(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料溶液が流れる流路の一部分に、固定化されたヒスタミン酸化酵素を有し、前記流路の前記固定化されたヒスタミン酸化酵素の位置よりも下流部分に、電極反応を介して過酸化水素を還元する性質を有する膜で修飾された電極を有しているヒスタミンセンサであって、
前記固定化されたヒスタミン酸化酵素がビーズに固定化されたヒスタミン酸化酵素であり、
前記電極反応を介して過酸化水素を還元する性質を有する膜で修飾された電極が、更に、アニオン性の高分子膜、あるいはＬ-アスコルビン酸酸化酵素を含有する膜で修飾されていることを特徴とするヒスタミンセンサ。
【請求項２】
試料溶液が流れる流路の一部分に、固定化されたヒスタミン酸化酵素を有し、前記流路の前記固定化されたヒスタミン酸化酵素の位置よりも下流部分に、電極反応を介して過酸化水素を還元する性質を有する膜で修飾された電極を有しているヒスタミンセンサであって、
前記固定化されたヒスタミン酸化酵素がビーズに固定化されたヒスタミン酸化酵素であり、
前記流路の前記固定化されたヒスタミン酸化酵素の位置よりも上流部分に、Ｌ-アスコルビン酸酸化酵素を含有する膜を有することを特徴とするヒスタミンセンサ。
【請求項３】
試料溶液が流れる流路の一部分に、固定化されたヒスタミン酸化酵素を有し、前記流路の前記固定化されたヒスタミン酸化酵素の位置よりも下流部分に、電極反応を介して過酸化水素を還元する性質を有する膜で修飾された電極を有しているヒスタミンセンサであって、
前記固定化されたヒスタミン酸化酵素が前記流路の内壁に、共有結合によって固定化されるかあるいは高分子膜内に取り込まれた形で固定化されたヒスタミン酸化酵素であり、
前記電極反応を介して過酸化水素を還元する性質を有する膜で修飾された電極が、更に、アニオン性の高分子膜、あるいはＬ-アスコルビン酸酸化酵素を含有する膜で修飾されていることを特徴とするヒスタミンセンサ。
【請求項４】
試料溶液が流れる流路の一部分に、固定化されたヒスタミン酸化酵素を有し、前記流路の前記固定化されたヒスタミン酸化酵素の位置よりも下流部分に、電極反応を介して過酸化水素を還元する性質を有する膜で修飾された電極を有しているヒスタミンセンサであって、
前記固定化されたヒスタミン酸化酵素が前記流路の内壁に、共有結合によって固定化されるかあるいは高分子膜内に取り込まれた形で固定化されたヒスタミン酸化酵素であり、
前記流路の前記固定化されたヒスタミン酸化酵素の位置よりも上流部分に、Ｌ-アスコルビン酸酸化酵素を含有する膜を有することを特徴とするヒスタミンセンサ。
【請求項５】
請求項１乃至４のいずれかに記載のヒスタミンセンサにおいて、前記電極が絶縁性基板上に形成された薄膜電極であることを特徴とするヒスタミンセンサ。
【請求項６】
請求項１乃至４のいずれかに記載のヒスタミンセンサにおいて、前記電極反応を介して過酸化水素を還元する性質を有する膜がペルオキシダーゼ系の酵素を含有する膜であることを特徴とするヒスタミンセンサ。
【請求項７】
請求項１乃至６のいずれかに記載のヒスタミンセンサにおいて、前記流路の前記固定化されたヒスタミン酸化酵素の位置よりも上流部分に、電気化学的に酸化されやすい物質を酸化するための電極を有することを特徴とするヒスタミンセンサ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、食肉、鮮魚などの食品検査や、脳脊髄液などの生体試料の測定において試料中に含まれるヒスタミンを高感度、かつ連続的に定量分析するためのヒスタミンセンサに関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヒスタミンは生体アミンの一種であり、消化液の分泌やアレルギー反応に関係するのみならず、脳内の伝達物質として働く分子である。また、魚介類や食肉中のヒスチジンが微生物と反応することにより生じるため、食品衛生上、食品中の濃度を迅速に測定する方法が求められている。
【０００３】
食品中のヒスタミンについては、北米食品薬品局（ＦＤＡ）が１９８２年に蛍光法によるヒスタミンの測定法を定めている。蛍光法はヒスタミンとクロマトグラフィにおける誘導体化試薬としても良く使用されている蛍光試薬である o-フタルアルデヒドとの反応により蛍光物質を合成し、その蛍光強度より濃度を求めるものである。しかしながら、蛍光法は妨害物質の影響を受けやすく、前もって妨害物質を除去する必要があることや、蛍光試薬が必要であるなどといった問題があり、試薬の反応時に正確な時間と温度の制御が必要である。
【０００４】
一方、液体クロマトグラフィによるヒスタミンの定量方法も数多く報告されている。例えば、本願発明者の内の１名は脳などの生体組織に含まれるヒスタミンとメチルヒスタミンの濃度を高速液体クロマトグラフィにより感度良く検出している (K. Alam、M. Sasaki、T. Watanabe and K.Maeyama、Analytical Biochemistry、229巻、26-34頁 (1995年) 参照）。この方法ではカラムによって数種類のアミンを分離した後、ジアミン酸化酵素が固定化された酵素カラムによりヒスタミンを酸化して過酸化水素を発生させ、これに蛍光試薬であるルミノールとフェリシアン化カリウムを混合して化学発光を起こし、その発光強度から定量を行っている。
