(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペプチド及びタンパク質の一次構造におけるＬｙｓ−Ａｒｇ及びＡｒｇ−Ａｒｇ配列を認識して、該配列のＣ末端側を切断する基質特異性を有し、分子量が約６７，０００（ゲル濾過法による）であり、等電点が３．９であることを特徴とするエンド型システインプロテアーゼ。
【請求項２】
次の理化学的性質
（１）酵素作用
弱酸性下で塩基性タンパク質もしくはペプチドをよく加水分解する
（２）基質特異性
ペプチド及びタンパク質の一次構造におけるＬｙｓ−Ａｒｇ及びＡｒｇ−Ａｒｇ配列を認識して、該配列のＣ末端側を切断する基質特異性を有する（３）至適ｐＨ：ｐＨ６．０（基質としてＺ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＭＣＡを用いて測定、ここでＺはベンジルオキシカルボニル基であり、ＭＣＡは４−メチルクマリル−４−アミド基である）
（４）安定ｐＨ範囲：ｐＨ３〜６．５のｐＨ域で安定である（基質としてＺ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＭＣＡを用いて測定）。
（５）作用適温の範囲：３０〜４０℃
（６）ｐＨ８以上において３０分または７０℃、３０分で完全に失活する。
（７）阻害、活性化及び安定化
ジチオトレイトール、２−メルカプトエタノール、システイン塩酸塩により活性化され、Ｎ−［Ｎ−（Ｌ−３−トランス−カルボキシラン−２−カルボニル）−Ｌ−ロイシル］−アグマチン、モノヨード酢酸、Ｎα−トシル−Ｌ−リジル−クロロメチルケトン、ロイペプチンにより完全に阻害される
（８）分子量：約６７，０００（ゲル濾過法による）、約２２，３００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる）
天然では分子量２２，３００のサブユニットが３個結合し、構成されている
（９）等電点：３．９（等電点電気泳動による）
を有する請求項１記載のエンド型システインプロテアーゼ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、塩基性タン白質、例えば、プロタミン、ヒストン等を選択的に分解する基質特異性を有し、アルギニンに富んだ低分子のペプチドを容易に製造することができ、例えば、生理活性ペプチドとしての利用の如き医薬品分野、飲食品分野、その他のプロテアーゼ利用分野において有用なシステインプロテアーゼ及びその製法に関し、更に詳しくは、白子由来の新規なシステインプロテアーゼ及びその製法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来から市販されているプロテアーゼは、例えば、プロタミン等の塩基性タン白質を分解することは困難であり、塩基性タン白質の分解方法としては塩酸を添加して加水分解することが行われている。しかし、この塩酸分解では、最終生産物に塩素化合物が混入する危険性があるうえ、アミノ酸単位にまで分解されてしまうため、分解産物は生理活性を失うという欠点がある。
【０００３】
一方、塩基性タン白質によく作用するプロテアーゼとしては、例えば、細菌から単離されたサーモリシン（thermolysin）（EC 3.4.24.27)[Adv.Enzymol.41,179(1974)]、カビからのペニシロリシン（penicillolysin）[Agric.Biol.Chem.55,2191(1991)]が知られているが、これらの酵素はいずれも金属酵素であり、本発明の酵素とは本質的に異なる。また、魚の筋肉中より単離されたカテプシンB,L,H[Comp.Biochem.Physiol.96B,No.2,247(1990)及びComp.Biochem.Physiol.96B,No.4,733(1990)]が知られているが、、本発明の酵素とは基質特異性が異なり、収量が少なく、工業的な実用性は乏しい。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
