(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経成長因子（以下、「ＮＧＦ」という）を有効成分とする、巨核球増殖分化剤。
【請求項２】
ＮＧＦが天然由来のヒトＮＧＦである、請求項１に記載の巨核球増殖分化剤。
【請求項３】
ＮＧＦが遺伝子組み換えの手法により産生されたヒトＮＧＦである、請求項１に記載の巨核球増殖分化剤。
【請求項４】
ＮＧＦが、以下のａ）又はｂ）から選択される蛋白質である、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の巨核球増殖分化剤：
ａ）配列番号１のアミノ酸配列を有する蛋白質；又は
ｂ）配列番号１のアミノ酸配列のうち１つまたは複数のアミノ酸残基が置換、欠失または挿入により変異しているアミノ酸配列を有し、かつＮＧＦ蛋白質の有する神経栄養因子（以下、「ＮＦ」という）活性を保持している蛋白質
である、請求項１ないし３のいずれか1項に記載の巨核球増殖分化剤。
【請求項５】
ＮＧＦ蛋白質が配列番号１のアミノ酸配列を有する、請求項４に記載の巨核球増殖分化剤。
【請求項６】
ＮＧＦ蛋白質が糖鎖を有するものである、請求項１−５のいずれか１項に記載の巨核球増殖分化剤。
【請求項７】
インターロイキン−１、インターロイキン−２、インターロイキン−３、インターロイキン−４、インターロイキン−５、インターロイキン−６、インターロイキン−７、インターロイキン−１０、インターロイキン−１１、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子、マクロファージコロニー刺激因子、エリスロポエチン、塩基性線維芽細胞増殖因子、酸性線維芽細胞増殖因子、インスリン様増殖因子、上皮増殖因子、肝細胞増殖因子、トランスフォーミング成長因子−α、プロテアーゼネキシンＩ、プロテアーゼネキシンＩＩ、血小板由来成長因子、コリン作動性分化因子または白血球遊走阻止因子の少なくとも１種をさらに含有してなる、請求項１に記載の巨核球増殖分化剤。
【請求項８】
インターロイキン−３をさらに含有してなる、請求項１に記載の巨核球増殖分化剤。
【請求項９】
血小板減少症および／または血小板機能低下を伴う疾患の治療用の組成物である、請求項１−８のいずれか１項に記載の巨核球増殖分化剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、神経栄養因子（ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ：以下、「ＮＦ」という）活性を有する物質および生体内でＮＦの産生を促進する物質の少なくとも１種を有効成分とする巨核球増殖分化剤に関する。本発明の巨核球増殖分化剤は、巨核球の増殖分化が十分でないために生じる疾患、特に血小板減少症および／または血小板機能低下を伴う疾患の治療薬として有用である。
【０００２】
【従来の技術】
血小板は、造血幹細胞から分化した巨核球の細胞質が断片化して生成される、血液中の無核の細胞である。血小板の寿命はヒトで９−１０日と短いにもかかわらず、血液中の血小板濃度は定常状態においてほぼ一定に保たれている。また実験動物において種々の方法で血小板を減少させても、数日のうちに血液中の血小板数の回復が認められる。これらのことから血小板減少期において血小板の産生を促進する因子が存在することが想定されていた。
【０００３】
血小板は止血機構において重要な役割を果たしている。血小板の減少または機能低下を伴う疾患の場合（Ｆａｎｃｏｎｉ症候群、無巨核球性血小板減少症、再生不良性貧血、Ｂｅｒｎａｒｄ−Ｓｏｕｌｉｅｒ症候群等）は臨床的に危険であり、特に出血した場合にはそれをコントロールできなくなるような状態に陥る。このような危険を回避するためには、血小板を増多する因子の使用が有益である。さらに、血小板増多因子の使用は、血小板減少症等の造血系疾患のみならず、白血病治療のための骨髄移植におけるエリスロポエチン、顆粒球コロニー刺激因子等のサイトカインの治療効果を高めたり、あるいはまた、ガン化学療法や放射線療法の際の血小板減少のコントロールにも有益である。従って、血小板の増多因子が得られれば、そのような治療法の成功率はさらに上昇し、患者の入院期間も短縮できると期待される。
【０００４】
