(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中のアナライトの測定方法であって、下記工程：
ａ．IMPDHの活性に適する条件下で、該アナライトを含有すると思われるサンプルを、該アナライトに対する抗体の結合親和性に関して本質的に該アナライトと同様に挙動するアナライト類似体とIMPDHの不競合インヒビターとを含むアナライト類似体−インヒビターコンジュゲート、該アナライトに特異的な受容体、IMP、NADおよびIMPDHと合一にする工程；
ｂ．NADHの生成をモニターする工程；および
ｃ．NADHの生成を、該サンプル中での該アナライトの存在または量と互いに関連付ける工程
を含む上記方法。
【請求項２】
前記アナライトが、薬物、薬物誘導体、ホルモン、ポリペプチドおよびオリゴヌクレオチドからなる群から選ばれる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記不競合インヒビターがミコフェノール酸またはミコフェノール酸類似体である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記アナライトがミコフェノール酸である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記アナライトがチロキシンである、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記アナライトがジゴキシゲニンである、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記アナライトがテオフィリンである、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
サンプル中のアナライトを測定するための試薬であって、該アナライトに対する抗体の結合親和性に関して本質的に該アナライトと同様に挙動するアナライト類似体とIMPDHの不競合インヒビターとを含むアナライト類似体−インヒビターコンジュゲートを含んでなる上記試薬。
【請求項９】
前記不競合インヒビターがミコフェノール酸またはミコフェノール酸類似体である、請求項８に記載の試薬。
【請求項１０】
前記アナライトが、薬物、薬物誘導体、ホルモン、ポリペプチドおよびオリゴヌクレオチドからなる群から選ばれる、請求項８に記載の試薬。
【請求項１１】
前記アナライトがミコフェノール酸である、請求項10に記載の試薬。
【請求項１２】
前記アナライトがチロキシンである、請求項10に記載の試薬。
【請求項１３】
前記アナライトがジゴキシゲニンである、請求項10に記載の試薬。
【請求項１４】
前記アナライトがテオフィリンである、請求項10に記載の試薬。
【請求項１５】
サンプル中のアナライトの測定アッセイを行うためのキットであって、
ａ．NADを含む第1の試薬；および
ｂ．IMPと、IMPDHと、該アナライトに対する抗体の結合親和性に関して本質的に該アナライトと同様に挙動するアナライト類似体およびIMPDHの不競合インヒビターを含むアナライト類似体−インヒビターコンジュゲートとを含む第2の試薬、
をパッケージして組み合せて含んでなり、該第1の試薬または該第2の試薬はさらに、該アナライトに特異的な受容体を含む、上記キット。
【請求項１６】
さらに、既知量の前記アナライトを含んでなる較正用試薬を含む、請求項15に記載のキット。
【請求項１７】
前記不競合インヒビターがミコフェノール酸またはミコフェノール酸類似体である、請求項15に記載のキット。
【請求項１８】
前記アナライトが、薬物、薬物誘導体、ホルモン、ポリペプチドおよびオリゴヌクレオチドからなる群から選ばれる、請求項15に記載のキット。
【請求項１９】
前記アナライトがミコフェノール酸である、請求項18に記載のキット。
【請求項２０】
前記アナライトがチロキシンである、請求項18に記載のキット。
【請求項２１】
前記アナライトがジゴキシゲニンである、請求項18に記載のキット。
【請求項２２】
前記アナライトがテオフィリンである、請求項18に記載のキット。
【請求項２３】
薬物、薬物誘導体、ホルモンおよびオリゴヌクレオチドからなる群から選ばれるアナライトに対する抗体の結合親和性に関して本質的に該アナライトと同様に挙動するアナライト類似体と、IMPDHの不競合インヒビターとを含むアナライト類似体-インヒビターコンジュゲート。
【請求項２４】
前記アナライトが薬物もしくは薬物誘導体である、請求項23に記載のコンジュゲート。
【請求項２５】
前記不競合インヒビターがミコフェノール酸またはミコフェノール酸類似体である、請求項24に記載のコンジュゲート。
【請求項２６】
前記薬物がジゴキシゲニンである、請求項24に記載のコンジュゲート。
【請求項２７】
化合物5’-[(ジゴキシゲニン-3-イル)-β-アミドメチル-MPAである、請求項26に記載のコンジュゲート。
【請求項２８】
化合物4’-[(ジゴキシゲニン-3-イル)-オキシメチルカルボニル-DADOO-カルボニルメチル-MPAである、請求項26に記載のコンジュゲート。
【請求項２９】
化合物5’-[(ジゴキシゲニン-3-イル)-オキシメチルカルボニル-DADOO-カルボニルメチル-MPAである、請求項26に記載のコンジュゲート。
【請求項３０】
前記薬物がテオフィリンである、請求項24に記載のコンジュゲート。
【請求項３１】
化合物5’-[(テオフィリン-8-ブチルアミドエチルアミノカルボニルオキシ)イソプレニル]-MPAである、請求項30に記載のコンジュゲート。
【請求項３２】
前記アナライトがホルモンである、請求項23に記載のコンジュゲート。
【請求項３３】
前記不競合インヒビターがミコフェノール酸またはミコフェノール酸類似体である、請求項32に記載のコンジュゲート。
【請求項３４】
前記ホルモンがチロキシンである、請求項32に記載のコンジュゲート。
【請求項３５】
化合物L-チロキシン-5’-イソプレニル-MPAである、請求項34に記載のコンジュゲート。
【請求項３６】
前記アナライトがヌクレオチドである、請求項23に記載のコンジュゲート。
【請求項３７】
前記不競合インヒビターがミコフェノール酸またはミコフェノール酸類似体である、請求項36に記載のコンジュゲート。
【請求項３８】
以下の構造：
【化１】
0003737968.tif 000024
（式中、ｎ＝１〜10であり、Ｘは薬物誘導体、ホルモン誘導体、ポリペプチドまたはオリゴヌクレオチドである。）
を有するアナライト類似体-インヒビターコンジュゲート。
【請求項３９】
ｎ＝１である、請求項38に記載のコンジュゲート。
【請求項４０】
Ｘ＝ジゴキシゲニン-3-イル-オキシメチルカルボニル-DADOOである、請求項39に記載のコンジュゲート。
【請求項４１】
Ｘ＝3-アミノ-ジゴキシゲニンである、請求項39に記載のコンジュゲート。
【請求項４２】
以下の構造：
【化２】
0003737968.tif 000025
（式中、Ｘは薬物誘導体、ホルモン誘導体、ポリペプチドまたはオリゴヌクレオチドである。）
を有するアナライト類似体-インヒビターコンジュゲート。
【請求項４３】
Ｘ＝ジゴキシゲニン-3-イル-オキシメチルカルボニル-DADOOである、請求項42に記載のコンジュゲート。
【請求項４４】
以下の構造：
【化３】
0003737968.tif 000026
（式中、ｎ＝１〜２であり、Ｘは薬物誘導体、ホルモン誘導体、ポリペプチドまたはオリゴヌクレオチドである。）
を有するアナライト類似体-インヒビターコンジュゲート。
【請求項４５】
Ｘが-O-CONH-(CH2)2-NH-チロキシンである、請求項44に記載のコンジュゲート。
【請求項４６】
Ｘが-O-CONH-(CH2)2-NHC(=O)-(CH2)4-テオフィリンである、請求項44に記載のコンジュゲート。
【請求項４７】
Ｘが下記のものである、請求項44に記載のコンジュゲート。
【化４】
0003737968.tif 000027
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
本発明は、概して、液体媒体中のアナライトの測定の分野に関する。さらに詳細には、本発明は、生物学的サンプル中のアナライトを測定するためのイムノアッセイに関する。
【０００２】
Boguslaski, R.C.らの米国特許第4,134,792号（1979年）は、液体媒体中のアラナイトの検出のための標識物質としての可逆的に結合する酵素モジュレーターの使用、特にイムノアッセイにおける該アナライトの類似体に結合させた競合的インヒビターの使用を記載している。
【０００３】
Dorn, A.R.の米国特許出願第09/328,741号（1999年６月９日出願）は、生物学的サンプル中のミコフェノール酸の酵素的測定の方法を記載している。
【０００４】
イノシン-5’-モノホスフェートデヒドロゲナーゼ（EC1.1.1.205）は、イノシン-5’-モノホスフェート（IMP）のNDA依存的酸化を触媒して、キサントシン-5’-モノホスフェート（XMP）にする［Magasanik, B.ら, J. Biol. Chem. 226:339-350(1957)およびJacksonら, Nature 256:331-333(1975)］。この酵素は、基質と補因子との結合および生成物の放出、という順序だった一連のBi−Bi反応に従う。まず最初に、IMPはIMPDHに結合する。これに続いて、補因子NADの結合が起こる。還元された補因子であるNADHは次に該生成物から放出され、続いて生成物XMPが生じる。この機構は、大部分の他の既知のNAD依存性デヒドロゲナーゼのもの（基質の添加順序がランダムであるか、またはNADが基質よりも先に結合することが必要である）とは異なっている。
【０００５】
ヒトIMPDHの２つのイソ型（Ｉ型およびII型と命名されている）が同定され、配列決定されている［Collartら, J. Biol. Chem. 263:15769-15772(1988)およびNatsumedaら, J. Biol. Chem. 265:5292-5295(1990)］。それぞれのイソ型は514個のアミノ酸であり、両者のイソ型は84％の配列同一性を有する。IMPDHのＩ型およびII型の両者は、溶液中で活性な四量体を形成し、その際のサブユニットの分子量は56kDaである［Yamadaら, Biochemistry 27:2737-2745(1988)］。
【０００６】
発明の概要
その最も狭義の適用において、本発明は、ミコフェノール酸による酵素イノシン-5’-モノホスフェートデヒドロゲナーゼ（IMPDH）の特異的な不競合阻害に基づく、ミコフェノール酸に特異的な定量的均一系イムノアッセイにより例示される。IMPDHの阻害は、ミコフェノール酸による阻害が不競合性であるために、ミコフェノール酸の濃度にのみ依存する。したがって、ミコフェノール酸の濃度が高くなるほど、該酵素は大きく阻害される。還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NADH）の形成を340nmにて測定することにより、その反応がモニターされる。IMPDHは次の反応を触媒する。
【０００７】
【化５】
0003737968.tif 000002
均一系イムノアッセイの開発は、ミコフェノール酸もしくはMPA誘導体または任意のIMPDHの不競合インヒビター上のある位置にリガンドが結合することにより達成でき、ここで、そうした結合はIMPDHの不競合阻害に干渉しない。アナライトが存在しない場合、アナライト特異的抗体は該リガンド−MPA誘導体に結合し、そのIMPDHの阻害を妨げる。アナライトが存在する場合、アナライトがその抗体に結合することにより、リガンド-MPA誘導体が自由になりIMPDHを阻害する（表３、パートＣ）。
【０００８】
NADH（還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）の形成速度は、波長340nm（すなわち、NADHの特徴的吸光領域）における吸光度の変化をモニターすることにより測定でき、次にこの吸光度の変化をアナライトの濃度と互いに関連付ければよい。
【０００９】
リガンド結合のための誘引部位は、ミコフェノール酸およびその誘導体のヘキサン酸部分の鎖（hexanoic chain）上、特に4’炭素および5’炭素に存在する（図１）。幾つかの化合物がこれらの基準を満足している。Nelson, P.H.ら, Journal of Medicinal Chemistry 33:833-838(1990)、Rohloff, J.C.ら, Tetrahedron Letters 36(43):7803-7806(1995)、Artis, D.R.ら, PCT出願公開 WO95/22536号(1995)およびArtis, D.R.ら, PCT出願公開WO95/22538号(1995)を参照されたい。これらの誘導体の中の幾つかは、ミコフェノール酸よりも高い阻害を示し、したがってホモジニアスイムノアッセイにより高い感度を賦与できるであろう。Smith, D.B.ら, J. Org. Chem. 61:2236-2241(1996)を参照されたい。
