(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
皮膚欠損の処置の際に使用するための表皮等価物または皮膚等価物の移植片を作製するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）成長期の毛の無傷の毛包を培養して、外毛根鞘細胞を得る工程；
（ｂ）該外根鞘細胞を培養して、ケラチノサイト前駆体細胞を得る工程；および；
（ｃ）該ケラチノサイト前駆体細胞を含む、表皮等価物または皮膚等価物を調製する工程、
を包含し、ここで細胞の培養全てが、５％未満の濃度の同種または自己のヒト血清を含む培地中で行われる、方法。
【請求項２】
培養前に、１つ以上の抗菌剤および抗真菌剤を含むリンス緩衝液中で、前記成長期の毛の無傷の毛包をインキュベートする工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記外毛根鞘細胞は、皮膚欠損の処置をその後受ける個体から得られた自己細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記外毛根鞘細胞が同種細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法であって、前記表皮等価物または皮膚等価物は、同種または自己の生物学的補充物のみを含有する培地で培養された外毛根鞘細胞を含む、方法。
【請求項６】
前記ケラチノサイト前駆体細胞が、約３×１０４細胞／ｃｍ２と約１×１０５細胞／ｃｍ２との間の培養密度を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記表皮等価物または皮膚等価物が、その上部または角質化した側面上でフィブリン接着剤を用いて被覆されている、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記表皮等価物または皮膚等価物が、その上部または角質化した側面上にキャリア膜で被覆される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
請求項１、７、または８に記載の方法であって、ここで、前記表皮等価物または皮膚等価物が、その上部または角質化した側面上で、乳化された１以上の抗菌剤、抗真菌剤、または抗ウイルス剤を含むフィブリン接着剤を用いて被覆されている、方法。
【請求項１０】
表皮等価物または皮膚等価物の移植片であって、該移植片は、以下：
（ａ）成長期の毛の無傷の毛包から得られた外毛根鞘細胞を培養することにより得られたケラチノサイト前駆体細胞であって、ここで全ての培養が、５％未満の同種または自己のヒト血清を含む培地中で行われる、ケラチノサイト前駆体細胞；
（ｂ）微細孔膜であって、その上で前記ケラチノサイト前駆体細胞が増殖し、かつ１００，０００ダルトンまでの分子量のタンパク質の拡散を可能にする、微細孔膜；および
（ｃ）該微細孔膜の下面において増殖する、フィーダー細胞系、
を含む、移植片。
【請求項１１】
前記ケラチノサイト前駆体細胞は、皮膚欠損の処置をその後受ける個体から得られた自己細胞から誘導される、請求項１０に記載の表皮等価物または皮膚等価物の移植片。
【請求項１２】
前記ケラチノサイト前駆体細胞が同種細胞から誘導される、請求項１０に記載の表皮等価物または皮膚等価物の移植片。
【請求項１３】
前記ケラチノサイト前駆体細胞が、約３×１０４細胞／ｃｍ２と約１×１０５細胞／ｃｍ２との間の培養密度を有する、請求項１０に記載の表皮等価物または皮膚等価物の移植片。
【請求項１４】
前記表皮等価物または皮膚等価物が、その上部または角質化した側面上がフィブリン接着剤で被覆されている、請求項１０に記載の表皮等価物または皮膚等価物の移植片。
【請求項１５】
前記表皮等価物または皮膚等価物が、その上部または角質化した側面上がキャリア膜で被覆されている、請求項１０に記載の表皮等価物または皮膚等価物の移植片。
【請求項１６】
請求項１０、１４、または１５に記載の表皮等価物または皮膚等価物の移植片であって、ここで、該表皮等価物または皮膚等価物が、その上部または角質化した側面上で、乳化された１以上の抗菌剤、抗真菌剤、または抗ウイルス剤を含むフィブリン接着剤を用いて被覆されている、表皮等価物または皮膚等価物の移植片。
【請求項１７】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法によって作製される、表皮等価物または皮膚等価物の移植片。
【請求項１８】
皮膚欠損の処置のためのキットであって、該キットは、以下：
（ａ）以下：
（ｉ）請求項１０〜１７のいずれか１項に記載の表皮等価物または皮膚等価物の移植片；
（ｉｉ）キャリア膜であって、該移植片は、その上部または角質化した側面上が被覆されている、キャリア膜；および
（ｉｉｉ）輸送培地、
を含む、容器；ならびに
（ｂ）使用方法を示した説明書、
を備える、キット。
【請求項１９】
前記輸送培地が、同種または自己の生物学的サンプルのみを含む培地、および硬化またはゲル化媒体を含む、請求項１８に記載のキット。
【請求項２０】
前記硬化またはゲル化媒体が、アガロース、メチルセルロース、または別のゲル化物質からなる群から選択される、請求項１９に記載のキット。
【請求項２１】
前記キャリア膜は、ポリエステル、ＰＴＦＥ、ポリウレタン、ヒアルロン酸、ポリ乳酸、コラーゲン、またはシリコーン、あるいはワセリンガーゼ包帯を含む群から選択される、１つ以上の材料型から作製される、請求項１８に記載のキット。
【請求項２２】
前記表皮等価物または皮膚等価物が、その上部または角質化した側面上がフィブリン接着剤で被覆されており、該フィブリン接着剤は、該フィブリン接着剤中に乳化された１以上の抗菌剤、抗真菌剤、または抗ウイルス剤を含む、請求項１８に記載のキット。
【請求項２３】
皮膚欠損を治療するための表皮等価物または皮膚等価物の移植片において引き続き使用するための、毛髪の外毛根鞘からケラチノサイト前駆体細胞を選択するための方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）該外毛根鞘に由来するケラチノサイト前駆体細胞を、引き抜かれた成長期の毛髪全体を微細孔膜へ接着させることにより初代培養する工程であって、該微細膜は、増殖が停止／制限されたフィーダー細胞を、該微細膜の下面に有し、その結果、毛髪の外毛根鞘からケラチノサイト前駆体細胞を選択し、ここで該微細膜は、１００，０００ダルトンまでの分子量のタンパク質の拡散を可能にする、工程；
（ｂ）該初代培養物から採取された外毛根鞘を、微細孔膜に播種することによって、器官型に培養する工程であって、該微細孔膜がまた、増殖が停止／制限されたフィーダー細胞を該微細孔膜の下面上に有する、工程；ならびに
（ｃ）移植片挿入物として引き続いて使用するための、ケラチノサイト前駆体細胞およびキャリア膜から構成される表皮等価物または複合皮膚等価物を、工程（ｂ）からの該器官型培養物の上部にキャリア膜を配置し、そして該皮膚または表皮の等価物を脱着することによって生成する工程であって、該移片挿入物は、単一層状単位として一体である、ケラチノサイト前駆体細胞およびキャリア膜から構成される、工程、を包含し、ここで細胞の培養全てが、５％未満の濃度の同種または自己のヒト血清を含む培地中で行われる、方法。
【請求項２４】
前記外毛根鞘細胞は、皮膚欠損の処置をその後受ける個体から誘導された自己細胞である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記外毛根鞘細胞が同種細胞である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記ケラチノサイト前駆体細胞の培養密度が、約３×１０４細胞／ｃｍ２と約１×１０５細胞／ｃｍ２との間である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記微細孔膜上の前記増殖−停止／制限されたフィーダー細胞の培養密度が、約１×１０４細胞／ｃｍ２と約５×１０４細胞／ｃｍ２との間である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
前記増殖−停止／制限されたフィーダー細胞が、寄託または不死化された細胞である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２９】
前記表皮等価物または皮膚の等価物は、同種または自己の生物学的補充物のみを含有する培地で培養された外毛根鞘細胞を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項３０】
前記表皮等価物または皮膚の等価物は、血液成分からの同種または自己の遊離物のみを含有する培地で培養された外毛根鞘細胞を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項３１】
前記表皮等価物または皮膚等価物は、血液成分からの同種または自己の遊離物のみを含有する培地で培養された外毛根鞘を、約０．１％〜約２０％の濃度で含む、請求項２３または３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記表皮等価物が、それらの上部または角質化した側面上がフィブリン接着剤で被覆されている、請求項２３に記載の方法。
【請求項３３】
前記表皮等価物が、それらの上部または角質化した側面上がキャリア膜で被覆されている、請求項２３または３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記微細孔膜が、フィブリン、フィブロネクチン、コラーゲン、ラミニンおよびヒアルロンナンからなる群から選択される１以上の細胞外マトリクス物質によって被覆される、請求項２３に記載の方法。
【請求項３５】
