(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のステップを含んでなる、幹細胞及び／又は前駆細胞の集団を拡張させかつこれらの細胞の集団の分化を阻害する方法：
（ａ）前記細胞に細胞増殖のための条件を生体外で与え；そして
（ｂ）前記細胞をテトラエチレンペンタミン、キャプトプリルおよびペニシラミンからなる群から選択される少なくとも一つの遷移金属キレート化剤と接触させ；
それにより前記幹細胞及び／又は前駆細胞を生体外で拡張させかつこれらの細胞の分化を阻害する。
【請求項２】
細胞増殖のための前記条件がサイトカイン又はサイトカイン類を含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記サイトカイン又はサイトカイン類が初期に作用するサイトカイン類である請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記初期に作用するサイトカイン類が、幹細胞因子、ＦＬＴ３リガンド、インターロイキン−６、トロンボポエチンおよびインターロイキン−３からなる群から選択される請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記サイトカイン又はサイトカイン類が、後期に作用するサイトカイン類である請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記後期に作用するサイトカイン類が、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子およびエリスロポエチンからなる群から選択される請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記幹細胞及び／又は前駆細胞が、造血幹細胞または造血前駆細胞、神経幹細胞または神経前駆細胞、オリゴデンドロサイト幹細胞またはオリゴデンドロサイト前駆細胞、皮膚幹細胞または皮膚前駆細胞、肝幹細胞または肝前駆細胞、筋肉幹細胞または筋肉前駆細胞、骨幹細胞または骨前駆細胞、間葉幹細胞または間葉前駆細胞、膵幹細胞または膵前駆細胞、軟骨幹細胞または軟骨前駆細胞および支質幹細胞または支質前駆細胞からなる群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記幹細胞又は前駆細胞が、骨髄、末梢血液および新生児臍帯血からなる群から選択される起源由来の細胞である請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞が、造血ＣＤ３４＋細胞について豊富化されている請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞が、未分化幹細胞および前駆細胞からなる群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
以下のステップを含んでなる、受容者に移植するための拡張された未分化の造血細胞の調製方法：
（ａ）（ｉ）前記造血細胞に細胞増殖のための条件を与え；そして
（ｉｉ）前記造血細胞をテトラエチレンペンタミン、キャプトプリルおよびペニシラミンからなる群から選択される少なくとも一つの遷移金属キレート化剤と接触させ；
それにより前記造血細胞を生体外で拡張させかつこれらの細胞の分化を阻害し；そして
（ｂ）前記拡張された未分化の造血細胞を単離する。
【請求項１２】
前記造血細胞が、末梢血液、骨髄および新生児臍帯血からなる群から選択される起源から得られる請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記造血細胞が幹細胞について豊富化されている請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記造血細胞が前駆細胞について豊富化されている請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
以下のステップを含んでなる、幹細胞に外来遺伝子を形質導入する方法：
（ａ）（ｉ）前記幹細胞に細胞増殖のための条件を与え；そして
（ｉｉ）前記幹細胞をテトラエチレンペンタミン、キャプトプリルおよびペニシラミンからなる群から選択される少なくとも一つの遷移金属キレート化剤と接触させ；
それにより前記幹細胞を生体外で拡張させかつこれらの細胞の分化を阻害し；そして
（ｂ）前記拡張された未分化の幹細胞に外来遺伝子を形質導入する。
【請求項１６】
形質導入が、外来遺伝子を含有するベクターによって行われる請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
テトラエチレンペンタミン、キャプトプリルおよびペニシラミンからなる群から選択される少なくとも一つの遷移金属キレート化剤の存在下で生体外で拡張された細胞を含有する、拡張されかつ生体外で培養された治療用の細胞製剤。
【請求項１８】
幹細胞をテトラエチレンペンタミン、キャプトプリルおよびペニシラミンからなる群から選択される少なくとも一つの遷移金属キレート化剤と接触させるステップを含み、前記接触は前記幹細胞を収穫、単離及び貯蔵するステップの少なくとも一つで行われる、幹細胞の保存方法。
【請求項１９】
テトラエチレンペンタミン、キャプトプリルおよびペニシラミンからなる群から選択される少なくとも一つの遷移金属キレート化剤の一定量を補充した幹細胞収集バッグ、幹細胞分離緩衝液又は幹細胞洗浄緩衝液であって、前記量が初期造血細胞及び／又は造血前駆体細胞の集団の分化を阻害するのに十分である幹細胞収集バッグ、幹細胞分離緩衝液又は幹細胞洗浄緩衝液。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の属する技術分野および発明の背景
本発明は幹細胞と前駆細胞の増殖と分化を制御する方法に関する。さらに詳しく述べると、本発明は、遷移金属のキレート化剤で処理して遷移金属の有効性を低下させることによって、幹細胞と前駆細胞の増殖を強制するが分化を抑制する方法に関する。
【０００２】
細胞の分化と増殖
血液細胞の通常の産生（造血）は、しっかりと組み合わされた増殖と分化のプロセスによって行われる。大部分の造血細胞において、分裂に続いて、娘細胞は、一連の漸進的な変化を受けて、最終的に、完全に分化した（成熟した）機能的血液細胞になり、その血液細胞はほとんどの場合、増殖することができない。
【０００３】
したがって、分化のプロセスは、細胞分裂を、制限し、最終的に停止させる。幹細胞として知られている造血細胞の少数のみが、細胞分裂を行い、親細胞と類似のまたは同一の子孫が生成する。自己複製として知られているこの種の細胞分裂は、幹細胞の固有の特性であり、最も分化していない状態の幹細胞の小プールを維持するのに役立つ。いくらかの幹細胞は、その自己複製能力を失い、細胞分裂に続いて、最終的に成熟細胞を生じる各種の系統の拘束前駆細胞（commited progenitor）を提供する。その成熟細胞は血液細胞系の機能的性能を提供するが、幹細胞は、アポトーシス（プログラムされた細胞死）によって一層分化した細胞を連続的に失いおよび／または細網内皮系によって老化成熟細胞が積極的に除去されるにもかかわらず、一生を通じて造血の維持に関与している。
【０００４】
以下にさらに詳細に述べるように、幹細胞およびその外の特定のリンパ−造血細胞のサブ集団の半ビボ（「生体外で」とも称する）（ｅｘ  ｖｉｖｏ）培養による拡張（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）は重要な臨床用途をもっている。
【０００５】
このような集団を豊富化する（enrich）ための各種のプロトコルが提案されて実験されている。採用されている主な実験戦略としては、ＣＤ３４＋の選択ありまたはなしで（８）；初期および後期の増殖因子の異なるカクテルで（１７）；血清ありまたはなしで（７）；静置培養、迅速に培地を交換する培養（１８）または連続的な潅流下（バイオリアクター）で（６）；ならびに樹立された、支質細胞層ありまたはなしで（１９）行われる単核細胞のインキュベーションがある。
【０００６】
中期前駆細胞と後期前駆細胞の有意な拡張は、７−１４日間の半ビボ培養で得られることが多かったが、増殖の可能性が高い初期造血（ＣＤ３４＋ＣＤ３８−）幹細胞の量は通常、減少した（６，２０−２２）。
【０００７】
したがって、これらの培養では、真の幹細胞の拡張が行われず、むしろ、幹細胞が増殖してプレ前駆細胞（pre-progenitor cell）に分化し、原幹細胞のプールの減少が付随して起こる。
【０００８】
幹細胞の最大の半ビボ拡張を達成するには、以下の条件を満たさねばならない。すなわち（ｉ）分化は、可逆的に妨害もしくは遅延されねばならず、そして（ii）自己複製は最大限に時間延長されねばならない。
【０００９】
細胞の分化における銅の役割
造血細胞の発生への銅の関与の可能性は、以下の知見から推測できる。
【００１０】
銅欠乏症の臨床症状
銅欠乏症は、遺伝性欠陥、例えばメンケス症候群もしくは小児脂肪便症、または後天的条件から起こる。後者の場合は、一般に栄養失調が関連している。銅欠乏症は、銅を補充しない全非経口栄養摂取（例えば腸の切除による）、高レベルの亜鉛の消費〔低体重のおよび／または牛乳（不充分な銅供給源）を与えられた新生児の銅の利用を阻害し、重篤な症例ではShwanchman症候群になる〕によって起こる。また、ウイルソン病などの銅の過剰負荷の症例に、銅キレート化剤でかたよった治療を行うと、銅欠乏症をもたらすことがある。
【００１１】
銅欠乏症の臨床症候群としては、成長、脳の発達、骨の強さと形態、心筋の収縮性、コレステロールとグルコースの代謝、宿主防護（免疫）の機構などの欠陥がある。
【００１２】
この研究に特に関連して重要なことは、銅欠乏症が貧血、好中球減少症および血小板減少症を含む、血液異常と関連していることが多いことである。これらの病的発現はすべて、鉄分による治療に対して反応が鈍いが銅の補充によって迅速にもとに戻る（２７−２８）。
【００１３】
銅欠乏症が好中球減少症をもたらす機序は分かっていない。可能性がある原因としては、以下の原因の単独または組み合わせたものがある。すなわち（ｉ）骨髄（ＢＭ）中の前駆細胞の早期死；（ii）ＢＭ中の前駆細胞からの好中球の生成の障害；(iii)ＢＭ内での細胞成熟速度の低下；（iv）ＢＭからの循環系への好中球の放出の障害；（ｖ）循環中の好中球の消失速度の増大である。
【００１４】
