(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペプチド鎖のアルギニンと任意のアミノ酸残基との結合及び／又はリジンと任意のアミノ酸残基との結合を加水分解し得る加水分解酵素が、平均粒径０．１〜５０μｍの微粒子の表面に担持されていることを特徴とする血液凝固促進剤。
【請求項２】
請求項１記載の血液凝固促進剤が、有底の管状容器の内壁面に存在せしめられていることを特徴とする血液検査用容器。
【請求項３】
請求項１記載の血液凝固促進剤が、有底の管状容器の内壁面に、水溶性バインダーとともに存在せしめられていることを特徴とする血液検査用容器。
【請求項４】
水溶性バインダーに血餅付着防止成分が含まれていることを特徴とする請求項３記載の血液検査用容器。
【請求項５】
あらかじめ血餅付着防止成分が内壁面に存在せしめられている有底の管状容器の内壁面に、請求項１記載の血液凝固促進剤が水溶性バインダーとともに存在せしめられていることを特徴とする血液検査用容器。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、血清生化学検査及び血清免疫学検査などの臨床検査分野において用いられる血液凝固促進剤及び血液検査用容器に関する。
【０００２】
【従来の技術】
病気の予防や診断の目的で血液検査が広く行われているが、血液検査の多くは血清生化学検査、血清免疫学検査、血清内分泌物質検査、血清腫瘍マーカー検査及び血清薬物濃度検査などの血清検査である。その検査に供される血清は、通常、血液検査用容器に採取された血液が凝固された後、遠心分離によって比重の異なる血餅から分離され、ピペットを用いることにより、又はデカンテーションにより採取されている。
【０００３】
血液の採取に使用される血液検査用容器は、従来から、ガラス製やポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタレート等の合成樹脂製のものが使用されているが、血液の凝固時間については、最も短いとされるガラス製容器でも４０〜６０分を必要とし、合成樹脂製容器では４時間以上かかってしまう。そこで、従来より血液凝固を短時間で行える血液凝固促進剤の検討がなされてきた。
【０００４】
血液の凝固は、血液凝固第XII 因子の活性化により開始し、その後、数多くの反応段階を経て、最終的にフィブリノーゲンがフィブリンに転化した時点で終了する複雑な経路を有することがわかっている。
【０００５】
特開平５−１５７７４７号公報には、血液の凝固を促進する成分として、血液の凝固反応系の最終段階であるフィブリノーゲンがフィブリンに転化する反応を促進するトロンビンや蛇毒酵素等の酵素系薬剤を用いることが記載されている。
【０００６】
ところで、近年、検査機器の進歩に伴って、より迅速な検査が望まれている。従来は採血後、検査結果が得られるまでに数時間以上を必要とするのが通常であったが、診察の待ち時間の３０〜６０分程度の間に採血、検査をし、結果が得られることが望まれている。その理由は、診察に際して重要な情報が得られるだけでなく、早期に、より有効な治療を行えるからである。
【０００７】
上記公報の方法によると、トロンビンや蛇毒酵素等の酵素系薬剤は、不織布、濾紙、布等の支持体に含浸されて血液検査用容器の管内中央部に収容されている。この方法において血液検査用容器として合成樹脂製容器を用いた場合、凝固時間は大幅に短縮され、５分程度で大部分の血液が凝固するものの、実際に完全に凝固するには１０分程度必要である。ところが、上記のような迅速検査を目的とする場合は、５分以内で完全に血液を凝固させる必要があり、この公報の方法では不十分であった。
【０００８】
