(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（Ｉ）：
【化１】
0003740716.tif 000010
（式中、Ｒは
【化２】
0003740716.tif 000011
を表し、Ｙはイオウ原子を表し、Ｘはハロゲン原子を表す。但し、環Ａはニトロ基、ハロゲン原子又は炭素数１〜６のアルキル基を置換基として有していても良い。）で示されるアシルチオコリン誘導体。
【請求項２】
アシルチオコリン誘導体が、2-テノイルチオコリンハライド、3-フルオロ-2-テノイルチオコリンハライド、5-フルオロ-2-テノイルチオコリンハライド、3-クロロ-2-テノイルチオコリンハライド、5-クロロ-2-テノイルチオコリンハライド、5-ブロモ-2-テノイルチオコリンハライド、3-メチル-2-テノイルチオコリンハライド、4-メチル-2-テノイルチオコリンハライド、5-メチル-2-テノイルチオコリンハライド、3,5-ジメチル-2-テノイルチオコリンハライド、5-エチル-2-テノイルチオコリンハライド、3-テノイルチオコリンハライド、5-フルオロ-3-テノイルチオコリンハライド、2-クロロ-3-テノイルチオコリンハライド、5-ブロモ-3-テノイルチオコリンハライド、2-メチル-3-テノイルチオコリンハライド、5-メチル-3-テノイルチオコリンハライド又は2,5-ジメチル-3-テノイルチオコリンハライドである、請求項１に記載の誘導体。
【請求項３】
アシルチオコリン誘導体が、5-メチル-2-テノイルチオコリンアイオダイド、2-テノイルチオコリンアイオダイド、5-クロロ-2-テノイルチオコリンアイオダイド、3-メチル-2-テノイルチオコリンアイオダイド又は3-テノイルチオコリンアイオダイドである、請求項１に記載の誘導体。
【請求項４】
偽性コリンエステラーゼを含む試料と、請求項１〜３の何れかに記載のアシルチオコリン誘導体とを反応させ、偽性コリンエステラーゼの作用により遊離したチオコリンを測定し、その測定結果に基づいて偽性コリンエステラーゼの活性を求めることを特徴とする、偽性コリンエステラーゼの活性測定方法。
【請求項５】
請求項１〜３の何れかに記載のアシルチオコリン誘導体を基質として含んで成ることを特徴とする、偽性コリンエステラーゼ活性測定用試薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、偽性コリンエステラーゼ（コリンエステラーゼ  Ｅ．Ｃ．３．１．１．８）の活性測定用の基質として有用なアシルチオコリン誘導体及び該化合物を基質として用いる偽性コリンエステラーゼ活性測定法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
コリンエステラーゼは、コリンエステル類をコリンと有機酸に加水分解する酵素の総称であり、その臓器分布、生化学的性質から２種に類別されている。
血中に存在するコリンエステラーゼの内、神経組織、赤血球等に存在しアセチルコリンを至適基質とするコリンエステラーゼを特に真性コリンエステラーゼ（アセチルコリンエステラーゼ  Ｅ．Ｃ．３．１．１．７）と呼び、肝臓、膵臓、血清中等に存在し非コリン性エステルをも加水分解する酵素を偽性コリンエステラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．１．８コリンエステラーゼ）と呼んでいる。
この内日常の臨床検査で測定されるのは偽性コリンエステラーゼであり、その活性の測定は、肝疾患、特に肝実質障害の診断指標として重要である。
【０００３】
血清中の偽性コリンエステラーゼ活性の測定方法は種々報告されており、合成基質を使用した活性測定法は、日常の臨床検査分野に実用化されているものもあるが、これらの方法は各々に測定系特有の測定誤差要因があり、測定値の不正確さ等の問題を抱えている。
従来の測定方法の例を挙げるとアセチルコリンを基質とする測定法とベンゾイルコリン等の合成基質を用いる方法とに大別される。
アセチルコリンを基質とする方法の代表的なものとしては、例えば▲１▼  検圧法〔 R. Ammon, Pfluger's Arch, Ges Physiol., 233, 487(1933)〕、▲２▼  pHメー ター法〔 H. O. Michel, J. Lab & Clin.Med., 34, 1564(1949)〕、▲３▼  pH指示 薬比色法（指示薬別にフェノールレッド法〔高橋浩，柴田進：医学と生物学，20，96(1951)〕、ブロムチモールブルー法〔 H. G. Biggs, et al., Amer. J.Clin. Path., 30, 181(1958)〕, m-ニトロフェノール法〔佐々木匡秀：臨床病理，12，555(1964)〕等とも呼ばれる。）