【００１０】
本発明の好ましい実施形態では、不競合インヒビターであるミコフェノール酸（MPA）をリガンドに結合させ、ミコフェノール酸についての均一系イムノアッセイに用いた。
【００１１】
不競合インヒビター−リガンドコンジュゲートの使用は、競合インヒビター−リガンドコンジュゲートの使用よりも好ましい。何故ならば、前者のコンジュゲートは、薬物および天然に存在する物質（一般に酵素の競合インヒビターとなり得る）からの干渉を非常に受け難いからである。酵素の不競合インヒビターは自然界では稀少であり、したがって薬物および天然の物質からの干渉を受け難いはずである。
【００１２】
その最も広義の適用において、本発明は、任意のアナライトの測定に用いることができる。本明細書中で具体的に例示されるものは、ミコフェノール酸、ジゴキシゲニン、チロキサンおよびテオフィリンを測定するための本発明の使用である。また、薬物もしくは薬物誘導体、ホルモン、ポリペプチドおよびオリゴヌクレオチドを含む任意のアナライトを測定するための本発明の使用も教示されている。本発明の方法を用いるアッセイに適する他の薬物もしくは薬物誘導体の例としては、抗生物質（例えばゲンタマイシン、アミカシン、トブラマイシン、ネチルマイシンおよびバンコマイシン）；強心薬（例えば、ジゴキシン、ジギトキシン、N-アセチルプロカインアミド、プロカインアミド、キニジンおよびリドカイン）；抗発作薬（例えば、フェニトイン、フェノバルビタール、プリミドン、バルプロ酸、エトスクシミドおよびカルバマゼピン）；鎮痛薬（例えば、アセトアミノフェンおよびアセチルサリチル酸）；および免疫抑制剤［例えば、MPA、シクロスポリン、ラパマイシン（シロリマス(sirolimus)）、FK506（タクロリマス(tacrolimus)）］のような治療用薬物、ならびに、アンフェタミン、バルビツレート、ベンゾジアゼピン、カンナビノイド、コカイン代謝産物（ベンゾイルエクゴニン）、メタドン、アヘン類、フェンシクリジン、プロポキシフェンおよびLSDのような乱用薬物が挙げられる。本発明の方法を用いるアッセイに適するホルモンの例としては、チロキシン、甲状腺刺激ホルモン、エストロゲン、プロゲステロン、テストステロン、プロラクチン、濾胞刺激ホルモン、絨毛性ゴナドトロピンおよび黄体化ホルモンが挙げられる。本発明の方法を用いるアッセイに適するポリペプチドの例としては、ヘモグロビンA1c、トロポニン-Tおよびトロポニン-Ｉのようなタンパク質およびエピトープが挙げられる。本発明の方法を用いるアッセイに適するオリゴヌクレオチドの例としては、淋菌、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）、クラミジアおよび肝炎感染の検出および定量に対して十分特異的である配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる特定のオリゴヌクレオチド配列が挙げられる。
【００１３】
本発明の別の態様は、本発明の方法によりアナライトの測定のためのアッセイを行うための試験キットであって、NADと、IMPDHと、IMPと、MPAおよび該アナライトのリガンドを含むコンジュゲートとを含む１種以上の試薬組成物をパッケージして組み合せて含んでなる該試験キットに関する。
【００１４】
発明の詳細な説明
均一系酵素イムノアッセイの開発を容易にするはずであるIMPDHのミコフェノール酸阻害の幾つかの特性があることが見出されている。ミコフェノール酸阻害の感度（10〜20nM）およびその不競合阻害は、均一系酵素イムノアッセイにおけるその使用に有利である。リガンドをミコフェノール酸に慎重に結合させてリガンド−インヒビターコンジュゲートを形成することにより、特定のアナライトについての均一系酵素イムノアッセイを開発することができる。リガンドを不競合インヒビターに結合させることは、ミコフェノール酸測定の特定の場合に非常に好ましい。何故ならば、IMPおよびNADの多くの競合インヒビターが存在し、アッセイの特異性を低下させるからである。一般に、リガンド−インヒビターコンジュゲートにおいて競合インヒビターを用いると、アッセイ性能における干渉が起こる。この理由は、多くの薬物および天然に存在する物質が競合インヒビターとして存在し、これらが特異性を大きく低下させるからである。
【００１５】
IMPDH酵素の不競合インヒビターは、該酵素の活性部位に結合することにより阻害し、かつ該酵素の阻害に関してIMPまたはNADと競合しない物質である。不競合阻害は、インヒビターがIMPDH−XMP複合体と該酵素の活性部位で可逆的に結合して、IMPDH−XMP−インヒビター複合体を形成する場合に起こり、この複合体はXMP生成物を放出することができない。このタイプの阻害は、基質の濃度を増大させることによって逆戻りすることはない。NADHは一度だけ放出されるが、XMPは放出されない。一方、非競合インヒビターは、基質結合部位以外の部位で結合する。非競合阻害もまた、基質の濃度を増大させることによって逆戻りすることはない。
【００１６】
使用に好ましいIMPDH酵素は、ヒトＴリンパ球由来の組換えIMPDH-II酵素である。
【００１７】
本発明のイムノアッセイのアナライト濃度に対する感度は、MPAによる阻害に対する感度が様々に異なる各種形態のIMPDHの使用により変えることができる。例えば、MPAに対する幾つかの形態のヒトIMPDHのインヒビター定（inhibitor constants）（Ki）は次のとおりである。
【００１８】
0003737968.tif 000003
各種の酵素形態はMPA阻害に対して様々に異なる感度を有するので、それらはまた、リガンド−インヒビターによる阻害に対しても様々に異なる感度を有し、そのため、異なる感度レベルまたはアナライトの測定範囲を有するイムノアッセイを作り出すのに有利である。
【００１９】
本発明は、アッセイ感度の調整を提供する。アッセイ感度の調整または変更は、MPAもしくはMPA誘導体または任意のIMPDHの不競合インヒビターに対して様々に異なる感度を有する各種形態のIMPDHを用いずには容易に達成することはできない。
【００２０】
アナライトを含むと思われるサンプル：アナライト（すなわち、ミコフェノール酸または他のIMPDHインヒビター）を当然含んでいると思われる任意のサンプルは本発明の方法により分析することができる。該サンプルは、典型的には、宿主からの体液（例えば、尿、全血、血漿、血清、唾液、精液、便、痰、脳脊髄液、涙、粘液、など）のような水性溶液であるが、好ましくは血漿または血清である。該サンプルは、必要により予備処理してもよく、該アッセイに干渉しない任意の簡便な媒体中に調製してもよい。水性媒体が好ましい。
【００２１】
ミコフェノール酸の量の測定：定量方法、半定量方法および定性方法、ならびにミコフェノール酸を測定するための全ての他の方法が、ミコフェノール酸の量の測定方法であると考えられる。例えば、単にミコフェノール酸を含有すると思われるサンプル中でのミコフェノール酸の存在の有無だけを検出する方法は、本発明の範囲に含まれると考えられる。「検出（すること）」および「測定（すること）（determining）」という用語、ならびに「測定（すること）（measuring）」の他の一般的な類義語は本発明の範囲内であるとする。
【００２２】
本発明に従うMPAの測定は、単位時間当たりのNADHの吸光度の変化を測定する速度アッセイ法（rate-assay method）、または一定時間が経過した後に反応を停止させる終点法（end-point method）により行うことができる。該方法は、実験室での分析または臨床的分析のための自動分析装置に容易に適用可能である。自動実験室分析装置の例はCOBAS INTEGRAおよびROCHE/HITACHIシリーズアナライザー（Roche Diagnostics, Indianapolis, IN）である。他のNADHの測定方法も意図され、例えば、Babson,A.L.ら, Clinical Chemistry 19(7):766-769(1973)に記載されているようにNADの還元をテトラゾリウム塩、塩化2-p-ニトロフェニル-5-フェニルテトラゾリウム（INT）の還元と組合せることが挙げられ、この場合、フェナジンメトスルフェートが中間の電子運搬体として作用する。
【００２３】
較正用物質(calibration material)とは、測定しようとするアナライトの既知量を含有する任意の標準物質または基準物質を意味する。アナライトを含有すると思われるサンプルおよび較正用物質は、同様の条件下でアッセイされる。次に、未知の試料について得られた結果を該標準品について得られた結果と比較することにより、アナライトの濃度を算出する。これは通常、図２、３、４および５に示すような検量曲線を作成することにより行われる。
【００２４】
補助的物質：本発明に従うアッセイでは、種々の補助的物質がしばしば用いられる。例えば、アッセイ媒体中には通常は緩衝液、ならびにアッセイ成分および該アッセイ媒体のための安定化剤が存在する。しばしば、これらの添加剤に加えて、アルブミンのような追加のタンパク質または界面活性剤（特に非イオン性界面活性剤）などを含ませてもよい。
【００２５】
IMPDHとは、酵素イノシン-5’-モノホスフェートデヒドロゲナーゼ（EC 1.1.1.205）をいい、これはイノシン-5’-モノホスフェートからのキサンチン-5’-モノホスフェートの形成を触媒する。本発明は、天然の供給源もしくは組換え供給源または部位特異的突然変異体に由来するIMPDHの使用を意図するものであり、任意のイソ型、部位特異的突然変異体またはイソ型の混合物を用い得る。
【００２６】
本明細書および請求の範囲の全体を通してミコフェノールについてのいかなる記載も、ミコフェノール酸、ならびにIMPDH阻害により生物学的な意味でミコフェノール酸として作用するその生物学的に活性でかつ治療的に活性な代謝産物および誘導体を包含しようとするものである、と理解すべきである。
【００２７】
本発明の別の態様は、アナライトの測定のための本発明のアッセイ方法を簡便に実施するのに有用なキットに関する。本発明の汎用性を高めるために、本発明の方法に有用な試薬は、該試薬の割合が該方法およびアッセイの実質的な最適化をもたらすように、液体または凍結乾燥した形態で同一または別々の容器にパッケージして組み合せて提供してもよい。該試薬は、該試薬の交差反応性および安定性に応じて、それぞれ別々の容器に入っていてもよいし、あるいは各種の試薬を１つ以上の容器に一緒にしてもよい。
【００２８】
本発明のキットは、NDAと、IMPDHのインヒビターおよびアナライトのリガンドを含むリガンド−インヒビターコンジュゲートと、IMPと、IMPDHとを含んでなる。該試薬は、液体形態で保持してもよいし、凍結乾燥させてもよい。該キットはさらに、較正用物質および対照物質を含み得る。
【００２９】
しかし、本発明は、ミコフェノール酸の測定以外の用途も有する。本明細書に記載のアプローチを用いて、4’位または5’位で適切に誘導体化されたミコフェノール酸もしくはMPA誘導体または任意のIMPDHの不競合酵素インヒビターへ結合させるために適切な反応性基を用いて誘導体化されている任意のリガンド（例えばテオフィリン、ジゴキシン、フェニトイン、ペプチド断片、オリゴヌクレオチド、モルフィン、コカインなどが挙げられるが、それらに限定されない）を用いて、未知のサンプル中の対応するアナライトを測定することができる。これらの位置での誘導体化により新たな光学活性中心がつくられる。立体異性体は本発明の範囲内であると考えられる。
【００３０】
本発明の中心的特徴は、薬物誘導体と結合するように伸長させることができる適切な結合基で5’位で置換されているMPA誘導体を合成できることである。本発明では２種の異なるタイプの結合基が開示されており、5’-カルボキシアルキルMPA薬物誘導体および5’-イソプレニル結合MPA薬物誘導体が挙げられる。
【００３１】
MPAエステルの5’位での置換には、低温での、ビス（トリメチルシリル）アミドナトリウムおよびDMPUの存在下でのアルキルハロアセテートを用いるアルキル化反応が関与する。DMPUの代わりにHMPAを用いれば、このアルキル化反応が全体的に向上すると思われる。このアルキル化反応は、リンカーでの選択的エステル加水分解の後でアルキルハロプロピオネートまたはアルキルハロブチレートを用いて5’-カルボキシエチルMPAエステルまたは5’-カルボキシプロピルMPAエステルを調製するように拡大することができる。そして、リンカーにおけるカルボキシ官能基（carboxy function）は、活性なエステルへと変換することにより、多種多様な合成経路を可能にし、次いで、適切に誘導体化された薬物誘導体（最も一般的には、アミド結合をつくるためにリンカー含有アミノ基を有する薬物）に結合できるようにする。
