(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
吸水性基材の表面上の任意の領域に設けた固定相に固定化された、検査対象物と特異的に結合し得る第一の免疫化学的成分と、検査対象物と特異的に結合し得る第二の免疫化学的成分および検査対象物とは結合しない第三の免疫化学的成分に標識物質が結合してなる標識体（第一標識体）とで、被検試料中の検査対象物をサンドイッチした免疫複合体を該固定相上に形成させて、固定相上の標識物質のシグナルを測定する免疫学的検査方法であって、該第三の免疫化学的成分と介在物質を介して特異的に結合し得る第四の免疫化学的成分に標識物質が結合してなる標識体（第二標識体）が、該介在物質を介して上記サンドイッチ型免疫複合体中の第三の免疫化学的成分に結合した免疫複合体を形成させて標識物質のシグナルを増幅することを特徴とする方法。
【請求項２】
該吸水性基材の一端と固定相との間に、第一および第二標識体の少なくとも１つが、水との接触によって脱離し得る形態で保持される標識相が設けられていることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
該吸水性基材の一端と固定相との間に、第二標識体が水との接触によって脱離し得る形態で保持される標識相が設けられている請求項２記載の方法であって、且つ以下の工程を含むことを特徴とする方法：
(1) 該吸水性基材の該一端から、被検試料を含有する液、第一標識体を含有する液および該介在物質を含有する液の混合物を展開し、
(2) 該吸水性基材上で形成される検査対象物、第一標識体、介在物質および第二標識体からなる免疫複合体を固定相に固定化された第一の免疫化学的成分に結合させて捕捉した後、
(3) 該固定相上の標識物質のシグナルを測定することにより該検査対象物を検出する。
【請求項４】
該吸水性基材の一端と固定相との間に、第二標識体が水との接触によって脱離し得る形態で保持される標識相が設けられている請求項２記載の方法であって、且つ以下の工程を含むことを特徴とする方法：
(1) 該吸水性基材の該一端と固定相との間の任意の領域に被検試料を供給し、  (2) 該吸水性基材の該一端から、第一標識体を含有する液と該介在物質を含有する液との混合物を展開し、
(3) 該吸水性基材上で形成される検査対象物、第一標識体、介在物質および第二標識体からなる免疫複合体を固定相に固定化された第一の免疫化学的成分に結合させて捕捉した後、
(4) 該固定相上の標識物質のシグナルを測定することにより該検査対象物を検出する。
【請求項５】
該吸水性基材の該一端と該固定相との間の任意の領域（但し、被検試料を該吸水性基材の該一端と固定相との間の任意の領域に供給する場合は、その領域を含めてそれより固定相側の領域）に、検査対象物と被検試料中の他の物質とを分離し得る分離相がさらに設けられていることを特徴とする請求項３または４記載の方法。
【請求項６】
該分離相が、該吸水性基材の該一端と標識相との間の任意の領域に存在する請求項５記載の方法。
【請求項７】
該介在物質が抗原抗体反応により第三および第四の免疫化学的成分と特異的に結合する物質である請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
該標識物質が着色粒子である請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
該着色粒子が着色されたラテックス粒子または金コロイド粒子である請求項８記載の方法。
【請求項１０】
検査対象物と特異的に結合し得る第一の免疫化学的成分を固定化した固定相を表面上の任意の領域に設けた吸水性基材、検査対象物と特異的に結合し得る第二の免疫化学的成分および検査対象物とは結合しない第三の免疫化学的成分に標識物質が結合してなる標識体（第一標識体）、該第三の免疫化学的成分と介在物質を介して特異的に結合し得る第四の免疫化学的成分に標識物質が結合してなる標識体（第二標識体）、並びに第三および第四の免疫化学的成分の結合を仲介する介在物質を含む免疫学的検査キット。
【請求項１１】
該吸水性基材の一端と固定相との間に、第一および第二標識体の少なくとも１つが、水との接触によって脱離し得る形態で保持される標識相が設けられていることを特徴とする請求項１０記載のキット。
【請求項１２】
該吸水性基材の一端と固定相との間に、第二標識体が水との接触によって脱離し得る形態で保持される標識相が設けられている請求項１１記載のキットであって、且つ以下の（ａ）および（ｂ）の免疫学的検査方法に使用され得ることを特徴とするキット：
方法（ａ）
(1) 該吸水性基材の該一端から、被検試料を含有する液、第一標識体を含有する液および該介在物質を含有する液の混合物を展開し、
(2) 該吸水性基材上で形成される検査対象物、第一標識体、介在物質および第二標識体からなる免疫複合体を固定相に固定化された第一の免疫化学的成分に結合させて捕捉した後、
(3) 該固定相上の標識物質のシグナルを測定することにより該検査対象物を検出する。
方法（ｂ）
(1) 該吸水性基材の該一端と固定相との間の任意の領域に被検試料を供給し、  (2) 該吸水性基材の該一端から、第一標識体を含有する液と、該介在物質を含有する液との混合物を展開し、
(3) 該吸水性基材上で形成される検査対象物、第一標識体、介在物質および第二標識体からなる免疫複合体を固定相に固定化された第一の免疫化学的成分に結合させて捕捉した後、
