(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＧＦを有効成分として含有することを特徴とする軟骨障害治療剤。
【請求項２】
ＨＧＦを有効成分として含有することを特徴とする軟骨細胞増殖促進剤。
【請求項３】
ＨＧＦを有効成分として含有することを特徴とするプロテオグリカン生成促進剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は軟骨疾患の治療及び予防に有用な薬剤に関し、より詳細には、ＨＧＦ(Hepatocyte Growth Factor)を有効成分として含有する軟骨障害治療剤、軟骨細胞増殖促進剤及びプロテオグリカン生成促進剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
軟骨は軟骨細胞とこれを取り囲む基質からなる結合組織であり、関節、脊柱の椎間板、肋軟骨、耳介、外耳道、恥骨結合、咽喉蓋などに存在する。軟骨は、軟骨細胞と、軟骨細胞が産生する軟骨基質からなり、軟骨基質はコラーゲン線維などの線維成分、プロテオグリカン及び水が主な成分であり、軟骨は軟骨基質の混じりぐあいにより、硝子軟骨（肋軟骨、咽喉軟骨、関節軟骨など）、弾性軟骨（耳介軟骨など）及び線維軟骨（椎間板軟骨、恥骨軟骨、関節軟骨など）に分類することができる。上記の軟骨基質において、コラーゲン線維は軟骨の張力及び剪断力に対する剛性と強度に関与し、プロテオグリカンは圧縮力に対する強度に関与し、水は生体組織として粘弾性体としての特性にあずかっているとされており、例えば、関節軟骨の場合、軟骨の質重量の７８．６％は水が占め、コラーゲンが２０％を占め、プロテオグリカンが７％を占めている。
軟骨の作用としては、骨端の摩擦の低減（骨間の軟骨）、弾性の保持（耳介軟骨など）、運動機能（肋軟骨、恥骨軟骨など）が挙げられる。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
上記のように軟骨は生体の機能維持の上で重要な作用を有しており、従来から軟骨の障害に起因する種々の疾患が知られ、例えば、軟骨形成異常症、変形性関節症、変形性椎間板症、骨折の修復・治癒不全などが例示される。特に、高齢化社会の到来、スポーツによる外傷の増加、キーパンチャー病などに代表される職業病の出現などにより、関節障害患者は著しく増加しており、この領域における医療の進歩が要望されている。
従来から軟骨障害を治療するために種々の治療法が試みられてきているが、それらは直接的に原因の解消を目的とするものではなく、例えば、抗炎症剤などを投与することにより、その疾患に基づく痛みなどの障害を抑制する方法；関節にヒアルロン酸製剤などを注入して関節の動きを潤滑にする方法など、対症療法的なものでしかなかった。
このように、関節障害の根治的治療法は見出されておらず、特に変形性関節症は患者数が多く、その有効な治療法が切望されている。
【０００４】
本発明者らは上記の課題を解決するために鋭意検討した結果、ＨＧＦが軟骨細胞の増殖を促進し、またプロテオグリカンの生成を促進する作用を有し、軟骨障害に起因する種々の疾患の治療に有効であることを見出し、本発明を完成させた。  上記のＨＧＦは肝実質細胞を in vitro で増殖させる因子として見出されたタンパク質である（Biochem Biophys Res Commun, 122, 1450, 1984、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 6489, 1986、 FFBS Letter, 22, 311, 1987、Nature, 342, 440, 1989、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 3200, 1990）。肝実質細胞を特異的に増殖させる因子として発見されたＨＧＦは、本発明者らをはじめとする多くの研究者による最近の研究成果によって、生体内で組織傷害治癒などの種々の活性を示している事が明らかとなり、研究対象としてのみならずヒトや動物の治療薬などへの応用に期待が集まっている。