上記した如き従来の技術では、塩基性タン白質を効率よく分解して、飲食品、医薬品等に有用な生理活性に優れた低分子のペプチドを得ることは困難であった。そこで、安全性の要求される食品工業及び医薬品分野で利用できる生理活性ペプチドを安全かつ効率よく得ることができる、新規な塩基性タン白質分解酵素の開発が望まれている。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、食品とされる天然素材からの塩基性タン白質をよく分解する酵素のスクリーニングを鋭意繰り返し研究を重ねた結果、鮭、鱒、鰊、鱈、鮪、鰹等の魚類の白子に強い分解活性があることを見出し、それから塩基性タン白質に作用する酵素を単離、精製し、その酵素的性質を解明して、本発明を完成した。本発明により得られる酵素は、新規なエンド型システインプロテアーゼであり、塩基性タン白質であるプロタミン、ヒストン等を選択的に分解する基質特性を有する。
【０００６】
しかして、該酵素を用いることにより、プロタミン等の塩基性タン白質からアルギニンに富んだ生理活性ペプチドを容易に得ることができるほか、該酵素は、アンギオテンシンIのＣ末端のHis-Leu間を切断し、アンギオテンシンIIに変換するアンギオテンシン変換酵素の作用も持つため、医薬品への応用が期待される。しかも、原料である魚類の白子は、食用とされているもので安全であり、また、安価に入手できるため製造コストも低く、食品工業への応用に最適である。  以下、本発明の酵素の製法、理化学的性質等について更に詳しく説明する。
【０００７】
本発明により提供されるエンド型システインプロテアーゼは魚類の白子から採取することができ、採取することのできる魚類の白子としては、例えば、鮭、鱒、鰊、鱈、鮪、鰹等の魚類の白子を挙げることができるが，殊に，白子の重量が大きく、また、水揚げ量の多い鮭の白子が好適である。これら魚類の白子は，生鮮品，冷凍品及び塩蔵品のいずれも利用することができる。
【０００８】
これら魚類の白子からエンド型システインプロテアーゼを分離採取する方法としては，例えば，鮭の白子を磨砕処理した後，磨砕物１重量部に対して通常約１〜約１０重量部、好ましくは約３〜約８重量部の水もしくはｐＨ約５〜７の緩衝液を加えて撹拌抽出し，好ましくは抽出液を再度ｐＨ約５〜６に調整した後、得られる抽出水層部を遠心分離し、脂肪を分離除去し，更にこの水層部をケイソウ土，セルロースなどの濾過助剤を用いて濾過し，清澄な粗酵素液を得る方法を例示することができる。
【０００９】
得られる粗酵素液は，場合により、凍結濃縮，減圧濃縮，限外濾過などの適宜な濃縮手段を用いて、該酵素の活性低下をきたさない温度，例えば，約４０℃以下の温度で濃縮することにより粗酵素濃縮物とすることができる。
【００１０】
さらに、該濃縮液は、遠心分離し、その上澄み液をサンプル前処理用の陰イオン交換樹脂、例えばＳＥＰ−ＰＡＫ  ＱＭＡ（ミリポア社製）、Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ファルマシアバイテク社製）など、あるいはアフィニテイカラム、例えば、Ａｒｇｉｎｉｎｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ（ファルマシアバイテク社製）などで溶出し、この溶出液について、例えば、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  １２ＨＲ（ファルマシアバイテク社製）、Ｓｈｏｄｅｘ  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＫＷ−８０３（昭和電工社製）などのゲル濾過カラムを用いて活性画分を分取し、単一成分として分離精製することができる。
【００１１】
本発明の魚類白子由来の新規なシステインプロテアーゼは、ペプチド及びタンパク質の一次構造におけるＬｙｓ−Ａｒｇ及びＡｒｇ−Ａｒｇ配列を認識して、該配列のＣ末端側を切断する基質特異性を有するエンド型システインプロテアーゼであり、これまで知られていた塩基性タン白質に作用するプロテアーゼとは全く異なる新規な酵素である。
【００１２】