(4) 該固定相上の標識物質のシグナルを測定することにより該検査対象物を検出する。
【請求項１３】
該吸水性基材の該一端と固定相との間の任意の領域（但し、被検試料を該吸水性基材の該一端と固定相との間の任意の領域に供給する場合は、その領域を含めてそれより固定相側の領域）に、検査対象物と被検試料中の他の物質とを分離し得る分離相がさらに設けられていることを特徴とする請求項１２記載のキット。
【請求項１４】
該分離相が、該吸水性基材の該一端と標識相との間の任意の領域に存在する請求項１３記載のキット。
【請求項１５】
該介在物質が抗原抗体反応により第三および第四の免疫化学的成分と特異的に結合する物質である請求項１０〜１４のいずれかに記載のキット。
【請求項１６】
該標識物質が着色粒子である請求項１０〜１５のいずれかに記載のキット。
【請求項１７】
該着色粒子が着色されたラテックス粒子または金コロイド粒子である請求項１６記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、簡便、迅速に且つ高精度、高感度で被検試料中の検査対象物の検出を行い得る免疫学的検査方法およびそのためのキットに関する。より詳細には、本発明は検出シグナルを増幅させる工程を含む免疫クロマトグラフ法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
生体試料等の免疫学的分析法において、迅速且つ簡便にその検査を行う方法として免疫クロマトグラフ法が挙げられる。この方法は、一般に以下のような工程を含む。すなわち、検査対象物と特異的に結合し得る抗体を固定化した固定相を有する吸水性基材からなる検査片の一端より、該検査対象物に特異的に結合し得る標識された抗体と被検液との混合物を吸収させて展開すると、該混合物中で形成された標識抗体−検査対象物複合体は固定化された抗体と結合して固定相上に捕捉される。したがって、該固定相に結合した標識抗体を測定することにより被検液中の検査対象物を測定することができる。
【０００３】
また、上記免疫クロマトグラフ法の検出シグナルをより高感度で得るための方法として、特開平１０−０６２４１９号において、二種の標識抗体を用いる方法が開示されている。つまり、検査対象物と特異的に結合し得る抗体を標識した第一標識抗体と、該抗体に特異的に結合し得る二次抗体を標識した第二標識抗体とを、検査片中の被検試料滴下部と固定相（該検査対象物と特異的に結合し得る別の抗体が固定化されている）の間に標識相としてそれぞれ設置した（吸収させた）構成である。試料中の検査対象物は、第一標識抗体と複合体を形成した後、さらに第二標識抗体が第一標識抗体に結合して（被検物−第一標識抗体−第二標識抗体）の複合体を形成する。該免疫複合体は固定相上に固定化された抗体により捕捉される。したがって、固定相上で第二標識抗体により増幅させたシグナルが検出される。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上記のシグナル増幅免疫クロマトグラフ法によってもまだ十分な検出感度が得られていないのが現状である。さらに、被検試料が糞便、尿、血液等の場合、前処理として試料を適当な緩衝液に懸濁する工程、および／または被検試料中の夾雑物質を分離除去する部分精製工程等の付加的な操作が必要となり、迅速性に欠けるといった問題点もある。したがって、本発明の目的は、免疫クロマトグラフ法に関し、より迅速に、且つ高感度で検査対象物を検出することが可能な免疫学的検査方法およびそのためのキットを提供することである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記の目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、検査対象物と特異的に結合する第二の抗体とともに検査対象物とは結合しない抗体を標識物質に結合して第一標識体とし、さらにこの検査対象物とは結合しない抗体と介在物質を介して特異的に結合し得る免疫化学的成分（具体的には、例えば、検査対象物とは結合しない抗体により認識される抗原を介して結合する、該抗原を認識する抗体）に標識物質を結合して第二標識体とし、これらを用いて免疫クロマトグラフ法を行い、吸水性基材の固定相上において、（固定化された抗体−検査対象物−第一標識体−介在物質−第二標識体）の免疫複合体を形成させることにより、固定相上での検出シグナルが従来よりも効率よく増幅され、より高感度に検査対象物を検出できることを見出した。特に、吸水性基材の被検試料滴下部と固定相との間に、第二標識体を水との接触によって脱離可能な形態で保持した標識相を設け、この吸水性基材に被検試料、第一標識体および該介在物質を展開して免疫クロマトグラフ法を行うことにより、迅速且つ高感度に検査対象物を検出することに成功した。また、被検試料を予め吸水性基材の固定相と該固定相より標識相により近い方の一端との間に供給し、該吸水性基材の該一端から第二標識体および介在物質を展開させる（以下、被検試料、第二標識体および介在物質を滴下する吸水性基材の一端を、吸液部と称する場合もある）ことにより、被検試料を希釈する前処理を省略できることを見出して、測定時間を短縮することに成功した。さらに、吸液部と固定相との間に、特に吸液部と標識相との間に、被検試料中の検査対象物と他の物質とを分離するための分離相を設けることにより、被検試料の部分精製などの前処理を省略でき、より迅速で、高精度且つ高感度の測定を行うことに成功して本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち、本発明は以下の通りである。
