(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）緩衝剤；
ｂ）還元剤；
ｃ）安定化タンパク質；
ｄ）キレート剤；
ｅ）塩；および
ｆ）トロポニンまたはそのフラグメントを含んでいる、トロポニンまたはそのフラグメントを安定化するための液体組成物。
【請求項２】
トロポニンフラグメントは配列番号２である請求項１の組成物。
【請求項３】
トロポニンフラグメントは配列番号３である請求項１の組成物。
【請求項４】
凍結されている請求項１の組成物。
【請求項５】
ブロッキング剤をさらに含んでいる請求項１の組成物。
【請求項６】
ブロッキング剤はゼラチンである請求項５の組成物。
【請求項７】
安定化タンパク質はアルブミンである請求項１の組成物。
【請求項８】
アルブミンはプロテアーゼ不含である請求項７の組成物。
【請求項９】
増嵩剤をさらに含んでいる請求項１の組成物。
【請求項１０】
凍結乾燥されている請求項９の組成物。
【請求項１１】
増嵩剤は、トレハロース、グルコース、スクロース、ガラクトース、マンノース、マルトース、ラクトース、イソマルトース、セロビオース、マンノビオース、メルビオース、マルトトリオース、ナイストース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオースおよびマルトヘプタオースよりなる群から選ばれる請求項９の組成物。
【請求項１２】
ａ）緩衝剤；
ｂ）Ｎ−アセチルシステイン、２−アミノエタンチオール、２−メルカプトエタノール、２−メルカプトエチルアニリンおよびジチオスレイトールよりなる群から選ばれた還元剤；
ｃ）アルブミン、卵アルブミンおよびカゼインよりなる群から選ばれた安定化タンパク質；
ｄ）エチレンビス（オキシエチレンニトリロ）テトラ酢酸（ＥＧＴＡ）、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）、クエン酸塩またはシュウ酸塩より選ばれたキレート剤；
ｅ）塩；および
ｆ）トロポニンまたはそのフラグメントを含んでいる、トロポニンまたはそのフラグメントを安定化するための液体組成物。
【請求項１３】
凍結されている請求項１２の組成物。
【請求項１４】
ブロッキング剤をさらに含んでいる請求項１２の組成物。
【請求項１５】
ブロッキング剤はゼラチンである請求項１４の組成物。
【請求項１６】
増嵩剤をさらに含んでいる請求項１２の組成物。
【請求項１７】
凍結乾燥されている請求項１６の組成物。
【請求項１８】
増嵩剤は、トレハロース、グルコース、スクロース、ガラクトース、マンノース、マルトース、ラクトース、イソマルトース、セロビオース、マンノビオース、メルビオース、マルトトリオース、ナイストース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオースおよびマルトヘプタオースよりなる群から選ばれる請求項１６の組成物。
【発明の詳細な説明】
本発明の分野
本発明は、一般的にはタンパク質およびペプチドを安定化するため水溶液に関する。詳しくは、本発明はタンパク質およびペプチド、特にトロポニン，ミオグロビン，ＣＫ，ＣＫイソ酵素，ＬＤ，ＬＤイソ酵素およびミオシン、およびそれらのフラグメント，最も特にトロポニンの合成および組換ペプチドを含むトロポニンおよびトロポニンフラグメントのための診断アッセイ用の水性較正および対照溶液に関する。
本発明の背景
多数の生理学的状態がＣＫ−ＭＢ、ミオグロビン、ミオシンおよびトロポニンの上昇したレベルに関連する。上昇したレベルは一般に心筋梗塞および心筋傷害を招来する他の症状に関連する。
主として急性心筋梗塞とこれらタンパク質の上昇したレベルの関連のため、急性心筋梗塞（ＡＭＩ）のためのテストが体液中のこれらタンパク質レベルを測定するために考案され、または考案されつつある。このためこれらタンパク質は心臓マーカーとして知られている。急性心筋梗塞は、特にアメリカ合衆国においては主要な病因および死因であり続けている。推定１５０万人の病院入院患者が心筋梗塞の疑いまたは関連する心臓病へ帰属し得る。これらの患者のうち、大体２５％だけが実際にＡＭＩにかかっており、３０％は不安定アンギナで入院し、２０％は安定な冠動脈病（ＣＡ）を有し、残りの２５％はＣＡＤを持っていない。直ちにケアおよび入院を必要とする患者を危険でない患者から区別することは有効な医学的ケアを提供し、入院コストを減らし、そして病院設備を有効に管理することにおいて大きな価値がある。現在の研究は早期の介入が最適の治療対策にとって決定的であることを指示する。
これらの治療対策は、損傷した心筋への血流の回復、梗塞サイズの局限およびそれにより心機能を保存する可能性を有している。新しい治療介入機構、特にストレプトキナーゼおよび組織プラスミノーゲンアクチベーターのような血栓溶解剤が心臓動脈血流を回復し、そして死亡頻度を減らすために利用可能である。大多数の臨床医は介入はできるだけ早く行うべきであり、そして胸痛の発現後最初の４時間以内でなければならないと信じている。
このため、理想的な心臓マーカーまたはマーカーの組合せは心臓組織に特異的でなければならず、それはＡＭＩの開始後４時間以内の診断でなければならず、それはＡＭＩ後少なくとも７日間いくらか上昇し続けるがしかし最初のＡＭＩの最初の数日間でさえも再梗塞を検知しなければならない。
ＡＭＩの診断は現在異常な心電図（ＥＣＧ）、臨床症候および履歴、および上昇した心臓酵素レベルに基づいている。現在ＣＫＭＢがしばしばＡＭＩに対する決定的血清マーカーとして使用されている。
しかしながらＥＣＧおよび臨床的提示はしばしば心臓損傷の非結論的または矛盾する予見を与える。ＣＫ−ＭＢテストは最終診断への貢献においていくつかの制限を有する。骨格筋損傷および激しい運動は人工的にＣＫ−ＭＢレベルを上昇することがあり、臨床図を困乱し得る。加えて、ＣＫ−ＭＢはＡＭＩ後４〜６時間まで診断的に上昇しない。加えて、ＣＫ−ＭＢレベルはＡＭＩ後４８〜７２時間診断できなくなる。
ＣＫ−ＭＢはこの検体の診断測定をモニターするための対照溶液中に調製されている。しかしながらＣＫ−ＭＢはヒト血清中および通常の衝緩水溶液中では限られた安定性を有する酵素である。米国特許No.４，９９４，３７５は安定な再構成水系対照を開示する。現在ＣＫ−ＭＢレベルの測定のため市場で入手し得るＤａｄｅ  Ｓｔｒａｔｕｓ  ＣＫ−ＭＢ蛍光分析酵素イムノアッセイキットのようなイムノアッセイキットがある。これらキットの多くは較正液を含んでいる。Ｄａｄｅ  ＣＫ−ＭＢ／ミオグロビンイムノアッセイコントロールのようなＣＫ−ＭＢを含有する対照溶液も商業的に入手し得る。