血液が完全に凝固しないうちに遠心分離を行うと、遠心分離の間に凝固反応が進行し、生成したフィブリンが血清中に残ってしまい、血清がゲル化して検査用容器から取り出すことができず、検査に供することができなくなる。従って、凝固後の遠心分離操作を含めると、従来の方法では１０分以内で血清検体を得ることは不可能であった。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は上記問題点を解決するものであり、その目的は、血液を短時間で凝固させる血液凝固促進剤、及びそれを用いた血液検査用容器を提供することである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
請求項１記載の血液凝固促進剤（以下、本発明１という）は、ペプチド鎖のアルギニンと任意のアミノ酸残基との結合及び／又はリジンと任意のアミノ酸残基との結合を加水分解し得る加水分解酵素が、平均粒径０．１〜５０μｍの微粒子の表面に担持されていることを特徴とする。
【００１１】
請求項２記載の血液検査用容器（以下、本発明２という）は、請求項１記載の血液凝固促進剤が、有底の管状容器の内壁面に存在せしめられていることを特徴とする。
【００１２】
請求項３記載の血液検査用容器（以下、本発明３という）は、請求項１記載の血液凝固促進剤が、有底の管状容器の内壁面に、水溶性バインダーとともに存在せしめられていることを特徴とする。
【００１３】
請求項４記載の血液検査用容器（以下、本発明４という）は、水溶性バインダーに血餅付着防止成分が含まれていることを特徴とする請求項３記載の血液検査用容器である。
【００１４】
請求項５記載の血液検査用容器（以下、本発明５という）は、あらかじめ血餅付着防止成分が内壁面に存在せしめられている有底の管状容器の内壁面に、請求項１記載の血液凝固促進剤が水溶性バインダーとともに存在せしめられていることを特徴とする。
【００１５】
以下、本発明の血液凝固促進剤について詳しく説明する。
本発明の血液凝固促進剤は、加水分解酵素が微粒子の表面に担持されていることを特徴とする。
【００１６】
上記加水分解酵素はプロテアーゼであり、ペプチド鎖のアルギニンと任意のアミノ酸残基との結合及び／又はリジンと任意のアミノ酸残基との結合を加水分解し得るものに限定される。
上記加水分解酵素としては、例えば、トリプシン、トロンビン、蛇毒トロンビン様酵素等のセリンプロテアーゼ；カテプシンＢ、フィシン等のチオールプロテアーゼ；キニナーゼＩ等の金属プロテアーゼ等が挙げられ、特にセリンプロテアーゼが好ましい。
【００１７】
上記加水分解酵素の使用量は、少なくなると血液凝固の時間が長くなったり、凝固が不完全になることがあり、多くなると検査値に悪影響を及ぼす恐れがあるので、血液１ｍＬあたり０．１〜１００単位が好ましく、０．５〜５０単位がより好ましい。
【００１８】
上記微粒子の比重は１．０３ｇ／ｃｍ3 以上であることが好ましい。これを下回ると、遠心分離操作の後も血清検体中に該微粒子が浮遊する恐れがある。
【００１９】
上記微粒子の平均粒径は０．１〜５０μｍの範囲である。０．１μｍ未満では微粒子を安定的に生産することが困難となったり、上記加水分解酵素を均一に担持できなかったり
する恐れがある。５０μｍを超えると血液の凝固が始まるまでに微粒子が沈降してしまい、凝固が部分的に進行する恐れがある。
【００２０】
上記微粒子の素材は上記加水分解酵素を安定的に担持、特に物理吸着させ得るものであり、かつ比重が１．０３ｇ／ｃｍ3 以上であれば特に限定されないが、例えばガラス；金属；ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリメチルメタクリレート、ポリアクリロニトリル、不飽和ポリエステル樹脂、エポキシ樹脂、エポキシ−アクリレート樹脂等の合成樹脂が挙げられる。これらの中でも上記加水分解酵素をより安定的に担持、特に物理吸着させ得る点から合成樹脂が好ましい。
【００２１】
