(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）０．５ｃｍ２あたり１００，０００〜１０，０００，０００個の密度で分離した部位を含むパターン化した基体よりなる表面を有し、光ファイバーバンドルではない、基体と；
ｂ）少なくとも第１および第２サブ集団を含む微小球の集団であって、該第１および第２サブ集団が各々、第１および第２生物活性剤を含む微小球の集団と
を含み、その微小球が上記した部位にランダムに分布している構成物。
【請求項２】
該基体がガラスである、請求項１記載の構成物。
【請求項３】
該基体がプラスチックである、請求項１記載の構成物。
【請求項４】
該部位が化学的に官能化された部位を含む、請求項１、２または３記載の構成物。
【請求項５】
該生物活性剤が核酸を含む、請求項１、２、３または４記載の構成物。
【請求項６】
該生物活性剤が蛋白を含む、請求項１、２、３または４記載の構成物。
【請求項７】
該蛋白が酵素および抗体からなる群より選択される、請求項６記載の構成物。
【請求項８】
第１および第２サブ集団が各々、該生物活性剤同定能を有する第１および第２の光学的サインを含む、請求項１、２、３、４、５、６または７記載の構成物。
【請求項９】
光学的サインの少なくとも１つが少なくとも１つの蛍光色素を含む、請求項８記載の構成物。
【請求項１０】
光学的サインの少なくとも１つが少なくとも２つの蛍光色素を含む、請求項８または９記載の構成物。
【請求項１１】
試料中の標的分析物の有無を測定する方法であって：
ａ）該試料を、
ｉ）０．５ｃｍ２あたり１００，０００〜１０，０００，０００個の密度で分離した部位を含むパターン化した基体よりなる表面を有し、光ファイバーバンドルではない、基体と；
ｉｉ）少なくとも第１および第２サブ集団を含む微小球の集団であって、該第１および第２サブ集団が各々、第１および第２生物活性剤を含む微小球の集団と
を含み、該微小球が該部位にランダムに分布している、構成物と接触させ、
ｂ）該標的分析物の有無を決定する
ことを特徴とする方法。
【請求項１２】
少なくとも第１および第２サブ集団が各々、生物活性剤同定能を有する光学的サインを含む、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
さらに、該基体上にある各生物活性剤の位置を同定することを特徴とする、請求項１１または１２記載の方法。
【請求項１４】
ａ）０．５ｃｍ２あたり１００，０００〜１０，０００，０００個の密度で個々の部位を含むパターン化した表面を、光ファイバーバンドルではない基体上に形成させ；
ｂ）個々の部位が微小球を含有するように、その表面に微小球をランダムに分布させ、ここで、微小球が少なくとも第１および第２サブ集団を含み、該第１および第２サブ集団が各々、第１および第２生物活性剤を含む
ことを特徴とする構成物の製法。
【請求項１５】
少なくとも第１および第２サブ集団が各々、生物活性剤同定能を有する光学的サインを含む、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
分布がサブ集団を該部位に連続的に加えることよりなる、請求項１４または１５記載の方法。
【請求項１７】
該生物活性剤が核酸である、請求項１４、１５または１６記載の方法。
【請求項１８】
該生物活性剤が蛋白である、請求項１４、１５または１６記載の方法。
【請求項１９】
ランダム沈着アレイを含む光ファイバーバンドル以外の基体を含む構成物であって、該アレイが０．５ｃｍ２あたり１００，０００〜１０，０００，０００個の密度で分離した部位を含み、ここに、微小球が該部位にランダムに分散されており、該微小球が少なくとも第１および第２サブ集団を含み、該第１および第２サブ集団が各々、第１および第２生物活性剤を含む構成物。
【請求項２０】
分離した部位がウェルである、請求項１９記載の構成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願は、１９９７年３月１４日に出願された係属中の米国特許第０８／８１８，９１９号の一部継続出願である。
【０００２】
（背景技術）
特に過去１０年の間に、化学分析測定のための光吸収色素と組み合わせた光ファイバーおよび光ファイバーストランドの使用が急速に発展してきた。このような目的の光ファイバーおよび技術の使用は、Milanovichら、"Novel Optical Fiber Techniques For Medical Application", Proceedings of the SPIE 28th Annual International Technical Symposium On Optics and Electro-Optics, Volume 494, 1980; Seitz, W.R., "Chemical Sensors Based On Immobilized Indicators and Fiber Optics" in C.R.C. Critical Reviews In Analytical Chemistry, Vol. 19, 1988, pp. 135-173; Wolfbeis, O.S., "Fiber Optical Fluorosensors In Analytical Chemistry" in Molecular Luminescence Spectroscopy, Methods and Applications (S.G. Schulman編）, Wiley & Sons, New York (1988); Angel, S.M., Spectroscopy 2 (4): 38 (1987); Waltら、"Chemical Sensors and Microinstrumentation", ACS Symposium Series, Vol. 403, 1989, p. 252およびWolfbeis, O.S., Fiber Optic Chemical Sensors, Ed. CRC Press, Boca Raton, FL, 1991, 2nd Volumeによって記載されている。
【０００３】
光ファイバーをイン・ビトロ／イン・ビボセンサーにおいて使用する場合、１またはそれ以上の光吸収色素をその遠位末端近くに置く。典型的には、適当な光源由来の光を用いて、ファイバーの近位末端を通じて色素を照らす。光は、光ファイバーの長さに沿って伝搬し、この伝搬した光の一部は遠位末端を出て、色素によって吸収される。光吸収色素は、固定されていてもよく、またはされていなくてもよく；光ファイバー自体に直接接着してもよく、またはしなくてもよく；１以上の目的の分析物を含有する流体試料中に懸濁されていてもよく、またはされていなくてもよく；第２の光学的測定における二次使用のために保持可能であってもよく、保持可能でなくてもよい。
【０００４】
いったん光が色素に吸収されると、波長および強度の異なるいくつかの光が再発光し、同一ファイバーまたは収集ファイバーのいずれかによって、観察および測定する検出システムに伝えられる。光ファイバーによって伝えられた光と光吸収色素の特性との間の相互作用は、定性および定量測定のための光学的基礎を提供する。
【０００５】
種々の分析目的のためのファイバーストランドおよび光ファイバーのバンドルと共に従来より使用される光吸収色素の多くの異なるクラスのうち、吸収後に光を放射する「発蛍光団（fluorophore）」と呼ばれる組成物および光を吸収し、光としてそれを放射するよりもむしろ、吸収した光を内的に熱に変換する「発色団（chromophore）」と呼ばれる組成物がより一般的である。
【０００６】
蛍光は、特定の波長で光（光子）を吸収し、次いで、より長波長の光をより低エネルギーで放射するいくつかの分子の能力に基づく物理現象である。蛍光を発することのできる物質は、いくつかの共通の特徴：１の波長λabで光エネルギーを吸収し；励起状態のエネルギー状態に達し；次いで、別の光波長λemで光を放射する能力を共有する。吸収および蛍光発光スペクトルは、各発蛍光団に特有であり、しばしば、わずかに重複する２つの別々の曲線として線図で表される。同じ蛍光発光スペクトルは、一般に、励起光の波長に関係なく観察され、したがって、励起光の波長およびエネルギーは適度に変化させてもよいが；発蛍光団によって放射される光は常に、同じ発光スペクトルを提供するであろう。最後に、蛍光シグナルの強度は、放射された光の収量として測定してもよい。蛍光収量は、最初に発蛍光団によって吸収された光子数と比較した放射された光子数の比率である。これらの各特徴のより詳細な情報のために、下記の参考文献を推薦する。Lakowicz, J.R., Principles of Fluorescence Spectroscopy, Plenum Press, New York, 1983; Freifelder, D., Physical Biochemistry, 第２版, W.H. Freeman and Company, New York, 1982, "Molecular Luminescence Spectroscopy Methods and Applications; PartI" (S. G. Schulman編) in Chemical Analysis, vol. 77, Wiley & Sons, Inc., 1985, The Theory of Luminescence, StepanovおよびGribkovskii, lliffe Books, Ltd., London, 1968。
【０００７】
対照的に、光を吸収し、蛍光を発しない物質は、通常、光を熱または運動エネルギーに変換する。吸収した光を内的に変換する能力は、その色素が「発色団」であると同定する。発色団のような光エネルギーを吸収する色素は、エネルギーの個々の波長でエネルギーを吸収し、その波長で特有のモル吸収係数によって特徴付けられる。ファイバー光ストランドならびに吸収係数と組み合わせた可視光および紫外線波長を用いる吸収分光法を用いる化学分析は、スペクトル測定によって目的の特異的分析のための濃度の決定を可能にする。光ファイバーを介した吸光度測定の最も一般的な使用は、ベールの法則にしたがって計算される濃度を決定することであり；したがって、単一の吸光度波長で、所定の波長で光エネルギーを吸収する組成物の量が多ければ多いほど、試料に対する光学濃度がより大きくなる。このように、吸収された光の総量は直接、試料中の組成物の量に相関する。
【０００８】
定性および定量分析測定において光ファイバーセンサーを使用する近年の改良点の多くは、光ファイバーの遠位末端に種々の光吸収色素を置く、および／または固定することが望ましいことに関係する。このように、種々の異なる光ファイバー化学センサーおよび方法が、特定の分析測定および応用、例えば、ｐＨ測定、酸素検出および二酸化炭素分析について報告されてきた。これらの発展は、下記の出版物によって例示される。Freemanら、Anal. Chem. 53:98 (1983); Lippitschら、Anal. Chem. Acta. 205:1, (1988); Wolfbeisら、Anal. Chem. 60:2028 (1988); Jordanら、Anal. Chem. 59: 437 (1987); Lubbersら、Sens. Actuators 1983; Munkholmら、Talanta 35:109 (1988); Munkholmら、Anal. Chem. 58:1427 (1986); Seitz, W.R., Anal. Chem. 56:16A-34A (1984); Petersonら、Anal. Chem. 52: 864 (1980); Saariら、Anal. Chem. 54:821 (1982); Saariら、Anal. Chem. 55: 667 (1983); Zhujunら、Anal. Chem. Acta. 160:47 (1984); Schwabら、Anal. Chem. 56: 2199 (1984); Wolfbeis, O.S., "Fiber Optic Chemical Sensors", Ed. CRC Press, Boca Raton, FL, 1991, 2nd Volume;およびPantano, P., Walt, D.R., Anal. Chem. 481A-487A, Vol. 67, (1995)。
【０００９】
より近年には、単一の別個のファイバー光バンドルと共に複数の色素の使用を可能にするファイバー光センサーが構築された。Waltらの米国特許第５，２４４，６３６号および第５，２５０，２６４号は、複数の異なる色素をバンドルの遠位末端に付着するシステムを開示する（これらの各特許の教示は、出典明示により本明細書の一部とされる）。開示された形態は、バンドルの分離した光ファイバーが光学上、個々の色素にアクセスできるようにする。これは、２個以上の色素（各色素は異なる分析物に対し感受性である）由来のシグナルが結合する場合に生じる各色素からの再発光において個々のシグナルを解読するという問題を回避し、色素の発光スペクトルにおいて有意な重複が存在する。
【００１０】
二つの先の特許の考案は、複数の化学的機能性を単一の光ファイバー・バンドルセンサーの末端に配置することであった。該配置により、典型的に小さいバンドルによって遠く離れてモニターできる分析化学センサーが得られた。しかしながら、欠点は、センサーの末端にある化学的機能性（該機能性は一連の様式においてセンサー末端に確立された）に関連する種々の化学的性質を応用することが困難であることである。これはゆっくりとした工程であり、実際、たった１０個の機能性を応用できるのみであった。したがって、標的分析物の検出を可能にするためにエンコードまたはデコードされることのできる微小球（microsphere）を含む大きなファイバーオプティックアレイの生成を可能にする構成物（composition）および方法が望ましい。
【００１１】
（発明の開示）
