(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
コラーゲン及び／またはゼラチンをコラゲナーゼ処理した分解物であって平均分子量が１，３００であるポリペプチドおよびアスコルビン酸及びその誘導体の１種または２種以上を含有し、創傷部位における線維芽細胞の遊走を誘導することを特徴とする創傷治癒剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、経口用または皮膚外用である創傷治癒剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
コラーゲンは、生体内蛋白質の約１／３を占め、血管や皮膚、骨に多く存在し、細胞の足場としてこれら組織の形成、構築に重要な役割を果たしている。コラーゲンは、消化酵素でほとんど分解されないため栄養価の低い蛋白質と考えられていたが、コラーゲンを摂取することによる新陳代謝促進（特開平7−278012）、頭髪の直径が太くなる（Nutrition Reports International, 13, 579, 1976）ことや、関節症治療用薬剤としての利用（特開昭63−39821）等が報告されており、有効性が見直されている。コラーゲンやゼラチンは、その細胞支持機能を利用して医療材料としても注目を集めている。例えば、止血剤、人工血管、癒着防止膜、あるいは連続装用のコンタクトレンズ等であり、多くの用途への開発が進められている。特に、切創、刺創、割創、挫創、裂創、摩創といった創傷に対する、人工皮膚としての利用が注目されている（特開平5−184662）。
【０００３】
しかし、その用途は該皮膚損傷部を乾燥から守り、自己組織侵入の足場として役割を果たす機能であり、積極的な細胞遊走を促す機能とは異なる。また、コラーゲンやゼラチン、及びその分解物を、殺菌作用、創傷治癒作用、細胞賦活作用等、皮膚の再生を促す尿素とともに配合することが提案されているが（特開昭61−33105）、これは水溶液中の尿素の安定化を目的としたものであり、積極的な細胞遊走を促す機能を有する創傷治癒剤ではない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は上記事情に鑑みてなされたもので、連用しても副作用の惧れがない、効果的で安全性の高い、創傷等の傷害に対して皮膚の再生を促す創傷治癒剤を提供することをその課題とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記諸目的を解決すべく鋭意検討した結果、特定の分子量のコラーゲンまたはゼラチンの分解物が創傷治癒効果を有することを見出し、この知見に基づいて本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち、本発明は、
１．コラーゲン及び／またはゼラチンの分解物であって平均分子量が500以上2500未満のポリペプチドを含有することを特徴とする創傷治癒剤、
２．アスコルビン酸及びその誘導体の１種または２種以上を含有することを特徴とする上記１記載の創傷治癒剤、
３．経口用である上記１または２記載の創傷治癒剤、
４．皮膚外用である上記１または２記載の創傷治癒剤、
５．ポリペプチド含有量が、組成物全量に対して、0.01〜50重量％であることを特徴とする上記１，２または３記載の創傷治癒剤、
６．ポリペプチド含有量が、組成物全量に対して0.001〜20重量％であることを特徴とする上記１、２または４記載の創傷治癒剤。
７．ポリペプチド含有量が、組成物全量に対して、0.01〜50重量％、及びアスコルビン酸及びその誘導体の含有量が0.001〜80重量％であることを特徴とする上記２または３記載の創傷治癒剤、
８．ポリペプチド含有量が、組成物全量に対して、0.001〜20重量％、及びアスコルビン酸及びその誘導体の含有量が0.001〜60重量％であることを特徴とする上記２または４記載の創傷治癒剤、
である。
【０００７】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のコラーゲンまたはゼラチンの分解物を得るのに原料として使用するコラーゲンは、例えば牛や豚や魚などの動物の皮膚、骨及び腱などの結合組織から抽出したもの、もしくはコラーゲンを熱変性したゼラチンなど全てのものが使用可能である。これら原料重量の2〜40倍程度、好ましくは5〜10倍程度の水で加熱溶解し、コラーゲンまたはゼラチン溶液を調製する。尚、使用する水は水道水、純水、蒸留水など何れでも良い。
【０００８】
コラーゲンまたはゼラチンの分解物を得るための、これらの加水分解は、タンパク分解酵素のような酵素を使用して行うことができる。加水分解物の調製に用いる酵素としては、特に限定されるものではなく、トリプシン、キモトリプシン、ズブチリシン、エラスターゼ、プロリン特異性プロテアーゼ、ストレプトコッカス属の微生物が産生するプロテアーゼ、パパイン、ペプシン、サーモリシン等が利用できる。また、エキソペプチターゼとしてカルボキシぺプチターゼＹ、アスペルギルス属の産生するプロテアーゼ、ストレプトミセス属に微生物が産生するプロテアーゼ、リゾープス属の微生物が産生するプロテアーゼ、乳酸菌が産生するプロテアーゼ等が利用できるが、好ましくは、クロストリジューム属、ストレプトミセス属などの細菌、放線菌あるいは真菌由来のコラゲナーゼが良い。また、遺伝子組み替え技術により他の菌体に産生させたもので、類似の基質特異性を有する酵素であっても問題なく、これらの微生物により醗酵させることも可能である。更に複数の酵素を混合して使用しても良い。
