(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号４の「デス・ドメイン」配列を有するＮＧＦ−Ｒ、配列番号５の「デス・ドメイン」配列を有するＭＯＲＴ−１および配列番号２の「デス・ドメイン」配列を有するアンキリン１からなる群より選ばれた「デス・ドメイン」を含有する調節タンパク質の「デス・ドメイン」に特異的な抗体。
【請求項２】
前記抗体が、１つより多くの前記「デス・ドメイン」を含有する調節タンパク質の「デス・ドメイン」に結合しうる請求項１記載の抗体。
【請求項３】
１つの前記「デス・ドメイン」を含有する調節タンパク質の「デス・ドメイン」に特異的な抗体のフラグメントからなり、該フラグメントが前記「デス・ドメイン」に結合可能な請求項１記載の抗体。
【請求項４】
１つより多くの前記「デス・ドメイン」を含有する調節タンパク質の「デス・ドメイン」に特異的な抗体のフラグメントからなり、該フラグメントが１つより多くの前記「デス・ドメイン」を含有する調節タンパク質の前記「デス・ドメイン」に結合可能な請求項２記載の抗体。
【請求項５】
抗体が、モノクローナル抗体からなる請求項１記載の抗体。
【請求項６】
抗体が、モノクローナル抗体からなる請求項２記載の抗体。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、タンパク質の細胞内ドメイン内に含まれる調節エレメント（ｅｌｅｍｅｎｔ）（ドメインまたはモチーフ）により媒介される細胞内ジグナリングプロセスにより効果を及ぼす調節タンパク質の分野に一般的に関する。さらに詳しくは、本発明は、広い範囲の関連タンパク質および関連しないタンパク質、たとえば、ｐ５５  ＴＮＦ−Ｒ、ＦＡＳ−Ｒ、ＮＧＦ−ＲのようなＴＮＦ／ＮＧＦファミリーの受容体類、関連タンパク質ＭＯＲＴ−１、ＴＲＡＤＤやＲＩＰとして既知のタンパク質類ならびに関連しないタンパク質アンキリン１、に存在する新規に発見された「デス・ドメイン」モチーフと相互作用するかまたは結合することのできるタンパク質、ペプチド、抗体またはその類似体もしくはフラグメント、ならびに有機化合物である新規なモジュレーターに関する。これらの新規なモジュレーターは、「デス・ドメイン」モチーフを含むタンパク質の活性をモジュレートまたは調節することができる。
背景技術
タンパク質内に含まれる調節部位またはモチーフにより媒介される細胞内ジグナリングプロセスの方法で細胞に調節効果を及ぼす、きわめて大きなグループの調節タンパク質類がある。このグループのタンパク質類のメンバーは、たとえばｐ５５およびｐ７５  ＴＮＦ受容体類（ｐ５５およびｐ７５  ＴＮＦ−Ｒｓ）、ＮＧＦ受容体（ＮＧＦ−Ｒ）およびＦａｓ／ＡＰＯ１タンパク質（Ｆａｓ−リガンド受容体またはＦＡＳ−Ｒともいい、以下、ＦＡＳ−Ｒという）のようなＴＮＦ／ＮＧＦファミリーの受容体に属する受容体を含み、これらの受容体は、細胞外リガンド−結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内（ＩＣ）ドメイン、その細胞内ドメインまたはその部位は細胞外ドメインへリガンドが結合することにより開始する細胞内シグナリングの出来事の媒介に関与する、を有することにより特徴付けられる。このグループのほかのメンバーとしては、様々な細胞内タンパク質、たとえばこれらのタンパク質がほかの細胞骨格タンパク質、たとえばスペクトリン、またはほかの膜貫通タンパク質に関連するかまたは結合する能力におそらく関与する調節ドメインを有する、細胞骨格関連構造タンパク質、アンキリンがあげられる。このグループのさらなるほかのメンバーは最近同定されたＭＯＲＴ１タンパク質（ＨＦ１ともいい、共に係属中のＩＬ  １１２００２およびＩＬ  １１２６９２を参照）であり、それはＦＡＳ−Ｒの細胞内ドメインに特異的に結合することができ、また自己会合および、リガンド−非依存の方法（ｍａｎｎｅｒ）で細胞への細胞傷害性効果を媒介することもできる。ＭＯＲＴ−１では、調節ドメインもまた同定された（ＩＬ  １１２６９２参照）。
腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）およびリンホトキシン（ＴＮＦ−β）（以下、ＴＮＦはＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−βの両者を意味する）は、単核食細胞によっておもに形成される多機能な前炎症性（ｐｒｏ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）サイトカイン類であり、細胞に多大な影響を及ぼす（Ｗａｌｌａｃｈ，Ｄ．（１９８６）ｉｎ：Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ７（Ｉｏｎ  Ｇｒｅｓｓｅｒ，ｅｄ．），ｐｐ．８３−１２２，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ；ａｎｄ  Ｂｅｕｔｌｅｒ  ａｎｄ  Ｃｅｒａｍｉ（１９８７））。ＴＮＦ−αとＴＮＦ−βの両者は、特定の細胞表面受容体類に結合することによってそれらの効果を開始する。その効果のうちのいくつかは生物にとって利益になるようである。たとえば、それらは腫瘍細胞またはウイルス感染した細胞を破壊するかもしれず、顆粒球の抗菌活性を増大させるかもしれない。このように、腫瘍や感染源に対する生物の防御にＴＮＦは寄与し、かつ損傷からの回復に寄与する。ＴＮＦは抗腫瘍剤として用いることができ、その適用の際にはＴＮＦが腫瘍細胞の表面のその受容体に結合し、それによって腫瘍細胞を死へと導く出来事が始まる。ＴＮＦは抗感染薬としても用いることができる。
しかしながら、ＴＮＦ−αとＴＮＦ−βの両者は有害な効果も有する。過剰に産生されたＴＮＦ−αは数種の疾患において主たる病原の役割をすることがありうる、という証拠がある。さらに、ＴＮＦ−αの効果、主として血管系に対する効果は敗血症性ショック症状の主たる原因である、と現在のところ知られている（Ｔｒａｃｅｙ  ｅｔ  ａｌ.，１９８６）。いくつかの疾患では、ＴＮＦは脂肪細胞の活性を抑制することおよび食欲不振を引き起こすことにより体重の過剰損欠（悪液質）を引き起こすかもしれず、そのためにＴＮＦ−αはカケクチンと呼ばれていた。ＴＮＦはリウマチ様疾患においては組織に対する損傷のメディエーターとして（Ｂｅｕｔｌｅｒ  ａｎｄ  Ｃｅｒａｍｉ，１９８７）、移殖片対宿主反応においては観察される損傷の主たるメディエーターとして（Ｐｉｑｕｅｔ  ｅｔ  ａｌ.，１９８７）も記載されていた。さらに、ＴＮＦは炎症の過程およびほかの多くの疾患と関係することが知られている。
２種の明らかに独立して発現される受容体、ｐ５５およびｐ７５  ＴＮＦ−Ｒｓは、ＴＮＦ−αとＴＮＦ−βの両者と特異的に結合し、前述のＴＮＦの生物学的効果を開始および／または媒介する。これらの２種の受容体は構造的に似ていない細胞内ドメインを有するが、それはそれらが異なるシグナリングをすることを示唆している（Ｈｏｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ.，１９８９；Ｅｎｇｅｌｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ.，１９９０；Ｂｒｏｃｋｈａｕｓ  ｅｔ  ａｌ.，１９９０；Ｌｏｅｔｓｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ.，１９９０；Ｓｃｈａｌｌ  ｅｔ  ａｌ.，１９９０；Ｎｏｐｈａｒ  ｅｔ  ａｌ.，１９９０；Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ.，１９９０；ａｎｄ  Ｈｅｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ.，１９９０参照）。しかしながら、細胞のメカニズム、たとえばｐ５５およびｐ７５  ＴＮＦ−Ｒｓの細胞内シグナリングに関係する様々なタンパク質やおそらくはほかの因子類は、まだ今のところ解明されていない（ＩＬ  １０９６３２に、ｐ５５およびｐ７５  ＴＮＦ−Ｒｓの細胞内ドメインに結合しうる新規なタンパク質が初めて記載されている。これらの細胞内ドメインはそれぞれｐ７５ＩＣおよびｐ５５ＩＣ、と称する）。リガンド、すなわちＴＮＦ（αまたはβ）が受容体に結合したのちに通常生じることがこの細胞内シグナリングである。それは反応のカスケードの開始に関与し、その結果ＴＮＦに対して観察される細胞の応答が生ずる。
前述のＴＮＦの細胞致死性効果に関しては、これまでに研究されたたいていの細胞ではこの効果はｐ５５  ＴＮＦ−Ｒによっておもに引き起こされる。ｐ５５  ＴＮＦ−Ｒの細胞外ドメイン（リガンド結合ドメイン）に対する抗体は、それら自身が細胞致死性効果を引き起こすことができ（ＥＰ  ４１２４８６参照）、その効果はこれらの抗体による受容体の架橋の有効性と関係するが、細胞内シグナリングプロセスの発生の第１段階であると信じられている。さらに、突然変異の研究（Ｂｒａｋｅｂｕｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ.，１９９２；Ｔａｒｔａｇｌｉａ  ｅｔ  ａｌ.，１９９３）によれば、ｐ５５  ＴＮＦ−Ｒの生物学的機能はその細胞内ドメインの完全さに依存することが示されており、したがって、ＴＮＦの細胞致死性効果を導く細胞内シグナリングの開始は、ｐ５５  ＴＮＦ−Ｒの２またはそれより多くの細胞内ドメインの会合の結果として生ずる、ということが示唆されている。さらには、ＴＮＦ（αおよびβ）はホモトリマーとして存在し、受容体分子に対するその結合能および架橋能、すなわち受容体の凝集を生じさせる能力によって、ｐ５５  ＴＮＦ−Ｒを介する細胞内シグナリングを誘導すると示唆される。共に係属中のＩＬ  １０９６３２およびＩＬ  １１１１２５には、ｐ５５ＩＣとｐ５５ＤＤがいかにして自己会合し、リガンドに依存した様式でＴＮＦに関連した効果を細胞内に誘導することができるかについて記載されている。
ＴＮＦ／ＮＧＦ受容体スーパーファミリーのほかのメンバーは、Ｆａｓ抗原とも言われ、様々な組織に発現される細胞表面タンパク質であり、そしてＴＮＦ−ＲおよびＮＧＦ−Ｒを含む多数の細胞表面受容体と相同性を共有するＦＡＳ受容体（ＦＡＳ−Ｒ）である。ＦＡＳ−Ｒはアポトーシスの形態で細胞死を媒介し（Ｉｔｏｈ  ｅｔ  ａｌ.，１９９１）、自己反応性Ｔ細胞のネガティブセレクターとして働く、すなわちＴ細胞の成熟の間にＦＡＳ−Ｒは自己抗原を認識するＴ細胞のアポトーシスによる死（ａｐｏｐｔｏｐｉｃ  ｄｅａｔｈ）を媒介するようである。また、ＦＡＳ−Ｒ遺伝子（ｌｐｒ）の突然変異により、ヒト自己免疫疾患全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）に似ているマウスのリンパ球分裂疾患が生ずるということも見出されている（Ｗａｔａｎａｂｅ−Ｆｕｋｕｎａｇａ  ｅｔ  ａｌ.，１９９２）。ＦＡＳ−Ｒのリガンドは数ある中でもキラーＴ細胞（または細胞傷害性Ｔリンパ球−ＣＴＬｓ）によって担持される細胞表面関連分子であると考えられており、したがって、前記ＣＴＬｓがＦＡＳ−Ｒを担持する細胞に接触すると、それらはＦＡＳ−Ｒを担持する細胞のアポトーシスによる細胞死を誘導することができる。さらに、ＦＡＳ−Ｒに特異的なモノクローナル抗体が作製されたが、このモノクローナル抗体は、ヒトＦＡＳ−ＲをコードするｃＤＮＡによって形質転換されたマウス細胞を含む、ＦＡＳ−Ｒ担持細胞のアポトーシスによる細胞死を誘導することが可能である（Ｉｔｏｈ  ｅｔ  ａｌ.，１９９１）。
