(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式：
0003805360.tif 000012
［式中、Ｒ1およびＲ2は共同で、フェニル部分と縮合する環を形成し、−(ＣＨ2)4−を構成し、Ｒ3は水素であるか；またはＲ1は炭素数１〜４のアルキルであり、Ｒ2およびＲ3は共同で、フェニル部分と縮合する環を形成し、−Ｏ(ＣＨ2)2Ｏ−、−ＮＨ(ＣＨ2)2Ｏ−、−Ｎ＝ＣＨ−ＣＨ＝Ｎ−から成る群から選択する基を構成する。］
で示される化合物または薬学的に許容し得るその塩。
【請求項２】
Ｒ1は、メチル、エチル、n−プロピル、イソプロピルから成る群から選択する基である請求項１記載の化合物。
【請求項３】
Ｒ2およびＲ3が共同で、フェニル環に縮合した環を形成し、Ｒ1のハメットσmeta値は０．４またはそれ以下である請求項１記載の化合物。
【請求項４】
Ｒ1のハメットσmeta値が、０．１５またはそれ以下である請求項３記載の化合物。
【請求項５】
Ｒ1およびＲ2が共同で、−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−を構成する請求項１記載の化合物。
【請求項６】
Ｒ2およびＲ3が共同で、−ＮＨ−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｏ−、−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｏ−、−Ｎ＝ＣＨ−ＣＨ＝Ｎ−から成る群から選択する基を構成し、Ｒ1のσmeta値は０．１５またはそれ以下である請求項１記載の化合物。
【請求項７】
５−メチル−６−Ｎ−(２−イミダゾリル)アミノ−１,４−ベンゾジオキサン；５−メチル−６−Ｎ−(２−イミダゾリル)アミノ−２,３−ジヒドロ−１,４−ベンゾオキサジン；５−メチル−６−Ｎ−(２−イミダゾリル)アミノ−キノキサリンから成る群から選択する請求項１記載の化合物。
【請求項８】
哺乳動物おいてα2Aアドレナリン受容体の選択的刺激を行って処置効果を達成するための医薬組成物であって、式：
0003805360.tif 000013
［式中、Ｒ1およびＲ2は共同で、フェニル部分と縮合する環を形成し、−(ＣＨ2)4−を構成し、Ｒ3は水素であるか；またはＲ1は炭素数１〜４のアルキルであり、Ｒ2およびＲ3は共同で、フェニル部分と縮合する環を形成し、−Ｏ(ＣＨ2)2Ｏ−、−ＮＨ(ＣＨ2)2Ｏ−、−Ｎ＝ＣＨ−ＣＨ＝Ｎ−から成る群から選択する基を構成する。］
で示される化合物もしくはその混合物または薬学的に許容し得るその塩を、処置有効量で含有する組成物。
【請求項９】
Ｒ1は、メチル、エチル、n−プロピル、イソプロピルから成る群から選択する基である請求項８記載の組成物。
【請求項１０】
Ｒ2およびＲ3が共同で、フェニル環に縮合した環を形成し、Ｒ1のハメットσmeta値は０．１５またはそれ以下である請求項８記載の組成物。
【請求項１１】
Ｒ1およびＲ2が共同で、−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−を構成する請求項８記載の組成物。
【請求項１２】
Ｒ2およびＲ3が共同で、−ＮＨ−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｏ−、−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｏ−、−Ｎ＝ＣＨ−ＣＨ＝Ｎ−から成る群から選択する基を構成し、Ｒ1のσmeta値は０．１５またはそれ以下である請求項８記載の組成物。
【請求項１３】
式（Ｉ）で示される化合物は、５−メチル−６−Ｎ−(２−イミダゾリル)アミノ−１,４−ベンゾジオキサン；５−メチル−６−Ｎ−(２−イミダゾリル)アミノ−２,３−ジヒドロ−１,４−ベンゾオキサジン；５−メチル−６−Ｎ−(２−イミダゾリル)アミノ−キノキサリンから成る群から選択する請求項８記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、置換フェニル−２−アミノイミダゾールに関する。とりわけ、本発明は、そのような化合物であって、α2Aアドレナリン受容体に結合し、それを活性化するのに有用であり、末梢痛、高眼圧および高血圧の処置において、麻酔の補助薬として、および鎮静剤として有用である化合物に関する。
発明の背景
薬剤の分野において、フェニル−２−アミノ−イミダゾール誘導体は少数知られている。
ジェン(Jen)ら[ジャーナル・オブ・メディシナール・ケミストリー(J.Med.Chem.)、１８(１)、９０−９９(１９７５)]は、下記化合物を合成し、その抗高血圧活性および胃液分泌抑制活性を試験した。このような化合物は、試験された広範な環式および非環式アミジンの一部であるが、そのような化合物のみが、本発明と共通の特徴を有する。
0003805360.tif 000002
［式中、２つの基Ｒは同じもので、Ｈ、ＣｌまたはＣＨ3である。］
グレンフェルド(Gurenfeld)の米国特許第３４５９７６３号には、種々の置換イミダゾール化合物が開示されている。開示された化合物は主として、一般構造がフェニル−２−アミノ−イミダゾールおよび１−Ｎ−フェニル−２−アミノ−イミダゾールであるレギオ異性体である。いずれの化合物群も、同じ中間体から酸誘導環化によって生成すると考えられる。p−フルオロ類似体(本発明の範囲外である)を試験したところ、それは中程度の降圧活性を有することがわかった。２つのレギオ異性体が混合物として生成し、それを再結晶によって分離するのか、または、ある中間体構造は一方のレギオ異性体を他方よりも選択的に生成するのかは、上記特許明細書からは明らかでない。
