(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
リーサスＤ抗原に対して特異性を有する抗原結合性構造を形成し得るポリペプチドであって、以下の表に示される配列番号に従って、同一の又は異なる同定番号を有するアミノ酸配列ＶH及びＶLの組のリーサスＤ−特異的ＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域及びＣＤＲ３領域を含有するポリペプチド：
0003841360.tif 000018
【請求項２】
請求項１の表中の配列番号による同一の同定番号を有するアミノ酸配列ＶH及びVLの組のリーサスＤ−特異的ＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域及びＣＤＲ３領域を含有する請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
アミノ酸配列ＶH及びＶLを有する領域を含有し、そして請求項１の表中の配列番号による同定番号を有する請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項４】
抗原結合性Fabフラグメントとして特徴づけられる、請求項１から３のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項５】
完全な抗−リーサスＤ抗体を形成し得る免疫グロブリン重鎖及び軽鎖を含む請求項１から３のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項６】
リーサスＤ抗原に対して特異性を有する抗原結合性構造を形成し得るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、以下の表に示される配列番号による同一の又は異なる同定番号を有するポリヌクレオチドＶH及びＶLの組のリーサスＤ−特異的ＣＤＲ１セグメント、ＣＤＲ２セグメント及びＣＤＲ３セグメントを有する領域を含有するポリヌクレオチド：
0003841360.tif 000019
【請求項７】
リーサスＤ抗原に対して特異性を有する抗原結合性構造を形成し得るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、請求項６の表中の配列番号による同一の同定番号を有するポリヌクレオチドＶH及びＶLの組のリーサスＤ−特異的ＣＤＲ１セグメント、ＣＤＲ２セグメント及びＣＤＲ３セグメントを有する領域を含有する請求項６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８】
請求項６の表中の配列番号による同定番号を有するポリヌクレオチドＶH及びＶLを有する領域を含有する請求項６または７に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９】
抗原結合性Fabフラグメントを形成し得るポリペプチドをコードする請求項６から８のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０】
完全な抗−リーサスＤ抗体を形成し得るポリペプチドをコードする請求項６から８のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１】
リーサスＤ抗原に対して特異性を有する抗原結合性構造を形成し得、特に部分リーサスＤVI変異体との反応性を示し、リーサス陰性表現型の赤血球とは反応する証拠がなく、特にリーサス対立遺伝子(allele)Ｃ、ｃ、Ｅ及びeに対して反応しない組換えポリペプチド。
【請求項１２】
請求項11に記載のポリペプチドを選択する方法であって、該方法は以下の工程をこの順で含む：a)以下の赤血球:ブロメラーゼで処理された表現型１(r'r、Ccddee)、ブロメラーゼ非処理の表現型１、ブロメラーゼで処理された表現型２(ryry CCddEE)及びブロメラーゼ非処理の表現型２;とネガティブ吸着を数回行なう工程;
b)ブロメラーゼ処理又は非処理のＤVI+赤血球とのボシティブ吸着を行なう工程;
c)ＤVI+赤血球に結合するファージの力価(titer)を測定する工程;及びd)ＤVI+赤血球に結合するファージの力価が所望のレベルに達するまで、工程a)、b)及びc)を繰り返す工程。
【請求項１３】
前記抗原結合性構造を形成し得る組換えポリペプチドがFabフラグメントである請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
重鎖及び軽鎖の可変領域を有する抗−リーサスＤ抗体であって、該抗体は、以下の表による同一の又は異なる同定番号を有するアミノ酸配列ＶH及びＶLの組のリーサスＤ−特異的ＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列、及びＣＤＲ３配列を有する、抗−リーサスＤ抗体：
0003841360.tif 000020
【請求項１５】
請求項14の表中に示される同一の同定番号を有するアミノ酸配列ＶH及びＶLの組のリーサスＤ−特異的ＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列、及びＣＤＲ３配列を有する、重鎖及び軽鎖の可変領域を有する抗リーサスＤ抗体。
【請求項１６】
請求項14の表中に示される配列番号による同定番号を有するアミノ酸配列ＶH及びＶLの組を含有する請求項14又は15に記載の抗−リーサスＤ抗体。
【請求項１７】
免疫グロブリンの定常領域が、定義されたイソタイプIgG1、IgG2、IgG3、又はIgG4の少なくとも１つである、請求項14から16のいずれか１項に記載の抗−リーサスＤ抗体。
【請求項１８】
請求項14から17のいずれか１項に記載の完全な抗−リーサスＤ抗体の調製方法であって、該方法は以下の工程をこの順で含む:a)特定のプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応を行なうことにより、抗−リーサスＤ−Fabをコードするプラスミドから、配列表の配列番号１〜26及び29〜32に示されるリーサスＤ−特異的ＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、及びＣＤＲ３領域を各々有する、一対の重鎖Ｖ遺伝子セグメント及び軽鎖Ｖ遺伝子セグメントのメンバーを、それぞれ別個に増幅する工程;
b)ヒトγ1、γ2、γ3及びγ4重鎖のいずれか一つ及びヒトκ又はλ軽鎖をコードしている免疫グロブリン定常領域遺伝子セグメントを有する適切なプラスミド中で、完全な抗−リーサスＤ免疫グロブリン重鎖と完全な抗−リーサスＤ免疫グロブリン軽鎖とを、それぞれ別個に調製し、得られたプラスミドを別個に適切なE.coliバクテリアに形質転換する工程;及びc)得られたプラスミドを適切な真核宿主細胞にコトランスフェクトし、該細胞を培養し、形質転換しなかった細胞を除き、その培養物をクローニングし、最も生産性の高いクローンを選択し、生産用培養物としてそれを使用して、そして該細胞培養物の上清から完全な抗体を単離する工程。
