(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ保護基としての９−フルオレニルメチルオキシカルボニル(Ｆmoc)の使用により特徴付けられる固相ポリペプチド合成法と、それに続く、２個のシステイン残基の特異的酸化および純粋な環状ペプチドをもたらす逆相ＨＰＬＣ精製方法を包含する、
RILAVERYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNAS
（ここで、環状ジスルフィドは、配列 CSGKLICの２個のシステイン残基の間で形成される。）のペプチドの製造方法。
【請求項２】
９−フルオレニルメチルオキシカルボニル(Ｆmoc)をアミノ保護基として使用する固相ポリペプチド合成法と、それに続く、２個のシステイン残基の特異的酸化および純粋な環状ペプチドをもたらす逆相ＨＰＬＣ精製方法を包含する製造方法により調製される、
RILAVERYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNAS
（ここで、環状ジスルフィドは、配列 CSGKLICの２個のシステイン残基の間で形成される。）のペプチド。
【請求項３】
ＨＩＶ−１に対する抗体の検出、並びにＡＩＤＳ、ＡＲＣ及び前ＡＩＤＳ状態の診断のための組成物であって、
RILAVERYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNAS
（ここで、環状ジスルフィドは、配列 CSGKLICの２個のシステイン残基の間で形成される。）のペプチドを抗原として含んでなる組成物。
【請求項４】
ＨＩＶ−１に対する抗体の検出方法であって、
RILAVERYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNAS
（ここで、環状ジスルフィドは、配列 CSGKLICの２個のシステイン残基の間で形成される。）のペプチドを使用すること含んでなる方法。
【請求項５】
試験方法がＥＬＩＳＡ、血球凝集反応、単一ドットまたは複数ドットストリップアッセイ法を包含する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
免疫化学試薬が、
RILAVERYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNAS
（ここで、環状ジスルフィドは、配列 CSGKLICの２個のシステイン残基の間で形成される。）のペプチドであることを特徴とする、ＨＩＶ−１に対する抗体の検出、並びにＡＩＤＳ、ＡＲＣ及び前ＡＩＤＳ状態の診断のための試験キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＨＩＶ抗体を検出するための新規の環状合成ペプチド及び線状の合成ペプチドとその組合せに関する。
【０００２】
【従来の技術】
後天性免疫不全症候群(ＡＩＤＳ)、ＡＩＤＳ関連複合体(ＡＲＣ)及び前ＡＩＤＳは、レトロウィルス、すなわちヒト免疫欠損ウィルスタイプ１(ＨＩＶ−１；またＨＴＬＶ−III、ＬＡＶ−１及びＡＲＶとしても知られている)により引き起こされると思われて来た。最近、ＨＩＶ−２(正式にはＬＡＶ−２)と呼ばれるもう１種の病原性ヒトレトロウィルスが、ＡＩＤＳを有する西アフリカの患者から単離された(Ｍontagnierなど、国際公表番号 Ｗ０８７／０４４５９として１９８７年、７月３０日に公表されたＰＣＴ／ＦＲ８７／０００２５)。ＨＩＶ−２は、ＨＩＶ−１及びＳimian免疫欠損ウィルス(ＳＩＶ)と多くの配列を共有することが最近示された(Ｇuyaderなど、Ｎature，３２６：６６２〜６６９，１９８７)。
【０００３】
たとえ他の番号システムが本発明に関する従来技術に使用されても、本発明に使用されるアミノ酸のための番号システムは、ＨＩＶ−１タンパク質のためには、Ｒatnerなど、Ｎature，３１３：２７７〜２８４，１９８５のシステム及びＨＩＶ−２タンパク質のためには、Ｇuyaderなど、Ｎature，３２６：６６２〜６６９（１９８７）のシステムである。ペプチドにおける本発明に使用されるアミノ酸は、次のような単一の文字コードにより与えられる：ala＝Ａ，arg＝Ｒ，asn＝Ｎ，asp＝Ｄ，cys＝Ｃ，gln＝Ｑ，glu＝Ｅ，gly＝Ｇ，his＝Ｈ，ile＝Ｉ，leu＝Ｌ．lys＝Ｋ，met＝Ｍ，phe＝Ｆ，pro＝Ｐ，ser＝Ｓ，thr＝Ｔ，trp＝Ｗ，tyr＝Ｙ及びval＝Ｖ。
【０００４】
ＨＩＶ−１により感染された患者の血清中の抗体の検出のための初期免疫診断試験は、抗原して完全なウィルスを使用した。第２世代試験は、組換えＤＮＡ方法により得られたポリペプチド配列を使用した。Ｃabradillaなど、Ｂio／Ｔechnology，３：１２８〜１３３（１９８５）及びＣhangなど、Ｂio／Ｔechnology，３：９０５〜９０９（１９８５）は、それぞれ８２個及び１０２個のアミノ酸残基の細菌により合成されたウィルスタンパク質を得ることに成功した。Ｅ.Ｐ.８６２０２３１４号及び８６１１４２４３号は、単独で又は混合して免疫反応性であるgp４１及びgp１２０の領域を包含する組換えポリペプチドを記載する。Ｓhoemanなど、Ａnal. Ｂiochem．１６１：３７０〜３７９（１９８７）はまた、ＨＩＶ−１により感染された患者からの血清中に存在する抗体との免疫反応特性を有する、gp４１からのいくつかのポリペプチドを記載する。上記アッセイ方法は許容されない。それらの感度の欠乏は、それが検出から漏れ、そして血液生成物受容体を感染せしめるウィルスを含む血液を可能にする場合、重大である。これらの抗原調製物中に存在する不純物は、健康な個人を苦悩にする、許容できない高レベルの誤った陽性結果の原因である。
【０００５】
次に、従来技術においては、より短いエピトープの同定が行なわれたことが明らかになった。これは、それらが容易且つ低費用で調製され得るためであり、そしてより重要なことには、ＡＩＤＳに関係しないウィルスタンパク質との共有エピトープの存在による誤った陽性の試験結果の危険性を減じるためである。これに関しては、Ｇallaher，Ｃell，５０：３２７〜３２８，１９８７は、ＨＩＶ−１のgp４１の領域が、呼吸シンシチウムウィルスとの５個の隣接するアミノ酸残基の配列及びはしかウィルスＦ１糖タンパク質の４個の等しく分配されたアミノ酸の配列を共有することを見出した。従って、この領域又は発見されるべきいづれか他の共通領域を含むさらに高く精製された組換えポリペプチドが、誤った陽性結果を潜在的に担当するであろう。
【０００６】
卓越した特異性とは別に、ＨＩＶウィルスのユニーク且つ高く保存されたエピトープに対応するより短いペプチド配列の同定が、化学合成によるその産生をより容易且つより安価にする。実験的な方法が記載されて来た。これらの方法は、活性タンパク質の表面上に暴露される予定である短いアミノ酸配列の選択に関与することができる(Ｈopp and Ｗoods，Ｊ. Ｉmmunol. Ｍet．８８：１〜１８，１９８６を参照のこと)。いく分有用であるけれども、これらの方法はほとんど表示的でない。それにもかかわらず、それらは、ＡＩＤＳの原因であるウィルスのタンパク質上に存在するエピトープの同定のために多く適用されて来た。たとえば、アメリカ特許第４,６２９,７８３号、国際特許出願番号 ＰＣＴ／ＵＳ８６／００８３１及びＥ.Ｐ.出願第８６３０３２２４号は、ＡＩＤＳの診断キットに有用である。ＨＩＶ−１のp１８，p２５，gp４１及びgp１２０タンパク質からの種々の合成ペプチドを開示する。
【０００７】
