(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一定量の血液以外の体液中の細胞を固定しかつ球状化する方法であって、細胞は、懸濁し続け、２４時間より長い間その容積および内容物を維持し、一定量の血液以外の体液を、少なくとも１種類のアルデヒド、少なくとも１種類の界面活性剤およびシクロデキストリンを含む一定量の水性試薬組成物と混合することを含む方法。
【請求項２】
血液以外の体液を分析する方法であって、
（ａ）一定量の体液を、少なくとも１種類のアルデヒド、少なくとも１種類の界面活性剤およびシクロデキストリンを含む水溶液状の試薬組成物と混合すること、
（ｂ）自動分析装置中に試薬混合物を吸引すること、
（ｃ）フロー・サイトメトリーにより実質的に１度に１個の細胞について試薬混合物中の各成分を分析すること、および
（ｄ）体液の各細胞成分の数を得ることを含む方法。
【請求項３】
アルデヒドは、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、およびそれらの組合せからなる群から選択される少なくとも１種類であり、界面活性剤は、両性イオン性サーファクタントおよび非イオン性サーファクタントからなる群から選択される少なくとも１種類であり、シクロデキストリンは、アルファシクロデキストリン、ベータシクロデキストリンおよびガンマシクロデキストリンからなる群から選択される少なくとも１種類である請求項１に記載の方法。
【請求項４】
アルデヒドは、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、およびそれらの組合せからなる群から選択される少なくとも１種類であり、界面活性剤は、両性イオン性サーファクタントおよび非イオン性サーファクタントからなる群から選択される少なくとも１種類であり、シクロデキストリンは、アルファシクロデキストリン、ベータシクロデキストリンおよびガンマシクロデキストリンからなる群から選択される少なくとも１種類である請求項２に記載の方法。
【請求項５】
体液は、脳脊髄液（ＣＳＦ）、胸水、肺洗浄液、気管支洗浄液、滑液、腹膜液、骨髄吸引液、腹水、痰、唾液、リンパ液、涙、血清、血漿、精液、尿、および膀胱洗浄液からなる群から選択される請求項２に記載の方法。
【請求項６】
水溶液中に、少なくとも１種類のアルデヒド、少なくとも１種類の界面活性剤およびシクロデキストリンを含み構成される水性試薬組成物であって、請求項１から５のいずれか１項に記載の方法において使用される、水性試薬組成物。
【請求項７】
血液以外の体液中の細胞をフロー・サイトメトリー分析するための対照材料であって、一定量の血液以外の体液ならびに少なくとも１種類のアルデヒド、少なくとも１種類の界面活性剤およびシクロデキストリンを含む水性試薬組成物の混合物を含む対照材料。
【請求項８】
アルデヒドは、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、およびそれらの組合せからなる群から選択される少なくとも１種類であり、界面活性剤は、両性イオン性サーファクタントおよび非イオン性サーファクタントからなる群から選択される少なくとも１種類であり、シクロデキストリンは、アルファシクロデキストリン、ベータシクロデキストリンおよびガンマシクロデキストリンからなる群から選択される少なくとも１種類である、請求項７に記載の対照材料。
【請求項９】
水溶液中に、少なくとも１種類のアルデヒド、少なくとも１種類の界面活性剤およびシクロデキストリンを含み構成される水性試薬組成物であって、請求項７または８のいずれか１項に記載の対照材料に用いられる、水性試薬組成物。
【請求項１０】
アルデヒドは、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、およびそれらの組合せからなる群から選択される少なくとも１種類であり、界面活性剤は、両性イオン性サーファクタントおよび非イオン性サーファクタントからなる群から選択される少なくとも１種類であり、シクロデキストリンは、アルファシクロデキストリン、ベータシクロデキストリンおよびガンマシクロデキストリンからなる群から選択される少なくとも１種類である、請求項６または９に記載の組成物。
【請求項１１】
試薬組成物は、試薬ｐＨを約ｐＨ４．０からｐＨ７．０までの範囲に維持するための緩衝剤をさらに含む請求項１０に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、体液試料、特に脳脊髄液（ＣＳＦ）を、試料中に見いだされる可能性のある細胞成分の検出および定量のためにアッセイするための半自動法および全自動法ならびに試薬組成物に関する。本発明は、臨床応用に関連し、効率的で正確かつ信頼のおけるアッセイを提供する。
【０００２】
【従来の技術】
脳脊髄液（ＣＳＦ）は、脳の２つの髄膜間に存在し、脳半球および脊髄全体を循環する。ＣＳＦは、その下にある中枢神経組織の保護クッションとして働き、その他の機能には、廃棄物の収集、栄養分の循環、および中枢神経系の潤滑が含まれる。
【０００３】
ＣＳＦ分析の主な臨床的役割は、細菌性髄膜炎の診断、ウイルス性髄膜炎および真菌性髄膜炎、脳炎、神経疾患の鑑別診断、ならびにＣＳＦが関与する白血病の診断にある。ＣＳＦ分析の他の適応には、白血病およびリンパ腫の治療を受けている患者のモニタリングが含まれる。通常、ＣＳＦ試料の検査には化学的および免疫学的試験、より具体的には微生物学的検査および赤血球数（ＲＢＣ）、白血球数（ＷＢＣ）およびＷＢＣ分画値を得るための血液分析が含まれる。これらの結果は、臨床所見および放射線学的検査と相関し、臨床診断を提供する。
【０００４】
現在、ＣＳＦ検体の血液分析は、大部分の病院検査室で手動細胞計数および細胞鑑別法を用いて行われている。今日、これらの分析は、臨床検査のうちで最も大変な手作業の１つである。たとえば、現在の手動法を用いるＣＳＦ１検体の分析には約３０〜４５分を要する。現在、既存の血液学システムで利用できるＣＳＦ分析の自動法は存在しない。
【０００５】
通常、ＡＤＶＩＡ  １２０（登録商標）分析装置（Ｂａｙｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ、ＮＹ）などの自動細胞計数装置または血液分析装置は、全血の試料から細胞を数えるように設計されている。このような機器で用いられる標準試薬は、血漿の主成分の一部、たとえばアルブミン、リポタンパク質などのさまざまな化学効果を補正する、またはそれらを利用するように設計されている（たとえば、特許文献１および特許文献２を参照）。また、自動分析装置／細胞計数装置は通常、１回の分析サイクル当たり単一血液希釈液中の約２，０００から５０，０００個までの細胞を計数する。さらに、計数可能な細胞が占める領域と重なり合うわずか５から１０個の非細胞性粒子（または前のサイクルから持ち越された５から１０個の細胞、すなわちキャリーオーバー）の存在は、全血試料分析における確度および／または精度の極めてわずかな損失をもたらすにすぎない。さらに、ＡＤＶＩＡ  １２０などの機器は通常、自動的に希釈された一定量の全血を受け入れ、決まった計数時間に必要な細胞濃度を提供するように設計されている。
【０００６】
全血以外の体液、たとえば脳脊髄液は通常、赤血球および血小板を含まず、溶存タンパク質をほとんど含まないかまったく含まず、白血球も全血の典型的な数のわずか０．０１％を含むにすぎない。したがって、全血細胞分析を取り扱う同じ自動機器を用い、このような他の血液以外の体液について細胞数を測定する場合には、そのような試料の通常はほぼ無細胞の条件を補償するように試薬および希釈液が設計されている必要がある。さらに、全血細胞分析とは異なり、機器の分析サイクルが５から１０個の真の細胞を含むにすぎない容積の体液試料を取り扱う場合には、前記の非細胞性粒子およびキャリーオーバーの妨害が、血液以外の細胞をほとんど含まないこのような体液の分析では問題となる。
【０００７】
ＣＳＦなどの血液以外の体液の試料では細胞の濃度が低いため、同じ決まった計数時間に有用な精度を得るには、試料の希釈を大きく減らさねばならない。さらに、ＣＳＦなどのまれな試料は、全血試料に比べて特殊な範疇にあると考えられる。たとえば、体液試料、たとえばＣＳＦは通常、たまに乃至は不定期的に検査室に到着する。血液以外のたまに乃至は不定期的に到着する試料の分析にあわせて全血試料に対する自動分析装置の作業の流れを中断することは通常不都合である。これらのタイプの試料がくると、普通は「ＳＴＡＴ」試料としてすぐに分析されるが、一旦ためておいて後で分析したり、より効率のよい一括処理にまわされたりすることもある。しかしながら、このような未処理の体液試料は通常、２〜６℃における２４時間の保存後であっても多くの場合正確に分析することができる典型的な抗凝血全血試料ほど安定ではない。
【０００８】
【特許文献１】
米国特許第３７４１８７５号明細書
【特許文献２】
米国特許第４４１２００４号明細書
【特許文献３】
米国特許第４５７５４９０号明細書
【特許文献４】
米国特許第５０４５４７２号明細書
【特許文献５】
