(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２のアミノ酸配列よりなるトロンボポエチン（ＴＰＯ）のカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）が、ヒトエリスロポエチン（ＥＰＯ）とヒトＥＰＯのカルボキシ末端で融合している融合タンパク質。
【請求項２】
請求項１に記載の融合タンパク質をコードしている核酸。
【請求項３】
請求項２に記載の核酸を含む組み換えベクターで形質転換された宿主細胞株を培養し、生体内ヒトＥＰＯ活性強化融合タンパク質を製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新薬貧血治療剤であるエリスロポエチン(erythropoietin：以下、‘ＥＰＯという)の生体内(in vivo)活性が増進された融合蛋白質(fusion  protein)に関するものである。より具体的には、本発明はＥＰＯ分子に半減期(half-life)増加活性を持つ、生体内由来の特定ペプチドを融合させることによって、生体内半減期が増加してエリスロポエチン活性が画期的に増大した融合蛋白質に関するものである。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】
ＥＰＯは、分子量３０,０００〜３４,０００の糖蛋白質として、赤血球の生成および分化を促進する因子である。この蛋白質は、赤血球前駆細胞の受容体に結合して作用し、細胞内カルシウムイオン濃度の増加、ＤＮＡ生合成の増加およびヘモグロビン生成刺激などを起こす。この刺激因子ＥＰＯは、腎臓病患者の貧血、未熟児の貧血、甲状腺機能低下症(hypothyroidism)による貧血、栄養失調による貧血等の治療のために用いられる。組換ヒトＥＰＯの臨床的利用は拡大しつつある。しかし、半減期が短いために、平均週３回の投与を必要とするので幾らかの不便さとコストが高くなる。従って、ＥＰＯの生体内活性を長期間維持させれば、ＥＰＯの投与回数を大きく減少させることができる。
【０００３】
ＥＰＯの生体内活性度は、生体内半減期と比例する。生体内での半減期はＥＰＯが持つ糖鎖の末端に位置するシアリン酸(sialic acid)の含量と相関関係があることが知られている。従って、ＥＰＯの生体内活性は、糖鎖の存在によって大きく左右される。糖鎖の形態は細胞の種類によって、それぞれ異なって現れるので、同じ糖蛋白質を異なる種類の細胞で発現させれば、それぞれの種々の糖鎖の形態を呈する。最近、いくつかのバクテリアの種類は、糖鎖を付けることができることが明らかになったが、一般的にバクテリア、例えば、大腸菌(E.coli)は蛋白質に糖鎖を付けることができないことが知られている。大腸菌で発現される蛋白質には糖が付加されていないので、大腸菌で発現されるＥＰＯは糖鎖を含まず、この場合、インビトロ(in vitro)では活性が確認出来るが、生体内では全く活性を持っていない。その理由は、脱グリコシル化ＥＰＯは体内で急速に除去されて、その半減期がきわめて短いためである。結論として、糖鎖の存在の有無は、ＥＰＯの活性に非常に重要な役割を果たす。
【０００４】