ミオグロビンは骨格および心臓筋肉の両方に存在するマーカーである。ミオグロビンレベルはＡＭＩの２時間以内に上昇する。血清レベルは６〜８時間でピークに達するが、２４〜３６時間後には非診断レベルへ復帰する。しかしながら血清ミオグロビンレベルは骨格筋傷害後も増加する。ミオグロビンレベル測定のだめのＤａｄｅ  Ｓｔｒａｔｕｓミオグロビン蛍光分析酵素イムノアッセイキットのような商業的に入手し得る少数のイムノアッセイキットがある。ミオグロビン含有対照溶液はＤａｄｅ  ＣＫ−ＭＢ／ミオグロビンイムノアッイセ対照のようなソースから調製され、商業的に入手し得る。
トロポニンは筋組織の収縮メカニズムの調節機能を実行する、約８５ｋＤの分子量を有するタンパク質複合体である。トロポニン複合体を含むサブユニットのアミノ酸配列は決定されている。例えばＶａｌｌｉｎｓ  Ｗ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｃａｒｄｉａｃ  ｔｒｏｐｏｎｉｎ  Ｉ  ｕｓｉｎｇ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ，ＦＥＢＳ  ＬＥＴＴＥＲＳ：Ｖｏｌ．２７０，Ｎｏ．１，Ｓｅｐ．２，１９９０を見よ。トロポニンは、カルシウムの存在下筋肉内の収縮または弛緩のどちらかを制御するために協力する似た分子量の三つのサブユニットよりなる。これら三つのサブユニットはトロポニンＴ，ＣおよびＩと命名されている。心筋に含まれているＴおよびＩの両方は心臓に特異的なアミノ酸配列を有する。このためトロポニンＴおよびトロポニンＩの両方が心筋起源の損傷のテストにおいてすぐれた特異性のための可能性を持っている。心臓組織への損傷はこれら収縮タンパク質を損害後急速に循環中へ放出させ、感受性のための可能性を提供する。トロポニンはＡＭＩ後４〜６時間診断され、そして４〜１４日間上昇し続ける。
トロポニンのような収縮装置のタンパクは不溶性タンパク質複合体の一部である。このため精製したトロポニンを血清に入れる時それを可溶化するのは困難である。加えて、精製したトロポニン調製物は非常に不安定であり、そのコンフォメーションの見掛けの変化および／または容器表面への付着は分子の定量化を複雑化する傾向を有する。このためトロポニンを安定化する水溶液を設計することは非常に困難である。現在商業的に入手し得るトロポニンのための診断アッセイに使用する較正液および対照は液体の形において非常に限られた安定性を有する。
このためトロポニンを可溶化し、そして安定化するために有用な水溶液に対して需要が存在する。そのような溶液はトロポニンおよび他の心臓マーカーのための、または可溶化および／または安定化が困難な他のタンパク質のための診断対照または較正液マトリックスとして機能することができる。加えて、該マトリックスは該タンパク質を貯蔵するために有用である。
トロポニン、またはトロポニンと同様に安定性または溶解性問題を有する他のタンパク質のための較正または対照ベースを処方する時にはいくつかの基準を満たす必要がある。安定性問題が主要な関心事である。再現性および使用容易性のため液状製品が好ましく、そして安定でなければならない。しかしもし製品が凍結乾燥されるならば、復元後も安定でなければならない。以前のトロポニン較正液はヒト血清由来製品に基づいており、そして組成物の安定性へは非常に僅かしか貢献しない。例えば、ベーリンガーマンハイム製ヒト血清系凍結乾燥トロポニンＴ較正および対照の公表されている日付記入は復元後２〜８℃においてたった６時間であり、そして部分標本とし−２０℃で貯蔵するとき３月である。製品の安定性を増加するマトリックスが高度に望まれる。
さらに、正常または処理したヒト血清の使用は臨床医および製造者の両方へ健康問題を提供する。このため健康リスクを低減するマトリックスが高度に望まれる。
合成マトリックス中の較正剤は正常ヒト血清を用いる応答曲線の系を真似しなければならない。このことはマトリックスによって発生させた標準曲線から読取った結果が実際の生物学的環境における結果と比較して正確であることを保証するために重要である。
診断アッセイにおいては検体のテスト表面（例えば試験管、紙、スライド等のような固相支持体）への非特異的結合は、較正を正確に保ちそして矛盾した結果のリスクをなくすために最小化されなければならない。このためマトリックス中の検体の非特異的結合は最小化されなければならず、サンプルの非特異的結合と類似でなければならない。また、貯蔵中タンパク質またはタンパク質フラグメントは認められる程貯蔵容器へ結合しないことも重要である。
実際の検体よりも検体類縁体の方が望ましい場合がある。もし検体類縁体が検体の代わりに使用されるならば、類縁体の結合は検体の結合を模倣しなければならない。類縁体の免疫結合は当該タンパク質のそれを模倣しなければならないため、タンパク質のための類縁体を選定する時には特別の注意を使用しなければならない。このため結合部位のためのタンパク質のコンフォメーション依存性が類縁体において維持されなければならない。加えて、類縁体の安定性は検体のそれと同じかまたはそれより大でなければならない。再びタンパク質検体の安定性はそのコンフォメーションに関係し得る。最後にもしある類縁体をある検体に置換するならば、類縁体は検体より容易に入手可能であることが望ましい。
本発明の概要
本発明は、心臓マーカーのようなある種の不安定および／または貧溶性タンパク質のための診断アッセイのために、そして診断アッセイの精度および正確性をモニターするための較正曲線の実行に使用すべき、安定化した臨床検査室非ヒト血清誘導対照および／または較正剤マトリックスを提供する。特に、安定化したマトリックスはトロポニンＩ，トロポニンＴ，ＣＫ−ＭＢ，ミオグロビン，ミオシンおよびこれらタンパク質または検体のフラグメントの可溶化および／または安定化のために有用である。
このマトリックスは正常ヒト血清中の検体の安定性と少なくとも等しくそして好ましくはそれより良好な安定性を検体へ付与する成分の新規な混合物を使用する。特に、緩衝剤、アルブミン、ゼラチン、キレート剤、還元剤および塩類の水系混合物がすべて検体または検体アナログを安定化しそして可溶化するために微酸性ないし中程度のアルカリ性ｐＨにおいて使用される。