米国特許第５３５０６９５号明細書
【特許文献６】
米国特許第５３６０７３９号明細書
【特許文献７】
米国特許第５４１１８９７号明細書
【特許文献８】
米国特許第５４３８００３号明細書
【特許文献９】
米国特許第５６３３１６７号明細書
【特許文献１０】
米国特許第４７３５５０４号明細書
【特許文献１１】
米国特許第６０２５２０１号明細書
【特許文献１２】
米国特許第３７４１８７５号明細書
【特許文献１３】
米国特許第４４７５４９０号明細書
【特許文献１４】
米国特許第５８１７５１９号明細書
【特許文献１５】
米国特許第５８８８７５２号明細書
【非特許文献１】
Tycko, D.H. et al., 1983, “Cell by cell determination of and hemoglobin of isovolumetrically-sphered human red blood cells: A precision cytophotometric surrogate for red cell morphology”, Proc. Clinical Application of Flow, Sea Island, Georgia
【非特許文献２】
Tycko, D.H. et al., 1985, “Flow-cytometric light scattering measurements of red blood cell volume and hemoglobin concentration”, Appl. Optics, 24, 1355-1365
【非特許文献３】
S. Takano et al., 1977, J. Amer, Oil Chem. Soc., 54:139-143
【非特許文献４】
S. Takano et al., 1977, J. Amer. Oil Chem. Soc., 54:484-486
【非特許文献５】
Z. El Rossi, C. Horvath, 1982, Chromatographia, 15:75-82
【非特許文献６】
Kaminski and Linfield, 1979, J. Amer. Oil Chem. Soc., 56:771-773
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
したがって、全血以外のこのような体液試料を、２４時間以上の保存後であってもその後の正確な分析を安全に行える状態に細胞を固定する試薬と混合できることが望ましい。さらに、血液以外の体液試料が関わるこのような特殊な手順の場合、少なくとも数カ月間安定であり、必要な場合には、体液試料を用いて得られる細胞数の確度が保証されるようにシステム・ゲインを確認するために用いることができる対照材料を開発することが通常必要である。本発明は、これらの問題および要求を克服しかつ対処するために設計されている。
【００１０】
さらに、本発明は、ＣＳＦなどの体液試料を分析するための自動法および手順、すなわち半自動法および全自動法および手順を提供し、有利には、血液以外の試料を分析するための効率的で、信頼のおける時間のかからないアッセイを熟練開業医に提供する。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明は、体液試料、特に脳脊髄液（ＣＳＦ）試料を分析するため新たに開発されたアッセイ（方法）であって、自動細胞計数装置または分析装置のダイレクト・サイトメトリーの特徴を利用し、体液試料、たとえばＣＳＦ試料中で検出される赤血球および白血球の値およびパラメータを与えて報告するアッセイを提供する。この方法は半自動または全自動であり、ＡＤＶＩＡ  １２０（登録商標）血液分析装置（Ｂａｙｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ、ＮＹ）などの自動血液分析装置またはフロー・サイトメーターで行われることが好ましい。この方法は、試料中のすべての細胞を懸濁状態で球状化（ｓｐｈｅｒｅ）しかつ固定する試薬を併用して行われる。さらに、ゲーティング・ソフトウェアを併用して、分析を受けるＣＳＦ試料中の赤血球数（ＲＢＣ）、白血球数（ＷＢＣ）およびＷＢＣ分画値の分析および報告を行う。
【００１２】
本発明の一態様は、迅速かつ信頼のおけるアッセイにおいてＣＳＦの血液細胞成分を検出するための半自動法または全自動法を提供することである。通常、このような血液細胞成分はＣＳＦ中では極めて低濃度であり、このことが従来の方法を用いて信頼できるように検出することを困難にしている。本発明によれば、自動血液分析装置におけるＣＳＦの分析により、白血球、赤血球、およびＷＢＣ分画値を測定しかつ定量することができる。
【００１３】
本発明の別の態様は、自動分析装置で分析する血液以外の体液試料と混合するための水性試薬（試薬組成物）を提供することである。本発明によれば、体液試料には、たとえば本明細書に記載したＣＳＦ、肺または気管支の洗浄液、滑液、腹水などが含まれる。試薬組成物の配合は、本発明による半自動分析方法で使用するのに特に適している。
【００１４】
本発明の別の態様は、細胞が懸濁し続け、長時間その容積および内容物を維持するように、体液試料、またはその一定分取量中の細胞を固定しかつ球状化する方法を提供する。この方法によれば、一定量の体液を、混合物として少なくとも１種類のアルデヒド、少なくとも１種類の界面活性剤およびシクロデキストリンを含む溶液からなる一定量の水性試薬組成物と混合する。本発明による好ましい試薬組成物では、アルデヒドはグルタルアルデヒド、ホルムアルデヒド、またはグルタルアルデヒドおよびホルムアルデヒドの組合せであり、界面活性剤は両性イオン性洗浄剤であり、シクロデキストリンはヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンである。
【００１５】
本発明の他の態様は、体液中の細胞をフロー・サイトメトリーで分析するための対照材料であって、分析される体液の細胞および本発明による上記水性試薬組成物の混合物を含む対照材料を提供することである。
【００１６】
本発明のさらに別の態様は、体液中の細胞をフロー・サイトメトリーで分析するための対照材料であって、本明細書に記載の混合物中で固定しかつ球状化された後の細胞を含み、その細胞が異なる安定化水溶液中に再懸濁されている対照材料を提供することである。
【００１７】
本発明の別の態様は、本明細書に記載する動作モードとそれに伴う実行サイクルを備えた自動ダイレクト・サイトメトリー分析装置であって、本発明にしたがって全血以外の体液試料、たとえばＣＳＦの分析方法を実施するものを提供することである。
【００１８】
本発明の他の態様、特徴および利点は、以下の本発明の詳細な説明を読み、添付の図面に照らして考えれば、さらによく理解されるであろう。
【００１９】
【添付図面の説明】
図１Ａ〜１Ｄは、自動血液分析装置（すなわち、Ｂａｙｅｒ  ＡＤＶＩＡ  １２０自動分析装置）で検査した血小板に富む血漿（ＰＲＰ）のサイトグラム（ｃｙｔｏｇｒａｍ）を示す図である。図１Ａおよび１Ｂは、リン酸塩緩衝液で１：２０に希釈したＰＲＰ試料のダイレクト・サイトメトリー・サイトグラムを示している。白血球、すなわちリンパ球（ＬＹＭＰＨｓ）、単球（ＭＯＮＯｓ）、好中球（ＮＥＵＴｓ）、血小板、および好酸球（ＥＯｓ）は、互いによく分離している別個の集団を形成している。赤血球（ＲＢＣｓ）は球状化されないため、別個の集団を形成せず、リンパ球集団と部分的に重なり合っている。図１Ｃおよび１Ｄは、細胞を固定しかつ球状化するために本発明の試薬組成物で１：２０に希釈した図１Ａおよび１Ｂと同じＰＲＰ試料のＣＳＦダイレクト・サイトメトリー・サイトグラムを示している。図１Ａに比べると、固定されかつ球状化された白血球の位置が移動し、より明瞭な細胞集団を形成している。図１Ａとは対照的に、図１Ｃに見られる固定されかつ球状化された赤血球は、今度は別個の集団を形成し、リンパ球と重なり合っていない。図１Ｂとは対照的に、図１Ｄにおける好酸球は、はっきりと形成した好中球集団とは分離しているように見える。図１Ｅは、固定されかつ球状化されたＰＲＰ試料のサイトグラムを、オーバーレイされたミーマップと共に示しており、一組の座標の一方は細胞容積を示し、ほぼ直交する他方は屈折率（乾燥質量濃度に比例する）を示している。マップ上で容積は３０〜４１０ｆＬと異なり、３０ｆＬ単位で示す。密度は０〜４９ｇ／ｄＬと異なり、５ｇ／ｄＬ単位で示す。たとえば、好中球は１５０〜１８０ｆＬの平均容積、２９〜３４ｇ／ｄＬの平均乾燥質量を有する。
【００２０】
図２は、例示したＡＤＶＩＡ  １２０血液分析装置を用いて行う本発明による半自動ＣＳＦアッセイまたは他の体液アッセイの図解のフローチャートを示す図である。
【００２１】
図３Ａ〜３Ｃは、試料に対するさまざまな試薬のオスモル濃度の効果を示す図である（表２）。目標オスモル濃度１０７０ｍＯｓｍ（図３Ａ）、高オスモル濃度１１４０ｍＯｓｍ（図３Ｂ）、低オスモル濃度１０２４ｍＯｓｍ（図３Ｃ）の試薬を用いた同一ＰＲＰ試料を示す。１：１に希釈後、上記から、非浸透性溶質がそれぞれ約３６０ｍＯｓｍ、４３０ｍＯｓｍおよび３１４ｍＯｓｍの溶液と浸透圧的に等価な溶液が得られたことに注目すべきである。白血球集団は、オスモル濃度の増加に伴って時計回りに移動するが、サイトグラム中の適切なゲーティング領域に依然として含まれ、正確に分析することができる。このことは、本発明による試薬組成物をオスモル濃度の範囲で配合できることを立証している。
