(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
励起レーザ光を発して試料に照射する光源と、前記励起レーザ光と試料から発せられる蛍光とを分離する光分離手段と、前記励起レーザ光を２次元走査する走査手段と、前記走査手段と前記試料との間に配置された対物レンズと、前記光分離手段によって分離された蛍光を集光させるための集光レンズと、前記集光レンズの焦点面に設けられたピンホールと、前記ピンホールを通過した蛍光を検出する検出手段とを備えた共焦点レーザ走査顕微鏡において、
前記対物レンズの焦点面と共役な１次像面に標準蛍光サンプルとしての蛍光ガラスを抜き差し自在に設けることを特徴とする共焦点レーザ走査顕微鏡。
【請求項２】
前記蛍光ガラスは、レーザ光の波長λが３５１ｎｍ及び４８８ｎｍのとき、蛍光波長が５４２ｎｍ付近で蛍光強度が強くなるものであることを特徴とする請求項１記載の共焦点レーザ走査顕微鏡。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明はコンフォーカルピンホールを用いた共焦点レーザ走査顕微鏡に関する。
【０００２】
【従来の技術】
共焦点レーザ走査顕微鏡は、励起レーザ光を発して試料に照射する光源と、励起レーザ光と試料から発せられる蛍光とを分離する光分離手段と、励起レーザ光を２次元走査する走査手段と、走査手段と試料との間に配置された対物レンズと、光分離手段によって分離された蛍光を集光させるための集光レンズと、集光レンズの焦点面に設けられたピンホールと、ピンホールを通過した蛍光を検出する検出手段とを備える。
【０００３】
レーザ光源から射出された励起レーザ光は、ダイクロイックミラーによって反射された後、走査ミラーによって２次元的に振られ、対物レンズによって試料（例えば蛍光試薬が注入された生体細胞）面に集光される。励起レーザ光の照射によって試料から発生した蛍光は励起レーザ光とともに対物レンズから走査ミラーへと光路を逆行し、ダイクロイックミラーで励起レーザ光と分離される。ダイクロイックミラーを透過した蛍光は、集光レンズにより蛍光光路中に配置したピンホールに集光される。このとき、試料の結像部で発した蛍光のみがピンホールを通過し、蛍光検出器で受光されて電気信号に変換され、画像化される。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
ところで、ダイクロイックミラーは使用される励起光の波長に応じて切り換えたり、交換したりして使用される。しかし、ピンホールは極めて小さい（数十ミクロン程度）ので、光軸とピンホールとの位置がずれると画面が暗くなったり見えなくなったりしてしまう。
【０００５】
これは、ダイクロイックミラーを切り換える度に、ダイクロイックミラーを切り換えるためのスライダーや回転機構の切換位置がずれたり、ダイクロイックミラーの交換時に装着位置がずれたりして蛍光がピンホールから外れたり、けられ（一部が遮光されること）たりするからである。
【０００６】
そこで、ダイクロイックミラーを切り換える度に集光レンズの光軸やピンホールの位置が調整される。
【０００７】
すなわち、ダイクロイックミラーを切り換える度に、試料に実際に励起光を照射し、モニタ画面上の蛍光像を見ながら輝度値が大きくなる（画像が明るくなる）ように、集光レンズの光軸やピンホールに位置を動かして調整する。
【０００８】
しかし、実際の試料には蛍光を発し易い部分と蛍光を発し難い部分があるため、最大の輝度値である位置に合わせたつもりでも実際には最大の輝度値でない位置に合わせてしまう場合が生じ、調整は感覚に依存する定量性のないものとなってしまうという問題があった。
【０００９】
また、調整時に試料に対して必要以上に励起光を照射していまうため、試料に退色等のダメージを与えてしまうという問題があった。
【００１０】
