(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNAを有効成分とする、NGFの発現誘導剤。
【請求項２】
NGFの発現を誘導する方法であって、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNAを非ヒト動物細胞において発現させることを含む方法。
【請求項３】
配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質によるNGFの発現の誘導を調節する化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNAを発現可能に保持する形質転換細胞に、被検試料を接触させる工程、
（ｂ）該細胞におけるNGFの発現を検出する工程、および
（ｃ）被検試料を該細胞に接触させない場合（対照）と比較して、NGFの発現の誘導を促進または抑制する化合物を選択する工程、を含む方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、神経栄養因子の発現誘導剤、神経栄養因子の発現を誘導する方法、および神経栄養因子の発現の誘導を調節する化合物のスクリーニング方法に関する。
従来の技術
神経栄養因子（ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ，ＮＴＦ）は、神経細胞の生存や機能を維持したり、その伸長を促進したりする作用を有する因子であり、現在、神経関連疾患の医薬品開発の標的として非常に注目されている。
神経栄養因子としては、これまでにＮｅｒｖｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ＮＧＦ，神経成長因子）、ｂｒａｉｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ（ＢＤＮＦ，脳由来神経栄養因子）、ＮＴ−３、ＮＴ−４／５などが単離されている。ＮＧＦ、ＢＤＮＦ、並びにＮＴ−３、ＮＴ−４／５は物理的・化学的構造が非常に似通っており、また生理的な作用も類似しているタンパク質で、特にｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎと総称されている。またその他にｃｉｌｉａｒｙ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ（ＣＮＴＦ，毛様体神経栄養因子）、ｂａｓｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ｂＦＧＦ，塩基性線維芽細胞増殖因子）、ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ＥＧＦ，上皮成長因子）、ｇｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ（ＧＤＮＦ，グリア細胞由来神経栄養因子）、ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−Ｉ，−ＩＩ（ＩＧＦ−Ｉ，−ＩＩ，インスリン様成長因子）やインターロイキン−６（ＩＬ−６）などの各種サイトカイン群が単離されている。
これら単離された神経栄養因子は、一般的に中枢・末梢問わず神経細胞の変性や脱落を伴う疾患に対する治療法として神経栄養因子の投与が広く試みられている。また最近では、まだ前臨床の段階であるが、神経栄養因子の遺伝子治療も計画されており、さらに、脳に対する胎児神経細胞の移植治療の際に生着率を上げるためにも使用が考えられている。
臨床開発において、例えば、Ｎｅｒｖｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ＮＧＦ）（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ  Ｒｏｃｈｅ）では、糖尿病性末梢神経障害を対象として第３相試験まで進んだが有意な差は得られずに中止され、現在ではＨＩＶ脳症などに対する臨床応用が進められている。また、Ｂｒａｉｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ（ＢＤＮＦ）（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ／Ａｍｇｅｎ，Ｓｕｍｉｔｏｍｏ，Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ）では、筋萎縮性側索硬化症に対する臨床的な有効性は認められなかったが、その他一般的な神経障害や特に糖尿病性の末梢神経障害に対する臨床試験が計画されている。ＮＴ−３（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ／Ａｍｇｅｎ）では、糖尿病性末梢神経障害、筋萎縮性側索硬化症などを対象に臨床試験が進行している。さらに、Ｃｉｌｉａｒｙ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ（ＣＮＴＦ）（Ｃｙｔｏ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）では、筋萎縮性側索硬化症やハンチントン病に対する臨床試験が進められている。