【００３２】
ビス（トリメチルシリル）アミドナトリウムおよびHMPAの存在下でブロモ-イソプレニルリンカー（１）を用いてMPAエステルの5’位で置換することにより、MPA5’イソプレニルTBDPS誘導体が得られた。TBDPS基を加水分解して、5’-イソプレニル[0H]-MPA[OMEM]（５）を得た。この重要な中間体アルコールは、トリエチルアミンの存在下でジスクシンイミジルカーボネートで処理することによりN-ヒドロキシスクシンイミジルカーボネートに変換することにより活性化されている。この活性化カーボネートは単離せずに用いて、アミノ改変薬物に結合させ、ウレタン結合を有するMPA薬物コンジュゲートを得た。このウレタン結合は、1,,1’-カルボニルジイミダゾールまたはp-ニトロフェニルクロロホルメートによる該アルコールの活性化およびその中間体とアミノ基改変薬物誘導体との反応を用いることにより作製してもよい。この合成は、ブロモ-ビスイソプレニルTBDPSを用いることにより、MPAビス-イソプレニル薬物コンジュゲートにまで拡大することができる。このブロモ-ビスイソプレニルTBDPSは、J. Org. Chem, 62, 3529 (1997)にクロロ-ビス-イソプレニルTBDPSに関して記載されているような文献記載の手順に従って、ゲラニオール誘導体から調製できる。
【００３３】
ミコフェノール酸によるIMPDHの阻害はAnderson, J.H.ら, Journaol of Biological Chemistry 243(18):4762-4768(1968)に記載されている。IMPDHのインヒビターは米国特許第5,380,879号、同第5,444,072号、同第5,493,030号、同第5,536,747号、同第5,633,279号および同第5,807,876号ならびにPCT出願公開第WO94/01105号および第WO94/12184号にも記載されている。
【００３４】
大腸菌におけるヒトIMPDHのクローニングおよび発現はKonno, Y.ら, J. Biol. Chem 266(1):506-509(1991)に記載されている。Collart, F.R.らの米国特許第5,665,583号(1997)にも大腸菌におけるヒトIMPDHのクローニングおよび発現が記載されている。
【００３５】
アナライトとは、液体媒体中でのその存在または量を測定しようとする物質または物質群をいい、任意の薬物もしくは薬物誘導体、ホルモン、タンパク質抗原またはオリゴヌクレオチドを含むものである。
【００３６】
抗体、または好ましくは受容体とは、アナライトの特異的結合パートナーを意味し、リガンドに対して他の物質を排除する程の特異的結合親和性を有する任意の物質または物質群である。
【００３７】
リガンドとは、アナライトに対する抗体の結合親和性に関して本質的にアナライトと同様に挙動する任意の物質または物質群を意味し、任意の薬物もしくは薬物誘導体およびそれらの異性体、ホルモン、ポリペプチドまたはヌクレオチドを含むものである。
【００３８】
薬物の測定の一例は、Salamone, S.J.ら, 米国特許第5,618,926号(1997)に記載のモルフィンチオシアネートまたはコカインNHSエステル誘導体を、ミコフェノール酸もしくはMPA誘導体または任意のIMPDHのインヒビターの4’-または5’-置換アルキルアミノ誘導体に結合させて、未知サンプル中のモルフィンまたはコカインを測定することを含む。薬物の濃度をIMPDHの活性に対してプロットすることにより、定量的アッセイとすることができる。
【００３９】
本発明はまた、特定の目的DNAまたはRNAの存在を判定するための分子診断にも用い得る。この場合、ヌクレオチド−ミコフェノール酸コンジュゲート（N−MPA）は、オリゴヌクレオチド鎖の一部になっていない場合にIMPDHを阻害できる。このN−MPAが一旦オリゴヌクレオチド鎖に取り込まれると、該コンジュゲートのミコフェノール酸部分のIMPDHを阻害する能力はモジュレートされる。
【００４０】
該N−MPAコンジュゲートは、当業界で周知の手順に従って調製できる。該ヌクレオチドは、それがオリゴヌクレオチドを合成する酵素の基質となるように、糖、塩基またはリン酸部分から誘導体化できる。例えば、誘導体化ヌクレオチド塩基は、親電子物質（electrophile）または求核物質（nucleophile）を含むテザー(tether)を有してもよい。この誘導体は次いで、適切に誘導体化されたMPA分子と反応させてN−MPAコンジュゲートを形成することができる。
【００４１】
このアッセイは、ある割合（percentage）の該N−MPAコンジュゲートを、該オリゴヌクレオチドの合成に用いられるヌクレオチド混合物に添加することにより行われる。サンプルを該酵素および該オリゴヌクレオチドを重合するのに用いられるプローブと共に添加するが、DNAポリメラーゼおよびRNAポリメラーゼがそのような重合化酵素の例である。重合工程の終了時に、IMPDHを適切なIMPDH反応物質と共に添加する。該サンプルが目的のオリゴヌクレオチド配列を含んでいない場合、オリゴヌクレオチド合成は進行せず、N−MPAは遊離してIMPDHを阻害する。目的の配列がサンプル中に存在する場合、N−MPAは該オリゴヌクレオチドに取り込まれ、IMPDHの阻害に利用可能なN−MPAコンジュゲートはほとんどなくなる。遊離N−MPAの濃度はIMPDHの活性と反比例する。遊離N−MPAが消費されるほど、IMPDH活性は高くなる。
【００４２】
このアッセイは、特定の目的のDNAまたはRNA分子の存在を判定するための定性ベースおよび定量ベースの両者で使用できる。サンプル中に存在する目的物の量はIMPDHの活性に比例する。
【００４３】
MPA誘導体によるIMPDHの活性のモジュレーションはタンパク質抗原の検出にも適用できる。より大きな抗原のエピトープまたはミミトープ（mimitope）を表す短いポリペプチドは、当業界で公知の方法に従って、適切に誘導体化されたMPA分子に結合可能な基を含むように誘導体化して、ポリペプチド−MPAコンジュゲート（PP−MPA）を形成することができる。Amerongen, A.V.ら, Peptide Research 5(5):269-274(1992)を参照されたい。
【００４４】
該アッセイは、臨床サンプルをPP−MPA、抗体もしくは関心のある抗原に対して選択的である適切な結合パートナー、IMPDH、およびこのIMPDHアッセイで用いられる適切な試薬と混合することにより行う。サンプルが抗原を含まない場合、PP−MPAコンジュゲートは該抗体により結合され、IMPDHの阻害に利用できなくなる。サンプルが、特定の目的の抗原（そのために該アッセイを設計したもの）を含んでいる場合、該PP−MPAコンジュゲートは、存在する限られた抗体について該抗原と競合する。IMPDHの阻害の量は、サンプル中に存在する遊離の抗原の量に比例する。定量的アッセイは、抗原の濃度をIMPDHの活性の量に対してプロットすることにより得られる。存在する抗原の量はIMPDHの活性の量に反比例する。
【００４５】
以下の非限定的な実施例を参照することにより、本発明のさらに完全な理解が得られるであろう。
【００４６】
用いられる略語
ACES    N-[2-アセトアミド]-2-アミノエタンスルホン酸
DADOO  1,8-ジアミノ-3,6-ジオキサ-オクタン2,2’-（エチレンジオキシ）ビス-エチルアミン
DCC    1,3-ジシクロヘキシルカルボジイミド
DMF    N,N-ジメチルホルムアミド
DMPU  1,3-ジメチル-3,4,5,6-テトラヒドロ-2(1H)-ピリミジノン
EDC    1-エチル-3(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド
HMPA    ヘキサメチルホスホラミド
MEM    2-メトキシエトキシメチル
NaHMDS  ナトリウムビス（トリメチルシリル）アミド
NHS    N-ヒドロキシスクシンイミド
RP-HPLC  逆相高速液体クロマトグラフィー
TAPSO    3-[N-トリス-(ヒドロキシメチル)メチルアミノ]-2-ヒドロキシ-プロパンスルホネート,Na
TBAF    フッ化テトラブチルアンモニウム
TBDPS    tert-ブチルジフェニルシリル
Tboc    tert-ブトキシカルボニル
TCEP    トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩
THF      テトラヒドロフラン
以下の実施例において、太字の数字は図面中の対応する構造を指す。
【００４７】
実施例１
ミコフェノール酸アッセイのための抗体試薬の調製
１リットルの抗体試薬（すなわち第1の試薬）を以下のようにして調製した。約800mlの脱イオン水を容器に入れ、6.0ｇのACESを添加し、溶解した。２Ｎ NaOHでpHを6.0に調整した。次に、0.53gのNADを添加し、完全に溶解した。次に、10mlの腹水抗MPAモノクローナル抗体を添加した。次に、0.95ｇのアジ化ナトリウムを添加して溶解し、最後に1.0ｇのSUTTOCIDE A（GAF Chemicals Corp.）を添加して溶解した。脱イオン水で容量を１リットルに調整した。
【００４８】
【表１】
0003737968.tif 000004
用いた抗体は、AlexanderらによりPCT特許出願公開第WO96/02004号(1996)に記載されている手順に従って調製した。本発明の実施では、MPAに対する特異性を有する任意の抗体（モノクローナルまたはポリクローナル）を用い得る。しかし、モノクローナル抗体は、作製が容易であり一貫性があるので、通常は好ましい。
【００４９】
実施例２
ミコフェノール酸アッセイのための酵素試薬の調製
１リットルの酵素試薬（すなわち第2の試薬）を以下のようにして調製した。約800mlの脱イオン水を容器に入れ、56.3ｇのNaTAPSOを添加し、完全に溶解した。次に、81.6ｇの酢酸ナトリウム-3H2Oを添加して溶解した。次に、1.15ｇのTCEPを添加して溶解した。次に、0.319ｇのIMPを添加して溶解し、次に2.23ｇのNa2ESTAを添加して溶解した。次に、1.0ｇのSUTTOCIDE Aを添加して溶解した。容量を脱イオン水で１リットルに調整した。約13.4mlの組換えヒトIMPDH-IIを添加し（大腸菌溶解物）、完全に溶解して、37℃にて５分かけて340nmにおける4400×10-4の吸光度変化を達成した。次に、0.002ｇのリガンド−インヒビターコンジュゲート（MPA−MPA、実施例42）を添加して溶解した。
【００５０】
IMPDH-IIのクローニングおよび精製に用いた手順は、Carr, S.F.ら, J. Biological Chemistry 268(36):27286-27290(1993)に記載されており、その内容は引用により本明細書に組み入れる。IMPDHのクローニングは、Collart, F.R.ら,米国特許第5,665,583号(1997)にも記載されている。天然の供給源に由来するIMPDHは市販されていない。MPA、MPA誘導体またはIMPDHの不競合的インヒビターにより阻害されるIMPDHのどのような天然の供給源も好適である。
【００５１】
試薬成分の有効量は特定の要件に応じて様々に変わり、特定のアッセイ要件を満足するように簡単な実験室での実験により調整することができる。
【００５２】
リガンド−インヒビターの濃度は、該リガンドに対する特異的な抗体を用いた場合および用いない場合での該リガンド−インヒビターによるIMPDH阻害の程度に基づいて選定した。イムノアッセイで用いるために、抗体を用いた場合と用いない場合との阻害の変化率の最大の差を選んだ。一般に、インヒビターの濃度がそのIC50値よりもわずかに低く、かつ抗体のモル濃度がリガンド−インヒビターのモル濃度の半分よりもわずかに少ない場合に、IMPDH阻害の変化率の最大の差が得られることが判明した。抗体当たり２つの結合部位を有する場合、リガンド結合部位の総数は、リガンド−インヒビターの総モル濃度よりもわずかに少なかった。酵素活性は、リガンド−インヒビターのIC50値にわずかな影響を及ぼした。酵素活性が低くなるほど、リガンド−インヒビターのIC50値は低くなった。これは、Nowak, I.らのTherapeutic Drug Monitoring 19, 358-360(1997)と一致する。したがって、IMPDHの活性は、リガンド−インヒビターについて最低のIC50値が得られるように調整した。