この発明はこのような事情に鑑みてなされたもので、その課題は定量性のある調整を簡単に行うことができ、また調整の際、試料にダメージを与えないですむ共焦点レーザ走査顕微鏡を提供することである。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
前述の課題を解決するため請求項１記載の発明の共焦点レーザ走査顕微鏡は、励起レーザ光を発して試料に照射する光源と、前記励起レーザ光と試料から発せられる蛍光とを分離する光分離手段と、前記励起レーザ光を２次元走査する走査手段と、前記走査手段と前記試料との間に配置された対物レンズと、前記光分離手段によって分離された蛍光を集光させるための集光レンズと、前記集光レンズの焦点面に設けられたピンホールと、前記ピンホールを通過した蛍光を検出する検出手段とを備えることを特徴とする。
【００１２】
対物レンズの焦点面と共役な１次像面に標準蛍光サンプルとしての蛍光ガラスを抜き差し自在に設けたので、試料面に照射したのと同等の、集光レンズの光軸やピンホールの位置の調整を行うことができ、試料にダメージを与えることがなくなる。また蛍光ガラスは均一な蛍光を発するので、輝度値を用いた定量的な調整を行うことができる。
【００１３】
請求項２記載の発明の共焦点レーザ走査顕微鏡は、請求項１記載の発明の共焦点レーザ走査顕微鏡において、前記蛍光ガラスは、レーザ光の波長λが３５１ｎｍ及び４８８ｎｍのとき、蛍光波長が５４２ｎｍ付近で蛍光強度が強くなるものであることを特徴とする。
【００１４】
蛍光ガラスは、レーザ光の波長λが３５１ｎｍ及び４８８ｎｍのとき、蛍光波長が５４２ｎｍ付近で蛍光強度が強くなるので、波長が５４２ｎｍ付近の蛍光を観察することで安定した調整を行うことができる。
【００１５】
【発明の実施の形態】
以下、この発明の実施の形態を図面に基づいて説明する。
【００１６】
図１はこの発明の第１の実施形態に係る共焦点レーザ走査顕微鏡のブロック構成図である。
【００１７】
共焦点レーザ走査顕微鏡１は、照明光学系１０と、第１ダイクロイックミラー（光分離手段）２０と、スキャニングユニット（走査手段）３０と、リレー光学系４０と、バリアフィルタ２と、集光レンズ３と、ピンホール４ａが形成されたピンホールプレート４と、蛍光検出部（検出手段）５０と、蛍光画像システム６０とを備える。
【００１８】
照明光学系１０は、アルゴンレーザ光源（波長λ：３５１ｎｍ及び４８８ｎｍ）１１と、３５１ｎｍの波長を通す励起フィルタ１２（ＥＸフィルタ）と、全反射ミラー１３と、励起光の透過率を調整する減光フィルタ（ＮＤフィルタ）１４と、ビームエクスパンダ１５とから構成される。なお、第１ダイクロイックミラー２０を切換えるための機構は、例えばアリ溝又はボールレース等のスライダを用いることができるるが、その図示は省略されている。
【００１９】
第１ダイクロイックミラー２０はレーザ光と蛍光を分離させるものであって、ここでは３８０ｎｍ以下の波長の光を反射させるものを用いる。
【００２０】
スキャニングユニット３０は、水平スキャナ３１及び垂直スキャナ３２から構成される。水平スキャナ３１及び垂直スキャナ３２としては、ガルバノスキャナやレゾナントスキャナを用いる。
【００２１】
リレー光学系４０は、集光レンズ４１と、蛍光ガラス４２と、全反射ミラー４３と、対物レンズ４４とから構成される。蛍光ガラス４２は、対物レンズ４４の焦点面（ステージ４５上に載置された試料４６の任意のスライス面）と共役な１次像面４７に標準蛍光サンプルとして抜き差し自在に設けられている。
【００２２】
バリアフィルタ２は、３９０ｎｍ以上の波長の光を透過する。
【００２３】
集光レンズ３は試料面４５で発生した蛍光を対物レンズ４４の焦点面と共役な位置に設けられたピンホール４ａに集光させる。
【００２４】