しかしながら、より小さな抗原に対するこの傾向は、合成されたエピトープが、抗体により認識される厳密な立体配座を推定することができない危険性を伴う。これらの場合のそれぞれにおいて試験される血清サンプルの数はひじょうに制限されるけれども、小さな合成ペプチドによる特異性は、ひじょうに高いことが見出され(９５％〜１００％)たが、しかしながら、全体の感度は８０〜１００％の間であった。１００％の感度が達成される例のみにおいては、単に１０種のサンプルが試験された。
【０００８】
Ｓmithなど、Ｊ. Ｃlin. Ｍicrobiol．２５：１４９８〜１５０４，１９８７は、高い免疫反応性である２種のオーバラップペプチド、Ｅ３２及びＥ３４を記載する。２４０種の血清陰性検体から誤った陽性結果は得られなかったが、しかしその試験は３２２種のうち３種の血清陽性サンプルを見落とした(９９.１％の感度)。Ｗangなど、Ｐroc. Ｎatl. Ａcad. Ｓci．８３：６１５９〜６１６３，１９８６は、１つの２１−マ−ペプチドが１００％の特異性及び９８％の感度を示す(ＡＩＤＳの患者から取られた２２８種の血清陽性サンブルのうち、２２４種がこのペプチドに対して陽性であることが見出された)一連のオーバーラップペプチド(たとえばＳmithなど、によって発見されたＥ３２及びＥ３４ペプチドのアミノ酸残基)を記載する。
【０００９】
１９８７年１１月１３日に出願されたアメリカ特許出願第１２０,０２７号においては、ＡＩＤＳウィルスにより感染された患者の抗体と免疫反応する、gp４１(ＨＩＶ−１)の残基６０６〜６２０(SGKLICTTAVPWNAS)を包含する短い合成ペプチドが開示される。この例においては、特異性がまた卓越している(６３／６３)が、しかし５７種の確かな陽性のうち６種の血清陽性検体が検出され得なかった(８９％の感度)。
【００１０】
Ｇnannなど、Ｊ. Ｖirol．６１：２６３９〜２６４１，１９８７及びＪ. Ｉnfec. Ｄis．１５６：２６１〜２６７，１９８７はまた、gp４１(ＨＩＶ−１)の免疫優性領域から一連のオーバーラップペプチドを報告する。配列SGKLIC(６０６〜６１１)を有する１つのペプチドが試験される２２ ＨＩＶ−１陽性血清のいづれとも免疫反応しなかったそれらの発見が特に興味あるものであった。Ｎ−末端へのシステイン残基の付加はある免疫反応性を回復した。すなわち４４種の血清のうち２１種が７−マーのペプチドと反応した(４８％の感度)。Ｇnannなどは、cys−６０５がgp４１−(ＨＩＶ−１)タンパク質のセグメントの免疫反応性のために不可欠であることの結論を下した。
【００１１】
Ｇnannなどはまた、gp４１(ＨＩＶ−１)の位置６０５及び６１１(Ｒatnerの番号システム)でのシステイン残基が、ジスルフィド結合を通してのループの形成によりたぶんタンパク質のこの領域の抗原立体配座に臨界的な役割をはたすことができることを推定した。しかし、ジスルフィド結合の形成を同定し、そして証明するための著者による試みは失敗した。Ｇnannなどは、それらが一部のアミノ酸配列６０５〜６１１(ここで２個の末端のシステイン基はジスルフィド結合により結合されている)を含む合成ペプチドを有することを決して示さなかったので、そのようなジスルフィド結合を有するペプチドの性質は不明であり且つ推定できない。
【００１２】
位置６０５〜６１１で２個のシステイン残基を含む７−アミノ酸の一部の配列は、国際公開番号 ＷＯ８６／０６４１４として１９８６年１１月６日に発表されたＰＣＴ／ＵＳ８６／００８３１のような他の記録に開示されていて、ここで約bp７５１６〜７５９３の領域によりコードされるペプチドＸ(３９)及び約bp７５４３〜bp７５９３の領域によりコードされるペプチドVIII(７９)の両者は、上記刊行物においてＧnannなど、により論じられた７−アミノ酸配列(アミノ酸６０５〜６１１)を含む。そのペプチドは線状ペプチドとして報告され、そしてその著者は、環状構造のいづれの形成をも言及していない。
【００１３】
国際公開番号 ＷＯ８７／０６００５として１９８７年１０月８日に発表されたＰＣＴ／ＵＳ８７／００５７７においてＲosenなどは、ＨＩＶ−１のエンベロープ糖タンパク質(gp４１)のＣys(６０５)−Ｃys(６１１)を包含する一連の合成ペプチドが、中性又は塩基性水性緩衝液中での溶解に基づいて一連の自発的な酸化形質転換を受けることを報告している。その発明者は、これらの条件下で、ＥＬＩＳＡに使用されるペプチドが線状モノマー、環状モノマー、線状又は環状ダイマー及び種々の長さの線状ポリマーのランダム混合物であることを推定している。しかしながら、その発明者は、環状成分の存在を証明していず、そして存在する他の種々のダイマー及びポリマーを特徴づけていず、そして彼らは、そのポリマー形がＥＬＩＳＡ試験における反応性のために最っとも重要な成分であることを推定している。
【００１４】
Ｇnannなど、Ｓcience ２３７：１３４６〜１３４９，１９８７は、gp４１(ＨＩＶ−１)上の１つに相同する領域に２つのシステイン、たとえばＣys(６０５)及びＣys(６１１)を含むgp４２(ＨＩＶ−２)の残基５９２〜６０３を包含する短い線状合成ペプチドを報告する。このペプチドは、ＨＩＶ−２により感染された患者から取られた５種の血清のうち５種と反応した。
【００１５】
【発明が解決しようとする課題】
上記引用文献は、ＨＩＶ−１抗体を同定することにおいて有用であるペプチドを提供するけれども、それらはまた、陽性の血清サンプルを完全(１００％)に検出できないようなある欠点をも示す。たとえば、Ｇnannなど、Ｊ. Ｖirol．６１：２６３９〜２６４１（１９８７）は、６００〜６１１のアミノ酸配列に関するそれらの試験において、２２種の陽性血清のうち２２種すべてを検出し、そして彼らはまた、Ｃenters for Ｄisease Ｃontrol, Ａtlanta. Ｇaでの他の発明者に行なわれた、その同じ１２−アミノ酸配列(６００〜６１１)に関する類似する試験が７９種の陽性血清のうち７８種を検出したことを述べている。Ｊ. Ｉnfect．Ｄis.，１５６：２６１〜２６７，１９８７においてその同じ著者は、gp４１−(ＨＩＶ−１)からの同じ１２−アミノ酸配列が、アメリカ合衆国からの１３２人のＨＩＶ−１感染患者のうち１３１人と反応することを示した。
【００１６】
同じ文献において、ＨＩＶ−１陽性血清が５００倍以上に希釈される場合、これらの希釈された血清のいくつかが、低感度を示す陰性であることが見出された。
【００１７】
他の欠点は、被覆段階の間、システインを含むペプチドの多くの酸化形の形成に起因する十分に定義されていず且つ推定できない混合物のＥＬＩＳＡにおける使用である。
【００１８】
ひじょうに低レベルの抗体が存在する場合でさえ、ＨＩＶ−１及び／又はＨＩＶ−２抗体を含むすべてのサンプルを正常な試験条件下で陽性として検出できる十分に定義された構造の最終生成物のみをＥＬＩＳＡに使用するために、被覆段階の間、自発的な酸化に耐性であるペプチド又はペプチド混合物を提供することがひじょうに所望されるように思われる。
【００１９】
【課題を解決するための手段】
本発明によれば、ＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２抗体を１００％検出することに特に適合され、そして血清がひじょうに希釈される場合でさえ、すべてのＨＩＶ−１抗体を完全に検出できる新規の一連のペプチド又はアミノ酸配列が提供される。
【００２０】
より詳しくは、本発明の新規ペプチドは、５８６〜６２９のいづれかのアミノ酸配列(gp４１−ＨＩＶ−１)を含んで成り、ここでいづれか選択されたアミノ酸配列において、次の一部配列：
【００２１】
【化１】
0003851761.tif 000002
【００２２】
を提供するためにジスルフィド結合により結合される、６０５〜６１１のアミノ酸配列のそれぞれの末端でシステイン残基を含むアミノ酸配列が常に存在する。