一方、これら神経栄養因子自体のみならず、神経栄養因子の発現を誘導する因子に関してもの医薬品開発が試みられ、現在までのところ、神経栄養因子の産生機構とそれを促進する化合物がいくつか知られている。例えばβ２，３アゴニストであるクレンブテロール（ｃｌｅｎｂｕｔｅｒｏｌ）はβ−アドレナリン受容体を介したグリア細胞におけるＮＧＦの発現を促進することが知られている。アドレナリン受容体刺激後の経路としてはｃｙｃｌｉｃ−ａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ｃＡＭＰ）の増加からｃＡＭＰ作動性タンパク質リン酸化酵素（ｃＡＭＰ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ；ＰＫＡ）の活性化が関与していると報告されているが、最終的にＮＧＦの発現に至る経路の詳細は明らかでない。β−アドレナリン受容体を介したＰＫＡの活性化によるＮＧＦ発現経路はひとつの例にすぎず、これ以外にもフォルスコリン（ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ）によるｃＡＭＰ増加とＰＫＡの活性化による経路、ジアシルグリセロール（ｄｉａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ）やホルボールエステル（ｐｈｏｒｂｏｌ  ｅｓｔｅｒ）によるカルシウム依存性タンパク質リン酸化酵素（ｃａｌｃｉｕｍ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ；ＰＫＣ）の活性化を介する経路、ビタミンＤ３やインターロイキン−１β（ＩＬ−１β）やリポ多糖、セラミドによるスフィンゴミエリン（ｓｐｈｉｎｇｏｍｙｅｌｉｎ）を介した経路、各種サイトカインによる発現促進など、様々な薬物・試験系によりＮＧＦをはじめとする神経栄養因子の発現を制御する分子機構が報告されている（Ｓｅｍｋｏｖａ  Ｉ．Ａｎｄ  Ｋｒｉｅｇｌｓｔｅｉｎ  Ｊ．（１９９９）Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．Ｒｅｖ．３０，１７６−１８８）。また、ａＦＧＦがグリア細胞からのＮＧＦ産生を誘導することが知られている（Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １２６，１８−２０（１９９１））。さらにＩＬ−１やカテコールアミンなどもＮＧＦの発現を誘導することが知られている。
医薬品として開発されている神経栄養因子の発現誘導剤としては、例えば、Ｘａｌｉｐｒｏｄｅｎ（ＳＲ−５７７４６）がある。この物質は基本的には５−ＨＴ１Ａ受容体アゴニストであるが、動物モデルにおいて未知の作用機序によってＮＧＦの産生を増強し、神経障害の改善をもたらすことが報告されている。筋萎縮性側索硬化症やアルツハイマー病に対する臨床試験が進められている。また、神経栄養因子の遺伝子治療への応用も考えられている。
このように神経栄養因子白体とその誘導剤について医薬品開発が行なわれているが、中枢神経疾患を考えた場合、神経栄養因子は高分子のタンパク質であり、そのままのかたちでは血液脳関門（ＢＢＢ）を通過することはできない。すなわち、末梢に投与しても脳内に移行することはなく、中枢神経系の疾患に対しては効果がないと考えられるため、投与方法としては直接脳内に注入するしかない。一方、誘導剤では仮に低分子で血液脳関門を通過できるものならば、中枢神経系疾患にも効果が期待できる。また、末梢神経疾患を対象とした場合でも、末梢神経障害に対する臨床試験の成績を考えると神経栄養因子をそのまま投与してもほとんど効果はないため、誘導剤による神経栄養因子産生の増強などを試みるほうが望ましいと考えられる。
また、神経栄養因子の直接投与は、患部へ持続的に投与することが必要となるが、誘導剤の場合、遺伝子治療を考えれば恒常的な発現が期待でき、また低分子化合物であれば簡略化された投与（経口、皮下等）によって必要とされる生体内濃度を維持することが可能となり、結果として恒常的な発現が期待できる。
しかしながら、このような医薬品としての有用性にもかかわらず神経栄養因子の誘導剤に関する報告例は、いまだ少なく、新たな神経栄養因子の誘導剤の開発が望まれている。
発明の開示
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、神経栄養因子の発現を誘導する因子を同定し、これを利用した神経栄養因子の発現誘導剤、神経栄養因子の発現を誘導する方法、および神経栄養因子の発現の誘導を調節する化合物のスクリーニング方法を提供することを課題とする。
本発明者らは、ヒト胎児精巣由来のテラトカルシノーマ細胞であるＮＴ−２神経前駆細胞をレチノイン酸処理し、処理後の細胞からｍＲＮＡを調製し、さらに該ｍＲＮＡからオリゴキャップ法により複数の全長ｃＤＮＡをクローニングした。これら全長ｃＤＮＡの塩基配列を解析し、その中から、分泌シグナルを持つ新規遺伝子（ＰＳＥＣ５６）を見出した。