本発明の血液凝固促進剤を製造するには、例えば、水又は緩衝液に上記微粒子を懸濁させた後、上記加水分解酵素を所定量添加し、これを所定時間穏やかに振とうさせる方法が挙げられる。また、別の方法としては、水又は緩衝液に上記加水分解酵素を所定量溶解させ、この溶液を、薄膜状に展延した上記微粒子に所定量噴霧した後、乾燥させる方法が挙げられる。
【００２２】
本発明の血液検査用容器は、有底の管状容器の内壁面に本発明の血液凝固促進剤が存在せしめられている。
【００２３】
上記管状容器の素材としては、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリメチルメタクリレート、ポリアクリロニトリル等の熱可塑性樹脂；不飽和ポリエステル樹脂、エポキシ樹脂、エポキシ−アクリレート樹脂等の熱硬化性樹脂；酢酸セルロース、プロピオン酸セルロース、エチルセルロース、エチルキチン等の変性天然樹脂；ソーダ石英ガラス、リンケイ酸ガラス、ホウケイ酸ガラス等のケイ酸塩ガラス、石英ガラスなどのガラス；及びこれらを主成分とするもののいずれもが用いられる。
【００２４】
上記管状容器は、識別のために外面の一部が着色されていてもよく、また、採血量を計量するための目盛りが設けられていてもよい。
【００２５】
上記血液検査用容器を製造するには、例えば、本発明の血液凝固促進剤の水懸濁液の所定量を、上記管状容器の内壁面にスプレー装置により噴霧した後、乾燥させる方法が挙げられる。
【００２６】
本発明の血液検査用容器は、本発明３のように、本発明の血液凝固促進剤が、有底の管状容器の内壁面に、水溶性バインダーとともに存在せしめられていてもよい。
【００２７】
上記水溶性バインダーとしては、例えば、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、アクリル酸系共重合体、ポリオキシアルキレンブロック共重合体等が挙げられる。
【００２８】
本発明３の血液検査用容器を製造するには、例えば、本発明の血液凝固促進剤の水懸濁液に上記水溶性バインダーを所定量溶解させ、この所定量を、有底の管状容器の内壁面にスプレー装置により噴霧した後、乾燥させる方法が挙げられる。
また、別の方法としては、上記水溶性バインダーの水溶液を予め調製し、この所定量を、有底の管状容器の内壁面にスプレー装置により噴霧した後、この上に本発明の血液凝固促進剤の水懸濁液の所定量を、スプレー装置により噴霧した後、乾燥させる方法が挙げられる。
【００２９】
本発明の血液検査用容器は、本発明４のように、本発明の血液凝固促進剤が、有底の管状容器の内壁面に、血餅付着防止成分が含まれている水溶性バインダーとともに存在せしめられていてもよい。
【００３０】
本発明４の血液検査用容器においては、血餅付着防止成分が管内壁面に存在することにより、血液が凝固した後の血餅成分が容器内壁面に付着することが防止され、遠心分離時に血餅の移動が制限されることがなく血餅と血清とが良好に分離される。
【００３１】
上記血餅付着防止成分としては、水に対して難溶又は不溶の親水性物質が挙げられ、例えば、脂肪族変性シリコーンオイル（例えば、ジメチルポリシロキサン等）、芳香族変性シリコーンオイル（例えば、メチルフェニルポリシロキサン等）、部分ケン化ポリビニルアルコール、ビニルピロリドンと酢酸ビニルの共重合体などが挙げられる。
【００３２】
本発明４の血液検査用容器を製造するには、例えば、本発明の血液凝固促進剤の水懸濁液に上記水溶性バインダー及び上記血餅付着成分をそれぞれ所定量溶解させ、この所定量を、有底の管状容器の内壁面にスプレー装置により噴霧した後、乾燥させる方法が挙げられる。
また、別の方法としては、上記水溶性バインダー及び上記血餅付着防止成分のそれぞれ所定量を溶解させた水溶液を予め調製し、この所定量を、有底の管状容器の内壁面にスプレー装置により噴霧した後、この上に本発明の血液凝固促進剤の水懸濁液の所定量を、スプレー装置により噴霧した後、乾燥させる方法が挙げられる。
【００３３】