が挙げられ、合成基質を用いる方法の代表的なものとしては、例えば▲１▼ベンゾイルコリンを基質とする方法〔岡部紘明，他：臨床病理，25，751(1977)〕、▲２▼オルトトルオイルコリンを基質とする方法〔特開昭５４−１３８５３３号公報〕、▲３▼p-ヒドロキシベンゾイルコリンを基質とする方法〔特開昭５７−１１０１９８号公報、特開昭５８−１２９９９９号公報等〕、▲４▼ベンゾイルコリンを基質とする方法〔 W. Kalow and K. Genet, Canad. J.Biochem. & Physiol., 35, 339(1957)〕、▲５▼ジヒドロキシベンゾイルコリンを基質とする方法〔特開昭６０−２３８０００号公報、特開昭６２−２４４３９７号公報等〕、▲６▼ブチリルチオコリンを基質とする方法〔P. J. Garry and J. I. Routh, Clin. Chem., 11, 91(1965)〕、▲７▼２，３−ジメトキシベンゾイルチオコリンを基質とする方法〔M. Yamada, et al., Chem.Pharm. Bull., 35, 1941(1987)、特開昭６２−１０３０６０号公報〕等が挙げられる。
【０００４】
しかしながら、アセチルコリンを基質とした測定法には、偽性コリンエステラーゼのみならず混在する真性コリンエステラーゼの活性も併せて測定してしまうため測定結果の信頼度が低いという問題点がある。
これに対し、合成基質を用いた測定法は、偽性コリンエステラーゼに対する特異性が高いことから、実際の臨床分野での測定に利用されている。
特に、例えばブチリルチオコリン、2,3-ジメトキシベンゾイルチオコリン等のチオコリンを基質として用いる測定法（チオコリン法）は、その他の合成基質を用いる方法、例えば複雑な酵素系を使用するため変動因子が多くなり再現性や測定精度等の点で問題のある酵素法（より具体的には、例えばベンゾイルコリン等の合成基質を使用する方法。）や、ＵＶ法（より具体的には、例えばp-ヒドロキシベンゾイルコリン、ベンゾイルコリン、ジヒドロキシベンゾイルコリン等の基質を使用する方法。）等に比較して、反応機構が明解で測定精度が高いという長所を有しているため、広く利用されてる。
【０００５】
しかしながら、上述した如きチオコリン誘導体は、水溶液中での安定性は必ずしも良好とはいえず、チオコリン法用の試液は用時調製せざるを得ないという問題がある。
それ故、溶液中で長期間安定で、偽性コリンエステラーゼに対する特異性が高く且つ初速度測定による偽性コリンエステラーゼ活性測定法用の基質として使用が可能なチオコリン誘導体及びそれを基質として用いた新規な偽性コリンエステラーゼ測定試液の出現が渇望されている現状にある。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上述した如き状況に鑑みなされたもので、偽性コリンエステラーゼに対する特異性が高く、偽性コリンエステラーゼに対して然るべきＫｍ値を持ち、しかも非酵素的自己水解が極めて少なく、溶液中でも長期間安定なアシルチオコリン誘導体及びそれを基質として用いる偽性コリンエステラーゼの測定方法を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明は、一般式（Ｉ）：
【０００８】
【化３】
0003740716.tif 000002
【０００９】
（式中、Ｒは
【００１０】
【化４】
0003740716.tif 000003
【００１１】
を表し、Ｙはイオウ原子を表し、Ｘはハロゲン原子を表す。但し、環Ａはニトロ基、ハロゲン原子又は炭素数１〜６のアルキル基を置換基として有していても良い。）で示されるアシルチオコリン誘導体、の発明である。
【００１２】
また、本発明は、偽性コリンエステラーゼを含む試料と、上記一般式（Ｉ）で示されるアシルチオコリン誘導体とを反応させ、偽性コリンエステラーゼの作用により遊離したチオコリンを測定し、その測定結果に基づいて偽性コリンエステラーゼの活性を求めることを特徴とする、偽性コリンエステラーゼの活性測定方法、の発明である。
【００１３】
更にまた、本発明は、上記アシルチオコリン誘導体を基質として含んで成ることを特徴とする、偽性コリンエステラーゼ活性測定用試薬、の発明である。
【００１４】
即ち、本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、一般式（Ｉ）で示されるアシルチオコリン誘導体が、偽性コリンエステラーゼと特異的に反応し、しかも偽性コリンエステラーゼに対して然るべきＫｍ値を持ち、且つ非酵素的自己水解が極めて少なく、溶液中でも長期間安定であること、また、該アシルチオコリン誘導体を偽性コリンエステラーゼの基質として用いれば、偽性コリンエステラーゼの活性を感度良く且つ精度良く測定し得ることを見い出し、本発明に到達した。
【００１５】
本発明の一般式（Ｉ）で示される化合物に於いて、Ｘは例えばフッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等のハロゲン原子であり、中でも偽性コリンエステラーゼ活性への影響を考慮するとヨウ素原子が好ましく挙げられる。
また、置換基Ｒは、下記式
【００１６】
【化５】
0003740716.tif 000004
【００１７】
で示される。
【００１８】