【０００５】
液体クロマトグラフィ法では極めて低い検出限界（即ち高感度）が得られるが、分離プロセスのみで１０分以上の時間がかかるため、汎用性、迅速性が損なわれる。また、細胞からのヒスタミンの放出挙動など、より短い時間分解能が必要な場合には不都合である。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
一方、近年、酵素反応と電気化学検出器あるいは酸素センサを組み合わせることによりヒスタミンを検出する方法が提案されている。モノアミン酸化酵素膜を修飾した酸素電極を用いて溶存酸素の変化よりヒスタミンを定量する方法が提案されている（I. Karube et al.、Enzyme Microb. Technol.、2巻、117-120頁   (1980年) 参照）。また、被測定液にヒスタミン酸化酵素を混合し、被測定液の酸素消費量を測定することによりヒスタミンを迅速に定量する方法が提案されている（寄藤他、特開平５−２３６９５２号公報、大橋他、特開平１０−１７４５９９号公報参照）。
【０００７】
しかしながら、前者の方法では、大橋らにより（大橋他、特開平１０−１７４５９９号公報記載のように）修飾膜の作製法や反応温度により特性が変動することなど多くの問題点が指摘されている。一方、後者では被測定液に含まれるヒスタミン全量を酵素反応により酸化するため、化学量論関係が成立し、測定精度が高い。しかしながら、被測定液に高価な酵素を添加するため費用がかかること、近年、医学生理学の測定で要求されている細胞レベルへのヒスタミンの測定などマイクロリットル、ナノリットルレベルの微少量試料の測定では測定系の酸素濃度をコントロールするのが困難であり、またヒスタミン濃度が低い場合には酸素のわずかな減少量を測定する必要があり、酵素反応生成物を測定する方式に較べて、低濃度での定量性に劣るなどの問題があった。
【０００８】
一方、酵素反応生成物を測定する方法として、ジアミン酸化酵素を修飾した白金電極を利用するアンペロメトリックなセンサも報告されている（例えば、S.  Tombelli et al.、Anal. Chim. Acta、358巻、3号、277-284頁、(1998年）参照）。この方法では、酸素濃度が基質濃度より充分大きい場合、酵素反応生成物である過酸化水素を再現性良く測定できる。特にヒスタミン濃度が低い場合、酸素消費量が少ないため、試料内の酸素濃度を調整する必要がなく、酸素減少量を測定する方法に比べて簡便である。また、センサも容易に微小化できる。しかしながら、過酸化水素を酸化して測定を行うには白金電極の電位を 500 mV 以上（銀／塩化銀参照電極に対して）にする必要があり、試料中に共存し電気化学的に酸化されやすい Ｌ-アスコルビン酸、尿酸などの妨害を受けやすい問題点があった。また、ジアミン酸化酵素は多くのジアミン類と反応するため、ヒスタミンを選択性良く測定することができなかった。一方、過酸化水素を、ペルオキシダーゼ系の酵素を用い、電子伝導性の膜を介して電極反応により還元する方法が提案されている（例えば、M. Vreeke、R. Maidan、A. Heller、Analytical Chemistry、64巻、 3084-3090頁、(1998年）参照)。発明者らはポリビニルピリジンのオスミウム錯体に西洋ワサビペルオキシダーゼを結合した膜とヒスタミン酸化酵素膜を２層に修飾した電極を用いることにより 0 V 付近の低い電位でヒスタミンを高感度に測定できることを報告した（丹羽、栗田、堀内、鳥光、前山、谷沢、日本分析化学会第４７年会要旨集、51頁参照）。この方法では低い検出限界が得られるものの、膜に固定された酵素の量や膜厚により信号の絶対値が変化する問題があった。
【０００９】
本発明の目的は、試料中のヒスタミン濃度を測定するための電気化学センサにおける上記課題を解決し、簡便な方法で、低い濃度まで高感度に、選択性および再現性良く、ヒスタミン濃度を測定するセンサを提供することである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明は、上記目的を達成するために、請求項１に記載のように、
試料溶液が流れる流路の一部分に、固定化されたヒスタミン酸化酵素を有し、前記流路の前記固定化されたヒスタミン酸化酵素の位置よりも下流部分に、電極反応を介して過酸化水素を還元する性質を有する膜で修飾された電極を有しているヒスタミンセンサであって、前記固定化されたヒスタミン酸化酵素がビーズに固定化されたヒスタミン酸化酵素であり、前記電極反応を介して過酸化水素を還元する性質を有する膜で修飾された電極が、更に、アニオン性の高分子膜、あるいはＬ-アスコルビン酸酸化酵素を含有する膜で修飾されていることを特徴とするヒスタミンセンサを構成する。
また、本発明は、請求項２に記載のように、