アドレナリン受容体の、異なるカテゴリーおよびサブタイプへの分類についての背景を、以下、簡単に説明する。アドレナリン受容体は、１９４８年にアールキスト(Ahlquist)によって、α型およびβ型に初めて分類された。この分類は、薬理学的性質に基づくものである。その後、β−アドレナリン受容体は、更にβ1およびβ2サブタイプに分類された。この分類も、１２の作動剤の相対効力比較による薬理学的定義に基づくものである。α−アドレナリン受容体も、α1およびα2サブタイプに更に分類された。この分類は、最初は、α1受容体(シナプス後)およびα2受容体(シナプス前)の推定存在位置に基づくものであった。しかし、現在では、このような生理学的分類は用いられず、拮抗剤であるヨヒンビンおよびプラゾシンに対する親和性を利用する薬理学に基づくのが、α−アドレナリン受容体分類に最も有用であると一般に認識されている。α1受容体においては、プラゾシンがヨヒンビンよりも強力で、α2受容体においては、ヨヒンビンがプラゾシンよりも強力である。放射リガンド結合試験に基づき、α2−アドレナリン受容体にサブタイプが存在する可能性のあることが、１９８１年にビルンド(Bylund)らによって初めて提案された。この最初の研究は、種々の種から採った種々の組織を用いて行われた。種間の受容体の異質が重要であると考えられるが、「サブタイプ」という用語を、薬理学者は通例、同種内、特に同一組織内において示され得る異質に対して専ら用いる。ビルンドおよび共同研究者らは後に、ヒトおよびラットの脳のある部分は、プラゾシンに対する親和性が３０〜４０倍も異なる２種類のα2−アドレナリン受容体が存在する部位を有することを示した。この知見は、α2受容体の、ＡおよびＢサブタイプへの分類を裏付けるものである。
α2アドレナリン受容体に選択的な当分野でよく知られた化合物例を、次に挙げる：
0003805360.tif 000003
クロニジンは血圧降下剤として臨床的に有用であり、鼻充血除去剤、眼圧降下剤、および麻酔補助剤として試験されている。クロニジンの作用機序は、中枢作用α2アドレナリン部分作動剤としてのものであると文献に記載されている。ブリモニジン(ＵＫ１４３０８)は、より新しい、より親油性のα2アドレナリン作動剤であり、これも、抗高血圧剤、眼圧降下剤、およびα2作動剤が有効な他の症状の処置剤として試験されている。
α2A選択性を有することが報告されている既知のα2選択的作動剤の例を、更に次に挙げる：
0003805360.tif 000004
上記化合物のα2Aアドレナリン受容体活性に関する研究は、次の文献に報告されている：タカノ，ワイ(Takano,Y.)ら、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・ファーマコロジー(Eur.J.Pharmacol.)、２１９(３)、第４６５−６８頁(１９９２)；エンジェル，アイ(Angel,I.)ら、ジャーナル・オブ・ファーマコロジー・アンド・エクスペリメンタル・セラピューティクス(J.Pharmacol.Exp.Ther.)、２５４(３)、第８７７−８２頁(１９９０)；およびヒロセ，エイチ(Hirose,H.)ら、ジャーナル・オブ・ラボラトリー・アンド・クリニカル・メディシン(J.Lab.Clin.Med.)、１２１(１)、第１１−１２頁(１９９３)。これらの研究は、疼痛伝達および高血糖に関してα2A受容体を試験したものである。
本発明において、選択的作動剤とは、その名の通り、ある特定の受容体サブタイプに、他の関連するが異なるサブタイプの受容体よりも優先的に結合し、それを活性化する化合物を意味する。例えば、α2Bまたはα2Cサブタイプ受容体よりも優先的にα2Aサブタイプ受容体に結合し、それを活性化する化合物は、α2A選択的作動剤である。活性化とは、ある受容体を、その受容体によって調節または作動される生化学的反応を開始するよう誘発することを意味する。活性化とは更に、受容体を、その機能を表現するよう誘導することであるとも考えられる。
α2受容体のサブタイプの同定は、そのようなサブタイプの薬理学的および生理学的特徴付けに先行した。しかし、α2A受容体が眼の毛様体において確認されており、それ故、緑内障において調節的メカニズムを有すると仮定される[ジン，ワイ(Jin,Y.)ら、ジェイ・オキュル・ファーマコル(J.Ocul.Pharmacol.)、１０(１)、第３５９−６９頁(１９９４)]。疼痛知覚または疼痛軽減に関しても研究されている[ミラン，エム・ジェイ(Millan,M.J.)、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・ファーマコロジー、２１５(２−３)、第３５５−６頁(１９９２)]。
発明の概要
本発明により、式(Ｉ)で示される化合物(その多くは新規化合物である)は、α2Aアドレナリン受容体の選択的作動剤であることがわかった。
0003805360.tif 000005
このような化合物のα2A選択性は、ベンゼンまたは縮合芳香環上で、式(Ｉ)中の基Ｒ1の位置に存在する置換基によって大きく向上する。この効果について特定の理論を支持するわけではないが、オルト置換基は、ベンゼン環に対するイミダゾール環の「ねじれ」(フェニル環面とイミダゾール環面との成す角度の変化)を誘導すると考えられる。Ｒ1、Ｒ2またはＲ3の置換基が芳香環に電子を供与し得る場合、α2A選択性は更に向上する。