好中球が減少する銅欠乏症の患者のＢＭを検査すると、成熟した細胞が欠除していること（“成熟停止”）を示す。このようなＢＭ由来の細胞は、銅欠乏血清を含有する半固形培地中にコロニーを形成せず、銅を含有する血清中には正常なコロニーを形成する性能を保持していることが報告されている。これらの試験結果は、患者のＢＭ中に無傷の前駆細胞が存在していることを示し、かつ発生の遮断が前駆細胞の段階の末端で起こることを示唆している（２９−３０）。
【００１５】
細胞系内での銅の作用
銅のこの作用も、インビトロで樹立された細胞系で研究されている（３１−３４）。このような細胞系の一つ（ＨＬ−６０）は、急性前骨髄球性白血病が見られる患者由来のものであった。骨髄芽球および前骨髄球の特性を有するこれらの細胞は、培養で無限に増殖できる。各種の薬剤、例えばレチノイン酸（ＲＡ）を培地に添加すると、上記細胞は、分化して、成熟した顆粒球のすべてではないがいくつかの特徴を示す細胞になる。
【００１６】
これらの細胞の銅の状態（Copper status）の研究結果は、１細胞当たり細胞質が含有する銅含量は、ＲＡで処理した細胞の場合、未処理の細胞に比べて有意差はないが、タンパク質含量に対する銅含量は２倍であることを示した。このことは、ＲＡで処理した細胞は、タンパク質含量が、未処理の対応物と比べて約１／２であるためである。６７Ｃｕを使用して、銅摂取速度が、ＲＡ処理の最初の２日間は有意に速いが後期には速くないことが報告されている。６７Ｃｕの細胞内分布は、高分子量（ＭＷ）の画分（＞１００ｋＤ）および約２０ｋＤの低分子量の画分に、顕著であり、ＲＡで処理された細胞の高ＭＷ画分に、より高い比率の銅が存在していることが見出された。
【００１７】
通常の血清を補充した増殖培地に過剰の銅を添加すると、ＲＡが誘発する分化が若干増大した。ＲＡで処理したＨＬ−６０細胞は、必ずしも正常な細胞発育を示さないが、これらの試験結果は、好中球の分化が銅を必要とする可能性を指摘している。
【００１８】
他の実験で、ＨＬ−６０細胞は、銅のキレート化剤で処理することによって銅を欠乏させることができ、そしてこのような処理の後、その生存度と増殖速度は変化しないことが示されている。
【００１９】
これらの現象はすべて銅が原因であったが、いくつかの臨床作用と生物学的作用が銅と他の遷移金属によって共有されていることが報告されている。
【００２０】
例えば、銅欠乏症に観察されるのと類似の臨床症候群は、高レベルの亜鉛を消費した後にも見られるが（４０−４２）、この現象は、銅の利用を妨げることが知られている（例えば４３）。
【００２１】
ヒト肝細胞癌の研究で、腫瘍組織中の銅と亜鉛両者の濃度が、組織の分化度とともに低下していることが発見された（４４）。
【００２２】
別の研究で、ラットの肝細胞の初代培養物に、銅、亜鉛および鉄を添加すると、細胞の複製および管状構造の生成を誘発したことが報告された。それらの管を内張りする細胞は、胆管細胞の形態学的および生化学的特徴になった（４５）。
【００２３】
各種の遷移金属は、分化に関連する多種類の酵素と転写因子の産生と活性に影響することが知られている。その例としては、Ｃｕ／Ｚｎを含有するスーパージスムターゼ（４６）；メタロチオネイン類およびその転写調節因子類（例えばＭＴＦ−１）（４７−４９）；７０ＫＤａの熱ショックタンパク質（ｈｓｐ７０）（５０）；角質細胞が分化中に、ｒａｓ−ＧＴＰａｓｅ活性化タンパク質と会合するｐ６２タンパク質（５１）；ＨＬ−６０細胞の分化が誘発されている間に活性化される中性のスフィンゴミエリナーゼ（５２）；およびウシの水晶体のロイシンアミノペプチダーゼ（５３）がある。
【００２４】
本発明を実施化している間に、遷移金属の特に銅に結合する（銅をキレート化する）一連の化学薬剤が、幹細胞および中期と後期の前駆細胞の分化のプロセスを阻害（遅延）して、活性細胞増殖の相を、半ビボで刺激し延長できることが発見された。銅などの遷移金属の減少（部分的または完全な減少）のこの新しく発見された作用を、各種の造血細胞の半ビボ拡張を最大にするために使用した。
【００２５】
発明の要約
幹細胞と前駆細胞のインビボまたは半ビボでの増殖と分化を制御する方法が、本発明によって提供される。
【００２６】
以下に述べる本発明の好ましい実施態様の別の特徴にしたがって、細胞が増殖し同時に遷移金属を利用する前記細胞の性能を低下させる条件を細胞に与えるステップを含んでなる、細胞集団を拡張させながら同時にそれら細胞の分化を阻害する方法が提供される。その結果、細胞の分化が阻害されながら、細胞の拡張または増殖が加速される。
【００２７】
記載されている好ましい実施態様のさらに別の実施態様で、細胞は生体内にあり（インビボ）、生体内で、細胞増殖の条件を自然に与えられ、一方、遷移金属キレート化剤および／または亜鉛を投与することによって、遷移金属を利用する細胞の性能が低下する。
【００２８】
記載されている好ましい実施態様のさらに別の特徴にしたがって、遷移金属キレート化剤は、ポリアミンキレート化剤類、エチレンジアミン、ジエチレントリアミン、トリエチレンテトラミン、トリエチレンジアミン、テトラエチレンペンタミン、アミノエチルエタノールアミン、アミノエチルピペラジン、ペンタエチレンヘキサミン、トリエチレンテトラミン−塩酸、テトラエチレンペンタミン−塩酸、ペンタエチレンヘキサミン−塩酸、キャプトプリル（ｃａｐｔｏｐｒｉｌ）、ペニシラミンおよび遷移金属結合ペプチド類からなる群から選択される。
【００２９】
記載されている好ましい実施態様のさらに別の特徴にしたがって、細胞は半ビボの細胞である。
【００３０】
記載されている好ましい実施態様のさらに別の特徴にしたがって、細胞に、細胞増殖のための条件を付与することには、細胞に栄養素とサイトカイン類を提供することが含まれる。
【００３１】
記載されている好ましい実施態様のさらに別の特徴によって、上記サイトカイン類は初期に作用するサイトカイン類である。
【００３２】
記載されている好ましい実施態様のさらに別の特徴にしたがって、上記の初期に作用するサイトカイン類は、幹細胞因子、ＦＬＴ３リガンド、インターロイキン−６、トロンボポエチンおよびインターロイキン−３からなる群から選択される。
【００３３】
記載されている好ましい実施態様のさらに別の特徴にしたがって、上記サイトカイン類は後期に作用するサイトカイン類である。
【００３４】
記載されている好ましい実施態様のさらに別の特徴にしたがって、上記の後期に作用するサイトカインは、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子およびエリスロポエチンからなる群から選択される。
【００３５】
記載されている好ましい実施態様のさらに別の特徴にしたがって、細胞は、造血細胞、神経細胞とオリゴデンドロサイト細胞、皮膚細胞、肝細胞、筋肉細胞、骨細胞、間葉細胞、膵細胞、軟骨細胞および支質細胞からなる群から選択される。
【００３６】
記載されている好ましい実施態様のさらに別の特徴にしたがって、細胞は、骨髄、末梢血液および新生児の臍帯血からなる群から選択される起源から得られる。
【００３７】
記載されている好ましい実施態様のさらに別の特徴にしたがって、細胞は、造血ＣＤ３４＋細胞が豊富化されている。
【００３８】
記載されている好ましい実施態様のさらに別の特徴にしたがって、細胞は、非分化幹細胞および拘束前駆細胞（「前駆細胞」とも称する）（ｃｏｍｍｉｔｅｄ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ）からなる群から選択される。
【００３９】
以下に記載されている本発明の好ましい実施態様の別の特徴にしたがって、（ａ）移植すべき造血細胞を、ドナーから得て；（ｂ）前記細胞が増殖し同時に遷移金属を利用する前記細胞の性能を低下させる条件を前記細胞に半ビボで与えて、前記細胞の集団を拡張させ同時にその細胞の分化を阻害し；次いで（ｃ）その細胞を患者に移植するステップを含んでなる造血細胞を移植する方法が提供される。
【００４０】
記載されている好ましい実施態様のさらに別の特徴にしたがって、ドナーと患者は個別の個体である。
【００４１】
記載されている好ましい実施態様のさらに別の特徴にしたがって、造血細胞は、末梢血液、骨髄および新生児の臍帯血からなる群から選択される起源から得られる。
【００４２】
記載されている好ましい実施態様のさらに別の特徴にしたがって、造血細胞を得るのに、さらにその細胞を幹細胞について豊富化することが含まれている。
【００４３】
記載されている好ましい実施態様のさらに別の特徴にしたがって、造血細胞を得るのに、さらにその細胞を前駆細胞について豊富化することが含まれる。
【００４４】
以下に記載の本発明の好ましい実施態様の別の特徴にしたがって、（ａ）形質導入をすべき幹細胞を得て；（ｂ）前記細胞が増殖し同時に遷移金属を利用する前記細胞の性能を低下させる条件を前記細胞に半ビボで与えて、細胞の集団を拡張させ、同時にその細胞の分化を阻害し、次いで（ｃ）その細胞に外来遺伝子（exogene）を形質導入するステップを含んでなる、幹細胞に外来遺伝子を形質導入する方法が提供される。
【００４５】
記載されている好ましい実施態様のさらに別の特徴にしたがって、形質導入は外来遺伝子を含有するレトロウィルスによって行われる。
【００４６】
以下に記載されている本発明の好ましい実施態様の他の特徴にしたがって、（ａ）患者から造血前駆細胞を得て、（ｂ）前記細胞が増殖し同時に遷移金属を利用する前記細胞の性能を低下させる条件を前記細胞に半ビボで与えて、その細胞の集団を拡張させ、同時にその細胞の分化を阻害し、次いで（ｃ）その細胞を患者に移植するステップを含んでなる養子免疫療法が提供される。
【００４７】
以下に記載されている本発明の好ましい実施態様の別の特徴にしたがって、（ａ）ドナーに、細胞の、遷移金属を利用する性能を低下させる薬剤を投与して、幹細胞の集団を拡張し、同時に、幹細胞の分化を阻害し、次いで（ｂ）その細胞を白血球分離法で収穫するステップを含んでなる、骨髄幹細胞を、ドナーの末梢血液中に可動化させて（mobilize）その細胞を収穫する方法が提供される。
【００４８】
記載されている好ましい実施態様のさらに別の特徴にしたがって、サイトカイン、例えば初期に作用するサイトカイン、例えば、限定されないが幹細胞因子、ＦＬＴ３リガンド、インターロイキン−６、トロンボポエチンおよびインターロイキン−３および／または、後期に作用するサイトカイン、例えば、限定されないが、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子およびエリスロポエチンを組み合わせて、ドナーに投与するステップをさらに含んでなる方法が提供される。
【００４９】
記載されている好ましい実施態様のさらに別の特徴にしたがって、前記薬剤は、遷移金属キレート化剤および亜鉛からなる群から選択される。
【００５０】