試料溶液が流れる流路の一部分に、固定化されたヒスタミン酸化酵素を有し、前記流路の前記固定化されたヒスタミン酸化酵素の位置よりも下流部分に、電極反応を介して過酸化水素を還元する性質を有する膜で修飾された電極を有しているヒスタミンセンサであって、前記固定化されたヒスタミン酸化酵素がビーズに固定化されたヒスタミン酸化酵素であり、前記流路の前記固定化されたヒスタミン酸化酵素の位置よりも上流部分に、Ｌ-アスコルビン酸酸化酵素を含有する膜を有することを特徴とするヒスタミンセンサを構成する。
また、本発明は、請求項３に記載のように、
試料溶液が流れる流路の一部分に、固定化されたヒスタミン酸化酵素を有し、前記流路の前記固定化されたヒスタミン酸化酵素の位置よりも下流部分に、電極反応を介して過酸化水素を還元する性質を有する膜で修飾された電極を有しているヒスタミンセンサであって、前記固定化されたヒスタミン酸化酵素が前記流路の内壁に、共有結合によって固定化されるかあるいは高分子膜内に取り込まれた形で固定化されたヒスタミン酸化酵素であり、前記電極反応を介して過酸化水素を還元する性質を有する膜で修飾された電極が、更に、アニオン性の高分子膜、あるいはＬ-アスコルビン酸酸化酵素を含有する膜で修飾されていることを特徴とするヒスタミンセンサを構成する。
また、本発明は、請求項４に記載のように、
試料溶液が流れる流路の一部分に、固定化されたヒスタミン酸化酵素を有し、前記流路の前記固定化されたヒスタミン酸化酵素の位置よりも下流部分に、電極反応を介して過酸化水素を還元する性質を有する膜で修飾された電極を有しているヒスタミンセンサであって、前記固定化されたヒスタミン酸化酵素が前記流路の内壁に、共有結合によって固定化されるかあるいは高分子膜内に取り込まれた形で固定化されたヒスタミン酸化酵素であり、前記流路の前記固定化されたヒスタミン酸化酵素の位置よりも上流部分に、Ｌ-アスコルビン酸酸化酵素を含有する膜を有することを特徴とするヒスタミンセンサを構成する。
また、本発明は、請求項５に記載のように、
請求項１乃至４のいずれかに記載のヒスタミンセンサにおいて、前記電極が絶縁性基板上に形成された薄膜電極であることを特徴とするヒスタミンセンサを構成する。
また、本発明は、請求項６に記載のように、
請求項１乃至４のいずれかに記載のヒスタミンセンサにおいて、前記電極反応を介して過酸化水素を還元する性質を有する膜がペルオキシダーゼ系の酵素を含有する膜であることを特徴とするヒスタミンセンサを構成する。
また、本発明は、請求項７に記載のように、
請求項１乃至６のいずれかに記載のヒスタミンセンサにおいて、前記流路の前記固定化されたヒスタミン酸化酵素の位置よりも上流部分に、電気化学的に酸化されやすい物質を酸化するための電極を有することを特徴とするヒスタミンセンサを構成する。
【００１１】
この構成においては、ヒスタミンをほぼ完全に酸化するために十分な量のヒスタミン酸化酵素を用いることができるので、上記のポリビニルピリジンのオスミウム錯体に西洋ワサビペルオキシダーゼを結合した膜とヒスタミン酸化酵素膜を２層に修飾した電極を用いる場合における問題点、すなわち固定された酵素の量や膜厚により信号の絶対値が変化する問題を解消することができる。
【００１２】
この構成のヒスタミンセンサを用い、センサ内に導入されるヒスタミンを酵素反応によりほとんど完全に酸化し、その酵素反応において生成した過酸化水素を、電極反応を介し、低い電位で還元して、その時に流れる電流を測定することにより、ヒスタミン濃度を、高い精度と高い感度と良好な選択性で測定することができる。
【００１３】
【発明の実施の形態】
図１は、本発明に関わるヒスタミンセンサの基本的な構造図である。センサはシリンジポンプ１や高速液体クロマトグラフィに用いるプランジャーポンプ２によりキャリア液３をヒスタミンセンサに送液し、その途中で、インジェクター４により試料を一定量のみ導入する。試料は前電解用電極５に接触した後にヒスタミン酸化酵素が固定化された反応器６に入る。前電解用電極５の役割は、試料中に多量のＬ-アスコルビン酸が含まれるような場合に、それを電極酸化して、ヒスタミンの定量に影響を与えないようにすることにある。反応器６に導入された溶液に含まれるヒスタミンは、反応器６内に固定化されたヒスタミン酸化酵素によってほぼ完全に酸化され、この酸化反応によって生成した過酸化水素はフローセル７に入って、作用電極８上の電極反応により検出される。フローセル７には、作用電極８に対する対向電極９と参照電極１０とが配置されている。各電極への電圧の印加および電極電流の計測はポテンシオスタット１１により行われ、計測の結果はレコーダ１２によって記録される。電極反応後の液は廃液１３としてフローセル７外に排出される。
【００１４】
図２は図１におけるフローセル７の拡大断面図を示す。図２に示したように、グラッシーカーボン電極上に、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を含有するオスミウムポリビニルピリジン誘導体の修飾膜（図中、Ｏｓ-ｇｅｌ-ＨＲＰフィルムと表示）を形成したものである。作用電極と対向電極との間の間隔はガスケットによって一定に保たれ、両電極間の間隙が流路の一部となって、液中の過酸化水素はここで電極反応によって還元される。