【００２２】
図４は、８０個のＣＳＦ試料について、ＷＢＣ結果を示し、ＷＢＣ数の手動分析結果とＡＤＶＩＡ  １２０分析装置で行った本発明によるＣＳＦアッセイの結果との相関を示す図である。
【００２３】
図５は、ＷＢＣ数が５個／μＬ以下の５２個のＣＳＦ試料について、ＷＢＣ数の手動分析結果とＡＤＶＩＡ  １２０分析装置で行った本発明によるＣＳＦアッセイの結果との相関を示し、手動結果の不正確さを反映する±２ＳＤを示す図である。
【００２４】
図６は、７４個のＣＳＦ試料における０から１８４０のＲＢＣ数について、手動分析結果とＡＤＶＩＡ  １２０分析装置で行った本発明によるＣＳＦアッセイ結果との相関を示す図である。
【００２５】
図７は、７８個のＣＳＦ試料における好中球数について、手動分析結果とＡＤＶＩＡ  １２０分析装置で行った本発明によるＣＳＦアッセイ結果との相関を示している。この試験における試料は、好中球と確実に識別するのに十分な好酸球を含んでいなかったため、図７のグラフは、多形核球、すなわち好中球（ＮＥＵＴｓ）と好酸球（ＥＯｓ）の総数のみを示す図である。
【００２６】
図８は、７８個のＣＳＦ試料におけるリンパ球数について、手動分析結果とＡＤＶＩＡ  １２０分析装置で行った本発明によるＣＳＦアッセイ結果との相関を示す図である。
【００２７】
図９は、７８個のＣＳＦ試料における単球数について、手動分析結果とＡＤＶＩＡ  １２０分析装置で行った本発明によるＣＳＦアッセイ結果との相関を示す図である。
【００２８】
図１０は、７８個のＣＳＦ試料における単核球数について、手動分析結果とＡＤＶＩＡ  １２０分析装置で行った本発明によるＣＳＦアッセイ結果との相関を示す図である。
【００２９】
図１１Ａ〜１１Ｈは、実施例１に記載の病院検査室から得られたＣＳＦ試料の分析結果を示す図である。図１１Ａ：正常でほぼ無細胞のＣＳＦ試料の分析；図１１Ｃ：ＷＢＣ数の少ない試料の分析；図１１Ｅ：約２０ＷＢＣのレベルでＷＢＣを含む試料の分析；および図１１Ｇ：約１００ＷＢＣ／μＬのレベルの試料の分析。図１１Ａ、１１Ｃ、１１Ｅ、および１１Ｇのサイトグラム下の表（すなわち、それぞれ図１１Ｂ、１１Ｄ、１１Ｆ、および１１Ｈ）は、ＡＤＶＩＡ  １２０自動分析装置機器を用いて得られたＣＳＦアッセイ結果および基準手動結果を示している。
【００３０】
図１２Ａおよび１２Ｂは、実施例４に記載のＷＢＣ（図１２Ａ）およびＲＢＣ（図１２Ｂ）に関する回帰分析結果を示す図である。実験的に得られた（観測された）細胞数は、白血球および赤血球に関して期待値と一致している。
【００３１】
【発明の実施の形態】
本発明は、ＣＳＦ試料などの体液試料を分析するための正確かつ感度のよい半自動および全自動アッセイを提供する。本発明の方法の利点は、試料中に存在する可能性のあるすべての細胞を、細胞溶解させることなく球状化しかつ固定する試薬を併用し、自動血液分析装置または細胞計数装置のダイレクト・サイトメトリー・サンプリングの特徴を開発しかつ使用することである。このアッセイ／方法は、通常は少量でほぼ無細胞の体液試料を、正確に、信頼できるようにかつ感度よく分析することを可能にする。
【００３２】
ＣＳＦなどの血液以外の体液の分析は、特にＡＤＶＩＡ  １２０ダイレクト・サイトメトリー自動機器などの血液分析装置で行われるときには、ゲーティング・ソフトウェアを利用する。この分析装置で行われる新たに開発された水圧サイクルは、分析に少量の試料を使用することを可能にし、また、このアッセイに必要な清浄度を維持する。
【００３３】
この分析で使用する新たな球状化および固定試薬は、調製試料を保存し、正確に試料を分析することができる採取後の時間を延長する。このことは、体液試料、たとえばＣＳＦ試料を、所望ならばバッチ式で分析するか、将来の分析のために４℃で１週間までの保存を可能にする。調製ＣＳＦ試料は、室温（たとえば１８〜３０℃）で数時間保存することができる。したがって、本発明の方法および試薬により、ＣＳＦ試料などの体液試料は、それらの自動サイトメトリー分析までの時間および分析の間の安定性という点で、血液試料と同様の、またはより良好な挙動を示すことができる。
【００３４】
血球を球状化するためにこれまでに開発された試薬には、等容積のままで赤血球も白血球も球状化する両性イオン性サーファクタントが含まれる（たとえば、特許文献２、特許文献３、特許文献４、特許文献５、特許文献６、特許文献７、特許文献８および特許文献９を参照）。テトラデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニオプロパンスルホネート（ＴＤＡＰＳ）などの両性イオン性サーファクタント（界面活性剤）を等張生理的溶液中８．３ｍｇ／Ｌの濃度で用いて血小板に富む血漿（ＰＲＰ）を１：２０に希釈し、ＡＤＶＩＡ  １２０自動分析装置でＲＢＣモードのダイレクト・サイトメトリーにより細胞を検査すると、図１Ｃのようなサイトグラムが得られる。
【００３５】
ＰＲＰに関してはさらに、新たに混合した正常血液の抗凝血試料を放置した場合、両凹面の赤血球はコインが重なり合ったような細胞の重なりを形成し始めることがよく知られている。これらは、個々の細胞（赤血球、白血球、または血小板）の沈降速度よりもはるかに早い速度で沈降し始める。約３０分から約１２０分後（血液試料にもよるが）、血液は２つの区画、すなわち赤血球が濃縮された暗赤色の下層と、白血球および血小板が血漿中に懸濁し、また白血球１個当たり約１〜２個の未沈降赤血球を含む黄色がかった淡紅色の上層とに分離する。あまりに長く沈降が延長された場合には、多くの白血球もまた赤血球層の頂面まで下降し、バフィー・コートと呼ばれるものを形成する。通常、この上層が血小板に富む血漿（ＰＲＰ）と呼ばれる。
【００３６】
リンパ球（LYMPHs）、単球（MONOs）、好中球（NEUTs）、好酸球（EOs）、血小板および赤血球（RBCs）を表す点の集団は、図１Ａ、１Ｃおよび１Ｅのサイトグラム上で個別に表示が付されている。これらの代表的サイトグラムにおけるこれらの細胞の位置は、本発明についてさらに論議するための有用な基準枠組みとして役立つ。
【００３７】
したがって、ＣＳＦなどの通常はほとんど細胞を含まない体液を処理し、各細胞タイプについて図１Ｃに示す位置とほぼ同じ位置でサイトグラムを作成することが望ましい。その理由は、血液分析に通常用いられる自動細胞計数装置を用い、適切な閾値（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄｉｎｇ）アルゴリズムで各細胞集団中の細胞数を正確に計数できるからである。さらに、各球状化細胞の位置は、球状化細胞を特徴づけるのに役立つ２つのパラメータ、すなわちその正確な容積およびその乾燥質量濃度を記録する（図１Ｅ）（たとえば、非特許文献１、非特許文献２、特許文献１０および特許文献１１を参照）。
【００３８】
通常の組織学的目的ならびにフロー・サイトメトリー分析の双方にとって、ホルムアルデヒドおよびグルタルアルデヒドなどのアルデヒドの水溶液が細胞を固定するのに有用であることはよく知られている（たとえば、特許文献１２、特許文献２および特許文献１３を参照）。通常、グルタルアルデヒドはホルムアルデヒドよりも低濃度でより有効であり、細胞をより迅速に固定する。一方、固定は、球状化剤が目的を果たすことができる前に非球状細胞の形を固定するほど迅速であってはならない。したがって、アルデヒドと球状化剤の濃度の比、ならびに試薬の絶対濃度の選択は、分析すべき試料の固定プロセスおよび試薬では比較的重要である。
【００３９】
さらに、最終的な試薬と試料の混合物における球状化剤とタンパク質の比も重要であり、これはサーファクタントを「緩衝する」ために十分なタンパク質濃度が必要なためである。しかしながら、両性イオン性サーファクタントを使用することにより、赤血球についてはこの問題がそれほど重大ではないことが明らかにされている（たとえば、特許文献９を参照）。たとえば、グルタルアルデヒドとＴＤＡＰＳのさまざまな組合せを等張食塩水で１：２０に希釈したＰＲＰと中性のｐＨで混合した場合、赤血球を完全に球状化するのにちょうど十分なＴＤＡＰＳの濃度が、一部の白血球の位置を、通常、図１Ｃの基準サイトグラムにおける位置の左（および下方）に移動させることが分かった。図１Ｃのサイトグラムにおける白血球の位置に基づき、ミー（Ｍｉｅ）マップを参照すると、これらの細胞が容積を変化させ、溶質を漏出し、かつ乾燥質量を失うと判断された。しかしながら、同じ濃度のＴＤＡＰＳおよびグルタルアルデヒドを用い、等張食塩水の代わりに無細胞血漿でＰＲＰを希釈した場合には、細胞はサイトグラムにおいて「正しい」位置に戻った。したがって、タンパク質濃度がさまざまに変化する中で、両性イオン性サーファクタントは赤血球膜への損傷に関してはより「寛大」であるが、血液試料中の白血球についてはそれほどでもないようである。