このマトリックスを調製するための方法も開示される。
【図面の簡単な説明】
図１は、種々のマトリックス中の組換全長トロポニンＩの２〜８℃における安定性の比較を図示する。
図２は、種々のマトリックス中の組換え製造した８０アミノ酸ペプチドの２〜８℃における安定性の比較を図示する。
図３は、種々のマトリックス中のトロポニンＩの合成ペプチドの１０ｎｇ／ｍＬ較正剤の２〜８℃における安定性の比較を図示する。
図４は、種々のマトリックス中のトロポニンＩの合成ペプチドの５０ｎｇ／ｍＬ較正剤の２〜８℃における安定性の比較を図示する。
図５は、種々のマトリックス中のトロポニンＩの合成ペプチドの３７℃における安定性の比較を図示する。
図６は、すべてのマトリックスがプロテアーゼ阻害剤を含んでいる種々のマトリックス中のトロポニンＩの合成ペプチドの３７℃における安定性の比較を図示する。
図７は、本発明のマトリックス中のトロポニンＩの合成ペプチドの異なるレベルの較正曲線を図示する。
本発明の詳細な説明
心臓マーカーおよび他の不安定タンパク質のための臨床検査室非ヒト血清誘導対照および／または較正剤マトリックスは、すべて微酸性ないし中程度アルカリ性ｐＨにおいて、緩衝剤、アルブミン、卵アルブミン、カゼイン等のような安定化タンパク質、キレート剤、還元剤および塩の水溶液を含む。
マトリックスはゼラチン、洗剤およびプロテアーゼ阻害剤のようなブロッキング剤を含むことができる。微生物発育を阻止するため保存剤を加えてもよい。心臓マーカーまたは他の不安定なまたは比較的不溶性のタンパク質またはそのフラグメントのような検体または検体アナログも添加される。もし較正剤または対照が凍結乾燥または凍結されるならば、糖類または他の増嵩剤が添加される。
好ましい緩衝剤は、トリス緩衝剤およびリン酸塩緩衝剤のような緩衝剤を含む。他の緩衝剤は、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ），Ｎ−トリスヒドロキシメチル−メチル−２−アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ），３−〔Ｎ−ビス（ヒドロキシメチル）アミノ〕−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＤＩＰＳＯ），ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）（ＨＥＰＰＳＯ），トリス（ヒドロキシメチル）アミノエタン、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−アミノエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ），３−〔Ｎ−（トリス−ヒドロキシメチル）メチルアミノ〕−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ）、および（２−アミノ−２−オキソエチル）アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）を含む。最も好ましい緩衝剤はリン酸ナトリウムのようなリン酸塩である。
緩衝剤の濃度は約１０ｍＭないし２００ｍＭでよい。好ましくは濃度は約２５ｍＭないし１００ｍＭである。最も好ましくは濃度は約５０ｍＭである。
安定化タンパク質はアルブミン、卵アルブミン、カゼイン等である。安定化タンパク質は、他の成分と同様に、マトリックス中の検体の安定性を妨害する夾雑物を実質上不含でなければならない。プロテアーゼのようなタンパク質構造を不安定化または破壊し得る物質はそのような夾雑物の例である。アルブミンが好ましい安定化タンパク質である。アミブミンの源は決定的ではない。アルブミンは起源において天然でも組換物でもよい。天然アルブミンの最も入手し易い源はウシアミブミンである。もし検体またはアナログがプロテアーゼ分解に服し得るならば、アルブミンは実質上プロテアーゼ不含であることが最も好ましい。代わりにプロテアーゼ阻害剤を添加することができる。アルブミンの好ましい濃度は５〜２０％，８〜１２％、そして最も好ましくは約１０％である。
どんな特定の理論に拘束されることを望むものではないが、タンパク質安定剤は検体または検体アナログに対して保護効果を提供するものと信じられる。
ブロッキング剤（すなわち表面への検体または検体アナログの非特異的結合を最小化する剤）、例えばゼラチン、カゼイン、卵アルブミン等を添加してもよい。ゼラチンが好ましいブロッキング剤である。ゼラチンは、もしウシ起源であるならば約０．０１ないし０．１５％，最も好ましくは０．１％の濃度において添加される。もしゼラチンが他の起源のもの（例えば魚）であるならば、濃度は適切に調節される。
キレート剤も添加される。好ましいキレート剤はエチレンビス（オキシエチレンニトリロ）テトラ酢酸（ＥＧＴＡ）およびエチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）、クエン酸ナトリウム、またはシュウ酸ナトリウム、カリウム、アンモニウムまたはリチウムのようなシュウ酸塩である。キレート剤の濃度は１ｍＭないし１５ｍＭ、そして最も好ましくは５ないし１０ｍＭである。
好ましくは還元剤はＮ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）である。使用し得る他の還元剤の例は２−アミノエタンチオール、２−メルカプトエタノール、２−メルカプトエチルアニリンおよびジチオスレイトールを含む。
還元剤の濃度は約０ないし５ｍＭでよく、好ましくは還元剤は約２ｍＭないし３．５ｍＭ，最も好ましくは約２．６ｍＭである。
ｐＨは約５．０ないし８．０でよい。僅かに酸性のｐＨ値はトロポニンの非特異的結合を低下させる。好ましいｐＨ範囲は５ないし７．５であり、そして最も好ましくは約７．０である。
好ましい塩は塩化ナトリウムである。多数の他の塩を代替し得る。他の塩類の例はカリウム塩、アンモニウム塩およびリチウム塩を含む。