Ｔリンパ球のほかに様々のほかの正常細胞がそれらの表面にＦＡＳ−Ｒを発現しており、この受容体をトリガーすることにより殺されることが可能であることも見出されている。このような傷害プロセスが制御されずに誘導されることは、ある疾患における組織損傷、たとえば急性肝炎における肝細胞の破壊、の原因となるのではないかと疑われている。したがって、ＦＡＳ−Ｒの細胞傷害性活性を抑制する方法を見出すことによって治療が可能になるかもしれない。
反対に、ある悪性細胞およびＨＩＶ感染細胞がそれらの表面にＦＡＳ−Ｒを担持することも見出されているので、ＦＡＳ−Ｒを介する細胞傷害性効果をこれらに引き起こすためにＦＡＳ−Ｒに対する抗体またはＦＡＳ−Ｒリガンドが用いられてもよく、それによってそのような悪性細胞やＨＩＶ感染細胞と戦う手段が提供されてもよい（Ｉｔｏｈ  ｅｔ  ａｌ.，１９９１参照）。したがって、ＦＡＳ−Ｒの細胞傷害性活性を増大するためのほかの方法を見出すことにより、さらに治療が可能になるかもしれない。
共に係属中のＩＬ  １０９６３２、ＩＬ  １１１１２５およびＩＬ  １１２００２には、ＦＡＳ−Ｒの細胞内ドメイン、いわゆるＦＡＳ−ＩＣは自己会合することができ、かつこの細胞内ドメイン内にＦＡＳ−ＩＣの自己会合に主として関与する「デス・ドメイン］（ＤＤ）と称する領域を含むことが記載されている。この「デス・ドメイン」はｐ５５  ＴＮＦ−Ｒ「デス・ドメイン」（ｐ５５ＤＤ）と相同な配列を共有する。
ＴＮＦ（αまたはβ）およびＦＡＳ−Ｒリガンドに対する細胞の応答、たとえば前述の病理学的な状態における細胞の応答をモジュレートする方法を提供することは長い間必要であると考えられている。ＴＮＦまたはＦＡＳ−Ｒリガンドが過剰に発現されているばあいは、ＴＮＦまたはＦＡＳ−Ｒリガンドによって誘導される細胞致死性効果を抑制することが望まれ、一方ほかの状態、たとえば創傷を治癒させたいばあいは、ＴＮＦ効果を増大することが望ましく、腫瘍細胞またはＨＩＶ感染細胞におけるＦＡＳ−Ｒのばあいは、ＦＡＳ−Ｒが媒介する効果を増大することが望ましい。
細胞表面に結合しているＴＮＦ−ＲｓへのＴＮＦの結合と競合させるために、抗ＴＮＦ抗体または可溶性ＴＮＦ受容体（本質的には受容体の可溶性細胞外ドメインである）を用いてＴＮＦのその受容体に対する結合を抑制し、ＴＮＦの有害な効果を調節するよう、多くのアプローチが本発明者らによって行なわれている（たとえば、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏｓ．ＥＰ  １８６８３３、ＥＰ  ３０８３７８、ＥＰ  ３９８３２７およびＥＰ  ４１２４８６参照）。さらに、ＴＮＦによって誘導される細胞の効果のためにはＴＮＦがその受容体に結合することが必要であるということにもとづいて、本発明者らによるアプローチ（たとえばＩＬ  １０１７６９およびその対応ＥＰ  ５６８９２５参照）は、ＴＮＦ−Ｒｓの活性をモジュレートすることによりＴＮＦ効果をモジュレートするよう行なわれている。要するに、ＥＰ  ５６８９２５（ＩＬ  １０１７６９）はＴＮＦ−Ｒｓにおけるシグナル伝達および／または切断（ｃｌｅａｖａｇｅ）をモジュレートする方法に関し、その方法によればペプチドまたはほかの分子が受容体それ自身またはその受容体と相互に作用するエフェクタータンパク質のいずれかと相互に作用してＴＮＦ−Ｒｓの正常な機能をモジュレートする。ＥＰ  ５６８９２５にはｐ５５ＴＮＦ−Ｒの細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインに変異を有する様々なｐ５５ＴＮＦ−Ｒｓの変異体の構築および特徴付けが記載されている。ここではｐ５５  ＴＮＦ−Ｒの前記ドメイン内の領域が受容体を機能させること、すなわちリガンド（ＴＮＦ）の結合およびそれに引き続くシグナル伝達ならびに細胞内シグナリング（これにより最終的に細胞にＴＮＦ効果が観察されることになる）、に不可欠であるとして同定された。さらに、ＴＮＦ−Ｒの前記ドメインの様々な領域に結合することのできるタンパク質、ペプチドまたはほかの因子（そのタンパク質、ペプチドおよびほかの因子はＴＮＦ−Ｒの活性を調節またはモジュレートに関係してもよい）を単離し、同定するための多くのアプローチも記載されている。そのようなタンパク質およびペプチドをコードするＤＮＡ配列を単離し、クローニングするための多くのアプローチ、これらのタンパク質およびペプチドの産生のための発現ベクターを構築するための多くのアプローチそしてＴＮＦ−ＲとまたはＴＮＦ−Ｒの様々の領域に結合する前記タンパク質およびペプチドと相互に作用する抗体またはそれらのフラグメントを作製するための多くのアプローチがＥＰ  ５６８９２５にも記載されている。しかしながら、ＥＰ  ５６８９２５にはＴＮＦ−Ｒｓ（たとえば、ｐ５５  ＴＮＦ−Ｒ）の細胞内ドメインに結合する実際のタンパク質およびペプチドの記載はなく、ＴＮＦ−Ｒｓの細胞内ドメインに結合するそのようなタンパク質またはペプチドを単離し、同定するための酵母ツーハイブリッドアプローチの記載も何らされていない。同様に、ＦＡＳ−Ｒ細胞内ドメインに結合することができるタンパク質またはペプチドについてはこれまでのところ開示されていない。
このように、ＴＮＦの効果またはＦＡＳ−Ｒリガンドの効果を阻害することが望まれているばあいは、細胞表面でのＴＮＦ−ＲｓかＦＡＳ−Ｒの量または活性を低下させることが望ましく、増大されたＴＮＦまたはＦＡＳ−Ｒリガンドの効果が求められるばあいは、ＴＮＦ−ＲｓまたはＦＡＳ−Ｒの量または活性を増大することが望ましい。これまでのところ、ｐ５５  ＴＮＦ−Ｒおよびｐ７５  ＴＮＦ−Ｒの両者のプロモーターが配列決定され、分析されて、様々な転写調節因子に特定のキー配列（ｋｅｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）モチーフが多数わかっている。そして、これらのＴＮＦ−Ｒｓの発現自体はそれらのプロモーターレベルで調節されることができる。すなわち受容体の数を減少させるためにはプロモーターからの転写を抑制し、受容体の数を増加させるためにはプロモーターからの転写を増大する（ＩＬ  １０４３５５およびＩＬ  １０９６３３参照）。これに対応する、ＦＡＳ−Ｒ遺伝子のプロモーターレベルでのＦＡＳ−Ｒの調節に関する研究は、これまでのところ報告されていない。
さらに、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体およびその構造的に関連する受容体ＦＡＳ−Ｒは、リンパ球が産生するリガンド類によって刺激されると、それら自身の活動停止を導く分解活性を細胞に引き起こすということは既知であるが、このトリガーのメカニズムは依然理解されていない、ということも記載しておくべきであろう。突然変異の研究によれば、ＦＡＳ−Ｒおよびｐ５５  ＴＮＦ受容体（ｐ５５−Ｒ）において細胞傷害性のためのシグナリングは、それらの細胞内ドメイン内の別々の領域に関係するということが示されている（Ｂｒａｋｅｂｕｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ.，１９９２；Ｔａｒｔａｇｌｉａ  ｅｔ  ａｌ.，１９９３；Ｉｔｏｈ  ａｎｄ  Ｎａｇａｔａ，１９９３）。これらの領域（「デス・ドメイン」）には配列に類似性がある。ＦＡＳ−Ｒおよびｐ５５−Ｒの両者の「デス・ドメイン」は自己会合をする傾向がある。それらの自己会合は、シグナリングの開始に必要な受容体の凝集を明らかに促進し（ＩＬ  １０９６３２、ＩＬ  １１１１２５およびＩＬ  １１２００２とともにＳｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ.，１９９４；Ｗａｌｌａｃｈ  ｅｔ  ａｌ.，１９９４；Ｂｏｌｄｉｎ  ｅｔ  ａｌ.，１９９５参照）、受容体の発現レベルが高いとリガンド−非依存性シグナリングを引き起こすことにもなりうる（ＩＬ  １０９６３２、ＩＬ  １１１１２５およびＢｏｌｄｉｎ  ｅｔ  ａｌ.，１９９５）。
アンキリンは内在性膜成分と細胞骨格のエレメント間の相互作用を制御し、脳組織のような広い範囲の組織および赤血球中に見られる一群のタンパク質を構成するものであり、赤血球アンキリンは最もよく特徴付けられているものである。アンキリンは、細胞の細胞骨格エレメントと関連する細胞内タンパク質であり、３つのドメイン：膜貫通タンパク質の細胞内ドメインとの結合に関係する上流の（ｕｐｐｅｒ）ドメイン、この上流のドメインは既知のリピート、いわゆるアンキリンリピートを含む；スペクトリンとの結合に関係する中流の（ｍｉｄｄｌｅ）ドメイン、すなわちアンキリンを介して膜貫通タンパク質へスペクトリンが結合する；およびリン酸化されうる調節ドメインであるＣ末端のドメインまたは下流の（ｌｏｗｅｒ）（または３番目の）ドメイン、このドメインはリン酸化または脱リン酸化されるとほかの２つのドメインの活性を調節する、を有する。この最後の調節ドメインは３つの部分：選択的スプライシングにより自然に欠失されうる中間部分（したがっていくつかのアンキリンにはこの部分があるが、そのほかのものにはない）；およびあまりよく特徴付けられていないほかの２つの部分（アンキリンについての総説は、Ｌｕｘ  ｅｔ  ａｌ.，１９９０およびＬａｍｂｅｒｔ  ａｎｄ  Ｂｅｎｎｅｔｔ，１９９３参照）、も有する。
しかしながら、以下に述べるように、前記アンキリンの調節（Ｃ末端）ドメインの上流部にいわゆる「デス・ドメイン」モチーフが含まれ、それはタンパク質の結合を媒介するよう機能することができる（最初の２つのアンキリンドメインの活性）かまたはアンキリンタンパク質を調節するよう立体配座的に機能することができる、ということが本発明にしたがって発見されたことは記載しておくべきであろう。
ＮＧＦ−Ｒはあまり特徴付けられていない低親和性のＮＧＦ受容体である。ＮＧＦ−Ｒは、ＮＧＦにより誘導される効果のための細胞内でのシグナリングに関与するかもしれないように、成長調節に関与すると考えられている。しかしながら、最近の刊行物は、ＮＧＦの不存在下でのＮＧＦ−Ｒの過剰発現は細胞死を引き起こしうる、と開示している。このように、ＮＧＦ−Ｒは細胞の生存率における調節の役割を有すると思われる（Ｒａｂｉｚａｄｅｈ  ｅｔ  ａｌ.，１９９３参照）。
しかしながら、以下に述べるように、ＮＧＦ−Ｒはその細胞内ドメインに「デス・ドメイン」を含み、それは細胞の生存率に関してＮＧＦ−Ｒが果たす調節の役割に関連した細胞内の出来事の媒介に関与しうる、ということが本発明にしたがって発見されたことは記載しておくべきであろう。
ＭＯＲＴ−１は、ＦＡＳ−Ｒの細胞内ドメインに結合し、自己会合することができかつそれ自身の細胞傷害性を活性化することができる、最近発見されたタンパク質である。このため、ＭＯＲＴ−１は細胞内シグナリングプロセスに関与する調節タンパク質でもある。ＭＯＲＴ−１は、その観察される生物学的活性に関連する「デス・ドメイン」モチーフを有することも発見された（共に係属中のＩＬ  １１２００２およびＩＬ  １１２６９２参照）。
