(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
加温したアセトンにより処理してあるクロロフィルが細胞から選択的に除去されているアスタキサンチン含有ヘマトコッカス藻体。
【請求項２】
加温したアセトンにより処理し、さらに酵素処理又は乾燥処理してあるクロロフィルが細胞から選択的に除去されているアスタキサンチン含有ヘマトコッカス藻体。
【請求項３】
アスタキサンチンを含有するヘマトコッカス藻体を、加温したアセトンで処理することにより、アスタキサンチンを含有するヘマトコッカス藻体からクロロフィルを選択的に除去する方法。
【請求項４】
アスタキサンチンを含有するヘマトコッカス藻体を、加温したアセトンで処理し、さらにこれを酵素処理又は乾燥処理することにより、アスタキサンチンを含有するヘマトコッカス藻体からクロロフィルを選択的に除去する方法。
【請求項５】
アスタキサンチンを含有するヘマトコッカス藻体を、加温したアセトンで処理した後、有機溶媒により抽出してクロロフィル含量の少ないアスタキサンチンを得る方法。
【請求項６】
アスタキサンチンを含有するヘマトコッカス藻体を、加温したアセトンで処理し、さらにこれを酵素処理又は乾燥処理した後、有機溶媒により抽出してクロロフィル含量の少ないアスタキサンチンを得る方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、飼料、餌料、食品、化粧品、医薬品等広範囲に利用できるアスタキサンチンを多量に含有したヘマトコッカス藻体とその抽出物に関する。
アスタキサンチンは、甲殻類、魚類等の水産生物に含まれる赤色カロチノイド色素で、これらの生物の肉色や体色の発現に深く関与している。現在、アスタキサンチンは、マダイやサケ等の養殖魚や鶏卵の色揚げ剤として使用されている（特開平5-292897号公報、特開平6-105657号公報）。
【０００２】
【従来の技術】
有望なアスタキサンチン生産源の一つである単細胞緑藻ヘマトコッカスは、栄養細胞から休眠状態であるシスト細胞に形態変化した後に、多量のアスタキサンチンをシスト細胞中に蓄積する。このシスト細胞の細胞壁は非常に強固であり、シスト細胞からアスタキサンチンを抽出するためには、物理的な細胞壁の破壊が必要である（特開平3-83577 号公報）。また、強固な細胞壁を有するシスト細胞を養殖魚の餌料に混合した場合、その吸収性が悪いためアスタキサンチンの色揚げ効果は低下する（Sommer, T. R. er al.:Aquaculture, 94, 79-88 (1991)) 。
さらに、ヘマトコッカス藻体を破壊後、有機溶媒等で抽出したアスタキサンチン抽出物は、光合成生物特有の色素であるクロロフィルが多量に混在している。クロロフィルは、化学的・酵素的にフェオフォルバイド等の分解物に容易に変換される。このクロロフィル分解物は、太陽光によって皮膚等の炎症を引き起こす光過敏症原因物質の一つであるため、クロロフィルおよびその分解物を抽出物から除去する必要がある（広門雅子： Foods & Food Ingredients J. Jpn., 172, 29-36 (1997)) 。一般に、カロチノイドとクロロフィルを含む抽出物は、ケン化処理により夾雑物であるクロロフィルを選択的に除去することが可能であるが、ヘマトコッカスからアスタキサンチンを抽出する場合には、ケン化処理によりアスタキサンチンからアスタシンへの酸化が速やかに進行するため（Britton, G.:Methods Enzymol., 111, 113-149 (1985))、ケン化処理をクロロフィル除去に用いることができない。さらに、アスタキサンチンの酸化物であるアスタシンは、アスタキサンチンに比べてその色揚げ効果が低いことが知られている（片山輝久：水産動物のカロチノイド（日本水産学会編), pp.41-59,  恒星社厚生閣 (1978))。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