【００４０】
体液試料の希釈液および／または混合物用の試薬組成物を配合する目的にとって、成分または要素として血漿またはタンパク質を含有する試薬を調製することは、特にアルデヒドの存在下では好都合なことではなく、それは通常、アルデヒドがタンパク質と反応してそれらを架橋し、それによってタンパク質の溶解性、安定性および緩衝能力を変化させるからである。したがって、全血試料以外の体液試料と一緒に使用する本発明によれば、血漿タンパク質に代わって、サーファクタントの緩衝液として働き、サーファクタントと可逆的に結合する比較的アルデヒドに不活性な材料を含む試薬組成物を設計した。
【００４１】
全血以外の体液と混合するための試薬組成物に含めるために適した材料として用いかつ新たに発見した材料はシクロデキストリンである。大きな水溶性の理由から、ヒドロキシプロピル化−β−シクロデキストリンが好ましい。修飾されていないアルファ（α）、ベータ（β）およびガンマ（γ）シクロデキストリンも適しているが、これら後者のタイプのシクロデキストリンの低い水溶性が、製造の利便性に寄与する濃縮原液の調製に使用することができる製剤をいくぶん制限することは理解されるであろう。
【００４２】
したがって、本発明の一実施形態は、自動血液分析装置機器を用いて分析するための、ＣＳＦなどの体液と混合するのに特に適している水性試薬組成物を提供する。本発明によれば、この試薬は、細胞が長時間懸濁し続け、それらの容積および内容物を維持するように、一定量の体液中の細胞を固定しかつ球状化するために用いられる。その方法は、一定量の体液を、適切なアルデヒド、界面活性剤およびシクロデキストリンを含む一定量の水性試薬、すなわち試薬組成物と混合して試薬混合物を作成し、ダイレクト・サイトメトリーを用いる自動分析装置で事実上１度に１個の細胞について混合物を分析するものである。
【００４３】
本発明の水性試薬組成物は、少なくとも１種類の固定剤、好ましくはホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、またはそれらの組合せを含む。試薬中のホルムアルデヒド含量は、ホルムアルデヒドの３７重量％水溶液であるホルマリンを添加することによって調節する。ＣＳＦ試薬では、ホルムアルデヒドは、約１０ｇ／Ｌから約２５ｇ／Ｌまで、具体的には約１５ｇ／Ｌから約２３ｇ／Ｌまで、より具体的には約１７ｇ／Ｌから約２３ｇ／Ｌまで、最も具体的には約１７．０３ｇ／Ｌから約２３．０５ｇ／Ｌまで、好ましくは約１８．０ｇ／Ｌから約２１．０ｇ／Ｌまで、より好ましくは約１９．０ｇ／Ｌから約２１．０ｇ／Ｌまでの量で存在する。
【００４４】
試薬中のグルタルアルデヒド含量は、２５重量％溶液または５重量％溶液を添加することによって調節する。ＣＳＦ試薬では、グルタルアルデヒドは、約１ｇ／Ｌから約５ｇ／Ｌまで、具体的には約２ｇ／Ｌから約３ｇ／Ｌまで、より具体的には約２．１ｇ／Ｌから約２．９ｇ／Ｌまで、さらにより具体的には約２．３ｇ／Ｌから約２．８ｇ／Ｌまで、好ましくは約２．２５ｇ／Ｌから約２．７５ｇ／Ｌまで、より好ましくは約２．４ｇ／Ｌから約２．６ｇ／Ｌまでの量で存在する。また、この製剤は、シクロデキストリン、好ましくはヒドロキシプロピル化β−シクロデキストリンを、約１０ｇ／Ｌから約３５ｇ／Ｌまで、具体的には約１４ｇ／Ｌから約３５ｇ／Ｌまで、より具体的には約１４．１ｇ／Ｌから約３５．２ｇ／Ｌまで、好ましくは約１５ｇ／Ｌから約２１ｇ／Ｌまで、より具体的には約１５．５〜１５．８ｇ／Ｌから約２１〜２１．１ｇ／Ｌまで、より好ましくは約１６．７ｇ／Ｌから約１８．５ｇ／Ｌの量で含む。さらに、界面活性剤、すなわち洗浄剤またはサーファクタントは、約１．５ｇ／Ｌから約３．０ｇ／Ｌまで、好ましくは約１．８ｇ／Ｌから約２．５ｇ／Ｌまで、より好ましくは約１．８ｇ／Ｌから約２．２ｇ／Ｌまで、さらにより好ましくは約１．９ｇ／Ｌから約２．１ｇ／Ｌまで、さらにより好ましくは約１．８８ｇ／Ｌから約２．１２ｇ／Ｌの量で、試薬製剤に含まれている。
【００４５】
本発明の試薬で用いることができる好適な界面活性剤、すなわちサーファクタントまたは洗浄剤には、非イオン性および両性イオン性サーファクタントが含まれる。本発明の試薬組成物では、いくつかの種類の両性イオン性サーファクタント、または非イオン性サーファクタントを球状化剤として用いることができる。サーファクタントは、分析を受ける体液試料中に存在する可能性のあるどの細胞も実質的に球状化するのに有効な量で組成物中に存在する。
【００４６】
好適な種類の両性イオン性サーファクタントの非限定的例には、カルボキシベタイン、スルホベタイン（スルタインの別名でも知られる）、アミドベタインおよびスルホアミドベタインを含むベタイン類が含まれる。試薬組成物で用いるのに特に興味があるのは、Ｃ8〜Ｃ18好ましくはＣ10〜Ｃ18アルキルベタイン、スルホベタイン、アミドベタイン、およびアミドベタイン、たとえばラウリルアミドプロピルベタイン（ＬＡＢ）タイプのベタインである。
【００４７】
ベタインの類で好適な両性イオン性サーファクタントの非限定的例には、ｎ−アルキルジメチルアンモニオメタンカルボキシレート（ＤＡＭＣ）、ｎ−アルキルジメチルアンモニオエタンカルボキシレート（ＤＡＥＣ）およびｎ−アルキルジメチルアンモニオプロパンカルボキシレート（ＤＡＰＣ）が含まれる。スルホベタインの類の両性イオン性サーファクタントの例には、ｎ−アルキルスルタイン、またはｎ−アルキルジメチルアンモニオメタンスルホネート（ＤＡＭＳ）、ｎ−アルキルジメチルアンモニオエタンスルホネート（ＤＡＥＳ）、ｎ−アルキルジメチルアンモニオプロパンスルホネート（ＤＡＰＳ）およびｎ−アルキルジメチルアンモニオブタンスルホネート（ＤＡＢＳ）などのｎ−アルキルジメチルアンモニオアルキルスルホネートが含まれるが、これらに限定されるものではない。「ＤＡＰＳ」サーファクタント系では、ＴＤＡＰＳ（「Ｔ」はｎ−テトラデシルを表わす）；ＤＤＡＰＳ（「Ｄ」はドデシルを表わす）が本発明では特に適しており、好ましい。
【００４８】
アミドベタインの類には、ｎ−アルキルアミドメタンジメチルアンモニオメタンカルボキシレートまたはｎ−アルキルアミドメタンジメチルアンモニオエタンカルボキシレートが含まれるが、これらに限定されるものではない。好ましいアミドベタインは、ラウリルアミドプロピルベタイン（ＬＡＢ）である。また、ｎ−アルキルアミドメタンジメチルアンモニオメタンスルホネート、ｎ−アルキルアミドメタンジメチルアンモニオエタンスルホネートおよびｎ−アルキルアミドメタンジメチルアンモニオプロパンスルホネートなどの類似のアミドベタインスルホネートも適している。さらに、脂肪酸源としてココナッツ油を有するアミドベタイン、たとえば、ココアミドプロピルベタイン（ＣＡＰＢ）およびココアミドスルホベタイン（ＣＡＳＢ）を使用することも考えられる。ベタイン類、スルホベタイン類、アミドベタイン類およびアミドスルホベタイン類についての詳細な説明は、関連文献である、たとえば非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５および非特許文献６に見いだされる。
【００４９】
使用に適したその他の両性イオン性サーファクタントには、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）および３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳＯ）が含まれる。
【００５０】
一般に、本発明で用いるのに適した非イオン性サーファクタントには、アルキルグリコシド類が含まれる。好ましい非イオン性サーファクタントには、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド、ｎ−テトラデシル−β−Ｄ−マルトシドおよびｎ−テトラデシル−β−Ｄ−グルコシドが含まれる。
【００５１】
通常、ｐＨを約ｐＨ４．０からｐＨ７．０まで、好ましくはｐＨ４．５からｐＨ６．５まで、より好ましくはｐＨ５．０からｐＨ６．４まで、さらにより好ましくは約ｐＨ５．０から５．６までの範囲に維持するため、本発明の試薬組成物の製剤中に緩衝化剤も含まれる。ｐＨ範囲の上端では、試薬のグルタルアルデヒド成分の貯蔵寿命は一般に短縮され、ｐＨ範囲の下端では、グルタルアルデヒドはホルムアルデヒドと競合せず（ｏｕｔ−ｃｏｍｐｅｔｅ）、細胞およびタンパク質クランピングの早期発現につながる。緩衝化剤の非限定的例には、Ｎａ2ＨＰＯ4および／またはＮａＨ2ＰＯ4、クエン酸およびその塩、コハク酸およびその塩、ならびにＥＤＴＡおよびその塩、たとえばＫ3ＥＤＴＡなどの塩類が含まれ、その量は約４０ｍＭｏｌから約６０ｍＭｏｌまで、より好ましくは約４８ｍＭｏｌから約５２ｍＭｏｌまでである。
【００５２】
クエン酸は、３つのｐＫａ、すなわち３．１３、４．６７、および６．４０を有している。したがって、特に約ｐＨ４．８から約ｐＨ６．４までのｐＨ範囲においては本発明の目的にとって良好な緩衝液である。６．４以上では、リン酸塩緩衝液を用いることが好ましい。また、試薬組成物は、キレート化剤、たとえば、エチレンジアミン４酢酸（ＥＤＴＡ）、またはその塩（たとえば、Ｋ3ＥＤＴＡ）を含み、試薬の安定性を維持することができる。
