(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式ＩＩ：
【化１】
0003810906.tif 000023
（Ｒ3 はアリールメチルである。）を有する化合物の調製方法であって、下記式Ｉ：
【化２】
0003810906.tif 000024
を有するフェノールと、ジ（アリールメチル）ホスファイト、テトラハロメタン、第三アミン及びアシル化触媒とを反応させて式ＩＩの保護ホスフェートを生成することを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、抗悪性腫瘍化合物の新規な調製方法及びその抗悪性腫瘍化合物の新規な中間体に関する。更に詳細には、４′−デメチルエピポドフィロトキシングルコシド４′−ホスフェートの調製方法及びそのホスフェートを調製する中間体化合物に関する。本発明は特にエトポシドホスフェートの調製方法及びエトポシドホスフェートからエトポシドを調製する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
エトポシド及びテニポシドは、癌の臨床治療において広く使用されている４′−デメチルエピポドフィロトキシングルコシド誘導体である。特に、エトポシドは合衆国において小細胞肺癌及びこう丸癌の治療に承認されている。しかしながら、エトポシドは水中における溶解性に限度があり適切な医薬組成物に処方することを困難にする。
エトポシドの水溶解性及び投与されるべきその効力を増大させるために、エトポシドホスフェートはプロドラッグとして調製される。エトポシドホスフェートは体内でエトポシドに代謝し、それから体利用される。水溶性プロドラッグの１例が米国特許第 4,904,768号に記載されており、４′−ホスフェート基を有する４′−デメチルエピポドフィロトキシングルコシド誘導体の水溶性プロドラッグが開示されている。その中に開示されている１例はエトポシド４′−ホスフェートである。エトポシド４′−ホスフェートは、エトポシドとオキシ塩化リンとを反応させた後加水分解するか又はエトポシドとジフェニルクロロホスフェートとを反応させた後水素添加してフェニル基を除去することにより調製される。
【０００３】
エピポドフィロトキシングリコシドの調製は、米国特許第 4,997,931号にも開示されている。４′−デメチルエピポドフィロトキシングルコシドは、４′−保護４′−デメチルエピポドフィロトキシンと保護糖とを縮合することにより調製される。次いで得られた化合物を誘導化して対応する４′−ホスフェートを生成する。
エトポシド及びエトポシドホスフェートの従来の調製方法は、典型的には、フェノールを保護し、保護糖とカップリングし、次いで保護基を除去することを必要とする。更に、これらの方法のほとんどにはヒドロキシ基及びリン酸基に別個の保護基が必要である。別個の保護基には、それぞれの保護基を除去するために多段階が必要である。脱保護工程にはたいてい酸性又はアルカリ性条件が必要であり、これが最終生成物を分解して低収率となる。
エトポシドホスフェートは、通常エトポシドから更にリン酸化及び脱保護工程によって調製される。これらの多段階により、典型的には、所望化合物の全収率が低下し、エトポシドのグルコシドヒドロキシルの好ましくないリン酸化のために化合物の生成に費用がかかりかつ困難が生じる。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
新規な保護糖と新規な保護４′−デメチル−４−エピポドフィロトキシン−４′−ホスフェートとをカップリングすることによる４′−デメチルエピポドフィロトキシングルコシド４′−ホスフェート、特にエトポシドホスフェートの調製方法に関する。更に詳細には、本発明はジ（アリールメチル）保護糖及びテトラアリールメチル保護４′−デメチル−４−エピポドフィロトキシングルコシド４′−ホスフェート並びにそのエトポシドホスフェートの調製方法に関する。ヒドロキシ及びリン酸基についてのアリールメチル保護基は、同一か又は異なってよく、ベンジル又はＣ1-4 アルキル、ヒドロキシ、フェニル、ベンジル、ハロゲン、アルコキシ、ニトロ、カルボキシル及びそのエステルからなる群より選ばれた１種以上で置換された置換ベンジルであることが好ましい。ジ（アリールメチル）４′−デメチル−４−エピポドフィロトキシン−４′−ホスフェートは、フェノールとジ（アリールメチル）ホスファイト、テトラハロメタン、第三アミン及びアシル化触媒とを適切な溶媒中で反応させることにより調製される。
【０００５】