【０００９】
加水分解に使用する酵素量は、原料に対し重量比0.01％〜10％程度、好ましくは1％程度が良く、温度条件は室温〜55℃、好ましくは37℃〜40℃、反応時間は1〜24時間、好ましくは1〜4時間処理する。また、pH条件は酵素添加前に最適pHに調整する。コラゲナーゼの場合、pH6〜8が適当である。加水分解終了後加熱して酵素を失活させ、冷却後必要に応じて濾過、脱塩、濃縮、乾燥を行うと良い。
【００１０】
分子量別に分離することにより、本発明で使用する平均分子量のポリペプチドであるコラーゲン、ゼラチンの分解物を得ることができる。分子量別の分離は、好ましくはゲル濾過法により行うことができる。分子量の検出波長は210〜290nm、好ましくは210〜220nmのUV波長を用いて求めことができる。
【００１１】
コラーゲンまたはゼラチンの分解物として、平均分子量が500以上2500未満のポリペプチドを用いる。このようなポリペプチドは、平均分子量500以上2500未満のポリペプチドをその主要構成成分としている。より好ましくは、平均分子量が1000〜1500のポリペプチドである。特に、平均分子量が1100〜1300のポリペプチドが好ましい。
【００１２】
また、本発明で使用するアスコルビン酸としては、L−アスコルビン酸を挙げることができ、その誘導体とはそのエステルまたは塩を挙げることができる。より具体的な例として、エステルには、L−アスコルビン酸モノステアレート、L−アスコルビン酸モノパルミテート、L−アスコルビン酸モノオレート等のアスコルビン酸モノアルキルエステル類、L−アスコルビン酸モノリン酸エステル、L−アスコルビン酸−2−硫酸等のアスコルビン酸モノエステル誘導体、L−アスコルビン酸ジステアレート、L−アスコルビン酸ジパルミテート、L−アスコルビン酸ジオレート等のアスコルビン酸ジアルキルエステル類、L−アスコルビン酸ジリン酸エステル等のアスコルビン酸ジエステル誘導体、L−アスコルビン酸トリステアレート、L−アスコルビン酸トリパルミテート、L−アスコルビン酸トリオレート等のアスコルビン酸トリアルキルエステル類、L−アスコルビン酸トリリン酸エステル等のアスコルビン酸トリエステル誘導体等を挙げることができるが、これらに限定されるわけではない。塩としては、アスコルビン酸と各種塩基との塩があげることができる。例えば、アルカリ金属塩（例えばナトリウム塩等）、アルカリ土類金属塩（例えば、カルシウム塩、マグネシウム塩等）等が挙げることができるがこれらに限定されるわけではない。
【００１３】
本発明のポリペプチドは卓越した細胞遊走促進機能を有しており、経口用あるいは皮膚外用の創傷治癒剤として使用可能である。また前記に記載したアスコルビン酸及び／またはその誘導体を併用することにより、より優れた効果を示す。
【００１４】
本発明のコラーゲン、ゼラチン分解物は、切創、刺創、割創、挫創、裂創、摩創といった創傷等の傷害に対して有用である。創傷治癒のメディエーターである３’，５’−サイクリックアデノシンモノフォスフェート（ｃAMP）の細胞遊走作用を促進することで素早く創傷部に細胞を密集させる。また、コラーゲン産生、細胞増殖、分化といった細胞賦活作用を高め、皮膚再生を促す。従って、本発明により優れた創傷治癒剤が提供される。
【００１５】
本発明の「経口用」の創傷治癒剤は、食品、医薬等として使用できる。栄養補助食品、機能性食品、健康食品、特定保健用食品等として使用してもよい。形態としては、経口摂取可能な粉末、散剤、顆粒、錠剤、カプセル、液体などの剤型にすることが可能である。また、食品としては、ジュースのような飲料に配合することもできる。経口用の場合、ポリペプチドの添加量は、全剤中0.01〜50重量％が好ましく、特に好ましくは15重量％以上、50質量％以下である。また、アスコルビン酸またはその誘導体を含有する場合には、その含有量は、0.001〜80重量％が好ましく、特に好ましくは、0.1重量％以上、80重量％以下である。食品、医薬としての摂取量については特に制限はないが、0.03〜3g／日程度が好ましい。
【００１６】
また、本発明の「皮膚外用」の創傷治癒剤は、薬事法のいう化粧品、医薬部外品、医薬品等に含まれる製品であることができる。スキンケアー製品、ヘアケアー製品、軟膏等に用いられる。特に限定されるものではないが、その剤形は水溶液系、可溶化系、乳化系、粉末系、油液系、ゲル系、軟膏系、エアゾール系、水―油２層系、水―油―粉末３層系等、幅広い剤形を取り得る。本発明の皮膚外用組成物におけるポリペプチド含有量は、全重量の0.001〜20重量％程度、好ましくは0.1〜10重量％である。また、アスコルビン酸またはその誘導体を含有する場合には、その含有量は、0.001〜60重量％が好ましく、特に好ましくは、0.001〜10重量％である。皮膚外用としての、適用量は、症状の違いにより適宜選択されるが、通常は１日当りポリペプチド量として0.00001〜0.5g程度の範囲である。またこれを１〜４回／日に分けて投与することももちろん差し支えない。