【００２３】
さらにより詳しくは、本発明の新規の環状ペプチドは、その中に下記一般式：
【００２４】
【化２】
0003851761.tif 000003
【００２５】
〔式中、ｘはアミノ末端、１つのアミノ酸又はアミノ酸６０４から始まり、そしてアミノ酸５８６まで戻るアミノ酸配列(gp４１−ＨＩＶ−１)を表わし；そしてｙはカルボキシル末端、１つのアミノ酸又はアミノ酸６１２から始まり、そしてアミノ酸６２９まで延びるアミノ酸配列(gp４１−ＨＩＶ−１)を表わす〕で表わされるアミノ酸配列６０５〜６１１(gp４１−ＨＩＶ−１)を含んで成る。
【００２６】
より特定には、ｘは５８６から６０４まで延びる次のアミノ酸配列(gp４１−ＨＩＶ−１)の１つを表わし：
G
WG
IWG
GIWG
LGIWG
LLGIWG
QLLGIWG
QQLLGIWG
DQQLLGIWG
KDQQLLGIWG
LKDQQLLGIWG
YLKDQQLLGIWG
RYLKDQQLLGIWG
ERYLKDQQLLGIWG
VERYLKDQQLLGIWG
AVERYLKDQQLLGIWG
LAVERYLKDQQLLGIWG
ILAVERYLKDQQLLGIWG
RILAVERYLKDQQLLGIWG
そしてｙはカルボキシル基又は６１２から６２９まで延びる次の１又は複数のアミノ酸配列(gp４１−ＨＩＶ−１)を表わす：
T
TT
TTA
TTAV
TTAVP
TTAVPW
TTAVPWN
TTAVPWNA
TTAVPWNAS
TTAVPWNASW
TTAVPWNASWS
TTAVPWNASWSN
TTAVPWNASWSNK
TTAVPWNASWSNKS
TTAVPWNASWSNKSL
TTAVPWNASWSNKSLE
TTAVPWNASWSNKSLEQ
TTAVPWNASWSNKSLEQG
TTAVPWNASWSNKSLEQGC
TTAVPWNASWSNKSLEQI。
【００２７】
下記の一般式（Ｉ）：
【００２８】
【化３】
0003851761.tif 000004
【００２９】
〔式中、ｘ及びｙは前記に定義された通りである〕
で表わされる少なくとも１つのペプチド及び
−４９７から５１８まで延びるアミノ酸配列(gp１２０ ＨＩＶ−１)により特徴づけられるgp１２０のペプチド、又は
−４９７から５１８まで延びるアミノ酸配列(gp１２０ ＨＩＶ−１)により特徴づけられるgp１２０のペプチド及び２４１から２６３まで延びるアミノ酸配列(p２４ ＨＩＶ−１)により特徴づけられるp２４のペプチド、又は
−４９７から５１８まで延びるアミノ酸配列(gp１２０ ＨＩＶ−１)により特徴づけられるgp１２０のペプチド及び５８６から６２０まで延びるgp４１ ＨＩＶ−１のペプチドの組合せ又は混合物もまた本発明の範囲内に存在する。
【００３０】
本発明によれば、ＨＩＶ−２により感染された少数の患者から取られた血清の１００％を同定することに有用である一連の新規ペプチド又はアミノ酸配列もまた提供される。ＨＩＶ−１及び／又はＨＩＶ−２の両者を検出するために本発明に記載されたペプチド又はペプチドの混合物のいくらかを使用することが可能である。
【００３１】
より詳しくは、本発明の新規ペプチドは、５７８〜６１３のいづれかのアミノ酸配列(gp４２−ＨＩＶ−２として言及されるであろう推定上のgp４１.７)を含んで成り、ここでいづれか選択されたアミノ酸配列において、次の一部配列：
【００３２】
【化４】
0003851761.tif 000005
【００３３】
を提供するためにジスルフィド結合により結合される、５９７〜６０３(gp４２−ＨＩＶ−２)のアミノ酸配列のそれぞれの末端でシステイン残基を含むアミノ酸配列が常に存在する。
【００３４】
さらにより詳しくは、本発明の新規の環状ペプチドは、その中に下記一般式（II）：
【００３５】
【化５】
0003851761.tif 000006
【００３６】
〔式中、ｘ1はアミノ末端、１つのアミノ酸又はアミノ酸５９６から始まり、そしてアミノ酸５７８まで戻るアミノ酸配列(gp４２−ＨＩＶ−２)を表わし；そしてｙ1はカルボキシル末端、１つのアミノ酸又はアミノ酸６０４から始まり、そしてアミノ酸６１３まで延びるアミノ酸配列(gp４２−ＨＩＶ−２)を表わす〕で表わされるアミノ酸配列(gp４２−ＨＩＶ−２)を含んで成る。
【００３７】
より特定には、ｘ1は５７８から５９６まで延びる次のアミノ酸配列(gp４２−ＨＩＶ−２)の１つを表わし：
G
WG
SWG
NSWG
LNSWG
RLNSWG
ARLNSWG
QARLNSWG
DQARLNSWG
QDQARLNSWG
LQDQARLNSWG
YLQDQARLNSWG
KYLQDQARLNSWG
EKYLQDQARLNSWG
IEKYLQDQARLNSWG
AIEKYLQDQARLNSWG
TAIEKYLQDQARLNSWG
VTAIEKYLQDQARLNSWG
RVTAIEKYLQDQARLNSWG
そしてｙ1は６０４から６１３に延びる次のアミノ酸配列(gp４２−ＨＩＶ−２)の１つを表す：
H
HT
HTT
HTTV
HTTVP
HTTVPW
HTTVPWV
HTTVPWVN
HTTVPWVND
HTTVPWVNDS。
【００３８】
下記一般式（II）：
【００３９】
【化６】
0003851761.tif 000007
【００４０】
〔式中、ｘ1及びｙ1は前記に定義された通りである〕で表わされる少なくとも１つの合成ペプチド及び外部エンベロープ糖タンパク質(ＥＧＰ)の及び４８６から５０８まで延びるアミノ酸配列により特徴づけられるペプチド２０３と呼ばれるペプチド、又はＥＧＰの及び４８６から５０１まで延びるアミノ酸配列により特徴づけられるペプチド204と呼ばれるペプチドの組合せまたは混合物もまた、本発明の範囲内にある。
【００４１】
さらに、前記定義されたgp１２０及び／又はp２４及び／又はＥＧＰアミノ酸配列の１又は複数の線状ペプチドの不在又は存在中で、式Ｉの少なくとも１つのペプチド及び式IIの１つのペプチド(ここで、ｘ，ｙ，ｘ1及びｙ1は前記の通りである)を含んで成る合成ペプチドの組合せを使用することもまた、本発明の範囲内にある。
【００４２】
本発明の新規混合物の１つの意外な利点は、それらが、１３７８人のＨＩＶ−１陽性の被検者及び５人のＨＩＶ−２陽性の被検者から成る大パネルの血清に由来するＨＩＶ抗体の完全な検出を提供することができることである。もう１つの利点は、最少の誤った陽性をもたらす本発明の混合物により保持される高レベルの特異性である。
【００４３】
【発明の実施の形態】
（合成のためのペプチドの選択）
ペプチドが、ＨＩＶ−１単離体の既知のアミノ酸配列及び保存される領域の知識に基づく合成のために選択された。つい最近、ＨＩＶ−２(最近出願した新しいウィルスである)は、ＨＩＶ−１との相当の相同性を共有することが示された。従って、ＨＩＶ−１及び／又はＨＩＶ−２の両者を検出するために本発明に記載されるペプチド又はペプチドの混合物を使用することが可能である。
【００４４】
既知のアミノ酸配列の他に、ポリペプチドの一部が表面配向され、そして従って免疫原性であることを推定することを助ける種々の生理化学的原理を用いることによって、可能性あるエピトープが選択される。これらは、Ｈopp and Ｗoods(Ｐroc．Ｎat．Ａcad．Ｓci．７８，３８２４〜３８２８，１９８１)の親水性プロット及びＫyte and Ｄoolittle(Ｊ．Ｍol．Ｂiol．１５７，１０５〜１３２，１９８２)による類似するアプローチを含む。また、タンパク質立体配座の実験的な推定(Ｃhou and Ｆasman，Ａnn．Ｒev．Ｂiochem.，４７，２５１〜２７６，１９７８)は、そのポリペプチドの一部が免疫原性であることを推定することにおいて有用なガイドである。これらの理論的なアプローチは有用なガイドであるけれども、本発明の研究の間、発見された多くの例外が存在する。
