(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
食品工業研究所（Ｆｏｏｄ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、ＦＩＲＤＩ）に寄託されて受託番号ＣＣＲＣ９３００３２を有し、そしてアメリカンタイプカルチャーセンター（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｅｎｔｅｒ、ＡＴＣＣ）に寄託されて受託番号ＰＴＡ−１２３３を有する、アントロディア  カンフォラータ（Ａｎｔｒｏｄｉａ  ｃａｍｐｈｏｒａｔａ）の分離株。
【請求項２】
主要炭素源として、ポテト−デキストロース培養基又はフルクトースを含有する合成培地から選択される培地で培養した時に、ハンター座標系（Ｈｕｎｔｅｒ‘ｓ  ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅ  ｓｙｓｔｅｍ）を使用して測定される培養物の赤色指標ａが、ａ≧３である請求項１記載の分離株。
【請求項３】
薬理的活性を有するアントロディア  カンフォラータ（Ａｎｔｒｏｄｉａ  ｃａｍｐｈｏｒａｔａ）の培養物を生産する方法であって、
（ａ）アントロディア  カンフォラータ（Ａｎｔｒｏｄｉａ  ｃａｍｐｈｏｒａｔａ）の分離株の植菌用菌糸を、該分離株の培養に好適な液体培地中に植菌し；
（ｂ）工程（ａ）から得られる培養物を培養し；そして
（ｃ）ハンター座標系（Ｈｕｎｔｅｒ‘ｓ  ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅ  ｓｙｓｔｅｍ）を使用して測定される培養物の赤色指標ａが、ａ≧７である時に該培養物を収穫する；
ことを含む方法。
【請求項４】
アントロディア  カンフォラータ（Ａｎｔｒｏｄｉａ  ｃａｍｐｈｏｒａｔａ）の培養物を生産する方法であって、
（ａ）アントロディア  カンフォラータ（Ａｎｔｒｏｄｉａ  ｃａｍｐｈｏｒａｔａ）の分離株の植菌用菌糸を、該分離株の培養に好適な液体培地中に植菌し；
（ｂ）工程（ａ）から得られる培養物を培養し；そして
（ｃ）ハンター座標系（Ｈｕｎｔｅｒ‘ｓ  ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅ  ｓｙｓｔｅｍ）を使用して測定される培養物の赤色指標ａが、ａ≧７である時に該培養物を収穫する；
ことを含む方法。
【請求項５】
請求項１又は２記載の分離株を植菌工程（ａ）に使用する、請求項３又は４記載の方法。
【請求項６】
培地が、主要な炭素源として、ポテト−デキストロース培養基又はフルクトースを含有する合成培地から選択される、請求項３又は４記載の方法。
【請求項７】
合成培地が、窒素源として酵母抽出物を含有する、請求項６記載の方法。
【請求項８】
合成培地が、所望により麦芽抽出物又はグルコースを含有する、請求項６記載の方法。
【請求項９】
薬理的活性が、腫瘍又はガン細胞に対する阻害活性である、請求項３又は４記載の方法。
【請求項１０】
薬理的活性を有する菌類培養物を生産する方法であって、アントロディア  カンフォラータ（Ａｎｔｒｏｄｉａ  ｃａｍｐｈｏｒａｔａ）の分離株由来の植菌用菌糸をポテト−デキストロース培養基中で培養し、ハンター座標系（Ｈｕｎｔｅｒ‘ｓ  ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅ  ｓｙｓｔｅｍ）を使用して測定される培養物の赤色指標ａが、ａ≧７である時に該培養物を収穫することを含む方法。
【請求項１１】
菌類培養物を生産する方法であって、アントロディア  カンフォラータ（Ａｎｔｒｏｄｉａ  ｃａｍｐｈｏｒａｔａ）の分離株由来の植菌用菌糸をポテト−デキストロース培養基中で培養し、ハンター座標系（Ｈｕｎｔｅｒ‘ｓ  ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅ  ｓｙｓｔｅｍ）を使用して測定される培養物の赤色指標ａが、ａ≧７である時に該培養物を収穫することを含む方法。
【請求項１２】