以下、本発明のシステインプロテアーゼの酵素学的性質について説明する。
【００１３】
(１) 酵素作用：
本発明の酵素はｐＨ３乃至６．５の弱酸性下でペプチド及びタンパク質中の一次構造におけるＬｙｓ−Ａｒｇ及びＡｒｇ−Ａｒｇ配列を認識して、該配列のＣ末端側を切断する。
【００１４】
（２）基質特異性
本発明の酵素の低分子合成基質に対する基質特異性を下記表１に示す。
【００１５】
【表１】
0003751086.tif 000002
【００１６】
* ＭＣＡは４−メチルクマリル−７−アミド基、Ｂｚはベンゾイル基、
Ｚはベンジルオキシカルボニル基、Ｓｕｃはサクシニル基、Ｂｏｃはｔ−ブチルオキシカルボニル基、そしてＥ（ＯＢｚｌ）はγ−ベンジル−Ｌ−グルタミン酸残基をそれぞれ表わす。
【００１７】
**合成基質カルボベンゾキシ−アルギニル−アルギニル−４−メチルクマリル−７−アミド（以下、Ｚ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＭＣＡと表記することがある）に対する活性を100％とした場合の相対活性（％）。ｐＨ６.０及び３０℃にて測定。
【００１８】
酵素反応には、活性化剤である２−メルカプトエタノール(５ｍＭ)と、金属酵素の影響を除去するために、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）(1mM)を添加した。
【００１９】
表１の結果から明らかな如く、本発明の酵素は、カテプシンＢ、Ｌがよく分解するArg-MCAやBz-Arg-MCAをほとんど分解しないが、Lys-Arg及びArg-Arg配列をよく認識して、該配列のＣ末端側を切断する基質特異性を有する。
【００２０】
また、本発明の酵素のように、Lys-Arg及びArg-Arg配列を認識し切断する特異性は、生体内のプロセシングに関与する酵素として認められているが、今まで見出されてきた酵素はすべて活性中心がセリンのプロテアーゼ群である。この点からも本発明の酵素がプロセシングの作用をもつ全く新規なシステインプロテアーゼであると言える。
【００２１】
(３)  作用至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲
本発明の酵素を基質Z-Arg-Arg-MCAに作用させた場合のｐＨと酵素活性との関係を図１に示す。図１から明らかなように、本発明の酵素の至適ｐＨは６である。また、各種ｐＨのリン酸緩衝液（３０℃）中での本発明の酵素の残存活性をプロットした図２から明らかなように、本発明の酵素の安定ｐＨ範囲はｐＨ約３〜ｐＨ約６．５の範囲である。
【００２２】
（４）作用至適温度及び熱安定性
本発明の酵素の作用至適温度及び熱安定性について測定した結果を図３及び図４に示す。反応はZ-Arg-Arg-MCAを基質とし、ｐＨ６．０のリン酸緩衝液（5mM 2-メルカプトエタノール+1mM EDTA)中にて行った。至適温度は１０〜６０℃における５分間の活性を測定することにより、また、熱安定性は上記の緩衝液にて希釈した酵素液をそれぞれの温度で１０分又は３０分間インキュベートした後、３０℃にて活性を測定することにより決定した。
【００２３】
その結果、本発明の酵素の作用適温の範囲は３０℃〜４０℃であり、また、至適温度は４０℃であって、３０℃以下の温度において安定であった。
【００２４】
(５) ｐＨ、温度などによる失活の条件
本発明の酵素はｐＨ８以上において３０分、または７０℃、３０分間の加熱で完全に失活する。
【００２５】
(６) 活性化剤及び阻害剤に対する影響
本発明の酵素を０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）中で各種活性化剤及び阻害剤とともに３０℃で３０分間前インキュベートしたものを用いて、合成基質Z-Arg-Arg-MCAに作用させたときの残存活性の変化を調べた。その結果を下記表２に示す。
【００２６】
【表２】
0003751086.tif 000003
【００２７】
* コントロールは活性化剤、阻害剤を添加しないときの酵素活性であり、表中の活性はこのコントロールを１００としたときの相対活性で示す。