本発明の１実施態様による保護糖は2,３−ジ−Ｏ−ベンジル−4,６−Ｏ−エチリデン−α，β−Ｄ−グルコピラノースであり、ジベンジル４′−デメチル−４−エピポドフィロトキシンホスフェートと溶媒中でカップリングしてテトラベンジル保護エトポシドホスフェートを生成する。保護エトポシド４′−ホスフェートを結晶化又は再結晶してＣ−１″−βアノマーを回収する。保護基を水素添加又は他の手段によりグリコシド及びリン酸基から同時に除去してエトポシドホスフェートを生成する。
この全工程は、費用のかかる精製段階なしでエトポシド４′−ホスフェートを純粋な形で得るのに効率がよい。保護ジベンジル−４−（2,３−ジ−Ｏ−ベンジル−4,６−Ｏ−エチリジン−β−Ｄ−グルコピラノシル）−４′−ジメチル−４−エピポドフィロトキシン−４′−ホスフェートを反応媒体から容易に結晶化するか又は再結晶してＣ−１″−β型を実質的に純粋な形で単離する。所望のアノマーの単離は、通常単一の結晶化工程で得られる。
詳細には、下記式Ｖ：
【０００６】
【化５】
0003810906.tif 000002
【０００７】
を有する化合物の調製方法であって、
下記式ＩＩＩｂ：
【０００８】
【化６】
0003810906.tif 000003
【０００９】
（式中、Ｒ1 はアリールメチルヒドロキシ保護基であり、Ｒ2 はアリールメチルであるか又は２つのＲ2 は一緒にエチリデンである。）を有する化合物と、下記式ＩＩ：
【００１０】
【化７】
0003810906.tif 000004
【００１１】
（式中、Ｒ3 はアリールメチルであり、Ｒ1 、Ｒ2 及びＲ3 は同一か又は異なる。）を有する化合物とをルイス酸の存在下反応媒体中で反応させて、下記式ＩＶｂ：
【００１２】
【化８】
0003810906.tif 000005
【００１３】
を有する化合物を生成し、
化合物ＩＶｂのＣ−１″−βアノマーを選択的に結晶化し、引き続きヒドロキシ及びリン酸保護基を除去し、Ｒ2 がアリールメチルヒドロキシ保護基の場合には、化合物ＩＶｂと炭素原子１〜５個を有するカルボニル又はそのアセタール等価物とを反応させることを含む方法に関する。
更に本発明の態様は、下記式ＶＩ：
【００１４】
【化９】
0003810906.tif 000006
【００１５】
を有する化合物の調製方法であって、
緩衝液中下記式Ｖ：
【００１６】
【化１０】
0003810906.tif 000007
【００１７】
を有する化合物を、ホスファターゼ酵素と反応させてリン酸基を除去し、式ＶＩの該化合物を回収することを含む方法である。
もう１つの態様は、下記式ＶＩ：
【００１８】
【化１１】
0003810906.tif 000008
【００１９】
を有する化合物の調製方法であって、
下記式Ｉ：
【００２０】
【化１２】
0003810906.tif 000009
【００２１】
を有する化合物をリン酸化剤でリン酸化して、下記式ＩＩ：
【００２２】
【化１３】
0003810906.tif 000010
【００２３】
（Ｒ3 はアリールメチルである。）
を有する保護４′−デメチル−４−エピポドフィロトキシン−４′−ホスフェートを生成し、
式ＩＩの該化合物と下記式ＩＩＩ：
【００２４】
【化１４】
0003810906.tif 000011
【００２５】
を有する保護糖とを反応させて、
下記式ＩＶ：
【００２６】
【化１５】
0003810906.tif 000012
【００２７】
（Ｒ1 はアリールメチル保護基である。）を有する化合物を生成し、式ＩＶのＣ−１″−β型を単離し、ヒドロキシ及びリン酸保護基を除去して下記式Ｖ：
【００２８】
【化１６】
0003810906.tif 000013
【００２９】
を有する化合物を生成し、
式Ｖの該化合物をホスファターゼ酵素で処理してリン酸基を除去するとともに式ＶＩの化合物を生成する方法を提供するものである。
【００３０】
【課題を解決するための手段】
４′−デメチルエピポドフィロトキシングルコシド４′−ホスフェート、特にエトポシド４′−ホスフェート、その薬学的に許容しうる塩及び溶媒和物の改良された調製方法に関する。本発明は、更にアリールメチル保護糖及びエトポシド及びエトポシド４′−ホスフェートに対するアリールメチル保護前駆体の調製に関する。更に結晶化によりアノマーを容易に分離することができるヒドロキシ及びリン酸保護基を用いてエトポシドホスフェートを製造する方法に関する。更に有利な特徴は、ヒドロキシ及びリン酸保護基が最終生成物を分解することなく同時に除去することができる容易さである。