【００４５】
多くの場合、免疫診断試薬としてより有用なペプチドを製造するためには、その抗原特性を変えないで、天然に存在する配列を変性することが所望される。そのような変性とは、
−へテロ二価性架橋試薬、たとえばスルホスクシンイミジル−４−(p−マレイミドフェニル)ブチレート(結合をもたらすための好ましい試薬)によりキャリヤータンパク質へのペプチドの結合を促進するためにアミノ又はカルボキシル末端でのシステイン残基の付加；
支持ペプチド又は大きなペプチドヘの結合のために又はペプチドの物理的又は化学的性質を変性するために、ペプチドのお互いの結合を促進するためのオリゴペプチドのＣＯＯＨ又はＮＨ2末端でのあるアミノ酸の付加を含む。そのような変性は、エステル化反応を通してリンカーとして使用され得るチロシン、グルタミン酸又はアスパラギン酸の付加により、及びシッフ塩基又はアミド形成、すなわち末端−ＮＨ2アシル化、チオグリコール酸アミド化、末端−ＣＯＯＨアミド化による誘導体化、たとえばアンモニア、メチルアミン形成により結合され得るリシンの付加によりもたらされる。これらの修飾は、ペプチド上の実効電荷の変化をもたらし、そしてまた、固体支持体、キャリヤー又は他のペプチドヘのそのペプチドの共有結合も促進することができる。これらの修飾は、ペプチドの免疫反応性の変化をもたらさない。すなわち、自発的に酸化する傾向があるアミノ酸であるメチオニンが、抗原性を変えないでノルロイシンにより通常置換され得る。
【００４６】
ペプチド配列は、種々の変化、たとえば挿入、欠失及び置換(保存性又は非保存性のいづれか)にゆだねられ得、そしてそのような変化は、それらの使用においてある利点を提供するであろう。これらの変化は、たとえばgly，ala；val，ile，leu；asp，glu；asn，gln；ser，thr；lys，arg；phe，tyr；ala，ser；ala，thr；ala，val；ala，pro；ala，glu；leu，gln；gly，phe；ile，ser；及びile，metの組合せを含む。
【００４７】
ペプチドの受動的な吸収を促進するために少数(１〜１０)の疎水性アミノ酸から成る“テール”を固体支持体に付加することが便利である。この修飾は、ＣＯＯＨ又はＮＨ2末端のいづれかで行なわれ得る。好ましい付加はphe−ala−phe−ala−pheである。
【００４８】
本発明によれば、ＨＩＶ−１抗体の検出のために有用な選択された環状ペプチドは、５８６〜６２９のアミノ酸配列(gp４１−ＨＩＶ−１)を含んで成るペプチドであり、ここでいづれかの選択されたアミノ酸配列においては、式Ｉの環状ペプチドを提供するためにシステイン残基がジスルフィド結合により、６０５〜６１１のgp４１−(ＨＩＶ−１)アミノ酸配列のそれぞれの末端で結合されているアミノ酸配列が常に存在する。好ましい環状ペプチドは、次の条件のペプチドである：
ｘがＮＨ2Ｇであり、そしてｙがTTAVPWNAS−ＣＯＯＨ(８０)であり；
ｘがＮＨ2−RILAVERYLKDQQLLGIWG−であり、そしてｙが−TTAVPWNAS−ＣＯＯＨであり(８７ｃ)；
ｘがＮＨ2−VERYLKDQQLLGIWG−であり、そしてｙが−TTAVPWNAS−ＣＯＯＨであり(８８)；
ｘがＮＨ2−Ｇであり、そしてｙが−TTAVPWNASWSNKSLEQGC−ＣＯＯＨであり(１０３)、そして
ｘがＮＨ2−Ｇであり、そしてｙが−TTAVPWNASWSNKSLEQI−ＣＯＯＨである(９６)。
【００４９】
また、本発明によれば、ＨＩＶ−２抗体の検出のために有用な選択された環状ペプチドは、５７８〜６１３のアミノ酸配列(gp４２−ＨＩＶ−２)を含んで成るペプチドであり、ここでいづれかの選択されたアミノ酸配列においては、式IIの部分配列を提供するために、システイン残基がジスルフィド結合により５９７〜６０３のアミノ酸配列(gp４２−ＨＩＶ−２)のそれぞれの末端で結合されているアミノ酸配列が常に存在する。
【００５０】
本発明の式（II）の好ましい環状ペプチドは、次の条件のペプチドである：
ｘ1がＮＨ2−RVTAIEKYLQDQARLNSWG−であり、そしてｙ1が−ＣＯＮＨ2であり(ペプチド１４６)；
ｘ1がＮＨ2−QDQARLNSWG−であり、そしてｙ1が−HTTVPWVNDS−ＣＯＮＨ2であり(ペプチド１４７)；
ｘ1がＡc.QDQARLNSWG−であり、そしてｙ1が−ＣＯＮＨ2であり(ペプチド２００)；
ｘ1がＮＨ2Ｇ−であり、そしてｙ1が−HTTVPWVNDS−ＣＯＯＨであり(ペプチド２０１)；そして
ｘ1がＮＨ2−RVTAIEKYLQDQARLNSWG−であり、そしてｙ1がHTTVPWVNDS−ＣＯＯＨである(ペプチド２０２)。
【００５１】
最っとも好ましい環状ペプチドは、ペプチド８０，８７ｃ，１４６，１４７，２００，２０１及び２０２である。
【００５２】
表１は、本発明の好ましい環状ペプチドのために、Ｒatnerなど、Ｎature ３１３：２７７〜２８４（１９８５）により公表された配列に基づいてのＨＩＶ−１のためのアミノ酸の位置番号及びＧuyaderなど、Ｎature ３２６：６６２〜６６９（１９８７）により公表された配列に基づいてのＨＩＶ−２のためのアミノ酸の位置番号を提供する。
【００５３】
【表１】
0003851761.tif 000008
【００５４】
同定される領域は、ＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２に対する抗体を検出することにおいてひじょうに免疫反応性であるので、いづれかＨＩＶ単離体のその対応する領域がまた興味の対象であることは明らかである。同様に、ＨＩＶの他の単離体又は他の血清タイプに見出される配列もまた、本発明の範囲内にある。
【００５５】
１又は２個のチオールを含有する残基、たとえばシステインを線状ペプチド配列に付加し、それによって対応する環状ペプチドの調製のために残基を付与することもまた、本発明の範囲内にある。
【００５６】
一般的に言えば、脱アミノ−ジカルバ相同体が、gp４１−(ＨＩＶ−１)の位置６１１又はgp４２−(ＨＩＶ−２)の位置６０３でアミノスベリン酸(Ａsu)によるジスルフィド架橋に含まれる２個のシステインの置換により合成され得る。
【００５７】
複数のペプチド配列を共有結合し、又は複数のペプチドから成るポリマーを形成することが所望される。そのような変性は、抗原性質を失わないで固体表面上への抗原の受動的吸着を促進せしめることができる。
【００５８】
（線状及び環状ペプチドの調製）
樹脂支持体は、ポリペプチドの固相調製のために当業界において通常使用される適切な樹脂であり、好ましくはp−ベンジルオキシアルコールポリスチレン及びp−メチルベンジドリルアミン樹脂である。初めの保護されたアミノ酸の樹脂支持体への結合に続いて、アミノ保護基が、当業界で従来使用されている固相ペプチド合成の標準方法により除去される。アミノ保護基の除去の後、残る保護されたα−アミノ基及び必要なら、側鎖を保護されたアミノ酸が、所望する生成物を得るために引き続いて結合される。他方、多重アミノ酸基が、樹脂支持性アミノ酸配列との結合の前、溶液方法を用いて結合され得る。
【００５９】
適切な結合試薬の選択は、当業界で確立している。たとえば、適切な結合試薬は、単独で又は好ましくは１−ヒドロキシベンゾトリアゾールの存在下でＮ,Ｎ'−ジイソプロピルカルボジイミド又はＮ,Ｎ'−ジシクロヘキシルカルボジイミド(ＤＣＣ)である。もう１つの有用な結合方法は、保護されたアミノ酸の予備形成された対称無水物を使用する。
【００６０】