【請求項１９】
請求項１から３のいずれか１項に定義される少なくとも一つのポリペプチド又は請求項14から17のいずれか１項に記載の抗−リーサスＤ抗体の少なくとも１つを含有する、新生児溶血症の予防、特発性血小板減少性紫斑病の処置及びリーサス不適合性血液の輸血ミスの処置のための薬学的組成物。
【請求項２０】
請求項４に記載のFabフラグメントあるいは請求項14から17のいずれか１項に記載の抗−リーサスＤ抗体を含有するリーサスＤ型分類のための診断薬組成物。
【発明の詳細な説明】
本発明は、リーサス（Rhesus）Ｄ抗原に対して特異性を有する抗原結合性構造を形成し得るポリペプチドに関し、特に、リーサスＤ抗原に対して特異性を有するFab分子に関する。本発明はまた、それらを用いて薬学的組成物及び診断薬組成物を提供することに関する。上記Fabフラグメントは、遺伝子工学的に設計されて完全な抗体の成分とされたとき、新生児溶血症（ＨＤＮ）の予防に有用である。本発明は上記ポリペプチドの新規なＤＮＡ配列とアミノ酸配列を提供する。
従って、その抗体は、リーサス陽性の子供の誕生前あるいは誕生直後のリーサス陰性の女性の保護のために使用されて、次の妊娠におけるＨＤＮを防止することができる。
本発明はまた、抗−リーサスＤ免疫グロブリンから得るかもしれない、他の疾患の処置、例えば、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）の処置のために、上記Fab分子単独あるいは完全な抗体として上記Fab分子とFc定常領域と組み合わせたものを適用することを包含する。
さらに、リーサス陽性血液をリーサス陰性の受血者に誤って輸血した後に、リーサスＤ抗原に対する感受性を防止するために、抗−リーサスＤ免疫グロブリンを使用することができる。さらに、本発明はこれらのFabフラグメント及び抗体の診断薬への応用に関する。
ＨＤＮは、母親の抗体に起因する胎児及び新生児の溶血性貧血の一般的な呼称である。これらの抗体は胎児の赤血球表面の抗原に結合する。これらの抗原はリーサス式、ＡＢＯ式あるいは他の血液型系に属し得る。
リーサス式血液型系は５つの主な抗原：Ｄ、Ｃ、ｃ、Ｅ及びｅを含んでいる（Issitt, P.D., Med. Lab. Sci. 45:395, 1988）。Ｄ抗原はこれらの抗原の中でも最も重要な抗原であるが、それは免疫原性が高く、リーサス不適合性妊娠中及びリーサス不適合性血液の輸血後、抗−リーサスＤ抗体を引き起こすからである。Ｄ抗原は、ヨーロッパにおけるほぼ８５％のカフカス人に見いだされ、これらの個体はリーサス陽性と言われている。Ｄ抗原を有しない個体はリーサス陰性と呼ばれている。Ｄ抗原の発現は変化し得るが、それは、低い抗原密度（以下、弱ＤあるいはＤUという）、あるいは部分的抗原性（以下、部分Ｄ抗原という）による。
リーサスＤ抗原は、赤血球の膜タンパク質であり、最近クローニングされてその一次構造が記載されている（Le Van Kim, C.ら、PNAS 89:10925,1992）。モデル化した研究により、リーサスＤ抗原は、非常に短い結合領域を有し、細胞膜の外側に広がるかあるいは細胞質中に突出する１２個のトランスメンブレン領域を有することが提案されている。
部分Ｄ表現型は、最初、赤血球上にＤ抗原を有するが血清中にはアロ抗−Ｄを有する個体で同定された（Rose, R. R.及びSanger, R., Blood groups in man, Blackwell Scientific, Oxford, U.K. 1975; Tippett, P.ら、Vox Sanguinis. 70:123, 1996）。これは、Ｄ抗原が少なくとも９つの異なるエピトープ（ｅｐＤ１からｅｐＤ９）を有するモザイク構造であると考えることにより説明される。それ故、Ｄ変異個体の中には、その赤血球がこのモザイク構造の一部を欠失し、欠如したＤエピトープに対して抗体が作成される。部分Ｄ抗原に対して抗体を作るリーサス陽性個体は、６つの主な異なるカテゴリー（ＤIIからＤVII）に分類されており、それぞれにはそのＤ抗体に異なる異常がある。さらに最近、これらのＤカテゴリーは、ヒトモノクローナル抗−Ｄ抗体のパネルに対してテストしたとき、異なる反応パターンを与えたことが示された（1996;Tippett, P.ら、Vox Sanguinis. 70:123, 1996）。この異なる反応パターンにより９つのエピトープが同定され、それによって異なる部分Ｄカテゴリーを定義する。Ｄ抗原上に存在するエピトープの数は、ある部分Ｄカテゴリーから、最小の、ｅｐＤ３、ｅｐＤ４及びｅｐＤ９を発現するＤVIカテゴリーを有する他の部分Ｄカテゴリーの間で変化する。ＤVIカテゴリーは、臨床上重要であり、それは、ＤVI女性が、新生児溶血症を引き起こすのに十分に強く免疫され得るからである。
新生児溶血症の防止に対する抗RhＤ ＩｇＧの予防効果は良好に確立されており、長年ルーチン的に使用されている。その結果、この重篤な疾患は希になってきた。それにも係わらず、この疾患に内在する原因、すなわち、RhＤ陽性の子供を妊娠しているRhＤ陰性の母親の間にある不適合性が、依然として残っており、従って治療量の抗−RhＤ IgＧを継続して投与する必要がある。
最近、抗−RhＤ IgＧの継続的な供給の保証が一層問題となってきた。同種免疫された（alloimmunized）多産のリーサス陰性の女性からの利用可能な高度免疫血清の蓄積が、予防用抗−RhＤの成功により激減した。従って、現在の生産方法では、高タイターの抗血清を製造するためにますます嫌がるドナーの一群を繰り返し免疫する必要がある（Selinger, M., Br. J. Obstet. Gynaecol. 98:509, 1991）。また、関連する危険因子及び技術的問題もある。それは例えば、Ｂ型肝炎ウイルス、エイズウイルス、及び他の未知のウイルスのようなウイルス性の疾患の伝達という危険を伴う、繰り返し免疫のためのリーサス陽性赤血球細胞を使用することである（Hughes-Jones, N.C., Br. J. Haematol. 70:263, 1988）。従って、他の方法での抗−RhＤ抗体の生産が求められている。
過去数年、高度免疫血清の種々の異なる供給源が試みられたが、すべて、欠点を有している。エプシュタイン  バール  ウイルス（ＥＢＶ）によるリンパ球の形質転換は、Ｂリンパ芽球化セルライン（B lymphoblastoid cell line）となり、それはリーサスＤ抗原に対する抗体を含む特定の抗体を分泌する（Crawfordら、Lancet. 386:Feb. 19th, 1983）が、そのセルラインは不安定であり、さらなるクローニングが要求される。また、低い形質転換効率（Ｂ細胞の１−３％）のため、潜在的なレパートリー（repertoire）の中から、ほんの限られた範囲の抗体特異性しか得られない。さらに、マウスはリーサスＤ抗原に応答しないと思われるので、キメラ抗体あるいはヒト化抗体の作成に用いることができるマウスのモノクローナル抗体は利用できない。最近まで、他の唯一の方法は、ハイブリドーマ技術を用いてヒト抗体を作成することであったが、これもまた、適切なヒトミエローマ細胞との融合パートナーがないという制限を受けていた（Kozbor, D.及びRoder, J.C., Immunol. Today. 4:72, 1983）。