式(Ｉ)中、Ｒ1は炭素数１〜４のアルキルもしくはアルケニル、シクロプロピル、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、−ＯＲ4、−ＳＲ4、−ＮＲ4Ｒ4または−Ｓｉ(Ｒ4)3(Ｒ4は炭素数１〜４のアルキルもしくはアルケニル、または水素)であり、Ｒ2およびＲ3は、Ｒ1および水素から成る群から選択する基であるか；またはＲ1およびＲ2は共同で、フェニル部分と縮合する環を形成し、−(ＣＨ2)4−、−ＮＨ(ＣＨ2)2ＮＨ−、−Ｏ(ＣＨ2)2Ｏ−、−ＮＨ(ＣＨ2)2Ｏ−、−Ｓ(ＣＨ2)2Ｓ−、−ＮＨ(ＣＨ2)Ｓ−および−Ｏ(ＣＨ2)2Ｓ−から成る群から選択する基を構成し、Ｒ3はＲ1および水素から成る群から選択する基であるか；またはＲ2およびＲ3は共同で、フェニル部分と縮合する環を形成し、−(ＣＨ2)4−、−ＮＨ(ＣＨ2)2ＮＨ−、−Ｏ(ＣＨ2)2Ｏ−、−ＮＨ(ＣＨ2)2Ｏ−、−Ｓ(ＣＨ2)2Ｓ−、−ＮＨ(ＣＨ2)Ｓ−、−Ｏ(ＣＨ2)2Ｓ−、−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ＝ＣＨ−、−Ｎ＝ＣＨ−ＣＨ＝Ｎ−および−Ｎ＝ＣＨ−Ｎ＝ＣＨ−から成る群から選択する基を構成する。式(Ｉ)で示される化合物は、薬学的に許容し得る塩の形態であってもよい。
前記のＲ1／Ｒ2またはＲ2／Ｒ3を表す非対称原子鎖に関して、端の結合原子はいずれの向きで環に結合してもよい。例えば−ＣＨ＝Ｎ＝ＣＨ＝Ｎ−の場合、最初の炭素原子がベンゼン環のＲ2の位置に結合し、末尾の窒素原子がＲ3の位置に結合していてよく、その逆もまた可能である(末尾の窒素がＲ2に、最初の炭素がＲ3に結合)。
更に、前記化合物は、α2A受容体を介するアドレナリン作動性調節に関連のある症状を処置するのに有用である。処置し得る症状の例は、末梢痛、少なくとも一方の眼における眼圧の降下もしくは維持または緑内障症状、および心臓血管高血圧である。他の医療用途は、鎮静、高血糖の処置、および麻酔剤効果の増強である。
すなわち、本発明は、ヒトまたはそれ以外の哺乳動物においてアドレナリンα2A受容体を選択的に刺激する方法であって、α2Aアドレナリン受容体刺激を要する哺乳動物に、式(Ｉ)で示される化合物もしくはその混合物または薬学的に許容し得るその塩を、処置有効量で投与することを含んで成る方法にも関する。本発明の化合物は、哺乳動物において、１種またはそれ以上の所望の処置効果をもたらすのに有用である。
式(Ｉ)で示される化合物の薬学的に許容し得る塩も、本発明の範囲に包含される。本発明の化合物の薬学的に許容し得る酸付加塩は、薬学的に許容し得る陰イオンを有する無毒性付加塩を形成する酸から形成する塩であり、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硫酸塩、硫酸水素塩、リン酸塩(phosphateまたはacid phosphate)、酢酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、シュウ酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、グルコン酸塩、糖酸塩またはp−トルエンスルホン酸塩である。薬学的に許容し得る塩は、親化合物の活性を保持しており、被投与体および環境に対して有害または不都合な作用を及ぼさないいずれの塩であってもよい。
有機アミン塩は、例えばモノ−、ジ−およびトリ−アルキルアミンまたはエタノールアミンのようなアミンから得られ、特にアンモニウム塩である。カフェイン、トロメタミンなどの分子から塩を生成することもできる。酸付加塩を形成し得るほど十分に塩基性の窒素が存在する場合は、いずれの無機もしくは有機酸またはアルキル化剤(例えばヨウ化メチル)と酸付加塩を形成してもよい。多くの単純な有機酸、例えば一塩基性、二塩基性または三塩基性酸のいずれかを使用することもできる。薬学的に許容し得る塩は、そのような塩(例えばアミン官能基の酸塩)を形成することができる官能基を有するいずれの本発明化合物に対しても合成し得る。
一般的な態様
定義
本発明の化合物はいずれも、式：
0003805360.tif 000006
で示される(２−イミダゾリル)アミノ構造を有する。この基は、環外の窒素を介して、芳香環に結合している。イミダゾール環を持たないアドレナリン作動性化合物も当分野において知られている。式：
0003805360.tif 000007
で示される化合物は、二重結合が他の窒素にシフトし得る互変異性体として存在する。このような化合物の化学的命名は、２−アミノ−イミダゾリン（左）および２−イミノ−イミダゾリジン（右）である。このような互変異性形態はいずれも、イミダゾール環の４−５位に二重結合を持たない。
本発明において「アルキル」とは、直鎖および分枝鎖アルキル基を包含する。「低級アルキル」とは、特記しない限り、炭素数１〜６の直鎖アルキル、および炭素数３〜６の分枝鎖アルキルを包含する。同様に、「アルケニル」および「アルキニル」とは、直鎖および分枝鎖基を包含し、直鎖の場合、炭素数は２〜６で、分枝鎖の場合、炭素数は３〜６である。
発明の詳細な説明
式(Ｉ)で示される本発明の化合物においては、好ましくはＲ1は水素ではなく、より好ましくはＲ1および／またはＲ2および／またはＲ3は、芳香環に電子を供与し得る置換基である。芳香環に電子を供与し得る基は、Ｒ1およびＲ2、またはＲ2およびＲ3の位置でアリール環に縮合した環を包含する。