【００１５】
本発明に関わるヒスタミンセンサを用いてヒスタミンを測定する際の反応式を次に示す。
【００１６】
【化１】
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【００１７】
ヒスタミンは、酵素反応器に固定化されたヒスタミン酸化酵素により、式１に示すように酸化され、１分子のヒスタミンから１分子の過酸化水素（Ｈ2Ｏ2）が生成する。生成した過酸化水素は電極上のペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）により還元されるが、その際にペルオキシダーゼ自身は酸化体となり、電極とペルオキシダーゼとの間の電子移動を仲介する膜を酸化する（式２）。その後、膜が、式３に示すように、電極により還元されることにより電極に電流（還元電流）が流れ、それがポテンシオスタットによって測定される。これらの反応式から明らかなように、酸化されたヒスタミンの量と、電極より供給される電子の量とは比例するために、電極を流れる還元電流値を時間について積分して電子の量を求めることによりヒスタミンを定量することができる。
【００１８】
ペルオキシダーゼの膜を介した還元反応は、銀／塩化銀参照電極に対して 0 mV 以下の低い電位で行うことができる。このように、電極反応に還元反応を用いることにより、妨害物質の影響の少ない低い電位での測定が可能になる。一方、培養細胞から放出される試料を連続的に測定する場合においては、センサの廃液側をシリンジポンプなどで吸引して試料を導入することもできる。また、試料量を減らすために反応器と検出器を集積化した微小化センサをマイクロマシン技術を用いてガラスやシリコン基板に作製して用いることもできる。
【００１９】
本発明に関わるセンサの製造工程においては、まず、ヒスタミン酸化酵素の流路への固定化を行う。
【００２０】
図３はヒスタミン酸化酵素の固定化の方法を説明する図である。すなわち、ヒスタミン酸化酵素の固定化の方法としてはビーズに酵素を固定化し、それを直接あるいは、図３（ａ）に示すように、カラムに充填した形で反応器内に設置する方法や、図３（ｂ）に示すように、流路の内壁へ酵素を固定化して中空の反応器を作製する方法等をあげることができる。なお、酵素を固定化する方法としては、後述の実施例１におけるように、共有結合による固定化方法、あるいは、後述の実施例４におけるように、高分子膜内に取り込む形で固定化する方法などがある。
【００２１】
一方、検出用のフローセルは、高速液体クロマトグラフィやフローインジェクション分析に用いる市販の電気化学フローセルを使用する方法やホトリソグラフィとスパッタ、蒸着、ＣＶＤ（化学気相堆積法）などの薄膜形成技術を用いて作製した電極と流路を組みあわせることにより得られる。電極の上には過酸化水素を還元し電極から電子を受け取る性質を有する膜を形成する。具体的には例えば導電性高分子に過酸化水素を還元するペルオキシダーゼを複合した膜などが利用可能である。
【００２２】
更に、試料溶液にＬ-アスコルビン酸などの電気化学測定の妨害となる物質を含む場合は、膜中に更にＬ-アスコルビン酸酸化酵素を複合するか、あるいは、最上層にアニオン性の高分子膜を修飾し、膜の静電的な反発作用によりＬ-アスコルビン酸等の妨害物質の影響を除くことができる。
【００２３】
導電性高分子膜としては、ポリピロールやその誘導体、ポリアニリンやその誘導体が挙げられる。これらの膜はペルオキシダーゼ、あるいはペルオキシダーゼとそれぞれの高分子のモノマーを塩化カリウムなどの電解質と共に溶解させた水溶液にセンサ用の電極を参照電極、対向電極と共に浸した後、各電極をポテンシオスタットの対応する端子に繋ぎ、センサ用の電極に電位を印加することにより酵素を取り込んだ膜を形成することができる。あるいはペルオキシダーゼを含むポリビニルフェロセン膜やオスミウム-ポリビニルピリジン膜などの酸化還元性の高分子も使用することができる。最上層へ修飾するアニオン性の膜としてはナフィオン等をあげることができる。
【００２４】
すでに述べたように、本発明に関わるヒスタミンセンサにおいては、電極還元反応を、銀／塩化銀参照電極に対して 0 mV 以下の低い電位で行う。このため、肥満細胞や脳神経細胞のヒスタミンを計測する際に共存する電気化学的に活性なＬ-アスコルビン酸が電極で直接酸化されない電位で測定を行うことができ、高い選択性を実現することができる。一方、ペルオキシダーゼが過酸化水素を還元する際に、多量のＬ-アスコルビン酸が存在すると、酸化状態にあるペルオキシダーゼや導電性高分子がＬ-アスコルビン酸により還元される（ R. Maidan and A. Heller、Amalytical Chemistry、64巻、2889-2896頁、(1992年) 参照）。このため、ヒスタミンが酸化されて生成する過酸化水素の量が一定の場合でも、Ｌ-アスコルビン酸の膜内濃度が増加すると、電極上で観測される還元電流は減少する。この反応は、修飾電極最上部にナフィオンなどのアニオン性の膜をコーティングするか、あるいは酵素反応器の上流に電極（図１の前電解用電極５）を組み込み、前電解により試料に含まれるＬ-アスコルビン酸をほとんど酸化することにより防ぐことができる。