前記微細孔膜が、該微細孔膜の下面に増殖−停止／制限されたフィーダー細胞系を有し、該フィーダー細胞系が、ヒト皮膚線維芽細胞、表皮細胞、間葉細胞、神経細胞および内皮細胞を含む群から選択される少なくとも１つの細胞型を有する、請求項２３または３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記キャリア膜が、ポリエステル、ＰＴＦＥ、ポリウレタン、ヒアルロン酸、ポリ乳酸、コラーゲン、またはシリコーン、あるいはワセリンガーゼ包帯を含む群より選択される、１つ以上の材料型から作製される、請求項２３に記載の方法。
【請求項３７】
前記表皮等価物のサイズが、１．０ｃｍ、１．５ｃｍ、２．０ｃｍ、および２．５ｃｍの直径からなる群より選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項３８】
請求項１０〜１７のいずれかに記載の表皮等価物または皮膚等価物を出荷するまたは輸送する方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）該表皮等価物を培養培地から脱着する工程、および
（ｂ）該表皮等価物を輸送培地へ移す工程、を包含する、方法。
【請求項３９】
前記表皮等価物または皮膚等価物が、それらの上部または角質化した側面がキャリア膜で被覆されている、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記表皮等価物または皮膚等価物が、移植時において将来使用するためにさらに封入および出荷される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記輸送培地が硬化またはゲル化培地を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
前記硬化またはゲル化培地が、アガロース、メチルセルロース、または別のゲル化物質からなる群から選択される、請求項４１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、ヒトケラチノサイト前駆体および皮膚線維芽細胞の細胞培養の分野に関する。本発明はまた、皮膚移植手順によって皮膚欠損を修復する際の培養ケラチノサイト前駆体細胞の使用に関する。
【０００２】
（発明の背景）
皮膚欠損の治癒は、３つの一般的な期によって進行する：（ｉ）炎症、（ｉｉ）創傷細胞の移動および有糸分裂、および（ｉｉｉ）細胞外マトリクスの生成および再造形。これらの事象の規則正しい順序は、細胞、増殖因子、および細胞外マトリクスタンパク質間の相互作用によって調整されると考えられる。皮膚創傷治癒の困難な段階は、表皮再生（すなわち、再上皮形成）である。創傷縁からの毛胞内（ｉｎｔｅｒｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ）表皮ケラチノサイトに加えて、残留の毛胞からの外毛根鞘（ＯＲＳ）はまた、このプロセスに寄与する（例えば、Ｅｉｓｅｎら、１５  Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１４５−１５５（１９５５）を参照）毛胞のＯＲＳは、大部分が、未分化ケラチノサイトから成り、未分化ケラチノサイトは、硬化内毛根鞘および毛幹の円筒形構造を取り囲む（例えば、Ｍｏｎｔａｇｎａ＆Ｐａｒａｋｋａｌ，Ｔｈｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｋｉｎ  １７２−２５８（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，１９７４）を参照）。最近の文献はまた以下を記載している：ＯＲＳ細胞は基底毛胞内ケラチノサイトよりも分化に対する貢献のレベルが低いこと（例えば、Ｃｏｕｌｏｍｂｅら、１０９  Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２２９５−２３１２（１９８９）；Ｌｉｍａｔら、１９４  Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２１８−２２７（１９９１）；Ｌｉｍａｔら、２７５  Ｃｅｌｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓ．１６９−１７６（１９９４）を参照）、ならびに標識保持（ｌａｂｅｌ−ｒｅｔａｉｎｉｎｇ）細胞が、隆起領域（これは、おそらく皮膚上皮組織のための幹細胞を表す）付近の動物およびヒトのＯＲＳ領域において検出されていること（例えば、Ｃｏｔｓａｒｅｌｉｓら、６１  Ｃｅｌｌ  １３２９−１３３７（１９９０）；Ｋｏｂａｙａｓｈｉら、９０  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７３９１−７３９５（１９９３）；Ｙａｎｇら、１０５  Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１４−２１（１９９３）；Ｒｏｃｈａｔら、７６  Ｃｅｌｌ  １０７３−１０７６（１９９４）；Ｍｏｌｌ，１０５  Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１４−２１（１９９５）を参照）。さらに、引き抜いた成長期頭皮毛胞から単離されるヒトＯＲＳ細胞は、インビトロで広範に増殖され得る（例えば、Ｗｅｔｅｒｉｎｇｓら、１０４  Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１−５（１９８１）；Ｌｉｍａｔ＆Ｎｏｓｅｒ，８７  Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．４８５−４８８（１９８６）；Ｉｍｃｋｅら、１７  Ｊ．Ａｍ．Ａｃａｄ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．７７９−７８６（１９８７）；Ｌｉｍａｔら、９２  Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．７５８−７６２（１９８９）を参照）。従来の液内培養条件下で、ＯＲＳ細胞は、形態的および生化学的（例えば、ケラチンプロフィール）両方の判断基準で、毛胞内表皮ケラチノサイトと似ている（例えば、Ｓｔａｒｋら、３５  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ２３６−２４８（１９８７）；Ｌｉｍａｔら、９２  Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．７５８−７６２（１９８９）；Ｌｉｍａｔら、６４２  Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１２５−１４７（１９９１）を参照）。ヒト皮膚線維芽細胞との器官型共培養において（すなわち、表皮環境を模倣する条件下で）、ＯＲＳ細胞は、組織学的、免疫組織学的、超微細構造学的および生物化学的な判断基準に関して、再生表皮の重層表皮記憶（ｓｔｒａｔｉｆｉｅｄ  ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ  ｒｅｍｉｎｉｓｃｅｎｔ）を発現する（例えば、Ｌｅｎｏｉｒら、１３０  Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．６１０−６２０（１９８８）；Ｌｉｍａｔら、１９４  Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２１８−２２７（１９９１）；Ｌｉｍａｔら、６４２  Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１２５−１４７（１９９１）を参照）。このような器官型培養物がヌードマウスに移植される場合、ＯＲＳ細胞は、恒常性制御下にある正常な新表皮を形成する（例えば、Ｌｉｍａｔら、５９  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  １０３２−１０３８（１９９５）を参照）。従って、ヒトＯＲＳ細胞は、臨床用途について非常に重要である。
【０００３】
ここ十年、創傷範囲に培養上皮細胞を使用することについて関心が集まっている。第一に、培養した自己の毛胞内ケラチノサイトのシートが、首尾良く急性創傷に移植され、主には以下の処置においてである：３度より上の熱傷（例えば、Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒら、１  Ｌａｎｃｅｔ  ７５−７８（１９８１）；Ｃｏｍｐｔｏｎら、６０  Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．６００−６１２（１９８９）を参照）、しかしまた、表皮水疱症（例えば、Ｃａｒｔｅｒら、１７  Ｊ．Ａｍ．Ａｃａｄ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．２４６−２５０（１９８７）を参照）、壊疽性膿皮症（例えば、Ｄｅａｎら、２６  Ａｎｎ．Ｐｌａｓｔ．Ｓｕｒｇ．１９４−１９５（１９９１）；Ｌｉｍｏｖａ＆Ｍａｕｒｏ，２０  Ｊ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．Ｓｕｒｇ．Ｏｎｃｏｌ．８３３−８３６（１９９４）を参照）、および巨大先天性母斑の切除（例えば、Ｇａｌｌｉｃｏら、８４  Ｊ．Ｐｌａｓｔ．Ｒｅｃｏｎｓｔｒ．Ｓｕｒｇ．１−９（１９８９）を参照）または接着双生児の分離（例えば、Ｈｉｇｇｉｎｓら、８７  Ｊ．Ｒｏｙａｌ  Ｓｏｃ．Ｍｅｄ．１０８−１０９（１９９４）を参照）の後の創傷。
【０００４】
