(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２に示されるアミノ酸配列１〜３３２のうち少なくともアミノ酸７〜１５１を含むアミノ酸配列において、下記のものからなる群より選択される、変更されたグリコシル化部位を有するかつｍｐｌリガンド活性を有するｍｐｌリガンド類似体：
［Ａｓｎ30、Ｔｈｒ32］ｍｐｌリガンド；
［Ａｓｎ82、Ａｌａ83］ｍｐｌリガンド；
［Ａｓｎ53、Ｔｈｒ55］ｍｐｌリガンド；
［Ａｓｎ58、Ｔｈｒ60］ｍｐｌリガンド；
［Ａｓｎ30、Ｔｈｒ32、Ａｓｎ120、Ｔｈｒ122］ｍｐｌリガンド；
［Ａｓｎ54、Ｓｅｒ56］ｍｐｌリガンド；
［Ａｓｎ52、Ｔｈｒ54］ｍｐｌリガンド；
［Ａｓｎ81、Ｔｈｒ83］ｍｐｌリガンド；
［Ａｓｎ56］ｍｐｌリガンド；
［Ｔｈｒ163、Ａｓｎ164、Ｔｈｒ166］ｍｐｌリガンド；
［Ａｓｎ30、Ｔｈｒ32、Ａｓｎ120、Ｔｈｒ122、Ａｓｎ55、Ｔｈｒ57、Ｔｈｒ163、Ａｓｎ164、Ｔｈｒ166］ｍｐｌリガンド；
［Ａｓｎ25］ｍｐｌリガンド；及び
［Ａｓｎ120、Ｔｈｒ122］ｍｐｌリガンド。
【請求項２】
前記ｍｐｌリガンドが下記のものからなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の類似体：
ｍｐｌリガンド１〜３３２      配列番号２のアミノ酸１〜３３２
ｍｐｌリガンド１〜１９９      配列番号２のアミノ酸１〜１９９
ｍｐｌリガンド１〜１９１      配列番号２のアミノ酸１〜１９１
ｍｐｌリガンド１〜１８３      配列番号２のアミノ酸１〜１８３
ｍｐｌリガンド１〜１７４      配列番号２のアミノ酸１〜１７４
ｍｐｌリガンド１〜１６３      配列番号２のアミノ酸１〜１６３
ｍｐｌリガンド１〜１５３      配列番号２のアミノ酸１〜１５３
ｍｐｌリガンド１〜１５２      配列番号２のアミノ酸１〜１５２
ｍｐｌリガンド１〜１５１      配列番号２のアミノ酸１〜１５１
ｍｐｌリガンド７〜３３２      配列番号２のアミノ酸７〜３３２
ｍｐｌリガンド７〜１９１      配列番号２のアミノ酸７〜１９１
ｍｐｌリガンド７〜１９９      配列番号２のアミノ酸７〜１９９
ｍｐｌリガンド７〜１８３      配列番号２のアミノ酸７〜１８３
ｍｐｌリガンド７〜１７４      配列番号２のアミノ酸７〜１７４
ｍｐｌリガンド７〜１６３      配列番号２のアミノ酸７〜１６３
ｍｐｌリガンド７〜１５３      配列番号２のアミノ酸７〜１５３
ｍｐｌリガンド７〜１５２      配列番号２のアミノ酸７〜１５２
ｍｐｌリガンド７〜１５１      配列番号２のアミノ酸７〜１５１。
【請求項３】
真核生物細胞中での外来性ＤＮＡの発現生成物である、請求項１または２のいずれかに記載の類似体。
【請求項４】
前記真核生物細胞が哺乳動物細胞である、請求項３に記載の類似体。
【請求項５】
前記哺乳動物細胞がチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である、請求項４に記載の類似体。
【請求項６】
請求項１または２のいずれかに記載のｍｐｌリガンド類似体をコードするＤＮＡ。
【請求項７】
宿主細胞にｍｐｌリガンド類似体を発現させるように請求項６に記載のＤＮＡでトランスフェクションされた真核生物宿主細胞。
【請求項８】
薬学的に許容できる希釈剤、アジュバントまたは担体と共に、請求項１〜５のいずれかに記載のｍｐｌリガンド類似体を治療的に有効な量で含む、血小板減少症治療用組成物。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、少なくとも一つの変化したＯ−またはＮ−結合型グリコシル化部位を有するｍｐｌリガンド類似体に関する。本発明は、これらのｍｐｌリガンド類似体をコードするＤＮＡ配列、ならびに類似体発現のための組み換えプラスミドおよび宿主細胞にも関する。
発明の背景
ＭＧＤＦ、すなわち巨核球成長および発生因子は、循環血小板量の主要な調節物質であるらしい最近クローニングされたサイトカインである。バートレイ（Ｂａｒｔｌｅｙ，Ｔ．Ｄ．）らのＣｅｌｌ第７７巻：１１１７〜１１２４頁（１９９４年）；ロック（Ｌｏｋ，Ｓ．）らのＮａｔｕｒｅ第３６９巻：５６５〜５６８頁（１９９４年）；ドゥ・ソーベジ（ｄｅ  Ｓａｕｖａｇｅ，Ｆ．Ｊ．）らのＮａｔｕｒｅ第３６９巻：５３３〜５３８頁（１９９４年）；ミヤザキ（Ｍｉｙａｚａｋｉ，Ｈ）らのＥｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．第２２巻：８３８頁（１９９４年）；およびクッター（Ｋｕｔｅｒ，Ｄ．Ｊ．）らのＰＮＡＳＵＳＡ第９１巻：１１１０４〜１１１０８頁（１９９４年）参照。バートレイ（Ｂａｒｔｌｅｙ，Ｔ．Ｄ．）らのＣｅｌｌ第７７巻：１１１７〜１１２４頁（１９９４年）に記載されたＭＧＤＦは、トロンボポイエチン（ｔｈｒｏｍｂｏｐｏｉｅｔｉｎ：ＴＰＯ）、ｍｐｌリガンドおよびメガポイエチン（ｍｅｇａｐｏｉｅｔｉｎ）とも呼ばれる。本明細書中で、“ｍｐｌリガンド”という用語は、一般的に、ＴＰＯおよびＭＧＤＦを含む、ｍｐｌレセプターを活性化する全てのポリペプチドに言及するのに用いられる。ｍｐｌレセプターは、活性化時に巨核球および血小板の生成および／または発生に導く細胞表面タンパクである。ＷＯ９２／０７０７４を参照されたい。
“ｍｐｌリガンド類似体”は、炭水化物結合部位の数、位置または型に影響を与えるように天然の配列と異なるポリペプチドである。そのようなポリペプチドは、本発明の一つの態様である。成熟した天然ヒトｍｐｌリガンドは、合計で３３２個のアミノ酸を有するタンパクである。（２１アミノ酸長のリーダー配列に結合された）このタンパクの配列および対応するｃＤＮＡを、図１に示す（配列番号１および２）。
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）およびＥ．ｃｏｌｉ細胞の両方において生成される組み換えｍｐｌリガンドは、マウス、ラットおよびサルの生体内において巨核球および／または血小板を特異的に刺激または増加させる生物学的活性を有することが示された。例えば、フント（Ｈｕｎｔ，Ｐ．）らのＢｌｏｏｄ第８４（１０）巻：３９０Ａ頁（１９９４年）を参照のこと。図１のアミノ酸位置２２から出発して少なくとも１５１個のアミノ酸をもつように切頭（truncated）されたヒトｍｐｌリガンド分子は（ヒトのｃＤＮＡによりコードされる３３２アミノ酸のタンパクと比較して）、生体内において生物学的活性を維持している。図２（配列番号３および４）は、成熟型で１７４個のアミノ酸を有し生物学的活性を有する切頭型ｍｐｌリガンド分子の一例を示す。図２には、２１アミノ酸のＮ末端リーダー配列に結合している１７４アミノ酸長のタンパクが示されている。下記の実施例において、この分子を用いてｍｐｌリガンド類似体の幾つかを製造した。他の類似体は、図１のアミノ酸１〜１９９、１〜１９１、および１〜１８３に基づく。成熟型ヒト配列ｍｐｌリガンドタンパクのＮ末端の最初の６個のアミノ酸を除去し、生物学的活性を維持することも可能である。従って、図１に示すヒトｍｐｌリガンドの成熟型アミノ酸配列のアミノ酸７〜１５１（７および１５１も含む）内に生物学的活性が維持されるようである。
通常、真核生物細胞により産生された多くの細胞表面の分泌タンパクは、一またはそれ以上のオリゴ糖基により修飾される。この修飾は、グリコシル化と呼ばれるが、タンパクの物理的性質に大きく影響を与えることができ、タンパクの安定性、分泌および細胞内局限において重要でもあり得る。適正なグリコシル化は、生物学的活性に必須であり得る。実際、真核生物からの一部の遺伝子は、タンパクをグリコシル化するための細胞過程を欠くバクテリア（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）において発現されたときに、グリコシル化の欠如により活性がほとんどないかまたは全く無い状態で回収されるタンパクを生成する。
グリコシル化は、ポリペプチド主鎖に沿った特異的な位置または部位において生じ、通常二つの型がある。すなわち、Ｏ−結合型オリゴ糖はセリン（Ｓｅｒ）またはトレオニン（Ｔｈｒ）残基に結合し、一方、Ｎ−結合型オリゴ糖（鎖）は、配列Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（Ｘはプロリンを除く任意のアミノ酸であり得る）の一部である場合、アスパラギン（Ａｓｎ）残基に結合する。Ｘは、好ましくは、プロリンを含まない１９個の天然アミノ酸の一つである。Ｎ−結合型およびＯ−結合型オリゴ糖と各型において見られる糖残基の構造は異なる。両方において共通して見られる一つの型の糖はＮ−アセチルノイラミン酸（以下、シアル酸と呼ぶ）である。シアル酸は、通常、Ｎ−結合型およびＯ−結合型オリゴ糖の両方の末端残基であり、その陰電荷故に、糖タンパクに酸性を付与し得る。
本明細書中で用いられるグリコシル化“部位”は、グリコシル残基に構造的に結合することのできるアミノ酸残基であるが、そのような部位はグリコシル残基に実際に結合しても結合しなくてもよい。前述したように、Ｏ−結合部位はＳｅｒまたはＴｈｒ残基であるが、Ｎ−結合部位はＡｓｎ−Ｘ−ＳｅｒまたはＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒであり、ＸはＰｒｏ以外の任意のアミノ酸と定義される（好ましくはＰｒｏを除く１９個の天然アミノ酸の一つである）。所定の部位がグリコシル鎖でグリコシル化されるかどうかは、分子が発現される宿主細胞、その部位に隣接するアミノ酸、および他の因子により決定される。
本明細書中で用いられる、所定のｍｐｌリガンド類似体に結合される“鎖”の数は、特定の宿主細胞により発現される所定のｍｐｌリガンド分子に結合される炭水化物（すなわちグリコシル）鎖の平均の数である。特に、天然および対応する組み換えｍｐｌリガンドのためのグリコシル化部位は通常同じであるが、鎖の数は、組み換え発現のために用いられる特定の宿主細胞がグリコシル鎖を、天然源と比べて同じ部位に結合させるか否かによっておそらく変化する。本明細書中で、組み換え型と天然型のｍｐｌリガンド類似体を比較する場合常に、天然源がその長さを有するｍｐｌリガンド分子を実際に生成するか否かに拘わらず同じ数のアミノ酸が比較される。すなわち、“天然型”とは、そのような天然源中に実際に発現される分子の長さよりも特定の種（例えばヒト）において用いられる配列に言及する。
天然型ｍｐｌ配列はグリコシル化分子である。天然型ｍｐｌリガンドのグリコシル化パターンは、ｍｐｌリガンドにおいて見られた二つの重要なドメインに関係する。分子の活性部分に相当する、成熟型ヒトｍｐｌリガンドの最初の約１５１個のアミノ酸の配列は、エリトロポエチン（ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ：ＥＰＯ）、すなわち赤血球の生成を刺激することのできるサイトカインに著しく類似しており、ヒトｍｐｌリガンドの“ＥＰＯ様”ドメインと呼ばれる。成熟型タンパクの残りのアミノ酸は、Ｎ−結合型グリコシル化のための天然部位の全てでないにしても大部分を含むので、いわゆる“Ｎ−結合型炭水化物”ドメインを構成する。ヒトｍｐｌリガンドにおいて、Ｎ−結合型グリコシル化ドメインに全てが含まれる６つのＮ−結合型グリコシル化部位が存在する。両方のドメインがＯ−結合型グリコシル化部位を含む。分子内に推定１２〜１４個のＯ−結合型グリコシル化鎖が存在する。ＣＨＯ細胞内に組み換え的に発現されたヒトｍｐｌリガンドＤＮＡを用いた実験的証拠は、ＥＰＯ様ドメインにおいて少なくとも二つのＯ−結合部位が１位（Ｓｅｒ）および３７位（Ｔｈｒ）においてグリコシル化されることを示している。
ｍｐｌリガンドのような糖タンパクは、等電点電気泳動（ＩＥＦ）のような技術を用いて異なる電荷形に分離され得る。例えば、幾つかのグループが、粗製のまたは部分精製のエリスロポイエチン調製物のＩＥＦによる研究を報告している（ルコフスキー（Ｌｕｋｏｗｓｋｙ）らのＪ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．第５０巻：９０９頁（１９７２年）；シェルトン（Ｓｈｅｌｔｏｎ）らのＢｉｏｃｈｅｍ．Ｍｅｄ．第１２巻：４５頁（１９７５年）；フール（Ｆｕｈｒ）らのＢｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．第９８巻：９３０頁（１９８１年））。
ｍｐｌリガンド分子のグリコシル化に関する前記情報にも拘わらず、異なるグリコシル化パターンを有し向上した生物学的活性を維持または有するｍｐｌリガンド分子を得る必要性が残っている。
従って、本発明の目的は、ｍｐｌリガンド類似体と呼ばれる新規グリコシル化ｍｐｌリガンド分子を提供することである。本発明のさらなる目的は、そのような分子を含む医薬組成物、およびｍｐｌリガンドで治療できる症状を、本発明のｍｐｌリガンド類似体を用いて治療する方法を提供することにある。
発明の要約
一つの実施態様において、本発明は、対応する天然型配列ｍｐｌリガンドと比べて、グリコシル化のための部位が少なくとも一つ付加された、少なくとも一つ欠失された、および／または少なくとも一つ付加されると共に欠失されたアミノ酸配列を含むｍｐｌリガンドの類似体に関する。グリコシル化のための付加または欠失された部位によって、対応する天然型配列ｍｐｌリガンド、特にヒトｍｐｌリガンドよりも、炭水化物鎖の数がより多くまたはより少なくなり、またシアル酸含量がより高くまたはより低くなる。例えば、一つの型の類似体は、同じ位置または別の位置における、一つ以上のＮ−またはＯ−結合部位の除去、および一つ以上のＮ−またはＯ−結合部位の付加を含み得る。
前記実施態様のもう一つの態様において、本発明は、一つ以上のＮ−またはＯ−結合型グリコシル化部位が一つ以上の非天然部位で置換されているアミノ酸配列を含むリガンドｍｐｌリガンド類似体に関する。すなわち、Ｎ−結合部位は異なるＮ−結合部位で置換されてよく；Ｎ−結合部位はＯ−結合部位で置換されてよく；Ｏ−結合部位は異なるＯ−結合部位で置換されてよく；およびＯ−結合部位はＮ−結合部位で置換されてよい。
いかなる前記変化の組み合わせも、さらに本発明に含まれる。
本発明は、さらに、そのようなｍｐｌリガンド類似体をコードするＤＮＡ配列、ならびに類似体発現のための組み換えプラスミドおよび宿主細胞に関する。
前記の全ての場合において、グリコシル化部位の変化は、得られるｍｐｌリガンド類似体におけるグリコシル鎖の数、量、位置または型（Ｎ−とＯ−）の変化を導き、ｍｐｌリガンドの生物学的活性を維持する、すなわち、類似体はｍｐｌレセプターをなお、活性化することができる。ｍｐｌレセプターの活性化は、巨核球産生が高められ、それにより生体内で血小板が増加することを意味する。
【図面の簡単な説明】
図１は、シグナルペプチド（アミノ酸−２１〜−１）および成熟アミノ酸配列（１〜３３２）を含む天然ヒトｍｐｌリガンドのＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す。
図２は、２１アミノ酸長のシグナルペプチドに結合しているヒト成熟ｍｐｌリガンド配列のアミノ酸１〜１７４に対応するｍｐｌリガンドのＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す。コード領域に隣接する配列が、ＸｂａＩおよびＳａｌＩクローニング部位をそれぞれ５’および３’末端に導入した。