【００２５】
以下に、本発明の実施の形態について、実施例を用いて、更に詳しく説明する。
【００２６】
（実施例１）
上記において説明した本願発明の電気化学検出器を用いて次のような実験を行った。
【００２７】
図４に、ヒスタミン酸化酵素をガラスビーズに固定化する工程を示す。
【００２８】
（ａ）
ガラスビーズ（直径 20μｍ）を約 1ｇ、３-アミノプロピルトリエトキシシラン 1％を溶解させたアセトン中にけん濁させ、70℃で３時間反応させた。この反応（シランとビーズ表面との反応）により、ビーズの表面が末端にアミノ基（−ＮＨ2）をもつ分子で修飾される。
【００２９】
（ｂ）
反応後、ガラスビーズが沈降するのを待ち、上澄み液を捨て、再度アセトンを加えてその操作を３回くり返すことにより洗浄した。アセトンを蒸発させた後、今度は 2％のグルタルアルデヒド水溶液にビーズをけん濁させ１時間反応させた。この反応により、ビーズの表面が末端にアルデヒド基（−ＣＨＯ）をもつ分子で修飾された形になる。
【００３０】
（ｃ）
反応後、ビーズをフィルターによりろ過回収し、水洗を行って未反応のグルタルアルデヒドを完全に除いた。次にヒスタミン酸化酵素を溶解させた 100ｍＭリン酸緩衝溶液（ｐＨ 7.0、酵素濃度：10 ユニット／ｍリットル）にビーズを溶解させ、３時間以上放置し酵素をビーズ上のグルタルアルデヒドと反応させて、酵素をビーズに固定化した。図中、酵素を、Ｅと表示した正方形で示す。
【００３１】
（ｄ）
酵素固定化後、 1％グリシン水溶液で洗浄して未反応のアルデヒド残基をグリシンと反応させて、分子の末端を化学的に比較的安定なカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）とし、ヒスタミン酸化酵素の固定化工程を終了した。
【００３２】
次に高速液体クロマトグラフイの配管に使用するピークチューブ（内径 0.5 ｍｍ、長さ 4ｃｍ）の一方の出口に円筒型のフェルト（外径 0.5ｍｍ、長さ 3 ｍｍ）を挿入し、フィルタとした。次にもう一方の出口よりシリンジを用いて緩衝溶液にけん濁させた酵素固定化ビーズを充填した。充填後、もう一方の出口も円筒型のフェルトで塞ぎ、酵素反応器を得た。
【００３３】
次にグラッシーカーボン電極（直径 6ｍｍ：ビーエ一エス社製）上に西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を含むオスミウムポリビニルピリジン誘導体溶液（Bioanalytical Systems 社製）を 2μリットル塗布し乾燥させて高分子膜を形成した。この電極をフローセル中にセットし、上流側にヒスタミン酸化酵素を固定化したビーズを充填したカラムを挿入し、ポンプや前電解用電極をセットして図１に示したセンサを構成した。
【００３４】
センサの作用電極（図１の８）、前電解用の白金円管電極（図１の５）、銀／塩化銀参照電極（図１の１０）および対向電極（ステンレスブロック製、図１の９）をポテンシオスタットＬＣ４Ｃ（Bioanalytical Systems 社製、図１のポテンシオスタット１１）のそれぞれに対応する端子に接続した。またセンサは高速液体クロマトグラフィ用のポンプを用いて送液し、ヒスタミン酸化酵素固定化カラム（図１の反応器６）とポンプの間にはサンプルインジェクター（図１の４）を組み込んだ。
【００３５】
センサの作用電極の電位を銀／塩化銀参照電極に対して 0Ｖに保持し、ポンプにより流速 10μリットル／分で送液しながらサンプルインジェクターより一定量のサンプルを注入した。その結果を図５に示す。
【００３６】
濃度 1μＭのヒスタミン溶液を 10μリットル注入すると 25ｎＡのピークが得られた。一方、メチルヒスタミンを濃度 1μＭで注入すると、電流値は 3.5ｎＡ程度であった。一方、ジアミンであるプトレシンやカダベリンを加えると応答は数百分の１となり、高い選択性が得られることが分かった。
【００３７】
図６にヒスタミン濃度と電流の関係を示す。図が示すように、きわめて広いヒスタミン濃度範囲において、濃度と電流値の直線関係が得られていることが分かる。このような実用上好ましい直線関係が得られる理由は、本発明に関わるヒスタミンセンサにおいて、試料中のヒスタミンがヒスタミン酸化酵素によってほとんど完全に酸化されていることにある。この酸化が不完全であると、特にヒスタミン濃度が高い範囲において、電流値が比例計算で求められる値よりも小さくなり、その分だけ測定誤差を生じる。また、ヒスタミンの濃度を 10ｎＭまで減らしても測定を行うことができ、低い検出限界を達成することができた。一方、図４のピークを時間に関して積分すると、最も高濃度である 100μＭのヒスタミンを 10μリットル注入した場合、1.9×10-4Ｃの電荷が観測され、化学量論的数値計算によって、注入したヒスタミンがほぼ 100％反応していることが分かった。