(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
雌マウスの乳汁中への、成熟した形態または融合した形態での目的異種タンパク質の製造方法であって、
前記雌マウスを飼育し、
乳汁を回収して、そこから前記タンパク質を回収して必要ならば単離することを含んでなり、
前記雌マウスは、そのゲノム中に目的のタンパク質をコードするＤＮＡが組み込まれてなるトランスジェニックマウスであって、該目的のタンパク質をコードするＤＮＡが、第１図に示されるウサギＷＡＰプロモータ領域の３′末端から少なくとも６．３Ｋｂの長さを有するフラグメントの制御下にあることを特徴とする、方法。
【請求項２】
ＷＡＰプロモーターのＤＮＡが、第１図に示されるＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩ部位の間の６．３Ｋｂ配列を含むものである、請求の範囲第１項に記載の方法。
【請求項３】
前記目的の異種タンパク質をコードするＤＮＡが、第１図に示されるプロモータ領域の３′末端から１７Ｋｂの長さのフラグメントの制御下にある、請求の範囲第１項または第２項に記載の方法。
【請求項４】
ＷＡＰプロモーターのＤＮＡが、第１図に示されているＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩとの間の１７Ｋｂの配列を含むものである、請求の範囲第３項に記載の方法。
【請求項５】
前記目的のタンパク質をコードするＤＮＡの５′末端側に、第１図に示されるプロモータ領域が存在する、請求の範囲第１〜４項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
異種タンパク質をコードするＤＮＡに対応するＤＮＡにおいて、イニシエーターのＡＴＧコドンが欠失している、請求の範囲第１〜５項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記雌マウスの乳汁から目的のタンパク質を回収するために、
ａ）  乳腺を回収し、
ｂ）  この乳腺を、温度０℃で２時間〜１８時間インキュベートし、
ｃ）  乳腺から自然に滲出した乳汁を回収し、
ｄ）  この乳汁から目的のタンパク質を単離して、前記の精製したタンパク質を得る、請求の範囲第１〜６項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
異種タンパク質をコードするＤＮＡが、ヒト成長ホルモンをコードするＤＮＡである、請求の範囲第１〜７項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
異種タンパク質が、
成長因子、
インターロイキン、
刺激因子、
キナーゼ、
凝固因子、
α−抗トリプシン、
ヒルジン
から選択される、請求の範囲第１〜８項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
タンパク質が、
エリスロポエチン
Ｇ−ＣＳＦ，
α−抗トリプシン
ウロキナーゼ、
ＶＩＩＩ因子
から選択される、請求の範囲第９項に記載の方法。
【請求項１１】
目的のタンパク質をコードするＤＮＡが、ＶＩＩＩ因子遺伝子の最初のイントロン、およびその後にあるヒトＶＩＩＩ−ΔＩＩ因子のｃＤＮＡからなるものである、請求の範囲第１０項に記載の方法。
【請求項１２】
ゲノム中に目的の異種タンパク質をコードするＤＮＡを含み、それが第１図に示されるウサギＷＡＰプロモータ領域の３′末端から少なくとも６．３Ｋｂの長さを有するフラグメントによって制御されるものである、真核細胞。
【請求項１３】
雌マウスの乳房の主要上皮細胞である、請求の範囲第１２項に記載の真核細胞。
【請求項１４】
請求の範囲第１２および１３項のいずれか一項に記載の細胞を含んでなる、トランスジェニックマウス。
【請求項１５】
第１図に示されるウサギＷＡＰプロモータ領域の３′末端から少なくとも６．３Ｋｂの長さを有するフラグメントの制御下にある、目的のタンパク質をコードする少なくとも１種類の異種遺伝子を含んでなる、ＤＮＡ。