芳香環、特にベンゼン環上の、１個および複数の原子から成る置換基の電子供与性の経験的尺度は、ハメット値である[ハメット式log(Ｋ／Ｋ°)＝ρσにおけるσ値]。個々の原子のもう一つの評価手段は、電気陰性度である。これは、個々の原子の電子供与または吸引性の尺度であるが、この値は多原子置換基には無く、共有結合内で原子が形成する電子の「吸引(pull)」を評価するものである。ハメットのσ値は、物質の反応性に対する置換基効果の影響を評価するものであり、ベンゼン環の基質基に対してメタおよびパラの置換基について求められている。このような値の表は、有機および物理有機書に記載されている[例えば、ヴォーゲル(Vogel)のハンドブック・オブ・オーガニック・ケミストリー(Handbook of Organic Chemistry)]。多くの場合、このような値は、適当な置換芳香族カルボン酸と不置換芳香族カルボン酸との酸解離定数の比較によって求められる。オルト位置の置換基については、環上の反応中心に置換基が近接していることによる隣接効果の故に、σortho値は信頼性のある測定がいずれの場合も不可能で、それ故、文献に記載されていない。しかし、本発明を定義する目的のために、隣接効果にもかかわらず、σmeta値により、オルト位の置換基の環への電子供与の尺度を提供する。この評価は置換基を有する化合物と不置換(すなわち、「水素置換」)化合物との比較であるので、明らかなように、水素のσ値は０である。出願人は、多原子置換基および環縮合を包含する本発明の範囲を定義するための、芳香環への電子供与について、より良い経験的評価手段を知らない。従って、当分野でよく知られた方法によって求められたσmeta値に基づいて、フェニルおよび縮合芳香環系への置換基の電子供与を評価する。
文献記載のリスト中に示されていないσ値を求めるための実験的方法は、アドバンスド・オーガニック・ケミストリー(Advanced Organic Chemistry)、ジェイ・マーチ(J.March)、マグロー・ヒル・ブック社(McGraw Hill Book Company)、第２５１−２５３頁(１９７７)に説明されている。ハメット式については、ジャフェ(Jaffe)、ケミカル・レヴューズ(Chem.Rev.)、５３、１９１(１９５３)に記載されている。ハメット式のρ値の表は、ウェルズ(Wells)、ケミカル・レヴューズ、６３、１７１−２１８(１９６３)、およびベックム(Bekkum)、ヴェルカーデ(Verkade)およびウェプスター(Wepster)、レクエイル・デス・トラバウクス・ヒミケス・デス・パイス・バス(Recl.Trav.Chim.Pays Bas)、７８、８２１−８２７(１９５９)に示されている。
好ましい本発明の化合物は、σmetaが０．４またはそれ以下の置換基をオルトに有する化合物である。より好ましい化合物は、σmeta値が約０．１５またはそれ以下の電子供与性基(σが負の値である置換基を包含する)をＲ1に有する化合物である。より一層好ましいのは、Ｒ2および／またはＲ3、およびＲ1の位置に、電子供与性基を有する化合物である。Ｒ2およびＲ3の位置でベンゼン環に飽和複素環が縮合し、かつ、σmeta値が約０．１５またはそれ以下の電子供与性基(σが負の値である置換基を包含する)をＲ1に有する化合物が、最も好ましい。
反応式Ｉには、本発明の２−アミノイミダゾール化合物を得るための一般合成経路を示す。Ｒ1、Ｒ2およびＲ3は、式Ｉに関して定義した通りである。適当に置換したアニリン(アミノベンゼン)を、テトラヒドロフラン中で強塩基(例えば水素化カリウム)で処理し、次いでフェニルシアネートと反応させる。得られるＮ−シアノアニリンを、エタノール中、メタンスルホン酸または他のプロトン性酸の存在下に、アミノアセトアルデヒドジエチルアセタールと共に還流して、Ｎ−(２,２−ジエトキシエチル)−Ｎ"−(アニリノ)グアニジンを生成する。そのジエトキシ部分を２０％ＨＣｌ中で加水分解し、次いで、水性塩基(例えばＮａＯＨ)処理によってイミダゾール環を形成するよう環化することによって、ベンゼン環上に種々の置換基を有するＮ−(２−イミダゾリル)アミノベンゼン化合物を生成する。アミノベンゼンの代わりに、６−アミノキノキサリン環のようなアミノ基含有環系を出発物質として、６−(Ｎ−シアノ)アミノキノキサリンのような他の化合物を生成し得る。
0003805360.tif 000008
本発明を、以下の実施例によって更に説明する。実施例は、本発明の特定の実施態様を説明するもので、請求の範囲を制限することを意図するものではない。
実施例１
２−Ｎ−(フェニル)アミノ−１Ｈ−イミダゾール
Ａ．
Ｎ−シアノアニリン
アニリン(５．００g、５３．７ミリモル)を、無水エーテル(２５ml)およびペンタン(２５ml)に溶解し、０℃に冷却した。冷却したアニリン溶液に、臭化シアン(１０．００g、１０５ミリモル)を加え、室温で一晩攪拌した。混合物を濃縮して、スラリー状の生成物を得た。スラリーにエーテルを加え、生じた沈殿を濾過により分解した。濾液を濃縮して、純粋なＮ−シアノアニリン(４．６g、収率７２％)を得た。
Ｂ．
Ｎ−(２,２−ジエトキシエチル)−Ｎ'−(フェニル)グアニジン
上記シアナミド(４．６g、３９ミリモル)を、無水エタノール(１００ml)に溶解した。その溶液に、アミノアセトアルデヒドジエチルアセタール[アルドリッチ(Aldrich)、１５．５g、１１７ミリモル]、およびメタンスルホン酸(アルドリッチ、４．１４g、３９ミリモル)を加えた。出発物質が薄層クロマトグラフィーによって検出されなくなるまで(４８時間)、混合物を加熱還流した。粗反応混合物を、減圧下に濃縮し、フラッシュクロマトグラフィー(シリカ；アンモニアで飽和したメタノール５％／クロロホルム)により精製して、Ｎ−(２,２−ジエトキシエチル)−Ｎ'(フェニル)グアニジン(６．５g、６６％)を粘性油状物として得、これを更に精製することなく、次の工程に使用した。
Ｃ．
２−Ｎ−(フェニル)アミノ−１Ｈ−イミダゾール
前工程のアセタール(１．３g、５．１７ミリモル)を、濃塩酸[マリンクロット(Mallinkcrodt)、３７％、１０ml]および水(１０ml)の溶液に、０℃で１時間にわたって溶解した。６Ｎ水酸化ナトリウムの添加により、溶液を塩基性(ｐＨ＝１４)とし、１５分間攪拌した。得られた溶液を塩化メチレンで抽出し、濃縮し、フラッシュクロマトグラフィー(シリカ；アンモニアで飽和したメタノール５％／クロロホルム)により精製して、２−Ｎ−(フェニル)アミノ−１Ｈ−イミダゾール(３５mg、４．５％)を得た。
実施例２