このような急性創傷と対照的に、培養ケラチノサイトを慢性創傷（例えば、脚潰瘍）に移植することは、ほとんど成功しなかった。同種移植片は、永久的な「生着」という結果にならず（例えば、Ｆａｂｒｅ，２９  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．１６１−１６６（１９９１）を参照）、従って「非常に有効であるが高価な生物学的包帯」として分類され得る（例えば、Ｐｈｉｌｌｉｐｓら、２１  Ｊ．Ａｍ．Ａｃａｄ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１９１−１９９（１９８９）を参照）。以下を含む種々の様式によって移植される自己ケラチノサイトの再現性のある規模の大きな確実な「生着」は、科学文献において納得のいくように未だに実証されていない：少量の角質化していない細胞層のみからなる液内ケラチノサイト培養物のシート（Ｈｅｔｔｏｎら、１４  Ｊ．Ａｍ．Ａｃａｄ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．３９９−４０５（１９８６）；Ｌｅｉｇｈ＆Ｐｕｒｋｉｓ．１１  Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．６５０−６５２（１９８６）；Ｌｅｉｇｈら、１１７  Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．５９１−５９７（１９８７）；Ｈａｒｒｉｓら、１８  Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．４１７−４２０（１９９３））、コラーゲン被覆包帯へ塗布されたトリプシン処理単一細胞（Ｂｒｙｓｋら、２５  Ｊ．Ａｍ．Ａｃａｄ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．２３８−２４４（１９９１））、皮膚等価物（Ｍｏｌら、２４  Ｊ．Ａｍ．Ａｃａｄ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．７７−８２（１９９１））。定量的な知見の同一の欠如はまた、新鮮に単離された自己毛胞内ケラチノサイト（Ｈｕｎｙａｄｉら、１４  Ｊ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．Ｓｕｒｇ．Ｏｎｃｏｌ．７５−７８（１９８８））またはＯＲＳ細胞（Ｍｏｌｌら、４６  Ｈａｕｔａｒｚｔ  ５４８−５５２（１９９５））（これらは、フィブリン接着剤（ｆｉｂｒｉｎ  ｇｌｕｅ）の使用によって創傷床へ固定される）の移植に関する種々の報告についても当てはまる。しかし、ケラチノサイトの培養の間に使用されるウシ血清の不利益は、ウシ血清がケラチノサイト内で抵抗するという事実に起因して、減少される「生着」に寄与し得る（例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎら、１１  Ｊ．Ｂｕｒｎ  Ｃａｒｅ  Ｒｅｈａｂ．５０４−５０９（１９９０）を参照）ことが、注意されるべきである。
ＤＥ−Ａ−１９６５１９９２は、皮膚等価物を作製するための、１０〜１５％の自己または同種の血清中での外根鞘細胞の培養について記載する。この皮膚等価物は、取り扱いを最適にするために、移植の前に、ヒアルロン酸膜または他の生分解性の材料の上に播種され得る。
Ｌｅｎｏｉｒ−Ｖｉａｌｅ，Ｍ．Ｃ．（Ａｒｃｈ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．Ｒｅｓ．１９９３、２８５：１９７頁−２０４頁）は、ヒトの毛包の外根鞘から再構築された表皮のインビトロの調製について記載する。この際構築された表皮は、薬理学的な研究のための価値ある、かつ有望な道具として記載され、そして創傷治癒の１つの型を示し得る。
Ｌｉｍａｔ，Ａ．（Ｊ．ｏｆ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ  ２０００、Ｎｏｖ．７、１２８頁〜１３４頁）は、表皮等価物を作製するための毛包（除去された毛球および漏斗部）の培養、および慢性脚潰瘍を処置するためのその使用について記載する。
【０００５】
（発明の要旨）
本明細書中で本発明を開示する前に、ＯＲＳケラチノサイトの初代培養物の産生のための標準的方法論は、成長期（つまり、成長している毛幹）毛を引き抜き、続いて毛球および漏斗部毛幹を除去する注意深い顕微解剖から成った。得られた外毛根鞘を、次いで、初代ケラチノサイト培養の開始のための培養挿入部分上に配置した。しかし、成長期毛を、毛球および漏斗部毛幹を除去する最初の顕微解剖なしで、直接培養挿入部分上に配置した、非常に多くの引き続く研究（およそ２００）によって、このような単調なそして時間を浪費する、引き抜いた成長期毛の解剖は必要ないことが、実証された。このことは、著しく、取り扱いプロセスを簡略化し、汚染のリスクを軽減するのに役立ち、そしてケラチノサイト細胞の平板培養のより効率的な開始を生じた。
【０００６】
従って、本発明の目的は、ヒトおよび動物の両方における種々の型の皮膚欠損（例えば、脚潰瘍、糖尿病性潰瘍、とこずれなどの慢性創傷）の処置のための、完全に規定された条件下で外毛根鞘（ＯＲＳ細胞）からケラチノサイトまたはケラチノサイト前駆体を産生するための改良された、かつ簡略化された方法を提供することである。創傷の処置におけるそれらの使用に加えて、ケラチノサイトはまた、形成手術および美容手術において、またはこのような皮膚支持（例えば、入れ墨、母斑、皮膚癌、乳腫の除去の術後、切除後、性転換または処女膜形成において、皮膚再表面化（ｓｋｉｎ  ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）後の光化学作用損傷皮膚の回復、鼓室形成、外耳管の上皮形成など）の要求がある場合はいつでも、使用され得る。
【０００７】
これら前述の目的は、引き抜いた成長期または成長中の毛髪全体を、微細孔膜上において移植および培養することによって達成され、この微細孔膜は、ヒト線維芽細胞フィーダー細胞を微細孔膜の下面に保持する。このような初代培養において、多量のＯＲＳ細胞が、ドナーの暦年齢とは関係なく容易にかつ繰り返し得る。このようなＯＲＳ細胞は、複合皮膚（すなわち、皮膚−表皮等価物または表皮等価物）の引き続く調製のために使用され得るか、あるいは、その後それらを使用するために凍結保存して貯蔵され得る。
【０００８】
皮膚等価物または表皮等価物の引き続く調製は、調節された微細孔膜上にこれらのＯＲＳ細胞を「播種する」ことによって達成され、この微細孔膜は、線維芽フィーダー細胞（最も好ましくは、増殖−停止／制限された皮膚線維芽「フィーダー細胞」）を微細孔膜下面に保持する。培養の間、これらのＯＲＳ細胞は、正常の表皮の組織分化と類似であると実証された組織分化を受ける。この知見は、増殖細胞の多くの画分に起因している可能性が最も高い。本明細書中で開示される改変培養条件は、自己ＯＲＳ細胞からインビトロで生成された表皮等価物を用いての、慢性創傷の首尾の良い処置のために重要である。
【０００９】
本発明のさらなる目的は、成長期の毛髪を、細胞外マトリクス起源の１つ以上の分子で被膜されたポリマー性微細孔膜上に接着することによるＯＲＳ誘導ケラチノサイトのための改良された培養システムを提供することである。ＯＲＳ細胞のこれらの改良された培養物（皮膚等価物または表皮等価物として命名される）は、皮膚欠損、特には慢性創傷を処置するために使用され得る。
【００１０】
本発明のさらなる別の目的は、減少した濃度の同種異系または同種の血清を使用して、皮膚または表皮の等価物を生成することである。これは、インビトロ培養工程における補充物のために、例えば、血液生成物の臨床使用によって、血液成分（例えば、血小板）から誘導または遊離された自己または同種のヒト血清および物質を使用することによって、疾患伝播のリスクを非常に軽減する。
【００１１】
本発明のさらなる目的は、移植前の輸送の間、皮膚または表皮の等価物の機械的損傷（例えば、種々の構成層の分離）の確率を減少する方法論である。
【００１２】
本発明の上記の方法論の臨床的利益には、以前から使用されている慢性創傷の移植技術と比較すると、以下が挙げられるが、これらに限定されない：非侵襲性（その結果、細胞は繰り返し利用可能である）、移植手順の間の外科的設備または麻酔の必要性の無いこと、および移植手順に続いて要求されるたった２時間の短い固定化時間。
【００１３】
（発明の詳細な説明）
他に定義しない限り、本明細書において使用される全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する分野の当業者によって共通に理解される同一の意味を有する。本明細書で記載されるのと同様または等価の任意の方法および物質が、本発明の実施において使用され得るが、好ましい方法および物質がここで記載される。本明細書中に記載される全ての刊行物は、その全体が本明細書中で参考として援用される。
【００１４】
本明細書中で使用される用語「ケラチノサイト層」は、より分化したまたはあまり分化していない構造を有するインビトロで生じるケラチノサイト組織培養物を意味する。本明細書中で使用される用語「表皮等価物」は、組織学的構造において天然の表皮と似ている（特に角質層の層形成および発達に関して）インビトロで生じる器官型組織培養物を意味する。正常な重層表皮は、小さな立方体様の細胞の基底層、次第に扁平になる細胞のいくつかの有棘層、隆起顆粒層、および正常角化角質層からなる。全てのこれらの層は、本発明の主題である表皮等価物において検出され得る。免疫組織化学によってアッセイされる表皮分化産物（例えば、ケラチン、被膜、フィラグリン、インテグリン）の所在は、正常な表皮において見られるのと同様である。
【００１５】
本明細書中で使用される用語「自己の」は、以下を意味する：（ｉ）移植されるべき生物学的材料が、表皮等価物で処置されるべき個体から誘導されること、または（ｉｉ）組織培養物に添加される生物学的材料が、組織培養のための細胞のドナー由来であること。
【００１６】
本明細書で使用される用語「同種の」は、以下を意味する：（ｉ）移植されるべき生物学的材料が、表皮等価物で処置されるべき個体と同様の種類の１以上の個体から誘導されること；または（ｉｉ）組織培養物へ添加される生物学的材料が、組織培養のための細胞のドナーと同一の種類の１以上の個体由来であること。
【００１７】
用語「器官型の培養」などは、細胞の分化を促進する条件下での細胞の培養をいう。器官型の培養の条件下で、細胞の増殖は、「増殖性の」条件（例えば、初代培養の条件）下での培養と比較して遅められ、そして完全に停止され得る。今回の場合、器官型の培養物のための重要な条件は、空気−液体界面での細胞の管理である（いわゆる「リフトした（ｌｉｆｔｅｄ）」培養条件）。