一般式（Ｉ）中のＡで示される環（即ち、フラン環又はチオフェン環）には、Ｒ以外に更に置換基を１〜３個有していても良いが、偽性コリンエステラーゼとの反応性を考慮すると、少なくとも１つは水素原子のままであることが望ましい。
【００１９】
該置換基としては、例えばハロゲン原子、ニトロ基、アルキル基、アルコキシ基、アセトアミド基、アシル基、又はアルキル基で置換されていてもよいアミノ基等が挙げられる。ハロゲン原子としては、例えばフッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等が挙げられる。アルキル基としては、低級アルキル基、例えばＣ1〜Ｃ6のアルキル基が好ましく、具体的にはメチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、アミル基、ヘキシル基等（直鎖状でも分枝状でも何れにても可。）が挙げられ、特に好ましくはＣ1〜Ｃ4のアルキル基が挙げられる。アルコキシ基としては、低級アルコキシ基、例えばＣ1〜Ｃ6のアルコキシ基が好ましく、具体的にはメトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、ブトキシ基、ペンチルオキシ基、ヘキシルオキシ基等（直鎖状でも分枝状でも何れにても可。）が挙げられ、特に好ましくはＣ1〜Ｃ4のアルコキシ基が挙げられる。アシル基としては、カルボン酸由来のアシル基が好ましく、例えば低級アシル基、置換基を有していても良いベンゾイル基等が挙げらる。カルボン酸由来の低級アシル基としては、例えばＣ2〜Ｃ8のアシル基が好ましく、具体的にはアセチル基、プロパノイル基、ブタノイル基、ペンタノイル基、ヘキサノイル基、ヘプタノイル基、オクタノイル基等が挙げられ、特に好ましくはＣ2〜Ｃ5のアシル基が挙げられる。カルボン酸由来の置換基を有していても良いベンゾイル基の置換基としては、例えばメチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基等のアルキル基、例えばメトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、ブトキシ基等のアルコキシ基、ニトロ基、シアノ基、例えばフッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等のハロゲン原子等が挙げられる。置換基を有していても良いベンゾイル基の具体例としては、例えば2-メチルベンゾイル基、3-メチルベンゾイル基、4-メチルベンゾイル基、2-メトキシベンゾイル基、3-メトキシベンゾイル基、4-メトキシベンゾイル基、3,5-ジメトキシベンゾイル基、2-ニトロベンゾイル基、3-ニトロベンゾイル基、4-ニトロベンゾイル基、3,5-ジニトロベンゾイル基、2-シアノベンゾイル基、3-シアノベンゾイル基、4-シアノベンゾイル基、2-クロロベンゾイル基、3-クロロベンゾイル基、4-クロロベンゾイル基、2-ジメチルアミノベンゾイル基、3-ジメチルアミノベンゾイル基、4-ジメチルアミノベンゾイル基、2-トリフルオロメチルベンゾイル基、3-トリフルオロメチルベンゾイル基、4-トリフルオロメチルベンゾイル基等が挙げられる。アルキル基で置換されていてもよいアミノ基はモノ置換体でもジ置換体でも何れにてもよい。アルキルアミノ基のアルキル基としては、低級アルキル基、例えばＣ1〜Ｃ6のアルキル基が好ましく、具体的にはメチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、アミル基、ヘキシル基等の低級アルキル基（直鎖状でも分枝状でも何れにても可。）が挙げられ、特に好ましくはＣ1〜Ｃ4の低級アルキル基が挙げられる。
【００２０】
一般式（Ｉ）でＹが酸素原子であるアシルチオコリン誘導体の具体例としては、2-フロイルチオコリンハライド、3-クロロ-2-フロイルチオコリンハライド、5-クロロ-2-フロイルチオコリンハライド、3-ブロモ-2-フロイルチオコリンハラ イド、5-ブロモ-2-フロイルチオコリンハライド、3-メチル-2-フロイルチオコリンハライド、4-メチル-2-フロイルチオコリンハライド、5-メチル-2-フロイルチオコリンハライド、3,5-ジメチル-2-フロイルチオコリンハライド、5-ニトロ-2-フロイルチオコリンハライド、5-エチル-2-フロイルチオコリンハライド、5-プ ロピル-2-フロイルチオコリンハライド、3-メトキシ-2-フロイルチオコリンハライド、5-メトキシ-2-フロイルチオコリンハライド、3-アセトアミド-2-フロイルチオコリンハライド、5-アセトアミド-2-フロイルチオコリンハライド、3-フロ イルチオコリンハライド、2-クロロ-3-フロイルチオコリンハライド、4-クロロ-3-フロイルチオコリンハライド、5-クロロ-3-フロイルチオコリンハライド、2- ブロモ-3-フロイルチオコリンハライド、5-ブロモ-3-フロイルチオコリンハライド、2-メチル-3-フロイルチオコリンハライド、2,4-ジメチル-3-フロイルチオコリンハライド、2,5-ジメチル-3-フロイルチオコリンハライド、5-エチル-3-フロイルチオコリンハライド、5-プロピル-3-フロイルチオコリンハライド、4-メト キシ-3-フロイルチオコリンハライド、5-メトキシ-3-フロイルチオコリンハライド、4-アセトアミド-3-フロイルチオコリンハライド、5-アセトアミド-3-フロイルチオコリンハライド等が挙げられる。