従って、本発明の目的は、上記問題点を解決する、リーサスＤ抗原に対して反応性を有するFabフラグメント及びそのFabフラグメントを含む完全抗体を提供することにある。
ここ数年、レパートリークローニング技術及びファージディスプレイライブラリーの構築技術が新しい可能性を開いて、特定の特異性を有するヒト抗体が生産されるようになった（Williamson, R.A.ら、PNAS 90:4141,1993）。これらの方法が、リーサスＤ抗原に特異性を有する抗原結合性構造を形成し得るポリペプチド、特にリーサスＤ抗原及び部分Ｄ抗原に対して活性を有するFabフラグメントの生産に適用された。
レパートリークローニング法を用いるヒト抗体の生産について、近年報告されている（Barbas III, C.F.及びLerner, R.A., Companion Methods Enzymol. 2:119, 1991）が、これは末梢血Ｂ細胞からのｍＲＮＡの単離に基づいている。この方法は、天然の抗体、自己抗体あるいは免疫応答の過程において生産される抗体を単離する手段を提案する（Zebedee, S.L.ら、PNAS 89:3175, 1992; Vogel, M.ら、Eur. J. Immunol. 24:1200,1994）。この方法は、特定のドナーからの免疫グロブリン（Ig）分子をコードするｍＲＮＡを出発材料として、組換え抗体ライブラリーを構築することによる。末梢血リンパ球（ＰＢＬ）だけがドナーから単離されるので、ＰＢＬを集める直前に所望の抗原で個体をブースト（boost）しておくと、末梢血中に、特定の抗体を生産するＢ細胞を見いだす機会が増加する（Persson, M.A.A.ら、PNAS 88:2432, 1991）。ついで、全ＲＮＡが単離され、IgレパートリーのｍＲＮＡを特異的プライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）でクローン化し、その後Ig分子の重鎖及び軽鎖を線状ファージ粒子の表面で共発現させ、それによってＢ細胞に類似し、抗原に結合できる”生物体”が形成される。文献では、この方法はまた、コンビナトリアルアプローチ（combinatorial approach）として知られており、重鎖及び軽鎖が独立に組み合わされて機能的なFab抗体フラグメントとなるようにされている。このフラグメントは線状ファージのpIIIと呼ばれるテイルプロテイン（tail protein）の一つに結合している。Fab分子を有するファージ（以下、Phab粒子という）は、バイオパニング（bio-panning）として知られているプロセスにより選択されて所望の抗原特異性を得る。抗原を固体支持体に結合させ、特異的Phabはその抗原に結合するが、非特異的Phabは洗い流され、最後にその特異的Phabを固体支持体から溶出する。ついで特異的Phabを、バクテリアで増幅し、固体支持体上の抗原に再結合させて、バイオパニングのプロセス全体を繰り返す。
パニングの連続的な繰り返し、選択したPhabのバクテリアでの増幅により、特異的Phabが濃縮されるが、それはパニングのそれぞれのラウンド後にプレーティングしたときに、コロニー形成ユニット（cfu）の力価が上昇することで確認される。本発明者らの以前の経験及び発表されたデータは、特異的ファージが通常、４から６ラウンド後に検出できることを示している（Vogel, M.ら、Eur.J. Immunol. 24:1200, 1994）。上記の関連技術には、しかしながら、開示されたステップを用いて抗−RhＤ抗体のFabフラグメントをうまく調製するヒントはない。
添付の図１ａから１６ｂには、抗−RhＤ  Fabフラグメントの可変領域（Ｖ領域）をコードするＤＮＡ配列並びに対応するポリペプチド配列が開示されている。
図１７は本発明に用いられるpComb3発現系を示す。
図１８及び１９は、実施例６に記載した完全抗体の重鎖及び軽鎖の遺伝子の個々の調製を示す。
本発明は、請求項１の定義に基づいて、リーサスＤ抗原に特異性を有する抗原結合性構造を形成し得るポリペプチドに関する。請求項１の表１は、添付の図を引用する。各配列のための同定番号が与えられている。リーサスＤ特異的ＣＤＲ１領域（相補性決定領域１、complementarity determining region 1）、ＣＤＲ２領域及びＣＤＲ３領域の位置は、図面内と請求項１の表中の塩基対番号に従って示されている。本発明の好ましいポリペプチドは、図１ａ−１６ｂに示される配列による重鎖及び軽鎖の可変領域を含む抗−リーサスＤ抗体である。図１ａ、２ａ．．．．１６ａは重鎖の可変領域に関し、図１ｂ、２ｂ．．．．１６ｂは軽鎖の可変領域に関する。
さらに、本発明は、請求項６の定義に従って、抗原結合ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に関する。好ましいＤＮＡ配列は、図１ａ−１６ｂに従う、抗−RhＤ抗体のFabフラグメントの可変領域をコードする配列である。図１ａ、２ａ．．．．１６ａは重鎖に関し、図１ｂ、２ｂ．．．．１６ｂは軽鎖に関する。
また、本発明は、請求項１１に定義される組換えFabポリペプチドの調製方法に関する。
また、本発明は、請求項１２における組換えポリペプチドの選択方法に関する。
さらに、本発明は、請求項１４に定義される抗−RhＤ抗体に関し、好ましくは既知の重鎖及び軽鎖の定常領域と結合している図１ａから１６ｂにおける重鎖及び軽鎖の可変領域を含む抗−RhＤ免疫グロブリン分子である。
また、本発明は、本発明のポリペプチド、抗−RhＤ抗体あるいはFabフラグメントを含む薬剤組成物及び診断組成物に関する。
トータルの、各パニング後に得られた再増幅されたPhab集団は、例えばELISAアッセイ及びイムノドットアッセイ等の種々の方法を用いて特異性を測定できる。また、それは抗原の性質により明らかにすることもできる。例えば、抗リーサスＤPhabsは、ウサギ抗−ファージ抗体あるいは等価のクームス試薬（Coombs reagent）を架橋(cross rinking)抗体として用いる間接赤血球凝集反応で検出できる。いったんトータルのPhab集団が所望の抗原に対して陽性と同定されれば、個々のPhabクローンを単離して、この所望のFab分子をコードするＤＮＡの配列が決定される。個々のFabは、次に、pComb３発現系を用いて製造され得るが、これは、図１６に図示されている。この系において、テイルプロテインpIIIをコードするgIII遺伝子はファージミドベクターpComb3から切り出される。このことにより、バクテリアのペリプラズムに可溶性のFabが生産される。このような個々のFabフラグメントは、次に、抗原特異性をテストされ得る。