分離株が、食品工業研究所（Ｆｏｏｄ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，ＦＩＲＤＩ）に寄託されて受託番号ＣＣＲＣ９３００３２を有し、そしてアメリカンタイプカルチャーセンター（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｅｎｔｅｒ，ＡＴＣＣ）に寄託されて受託番号ＰＴＡ−１２３３を有する、アントロディア  カンフォラータ（Ａｎｔｒｏｄｉａ  ｃａｍｐｈｏｒａｔａ）の分離株である、請求項１０又は１１記載の方法。
【請求項１３】
薬理的活性が、腫瘍又はガン細胞に対する阻害活性である、請求項１０記載の方法。
【請求項１４】
薬理的活性を有する菌類培養物を生産する方法であって、アントロディア  カンフォラータ（Ａｎｔｒｏｄｉａ  ｃａｍｐｈｏｒａｔａ）の分離株由来の植菌用菌糸を、主要炭素源としてフルクトースを含有する合成培地中で培養し、ハンター座標系（Ｈｕｎｔｅｒ‘ｓ  ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅ  ｓｙｓｔｅｍ）を使用して測定される培養物の赤色指標ａが、ａ≧７である時に該培養物を収穫することを含む方法。
【請求項１５】
菌類培養物を生産する方法であって、アントロディア  カンフォラータ（Ａｎｔｒｏｄｉａ  ｃａｍｐｈｏｒａｔａ）の分離株由来の植菌用菌糸を、主要炭素源としてフルクトースを含有する合成培地中で培養し、ハンター座標系（Ｈｕｎｔｅｒ‘ｓ  ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅ  ｓｙｓｔｅｍ）を使用して測定される培養物の赤色指標ａが、ａ≧７である時に該培養物を収穫することを含む方法。
【請求項１６】
分離株が、食品工業研究所（Ｆｏｏｄ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，ＦＩＲＤＩ）に寄託されて受託番号ＣＣＲＣ９３００３２を有し、そしてアメリカンタイプカルチャーセンター（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｅｎｔｅｒ，ＡＴＣＣ）に寄託されて受託番号ＰＴＡ−１２３３を有する、アントロディア  カンフォラータ（Ａｎｔｒｏｄｉａ  ｃａｍｐｈｏｒａｔａ）の分離株である、請求項１４又は１５記載の方法。
【請求項１７】
薬理的活性が、腫瘍又はガン細胞に対する阻害活性である、請求項１４記載の方法。
【請求項１８】
合成培地が、窒素源として酵母抽出物を含有する、請求項１４又は１５記載の方法。
【請求項１９】
合成培地が、所望により麦芽抽出物又はグルコースを含有する、請求項１４又は１５記載の方法。
【請求項２０】
請求項２乃至１９のいずれか１つに記載の方法から得られる産生物。
【請求項２１】
ガン又は腫瘍疾患の治療用医薬の製造のための、請求項２０記載の産生物の使用。
【請求項２２】
請求項２乃至１９のいずれか１つに記載の方法から得られる産生物を含有するガン又は腫瘍疾患の治療用医薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、医学及び食物分野において有用な産生物を提供するための、アントロディア  カンフォラータ（Ａｎｔｒｏｄｉａ  ｃａｍｐｈｏｒａｔａ）の分離株を培養する方法に関する。本発明は、また、好適な培地で培養した時に、その培養物が薬理的活性を示す、新規なアントロディア  カンフォラータの分離株に関する。
【０００２】
【従来の技術】
アントロディア  カンフォラータ（Ａｎｔｒｏｄｉａ  ｃａｍｐｈｏｒａｔａ）［（Ｚａｎｇ  ＆  Ｓｕ）Ｓ．−Ｈ．Ｗｕ，Ｒｙｖａｒｄｅｎ  ＆  Ｔ．Ｔ．Ｃｈａｎｇ］は、また台湾で「ニシャンチ」あるいは「ニシャンク」として知られているが、純粋培養した時、子実体に現れる担子胞子の筒状形態、ややアミロイド状の骨格菌糸、苦味と軽いシナモン味、仰向け状から傘状の担子器果、そしてまた厚膜胞子と花冠状分生胞子などで特徴付けられる新種の菌として最近報告された。この新種の菌の生育は極めて遅く、かつ、固有の樹木種であるＣｉｎｎａｍｏｍｕｍ  ｋａｎｅｈｉｒａｉ  Ｈａｙ（クスノキ科）のみを唯一の宿主として生育する。