１．吸水性基材の表面上の任意の領域に設けた固定相に固定化された、検査対象物と特異的に結合し得る第一の免疫化学的成分と、検査対象物と特異的に結合し得る第二の免疫化学的成分および検査対象物とは結合しない第三の免疫化学的成分に標識物質（特に着色粒子、就中、着色されたラテックス粒子または金コロイド粒子）が結合してなる標識体（第一標識体）とで、被検試料中の検査対象物をサンドイッチした免疫複合体を該固定相上に形成させて、固定相上の標識物質のシグナルを測定する免疫学的検査方法であって、該第三の免疫化学的成分と介在物質を介して特異的に結合し得る第四の免疫化学的成分に標識物質（特に着色粒子、就中、着色されたラテックス粒子または金コロイド粒子）が結合してなる標識体（第二標識体）が、該介在物質を介して上記サンドイッチ型免疫複合体中の第三の免疫化学的成分に結合した免疫複合体を形成させて標識物質のシグナルを増幅することを特徴とする方法。
２．該吸水性基材の一端と固定相との間に、第一および第二標識体の少なくとも１つが、水との接触によって脱離し得る形態で保持される標識相が設けられていることを特徴とする上記１の方法。
３．該吸水性基材の一端と固定相との間に、第二標識体が水との接触によって脱離し得る形態で保持される標識相が設けられている上記２の方法であって、且つ以下の工程を含むことを特徴とする方法：
(1) 該吸水性基材の該一端から、被検試料を含有する液、第一標識体を含有する液および該介在物質を含有する液の混合物を展開し、
(2) 該吸水性基材上で形成される検査対象物、第一標識体、介在物質および第二標識体からなる免疫複合体を固定相に固定化された第一の免疫化学的成分に結合させて捕捉した後、
(3) 該固定相上の標識物質のシグナルを測定することにより該検査対象物を検出する。
４．該吸水性基材の一端と固定相との間に、第二標識体が水との接触によって脱離し得る形態で保持される標識相が設けられている上記２の方法であって、且つ以下の工程を含むことを特徴とする方法：
(1) 該吸水性基材の該一端と固定相との間の任意の領域に被検試料を供給し、  (2) 該吸水性基材の該一端から、第一標識体を含有する液と該介在物質を含有する液との混合物を展開し、
(3) 該吸水性基材上で形成される検査対象物、第一標識体、介在物質および第二標識体からなる免疫複合体を固定相に固定化された第一の免疫化学的成分に結合させて捕捉した後、
(4) 該固定相上の標識物質のシグナルを測定することにより該検査対象物を検出する。
５．該吸水性基材の該一端と該固定相との間の任意の領域（但し、被検試料を該吸水性基材の該一端と固定相との間の任意の領域に供給する場合は、その領域を含めてそれより固定相側の領域）、特に該吸水性基材の該一端と標識相との間の任意の領域に、検査対象物と被検試料中の他の物質とを分離し得る分離相がさらに設けられていることを特徴とする上記３または４の方法。
６．該介在物質が抗原抗体反応により第三および第四の免疫化学的成分と特異的に結合する物質である上記１〜５のいずれかの方法。
７．検査対象物と特異的に結合し得る第一の免疫化学的成分を固定化した固定相を表面上の任意の領域に設けた吸水性基材、検査対象物と特異的に結合し得る第二の免疫化学的成分および検査対象物とは結合しない第三の免疫化学的成分に標識物質（特に着色粒子、就中、着色されたラテックス粒子または金コロイド粒子）が結合してなる標識体（第一標識体）、該第三の免疫化学的成分と介在物質を介して特異的に結合し得る第四の免疫化学的成分に標識物質（特に着色粒子、就中、着色されたラテックス粒子または金コロイド粒子）が結合してなる標識体（第二標識体）、並びに第三および第四の免疫化学的成分の結合を仲介する介在物質を含む免疫学的検査キット。
８．該吸水性基材の一端と固定相との間に、第一および第二標識体の少なくとも１つが、水との接触によって脱離し得る形態で保持される標識相が設けられていることを特徴とする上記７のキット。
９．該吸水性基材の一端と固定相との間に、第二標識体が水との接触によって脱離し得る形態で保持される標識相が設けられている上記７のキットであって、且つ以下の（ａ）および（ｂ）の免疫学的検査方法に使用され得ることを特徴とするキット：
方法（ａ）
(1) 該吸水性基材の該一端から、被検試料を含有する液、第一標識体を含有する液および該介在物質を含有する液の混合物を展開し、
(2) 該吸水性基材上で形成される検査対象物、第一標識体、介在物質および第二標識体からなる免疫複合体を固定相に固定化された第一の免疫化学的成分に結合させて捕捉した後、
(3) 該固定相上の標識物質のシグナルを測定することにより該検査対象物を検出する。
方法（ｂ）
(1) 該吸水性基材の該一端と固定相との間の任意の領域に被検試料を供給し、  (2) 該吸水性基材の該一端から、第一標識体を含有する液と、該介在物質を含有する液との混合物を展開し、
(3) 該吸水性基材上で形成される検査対象物、第一標識体、介在物質および第二標識体からなる免疫複合体を固定相に固定化された第一の免疫化学的成分に結合させて捕捉した後、
(4) 該固定相上の標識物質のシグナルを測定することにより該検査対象物を検出する。