ＥＰＯの活性を増加させるために多くの研究が行われてきた。主な研究方法は、突然変異誘発方法(mutagenesis)でＥＰＯ遺伝子に突然変異を誘発させることによって、いくつかのアミノ酸を置換する方法である。例えば、ＰＣＴ／ＵＳ９４／０９２５７(名称：エリスロポエチン類似体、出願人：アムジェン)には突然変異誘発を通じてＥＰＯの糖含量を増加させることによって、体内半減期を増加させる方法が開示されている。また、ＥＰＯの二量体(dimer)形成によって、ＥＰＯの生体内半減期を増加させる試みもあった(A. J. Sytkowski et al., J.B.C. vol. 274, No. 35, pp24773-24778)。また、公知の他の方法は、遺伝b子工学的方法を用いてＥＰＯ分子と新しいアミノ酸、ペプチドまたは蛋白質断片を融合させてＥＰＯの糖鎖含量、すなわち、ＥＰＯのシアリン酸の含量を増加させることによって、生体内活性度を増進させる方法等がある。しかし、この目的のために、すべてのアミノ酸、ペプチドまたは異質な蛋白質断片を使用することはできない。多くの場合、このような修飾は蛋白質固有の活性を低下または喪失させる結果を招き、生体内で用いられる時に抗原性の問題を引き起こし得るからである。
【０００５】
ＥＰＯに関するものではないが、融合蛋白質またはキメラ蛋白質(chimeric protein)などが研究されており、例えば、性ホルモンの一種である卵胞形成ホルモンに関したものがある(参照：Furuhashi et al., 1995, Mol. Endocrinol)。しかし、遺伝子工学を用いた蛋白質の修飾は多くの危険性があるので、それらの方法は実際の産業には適用されなかった。すなわち、専門的技術無しではその目的蛋白質自体を得ることも容易ではなく、反対に、多くの場合、新しいアミノ酸の添加または置換によって蛋白質本来の活性が喪失するか、減少し得るからである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
発明の開示
本発明者らは、ＥＰＯ分子に新しいアミノ酸、ペプチドまたは蛋白質断片を融合させてＥＰＯの糖鎖含量を増加させることによって、その生体内活性度を強化し得る新しい方法を開発するために鋭意研究を行ってきた。その結果、体内に既に存在する蛋白質である血小板産生因子(thrombopoietin、以下、‘ＴＰＯ’という)のカルボキシ末端に位置するペプチド断片(carboxy terminal peptide、以下、‘ＣＴＰ’という)をＥＰＯのカルボキシ末端に融合させて得た融合蛋白質がＥＰＯ本来の活性をそのまま保有しながら、糖鎖形成部位(glycosylationsite)を増加させる多数のアミノ酸によって、生体内半減期が画期的に増加する一方、体内適用時の抗原性も誘発しないという事実を見出した。その結果、本発明者らは発明を完成した。
【０００７】
従って、本発明の目的はＴＰＯのＣＴＰをヒトＥＰＯのカルボキシ末端に融合させた、ヒトＥＰＯの生体内活性が増強した融合蛋白質を提供することである。
【０００８】
本発明の他の目的は上記融合蛋白質をコードする核酸、上記核酸を含有する組換えベクターおよび上記組換えベクターで形質転換された形質転換体を提供することである。
【０００９】
本発明の他の目的は上記形質転換体を培養して増強したヒトＥＰＯ活性を持つ融合蛋白質を製造する方法を提供することである。
【００１０】
第１に、本発明はヒトＥＰＯのカルボキシ末端にＴＰＯのＣＴＰを融合させた、生体内ヒトＥＰＯ活性が強化融合蛋白質に関するものである。上記ＣＴＰは配列番号１に記載されたＴＰＯの１７６〜３５３の位置のアミノ酸(以下、‘ＬＴＰ’という)またはその一部、特に配列番号２に記載されたＴＰＯの３３７〜３５３の位置のアミノ酸(以下、‘ＳＴＰ’という)を含むことが望ましい。
【００１１】
特に、本発明にかかる融合蛋白質は、配列番号３または４に記載されたアミノ酸配列を含むことができる。
【００１２】
第２に、本発明は上記融合蛋白質をコードする核酸、核酸を含有する組換えベクター、上記組換えベクターで形質転換された宿主細胞株、好ましくはＣＨＯ(Chinese hamster ovary)細胞に関するものである。