アントロディア  カンフォラータの詳細な特徴付けと分類上の位置付けは、Ｃｈａｎｇ，Ｔ．Ｔ．ら、「台湾におけるＣｉｎｎａｍｏｍｕｍ  ｋａｎｅｈｉｒａｉに生育する新種のアントロディア  シンナモメア（Ａｎｔｒｏｄｉａ  ｃｉｎｎａｍｏｍｅａ）」、Ｍｙｃｏｌ．Ｒｅｓ．，９９（６）：７５６−７５８（１９９５）及びＷｕ，Ｓ．−Ｈ．ら、「アントロディア  シンナモメア［Ａｎｔｒｏｄｉａ  ｃｉｎｎａｍｏｍｅａ（ニシャンチ）］、台湾における薬用カビの新規な組合わせ」，Ｂｏｔ．Ｂｕｌｌ．Ａｃａｄ．Ｓｉｎ．３８：２７３−２７５（１９９７）に記載されており、その全面的開示は、参照することにより本明細書に取り入れられている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
台湾民間薬の中で、Ａ．カンフォラータの子実体はある種の薬用効果を有すると信じられている。伝統的方法に従い、子実体は乾燥末に粉砕されたり他の薬草類と煎じられ、飲み薬として中毒、下痢、腹痛、高血圧、皮癬、肝ガンなどにより引き起こされた症状の治療に使われる。しかしながら、前述の諸点についての薬理学的又は臨床的研究は、これまで文献に出てきていない。厳格な宿主特異性と天然での希少性、ならびに、人工培養の不成功の理由により、ニシャンチは台湾で極めて高価である。近年、高品質の本カビの子実体は１ｋｇ当り約１５，０００ＵＳドルという極めて高い価格で販売されている。
【０００４】
従って、本菌、Ａ．カンフォラータが持つ薬理的活性を保持しながら、好適な人工環境のもとで、本菌を大量に培養する方法の確立が求めらている。また、好適な人工環境のもとで培養された時、薬理学的に有用な活性を示すＡ．カンフォラータの分離株を得ることが求めらている。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
従って、本発明の目的は、Ａ．カンフォラータの分離株の培養に好適な方法であって、水面下培養時に菌糸状態で良好に生育し得る方法を提供することである。この目的のために、本発明者らは食品工業研究所（ＦＩＲＤＩ）、中華民国、台湾、新竹で収集されたＡ．カンフォラータの５種の分離株を検討した。加えて、驚くべきことにその内の１株が所望の薬理的活性、特に抗腫瘍活性を示すことを見出した。本発明の好ましい実施態様によれば、通常は炭水化物である培地の炭素源が、Ａ．カンフォラータを培養するための最適環境を得るために、極めて重要と思われる。
【０００６】
本発明のもう１つの目的は、好適な人工環境のもとで生育した時に、所望の薬理的活性、特に抗腫瘍活性を保持している、新規なアントロディア  カンフォラータの分離株を提供することである。この目的のために本発明者らは、水面下培養時に菌糸状態で良好に生育することができ、かつ、その培養物が優れた薬理的活性を示す、Ａ．カンフォラータの分離株を分離し同定した。
【０００７】
従って本発明は、薬理的活性を有するＡ．カンフォラータの分離株の培養物を生産する方法であって：
（ａ）Ａ．カンフォラータの分離株の菌糸を、該分離株の生育に好適な培地に植菌し；
（ｂ）工程（ａ）から得られる培養物を培養し；そして
（ｃ）ハンター座標系（Ｈｕｎｔｅｒ‘ｓ  ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅ  ｓｙｓｔｅｍ）を使用して測定される培養物の赤色指標ａが、ａ≧３である時に該培養物を収穫する；
工程を含む方法を提供する。
【０００８】
本発明の他の目的は、上記の方法で得られる産生物を提供することである。
【０００９】
本発明の更なる目的は、上記の方法で得られる産生物を含有する、薬剤組成物あるいは栄養補助剤を提供することである。
【００１０】