【００２１】
一般式（Ｉ）でＹがイオウ原子であるアシルチオコリン誘導体の具体例としては、2-テノイルチオコリンハライド、3-フルオロ-2-テノイルチオコリンハライド、5-フルオロ-2-テノイルチオコリンハライド、3-クロロ-2-テノイルチオコリンハライド、5-クロロ-2-テノイルチオコリンハライド、5-ブロモ-2-テノイルチオコリンハライド、3-メチル-2-テノイルチオコリンハライド、4-メチル-2-テノイルチオコリンハライド、5-メチル-2-テノイルチオコリンハライド、3,5-ジメチル-2-テノイルチオコリンハライド、5-エチル-2-テノイルチオコリンハライド、3-メトキシ-2-テノイルチオコリンハライド、5-メトキシ-2-テノイルチオコリンハライド、3-アセトアミド-2-テノイルチオコリンハライド、5-アセトアミド-2-テノイルチオコリンハライド、3-テノイルチオコリンハライド、5-フルオロ-3-テノイルチオコリンハライド、2-クロロ-3-テノイルチオコリンハライド、5-ブロモ-3-テノイルチオコリンハライド、2-メチル-3-テノイルチオコリンハライド、5-メチル-3-テノイルチオコリンハライド、2,5-ジメチル-3-テノイルチオコリンハライド、5-メトキシ-2-テノイルチオコリンハライド、3-アセトアミド-2-テノイルチオコリンハライド、5-アセトアミド-2-テノイルチオコリンハライド等が挙げられる。
【００２２】
一般式（Ｉ）で示される化合物は、例えば、レンショウ（R. R. Renshaw）等 の合成法〔J. Am. Chem. Soc., 60, 1765(1938)〕に準じて容易に製造すること ができる。
即ち、先ず一般式（II）：
Ｚ−ＣＯＸ’      （II）
〔式中、Ｚは、
【００２３】
【化６】
0003740716.tif 000005
【００２４】
又は
【００２５】
【化７】
0003740716.tif 000006
【００２６】
（式中、Ｒ、Ｙは前記と同じ。）
で示されるフリル基又はチエニル基を表し、Ｘ’はハロゲン原子を表す。また、環Ａ（即ち、フラン環又はチオフェン環）は先に説明した置換基を有していても良い。〕
で示される酸塩化物と、該酸塩化物１モルに対して１〜1.5モルのジメチルアミノエタンチオールとを適当な溶媒（例えばジエチルエーテル等）中で、０〜30℃で２〜24時間程度反応させた後、析出する結晶を濾取し、アルカリ溶液（例えば炭酸水素ナトリウム溶液等）で処理する。次いで、適当な溶媒（例えばジエチルエーテル等）を用いて目的物を抽出した後、これを適当量のハロゲン化メチルと反応させて４級塩化し、要すれば常法により精製すれば目的とする一般式（Ｉ）で示されるアシルチオコリン誘導体を容易に且つ収率良く製造することができる。
【００２７】
一般式（II）で示される酸塩化物は、市販のものを用いても良いし、市販のものがない場合には、相当する市販のカルボン酸を塩化チオニル等で処理することにより容易に得られるのでこのようにして得たものを用いても良いし、或いは、相当する市販のエステル体を一旦アルカリ加水分解してカルボン酸誘導体とし、これに例えば塩化チオニル等を作用させることにより容易に得られるのでこのようにして得たものを用いれば足りる。
【００２８】
一般式（Ｉ）で示されるアシルチオコリン誘導体のうち、強力な電子吸引性のニトロ基を有する誘導体は、水溶液中での安定性はそれほど高くはないが、無置換体、ハロゲン原子を有する誘導体、アルキル基を有する誘導体等は、長期間保存した場合でも非酵素的自己水解が少なく（盲検値が低く）水溶液中での安定性は良好である。特にアルキル基を有する誘導体は水溶液中での安定性が良好で、液状化試薬に使用するのに適している。
【００２９】
一般式（Ｉ）で示されるアシルチオコリン誘導体を基質として用いた偽性コリンエステラーゼの活性測定は、基質として一般式（Ｉ）で示されるアシルチオコリン誘導体を用いる以外は、所謂チオコリン法に準じて行なえば足りる。
即ち、検体と、適当なＳＨ基発色試薬を含む適当な緩衝液［例えば15〜100mM 程度のトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン-マレイン酸緩衝液、リン酸緩 衝液、3-(N-モルホリノ)-2-ヒドロキシプロパンスルホン酸緩衝液等、pＨは通常6.5〜９、好ましくは7.5〜8.5程度］とを接触せしめ、通常30〜40℃、好ましく は37℃で適当な時間インキュベイトした後、本発明のアシルチオコリン誘導体を含む溶液の適当量を添加し、同条件で反応を行なわせ、偽性コリンエステラーゼの作用により生成されるチオコリンがＳＨ基発色試薬と反応した結果生成する発色体の増加を適当な測定装置（分光光度計、自動分析装置等）を用いて単位時間当たりの吸光度の増加として測定し、得られた吸光度変化量を発色体の分子吸光係数を用いて単位換算し、試料中の偽性コリンエステラーゼ量を測定する、所謂初速度法により測定を行なえば良い。また、検体と、上記した如きＳＨ基発色試薬を含む適当な緩衝液とを混合し、通常30〜40℃、好ましくは37℃で適当な時間インキュベイトした後、本発明のアシルチオコリン誘導体を含む溶液の適当量を添加し、同条件で一定時間反応させた後に反応液に適当な偽性コリンエステラーゼ阻害剤（例えば硫酸キニジン等）を添加して反応を停止させ、得られた反応液の吸光度を適当な測定装置により測定し、得られた吸光度を、予め濃度既知の偽性コリンエステラーゼ溶液を試料として同様に操作して作成した偽性コリンエステラーゼと発色体の吸光度との関係を表す検量線に当てはめて試料中の偽性コリンエステラーゼ量を測定する方法により行なっても良い。