上記の目的によると、本発明は、分離した（discrete）部位を含む表面を有する基体、および該部位上に分布した微小球の集団を含む構成物を提供する。該部位はウェルまたは化学的に機能化された部位であってもよい。
【００１２】
さらなる態様において、本発明は、試料中の標的分析物の存在を決定する方法を提供する。該方法は、分離した部位を含む表面を有する基体ならびに少なくとも第一および第二のサブ集団よりなる微小球の集団を含む構成物と試料を接触させることを特徴とする。各サブ集団は、生物活性剤および生物活性剤を同定できる光学的サインを含む。微小球は、分離した部位が微小球を含有するように表面上に分布される。次いで、標的分析物の存在または不在が決定される。
【００１３】
さらなる態様において、本発明は、基体上に個々の部位を含む表面を形成し、個々の部位が微小球を含有するように該表面上に微小球を分布することを特徴とする、構成物の作成方法を提供する。微小球は、少なくとも第一および第二のサブ集団よりなり、各サブ集団は生物活性剤および該生物活性剤を同定できる光学的サインを含む。
【００１４】
添付の図面において、参照記号は異なる図面をとおして同じ部分を示す。図面は、必ずしも一定の比率で描かれているわけでなく；代わりに本発明の原理を説明することに重きを置く。
【００１５】
（発明を実施するための最良の形態）
本発明は、２つの共同的な発明：１）異なる化学的機能性を担持するビーズ（微小球とも呼ばれる）を一緒に混合してもよく、一方、光学的に応答可能なエンコーディングスキーム（「光学的サイン」）を用いて各ビーズの機能性を同定できる能力が保持されているビーズに基づく分析化学システムの開発；および２）個々のビーズに結合できる個々の部位を含有するパターン化した表面を含む基体の使用に基づいている。これは、生物活性剤（すなわち、核酸および抗体のような化合物）をそれらのアレイ上の配置とはかけ離して合成することを可能とする、すなわち、生物活性剤をビーズ上で合成でき、ついで、ビーズをパターン化した表面にランダムに分布させることができる。ビーズは、まず、光学的サインでコードされるので、このことは、アレイが後に「デコード（decode）」できることを意味する。すなわち、アレイを作成後、アレイ上の個々の部位の位置と、特定の部位でのビーズまたは生物活性剤とを相関させることができる。このことは、先行分野のin situ合成やスポッティング技術と比べて迅速かつ安価に、ビーズをアレイ上でランダムに分布させることができることを意味する。より詳しく下記するように、いったんアレイにビーズが負荷されると、試験後に起こる完全または部分的デコーディングを用いて、アレイをデコードできるか、または使用できる。
【００１６】
したがって、本発明は、個々の部位を含む表面を有する少なくとも第１の基体を含むアレイ構成物を提供するものである。本明細書における「アレイ」は、アレイフォーマットにおける複数の生物活性剤を意味し、アレイのサイズは構成物およびアレイの最終使用目的に依存する。アレイは、約２つの異なる生物活性剤（すなわち、異なるビーズ）から数百万まで含むことができ、非常に大きなファイバーオプティック・アレイも可能である。一般に、アレイは、ビーズおよび基体のサイズならびにアレイの最終使用目的に応じて、２から１０億以上を含むことができ、すなわち、非常な高密度、高密度、中密度、低密度、非常な低密度のアレイとすることができる。非常な高密度のアレイの好ましい範囲は、約１０,０００,０００〜約２,０００,０００,０００で、好ましくは約１００,０００,０００〜約１,０００,０００,０００である。高密度アレイの範囲は、約１００,０００〜約１０,０００,０００で、特に好ましくは約１,０００,０００〜約５,０００,０００である。中密度アレイの範囲は、約１０,０００〜約５０,０００で、特に好ましくは約２０,０００〜約３０,０００である。低密度アレイは、一般に、１０,０００より少なく、約１,０００〜約５,０００が好ましい。非常な低密度アレイは約１,０００より少なく、約１０〜約１,０００が好ましく、約１００〜約５００が特に好ましい。ある具体例においては、本発明の構成物はアレイフォーマットでなくてもよく、すなわち、ある具体例については、単一の生物活性剤を含む構成物も同様に作成してよい。加えて、いくつかのアレイでは、異なるまたは同一構成物の複数の基体を使用してもよい。かくして、例えば、大きなアレイは複数のより小さい基体を含むことができる。
【００１７】
また、本発明の構成物の１つの利点は、特に、ファイバーオプティック技術を介して、極端な高密度アレイを作成できることである。したがって、例えば、２００ｎｍのビーズを使用でき、非常に小さなファイバーも公知であり、０．５ｃｍ2当り個々のビーズおよびファイバー１５,０００,０００以上の密度で、１ｍｍ2のファイバーオプティク・バンドル中２５０,０００もの多数の異なるファイバーおよびビーズを得ることも可能である。
【００１８】
構成物は基体を含む。本明細書で使用する「基体」または「固体支持体」または他の文法的同等物は、ビーズの接着または結合に適した分離した個々の部位を含むように修飾でき、少なくとも１つの検出法に敏感に反応するいずれかの物質を意味する。当業者に明らかなごとく、可能な基体の数は非常に多く、限定するものではないが、ガラス、修飾または機能化ガラス、プラスチック（アクリル、ポリスチレンおよびスチレンと他の物質との共重合体、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリウレタン、テフロン等を包含する）、多糖類、ナイロンまたはニトロセルロース、樹脂、シリカまたはシリコンおよび修飾シリコンを包含するシリカベース物質、炭素、金属、無機ガラス、プラスチック、オプティカルファイバー・バンドルおよび種々の他のポリマーが包含される。一般に、基体は光学的検出を可能にし、認めうるほどに蛍光を発しない。
【００１９】
１の具体例において、基体は光ファイバー・バンドルまたはアレイを含まない。
【００２０】
一般に、基体は平ら（平面）であるが、当業者に明らかなごとく、他の形状の基体も同様に使用でき、例えば、試料のビーズへの接近を可能とし、検出に共焦点（cofocal）顕微鏡を使用できるプラスチックの多孔質ブロックにビーズを埋め込むことにより、三次元形状も使用できる。同様に、ビーズをフロー‐スルー（flow-through）試料分析用のチューブの内表面に位置させて試料容量を最少にすることもできる。好ましい基体には、以下に説明する光ファイバー・バンドルや、ガラス、ポリスチレンと他のプラスチックおよびアクリルのような平面基体が包含される。
【００２１】
基体の少なくとも１つの表面を修飾して、後の微小球との結合のための分離した個々の部位を含ませる。これらの部位は、物理的に変化した部位、すなわち、ビーズを保持して微小球をその中で支えることができる基体におけるウェルまたは小さなくぼみ、または、他の力（磁力または圧縮）の使用、または、化学的に機能化された部位のような化学的に変化したもしくは活性化された部位、静電気的に変化された部位、親水性／疎水性的に機能化された部位、接着剤のスポット等を含むことができる。
【００２２】
部位はパターン、すなわち、規則的なデザインまたは形状であってもよく、またはランダムに分布させてもよい。好ましい具体例では、Ｘ−Ｙ座標平面でアドレス指定できるように部位の規則的なパターンを用いる。この意味での「パターン」には、好ましくは基体上のビーズに高密度を可能とするユニットセルの繰返しが包含される。しかし、これらの部位は、分離した部位でなくてもよいことに注意すべきである。すなわち、例えば、いずれかの位置でビーズの接着を可能にする接着剤または化学的機能性の均一な表面を使用することも可能である。かくして、基体の表面を修飾して、個々の部位が他の部位と連続していても、不連続であっても、微小球の個々の部位への接着を可能とさせる。したがって、基体の表面を、単一の結合ビーズのみを有することができる分離した部位が形成されるように修飾するか、別法として、基体の表面を修飾し、ビーズがどこかに沈み、最後に分離した部位に入らせることもできる。
【００２３】
好ましい具体例において、基体の表面を修飾してウェル、すなわち、基体表面のくぼみを含ませる。これは、限定するものではないが、フォトリトグラフィー、スタンプ技術、成型技術およびマイクロエッチング技術を包含する種々の技術を用いて、当業者に一般的に知られている方法で行なうことができる。当業者に明らかなごとく、用いる技術は構成物および基体の形状に依存する。
【００２４】
好ましい具体例において、物理的変化を基体の表面に作成し、部位を生じさせる。好ましい具体例において、基体はファイバーオプティカル・バンドルであり、基体の表面は、ファイバー・バンドルの一末端である。この具体例において、ウェルは、個々のファイバーを含むファイバーオプティカル・バンドルの末端または遠位末端中に作成される。この具体例において、個々のファイバーの芯がクラッディングに関してエッチングされ、ファイバーの一端に小さなウェルまたはくぼみが形成される。ウェルの必要な深さはウェルに加えるビーズのサイズに依存する。
【００２５】
一般に、この具体例において、該ウェルは付加的に以下に概説するように化学的に機能するが、微小球はウェルに共有結合しておらず、ビーズ上に架橋剤を用いることができ、あるいは物理的バリアー、すなわち、フィルムまたは膜を用いることもできる。
【００２６】
好ましい具体例においては、本発明の微小球を基体上の分離した部位または位置に共有または非共有のいずれかで結合させるのに用いることのできる、化学的に修飾された部位を含有するように基体の表面を修飾する。本明細書中の「化学的に修飾された部位」とは、微小球を共有結合させるのに用いることのできるアミノ基、カルボキシ基、オキソ基およびチオール基を包含する一のパターンの化学官能基（一般的に対応する反応性官能基も含有する）の付加；微小球を結合させるのに用いることのできる一のパターンの接着剤の付加（接着剤を付加するための従来の官能基導入によるか、または接着剤の直接的付加のいずれかによる）；微小球がその部位と反対の荷電基を有する場合に、微小球の静電気的接着のための一のパターンの荷電基の付加（官能基導入と類似）；適当な実験条件下での疎水性または親水性微小球の付加がヒドロアフィニティーに基づいて微小球の該部位への結合をもたらすように、該部位を特異に疎水性または親水性とする一のパターンの官能基の付加を包含するが、これらに限定されるものではない。例えば、水性系にて、疎水性部位を疎水性ビーズと使用すると、そのビーズは優勢的に該部位に結合する。上記したように、「パターン」は、この意味において、ビーズを分離した部位に接着させるためにその表面を均一に処理するのに用いること、ならびにその表面を処理して分離した部位を得ることを包含する。当業者に自明であるように、これは種々の方法で行うことができる。
【００２７】
本発明の構成物はさらに微小球の集団を含む。本明細書中の「集団」とは、アレイについて上記したように、複数のビーズを意味する。集団内には、一個の微小球または複数の同じ微小球とすることのできる別々のサブ集団がある。すなわち、ある具体例においては、以下にさらに詳細に記載するように、アレイは各生物活性剤に対し一個のビーズを含有するだけであってもよい；好ましい具体例は各タイプの複数のビーズを利用する。
【００２８】
本明細書中の「微小球」または「ビーズ」または「粒子」あるいは文法的同等物は、小さな分離した粒子を意味する。ビーズの構成物は、生物活性剤の種類および合成方法に応じて変化するであろう。適当なビーズ構成物は、ペプチド、核酸および有機物の合成に用いられる組成物、例えば、プラスチック、セラミック、ガラス、ポリスチレン、メチルスチレン、アクリルポリマー、常磁性物質、トリアゾル、カーボングラファイト、二酸化チタン、ラテックスまたは架橋デキストラン、例えば、セファロース、セルロース、ナイロン、架橋ミセルおよびテフロンを含むが、これらに限定されるものではなく、このすべてを用いることができる。Bangs Laboratories、Fishers INの「ミクロスフェア・ディテクション・ガイド（Microspere Detection Guide）」が有用なガイドブックである。
【００２９】
ビーズは球状である必要はなく；不規則な粒子を用いることもできる。加えて、生物活性剤の接着またはタグの接着に利用できるビーズの表面積を増加させるのに、ビーズは多孔質であってもよい。ビーズの大きさは、ナノメーター、すなわち１００ｎｍから、ミリメーター、すなわち１ｍｍの範囲にあり、約０．２ミクロンないし約２００ミクロンのビーズが好ましく、約０．５ないし約５ミクロンのビーズが特に好ましいが、ある場合には、さらに小さなビーズを用いることもできる。
【００３０】
図１は、本発明の原理によるビーズまたは微小球１０の構築を説明するものである。先行技術と同様に、典型的には、微小球表面に適用される生物活性剤１２を微小球１０に提供する。標的となる分析物の存在下において、微小球あるいは微小球周囲の領域を含めて微小球の光学的サインが変化するように生物活性剤を設計する。
【００３１】
本発明の重要な点は、基体表面上にビーズを結合あるいは付着させることのできる基体／ビーズ対を使用することであり、その結果、アッセイ中にビーズが動かないようになることである留意すべきである。
各微小球は２つの成分：生物活性剤および光学的サインを含む。
【００３２】
本明細書の「候補生物活性剤」または「生物活性剤」または「化学的官能基」または「結合リガンド」は、本発明の微小球に結合しうる分子、例えば、蛋白、オリゴペプチド、小型有機分子、多糖、ポリヌクレオチド等を意味する。本発明の組成物は２つの主要用途を有することが理解されるはずである。後でさらに十分に説明するが、好ましい具体例において、本発明の構成物を用いて特定の標的分析物の存在、例えば、特定のヌクレオチド配列または酵素、抗体もしくは抗原のごとき特定の蛋白の存在または不存在を検出する。もう１つの好ましい具体例において、本発明の構成物を用いて、特定の標的分析物との結合を調べて生物活性剤、すなわち、薬剤候補をスクリーニングする。
【００３３】