５−メチル−６−Ｎ−(２−イミダゾリル)アミノキノキサリン(６)
Ａ．
５−メチル−６−(Ｎ−シアノ)アミノキノキサリン(４)
−７８℃で、無水テトラヒドロフラン(２０ml)中の水素化カリウム(３．７０g、９２．２７ミリモル)のスラリーに、ＴＨＦ(６０ml)中の６−アミノ−５−メチルキノキサリン(３)(６．３７g、４０．１２ミリモル)をカニューレから加えた。この混合物を、０℃で１時間攪拌した。気体発生が鎮まった後、フェニルシアネート(５．２５g、４４．１３ミリモル)をシリンジから加えた。混合物を０℃で更に４時間攪拌した。その攪拌溶液に、無水ジエチルエーテル(３０ml)を加え、生じた沈殿を濾取し、Ｈ2Ｏに溶解し、熱濾過し、ＨＣｌ(６Ｎ)でｐＨ６に中和し、生じた沈殿を濾取した。母液にも、沈殿が生じるまでＨＣｌを滴下した。沈殿を濾取し、Ｈ2Ｏに溶解し、熱濾過し、ＨＣｌでｐＨ６に中和し、沈殿を回収して、他の固体と合した。合した固体をジエチルエーテル中で１時間にわたってスラリーとし、濾過した。固体を減圧乾燥し、純粋な化合物４(４．９８g、収率６８％)を得た。
1Ｈ ＮＭＲ(ＤＭＳＯ)：２．５７(ｓ、３Ｈ)、７．６５(ｄ、Ｊ＝９．３Ｈｚ、１Ｈ)、７．９８(ｄ、Ｊ＝３．９Ｈｚ、１Ｈ)、８．８３(ｓ、１Ｈ)、８．９０(ｓ、１Ｈ)、９．９０−１０．１０(ｂｒｓ、１Ｈ)。
13Ｃ ＮＭＲ(ＤＭＳＯ)：１０．４０、１１２．３２、１１９．８０、１２０．３６、１２８．１９、１３７．１０、１３８．９７、１４１．５４、１４３．５９、１４５．１８。
ＩＲ(ＫＢｒ)：３２２０、２２３９、１６１８、１５００cm-1
ＭＳ：Ｃ10Ｈ8Ｎ4(Ｍ+)として正確な質量計算値１８４．０７４８、実測値１８４．０７６２。
Ｂ．
Ｎ−(２,２−ジエトキシエチル)−Ｎ"−[６−(５−メチルキノキサリニル)]グアニジン(５)
還流冷却器およびドリーライト(Drierite、商標)乾燥カラムを取り付けた二口丸底フラスコ内の、無水エタノール(１２０ml)中の化合物４(１．４３g、７．７６ミリモル)のスラリーに、アミノアセトアルデヒドジエチルアセタール(４．１３g、３１．０３ミリモル)、およびメタンスルホン酸(アルドリッチ、０．７５g、７．７６ミリモル)を加えた。出発物質が薄層クロマトグラフィーによって検出されなくなるまで(４８時間)、混合物を加熱還流した。粗反応混合物を減圧下に濃縮し、フラッシュクロマトグラフィー(シリカ；アンモニアで飽和したメタノール１０％／クロロホルム)により精製して、化合物５を薄色泡状物として得、これを更に精製することなく、次の工程に使用した。
1Ｈ ＮＭＲ(ＣＤＣｌ3)：１．２１(ｔ、Ｊ＝７．０Ｈｚ、６Ｈ)、２．５５(ｓ、３Ｈ)、３．４３(ｄ、Ｊ＝５．５Ｈｚ、２Ｈ)、３．５２−３．６４(ｍ、２Ｈ)、３．６５−３．８０(ｍ、２Ｈ)、４．６１(ｔ、Ｊ＝５．５Ｈｚ、１Ｈ)、４．９０−５．２０(ｂｒｓ、３Ｈ)、７．３７(ｄ、Ｊ＝８．８Ｈｚ、１Ｈ)、７．７２(ｄ、Ｊ＝８．８Ｈｚ、１Ｈ)、８．５５(ｄ、Ｊ＝１．８Ｈｚ、１Ｈ)、８．６５(ｄ、Ｊ＝１．８Ｈｚ、１Ｈ)。
ＭＳ：Ｃ14Ｈ18Ｎ5Ｏ2(Ｍ+・−Ｃ2Ｈ5+)として正確な質量計算値２８８．１４６０、実測値２８８．１４５８。
Ｃ．
５−メチル−６−Ｎ−(２−イミダゾリル)アミノキノキサリン(６)
アセタール(化合物５)を、濃ＨＣｌ(マリンクロット、３７％、１５ml)および水(１５ml)の溶液に、０℃で溶解した。場合によっては、ＨＣｌ添加直後に無色沈殿が生成することがあり、これを濾去し得る。得られた溶液を、周囲温度に昇温しながら１時間攪拌した。６Ｎ水酸化ナトリウムの添加により、溶液を塩基性(ｐＨ＝１４)とし、１５分間攪拌した。次いで、１Ｎ−ＨＣｌの添加により、中性ｐＨに戻した。黄色沈殿を濾取し、アンモニアで飽和したＭｅＯＨ５％／ＣＨＣｌ3を用いてシリカで濾過して、純粋な生成物を得た。母液を凍結乾燥し、母液中に残留した生成物をメタノールで抽出し、ＮａＣｌを濾去した。この粗生成物も、前記と同様にシリカで濾過し、純物質を合して、純粋な化合物６(１．４６g、６．４９ミリモル)を得た。２工程を経た収率は、７９％であった。
元素分析：Ｃ12Ｈ11Ｎ5として：
計算値  Ｈ４．９２  Ｃ６３．９８  Ｎ３１．０９
実測値  Ｈ４．８３  Ｃ６３．７４  Ｎ３０．９５
1Ｈ ＮＭＲ(ＤＭＳＯ)：２．６２(ｓ、３Ｈ)、６．７０−６．９０(ｂｒｓ、２Ｈ)、７．８１(ｄ、Ｊ＝９．３Ｈｚ、１Ｈ)、８．３０(ｓ、１Ｈ)、８．４４(ｄ、Ｊ＝９．３Ｈｚ、１Ｈ)、８．６６(ｄ、Ｊ＝１．８Ｈｚ、１Ｈ)、８．８０(ｄ、Ｊ＝１．８Ｈｚ、１Ｈ)、１１．０(ｂｒｓ、１Ｈ)。
実施例３
５−ブロモ−６−Ｎ−(２−イミダゾリル)アミノキノキサリン
Ａ．
５−ブロモ−６−(Ｎ−シアノ)アミノキノキサリン・ナトリウム塩
周囲温度で、無水テトラヒドロフラン(１５０ml)中の６−アミノ−５−ブロモキノキサリン(６．６１g、２９．４ミリモル)の溶液に、水素化ナトリウム(アルドリッチ、油中６０％懸濁液、１．７７g、７３．５ミリモル)を少しずつ加えた。気体発生が鎮まり始めたら、混合物を攪拌しながら９０分間加熱還流した。反応混合物を周囲温度に冷却し、フェニルシアネートをシリンジから加えた。この混合物を更に２時間還流した後、元の体積の５０％まで濃縮した。生じた沈殿を濾取し、ジエチルエーテルで濯ぎ、減圧乾燥して、５−ブロモ−６−(Ｎ−シアノ)アミノキノキサリン・ナトリウム塩(６．６０g、収率８３％)を黄緑色固体として得た。
1Ｈ ＮＭＲ(ＤＭＳＯ)：７．５７(ｄ、Ｊ＝９．１Ｈｚ、１Ｈ)、７．６４(ｄ、Ｊ＝９．１Ｈｚ、１Ｈ)、８．３６(ｄ、Ｊ＝２．０Ｈｚ、１Ｈ)、８．６３(ｄ、Ｊ＝２．０Ｈｚ、１Ｈ)。
ＭＳ：Ｃ9Ｈ5ＢｒＮ4(Ｍ+)として正確な質量計算値２４７．９６９７、実測値２４７．９７００。
Ｂ．
Ｎ−(２,２−ジエトキシエチル)−Ｎ'−[６−(５−ブロモキノキサリニル)]グアニジン