【００５３】
【表２】
0003737968.tif 000005
実施例３
ミコフェノール酸の測定
ミコフェノール酸を添加したヒト血漿サンプルを、本発明の方法を用いてMPAについてアッセイした。HITACHI 717アナライザー（Roche Diagnostics Corp., Indianapolis）をプログラムして、３μlのサンプルおよび150μlの抗体試薬を計量して37℃のキュベットに入れ、次にそれらを混合し、５分間インキュベートし、その後、150μlの酵素試薬を添加して混合した。340nmにおける吸光度の差を、最初の酵素試薬添加から酵素試薬添加の５分後まで算出した。
【００５４】
【表３】
0003737968.tif 000006
表３は、リガンド−インヒビターコンジュゲート（MPA−MPA）、MPA抗体およびミコフェノール酸アナライト（MPA）の濃度の関数としてのIMPDHの活性を示す。このデータから、このリガンド−インヒビターコンジュゲートが、均一系イムノアッセイに必要とされる有用な阻害特性を有すること、すなわち、該リガンド−インヒビターコンジュゲートがIMPDHおよびその特異的抗体の両者により結合され、この結合が互いに排他的な事象であることが示される。サンプルセットＡでは、該試薬は抗体もリガンド−インヒビターも含んでおらず、最大のIMPDH活性を生じた。サンプルセットＢでは、酵素試薬はリガンド−インヒビターを含有しており、リガンド−インヒビターのIMPDH活性に及ぼす影響を示すために用いた。サンプルセットＣは、抗体およびリガンド−インヒビターの両者が存在する場合のMPAによるIMPDH活性のモジュレーションを示すために設定した。サンプルセットＤでは、抗体試薬中にはMPAまたはMPA−MPAコンジュゲートに結合するのに十分な抗体は存在せず、不十分な抗体濃度の影響を示す。サンプルセットＥでは、MPAの大部分に結合するのに十分な抗体が存在し、MPAにだけ結合する抗体の影響を示す。これらの結果を、サンプルセットＡを用いて見られる抗体を用いない場合に得られた結果と比較する。
【００５５】
実施例４
ブロモ-イソプレニルリンカー、MPA-メチルエステルおよび3-β-アミノ-ジゴキシゲニンの調製
ブロモ-イソプレニルリンカー（１）は、Stephanie E. SenおよびGregory J. EwingによりJ. Org. Chem. 62:3529-3536(1997)に公表された手順に従って調製した。
【００５６】
MPAメチルエステル（２）は、William A. Lee, Leo Gu, Andrew R. Miksztal, Nancy Chu, Kwan LeungおよびPeter H. NelsonによりPharmaceutical Research 7,161-166(1990)に公表された手順に従って調製した。
【００５７】
3-β-アミノ-ジゴキシゲニンは、Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 9, 771-744(1999)に公表された手順に従って調製した。
【００５８】
テオフィリンアミン（17）はPCT特許出願公開第WO87/07955号(1987)に公表された手順に従って調製した。
【００５９】
実施例５
5’-イソプレニル[OTBDPS]-MPAメチルエステル（３）の調製
4.02ml（4.01mmol）のナトリウムビス（トリメチルシリル）アミドの溶液［テトラヒドロフラン(THF)中での１Ｍ溶液］を、アルゴン雰囲気下、ドライアイス／アセトン浴内で冷却した。この反応混合物に、600mg（1.79mmol）のMPAメチルエステル（２）を７mlの無水THFに溶解した溶液を滴下した。得られた溶液を−78℃で30分間攪拌し、84mg（0.46mmol）のヘキサメチルホスホラミド（HMPA）を２mlのTHFに溶解した溶液を添加した。この反応混合物を−78℃で15分間攪拌し、840mg（2.08mmol）のブロモ-イソプレニルリンカー（１）を２mlのTHFに溶解した溶液を滴下した。該ドライアイス浴を外し、反応物を20分かけてゆっくりと室温まで温めた。該反応混合物を５mlの飽和塩化アンモニウムで反応停止させた。該反応混合物に、100mlの水を添加し、200mlの酢酸エチルで抽出した。有機層を分離し、水性部分を酢酸エチルで再抽出した（３×100ml）。合せた有機部分を100mlの食塩水で洗浄し、乾燥し（Na2SO4）、濃縮した。この粗生成物を20％酢酸エチル（ヘキサン中溶液）を用いてシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、501mg（43％、0.76mmol）の5’-イソプレニル[OTBDPS]-MPAメチルエステル（３）を得た。
【００６０】
実施例６
5’-イソプレニル[OTBDPS]-MPA[OMEM]メチルエステル（４）の調製
240mg（0.36mmol）の３を５mlの無水ジクロロメタンに溶解した溶液を氷浴内で冷却した。この反応混合物に、76μl（0.433mmol）のN,N-ジイソプロピルエチルアミン、続いて42μl（0.36mmol）の塩化2-メトキシエトキシメチルを添加した。この混合物を、氷浴内で１時間および室温で18時間攪拌した。この混合物を15mlのジクロロメタンで希釈した。有機層を３×20mlの水で洗浄し、乾燥し（Na2SO4）、濃縮した。この粗生成物を60％ヘキサン（酢酸エチル中溶液）を用いてシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、175mg（0.23mmol、64％）の４を得た。
【００６１】
実施例７
5’-イソプレニル[OH]-MPA[OMEM]メチルエステル（５）の調製
1.09ｇ（1.46mmol）の４を40mlのTHFに溶解した溶液を０℃に冷却した。この冷却溶液に、4.37ml（4.35mmol）のフッ化テトラブチルアンモニウム（THF中での１Ｍ溶液）をアルゴン雰囲気中で添加した。この反応混合物を０℃で1.5時間および室温で１時間攪拌した。この反応混合物を５mlの水で反応停止させ、濃縮した。この反応混合物を75mlのジクロロメタンで希釈し、３×75mlの水で洗浄し、乾燥し（Na2SO4）、濃縮した。この粗生成物を80％酢酸エチル（ヘキサン中溶液）を用いてシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、408mg（0.806mmol、55％）の５を得た。
【００６２】
実施例８
L-チロキシン[N-tBoc]（６）の調製
磁気攪拌した4.5ｇ（5.8mmol）のL-チロキシン、18mlのDMF、5.85mlの１Ｎ NaOH、495mgのNaHCO3および18mlの水の混合物を得た。この懸濁液に、1.28ｇ（5.8mmol）のジ-t-ブチルジカーボネートを18mlのジメチルホルムアミドに溶解したものを添加した。得られた反応混合物を４時間攪拌し、次いで室温で減圧下で濃縮した。残留物に、45mlのメタノールを添加し、未溶解の物質を濾別した。濾液に、沈殿が完了するまで１Ｎ HCl（20ml）を添加した。固形物を濾過し、風乾して、4.2ｇ（4.78mmol、82％）のL-チロキシン[N-tBoc]（６）を得た。
【００６３】
実施例９
L-チロキシン(N-tBoc)-アミドエチレンアミン（７）の調製
500mg（0.57mmol）のL-チロキシン(N-tBoc)（６）に、15mlの無水DMFを添加し、続いて149mg（1.29mmol）のN-ヒドロキシスクシンイミドおよび283mg（1.47mmol）の1-エチル-3-(3-ジメチルアミノ-プロピル)カルボジイミドを添加した。この混合物を室温で３時間攪拌した。この活性化エステルはその場（in situ）で次の工程に用いた。
【００６４】
5.5mlの無水ピリジンに、1.5ml（22mmol）のエチレンジアミンを添加した。この混合物を室温で５分間攪拌し、先に調製したチロキシン活性化エステル（in situで調製したもの）をこの溶液に滴下した。この混合物を室温で48時間攪拌した。この反応混合物を濃縮し、100mlの飽和Na2CO3溶液を添加した。固形物を濾別し、100mlの水で洗浄した。この粗固体を50％クロロホルム（メタノール中溶液）を用いてカラムクロマトグラフィーにより精製して、250mg（0.27mmol、48％）の７を得た。
【００６５】
実施例10
5’-[(イソプレニルオキシカルボニルアミノエチレンアミド)-チロキシン(N-tBoc)]-MPA[OMEM]メチルエステルコンジュゲート（８）の調製
25mg（0.049mmol）の（５）に、１mlのTHFを添加し、続いて12.6mg（0.046mmol）のN,N’-ジスクシンイミジルカーボネートおよび20μlのトリエチルアミンを添加した。この混合物を室温で18時間攪拌して、対応するN-ヒドロキシスクシンイミジルカーボネートを得た。
【００６６】
L-チロキシン-[N-tBoc]-アミドエチレンアミン（７、22mg、0.023mmol）を１mlの無水DMFに溶解し、100μlのトリエチルアミンを添加した。この溶液に、先に調製したMPA−N-ヒドロキシスクシンイミジルカーボネート溶液（in situで調製したもの）を滴下した。この反応物を室温で30分間攪拌し、ロータリーエバポレーターで濃縮した。残留物を、0.1％のトリフルオロ酢酸を含有する水／アセトニトリル勾配系を用いて分取RP-HPLC［Rainin C-18(ODS)21.4mm×250mm］により精製した。生成物を含有する画分を合わせ、アセトニトリルを留去し、残留した混合物を凍結乾燥して、24mg（0.016mmol、34％）の８を得た。
【００６７】
実施例11
5’-[(イソプレニルオキシカルボニルアミノエチレンアミド)-チロキシン(N-tBoc)]-MPA[OMEM]コンジュゲート（９）の調製
22mg（0.015mmol）の5’-[(イソプレニルオキシカルボニルアミノエチレンアミド)-チロキシン(N-tBoc)]-MPA[OMEM]メチルエステル（８）に、２mlのメタノールおよび40mg（1.6mmol）の水酸化リチウム（１mlの水に溶解したもの）を添加した。この混合物を室温で２日間攪拌し、ロータリーエバポレーターで濃縮した。この反応混合物に２mlの水を添加し、希リン酸を用いてpHを６に調整した。この反応液を濃縮乾固し、100mlのメタノールを添加した。この混合物を濾過し、濾液を濃縮した。残留物を、0.1％のトリフルオロ酢酸を含有する水／アセトニトリル勾配系を用いて分取RP-HPLC［Rainin C-18(ODS)21.4mm×250mm］により精製した。生成物を含有する画分を合わせ、アセトニトリルを留去し、残留した混合物を凍結乾燥して、11mg（0.007mmol、52％）の９を得た。
【００６８】
実施例12
5’-[(イソプレニルオキシカルボニルアミノエチレンアミド)-チロキシン]-MPAコンジュゲート（11）の調製
５mg（0.003mmol）の5’-[(イソプレニルオキシカルボニルアミノエチレンアミド)-チロキシン(N-tBoc)]-MPA[OMEM]メチルエステルコンジュゲート（９）に、1.5mlのジクロロメタンを添加し、この溶液を０℃に冷却した。この溶液に、200μlの50％トリフルオロ酢酸（ジクロロメタン中溶液）の氷冷溶液を５分間隔で２回に分けて添加した。この混合物を氷浴内でさらに15分間攪拌した。これを減圧下で濃縮した。生成物の形成は、0.1％のトリフルオ酢酸を含有する水／アセトニトリルの勾配系を用いて分析用RP-HPLC［C-18、Vydac 4.6mm×250mm］によりモニターした。この反応液をトリフルオロ酢酸処理に再度供した。粗反応混合物を1.5mlのジクロロメタンに再溶解し、この溶液を０℃に冷却した。この溶液に、200μlの50％トリフルオロ酢酸（ジクロロメタン中溶液）の氷冷溶液を５分間隔で２回に分けて添加した。この混合物を０℃で25分攪拌した。この反応混合物をロータリーエバポレーターで、次いで高真空ポンプで濃縮した。生成物の形成は、0.1％のトリフルオロ酢酸を含有する水／アセトニトリルの勾配系を用いて分析用RP-HPLC［C-18、Vydac 4.6mm×250mm］によりモニターした。その結果から、この反応物が主にMEM-脱保護5’-[(イソプレニルオキシカルボニルアミノエチレンアミド)-チロキシン(N-tBoc)]-MPA（10）と幾らかの目的の生成物（11）とを含むコンジュゲート混合物であることが示された。
【００６９】