【００１３】
第３に、本発明は上記形質転換細胞株を培養することによって増強されたヒトＥＰＯの活性を持つ融合蛋白質を製造する方法に関するものである。
以下、本発明をより詳細に説明する。
【００１４】
発明を実施するための最良の形態
本発明は、目的とする融合蛋白質の遺伝子の製造およびクローニング、目的遺伝子の発現ベクターの構築、動物細胞の形質転換、発現、分離および生物学的検定の段階を含む。
【００１５】
(１)遺伝子の製造
ＥＰＯ  cＤＮＡは、ヒト由来胎児肝臓のcＤＮＡライブラリー(インビトロジェン(Invitrogen)社)で予め製作されたＥＰＯ  cＤＮＡ末端(ＥＰ１およびＥＰ２)の相補的プライマーを用いて通常のＰＣＲ(バイオニアー(Bioneer Co.)のＰＣＲプリミックスキット(PreMix Kit))技術を行うことによって得ることができる。ＴＰＯ  cＤＮＡも上記と同様の方法によってＴＰＯcＤＮＡ末端(Ｔ１およびＴ２)の相補的なプライマーを使用して得られる。
【００１６】
EP1：ATGGGGGCACGAATGTCCTGCCTGGCTGG(配列番号５)
EP2：GTCCCCTGTCCTGCAGGCCT(配列番号６)
T1：ATGGATCTGACTGAATTGCTCCTC(配列番号７)
T2：TTACCCTTCCTGAGACAGATTCTGGGA(配列番号８)
【００１７】
ＰＣＲで得られたＥＰＯ  cＤＮＡとＴＰＯ  cＤＮＡをクローニングベクターであるpＧＥＭ−Ｔ(プロメガ(Promega)社)にそれぞれクローニングした。このpＧＥＭ−ＥＰＯおよびpＧＥＭ−ＴＰＯは、塩基配列を確認した後、以後作業の鋳型として用いる。
【００１８】
本発明で利用されるＴＰＯのＣＴＰ遺伝子であるＬＴＰは、pＧＥＭ−ＴＰＯを鋳型としてプライマーＥＬ１とＴ２を使用してＰＣＲを行うことによって得られる。
EL1：GAGGCCTGCAGGACAGGGGACGCCCCACCCACCACAGCTGTCC(配列番号９)
【００１９】
プライマーＥＬ１にはＥＰＯの３'末端部位に位置する制限酵素ＳtuＩ位置に至る遺伝子と、ＬＴＰ遺伝子(ＴＰＯの１７６〜３５３番アミノ酸)の５'末端の一部分とを同時に含んでいる。一方、pＧＥＭ−ＥＰＯを鋳型として用い、プライマーＥＰ１とＥＰ２を使用してＰＣＲを行ってＥＰＯ遺伝子のみを得る。このようにして得たＥＰＯ遺伝子とＬＴＰ遺伝子を制限酵素ＳtuＩでそれぞれ処理した。その後、ＥＰＯとＬＴＰ遺伝子の断片を結合(ligation)して、結合生成物を鋳型として用い、プライマーＥＰ１１とＬ２を使用してＰＣＲを行って約１１１３bpsの遺伝子断片ＥＬＴＰを得る。
EP11：TAAGCTTATGGGGGTGCACGAATGT(配列番号１０)
L2：TGGATTCTTACCCTTCCTGAGACAGATTC(配列番号１１)
【００２０】
この遺伝子をクローニングベクターのpＧＥＭ−Ｔにクローニングした後、塩基配列を確認した(pＧＥＭ−ＥＬＴＰ図３(ａ))。
【００２１】
また、本発明で利用される遺伝子ＳＴＰは合成およびＰＣＲセルフ−プライミング過程によって得る。合成された遺伝子断片は、下記ＥＳ１、Ｓ２、Ｓ３および上記Ｌ２である。
ES1：AGGGGAGGCCTGCAGGACAGGGGACCCTCTTCTAA(配列番号１２)
S2：GTGGGTGTAGGATGTGTTTAGAAGAGG(配列番号１３)
S3：TACACCCACTCCCAGAATCTGTCTC(配列番号１４)
【００２２】