ファージディスプレイアプローチもまた、不安定なハイブリドーマセルラインからモノクローナル抗体を救出する手段として用いられてきた。これは、抗リーサスＤ抗体について報告されている（Siegel, D. L.及びSilberstein, L.E., Blood. 83:2334, 1994; Dziegiel, M.ら、J. Immunol. Methods. 182:7, 1995）。また、免疫化されていないドナーから構築されたファージディスプレイライブラリーを用いて、ヒト血液型抗原に特異的なＦｖフラグメント（すなわち、重鎖及び軽鎖の可変領域、ＶH及びＶL）が選択されてきた。このヒト血液型抗原はリーサスＤ抗原に対して反応性のある一つのＦｖフラグメントを含んでいた（Marks, J.D.ら、Biotechnology. 11:1145, 1993）。
コンビナトリアルライブラリーを構築するに際して考慮すべき重要なことは、ＲＮＡ抽出に用いる細胞源及びパニングに用いる抗原の性質である。従って、本発明においては、リーサスＤ+赤血球（rbc）を静脈内（i.v.）にブーストされた高度免疫ドナーを用いる。ドナーのＰＢＬが静脈内ブースト後５日目及び１８日目に集められて、２つのコンビナトリアルライブラリーを構築するのに使用された。以下、それぞれ、ライブラリーＤ１（ＬＤ１）とライブラリーＤ２（ＬＤ２）という。集めたＰＢＬの二重免疫蛍光分析を、パンＢ細胞（pan B cell）及びリンパ芽球のそれぞれのマーカーＣＤ２０及びＣＤ３８を用いて行った結果、形質転換細胞(plasma cell)形態のリンパ芽球Ｂ細胞（lymphoblastoid B cell）の割合が正常より高いことが示された。一般的には、正常な場合、形質細胞は末梢血中では１％より少ないので、多数の形質細胞が末梢血中で見出されるのは非常にめずらしい。これは、おそらく、ドナーが高い割合でリーサスＤ抗原に特異性を有する循環性のＢ細胞を有していることを示す。
ライブラリーを構築後、リーサスＤ抗原に特異的なPhabを、表現型Ｒ１Ｒ１（ＣＤｅ／ＣＤｅ）の新鮮な無傷のrbc、すなわち、リーサスＤのタイプ分けに用いる対照細胞を用いるバイオパニングにより選択した。これは、必要であった。なぜなら、リーサスＤ抗原は、417のアミノ酸を有する膜内在性タンパク質であり（Le Van Kim, C.ら、PNAS 89:10925, 1992）、精製の過程でその免疫原性を失い（Paradis, G.ら、J. Immunol. 137:240, 1986）、それゆえ、化学的に精製されたＤ抗原は、このシステムで既に選択された他の抗原特異性のように免疫反応性Phab選択用の固相に結合できない（Vogel, M.ら、Eur. J. Immunol. 24:1200, 1994）。モデル研究の結果、リーサスＤ抗原の非常に短い結合領域は細胞膜の外側に広がるか、細胞質内に突出していることが示唆された
0003841360.tif 000002
このように、抗体に認識され得るRhＤ抗原の部分は比較的限られており、構造的に制約されているようである。Ｄ膜タンパク質のある特定のエピトープを本質的に欠失している部分Ｄ表現型に対して反応性のあるPhabの選択を考えるとき、Ｄ抗原の上記側面を考慮することはPhabの選択に際してより重要となる（Mouro, I.ら、Blood. 83:1129, 1994）。
さらに、無傷のrbcは、Ｄ抗原を発現するだけではないので、rbc上の他の抗原性タンパク質と反応するPhabを吸着して除くために、リーサスＤ陰性rbc上での一連の非吸着試験を行なわねばならない。
このパニング手順をＬＤ１及びＬＤ２ライブラリーの両方に由来するPhabについて行い、ライブラリーＬＤ１から６個の異なるFab生産クローンを、ライブラリーＬＤ２から８個の異なるFab生産クローンを、そしてＬＤ１とＬＤ２とをプールしたライブラリーから２個のFab生産クローンを単離した。
それらの命名と配列がリストされている図番を、表１に示す。
0003841360.tif 000003
上記Fabクローンは、リーサスＤ抗原と、５個のテストしたＤurbc中の３個に排他的に反応性であり、Rh33、ＤIII、ＤIVa、ＤIVb、ＤVa、ＤVIIの部分Ｄ表現型に対する凝集反応性を有している。
しかし、Phabのパニングに上記Ｒ１Ｒ１rbcを用いたとき、部分ＤVI表現型に反応性のクローンは選択されなかった。組換えライブラリーの構築に際してテストした最初の高度免疫ドナーの血清はＤVI表現型に反応性であったので、組換えライブラリーもまた抗−ＤVI特異性を有するはずである。
ＤVI反応性を選択するために、パニング条件を変えて異なる細胞を用いた。rbcがタイプ分けされ、部分ＤVI表現型を発現することが知られている特定のドナーを細胞源としてＬＤ１及びＬＤ２ライブラリーの再−パニングを行なった。この第２の一連のパニングは一連の第１のパニングと本質的に同様の方法で行なったが、Ｒ１Ｒ１の代わりにＤVIrbcを用い、ＤVIrbcにブロメラーゼ（bromelase）処理を加えた点が異なった。ＤVI表現型はリーサスＤエピトープの最少数を発現し、それゆえに、それに対する抗体を作成することが困難である。リーサスＤ陰性個体から作成されたポリクローナル抗−Ｄは、選択しなかった場合わずか１５％、選択した場合３５％が、ＤVI＋細胞と反応したことが報告されている（Mouro, I.ら、Blood. 83:1129, 1994）。ブロメラーゼ処理によりN−アセチルノイラミン酸（シアリル酸）がrbc膜から除かれるが、リーサスＤVIエピトープが、予め吸着したPhabと、パニングしている間に、より接近できるようにするためにブロメラーゼ処理を行った。
ＬＤ１ライブリーに対するこの第２の一連のパニングで１個のFab生産クローンLD1-6-17が取得された。命名を表２に示す。
0003841360.tif 000004
しかし、このクローンはリーサス対立遺伝子（allele）Ｃ及びＥと反応性であり、ＤVI陽性rbcに擬陽性反応を示した。これは、また、Ｃ対立遺伝子を発現させるＤVIドナーの表現型（CcDVIee）によるものであり、リーサス陰性rbc（ccddee）に吸着、除去されなかった。
そこで、吸着相に異なるrbcを用いて、第三の一連のパニングをＬＤ１とＬＤ２とをプールしたライブラリーについて行なった。ＤVI陽性rbcにおける吸着工程と溶出の両方においてブロメラーゼ処理及び非処理の両方のrbcを用いて、パニングを６ラウンドした後、Phabの全体集合を得た。このPhabは表現型Ｒ１Ｒ１（CCDDee）のrbc並びにＤVI変異体を発現する２つのドナーと排他的に反応した。