【００１８】
本明細書中で使用される用語「血液成分からの遊離物」は、血液成分（例えば、血小板）から得られるサイトカインまたは他の増殖因子の任意の組み合わせを意味する。例えば、トロンビンで刺激される血小板は、周囲の媒体へそれらのα顆粒の内容物を放出する。α顆粒は、通常、いくつかのサイトカイン（例えば、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、トランスホーミング増殖因子αおよびβ（ＴＧＦ  α／β）、血小板第４因子（ＰＦ−４）、血小板基礎タンパク質（ＰＢＰ））を含有する。しかし、血小板由来のサイトカインおよび他の増殖因子を、トロンビンでの刺激以外の他の方法によって得ることは、可能である。その上、他の血液成分は、同様に増殖因子およびサイトカインを産生する。例えば単球は、ＩＬ−１、ＴＮＦα、ＩＬ−６および目的の他の物質を産生する。
【００１９】
（ＯＲＳ細胞由来の表皮等価物を調製するための一般的な方法）
ケラチノサイト前駆体細胞は、表皮等価物で引き続いて処置されるべきである個体から誘導される、成長期または成長中の毛髪の外毛根鞘（ＯＲＳ）から、選択される。一般に、約４０個の毛胞が頭皮から摘み取られ、そして成長期である毛胞（すなわち、成長中の毛幹）は、次いで、解剖顕微鏡下で選択される。総計４週間の培養が、通常、５個の毛胞から約１ｃｍ2の表皮等価物を得るために要求される。しかし、改善された培養および発酵の技術を用いて、より高い収量（すなわち、この期間内での大きな面積の表皮等価物）を得ることは可能であり得る。
【００２０】
ＯＲＳケラチノサイトの初代培養物の産生のための以前の標準的な方法は、成長期（すなわち、成長中の毛幹）毛髪の摘み取ること、続いて、毛球および漏斗部毛幹を除去するための注意深い顕微鏡解剖からなった。得られた外毛根鞘（ＯＲＳ）を、次いで、初代ケラチノサイト培養の開始のために培養挿入物上に配置した。しかし、数多くの引き続く研究（約２００個）（これらの研究では、成長期の毛髪は、毛球および漏斗部毛幹を取り除くための最初の顕微鏡解剖を実施することなしに、培養挿入物上に直接配置された）は、このような退屈かつ時間を食う、摘み取られた成長期の毛髪の解剖は必要ないことを実証した。これは、取り扱いプロセスを著しく単純化し、汚染の危険性を軽減するのに役立ち、そしてケラチノサイト細胞平板培養のより効率的な開始を生じた。
【００２１】
選択される成長期の毛髪は、種々の抗菌剤および抗真菌剤（例えば、ファンギソン、ペニシリン、およびストレプトマイシン）を含有する適切なリンス緩衝液中でインキュベートされた。この手順に続いて、摘み取られた全体の成長期の毛髪は、直接、培養挿入物上へ配置され、そして数日、好ましくは７〜１４日、そしてより好ましくは８〜１０日間増殖させる。任意のさらなる工程は、初代培養を通過する工程、および大きな面積の表皮等価物の調製のためのより細胞性の材料を得るための第２培養を実施する工程からなる。
【００２２】
培養挿入物（１以上の細胞外マトリクス物質（例えば、フィブリン、フィブロネクチン、コラーゲン、ラミニンまたはヒアルロナン（ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ）あるいはそれらの混合物）で被覆された微細孔膜）は、増殖−停止／制限されたフィーダー細胞システムをその下面上に保有する。このような細胞外マトリク物質を有するこの膜挿入物のコーティングは、以下を提供する：（ｉ）成長期の毛髪の最初の接触のための増強された培養表面（すなわち、それは容易に固着し、そして静止したままである）；（ｉｉ）外毛根鞘（ＯＲＳ）の成長期毛胞から離れたＯＲＳケラチノサイトの移動を有意に増強する表面；ならびに（ｉｉｉ）播種されたＯＲＳケラチノサイトの増加した成長率（すなわち、完全に分化した皮膚等価物または表皮等価物の産生のために必要である培養時間全体）が４週間の代わりに３週間に減少され得ること。
【００２３】
微細孔挿入物膜の下面上に配置される上記の増殖−停止／制限されたフィーダー細胞は、ヒト皮膚生検から得られる初代皮膚線維芽細胞からなる。初代皮膚線維芽細胞は、摘み取られた成長期の毛髪のための「フィーダー細胞」としてのそれらの使用前に４〜６時間、マイトマイシン−Ｃで処理され、次いで培養挿入物の下側に配置される。増殖−停止／制限は、マイトマイシン−ＣまたはＸ−線処理のいずれかによってか、あるいは、好ましくは、５％未満の、そして好ましくは２％の減少された血清濃度によって、誘導される。いくつかの培養は１０％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ；Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して実施されるが、同種異系の成分の数を減少するために、現在ではヒト血清を利用することによって、ＯＲＳ細胞の顕著であり優れた成長および増殖が提供されことが見出されたことが、注意されるべきである。その上、ヒト血清は、好ましくは５％未満の濃度で、そしてより好ましくは、２％の濃度で使用される。このような低い血清濃度の存在において、本発明の初代ヒト皮膚線維芽細胞は、有意に、または完全に、増殖を停止する。従って、同様の様式において、自己のＯＲＳ培養システムにおける２個の高価なかつ潜在的に複雑な工程は、省かれ得る。この２つの複雑な工程は以下を包含する：（ｉ）＞５％濃度の高い血清の除去（これは、このプロセスの全体的なコストを有意に軽減する）および；（ｉｉ）マイトマイシン−Ｃ処理の除去（これは、完全にマイトマイシン−Ｃを含まない培養システムを提供し、そして、表皮等価物の増殖の前に、初代培養挿入物からの薬物の完全な排除に関する任意の関連事を排除する。さらに、減少された血清濃度の使用は、代替のフィーダー細胞停止手順（すなわち、Ｘ線曝露工程）が省かれることを可能にし、従って、手順全体における有意な時間および支出を節約する。
【００２４】
ＯＲＳ細胞を適切な密度（すなわち、１×１０3〜１×１０6細胞／ｃｍ2、そしてより好ましくは、５×１０4〜１×１０5細胞／ｃｍ2）まで拡大することに続いて、それらを表皮等価物の調製のために使用する。好ましくは、細胞はコンフルエンスまで増殖される。この表皮等価物は、適切な細胞密度（すなわち、３０×１０3〜１００×１０3細胞／ｃｍ2、そして好ましくは、６０×１０3細胞／ｃｍ2）でＯＲＳ細胞を播種することによって、培養デバイス（これは、培養中に、空気−液体界面まで細胞を「リフト」するために適切である）内で調製される。引き続いて、播種から１〜４日後（好ましくは、播種から３日後）、ＯＲＳ細胞を空気に曝し（例えば、挿入物内の培地の吸引によって）、次いで、この培養を、このような「リフト」培養条件において、約１０〜２０日間、そして好ましくは１４〜１８日間続ける。この培地をリフトされた培養の間、定期的（好ましくは、２または３日ごと）に交換した。
【００２５】
本発明はまた、さらなる層を含む皮膚等価物を含み、そしてそれゆえ、表皮等価物よりもより複雑な構造体である。皮膚等価物は、それらの表皮部分としての分化したＯＲＳ細胞を含み、そしてまた、マトリクス成分（好ましくは、組み込まれた皮膚線維芽細胞および／または他の細胞（すなわち、「組み込まれたマトリクス」）を含有する層を含む。皮膚等価物は、１以上の細胞外マトリクス物質（例えば、フィブリン、フィブロネクチン、コラーゲン、ラミニンまたはヒアルロナンあるいはそれらの混合物）を有するマトリクスを上述の微細孔膜の上面上に配置することによって、作製した。ヒト皮膚線維芽細胞（好ましくは、自己ヒト皮膚線維芽細胞）を組み込む場合、細胞は、１×１０3〜１×１０7細胞／ｃｍ3；好ましくは１×１０4〜１×１０5細胞／ｃｍ3；そして最も好ましくは約５×１０4細胞／ｃｍ3の密度で組み込まれる。ＯＲＳの初代培養物は、次いで、マトリクスの上部へ播種され（好ましくは、組み込まれた皮膚線維芽細胞および／または他の細胞を含有する）、器官型の培養は、上で記載される通り行われる。皮膚等価物の調製の詳細な説明について（例えば、Ｌｉｍａｔら、１９４  Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２１８−２７７（１９９１）を参照のこと）。
【００２６】
しかし、マトリクス内に組み込まれる細胞は、表皮線維芽細胞のみに限定される必要はないことに注意するべきである；例えば、表皮細胞、間葉細胞、神経細胞および／または内皮細胞もまた、使用され得る。組み込まれた細胞は、好ましくは、皮膚組織から得られ、そしてより好ましくは同種異系の細胞であり、そして最も好ましくは自己細胞である。
【００２７】
全ての培養工程は、ＯＲＳ細胞の増殖および毛胞からのそれらの成長を可能とする適切な培地において実施され、培地は、典型的には、２〜３日ごとに交換される。一般的には、全ての工程のために使用される培地は、同一である。培地は、典型的には、最小培地をベースとし、そしていくつかのさらなる成分を含有する。１つの共通の成分は、０．５〜６０％の濃度での血清である。本発明の好ましい実施態様において、ヒト血清は、５％未満の濃度で、そして最も好ましくは２％の濃度で使用される。さらに、無血清培地の開発とともに、血清を全体として省略することが可能であり得る。上皮増殖因子（ＥＧＦ）は、ケラチノサイトの移動を模倣し、そして、増殖の刺激を生じるそれらの配列を遅らせる。コレラトキシン、ヒドロコルチゾン、インスリン、アデニンおよびトリヨードサイロニンは、増殖を刺激する効果を有する。これらの成分の全ては、従って、表皮等価物を調製するための培地において有用である。にもかかわらず、１つまたは別のこれらの成分を省略するまたは交換することが可能であり得る。
【００２８】