蛍光検出部５０は、４４０ｎｍ以上の波長の蛍光を透過する第２ダイクロイックミラー５１と、４００〜４４０ｎｍの波長の蛍光を通すエミッション（Ｅｍ）フィルタ５２と、蛍光検出器５３と、４４０ｎｍ以上の波長の蛍光を通すエミッション（Ｅｍ）フィルタ５４と、蛍光検出器５５とから構成される。蛍光検出器５３，５５は、１つの励磁光で２つの波長の光を観察でき、それぞれピンホール４ａを通過した蛍光を検出して電気信号に変換し出力する。
【００２５】
蛍光画像システム６０は、アンプ６１、Ａ／Ｄコンバータ６２、モニタ６３、メモリ６４、ＣＰＵ６５から構成される。
【００２６】
次に集光レンズ３又はピンホールプレート４を動かす調整時の動作を図１を参照して説明する。
【００２７】
第１ダイクロイックミラー２０が切り換えられたとき、蛍光ガラス４２を一次像面４７に挿入する。
【００２８】
アルゴンレーザ光源１１から射出されたレーザ光は、励起フィルタ１２を透過し、全反射ミラー１３で反射され、減光フィルタ１４で調光された後、ビームエクスパンダ１５で対物レンズ４４の瞳面を満たせる大きさに拡大される。
【００２９】
このレーザ光は、第１ダイクロイックミラー２０によって反射された後、スキャニングユニット３０でスキャニングされ、集光レンズ４１によって１次像面４７に挿入された蛍光ガラス４２上に集光する（レーザ光は、この際も２次元的に振られている）。
【００３０】
蛍光ガラス４２は、レーザ光の照射によって５４２ｎｍ程度の波長の蛍光（緑色）を発生する。この蛍光は集光レンズ４１からスキャニングユニット３０へと光路を逆行する。スキャニングユニット３０では、通常の観察時と同様にデスキャニングされる。
【００３１】
第１ダイクロイックミラー２０を通過した蛍光は、バリアフィルタ２を通った後集光レンズ３で集光される。
【００３２】
ピンホール４ａを通過した蛍光は、光蛍光検出器５３で電気信号に変換され、アンプ６１で増幅された後、Ａ／Ｄコンバータ６２で、例えば２５６段階のデジタル信号に変換される。このデジタル信号はデジタルメモリ６４に記憶され、ＣＰＵ６５の制御や演算回路により輝度信号を分離する処理等を行った後、再びアナログ信号に戻してモニタ６３にデジタル画像として出力される。
【００３３】
その際、例えばモニタ６３の画面をズーム画面表示や静止画面表示としておき、画面の中心（スキャン中心）又は中心付近の輝度値が最大となるように、集光レンズ３の光軸又はピンホールプレート４の位置を調整し、蛍光の光軸とピンホールの中心を一致させる。
【００３４】
この第１実施形態によれば、試料面に照射したのと同等の調整を試料にダメージを与えることなく行える。また均一な蛍光を発する蛍光ガラスを用いるので、輝度値の定量的な調整を行うことができる。
【００３５】
図２はこの発明の第２の実施形態に係る共焦点レーザ走査顕微鏡のブロック構成図であり、図１と同一部材には同一符号を付して説明を省略する。
【００３６】
この第２の実施形態においては、ＣＰＵ６５によって駆動が制御される第１の駆動回路７０と、第２の駆動回路８０とを設けたことが第１の実施形態の構成と相違する。
【００３７】
第１の駆動回路７０は蛍光ガラス４２を１次像面４７に挿入させるためのものであり、第２の駆動回路８０は集光レンズ３の光軸又はピンホールプレート４の位置を移動させるためのものである。
【００３８】
次に集光レンズ３又はピンホールプレート４を動かす調整時の動作を図２を参照して説明する。
【００３９】
第１ダイクロイックミラー２０が切り換えられたことを示す信号２０ａを入力したとき、ＣＰＵ６５は制御信号６５ａを駆動回路７０へ出力し、蛍光ガラス４２を一次像面４７に挿入する。
【００４０】
アルゴンレーザ光源１１から射出されたレーザ光は、第１実施形態の場合と同じ光路を通ってピンホール４ａに達する。
【００４１】
ピンホール４ａを通過した蛍光は、光蛍光検出器５３で電気信号に変換され、アンプ６１で増幅された後、Ａ／Ｄコンバータ６２で、例えば２５６段階のデジタル信号に変換される。このデジタル信号はデジタルメモリ６４に記憶され、ＣＰＵ６５の制御や演算回路により輝度信号を分離する処理等を行った後、再びアナログ信号に戻してモニタ６３にデジタル画像として出力される。