成長するポリペプチド鎖上に導入されるそれぞれのアミノ酸のために使用される必要なα−アミノ保護基は、好ましくは９−フルオレニルメチルオキシカルボニル(Ｆmoc)である。しかしながら、保護基が結合条件下で分解せず、そして成長分子にすでに存在するいづれか他の保護基の存在下で選択的に容易に除去できるかぎり、どんな保護基でも使用され得る。
【００６１】
側鎖アミノ酸のための基を選択するための基準は次の条件である：（ａ）合成のそれぞれの段階でα−アミノ保護基の除去のための選択的な反応条件下での種々の試薬に対する保護基の安定性：（ｂ）保護基はその戦略的特性を保持すべきであること(すなわち、結合条件下で分離しないこと)及び（ｃ）保護基は、ポリペプチド合成の終結後及びポリペプチド構造に影響を及ぼさない条件下で容易に除去できるべきであること。
【００６２】
完全に保護された樹脂支持性ペプチドは、適切なスカベンジャー、たとえばアニソール、チオアニソール、エチルメチルスルフィド、１，２−エタンジチオール及び関連する試薬の存在下で室温で１〜６時間、塩化メチレン中、トリフルオロ酢酸の５０〜６０％ 溶液によりp−ベンゼルオキシアルコール樹脂から分離される。同時に、ほとんどの酸不安定側鎖保護基が除去される。より酸耐性の保護基は、ＨＦ処理により除去される。
【００６３】
本発明の環状ペプチドは、当業界で一般的に知られているペプチド合成の次の技法により、保護された又は保護されていないＳＨ−基のジスルフィド結合への直接的な酸化転換により調製される。好ましい方法とは、フェリシアン化カリウムによる遊離ＳＨ−基の直接的な酸化を包含する。そのような環状ペプチドは、抗体への結合を助けることができるより固定されたコンホメーションを取る。システイン−システインのジスルフィド結合が天然のウィルスタンパク質に存在するかどうかは知られていない。
【００６４】
（ペプチド混合物）
１３７８人のＨＩＶ−１陽性被検者及び５人のＨＩＶ−２陽性被検者の血清に由来するＨＩＶ抗体の完全な検出を提供することが見出されている環状及び線状ペプチドの混合物もまた、本発明の範囲内にある。また、本発明の新規混合物は、最少数の誤った陽性をもたらす高レベルの特異性を提供することが見出された。
【００６５】
さらに、本発明の混合物は、下記一般式：
【００６６】
【化７】
0003851761.tif 000009
【００６７】
〔式中、ｘ及びｙは前記定義通りである〕で表わされる少なくとも１種の環状ペプチド及び
−gp１２０の線状ペプチド、又は
−gp１２０の線状ペプチド、p２４の線状ペプチド及びgp４１の線状ペプチド、又は
−gp１２０の線状ペプチド及びgp４１の線状ペプチドを含んで成る。
【００６８】
本発明の他の混合物は、下記一般式：
【００６９】
【化８】
0003851761.tif 000010
【００７０】
〔式中、ｘ1及びｙ1は前記定義通りである〕で表わされる少なくとも１種の環状ペプチド及びＨＩＶ−２のＥＧＰの線状ペプチドの１つを含んで成る。
【００７１】
gp４１−(ＨＩＶ−１)及びgp４２−(ＨＩＶ−２)に由来する環状ペプチドがひじょうに保存され且つ免疫優性の領域をまねたとしても、gp４１の他のペプチド配列及びＨＩＶの他の２種の免疫原タンパク質からのいくらかを含むことは、より安全であることが見出された。そのような感染された個人の血清中に含まれる抗体がもはや環状ペプチドに結合できない程度に突然変異がこのエピトープを変性する場合、この血清は、アッセイシステムに含まれる他のエピトープに対して向けられた他の抗体によりなお陽性であることが見出された。しかしながら、混合物に使用され得るペプチドの数は限定される。まず第１に、多過ぎる異なったペプチドは、誤った陽性結果の割合を高めるであろう。特に、p２４タンパク質の多くのペプチドは、しばしば許容できない低い特異性を招くことが見出された。第２に、混合物中における多過ぎるペプチドの付加は、免疫優性ペプチドを希釈し、そして試験の感度を低めるであろう。
【００７２】
より特定には、gp１２０の線状ペプチドは、４９７〜５１８のアミノ酸配列を有し、そして次の式：
ＮＨ2−CGKIEPLGVAPTKAKRRVVQREKR−ＣＯＯＲ(７１)に相当する。
【００７３】
p２４の線状ペプチドは、２４１〜２６３のアミノ酸配列を有し、そして次の式：
ＮＨ2−CGSTLQEQIGWNTNNPPIPVGEIYK−ＣＯＯＨ(６１)に相当する。
【００７４】
ＥＧＰ(ＨＩＶ−２)の線状ペプチドは、４８６〜５０１のアミノ酸配列(ペプチド２０４)又は４８６〜５０８のアミノ酸配列(ペプチド２０３)を有し、そしてそれぞれ次の式：
ＮＨ2LVEITPIGFAPTKEKRYSSAHGR−ＣＯＯＨ(２０３)又は
ＮＨ2LVEITPIGFAPTKEKR−ＣＯＯＨ(２０４)に相当する。
【００７５】
（ＨＩＶ抗体の検出）
本発明のペプチド及びペプチド混合物は、当業界において良く知られている方法に従ってＡＩＤＳ関連抗体の検出のための診断試薬として使用される。ＡＩＤＳに対する抗体の決定における本発明のペプチドの主な利点は、これまで使用されて来た既知の抗原と比べてのそれらの特異性にある。
【００７６】
ＡＩＤＳウィルスに対する抗体の決定のための１つの方法に従えば、いわゆる“ウェスターンブロット”分折が使用される(Ｔowbin，Ｈ.，Ｓtaehelin．Ｔh．and Ｇordon，Ｊ.，Ｐroc．Ｎat．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ ７６，４３５０〜４３５４（１９７９）)。この方法によれば、本発明のペプチド又は複数のペプチドがニトロセルロース紙上に適用される。このニトロセルロース紙は含浸され、そして次に試験されるべき血清により処理される。洗浄の後、そのニトロセルロース紙は、酵素によりラベルされた抗−ヒトＩgＧにより処理される。次に、その酵素活性が適切な基質により決定される。もちろん他の放射性ラベル又は螢光ラベルも使用され得る。
【００７７】
本発明のペプチド又はペプチド混合物を用いてのＡＩＤＳウィルスに対する抗体の決定のための好ましい便利且つ従来の方法は、酵素結合性免疫吸着アッセイ(ＥＬＩＳＡ)である。この試験によれば、本発明のペプチド又はペプチド混合物が、ミクロタイタープレートの壁上に吸着される。次に、その壁は、試験されるべき血清により処理される。洗浄の後、ペルオキシダーゼによりラベルされた抗−ヒトＩgＧがその壁に付加される。そのペルオキシダーゼの決定は、対応する基質、たとえo−フェニレンジアミンにより行なわれる。また、この方法において、ペルオキシダーゼは、他のラベル、たとえば放射性又は螢光ラベルにより交換され得る。
【００７８】
ＥＬＩＳＡ試験においては、個々のペプチド又はその組合せを使用することが可能である。誤った応答の原因となる抗体を同時に排除しながら、抗体を検出するための最っとも効果的なペプチドを組合すことを可能にするので、後者が好ましい。いくつかの血清サンプルが、抗原として個々のペプチドとの不確かな応答を示しながら、ペプチドの混合物との正しい陽性結果を示すことが、これらの研究の間、発見された。従って、ＨＩＶ抗体のための信頼すべき試験は、ペプチド抗原の適切な組合せによってのみ達成され得る。
【００７９】
本発明のペプチド又はペプチド混合物による、ＡＩＤＳウィルスに対する抗体の決定のためのもう１つの方法は、いわゆる“二抗原−サンドイッチ法”による酵素免疫試験である。この方法は、Ｉmmunologocal Ｍethods ２０：２５〜３４（１９７８）に記載されるＭaiolini，Ｒ. Ｉ.の研究に基づかれている。この方法によれば、試験されるべき血清が、本発明のペプチド又はペプチド混合物が被覆されている固相(捕獲層)及びペルオキシダーゼによりラベルされている本発明のペプチド又はペプチド混合物(プローブ層)と接触せしめられる。その免疫反応は、１又は２段階で行なわれ得る。その免疫反応が２段階で行なわれる場合、洗浄段階が２回のインキュベーションの間で行なわれる。免疫反応の後、洗浄段階が行なわれる。その後、ペルオキシダーゼが、基質、たとえばo−フェニレンジアミンにより決定される。
