(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
サーマス・エスピーＡ４株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１５２３６）由来の菌体内酵素で、配列表の配列番号１に記載のＮ−末端アミノ酸配列を含む新規な耐熱性β−ガラクトシダーゼ。
【請求項２】
配列表の配列番号１に記載のＮ−末端アミノ酸配列を含む耐熱性β−ガラクトシダーゼ産生能を有するサーマス・エスピーＡ４株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１５２３６）。
【請求項３】
サーマス・エスピーＡ４株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１５２３６）を培養し、培養物から請求項１記載の耐熱性β−ガラクトシダーゼを採取することを特徴とする新規な耐熱性β−ガラクトシダーゼの製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規な耐熱性β−ガラクトシダーゼに関し、詳しくは、サーマス・エスピーＡ４株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１５２３６）由来の新規な耐熱性β−ガラクトシダーゼに関するものである。
本発明のβ−ガラクトシダーゼは、温泉の熱水，泥などのサンプルより分離したサーマス属細菌に由来し、本酵素は耐熱性に優れており、食品工業用酵素としてきわめて有用なものである。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】
低乳糖牛乳の生産や乳清中に含まれる乳糖の分解を効率よく行うために、固定化β−ガラクトシダーゼを用いた連続乳糖分解システムが開発され、一部で実用化されている。固定化される酵素の性質は、基質である乳糖との親和性が高いとともに、固定化してもその活性を失わず、殺菌処理などによる加熱に耐えうることが望ましい。
そこで、種々の好熱性細菌由来のβ−ガラクトシダーゼが検討され、これまでにサーマス(Thermus) 4-1A株( D.A.Cowan et al. Biotech. Bioeng.,26, 1141-1145(1984)), バチルス・ステアロサーモフィルス(Bacillus stearothermophilus) ATCC 8005 株( H.Hirata et al. J. Bacteriol., 166 (3), 722-727 (1986)、H.Hirata et al. Appl. Environ. Microbiol., 49 (6), 1547-1549 (1985) ) 由来のβ−ガラクトシダーゼが報告されているが、サーマス属細菌の耐熱性β−ガラクトシダーゼについては、アミノ酸レベルやＤＮＡレベルで、その構造が明らかにされたものはまだない。
ところで、現在、汎用されているβ−ガラクトシダーゼは、酵母である Kluyveromyces flagilis, Kluyveromyces lactis 、カビである Aspergillus oryzae,Aspergillus niger 由来のものである。これらは、いずれも高収率で生産できるため安価であるが、耐熱性という点ではバチルス・ステアロサーモフィルス由来のものに比べて劣っている。しかし、バチルス・ステアロサーモフィルス由来のβ−ガラクトシダーゼは酵素の収率が低いため、一般に汎用されていない。
【０００３】
そこで、本発明が解決しようとする課題は、耐熱性に優れたβ−ガラクトシダーゼを産生する微生物を探索して、該微生物由来の酵素を精製し、それが効果的に乳糖を分解することを証明することである。また、本発明のサーマス属細菌由来のβ−ガラクトシダーゼは、自然界からスクリーニングされたもので、そのＮ−末端アミノ酸配列から新規の酵素であることが明らかとなった。さらに、精製した該耐熱性β−ガラクトシダーゼは従来のサーマス属細菌由来のものよりも基質親和性が高く、より実用的なものである。