以下に記載される本発明の好ましい実施態様の別の特徴にしたがって、赤芽球前駆細胞の成熟／分化を減速させて、β−異常ヘモグリン症の患者を治療する方法であって；その患者に、その細胞の、遷移金属を利用する性能を低下させて幹細胞の集団を拡張し、同時に、幹細胞の分化を阻害する薬剤を投与し、その結果、その薬剤が身体から自然に除去されると、その細胞は成熟が加速されて、胎児ヘモグロビンの産生が増大するステップを含んでなる方法が提供される。
【００５１】
記載されている好ましい実施態様のさらに別の特徴にしたがって、前記薬剤は、遷移金属キレート化剤と亜鉛からなる群から選択される。
【００５２】
以下に記載されている本発明の好ましい実施態様の別の特徴にしたがって、細胞の、遷移金属を利用する性能を低下させて、細胞の集団を拡張させるが同時に細胞の分化を阻害する薬剤の存在下、半ビボで増殖させた細胞を含有する、半ビボで培養した治療用細胞製剤が提供される。
【００５３】
記載されている好ましい実施態様のさらに別の特徴にしたがって、上記薬剤は、遷移金属の金属キレート化剤および亜鉛からなる群から選択される。
【００５４】
本発明のその外の実施態様にしたがって、遷移金属のキレート化剤の存在下、収穫、単離および貯蔵からなる群から選択されるステップの少なくとも一つで幹細胞を処理するステップを含んでなる幹細胞の保存法が提供される。
【００５５】
さらに本発明に従って、それぞれ、細胞の分化を阻害する有効な量または濃度の遷移金属キレート化剤を補充された幹細胞の収集バッグ、分離および洗浄用の緩衝液が提供される。
【００５６】
本発明は、細胞を増殖させるが、遷移金属を減少させることで細胞の分化を遅延させる方法を提供することによって、現在知られている配置構成の欠点を成功裡に処理する。
本発明の方法のさらなる特徴と利点を以下に説明する。
【００５７】
図面の簡単な説明
本発明は、本願において、添付図面を参照して、単に実施例として説明する。
【００５８】
図１はＣＤ３４細胞のクローンを形成する性能（clonlogenic potential）に対するＴＥＰＡの短期間の作用を示す棒グラフである。臍帯血由来のＣＤ３４細胞を、低投与量のサイトカイン類、すなわちＦＬＴ３−５ｎｇ／ｍｌ、ＳＣＦ−１０ｎｇ／ｍｌ、ＩＬ−６−１０ｎｇ／ｍｌの存在下で、かつＴＥＰＡなしまたは各種濃度のＴＥＰＡありで、３×１０４細胞／ｍｌにて、液体培養で平板培養した。７日目に、０．１ｍｌずつの試料を、半固形培地で細胞をクローン化し、コロニーを１４日後に計数することによって、コロニー形成細胞について検定した。二つの独立した実験の結果を示してある。
【００５９】
図２は全細胞およびＣＤ３４細胞に対する、ＴＥＰＡの短期間の作用を示す棒グラフである。臍帯血由来のＣＤ３４細胞を、ＦＬ−５ｎｇ／ｍｌ、ＳＣＦ−１０ｎｇ／ｍｌ、ＩＬ−６−１０ｎｇ／ｍｌの存在下でかつＴＥＰＡ（２０μＭ）ありまたはなしで、液体培養で平板培養した。７日目に、ウェル内培養物の容積の１／２を取り出し次いでそれを、図に示したように新鮮な培地およびＩＬ−３（２０ｎｇ／ｍｌ）で置換することによってデミ−デポピュレート（demi-depopulate）した。１４日目にＣＤ３４細胞の比率（右）および全細胞数（左）を、希釈計数を掛け算して求めた。
【００６０】
図３はＣＤ３４細胞の細胞数およびクローン形成性能に対するＴＥＰＡの長期間の作用を示す棒グラフである。臍帯血由来のＣＤ３４細胞を、高投与量のサイトカイン類すなわちＦＬ−５０ｎｇ／ｍｌ、ＳＣＦ−５０ｎｇ／ｍｌ、ＩＬ−６−５０ｎｇ／ｍｌ、ＩＬ−３−２０ｎｇ／ｍｌ、Ｇ−ＣＳＦ−１０ｎｇ／ｍｌ、ＥＰＯ−１Ｕ／ｍｌの存在下でかつＴＥＰＡ（２０μＭ）ありかまたはなしで、３×１０４細胞／ｍｌにて液体培養で平板培養した。４日目に、サイトカイン類とＴＥＰＡを補充した新鮮な培地０．９ｍｌで、培養物を１：１０の比率で希釈した。７日目、１４日目および２１日目に、培養物の容積の１／２を取り出し次いでそれを、図に示したように新鮮な培地、サイトカイン類およびＴＥＰＡで置換して培養物をデミ−デポピュレートした。収穫した培地の細胞を計数して、イニシエーティング細胞が１×１０３である部分を半固形培地でクローン化した。液体培養物中の細胞の数（上図）と半固形培地中のコロニーの数（下図）を、希釈計数を掛け算して示してある。＊印は小さなコロニーと細胞クラスターを示す。
【００６１】
図４は初期サイトカイン類とともに培養されたＣＤ３４細胞に対するＴＥＰＡの長期間の作用を示す棒グラフである。臍帯血由来のＣＤ３４細胞を、ＦＬ−５０ｎｇ／ｍｌ、ＳＣＦ−５０ｎｇ／ｍｌおよびトロンボポエチン（ＴＰＯ）−２０ｎｇ／ｍｌの存在下でかつＴＥＰＡ（１０μＭ）ありまたはなしで液体培養で平板培養した。１週間毎に、培養物容積の１／２を取り出し、図に示したように、それを新鮮な培地、サイトカイン類およびＴＥＰＡで置換することによって、培養物をデミ−デポピュレートした。収穫した培地の細胞を計数して、イニシエーティング細胞が１×１０３の部分を半固形培地でクローン化した。液体培養物中の細胞の数（下図）と半固形培養物内のコロニーの数（上図）を、希釈計数を掛け算して示してある。＊印は、コロニーが全く発生しなかったことを示す。
【００６２】
図５は赤血球前駆細胞の発生に対するＴＥＰＡの作用を示す棒グラフである。正常な成人ドナーから得た末梢血液単核細胞を、赤血球二相液体培養システムで培養した（２３−２５）。培養物第二相は、１０μＭのＴＥＰＡなしまたはありで補充した。培養物は、１４日後に、全細胞と、ヘモグロビン含有細胞〔ベンジジン陽性（Ｂ＋）細胞〕について分析した。
【００６３】
図６ａ−ｄは細胞の成熟に対するＴＥＰＡの作用を示す図である。ＴＥＰＡなし（図６ａと図６ｃ）とＴＥＰＡあり（図６ｂと図６ｄ）の場合の長期間（７週間）培養物中の細胞の形態と構造を示す。Cytospinで調製したスライドガラスをMay-Grunwald Giemsaで染色した。倍率は、図６ａと６ｂが×６００で図６ｃと６ｄが×１４８５である。
【００６４】
図７はＣＤ３４細胞で開始される培養物の細胞数とクローン形成性能に対する遷移金属キレート化剤の作用を示す棒グラフである。臍帯血由来のＣＤ３４細胞を、ＦＬ−２０ｎｇ／ｍｌ、ＳＣＦ−２０ｎｇ／ｍｌ、ＩＬ−３−２０ｎｇ／ｍｌ、ＩＬ−６−２０ｎｇ／ｍｌが存在しかつＴＥＰＡ−１０μＭ、キャプトプリル（ＣＡＰ）−１０μＭまたはペニシラミン（ＰＥＮ）−１０μＭの存在下で、液体培養で平板培養した。７日目に、細胞を計数し、イニシエーティング細胞が１×１０３の培養物の部分を、半固形培地で平板培養した。棒は、７日目の全細胞数（×１０３／ｍｌ）と、クローン化して１４日目のプレート当たりのコロニーの数を示す。
【００６５】
図８はＣＤ３４細胞のクローン生成性能と全細胞数に対する銅の作用を示す棒グラフである。臍帯血由来のＣＤ３４細胞を、サイトカイン類すなわちＦＬ−１０ｎｇ／ｍｌ、ＳＣＦ−１０ｎｇ／ｍｌ、ＩＬ−３−１０ｎｇ／ｍｌ、ＩＬ−６−１０ｎｇ／ｍｌの存在下で、液体培養で平板培養した。培養物に、図に記載したように、硫酸銅−５μＭとＴＥＰＡ−２０μＭを補充した。７日目に、細胞を計数し（下図）、次いでイニシエーティング細胞が１×１０３の部分を半固形培地で平板培養した。コロニーは１４日後に採点した（上図）。
【００６６】
図９は培養されたＣＤ３４細胞のクローン生成性能に対するイオンの作用を示す棒グラフである。臍帯血由来のＣＤ３４細胞を、ＦＬ−１０ｎｇ／ｍｌ、ＳＣＦ−１０ｎｇ／ｍｌ、ＩＬ−３−１０ｎｇ／ｍｌ、ＩＬ−６−１０ｎｇ／ｍｌの存在下でかつＴＥＰＡ−１０μＭありまたはなしで液体培養で平板培養した。培養物には、図に記載したように、硫酸銅−５μＭ、亜セレン酸ナトリウム−５ｍＭまたは鉄を飽和させたトランスフェリン０．３ｍｇ／ｍｌを補充した。７日目に、イニシエーティング細胞が１×１０３である培養物の部分を、半固形培地で平板培養した。１４日後に、コロニーを採点した。
【００６７】
図１０はＣＤ３４細胞の増殖性能に対する亜鉛の作用を示す棒グラフである。臍帯血由来のＣＤ３４細胞を、ＦＬ−１０ｎｇ／ｍｌ、ＳＣＦ−１０ｎｇ／ｍｌ、ＩＬ−３−１０ｎｇ／ｍｌ、ＩＬ−６−１０ｎｇ／ｍｌの存在下でかつＴＥＰＡ−１０μＭまたは硫酸亜鉛−５ｍＭまたは両者ありで液体培養で平板培養した。７日目に、イニシエーティング細胞が１×１０３の部分を半固形培地で平板培養した。コロニーを１４日後に採点した。
【００６８】
図１１ａ−ｃはＣＤ３４の長期間培養物に対するＴＥＰＡの作用を示す棒グラフである。ＳＣＦ、ＦＬＴ３およびＩＬ−６（各々５０ｎｇ／ｍｌ）ならびにＩＬ−３（２０ｎｇ／ｍｌ）の存在下でかつＴＥＰＡ（１０μＭ）ありまたはなしで、液体培地内で精製細胞を平板培養することによって、培養を、１０４の臍帯血由来のＣＤ３４細胞で開始した。１週間毎に、細胞の１／２を取り出し続いて新鮮な培地、サイトカイン類およびＴＥＰＡを添加することによって、培養物をデミ−デポピュレートした。指定の週に、細胞を計数し、そして半固形培地でクローン化することによって、コロニー形成細胞（ＣＦＵｃ）について検定した。ＣＦＵｃの頻度を、細胞数当たりのＣＦＵｃの数として算出した。１日目に精製ＣＤ３４細胞をクローン化して、１０４のイニシエーティング細胞当たり２．５×１０３のＣＦＵｃが生成した。＊印はコロニーが全く発生しなかったことを示す。
【００６９】
図１２−１４は異なる組み合わせの初期サイトカイン類の存在下での細胞増殖、ＣＦＵｃおよびＣＦＵｃの頻度に対するＴＥＰＡの作用を示す棒グラフである。臍帯血由来のＣＤ３４細胞を、ＳＣＦ、ＦＬＴ３およびＩＬ−６の存在下で（ＳＣＦ、ＦＬＴ、Ｉｌ−６）（各々５０ｎｇ／ｍｌ）かつＴＥＰＡ（１０μＭ）ありまたはなしで、液体培地内で、図１１ａ−ｃに詳細に記載したようにして培養した。さらに、培養物には、図に記載してあるように、ＩＬ−３（２０ｎｇ／ｍｌ）、ＴＰＯ（５０ｎｇ／ｍｌ）または両者を補充した。１週間毎に、培養物をデミ−デポピュレートして新鮮な培地、サイトカイン類およびＴＥＰＡを補充した。指定の週に、細胞を計数し（図１２）、ＣＦＵｃについて検定し（図１３）およびＣＦＵｃの頻度を算出した（図１４）。＊印はコロニーが全く発生しなかったことを示す。
【００７０】
図１５は対照およびＴＥＰＡを補充されたＣＤ３４培養物のＣＦＵｃ頻度に対するＧ−ＣＳＦとＧＭ−ＣＳＦの作用を示すグラフである。臍帯血由来のＣＤ３４細胞を図１１ａ−ｃに詳記したようにして培養した。１週間後、対照およびＴＥＰＡの培養物の１／２に、後期作用性サイトカインであるＧ−ＣＳＦとＧＭ−ＣＳＦ（各々１０ｎｇ／ｍｌ）を補充した。１週間毎に、培養物はデミ−デポピュレートして新鮮な培地、サイトカイン類およびＴＥＰＡを補充した。３，４および５週目に細胞を計数し、ＣＦＵｃについて検定し、次いでＣＦＵｃ頻度を算出した。
【００７１】
