(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ターゲットポリ核酸配列を同定する方法であって、
(a)前記ターゲットポリ核酸配列が正常配列を有する場合には第１のプローブおよび第２のプローブが前記ターゲットポリ核酸配列に完全に相補的であり、前記ターゲットポリ核酸配列が変異配列を有する場合には第１のプローブまたは第２のプローブが前記ターゲットポリ核酸配列に対してミスマッチを有するように、分離性部分に結合させた第１のプローブと、ラベルに結合させた第２のプローブとを用意し、
(b)前記第１のプローブおよび前記第２のプローブが前記ターゲットポリ核酸配列にハイブリダイズするような条件下で、前記第１のプローブおよび前記第２のプローブと前記ターゲットポリ核酸配列とを混合して第１の反応混合物を形成し、
(c)前記第１のプローブおよび前記第２のプローブが前記ターゲットポリ核酸配列にマッチングしている場合に前記第１のプローブと前記第２のプローブが連結されるような条件下で、ライゲーション用試薬を添加して第２の反応混合物を形成し、
(d)前記第１のプローブの前記分離性部分を利用して反応混合物から前記第１のプローブを分離し、さらに
(e)分離後の第１のプローブを分析して、前記第２のプローブのラベルが結合されているか否かを決定する工程、を含み、必要に応じて、前記工程(c)と(d)の順序は逆であってよく、あるいは前記工程(c)を前記工程(b)と同時に行ってよく、
前記ライゲーション工程(c)において、前記第２の反応混合物中に２００から１０００ｍＭの塩化ナトリウムが含まれるか、あるいは１００ｍＭから２００ｍＭの塩化カリウムが含まれ、
ライゲーションが起こらないことが見出される場合には、前記ターゲットポリ核酸配列に変異が生じていると特定されることを特徴とする方法。
【請求項２】
前記工程(c)の後に変性工程を含み、前記第２の反応混合物を変性させることによって、前記第１のプローブおよび前記第２のプローブを前記ターゲットポリ核酸配列から分離させることを特徴とする請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項３】
前記分離性部分が不溶性粒子であることを特徴とする請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項４】
前記分離性部分が磁性粒子であることを特徴とする請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項５】
前記ラベルが、酵素由来物質、放射性物質、蛍光性物質、発光性物質、および検出可能な物質に結合できる物質より成る群より選択されることを特徴とする請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項６】
前記検出可能な物質に結合できる物質が、アビジンまたはビオチンであることを特徴とする請求の範囲第５項記載の方法。
【請求項７】
前記ラベルが発光性物質であることを特徴とする請求の範囲第５項記載の方法。
【請求項８】
前記ラベルがアクリジニウムエステルであることを特徴とする請求の範囲第７項記載の方法。
【請求項９】
前記ラベルがアクリジニウムエステルであり、前記工程(e)が、ＤＮＡａｓｅを添加し、さらにその後フラッシュ剤を添加することを含むことを特徴とする請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項１０】
前記ターゲットポリ核酸配列が、ＤＮＡまたはそのポリマー、ＲＮＡまたはそのポリマー、およびウィルス性物質から成る群より選択されることを特徴とする請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項１１】
前記工程(b)の前に、前記ターゲットポリ核酸を増幅する工程をさらに含むことを特徴とする請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項１２】
増幅法が、ポリメラーゼ連鎖反応、リガーゼ連鎖反応およびＱβレプリカーゼを利用する方法から成る群より選択されることを特徴とする請求の範囲第１１項記載の方法。
【請求項１３】
前記ライゲーション用試薬が、酵素的または化学的に作用して２種類のプローブを連結することを特徴とする請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項１４】
前記ライゲーション用試薬がリガーゼであることを特徴とする請求の範囲第１３項記載の方法。
【請求項１５】
前記第２の反応混合物中の塩化ナトリウムの濃度が５００〜７００ｍＭであることを特徴とする請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項１６】
前記第２の反応混合物中の塩化ナトリウムの濃度が約６００ｍＭであることを特徴とする請求の範囲第１５項記載の方法。
【請求項１７】
変性後、サンプルをクロマトグラフィカラムに通し、次いで該カラムを分析して、該カラムにラベルが結合されているか否かを決定することを特徴とする請求の範囲第２項記載の方法
【請求項１８】
前記プローブの一方はミディバリアント(midi variant)配列の第１のサブニットに結合しかつ他方のプローブはミディバリアント配列の第２のサブユニットに結合しており、分離された第１のプローブを分析して、該第１のプローブが、Ｑβレプリカーゼを含有する反応混合物中に導入された場合に複製能力を有するか否かを決定することを特徴とする請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項１９】
プローブと一緒にＱβレプリカーゼを添加し、プローブが複製されたか否かを測定することにより分析を行うことを特徴とする請求の範囲第１８項記載の方法。
【請求項２０】
前記ラベルが、ハイブリダイゼーションおよびライゲーションを妨害しないような位置に配置されることを特徴とする請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項２１】
変性の前に、反応液のアリコートを取り出し、該アリコートを分析して、以下の操作：
(i) 分離性部分を含有するプローブを分離し；さらに
(ii)分離後のプローブを分析して、それにラベルが結合されているか否かを決定する；により、ラベルがターゲットにハイブリダイズされたか否かを決定する工程を追有することを特徴とする請求の範囲第２項記載の方法。
【請求項２２】
前記分離性部分を含有するプローブの分離後、残存する上澄み液を分析して、該上澄み液中に含まれるラベルの存在を検出する工程を含むことを特徴とする請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項２３】
ライゲーション用試薬が、Ｔａｑ  ＤＮＡリガーゼまたはＴ４  ＤＮＡリガーゼから成る群より選択されることを特徴とする請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項２４】
Ｔａｑ  ＤＮＡリガーゼを含有する緩衝液が、ｔＲＮＡを追有することを特徴とする請求の範囲第２３項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
遺伝子プローブ技術は、遺伝病の発症を予測したり臨床的現状を診断するのに重要な分析手段となっている。しかしながら、現在用いられている技術は、遅くて面倒であり、また、有害な化学物質を使用するものである。遺伝子プローブの分野で採用されている幾つかの手法については、最近Plaha等が検討している（14 Biotechniques 566, 1993）。現在行われている遺伝子プローブ技術は、一般に、電気泳動法を使用するものであり、多くの場合、長いポリアクリルアミドゲル上で実施される。実験者が接触する化学物質の幾つかは有害なものと考えられる。すなわち、アクリルアミドモノマー（その幾分かはポリマーゲルに残存することがある）は神経毒があると考えられている。ポリアクリルアミドゲルによる電気泳動は一般に数時間を要し、他方、Plahaに記載されている新しいゲルを使用する分析では単一の泳動実験に１６時間を要する。その他の技術としては放射性マーカーを使用するので、特別の取扱い管理と廃棄技術が必要である。さらに、現行の方法は、その他の点においても比較的長時間の操作が必要となる。（例えば、サザンブロット法は終了するまで約４８時間を要する。）
さらに、電気泳動は、それ自身、不確定な結果をもたらす可能性がある。先ず、エチジウムブロミドを用いる技術はそれほど感度が高くない場合が多い。第二に、いろいろな遺伝子断片を確実に分離できる条件を見出さなければならない。第三に、得られる結果は、殆どの場合、定性的なものであり、定量的なものではない。さらに、サイズが同じか類似しているが配列が１塩基だけ異なっているようなＤＮＡフラグメントを区別することはできないことも、従来の手法の有用性に限界を与えている。
ＤＮＡをベースとする分析に固有の感度上の限界は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって克服し得る。ＰＣＲにより特定の配列を増幅することにより、極度に少量しか存在しない当該配列を検出することが可能となる（Saiki他、Science 1350, 1985）。このＰＣＲ法は、ＤＮＡ配列を増幅して、ＰＣＲが利用できるようになる前に存在していた感度上の限界を克服できるものではあるが、ＰＣＲの使用には依然として多くの問題が伴う。ＰＣＲ反応の生成物は、プライマー・ダイマーおよび非特異的プライミングにより人為構造を含んであり、特にサンプル中にターゲット配列が存在しない場合にこれが生じる。感度が鋭敏であるので、ＰＣＲは不純物による誤った陽性結果をもたらす可能性がある。ＰＣＲ法そのものは、遺伝病（例えば、嚢胞性線維症）に存在しているような点突然変異のような配列間の僅かの相違を簡単に識別できるものではない。これらの限界があるため、ＰＣＲによる増幅後に特定のターゲット配列が存在していることを確認できることが所望される。これまでの研究者は、各種のゲル上でのサンプルの分析に対する前駆手段としてハイブリダイゼーション（hybridization）法とライゲーション（ligation）法を用いてきた。（Landegren他、24 1 Science, 1077, 1988参照）。しかしながら、これらの方法は、遅くて不便であり、自動化装置に簡単に使用できるものではない。
