(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ．４の８１４−１４８５位に相当する塩基配列からなるＤＮＡ。
【請求項２】
請求項１に記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
【請求項３】
ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ．４の１５６６−２６４８位に相当する塩基配列からなるＢｇｌＩＩメチラーゼ遺伝子をコードするＤＮＡを含み且つ請求項２に記載の組換えベクターにより形質転換した宿主細胞。
【請求項４】
エンドヌクレアーゼが発現するのに好適な条件下で、請求項３に記載の宿主細胞を培養することを含むＢｇｌＩＩ制限エンドヌクレアーゼの産生方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、BglII制限エンドヌクレアーゼ及び修飾メチラーゼをコードする組換えDNA並びに組換えDNAを含む細胞からこれらの酵素を産生することに関する。
【０００２】
【従来の技術】
制限エンドヌクレアーゼは、今や分子生物学の主要な道具のひとつである。これらは天然では広範な微生物、eubacteria及びarchaebacteria[Roberts及びMacelis，Nucl．Acid  Res.20：2167−2180(1992)]の両方に産生するが、精製すると配列-特異的方法でDNAを小さなフラグメントに切断するために使用し得る。多くの種類の制限酵素を大規模に使用し得ることにより、DNA分子を成分遺伝子に特定的に識別し且つ細分し得る。
【０００３】
制限エンドヌクレアーゼは制限-修飾(RM)系の一成分であり、40年にわたり広く研究されてきた[Luria及びHuman，J.Bacteriol.64：557-569,(1952)；Bertani及びWeigle，J.Bacteriol.65：113-121,(1953)]。通常この系は第二成分の修飾メチラーゼを含んでいる[Arber及びLinn，Ann.Rev.Biochem.,38：467-500,(1969)；Boyer，Ann.Rev.Microbiol.25：153-176,(1971)]。自然界ではRM系は、細胞内に入る外来DNAを破壊する"バクテリア免疫系"として作用すると考えられている[Smith，PAABS REVISTA 5：313-318,(1976)]。しかしながら、個々の微生物は７つもの異なったRM系を含むことが公知であり、この明白な冗長性はこれらの系が他の機能も同様に提供することを示唆している[Steinら，J.Bacteriol．174：4899-4906，(1992)]。
【０００４】
微生物に於いて、制限エンドヌクレアーゼは特異的認識配列に関して入ってくるDNAを精査し、DNA分子内で二重鎖を切断する[Meselson，Ann.Rev.Biochem.41：447-466,(1972)]。修飾メチラーゼはその制限相手の作用に対して微生物自身のDNAを保護するように作用する。メチラーゼはその対応するエンドヌクレアーゼと同一DNA配列を識別且つ結合するが、切断するかわりに制限配列内で特定残基をメチル化し、これによりエンドヌクレアーゼによる(endonucleolytic)結合または切断を妨害する[Smith，Science 205：455-462,(1979)]。このようにして、微生物宿主DNAは、細胞内で制限エンドヌクレアーゼによる切断に対して完全に耐性となる。
【０００５】
"RM系"という用語は当初、成分が遺伝子的に定義された系のみに適用されていた。しかしながら、現在、この用語は微生物から単離した任意の部位-特異的エンドヌクレアーゼを指すようになった。多くの場合、修飾メチラーゼ成分の存在は厳密な証拠なく仮定されている[Roberts，CRC Crit.Rev.Biochem.4：123-164,(1976)]。
【０００６】
多くの制限酵素が種々の微生物から単離されることが明らかになったとき、Smith及びNathans[J.Mol.Biol.81：419-423,(1973)]は、今日では少し変形されている学名命名法を案出した。制限酵素は、それが単離された属及び種を略称する３つの文字の名称で名付けられる。必要により、４つの文字を追加して株を示す(Hindなど)。系の名前の後のローマ数字は、同一起源由来の多くの酵素と異なることを示している。接頭文字Ｒ及びＭは、各々制限エンドヌクレアーゼまたは修飾メチラーゼを指すが、通常含まれない。３文字の名称を接頭文字なしに使用する際、これはエンドヌクレアーゼを指すと理解される。
【０００７】
制限エンドヌクレアーゼ、及びDNAメチラーゼは幾分、遺伝子工学に関してそれほど重要な試薬ではなくなってきている。生物工学の分野が成長及び発達するにつれて、これらの酵素を多量に産生するための商業的動機が高まって来た。しかしながら、これらの天然の微生物から制限酵素を大量生産するのは、幾つかの理由から困難である。第１に、多くの微生物が数種のRM系を産生するので、異なる産物を生物化学的に分離するのは問題がある。第２に、多くの制限系以外に、微生物は制限酵素調製物から生物化学的に分離するのが困難なDNA結合タンパク質及び他のヌクレアーゼも産生し得る。第３に、微生物により産生された特定の酵素量は非常にまちまちで、生長条件に依存して変動し得る。最後に、数種の微生物は、生長させるのが困難、高価または危険でさえある。これらの問題を解決するために及び制限酵素を複製可能に多量に得るために、遺伝子工学方法を微生物の高度に産生可能な株を作り出すために適用した。
【０００８】
RM系のクローニングは最初に1970年代に始まったが、以来、努力にも拘わらず多くの問題を包含している。個々のクローニングプロジェクトに固有の問題とは、重要な遺伝子を識別及び単離することである。幾つかのRM系はプラスミド由来であり、これらの場合メチラーゼ及びエンドヌクレアーゼ遺伝子の両方をコードするDNAを単離し、これらを新しいベクターの上に転移させるのは比較的容易である[EcoRV：Bougueleretら，Nucl.Acid Rec.12：3659-3676,(1984)；PaeR7：Theriault及びRoy，Gene 19：355-359,(1982)；Gingeras及びBrooks，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：402-406,(1983)；PvuII：Blumenthalら，J.Bactriol.164：501-509,(1985)]。
【０００９】
しかしながら、非常に多くのRM系はコードされたプラスミドではない。これらは主に、染色体DNAが制限エンドヌクレアーゼまたは他の手段を使用してクローン化可能な大きさの小さな断片に切断する"ショットガン"法によりクローン化されてきた。これらの断片をクローニングベクター上にen masse連結し、各遺伝子が多数回現れる"ライブラリー"を産生する好適な微生物宿主に形質転換する。産生された数千ものの中から重要な遺伝子を保持するこれらのクローンを識別する選択方法を発見するのは困難である。
【００１０】
系の従来の特性により影響を受けたRM系をクローン化するのに成功裏に使用した第１の選択方法は、バクテリオファージの使用を含んでいた。ファージの攻撃に暴露された時、RM系を保持する細胞は生存したが、RM系を発現しないものは生存しなかった[HhaII：Mannら，Gene 3:97-112,(1978)：PstI：Walderら，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:1503-1507,(1981)]。意外にも、この方法は全てはうまく行かなかった。クローン化RM系は選択的に生存物を与えるようには常に発現されない。さらに、細胞中に多くのRM系が存在する場合、特定のRM系をターゲットできなくても、クローン化したいであろう。さらにRM系以外の他のクローン化機能は細胞をファージの攻撃から守り、選択後生存できるようにし得る[Mannら，略；Howardら，Nucl.Acids Res.14：7939-7951,(1986)；Slatkoら，Nucl.Acids Res.15:9781-9796,(1987)]。
【００１１】
より広く成功している第２の方法では、メチラーゼ遺伝子の発現を選択し、形質転換時、クローン化されたメチラーゼ遺伝子を含み且つ発現するライブラリー内の任意のプラスミドはその同種の認識部位をメチル化する。ライブラリーが好適な特異性のエンドヌクレアーゼにより切断されて順に選択される場合、修飾プラスミドは切断されずに、第２の形質転換段階時にも生存可能なままでなければならない。メチラーゼ遺伝子を含まない他のプラスミドはエンドヌクレアーゼにより切断されて、より低い効率で形質転換しなければならない[Kissら，Nucl.Acids Res.13：6403-6421,(1985)；Lunnenら, Gene,74:25-32,(1988)]。このように研究されて来た全てのRM系に於いて、制限エンドヌクレアーゼ及び修飾メチラーゼ遺伝子は互いに非常に近接している[Wilson，Nucl.Acid Res.19：2539-2566,(1991)]ので、メチラーゼ選択は完全RM系を産生することもある。他の場合では、選択によりメチラーゼ遺伝子のみが産生することもある。しかしながら、第２段階でエンドヌクレアーゼ遺伝子を含むより大きいかまたは隣接フラグメントをクローン化することも可能であった(Kissら，略)。
【００１２】
好適な選択方法を知見する以外に、RM系をクローン化しようとする際に他の多くの問題点が発生した。例えばある系では、エンドヌクレアーゼ遺伝子を修飾により予め保護していない宿主細胞に導入する際に問題が発生した。両方の遺伝子を共通のDNAフラグメントに一緒に導入する場合、例えばエンドヌクレアーゼが非常に早くまたは非常に多量に産生される場合、メチラーゼはエンドヌクレアーゼの作用から宿主ゲノムを好適に保護し得ない。エンドヌクレアーゼ遺伝子が導入される前にエンドヌクレアーゼ遺伝子の活性に対して細胞を保護するために、異なるベクター上に別個に２つの遺伝子をクローン化することが案出されてきた(Howardら，略)。ベクターの賢明な選択は、クローンの安定性並びにエンドヌクレアーゼの十分な産生にも重要である[Brooksら，Nucl.Acids Res.19：841-850,(1991)]。