本発明者らは、この遺伝子をＣＯＳ細胞に導入し、該遺伝子を発現するＣＯＳ細胞の培養上清について脊髄後根神経節（ＤＲＧ）細胞に対する活性の検討を行なったその結果、この培養上清が、該細胞の神経突起伸長作用を有することを見出した。一方、培養上清から金属アフィニティカラムを用いて精製したＰＳＥＣ５６タンパク質自体は、ＤＲＧ細胞に対して全く神経突起伸長作用を示さなかった。
そこで、本発明者等は、次に、この培養上清に含まれる活性の本体を突きとめるべく検討を行なった。その結果、ＰＳＥＣ５６を遺伝子導入したＣＯＳ−７細胞の培養上清をＮＧＦに対する抗体で処理することにより、培養上清のＤＲＧ細胞に対する神経突起伸長作用が抑制されること、さらに、ＰＳＥＣ５６遺伝子を導入したＣＯＳ−７細胞の培養上清にＮＧＦが検出されることを見出した。即ち、本発明者等は、培養上清に含まれる活性の本体が、ＮＧＦであることを明らかにした。
このように細胞内におけるＰＳＥＣ５６タンパク質の発現がＮＧＦの発現を誘導したことから、ＰＳＥＣ５６タンパク質やその遺伝子は、細胞におけるＮＧＦの発現の誘導剤として利用することができる。また、ＰＳＥＣ５６タンパク質の発現によるＮＧＦの発現の誘導系は、神経系の疾患の治療薬や予防薬の開発への利用も可能である。
本発明は、以上の知見に基づくものであり、具体的には、
（１）  ＰＳＥＣ５６タンパク質または該タンパク質をコードするＤＮＡを有効成分とする、神経栄養因子の発現誘導剤、
（２）  神経栄養因子がＮＧＦである、（１）に記載の薬剤、
（３）  神経栄養因子の発現を誘導する方法であって、ＰＳＥＣ５６タンパク質を発現させることを含む方法、
（４）  神経栄養因子がＮＧＦである、（３）に記載の方法、
（５）  ＰＳＥＣ５６タンパク質による神経栄養因子の発現の誘導を調節する化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）ＰＳＥＣ５６タンパク質をコードするＤＮＡを発現可能に保持する形質転換細胞に、被検試料を接触させる工程、
（ｂ）該細胞における神経栄養因子の発現を検出する工程、および
（ｃ）被検試料を該細胞に接触させない場合（対照）と比較して、神経栄養因子の発現の誘導を促進または抑制する化合物を選択する工程、を含む方法、および
（６）  神経栄養因子がＮＧＦである、（５）に記載の方法、を包含するものである。
本発明は、ＰＳＥＣ５６タンパク質または該タンパク質をコードするＤＮＡを有効成分とする、神経栄養因子の発現誘導剤を提供する。
本発明の発現誘導剤の有効成分である「ＰＳＥＣ５６タンパク質」としては、配列番号：２に記載のＰＳＥＣ５６タンパク質の他、これと機能的に同等なタンパク質が含まれる。本発明において「配列番号：２に記載のＰＳＥＣ５６タンパク質と機能的に同等なタンパク質」とは、対象となるタンパク質が、配列番号：２に記載のＰＳＥＣ５６タンパク質とその一次構造において高い相同性を有し、配列番号：２に記載のＰＳＥＣ５６タンパク質と同様に、その発現により神経栄養因子の発現を誘導する活性を有するタンパク質を指す。その名称は問わない。ここで「高い相同性」とは、少なくとも４０％以上、好ましくは６０％以上、さらに好ましくは８０％以上（例えば、９０％以上、９５％以上）の配列の同一性を指す。このようなタンパク質としては、例えば、配列番号：２に記載のＰＳＥＣ５６タンパク質の変異体やバリアント、他の生物由来の相同タンパク質などが含まれるが、これらに制限されない。神経栄養因子を誘導する活性は、例えば、被検タンパク質をＣＯＳ細胞内で発現させ、その培養上清にＮＧＦなどの神経栄養因子が分泌されるか否かを指標に検出することができる（実施例２参照）。
配列番号：２に記載のＰＳＥＣ５６タンパク質と機能的に同等なタンパク質は、当業者であれば、例えば、タンパク質中のアミノ酸配列に変異を導入する方法（例えば、部位特異的変異誘発法（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｅｄｉｔ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｐｕｂｌｉｓｈ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｓｅｃｔｉｏｎ  ８．１−８．５））を利用して調製することができる。また、自然界におけるアミノ酸の変異により生じることもある。本発明の「ＰＳＥＣ５６タンパク質」には、配列番号：２に記載のＰＳＥＣ５６タンパク質のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／もしくは付加などにより変異したタンパク質であって、配列番号：２に記載のＰＳＥＣ５６タンパク質と機能的に同等なタンパク質が含まれる。タンパク質におけるアミノ酸の変異数や変異部位は、その機能が保持される限り制限はない。変異数は、典型的には、全アミノ酸の１０％以内であり、好ましくは全アミノ酸の５％以内であり、さらに好ましくは全アミノ酸の１％以内である。ＰＳＥＣ５６タンパク質のアミノ酸が欠失したタンパク質には、例えば、シグナルペプチドが除去されたタンパク質が含まれる。