【００３０】
ここで使用できるＳＨ基発色試薬としては、従来からこの分野で用いられているものはすべて使用でき、より具体的には例えばＤＴＮＢ［5,5'-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸)］、2-ＰＤＳ（2、2'-ジチオジピリジン）、4-ＰＤＳ（4,4'-ジ チオジピリジン）、5-ニトロ-2-ＰＤＳ［2、2'-ジチオビス(5-ニトロピリジン)］、2、2'-ジチオジピリミジン、2,2'-ジチオビス(4-メチルピリミジン)、2,2'-ジ チオビス(4,6-ジメチルピリミジン)等のエルマン試薬類等が好ましく挙げられる。また、これらＳＨ基発色試薬の使用濃度としては、用いる試薬の種類により若干異なるが、反応時の濃度として通常0.05〜0.5mM、好ましくは0.1〜0.3mMの範 囲から適宜選択される。
【００３１】
尚、上記の測定では、ＳＨ基発色試薬を含む溶液と本発明のアシルチオコリン誘導体を含む溶液とを使用したが、ＳＨ基発色試薬と本発明のアシルチオコリン誘導体が共存する溶液を用いても上記に準じた操作により測定を行なうことができることは言うまでもない。この場合、測定試液を予め反応させる温度にまで加温しておいても良い。
【００３２】
また、上記した如き方法により測定を行なうにあたり、ＳＨ基発色試薬を含む（更に要すれば本発明のアシルチオコリン誘導体を基質として含む）適当な緩衝液中には、通常この分野の緩衝液に添加される例えば界面活性剤、酵素活性賦活剤、キレート剤、塩類、防腐剤、殺菌剤等が含まれていても良く、それらの使用濃度は通常この分野で使用される範囲の中から適宜選択すれば足りる。
【００３３】
尚、本発明のアシルチオコリン誘導体の内、置換基としてアルキル基が１個導入された誘導体や無置換のフロイル型の誘導体は、340nmに於けるＵＶ吸収が充 分に小さいので、上述した2-ＰＤＳや4-ＰＤＳ等のＳＨ基発色試薬と組み合わせて、ヘモグロビンやビリルビンの影響が小さい紫外領域で吸光度測定を行なうことも可能である。
また、本発明の偽性コリンエステラーゼ活性測定用試薬は、一般式（Ｉ）で示される本発明のアシルチオコリン誘導体を基質として含有するものであり、その他必要に応じて例えば緩衝剤、界面活性剤、酵素活性賦活剤、キレート剤、塩類、防腐剤、殺菌剤等を適宜含有するものである。尚、夫々の構成要素の好ましい態様、具体例等は上で述べたとおりである。また、本発明のアシルチオコリン誘導体は溶液中での安定性に優れているので、本発明の偽性コリンエステラーゼ活性測定用試薬は溶液として調製することもできる。
以下に実施例を示し本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらにより何等限定されるものではない。
【００３４】
【実施例】
実施例１．2-フロイルチオコリンアイオダイドの合成
2-ジメチルアミノエタンチオール塩酸塩（東京化成（株）製）7.1g（50mmol）を水50mlに溶解し、これに炭酸水素ナトリウム５gを加えて液性をpＨ９以上とすることにより2-ジメチルアミノエタンチオールを遊離させた。これをジエチルエーテル200mlで抽出し、抽出液を無水硫酸マグネシウムで乾燥後濾過して得られ た濾液に、2-フロイルクロリド（和光純薬工業（株）製）6.53g（50mmol）を含 むジエチルエーテル溶液100mlを冷却下攪拌しながら滴下して反応させた。反応 終了後、反応溶媒を留去し、残渣を水150mlに溶解させ、炭酸水素ナトリウム５gを添加してｐＨ９以上とした後、ジエチルエーテル200mlで抽出した。抽出液を 硫酸マグネシウムで乾燥後濾過し、濾液にヨウ化メチル25g（176mmol）を加えて室温で３日間攪拌反応させた。反応終了後析出した結晶を濾取し、水から再結晶して、目的の2-フロイルチオコリンアイオダイド8.1g（収率47％）を得た。
融点：260〜261℃。
元素分析値：C10H16INO2Sとして
計算値(％)：Ｃ  35.20、Ｈ  4.73、Ｎ  4.10。
実測値(％)：Ｃ  35.17、Ｈ  4.81、Ｎ  4.23。
ＩＲ：第１図に示す。
【００３５】
実施例２．5-メチル-2-テノイルチオコリンアイオダイドの合成