【００８０】
適切な固相は、有機及び無機ポリマー〔アミラーゼ、デキストラン、天然又は変性されたセルロース、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、アガロース、磁鉄鉱、多孔性ガラス粉末、ポリビニリデンフルオリド(Ｋynar)及びラテックス〕、試験容器(試験管、タイタープレート又はガラス又は人工的な材料のキュベット)の内壁及び固体物(ガラス及び人工的な材料のロッド、末端が太くなったロッド、末端のローブ又はラメラを有するロッド)の表面である。ガラス及び人工的材料からの球体は、特に適切な固相キャリヤーである。
【００８１】
本発明のペプチド及びペプチド混合物は、ＡＩＤＳウィルスに対する抗体の決定において有用であるのみならず、またＡＩＤＳウィルス自体の決定のためにも有用である。なぜならば、これらのペプチド(遊離、重合されている又は適切なキャリヤーに接合されている)は、ＡＩＤＳウィルスに対する抗体、特にモノクローナル抗体を誘発することにおいて有用であるからである。そのような抗体は、本発明のペプチド又はペプチド混合物の十分な量を哺乳類又は鳥類に注射し、そして前記動物の血清から前記抗体を回収することによって産生され得る。
【００８２】
抗体を誘発するための適切な宿主動物は、哺乳類、たとえばウサギ、ウマ、ヤギ、テンジクネズミ、ラット、マウス、ウシ、ヒツジ、等を包含する。
【００８３】
一般的に知られている種々の方法は、ＡＩＤＳウィルス又はその一部の決定に使用され得る。
【００８４】
１つのそのような方法においては、アッセイされるべき血清サンプルの既知量、本発明の放射性ラベルされた環状ペプチド又はペプチド混合物及び本発明のラベルされていないペプチド又はペプチド混合物が一緒に混合され、そして静置される。抗体／抗原複合体が、当業界において既知の方法により、すなわち硫酸アンモニウム、ポリエチレングリコール、第二抗体(過剰量か又は不溶性支持体に結合されている)、デキストラン被覆性木炭及び同様のものによる処理により、結合されていない試薬から分離される。本発明のラベルされたペプチド又はペプチド混合物の濃度は結合された又は結合されていない相のいづれかにおいて決定され、そしてサンプルのＡＩＤＳ含有量は、それ自体既知の方法で標準曲線と観察されるラベルされた成分のレベルとを比較することによって決定され得る。
【００８５】
もう１つの適切な方法は、“二抗体サンドイッチアッセイ”である。このアッセイによれば、試験されるべきサンプルが２種の異なった抗体により処理される。これらの抗体の１つはラベルされ、そして他は固相上に被覆される。固相として、本明細書において前で言及されたものが考慮される。適切なラベルは、酵素、たとえばペルオキシダーゼ、放射性ラベル又は螢光ラベルである。好ましい固相はプラスチックビーズであり、そして好ましいラベルは、ホースラディシュペルオキシダーゼである。種々の抗体が、種々の動物、たとえばヒツジ及びウサギを免疫化することによって高められ得る。
【００８６】
もう１つの方法は、モノクローナル抗体を産生するための良く知られたＫoehler and Ｍilstein技法を用いることにある。同じ抗原に対して(但し異なったエピトープに対してではない)向けられるモノクローナル抗体を識別するために、Ｓtahliなど、Ｊ．Ｉmmunological Ｍethods ３２：２９７〜３０４（１９８０）の方法が使用され得る。
【００８７】
もちろん、抗血清(ポリクローナル抗体)及びモノクローナル抗体を使用することも可能である。
【００８８】
“二抗体サンドイッチ法”によれば、サンプルが、固相抗体及びラベルされた抗体と共にインキュベートされる。まず、固相抗体によりサンプルを処理し、そして洗浄の後、ラベルされた抗体によりサンプルを処理することが可能である。しかし、まず固相抗体によりサンプルを処理し、そして一定の時間の後、ラベルされた抗体により処理することも可能である。さらに及び好ましくは、固相抗体及びラベルされた抗体により一緒にサンプルを処理することが可能である。
【００８９】
免疫反応の後、洗浄段階が行なわれる。洗浄の後、当業界で既知の方法に従って、ラベルが決定される。ラベルとしてペルオキシダーゼが使用される場合、その決定は、基質、たとえばフェニレンジアミン又はテトラメチルベンジジンにより行なわれる。ラベルされた成分の量は、サンプル中に存在する抗原の量に比例する。
【００９０】
ＡＩＤＳウィルス又はＡＩＤＳウィルスに対する抗体の決定のための上記のような方法は、容器中に、本発明の環状ペプチド又はＡＩＤＳウィルスに対する抗体(本発明の環状ペプチド又は環状及び線状ペプチドの混合物により誘発された)を含んで成る適切な試験キットで行なわれ得る。
【００９１】
さらに、本発明の環状ペプチド及び本発明の環状及び線状ペプチドの混合物は、ＡＩＤＳウィルスに対する保護免疫性を誘発できるワクチンとして使用される。投与のルート、抗原投与量、注入の回数及び頻度は、個人ごとに異なり、そして他のウィルス感染において免疫性を提供することに現在使用されている方法に匹敵することができる。ワクチンは、既知の方法に従って調製される。ワクチン組成物は、便利には、生理学的に許容できるキャリヤー物質と共に組合されるであろう。そのワクチン組成物は、アジュバント又は免疫応答のいづれか他のエンハンサーを含むことができる。さらに、そのワクチン組成物は、ＡＩＤＳの他に他の疾病に対する免疫性を提供するために他の抗原も含むことができる。
【００９２】
（試験されたパネル血清）
本発明の生成物により試験されたパネル血清を、広範囲の種類の個人から得、そしてそれは、ＨＩＶ−１に対して血清陰性であることが知られている８４５個のサンプル及びそれに対して血清陽性であることが確認されている１３７８個のサンプル並びにＨＩＶ−２に対して血清陽性であることが確認されている５個のサンプルを含む。
【００９３】
表２は、血清サンプルが取られた被検体及びそれらのＨＩＶ血清学的状態の説明を示す。
【００９４】
【表２】
0003851761.tif 000011
【００９５】
（結果）
本発明の環状ペプチド及び１又は複数の線状ペプチドとのそれらの混合物が、種々の血清(このいくらかは陽性であり、そして他は陰性であることが確められている)に対して、前記ＥＬＩＳＡ試験に従って試験された。
【００９６】
表３は、既知のＨＩＶ−１陽性血清を同定することにおいて個々に評価された単一のペプチドの結果を提供する。
【００９７】
表４に表３のペプチドのアミノ酸配列を示す。
【００９８】
表５は、既知のＨＩＶ−２陽性血清を同定することにおいて個々に評価された単一のペプチドの結果を提供する。
【００９９】
表６は、種々の希釈度でのいくつかの血清の結果を比較することによって、ＥＬＩＳＡ試験における環状ペプチド対非環状ペプチドの感度を例示するために提供される。それぞれの対内で、環状相同体がその線状相同体よりもより活性であることが注目されるであろう。これらのデータは、抗体との反応において、一定のペプチドの環状性の重要性を明確に示す。
【０１００】