ｐ５５  ＴＮＦ−ＲまたはＦＡＳ−Ｒの細胞内ドメインに結合し、それらの細胞致死性効果の誘導に明らかに係わる２つのさらなる細胞内タンパク質ＲＩＰ（Ｓｔａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ.，１９９５）およびＴＲＡＤＤ（Ｈｓｕ  ｅｔ  ａｌ.，１９９５）が最近クローン化された。３つのタンパク質、ＭＯＲＴ−１、ＲＩＰおよびＴＲＡＤＤのすべては、ｐ５５−ＴＮＦ−ＲとＦＡＳ−Ｒの各細胞内ドメインの「デス・ドメイン」間に共有される配列モチーフを含むことが見出された。それら受容体のばあいのように、この３つの細胞内タンパク質の「デス・ドメイン」モチーフ（ＤＤ）はタンパク質−タンパク質相互作用の部位のようである。３つのタンパク質は、ｐ５５−ＴＮＦ−ＲおよびＦＡＳ−Ｒ細胞内ドメインと、受容体のＤＤｓにそれらのＤＤｓが結合することにより相互作用する。ＴＲＡＤＤおよびＲＩＰ（ＭＯＲＴ−１ではないが）の両者においては各ＤＤｓは自己会合する。現在、ＭＯＲＴ−１およびＴＲＡＤＤはＦＡＳ−Ｒおよびｐ５５  ＴＮＦ−Ｒに異なって結合することが見出され、かつ互いに結合することも見出された。さらに、両者はＲＩＰへ効果的に結合する。
前記３つの細胞内タンパク質間の相互作用を干渉することは、この相互作用により引き起こされる効果をモジュレーションすることになるであろう。したがって、ＭＯＲＴ−１へのＴＲＡＤＤ結合の抑制はＦＡＳ−Ｒ−ｐ５５  ＴＮＦ−Ｒ相互作用をモジュレートするかもしれない。ＭＯＲＴ−１へのＴＲＡＤＤ結合の前記抑制に加えて、ＲＩＰの抑制はＦＡＳ−Ｒ−ｐ５５  ＴＮＦ−Ｒ相互作用をさらにモジュレートするかもしれない。
ｐ５５  ＴＮＦ−Ｒの「デス・ドメイン」に対するモノクローナル抗体、とくにはＴＲＡＤＤおよびＲＩＰの結合部位または部位群に対するモノクローナル抗体は、これらのタンパク質の結合を抑制するかまたは妨げるために用いることもでき、したがってＦＡＳ−Ｒとｐ５５  ＴＮＦ−Ｒの間の相互作用のモジュレーションを引き起こすこともできる。
ＴＮＦ／ＴＮＦ−ＲおよびＦＡＳ−リガンド／ＦＡＳ−Ｒに関して前述したことに類似して、前記タンパク質、すなわちアンキリン、ＮＧＦ−ＲおよびＭＯＲＴ−１の活性をモジュレートするための方法を提供すること、すなわち、それらの活性が有害な効果、たとえば細胞の細胞傷害性関連疾患／傷害または細胞形状における立体配座的変化、に関連するばあいは、それらの活性を抑制すること、またはそれらの活性を所望するばあい、たとえば疾患細胞の破壊が望まれるばあいには、それらの活性を高めることも必要である。
共に係属中の出願、ＩＬ  １０９６３２、ＩＬ  １１１１２５、ＩＬ  １１２００２およびＩＬ  １１２６９２では、ＴＮＦ／ＮＧＦ受容体ファミリーに属する受容体の活性のモジュレーションに関与するタンパク質が記載されており、これらのタンパク質は１またはそれより多くのこれらの受容体の細胞内ドメインと結合／関連することができることにより特徴付けられる。
本発明は、いわゆる「デス・ドメイン」モチーフを含有するタンパク質の細胞内ドメインにおける１またはそれより多くの「デス・ドメイン」モチーフと相互作用／結合することができる、タンパク質、ペプチド、抗体および有機化合物のようなモジュレーターに関する。「デス・ドメイン」モチーフを含有するタンパク質とは、関連するものたとえばＴＮＦ／ＮＧＦ受容体ファミリーのメンバーまたはそれに関係するタンパク質、たとえばＭＯＲＴ−１であり、また関係しないタンパク質、たとえばアンキリンである。これらのモジュレーターは、「デス・ドメイン」モチーフ含有タンパク質の「デス・ドメイン」モチーフに共通する概括的な構造の特徴を認識し、かつこれらのタンパク質のそれぞれに異なる「デス・ドメイン」モチーフに存在する特定の構造の特徴も認識することにより特徴付けられる。
したがって、前記のように、１またはそれより多くの「デス・ドメイン」モチーフ含有タンパク質の「デス・ドメイン」モチーフに結合するかまたは相互作用することができ、それによりこれらのタンパク質の活性をモジュレートすることができるモジュレーターを提供することは、本発明の１つの目的である。
本発明のほかの目的は、これらのモジュレーターの１つのクラスに対するアンタゴニスト（たとえば、抗体）、すなわち「デス・ドメイン」モチーフ含有タンパク質に結合する、自然に生じるタンパク質またはペプチドであり、その「デス・ドメイン」モチーフ結合タンパク質またはペプチドが陽性のシグナルエフェクター（すなわち、シグナリングを誘導する）であるばあいに、シグナリングプロセスを抑制したいならば用いられることができ、前記「デス・ドメイン」モチーフ結合タンパク質が陰性のシグナルエフェクター（すなわち、シグナリングを抑制する）であるばあいに、シグナリングプロセスを高めたいならば用いられることができる、アンタゴニストを提供することである
本発明のさらなるほかの目的は、たとえばシグナリングプロセスのさらに下流に関与するであろうさらなるタンパク質または因子を単離し、特徴付けるための、および／またはシグナリングプロセスのさらに上流のほかの受容体、この受容体にこれらの「デス・ドメイン」モチーフ結合タンパク質が結合し、このため、その受容体の機能にもこれらは関与する、を単離し、同定するために、そのような「デス・ドメイン」モチーフ結合タンパク質またはペプチドを使用することである。
さらに、前述の「デス・ドメイン」モチーフ結合タンパク質を、それらに対するポリクローナルおよび／またはモノクローナル抗体の作製のために抗原として使用することは本発明の目的である。同様に、その抗体が異なるソース、たとえば細胞抽出物または形質転換された細胞系から新しい「デス・ドメイン」モチーフ結合タンパク質を精製するために使用されてもよい。
さらに、これらの抗体は診断のために、たとえば「デス・ドメイン」モチーフ含有タンパク質のグループに属する様々なタンパク質により媒介される細胞の効果の異常な機能に関連する障害を同定するために使用されてもよい。
本発明のさらなる目的は、「デス・ドメイン」モチーフ含有タンパク質の活性に関連する状態の治療または予防のための、前記「デス・ドメイン」モチーフ結合モジュレーター（タンパク質、ペプチド、有機分子）からなる薬学的組成物、および「デス・ドメイン」モチーフ結合タンパク質アンタゴニストまたはペプチドアンタゴニストからなる薬学的組成物を提供することであり、前記組成物は、たとえば、ＴＮＦもしくはＦＡＳリガンド効果またはＮＧＦ−Ｒ、ＭＯＲＴ−１、ＲＩＰ、ＴＲＡＤＤおよびアンキリンにより媒介される効果を高めるため、またはＴＮＦもしくはＦＡＳリガンド効果または組成物に含まれる「デス・ドメイン」モチーフ結合モジュレーターまたはそのアンタゴニストの前記性質に依存することにより媒介される効果を抑制するために使用することができる。
本発明のなおさらなる目的は、様々な「デス・ドメイン」モチーフを含有するタンパク質のモジュレーターとなる相補的ペプチドおよび有機分子のデザインおよび合成のためにそれらタンパク質の様々な「デス・ドメイン」モチーフを使用することである。
発明の開示
本発明は、広い範囲のタンパク質、そのうちのいくつかは関連しているが、そのほかのものは関連していない、にいわゆる「デス・ドメイン」モチーフが存在するという驚くべき、かつ予期されなかった発見にもとづく。たとえば、この「デス・ドメイン」モチーフは互いに関連するｐ５５  ＴＮＦ−Ｒ、ＦＡＳ−Ｒ、ＮＧＦ−Ｒ、ＭＯＲＴ１、ＲＩＰおよびＴＲＡＤＤだけでなく、関連していないタンパク質、アンキリンにおいて見出された。
前記のように、「デス・ドメイン」モチーフを含むタンパク質のこのモチーフは、これらのタンパク質の細胞内調節ドメインに位置する。このために、「デス・ドメイン」モチーフは細胞の生存率（細胞死）だけでなく細胞形状／コンホメーションに関連する調節機能に関与すると考えられ、この機能は細胞表面で行われ（すなわち、このモチーフを含む受容体のばあい）または細胞表面に近接するところで行われる（すなわち、構造細胞内タンパク質（structural intracellular protein）、たとえばアンキリンのばあい）。さらに、本発明にしたがえば、「デス・ドメイン」モチーフは広い範囲の関連するタンパク質や関連しないタンパク質の間に保存されている、という観察により、このモチーフは重要な調節機能を有するであろう、ということがわかる。
したがって、本発明は、「デス・ドメイン」モチーフを含有するタンパク質の調節部位である「デス・ドメイン」モチーフを含有する調節タンパク質によって媒介される細胞内に生じる出来事を調節するモジュレーターを提供する。このモジュレーターは前記調節タンパク質に含有される１またはそれより多くの「デス・ドメイン」モチーフと相互作用することができ、１またはそれより多くの前記調節タンパク質の調節作用に影響を及ぼすことが可能である。
とくに、本発明は、
（ｉ）１またはそれより多くの「デス・ドメイン」モチーフと相互作用することのできる、自然に生じた「デス・ドメイン」モチーフ結合タンパク質、そのペプチド、類似体および誘導体からなる群より選ばれたモジュレーター、
（ii）「デス・ドメイン」モチーフを含有する調節タンパク質の「デス・ドメイン」モチーフ配列を基質として用いることにより合成される、合成により製造される相補的なペプチドであり、１またはそれより多くの前記「デス・ドメイン」モチーフと相互作用することのできるペプチドからなる群より選ばれたモジュレーター、
（iii）１またはそれより多くの前記「デス・ドメイン」モチーフと相互作用できる抗体またはその活性フラグメントからなる群より選ばれたモジュレーター、
（iv）１またはそれより多くの前記「デス・ドメイン」モチーフと相互作用できる有機化合物であり、既知の化合物に由来し、結合アッセイにおいて基質として前記「デス・ドメイン」モチーフを用いることにより選ばれる有機化合物かまたは前記有機化合物をデザインして合成するための基質として前記「デス・ドメイン」モチーフを用いて合成される有機化合物からなる群より選ばれたモジュレーター、
（ｖ）１またはそれより多くの「デス・ドメイン」モチーフと相互作用することができる、自然に生じる「デス・ドメイン」モチーフ配列に由来するペプチドもしくはポリペプチドならびに１またはそれより多くの前記「デス・ドメイン」モチーフと相互作用することができる前記ペプチドもしくはプロペプチドの類似体および誘導体からなる群より選ばれたモジュレーター、
（vi）「デス・ドメイン」モチーフ含有タンパク質の「デス・ドメイン」に共通する概括的な「デス・ドメイン」モチーフ配列の特徴を認識できることにより、および前記タンパク質の各「デス・ドメイン」モチーフ配列に特有な、その特定の配列の特徴である、１またはそれより多くの特定の「デス・ドメイン」モチーフを認識できることによりさらに特徴付けられる（ｉ）〜（ｖ）のいずれかのモジュレーター、
（vii）ｐ５５  ＴＮＦ−Ｒ、ＦＡＳ−Ｒ、ＮＧＦ−Ｒ、ＭＯＲＴ−１、ＲＩＰ、ＴＲＡＤＤおよびアンキリン１からなる群に属するタンパク質に含まれる１またはそれより多くの「デス・ドメイン」モチーフと相互作用できる（ｉ）〜（vi）のいずれかのモジュレーター、