本発明の上記の及び他の目的及び特徴は、添付の図面と共に以下の発明の実施の形態の記述を参照することにより明白になるであろう。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明に従い、Ａ．カンフォラータの１分離株が中華民国、台湾、台東郡で分離され、そして、これと他の４株の分離株が天然素材培地もしくは合成培地で成功裏に培養された。これら５種の分離株は、食品工業研究所（ＦＩＲＤＩ）、中華民国、台湾、新竹に所属する培養菌収集・研究センター（Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ、ＣＣＲＣ）に寄託され、それぞれ受託番号はＣＣＲＣ３５３９６（１９９４年１２月１日付）、３５３９８（１９９４年、１２月１日付）、３６４０１、３６７９５及び９３００３２（２０００年、１月２７日付）である。
【００１２】
本明細書で使用される天然培地又は天然素材培地という用語は、当業者にとって通常の意味を持つもので、主に天然にある素材から成る培地を示す。本発明によれば、商業的に入手可能なＧＩＢＣＯ社製のポテト−デキストロース培養基が好ましい。
【００１３】
本明細書で使用される合成培地という用語は、明確な化学構造を持つ種々の成分と、所望により１つ以上の天然素材由来の未精製成分との人工混合物を意味する。一般に、合成培地は、炭素源、窒素源、無機塩などの微量元素、及び必要によりビタミン類又は他の成長因子を含んでいる。
【００１４】
炭素源は、グルコース、ショ糖、ガラクトース、フルクトース、コーンスターチ、麦芽抽出物及びそれらの組み合わせを包含するが、これらに限定されない。所期の効果の観点から、合成培地は、主要炭素源としてフルクトースを含むのが好ましく、必要により麦芽抽出物又はグルコースが追加される。好ましくは、炭素源は、合成培地の総体積を基準にして１．５−２．５ｗ／ｖ％の範囲で、より好ましくは２．５ｗ／ｖ％の量で含まれる。
【００１５】
窒素源は、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、カザミノ酸、酵母抽出物、ペプトン、トリプトン及びそれらの組み合わせを包含するが、これらに限定されない。本発明によれば、好ましくは、合成培地は窒素源として酵母抽出物を含む。窒素源は、合成培地の総体積を基準にして０．２−２．５ｗ／ｖ％の範囲が好ましく、より好ましくは０．５ｗ／ｖ％の量で含まれる。
【００１６】
本発明の方法は、菌の子実体自体を粉砕したり煎じるようなニシャンチの取り扱いの伝統的方法に比較して、製薬工業において所望する菌を簡便に操作し、その大量生産に迅速に対応できるという明白な利便性を持つ。
【００１７】
５種のＡ．カンフォラータの分離株が、医薬分野での可能性、特に腫瘍又はガン細胞の増殖阻害能について検討された。これら分離株の腫瘍細胞に対する増殖阻害能を評価するため、天然培地と合成培地でのＡ．カンフォラータ培養物の水相をＭＴＴ比色定量試験に供した。
【００１８】
本明細書で使用されるＭＴＴ比色定量試験、又はＭＴＴテトラゾリウム定量試験という用語は、米国国立ガン研究所の医療開発プログラム、ガン治療部門により１９８０年代に確立された、抗ガン剤スクリーニングスキームを意味する（例えば以下を参照。Ａｌｌｅｙ、Ｍ．Ｃ．ら、「微量培養テトラゾリウム定量法を使用したヒト腫瘍細胞系パネルによる薬剤スクリーニング法の可能性」、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４８：５８９−６０１，１９８８；Ｓｃｕｄｉｅｒｏ，Ｄ．Ａ．ら、「ヒト及び他の腫瘍細胞系を使用した培養における細胞増殖と薬剤感受性に対する可溶性テトラゾリウム・フォルマザン定量法の評価」、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４８：４８２７−４８３３，１９８８；Ｖｉｓｔｃａ，Ｄ．Ｔ．ら、「テトラゾリウムをベースにした細胞生存性の定量法：フォルマザンに影響する選ばれたパラメターの厳密な検討」、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５１：２５１５−２５２０，１９９１；並びに、Ｍｏｎｋｓ，Ａ．ら、「培養されたヒト腫瘍細胞系の多様なパネルを使用した、高能率抗ガン剤スクリーニング法の可能性」、Ｊ．Ｎａｔ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．８３：７５７−７６６，１９９１）。
【００１９】