ＤＮＡ配列分析用の現行の技術の欠点をなくし、より迅速でより正確な結果を与える新規な分析法がこのたび開発された。この新規な技術は、ＰＣＲと併用して、遺伝子プローブ分析における精度を向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
図１：デルタＦ−５０８対立遺伝子（アレル）および正常対立遺伝子の検出に用いたプローブ分析フォーマット。
図２：ＰＣＲにより増幅されたヒトＤＮＡの９つのサンプルにおけるデルタＦ−５０８対立遺伝子および正常対立遺伝子の同時分析に関するＨＬＭの結果。デルタＦ−５０８対立遺伝子に特異的なプローブはＤＭＡＥでラベルし、正常対立遺伝子に特異的なプローブはＬＥＡＥでラベルした。
図３：デルタＦ−５０８およびデルタＩ−５０７変異部位近傍におけるＣＦＴＲ遺伝子のエクソン１０の配列の一部。下線を施した配列は、常磁性粒子上に固定化したプローブ（ＰＭＰ．５０８またはＰＭＰ．５０７）およびアクリジニウムエステルでラベルしたプローブ（５０８．ＮＯＲまたは５０７．ＮＯＲ）に相補的である。
図４：デルタＦ−５０８分析およびＩ−５０７分析用プローブと各種対立遺伝子との間で作成したハイブリッド。
図５：ＰＣＲにより増幅されたヒトＤＮＡの９つのサンプルにおけるデルタＩ−５０７変異の検出に関するＨＬＭ結果。
図６：ＣＲにより増幅されたヒトＤＮＡの３つのサンプルについて行った、正常、デルタＦ−５０８およびデルタＩ−５０７対立遺伝子の存在に関するＨＬＭ分析。
図７：同時ハイブリダイゼーション−ライゲーションプロトコールに従いＴａｑＤＮＡリガーゼを用いて、ＰＣＲ増幅ヒトＤＮＡの３つのサンプルについて行った、正常、デルタＦ−５０８およびデルタＩ−５０７対立遺伝子の存在に関するＨＬＭ分析。
図８：Ｇ５４２Ｘ対立遺伝子と正常対立遺伝子のＨＬＭによる識別。
図９：ＨＬＭによるデルタＦ−５０８変異とＧ５４２Ｘ変異の同時検出。
図１０：32Ｐ−Ｇ５５１Ｄ．ＮＯＲまたは32Ｐ−Ｇ５５１Ｄ．ＣＦを用い２００ｍＭ  ＮａＣｌでＴ４  ＤＮＡリガーゼを使用したＨＬＭによる正常配列、Ｇ５５１Ｄ配列、Ｇ５５１Ｓ配列およびＱ５５２Ｘ配列の識別。
図１１：32Ｐ−Ｇ５５１Ｄ．ＮＯＲおよび32Ｐ−Ｇ５５１Ｄ．ＣＦを用い６００ｍＭ  ＮａＣｌでＴ４  ＤＮＡリガーゼを使用したＨＬＭ。
図１２：32Ｐ−Ｇ５５１Ｄ．ＣＦまたは32Ｐ−Ｇ５５１Ｄ．ＮＯＲを用い２００ｍＭ  ＫＣｌでＴａｑ  ＤＮＡリガーゼを使用した正常、Ｇ５５１Ｄ、Ｇ５５１Ｓ、およびＱ５５２Ｘ配列の識別。
図１３：Ｔａｑ  ＤＮＡリガーゼを使用し塩の条件を変化させた場合におけるＧ５５１Ｄの分析の比較。
図１４：ライゲーション特異性を系統的に検討するためのｐ５３モデル。上の配列は、ターゲットの配列（ｐ５３遺伝子のコドン１７５の両側にある領域）である。プローブの配列は下に示す。“Ｘ”および“Ｙ”としるした位置を系統的に変化させ４種類のヌクレオチドとした。
図１５：ＰＣＲ増幅サンプルのデルタＦ−５０８分析について計算したライゲーション百分率。
図１６：ＰＣＲ増幅ヒトＤＮＡの遺伝子型に関してＨＬＭから計算したライゲーション百分率の相関関係。誤差バーは９９％信頼区間を表す。
図１７：デルタＦ−５０８プローブを用いＴ４  ＤＮＡリガーゼによるデルタＦ−５０８配列とデルタＩ−５０７配列との識別能をＮａＣｌ濃度の関数として示したもの。
図１８：Ｔ４  ＤＮＡリガーゼおよびＴａｑ  ＤＮＡリガーゼを用いる５′（２）および３′（２）ミスマッチの識別能をライゲーション百分率として示したもの。
図１９：いろいろな塩基対について３′（１）ミスマッチの識別能をライゲーション百分率として示す。Ｔ４  ＤＮＡリガーゼの濃度が２つの異なる場合について（１ｎＭおよび２４０ｎＭ）、データを示している。
図２０：いろいろな塩基対について５′（１）ミスマッチの識別能をライゲーション百分率として示す。Ｔ４  ＤＮＡリガーゼの濃度が２つの異なる場合について（１ｎＭおよび２４０ｎＭ）、データを示す。
発明の詳細な説明
この新規な技術は遺伝子プローブ分析用に開発されたものである。ＤＮＡ分析のこの最初の段階は、一般に、目的の配列を増幅するための増幅技術（例えば、ＰＣＲ）を含む。当然のことであるが、分析サンプル中に充分量の未知配列が存在している場合には、増幅が必要でないこともある。増幅工程の後、ハイブリダイゼーション−ライゲーション法（ＨＬＭ：hybridization ligation method）を用いて増幅生成物の同定を行う。遺伝子配列の同定を助けるために容易に分離できる粒子（例えば、磁性粒子）を、識別性（標識となる）部分（例えば、アクリジニウムエステルのような発光性マーカー）とともに使用する。
同定すべき配列の量が充分でない場合には、当該技術の最初の部分において目的の配列を増幅するための増幅法が含まれる。ＰＣＲ法はここ数年来知られている。例えば、Saikiらは、β−グロブリンのゲノム配列に対する酵素的増幅技術について記述しており、該技術では、増幅すべき領域の両側に２種類のオリゴヌクレオチドプライマーを設け、変性されたゲノムＤＮＡの鎖にこのプライマーをアニーリングし、そして、大腸菌またはThermus acquaticus由来のＤＮＡポリメラーゼおよびデオキシリボヌクレオチド三リン酸を用いて伸長させ、この変性、アニーリングおよび伸長から成るサイクルを繰り返している（Saiki他，230 Science 1350, 1985；Saiki他，239 Science 487, 1988）。最近、各種の増幅技術が開発されており［例えば、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）やＱβレプリカーゼ］、これらの増幅技術のいずれかを、ＰＣＲの代わりに、または、その他の増幅技術の１種またはそれ以上と組合せて用いることもできる。さらに、これ以外の増幅技術が開発されることも期待される。増幅に用いる厳密な技術は本発明にとって重要ではなく、遺伝子プローブ法における当業者であればここで用いる技術全般およびそれぞれの技術の利害得失について熟知しているものと推察される。重要な事実は、比較的少量のＤＮＡサンプルが増幅されることにより、ここで用いる分析法の感度が通常よりも高くなるということである。
ＰＣＲ法は一般に上述したような手法を含んでいる。この基本的技術に対して当業者に知られているような多くの変形があり、例えば、「ＰＣＲプロトコール（ＰＣＲ  Protocols）」［Innis(MA),Gelfand(DH),Sninsky(JJ),およびWhite(TJ)編集、Academic Press社発行，1990］に記載されている。ＰＣＲ反応がどのように実施されるかの１つの例は、本明細書の実施例において詳述している。
増幅サンプルが入手できれば、該材料はＨＬＭによって分析される。ＨＬＭにおいては、ターゲット配列に部分的または全面的に相補的な配列が、２種類またはそれ以上のプローブに導入され、該プローブがターゲットオリゴヌクレオチドと反応させられる。本明細書では多くの場合、２種類のプローブのみを用いる場合について検討するが、後述するように２以上のプローブを用いることもできる。該相補的配列の一部分は、反応混合物から容易に分離することのできる不溶性の物質（材料）に結合される。例えば、磁性粒子が用いられる。他の可能な物質としては、遠心操作により反応混合物から分離されることのできる物質が挙げられる。一方、該相補的配列の第二の部分は、分析手段により検出されることのできる物質（材料）に結合される。例えば、アクリジニウムエステルのような化学発光性物質が用いられる。他の例は、蛍光団や発色団である。これら２種類の相補的配列がターゲット配列にハイブリダイズされる。ハイブリダイゼーション溶液は塩を含有するが、これは、一般的には約５００〜７００ｍＭのＮａＣｌであり、約６００ｍＭの濃度が最も好ましい。ハイブリダイゼーションは温度を上昇させて（例えば、４５℃）実施される。ハイブリダイゼーションの後、プローブのうちの１つの不溶性を利用して、ラベルを有する非ハイブリダイズ化プローブからハイブリダイズされたものを分離する。その後、リガーゼを用いて、それらのプローブの２つの相補的配列が、該２つのプローブの結合部に隣接した領域において、ターゲットに正確にマッチング（適合）していれば、それらの端部核酸は互いに充分に近くにありリガーゼにより連結される。他方、ターゲット配列が予測された配列とかなり違っていれば、それらのプローブ上の端部核酸は互いに充分に離れており、その結果、リガーゼによって結合されることはできない。例えば、もしターゲットが、２種類のプローブが出会う場所においてヌクレオチド欠失していれば、一方のプローブ上の端部ヌクレオチドは他のプローブとオーバーラップし２種類のプローブはライゲーション（連結）されない。同様に、ターゲットに挿入ヌクレオチドがあれば、２種類のプローブは互いに充分に近接せずライゲーションが生じない。さらに、２種類のプローブが出会う位置でミスマッチが存在すれば、本明細書で説明するような条件下で２種類のプローブは効率的にライゲーションされない。
プローブ類の端部塩基がターゲットに結合したり結合し損なったりすることに応じてライゲーションは上述したように進行するが、当業者であれば、そのような端部から離れた位置においてプローブ上にミスマッチがあることもターゲットへのプローブの結合に何らかの影響を与えることに気がつくことであろう。例えば、端部塩基から数塩基離れた位置にあるプローブ上の塩基がターゲット上の対応する塩基に結合できない場合に、プローブとターゲットとの間に、端部プローブをライゲーションさせないような充分な不整合が生じないこともある。プローブとターゲット間の立体的な因子や全体的な結合性が、ターゲットの組成を決定するのに際して本手法の全体的な有効性に影響を与えるのである。これに対して、プローブの連結部から離れた不整合は、２種類のプローブがライゲーションされないような大きな影響を与え得る。後述の実施例は、プローブの連結部から２塩基分離れた部位における不整合が、プローブのライゲーションを充分に妨げる場合を示す。
同様にして、正常配列の一部にハイブリダイズしライゲーションすると期待できるような幾組かのプローブを用いることにより、ターゲットが変異（突然変異：mutation）を含有するか否かを決定することができる。ハイブリダイゼーションまたはライゲーションが起こらないことが見いだされたならば、調べているターゲット部分におそらく変異が生じているものと結論することができる。ターゲットの隣の部分に移動することにより、同様の実験を行うことができる。このようにして、ターゲットに沿って逐次的に移動することにより、変異が見いだされるターゲット上の単一または複数の部位を決定することができ、また、さらに進んで、各変異部位において発生した正確な変異を同定できる実験を設計することができる。