生物活性剤は多くの化学的クラスを包含するが、典型的には、それらは有機分子であり、好ましくは、分子量が１００ダルトンよりも大きく約２５００ダルトン未満の小型有機化合物である。生物活性剤は蛋白との構造的相互作用、特に水素結合に必要な官能基を含むものであり、典型的には少なくとも１つのアミン、カルボニル、ヒドロキシルまたはカルボキシル基を包含する。しばしば生物活性剤は、１個またはそれ以上の上記官能基で置換された環状炭素構造または複素環構造および／または芳香族またはポリ芳香族構造を含む。生物活性剤は生体分子のなかから見出され、ペプチド、核酸、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、それらの誘導体、構造アナログまたはそれらの組み合わせを包含する。核酸および蛋白が特に好ましい。
【００３４】
合成または天然化合物のライブラリーを包含する広範な種々の源から生物活性剤を得ることができる。例えば、種々の広範な有機化合物および生体分子のランダム合成および特異的合成を包含する多くの手段が利用可能である。別法として、細菌、真菌、植物および動物の抽出物の形態となった天然化合物のライブラリーも利用可能であるかあるいは容易に得ることができる。さらに、天然のライブラリーまたは合成により得られたライブラリーおよび化合物は、慣用的な化学的、物理的および生化学的手段により容易に修飾される。知られている薬理学的作用剤をランダムまたは特異的な化学修飾に用いてもよく、例えば、構造アナログを得るためにアシル化、アルキル化、エステル化および／またはアミド化を行ってもよい。
【００３５】
好ましい具体例において、生物活性剤は蛋白である。本明細書において「蛋白」は少なくとも２個の共有結合したアミノ酸を意味し、蛋白、ポリペプチド、オリゴペプチドおよびペプチドを包含する。蛋白は天然に存在するアミノ酸およびペプチド結合ら構成されていてもよく、あるいは合成ペプチド模倣構造から構成されていてもよい。よって、本明細書の用語「アミノ酸」または「ペプチド残基」は、天然に存在するアミノ酸および合成アミノ酸の両方を意味する。例えば、ホモフェニルアラニン、シトルリンおよびノルロイシンは本発明の目的からすればアミノ酸と見なされる。側鎖は（Ｒ）または（Ｓ）のいずれの配置において存在していてもよい。好ましい具体例において、アミノ酸は（Ｓ）またはＬ−配置である。例えば、インビボでの分解を防止または遅延させるために非天然側鎖を用いる場合には、非アミノ酸および置換体を用いてもよい。
【００３６】
１の好ましい具体例において、生物活性剤は天然に存在する蛋白または天然に存在する蛋白のフラグメントである。よって、例えば、蛋白を含有する細胞抽出物、あるいは蛋白性細胞抽出物のランダムまたは特異的な消化物を用いてもよい。このようにして、原核性および真核性蛋白を調製して本明細書記載の系においてスクリーニングしてもよい。この具体例において、細菌、真菌、ウイルスおよび哺乳動物蛋白のライブラリーが特に好ましく、哺乳動物ライブラリーが特に好ましく、ヒト蛋白が殊の外好ましい。
【００３７】
好ましい具体例において、生物活性剤は約５個ないし約３０個のアミノ酸のペプチドであり、約５個ないし約２０個もアミノ酸が好ましく、約７個ないし約１５個が特に好ましい。すでに説明したようにペプチドは天然に存在する蛋白の消化物であってもよく、ランダムなペプチドまたは「片寄った」ランダムなペプチドであってもよい。本発明において「ランダム化」またはその文法上の同義語は、それぞれの核酸およびペプチドがそれぞれランダムなヌクレオチドおよびアミノ酸を必須としてなることを意味する。一般的にはこれらのランダムなペプチド（または核酸、後で説明する）は化学合成されるので、それらはいずれの位置にいずれのヌクレオチドまたはアミノ酸を含んでいてもよい。ランダム化蛋白または核酸が得られ、長さおよび配列の可能な組み合わせのすべてまたは大部分が得られるようにるように合成方法を設計することができ、かくして、ランダム化生物活性蛋白性作用剤のライブラリーが得られる。
【００３８】
好ましい具体例において、生物活性剤のライブラリーを使用する。ライブラリーは十分な構造的多様性を有する生物活性剤の集団を提供して確率的に十分な範囲の標的分析物への結合を生じさせるものでなくてはならない。したがって、相互作用ライブラリーは、そのメンバーの少なくとも１つが標的分析物に対するアフィニティーを生じさせる構造を有するよう、十分に大きなものでなければならない。相互作用ライブラリーに必要な絶対的なサイズを計ることは困難であるが、自然は免疫応答に関するヒントを与えてくれる。１０７〜１０８個の異なる抗体の多様性は、生物が直面する最も潜在的可能性の高い抗原との相互作用に十分なアフィニティーを有する少なくとも１つの組み合わせを提供する。公表されているインビトロ選択法もまた、標的に対するアフィニティーを有する構造を見つけるには１０７ないし１０８のライブラリーサイズで十分であることを示している。よって、好ましい具体例において、少なくとも１０６個、好ましくは少なくとも１０７個、より好ましくは少なくとも１０８個、最も好ましくは１０９個の異なる生物活性剤が本発明方法において同時に分析される。好ましい方法はライブラリーのサイズおよび多様性を最大化する。
【００３９】
１の具体例において、ライブラリーが十分にランダム化され、いずれの位置においても配列優位性または一定性がなくなる。好ましい具体例において、ライブラリーは片寄ったものである。すなわち、配列中のいくつかの位置が一定であるか、あるいは配列が限定された数の候補から選択される。例えば、好ましい具体例において、ヌクレオチドまたはアミノ酸残基が一定のクラスに限定され、例えば疎水性アミノ酸、親水性残基、立体的に片寄った（小さいあるいは大きい）残基、架橋のためのシステインを生じさせるもの、ＳＦ−３ドメインのためのプロリン、リン酸化部位のためのセリン、スレオニン、チロシンまたはヒスチジン等、あるいはプリン等に限定される。
【００４０】
好ましい具体例において、生物活性剤は核酸（一般的には、本明細書において「プローブ核酸」または「候補プローブ」という）である。本明細書において「核酸」または「オリゴヌクレオチド」またはその文法上の同義語は、共有結合した少なくとも２個のヌクレオチドを意味する。一般的には、本発明の核酸はホスホジエステル結合を含有するが、以下に説明するいくつかの場合には、別の骨格を有していてもよい核酸アナログが包含され、例えばそれらはホスホラミド（Beaucage, et al., Tetrahedron, 49(10):1925 (1993) およびその中の引用文献; Letsinger, J. Org. Chem., 35:3800 (1970); Sprinzl, et al., Eur. J. Biochem., 81:579 (1977); Letsinger, et al., Nucl. Acids Res., 14:3487 (1986); Sawai, et al., Chem. Lett., 805 (1984), Letsinger, et al., J. Am. Chem. Soc., 110:4470 (1988); および Pauwels, et al., Chemica Scripta, 26:141 (1986)）、ホスホロチオエート（Mag, et al., Nucleic Acids Res., 19:1437 (1991); および U.S. Patent No. 5,644,048）、ホスホロジチオエート（Briu, et al., J. Am. Chem. Soc., 111:2321 (1989)）、Ｏ−メチルホスホロアミダイト結合（Eckstein, Oligonucleotides and Analogues:  A Practical Approach, Oxford University Press参照）、ならびにペプチド核酸骨格および結合（Egholm, J. Am. Chem. Soc., 114:1895 (1992); Meier, et al., Chem. Int. Ed. Engl., 31:1008 (1992); Nielsen, Nature, 365:566 (1993); Carlsson, et al., Nature, 380:207 (1996)参照）を含んでいてもよい（すべての文献を出典明示により本明細書に一体化させる）。他のアナログ核酸は、陽性骨格を有するもの（Denpcy, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:6097 (1995)）、非イオン性骨格を有するもの（米国特許第5,386,023; 5,637,684; 5,602,240; 5,216,141および4,469,863号; Kiedrowshi, et al., Angew. Chem. Intl. Ed. English, 30:423 (1991); Letsinger, et al., J. Am. Chem. Soc., 110:4470 (1988); Letsinger, et al., Nucleosides & Nucleotides, 13:1597 (1994); ASC Symposium Series 580, "Carbohydrate Modifications in Antisense Research", Ed. Y.S. Sanghui and P. Dan Cookの第２章および第３章; Mesmaeker, et al., Bioorganic & Medicinal Chem. Lett., 4:395 (1994); Jeffs, et al., J. Biomolecular NMR, 34:17 (1994); Tetrahedron Lett., 37:743 (1996)）ならびに米国特許第５２３５０３３号および第５０３４５０６号およびASC Symposium Series 580, "Carbohydrate Modifications in Antisense Research", Ed. Y.S. Sanghui and P. Dan Cookの第６章および第７章に記載されたものを含む非リボース骨格を有するものを包含する。１個またはそれ以上の炭素環式の糖を含有する核酸も核酸の定義に包含される（Jenkins, et al., Chem. Soc. Rev., (1995) pp. 169-176参照）。いくつかの核酸アナログがRawls, C & E News, June 2, 1997, page 35に記載されている。これらすべての文献を出典明示により本明細書に一体化させる。リボースリン酸骨格のこれらの修飾を行って、標識のごときさらなる部分を付加してもよく、あるいは生理学的環境におけるかかる分子の安定性および半減期を増大させてもよい。さらに、天然に存在する核酸とアナログとの混合物を調製することもできる。別法として、異なる核酸アナログの混合物、および天然に存在する核酸とアナログとの混合物を調製してもよい。説明したように核酸は１本鎖または２本鎖であってよく、あるいは２本鎖配列および１本鎖配列の両方の部分を含んでいてもよい。核酸はＤＮＡであってもよく、ゲノムおよびｃＤＮＡのいずれであってもよく、ＲＮＡまたはハイブリッドであってもよく、核酸はデオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドのいずれの組み���わせを含んでいてもよく、また、ウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシン、イソグアニンを包含するいずれかの塩基の組み合わせ、ならびにニトロピロールおよびニトロインドールのごとき塩基対アナログ等を含んでいてもよい。
一般的には、上記のように、核酸生物活性剤は天然に存在する核酸、ランダムな核酸、または「片寄った」ランダムな核酸であってよい。例えば、原核ゲノムまたは真核ゲノムの消化物を、蛋白に関して上で説明したように使用してもよい。
【００４１】
一般的には、標的配列（試料の標的分析物の配列または本明細書記載の他のプローブ配列）に相補的であるように本発明のプローブを設計して、標的と本発明のプローブとのハイブリダイゼーションが起こるようにする。この相補性には完全性が必要とされることはない。標的配列と本発明の１本鎖核酸との間のハイブリダイゼーションを妨害するいくつかの数の塩基対ミスマッチが存在してもよい。しかしながら、変異の数が非常に多くて、最小のストリンンシーのハイブリダイゼーション条件下においてさえハイブリダイゼーションが起こらない場合には、その配列は相補的な標的配列でない。よって、本明細書において「実質的に相補的」は、選択された反応条件下において標的配列にハイブリダイゼーションするほど十分にプローブが相補的であることを意味する。高いストリンジェンシーの条件が当該分野において知られている。例えば、Maniatis et al.,  Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d Edition, 1989, and Short Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubel, et al.参照、両方の文献を出典明示により本明細書に一体化させる。ストリンジェントな条件は配列に左右されるものであり、異なった条件において相違するものである。より長い配列はより高い温度で特異的にハイブリダイゼーションする。核酸のハイブリダイゼーションに関するさらなる指針はTijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Acid Probes, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993)において見出される。一般的には、ストリンジェントな条件は決められたイオン強度、ｐＨにおける配列の融解温度（Ｔｍ）よりも約５〜１０℃低く選択される。Ｔｍは、標的に対して相補的なプローブの５０％が平衡状態において標的配列にハイブリダイゼーションする温度である（決められたイオン強度、ｐＨおよび核酸濃度において）（標的配列が過剰に存在するので、Ｔｍにおいてプローブの５０％が平衡状態にある）。ストリンジェントな条件は、塩濃度が約１．０Ｍのナトリウムイオンよりも低い条件であり、典型的にはｐＨ７．０ないし８．３において約０．０１ないし１．０Ｍのナトリウムイオン濃度であり（あるいは他の塩類でもよい）、短いプローブ（例えば１０ないし５０ヌクレオチド）の場合には温度が低くても約３０℃であり、長いプローブ（例えば５０ヌクレオチドよりも長い）の場合には温度が低くても約６０℃の条件である。ホルムアミドのごとき脱安定化剤を添加してストリンジェントな条件を達成してもよい。もう１つの具体例において、あまりストリンジェントでないハイブリダイゼーション条件を用いる。例えば、当該分野で知られた中程度または低いストリンジェンシーの条件を用いてもよい。ManiatisおよびAusbelの上記文献、およびTijssenの上記文献参照。