血液成分（例えば、血小板、単球またはリンパ球）からの遊離物は、細胞増殖活性の源として役立ち得、そしてそれゆえ、血清を置換し得、そして上述の他の成分を提供し得る。特定の培養時間について、血清含有培地は、規定された無血清培地（例えば、ＳＦＭ（Ｇｉｂｃｏ  Ｅｕｒｏｐｅ，Ｅｔｔｌｉｎｇｅｎ））によって、おそらく置換され得る。血液成分（例えば、血小板、単球またはリンパ球）からの遊離物（特に、相同または自己由来）は、細胞増殖活性の源として役立ち得、そして従って、血清と置換し得、そして他の上述の成分を提供し得、あるいは実際にさらなる成分を提供し得る。血液成分は、遊離物がこれらの成分が得られる血液と同一の最終体積へされた後、０．１％〜２０％、そして好ましくは１％〜５％の濃度で培養培地に添加されるべきである。これらの遊離物は、血清中に存在するいくつかの増殖因子（例えば、ＰＤＧＦ、ＥＣＦまたはＴＧＦ）を含有する。しかし、血清および遊離物は、多くの物質を含有し、そして全てが特徴付けされているわけではない。
【００２９】
血小板からの遊離物は、栓球以外の全ての細胞をペレット化するために、抗凝固処理した全血（好ましくはヒトの血液）を遠心分離することによって得られた。上清を再び遠心分離して栓球を遠沈する。栓球を、適切な緩衝液（例えばリン酸緩衝液）中に懸濁し、種々の増殖因子（例えば、ＰＤＧＦ、ＰＦ−４、ＴＧＦ−β、ＥＧＦ、β−トロンボグロブリン）の混合物を有するそれらのα顆粒を遊離するために、トロンビンで処理した。さらなる遠心分離工程において、全ての細胞性物質を除去した。最後に、上清が緩衝液で補充され、成分が得られる元の血液サンプルの容積にされた。血液成分は、０．１％〜２０％；好ましくは、１％〜１０％；そしてより好ましくは２％〜５％の濃度で培養培地に添加されるべきである。
【００３０】
同様に、遊離物は、細胞を破壊し（例えば、音波破砕、凍結融解法などによって）そして増殖因子を精製する（例えば、濾過または免疫学的方法によって）ことによって、他の血液細胞（例えば単球）から得られ得る。
【００３１】
血液成分遊離物はまた、表皮等価物または皮膚等価物を移植する過程で、創傷床の調子を整えるために使用され得る。さらに、遊離物を含有しかつ器官型培養工程を実施するために使用される培養培地は、細胞により馴化された後に表皮等価物または皮膚等価物を移植する過程で皮膚欠損の床の調子を整えるために使用され得る。
【００３２】
培養は、通常、微細孔膜を有する挿入物において実施され、この微細孔膜は、同種のまたは自己のヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ）を、特に、それらの下面に分裂後期のＨＤＦを含有する。ＨＤＦは、表皮等価物のよりよい増殖を得るために培地を馴化する因子を分泌する。ＨＤＦ層は、５×１０3〜１×１０5細胞／ｃｍ2、そして好ましくは約１×１０4〜５×１０4細胞／ｃｍ2で、形成され得る。ＨＤＦは、好ましくは、分裂後期であるが、しかし、早い時期の継代細胞は、照射される場合、マイトマイシンＣで処理される場合、またはこれらの増殖を阻害するがこれらの代謝を維持するために他の方法で（すなわち、血清濃度の減少によって）処理される場合、使用され得る。
【００３３】
１実施態様において、複合皮膚（ｄｅｒｍａｌ）（「複合皮膚（ｓｋｉｎ）」）等価物についての移植厚みは、０．４ｍｍを超えない。
【００３４】
微細孔膜は、培養基材として適切である。なぜならば、これらは、物質が一方から他方へ拡散することを可能にするが、細胞に対して障壁として作用するからである。この膜の孔サイズは、本発明において限定ではないが、１００，０００ダルトンまでの分子量、および好ましくは７０，０００ダルトンまでの分子量のタンパク質の拡散を可能にするように十分であるべきである。この膜は、少なくとも小さなホルモン（例えば、インスリン）の拡散を可能にし、そして１５，０００ダルトン分子量までのタンパク質の通過を可能にするべきである。ＯＲＳ細胞のＨＤＦとの混合を防止しながら、培養したＯＲＳ細胞への可溶性因子の拡散を可能にする機能を実施するための微細孔膜以外の手段はまた、使用可能である。
【００３５】
当該分野において典型的な微細孔膜が、通常使用される。しかし、生分解性材料（例えば、ポリヒアルロン酸またはポリ乳酸）から作製された膜がまた、使用され得る。生分解性微細孔膜を使用した場合、全体の培養物（分化したＯＲＳ細胞、微細孔膜およびＨＤＦを含む）が、皮膚欠損に移植されることが意図される。従って、この実施態様において、この膜の下面上に増殖したＨＤＦは、分裂後期である必要がなく、または増殖を防止するように処理される必要もない。ＨＤＦは、ケラチノサイトより免疫原性が少ない傾向がある一方、この実施態様が使用される場合、ＨＤＦが同種異系の細胞であり、好ましくは自己細胞であることが望ましい。
【００３６】
１実施態様において、メッシュ移植片の厚みは、３０〜３００ミクロンの範囲であり得る。好ましくは、メッシュ移植片厚みが、０．５〜０．７５ｍｍの範囲である。非常に厚い組織（例えば、皮膚コラーゲン＋ケラチノサイト組織で被覆された線維芽細胞）の組織移植片は、特に、皮膚線維芽細胞コラーゲン層上に存在するケラチノサイト層について、非常に迅速に虚血性の細胞死を生じ得る。対照的に、このメッシュ移植片組織は、創傷部位において「生着」し得る。
【００３７】
本発明の表皮等価物は、直径約６ｍｍ〜約２．５ｃｍのサイズの範囲であり得、好ましい直径は２．５ｃｍである。実施の程度について、本明細書中に開示される実験は、直径約２．５ｃｍの表皮等価物を用いて実施された。
【００３８】
１実施態様において、表皮等価物についての好ましい範囲は、５０〜１５０ミクロンである。特定の実施態様において、表皮等価物は、非常に薄い（当該分野において一般的に使用されるよりも薄い、例えば、６０ミクロン）。非常に厚い自己の移植片を作製することは、適切な血液供給が達成されることを妨げ、その結果、表皮は、創傷部位に「生着」しないと仮説が立てられた。対照的に、本発明の表皮等価物は、創傷部位に「生着」し得る。
【００３９】
しかし、多くの場合において、皮膚等価物または表皮等価物は、それらが産生される設備から、それらが使用される施設へ送達されなければならない。従って、皮膚等価物または表皮等価物の輸送を可能にするシステムが必要であり、皮膚等価物または表皮等価物は、移植に必要な準備が整った状態に維持されている。微細孔膜が、移植前に、基底細胞層から除去されるかどうかに関わらず、培養の間、それらと類似する状態は、好都合であるようである。皮膚等価物または表皮等価物が、基底層由来の培地のみと接触した（すなわち、培養の間の）状態を維持するために、０．１％〜５％の範囲の濃度のアガロース、そして好ましくは０．５％〜１％の濃度で、または匹敵する濃度のメチルセルロースまたは任意の他のゲル化物質が、輸送培地を凝固させるために使用され得る。皮膚等価物または表皮等価物は、凝固化またはゲル化媒体の上に予め組み込まれた挿入物の膜上に、基底層を下にして配置される。これらの挿入物を含有するマルチウエルディッシュは、次いで、テイベックカバー（ｔｙｖｅｋ  ｃｏｖｅｒ）によって封入されるブリスターに配置され、そして出荷される。皮膚等価物または表皮等価物は、最も好ましくは、最初のパッケージングの２４〜４８時間内に移植するために使用される。
【００４０】
表皮等価物の安定性を改善するために、キャリア膜を、表皮等価物の上部、すなわち角質化面）に配置し、そして最終的にそれに接着させる技術が、開発された。接着剤として、フィブリン接着剤が好ましいが、以下の他の選択肢が挙げられるが、これらに限定されない：コラーゲン、フィブロネクチン、プロテオグリカン（例えば、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸など）などの細胞外マトリクス成分、または基底膜帯成分（例えば、ラミニン、ＭａｔｒｉｇｅｌTM、またはＬ−ポリリジン）、または類似の組織接着剤がまた使用され得る。
【００４１】
本発明において利用されるキャリアは、合成膜からなり得、以下の材料の１つまたはそれ以上から作製される（ポリエステル、ＰＴＦＥまたはポリウレタン）；１つまたはそれ以上の生分解性ポリマー（例えば、ヒアルロン酸、ポリ乳酸またはコラーゲン）；またはシリコーンもしくはワセリンガーゼ包帯、あるいは創傷包帯に適切な任意の他の材料。創傷包帯に適切であるこれらの材料は、皮膚等価物または表皮等価物が移植された直後に、キャリアが除去されることを要求するよりむしろ、キャリアが、所定の位置に留まり、数日間、移植された皮膚等価物または表皮等価物を固定化することを可能にする。従って、キャリアは、安定性を増強しかつ取り扱いを改善するだけでなく、それはまた、創傷において、物理的な損傷ならびにタンパク質分解環境および細菌に対して、保護的被膜として役立つ。その上、それは、移植の配向（すなわち、基底側が下、角質側が上）のために役立つ。
【００４２】
キャリア上に置かれる皮膚等価物または表皮等価物は、移植のための準備が出来ている状態に保持されなければならない。微細孔膜が輸送のために基底細胞層から取り除かれるかとうかに関わらず、培養の間のものと似ている状態が、好都合であるようである。皮膚等価物または表皮等価物を、基底層からの培地とのみ接触する（すなわち、培養の間の）状態に保持するために、１％〜５％の範囲の濃度の、そして好ましくは、１〜３％のアガロース；メチルセルロース；または匹敵する濃度の任意の他のゲル化物質は、培地を凝固化するために使用され得る。キャリアを共に有する表皮等価物は、それらの基底層が凝固化またはゲル化培地の上に配置される。次いで、全デバイスが、気密の様式で封入され、そして出荷される。表皮等価物は、最も好ましくは、最初のパケージングの２４時間以内に移植するために使用される。
【００４３】
皮膚等価物または表皮等価物は、創傷または他の皮膚欠損の床に単に配置することによって移植される。好ましくは、皮膚等価物または表皮等価物は、次いで、固定される（患者は、２時間固定される）。固定化のための好ましい方法は、生分解性材料の使用によって、いくらかの種類の組織接着剤または適切な包帯によってである。前述したように、皮膚欠損の床は、血液遊離物または、器官型培養からの培地を用いて、移植の前または同時に、処理され得る。
【００４４】
カプセル化した細胞デバイス（１００ミクロン膜、中空ファイバーの中心まで２００−２５０ミクロン）を使用する研究において、ヒトの皮膚線維芽細胞の良好な生存は、最も近い血管からの３００ミクロンの距離で、得られた。
【００４５】