上記の生成物を再度、トリフルオロ酢酸処理に供した。上記の反応混合物を２mlのジクロロメタンで処理し、氷浴内で冷却した。この混合物に、600μlの50％トリフルオロ酢酸（ジクロロメタン中溶液）の氷冷溶液を５分間隔で３回に分けて添加した。この混合物を該氷浴内でさらに25分間攪拌した。この混合物を減圧下で濃縮した。粗生成物を、0.1％のトリフルオ酢酸を含有する水／アセトニトリルの勾配系を用いて半分取RP-HPLC［C-18、Vydac 10mm×250mm］により精製した（３ml／分）。生成物を含有する画分を合わせ、アセトニトリルを留去し、残留した混合物を凍結乾燥して、1.8mg（0.0013mmol、45％）の11を得た。
【００７０】
実施例13
MPA t-ブチルエステル（12）の調製
ミコフェノール酸（860mg、2.68mmol）を、700μlの濃H2SO4を含有する1,4-ジオキサンの溶液に溶解した。この溶液を加圧ビンに移し、これを氷上で冷却した。イソブチレン（20m）をそのミコフェノール酸溶液に注いだ。この加圧ビンに栓をし、室温で2日間にわたり非常にゆっくり磁気攪拌した。この混合物をドライアイス／アセトン下で冷却し、圧力をゆっくり解除した。この混合物を室温まで温め、150mlの酢酸エチルで希釈した。水性部分を分離し、３×100mlの酢酸エチルで抽出した。合せた有機層を100mlの水、100mlの飽和NaHCO3、続いて100mlの水で洗浄し、乾燥し（Na2SO4）、濃縮した。粗生成物を、80％ヘキサン（酢酸エチル中溶液）を用いてシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、590mg（1.63mmol、60％）のMPA t-ブチルエステル（12）を得た。
【００７１】
実施例14
5’-エトキシカルボニルメチル-MPA t-ブチルエステル（13）の調製
3.2ml（3.19mmol）のナトリウムビス（トリエチルシリル）アミドの溶液（THF中での1.0Ｍ溶液）をドライアイス／アセトン浴内でアルゴン雰囲気下で−78℃に冷却した。この冷却溶液に、0.32ml（2.64mmol）のDMPUを添加し、−78℃で15分間攪拌した。この反応混合物に、398mg（1.10mmol）のMPA t-ブチルエステル（12）の溶液（５mlの新たに蒸留したTHF中溶液）を滴下した。この反応混合物を−78℃で30分間攪拌し、0.18ml（1.61mmol）のブロモ酢酸エチルを添加した。得られた混合物を−40℃で３時間および０℃で１時間攪拌した。この反応液を10mlの飽和塩化アンモニウムで反応停止させ、この混合物を室温まで温めた。さらに80mlの飽和塩化アンモニウムを添加し、水性部分を酢酸エチルで抽出した（３×80ml）。有機層を合わせ、乾燥し（Na2SO4）、濃縮した。粗生成物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより、まず80％ヘキサン（酢酸エチル中溶液）で、次いで50％酢酸エチル（ヘキサン中溶液）で溶出することにより精製して、不純物を含有する生成物330mgを得た。これを、0.1％のトリフルオロ酢酸を含有する水／アセトニトリルの勾配系を用いて分取RP-HPLC［Rainin C-18(ODS) 21.4mm×250mm］により再精製した。生成物を含有する画分を合わせ、アセトニトリルを留去し、残留した混合物を凍結乾燥して、163mg（0.35mmol、32％）の13を得た。
【００７２】
実施例15
5’-カルボキシメチル-MPA t-ブチルエステル（14）の調製
141mg（0.30mmol）の13の溶液を41.1mlのDMSO中で調製した。これを81mlの0.1Ｍリン酸カリウム緩衝液（pH 7.0）で希釈し、306μlのエステラーゼ（ブタの肝臓由来、Roche Diagnostics, 懸濁液 10mg/ml）を添加した。この反応混合物を室温で３日間攪拌し、濾過した。濾液は、分取RP-HPLC［WATERS DELTAPAK C-18 50×250mm、0.1％のトリフルオロ酢酸を含有する水／アセトニトリル系］を用いて精製した。生成物を含有する画分を合わせ、アセトニトリルを留去し、混合物を凍結乾燥して、76mg（0.17mmol、57％）の5’-カルボキシメチル-MPA t-ブチルエステル（14）を得た。
【００７３】
実施例16
5’-(ジゴキシゲニン-3-イル-β-アミドメチル)-MPA t-ブチルエステルコンジュゲート（15）の調製
5’-カルボキシメチル-MPA t-ブチルエステル（20mg、46μmol）を193μlのDMFに溶解した。この反応混合物に、7.95mg（69μmol）のN-ヒドロキシスクシンイミドおよび11.4mg（55.2μmol）のDCCを添加した。この反応混合物を室温で３時間攪拌した。さらに2.65mg（23μmol）のN-ヒドロキシスクシンイミドおよび2.85mg（13.8μmol）のDCCを55μlのDMFに溶解したものを添加し、反応混合物を室温で１時間攪拌した。23.2mg（46μmol）の3-β-アミノ-ジゴキシゲニンを63.8μl（460μmol）のトリエチルアミンおよび120μlのDMFに溶解した溶液を添加した。この反応混合物を室温で１時間攪拌し、蒸発させて、68mgの粗生成物（15）を得た。これは、さらに精製せずに次の工程で用いた。
【００７４】
実施例17
5’-(ジゴキシゲニン-3-イル-β-アミドメチル)-MPAコンジュゲート（16）の調製
5’-(ジゴキシゲニン-3-イル-β-アミドメチル)-MPA t-ブチルエステル（15）の粗生成物を３mlのジクロロメタンに溶解した。この反応混合物に、３mlのトリフルオロ酢酸を添加し、この溶液を室温で正確に30分間攪拌した。次にこの溶液を蒸発させ、残留物を直ちに以下のようにして精製した。
【００７５】
残留物を1.5mlのメタノールに溶解し、直ちに半調製用RP-HPLC［Vydac C-18 300Å 10μm 22×250mm、0.1％のトリフルオロ酢酸を含有する水／アセトニトリル系］を用いて精製して、7.3mgの異性体Ａ（16A）および7.4mgの異性体Ｂ（16B）を得た。
【００７６】
【表４】
0003737968.tif 000007
実施例１８
チロキシンアッセイのための抗体試薬の調製
抗体試薬、または第１試薬１Lを以下のようにして調製した。脱イオン水約 800 mlを容器に注ぎ入れ、N-[2-アセトアミド]-2-アミノエタンスルホン酸(ACES)6.0 gを添加して溶解させた。2N NaOHでpHを6.0に調整した。次に、NAD 0.663 gを添加して完全に溶解させた。その後、アジ化ナトリウム 0.95 gを添加して溶解させ、最後にSUTTOCIDE A 1.0 gを添加して溶解させた。脱イオン水で容積を１Lに調整した。最後に、抗L-チロキシンモノクローナル抗体 10 mgを添加した。
【００７７】
【表５】
0003737968.tif 000008
使用した抗体は、本発明が属する分野の技術者が容易に入手し得るものでかつ既知の手法にしたがって調製した。本発明の実施において、モノクローナルまたはポリクローナルのいずれでも、チロキシンに特異性を持つあらゆる抗体を使用することができる。しかし、製造の容易性および一貫性の理由から、モノクローナル抗体が一般的に好ましい。
【００７８】
実施例１９
チロキシンアッセイのための酵素試薬の調製
酵素試薬、または第2試薬１Lを以下のようにして調製した。脱イオン水約800 mlを容器に注ぎ入れ、NaTAPSO 168.8 gを添加して完全に溶解させた。次に、TCEP 1.15 gを溶解させた。次にIMP 31.4 gを溶解させ、その後Na２EDTA 2.23 gを溶解させた。次にSUTTOCIDE A 1.0 gを溶解させた。脱イオン水で容積を１Lに調整した。（大腸菌溶菌上清の35％硫酸アンモニウム沈殿物として）十分な組換えヒトIMPDH-IIを添加して完全に溶解させ、37℃で5分間にわたって340 nmにおける吸光度の変化が780×10-4に達するようにした。次に、リガンドインヒビターである5'-[(イソプレニルオキシカルボニルアミノエチレンアミド)-チロキシン]-MPAコンジュゲート（11）0.0005 gを添加して溶解させた。
【００７９】
【表６】
0003737968.tif 000009
実施例２０
チロキシンの測定
本発明の方法を使用して、L-チロキシンを添加した生理食塩水サンプルをチロキシンについてアッセイした。サンプルは、生理食塩水中にL-チロキシン（Sigma Chemical）を懸濁させ、1N NaOHの滴下によって溶解させ、その後生理食塩水で希釈して最終濃度100、250、500および1000 ng/mlとすることによって調製した。
【００８０】
HITACHI 917分析機（Roche Diagnostics Corp.,Indianapolis）を、37 ℃キュベットにサンプル 3μlおよび抗体試薬 150μlを注入するようにプログラムし、次にこれを混合して5分間インキュベートし、その後酵素試薬 150μlを添加して混合した。酵素試薬添加後3分13秒から4分42秒までの時間（読取りウインドウ 29-34）の340 nmの反応率（mA／分）を算出した。得られた結果を図２に示す。
【００８１】
実施例２１
ジゴキシゲニンアッセイのための抗体試薬の調製
抗体試薬、または第１試薬１Lを以下のようにして調製した。脱イオン水約800 mlを容器に注ぎ入れ、ACES 6.0 gを添加して溶解させた。2N NaOHでpHを6.0に調整した。次に、NAD 0.53 gを添加して完全に溶解させた。その後、アジ化ナトリウム 0.95 gを添加して溶解させ、最後にSUTTOCIDE A 1.0 gを添加して溶解させた。脱イオン水で容積を１Lに調整した。最後に、抗ジゴキシゲニンモノクローナル抗体 25 mgを添加した。
【００８２】
【表７】
0003737968.tif 000010
使用した抗体は市販品（Roche Cat.No.1333062）である。しかし、本発明の実施において、モノクローナルまたはポリクローナルのいずれでも、ジゴキシゲニンに特異性を持つあらゆる抗体を使用することができる。しかし、製造の容易性および一貫性の理由から、モノクローナル抗体が一般的に好ましい。
【００８３】
実施例２２
ジゴキシゲニンアッセイのための酵素試薬の調製
酵素試薬、または第2試薬１Lを以下のようにして調製した。脱イオン水約800 mlを容器に注ぎ入れ、NaTAPSO 56.3 gを添加して完全に溶解させた。次に、酢酸Na-3H２O 81.6 gを添加して溶解させた。次に、TCEP 1.15 gを溶解させた。次にIMP 0.319 gを溶解させ、その後Na２EDTA 2.23 gを溶解させた。次にSUTTOCIDE A 1.0 gを溶解させた。脱イオン水で容積を１Lに調整した。（大腸菌溶菌上清の35％硫酸アンモニウム沈殿物として）十分な組換えヒトIMPDH-IIを添加して完全に溶解させ、37℃で5分間にわたって340 nmにおける吸光度の変化が1280×10-4に達するようにした。次に、リガンドインヒビターである4'-[(ジゴキシゲニン-3-イル)-オキシメチルカルボニル-DADOO-カルボニルメチル]-MPAまたは5'-[(ジゴキシゲニン-3-イル)-オキシメチルカルボニル-DADOO-カルボニルメチル]-MPA 0.001 gを添加して溶解させた。
【００８４】
【表８】
0003737968.tif 000011
実施例２３
ジゴキシゲニンの測定
本発明の方法を使用して、ジゴキシゲニンを添加した生理食塩水サンプルをジゴキシゲニンについてアッセイした。ジゴキシゲニン（Sigma Chemical）を最初に100％ DMSO中に溶解させ、その後正常ヒト血漿に添加して濃度 0.5、1.0、5.0および10.0μg/mlとした。HITACHI 717分析機（Roche Diagnostics Corp.,Indianapolis）を、37℃キュベットにサンプル 20μlおよび抗体試薬 150μlを注入するようにプログラムし、次にこれを混合して5分間インキュベートし、その後の時点で酵素試薬 150μlを添加して混合した。最初の酵素試薬添加時から酵素試薬添加後5分までの340 nmにおける吸光度の差異を算出した。得られた結果を図３に示す 。
【００８５】
この実施例から、4'または5'のいずれの位置で調製したコンジュゲートも本発明において使用可能であることが示される。
【００８６】
実施例２４
ジゴキシゲニンアッセイのための抗体試薬の調製
抗体試薬、または第１試薬１Lを以下のようにして調製した。脱イオン水約800 mlを容器に注ぎ入れ、ACES 6.0 gを添加して溶解させた。2N NaOHでpHを6.0に調整した。次に、NAD 0.663 gを添加して完全に溶解させた。その後、アジ化ナトリウム 0.95 gを添加して溶解させ、最後にSUTTOCIDE A 1.0 gを添加して溶解させた。脱イオン水で容積を１Lに調整した。最後に、抗ジギトキシンモノクローナル抗体 10 mgまたは15 mgを添加した。
【００８７】
【表９】
0003737968.tif 000012