【００１３】
E.coli中のRM系をクローニングするもう一つの障害は、異種のメチラーゼ類をクローン化し且つ発現させる試みの際に現れた。E.coliは、異種チトシン及び/またはアデニンメチル化を含む外来DNAを制限する種々の系を持つ[Raleigh及びWilson，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：9070-9074,.(1986)；Noyer-Weidnerら，Mol.Gen.Genet.205：469-475,(1986)；Waite-Reesら，J.Bacteriol.173:5207-5219,(1991)]。これらの系は、種々のメチラーゼ遺伝子をクローン化し、遺伝子的に印をつけたE.coli株中でこれらを発現させる試みのときだけに現出した。この問題は、時折、これらの系を欠くE.coli変異体を産生させることにより克服できた。RM系をクローニングするときにも問題が残っているが、より多くの系が研究されるにつれて、より良いクローニング方法が開発されている。
【００１４】
グラム陽性細菌Bacillus globigii由来のBglIIは、識別及び特徴付けすべき第１のRM系のひとつであった[Wilson及びYoung,Schlessinger（編集），Microbiology-1976,American Society for Microbiology,p.305-357,(1976)]。名称が包含するように同一種から単離されたもうひとつのRM系、即ちBglIが存在する。BglI及びBglII系の両方は従来法に於いて、未改変バクテリオファージによる感染に対してバクテリアを保護するように挙動する。研究者らは、酵素が似たような分子量及びイオン特性を持つため、生化学的手段によりR.BglIIからR.BglIを分離することが非常に困難であることを知見した[Pirrotta，Nucl.Acids Res.3:1747-1760,(1976)]ので、遺伝子方法を使用した。B.globigiiを、標準法により突然変異誘発し、個々の単離物を非常に関連した株のBacillus subtilis上で増幅させた未改変ファージを使用する低レベルのファージ制限に関してスクリーニングした。各々R.BglIまたはR.BglIIのみを産生するB.globigii RUB561及びRUB562と名付けられた２つの変異株をこの方法で産生させた[Duncanら，J.Bacteriol.134：338-344,(1978)]。変異株はBglI及びBglIIの両方に関するメチラーゼを保持していた。本出願人は、ファージ制限に関するスクリーニングと組み合わせた突然変異誘発を使用することは、RM系成分の分離及び精製に関して一般的に適用し得る方法であると考えた。しかしながら、以後、RM系の発見は異種バクテリア内の遺伝子系の開発よりもずっと速度が速く、この方法は他のRM系に適用できなかった。それにも拘わらず、２つのB.globigii株はBglI及びBglIIエンドヌクレアーゼの産生に広く使用されてきた。さらに、両方の株は以下に記載の如くBglII RM系のクローニングにも重要であることが証明された。
【００１５】
【発明の概要】
本発明は、Bacillus globigii RUB562(Duncanら，前掲；New England Biolabs Culture Collection)から得られるBglII制限エンドヌクレアーゼ及び修飾メチラーゼに関する遺伝子をコードする組換えDNA並びに組換えDNAを含む細胞から酵素を産生させる関連方法に関する。本発明は、制限エンドヌクレアーゼBglII、即ちDNA配列5'-AGATCT-3'を認識し、AとGの間の認識配列内で切断し、４塩基5'伸長を残す酵素(Pirrotta，前掲)を発現する形質転換された宿主にも関する。本発明により産生したBglII制限エンドヌクレアーゼは実質的に純粋で、実施例１、段階19に記載の通常法により製造した制限エンドヌクレアーゼ中に通常知見される汚染物を含まない。BglII RM系をクローニングする好ましい方法の一つは、好適なベクターを構築し、B.globigii RUB561(RII- MII+)由来のDNAを含む幾つかのライブラリーを作成し、BglII修飾メチラーゼをコードするDNAを含むこれらのクローンを単離し、BglII制限エンドヌクレアーゼタンパク質を精製してそのアミノ末端配列を決定し、エンドヌクレアーゼ遺伝子の5'末端に特異的な変性オリゴヌクレオチドプローブを設計し、BglIIメチラーゼをコードするプラスミド上でエンドヌクレアーゼ遺伝子の末端及び方向を決め、B.globigii RUB561由来のbglIIMをコードするフラグメントの制限プロフィールとB.globigii RUB562(RII+MII+)染色体の対応する領域とを比較し、B.globigii RUB562由来の好適なフラグメントをクローニングし、エンドヌクレアーゼ活性に関して得られたクローンをスクリーニングし、調節プロモーターの後ろのエンドヌクレアーゼ遺伝子をクローニングし、調節エンドヌクレアーゼ構築物を中程度のコピー数のベクター上でBglIIメチラーゼ遺伝子を保持する宿主に形質転換し、上記条件下で細胞を生長させてエンドヌクレアーゼの発現を誘発させ、次いで標準法を用いてBglIIエンドヌクレアーゼを精製することを含む。
【００１６】
【詳細な説明】
本発明は、BglII制限エンドヌクレアーゼ及び修飾メチラーゼをコードする組換えDNA並びにこのような組換えDNAを含むクローンから産生した酵素に関する。
【００１７】
本発明を通じて、BglII RM系のクローニングが幾つかの因子のために複雑であることが分かった。第１に、共通のクローニングベクター(即ち、pBR322，pUC19，pACYC184など)はいずれもBglII部位を含まなかったので、新規ベクターを製造しなくてはならなかった。第２に、より重要な点として、クローン化された他の多くのRM系と異なり、２つのBglII RM遺伝子は天然E.coli宿主に１段階でトランスファーできない。従来法でライブラリーを作成及び選択しようとする試みは効果がないことが判明した(図１参照)。幸い、本出願人はBglIIエンドヌクレアーゼ遺伝子(bglIIR)が不活化された突然変異B.globigii株を自由に使用できた。突然変異株から単離したDNAと一緒に、多重BglII部位をもつ本出願人の新規ベクターを使用して、本出願人は、ライブラリーの構築、M.BglII発現の選択及び組換えプラスミド上のBglIIメチラーゼ遺伝子を保持するクローンを単離できた。
【００１８】
突然変異株由来のbglIIMのクローニングにより、bglIIRのクローニングがさらに複雑になった。変異株ライブラリーから活性bglIIRをクローン化できなかったので、非常に多くの追加段階が必要なことが判明した。これらの段階には、高コピー数ベクター上でのbglIIMのサブクローニング及び過剰発現、B.globigii RUB562由来のR.BglIIの非常に純粋なサンプルの製造；エンドヌクレアーゼタンパク質のサイズ決定及びそのアミノ末端の配列決定、対応するDNAオリゴヌクレオチドプローブの設計並びにbglIIM組換えプラスミドへのプローブのハイブリダイゼーションの探知を含む。さらに、メチラーゼ遺伝子がクローン化された変異株B.globigii RUB561株が、突然変異工程の結果としてエンドヌクレアーゼ遺伝子領域に任意の目立った染色体転移を含んでいたかどうかを検討することが必要であった。全く転移が起きなかったことを確認後、bglIIRの5'末端を含む領域をbglIIMプラスミド上にマッピングし、一連のPCR実験からエンドヌクレアーゼ遺伝子の方向を決定した。この情報を使用して、第２のゲノムライブラリーを、pACYC177にクローン化したB.globigii RUB562 DNAのサイズ-選択制限フラグメントから製造した。ライブラリーを、bglIIM-含有プラスミドにより保護したE.coli宿主細胞に形質転換した。形質転換コロニーをR.BglII活性に関して50個の群でスクリーニングし、これらの群からbglIIRを保持し且つ発現する個々のコロニーを識別した。R.BglIIのオーバーエクスプレッサーを製造するためにさらにクローンを操作することが必要であった。
【００１９】
bglIIM及びbglIIRが好ましくクローン化され且つ発現される本明細書中に記載の方法は図２に示されており、以下の段階を含む。
【００２０】
１．クローニングベクター構築：プラスミドpAMB3、即ち３つの計画的に配置されたBglII部位を含むpBR322誘導体(図３)を構築する。その構築法は実施例１に記載されている。
【００２１】
２．ゲノムDNA精製：bglIIMのクローニングに関しては、Bacillus globigii RUB561をLB培地で生長させる。bglIIRのクローニングに関しては、Bacillus globigii RUB562を同様に生長させる。細胞を収穫し、DNAを精製する。
【００２２】
３．ゲノムDNA消化：B.globigii RUB561 DNAを制限エンドヌクレアーゼ、例えばHindIII、EcoRIまたはPstIで完全に消化させる。PstIは消化するとbglIIMクローンしか与えないので、この操作の詳細のみ記載する。
【００２３】
４．"ショットガン"ライブラリー製造：消化したゲノムDNAを、PstI-切断して脱ホスホリル化したpAMB3ベクターに連結する。連結混合物を使用してRR1またはK802(各々、ATCC 31343及びATCC 33526)のようにE.coli宿主を形質転換する。RR1は好ましい宿主株である。エレクトロポレーションは形質転換の好ましい方法であるが、化学的方法も使用し得る。
【００２４】
５．細胞ライブラリー選択：形質転換混合物を選択的抗生物質培地上に載置する。この場合、テトラサイクリンプレートを使用する。一晩インキュベーション後、形質転換体をプレートから掻き出し、細胞ライブラリーを構築するためにプールする。B.globigiiゲノムを好適に確実に発現させるために、10,000コロニー以上を含むライブラリーだけを使用する。