次に、電極電位を -50ｍＶ（銀／塩化銀参照電極に対して）にしてＬ-アスコルビン酸（10μＭ、10μリットル）を注入すると、0.4ｎＡの酸化電流が観測されるのみであり、Ｌ-アスコルビン酸単独ではほとんど電流が流れないことが分かった。しかしながら、1μＭのヒスタミンとＬ-アスコルビン酸を両方含む溶液を 10μリットル注入すると、還元電流は 4.7ｎＡに減少した。これは、ヒスタミン酸化酵素の反応で発生した過酸化水素がＨＲＰで還元されＨＲＰにオスミウム-ポリビニルピリジン膜を通して電極から電子が供給される際に、ＨＲＰや高分子がＬ-アスコルビン酸により還元され、電極から供給される電子が減少するためである。そこで、図１に示した前電解用電極５に 700ｍＶの電位を印加し、Ｌ-アスコルビン酸が反応器６に入る前に酸化されるような処置を講じてから、同一の試料を注入すると、電流値は 24.3ｎＡまで回復し、Ｌ-アスコルビン酸の影響をほぼ完全に除去できることが分かった。
【００３８】
試料として、常温で５日間放置したハマチ切り身と解凍直後のハマチの切り身をホモジナイザーですり潰し、ろ過した液を各 10μリットルずつセンサに注入した。その結果、前者では 21(±0.5、n = 5)ｎＡ、後者では 0.02ｎＡのピークが得られ、鮮度の測定に十分便用可能であることが分かった。ここに、n = 5 は、データの個数が５であることを示している。
【００３９】
（実施例２）
実施例１と同様な方法で作製した電極をセットしたフローセルと、ヒスタミンを固定化したビーズを充填したカラムを用いた測定系を図７に示す。図７において、フローセルの廃液側をシリンジポンプに接続し、カラムをテフロン細管を介して、先端を熱で延伸したキャピラリーに接続した。センサの作用、参照、対向電極を実施例１と同じポテンシオスタットに接続し、作用電極に銀／塩化銀対向電極に対して -50ｍＶの電位を印加した。ガラス管を顕微鏡用のマイクロポジショナーに取り付けた。顕微鏡観察下にラットＲＢＬ-２Ｈ３培養細胞を入れたシャーレを置き、顕微鏡観察下でガラス管の先端を細胞のコロニーに 1μｍの距離まで近接させた。ＲＢＬ-２Ｈ３セルはあらかじめ１０時間前に培養液中にイムノグロブリンＥ（ＩｇＥ）を加えて置いたものを使用した。細胞近傍液を流速  4μリットル／分で吸引しながら、細胞を牛血清アルブミンにジニトロフェノールを結合させたもの（ＢＳＡ-ＤＮＰ）を含む緩衝溶液を加えると、還元電流の増加が観測された。一方、ＢＳＡ-ＤＮＰを含んでいない溶液では電流値の増加は全く観測されず、抗原抗体反応に伴うヒスタミン放出をセンサによりリアルタイム検出することができた。
【００４０】
（実施例３）
図８は、本発明に関わるヒスタミンセンサの一実施例におけるセンサの構造を示す。図８において、８１はシリンジポンプ、８２はＨＲＰを含オスミウム-ポリビニルピリジン膜を修飾した作用電極、８３は銀参照電極、８４は対向電極、８５は前電解用電極、８６はヒスタミン酸化酵素を充填した微少量反応器、８７はサンプリング用ガラスキャピラリー、８８は電極が形成された基板、８９は微小流路が形成された基板、９０は微小流路である。ここで、電極が形成された基板８８は絶縁性基板であり、その上に各電極が薄膜電極の形で形成されている。
【００４１】
図８において、サンプリング用ガラスキャピラリー８７より連続的に採取されたヒスタミンは微少量反応器８６中で酵素反応し、生成した過酸化水素は作用電極８２上でＨＲＰを含むオスミウム-ポリビニルピリジン膜を介して電極還元される。
【００４２】
センサは微小流路が形成された基板８９と電極が形成された基板８８とを貼り合わせて作製されている。このセンサの作製工程を以下に示す。
【００４３】
まず、微小な矩形断面の流路を有する基板を次のようにして作製した。すなわち、パイレックスガラスウェハ（３インチ）上にポリイミド（東レ製）を厚さ  20μｍになるようスピンコート（回転塗布）した。次に、シリコン系反応性イオンエッチング（ＲＩＥ）用フォトレジスト（ＮＴＴ-ＡＴ社製）をスピナー（回転塗布機、ミカサ社製）により 2000回転／分で回転塗布した。その後、流路パタンが描かれたフォトマスクをウェハに重ね、マスクアライナーＰＬＡ-５０１（キヤノン製）を用いて流路のパタンを露光した。露光後、アルカリ現像液中で現像を行い、水洗、乾燥してレジストパタンを形成した。現像後のウェハでは流路以外の部分がシリコン系レジストパタンに覆われているので、このレジスト付き基板を反応性イオンエッチング装置（ＤＥＭ-４５１、アネルバ製）に入れ、シリコン系レジストパタンをマスクにして酸素プラズマによりレジストに覆われていない部分のポリイミド膜を除去した。エッチング条件は、圧力 5Ｐａ、パワー 100Ｗ、酸素流量 100ＳＣＣＭで時間は 110分とした。ポリイミドパタンを形成後、基板を別の反応性イオンエッチング装置（ＤＥＭ-４５１、アネルバ製）に入れ、ポリイミドをマスクにしてＣ2Ｆ6ガスのプラズマによりガラスをエッチングした。条件は圧力 2Ｐａ、パワー 500Ｗ、流量 100ＳＣＣＭ、時間 120分とし、深さを 22μｍとした。ガラス流路を形成後、酸素の反応性イオンエッチング装置により、残ったポリイミド膜を取り除きガラス流路を得た。その後、流路の両端から約 7ｍｍ程ダイシングソー（ディスコ社製）により、端から 1ｍｍが 400μｍの深さになるように、幅 400μｍカットしキャピラリー接続用の溝とした。