【発明の詳細な説明】
本発明は、トランスジェニック動物の乳汁への所望なタンパク質の調製法に関する。本発明はそのような動物を得ることを可能にする構築物、得られた動物、並びに異種タンパク質を発現させる構を含む細胞にも関する。
生物学上、治療上または産業上望まれる、天然にはわずかな量でしかまたは精製が難しい形態でしか産生されないタンパク質を得る目的で、いくつかの方法が検討されてきた。
これにより、細菌または酵母のような微生物による遺伝子組換え技術を使用してタンパク質を産生することが可能となった。しかしながら、大部分のタンパク質では、合成後にある種の反応基の化学修飾、グリコシル化などの成熟段階が必要である。原核細胞は、この成熟を行い、したがって不活性タンパク質および／または高い抗原性を有するタンパク質を産生するのに十分な量の酵素を含有していない。
それ故、真核細胞中でこれらのタンパク質を合成し、適当な酵素的転換を行うようにするのが好ましい。しかしながら、組織細胞を大規模に培養するには、多くの技術的および経済的問題が存在する。
それ故、もう一つの方法は、トランスジェニック動物を用い、イン・ビボで細胞によってこれらのタンパク質を産生させることからなっている。用いる系には、回収が容易なタンパク質を多量に産生させることができることが望まれる。それ故、組換えタンパク質がトランスジェニック動物の乳腺で産生され、乳汁中に排出されることが有利である。これは実に容易に採集することのできる体液であり、その複雑さも比較的限られており、タンパク質分解活性も低く、加えて、組換えタンパク質の成熟工程も確実に行われることになると思われる（グリコシル化、リン酸化、分裂等）。
このようにして、マウスまたは雌ヒツジの乳腺で、別種の乳汁タンパク質または通常は乳汁中に存在しないタンパク質を合成することができるようになった（文献１〜１５）。
しかしながら、このようにして産生されるタンパク質の濃度は極端に変化する可能性がある。これは、それ自体が動物毎に変化する導入遺伝子（transgene）の組み込み過程によって、トランスジェニック動物毎に異なってしまうことによる。遺伝子構築物の性質もまた重要であり、乳汁タンパク質遺伝子の発現を調製する要素は多数あり、遺伝子のプロモーター領域および転写部分の各種の地点に位置すると考えられる。ヒツジのβ−ラクトグロブリン、ラットＷＡＰおよびラットβ−カゼインのプロモーターによって、これらのタンパク質をトランスジェニックマウスで合成させることができる。しかしながら、その濃度は、系統的にはβ−ラクトグロブリンの場合のみ高い。同様に、β−ラクトグロブリンプロモーターはヒトα−１−抗トリプシンの合成を指示し、これはトランスジェニックマウスの乳汁中で乳汁１ｍｌ当たり７ｍｇの値に達する。このαs1−カゼインプロモーターによりヒトウロキナーゼを合成することができるが、今日まで使用されてきたラットβ−カゼインおよびウサギβ−カゼイン遺伝子のプロモーターの活性は限定されたものである。マウスＷＡＰ遺伝子のプロモーターは、トランスジェニックマウスの乳汁中に分泌される数種類の異種タンパク質（プラスミノーゲン活性化因子、ＣＤ４）の合成を指示する。しかしながら、このプロモーターによって得られるタンパク質の量は比較的少ない。
更に、プロモーターが外来遺伝子との会合によってその特異性が修飾されることも起り得る。この方法で、Ｇｕｅｎｚｂｕｒｇ等（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １９９１年）は、トランスジェニック動物において、マウスＷＡＰプロモーターに依存する組み換えＤＮＡを用い成長ホルモンの分泌物を得ているが、成長ホルモンはこの場合にはBergmanのグリア細胞中に小脳でも産生される。このような現象が、毒性および動物の早熟死をもたらすこともある。
本発明は、うさぎＷＡＰ遺伝子のプロモーターの特に興味深い現象に基くものである。実際に、ウサギＷＡＰ（「乳清の酸性タンパク質」）は、比較的豊富に存在するウサギの乳汁タンパク質（乳汁１ｍｌ当たり１５ｍｇ）であり、ウサギは大規模に使用することのできるトランスジェニック動物と考えることができる。