ジゴキシゲニン異性体Ｂについては、より少量のモノクローナル抗体を使用した。その理由は、このインヒビターについてはより少量のモノクローナル抗体でより良好なアッセイ感度が観察されるからである。これは、このインヒビターとのIMPDHの結合と、このインヒビターとのモノクローナル抗体の結合との間における改善された競合によるのかもしれない。これはIMPDHおよびモノクローナル抗体に対するインヒビターの親和性が増加した結果であると考えられる。
【００８８】
実施例２５
ジゴキシゲニンアッセイのための酵素試薬の調製
酵素試薬、または第2試薬１Lを以下のようにして調製した。脱イオン水約800 mlを容器に注ぎ入れ、NaTAPSO 168.8 gを添加して完全に溶解させた。次に、TCEP 1.15 gを溶解させた。次にIMP 31.4 gを溶解させ、その後Na２EDTA 2.23 gを溶解させた。次にSUTTOCIDE A 1.0 gを溶解させた。脱イオン水で容積を１Lに調整した。（大腸菌溶菌上清の35％硫酸アンモニウム沈殿物として）十分な組換えヒトIMPDH-IIを添加して完全に溶解させ、37℃で5分間にわたって340 nmにおける吸光度の変化が3300×10-4に達するようにした。次に、リガンドインヒビターである5'-[(ジゴキシゲニン-3-イル)-β-アミドメチル]-MPA（異性体Ａ）または5'-[(ジゴキシゲニン-3-イル)-β-アミドメチル]-MPA（異性体Ｂ）0.0002 gを添加して溶解させた。あるいは、これに代えてリガンドインヒビターである5'-[(ジゴキシゲニン-3-イル)-オキシメチルカルボニル-DADOO-カルボニルメチル]-MPA（ラセミ体）0.0005 gを添加して溶解させた。
【００８９】
【表１０】
0003737968.tif 000013
実施例２６
ジゴキシゲニンの測定
本発明の方法を使用して、ジゴキシゲニンを添加した生理食塩水サンプルをジゴキシゲニンについてアッセイした。ジゴキシゲニン（Sigma Chemical）を最初に100％ DMSO中に溶解させ、その後生理食塩水に添加して濃度0、10、20、30、40、50 、60、70、80、90および100μg/mlとした。HITACHI 917分析機（Roche Diagnostics Corp.,Indianapolis）を、37℃キュベットにサンプル 3μlおよび抗体試薬 150μlを注入するようにプログラムし、次にこれを混合して5分間インキュベートし、その後の時点で酵素試薬 150μlを添加して混合した。最初の酵素試薬添加時から酵素試薬添加後4分42秒までの340 nmにおける吸光度の差異を算出した。得られた結果を図４に示す。
【００９０】
この実施例は、リガンドインヒビターコンジュゲートについて異なる長さのリンカーの使用に関して説明している。
【００９１】
実施例２７
テオフィリンアッセイのための第１試薬の調製
第１試薬１Lを以下のようにして調製した。脱イオン水約800 mlを容器に注ぎ入れ、ACES 6.0 gを添加して溶解させた。2N NaOHでpHを6.0に調整した。次に、NAD 0.66 gを添加して完全に溶解させた。その後、アジ化ナトリウム 0.95 gを添加して溶解させ、最後にSUTTOCIDE A 1.0 gを添加して溶解させた。脱イオン水で容積を１Lに調整した。
【００９２】
【表１１】
0003737968.tif 000014
実施例２８
テオフィリンアッセイのための第2試薬の調製
第2試薬１Lを以下のようにして調製した。脱イオン水約800 mlを容器に注ぎ入れ、NaTAPSO 168.8 gを添加して完全に溶解させた。次に、TCEP 1.15 gを溶解させた。次にIMP 31.4 gを溶解させ、その後Na２EDTA 2.23 gを溶解させた。次にSUTTOCIDE A 1.0 gを溶解させた。脱イオン水で容積を１Lに調整した。（大腸菌溶菌上清の35％硫酸アンモニウム沈殿物として）十分な組換えヒトIMPDH-IIを添加して完全に溶解させ、37℃で5分間にわたって340 nmにおける吸光度の変化が3100×10-4に達するようにした。次に、リガンドインヒビターである5'-[(テオフィリン-8-ブチルアミドエチルアミノカルボニルオキシ)イソプレニル]-MPA（20）0.00027 gを添加して溶解させた。最後に抗テオフィリンモノクローナル抗体 10 mgまたは25 mgを添加した。
【００９３】
【表１２】
0003737968.tif 000015
使用した抗体は、本発明が属する分野の技術者が容易に入手し得るものでかつ既知の手法にしたがって調製した。本発明の実施において、モノクローナルまたはポリクローナルのいずれでも、テオフィリンに特異性を持つあらゆる抗体を使用することができる。しかし、製造の容易性および一貫性の理由から、モノクローナル抗体が一般的に好ましい。
【００９４】
実施例２９
テオフィリンの測定
本発明の方法を使用して、テオフィリンを添加した生理食塩水サンプルをアッセイした。テオフィリン（Sigma Chemical）を最初に生理食塩水に溶解させ（1 mg/10 ml）、その後希釈して濃度 0、5、10、20、40および50μg/mlとした。HITACHI 717分析機（Roche Diagnostics Corp.,Indianapolis）を、37℃キュベットにサンプル 3μlおよび第１試薬 150μlを注入するようにプログラムし、次にこれを混合して5分間インキュベートし、その後の時点で第2試薬 150μlを添加して混合した。最初の第2試薬添加時から第2試薬添加後5分までの340 nmにおける吸光度の差異を算出した。得られた結果を図５に示す。
【００９５】
この実施例では、インヒビターと抗体は同一の試薬中に配合した。この実施例で使用した特定のテオフィリン抗体は、薬剤と比較してインヒビターに対して比較的低い親和性を有していたので、あらかじめインヒビター-抗体コンジュゲートを形成するために、サンプルの添加前にまず抗体とインヒビターを結合させた。その後薬剤を含有するサンプルを添加すると、この薬剤に対する抗体の親和性の方が高いため、薬剤はインヒビターと置き代わり、それによってインヒビターを遊離して酵素を阻害する。
【００９６】
実施例３０
リガンドインヒビターの阻害定数
IC５０（インヒビター定数）とは、酵素活性の50％阻害をもたらすインヒビターのモル濃度である。この実施例を使用して、各種のMPA誘導体による酵素阻害の効力を説明する。
【００９７】
このアッセイでは、IMPDH IIによるIMPからXMPへの転換中のNADHの形成を測定する。分光光度計を使用して、340 nmにおいて40℃で10分間、反応をモニターする。この実施例で使用する手法は、Nelson,P.H.ら、J.Med.Chem.39,4181-4196(1996)に記載のものである。インヒビターを100％ DMSO中で希釈した。
【００９８】
125 mM Tris HCl,pH 8.0、125 mM KCl、3.75 mM EDTA、125 g/ml BSA、0.0625 mM IMPおよび0.125 mM NADを含有する反応バッファー 100 mlを調製した。100mM Tris HCl,pH 8.0、100 mM KCl、3.0 mM EDTA、100 /ml BSAを含有する酵素希釈液 100 mlを調製した。
【００９９】
IMPDH II酵素を酵素希釈液で0.0065 U/mlに希釈した。反応キュベット中の酵素の最終濃度を0.00065 U/mlとした。サンプル（誘導体）をDMSO中に溶解して 1 mg/mlとした。サンプルを100％ DMSOでさらに希釈した。すべての希釈液をあらかじめ調製した 1 mM原液から新たに調製した。
【０１００】
アッセイ形式は以下の通りである：分光光度計中の6つのキュベットに反応バッファー 800μlを添加した。DMSOのみ（対照）または試験するコンジュゲート／MPA誘導体についてサンプル濃縮液 100μlを添加した。反応バッファーおよびサンプルを含むキュベットを反転によって混合した。反応バッファーおよびサンプルを含むキュベットを40℃で5分間インキュベートした。酵素溶液 100μlの添加によって反応を開始させた。キュベットを再度反転によって混合した。反応を340 nmでモニターし、10分間データを取得した。結果を使用してサンプルについてのIC５０を決定した。
【０１０１】
当業者に既知の方法にしたがい、化合物（3）のエステル基の水酸化リチウム加水分解およびTBDPS基の脱保護によって、MPA-イソプレニル（ラセミ体、3A） を調製した。（3）の合成についての記載と同様の手法で、アルキルブロミド（1）による、5'位置での（2）の[(S)-4-ベンジル-2-オキサゾリジノン-1-イル]イミド類似体[Rohloffら、Tetrahedron Lett.,36,7803-7806(1995)]のアルキル化を行い、その後当業者に既知の方法を使用して、TBDPS基の脱保護およびオキサゾリジニル基の加水分解を実施して、キラルMPA-イソプレニル（3B）のR異性体を作成した。
【０１０２】
【表１３】
0003737968.tif 000016
この表は数種のMPA誘導体について取得したIC５０データを示している。IC５０データは、酵素活性を50％低下させるMPAインヒビターのモル濃度である。ｘ軸上のアッセイ混合物中のMPAインヒビターのモル濃度に対するｙ軸上の活性率（MPAインヒビターが全くない場合の酵素速度に対するMPAインヒビターがある場合の酵素速度の比率）のプロットへの非線形曲線の当てはめを使用することによって、IC５０値を決定する。この非線形曲線の当てはめのためにSigma-Plot 4.0ソフトウェアを使用し、以下の回帰式を使用した；双曲線減衰、2パラメーター、ｙ＝ａｂ／（ｂ＋ｘ）、式中、ｙ＝活性率、ｘ＝インヒビターのモル濃度、ａ＝１、およびｂ＝IC５０。
【０１０３】
このIC５０の結果は、IMPDHのMPA誘導体インヒビターの5'位置のキラリティー(chirality)の重要性を示しており、そして本発明者らのより効力のある鏡像体の空間幾何構造はSmith,D.B.ら、Journal of Organic Chemistry 61,2236-2241(1996)と一致している。
【０１０４】
プロトタイプインヒビターとして、MPA親構造に結合した薬剤(MPA)を有するMPA-MPA誘導体を使用した。MPA-MPAはMPAについてのイムノアッセイにおいてプロトタイプ薬剤インヒビターとして作用することが証明されているので、このインヒビターに関するIC５０値の尺度がMPAだけではなく新規な薬剤についてもイムノアッセイの成功の予測手段となり得る。比較的低いIC５０値を有する薬剤インヒビターは、IMPDH活性のより強力なインヒビターとなり、したがって記載したイムノアッセイについて有用であると考えられる。例えば、MPA-チロキシンイソプレニルは比較的低いIC５０値を有し、イムノアッセイにおいて、MPA-テオフィリンよりも感度が大きかった。また、キラル誘導体はIMPDHのより強力なインヒビターであり、MPA誘導体のS鏡像体がより効力があることを報告している既報と合致する（J.Org.Chem.61,2236-2241(1996)）。
【０１０５】
＊これらの誘導体に関するIC５０値は少し異なる方法を使用して決定した。これらの誘導体については、第2試薬に抗体を添加せず、またサンプルとして生理食塩水のみを使用した以外は、チロキシンについて実施例２０、テオフィリンについて実施例２９の記載にしたがって、インヒビターを含む場合と含まない場合の酵素速度を決定した。HITACHI 917を使用して、それぞれが各種の濃度のインヒビターを含有する多数の第2試薬をアッセイした。第1試薬は実施例２０および２９に記載した通り変更しないものとした。これらの各種濃度のインヒビターを用いて取得した速度率をインヒビターのモル濃度に対してプロットし、記載したようにIC５０を算出した。
【０１０６】
実施例３１
(ジゴキシゲニン-3-イル)-オキシメチルカルボニル-DADOO（24）の合成
トリエチルアミン 1.3 mlおよびジオキサン 15 mlにジアミノ-ジオキサ-オクタン 1.35 g（9.2 mmol）を溶解し、室温で撹拌した。この混合物にジオキサン10 ml中のジゴキシゲニン-3-cme-NHS 500 mg（0.92 mmol）を滴下ロートによって15分以内で添加した。室温で１時間撹拌した後、溶媒を蒸発させ、粗生成物をメタノール 10 mlに溶解し、調製用RP-HPLC（Waters Delta Pak C-18 50x250 mm、水／アセトニトリル／0.1％TFA）で精製した。純粋画分をプールし、凍結乾燥して、油状生成物 520 mgが得られた。
【０１０７】
実施例３２
[(ジゴキシゲニン-3-イル)-オキシメチルカルボニル-DADOO-カルボニルメチル]-MPA（28）の合成