方法は、反応媒体から結晶化するか又は適切な溶媒から再結晶することによりアノマー的に純粋なＣ−１″−β型に容易に分離することができる方法でアリールメチル、特にベンジル保護エトポシド４′−ホスフェートを生成する。本全工程は迅速かつ効率がよく、エトポシド４′−ホスフェートの効果的な調製方法を提供する。リン酸基はホスファターゼ酵素によって容易に除去することができ、エトポシド、その薬学的に許容しうる塩及び溶媒和物の効率のよい調製方法を提供する。
【００３１】
全工程は、後に詳細に論じられるようにエトポシドホスフェート又はエトポシドを製造するのに効率がよい。好ましい実施態様においては、ジベンジル４′−デメチル−４−エピポドフィロトキシン−４′−ホスフェートをルイス酸の存在下に2,３−ジベンジル−4,６−Ｏ−エチリデン−α，β−Ｄ−グルコピラノースとカップリングしてジベンジル４−（2,３−ジ−Ｏ−ベンジル−4,６−Ｏ−エチリデン−α，β−Ｄ−グルコピラノシル）−４−デメチル−４−エピポドフィロトキシン−４′−ホスフェートのアノマー混合物を生成する。驚くべきことに、Ｃ−1 ″−βは実質的に純粋な形で溶液から容易に結晶化されることがわかった。Ｃ−1 ″−βアノマーは、反応媒体から直接結晶化するか又は適切な溶媒から再結晶する。次いで、Ｃ−1 ″−βアノマーを回収及び水素添加してヒドロキシ及びリン酸保護基を同時に除去する。
本明細書で用いられる薬学的に許容しうる塩なる語は、モノ及びジアルカリ金属塩及びアルカリ土類金属塩を包含する。好ましい実施態様においては、最終化合物はエタノレート溶媒和物である。溶媒和物はエタノールのような有機溶媒から標準法を用いて結晶化又は再結晶することにより形成される。アルキリデンなる語は、例えばエチリデン、プロピリデン及びイソプロピリデンのような直鎖又は分枝鎖アルキル鎖を包含する。
【００３２】
本発明の１態様においては、本工程は式Ｉの４′−デメチルエピポドフィロトキシンをリン酸化して式ＩＩの保護ジ（アリールメチル）４′−デメチルエピポドフィロトキシン−４′−ホスフェートを生成するものである。リン酸化工程は、４′−デメチルエピポドフィロトキシンとジ（アリールメチル）ホスファイト、テトラハロメタン、第三アミン及びアシル化触媒とを反応させることにより行われることが好ましい。テトラハロメタンは、式ＣＸ4(ＸはＦ、Ｃｌ、Ｂｒ及Ｉからなる群より選ばれたハロゲンである。）を有する。好ましい実施態様においては、テトラハロメタンはＣＣｌ4 である。炭素についてのハロゲンは同一か又は異なってよい。好ましい実施態様における第三アミンはＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＡ）であるが、適切な他の第三アミンも用いられる。アシル化触媒は当該技術において既知の標準触媒とすることができる。好ましい実施態様においては、アシル化触媒はＮ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）である。反応は下記のように略述される。
【００３３】
【化１７】
0003810906.tif 000014
【００３４】
（式中Ｒ3 はアリールメチルである。）
好ましい実施態様においては、Ｒ3 はベンジルであり、それにより得られたホスフェートは下記化合物ＩＩａを有する構造を有する。下記式において、Ｂｎはベンジルを表す。
【００３５】
【化１８】
0003810906.tif 000015
【００３６】
また、Ｒ3 はＣ1-4 アルキル、ヒドロキシ、フェニル、ベンジル、ハロゲン、アルコキシ、ニトロ、カルボキシル及びそのエステルからなる群より選ばれた１種以上で置換されたベンジル基である。適切な置換ベンジル基としては、例えば、２−メチルベンジル、３−メチルベンジル、４−メチルベンジル、１又は２−ナフチル、2,３又は４−フェニルベンジル、４−メトキシカルボニルベンジル、2,６−ジクロロベンジル、２−フルオロベンジル及びペンタフルオロベンジルが挙げられる。
このリン酸化工程は、保護ジ（アリールメチル）４′−デメチルエピポドフィロトキシン−４′−ホスフェートを高収率で生成する効率のよいかつ容易な工程である。本工程は、実質的に迅速かつ化合物Ｉのフェノールヒドロキシ基に極めて選択的であるワンポット工程である。本工程は４′−デメチルエピポドフィロトキシンのリン酸化に特に有利であるが、例えばｐ−フルオロフェノール、2,６−ジメトキシフェノール、1,２−ベンゼンジオール及び４−ヒドロキシフェネチルアルコールようなフェノール類に一般的でありかつ極めて選択的である。４−ヒドロキシフェネチルアルコールを用いる方法は、第一アルコールでほとんどリン酸化を生じなかった。エトポシドをリン酸化すると、予備生成ジベンジルクロロホスフェートよりグリコシドリン酸化されずに所望の生成物を得た。