本発明は、雌哺乳動物の乳汁中で目的の異種タンパク質を成熟した形態または融合した形態で調製する方法であって、この方法は、
雌哺乳動物を飼育し、
乳汁を回収し、そこからタンパク質を回収し、必要ならば分離することからなる方法であって、
前記雌哺乳動物は、そのゲノム中に、ウサギＷＡＰタンパク質を発現させる要素中に存在しかつ完全なＷＡＰプロモータの３′未満かせ少なくとも３Ｋｂの長さを有するフラグメント上に位置している少なくとも一つの配列の制御下にある、目的のタンパク質をコードする配列が組み込まれてなるトランスジェニック動物であることを特徴とする方法に関する。
好ましくは、本発明は、目的のタンパク質の発現を制御する配列が、ＷＡＰプロモーター３′末端から３Ｋｂと６．３Ｋｂとの間のフラグメント上に位置する発現要素をも含んでいる方法に関する。
トランスジェニック動物の生産は既知であり、前記の報告中に同様の構築物について広汎に説明されているが、
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Ｈｅｎｎｉｇｈａｕｓｅｎら、Ｂｕｒｄｏｎら、Ｒｅｄｄｙらの文献並びに特許ＷＯ９００５１８８号明細書にも記載されている。
遺伝子導入の方法についての詳細な説明は詳しく繰り返し述べることはしないが、前記の文書を本明細書の開示の一部として引用する。
「目的の異種タンパク質」とは、天然にはウサギＷＡＰプロモーターによって制御されないタンパク質を本質的に指すものとする。
本発明の方法では、使用する雌哺乳動物は好ましくはウサギであるが、これらの構築物は他の哺乳類、例えばマウスでも有効である。
得られた乳汁は目的のタンパク質を含んでおり、これは単離することができ、あるいは次にそれが成熟した形態であるか融合した形態であるかによって、必要ならば化学的または酵素的な開裂を行わせることができる。
用いるＤＮＡ構築物は、１細胞から８細胞段階までの受精卵へマイクロインジェクションによって導入した後、前記に説明する基準に適合する動物、すなわちトランスジェニックであって乳汁中で前記のタンパク質を発現する動物を選択するのが好ましい。
細菌性のクロラムフェニコールアセチル転移酵素（ＣＡＴ）のレポーター遺伝子上にグラフトされたＷＡＰ遺伝子のプロモーター領域は、２種類の極めて重要な乳汁分泌ホルモンであるプロラクチンおよび糖質コルチコイドに感受性である要素を含む。これらのホルモンは、ハイブリッド遺伝子をウサギ乳房の主要上皮細胞（primary epithelisl cell）にトランスフェクションすると、ＣＡＴ遺伝子の発現に強い刺激を与える。このホルモン応答は、使用するプロモーターの長さによって変化する。それ故、ウサギＷＡＰ遺伝子のプロモーターは、今日まで使用されてきたマウスおよびラットのＷＡＰ遺伝子のプロモーターよりも遥かに効果的である。
特に、本発明による方法では、ウサギＷＡＰ遺伝子の完全プロモーターに対応する配列またはプロモーターの機能を保持する同等の配列を目的のタンパク質をコードする配列の５′末端に先行させることができる。この場合には、総てのＷＡＰ遺伝子および前記の遺伝子または同等の配列のＷＡＰプロモーターを使用することも可能である。本出願明細書に添付されている第５図は、前記のウサギＷＡＰ遺伝子を表わしているものである。
「同等の配列」とは、好ましくはＷＡＰプロモーターの３′末端から少なくとも３Ｋｂの長さを有し、特に完全なウサギＷＡＰプロモーターの３′末端から少なくとも６．３Ｋｂの長さを有するフラグメント上に位置し、とりわけＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩ部位（第１図）の間に位置する、発現要素を含むものを表わすと理解される。