図３は、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＣＨＯ発現ｍｐｌリガンドを用いたウエスタンブロットを示す。ＭＫは、Ｅ．ｃｏｌｉ内において発現されるようにｍｐｌリガンドのＮ−末端に付加されるＭｅｔ−Ｌｙｓを表し、カテプシンＣのようなジペプチダーゼを用いて切除され得る。ＭＫが除去された分子はｄｅｓＭＫと呼ばれる。グリコシダーゼノイラミニダーゼおよびＯ−グリカナーゼでの処理が示されている。
図４は、正常マウスにおけるＥ．ｃｏｌｉおよびＣＨＯ発現ｍｐｌリガンドの生体内活性を血小板数として示す。データは、グリコシル化ｍｐｌリガンド（ＣＨＯ）物質が非グリコシル化（Ｅ．ｃｏｌｉ）物質よりも優れた活性を有することを示している。これは、グリコシル化物質についての増加した半減期の結果であり得る。例えば、ＣＨＯ３３２は、ＣＨＯ細胞内に発現されたヒトｍｐｌリガンドアミノ酸１〜３３２（図１）を示す。
図５は、組み換えヒトｍｐｌリガンドおよび類似体４、６、７、９、１０および１１のＣＯＳ細胞上澄みのウエスタンブロット分析を示す。類似体の構築は実施例４に示されている。類似体４、７および１０は、ゲル移動が遅いことにより証明されるように少なくとも一つのさらなる炭水化物鎖を有する。類似体番号は表１に提供されている類似体番号に相当する（すなわち、１１は類似体Ｎ１１に相当する）。対照は、表１中のＮ１である。
図６は、組み換えヒトｍｐｌリガンドおよび類似体４、５、１３、１４および１５のＣＯＳ細胞上澄みのウエスタンブロット分析を示す。類似体の構築は実施例４に示されている。類似体４、１３、１４および１５は、ゲル移動が遅いことにより証明されるように少なくとも一つのさらなる炭水化物鎖を有する。
図７は、Ｎ−グリカナーゼで処理した後のヒトｍｐｌリガンドおよび示されたｍｐｌリガンド類似体のＣＯＳ細胞上澄みのウエスタンブロット分析を示す。結果は、類似体が異なるグリコシル化パターンを有することを示している。
図８は、ｍｐｌリガンド類似体を用いたヒト巨核球成長バイオアッセイの結果を示す。パネルＡおよびＤは、それぞれ陽性および陰性の対照である。パネルＡに示されるウエルには、３７．５ｐｇの野生型（すなわち天然型配列）ｍｐｌリガンド１〜１７４ＣＯＳ−１ならし培地を入れたが、実質的な巨核球成長を示している。パネルＤには、１．５μｌのＣＯＳ−１ｍｏｃｋならし培地を入れたが、成長を示していない。パネルＢおよびＣは、それぞれｍｐｌリガンド１〜１７４類似体７および１０である。パネルＢには、９．０ｐｇのｍｐｌリガンドＣＯＳ−１ならし培地を入れ、パネルＣには、２７ｐｇを入れたが、共に優れた巨核球成長を示している。
図９は、ＣＨＯｍｐｌリガンド１〜１７４ならびに類似体Ｎ４およびＮ１５のウエスタンブロット分析を示している（表１参照）。ゲル移動が遅いことは、類似体Ｎ４（４Ｂ）が一つの更なるオリゴ糖を有し、類似体Ｎ１５（１５−８）が二つの更なるオリゴ糖を有することを示している。
図１０は、示されるＮ−グリカナーゼでの処理を行うまたは行わないときのＣＨＯ細胞産生ｍｐｌリガンド類似体のウエスタンブロットを示す。Ｎ−グリカナーゼでの処理後のゲル移動が遅いことは、Ｎ−結合オリゴ糖の存在を示している。
図１１は、種々の形態のｍｐｌリガンドを種々の投与量で用いて処理したマウスからの血小板数を示している。データは、Ｎ−および／またはＯ−結合型炭水化物の量の増加が生体内活性の向上につながることを示している。
図１２は、類似体Ｎ１０、Ｎ１５、Ｎ３３、Ｎ３９、Ｎ３１、Ｎ３５およびＮ４０と共に、ＣＯＳ産生ｍｐｌリガンド１〜１７４のウエスタンブロット分析を示している。付加されたＮ−結合型グリコシル化部位の数も示されている。図は、Ｎ−結合部位の数が増加すると、Ｎ−結合型炭水化物の量の増加のためにｍｐｌリガンドの移動度が低下することを示している。
図１３は、類似体Ｎ１５、Ｎ２９、Ｎ３０およびＮ３８と共に、ＣＯＳ産生ｍｐｌリガンド１〜１７４のウエスタンブロット分析を示している。Ｎ−結合型グリコシル鎖の数も示されている。
発明の詳細な説明
本発明は、対応する配列を有する天然型ｍｐｌリガンドと比べて異なるグリコシル化部位を有するｍｐｌリガンドを提供する。好ましくは、得られる分子は、哺乳動物細胞内（例えばＣＯＳ、ＣＨＯおよびヒト細胞）において発現された際にグリコシル鎖により占有される付加的グリコシル化部位を有するものである。
第一の実施態様において、本発明は、対応する天然型配列ｍｐｌリガンドと比べて、グリコシル化のための部位が少なくとも一つ付加された、少なくとも一つ欠失された、および／または少なくとも一つ付加されると共に欠失されたアミノ酸配列を含むｍｐｌリガンドの類似体に関する。グリコシル化のための付加または欠失された部位によって、対応する天然型配列ｍｐｌリガンド、特にヒトｍｐｌリガンドよりも、炭水化物鎖の数がより多くまたはより少なくなり、またシアル酸含量がより高くまたはより低くなる。一つの部位の欠失と別の部位の付加との組み合わせにより、部位の数は正味変化せず、むしろ部位の位置および／または型が変化する。そのように組み合わせた変化類似体も本発明の範囲に入る。
前記実施態様のもう一つの態様において、本発明は、一つ以上のＮ−またはＯ−結合型グリコシル化部位が一つ以上の非天然部位で置換されているアミノ酸配列を含むｍｐｌ類似体に関する。すなわち、Ｎ−結合部位は異なるＮ−結合部位で置換されてよく；Ｎ−結合部位はＯ−結合部位で置換されてよく；Ｏ−結合部位は異なるＯ−結合部位で置換されてよく；および／またはＯ−結合部位はＮ−結合部位で置換されてよい。実質的に同じ位置においてある一つの部位を別の部位で置換することは、その部位におけるグリコシル化効率の上昇または他の効果につながり得る。例えば、Ｓｅｒ残基ではなくＴｈｒ残基がＯ−結合部位においてグリコシル化効率を向上させ得る効果がここで提供される。
本明細書中で用いられる“ｍｐｌリガンド”という用語は、天然ｍｐｌリガンド、天然ｍｐｌリガンドの切頭体（truncation）、ならびに、巨核球および／または血小板の成長、発生および／または産生を特異的に刺激する生物学的活性を有するように天然ｍｐｌリガンドと充分に重複するグリコシル化およびアミノ酸配列を有する非天然ポリペプチドを含む。少なくとも図１のアミノ酸７〜１５１からアミノ酸１〜３３２に基づくｍｐｌリガンド類似体が好ましい。
好ましい実施態様において、ｍｐｌリガンドは、真核生物宿主細胞内にトランスフェクションされている外来性ＤＮＡ配列の発現生成物である；すなわち好ましい実施態様において、ｍｐｌリガンドは“組み換えｍｐｌリガンド”である。好ましい真核生物宿主は哺乳動物、特に好ましくはＣＨＯ細胞である。組み換えｍｐｌリガンドは、ｍｐｌリガンドのクローニングおよび発現に関して本明細書に引用されている刊行物および本明細書に記載されている手順に従って有利に生成される。
一部の更なる好ましいｍｐｌリガンド分子は図１に基づいて以下のアミノ酸配列を有する：
ｍｐｌリガンド１〜３３２    図１のアミノ酸１〜３３２
ｍｐｌリガンド１〜１９９    図１のアミノ酸１〜１９９
ｍｐｌリガンド１〜１９１    図１のアミノ酸１〜１９１
ｍｐｌリガンド１〜１８３    図１のアミノ酸１〜１８３
ｍｐｌリガンド１〜１７４    図１のアミノ酸１〜１７４
ｍｐｌリガンド１〜１６３    図１のアミノ酸１〜１６３
ｍｐｌリガンド１〜１５３    図１のアミノ酸１〜１５３
ｍｐｌリガンド１〜１５２    図１のアミノ酸１〜１５２
ｍｐｌリガンド１〜１５１    図１のアミノ酸１〜１５１
ｍｐｌリガンド７〜３３２    図１のアミノ酸７〜３３２
ｍｐｌリガンド７〜１９９    図１のアミノ酸７〜１９９
ｍｐｌリガンド７〜１９１    図１のアミノ酸７〜１９１
ｍｐｌリガンド７〜１８３    図１のアミノ酸７〜１８３
ｍｐｌリガンド７〜１７４    図１のアミノ酸７〜１７４
ｍｐｌリガンド７〜１６３    図１のアミノ酸７〜１６３
ｍｐｌリガンド７〜１５３    図１のアミノ酸７〜１５３
ｍｐｌリガンド７〜１５２    図１のアミノ酸７〜１５２
ｍｐｌリガンド７〜１５１    図１のアミノ酸７〜１５１
例えば、ｍｐｌリガンド１〜１８３、１〜１９１、７〜１８３および７〜１９１は、より短い配列と比べて、そのＣ−末端に一つまたは二つの付加的天然グリコシル化部位を有することに注目すべきである。前述の各場合において、そのＮ−末端にＭｅｔ−Ｌｙｓがさらに含まれ得る。
本明細書中で言うインビトロ比活性は、相対的なインビトロ比活性の測定値であり、絶対的なインビトロ比活性の測定値ではない。この出願の目的において、比活性は、同じアッセイを用いて、同じ内部標準を含む同じ条件を用いてアッセイされ、比活性等の計算に用いられる同じデータ解析を有するｍｐｌリガンド類似体の相対的活性の比較にのみ用いられる。
本明細書中で用いられる“ｍｐｌリガンドの類似体”または“ｍｐｌリガンド類似体”という表現は、ｍｐｌリガンドのアミノ酸配列に一つ以上の変化を有し、それにより炭水化物結合の部位の型（Ｎ−またはＯ−結合：結合炭水化物の量に影響を与え得る）、数または位置が変化しているｍｐｌリガンドを示す。好ましい実施態様において、グリコシル化部位の変化は、ｍｐｌリガンド分子に結合しているグリコシル鎖の数の変化につながる。特に好ましい実施態様において、グリコシル化部位の変化は、少なくとも一つ（通常１〜６、好ましくは１〜５、特に好ましくは２〜４）のグリコシル鎖を付加し、最も好ましくは鎖はＮ−結合を介して付加される。もう一つの特に好ましい実施態様において、ｍｐｌリガンド類似体は、天然配列ｍｐｌリガンド（例えばヒトｍｐｌリガンド）と比べて少なくとも同等のインビボ生物学的活性を維持し、生物学的活性のアッセイにおいて測定して、インビボにおいて実質的により高い活性を有し得る。そのようなアッセイは、巨核球または血小板産生を検出するアッセイを含む。
そのようなｍｐｌリガンドの類似体の製造のために、好ましくは、グリコシル化に利用できる部位を付加、除去または変化させるアミノ酸残基の付加、欠失または置換につながる部位特異的変異誘発により生成が行われる。“変化”というのは、一つの部位が欠失され、別の部位が欠失部位と同じかまたは別の位置において付加されていることを示す。しかしながら、当業者が認めるように、他の方法により同じアミノ酸配列をコードする遺伝子を得ることができ、そのような方法も本明細書に含まれる。得られる類似体は、天然ヒト／組み換えｍｐｌリガンドよりも少ないかまたは多い（好ましくは多い）結合炭水化物鎖を有し得る。
一つ以上の炭水化物（すなわちグリコシル）鎖のｍｐｌリガンドへの付加は、本発明の一つの重要な目的である。対応する天然アミノ酸配列（例えば１〜３３２または１〜１７４、等）において見付かるよりも多くの炭水化物鎖を有するｍｐｌリガンド類似体は、実質的に生物学的活性を活性を低下させるような方法で二次構造または三次構造を乱すことのないグリコシル化部位を付加することにより生成される。本明細書中で用いられる“天然”ｍｐｌリガンドとは、特定の長さのｍｐｌリガンド種が実際に天然種で発現されなくとも、関連類似体に対応する数のアミノ酸を有するアミノ酸配列を意味する。有利には、ｍｐｌリガンドの類似体は、Ｎ−グリコシル化またはＯ−グリコシル化のための６個以下の付加的部位を有し、それにより１〜６個の付加的Ｎ−結合型またはＯ−結合型炭水化物鎖（またはその組み合わせ）が付加される。
例えば、３０位におけるＰｒｏがＡｓｎにより置換され、３２位におけるＶａｌがＴｈｒにより置換されて、Ｎ−グリコシル化のための新しい部位として役立つ配列Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒが得られる（以下の類似体Ｎ４；表１参照）。
突然変異を組み合わせることにより二つ以上の更なるＮ−結合鎖を有する類似体も構築することができ；例えば、表１に記載された類似体Ｎ４とＮ１０とを組み合わせて炭水化物付加のための二つの更なる部位を有する類似体を生成することができる（すなわち表１の類似体Ｎ１５）。同様にして、三つ以上鎖が付加された類似体を構築することができる。当業者に認められるように、本発明は、（部位の数、型または位置において）グリコシル化のための異なる部位を有するｍｐｌリガンドの多くの他の類似体を含む。本発明のｍｐｌリガンド類似体は、全ての場合において特に好ましくはヒトアミノ酸配列を有するｍｐｌリガンドに基づく（図１および２を参照）が、他の種（例えば、イヌ、ブタ、サル、マウスまたはラット）からのｍｐｌリガンド配列に基づく類似体も本明細書中で意図されている。
グリコシル化部位の形成のためにアミノ酸を挿入することも考えられる。例えば、以下のように、５７位のＧｌｕがＴｈｒで置換され、Ａｓｎが５５位のＭｅｔの直後に挿入される。
0003836877.tif 000002
これにより新しいグリコシル化部位が付加される（アミノ酸５５’、５６および５７）。以下の類似体Ｎ２３を参照のこと。
本発明の類似体には、ｍｐｌリガンドのカルボキシ末端から伸びる一つ以上のアミノ酸を有し、カルボキシ末端の伸長により少なくとも一つの付加的炭水化物部位が提供される類似体も含まれる。ｍｐｌリガンドのカルボキシ末端は、使用するｍｐｌリガンド（例えば、ｍｐｌリガンド１〜３３２アミノ酸、またはｍｐｌリガンド１〜１６３アミノ酸）の特定の型により変化するだろう。一つ以上のＮ−またはＯ−結合型グリコシル化部位を含むアミノ酸をカルボキシ末端に付加することにより、ｍｐｌリガンド種のカルボキシ末端に更なる炭水化物部位を付加することができる。
表１および表６は、Ｎ−結合型炭水化物鎖のための更なる部位を有する幾つかの例としてのｍｐｌリガンド類似体を列挙する。類似体は、Ｎ−結合部位を形成するためにヒトアミノ酸配列に基づくヒトｍｐｌリガンドポリペプチド鎖中の種々の位置に含まれる配列Ａｓｎ−Ｘ−ＳｅｒまたはＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒを有する。表４および表７は、ＳＤＳゲル上での糖タンパクの移動により検証される、少なくとも一つの追加のＮ−結合炭水化物鎖を付加する類似体を列挙する（実施例６および図３、５、６、７、９、１０、１２および１３）。これらの表は、本明細書で定義される“類似体”でない幾つかの切頭型種（すなわち、Ｎ１、Ｎ１６、Ｎ１７およびＮ３１）も含む。種々の切頭型種がいかに製造されたかを示すためにこれらのものが表に列挙されている。
本明細書に開示されるｍｐｌリガンド類似体をコードするＤＮＡ配列、好ましくはＮ−結合鎖のための追加の部位を有する類似体をコードするものも本発明に含まれる。炭水化物のための結合部位を形成、欠失および／または変更させる目的でｍｐｌリガンドＤＮＡ配列に変化を導入するために用いられる手順が、実施例４および１４に開示されている。
これらｍｐｌリガンド類似体は、外来性ＤＮＡ配列の発現産物である、すなわち組み換えＤＮＡ技術により製造することができ、それらは化学的に合成された生成物であってもよいし、または組み合わせた方法により製造されてもよい。外来性ＤＮＡ配列は、ｍｐｌリガンド類似体をコードするｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ又は化学合成ＤＮＡを含む。そのような類似体の発現のために有用な真核生物宿主細胞および組み換えＤＮＡプラスミドも提供される。発現ベクターは、真核生物宿主細胞中においてクローン化ＤＮＡ配列を発現することのできる任意のベクター、特にＣＯＳおよびＣＨＯ細胞中での発現に用いられるベクターを含む。そのようなベクターの例は、プラスミドｐＤＳＲαおよびｐＤＳＲα２を含む（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．第８巻：４６６〜４７２頁（１９８８年）；ＷＯ９１／１３１６０（１９９１年）；およびＷＯ９０／１４３６３（１９９０年）参照）。当業者に知られている標準的手順により、ｍｐｌリガンド類似体を発現するＣＯＳおよびＣＨＯ宿主細胞の培養を行った。