【００３７】
好ましい溶媒はアセトニトリルであるが、ハロゲン化又は非ハロゲン化溶媒もリン酸化に用いられる。テトラハロメタン、特に四塩化炭素は従来法での溶媒より試薬量でのみ用いられることが好ましい。リン酸化反応に用いられるテトラハロメタン量は、出発フェノール１当量に対して１当量以上である。更に反応は温和な条件下室温以下、典型的には約−１０℃以下で行われる。更にリン酸化反応はジベンジルクロロホスフェート（ＤＢＰＣｌ）がその場で生成されるので、実質的に添加ＤＢＰＣｌなしで行われる。これにより、分離工程でＤＢＰＣｌを調製する必要が回避されるとともに得られたリン酸化生成物の不純物含量が減少する。典型的には、反応は約４５分で完結する。イソプロピルアルコール中で再結晶するような標準法により化合物ＩＩを回収する。
【００３８】
次いで、化合物ＩＩをルイス酸の存在下にヒドロキシ保護グルコピラノースとカップリングする。好ましい実施態様においては、ルイス酸は三フッ化ホウ素エーテラートである。他のルイス酸としては、例えば、ＡｌＣｌ3 、ＺｎＣｌ2 、Ｅｔ2 ＡｌＣｌ、ＣＦ3 ＳＯ3 Ｈ、ＣＦ3 ＳＯ3 Ａｇ、Ｚｎ（ＣＦ3 ＳＯ3)2 びＴＭＳＣＦ3 ＳＯ3 が挙げられる。カップリング反応は、分子ふるいの存在下に行われる。カップリング反応は、ハロゲン化又は非ハロゲン化溶媒、最適にはアセトニトリル中で行われる。他の溶媒としては、例えば、プロピオニトリル、アセトン、塩化メチレン、クロロホルム、1,２−ジクロロエタン及びその混合液が挙げられる。
好ましいヒドロキシ保護グルコピラノースは、下記式ＩＩＩを有する。
【００３９】
【化１９】
0003810906.tif 000016
【００４０】
（式中、Ｒ1 はアリールメチルである。) 好ましい実施態様においては、Ｒ1 はグルコピラノースが下記構造ＩＩＩａを有するようなベンジルである。
【００４１】
【化２０】
0003810906.tif 000017
【００４２】
更に実施態様においては、Ｒ1 はＣ1-4 アルキル、ヒドロキシ、フェニル、ベンジル、ハロゲン、例えばフルオロ、クロロ、ブロモ及びヨード、アルコキシ、ニトロ、カルボン酸及びそのエステルからなる群より選ばれた１種以上で置換される置換ベンジルである。適切な置換ベンジル基としては、２−メチルベンジル、３−メチルベンジル、４−メチルベンジル、１又は２−ナフチル、2,３又は４−フェニルベンジル、４−メトキシカルボニルベンジル、2,６−ジクロロベンジル、２−フルオロベンジル及びペンタフルオロベンジルが挙げられる。典型的には、Ｒ1 はＲ3 と同一である。
グルコピラノースは、更に下記式ＩＩＩｂを有する構造を有する。
【００４３】
【化２１】
0003810906.tif 000018
【００４４】
（式中、Ｒ1 は上記の通りであり、２つのＲ2 基は一緒にエチリデンである。）他の実施態様においては、２つのＲ2 基は一緒にプロピリデン又はイソプロピリデンである。
化合物ＩＩＩ、ＩＩＩａ及びＩＩＩｂは、米国特許第 4,997,931号に記載されているような既知の方法によって調製される。アリール保護グルコピラノースは、Ｃ−１−α，βのアノマー混合物として形成される。たいていのアノマー混合物と異なり、アリールメチルグルコピラノースのＣ−１−βアノマーは結晶化によりαアノマーから分離することができる。詳細には、グルコピラノース化合物ＩＩＩａのアノマー混合物はヘキサンから結晶化して化合物ＩＩＩａの実質的にアノマー的に純粋なＣ−１−β型を得ることができる。更に、１：１のβ：α開始組成を有するグルコピラノース化合物ＩＩＩａはβ：α比８５：１５に経時固化する。
化合物ＩＩＩの保護グルコピラノースと化合物ＩＩの保護４′−デメチル−４−エピポドフィロトキシン−４′−ホスフェートとのカップリング反応は、ルイス酸の存在下アセトニトリル中で行われる。
【００４５】
【化２２】
0003810906.tif 000019
【００４６】
化合物ＩＩＩａのヒドロキシ保護グルコピラノースとジベンジル４′−デメチル−４−エピポドフィロトキシン−４′−ホスフェート（ＩＩａ）とのカップリングは、下記式ＩＶａを有するジベンジル４−（2,３−ジ−Ｏ−ベンジル−4,６−Ｏ−エチリデン−Ｄ−グルコピラノシル）−４′−デメチル−４−エピポドフィロトキシン−４′−ホスフェートのＣ−１″−α，βアノマー混合物を生成する。
【００４７】
【化２３】
0003810906.tif 000020
【００４８】
カップリング反応は、三フッ化ホウ素エーテラートの存在下に迅速かつ容易に進行して化合物ＩＶａのα及びβアノマーを生成する。
