）に通すことにより精製した。収量は1 mgであった。安定化のためにウシ血清アルブミンを10 mg/mlになるように添加し−20℃に保存した。
【００２４】
【実施例３】
免疫組織染色
バイオプシーされたヒト皮膚を常法に従ってパラフィン切片にした。脱パラフィンの後、次の手順にて組織免疫染色を実施した。すなわち、１）TBS（0.05Mトリス塩酸, pH7.6/ 0.15M NaCl）で5分間インキュベーションする、２）0.025%プロナーゼ/0.05Mトリス塩酸, pH7.6中で20分間インキュベーションする、３）3％過酸化水素水/TBS中で5分間を3回インキュベーションする、４）2％正常ブタ血清/TBS中で20分間インキュベーションする、５）本発明のウサギポリクローナル抗体（約5μg/ml；2%正常ブタ血清/TBS中）と４℃で一晩インキュベーションする、６）0.2%ツイーン/TBS中で5分間を3回インキュベーションする、７）ビオチン化ブタ抗ウサギIgG（DAKO社製、コード番号E353、500倍希釈で使用）と30分間インキュベーションする、８）0.2%ツイーン/TBS中で5分間を3回インキュベーションする、９）StreptABComplex/HRP（DAKO社、コード番号  K377）を用いて30分間インキュベーションする、１０）0.2%ツイーン/TBS中で5分間を3回インキュベーションする、１１）ペルオキシダーぜ基質液と5−15分間インキュベーションする、１２）純水で洗浄する、１３）ヘマトキシリンで対比染色した後、観察する。この実験の結果を図１〜５に示した。
【００２５】
皮膚の場合、普段露出している顔面では老人で強い染色がみられた。一方、普段被覆されている胸部では染色がみられなかった。また、若齢者では顔面でも全く染色がみられなかった。老人の血管内皮、あるいは顔面脂漏性角化症の皮下組織でも強い染色がみられた。
【００２６】
【実施例４】
ウェスタンブロッティング
バイオプシーにて得られたヒト老人皮膚を純水で抽出後、残査に６Mグアニジン塩酸を加え、抽出されたタンパク質をウェスタンブロッティングに供した。すなわち、抽出サンプルを12.5％ゲルを用いたSDS-PAGEにかけ、分離されたタンパク質をPVDF膜にブロットした。このPVDF膜と本発明のウサギポリクローナル抗体（約1μg/ml；1%ウシ血清アルブミン/0.05%ツイーン20/PBS中）を室温で1時間反応させた後、PBSで3回洗浄した。次にヤギ抗ウサギIgG−HPR複合体と室温で30分間反応させた後、PBSで3回洗浄し、0.6 mg 3−アミノ−９−エチルカルバゾール/0.03% H2O2/0.2M酢酸緩衝液 (pH5.2)と反応させた。この実験により分子量50kDa付近の染色バンドが検出された（図６）。
【００２７】
【発明の効果】
以上のように、本発明は、Asp151がβD体であるαAクリスタリンに対して特異的な抗体が、レンズ以外の組織中に存在する老化マーカーあるいはストレスマーカーと反応することを見い出した。これにより、ヒト組織中又は体液中に存在するそれらマーカーを検出及び定量することができるようになった。従って、本発明は、老化の度合、ストレス度、及び病的変化の観察に大いに寄与するものと考えられる。
【００２８】
【図面の簡単な説明】
【図１】82歳女性の顔面皮膚の免疫組織染色を示しており、いろいろな部位に染色がみられる。
【図２】72歳男性の胸部皮膚の免疫組織染色を示しており、染色はみられない。
【図３】9歳男性の顔面皮膚の免疫組織染色を示しており、染色はみられない。
【図４】69歳男性の顔面脂漏性角化症皮下の免疫組織染色を示しており、エラスチン繊維に強い染色がみられる。
【図５】69歳男性の顔面脂漏性角化症皮下の免疫組織染色を示しており、血管内皮に強い染色がみられる。
【図６】老人顔面皮膚由来タンパク質のウェスタンブロッティングを示しており、分子量50kDa付近の染色バンドが検出された。レーン１は標準マーカー、レーン２は老人皮膚のクーマシーブリリアントブルー染色、レーン３は老人皮膚の本発明ポリクローナル抗体によるウェスタンブロッティングであり、矢印は分子量５０kDa付近の染色バンドを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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