【００２５】
６．組換えプラスミド精製：組換えプラスミドを細胞ライブラリーからin toto精製し、プラスミドライブラリーを形成する。精製方法は、塩化セシウム-臭化エチジウム勾配遠心分離を含むのが好ましい。
【００２６】
７．プラスミドライブラリー選択：次いでプラスミドライブラリーを、B.globigii RUB562細胞から製造した大過剰のR.BglIIで完全に消化させる。エンドヌクレアーゼ消化は、完全bglIIM-保持プラスミドの集団中で比較的頻度を高める未改変プラスミド(bglIIMを発現しない)を選択的に切断する。切断したプラスミドを、bglIIMを発現しないプラスミドの形質転換効率を減少させるようにも作用する大過剰のアルカリホスファターゼで処理する。
【００２７】
８．bglIIMクローンの識別：消化したプラスミドライブラリーDNAを、RR1またはK802のように好適な宿主株にエレクトロポレーションにより形質転換し、形質転換体を抗生物質培地上で選択する。DNAを個々のコロニーから単離し、R.BglIIによる切断に対する耐性によるM.BglII-特異的改変に関して分析する。プラスミドDNAは消化に対して完全にまたは実質的に耐性でなければならない。さらに確認する場合には、λファージを推定上のbglIIMクローン上で生長させ、ファージDNAを精製し、次いでR.BglII切断に関してチェックする。最終的に、組換えプラスミドの挿入領域を欠失し、残りのベクターを形質転換し、次いで精製し、完全BglII部位の存在に関してチェックする。
【００２８】
９．bglIIMのマッピング及びサブクローニング：メチラーゼ遺伝子はB.globigii RUB561、即ちエンドヌクレアーゼ活性を欠く変異株からクローン化されているので、メチラーゼクローンは活性R.BglIIを産生するとは予測されないし、且つ産生しない。第２のB.globigii株(即ち、RUB562)から別の段階でbglIIRをクローン化する必要がある。クローニング前に、高レベルでM.BglIIを産生する宿主を構築しなければならない。この目的に関しては、Tn5トランスポゾン突然変異マッピングと組み合わせた欠失マッピングによってbglIIMを挿入物内に配置する。フラグメントをpIJ2926、即ち多重クローニング部位内にBglII部位を持つpUC19誘導体にトランスファーする[Janssen及びBibb，Gene 124:133-134,(1993)]。一連の欠失実験により、高レベルのbglIIMを発現するサブクローンを構築する(図４)。このプラスミドをpMBN2と名づける(図４Ｄ)。
【００２９】
１０．B.globigii RUB561及びRUB562 DNAのサザンブロット比較：B.globigii RUB561由来のbglIIMを含む7.5kb PstIフラグメントを、各々B.globigii RUB561及びRUB562由来のゲノムDNAに並行にハイブリダイズし、この領域内の全染色体転移がRUB561またはRUB562株の突然変異に関与したかを調査する。そのような転移は知見されない。
【００３０】
１１．bglIIRの配置：R.BglIIをB.globigii RUB562細胞から殆ど均一となるまで精製する。精製タンパク質は、SDSポリアクリルアミドゲル上で約27kDaの単一バンドとして移動する。従って、これは約750bpの遺伝子によりコードされる。
【００３１】
最初の21アミノ酸の配列を決定する。エンドヌクレアーゼ遺伝子の5'末端に特異的な変性オリゴヌクレオチドプローブを合成し、ハイブリダイゼーション実験で使用するために放射活性標識する。ハイブリダイゼーション実験から、bglIIMに近位のクローン化PstIフラグメントの末端にbglIIRがあることが判明した。
【００３２】
pBR322特異的プライマーと組み合わせてセンス及びアンチセンスbglIIRオリゴヌクレオチドを使用するポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を使用して、bglIIRの方向を決定する。PCR実験から、bglIIR転写の方向がbglIIMに向かっていることを示す。
【００３３】
１２．bglIIRのクローニング：BglII RM系の一段階クローニングに含まれる問題を回避するために、BglIIRを改変宿主細胞にクローン化する。精製B.globigii RUB562 DNAをPstIエンドヌクレアーゼにより完全に消化させ、好適なサイズに切断されたフラグメントをゲル精製して、PstI切断pACYC177に連結させる。連結混合物を、bglIIMを発現するプラスミドpMBN2を保持するE.coli細胞にエレクトロポレーションにより形質転換させる。E.coli K802を宿主として選択する。両方のプラスミドを保持し、２つの抗生物質(即ち、アンピシリン及びカナマイシン)に対して耐性の形質転換体を選択する。
【００３４】
１３．bglIIRを保持するクローンの識別：選択した形質転換体を抗生物質プレート上に50群を二重に載置し、エンドヌクレアーゼ活性に関してスクリーニングする。各対の１枚のプレート由来のコロニーをプールし、溶解させ、次いで粗な抽出物をR.BglII活性に関してアッセイする。試験で陽性の群に関しては、個々のコロニーを生長させ、R.BglII活性に関して別個にアッセイする。プラスミドDNAを陽性クローンから精製し、その特性を確認するために挿入フラグメントを分析する。bglIIR及びbglIIMをコードする7.5kb PstIフラグメントを含むpACYC177プラスミドを識別し、これをpMRB1と名付ける(図６Ａ)。
【００３５】
１４．bglIIM及びbglIIR遺伝子のマッピング及びキャラクタリゼーション：完全BglII RM系を、制限マッピング及びサブクローニング図(６Ｂ)により元の7.5kb PstIフラグメントの3.0kb PstI-HincIIサブフラグメント上に配置する。3.0kb サブフラグメントのヌクレオチド配列は、メチラーゼ及びエンドヌクレアーゼ遺伝子の過剰発現を助長するように産生される。
【００３６】
１５．bglIIMの発現の増加：予備実験から、bglIIRを過剰発現させるために、最初にbglIIM発現を増加させることが必須であることが判明した。bglIIM過剰発現に関する多くの試みとしては、種々の強いE.coliプロモーターの後ろのE.coli染色体上にbglIIMを移動させ、その産物がBglII認識配列を含む部位をメチル化する、Bacillus stearothermophilus Y由来のbstYIMをbglIIMと置換することを含む。しかしながら最適な結果は、中程度のコピー数のプラスミドpSYX19、即ちpBR322-及びpACYC-ベースのプラスミドの両方と適合性のpSC101誘導体上のlacプロモーターからbglIIMを発現させることにより得られる(図５；S.Xu.New England Biolabs)。製造した構築物をpSYXBglMと名付ける(図４Ｇ)。
【００３７】
１６．bglIIRの過剰発現：bglIIRの最適発現への試みとしては、種々のコピー数レベルのプラスミド上の構成及び誘導可能な強いプロモーターの両方を使用することを含む。強い構成プロモーターの後ろにクローン化する際、bglIIR は不安定であることが判明した。ベクターpAGR3、即ちイソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド(IPTG)により誘導可能な、tacプロモーターにより発現されるpBR322誘導体を使用すると最良の結果が得られる(図７；W.Jack,New England Biolabs)。bglIIR遺伝子をpAGR3にトランスファーし、NcoI部位でtacプロモーターにフレーム内で融合させる。これは、PCRによりbglIIRを含むDNAフラグメントの増幅により実施する。あるいは、この構築物は、PCRのかわりに特定部位の突然変異誘発を用いて実施し得、且つ製造した。このエンドヌクレアーゼ-発現プラスミドをpAGRBglR2と名付ける(図６Ｅ)。
【００３８】
１７．過剰発現株の構築：過剰発現に関しては、E.coli株ER2206(E.Raleigh, New England Biolabs)が好ましい宿主である。ER2206はlacリプレッサーのオーバープロデューサーである。細胞内の高濃度のlacリプレッサーは、誘発前のtacプロモーター由来の発現を減少させる。プラスミドpSYXBglMをエレクトロポレーションにより株に形質転換し、形質転換体をカナマイシン耐性に関して選択した。
【００３９】
第２段階では、ER2206(pSYXBglM)を、pAGRBglR2でエレクトロポレーションにより形質転換してコンピテントとし、二重形質転換体を抗生物質培地上で選択する。液体培地上で後期対数増殖期まで生長させ、IPTGで数時間誘導し、次いで粗な抽出物を製造後、形質転換体をR.BglII活性に関して試験する。
【００４０】
１８．R.BglIIの産生：R.BglIIは、ER2206(pSYXBglM；pAGRBglMR2)細胞から、富裕培地、例えば好適な抗生物質を含むLB中、発酵器内での増殖により産生し得る。IPTGで数時間誘導後、細胞を遠心分離により収穫し、超音波処理により破砕し、次いでR.BglII活性を含む粗な細胞抽出物を得る。
【００４１】
１９．R.BglIIの精製：酵素が実質的に他の汚染エンド-及びエキソヌクレアーゼを含まなくなるまで、標準タンパク質精製法(例えば、イオン交換クロマトグラフィー)により段階18に記載の粗な細胞抽出物からR.BglIIを精製する。
【００４２】
上記概要の段階は、本発明を実施する好ましい態様を示すが、当業者には上記の試みは、公知方法によって変形し得ることは公知である。
【００４３】
以下の実施例は、現在のところ実施する上で好ましいものとして本発明の態様を例示するものである。実施例は本発明を説明するものであって、特許請求の範囲の記載以外には本発明を一切限定するものではない。
【００４４】
【実施例】
実施例１
BglII制限エンドヌクレアーゼ及び修飾メチラーゼ遺伝子のクローニング
[注：実施例１で使用する標準法の詳細は、本セクションの最後に含まれる]