図１６−１７は長期間の細胞増殖とＣＦＵｃの産生に対する培地＋ＴＥＰＡの部分変更と完全変更の作用を示すグラフである。臍帯血由来のＣＤ３４細胞を、図１１ａ−ｃに詳記したようにして培養した。１週間毎に、培養物はデミ−デポピュレートして新鮮な培地、サイトカイン類およびＴＥＰＡで補充した。１週間毎に、培養内容物（細胞および上澄み液）の１／２を取り出して、新鮮な培地、サイトカイン類およびＴＥＰＡありまたはなしで置換した（部分的変更）。あるいは、培養物の全内容物を収穫し、遠心分離し、上澄み液と細胞の１／２を廃棄して、残りの細胞を、新鮮な培地とサイトカイン類およびＴＥＰＡありまたはなしで再培養した（完全変更）。指定の週に、細胞の数（図１６）とＣＦＵｃの数（図１７）を求めた。
【００７２】
図１８はＣＤ３４細胞の拡張に対するＴＥＰＡの作用を示す棒グラフである。臍帯血由来のＣＤ３４細胞を、図１１ａ−ｃに詳記したようにして培養した。１，２および３週目に、ＣＤ３４＋細胞をフローサイトメトリーで計数した。＊印はコロニーが全く発生しなかったことを示す。
【００７３】
図１９はＣＦＵｃ頻度に対する、ＴＥＰＡの遅い添加の作用を示すグラフである。臍帯血由来のＣＤ３４細胞を、図１１ａ−ｃに詳記したようにして培養した。ＴＥＰＡ（１０μＭ）を、培養の開始時（１日目）または６日後に添加した。１週間毎に、培養物はデミ−デポピュレートして新鮮な培地、サイトカイン類およびＴＥＰＡを補充した。３，４および５週目に、ＣＦＵｃを計数して検定し、次いでＣＦＵｃ頻度を算出した。
【００７４】
図２０は長期間のＣＦＵｃ産生に対する、単一のサイトカインとともに行う短期間のプレインキュベーションの作用を示すグラフである。臍帯血由来のＣＤ３４細胞を、図１１ａ−ｃに詳記したようにして培養した。培養物は、１日目に、ＳＣＦ、ＦＬＴ３、ＩＬ−６（各々５０ｎｇ／ｍｌ）およびＩＬ−３（２０ｎｇ／ｍｌ）でかつＴＥＰＡ（１０μＭ）ありまたはなしで補充した。あるいは、培養物は、１日目に、ＴＥＰＡ（１０μＭ）および単一のサイトカインとしてのＦＬＴ３（５０ｎｇ／ｍｌ）で補充した。２日目に、これらの培養物に、ＳＣＦ、ＩＬ−６（各々５０ｎｇ／ｍｌ）およびＩＬ−３（２０ｎｇ／ｍｌ）を添加した。１週間毎に、これら培養物のデミ−デポピュレートして、新鮮な培地、サイトカイン類およびＴＥＰＡを補充した。指定の週に、細胞を、ＣＦＵｃについて検定した。
【００７５】
図２１ａ−ｂはＣＤ３４細胞培養物に対するポリアミンキレート化剤の作用を示すグラフである。臍帯血由来のＣＤ３４細胞を、図１１ａ−ｃに詳記したようにして培養した。ポリアミンキレート化剤のテトラエチレンペンタミン（ＴＥＰＡ）、ペンタエチレンヘキサミン（ＰＥＨＡ）、エチレンジアミン（ＥＤＡ）またはトリエチレン−テトラミン（ＴＥＴＡ）を、各種の濃度で添加した。１週間毎に、培養物を、デミ−デポピュレートして、新鮮な培地、サイトカイン類およびキレート化剤を補充した。３，４，６および７週目に、細胞を計数し、ＣＦＵｃについて検定した。示した試験結果は、最適活性を有する濃度すなわちＴＥＰＡ−４０μＭ、ＰＥＨＡ−４０μＭ、ＥＤＡ−２０μＭおよびＴＥＴＡ−２０μＭの場合の結果である。
【００７６】
図２２ａ−ｂはＣＤ３４細胞培養物に対する遷移金属キレート化剤の作用を示すグラフである。臍帯血由来のＣＤ３４細胞を、図１１ａ−ｃに詳記したようにして培養した。キレート化剤のキャプトプリル（ＣＡＰ）、ペニシラミン（ＰＥＮ）およびＴＥＰＡを各種の濃度で添加した。１週間毎に、培養物を、デミ−デポピュレートして新鮮な培地、サイトカイン類およびキレート化剤を補充した。４，５および７週目に、細胞を計数し、ＣＦＵｃについて検定した。示した結果は、最適活性を有する濃度すなわちＴＥＰＡ−１０μＭ、ＰＥＮ−５μＭおよびＣＡＰ−４０μＭの場合の結果である。
【００７７】
図２３ａ−ｂはＣＤ３４細胞培養物に対する亜鉛の作用を示すグラフである。臍帯血由来のＣＤ３４細胞を、図１１ａ−ｃに詳記したようにして培養した。亜鉛（Ｚｎ）を、１日目に、各種濃度で添加した。１週間毎に、培養物を、デミ−デポピュレートして新鮮な培地、サイトカイン類およびＺｎを補充した。４，５および７週目に、細胞を計数し、ＣＦＵｃについて検定した。
【００７８】
図２４は末梢血液由来のＣＤ３４細胞培養物に対するＴＥＰＡの作用を示すグラフである。末梢血液由来のＣＤ３４細胞を、図１１ａ−ｃに詳記したようにして培養した。培養物には、ＴＥＰＡを補充しまたは補充しなかった。１週間毎に、培養物を、デミ−デポピュレートして新鮮な培地とＴＥＰＡを補充した。１週目と４週目に、細胞をＣＦＵｃについて検定した。＊印はコロニーが全く発生しなかったことを示す。
【００７９】
好ましい実施態様の説明
本発明は、細胞の人集団を含有する半ビボで培養された細胞の治療用細胞製剤を提供するために使用できる幹細胞と前駆細胞の増殖と分化を制御する方法であって、分化は阻害されるが拡張は増大される方法の発明である。具体的に述べると、本発明は、造血細胞の移植に用いる幹細胞と前駆細胞、遺伝子治療に使用できる遺伝子操作に適した幹細胞、および例えば限定されないがβ−異常ヘモグロビン症などの疾患の新しい治療手段を提供するのに使用できる。
【００８０】
本発明は、幹細胞および前駆細胞の増殖と分化を制御する方法に関する。さらに詳しく述べると、本発明は、遷移金属、特に銅の利用効率を修正することによって、幹細胞および前駆細胞に増殖を強制するが分化を抑制する方法に関する。
【００８１】
本発明の方法の原理と操作は、添付図面と付随する説明と実施例によってより充分に理解できる。
【００８２】
本発明の少なくとも一つの実施態様を詳細に説明する前に、本発明は、以下の説明に述べられているかまたは添付図面に示されている要素の詳細な構造と配置に用途が限定されるものではないと解すべきである。本発明は、他の実施態様が可能であり、または各種の方法で実施することができる。また、本願で利用される表現法と用語は、説明を目的とするものであり、限定とみなすべきではないと解すべきである。
【００８３】
本発明の研究の過程で、銅などの遷移金属に結合（キレート化）するか、または銅の代謝を阻害する一連の化学薬剤が、幹細胞および中期と後期の前駆細胞の分化するプロセスを可逆的に阻害（遅延）することができて、活性細胞増殖の相を刺激し延長することができることが発見されたのである。
【００８４】
遷移金属を減少させるこの新たに発見された作用が利用されて、各種の造血細胞の半ビボでの拡張が最大限になった。このような半ビボで拡張された細胞はいくつもの臨床状態に利用できる。以下にいくつかの例を挙げる。
【００８５】
造血細胞の移植：造血細胞の移植は、各種の遺伝性疾患または悪性疾患に対する優れた治療法になっている。初期の移植法は、全骨髄（ＢＭ）集団を利用したが、最近は、幹細胞（ＣＤ３４＋細胞）が豊富化された一層特別な集団が使用されている（１）。
【００８６】
かような細胞は、骨髄に加えて、末梢血液（ＰＢ）および新生児臍帯血液（ＣＢ）などの他の起源から得ることができる（２）。ＰＢ細胞による移植は、ＢＭに比べて、汎血球減少の期間が短くなるので、感染症や出血の危険性が少なくなる（３−５）。
【００８７】
移植にＰＢを使用する場合の追加の利点は、利用しやすいことである。ＰＢ移植を制限する因子は、循環する多分化能性の幹細胞と前駆細胞の数が少ないことである。
【００８８】
ＰＢ由来の幹細胞を、移植に用いるのに十分得るため、これらの細胞は、化学療法とサイトカイン類で処理することによって骨髄から循環系へ可動化させた後、白血球分離法を繰り返して“収穫される”（３−４）。この処理は、正常なドナーに対して適切なものでないことは明らかである。
【００８９】
半ビボで拡張された幹細胞を移植して使用すると、以下の利点がある（２，６−７）。
【００９０】
成人の造血系を再構成するのに必要な血液の容積が減少し、かつ可動化と白血球分離法が必要でなくなる（３）。
【００９１】
将来使用する可能性がある少数のＰＢもしくはＣＢの幹細胞を貯蔵することができる。
【００９２】
悪性腫瘍がみられる患者の自己移植の場合、自己注入時の汚染腫瘍細胞が疾患再発の原因になることが多い（３）。ＣＤ３４＋幹細胞を選択し拡張すると、最終の移植体の腫瘍細胞の負荷量が減少する。
【００９３】
上記培養物はＴリンパ球が有意に減少する。このことは、同種異系の移植片を移植する際に、移植片宿主相関病を少なくするのに有用である。
【００９４】
臨床試験は、少数のＰＢＣＤ３４＋細胞由来の半ビボで拡張された細胞を移植すると、高投与量の化学療法で治療された患者の造血を回復できることを示したが、その試験結果によって、これらの培養された細胞の長期間にわたるインビボでの造血能力について、しっかりした結論を下すことはできない（３−４）。
【００９５】
移植に成功するには、血球減少相の期間が短いことと移植期間の長いことが重要である。移植片に、中期と後期の前駆細胞を含めると、ドナー由来の成熟細胞の産生を加速しかつ血球減少相を短縮することができる。それ故、半ビボで拡張された細胞が、造血の短期間での回復と長期間にわたる復原を最適化するため、幹細胞に加えて、一層分化した前駆細胞を含有していることが大切である。中期と後期の前駆細胞、特に好中球系統と骨髄巨核球系統に拘束されているものの拡張は、幹細胞の拡張とあいまって、上記目的を達成するのに役立つはずである（８）。
【００９６】
かような培養物は、骨髄を完全に除かれた患者に造血を復原するのに有用であるのみならず通常の放射線療法または化学療法に続く骨髄の回復を短期間で行うための補助手段としても有用である。
【００９７】
まれな細胞の遺伝子欠陥の出生前の診断：出生前の診断は、妊婦から胚細胞を収集し次いでそれを遺伝子欠陥について分析して行った。胚細胞を収集する好ましい非侵襲の方法は、母体の血液循環系中に浸透した胚の有核赤血球前駆体を分離することによって行われる。しかしこのような細胞は非常にまれであるから、分析する前に細胞の拡張を行わねばならない。したがって、本発明は、出生前に診断するため胚細胞を拡張する方法を提供するものである。
【００９８】
遺伝子療法：長期間の遺伝子治療に成功するには、そのデノムに導入遺伝子を組み込まれた形質導入幹細胞が高頻度で存在していることが不可欠の必要条件である。ＢＭ組織の場合、その細胞の大部分は、サイクリング（cycling）前駆細胞（細胞周期を進行中の前駆細胞）であり、一方、幹細胞は細胞集団の小画分のみを構成し、その大部分は、静止した非サイクリング状態である。
【００９９】
ウィルスベースの（例えばレトロウィルスベースの）ベクターは、導入遺伝子を宿主ゲノムに組み込むのに、活性細胞分裂（active cell division）が必要である。そのため、新鮮なＢＭ幹細胞に遺伝子を導入することは非常に効率が悪い。半ビボで、幹細胞の精製された集団を拡張しかつその細胞分裂を調節できると、それらの形質導入の確率を増大することができる（９）。
【０１００】