この定量試験で、植物又は微生物（本明細書では、Ａ．カンフォラータからの５種の分離株）由来の潜在的抗ガン剤や天然物の薬効が、ヒト悪性腫瘍の主要な臨床上のカテゴリーをそれぞれ代表する細胞系パネル群に対して検討された。ウエル当りの生存細胞数は、フォルマザン形成に正比例し、可溶化により分光測光法で測定できる。原則として、生物活性物質又はそれらを含む天然物は細胞増殖を阻害するか、さらには停止させることができ、その結果、フォルマザンがほとんど形成されない。
【００２０】
５種の分離株の中で、Ａ．カンフォラータ  ＣＣＲＣ  ９３００３２が優れた薬理的活性を持つことが見出された。この菌株は、また、特許手続きのための微生物寄託に関する国際的承認についてのブタペスト条約に基づき、２０００年１月２７日付けでアメリカタイプカルチャーセンター（ＡＴＣＣ）に寄託され（寄託者による参照ＩＤ番号：Ａｎｔｒｏｄｉａ  ｃａｍｐｈｏｒａｔａ  ＣＣＲＣ３６７９９）、受託番号ＰＴＡ−１２３３を有している。とりわけＭＴＴ比色定量試験の結果は、Ａ．カンフォラータ  ＣＣＲＣ  ９３００３２が、設計された培養条件（ポテト−デキストロース培養基、又は主要炭素源としてフルクトースを含む合成培地）で培養した時に優れた抗腫瘍活性を有していることを示す。
【００２１】
選択された培地を用いて、Ａ．カンフォラータ  ＣＣＲＣ  ９３００３２の培養に成功したことに鑑みて、上述した本発明の方法を用いて、Ａ．カンフォラータ  ＣＣＲＣ  ９３００３２の薬理的活性特性と実質的に同一な薬理的活性特性を有する、新規なＡ．カンフォラータの分離株を分離し培養することが可能であることが、当業者により理解されるであろう。
【００２２】
おそらく、目標とする腫瘍細胞に働く未知の活性物質（類）は、例えば、培地中の特定の組成など好適な環境が与えられれば、菌糸から培養物の液相中に産生され、分泌される。従って、本発明者らの予期せぬ発見は、最適化された大規模醗酵によるＡ．カンフォラータの大量生産のための実施可能な方法と、それから由来する培養物の健康食品のような有用素材の製造への利用を示唆するものである。
【００２３】
従って本発明は、Ａ．カンフォラータの薬草医薬品用途への適用性に対して有益である。本発明は、また、得られたＡ．カンフォラータ培養物を、そのような治療を必要とする患者における、ガン又は腫瘍疾患の治療に利用することに対して、門戸を開くものである。
【００２４】
【実施例】
以下の実施例は、説明の目的だけのためのものであり、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【００２５】
例１：Ａ．カンフォラータ  ＣＣＲＣ  ９３００３２の天然培地での液体培養物の調製
培養株の保持
培養菌収集・研究センター（ＣＣＲＣ）に寄託したＡ．カンフォラータ  ＣＣＲＣ  ９３００３２分離株の保存株は、ポテト−デキストロース寒天（ＰＤＡ、Ｄｉｆｃｏ社から購入）のスラントチューブを用い、２５℃で保持し、２ヶ月ごとに植え継いだ。ＰＤＰプレート上の作業用株は，ＰＤＡスラントから植菌し、２８℃で１５−２０日間培養した。
【００２６】
植菌用菌糸の調製
１５−２０日間の培養後、雑菌の混入がないことを確認するため、アントロディア  カンフォラータ  ＣＣＲＣ  ９３００３２の菌糸の特徴を光学顕微鏡で調べた。全菌糸を細かい断片に裁断した後、５０ｍｌの滅菌水中で、ホモジナイザー（Ｏｓｔｅｒｉｚｅｒ）により３０秒間、無菌的に均質にした。その菌糸懸濁液１０ｍｌ分をその後の試験のために、植菌用に使用した。
【００２７】
水面下の振盪培養
ポテト−デキストロース培養基（ＰＤＢ、Ｄｉｆｃｏ社から購入）を製造者の使用説明書に従い調製した。５００ｍｌエーレンマイヤーフラスコ中にある１００ｍｌの天然素材培地に対し、１０ｍｌのＡ．カンフォラータ  ＣＣＲＣ  ９３００３２の植菌液を加えた。水面下の培養は、３０℃で１４日間、定常振盪（５０ｒｐｍ、Ｈｏｔｅｃｈ社から購入の軌道回転振盪機）で培養した。培養終了時に菌培養物を、吸引濾過ロート、フラスコ及び真空装置から成る簡単な濾過装置を通過させた。濾液をその後のＭＴＴ比色定量試験に使用した。ロート上に収穫されたペレットは６０℃で７日間乾燥し、全菌体量の乾燥重量を計測した。本試験は３回繰り返した。
【００２８】