１．クローニングベクター構築：使用したクローニングベクターは、以下の如く３つのBglIIリンカーの挿入によりpBR322から誘導したpAMB3であった。
【００４５】
pBR322 10μgを、50μlの反応容積中、PvuII(エンドヌクレアーゼはNew England Biolabsから入手し、供給された緩衝液を使用して推薦条件下で反応を実施した)10単位で37℃２時間消化させた。反応混合物10μlを、供給されたリガーゼ緩衝液(50mM Tris pH 7.8，10mM MgCl2，10mM DTT，1mM ATP，25μg/ml ウシ血清アルブミン)中の２μg非ホスホリル化BglIIリンカー(dCAGATCTG；New England Biolabs)、40単位 T4 DNAリガーゼ(New England Biolabs)及び20単位 SspIを含む100μl 連結反応混合物に添加した。混合物を室温で一晩インキュベートした。次いで等容量のクロロホルムで一回抽出した。連結混合物をCaCl2法を使用してE.coli RR1細胞に形質転換し、細胞をアンピシリンを含むLB寒天プレート(1リットルのLB培地は、10g トリプトン，５g 酵母抽出物，10g NaCl，1g デキストロース，1g MgCl2を含み、NaOHでpHを7.2に調節した。LB寒天は、1.5%寒天を添加したLB培地である)上に載置した。プラスミドDNAをアルカリ溶解ミニプレプ方法を使用して個々の形質転換体から単離し、BglIIで消化させ、次いでリンカーを含むプラスミドに関してスクリーニングするためにアガロースゲル上の電気泳動により分析した。この構築物をpB2066と名付けた。
【００４６】
実験の第２ラウンドでは、非ホスホリル化BglIIリンカーを、上記方法の反復によりpB2066のSspI部位に挿入した。pAMB2と名付けたこの新しい構築物は、２つのBglIIリンカーを含んでいた。
【００４７】
別の実験では、pBR322 ４μgをDraI 40単位で消化させた。37℃で30分後、反応を停止し、フェノール/クロロホルム抽出法を用いてDNAを精製した。再懸濁したDNAを、ホスホリル化BglIIリンカー(d(pCAGATCTG)；New England Biolabs)を使用したこと、及び制限エンドヌクレアーゼを連結反応に添加しなかったことを除いて上記の如く過剰量のBglIIリンカーに連結した。16℃で２時間連結後、反応混合物をフェノール、次いでクロロホルム抽出し、エタノール沈殿させた。次いで精製DNAをBglIIで消化させて過剰に連結したリンカーを除去した。エンドヌクレアーゼを加熱失活し、反応を16℃で１時間、再連結した。クロロホルム抽出後、反応混合物を使用してCaCl2法でE.coli RR1細胞を形質転換し、載置した細胞をアンピシリン-耐性コロニーに関して選択した。アルカリ溶解法により個々の形質転換体から単離したプラスミドをBglIIで消化させ、正しい構築物をスクリーニングするためにアガロースゲル電気泳動により分析した。pB3232と名付けたこの構築物は、アンピシリン耐性遺伝子の外の19bp DraIフラグメントの代わりにBglIIリンカーを有していたが、アンピシリン耐性遺伝子内にDraI部位も持ち、遺伝子は完全且つ機能的なままであった。
【００４８】
ベクターpAMB3を以下の方法によりpAMB2及びpB3232を組み合わせて製造した。pAMB2 10μgを単一150μl反応液中、PstI及びNdeI各々20単位で消化させ、pB3232 10μgを並行反応中、PstI、NdeI及びBamHI各々20単位で消化させた。消化したDNAを0.7% アガロースゲル(IBI,分子グレード) 上で電気泳動し、pAMB2由来の3051bp PstI-NdeIフラグメント及びpB3232由来の1312bp NdeI-PstIフラグメントを単離した。各フラグメント２μgを連結混合物中で混和した。室温で一晩連結し、クロロホルム抽出後、連結混合物をCaCl2法を用いてE.coli RR1細胞を形質転換するために使用した。形質転換体をアンピシリン及びテトラサイクリンを両方含むLB寒天プレート上で選択し、個々の単離物由来のプラスミドをBglIIで消化させ、次いで正しい構築物を調査するために電気泳動により分析した。pAMB3プラスミドは図３に示されている。
【００４９】
２．ゲノムDNA精製：メチラーゼ選択ライブラリー用のDNAをBacillus globigii株RUB561から精製した。B.globigii RUB561を、一晩培養した培地10mlを使用してLB培地500mlに接種し、振盪しながら37℃で飽和するまで生長させた。JA-17ローターのついたBeckman J2-21遠心分離機中、5000rpmで10分間遠心分離することにより細胞を収穫した。細胞ペレットを全部で100ml Tris-EDTA 緩衝液(100mM Tris pH8.0,100mM EDTA)中で再懸濁させることにより洗浄し、次いで前記の如く再遠心分離した。ペレットを全部で10ml Tris-EDTA緩衝液中に再懸濁させ、プールした。遠心分離ボトルを追加の10ml Tris-EDTA緩衝液で洗浄し、プールに加えた。リゾチーム(Sigma)を終濃度0.125mg/mlで添加し、懸濁液を緩やかに転倒することにより混合し、少なくとも30分間37℃でインキュベートした。次いで懸濁液をpH 9.0でTris-EDTA緩衝液の等容量で希釈し、SDSを終濃度１%で添加し、懸濁液を50℃で15分間インキュベートし、完全に溶解させた。
【００５０】
プロテイナーゼＫ(Boehringer Mannheim GmbH)を終濃度0.05mg/mlで添加し、37℃で１〜２時間インキュベーションを継続した。SDSをTE緩衝液(10mM Tris,pH8.0,1mM EDTA)に対する透析で除去し、透析物をTE１容量で希釈した。固体CsClを1g/mlになるまで添加し、臭化エチジウムを100μg/mlになるまで添加した。溶液をBeckman Ti70ローター中、44,000rpmで48時間、超遠心分離にかけ、DNAバンドをシリンジで抽出し、臭化エチジウムをイソアミルアルコールで抽出除去した。CsClを上記の如く透析除去し、透析物をフェノール、次いでクロロホルムで抽出し、溶液を上記の如くTEに対して最後に透析した。最終収量は、500ml 飽和培地からB.globigii RUB561 DNAが200μgであった。
【００５１】
３．ゲノム及びベクターDNA消化：BglII RM系をクローニングしようと試みる間、ライブラリーを多くの制限消化物から作成した。PstIは消化して１個のクローンを産生するので、その操作の詳細のみを記載する。
【００５２】
B.globigii RUB561 DNA ５μgを、標準条件下、過剰量のPstIを使用して完全に切断し、反応液をフェノールで１回抽出した。DNAを95% エタノールを２容量添加して沈殿させた。
【００５３】
pAMB3 DNA ５μgをPstIで37℃で90分間、消化させた。仔ウシ腸ホスファターゼ(Boehringer Mannheim GmbH)22単位を添加し、反応を37℃でさらに30分間継続した。B.globigii DNAと同様の方法で反応をフェノール抽出し、次いでエタノール沈殿させた。
【００５４】
４．DNA連結：PstI-消化ベクター(pAMB3)及び挿入物(B.globigii RUB561 染色体DNA)を、推奨された連結緩衝液中に400ng 挿入DNA、100ng ベクターDNA及び20単位 T4 DNAリガーゼを含む100μl 反応液中で室温で一晩一緒に連結した。次いで、連結混合物をMillipore VS フィルター上でH2Oに対して室温で30分間透析した。フィルターを追加の100μl H2Oで洗浄し、洗浄液を連結混合物と混和した。
【００５５】
５．一次細胞ライブラリー構築：E.coli RR1細胞を標準法を使用してエレクトロポレーション用に製造した。段階４からの透析した連結混合物５μlをE.coli RR1細胞にエレクトロポレーションした。形質転換細胞をテトラサイクリンを含む大きな(150mm)LB寒天プレート上に塗布した。37℃で一晩インキュベーション後、全部で約12,000個の形質転換体がプレート４枚から得られた。プレートをLB上に重ね、一次細胞ライブラリーを形成するためにコロニーをプールした。
【００５６】
６．一次プラスミドライブラリー単離：標準Triton溶解方法を使用して、プラスミドを一次細胞ライブラリーから単離した。超遠心分離後、精製DNAを約0.1mg/mlの終濃度になるように、１ml TEの終容量に再懸濁した。
【００５７】
７．プラスミドライブラリーの選択：一次ライブラリーDNA約２μgを、100μl反応容積中、37℃でBglIIエンドヌクレアーゼ48単位で消化させた。90分消化後、仔ウシ腸ホスファターゼ22単位及び追加の32単位のBglIIを添加し、さらに60分間インキュベーションを継続した。DNAを記載の如く精製し、15μl TE中に再懸濁させた。再懸濁したDNAで、完全消化及び脱ホスホリル化反応を繰り返した。処理したプラスミドDNAを上記の如くH2Oに対して透析した。
【００５８】
８．形質転換：約５ng DNAを含む、1:100に希釈した透析サンプル５μlを使用して、エレクトロポレーションによりE.coli RR1細胞40μlを形質転換した。形質転換細胞をテトラサイクリンを含むLB寒天プレート上に載置した。37℃で一晩インキュベーション後、プレート１枚当たり平均して８つの形質転換体が選択ライブラリーDNA５ngから得られ、未選択ライブラリーDNAと匹敵する量のプレート１枚当たり約8300個が得られた。従って選択倍率は約1000倍であった。
【００５９】
９．生存するプラスミドの分析：選択後生存する形質転換体16個を液体培地上で生長させ、そのプラスミドDNAを標準ミニプレプ方法を使用して単離した。プラスミドを各々PstI及びBglIIを用いる並行反応で消化させ、アガロースゲル電気泳動により分析した。16個のプラスミドの内15個は7.5kb PstI挿入物を含んでおり、BglII切断に対して完全に耐性であった。残り１個のプラスミドは全く挿入物を含んでおらず、BglII切断に対して耐性ではなかった。耐性クローンのうち１個をさらなる物性評価のために選択し、そのプラスミドをpMB05と名付ける(図４Ａ)。
【００６０】