そこで、本発明のうち請求項１ないし請求項３に記載の発明は、第一に、細胞壁を物理的に破壊することなく、アスタキサンチンの抽出効率を高めたアスタキサンチン含有ヘマトコッカス藻体を提供することを目的とする。また、第二に、アスタキサンチンを酸化させてアスタシンへ変えることなく、夾雑物であるクロロフィルを選択的に除去したアスタキサンチン含有ヘマトコッカス藻体を提供することを目的とする。
本発明のうち請求項４に記載の発明は、上記のアスタキサンチン含有ヘマトコッカス藻体から抽出した、クロロフィル含量の少ないアスタキサンチン抽出物を提供することを目的とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、親水性有機溶媒であるアセトンを加温してこの熱アセトンでヘマトコッカス藻体を前処理することによって、クロロフィルを選択的に細胞内から除去できることを見いだした。
さらに、本発明者らは、ヘマトコッカス藻体を、アセトンを加温して、熱アセトンによる処理を行うことによって、クロロフィルの除去と同時に細胞壁の透過性の改善が行われ、細胞を物理的に破壊することなく、細胞壁分解酵素処理や乾燥処理によりヘマトコッカス藻体からアスタキサンチンを容易に抽出できることを見いだした。
【０００５】
よって、本発明のうち、請求項１に記載の発明は、クロロフィルが細胞から選択的に除去されているアスタキサンチン含有ヘマトコッカス藻体である。
また、請求項２に記載の発明は、加温したアセトンにより処理してある請求項１に記載のヘマトコッカス藻体である。
さらに、請求項３に記載の発明は、加温したアセトンにより処理し、さらに酵素処理又は乾燥処理してある請求項１に記載のヘマトコッカス藻体である。
さらに、請求項４に記載の発明は、請求項１ないし請求項３のいずれかに記載のヘマトコッカス藻体を有機溶媒により抽出して得られるクロロフィル含量の少ないアスタキサンチン抽出物である。
【０００６】
以下に本発明を詳細に説明する。
本発明に使用される緑藻類としては、ヘマトコッカス属に属し、アスタキサンチンを生産する藻体であれば、いかなる緑藻類でも使用し得る。具体的には、ヘマトコッカス・プルビアリス（Haematococcus pluvialis)、ヘマトコッカス・ラキュストリス（Haematococcus lacustris)、ヘマトコッカス・カペンシス (Haematococcus capensis) 、ヘマトコッカス・ドロエバケンシス (Haematococcus droebakensis) 、ヘマトコッカス・ジンバビエンシス (Haematococcus zimbabwiensis)などが挙げられる。
さらに具体的には、ヘマトコッカス・プルビアリス NIES 144 、ヘマトコッカス・ラキュストリスATTC 30402, ATCC 30453, IAM C296, IAM 392, IAM 393, IAM 394, IAM 399、ヘマトコッカス・カペンシス UTEX 1023、ヘマトコッカス・ドロエバケンシス UTEX 55、ヘマトコッカス・ジンバビエンシス UTEX 1758などの緑藻類が挙げられる。
本発明に好適に用いられるヘマトコッカス・プルビアリス藻体の栄養細胞は、暗所で酢酸などの有機物を炭素源として従属栄養的に培養することにより得られる。また、明所で炭酸ガスを炭素源として独立栄養的に、あるいは明所で酢酸などの有機物と炭酸ガスの両方を炭素源として混合栄養的にも増殖させ得る（Kobayashi, M. et al.:J. Ferment. Bioeng., 74, 17-20 (1992)) 。従って、上記いずれの方法を用いても栄養細胞が製造され得る。
【０００７】