これらの４つ遺伝子断片を1μlずつ採って(５０pモル／μl)、ＢＭ社の高正確度Taq(high fidelity Taq)システムを使用してＰＣＲを行った。
【００２３】
１％アガロースゲルで、約５０bpの遺伝子断片(ＳＴＰ遺伝子)を確認した。この遺伝子はＴＰＯのカルボキシ末端１７個のアミノ酸(３３７〜３５３位置のアミノ酸)をコードする(図１)。
【００２４】
pＧＥＭ−ＥＰＯを鋳型として用い、プライマーＥＰ１１とＥＰ２を使用してＰＣＲを行い、ＥＰＯ遺伝子のみを得る。このＥＰＯ遺伝子とＳＴＰ遺伝子を同時に鋳型として用い、プライマーＥＰ１１とＬ２を使用してＢＭ社の高正確度Taqシステムを使用するＰＣＲを行うことによって、約６３０bpsの所望の融合遺伝子のＥＳＴＰ遺伝子を得る。この遺伝子をクローニングベクターリンpＧＥＭ−Ｔにクローニングした後、塩基配列を確認した(pＧＥＭ−ＥＳＴＰ、図３(ｂ))。
【００２５】
(２)発現ベクターの構築
発現ベクターはインビトロジェン(Invitrogen)社のｐcＤＮＡ３.１ベクターを用いる。
【００２６】
ｐcＤＮＡ３.１ベクターを制限酵素Ｈind IIIおよびＢamＨＩで処理して直線状ベクターを得た後、pＧＥＭ−ＥＬＴＰとpＧＥＭ−ＥＳＴＰをそれぞれ同じ制限酵素であるＨind IIIおよびＢamＨＩで処理する。アガロースゲル上でキアゲン(Qiagen)抽出キットを用いて消化されたｐcＤＮＡ３.１、ＥＬＴＰおよびＥＳＴＰ遺伝子を分離した。その後、それぞれ遺伝子を結合(ligation)させて、結合物は大腸菌ＮＭ５２２内に導入した。ＬＢ−アンピシリン固体培地で一夜培養した後、生成したコロニーからプラスミドを分離して制限酵素Ｈind IIIとＢamＨＩを処理した。その後、１％アガロースゲル電気泳動でＥＬＴＰおよびＥＳＴＰ遺伝子を持つコロニーを選別する。このプラスミドをそれぞれｐcＤＮＡ−ＥＬＴＰおよびｐcＤＮＡ−ＥＳＴＰと称した(図３(ａ)および(ｂ))。
【００２７】
(３)ＣＨＯ細胞の形質転換および発現
６０mm細胞培養皿(dish)でＣＨＯ細胞(ＤＧ４４)を培養して４０〜８０％(１〜４×１０５細胞／６０mm皿)の集密となるようにする。ＢＭ社のスーパーフェクション試薬(superfection reagent)３μlと細胞培養培地(α−ＭＥＭ−培地、無血清、無抗生物質)９７μlをよく混合し、これに、pcＤＮＡ−ＥＬＴＰ(０.１μg／ μl以上、約２μg)、およびdhfr遺伝子が含まれるベクターpＬＴＲdhfr２６(ＡＴＣＣ３７２９５、０.２μg)を添加した。混合物を室温で５〜１０分間反応させた後、上記で調製した上記細胞に加えた。一日経過後、Ｇ４１８を５００μg／mlの培地(α−ＭＥＭ−培地、１０％ＦＢＳ)に交換した。ついで、この培地を約７〜１０日間５００μg／μlのＧ４１８培地で交換すると、この間にＧ４１８抵抗性遺伝子を持たない細胞と陰性コントロール細胞は完全に死滅する。Ｇ４１８培地で選別された細胞を十分に培養した後、ＢＭ社のＥＰＯ  ＥＬＩＳＡキットを用いて培養液から発現されたＥＬＴＰ蛋白質を確認する。このような方法をＥＳＴＰ発現ベクターを同様に適用した後、ＥＳＴＰ融合蛋白質の発現もまた確認した。
【００２８】
(４)発現されたＥＬＴＰおよびＥＳＴＰの精製
抗−ＥＰＯモノクロナール抗体(Ｒ＆Ｄ社製)を用いて分離精製用親和性樹脂(affinity resin)を下記のように製作する。
【００２９】