本発明の血液検査用容器は、本発明５のように、あらかじめ血餅付着防止成分が内壁面に存在せしめられている有底の管状容器の内壁面に、本発明の血液凝固促進剤が水溶性バインダーとともに存在せしめられていてもよい。
【００３４】
本発明５の血液検査用容器を製造するには、例えば、上記血餅付着防止成分の水溶液を調製し、その所定量を、有底の管状容器の内壁面にスプレー装置により噴霧した後、本発明の血液凝固促進剤を、本発明３の血液検査用容器の製造方法で説明した方法で、上記水溶性バインダーとともに存在させる方法が挙げられる。
【００３５】
本発明２〜５の血液検査用容器には、さらに血清分離剤が収容されていてもよい。血清分離剤は、通常、容器の底部に収容される。この場合は、血液検査用容器に採血された血液が凝固した後、遠心分離を行うと、血清分離剤が血餅と血清の間に移動して隔壁を形成することにより血清が血餅と分離される。
【００３６】
上記血清分離剤としては、公知の、チクソトロピー性を有するゲル状物が挙げられ、例えば、常温で流動性を有する合成樹脂等に、チクソトロピー性付与剤、比重調整剤、及び粘度調整剤等の添加物を添加し混合することにより得られる。
【００３７】
上記合成樹脂としては、例えば、ジシクロペンタジエンのオリゴマー、シクロペンタジエンのオリゴマーなどが、上記チクソトロピー性付与剤としては、例えば、ソルビトールと芳香族アルデヒドとの縮合物などが、上記比重調整剤としては、例えば、シリカ、塩化パラフィンなどが、上記粘度調整剤としては、例えば、フタル酸エステル、エポキシ化大豆油などがそれぞれ挙げられる。
【００３８】
本発明の血液検査用容器は、通常の血液検査用容器のほか、真空採血管としても使用できる。この真空採血管は、上記管状容器の内壁面に上記のいずれかの方法により本発明の血液凝固促進剤を存在させ、必要に応じて上記血清分離剤を該容器底部に収容した後、排気して、ブチルゴム、熱可塑性エラストマー又は合成樹脂などを素材とする密封性の優れた栓で密封することにより得られる。
【００３９】
【発明の実施の形態】
次に、本発明の実施例を説明する。
以下の実施例及び比較例において、試薬、容器等としては以下のものを用いた。
・加水分解酵素・・・トロンビン（商品名：トロンビン持田、持田製薬社製）
・微粒子・・・ポリスチレン微粒子（積水化学工業社製）
・水溶性バインダー・・・  ポリビニルピロリドン（商品名：ＰＶＰＫ−３０、和光純薬社製）
・血餅付着防止成分・・・シリコンオイル（商品名：ＳＦ８４２７、東レダウコーニング社製）
・有底管状容器・・・ガラス製（商品名：ニプロクリーンチューブＣＴ−１０、ニプロ社製）。ポリエチレンテレフタレート製（１６ｍｍ径×１００ｍｍ、積水化学工業社製）
【００４０】
（実施例１）
平均粒径１μｍのポリスチレン微粒子の１０重量％蒸留水懸濁液５ｇに、トロンビン１００００単位を溶解した後、３７℃で穏やかに２４時間振とうしてトロンビンをポリスチレン微粒子の表面に物理吸着させた。この懸濁液の０．０４ｇを、ガラス製の管状容器の内壁面に均一にスプレー塗布し、風乾して血液検査用容器を作製した。この容器に血液を８ｍＬ採取したときのトロンビンの量は血液１ｍＬあたり１０単位となる。
【００４１】
健常人の血液８ｍＬを上記血液検査用容器に採取し、採取終了時点から血液が凝固するのに要する時間（血液凝固時間）を測定した。凝固の判定は、血液検査用容器を転倒しても血液が流れ出ない時点とした。
次いで凝固した血液を２５℃、１３００Ｇ（２５００ｒｐｍ）で５分間遠心分離し、分離された血清中のフィブリンの有無を目視観察した。以上の結果を表１に示した。
【００４２】
（実施例２）
平均粒径１μｍのポリスチレン微粒子の１０重量％蒸留水懸濁液５ｇに、トロンビン１００００単位を溶解した後、３７℃で穏やかに２４時間振とうしてトロンビンをポリスチレン微粒子の表面に物理吸着させた。次いでポリビニルピロリドン０．０２ｇを溶解した後、この懸濁液の０．０４ｇを、ガラス製の管状容器の内壁面に均一にスプレー塗布し、風乾して血液検査用容器を作製した。