例２：Ａ．カンフォラータ  ＣＣＲＣ  ９３００３２の合成培地での液体培養物の調製
天然培地を合成培地に置き換えた以外は何も変更しないで、例１を繰り返した。各合成培地は、０．５％（ｗ／ｖ）の酵母抽出物（Ｄｉｆｃｏ社製）、０．１％（ｗ／ｖ）のＫ2ＨＰＯ4（Ｍｅｒｋ社製）、０．０５％（ｗ／ｖ）のＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ（Ｍｅｒｋ社製）、及び、主要炭素源として、フルクトース、グルコース、ショ糖、麦芽抽出物又はコーンスターチから選択された１種の炭水化物２．５％を含む。本試験は３回繰り返した。
【００２９】
例１及び例２の結果を表１に示す。
【００３０】
【表１】
0003830731.tif 000002
【００３１】
表１に示すように、菌糸の最大乾燥重量は、炭素源としてコーンスターチ又は麦芽抽出物を使用した合成培地で得られた。菌糸ペレットの平均サイズはかなり小さく、通常直径約１−３ｍｍであった。得られた培養物の色調は各々異なり、それらに含まれる組成に依存しているように思われる。例えば、ポテト−デキストロース培養基で得られた培養物は暗赤色であり、類似の色調が主要な炭素源としてフルクトースを加えた合成培地で得られた培養物で観察された。他方、他の培養物の色調は極めて異なっていた。炭素源としてグルコース又はコーンスターチを使用した合成培地から得られた培養物は培養の終わりには黄色となり、一方、麦芽抽出物を使用した合成培地から得られた培養物の色調は茶色であった。
【００３２】
例３：ＭＴＴ［３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド］比色定量試験
ＭＴＴ定量試験用サンプルの調製
例１及び例２から集められたＡ．カンフォラータの培養濾液（試験サンプル）と非植菌培地（対照サンプル）をＭＴＴ定量試験に使用した。培養濾液及び培地をアンモニア水（ＮＨ4ＯＨ）でｐＨ７に調整し、オートクレーブで滅菌した。そのサンプルは分析までの間、４℃で保存した。
【００３３】
細胞系と培養
ＭＣＦ−７、Ｈｅｌａ、ＡＧＳ、ＣＯＬＯ  ３２０ＨＳＲ及びＨｅｐ  Ｇ２細胞などを含む腫瘍細胞系をＭＴＴ比色定量試験用に選択した。これらを、１０％胎児ウシ血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ社製）と２ｍＭのＬ−グルタミン酸塩（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）を添加したＲＰＭＩ  １６４０（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）培地で保存用に保持した。これらの細胞系の培養物を、トリプシン−ＥＤＴＡ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）を用いて週１、２回継代培養し、培養フラスコから細胞を剥離した。
【００３４】
ＭＴＴ−微量培養テトラゾリウム定量試験
腫瘍細胞株を収穫し、計数し、適切な濃度で９６ウエル−マイクロタイタープレートに植えつけた。例えば、Ｈｅｌａ細胞の初期濃度は、１ウエル当り１０００細胞数であり、Ｈｅｐ３Ｂ２．１−７、ＨｅｐＧ２、ＡＧＳ，ＣＯＬＯ  ３２０ＨＳＲ及びＭＣＦ−７細胞では１ウエル当り３０００細胞数であった。１ウエル当りの細胞培養培地の総量は１８０μｌとし、５％ＣＯ2濃度のインキュベーターで３７℃で一晩培養した。
【００３５】
２０μｌ分のサンプル液を３つ培養ウエルに入れ、上述の培養条件で３日間培養した。その後、あらかじめＰＢＳ液（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）中、５ｍｇ／ｍｌ濃度で調製し、４℃で保存してある２０μｌのＭＴＴ（Ｍｅｒｋ社製）を各々のウエルに加えた。
【００３６】
３７℃で４時間追加インキュベートした後，各々のウエルから上清液を取り除き、ＭＴＴ−フォルマゾン生成物を溶解するため、１００μｌの１００％ＤＭＳＯ（ジメチルスルフォキシド、Ｓｉｇｍａ社から入手可能）を加えた。機械的プレートミキサーで完全に混合した後、５４０ｎｍでの吸光度をマイクロプレートリーダー（ＭＲＸ、Ｄｙｎｅｘ社製）で測定した。試験されたＡ．カンフォラータの培養濾液の腫瘍細胞増殖阻害率は、各試験サンプルの吸光度を対応する対照サンプルの吸光度で割って計算した。結果を図１及び図２に示す。
