(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アンジオテンシン変換酵素の活性を阻害するアンジオテンシン変換酵素阻害剤であって、該阻害剤はブタ心臓またはブタ肝臓を食品添加物用プロテアーゼを用いてｐＨ値が 3.0±0.5 、温度が 40〜60 ℃、反応時間が 12〜24 時間の条件で加水分解して得られ、
前記食品添加物用プロテアーゼが前記ブタ心臓に対してはデナプシン１０Ｐを、前記ブタ肝臓に対してはＸＰ−４１５をそれぞれ用いることを特徴とするアンジオテンシン変換酵素阻害剤。
【請求項２】
ブタ心臓またはブタ肝臓を加熱処理して、該ブタ心臓または該ブタ肝臓に含まれる内因性プロテアーゼを失活させる失活工程と、前記失活工程後のブタ心臓またはブタ肝臓を食品添加物用プロテアーゼを用いてｐＨ値が 3.0±0.5 、温度が 40〜60 ℃、反応時間が 12〜24 時間の条件で加水分解する酵素分解工程とを含むアンジオテンシン変換酵素阻害剤の製造方法であって、
前記酵素分解工程は、前記食品添加物用プロテアーゼとして、前記ブタ心臓に対してはデナプシン１０Ｐを、前記ブタ肝臓に対してはＸＰ−４１５をそれぞれ用いて分解する工程であることを特徴とするアンジオテンシン変換酵素阻害剤の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ブタ内臓抽出物から得られ、特に、血圧降下剤、血圧降下用食品として有用なアンジオテンシン変換酵素（以下ＡＣＥと略す）阻害剤およびその製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、日本人の食生活が欧米化し、またコンビニエンスストアやファーストフードの普及によって食事当たりの品数が減少の傾向を見せている。このような食生活の変化が生活習慣病増加の原因の一つとなっている。
生活習慣病の一つに、循環器系統の疾患である高血圧がある。高血圧症は、病的に血圧上昇の明らかなもの（病侯性高血圧）と、不明なもの（本能性高血圧）とに大別されている。前者は病気の原因を治癒させることによって高血圧を治癒させることができるのに対して、後者は原因に対する直接的な治療は難しい。また生体中では、レニン−アンジオテンシン系が血圧上昇の重要な役目を担っていると考えられており、その阻害薬が高血圧の治療に有効とされ、多くの阻害薬が開発されてきた。しかし、強力な阻害薬である合成化合物には、副作用としての空咳等が知られており、安全性の点で問題が残っている。このように、副作用の問題や、食事として摂れる簡便性の点からも、マイルドに働く天然物由来ＡＣＥ阻害剤を検索することは、生活習慣病が蔓延している現代社会では有用である
。
【０００３】
ここで、ＡＣＥを含むレニン−アンジオテンシン系について説明する。アンジオテンシンは動物の生体中に存在する生理活性ペプチドで、I、II、III の 3種類が知られている。アンジオテンシンＩは、10個のアミノ酸からなるデカペプチドで、このＣ末端からＨｉｓ−Ｌｅｕが遊離したオクタペプチドがアンジオテンシンIIである。アンジオテンシンIIは、強力な血圧上昇作用を持っており、この反応を触媒する酵素がＡＣＥである。また、アンジオテンシンIIのＮ末端のＡｓｐが除かれると、アンジオテンシンIII となる。アンジオテンシンIII の血圧上昇作用はアンジオテンシンIIの1/2 となっている。
この他アンジオテンシンII、III は副腎皮質に作用して、鉱質コルチコイドの一つであるアルドステロンの生合成、分泌を促す。これは、ステロイドホルモンの一種で生体中での鉱質（特にナトリウムとカリウム）代謝に関与している。この代謝作用は、おもに、ナトリウムイオンの再吸収増加による体内貯留作用と、カリウムイオンの腎臓での排泄の促進作用で、水代謝にも影響を及ぼしている。アルドステロンへの作用はアンジオテンシンII、III とも等価の分泌促進作用を持っている。また、腎臓や血漿中に存在する、血圧降下作用を持つアミノ酸 9個からなる生理活性ペプチドであるブラジキニンは、ＡＣＥのよって不活性化される。