このプロモーターは、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩ部位の間の１７Ｋｂの配列、または、このフラグメント上に位置する発現要素を含む配列を含むことができる。本発明の構築物に必須の要素は、プロモーターの３′末端から１７．６Ｋｂの長さを有するフラグメント上に位置する。
この長いプロモーターは、これに結び付いている外来遺伝子の発現を更に促進する要素を提供し、またはこれらをゲノムに導入された遺伝子の挿入部位と更に独立させることによって、一層規則的に高く発現させることができる。
６．３Ｋｂの短いプロモーターは、乳汁産生ホルモンという、１７Ｋｂの長いプロモーターによって得られるものと実際上同一のホルモンに応答し、遺伝子が非常に高レベルでベクター中においてそれと関連しているタンパク質の合成を指示することができる。
本発明は、前記で定義した構築物であってウサギＷＡＰタンパク質遺伝子に対応する配列においてイニシエーターＡＵＧコドンが欠失しているものにも関する。
この修飾は特に、部位特異的突然変異誘発によって得ることができる。
目的のタンパク質をコードする配列がＷＡＰ遺伝子の総てまたは一部の配列と融合した形態であるときには、このタンパク質のＡＴＧ配列をなくすことができる。
従って、ウサギＷＡＰタンパク質は、この種類の構築物を用いて例えばトランスジェニックマウスで発現させることができる。
イニシエーターのＡＵＧコドンを喪失しているいてもよいウサギＷＡＰタンパク質遺伝子を含むこの種類の構築物においては、目的のタンパク質に対する遺伝子またはｃＤＮＡを、実施例から明らかになるように、異なる部位に配置して、異なるレベルおよび種類の構築物を生じさせることができる。
本発明の別の態様によれば、雌哺乳動物の産生する乳汁およびこれに含まれるタンパク質を回収する方法であって、前記の雌哺乳動物の乳汁から目的のタンパク質を回収するため、
ａ）乳腺を回収し、
ｂ）この乳腺を、約０℃の温度で２時間〜１８時間インキュベートし、
ｃ）乳腺から自然に滲出した乳汁を回収し、
ｄ）目的のタンパク質を乳汁から単離して、前記の精製したタンパク質を得ることを特徴とする方法が提供される。
この方法は、異種タンパク質の産生の枠組で、ＷＡＰタンパク質遺伝子をそのゲノムフラグメントに組み込んだトランスジェニック動物を用いて開発したが、これは乳汁から単離することが所望な任意のタンパク質の精製に応用することができる。
これは、反芻動物以外の哺乳類の通常の採乳方法と比較すると、その採集量に関しては、とりわけマウスのような小動物ではかなり有利であることを示している（２４）。回収した乳汁の組成は、自然に産生した乳汁の組成と同じである。また、この方法では、乳腺を氷中で輸送することによって、生産場所で得られた生成物を精製および処理の場所へと容易に運搬することができる。
本発明の異種タンパク質の調製法では、その変法のいずれによっても、多種類のタンパク質を得ることが可能である。これらのタンパク質の中で、下記のものが特記される：
成長因子、
インターロイキン、
刺激因子、
キナーゼ、
凝固因子、
α−抗トリプシン、
ヒルジン
特に、
エリスロポエチン、
Ｇ−ＣＳＦ、
α−抗トリプシン、
ウロキナーゼ、
ＶＩＩＩ因子。
下記の構築物を挙げることができる：
−ＷＡＰ−ヒトα１−抗トリプシン構築物（Ａｒｇ３５８類似体）：Ｍｅｔｈ３５８の代わりにＡｒｇ３５８を有するヒトの全α１−抗トリプシン遺伝子（Courtney,Bull.Inst.Pasteur,(1988),86,85-94）を、ＷＡＰ−ＧＨ構築物をモデルとして、未翻訳の５′Ｐ配列のＨｉｎｄＩＩＩ部位のウサギＷＡＰ遺伝子の長いプロモーター（１７．６Ｋｂ）に融合した。数種類のラインのマウスが、ヒト遺伝子を乳汁１ｍｌ当たり５ｍｇの濃度で発現する。
−ＷＡＰ−ヒトエリスロポエチン構築物：  ヒトの全エリスロポエチン遺伝子（Semenza等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,(1989),86,2301-2305）をウサギＷＡＰ遺伝子のプロモーター（６．３Ｋｂおよび１７．６Ｋｂ）に融合した。