ｍｐｌリガンドに結合している炭水化物鎖の数、型、位置または量を変化させることにより、増加した溶解性、タンパク分解に対するより大きな抵抗性、低下した免疫原性、増加した血清半減期、および増加したまたは変化した生物学的活性のような有利な性質が付与され得る。
ｍｐｌリガンド類似体Ｎ２〜Ｎ１５（Ｎ１はヒトｍｐｌリガンド１〜１７４；表２参照）を発現するＣＯＳ細胞からのならし培地を、インビトロ生物学的活性について分析し、結果を表４に示す。
ｍｐｌリガンド類似体／切頭体Ｎ１５〜Ｎ４０を発現するＣＯＳ細胞からのならし培地を、インビトロ生物学的活性について分析し、結果を表７に示す。
種々の型についてのインビボ生物学的活性の結果を図１１に示す（実施例１３参照）。
本発明の別の実施態様は、１分子当たり特定数を超えるシアル酸を有する、例えば、真核生物細胞中において天然にまたは組み換えにより生成されるｍｐｌリガンド１〜３３２、１〜１９９、１〜１９１、１〜１８３、１〜１７４、１〜１６３、１〜１５３、１〜１５２または１〜１５１において見られるよりも多くを有するｍｐｌリガンドまたはｍｐｌリガンド類似体を優先的に合成する哺乳動物（例えば、チャイニーズハムスター卵巣：ＣＨＯ）宿主細胞に関する。
類似体Ｎ４およびＮ１５のインビトロ活性を、ＣＨＯ細胞中に発現される全長および種々の切頭型種のインビトロ活性と共に表５に示す。
ｍｐｌリガンド分子のシアル酸含量は、そのインビボ生物学的活性に影響を与え得る。例えば、テトラアンテナリィ（４分岐）Ｎ−結合型オリゴ糖は、最も一般的に、シアル酸結合のための４つの可能な部位を提供し、一方アスパラギン結合部位においてテトラアンテナリィ型に取って代わり得るバイアンテナリィおよびトリアンテナリィオリゴ糖は、一般的に、せいぜい２つまたは３つの結合シアル酸しか有さない。Ｏ−結合型オリゴ糖は一般的にシアル酸結合のための二つの部位を提供する。すなわち、Ｏ−結合型炭水化物に取って代わったＮ−結合型炭水化物を有するｍｐｌリガンド分子は、Ｎ−結合型オリゴ糖がテトラアンテナリィであるならば、鎖当たり二つの追加のシアル酸を含み得る。テトラアンテナリィ鎖を選択的に組み換えｍｐｌリガンドに付加し、それによりシアル酸結合部位の数を最大にする細胞について培養哺乳動物細胞をスクリーニングした。
ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）を欠くチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞が、組み換えｍｐｌリガンドを含む組み換え糖タンパクの生成のために一般的に用いられる宿主細胞である。
本発明の治療的に有効量のｍｐｌリガンド類似体を、ｍｐｌリガンド療法において有用な適当な希釈剤、アジュバントおよび／または担体と共に含む組成物もまた、本発明に含まれる。本明細書で用いられる“治療的に有効量”とは、所定の条件および投与計画に治療的効果を提供する量を意味する。
本発明の組成物は、非経口的に全身的に投与することができる。あるいは、組成物を静脈内または皮下に投与することができる。全身的に投与するときに、本発明で用いられる治療組成物は、発熱因子を含まない非経口的に許容され得る水溶液の形態とし得る。ｐＨ、等張性、安定性等に関して薬学的に許容できるタンパク溶液の調製は、当分野の技術内のことである。選択される特定の投与経路は、治療される症状による。ｍｐｌリガンドまたはｍｐｌリガンド類似体の投与は、好ましくは、ヒト血清アルブミンのような適当な担体、緩衝塩溶液のような適当な希釈剤、および／または適当なアジュバントを含む製剤の一部として行われる。必要な投与量は、患者の血小板レベルを上昇させるのに充分な量であり、治療される症状の重さ、および使用される投与方法等により変化する。
本発明の方法および組成物により治療すべき症状は、通常、存在する巨核球／血小板欠乏または将来の予想される巨核球／血小板欠乏（例えば、予定されている手術のために）を含むものである。そのような症状は、通常は、インビボにおける活性ｍｐｌリガンドの欠乏（一時的または永久的）の結果である。血小板欠乏の一般的用語は、血小板減少症であり、本発明の方法および組成物は、通常、血小板減少症の治療に利用できる。
血小板減少症（血小板欠乏）は、化学療法、骨髄移植、種々の薬剤を用いる他の療法、放射線治療、手術、事故による出血および他の特定の症状を含む種々の理由に起因する。血小板減少症を含み本発明により治療され得る特定の症状としては、例えば、再生不良性貧血、突発性血小板減少症、血小板減少症につながる転移性腫瘍、全身性紅斑性狼そう、巨脾腫、ファンコーニ症候群、ビタミン１２欠乏、葉酸欠乏、メイ−ヘグリン異常、ヴィスコット−オールドリッチ症候群、および発作性夜間血色素尿症を含む。また、ＡＩＤＳのためのある治療は血小板減少症（例えばＡＺＴ）につながる。特定の創傷の癒合障害も血小板数の増加により有利となる。
例えば将来の手術または将来の血小板減少症誘発治療による予想される血小板欠乏に関して、本発明のｍｐｌリガンド類似体を、血小板が必要となる数日〜数時間前に投与することができる。急性の状況、例えば、事故による大量の出血に関して、ｍｐｌリガンド類似体を血液または精製血小板と共に投与することができる。
前記疾病の治療のための方法に含まれる投与計画は、薬剤の作用を変える種々の因子、例えば、患者の年齢、症状、体重、性別および食事、感染の重さ、投与時間、および他の臨床的因子を考慮して担当医により決められる。通常、一日の投与量は、体重１ｋｇ当たりｍｐｌリガンド類似体０．０１〜１０００μｇ、好ましくは体重１ｋｇ当たり０．１〜１０μｇである。
本発明の治療法、組成物およびポリペプチドを、他の症状により特徴付けられる症状および血小板欠乏の治療において、単独でまたは他のサイトカイン、可溶性ｍｐｌ（すなわちｍｐｌリガンド）レセプター、造血因子、インターロイキン、成長因子または抗体と組み合わせて用いることができる。ｍｐｌリガンド類似体分子が、ＩＬ−３またはＧＭ−ＣＳＦのような通常の造血刺激剤と組み合わせて、ある状態の血小板減少症を治療するのに有用であることが明らかである。他の巨核球刺激因子、すなわち、ｍｅｇ−ＣＳＦ、幹細胞因子（ＳＣＦ）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）、または巨核球刺激活性を有する他の分子も、ｍｐｌリガンドと一緒に用いることができる。そのような同時投与のためのサイトカインまたは造血因子の更なる例は、ＩＬ−１アルファ、ＩＬ−１ベータ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１１、コロニー刺激因子−１（ＣＳＦ−１）、ＧＭ−ＣＳＦ、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、ＥＰＯ、インターフェロン−アルファ（ＩＮＦ−アルファ）、ＩＮＦ−ベータ、またはＩＮＦ−ガンマを含む。巨核球がいったん成熟状態に達すると巨核球を血小板に断片化する効果を有すると思われる可溶性哺乳動物Ｍｐｌレセプターの有効量を同時にまたは連続的に投与するのが、さらに有用であり得る。すなわち、ｍｐｌリガンド類似体を投与（成熟巨核球の数を増やすために）し、続いて可溶性ｍｐｌレセプターを投与（類似体を不活性化し成熟巨核球から血小板を産生させるために）することは、血小板産生を刺激する特に有効な手段であることが期待される。前述の投与量は、治療組成物中のそのような追加の成分を補うように調整される。治療した患者の経過は、一般的方法によりモニターすることができる。
例えば活性、安定性、半減期等を向上させるために本発明の類似体の更なる変更を行うこともできる。例えば、タンパク上のアミノ基を介してまたは炭水化物基を介してｍｐｌリガンド類似体にペグ化（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）（ポリまたはモノ）を付加することができる。また、脂肪酸または他のポリマーをタンパクまたは炭水化物基に結合することができる。
以下の実施例は、本発明をより詳しく説明するために提供されるが、本発明の限定を意図するものではない。実施例で用いられるバイオアッセイで使用されるｍｐｌリガンド標準は、Ｅ．ｃｏｌｉ中に発現され、再び活性構造に折り畳まれ、精製された組み換えｍｐｌリガンド標準である。すなわち、相対的比活性のみが測定される。
実施例１
Ｍｐｌリガンド１〜１７４の構築
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、ヒト胎児肝臓ｃＤＮＡライブラリー（バートレイ（Ｂａｒｔｌｅｙ）らのＣｅｌｌ第７７巻：１１１７から１１２４頁（１９９４年））から図２のアミノ酸１〜１７４（Ｓ−Ｐ−Ａ−Ｐ−Ｐ−Ａ．．からはじまる）をコードするヒトｍｐｌリガンド遺伝子を生成した。５’ＰＣＲプライマーは、ヒトｍｐｌリガンドのアミノ末端、ＸｂａＩ部位および最適化Ｋｏｚａｋ配列をコードした。３’プライマーは、終止コドンおよびＳａｌＩ制限部位を含んでいた。増幅したＤＮＡフラグメントをＸｂａＩおよびＳａｌＩで消化し、次にＸｂａＩおよびＳａｌＩで切断したｐＤＳＲα２に連結した。得られたプラスミドであるｐＤＳＲα２ｍｐｌリガンド１〜１７４を、哺乳動物細胞発現のために用いた。得られる遺伝子（シグナルペプチドを含む）の配列を図２に示す。
ｍｐｌリガンド１〜１７４を含むプラスミドＤＮＡをＸｂａＩおよびＳａｌＩ制限酵素で消化し、得られるＤＮＡフラグメントをアガロースゲル電気泳動に付し、ＧｅｎｅＣｌｅａｎTMキットおよび製造者（ＢＩＯ  １０１社）により提供される手順を用いてゲルから６０５ｎｔ  ｍｐｌリガンド１〜１７４ＤＮＡフラグメントを単離した。ＷＯ９０／１４３６３（１９９０年）に記載のプラスミドｐＤＳＲα２もＸｂａＩおよびＳａｌＩ制限酵素で消化し、ベクターフラグメントを回収した。二つのフラグメントの連結によりｐＤＳＲα２（ｍｐｌリガンド１〜１７４）が得られる。
実施例２
ＣＨＯ細胞中におけるｍｐｌリガンド１〜１７４の発現および精製
ジヒドロ葉酸リダクターゼ欠乏（ＤＨＦＲ-）チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞をｐＤＳＲα２−ｍｐｌリガンド１〜１７４でトランスフェクションした。ＣＨＯ  Ｄ-培地（ＤＭＥＭ、１０％牛胎児血清、１％ペニシリン／ストレプトマイシン／グルタミン、１％非必須アミノ酸（ギブコ社（Ｇｉｂｃｏ）製）および１％ＨＴ助剤（ギブコ社製））中で成長させた１×１０6ＣＨＯ  ＤＨＦＲ-細胞を、トランスフェクションの前日に１００ｍｍ組織培養皿にプレーティングした。４つのトランスフェクションを行った。４つの各トランスフェクションにおいて、ＰｖｕＩおよび緩衝液Ｈ（ベーリンガーマンハイム社（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）製）で消化することによりプラスミドＤＮＡ（５０μｇ）を線状化した。ＤＮＡ沈殿物を形成し、哺乳動物細胞トランスフェクテョンキット（Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ  ｍｅｄｉａ）によりプレートに滴加した。組織培養培養器内で２４時間後、培地を新しいＣＨＯＤ-培地で置き換えた。２４時間後、ウエル当たりＣＨＯ選択培地（Ｄ−ＭＥＭ、５％透析牛胎児血清、１％ペニシリン／ストレプトマイシン／グルタミン、１％非必須アミノ酸（ギブコ社（Ｇｉｂｃｏ）製））１００μｌと共に細胞を９６ウエル組織培養プレートに分け、形質転換株を選択した。コロニーが出現するまで培地を１週間毎に変えた。２週間後、以下の３２Ｄ細胞増殖アッセイ（実施例９参照）の使用についてｍｐｌリガンド発現をスクリーニングした。１×１０5単位／ｍｌを越えて発現されるこれらのクローンを増やし、凍結貯蔵器内で凍結した。一つのクローンをローラー瓶製造のために増やし、ならし培地約８リッターを製造した。
ｍｐｌリガンド１〜１７４ｃＤＮＡを含むプラスミドｐＤＳＲα２を前述のようにＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞中にトランスフェクションした。ｍｐｌリガンド１〜１７４を発現するＣＨＯ細胞を接種したローラー瓶からの血清非含有ＣＨＯ細胞ならし培地（５０％Ｄ−ＭＥＭ、５０％ＨＡＭＳ−Ｆ１２、１％ペニシリン／ストレプトマイシン／グルタミン、１％非必須アミノ酸（ギブコ社（Ｇｉｂｃｏ）製）２リッターを、２Ｌアミコンモデル２０００攪拌セルおよび１００００ダルトン分子量カットオフ薄膜（ＹＭ１０、アミコン社（Ａｍｉｃｏｎ）製）を用いて１５倍に濃縮した。次に、濃縮したならし培地４５ｍｌを、ファーマシア社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）製ＦＰＬＣを用いて流速０．４ｍｌ／分で４ｍｌ  ｈｕ−ＭＰＬ−Ｘアフィニテイカラムに直接負荷した。アフィニテイカラムは、ファーマシア社製ＣＮＢｒ活性化セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）樹脂１ｍｌ当たり１．５〜２．５ｍｇのＭｐｌ−Ｘ（ｍｐｌレセプターの可溶性細胞外ドメイン）を製造者に指示されるように結合することにより作製した。負荷後、カラムを燐酸塩緩衝塩水（ＰＢＳ：１０ｍＭ  Ｎａ・ＰＯ4  ｐＨ６．８／１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）１６ｍｌで洗い、次に、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０／１Ｍ  ＮａＣｌの２４ｍｌで洗った。ｍｐｌリガンド（１〜１７４）を、２０ｍＭ  ＣＡＰＳ（３−［シクロヘキシルアミノ］−１プロパンスルホン酸）ｐＨ１０．５／１Ｍ  ＮａＣｌ／５ｍＭ  ＣＨＡＰＳ（３−［（３−コルアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート）の４０ｍｌで６ｍｌずつの分画量で溶離した。第２のフラクションは１４％ＳＤＳゲル上にシングルバンドを形成した。この物質を濃縮し、０．９％ＮａＣｌの塩溶液で緩衝液交換すると、インビトロ及びインビボで生物学的に活性であった。他の型のＣＨＯ細胞発現ｍｐｌリガンドを同様にして精製した。
実施例３
組み換えヒトｍｐｌリガンドのインビボ生物学的活性
種々の型のｍｐｌリガンドで処理したマウスからの血小板数を測定した。ＣＨＯ由来ｍｐｌリガンド１〜３３２、１〜１７４、１〜１６３および１〜１５３を製造し、Ｍｐｌレセプター親和性クロマトグラフィーにより精製した。Ｅ．ｃｏｌｉ由来Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−ｍｐｌリガンド１〜３３２、Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−ｍｐｌリガンド１〜１７４、Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−ｍｐｌリガンド１〜１６３およびＭｅｔ−Ｌｙｓ−ｍｐｌリガンド１〜１５３を製造し、従来のクロマトグラフィーで精製した。