**各略記号の意味は次のとおりである。
【００２８】
ＤＴＴ：ジチオトレイトール
Ｅ−６４：Ｎ−［Ｎ−（Ｌ−３−トランス−カルボキシシラン−２−カルボニル）−Ｌ−ロイシル］−アグマチン
ＰＣＭＢ：パラクロロマーキュリー安息香酸
ＰＭＳＦ：フェニルメタンスルフォニルフルオライド
ＴＬＣＫ：Ｎα−トシル−Ｌ−リジル−クロロメチルケトン
ＡＰＭＳＦ：４−（アミジノフェニル）メタンスルフォニルフルオラ  イド
ＴＰＣＫ：Ｎ−トシルフェニルアラニルクロロメタン
ＺＰＣＫ：ベンジルオキシカルボニルフェニルアラニルクロロメタン
この結果より、本発明の酵素は、ＤＴＴ、２−メルカプトエタノール及びシスティン塩酸塩により活性は著しく増加することがわかる。このことから、本発明の酵素の活性中心には−ＳＨ基が関与していることが考えられる。また、Ｅ−６４、モノヨード酢酸、ＴＬＣＫ、ロイペプチンにより完全に阻害されることから、本発明の酵素の活性中心はシステイン残基であると判断される。
【００２９】
(７）力価測定法及び力価表示
力価の測定は，基質ペプチジル−４−メチル−クマリル−７−アミド（peptidyl-MCA）の加水分解により生成する蛍光性の７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ）の量を蛍光光度計にて定量することによって行った。すなわち、酵素液２０μｌと、１ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）及び１ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）を混合し、３０℃，２０分間予熱の後，これにジメチルスルホオキシド（ＤＭＳＯ）に溶解した１０ｍＭのZ-Arg-Arg-MCAもしくはZ-Phe-Arg-MCAを５μｌ加え、すばやく混合し一定時間の蛍光の増加を測定する。
【００３０】
蛍光は、Ｆ−３０００型蛍光光度計（日立製）により、３６０ｎｍの励起光を用いて、４４０ｎｍで測定する。この際、反応液の液温が３０℃になるようにセル槽の温度をコントロールする。
【００３１】
酵素単位は，上記の条件で１秒間に１モルの７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ）を生成することのできる酵素量を１酵素単位：１カタール（１ｋａｔ）として算定し，酵素活性（kat／mｌ）として表わす。また、基質濃度と酵素の反応速度との関係よりＫｍ：Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ定数及びＶｍａｘ：最大速度を求める。さらに、最大速度とタン白濃度よりκｃａｔ：モル速度を求める。本発明の酵素のＫｍ値、κｃａｔ、及びκｃａｔ／Ｋｍを下記表３に示す。
【００３２】
【表３】
0003751086.tif 000004
【００３３】
(８) 精製方法
本発明の酵素は，前記した如く魚類の白子を脱脂後，水または緩衝液を用いて抽出された粗酵素液を限外濾過等により濃縮し、この濃縮液を前記したような陰イオン交換樹脂やゲル濾過カラムを用いて活性画分を単一成分に分離精製する。
【００３４】
例えば、粗酵素濃縮物に１Ｍ酢酸緩衝液（pH5.0)を添加混合したのち遠心分離（15000rpm/5min.）し、その上澄液をサンプル前処理用デイスポーザブルカラムＳＥＰ−ＰＡＫ  ＱＭＡ（ミリポア社製）を用いて２０ｍＭ酢酸緩衝液と５００ｍＭ塩化ナトリウム液の混液で溶出する。次にこの溶出液をＳｕｐｅｒｏｓｅ１２ＨＲ１０／３０（ファルマシアバイテク社製）を用いてゲル濾過し、活性画分を分離した後、その活性画分をＡｒｇｉｎｉｎｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ（ファルマシアバイテク社製）を用いてアフィニティークロマトグラフィーし、活性画分を分解する。更に、その活性画分をＳｈｏｄｅｘ  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＫＷ−８０３（昭和電工社製）を用いて単一成分に精製する。
【００３５】