カップリングの前に、化合物ＩＩＩ、特にＩＩＩａのβ型を単離することは必要ない。ＩＶａαとＩＶａβの最終比は、反応がハロゲン化溶媒中で行われる場合出発化合物ＩＩＩａのアノマー組成に依存しない。アセトニトリル中で化合物ＩＩａとＩＩＩａ（β：α８５：１５）を三フッ化ホウ素エーテラートの存在下−２０℃でカップリングすると化合物ＩＶａβとＩＶａαを７２：２８の比で生じる。糖のアノマー化はハロゲン化溶媒中で極めて迅速に起こるが、アノマー化はアセトニトリル中では極めて遅いと考えられる。
更に実施態様においては、適切な塩を反応混合液に加えて溶媒のイオン強度を増大させることができる。適切な塩としては、アルカリ及びアルカリ土類金属過塩素酸塩が含まれる。例えば、アセトニトリルに溶解した0.５M ＬｉＣｌＯ4 を使用するとＩＶａβ：α比を８１：１９に増大した。
【００４９】
得られた化合物ＩＶａα，βのアノマー混合物をメタノールから再結晶して実質的に純粋なＣ−１″−β型を高収率で得ることができる。メタノール又は他の溶媒と併用したメタノール中で単一結晶化すると極性の低いＩＶａβアノマーをほとんど完全に実質的にＩＶａαアノマーの混入なく晶出する。
カップリング反応は、通常室温以下で、好ましくは約−１０〜４０℃で行われる。カップリング反応は低温でゆっくり進行するが、低温は反応混合液中ＩＩＩａのアノマー化を遅くすることによりＩＶａＣ−１″−βアノマーの形成に有利である。例えば、アセトニトリル中−２０℃でジベンジル４′−デメチル−４−エピポドフィロトキシン−４′−ホスフェートと2,３−ジ−Ｏ−ベンジル−4,６−Ｏ−エチリデン−α，β−Ｄ−グルコピラノース（β：α８５：１５）をカップリング反応させると、ＩＶａβとＩＶａαを７２：２８の比で生じ、−４０℃ではその比は７４：２６である。プロピオニトリル中−２０℃で同様にカップリング反応させると、ＩＶａβ：ＩＶａα比５７：４３となり、−７８℃ではその比は７６：２４である。
【００５０】
カップリング反応に好ましい溶媒は、反応がカップリング反応の標準溶媒に比べて迅速に進行するのでアセトニトリルである。アセトニトリルはカップリング反応を約２時間で完結させる予測できない特性を有するが、ジクロロエタン中の反応は約１８時間かかる。アセトニトリル中のカップリング反応はプロピオニトリルより速い。更に、アセトニトリル中のカップリング反応はＩＶａβアノマーを多く形成することができる。ジベンジル４′−デメチル−４−エピポドフィロトキシン−４′−ホスフェートと2,３−Ｏ−ベンジル−4,６−Ｏ−エチリデン−α，β−Ｄ−グルコピラノースのカップリング反応において数種の溶媒を検討した。典型的には、β：α比は溶媒の誘電率が高くなるにつれて増大した。
グルコピラノースについての置換ベンジル保護基の置換基も、ＩＶａαに対するＩＶａβの形成比に影響する。例えば、オルト位におけるかさ高い基は化合物ＩＶαに立体障害を生じることにより化合物ＩＶのＣ−１″−β型に有利であるが、メタ及びパラ置換基はほとんど障害を生じない。電子引抜基もＣ−１″−βアノマーに有利である。β：α最大比はペンタフルオロベンジルで得られ、ＩＶａＣ−１″−β：ＩＶａＣ−１″−α８０：２０を生じる。
【００５１】
ＩＶａα，βのアノマー混合物は、標準処理後単一の結晶化工程により実質的に純粋なＣ−１″−β型を得るために分離される。ＩＶａα，βのアノマー混合物をメタノールに溶解する。この溶液を加熱還流して化合物ＩＶａα，βを完全に溶解する。この溶液を室温に冷却する。得られた沈澱は、化合物ＩＶａの実質的に純粋なＣ−１″−β型である。
好ましい実施態様においては、化合物ＩＶａのＣ−１″−β型を得る結晶化はカップリング反応とともに直接行われる。カップリング反応が完了した後抽出又は標準処理なしで、溶液にメタノールを加え、この溶液を０℃まで温める。次いでこの溶液を０℃で数時間放置する。得られた固形物は、実質的に純粋なＩＶａＣ−１″−βであることがわかった。
化合物ＩＶａのＣ−１″−βアノマーを５０：５０のアノマー混合物からさえも直接結晶化する能力は、本方法の重要かつ予想できない利点である。J. March, Advanced Organic Chemistry, 4th Ed., John Wiley & Sons, New York, 1992, p.121 に報告されているように、極めてわずかなジアステレオマーを単一の結晶化で分離することができる。
【００５２】