図４は、種々の型のＣＨＯ細胞由来（実線）またはＥ．ｃｏｌｉ由来（破線）組み換えヒトｍｐｌリガンドで処理したマウスからの血小板数を示す。正常な雌のＢａｌｂ／ｃマウスに示された濃度のｍｐｌリガンドを５日間連続して皮下注射した。最後の注射から２４時間後に尾静脈の横の小さな切り口から試験血液を採血した。シスメックス（Ｓｙｓｍｅｘ）電気血球分析機（カリフォルニア州アーヴィン在バックスター・ダイアグノスティクス社（Ｂａｘｔｅｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．）製）を用いて血球分析を行った。データは、４匹の動物の平均値に平均の＋／−標準誤差を付して表す。合計白血球数または赤血球数のような他の血球パラメーターは、これらの処理により影響を受けなかった（データは示さない）。
結果は、ＣＨＯ細胞発現型ｍｐｌリガンドが、Ｅ．ｃｏｌｉ中で製造した同じ型のｍｐｌリガンドと比べて増加したインビボ活性を有することを示している。実施例６において示されるように、ＣＨＯ細胞発現型ｍｐｌリガンドは全てＮ−および／またはＯ−結合型炭水化物を含み、Ｅ．ｃｏｌｉ発現ｍｐｌリガンド型のものはそのような炭水化物を含まない。これは、炭水化物がｍｐｌリガンドのインビボ活性を高めることを示している。炭水化物により付与された増加したインビボ活性は、増加した循環半減期、増加した安定性または両者の組み合わせの結果であり得る。
実施例４
ｍｐｌリガンド類似体Ｎ２〜Ｎ１５の構築
ｍｐｌリガンドのための追加のグリコシル化部位を生成させる手順を以下に記載する。
以下のオリゴヌクレオチドプライマーを合成してインビトロ変異誘発に用いて類似体Ｎ２〜Ｎ１４を製造した（これらの類似体の構造については表１参照）。
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ｍ１３ｍｐ１８  ｍｐｌリガンド１〜１７４を構築するために、図２の遺伝子を、ＸｂａＩおよびＳａｌＩ制限酵素消化ｍ１３ｍｐ１８ＤＮＡ中に導入した。クンケル（Ｋｕｎｋｅｌ）らのＭｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．第１５４巻：３６７頁（１９８７年）およびメシング（Ｍｅｓｓｉｎｇ）のＭｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．第１０１巻：２０頁（１９８３年）に記載されているようにして、ｍ１３ｍｐ１８（ｍｐｌリガンド１〜１７４）により感染されたＥ．ｃｏｌｉ菌株ＲＺ１０３２の上澄みから一本鎖ＤＮＡを回収した。インビトロ変異誘発のために、一本鎖ＤＮＡ約０．５μｇおよび前記合成プライマーの一つ０．１２５ｐｍｏｌｅを緩衝液（２５０ｍＭＴｒｉｓ  ｐＨ７．８、５０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、５０ｍＭジチオスレイトールおよび１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ−ファーマシア社製））６μｌと混合した。プライマーを、添加前にＡＴＰおよびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼで予めキナーゼ処理した。プライマーを鋳型にアニーリングするために、反応容積を水で１０μｌに調節し、混合物を６５℃で５分間加熱し、次に室温まで冷却した。伸長反応のために、ｄＴＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＣＴＰの各２．５μｌとＡＴＰ１ｍｌを（全て１０μＭで）添加し、続いてＥ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼ（Ｋｌｅｎｏｗフラグメント）１μｌ（１単位）およびＴ４ＤＮＡリガーゼ１μｌ（１単位）を添加した。次に混合物を１４℃で一晩インキュベートし、それを用いてＥ．ｃｏｌｉＪＭ１０９（ヤニッシュ−ペロン（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ）らのＧｅｎｅ第３３巻：１０３頁（１９８５年））を前述（前記メシング）のように形質転換した。
異なるハイブリッド化（differential hybridization）により突然変異クローンを同定するために、栄養寒天上のプラクをジーンスクリーンフィルター（ニュー・イングランド・ニュークリアー社（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ）製）に移した。ＤＮＡを、ＵＶストラタリンカー（Ｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ）モデル１８００（ストラタジーン社（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）製）内で自己架橋モードを用いて照射することによりフィルターに架橋させた。次にそれらを、１％ＳＤＳを含む６×ＳＳＣ（０．９Ｍ  ＮａＣｌ／０．０９Ｍ  Ｎａ・クエン酸塩）内において６０℃で１時間インキュベートした。ハイブリッド化のために、前記オリゴヌクレオチドプライマー（８ｐｍｏｌｅ）の末端をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼおよびγ３２Ｐ−標識ＡＴＰで標識し、６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳおよびニシン精子ＤＮＡ１２５μｇ／ｍｌ内でフィルターと一緒に一晩インキュベートした。ハイブリッド化温度は、オリゴヌクレオチド融点の推定値により選んだ。通常、ハイブリッド化温度は、融点より約１０℃低くした。翌日、フィルターを、ハイブリッド化温度で６×ＳＳＣ／１％ＳＤＳにより２回洗い、続いてハイブリッド化温度で６×ＳＳＣにより２回洗い、オートラジオグラフィーに付した。必要な場合、野生型ｍｐｌリガンドｃＤＮＡ配列を有するプラークへのハイブリッド化が殆どまたは全く検出されなくなるまで温度を上昇させながらフィルターを６×ＳＳＣで洗った。これらの条件下に陽性のハイブリッド化シグナルを出すクローンを同定し、再度ＪＭ１０９中にトランスフェクションして純水なクローンを単離した。ジデオキシ鎖終止配列分析は、突然変異が存在することを示した。
所望の変化を有する二本鎖ｍ１３  ｍｐｌリガンド１〜１７４ＤＮＡを、ＱＩＡＧＥＮキット（カリフォルニア州在チャッツワース社（Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ）製）で製造社により提供された方法を用いて、トランスフェクションされたＪＭ１０９細胞から回収した。ＤＮＡをＸｂａＩおよびＳａｌＩで消化し、６０５ｂｐ  ｍｐｌリガンドＤＮＡフラグメントを単離した。ｐＤＳＲα２をＸｂａＩおよびＳａｌＩで消化した。ベクターフラグメントを単離し、前記ｍｐｌリガンドフラグメントに結合させた。組み換えプラスミドを制限分析により同定した。得られるプラスミド（ｍｐｌリガンド１−１７４−ＮＸ（ＮＸは類似体番号）と表される）は、示された位置に変更されたアミノ酸残基を有するｍｐｌリガンド類似体をコードするＤＮＡを含む。次に得られるプラスミドを再度配列決定して所望突然変異の存在を確認する。
３０位および１２０位に二つの追加のＮ−結合型グリコシル化部位を有する類似体Ｎ１５を構築した。Ａｓｎ３０およびＴｈｒ３２突然変異を含むｐＤＳＲα２ｍｐｌリガンド１７４−Ｎ４を、ＸｂａＩおよびＰｓｔＩ制限酵素で消化し、約３８５ｎｔＤＮＡフラグメントを単離した。Ａｓｎ１２０およびＴｈｒ１２２突然変異を含むｐＤＳＲα２ｍｐｌリガンド１７４−Ｎ１０を、ＰｓｔＩおよびＳａｌＩ制限酵素で消化し、約２２０ｎｔＤＮＡフラグメントを単離した。ｐＤＳＲα２を、ＸｂａＩおよびＳａｌＩで消化した。ベクターフラグメントを単離し、前記ｍｐｌリガンドフラグメントに連結した。これにより、Ａｓｎ３０、Ｔｈｒ３２、Ａｓｎ１２０およびＴｈｒ１２２置換を含むｐＤＳＲα２ｍｐｌリガンド１７４−Ｎ１５が得られる。
これらの一般的手順を用いて表１に示すｍｐｌリガンド類似体を構築した。各々の類似体についてのＤＮＡ配列の変化を示す；あるいは変異誘発のために用いられるオリゴヌクレオチドプライマーがヒトｍｐｌリガンドの配列に相補的な配列を有していた。
0003836877.tif 000004
註：類似体Ｎ２〜Ｎ１５をここで同義的に類似体２〜１５と呼ぶ。さらに、本明細書中で用いられているように、例えば、［Ａｓｎ22］ｍｐｌリガンドは、好ましくは少なくとも図１のアミノ酸７〜１５１を有するヒト配列（先に示した好ましいヒトｍｐｌリガンド配列を含む）である、考慮される特定のｍｐｌリガンド種中の２２位においてアミノ酸の代わりにアスパラギン酸が置換されていることを示している。すなわち、ｍｐｌリガンド１〜１７４（ヒト配列）の２２位においてロイシン残基の代わりにアスパラギン残基を置換することによって、［Ａｓｎ22］ｍｐｌリガンド１〜１７４により表され得るｍｐｌリガンド類似体が得られる。
ｐＤＳＲα２  １−１７４−ＮＸ（ここでＮＸは類似体番号）と示されるプラスミドは、ｍｐｌリガンドＤＮＡをｐＤＳＲα２に挿入することにより構築された。発現ベクターｐＤＳＲα２は、ＷＯ９０／１４３６３（１９９０年）に一般的に記載されている。ｐＤＳＲα２をＸｂａＩおよびＳａｌＩで消化することによりｐＤＳＲα２  ｍｐｌ-リガンド１−１７４−ＮＸプラスミドを形成した。ベクターフラグメントを単離し、所望の配列を含む約６０５ｂｐフラグメントに連結する。
実施例５
ＣＯＳ細胞中におけるｍｐｌリガンドおよびｍｐｌリガンドＮ１〜Ｎ１５の発現
表１に記載されているｍｐｌリガンド類似体およびヒトｍｐｌリガンドのｃＤＮＡクローンを、電気穿孔法によりＣＯＳ−１細胞（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ−１６５０）中に移入した。ＣＯＳ−１細胞を半集密化した培養皿から採取し、培地（１０％牛胎児血清および１％Ｌ−グルタミン／ペニシリン／ストレプトマイシン（アービン・サイエンティフィック社（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）製）を含むダルベッコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）の改良必須培地）で洗い、６×１０6細胞／ｍｌに再懸濁させた。細胞０．５ｍｌを０．２ｃｍ電気穿孔キュベット（バイオ−ラッド社（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）製）に移し、ＢＴＸ電気穿孔システムエレクトロセルマニピュレーター６００を用い、ｍｐｌリガンド類似体をコードするプラスミドＤＮＡ５０μｇで電圧を低く設定して、６５０μＦおよび１３０ボルトで電気穿孔した。電気穿孔細胞を、培地１０ｍｌ中で１００ｍｍ組織培養皿にプレーティングした。プレーティングしてから１２〜２４時間後、培地を新しい培地１０ｍｌで置き換えた。ならし培地を、電気穿孔後３〜５日に採取した。
実施例６
ｍｐｌリガンドおよびｍｐｌリガンドＮ１〜Ｎ１５の特徴付け
Ａ．炭水化物付加の測定
実施例５に記載のｍｐｌリガンド類似体ｃＤＮＡでトランスフェクションしたＣＯＳ細胞からのｍｐｌリガンド類似体またはｍｐｌリガンド約３０〜６０ｎｇを含む上澄みを、ウサギ抗ｍｐｌリガンドポリクローナル抗体を用いて、室温で一晩免疫沈殿させた。発現が低い場合、免疫沈殿において約８〜９ｍｌの最大体積を用いた。抗体は、Ｅ．ｃｏｌｉから発現され精製されたｍｐｌリガンド１〜１６３に対するものであった。０．１％アジ化ナトリウムを含む燐酸塩緩衝塩水（ＰＢＳ）中の１：１タンパクＡ−セファロース３０μｌを免疫沈殿に添加し、室温で１時間インキュベートした。サンプルを遠心分離し、ＰＢＳで洗い、ＳＤＳサンプル緩衝液（０．１２５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ６．８／４％ＳＤＳ／２０％グリセロール／１０％β−メルカプトエタノール／０．００１％ブロモフェノールブルー）中に再び懸濁させた。そのサンプルを１２％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析し、ニトロセルロースに移し、合成ｍｐｌリガンドペプチド（例えば図１のアミノ酸残基４７〜６２に相当する）に対するマウス抗ｍｐｌリガンドモノクローナル抗体を用いて前記ウエスタン分析（ブルネット（Ｂｕｒｎｅｔｔｅ）らのＡｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．第１１２巻：１９５〜２０３頁（１９８１年）；エリオット（Ｅｌｌｉｏｔｔ）らのＧｅｎｅ第７９巻：１６７〜１８０頁（１９８９年））に付した。バンドを含むｍｐｌリガンドをＥＣＬキット（アマーシャム社（Ａｍｅｒｓｈａｍ）製）を用いて視覚化した。
図５は、類似体Ｎ４、Ｎ７およびＮ１０ＤＮＡでトランスフェクションした細胞からのＣＯＳ細胞上澄みがヒト配列ｍｐｌリガンド１７４（Ｎ１）と比べて寸法（size）が大きくなっていることを示している。図６は、類似体Ｎ１３、Ｎ１４およびＮ４ＤＮＡでトランスフェクションした細胞からのＣＯＳ細胞上澄みもヒト配列ｍｐｌリガンドと比べて寸法が大きくなっていることを示している。この寸法増加は、付加的Ｎ−結合型炭水化物鎖を示している。Ｎ１５は、二つの付加的Ｎ−結合型グリコシル化部位を含む。図６は、ただ１つの付加的Ｎ−結合型グリコシル化を含む類似体より大きな寸法を有する物質をこの類似体が有することを示している。タンパクの寸法は、分子量が既知のタンパク標準と比べた、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上での移動度から推定した。図６から計算されたより大きなバンドの推定寸法を表２に示す。この結果は、Ｎ１５が二つの付加的Ｎ−結合鎖を含むことを示している。他の選択された類似体のウエスタンブロット分析を図６に示す。
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ｍｐｌリガンド類似体の寸法増加がＮ−結合型炭水化物によることを示すために実験を行った。ｍｐｌリガンドを含むＣＯＳ細胞ならし培地を免疫沈殿させ、前述のようにＰＢＳで洗った。次に各チューブに０．５％ＳＤＳ１０μｌを加え、各サンプルを３分間沸騰させた。次に以下の成分を添加した：１０．８μｌの０．５Ｍ  ＮａＰＯ4  ｐＨ８．６、５ｍｌの７．５％ノニデット（ｎｏｎｉｄｅｔ）Ｐ４０および３μｌの２５０単位／ｍｌ  Ｎ−グリカナーゼ（ゲンザイム社（Ｇｅｎｚｙｍｅ）製）。Ｎ−グリカナーゼ処理はＮ−結合型炭水化物を除去する。サンプルを３７℃で６時間インキュベートした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液の添加により反応を停止し、次に、抗ｍｐｌリガンドモノクローナル抗体および前記抗マウスＥＣＬウエスタン検出キット（アマーシャム社製）を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥウエスタン分析（１２％アクリルアミド）に付した。この方法を用いるＮ−結合鎖の分析を、ヒトｍｐｌリガンドおよびｍｐｌリガンド類似体について図７に示した。Ｎ−グリカナーゼでの処理後、Ｎ４、Ｎ７およびＮ１０についてのウエスタンブロット上での移動度はＮ１の移動度まで低下した。予想されるように、Ｎ１はＮ−結合型グリコシル化部位を有さないのでＮ−グリカナーゼによるＮ１の処理は、移動度に影響を与えなかった。これらの結果は、観察される寸法増加がＮ−結合型炭水化物の付加によるものであることを示している。