ＣＮＢｒ−活性化セファロース４Ｂ０.３ｇを１mM  ＨＣｌで２０分間膨潤させ、樹脂をカラムに移した後、１mM  ＨＣｌで洗浄する。樹脂を４mlのカップリング緩衝液(０.１Ｍ  ＮaＨＣＯ３、０.５Ｍ  ＮaＣｌ、pＨ  ８.３)で洗浄した後、直ぐに４mlカップリング緩衝液に入っている抗−ＥＰＯモノクロナール抗体(５００μg／バイアル)と混合し、チューブを振りながら常温で２時間反応させた。遮断緩衝液(０.２Ｍ  グリシン、pＨ  ８.０)にリフレッシュした後、常温で２時間チューブを振りながら反応させる。６.５mlのカップリング緩衝液、６.５mlの酢酸緩衝液(０.１Ｍ  酢酸、０.５Ｍ  ＮaＣｌ、pＨ  ４)および６.５mlのカップリング緩衝液で順次洗浄する。このように調製された樹脂を用いてカラムを製作し、次のように精製を実施する。
【００３０】
細胞を血清無含有培地で１日培養した後、培養液のみをセントリプレップ(Centriprep、ＭＷＣＯ  １０,０００、ミリポア(Milipore)社製)を用いて約５分の１に濃縮する。約２０ml／hrの流速でＰＢＳによって平衡化させたカラムに添加して再びＰＢＳで洗浄した。カラムおよび溶離液に適用された抽出緩衝液(０.１Ｍ  グリシン、pＨ  ２.８)は、直ぐに１Ｍトリス(Tris)でpＨ７.５となるように滴定する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染色によって分析したとき、純度は最小９７％以上である(図４)。
【００３１】
(５)バイオアッセイ法による活性測定
フェニルヒドラジンで処理されたマウスの脾臓細胞を用いるバイオアッセイ試験で、発現および適当に精製されたＥＬＴＰおよびＥＳＴＰはＥＰＯより高い活性を示す。ＥＬＴＰおよびＥＳＴＰと融合させたカルボキシ末端がＥＰＯの活性自体を妨害しないことを確認することができる。
【００３２】
(６)薬物動態学試験
製造されたＥＬＴＰおよびＥＳＴＰが実際生体内で長い半減期を持っているかの否かを確認するために、薬物動態学試験をマウスを対象に実施した。このとき、合計４匹のマウスに対し、候補物質を１匹当たり２０ユニットの投与量で静脈内(iv)投与する。経時的血中濃度を確認するために、３０分間隔で採血した後、ベーリンガー・マンハイム(Boehringer Mannheim)社のＥＩＡキットを使用して濃度を測定した。マウス薬物動態学試験で候補物質ＥＬＴＰおよびＥＳＴＰは対照薬物であるＥＰＯより遥かに長い半減期を持っていることがわかった(図５)。
【００３３】
以下、本発明を実施例に基づいてより具体的に説明する。しかし、下記実施例は本発明を説明するものと理解されるべきであって、本発明の範囲をいかなる方法によっても制限するものではない。
【００３４】
実施例１：遺伝子調製
ＥＰＯ  cＤＮＡをヒト由来胎児肝臓のcＤＮＡライブラリー(インビトロジェン社)で、予め製作されたＥＰＯ  cＤＮＡの両末端に相補的なプライマー(ＥＰ１、ＥＰ２)を５０pmolの量で使用して通常のＰＣＲ(バーイオニア社のＰＣＲプリミックスキット)を行って得た。ＴＰＯ  cＤＮＡをＴＰＯ  cＤＮＡの両末端に相補的なプライマーＴ１およびＴ２)を使用して同様の方法によって得た。ＢＭ社の高正確度Taq(high fidelity Taq)システムを使用して、５２℃でアニーリング(annealing)４０秒、７２℃で５５秒、９４℃で２０秒の条件で、総３０サイクルのＰＣＲを行ってＥＰＯ  cＤＮＡとＴＰＯ  cＤＮＡを得た。これをクローニングベクターであるpＧＥＭ−Ｔ(プロメガ社)にそれぞれクローニングした。すなわち、ＰＣＲ産物を１％アガロースゲルから抽出してpＧＥＭ−Ｔに結合させた後、大腸菌ＮＭ５２２を形質転換させた。形質転換された大腸菌は、Ｘ−gal／ＩＰＴＧを塗抹したＬＢ−アンピシリン固体培地で一夜培養した。白色コロニーからプラスミドを精製して制限酵素(ＳacＩ、ＳacII)と反応させ、それぞれのcＤＮＡが含まれているコロニーを選別した。この段階で得たベクターをpＧＥＭ-ＥＰＯおよびpＧＥＭ−ＴＰＯとそれぞれ命名して塩基配列を確認した後、以後作業の鋳型として用いた。