還流冷却器およびドリーライト乾燥カラムを取り付けた二口丸底フラスコ内の、無水エタノール(２５ml)中の５−ブロモ−６−(Ｎ−シアノ)アミノキノキサリン・ナトリウム塩(０．２６g、０．９４ミリモル)の溶液に、アミノアセトアルデヒドジエチルアセタール(アルドリッチ、０．１９g、１．３９ミリモル)、次いでメタンスルホン酸(アルドリッチ、０．１１g、１．１３ミリモル)を加えた。出発物質が薄層クロマトグラフィーによって検出されなくなるまで(２４時間)、混合物を加熱還流した。粗反応混合物を、減圧下に濃縮し、酢酸エチルに溶解し、飽和炭酸水素ナトリウム、水および塩水で洗った。有機相を濾過し、再度濃縮して褐色油状物を得、これをフラッシュクロマトグラフィー(シリカ；テトラヒドロフラン４０％／酢酸エチル)により精製して、Ｎ−(２,２−ジエトキシエチル)−Ｎ'−[６−(５−ブロモキノキサリニル)]グアニジン(０．２７g、０．７０ミリモル、収率７４％)を得た。少量の不純物が生成物と共に溶出したが、以後の反応を妨害しなかった。
1Ｈ ＮＭＲ(ＣＤＣｌ3)：１．２３(ｔ、Ｊ＝７．０Ｈｚ、６Ｈ)、３．４６(ｄ、Ｊ＝５．０Ｈｚ、２Ｈ)、３．５５−３．７０(ｍ、２Ｈ)、３．７１−３．８３(ｍ、２Ｈ)、４．７０(ｔ、Ｊ＝５．０Ｈｚ、１Ｈ)、４．９０(ｂｒｓ、１Ｈ)、５．２５(ｂｒｓ、２Ｈ)、７．４６(ｄ、Ｊ＝９．０Ｈｚ、１Ｈ)、７．８０(ｄ、Ｊ＝９．０Ｈｚ、１Ｈ)、８．６０(ｄ、Ｊ＝１．９Ｈｚ、１Ｈ)、８．７６(ｄ、Ｊ＝１．９Ｈｚ、１Ｈ)。
ＭＳ：Ｃ13Ｈ15ＢｒＮ5Ｏ2(Ｍ+・−Ｃ2Ｈ5+)として正確な質量計算値３５２．０４０９、実測値３５２．０４０１。
Ｃ．
５−ブロモ−６−Ｎ−(２−イミダゾリル)−アミノキノキサリン
実施例６の化合物(３．１０g、８．１４ミリモル)を、濃塩酸(３７％、１５ml)および水(１５ml)の溶液に、０℃で溶解した。得られた溶液を周囲温度に昇温しながら、２時間攪拌した。次いで、２Ｎ水酸化ナトリウムの添加により、溶液を塩基性(ｐＨ＝１３)とし、１０分間攪拌した。次いで、１Ｎ塩酸の添加により、中性ｐＨに戻した。黄緑色の粗生成物を濾取し、母液を凍結乾燥した。母液中に残留した粗生成物をメタノールで抽出し、塩化ナトリウムを濾去した。粗生成物を合し、メタノールを用いてシリカに吸着した後、フラッシュクロマトグラフィー(シリカ；メタノール１０％／クロロホルム)に付して、純粋な５−ブロモ−６−Ｎ−(２−イミダゾリル)アミノキノキサリン(１．８６g、６．４１ミリモル、収率７９％)を得た。
1Ｈ ＮＭＲ(ＤＭＳＯ)：６．６５−６．７０(ｂｒｓ、２Ｈ)、７．９９(ｄ、Ｊ＝９．３Ｈｚ、１Ｈ)、８．６２(ｓ、１Ｈ)、８．７３(ｄ、Ｊ＝９．３Ｈｚ、１Ｈ)、８．７４(ｄ、Ｊ＝１．９Ｈｚ、１Ｈ)、８．８９(ｄ、Ｊ＝１．９Ｈｚ、１Ｈ)、１１．２９(ｂｒｓ、１Ｈ)。
元素分析：Ｃ11Ｈ8ＢｒＮ5として：
計算値  Ｈ２．７８  Ｃ４５．５４  Ｎ２４．１４
実測値  Ｈ２．８２  Ｃ４５．７３  Ｎ２３．９０
0003805360.tif 000009
試薬：a)Ｂｒ−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｂｒ、ＮａＩ(５モル％)、アセトン；b)ＣＨ3Ｃ(Ｏ)ＯＣ(Ｏ)ＣＨ3、ＰＰＡ；c)ＮａＣｌＯ；d)ＥｔＯ2ＣＣｌ、ジイソプロピルエチルアミン；e)ＮａＮ3；f)ベンジルアルコール、Δ；g)Ｈ2、Ｐｄ−Ｃ；h)Ｎ,Ｎ−２,２−(ジエトキシ)−エチルカルボジイミド、ＣＨ3ＳＯ3Ｈ；i)ＨＣｌ、Ｈ2Ｏ
実施例４には、反応式IIに示す５−メチル−６−Ｎ−(２−イミダゾリル)−アミノ−１,４−ベンゾジオキサン合成の実験を詳細に説明する。
実施例４
５−メチル−６−Ｎ−(２−イミダゾリル)−アミノ−１,４−ベンゾジオキサン
Ａ．
５−メチル−１,４−ベンゾジオキサン
アルゴン雰囲気中、モートン(Morton)フラスコ内で、アセトン中の、３−メチルカテコール(１２．４g、１００ミリモル、アルドリッチ)、１,２−ジブロモエタン(９．５ml、１１０ミリモル、アルドリッチ)および炭酸カリウム(３４．６g、０．２５モル)の混合物を、機械的に攪拌しながら一晩加熱還流した。出発物質が存在したので、ヨウ化ナトリウム(０．７５g、５．０ミリモル)を加えた。混合物を更に４８時間加熱した後、黒色スラリーを水に注ぎ、エーテルで３回抽出した。エーテル相を５％チオ硫酸ナトリウムで１回洗い、ＭｇＳＯ4で乾燥し、厚さ１インチ、幅１／２インチのシリカパッドに通し(エーテルでよく洗浄)、濃縮し、蒸留[球管(Kugelrohr)、８０℃、０．０５mmＨｇ]して、黄金色油状物(１０．５g)を得た。この油状物は、ＮＭＲによると、少量の不純物を含んでいた。フラッシュクロマトグラフィー(２インチ×８インチカラム中、ＳｉＯ2４００ml；酢酸エチル５％／ヘキサンで溶離)に付して、純粋な生成物(９．０g)を得た。
Ｂ．
５−メチル−６−アセチル−１,４−ベンゾジオキサン
窒素雰囲気中、５５〜６２℃の加熱浴内で、ベンゾジオキサン(Ａ)(６０ミリモル、９．０g)および無水酢酸(６０ミリモル、６．１３g、アルドリッチ)の混合物を、機械的に攪拌しながら、ポリリン酸(７６．４g)で９０分間処理した。反応混合物を冷却し、水(１００ml)を加えて反応を停止した。反応混合物を水に注ぎ、エーテルで３回抽出した。合したエーテルフラクションを、飽和ＮａＨＣＯ3溶液で２回、および飽和ＮａＣｌ溶液で１回洗い、ＭｇＳＯ4で乾燥し、濃縮して、油状の半固形物を得た。クロマトグラフィー(２インチ×６インチカラム中、ＳｉＯ2；酢酸エチル１０％／ヘキサンで溶離)に付して、結晶固体(４．０g)、純粋な油状物(１．５g)、および油状混合物(２g)を得た。１Ｈ−ＮＭＲによると、結晶フラクションが所望の生成物であった。Ｘ線結晶学的にも、このことを確認した。