養子免疫療法：半ビボで拡張された確定リンパ系サブ集団（subpopulation）が、研究されており、かつ各種の悪性腫瘍、免疫不全、ウィルスと遺伝子の疾患の養子免疫療法に使用されている（１０−１２）。
【０１０１】
その治療法は、必要な免疫応答を促進するかまたは欠陥機能を置き換える。この方法は、Rosenbergら（１３）が、多数の自己の半ビボで拡張された非特異的キラーＴ細胞および実質的に半ビボで拡張された特異的な腫瘍浸透リンパ球を用いて、臨床によって最初に開発した。
【０１０２】
機能的に活性の抗原提示細胞が、サイトカインを保持する培養物中、ＣＤ３４＋ＰＢ細胞の出発集団から増殖させることができることも報告されている。これらの細胞は、可溶性タンパク質の抗原を、インビトロで自己Ｔ細胞に提示することができるので、高投与量の化学療法の後の微小の残存疾患の免疫療法のための新しい可能性が見込まれる。抗原提示樹状細胞の半ビボでの拡張も研究された（１４−１６）。
【０１０３】
非造血性の幹細胞と前駆細胞の半ビボ拡張：例えば神経幹細胞またはオリゴデンドロサイトの前駆細胞の半ビボ拡張。
ミエリンの障害は、今までのところまだ不治のヒト神経疾患の重要なグループを形成している。動物モデルの場合、特に、オリゴデンドロサイト系の細胞を移植すると、病巣に有意に髄鞘が再び生成して、機能が回復した生理学的徴候が現れる（３６）。将来の治療は、移植、および内因性修復の促進の両方を行うことができ、これら二つの方法は、ドナーの組織の半ビボの処理と組み合わせることができる。
【０１０４】
米国特許第５４８６３５９号は、２種以上の組織（例えば骨、軟骨、筋肉または骨髄支質）に分化できる単離されたヒト間葉幹細胞、およびヒト間葉幹細胞を単離し精製しおよび培養で拡張する方法を教示している。
【０１０５】
米国特許第５７３６３９６号は、単離され、培養で拡張されたヒト間葉幹細胞のインビトロまたは半ビボでの系統特異的誘発法（lineage-directed induction）であって、その間葉幹細胞を、選択された系統へのその分化を誘発するのに有効な生物活性因子と接触させるステップを含んでなる方法を教示している。さらに、かような培養で拡張され系統に対し誘発された間葉幹細胞を、それらが、間葉組織の再生または修復を行うために起源とした宿主中に導入することも含む方法が開示されている。
【０１０６】
米国特許第４６４２１２０号は、軟骨と骨類の欠陥を修復するのに用いる組成物を教示している。これらの組成物は、そのまままたは天然もしくは人工の骨の中に埋包されて、ゲルの形態で提供される。そのゲルは特定のタイプの細胞を含有している。これらの細胞は、胚の拘束軟骨細胞、または一般に、ライブリノーゲン、アンチプロテアーゼおよびトロンビンを組み合わせた軟骨形成誘発因子の影響によって軟骨細胞に変換しうる可能性があるあらゆる種類の間葉組織起源の組織でよい。
【０１０７】
米国特許第５６５４１８６号は、血液が含有する間葉組織細胞が、培養で増殖し、そしてインビボで、動物モデルで示されているように、その血液から創傷部位に移行して皮膚を生成することができることを教示している。
【０１０８】
米国特許第５７１６４１１号は、動物とヒトの創傷または火傷の皮膚を再生する方法を教示している。この方法は、最初、創傷をコラーゲングリコサミノグリカンマトリックスで覆い、その移植されたＧＣマトリックスを、間葉細胞と血管によって、健康な下側の組織から浸透させ、次いで、動物またはヒトの体表面の創傷のない部位の、動物またはヒトから採取した表皮細胞から増殖させた培養表皮自己移植シートをはりつけるステップを含んでなる方法である。得られた移植片は生着速度に優れ、かつ、正常な皮膚の外観、成長、成熟および分化を示している。
【０１０９】
米国特許第５７１６６１６号は、軟骨または肺臓の欠陥を特徴とする疾患、障害または症状がみられる患者を治療する方法を教示している。この方法は、正常な同系の個体から単離した支質細胞を静脈投与するか、または単離された細胞の遺伝子欠陥を矯正した後、患者から単離した支質細胞を静脈投与するステップを含んでなる方法である。遺伝子を受容者の個体に導入する方法も開示されている。その方法は、骨髄試料を、受容者の個体または適合した同系ドナーから得て、その試料から付着細胞を単離し、受容者または適合同系ドナーから単離した付着細胞に、遺伝子をトランスフェクトし、次いで、そのトランスフェクトされた付着細胞を受容者の個体に静脈投与するステップを含んでなる方法である。調節配列に作動可能に連結された外因性遺伝子を含有する、単離された支質細胞を含有する組成物が開示されている。
【０１１０】
上記の各例では、非造血幹細胞と非造血前駆細胞が、器官の失われたかまたは損傷した細胞を補充するための細胞の外部供給源として使用されている。このような用途には、第一に、必要な細胞集団を得るため、分化する前に、細胞の拡張（cell expansion）が必要である。上記の諸米国特許に開示されている方法のいずれかを実施する際、本発明の方法が非常に有効かつ有用になるのは、このステップである。
【０１１１】
半ビボおよびインビボ両者の用途の追加例：皮膚の再生、肝臓の再生、筋肉の再生および骨粗しょう症における骨の増殖。
【０１１２】
骨髄幹細胞の末梢血液中への可動化〔ペリフェラリゼーション（peripheralization）〕：遷移金属キレート化剤の作用の発見はインビボでも利用できる。上記のように、移植に用いるＰＢ由来幹細胞は、化学療法およびサイトカインで治療することによってこれら細胞を骨髄から循環系に可動化させた後、白血球分離法を繰り返して“収穫”される（３−４）。
【０１１３】
化学療法の使用は、正常なドナーに対して勿論、適切でない。ＴＥＰＡなどの遷移金属キレート化剤をドナーへ投与すると、骨髄幹細胞のプールが増大し、次に、そのプールは内因性Ｇ−ＣＳＦまたは注射されたＧ−ＣＳＦによって周縁に向かって可動化される。
【０１１４】
白血病：正常な造血と異なり、白血病の場合、増殖と分化のプロセスが連結しておらず、その悪性細胞は、分化できないので、連続的に増殖する性能を維持している。
【０１１５】
遷移金属の特に銅の減少によって、正常な前駆細胞の増殖と分化のプロセスを連結しないように駆動する分子現象を理解すれば、白血病発生に関与する細胞プロセスを解明することができる。
【０１１６】
胎児ヘモグロビン産生の刺激：胎児ヘモグロビンが増大すると、鎌状細胞貧血およびβ−サラセミアなどのβ−異常ヘモグロビン症がみられる患者の臨床徴候が改善することが報告されている（３８）。
【０１１７】
胎児ヘモグロビンは、通常、全ヘモグロビンの約１％を占めているが、赤血球産生が加速されると（例えば、急性の溶血または出血またはエリスロポエチンの投与によって）上昇する（３５）。
【０１１８】
この現象は、赤血球前駆細胞の成熟／分化のプロセスの加速と関連していることが示唆されている（３７）。
【０１１９】
ＴＥＰＡなどの遷移金属キレート化剤を、β−異常ヘモグロビン症の患者に投与すると、第一に（分化を阻止することによって）、患者の初期赤血球前駆細胞のプールを増大して同期化する（synchronize）。
【０１２０】
上記薬剤の投与を中止した後、その薬剤が身体から排泄されると、その初期集団は成熟が加速され、胎児ヘモグロビンの産生が増大する。
【０１２１】
したがって、本発明によって、細胞の集団を拡張し、同時にその細胞の分化を阻害する方法が提供される。この方法は、細胞が増殖し同時に遷移金属を利用するその細胞の性能を低下させる条件を、その細胞に与えるステップを含んでいる。
【０１２２】
遷移金属を利用する細胞の性能の低下は、例えば（例えば適切なキレート化剤で）遷移金属を減らすことによって、または（例えば亜鉛イオンを添加して）遷移金属の代謝を妨害することによって実施できる。
【０１２３】
用語“阻害する”は、本願で使用する場合、ゆっくり行う、減少させる、遅らせる、防止するまたは無効にすることを意味する。
【０１２４】
用語“分化”は、本願で使用する場合、発育中、比較的一般的な種類から特殊な種類への変化を意味する。各種細胞系の細胞分化は、十分に報告されているプロセスなので、本願ではそれ以上に述べる必要はない。
【０１２５】
本発明の好ましい実施態様によれば、拡張すべき細胞は生体内に存在している。この場合、細胞が増殖する条件は、自然に提供される。したがって、遷移金属、例えば限定されないが銅を利用する細胞の性能の低下は、遷移金属例えば銅のキレート化剤、亜鉛イオンまたは両者を投与することによって実施される。
【０１２６】
遷移金属のキレート化剤および／または亜鉛イオンの投与は、これらのものを含有し、さらに粘稠化剤、担体、緩衝剤、希釈剤、界面活性剤、保存剤などの当該技術分野で公知のすべてのものを含有していてもよい医薬組成物で行われる。
【０１２７】
その医薬組成物は、局所または全身の治療が選択されるかどうかおよび治療される部位によって一つ以上の方法で投与できる。投与は、局所に（眼内、膣内、直腸内、鼻腔内を含む）、経口で、吸入により、または非経口で例えば静脈内点滴、または腹腔内、皮下、筋肉内、または静脈内注射で行うことができる。
【０１２８】
局所投与用の配合剤としては、限定されないが、ローション剤、軟膏剤、ゲル剤、クリーム剤、坐剤、滴剤、液剤、スプレー剤および粉末薬がある。通常の医薬担体、水性、粉末もしくは油状の基剤、粘稠化剤が必要であるかまたは望ましい。
【０１２９】
経口投与用の組成物としては、粉末薬もしくは顆粒剤、水もしくは非水性媒体の懸濁剤もしくは水剤、サシェ剤、カプセル剤または錠剤がある。粘稠化剤、希釈剤、着香剤、分散助剤、乳化剤または結合剤が望ましい。
【０１３０】
非経口投与用の配合剤としては限定されないが、緩衝剤、希釈剤などの適切な添加剤も含有する滅菌溶液がある。
【０１３１】
投薬は、治療すべき症状の重症度と反応性によって決まるが、数日〜数カ月間または治癒するまでまたは疾患状態が減退するまで続く治療の過程で、通常、１日当たり１回以上である。当業技術者であれば最適の投与量、投与法および反復率（repetition rete）は容易に決定できる。徐放投与方式が、いくつかの用途で有利である。
【０１３２】
本発明の他の好ましい実施態様で、拡張すべき細胞は、半ビボで存在している。
【０１３３】
用語“半ビボ（ex vivo）”は、本願で使用する場合、生きている生物から取り出されて、その生物の外部（例えば試験管内）で増殖される細胞を意味する。しかし、用語“半ビボ”は、本願で使用する場合、各種の細胞系（例えばＨＬ−６０、ＨｅＬａなど）のようにインビトロ（in vitro）でしか増殖しないことが知られている細胞を意味しない。
【０１３４】
半ビボで増殖する細胞に、細胞増殖の条件を与えることには、それらの細胞に栄養素および好ましくは１種以上のサイトカインを与えることが含まれる。また、それら細胞の、銅などの遷移金属を利用する性能は、適切な遷移金属キレート化剤および／または亜鉛イオンによって低下させる。