また、本酵素のＮ−末端アミノ酸配列が決定されたことにより、このアミノ酸配列より推定されるＤＮＡ配列をプローブとしてサーマス属及び他属細菌の耐熱性β−ガラクトシダーゼをクローニングすることも可能となった。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、まず各地の温泉より採集した熱水や泥などのサンプルよりスクリーニングを行い、β−ガラクトシダーゼ活性の高い微生物菌株を選択した。この菌株の菌学的性質を調べ、本菌はサーマス属細菌であると同定した。次いで、該菌株由来のβ−ガラクトシダーゼを精製し、諸性質を決定すると共に、そのＮ−末端アミノ酸配列を決定した。相同性検索の結果、従来報告されているバチルス・ステアロサーモフィルス由来のβ−ガラクトシダーゼＩとは４０．９％の低い相同性が示されたことから、本発明のβ−ガラクトシダーゼは新規な酵素であると確認した。また、この精製酵素は従来のサーマス属細菌由来β−ガラクトシダーゼよりも基質親和性が高いことが証明された。本発明はかかる知見により完成されたものである。
【０００５】
請求項１記載の本発明は、サーマス・エスピーＡ４株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１５２３６）由来の菌体内酵素で、配列表の配列番号１に記載のＮ−末端アミノ酸配列を含む新規な耐熱性β−ガラクトシダーゼであり、請求項２記載の本発明は、配列表の配列番号１に記載のＮ−末端アミノ酸配列を含む耐熱性β−ガラクトシダーゼ産生能を有するサーマス・エスピーＡ４株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１５２３６）である。
【０００６】
【発明の実施の形態】
以下に本発明を詳細に説明する。
耐熱性に優れたβ−ガラクトシダーゼを産生する微生物の探索は以下のようにして行った。
各地の温泉から採集した熱水や泥などのサンプルを、X-gal を含むサーマス属細菌用平板培地に塗沫して７０℃で２日間培養し、出現したコロニーのうち青色または緑色を呈しているものを選び、上記と同じ組成の液体培地に移して培養する。培養終了後、培養液から遠心分離などの固−液分離を行って菌体を集めた後、超音波破砕処理，ホモジナイザー処理などによって菌体を破砕して粗酵素液とする。この酵素のｏ−ニトロフェニルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）に対するβ−ガラクトシダーゼ活性を測定し、最終的に該β−ガラクトシダーゼ活性が高く、増殖が早い菌株を選択する。このようにして、静岡県の熱川温泉より分離した菌株を選択した。本菌は、好気性のグラム陰性桿菌であり、カロチノイド系と考えられる油溶性の黄色色素を産生することから、サーマス属に属するものと同定した。本菌をサーマスＡ４株と命名した。本菌は工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されており、その受託番号はＦＥＲＭ  Ｐ−１５２３６である。
【０００７】
次に、本発明のβ−ガラクトシダーゼの採取と精製は以下の方法により行うことができる。
選択した菌株を、サーマス属細菌用液体培地を用いて大量培養し、培養物から遠心分離等の固−液分離手段によって菌体を回収する。次いで、該菌体をリン酸ナトリウム緩衝液等に懸濁し、適当な破砕手段によって破砕して粗酵素液(cell free extract) とする。この粗酵素液について、ＯＮＰＧに対する加水分解活性を指標としてβ−ガラクトシダーゼを精製する。
まず、上記の粗酵素液を８０％飽和の硫安等による硫安塩析を行い沈殿を回収し、該沈殿をトリス−塩酸緩衝液等に分散させた後、同じ緩衝液に対して透析処理を行う。次いで、各種のクロマトグラフィーを用いて分画し、精製する。例えば、イオン交換クロマトグラフィー，ヒドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィー，ゲル濾過クロマトグラフィー，疎水性クロマトグラフィー等を適宜組み合わせて精製する。
【０００８】
このようにして精製した後、常法に従って酵素の諸性質を決定する。本酵素のＮ−末端アミノ酸配列の決定は、例えばプロテインシークエンサーを用いて行うことができる。決定されたＮ−末端アミノ酸配列を他のβ−ガラクトシダーゼのＮ−末端アミノ酸配列と比較することが可能である。さらに、所望により本酵素に対して遺伝子工学的改良を加えることにより、より実用的なβ−ガラクトシダーゼを創製することも可能である。
【０００９】
以下に、本発明のβ−ガラクトシダーゼの理化学的性質を示す。
（１）作用  ラクトースをガラクトースとグルコースに加水分解する。
（２）基質特異性  ラクトース（Ｋｍ＝２０ｍＭ），ＯＮＰＧ（Ｋｍ＝５．９ｍＭ）