5-メチル-2-チオフェンカルボン酸（アルドリッチ社製）7.1g（50mmol）と塩 化チオニル25mlとを反応させた後、過剰の塩化チオニルを減圧下留去し、5-メチル-2-チオフェンカルボン酸クロリド（酸クロリド）7.8g（収率97.1％）を得た。この酸クロリド7.8gをジエチルエーテル100mlに溶解したものを、前記実施例 １と同様にして得た2-ジメチルアミノエタンチオールを5.25g含むジエチルエー テル200mlに滴下して０〜25℃で６時間反応させた後反応溶媒を減圧留去した。
残渣を水150mlに溶解し、炭酸水素ナトリウム５gを加えてpＨ９以上とした後、 ジエチルエーテル150mlで抽出した。抽出液を硫酸マグネシウムで乾燥後、濾過 して得られた濾液にヨウ化メチル25g（176mmol）を加えて、３日間室温で攪拌反応させた。反応終了後、析出した結晶を濾取し、水から再結晶して、目的の5-メチル-2-テノイルチオコリンアイオダイド8.17g（収率44％）を得た。
融点：242〜243℃。
元素分析値：C11H18INOS2として
計算値(％)：Ｃ  35.58、Ｈ  4.89、Ｎ  3.77。
実測値(％)：Ｃ  35.63、Ｈ  5.01、Ｎ  3.69。
ＩＲ：第２図に示す。
【００３６】
実施例３．5-ブロモ-2-フロイルチオコリンアイオダイドの合成
5-メチル-2-チオフェンカルボン酸50mmolの代りに5-ブロモ-2-フランカルボン酸（和光純薬工業（株）製）50mmolを用いた以外は、実施例２と同じ試薬を用い、実施例２と同様にして反応及び後処理を行なって、5-ブロモ-2-フロイルチオコリンアイオダイド9.03gを得た（収率43％）。
融点：273〜275℃。
元素分析値：C10H15BrINO2Sとして
計算値(％)：Ｃ  28.59、Ｈ  3.60、Ｎ  3.33。
実測値(％)：Ｃ  28.60、Ｈ  3.58、Ｎ  3.43。
ＩＲ：ν1650cm-1(C=O)。
【００３７】
実施例４．5-ニトロ-2-フロイルチオコリンアイオダイドの合成
5-メチル-2-チオフェンカルボン酸50mmolの代りに5-ニトロ-2-フランカルボン酸（東京化成（株）製）50mmolを用いた以外は、実施例２と同じ試薬を用い、実施例２と同様にして反応及び後処理を行なって、5-ニトロ-2-フロイルチオコリンアイオダイド7.34gを得た（収率38％）。
融点：177〜178℃。
元素分析値：C10H15IN2O4Sとして
計算値(％)：Ｃ  31.10、Ｈ  3.91、Ｎ  7.25。
実測値(％)：Ｃ  31.22、Ｈ  3.88、Ｎ  7.21。
ＩＲ：ν1660cm-1(C=O)。
【００３８】
実施例５．3-フロイルチオコリンアイオダイドの合成
5-メチル-2-チオフェンカルボン酸50mmolの代りに3-フランカルボン酸（和光 純薬工業（株）製）50mmolを用いた以外は、実施例２と同じ試薬を用い、実施例２と同様にして反応及び後処理を行なって、3-フロイルチオコリンアイオダイド8.36gを得た（収率49％）。
融点：257〜258℃。
元素分析値：C10H16INO2Sとして
計算値(％)：Ｃ  35.20、Ｈ  4.73、Ｎ  4.10。
実測値(％)：Ｃ  35.11、Ｈ  4.77、Ｎ  4.05。
ＩＲ：ν1660cm-1(C=O)。
【００３９】
実施例６．2-メチル-3-フロイルチオコリンアイオダイドの合成
5-メチル-2-チオフェンカルボン酸50mmolの代りに、2-メチル-3-フランカルボン酸メチルエステル（アルドリッチ社製）を10％水酸化ナトリウムで加水分解して得た2-メチル-3-フランカルボン酸50mmolを用いた以外は、実施例２と同じ試 薬を用い、実施例２と同様にして反応及び後処理を行なって、2-メチル-3-フロイルチオコリンアイオダイド7.28gを得た（収率41％）。
融点：171〜172℃。
元素分析値：C11H18INO2Sとして
計算値(％)：Ｃ  37.20、Ｈ  5.11、Ｎ  3.94。
実測値(％)：Ｃ  37.14、Ｈ  5.15、Ｎ  3.83。
ＩＲ：ν1665cm-1(C=O)。
【００４０】
実施例７．2,5-ジメチル-3-フロイルチオコリンアイオダイドの合成
5-メチル-2-チオフェンカルボン酸50mmolの代りに、2,5-ジメチル-3-フランカルボン酸メチルエステル（アルドリッチ社製）を10％水酸化ナトリウムで加水分解して得た2,5-ジメチル-3-フランカルボン酸50mmolを用いた以外は、実施例２ と同じ試薬を用い、実施例２と同様にして反応及び後処理を行なって、2,5-ジメチル-3-フロイルチオコリンアイオダイド9.05gを得た（収率49％）。
融点：177〜178℃。
元素分析値：C12H20INO2Sとして
計算値(％)：Ｃ  39.03、Ｈ  5.46、Ｎ  3.79。
実測値(％)：Ｃ  39.14、Ｈ  5.46、Ｎ  3.83。
ＩＲ：ν1660cm-1(C=O)。
【００４１】
実施例８．2-テノイルチオコリンアイオダイドの合成
2-フロイルクロリド50mmolの代りに2-テノイルクロリド（和光純薬工業（株）製）50mmolを用いた以外は、実施例１と同じ試薬を用い、実施例１と同様にして反応及び後処理を行なって、2-テノイルチオコリンアイオダイド7.68gを得た（収率43％）。