【００５３】
本発明による試薬組成物としては、グルタルアルデヒドおよびホルムアルデヒド（ホルムアルデヒドは細胞表面サイトを素早く満たし、さもないと遅発型のグルタルアルデヒド誘発性細胞間および血漿タンパク質架橋につながり、ついで細胞クランピングおよび／またはタンパク質沈殿につながる）と、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、および両性イオン性サーファクタントであるＴＤＡＰＳとの組合せが特に好ましい。
【００５４】
下記の作業溶液への最終的希釈用である本発明による上記の試薬の濃縮原液の典型的かつ非限定的最終製剤は、水性（２０〜６７．６ｇ／Ｌ）ホルマリン（７．４〜２５ｇ／Ｌホルムアルデヒド）、１〜６ｇ／Ｌグルタルアルデヒド、１５〜４２ｇ／Ｌヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（Ｃｅｒｅｓｔａｒ８２００４）、および２〜６ｇ／ＬのＴＤＡＰＳを含有し、クエン酸ナトリウムまたはＮａ2ＨＰＯ4などの緩衝塩でｐＨ５〜８に調整される。本発明の半自動アッセイで用いる本発明の試薬組成物の好ましい成分およびそれらの好ましい量の一覧を表１に示す。表１に示すＣＳＦ試薬にとって好ましいｐＨ範囲は、約５．３〜５．５である。この試薬組成物は、本法における使用、および長期、たとえば少なくとも１年の保存に関して安定性を示す。好ましい試薬および量は例および指針を示すもので限定を意図していないことは理解されるであろう。
【表１】
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【００５５】
通常、作業溶液は、等張（たとえば、２９０ミリオスモル、ｍＯｓｍｏｌ／Ｋｇ；ｍＯｓｍ）食塩水または他の生理的溶液で原液を、たとえば１：５から１：２０に希釈することによって作製する。ある目的では、張性が２００ｍＯｓｍと低い食塩溶液および４００ｍＯｓｍと高い食塩溶液を用いることができる。作業溶液は、約１０６０ｍＯｓｍから約１０８０ｍＯｓｍの作業用張性で作成することが好ましく、通常はＣＳＦなどの体液試料と１：１の希釈で混合する。作業溶液の大部分の張性は、細胞膜を容易にかつ速やかに通過し、非浸透性溶質の１０００ｍＯｓｍ溶液から予想される重大な浸透圧による縮小にほとんど寄与しないホルムアルデヒドに起因していることことに注目すべきである。実際、１：１希釈後、作業溶液の浸透圧効果は、約３６０ｍＯｓｍの塩溶液に相当する。
【００５６】
表２および図３Ａ〜３Ｃは、いくつかの異なるオスモル濃度を有する試薬を用いて行ったＣＳＦアッセイの結果を示している。白血球集団は、サイトグラム（図３Ａ〜３Ｃ）中の適切なゲーティング領域内にあり、オスモル濃度の増加に伴う時計回りの移動にもかかわらず正確に分析することができる。したがって、本発明による試薬は、本明細書に示されるように、各種オスモル濃度において適切に作成されている。
【表２】
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【００５７】
一例として、ＣＳＦ分析法の好ましい実施形態では、同容積のＣＳＦ試料を同容積のＣＳＦ試薬と混ぜ、Ｂａｙｅｒ  ＡＤＶＩＡ  １２０自動分析装置などの自動機器にかける。この機器により分析することができるＣＳＦ試料の容積は、血球計におけるＣＳＦの顕微鏡検査により現在分析することができる最大容積（たとえば、１μｌ）の３．７倍である。その結果、計数精度には３．７の平方根（すなわち、ＳＱＲＴ３．７）の改善がある。したがって、本方法は、その安定性により、通常は無細胞、あるいは無細胞に近いＣＳＦのような試料を迅速に、正確に、信頼できるようにかつ効率的に分析するのに有利である。
【００５８】
本発明の別の態様は、脳脊髄液（ＣＳＦ）に加え、それ以外の、たとえば胸水試料、肺または気管支洗浄液試料、滑液試料、腹膜液試料、骨髄吸引試料、腹水試料、痰試料、唾液試料、リンパ液、涙、血清、血漿、精液、尿、または膀胱洗浄試料などの体液試料の分析を包含する。このような試料は、かならずではないが、細胞をほとんど含まないことが多い。細胞の濃度がＣＳＦにおけるよりも実質的に高い場合には、球状化／固定試薬による１：１を超える希釈を用いる。したがって、本方法の感度は、さまざまに異なる体液試料における細胞の分析に十分適している。また、このような体液試料を本発明の試薬組成物と混ぜ、室温で少なくとも８時間の安定性、および４℃で２４時間を超える安定性を有する、より安定な試薬混合物を調製することができる。
【００５９】
具体的であるが非限定的実施形態では、本発明は、ＡＤＶＩＡ  １２０血液分析装置によるＣＳＦ試料の分析を包含する。タイミング・サイクルおよび分析アルゴリズムに対する変更を含む適切なシステム／ソフトウェアの改良により、本発明の他の用途には、残留するＲＢＣ、ＷＢＣおよび血小板の存在についての血液バンクにおける新鮮凍結血漿ユニットのモニタリングが含まれる。これらのユニットの品質管理にとって典型的な許容範囲の細胞レベルは、それぞれ１〜６×１０3ＲＢＣ／μＬ未満、１００ＷＢＣ／μＬ未満および２０×１０3ＰＬＴ／μＬ未満である。
【００６０】
本発明に包含され、本明細書に記載のように、本明細書でＡＤＶＩＡ  １２０ＣＳＦ試薬と呼ばれ、ＡＤＶＩＡ  １２０分析装置で分析するためにＣＳＦ試料を調製するための試薬組成物を開発した。ＣＳＦ試料について記載した試薬および方法は、本発明によって企図され上記に示したように、その他の体液試料の分析にも適していることは理解されるであろう。したがって、本明細書で使用する用語「ＣＳＦアッセイ」または「ＣＳＦ試薬」には、ＣＳＦの他に、本明細書の他の場所に示した通常はほぼ無細胞の他の体液に関するアッセイおよび試薬が含まれることを意味する。
【００６１】
一実施形態では、ＡＤＶＩＡ  １２０ＣＳＦ法は、同容積の液体試料、たとえば脊髄液試料、および球状化／固定試薬組成物を組み合わせてかつ混合し、試薬／試料混合物を作成するオフライン調製を含む。すなわち、ユーザは、同量の試料液（ＣＳＦ試料）およびＣＳＦ試薬を混合することにより分析用試料を手動で調製し、その混合物をＡＤＶＩＡ  １２０自動機器中に吸引する。
【００６２】
一定量の体液試料（たとえば、ＣＳＦ）およびＣＳＦ試薬を含有する試薬混合物を含むように調製しかつ混合された試料は、ＡＤＶＩＡ  １２０分析装置中への吸引前にはガラスまたはプラスチック・チューブ中にある。分析を受ける試料について報告できる白血球および赤血球パラメータ（たとえば、ＷＢＣ、ＲＢＣ、および４要素のＷＢＣ百分率、すなわちリンパ球、単球、好中球および好酸球の数および比率）を得るためには、１度の試料吸引で十分である。
【００６３】
大部分の細胞含有ＣＳＦ試料には、少数の白血球が、さらに少数の赤血球および血小板と共に含まれる。これらの要素は、全血試料におけるよりも容易にＣＳＦ試料中のすべての細胞タイプを同時に数えかつ分類することを可能にする。対照的に、全血試料は多数の赤血球、血小板、および白血球を含む。赤血球の濃度が高すぎるため、実質的に適切な計数を行うために血液試料を希釈しなければならない。これらの条件下であっても、典型的な血液分析装置のセンシング・ゾーンにおける２個以上の赤血球の同時計数（ｃｏｉｎｃｉｄｅｎｃｅ）は、計数した事象総数の４％〜７％である。
【００６４】
本明細書および以下に記載の自動検出システムでは、赤血球、血小板、および白血球は、別個のシグナル検出領域、すなわち集団を占有する。しかしながら、赤血球同時発生シグナルは、好中球、好酸球、ある場合には単球と同じシグナル検出領域を占有する。全血では、赤血球と白血球の比が通常５００対１であるため、赤血球同時発生シグナルがこれらの白血球シグナルをマスクし、適切に分類されないことがある。したがって、全血試料においては赤血球および血小板とは別に白血球を分析する必要がある。通常、これは、まず赤血球を溶解し、次いで残った血小板および白血球を分析することによって行われる。
【００６５】
対照的に、ＣＳＦなどの体液試料における赤血球および血小板の数、ならびに白血球に対する赤血球および血小板の相対濃度が小さいことは、通常１回の分析サイクルにおける単一測定チャンネル内でこれらの試料成分のすべてを計数し、かつ分類することを可能にする。このような全血以外の試料における低濃度の赤血球は、赤血球同時発生をほとんどまたはまったくもたらさないため、好中球、好酸球、および単球はマスクされない。
【００６６】
上記に基づき、体液細胞分析、たとえばＣＳＦ細胞分析に適した方法は、光学フロー・サイトメーターのセンシング・ゾーン（フロー・セル）を介する体液試料中の細胞の一列縦隊通過（すなわち、実質的に１度に１個の細胞）を含む。各細胞がフロー・セルに焦点を合わせた単色光のビームを遮断するため、細胞の大きさおよび屈折率に特有の形で光を散乱する。３種類の適切に配置された検出器は、赤血球、リンパ球＋好塩基球、単球、好中球、および好酸球、ならびに血小板の別個の集団を形成する散乱／散乱スペースおよび散乱／吸収スペースにシグナルを生じる。