【００４２】
本明細書の用語「標的配列」またはその文法上の同義語は、核酸の１の鎖上の核酸配列を意味する。標的配列は遺伝子、調節配列、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡおよびｒＲＮＡを包含するＲＮＡ、あるいはその他の一部分であってもよい。それはいずれの長さであってもよく、長い配列のほうがより特異的であることが理解されている。当業者により理解されるように、相補的標的配列は多くの形態で存在しうる。例えば、それがより大きな核酸配列中に含まれていてもよく、すなわち、ゲノムまたはｍＲＮＡの全体または一部であってもよく、とりわけ、プラスミドまたはゲノムＤＮＡの制限フラグメントであってもよい。後でより十分に説明するように、試料中の標的配列の存在または不存在を決定するために、標的配列にハイブリダイゼーションするようにプローブが作成される。一般的に言えば、この用語は当業者により理解されるであろう。
【００４３】
好ましい具体例において、生物活性剤は有機化学的部分であり、広範かつ種々のものが文献において見出される。
【００４４】
好ましい具体例において、各ビーズは単一タイプの生物活性剤を含むが、好ましくは、複数種の個々の生物活性剤が各ビーズに結合される。同様に、好ましい具体例は単一の生物活性剤を含む１個よりも多い微小球を用いる。すなわち、微小球のサブ集団を用いることにより系中に余剰分が形成され、サブ集団中の各微小球は同じ生物活性剤を含む。
【００４５】
当業者により理解されるように、生物活性剤はビーズ上で直接的に合成されたものであってもよく、あるいは製造されてから結合されたものであってもよい。好ましい具体例において、リンカーを用いて生物活性剤をビーズに結合させて、良好な結合、標的分子との良好な相互作用を可能にする十分な柔軟性を持たせ、さらに望ましくない結合反応を回避する。
【００４６】
好ましい具体例において、生物活性剤はビーズ上で直接合成される。当該分野において知られているように、現在、ペプチド、有機部分、および核酸のごとき多くのクラスの化合物が固体支持体上で合成されている。現在の合成手法をビーズに適用することは比較的素直な方法である。
【００４７】
好ましい具体例において、最初に生物活性剤を合成し、次いで、ビーズに共有結合させる。当業者に理解されるように、生物活性剤およびビーズの組成に応じてこれを行う。ある種のポリマーのごとき固体支持体表面をチオール、アミン、カルボキシル等のごとき化学反応性基で官能化させることは当業者に広く知られている。したがって、使用者による所望官能基の結合を容易ならしめる表面化学基を有する「ブランク」微小球を用いてもよい。ブランク微小球用のこれらの表面化学基のいくつかの例を表１に示す。
【００４８】
【表１】
0003836323.tif 000002
【００４９】
これらの官能基を用いて、どのような数の異なる生物活性剤であってもビーズに結合させることができる。例えば、炭水化物を含有する生物活性剤をアミノ官能化支持体に結合させてもよい。標準的方法を用いて炭水化物のアルデヒドを得て、次いで、アルデヒドを表面上のアミノ基と反応させる。別の具体例において、スルフヒドリルリンカーを用いてもよい。ＳＰＤＰ、マレイミド、α−ハロアセチル、およびピリジルヒスルフィドのごとき当該分野において知られた多くのスルフヒドリル反応性リンカーがあり（例えば、the 1994 Pierce Chemical Company catalog, technical section on cross-linkers, pages 155-200参照, 出典明示により本明細書に一体化させる）、それらを用いてシステイン含有蛋白性物質を支持体に結合させることができる。別法として、生物活性剤上のアミノ基を、表面上のアミノ基への結合に用いてもよい。例えば、多くの安定な二官能基（bifunctional group）が当該分野において知られており、ホモ二官能基およびヘテロ二官能基リンカーが包含される（Pierce Catalog and Handbook, pages 155-200参照）。さらなる具体例において、良く知られたリンカーを用いて（Pierceのカタログ参照）カルボキシル基（表面のものあるいは生物活性剤のもの）を誘導体化させてもよい。例えば、カルボジイミドはカルボキシル基を活性化させ、アミンのごとき良好な求核物質により攻撃を受けさせる（Torchilin et al., Critical Rev. Therapeutic Drug Carrier Systems, 7(4):275-308 (1991)参照、出典明示により本明細書に一体化させる）。当該分野で知られた他の方法、例えば、ポリマーへの抗体の結合に関する方法を用いて蛋白性生物活性剤を結合させてもよい（Slinkin et al., Bioconj. Chem. 2:342-348 (1991); Torchilin et al., supra;  Trubetskoy et al., Bioconj. Chem. 3:323-327 (1992); King et al., Cancer Res. 54:6176-6185 (1994); and Wilbur et al., Bioconjugate Chem. 5:220-235 (1994)、すべての文献を出典明示により本明細書に一体化させる）。上記方法を包含する種々の方法で生物活性剤を結合させてもよいことが理解されるはずである。結合方法が生物活性剤の機能性を有意に変化させないことが重要であり、すなわち、生物活性剤と標的との相互作用を可能にするように柔軟性のある様式で生物活性剤を結合させるべきである。
【００５０】
微小球に酵素を固定化するための特別な方法が当該分野において知られている。１の場合において、ＮＨ２表面化学基を有する微小球を使用する。ｐＨ６．９のリン酸バッファーセイライン（１０ｍＭ）（１３８ｍＭ ＮａＣｌ，２．７ｍＭ ＫＣｌ）中２．５％グルタルアルデヒドを用いて表面の活性化を行う。室温において撹拌台上でこれを２時間撹拌する。次いで、微小球を０．０１％ツイン２０（界面活性剤）−０．０２％を含有する超純水ですすぎ、０．０１％ツイン２０を含有するｐＨ７．７のＰＢＳで再度すすぐ。最後に、好ましくは０．４５μｍｍのamiconマイクロピュアフィルターを用いて前濾過した後で酵素を溶液に添加する。
【００５１】
微小球は、生物活性剤のほかに、結合した生物活性剤の同定に使用できる光学的サインを含む。すなわち、微小球の各サブ集団は、当該微小球のサブ集団のユニークな生物活性剤の同定に使用できるユニークな光学的サインまたは光学的タグを含む。異なる光学的サインを有する他の位置のビーズからユニークな光学的サインを含むビーズを識別してもよい。本明細書にて説明するように、各生物活性剤が結合した光学的サインを有する結果、特定の生物活性剤を含む微小球がその特徴に基づいて同定可能となる。後でさらに十分に説明するように、例えば、別の同定レベルを使用する場合、例えば、異なるサイズのビーズを使用する場合、あるいはアレイが異なったバッチのビーズに連続的に負荷される場合において、アレイ中で光学的サインを再使用または二重にすることが可能である。
【００５２】
好ましい具体例において、一般的には、光学的サインはレポーター色素、好ましくは蛍光色素の混合物である。混合物の組成（すなわち、１の色素の別の色素に対する割合）および色素濃度（シグナル強度の相違を生じさせる）の両方を変化させることにより、ユニークなタグのマトリックスが得られる。色素をビーズ表面に共有結合させることにより、あるいは別法として色素をビーズ中に取り込ませることにより、これを行ってもよい。色素は発色基または燐光発色基であってもよいが、好ましくは、強力なシグナルにより解読の際に良好なシグナル−ノイズ比が得られる蛍光色素である。本発明における使用に適した色素は、ユーロピウムおよびテルビウムを包含する蛍光ランタニド複合体、フルオレセイン、ローダミン、テトラメチルローダミン、エオシン、エリスロシン、クマリン、メチルクマリン、ピレン、マラカイトグリーン、スチルベン、ルシファーイエロー、カスケードブルーＴＭ、テキサスレッド、および1989-1991 Molecular Probes Handbook by Richard P. Haugland（出典明示により本明細書に一体化させる）に記載された他の色素等が挙げられるが、これらに限らない。
【００５３】
好ましい具体例において、少なくとも２種の色素の割合において符号化を行うことができるが、例えば、ビーズのサイズにおいてより大きな符号化ディメンジョンを加えてもよい。さらに、標識は別の標識から識別可能なものであり、よって、２種の異なる標識が異なる分子を含んでいてもよく（すなわち、２種の異なる蛍光）、あるいはまた１の標識が２の異なった濃度または強度であってもよい。
【００５４】
好ましい具体例において、色素をビーズ表面に共有結合させる。生物活性剤の結合に関して一般的に説明したように、ビーズ表面上の官能基を用いてこを行ってもよい。当業者に理解されるであろうが、色素に対する影響が最小となるようにこれらの結合を行う。
【００５５】
好ましい具体例において、一般的には、色素をビーズマトリックス中またはビーズの孔中に取り込ませることにより色素をビーズに非共有結合させる。図１の具体例を参照すれば、レポーター色素１４が微小球１０に付加され、２種またはそれ以上の色素の割合において符号化が生じる。レポーター色素１４は発色基型であってもよい。しかしながら、解読時に蛍光の強さはより良好なシグナル−ノイズ比を生じさせるので蛍光色素が好ましい。さらに、１種の色素の濃度における符号化よりもむしろ２種またはそれ以上の色素の割合における符号化が好ましい。なぜなら、１種の色素の濃度における符号化は、レポーター色素の特徴および検出器の感度を調べるために使用される光の強度に対して感度を失わせるからである。
１の具体例において、色素がビーズではなく生物活性剤に付加されるが、このことは一般的には好ましくない。
【００５６】
図２は、微小球の調製を示すプロセスダイアグラムである。工程５０において、ストック微小球のアリコートを真空濾過して乾燥ケークを生成する。１つの実施態様において、メチルスチレン（８７％）およびジビニルベンゼン（１３％）の微小球コポリマーを使用する。これは３．１μｍの直径を有する。次いで、この乾燥ケークをばらばらにし、工程５２において、そこに色素溶液を添加して、微小球の光学的サインに、意図する表面化学官能基に関する情報をエンコードする。色素を微小球の表面に共有結合させてもよいが、これは化学官能基のために残しておくことが望ましい表面結合部位を消費する。好ましくは、微小球を膨潤させる有機溶媒（例えば、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ））中に溶解した一定の比率の２個以上の蛍光レポーター色素を含む色素溶液中に微小球を入れる。色素溶液中に微小球を浸漬する時間の長さは、その強度および比率範囲の広さを決定する。
【００５７】
例示的な２色素システムにおいて、テキサスレッドカダベリン（ＴＲＣ）（λａｂ＝５８０ｍｍで励起され、λｅｍ＝６３０ｍｍで発光する）をインドジカルボシアニン（ＤｉＩＣ）と組合せて使用する：６１０／６７０（λａｂ／λｅｍ）。一般に、色素は分析に含まれる化学に適合し、スペクトルが適合するように選択される。これは分析物および重複する発光スペクトル領域に寄与するエンコード色素比率の両方の存在に基くシグナル寄与の決定に関連するデコンボリューションの問題を回避する。
【００５８】
使用可能な他の色素の例は、Excitonのオキサジン（Oxazin）（６６２／７０５）、ＩＲ−１４４（７４５／８２５）、ＩＲ−１４０（７７６／８８２）、ＩＲ−１２５（７８６／８００）、Molecular Probesのボディピー（Bodipy）６６５／６７６、同じくMolecular Probesのナフトフルオレセイン（Naphthofluorescein）（６０５／６７５）である。ラタニド（lathanide）複合体を使用してもよい。近赤外以外で発光する蛍光色素を使用してもよい。発色団色素は、例えばラマン散乱に基く色素または偏光色素を使用するよりエキゾティックな処方と同様に、光学的に呼掛け可能な特徴を生成するさらに別の代替物である。特定の色素対が異なる化学官能基をエンコードする能力は、レシオメーター測定の解像度に依存する。控え目にいっても、いずれもの色素対が、少なくとも２０の異なる比率を識別する能力を提供するはずである。特定の色素の組を用いて作製される２個の色素の特有の組合せの数を以下の表２に示す。
【００５９】
【表２】
0003836323.tif 000003
【００６０】
このように、６個の色素および各色素対についての２０の異なる比率を使用して、３００の別々の化学官能基を微小球の所定の集団においてエンコードし得る。２個より多い色素の組合せによって、エンコードの組み合わせのさらなる多様性が提供される。さらに、色素の濃度はその強度に寄与する；従って、強度は、特有の光学的サインの数を増加させるための別の方法である。
【００６１】
工程５４において、微小球を真空濾過して、過剰の色素を除去する。次いで、微小球を水または他の微小球を膨潤させないが色素がなお可溶性である液体中で洗浄する。これは微小球から色素をすすぎ出すことなく残存色素をすすいで除くことを可能にする。