ＨＧＦは主に間葉系の細胞により産生されていることが解明されており、近隣細胞から必要に応じてＨＧＦが供給される、所謂パラクリン機構が成立していることが明らかにされている。しかしながら、肝臓や腎臓に傷害を受けたとき、傷害を受けていない臓器、例えば肺などにおいてもＨＧＦの産生が高まることから、所謂エンドクリン機構によってもＨＧＦが供給されていると考えられる。
このようなＨＧＦの受容体に関して、最近の研究から、ｃ−Ｍｅｔ原腫瘍遺伝子がＨＧＦ受容体をコードしていることが確定的になった(Bottaro et al., Science 251, 802-804, 1991; Naldini et al., Oncogene 6, 501-504, 1991)。
上述のようにＨＧＦに関しては多くの知見が得られているが、ＨＧＦの軟骨細胞増殖促進作用及びプロテオグリカン生成促進作用は従来知られていない新規な知見であり、かかる知見に基づいてなされた本発明は軟骨障害に起因する種々の疾患の治療に有用な薬剤を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
上記の課題を解決するためになされた本発明は、
▲１▼ＨＧＦを有効成分として含有することを特徴とする軟骨障害治療剤；
▲２▼ＨＧＦを有効成分として含有することを特徴とする軟骨細胞増殖促進剤；
▲３▼ＨＧＦを有効成分として含有することを特徴とするプロテオグリカン生成促進剤に関する。
【０００６】
本発明で使用されるＨＧＦとしては、医薬として使用できる程度に精製されたものであれば、種々の方法で調製されたものを用いることができる。
ＨＧＦの調製方法としては、各種の方法が知られている。例えば、ラット、ウシ、ウマ、ヒツジなどの哺乳動物の肝臓、脾臓、肺臓、骨髄、脳、腎臓、胎盤等の臓器、血小板、白血球等の血液細胞や血漿、血清などから抽出、精製して得ることができる(FEBS Letters, 224, 312, 1987、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 5844, 1989など参照)。
また、ＨＧＦを産生する初代培養細胞や株化細胞を培養し、培養物（培養上清、培養細胞等）から分離精製してＨＧＦを得ることもできる。あるいは遺伝子工学的手法によりＨＧＦをコードする遺伝子を適切なベクターに組込み、これを適当な宿主に挿入して形質転換し、この形質転換体の培養上清から目的とする組換えＨＧＦを得ることができる(例えば、Nature, 342, 440, 1989、特開平５−１１１３８３号公報、Biochem. Biophys. Res. Commun., 163, 967, 1989など参照)。上記の宿主細胞は特に限定されず、従来から遺伝子工学的手法で用いられている各種の宿主細胞、例えば大腸菌、枯草菌、酵母、糸状菌、植物又は動物細胞などを用いることができる。
【０００７】
より具体的には、ＨＧＦを生体組織から抽出精製する方法としては、例えば、ラットに四塩化炭素を腹腔内投与し、肝炎状態にしたラットの肝臓を摘出して粉砕し、Ｓ−セファロース、ヘパリンセファロースなどのゲルカラムクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ等の通常の蛋白質精製法にて精製することができる。