もしプロテアーゼ阻害剤を添加するならば、アプロチニンおよびプロテアーゼ阻害剤（シグマ）が有効であり、そして製造者の推奨濃度において使用し得る。他のプロテアーゼ阻害剤の例は、（２Ｓ，３Ｒ）−３−アミノ−２−ヒドロキシ−５−メチルヘキサノイル〕−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｓｐ（アマスタチン−シグマ）、〔２Ｓ，３Ｒ〕−３−アミノ−２−ヒドロキシ−４−〔４−ニトロフェニル〕−ブタノイル−Ｌ−ロイシン、アンチパイン、〔２Ｓ，３Ｒ〕−３−アミノ−２−ヒドロキシ−５−メチルヘキサノイル〕−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｓｐ（エピアマスタチン−シグマ），（〔２Ｒ，３Ｒ〕−３−アミノ−２−ヒドロキシ−４−フェニルブタノイル）−Ｌ−ロイシン（エピベスタチン−シグマ）、フォロキシミチン、アセチル−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−ａｌ（ロイペプチン−シグマ）、４−アミノ−３−ヒドロキシ−６−メチルヘプタン酸、Ｎ−（α−ラムノピラノシルオキシ−ヒドロキシフォスフィニル）−Ｌｅｕ−Ｔｒｐおよびフェニルメタンスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）を含む。
もし添加するならば、好ましい洗剤はＳＤＳおよびトリトンＸ−１００である。他の洗剤はＴｗｅｅｎ−２０，ブリジ、ソルビチン、タージトールおよびノニデットを含む。洗剤の濃度は０．０５％ないし０．３％でよい。好ましい範囲は０．０５％ないし０．２％である。最も好ましい濃度は０．１％である。
保存剤は微生物およびカビ発育を防止するために添加してよい。保存剤は少なくとも０．０３％のクロトリマゾール、少なくとも０．０１７％のクロラムフェニコール、または少なくとも０．０５％のアジ化ナトリウムでよい。他の保存剤はゲンタマイシン、マイコスタチン、チメラゾールおよびカソンの有効濃度を含む。
マトリックスを調製するため、ポリプロピレンのようなプラスチックを使用しなければならない。これはガラスへの非特異性結合によるガラスへのタンパク質の損失を最小化する。代わりにガラス系研究室器具を使用できるが、しかし使用前シリコーン処理しなければならない。
もし較正剤または対照マトリックスを凍結乾燥または冷凍するならば、増嵩剤が添加される。好ましい増嵩剤は３ないし１０％におけるトレハロースおよび約１００ｍＭにおけるスクロースである。トレハロースの最も好ましい濃度は約５〜１０％である。他の増嵩剤はグルコース、スクロース、ガラクトース、マンノース、ラクトース、イソマルトース、セロビオース、マンノビオース、メルビオース、マルトトリオース、ナイストース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオースおよびマルトヘプタオースを含む。
マトリックス１リットルは、ＢＳＡ約３０ｇ、ゼラチン約１ｇ、塩化ナトリウム約１５ｇ、ＥＤＴＡ約３ｇ、トレハロース約５０ｇ、保存剤、および検体または検体アナログの臨床的に適切なレベルを０．５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液７００ml中に溶解することによって調製することができる。すべての成分が溶解した後、ｐＨが７．０へ調節され、その後リン酸ナトリウムのような緩衝液の適量が体積を１．０リットルとするために加えられる。溶液は適当な容器へ無菌充填され、そして凍結乾燥される。マトリックスを含む凍結乾燥した検体はＢＳＡ６５ｇ，ＮａＣｌ２５ｇ，プロテアーゼ阻害剤およびＮＡＣ約０．４ｇを含んでいる希釈剤１リットルを加えることによって復元される。
代わりに、マトリックス１リットルは、ＢＳＡ約１００ｇ，ゼラチン約１ｇ，塩化ナトリウム約４０ｇ，ＥＤＴＡ３ｇ，保存剤，ＮＡＣ０．４ｇ，および検体または検体アナログの臨床的に適切なレベルを０．５０ｍＭリン酸ナトリウム７００ml中に溶解することによって調製することができる。すべての成分が溶解した後、ｐＨ７．０へ調節され、次にリン酸ナトリウムのような緩衝液の適量が体積を１．０リットルとするために加えられる。液は部分標本化され、そして冷蔵または冷凍して貯蔵される。もし液が冷凍されるならば、増嵩剤が加えられる。
驚くことにトロポニンＩ検体のために、トロポニンＩフラグメントも増加した安定性を有する。これはトロポニンＩフラグメントの安定性はマトリックスが正常ヒト血清である時全長トロポニンＩよりも低いことがわかっているので驚くべきである。加えて、ある種のトロポニンＩフラグメントは全長トロポニンＩ分子に比較する時アッセイに使用される抗トロポニン抗体に対して同様な結合を有していた。
このため、本発明は先行技術を上廻る多くの利益を有する。このマトリックスは非ヒト血清由来であり、これは使用者（および製造従事者）をヒト血液製品との接触により伝播し得る多数の疾病への暴露から防止する。このマトリックスは検体を液体の形で長期間安定に保つことができる。現行の処方物も凍結乾燥または冷凍することができ、そして非常に少ない較正変動をもって少なくとも９ケ月棚貯蔵まで信頼して復元または解凍することができる。復元または解凍後、検体は２〜８℃において３週間までは安定である。マトリックス中への検体のスパイキングはヒト血清曲線に密接に平行する較正曲線を得る。合成マトリックス中の非特異性結合レベルも正常ヒト血清に見られるレベルに密接に平行する。さらにタンパク質の組換えまたは合成的に製造したペプチドフラグメントを全長タンパク質に代えて使用することができる。実際、組換えまたは合成的に製造したフラグメントの入手性および再現性と組合せたそれらのマトリックス中の安定性の故にこれらフラグメントが好ましい。検体アナログ（例えばフラグメント）は全長マーカーと類似の結合特性を持たなければならない。エピトープ部位を決定しそしてマップする方法は、特異性抗原に対する抗体を製造する技術と同様に当業者には知られている。
本発明のマトリックスは多数の検体のために使用することができるが、しかしそれは心臓マーカー，特にトロポニンおよびＣＫ−ＭＢのような検体が不安定でそして／または比較的不溶性のタンパク質である時に特に有用であることを理解すべきである。
実施例１
較正標準／対照マトリックスの調製