【００６７】
本発明の方法を実施する際に用いることができる、または使用に適応させることができる現在の自動分析装置およびフロー・サイトメーター分析装置システムには、Ｂａｙｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋから市販されているＢＡＹＥＲ  Ｈ*（商標）シリーズの自動血液分析装置、たとえばＢＡＹＥＲ  Ｈ*３（商標）分析装置およびＡＤＶＩＡ  １２０分析装置が含まれる。このような分析装置機器は、細胞検出ならびに細胞パラメータの定量的および定性的分析のための散乱／散乱および散乱／吸収システムと一緒に使用するのに適している。このような分析装置の非限定的説明は、特許文献１４、特許文献８、特許文献５および特許文献１０に見いだされ、これらの内容の全体を参照により本明細書に組み込む。適切なハードウェアおよびシステム・コンポーネントを有するその他の血液分析装置システムを本発明に従って使用し、または使用に適応させることができることは理解されるであろう。
【００６８】
本発明による低い試料希釈は、手動測定に比べてより多数の細胞が計数され、より正確かつ詳細な結果を得ることを可能にする。性能仕様書は、ＣＳＦソフトウェアを組み込んだＡＤＶＩＡ  １２０自動システムで行われる正常および異常ＣＳＦ試料に基づいている。試料を含む試薬混合物は、ＣＳＦ分析のための分析サイクルおよびユーティリティ・サイクルを用い、ＡＤＶＩＡ  １２０血液分析装置のダイレクト・サイトメトリー水圧経路を介して吸引する。ＣＳＦ分析サイクルは、最小容積の調製試料の吸引を可能にする。ユーティリティ・サイクル（リフレッシュおよび洗浄）は、流体経路の清浄度を維持する画期的な水圧サイクルである。通常、ＡＤＶＩＡ  １２０分析装置は、そのコンピュータ・コンポーネントを介し、吸引された試薬混合物の試料成分からＲＢＣおよびＷＢＣの絶対数、およびＷＢＣ分画パラメータ値を算出する。場合により、各細胞の容積および乾燥質量濃度ならびにこれらのパラメータの平均値および比を記録することができる。
【００６９】
アッセイ中にこの機器により分析されるＣＳＦ試料の容積は、血球計におけるＣＳＦの顕微鏡検査により通常分析される量の３．７倍である。したがって、本発明は、計数精度にＳＱＲＴ３．７倍の改善をもたらす。
【００７０】
別の実施形態では、全自動法が本発明により企図されている。全自動法は、吸引に続く機器における一定量の体液試料と試薬組成物の自動混合および自動分析装置によるアッセイの実行を含む。このような全自動アッセイは、オペレータによる手動操作の必要性を取り除くことにより効率を高める。しかしながら、試料を約４時間以上保存しなければならない場合には、半自動法が好ましく、それは細胞固定により試料の変質を防ぐためであることは理解されるであろう。
【００７１】
本発明のＣＳＦ試薬は、試料中のどの細胞も球状化しかつ固定する試薬化合物を含む。適当な試薬性能を検証するために、各試料または試料の各バッチ（たとえば、ＣＳＦ試料）をアッセイする前に品質管理（ＱＣ）品をアッセイすることが好ましい。ＣＳＦアッセイは、ＣＳＦソフトウェアを利用できる利用者にのみ利用できることが好ましい。選択的利用可能性のさまざまな手段には、たとえば、試薬バー・コード、ウィザード・キー、またはスマート・カードが含まれる。
【００７２】
ＡＤＶＩＡ  １２０機器が半自動または全自動ＣＳＦアッセイを行う具体的な実施形態では、自動分析装置は、本明細書に記載の試料分析に関係するいくつかのサイクルを行う。ダイレクト・サイトメトリー分析、好ましくは本発明による半自動分析の場合には、体液試料、たとえば髄液試料の導入をシステムによる分析のためにオープン・チューブ吸引によって行う。オペレータは、吸引プローブを調製試料中に入れ、システムの前部にある吸引パッドを押し下げることにより吸引を始める。ＣＳＦ分析サイクルには、試料導入（ｓｈｕｔｔｌｅ）、計数および洗浄の３段階がある。
【００７３】
試料導入段階の間、バキューム・シャトル・チャンバー（ＶＳＣ）のベント・バルブおよび廃液バルブがほぼ同時に開き、シャトル・チャンバー内に留まっている残った液体をすべてパージする。次いで、ＶＳＣのベント・ポートが閉じ、ＶＳＣの試料入口が開き、ＲＢＣダイレクト・サイトメトリー・バルブが開き、システム真空はＲＢＣダイレクト・サイトメトリー・ラインを通って試料を引き上げる。試料は、Ｕｎｉｆｉｅｄ  Ｆｌｕｉｄｉｃｓ  Ｃｉｒｃｕｉｔ（ＵＦＣ）を速やかに通過してＲＢＣコンセントリック・フロー・モジュール（ＣＦＭ）の試料ラインに入り、ＣＦＭシャトル・ポートからＵＦＣ内のシャトル・チャンバーに達する。試料が導入されている間は、プランジャーが下がるごとに正確な量の試料が試料ポンプ中に引き入れられる。
【００７４】
計数段階は、ＲＢＣ  Ｓｈｅａｔｈバルブおよびフロー・セル出口バルブが開くと共に始まり、シース・ポンプが同時に下がる間に試料ポンプが押し上げられる。この効果は、一定速度で試料を引き上げ、ＣＦＭおよびフロー・セルを介して収めることである。試料がフロー・セルを通過する間に試料中の細胞によって発生するシグナルを取得する。試料計数が終わると、ＲＢＣ  Ｓｈｅａｔｈバルブおよびフロー・セル出口バルブが閉じ、ＲＢＣ  Ｓｈｅａｔｈ  Ｓｙｒｉｎｇｅ  Ｗａｓｔｅバルブが開く。次いで、シース・シリンジが押し上げ、分析済みの液体を廃棄物に送る。直ちに洗浄段階が続き、試料ラインを通じて洗浄溶液（たとえば、特許文献１５に記載の万能洗浄試薬溶液）を押し、次の試料を調製するために乾燥する。
【００７５】
ＣＳＦ分析サイクルの他に、自動ＣＳＦアッセイと一緒に使用するために他の２種類のサイクルを開発した。ＣＳＦリフレッシュ・サイクルは、調製試料の吸引前にシステムの清浄度を保証するためフロー・セル中のバックグラウンド数を読み取るように設計した。オペレータから依頼された場合には、ＣＳＦリフレッシュ・サイクルは、ＵＦＣブロック内のすべての反応チャンバー中に洗浄液を入れ、分析装置の前部経路（すなわち、吸引プローブ、試料シヤー・バルブおよび関連ライン）を洗浄し乾燥する。次いで、ＣＳＦ分析サイクルの計数段階に記載した同じ技法を用い、システムはフロー・セルを介して洗浄液を吸引し、フロー・セルを通過する液体の計数値を得る。
【００７６】
ＣＳＦ洗浄サイクルは、ダイレクト・サイトメトリー・ラインおよびバルブに具体的に対処する追加のクリーニング・サイクルを提供するように設計する。開始すると、システムは、ＲＢＣ  ＳｈｅａｔｈラインならびにＲＢＣおよびＰｅｒｏｘダイレクト・サイトメトリー・バルブを開く。サイクルが進行するにつれ、ダイレクト・サイトメトリー経路を介し、Ｐｅｒｏｘチャンバー中にＣＦＭ試料ラインを通して洗浄液を逆流置換（ｂａｃｋ  ｆｌｕｓｈ）する。Ｐｅｒｏｘ廃液バルブが開き、逆流置換した流出液を効率的に廃液に引き込む。
【００７７】
全自動分析の場合には、ＡＤＶＩＡ  １２０の試料プローブ中にそのままのＣＳＦ試料を直接吸引し、同容積の球状化／固定試薬による希釈は内部で起きる。
【００７８】
本発明の半自動実施形態のためのＣＳＦ試料調製は、本発明のＣＳＦ試薬によりＣＳＦ試料を手動希釈するものである。ＣＳＦ試料の外観が反映するＣＳＦ試料の細胞密度は、ＣＳＦ試料と使用するＣＳＦ試薬の比を決定する。たとえば、多数の赤血球を含有する試料は、淡紅色から赤色に見え、多数の白血球を含有する試料は、白っぽく不透明に見えるはずである。これらの試料は、作業溶液で１：１に希釈する前の予備希釈を必要とし、これに比べ、比較的少ない細胞を含有する透明で無色の試料は予備希釈を必要としない。約５分間の最小インキュベーション時間の後、調製試料をＣＳＦモードのＡＤＶＩＡ  １２０分析装置で分析する。自動分析、たとえば半自動法による分析のために調製されたＣＳＦ試料は、室温または４℃で約５分から約４時間安定である。
【００７９】
好ましい態様では、ＡＤＶＩＡ  １２０分析装置は、システムと一体の部分として、ＣＳＦアッセイにおける試料を処理しかつ分析するように構成される。一般的には、市販のＷｉｎＭＤＩソフトウェア・パッケージ（Ｔｈｅ  Ｓｃｒｉｐｐｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を使用し、ＣＳＦ試料分析を行うことができるようにＡＤＩＶＡ  １２０システムでフロー・サイトメトリー・データを分析する。ＣＳＦ試料は、ＣＳＦモードの臨床用ＡＤＶＩＡ  １２０ソフトウェアで処理する。ＣＳＦ試料は、ＭａｎｕａｌＯｐｅｎ  Ｔｕｂｅ（ＭＯＴ）サンプラーから単独またはバッチ式で分析することができる。ＣＳＦ患者試料の身体的特徴は、コード化されたコメントとして機器に入力される。Ｂａｙｅｒ  ＡＤＶＩＡ  １２０機器は、新たなＣＳＦ試料を分析するごとに新たなＣＳＦ  Ｒｕｎ  Ｓｃｒｅｅｎを提供する。ＣＳＦ試料は、それぞれ個別に単位の選択肢を有しており、すなわち細胞数は、個／μＬまたは個／Ｌの単位で記録することができる。ＣＳＦソフトウェアが入ったコンピュータへのアクセスは、たとえば、スマート・カード、ウィザード、バー・コードまたはキーによって提供することができる。
【００８０】