【００３５】
本発明で用いられるＴＰＯのＣＴＰ遺伝子であるＬＴＰはpＧＥＭ−ＴＰＯを鋳型として用い、プライマーＥＬ１とＴ２(５０pmol)を用いてＢＭ社の高正確度タグシステムを使用して５０℃でアニーリング４０秒、７２℃で４５秒、９４℃で２０秒の条件で総３０サイクルのＰＣＲを行うことによって得た。プライマーＥＬ１にはＥＰＯ３'末端付近に存在する制限酵素ＳtuＩ位置から３'末端までの遺伝子とＬＴＰ遺伝子の５'末端の一部分を同時に含んでいる。１％アガロースゲルで約５３４bpsの遺伝子断片を確認した(ＬＴＰ遺伝子)。この遺伝子はＴＰＯのカルボキシ末端１７８個(１７６〜３５３番)のアミノ酸をコードする(図１)。
【００３６】
他方では、pＧＥＭ−ＥＰＯを鋳型として用い、プライマーＥＰ１とＥＰ２を使用して上記と同じ条件でＰＣＲを行ってＥＰＯ遺伝子のみを得た。
【００３７】
得られたＥＰＯ遺伝子とＬＴＰ遺伝子を制限酵素ＳtuＩでそれぞれ処理して、キアゲン抽出キットを使用して精製した後、リガーゼ(ligase)で結合させた。遺伝子ＥＰＯの断片とＬＴＰ断片が結合遺伝子を鋳型として使用し、プライマーＥＰ１１とＬ２を用いて(５０pmol)ＢＭ社の高正確度Taqシステムを使用して５５℃でアニーリング４０秒、７２℃で６０秒、９４℃で２０秒の条件で、総３０サイクルを行って約１１１３bpsの所望の融合遺伝子であるＥＬＴＰ遺伝子を得た。この遺伝子をクローニングベクターであるpＧＥＭ−Ｔに上記と同様にしてクローニングした後、塩基配列を確認した(pＧＥＭ−ＥＬＴＰと命名、図３(ａ))。
【００３８】
遺伝子ＳＴＰは、合成およびＰＣＲセルフ−プライミングを用いて得た。合成された遺伝子断片はＥＳ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｌ２である。これらの４つのＤＮＡ断片を１μlずつ採って(５０pmol／μl)、ＢＭ社の高正確度Taqシステムを使用して５５℃でアニーリング４０秒、７２℃で４０秒、９４℃で２０秒の条件で、総１５サイクルのＰＣＲを行った。１％アガロースゲルで約５０bpの遺伝子断片を確認した(ＳＴＰ遺伝子)。この遺伝子はＴＰＯのカルボキシ末端１７個のアミノ酸(３３７〜３５３番)をコードする(図１)。
【００３９】
pＧＥＭ−ＥＰＯを鋳型として用い、プライマーＥＰ１１とＥＰ２を使用して上記と同一条件でＰＣＲを行ってＥＰＯ遺伝子のみを得た。このＥＰＯ遺伝子とＳＴＰ遺伝子を同時に鋳型として用い、プライマーＥＰ１１とＬ２を用いてＢＭ社の高正確度タグシステムを使用し、５８℃でアニーリング４０秒、７２℃で５０秒、９４℃で２０秒の条件で、総３０サイクルのＰＣＲを行うことによって、約６３０bpの所望の融合遺伝子のＥＳＴＰ遺伝子を得た。この遺伝子をクローニングベクターリンpＧＥＭ−Ｔに上記と同様にしてクローニングした後、塩基配列を確認した(pＧＥＭ-ＥＳＴＰと命名、図３(ｂ))。
【００４０】
実施例２：発現ベクターｐcＤＮＡ−ＥＬＴＰおよびｐcＤＮＡ−ＥＳＴＰの調製