１０．該吸水性基材の該一端と固定相との間の任意の領域（但し、被検試料を該吸水性基材の該一端と固定相との間の任意の領域に供給する場合は、その領域を含めてそれより固定相側の領域）、特に該吸水性基材の該一端と標識相との間の任意の領域に、検査対象物と被検試料中の他の物質とを分離し得る分離相がさらに設けられていることを特徴とする上記９のキット。
１１．該介在物質が抗原抗体反応により第三および第四の免疫化学的成分と特異的に結合する物質である請求項７〜１０のいずれのキット。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明の方法により検出され得る検査対象物は、免疫化学的反応（すなわち抗原抗体反応）により第一の免疫化学的成分および第二の免疫化学的成分と結合してサンドイッチ免疫複合体を形成し得るものであれば特に制限されない。例えば、細菌（特に大腸菌Ｏ−１５７、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌等の病原性細菌）、放線菌、酵母、かび、ウイルス（特に、ＨＩＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ等）などの微生物もしくは表面抗原等の該微生物の構成蛋白質、またはそれらに対する抗体、あるいは腫瘍マーカー抗原などの生体試料中の抗原性ペプチド等が挙げられる。
【０００８】
本発明の方法において、固定相に固定化される第一の免疫化学的成分と、第一標識体として用いる第二の免疫化学的成分は、いずれも抗原抗体反応により検査対象物と特異的に結合し得る物質であれば特に制限はない。検査対象物が抗原（例えば、蛋白質、ペプチド、ハプテンなど）であれば、第一および第二の免疫化学的成分は、該抗原と特異的に結合し得る抗体である。該抗体はモノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよい。また本発明における抗体とは、検査対象物との特異的親和性を保持する抗体の断片物、例えばＨ鎖、Ｌ鎖、Ｆab、Ｆ(ab')2、ＶH 、ＶL 等も含むものとする。一方、検査対象物が抗体である場合には、第一および第二の免疫化学的成分は、該抗体と特異的に結合し得る抗原もしくは該抗体を抗原として特異的に結合し得る二次抗体である。第一の免疫化学的成分および第二の免疫化学的成分は、検査対象物に応じてサンドイッチ法などで用いられる自体公知のものを適宜選択すればよい。また、該免疫化学的成分が抗体であれば、単離された検査対象物を感作抗原として、公知の抗体作製技術を用いて調製することもできる。第一および第二の免疫化学的成分がいずれも抗体の場合、第一の抗体および第二の抗体は、同一のものであっても異なるものであってもよい。また、異なる抗体としては、同一の抗原決定基を認識する二種の抗体を用いることも、あるいは異なる抗原決定基を認識する二種の抗体を用いることもできる。
【０００９】
本発明において、第一標識体として用いる第三の免疫化学的成分、および第二標識体として用いる第四の免疫化学的成分は、介在物質を介して特異的に結合し合える抗体（モノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよい。また、Ｈ鎖、Ｌ鎖、Ｆab、Ｆ(ab')2、ＶH 、ＶL 等の断片化された抗体であってもよい）または抗原（例えば、蛋白質、ペプチド、ハプテンなど）であり、且つ検査対象物および固定化された第一の免疫化学的成分とは特異的親和性を有しないものである。好ましくは、これらの免疫化学的成分は、さらに第二の免疫化学的成分とも特異的親和性を有しないものである。
【００１０】
第三および第四の免疫化学的成分の結合を仲介する本発明の介在物質は、第三および第四の免疫化学的成分に同時に結合して（第三の免疫化学的成分−介在物質−第四の免疫化学的成分）の複合体を形成し得る物質であれば特に限定されないが、好ましくは、抗原抗体反応により第三および第四の免疫化学的成分と特異的に結合し得る免疫化学的成分である。すなわち、第三の免疫化学的成分が抗体であれば、介在物質は該抗体により認識される抗原もしくは該抗体と特異的に結合し得る二次抗体であり、第四の免疫化学的成分は該抗原と特異的に結合し得る抗体もしくは該二次抗体により認識される抗原であることが好ましい。このとき、第三および第四の免疫化学的成分がともに抗体であれば、それらは同一の抗体であっても異なるものであってもよい。一方、第三の免疫化学的成分が抗原であれば、介在物質は該抗原と特異的に結合し得る抗体であり、第四の免疫化学的成分は該抗体により認識される抗原もしくは該抗体と特異的に結合し得る二次抗体である。第三および第四の免疫化学的成分がともに抗原であれば、それらは同一の抗原であっても、介在物質である抗体と交叉反応性のある異なる抗原であってもよい。第三および第四の免疫化学的成分、並びに介在物質は、サンドイッチ法等で用いられている公知のものを適宜選択して使用することができる。
【００１１】
本発明において用いられる吸水性基材は、検査対象物を含有する被検試料、例えば、食品から抽出した溶液やその培養上清、血清や血液、尿、便、唾液等、あるいはそれらを適当な希釈溶媒によって希釈してなる希釈液、第一標識体、第二標識体および介在物質をそれぞれ含有する液を吸収できるものであれば特に限定されない。本発明においては、被検試料中の検査対象物が第一標識体や固定相に固定化された第一の免疫化学的成分と十分な反応を行うための、並びに第一標識体が介在物質を介して第二標識体と十分な反応を行うための時間を確保できるような吸水性基材が好ましく用いられる。
