(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
人尿トロンボモジュリン含有試料をトロンビン結合アフィニティクロマトグラフィーで予備精製し、次いでヒドロキシアパタイトを吸着剤とする吸着クロマトグラフィーで精製することを特徴とするトロンボモジュリンの精製方法。
【請求項２】
人尿トロンボモジュリン含有試料の溶液をヒドロキシアパタイトを吸着剤とするカラム吸着クロマトグラフィーにかけ、その際カラムからの脱着をリン酸の濃度勾配を用いて行い、最初に溶出する活性画分を採取することを特徴とする精製トロンボモジュリンの製造法。
【請求項３】
人尿トロンボモジュリン含有試料中のトロンボモジュリンをトロンビン結合アフィニティクロマトグラフィーで予備精製し、次いでヒドロキシアパタイトを吸着剤とするカラム吸着クロマトグラフィーにかけ、その際カラムからの脱着をリン酸の濃度勾配を用いて行い、最初に溶出する活性画分を採取することを特徴とする精製トロンボモジュリンの製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は人尿中のトロンボモジュリンを濃縮、精製する方法に関する。トロンボモジュリンは抗血液凝固物質であり、血液凝固能異常に関わる疾患の予防及び治療剤として期待されている。
【０００２】
【従来の技術】
トロンボモジュリン（以下ＴＭと略称する）は血管内皮細胞上に存在する高親和性のトロンビン受容体でプロテインＣの活性化を促進する蛋白としてエヌ・エル・エスモン（Ｎ．Ｌ．Ｅｓｍｏｎ）らにより見いだされた（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：８５９−８６４，１９８２）。ＴＭはトロンビンと１：１で結合し、Ｃａ2+の存在下でプロテインＣを活性化する一方、ＴＭに結合したトロンビンはフィブリノゲン凝固作用、血小板活性化などほとんどすべての凝固活性を失う。またＴＭは内因性ヘパリン作用を示し、アンチトロンビンIII によるトロンビン抑制を促進することも知られており、新しいタイプの薬剤として臨床応用が期待されている。
【０００３】
ヒトＴＭは当初エッチ・エッチ・サレム（Ｈ．Ｈ．Ｓａｌｅｍ）らによって人胎盤から精製されたが（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９：１２２４６−１２２５１，１９８４）、大量にＴＭを得る際の材料としては不適切であった。またヒトＴＭの遺伝子構造も鈴木らによって明らかにされたが（ＥＭＢＯ  Ｊ．６：１８９１−１８９７，１９８７）、ＴＭは多くの糖鎖を含んでいるため遺伝子工学的手法により天然型と全く同じ糖鎖を有するものを合成するのは難しい。
その後、山本ら（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１３：４３３−４４０，１９９３）やディ・イ・ジャクソン（Ｄ．Ｅ．Ｊａｃｋｓｏｎ）ら（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２１：１０７９−１０８７，１９９４) により人尿中ＴＭが精製され、天然型ＴＭの精製原料として人尿が適していることが示された。
尿からの精製法については山本らはＱＡＥセファデックス、抗ＴＭモノクロナール抗体カラム、トロンビンをリガンドとしたアフィニティーカラム、セファデックスＧ−２００を用いて精製ＴＭを得ているが、この方法にはモノクロナール抗体の調製が必要で、煩雑である。また、ディ・イ・ジャクソン（Ｄ．Ｅ．Ｊａｃｋｓｏｎ）らはＤＥＡＥセファロース、トロンビンをリガンドとしたアフィニティーカラム、逆相ＨＰＬＣによって精製しているが、逆相ＨＰＬＣでの収率が極めて悪い点、ＨＰＬＣを用いているので大量精製には不向きであるという問題点がある。さらに青木ら（特開６３−３０４２３）や国広ら（特開０３−２１８３９９）は新鮮尿からイオン交換クロマトグラフィー、トロンビン結合アフィニティーカラム、ゲルろ過によりＴＭを精製したと報告している。しかしながら本発明者らの経験では尿中に含まれるＴＭ量は必ずしも一定しておらず、特に尿中含量が低い場合にはこの方法では不十分であることが多い。従ってこのような場合に簡便で且つ有効な精製手段の開発が望まれる。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
そこで、本発明者らは尿中のＴＭ含量に関わらず純度の高いＴＭを得るための精製手段について検討することにした。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らはこの課題を解決するために研究を重ねた結果、ヒドロキシアパタイトを吸着剤とする吸着クロマトグラフィーがトロンボモジュリンの精製に極めて有効であることを見いだし、本発明を確立するに至った。