（viii）前記群のタンパク質の「デス・ドメイン」モチーフに共通する配列の特徴、その特徴は、図１に示される「デス・ドメイン」モチーフ内の位置に共通するアミノ酸残基Ｗ（トリプトファン）、Ｌ（ロイシン）、Ｉ（イソロイシン）、Ａ（アラニン）、Ｄ（アスパラギン酸）、Ｅ（グルタミン酸）、Ｔ（トレオニン）、Ｒ（アルギニン）およびＹ（チロシン）の群からなる、と相互作用できることによりさらに特徴付けられる（vii）のモジュレーター、を提供する。
本発明は、（ｉ）、（ii）および（vii）のうちのいずれかのタンパク質、ペプチドもしくはポリペプチドまたは類似体であるモジュレーターをコードするＤＮＡ配列も提供する。
本発明の前記ＤＮＡ配列の１つの具体例は、
（ａ）天然の「デス・ドメイン」モチーフ結合タンパク質またはペプチドのコード領域に由来するｃＤＮＡ配列、
（ｂ）中程度のストリンジェントな条件下で（ａ）の配列とハイブリダイズでき、生物学的に活性な「デス・ドメイン」モチーフ結合タンパク質またはペプチドをコードするＤＮＡ配列、および
（ｃ）（ａ）および（ｂ）で定義したＤＮＡ配列に対する遺伝コードが縮重し、生物学的に活性な「デス・ドメイン」モチーフ結合タンパク質またはペプチドをコードするＤＮＡ配列
からなる群より選ばれた、自然に生じるタンパク質またはペプチドをコードするＤＮＡ配列である。
本発明のＤＮＡ配列のほかの具体例は、
（ｉ）ｐ５５  ＴＮＦ−Ｒ、ＦＡＳ−Ｒ、ＮＧＦ−Ｒ、ＭＯＲＴ−１およびアンキリン１からなる群のうちの１またはそれより多くのタンパク質の「デス・ドメイン」モチーフと結合できる「デス・ドメイン」モチーフ結合タンパク質またはペプチドをコードするＤＮＡ配列、
（ii）「デス・ドメイン」モチーフ含有タンパク質の、自然に生じる「デス・ドメイン」モチーフ配列に由来するペプチドまたはポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、
（iii）ｐ５５  ＴＮＦ−Ｒ、ＦＡＳ−Ｒ、ＮＧＦ−Ｒ、ＭＯＲＴ−１、ＲＩＰ、ＴＲＡＤＤおよびアンキリン１からなる群のタンパク質のうちのいずれかの「デス・ドメイン」モチーフ配列に由来するペプチドまたはポリペプチドをコードするＤＮＡ配列
である。
さらに本発明は、
（ａ）１またはそれより多くの「デス・ドメイン」モチーフ含有タンパク質の１またはそれより多くの「デス・ドメイン」モチーフと結合できるかまたは相互作用できる本発明のＤＮＡ配列によってコードされるタンパク質、ペプチドもしくはポリペプチドならびにそのうちのいずれかの類似体、
（ｂ）本発明のＤＮＡ配列からなるベクター、
（ｃ）真核宿主細胞で発現できる（ｂ）のベクター、
（ｄ）原核宿主細胞で発現できる（ｂ）のベクター、
（ｅ）（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）のベクターを含有する形質転換された真核または原核宿主細胞、
（ｆ）（ｅ）の形質転換された宿主細胞を、前記タンパク質、ペプチド、ポリペプチドまたは類似体の発現に適した条件下で培養すること、前記タンパク質、ペプチド、ポリペプチドまたは類似体の翻訳後修飾を行うことおよび発現したタンパク質、ペプチド、ポリペプチドまたは類似体を、形質転換した培養培地からまたは形質転換した細胞の細胞抽出物から抽出することからなる（ａ）のタンパク質、ペプチド、ポリペプチドまたは類似体を製造する方法、
（ｇ）（ａ）のタンパク質、ペプチド、ポリペプチドまたは類似体に特異的な抗体またはその活性フラグメントもしくは誘導体
をも提供する。
本発明は、ｐ５５  ＴＮＦ−ＲおよびＦＡＳ−Ｒによって介されるＴＮＦまたはＦＡＳ−Ｒリガンドの細胞への効果、またはＮＧＦ−Ｒ、ＭＯＲＴ−１、ＲＩＰ、ＴＲＡＤＤ、アンキリン１によってかもしくは「デス・ドメイン」モチーフを含有するほかのタンパク質によって細胞に介される機能をモジュレートする方法も提供する。その方法は、本発明のタンパク質、ペプチド、ポリペプチドまたは類似体（前記（ａ）参照）からなる群から選ばれた１またはそれより多くのタンパク質、ペプチド、ポリペプチドまたは類似体、それらすべては「デス・ドメイン」モチーフと結合できるかまたは相互作用でき、前記「デス・ドメイン」モチーフ含有タンパク質の活性をモジュレートできる、前記細胞を処理することからなり、前記細胞の処理が、１またはそれより多くの前記タンパク質、ペプチド、ポリペプチドまたは類似体をそれらの細胞内導入に適した形態で前記細胞に導入することまたは１またはそれより多くの前記タンパク質、ペプチド、ポリペプチドまたは類似体をコードするＤＮＡ配列をそれらの配列を担持するのに適したベクター、前記配列が細胞で発現されるようにその配列を細胞に挿入することのできるベクターの形態で前記細胞に導入することからなる。
前記方法の１つの具体例は、つぎの工程
（ａ）処理される細胞の表面上の特定の細胞表面受容体に結合できるウイルスの表面タンパク質（リガンド）をコードする配列および細胞に発現されると「デス・ドメイン」モチーフ含有タンパク質の活性をモジュレートできる、本発明のタンパク質、ペプチド、ポリペプチドおよび類似体から選ばれたタンパク質をコードする第２の配列を担持する組換え動物ウイルスベクターを構築すること、および
（ｂ）（ａ）のベクターを細胞に感染させること
からなる、組換え動物ウイルスベクターで細胞をトランスフェクションにより細胞を処理を行う方法である。
本発明のほかの方法は、ｐ５５  ＴＮＦ−ＲおよびＦＡＳ−Ｒによって介されるＴＮＦまたはＦＡＳ−Ｒリガンドの細胞への効果またはＮＧＦ−Ｒ、ＭＯＲＴ−１、ＲＩＰ、ＴＲＡＤＤ、アンキリン１もしくは「デス・ドメイン」モチーフを含有するほかのタンパク質によって細胞に介される機能をモジュレートする方法であって、本発明の抗体またはその活性フラグメントもしくは誘導体で前記細胞を処理することからなり、その処理は、細胞内に適用されるように形成された、抗体、その活性フラグメントまたは誘導体を含有する適切な組成物を細胞に適用することにより行われる。
さらに本発明のほかの方法は、ｐ５５  ＴＮＦ−ＲおよびＦＡＳ−Ｒによって介されるＴＮＦまたはＦＡＳ−Ｒリガンドの細胞への効果またはＮＧＦ−Ｒ、ＭＯＲＴ−１、ＲＩＰ、ＴＲＡＤＤ、アンキリン１もしくは「デス・ドメイン」モチーフを含有するほかのタンパク質により細胞に介される機能をモジュレートする方法であって、前述の本発明の配列の少なくとも一部分のアンチセンス配列をコードする配列から選ばれ、少なくとも１つの「デス・ドメイン」モチーフ結合タンパク質またはペプチドの発現をブロックできるオリゴヌクレオチド配列で細胞を処理することからなる方法である。
前記方法の１つの具体例は、前述のように前記ウイルスの第２の配列がオリゴヌクレオチド配列をコードし、そのウイルスベクターを介して細胞に前記オリゴヌクレオチド配列が導入される方法である。
本発明のほかの方法は、
（ｉ）（ａ）特定の腫瘍細胞表面受容体もしくはＨＩＶ感染細胞表面受容体またはほかの疾患の細胞に担持される受容体と結合できるウイルス表面タンパク質をコードする配列および前記腫瘍細胞、ＨＩＶ感染細胞またはほかの疾患の細胞で発現されると、それら細胞を殺すことができる、本発明のタンパク質、ペプチド、ポリペプチドおよび類似体から選ばれるタンパク質をコードする配列を担持する組換え動物ウイルスベクターを構築すること、および
（ｂ）前記腫瘍細胞もしくはＨＩＶ感染細胞またはほかの疾患の細胞に前記（ａ）のベクターを感染させること
からなる腫瘍細胞もしくはＨＩＶ感染細胞またはほかの疾患の細胞を処理する方法、
（ii）ｐ５５  ＴＮＦ−ＲおよびＦＡＳ−Ｒによって介されるＴＮＦまたはＦＡＳ−Ｒリガンドの細胞への効果、ＮＧＦ−Ｒ、ＭＯＲＴ−１、ＲＩＰ、ＴＲＡＤＤ、アンキリン１または「デス・ドメイン」モチーフを含有するほかのタンパク質によって細胞に介される機能をモジュレートする方法であって、本発明のタンパク質またはペプチドをコードする細胞のｍＲＮＡ配列と相互作用できるリボザイム配列をコードするベクターを、リボザイム配列の発現を可能とする形態で前記細胞に導入し、リボザイム配列が細胞に発現されると、それが細胞のｍＲＮＡ配列と相互作用し、そのｍＲＮＡ配列を切断して前記タンパク質やペプチドの細胞での発現を抑制するリボザイム操作を適用することからなる方法、
（iii）本発明の「デス・ドメイン」モチーフ結合タンパク質またはペプチドに結合できるタンパク質、ペプチド、因子または受容体を単離して同定する方法であって、本発明の前記タンパク質またはペプチドをアフィニティクロマトグラフィーマトリックスに接着させ、接着したタンパク質を細胞抽出物と接触させ、そののちに、接着したタンパク質と結合した細胞抽出物からタンパク質、因子または受容体を溶出して単離し、分析するアフィニティクロマトグラフィーの操作を適用することからなる方法、
（iv）本発明の「デス・ドメイン」モチーフ結合タンパク質またはペプチドに結合できるタンパク質を単離して同定する方法であって、「デス・ドメイン」モチーフ結合タンパク質をコードする配列を１つのハイブリッドベクターに担持させ、ｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムＤＮＡライブラリーからの配列を第２のハイブリッドベクターに担持させ、そののちそれらベクターを用いて酵母宿主細胞を形質転換し、陽性の形質転換細胞を単離し、第２のハイブリッドベクターを抽出して「デス・ドメイン」モチーフ結合タンパク質に結合するタンパク質をコードする配列をえる酵母ツーハイブリッド操作を適用することからなる方法
である。
本発明は、ｐ５５  ＴＮＦ−ＲおよびＦＡＳ−Ｒによって介されるＴＮＦまたはＦＡＳ−Ｒリガンドの細胞に対する効果、またはＮＧＦ−Ｒ、ＭＯＲＴ−１、ＲＩＰ、ＴＲＡＤＤ、アンキリン１もしくは「デス・ドメイン」モチーフを含有するほかのタンパク質によって細胞に介される機能をモジュレートするための薬学的組成物であって、活性成分として本発明のモジュレートを含有する組成物も提供する。
本発明の薬学的組成物の具体例としては、
（ｉ）ｐ５５  ＴＮＦ−ＲおよびＦＡＳ−Ｒによって介されるＴＮＦまたはＦＡＳ−Ｒリガンドの細胞に対する効果、またはＮＧＦ−Ｒ、ＭＯＲＴ−１、ＲＩＰ、ＴＲＡＤＤ、アンキリン１もしくは「デス・ドメイン」モチーフを含有するほかのタンパク質によって細胞に介される機能をモジュレートするための薬学的組成物であって、細胞表面受容体と結合できるタンパク質をコードし、本発明のタンパク質またはそのペプチドもしくは類似体をコードする組換え動物ウイルスベクターを活性成分として含有する薬学的組成物、
（ii）ｐ５５  ＴＮＦ−ＲおよびＦＡＳ−Ｒによって介されるＴＮＦまたはＦＡＳ−Ｒリガンドの細胞に対する効果、またはＮＧＦ−Ｒ、ＭＯＲＴ−１、ＲＩＰ、ＴＲＡＤＤ、アンキリン１もしくは「デス・ドメイン」モチーフを含有するほかのタンパク質によって細胞に介される機能をモジュレートするための薬学的組成物であって、本発明の配列のアンチセンス配列をコードするオリゴヌクレオチド配列を活性成分として含有する薬学的組成物
があげられる。
本発明のさらなる方法は、「デス・ドメイン」モチーフ含有タンパク質の「デス・ドメイン」モチーフに結合できるタンパク質を単離して同定する方法であって、本発明の配列またはその一部分をプローブとして用いてｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡライブラリーから少なくとも部分的にそれと相同性を有する配列を結合させ、そののち結合した配列をＰＣＲ操作で増幅してクローン化し、本発明の前記配列と少なくとも部分的に相同性を有するタンパク質をコードするクローンをえる、ノン−ストリンジェントサザンハイブリダイゼージョンとそれに続くＰＣＲクローニングの操作を適用することからなる方法である。