Ｂ．ｍｐｌリガンド上のＯ−結合型炭水化物の分析
Ｏ−結合型炭水化物のヒトｍｐｌリガンドへの寄与を分析するために、前述のＣＨＯ細胞ならし培地から種々の型のタンパクを精製した。それぞれが、Ｏ−グリカナーゼ（グリコペプチドアルファ−Ｎ−アセチルガラクトースアミニダーゼ、オックスフォード・グリコシステムズ（Ｏｘｆｏｒｄ  ＧｌｙｃｏＳｙｓｔｅｍｓ）による＋／−処理を受けた。Ｏ−グリカナーゼは糖タンパクからＯ−結合型炭水化物を除去する。それぞれの型のＥ．ｃｏｌｉ発現バージョンを、非グリコシル化対照として用いた。Ｏ−結合型炭水化物に起因する分子量の相違を解決するために、まずＮ−結合型炭水化物を除去する必要があった。全長バージョンであるｍｐｌリガンド１〜３３２はＮ−結合型炭水化物を含むので、Ｎ−グリカナーゼ処理が一晩のインキュベーションであること以外はＣＯＳ細胞発現ｍｐｌリガンド類似体について前述したように、ＣＨＯ細胞発現全長サンプルに、Ｎ−グリカナーゼ（ペプチド−Ｎ４−（Ｎ−アセチル−ベータ−グルコサミニル）アスパラギンアミダーゼ）処理を行った。
全長（１〜３３２）ｍｐｌリガンドについてＯ−グリカナーゼ処理を進める前に、サンプルのｐＨ範囲を、１００ｍＭ酢酸１／１５容、ｐＨ２．２を用いてｐＨ６．０〜７．０に調節した。ＳＤＳ中で３分間沸騰することによりタンパク１μｇを変性し、１ｍＭ酢酸カルシウム、ｐＨ６．８中の１Ｕ／ｍｌノイラミニダーゼ（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｕｒｅｆａｃｉｅｎｓ由来のシアリダーゼ、ベーリンガーマンハイム社製）および２０ｍＭ燐酸ナトリウム、ｐＨ６．８を用いて３７℃で６０分間インキュベートした。
次に、最終容量が１００μｌになるように５ｍＵの酵素を添加することによりＯ−グリカナーゼによる処理を行い、続いて３７℃で一晩インキュベートした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１５％アクリルアミド）でタンパク（０．２μｇ／レーン）を分離した。０．２μｍのニトロセルロースに移し、抗ｍｐｌリガンドポリクローナル抗体で一晩インキュベートした後、ｍｐｌリガンドタンパクを、抗ウサギＥＣＬウエスタン検出キット（アマーシャム社製）を用いて視覚化した。
図３は、４つの異なる型のヒトｍｐｌリガンドのウエスタンブロットを示す。全長ｍｐｌリガンド１〜３３２をレーン１〜３に、ｍｐｌリガンド１〜１７４をレーン４〜６に、ｍｐｌリガンド１〜１６３をレーン７〜９に、およびｍｐｌリガンド１〜１５３をレーン１０〜１２に表す。レーン２、５、８および１１に示されるノイアミニダーゼおよびＯ−グリカナーゼでの処理は、レーン３、６、９および１２の非グリコシル化物質より分子量を低下させた。全ての場合において、移動度が、Ｅ．ｃｏｌｉ中に発現される非グリコシル化バージョンよりも増加した。これらの結果は、レーン１、４、７および１０のより大きな寸法のバンドがＯ−結合型炭水化物によることを示している。各バンドの分子量は、分子量の知られているタンパクの移動度と比較することにより推定した。
異なるタンパクの推定分子量を示す表３に見られるように、移動度のみかけのシフトは、ｍｐｌリガンド１〜３３２について１４個ものＯ−結合型炭水化物鎖（おそらく９５０ダルトン／鎖）、ｍｐｌリガンド１〜１７４について９個の鎖、ｍｐｌリガンド１〜１６３について４個の鎖、およびｍｐｌリガンド１〜１５３について２個の鎖を説明できる。レーン２におけるサンプルランは全長ｍｐｌリガンド１〜３３２である。おそらく３７℃でのグリコ酵素中での延長されたインキュベーションのために、このタンパクが分解されたことが明らかである。従って、レーン３におけるＥ．ｃｏｌｉ発現非グリコシル化バージョンを用いて、ＣＨＯ細胞発現ｍｐｌリガンド１〜３３２に付加されたＯ−結合型炭水化物のおよその分子量を計算した。
これらの結果は、全てのＣＨＯ発現型の試験したｍｐｌリガンド上の炭水化物の存在と一致する。単糖組成物の直接分析によりＣＨＯ細胞発現ｍｐｌリガンド１〜３３２、１〜１７４および１〜１６３についてＯ−結合型炭水化物の存在を確認した。酸加水分解によりシアル酸、ＧａｌＮＡｃおよびＧａｌを糖タンパクから分離した。高速アニオン交換クロマトグラフィーおよびパルス電流滴定検出により単糖を検出した。各型のｍｐｌリガンドにおいて全部で三つの糖を検出した。この結果は、Ｏ−結合型炭水化物を含むシアル酸の存在を示している。このータは、ＣＨＯ細胞発現型のｍｐｌリガンドが全て、Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現された対応する型よりもインビボでより活性である図４に見られるインビボデータと相関する。すなわち、炭水化物の存在はｍｐｌリガンドのインビボ活性を高める。
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実施例７
ｍｐｌリガンドＥＬＩＳＡアッセイ
ポリクローナル抗体の作製−−ニュージーランド白ウサギを、Ｅ．ｃｏｌｉ中で製造された組み換えヒトｍｐｌリガンド１〜１６３を用いて３ケ月間、過免疫化した。高抗体力価を示す６匹のウサギからの抗血清を貯留し、特異的抗ｍｐｌリガンド抗体をアフィニティ精製した。
アフィニティ精製−−組み換えヒトｍｐｌリガンド１〜１６３を、製造者の指示に従ってＡｃｔｉｇｅｌ−ＡＬＤ（ステロジーンバイオセパレーションズ社（Ｓｔｅｒｏｇｅｎｅ  Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ）製）に共有結合させた。ウサギ抗血清の一部をｍｐｌリガンドアフィニティゲルに添加し、スラリーをロッカープラットフォームで一晩４〜８℃で穏やかに攪拌した。非結合血清タンパクを、ゲル床からＰＢＳで洗い、次に特異的に結合した抗ｍｐｌリガンド抗体をイムノピュアジェントルＡｇ／Ａｂ溶離緩衝液（ピアースケミカル社（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）製）で溶離した。回収された抗体を数回交換したＰＢＳで透析し、次に抗体溶液をアミコン攪拌セル限外濾過装置で濃縮し、得られた抗体濃縮物を特異的抗ｍｐｌリガンド抗体の供給源として、続いてウエル被覆および酵素結合体調製に用いた。
ＥＬＩＳＡ試薬−−イムロン４リムーブウエルストリップ（ダイナテックラボラトリーズ社（Ｄｙｎａｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）製）をアフィニティ精製したウサギ抗ｍｐｌリガンド抗体で被覆した。アフィニティ精製抗体を０．１Ｍ重炭酸ナトリウム（ｐＨ約８．２に新しく調製）で２．５μｇ／ｍｌの濃度に希釈した。各ウエルに１００μｌの抗体を入れ、密閉し加湿したチャンバー内でプレートを室温で２４時間インキュベートした。次に、ＴＥＮ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ７．４／１０ｍＭ  ＥＤＴＡ／１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）中の１％牛胎児血清５％スクロースからなるブロッキング溶液２００μｌを各ウエルに添加し、密閉し加湿したチャンバー内でプレートを室温でさらに２４時間インキュベートした。併せた被覆およびブロッキング溶液をウエルから除去した。さらなる過被覆／ブロッキング工程はＰＢＳ中スーパーブロックブロッキング緩衝液（ピアースケミカル社（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）製）３００μｌを各ウエルに添加することを含んだ。室温で約５分間放置した後、この溶液を除去し、ウエルを室温で２４時間風乾させた。ｍｐｌリガンドＥＬＩＳＡで使用するまで、被覆ウエルを密封プラスチック袋内に４〜８℃で貯蔵した。
貯留ウサギ抗血清からのアフィニティ精製抗ｍｐｌリガンド抗体を西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）に共有結合させてシグナル発生抗体として用いた。アフィニティ精製抗体を、イミノチオレーンＨＣｌ（フルカケミカル社（Ｆｌｕｋａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ．）製）で誘導体化した。別途、ＨＲＰＯを、Ｎ−スクシンイミジル６−マレイミドカプロエート（フルカケミカル社（Ｆｌｕｋａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ．）製）で誘導体化した。二つの活性化タンパクを併せて共有結合させた。次に反応混合物をクロマトグラフィーにかけてＦＰＬＣスパロース（Ｓｕｐｅｒｏｓｅ）６（ファーマシア社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）製）カラム内を流下させて、所望の分子量（すなわち約２００ｋＤ）の抗体：ＨＲＰＯ結合体を単離した。所望の結合体を含むフラクションを併せ、セントリコン（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ）３０（グレース社（Ｗ．Ｒ．Ｇｒａｃｅ  ＆  ｃｏ．）アミコン部製）中で濃縮し、−２０℃で５０％グリセロール溶液として貯蔵した。この抗ｍｐｌリガンドＡｂ：ＨＲＰＯ濃縮物をＰＢＳ中２％牛胎児血清中に希釈してＥＬＩＳＡで使用した。ＥＬＩＳＡで使用した結合体の最終濃度は２５０〜５００ｎｇ／ｍｌであった。
Ｅ．ｃｏｌｉ細胞中で製造した組み換えヒトｍｐｌリガンド１〜１６３を標準の調製に用いた。このｍｐｌリガンドを、防腐剤として０．０５％チメロサールを含むＴＥＮ緩衝液中の２％牛胎児血清（シグマケミカル社（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）製）中に希釈した。調製した標準は１．０、０．５、０．２５、０．１２５および０．０６２ｎｇ／ｍｌのｍｐｌリガンドを含んでいた。
アッセイ−−ｍｐｌリガンド標準又はサンプル１００μｌをウエルに添加し、次に密封し加湿したチャンバー中で室温で１８〜２４時間インキュベートした。次にウエルの内容物と残留溶液を除去し、ウエルを洗浄溶液（ＴＥＮ緩衝液中０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で一度洗浄した。抗ｍｐｌリガンドＡｂ：ＨＲＰＯ結合体溶液（１００μｌ）を各ウエルに添加し、次に密封した加湿チャンバー中で室温で２時間インキュベートした。ウエルの内容物を除去し、次にＴＥＮ緩衝液中の０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で４回洗浄した。
発色のために、ＴＢＳ／過酸化物基質溶液（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ  ＆  Ｐｅｒｒｙ溶液Ａ＆Ｂ混合１：１）１００μｌを添加し、室温で２０分インキュベートした。停止溶液１００μｌ（０．５Ｎ硫酸）を添加することにより反応を停止し、マイクロタイタープレートリーダーにより４５０ｎｍで吸光度を読んだ。曲線適合プログラムを用いて作成した標準曲線からサンプル中のｍｐｌリガンド濃度を計算した。
実施例８
短時間液体培養巨核球アッセイにおけるｍｐｌリガンド１〜１７４類似体の生物学的活性
前述のようにしてｍｐｌリガンド１〜１７４の類似体を調製し、液状培養中での巨核球の成長を刺激する能力を検定した。ヒト白血球搬出装置（ニコル（Ｎｉｃｈｏｌ）らのＳｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ第１２巻：４９４〜５０５頁（１９９４年））から単離したＣＤ３４選択細胞を培地（ＩＭＤＭ／１％Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐグルタミン／１％非必須アミノ酸／１％ＭＥＭピルビン酸ナトリウム／１％ＭＥＭビタミン／１０％脱イオンＢＳＡ／１０％正常ヒトＡＢ血漿／１０μＭアルファ−チアシルグリセロール／２０μｇ／ｍｌ  Ｌ−アスパラギン）に２×１０5／ｍｌでプレーティングした。さらに、ｍｐｌリガンド（１〜１７４）またはｍｐｌリガンド１〜１７４類似体を含むＣＯＳ−１ならし培地１．５μｌを各ウエルに添加した。最終容積は、テラサキ型マイクロタイター組織培養プレート（ヴァンガードインターナショナル社（Ｖａｎｇａｒｄ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）製）中で１５μｌとした。細胞を、５％ＣＯ2中加湿箱内で３７℃にて８日間培養し、１％グルタルアルデヒドで培養ウエルに直接固定し、次に、抗−ＧＰＩｂ、抗−ＧＰＩＩｂ（バイオデザイン社（Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ）製）および抗−ＧＰＩｂ（カリフォルニア州カルピンテリア在ダコ社（Ｄａｋｏ）製）からなるモノクローナル抗体カクテルと一緒にインキュベートした。ストレプトアビジン−β−ガラクトシダーゼ検出装置（ＨｉｓｔｏＭａｒｋ、Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ  ａｎｄ  Ｐｅｒｒｙ）を用いて免疫反応を発色させた。より濃い色（実際の写真では青色）で確認された巨核球が図８に見られる。
図８のパネルＡおよびＤは、それぞれ陽性および陰性の対照である。パネルＡに示すウエルには、３７．５ｐｇの野生型ｍｐｌリガンド１〜１７４ＣＯＳ−１ならし培地を入れ、実質的な巨核球成長を示す。パネルＤには、１．５μｌのＣＯＳ−１ｍｏｃｋならし培地を入れたが、成長を示さない。図８のパネルＢおよびＣは、それぞれｍｐｌリガンド１〜１７４類似体Ｎ７およびＮ１０である。パネルＢには、９．０ｐｇのｍｐｌリガンドＣＯＳ−１ならし培地を入れ、パネルＣには２７ｐｇを入れ、両者は優れた巨核球成長を示す。
この実験は、試験したｍｐｌリガンドの類似体がインビトロでのヒト巨核球の産生を刺激することができることを示している。
実施例９
インビトロ細胞増殖アッセイにおけるｍｐｌリガンド１〜１７４類似体の生物学的活性