ライゲーションは、反応の特異性を確保できる条件下において実施される（後述の実施例参照）。入手できる多くのライゲーション用試薬の中の１つを用いてライゲーションは行われ、そのようなライゲーション試薬は、一般的に化学的または酵素的作用によりライゲーションを達成する。本発明において用いる条件と従来技術との間の重要な相違の一つは、かなり高い塩濃度によりライゲーション特異性を確保できることを見出したことである。従来より用いられた塩濃度（２００ｍＭ  ＮａＣｌ）では、ミスマッチのあるプローブのライゲーションを起こしてしまうことが見出されていた。本発明においては、高い塩濃度を用いることにより、予測されないような特異性の向上が見られた。例えば、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いてきわめて特異性の高いライゲーションを得るためには、塩濃度は、典型的には約５００から７００ｍＭ  ＮａＣｌであり、約６００ｍＭの濃度が好ましく、また、約１０００ｍＭまでの濃度が使用可能である。
ライゲーション工程を各種に変更して実施することも可能である。例えば、多くの異なるライゲーション用試薬を用いることもでき、実施例ではＴ４ＤＮＡリガーゼとＴａｑ  ＤＮＡリガーゼを使用する場合を示している。さらに、Ｔａｑリガーゼ緩衝液に、反応の感度を増加させるような他の成分を含有させることが好ましいこともある。例えば、ｔＲＮＡを含有させると、ラベル化プローブの非特異的結合によって起こされるバックグランドシグナルが減少されることが見出された。
ライゲーション工程を実施した後、変性工程により、ターゲット配列をプローブの配列から分離し、また、ライゲーション生成物を非ライゲーションプローブから分離する。次いで、遠心分離、磁場の付与またはその他の適当な手法により、不溶性物質に結合されていた物質を反応混合物から分離することができ、そして、リガーゼの作用により不溶性物質に結合したラベル（標識物）の存在を知ることができる。ここで開示した構成成分を用いれば、クロマトグラフィや電気泳動以外の手法を用いてターゲット物質の分離を行うことができる。かくして電気泳動またはクロマトグラフィが用いられていた場合よりも迅速に本方法を実行できる。更に、この検出技術は、放射活性、蛍光または発光を測定するなどにより定量性において優れている。後にラベル（標識体）を添加することのできる一般的に利用できるその他の検出法を用いてもよい。例えば、プローブにビオチンを化学的に結合させることもでき、そして、プローブの分離後、アビジンまたはストレプトアビジンに結合しているラベルをそれと反応させることにより、検出可能なラベルに結合されたプローブを構成することができる。第三に本発明の技術は、自動化装置の幾つかに利用することもでき、そのような装置の例としては、Ciba Corning Diagnostics社（米国マサチューセッツ州、Medfield）によって製造されているＡＣＳ１８０装置がある。
ターゲットの配列に関する知見を得るのに本技術を変形して使用することもできる。変性後に不溶性のプローブにラベルが結合していないことが見出された場合には、未だ変性を行っていない反応混合物からの別のアリコートを分析してもよい。このサンプルでは、不溶性マーカーを分離し（例えば、磁場を付加したり遠心分離を行う等による）、ターゲットを分析してマーカープローブがターゲットに結合しているか否かを決定することができる。このような場合には、ターゲットに対する２種類のプローブがハイブリダイゼーションしていることによりターゲットポリヌクレオチドの大部分の配列を予知することができ、そして、更なる実験を工夫することによりターゲットの当該領域（例えば、ライゲーション点近傍）における配列を確認することができる。
別の方法として、ライゲーション後にサンプルを変性させ、次いで固相を分離することにより同様の分析を行うこともできる。この手法では、分離した固相と上澄液（上清）の両方を分析してラベル化されたプローブが存在しているか否かを決定する。ラベルの大部分が上澄液のみに見出される場合には、プローブのライゲーションは生じなかったと結論することができ、予定していたライゲーション点におけるミスマッチ（不適合）を示唆している。しかしながら、ラベル化プローブはターゲットに結合性となっていたので、結論づけられることは、ターゲットは所期の配列もしくは所期に近い配列を有していたということ、またはラベル化されたプローブはターゲットにハイブリダイズしていなかったということである。したがって、ライゲーションが起こらなかったとしても、ターゲットの配列に関する多くの推測が可能となる。さらに、上澄液中および固相上のラベルの総量は、分析サンプル中のターゲットの合計量に近似しているはずである。ライゲーションを受けたラベル化プローブのパーセントは、サンプルの同型（ホモ）接合性または異型（ヘテロ）接合性を示唆することになる。さらに、固相上のラベルの溶液中のラベルに対する比率から、プローブ上の配列に関する更なる知見、例えば、遺伝子物質の一部が複製されている（例えば、fragile X）ような病気の存在に関する知見を得ることができる。これらの分析を実施するに当たっては、データは理論的に予測される値に正確に一致するものではないことに留意すべきである（すなわち、ホモ接合性サンプルについて固相中に１００％のラベルは見出されない）。（後の実施例参照。）
かくして、特定の部位に変異が生じる可能性があることがわかれば、特異的なプローブを作成してターゲットの配列を確認することができる。１つの部位に数種の変異の可能性がある場合には、数種のプローブを設計して各プローブに異なるラベルを施し、正常な配列であるか、または、変異配列であればどの変異が生じたかを決定することもできる。同様にして、１つのターゲット配列内の互いに近傍付近に生じている複数の変異を判断することもできる。さらに、このように２種またはそれ以上の異なるラベルが付与されたプローブを用いる手法は、上述のfragile Xのように多重型のターゲットが予想される場合にも適用することができる。
同一の分析内で用いる２種の異なるラベルとしては、例えば、蛍光性ドナーと蛍光性アクセプターの対が挙げられる。この場合、照射光を変化させることにより、２種のラベルを用いて３つの可能性を区別することもできる。もし第１のプローブに対する照射光が第１のラベルに典型的な蛍光を生じれば、第１のターゲットのみが存在していることを示すことになる。もし蛍光出力が第２のラベル由来のものであれば、２つのターゲットのいずれかが存在していることになる。もし第１のラベルを励起する照射光が第２のラベル由来の蛍光を生じれば、双方のターゲットが存在していることを示す。他方、第２のラベルを励起する照射光のみが第２のラベル由来の蛍光を生じれば、第２のターゲットのみが存在していることになる。
例えば、嚢胞性線維症の変形には１つの近傍域に多重変異が見出されている。例えば、デルタＦ−５０８およびデルタＩ−５０７変異は、いずれも３塩基対が欠失したものであり、これらの変異の位置は、ＣＦＴＲ遺伝子配列内で部分的にオーバラップ（重複）している。［ＣＦＴＲ遺伝子の配列については、Zielenski他による（10 Genomics 214, 1991）を参照されたい。］
この配列をカバーするＰＣＲ増幅生成物をポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析しても、これらの２つの変異を簡単に分離することはできないと考えられ、それは生成物が同じ大きさを有しているからである。しかしながら、ＨＬＭによればこれらの変異は区別される。また、ＣＦＴＲ遺伝子のエクソン１１は、塩基１７５６におけるＧ５４２Ｘ変異（配列番号  １１参照）や塩基１７８４におけるＧ５５１Ｄ変異（配列番号  １６参照）を含む多くのＣＦ変異部位を含有している。これらの変異部分をカバーする配列に単一のＰＣＲ増幅を行った後、ＨＬＭにより双方の変異の存在または不存在を簡単に確認することができる。
ＨＬＭ法とリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）との間には幾つかの類似点もあるが、実際にはこれらの技術には大きな違いがあることに留意すべきである。ＬＣＲ自体は、すでに知られた増幅法である。例えば、WuおよびWallaceによる“4 Genomics 560, 1989,”さらにはBaranyによる“88 Proc. Nafl. Acad. Sci. USA 189, 1991”を参照されたい。ＬＣＲにおいては、増幅しようとするターゲット遺伝子の１断片の各鎖に相補的な２つの部分をもつオリゴヌクレオチド（２つの部分が一緒になってターゲット遺伝子全体に相応する）をリガーゼとともに、増幅すべき遺伝子サンプルに添加する。添加してオリゴヌクレオチドがターゲット遺伝子に相補的であれば、リガーゼが２つのオリゴヌクレオチドを連結する。ＬＣＲは増幅法の１つであり、この手法においては、増幅すべき配列が分かっており、ターゲットに相補的なフラグメントを反応混合物に添加することが可能であり、この結果、リガーゼが添加されたときに、ライゲーションが起こりターゲットが増幅される。ＬＣＲは数サイクル繰り返すよう意図されたものであり、これにより、所望の配列を大量に得ることができる。
これに対して、ＨＬＭは分析のための手法であり、ターゲットに見出される可能性のある１種以上の予測配列に対するプローブがターゲットに添加される。プローブは、反応混合物からの分離を助ける物質、またはラベルに結合される。さらに、反応は単一回のみ実施するよう意図されている。
ＨＬＭ法には多くの変形が可能である。例えば、この検出法をカラムクロマトグラフィーと組み合わせることもできる。この手法では、オリゴヌクレオチドプローブの１つは、カラムクロマトグラフへの付着を引き起こすような置換基を含有する。例えば、プローブの１つをビオチン化すれば、ライゲーション後の生成物がアビジン−セファロース上に分離される。他のオリゴヌクレオチドとして蛍光性マーカーを含有するようにしてもよい。このようにすれば、カラムクロマトグラフ中をサンプルが通過すると、ライゲーションされたオリゴヌクレオチドはクロマトグラフに付着して蛍光性となる。したがって、カラム内で蛍光があれば、ライゲーションが起こったことを示すことになる。カラムクロマト法に上述した蛍光性ドナー／アクセプター対を使用することもできる。