第三の一連のパニングをＬＤ１およびＬＤ２のライブラリーについて行なった結果、ＤV1＋rbcと反応する２個のFab生産クローンを得た。命名を表３に示す。
0003841360.tif 000005
従って、合計１６個の異なる抗−リーサスＤFabクローンが単離された。これらのクローンからＤＮＡを単離し、ABI373A Sequencing Systemを用いる蛍光サイクル配列決定法を用いて配列を決定した。このFabクローンのヌクレオチド及び対応するアミノ酸配列は本発明の基礎を形成する。
配列解析により、同一のＶH遺伝子セグメントを有するが、異なるＶL遺伝子セグメントを有するいくつかのクローンが単離されたことが明らかにされた。これは、それぞれ２つのクローンLD2-1及びLD2-10、２つのクローンLD2-4及びLD2-11、及び３つのクローンLD2-14、LD1/2-6-3及びLD1/2-6-33の場合である。
得られたＤＮＡ配列及びFabフラグメントはリーサスＤ抗原に対する活性を有する完全抗体の調製に有用である。このような抗体の好ましい発現系は、マウスミエローマ細胞あるいはチャイニーズハムスター卵巣細胞である。
以下に記載の実施例は本発明を詳細に説明するものであり、本発明の範囲を限定するものではない。
実施例１は２つのコンビナトリアルライブラリー；特に前記ＬＤ１及びＬＤ２ライブラリーの構築について記載する。
実施例２はこのＬＤ１及びＬＤ２ライブラリーの、Ｒ１Ｒ１rbcを用いる一連のパニングについて詳細に記載する。
実施例３は、吸着のためのブロメラアーゼ処理rbc及びブロメラーゼ非処理rbcの両方を使用する一連のパニング、並びにブロメラーゼ処理したＤVI陽性rbcとプールしたＬＤ１及びＬＤ２ライブラリーを用いる一連のパニングについて記載する。
実施例４は、パニング後のリーサスＤ特異的Phabの濃縮と特異性をモニターするために、ウサギ抗−ファージ抗体を等価のクームス試薬として用いて間接赤血球凝集反応アッセイについて記載する。
実施例５は、診断薬に適用するためのFab抗体フラグメントの調製と精製について記載する。
実施例６は、本発明の配列を用いる完全な抗−リーサスＤ免疫グロブリンの調製について記載する。
実施例１
組換えＬＤ１及びＬＤ２ライブラリーの構築
a)リンパ球源
高度免疫リーサスＤドナーのボランティア集団のメンバーである成人男性に、静脈内に、血液型Ｏ RhＤ+の男性ドナーからのパックされた２mlのrbcをブーストした。ブースト投与後５日目と１８日目にＰＢＬを集めて、フィコール濃度勾配遠心分離で単核細胞（ＭＮＣ）を単離した（Lymphoprep、Pharmacia、ミルウォーキー、WI）。５日目のドナーのリンパ球解析結果を表４に示す。５日目のＭＮＣから、フェノール-クロロホルムグアニジンイソチアネート法を用いて、直接ＲＮＡを調製した（Chomczynski, P.及びSacchi, N., Anal. Biochem. 162:156, 1987）。１８日目のMNCを、ＲＮＡを抽出する前にまず、103U/mlのIL-2 Sandoz Research Center、ウイーン、オーストリア）及び10μg/mlのポークウィードマイトジェン（ＰＷＮ;Sigma L9379、ブッフス、スイス）を含むRPMI-1640培地（Seromed、バーゼル）で３日間培養した。
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ｂ）ライブラリーの構築
静脈内にブーストしてから５日目と１８日目（最終的にはＰＷＮ刺激の３日を含めて２１日目）に集めた細胞に対応するＬＤ１及びＬＤ２（詳細は上記）という２つの独立したライブラリーをそれぞれ構築した。ついで、これらの細胞からフェノール-クロロホルムグアニジンイソチアネート法により、全ＲＮＡを調製した。このＲＮＡの10μgを用いてｃＤＮＡを合成した。ｃＤＮＡの合成は、供給者（Boehringer Mannheim、ドイツ）が指示する条件で、オリゴ（ｄＴ）プライマー（400ng）とM-MuLV逆転写酵素を用いる逆転写で行った。ＰＣＲ増幅は、Vogel, M.ら、E.J. of Immunol. 24:1200, 1994に記載の方法で行った。簡単に述べると、100μlのＰＣＲ反応液は、10mM MgCl2を含むパーキンエルマー（Perkin-Elmer）緩衝液、5μl ｃＤＮＡ、150ngの、それぞれ適切な５’及び３’プライマー、それぞれ200μMの４つのすべてのdNTP及び２U/mlのTaqポリメラーゼ（Perkin Elmer、NJ）を含んでいた。Fab分子の重鎖及び軽鎖のＰＣＲ増幅を、Stratacyteからのプライマーセット（詳細は後述）を用いてそれぞれ別個に行った。重鎖については、ＶH遺伝子のそれぞれの６個のファミリーとハイブリダイズすう６個の上流プライマーを用いたのに対して、軽鎖については、１つのカッパ及び１つのラムダプライマーを用いた。下流のプライマーは、重鎖については、定常ドメインγ１及びγ３のヒンジ領域にマッチするように設計した。軽鎖については、下流プライマーはカッパ及びラムダ定常ドメインの３’末端にマッチしていた。重鎖及び軽鎖のＰＣＲ生成物を別々にプールし、ゲル精製し、XhoI/SpeI及びSac1/Xba１制限酵素（Boehringer Mannheim）で、それぞれ切断した。ＰＣＲ生成物を消化後、フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコールで一度抽出し、ゲルを切出して精製した。XhoI/SpeI消化Fdフラグメントとそれに続くSac1/Xba1消化軽鎖のｐComb3ベクターへの挿入、XL1-Blue細胞への形質転換、及びファージの生産は、Barbas III, C.F.及びLerner, R.A., Companion Methods Enzymol. 2:119, 1991の記載に基づいて行った。XL1-Blue E.coli細胞への形質転換後、サンプルをとり、プレートにタイターしてライブラリーサイズを決定した。これらの結果は、ＬＤ１及びＬＤ２について、それぞれ、7.5x106及び7.7x106cfu（コロニー形成ユニット）の発現ライブラリーであった。
ｃ）ＰＣＲプライマー
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ｄ）ベクター及びバクテリア株
Fdと軽鎖のクローニングに用いられたpComb3ベクターは、Scripps Research Instituteラホヤ、CA;(Barbas III, C.F.及びLerner, R.A., Companion Methods Enzymol. 2:119, 1991)から入手した。pComb3ベクターによる形質転換に用いられたE.coli株XL1-Blueと、VCSM13ヘルパーファージはStratacyte（ラホヤ、CA）から購入した。
実施例２
Ｒ１Ｒ１rbcを用いるＬＤ１及びＬＤ２ライブラリーからのリーサスＤ Phabの選択