最近、被覆のために使用されるいくつかの条件(炭酸緩衝液、pＨ ９.６)において、それらの配列中に２個のシステインを有する線状ペプチドが内部環状化及び重合を受けることが見出された。表６に示される結果がＨＩＶ−１抗体を検出することにおいて線状ペプチドよりも環状ペプチドの卓越性を明確に示したとしても、その高められた感度は、炭酸緩衝液(pＨ ９.６)中に溶解された後、線状ペプチドの可能性のある環状化及び重合のために過小評価されて来た。その実験は、前記のとおり炭酸緩衝液(pＨ ９.６)及びまた１０％ 酢酸(pＨ ２.７)中に溶解される線状８７ペプチド及び環状８７ｃペプチドによりくり返された。ペプチドのＨＰＬＣ分析は、炭酸緩衝液中において、使用される線状ペプチド８７が、室温でその溶液中に維持される場合、環状化及び重合を受けることを確証した。プレートに結合される線状ペプチドに対する環状ペプチドの正確な割合はまだ決定されていないけれども、環状化及び重合がマイクロタイタープレートのウエル中において生じたと思われる。
【０１０１】
炭酸緩衝液中において見られるのとは反して、１０％ 酢酸中に溶解された線状ペプチド８７は、ＨＰＬＣ及びエルマン試験によって指摘されるように線状のまま残存した。
【０１０２】
１０％ 酢酸中に溶解された環状ペプチド８７ｃは、環状のまま残存した(ＨＰＬＣ分析及び負のエルマン試験から)。
【０１０３】
この実験に使用されるプレートは、１０μg／mlでのペプチドの溶液により被覆された(表６の実験結果が０.５μg／mlでのペプチドにより被覆されたプレートにより得られた)。４種の異なったＨＩＶ−１陽性サンプルが連続的に希釈され、そしてそれらの力価が決定された。その力価を、すでに記載されたＥＬＩＳＡ方法の条件下で１.０の吸光度を示す血液希釈度として定義した。
【０１０４】
表６においてすでに示されたように、環状ペプチド８７ｃは、その対応する線状ペプチド８７よりも高い感度で、ＨＩＶ−１に対して特異的な抗体を検出することができることが表７において明確である。線状ペプチド８７に対する環状ペプチドにより測定される感度の割合は、１，３〜２，２の間であり、そして平均１，８である。環状８７ｃペプチドを用いてのＥＬＩＳＡ試験の感度が、線状ペプチド８７が線状で残存し、そして環状化又は重合されない条件(酸性pＨ)を用いて比較される場合、これらの割合はさらに高く、３.０〜４.５である。
【０１０５】
十分に定義された環状ペプチド８７ｃにより被覆されたプレートの感度とペプチド８７の種々のポリマーのみを含むクロマトグラフィー画分のプールにより被覆された他のプレートの感度とを比較する類似実験はまた、最大感度でのＨＩＶ−１抗体の検出において、環状ペプチド８７ｃの卓越性を示す。これらの実験の間、バックグラウンド読みが線状ペプチド８７により被覆されたプレート上で有意に高く(０.１４４±０.０１０対０.００６±０.００２)、そしてＡＩＤＳ試験において十分に酸化された環状ペプチド８７ｃを用いることの１つの利点を示すことがまた突然見出された。
【０１０６】
表８において、環状及び線状ペプチドの混合物は、既知のＨＩＶ陽性血清を同定することにおいて評価され、そして表９はＨＩＶ陰性血清に対するその同じ混合物の結果を示す。
【０１０７】
表８及び表９に使用される混合物は、次の通りである：
0003851761.tif 000012
【０１０８】
これらの混合物において、ペプチド２３，２９，２０３及び２０４は、次の配列を有する：
ＡcＮＨ−YGCSGKLIC−ＣＯＮＨ2                            (２３)
ＮＨ2−CGVKNWMTETLL−ＣＯＯＨ                         (２９)
ＮＨ2−LVEITPIGFAPTKEKRYSSAHGR−ＣＯＯＨ          (２０３)
ＮＨ2−LVEITPIGFAPTKEKR−ＣＯＯＨ                    (２０４)。
【０１０９】
表１０は、１６７種のＨＩＶ−１陽性血清及び５１種のＨＩＶ陰性血清をアッセイすることにおける本発明の混合物４とウェスターンブロット試験との間の試験の比較を示す。その結果は、ＥＬＩＳＡ試験における本発明の混合物４がウェスターンブロット試験よりも高い感度及び特異性を与えることを示す。
【０１１０】
表１１は、８２２種のＨＩＶ−１陽性血清及び１１４種のＨＩＶ陰性血清をアッセイすることにおける免疫螢光アッセイを示す。その結果は、ＥＬＩＳＡ試験における混合物４が免疫螢光アッセイよりも高い感度及び特異性を与えることを示す。
【０１１１】
表３から表１１まで以下にまとめて記載する。
【０１１２】
【表３】
0003851761.tif 000013
【０１１３】
【表４】
0003851761.tif 000014
【０１１４】
【表５】
0003851761.tif 000015
【０１１５】
【表６】
0003851761.tif 000016
【０１１６】
【表７】
0003851761.tif 000017
【０１１７】
【表８】
0003851761.tif 000018
【０１１８】
【表９】
0003851761.tif 000019
【０１１９】
【表１０】
0003851761.tif 000020
【０１２０】
【表１１】
0003851761.tif 000021
【０１２１】
結果は、既知のＨＩＶ−１陽性血清を正しく同定することにおけるあるペプチド混合物、特に好ましい混合物４及び５の卓越性及び既知のＨＩＶ−２陽性血清を正しく同定することにおける混合物６の卓越性並びにＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２陽性血清サンプルの両者を正しく同定することにおける最終混合物７の卓越性を明確に示す。単一のペプチドよりもむしろ混合物の使用が、抗体がひじょうに限定された数のエピトープに対して向けられている低い力価の異常な血清を同定する失敗の可能性を最少にする。すべての血清陽性サンプルがＥＬＩＳＡにより試験され、そしてウェスターンブロット又は免疫螢光アッセイにより確認された。矛盾する場合、サンプルは、最終の対照標準として取られるラジオイムノ沈殿アッセイによりアッセイされた。
【０１２２】
次の実施例は、本発明のペプチドの合成のための一般的な方法及びそのペプチドの利用を例示する。
【０１２３】
【実施例】
実施例１：Ｎα−Ｆmocにより保護されたアミノ酸残基を担持する樹脂の調製塩化メチレン(ＣＨ2Ｃl2)及びジメチルホルムアミド(ＤＭＦ)の混合物(４：１)中、所望するＮα−Ｆmoc保護性アミノ酸残基を、ＣＨ2Ｃl2：ＤＭＦ(４：１)中、p−ベンジルオキシアルコール樹脂の懸濁液に０℃で添加した。その混合物を数秒間、手で攪絆し、そして次にＮ,Ｎ'−ジシクロヘキシルカルボジイミド(ＤＣＣ)、次いで４−(ジメチルアミノ)ピリジンの触媒量により処理した。その混合物を、０℃でさらに３０分間攪絆し、そして次に室温で一晩攪絆した。濾過された樹脂を、ＣＨ2Ｃl2、ＤＭＦ及びイソプロパノール(それぞれ３回)及び最後にＣＨ2Ｃl2により連続的に洗浄した。その樹脂をＣＨ2Ｃl2中に懸濁し、氷浴中に冷却し、そしてその攪絆された懸濁液に、再蒸留されたピリジン、続いて塩化ベンゾイルを添加した。攪絆を０℃で３０分間続け、そして次に室温で６０分間続けた。濾過の後、その樹脂を、ＣＨ2Ｃl2、ＤＭＦ及びイソプロパノール(それぞれ３回)及び最終的に石油エーテル(２度)により連続的に洗浄し、その後、真空下で乾燥せしめ、一定の重量にした。Ｍeienhoferなど、(Ｉnt．Ｊ．Ｐeptide Ｐrotein Ｒes.，１３，３５，１９７９)による置換の分光光度決定は、樹脂上の置換の程度を示した。
【０１２４】
実施例２：連続するアミノ酸の結合
Ｎα−Ｆmoc保護性第１アミノ酸残基を担持する樹脂を、Ｌabortec ＳＰ６４０ Ｐeptide Ｓynthesizerの反応容器中に添加し、そして次のようにして処理した：
（１）ＤＭＦによる洗浄(それぞれ１分間、２度)、
（２）ＤＭＦ中、ピペリジンの２０％ 溶液による予備洗浄(３分間)、
（３）ＤＭＦ中、ピペリジンの２０％ 溶液による保護解除(１０分間)、