他の変形においては、プローブが結合される部分（moiety）が関係する。第１のプローブがライゲーション後のプローブの分離を可能にする部分（分離性部分）に結合され、第２のプローブがラベルとなる部分に結合されるのが殆どの場合であるが、２種類のプローブを他の部分、例えば他の配列に結合させることも可能である。例えば、Ｑβレプリカーゼ法を採用している場合には、ミディバリアント（midivariant）配列を有する２成分にプローブを結合させることもできる。この場合には、該ミディバリアント配列の第１の部分（例えば、ミディバリアントＡ）に第１のプローブを結合させ、ミディバリアントの第２の部分（ミディバリアントＢ）に第２のプローブを結合させる。ライゲーション工程後、Ｑβレプリカーゼによる反応中に複製が観察されれば、２種類のプローブがライゲーション（連結）されたことになる。それらのプローブがライゲーションされたということは、該プローブはターゲットとして同じ配列を有するということである。
本発明の方法の別の変形は、アクリジニウムエステルのような特定の発光性（ルミネセンス）ラベルを使用するときのフラッシュ剤（発光剤）を添加するタイミングに関係する。ライゲーションした後のプローブを変性し分離した後、フラッシュ剤を添加する前にDNAaseを添加することができる。このようにすれば、フラッシュ剤が添加されたときに発せられる光量を不溶性プローブが干渉することもあるので、高感度のテストが可能となる。したがって、フラッシュ剤の添加前に不溶性プローブを分離することにより、特異性のより高いシグナルを発生させることができる。
さらに別の変形は、使用するプローブの数に関係する。好ましい手法は、２種類のプローブ、すなわち、分離を促進するプローブと検出を促進するプローブを使用することであるが、２種類以上のプローブを使用することもできる。この場合には、プローブの１つが分離性部分（moiety）を含有し、別の１つが検出用部分を含有する。分離性部分が一方の末端プローブ上にありラベル（検出用）部分が他方の末端プローブ上にある場合には、その間のプローブがラベルを含有する必要はなくなる。この実験においては、ライゲーション後、ラベル用プローブが分離性プローブに結合されれば、その中間のプローブもターゲットにハイブリダイズされることになる。その理由は、もしそうでなければ、ラベル用プローブは分離性プローブを含むプローブ部分にライゲーションされないからである。多数プローブ実験の他の変形においては、１つのプローブが分離性部分を含有しその他のプローブは全てラベル化されているようにする。この場合には、ライゲーション後、分離性部分に結合したラベルの量が、全てのプローブがライゲーションされたか否かを示すことになる。２種類よりも多くのプローブを用い、前述したような変形態様（例えば、ライゲーションを実施したりまたは実施しない分析、変性前の分析など）と組み合わせることにより、いろいろな形態の分析が可能となることはこの分野の当業者には明らかであろう。
さらに、分離性部分または検出用部分の位置を変えることもできる。それらはプローブの末端部にあるのが好ましいが、ハイブリダイゼーションおよびライゲーションを妨げない限り、プローブの任意の位置に結合させることもできる。
本発明に従う新規な手法のさらに別の利点は、互いに密接な関係にある２つの変異（例えば、隣接したヌクレオチドにおいて起こる変異）を区別することができるようになったことである。
本発明の他の利点は、同一の実験において異なるプローブに異なるマーカーを用いることができることである。かくして、例えば、各プローブに別異のマーカーを使用し、考えられる２つの変異のうちの１つを１回の試験で確認することができる。マーカーは両者ともサンプルから分離することができ、例えば、異なる吸収スペクトルを介して両者を区別することができる。さらに、異なる不溶性粒子を使用することにより、分析前に２種類のプローブを互いに分離することができる。例えば、一方のプローブは不溶性で非磁性の粒子に依るようにし、他方のプローブに不溶性で磁性の粒子を使用すれば、先ず磁場を付与して磁性粒子とそれに結合されたマーカーを取り除くことができ、そして、残存液を遠心分離すれば、非磁性の不溶性粒子をそれに結合されたマーカーとともに除去することができる。このような分離法のその他の変形は当業者には明らかであろう。かくして、このような２種類のマーカーは、同じラベルを有する場合であっても互いに区別することができる。分離と検出の両方に利用できる手法の変形を１つの実験において組み合わせることにより、数種の変異や遺伝子変異の１つが存在することを１つの実験で確認することが可能となる。例えば、磁性粒子（Ｍ）を幾つかのプローブに使用し、非磁性粒子（ＮＭ）をその他のプローブに使用する；そして、プローブ中の第２のオリゴヌクレオチドの幾つかに化学発光性物質Ａを使用するとともに、残りに化学発光性物質Ｂを使用する。このようにすれば、わずかにこのような２つのパラメータを変化させることにより、１つの実験で４つの変異を検出することができる。（すなわち、この場合、プローブに対する付加物は、Ｍ−Ａ，ＮＭ−Ａ，Ｍ−Ｂ，ＮＭ−Ｂとなっている。）異なるマーカーを有し互いに分離されることのできる粒子（すなわち、異なるスペクトル特性またはその他の特性を有するもの）を用いることにより、１つの実験で多くの遺伝子変異を検出することも可能となる。
本発明の新規な手法の別の利点は、この手法は従来の手法よりも高感度であるということである。このように感度が増加したのは幾つかの因子による。例えば、ターゲット物質の存在を確認する分析法が高感度である。不溶性粒子を分離しそれに結合したマーカーを分析するという手法は、各構成成分を分離しなければならず、ターゲットの存在を定性および定量分析するのに染色に依存するという電気泳動法を用いる方法よりもはるかに高感度である。上述した手法をさらに変形することも可能である。例えば、反応混合物から不溶粒子を分離した後、不溶性粒子が沈澱させられるときに不溶性粒子に結合しているマーカーの量を測定することにより、ターゲットの量を求めることができる（例えば、不溶性物質について従来からの定量分析を適用する）。別の方法として、反応混合物から不溶性粒子を分離した後、該粒子を再懸濁させ再懸濁化粒子状のマーカーを測定することもできる。さらに、不溶性粒子からマーカーを分離し、マーカーおよび不溶性粒子の両方が溶液または懸濁状態にあるときにマーカーを測定することもできる。また、不溶性粒子からマーカーを分離した後、溶液から不溶性粒子を分離し、不溶性粒子の不存在下にマーカーを測定することもできる。
特定のＤＮＡ配列を検出すること以外に、ＨＬＭは、ＲＮＡターゲットにハイブリダイズされたプローブをリガーゼがライゲーションできるようにすれば、特定のＲＮＡ配列を検出するのに使用することもできる。本発明の手法は、さらに、ウィルス性物質およびその他のポリ核酸配列の分析に用いることもできる。さらに、実施例に示すように、ＨＬＭは、プローブのライゲーション連結部以外の部位において相違する配列を区別することができるので、この手法は、全遺伝子を含むような長大な配列セグメントをスキャンニングして正常配列と異なる変異を調べるのにも容易に適用され得る。
本発明のその他の変形は当業者には明らかであろう。以下の実施例は、本発明の各種の態様を示すものであるが、その有用性を限定するためのものではない。
実施例１：ＤＭＡＥおよびＬＥＡＥをラベルしたプローブを用いる化学発光ハイブリダイゼーション−ライゲーション分析による正常およびデルタＦ−５０８対立遺伝子の同時分析
化学発光（ルミネセンス）ハイブリダイゼーション−ライゲーション法をテストして、ＰＣＲにより増幅したヒトＤＮＡサンプル中の嚢胞性線維症におけるデルタＦ−５０８（配列番号  １）変異の検出性能を調べた。さらに、各サンプルについて正常対立遺伝子（配列番号  ２）およびデルタＦ−５０８対立遺伝子の存在を測定したが、この際、各対立遺伝子に特異的であるが２種類の異なるアクリジニウムエステル（ＤＭＡＥおよびＬＥＡＥ）でラベルされたプローブを用いた。ＤＭＡＥ誘導体（ジメチルアクリジニウムエステル）は短波長域（４００〜５００ｎｍ）で化学発光し、ＬＥＡＥ［長波長発光（longer wave length emitting）アクリジニウムエステル］は長波長域（５００〜６００ｎｍ）で化学発光するものである。
外部研究機関から入手したヒトＤＮＡ（２５０ｎｇ）の９個のサンプルをポリメラーゼ連鎖反応により増幅した（Saiki他、239 Science 487, 1988参照）。用いたプライマーは、Genset（フランスのパリ在）から入手したものであり、次の配列を有した。
0003738910.tif 000002
これらのプライマーを用いてＰＣＲ反応で増幅させたターゲット配列は、ＣＦＴＲ遺伝子（３）の１６１１〜１７０８塩基をカバーする９７塩基対（デルタＦ−５０８対立遺伝子は９４塩基対）から成るものであった。
ＰＣＲ反応系（７５μｌ）は、各プライマー３０ｐｍｏｌ、１．９ｍＭＭｇＣｌ2、ＡＴＰ、ＴＴＰ、ＧＴＰおよびＣＴＰのそれぞれ２００μＭ、および２．５ＵのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを含有した。９５℃において５分間変性した後、６０℃において４５秒間のアニーリング、７２℃において１分間の伸長、および９５℃において４５秒間の変性から成るＰＣＲを３０サイクル実施することによりサンプルを増幅した。最終サイクル後、各サンプルを７２℃において５分間インキュベートした。
ＰＣＲ反応液のアリコートを変性した後、以下の化学発光検出反応系に添加した：１００μｌ  ＴＥ、４Ｘ  ＳＳＣ、０．１％ＢＳＡ、０．０２％Tween−２０、１０μｇの常磁性粒子（ＰＭＰ）を含有し固定化プローブ（ＰＭＰ）を有する５％硫酸デキストラン、および各アクリジニウムエステル（５０８．ＣＦ−ＤＭＡＥ及び５０８．ＮＯＲ−ＬＥＡＥ）ラベル化プローブ１００ｆｍｏｌ．  検出用プローブの配列は以下のとおりであった。
0003738910.tif 000003
可能な分析フォーマットは図１にまとめている。
プローブを４５℃において１５分間、ＰＣＲ生成物にハイブリダイズさせた。粒子を磁性分離し、上澄液をデカンテーションすることにより未ハイバリダイズ化プローブを除去した。該粒子は、２×ＳＳＣ／０．１％Tween−２０で洗浄した。