【０１３５】
このキレート化剤および／または亜鉛イオンの最終濃度は、特定の用途に応じて、マイクロモルまたはミリモルの範囲内でよい。例えば、約０．１μＭ〜約１００ｍＭ、好ましくは約４μＭ〜約５０ｍＭ、さらに好ましくは約５μＭ〜約４０ｍＭの範囲内である。
【０１３６】
本発明の好ましい実施態様によれば、キレート化剤は、ポリアミンのキレート化剤であり、限定されないが、例えばエチレンジアミン、ジエチレントリアミン、トリエチレンテトラミン、トリエチレンジアミン、テトラエチレンペンタミン、アミノエチルエタノールアミン、アミノエチルピペラジン、ペンタエチレンヘキサミン、トリエチレンテトラミン−塩酸、テトラエチレンペンタミン−塩酸、ペンタエチレンヘキサミン−塩酸、キャプトプリルまたはペニシラミンがあり、テトラエチルペンタミンが好ましい。キレート化剤は、遷移金属結合モチーフを有する適切なペプチドでもよい。上記キレート化剤は、銅イオンに対して高いアフィニティーを有していることが知られている。しかし、これらのキレート化剤は他の遷移金属に対してもかなりのアフィニティーを有している（３９）。この文献（３９）は全体を本願に援用するものである。
【０１３７】
本発明の他の好ましい実施態様によれば、前記サイトカイン類は、初期作用性サイトカイン類の例えば限定されないが、幹細胞因子、ＦＬＴ３リガンド、インターロイキン−６、トロンボポエチンおよびインターロイキン−３、および／または後期作用性サイトカイン類の例えば限定されないが顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子およびエリスロポエチンである。
【０１３８】
上記細胞としては、限定されないが、造血細胞、神経細胞、オリゴデンドロサイト細胞、皮膚細胞、肝細胞、筋肉細胞、骨細胞、間葉細胞、膵細胞、軟骨細胞および支質細胞を含むあらゆる細胞系の細胞がある。
【０１３９】
本発明の方法によって半ビボで拡張するのに用いる造血細胞は、用途に応じて、骨髄、末梢血液または新生児臍帯血から得ることができる。
【０１４０】
造血細胞は、造血ＣＤ３４＋細胞（すなわち幹細胞）を豊富化することが好ましい。幹細胞の画分の豊富化は、当該技術分野で知られているように、細胞ソーティング（cell sorting）で行うことができる。
【０１４１】
本発明によって拡張される細胞は、分化されていない幹細胞または拘束前駆細胞でよい。幹細胞は、多種類の細胞系について知られている。これらの細胞は、その細胞系の最も分化されていない細胞であることが特徴である。一方、前駆細胞は、その細胞系内で分化経路にすでに拘束されているので、一層分化している。
【０１４２】
さらに本発明によって、造血細胞の移植方法が提供される。この方法には次のステップが含まれている。第一に、移植すべき造血細胞をドナーから得る。第二に、造血細胞は、その細胞が増殖し同時に遷移金属の特に銅を利用するその細胞の性能を低下させる条件を半ビボで与えられて、その細胞の集団が拡張され、同時に細胞の分化が阻害される。最後に、その細胞を患者に移植する。自己移植の場合、ドナーと患者は個別の個体である。これらの細胞は、末梢血液、骨髄または新生児臍帯血から得ることができる。これらの細胞は、幹細胞または前駆細胞を豊富化すること（例えば細胞ソーティングによって）が好ましい。
【０１４３】
さらに、本発明によって、幹細胞に、外来遺伝子（導入遺伝子）を形質導入（トランスフェクト、形質転換）する方法が提供される。この方法には、次のステップが含まれている。第一に、形質導入すべき幹細胞を入手する。第二に、その細胞が増殖し同時に遷移金属を利用するその細胞の性能を低下させる条件を、その細胞に半ビボで与えて、細胞の集団を拡張させ、同時に細胞の分化を阻害する。第三に、その細胞に、外来遺伝子を形質導入する。形質導入法は当該技術分野で公知であるので、本願ではそれ以上の説明は必要でない。形質導入のプロトコルの例は、Sambrook,J., Fritsch,E.F., Maniatis,T., “Molecular Cloning. A Laboratory Manual”Cold Spring Harbor Laboratory Press、ニューヨーク、１９８９年を含む多くの実験室マニュアルに見られる。形質導入は、外来遺伝子を含有するベクターで行うことが好ましい。
【０１４４】
さらに、本発明によって、養子免疫療法が提供される。この方法には以下のステップが含まれている。第一に、造血前駆細胞を患者から得る。第二に、その細胞にその細胞が増殖し同時に遷移金属の特に銅を利用するその細胞の性能を低下させる条件が半ビボで与えられて、その細胞の集団が拡張され同時に細胞の分化が阻害される。最後に、その細胞を、患者に移植する。
【０１４５】
さらに、本発明によって、骨髄幹細胞をドナーの末梢血液中に可動化させてその細胞を収穫する方法を提供する。この方法には以下のステップが含まれる。第一に、ドナーに、上記細胞の、遷移金属の特に銅を利用する性能を低下させる薬剤を投与して、幹細胞の集団を拡張させ、同時に幹細胞の分化を阻害する。第二に、その細胞を白血球分離法によって収穫する。ドナーにサイトカイン（初期および／または後期に作用するサイトカイン）を投与することは、可動化を高めるのに好ましい。前記薬剤は、遷移金属キレート化剤および／または亜鉛イオンが好ましい。
【０１４６】
さらに、本発明によって、赤血球前駆細胞の成熟／分化を減速させてβ−異常ヘモグロビン症の患者を治療する方法が提供される。この方法には、細胞の、遷移金属の特に銅を利用する性能を低下させる薬剤を患者に投与して幹細胞の集団を拡張し、同時に幹細胞の分化を阻害し、その結果、その薬剤が身体から自然に排泄されると、その幹細胞は成熟が加速されて胎児ヘモグロビンの産生が増大するステップが含まれる。
【０１４７】
さらに、本発明によって、半ビボで培養された細胞の治療用製剤が提供される。その製剤は、細胞の、遷移金属の特に銅を利用する性能を低下させて細胞の集団を拡張させ、同時に細胞の分化を阻害する薬剤の存在下、半ビボで増殖させた細胞を含有している。
【０１４８】
ここで以下の実施例を上記説明とともに参照して、本発明を説明するが、本発明を限定するものではない。
【０１４９】
実 施 例 １
実 験 の 手 順
ＣＤ３４細胞の選択：全血ユニット由来の末梢血液“バフィコート（buffy coat）”細胞、白血球分離法によって得た末梢血液細胞または臍帯血細胞を、Ficoll-Hypaque（密度１．０７７ｇ／ｍｌ）上に重層し、次いで１０００×ｇで、２０分間、室温で遠心分離した。単核細胞の間期層（interphase layer）を収集し、１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するＣａ／Ｍｇなしリン酸塩緩衝食塩水で３回洗浄した。得られた細胞を、マウスのモノクローナル抗ＣＤ３４抗体（０．５μｇ／１０６単核細胞）とともに４℃にて３０分間インキュベートし、次いで、miniＭＡＣＳ装置（Miltenyi-Biotec, Bergisch, Gladbach, ドイツ）を、メーカーのプロトコルにしたがって使用して単離した。
【０１５０】
培養の手順：前駆細胞を拡張するため、ＣＤ３４＋を豊富化した画分または未分離の単核細胞を、１０％の予め選択されたウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含有するα−最少必須培地（両者とともに米国ニューヨーク州グランドアイランド所在のＧＩＢＣＯから入手）または血清なしの培地（Progenitor−３４培地、米国ニューヨーク州グランドアイランド所在のLife Technologies）中に、約１−３×１０４細胞／ｍｌで接種した。これらの培地には、成長因子と遷移金属キレート化剤の混合物を補充した。過剰湿度の５％ＣＯ２空気の雰囲気内で、３７°にて培養物をインキュベートした。培地の１／２を、すべての補充剤を含有する新鮮な培地で、１週間毎に変えた。
【０１５１】
クローン化の可能性の評価：液体培地で発育させた細胞のクローン化の可能性を、異なる時間間隔で、半固形培地内で検定した。細胞を、洗浄し、３５ｍｍの皿の中の、組換え成長因子（ＳＣＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＥＰＯ）を補充したα培地を含有するメチルセルロース中に接種した。２週間インキュベートした後、培養物を倒立顕微鏡で採点した。コロニーを、その細胞の組成にしたがって、芽球、混合物、赤血球、骨髄および巨核球のコロニーに分離した。
【０１５２】
形態学的評価：得られた培養物集団の特性を決定するため、細胞の一部をスライドガラスの上に被着させ（cytocentrifuge, Shandon, Runcorn, 英国）、固定し、次いでMay-Grunwald Giemsaで染色した。細胞の残りの部分は、細胞内ヘモグリンについて、ベンジジンで染色した。
【０１５３】
免疫蛍光染色：異なる時間間隔で、液体培養物から得た細胞を、ＣＤ３４抗原について検定した。一部を収穫し、洗浄し、次いでＦＬＴＣで標識した抗ＣＤ４５モノクローナル抗体、およびＰＥで標識した抗ＣＤ３４（ＨＰＣＡ−２）モノクローナル抗体またはＰＥで標識した対照のマウスＩｇとともに、氷上でインキュベートした。インキュベートした後、赤色細胞を溶解溶液で溶解し、残った細胞を洗浄し、次いでフローサイトメーターで分析した。
【０１５４】
フローサイトメトリー：ＦＡＣＳtarplusフローサイトメーター（Becton-Dickinson, Immunofluorometry systems, 米国カリフォルニア州マウンテン・ビュー）を使用して、細胞を分析して選別した。シース液として食塩水を使用し、細胞を、１０００細胞／秒の速度で、７０ｍｍのノズルを通じて通過させた。４８８ｎｍのアルゴンレーザビーム（２５０ｍＷ）を、励起のための光源として使用した。グリーン（ＦＩＴＣ由来）蛍光を５３０±３０ｎｍの帯域フィルターを使って測定し、レッド（ＰＥ由来）蛍光を５７５±２６ｎｍの帯域フィルターを使用して測定した。ＰＭＴは適当な電圧に設定した。蛍光を測定するのに対する増幅を利用し、前方光散乱を測定するのに線形増幅を利用した。少なくとも１０４の細胞を分析した。
【０１５５】
実 施 例 ２
実 験 結 果
造血前駆細胞の増殖を刺激し分化を阻害する培養条件を開発しようとして、ＣＤ３４＋細胞を下記の補助剤とともに培養した。
【０１５６】
遷移金属キレート化剤、例えばテトラエチレンペンタミン（ＴＥＰＡ）、キャプトプリル（ＣＡＰ）、ペニシラミン（ＰＥＮ）などのキレート化剤、または遷移金属の代謝を阻害する亜鉛などのイオン。