また、配列番号：２に記載のＰＳＥＣ５６タンパク質と機能的に同等なタンパク質は、当業者に周知のハイブリダイゼーション技術あるいは遺伝子増幅技術を利用して単離することも可能である。即ち、当業者であれば、配列番号：２に記載のＰＳＥＣ５６タンパク質をコードするＤＮＡ（配列番号：１）またはその一部をプローブとしたハイブリダイゼーション技術（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙｅｄｉｔ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｐｕｂｌｉｓｈ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｓｅｃｔｉｏｎ  ６．３−６．４）を利用して、ヒトやラット、マウス等の生物由来の試料から、該プローブと相同性の高いＤＮＡを単離し、さらに、単離したＤＮＡからそれに対応するタンパク質を調製することは通常行いうることである。
このようなタンパク質をコードするＤＮＡを単離するためのストリンジェントなハイブリダイゼーション条件としては、通常「１ｘＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ、３７℃」程度であり、より厳しい条件として「０．５ｘＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ、４２℃」程度であり、さらに厳しい条件としては「０．２ｘＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ、６５℃」程度である。ハイブリダイゼーションの条件が厳しくなるほどプローブ配列と高い相同性を有するＤＮＡの効率的な単離を期待しうる。但し、上記ＳＳＣ、ＳＤＳおよび温度の条件の組み合わせは例示であり、当業者であれば、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する上記若しくは他の要素（例えば、プローブ濃度、プローブの長さ、ハイブリダイゼーション反応時間など）を適宜組み合わせることにより、上記と同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
また、遺伝子増幅技術（ＰＣＲ）（Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｅｄｉｔ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｐｕｂｌｉｓｈ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｓｅｃｔｉｏｎ  ６．１−６．４）を用いて、配列番号：２に記載のＰＳＥＣ５６タンパク質をコードするＤＮＡ配列（配列番号：１）の情報をもとに設計したプライマーを利用して、該タンパク質をコードするＤＮＡ配列またはその一部と相同性の高いＤＮＡを増幅して単離し、さらに、これをもとに配列番号：２に記載のＰＳＥＣ５６タンパク質と機能的に同等なタンパク質を得ることも可能である。
このようなハイブリダイゼーション技術や遺伝子増幅技術を利用して単離されるＤＮＡがコードするタンパク質は、通常、配列番号：２に記載のＰＳＥＣ５６タンパク質とアミノ酸配列において高い相同性を有する。
塩基配列の相同性は、ＢＬＡＳＴ  Ｎにより相同性検索を行い、例えば、ＰＳＥＣ５６タンパク質をコードする１７４６ｂｐのＤＮＡ領域中４００ｂｐ以上の長さの領域について４０％以上の相同性を示す場合に、「相同性あり」と判定することができる。また、アミノ酸配列の相同性は、ＢＬＡＳＴ  Ｘにより相同性検索を行い、例えば、ＰＳＥＣ５６タンパク質の５８２残基のアミノ酸配列中８０残基以上の長さの領域について３０％以上の相同性を示す場合に、「相同性あり」と判定することができる。また、これ以外にも、ＦＡＳＴＡ、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎなどの検索アルゴリズムを用いて決定することもできる（ＧｅｎＢａｎｋ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｗｅｂ／ＧｅｎＢａｎｋ／））。
なお、ＰＳＥＣ５６の配列（配列番号：１．２参照）は、塩基配列レベルでヒトＦＫＢＰ１２と１８５−７５１ｂｐ間で４９％、５５２−９８６ｂｐ間で４８％、１２１３−１６３５ｂｐ間で４８％の相同性を示し、ＦＫＢＰドメインが３つ縦に並ぶ一次構造を有する。また当該アミノ酸配列においてＣ末端には、「Ｈｉｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ」という小胞体移行シグナルと見られる配列が確認されている。ＰＳＥＣ５６の配列は、マウスＦＫＢＰ６５と塩基配列で７６％（１−２６３２ｂｐ）、アミノ酸レベルで８８％（１−５８２残基）の相同性を有する。