【００６２】
工程５６において、既に存在しない場合、生物活性剤を微小球表面に結合させる。表面化学が、物理的に周辺の表面に限定されず、微小球の体積全体にわたって存在し得ることを理解するべきである。
【００６３】
一旦、少なくとも１つの生物活性剤および光学的サインを含む微小球を作製すれば、微小球を基体の表面上の分離した部位に添加する。これは、多くの方法で行うことができるが、一般に、分離した部位での微小球の会合を可能にする条件下でビーズを表面に添加する工程を包含する。表面上でのビーズの会合は、例えば、化学結合部位が基体およびビーズの両方に付加される場合は表面へのビーズの共有結合を；電荷、疎水性もしくは親水性を結合の基礎として使用する場合は静電もしくは水親和性を；接着剤の使用のような物理的であるが非共有性の結合を；または空間的結合（例えば、ビーズのウェル内の局在化）を包含してもよい。いくつかの実施態様において、最初の局在化の後により永続的な結合（例えば、アレイ上の架橋剤、フィルムまたはメンブレンの使用を介する）をさせることが好ましくあり得る。
【００６４】
図３は、異なる生物活性剤を有する微小球集団から形成される微小球システムまたは微小球のアレイ１００を模式的に示す。多数の微小球および生物活性剤を用いてもよいが、この例では、３個のみの微小球集団を示す。微小球の個々の集団またはサブ集団を１０ａ、１０ｂ、１０ｃとして表し、それぞれ例示的な官能基として生物活性剤またはプローブ配列６０ａ、６０ｂ、６０ｃを有する。そのそれぞれの生物活性剤の対応する分布を有して、サブ集団を基体上でランダムにまたは整然と組合せてもよい。
【００６５】
代表的には、従来の方法を用いて、異なる生物活性剤を有する微小球集団の混合の結果、各々の対応する標的配列についての選択性に関する情報が損失する。プローブ配列６０ａ、６０ｂおよび６０ｃの各々を有する微小球の溶液中で、蛍光マーカー色素６４の濃縮が微小球１０上に観察される場合、標的配列６２ａ、６２ｂおよび６２ｃの少なくとも１つが存在することを決定することが可能である。しかし、従来のアプローチを用いて、代表的には、生物活性剤またはプローブ配列６０ａ、６０ｂおよび６０ｃのどれが活性を生成しているかを決定する方法はない。なぜなら、どの微小球がどのプローブ配列を含んでいるかに関する情報はサブ集団が混合されたときに失われるからである。
【００６６】
しかし、微小球システム１００および本発明の方法を用いれば、各サブ集団中の各微小球には共通の光学的サインがエンコードされる。示した例において、微小球１０ａによって表されるサブ集団は２つのレポーター色素の比率１０：１を有し；微小球１０ｂのサブ集団は同じレポーター色素の比率１：１を有し；微小球１０ｃのサブ集団はレポーター色素の比率１：１０を有する。
【００６７】
このように、ランダムに混合した微小球のサブ集団は、保有される生物活性剤６０ａ〜６０ｃの各々に別々に基いた分析化学システムとして有用である。微小球アレイまたはシステム１００を、生物活性剤のいくつかが相互作用し得る目的の分析物に曝露する。いずれもの相互作用が対応する微小球の光学的応答を、例えば蛍光色素６４を微小球に結合させることによって変化させる。光学的サインが変化した微小球の化学官能基を同定することによって、エンコードされた色素の組み合わせを使用して、化学的同一性および分析物の濃度に関する情報が、微小球システム１００中に含まれる各生物活性剤の相互作用または非相互作用に基いて獲得され得る。
【００６８】
その光学的サインの変化または活性を示す微小球を従来の光学縦列および光学検出システムによって同定してもよい。デコードもまた手動でまたはコンピューターの支援で自動で実施できる。使用する特定のエンコードまたはレポーター色素およびその作動波長に依存して、特定の波長用に設計された光学フィルターを生物活性剤の微小球の光学的呼掛けに用いてもよい。好ましい実施態様において、分析化学微小球システムを、基体としての光ファイバーバンドルまたはファイバー光アレイと共に使用する。
【００６９】
図４は、ファイバー光アセンブリ２００を光学検出システムとともに用いる微小球に基く分析化学システムを示す模式的ブロックダイアグラムである。ファイバー光アセンブリ２００はファイバー光バンドルまたはアレイ２０２を含み、これは光がファイバー間で混合されないようにクラッドファイバーから構築される。微小球アレイまたはシステム１００はバンドルの遠位末端２１２に結合され、近位末端２１４はｚ−並進ステージ２１６およびｘ−ｙミクロポジショナー２１８によって受けられる。これら２個の構成要素は共同で作用してバンドル２０２の近位末端２１４を顕微鏡対物レンズ２２０に対して適切に配置する。対物レンズ２２０によって集められた光は、３個のポインターキューブスライダーを有する反射光蛍光アタッチメント２２２に通過する。アタッチメント２２２は、７５ワットＸｅランプ２２４から対物レンズを通ってファイバーバンドル２０２に送られる光の差込みを可能にする。光源２２４からの光は集光レンズ２２６によって集められ、次いでフィルターおよびシャッターホイール２２８によってフィルターおよび／またはシャッターされ、次いでＮＤフィルタースライド２３０を通過する。
【００７０】
バンドル２０２の遠位末端２１２から戻る光はアタッチメント２２２によって倍率チェンジャー２３２に通過させられる。この倍率チェンジャーはファイバーの近位または遠位末端の画像サイズの調節を可能にする。倍率チェンジャー２３２を通った光は、次いで第２のホイール２３４によってシャッターおよびフィルターされる。次いで光は電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラ２３６上で画像化される。コンピューター２３８は画像化処理ソフトウェアを実行してＣＣＤカメラ２３６からの情報を処理し、可能であれば第１および第２のシャッターおよびフィルターホイール２２８、２３４を制御する。ファイバーセンサー２００を除く、すなわちバンドル２０２の近位末端の左までの計装については、Bronk, et al., Anal. Chem. 1995, Vol. 67, number 17, pp. 2750-2752によってより十分に論じられている。
【００７１】
微小球アレイまたはシステム１００を、種々の適合するプロセスを使用して光ファイバーバンドルの遠位末端に結合してもよい。微小球がバンドルの末端の近くに位置することが重要である。このことは、各光ファイバー中を戻る光が優勢に単一の微小球のみから来ることを確実にする。この特性は、個々の微小球の光学的サインの呼掛けを可能にして、微小球の官能基を含む反応を同定し、またその微小球中に含まれる色素比率をデコードするために必要である。しかし、接着または貼付技術は、分析物から微小球を化学的に隔離してはならない。
【００７２】
図５Ａおよび５Ｂは、バンドル２０２の遠位末端の顕微鏡写真であり、微小球１０をバンドル２０２に結合するための好ましい技術を示す。ウェル２５０はバンドル各光ファイバー２５２の中央に形成される。図５Ｂに示すように、ウェル２５０のサイズは微小球１０のサイズ整合しており、その結果微小球１０をウェル２５０内に配置させることができる。従って、バンドル２０２の各光ファイバー２５２は、そのウェル５中に含まれる単一の微小球１０からの光を伝える。その結果、バンドル２０２の末端をＣＣＤアレイ２３６上に画像化することによって、微小球１０の光学的サインが個々に呼掛け可能である。
【００７３】
図６は、どのようにしてミクロウェル２５０が形成され、微小球１０がウェル中に配置されるかを示す。１ｍｍの六角形に充填された画像化ファイバーは直径約３．７μｍのコアを有する約２０，６００個の独立した光ファイバーを含む（パーツ番号ＥＴ２６、Galileo Fibers）。代表的には、各ファイバーのコアは出発事前形成の結果、すなわち、ファイバーの延伸の間に六角形の形状となっており、通常は形状を変化させない。しかし、いくつかの場合、形状は環状であり得る。
【００７４】
工程２７０において、ファイバーバンドル２０２の近位および遠位末端２１２、２１４の両方は連続的に１２μｍ、９μｍ、３μｍ、１μｍおよび０．３μｍラップ仕上フィルム上で研磨される。次いで、末端を傷について原子間力顕微鏡で検査することができる。工程２７２において、代表的なエッチングをバンドル２０２の遠位末端２１２で実施する。０．２ｇのＮＨ４Ｆ（フッ化アンモニウム）、６００μｌの蒸留Ｈ２Ｏおよび１００μｌのＨＦ（フッ化水素酸）の溶液（５０％ストック溶液）を使用してもよい。遠位末端２１２をこの溶液中で特定の時間、好ましくは約３０〜６００秒（約８０秒が好ましい）エッチングする。
【００７５】
この溶液から取り出し、工程２７４において、バンドルの末端を直ちに脱イオン水中に入れて、さらなるエッチングを停止する。次いで、ファイバーをなま水道水中ですすぐ。この段階で、好ましくは超音波処理を数分間実施して、反応物から塩生成物を除去する。次いで、ファイバーを風乾する。
【００７６】
上記の手順は、バンドル２０２の各ファイバーについてのクラッド２５６に関して好都合に、ファイバーコア２５４の異方性エッチングによってウェルを生じさせる。ウェルはほぼコア２５４の直径３．７μｍを有する。この直径は例中で使用する微小球の直径３．１μｍよりわずかに大きいように選択される。ゲルマニウム−ドープ化シリカクラッド２５６よりもコア２５４の純粋なシリカがフッ化水素酸の存在下で早くエッチングされるので、選択的エッチングが生じる。
【００７７】
次いで、工程２７６において、多数の異なる技術に従って、微小球をウェル２５０中に入れる。微小球の配置は、所望のランダムに混合した微小球のサブ集団を含む溶液を遠位末端２１２に滴下し、バンドルを超音波処理して微小球をウェルに沈降させ、微小球の溶媒を蒸発させることによって達成してもよい。あるいは、サブ集団をバンドル末端に連続的に添加することができる。次いで、スルホン化ナフィオンの希釈溶液（これを末端に滴下する）を使用することによって微小球１０をウェル２５０中にに固定し得る。溶媒が蒸発すると、ナフィオンの薄いフィルムが微小球上に形成され、これが微小球を適所に保持する。このアプローチはＦＩＴＣ官能基を有するｐＨ指示用微小球の固定化に適合する。得られた固定化微小球のアレイは、スルホン化ナフィオンの水素イオンに対する透過性によってそのｐＨ感受性を保持している。しかし、ナフィオンは大部分の水溶性種に対して不透過性であるので、このアプローチを一般的に用いることはできない。同様のアプローチを異なるポリマーについて用いることができる。例えば、ポリエチレングリコール、ポリアクリルアミドまたはポリヒドロキシメチルメタクリレート（ポリＨＥＭＡ）の溶液をナフィオンの代わりに使用して水性種に対する必要な透過性を提供することができる。
【００７８】
別の固定化アプローチには、その対応するミクロウェル２５０中で各微小球１０をトラップするように膨潤する微小球を用いる。このアプローチにおいて、まず、遠位末端２１２上のミクロウェルアレイの存在下で非膨潤性溶媒中に懸濁した微小球を超音波処理することによって微小球をミクロウェル２５０中に微小球を分布させ。ミクロウェル中への配置後、次いで微小球を水性緩衝液に曝露する。その中で微小球は膨潤し、それによって、マフィン缶中で膨れ上がるマフィンのように、物理的にトラップされる。
【００７９】
一般に、アレイの作製およびアレイのデコードの方法は、特有にエンコードできる異なる候補物質の数を最大にするように行う。本発明の構成物を種々の方法で作製してもよい。一般に、ビーズを含む溶液またはスラリーを、ビーズ結合用部位を含む表面に添加することによってアレイを作製する。これを、水性溶媒および有機溶媒、ならびに混合物を含む種々の緩衝液中で行ってもよい。溶媒を蒸発させ、過剰のビーズを除去することができる。
【００８０】
好ましい実施態様において、非共有法を使用してビーズをアレイに会合させる場合、ビーズをアレイ上へ負荷する新規の方法を使用する。この方法は、アレイを粒子（微小球および細胞を含む）の溶液に曝露する工程、次いでエネルギーを加える（例えば、混合物の撹拌または振動）工程を包含する。弱く会合したビーズを落とすために十分なエネルギーを用いて撹拌を行うので、これによってより堅固に会合した粒子を含むアレイが生じる。この部位は異なるビーズの結合に利用可能である。この方法で、部位に対する高い親和性を示すビーズを選択する。この方法で作製したアレイはより静的な負荷に比較して以下の２つの主な利点を有する：第１に、より高い割合の部位が容易に充填される；第２に、このようにして負荷したアレイはアッセイの間のビーズの損失が実質的に減少する。従って、好ましい実施態様において、この方法を使用して、少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約７５％、特に好ましくは少なくとも約９０％の部位が充填されたアレイが生じる。同様に、この方法で生じたアレイは、アッセイの間に約２０％未満、好ましくは約１０％未満、特に好ましくは約５％未満のビーズを損失する。
【００８１】
この実施態様において、分離した部位を有する表面を含む基体を粒子（ビーズ、細胞など）を含む溶液中に浸漬する。表面はパターン化された表面上にウェル（本明細書に記載のような）または他の型の部位を含んでもよく、その結果、部位に対する差次的親和性が存在する。この差次的親和性によって、競合プロセスが生じ、その結果より堅固に会合する粒子が選択される。好ましくは、ビーズを「負荷」するべき表面全体は、溶液と液体接触している。この溶液は一般にビーズ：溶液（ｖｏｌ：ｖｏｌ）約１０，０００：１〜１：１の範囲のスラリーである。一般に、溶液にいずれもの試薬（水性緩衝液、有機溶媒、塩、他の試薬成分などを含む）を含めることができる。さらに、溶液は好ましくは過剰のビーズを含む。すなわち、アレイ上の部位より多いビーズが存在する。好ましい実施態様は、２倍から１０億倍過剰のビーズを利用する。
【００８２】