本発明に用いるヘマトコッカス藻体の培養に使用される栄養培地は、緑藻類が資化し得るものであれば、いずれも使用し得る。炭素源としては、例えば、従来から知られている酢酸の他、ピルビン酸、エタノール、およびＴＣＡ関連有機酸などがある。窒素源としては、有機あるいは無機の窒素化合物が用いられ得る。例えば、アスパラギン、グリシン、グルタミン等のアミノ酸、酵母エキス、硝酸塩等が挙げられる。これらの炭素源、窒素源を組み合わせた培地が用いられる他、必要に応じて、無機塩も添加され得る。好ましい培地は、例えば酵母エキス2.0g/L、酢酸ナトリウム  1.2g/L、L-アスパラギン酸  0.4g/L、MgCl2・6H2O  985μM 、FeSO4・7H2O 36μM 、CaCl2・2H2O  136μM 、pH 6.8である。緑藻類の培養条件は、用いる緑藻によっても異なるが、光照射強度は、一般に 0〜40000 ルクス、好ましくは 500〜20000 ルクス、さらに好ましくは1500〜10000 ルクスである。生育温度は緑藻類により異なるが、通常、 5〜50℃、好ましくは10〜37℃、さらに好ましくは15〜30℃である。また、炭酸ガスを用いない場合は、酸素を供給しながら行い得る。
【０００８】
このようにして培養したヘマトコッカス藻体の栄養細胞はアスタキサンチン合成能が低いため、アスタキサンチン合成を高めるためには、様々なストレスによりアスタキサンチン合成の誘導・活性化を行う必要がある。すなわち、栄養源枯渇（Kakizono, T. et al.:J. Ferment. Bioeng., 74, 403-405 (1992))、強光 (Kobayashi, M. et al.:J. Ferment. Bioeng., 74, 61-63 (1992)) 、活性酸素 (特開平5-68585 号公報) 、高温 (特開平7-39389 号公報) 、乾燥 (特開平8-103288号公報) 等の環境ストレスを単独又は組み合わせて付加することにより、栄養細胞を休眠状態であるシスト細胞に速やかに形態変化させることができる。この形態変化に伴いアスタキサンチン合成系が誘導され、環境ストレスにより著しく活性化を受けるため、シスト細胞中にアスタキサンチンが多量蓄積される。アスタキサンチンは強力な抗酸化能を有しており、様々な環境ストレスに対する生体防御物質の一つとして機能している。このようにヘマトコッカス藻体によるアスタキサンチン生産には、栄養細胞とシスト細胞を分けて考えた二段階の培養プロセスが最適であると考えられる。
【０００９】
このようにして培養したヘマトコッカス藻体のシスト細胞は、遠心分離等により容易に回収され、アスタキサンチンの抽出工程が行われる。ヘマトコッカス藻体を加温した親水性有機溶媒であるアセトンで前処理する。アセトンは10〜100 ％濃度のもの、好ましくは30〜50％濃度のものを用い、アセトンの温度は40℃〜沸点まで、好ましくは60〜85℃となるように 0.5分以上、好ましくは２〜10分程度加温する。すなわち、ヘマトコッカス藻体を加温したアセトンにより処理する方法としては40％程度のアセトン溶液中にシスト細胞を浸漬して所定時間加温するか、又は熱アセトン溶液中にシスト細胞を所定時間浸漬する。本発明においては、どちらの方法を選んでもよく、その他、加温したアセトンで処理する方法は特に限定するものではない。このようにヘマトコッカス藻体を熱アセトン中で処理した後暫時静置する。静置条件は、０〜40℃、好ましくは０〜10℃で、１〜72時間、好ましくは１〜24時間程度でよい。このような前処理をすることによって、クロロフィルが選択的に細胞外に除去されたアスタキサンチン含有ヘマトコッカス藻体を得ることができる。これは、親水性有機溶媒に対するクロロフィルとカロチノイドの溶解度の差、すなわちクロロフィルはカロチノイドに比べ親水性物質であることに基づくものである。さらに、熱アセトンによる処理を行うことによって、クロロフィルの除去と同時に細胞壁の透過性の改善が行われ、細胞を物理的に破壊することなく、アスタキサンチンを抽出することが可能となる。さらに、遠心分離等によって溶媒を除去した後、細胞壁分解酵素や乾燥処理（例えば、凍結乾燥やスプレイドライ) を行うことによってアスタキサンチンの抽出効率をいっそう向上させることができる。すなわち、このようにヘマトコッカス藻体に対して、熱アセトン処理と細胞壁溶解酵素処理又は乾燥処理を併用することにより、細胞壁の透過性が改善された吸収性の高いアスタキサンチン含有ヘマトコッカス藻体が得られる。