化合物ＩＶのＣ−１″−βアノマーを回収した後、ヒドロキシ及びリン酸保護基は既知の方法、好ましくは水素添加により同時に除去される。水素添加脱保護工程は、エトポシドホスフェートを最少の分解による高収率で十分生成するように進行する。化合物ＩＶ、ＩＶａ及びＩＶｂは酸及び塩基双方に極めて不安定かつ感受性である。ヒドロキシ及びリン酸保護基を除去する酸又は塩基を用いる既存の方法は、通常所望生成物の一部を分解する。更に、脱保護工程はグルコピラノースからエチリデン基を分解することができる。保護基を除去する既存の方法に比べて、水素添加法は１脱保護工程しか必要としない、重金属を必要としない及び緩和な中性条件下で工程が行われて高収率を得るという点で有利である。他の方法のようにエトポシドホスフェートを純粋な形で得るためにクロマトグラフィーを必要としない。水素添加は、既知の多数の方法によるものである。典型的には、水素添加は適切な溶媒又は溶媒混合液中貴金属触媒の存在下にある。
好ましい実施態様においては、水素添加は化合物ＩＶａＣ−１″−βの５０／５０メタノール／テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）溶液中４％パラジウム／炭素を用いて行われる。混合液は水素４０−５０psigで数時間、典型的には３−６時間水素添加される。次いで、触媒がろ過により除去され、エトポシドホスフェートがエタノールから再結晶される。ＩＶＣ−１″−βの式Ｖのエトポシドホスフェートへの脱保護は次の通りである。
【００５３】
【化２４】
0003810906.tif 000021
【００５４】
式Ｖの４′−デメチルエピポドフィロトキシングルコシド４′−ホスフェートは、適切なカチオン源と接触させることによりその薬学的に許容しうる塩に変換される。例えば、ナトリウム塩はホスフェートを適切なナトリウム塩基で処理することにより行われ、そのナトリウム塩の形成がもたらされる。式Ｖの４′−デメチルエピポドフィロトキシングルコシド４′−ホスフェートの溶媒和も既知の方法で得られる。
エトポシドホスフェートは、更に水性緩衝液中ホスファターゼ酵素を用いてリン酸基を除去することによりエトポシドに変換される。ホスファターゼは、エトポシドホスフェートを完全にエトポシドに変換することができる。反応は、室温においてｐＨ約５−１２、好ましくはｐＨ６−９の緩衝液を含むタンク中行われる。典型的には、エトポシドホスフェートは水性緩衝液と混合すると溶媒和の形にある。
【００５５】
エトポシド４′−ホスフェートのエトポシドへの酵素変換は、変換が緩和な条件下エトポシド又はエトポシド４′−ホスフェートを分解せずに行われるので有利である。例えば、不安定なエチリデン基はホスファターゼ酵素で実質的に影響されない。酵素は、ｐＨ５−１２、好ましくはｐＨ６−９でホスファターゼ活性を有する任意の酵素である。適切なホスファターゼ酵素としては、酸性及びアルカリ性ホスファターゼが含まれる。ホスファターゼは、ウシ及び子ウシ腸粘膜のようなウシ、細菌又は他のものから得られる。また、ホスファターゼはホスファターゼ活性を有することが既知であるコムギ胚芽リパーゼとすることができる。これらの酵素は、シグマケミカル社から入手することができる。
適切な緩衝液としては、例えばＭ−トリスｐＨ7.８、Ｍ−トリスｐＨ8.７、Ｍ−ホウ酸塩ｐＨ１0.０及びＭ−重炭酸塩ｐＨ１0.３が挙げられる。エトポシドホスフェートＶのエトポシドＶＩへの脱リン酸化は次の通りである。
【００５６】
【化２５】
0003810906.tif 000022
【００５７】
下記の限定しない実施例は、本発明の好ましい実施態様を示すものである。
【００６０】
【参考例】
ジベンジル４′−デメチル−４−エピポドフィロトキシン−４′−ホスフェート（IIａ）
炉乾燥した１リットルの３つ口丸底フラスコに滴下漏斗、攪拌棒、温度計、２隔膜及びＮ2 導入口を取り付けた。フラスコに４′−デメチルエピポドフィロトキシン（Ｉ、２５.００ｇ、６２.４５ミリモル）及び無水アセトニトリル（３６７ml、0.１７M）を充填した。懸濁液を−１０℃に冷却した。四塩化炭素（３０.１ml、３１２.２５ミリモル）を加え、温度を−１０℃に保持した。Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（２２.８４ml、１３１.１５ミリモル）を注射器で３分かけて加えた。Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン（０.７６３ｇ、６.２５ミリモル）を一度に全部加え、次いでジベンジルホスファイト（２０.００ml、９０.５５ミリモル）を１５分間かけて加えた。反応は添加中少し発熱したが、外部を冷却しながら内部温度を１０℃に保持した。