浸漬によってアッセイ条件を模倣することができる。例えば、試料を含むマイクロタイタープレート中へアレイを上から「浸す」場合、この構成を負荷用に反復して、重力によって落とされる可能性のあるビーズを最小化することができる。
【００８３】
一旦表面を浸漬すれば、基体、溶液またはその両方を競合プロセスに供し、それによってより低い親和性を有する粒子を基体から解離させ、部位に対するより高い親和性を示す粒子に置換することができる。この競合プロセスを、熱、超音波処理、撹拌または混合、振動または撹拌の形態での、溶液、基体またはその両方へのエネルギーの導入によって行う。
【００８４】
好ましい実施態様は撹拌または振動を利用する。一般に、基体の操作の量を最小化してアレイへの損傷を防止する。従って、好ましい実施態様は、アレイではなく溶液の撹拌を利用するが、いずれもが作動する。当業者に理解されるように、この撹拌はいずれもの形態に対しても行うことができるが、好ましい実施態様はマイクロタイタープレートシェーカーを使用して撹拌したビーズ溶液を含むマイクロタイタープレートを利用する。
【００８５】
撹拌を、所望の充填までアレイに負荷するために十分な期間進行させる。ビーズのサイズおよび濃度ならびにアレイのサイズに依存して、この時間は約１秒〜数日、好ましくは約１分〜約２４時間の範囲であり得る。
【００８６】
アレイの全ての部位がビーズを含まない可能性がある、すなわち、基体表面上にいくつかの空の部位が存在し得ることに留意するべきである。さらに、これは好ましくはないが、１個より多いビーズを含む部位がいくつか存在し得る。
【００８７】
最も一般的な微小球処方の１つはテンタゲル（tentagel）（スチレン−ポリエチレングリコールコポリマー）である。この微小球はヘキサンのような非極性溶媒中では非膨潤性であり、より極性のまたは水性の媒質への曝露に際して体積が約２０〜４０％膨潤する。微小球自体の拡散または透過特性を有意には弱めないので、このアプローチは非常に望ましい。
【００８８】
図７Ａおよび７Ｂは、最初の配置前、タッピングおよび空気パルスへの曝露後のウェル２５０中のポリマーコート微小球１２を示す。図７Ａおよび７Ｂは、特定の固定化技術なしでさえ、機械的撹拌に起因するウェルからの微小球の認識可能な損失がないことを示す。この効果はおそらく微小球と光ファイバーとの間の静電力に起因する。この力は、微小球をウェル内に結合させる傾向にある。従って、大部分の環境において、微小球のためにいずれかの化学的または機械的固定化を使用することが不用となり得る。
【００８９】
好ましい実施態様において、特にウェルを使用する場合、超音波処理工程を使用してビーズをウェル中に配置してもよい。
【００９０】
アレイの全ての部位がビーズを含むとはかぎらない、すなわち、基体表面上にいくつかの空の部位が存在し得ることに留意するべきである。さらに、これは好ましくはないが、１個より多いビーズを含む部位がいくつか存在し得る。
【００９１】
いくつかの実施態様において、例えば、化学結合を行う場合、ビーズを非ランダムにまたは整然と結合させることが可能である。例えば、光活性化可能結合リンカーまたは光活性化可能接着剤もしくはマスクを使用して、アレイ上の選択された部位を連続的に結合に適切にして、ビーズの規定された集団が配置されるようにし得る。
【００９２】
さらに、アレイのサイズは特有の光学的サインの数によって設定されるので、特有の光学的サインの組を「再使用」して、より多数の試験部位を可能にすることができる。これはいくつかの方法で、例えば、アレイ内での位置的コードスキームを使用することによって行い得、異なるサブバンドルが光学的サインの組を再使用し得る。同様に、１つの実施態様は、ビーズのサイズをコード様式として利用し、各ビーズサイズに特有の光学的サインの組の再使用を可能にする。あるいは、アレイへのビーズの連続的部分的負荷もまた、光学的サインの再使用を可能にできる。
【００９３】
好ましい実施態様において、空間的または位置的コードシステムを行う。この実施態様において、利用されるサブバンドルまたはサブアレイ（すなわち、全アレイの部分）が存在する。電話システムから類推すると、各サブアレイは「地域番号」であり、これは他のサブアレイ（これはサブアレイの位置によって分離されている）の同じタグ（すなわち、電話番号）を有することができる。従って、例えば、同じ特有のタグをバンドル毎に再使用することができる。従って、５０個の特有のタグの、１００個の異なるサブアレイとの組合せでの使用は、５０００個の異なる生物活性剤のアレイを形成することができる。この実施態様において、１つのバンドルを他のバンドルから同定可能であることが重要になってくる；これを一般に手動で、またはマーカービーズ（すなわち、各サブアレイについての特有のタグを含むビーズ）の使用を介して行う。
【００９４】
別の実施態様において、微小球サイズのようなさらなるエンコードパラメーターを追加することができる。例えば、異なるサイズのビーズの使用も光学的サインの組の再使用を可能にし得る；すなわち、異なるサイズの微小球を使用して微小球のエンコードディメンションを拡大することが可能である。異なるファイバー直径または断面を有するピクセルを含む光ファイバーアレイを製造することができる；あるいは、２つ以上のファイバー光バンドル（各々が個々のファイバーの異なる断面を有する）を一緒に加えて、より大きなバンドルを形成させることができる；または同じサイズの断面のファイバーのファイバー光バンドルを、異なるサイズのビーズとともに使用することができる。異なる直径を用いて、最大のウェルに最大の微小球を充填し、次いで全てのサイズのウェルが充填されるまで、次第により小さなウェル中のより小さな微小球に移動することができる。こうして、同じ色素比を使用して、異なるサイズの微小球をエンコードし、それによってアレイ中に存在する異なるオリゴヌクレオチド配列または化学官能基の数を拡大することができる。ファイバー光基体について概説したが、この方法ならびに本明細書中に概説する他の方法に、他の基体および他の結合様式を同様に使用することができる。
【００９５】
好ましい実施態様において、コードおよびデコードを、微小球のアレイへの連続的負荷によって達成する。空間的コードについて上記で概説したように、この実施態様において、光学的サインを「再使用」することができる。この実施態様において、各々が異なる生物活性剤を含む微小球のライブラリー（または各々が異なる生物活性剤を含むサブ集団）を複数のサブライブラリーに分割する；例えば、所望のアレイのサイズおよび特有のタグの数に依存して、各々が全ライブラリーの約１０％を含む１０個のサブライブラリーを作製し得、各サブライブラリーはおおよそ同じ特有のタグを含む。次いで、第１のサブライブラリーをウェルを含むファイバー光バンドルに加え、各生物活性剤の位置を、その光学的サインを使用して決定する。次いで、第２のサブライブラリーを加え、各光学的サインの位置を再度決定する。この場合、シグナルは「第１」光学的サインおよび「第２」光学的サインを含む；２つのマトリックスを含めることによって、各サブライブラリー中の各ビーズの位置を決定することができる。同様に、第３、第４などのサブライブラリーを連続的に加えることによってアレイを充填させる。
【００９６】
このように、微小球および表面上に分離した部位を有する基体を含む本発明の構成物を利用して、アレイは大きなスペクトルの化学官能基から作製される。詳細には、本発明における使用に適合可能な先行技術のセンサーは、微小球センサーの以下の４つの広い分類を包含する：１）基本的インジケーター化学センサー；２）酵素に基くセンサー；３）免疫に基くセンサー（その両方はタンパク質センサーのより広い一般的分類の一部である）；および４）ジェノセンサー（geno-sensor）。
【００９７】
好ましい態様において、生物活性剤を化合物を検出するのに使用する。多数の基本的指示センサーがすでに明らかにされている。例には、
【００９８】
【表３】
0003836323.tif 000004
【００９９】
【表４】
0003836323.tif 000005
【０１００】
【表５】
0003836323.tif 000006
が含まれる。
【０１０１】
表IIIに挙げた化学物質は、各々、標的分析物の存在下で、以下にさらに完全に示すように、光学的に呼掛け可能なシグナル(optically interrogatable signal)または光学的シグナルの変化を直接生じさせる。
酵素に基づくミクロスフェアセンサーも明らかにされており、ミクロスフェア上に明示され得る。例には、
【０１０２】
【表６】
0003836323.tif 000007
が含まれる。
【０１０３】
一般に、前により完全に記載したように、酵素感受性化学分析物の存在により誘導される光学的シグナルの変化は、化学官能性のこのクラスにおいては間接的に生じる。ミクロスフェア結合酵素、例えばグルコースオキシダーゼは標的分析物、例えばグルコースを分解し、共基質、例えば酸素を消費し、または、いくらかの副産物例えば過酸化水素を生じる。酸素感受性色素は、次いでシグナル変化を誘発するために使用する。
【０１０４】
免疫に基づくミクロスフェアセンサーは、環境汚染物質、例えば農薬、除草剤、ＰＣＢ’ｓおよびＰＡＨ’ｓなどの検出に関して立証されている。加えて、これらのセンサーは、診断、例えば、細菌(例えば、レプラ、コレラ、ライム病および結核)、ウイルス(例えば、ＨＩＶ、ヘルペス単体、サイトメガロウイルス)、真菌(例えば、アスペルギルス症、カンジダ症、クリプトコックス症)、マイコプラズマ(例えば、マイコプラズマ肺炎)、原生動物(例えば、アメーバ症、トキソプラズマ症)、リケッチア(例えば、ロッキーマウンテン斑点熱)および妊娠テストのためにも使用されている。
【０１０５】
ミクロスフェア遺伝子センサーを作成してもよい(実施例を参照されたい)。これらは典型的には、プローブ配列をミクロスフェア表面に、化学的に、典型的にはＮＨ２基により付着させることにより構築する。蛍光色素分子、例えばフルオレセインを溶液中の標的配列に付着させる。光学的に呼掛け可能なシグナルの変化は、ミクロスフェアへの標的配列の結合と共に生じる。これにより、一般に、ミクロスフェアを取り囲む色素の濃度が溶液中よりも高くなる。明らかにされているいくらかのプローブと標的配列(Ferguson, J.A.et al. Nature Biotechnology, Vol. 14, Dec. 1996を参照されたい)を次の表Ｖに示す。
【０１０６】
【表７】
0003836323.tif 000008
【０１０７】
遺伝子センサーは、標識としてのハイブリダイゼーション指示薬の使用に基づき得ることにさらに注目すべきである。ハイブリダイゼーション指示薬は二重鎖の核酸に通常可逆的に、選択的に結合する。ハイブリダイゼーション指示薬には、挿入物(intercalators)および、マイナーおよび／またはメジャー溝結合部(minor and/or major groove binding moieties)が含まれる。好ましい態様においては、挿入(intercalation)は一般に、二重鎖核酸の存在下でのみ生じ、標的ハイブリダイゼーションの存在下でのみ標識がライトアップするので、挿入物を用いてもよい。
【０１０８】
本発明は、センサーのこれらのタイプのいずれかまたは全てと共に用いてもよい。当業者に認識されるように、センサーのタイプと組成は、標的分析物の組成により広く変化する。つまり、センサーは、核酸、タンパク質(酵素センサーおよび免疫センサーを含む)、脂質、炭水化物などを検出するために作成してもよく、同様に、これらのセンサーは核酸、タンパク質、脂質、炭水化物などである生物活性剤を含んでもよい。加えて、単一アレイセンサーは、分析物の複合型に対する異なる結合リガンドを含んでもよい。例えば、ＨＩＶに対するアレイセンサーは、ウイルスゲノムの直接検出のための複合核酸プローブ、ウイルス粒子の直接検出のためのタンパク質結合リガンド、抗ＨＩＶ抗体の検出のための免疫成分などを含んでもよい。
【０１０９】
ビーズおよび基体に加えて、本発明の構成物は、他の成分、例えば光源、光学成分(例えばレンズおよびフィルター)、ディテクター、データ分析のためのコンピューター成分などを含んでもよい。
本発明のアレイは、生物活性剤の同定についての情報をアレイ中に作成するべく構築し、基体の表面上のビーズのランダムな沈着(deposition)が「デコード」され、全位置における生物活性剤の同定が可能となるように構築する。これは、種々の方法で行うことができる。
好ましい態様においては、ビーズを基体に乗せ、次いでアッセイを行う前にアレイをデコードする。これは、アレイ上の各位置においてビーズと結合した光学的サインを検出することにより行う。ユニークな光学的サインを用いる場合または、結果として、光学的サインのセットの「再利用」に関して前に概説しているように、全て一度に行ってもよい。これとは別に、デコーディングは、アッセイを行った後に生じてもよい。
【０１１０】
一度作成され、必要な場合にデコードされると、該構成物は、多くの適用に用いられる。一般に、標的分析物を含むサンプル(標的分析物の検出のための、または標的分析物の結合パートナーのスクリーニングのための)を、標的分析物の、生物活性剤の少なくとも一つへの結合に適した条件、すなわち一般に生理的条件下でアレイに添加する。標的分析物の存在または不在をついで検出する。当業者により認識されるように、これは、様々な方法、一般に、光学的シグナルの変化を用いることより行うことができる。この変化は、多くの異なるメカニズムにより生じ得る。いくらかの例としては、色素-標識分析物のビーズへの結合、ビーズ上またはビーズ付近の色素種の呈示、存在している色素種の破壊、ビーズ上の色素との分析物の相互作用に関する光学的サインの変化またはいずれかの他の光学的に検出可能な事象が含まれる。
【０１１１】