また、遺伝子組換え法を用い、ヒトＨＧＦのアミノ酸配列をコードする遺伝子を、ウシパピローマウィルスＤＮＡなどのベクターに組み込んだ発現ベクターによって動物細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、マウスＣ１２７細胞、サルＣＯＳ細胞などを形質転換し、その培養上清より得ることができる。
【０００８】
かくして得られたＨＧＦは、ＨＧＦと実質的に同効である限り、そのアミノ酸配列の一部が欠失又は他のアミノ酸により置換されていたり、他のアミノ酸配列が一部挿入されていたり、Ｎ末端及び／又はＣ末端に１又は２以上のアミノ酸が結合していたり、あるいは糖鎖が同様に欠失又は置換されていてもよい。
【０００９】
本発明の治療剤及び促進剤は上記のＨＧＦを有効成分とし、ＨＧＦは後記試験例に示されるように、軟骨細胞の増殖を促進し、またプロテオグリカンの生成を促進する作用を有する。更に、ＨＧＦは、障害を受けていない軟骨組織には作用を示さず、障害を受けている軟骨組織にのみ作用するので、副作用を惹起するおそれが少ないという特長を有する。従って、本発明の治療剤及び促進剤は、軟骨障害に起因する各種疾患の治療・予防に有効であり、これらには例えば下記の疾患が包含される。
【００１０】
変形性関節炎
軟骨形成異常症
骨折の治癒及び修復
外傷による関節軟骨、関節円板の修復
急性化膿性関節炎
結核性関節炎
梅毒性関節炎
慢性関節リウマチ
リウマチ熱、全身性エリテマトーデス
変形性脊椎症
椎間板ヘルニア
骨移植による修復
【００１１】
本発明の治療剤及び促進剤は、ヒトの他、哺乳動物（例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、イヌ、ネコ等）における軟骨障害に起因する種々の疾患の治療・予防に適用される。
【００１２】
本発明の治療剤及び促進剤は種々の製剤形態（例えば、液剤、固形剤、カプセル剤等）をとりうるが、一般的には有効成分であるＨＧＦのみ又はそれと慣用の担体と共に注射剤、吸入剤、坐剤又は経口剤とされる。当該注射剤は常法により調製することができ、例えば、ＨＧＦを適切な溶剤（例えば、滅菌された水、緩衝液、生理食塩水等）に溶解した後、フィルター等で濾過して滅菌し、次いで無菌的な容器に充填することにより調製することができる。注射剤中のＨＧＦ含量としては、通常0.0002〜0.2(W/V%)程度、好ましくは0.001〜0.1(W/V%)程度に調整される。また、経口薬としては、例えば、錠剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、軟又は硬カプセル剤、液剤、乳剤、懸濁剤、シロップ剤などの剤形に製剤化され、これらの製剤は製剤化の常法に準じて調製することができる。坐剤も慣用の基剤（例えば、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチン、マクロゴール、ウィテップゾル等）を用いた製剤上の常法によって調製することができる。また、吸入剤も製剤上の常套手段に準じて調製することができる。
製剤中のＨＧＦ含量は、剤形、適用疾患などに応じて適宜調整することができる。
【００１３】
製剤化に際して、好ましくは安定化剤が添加され、安定化剤としては、例えば、アルブミン、グロブリン、ゼラチン、グリシン、マンニトール、グルコース、デキストラン、ソルビトール、エチレングリコールなどが挙げられる。さらに、本発明の製剤は製剤化に必要な添加物、例えば、賦形剤、溶解補助剤、酸化防止剤、無痛化剤、等張化剤等を含んでいてもよい。液状製剤とした場合は凍結保存、又は凍結乾燥等により水分を除去して保存するのが望ましい。凍結乾燥製剤は、用時に注射用蒸留水などを加え、再溶解して使用される。
【００１４】