前述のようにｍｐｌリガンド１〜１７４の類似体を調製し、３２Ｄ−ｍｐｌ細胞の増殖を刺激する能力を検定した。３２Ｄ−ｍｐｌ細胞を構築するために、全長ヒトｍｐｌレセプター配列（ヴィゴン（Ｖｉｇｏｎ，Ｉ．）らのＰＮＡＳ第８９巻：５６４０〜５６４４頁（１９９２年）製）をモロニーマウス肉腫ウイルスの転写プロモーターを含む発現ベクターにサブクローニングした。この構築物６μｇおよび両栄養性レトロウイルスパッケージング構築物（ランドー（Ｌａｎｄａｕ，Ｎ．Ｒ．）、リットマン（Ｌｉｔｔｍａｎ，Ｄ．Ｒ．）のＪｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ第６６巻：５１１０〜５１１３頁（１９９２年））６μｇを、ＣａＰＯ4哺乳動物トランスフェクションキット（ストラタジーン社（ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）製）を用いて３×１０6２９３細胞中にトランスフェクションした。２日後に同じ細胞をトランスフェクションし、４日後に再度トランスフェクションした。最後のトランスフェクションの後日、ＩＬ−３依存性マウス細胞系（３２Ｄ、クローン２３；グリーンバーガー（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇｅｒ）らのＰＮＡＳ第８０巻：２９３１〜２９３６頁（１９８３年））を用いて２９３細胞を共培養した。２４時間後、３２Ｄ細胞を取り出し、ＢＳＡグラジエント（Ｐａｔｈ−ｏ−ｃｙｔｅ；マイルス社（Ｍｉｌｅｓ  Ｉｎｃ．）製）中でバンド形成した。１ｎｇ／ｍｌマウスＩＬ−３中で細胞を増やし、次に、２０％ＡＰＫ９血清（バートレイ（Ｂａｒｔｌｅｙ）らのＣｅｌｌ第７７巻：１１１７〜１１２４頁（１９９４年））中での成長により選択した。ポリクローナルウサギ抗ペプチド（ＭＰＬ）血清を用いるＦＡＣＳによりレセプターの細胞表面発現について細胞を分類した。これらのサイトカイン依存性マウス３２Ｄ−ｍｐｌ細胞はｍｐｌリガンドに反応性がある。１０％胎児クローンＩＩ血清（ハイクローンラボラトリーズ社（Ｈｙｃｌｏｎｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）製）および１．０ｎｇ／ｍｌ  ｍｕＩＬ３を１×１０6細胞／ｍｌの細胞密度となるように含むＭＥＭ培地において３２Ｄ−ＭＰＬ細胞を成長させた。細胞を遠心分離（約５００ＸＧ）により収集し、ｍｕＩＬ３を欠く成長培地で２回洗浄し、１×１０5細胞／ｍｌで再懸濁させた。
ｍｐｌリガンド１〜１６３を用いて５０００〜１ｐｇ／ｍｌにわたる、１２点におよぶｍｐｌリガンド標準曲線を作成した。標準ｍｐｌリガンドまたはアッセイサンプルの各希釈液１００μｌを、再懸濁細胞１００μｌ（１００００細胞／ウエル）を含む９６ウエルマイクロタイター組織培養プレートの適当なウエルに添加し、３７℃および１０％ＣＯ2の条件下に加湿培養器内で培養した。４８時間後、ＭＴＳ試薬（水性非放射性細胞増殖キット、プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ）製）４０μｌを各ウエルに添加し、１４〜１８時間後に、プレートリーダーで４９０ｎＭにてプレートを読んだ。サンプル中のインビトロ活性を、各サンプルについての用量応答曲線から計算した。１単位は、最大刺激の５０％を提供するのに必要な各サンプル中のｍｐｌリガンドの量と定義される。比活性は、ｍｐｌリガンドＥＬＩＳＡにより決められるｍｐｌリガンド濃度（ｎｇ／ｍｌ）で生物学的活性（単位／ｍｌ）を割ることにより計算した。
トランスフェクションされＣＯＳ細胞中で発現されるｍｐｌリガンド類似体の比生物学的活性を表４に示す。炭水化物付加に対するアミノ酸置換の効果も要約する。精製ヒト配列ｍｐｌリガンドは、前記アッセイにより決定される２００〜３００単位／ｎｇであるインビトロ活性を有する。表４から、付加的炭水化物鎖（実施例６のセクションＡで決められる）、例えばＮ４およびＮ１０を含んでいても、さらなるＮ−結合型炭水化物を含むｍｐｌリガンド類似体、ならびに天然型配列ｍｐｌリガンドが発現されることが明らかである。これらの類似体はともに、インビトロ生物学的活性も完全に維持していた。従って、Ｎ−結合型炭水化物を含むｍｐｌリガンド類似体が哺乳動物細胞において正常に発現され、それらは正常なまたは高められたインビトロ生物学的活性を有し得る。
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実施例１０
ＣＨＯ細胞中での発現およびｍｐｌリガンド１〜１７４、Ｎ４およびＮ１５の精製
ｍｐｌリガンド１〜１７４、Ｎ４およびＮ１５ｃＤＮＡを含むｐＤＳＲα２を、実施例２に記載のプロトコールを用い、以下の変更を加えてＤＨＦＲ−欠損ＣＨＯ細胞中にトランスフェクションした。
各類似体について一回のトランスフェクションを行った。トランスフェクションから３週間後、ｍｐｌリガンドＥＬＩＳＡによりｍｐｌリガンド発現をスクリーニングした。各型について三つの発現クローンを凍結貯蔵した。各類似体についての最も高い発現クローンをローラー瓶製造のため増殖した。Ｎ４について、ならし培地（５０％Ｄ−ＭＥＭ、５０％ＨＡＭＳ−Ｆ１２、１％ペニシリン／ストレプトマイシン／グルタミン、１％非必須アミノ酸（ギブコ社（Ｇｉｂｃｏ）製））７．４リッターを製造し、Ｎ１５について、ならし培地４．６リッターを製造した。
ｍｐｌリガンド１〜１７４（２．９Ｌ）、Ｎ４（７．４Ｌ），Ｎ１５（４．４Ｌ）を発現するＣＨＯ細胞を接種したローラー瓶からの血清非含有ＣＨＯ細胞ならし培地を、Ｓ１Ｙ１０（１００００ダルトン分子量カットオフ）アミコン螺旋限外濾過カートリッジを用いて、それぞれ１２−、１９−、および１２−倍に濃縮した。次に、濃縮したならし培地１５０ｍｌを、０．３ｍｌ／分の流速で３．３ｍｌ  ｈｕ−ＭＰＬ−Ｘ（レセプター）アフィニティカラムに直接負荷した。アフィニティカラムは、製造者により勧められるように、ファーマシア製ＣＮＢｒ活性化セファロース樹脂１ｍｌ当たりＭｐｌ−Ｘ（Ｍｐｌレセプターの可溶性細胞外ドメイン）１．０〜１．５ｍｇを結合させることにより構築した。負荷後、カラムを燐酸塩緩衝塩水（ＰＢＳ：１０ｍＭ  ＮａＰＯ4  ｐＨ６．８／１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）３０ｍｌで洗浄し、次に１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０／１Ｍ  ＮａＣｌ／１ｍＭ  ＣＨＡＰＳ６０ｍｌで洗浄した。ｍｐｌリガンド１〜１７４を、２０ｍＭ  ＣＡＰＳ（３−［シクロヘキシルアミノ］−１  プロパンスルホン酸）  ｐＨ１０．５／１Ｍ  ＮａＣｌ／１ｍＭ  ＣＨＡＰＳ（３−［（３−コルアミドプロピル）ジメチルアモニオ］−１−プロパンスルホネート）３０ｍｌで溶離した。
各溶離フラクションに１Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．０の０．６ｍＬを添加することによりフラクションを中和した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０／１Ｍ  ＮａＣｌ／１ｍＭ  ＣＨＡＰＳでの洗浄中に、１〜１７４ｍｐｌリガンドの明らかな「溶出（bleeding）」を示した。溶離フラクションをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。ｍｐｌリガンド１〜１７４を含むこれらのフラクションを貯留した。このアフィニティ精製を改良し、以下の変更を加えて繰り返した：０．５ｍＬ／分での負荷および溶離、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０／１Ｍ  ＮａＣｌ／１ｍＭ  ＣＨＡＰＳ洗浄での除去。
一本のｍｐｌリガンドバンドを含む全てのフラクションを、５０ｍＬ攪拌セル中のYM１０（１００００ドルトン分子量カットオフ）膜を用いてかつセントリコン装置に切り換えて濃縮した。この濃縮物０．５ｍＬを、０．２５ｍＬ／分でＰＢＳ平衡ファーマシアスーパーデックス（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ）２００ＨＲ１０／３０ゲル濾過カラムに直接添加して、フラクションを０．２５ｍＬずつ集めた。一本のｍｐｌリガンドバンド（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に基づく）を含む全ての溶離フラクションを貯留した。
他の型（Ｎ４およびＮ１５）のＣＨＯ細胞発現ｍｐｌリガンドを同様に（二つのアフィニティ精製物を貯留し、一本のスーパーデックス２００ゲル濾過カラムを通した）精製した。
実施例１１
ＣＨＯ細胞発現Ｎ４およびＮ１５についての炭水化物付加の測定
ＣＨＯ細胞中に発現されたｍｐｌリガンド中にＮ−結合型炭水化物が含まれるかどうか決定するために、実施例６に記載の方法で、以下の変更を加えてＳＤＳ−ＰＡＧＥウエスタンブロットによりならし培地を分析した。
ローラー瓶からのＣＨＯ  Ｄ−ならし培地を用いた。サンプルを、セントリコン（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ）−１０遠心分離濃縮器（マサチューセッツ州ビバリー在アミコン社（Ａｍｉｃｏｎ）製）に添加し、固定角ローター（ＪＡ２０．１）を用いるベックマンＪ２−ＨＳ遠心分離器で６０００ｒｐｍにて１時間回転させた。ｍｐｌリガンド類似体約１００ｎｇを含む濃縮サンプルを、ＳＤＳサンプル緩衝液（実施例６に記載）と共にＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに載置し、炭水化物を含まないＥ．ｃｏｌｉ発現ｍｐｌリガンドＭＫ１〜１７４も載置した。図９は、予想された量の炭水化物と相関する移動度の差異を示している。最も早い移動度の種であるＭｅｔ−Ｌｙｓ（１〜１７４）Ｅ．ｃｏｌｉｍｐｌリガンドの後に、ｍｐｌリガンド１〜１７４（ＣＨＯ）、Ｎ４（ＣＨＯ）およびＮ１５（ＣＨＯ）の順に続いた。図９参照のこと。非グリコシル化ｍｐｌリガンドに対する寸法増加の最も可能性の高い説明は、ｍｐｌリガンド１〜１７４（ＣＨＯ）上の付加的Ｏ−結合型炭水化物、Ｎ４（ＣＨＯ）上の付加的Ｏ−結合型炭水化物および一つの付加的Ｎ−結合型オリゴ糖、およびＮ１５（ＣＨＯ）上の付加的Ｏ−結合型炭水化物および二つの付加的Ｎ−結合型オリゴ糖である。
分子量の増加が本当にＮ−結合型炭水化物鎖の付加によるものであることを立証するために、実施例６に記載のＮ−結合型炭水化物を除去するためにＮ−グリカナーゼでサンプルを処理した。各サンプルは、ならし培地から精製されたｍｐｌリガンド類似体約１００ｎｇを含んでいた。
Ｎ−グリカナーゼでの処理後に、Ｎ４（ＣＨＯ）およびＮ１５（ＣＨＯ）の移動度はｍｐｌリガンド１〜１７４（ＣＨＯ）のものまで低下した。Ｎ−グリカナーゼでｍｐｌリガンドＭＫ１〜１７４（Ｅ．ｃｏｌｉ）またはｍｐｌリガンド１〜１７４（ＣＨＯ）を処理することは、いずれの型のものもＮ−結合型炭水化物を含むことが予想されないので、移動度に影響を与えなかった。Ｎ−グリカナーゼ処理を無処理に対して比較すると、Ｎ４についての寸法の差異は一本のＮ−結合型炭水化物鎖の寸法に対応し、Ｎ１５についての寸法差異は二本の炭水化物鎖の寸法に対応することが示される。すなわち、これらの二つのｍｐｌリガンド型についてのＮ−結合型グリコシル化部位の付加は、これらの種がＣＨＯ細胞中に発現されたときに追加のＮ−結合型炭水化物を生じさせる。図１０参照のこと。
実施例１２
ＣＨＯ細胞中に形成されたｍｐｌリガンド類似体のインビトロ生物学的活性
発現されＣＨＯ細胞またはＥ．ｃｏｌｉ細胞から精製された精製ｍｐｌリガンドおよび類似体を、標準としてＣＨＯ細胞中に産生されたｍｐｌリガンド１〜３３２を用いて得た曲線から活性を算出した以外は実施例９に記載のアッセイおよび因子依存性細胞系３２Ｄ−ＭＰＬを用いて、インビトロ生物学的活性について分析した。種々の型のインビトロ生物学的比活性を表５に示す。この表から、ＣＨＯ細胞中に発現される付加的炭水化物を含むｍｐｌリガンド類似体がインビトロ生物学的活性を有することが明らかである。
0003836877.tif 000009
実施例１３
ｍｐｌリガンド類似体のインビボ生物学的活性
種々の型のｍｐｌリガンドで処理したマウスからの血小板数を測定し、結果を図１１に示す。ＣＨＯ由来ｍｐｌリガンド１〜３３２、１〜１７４、Ｎ４およびＮ１５を製造し、ｍｐｌレセプターアフィニティクロマトグラフィーにより精製した。Ｅ．ｃｏｌｉ由来Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−ｍｐｌリガンド１〜１７４を製造し、従来のクロマトグラフィーにより精製した。示された濃度の各型のものを、正常な雌Ｂａｌｂ／ｃマウスに一日一回、５日間皮下投与した。最後の注射から２４時間後に尾静脈の横の小さな切り口からの試験血液を採血した。シスメックス（Ｓｙｓｍｅｘ）電気血球分析機（カリフォルニア州アーヴィン在バックスター・ダイアグノスティクス社（Ｂａｘｔｅｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．）製）を用いて血球分析を行った。データは、４匹の動物の平均測定値に平均の＋／−標準誤差を付して表す。総白血球数または赤血球数のような他の血球パラメーターは、これらの処理により影響を受けなかった（データは示さない）。
全ての型のものが血小板数の増加を刺激した。しかしながら、異なる型のものの活性は異なった。相対インビボ活性は、ｍｐｌリガンドＭＫ１〜１７４（Ｅ．ｃｏｌｉ）＜ｍｐｌリガンド１〜１７４（ＣＨＯ）＜Ｎ４（ＣＨＯ）＜ｍｐｌリガンド１〜３３２（ＣＨＯ）＜Ｎ１５（ＣＨＯ）であった。結果は、非天然Ｎ−結合型炭水化物の付加によりインビボ活性が増加することを示している。さらに、炭水化物の量の増加がインビボ活性を比例的に増加させることが示されている。
実施例１４
オーバーラップＰＣＲによるｍｐｌリガンド類似体および切頭型Ｎ１６〜Ｎ４０の構築
類似体Ｎ１６〜Ｎ４０（これらの類似体の構造については表６参照のこと）を、チェン（Ｃｈｅｎｇ）らのＰＮＡＳ第９１巻：５６９５頁（１９９４年）に記載のプロトコールを用いて、オーバーラップＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）により構築した。各構築において一般的に一つまたは二つの突然変異が導入された。
以下のオリゴヌクレオチドプライマーを合成して、類似体Ｎ１６〜Ｎ４０の調製に用いた：
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一つの新しいグリコシル化部位を導入する構築、二つの連続工程で行った。工程１において、４つの異なるオリゴヌクレオチドを用いて二つの反応を行った。これらのオリゴ化合物は、５’正方向プライマー、逆方向変異誘発プライマー、正方向変異誘発プライマー（通常、逆方向変異誘発プライマーに相補的である）および逆方向３’プライマーを含んでいた。逆方向３’プライマーは、停止コドンを導入し続いてＳａｌＩ制限部位を導入する配列を含んでいた。停止コドンは、１７５、１８４、１９２および２００位において導入された。すなわち、長さ１〜１７４、１〜１８３（Ｎ１６）、１〜１９１（Ｎ１７）および１〜１９９（Ｎ３１）の型のものを製造することができた。ＰＣＲ１は、鋳型ＤＮＡ（ｍｐｌリガンド１〜１７４配列または全長ｍｐｌリガンド１〜３３２配列を含むｐＤＳＲα２）、５’正方向プライマーおよび逆方向変異誘発プライマーを使用した。ＰＣＲ２は、鋳型ＤＮＡ、３’逆方向プライマーおよび正方向変異誘発プライマーを使用した。次に、二つのＰＣＲ反応を行い、増幅ＤＮＡフラグメントをアガロースゲル電気泳動により分離した。正しい寸法のＤＮＡフラグメントを含むアガロースの小片をゲルから切り出した。
ＰＣＲ１およびＰＣＲ２からのＤＮＡフラグメントを一緒にし、５’正方向および３’逆方向プライマーのみを用いて第３のＰＣＲ反応を実施した。すなわち、ｍｐｌリガンドに挿入された所望の突然変異を含む全長ＤＮＡセグメントを増幅した。