ａ）吸着及びバイオ-パニング
Ｏ型Rh陽性rbc（Ｒ１Ｒ１）でのポジティブ選択の前に、一連の３回の、Ｏ型Rh陰性rbcへのネガティブ吸着をそれぞれのパニングラウンドについて行なった。新鮮なrbcをＡＣＤ（酸−クエン酸−デキストロース）抗凝固剤中に集め、0.9％NaClで３回洗浄した。rbcをヘイエム（Hayems）溶液中でカウントし、40×106/mlに調整した。吸着：PBS/3％BSA中のファージ調製物１mlを、12mlチューブ（Greiner 187261、ライナッハ、スイス）中のＯ型Rh陰性rbcペレット（16×106rbc）に加えて、注意深く振盪しながら、室温で30分、インキュベートした。すべてのチューブが、PBS/3％BSA中で、室温で最低でも１時間、予めブロックされた。rbcを300×ｇ、5分、４℃で遠心分離し、ペレット化した。得られたファージ上清を注意深く集めた。このプロセスをさらに２回繰り返した。最後の吸着後、ファージ上清をＯ型Rh陽性rbcペレット（16×106rbc）に加えて、ゆっくり振盪しながら、室温で30分、インキュベートした。次に、rbcを少なくとも５回、10mlの氷冷PBSで洗浄し、300×ｇ、5分、４℃で遠心分離し、200μlの76mMのクエン酸pH2.8を用いて６分、室温で溶出し、200μlの１Mトリスで中和した。rbcを300×ｇ、5分、４℃で遠心分離し、溶出したファージを含む、得られた上清を注意深く取り出して、キャリアータンパク（0.3％BSA）とともに４℃で保存し、再増幅に備えた。各パニングラウンドのリーサスＤ特異的Phabの数を表５に示す。
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実施例３
ＤVI＋rbcを用いるプールしたＬＤ１及びＬＤ２ライブラリーからのリーサスＤ Phabの選択
ａ）rbcＯ型Ｒｈ陰性、表現型１（r'r、Ccddee）及び２（ryry、CCddEE）への吸着
Ｏ型RhＤVI陽性rbcでのポジティブ選択の前に、一連の４回の、Ｏ型Rh陰性rbcへのネガティブ吸着をそれぞれのパニングラウンドについて行なった。ネガティブ吸着は以下の順序で行なった：ステップ１）ブロメラーゼ処理された表現型１；ステップ２）ブロメラーゼ非処理の表現型１；ステップ３）ブロメラーゼ処理表現型２；ステップ４）ブロメラーゼ非処理表現型２。凍結rbcをソルビットとリン酸緩衝化生理食塩水との混合液中で解凍し、最低でも10分間この液の中に放置し、５ないし６回リン酸緩衝化生理食塩水で洗浄し、最後に安定化溶液（DiaMed EC-溶液）に保存し、使用に備えた。パニングの前に、rbcを３回、0.9％NaClで洗浄し、ヘイエム溶液中でカウントした。吸着：PBS/3%BSA中のファージ調製物１mlを12mlチューブ（Greiner 187261、ライナッハ、スイス）中のステップ１のrbcペレット（2×108）に加え、注意深く振盪しながら、室温で30分、インキュベートした。すべてのチューブを、PBS/3％BSAで室温で最低でも１時間、予めブロックした。rbcを、300×ｇ、5分、４℃で遠心分離し、ペレット化した。得られたファージ上清を注意深く集めた。このプロセスを、上記詳述したステップ２、３、及び４のrbcを用いて繰り返した。
ｂ）rbcリーサスＤ陰性r'r及びryry並びにリーサスＤVI＋のブロメラーゼ処理ブロメラーゼ30（Baxter、デュディンゲン、スイス）を用いて、rbcリーサスＤVI＋を処理した。その処理には、通常の赤血球凝集反応アッセイに使用するのと同じ割合、すなわち、2×106rbc当たり10μlのブロメラーゼを用いた。このように、ブロメラーゼを必要量のrbcに対して加えて37℃、30分インキュベートし、ついで３回、0.9％NaClで洗浄し、ヘイエム溶液中で再びカウントしてから、PBS/3％BSA中で必要な濃度に調整し、Phabパニングに用いた。
ｃ）ブロメラーゼ処理リーサスＤVI+rbcのバイオ−パニング
非ブロメラーゼ処理rbc ryryの最後の吸着処理後、ファージ上清溶液を２等分し、酵素処理又は非酵素処理のrbc Ｏ型Rh ＤVI+ペレット（40×106）にそれぞれに加えて、ゆっくり振盪しながら、さらに、室温で30分、インキュベートした。次に、rbcの２つの集団を少なくとも５回、10mlの氷冷PBSで洗浄し、300×ｇ、5分、４℃で遠心分離し、200μlの76mMのクエン酸pH2.8を用いて６分、室温で溶出し、200μlの１Mトリスで中和した。rbcを300×ｇ、5分、４℃で遠心分離し、得られたブロメラーゼ処理又は非ブロメラーゼ処理ＤVI+rbcから溶出したファージを含む上清を注意深く取り出して、キャリアータンパク（0.3％BSA）とともに４℃で保存し、再増幅に備えた。さらなるパニングのラウンドでは、ブロメラーゼ処理又は非ブロメラーゼ処理ＤVI+から溶出したファージを別々に保存し、それぞれを吸着プロトコールステップ１から４に用いた。溶出ステップはパニングラウンド１と比較して少し異なっていたが、それは、ファージ集団は、以降２分割されなかったからである。ブロメラーゼ処理ＤVI+rbcから溶出したファージだけは、再び、ブロメラーゼ処理ＤVI+rbcから溶出させ、ブロメラーゼ非処理ＤVI+rbcから溶出したファージだけは、再び、ブロメラーゼ非処理ＤVI+rbcから溶出させた。各パニングラウンド後のＤ特異的Phabの数を表６に示す。
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実施例４
パニングラウンドのモニタリングとウサギ抗−ファージ抗体を用いた濃縮Phabの特異性の決定
間接的赤血球凝集反応活性
異なるＡＢＯ血液型及びリーサス血液型の新しく採取したrbcを0.9％NaClで３回洗浄し、0.9％NaCl又はPBS/3％BSAのいずれかの3−5％溶液（45-50×107/ml）に調整した。それぞれのテスト条件は、50μlrbcと100μlテストサンプル（沈殿した及び増幅したファージ又はコントロール抗体）とをガラス製血液型分離チューブ（Baxter、デュディンゲン、スイス）で共に30分、37℃でインキュベートした。rbcを0.9％NaClで３回洗浄し、陽性コントロールとしてのクームス試薬（Baxter、デュディンゲン、スイス）を２滴加えてインキュベートするか、又は、100μlの1/1000希釈ウサギ抗−ファージ抗体とインキュベートした。ウサギ抗−ファージ抗体は、ウサギをファージVCSM13調製物で免疫し、Affi−Gel Blueカラムで精製し、E.coliに吸着させて、E.coli特異的抗体を除去して得られた。チューブを20分、37℃でインキュベートして、125×ｇで、１分、遠心分離し、rbcの凝集反応は、注意深く振盪し、拡大鏡で観察した。
精製Fabの凝集反応テストには、ウサギ抗−ファージ抗体の代わりに親和性で精製した抗−Fab抗体（The Binding Site、バーミンガム、英）を用いた。