本発明の治療剤及び促進剤は、その製剤形態に応じた適当な投与経路により投与され得る。例えば、注射剤の形態にして静脈、動脈、皮下、筋肉内などに投与することができる。その投与量は、患者の症状、年齢、体重などにより適宜調整されるが、通常ＨＧＦとして0.05mg〜500mg、好ましくは１mg〜100mgであり、これを１日１回ないし数回に分けて投与するのが適当である。
【００１５】
【発明の効果】
本発明において、有効成分であるＨＧＦは、軟骨細胞の増殖を促進し、またプリテオグリカンの生成を促進させる作用を有している。従って、本発明の治療剤及び促進剤は、前述した軟骨障害に起因する各種疾患の治療・予防に有用である。更に、ＨＧＦは、障害を受けている軟骨組織にのみ作用するので、副作用の少ない薬剤を得ることができるという効果を奏する。
【００１６】
【実施例】
以下、実施例及び製造例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。なお、以下の実験で使用した材料及び方法は以下のとおりである。
【００１７】
材料と方法
▲１▼in situハイブリダイゼーション
ラットＨＧＦ−ｃＤＮＡ（ＲＢＣ１  クローン）(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 3200, 1990)の１．４ｋｂ  ＥｃｏＲＩ断片をｐＧＥＭ７ベクターにサブクローンし［ａ−35Ｓ］ＵＴＰ（４００Ｃｉ／ｍｍｏｌ、アマシャム社）で標識化したアンチセンスとセンスのＲＮＡプローブを作製した。標識した転写物は、リボプローブとして５０−１５０塩基にアルカリ加水分解した。
in situハイブリダイゼーションは文献(Biochem. Biophys. Res. Commun., 173, 42, 1990)記載の方法で実施した。サンプルは４％パラホルムアルデヒド−リン酸生理食塩水溶液で固定し、エタノールで脱水、トルエンで洗浄後、パラフィンに包埋した。５μｍの切片を切り出し、ポリーＬ−リジンでコートしたスライドグラスにマウントした。切片はグリシンと無水酢酸で脱パラフィンし、５０℃、１６時間プローブでハイブリダイズした。その後、切片を０．１×ＳＳＣ液で５０℃、１時間洗浄し、ＲＮＡａｓｅＡ（２０μｇ／ｍｌ）で３７℃、３０分処理してから、２×ＳＳＣ液で３７℃、１０分間で２回洗浄した。切片は乳剤（１：１コダックＮＢＴ−２希釈液）に浸し２週間露光した。切片はコダックＤ−１９に現像定着し、ヘマトキシリン・エオジンで染色した。
【００１８】
▲２▼細胞と細胞培養
軟骨細胞は、文献(J. Cell. Physiol., 133, 491, 1987)記載の方法に準じて、ニュージーランドホワイトウサギの２３日齢胎児と４週齢新生児から単離した。関節軟骨は膝の大腿骨関節軟骨から、肋軟骨は肋骨の硝子軟骨から単離した(Dev. Biol., 136, 500, 1989)。滑膜線維芽細胞は、膝関節の滑膜組織から単離した。細切した滑膜組織断片を１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭで１０日間培養し、トリプシン処理で増殖した細胞を集めた。文献(Exp. Cell Res., 157, 483, 1985)記載の方法に準じて、２０日齢ラット胎児の脚筋肉組織から胎生間葉系細胞を単離した。脚芽間葉細胞は、１０．５日齢のラット胎児から単離した。脚芽は外科用顕微鏡下で切り出し、０．２５％トリプシンで３０分で処理後、ピペッテングしナイロンガーゼで単離細胞を得た。脚芽細胞以外全ての細胞は、１０％ＦＢＳ、６０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＤＭＥＭ（以下、培地Ａという）で３７℃、５％ＣＯ2／９５％空気下で維持した。
【００１９】
▲３▼ＤＮＡ合成の測定