このように、ＡＣＥは、血圧上昇に関与するアンジオテンシンIIの生成を促進し、血圧降下に関係するブラジキニンを不活性化することによって、生体中で血圧上昇に関わっている。
人をはじめとした動物が食事をすると、消化管内でタンパク質が消化されて、吸収されるまでに様々なペプチドが生成する。これら食品由来のペプチドの中には、そのまま吸収利用され血中でＡＣＥの基質となり、拮抗的にアンジオテンシンI からIIへの変換を阻害し、同時にブラジキニンの分解をも阻害して生体中での血圧上昇を抑制する作用を示すものもある。
【０００４】
一方、食用ブタは生後約半年で屠殺すると、体重は約 115kg〜120kg で、そのうち血液が、約 5〜6％、四肢端が 1％以下、内臓が 13〜14％、そして可食部の約 65％が枝肉となる。枝肉はさらに部位別に分けられる。内臓については、廃棄される肺、脾臓以外の臓器は、その 30％くらいが異常や疾病のため廃棄、残りが可食部分になる。これらは、関東地方を中心にホルモンとして食べられているが、三重県を始め、関西地方ではあまり食されていない。また、内臓の部位別では、心臓や、大腸、小腸に比べて、肝臓については、ホルモン業者に売却後、ペットフード等に利用されている傾向があり、いずれにしても高付加価値のある商品とはなっていない。
従来、ブタの血漿由来のＡＣＥ阻害物質が知られている（特開平３−１８２０６９号公報）。
また、魚介肉、ブタ肉、牛肉または鶏肉などをサーモライシンまたはペプシンにより加水分解してＡＣＥ阻害剤活性を有する組成物の製造方法が知られている（特開平５−２４４９７９号公報）。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、枝肉と異なり、高付加価値のある商品とはなっていない、ブタ内臓の肝臓や心臓に起源を持つＡＣＥ阻害剤およびその製造方法がないという問題がある。
特にブタ内臓由来により、温和に働き、しかも副作用の少ない食品添加物としてのＡＣＥ阻害剤およびその製造方法がないという問題がある。
本発明は、このような問題に対処するためになされたもので、高付加価値のある商品として利用されていなかったブタ内臓を原料として得られるＡＣＥ阻害物質およびその製造方法を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
請求項１の発明は、アンジオテンシン変換酵素の活性を阻害するアンジオテンシン変換酵素阻害剤であって、該阻害剤はブタ心臓またはブタ肝臓を食品添加物用プロテアーゼを用いてｐＨ値が 3.0±0.5 、温度が 40〜60 ℃、反応時間が 12〜24 時間の条件で加水分解して得られ、上記食品添加物用プロテアーゼが上記ブタ心臓に対してはデナプシン１０Ｐを、上記ブタ肝臓に対してはＸＰ−４１５をそれぞれ用いることを特徴とする。
請求項２の発明は、ブタ心臓またはブタ肝臓を加熱処理して、該ブタ心臓または該ブタ肝臓に含まれる内因性プロテアーゼを失活させる失活工程と、上記失活工程後のブタ心臓またはブタ肝臓を食品添加物用プロテアーゼを用いてｐＨ値が 3.0±0.5 、温度が 40〜60 ℃、反応時間が 12〜24 時間の条件で加水分解する酵素分解工程とを含むアンジオテンシン変換酵素阻害剤の製造方法であって、上記酵素分解工程は、上記食品添加物用プロテアーゼとして、上記ブタ心臓に対してはデナプシン１０Ｐを、上記ブタ肝臓に対してはＸＰ−４１５をそれぞれ用いて分解する工程であることを特徴とする。
【０００７】
ブタ内臓、特に、その肝臓および心臓から選ばれた少なくとも一つのブタ内臓を食品添加物用プロテアーゼを用いて分解することにより、他の肉類、または内蔵以外の部位由来のＡＣＥ阻害剤に比較して優れたＡＣＥ阻害剤となる。また、水溶性であるので食品添加物として利用しやすい。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明に用いるブタ内臓は食用ブタの内臓であればいずれの種類でもよい。特に、生産量から考えて有用なのは大ヨークシャー種（Ｗ）とランドレース種（Ｌ）を掛け合わせた雌豚に、デュロック種（Ｄ）の雄豚を掛け合わせた３元交配種（ＷＬＤもしくはＬＷＤ）の内臓が好ましい。
【０００９】