bglIIM遺伝子を保持すると考えられている7.5kb PstI挿入物をBglII-耐性クローンの１つから除去し、そのBglII部位が完全であるかどうかを評価するためにベクターを再連結させた。約１μgのクローンDNAをPstI 20単位で消化させ、ベクターを１ml容積中で一晩、再連結させた。約0.5μgのDNAをCaCl2法を使用してE.coli細胞に形質転換し、形質転換体DNAをアルカリ溶解ミニプレプ方法により単離した。次いでプラスミドを上記の如くPstI及びBglIIで並行反応で消化させ、アガロースゲル電気泳動により分析した。試験した全てのプラスミドが7.5kb挿入物を欠失し且つBglIIにより完全に消化されており、これがBglII消化に対する耐性を与える7.5kb挿入物中にコードされた機能であったことが確認できた。
【００６１】
１０．メチラーゼ-産生宿主の構築：pMB05の広範囲にわたる制限マップを作成し(図４Ａ)、欠失及びTn5挿入突然変異誘発により好適なbglIIM部位を決定した。高レベルのメチラーゼ発現をもつbglIIMクローンを構築するために、pMB05挿入物を高コピー数pUC-誘導ベクターにトランスファーし、非必須DNAの２領域を挿入物から欠失させた。
【００６２】
pMB05 DNA 20μgを容量500μl中PstI 80単位で37℃３時間消化させた。消化フラグメントを0.7% アガロースゲル上の電気泳動により分離し、7.5kb挿入物をDEAEペーパー溶離プロトコルを用いてゲルから単離した。単離フラグメントを、PstI-切断し次いで脱ホスホリル化pIJ2926ベクターDNAに連結した。連結混合物を、RbCl法によりコンピテントにしたE.coli ED8767細胞[Raleighら，Nucl.Acids Res.16:1563-1575,(1988)]に形質転換し、プラスミドをアルカリ溶解法を用いて単離し、ベクター内の挿入物の方向を制限消化物から決定した。この構築物をpMB261と名付けた(図４Ｂ)。
【００６３】
pMB261ミニプレプDNA １μgを50μl反応液中、EcoRV 20単位で消化させた。50μl消化物(0.25μg DNAを含む)のうちの12.5μlを600μl連結反応中で希釈した。連結混合物をフェノールで１回抽出し、クロロホルムで１回抽出し、２容量のエタノールを添加してDNAを沈殿させ、次いで−20℃で一晩凍結させた。DNAをCaCl2法を使用してコンピテントE.coli RR1細胞に形質転換し、プラスミドを６つの形質転換体から単離し、好適な制限パターンに関してチェックした。この新規構築物をpMB263と名付けた(図４Ｃ)。
【００６４】
pMB263ミニプレプDNA ４μgを100μl容量中、NdeIで完全に消化させた。フェノール及びクロロホルム抽出、エタノール沈殿後、再懸濁させたDNA １μgを500μl反応液中で室温で一晩連結させた。連結反応をクロロホルムで１回抽出し、CaCl2法でコンピテントとしたE.coli ED8767細胞を形質転換するのに使用した。９つの形質転換体由来のプラスミドを単離し、好適な制限パターンに関してチェックした。この新規構築物をpMBN2と名付けた(図４Ｄ)。
【００６５】
E.coli K802細胞をコンピテントとし、標準法を使用してpMBN2により電気泳動的に形質転換した。個々の形質転換コロニーをアンピシリン耐性に関して選択し、プラスミドをミニプレプ法により単離し、その制限プロフィールをチェックした。E.coli K802(pMBN2)をエンドヌクレアーゼ遺伝子をクローニングするための宿主として使用した。
１１．B.globigii RUB562 DNAの精製及び分析：B.globigii RUB562由来のDNAを段階２に記載のRUB561 DNAと同様の方法で精製した。
【００６６】
サザンブロットハイブリダイゼーション分析[Maniatisら,Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor,NY(1982)]から、bglIIMを取り囲む領域中、株RUB561及びRUB562の間に明らかな染色体の差はないことが明らかになった。
１２．bglIIRの配置：bglIIRの配置及び方向を、エンドヌクレアーゼタンパク質のアミノ末端配列から誘導した縮退オリゴヌクレオチドプローブを使用して決定した。
【００６７】
この目的のために、BglIIエンドヌクレアーゼを標準タンパク質精製法を使用してB.globigii RUB562細胞から殆ど均一になるように精製した。精製タンパク質の最初の16アミノ酸残基のタンパク質配列を、Applied Biosystems 470A 気相シーケンサーで逐次分解により決定し、Met Lys Ile Asp Ile Thr Asp Tyr Asn His Ala Asp Glu Ile Leu Asn(配列番号１)であることが判明した。タンパク質配列に基づいて、コンプレキシティ(complexity)256の21-塩基アンチセンスオリゴヌクレオチドプローブ:(ATYTCRTCNGCRTGRTCRTAR；配列番号２)及びコンプレキシティ36の17-塩基のセンスプローブ:(ATGAARATHGAYATHAC；配列番号３)(但し、Ｒ＝ＡまたはＧ、Ｙ＝ＣまたはＴ、Ｈ＝ＡまたはＣまたはＴ、Ｎ＝ＡまたはＣまたはＧまたはＴである)を合成した。
【００６８】
これらの縮退エンドヌクレアーゼ-特異的ハイブリダイゼーションプローブ(Howardら,前掲)を用いるpMB05プラスミドのサザンブロットハイブリダイゼーション分析により、エンドヌクレアーゼ遺伝子の5'末端をpMB05挿入物内の1.1kb PstI-NdeIフラグメント上に配置した。さらに、pBR322 PstI時計方向及び反時計方向プライマーと一緒に上記センス及びアンチセンスプライマーを使用するPCR実験を、bglIIRの方向を決定するためにpMB05上で実施した。この実験結果から、クローン化PstIフラグメントが完全遺伝子を含まなくてはならないようにbglIIRが配置且つ配向されていることが明白になった。
【００６９】
１３．bglIIRのクローニング：bglIIRを、pACYC177中の7.5kb サイズ選択したB.globigii RUB562 DNA PstIフラグメントのプラスミドライブラリーからクローン化した。
【００７０】
B.globigii RUB562 ゲノムDNA 25μgを容積400μl中、PstIで37℃4.5時間消化させた。消化したDNAを0.7% アガロースゲル上の電気泳動により分離し、約6.5〜8.5kbのサイズのフラグメントをDEAEペーパー溶離により単離した。サイズ選択したDNAを15μl TE(終濃度約80μg/ml)中に再懸濁させた。
【００７１】
pACYC177ベクターDNA５μgをPstIで37℃で1.5時間消化させた。仔ウシ腸-ホスファターゼ及び追加のPstIをこの時点で添加し、さらに60分間インキュベーションを継続した。消化したDNAを精製し、20μl TE中に再懸濁させた。
【００７２】
サイズ選択したRUB562 PstIフラグメント約0.6μgを、53μl反応容積中、T4 DNA リガーゼ400単位でPstI-消化及び脱ホスホリル化pACYC177 0.2μgに連結した。連結混合物50ngを使用して、CaCl2法を用いるコンピテントE.coli K802(pMBN2)を形質転換した。形質転換体をカルベニシリン及びカナマイシンの両方の耐性に関して選択した。
【００７３】
１４．エンドヌクレアーゼ-産生クローンの識別：サイズ選択ライブラリーの形質転換体から、50コロニーの11セットをカルベニシリン及びカナマイシンを補ったLB寒天プレート上に二重に拾い出した。各セットの１プレートからコロニーを5ml LBに集め、プールし、遠心分離して収穫し、次いで0.8ml超音波緩衝液(100mM NaCl,50mM Tris pH 8.0,10mM β-メルカプトエタノール)中に再懸濁させた。10μl 0.5M EDTA及び25μl 10mg/mlリゾチームを細胞の各チューブに添加し、チューブを−70℃で凍結させた。融解後、細胞抽出物をHeat Systems W-225R ソニケーター(Ultrasonics,Inc.)中で15分間超音波処理し、10分間遠心分離して細胞破片を除去した。各粗な抽出物の１μl及び７μlをそれぞれ、BglII用に推薦された緩衝液中、単一BglII部位を含むBamHI-直線化pBR3232 DNA上でR.BglII活性に関して、37℃で１時間分析した。R.BglII活性は、分析した粗な抽出物の11個のプールの内９個に知見された。
【００７４】
陽性プレートの１個から個々のコロニーをカルベニシリン及びカナマイシンを補った５ml LB上で一晩生長させ、抽出物を製造し、上記の如くR.BglII活性に関して分析した。分析した11個の粗な抽出物の内２個がR.BglII活性を示した。さらなる実験から、両方のクローンが細胞1グラム当たり約100,000単位のR.BglII活性を発現し、B.globigii RUB562細胞の約３倍の過剰発現であることが判明した。bglIIR及びbglIIMを含むpACYC17プラスミドをpMRB1と名付けた(図６Ａ)。
【００７５】
１５．bglIIM及びbglIIRのヌクレオチド配列決定：標準制限マッピング法を使用して、bglIIR及びbglIIMを3.0kb PstI-HincIIフラグメントにマップした(図６Ｂ)。領域を標準法により幾つかの断片にサブクローン化し、ヌクレオチド配列をDNAポリメラーゼＩクレノウフラグメント(New England Biolabs)及び/またはCircumVent シークエンシング法(New England Biolabs)を用いるジデオキシ法[Sangerら，Proc. Natl. Acad. Sci.USA 74:5463-5467,(1977);Sanger及びCoulson,FEBS Letters 87:107-110,(1978)]により完全領域に関して製造した。bglIIM及びbglIIRをコードする3188bp領域のヌクレオチド配列を配列番号４に示す。
【００７６】
１６．過剰発現するメチラーゼ構築物の製造：その発現を増加させるために、bglIIMをpSYX19にクローン化した(図５)。
【００７７】