−ＷＡＰ−ヒトＶＩＩＩ−ΔＩＩ因子構築物：  ヒトのＶＩＩＩ−ΔＩＩ因子のｃＤＮＡ（Ｂ領域から欠失したもの[Meulienら、Prot.Engin,(1988),2,301-306]）であってＶＩＩＩ因子遺伝子の最初のイントロンがその前にあり、ポリアデニル化配列を欠いたものを、部位特異的突然変異誘発によって導入されたＨｉｎｄＩＩＩ部位であって天然のＡＵＧより前にウサギの全ＷＡＰ遺伝子の内側に導入する。
本発明による構築物によって全く予期しない結果を得ることができ、特にヒトおよびウシ成長ホルモン遺伝子と結合したＷＡＰの６．３ｋｂプロモーターが、トランスジェニックマウス乳汁中でこれらのタンパク質の合成を、極めて高い濃度（１−２１ｍｇ／ｍｌ）で指示できることができるのである。
トランスジェニックマウスの乳汁に含まれるｈＧＨは、構造的に完全である。このｈＧＨは、その生物学的活性も保存していた（その成長ホルモン活性ではなく、プロラクチン活性により評価）。生物学的試験では、ホルモン濃度は１０ｍｇ／ｍｌであり、この値は放射免疫学的試験および電気泳動法により得た値と一致している。
それ故、ウサギＷＡＰ遺伝子のプロモーターは、今日まで用いられてきたマウスおよびラットのＷＡＰ遺伝子のプロモーターより遥かに効果的である。
下記の第１表は、出版物２から１５の結果をまとめたものであり、従って先行技術で公表された利点と比較して本発明による構築物を用いて得られる利点を明らかにしている。
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必須の前提の１つは、ウサギのＤＮＡフラグメント（６．３Ｋｂ）が、そのマウスおよびラットの相同染色体（２．６Ｋｂおよび０．９Ｋｂ）よりも遥かに長かったということにあると考えることができる。必須の制御要素は、使用したマウスおよびラットＤＮＡフラグメントでは欠落している場合がある。
本発明はまた、本発明によるトランスジェニック動物を得ることができる構築物にも関する。
本発明は、とりわけＤＮＡ配列およびベクターであって本発明の方法の実施を可能にするもの、特に、ウサギＷＡＰタンパク質を発現させる要素中に存在しかつ完全なＷＡＰプロモータの３′末端から少なくとも３Ｋｂの長さを有するフラグメント上に位置している少なくとも一つの配列の制御下にある、目的のタンパク質をコードする少なくとも一つの異種遺伝子を含んでなるＤＮＡ配列に関する。
本発明は、本発明による方法に使用することのできるトランスジェニック動物、および、本発明による構築物を含む形質転換細胞にも関する。
対象となる動物は様々なものがあげられるが、ウサギは豊富な組換えタンパク質を得るのに用いることができると考えられる動物である。毎日最大１００ｍｌまでの乳汁を採集することができる。この乳汁は、タンパク質に富む（反芻動物の乳汁より遥かに豊富である）。大型のトランスジェニック動物よりもウサギを得る方が、一層容易で廉価である。また、ウサギＷＡＰ遺伝子のプロモーターは、ウサギの組換えタンパク質合成を指示する上で最善のものと考えられる。
本発明の他の特徴および利点、［ｓｉｃ］は、下記の図を参照しながら下記の実施例を読むことにより明らかになろう。
第１図  ウサギＷＡＰ遺伝子地図。
第２ａ図  プラスミドｐＷ３構築物の概略図。
第２ｂ図  プラスミドｐ−ポリＩＩＩ−Ｉのポリリンカー。
第３図  プラスミドｐＪ４構築物の概略図。
第４図  構築物ｐＷ３およびｐＪ４を有するトランスジェニックマウスラインにおけるヒトおよびウシ成長ホルモンの産生。
第５図  ウサギＷＡＰ遺伝子配列。
第６図  イン・ビボで使用した様々な構築物の概略図。
第７図  ＣＡＴレポーター遺伝子および可変長さのプロモーターＷＡＰを含む構築物の概略図。
第８図  第７図に記載した構築物の効率。
実施例１：  プラスミドｐＷ３の構築物
最初にプラスミドｐ２６Ｃを調製する。
プラスミドｐ２６Ｃは、ＷＡＰ遺伝子ＢａｍＨ１−ＨｉｎｄＩＩＩ配列（第１図の６．３Ｋｂフラグメント）を（ＢａｍＨ１［ｓｉｃ］およびＨｉｎｄＩＩＩ部位の間の）Ｐ−ポリＩＩＩ−Ｉベクターのポリリンカーに導入することによって得た。