融点：265〜266℃。
元素分析値：C10H16INOS2として
計算値(％)：Ｃ  33.62、Ｈ  4.51、Ｎ  3.92。
実測値(％)：Ｃ  33.51、Ｈ  4.43、Ｎ  3.94。
ＩＲ：ν1655cm-1(C=O)。
【００４２】
実施例９．5-クロロ-2-テノイルチオコリンアイオダイドの合成
5-メチル-2-チオフェンカルボン酸50mmolの代りに5-クロロ-2-チオフェンカルボン酸（東京化成（株）製）50mmolを用いた以外は、実施例２と同じ試薬を用い、実施例２と同様にして反応及び後処理を行なって、5-クロロ-2-テノイルチオコリンアイオダイド8.23gを得た（収率42％）。
融点：265〜266℃。
元素分析値：C10H15ClINOS2として
計算値(％)：Ｃ  30.66、Ｈ  3.86、Ｎ  3.58。
実測値(％)：Ｃ  30.63、Ｈ  3.85、Ｎ  3.44。
ＩＲ：ν1665cm-1(C=O)。
【００４３】
実施例１０．3-メチル-2-テノイルチオコリンアイオダイドの合成
5-メチル-2-チオフェンカルボン酸50mmolの代りに3-メチル-2-チオフェンカルボン酸（アルドリッチ社製）50mmolを用いた以外は、実施例２と同じ試薬を用い、実施例２と同様にして反応及び後処理を行なって、3-メチル-2-テノイルチオコリンアイオダイド8.73gを得た（収率47％）。
融点：241〜242℃。
元素分析値：C11H18INOS2として
計算値(％)：Ｃ  35.58、Ｈ  4.89、Ｎ  3.77。
実測値(％)：Ｃ  35.54、Ｈ  4.81、Ｎ  3.93。
ＩＲ：ν1660cm-1(C=O)。
【００４４】
実施例１１．3-テノイルチオコリンアイオダイドの合成
5-メチル-2-チオフェンカルボン酸50mmolの代りに3-チオフェンカルボン酸（ 和光純薬工業（株）社製）50mmolを用いた以外は、実施例２と同じ試薬を用い、実施例２と同様にして反応及び後処理を行なって、3-テノイルチオコリンアイオダイド8.57gを得た（収率48％）。
融点：275℃。
元素分析値：C10H16INOS2として
計算値(％)：Ｃ  33.62、Ｈ  4.51、Ｎ  3.92。
実測値(％)：Ｃ  33.61、Ｈ  4.71、Ｎ  3.74。
ＩＲ：ν1650cm-1(C=O)。
【００４５】
実験例１．チオコリン誘導体の水溶液中での保存安定性の検討
ブチリルチオコリンアイオダイド、2,3-ジメトキシベンゾイルチオコリン（ＤＭＢＴ）又は本発明のアシルチオコリン誘導体を６mM含む水溶液を塩酸でpＨ4.8に調整したものを10℃又は30℃で12ヶ月間保存した。
調製直後又は10℃若しくは30℃で12ヶ月間保存後のこれらの基質溶液0.5mlと、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)-4Na(0.1%)、食塩(0.23M)、5,5'-ジチオビス-（2-ニトロ安息香酸）(0.25mM)を含む0.1M トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン-塩酸緩衝液 2.0ml(pＨ7.4)とを混合反応させ、反応液の吸光度(415nm)を測定した。
10℃又は30℃で12ヶ月間保存後の基質溶液を使用して得られた吸光度から、調製直後の夫々の基質溶液を使用して得られた吸光度を差し引いた値（吸光度差。即ち、試薬盲検値の上昇の程度を示す値。）を求めた結果を表１に示す。
【００４６】
【表１】
0003740716.tif 000007
【００４７】
表１の吸光度差値の比較から、本発明のアシルチオコリン誘導体が30℃で12ヶ月保存で自己水解を起こす程度は、ブチリルチオコリンアイオダイドのそれに対して1.8〜6.2％程度、2,3-ジメトキシベンゾイルチオコリンのそれに対して2.2〜7.6％程度であると考えられるので、本発明のアシルチオコリン誘導体は水溶液中での安定性が従来品に比較して極めて高いことが判る。
【００４８】
実施例１２．偽性コリンエステラーゼ活性の測定
（試薬）
・第１試液
EDTA-4Na(0.1%)、食塩(0.23M)、5,5'-ジチオビス-（2-ニトロ安息香酸）(0.25mM)を含む1.0M トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン-塩酸緩衝液(pＨ7.4) を第１試液とした。
・第２試液（基質液）
2-フロイルチオコリンアイオダイドを６mM含む水溶液を第２試液とした。
（操作法）
第１試液２mlとヒト血清検体0.02mlとを混合し、37℃で２分間インキュベートした後、更に第２試液0.5mlを添加し、37℃で450nmに於ける１分間当たりの吸光度変化（ΔＡ）を測定した。また、人血清の代りに精製水を検体として用いた以外は同じ試液を用い同様の操作を行なって試薬ブランク（ΔＢ）を測定した。得られた各吸光度を下式に代入し各検体の偽性コリンエステラーゼ活性値を算出した。
検体の偽性コリンエステラーゼ活性（IU/l）＝［（ΔＡ−ΔＢ）×2.52×1000］／（7.9×0.02）