５０ｍＭのトリス１００μｌ（ｐＨ７．６）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１ｍＭ  ＡＴＰ、１ｍＭ  ＤＴＴ、５％ポリエチレングリコール８００、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、２ＵのＴ４  ＤＮＡリガーゼから成る溶液に粒子を再懸濁させることにより、ハイブリダイズ化プローブをライゲーションした。反応系を３７℃で１５分間、インキュベートした。上述したように粒子を分離し洗浄した後、ハイブリダイズ化されてはいるがライゲーションはされていないＡＥプローブを除去した。粒子を上述したように１回洗浄した後、１０ｍＭトリス１００μｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭＭｇＣｌ2、１ｍＭ  ＥＤＴＡおよび０．５μｇ／μｌ  ＤＮａｓｅＩ（ＢＲＬ）中に再懸濁させた。この粒子懸濁液を標準的なフラッシュ剤（例えば、Ｌａｗ他による米国特許第５，２４１，０７０号参照）を用いてフラッシュ（発光）させ、二波長発光計で化学発光を検出することにより、異なる２種類のラベル由来の化学発光シグナルを同時測定した。
ＰＣＲ増幅生成物に関するこの化学発光ハイブリダイゼーション／ライゲーション分析の結果を図１に示す。得られた化学発光シグナルからは、ＰＣＲ増幅生成物中にデルタＦ−５０８対立遺伝子および正常対立遺伝子が存在していることが明瞭に確認された。予想されたように、対立遺伝子に特異的なプローブは、遺伝子型とは無関係に各サンプルにハイブリダイズしており、また、後続のライゲーション工程は２つの異なる対立遺伝子の配列を区別していた。ターゲット配列に完全に相補的なハイブリダイズ化プローブの連結部においてのみ効率的なライゲーションが認められたからである。
これらの対立遺伝子を化学発光を利用して検出することによりこれらのサンプルの診断が可能となり、その結果は、１つの例外を除き、別の研究機関による同じサンプル群の分析と完全に一致した。
デルタＦ−５０８対立遺伝子および正常対立遺伝子の双方に特異的なＡＥプローブを用いて各サンプルを分析して、それらのサンプルの遺伝子型を同定した。化学発光の強さ（図２）は、また、サンプルの遺伝子型を示していた。すなわち、ヘテロ（異型）接合性の個人については、ホモ（同型）接合性の症例に比べて、中間レベルの化学発光が観察された（例えば、サンプル１、７および９における正常対立遺伝子）。サンプル７は、例外サンプルであった。５０８．ＮＯＲ−ＬＥＡＥプローブ由来の化学発光強度は、該サンプルがこの対立遺伝子についてはヘテロ接合性であることを示していたが、５０８．ＣＦ−ＤＭＡＥ由来のシグナルは、デルタＦ−５０８変異については該サンプルが陰性であることを示していたからである。これらの結果を総合すると、このサンプルにおける第２の対立遺伝子はデルタＦ−５０８および正常配列のいずれも含有しておらず、その代わりに第２の嚢胞性線維症変異を含有していると考えられた。さらに、これらのＰＣＲ生成物は、８Ｍの尿素／１０％ポリアクリルアミドゲル上の電気泳動分析にも供され、分離バンドは、エチジウムブロミドにより可視化された（データは示さず）。正常対立遺伝子（９７ｂｐ）およびＣＦ対立遺伝子（９４ｂｐ）由来の生成物は、ゲル上ではっきりと分離され、診断が可能であった。さらに、ヘテロ接合性サンプルは、見掛け上大きな生成へテロ二本鎖に起因するバンドも含有した。この点に関し、電気泳動分析に基づくと、サンプル１、７および９は同一のものと考えられ、デルタＦ−５０８／正常ヘテロ接合対であると同定できるであろう。前に指摘したように、化学発光データに基づくと、サンプル７は正常対立遺伝子についてはヘテロ接合性であったが、デルタＦ−５０８対立遺伝子を含有していないと思われた。この不一致は、実施例２において解決され、ＨＬＭが電気泳動のような標準的な分析法に比べてさらに正確な診断を与える性能を有することが示された。
実施例２：化学発光ハイブリダイゼーション−ライゲーションによるデルタＦ−５０８およびデルタＩ−５０７変異の識別
デルタＦ−５０８変異は、嚢胞性線維症（ＣＦ）において最もよく見られる変異であり、嚢胞性線維症染色体（３）の約６８％に起こる。この変異は、ＣＦＴＲ遺伝子（３）のエクソン１０において３個の塩基対が欠失したものである。この変異部位周辺のエクソン１０の配列は図３に示されている。デルタＩ−５０７（配列番号  ８）変異は、これよりかなり稀なＣＦ変異であり、やはり３塩基対が欠失したものであり、デルタＦ−５０８変異と部分的にオーバーラップしている。これら２種類ＣＦ対立遺伝子の配列は１塩基が異なる。
実施例１においては化学発光ハイブリダイゼーション−ライゲーション分析がデルタＦ−５０８対立遺伝子と正常対立遺伝子とを区別する性能があることを示した。本実施例では、該分析がデルタＦ−５０８対立遺伝子とデルタＩ−５０７対立遺伝子とを区別する性能があることを示す。この応用法においては、ライゲーション工程が、単一の位置が異なるような配列を区別することが必要である。さらに、これらのハイブリッドにおけるミスマッチ部位は、ライゲーション連結部から除去された１塩基で生じる。デルタＦ−５０８プローブとデルタＩ−５０７プローブとの間で形成されたハイブリッドおよび異なるターゲット配列は図４に示す。
ポリメラーゼ連鎖反応で増幅されたヒトＤＮＡから得た９個の臨床サンプル（実施例１と同じ）について、デルタＩ−５０７変異が存在するかの分析を行った。本分析では実施例と同様のフォーマットに従ったが、固相とアクリジニウムエステル（ＤＭＡＥ）ラベル化プローブは次のようにした。
0003738910.tif 000004
ＰＣＲ増幅したヒトＤＮＡの追加の３サンプルについて、前と同じプロトコールおよびＴａｑ  ＤＮＡリガーゼ（Epicentre Technologies製）を用いるプロトコールに従って、デルタＦ−５０８、デルタＩ−５０７および正常対立遺伝子の分析を行った。Ｔａｑ  ＤＮＡリガーゼは熱安定性を有するので、高温でライゲーション反応が行えるようになるとともに、ハイブリダイゼーションとライゲーション工程を同時に実施することができる。この同時ハイブリダイゼーション−ライゲーションに用いた緩衝液は、２０ｍＭトリス（ｐＨ８．３）、２００ｍＭのＫＣｌ、１０μＭのｔＲＮＡ、１０ｍＭのＭｇＣｌ2、０．５ｍＭのＮＡＤ、および０．０１％のトリトン（Triton）Ｘ−１００から成るものであった。反応系は１００ユニットのＴａｑ  ＤＮＡリガーゼを含有した。同時ハイブリダイゼーション−ライゲーションは６０℃において３０分間実施した。
９サンプルの化学発光ハイブリダイゼーション−ライゲーション分析の結果を図５に示す。サンプル７のみがデルタＩ−５０７対立遺伝子に関し陽性であった。この結果と実施例１の結果を総合すると、これらのサンプルは次のように同定することができる。
0003738910.tif 000005
追加の３サンプルに行ったデルタＦ−５０８、デルタＩ−５０７および正常対立遺伝子に関する結果は図６および図７に示す。これらのサンプルの同定は配列決定で確認した。
実施例１および２の結果は、化学発光ハイブリダイゼーション−ライゲーション分析により、ライゲーション連結部位からわずか１塩基離れたところで１塩基が異なる配列を識別できることを示している。本実施例に従う特別の応用法では、嚢胞性線維症変異のデルタＦ−５０８とデルタＩ−５０７が識別された。これにより、以前にデルタＦ−５０８／Ｎと考えられたサンプルは、正しくはデルタＩ−５０７／Ｎと同定することができた。サンプル７および３０は、該サンプルのＰＣＲ生成物の電気泳動による移動性に基づいてデルタＦ−５０７／Ｎヘテロ接合体と考えられていた。しかし、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によるこれらのＰＣＲ生成物の分析では、デルタＦ−５０８変異とデルタＩ−５０７変異を簡単に識別することはできない。両変異とも３個の塩基対欠失から成り、これら対立遺伝子由来のＰＣＲ生成物はサイズが同じであるからである。
実施例３：嚢胞性線維症のＧ５４２Ｘ変異分析
これまでの実施例により、化学発光ハイブリダイゼーション−ライゲーション分析が、デルタＦ−５０８およびデルタＩ−５０７変異部位における正常対立遺伝子と嚢胞性線維症対立遺伝子を識別する性能を有することを示した。第３の嚢胞性線維症変異であるＧ５４２Ｘ（配列番号11）は、ＣＦＴＲ遺伝子のエクソン１１に生じる点（突然）変異である。この変異を検出する現行の方法は配列決定を必要として、時間を要し面倒な手法である。この変異を検出するための化学発光ハイブリダイゼーション−ライゲーション分析は、正常対立遺伝子（配列番号12）と嚢胞性線維症対立遺伝子を相違させる１個の塩基置換を識別することができなければならない。
実施例２に記載したのと同様の同時ハイブリダイゼーション−ライゲーション分析によりＴａｑ  ＤＮＡリガーゼを用いてＧ５４２Ｘを分析した。Ｇ５４２Ｘ用プローブの配列は以下のとおりであった。
0003738910.tif 000006
分析結果は図８に示しており、Ｇ５４２Ｘ配列に対してはＧ５４２Ｘ．ＣＦプローブのみがライゲーションされ、また、正常配列にはＧ５４２Ｘ．ＮＯＲプローブのみがライゲーションされたことを示している。本実施例においては、ライゲーション連結部におけるＴ−ＣおよびＧ−Ａのミスマッチは効率的にライゲーションされなかった。
実施例４：デルタＦ−５０８およびＧ５４２Ｘの同時分析
化学発光ハイブリダイゼーション−ライゲーション分析は、多数の配列を同時検出するのに用いることができる。このような性能の１つの例は、デルタＦ−５０８対立遺伝子と正常対立遺伝子の同時検出であった（実施例１）。他の応用例は、遺伝病やガンに潜在する２種またはそれ以上の変異を検出することである。例えば、嚢胞性線維症に潜在する変異は２００以上あると報告されている。デルタＦ−５０８変異は最も一般的な変異であり、嚢胞性線維症染色体の約６８％に生じる。第２番目によく起こる嚢胞性線維症変異はＧ５４２Ｘ変異であり、これはＣＦＴＲ遺伝子のエクソン１１に生じる点変異である。２種類の異なるアクリジニウムエステルラベルを使用して単一の遺伝子座にある正常対立遺伝子とＣＦ対立遺伝子を検出する代わりに、単一の分析によりデルタＦ−５０８およびＧ５４２Ｘ変異を検出することもできる。原理的には、異なる化学発光性を有するアクリジニウムエステル誘導体の数に応じた数の変異を単一の分析で検出することができる。その他のラベル、例えば蛍光団によっても多数の遺伝子座を同時に分析することが可能である。