血小板増多因子の同定には従来から多くの努力が払われており、現在、造血幹細胞から巨核球をへて血小板が産生される系（巨核球血小板系造血）において血小板の前駆細胞である巨核球の形成に関与すると考えられる種々の調節因子が同定されている。
【０００５】
これらの調節因子は、大きく２種類に分類される。第１のグループは単独で巨核球コロニーを形成させるもので巨核球コロニー刺激因子（Ｍｅｇ−ＣＳＦ）と呼ばれる。第２のグループは単独で巨核球コロニーを形成させる活性はないが、前者を共存させると巨核球のコロニー数を増やしたり、その増殖分化を促進する作用を有するもので巨核球増幅因子（Ｍｅｇ−ＰＯＴ）と呼ばれる。第１のグループに属する例としてインターロイキン−３（ＩＬ−３）、顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）が知られている。第２のグループに属する例としてエリスロポエチン（ＥＰＯ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−７（ＩＬ−７）、インターロイキン−１１（ＩＬ−１１）、白血球遊走阻止因子（ＬＩＦ）等が知られている。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの活性によって同定された因子の中には、実際にｉｎ  ｖｉｖｏにおいて血小板数の増加や回復時期の短縮等の効果が認められているものもある（溝口秀昭：蛋白質  核酸  酵素，３６，１１９５（１９９１））。
【０００６】
巨核球の増殖分化を促進し、安全性の高いものが見いだされれば、臨床面においても有益である。
【０００７】
しかし、これらの因子の多くは、巨核球／血小板系の増殖や分化のみではなく、各系統の血球の分化にも関与するなど極めて多様な生物活性を示す。例えば、ＩＬ−６およびＩＬ−１１には、実際にｉｎ  ｖｉｖｏにおける血小板の増多作用があるが、急性期蛋白質の産生を促したり、場合によっては悪液質を引き起こすおそれもある。また、ＩＬ−６の場合、腎臓のメサンギウム細胞を増殖させ腎不全を起こす可能性がある（松田正ら：蛋白質  核酸  酵素，３６，１１８４（１９９１））。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、安全性の高いＮＦ活性を有する物質および生体内でＮＦの産生を促進する物質の少なくとも１種を有効成分とする巨核球増殖分化剤を提供することを目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、巨核球の増殖分化を促進する作用を有する、新規な巨核球増殖分化因子を見いだすべく鋭意研究を重ねた結果、本発明を完成した。即ち、本発明によれば、ＮＦ活性を有する物質および生体内でＮＦの産生を促進する物質の少なくとも１種を有効成分とする巨核球増殖分化剤、特に、血小板減少症および／または血小板機能低下を伴う疾患の治療に有効な治療薬が提供される。
【００１０】
本発明の有効成分である神経栄養因子（ＮＦ）活性を有する物質とは、神経細胞（ニューロン）に作用し、その分化、成熟、生存、再生または老化等において重要な役割を担っている物質の総称である。ＮＦの例としては、１９４０年代後半に発見された神経成長因子（ｎｅｒｖｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ；ＮＧＦ）がある。ＮＧＦは、アミノ酸１１８個のポリペプチド鎖（配列番号１）が２本非共有結合した二量体構造をもつ分子量約２６,０００の蛋白質である。従来知られている機能としては、交感ニューロン、神経冠由来の知覚ニューロン、脳の一部のコリン作動性ニューロンに作用し、その生存や機能の維持、神経突起の伸長、神経伝達物質の合成促進等がある（Ｍｅｉｅｒ，Ｒ．，ら  ＥＭＢＯ  Ｊ．，５，  １４８９−１４９３（１９８６））。またＮＦの別の例としては、１９８２年にＮＧＦと相同性の高い蛋白質として発見された、脳由来神経栄養因子（ｂｒａｉｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ；ＢＤＮＦ）が挙げられる。さらに、別の例として、ＮＧＦやＢＤＮＦと相同性が高く、かつＮＦ作用を有する因子が近年新たに３種発見されている（ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＮＴ−５）。