本発明のＣＳＦアッセイにより測定されるパラメータを表３に示す。
【表３】
0003759512.tif 000004
0003759512.tif 000005
【００８１】
半自動ＣＳＦ法では、分析装置は、ＣＳＦ試料に対し、ＷＢＣ数、ＲＢＣ数、および４要素のＷＢＣ分画を実行する。この方法は、１時間当たり１２０試料までの試料スループットを可能にする。
体液を分析するための本半自動法は、アッセイ性能において、および顧客にとって多くの利点を提供する。ＣＳＦなどの体液のアッセイの自動化は、手動法を用いて得られる結果に比べて著しく早く得られる結果を提供する。たとえば、本発明による半自動アッセイ結果は１時間当たり約６０から１２０試料の割合で得られるが、完全に手動のアッセイ結果は、１時間当たり１から２試料の割合で得られる。
【００８２】
さらに、半自動法が必要とするオペレータの技術は、手動の細胞計数に必要とされる技術より少ない。細胞数、分画百分率および絶対数の一巡時間がより早いのは、これらの値およびパラメータが自動的に計算されるためである。エンド・ユーザは、仕事の減少、材料のコスト、検査室効率の改善および一巡時間の短縮の恩恵を受ける。さらに、この方法は、患者結果の確度および精度の向上を提供し、患者結果をより早く医師に報告することができる。労働時間も、たとえば、１試料につき少なくとも約２０分は短縮される。
【００８３】
本発明の別の態様は、ＣＳＦアッセイ・テスト・キットおよび他の体液をアッセイするためのテスト・キットを包含する。ＣＳＦキットには、設定サイクル数決定のための本発明による試薬組成物を含む試薬瓶および、場合によるが、好ましくは、自動分析装置機器でＣＳＦ試料または対照を処理するためのソフトウェア・アクセスを可能にするスマート・カード、バー・コードまたはキーが含まれることが好ましい。テスト・キットは、たとえば対照試料および／または患者のＣＳＦ試料を処理する約２５回のＣＳＦテスト用に十分な容積の試薬組成物と一緒に包装されていることが好ましい。
【００８４】
ＣＳＦ対照がテスト・キットの一部であってもよく、あるいは対照は別個のキットとしてもよい。ＣＳＦ対照については、テスト・キットとは別の対照キット、２つの細胞数レベルで値が割り当てられたＣＳＦ対照製品が含まれていることが好ましい。この２つの細胞数対照は、２つの細胞数レベル、約１００ＷＢＣ／μＬの高対照および約１０ＷＢＣ／μＬの低対照を含む。また、ＣＳＦ対照は、本発明による試薬組成物を含むことが好ましい。
【００８５】
さらに、ＣＳＦ対照品は、ロット番号、目的値、許容できる範囲および有効期限などを各パラメータおよび各レベルについて提供する読みやすい（オペレータにより）添付文書を含むことが好ましい。また、本発明には、ユーザがシステムのバー・コード・リーダーでバー・コードをスキャンでき、その後、適切な値（たとえば、目標値、範囲など）が分析装置のＱＣファイル中へ自動的に入力されるように、バー・コードを付けられた情報も包含される。また、キットには使用説明書が含まれることが好ましい。
【００８６】
本発明の、ＡＤＶＩＡ  １２０自動分析装置を用いて行うことが好ましいＣＳＦアッセイは、臨床的確度も相対的確度も提供する。ＣＳＦ試料におけるＡＤＶＩＡ  １２０ＷＢＣ数を、基準手動数と比較する。正常試料は、１μＬ当たり約０〜５個のＷＢＣ細胞を含む試料と定義され、異常試料は、通常１μＬ当たり約５個を超えるＷＢＣ細胞を含む試料と定義される。５４個の正常試料および２６個の異常ＣＳＦ試料を使い基準方法によって測定した研究は、ＡＤＶＩＡ  １２０機器が９５％以上の感度および８５％以上の特異性を有していることを示した（実施例５）。多くの試料で計数される細胞が、特に基準手動数では極めて少数であるため、統計学的理由のみからもこのアッセイの性能は最適であると考えられることは理解されるであろう。
【００８７】
実施例
以下の実施例は、本発明を例示するための本発明の具体的態様について記載し、当業者に本方法の説明を提供している。これらの実施例は、本発明の理解および実施に有用な具体的方法およびそのさまざまな態様を提供しているにすぎないことから、本発明を限定していると解釈すべきではない。
【００８８】
実施例１
本発明によるＣＳＦ試料の分析
図１１Ａ〜Ｈに示すサイトグラムは、病院検査室から得られたＣＳＦ試料の分析から得られた結果を示している。試料は、２時間以内に分析用として受領した。ＣＳＦ試料は、試料０．５ｍＬを本発明によるＣＳＦ試薬０．５ｍＬに添加することにより調製した。試料および試薬組成物の混合物を室温で５分インキュベートし、ダイレクト・サイトメトリー・モードのＡＤＶＩＡ  １２０自動分析装置に吸引した。試料取得からの生データ・ファイルをＦｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｓｔａｎｄａｒｄ（ＦＣＳ）フォーマットに変換し、ＷｉｎＭＤＩソフトウェアを用いてオフラインで分析した。図１１Ａは、正常でほぼ無細胞のＣＳＦ試料の分析結果を示している。図１１Ｂは、図１１Ａに関連するＡＤＶＩＡ  １２０自動結果および基準手動ＣＳＦ結果を示している。図１１Ｃは、ＷＢＣ数の少ない試料の分析結果を示している。図１１Ｄは、図１１Ｃに関連するＡＤＶＩＡ  １２０自動結果および基準手動ＣＳＦ結果を示している。図１１Ｅは、約２０ＷＢＣのレベルでＷＢＣを含む試料の分析結果を示している。図１１Ｆは、図１１Ｅに関連するＡＤＶＩＡ  １２０自動結果および基準手動ＣＳＦ結果を示している。図１１Ｇは、約１００ＷＢＣ／μＬのレベルの試料の分析結果を示している。図１１Ｈは、図１１Ｇに関連するＡＤＶＩＡ  １２０自動結果および基準手動ＣＳＦ結果を示している。自動および手動値の比較は、２つの方法間の良好な一致を示している。
【００８９】
実施例２
確度の結果
取得した８０個のＣＳＦ試料について、本発明の方法およびＡＤＶＩＡ  １２０自動分析装置を用いて得られたデータを基準手動値と比較した。下表４は、８０個のＣＳＦ試料について得られたＲＢＣ、ＷＢＣおよびＷＢＣ分画の絶対値を比較するための回帰統計を要約している。すべてのＣＳＦ試料を以下のように調製した。ＣＳＦ試料は、試料０．５ｍＬを本発明によるＣＳＦ試薬０．５ｍＬに添加することにより調製した。試料および試薬混合物を室温で５分インキュベートし、ダイレクト・サイトメトリー・モードのＡＤＶＩＡ  １２０自動分析装置に吸引した。試料取得からの生データ・ファイルをＦｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｓｔａｎｄａｒｄ（ＦＣＳ）フォーマットに変換し、ＷｉｎＭＤＩソフトウェアを用いてオフラインで分析した。
【表４】
0003759512.tif 000006
*端数を切り上げたＲＢＣ値；ＮＡ：該当せず
Ｓｙｘ、「推定の標準誤差」は、データ・ポイントが回帰直線の周りに集まる程度である。ポイントが直線に近ければ近いほど推定の標準誤差は小さく、比較されている２つの方法間の一致は良好である。
【００９０】
図４は、本実施例に記載の実験から得られたＷＢＣ結果を示し、８０個のＣＳＦ試料について、ＷＢＣ数の手動分析結果とＡＤＶＩＡ  １２０分析装置で行った本発明によるＣＳＦアッセイの結果との相関を示している。図４および以下に記載の図では、すべてのＣＳＦ試料は、前述の通りに調製した。
【００９１】
図５は、ＷＢＣ数が５個／μＬ以下の試料について、ＷＢＣ数の手動分析結果とＡＤＶＩＡ  １２０分析装置で行った本発明による本実施例に記載の実験から得られたＣＳＦアッセイの結果との相関プロットを示し、５２個のＣＳＦ試料についてのこのように低い数の不正確さを反映する±２ＳＤを示している。
【００９２】
図６は、７４個のＣＳＦ試料における０から１８４０のＲＢＣ数について、ＲＢＣ数の手動分析結果とＡＤＶＩＡ  １２０分析装置で行った本発明による本実施例に記載の実験から得られたＣＳＦアッセイ結果との相関プロットを示している。
【００９３】
図７は、７８個のＣＳＦ試料における好中球数について、手動分析結果とＡＤＶＩＡ  １２０分析装置で行った本発明による本実施例に記載の実験から得られたＣＳＦアッセイ結果との相関プロットを示している。この試験における試料は、好中球と識別するのに十分な好酸球を含んでいなかったため、このグラフは、多形核（ＰＭＮ）球の総数を示している。
【００９４】
図８は、７８個のＣＳＦ試料におけるリンパ球数について、手動分析結果とＡＤＶＩＡ  １２０分析装置で行った本発明による本実施例に記載の実験から得られたＣＳＦアッセイ結果との相関プロットを示している。
【００９５】
図９は、７８個のＣＳＦ試料における単球数について、手動分析結果とＡＤＶＩＡ  １２０分析装置で行った本発明による本実施例に記載の実験から得られたＣＳＦアッセイ結果との相関プロットを示している。
【００９６】
図１０は、７８個のＣＳＦ試料における単核球（リンパ球と単球）数について、手動分析結果とＡＤＶＩＡ  １２０分析装置で行った本発明による本実施例に記載の実験から得られたＣＳＦアッセイ結果との相関プロットを示している。
【００９７】
実施例３
精度の結果