経口用の製剤および皮膚外用製剤は、通常、食品、医薬、化粧料の分野で用いられている製剤化方法により製造することができる。
本発明のコラーゲン、ゼラチン分解物は、コラーゲンやゼラチンの性質からして、毒性面での問題はないと言える。
【００１７】
上記のように、本発明はコラーゲン及び／またはゼラチンの分解物であって平均分子量が500以上2500未満のポリペプチドを含有することを特徴とする経口用または皮膚外用の創傷治癒剤であり、更に既に報告されているアスコルビン酸やその誘導体の細胞賦活作用（医学のあゆみ、6月号別冊、39−44頁、1996年）を組み合わせることにより、より優れた創傷治癒効果を発現する。すなわち、切創、刺創、割創、挫創、裂創、摩創といった創傷等の傷害に対して細胞遊走を促進することで素早く創傷部に細胞を密集させ、またコラーゲン産生、細胞増殖、分化といった細胞賦活作用を高めることにより、皮膚再生を促す優れた創傷治癒剤である。
【００１８】
【実施例】
以下に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００１９】
製造例１
[コラゲナーゼ消化分解物]
コラーゲン蛋白として、牛真皮より調製したゼラチン30gを蒸留水300mlに加温溶解した。コラゲナーゼタイプＩ（Worthington Biochemical Corp製）300mgを加え、アンモニア水にてpH7.5に調製した後37℃で1時間放置した。反応終了後、反応液を100℃で3分間加熱し、酵素を失活させ、次いで0.45μmのフィルターで滅菌濾過した。
【００２０】
この濾液を蒸留水で平衡化したセファデックス LH−20（ファルマシア社製）によるゲル濾過を行い、6分画しそれぞれを凍結乾燥した。ゲル濾過のクロマトの結果を図１に示す。それぞれのピークはスーパーデックス ぺプチド HR10／30（ファルマシア社製）を用いて、0.3M NaClを含む0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.2）溶出液を用いて平均分子量を求めたところ、試験試料はそれぞれ、10000、2500、1300、1030、490、320であった。それぞれの画分は実施例１の試験に用いた。また、1300及び320の画分については、実施例２の試験にも用いた。
【００２１】
製造例２
[ペプシン消化分解物]
コラーゲン蛋白として、牛真皮より調製したゼラチン30gを蒸留水300mlに加温溶解した。ペプシン（Biozyme Lab.,LTD製）300mgを加え、希塩酸にてpHを2.0に調製した後37℃で1時間放置した。反応終了後、水酸化ナトリウム水溶液でpH７に再調製した後、100℃で3分間加熱反応し、ペプシンを失活させ、次いで0.45μmのフィルターで滅菌濾過した。
【００２２】
この濾液を蒸留水で平衡化したセファデックス LH−20（ファルマシア社製）によるゲル濾過を行った。このものの平均分子量を測定したところ、20000〜60と広く分布していた。この画分中12000の画分を凍結乾燥し、実施例１の試験に用いた。ゲル濾過のクロマトの結果を図２に示す。
【００２３】
実施例１
[細胞遊走性試験１]
CCD45SK正常ヒト皮膚繊維芽細胞（大日本製薬株式会社製）を10％の非動化したウシ胎児血清（以下、FBSと略す）、0.1％非必須アミノ酸（以下、NEAAと略す）含有MEM培地にて、37℃、5％炭酸ガス存在下で培養した。コンフルエントになった細胞は、0.5％FBS、0.1％NEAA、含有培地に置換し、24時間の馴化後、培地を吸引除去し、セルスクレーパーにより細胞層を一部剥離し、創傷を作成した。創傷を作成した細胞はPBSにより洗浄後、細胞遊走の開始剤として1μM N6,2’-O-dibutyryl adenosine 3’:5’-cyclic monophosphate（以下dbcAMPと略す）を24時間プレインキュベーションし、その後、被験試料を10μg／ml（またはアスコルビン酸；200μM）添加し細胞遊走促進効果を調べた。48時間後、細胞は10％ホルマリン含有PBSにて固定し、ヘマトキシリンにて染色を行い、写真撮影より遊走した細胞数を測定した。結果を表−１に示す。表−１より平均分子量1030、1300（表−1；No.4,5）の分解物を加えたものに細胞遊走促進効果が高いことがわかる。また、アスコルビン酸投与により、より優れた効果を示した（表−１；No.9）。
【００２４】
【表１】
0003805975.tif 000002
【００２５】
実施例２
[細胞遊走性試験２]