これらの３種は総称してニューロトロフィン（ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ；ＮＴ）ファミリーと呼ばれている。さらに、別の神経栄養因子として、毛様体神経栄養因子（ｃｉｌｉａｌｌｙ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ；ＣＮＴＦ）、ヘパリン親和性神経栄養因子（ｈｅｐａｒｉｎｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ；ＨＢＮＦ）（ｐｌｅｉｏｔｒｏｐｈｉｎ；ＰＴＮと同等）等が挙げられる（蛋白質  核酸  酵素，Ｖｏｌ．３６，  Ｎｏ．７，（１９９１）２４９−２５７頁）。
【００１１】
本発明は、ＮＦがヒト巨核球系細胞の増殖分化を促進させるという知見、さらに詳しくは、ＮＦが正常マウス骨髄細胞に対してＭｅｇ−ＰＯＴ活性を有するという驚くべき知見に基づいて完成された。ＮＦの巨核球増殖分化因子としての生理活性は従来全く知られておらず、本発明によって初めて明らかにされたものである。
【００１２】
ＮＦの巨核球増殖分化因子としての活性の種特異性は、後述の実施例６に示す通り厳密でない。従って、本発明の巨核球増殖分化剤の有効成分としては、ＮＦ活性が得られる限り、特定の種由来のＮＦである必要はない。しかし、ヒトに使用する場合には種々のヒトＮＦを用いることが好ましい。本明細書においてヒトＮＦとは、ヒト由来の物質であって、神経細胞に作用し、その分化、成熟、再生または老化等に生理学的影響を及ぼす物質であればよく、これらに限られるわけではないが、例えば、ＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＣＮＴＦ、ＨＢＮＦならびに、ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＮＴ−５等のＮＴファミリーが含まれる。ＮＦは、天然に発現しているものから既知の方法により得られたものを使用できる。あるいは、これらの蛋白質のアミノ酸配列および遺伝子配列は既知であり、これらの配列に基づいて確立されている遺伝子工学的手法により産生することもできる。遺伝子組換えの手法によって製造されたＮＦは市販されており、容易に入手可能である（例えば、Ａｕｓｔｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ社）。ＮＦはまた、所望により糖鎖が結合していてもよく、また結合していなくてもよい。
【００１３】
ＮＦはさらに、天然の蛋白質のアミノ酸配列のうち１つまたは複数のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入等により変異したものであっても、ＮＦ活性を有する物質であれば本発明の巨核球増殖分化剤の有効成分に含まれる。変異は自然に生じたものであっても、遺伝子工学的手法によって施したものであってもよい。当業者は、慣用された方法により容易にこのような変異蛋白質を作成することができるであろう。
【００１４】
本発明の一態様においては、巨核球増殖分化剤の有効成分として、ＮＦ活性を有する物質を直接用いる代わりに、生体内でＮＦの産生を促進する物質を単独で、またはＮＦ活性を有する物質とともに用いることもできる。生体内でＮＦの産生を促進する物質としては、これらに限られるわけではないが、例えば、エピネフリン、ノルエピネフリン、ドーパミン等のカテコールアミン類、４−メチルカテコール、プロペントフィリン、１，４−ベンゾキノン類（古川昭栄：ＨＵＭＡＮ  ＳＣＩＥＮＣＥ，Ｏｃｔｏｂｅｒ  ８，（１９９２））、ニコチン（特開平５−２０１８６０号）、ポリ塩基性アミノ酸、ポリ塩基性アミノ酸を分子内に有するペプチド（特開平５−５１３２５号）、マルホルミンＡ１、Ａ２、Ａ３およびＡ４（特開平５−２６２６６３号）、式（I）：
【化１】
0003830553.tif 000002
で表されるトリペプチドを有効成分とする物質（特開平５−２８４９９２号）、一般式（ＩＩ）：
【化２】
0003830553.tif 000003
［式中、Ｒ1、Ｒ2は同一または異なっていて、水素、ハロゲン、アルキル基、アルコキシ基、または置換されていてもよいフェニル基であり、
Ａｒは置換されていてもよいアリール基またはヘテロアリール基であり、