このクローニングの際に、ＢａｍＨ１［ｓｉｃ］部位は欠失され、ベクターｐ２６Ｃに存在するＣｌａＩ部位と交換された（第２図）。それ故、ベクターｐ２６Ｃは６．３ＫｂＷＡＰプロモーターの依存下で配置された外来遺伝子を受け入れることのできるプラスミドである。外来遺伝子の導入は、例えばポリリンカーのＳａｌＩ部位で行うことができる（第２図）。この全プロモーターおよび外来遺伝子を含む挿入物は、プラスミドのポリリンカーｐ−ポリＩＩＩ−Ｉの末端にある２つのＮｏｔＩ部位で切断した後プラスミドから単離することができる。
プラスミドｐ２６Ｃから得られるプラスミドｐＷ３（第２図による）は、ウサギＷＡＰ遺伝子のプロモーター（６．３Ｋｂ）およびヒト成長ホルモン遺伝子（ｈＧＨ）を含む。このトランスジェニックマウスを得るために使用するフラグメントは、２つのＮｏｔＩ部位の間にある。
ＨｉｎｄＩＩＩ部位を部位特異的突然変異誘発によって遺伝子のリーダーシーケンスに導入して、クローニング部位として働くようにした。
実施例２：  プラスミドｐＪ４の構築物
プラスミドｐ２６から得られるプラスミドｐＪ４（第３図による）は、ウサギＷＡＰ遺伝子のプロモーター（６．３Ｋｂ）およびウシ成長ホルモン遺伝子（ｂＧＥ）を含む。トランスジェニックマウスを得るのに用いたフラグメントは、２つのＮｏｔＩ部位の間にある。
プラスミドｐ２６を含むＥ．ｃｏｌｉ株は、１９９１年６月１２日に寄託番号Ｉ−１１１６で、パスツール研究所のCollection Nationale de Culture de Microorganisms、25Rue du Docteur Roux、75724PARIS CEDEX１５に寄託された。
実施例３：  トランスジェニックマウスの産生
ｐｗ３およびｐＪ４フラグメントを用いてトランスジェニック動物を得た。トランスジェニックマウスは、従来の手法であるマイクロインジェクション（Brinster et al.、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,(1985),82,4438-4442）によって得た。５００コピーの遺伝子を含む２−ｐｌを、マウス胎児の雄性前核に注入した。この構築物は、ベクターｐ−ポリＩＩＩ−Ｉで調製した（Lathe et al.、Gene(1987),57,k193-201）。組換え遺伝子を含むこのベクターのＮｏｔＩ−Ｎｏｔｌフラグメントをマイクロインジェクションした。次に胎児をホルモン調製した養母の雌性卵管に移した。操作した胎児の約１０％から幼若マウスが生まれ、操作した胎児の２−５％からトランスジェニック幼若マウスが生まれた。導入遺伝子の存在は、マウスの尾から抽出したＤＮＡからのサザンブロッティングの手法によって確認した。動物の血液および乳汁中の成長ホルモンの濃度は、特異的な放射免疫的試験によって評価した。
ｈＧＨの生物学的活性は、乳汁をウサギの細胞または乳房の組織片の培地に加えることによって評価した。乳汁中のｈＧＨ含有量は、ｍＲＮＡおよびタンパク質の測定によって評価したβ−カゼイン遺伝子の発現を引き起こした。
実施例４：  構築物ｐＷ３およびｐＪ４を組み込んだトランスジェニックマウスの乳汁中のヒトまたはウシ成長ホルモンの産生
ホルモン濃度は、特異的放射免疫学的試験によって測定した。
トランスジェニックマウスの乳汁におけるｈＧＨの同定は、下記の手段で行う。マウス乳汁を１５０，０００ｇで１時間遠心分離してカゼインミセルを沈澱させる。この上清（ウェル当たり１μｌ）を回収し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によって、コントロールのヒト成長ホルモンおよびコントロール乳汁の存在下で検討した。この結果を第４図に示す。
構築物ｐＷ３を組み込んだ動物は、乳汁１ｍｌ当たり１０ｍｇ程度のｈＧＨ濃度となり、１ｍｌ当たり２１ｍｌに達する場合もある。
構築物ｐＪ４を組み込んだ動物は、乳汁１ｍｌ当たり５ｍｌ程度から１７ｍｇ／ｍｌまでのｂＧＨを産生する。