合成したターゲット配列を用いて性能試験用のモデル分析を行った。分析プロトコールは、実施例２で記載したものと同じであり、Ｔａｑ  ＤＮＡリガーゼを使用し、同時ハイブリダイゼーション−ライゲーションを実施した。２種類の固相および２種類のアクリジニウムエステルをラベルしたプローブを用いて、各セットをそれぞれＦ−５０８変異用およびＧ５４２Ｘ変異用とした。デルタＦ−５０８変異用のプローブは、アクリジニウムエステルラベルがＬＥＡＥであること以外は、実施例１で記載したものと同じである。Ｇ５４２Ｘ用プローブの配列は、実施例３で用いたものと同じである。分析結果は図１にまとめており、どの組合せのターゲットを用いてもデルタＦ−５０８配列とＧ５４２Ｘ配列が検出されたことを示している。このことは、同一の分析において多数の遺伝子変異を検出できることを示している。
実施例５：Ｇ５５１Ｄ、Ｇ５５１ＳおよびＱ５５２Ｘ嚢胞性線維症変異の識別
ＣＦＴＲ遺伝子のエクソン１１は、上述の実施例で記載したＧ５４２Ｘ以外にも多くの嚢胞性線維症変異を含有している。エクソン１１の比較的短い配列内に多数の変異部位が存在しているために、これまでは、起こり得るこのような変異を検出し識別するためには該エクソン由来のＰＣＲ生成物の配列決定を行うことを必要としていた。ＨＬＭによりエクソン１１嚢胞性線維症変異の分析を簡略化できるようにするには、この方法の特異性が近接密集した変異部位を識別できることを必要とした。Ｇ５５１Ｄ変異（配列番号16）は、最も一般的な嚢胞性線維症変異の１つであり、約０．５％の頻度で見出されている。これは、正常遺伝子におけるＧ１７８４（配列番号17）がＡに変化した点（突然）変異である。このＧ５５１Ｄの近傍部位の塩基１７８３においてＧ５５１Ｓ（配列番号18）が存在し、さらに塩基１７８においてＱ５５２Ｘ（配列番号19）が存在する。さらに、Ｇ５５１Ｄ変異の特性から、ＨＬＭによりＧ−Ｔミスマッチを識別することが必要であるが、これは識別するのに最も困難なミスマッチである（下記参照）。本実施例では、ＨＬＭが、Ｇ５５１Ｄ変異を検出し、且つ、該変異とその近傍にある他の変異部位を識別できる性能を有することを明らかにした。
Ｇ５５１Ｄ分析に用いたプローブの配列は次のとおりである。
0003738910.tif 000007
分析に際し、Ｇ５５１Ｄ．ＣＦおよびＧ５５１Ｄ．ＮＯＲは、それらの５′末端に32Ｐでラベルした。ライゲーション生成物の検出は、液相シンチレーション計数により行った。分析は、既知のようにＴ４  ＤＮＡリガーゼおよびＴａｑ  ＤＮＡリガーゼを用いるプロトコールに従うか、あるいは、該プロトコールにおける塩の条件を修正してＨＬＭの特異性を向上させて実施した。これには、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いる場合については、ＮａＣｌ濃度を２００ｍＭから６００ｍＭに増加させたことを含む。Ｔａｑ  ＤＮＡリガーゼを用いるプロトコールにおいてはＫＣｌの代わりにＮａＣｌを用いた。ライゲーションの詳細な条件については以下に数値を示す。
Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いＮａＣｌを２００ｍＭとしたＨＬＭ分析の結果を図１０に示す。ＨＬＭにより、Ｇ５５１Ｄ配列とその他の変異配列とを識別することはできたが、Ｇ５５１Ｄ．ＣＦプローブを用いてＧ５５１Ｄ配列と正常配列との間に本質的な相違は認められなかった。そこで、ＮａＣｌ濃度を６００ｍＭに増加させることにより、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いるＨＬＭ特異性を向上させた（図１１）。Ｔａｑ  ＤＮＡリガーゼを用いるＨＬＭを実施することにより識別性能はさらに良好となり、該条件下ではＧ５５１Ｄ．ＣＦプローブまたはＧ５５１Ｄ．ＮＯＲプローブを使用して配列の相違は簡単に識別された。２００ｍＭのＫＣｌとＧ５５１Ｄ．ＣＦを用いＴａｑ  ＤＮＡリガーゼを使用するプロトコールに従えば、Ｇ５５１Ｄ配列と正常配列間の識別は明白であったが、正常ターゲットについてバッグランドを超えるライゲーションが認められた。このシグナルは、Ｔａｑ  ＤＮＡリガーゼを使用するプロトコールにおいてＮａＣｌを代用することにより低下させることができた（図１３）。
以上の結果を総合すれば、ＨＬＭは１塩基のみが異なるような配列を識別し、特に、そのような単一塩基変化部位がライゲーション連結部から離れている場所にあるようなときでも識別する性能を有することが明らかである。
実施例６：ｐ５３モデルを利用するハイブリダイゼーション−ライゲーションの特異性の系統的検討
これまでの実施例により、ＨＬＭが、欠失、挿入および点変異を含む微妙な相違のある配列を識別する性能を有することが確立された。検討した各事例において、このような配列の相違を識別できるようなライゲーション特異性が得られる条件が確立された。本実施例においては、ミスマッチのあらゆる可能な組合せにより相違しているような配列を識別する性能を調べることにより、ＨＬＭの特異性を系統的に検討する。
ｐ５３遺伝子は、腫瘍抑制物質として機能するタンパク質をコードしている。この遺伝子の変異は、広範な腫瘍において見出され、このような変異が最も多く見られる位置はコドン１７５、２４５および２４８の周りに密集している。ライゲーションの特異性を系統的に検討するためのモデルとして、コドン１７５の周りのｐ５３遺伝子の一部を選択した（配列番号23）。このモデル用のターゲットおよびプローブの配列は図１４に示す。ハイブリダイゼーションおよびライゲーションは溶液中で実施した。Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いた分析を行うために、既述した濃度のＮａＣｌを含有するライゲーション緩衝液中で、プローブ（32ｐをラベルした配列番号24および25）をターゲットと混合した。反応系を３７℃で１５分間インキュベートし、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（１Ｕ）を添加し、反応系をさらに１５分間、３７℃でインキュベートした。該反応液のアリコートを変性（８Ｍ尿素）ポリアクリルアミド（１５％）ゲル電気泳動により分析した。ライゲーション生成物および未ライゲーションオリゴマーに対応するバンドを切除し液相シンチレーション計数により計測して、ライゲーションした全オリゴマーのパーセントを計算した。Ｔａｑ  ＤＮＡリガーゼを用いる分析も同様に行った。但し、この場合、反応の開始時に該リガーゼを添加した。
２００ｍＭのＮａＣｌを用いた場合にライゲーション連結部の５′リン酸または３′ＯＨヌクレオチド位置において生じたミスマッチに対するＴ４ＤＮＡリガーゼの識別性能を表IIにまとめる。３′ＯＨヌクレオチドにおけるミスマッチは、５′Ｐヌクレオチドにおけるミスマッチよりも遥かに識別が容易であった。ＮａＣｌ濃度を６００ｍＭに増加させると、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼの特異性は、２００ｍＭにおける場合よりも向上した。６００ｍＭのＮａＣｌでは、５′Ｐまたは３′ＯＨ位置のいずれにおいてもあらゆる可能性のミスマッチが識別され、Ｇ−ＴおよびＣ−Ａミスマッチすら識別された（表III）。
２００ｍＭのＫＣｌ中４５℃におけるＴａｑ  ＤＮＡリガーゼの特異性はＴ４  ＤＮＡリガーゼの特異性よりも優れていた。さらに、Ｔａｑリガーゼ緩衝液にＮａＣｌを含有させると、Ｔａｑ  ＤＮＡリガーゼの特異性は幾分向上した。
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0003738910.tif 000011
実施例７：診断基準としてライゲーション百分率を用いるＰＣＲ増幅ヒトＤＮＡ中のデルタＦ−５０８および正常対立遺伝子の分析
独立した研究機関からＰＣＲで増幅されたヒトＤＮＡのサンプルを入手した。これまでの実施例で記載したのと同様に、デルタＦ−５０８対立遺伝子（配列番号1）のＨＬＭ分析を行った。ハイブリダイズされてはいるがライゲーションされていないプローブを除去するための変性工程において、この放出プローブを含有する上澄液を保存して別途フラッシュ（発光）させ、ハイブリダイズされ且つライゲーションされたラベル化プローブを含有するＰＭＰのフラッシングとは別にした。この上澄液およびＰＭＰからの化学発光シグナルの合計が、サンプルにハイブリダイズしたラベル化プローブの総量の尺度となり、ひいては、これが、反応系中のサンプルＤＮＡの総量の尺度となる。さらに、ＰＭＰからの化学発光シグナルを上澄液およびＰＭＰからの化学発光シグナルの合計で除することにより、ハイブリダイズされたプローブのうちライゲーションを受けたものの分率（フラクション）が得られる。ヒトＤＮＡの各サンプルから得られるＰＣＲ生成物の量はサンプル毎に異なっているかも知れないので、ライゲーションされたラベル化プローブの分率から、ある対立遺伝子に関してホモ接合性のサンプル、ある対立遺伝子に関してヘテロ接合性のサンプル、および、そのような対立遺伝子を含まないサンプルを明瞭に区別することができる。さらに、プローブは、デルタＦ−５０８対立遺伝子、正常対立遺伝子、およびデルタＩ−５０７対立遺伝子にハイブリダイズするものと予想されるので、変性工程において放出されたラベル化プローブの化学発光を測定することは、分析の構成成分が、ライゲーションに関して陰性であるようなサンプルに正しく作用しているかを判断する手段となる。
ＨＬＭによるデルタＦ−５０８分析の結果をパーセントライゲーション（ライゲーション百分率）として計算し図１５にまとめている。ライゲーションされたラベル化プローブのパーセントを計算することにより、ホモ接合性、ヘテロ接合性、および陰性のサンプル間を明瞭に区別することができた。この計算値は、生の化学発光データよりも信頼性の高い診断指数であることがわかる。サンプルは、存在するＤＮＡの全量において５倍以上変化していることが見出されたからである。図１６においては、正常対立遺伝子について行った同様の分析の結果をデルタＦ−５０８の分析の結果と比較している。
実施例８：デルタＦ−５０８対立遺伝子とデルタＩ−５０７対立遺伝子との識別に対するＮａＣｌ濃度の影響
これらの２種類の対立遺伝子の配列は、１ヶ所において異なっている（図４参照）。２００ｍＭのＮａＣｌ中においてＴ４  ＤＮＡリガーゼを用いるＨＬＭにより、これら２つの嚢胞性線維症変異間の識別を行うことが可能であった（実施例１及び２参照）。ｐ５３配列を用いるＴ４  ＤＮＡリガーゼの特異性に対するＮａＣｌ濃度の影響を示した実施例６の結果に照らして、デルタＦ−５０８プローブを用いデルタＦ−５０８配列とデルタＩ−５０７配列間を識別するＴ４  ＤＮＡリガーゼの性能に対するＮａＣｌ濃度の影響を調べた。既述のようにデルタＦ−５０８およびデルタＩ−５０７の合成ターゲット配列についてＨＬＭを実施した。但し、ライゲーション緩衝液は、２００、４００、６００、８００または１０００ｍＭのＮａＣｌで調製した。変性工程において、上澄液を保存し、別途フラッシング（発光）させて、ハイブリダイズされているがライゲーションされていないプローブの量を測定した。実施例７のように、ハイブリダイズされた総量のうちライゲーションされた５０８．ＣＦ−ＤＭＡＥプローブのパーセントを計算した。