Ｙは単結合または鎖内に二重結合を有していてもよいアルキレン基であり、そして、
Ｗは式Ｗａ：
【化３】
0003830553.tif 000004
（ここで、Ｒ3、Ｒ4は同一または異なっていて、水素、ハロゲン、アルキル基、アルコキシ基、または置換されていてもよいフェニル基であり、
Ｘは−Ｏ−、−Ｓ−または−Ｎ（Ｒ5）−（Ｒ5は水素、アルキル基またはアシル基である）であり、
Ｚは単結合、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｒ6）−（Ｒ6は水素、アルキル基またはアシル基である）、または−ＣＯＮ（Ｒ7）−（Ｒ7は水素、アルキル基またはアシル基である）であり、
Ａはアルキレン基であり、
Ｂはアルコキシカルボニル基、カルボキシル基、水酸基、−Ｎ（Ｒ8）（Ｒ9）（Ｒ8、Ｒ9は同一または異なっていて、水素、アルキル基、ヒドロキシアルキル基、アシル基、または置換されていてもよいアラルキル基もしくはヘテロアラルキル基であるか、あるいは隣接する窒素原子と結合して複素環を形成する基である）、または−ＣＯＮ（Ｒ10）（Ｒ11）（Ｒ10、Ｒ11は同一または異なっていて、水素、アルキル基、ヒドロキシアルキル基、アシル基、または置換されていてもよいアラルキル基もしくはヘテロアラルキル基であるか、あるいは隣接する窒素原子と結合して複素環を形成する基である）である）により表される基であるか、あるいは式Ｗｂ：
【化４】
0003830553.tif 000005
（ここで、Ｒ12、Ｒ13は同一または異なっていて、水素、アルキル基、ヒドロキシアルキル基、アシル基、置換されていてもよいフェニル基、または置換されていてもよいアラルキル基もしくはヘテロアラルキル基であるか、あるいは隣接する窒素原子と結合して複素環を形成する基であり、
Ｐは、−Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）p−（ｐは、０〜２の整数を表す）、−Ｎ（Ｒ14）−（Ｒ14は水素、アルキル基またはアシル基である）または−Ｎ（Ｒ15）ＣＯ−（Ｒ15は水素、アルキル基またはアシル基である）であり、
Ｑは、アルキレン基、環状アルキレン基、酸素または硫黄が介在したアルキレン基または末端にカルボニル基を有するアルキレン基である）により表される基であるか、または式Ｗｃ：
【化５】
0003830553.tif 000006
（ここで、ｎは３〜５の整数を示す）で表される基である］
で示されるピリジン化合物を有効成分とする物質（特開平４−３５２７２１号）、一般式（ＩＩＩ）：
【化６】
0003830553.tif 000007
［式中、Ｒは水素、または所望により水酸基、カルボキシル基、メルカプト基、カルバモイル基、ヒドロキシフェニル基、グアニジノ基、イミダゾリル基もしくはメチルメルカプト基によって置換されていてもよいＣ1−Ｃ4アルキル基であり、Ｒ1、Ｒ2およびＲ3はそれぞれ独立して、水素、アルキル基、アルケニル基またはベンジル基である］
で示されるオキサゾピロロキノリン類および／またはそのエステルを有効成分とする物質（特開平６−９３９６号）、一般式（ＩＶ）：
【化７】
0003830553.tif 000008
［式中、Ｒは水素原子またはＣ1−Ｃ4のアルキル基である］
で表されるチオフェン化合物（特開平６−１５７５１２号）、一般式（Ｖ）：
【化８】
0003830553.tif 000009
［式中、Ｒ1およびＲ2は同一または異なっていて、Ｃ8−Ｃ30のアシル基であり、Ｘは、水素原子、または置換もしくは無置換の低級アルキル基、Ｃ3−Ｃ8のシクロアルキル基または３−８員複素環であり、Ｙは水素原子または対カチオン基を表す。ただし、Ｘ中に対アニオンを持たないカチオン基を有する場合には、ＯＹは酸素アニオンである］
で示されるジアシル型グリセロリン脂質（特開平６−１５７３３８号）等が含まれる。これらの生体内でＮＦの産生を促進する物質は、前記各文献に基づいて合成等により産生することができる。また、あるものは市販として、容易に入手可能である。
【００１５】