このように、アスタキサンチンの抽出効率が改善されたヘマトコッカス藻体からアスタキサンチンを抽出する。アスタキサンチンの抽出には、90％アセトン等の有機溶媒を用い、１〜24時間処理するとよい。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態の一例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、下記実施例は本発明を制限するものではない。
【実施例１】
表１に示す培養基 100mlを 200ml容のフラスコに入れ、121 ℃で15分間滅菌した。同じ組成を有する維持用の培養基に別に培養したヘマトコッカス・プルビアリス (Haematococcus pluvialis) NIES 144 のシードを接種し、1500ルクスの光照射下、生育温度20℃で４日間、液体培養した。
上記液体培養で得られた栄養細胞に、炭素源として酢酸濃度が45mM、鉄イオン濃度 (FeSO4・7H2O)が 450μM となるように添加し、9000ルクスの光照射下、
20℃でさらに 4日間培養した。栄養細胞は速やかにシスト細胞へ形態変化し、細胞内に著量のアスタキサンチンを蓄積した。
このようにして得られたシスト細胞からクロロフィルの選択的な除去を検討するため、シスト細胞を親水性有機溶媒である 0〜100 ％アセトン溶液に浸漬し、４℃、24時間、暗所で静置した。遠心分離により溶媒を除去し、藻体中に残存する色素量（クロロフィル・アスタキサンチン) を、Kobayashi らの方法 (Kobayashi, M. et al.:J. Ferment. Bioeng., 71, 335-339 (1991)) に従い定量した。すなわち、細胞を超音波処理で完全に破壊後、90％アセトンで１時間抽出し、アスタキサンチンは 480nmの吸光度により、クロロフィルは 663、 645、630nm の吸光度により測定した。その結果を〔図１〕に示す。40％以上のアセトン濃度溶液に、４℃、24時間シスト細胞を浸漬することにより、細胞からクロロフィルの溶出が認められた。一方、シスト細胞を 0〜100 ％アセトン溶液に浸漬し、80℃で２分間加温後、４℃、24時間、暗所で静置し、残存する色素量を定量した。シスト細胞を10％以上のアセトン濃度で加温することにより、大部分のクロロフィルを選択的に細胞外へ溶出することができた。その結果も〔図１〕に示す。シスト細胞を水に浸漬し加温した場合には、クロロフィルの溶出が認められないことから、加温したアセトン（すなわち熱アセトン）でシスト細胞を処理することにより細胞壁の透過性が変化し、アスタキサンチンに比べ親水性溶媒に溶解しやすいクロロフィルが細胞外へ特異的に溶出したものと考えられる。
【００１１】
【表１】
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【００１２】
【実施例２】
実施例１と同様に培養して得られたシスト細胞を、 0〜40％アセトン溶液に浸漬し、80℃で２分間加温後、４℃、24時間、暗所で静置した。遠心分離により溶媒を除去し、この熱アセトンで処理したシスト細胞を凍結乾燥した。この凍結乾燥シスト細胞からのアスタキサンチンの抽出されやすさを抽出効率（％）により評価した。抽出効率、すなわち、無破壊の細胞から90％アセトンで１時間抽出により溶出するアスタキサンチン量と超音波処理で完全に破壊した細胞から90％アセトンで１時間抽出により溶出するアスタキサンチン量の比は次式により算出される。