（３）至適温度  酵素の熱による失活を無視した見かけの至適温度は９０℃以上（４）耐熱性  ８５℃で２時間保温後、７５％残存活性
（５）至適ｐＨ  ５．５〜８．０
（６）分子量  ８６ｋＤａ（単量体）
（７）阻害剤  鉄イオン，銅イオン，ＰＭＳＦ
（８）活性剤  マンガンイオン，コバルトイオン，亜鉛イオン，ＤＴＴ，β−メルカプトエタノール，システイン
（９）Ｎ−末端アミノ酸配列  配列表の配列番号１記載の通り
【００１０】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれにより制限されるものではない。
実施例１
各地の温泉（温度６５〜９４℃、ｐＨ７前後）から熱水およびそれに接している微生物マットなどを採取した。これらをサーマス属細菌用平板培地（１リットル中、４ｇ  ポリペプトン、2 ｇ  酵母エキス、１％  ラクトース、1 ｇ  ＭｇＣｌ2 、１０ｇ  ＧＥＬＲＩＴＥ、１０ｍｌ  Ｘ−ｇａｌ溶液（２０ｍｇ／ｍｌジメチルホルムアミド溶液）、１００ｍｌ  １０×ｂａｓａｌ  ｓａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（この溶液１リットル中には６．８９ｇ  ＮａＮＯ3 、１．５ｇＣａＳＯ4 ・２Ｈ2 Ｏ、１．１ｇ  ＮａＨＰＯ4 、１．０３ｇ  ＫＮＯ3 、１．０ｇ  ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ、１．０ｇ  ニトリロ三酢酸、０．０８ｇ  ＮａＣｌ、１０ｍｌ  ＦｅＣｌ2 水溶液（０．２８ｇ／Ｌ）、１０ｍｌ  Ｎｉｔｓｃｈ’ｔｒａｃｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎが含まれている) （なお、Ｎｉｔｓｃｈ’ｔｒａｃｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  １リットル中には２．２ｇ  ＭｎＳＯ4 ・Ｈ2 Ｏ、０．５ｇ  ＺｎＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ、０．５ｇＨ3 ＢＯ4 、０．５ｍｌ  Ｈ2 ＳＯ4 、０．０４６ｇ  ＣｏＣｌ2 ・６Ｈ2 Ｏ、０．０２５ｇ  Ｎａ2 ＭｏＯ4 ・２Ｈ2 Ｏ、０．０１６ｇ  ＣｕＳＯ4 が含まれている) ）に塗沫して７０℃で培養した。
【００１１】
２日ほど培養するとコロニーが生じるので、そのうち青−緑色を呈しているもののみを画線分離した。分離により青色を呈さなくなるものもあったが、十分に青色を保っているコロニーを液体培地（先述の平板培地の組成よりＭｇＣｌ2 とＧＥＬＲＩＴＥを除いたもの）に移して７０℃で４８時間培養した。
培養終了後、培養液を遠心分離して集菌後、菌体を超音波破砕して粗酵素液とし、これのＯＮＰＧに対するβ−ガラクトシダーゼ活性を測定した。その結果、β−ガラクトシダーゼ活性が高く、増殖が速い菌株（Ａ４株と名付けた）を選択した。本菌株に由来するβ−ガラクトシダーゼを以後Ａ４−β−Ｇａｌと称することにする。このＡ４株は静岡県の熱川温泉より分離された菌株で、菌学的性質を調べた結果、好気性のグラム陰性桿菌で、カロチノイド系と考えられる油溶性の黄色色素を産生することから、サーマス属に属するものと認められ、サーマスＡ４株と命名した。本菌株はＦＥＲＭ  Ｐ−１５２３６として工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている。
【００１２】
実施例２
実施例１で得られたＡ４株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１５２３６）を実施例１に示したと同様の液体培地を用いて９０リットル容ジャーファーメンターで７０℃で２日間培養し、約７０リットルの培養液を得た。この培養液よりＡ４株の菌体を遠心分離によって回収した。
遠心分離により得た菌体（約７２０ｇ、湿物重）のうち半量（３６０ｇ）を４リットルの５０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁し、５℃以下にて約２０時間循環させながら連続的に超音波破砕した。これを遠心分離して得た上清（比活性は０．１１５ｕｎｉｔ／ｍｇ）に８０％飽和となるよう硫安を加え、４℃で一晩放置した。生じたタンパク質の沈殿を遠心分離にて回収し、１リットルの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に分散させて、同じ緩衝液に対して透析を行った。