本発明のＮＦ活性を有する物質および生体内でＮＦの産生を促進する物質の少なくとも１種を有効成分として含有する巨核球増殖分化剤は、Ｍｅｇ−ＰＯＴ活性を有し、体内に投与された時、存在するＭｅｇ−ＣＳＦと協力して巨核球系細胞の増殖分化を促進させる。従って、本発明の巨核球増殖分化剤は血小板減少および／または血小板機能低下を伴う疾患の治療に有効である。血小板減少による疾患の例としては、Ｆａｎｃｏｎｉ症候群、再生不良性貧血、悪性リンパ腫瘍もしくは急性白血病等の癌、慢性肝障害、腎不全、手術時若しくは保存血の大量輸血患者、重症感染症、骨髄障害性血小板減少症、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ＳＴＥ、蛇咬症、溶血性尿毒症性症候群、脾機能亢進症、出血等がある。血小板機能異常による疾患の例としては、Ｂｅｒｎａｒｄ−Ｓｏｕｌｉｅｒ症候群、Ｇｌａｎｚｍａｎｎ’ｓ血小板無力症、尿毒症、抗血小板抗体、骨髄増殖性疾患等がある。
【００１６】
本発明の巨核球増殖分化剤の投与は、限定するわけではないが、一般に非経口的に行われ、例えば注射投与することにより好ましく実施できる。本発明の巨核球増殖分化剤の治療または改善薬としての使用量は、その使用方法、使用目的等により異なるが、例えば、ヒトＮＧＦの蛋白質量として、注射投与して用いる場合には、例えば、１日量約０．００２μｇ／ｋｇ−２０ｍｇ／ｋｇを投与するのが好ましく、より好ましくは、１日量約０．２μｇ／ｋｇ−２ｍｇ／ｋｇである。
【００１７】
本発明の巨核球増殖分化剤を液剤として調製する場合は、ＮＦ活性を有する物質および／または生体内でＮＦの産生を促進する物質を水性溶剤（例えば、蒸留水）、水溶性溶剤（例えば、生理食塩水、リンゲル液）、油性溶剤（例えば、ゴマ油、オリーブ油）等の溶剤に溶解して、慣用の方法により調製できる。さらに所望により溶解補助剤（例えば、サリチル酸ナトリウム、酢酸ナトリウム）、緩衝剤（例えば、クエン酸ナトリウム、グリシン）、等張化剤（例えば、ブドウ糖、転化糖）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコール）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノール）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカイン）等の添加剤を加えることもできる。また、該水溶液におけるｐＨは、約３−８に、さらに好ましくは約５−７に調整される。上記ｐＨ範囲に調整するためには、例えば希酸（例えば、希塩酸）や希アルカリ（例えば、希水酸化ナトリウム、希炭酸水素ナトリウム）等を添加することにより行える。
【００１８】
また、本発明の巨核球増殖分化剤を固形状のものとして調製する場合は、例えば、ＮＦ活性を有する物質および／または生体内でＮＦの産生を促進する物質を凍結乾燥するか、または、固形状（例えば、粉末状）のＮＦ活性を有する物質および／または生体内でＮＦの産生を促進する物質に希釈剤（例えば、蒸留水、生理食塩水、ブドウ糖）、賦形剤（例えば、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、アルギン酸ナトリウム）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、塩化ベンザルコニウム、フェノール）、無痛化剤（ブドウ糖、グルコン酸カルシウム、塩酸プロカイン）等を混合し、凍結乾燥等の慣用手段により、固形状筋肉内注射用製剤に製造することができる。この製剤は、用時適当な溶剤に溶解して使用することができる。
【００１９】
本発明の巨核球増殖分化剤の製剤化にあたり、例えば、ＮＦ活性を有する物質および／または生体内でＮＦの産生を促進する物質を含有する液剤に、安定剤としてヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を配合すると、溶液状態でｐＨ３−８を示すように調整することができる。このようにすると、保存中および凍結や凍結乾燥操作におけるＮＦ活性を有する物質および／または生体内でＮＦの産生を促進する物質の活性低下が少なく、また凍結品においてはその再溶解時の溶状が透明であるので好ましい。ＨＳＡとしては、いかなるものでもよいが、本組成物を臨床応用するためには、非経口投与に用いる程度の品質のものが好ましい。例えば、健康人血漿を原料としてＣｏｈｎのエタノール分画第６法によって分画精製したものが用いられる。また、安定剤として、アセチルトリプトファンナトリウムや、カプリル酸ナトリウムを含むものであってもよい。ＨＳＡは、各成分を水溶液とした場合に、水溶液１ｍｌあたり約０．１ｍｇ−約５０ｍｇ、特に、約０．５ｍｇ−約２０ｍｇ含有させることが好ましい。