本実施例は、ＡＤＶＩＡ  １２０自動分析装置で行った本発明の方法を用い、２個ずつ取得した３１個の病院ＣＳＦ試料から得られた精度に関する結果を示す。下式を用いて再現性について試料を評価した。
［（ΣΔ2）／２ｎ］1/2
（ここで、ΣΔは、２個の試料間の差の合計であり、ｎは、試料数である。）
標準偏差（ＳＤ）および％ＣＶ（変動係数、（１００×（ＳＤ／平均））をＷＢＣ、ＲＢＣ、ＰＭＮおよびＭＮ細胞数について算出し、これらを表５に示す。
【表５】
0003759512.tif 000007
【００９８】
実施例４
直線性の結果
０％、０．０５％、０．１％、０．２％、１％、１０％および１００％の直線性プールを血小板に富む血漿試料から作製した。これらの試料をＣＳＦ試薬で１：１に希釈し、ダイレクト・サイトメトリー・モードのＡＤＶＩＡ  １２０サイトメトリー分析装置で分析した。表６Ａは、本実施例に記載の分析から得られた５個の複製についてＷＢＣおよびＲＢＣの期待値に対する測定値を示している。表６Ｂに示すように、最大偏差についての結果は直線性規格の範囲内であった。
【表６Ａ】
0003759512.tif 000008
【表６Ｂ】
0003759512.tif 000009
図１２Ａおよび１２Ｂは、ＷＢＣ（図１２Ａ）およびＲＢＣ（図１２Ｂ）に関する回帰分析結果を示している。測定されたように、実験的に得られた（観測された）細胞数は、白血球および赤血球に関して期待値と一致している。
【００９９】
実施例５
臨床的感度および特異性
ＷＢＣ数について真理値表解析を用いて臨床的感度および特異性を算出し、１μＬ当たり５個を超えるＷＢＣの値を陽性と見なした。表７は、分布分類に関して試料を評価するための図式を示している。表８は、自動法および基準手動法を用いて分析された８０個のＣＳＦ試料の分布を示している。１μＬ当たり５個を超えるＷＢＣの存在を、試料が異常として分類した。方法比較の結果を表９に示す。試料分布から導かれる統計値は、２つの方法間で良い一致を示す。この比較では７個の試料が偽陽性として分類され（表７）、以下のように説明できるであろう。自動法は、手動法に比べより大容積の試料およびより多くの細胞を計数するため、細胞事象を検出する際には手動法よりも正確である。
【表７】
0003759512.tif 000010
上表７において：
ＴＰ（真陽性）＝両方法が異常で一致した試料数
ＴＮ（真陰性）＝両方法の正常で一致した試料数
ＦＮ（偽陰性）＝基準法により異常と、および試験方法により正常と判断された試料数
ＦＰ（偽陰性）＝基準法により正常と、および試験方法により異常と判断された試料数
真理値表計算
・一致率＝（ＴＰ＋ＴＮ）／（ＴＰ＋ＴＮ＋ＦＰ＋ＦＮ）×１００％
・偽陰性率＝ＦＮ／（ＦＮ＋ＴＰ）×１００％
・偽陽性率＝ＦＰ／（ＦＰ＋ＴＮ）×１００％
・感度％＝（１００−ＦＮ率）＝異常のある試料における正確な判定の割合
・特異性％＝（１００−ＦＰ率）＝異常のない試料における正確な判定の割合
【表８】
0003759512.tif 000011
【表９】
0003759512.tif 000012
【０１００】
上表９における上記パーセンテージは、このような少数の細胞が関わる分析が、統計学的サンプリング誤差により、正確な結果、すなわち真陽性（ＴＰ）または真陰性（ＴＮ）結果、または不正確な結果、すなわち偽陽性（ＦＰ）または偽陰性につながることがいかに多いかを示している。
【０１０１】
本発明が関係する現況技術をより完全に説明するため、本明細書で言及また引用したすべての発行済みおよび権利の与えられた特許、特許出願、公開されたＰＣＴおよび米国出願、論文、書籍、参考文献、リファレンス・マニュアルならびに要約の全体を参照により本明細書に組み込む。
【０１０２】
本発明の範囲および精神を逸脱しない範囲で前述の内容を変更することが可能であることから、上記説明に含まれ、または添付の請求の範囲に定義される内容は、本発明を記述および例示していると解釈されることを意図している。上記の教示に鑑みて、本発明の多くの変更形態および変形形態が可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】リン酸塩緩衝液で１：２０に希釈したＰＲＰ試料のダイレクト・サイトメトリー・サイトグラムを示す。
【図１Ｂ】リン酸塩緩衝液で１：２０に希釈したＰＲＰ試料のダイレクト・サイトメトリー・サイトグラムを示す。
【図１Ｃ】本発明の試薬組成物で１：２０に希釈した図１Ａと同じＰＲＰ試料のＣＳＦダイレクト・サイトメトリー・サイトグラムを示す。
【図１Ｄ】本発明の試薬組成物で１：２０に希釈した図１Ｂと同じＰＲＰ試料のＣＳＦダイレクト・サイトメトリー・サイトグラムを示す。
【図１Ｅ】固体されかつ球状化されたＰＲＰ試料のサイトグラムをオーバーレイされたミーマップと共に示す。
【図２】本発明による半自動ＣＳＦアッセイまたは他の体液アッセイを図解するフローチャートである。
【図３Ａ】試薬のオスモル濃度が１０７０ｍＯｓｍ（目標濃度）であるときのＰＲＰ試料に対する効果を示す。
【図３Ｂ】試薬のオスモル濃度が１１４０ｍＯｓｍ（高濃度）であるときのＰＲＰ試料に対する効果を示す。
【図３Ｃ】試薬のオスモル濃度が１０２４ｍＯｓｍ（低濃度）であるときのＰＲＰ試料に対する効果を示す。
【図４】８０個のＣＳＦ試料について、ＷＢＣ数の手動分析結果と本発明によるＣＳＦアッセイの結果との相関を示す図である。
【図５】ＷＢＣ数が５個／μＬ以下の５２個のＣＳＦ試料について、ＷＢＣ数の手動分析結果と本発明によるＣＳＦアッセイの結果との相関を示す。
【図６】ＲＢＣ数が０〜１８４０個である７４個のＣＳＦ試料について、ＲＢＣ数の手動分析結果と本発明によるＣＳＦアッセイ結果との相関を示す図である。
【図７】７８個のＣＳＦ試料について、好中球数の手動分析結果と本発明によるＣＳＦアッセイ結果との相関を示す。
【図８】７８個のＣＳＦ試料について、リンパ球数の手動分析結果と本発明によるＣＳＦアッセイ結果との相関を示す。
【図９】７８個のＣＳＦ試料について、単球数の手動分析結果と本発明によるＣＳＦアッセイ結果との相関を示す。
【図１０】７８個のＣＳＦ試料について、単核球数の手動分析結果と本発明によるＣＳＦアッセイ結果との相関を示す。
【図１１Ａ】実施例１に記載の病院検査室から得られた正常でほぼ無細胞のＣＳＦ試料の分析結果を示すサイトグラムである。
【図１１Ｂ】実施例１に記載の病院検査室から得られた正常でほぼ無細胞のＣＳＦ試料の本発明によるＣＳＦアッセイ結果と対照手動分析結果を示す。
【図１１Ｃ】実施例１に記載の病院検査室から得られたＷＢＣ数の少ないＣＳＦ試料の分析結果を示すサイトグラムである。
【図１１Ｄ】実施例１に記載の病院検査室から得られたＷＢＣ数の少ないＣＳＦ試料の本発明によるＣＳＦアッセイ結果と対照手動分析結果を示す。
【図１１Ｅ】実施例１に記載の病院検査室から得られた約２０ＷＢＣのレベルでＷＢＣを含むＣＳＦ試料の分析結果を示すサイトグラムである。
【図１１Ｆ】実施例１に記載の病院検査室から得られた約２０ＷＢＣのレベルでＷＢＣを含むＣＳＦ試料の本発明によるＣＳＦアッセイ結果と対照手動分析結果を示す。
【図１１Ｇ】実施例１に記載の病院検査室から得られた約１００ＷＢＣ／μＬのＣＳＦ試料の分析結果を示すサイトグラムである。
【図１１Ｈ】実施例１に記載の病院検査室から得られた約１００ＷＢＣ／μＬのＣＳＦ試料の本発明によるＣＳＦアッセイ結果と対照手動分析結果を示す。
【図１２Ａ】実施例４に記載のＷＢＣに関する回帰分析を示す。
【図１２Ｂ】実施例４に記載のＲＢＣに関する回帰分析を示す。
【図１Ａ】
0003759512.tif 000013
【図１Ｂ】
0003759512.tif 000014
【図１Ｃ】
0003759512.tif 000015
【図１Ｄ】
0003759512.tif 000016
【図１Ｅ】
0003759512.tif 000017
【図２】
0003759512.tif 000018
【図３Ａ】
0003759512.tif 000019
【図３Ｂ】
0003759512.tif 000020
【図３Ｃ】
0003759512.tif 000021
【図４】
0003759512.tif 000022
【図５】
0003759512.tif 000023
【図６】
0003759512.tif 000024
【図７】
0003759512.tif 000025
【図８】
0003759512.tif 000026
【図９】
0003759512.tif 000027
【図１０】
0003759512.tif 000028
【図１１Ａ】
0003759512.tif 000029
【図１１Ｂ】
0003759512.tif 000030
【図１１Ｃ】
0003759512.tif 000031
【図１１Ｄ】
0003759512.tif 000032
【図１１Ｅ】
0003759512.tif 000033
【図１１Ｆ】
0003759512.tif 000034
【図１１Ｇ】
0003759512.tif 000035
【図１１Ｈ】
0003759512.tif 000036
【図１２Ａ】
0003759512.tif 000037
【図１２Ｂ】
0003759512.tif 000038