ＤＮＡ合成速度は、１０％ＴＣＡ不溶性細胞沈殿への［3Ｈ］−チミジン（［６−3Ｈ］−チミジン、アマシャム社、２０Ｃｉ／ｍｍｏｌ）の取り込みの測定で評価した(J. Clin. Invest., 85, 626, 1990)。細胞は、９６穴プレートの６ｍｍウエル当り１．５×１０4個の密度で播種し、コンフルエントになるまで培養した。増殖を停止するため、細胞は０．３％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭの０．１ｍｌでプレインキュベーションした。種々の濃度のＨＧＦを培地に添加した。インキュベーションは２４時間続けた。１μＣｉ／ｍｌ［3−Ｈ］チミジンは、インキュベーション停止３時間前に添加した。標識後細胞は氷冷ＰＢＳで３回、３ｍＭチミジンを含有する５％ＴＣＡで２回、エタノール：ジメチルエーテル（３：１）で１回洗浄した。ウエル内の残渣は、１００μｌの０．１Ｎ ＮａＯＨで可溶化し、液体シンチバイアルに移し、１Ｎ ＨＣｌで中和後、放射能をシンチレーションカウンター（Ｒａｃｋ−ｂｅｔａ、ファルマシア社）で測定した。
【００２０】
▲４▼プロテオグリカン合成の測定
軟骨細胞は、６ｍｍウエル当り１．５×１０4個の密度で播種し、０．１ｍｌの培地Ａで維持した。細胞がコンフルエントに達したら、０．３％ＦＢＳを含有する０．１ｍｌのＤＭＥＭで２４時間プレインキュベーションした。その後、０．３％ＦＢＳとＨＧＦを含有する０．１ｍｌのＤＭＥＭで２４時間インキュベーションした。１μＣｉ／ｍｌの［35Ｓ］−硫酸基をインキュベーション終了２０時間前に添加した。プロテオグリカン合成は、プロテアーゼ消化後のセチルピリジニウムクロライドでの沈殿物への［35Ｓ］−硫酸基の取り込みの測定により評価した(Exp. Cell Res., 130, 73, 1980)。
【００２１】
▲５▼総ＲＮＡ調製と逆転写ＰＣＲ
軟骨から総ＲＮＡは、文献(Anal. Biochem., 203, 352, 1992)記載の方法の変法で調製した。新鮮単離組織断片（０．１ｇ湿重量）は、４Ｍグアニジンチオシアネート、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ塩酸（ｐＨ７．５）、１％２−メルカプトエタノールの４Ｍ ＧＩＴＣ溶液２ｍｌですばやくホモジェネートした。ホモジェネートは１０％ＳＤＳ１００μｌに混合し、微量遠心機で５分間遠心した。上清２ｍｌをベックマンポリアロマー遠心チューブ（１３×５１ｍｍ）中で、同容量の１．６ｇセシウムトリフルオロアセテートと１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）に重層した。試料を３５，０００ｒｐｍ（１４７，０００×ｇ）で１８℃、２０時間遠心した。上清を吸引除去後、沈殿を４Ｍ ＧＩＴＣ溶液２００μｌに溶解し、フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）で抽出処理後、２０μｌの３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）を混ぜ、２倍容量（４４０μｌ）のエタノールで沈殿させた。沈渣はＤＥＰＣ処理水に溶解した。
まず、０．５μｇ総ＲＮＡからファーストストランドｃＤＮＡの合成をＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ逆転酵素(Gibco-BRL)と下流域のアンチセンスプライマーを使って行った。引き続いてＰＣＲ増殖を行った。増殖は、９４℃で３０秒、５８℃で１分、７２℃で１．５分での３５サイクル（軟骨細胞の場合）又は４０サイクル（軟骨組織の場合）の条件で行った。ＰＣＲ増殖のプライマー塩基配列は、ラットとマウスのｃ−Ｍｅｔ(Oncogene, 2, 593, 1988)に対しては５’−ＣＡＧＴ（Ａ／Ｇ）ＡＴＧＡＴＣＴＣＡＡＴＧＧＧＣＡＡＴ−３’と５’−ＡＡＴＧＣＣＣＴＣＴＴＣＣＴＡＴＧＡＣＴＴＣ−３’で７２５ｂｐ断片を作製した。