【０００６】
本発明は、人尿トロンボモジュリンの精製にヒドロキシアパタイトを吸着剤とする吸着クロマトグラフィーを用いることを特徴とする人尿トロンボモジュリンの精製方法である。
本発明の方法の原料である人尿トロンボモジュリン含有試料としては原尿または硫安分画等により濃縮したものが用いられるが、種類としては特に限定はされないが、できれば陰イオン交換クロマトグラフィー、トロンビン結合アフィニティークロマトグラフィーなどで予備精製したものが好ましい。
【０００７】
ヒドロキシアパタイトは、市販品（生化学工業（株）製、和光純薬（株）製など）を用いることができる。
【０００８】
また試料量が少ない場合には分取用あるいは分析用ＨＰＬＣカラム、例えばＴＳＫｇｅｌ  ＨＡ−１０００（東ソー（株））、ＫＢＣ系カラム（高研）などが使用可能である。
【０００９】
ヒドロキシアパタイトをカラムに詰めた後、ｐＨ５−８好ましくはｐＨ６−７に調整した１−３０ｍＭ好ましくは５−１０ｍＭのリン酸系緩衝液でカラムを平衡化する。この時使用する平衡化液には塩化カルシウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウムなどの塩類を添加した方が効果的である。特に好ましくは１ｍＭ以下の塩化カルシウムを用いるのがよい。
【００１０】
次に同緩衝液に置換した試料をカラムにアプライした後、同緩衝液で十分に洗浄する。２８０ｎｍにおける吸収が十分低下した後、リン酸の直線濃度勾配で溶出する。ＴＭの精製には５から３００ｍＭ程度の濃度勾配が適当であるが、ＴＭは一番最初に溶出され（リン酸濃度が５０−１００ｍＭ程度）、引き続いて不純物が溶出されてくる。なおオープンカラムを用いる場合にはカラムの形状を細長くした方が良好な分離が得られる。本工程終了時でまだ不純物が検出される場合にはゲルろ過などで最終精製を行うことができるが、本発明のヒドロキシアパタイトを用いる吸着クロマトグラフィーでは比活性の低い試料をかけた時も精製後には比活性の高い試料をかけた時と同等の純度のものが得られるのが特長である。
【００１１】
本発明の方法はたとえば、イオン交換クロマトグラフィー、トロンビン結合アフィニティークロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィーなどの他のクロマトグラフィーと組み合わせて人尿トロンボモジュリンの精製に用いることができる。
【００１２】
なお、各精製工程におけるＴＭの活性測定は以下の方法で行うことができる。緩衝液Ａ（０．１Ｍ塩化ナトリウム、３．５ｍＭ塩化カルシウムを含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５））３０μｌ、ヒトプロテインＣ溶液（緩衝液Ｂ（緩衝液Ａに０．１％  ＢＳＡを溶かした液）で１００μｇ／ｍｌに調製した液）１０μｌ、試料及び標準試料１０μｌを混合後、ヒトトロンビン溶液（緩衝液Ｂで４Ｕ／ｍｌに調製した液）５０μｌを添加し、３７℃で３０分間インキュベートする。その後、ヒトアンチトロンビンIII 溶液（緩衝液Ｃ（０．１Ｍ塩化ナトリウム、１ｍＭ塩化カルシウムを含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５））で５０μｇ／ｍｌに調製した液）１５０μｌ、ヘパリン溶液（緩衝液Ｃで２Ｕ／ｍｌに調製した液）５０μｌを添加し、３７℃で１５分間インキュベートする。基質溶液（テストチームＳ−２３６６（第一化学（株））２５ｍｇを２３．１９ｍｌの緩衝液Ｃに溶解した液）６００μｌを添加し、３７℃で２０分間インキュベート後、５０％酢酸溶液１００μｌを加えて反応を停止させる。４０５ｎｍにおける吸収を測定し、標準試料の値から試料中のＴＭ含量を算出する。（標準試料としてはウサギ肺由来ＴＭを緩衝液Ｂで２，５，１０，２０，４０ｍＵ／ｍｌに希釈したものを使用。）
【００１３】
【実施例】
次に本発明の方法について実施例により具体的に示すが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００１４】
（実施例１）