【００１３】
透析を終了したサンプル約３リットルを３００ｍｌずつＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ陰イオン交換クロマトグラフィーで分画した。分画条件は以下の通りである。
カラム：Ｑ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）
カラムサイズ：Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＸＫ５０  （５０×２４０ｍｍ）
緩衝液：Ａ：５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），０．０２％  ＮａＮ3 
Ｂ：１Ｍ  ＮａＣｌ／緩衝液Ａ
溶出：十分に吸着させてから、２時間でＮａＣｌ濃度を０Ｍから１Ｍまで直線的に上昇させて溶出させた。
流速：４ｍｌ／ｍｉｎ
フラクションサイズ：８ｍｌ
このようにして活性画分（約９６０ｍｌ）を回収し、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ活性画分（比活性は０．２６９ｕｎｉｔ／ｍｇ）を得た。これを常法に従い硫安塩析、透析により脱塩濃縮して約６００ｍｌにした。
【００１４】
次に、これを５０ｍｌずつハイドロキシアパタイトカラムで分画した。条件は以下の通りである。
カラム：ギガパイト (生化学工業)
カラムサイズ：Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＸＫ５０  （５０×７０ｍｍ）
緩衝液：Ａ：１０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）, ０．０２％ＮａＮ3 
Ｂ：５００ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）, ０．０２％  ＮａＮ3 
溶出：目的タンパク質はこのカラムと弱い相互作用しか持たないので、十分な量の緩衝液Ａを流して目的タンパク質を溶出してから、緩衝液Ｂの２０％、１００％のステップワイズで他のタンパク質を溶出した。
流速：４ｍｌ／ｍｉｎ
フラクションサイズ：８ｍｌ
活性画分を回収し、ハイドロキシアパタイト活性画分（約４３０ｍｌ、５．０４ｕｎｉｔ／ｍｇ）を得た。
【００１５】
さらに、これを５０ｍｌずつＭｏｎｏ  Ｑ  ＨＲ１０／１０カラムを用いたＨＰＬＣで分画した。分画の条件は以下の通りである。
カラム：Ｍｏｎｏ  Ｑ  ＨＲ１０／１０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）
緩衝液：Ａ：５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），０．０２％  ＮａＮ3 
Ｂ：１Ｍ  ＮａＣｌ／緩衝液Ａ
溶出：十分に吸着させてから、４０分間でＮａＣｌ濃度を０Ｍから０．４Ｍまで直線的に上昇させて溶出させた。
流速：４ｍｌ／ｍｉｎ
ＮａＣｌ濃度が約０．３Ｍのときに活性のピークが得られたので、この活性画分を回収し、Ｍｏｎｏ  Ｑ活性画分（約１１５ｍｌ、８．１０ｕｎｉｔ／ｍｇ）を得た。
この際のクロマトグラムを図１に示した。なお、図中の実線はＡ４−β−Ｇａｌの相対活性を示し、破線は２８０ｎｍにおける吸光度を示し、一点鎖線はグラジエントの塩濃度を示す。
【００１６】
Ｍｏｎｏ  Ｑ活性画分を限外濾過（分画分子量３００００）によりおよそ１０ｍｌまで濃縮してからこれを１ｍｌずつ以下の条件で分画した。
カラム：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  Ｄｉｏｌ−３００（２０×５００ｍｍ）（ＹＭＣ）
緩衝液：０．１Ｍ  ＫＨ2 ＰＯ4 −Ｋ2 ＨＰＯ4 （ｐＨ７．０），０．２Ｍ
ＮａＣｌ
流速：０．３ｍｌ／ｍｉｎ
活性のピークは分子量約８６ｋＤａの蛋白質のピークと重なっていた。この活性画分を回収し、ゲル濾過活性画分（約２２ｍｌ、４９．３ｕｎｉｔ／ｍｇ）とした。
【００１７】
ゲル濾過活性画分約２２ｍｌに等量の１．７Ｍ  （ＮＨ4)2 ＳＯ4 を加えたものを、Ｐｈｅｎｙｌ−Ｓｕｐｅｒｏｓｅ疎水性クロマトグラフィーにより３ｍｌずつ以下の条件で分画した。