【００３７】
図１では、選択された培養基はポテト−デキストロース培養基で、Ａ．カンフォラータ  ＣＣＲＣ  ９３００３２分離株は、３０℃、５０ｒｐｍ、１０％の植菌量で１４日間培養した（例１）。培養物から培養濾液を収穫し、Ｈｅｌａ、ＥＳ２、Ｈｅｐ３Ｂ、ＭＣＦ−７、ＡＧＳ、ＣＯＬＯ  ２０５、ＣＯＬＯ  ３２０ＨＳＲ及びＣａｃｏ−２細胞を含む数種の典型的な腫瘍細胞系に対して、インキュベートし、ＭＴＴ−テトラゾリウム定量法で試験した。
【００３８】
図１は、ポテト−デキストロース培養基で培養されたＡ．カンフォラータ  ＣＣＲＣ  ９３００３２分離株からの培養濾液の添加により、腫瘍細胞系の増殖率は対照サンプルからの結果に比べ顕著に減少することを示している。例示すると、例１の培養濾液で処理されたＭＣＦ−７細胞の増殖率は、対応する対照の増殖率を基準にして８％であり、一方同様に処理されたＣＯＬＯ  ３２０ＨＳＲ及びＡＧＳ細胞では増殖率はわずかに４％である。
【００３９】
図２では、表１に掲げた合成培地の組成を使用し、３０℃、５０ｒｐｍ、１０％の植菌量で１４日間培養した。Ｈｅｌａ、ＡＧＳ、ＣＯＬＯ  ３２０ＨＳＲ、Ｈｅｐ  Ｇ２及びＭＣＦ−７細胞の５種類の腫瘍細胞系をＭＴＴ−テトラゾリウム定量試験に使用した。図２に示すように、腫瘍細胞の増殖に対する有意な阻害効果を、フルクトースを主要炭素源とした合成培地からの培養濾液で処理した細胞において観察した。加えて、ＣＯＬＯ  ３２０ＨＳＲ及びＭＣＦ−７細胞系では増殖率が２０％未満に減少した。驚いたことには、グルコース、麦芽抽出物、コーンスターチのそれぞれを主要炭素源とした同一の合成培地で培養した時には、Ａ．カンフォラータ  ＣＣＲＣ  ９３００３２分離株は、腫瘍細胞系の増殖を有意には阻害しなかった。さらにその上、何らかの理由で、時折培養基が暗赤色にならなかった時、Ａ．カンフォラータ  ＣＣＲＣ  ９３００３２分離株の阻害能は極端に減少し、かつ、ＡＧＳとＭＣＦ−７腫瘍細胞系のみに限定されていた。
【００４０】
従って、ポテト−デキストロース培養基及びフルクトースを含む合成培地からの培養濾液が暗赤色を帯びることは、試験した菌培養物の腫瘍細胞に対する阻害効果が、培養物の色調とおそらく相関していることを示唆する。この推定を例４でさらに検討する。
【００４１】
例４：Ａ．カンフォラータ培養濾液の阻害活性と色調外観の一致
本例では、ＣＣＲＣ  ９３００３２分離株を５リッターファーメンターで培養した。各サンプルを植菌後、１４３、１６７、２１６、２３９、２６３、２８７及び３１１時間目に培養物から抜き取り、ＭＴＴ−テトラゾリウム定量試験に使用した。収集した各培養物サンプルをＬｏｖｉｂｏｎｄ  ＴｉｎｔｏｍｅｔｅｒＰＦＸ９９０で検出した。サンプルの色調外観はハンター座標系のＬ、ａ及びｂ座標で表現される。このシステムでは、Ｌ値が大きいほどより高いレベルの輝度を表し、ａ値が正で大きいほどより高いレベルの赤色を表し、そして、ｂ値が正で大きいほどより高いレベルの黄色を表す。初期培地をブランク標準に使用した。これらの結果を図３と以下の表２に示す。
【００４２】
【表２】
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【００４３】
濾液のａ値（すなわち、赤色）が急に増すにつれて、腫瘍細胞の増殖率が有意に減少することを見ることができる。濾液のａ値が３より大きい時、被験腫瘍細胞に対し２０％の阻害が示される一方、所望の濾液、すなわち、腫瘍細胞に対しより高い阻害効果がある濾液は、７より大きいａ値を持ち、裸眼で赤色を観察できることが内挿法により推定される。
【００４４】
理論に限定されることを望まないが、ＣＣＲＣ  ９３００３２分離株は有利な遺伝的背景を持つであろうこと、それ故、例えば、特定の培養基中で活性物質（類）を産生及び／又は分泌するのを促進する１組の酵素群を含むであろうことが推定される。代謝物は培地の環境と共に、培養物の色調の黄色から暗赤色への変化をもたらす。おそらく、活性物質自体がテルペノイドのような共役二重結合を持ち、それらが分泌される液体培養物に暗赤色を与えるのであろう。従って、培養物の色調外観は、培養物の阻害活性を評価する有用な指標となるものと思われる。