本発明の発現誘導剤の有効成分としては、このように配列番号：２に記載のＰＳＥＣ５６タンパク質をコードするＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡによりコードされる、配列番号：２に記載のＰＳＥＣ５６タンパク質と機能的に同等なタンパク質もまた含まれる。
ＰＳＥＣ５６タンパク質は、組み換えタンパク質として、また天然のタンパク質として調製することが可能である。組み換えタンパク質は、例えば、ＰＳＥＣ５６タンパク質をコードするＤＮＡを挿入したベクターを適当な宿主細胞に導入し、形質転換体内で発現したタンパク質もしくは培養上清中に分泌されたタンパク質を精製することにより調製することが可能である。一方、天然のタンパク質は、例えば、ＰＳＥＣ５６タンパク質に対する抗体を結合したアフィニティーカラムを利用して調製することができる（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｅｄｉｔ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｐｕｂｌｉｓｈ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｓｅｃｔｉｏｎ  １６．１−１６．１９）。
本発明の発現誘導剤の有効成分としての「ＰＳＥＣ５６タンパク質をコードするＤＮＡ」としては、ＰＳＥＣ５６タンパク質をコードしうるものであれば、その形態に特に制限はなく、ｃＤＮＡの他、ゲノミックＤＮＡ、化学合成ＤＮＡなども含まれる。本発明のＤＮＡは、ＰＳＥＣ５６タンパク質をコードするＤＮＡ配列（例えば、配列番号：１）もしくはその一部をプローブとしたハイブリダイゼーション法やこれらＤＮＡ配列の情報をもとに合成したプライマーを用いたＰＣＲ法等の常法により調製することが可能である。
本発明の発現誘導剤の有効成分としての「ＰＳＥＣ５６タンパク質をコードするＤＮＡ」は、細胞内で発現可能な形態であれば特に制限はない。好ましくは、該ＤＮＡは細胞内での発現を保証するベクターに挿入されている。ベクターとしては、例えば、ｐＭＥ１８Ｓ  ＦＬ３、ｐｃＤＮＡ３．１（−）、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）などを好適に用いることができる。
本発明の発現誘導剤は、試験研究のための試薬として用いることができる。また、神経系疾患などの疾患の治療や予防のための医薬として用いることができる。即ち、本発明の「発現誘導剤」には、試薬および医薬の双方が含まれる。
本発明の発現誘導剤による、誘導の対象となる神経栄養因子としては、ＮＧＦの他、ＢＤＮＦ、ＮＴ−３、ＮＴ−４／５、ＣＮＴＦ、ＧＤＮＦなどが挙げられるが、これらに制限されない。本発明において「神経栄養因子」とは、脳神経系に働く細胞成長因子であって、特に神経細胞に対して成長、分化、（生存・機能）維持作用を有する因子を指す。
本発明は、また、神経栄養因子の発現を誘導する方法を提供する。この方法は、ＰＳＥＣ５６タンパク質を発現させることを含む。この方法に適用可能な細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて種々の細胞が用いられる。例えば、グリア細胞、シュワン細胞などの神経栄養因子を産生している細胞が主たる対象となるが、これに限定されるものではない。細胞内でＰＳＥＣ５６タンパク質を発現させるためには、例えば、ＰＳＥＣ５６タンパク質をコードするＤＮＡを細胞内でその発現を保証するベクターに挿入し、該ベクターを標的細胞に導入すればよい。ベクターの細胞への導入の一般的な方法としては、リポフェクトアミン法、リン酸カルシウム沈殿法、電気パルス穿孔法、マイクロインジェクション法などが挙げられるが、これらに制限されない。ベクターを生体に投与する場合には、レトロウイルス、アデノウイルス、センダイウイルスなどのウイルスに由来するベクターやリポソームなどの非ウイルスベクターを用いることができる。この場合、ｉｎ  ｖｉｖｏ投与の他、ｅｘ  ｖｉｖｏ投与を行なうことも考えられる。
本発明は、また、ＰＳＥＣ５６タンパク質による神経栄養因子の発現の誘導を調節する化合物をスクリーニングする方法を提供する。本発明のスクリーニング方法は、上記の神経栄養因子の発現誘導系に被検試料を添加して、ＰＳＥＣ５６発現に応答した神経栄養因子の発現に対する該被検試料の影響を評価することを特徴とする。即ち、本発明のスクリーニング方法は、（ａ）ＰＳＥＣ５６タンパク質をコードするＤＮＡを発現可能に保持する形質転換細胞に、被検試料を接触させ、（ｂ）該細胞における神経栄養因子の発現を検出し、（ｃ）被検試料を該細胞に接触させない場合と比較して、神経栄養因子の発現の誘導を促進または抑制する化合物を選択する、ことにより実施することができる。