pSYX19 1.6μgを総容量50μl中BamHI 60単位で消化させた。37℃で90分間、消化を実施した。仔ウシ腸ホスファターゼ10単位を添加し、反応をさらに37℃で30分インキュベートした。消化したDNAを精製し、10μl TE中に再懸濁させた。
【００７８】
1μg pMBN2を総容量50μl中、HincII 30単位で37℃で１時間消化させた。消化したDNAを上記の如く精製し、10μl TE中に再懸濁させ、総容量50μl中T4 DNAリガーゼ400単位で再連結させた。連結を16℃で一晩実施した。E.coli ED8767細胞を連結したDNA２ngでエレクトロポレーションし、細胞をカルベニシリンを含むLB寒天プレート上に載置した。プラスミドをアルカリ溶解ミニプレプ法を使用して形質転換体から単離し、最初にNdeI、次いでHincIIでタンデム反応中で消化させ、アガロースゲル上の電気泳動により分析した。所望のHincII欠失をもつ形質転換体のひとつ由来のプラスミドをTriton溶解法を使用して精製し、これをpBM1と名付けた(図４Ｅ)。
【００７９】
pBM1 ５μgを総容量50μl中、NdeI 60単位で37℃１時間消化させた。消化したDNAを上記の如く精製し、20μl TE中に再懸濁させた。再懸濁したDNAを50μl 反応容積中、推薦された緩衝液中のDNAポリメラーゼＩクレノウフラグメント10単位並びにdATP、dCTP、dGTP及びdTTP各0.3mMで処理し、その末端を充填した。反応を25℃で30分、次いで65℃で５分インキュベートした。この反応混合物10μlを、1μg ホスホリル化BamHIリンカー(d(pCGGATCCG);New England Biolabs)及びT4 DNAリガーゼ1200単位を含む連結反応混合物100μlに添加した。連結を16℃で一晩実施した。E.coli ED8767細胞を消化したDNA約5ngでエレクトロポレーションし、細胞をカルベニシリンを含むLB寒天上に載置した。プラスミドをアルカリ溶解ミニプレプ法を使用して形質転換体から単離し、BamHIで消化させ、次いでアガロースゲル上の電気泳動により分析した。所望のBamHIリンカーのついた形質転換体のひとつからのプラスミドをTriton溶解法を用いて単離し、これをpBM1-Bamと名付けた(図４Ｆ)。
【００８０】
pBM1-Bam 10μgを総容量150μl中、BamHI 160単位で消化させた。消化を37℃で60分間実施した。消化したプラスミドのフラグメントを0.5%アガロースゲル上の電気泳動により分離した。1.8kb DNAバンドを切り出し、製造業者の説明書に従ってPrep-a-Gene DNA Purification Matrix Kit(Bio-Rad Laboratories)を用いて精製した。DNAをPrep-a-Gene Elution Bufferの終容量75μlに再懸濁させた。
【００８１】
BamHI-消化pSYX19 0.1μgを反応容量50μl中のT4 DNAリガーゼ400単位でbglIIMフラグメント0.75μgに16℃で18時間連結した。連結をクロロホルム等容量で一回抽出して停止し、H2Oで透析した。
【００８２】
E.coli ED8767細胞を連結混合物10μlでエレクトロポレーションし、カナマイシンを含むLB寒天上に細胞を載置した。37℃で一晩インキュベーション後、得られた形質転換体12個をカナマイシンを含むLBブイヨンの５ml培地上で生長させ、そのプラスミドDNAをアルカリ溶解ミニプレプ法を使用して単離した。プラスミドDNAを正しい制限フラグメントに関してチェックした。1つのコロニーをin vivoでλvirファージ(New England Biolabs Culture Collection)DNAをメチラートする能力に関して試験した。この新しい構築物をpSYXBglMと名付けた(図４Ｇ)。
【００８３】
１７．誘導可能なエンドヌクレアーゼ構築物の製造：エンドヌクレアーゼ遺伝子を過剰発現させるために、発現ベクターpAGR3(図７)を使用した。bglIIRをpBglR1.8Bと呼称される存在するクローンからPCRにより増幅した(図６Ｃ)。BspHI及びBsmHI部位を反応で使用したオリゴヌクレオチドプライマー中に作成した。プライマー１は、bglIIRの翻訳開始を含む配列を含み、下線をつけたBspHI部位：5' GGA GAC ACT CTC ATG AAG ATT G 3'(配列番号５)を作り出すために元の配列の変化した２塩基を含んでいた。プライマー２は、bglIIR由来の停止コドンの直後に配列を含んでおり、下線をつけたBamHI部位：5' TGT TTA TAT GGA TCC TCA CTC AC 3'(配列番号６)を作成するために元の配列の変化した２塩基を含んでいた。これらの２つのプライマー間の0.8kbフラグメントを、(16.6mM (NH4)SO4,67mM Tris-HCl pH 8.8,6.7mM MgCl2,10mM β-メルカプトエタノール,187μM 各dNTP,100μg/ml BSA)中の2.5単位Taqポリメラーゼ(Bethesda Research Laboratories)、10ng pBglR1.8B 鋳型、及び0.25mM 各プライマーと、PCR反応中、93℃で1.5分、60℃で1.5分、及び72℃で1.5分、30サイクル増幅した。サンプルを第１のサイクル前に93℃で５分間インキュベートし、最終サイクル後72℃で３分間インキュベートした。
【００８４】
次いで、PCR産物をフェノール、次いでクロロホルムで各１回ずつ抽出し、ドライアイス-エタノール浴中エタノールで12分間沈殿させ、遠心分離により収集し、次いで10μl TE中に再懸濁させることにより消化用に精製した。再懸濁させたDNA(約３μg)を50μl反応容積中、50単位BamHI及び12.5単位BspHIで37℃で60分間消化させた。消化したDNAを0.7%アガロースゲル上の電気泳動により分離し、正しいバンドを切り出し、製造業者の説明書に従ってBio-Rad Prep-a-Geneキットを使用してDNAを精製し、次いで30μl Prep-a-Gene Elution Buffer中に再懸濁させた。
【００８５】
消化したPCR産物をNcoI-及びBamHI-消化及び脱ホスホリル化pAGR3 DNAに連結し、連結混合物をpSYXBglMプラスミドを含むE.coli ER2206細胞にエレクトロポレーションした。形質転換細胞をカルベニシリン、カナマイシン及びテトラサイクリンを含むLB寒天プレート上で選択した。プラスミドをアルカリ溶解法を使用して単離し、制限エンドヌクレアーゼで消化させ、アガロースゲル電気泳動を使用して分析した。正しい配置をもつプラスミドを含むクローンを粗な抽出物中でエンドヌクレアーゼ活性に関して試験した。この新規エンドヌクレアーゼ-発現プラスミドをpAGRBglR2と名付けた(図６Ｅ)。
【００８６】
新規クローンを最適生長及び発現条件に関して試験した。クローンをカルベニシリン、カナマイシン及びテトラサイクリンを含むLB上で30℃で後期対数増殖期(Klett-Summerson photoelectric colorimeter中で100の読取値)まで生長させ、0.5mM IPTGで誘発させ、次いでさらに30℃で20時間生長させて収穫すると、最適結果が得られた。これらの条件下で、R.BglIIの収量は細胞1グラム当たり1,200,000単位であり、B.globigii RUB562細胞の40倍の過剰発現であった。さらに物性分析及び最適化用に選択したクローンの単離物は株NEB#731であった。NEB#731のサンプルは、1993年２月23日にMeryland州、RockvilleのAmerican Type Culture Collectionに寄託され、寄託番号No.69247を受けた。NEB#731の粗な細胞抽出物から産生されたBglII制限エンドヌクレアーゼ活性の滴定を図８に示す。
【００８７】
１８．発酵：好適な抗生物質を含むLB1リットルに接種するのに単一コロニーを使用し、培地を最終密度109細胞/mlになるまで30℃で一晩生長させた。一晩培養した培地を使用して、pH7.1の同一培地100リットルを入れた発酵器に接種するのに使用した。発酵器の培地をKlett＝100になるまで30℃で生長させ、0.3mM IPTGで誘発し、30℃で一晩生長させた。細胞をSharples遠心分離機で16,000rpmで連続収穫した。最終収量は細胞758グラムであった。
【００８８】
１９．R.BglII精製：細胞約400グラムを、50mM NaClを含む緩衝液Ａ(20mM Tris-HCl pH7.1,0.1mM EDTA，10mM β-メルカプトエタノール)約1200mlに再懸濁させ、Manton-Gaulin 15M ラボホモジナイザー(12,000psiで約４回またはOD595及びOD260レベルオフになるまで)で破壊した。破片をSharples 遠心分離機で40分間遠心分離して除去した。固体NaClを上清に終濃度400mMで添加し、ポリエチレングリコール(PEG)を7.5%になるまで添加した(30分で撹拌しながら添加した)。PEGをBeckman遠心分離機で4000rpmで20分間回転させることにより沈殿させ、ペレットを廃棄した。
【００８９】
上清を緩衝液Ａで終濃度150mM NaClになるまで希釈し、伝導度メーターでモニターした。サンプルを150mM NaClを含む緩衝液Ａで平衡化させた５cm×13cmのヘパリン-セファロースカラム(Pharmacia LKB Biotechnologies)上に載置した。カラムを150mM NaClを含む緩衝液Ａ 約500mlで洗浄した。タンパク質を緩衝液Ａ中、150mM〜1200mM NaClの勾配液2000mlで溶離させ、画分24mlを集めた。R.BglII活性は0.6と0.85M NaClの間に溶離した。この時点及び精製する間、活性を基質として１μlλDNA(New England Biolabs)、1μlカラム画分及び標準緩衝液条件を使用するアッセイにより測定し、37℃で２分間インキュベートした。
【００９０】