さらに、「デス・ドメイン」モチーフ含有タンパク質の活性をモジュレートできる薬物をデザインする方法であって、実施例３および４に記載した操作からなる方法も提供する。
至る所で用いられるつぎの用語「ｐ５５  ＴＮＦ−ＲおよびＦＡＳ−Ｒによって介されるＴＮＦまたはＦＡＳ−Ｒリガンドの細胞への効果、またはＮＧＦ−Ｒ、ＭＯＲＴ−１、ＲＩＰ、ＴＲＡＤＤ、アンキリン１もしくは「デス・ドメイン」モチーフを含有するほかのタンパク質によって細胞に介される機能のモジュレーション／媒介」は、インビトロのみならずインビボでの処理も含有するものであると理解される、ということを記載しておくべきである。
さらに、至る所で用いられている本発明の抗体およびこれらの抗体を用いる方法はいわゆる「ヒト化」抗体またはその使用を包含するものである。
【図面の簡単な説明】
図１は実施例１に記載のように、ＭＯＲＴ−１、ｐ５５  ＴＮＦ−Ｒ、Ｆａｓ／ＡＰＯ１（ＦＡＳ−Ｒ）、低親和性ＮＧＦ受容体（ＮＧＦ−Ｒ）およびアンキリン１（Ａｎｋｙｒｉｎ  １）の調節ドメインのＣ末端部分における「デス・ドメイン」モチーフの配列相同性を模式的に表す。
図２は酵母ツーハイブリッド試験におけるｐ５５−Ｒ、Ｆａｓ／ＡＰＯ１、ＭＯＲＴ１、ＴＲＡＤＤおよびＲＩＰの「デス・ドメイン」の相互作用およびこれらのタンパク質におけるｌｐｒcg様突然変異のそれらの相互作用に対する効果を表す。ＤＤモチーフの上流を短くしたつぎのヒト  タンパク質：ｐ５５−Ｒ（残基３２６〜４２６）、ＦＡＳ−Ｒ（残基２１０〜３１９）、ＭＯＲＴ−１（残基９２〜２０８）、ＴＲＡＤＤ（残基１９５〜３１２）およびＲＩＰ（残基２６１〜３７２）を包含するＧａｌ４  ハイブリッド構築物だけでなく、これらのタンパク質のつぎの点突然変異体：ｐ５５−Ｒ  Ｌ３５１Ｎ、ＦＡＳ−Ｒ  Ｖ２３８Ｎ、ＭＯＲＴ−１  Ｖ１２１ＮおよびＲＩＰ  Ｆ３０８Ｎ（ＤＤｓ内のこれらの突然変異部位はｌｐｒcgマウスのＦＡＳ−Ｒにおいて見出されたものに相当する）の相互作用の評価。各ｃＤＮＡ挿入物をＧａｌ４  ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）およびＧａｌ４  活性化ドメイン（ＡＤ）構築物（ｐＧＢＴ９およびｐＧＡＤ−ＧＨ）へ共に導入し、トランスフェクトされたＳＦＹ５２６酵母内でのほかの全ての挿入物への両構築物の挿入物の結合は、β−ガラクトシダーゼ発現フィルターアッセイにより評価した。結果は強い発色に要求される時間について示されている。ＮＤは、行わず（ｎｏｔ  ｄｏｎｅ）を示す。
図３は酵母ツーハイブリッド試験において観察されたＤＤ相互作用の概略的な図である。図２に記載した実験において観察されたように、ＤＤのアイコンをつなぐ矢印（ａｒｒｏｓｅ）の長さおよび厚みは相互作用の度合に相当する。
図４はトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞でのＭＯＲＴ−１、ＴＲＡＤＤおよびＲＩＰの相互作用を表す。ＦＬＡＧオクタペプチドとＮ末端で融合したＭＯＲＴ−１（ＧｅｎＢａｎｋ受入れ番号  Ｕ２４２３１のヌクレオチド１９〜７５３）、ならびにＦＬＡＧオクタペプチドもしくはＨＡエピトープ（Ｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ.，１９８８）とＮ末端で融合したＴＲＡＤＤ（アミノ酸１９５〜３１２）およびＲＩＰ（アミノ酸２６１〜３７２）のＤＤｓを、ＨｅＬａ細胞において単独でまたは２種の混合において発現させ、［35Ｓ］−Ｃｙｓおよび［35Ｓ］−Ｍｅｔで代謝的に標識した。同時発現したタンパク質の交差免疫沈降は、示した抗体を用いて行なった。タンパク質はＳＤＳポリアクリルアミドゲル電流泳動（１５％アクリルアミド）により、続いてオートラジオグラフィーにより分析した。ＭＯＲＴ−１およびＲＩＰを含む細胞の溶解質において、両タンパク質の同時免疫沈降はそれらのうちのいずれか１つに対する抗体を用いてえられた。しかしながら、ＴＲＡＤＤおよびＲＩＰを含む溶解質においては、ＲＩＰに対する抗体を用いたばあいのみ、そして明らかに構造的妨げのために、ＴＲＡＤＤおよびＭＯＲＴ−１を含む溶解質においては、ＴＲＡＤＤに対する抗体を用いたばあいのみ２つのタンパク質の同時免疫沈降は観察された。
発明の詳細な説明
本発明は、１つの観点において、「デス・ドメイン」モチーフ含有タンパク質の１またはそれより多くの「デス・ドメイン」モチーフに、これらのタンパク質内の「デス・ドメイン」モチーフに共通する配列の特徴を認識する効力により結合することができる新規なタンパク質またはペプチドに関する。このために、「デス・ドメイン」モチーフ結合タンパク質またはペプチドは、「デス・ドメイン」含有タンパク質のこのグループのメディエーターまたはモジュレーターとして考えられている。「デス・ドメイン」モチーフ含有タンパク質のこのグループは、（ｉ）ＴＮＦ／ＮＧＦ受容体ファミリーのメンバー、たとえばｐ５５  ＴＮＦ−Ｒ、ＦＡＳ−Ｒ（ＦＡＳ／ＡＰＯ１）および低親和性のＮＧＦ受容体（ＮＧＦ−Ｒ）；（ii）ほかの関連するタンパク質、たとえばとりわけその特徴が自己会合しかつＦＡＳ−Ｒの細胞内ドメインに特異的に結合することができる、最近発見されたＭＯＲＴ−１（またはＨＦ１）と称する（「Ｍｅｄｉａｔｏｒ  ｏｆ  Ｒｅｃｃｅｐｔｏｒ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｔｏｘｉｃｉｔｙ」であるため）タンパク質；だけでなく（iii）明らかに関連しないタンパク質、たとえば細胞骨格タンパク質アンキリン１、を含む。「デス・ドメイン」モチーフおよびその特徴のいくつかは、ｐ５５  ＴＮＦ−Ｒ、ＦＡＳ−ＲおよびＭＯＲＴ−１に関して、係属中のイスラエル国出願番号１０９６３２、１１１１２５、１１２００２および１１２６９２に開示されている。ＮＧＦ−Ｒおよびアンキリン１に存在する「デス・ドメイン」モチーフは本発明にしたがって開示されている（実施例１参照）。
前記係属中出願では、ｐ５５−ＴＮＦ−Ｒおよび／またはＦＡＳ−Ｒの細胞内ドメインに特異的に結合することができ多数のタンパク質（ＭＯＲＴ−１を含む）が記載されている。しかしながら、対照して、本発明は、この１つの観点において、「デス・ドメイン」モチーフを有することにより特徴付けられるグループに属する前記タンパク質の１またはそれより多くの「デス・ドメイン」に特異的に結合するタンパク質またはペプチドに関する。本発明の前記タンパク質またはペプチドと「デス・ドメイン」モチーフ間のその結合／相互作用は、様々な「デス・ドメイン」モチーフに共通する配列の特徴によるものである。このために、本発明のタンパク質またはペプチドは、「デス・ドメイン」モチーフに共通する特徴を認識することにより１またはそれより多くのこのグループのタンパク質のメンバーの活性をモジュレートすることまたは媒介することができる、ということにより特徴付けられる。
したがって、本発明に含まれるのは、様々な「デス・ドメイン」モチーフに結合するタンパク質またはペプチドの大きなグループであり、タンパク質またはペプチドのいくつかは特定のタンパク質または受容体の特定の「デス・ドメイン」に結合し、ほかのものは１つより多くの前記タンパク質／受容体のうちの１つより多くの前記モチーフに結合する。図１から、ｐ５５  ＴＮＦ−Ｒ、ＦＡＳ−Ｒ、ＮＧＦ−Ｒ、ＭＯＲＴ１およびアンキリン１のような「デス・ドメイン」モチーフ含有タンパク質における「デス・ドメイン」モチーフに共通する配列の特徴は、図１に示される位置に、Ｗ（トリプトファン）、Ｌ（ロイシン）、Ｉ（イソロイシン）、Ａ（アラニン）、Ｄ（アスパラギン酸）およびＥ（グルタミン酸）、だけでなくＴ（トレオニン）、Ｒ（アルギニン）およびＹ（チロシン）のような共通のアミノ酸残基（ブラックバックグラウンドで印した残基）を含むことがわかる。
本発明のタンパク質またはペプチドは、前記係属中特許出願（実施例３も参照）に記載されたように、たとえばｐ５５−ＴＮＦ−Ｒ、ＦＡＳ−Ｒ、ＭＯＲＴ−１、ＮＧＦ−Ｒ、アンキリン１の「デス・ドメイン」モチーフをプローブまたは「バイト（ｂａｉｔ）」としてこれら「デス・ドメイン」モチーフの１またはそれより多くに結合することができるタンパク質またはペプチドを発現するクローンをゲノムまたはｃＤＮＡライブラリーから単離するために用いる酵母ツーハイブリッド操作を用いることによりえることができる。また、合成ＤＮＡ配列を、ｐ５５−ＴＮＦ−Ｒ、ＦＡＳ−Ｒ、ＭＯＲＴ−１、ＮＧＦ−Ｒ、アンキリン１の「デス・ドメイン」モチーフに共通する配列の特徴（図１参照）の全てを含んで、共通のまたは「一般的な（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ）」「デス・ドメイン」モチーフ配列を提供するために合成することができ、同様に、この「デス・ドメイン」モチーフ配列に結合できるタンパク質またはペプチドをコードするｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーからクローンを単離および同定するための酵母ツーハイブリッド操作に用いることができる。
本発明のタンパク質およびペプチドをえるためのほかのアプローチは、たとえばｐ５５  ＴＮＦ−Ｒ、ＦＡＳ−Ｒ、ＭＯＲＴ１、ＮＧＦ−Ｒおよびアンキリン１の「デス・ドメイン」モチーフ配列を有するペプチドまたはタンパク質フラグメント、または全ての前記「デス・ドメイン」モチーフに共通する配列の特徴（図１参照）を有する合成的に産生された「デス・ドメイン」モチーフペプチドをクロマトグラフィー基質またはマトリックスに接着させ、（ヒト／ホ乳類由来の）細胞抽出物または溶解質と接触させ、１またはそれより多くの「デス・ドメイン」モチーフに結合できるタンパク質またはペプチドを単離する、たとえばアフィニティークロマトグラフィーのようなよく知られた標準的な操作を含む。同様に、特定のアミノ酸配列（「デス・ドメイン」モチーフ配列）に結合できるタンパク質またはペプチドを単離するために通常用いられるほかの標準的化学的操作または組換えＤＮＡ操作を本発明のタンパク質またはペプチドをえるために用いることができる。
このように、本発明は本発明のタンパク質またはペプチドをコードするＤＮＡ配列およびこれらの配列によりコードされるタンパク質およびペプチドにも関する。
さらに、本発明は本発明のこれらのタンパク質およびペプチドの生物学的に活性な類似体および誘導体をコードするＤＮＡ配列ならびにそれらによってコードされる類似体にも関する。前記類似体および誘導体の製造は通常の方法によって行なわれる（たとえばＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ.，１９８９参照）。その方法ではこれらのタンパク質をコードするＤＮＡ配列において１またはそれより多くのコドンが欠失、付加またはほかのものによって置換されていてもよく、未変性のタンパク質に対して少なくとも１つのアミノ酸残基の変化を有する類似体がえられる。受け入れられる類似体類は、少なくとも「デス・ドメイン」モチーフ含有タンパク質の前記グループのメンバーの１またはそれより多くの「デス・ドメイン」モチーフへの結合の可能性を保持しているものかまたはほかのいずれかの結合や酵素活性を介することのできるもの、たとえば「デス・ドメイン」モチーフに結合するがシグナルを出さない、すなわちさらに下流の受容体、タンパク質またはほかの因子には結合しないかシグナルに依存する反応を触媒しない類似体である。いわゆるドミナントネガティブ効果を有する類似体、すなわち「デス・ドメイン」モチーフに対する結合かまたはその結合ののちにひき続くシグナリングのいずれかが欠失している類似体は、前記のようにして産生することができる。前記類似体は、たとえば天然のＩＣ結合タンパク質と競合させてＴＮＦの効果、ＦＡＳ−リガンドの効果、ＮＧＦ−Ｒによる効果、ＭＯＲＴ−１による効果およびアンキリン１による効果を抑制するために使用することができる。