発現ベクターとしてインビトロジェン社のｐcＤＮＡ３.１ベクターを用いた。pＧＥＭ−Ｔベクターにクローニングされている遺伝子ＥＬＴＰおよびＥＳＴＰは末端にそれぞれ制限酵素Ｈind IIIおよびＢamＨＩの認識部位を含む。ｐcＤＮＡ３.１、pＧＥＭ−ＥＬＴＰおよびpＧＥＭ−ＥＳＴＰをそれぞれ制限酵素Ｈind IIIとＢamＨＩで処理した。アガロースゲル上で直線状ｐcＤＮＡ３.１とＥＬＴＰ、ＥＳＴＰ遺伝子をキアゲン抽出キットを用いて得た後、ｐcＤＮＡ３.１にＥＬＴＰまたはＥＳＴＰ遺伝子をそれぞれ結合させ大腸菌ＮＭ５２２を形質転換させた。形質転換された大腸菌をＬＢ−アンピシリン固体培地で一夜培養した後、生成したコロニーからプラスミドを分離して制限酵素Ｈind IIIとＢamＨＩを処理し、１％アガロースゲル電気泳動でＥＬＴＰ、ＥＳＴＰ遺伝子が含まれたコロニーのみを選別した。このプラスミドをｐcＤＮＡ３.１−ＥＬＴＰおよびｐcＤＮＡ３.１−ＥＳＴＰとそれぞれ命名した(図３)。
【００４１】
実施例３：ＣＨＯ細胞の形質転換および発現
６０mm細胞培養皿でＣＨＯ細胞(ＤＧ４４)を培養して、４０〜８０％(１〜４×１０５細胞／６０mm皿)集蜜となるようにした。ＢＭ社のスーパーフェクション試薬３μlと細胞培地(α−ＭＥＭ−培地、無含有血清、無含有抗生物質)９７μlをよく混合し、プラスミドｐcＤＮＡ−ＥＬＴＰ(＝０.１μg／μl、約２μg)、およびdhfr遺伝子を含むｐＬＴＲdhfr２６(ＡＴＣＣ３７２９５、０.２μg)を添加した。混合物を室温で５〜１０分間反応させた後、上記で調製した細胞に加えた。一日経過後、培地をＧ４１８を５００μg／ml含む培地(α−ＭＥＭ−培地、１０％  ＦＢＳ)に交換した。約７〜１０日間Ｇ４１８を５００μg／ml含む培地に交換すると、Ｇ４１８抵抗性遺伝子を持たない細胞と陰性コントロールの細胞は完全に死滅した。Ｇ４１８培地で選別された細胞を十分に培養した後、ＢＭ社のＥＰＯ  ＥＬＩＳＡキットを用いて培養液から発現されたＥＬＴＰ蛋白質を確認した。ｐcＤＮＡ−ＥＳＴＰの場合も同様に進行した。
【００４２】
実施例４：発現された融合蛋白質の精製
Ｒ＆Ｄシステム社の抗−ＥＰＯモノクロナール抗体を用いて分離精製用親和性樹脂を下記のように調製した。
【００４３】
ＣＮＢｒ活性化されたセファロース４Ｂ  ０.３ｇを１mM  ＨＣｌで２０分間膨潤させ、樹脂をカラムに移した後、１mM  ＨＣｌで洗浄した。樹脂を４mlのカップリング緩衝液(０.１Ｍ  ＮaＨＣＯ３、０.５Ｍ  ＮaＣｌ、pＨ  ８.３)で洗浄した後、直ぐに４mlカップリング緩衝液に入っている抗−ＥＰＯモノクロナール抗体(５００μg／バイアル)とチューブ内で混合して常温で２時間反応させた。このとき、チューブをよく振った。遮断緩衝液(０.２Ｍ  グリシン、pＨ  ８.０)でリフレッシュした後、常温で２時間振りながら反応させた。６.５mlカップリング緩衝液、６.５ml酢酸緩衝液(０.１Ｍ  酢酸、０.５Ｍ  ＮaＣｌ、pＨ  ４)および６.５mlカップリング緩衝液で順次洗浄した。調製された樹脂を用いてカラムを製作して次のように精製した。
【００４４】
細胞を血清無含有培養液で１日間培養した後、培養液のみをミリポア社のセントリプレップ(Centriprep、ＭＷＣＯ  １０,０００)を用いて約５分の１に濃縮させた。約２０ml／hrの流速でＰＢＳによって平衡化させたカラムに充填し、再びＰＢＳで洗浄した。抽出緩衝液(０.１Ｍグリシン、pＨ２.８)をカラムに添加した後、溶出液を直ぐ１ＭトリスでpＨ７.５で滴定した。精製されたＥＬＴＰおよびＥＳＴＰのＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を図４に示した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染色によって分析したとき、純度は９７％以上であった。
【００４５】
実施例５：バイオアッセイ法による活性測定