活性画分をプールし、150mM NaClを含む緩衝液Ａ ４リットルで一晩透析した。透析物を150mM NaClを含む緩衝液Ａで平衡化させた1.5cm×34cmの第２のヘパリン-セファロースカラム(Pharmacia LKB)上に載置した。カラムを150mM NaClを含む緩衝液Ａの２カラム容積で洗浄した。タンパク質を緩衝液Ａ中150mM〜1200mM NaClの勾配液1000mlで溶離させ、画分12mlを集めた。上記の如くアッセイしたR.BglIIエンドヌクレアーゼ活性は、0.4と0.65M NaClの間に溶離した。
【００９１】
活性画分をプールし、ウシ胎児血清アルブミンを終濃度100μg/mlで添加し、溶液を貯蔵緩衝液(50mM KCl，10mM Tris pH 7.4，0.1mM EDTA，１mM DTT，50% グリセロール)で一晩透析し、容積を減少させた。
【００９２】
透析物をSepadex G-75サイジングカラム(2.5cm×114cm)に載置し、カラムに緩衝液Ｂ(50mM KCl，10mM Tris pH 7.4，0.1mM EDTA，1mM DTT，10% グリセロール)を流速4.5ml/時で流した。R.BglIIは容積60mlで溶離し、活性画分をプールし、ウシ血清アルブミンを終濃度200mg/mlで添加し、酵素を貯蔵緩衝液で再透析した。
【００９３】
この精製方法を使用して、R.BglII 1.2×106単位を得た。収率は16%であった。
【００９４】
この精製法により得られたBglII制限エンドヌクレアーゼは実質的に純粋で、非特異的エンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼを含んでいなかった。BglII制限エンドヌクレアーゼ製剤の純度を以下の標準法によりチェックした。
【００９５】
１)連結：λDNAが15倍過剰発現した後、産生したDNAフラグメントの95%以上はT4 DNAリガーゼに連結できた(16℃で1−2mM の5'末端濃度)。これらの連結フラグメントのうち95%は再切断可能であった。
【００９６】
２)延長消化：λ DNA 1μg及び酵素400単位を含む50μl反応液を16時間インキュベーション後、１時間インキュベートした酵素1単位を含む反応液と同一パターンのバンドが生じた。
【００９７】
３)エキソヌクレアーゼ活性：超音波処理した[3H]DNA(105cpm/mg)１μgを含む50μl反応液中、酵素3,000単位で37℃で４時間インキュベーション後、放射能0.1%未満が放出された。
【００９８】
４)エンドヌクレアーゼ汚染：1μgφ X174 RFI DNAを含む50μl反応液中、酵素80単位で37℃で４時間インキュベーション後、DNAの10%がRFIIに転換した。全ての試験を以下の反応緩衝液[50mM NaCl，10mM Tris-HCl，10mM MgCl2，１mM DTT(pH 7.9，25℃)]中で実施した。
【００９９】
標準法の説明
１．抗生物質の培地への添加：液体培地及び寒天プレートの両方に、必要により所定濃度の以下の抗生物質：アンピシリン(50μg/ml)；カルベニシリン(50μg/ml)；テトラサイクリン(10μg/ml)；カナマイシン(50μg/ml)を添加した。
【０１００】
２．制限エンドヌクレアーゼ消化後のDNA精製：制限消化反応を等容量のフェノールで１回及び等容量のクロロホルムで１回抽出した。95%エタノール２容量を添加し、混合物をドライアイス-エタノール浴中で10分インキュンベートし、DNAを沈殿させる。DNAをエッペンドルフミクロ遠心分離機中で４℃で10分間遠心分離することにより集め、上清をデカンテーションし、DNAペレットを好適な容量のTE緩衝液に再懸濁させる。
【０１０１】
３．CaCl2を用いるコンピテントE.coli細胞の製造：E.coli細胞を後期対数増殖期(Klett＝100)まで液体培地中で生長させ、次いで遠心分離により収穫することにより形質転換用に製造する。細胞を50mM CaCl2の半分の容量で洗浄し、前述の如く収穫し、最終的に元の50mM CaCl2の1/50容量中に再懸濁させる。
【０１０２】
４．コンピテントカルシウム-処理E.coli細胞の形質転換：DNAと200μl細胞と混合し、次いで氷上で20分間インキュベートすることにより細胞を形質転換する。細胞を42℃で２分間インキュベーションすることにより熱ショックを与える。LB培地を添加し、細胞を37℃で１時間インキュンベートし、好適な(複数の)抗生物質を含む寒天プレート上に散布する。
【０１０３】
５．アルカリ溶解"ニミプレプ"法によるプラスミド単離：５mlの一晩培養した培地からの細胞をBeckman JA-17ローター中、5000rpmで10分間遠心分離することにより収穫し、100μl氷冷GET緩衝液(50mM グルコース，10mM EDTA，25mM Tris-HCl pH 8.0，4mg/ml リゾチーム)中に再懸濁させる。室温で５分間インキュベーション後、新しく調製した溶液(0.2N NaOH，１% SDS)200μlを添加する。溶液を転倒することにより緩やかに混合し、氷上で５分間インキュンベートする。氷酢酸でpH 4.8に調節した５M 酢酸カリウム溶液150μlを溶解物に添加する。細胞溶解物を混合し、氷上で５分間インキュンベートし、エッペンドルフ遠心分離機で４℃で５分間遠心分離する。上清をフェノール:クロロホルム1:1の等容量で１回洗浄し、混合し、エッペンドルフ遠心分離機で２分間回転させる。95%エタノール２容量を最上層に添加し、混合物を室温で５分間インキュンベートし、DNAをエッペンドルフ遠心分離機中５分間遠心分離して集める。ペレットを70%エタノール１mlで洗浄し、上記の如く再遠心分離する。上清をデカンテーションし、DNAペレットを風乾または真空デシケーター中で乾燥させ、乾燥ペレットを20μg/ml RNaseを含む50μl TE中に再懸濁させる。
【０１０４】
６．エレクトロポレーションによるE.coli細胞の形質転換：１リットルのLB培地にE.coli細胞の一晩培養した培地を1:500で接種する。培地が中間対数増殖期(Klett＝65)に到達したら、細胞をJA-14ローターのついたBeckman J2-21遠心分離機中、4000rpmで15分間遠心分離することにより収穫する。上清をデカンテーションし、細胞を1リットルの滅菌H2O中に４℃で再懸濁させる。細胞を上記の如く収穫し、0.5リットルの滅菌H2Oに４℃で再懸濁させる。細胞を上記の如く収穫し、10%グリセロールを含む20ml滅菌H2O中で４℃で３回再懸濁させる。細胞を上記の如く収穫し、最後に10%グリセロールを含む２ml滅菌H2O中で４℃で再懸濁させる。この時点までの細胞密度は、少なくとも３×1010細胞/mlでなければならない。このようにして製造した細胞はすぐに使用し得るが、−70℃で無期限に貯蔵でき、使用直前に氷上で融解する。
【０１０５】
細胞をDNA(1-40ml容積)と40μl細胞と一緒に混合し、次いで氷上で１分間インキュンベートすることによりエレクトロポレーションする。25μFD静電容量及び2.5kVパルスで200Ω抵抗に設定したBio-Rad Gene Pulser装置で混合物に電流をかける。エレクトロポレーションした細胞を1ml LB中に再懸濁させ、37℃で１時間インキュンベートし、好適な抗生物質を含む寒天プレート上に散布する。
【０１０６】
７．Triton溶解によるプラスミド単離方法：細胞を、JA-17ローターをつけたBeckman J2-21遠心分離機中で5000rpmで15分間遠心分離することにより液体培地から収穫し、培地1リットル当たり８ml Tris-蔗糖緩衝液(50mM Tris pH 8.0，25%蔗糖)中に再懸濁させる。細胞をプールし、このプールに培地1リットル当たり0.8ml 0.5M EDTA pH8.0、0.8ml 10mg/ml リゾチーム及び5.6ml Toriton緩衝液(62.5mM EDTA，１% Triton X-100，50mM Tris-HCl pH 8.0)を添加する。成分を緩やかに転倒することにより混合し、氷上で30分間インキュベートし、上記と同一ローター中16,000rpmで45分間遠心分離して細胞破片を分離する。1.1g/ml CaClを上清に添加し、臭化エチジウムを100μg/mlになるまで添加する。混合物をTi70ローターのついたBeckman L8-55超遠心分離機中で44,000rpmで48時間(または55,000rpmで24時間、その後44,000rpmで1時間)回転させる。遠心分離後、DNAバンドをCsCl勾配液からシリンジで除去し、H2O ２容量で希釈し、DNAを95%エタノール２容量を添加することにより得られた溶液から沈殿させ、−20℃で少なくとも30分間凍結させる。DNAをJA-17ローターのついたBeckman J2-21遠心分離機中、12,000rpmで20分間回転させることにより集め、上清をデカンテーションし、ペレットを1-2ml TEに再懸濁させる。DNA溶液をフェノール等容量で１回抽出し、次いでクロロホルム等容量で抽出する。LiClを0.2M 濃度で添加し、次いで95% エタノール２容量を添加する。DNAを−70℃で一晩凍結することにより２度沈殿させ、上記の如く集める。最終DNAペレットを0.5ml TEに再懸濁させる。
【０１０７】
８．アガロースからのDNAのペーパー溶離：ワットマンクロマトグラフィーペーパーDE81を2.5M NaCl中に数時間浸漬させ、H2Oで数分間洗浄し、乾燥させる。
【０１０８】
アガロースゲル電気泳動によりフラグメントを分離後、精製すべきDNAバンドの隣のゲルにウエルを切り込み、上記の如く製造したDEAEペーパーをウエルに挿入する。ウエルに緩衝液を満たし、所望のバンドが切断ウエルに移動するようにゲルを90°の角度で回転させ、バンドが移動するまでは浸水させないようにする。
【０１０９】
洗浄装置は、1.5mlエッペンドルフチューブ内部に配置された底に穴のついた0.5mlエッペンドルフチューブからなる。調製チューブ内で、液体にペーパーを浸し、遠心分離により底の穴を通して液体を排水することにより、DEAEペーパーを150μl低塩緩衝液(0.1M NaCl，10mM Tris pH 8.0，１mM EDTA)で２回洗浄する。これを75μl高塩緩衝液(1.0M NaCl，10mM Tris pH 8.0，1mM EDTA)中で４回実施する。高塩洗浄液をプールし、フェノール:クロロホルム1:1の等容量で１回及びクロロホルムで１回抽出する。95%エタノールを２容量以上添加することによりDNAを沈殿させ、ドライアイス-エタノール浴中で15分間凍結させ、次いで４℃で10分間遠心分離する。上清を注意深く除去し、ペレットを乾燥させ、好適な容量のTE中に再懸濁させる。