（実施例１  ＯＲＳ細胞の調製）
本発明において開示されるように、毛胞の外毛根鞘（ＯＲＳ）由来のケラチノサイト前駆体細胞を選択し、そして引き続いて以下の方法論の使用によって培養した。
【００４６】
約４０個の毛胞を毛抜きを用いて個体の後頭部頭皮から摘み取り、次いで成長期の毛胞（例えば、十分に発達した毛根鞘によって検出する）を解剖顕微鏡下で選択した（例えば、Ｌｉｍａｔ＆Ｎｏｓｅｒ，８７  Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．４８５−４８８（１９８６）；Ｌｉｍａｔら、９２  Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ，Ｄｅｒｍａｔｏｌ．７８５−７６２（１９８９）を参照のこと）。成長期の毛髪を、毛球および漏斗部毛幹を除去するために以前利用されていた顕微解剖を実施せずに、直接、微細孔培養挿入物に配置した。
【００４７】
一般的に、６個の成長期毛を、その下面上に予め形成されたフィーダー層（これは、好ましくは、１ｃｍ2当たり２０×１０3の分裂後期ヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ）からなる）を保有する細胞挿入物（Ｃｏｓｔａｒ）の微細孔膜上に外植した（例えば、Ｌｉｍａｔら、９２  Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ.７５８−７６２（１９８９）を参照のこと）。ＨＤＦを、健康な、反復してＨＩＶ血清学陰性および肝炎血清学陰性個体の皮膚外植片から誘導され、そして１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、または好ましくは５％未満のヒト血清、または最も好ましくは２％ヒト血清を補充したＤＭＥＭ中で培養した。
【００４８】
成長期の毛髪由来の外毛根鞘（ＯＲＳ）細胞の効率的な成長および高い増殖速度を得る目的のために、ＨＤＦフィーダー細胞を培養皿の底面に配置せず、ＨＤＦ層とＯＲＳ細胞を支持する微細孔膜との間にさらなる培地層を生じさせることが重要である。微細孔膜の１側面での各細胞型を増殖させることは、非常に近い相互作用を可能にするが、線維芽細胞でのＯＲＳ細胞の相互汚染を防止し、従って、ＯＲＳ細胞の純培養を保証する。
【００４９】
利用した培養培地は、２％ヒト血清、１ｍｌの培養培地当たり１０ｎｇの上皮増殖因子、０．４μｇ／ｍｌのヒドロコルチゾン、０．１３５ｍＭアデニン、および２ｎＭのトリヨードサイロニン（全てＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯから得た）を補充したダルベッコ改変イーグル培地／Ｆ１２（３：１  ｖ／ｖ）からなった。培養培地の好ましい最終Ｃａ2+濃度は、１．５ｍＭである（例えば、Ｗｕら、３１  Ｃｅｌｌ  ６９３−７０３（１９８２）；Ｌｉｍａｔ＆Ｎｏｓｅｒ、８７  Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．４８５−４８８（１９８６）を参照のこと）。約２週間内に、ＯＲＳ細胞は増殖し、そしてコンフルエンスに達した。これらを、０．１％トリプシン／０．０２％ＥＤＴＡ混合液で解離し、生存度を調べ、そして表皮等価物の調製のために使用した。最初の培養を１０％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ；Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して実施したが、同種異系成分の数を減少するために、現在ではヒト血清を使用することによって、ＯＲＳ細胞の優れた成長および増殖が提供されたことが注意されるべきである。ヒト血清は、好ましくは、５％未満の濃度、そして最も好ましくは、２％の濃度で利用される。
【００５０】
摘み取った成長期の毛髪を、下面上にフィーダー細胞として分裂後期ＨＤＦを保有する培養挿入物の膜上に直接外植することは、ＯＲＳ細胞の初代培養を確立するための、単純で、効率的な、かつ再現性のある方法であると分かった。約８０％の外植された毛胞は、９０才より上の年齢の個体から誘導された場合でさえ、ＯＲＳ細胞の増殖を生じた。１４日後、挿入物の広い面積が、密集して配列された小さな細胞によって覆われ、この時点で、これらを、本発明の表皮等価物の調製のために使用した。
【００５１】
７０株のＯＲＳ細胞（これは合計３０名のドナーから誘導された）の増殖挙動の比較は、若者（すなわち、１９〜５０歳の２１名のドナー）と年寄り（すなわち、５１〜９３歳の９名のドナー）との間で有意差がないことを実証した。１つの外植された毛胞当たり約５×１０5の細胞が一般に得られ、そして細胞生存度の全体的な程度は、典型的に９５％より高かった。逆に、フィーダー層としての分裂後期のＨＤＦの非存在下では、外植された毛胞由来のＯＲＳ細胞の散在性の増殖のみが存在した。
【００５２】
（実施例２  表皮等価物の調製）
初代培養から収集したＯＲＳ細胞を、３０×１０3細胞／ｃｍ2〜１００×１０3細胞／ｃｍ2、そして好ましくは６０×１０3細胞／ｃｍ2の密度で、微細孔膜の下面上に分裂後期ＨＤＦ細胞を、１０×１０3細胞／ｃｍ2〜５０×１０3細胞／ｃｍ2、そして好ましくは２０×１０3細胞／ｃｍ2で予め播種しておいた細胞培養挿入物（Ｃｏｓｔａｒ）上に播種した。ＯＲＳ細胞の培養と同様に、ＨＤＦフィーダー細胞をＯＲＳ細胞に極めて接近して維持するが、同時にこれらを微細孔膜の使用によって隔離した状態を維持することが重要である。この培養技術は、発生中の組織の増殖、分化、従ってホメオスタシスを増強する。
【００５３】
培養培地は、前出で記載した初代培養物の調製のために利用したものと同一のものであった。７２時間後、ＯＲＳ細胞を、挿入物内部の液体培地の吸引によって空気に曝し（すなわち、挿入物の下面は、培地と接触したままである）、そしてさらに１２〜１４日間培養し、毎週３回培地を交換した。あるいは、リフトした培養の１週間後、血清は全く省略され得る。
【００５４】
移植のために、従来利用されるプロトコル（これは、一般的に、創傷移植のための完全に分化した表皮等価物の調製に利用される）は、医師が、メスで培養挿入物の全周を注意深く切断し、その結果、付着した皮膚パッチを、扁平側を上にして挿入物膜（ヒト皮膚線維芽細胞で下側が被覆されている）の離れを容易にするように要求する。次いで、皮膚パッチは、細密な鉗子を用いて剥ぐことによってこの膜から放出され、そして患者への最終移植のための培養皿中の新しい膜ディスク上に、基底側を上にして配置される。この上記の手順は、骨が折れ、かつ時間を消費し、そして基底および扁平配向の反転を導き得る。
【００５５】
キャリア膜パッチキャップを使用する顕著により単純な方法が考案され、この方法は、扁平表面層の上部に直接配置される膜パッチキャップ（以下に記載のフィブリン接着剤パッチ手順と類似）を使用する。次いで、膜キャップは、細密な鉗子を使用して、以下の皮膚パッチと共に容易に掴まれ、そして培養挿入物ウエル表面から剥がされ得、そして、例えば、希釈Ｄｉｓｐａｓｅ溶液中でのインキュベーション後、培養挿入物膜から剥がされ得る。この膜は、次いで、移植片の配向を混同せずに（すなわち、基底側が下、扁平側が上）、創傷上へ移植片を配置するためのプレートとして役立ち得る。
【００５６】
安定化のためおよび移植の場合の保護的コーティングとして、本発明の表皮等価物は、希釈フィブリン接着剤で上部がコーティングされ、このフィブリン接着剤はまた、上部（すなわち、角質化した）側を明らかに確認するに役立つ。フィブリン接着剤（本発明の好ましい実施態様）は、一般的に受容される天然のヒト生成物であり、これは、組織接着剤として広範に使用される。薄いコーティングのフィブリン接着剤（これは、肉眼ではっきりと見える）の、表皮等価物の角質化した扁平空気曝露表面への塗布によって、この表皮等価物を創傷部位上へ配置する医師は、適切な移植片配向（すなわち、皮膚パッチの基底表面が、常に、明確に見えるフィブリン接着剤キャップを有しない側である）を完全に確信する。以前は、多くの場合、創傷移植のための表皮パッチの調製の間、パッチの配向は見分けがつかなかった。皮膚パッチが、移植部位に対して扁平側が下の配向で配置される場合、成功移植の可能性が有意に減少する。従って、この単純な「マーキング」の使用は、この問題を完全に排除する。
【００５７】
さらに、抗菌および／または抗真菌の物質がまた、フィブリン接着剤に含まれ得、その結果、移植片の任意の微生物の汚染または異常増殖を妨害する。多くの慢性病巣が、慢性的に感染しており、これは、移植片の「生着」、および最初の皮膚移植に引き続く創傷治療を阻害し得る。その上、フィブリン接着剤表面キャップ内の直接乳化による１以上の抗生物質または抗真菌剤の添加は、十分な量の抗菌剤の、移植部位への送達において有意な改善を提供し得る。
【００５８】
初代培養から収集され、そしてその下面に分裂後期ＨＤＦを保有する挿入物膜上での空気−液体界面で培養されたＯＲＳ細胞は、典型的に、１４日以内に重層上皮を発生させることに注意すべきである。この重層上皮は、次第に扁平になる細胞の厚い基底上画分の下の、小さな立方体様細胞の基底層からなる。顕著な顆粒層ならびに正常角化（ｏｒｔｈｏｋｅｒａｔｏｔｉｃ）角質層もまた、存在すると分かった。
【００５９】
ＯＲＳ細胞増殖を生じる毛胞の約８０％の表皮所見に基づいて、約５の成長期の毛胞が、１ｃｍ2の皮膚等価物の産生のために必要であった。移植可能な表皮等価物を産生するための期間は、通常、全体として４週間であった（すなわち、初代培養のために２週間、そして引き続く器官型培養のたにめ２週間）。
【００６０】
（実施例３  安定化）
送達の前に、表皮等価物を、適切な直径のシリコーン膜を培養物の角質化した上部面上へ配置することによって、「オントップコーティングする（ｃｏａｔｅｄ  ｏｎ−ｔｏｐ）」。さらに安定性を増強するために（例えば、薄いおよび／または大きな皮膚等価物の場合）、ならびに、シリコーン膜の接着を増加させるために、薄層の組織接着剤（例えば、フィブリン接着剤）を予め塗布し得る。
【００６１】