この容器に血液を８ｍＬ採取したときのトロンビンの量は血液１ｍＬあたり１０単位となる。この血液検査用容器を用いて、実施例１と同様にして血液凝固時間の測定とフィブリンの有無の目視観察を行った。結果を表１に示した。
【００４３】
（実施例３）
平均粒径１μｍのポリスチレン微粒子の１０重量％蒸留水懸濁液５ｇに、トロンビン１００００単位を溶解した後、３７℃で穏やかに２４時間振とうしてトロンビンをポリスチレン微粒子の表面に物理吸着させた。次いでポリビニルピロリドン０．０２ｇ及びシリコンオイル０．０２ｇを溶解した後、この懸濁液の０．０４ｇを、ポリエチレンテレフタレート製の管状容器の内壁面に均一にスプレー塗布し、風乾して血液検査用容器を作製した。
この容器に血液を８ｍＬ採取したときのトロンビンの量は血液１ｍＬあたり１０単位となる。この血液検査用容器を用いて、実施例１と同様にして血液凝固時間の測定とフィブリンの有無の目視観察を行った。結果を表１に示した。
【００４４】
（実施例４）
シリコンオイルの０．４重量％の水溶液０．０４ｇを、ポリエチレンテレフタレート製の管状容器の内壁面に均一にスプレー塗布し、風乾したものを管状容器としたこと以外は実施例２と同様にして血液検査用容器を作製した。
この容器に血液を８ｍＬ採取したときのトロンビンの量は血液１ｍＬあたり１０単位となる。この血液検査用容器を用いて、実施例１と同様にして血液凝固時間の測定とフィブリンの有無の目視観察を行った。結果を表１に示した。
【００４５】
（実施例５）
平均粒径１μｍのポリスチレン微粒子の１０重量％蒸留水懸濁液１０ｇを用いたこと以外は実施例１と同様にして血液検査用容器を作製した。
この容器に血液を８ｍＬ採取したときのトロンビンの量は血液１ｍＬあたり５単位となる。この血液検査用容器を用いて、実施例１と同様にして血液凝固時間の測定とフィブリンの有無の目視観察を行った。結果を表１に示した。
【００４６】
（実施例６）
平均粒径１μｍのポリスチレン微粒子の１０重量％蒸留水懸濁液１ｇを用いたこと以外は実施例１と同様にして血液検査用容器を作製した。
この容器に血液を８ｍＬ採取したときのトロンビンの量は血液１ｍＬあたり５０単位となる。この血液検査用容器を用いて、実施例１と同様にして血液凝固時間の測定とフィブリンの有無の目視観察を行った。結果を表１に示した。
【００４７】
（実施例７）
平均粒径１０μｍのポリスチレン微粒子を用いたこと以外は実施例３と同様にして血液検査用容器を作製した。
この容器に血液を８ｍＬ採取したときのトロンビンの量は血液１ｍＬあたり１０単位となる。この血液検査用容器を用いて、実施例１と同様にして血液凝固時間の測定とフィブリンの有無の目視観察を行った。結果を表１に示した。
【００４８】
（実施例８）
平均粒径４０μｍのポリスチレン微粒子を用いたこと以外は実施例３と同様にして血液検査用容器を作製した。
この容器に血液を８ｍＬ採取したときのトロンビンの量は血液１ｍＬあたり１０単位となる。この血液検査用容器を用いて、実施例１と同様にして血液凝固時間の測定とフィブリンの有無の目視観察を行った。結果を表１に示した。
【００４９】
（比較例１）
蒸留水５ｇに、トロンビン１００００単位を溶解した液の０．０４ｇを、直径１６ｍｍ、厚み５０μｍのポリエチレンテレフタレート製のフィルムの片面に均一に塗布し、風乾したものを、ガラス製の管状容器の内部中央部に係止させて血液検査用容器を作製した。
この容器に血液を８ｍＬ採取したときのトロンビンの量は血液１ｍＬあたり１０単位となる。この血液検査用容器を用いて、実施例１と同様にして血液凝固時間の測定とフィブリンの有無の目視観察を行った。結果を表１に示した。
【００５０】
（比較例２）
比較例１と同様にして血液検査用容器を作製した。
健常人の血液８ｍＬを上記血液検査用容器に採取し、採取終了時点から５分後に血液を２５℃、１３００Ｇ（２５００ｒｐｍ）で５分間遠心分離し、分離された血清中のフィブリンの有無を目視観察した。結果を表１に示した。