以下に異なる２ロットの人尿各２０００Ｌから精製した結果について示した。新鮮な人尿２０００ＬをｐＨ５．５とした後、吸着体としてキトサン０．５％（ｗ／ｖ）を加えて攪はんした。ｐＨを５．５に３０分間保った後、ろ過し、水洗浄後５％硫酸アンモニウム溶液（ｐＨ１０．５）に懸濁して室温で１時間攪はんした。その後ろ過洗浄して吸着成分を溶出した後、６０％硫安分画を行い、沈澱部分を回収した。得られた沈澱を２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解後、同緩衝液に透析し、あらかじめ同緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−トヨパール６５０Ｍカラム（樹脂量１．２Ｌ，１１．５×１１ｃｍ）（東ソー（株））にアプライした。カラムを同緩衝液で洗浄後、０．３Ｍ塩化ナトリウムを含む同緩衝液で溶出した。この溶出画分をプールし、２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で３倍希釈後、最終濃度が５ｍＭとなるように塩化カルシウムを添加した。次にあらかじめ０．１Ｍ塩化ナトリウム、５ｍＭ塩化カルシウムを含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化したＤＩＰ−トロンビン結合セファロースカラム（樹脂量４０ｍｌ，２．５×８ｃｍ）にアプライし、同緩衝液で洗浄後、２Ｍ塩化ナトリウム、１０ｍＭ  ＥＤＴＡを含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で溶出した。溶出画分を０．４ｍＭ塩化カルシウム、０．９％塩化ナトリウムを含む５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８）に透析後、あらかじめ同緩衝液で平衡化したヒドロキシアパタイトカラム（樹脂量２０ｍｌ，１．０ｃｍ×２５ｃｍ）（生化学工業（株））にアプライした。同緩衝液で洗浄後、５から３００ｍＭのリン酸ナトリウム直線濃度勾配で溶出したところ、図１（Ｌｏｔ．１）及び図２（Ｌｏｔ．２）に示すようにＴＭ活性は最初に鋭いピークとして溶出され、それに続いて不純物が溶出されてきた。この活性画分を濃縮後、あらかじめ０．９％塩化ナトリウムを含む２５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したセファクリルＳ−３００カラム（樹脂量８０ｍｌ，１．５ｃｍ×９０ｃｍ）（ファルマシア）にアプライし、同緩衝液で溶出した。２回の精製結果を表１に示したが、ヒドロキシアパタイトカラムにかける前の比活性が低い試料でも精製後には十分高い比活性のものが得られた。また最終精製試料の還元、非還元条件下のＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動の結果を図３に示したが、いずれのロットにおいてもＴＭに特徴的な近接する２本のバンド（還元条件下で分子量７万付近）が認められた。
【００１５】
【表１】
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【００１６】
（実施例２）
次に精製された試料が確かにＴＭであることを確認するためにアミノ酸組成及びＮ末端アミノ酸配列について調べた。なおアミノ酸組成は６Ｎ塩酸加水分解後、アミノ酸分析装置（ベックマン社製）により分析し、Ｎ末端アミノ酸配列はプロテインシークエンサー４７３Ａ（アプライドバイオシステム社製）にて分析した。
アミノ酸分析の結果を表２に、Ｎ末端アミノ酸配列を下に示したが、いずれも既報の結果と良く一致し、精製品が確かにヒトＴＭであることが確認された。
Ｎ末端アミノ酸配列：Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｐ
ｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−
【００１７】
【表２】
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【００１８】
【発明の効果】
本発明によれば、操作容易な吸着クロマトグラフィーによって人尿トロンボモジュリンを高倍率で濃縮精製することができるばかりでなく、トロンボモジュリン比活性の低い試料でも比活性の高い試料を用いる場合に勝る精製倍率で精製することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１において、ヒドロキシアパタイトカラムに人尿トロンボモジュリン含有試料（Ｌｏｔ．１）を吸着後リン酸ナトリウム直線濃度勾配で溶出したときのトロンボモジュリンの溶出パターンを示す。
【図２】実施例１において、図１の場合と同様に試料（Ｌｏｔ．２）について行ったトロンボモジュリンの溶出パターンを示す。
【図３】実施例１において、得られた人尿トロンボモジュリン精製物の還元および非還元条件下のＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動の結果を示す写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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