（４）ＤＭＦによる洗浄(それぞれ１秒間、４度)、
（５）イソプロパノールによる洗浄(それぞれ３０秒間、２度)、
（６）ＤＭＦによる洗浄(それぞれ４５秒間、２度)、
（７）遊離アミノ基のためのチェック−Ｋaiser試験(陽性であるべきである)、
（８）そのペプチド樹脂を、所望するＦ−moc−保護性アミノ酸３モル当量及び両蒸留された乾燥ＤＭＦ中にすべて溶解された１−ヒドロキシベンゾトリアゾール３モル当量と共に２分間、軽く振盪すること、
（９）次に、固体ＤＣＣ(３.３モル当量)を、反応容器に添加すること、
（10）その反応混合物の２時間の振盪、
（11）ＤＭＦによる洗浄(それぞれ４５秒間、２度)、
（12）イソプロパノールによる洗浄(それぞれ４５秒間、２度)。
【０１２５】
１２段階の後、ニンヒドリン試験のためにアリコートを取る。その試験が陰性である場合、次のアミノ酸の結合のために段階１に戻す。その試験が陽性であり又はわずかに陽性である場合、段階６〜１２をくり返す。
【０１２６】
本発明に記載されるペプチドのアミノ酸のそれぞれの結合のために上記スキームを用いる。ＦmocによるＮ−α保護を、合成を通して残るアミノ酸のそれぞれにより使用する。
【０１２７】
放射性ラベルされたペプチドを、上記結合方法を用いて3Ｈ−グリシンの導入により得る。
【０１２８】
最後のアミノ酸の付加の後、Ｎ−末端残基のＮα−Ｆmocを、上記スキームの段階１〜７に戻すことによって除去する。ペプチド樹脂をＣＨ2Ｃl2により洗浄し、そして真空乾燥せしめ、保護された粗ペプチドを得る。
【０１２９】
実施例３：保護解除及び樹脂からペプチドの切断
保護されたペプチド−樹脂を、２.５％ エタンジチオール及び２.５％ アニソールを含む、ＣＨ2Ｃl2中、トリフルオロ酢酸(ＴＦＡ)の５５％ 溶液中に懸濁する。その混合物をＮ2によりフラッシュし、そして室温で１.５時間攪絆する。その混合物を濾過し、そしてその樹脂をＣＨ2Ｃl2により洗浄する。その樹脂を、ＣＨ2Ｃl2中、２０％ ＴＦＡにより室温で５分間再び処理する。その混合物を濾過し、そして樹脂をＣＨ2Ｃl2中、２０％ ＴＦＡにより洗浄し、そして次にＣＨ2Ｃl2により洗浄する。集められた濾液を３５℃以下で真空蒸発せしめ、そして残留物を、乾燥ジエチルエーテルにより数度こまかくすり砕く。固形物を１０％水性酢酸中に溶解し、そして粗組成物を得るために凍結乾燥する。
【０１３０】
arg及びcys残基を含むペプチドをさらに、アニソール及びジメチルスルフィドの存在下で０℃で１時間、ＨＦ処理により保護解除する。固形物を１０％ 水性酢酸中に溶解し、そして粗組成物を得るために凍結乾燥せしめる。
【０１３１】
実施例４：ペプチドの精製
粗ペプチドを、移動相のグラジエントを有するＣ18又はＣ4逆相のＶydacカラム(２.５×２５mm)上で分離用ＨＰＬＣにより精製する。流出液を２２０nmでモニターし、そして続いて分析用ＨＰＬＣによりモニターする。
【０１３２】
適切な画分をプールし、蒸発せしめ、そして凍結乾燥せしめる。合成ペプチドの同定を、分析用逆相クロマトグラフィー及びアミノ酸分析により確証する。
【０１３３】
実施例５：ペプチドの環状化
フェロシアン化カリウムの溶液(０.１Ｍ，pＨ ７.０)を、線状ペプチドの希釈水溶液(０.５mＭ)にpＨ ７.０でゆっくりと添加する。室温で２時間放置した後、そのpＨを５.０に下げ、そしてその溶液をイオン交換樹脂(Ｂio−Ｒad Ａg−３−Ｘ４ａ，Ｃl−形）により３０分間処理する。その懸濁液を濾過し、そしてその濾液を凍結乾燥せしめ、粗環状ペプチドを得る。そのペプチドを、分離用逆相ＨＰＬＣにより精製し、そしてアミノ酸分析により特徴づける。環状化の証明を、環状ペプチドのＨＰＬＣ移動性と出発の線状ペプチドとを比較することによって、線状ペプチドに戻る環状ペプチドのアリコートを還元することによって及びまた、環状化の後、遊離スルフヒドリル基の消失(エルマン試験)を観察することによって得る。
【０１３４】
環状ペプチドとそれらの対応する線状ペプチドとの間の生理化学的相違を示すために、ＨＰＬＣにおける保持時間の相違を示す表１２に言及する。
【０１３５】
【表１２】
0003851761.tif 000022
【０１３６】
実施例６：ウシ血清アルブミン又はキーホールリムペット(アオガイ)へモシアニンヘのペプチドの接合
ペプチドを、スルホスクシンイミジル−４−(p−マレイミドフェニル)ブチレート(Ｓulfo−ＳＭＰＢ)により前もって誘導体化されたＢＳＡ又はＫＬＨに接合せしめる。
【０１３７】
スルホ−ＳＭＰＢ(Ｐierce Ｃhemicals)の水溶液を、０.０２Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液(pＨ ７.０)中、ＢＳＡ又はＫＬＨの溶液に添加する。その混合物を、室温で４５分間振盪し、そして、活性化されたキャリヤーをすぐに、０.１Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液(pＨ ６.０)により平衡化されたＳephadex Ｇ−２５カラムに４℃で適用する。
【０１３８】
活性化されたキャリヤーに対応する、最初のピークの吸光度の画分を丸底フラスコに集め、それに０.０５Ｍ リン酸ナトリウム緩衝液(pＨ ６.２)中、ペプチドの溶液を添加する。その混合物をＮ2により十分にフラッシュし、そして室温で一晩インキュベートする。その結合効力を、３Ｈによりラベルされたペプチドを用いて及び接合体のアミノ酸分析によりモニターする。
【０１３９】
実施例７：酵素結合性免疫吸着アッセイ(ＥＬＩＳＡ)によるＨＩＶに対する抗体の検出
マイクロタイタープレートのそれぞれのウェルを、ペプチド又はペプチド混合物を含む溶液(５μg／ml)１００μlにより飽和せしめ、そして一晩放置する。ウェルを空にし、そして洗浄緩衝液(Ｔris，０.０４３Ｍ；ＮaＣl，０.５Ｍ；チメロザル、０.０１％ Ｗ／Ｖ；Ｔween ２０，０.０５％ Ｖ／Ｖ；pＨ ７.４)により２度洗浄する。次に、ウェルを、洗浄緩衝液０.３５mlにより３７℃で１時間飽和せしめ、そして同じ緩衝液により１度洗浄する。分析されるべき血清サンプルを、検体緩衝液(洗浄緩衝液＋カゼイン、０.０５％ Ｗ／Ｖ)により希釈する。ウェルを洗浄緩衝液によりすすぎ、その後希釈された血清サンプル(０.１ml)を添加する。これらを室温で１時間インキュベートする。次にウェルを空にし、洗浄緩衝液によりすぐに２度洗浄し、そして次に２分間１度洗浄する。洗浄緩衝液中、１％ Ｗ／Ｖウシ血清アルブミンにより希釈された接合体溶液(ラベルされたヒトＩgＧペルオキシダーゼに対するアフィニティ精製されたヤギ抗体、５０％ グリセロール５ml中０.５mg)を、それぞれのウェルに添加し(０.１ml)、そして室温で１時間インキュベートする。次にウェルを空にし、そして急速に洗浄緩衝液により２度洗浄し、そして次に５度洗浄し、ここで緩衝液は洗浄当り２分間、ウェルを接触せしめる。基質溶液(３,３',５,５'−テトラメチルベンジジン、ＤＭＳＯ １ml当り８mg)を、３０％ Ｈ2Ｏ2 ０.１％ Ｖ／Ｖを含む０.１Ｍのクエン酸塩−酢酸塩緩衝液(pＨ ５.６)１００体積により希釈し、そしてそれぞれのウェルに添加する(ウェル当り、０.１ml)。１０分後、それぞれのウエルの内容物を、２ＮのＨ2ＳＯ4 ０.１mlにより処理し、そして対４５０nmで吸光度を読む。すべての測定は２度行なわれる。
【０１４０】
【発明の効果】
本発明によれば、ＨＩＶ−２により感染された少数の患者から取られた血清の１００％を同定することに有用である一連の新規ペプチド又はアミノ酸配列もまた提供される。ＨＩＶ−１及び／又はＨＩＶ−２の両者を検出するために本発明に記載されたペプチド又はペプチドの混合物のいくらかを使用することが可能である。