結果は図１７にまとめている。２００ｍＭのＮａＣｌ中、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼにより、デルタＦ−５０８配列とデルタＩ−５０７配列とを充分に識別することができた。塩濃度６００ｍＭまで増加させるに従い、デルタＩ−５０７配列に関して認められるライゲーション量は抑制されるがデルタＦ−５０８配列に関してはライゲーションのレベルが維持されることにより、それらの配列間の識別性能は向上した。ＮａＣｌ濃度が６００ｍＭを超えると、デルタＦ−５０８ターゲットについてライゲーションが低下し始める。
実施例９：ビオチン化プローブとアビジン−ＰＭＰを用いるΔＦ−５０８のハイブリダイゼーション−ライゲーション分析
ビオチン化プローブ（Biotin-CF1）とアクリジニウムエステルラベル化プローブ（508.CF-AE）を用い溶液中でハイブリダイゼーションおよびライゲーション反応を行った。１pmolのBiotin−ＣＦ１、１００fmolの５０８．ＣＦ−ＡＦ、および１００ユニットのＴａｑ  ＤＮＡリガーゼを含有する１００μｌ緩衝液（２００ｍＭのトリス（ｐＨ８．３）、１００ｍＭのＮａＣｌ、１００ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ2、１０μＭのｔＲＮＡ、０．０５ｍＭのＮＡＤおよび０．０１％のTritonＸ−１００）中、５０℃においてハイブリダイゼーション−ライゲーション反応を実施した。反応の開始には、１）１fmolの正常ターゲット、２）１fmolのΔＩ−５０７ターゲット、３）１fmolのΔＦ−５０８ターゲットまたは４）ターゲットなしのいずれかを添加した。反応系を５０℃で１時間インキュベートした。各反応系に１０μｇのアビジン−ＰＭＰ（Promega製）を添加し、さらに１０分間インキュベートした。磁性を利用して粒子を分離し、上澄液を吸引除去し、粒子を０．２×ＳＳＣ／０．１％Tween−２０で洗浄した。この洗浄を２回繰り返した。アビジン−ＰＭＰを１５０μｌの洗浄緩衝液中に再懸濁し、５５℃において１０分間インキュベートしてハイブリダイズされてはいるがライゲーションされていないプローブを除去した。磁性作用を利用してアビジン−ＰＭＰを分離し、上澄液を除去してフラッシュ（発光）させた。このアビジン−ＰＭＰを一回洗浄し、DNase I（ＢＲＬ）を含有する１０ｍＭのＭｇＣｌ2および５０ｍＭのトリス（ｐＨ７．５）の１００μｌ中に再懸濁しフラッシュさせた。分析結果を以下の表にまとめる。
0003738910.tif 000012
この分析フォーマットは、ビオチン化プローブとともに汎用的な固相試薬（アビジン−ＰＭＰ）を利用できることを示す。このフォーマットは、同一の試験管内で多数の遺伝子座の分析を行うことが求められているような多重分析を意図する場合に特に有用であろう。さらに、固相のハイブリダイゼーションおよびライゲーションは、ＰＭＰ上に固定化された１つのプローブを用いる場合よりも迅速に進行することができる。
実施例１０：ライゲーション特異性とＧ５５１Ｄモデルの結果
以上の結果を本明細書の実施例５において得られた結果に拡張する。前述したのと同様にＴ４  ＤＮＡリガーゼおよびＴａｑ  ＤＮＡリガーゼを用いてハイブリダイゼーション−ライゲーション分析を行った。Ｇ５５１Ｄ配列に特異的なＡＥプローブを用いた分析結果は以下の表にまとめている。Ｒ５５３Ｘと称するターゲット配列を用いることによりライゲーション特異性に関し更なる知見が得られる（表VI参照）。
Ｇ５５１Ｄ．ＮＯＲプローブを用いる分析により、Ｇ５５１Ｓ配列とＱ５５２Ｘ配列とを識別できた。このことは、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼおよびＴａｑ  ＤＮＡリガーゼが、ライゲーション連結部以外の場所におけるミスマッチを識別する性能を有することを示している。さらに、Ｇ５５１Ｄ．ＮＯＲを用いる分析により、Ｔ４ＤＮＡリガーゼがＲ５５３Ｘ配列を識別できるものと考えられる。これには、該酵素が、ライゲーション連結部の３′水素基側から５塩基分離れた場所におけるミスマッチを識別することが必要である。
この分析結果は、単一のミスマッチではなく２つのミスマッチが存在する場合に、識別能の向上が得られることを示している。例えば、Ｇ５５１Ｄ．ＮＯＲを用いる分析では、ＴａｑリガーゼによりＲ５５３Ｘ配列は識別されない。見方を変えると、３′（５）Ｔ−Ｇミスマッチは、Ｔａｑ  ＤＮＡリガーゼによりライゲーションを妨げない。Ｇ５５１Ｄ．ＣＦを用いる分析において、正常ターゲット配列に対する誤ライゲーションの割合は５％であり、他方、Ｒ５５３Ｘに対する誤ライゲーションの割合は２％であった。このことは、識別能を向上させるのに、ライゲーション連結部から数塩基分離れたところにミスマッチを導入することが有用であることを示している。最終的には、このような戦略により、現在は識別されていないようなミスマッチの識別を行うことが可能となる。このような見解は、Ｇ５５１Ｄ．ＣＦおよびＴ４  ＤＮＡリガーゼを用いる分析を考慮すれば明らかであろう。この酵素は、５′（１）におけるＧ−Ｔミスマッチを識別しなかったが、Ｒ５５３Ｘにおいて生じるミスマッチの組合せは識別された。
0003738910.tif 000013
実施例１１：ライゲーション連結部から離れた位置におけるミスマッチの識別
本明細書で既述したｐ５３モデルを用いて、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼおよびＴａｑ  ＤＮＡリガーゼがライゲーション連結部から１塩基離れた位置におけるミスマッチを識別する性能を系統的に検討した。これらの位置は、ライゲーション連結部がどちら側にあるかに応じて、５′（２）および３′（２）と呼称する。結果は、添付図にまとめている。いずれの酵素によっても３′（２）位置におけるミスマッチはすべて識別された。両酵素とも、５′（２）におけるミスマッチをすべて識別するわけではなかった。（図１８参照）。
実施例１２：ライゲーション特異性に対する酵素濃度の影響
Ｔ４  ＤＮＡリガーゼの濃度を２種類、すなわち、１ｎＭと２４０ｎＭにして比較を行った。Ｔ４  ＤＮＡリガーゼの５′（１）ミスマッチおよび３′（１）ミスマッチ識別能をｐ５３モデルで検討した。結果は図にまとめている。明らかに、３′（１）ミスマッチに対するライゲーション特異性は、低濃度において向上しており、相補的マッチに対するライゲーションが実質的に減損していることもない。５′（１）ミスマッチについても向上が認められ、特にプリン−プリンミスマッチに対して向上しているが、３′（１）ミスマッチに対しては全体として有意な程ではなかった。（図１９および図２０参照。）
配列リスト
(1)一般情報
(i)  出願人：チバ・コーニング・ダイアグノスティクス・コーポレーション（Ciba Corning Diagnostics Corp.）Martinelli, Richard A. Arruda, John C.
(ii)  発明の名称：特定の核酸配列を検出するためのハイブリダイゼーション−ライゲーション分析（Hybridization-Ligation Assays for the Detection of Specific Nucleic Acid Sequences）。
(iii) 配列の数：２６
(iv)  通信先住所：
(A)宛先：Ciba-Corning Dagnostics Corp.
(B)街：63 North Street
(C)市：Medfield
(D)州：Massachusetts
(E)国：USA
(F)ZIP番号：02052
(v)  コンピューター解読形態
(A)媒体：３．５インチディスク、記憶容量１．４４Ｍｂ
(B)ＩＢＭコンパチブル
(C)オペレーティングシステム：ＩＢＭ  ＤＯＳ５．０
(D)ソフトウェア：ＷＯＲＤ  ６．０
(vi)  当出願に関するデータ
(A)出願番号：未入手
(B)出願日：未入手
(C)分類：未入手
(vii) 先行出願に関するデータ
(A)出願番号：ＵＳ０８／２２２、６１３
(B)出願日：１９９４年４月４日
(C)分類：未入手
(viii)代理人情報
(A)氏名：Morgenstern, A.S.
(B)登録番号：２８，２４４
(C)整理番号：ＣＣＤ−１１３
(ix)  通信手段情報
(A)電話：５０８−３５９−３８３６
(B)ファクシミリ：５０８−３５９−３８８５
(2)配列番号１に関する情報：
(i)   配列の特徴：
(A)長さ：４７塩基
(B)種類：核酸
(C)鎖：一本鎖
(D)トポロジー：線状
(ii)  分子型：ゲノムＤＮＡ
(A)内容：デルタＦ−５０８。ＣＦＴＲ遺伝子の配列の一部であり、塩基番号１６５２を囲むが、塩基１６５３〜１６５５を欠失したもの。
(xi)  配列：配列番号：１：
0003738910.tif 000014
(3)配列番号２に関する情報：
(i)   配列の特徴：
(A)長さ：５０塩基
(B)種類：核酸
(C)鎖：一本鎖
(D)トポロジー：線状
(ii)  分子型：ゲノムＤＮＡ
(A)内容：正常。ＣＦＴＲ遺伝子のエクソン１０の配列の一部であり、塩基番号１６５２を囲む。
(xi)  配列：配列番号：２：
0003738910.tif 000015
(4)配列番号３に関する情報：
(i)   配列の特徴：
(A)長さ：２４塩基
(B)種類：核酸
(C)鎖：一本鎖
(D)トポロジー：線状
(ii)  分子型：ゲノムＤＮＡ
(A)内容：Ｃ１６Ｂ。ＣＦＴＲ遺伝子のエクソン１０の塩基１６１１〜１６３４。
(xi)  配列：配列番号：３：
0003738910.tif 000016
(5)配列番号４に関する情報：
(i)   配列の特徴：
(A)長さ：２４塩基
(B)種類：核酸
(C)鎖：一本鎖
(D)トポロジー：線状
(ii)  分子型：ゲノムＤＮＡ
(A)内容：Ｃ１６Ｄ。ＣＦＴＲ遺伝子のエクソン１０の塩基１７０８〜１６８４。
(xi)  配列：配列番号：４：
0003738910.tif 000017
(6)配列番号５に関する情報：
(i)   配列の特徴：
(A)長さ：５３塩基
(B)種類：核酸
(C)鎖：一本鎖
(D)トポロジー：線状
(ii)  分子型：他のＤＮＡ／ゲノムＤＮＡ