オントップコーティングは、（１）安定性を増強させ、そして移植片の取り扱いを改善し、そして（２）物理的損傷ならびに創傷におけるタンパク質分解環境および細菌に対して保護的コートとして役立つ。
【００６２】
（実施例４  出荷）
オントップコーティングした表皮等価物を、希釈したＤｉｓｐａｓｅ中でのインキュベーションによって培養挿入物膜から脱着し、次いで、この表皮等価物は、シリコーン膜と共に、細密な毛抜きを使用して掴み、そしてこれらを、マルチウエルディッシュのウエル中の、培養培地で浸潤した０．７％アガロース中に予め組み込まれた挿入物の膜上に移す。これらの皿を、次いで、出荷用容器に配置する。創傷床への塗布のために、表皮等価物をシリコーン膜とともに再度掴み、これは、（１）移植片の配向（すなわち、基底側が下、角質化した側が上）のために役立ち、そして（２）それを創傷に移植された表皮等価物上に残したままにすることによって、保護的コートとして役立つ（上記を参照のこと）。
【００６３】
（実施例５  培養した自己外毛根鞘細胞から産生した皮膚等価物を用いての、慢性的脚潰瘍の好結果の処置）
毛胞の外毛根鞘は、これらの細胞が露出した領域上へ移されると、皮膚創傷の治癒の間に小胞内の表皮ケラチノサイトの代わりとなり得、そして、表皮再生に寄与する（Ｌｉｍａｔら、１０７（１）Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１２８−３５（１９９６）、参考として引用される）。本発明の改善した培養技術を使用して、本発明者は、治癒に不応性の慢性的脚潰瘍を羅患する患者の培養した外毛根鞘細胞（主に血管起源）由来の表皮等価物を産生した。このような表皮等価物において、組織構成ならびに表皮等価物産物（ケラチン１０、被膜、フィラグリン）およびインテグリンの免疫学的局在決定は、正常な表皮とは区別不能であった。ブロモデオキシウリジン取り込み細胞の数によって決定されるように、基底層は、ドナーの年齢とは無関係な、増殖性細胞の多くの画分を含有した。外毛根鞘細胞（これは、表皮等価物を調製するために使用される）のＦＡＣＳ分析は、β１−インテグリン（すなち強力な幹細胞マーカー）の増強した発現を有する小細胞の割合を示した。急性的創傷とは対照的に、移植された培養自己ケラチノサイトの主な最終的生着は、慢性的創傷において納得のいくようには実証されていない。５人の患者における１１個の潰瘍に対して自己外毛根鞘細胞からインビトロで産生された表皮等価物を移植すると、約８０％の最終的生着率を生じ、そして高密度に配列した培養物で移植された７個の潰瘍のうち５個が、２〜３週間で引き続いて完全に治癒した。培養自己ケラチノサイトを用いての慢性的脚潰瘍の処置におけるこの改善は、おそらく、増殖性細胞の大きな画分、ならびに移植片の崩壊を予防する高度に発達した角質層に依存する。新規の技術の実施上の利益は、その非侵襲性、手術設備または麻酔の必要性のないこと、および移植後の短い固定時間である。
【００６４】
（インビトロ実験：細胞培養）約４０個の毛胞を、９１歳までの年齢の個体の後頭頭皮から摘み取り、そして成長期であるものを解剖顕微鏡下で選択した。毛球ならびに漏斗部分を、顕微手術用メスを用いて取り除いた。通常、６個の毛胞を、細胞培養挿入物（Ｆａｌｃｏｎ  ３０９０；Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｎｅｓ，ＮＪ）の微細孔膜上に外植し、この細胞培養挿入物は、その下面において、１０5個の分裂後期のヒト皮膚線維芽細胞から作製された予め形成されたフィーダー層を保有した。培養培地は、１０％のウシ胎仔血清（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎ）１ｍｌ当たり１０ｎｇの上皮増殖因子、１ｍｌ当たり０．４μｇのヒドロコルチゾン、０．１ｎＭのコレラトキシン、０．１３５ｍＭのアデニン、および２ｎＭのトリヨードサイロニン（全てＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯから）を補充し、最終Ｃａ2+濃度は、１．５ｍＭであるダルベッコ改変イーグル培地／Ｆ１２（３：１）からなる。約２週間以内に、ＯＲＳ細胞は、増殖し、そしてコンフルエンスに達した。これらを、トリプシン／ＥＤＴＡ  ０．１％／０．０２％で解離させ、生存度について検査し、そしてケラチノサイト増殖培地（０．１５ｍＭのＣａ2+を含有するＫＧＭ；ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）における第２培養において増殖させたか、またはフローサイトメトリー分析および表皮等価物の調製のために使用したかのいずれかを行った（以下を参照のこと）。液体窒素における長い時間の貯蔵のために、それらを、１０％ウシ胎仔血清および１０％のジメチルスルホキシドを含有するＫＧＭ中で凍結した。
【００６５】
比較のため、ＯＲＳ細胞の初代培養をまた、以前に記載のように（Ｌｉｍａｔら、１９８９）毛胞のトリプシン処理、および分裂後期の線維芽細胞から作製した予め形成したフィーダー層上に、分離させたＯＲＳ細胞を平板培養することによっても達成した。混乱を避けるため、この方法によって得られた毛胞を「トリプシン処理毛胞」を呼ぶ。
【００６６】
線維芽細胞を、ＨＩＶ血清学陰性および肝炎血清学陰性の健康な個体の皮膚移植から誘導され、そして１０％ウシ胎仔血清を補充したダルベッコ改変イーグル培地／Ｆ１２（３：１  ｖ／ｖ）中で培養した。
【００６７】
（フローサイトメトリー）種々のインテグリン鎖と反応するＩｇＧIサブタイプの以下のマウスモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を使用した：β1鎖と反応する４Ｂ４（Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｈｉａｌｅａｈ，ＦＬ）、α2鎖と反応する５Ｅ８、α３鎖と反応するＪ１４３、αv鎖と反応するＬｖ２３０、およびα6鎖と反応するＭＴ７８。ＭＡｂ  ４３９−９Ｂは、β4鎖を認識する。
【００６８】
１×１０6／ｍｌのＯＲＳ細胞を、リン酸緩衝化生理食塩水、１％のウシ胎仔血清、および０．０２％のＮａＮ3を用いて４℃で１回洗浄し、そして１ｍｌの同一の緩衝液で再構成した。１００μｌの細胞懸濁液を、次いで、０．１μｇのｍＡｂまたはアイソタイプコントロール抗体（Ｄａｋｏ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）と共に２５分間４℃でインキュベートした。同一の緩衝液で２回洗浄した後、細胞をフィコエリトリン標識のポリクローンナルヤギ抗マウス抗体（Ｄａｋｏ）と共にさらに２５分間４℃でインキュベートし、再度洗浄し、そして引き続いて２％のパラホルムアルデヒドを補充した上記の緩衝液で固定した。細胞を、パワーパックを備える４−対数スケールＥＰＩＣＳ  Ｐｒｏｆｉｌｅ  ＩＩフローサイトメータで分析し、そしてそのデータをＥＬＩＴＥソフトウエア（Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して分析した。
【００６９】
（表皮等価物）初代培養から収集したＯＲＳ細胞を、細胞培養挿入物（Ｆａｌｃｏｎ  ３０９５）の微細孔膜の下面に５×１０4分裂後期線維芽細胞を保有する細胞培養挿入物上に、５×１０5／ｃｍ2の密度で播種した。培養培地は、初代培養の調製のためのものと同一であった。２４時間後、ＯＲＳ細胞を、挿入物内部の培地の吸引によって空気に曝露し、次いで、１２〜１４日間、１週間当たり３回培地を交換しながら培養した。いくつかの培地において、６５μＭの５−ブロモ−２’−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ；Ｓｉｇｍａ）を最後の１８時間添加した。
【００７０】
組織学分析のために、標準的手順に従って、表皮等価物を６ｍｍパンチを有する挿入物（Ｓｔｉｅｆｅｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｕｍ，Ｏｆｆｅｎｂａｃｈ  ａｍ  Ｍａｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から切除し、５％ホルマリンに固定し、そして基礎をなす挿入物膜と共にさらに処理した。免疫組織学的な検査のために、表皮等価物を同様に打ち抜いたが、次いで、挿入物膜から細密な毛抜きによって分離し、液体冷却イソペンタン中で急速凍結し、そして−８０℃で処理まで保存した。
【００７１】
間接免疫蛍光のために、６μｍの低温槽切片を空気乾燥し、氷冷したアセトン／エタノール（１：１）で固定し、リン酸緩衝化生理食塩水で再水和し、非免疫血清で１５分間ブロックし、そして室温で６０分間、一次抗体と共にインキュベートし、大規模な洗浄後、二次抗体と共に４５分間インキュベートした。以下のｍＡｂを一次抗体として使用した：Ｋｓ８．６０（主にケラチン（Ｋ）１０と反応し、そしてＫ１とあまり反応しない）１：２０に希釈（Ｓｉｇｍａ）；抗−ヒト被膜、１：１００に希釈（Ｓｉｇｍａ）；抗−ヒトプロフィラグリン／フィラグリン、１：１００に希釈（ＢＴＩ，Ｓｔｏｕｇｈｔｏｎ，ＭＡ）；β1、インテグリン鎖に対する４Ｂ４、（Ｃｏｕｌｔｅｒ）。フルオレセインイソチオシアネートと結合体化したマウスＩｇＧに対する二次ｍＡｂを、Ｓｉｇｍａから購入した。負のコントロールとして、切片を非免疫血清および結合体化二次抗体と共にインキュベートし、これは、数例において、完全に角質化した領域の弱い拡散染色を表した。
【００７２】
ＢｒｄＵ陽性細胞の決定のために、低温槽切片を１．５Ｍ  ＨＣｌ中で変性させ、そして引き続いて、０．５μｇ／ｍｌのＨｏｅｃｈｓｔ  ３３２５８で３０分間、１：１００に希釈したｍＡｂ抗−ＢｒｄＵ（Ｐａｒｔｅｃ，Ａｒｌｅｓｈｅｉｍ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）と共に４５分間、そして１：３０に希釈したフルオレセインイソチオシアネート結合抗−マウスＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ）と共に４５分間インキュベートした。基底層におけるＢｒｄＵ陽性細胞の割合は、７２歳および９１歳の年齢の２人の脚潰瘍患者のＯＲＳ細胞から調製した表皮等価物において決定した（ｎ＝４；１患者当たり２個の表皮等価物）。各表皮等価物について、１０個の無作為に選択した切片における約２５００個の基底に位置する核を数えた。