アガロースゲル電気泳動により、増幅したフラグメントを再び分離し、正しい寸法のＤＮＡフラグメントを、ＧｅｎｅＣｌｅａｎTMキットおよび製造者（ＢＩＯ  １０１社）により提供される手順を用いて精製した。精製したＤＮＡをＸｂａＩおよびＳａｌＩで消化し、次に再びＧｅｎｅＣｌｅａｎTMキットを用いて精製した。次にフラグメントをＸｂａＩおよびＳａｌＩで切断したｐＤＳＲα２内に連結した。連結ＤＮＡを、キャリアｔＲＮＡの存在下に０．３Ｍ  ＮａＯＡｃ  ｐＨ５．２中エタノール２容を用いて沈殿させ、Ｅ．ｃｏｌｉ中に形質転換した。クローンを制限分析およびアガロースゲル電気泳動により試験して、これらが正しい寸法のＤＮＡ挿入物を含むことを確認した。次に精製プラスミドＤＮＡを調製し、ｍｐｌリガンド挿入体を配列決定して、所望の突然変異の存在を確認し、更なるアミノ酸変化が導入されていないことを確認した。
幾つかの場合において、二つ異常の突然変異が同時に組み合わされた：すなわちＮ２９、Ｎ３３、Ｎ３４、Ｎ３５、Ｎ３９およびＮ４０を参照されたい。これは、新しい置換を、既に変化を含んでいるＤＮＡに導入することにより行うことができる。例えば、Ｎ１５中にＮ２３変化を導入することによりＮ３３を製造した。この場合、Ｎ２３変異誘発プライマーおよびＮ１５鋳型ＤＮＡを用いて前記手順を行った。
もう一つの方法において、鋳型ＤＮＡ中に二つの変化を同時に導入することができる。鋳型ＤＮＡは天然型配列を含むことができるか、または既に変化を含むｍｐｌリガンド型をコードする配列を含むことができる。これらの場合、工程１は三つのＰＣＲ反応と６つのオリゴ化合物を含んでいた。オリゴ化合物は、５’正方向プライマー、２対の正方向および逆方向変異誘発プライマー、および逆方向３’プライマーを含んでいた。プライマーの各対は互いに相補的であり、一つの新しいグリコシル化部位を導入するように設計された配列を含んでいた。
ＰＣＲ１は、鋳型ＤＮＡ、５’正方向プライマーおよび逆方向変異誘発プライマー（pair１からのもの）を含んでいた。ＰＣＲ２は、鋳型ＤＮＡ、正方向変異誘発プライマー（pair１からのもの）および逆方向変異誘発プライマー（pair２からのもの）（ここでpair２プライマーはpair１プライマーに対して３’である）を含んでいた。ＰＣＲ３は、鋳型ＤＮＡ、正方向変異誘発プライマー（pair２からのもの）および逆方向３’プライマーを含んでいた。
各ＰＣＲ反応からのＤＮＡフラグメントを、アガロースゲル電気泳動により分離し、前述のように切り出した。次に、三つのＤＮＡグラグメントを一緒にし、５’正方向および３’逆方向プライマーのみを用いて再びＰＣＲにより増幅した。
次に、二つの新しいグリコシル化部位を含む配列を有する意図する遺伝子全体をコードするＤＮＡセグメントを精製し、ＸｂａＩおよびＳａｌＩで切断し、前述のようにＸｂａＩおよびＳａｌＩ切断ｐＤＳＲα２内に連結した。
既に突然変異を含む鋳型においてＰＣＲ反応を行うことにより複数の突然変異を組み合わせることもできる。例えば、Ｎ３９を、Ｎ１５鋳型ＤＮＡにＮ３６およびＮ３８変化を導入することにより製造した。これは、Ｎ３６の製造に用いたもの（Ｎ３６（１））とは異なる組み合わせのプライマー（Ｎ３６（２））を用いて行った。前記プライマーを参照のこと。両方の組み合わせのプライマーが同じ突然変異を導入した。
より長いｍｐｌリガンド型を製造することもできた。すなわち、ＰＣＲ３における３’逆方向プライマー、（工程１）および工程２のＰＣＲプライマーがＮ３１の製造に用いられたプライマーであること以外はＮ３９と同様の方法によりＮ４０を製造した。このプライマーは、ＳａｌＩ制限部位に続く２００位に停止コドンを導入した。さらに、ＰＣＲ３に用いられる鋳型ＤＮＡは、全長ｍｐｌリガンド（１〜３３２）をコードする配列を含んでいた。
典型的ＰＣＲ反応混合物は、正方向および逆方向プライマー（５ｐｍ／μｌ）の各４μｌ、鋳型（５０ｎｇ）１μｌ、５×ＬＰ緩衝液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｃｉｎｅ  ｐＨ８．７／２５％グリセロール／４２５ｍＭ  ＫＯＡｃ）１０μｌ、ｄＮＴＰストック（各１ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）１０μｌ、ｒｔＴｈポリメラーゼ（パーキンエルマー社（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）製；２．５Ｕ／μｌ）０．８μｌ、およびＶｅｎｔポリメラーゼ（ＮＥＢ；１×ＬＰ緩衝液中１：１００の新しい希釈後に０．０１Ｕ／μｌ）２μｌを含んでいた。Ｈ2Ｏを添加して最終容量を５０μｌにした。全ての成分を示す順番で一緒に添加し、最初のサイクル中の温度が６０℃を越えたときに５０ｍＭ  ＭｇＯＡｃ  １μｌを添加することによりＰＣＲを開始した。反応条件：９４℃、１０秒／４５℃、１分／６８℃、５分の２サイクル、続いて９４℃、１０秒／５５℃、１分／６８℃、５分の２５サイクル。
これらの一般的手順を用いて、表６に示すｍｐｌリガンド類似体および切頭型Ｎ１６〜Ｎ４０を構築した。各型についてのＤＮＡ配列の変化を示す。
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前記表中の、符号（ｉ）は記載のアミノ酸を挿入していることを示す。例えば、Ｇｌｕ57→Ａｓｎ55'(i)、Ｔｈｒ57（表６中の類似体Ｎ２３）は、５７位のＧｌｕがＴｈｒで置換されており、さらに、５５位においてＭｅｔの直後にＡｓｎが挿入されており、その後のアミノ酸がその前に付された番号を維持するようにＡｓｎは５５’と番号が付けられた。
先の実施例からの全ての変化を含む実施例は、「＋」の符号で結合された特定の類似体番号により示される。Ｎ３５、Ｎ３９およびＮ４０を参照のこと。これらの類似体のアミノ酸鎖の長さを括弧内に示す。すなわち、類似体Ｎ３５は、類似体Ｎ４、Ｎ２３、Ｎ３０およびＮ３１についての全ての変化を組み合わせて含む。Ｎ３１について示される変化は、類似体Ｎ３５が１９９アミノ酸長であることを示す。表６中の全ての類似体は、異なる長さであることを示す場合を除いて１７４アミノ酸長である（あるいは、アミノ酸が挿入されている場合、合計の長さは挿入されたアミノ酸の数により増加する）。
実施例１５
ｍｐｌリガンド類似体および切頭型Ｎ１６〜Ｎ４０の特徴付け
Ａ．ｍｐｌリガンド類似体の発現レベルおよびインビトロ生物学的活性の測定
種Ｎ１６〜Ｎ４０を、電気穿孔法（実施例５）またはＣａＰＯ4法（哺乳動物細胞トランスフェクションキット；Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ  ｍｅｄｉａ）を用いてＣＯＳ細胞中にトランスフェクションした。３〜４日後、細胞非含有ならし培地を採取し、アリコートを取り−70℃で貯蔵した。実施例７に記載されているように発現レベルをＥＬＩＳＡアッセイにより測定した。上澄みも、実施例９に記載の方法で一つの変更を加えて、生物学的活性について検定した。活性は、標準として精製ＣＨＯ細胞発現ｍｐｌリガンド１〜３３２を用いて標準曲線から算出した。
結果を表７に示す。表７に示すように、大部分のｍｐｌリガンド類似体は発現し分泌された。類似体の一部は、分泌が増加しているようであった。これらのサンプルのバイオアッセイは、大部分のものの比活性が非改変型のものにも匹敵することを示した。類似体の一部は、複数のＮ−結合型炭水化物鎖を含んでいた（以下参照のこと）。これは、炭水化物付加が類似体の分泌および正常インビトロ活性の増加につながり得ることを示している。
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Ｂ．炭水化物付加の測定
表６に示す類似体を、実施例６に記載の手順を用いてＮ−結合型炭水化物を付加しているか試験した。
一部の類似体（Ｎ２１、Ｎ２２、Ｎ３０、Ｎ３３およびＮ３６）を、変更した手順を用いても試験した。この試験は必要である。なぜなら、ウエスタンブロットを行うために用いたモノクローナル抗体がアミノ酸残基４７〜６２を含むペプチドに対するものであり、表６に記載の類似体の一部がこの抗体（例えばＮ２１）との免疫反応性に影響を与える置換を含むからである。従って、これらの類似体を分析するために、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞発現ｍｐｌリガンド１〜１６３に対するマウスモノクローナル抗体を用いて上澄みを免疫沈殿させた。
典型的に、ｍｐｌリガンド類似体５０ｎｇを免疫沈殿させるために抗体１５μｇを使用した。ウサギ抗ｍｐｌリガンドポリクローナル抗体（典型的に１μｇ／ｍｌ；Ｅ．ｃｏｌｉ細胞発現ｍｐｌリガンド１〜１６３に対する抗体）および抗ウサギＥＣＬキット（アマーシャム社（Ａｍｅｒｓｈａｍ）製）を用いてブロットをインキュベートすることにより免疫沈殿バンドを視覚化する以外は実施例６に記載の方法により、免疫沈殿材料を用いてウエスタンブロットを行った。種々の実験の結果を表７に示す。一部の類似体は、Ｎ−結合型炭水化物（N２１、N２２、N２３、N２９、N３０、N３１、N３３、N３４、N３５、N３６、N３８、N３９およびN４０）の存在を示す寸法増加を示した。これらの類似体のサブセットは二つ以上のＮ−結合鎖を有していた：例えばN２９、N３３、N３４、N３５、N３９およびN４０。これらの類似体は正常またはより高いレベルで分泌され、ｍｐｌリガンド１〜１７４に匹敵するインビトロ生物学的活性を有していた。このことは、発現または生物学的活性のいずれにも悪影響を与えることなく多機能性Ｎ−結合型グリコシル化部位をｍｐｌリガンドに導入し得ることを示している。
複数のオリゴ糖鎖をｍｐｌリガンドに付加し得ることを示すために、ＣＯＳ細胞中に発現した種々の類似体を実施例６に記載のようにしてウエスタンブロットにより分析した。図１２は、付加したＮ−結合型グリコシル化部位の数の増加につれて類似体の移動度が低下することを示している。４つの新しい部位を有する類似体Ｎ３９およびＮ４０が示される。最もＮ−結合部位を有する類似体は移動度が最も低い。この結果は、１〜１７４および１〜１９９の両方の型のｍｐｌリガンドについて観察される。このことは、少なくとも４つの類似体を組み合わせて複数のＮ−結合型炭水化物鎖を有する新しい類似体を得ることができることを示している。
実施例１６
Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒを含むグリコシル化部位とＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒを含む部位との比較
Ｎ−結合型グリコシル化部位は、Ａｓｎ−Ｘ−ＴｈｒまたはＡｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ（ＸはＰｒｏ以外の２０個の天然アミノ酸のうちの任意の一つであり得る）を含む。第３の位置においてＳｅｒまたはＴｈｒのいずれが好ましいかを決めることが望まれる。従って、第３の位置にＳｅｒまたはＴｈｒを含むｍｐｌリガンドグリコシル化類似体をそれぞれが含む２組の類似体を試験して、Ｎ−結合型グリコシル化部位の占有率％への影響があるかどうか調べた。Ｎ１５は二つのＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ部位を含み、Ｎ２９は正確に同じ位置に二つのＡｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ部位を含む。同様に、Ｎ３０は一つのＡｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ部位を含み、Ｎ３８は同じ位置に一つのＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ部位を含む。
これらの２組の類似体を比較するために、それらをＣＯＳ細胞中に発現させ、分泌ｍｐｌリガンドを実施例６に記載のようにウエスタンブロットに付した。図１３は結果を示す。Ｎ１５は、Ｎ２９と比べて大きく増加した割合でグリコシル化ｍｐｌリガンドを有する。対照的に、Ｎ３０とＮ３８とを比較した場合、グリコシル化と非グリコシル化ｍｐｌリガンドの割合には差異がほとんど無かった。これらの結果は、Ａｓｎ−Ｘ−ＳｅｒとＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒの両方をｍｐｌリガンド中に導入することができ、両者がＮ−結合型炭水化物付加のための部位として作用し得ることを示している。さらに、ある場合には、Ａｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ列が好ましい（すなわち、より効果的にグリコシル化される）。
本発明を、その好ましい実施態様と考えられるものについて説明したが、開示された実施態様に限定されるものではなく、それどころか、添付の請求の範囲の思想および範囲内に含まれる種々の変更および均等物が包含され、請求の範囲は、そのような変更および均等物を含むように最も広く解釈されるべきものである。
配列表
配列番号：１の情報
配列の特徴
配列の長さ：１３４２塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ
特徴
特徴を示す記号：ＣＤＳ
存在位置：３６．．１０９４
特徴
特徴を示す記号：ｓｉｇ  ペプチド
存在位置：１．．９８
特徴
特徴を示す記号：成熟ペプチド
存在位置：９９．．１０９４
配列
0003836877.tif 000018
0003836877.tif 000019
配列番号：２の情報
配列の特徴
配列の長さ：３５３アミノ酸
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
配列
0003836877.tif 000020
0003836877.tif 000021
配列番号：３の情報
配列の特徴
配列の長さ：６００塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ
特徴
特徴を示す記号：ＣＤＳ
存在位置：１２．．５９６
特徴
特徴を示す記号：ｓｉｇ  ペプチド
存在位置：１２．．７４
特徴
特徴を示す記号：成熟ペプチド
存在位置：７５．．９６
配列
0003836877.tif 000022
配列番号：４の情報
配列の特徴
配列の長さ：１９５アミノ酸
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
配列
0003836877.tif 000023
配列番号：５の情報
配列の特徴
配列の長さ：２２塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
記載：／ｄｅｓｃ＝核酸
配列
0003836877.tif 000024
配列番号：６の情報
配列の特徴
配列の長さ：２２塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
記載：／ｄｅｓｃ＝核酸
配列
0003836877.tif 000025
配列番号：７の情報
配列の特徴
配列の長さ：２４塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
記載：／ｄｅｓｃ＝核酸
配列
0003836877.tif 000026
配列番号：８の情報
配列の特徴