カラム：Ｐｈｅｎｙｌ−Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  ＨＲ５／５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）
緩衝液：Ａ：５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），０．８５Ｍ  （ＮＨ4)2 ＳＯ4 ，０．０２％  ＮａＮ3 
Ｂ：５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），，０．０２％
ＮａＮ3 
溶出：十分に吸着させた後、Ｂ緩衝液の割合を０％から５０％に切り替え、さらに５０％から１００％まで直線的に上昇させて溶出させた。
流速：０．６ｍｌ／ｍｉｎ
Ｂ緩衝液の割合が１００％、すなわち硫安濃度がほぼ０となったときに活性画分が溶出されたので、この活性画分を回収してＰｈｅｎｙｌ−Ｓｕｐｅｒｏｓｅ活性画分（約１０ｍｌ、４８．６ｕｎｉｔ／ｍｇ）を得た。
この際のクロマトグラムを図２に示した。なお、図中の実線はＡ４−β−Ｇａｌの相対活性を示し、実線は２８０ｎｍにおける吸光度を示し、矢印で示したピークはＡ４−β−Ｇａｌの相対活性のピークと重なっていることを示す。また、破線はグラジエントの緩衝液Ｂの割合を示す。
【００１８】
以上に述べた精製各段階の総タンパク質量、総活性、比活性、収率、精製倍率を表１に示した。なお、タンパク質濃度および酵素活性の測定は以下の方法により行った。
タンパク質濃度はＢｉｏ−Ｒａｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓａｙ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を用いて測定した。標準にはＢｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎを用いた。
【００１９】
ＯＮＰＧを基質としたときのβ−ガラクトシダーゼ活性は以下のようにして測定した。キュベット中の反応混合液（５０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液 (ｐＨ６．５）、１ｍＭ  ＭｇＣｌ2 、２．８ｍＭ  ＯＮＰＧ、全量は２．９ｍｌ）を７０℃に保ち、酵素液を１００μｌ加えて３０秒後から１分間の４０５ｎｍにおける吸光度の変化を測定した。ｏ−ニトロフェノールの４０５ｎｍにおけるモル吸光係数は３．１×１０3 Ｍ-1ｃｍ-1として計算した。なお、精製の途中の段階での各フラクションの活性は簡易的に以下のようにして測定した。測定するフラクションから１０μｌを９６穴マイクロウェルプレートにとり、１８０μｌのバッファー（５０ｍＭ  リン酸ナトリウム (ｐＨ６．５）、1 ｍＭ  ＭｇＣｌ2)を加えた。次に、１０μｌの１０ｍＭ  ＯＮＰＧを加えて、すぐに８０℃のインキュベーターに入れて１５分間おいた。このあとＭＴＰ−１００マイクロプレートリーダーで４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。対照にはフラクションからの液の代わりに同じバッファーを用いた。なお、ＯＮＰＧと同様にｐ−ニトロフェニルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＰＮＰＧ）もβ−ガラクトシダーゼの基質として用いられる。
【００２０】
乳糖を基質としたときのβ−ガラクトシダーゼ活性は以下のようにして測定した。反応混合物（１０−１００ｍＭ  ラクトース、１０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液 (ｐＨ６．５）、酵素液、全量は１ｍｌ）を７０℃で１時間反応させ、反応前と反応後のラクトースの量の変化をイオンクロマトグラフィー（ＤＩＯＮＥＸ社製，ＤＸ３０００型) で測定した。測定条件は以下の通りであった。
カラム：Ｃａｒｂｏ−ｐａｋ  ＰＡ−１００
移動相：１５０ｍＭ  ＮａＯＨ
流速：０．８ｍｌ／ｍｉｎ
検出器：ＰＡＤ
【００２１】
【表１】
0003766461.tif 000002
【００２２】
Ｐｈｅｎｙｌ−Ｓｕｐｅｒｏｓｅ分画までの精製によってＡ４−β−Ｇａｌは４２３倍にまで精製され、次に記すＳＤＳ−ＰＡＧＥによりほぼ純品であることが確認された。そこで、このＰｈｅｎｙｌ−Ｓｕｐｅｒｏｓｅ活性画分を用いて酵素の諸性質を調べた。
【００２３】