【００１２】
吸水性基材が吸水性に劣る場合には、後述するように被検試料が固定相に到達するのに長時間を要し、その結果、迅速な測定を行うことができない。一方、吸水性基材の吸水性があまりに高すぎる場合には、被検試料中の検査対象物が標識体や固定相の第一免疫化学的成分と十分な反応を行うために必要な時間が不足するので、正確な測定を行うことが困難である。
【００１３】
したがって、本発明における吸水性基材の好ましい吸水性の程度は、５ｍｍ幅の短冊状に裁断した吸水性基材の片端部を水に浸漬し、１分間経過後の吸水距離が０．５〜５ｃｍ程度である。
【００１４】
本発明の吸水性基材の好ましい具体例としては、不織布、濾紙、ガラス繊維布、ガラスフィルター、ニトロセルロースフィルター、多孔質材料などが挙げられる。これらの基材は適度な吸水速度を有するとともに、標識物質が着色粒子の場合、着色粒子が結合して発色した際の目視確認性に優れるなどの利点を有するものである。
【００１５】
また、これらの基材の吸水性を調整するために、基材の表面に親水性重合体や界面活性剤を被覆し、あるいは含浸させることもできる。さらに、本発明においては吸水性基材として同一材料からなる基材を用いてもよいし、あるいは異種の材料からなるものを任意の接着手段によって接合して得られる連続した基材を用いることもできる。
【００１６】
本発明において、吸水性基材の形状は、被検試料を展開できる形状であれば特に限定されるものではなく、例えば、矩形のシート状（片状）やロッド状などが好ましい。
【００１７】
本発明において、固定相とは、検査対象物と特異的に結合し得る第一の免疫化学的成分が吸水性基材上に固定化された領域を意味する。第一の免疫化学的成分を吸水性基材上に固定化する方法（固定化相の作製方法）も特に限定されるものではないが、従来から知られている物理吸着法や共有結合法によるのが好適であり、特に、該免疫化学的成分が基材から脱離しにくいという点で共有結合法によるのが好ましい。吸水性基材が上記共有結合法のための官能基を有しないときは、例えば適当な官能基を有する重合体を用いて基材を作製し、吸水性基材の吸水性を阻害しない程度に付着させることができる。また、第一の免疫化学的成分および親水性重合体を含む溶液を吸水性基材に塗布した後、上記親水性重合体を凝固させる凝固溶剤に浸漬することで固定相を作製することもできる。上記親水性重合体としては、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアルコール、ヒドロキシエチルセルロースなどが用いられる。また、上記凝固溶剤としては、アセトン、エタノール、メタノール、エーテルなどを用いることができる。
【００１８】
本発明において、上記固定相と、吸水性基材の一端の、被検試料含有液、第二標識体含有液、介在物質含有液等の吸収が開始される部位（すなわち吸液部）との間の距離は特に限定されないが好ましくは１〜６ｃｍ、より好ましくは３〜４ｃｍ程度である。距離があまりに遠すぎると、固定相まで被検試料が到達しなかったり、検出シグナル感度が強すぎたり、あるいは測定に時間がかかる等の問題を生じるおそれがある。一方、距離が近すぎると固定相上に捕捉される標識物質が均一ではなくまばらになったり、検出シグナル感度が低すぎるという問題を生じるおそれがある。
【００１９】
吸液部としては、被検試料、標識体、並びに介在物質をそれぞれ含有する液の吸水性基材への移動を妨げるものでなければ特に限定されず、基材と兼用したものであっても、新たに不織布や織布等を該吸水性基材に接着させたものであってもよい。本発明において、検査対象物に特異的に結合し得る第一の免疫化学的成分が固定化された固定相、並びに吸液部を有する吸水性基材を、以下、本発明の免疫学的検査片または単に検査片という場合もある。
【００２０】
本発明の方法における第一標識体は、検査対象物に特異的に結合し得る免疫化学的成分（第二の免疫化学的成分）および検査対象物とは結合しない第三の免疫化学的成分に標識物質を結合させたものであり、また、第二標識体は、該第三の免疫化学的成分と介在物質を介して特異的に結合し得る免疫化学的成分（第四の免疫化学的成分）に標識物質を結合させたものである。ここで用いられる標識物質は、免疫化学的測定法において常套的に使用されるいかなる標識物質であってもよく、例えば着色粒子、酵素（アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ等）、蛍光物質（ＦＩＴＣ、ローダミン等）などが挙げられるが、効率のよい検出シグナルの増幅を達成するためには、第一および第二標識体に使用される標識物質は同一のものであることが好ましい。本発明の方法では、迅速な検出を行う意味で、標識物質として着色粒子が好ましく使用される。着色粒子は肉眼で検出可能なものであれば特に制限はなく、例えば、金、銀、銅などの金属からなるコロイド粒子、スダンブルーやスダンレッドIV、スダンIII 、オイルオレンジ、キニザリングリーン等に代表される顔料や染料などでラテックスを着色してなる着色ラテックスなどを用いることができる。目視確認性の点からは、金コロイドや青、赤、緑もしくはオレンジ色に着色した着色ラテックスの使用が好ましく、また、分散安定性や検査対象物の検出感度の調節が容易であるなどの点を考慮すると、青色、赤色等に着色された水分散型高分子重合体粒子からなる着色ラテックスを使用することがさらに望ましい。