肥育したブタは食肉用として生後半年間肥育したものを屠殺、新鮮内臓を用いることが好ましく、内臓としては肝臓、心臓、肝臓および心臓の混合が、後述する実験の結果、他の内蔵よりもＡＣＥ阻害活性が高くなるので好ましい。
【００１０】
本発明に用いる食品添加物用プロテアーゼは、食品添加物として用いられているプロテアーゼである。食品添加物として用いられていれば、他の用途、例えば皮革用、クリーニングに用いられていてもよい。本発明に係るＡＣＥ阻害剤は食品に効果的に応用でき、またＡＣＥ阻害剤を工業的に安価に製造できるためである。
本発明に用いることができる好ましい食品添加物用プロテアーゼとしては、細菌プロテアーゼ、糸状菌プロテアーゼ、パパインおよびこれらを主成分とするプロテアーゼが挙げられる。
【００１１】
具体的に好適な食品添加物用プロテアーゼとしては、デナチームＡＰ、ビオプラーゼＳＰ−１５ＦＣ、ビオプラーゼＳＰ−４ＦＣ、パパイン、デナプシン１０Ｐ、およびＸＰ−４１５（いずれもナガセ生化学（株）社製、商品名）を挙げることができる。
【００１２】
デナチームＡＰは糸状菌 Aspergillus oryzae 起源の中性プロテアーゼで、タンパク質の可溶化に用いられている。ｐＨ値は 7.0、温度は 50℃がそれぞれ反応に最適な値である。
【００１３】
ビオプラーゼは枯草菌 Bacillus subtilis起源のアルカリ性プロテアーゼで、基質特異性が低く肉エキスの製造やイカの剥皮処理等に用いられている。ｐＨ値は 8.0、温度は 55℃がそれぞれ反応に最適な値である。
【００１４】
パパインはパパイヤの酵素であるが、（Arg,Lys,Glu,His,Gly,Tyr の部位で切断するシステインプロテアーゼ）、食品添加用精製パパインである。ｐＨ値は 7.0、温度は 55℃がそれぞれ反応に最適な値である。
【００１５】
デナプシン１０Ｐは糸状菌 Aspergillus niger起源の酸性プロテアーゼで、酸性側でタンパク質を分解する。ｐＨ値は 3.0、温度は 40℃がそれぞれ反応に最適な値である。
【００１６】
ＸＰ−４１５は糸状菌Rhizopus delemarの生産するプロテアーゼを主体とする酵素剤で、プロテアーゼ以外にβ-1,3グルカナーゼ、ポリガラクツロナーゼ等を含み、植物組織を分解し、醸造酒の粘度低下等に使用されている。ｐＨ値は 3.0、温度は 40℃がそれぞれ反応に最適な値である。
【００１７】
上記食品添加物用プロテアーゼを用いてブタの肝臓等を加水分解することにより、ＡＣＥ阻害剤が得られる。製造方法について、以下説明する。
ブタの肝臓、心臓、またはそれらの混合物を細片として水中に懸濁した後、ミキサー等でホモジナイズする。これを加熱処理して内因性のプロテアーゼを失活させる。この条件は、内因性のプロテアーゼを失活させることができる加熱処理条件であればよく、ブタの肝臓等の場合、 95〜98℃に 15〜20 分間保持することが好ましい。冷却した後、必要に応じてさらにホモジナイズして、プロテアーゼを加えて所定の条件で酵素による加水分解反応を行なう。
【００１８】
加水分解反応条件は、ブタの肝臓等を加水分解できる条件であればよい。例えば、ホモジナイズされたブタの肝臓等の液を、使用するプロテアーゼの反応に適したｐＨ値となるように酸またはアルカリによりｐＨ調整する。なお、反応に適したｐＨ値とは、上述した最適ｐＨ値±0.5 の範囲をいう。その後、プロテアーゼを加えて 40〜60 ℃に 12〜24 時間保持することにより加水分解できる。反応停止は、例えば、煮沸処理等によりプロテアーゼを失活させる。
得られた加水分解液を必要に応じて再度ホモジナイズして均一化した後に、中和、遠心分離、上澄み液のろ過により水溶性のＡＣＥ阻害剤が得られる。
【００１９】
得られた水溶性のＡＣＥ阻害剤は、そのままの形態でも、あるいは公知の方法により高速液体クロマトグラフィー（以下ＨＰＬＣと略す）による部分精製を行なって、より純度の高い形態としても用いることができる。
本発明のＡＣＥ阻害剤は、機能性食品素材として用いることができる。特に本発明品を用いることにより、血圧降下を促進できる。また、錠剤、カプセル剤等として血圧降下剤として用いることができる。