（１）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量の推定
ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）はＬａｅｍｍｌｉ（U.K.Laemmli Nature (London), 227, 680-685 (1970)) の方法に準じて行い、クマシーブリリアントブルーＲ−２５０染色で可視化した。すなわち、精製各段階のサンプルをタンパク質濃度が約１ｍｇ／ｍｌとなるように調製し、常法に従ってＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、クマシーブリリアントブルーで染色した。
精製各段階のサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけたものを図３に示した。なお、図中レーン１は分子量マーカー、レーン２は菌体破砕物の上清、レーン３はＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅで分画した活性画分、レーン４はハイドロキシアパタイトで分画した活性画分、レーン５はＭｏｎｏ−Ｑで分画した活性画分、レーン６はゲル濾過で分画した活性画分、レーン７はＰｈｅｎｙｌ−Ｓｕｐｅｒｏｓｅで分画した活性画分、レ−ン８は逆相ＨＰＬＣで精製した際のメインピークをそれぞれ示している。
ここで、Ａ４−β−Ｇａｌは分子量がおよそ７５ｋＤａの位置にバンドを形成した。一方、ここには示さないが、ゲル濾過分画の際、Ａ４−β−Ｇａｌの分子量はおよそ８６ｋＤａと見積もられた。これらのことから、Ａ４−β−Ｇａｌは分子量が約８６ｋＤａの単量体であると推定した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて分子量が低く見えるのはＡ４−β−Ｇａｌの疎水性が大きいためと考えられる。
【００２４】
（２）ミカエリス定数
Ａ４−β−Ｇａｌのミカエリス定数（Ｋｍ）は、初期基質濃度を変化させたときの反応初速度の変化を測定し、Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋプロットを用いて算定した。ＯＮＰＧに対するＫｍ値は５．９ｍＭ、乳糖に対するＫｍ値は２０ｍＭであった。
なお、第２表に比較としてサーマス４−１Ａ株( D.A.Cowan et al. Biotech. Bioeng.,26, 1141-1145(1984))、バチルス・ステアロサーモフィルスＡＴＣＣ８００５株( H.Hirata et al. J. Bacteriol., 166 (3), 722-727 (1986)、H.Hirata et al. Appl. Environ. Microbiol., 49 (6), 1547-1549 (1985) のβ−ガラクトシダーゼのミカエリス定数も示した。
【００２５】
【表２】
0003766461.tif 000003
【００２６】
（３）温度依存性
Ａ４−β−Ｇａｌの温度依存性は、活性測定時に反応混合液を７０℃に保つ代わりにそれぞれの目的温度に保って測定することで決定した。８０℃以上ではＯＮＰＧの熱分解が起こるので、酵素液の代わりに５０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）を１００μｌ加えて同様に測定した値を用いて補正した。この条件下でのＡ４−β−Ｇａｌ酵素の熱による失活を無視した見かけの至適温度は９０℃以上であった。
【００２７】
（４）ｐＨ依存性
Ａ４−β−ＧａｌのｐＨ依存性は、活性測定時に反応混合液中の５０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）に代えて目的のｐＨ緩衝液を加えて同様に測定することにより決定した。緩衝液には、５０ｍＭ  クエン酸ナトリウム緩衝液 (ｐＨ３．５〜６．０）、５０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５〜８．０) 、５０ｍＭ  グリシン−ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０〜９．０）を用いた。その結果、Ａ４−β−Ｇａｌの至適ｐＨはおよそ５．５〜８．０であった（図４参照）。なお、図中の─●─はクエン酸ナトリウム緩衝液、─■─はリン酸緩衝液、─▲─はグリシン−ＮａＯＨ緩衝液を用いたときの結果を示した。