【００２１】
着色粒子の粒径は、検出の際の発色がよく且つ吸水性基材の吸水性を低下させない程度の該基材中での移動性を有するものであれば特に制限はないが、保存安定性や調製が容易であるなどの点から、好ましくは０．０１〜５μｍ、より好ましくは０．０５〜３μｍの範囲が例示される。粒径があまりに小さすぎると、１粒子あたりの着色の程度が少ないので、固定相に結合しても発色の程度が悪く目視確認性に劣るようになる。また、粒径が大きすぎると、着色粒子わずかに凝集しただけで吸水性基材に目詰まりを起こして吸水性を低下させたり、非特異的発色を生じたりすることがある。
【００２２】
第二および第三の免疫化学的成分の両方、並びに第四の免疫化学的成分を、このような着色粒子で標識する方法としては、従来公知の方法、例えば共有結合法、物理的吸着法、イオン結合法等を使用することができるが、免疫化学的成分からの着色粒子の脱離がなく安定であるという点から共有結合法がより好ましく用いられる。
【００２３】
本発明の方法において、被検試料中の複数の検査対象物を検出するために、対応する複数の免疫化学的成分をそれぞれ別の着色粒子で標識することができるが、この際に用いられる着色粒子は同一色であっても異なる色であってもよい。同一色の着色粒子を用いる場合、各検査対象物にそれぞれ特異的に結合し得る免疫化学的成分を固定化した固定相を識別可能な程度に離して設置することが望ましい。
【００２４】
標識物質が酵素や蛍光物質の場合には、固定相の標識物質の検出は、ＥＩＡや蛍光抗体法（ＦＩＡ）で従来使用されている検出手段が適宜選択される。
【００２５】
本発明において、標識相とは、吸水性基材の吸液部と固定相との間に設けられた、第一標識体および／または第二標識体を水との接触によって脱離し得る形態で保持する領域を意味する。第一および第二標識体の両方を保持する場合、第一標識体を保持する第一標識相と第二標識体を保持する第二標識相を別個に作製しても、あるいは第一および第二標識体を混合して１つの標識相に保持してもよい。
【００２６】
本発明の一態様においては、標識相は、第二標識体のみを保持するものである。
【００２７】
標識相の作製方法としては特に制限はないが、例えば、標識体を含有する液を吸水性基材の吸液部と固定相との間の任意の領域に塗布し、適当な条件下で乾燥させる（例えば、凍結乾燥）方法が挙げられる。また、水溶性重合体もしくはサッカロース溶液中に標識体を分散させ、該分散液を吸水性基材上に塗布して同様に乾燥させてもよい。この方法は、水溶性重合体またはサッカロースが容易に水溶化し、標識体が速やかに基材から脱離して被検試料中の検査対象物および／または介在物質を介してもう一方の標識体と反応し得るとともに、水溶性重合体やサッカロースの濃度を調整することにより吸水性基材の所定の領域に標識体を保持させるのに適当な粘度を得ることができ、さらに乾燥に際して標識体の凝集や変性を防ぎ、また乾燥後に標識体が吸水性基材から脱離しにくいという点で有利である。
【００２８】
上記水溶性重合体としては、例えば、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、セルロースエステル（例えば、メチルセルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシエチルセルロース、オキシエチルセルロース、シアンエチルセルロース等）、ゼラチンなどが好ましく用いられる。
【００２９】
第一標識体含有液、第二標識体含有液および介在物質含有液は、標識体または介在物質を適当な分散媒（溶媒）中に分散（溶解）させることにより調製される。標識体または介在物質を分散させる分散媒は、検査対象物と第一標識体、第一標識体と介在物質および介在物質と第二標識体の特異的結合反応を阻害しないものであれば特に制限はないが、好ましくは該抗原抗体反応に適したｐＨおよび塩濃度の有する緩衝液、例えばリン酸緩衝液、酢酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液等を適宜選択して使用することができる。シグナル検出時の各標識体濃度は０．００５〜５％、好ましくは０．０１〜０．５％の範囲である。濃度があまりに低すぎると、固定相に結合する粒子数が少なく検出感度が悪くなる。また、濃度が高すぎると、不経済なばかりでなく過剰の標識物質が固定相以外に残留し、固定相のシグナルを不明瞭にする等の問題を生じる。
【００３０】
本発明の方法の好ましい一態様としては、以下の方法が例示される。すなわち、吸水性基材の一端（すなわち吸液部）から、被検試料を含有する液、第一標識体を含有する液、並びに第三および第四の免疫化学的成分の結合を仲介する介在物質を含有する液の混合物（該混合物中で被検試料中の検査対象物が第一標識体中の第二の免疫化学的成分と、また第一標識体中の第三の免疫化学的成分が介在物質と特異的に結合して複合体を形成する）を滴下して展開すると、該複合体は液の移動とともに吸水性基材上を移動する。液が標識相に到達すると、そこに保持されていた第二標識体は水との接触によって標識相から脱離する。さらに、第二標識体中の第四の免疫化学的成分が介在物質を介して第一標識体中の第三の免疫化学的成分と結合して、さらに吸水性基材上を移動する。そして、形成された免疫複合体は、固定相に固定化された第一の免疫化学的成分と結合して固定相上に捕捉される。このようにして、第一および第二標識体を構成する標識物質が固定相上に集合、結合して検出シグナルが増幅され、それによってより高感度に検査対象物の存在を検出することが可能となる。