初期に作用するサイトカイン：幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＦＬＴ３リガンド（ＦＬ）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）およびインターロイキン−３（ＩＬ−３）。
後期作用性サイトカイン：顆粒コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）およびエリスロポエチン（ＥＰＯ）。
【０１５７】
ＣＤ３４＋の短期間培養物の増殖とクローン性に対するＴＥＰＡの作用：ＣＤ３４＋細胞にＴＥＰＡを加え、低投与量の初期作用性サイトカインとともに培養した結果、全細胞数およびＣＤ３４＋細胞の数（蛍光で標識した特定の抗体を利用するフローサイトメトリーで測定、図２）ならびに細胞のクローン性（半固形培地内で培養物の一部分を平板培養し、２週間後に発生するコロニーを採点して測定、図１）が、サイトカインだけを補充した培養物と比べて有意に増大した。ＴＥＰＡの存在下で半固形培地に発生したコロニーは、骨髄、赤血球および混合表現型のコロニーであった。
【０１５８】
高投与量の初期サイトカイン類を補充したか（表１）または初期作用性と後期作用性のサイトカインを組み合わせて補充した（図３）培養物におけるＴＥＰＡの作用をさらに評価した。これらの試験結果は、ＴＥＰＡが、これらの培養物中のＣＤ３４＋細胞のクローン性と比率を有意に増大することを示した。全細胞については、初期サイトカインを補充した培養物ではＴＥＰＡによって増大したが（表１、図２）、初期サイトカインと後期サイトカインの両者を補充した培養物ではＴＥＰＡは限界的な（marginal）阻害を起こした（図３）。
【０１５９】
【表１】
0003810273.tif 000002
【０１６０】
ＦＬ−５０ｎｇ／ｍｌ、ＳＣＦ−５０ｎｇ／ｍｌ、ＩＬ−６−５０ｎｇ／ｍｌの存在下、ＩＬ−３−２０ｎｇ／ｍｌありもしくはなしでかつＴＥＰＡ−１０μＭありもしくはなしで液体培養にて、臍帯血由来のＣＤ３４細胞を平板培養した。７日目に、ＣＤ３４細胞の比率と全細胞数を測定した。イニシエーティング細胞が１×１０３の部分を、半固形培地でクローン化することによって、コロニー形成細胞（ＣＦＵ）についてゼロ日目と７日目に検定した。ＣＦＵの拡張は、７日目に存在するＣＦＵ／ゼロ日に存在するＣＦＵの比率を示す。
【０１６１】
ＣＤ３４＋の長期間培養物の増殖とクローン性に対するＴＥＰＡの作用：１週間毎にデミ−デポピュレーション（demi-depopulation）（培養容積の１／２を取り出して新しい培地とサイトカインで置換）を行うことによって、長期間培養物を３−５週間維持した。ＴＥＰＡを添加した結果、初期サイトカイン（図４）または初期サイトカインと後期サイトカインの両者（図３）を補充した長期間培養物のクローン性がサイトカインだけを補充した培養物に比べて高くなった。
【０１６２】
培養を３週間行った後、サイトカインだけを補充した培養物はクローン性が急激に低下したが、サイトカインを組み合わせてＴＥＰＡで処理した培養物は高いクローン性を維持した。なおそのクローン性は短期間培養物よりはるかに高かった。
【０１６３】
造血細胞の成熟に対するＴＥＰＡの作用：造血細胞の成熟に対するＴＥＰＡの作用をいくつかのモデルで試験した。
【０１６４】
マウスの赤白血病細胞（ＭＥＬ）：ＭＥＬ細胞は赤芽球様細胞である。いくつもの化学薬剤（分化誘発剤）で処理されると、ＭＥＬ細胞は赤血球分化を起こして、ヘモグロビンが蓄積される。ＭＥＬ細胞を、分化誘発剤のヘキサメチレンビスアセトアミド（ＨＭＢＡ）およびキレート化剤のＴＥＰＡもしくはキャプトプリルの存在下で培養した。培養３日目に、細胞の全数とヘモグロビン含有細胞の比率を測定した（表２）。試験結果は、ＴＥＰＡとキャプトプリルの両者が、ＨＭＢＡで誘発されるＭＥＬ細胞の分化を阻害することを示した。
【０１６５】
ヒト赤血球細胞の培養物：参照文献２３−２６に特に記載されているような２相液体培養法に従って、正常なヒトの赤血球細胞を増殖させた。第一相において、末梢血液単核細胞を、初期成長因子の存在下、５−７日間インキュベートした。第二相においては、これらの因子を、赤血球特異的増殖／分化因子であるエリスロポエチンで置換した。
【０１６６】
これらの培養物は、第二相の開始（initiation）時にＴＥＰＡを補充した。全細胞数およびヘモグロビン含有細胞の比率を１４日後に測定した。試験結果（図５）は、ＴＥＰＡの存在下では、ヘモグロビン含有細胞が急激に減少し、一方、細胞の全数はごくわずかしか減少しなかったことを示した。
【０１６７】
これらの試験結果は、ＴＥＰＡが赤血球分化を阻害するが、前駆細胞の増殖性能に有意に影響しないことを示唆している。
【０１６８】
【表２】
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【０１６９】
マウスの赤赤血球病細胞（ＭＥＬ）を、分化誘発剤のヘキサメチレンビスアセトアミド（ＨＭＢＡ、４ｍＭ）を補充しかつ異なる濃度のＴＥＰＡまたはキャプトプリルありもしくはなしの液体培地で培養した。３日目に、全細胞数とヘモグロビン含有（ベンジジン陽性）細胞を測定した。
【０１７０】
ＣＤ３４＋で開始された培養物：ＣＤ３４＋細胞で開始された長期間液体培養物を、サイトカインの異なるカクテルで維持した。これら培養物の１／２に、ＴＥＰＡを連続的に補充した。細胞の分化の状態を試験するため、サイトスピンプリパレーション（cytospin preparation）を、May-Grunwald Giemsaで染色した（図６ａ−ｄ）。試験結果は、ＴＥＰＡなしで４−５週間維持された培養物は、完全に分化した細胞だけを含有し、一方、ＴＥＰＡありの培養物は、完全に分化した細胞に加えて、１０％−４０％の未分化の芽球様細胞のサブセットを含有していることを示した。
【０１７１】
これらの試験結果は、ＴＥＰＡが、ＣＤ３４＋細胞の分化の遅延を誘発して、長期間の半ビボ培養物中の初期前駆細胞の増殖と蓄積が延長されることを示唆している。
【０１７２】
ＴＥＰＡの活性の機構：ＴＥＰＡが、銅などの遷移金属を減少させることによって、ＣＤ３４＋細胞に影響を与えるかどうかを確認するため、２種の方法を行った。
【０１７３】
第一の方法で、異なる遷移金属キレート化剤：テトラエチレンペンタミン（ＴＥＰＡ）、キャプトプリル（ＣＡＰ）またはペニシラミン（ＰＥＮ）の作用を評価した。その試験結果は、これらの化合物がすべて、ＣＤ３４＋細胞に対して、ＴＥＰＡと同じ作用を共有していることを示した（図７）。
【０１７４】
第二の方法は、ＴＥＰＡで処理した培養物に銅を補充する方法である。その試験結果は、ＴＥＰＡの活性が銅によって逆転し（図８）、一方、他のイオンの例えば鉄やセレンなどを補充した場合、少なくとも、本願で採用される短期間〜中間の期間の培養では逆転しないことを示した（図９）。
【０１７５】
亜鉛は、遷移金属の代謝、例えば銅の代謝を阻害することが知られているが、それ自体で、培養物のクローン性を拡大する。この作用は、亜鉛とＴＥＰＡの両者の存在下で非常に強力であった（図１０）。
【０１７６】
上記の諸実施例において、ＣＤ３４細胞の培養物に、例えば、初期採用性サイトカインとポリアミン薬剤であるテトラエチレンペンタミン（ＴＥＰＡ）を補充することによって、支質の支持なしで長期間培養物（ＬＴＣ）を維持できることが示されている。これらの培養物において以下の三つの現象すなわち（ｉ）細胞の連続増殖；（ii）クローン形成性細胞（clonogenic cell）（ＣＦＵｃ）の拡張；および(iii)細胞の未分化状態での維持が明らかであった。
【０１７７】
対照的に、ＴＥＰＡで処理されていない対照培養物は、増殖を停止してＣＦＵｃを生成し、次いでそれらの細胞は、著しく早く分化した。
【０１７８】
したがって、ＴＥＰＡおよび他の遷移金属キレート化剤は、遷移金属、特に銅をキレート化させて細胞の分化を阻害／遅延することによって長期培養物を維持する。
【０１７９】
以下の実施例３は、上記結果をさらに立証して、長期培養物に対する最適培養条件を教示し、造血細胞の分化に影響する追加のキレート化剤を教示しそしてＴＥＰＡなどのキレート化剤の標的細胞に対する活性の機構の解明に役立つ。
【０１８０】
実 施 例 ３
ヒトの新生児臍帯血由来のＣＤ３４＋細胞を、免疫磁気法で精製し、次いでサイトカインを補充しかつ遷移金属キレート化剤ありまたはなしの液体培地内で培養した。１週間毎に、培養物は、培養内容物（上澄み液と細胞）の１／２を取り出して、それを、新鮮な培地、サイトカインおよびキレート化剤で置換することによってデミ−デポピュレート（demi-depopulate）した。指定の週毎に、培養物の細胞内容物を、全細胞（手動顕微鏡／血球計数法による）、ＣＤ３４＋細胞（免疫フローサイトメトリーによる）およびクローン形成性細胞（細胞を、サイトカインを補充した半固形培地内でクローン化することによる）について定量した。これらの培養物は１×１０４の細胞でイニシエートした。その細胞の５０−８０％はＣＤ３４＋であり、２５−５０％はＣＦＵｃであった。その試験結果を図１１−２４に示したが、１×１０４のイニシエーティング細胞当たりで計算した（それら数値は希釈係数を掛け算されている）。
【０１８１】
図１１は、長期間のＣＤ３４培養物に対するＴＥＰＡの作用を示す。初期作用性サイトカインを補充した液体培地内（支質細胞を欠いている）で、ＣＤ３４細胞で開始された培養物は、ＴＥＰＡによって、長期間（＞６週間）維持できた。このような培養物内で、サイトカインと組み合わせたＴＥＰＡは、クローン形成性細胞（ＣＦＵｃ）の維持と拡張を支持した。なおその培養物は２．５×１０３のＣＦＵｃでスタートした。６週間後に、培養を終結したところ、ＴＥＰＡで処理した培養物は３００×１０３のＣＦＵｃを含有していた（すなわち、１２０倍の拡張）が対照の培養物はＣＦＵｃを全く含有していなかった。
【０１８２】
図１２−１４は、異なる組み合わせの初期サイトカインの存在下での細胞の増殖、ＣＦＵｃおよびＣＦＵｃの頻度（frequency）に対するＴＥＰＡの作用を示す。初期作用性サイトカイン類ＴＰＯ、ＳＣＦ、ＦＬＴ、ＩＬ−６とＴＥＰＡとの組み合わせが、クローン形成性能（clonogenic potential）を有する細胞の維持と長期間拡張のための最適の組み合わせであることが見出された。
【０１８３】
図１５は、対照のＣＤ３４培養物およびＴＥＰＡを補充したＣＤ３４培養物のＣＦＵｃ頻度に対するＧ−ＣＳＦとＧＭ−ＣＳＦの作用を示す。細胞の分化を刺激する後期作用性サイトカインのＧ−ＣＳＦとＧＭ−ＣＳＦを培養物に補充すると、クローン形成性細胞が迅速に失われた。この分化刺激作用はＴＥＰＡによって遮断される。
【０１８４】