好ましい態様において、光学的シグナルの変化は、標識された標的分析物の、検出可能なラベル、好ましくはフルオロクロームのような光学的ラベルとの直接的または間接的な結合の結果として生じる。つまり、例えば、タンパク質性標的分析物を用いる場合、蛍光を用いて直接的に、または、標識抗体の使用により間接的に標識することができる。同様に、核酸は、当該分野で公知のように、例えばＰＣＲ増幅中にフルオロクロームを用いて容易に標識される。これとは別に、標的配列の結合に関して、挿入色素(intercalating dye)(例えばエチジウムブロマイド)を、標的のプローブ配列への結合の存在を示すために続いて添加することができる。標的分析物が生物活性剤に結合すると、その部分で新たな光学的シグナルが生じ、次いでこれを検出することができる。
【０１１２】
これとは別に、前に記載したように、いくらかの場合においては、酵素のような標的分析物は、直接的または間接的に、光学的に検出可能な種(例えば蛍光産物)を生じる。
さらに、いくらかの態様において、光学的サインの変化は、光学的シグナルの基礎である可能性がある。例えば、いくらかの化学標的分析物の、ビーズ上のいくらかの蛍光色素との相互作用により光学的サインが変化し、次いで異なる光学的シグナルが生じ得る。例えば、フルオロフォア誘導レセプターを用いることができ、ここで、リガンドの結合によりシグナルが変化する。
【０１１３】
好ましい態様においては、センサー重複(sensor redundancy)を用いる。この態様では、同一の生物活性剤を含む多数のセンサーエレメント、例えばビーズを用いる。すなわち、各副次母集団(subpopulation)には、同じ生物活性剤(例えば結合リガンド)を含む多数のビーズが含まれる。所定のアレイのための多くの同じセンサーエレメントを用いることにより、各センサーエレメントからの光学的シグナルを組み合わせることができ、かなり数の統計分析を前記のように行うことができる。これは、種々の理由に関して行うことができる。例えば、時間変化測定(time varying measurement)において、重複により、システム中のノイズを有意に減じることができる。時間に基づかない測定に関しては、重複によりデータの信頼性が有意に増し得る。
【０１１４】
好ましい態様においては、多くの同一センサーエレメントを用いる。当業者に認識されるように、多くの同じセンサーエレメントは、適用およびセンサーアレイの使用とともに変化する。一般に、概して２〜数千を用いることができ、２〜１００が好ましく、２〜５０が特に好ましく、および、５〜２０がとりわけ好ましい。一般に、いくらかの適用においてはより一致するエレメントを用いることができるが、およそ１０のビーズにより十分な利点が与えられることが予備結果により示される。
【０１１５】
獲得するやいなや、各ビーズ副次母集団内の多くのセンサービーズからの光学的応答シグナルを操作し、基線調整、平均、標準偏差分析、分布およびクラスター分析、信頼区間分析、平均試験などを含む広範囲の方法で分析することができる。
【０１１６】
好ましい態様において、光学的応答シグナルの第一操作は光学的基線調整である。典型的な方法においては、標準化した光学的応答を、全データ点から整数１.０を差し引くことにより０.０の値で始まるように調整する。これを行うことにより、ともに合計した場合ですら基線ループのデータをゼロに維持することが可能となり、ランダムな応答シグナルノイズが相殺される。サンプルが蒸気である場合、蒸気パルス-ループ時間領域はしかし、蒸気パルスの前にポジティブ、ネガティブまたはニュートラルいずれかの特徴的な応答変化をしばしば示し、はじめの数データ点において、ＣＣＤカメラにおいて蓄積されたチャージによるドリフト関連ノイズを克服するための基線調整がしばしば必要となる。ドリフトがない場合、各ビーズセンサーに関する始めのデータ点からの基線は典型的には、同じビーズに関する全応答データから差し引く。ドリフトが見られる場合、各ビーズセンサーに関する始めの１０データ点からの平均基線を、同じビーズに関する全応答データから差し引く。この基線調整を適用することにより、多数のビーズ応答を合計する場合、基線はゼロのままでそれらを拡大することができる。全ビーズは同時にサンプルに応答するので(例えば、蒸気パルス)、それらは全てまさに同時にパルスを見、それらの応答をオーバーレイするのに記録または調整は必要とされない。加えて、基線調整の他のタイプを、用いるシステムの必要性および出力により行ってもよい。
【０１１７】
一度基線を調整したら、いくらかの態様においてはこれは必要とされないが、多くの可能な統計学的分析を行い、既知の統計パラメータを得ることができる。重複性に基づく分析は公知であり、Freund and Walpole, Mathematical Statistics, Prentice Hall, Inc. New Jersey, 1980に概説されており、本明細書中にその全てを引用により組み込む。
好ましい態様において、シグナルの加算は、単に、各時間点の全応答の強度値を足すことにより行い、全ビーズ応答の合計からなる新規な時間応答を生じる。これらの値は基線調整したものか、未処理のものであり得る。本明細書中に記載する全分析に関して、シグナルの加算は実時間またはデータ取得後のデータ換算(post-data acquisition data reduction)および分析中に行うことができる。一つの態様において、シグナルの加算は、市販のスプレッドシートプログラム(Excel, microsoft, Redmond, WA)を用いて、光学的応答データを集めた後に行う。
【０１１８】
好ましい態様において、蓄積された応答データは、単に連続時間間隔の全データ点を加えることにより生じる。特定時間間隔の全データ点の合計からなるこの最終コラム(final column)を次いで個々のビーズ応答と比較またはプロットし、シグナル増強または、改良されたシグナル対ノイズ比の程度を図１４および１５に示すように決定する。
【０１１９】
好ましい態様において、副次母集団(すなわち多数の同一ビーズ)の平均は、周知の等式１:
等式１
【化１】
0003836323.tif 000009
を用いて決定する。
いくらかの態様において、副次母集団を再定義し、必要であればいくらかのビーズ(例えば、以下に記載するような、明らかなアウトライアー)を除外してもよい。
【０１２０】
好ましい態様において、副次母集団の標準偏差は、一般に等式２(全副次母集団に関して)および等式３(全母集団同様のものに関して):
等式２
【化２】
0003836323.tif 000010
等式３
【化３】
0003836323.tif 000011
を用いて決定することができる。
平均に関しては、副次母集団を再定義して、必要な場合にいくらかのビーズ(例えば、以下に記載するような明らかなアウトライアー)を除外してもよい。
【０１２１】
好ましい態様において、特定のデータ点が副次母集団内に統計学的妥当性を有するかどうかを評価するために、ｔ分布およびクラスター分析を含むがこれらには制限されない方法を用いることにより統計学的分析を行う。これは、そうしなければ結果をゆがめ、いずれかの特定に実験のシグナル対ノイズ比を増す可能性のあるアウトライアーを統計学的に棄却するために行ってもよい。これは、等式４:
等式４
【化４】
0003836323.tif 000012
を用いて行うことができる。
好ましい態様において、データの質は当該分野で公知の信頼間隔を用いて評価する。信頼間隔を、結果の統計学的妥当性を測定するためのより包括的なデータの加工を促進するために用いることができる。
【０１２２】
好ましい態様において、ビーズの副次母集団の統計学的パラメータを、仮説試験を行うのに用いる。一つの適用は、平均試験とも呼ばれる、平均に関する試験である。この適用において、統計学的評価を、２つの副次母集団が異なっているかどうかを決定するために行う。例えば、一つのサンプルをアレイ中の各副次母集団に関する別のサンプルと比較して、変化が統計学的に有意であるかどうかを決定する。
【０１２３】
加えて平均試験は、同じコードを共有する２つの異なるアッセイを識別するために用いることもできる。２つのアッセイが、それぞれ統計学的に異なる結果を示す場合、共通のコードを共有する副次母集団は、アッセイおよび、以下の等式５:
等式５
【化５】
0003836323.tif 000013
に示すような平均試験に基づいて区別することができる。
さらに、センサーエレメントの副次母集団の個々のメンバーの分布の分析してもよい。例えば、副次母集団の分布を評価して、該分布が二項式、ポアソン、超幾何分布などであるかどうかを決定することができる。
【０１２４】
センサー重複に加えて、好ましい態様は、単一標的分析物へ指向されるが同一ではない多くのセンサーエレメントを利用する。例えば、単一標的核酸分析物は、それぞれ異なるプローブを含む２またはそれ以上のセンサーエレメントを有していてもよい。非特異的結合相互作用は統計学的に最小化され得るために、これにより信頼性のレベルが付加される。核酸標的分析物を評価する場合、重複核酸プローブは重複、隣接、または空間的に分離している可能性がある。しかし、２つのプローブが単一の結合部位に競合しないことが好ましく、それゆえ、隣接または分離プローブが好ましい。同様に、タンパク質性標的分析物を評価する場合、好ましい態様は、標的の異なる部位に結合する生物活性剤結合試薬を利用する。例えば、抗体(または抗体断片)を標的タンパク質の結合のための生物活性剤として使用する場合、好ましい態様は、異なるエピトープに対する抗体を利用する。
【０１２５】
この態様において、多数の異なるセンサーエレメントを用いることができ、約２〜約２０が好ましく、約２〜約１０が特に好ましく、および、２、３、４または５を含む２〜約５が特に好ましい。しかし前記のように、適用により、より多くを用いてもよい。
前記のように、多くの統計学的分析を標的重複センサーからのデータに関して行うことができる。
センサーエレメント加算(本明細書中、ビーズを用いる場合、「ビーズ加算」ともいう)の一つの利点は、生じ得る感度の増加である。ゼプトモル範囲の検出限度が観察される。
【０１２６】
当業者に認識されるように、いくらかの態様において、標的分析物の存在または不在は、表面強化ラマンスペクトロスコピー、表面プラズモン共鳴、放射能活性などを含むがこれらには制限されない他の光学的または非光学的シグナルの変化を用いて行ってもよい。
アッセイは、当業者により認識されるような種々の実験条件下で行うことができる。種々の他の試薬を、スクリーニングアッセイに含むことができる。これらには、最適のタンパク質-タンパク質結合を促進するおよび/または、非特異的またはバックグラウンド相互作用を減じるのに用いることができる塩、中性タンパク質、例えばアルブミン、洗剤などを含むが、これらには制限されない。別に、アッセイの効能を改良する試薬、例えばプロテアーゼインヒビター、ヌクレアーゼインヒビター、抗微生物試薬などを用いてもよい。成分の混合物は必要な結合を提供するいずれの順番で添加してもよい。種々のブロッキングおよび洗浄ステップを、当該分野で公知のように利用してもよい。
【０１２７】
好ましい具体例においては、その構成物を用いて標的分析物の有無について試料溶液を検査する。「標的分析物」または「分析物」あるいは本明細書中での均等な物は、結合パートナーについて検出または評価されるべき、いずれの原子、分子、イオン、分子イオン、化合物または粒子も意味する。当業者に明らかであるように、本発明においては多数の分析物を用いることができる；基本的には、生物活性剤に結合するか、または結合パートナー（すなわち、薬物候補）を試験するための、いずれの標的分析物を用いることもできる。
適当な分析物は、生物分子を含め、有機および無機分子を包含する。標的分析物の検出を行う場合、適当な標的分析物は、限定されるものではないが、大気中の汚染物質（農薬、殺虫剤、トキシン等を含む）；化学物質（溶媒、ポリマー、有機物質等を含む）；治療用分子（治療薬および濫用物質、抗生物質等を含む）；生物分子（ホルモン、サイトカイン、蛋白、核酸、脂質、炭水化物、細胞膜抗原および受容体（神経性、ホルモン性、栄養素および細胞表面受容体）またはそのリガンド等）；全細胞（（病原性細菌などの）原核生物および哺乳動物の腫瘍細胞を含む真核生物細胞を含む）；ウイルス（レトロウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、レンチウイルス等を含む）；および胞子などを包含する。特に好ましい分析物は核酸および蛋白である。
【０１２８】
好ましい具体例においては、標的分析物は蛋白である。当業者にとって明らかであるように、本発明に従って、結合パートナーについて検出または評価することのできる極めて多数の潜在的な蛋白性標的分析物がある。適当な蛋白標的分析物は、限定されるものではないが、（１）免疫グロブリン；（２）酵素（および他の蛋白）；（３）ホルモンおよびサイトカイン（その多くは細胞性受容体に対するリガンドとして供する）；および（４）他の蛋白を包含する。
好ましい具体例において、標的分析物は核酸を包含する。これらのアッセイには極めて多種の用途がある。
好ましい具体例においては、そのプローブを遺伝的診断に用いる。例えば、本明細書に開示の技法を用いて標的配列、例えば、ポリープ症以外の結腸癌についての遺伝子、ＢＲＣＡ１乳癌遺伝子、種々の癌に関与する遺伝子であるＰ５３、アルツハイマー病となる危険性の高いＡｐｏＥ４遺伝子、患者、嚢胞性繊維形成遺伝子における変異または当該分野にて周知の他の遺伝子の簡単な徴候的スクリーニングを可能とする、プローブを製造することができる。
【０１２９】
付加的な具体例において、本発明の複合体を用いてウイルスおよび細菌の検出を行った。この具体例においては、種々の細菌およびウイルスから標的配列を検出するようにプローブを設計する。例えば、血流スクリーニング法は抗ＨＩＶ抗体の検出に依存している。本明細書に開示されている方法は臨床試料を直接スクリーニングし、ＨＩＶ核酸配列、特に保存性の高いＨＩＶ配列を検出することが可能となる。加えて、該方法は、抗ウイルス療法の効能を評価する改良方法として、患者内を循環しているウイルスを直接モニター観察することができる。同様に、この方法にて、白血病に関連するウイルス、ＨＴＬＶ−ＩおよびＨＴＬＶ−ＩＩを検出することができる。結核、クリミジアおよび他の性的に伝染する疾患などの細菌感染も検出することができる。