反応を−１０℃で３７分間攪拌した。この時に出発物質が溶解し、次いで反応物をＨＰＬＣ処理した。０.５M ＫＨ2 ＰＯ4(１５ml)を加え、この溶液を室温に温めた。混合液をＥｔＯＡｃ（１×３５０ml）で抽出し、次いで水洗（２×１００ml）した。有機層をＮａ2 ＳＯ4 で乾燥し、減圧下で１５０ml量に濃縮した。２−プロパノール（５００ml）を加えた。溶媒（２００ml）を減圧下で除去し、この時に固形物が沈澱した。２−プロパノール（５００ml）を加え、次いで更に５５０mlの溶媒を減圧下で除去した。最後に、２−プロパノール（２５０ml）を加え、混合液を固形物がすべて溶解するまで加熱還流した。黄色溶液を室温まで、次に０℃まで４時間冷却した。白色固形物を集め、冷２−プロパノールで２回洗浄し、減圧（４０℃、２０mmＨｇ）下で乾燥して３7.１５ｇ（９０.１％）を得た。
【００６１】
HPLC Rt Rf (10% MeOH/CH2Cl2): 0.66 。
1H NMR (CDCl3):δ7.37-7.28 (mH),6.81 (s, 1H), 6.39 (s, 1H), 6.30 (s, 2H), 5.90 (dd, 2H, J=1.0, 12.7 Hz),5.28-5.14 (m, 4H), 4.71 (d, 1H, J=3.4 Hz), 4.53 (d, 1H, J=5.1 Hz), 4.25(dd, 1H, J=8.7, 10.7 Hz), 3.63 (s, 6H), 3.27 (dd, 1H, J=5.2, 14.1 Hz),2.71-2.61 (m, 1H) 。
13C NMR (CDCl3):δ175.27, 151.15, 151.11, 148., 147.32, 137.28, 136.04, 135.94, 132.19, 131.35, 128.43, 128.30, 128.26, 127.69, 127.64, 110.13, 109.32, 107.66, 101.45, 69.62, 69.53, 69.46, 67.75,66.17, 56,06, 43.81, 40.39, 38,47 。
【００６４】
【参考例５】
ジベンジル４−（2,３−ジ−Ｏ−ベンジル−4,６−Ｏ−エチリデン−β−Ｄ−グルコピラノシル）−４′−デメチル−４−エピポドフィロトキシン−４′−ホスフェート（ＩＶａβ)(ジクロロエタン中でカップリング）                    
攪拌棒、温度計、２隔膜及びＮ2 導入口を備えた炉乾燥した２５０mlの３つ口丸底フラスコにジベンジル４′−デメチル−４−エピポドフィロトキシン−４′−ホスフェート（ＩＩａ、１4.２９５ｇ、２1.５７ミリモル）、乾燥４Ａ分子ふるい（１／１６″ペレット)(２8.６ｇ）、2,３−ジ−Ｄ−ベンジル−4,６−Ｏ−エチリデン−α，β−Ｄ−グルコース（ＩＩＩａα，β、１0.０ｇ、２5.８８ミリモル）及び無水1,２−ジクロロエタン（１４３ml）を充填した。この溶液を均一になるまで攪拌し、次いで−２０℃まで冷却した。三フッ化ホウ素エーテラート（7.１５ml、５8.２４ミリモル）を１０分かけて滴下した。反応を−２０℃で１８分間保持した。ピリジン（5.２３ml、６4.７ミリモル）を加え、混合液が褐色から黄色に変わった。混濁溶液を室温に温め、ＣＨ2 Ｃｌ2(２００ml）で希し、ろ過して固形分を除去した。溶液を３％ＨＣｌ（１００ml）、水（１００ml）、最後に飽和ＮａＣｌ（１００ml）で洗浄した。有機層をＮａ2 ＳＯ4 で乾燥し、減圧下で黄色油状物に濃縮した。還流メタノール（１５００ml）を攪拌しながら加えた。混合液を室温に冷却し、一晩放置した。白色固形物を集め、メタノールで２回すすいだ。固形物ＩＶａβを減圧（４０℃、２０mmＨｇ）下で乾燥し、8.８６ｇ（３9.８％）を得た。
【００６５】
所望の生成物ＩＶβのいくらかとともにＣ−１″−α異性体ＩＶαが母液中に残った。この残存しているカップリング生成物を結晶化及び／又はクロマトグラフィーで回収した。ＩＶβを結晶化する前の粗生成物のβ：α比は５４：４６であった。カップリング生成物の全収率は８１％であった。
ジベンジル４−（2,３−ジ−Ｏ−ベンジル−4,６−Ｏ−エチリデン−α−Ｄ−グルコピラノシル）−４′−デメチル−４−エピポドフィロトキシン−４′−ホスフェート（ＩＶａα)                                  