配列の長さ：２５塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
記載：／ｄｅｓｃ＝核酸
配列
0003836877.tif 000027
配列番号：９の情報
配列の特徴
配列の長さ：２１塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
記載：／ｄｅｓｃ＝核酸
配列
0003836877.tif 000028
配列番号：１０の情報
配列の特徴
配列の長さ：２４塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
記載：／ｄｅｓｃ＝核酸
配列
0003836877.tif 000029
配列番号：１１の情報
配列の特徴
配列の長さ：２６塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
記載：／ｄｅｓｃ＝核酸
配列
0003836877.tif 000030
配列番号：１２の情報
配列の特徴
配列の長さ：２１塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
記載：／ｄｅｓｃ＝核酸
配列
0003836877.tif 000031
配列番号：１３の情報
配列の特徴
配列の長さ：２５塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
記載：／ｄｅｓｃ＝核酸
配列
0003836877.tif 000032
配列番号：１４の情報
配列の特徴
配列の長さ：３２塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
記載：／ｄｅｓｃ＝核酸
配列
0003836877.tif 000033
配列番号：１５の情報
配列の特徴
配列の長さ：２５塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
記載：／ｄｅｓｃ＝核酸
配列
0003836877.tif 000034
配列番号：１６の情報
配列の特徴
配列の長さ：２２塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
記載：／ｄｅｓｃ＝核酸
配列
0003836877.tif 000035
配列番号：１７の情報
配列の特徴
配列の長さ：２５塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
記載：／ｄｅｓｃ＝核酸
配列
0003836877.tif 000036
配列番号：１８の情報
配列の特徴
配列の長さ：３８塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
記載：／ｄｅｓｃ＝核酸
配列
0003836877.tif 000037
配列番号：１９の情報
配列の特徴
配列の長さ：２８塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
記載：／ｄｅｓｃ＝核酸
特徴
特徴を示す記号：−
存在位置：相補（１．．２８）
配列
0003836877.tif 000038
配列番号：２０の情報
配列の特徴
配列の長さ：２９塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
記載：／ｄｅｓｃ＝核酸
特徴
特徴を示す記号：−
存在位置：相補（１．．２９）
配列
0003836877.tif 000039
配列番号：２１の情報
配列の特徴
配列の長さ：２９塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
記載：／ｄｅｓｃ＝核酸
特徴
特徴を示す記号：−
存在位置：相補（１．．２９）
配列
0003836877.tif 000040
配列番号：２２の情報
配列の特徴
配列の長さ：２９塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
記載：／ｄｅｓｃ＝核酸
配列
0003836877.tif 000041
配列番号：２３の情報
配列の特徴
配列の長さ：２９塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
記載：／ｄｅｓｃ＝核酸
特徴
特徴を示す記号：−
存在位置：相補（１．．２９）
配列
0003836877.tif 000042
配列番号：２４の情報
配列の特徴
配列の長さ：３３塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
記載：／ｄｅｓｃ＝核酸
配列
0003836877.tif 000043
配列番号：２５の情報
配列の特徴
配列の長さ：３３塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
記載：／ｄｅｓｃ＝核酸
特徴
特徴を示す記号：−
存在位置：相補（１．．３３）
配列
0003836877.tif 000044
配列番号：２６の情報
配列の特徴
配列の長さ：３１塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
記載：／ｄｅｓｃ＝核酸
配列
0003836877.tif 000045
配列番号：２７の情報
配列の特徴
配列の長さ：３１塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
記載：／ｄｅｓｃ＝核酸
特徴
特徴を示す記号：−
存在位置：相補（１．．３１）
配列
0003836877.tif 000046
配列番号：２８の情報
配列の特徴
配列の長さ：３１塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
記載：／ｄｅｓｃ＝核酸
配列
0003836877.tif 000047
配列番号：２９の情報
配列の特徴
配列の長さ：３１塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
記載：／ｄｅｓｃ＝核酸
特徴
特徴を示す記号：−
存在位置：相補（１．．３１）
配列
0003836877.tif 000048
配列番号：３０の情報
配列の特徴
配列の長さ：３２塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
記載：／ｄｅｓｃ＝核酸
配列
0003836877.tif 000049
配列番号：３１の情報
配列の特徴
配列の長さ：３２塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
記載：／ｄｅｓｃ＝核酸
特徴
特徴を示す記号：−
存在位置：相補（１．．３２）
配列
0003836877.tif 000050
配列番号：３２の情報
配列の特徴
配列の長さ：３２塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
記載：／ｄｅｓｃ＝核酸
配列
0003836877.tif 000051
配列番号：３３の情報
配列の特徴
配列の長さ：３２塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
記載：／ｄｅｓｃ＝核酸
特徴
特徴を示す記号：−
存在位置：相補（１．．３２）
配列
0003836877.tif 000052
配列番号：３４の情報
配列の特徴
配列の長さ：３１塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
記載：／ｄｅｓｃ＝核酸
配列
0003836877.tif 000053
配列番号：３５の情報
配列の特徴
配列の長さ：３１塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
記載：／ｄｅｓｃ＝核酸
特徴
特徴を示す記号：−
存在位置：相補（１．．３１）
配列
0003836877.tif 000054
配列番号：３６の情報
配列の特徴
配列の長さ：３２塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
記載：／ｄｅｓｃ＝核酸
配列
0003836877.tif 000055
配列番号：３７の情報
配列の特徴
配列の長さ：３２塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
記載：／ｄｅｓｃ＝核酸
特徴
特徴を示す記号：−
存在位置：相補（１．．３２）
配列
0003836877.tif 000056
配列番号：３８の情報
配列の特徴
配列の長さ：３１塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
記載：／ｄｅｓｃ＝核酸
配列
0003836877.tif 000057
配列番号：３９の情報
配列の特徴
配列の長さ：３１塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
記載：／ｄｅｓｃ＝核酸
特徴
特徴を示す記号：−
存在位置：相補（１．．３１）
配列
0003836877.tif 000058
配列番号：４０の情報
配列の特徴
配列の長さ：３１塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
記載：／ｄｅｓｃ＝核酸
配列
0003836877.tif 000059
配列番号：４１の情報
配列の特徴
配列の長さ：３１塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
記載：／ｄｅｓｃ＝核酸
特徴
特徴を示す記号：−
存在位置：相補（１．．３１）
配列
0003836877.tif 000060
配列番号：４２の情報
配列の特徴
配列の長さ：２４塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
記載：／ｄｅｓｃ＝核酸
配列
0003836877.tif 000061
配列番号：４３の情報
配列の特徴
配列の長さ：２４塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
記載：／ｄｅｓｃ＝核酸
特徴
特徴を示す記号：−
存在位置：相補（１．．２４）
配列
0003836877.tif 000062
配列番号：４４の情報
配列の特徴
配列の長さ：２４塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
記載：／ｄｅｓｃ＝核酸
配列
0003836877.tif 000063
配列番号：４５の情報
配列の特徴
配列の長さ：２４塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
記載：／ｄｅｓｃ＝核酸
特徴
特徴を示す記号：−
存在位置：相補（１．．２４）
配列
0003836877.tif 000064
配列番号：４６の情報
配列の特徴
配列の長さ：２７塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
記載：／ｄｅｓｃ＝核酸
配列
0003836877.tif 000065
配列番号：４７の情報
配列の特徴
配列の長さ：２７塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
記載：／ｄｅｓｃ＝核酸
特徴
特徴を示す記号：−
存在位置：相補（１．．２７）
配列
0003836877.tif 000066
配列番号：４８の情報
配列の特徴
配列の長さ：３３塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
記載：／ｄｅｓｃ＝核酸
特徴
特徴を示す記号：−
存在位置：相補（１．．３３）
配列
0003836877.tif 000067
配列番号：４９の情報
配列の特徴
配列の長さ：３１塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
記載：／ｄｅｓｃ＝核酸
配列
0003836877.tif 000068
配列番号：５０の情報
配列の特徴
配列の長さ：３１塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
記載：／ｄｅｓｃ＝核酸
特徴
特徴を示す記号：−
存在位置：相補（１．．３１）
配列
0003836877.tif 000069
配列番号：５１の情報
配列の特徴
配列の長さ：２６塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
記載：／ｄｅｓｃ＝核酸
配列
0003836877.tif 000070
配列番号：５２の情報
配列の特徴
配列の長さ：２６塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
記載：／ｄｅｓｃ＝核酸
特徴
特徴を示す記号：−
存在位置：相補（１．．２６）
配列
0003836877.tif 000071
配列番号：５３の情報
配列の特徴
配列の長さ：３１塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
記載：／ｄｅｓｃ＝核酸
配列
0003836877.tif 000072
配列番号：５４の情報
配列の特徴
配列の長さ：３１塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
記載：／ｄｅｓｃ＝核酸
特徴
特徴を示す記号：−
存在位置：相補（１．．３１）
配列
0003836877.tif 000073
配列番号：５５の情報
配列の特徴
配列の長さ：２７塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
記載：／ｄｅｓｃ＝核酸
配列
0003836877.tif 000074
配列番号：５６の情報
配列の特徴
配列の長さ：２７塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
記載：／ｄｅｓｃ＝核酸
特徴
特徴を示す記号：−
存在位置：相補（１．．２７）
配列
0003836877.tif 000075
【図１Ａ】
0003836877.tif 000076
【図１Ｂ】
0003836877.tif 000077
【図１Ｃ】
0003836877.tif 000078
【図２Ａ】
0003836877.tif 000079
【図２Ｂ】
0003836877.tif 000080
【図３】
0003836877.tif 000081
【図４】
0003836877.tif 000082
【図５】
0003836877.tif 000083
【図６】
0003836877.tif 000084
【図７】
0003836877.tif 000085
【図８Ａ】
0003836877.tif 000086
【図８Ｂ】
0003836877.tif 000087
【図８Ｃ】
0003836877.tif 000088
【図８Ｄ】
0003836877.tif 000089
【図９】
0003836877.tif 000090
【図１０】
0003836877.tif 000091
【図１１】
0003836877.tif 000092
【図１２】
0003836877.tif 000093
【図１３】
0003836877.tif 000094