本発明による方法では、１．５ｍｌの乳汁／マウス乳腺の収穫が可能になる（乳腺を氷中に入れることによる）。それ故、３〜５ｍｌの濃度で外来タンパク質を発現する２００匹の授乳マウスは、粗タンパク質１ｇを提供する。
実施例５：  遺伝子構築物
トランスジェニック動物の乳汁で組換えタンパク質を発現するのに使用する遺伝子構築物は、いずれの場合にもウサギＷＡＰ遺伝子の調節領域であるＢａｍＨ１−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメント（６．３Ｋｂ）またはＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメント（１７．６Ｋｂ）を含む。プラスミドＷＡＰ−ｈＧＨ、ＷＡＰ−ｂＧＨ、ＷＡＰ−α−ＡＴおよびＷＡＰ−ＥＰＯは、それぞれ、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）、Ａｒｇ３５８で変異させたヒトα１−抗トリプシンおよびヒトエリスロポエチンの全遺伝子（リーダー配列、エキソン、イントロンおよび複写終結因子）を含む。これらの構築物において、遺伝子はＨｉｎｄＩＩＩ部位でＷＡＰ遺伝子の調節領域と関連されていた。この構築物ＷＡＰ−ＦＶＩＩＩ−ΔＩＩは、ヒトＶＩＩＩ因子のｃＤＮＡを、ヒトＶＩＩＩ因子遺伝子のイントロンが前にあるΔＩＩの形態で含む。このイントロン−ｃＤＮＡ集合体を、ウサギの全ＷＡＰ遺伝子（第６図）のＨｉｎｄＩＩＩ部位に導入した。
実施例６：  インビトロにおけるウサギＷＡＰ遺伝子の制御領域の活性の同定
ＷＡＰ遺伝子の転写開始部位の上流に位置する領域の種々の長さのものを、レポーター遺伝子（ＣＡＴ遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）と結合した（第７図）。これらの構築物は、ラットの尾のコラーゲンＩゲル上で培養した乳房の上皮細胞に、リポフェクチンを用いたトランスフェクションによって導入した。次にこの細胞を、ホルモン（インシュリン、コルチゾール、プロラクチン）の存在下で３日間保持した。次いで、この酵素を細胞抽出物中で測定した。１８０６ｂｐまたはそれ未満の調節領域しか含まない構築物は、ＣＡＴ遺伝子を発現させない。３０００ｂｐを含む構築物には弱い活性があるが、６３００および１７，６００ｂｐを含む構築物は、ホルモンの存在下で明らかに発現する。プロラクチンは単独では、ＣＡＴ遺伝子上では弱いが有意な誘導作用を有する。インスリンおよびとりわけコルチゾールは、単独では不活性であるが、プロラクチンの作用を増幅する。遺伝子のホルモンに対する感受性は、細胞の内在ＷＡＰ遺伝子の感受性と全く同じである。それ故、−３０００−１８０６ｂｐおよび−６３００−３０００ｂｐ領域は、ＷＡＰ遺伝子を強力に発現させるのに必須の制御要素を含む（第８図）。１７，６００−６，３００ｂｐフラグメントは、インビトロでは追加の刺激を与えることはないが、これがトランスジェニック動物中でインビトロにおけるこのような作用を有するということを除外するものではない。これらの実験により、インビトロでのＷＡＰ遺伝子の制御領域の活性を、細胞のトランスフェクションによって初めて明らかにした。
参考文献
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図面の説明
第６図
トランスジェニック動物の乳汁に含まれる組換えタンパク質を発現させるのに用いた構築物。
第７図
ウサギＷＡＰ遺伝子の種々の長さのフラグメントの依存下で配置したＣＡＴ遺伝子を含む様々な構築物の模式図。
第８図
様々なプラスミドによってトランスフェクトされたウサギ乳房の主要上皮細胞の抽出物中に含まれるＣＡＴ活性の変化を表す。
【図１】
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【図２ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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