【００５１】
（比較例３）
蒸留水５ｇに、トロンビン１００００単位を溶解した後、ポリビニルピロリドン０．０２ｇ及びシリコンオイル０．０２ｇを溶解した後、この懸濁液の０．０４ｇを、ポリエチレンテレフタレート製の管状容器の内壁面に均一にスプレー塗布し、風乾して血液検査用容器を作製した。
この容器に血液を８ｍＬ採取したときのトロンビンの量は血液１ｍＬあたり１０単位となる。この血液検査用容器を用いて、実施例１と同様にして血液凝固時間の測定とフィブリンの有無の目視観察を行った。結果を表１に示した。
【００５２】
（比較例４）
比較例３と同様にして血液検査用容器を作製した。
健常人の血液８ｍＬを上記血液検査用容器に採取し、採取終了時点から５分後に血液を２５℃、１３００Ｇ（２５００ｒｐｍ）で５分間遠心分離し、分離された血清中のフィブリンの有無を目視観察した。結果を表１に示した。
【００５３】
【表１】
0003851442.tif 000002
【００５４】
実施例１〜８の血液検査用容器においては、比較例１、３の血液検査用容器に比較し血液凝固時間がはるかに短い。すなわち、本発明の血液凝固促進剤が管状容器の内壁面に存在せしめられている血液検査用容器は、トロンビンがプラスチックフィルムに塗布されて容器内に収容されている血液検査用容器、又はトロンビンが水溶性バインダー及び血餅付着防止成分とともに容器内壁面に存在せしめられている血液検査用容器に比較し血液凝固時間がはるかに短い。
【００５５】
【発明の効果】
本発明１の血液凝固促進剤は、上述の通りであり、微粒子の表面に特定の加水分解酵素が担持されているので、これを管状容器の内壁面に存在せしめて血液検査用容器とし、該容器に血液を採取すると、上記血液凝固促進剤が速やかに血液中に分散され、その分散した各微粒子に担持された酵素部分から血液凝固が起こるので、血液を短時間のうちに凝固させることができる。さらに、凝固状態が安定に保たれ、血清と血餅の分離が容易となるため、分離採取された血清中にフィブリンや血餅成分が混在することもない。また、血餅成分の収縮度合いも十分であるため、血清の収率も高くなる。
【００５６】
本発明２の血液検査用容器は、上述の通りであり、本発明１の血液凝固促進剤が、有底の管状容器の内壁面に存在せしめられていることにより、該容器に血液を採取すると、上記血液凝固促進剤が速やかに血液中に分散され、その分散した各微粒子に担持された酵素部分から血液凝固が起こるので、血液が短時間のうちに凝固する。さらに、凝固状態が安定に保たれ、血清と血餅の分離が容易となるため、分離採取された血清中にフィブリンや血餅成分が混在することもない。また、血餅成分の収縮度合いも十分であるため、血清収率も高くなる。
【００５７】
本発明３の血液検査用容器は、上述の通りであり、本発明１の血液凝固促進剤が、有底の管状容器の内壁面に水溶性バインダーとともに存在せしめられているので、血液凝固促進剤が管状容器の内壁面に安定的に存在されている。従って、血液検査用容器の保存中や運搬中に血液凝固促進剤が内壁面から剥離する恐れが少なくなり、上記本発明２と同様の効果がより確実に奏される。
【００５８】
本発明４の血液検査用容器は、上述の通りであり、本発明３と同様の効果の全てが奏されるとともに、更に、血餅付着防止成分が管状容器の内壁面に存在することにより、血液が凝固した後の血餅成分が管状容器の内壁面に付着することが防止され、遠心分離時に血餅の移動が制限されることがなく血餅と血清とが良好に分離される。
【００５９】
本発明５の血液検査用容器は、上述の通りであり、本発明３と同様の効果の全てが奏されるとともに、更に、あらかじめ血餅付着防止成分が管状容器の内壁面に存在せしめられているので、血液が凝固した後の血餅成分が管状容器の内壁面に付着することが確実に防止され、遠心分離時に血餅の移動が制限されることがなく血餅と血清とが良好に分離される。