表７は、Ｒ１Ｒ１rbcを用いる異なるパニング後のPhabサンプルの赤血球凝集反応テストをしたときの結果を示す。
表８は、リーサスＤVI+rbcを用いる異なるパニング後のPhabサンプルの赤血球凝集反応テストをしたときの結果を示す。
表９は、ＬＤ１及びＬＤ２ライブラリーからの個々のFabクローンと部分Ｄ変異体との反応性のパターンを示す。
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実施例５
診断薬に適用するためのFab抗体フラグメントの調製と精製
実施例２及び３で詳述したバイオ−パニング手順の後に、リーサスＤ+rbcに特異的に凝集反応活性を示すファージ集団を選択して、ファージミドＤＮＡの調製に使用した。より詳細には、ＬＤ１及びＬＤ２ライブラリーに対して、それぞれ、バイオ−パニングの５回目及び６回目のラウンド後、及びLD-1-6-17クローンを単離するためにＤVI+rbcの５回のバイオ−パニングを行った後のＲ１Ｒ１で選択したPhabを用いた。可溶性Fabを生成するために、ファージ粒子のpIIIテイルプロテインをコードするgIII配列を削除しなければならなかった。
Nucleotrapキット（Machery-Nagel）を用いてファージミドＤＮＡを調製し、この単離されたファージミドＤＮＡから、Nhe1/Spe1を用いて消化して、gIII配列を除去した。この方法は、Burton, D.R.ら、PNAS, 1989に記載されている。XL1-Blueに形質転換後、個々のクローンを選択し（命名は表１に記載）、50μg/mlのカルベニシリンを含むLB培地（Luria  broth）で、37℃で、600nmのＯＤが0.6になるまで培養した。培養物を2mMのイソプロピルβ-D-チオガラクトピラノシド（IPTG）（Biofinex、プラロマン、スイス）で誘発し、37℃、一夜生育させた。培養物全体を、10,000×gで30分間、4℃で遠心分離し、バクテリアとペレットとした。このバクテリアペレットをリゾチーム/ＤＮＡ分解酵素溶液で処理し、細胞内のFabフラグメントを遊離した。培養上清に遊離されるFabもあるので、これも別個に集めた。次にこれらのFab調製物をプールして、60％の硫酸アンモニウム（Merck,ダルムシュタット、ドイツ）で沈殿させてFabを濃縮し、リン酸緩衝化生理食塩水（PBS）で透析し、200,000×gで超遠心してあらゆる不溶性の複合体をペレット化した。Fab調製物をセラミックのヒドロキシアパタイトカラム（HTP Econo cartridge, BioRad,グラットブルグ、スイス）にかけ、PBS（緩衝液Ａ）及びPBS＋0.5M NaCl（緩衝液Ｂ）の濃度勾配溶出を用いて精製した。直線勾配は、40分間で0-100％に緩衝液Ｂが増加するようにプログラムされた。Fabは緩衝液Ｂ40-60％の間で単一ピークとして溶出した。抗−Fabパーオキシダーゼ融合物（The Binding Site、バーミンガム、イギリス）を用いたイムノドットアッセイで検出した陽性フラクションをプールし、ポリエチレングリコールとPBSに対する透析により濃縮した。各クローンについてのヒドロキシアパタイトカラムからの陽性フラクションが、ガラスチューブ中での標準的な間接赤血球凝集反応アッセイに用いられ、このアッセイには、標準クームス試薬（Baxter Diagnostics AG Dade、抗ヒト血清）あるいは抗−Fab（The Binding Site、バーミンガム、イギリス）を架橋試薬として用いた。部分Ｄ変異体に特異性を有すると決定されたこれらのFab（18頁に記載）を用いて、rbcの未知の部分Ｄ変異体の型が決定できる。
実施例６
完全な免疫グロブリン遺伝子の構築
LD2-14重鎖Ｖ遺伝子（ＶH遺伝子）を、抗−リーサスＤ−FabをコードするプラスミドLD2-14を用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で増幅した。ＰＣＲには特定のプライマーを用いた。5'-プライマーは、以下の配列を有していた：
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これに対して、３'-プライマーは、以下の配列を有していた：
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ＰＣＲ反応は、Deep Vent ＤＮＡポリメラーゼと緩衝液（2mM  Mg++）をNew England Biolabsから購入し、製造者が推奨する、100pmolの各プライマー、及びそれぞれ250μMの濃度の４種のデオキシヌクレオチドを含む条件下で行なった。反応は30サイクル行い、以下の温度ステップであった：94℃で60秒（第１サイクルでは２分まで延長）、57℃で60秒、72℃で60秒（最後のサイクルでは10分まで延長）。増幅後の３’−A突出部の付加は、その後の72℃で10分間、１ユニットのTaq ＤＮＡポリメラーゼ（Boehringer Mannheim、ドイツ）の存在下、インキュベートすることにより行なった。ＰＣＲ生成物は、QIAquick ＰＣＲ増幅キット（Qiagen、スイス）で精製し、InvitrogenのTAクローニングキット（サンディエゴ、米国）を用いて、ベクターPcriiでクローン化した。生じたプラスミドTAVH14を、SalIとBstEIIで消化して、Quiagen社のQIAquickゲル抽出キットを用いる調製用アガロースゲル電気泳動により、ＶH遺伝子を単離した。
無関係であるが完全なヒトゲノムの免疫グロブリンVH遺伝子を含有するベクター＃150（Sandoz Pharma、バーゼル）をSalIとBstEIIで切断して、Quiagen社のQIAquickゲル抽出キットを用いる調製用アガロースゲル電気泳動により、ベクターフラグメントを単離した。ベクターとＰＣＲ生成物との結合は25℃で2時間、迅速ＤＮＡ結合キット（Boehringer Mannheim、ドイツ）を用いて、全容量20μlで行なった。結合に続いて、反応混合物を20μlの水で希釈し、10倍容量のn-ブタノールで塩類を取り除いた。次いで、ＤＮＡを遠心分離でペレットとし、真空乾燥し、10μlの水に再度懸濁した。このＤＮＡ溶液の5μlを、40μlのエレクトロポレーション（electroporation）に適用性のE.coli XL1-blue MRF'（Stratagene、ラホヤ）に、GenePulser（BioRad、Gaithersburg）によりエレクトロポレーション（0.1cmキュベット，1.9kV，200Ω，25μFD）して、SOC培地で希釈して37℃、1時間培養し、アンピシリン（50μg/ml）を含むLBプレートにプレーティングした。生じコロニーのプラスミド−ミニプレプ(minipreps)（Qiagen、バーゼル）を制限酵素切断でチェックし、適切な挿入物の存在を確認した。