精製水約700ｍＬに、攪拌しつつ約３ｇのＥＤＴＡ（溶解するまで攪拌する）を、次いで約40.0ｇの塩化ナトリウム、約6.9ｇのリン酸一ナトリウム、約0.424ｇのＮＡＣ、約50ｇのトレハロース、165ｍｇ／ｍＬの最終濃度を提供するための約3.3ｍＬのクロラムフェニコール原液、最終濃度３ｐｐｍｓにするための約0.75ｍＬのクロルトリマゾール原液、約10ｍＬの１％ゼラチン水溶液を加え、次いで緩やかに攪拌しつつ、約95ｇのプロテアーゼ不含牛血清アルブミンを、そして２ｍＬの25％アジ化ナトリウムを加える。
実施例２
凍結乾燥された較正標準／対照マトリックスの調製
精製水約700ｍＬに、攪拌しつつ約３ｇのＥＤＴＡ、約15ｇの塩化ナトリウム、約７ｇのリン酸一ナトリウム、約50ｇのトレハロース、165ｍｇ／ｍＬの最終濃度を提供するための約3.3ｍＬのクロラムフェニコール原液、最終濃度３ｐｐｍｓにするための約0.75ｍＬのクロルトリマゾール原液、約10ｍＬの１％ゼラチン水溶液、そして約30ｇの牛血清アルブミンを加える。ｐＨを5.5に調製し、精製水によって総量を１Ｌに調節する。最終のマトリックスを濾過しそして凍結乾燥する。１Ｌの復元希釈液を、水溶液中で約65ｇのアルブミン、25ｇの塩化ナトリウム及び0.4ｇのＮＡＣ（プロテアーゼ阻害剤）及び約２ｍＬの25％アジ化ナトリウム溶液を合わせることによって調製する。
実施例３
較正標準／対照マトリックスの調製
精製水約700ｍＬに、約５ｇのＥＤＴＡ、約50ｇの塩化ナトリウム、約７ｇのリン酸一ナトリウム、約0.4ｇのＮＡＣ、最終濃度165ｍｇ／ｍＬを与えるための約3.3ｍＬのクロラムフェニコール原液、最終濃度３ｐｐｍｓを与えるための約0.75ｍＬのクロルトリマゾール原液、約10ｍＬの１％ゼラチン水溶液、約95ｇのプロテアーゼ不含牛血清アルブミンを加える。ｐＨを6.5に調整し、精製水によって総量を１Ｌに調節する。最終マトリックスは、無菌濾過してよい。
実施例４
組換えタンパク質を用いた較正標準の調製
約０乃至100ｎｇ／ｍＬの範囲のトロポニンＩ濃度を有する較正標準又は対照を作るのに十分な量の組換えトロポニンＩを加えることにより、ポリプロピレンの実験器具中で、ヒト組換えトロポニンＩの原液を調製した。
１つの実験においては、トロポニンＩ溶液は、100μｇ／ｍＬの十分量の未精製組換えトロポニンＩ溶液を次のマトリックスに加えることによって調製した：
正常ヒト血清、血漿、及び実施例１に記載したのと同様なマトリックス。
各マトリックスにつき、組換えトロポニンＩの100ｎｇ／ｍＬ溶液の最終液量は15ｍＬであった。組換えトロポニン１は、次の配列：
0003740644.tif 000002
を有し且つ、６個のヒスチジンのカルボキシ末端テールと、アミノ末端にファージＴ６遺伝子10リーダー配列からの７個のアミノ酸配列とを含んでいる。Vallins W.J. et al, Molecular cloning f human cardiac troponin I using polymerase chain reaction, FEBS LETTERS: Vol. 270, No.1, 2 September 1990をも参照。
これら３つのトロポニンＩ溶液の各々の部分量を、２〜８℃に貯蔵し、安定性につき評価した。評価の各日において、各トロポニンＩ溶液の部分量を、Stratus II Fluorometric Analyzerによって分析した。Stratus II Fluorometric Analyzerは、Dade International Inc.によって販売されている。この分析器の及びイムノアッセイの作動原理については、例えば、参照によりここに導入する米国特許第4,517,288及びGiegle et al, Clinical Chemistry 28: 1894-1898（1982）を参照。この分析器は、蛍光信号の変化速度を測定する。一般に、トロポニンＩ等のような分析対照に対する抗体が、ガラス繊維濾紙よりなる固相に前固定される。トロポニンＩでは、各トロポニンＩ溶液の部分量が抗体に適用され、抗体へ免疫学的に結合して反応区域を形成する。次に、アルカリ性ホスファターゼ−抗トロポニンＩ抗体よりなる接合体がこの反応区域に加えられる。この接合体は、トロポニンＩに結合する。４−メチル−ウンベリフェリルホスフェートを含有する基質洗浄液が反応区域に加えられる。前面蛍光光度計が、ミリボルト／分（ｍｖｍ）として指定された速度単位で蛍光の変化速度を測定する。
評価の結果は図１に見ることができる。図１に見ることができるように、本発明のマトリックスは、正常ヒト血清又は血漿に比してトロポニンＩ分析対照に対する一層の安定性を提供した。
実施例５
組換えにより製造されたペプチドを用いた較正標準の調製
約０乃至100ｎｇ／ｍＬの範囲のトロポニンＩ濃度を有する較正標準又は対照を作るのに十分な量の組換えトロポニンＩペプチドを加えることにより、ポリプロピレンの実験器具中でヒト組換えトロポニンＩペプチドの原液を調製した。
１つの実験においては、トロポニンＩの溶液は、配列
0003740644.tif 000003
を有し且つ、６個のヒスチジンのカルボキシ末端テールと、アミノ末端にファージＴ６遺伝子10リーダー配列からの７個のアミノ酸配列とを含んでいる組換えトロポニンＩの組換え80アミノ酸ペプチド（Vallins W.J. et al, Molecular cloning f human cardiac troponin I using polymerase chain reaction, FEBS LETTERS: Vol. 270, No.1, 2 September 1990をも参照。）を、7500ｎｇ／ｍＬで次のマトリックス：
正常ヒト血清、処理ヒト血漿、血漿及び実施例１に記載のものと同様のマトリックス
に、各マトリックス中組換えトロポニンＩペプチドの100ｎｇ／ｍＬ溶液を与えるに十分な量で加えることによって調製した。
これら４種のトロポニンＩ溶液の各々の部分量を、２〜８℃にて貯蔵し、安定性につき評価した。評価の各日に、各トロポニンＩ溶液の部分量をStratus II Fluorometric Analyzerによって分析した。Stratus II Fluorometric Analyzerは、Dade International Inc.によって販売されている。この分析器の及びイムノアッセイの作動原理については、例えば、参照によりここに導入する米国特許第4,517,288及びGiegle et al, Clinical Chemistry 28: 1894-1898（1982）を参照。この分析器は、蛍光信号の変化速度を測定する。一般に、トロポニンＩ等のような分析対照に対する抗体が、ガラス繊維濾紙よりなる固相に前固定される。トロポニンＩでは、各トロポニンＩ溶液の部分量が抗体に適用され、抗体へ免疫学的に結合して反応区域を形成する。次に、アルカリ性ホスファターゼ−抗トロポニンＩ抗体よりなる接合体がこの反応区域に加えられる。この接合体は、トロポニンＩに結合する。４−メチル−ウンベリフェリルホスフェートを含有する基質洗浄液が反応区域に加えられる。前面蛍光光度計が、ミリボルト／分（ｍｖｍ）として指定された速度単位で蛍光の変化速度を測定する。