【００２０】
【実施例】
実施例１
ブタの心臓 10g を切り分け、氷温で冷却した蒸留水 100ml 中に、細かく切り刻んだ状態で懸濁した。これを冷却しながらホモジナイズ用のミキサーで 1分間ホモジナイズしたのち、沸騰湯浴中に 20 分間入れて内因性のプロテアーゼを失活させ、冷却した後、さらに 30秒間ホモジナイズして試料を溶液中に均一化させた。
次に、 1N 水酸化ナトリウムまたは 1N 塩酸で、各プロテアーゼの最適ｐＨになるように調製した後、サンプル重量に対して 0.5重量％となるように表１に示すプロテアーゼを加えた。各プロテアーゼに最適の温度で 16 時間反応させて、その後 15 分間煮沸処理して酵素反応を止めた。酵素反応停止後 30 秒間ホモジナイズして均一化した後に、 1N 水酸化ナトリウムまたは 1N 塩酸で中和し、17,000xgで 15 分間遠心分離した。得られた上澄みはポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）膜等でろ過し、200ml にメスアップした。
【００２１】
供試試料の不溶性タンパク質の可溶化率を以下の方法で測定し、結果を表１に示す。
供試試料中の粗タンパク質のｇ数をａ、試料中の内因性のプロテアーゼを失活させメスアップし、その後窒素分析の結果から算出した可溶性の粗タンパク質のｇ数をｂ、プロテアーゼ処理して可溶化した試料中の粗タンパク質濃度をｃとして、以下の式から求めた。
可溶化率（％）＝｛（ｃ−ｂ）／（ａ−ｂ）｝×１００
【００２２】
ＡＣＥ阻害活性を次に方法で測定した。
1.2M 塩化ナトリウム 50μl と蒸留水（ブランク）もしくは 50μl の試料溶液を用意し、それに 40m Units のＡＣＥを含んだ、50mMホウ酸緩衝液（ｐＨ 8.3） 50μl を加えた。3 分間、37℃でインキュベートした後、基質として10mM Ｈｉｐ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕを含んだ 350mMホウ酸緩衝液（ｐＨ 8.3）50μl を加え、反応を開始した。30分間反応させた後、 1N 塩酸 200μl を加え反応を停止させた。5 分後、酢酸エチル1ml で遊離したヒプリル酸を抽出した。次に抽出液を遠心エバポレーターで蒸発乾固し、蒸留水1ml に溶解して 226nm で吸光度を測定した。この反応によって、基質であるヒプリルヒスチジルロイシンのヒプリル酸とヒスチジルロイシンの間が切断され、分光光学的に定量可能なヒプリル酸が生成し、その吸収波長である 226nm での吸光度を測定した。ＡＣＥ阻害活性（％）は、測定試料による測定値を（Ｓ）、測定試料の代わりに蒸留水を用いた場合を（Ｃ）、蒸留水にあらかじめ反応停止液（ 1N 塩酸、200μl ）を加えて反応させた場合を（Ｂ）として次の式から算出した。
ＡＣＥ阻害活性（％）＝｛（Ｃ−Ｓ）／（Ｃ−Ｂ）｝×１００
各プロテアーゼ処理ブタ内臓抽出物の粗タンパク質濃度は、ケルダール法によって窒素分析して求めた。
【００２３】
ＡＣＥ阻害活性の強さを示すために、ＡＣＥ阻害剤未添加の状態を酵素活性 100％として、その活性を半分に減じるのに必要な阻害剤の量を、反応生成物の生成量から求め阻害活性の強さ（ＩＣ50）として示した。
ＩＣ50の算出は、メスアップしたサンプルを各々希釈して、 3点ずつプロットし、両対数グラフ上での直線を求めてＡＣＥ活性が 50％になるときの阻害剤の濃度を求めＩＣ50の値とした。結果を表１に示す。
【００２４】
【表１】
0003851931.tif 000002
【００２５】
表１から明らかなように、プロテアーゼ処理前の可溶性部分ではＡＣＥ阻害活性をほとんど示さず、プロテアーゼ処理によって心臓抽出物は、ＡＣＥ阻害活性が現れた。また、各々のプロテアーゼ処理の中で、デナプシン１０Ｐ処理物が最も強いＡＣＥ阻害活性を示した。
【００２６】
実施例２
ブタの心臓を肝臓に代える以外は実施例１と同様にしてＡＣＥ阻害剤を得て
、実施例１と同様にして可溶化率（％）およびＩＣ50の値を求めた。結果を表２に示す。
【００２７】
【表２】
0003851931.tif 000003