THF 820μl中のジカルボキシMPA（27、実施例４３）41 mg（0.1084 mmol）の溶液に、ピリジン 8.77μl（0.1084 mmol）およびトリフルオロ酢酸無水物 15.3μlを添加し、混合物を3時間撹拌した。ピリジン 820μlに溶解した(ジゴキシゲニン-3-イル)-オキシメチルカルボニル-DADOO 69.3 mg（0.1084 mmol）を添加し、混合物を室温で16時間撹拌した。反応混合物を酢酸 1 mlで希釈し、調製用RP-HPLC（Waters Delta Pak C-18 50x250 mm、水／アセトニトリル／0.1％TFA）を用いて精製した。生成物を含む画分をプールし、凍結乾燥して、66 mgが得られた。生成物を1H-NMRおよびMSによって特性決定した。
【０１０８】
実施例３３
5'-[(テオフィリン-8-ブチルアミドエチルアミノカルボニルオキシ)-イソプレニル]-MPA[OMEM]メチルエステルコンジュゲート（18）の調製
5'-イソプレニル[OH]-MPA[OMEM]メチルエステル（5）23 mg（0.045 mmol）にTHF 1.5 mlを添加し、その後N,N'-ジスクシンイミジルカーボネート 20 mg（0.078 mmol）およびトリエチルアミン 20μlを添加した。混合物を室温で18時間撹拌し、対応するN-ヒドロキシスクシンイミジルカーボネートが得られた。
【０１０９】
テオフィリンアミン（17）14 mg（0.045 mmol）を無水DMF 1 mlに溶解し、トリエチルアミン 100μlを添加した。この溶液に、先に調製したMPA-N-ヒドロキシスクシンイミジルカーボネート溶液（in situ生成）を滴下した。溶液を調製用RP-HPLC（Rainin C-18(ODS) 21.4 mm x250 mm）によって、0.1％トリフルオロ酢酸を含有する水／アセトニトリル勾配系を使用して精製した。生成物を含む画分を一つにし、アセトニトリルを蒸発させ、残った混合物を凍結乾燥して、18が10 mg（0.011 mmol、26％）が得られた。
【０１１０】
実施例３４
5'-[(テオフィリン-8-ブチルアミドエチルアミノカルボニルオキシ)イソプレニル]-MPA[OMEM]コンジュゲート（19）の調製
アルゴン下で撹拌しながら、メタノール 2.4 ml中の5'-[(テオフィリン-8-ブチルアミドエチルアミノカルボニルオキシ)イソプレニル]-MPA[OMEM]メチルエステルコンジュゲート（18）11.7 mg（0.014 mmol）の溶液に、水 1.2 ml中の水酸化リチウム１水和物 24 mg（0.572 mmol）の溶液を添加した。RP-HPLC（Vydac C-18 ；300Å218TP54；4.6 mm x250 mm；0.1％TFA-H２O／0.1％TFA-CH３CN勾配）によってモニターしながら、反応物をアルゴン下で室温にて撹拌した。室温で4日後、保持時間がより短いピークの出現が増加して、出発物質の消費がほぼ完了した。反応混合物をリン酸希釈液で酸性化し（沈殿）、濃縮乾固させ、メタノールとともに磨砕し、固体を濾別した。濾液を濃縮乾固させ、残渣を再びCH３CN-H２O（1：1）中に溶解し、調製用RP-HPLC（Rainin C-18(ODS) 21.4 mm x250 mm）によって、0.1％TFA-H２O／0.1％TFA-CH３CN勾配を使用して精製した。生成物を含む画分を一つにし、減圧下でアセトニトリルを蒸発させ、残渣を凍結乾燥して、白色固体の（19）8 mg（0.0097 mmol、69％）が得られた。
【０１１１】
実施例３５
5'-[(テオフィリン-8-ブチルアミドエチルアミノカルボニルオキシ)イソプレニル]-MPA（20）の調製
アルゴン下、氷浴で冷却した乾燥塩化メチレン200μl中の5'-[(テオフィリン-8-ブチルアミドエチルアミノカルボニルオキシ)イソプレニル]-MPA[OMEM]コンジュゲート（19）1.0 mg（0.0012 mmol）の溶液に、塩化メチレン 40 μlに溶解したトリフルオロ酢酸 20μlの強冷溶液を約１分間かけて3回に分けて添加した。冷却を続けながら20分撹拌した後、高真空下での直接吸引によって、揮発物質を蒸発させた。残渣のRP-HPLC（Vydac C-18；300Å218TP54；4.6 mm x250 mm；0.1％TFA-H２O／0.1％TFA-CH３CN勾配）および1H-NMR（CD３OD）によって、所望のMEM-脱保護生成物の部分的形成が示された。この物質を再度プールし、濃縮乾固させ、乾燥塩化メチレンに再溶解し、再蒸発させた（3Ｘ）。 残渣を35分間撹拌した以外は上記のようにしてTFA処理した。溶媒を前記のように除去した。残渣のRP-HPLCおよび1H-NMR分析によって所望の生成物のさらなる形成と、出発物質の減少が示された。再度プールした物質を再濃縮し、前記のように処理し、30分間撹拌しながら上記のように3回目のTFA処理を再び行った。生成した反応混合物のRP-HPLC分析は副産物のピークの増加を伴い、反応の本質的な完結を示した。反応物を濃縮乾固させ、CH３CNに再溶解し、半調製用RP-HPLC（Vydac C-18；300Å218TP510；0.1％TFA-H２O／0.1％TFA-CH３CN勾配）によって精製した。生成物を含有する画分をプールし、減圧下でCH３CNを蒸発除去し、残渣を凍結乾燥して、白色固体の（20）約 0.5 g（約0.00068 mmol、約56％）が得られた。
【０１１２】
実施例３６
5'-t-ブトキシカルボニルメチル-MPAメチルエステル（21）の調製
ナトリウムビス（トリメチルシリル）アミド（THF中1.0 M溶液）溶液 26 ml（26 mmol）をアルゴン雰囲気下、ドライアイス／アセトン浴中で-78℃に冷却した。この冷却溶液に、DMPU 2.6 ml（22 mmol）を添加し、-78℃で15分間撹拌した。反応混合物に新たに蒸留したTHF 45 ml中のMPAメチルエステル（2）2.86 g（8.56 mmol）の溶液を滴下した。反応混合物を-78℃で1時間撹拌すると、反応混合物の色が淡黄色から橙黄色に変化した。この反応混合物にt-ブチルブロモアセテート 1.9 ml（912.8 mmol）を添加し、反応混合物を-78℃で3時間撹拌した。飽和塩化アンモニウム溶液 20 mlによって反応を停止させ、混合物を室温まで昇温させた。飽和塩化アンモニウムをさらに200 mlを添加し、反応混合物を酢酸エチル 3ｘ200 mlで抽出した。合わせた有機層を飽和塩化アンモニウム 300 mlで洗浄し、乾燥および濃縮した。酢酸エチル中の30％ヘキサンを使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって粗生成物を精製し、半固体 3.87 gを得た。この生成物の一部（1.45 g）を、RP-HPLC（Rainin C-18(ODS) 21.4 mm x250 mm）によって0.1％トリフルオロ酢酸を含有するアセトニトリル／水の勾配系を数回使用して精製した。生成物を含む画分を一つにし、アセトニトリルを蒸発させた。残渣を凍結乾燥して、5'-t-ブトキシカルボニルメチル-MPAメチルエステル（21）669 mg（1.49 mmol、47％）が得られた。
【０１１３】
実施例３７
5'-カルボキシメチル-MPAメチルエステル（22）の調製
5'-t-ブトキシカルボニルメチル-MPAメチルエステル（21）300 mg（0.67 mmol）に、ジクロロメタン中の50％トリフルオロ酢酸溶液 15 mlを添加した。混合物を室温で撹拌し、濃縮した。残渣を、酢酸エチル中の20％メタノールを使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製し、5'-カルボキシメチル-MPAメチルエステル（22）250 mg（0.63 mmol、95％）を得た。
【０１１４】
実施例３８
t-ブチルエステルの切断（別法）
ジクロロメタン 3.6 ml中の（21）360 mg（0.8 mmol）の溶液に、TFA 3.6 mlを添加し、反応混合物を10分間撹拌した。0.5 Mリン酸カリウムバッファー pH7.0 200 mlを添加し、混合物を酢酸エチル 100 mlで3回抽出した。有機層をプールし、硫酸マグネシウム上で乾燥し、溶媒を蒸発させた。生成物をHPLCおよび1H-NMRで特性決定した。
【０１１５】
実施例３９
5'-（スクシンイミド-N-オキシ）カルボニルメチル-MPAメチルエステル（23）の調製
粗5'-カルボキシメチル-MPAメチルエステル（22）200 mgと、THF 2 mlに溶解したN-ヒドロキシスクシンイミド 244 mg（2.12 mmol）およびジシクロヘキシルカルボジイミド 437 mg（2.12 mmol）を室温で2時間撹拌した。沈殿したジシクロヘキシル尿素を濾別し、濾液を調製用RP-HPLC（Waters Delta Pak C-18 50x250 mm、水／アセトニトリル／0.1％TFA）を使用して精製した。
【０１１６】
生成物を含有する画分をプールし、即時に凍結乾燥して、（23）129 mgを得た。生成物を1H-NMRおよびMSで特性決定した。
【０１１７】
実施例４０
5'-[(ジゴキシゲニン-3-イル)-オキシメチルカルボニル-DADOO-カルボニルメチル]-MPAメチルエステル（25）の調製
無水DMF 3.48 mlおよびトリエチルアミン 179μl中の(ジゴキシゲニン-3-イル)-オキシメチルカルボニル-DADOO 166 mg（0.259 mmol）の溶液に、無水DMF 1.74 ml中の（23）127 mg（0.259 mmol）をピペットで添加した。反応混合物を2時間撹拌した。この溶液に酢酸 500μlを添加し、この混合物を調製用RP-HPLC（Waters Delta Pak C-18 50x250 mm、水／アセトニトリル／0.1％TFA）を使用して精製した。生成物を含む画分をプールし、凍結乾燥して、（25）240 mgが得られた。生成物を1H-NMRおよびMSによって特性決定した。
【０１１８】
実施例４１
5'-[(ジゴキシゲニン-3-イル)-オキシメチルカルボニル-DADOO-カルボニルメチル]-MPA（26）の調製
DMSO 28.7 mlに溶解した5'-[(ジゴキシゲニン-3-イル)-オキシメチルカルボニル-DADOO-カルボニルメチル]-MPAメチルエステル（25）200 mg（0.2098 mmol）を0.1 Mリン酸カリウムバッファー pH7.0 56 mlと徐々に混合した。混合物はわずかに混濁した。エステラーゼ（Roche Diagnostics,Cat.No.104698）219μlを添加し、混合物を13日間撹拌した。沈殿物を濾過し、調製用RP-HPLC（Waters Delta Pak C-18 50x250 mm、水／アセトニトリル／0.1％TFA）を使用して濾液を精製した。生成物を含む画分をプールし、凍結乾燥して、（26）68 mgが得られた。生成物を1H-NMRおよびMSによって特性決定した。
【０１１９】
実施例４２
MPA-MPAの合成
不活性雰囲気下でテトラヒドロフラン 6 ml中のミコフェノール酸メチルエステル（2、1.337 g、4 mmol）の溶液を-78℃に冷却し、ヘキサメチルジシルアジ化ナトリウム（テトラヒドロフラン中 1 Mを9 ml、9 mmol）で25分間にわたって処理した。15分の撹拌の後、米国特許第5,493,030号、実施例 ZA-12Bにしたがって調製した(E)-4-1,3-ジヒドロ-6-メトキシ-4-メトキシエトキシメトキシ-7-メチル-3-オキソイソベンゾフラン-5-イル)-2-メチルブト-2-エニルブロミド（1.36 g、3.17 mmol）をテトラヒドロフラン（4 ml）中の溶液として15分間かけて添加した。反応物を1.5時間かけて徐々に約-40℃まで昇温させ、その後氷、水および濃塩酸の混合物（2 ml）上に注ぐことによって、反応を停止させた。酢酸エチル（2×100 ml）中に生成物を抽出した後、硫酸マグネシウム上で乾燥させた。有機物を濾過し、ロータリーエバポレーターを使用して、溶媒を除去した。ヘキサン中40％酢酸エチル、次にヘキサン中60％酢酸エチル、そして最後にヘキサン中80％酢酸エチルを使用したクロマトグラフィーを行って、油状物としてアルキル化生成物（191 mg）が得られ、これを次の反応で使用した。
【０１２０】
アルキル化生成物（190 mg）をメタノール（30 ml）に溶解し、p-トルエンスルホン酸 660 mgで処理し、窒素下、周囲温度で5時間撹拌した。次に減圧下でメタノールを除去し、反応物により水と酢酸エチルの間が分割された。水相を酢酸エチル 75 mlで洗浄し、その後一つに合わせた有機層を硫酸マグネシウム上で乾燥した。濾過後溶媒を除去して、物質 150 mgを得て、これを最終ステップに供した。