(A)内容：ＰＭＰ．５０８。塩基１〜２９は合成ＤＮＡのスペーサー。塩基３０〜５３は、ＣＦＴＲ遺伝子のエクソン１０の塩基１６５６〜１６７８から成る。
(xi)  配列：配列番号：５：
0003738910.tif 000018
(7)配列番号６に関する情報：
(i)   配列の特徴：
(A)長さ：２４塩基
(B)種類：核酸
(C)鎖：一本鎖
(D)トポロジー：線状
(ii)  分子型：ゲノムＤＮＡ
(A)内容：５０８．ＣＦ。ＣＦＴＲ遺伝子のエクソン１０の塩基１６２９〜１６５２。
(xi)  配列：配列番号：６：
0003738910.tif 000019
(8)配列番号７に関する情報：
(i)   配列の特徴：
(A)長さ：２７塩基
(B)種類：核酸
(C)鎖：一本鎖
(D)トポロジー：線状
(ii)  分子型：ゲノムＤＮＡ
(A)内容：５０８．ＮＯＲ。ＣＦＴＲ遺伝子のエクソン１０の塩基１６２９〜１６５５。
(xi)  配列：配列番号：７：
0003738910.tif 000020
(9)配列番号８に関する情報：
(i)   配列の特徴：
(A)長さ：４７塩基
(B)種類：核酸
(C)鎖：一本鎖
(D)トポロジー：線状
(ii)  分子型：ゲノムＤＮＡ
(A)内容：デルタＩ−５０７。ＣＦＴＲ遺伝子のエクソン１０の配列の一部であり、塩基番号１６５２を囲み、塩基１６５２〜１６５４を欠失したもの。
(xi)  配列：配列番号：８：
0003738910.tif 000021
(10)配列番号９に関する情報：
(i)   配列の特徴：
(A)長さ：５６塩基
(B)種類：核酸
(C)鎖：一本鎖
(D)トポロジー：線状
(ii)  分子型：ゲノムＤＮＡ／他のＤＮＡ
(A)内容：ＰＭＰ．５０７。塩基１〜２９は合成ＤＮＡのスペーサー；塩基３０〜５６はＣＦＴＲ遺伝子のエクソン１０の塩基１６７９〜１６５３から成る。
(xi)  配列：配列番号：９：
0003738910.tif 000022
(11)配列番号１０に関する情報：
(i)   配列の特徴：
(A)長さ：２４塩基
(B)種類：核酸
(C)鎖：一本鎖
(D)トポロジー：線状
(ii)  分子型：ゲノムＤＮＡ
(A)内容：５０７．ＣＦ。ＣＦＴＲ遺伝子のエクソン１０の塩基１６２６〜１６４９から成る。
(xi)  配列：配列番号：１０：
0003738910.tif 000023
(12)配列番号１１に関する情報：
(i)   配列の特徴：
(A)長さ：５４塩基
(B)種類：核酸
(C)鎖：一本鎖
(D)トポロジー：線状
(ii)  分子型：ゲノムＤＮＡ
(A)内容：Ｇ５４２Ｘ。ＣＦＴＲ遺伝子のエクソン１１の塩基１７３１〜１７８４から成り、塩基１７５６のＧがＴで置換されたもの。
(xi)  配列：配列番号：１１：
0003738910.tif 000024
(13)配列番号１２に関する情報：
(i)   配列の特徴：
(A)長さ：５４塩基
(B)種類：核酸
(C)鎖：一本鎖
(D)トポロジー：線状
(ii)  分子型：ゲノムＤＮＡ
(A)内容：ＮＯＲ１７３１．５４。ＣＦＴＲ遺伝子のエクソン１１の塩基１７３１〜１７８４。
(xi)  配列：配列番号：１２：
0003738910.tif 000025
(14)配列番号１３に関する情報：
(i)   配列の特徴：
(A)長さ：５２塩基
(B)種類：核酸
(C)鎖：一本鎖
(D)トポロジー：線状
(ii)  分子型：他のＤＮＡ／ゲノムＤＮＡ
(A)内容：ＰＭＰ．Ｇ５４２Ｘ。塩基１〜２７は合成ＤＮＡのスペーサーから成り、塩基２８〜５２はＣＦＴＲ遺伝子のエクソン１１の塩基１７８１〜１７５７から成る。
(xi)  配列：配列番号：１３：
0003738910.tif 000026
(15)配列番号１４に関する情報：
(i)   配列の特徴：
(A)長さ：２７塩基
(B)種類：核酸
(C)鎖：一本鎖
(D)トポロジー：線状
(ii)  分子型：ゲノムＤＮＡ
(A)内容：Ｇ５４２Ｘ．ＣＦ。ＣＦＴＲ遺伝子のエクソン１１の塩基１７５６〜１７３０から成り、塩基１７５６におけるＣがＴで置換されたもの。
(xi)  配列：配列番号：１４：
0003738910.tif 000027
(16)配列番号１５に関する情報：
(i)   配列の特徴：
(A)長さ：２７塩基
(B)種類：核酸
(C)鎖：一本鎖
(D)トポロジー：線状
(ii)  分子型：ゲノムＤＮＡ
(A)内容：Ｇ５４２Ｘ．ＮＯＲ。ＣＦＴＲ遺伝子のエクソン１１の塩基１７５６〜１７３０。
(xi)  配列：配列番号：１５：
0003738910.tif 000028
(17)配列番号１６に関する情報：
(i)   配列の特徴：
(A)長さ：４５塩基
(B)種類：核酸
(C)鎖：一本鎖
(D)トポロジー：線状
(ii)  分子型：ゲノムＤＮＡ
(A)内容：Ｇ５５１Ｄ．ＣＦＴＲ遺伝子のエクソン１１の塩基１７６３〜１８０７から成り、塩基１７８４におけるＧがＡで置換されたもの。
(xi)  配列：配列番号：１６：
0003738910.tif 000029
(18)配列番号１７に関する情報：
(i)   配列の特徴：
(A)長さ：４５塩基
(B)種類：核酸
(C)鎖：一本鎖
(D)トポロジー：線状
(ii)  分子型：ゲノムＤＮＡ
(A)内容：ＮＯＲ１７６３２．４５。ＣＦＴＲ遺伝子のエクソン１１の塩基１７６３〜１８０７。
(xi)  配列：配列番号：１７：
0003738910.tif 000030
(19)配列番号１８に関する情報：
(i)   配列の特徴：
(A)長さ：４５塩基
(B)種類：核酸
(C)鎖：一本鎖
(D)トポロジー：線状
(ii)  分子型：ゲノムＤＮＡ
(A)内容：Ｇ５５１Ｓ。ＣＦＴＲ遺伝子のエクソン１１の塩基１７６３〜１８０７から成り、塩基１７８３におけるＧがＡで置換されたもの。
(xi)  配列：配列番号：１８：
0003738910.tif 000031
(20)配列番号１９に関する情報：
(i)   配列の特徴：
(A)長さ：４５塩基
(B)種類：核酸
(C)鎖：一本鎖
(D)トポロジー：線状
(ii)  分子型：ゲノムＤＮＡ
(A)内容：Ｑ５５２Ｘ。ＣＦＴＲ遺伝子のエクソン１１の塩基１７６３〜１８０７から成り、塩基１７８６におけるＣがＴで置換されたもの。
(xi)  配列：配列番号：１９：
0003738910.tif 000032
(21)配列番号２０に関する情報：
(i)   配列の特徴：
(A)長さ：５２塩基
(B)種類：核酸
(C)鎖：一本鎖
(D)トポロジー：線状
(ii)  分子型：他のＤＮＡ／ゲノムＤＮＡ
(A)内容：ＰＭＰ．Ｇ５５１Ｄ。塩基１〜２９は合成ＤＮＡのスペーサーから成り、塩基３０〜５２はＣＦＴＲ遺伝子のエクソン１１の塩基１７８５〜１８０７から成る。
(xi)  配列：配列番号：２０：
0003738910.tif 000033
(22)配列番号２１に関する情報：
(i)   配列の特徴：
(A)長さ：２２塩基
(B)種類：核酸
(C)鎖：一本鎖
(D)トポロジー：線状
(ii)  分子型：ゲノムＤＮＡ
(A)内容：Ｇ５５１Ｄ．ＣＦ。ＣＦＴＲ遺伝子のエクソン１１の塩基１７８４〜１７６３から成り、塩基１７８４におけるＣがＴで置換されたもの。
(xi)  配列：配列番号：２１：
0003738910.tif 000034
(23)配列番号２２に関する情報：
(i)   配列の特徴：
(A)長さ：２２塩基
(B)種類：核酸
(C)鎖：一本鎖
(D)トポロジー：線状
(ii)  分子型：ゲノムＤＮＡ
(A)内容：Ｇ５５１Ｄ．ＮＯＲ。ＣＦＴＲ遺伝子のエクソン１１における塩基１７８４〜１７６３。
(xi)  配列：配列番号：２２：
0003738910.tif 000035
(24)配列番号２３に関する情報：
(i)   配列の特徴：
(A)長さ：３５塩基
(B)種類：核酸
(C)鎖：一本鎖
(D)トポロジー：線状
(ii)  分子型：ゲノムＤＮＡ
(A)内容：ｐ５３。ｐ５３遺伝子のコドン１７５の両側にある３５塩基。
(xi)  配列：配列番号：２３：
0003738910.tif 000036
(25)配列番号２４に関する情報：
(i)   配列の特徴：
(A)長さ：１６塩基
(B)種類：核酸
(C)鎖：一本鎖
(D)トポロジー：線状
(ii)  分子型：ゲノムＤＮＡ
(A)内容：ｐ５３．５′。ｐ５３遺伝子のコドン１７５のＣから５′に延びる１６塩基の配列。
(xi)  配列：配列番号：２４：
0003738910.tif 000037
(26)配列番号２５に関する情報：
(i)   配列の特徴：
(A)長さ：１９塩基
(B)種類：核酸
(C)鎖：一本鎖
(D)トポロジー：線状
(ii)  分子型：ゲノムＤＮＡ
(A)内容：ｐ５３．３′。ｐ５３遺伝子のコドン１７５のＧから３′に延びる１９塩基の配列。
(xi)  配列：配列番号：２５：
0003738910.tif 000038
(27)配列番号２６に関する情報：
(i)   配列の特徴：
(A)長さ：４５塩基
(B)種類：核酸
(C)鎖：一本鎖
(ii)  分子型：ゲノムＤＮＡ
(A)内容：Ｒ５３３Ｘ。ＣＦＴＲ遺伝子のエクソン１１の塩基１７６３〜１８０７から成り、塩基１７８９におけるＣがＴで置換されたもの。
(xi)  配列：配列番号：２６
0003738910.tif 000039
(28)配列番号２７に関する情報：
(i)   配列の特徴：
(A)長さ：２４塩基
(B)種類：核酸
(C)鎖：一本鎖
(ii)  分子型：ゲノムＤＮＡ
(A)内容：ＣＦ１。ＣＦＴＲ遺伝子のエクソン１０の塩基１６５６〜１６７８。
(xi)  配列：配列番号：２７：
0003738910.tif 000040
【図１】
0003738910.tif 000041
【図２】
0003738910.tif 000042
【図３】
0003738910.tif 000043
【図４】
0003738910.tif 000044
【図５】
0003738910.tif 000045
【図６】
0003738910.tif 000046
【図７】
0003738910.tif 000047
【図８】
0003738910.tif 000048
【図９】
0003738910.tif 000049
【図１０】
0003738910.tif 000050
【図１１】
0003738910.tif 000051
【図１２】
0003738910.tif 000052
【図１３】
0003738910.tif 000053
【図１４】
0003738910.tif 000054
【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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