スクリーニングに用いる形質転換細胞は、ＰＳＥＣ５６タンパク質をコードするＤＮＡが挿入されたベクターを、上記の当業者に公知の遺伝子導入法により細胞に導入することにより、調製することができる。ベクターが導入される宿主細胞としては特に制限はない。目的に応じて種種の細胞が用いられるが、例えば、目的のタンパク質を高発現させるための真核細胞としてＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞などが好適に用いられる。また、生体内においてはグリア細胞、シュワン組胞などの神経栄養因子を産生している細胞が主たる対象となるがこれに限定されるものではない。
こうして調製した細胞に接触させる被検試料としては、特に制限はない。例えば、細胞抽出液、遺伝子ライブラリーの発現産物、合成低分子化合物、合成ペプチド、天然化合物などを用いることができるが、これらに制限されない。
本発明のスクリーニングにおいては、被検試料接触後、該細胞における神経栄養因子の発現を検出する。神経栄養因子の発現は、例えば、ＰＳＥＣ５６遺伝子が導入された形質転換細胞の培養上清に対して、該神経栄養因子に対する抗体を利用したウェスタンブロッティングを行なうことにより検出することができる。
この検出の結果、被検試料を接触させないで検出した場合（対照）と比較して、神経栄養因子の発現量が増加していれば、用いた被検試料は、神経栄養因子の発現の誘導を促進すると判定され、逆に、対照と比較して、神経栄養因子の発現量が減少していれば、用いた被検試料は、神経栄養因子の発現の誘導を抑制すると判定される。
ＰＳＥＣ５６タンパク質およびその遺伝子、並びに本発明のスクリーニングにより単離される化合物は、脊髄損傷や末梢神経疾患の他、痴呆や脳梗塞などの中枢神経疾患の治療薬や予防薬としての応用が期待される。
ＰＳＥＣ５６遺伝子を遺伝子治療に用いる場合には、レトロウイルスベクターやアデノウイルスベクターなどのウイルスベクターまたはリポソームなどの非ウイルスベクターを利用して、患者に投与を行なう。投与方法には、ｉｎ  ｖｉｖｏ法およびｅｘ  ｖｉｖｏ法が含まれる。
また、ＰＳＥＣ５６タンパク質および本発明のスクリーニングにより単離される化合物を医薬品として用いる場合には、それら自体を直接患者に投与する以外に、公知の製剤学的方法により製剤化して投与を行うことも可能である。例えば、製剤上許容される担体（賦形済、結合剤、崩壊剤、矯味剤、矯臭剤、乳化剤など）、希釈剤、溶解補助剤などと配合して得られる医薬組成物を通常の方法に従って製剤化して得られる錠剤、カプセル剤、顆粒剤、注射剤、点滴剤などの形態で経口的または非経口的に投与することができる。
経口投与のために錠剤を用いる場合、通常用いられる担体にはショ糖、乳糖、マニトール、マルチトール、デキストラン、コーンスターチなどがあり、また通常ステアリン酸マグネシウムのような滑沢剤やパラベン類、ソルビン類などの保存剤、アスコルビン酸、α−トコフェロール、システインなどの抗酸化剤、崩壊剤、結合剤などが加えられる。カプセルとして経口投与する場合、有効な希釈剤は乳糖や乾燥コーンスターチである。
静脈注射、腹腔内注射あるいは点滴法などの非経口投与の場合は通常、活性成分溶液のｐＨを適当に調節し、緩衝させたのち滅菌して調整する。使用することのできるベヒクルあるいは溶剤としては蒸留水、リンゲル液、等張食塩水などが挙げられる。静注使用には溶質の合計濃度を調節し、その溶液が等張的であるようにする。
投与量は、年齢、体重、投与時間、投与方法、薬物の組み合わせ、患者のその時に治療をおこなっている病状の程度に応じ、それらあるいはその他の要因を考慮して決められる。その１日の投与量は患者の状態や体重、化合物の種類、投与経路などによって異なるが、たとえば経口的には約０．０１−１０００ｍｇ／人／日、好ましくは０．１−３００ｍｇ／人／日投与され、また非経口的には皮下、静脈内に約０．０１−５０ｍｇ／人／日、好ましくは０．０１−１０ｍｇ／人／日投与されることが望ましい。
発明を実施するための最良の形態
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
［実施例１］ＰＳＥＣ５６のクローニング
ＰＳＥＣ５６のクローニングには、ヒト胎児精巣由来のテラトカルシノーマ細胞でレチノイン酸処理により神経細胞に分化可能なＮＴ−２神経前駆細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社より購入）を用いた。添付マニュアルに従って、ＮＴ−２細胞を培養後、レチノイン酸を添加して、さらに２週間培養した。その培養細胞を集めて、文献（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ  ＆  Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）記載の方法によりｍＲＮＡを抽出した。さらに、オリゴｄＴセルロースでｐｏｌｙＡ（＋）ＲＮＡを精製した。ｐｏｌｙＡ（＋）ＲＮＡよりオリゴキャプ法［Ｍ．Ｍａｒｕｙａｍａ  ａｎｄ  Ｓ．Ｓｕｇａｎｏ，Ｇｅｎｅ，１３８，１７１−１７４（１９９４）］によりｃＤＮＡをクローニングした。Ｏｌｉｇｏ−ｃａｐ  ｌｉｎｋｅｒ（配列番号：４）およびＯｌｉｇｏ  ｄＴ  ｐｒｉｍｅｒ（配列番号：５）を用いて文献［鈴木・菅野，蛋白質  核酸  酵素，４１，１９７−２０１（１９９６）、Ｙ．Ｓｕｚｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，２００，１４９−１５６（１９９７）］に書いてあるようにＢＡＰ（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）処理、ＴＡＰ（Ｔｏｂａｃｃｏ  Ａｃｉｄ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）処理、ＲＮＡライゲーション、第一鎖ｃＤＮＡの合成とＲＮＡの除去を行った。次いで、５’（配列番号：６）と３’（配列番号：７）のＰＣＲプライマーを用いＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）により２本鎖ｃＤＮＡに変換し、ＳｆｉＩ切断した。次いで、ＤｒａＩＩＩで切断したベクターｐＭＥ１８ＳＦＬ３（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＢ００９８６４，Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒ，３３９２  ｂｐ）にｃＤＮＡの方向性を決めてクローニングした（図１）。これにより得たＤＮＡについてＤＮＡシークエンシング試薬（Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ，ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いてマニュアルに従ってシークエンシング反応後、ＤＮＡシークエンサー（ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７７，ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）でＤＮＡ塩基配列を解析した。それぞれのクローンの５’末端からの塩基配列をｏｎｅ  ｐａｓｓ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇにより、できる限り長く決定した。次いで、ｃＤＮＡの翻訳開始ＡＴＧの予測ソフト（ヘリックス研究所で開発したＡＴＧｐｒ）［Ａ．Ａ，Ｓａｌａｍｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，１４，３８４−３９０（１９９８）］で０．７以上のスコアを示すクローンのうちから、ＰＳＯＲＴ［Ｐｒｏｃ．Ｆｏｕｒｔｈ  Ｉｎｔ．Ｃｏｎｆ．Ｉｎｔｅｌｌ．Ｓｙｓ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，ｐ．１０９−１１５（１９９６）］でシグナル配列をもつと予測されるｃＤＮＡクローンＰＳＥＣ５６を選択した。このｃＤＮＡクローンについて全長塩基配列を決定し、タンパク質をコードする部分（ＯＲＦ）のアミノ酸配列を予想した。
ＰＳＥＣ５６の塩基配列を配列番号：１に、ＰＳＥＣ５６の塩基配列から予想されるＯＲＦのアミノ酸配列を配列番号：２に、ＰＳＥＣ５６の予想されるシグナル配列を配列番号：３に示す。
［実施例２］細胞の調製
脊髄後根神経節（ｄｏｒｓａｌ  ｒｏｏｔ  ｇａｎｇｌｉｏｎ；ＤＲＧ）細胞の調製は金承業の方法（脳・神経研究のプロトコール培養細胞から機能解析へ、御子柴克彦・清水孝雄  編，羊土社）に従った。即ち、妊娠１８日の雌性ラット（Ｃｒｊ：ＣＤ（ＳＤ）ＩＧＳ）から胎仔を摘出し、実体顕微鏡下でＤＲＧを摘出した。ＤＲＧを０．２５％トリプシンで処理する事により細胞を分散させた。神経細胞以外の付着性細胞を除去した後、ポリリジンコートした９６ウェルプレートに細胞を播種し（５，０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）、被験物質と１０％のＦＣＳを含むＤ−ＭＥＭ中、ＣＯ２インキュベータ内で２日間培養した。また、陽性コントロールとして神経成長因子（ｎｅｒｖｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ，ＮＧＦ）を用いた。
［実施例３］神経突起伸長作用の測定
上記の方法で調製した細胞を、ニューロフィラメントの発現を神経突起伸長の指標としてＣｅｌｌ−ｂａｓｅｄ  ＥＬＩＳＡで測定した。すなわち、細胞をホルマリンで固定した後、界面活性剤（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）で高透過性化させニューロフィラメントに対する特異的な抗体（ＳＭＩ３１；Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇｅｒ社）と反応させた。次に、前記の抗体をペルオキシダーゼ標識した抗体とペルオキシダーゼ用発色キットＴ（住友ベークライト社）で検出し、マイクロプレートリーダーを用いて４５０ｎｍの吸光度を測定した。
被験物質として、ＰＳＥＣ５６を遺伝子導入したＣＯＳ−７細胞の培養上清を用いた場合、培養上清はＤＲＧ細胞に対してＮＧＦと同様に、神経突起伸長作用を有する事が示された（図２）。