抽出効率(%) ＝〔無破壊細胞から90％アセトン１時間抽出により溶出するアスタキサンチン量／全アスタキサンチン量（超音波破壊細胞から90％アセトン１時間抽出により溶出するアスタキサンチン量）〕×１００
その結果を〔表２〕に示す。熱アセトン処理したシスト細胞を乾燥処理することにより大幅にアスタキサンチンが抽出されやすくなった。また、熱アセトン処理をする際のアセトン濃度の上昇に伴い、抽出効率は増大した。熱アセトン処理をせずに乾燥した場合、無破壊の細胞からはアスタキサンチンは抽出されなかった。
【００１３】
【表２】
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【００１４】
【実施例３】
実施例１と同様に培養して得られたシスト細胞を、40％アセトン溶液に浸漬して、40〜80℃で、 0.5〜10分間加温後、４℃、24時間、暗所で静置した。遠心分離により溶媒を除去した後、熱アセトン処理シスト細胞を凍結乾燥した。実施例２と同様に、各加熱温度、各加熱時間の熱アセトン処理シスト細胞のアスタキサンチンの抽出効率を測定した。その結果を〔図２〕に示す。加熱温度の上昇や加熱時間が長くなるにつれて、抽出効率は増大し、80℃で２分以上の熱アセトン処理が有効であった。
【００１５】
【実施例４】
実施例１と同様に培養して得られたシスト細胞を、40％アセトン溶液に浸漬して、80℃で２分間加温後、４℃、24時間、暗所で静置した。遠心分離により溶媒を除去して得られた熱アセトン処理シスト細胞 (10mg) を水 (10ml) に懸濁後、各種細胞壁分解酵素 (10mg) を添加した。37℃で24時間反応後、遠心分離により酵素処理シスト細胞を回収し、実施例２と同様に、各種細胞壁分解酵素の単独及び組み合わせによる酵素処理シスト細胞のアスタキサンチンの抽出効率を測定した。その結果を表３に示す。アクチナーゼ E（ナカライ）、キチナーゼ（シグマ）、ファンガーゼ I（和光）、フンセラーゼ（ヤクルト）、ノボザイム 234（ノボ・ノルディスク）、ペクチナーゼR 70（シグマ）、プロテアーゼ（シグマ）、プロテイナーゼ K（ベーリンガー）、ツニカーゼ（和光）、ウスキザイム（和光）、ヤタラーゼ（タカラ）、ザイモリアーゼ 100 T（生化学）の各酵素は有効ではなかった。一方、β-1, 3-グルカナーゼが主成分のキタラーゼ（和光）、β-1, 4-グルカナーゼが主成分のセルラーゼ・オノヅカ-RS(ヤクルト) 、β- グルクロニダーゼが主成分のアワビアセトンパウダー (abalone acetone powder, シグマ) の各酵素は有効で、特にこれら３種の酵素を併用することにより、アスタキサンチンの抽出効率は著しく増大した。熱アセトン処理をしていないシスト細胞を酵素処理した場合、アスタキサンチンの抽出効率は低下することから、細胞壁分解酵素の反応をより受けやすくするためには、その前処理として熱アセトン処理が重要である。
【００１６】
【実施例５】
アスタキサンチンの抽出と応用例
実施例１と同様に培養して得られたシスト細胞 100g(アスタキサンチン５％、クロロフィル２％含有）を、80℃に加温した40％アセトン溶液１L に浸漬し、80℃で２分間保持した後、急冷し、４℃、24時間、暗所で静置した。遠心分離により溶媒を除去し、熱アセトン処理したシスト細胞を回収し、常法通りスプレードライして乾燥細胞を得た。この乾燥細胞に90％エタノール溶液１L を加え、室温で24時間浸漬した後遠心分離によって細胞を除去して抽出液を得た。
この抽出液をエバポレーターにより濃縮し、アスタキサンチン抽出液100gを得た (試験区) 。
一方、熱アセトン処理を行わないシスト細胞をホモジナイザーで破壊し、同様の方法で90％のエタノールによって抽出、濃縮して100gのアスタキサンチン抽出液を得た (対照区) 。
試験区のアスタキサンチン及びクロロフィルはそれぞれ 3.5％、0.1 ％、また対照区のアスタキサンチン及びクロロフィルはそれぞれ 4.5％、1.8 ％であり、本発明によって、アスタキサンチンに対するクロロフィルの比率が、対照区に比べてきわめて低い抽出物を得ることができた。