評価の結果は図２に見ることができる。図２に見ることができるように、本発明のマトリックスは、正常ヒト血清（ＮＨＳ）、処理ヒト血漿（ＰＨＰ）又は血漿に比してトロポニンＩ分析対照に対する一層の安定性を提供した。
実施例６
合成ペプチドを用いた較正標準の調製
約０乃至50ｎｇ／ｍＬの範囲のトロポニンＩ濃度を有する較正標準又は対照を作るのに十分な量のペプチドを加えることによって、ポリプロピレンの実験器具内でトロポニンＩの合成ペプチドの原液を調製する。
ある実験においては、原液濃度（精製水中）1.4ｍｇ／ｍＬの配列
0003740644.tif 000004
を有するトロポニンＩの合成ペプチドを、次のマトリックス：
正常ヒト血清、血漿、処理ヒト血漿、合成マトリックス（ｐＨ7.6、100ｍＭトリス、150ｍＭ塩化ナトリウム、0.1％ゼラチン、２％ＢＳＡ、0.1％アジ化ナトリウム及び0.1％Ｚｏｎｙｌ蛍光界面活性剤（ＤＸＭＣ）を含有する。）、及び実施例１に記載したのと同様のマトリックス
に、各マトリックス中50ｎｇ／ｍＬのトロポニンＩ溶液及び10ｎｇ／ｍＬトロポニンＩ溶液を提供するに十分な量で加えることによって調製した。
これら４種のトロポニンＩ溶液の各々の部分量を、２〜８℃にて貯蔵し、安定性につき評価した。評価の各日に、各トロポニンＩ溶液の部分量をStratus II Fluorometric Analyzerによって分析した。Stratus II Fluorometric Analyzerは、Dade International Inc.によって販売されている。この分析器の及びイムノアッセイの作動原理については、例えば、参照によりここに導入する米国特許第4,517,288及びGiegle et al, Clinical Chemistry 28: 1894-1898（1982）を参照。この分析器は、蛍光信号の変化速度を測定する。一般に、トロポニンＩ等のような分析対照に対する抗体が、ガラス繊維濾紙よりなる固相に前固定される。トロポニンＩでは、各トロポニンＩ溶液の部分量が抗体に適用され、抗体へ免疫学的に結合して反応区域を形成する。次に、アルカリ性ホスファターゼ−抗トロポニンＩ抗体よりなる接合体がこの反応区域に加えられる。この接合体は、トロポニンＩに結合する。４−メチル−ウンベリフェリルホスフェートを含有する基質洗浄液が反応区域に加えられる。前面蛍光光度計が、ミリボルト／分（ｍｖｍ）として指定された速度単位で蛍光の変化速度を測定する。
評価の結果は図３及び４に見ることができる。図３及び４に見ることができるように、本発明のマトリックスは、正常ヒト血清、処理ヒト血漿（ＰＨＰ）、合成塩基ＤＸＭＣに比してトロポニンＩ分析対照類縁体に対する一層の安定性を提供した。
実施例７
合成ペプチドを用いた較正標準の調製
約０乃至100ｎｇ／ｍＬの範囲のトロポニンＩ濃度を有する較正標準又は対照を与えるに十分な量のペプチドを加えることによって、ポリプロピレンの実験器具内においてトロポニンＩの合成ペプチドの原液を調製する。
ある実験においては、40μｇ／ｍＬのトロポニンＩ溶液が、配列：
0003740644.tif 000005
を有するトロポニンＩ配列を、次のマトリックス：  正常ヒト血清、血漿、及び実施例１に記載したのと（マトリックスのｐＨを5.5に調製したことを除き）同様のマトリックス
に、各マトリックス中3.0ｍＬの100ｎｇ／ｍＬのトロポニンＩ溶液を与えるに十分な量で加えることによって、調製された。加えて、約3.5ｍｇ／ｍＬの濃度でＥＤＴＡが各マトリックスに加えられた。
第２の組の溶液を、溶液が、680ｎｇ／ｍＬのペプスタチン（PEPSTATIN）及び208μｇ／ｍＬのフッ化アミノエチルベンゼンスルホニルよりなるプロテアーゼ阻害剤カクテルをも含むことを除いて、上記と同様にして調製した。
これら６種のトロポニンＩの部分量を37℃に貯蔵し、安定性につき評価した。評価の各日に、各トロポニンＩ溶液の部分量をStratus II Fluorometric Analyzerによって分析した。Stratus II Fluorometric Analyzerは、Dade International Inc.によって販売されている。この分析器の及びイムノアッセイの作動原理については、例えば、参照によりここに導入する米国特許第4,517,288及びGiegle et al, Clinical Chemistry 28: 1894-1898（1982）を参照。この分析器は、蛍光信号の変化速度を測定する。一般に、トロポニンＩ等のような分析対照に対する抗体が、ガラス繊維濾紙よりなる固相に前固定される。トロポニンＩでは、各トロポニンＩ溶液の部分量が抗体に適用され、抗体へ免疫学的に結合して反応区域を形成する。次に、アルカリ性ホスファターゼ−抗トロポニンＩ抗体よりなる接合体がこの反応区域に加えられる。この接合体は、トロポニンＩに結合する。４−メチル−ウンベリフェリルホスフェートを含有する基質洗浄液が反応区域に加えられる。前面蛍光光度計が、ミリボルト／分（ｍｖｍ）として指定された速度単位で蛍光の変化速度を測定する。
評価の結果は図５及び６に見ることができる。図５及び６に見ることができるように、本発明のマトリックスは、プロテアーゼ阻害剤を含む又は含まない正常ヒト血清、又は血漿に比してトロポニンＩ分析対照類縁体に対する一層の安定性を提供した。
実施例８
トロポニンＩ較正標準及び対照を用いたイムノアッセイの実施
約０乃至50ｎｇ／ｍＬの範囲のトロポニンＩ濃度を有する較正標準又は対照を与えるに十分な量のペプチドを加えることにより、ポリプロピレンの実験器具内において、トロポニンＩの合成ペプチドの原液を調製する。
ある実施例においては、1.4ｍｇ／ｍＬの原液濃度の配列：
0003740644.tif 000006