このようにして分画精製したシステインプロテアーゼ活性を示す画分をＮａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥにて電気泳動した結果を図５に示す。図５からも明らかな如く、本酵素画分は未変性の状態では均一のタン白質であることが確認される。精製方法の具体例は後記実施例１〜６に示すとおりである。
【００３６】
（９）分子量
本発明の酵素の未変性状態での分子量は、Ｓｈｏｄｅｘ  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＫＷ−８０３によるゲル濾過での保持時間より推定を行ったところ、約６７，０００であった。また、本発明の酵素にドデシル硫酸ナトリウム塩（ＳＤＳ）とβ−メルカプトエタノールを加え、熱湯にて約３分間加熱し、酵素タンパクを変性させた後、その相対分子量を不連続のドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドスラブゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）（Nature 227,680,1970)により求めたところ、図６に示した如く約２２，３００であった。以上の結果より、本発明の酵素は、天然では分子量２２，３００のサブユニットが３個結合して構成されていることがわかる。
【００３７】
（１０）等電点
等電点電気泳動により等電点を測定したところ、本発明の酵素の等電点は図７で明らかな如く、３．９であった。
【００３８】
以上の如く、本発明の酵素は作用至適ｐＨが６、安定ｐＨ範囲がｐＨ３〜６．５であり、カテプシンＢにやや近い性質も示すが、Bz-Arg-MCAを分解しない点や、Z-Phe-Arg-MCAよりもZ-Arg-Arg-MCAをはるかによく分解する点などカテプシンＢとは明確に異なる特異性を有する。さらに、カテプシンＢの分子量（ゲル濾過による）は２５，０００（ヒト由来）あるいは２９，０００（サケ筋肉由来）であり、本発明の酵素の６７，０００よりかなり小さく、また、等電点は、カテプシンＢは４．５〜５．５（ヒト及びサケ筋肉由来）であり、本発明の酵素の等電点３．９とは異なる。
【００３９】
以上の理由により、本発明の酵素は従来既知のプロテアーゼとは別異の新規なシステインプロテアーゼであると考えられる。
【００４０】
【実施例】
以下、実施例により本発明の酵素の製造について更に具体的に説明する。
【００４１】
実施例１
２５℃の軟水１ｋｇに生の白鮭の白子（宮城県産）２５０ｇを添加し、ミキサー等でホモジナイズした。この液を遠心分離（５０００Ｇ×２０分間）し、上層の水溶液９００ｇを得た。更に、この水溶液をケイソウ土濾過し、抽出液８８０ｇを得た。この抽出液のｐＨ６．０におけるＺ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＭＣＡを基質とする酵素活性を測定した結果、７８ｎｋａｔ／ｍｌであった（以下、この抽出液を「サケ白子システインプロテアーゼ１」と称する）。
【００４２】
実施例２
実施例１で得られたサケ白子システインプロテアーゼ１の８８０ｇに硫酸アンモニウム１５５ｇを徐々に加え、かき混ぜて溶解させた後４℃で１５時間静置した。次いで、遠心分離により不溶物を除き分離液８９０ｇを得た。この分離液に硫酸アンモニウム３４３ｇを加えて溶解し、４℃で１５時間静置後遠心分離を行い、析出沈殿物３ｇを得た。この沈殿物をｐＨ６．０のリン酸緩衝液１２ｍｌに溶解し、得られた溶液を透析チューブ（Ｕｎｉｏｎ  Ｃａｒｂｉｄｅ  ｃｏｒｐ．社製）を用いて同じ緩衝液で透析処理して脱塩を行った。その結果、酵素液１８．３ｇを得た。この酵素液のｐＨ６．０におけるＺ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＭＣＡを基質とする酵素活性を測定した結果、１２００ｎｋａｔ／ｍｌであった（以下、この抽出液を「サケ白子システインプロテアーゼ２」と称する）。
【００４３】
実施例３