【００２２】
実施例１
発生四肢でのＨＧＦｍＲＮＡ発現
発生期マウスの肢芽におけるＨＧＦｍＲＮＡの発現をin situハイブリダイゼーション法で試験した。その結果を図１、図２及び図３に示す。
図１は早期発生期マウスの肢芽におけるＨＧＦｍＲＮＡの発現を示し、後肢の縦断面切片の顕微鏡写真であり、明視野（左側）及びそれに対応する暗視野（右側）はin situハイブリダイゼーション、オートラジオグラフィ及び染色後に撮影したものである。同図において、Ａ〜Ｄは１０．５日齢胎児、Ｅ〜Ｈは１１日齢胎児の切片である。
図２は指形成期マウスの肢芽におけるＨＧＦｍＲＮＡの発現を示し、後肢の縦断面切片の顕微鏡写真であり、明視野（左側）及びそれに対応する暗視野（右側）はin situハイブリダイゼーション、オートラジオグラフィ及び染色後に撮影したものである。同図において、Ａ及びＢは１２．５日齢胎児、Ｃ〜Ｆは１３日齢胎児、Ｇ〜Ｊは１４日齢胎児の切片である。また、Ｆｅは大腿骨、Ｆｉは腓骨、Ｔａは足根骨を、Ｉ〜Ｖは指番号を示す。
図３は発生期マウスの肢芽及び胸郭におけるＨＧＦｍＲＮＡの発現を示す顕微鏡写真であり、明視野（左側）及びそれに対応する暗視野（右側）はin situハイブリダイゼーション、オートラジオグラフィ及び染色後に撮影したものである。同図において、Ａ及びＢは１６日齢胎児の後肢の横断面切片を；Ｃ及びＤは１３日齢胎児、Ｅ及びＦは１４日齢胎児の胸郭の縦断面切片を示す。また、Ｔａは足根骨、Ｔｉは脛骨、Ｒｉｂは肋骨軟骨の前軟骨性集積を示す。
【００２３】
図１に示されるように、１１日目に四肢の底部領域周囲にＨＧＦｍＲＮＡのびまん性の発現が検出された。この段階で軟骨性集積は、四肢に発生していなかった。軟骨性集積が進行するとＨＧＦｍＲＮＡの発現部位はより制限されてきた。１２．５日目に基脚、接合脚、自脚部分が形成されるとき、ＨＧＦｍＲＮＡの発現は、手首／踝と肘／膝の関節領域で観察された（図２Ａ及びＢ参照。便宜上、膝及び踝について示した）。後期（１３〜１４日）には、ＨＧＦｍＲＮＡは、手首／踝と肘／膝の関節領域の軟骨集積の隣接し限定された間葉系細胞に発現していた（図２Ｃ〜Ｊ参照）。１６日目に、ＨＧＦｍＲＮＡは、足根骨の軟骨に隣接する限定された間葉細胞に局在化されていた（図３Ａ及びＢ参照）。ＨＧＦｍＲＮＡの四肢での発現レベルは、分化と共に減少した。試験を通じて手足の成長板でＨＧＦｍＲＮＡを検出しなかった。
【００２４】
実施例２
発生胸郭でのＨＧＦｍＲＮＡ発現
発生期マウスの胸郭におけるＨＧＦｍＲＮＡの発現をin situハイブリダイゼーション法で試験した。その結果を図３Ｃ〜Ｆに示す。
図３Ｃ〜Ｆに示されるように、ＨＧＦｍＲＮＡは、肋間の伸長した前軟骨性集積の先端の周囲肋間間葉組織で発現していた。前軟骨性集積ではハイブリダイゼーションのシグナルは、検出されなかった。
【００２５】
実施例３
ＨＧＦの軟骨細胞に対するスキャッター活性試験
分化している軟骨組織の周囲でどれがＨＧＦの標的細胞かを決めるため、膝関節軟骨と肋軟骨からの軟骨細胞、膝関節から滑膜細胞、四肢筋肉組織から増殖した線維芽細胞の培養細胞を調製し、これらの細胞に外因的に添加したＨＧＦの効果を検討した。
即ち、ウサギ関節軟骨細胞を１６ｍｍウエルに３×１０3細胞の密度で播種し、培地Ａで２日間維持した。その後、ＨＧＦで２日間処理を行った。インキュベーションの終了時に、位相差顕微鏡写真を撮影した。その結果を図４に示す。
図４に示されるように、ＨＧＦ非処理（コントロール）においては、多角形の軟骨細胞が増殖し島状になった（図４Ａ）。一方、ＨＧＦ（３ｎｇ／ｍｌ）で処理をした培養では軟骨細胞は、単細胞状態で島を形成しなかった（図４Ｂ）。従って、ＨＧＦは軟骨細胞の移動を刺激することが明らかになった。なお、ＨＧＦは、線維芽細胞及び滑膜細胞については分散させなかった。