本実験では上記方法とは別法のトランスウエルチャンバーを用いた方法により細胞の遊走、運動性を評価した。CCD45SK正常ヒト皮膚繊維芽細胞（大日本製薬株式会社製）は10％のFBS、0.1％NEAA含有MEM培地にて、37℃、5％炭酸ガス存在下でコンフルエントになるまで培養した。その後、細胞回収し1×105 cells/mlの懸濁液を8μmのポアサイズのトランスウエルチャンバー（NUNC社製）に150μl添加し、dbcAMP及び各々被験試料（100μg／ml）を添加した。トランスウエルチャンバーは10％FBS、500μl MEMまたはアスコルビン酸200μMを分注した24  wellプレート（IWAKI）上で48時間インキュベーションし、その後トランスウエルチャンバー中の細胞を綿棒で除去し、裏面に遊走した細胞数をDiff-quik（国際試薬株式会社製）試薬で染色後光学顕微鏡下で計測した。結果を表−２に示す。平均分子量1300（表−2；No.2）の分解物に細胞遊走促進効果が高いことがわかる。また、アスコルビン酸投与によって、より優れた効果を示した（表−２；No.4）。
【００２６】
【表２】
0003805975.tif 000003
【００２７】
処方例１
[錠剤の製造]
製造例１で得たゼラチン分解物中、平均分子量1300の画分を用いて常法に従って、下記組成の錠剤を製造した。
（組成）                               （配合；重量％）
ゼラチン分解物（平均分子量1300）             15
乳糖                                         63
コーンスターチ                               20
グァーガム                                    1.0
L−アスコルビン酸                             1.0
【００２８】
処方例２
[ジュースの製造]
製造例１で得たゼラチン分解物中、平均分子量1300の画分を用いて常法に従って、下記組成のジュースを製造した。
（組成）                               （配合；重量％）
果糖ブトウ糖液糖                              5.00
クエン酸                                     10.4
L−アスコルビン酸                             0.20
香料                                          0.02
色素                                          0.10
ゼラチン分解物（平均分子量1300）              1.00
水                                           83.28
【００２９】
処方例３
[スキンケアー製品（ハンドクリーム）の製造]
製造例1で得たゼラチン分解物中、平均分子量1300の画分を用いて常法に従って、下記組成のハンドクリームを製造した。
（組成）                               （配合；重量％）
イソステアリン酸イソプロピル                  8.0
ホホバ油                                      6.0
セタノール                                    8.0
ステアリルアルコール                          2.0
ポリオキシエチレンラウリルエーテル            1.5
プロピレングリコール                          6.0
ソルビトール                                  1.0
パラベン                                      0.4
ゼラチン分解物（平均分子量1300）              0.8
ビタミンE                                     0.5
L−アスコルビン酸                             1.0
香料                                          0.1
精製水                                       64.7
【００３０】
【発明の効果】
以上から明らかのように平均分子量500以上2500未満の領域からなるコラーゲン及び／またはゼラチン分解物は、細胞遊走促進効果を有し、更にアスコルビン酸及び／またはその誘導体を組み合わせることにより、より優れた効果を示すことから、それらを含む経口用及び皮膚外用の創傷治癒剤として有効である。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１はコラゲナーゼで分解したゼラチンのLH−20のクロマトグラフで、製造例１で調製された各画分を示したものである。
【図２】図２はペプシンで分解したゼラチンのLH−20のクロマトグラフであり、製造例２で調製された画分を示したものである。
【図１】
0003805975.tif 000004
【図２】
0003805975.tif 000005