【００４２】
その際、モニタ６３の画面の中心（スキャン中心）又は中心付近の輝度値が最大となるように、ＣＰＵ６５は所定のプログラムに基づいて駆動回路８０へ制御信号６５ｂを出力し、集光レンズ３の光軸又はピンホールプレート４の位置を動かして、蛍光の光軸とピンホールの中心を一致させる。
【００４３】
このＣＰＵ６５による制御を同じプログラムで処理すれば、同じデジタル画像に対して処理結果は常に同一となるので、画像再現性が極めてよい調整を行うことができる。
【００４４】
この第２実施形態によれば、第１実施形態と同様の調整をより確実かつ迅速に行うことができる。
【００４５】
なお、３５１ｎｍの波長を通す励起フィルタ１２、３８０ｎｍ以下の波長の光を反射させる第１ダイクロイックミラー２０、３９０ｎｍ以上の波長の光を透過するバリアフィルタ２、４４０ｎｍ以上の波長の蛍光を透過する第２ダイクロイックミラー５１、４００〜４４０ｎｍの波長の蛍光を通すエミッションフィルタ５２及び４４０ｎｍ以上の波長の蛍光を通すエミッションフィルタ５４を用いる代わりに、４８８ｎｍの波長を通す励起フィルタ１２、５１０ｎｍ以下の波長の光を反射させる第１ダイクロイックミラー２０、５１５ｎｍ以上の波長の光を透過するバリアフィルタ２、６２５ｎｍ以上の波長の蛍光を透過する第２ダイクロイックミラー５１、５００〜６２５ｎｍの波長の蛍光を通すエミッションフィルタ５２及び６３０ｎｍ以上の波長の蛍光を通すエミッションフィルタ５４を用いたときでも、上記各実施形態と同様に調整を行うことができる。
【００４６】
また、上記各実施形態においては、ピンホール４ａをピンホールプレート４に形成するようにしたが、シングルモードの光ファイバ等の端面を用いるようにしてもよい。
【００４７】
図３は蛍光ガラスの蛍光スペクトル図であり、横軸は蛍光波長λ（単位：ｎｍ）、縦軸は蛍光強度Ｉである。
【００４８】
この図から３５１ｎｍ及び４８８ｎｍの波長のレーザ光を蛍光ガラスに照射したとき、５４２ｎｍ付近で蛍光強度が最大となることがわかる。したがって、波長が５４２ｎｍ付近の蛍光を観察することで集光レンズの光軸やピンホールの位置の調整を行えば、安定した調整を行えることがわかる。
ることがわかる。
【００４９】
【発明の効果】
以上に説明したように請求項１に記載の発明の共焦点走査顕微鏡によれば、対物レンズの焦点面と共役な１次像面に標準蛍光サンプルとしての蛍光ガラスを抜き差し自在に設けたので、試料面に照射したのと同等の、集光レンズの光軸やピンホールの位置の調整を行うことができ、試料にダメージを与えることがなくなる。また蛍光ガラスは均一な蛍光を発するので、輝度値を用いた定量的な調整を行うことができる。そのため、調整後においては再現性の画像を取得することが可能となる。
【００５０】
請求項２に記載の発明の共焦点走査顕微鏡によれば、蛍光ガラスは、レーザ光の波長λが３５１ｎｍ及び４８８ｎｍのとき、蛍光波長が５４２ｎｍ付近で蛍光強度が強くなるので、波長が５４２ｎｍ付近の蛍光を観察することで安定した調整を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１はこの発明の第１の実施形態に係る共焦点レーザ走査顕微鏡のブロック構成図である。
【図２】図２はこの発明の第２の実施形態に係る共焦点レーザ走査顕微鏡のブロック構成図である。
【図３】図３は蛍光ガラスの蛍光スペクトル図である。
【符号の説明】
１  共焦点レーザ走査顕微鏡
３  集光レンズ
４ａ  ピンホール
１１  アルゴンレーザ光源
２０  ダイクロイックミラー（光分離手段）
３０  スキャニングユニット（走査手段）
４６  試料
４７  １次像面
５０  蛍光検出部（検出手段）
【図１】
0003814869.tif 000002
【図２】
0003814869.tif 000003
【図３】
0003814869.tif 000004