【００２６】
実施例４
軟骨細胞増殖に対するＨＧＦの効果
軟骨細胞の増殖に対するＨＧＦの効果を検討した。
即ち、４週齢のウサギから採取した関節軟骨細胞を培養した。コンフルエントになった細胞を２４時間血清除去処理をした後、種々の濃度のＨＧＦで処置し、材料及び方法の項に示した方法により［3Ｈ］−チミジンの取り込み量を測定した。また、ウサギ滑膜線維芽細胞についても同様な試験を行った。その結果を図５Ａ(関節軟骨細胞)及びＢ(滑膜線維芽細胞)に示す。なお、結果は３回の試験の平均値±標準偏差を示す(図５Ｃ、図６並びに図７Ａ及びＢにおいても同様)。
図５Ａに示されるように、ＨＧＦは、ウサギ関節軟骨細胞への［3Ｈ］−チミジンの取り込みを用量依存的に増加させ、ＤＮＡ合成の促進、即ち関節軟骨細胞に対する増殖促進作用を有することが示された。ＤＮＡ合成は、１ｎｇ／ｍｌのＨＧＦにおいて、コントロールに対して３倍の増加が認められた。一方、図５Ｂに示されるように、滑膜線維芽細胞はＨＧＦに反応しなかった。
【００２７】
また、別実験で、関節軟骨の細胞数に対するＨＧＦの効果を検討した。
即ち、１６ｍｍウエルにウサギ関節軟骨細胞を１×１０4細胞播種し、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地で維持した。次いで、１０ｎｇ／ｍｌのＨＧＦを添加して４８時間インキュベーションし、インキュベーション終了後、細胞数を測定した。その結果を図５Ｃに示す。
図５Ｃに示されるように、１０ｎｇ／ｍｌのＨＧＦは、コントロールに比べて細胞数を約１．８倍増加させた。
【００２８】
実施例５
プロテオグリカン生成に対するＨＧＦの効果
上記のように、ＨＧＦは軟骨細胞の増殖を促進したので、次に、前述の材料及び方法の項で示した方法により、関節軟骨細胞のプロテオグリカン生成に対する効果を検討した。プロテオグリカン合成は、プロテアーゼ消化後セチルピリジニウムクロライドで沈殿する巨大分子（グリコサミノグリカン）への［35Ｓ］−硫酸基の取り込みの測定で検討した(Exp. Cell Res., 130, 73, 1980)。なお、ＨＧＦに代えて、下記の因子についても試験した。
インスリン様成長因子（ＩＧＦ）−Ｉ：濃度１００ｎｇ／ｍｌ
ＩＧＦ−ＩＩ：濃度１００ｎｇ／ｍｌ
副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）：濃度１０-7Ｍ
ＴＧＦ−β：濃度３ｎｇ／ｍｌ
その結果を図６に示す。図６に示されるように、ＨＧＦは、用量依存的に［35Ｓ］−硫酸基の取り込みを増加させた。最大増加は、１ｎｇ／ｍｌのＨＧＦで得られた。この作用は、ＴＧＦ−β(J. Cell Physiol., 138, 329, 1989)やＰＴＨ(J. Clin. Invest., 85, 626, 1990)よりは弱かったが、ＩＧＦ−Ｉ及びＩＩとは同程度であった(Exp. Cell Res., 130, 73, 1980)。
【００２９】
実施例６
抗ＨＧＦ抗体存在下における、ＤＮＡ合成及びプロテオグリカン生成に対するＨＧＦの効果
前述のように、一般にＨＧＦはパラクリン機構で標的細胞に作用すると考えられており、前記のin situハイブリダイゼーションの結果は、この考えを支持していると思料される。そこで、この点を確認するために、ＨＧＦポリクローナル抗体が、軟骨細胞の機能を変化させるかどうかを検討した。
即ち、コンフルエントになったウサギ関節軟骨細胞を、３ｎｇ／ｍｌのＨＧＦの存在下又は非存在下、２５μｇ／ｍｌの抗ＨＧＦポリクローナル抗体（アフィニティーで精製したＩｇＧ画分）で処理又は非処理した。その後、前記の材料及び方法の項で示した方法により、［3Ｈ］−チミジン又は［35Ｓ］−硫酸基で標識し、ＤＮＡ合成又はプロテオグリカン生成を測定した。その結果を図７Ａ（ＤＮＡ合成）及びＢ（プロテオグリカン生成）に示す。なお、同図において、Ａｂは抗ＨＧＦポリクローナル抗体を示す。