Rf (50% EtOAc／ヘキサン）: 0.31。 1H NMR (CDCl3):δ7.38-7.21 (m, 20, 6.87 (s, 1H), 6.26 (s, 2H), 5.95 (d, 2H, J=5.8 Hz), 5.29-5.18 (m, 4H), 4.87 (dd, 3H, J=2.3, 11.1 Hz), 4.79-4.74 (m, 2H), 4.68-4.58 (m, 4H), 4.11 (t, 1H, J=7.9 Hz), 3.95 (q, 1H, J=10.6 Hz), 3.86 (t, 1H, J=9.2 Hz), 3.63 (s, 6H), 3.51 (dd, 1H, J=3.6, 9.4 Hz), 3.45 (d, 1H, J=7.2 Hz), 3.45 -3.35 (m, 3H), 2.82-2.75 (m, 1H), 1.32 (d, 3H, J=5.0 Hz)。13C NMR (CDCl): δ174.91, 151.22, 151.18, 148.44, 147.02, 138.56, 137.83, 137.05, 136.27, 136.18, 132.19, 129.27, 128.59, 128.45, 128.34, 128.24, 128.12, 127.96, 127.89, 127.72, 127.69, 110.44, 109.81, 107.85, 101.61, 101.08, 99.59, 82.07, 79.36, 78.59, 76.76, 75.09, 74.69, 69.52, 69.46, 69.41, 68.18, 67.04, 62.95, 56.15, 43.82, 41.10, 38.41, 20.40。
【００６６】
【参考例６】
本実施例は、同一反応容器で行われるカップリング及び結晶化工程を示すものである。攪拌棒を備えた５０mlの３つ口丸底フラスコを炉乾燥し、２隔膜を取り付け、Ｎ2 下で冷却する。ジベンジル４′−デメチル−４−エピポドフィロトキシン−４′−ホスフェート（1.００２ｇ、1.５１ミリモル）及び2,３−Ｏ−ベンジル−4,６−Ｏ−エチリデングルコピラノース（ＩＩａβ：α８５：１５、0.７０２ｇ、1.８１ミリモル）を加えた。固形分を無水アセトニトリル（１0.０ml）に溶解し、次いでこの溶液を−４０℃まで冷却した。三フッ化ホウ素エーテラート（0.５０ml、4.１ミリモル）を滴下した。この溶液を−４０℃で攪拌し、次いでＨＰＬＣ処理した。反応中生成物が若干沈澱した。６時間後、メタノール（３０ml）を滴下した。懸濁液を攪拌しながら−３０℃まで温め、次いで０℃で攪拌なしで１７時間放置した。固形物をブッフネル漏斗で集め、室温のメタノールで２回すすいだ。これにより0.９６６８ｇ（６2.０％）のＩＶａβをＨＩ１００％で生成した。
【００６７】
【参考例７】
エトポシド−４′−ホスフェート（Ｖ）
４％パラジウム／炭素、５０％湿潤（３１４mg）を５０／５０ＭｅＯＨ／ＴＨＦ（５０ml）中ジベンジル４−（2,３−ジ−Ｏ−ベンジル−4,６−Ｏ−エチリデン−β−Ｄ−グルコピラノシル）−４′−デメチル−４−エピポドフィロトキシン−４′−ホスフェート（ＩＶａβ、７５８mg）の溶液に加えた。この混合液を室温及び４０−５０psigの水素で３−６時間水素添加した。触媒をろ別し、ＭｅＯＨですすいだ。ろ液を減圧下（４０−６０℃、アスピレーター）８−１０ml量まで濃縮した。無水エタノール（５０ml）を加え、この溶液を再び−１０mlまで濃縮した。エタノール（２５ml）を再び加え、この溶液を１０mlまで濃縮した。エトポシド−４′−ホスフェートジエタノール溶媒和物の結晶種を加え、溶液の温度を約５０℃から１５−２０℃まで３０−６０分かけて調整した。１５−２０℃で更に３０分保持した後、白色結晶をろ過により集め、５℃のエタノール（５−１０ml）で洗浄した。固形物を高真空中２５−４０℃で乾燥した。ＨＰＬＣにより９9.２面積％純度に定量された４３６mg（７7.８％）のエトポシド−４′−ホスフェートジエタノール溶媒和物（Ｖ）を得た。
【００６８】
【実施例１】
エトポシド（ＶＩ）
磁気攪拌しながら、エトポシド−４′−ホスフェートジエタノール溶媒和物（Ｖ、４１０mg）を1.０M トリス緩衝液（8.０ml）に溶解した。１N ＮａＯＨで8.１〜8.７に調整した。この溶液を３５℃まで温めた。MilliQ水中アルカリ性ホスファターゼ（シグマ、カタログ #P6774)の溶液（2.０ml、２００単位／ml）を加えた。１０分以内に固形分が沈澱した。必要とされる１N ＮａＯＨを加えることによりｐＨ8.４−8.８の範囲に維持した。次いで反応物をＨＰＬＣ処理した。３時間後、混合液を１０℃まで１５分間冷却した。固形物を真空ろ過により集め、水洗（５−７ml）し、高真空（２０℃）中１８時間乾燥した。２４１mg（７６％）のエトポシド（ＶＩ）、ＨＰＬＣにより９5.５面積％を得た。