被験物質として、培養上清中より金属アフィニティカラムを用いて精製したＰＳＥＣ５６タンパク質を用いた場合、ＤＲＧ細胞に対して全く神経突起伸長作用を示さなかった（図３）。
以上の結果は、ＰＳＥＣ５６タンパク質自身が神経細胞の突起伸長に対する作用を有しているのではなく、ＰＳＥＣ５６を細胞に遺伝子導入することによって誘導されて合成されたＰＳＥＣ５６以外の分子にその作用本体があることを示している。
被験物質として、ＰＳＥＣ５６を遺伝子導入したＣＯＳ−７細胞の培養上清および前記物質をＮＧＦに対する抗体（Ｓｉｇｍａ社）で処理したものを用いた場合、ＤＲＧ細胞の神経突起伸長作用は抗ＮＧＦ抗体によって抑制された。この作用は他のＮＧＦに対する抗体を用いても同様に検出された（図４）。
［実施例４］神経成長因子（ｎｅｒｖｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ，ＮＧＦ）の測定
培養上清中ＮＧＦの測定はＰｒｏｍｅｇａ社のＮＧＦ測定キット（ＮＧＦ  ＥｍａｘＴＭ  ＩｍｍｕｎｏＡｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ）の添付プロトコールにしたがい、Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）により測定した。すなわち９６穴マイクロテストプレートに抗ＮＧＦポリクローナル抗体をコートした。ブロッキングをした後、被験物質を添加し、抗原抗体反応をした。さらに、抗ＮＧＦモノクローナル抗体を添加して抗原抗体反応をした後、二次抗体として酵素で標識した抗ラットＩｇＧ抗体を添加した。最後に酵素反応により発色する基質を加えた。発色した基質の吸光度を測定することにより、ＮＧＦを定量した。
被験物質としてＰＳＥＣ５６を遺伝子導入したＣＯＳ−７細胞の培養上清を用いた場合、培養上清中よりＮＧＦが検出された（約１００ｎｇ／ｍＬ）。しかし、Ｍｏｃｋ遺伝子を導入した場合ではＮＧＦは全く検出されなかった。
本実施例および図４の結果から、神経細胞の突起伸長に対して作用を有する本体分子はＮＧＦであることが示された。
［実施例５］ＰＳＥＣ５６タンパク質の精製
ＰＳＥＣ５６のＤＮＡをＭｙｃとポリヒスチジンのタグを付加するためのベクター（ｐｃＤＮＡ３．１（−）／ＭｙｃＨｉｓ−Ａ；ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社）に組み込んだ。リン酸カルシウム法またはリポフェクトアミン法により上記発現ベクターをＣＯＳ−７細胞に導入し、３日後に培養上清を回収した。
この培養上清中より金属アフィニティカラム（ＨｉｓＴｒａｐ；Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）を用いてポリヒスチジンが付加されたＰＳＥＣ５６タンパク質を精製した。すなわち、ニッケルイオンを添加したＨｉｓＴｒａｐカラムに培養上清を通し、カラムと結合したＭｙｃ−Ｈｉｓ−ＰＳＥＣ５６タンパク質を任意の濃度のイミダゾール溶液を用いて溶出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥと抗Ｍｙｃ抗体を用いたウエスタンブロッティングによってＭｙｃ−Ｈｉｓ−ＰＳＥＣ５６タンパク質を含有するフラクションを確認した（図５）。カラムからの溶出にはイミダゾールを用いたため、以後の実験に供するために目的のフラクションを集めた後に、ＰＤ−１０カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）を用いてゲル濾過により脱塩した。
産業上の利用の可能性
本発明により、ＰＳＥＣ５６を利用した神経栄養因子の発現誘導剤、神経栄養因子の発現を誘導する方法、および神経栄養因子の発現の誘導を調節する化合物のスクリーニング方法が提供された。本発明によりＰＳＥＣ５６からＮＧＦをはじめとする神経栄養因子の誘導・分泌に至る機構を解明することが可能となると共に、脊髄損傷や末梢神経疾患の他、痴呆や脳梗塞などの中枢神経疾患の新たな治療薬や予防薬の開発が可能となった。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、ｐＭＥ１８ＳＦＬ３クローニングベクターの構造を示す図である。スタッファーをＤｒａＩＩＩで切り出し、その部分にｃＤＮＡを挿入した。
図２は、ＰＳＥＣ５６をトランスフェクションしたＣＯＳ−７細胞の培養上清を含む培地でＤＲＧ細胞を培養して神経突起伸長作用を測定した結果を示す図である。
図３は、ＰＳＥＣ５６タンパク質を含む培地でＤＲＧ細胞を培養して神経突起伸長作用を測定した結果を示す図である。
図４は、ＰＳＥＣ５６タンパク質を含む培地でＤＲＧ細胞を培養して神経突起伸長作用を測定した結果を示す図である。
図５は、抗Ｍｙｃ抗体を用いたウエスタンブロッティングによってＭｙｃ−Ｈｉｓ−ＰＳＥＣ５６タンパク質を含むフラクションを確認した結果を示す写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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