【００３１】
本発明の方法の別の態様としては、上記の方法において、被検試料を吸液部から滴下する代わりに、吸液部と固定相との間に滴下または塗布した後、第一標識体を含有する液と介在物質を含有する液との混合物を吸液部に滴下して展開する方法が挙げられる。この場合、該混合液が被検試料を滴下または塗布した領域に達すると、被検試料中の検査対象物は、第一標識体と介在物質との複合体と結合して吸水性基材上を移動する。液が標識相に到達すると、そこに保持されていた第二標識体は水との接触によって標識相から脱離する。さらに、第二標識体中の第四の免疫化学的成分が介在物質を介して第一標識体中の第三の免疫化学的成分と結合して、さらに吸水性基材上を移動する。そして、形成された免疫複合体は、固定相に固定化された第一の免疫化学的成分と結合して固定相上に捕捉される。
【００３２】
本発明の免疫学的検査用キットは、本発明の免疫学的検査方法に好ましく用いることができる。該キットは、少なくとも下記の内容を含むものである。
(a) 検査対象物と特異的に結合し得る第一の免疫化学的成分を固定化した固定相を表面上の任意の領域に設けた吸水性基材
(b) 検査対象物と特異的に結合し得る第二の免疫化学的成分および検査対象物とは結合しない第三の免疫化学的成分に標識物質が結合してなる標識体（第一標識体）
(c) 該第三の免疫化学的成分と介在物質を介して特異的に結合し得る第四の免疫化学的成分に標識物質が結合してなる標識体（第二標識体）
(d) 第三および第四の免疫化学的成分の結合を仲介する介在物質
該吸水性基材、第一および第二標識体、並びに介在物質の好ましい態様は、上記したような本発明の方法において好ましく用いられるものである。
【００３３】
本発明のキットに用いられる吸水性基材は、好ましくは、その一端（すなわち吸液部）と固定相との間の任意の領域に、第一および第二標識体の少なくとも１つが水との接触によって脱離し得る形態で保持される標識相がさらに設けられたものである。特に、上記した本発明の方法の好ましい態様において用いられる吸水性基材は、吸液部と固定相の間の任意の領域に、第二標識体が水との接触によって脱離し得る形態で保持される標識相がさらに設けられたものである。
【００３４】
本発明のキットに用いられる吸水性基材のさらに好ましい態様の１つとして、吸液部と固定相との間の任意の領域（但し、被検試料を該吸水性基材の一端と固定相との間の任意の領域に滴下または塗布する場合はその領域を含めてそれより固定相側の領域）、特に吸液部と標識相との間に、検査対象物と被検試料中の他の物質とを分離し得る分離相をさらに設けたものが挙げられる。
【００３５】
本発明において、分離相は、分離しようとする方向の孔径が検査対象物、各標識体、並びに介在物質よりも大きく、分離除去しようとする被検試料中の他の物質よりも小さいことが望ましい。また、分離方向としては、標識体が吸水性基材上を展開する方向であっても、あるいはその方向と垂直の方向であってもよく、さらに、検査対象物を被検試料中の他の物質から分離した後は、該分離相を除去して後の測定を行ってもよい。
【００３６】
分離相の材質としては、例えば、レーヨン、ポリエステル等の不織布、濾紙、ガラス繊維布、ガラスフィルター、ニトロセルロースフィルター、ポリスルホンフィルター、多孔質材料等が挙げられる。
【００３７】
本発明のキットは、上記の内容物以外に、本発明の免疫学的検査方法において好ましく使用され得る付加的な内容物を含んでいてもよい。例えば、第一および第二標識体、並びに介在物質を分散（溶解）させるのに好ましく使用される上記の緩衝液などが挙げられる。
【００３８】
【実施例】
以下に実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、これら実施例は本発明の範囲を何ら限定するものではない。
【００３９】
実施例１  免疫学的検査用キット構成物の作製
（１）水分散型高分子重合体粒子からなる着色ラテックスの作製
スチレンモノマー５０ｇ、アクリル酸０．５ｇ、トリエチレングリコールジメタクリレート０．２ｇ、及び蒸留水４４０ｇを窒素気流下で温度７５℃にて攪拌しながら、これに過硫酸カリウム０．２５ｇを水１０ｇに溶解した水溶液を加え、１０時間重合させて、平均粒子径０．２２μｍの水分散型高分子重合体粒子の水分散液を得た。この重合体粒子分散液をアルカリ、酸、蒸留水の順序にて遠心洗浄した後、固形分濃度１０重量％に調整した（担体粒子分散液）。スダンブルー０．２ｇをトルエン２０ｍｌに溶解し、これにドデシル硫酸ナトリウム０．２ｇ、及び蒸留水１００ｍｌを加え、超音波分散機でこの混合液を乳化した。この液に上記担体粒子分散液（固形分濃度１０重量％）３０ｍｌを加え、室温にて２４時間攪拌した。この液をエバポレータにてトルエンを除去した後、０．０１Ｍほう酸緩衝液（ｐＨ７．５）にて遠心洗浄を行い、固形分濃度５重量％となるように調整した。この液５０ｍｌに、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩水溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）５ｍｌ、及び０．０３Ｍｍ−キシレンジアミン水溶液５０ｍｌを加え、室温にて５時間反応させた。この液を７５℃にて５時間加熱処理した後、前記と同じ緩衝液にて遠心洗浄を行い、固形分濃度１重量％となるように調整した（スダンブルー染色キシレンジアミンスペーサ化粒子分散液）。