Ｃ．
５−メチル−６−カルボキシ−１,４−ベンゾジオキサン
次亜塩素酸ナトリウムを新たに調製するために、水(５０ml)中のＣａ(ＣｌＯ)2(８０ミリモル、１１．４３g)を、水(２５ml)中のＮａ2ＣＯ3(７６ミリモル、８．０５g)およびＮａＯＨ(２４ミリモル、０．９６g)で処理した。それを混合しながら加熱し、次いで濾過することによって得た溶液に、固体アセトフェノン(前記工程Ａ)(２０ミリモル、３．８４g)を加えた。この混合物を、加熱浴内で、６０℃に一晩加熱した。その水性物質を分液漏斗に入れ、ジクロロメタンで２回洗った。次いで、その物質をエルレンマイヤーフラスコに移し、溶液がｐＨ３となるまで濃ＨＣｌを滴下した。固体を濾取し、水でよく洗った。そのＮＭＲデータは、所望の生成物のものと一致した。
Ｄ．
５−メチル−６−Ｎ−(２−イミダゾリル)−アミノ−１,４−ベンゾジオキサン
ジイソプロピルエチルアミン(２５ミリモル、４．３５ml)と、前工程による酸(２０ミリモル、３．９５g)との、アセトン中の混合物に、クロロギ酸エチル(２１ミリモル、２．０１ml)を、氷浴内で１０分間にわたって滴下した。０℃で３０分後、ＮａＮ3(４０ミリモル、２．６g、ＡＣＳ試薬)の水溶液を、１０分間にわたって滴下した。０℃で４５分後、反応混合物を氷水に注ぎ、ジクロロメタンで３回洗った。その溶液をＮａ2ＳＯ4で乾燥し、濃縮して油状物を得た。その油状物をトルエンおよびベンジルアルコール中で２時間加熱還流した。反応混合物を再度油状物に濃縮することにより、５−メチルベンゾジオキサンの６−ベンジルウレタンを得た。このウレタンを、ＴＨＦで１０％Ｐｄ／炭(２００mg)および水素ガスで処理することによって、アミンを遊離させた。
この遊離アミン(Ｄ)を用いて、前記実施例３の工程Ａ、ＢおよびＣと同様にして、標記生成物を合成した。
1Ｈ ＮＭＲ(ＤＭＳＯ)：２．００(ｓ、３Ｈ)、４．１２−４．２３(ｄｄ、４Ｈ、Ｊ＝７．１４Ｈｚ、２５．８Ｈｚ)、６．５５(ｄ、１Ｈ、Ｊ＝１１．４８Ｈｚ)、６．６(ｓ、２Ｈ)、７．１４(ｄ、１Ｈ、Ｊ＝８．７９Ｈｚ)、７．４５(ｓ、１Ｈ)、１０．４−１０．６(ｓ、１Ｈ)。
13Ｃ ＮＭＲ(ＤＭＳＯ)：９．７３、６３．５２、６４．３６、１１０．８３、１１３．６９、１１４．５６、１３４．８２、１３７．６３、１４１．２４、１４６．４８
ＭＳ：ＨＲＭＳ：Ｃ12Ｈ13Ｎ3Ｏ2(Ｍ+)として正確な質量計算値２３１．１００７、実測値２３１．１００８
元素分析：Ｃ12Ｈ13Ｎ3Ｏ2として：
計算値  Ｈ５．６７  Ｃ６２．３２  Ｎ１８．１７
実測値  Ｈ５．５７  Ｃ６２．１１  Ｎ１８．０８
実施例５
実験的アッセイ：結合親和性および受容体活性化
受容体結合アッセイ
Ａ．
組織の調製：ＵＣＩオーガン・アンド・ティシュ・バンク(ＵＣＩ  Organ and Tissue Bank)から入手したヒト大脳皮質(ＨＣＣ、α1受容体アッセイ用)から、膜懸濁液を調製した。すなわち、ポリトロン(Polytron)ホモジナイザーを用いてセッティング＃７で、氷冷５ｍＭトリス、ｐＨ７．４(２５ml)中で組織(１g)を３０秒間ホモジナイズし、４℃で３００×gで１０〜１２分間遠心した。上清を、２重ガーゼで濾過し、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．４で１:２に希釈し、４９０００×gで２０分間遠心した。ペレットフラクションを３回洗った(トリス−ＨＣｌ緩衝液に再懸濁し、４９０００×gで２０分間遠心)。次いで、ペレットを、結合アッセイを行うまで−８０℃で保存した。
細胞の調製：ヒトα2Aおよびヒトα2C受容体を発現するチャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞(それぞれ、ＣＨＯ−Ｃ１０およびＣＨＯ−Ｃ４)、並びにラットα2Bアドレナリン受容体を発現するＣＨＯ細胞(ＣＨＯ−ＲＮＧ)を、１０％ウシ胎児血清を補充したダルベッコ改変イーグル培地中で、通常の細胞培養法により、ほぼコンフルエントになるまで培養した。細胞を掻き採って、冷緩衝液(５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４)に入れた。次いで、ポリトロン・ホモジナイザーを用いてセッティング＃７で、細胞を２×１０秒間ホモジナイズし、４９０００×gで２０分間遠心した。ペレットフラクションを２回洗い[トリス−ＨＣｌ緩衝液(ｐＨ８)に再懸濁し、４９０００×gで１５〜２０分間遠心]、結合アッセイを行うまで−１００℃で保存した。
結合試験：ニュー・イングランド・ヌクレアー(New England Nuclear；マサチューセッツ州ボストン)から、放射リガンドの[3Ｈ]ラウオルシン(比活性８０Ｃｉ／ミリモル)および[3Ｈ]プラゾシン(比活性７６Ｃｉ／ミリモル)を入手した。冷凍膜ペレットを、２５ｍＭグリシン／グリシン、ｐＨ７．５に再懸濁し、下記条件下に放射リガンドとインキュベートした：ＣＨＯ−Ｃ１０、ＣＨＯ−ＲＮＧ、ＣＨＯ−Ｃ４−[3Ｈ]ラウオルシン、２２℃、３０分間；ＲＫＣ−[3Ｈ]ラウオルシン、０℃、１２０分間；およびＨＣＣ−[3Ｈ]プラゾシン、２２℃、３０分間；最終体積５００μｌ。インキュベーション時間の終了時に、サンプルを９６ウェル細胞ハーベスター内で、ガラスフィルター[ワットマン(Whatmann)ＧＦ／Ｂ]で濾過し、氷冷５０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液４mlで４回、手早く洗った。次いで、フィルターをオーブンで乾燥し、カウントのために、ベックマン(Beckman)のレディ・プロテイン(Ready Protein、商標)シンチレーションカクテル１０mlを入れたシンチレーションバイアルに移した。