【０１２１】
前ステップからのエステルを1：1のメタノール：水に溶解し、水酸化リチウム400 mgを添加した。反応物を窒素下、60℃で20時間、磁気撹拌し、その後冷却し、1 M NaHSO４上に注ぎ、酢酸エチルで3回（50 ml×3）抽出した。一つに合わせた有機物を飽和ブラインで洗浄し、その後硫酸マグネシウム上で乾燥した。減圧下で溶媒を除去し、次にt-ブチルメチルエーテル／ヘキサンからの再結晶化の後、粗生成物（101 mg）を得た。この物質についての1：1のヘキサン：酢酸エチルと1％酢酸を使用したフラッシュクロマトグラフィー後、酢酸エチルを使用してさらに再結晶化し、最終生成物（80 mg、融点146.4-147.4℃）を得た。
【０１２２】
実施例４３
4'-カルボキシメチルMPA（27）の調製
【化６】
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ジクロロメタン 200 ml中の3-ブチン-1-オール（i）（10.0 g、143 mmol、Aldrich Chemical Company）溶液を室温で撹拌した。イミダゾール（12.6 g、186 mmol）を添加し、次にt-ブチルジメチルシリルクロリド（22.6 g、150 mmol）（TBSCl）を添加し、溶液を20分間撹拌した。反応物を塩化メチレンで希釈し、水、1NHCl水溶液、ブラインで洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥した。溶媒を減圧下で除去し、残渣をヘキサンで希釈し、濾過し、そして溶媒を減圧下で除去し、油状物のシリルエーテル（ii）23.1 gを得て、これをそれ以上精製しないで使用した。
【０１２３】
テトラヒドロフラン 200 ml中の上記のようにして調製したシリルエーテル（ii）（8.8 g、48 mmol）の溶液を不活性雰囲気下で-78℃に冷却し、n-BuLi溶液（ヘキサン中 1.6 Mを31.5 ml、50.5 ml）をシリンジを用いて15分間かけて添加した。溶液を-78℃で1.5時間撹拌し、この時点で未希釈ヨードメタン（67.7 g、480 mmol）を添加し、溶液を一晩で室温まで温めた。1N塩化アンモニウム水溶液 20mlを添加し、テトラヒドロフランを減圧下で除去し、水溶液をジエチルエーテルで2回抽出した。エーテル溶液を水で2回、次にブラインで洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥した。溶媒を減圧下で除去し、油状物（iii）8.5 gを得て、これをそれ以上精製しないで使用した。
【０１２４】
【化７】
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THF 100 ml中のビス（シクロペンチルジエニル）ジルコニウムジクロリド（16.0 g、55 mmol）の懸濁液を不活性雰囲気下、室温で撹拌した。ヒドリドホウ酸トリエチルリチウム溶液（55 mmol、テトラヒドロフラン中 1Mを55 ml）を添加し、溶液を1時間撹拌した。テトラヒドロフラン 10 ml中の上記のようにして調製したシリルエーテル（iii）（5.0 g、27 mmol）の溶液をカニューレで添加した。次に反応物を50℃に1.5時間加熱し、その後25℃に冷却した。次にN-ブロモスクシンイミド（9.8 g、55 mmol）を添加し、反応物を20分間撹拌し、その後1N チオ硫酸ナトリウム 50 mlで停止させた。混合物をジエチルエーテルで希釈し、セライトを通して濾過し、1N チオ硫酸ナトリウムおよびブラインで順に洗浄し、その後硫酸マグネシウム上で乾燥した。溶媒を減圧下で除去した後に得られた残渣を、溶離液としてヘキサンを使用するシリカゲルのクロマトグラフィーにかけて、油状物の生成物臭化ビニル（iv）（2.1 g）を得て、これを次のステップで使用した。
【０１２５】
【化８】
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ジエチルエーテル 20 mlおよびベンゼン 5 mlの混合物中のマグネシウム（350 mg、14 mmol）の懸濁液を不活性雰囲気下、室温で撹拌した。この混合物に、反応を緩やかに還流でしながら、二臭化エチレン（2.7 g、14.4 mmol、1.24 ml）をシリンジによって30分かけて添加した。別のフラスコで、臭化ビニル（iv、3.65 g、13 mmol）の溶液をTHF 100 ml中、-78℃で撹拌した。この溶液に、t-ブチルリチウム（27.4 mmol、ヘキサン中 1.7M溶液 16.1 ml）を15分かけて滴下した。生成したビニルリチウム溶液に、上記の臭化マグネシウム溶液をカニューレで10分かけて添加し、溶液を-78℃で30分間撹拌し、ビニルグリニャール溶液を形成させた。このビニルグリニャール溶液にTHF 10 ml中のアルデヒド（v）「Smithら、J.Org.Chem.61,2236-2241(1996)」（5.0 g、14.4 mmol） の溶液をカニューレで5分かけて添加した。反応物を0℃に昇温させ、25分間撹拌した。次に、1N塩化アンモニウム水溶液 30 mlで反応を停止させ、ジエチルエーテルで3回抽出し、エーテル溶液を1N塩化アンモニウム水溶液、ブラインで順に洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥した。溶媒を減圧下で除去し、残渣を、ヘキサン中の10％〜20％酢酸エチルの勾配を使用するシリカゲルのクロマトグラフィーによって精製し、油状物のアリル型アルコール生成物（vi）2.90 gを得た。
【０１２６】
【化９】
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トリメチルオルトアセテート（11.4 g、12.0 ml、95 mmol）およびピバル酸（48 mg、0.5 mmol）の混合物中のアリル型アルコール（vi、2.6 g、4.7 mmol）の混合物を還流しながら11時間加熱した。反応物を一晩で室温まで冷却しながら撹拌した。次に反応物をジエチルエーテルで希釈し、水、飽和重炭酸水溶液、ブラインで洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥した。溶媒を減圧下で除去し、残渣を、溶離液としてヘキサン中の15％酢酸エチルを使用するシリカゲルのクロマトグラフィーにかけて、油状物のメチルエステル生成物（vii）1.5 gを得た。
【０１２７】
【化１０】
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アセトニトリル 50 ml中のメチルエステル（vii、1.5 g、2.5 mmol）の溶液を室温で撹拌した。アセトニトリル 50 ml中に希釈した40％HF溶液 5mlの溶液を添加し、反応物を5分間撹拌した。溶媒を減圧下で除去した。残渣をジエチルエーテルに溶解し、飽和重炭酸水溶液で3回、次にブラインで洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥した。溶媒を除去し、油状物のラクトン（viii）1.0 gを得て、これをそれ以上精製しないで使用した。
【０１２８】
【化１１】
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ラクトン溶液（viii、1.0 g、2.0 mmol）をアセトン 10 mlに溶解して、0℃に冷却した。この溶液に、ジョーンズ(Jones)試薬（3 M 水溶液1.2 ml、3.6 mmol）を添加し、反応物を45分間撹拌した。メタノール 3 mlで反応を停止させ、酢酸エチルで希釈し、1N 塩酸水溶液、水2回、ブラインで洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥した。溶媒を減圧下で除去し、残渣を、溶離液としてヘキサン中の35％酢酸エチルおよび1％酢酸を使用するシリカゲル上でのクロマトグラフィーにかけて、油状物の保護された二酸（ix）463 mgを得た。
【０１２９】
【化１２】
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メタノール 10 ml中の保護された二酸（ix、401 mg、0.8 mmol）を室温で撹拌した。水酸化リチウム水和物をメタノール 10 mlおよび水 2 mlの溶液に溶解し、二酸の溶液に添加し、反応物を3.5時間撹拌した。反応を1 N塩酸水溶液10mlで停止させ、酢酸エチルで3回抽出し、酢酸エチル層を合わせてブラインで洗浄した。溶媒を除去し、これによって得られた固体をジエチルエーテルおよびヘキサンの混合物とともに磨砕した。生成した固体を塩化メチレン／ヘキサンから再結晶化し、4'-カルボキシメチルMPA（27）、融点＝178℃、201 mgを得た。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、ミコフェノール酸の構造およびリガンド−インヒビターコンジュゲートであるMPA−MPA（ビス-MPA）の構造を示す。
【図２】  図２は、本発明に従ってチロキシン含有サンプルをアッセイした実施例20で得られた結果をプロットすることにより作成したグラフである。チロキシンの濃度をＸ軸にプロットし、340nmにおけるΔ（または終点）吸光度をＹ軸にプロットしてある。
【図３】  図３は、本発明に従ってジゴキシゲニン含有サンプルをアッセイした実施例23で得られた結果をプロットすることにより作成したグラフである。ジゴキシゲニンの濃度をＸ軸にプロットし、340nmにおけるΔ（または終点）吸光度をＹ軸にプロットしてある。
【図４】  図４は、本発明に従ってジゴキシゲニン含有サンプルをアッセイした実施例26で得られた結果をプロットすることにより作成したグラフである。ジゴキシゲニンの濃度をＸ軸にプロットし、340nmにおける吸光度率（rate of absorbance）をＹ軸にプロットしてある。
【図５】  図５は、本発明に従ってテオフィリン含有サンプルをアッセイした実施例29で得られた結果をプロットすることにより作成したグラフである。テオフィリンの濃度をＸ軸にプロットし、340nmにおける吸光度率をＹ軸にプロットしてある。
【図６】  図６は、実施例４、５、６および７に記載の5’-イソプレニル[OH]-MPA-[OMEM]メチルエステルの調製を示す。
【図７】  図７は、実施例８、９および10に記載の5’-[イソプレニルオキシカルボニルアミノエチレンアミド)-チロキシン(N-tBoc)]-MPA-[OMEM]メチルエステルコンジュゲートの調製を示す。
【図８】  図８は、実施例９に記載のL-チロキシン(N-tBoc)-アミドエチレンアミンの調製を示す。
【図９】  図９は、実施例11および12に記載の5’-[(イソプレニルオキシカルボニルアミノエチレンアミド)-チロキシン]-MPAコンジュゲートの調製を示す。
【図１０】  図10は、実施例13、14および15に記載の5’-カルボキシメチル-MPA t-ブチルエステルの調製を示す。
【図１１】  図11は、実施例16に記載の5’-(ジゴキシゲニン-3-イル-β-アミドメチル)-MPA t-ブチルエステルコンジュゲートの調製を示す。
【図１２】  図12は、実施例17に記載の5’-(ジゴキシゲニン-3-イル-β-アミドメチル)-MPAコンジュゲートの異性体Ａおよび異性体Ｂの調製を示す。
【図１３】  図13は、実施例31および32に記載の4’-(ジゴキシゲニン-3-イル)-オキシメチルカルボニル-DADOO-カルボニルメチル]-MPAの調製を示す。
【図１４】  図14は、実施例31および32に記載の4’-(ジゴキシゲニン-3-イル)-オキシメチルカルボニル-DADOO-カルボニルメチル]-MPAの調製を示す。
【図１５】  図15は、実施例33に記載の5’-［(テオフィリン-8-ブチルアミドエチルアミノカルボニルオキシ)-イソプレニル］-MPA[OMEM]メチルエステルコンジュゲートの調製を示す。
【図１６】  図16は、実施例35に記載の5’-［(テオフィリン-8-ブチルアミドエチルアミノカルボニルオキシ)-イソプレニル］-MPAの調製を示す。
【図１７】  図17は、実施例36、37、38および39に記載の5’-(スクシンイミド-N-オキシ)カルボニルメチル-MPAメチルエステルの調製を示す。
【図１８】  図18は、実施例40および41に記載の5’-［(ジゴキシゲニン-3-イル)-オキシメチルカルボニル-DADOO-カルボニルメチル］-MPAの調製を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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