【００２８】
表２から明らかなように、プロテアーゼ処理前の可溶性部分ではＡＣＥ阻害活性をほとんど示さず、プロテアーゼ処理によって肝臓抽出物は、ＡＣＥ阻害活性が現れた。また、各々のプロテアーゼ処理の中で、ＸＰ−４１５処理物が最も強いＡＣＥ阻害活性を示した。
【００２９】
比較例１
ブタの心臓をロース肉に代える以外は実施例１と同様にしてＡＣＥ阻害剤を得て、実施例１と同様にして可溶化率（％）およびＩＣ50の値を求めた。結果を表３に示す。
【００３０】
【表３】
0003851931.tif 000004
【００３１】
表３から明らかなように、ブタのロース肉においてはプロテアーゼ添加前からある程度のＡＣＥ阻害活性を示しており、プロテアーゼ添加によって逆にＡＣＥ阻害活性が低下した。
【００３２】
実施例３
実施例１および実施例２で得られたＡＣＥ阻害剤の中で、それぞれＡＣＥ阻害活性の最も強かった、ブタ心臓のデナプシン１０Ｐ処理物およびブタ肝臓のＸＰ−４１５処理物について、ＨＰＬＣによる部分精製を行なった。
カラムは、ＯＤＳ、Ｃ１８系のカラム（10.0ｘ250mm ）を用い、サンプルはタンパク質濃度で１回に約 600μg 用いた。溶媒は0.1 ％トリフルオロ酢酸、アセトニトリルと超純水を用い、流速 2.5ml/min、アセトニトリル 0〜60％のリニアグラジエントで溶出させた。この分離操作を 3回繰り返してフラクションを集め、減圧エバポレーターで濃縮乾燥し、300μl の超純水に溶解して、そのうち50μl を 2連でＡＣＥ阻害活性の測定に用いた。ブタ心臓のデナプシン１０Ｐ処理物の逆相クロマトグラフィーによる部分精製結果を図１に、逆相クロマトフラクションのＡＣＥ阻害活性の強さを図２に示す。同様に、ブタ肝臓のＸＰ−４１５処理物の逆相クロマトグラフィーによる部分精製結果を図３に、逆相クロマトフラクションのＡＣＥ阻害活性の強さを図４に示す。
【００３３】
図１〜図４に示すように、実施例１および実施例２で得られたＡＣＥ阻害剤は、フラクションナンバーＦｒ．１〜Ｆｒ．１０で示すように、複数のＡＣＥ活性阻害物質が含まれていることが判明した。また、これらの逆相クロマトフラクションをプロテインシーケンサーにかけて分析したところ、アミノ酸残基数で、 3〜4 残基程度のポリペプチドであることが判明した。なお、破線はアセトニトリル濃度を示す。
上記したように、本発明のＡＣＥ活性阻害剤は、未精製であっても精製品であってもＡＣＥ阻害活性が強いことを示した。
【００３４】
【発明の効果】
本発明は、ブタ内臓を食品添加物用プロテアーゼを用いて分解して得られるＡＣＥ阻害剤であるので、特に血圧降下剤、または血圧降下食品として有用である水溶性のＡＣＥ阻害剤含有剤が得られた。また、ブタ内臓を高付加価値を持たせる機能性素材、食品素材、特に温和に働き、しかも副作用の少ない食品添加物として利用できる。
【００３５】
また、ブタの肝臓および心臓から選ばれた少なくとも一つを含むブタ内臓を加熱して含まれる内因性プロテアーゼを失活させる工程と、該内因性プロテアーゼを失活させたブタ内臓を食品添加物用プロテアーゼを用いて分解する工程とを含むので、工業的に安価な原料で安全な食品添加物を製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  逆相クロマトグラフィーによるブタ心臓のデナプシン１０Ｐ分解物の部分精製を示した図である。
【図２】  ブタ心臓のデナプシン１０Ｐ分解物の部分精製物と各フラクションのＡＣＥ阻害活性の強さを示した図である。
【図３】  逆相クロマトグラフィーによるブタ肝臓のＸＰ−４１５分解物の部分精製を示した図である。
【図４】  ブタ肝臓のＸＰ−４１５分解物の部分精製物と各フラクションのＡＣＥ阻害活性の強さを示した図である。
【符号の説明】
Ｆｒ１〜Ｆｒ１０  フラクションナンバー
【図１】
0003851931.tif 000005
【図２】
0003851931.tif 000006
【図３】
0003851931.tif 000007
【図４】
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