図１６−１７は、長期間の細胞増殖（図１６）およびＣＦＵｃの産生（図１７）に対する、培地＋ＴＥＰＡの部分的変更または完全変更の作用を示す。得られた試験結果は、最大の拡張を維持するためには、ＴＥＰＡを、少なくとも１週間毎に、完全に取り替えなければならないことを示している。
【０１８５】
図１９は、ＣＦＵｃ頻度に対する、ＴＥＰＡの遅い添加の作用を示す。ＣＤ３４細胞をＴＥＰＡに初期に暴露することが、ＣＦＵｃの長期間の維持と拡張を行うのに決定的であったことは明らかであり、ＴＥＰＡが前駆細胞の分化に対し、分化の各種の段階で影響することを示唆している。
【０１８６】
図２０は、単一のサイトカインとの短期間のプレインキュベーションの、長期のＣＦＵｃ産生に対する作用を示す。試験結果は、ＴＥＰＡで処理された培養物は、サイトカイン類の全種類ではなくて単一のサイトカインを最初の２４時間に補充した場合、ＬＴＣ−ＣＦＣがより多く保存されることを示しているが、このことは、前者の条件下で細胞が一層効率的に遮断されることを示唆している。
【０１８７】
図２１ａ−ｂは、ポリアミンキレート化剤のＣＤ３４細胞培養物に対する作用を示す。ポリアミンキレート化剤は、長期培養中、細胞の増殖を維持しかつＣＦＵｃを拡張した。試験されたこれら化合物の中で、長い連鎖のポリアミンであるＴＥＰＡとＰＥＨＡが、短い連鎖のポリアミン類より有効であることが見出された。
【０１８８】
図２２ａ−ｂは、ＣＤ３４細胞培養物に対する、遷移金属キレート化剤の作用を示す。ペニシラミン（ＰＥＮ）とキャプトプリル（ＣＡＰ）は、公知の遷移金属キレート化剤であるが、長期の培養中、クローン形成性細胞の細胞増殖と拡張を維持した。
【０１８９】
図２３ａ−ｂは、ＣＤ３４細胞培養物に対する亜鉛の作用を示す。亜鉛は、遷移金属、特に銅の代謝を阻害することが知られており、その作用は、長期間の培養物中でのキレート化剤の作用に似ているが、前記キレート化剤類自体より作用の程度は小さい。
【０１９０】
したがって、造血前駆細胞の半ビボの拡張は、これら細胞の非分裂の分化細胞（non-dividing differentiated cell）への進行によって制限される。この分化プロセスは、該前駆細胞を支質細胞層上で培養することによって、遅延させることができる。その支質は細胞の連続増殖とＣＦＵｃの長期間の生成を支持するので、その支質が、該前駆細胞に対して抗分化作用を加えると考えられる。
【０１９１】
我々は、支質なしの培養物内に、細胞の連続増殖と、ＣＦＵｃの長期間の生成を維持する新規な系を開発した（図１１）。その系は、初期作用性サイトカイン類、例えば幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＦＬＴ３、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）（但しインターロイキン−３ありまたはなしの場合あり）および遷移金属キレート化剤の使用を組み合わせている（図１２−１４）。上記初期サイトカイン類は、該前駆細胞の生存と増殖を支持し、Ｇ−ＣＳＦやＧＭ−ＣＳＦなどの後期作用性サイトカインに比べて分化に対する刺激が低い（図１５）。これらのキレート化剤は、遷移金属の特に銅をキレート化することによって、分化を阻害する。１週間毎の完全な培地変更は、部分変更に比べて、ＬＴＣ−ＣＦＣの維持を改善した。これは、ＴＥＰＡ−遷移金属の錯体、例えばＴＥＰＡ−銅の錯体が安定でないことを示唆している（図１６−１７）。
【０１９２】
いくつもの証拠が、ＴＥＰＡは初期前駆細胞の分化を阻害することを示唆している（図１８）。例えば、ＴＥＰＡの添加が培養の６日目まで遅れたとき、その作用は、１日目からＴＥＰＡを補充されている培養物と比べて低下した（図１９）。
【０１９３】
ＴＥＰＡを１日目に添加すると、最適の結果が得られたが、２日目にサイトカイン類の全補充物を添加することが有利であった。したがって、１日目に１種類のサイトカイン例えばＦＬＴ３だけ補充され続いて残りのサイトカイン類（ＳＣＦ、ＴＰＯおよびＩＬ−３）を添加した、ＴＥＰＡ処理培養物は、すべてのサイトカイン類を１日目に添加された培養物より長期間維持された（図２０）。我々は、細胞の分化が、前記サイトカイン類によって駆動されかつ銅などの遷移金属類に依存しているので、分化を阻害するには、サイトカイン類の全補充物に暴露される前に、前記遷移金属を消耗させる必要があるという仮説を立てている。単一のサイトカインは迅速な活性化（増殖と分化）を支持しないが、細胞の生育能を維持するので、静止性の未分化ＣＤ３４が活性化する前に、その中の遷移金属を、ＴＥＰＡが効率的にキレート化することができる。
【０１９４】
選別することによって、各種のキレート化剤が、細胞の連続増殖およびＣＦＵｃの長期間にわたる生成を支持し、そして細胞の分化を遅らせることが見出された。これらの化合物としては、ポリアミン類、例えば限定されないがＴＥＰＡ、ＥＤＡ、ＰＥＨＡおよびＴＥＴＡ（図２１ａ−ｂ）、またはキレート化剤類、例えば限定されないがペニシラミン（ＰＥＮ）およびキャプトプリル（ＣＡＰ）（図２２ａ−ｂ）がある。遷移金属（特に銅）の代謝を阻害する亜鉛も、ＬＴＣ−ＣＦＣを支持した（図２３ａ−ｂ）
【０１９５】
実 施 例 ４
本発明の他の実施態様によって、幹細胞類、例えば限定されないが、臍帯血由来の幹細胞、末梢血液由来の幹細胞および骨髄由来の幹細胞を保存する方法が提供される。この方法は、遷移金属キレート化剤例えばＴＥＰＡの存在下、幹細胞を収集し、単離しおよび／または貯蔵して処理することによって実施される。
【０１９６】
臍帯血由来の細胞は、１０μＭＴＥＰＡの存在下またはなしで収集し次いで４℃で２４時間貯蔵した（分離せずに）。次にＣＤ３４＋細胞を、１０μＭのＴＥＰＡ−ＰＢＳ緩衝液またはＴＥＰＡなしのＰＢＳ緩衝液それぞれを使って分離した。次にその細胞を、１０μＭＴＥＰＡの存在下、長期間培養で増殖させた。
【０１９７】
試験結果は、ＴＥＰＡの存在下で処理した細胞で開始された培養物は８週間、拡張したが、ＴＥＰＡなしで貯蔵された細胞で開始された培養物は、わずか５週間で拡張が停止した。
【０１９８】
細胞の収集と、冷凍もしくは移植との間に少なくとも数時間かかることはよく知られている。
【０１９９】
これらの試験結果は、遷移金属キレート化剤、例えばＴＥＰＡを、収集バッグおよび分離緩衝液と洗浄緩衝液に加えると、幹細胞の収量が増大しかつ長期間増殖するそれら幹細胞の性能が改善されるので、“新鮮”な、冷凍保存されたかまたは半ビボで拡張された造血細胞を移植した後の短時間での生着と長時間のリポピュレーション（repopulation）が容易になる。
【０２００】
したがって、分化を阻害する遷移金属キレート化剤を有効量または有効濃度で補充した、幹細胞の収集バッグ分離緩衝液および洗浄緩衝液が、本発明によってさらに提供される。
【０２０１】
本発明を、その特定の実施態様とともに説明してきたが、多くの別法、変型および変化は当業技術者には分かることは明白である。したがって、本発明は、特許請求の範囲の精神と広い範囲内にあるすべてのかような別法、変型および変化を含むものである。
【０２０２】
【参考文献】
0003810273.tif 000004
0003810273.tif 000005
0003810273.tif 000006
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【図面の簡単な説明】
【図１】  ＣＤ３４細胞のクローンを形成する性能に対するＴＥＰＡの短期間の作用を示す棒グラフである。
【図２】  全細胞およびＣＤ３４細胞に対する、ＴＥＰＡの短期間の作用を示す棒グラフである。
【図３】  ＣＤ３４細胞の細胞数およびクローン形成性能に対するＴＥＰＡの長期間の作用を示す棒グラフである。
【図４】  初期サイトカイン類とともに培養されたＣＤ３４細胞に対するＴＥＰＡの長期間の作用を示す棒グラフである。
【図５】  赤血球前駆細胞の発生に対するＴＥＰＡの作用を示す棒グラフである。
【図６ａ】  細胞の成熟に対するＴＥＰＡなしの作用を示す図である。
【図６ｂ】  細胞の成熟に対するＴＥＰＡありの作用を示す図である。
【図６ｃ】  細胞の成熟に対するＴＥＰＡなしの作用を示す図である。
【図６ｄ】  細胞の成熟に対するＴＥＰＡありの作用を示す図である。
【図７】  ＣＤ３４細胞で開始される培養物の細胞数とクローン形成性能に対する遷移金属キレート化剤の作用を示す棒グラフである。
【図８】  ＣＤ３４細胞のクローン生成性能と全細胞数に対する銅の作用を示す棒グラフである。
【図９】  培養されたＣＤ３４細胞のクローン生成性能に対するイオンの作用を示す棒グラフである。
【図１０】  ＣＤ３４細胞の増殖性能に対する亜鉛の作用を示す棒グラフである。
【図１１】  図１１ａ−ｃはＣＤ３４細胞の長期間培養物に対するＴＥＰＡの作用を示す棒グラフである。
【図１２】  異なる組み合わせの初期サイトカイン類の存在下での細胞増殖に対するＴＥＰＡの作用を示す棒グラフである。
【図１３】  異なる組み合わせの初期サイトカイン類の存在下でのＣＦＵｃに対するＴＥＰＡの作用を示す棒グラフである。
【図１４】  異なる組み合わせの初期サイトカイン類の存在下でのＣＦＵｃの頻度に対するＴＥＰＡの作用を示す棒グラフである。
【図１５】  対照およびＴＥＰＡを補充されたＣＤ３４培養物のＣＦＵｃ頻度に対するＧ−ＣＳＦとＧＭ−ＣＳＦの作用を示すグラフである。
【図１６】  長期間の細胞増殖に対する培地＋ＴＥＰＡの部分変更と完全変更の作用を示すグラフである。
【図１７】  長期間のＣＦＵｃの産生に対する培地＋ＴＥＰＡの部分変更と完全変更の作用を示すグラフである。
【図１８】  ＣＤ３４細胞の拡張に対するＴＥＰＡの作用を示す棒グラフである。
【図１９】  ＣＦＵｃ頻度に対する、ＴＥＰＡの遅い添加の作用を示すグラフである。
【図２０】  長期間のＣＦＵｃ産生に対する、単一のサイトカインとともに行う短期間のプレインキュベーションの作用を示すグラフである。
【図２１】  図２１ａ−ｂはＣＤ３４細胞培養物に対するポリアミンキレート化剤の作用を示すグラフである。
【図２２】  図２２ａ−ｂはＣＤ３４細胞培養物に対する遷移金属キレート化剤の作用を示すグラフである。
【図２３】  図２３ａ−ｂはＣＤ３４細胞培養物に対する亜鉛の作用を示すグラフである。
【図２４】  末梢血液由来のＣＤ３４細胞培養物に対するＴＥＴＡの作用を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図６ｃ】
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【図６ｄ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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