この手順において、無関係に存在するベクター＃150のＶH遺伝子を、増幅したLD2-14の抗-リーサスＤ  ＶH配列で置換し、プラスミドcassVH14を作成した。生じた免疫グロブリンＶH遺伝子構築物の構造は、配列決定により確認し、EcoRI及びBamHIで切り出し、上記のようにゲル精製を行なった。発現ベクター＃10（Sandoz Pharma、バーゼル）は、ヒトゲノム免疫グロブリンＣγ１遺伝子セグメントを有しているが、これもまた、EcoRI及びBamHIで消化し、調製用アガロースゲル電気泳動で単離し、EcoRI/BamHI-ＶH遺伝子セグメント（これは、先にプラスミドcassVH14から得られた）と結合させ、そしてE.coli XL1-blue MRF'に、上記の概略のように、エレクトロポレーションした。これにより、完全な抗−リーサスＤ重鎖免疫グロブリン遺伝子が発現ベクター14IgG1（図及び）に含まれた。
LD2-14軽鎖Ｖ遺伝子（ＶL遺伝子）を同じ抗−リーサスＤ−FabプラスミドLD2-14から、ＰＣＲで増幅した。ＰＣＲには特定のプライマーが用いられた。5'-プライマーは、以下の配列を有していた：
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これに対して、３'-プライマーは、以下の配列を有していた：
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ＰＣＲ反応、生成物の精製およびそれに続くクローニング工程は、ＶH遺伝子について記載した工程と同様であったが、適切な軽鎖ベクターが用いられた点が異なる。簡単に述べると、ＶLＰＣＲ生成物をpＣＲIIベクターでクローン化してプラスミドTAVL14を作成し、そこからMluI及びHindIIIで切り出してゲル抽出により単離した。次に、ＶL遺伝子をベクター＃151（Sandoz Pharma、バーゼル）のMluI及びHindIII部位にクローニングし、無関係に存在するＶL遺伝子を、増幅したLD2-14の抗−リーサスＤ−ＶL配列で置換した。このようにして生じたプラスミドcassVL-14の配列を確認して、ＶL遺伝子に含まれるEcoRI/XbaIフラグメントを、ベクター＃98（Sandoz Pharma、バーゼル、スイス）のEcoRI及びXbaI部位にサブクローニングした。このベクター＃98は、ヒトゲノム免疫グロブリンＣκ遺伝子セグメントを有している。この手順により、プラスミド＃98中の無関係に存在するＶL遺伝子を置換し、完全な抗−リーサスＤ軽鎖免疫グロブリン遺伝子を有する発現ベクター14kappaを作成した。
発現ベクター14IgG1と14kappaを、それぞれ唯一の制限酵素切断部位EcoRI及びNotIで予め線状にしてから、マウスミエローマセルラインSP2/O-Ag 14（ATCC CRL 1581）にエレクトロポレーションでコトランスフェクトした。エレクトロポレーシンは以下のように行なった：対数増殖期の細胞を２度洗浄し、リン酸緩衝化蔗糖溶液(272 mM sucrose, 1mM MgCl2, 7mM NaH2PO4, pH7.4)に2×107細胞/ml濃度で懸濁した。0.8mlの細胞を0.4cmのキュベット（cuvette）に加え、15μgの線状化したプラスミド14IgG1と14kappaとを混合し、15分間氷冷した。290Volts, 200Ω, 25μFDでエレクトロポレーションを行い、再び15分間氷冷し、20mlの冷RPMI 1640培地（10%熱失活牛胎児血清、50μM β-メルカプトエタノールを含む）を有するＴ75細胞培養フラスコに移し、2時間室温に放置し、ついで、37℃で60時間インキュベートした。この期間の経過後、細胞を1mg/mlのG418を含む50mlの培地に移し、選択した。メトトレキセートの濃度を増加させながら組み込まれたＤＮＡを増幅させて、安定なトランスフェクタント（transfectant）を選択した。それ故、対応する抗体ｒD2-14の発現を増加させた。
培養物の上清（SｒD2-14）中のｒD2-14の発現を、ヒトγ１及びカッパ鎖に特異的な酵素免疫吸着測定法(ELISA)で検査した。Ph.Eur.に従って抗−Ｄアッセイで、リーサスＤ特異的免疫グロブリンを定量すると、この上清には、1.1から11.4μg/mlの間の凝集反応する抗体が含まれていることが判った。それらのリーサス陰性rbcに対する凝集反応陰性をテストしたところ、部分Ｄ変異体に対しては.coliで発現したFab LD2-14と同じ凝集反応能力を示した。データを表１０に示す。
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【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図９ａ】
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【図９ｂ】
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【図１０ａ】
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【図１０ｂ】
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【図１１ａ】
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【図１１ｂ】
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【図１２ａ】
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【図１２ｂ】
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【図１３ａ】
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【図１３ｂ】
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【図１４ａ】
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【図１４ｂ】
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【図１５ａ】
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【図１５ｂ】
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【図１６ａ】
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【図１６ｂ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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