【００１７】
応用例
（1)  アスタキサンチン含有藻体からなる錠剤（食品）
実施例５の方法によって調製した、熱アセトン処理後乾燥したアスタキサンチン含有藻体を、直接打錠機にて打錠し、栄養補助食品として利用可能な重量 200mgの錠剤を得た。
(2)  アスタキサンチンを内容物とするソフトカプセル（食品）
実施例５で得たクロロフィル含量の低いアスタキサンチン抽出液を、５倍量の大豆油に懸濁し、エバボレーターによってエタノールを可及的に除去した後、カプセル充填機にてカプセル充填し、内容物約 280mgの赤褐色状のカプセルを得た。
(3)  アスタキサンチンを内容物とするクリーム剤（化粧品）
実施例５でクロロフィル含量の低いアスタキサンチン抽出液を、白色ワセリンに10重量％になるように添加し、芳香剤などとともに、均一になるように攪拌し、通常の方法によりクリーム剤を作製した。
(4)  マーガリン（食品)(抗酸化剤及び着色剤として)
実施例５で得たクロロフィル含量の低いアスタキサンチン抽出液を、マーガリンの５重量％になるように植物油に添加し、減圧の蒸留によってエタノールを除去した後、乳化剤などとともに均一になるよう攪拌し、通常の方法によりマーガリンを作製した。このマーガリンは、通常のマーガリンと比較して、アスタキサンチンの存在により、うすい赤色を呈していた。
(5)  人工イクラ（食品）
実施例５で得たクロロフィル含量の低いアスタキサンチン抽出液を、１％アルギン酸ナトリウム水溶液に0.6 ％添加し、ホモジナイザーで分散後、5 ％塩化カルシウム凝固液に滴下し、直径 5mmの球状に成型した。外観は自然に近く、形状、色調ともイクラと酷似していた。
【００１８】
【表３】
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【００１９】
【発明の効果】
本発明によれば、ヘマトコッカス藻体を熱アセトン処理することにより、夾雑物であるクロロフィルを選択的に細胞外へ除去することができると同時に、ヘマトコッカス藻体を物理的に破砕することなく、有機溶媒等によってアスタキサンチンを抽出・回収することができる。さらに、この熱アセトン処理藻体を乾燥又は細胞壁分解酵素で処理することにより、藻体を物理的に破砕することなく、有機溶媒等によるアスタキサンチンの抽出・回収の効率をいっそう高めることができる。また、これらの処理を施したヘマトコッカス藻体は、細胞壁の透過性が大幅に改善されているため、吸収性がよく、魚類養殖その他の産業に寄与し得る。
すなわち、本発明によるアスタキサンチン含有ヘマトコッカス藻体は、細胞壁・細胞膜の透過性が変化しているため、藻体の物理的破砕を必要とせずに、アスタキサンチンを有機溶媒や油脂によって、直接抽出することが可能である。また、本発明によるアスタキサンチン含有ヘマトコッカス藻体は、アスタキサンチンを多量に含有し、かつ夾雑物であるクロロフィルおよびその分解物の含量が少ないため、ヘマトコッカス藻体から高純度のアスタキサンチンの回収が容易である。さらに、透過性の変化したアスタキサンチン含有藻体を用いることにより、アスタキサンチンの吸収効率の高い飼料、餌料、食品などの開発が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ヘマトコッカス・プルビアリスのシスト細胞を、加温したアセトン溶液に浸漬することによりクロロフィル色素が細胞外へ除去されることを示す。
【図２】  40％アセトンに浸漬し、各時間・各温度で加熱処理後、凍結乾燥したヘマトコッカス・プルビアリスのシスト細胞からのアスタキサンチンの抽出効率を示す。
【図１】
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【図２】
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