好ましい具体例においては、本発明の核酸は、水および食物の試料をスクリーニングする際の毒性細菌に対するプローブとしての使用を見出す。例えば、試料を処理して細菌を溶解させてその核酸を放出させ、ついで、限定されるものではないが、サルモネラ、カンピロバクター、ビブリオコレラ、レイシュマニア、イー・コリのエンテロトキシック株、およびレジオナリー疾患細菌などの病原菌を含む、細菌株を認識するようにプローブを設計する。同様に、本発明の構成物を用いて生体治療法を評価することもできる。
【０１３０】
さらなる具体例において、このプローブを法的な「ＤＮＡフィンガープリンティング」に用いて、犯罪事件のＤＮＡを犠牲者および容疑者から採取した試料と対合させる。
付加的な具体例において、アレイ中のプローブをハイブリダイゼーションによる配列決定に用いる。
本発明はまた、方法論として、標的核酸配列中の変異またはミスマッチを検出するための用途を見出す。例えば、最近では、多形的ＤＮＡマーカーを用いることで、遺伝的変異と表現型の間の関係を分析することに焦点が当てられている。従来の研究では、多形的位置マーカーとしてショートタンデム反復配列（ＳＴＲ）を利用していたが、最近の焦点は、ヒトゲノムＤＮＡにて１キロ塩基当たり平均頻度が１回以上で生じる、単一ヌクレオチド多形体（ＳＮＰ）を使用することにある。いくつかのＳＮＰ、特にコーディング配列におよびその周辺にあるＳＮＰは、治療的に関連する表現型変異体の直接的原因である可能性がある。臨床的に重要な表現型を生じさせる多くの周知の多形体がある；例えば、ａｐｏＥ２／３／４変異体はアルツハイマー病および他の疾患と種々の相関的な危険性で関連付けられる（Cordorら、Science ２６１（１９９３）を参照のこと）。ＳＮＰ遺伝子座を多様なＰＣＲ増幅に付し、つづいてオリゴヌクレオチドアレイにハイブリダイズすることが、少なくとも数百種のＳＮＰを同時に遺伝子型を決定する正確かつ信頼のおける方法であることが明らかにされている；Wangら、Science ２８０：１０７７（１９９８）を参照のこと；さらに、Schaferら、Nature Biotechnology １６：３３−３９（１９９８）を参照のこと。本発明の構成物は従来のアレイと容易に置き換えることができる。
【０１３１】
好ましい具体例においては、本発明の構成物を用いて生物活性剤をスクリーニングし、標的分子に結合し、好ましくはその機能を修飾するであろう、物質を見つける。上記したように、当業者に明らかであろう、広範囲に及ぶ種々のアレイフォーマットを行うことができる。一般に、結合パートナーに望ましい標的分析物を標識し；標的分析物と生物活性剤とを結合させ、その結果、標識をビーズにリクルートし、つづいて検出することとなる。
好ましい具体例においては、生物活性剤と標的分析物の結合は特異的であり；すなわち、生物活性剤は標的分析物に特異的に結合する。本明細書中の「特異的に結合する」なる語は、分析物と試験試料の他の成分または汚染物を区別するのに十分な特異性をもって、その活性剤が分析物に結合することを意味する。しかしながら、当業者に明らかなように、例えば、系が種々の結合リガンド、例えば、種々のリガンドのアレイを用いることができ、「エレクトリックノーズ」が作用するのと同様に、特定の分析物の検出がその「サイン」の結合リガンドのパネルへの結合を介するものである、あまり特異的でない結合を用いて分析物を検出することが可能であろう。これにより化学的分析物の検出において特定の有用性が明らかにされる。ある種の場合、すなわち、アフィニティの小さな結合パートナーを検出する場合には、洗浄工程は望ましくないが、非特異的結合を除去するのに、洗浄工程を含め、アレイの条件下で結合を保持するのに十分に結合していなければならない。ある種の場合、例えば、特定の生体分子を検出する場合には、分析物の結合リガンドとの解離定数は、約１０−４−１０−６Ｍ−１より小さく、約１０−５ないし１０−９Ｍ−１より小さいことが好ましく、約１０−７−１０−９Ｍ−１より小さいことが特に好ましい。
【０１３２】
以下に実施例を用いて上記した発明の使用方法、ならびに種々の態様の本発明を行うための最良の方法をさらに詳しく説明する。これらの実施例は本発明の範囲を何ら特定するものではなく、むしろ例示を目的とするものであると理解される。本明細書に引用したすべての刊行物は、その出典を明示することにより本明細書の一部とする。
【０１３３】
（実施例）
実施例１：酵素をベースとするセンサー
サブ集団Ａ
生物活性剤：  アルカリ性ホスファターゼ
標的基体：  フルオレセインジホスフェート（ＦＤＰ）
報告されている色素割合：  １：１のＤｉｌＣ：ＴＲＣ（ここで、ＤｉｌＣは１,１',３,３,３',３'−ヘキサメチル−ヨードジカルボシアニンヨーダイドであり、ＴＲＣはテキサスレッドカダベリンである）
【０１３４】
２つの色素の量子収率に基づいて、サブ集団の色素割合に関する光学的サインを代表する、一連の割合の光度を選択する。このサブ集団に関する光学的サインは：
0003836323.tif 000014
である。
【０１３５】
サブ集団Ｂ
生物活性剤：  β−ガラクトシダーゼ
標的基体：  フルオレセインジ−β−ガラクトピラノシド（ＦＤＧ）
報告されている色素割合：  １０：１のＤｉｌＣ：ＴＲＣであり、それは
0003836323.tif 000015
の光学的サインを意味する。
【０１３６】
サブ集団Ｃ
生物活性剤：  β−グルクロニダーゼ
標的基体：  フルオレセインジ−β−Ｄ−グルクロナイド（ＦＤＧｉｃｕ）
報告されている色素割合：  １：１０のＤｉｌＣ：ＴＲＣであり、それは
0003836323.tif 000016
の光学的サインを意味する。
【０１３７】
微小球集団が１またはそれ以上の基体中にある場合、その微小球にある個々の酵素は、４９０ｎｍで励起した場合に５３０ｎｍで蛍光を発光する、フルオレセインを産生する基体の崩壊を触媒する。ついで個々のビーズに局在化されているフルオレセインの産生をモニターする。この方法においては、微小球の回りでのフルオレセインの局在化は、９０％グリセロールおよび１０％基体の基体溶液を用いることで強化される。グリセロールは産生したフルオレセインが微小球反応部位から拡散していくのを防止する。
実験の間にまずエンコードされた波長のイメージを描写する。ＤｉｌＣおよびＴＲＣは共に５７７ｎｍで励起される。ＤｉｌＣの存在を示す６７０ｎｍでの、ＴＲＣの存在を示す６１０ｎｍでの各微小球の発光を、５９５ｎｍで二色性の、ＣＣＤ２３６について５秒間の捕捉時間を用いて記録した。次に、ファイバーバンドルの遠位末端２１２を緩衝液中に入れ、４９０ｎｍの光線を照射しながら別のイメージを描写する。５３０ｎｍのフルオレセイン波長における発光を５０５ｎｍでの二色性を用いて記録した。この場合、１秒間のＣＣＤ捕捉時間を用いた。この方法はバックグラウンドを標準化するイメージを提供する。緩衝液を除去し、ファイバーを乾燥させて基体溶液が希釈化されるのを回避した。
【０１３８】
ついで、基体溶液を導入し、３０分間の間、１分に対して３０秒毎にＣＣＤイメージを得た。その間、微小球に４９０ｎｍの光を照射し、５３０ｎｍでの発光を集めた。ついで、ファイバーを緩衝液に戻し、別のバックグラウンドイメージを捕捉した。フルオレセインの生成を示すシグナルを発生するこれらのビーズをデコードする。２つのレポーター色素、ＤｉｌＣ：ＴＲＣからの光度の割合に応じて、光学的に活性なビーズの生物活性剤を以下の表に従ってデコードする。
【表８】
0003836323.tif 000017
ついでこの方法を残りの２つの基体について繰返す。
【０１３９】
図８Ａ−８Ｃは、ビーズ集団をフルオレセインジホスフェートに曝した時にＣＣＤ２３６で得られたイメージである。図８Ａはアルカリ性ホスファターゼ微小球を４９０ｎｍで励起させ、５３０ｎｍでの発光を記録した場合のシグナルを示し、この波長での発光はフルオレセイン生成を示す。図８Ｂは微小球を５７７ｎｍで励起させ、６７０ｎｍでの発光を記録する場合の、ＣＣＤにより捕捉されるイメージを示す。この波長は微小球上のＤｉｌＣの濃度を示すエンコード化波長である。最後に、図８Ｃは微小球を５７７ｎｍで励起させ、微小球におけるＴＲＣの濃度を示す、６１０ｎｍでの発光を記録する場合のイメージを示す。
同様の血管にて、図９Ａおよび９Ｂは、微小球をフルオレセインβ−Ｄ−ガラクトシダーゼに曝した時の図である。図９Ａはフルオレセイン生成を示す、５３０ｎｍでの発光を示し；図８ＢはＤｉｌＣの存在を示す、６７０ｎｍで放出される光を示す。
図８Ａ−８Ｃおよび図９Ａ−９Ｂのこれらの微小球は、微小球の周辺のフルオレセイン生成が微小球の生物活性剤の関与する反応を示す光学的サインの変化として検出することができることを示す。微小球はまた、光学的サインがデコードされ、各微小球の官能特性を決定することを示すものである。
【０１４０】
イムノセンサー
ビーズの３つの別々のサブ集団を用いた。サブ集団Ａでは、ウサギ抗体（Ａｂ）を微小球の表面に付着させる；サブ集団Ｂでは、ヤギ抗体を微小球に付着させる；そしてサブ集団Ｃでは、マウス抗体を微小球に付着させる。これら３種の別々のサブ集団を、前に記載の実験における割合と同じようなＤｉｌＣ：ＴＲＣエンコード割合を用いて同定した。
実験の第１工程では、エンコードされた波長のイメージを５７７ｎｍの励起を用いて捕捉し、６１０および６７０ｎｍでの発光を調べた。このエンコードの後で、ファイバーを緩衝液中に入れ、４９０ｎｍで励起させながら５３０ｎｍでイメージを描写した。この操作でフルオレセイン発光波長でのバックグラウンド標準化シグナルが得られる。次に、ファイバーをフルオレセイン標識したウサギＩｇＧ抗原（Ａｇ）に入れた。ついでイメージをフルオレセインについて５３０ｎｍでの発光波長で２、３分毎に捕捉した。図１０Ａおよび１０Ｂはウサギ抗体に曝す前後で、微小球がＣＣＤにより捕捉されたイメージを示し、それが選択された微小球と集団との反応を示すのは明らかである。
【０１４１】
抗原溶液からのフルオレセインバックグラウンドが大きすぎて抗原−抗体シグナルを見ることができないならば、ファイバーバンドルを緩衝液中に入れることができる。これはバックグラウンド蛍光を除去し、Ａｂ−Ａｇシグナルだけを放出する。
本発明をはその好ましい具体例に関して特に図示かつ記載したが、添付する請求の範囲により特定されるような発明の精神および範囲から逸脱することなく、形態および詳細において変形しうることは当業者に明らかである。
【図面の簡単な説明】
【図１】  本発明の微小球の光学的サインエンコーディングおよび化学的機能化を示す概略図。
【図２】  本発明の微小球の調製、エンコーディングおよび機能化を示す工程図。
【図３】  異なる化学的機能性を有する微小球およびエンコードされた機能性の説明を含む微小球系を示す概略図。
【図４】  本発明のファイバーオプティックセンサーおよび関連の器機およびコントロールシステムの概略図。
【図５】  微小球を光ファイバー・バンドルの遠位末端に接着または付着させるための好ましい技術を示す顕微鏡写真。
【図６】  光ファイバー・バンドルにおけるウェル形成およびウェル中の微小球の付着を示す工程図。
【図７】  ウェル中の微小球の静電気結合を明らかにする物理的振動、タッピングおよびエア・パルシングの前後のウェル中の微小球のアレイを示す顕微鏡写真。
【図８】  各々、フルオレセイン放射波長、ＤｉｌＣのエンコーディング波長およびＴＲＣのエンコーディング波長にてフルオレセインジホスフェートに曝露したときのアルカリホスファターゼ微小球由来の顕微鏡写真。
【図９】  各々、フルオレセイン放射波長およびＤｉｌＣのエンコーディング波長にてフルオレセインβ−ガラクトピラノシドに曝露したときのβ−ガラクトシダーゼ微小球由来の光学的シグナルを示す顕微鏡写真。
【図１０】  フルオレセイン標識化抗原に曝露した前後のウサギ抗体微小球由来の光学的応答を示す顕微鏡写真。
【図１１】  ビーズ上に固定したＤＮＡの配列に相補的なＣｙ３−標識化プローブと１０分ハイブリダイゼーション後、ビーズ表面上にＤＮＡを合成したビーズ由来の光学的応答を示す顕微鏡写真。ビーズはランダムにＡ）エッチング化（etched）オプティカルイメージングファイバーまたはＢ）パターン化ポリマー（ポリウレタン）基体（チップ）上に分布させた。５ｎＭのＣｙ３−標識化プローブでハイブリダイゼーション後、基体をイメージングシステム上の光学的読取りのためのバッファー中に置いた。Ａ）は、バッファー溶液中の遠位（ビーズ化）末端と共に近位末端までをイメージ化された。Ｂ）は、トップからカバーガラスまでを直接イメージ化された。
【図１２】  異なる基体間での光学的応答を示す顕微鏡写真。Ａ）およびＢ）において基体はエッチング化オプティカルイメージングファイバーであり、Ｃ）における基体はチップである。図１１に示すようにデータが得られ、定量して平均強度および変化性が決定された。
【図１】
0003836323.tif 000018
【図２】
0003836323.tif 000019
【図６】
0003836323.tif 000020
【図３】
0003836323.tif 000021
【図４】
0003836323.tif 000022
【図５Ａ】
0003836323.tif 000023
【図５Ｂ】
0003836323.tif 000024
【図７Ａ】
0003836323.tif 000025
【図７Ｂ】
0003836323.tif 000026
【図８Ａ】
0003836323.tif 000027
【図８Ｂ】
0003836323.tif 000028
【図８Ｃ】
0003836323.tif 000029
【図９Ａ】
0003836323.tif 000030
【図９Ｂ】
0003836323.tif 000031
【図１０Ａ】
0003836323.tif 000032
【図１０Ｂ】
0003836323.tif 000033
【図１１Ａ】
0003836323.tif 000034
【図１１Ｂ】
0003836323.tif 000035
【図１２Ａ】
0003836323.tif 000036
【図１２Ｂ】
0003836323.tif 000037
【図１２Ｃ】
0003836323.tif 000038