【００４０】
（２）第一標識体含有液の作製
上記（１）で調製したスダンブルー染色キシレンジアミンスペーサ化粒子分散液１０ｍｌにグルタルアルデヒド水溶液（０．１ｍｇ／ｍｌ）１ｍｌを加え、室温にて２時間反応させた後、前記と同じ緩衝液にて遠心洗浄し、固形分濃度１重量％の分散液に調整した。この分散液１０ｍｌに第三の免疫化学的成分として抗ヒトヘモグロビン抗体（ウサギＩｇＧ，１０ｍｇ／ｍｌ）を１ｍｌ、第二の免疫化学的成分として抗ヒトＨＢｓ抗体（ウサギＩｇＧ，５ｍｇ／ｍｌ）を１ｍｌ、それぞれ加え、１０℃にて２４時間攪拌した。これを前記と同じ緩衝液で遠心洗浄し、固形分濃度１重量％となるように再分散させ、共有結合で抗体を結合したスダンブルー染色粒子標識抗ヒトヘモグロビン抗体−抗ヒトＨＢｓ抗体（第一標識体）含有液を得た。
【００４１】
（３）第二標識体含有液の作製
上記（１）で調製したスダンブルー染色キシレンジアミンスペーサ化粒子分散液１０ｍｌにグルタルアルデヒド水溶液（０．１ｍｇ／ｍｌ）１ｍｌを加え、室温にて２時間反応させた後、前記と同じ緩衝液にて遠心洗浄し、固形分濃度１重量％の分散液に調整した。この分散液１０ｍｌに、第四の免疫化学的成分として抗ヒトヘモグロビン抗体（ウサギＩｇＧ，１０ｍｇ／ｍｌ）２ｍｌ、を加え、１０℃にて２４時間攪拌した。これを前記と同じ緩衝液で遠心洗浄し、固形分濃度１重量％となるように再分散させ、共有結合で抗体を結合したスダンブルー染色粒子標識抗ヒトヘモグロビン抗体（第二標識体）含有液を得た。
【００４２】
（４）免疫学的検査片の作製
第一の免疫化学的成分として抗ヒトＨＢｓ抗体（ウサギＩｇＧ）を、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）にて希釈し、最終濃度１ｍｇ／ｍｌの水溶液に調整した。この水溶液に、ニトロセルロースメンブランフィルター（東洋ろ紙、５×１００ｍｍ）の一端から５０ｍｍ部位に１０μｌ塗布した後、直ちに３７℃で１時間静置した後、ニトロセルロースメンブランフィルターを取り出し、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０の水溶液に１時間浸漬させた。その後、ニトロセルロースメンブランフィルターを取り出し、室温で３時間静置し、抗ヒトＨＢｓ抗体を有するニトロセルロースメンブランフィルターを得た。次に、上記の抗ヒトＨＢｓ抗体固定化ニトロセルロースメンブランフィルターの試験片の一端（吸液部）の近傍に血球分離相（東洋ろ紙Ｎｏ．２、５×１０ｍｍ）を設け、固定相および血球分離相を有するニトロセルロースメンブランフィルターからなる検査片を得た。
５重量％ポリビニルピロリドン（粘度平均分子量２５０００）水溶液１ｍｌに、実施例１の（３）で作製した第二標識体含有液０．１ｍｌを加えて十分混合した後、この溶液１０μｌを上記検査片の固定相の位置から２０〜３０ｍｍの位置に塗布し、これをデシケーター内で２日間乾燥して、標識相を設けた免疫学的検査片を得た。
【００４３】
実施例２  免疫学的検査用キットによるヒトＨＢｓ抗原の検出
実施例１の（４）で作製した検査片の血球分離相に、ヒトＨＢｓ抗原を生理食塩水溶液に溶解させた被検液１０μｌを滴下した。その後、直ちにヘモグロビン抗原溶液（蛋白質濃度２００ｎｇ／ｍｌ）および実施例１の（２）で作製した第一標識体含有液（固形分濃度０．２重量％）の混合液１００μｌを吸液部に滴下して展開した（図１Ａ）。１０分後の固定相上での発色を目視観察した（図１Ｂ）。その結果を表１に示す。
【００４４】
【表１】
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【００４５】
比較例
実施例１の（２）で調製した第一標識体だけを用い、第二標識体および介在物質であるヘモグロビン抗原を用いない以外は実施例２と同様にヒトＨＢｓ抗原の測定を行った。すなわち、実施例１の（４）で作製した検査片の血球分離相に、ヒトＨＢｓ抗原を生理食塩水溶液に溶解させた被検液１０μｌを滴下した後、直ちに第一標識体含有液（固形分濃度０．２重量％）５０μｌを吸液部に滴下して展開し、１０分後の固定相での発色を目視観察した。その結果を表２に示す。
【００４６】
【表２】
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【００４７】
【発明の効果】
本発明の方法（および本発明のキットの使用）は、シグナルを増幅する工程を含む免疫クロマトグラフ法において、介在物質を介して第一標識体と第二標識体を結合させることにより、従来より効率よく検出シグナルを増幅させることができる。また、本発明の方法の好ましい態様においては、便や血液等の検査において従来必要とされた被検試料の前処理の工程を省略することができるので、より迅速に検査対象物を測定することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の免疫学的検査キットを用いたヒトＨＢｓ抗原の測定の各工程における抗原抗体反応の様子を示す模式図である。
【図１】
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