2.52  ：試薬と検体の総量（ml）
0.02  ：検体量（ml）
7.9   ：反応の結果生ずる2-ニトロ-5-メルカプト安息香酸の450nmに 於ける分子吸光係数（102×リットル×mol-1×mm-1）
【００４９】
参考例１．ブチリルチオコリン法による偽性コリンエステラーゼ活性の測定
実施例１２で偽性コリンエステラーゼ活性測定を行なった血清試料10検体について市販の偽性コリンエステラーゼ活性測定用試薬（基質：ブチリルチオコリンアイオダイド。コリンエステラーゼ-ＨＡテストワコー；和光純薬工業（株）製商品名）により偽性コリンエステラーゼ活性の測定を行なった。尚、測定操作法は、商品に添付の現品説明書に記載の標準操作法に従って行なった。
実施例１２で得られた活性測定値と参考例１で得られた活性測定値との相関図を図３に示す。
また、実施例１２で得られた活性測定値と参考例１で得られた活性測定値とを統計的に処理して得られた結果を以下に示す。
0003740716.tif 000008
以上の結果から、本発明の測定法で得られる活性値は、従来法であるブチリル チオコリン法で得られるそれと良好な相関性を示すことが判る。
【００５０】
実施例１３．偽性コリンエステラーゼ活性の測定
（試薬）
・第１試液
5,5'-ジチオビス-（2-ニトロ安息香酸）(0.25mM)を含む0.1M リン酸ナトリウム-0.1M 酒石酸ナトリウム緩衝液(pＨ7.4) を第１試液とした。
・第２試液（基質液）
実施例２．で得た5-メチル-2-テノイルチオコリンアイオダイドを２mM含む水溶液(pＨ4.5)を第２試液とした。
（操作法）
第１試液２mlとヒト血清検体0.05mlとを混合し、37℃で２分間インキュベートした後、更に第２試液0.5mlを添加し、37℃で415nmに於ける１分間当たりの吸光度変化（ΔＡ）を測定した。また、人血清の代りに精製水を検体として用いた以外は同じ試液を用い同様の操作を行なって試薬ブランク（ΔＢ）を測定した。得られた各吸光度を下式に代入し各検体の偽性コリンエステラーゼ活性値を算出した。
検体の偽性コリンエステラーゼ活性（IU/l）＝［（ΔＡ−ΔＢ）×2.55×1000］／（13.5×0.05）
2.55  ：試薬と検体の総量（ml）
0.05  ：検体量（ml）
13.5  ：反応の結果生ずる2-ニトロ-5-メルカプト安息香酸の415nmに 於ける分子吸光係数（102×リットル×mol-1×mm-1）
【００５１】
参考例２．ブチリルチオコリン法による偽性コリンエステラーゼ活性の測定
実施例１３．で偽性コリンエステラーゼ活性測定を行なった血清試料50検体について市販の偽性コリンエステラーゼ活性測定用試薬（基質：ブチリルチオコリンアイオダイド。コリンエステラーゼ-ＨＲテストワコー；和光純薬工業（株）製商品名）により偽性コリンエステラーゼ活性の測定を行なった。尚、測定操作法は、商品に添付の現品説明書に記載の標準操作法に従って行なった。
実施例１３で得られた活性測定値と参考例２で得られた活性測定値との相関図を図４に示す。
また、実施例１３で得られた活性測定値と参考例２で得られた活性測定値とを統計的に処理して得られた結果を以下に示す。
0003740716.tif 000009
以上の結果から、本発明の測定法で得られる活性値は、従来法であるブチリル チオコリン法で得られるそれと良好な相関性を示すことが判る。
【００５２】
【発明の効果】
以上に述べた如く、本発明は、新規アシルチオコリン誘導体と該誘導体を基質として用いる偽性コリンエステラーゼの活性測定方法を提供するものであり、本発明のアシルチオコリン誘導体は、非酵素的自己水解が少ないため水溶液中の安定性が従来の同様な基質に比較して極めて良好で、偽性コリンエステラーゼ活性測定用の基質溶液を溶液状態で供給することが可能となり、従来の固形製剤の形態で提供されていた基質試薬に於けるロット内でも基質濃度にバラツキが生じるという問題点を解消でき、しかも偽性コリンエステラーゼとの反応性が高いのでこれを基質として用いた測定法は精度良く偽性コリンエステラーゼ活性の測定が可能で且つ自動分析機への適用が容易である等の点に顕著な効果を奏する発明であり、斯業に貢献するところ極めて大なる発明である。
【００５３】
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１で合成したアシルチオコリン誘導体の赤外吸収スぺクトルを示す。
【図２】実施例２で合成したアシルチオコリン誘導体の赤外吸収スぺクトルを示す。
【図３】実施例１２で得られた活性測定値と参考例１で得られた活性測定値との相関図を示す。
【図４】実施例１３で得られた活性測定値と参考例２で得られた活性測定値との相関図を示す。
【図１】
0003740716.tif 000012
【図２】
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【図３】
0003740716.tif 000014
【図４】
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