図７に示されるように、抗ＨＧＦポリクローナル抗体の添加だけでは、関節軟骨細胞でのＤＮＡ合成もプロテオグリカン生成も変化させなかった。しかしながら、抗ＨＧＦポリクローナル抗体は、外因性に添加したＨＧＦの効果を完全に阻害した。このことは、軟骨細胞が軟骨自身の機能を調節するのに十分なＨＧＦを産生していないことを示している。
【００３０】
実施例７
ＨＧＦレセプターｍＲＮＡの軟骨細胞での発現
生体内及び生体外における軟骨細胞でのＨＧＦレセプター（ｃ−Ｍｅｔ）の発現を逆転写ＰＣＲで検討した。関節組織と肋軟骨の各部分を外科用顕微鏡下で、４週齢ラットから切り出し、総ＲＮＡは、方法と材料の項で述べたように抽出した。抽出したＲＮＡ（０．５μｇ）は逆転写し、ｃ−Ｍｅｔのプライマーを用いて増幅した後、１．５％アガロースゲル電気泳動法により分析した。その結果を図８に示す。
図８に示されるように、関節軟骨組織及び肋軟骨組織について４０回の増幅後、微量のｃ−Ｍｅｔ発現を検出し、培養軟骨細胞は３５回の増幅後、著明なｃ−Ｍｅｔ発現を認めた。
【００３１】
製造例１
ＨＧＦ製剤の生産例
(1)  ＨＧＦ                  ２０μｇ
ヒト血清アルブミン    １００ｍｇ
上記物質をｐＨ７．０の０．０１ＭのＰＢＳで溶解し、全量を２０ｍｌに調製し、滅菌後、バイアル瓶に２ｍｌずつ分注し、凍結乾燥密封した。
(2)  ＨＧＦ                  ４０μｇ
ツイーン８０              １ｍｇ
ヒト血清アルブミン    １００ｍｇ
上記物質を注射用生理食塩水に溶解し、全量を２０ｍｌに調製し、滅菌後、バイアル瓶に２ｍｌずつ分注し、凍結乾燥密封した。
【図面の簡単な説明】
【図１】早期発生期マウスの肢芽におけるＨＧＦｍＲＮＡの発現を示す顕微鏡写真（生物の形態）である（左側は明視野、右側はそれに対応する暗視野）。同図において、Ａ〜Ｄは１０．５日齢胎児、Ｅ〜Ｈは１１日齢胎児の縦断面切片である。
【図２】指形成期マウスの肢芽におけるＨＧＦｍＲＮＡの発現を示す顕微鏡写真（生物の形態）である（左側は明視野、右側はそれに対応する暗視野）。同図において、Ａ及びＢは１２．５日齢胎児、Ｃ〜Ｆは１３日齢胎児、Ｇ〜Ｊは１４日齢胎児の切片である。また、Ｆｅは大腿骨、Ｆｉは腓骨、Ｔａは足根骨を、Ｉ〜Ｖは指番号を示す。
【図３】発生期マウスの肢芽及び胸郭におけるＨＧＦｍＲＮＡの発現を示す顕微鏡写真（生物の形態）である（左側は明視野、右側はそれに対応する暗視野）。同図において、Ａ及びＢは１６日齢胎児の後肢の横断面切片；Ｃ及びＤは１３日齢胎児、Ｅ及びＦは１４日齢胎児の胸郭の縦断面切片を示す。また、Ｔａは足根骨、Ｔｉは脛骨、Ｒｉｂは肋骨軟骨の前軟骨性集積を示す。
【図４】ＨＧＦの軟骨細胞に対するスキャッター活性を示す顕微鏡写真（生物の形態）である。同図において、Ａはコントロール（ＨＧＦ非処理）を、ＢはＨＧＦ処理を示す。
【図５】軟骨細胞増殖に対するＨＧＦの効果を示す図である。同図において、Ａは関節軟骨細胞のＤＮＡ合成に対する効果を、Ｂは滑膜細胞のＤＮＡ合成に対する効果を、Ｃは関節軟骨細胞の増殖（細胞数）に対する効果を示す。
【図６】プロテオグリカン生成に対するＨＧＦの効果を示す図である。
【図７】抗ＨＧＦ抗体存在下における、ＤＮＡ合成（図７Ａ）及びプロテオグリカン生成（図７Ｂ）に対するＨＧＦの効果を示す図である。
【図８】ＨＧＦレセプターｍＲＮＡの軟骨細胞での発現を示す電気泳動写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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