【００４４】
一方、薄膜電極を有する基板を次のようにして作製した。すなわち、まず、３インチのパイレックスガラスウェハを用い、熱ＣＶＤ法により炭素薄膜（膜厚： 100 ｎｍ）を形成した。ＣＶＤ法は、石英基板をガラス管内において 1000℃に加熱し、出発物質としてフタロシアニンを用い、400℃で昇華、ウェハ上で熱分解させる方法を用いた。炭素膜が形成されたウェハ上にシリコン系反応性イオンエッチング（ＲＩＥ）用フォトレジスト（ＮＴＴ-ＡＴ社製）をスピナー（ミカサ社製）により 4000回転／分で回転塗布した。その後、電極パタンが描かれたフォトマスクをウェハに重ね、マスクアライナーＰＬＡ-５０１（キヤノン製）を用いて４電極のパタンを露光した。露光後、アルカリ現像液中で現像を行い、水洗、乾燥してレジストパタンを形成した。現像後のウェハでは電極パタンの部分のみがレジストパタンに覆われているので、このレジスト付き基板を反応性イオンエッチング装置（ＤＥＭ-４５１、アネルバ製）に入れ、レジストパタンをマスクにして酸素プラズマによりレジストに覆われていない部分の炭素膜を除去した。エッチング条件は、パワー70Ｗ、圧力 2Ｐａ、酸素流量 100ＳＣＣＭとした。その後、アセトン中で、レジストを剥離し電極パタンを得た。電極はサンプリング用のキャピラリーが接続されている側から前電解用電極、作用電極、参照電極、対向電極として用いた。作用電極上にはＨＲＰを含むオスミウムポリビニルピリジン誘導体溶液（Bioanalytical Systems 社製）を塗布し、膜を形成した。また、参照電極用基板上には参照物質として銀ペーストを薄く塗布した。
【００４５】
その後、キャピラリーを接続した矩形断面流路が形成された基板と酵素／高分子修飾薄膜電極が形成された基板とを両方の流路が向かい合うように押しあて位置合わせ後、光硬化性の接着剤を周りから浸み込ませた。接着剤が浸みこんだ後、高圧水銀ランプを用いて光を照射し、基板を接着し、センサチップを完成させた。
【００４６】
図９は上記のようにして作製したヒスタミンセンサの流路の上からの見取り図である。流路は酵素を充填するための幅の広い部分とその下流側に酵素を押さえるためのグレーティング状のフィルターが形成された構造を有している。溶融石英キャピラリー（サイズ、外径 375μｍ、内径 150μｍ、ＧＬサイエンス社製）をフィルタを挟んで幅の広い流路がある反対側の出口（図９における右側斜線部分）に埋め込み接着剤により固定し、その末端をシリンジポンプに接続した。実施例１で使用したヒスタミン酸化酵素を固定化したビーズをけん濁させた液に、センサチップのキャピラリーを接続していない側（図９における左側斜線部分）を浸し、液をマグネットスターラで撹拌しながら、シリンジで吸引するとビーズが流路内に導入され、反応器部分に充填された。その後、先端を熱で延伸して細くしたキャピラリー（図８中の８７）をセンサの流路（図９における左側斜線部分）に挿入し、光硬化性樹脂により接着した。
【００４７】
センサの前電解用電極、ヒスタミンを測定するための作用電極、参照及び対向電極（それぞれ、図８中の８５、８２、８３及び８４）をポテンシオスタットＬＣ４Ｃのそれぞれに対応する端子に接続した。測定はシリンジポンプを用いてサンプリング用のキャピラリーから溶液を吸引しながら、作用電極に -50ｍＶの電位を印加して行った。流速 1μリットル／分で溶液を吸引し、試料として 1μＭのヒスタミンを吸引すると 5.2ｎＡの還元電流が観測され、吸引されたヒスタミンがほぼ 100％反応していることが分かった。
【００４８】
一方、同一濃度のメチルヒスタミンを測定すると 0.8ｎＡの還元電流が観測された。また、ジアミンであるプトレシンやカダベリンを加えると応答は数百分の１であり、高い選択性が確認された。ヒスタミン濃度を下げていくと、20ｎＭの試料を注入してもＳ／Ｎ比が２以上で電流値の増加を観測することができた。また、流速 8μリットル／分で測定を行うと、試料導入開始後、約 20秒以内に定常状態に達し、これまで提案されているヒスタミンの酵素反応に伴う酸素消費を測定する方法に比較して優れた応答性が確認された。応答性は流速を上げると更に向上させることができた。
【００４９】
センサをマニピュレータに接続し、培養したラットＲＢＬ-２Ｈ３セルのコロニー（直径 100μｍ以下）に、顕微鏡観察下で、センサのサンプリングキャピラリー先端を 1μｍまで近接させた。ＲＢＬ-２Ｈ３セルはあらかじめ１０時間まえに培養液中にイムノグロブリンＥ（ＩｇＥ）を加えて置いたものを使用した。細胞近傍液を流速 1μリットル／分で吸引しながら、細胞を牛血清アルブミンにジニトロフェノールを結合させたもの（ＢＳＡ-ＤＮＰ）を加えると、図１０に示すように還元電流が増加し、僅かな量の細胞試料からのヒスタミンの放出をリアルタイムに近い形で高感度に測定することができた。
【００５０】
（実施例４）