【０１１０】
９．RbClを使用するコンピテントE.coli細胞の製造：E.coli細胞を液体培地中、中間対数増殖期(Klett＝60〜80)になるまで生長させ、氷上で凍結させ、次いでBeckman JA-14ローター中、4000rpmで５分間遠心分離して収穫する。細胞を1/5容量のTFB I(30mM 酢酸カリウム，100mM RbCl，10mM CaCl2，50mM MnCl2，15% グリセロール，0.2M 酢酸によりpH 5.8としたもの)中に再懸濁させ、凍結させ、上記の如く収穫する。細胞を元の容量の1/50のTFB II(10mM MOPS，75mM CaCl2，10mM RbCl，15% グリセロール,KOHでpH6.5にしたもの)に再懸濁させ、使用前に上記の如く氷上で15〜60分間凍結させる。
【０１１１】
CaCl2で処理した細胞に関して記載された同一形質転換プロトコルをRbClで処理した細胞に関して実施する。
【０１１２】
１０．メチル化のファージアッセイ：0.04% マルトース及び好適な抗生物質を含んだ富裕ブロス(1リットル当たり富裕ブロスは以下のものを含む：10g トリプトン;５g 酵母抽出物；５g NaCl；1N NaOHでpHを7.0に調節)を形質転換体の一晩培養した培地に1:100で接種する。新規培地を37℃で振盪しながら中間対数増殖期まで生長させ、細胞を遠心分離(4000rpm５分)により収穫し、1mM SM(100mM NaCl，8mM MgSO4・7H2O，50mM Tris-HCl pH 7.5，0.01% ゼラチン)中に再懸濁させる。λvirファージを感染の多重度10になるように添加し、細胞を37℃で20分間インキュベートして、ファージを吸着させる。インキュベーション後、0.04% マルトースを含む富裕ブロスを添加して容積を20mlに戻し、培地を37℃で一晩生長させる。翌日、クロロホルム200μlを培地に添加し、細胞破片を遠心分離し、次いで0.45μmフィルター(Schleicher及びSchuell)を通して濾過して除去する。ファージDNAをフェノール、次いでクロロホルムとの抽出により澄んだ上清１mlから単離し、−70℃でエタノール沈殿させ、遠心分離(Beckman JA-17ローター中、12000rpm、20分)し、次いで20μg/ml RNaseを含む100μl TE中にペレットを再懸濁させる。
【０１１３】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、Bacillus globigii RUB562(RII+MII+)由来のBglII RM系をクローン化する試みを示す。図示の如く、この株由来の完全系をクローン化する試みは成功しないことを証明した。従って、これらは本明細書内には記載されない。
【図２】図２は、明細書に記載の如くBglIIエンドヌクレアーゼをクローン化及び産生する好ましい方法を示す。
【図３】図３は、Bacillus globigiiゲノムライブラリーを作成するために使用したベクターpAMB3の図式である。ベクターはpBR322から誘導する。本図は、プラスミド(1990-1991，p110)のNew England Biolabsカタログマップから書き換えて、番号をつけてある。このマップは、pBR322を１度または２度切断する酵素の制限部位を示す。単一の部位をボールド型で示す。Ap＝アンピシリン耐性遺伝子；Tc＝テトラサイクリン耐性遺伝子；ropはRNaseIの活性を仲介するタンパク質をコードする；ORI＝複製開始点。３つの挿入BglIIリンカーの大凡の位置を矢印で示す。
【図４】図４は、bglIIM遺伝子のマッピング及びサブクローニングを図示する。図中、影のついた太線は、挿入B.globigii RUB561(RII-MII+)DNAを示す。プラスミドベクターDNAは細線により表されている。bglIIMの位置及び方向は長い矢印により示されている。存在する場合のlacプロモーター(Plac)の相対位置及び方向が短い矢印により示されている。各構築物中で使用されたプラスミドベクターは左端の括弧内に示されている。ベクターpAMB3及びpSYX19の詳細は図３及び５に各々与えられている。
Ａ．pMB05を構築するためにpAMB3上にトランスファーした、bglIIMを保持するBacillus globigii DNAの7.5kb PstIフラグメントである。挿入物内の重要な制限部位が示されている。
Ｂ．pMB261を形成するために発現ベクターpIJ2926に無傷の状態でトランスファーしたPstIフラグメントである。ベクター内に関連制限部位が含まれている。
Ｃ．pMB261のEcoRV部位の間の1.7kb欠失により形成された、プラスミドpMB263の挿入フラグメントである。
Ｄ．プラスミドpMB263のNdeI欠失により形成された、pMBN2の挿入フラグメントである。欠失により、pIJ2926ベクターの220bpに沿って挿入DNA1350bpを除去した。
Ｅ．pMBN2の4.7kb HincII欠失により形成された、pBM1の挿入フラグメントである。
Ｆ．クレノウポリメラーゼでNdeI部位を充填し、次いでその末端にBamHIリンカーを付加することにより作成した、pMB1-Bamの挿入フラグメントである。
Ｇ．pSYXBglMを形成するためにベクターpSYX19中に挿入されたbglIIMを含む1.8kbの得られたBamHIフラグメント、R.BglII過剰発現クローンに関して使用したメチラーゼ構築物である。
【図５】図５は、プラスミドベクターpSYX19の図を示す。プラスミド、即ち、pWSK129[Wang及びKushner，Gene 100：195-199,(1991)]は、そのコピー数を増加させるその複製開始点(pSC101 ori)に於ける突然変異を含む。図中、f1 ori＝f1複製開始点；Kan＝カナマイシン耐性遺伝子；MCS＝多重クローニング部位及びPlac＝lacプロモーターが示されており、その位置及び方向が短い矢印で示されている。bglIIMが挿入されるBamHI部位は、MCSに配置されている。
【図６】図６は、bglIIRが特徴付けされ、サブクローン化され次いで過剰発現される工程を図示している。図中、太い影の線は、bglIIM及びbglIIR遺伝子を含むB.globigii RUB562(RII+MII+)DNAを示している。重要な制限部位が示されている。bglIIR及びbglIIM遺伝子の位置及び方向が長い矢印で示されている。プロモーターPlac及びPtacは短い矢印で示されている。プラスミドベクターは括弧内に示されている。プラスミドpAGR3は図７に記載されている。
Ａ．pMRB1を形成するためにpACYC177[Chang及びCohen，J.Bacteriol.134：1141-1156,(1978)]にクローン化されるbglIIM及びbglIIRを含むB.globigii RUB562由来の7.5kB PstIフラグメントである。
Ｂ．そのヌクレオチド配列が決定された完全BglIIRM系を含む3.0kb PstI-HincII領域である。
Ｃ．pBglR1.8Bを形成するためにpUC18にクローン化された、bglIIRフラグメントを含む2.0kb PstI-SphIフラグメントである。
Ｄ．bglIIRを含むPCRにより産生された800bpフラグメントである。末端では、フラグメントがNcoI及びBamHI部位間で発現ベクターpAGR3に直接クローン化され得るようにBspHI及びBamHI部位をプライマー内に作製した。
Ｅ．pAGRBglR2を形成するために発現ベクター中にクローン化された、bglIIRを含むフラグメントである。
【図７】図７は、プラスミドベクターpAGR3の図を示している。W.Jack(New England Biolabs)により構築されたプラスミドは、lacIqリプレッサー遺伝子、転写ターミネーター(rrnb)及びtacプロモーター(Ptac)が付加された、pRS415[Simonsら，Gene 53：85-96,(1987)]の誘導体である。図中に示されている他の特徴は、正しい方向にbglIIRを挿入するために使用された、複製開始点(ori)、アンピシリン耐性遺伝子(amp)並びにNcoI及びBamHIクローニング部位である。翻訳開始コドン(ATG)はNcoI部位内に配置されており、ベクターのリボソーム結合部位の後ろに最適に配置されている。
【図８】図８は、ＮＥＢ＃７３１の細胞抽出物から得られたＢｇｌＩＩ制限エンドヌクレアーゼ活性の滴定を示すアガロースゲル電気泳動の写真である。ゲル上のレーンの番号は、左から右へレーン１から８まである。ＮＥＢ＃７３１から作成した粗な細胞抽出物を各々、希釈緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，ｐＨ８．０，１００ｍＭ  ＮａＣｌ）中に１：１００及び１：１０００で希釈した。各希釈液から１μｌ及び５μｌを使用して、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ  ＮａＣｌ及び１０単位ＳｓｐＩを含む５０μｌ反応混合物中で、ＰＩＪ２９２６ＤＮＡ０．５μＧを消化させた。３７℃で３０分間インキュベーション後、各希釈液からの反応混合物３０μｌを０．７％ＴＢＥアガロースゲル上に載置し、これを１時間泳動して、写真を撮った。ゲルのレーン中に含まれるものは、分子量マーカーとしてＢｓｔＥＩＩで切断したλＤＮＡ（レーン１及び８）；１６単位精製ＢｇｌＩＩを含む反応混合物（陽性対照；レーン２）；０．０５μｌ粗抽出物を含む反応混合物（レーン３）；０．０１μｌ粗抽出物を含む反応混合物（レーン４）；０．００５μｌ粗抽出物を含む反応混合物（レーン５）；０．００１μｌ粗抽出物を含む反応混合物（レーン６）；全くＢｇｌＩＩを含まない反応混合物（陰性対照；レーン７）であった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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