同様に、たとえば、ＴＮＦの効果、ＦＡＳリガンドの効果、ＮＧＦ−Ｒによる効果、ＭＯＲＴ−１による効果およびアンキリン１による効果を増大させる働きをするであろういわゆるドミナントポジティブ類似体が産生されてもよい。これらは天然の「デス・ドメイン」モチーフ結合タンパク質と同じかもしくはそれよりも良好な「デス・ドメイン」モチーフ結合特性ならびに同じかもしくはそれよりも良好なシグナリング特性を有するであろう。同様に、誘導体はタンパク質の１またはそれより多くのアミノ酸残基の側鎖を標準的に修飾することにより、またはタンパク質をほかの分子、たとえば当業者によく知られているような抗体、酵素、受容体などに複合させることにより製造してよい。
本発明の新規な「デス・ドメイン」モチーフ含有タンパク質およびペプチド、たとえばｐ５５  ＴＮＦ−Ｒ、ＦＡＳ−Ｒ、ＭＯＲＴ−１、ＮＧＦ−Ｒおよびアンキリン１、だけでなくＲＩＰおよびＴＲＡＤＤの１またはそれより多くの「デス・ドメイン」モチーフに結合することができるタンパク質およびペプチドは多くのことに使用できる可能性を有する。たとえば、
（ｉ）活性の増大が望まれる、抗腫瘍、抗炎症、または抗ＨＩＶもしくはほかの疾患／障害など効果の増大が望まれる状況において、それらはＴＮＦまたはＦＡＳ−Ｒリガンドの機能、もしくはＮＧＦ−Ｒ、ＭＯＲＴ−１、ＲＩＰ、ＴＲＡＤＤおよびアンキリン１または「デス・ドメイン」モチーフを含むほかのタンパク質の機能を模擬するかまたは増大させるために使用してよい。このばあいには、タンパク質またはペプチドは、それ自体が既知の標準的な操作によって細胞に導入されてよい。たとえば、タンパク質またはペプチドが細胞内で作用すること、すなわち細胞内に位置する「デス・ドメイン」モチーフと結合／相互作用することが要求され、効果が望まれる細胞にそれを導入することが望ましいので、細胞にこのタンパク質を特別に導入するためのシステムが必要である。これを行なう方法の１つはつぎのようである。組換え動物ウイルス、たとえばワクシニア（Ｖａｃｃｉｎｉａ）由来の１つを作製し、そのＤＮＡに対してつぎの２種の遺伝子を導入する：細胞に特異的に発現される細胞表面タンパク質に結合するリガンド、たとえばいくつかの細胞（ＣＤ４リンパ球、および関連する白血球）に特異的に結合するエイズ（ＨＩＶ）ウイルスｇｐ１２０タンパク質など、または赤血球もしくは神経組織（アンキリン１のばあい）に特異的に結合するリガンドまたはたとえばＭＯＲＴ−１、ＲＩＰ、ＴＲＡＤＤを発現しているタンパク質の「デス・ドメイン」モチーフ含有グループのほかのメンバーによって発現されることを特徴とする細胞へ特異的に結合するリガンドまたは組換えウイルスベクターが細胞に結合できるように、ＴＮＦ−Ｒ、ＦＡＳ−ＲまたはＮＧＦ−Ｒを担持する細胞に特異的に結合するそのほかのリガンドをコードする遺伝子；および新規な「デス・ドメイン」モチーフ結合タンパク質またはペプチドをコードする遺伝子。こうしてウイルスの表面に細胞表面結合タンパク質が発現すると、ウイルスは腫瘍細胞、ＨＩＶ感染細胞またはほかの細胞を標的とし、続いて「デス・ドメイン」モチーフ結合タンパク質またはペプチドをコードする配列がウイルスを介して細胞内に導入されるであろう。細胞で一度発現するとたとえば、ＴＮＦ、ＦＡＳ−Ｒリガンド、ＮＧＦ−Ｒ−媒介、ＭＯＲＴ−１−媒介、ＲＩＰ−およびＴＲＡＤＤ−媒介、またはアンキリン１−媒介効果が増大され、たとえば殺されることが望まれる腫瘍細胞またはほかのＴＮＦ−Ｒ−またはＦＡＳ−Ｒを担持する細胞の死が導かれるであろう。前記組換え動物ウイルスの構築は標準的な操作により行なわれる（たとえばＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ.，１９８９参照）。ほかの可能性は、新規なタンパク質またはペプチドの配列を、細胞に吸収され、そこで発現されることのできるオリゴヌクレオチドの形態で導入することである。
（ii）それらはたとえば、ＴＮＦ、ＦＡＳ−Ｒリガンド、ＮＧＦ−Ｒ−媒介、ＭＯＲＴ１−媒介およびアンキリン−１−媒介効果を阻害するために使用してもよい。たとえば、敗血症性ショック、移植片対宿主拒絶、急性肝炎またはほかの疾患／障害における組織の傷害のようなばあいでは、ＴＮＦで誘導されるＴＮＦ−Ｒ、ＦＡＳ−Ｒリガンドで誘導されるＦＡＳ−ＲまたはＮＧＦで誘導体されるＮＧＦ−Ｒ細胞内シグナリングまたはＭＯＲＴ１、ＲＩＰ、ＴＲＡＤＤおよびアンキリン−１により媒介される細胞内の出来事をブロックすることが望まれている。このような状況では、たとえば、標準的な方法によってこれらの新規なタンパク質またはペプチドのための配列をコードするアンチセンスを有するオリゴヌクレオチドを細胞へ導入することが可能であり、それによりこれらのタンパク質をコードするｍＲＮＡの翻訳が効果的にブロックされ、それらの発現がブロックされて「デス・ドメイン」モチーフ含有タンパク質により媒介される効果の前記所望の阻害が導かれるであろう。
前記オリゴヌクレオチドは、ウイルスによって担持される第２の配列をオリゴヌクレオ配列にした前記組換えウイルスアプローチを用いて細胞内に導入されてもよい。ほかの可能性はこれらのタンパク質またはペプチドに特異的な抗体を使用してその細胞内シグナリング活性を（「デス・ドメイン」モチーフへのそれらの結合を介して）阻害することである。
さらに、ＴＮＦ、ＦＡＳ−Ｒリガンド、ＮＧＦ−Ｒ−媒介、ＭＯＲＴ−１−媒介、ＲＩＰ−およびＴＲＡＤＤ−媒介もしくはアンキリン−１−媒介効果、またはほかの「デス・ドメイン」モチーフ含有タンパク質により媒介される効果を阻害するほかの方法は、最近開発されたリボザイムアプローチによるものである。リボザイムはＲＮＡを特異的に切断する触媒ＲＮＡ分子である。リボザイムは選択される標的ＲＮＡ、たとえば本発明の新規なタンパク質またはペプチドをコードするｍＲＮＡを切断するために創作されてもよい。そのようなリボザイムは選択されるｍＲＮＡに特異的な配列を有し、それと相互作用する（相補的に結合する）ことができ、続いてｍＲＮＡを切断して阻害することが望まれるタンパク質またはペプチドの発現を減少させ（または完全に消失させ）るであろう。その減少した発現のレベルは標的細胞でのリボザイム発現のレベルに依存する。リボザイムを選択される細胞に導入するために、任意の適切なベクター、たとえば通常この目的のために用いられるプラスミド、動物のウイルス（レトロウイルス）ベクターを使用してもよい（ウイルスが第２の配列として選択されるリボザイム配列をコードするｃＤＮＡを有する、前記（ｉ）も参照）。さらに、リボザイムは、たとえば発明のタンパク質またはペプチドの１またはそれより多くの発現を阻害するために用いることができるマルチプル標的（マルチ−標的リボザイム）を有するよう構築されることができる。（リボザイムに関する総説、方法などについては、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ.，１９９２；Ｚｈａｏ  ａｎｄ  Ｐｉｃｋ，１９９３；Ｓｈｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ.，１９９３；Ｊｏｓｅｐｈ  ａｎｄ  Ｂｕｒｋｅ，１９９３；Ｓｈｉｍａｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ.，１９９３；Ｃａｎｔｏｒ  ｅｔ  ａｌ.，１９９３；Ｂａｒｉｎａｇａ，１９９３；Ｃｒｉｓｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ.，１９９３  ａｎｄ  Ｋｏｉｚｕｍｉ  ｅｔ  ａｌ.，１９９３参照）。
（iii）それらは、それらに結合できるほかのタンパク質またはペプチド、たとえば細胞内シグナリングプロセスに関係し、「デス・ドメイン」モチーフ含有タンパク質の下流に存在するほかのタンパク質またはペプチドを単離、同定およびクローン化するために使用されてもよい。この状況では、これらの選択、すなわちそれらをコードするＤＮＡ配列は酵母ツーハイブリッドシステム（実施例２、下記参照）に使用されてもよい。前記システムではこれらのタンパク質またはペプチドの配列がｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡライブラリーからこれらの新規な「デス・ドメイン」含有タンパク質に結合できるタンパク質をコードするほかの配列（「プレイ（ｐｒｅｙ）」）を単離し、クローン化し、同定するために「ベイト」として用いられるであろう。同様に、本発明の特異的なタンパク質またはペプチド、すなわちｐ５５  ＴＮＦ−Ｒ、ＦＡＳ−Ｒ、ＮＧＦ−Ｒ、ＭＯＲＴ−１およびアンキリンに結合できるものがさらなるほかの受容体またはタンパク質に結合できるかどうかを決定されてもよい。さらに、このアプローチは、本発明のタンパク質またはペプチドが活性において機能的な役割、すなわちほかのなおも同定されていない「デス・ドメイン」モチーフ含有受容体またはタンパク質を有するほかの既知の受容体またはタンパク質に結合できるかどうかの決定に用いられてもよい。
（iv）これらの新規なタンパク質は同じクラスのほかのタンパク質、すなわち前記に列挙した、様々な受容体またはタンパク質の「デス・ドメイン」モチーフまたは機能的に関連する受容体またはタンパク質に結合し、かつそれらのモジュレーション／媒介に関係するものを単離し、同定し、クローン化するために使用されてもよい。この適用では前述の酵母ツーハイブリッドシステムを用いてもよく、またストリンジェントではないサザンハイブリダイゼーションに続いてＰＣＲクローニングを行なう、最近開発された（Ｗｉｌｋｓ  ｅｔ  ａｌ.，１９８９）システムを用いてもよい。Ｗｉｌｋｓらの刊行物には、キナーゼモチーフの既知の配列、創作されたキナーゼ配列にもとづいてストリンジェントではないサザンハイブリダイゼーションを適用し、そののちにＰＣＲによってクローニングをすることによる、２種の推定のタンパク質−チロシンキナーゼの同定およびクローニングが記載されている。このアプローチは、本発明にしたがって新規なタンパク質またはペプチドの配列を用い、「デス・ドメイン」モチーフ含有受容体またはタンパク質に結合することもできる「デス・ドメイン」モチーフ結合タンパク質またはペプチドに関係するものを同定してクローン化するために用いてもよい。