実施例３と同様な方法により、微小流路が加工されたガラス基板と、炭素薄膜電極が形成された基板を作製した。微小流路が加工された基板の流路両端には実施例３と同様に２本の溶融石英キャピラリーを接続した。両基板の見取り図を図１１に示す。図中、作用電極を、銀／塩化銀参照電極、対向電極と共にポテンシオスタットＢＡＳ１００Ｂ（Bioanalytical Systems 社製）に接続し、80000ユニット／リットルの西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、0.05Ｍの塩化カリウム、0.05Ｍのピロールを含む水溶液を入れた容器に浸した。銀／塩化銀電極に対して 1Ｖの電位を 20秒間印加してポリピロール／酵素複合膜で修飾された電極を得た。更にこの電極をアニオン性高分子であるナフィオンを３％含む溶液（アルドリッチ社製）に一瞬浸漬した後乾燥しヒスタミンセンサを作製した。次にヒスタミン酸化酵素 2重量％、牛血清アルブミン 2％、グルタルアルデヒド  0.2％含む水溶液を微小流路が加工された基板の流路幅が太い部分と、電極が形成された基板の、前電解用電極とポリピロール／ＨＲＰ複合膜の間に塗布し、乾燥させた。乾燥後、両基板を位置合わせをした後、紫外線硬化樹脂により張り合わせ、センサを得た。このセンサを実施例３と同様にヒスタミン溶液（濃度 1μＭ）を連続的に吸引注入すると、流速 8μリットル／分では 18.0ｎＡ（±1.7ｎＡ、n = 5）の還元電流が得られ、反応率が約７０％で、くり返し測定におけるばらつきも大きかった。
【００５１】
一方、流速 4μリットル／分で測定を行うと、12.7ｎＡ（±0.5ｎＡ、n = 5）の値が得られ、センサに導入されたヒスタミンが全て反応していることが分かった。また、100％反応時ではくり返し測定によるデータのばらつきが小さいことが分かった。一方、作用電極上がアニオン性高分子であるナフィオン膜により被覆されているため、前電解電極に電位を印加せずとも、Ｌ-アスコルビン酸の影響を抑制することができた。同様の効果は、ヒスタミン酸化酵素と共にＬ-アスコルビン酸酸化酵素を固定化した時や、電極上のポリピロール膜に、Ｌ-アスコルビン酸酸化酵素をＨＲＰと共に固定化した時にも観測された。
【００５２】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明は下記の効果を有する。すなわち、
１．試料より不純物などを分離することなく、直接、ヒスタミンの測定を行うことができる。
【００５３】
２．基質であるヒスタミンを完全に酵素反応させ、それによって生成する過酸化水素を完全に電極反応させることにより、高い測定精度でヒスタミンの測定を行うことができる。
【００５４】
３．細胞から放出されるヒスタミンなどのマイクロリットル以下の微少量試料中のヒスタミンの測定に使用することができる。
【００５５】
４．極めて感度が高く、20ｎＭ（0.01ｍｇ／1000ｇ）以下の検出限界が得られる。
【００５６】
５．微細化が容易なため、応答性が極めて速いセンサが得られ、30秒以下で応答を得ることができる。
【００５７】
本発明に関わるヒスタミンセンサは、上記の優れた特徴を有するので、従来、ヒスタミンセンサの有力な応用分野とされてきた食肉、鮮魚などの食品検査の分野のみならず、上記の優れた特徴を活かして、細胞計測など医学や生理学分野においても応用される可能性が高い。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の構成を説明する図である。
【図２】本発明に関わるヒスタミンセンサのフローセルの構成を説明する断面図である。
【図３】本発明に関わるヒスタミンセンサにおけるヒスタミン酸化酵素の固定化の方法を説明する図である。
【図４】本発明に関わるヒスタミンセンサの構成要素であるヒスタミン酸化酵素固定化ビーズの作製工程を説明する図である。
【図５】実施例１における測定結果を示す図である。
【図６】実施例１における測定結果を示す図である。
【図７】本発明の実施例２に示したヒスタミンセンサの構造と使用方法とを説明する模式図である。
【図８】実施例３におけるヒスタミンセンサの構造を説明する模式図である。
【図９】実施例３におけるヒスタミンセンサの流路の上からの見取り図である。
【図１０】実施例３における測定結果を示す図である。
【図１１】実施例４におけるヒスタミンセンサの構成を説明する図である。
【符号の説明】
１…シリンジポンプ、２…プランジャポンプ、３…キャリア液、４…インジェクタ、５…前電解用電極、６…反応器、７…フローセル、８…作用電極、９…対向電極、１０参照電極、１１…ポテンシオスタット、１２…レコーダ、１３…廃液、８１…シリンジポンプ、８２…作用電極、８３…銀参照電極、８４…対向電極、８５…前電解用電極、８６…微少量反応器、８７…サンプリング用ガラスキャピラリー、８８…電極が形成された基板、８９…微小流路が形成された基板、９０…微小流路。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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