競合アッセイのために１０μＭフェントラミンにより測定した特異的結合は、次の通りであった：２．４ｎＭ[3Ｈ]ブリモニジン−ＲｂＩＣＢ  ６２％；２．４ｎＭ[3Ｈ]ラウオルシン−ＲｂＩＣＢ  ７５％；２ｎＭ[3Ｈ]ラウオルシン−ＲｂＫｃ  ８８％；０．３ｎＭ[3Ｈ]ラウオルシン−ＣＨＯ−Ｃ１０  ９９％；０．４ｎＭ[3Ｈ]ラウオルシン−ＣＨＯ−ＲＮＧ  ９９％；０．３ｎＭ[3Ｈ]プラゾシン  ８７％；および１ｎＭ[3Ｈ]ラウオルシン−ＣＨＯ−Ｃ４  ９０％。バイオ・ラド(Bio Rad)から入手したタンパク質アッセイキットを用いて、タンパク質濃度を測定した。結合等温式、平衡解離および親和定数を、非線形最小二乗曲線フィッティングプログラムである、ＥＢＰＡ[バイオソフト(BioSoft)、またはベックマンのアキュフィット・コンペティション／サチュレーション(AccuFit Competition／Saturation)によって、分析および測定した。
Ｂ．
細胞の調製：ヒトα2A(ＣＨＯ−Ｃ１０)およびラットα2B(ＣＨＯ−ＲＮＧ)ヒトα2Ａアドレナリン受容体を発現するチャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞を、１０％ウシ胎児血清を補充したダルベッコ改変イーグル培地中で、通常の細胞培養法により、ほぼコンフルエントになるまで培養した。細胞を掻き採って、冷緩衝液(５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４)に入れた。次いで、ポリトロン・ホモジナイザーを用いてセッティング＃７で、細胞を２×１０秒間ホモジナイズし、４９０００×gで２０分間遠心した。ペレットフラクションを２回洗い[トリス−ＨＣｌ緩衝液(ｐＨ８)に再懸濁し、４９０００×gで１５〜２０分間遠心]、結合アッセイを行うまで−１００℃で保存した。
結合試験：Ｋｉの測定
ニュー・イングランド・ヌクレアー(マサチューセッツ州ボストン)から、放射リガンドの[3Ｈ]ラウオルシン(比活性８０Ｃｉ／ミリモル)および[3Ｈ]プラゾシン(比活性７６Ｃｉ／ミリモル)を入手した。冷凍膜ペレットを、２５ｍＭグリシン／グリシン、ｐＨ７．４に再懸濁し、下記条件下に放射リガンドとインキュベートした：ＣＨＯ−Ｃ１０、ＣＨＯ−ＲＮＧ、ＣＨＯ−Ｃ４−[3Ｈ]ラウオルシン、２２℃、３０分間；およびＨＣＣ−[3Ｈ]プラゾシン、２２℃、３０分間；最終体積５００μｌ。インキュベーション時間の終了時に、サンプルを９６ウェル細胞ハーベスター内で、ガラス繊維フィルター(ワットマンＧＦ／Ｂ)で濾過し、氷冷５０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液４mlで４回、手早く洗った。次いで、フィルターをオーブンで乾燥し、カウントのために、ベックマンのレディ・プロテイン・シンチレーションカクテル５mlを入れたシンチレーションバイアルに移した。競合アッセイのために１０μＭフェントラミンにより測定した特異的結合は、次の通りであった：０．３ｎＭ[3Ｈ]ラウオルシン−ＣＨＯ−Ｃ１０  ９９％；０．４ｎＭ[3Ｈ]ラウオルシン−ＣＨＯ−ＲＮＧ  ９９％；および０．３ｎＭ[3Ｈ]プラゾシン−ＨＣＣ  ８７％。バイオ・ラドから入手したタンパク質アッセイキットを用いて、タンパク質濃度を測定した。結合等温式、平衡解離および親和定数を、非線形最小二乗曲線フィッティングプログラムである、ベックマンのアキュフィット・コンペティション／サチュレーションによって、分析および測定した。
作用試験
精管：白ウサギから採った精管(２〜３cm)の前立腺端を、下記組成(ｍＭ)のクレブス−ベンゼレイト溶液の入った９ml臓器浴中の白金電極間に取り付ける：ＮａＣｌ(１１９)；ＫＣｌ(４．７)；ＭｇＳＯ4(１．５)；ＫＨ2ＰＯ4(１．２)；ＣａＣｌ2(２．５)；ＮａＨＣＯ3(２５)；グルコース(１１)。この溶液を３５℃に保ち、９５％Ｏ2および５％ＣＯ2を通した。この組織を、張力０．５gで３０分間平衡化した。次いで、四角波スティミュレーター[ワールド・フレシジョン・インスツルメンツＡ３１０アキュパルサー／Ａ３８５スティミュラス・アイソレーター(World Precision Instruments Ａ３１０  Accupulser／Ａ３８５  Stimulus Isolater)]を用いて、０．１Ｈｚ、２ms、９０ｍＡで、またはグラス(Grass)Ｓ４８スティミュレーターを用いて、０．１Ｈｚ、２ms、７０ボルトで、精管片をフィールド刺激した。３０分間電気刺激後、各濃度４分間の接触時間で、０．２５log単位の累積濃度−応答曲線を得た。各組織は、１種の薬物の試験にのみ使用した。フィールド刺激による組織の収縮を、グラスＦＴ−．０３フォース−ディスプレイスメント(force−displacement)トランスジューサーを用いて等尺性に測定し、グラス・モデル７Ｄフィジオグラフ(physiograph)に記録した。電気刺激によるピーク高の、薬物による低下を測定し、薬物使用前のピーク高に対する割合で表した。ピーク高を５０％低下する濃度として、ＩＣ50を求めた。
上記方法に従って、本発明の化合物例を試験した。試験結果を下記表に示す。受容体結合試験およびＫlは、特定の受容体への化合物の親和性の尺度である。精管アッセイは、化合物がα2A受容体に結合した場合の、該受容体活性化の程度を評価するものである。ウサギ精管は、α2A受容体サブタイプを主に有することがわかった。
0003805360.tif 000010
0003805360.tif 000011
当業者は本発明の範囲を外れることなく、本発明の前記化合物、その製法に変更を加えることができ、記載の製法を実施例範囲外の多くの化合物に適用することができる。すなわち、以下の請求の範囲は本発明の開示に照らして理解されるので、本発明の範囲は請求の範囲によってのみ解釈すべきである。