（ｖ）さらに、本発明の新規なタンパク質を利用するほかのアプローチは、アフィニティークロマトグラフィーの方法にそれらを用いてそれらが結合することのできるほかのタンパク質または因子たとえば、ＴＮＦ−Ｒｓ（ＴＮＦ／ＮＧＦ受容体スーパーファミリー）に関連するほかの受容体や細胞内シグナリングまたは構造調節プロセスに関係するほかのタンパク質または因子（たとえば、ＭＯＲＴ１、アンキリン１に関係する）を単離し、同定することである。この適用では本発明のタンパク質を個別にアフィニティークロマトグラフィーマトリックスに付着させ、細胞抽出物と接触させるかまたは細胞内シグナリングまたは構造調節プロセスに関係があると疑われるタンパク質または因子を単離してもよい。アフィニティークロマトグラフィー操作に続き、本発明の新規なタンパク質と結合するほかのタンパク質または因子を溶出し、単離して特徴付けることが可能である。
（vi）前述のように、本発明の新規なタンパク質またはペプチド誘導体は、免疫原（抗原）として使用してそれに特異的な抗体を産生してもよい。これらの抗体は細胞抽出物からかまたはそれらを産生する形質転換された細胞系からのいずれかから新規なタンパク質またはペプチドを精製する目的で使用されてもよい。さらに、これらの抗体は、たとえば、ＴＮＦ、ＦＡＳ−Ｒリガンド、ＮＧＦ−Ｒ、ＭＯＲＴ−１またはアンキリン１システムが異常に機能すること、たとえば過剰に活性化されるかまたは不充分な活性しかない、たとえばＴＮＦ−またはＦＡＳ−Ｒリガンドで誘導される細胞の効果またはＮＧＦ−Ｒ−、ＭＯＲＴ−１−またはアンキリン−１で媒介される細胞の効果に関する疾患を同定する目的の診断に使用されてもよい。このように、そのような疾患が新規なタンパク質または抗体に関与する多機能な細胞内シグナリングまたは構造調節システムに関連するのなら、前記抗体は重要な診断具として役立つであろう。
別の観点では、本発明は、「デス・ドメイン」モチーフ含有タンパク質の前記グループの「デス・ドメイン」モチーフの１またはそれより多くと特異的に結合または相互作用することができる、当技術のよく知られた標準的な操作により合成されるであろう相補的なペプチドに関する。これらの相補的なペプチドは、たとえばｐ５５−ＴＮＦ−Ｒ、ＦＡＳ−Ｒ、ＭＯＲＴ−１、ＲＩＰ、ＴＲＡＤＤ、ＮＧＦ−Ｒ、アンキリン１の「デス・ドメイン」モチーフ配列を基質として用い、かつこれらの「デス・ドメイン」モチーフ配列に相補的である配列のペプチドを標準的化学的方法により合成することにより合成されるであろう。適切な相補的ペプチドは、これらの「デス・ドメイン」モチーフの１またはそれより多くに結合することができ、それにより「デス・ドメイン」モチーフ含有タンパク質の活性をモジュレートまたは媒介することができるであろうものである。
相補的ペプチドは図１に説明する「デス・ドメイン」モチーフ配列の１またはそれより多くの基質を用いて産生されることができ、または既知の「デス・ドメイン」モチーフ配列に共通する配列の特徴の全て、たとえば前記アミノ酸残基Ｗ、Ｌ、Ｉ、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｔ、ＲおよびＹを有する合成ペプチド（前記参照）を用いて産生されるであろう。
前記産生される相補的ペプチド、および同様に、それらをコードするＤＮＡ配列は、標準的操作により容易に産生することができ、前記のように（ｉ）〜（vi）のいずれか１つを使用して、すなわち「デス・ドメイン」モチーフを含むタンパク質または受容体の活性を増大（機能の獲得（ｇａｉｎ−ｏｆ−ｆｕｎｃｔｉｏｎ））または阻害するために用いてもよく、またはモジュレーション／媒介、単離または診断の目的のためにそれらに特異的な抗体を産生するよう使用してもよい。
本発明に含まれるものは、相補的なペプチドを含む本発明のタンパク質およびペプチドに特異的な抗体（およびそれらの用途）だけでなく、「デス・ドメイン」モチーフペプチド自身に特異的な抗体、たとえばｐ５５−ＴＮＦ−Ｒ、ＦＡＳ−Ｒ、ＭＯＲＴ−１、ＮＧＦ−Ｒ、アンキリン１および「デス・ドメイン」モチーフを含むほかのタンパク質の「デス・ドメイン」である図１に示されるそれらのペプチドであることも記載されるべきである。これらの抗体は「デス・ドメイン」モチーフを含むタンパク質または受容体の活性を直接的にモジュレート／媒介するためにまたは前記「デス・ドメイン」モチーフを含むほかのタンパク質および受容体の単離、同定および特徴付け（前記のように、診断の適用を含む）のために用いることができる。
ここで記載される抗体に関しては、用語「抗体」はポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）、キメラ抗体、抗体に対する抗イディオタイプ（ａｎｔｉ−Ｉｄ）抗体を意味し、酵素的切断に限らず、ペプチド合成法または組換え法のような既知の技法のうちのいずれかにより提供されるそのフラグメントと同様に、可溶性の形態または結合した形態で標識されうる。
ポリクローナル抗体は、抗原で免疫された動物の血清由来の不均一な抗体分子の群である。モノクローナル抗体は抗原に特異的な抗体の実質的に均一な群を含み、その群は実質的に同様のエピトープ結合部位を含む。モノクローナル抗体は当業者に知られている方法でえられればよい。たとえば、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−４９７（１９７５）；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．４，３７６，１１０；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ.，ｅｄｓ.，Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）；およびＣｏｌｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ.，ｅｄｓ.，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  Ｎ．Ｙ.，（１９９２，１９９３）を参照のこと。これらの参考文献の内容は、「参考文献」により本明細書に完全に包含されている。前記抗体はＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＧＩＬＤを含むイムノグロブリンクラスおよびそれらのサブクラスのうちのいずれかであってもよい。本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマはｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｓｉｔｕまたはｉｎ  ｖｉｖｏで培養されてもよい。ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｓｉｔｕにおける高力価のモノクローナル抗体の産生は近年好まれている産生方法である。
キメラ抗体は、異なる動物種由来の異なる部分の分子であり、たとえばマウスモノクローナル抗体由来の可変領域とヒトイムノグロブリンの定常領域とを有する。キメラ抗体は適用の際の免疫原性を減少させるためにおもに用いられ、作製の際の収率を高めるために用いられる。たとえば、マウスモノクローナル抗体はハイブリドーマからの高収率を有するが、ヒトにおいては高い免疫原性を有するばあいに、ヒト／マウスキメラモノクローナル抗体が用いられる。キメラ抗体およびそれらの製造法は当該分野で既知である（Ｃａｂｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ.，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：３２７３−３２７７（１９８４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ.，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：６８５１−６８５５（１９８４）；Ｂｏｕｌｉａｎｎｅ  ｅｔ  ａｌ.，Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：６４３−６４６（１９８４）；Ｃａｂｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ.，Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｐａｔｅｎｔ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  １２５０２３（ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  １４，１９８４）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ.，Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：２６８−２７０（１９８５）；Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ.，Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｐａｔｅｎｔ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  １７１４９６（ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  Ｆｅｂｒｕａｒｙ  １９，１９８５）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ.，Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｐａｔｅｎｔ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  １７３４９４（ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  Ｍａｒｃｈ  ５，１９８６）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ.，ＰＣＴ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ＷＯ  ８６０１５３３，（ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  Ｍａｒｃｈ  １３，１９８６）；Ｋｕｄｏ  ｅｔ  ａｌ.，Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｐａｔｅｎｔ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  １８４１８７（ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  Ｊｕｎｅ  １１，１９８６）；Ｓａｈａｇａｎ  ｅｔ  ａｌ.，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７：１０６６−１０７４（１９８６）；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ.，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐａｔｅｎｔ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．ＷＯ８７０２６７１（ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  Ｍａｙ  ７，１９８７）；Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ.，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：３４３９−３４４３（１９８７）；Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ.，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８４：２１４−２１８（１９８７）；Ｂｅｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ.，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０４１−１０４３（１９８８）；ａｎｄ  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，ｓｕｐｒａ．）。これらの参考文献は「参考文献」の欄により本明細書に完全に包含されている。