を有するトロポニンＩの合成ペプチドを、実施例１に記載したのと同様のマトリックスに、次の濃度を有するトロポニンＩ較正標準溶液を製造するに十分な量で加えることによって、調製した：
０ｎｇ／ｍＬ、２ｎｇ／ｍＬ、８ｎｇ／ｍＬ、15ｎｇ／ｍＬ、25ｎｇ／ｍＬ、及び50ｎｇ／ｍＬ。
対照は、同様にして、約４ｎｇ／ｍＬ、20ｎｇ／ｍＬ及び35ｎｇ／ｍＬの対照溶液を与えるように調製した。
各トロポニンＩ溶液の部分量を凍結貯蔵した。凍結した溶液を融解させ、そして較正曲線を作った。上に論じたようにして調製した対照及び正常ヒト血漿から調製した対照もまた評価した。正常ヒト血清対照は、低対照については2.1〜2.9ｎｇ／ｍＬ、そして高対照については15.9〜21.5であった。各トロポニンＩ溶液の各々について２つのサンプルをStratus II Fluorometric Analyzerによって分析し、そして較正曲線を作った。Stratus II Fluorometric Analyzerは、Dade International Inc.によって販売されている。この分析器の及びイムノアッセイの作動原理については、例えば、参照によりここに導入する米国特許第4,517,288及びGiegle et al, Clinical Chemistry 28: 1894-1898（1982）を参照。この分析器は、蛍光信号の変化速度を測定する。一般に、トロポニンＩ等のような分析対照に対する抗体が、ガラス繊維濾紙よりなる固相に前固定される。トロポニンＩでは、各トロポニンＩ溶液の部分量が抗体に適用され、抗体へ免疫学的に結合して反応区域を形成する。次に、アルカリ性ホスファターゼ−抗トロポニンＩ抗体よりなる接合体がこの反応区域に加えられる。この接合体は、トロポニンＩに結合する。４−メチル−ウンベリフェリルホスフェートを含有する基質洗浄液が反応区域に加えられる。前面蛍光光度計が、ミリボルト／分（ｍｖｍ）として指定された速度単位で蛍光の変化速度を測定する。
ミリボルト／分（ｍｖｍ）で表した較正の結果を、表１に見ることができ、そして較正曲線は図６に示されている。
0003740644.tif 000007
0003740644.tif 000008
実施例９
ＣＫ−ＭＢ較正標準／対照の調製
約０乃至125ｎｇ／ｍＬの範囲のＣＫ−ＭＢ濃度を有する較正標準又は対照を与えるのに十分な量のＣＫ−ＭＢを加えることによって、ＣＫ−ＭＢの原液を調製する。
次の濃度：  ０、４、10、25、60及び125ｎｇ／ｍＬを有するＣＫ−ＭＢの較正溶液を与えるのに十分な量のＣＫ−ＭＢを、実施例１に記載されたのと同様のマトリックスに加えることによって、ＣＫ−ＭＢの溶液を調製する。対照を、同様の仕方で調製する。
実施例１０
トロポニンＴ較正標準／対照の調製
約０乃至12ｎｇ／ｍＬの範囲のトロポニンＴ濃度を有する較正標準又は対照を与えるに十分な量のトロポニンＴを加えることによって、トロポニンＴの原液を調製する。
次の濃度：  ０、１、２、４、８及び12ｎｇ／ｍＬを有するトロポニンＴの較正標準溶液を与えるに十分な量のトロポニンＴを、実施例１に記載されたのと同様のマトリックスに加えることによって、トロポニンＴの溶液を調製する。対照を、同様の仕方で調製する。
実施例１１
４℃における較正標準の安定性
実施例６において調製された較正標準と同様にして調製された較正標準の安定性を決定するために試験を行った。イムノアッセイキット（較正標準を含む）を調製し、約４℃にて貯蔵し、Stratus II Fluorometric Analyzerによって評価した。対照及び患者プール（共に−70℃に貯蔵され使用前に新たに解凍した）が予測される範囲で回収されるか否かを決定するために、評価の各日に、未開封の較正標準及び対照及び患者プールを用いて較正曲線を作った。対照及び患者プールの範囲は、各対照レベル及び患者プールの少なくとも80の複製を得ることによって予め確立してあった。対照限度は、＋／−２標準偏差又は平均の15％のうちの大きい方とした。アッセイ要素の全て、従って較正標準は、対照及び患者プールの各々について２つの測定が12％以内であり且つこれら２つの測定の平均が計算された範囲内に入るならば、許容し得ると決定された。アッセイキット、従って較正標準は、少なくとも60日間は許容し得ることが見出された。同様にして実施した第２の試験がこの結果を確認した。
25℃における較正標準の安定性
キット試薬が４℃ではなく25℃にて貯蔵されたことを除き、実施例１１に記載したのと同様にして２つの試験を実施した。キット、従って較正標準は、少なくとも７〜14日間は安定であることが見出された。
実施例１３
２乃至８℃／−70℃における較正標準の安定性
２ｎｇ／ｍＬ及び25ｎｇ／ｍＬの較正標準が70℃でも貯蔵されたことを除き、実施例１１に記載したのと同様にして試験を実施した。凍結した較正標準からの回収が測定され、４℃で貯蔵された較正標準と比較された。２〜８℃／−70℃の比率が求められた。−70℃における較正標準は、少なくとも60日間安定であることが見出された。同様にして実施した第２の試験は、この結果を確認した。
別の試験において、−70℃にて貯蔵された較正標準から作られた較正曲線に対して患者プール（上記実施例１１に記載したのと同様にして貯蔵され使用され、やはり実施例１１に記載した回収範囲を有する）の回収を測定した。較正標準は、少なくとも100日間安定であることが見出された。
配列表
（２）配列番号１の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：  ２１０
（Ｂ）型：  アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：  一本鎖
（Ｄ）トポロジー：  直鎖状
（ｉｉ）分子の種類：
（Ａ）記述：
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：  ｎｏ
（ｉｖ）アンチセンス：  ｎｏ
（ｖ）フラグメント型：
（ｖｉ）起源：
（Ａ）生物名：
（Ｂ）株名：
（Ｃ）固体・単離クローン名：
（ｖｉｉ）直接の起源：
（Ａ）ライブラリー名：
（Ｂ）クローン名：
（ｖｉｉｉ）ゲノム内での位置：
（Ａ）染色体／セグメント名
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）名／記号：
（ｘ）公表情報：
（Ａ）著者：  Vallins W.J. et al.