【００４５】
例５：稀釈した培養濾液による腫瘍細胞の増殖に対する阻害効果
Ａ．カンフォラータ  ＣＣＲＣ  ９３００３２分離株の阻害強度を同定するために、ポテト−デキストロース培養基中の微生物の培養物から得られた培養濾液を５、１０及び５０倍に稀釈し，ＭＴＴ−テトラゾリウム定量試験に供した。図４に図示した結果は、稀釈倍率が増加するに従い、培養濾液の腫瘍細胞に対する阻害効果は用量依存的に次第に減少することを示している。それでも、５倍稀釈の濾液を用いることにより、Ｈｅｐ  ３Ｂ、ＡＧＳ、ＥＳ−２及びＣＯＬＯ  ３２０ＨＳＲ細胞系の増殖の有意な阻害が観察された。５０倍稀釈の濾液で処理されたＥＳ−２及びＣＯＬＯ  ３２０ＨＳＲ細胞の増殖率は、非処理細胞からの結果に比べなお４０％より低く阻害された。
【００４６】
例６：異なるＡ．カンフォラータ分離株の培養物の腫瘍細胞に対する阻害効果
Ａ．カンフォラータ  ＣＣＲＣ  ９３００３２分離株を４種の他の分離株、それぞれＣＣＲＣ  ３５３９６、３５３９８、３６４０１及び３６７９５に置き換えた以外は何も変更しないで、例１及び例３を繰り返した。培養終了時に、４種の分離株由来の濾液はすべて黄色を呈した。図５に図示したように、その結果は、被験腫瘍細胞の増殖阻害活性に関して、ＣＣＲＣ  ９３００３２分離株が他４種の分離株より優れていることを示している。  このように、Ａ．カンフォラータ  ＣＣＲＣ  ９３００３２分離株は、薬剤組成物又は栄養補給剤の製造にとって期待される候補品と思われる。
【００４７】
本発明は、上述の特定した実施様態に関して記述されているが、本発明の精神と範囲を逸脱しない範囲で、関連の当業者には明らかな種々の修正や変更がなされてもよいことは認められるべきである。
【００４８】
【発明の効果】
Ａ．カンフォラータ  ＣＣＲＣ  ９３００３２分離株又はそれと同一の薬理的活性特性を有するＡ．カンフォラータの分離株は、優れた抗腫瘍活性を有している。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、腫瘍細胞の増殖が、ポテト−デキストロース培養基中で振盪培養したＡ．カンフォラータ  ＣＣＲＣ  ９３００３２由来の培養濾液によって影響されることを示す図であり、被験細胞系として、Ｈｅｌａ、ＥＳ−２、Ｈｅｐ  ３Ｂ、ＭＣＦ−７、ＡＧＳ、ＣＯＬＯ  ２０５、ＣＯＬＯ  ３２０ＨＳＲ、及びＣａｃｏ−２細胞株を含む。
【図２】図２は、腫瘍細胞の増殖が、合成培地中で振盪培養したＡ．カンフォラータ  ＣＣＲＣ  ９３００３２由来の培養濾液によって影響されることを示す図であり、被験細胞系として、Ｈｅｌａ、ＡＧＳ、ＣＯＬＯ  ３２０ＨＳＲ、Ｈｅｐ  Ｇ２及びＭＣＦ−７細胞を含む。
【図３】図３は、Ａ．カンフォラータ  ＣＣＲＣ  ９３００３２を振盪培養し、異なるサンプリング時間で収穫した培養濾液の、腫瘍細胞増殖に対する阻害効果を示す図であり、被験細胞系として、Ｈｅｌａ、ＡＧＳ、Ｈｅｐ  ３Ｂ２．１−７、及びＭＣＦ−７細胞を含む。
【図４】図４は、腫瘍細胞の増殖が、５、１０及び５０倍に稀釈したＡ．カンフォラータ  ＣＣＲＣ  ９３００３２の培養濾液によって影響されることを示す図であり、被験細胞系として、Ｈｅｌａ、ＥＳ−２、Ｈｅｐ  ３Ｂ、ＭＣＦ−７、ＡＧＳ、ＣＯＬＯ  ２０５、ＣＯＬＯ  ３２０ＨＳＲ、及びＣａｃｏ−２細胞を含む。
【図５】図５は、腫瘍細胞の増殖が、Ａ．カンフォラータの５種類の分離株、すなわち、ＣＣＲＣ  ３５３９６、３５３９８、３６４０１、３６７９５及びＣＣＲＣ  ９３００３２由来の振盪培養濾液によって影響されることを示す図であり、被験細胞系として、ＥＳ−２、ＡＧＳ、Ｈｅｐ  ３Ｂ２．１−７、及びＭＣＦ−７細胞を含む。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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