【００２０】
本発明の巨核球増殖分化剤の製剤化にあたっては、前記ＨＳＡに加えさらに、例えば、グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸、アラニン、プロリン等のアミノ酸、特にモノアミノ脂肪酸アミノ酸、もしくは環状アミノ酸、ブドウ糖、マンノース等の単糖類、ソルビット、マンニット等の糖アルコール類、およびこれらの生理学的に許容される塩、ならびにこれらの誘導体からなるグループから選択される化合物の１種類または２種類以上を配合してもよい。上記配合剤は、例えば、ＮＦ活性を有する物質および／または生体内でＮＦの産生を促進する物質を水溶液とした場合に、水溶液１ｍｌ当たり、単糖類または糖アルコール類の場合は約１０−１００ｍｇ、アミノ酸の場合は約５−５０ｍｇ配合することが好ましい。上記の製剤化にあたっては、水溶液を溶液状態でｐＨ約３−８、好ましくはｐＨ約５−７を示すように調整する。グルタミン酸等の酸性アミノ酸を配合する場合は該物質を上記所定量加えることにより、所定のｐＨに調整できる。あるいは、所望により、または上記酸性アミノ酸を配合しない場合は塩酸、リン酸等の鉱酸、もしくはコハク酸、酒石酸、クエン酸等の緩衝剤で所定のｐＨに調整できる。
【００２１】
本発明の巨核球増殖分化剤は、水溶液、凍結品または凍結乾燥品の形態が好ましく、特に、取り扱いや貯蔵の安定性の面から凍結乾燥品が好ましい。凍結品としての本発明の巨核球増殖分化剤は、水溶液として調製した巨核球増殖分化剤を原料として用い、これを通常約−８０℃〜−２０℃で凍結することにより製造できる。該凍結組成物は約−８０℃〜−１０℃で保管することが好ましい。凍結乾燥品としての本発明の巨核球増殖分化剤は、例えば上記凍結組成物を常法により減圧乾燥するか、または、上記水溶液もしくは上記凍結組成物の融解により得られる水溶液を、所望により小分けし、上述のように凍結した後、常法により減圧乾燥することにより製造することができる。あるいは、上記方法により製造した凍結乾燥品を、例えば前記した単糖類、糖アルコール類、アミノ酸等を含有し、所望により塩酸等でｐＨ調整された溶解液に再溶解することによって、本発明の巨核球増殖分化剤を溶解状態として使用してもよい。
【００２２】
注射用製剤としての本発明の凍結乾燥した巨核球増殖分化剤を製造する場合は、例えば、ＮＦ活性を有する物質および／または生体内でＮＦの産生を促進する物質の水溶液ならびに配合剤含有水溶液をそれぞれ除菌濾過して混合するか、これらの混合液を小分けする前に除菌濾過等により精製し、無菌操作によりバイアル瓶等に分注小分けした後上記凍結乾燥処理に付すことが好ましい。この場合、容器の空間部を真空にするか、窒素ガス置換することにより、該組成物の安定性を高めることができる。また、アミノ酸や単糖類あるいは糖アルコール類を含有する水溶液で、凍結乾燥品を溶解する場合には、その水溶液は除菌濾過し、無菌操作によりアンプル等に分注小分け後、常法により蒸気滅菌したものを用いることが好ましい。
【００２３】
本発明の巨核球増殖分化剤を投与するには、該組成物が水溶液のものである場合には、そのまま注射用溶解液として用いる。該組成物が凍結乾燥により固形状のものである場合には、蒸留水もしくは生理食塩水等を用いて溶解し注射用溶解液として用いる。なお、所望により前記の単糖類、糖アルコール類、アミノ酸等を含有し、前記と同様にｐＨ調整された溶解液で溶解した後使用することもできる。
【００２４】
さらに、本発明の巨核球増殖分化剤にはＮＦ活性を有する物質および／または生体内でＮＦの産生を促進する物質以外に、種々のサイトカインを１種類以上含有させることもできる。これらの例としては、これらに限られるわけではないが、インターロイキン−１、インターロイキン−２、インターロイキン−３（以下、「ＩＬ−３」という）、インターロイキン−４、インターロイキン−５、インターロイキン−６、インターロイキン−７、インターロイキン−１０、インターロイキン−１１、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）、インスリン様増殖因子、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、トランスフォーミング成長因子−α（ＴＧＦ−α）、プロテアーゼネキシンI、プロテアーゼネキシンII、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、コリン作動性分化因子（ＣＤＦ）、白血球遊走阻止因子（ＬＩＦ）等がある。