（Ｂ）表題：  Molecular Cloning of Human Cardiac Troponin I Using Polymerase Chain Reaction
（Ｃ）雑誌名：  FEBS LETTERS
（Ｄ）巻数：  270
（Ｅ）号：  １，２
（Ｆ）頁：  57〜61
（Ｇ）日付：  1990年９月
（ｘｉ）配列：  配列番号１
0003740644.tif 000009
（２）配列番号２の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：  ８０
（Ｂ）型：  アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：  一本鎖
（Ｄ）トポロジー：  直鎖状
（ｉｉ）分子の種類：
（Ａ）記述：
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：  ｎｏ
（ｉｖ）アンチセンス：  ｎｏ
（ｖ）フラグメント型：
（ｖｉ）起源：
（Ａ）生物名：
（Ｂ）株名：
（Ｃ）固体・単離クローン名：
（ｖｉｉ）直接の起源：
（Ａ）ライブラリー名：
（Ｂ）クローン名：
（ｖｉｉｉ）ゲノム内での位置：
（Ａ）染色体／セグメント名
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）名／記号：
（ｘ）公表情報：
（Ａ）著者：  Vallins W.J. et al.
（Ｂ）表題：  Molecular Cloning of Human Cardiac Troponin I Using Polymerase Chain Reaction
（Ｃ）雑誌名：  FEBS LETTERS
（Ｄ）巻数：  270
（Ｅ）号：  １，２
（Ｆ）頁：  57〜61
（Ｇ）日付：  1990年９月
（ｘｉ）配列：  配列番号２
0003740644.tif 000010
（２）配列番号３の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：  ３５
（Ｂ）型：  アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：  一本鎖
（Ｄ）トポロジー：  直鎖状
（ｉｉ）分子の種類：
（Ａ）記述：
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：  ｎｏ
（ｉｖ）アンチセンス：  ｎｏ
（ｖ）フラグメント型：
（ｖｉ）起源：
（Ａ）生物名：
（Ｂ）株名：
（Ｃ）固体・単離クローン名：
（ｖｉｉ）直接の起源：
（Ａ）ライブラリー名：
（Ｂ）クローン名：
（ｖｉｉｉ）ゲノム内での位置：
（Ａ）染色体／セグメント名
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）名／記号：
（ｘ）公表情報：
（Ａ）著者：
（Ｂ）表題：
（Ｃ）雑誌名：
（Ｄ）巻数：
（Ｅ）号：
（Ｆ）頁：
（Ｇ）日付：
（ｘｉ）配列：  配列番号３
0003740644.tif 000011
（２）配列番号４の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：  ３５
（Ｂ）型：  アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：  一本鎖
（Ｄ）トポロジー：  直鎖状
（ｉｉ）分子の種類：
（Ａ）記述：
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：  ｎｏ
（ｉｖ）アンチセンス：  ｎｏ
（ｖ）フラグメント型：
（ｖｉ）起源：
（Ａ）生物名：
（Ｂ）株名：
（Ｃ）固体・単離クローン名：
（ｖｉｉ）直接の起源：
（Ａ）ライブラリー名：
（Ｂ）クローン名：
（ｖｉｉｉ）ゲノム内での位置：
（Ａ）染色体／セグメント名
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）名／記号：
（ｘ）公表情報：
（Ａ）著者：
（Ｂ）表題：
（Ｃ）雑誌名：
（Ｄ）巻数：
（Ｅ）号：
（Ｆ）頁：
（Ｇ）日付：
（ｘｉ）配列：  配列番号４
0003740644.tif 000012
（２）配列番号５の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：  ３５
（Ｂ）型：  アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：  一本鎖
（Ｄ）トポロジー：  直鎖状
（ｉｉ）分子の種類：
（Ａ）記述：
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：  ｎｏ
（ｉｖ）アンチセンス：  ｎｏ
（ｖ）フラグメント型：
（ｖｉ）起源：
（Ａ）生物名：
（Ｂ）株名：
（Ｃ）固体・単離クローン名：
（ｖｉｉ）直接の起源：
（Ａ）ライブラリー名：
（Ｂ）クローン名：
（ｖｉｉｉ）ゲノム内での位置：
（Ａ）染色体／セグメント名
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）名／記号：
（ｘ）公表情報：
（Ａ）著者：
（Ｂ）表題：
（Ｃ）雑誌名：
（Ｄ）巻数：
（Ｅ）号：
（Ｆ）頁：
（Ｇ）日付：
（ｘｉ）配列：  配列番号５
0003740644.tif 000013
（２）配列番号６の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：  ３５
（Ｂ）型：  アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：  一本鎖
（Ｄ）トポロジー：  直鎖状
（ｉｉ）分子の種類：
（Ａ）記述：
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：  ｎｏ
（ｉｖ）アンチセンス：  ｎｏ
（ｖ）フラグメント型：
（ｖｉ）起源：
（Ａ）生物名：
（Ｂ）株名：
（Ｃ）固体・単離クローン名：
（ｖｉｉ）直接の起源：
（Ａ）ライブラリー名：
（Ｂ）クローン名：
（ｖｉｉｉ）ゲノム内での位置：
（Ａ）染色体／セグメント名
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）名／記号：
（ｘ）公表情報：
（Ａ）著者：
（Ｂ）表題：
（Ｃ）雑誌名：
（Ｄ）巻数：
（Ｅ）号：
（Ｆ）頁：
（Ｇ）日付：
（ｘｉ）配列：  配列番号６
0003740644.tif 000014
（２）配列番号７の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：  ８０
（Ｂ）型：  アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：  一本鎖
（Ｄ）トポロジー：  直鎖状
（ｉｉ）分子の種類：
（Ａ）記述：
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：  ｎｏ
（ｉｖ）アンチセンス：  ｎｏ
（ｖ）フラグメント型：
（ｖｉ）起源：
（Ａ）生物名：
（Ｂ）株名：
（Ｃ）固体・単離クローン名：
（ｖｉｉ）直接の起源：
（Ａ）ライブラリー名：
（Ｂ）クローン名：
（ｖｉｉｉ）ゲノム内での位置：
（Ａ）染色体／セグメント名
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）名／記号：
（ｘ）公表情報：
（Ａ）著者：
（Ｂ）表題：
（Ｃ）雑誌名：
（Ｄ）巻数：
（Ｅ）号：
（Ｆ）頁：
（Ｇ）日付：
（ｘｉ）配列：  配列番号７
0003740644.tif 000015
【図１】
0003740644.tif 000016
【図２】
0003740644.tif 000017
【図３】
0003740644.tif 000018
【図４】
0003740644.tif 000019
【図５】
0003740644.tif 000020
【図６】
0003740644.tif 000021
【図７】
0003740644.tif 000022