【００２８】
（５）耐熱性
Ａ４−β−Ｇａｌの耐熱性は、酵素液を目的温度で規定した時間保温し、保温終了後すぐに７０℃で残存活性を測定することで決定した。Ａ４−β−Ｇａｌは８５℃までであれば２時間保温した後も７５％以上の活性を保持していることが明らかになった（図５参照）。なお、図中の─●─は７５℃，─■─は８０℃，─▲─は８５℃，─◆─は９０℃，─▼─は９５℃のときの結果を示した。
また、７０℃では２０時間保温後も活性の低減が見られなかった。
【００２９】
（６）各種金属イオン、阻害剤による影響
二価の金属イオン（Ｍｎ，Ｍｇ，Ｆｅ，Ｚｎ，Ｃｕ）は最終１ｍＭ、阻害剤（ＥＤＴＡ, ＰＭＳＦ, ＤＴＴ，β−メルカプトエタノール, システイン, ヨード酢酸）は最終１０ｍＭとなるように反応混合液に添加し、通常通り活性測定を行った。その結果、マンガンイオン，コバルトイオン，亜鉛イオン，ＤＴＴ，β−メルカプトエタノールおよびシステインはＡ４−β−Ｇａｌを活性化した。鉄イオン，銅イオン，ＰＭＳＦはＡ４−β−Ｇａｌを阻害したが、ヨード酢酸による阻害はみられなかった（図６（ａ), (ｂ）参照）。なお、図中の（ａ）は金属イオンによる影響を、（ｂ）は阻害剤による影響を示した。
【００３０】
実施例３
Ａ４−β−ＧａｌのＮ−末端アミノ酸配列を決定するため、逆相ＨＰＬＣによる精製を以下の条件で行った。
0003766461.tif 000004
メインのピークを回収し、そのままプロテインシークエンサーにかけた。
【００３１】
Ａ４−β−ＧａｌのＮ−末端アミノ酸配列は、逆相ＨＰＬＣで精製したＡ４−β−Ｇａｌサンプルを常法に従い４７３Ａ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で分析して決定した。
その配列を配列表の配列番号１（ただし、Ｘは決定できなかったアミノ酸残基を示す。）に示す。Ｎ−末端より１５残基目までが決定できたが、そのうち１残基（５番目）は決定できなかった。
このアミノ酸配列とこれから推定されるＤＮＡ配列についてデータベース（ＮＢＲＦ−ＰＩＲ，Ｒｅｌｅａｓｅ  ４３．０）に登録されている配列との相同性検索を行ったところ、バチルス・ステアロサーモフィルスのβ−ガラクトシダーゼＩ（アクセッションナンバーＡ２９８３６）のＮ−末端部分と４０．９％の相同性があることが判明した（図７参照）。
【００３２】
【発明の効果】
本発明により、サーマス属細菌の産生する菌体内酵素であり、配列表の配列番号１に記載のＮ−末端アミノ酸配列を含む新規なβ−ガラクトシダーゼが提供される。さらに、このアミノ酸配列から推定されるＤＮＡ配列を用いて、サーマス属及び他の属の細菌等から相同性のあるβ−ガラクトシダーゼをクローニングすることが可能となり、実用的なβ−ガラクトシダーゼの創製に貢献できる。このβ−ガラクトシダーゼは耐熱性に富むので、食品工業用酵素として有用である。
【００３３】
【配列表】
【００３４】
配列番号：１
配列の長さ：１５アミノ酸残基，うち１残基は未決定
配列の型：アミノ酸
配列の種類：ペプチド
配列の特徴
Thermus sp.A4 株由来のβ−ガラクトシダーゼのN-末端アミノ酸の配列
存在位置：N-末端
配列
Met-Leu-Gly-Val-X-Tyr-Tyr-Pro-Glu-His-Trp-Pro-Lys-Glu-Arg
【図面の簡単な説明】
【図１】  Ｍｏｎｏ−Ｑカラムクロマトグラフィーのクロマトグラムを示した図である。
【図２】  Ｐｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｅｒｏｓｅクロマトグラフィーのクロマトグラムを示した図である。
【図３】  ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示した写真である。
【図４】  Ａ４−β−ＧａｌのｐＨ依存性を示した図である。
【図５】  Ａ４−β−Ｇａｌの耐熱性を示した図である。
【図６】  （ａ）はＡ４−β−Ｇａｌの金属イオンによる影響を、（ｂ）はＡ４−β−Ｇａｌの阻害剤による影響を示した図である。
【図７】  Ａ４−β−Ｇａｌと B. stearothermophilus由来のβ−ガラクトシダーゼＩとのＮ−末端アミノ酸配列を比較した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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