これらのサイトカインを含有させると巨核球増殖分化剤としての効果は相乗的に増加する。これらの添加量は特に限定しないが、例えば、ヒトＮＧＦを１００とした場合にそれぞれ０．０００１〜２０００００重量％添加すればよい。これらの補助的有効成分の添加量は上述の値に限定されるものでなく、症状、患者の年齢等により適宜決定すればよい。
【００２５】
なお、これらのサイトカインは必ずしもＮＦ活性を有する物質および生体内でＮＦの産生を促進する物質と同時に同じ薬剤として投与しなくてもよい。即ち、ＮＦ活性を有する物質および生体内でＮＦの産生を促進する物質の少なくとも１種を有効成分として含有する巨核球増殖分化剤の投与前、または後の適当な時期にこれらの補助的有効成分を投与しても構わない。
【００２６】
本明細書において、塩基、アミノ酸等を略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅによる略号または当該分野における慣用略号に基づく。
【００２７】
【実施例】
実施例１
ヒト巨核球系細胞株Ｓ１０細胞（特開平６−２６９２８４号）の増殖に及ぼすＮＧＦの影響を3Ｈ−ＴｄＲの取り込み法により検討した。９６穴マイクロプレートにて２％または１０％ＦＣＳ存在下、５×１０3個の細胞にマウス顎下腺由来２．５Ｓ  ＮＧＦ（ｍＮＧＦ、純度９５％以上、Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．社製）を１０ｐｇ／ｍｌ〜１μｇ／ｍｌまでの濃度で加え、４８時間培養後、０．５μＣｉの3Ｈ−ＴｄＲを添加し、４時間後のアイソトープの取り込みを測定した。
【００２８】
ｍＮＧＦはいずれの濃度のＦＣＳ存在下においても、濃度依存的にＳ１０細胞の増殖を促進させた。結果を図１に示す。
【００２９】
実施例２
実施例１で使用したｍＮＧＦはマウス顎下腺由来の精製品であるため夾雑物の混入が避けられない。そこで、Ｓ１０細胞に対する増殖促進が真にｍＮＧＦによるものであることを確認するために、抗ＮＧＦ抗体を添加した場合の影響を検討した。即ち、ｍＮＧＦに抗マウスＮＧＦ  ＩｇＧ画分（ＣＩＤｔｅｃｈ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ．社製）を加え、室温にて２時間反応させた後に、Ｓ１０細胞に添加し、増殖に及ぼす影響を3Ｈ−ＴｄＲの取り込み法により検討した。なお、ｍＮＧＦと抗マウスＮＧＦ  ＩｇＧ画分の最終濃度については、それぞれ１０ｎｇ／ｍｌおよび１０μｇ／ｍｌとなるようにした。
【００３０】
抗マウスＮＧＦ  ＩｇＧ画分のみを加えた場合はＳ１０細胞の増殖には影響を及ぼさなかったが、ｍＮＧＦによるＳ１０細胞の増殖促進活性は抗マウスＮＧＦＩｇＧ画分によって完全に抑えられた。従って、ｍＮＧＦそれ自体がＳ１０細胞の増殖を促進させたことが明らかとなった。結果を図２に示す。
【００３１】
実施例３
マウス無血清培養系におけるｍＮＧＦの巨核球コロニー形成に及ぼす影響を、溝口らの方法（Ａｃｔａ  Ｈｅｍａｔｏｌ  Ｊｐｎ．，４８：１７８０，（１９８５））に準じた方法により検討した。ＢＡＬＢ／ｃ  雌性マウス（６〜８週齢）の骨髄細胞２×１０5個に組換えマウスＩＬ−３（ｒｍＩＬ−３，Ｇｅｎｚｙｍｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社製）１００ｎｇ／ｍｌの存在あるいは非存在下、ｍＮＧＦを１ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌの濃度になるように添加し、軟寒天中にて、５％ＣＯ2、５％Ｏ2、１００％湿度のインキュベーターで７日間培養した。０．１％グルタルアルデヒドで固定後、アセチルコリンエステラーゼ染色により巨核球を同定し、３個以上の細胞からなる集塊をコロニーとして計数した。
【００３２】
ｍＮＧＦ単独では、巨核球コロニーの形成はほとんど認められなかったが、ｒｍＩＬ−３存在下では濃度依存的にコロニー形成が促進された。従って、ｍＮＧＦはＭｅｇ−ＣＳＦ活性は無いものの、Ｍｅｇ−ＰＯＴ活性を有することが示された。結果を図３に示す。