実施例２で得られたサケ白子システインプロテアーゼ２の０．５ｇをｐＨ６．０の酢酸緩衝液にて平衡化したセップパックバックＡｃｃｅｌｌ  ＱＭＡ  ２ｇ（日本ウオーターズ・リミテッド社製）に供し、同緩衝液で塩化ナトリウム濃度が０〜０．６Ｍまでのグラジエントを行い、本発明の酵素活性をもつ画分５ｍｌを得た。さらに同操作を１０回繰り返し５０ｍｌの同画分を得た。この分画物の活性は８５ｎｋａｔ／ｍｌ；３１ｎｋａｔ／ｍｇであった（以下、この抽出液を「サケ白子システインプロテアーゼ３」と称する）。
【００４４】
実施例４
実施例３で得られたサケ白子システインプロテアーゼ３の５０ｍｌを限外濾過膜（ウルトラフリー１５：日本ミリポア社製）にて１０倍に濃縮したものを０．５ｍｌづつ、ｐＨ６.０の酢酸緩衝液（含５０ｍＭ塩化ナトリウム）にて平衡化した直径１．０ｃｍ×３０ｃｍのＳｕｐｅｒｏｓｅ  １２（ファルマシアバイテク社製）に供し、同緩衝液にて溶出を行い、本発明の酵素活性をもつ画分７ｍｌを得た。この分画物の活性は５０ｎｋａｔ／ｍｌ；１９１ｎｋａｔ／ｍｇであった（以下、この抽出液を「サケ白子システインプロテアーゼ４」と称する）。
実施例５
実施例４で得られたサケ白子システインプロテアーゼ４を限外濾過膜（ウルトラフリーＣＬプラス：日本ミリポア社製）にて５倍に濃縮したものを、ｐＨ５．０の酢酸緩衝液にて平衡化した直径１．０ｃｍ×１０ｃｍのＡｒｇｉｎｉｎｅ  Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  ４Ｂ（ファルマシアバイテク社製）に供し、同緩衝液で塩化ナトリウム濃度０〜０．６Ｍまでグラジエントを行い、本酵素活性をもつ画分５ｍｌを得た。この分画物の活性は、４７ｎｋａｔ／ｍｌ；５５５ｎｋａｔ／ｍｇであった（以下、この抽出液を「サケ白子システインプロテアーゼ５」と称する）。
【００４５】
実施例６
実施例５で得られたサケ白子システインプロテアーゼ５の５ｍｌを限外濾過膜（ウルトラフリーＣＬプラス：日本ミリポア社製）にて１０倍に濃縮したものを、ｐＨ６．０の酢酸緩衝液（含５０ｍＭ塩化ナトリウム）にて平衡化した直径０．８ｃｍ×３０ｃｍのＳｈｏｄｅｘ  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＫＷ−８０３（昭和電工社製）に供し、同緩衝液にて溶出を行い、本発明の酵素活性をもつ画分３ｍｌを得た。この分画物の活性は、２３ｎｋａｔ／ｍｌ；１１５１ｎｋａｔ／ｍｇであった（以下、この抽出液を「サケ白子システインプロテアーゼ６」と称する）。このサケ白子システインプロテアーゼ６の酵素的性質は前記のとおりである。
【００４６】
【発明の効果】
本発明によれば、他のプロテアーゼでは分解しにくかった塩基性タン白質をよく分解し、安全性の要求される食品や医薬品分野等で有用な生理活性ペプチドの製造等に応用可能なエンド型システインプロテアーゼを、安価に入手できる鮭、鱒、鰊、鱈、鮪、鰹等の魚類の白子から得ることができる。また、本発明の酵素はアンギオテンシン変換酵素の作用も持つため、今後の医薬品への応用が考えられる重要な酵素である。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の酵素の至適ｐＨ範囲の測定結果を示すグラフである。
【図２】本発明の酵素の安定ｐＨ範囲の測定結果を示すグラフである。
【図３】本発明の酵素の至適温度範囲の測定結果を示すグラフである。
【図４】本発明の酵素の安定温度範囲の測定結果を示すグラフである。
【図５】本発明の酵素のポリアクリルアミドスラブゲル電気泳動(Native-PAGE)図である。
【図６】本発明の酵素のＳＤＳ−ポリアクリルアミドスラブゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）図である。
【図７】本発明の酵素の等電点を求めた等電点電気泳動の測定結果である。
【図１】
0003751086.tif 000005
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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