【００７３】
移植のために、表皮等価物を基礎をなす膜と共に挿入物から、６ｍｍパンチ（Ｓｔｉｅｆｅｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｕｍ）を使用して切除し、そして６ｍｍ直径の打ち抜いたポリエステル膜（Ｔｈｏｍａｐｏｒ  ９５８７７；Ｒｅｉｃｈｅｌｔ  Ｃｈｅｍｉｅ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）上に逆さまに配置した。ある患者において、直径８ｍｍのさらなる表皮等価物を同様にして調製した。付着した分裂後期線維芽細胞と共に有する挿入物膜を、次いで注意深く、細密な毛抜きを用いて取り除いた。それらの支持ポリエステル膜上の表皮等価物を、ダルベッコリン酸緩衝化生理食塩水中で洗浄し、そして創傷床上のそれらの塗布まで、通常、３０分以下の間そこに浸潤させた。
【００７４】
（慢性的脚潰瘍における自己移植）Ｅｔｈｉｃｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｂｅｒｎｅの認証により、そして書面でインフォームドコンセントを得た後、治療に不応性の慢性的脚潰瘍（彼らのうち４人が、同一の脚に２つを超える潰瘍を有し、持続時間は少なくとも４年であった；４人においては静脈または混合した動脈および静脈の疾患、１人においてはさらに真性糖尿病、１人においては皮膚リンパ貯留症）を羅患する５人の入院患者（１人の男性、４人の女性、５８歳〜９１歳）を予備研究に登録した。この潰瘍を、移植の用意ができるまで、従来通り洗浄した（主に親水コロイド包帯および局所的な抗菌剤を用いて）。次いで２０個までの自己表皮等価物（通常６ｍｍ幅、１つの潰瘍に８ｍｍ幅）を、基底層が潰瘍表面に対して下側になるように配置し、そして、支持ポリエステル膜を、細密な毛抜きを用いて注意深く除去した。この移植手順をベッドサイドで実施し；麻酔は必要なかった。この患者のうちの４人において、同一の脚にある別の潰瘍をコントロールとして供した。次いで、全ての潰瘍を、透明な半閉塞性の包帯（Ｔｅｇａｄｅｒｍ；３Ｍ，Ｌｏｎｄｏｎ，Ｃａｎａｄａ）を用いて覆い、弾性包帯（患者の動脈状態に圧力を合わせた）を重ねた。患者を、移植後直ちに２時間固定した。３日後、この半閉塞性の包帯を注意深く取り除き、そしてヒドロポリマー包帯（Ｔｉｅｌｌｅ：Ｊｏｈｎｓｏｎ＆Ｊｏｈｎｓｏｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ，Ａｓｃｏｔ，ＵＫ）を適用し、再度、弾性包帯によって覆った。次いで、ヒドロポリマー包帯を２〜５日ごとに交換した。完全な再上皮形成局所処置を局所的皮膚軟化薬に交換し、そしてこれらの患者に、彼らの動脈状態に適合させた長期間の圧縮治療を厳守するように告げた。移植片の生着および潰瘍の治癒を、包帯の各変換時に撮影した、規準化された写真によって実証した。
【００７５】
（正常表皮と同様な表皮等価物へのインビトロＯＲＳ細胞分化）摘み取った成長期の毛胞を、分裂後期線維芽細胞をフィーダー細胞として培養挿入物の下面に保有する培養挿入物の膜上に、直接移植することは、ＯＲＳ細胞の初代培養を確立するために、単純で、効率的で、かつ再現性のあるツールであるこを実証した。移植した毛胞の約８０％が、９１歳までの年齢の個体から誘導された場合でさえ、ＯＲＳ細胞の増殖を生じた。１４日後、挿入物の大部分が、緻密に配列した小細胞によって覆われ、その時、これらを、表皮等価物の調製のために使用した。逆に、トリプシン処理した毛胞から誘導されたＯＲＳ細胞は、大きなサイズの多数の細胞を伴う、緻密さの少ない配列を示した。３０人のドナーから誘導したＯＲＳ細胞の７０株の増殖挙動の比較は、若いドナー（１９〜５０歳の年齢の２１人のドナー）と年老いたドナー（５１〜９３歳の年齢の９人のドナー）との間での有意な差異を示さなかった。なぜならば、移植した毛胞１個当たり約０．５×１０6個の細胞が通常得られたからである。細胞生存度は９５％より高かった。分裂後期の線維芽細胞が存在しない場合、散発性の増殖のＯＲＳ細胞のみが存在した。
【００７６】
細胞表面上のβ1−インテグリンの相対的レベルと、ケラチノサイトの増殖能力との間の対数線形関係が推論されるので、２つの異なる技術によって確立されたＯＲＳ細胞（すなわち、移植された毛胞由来のＯＲＳ細胞、またはトリプシン処理された毛胞由来のＯＲＳ細胞）の初代培養物におけるインテグリンの発現を比較した。両方の技術によって増殖された、４人の異なるドナー由来のＯＲＳ細胞を、フローサイトメトリーによって分析した。これらの光散乱特性に基づいて、これらの細胞を２つのグループに細分割し得た；グループＡ（明らかに低い前方光散乱（ｆｏｒｗａｒｄ  ｌｉｇｈｔ  ｓｃａｔｔｅｒ）を有する（すなわち、より小さな細胞サイズ））、およびグループＢ（より高い前方光散乱を有し、従ってより大きな細胞サイズを有する）。移植された毛胞から誘導されたＯＲＳ細胞について、グループＡは全ての細胞数の約４％を占め、そしてグループＢは全ての細胞数の７２％を占め、一方、トリプシン処理された毛胞から増殖したＯＲＳ細胞については、それぞれ、２．６％および７５％の値が見られた（４個の個々の実験の平均値）。グループＡにおいて、β1〜β4のインテグリンについての染色細胞の割合ならびに、β1−およびより少ない程度でのα2−、α3−、αv−インテグリンの１細胞当たりの平均の蛍光は、トリプシン処理された毛胞由来のＯＲＳ細胞においてよりも、移植された毛胞から増殖されたＯＲＳ細胞においてより高かった。グループＢにおいて、２つの培養技術においては差異は検出されず、また、インテグリン陽性細胞の割合においても１細胞当たりの平均蛍光においても差異は検出されなかった。
【００７７】
初代培養から収集され、そして挿入物の下面に分裂後期線維芽細胞を保有する挿入物膜上に播かれたＯＲＳ細胞は、１４日以内に重層表皮を発現した。これは、次第に扁平になる細胞の厚い基底上（ｓｕｐｒａｂａｓａｌ）画分の下の小さな立方体様の細胞の基底層からなった。顆粒層および主に正常角化（ｏｒｔｈｏｋｅｒａｔｏｔｉｃ）角質層が存在した。
【００７８】
表皮分化産物の免疫学的局在決定は、正常表皮において見られたものと同一であった。従って、分化特異的Ｋ１０は、基底層に存在しなかったが、第２の層上から基底上に強く発現した。被膜は、中央層の棘（ｓｐｉｎｏｓｕｍ）に由来する典型的な蜂巣状パターンを示すのに対し、フィラグリンの染色顆粒は、角質層の真下の連続的な帯を形成した。正常な表皮においての場合、インテグリンのα2−、α3−およびβ1−鎖の反応性は、基底細胞の細胞質膜の全ての面にわたって分布され、進行性の分化とともに強度が減少するのを示した。
【００７９】
ＢｒｄＵ陽性細胞が、主に、表皮等価物の基底層に見られ、そして、基底細胞の２４％を占めた［２４６４±１１５基底細胞について５９７±２１ＢｒｄＵ陽性細胞（平均±ＳＤ）：ｎ＝４］。
【００８０】
８０％の毛胞がＯＲＳ細胞増殖を生じることに基づくと、約５個の成長期の毛胞が１ｃｍ2の表皮等価物を生成するために必要であった。移植可能な表皮等価物を産生するための期間は、通常４週間（すなわち、初代培養のために２週間、および器官型の培養のために２週間）であった。
【００８１】
（自己表皮等価物は、慢性脚潰瘍に首尾良く移植される）総計１１個を処置し、それらのうちの潰瘍のうちの７個をその潰瘍表面の約９０％を高密度に配列された培養物で被覆することによって処置し、それらのうちの４個を中央部分に単離した培養物を配置することによって処置した。移植後３日での包帯の１回目の交換において、移植片の約８０％が、両方のタイプの処置における創傷床に対して見みられ得そして接着性であった。続いての２〜３週間内に、高密度に移植された潰瘍の７個のうち５個において、移植片が合併し、完全な再上皮形成および治癒を生じた。残りの２個（慢性的に感染した（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）潰瘍）において、これらの移植片は部分的に破壊され、４〜５週間だけ治癒が遅れる結果となった。単離した移植片によって処置された潰瘍において、包帯のみで処置された同一の脚における潰瘍と比較して、加速された、主に創傷縁からの肉芽組織の形成および再上皮形成が存在した。このタイプの処置において、完全な再上皮形成を生じる移植片の引き続く拡大を伴う永久的な生着は、直径８ｍｍの寸法のより大きな表皮シートで処置された１つの潰瘍について実証されただけであった。同一の脚上に２個を超える潰瘍を有する４人の患者におけるコントロールの潰瘍は、３週間後にわずかに改善されたのみであり、この時、これらは、自己表皮等価物のさらなる移植によってか、または従来の手術によってかのいずれかによって処置された。
【００８２】
再上皮形成後、表皮は、初めは脆弱であり、少しの摩擦の外傷後に水疱形成する傾向をいくぶん有し、そして時折小さなびらんを生じた。これらの腐食は、従来の局所的な処置下で迅速に再上皮形成した。第１の患者は、６ヶ月間まで、現在も続いており、そして処置された領域の安定が増加するのを示し、そして潰瘍の再発は今のところない。
【００８３】
本発明の特定の実施態様の上記の詳細な説明から、例えば皮膚移植手順における引き続く使用のための毛胞の外毛根鞘（ＯＲＳ）からのケラチノサイトの選択および培養のための独特な方法論が記載されたことが、用意に理解されるべきである。特定の実施態様が本明細書中に詳細に開示されるが、これは、例示のみの目的のための実施例によってなされ、そして、上記の添付の特許請求の範囲に関して限定する意図はない。特に、種々の置換、代替、および改変が、特許請求の範囲によって規定される本発明の精神および範囲を逸脱することなく、本発明に実施され得ることが、本発明者によって考えられる。例えば、成長期毛髪の選択は、本明細書に記載される実施態様の知識を用いて、当業者にとって慣用的なことであることが考えられる。