フェニルヒドラジンをマウスに１日１回、２日間６０mg／kgずつ注射した。３日経過後、拡張した脾臓を分離してホモジナイザーで破砕して脾臓細胞を得た。脾臓細胞を６×１０６細胞／mlで希釈して９６ウェルプレートに細胞溶液１００μlずつ導入した。導入された各ウェルに標準ＥＰＯ(０〜５００mU／ml)と発現された融合蛋白質を１００mU／mlの濃度でそれぞれ加えた後、プレートを３７℃ＣＯ２インキュベーターで２２時間放置した。各ウェルにジメチル  ３[Ｈ]−チミジン(２０μＣi／ml)を５０μlずつ加えた後、同じインキュベーターで２時間さらに反応させ、反応液を各ウェル別にグラスフィルタ(Ｎunc １−７３１６４)に吸着させた。濾過物を生理食塩水で３回洗浄し、βカウンター用いて各フィルターの放射能量を測定した。融合蛋白質ＥＬＴＰおよびＥＳＴＰの活性を標準ＥＰＯと比較して測定した時、融合蛋白質の活性が標準ＥＰＯに類似するか、若干高く現れた。ＥＰＯに添加されたカルボキシ末端の存在は、ＥＰＯの活性自体を妨害しないことを確認することができた。
【００４６】
実施例６：薬物動態学試験
製造された候補物質が、実際に生体内で長い半減期を持っているか否かを確認するために、薬物動態学試験をマウスを対象に実施した。実施例５に記載された方法によって精製された融合蛋白質をそれぞれ合計４匹のマウスに対し、１匹当たり２０ユニットで静脈内(iv)投与した。経時的血中濃度を確認するために、マウスから３０分間隔で採血した後、ベーリンガー・マンハイム社のＥＩＡキットを使用して濃度を測定した。その結果を図５に示した。図５に示すように、ＥＬＴＰおよびＥＳＴＰは対照薬物のＥＰＯよりそれぞれ約３倍(ＥＰＯ半減期  ２２分、ＥＬＴＰ  ６０分、ＥＳＴＰ  ５７分)の遥かに長い半減期を示すことがわかった。
【００４７】
産業上の利用可能性
本発明にかかる融合蛋白質は、ＥＰＯの固有活性自体には影響を与えず、糖鎖を増加させるアミノ酸の存在によってＥＰＯの生体内半減期を画期的に増加させる。また、融合蛋白質は融合したペプチド、すなわち、ＬＴＰ又はＳＴＰが体内に存在するペプチドであるので体内に適用時に抗原性を誘発しない。
【００４８】
【配列表】
0003860097.tif 000002
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【図面の簡単な説明】
【図１】  FIGURE １(a)は、血小板産生因子(ＴＰＯ)のカルボキシ末端ペプチド(ＬＴＰ)の塩基およびアミノ酸配列を示す。
【図２】  FIGURE １(b)は、血小板産生因子(ＴＰＯ)のカルボキシ末端ペプチド(ＳＴＰ)の塩基およびアミノ酸配列を示す。
【図３】  FIGURE ２(ａa)は、エリスロポエチン(ＥＰＯ)とペプチドＬＴＰの融合蛋白質ＥＬＴＰの塩基およびアミノ酸配列を示す。
【図４】  FIGURE ２(ab)は、エリスロポエチン(ＥＰＯ)とペプチドＬＴＰの融合蛋白質ＥＬＴＰの塩基およびアミノ酸配列を示す。
【図５】  FIGURE ２(b)は、エリスロポエチン(ＥＰＯ)とペプチドＳＴＰの融合蛋白質ＥＳＴＰの塩基およびアミノ酸配列を示す。
【図６】  FIGURE３(a)は、発現ベクターｐcＤＮＡ−ＥＬＴＰの製作過程を示す模式図である。
【図７】  FIGURE３(b)は、ｐcＤＮＡ−ＥＳＴＰの製作過程を示す模式図である。
【図８】  FIGURE４は、発現ベクターＥＬＴＰおよびＥＳＴＰの電気泳動写真である。
【図９】  FIGURE５は、ＥＰＯ、ＥＬＴＰおよびＥＳＴＰの薬物動態学的結果を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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