【００３３】
実施例４
ｍＮＧＦのＭｅｇ−ＰＯＴ活性についても抗ＮＧＦ抗体による影響を検討した。ｍＮＧＦに抗ＮＧＦ  ＩｇＧ画分を加えて室温にて２時間反応させた後、マウス骨髄細胞に添加し無血清培養に付した。ｍＮＧＦと抗マウスＮＧＦ  ＩｇＧ画分の最終濃度は、それぞれ５０ｎｇ／ｍｌおよび５０μｇ／ｍｌとなるようにした。
【００３４】
抗マウスＮＧＦ  ＩｇＧ画分自体は巨核球コロニー形成には影響を及ぼさなかったが、ｍＮＧＦのＭｅｇ−ＰＯＴ活性をほぼ完全に抑制した。従って、ｍＮＧＦ自体がＭｅｇ−ＰＯＴ活性を有することが明らかとなった。結果を図４に示す。
【００３５】
実施例５
ｍＮＧＦのＭｅｇ−ＰＯＴ活性が直接作用か間接作用かを検討するため、非付着性骨髄細胞を用いて巨核球コロニー形成を試みた。即ち、１０％ＦＣＳを含む培地にマウス骨髄細胞を５×１０6個／ｍｌになるように懸濁させ、組織培養用シャーレに入れ３７℃、１００％湿度のＣＯ2インキュベーターにて静置した。１時間後、ピペットで洗い流しながら浮遊細胞を回収し、同様の操作をさらに２回繰り返し付着細胞を除去し、血清無添加の培地で洗浄した。このようにして調製した非付着性骨髄細胞を巨核球コロニー形成法に付した。
【００３６】
ｒｍＩＬ−３非存在下ではコロニー形成は認められなかったが、ｒｍＩＬ−３存在下（２５または１００ｎｇ／ｍｌ）では、ｍＮＧＦは濃度依存的にコロニー形成を促進させた。従って、ｍＮＧＦのＭｅｇ−ＰＯＴ活性は少なくとも単球・マクロファージ系の細胞を介さず巨核球に直接作用することが示唆された。結果を図５に示す。
【００３７】
実施例６
ＮＧＦは動物種間でアミノ酸配列が極めて良く保存されており、立体構造も極めて類似しているものと考えられる。実際、ｍＮＧＦはヒト巨核球系細胞株Ｓ１０の増殖を促進させた（実施例１、実施例２）。従って、ヒトＮＧＦがマウス巨核球コロニー形成を促進させることが予想される。そこでヒトＮＧＦとしてヒトＮＧＦ  ｃＤＮＡをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞より精製した組換えヒトＮＧＦ（ｒｈＮＧＦ，Ａｕｓｔｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ社製）を用いてマウス巨核球コロニー形成を試みた。
【００３８】
ｒｈＮＧＦは、ＩＬ−３非存在下ではコロニー形成には影響を及ぼさなかったが、ＩＬ−３存在下では濃度依存的に巨核球コロニー形成を促進させた。従って、ヒトＮＧＦもＭｅｇ−ＰＯＴ活性を有していることが明らかとなった。結果を図６に示す。
【００３９】
【発明の効果】
本発明の、ＮＦ活性を有する物質および生体内でＮＦの産生を促進する物質の少なくとも１種を有効成分とする新たな巨核球増殖分化剤は、巨核球の増殖分化を促進し、末梢血液中の血小板数を増加させる作用により、血小板減少症および／または血小板機能低下を伴う疾患の治療に有効な治療薬となる。
【００４０】
【配列表】
配列表
配列番号：１
配列の長さ：１１８
配列の型：アミノ酸
配列の種類：蛋白質
起源：
生物名：Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ
配列：
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【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、ｍＮＧＦのＳ１０細胞の増殖に対する効果を示す。
【図２】  図２は、ｍＮＧＦによるＳ１０細胞の増殖に対する抗ＮＧＦ抗体の効果を示す。
【図３】  図３は、マウス骨髄細胞無血清培養系におけるｍＮＧＦの巨核球コロニー形成に及ぼす効果を示す。
【図４】  図４は、ｍＮＧＦによる巨核球コロニー形成に対する抗ＮＧＦ抗体の効果を示す。
【図５】  図５は、マウス非付着性骨髄細胞無血清培養系における、ｍＮＧＦの巨核球コロニー形成に及ぼす効果を示す。
【図６】  図６は、マウス骨髄細胞無血清培養系におけるｒｈＮＧＦの巨核球コロニー形成に及ぼす効果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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