抗イディオタイプ（ａｎｔｉ−Ｉｄ）抗体は、抗体の抗原結合部位に一般的に関連する特有の決定基を認識する抗体である。イディオタイプ抗体は、モノクローナル抗体、それに対して抗イディオタイプが作製される、を用いて、モノクローナル抗体のソースと同一の種および遺伝型を有する動物（たとえば、マウスの株）を免疫することにより作製することができる。免疫された動物は免疫する抗体のイディオタイプ決定基を認識し、これらのイディオタイプ決定基に対する抗体（抗−イディオタイプ抗体）を産生することにより免疫する抗体のイディオタイプ決定基に対する応答をするであろう。たとえばＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．４，６９９，８８０を参照のこと。これは「参考文献」の欄により本明細書に完全に包含されている。
抗イディオタイプ抗体は、さらなるほかの動物に免疫応答を誘導するための「免疫原」（いわゆる抗抗イディオタイプ抗体を産生する）として用いられてもよい。抗抗イディオタイプは抗イディオタイプを誘導するオリジナルのモノクローナル抗体とエピトープ的に同一であってもよい。このようにモノクローナル抗体のイディオタイプ決定基に対する抗体を用いることにより、同一の特異性を有する抗体を発現するほかのクローンを同定することが可能である。
したがって、本発明の「デス・ドメイン」モチーフ含有ペプチド、「デス・ドメイン」結合タンパク質またはペプチド、または「デス・ドメイン」結合相補的ペプチド、類似体またはその誘導体に対して産生されるモノクローナル抗体は、適切な動物、たとえばＢＡＬＢ／ｃマウス、において抗イディオタイプ抗体を誘導するために用いてもよい。前記免疫されたマウスからの脾細胞は、抗イディオタイプモノクローナル抗体を分泌する抗イディオタイプハイブリドーマを産生するために用いられる。さらに、抗イディオタイプモノクローナル抗体はキーホールリンペット・ヘモシアニン（ＫＬＨ）のようなキャリアーと結合することができ、さらなるＢＡＬＢ／ｃマウスに免疫するために用いられることができる。これらのマウスからの血清は、前記タンパク質、ペプチド、類似体または誘導体のエピトープに特異的なオリジナルのモノクローナル抗体の結合特性を有する抗抗イディオタイプ抗体を含むであろう。
こうして、抗イディオタイプモノクローナル抗体は、それら自身のイディオタイプエピトープ、または評価されるエピトープに構造的に類似する「イディオトープ」、たとえばＧＲＢプロテイン−α、を有する。
用語「抗体」は、完全な分子とそれらのフラグメントたとえば、抗原に結合できるＦａｂとＦ（ａｂ′）2の両者を含むものも意味する。ＦａｂおよびＦ（ａｂ′）2フラグメントは完全な抗体のＦｃフラグメントがなく、循環からより急速に取り除かれ、完全な抗体よりも組織結合特異性が少なくてもよい（Ｗａｈｌ  ｅｔ  ａｌ.，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２４：３１６−３２５（１９８３））。
本発明に有用な抗体のＦａｂ、Ｆ（ａｂ′）2およびほかのフラグメントが、完全な抗体分子のためにここに記載されている方法にしたがって、「デス・ドメイン」結合タンパク質またはペプチドの検出および定量のために使用されてもよい。前記フラグメントは、パパイン（Ｆａｂフラグメントを産生するため）またはペプシン（Ｆ（ａｂ′）2フラグメントを産生するため）などの酵素を用いるタンパク質分解によって典型的に産生される。
抗体がある分子と特異的に反応してその分子と抗体とが結合できるばあいは、抗体は分子に「結合できる」といわれる。用語「エピトープ」は、抗体に結合されるいずれかの分子の一部分であって、その抗体に認識されうる部分を含むことを意味する。エピトープまたは「抗原決定基」は、アミノ酸や糖の側鎖などの化学的に活性な表面分子基から通常なり、特定の三次元構造特性のみならず特定の電荷特性も有する。
「抗原」は、抗体に結合されることのできる分子またはその分子の一部分であり、抗原のエピトープに結合できる抗体を動物にさらに産生させることができる。抗原は１またはそれより多くのあるエピトープを有していてもよい。前述の特異的な反応は、抗原が高度な選択性様式で相当する抗体と反応するが、ほかの抗原によって引きおこされてもよいほかの多数の抗体とは反応しないことを示すよう意図されている。
本発明で有用な抗体のフラグメントを含む抗体は、サンプル中の「デス・ドメイン」モチーフ結合タンパク質またはペプチド（相補的ペプチドを含む）の定量的または定性的検出または本発明の「デス・ドメイン」モチーフ結合タンパク質またはペプチドを発現する細胞の存在を検出するために用いてよい。これは、光学顕微鏡的、フローサイトメトリック的または蛍光定量的検出と組み合わされた、蛍光的に標識された抗体を用いる免疫蛍光法（以下参照）によって確立されうる。
本発明で有用な抗体（またはそのフラグメント）は、本発明の「デス・ドメイン」モチーフ結合タンパク質またはペプチドのｉｎ  ｓｉｔｕでの検出のために、免疫蛍光法または免疫電子顕微鏡法のように、組織学的に使用されてもよい。Ｉｎ  ｓｉｔｕ検出は患者から組織学的な試料を採取し、その試料に標識された本発明の抗体を提供することによって完成する。抗体（またはフラグメント）は好ましくは、標識抗体（またはフラグメント）を生物学的サンプルに適用するかまたは上にかぶせることにより提供される。このような操作を用いると、「デス・ドメイン」モチーフ結合タンパク質またはペプチドの存在のみならず、検査される組織でのその分布も測定されうる。本発明を用いると、広く様々な組織学的な方法（染色操作など）のいずれもが、そのｉｎ  ｓｉｔｕ検出を達成するために修飾されうる、ということを当業者であれば容易に認めるであろう。
本発明の「デス・ドメイン」モチーフ結合タンパク質のためのアッセイは典型的には、生物学的サンプル、たとえば生物学的液体、組織抽出物、リンパ球や白血球などの新鮮にえられた細胞または組織培地でインキュベートされた細胞など、を「デス・ドメイン」モチーフ結合タンパク質またはペプチドを同定することのできる検出可能な標識抗体の存在下でインキュベートし、当該分野でよく知られている多くの技法のうちのいずれかによりその抗体を検出することからなる。
生物学的サンプルはニトロセルロースのような固相支持体もしくは固相キャリヤー、または細胞、細胞の粒子もしくは可溶性タンパク質を固定化することのできるほかの固体支持体もしくは固体キャリヤーで処理されてもよい。支持体またはキャリヤーは適切な緩衝液で洗浄され、前記のように本発明の検出可能な標識抗体で処理してもよい。そののち、固相支持体またはキャリヤーを緩衝液で２度洗浄して結合していない抗体を除去してもよい。この固相支持体またはキャリヤーに結合した標識の量は従来の手段により検出すればよい。
「固相支持体」、「固相キャリヤー」「固体支持体」、「固体キャリヤー」、「支持体」または「キャリヤー」は、抗原や抗体を結合することのできるいかなる支持体またはキャリヤーをも意味するものである。よく知られている支持体またはキャリヤーとしては、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、中性セルロースおよび修飾されたセルロース、ポリアクリルアミド、ハンレイガン（ｇａｂｂｒｏｓ）およびマグネタイトがあげられる。キャリヤーの特性は、本発明の目的のためにはある程度まで可溶性であるかまたは不溶性であることができる。支持体の材料は事実上、結合される分子が抗原か抗体に結合できる限り、いかなる構造のコンフィグレーションであってもよい。このように、支持体またはキャリヤーのコンフィグレーションは、ビーズのような球状、試験管の内側表面またはロッドの外側表面のような円筒状であってもよい。また、表面はシート、テストストリップなどのように平らであってもよい。好ましい支持体またはキャリヤーはポリスチレンビーズを含む。抗体または抗原を結合するためのほかの適するキャリヤーについては、当業者であればわかり、ルーチンの実験を用いることにより同一のものを確認できるであろう。
前述のようにして本発明でえられた多数の抗体の結合活性は、よく知られている方法により測定すればよい。当業者であればルーチンの実験を用いることにより各測定のための操作および最適なアッセイ条件を決定することができるであろう。
洗浄、撹拌、振とう、ろ過などのほかのステップは、通常のようにまたは特定の条件に対しては必要に応じてアッセイ追加してもよい。
本発明の抗体を検出可能となるように標識することのできる方法のうちの１つは、抗体に酵素を結合させ、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）を用いることである。この酵素は、のちに適切な基質にさらされると検出可能な、たとえば分光光度的、蛍光定量的または可視的手段により、化学的分子を産生するように基質と反応するであろう。抗体を検出可能にするために標識する際に用いることのできる酵素は、限定されないが、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、スタフィロコッカスのヌクレアーゼ、デルタ−５−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、アルファ−グリセロリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、西洋ワサビパーオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼおよびアセチルコリンエステラーゼがあげられる。検出は酵素用の色素基質を用いる色素法により行なうことができる。検出は、同様にして調製されたスタンダードと比較した基質に対する酵素反応の程度を視覚的に比較することにより行なってもよい。
検出は様々なほかの免疫測定法を用いて行なってもよい。たとえば、放射能で標識された抗体または抗体のフラグメントにより、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）を用いてＲ−ＰＴＰアーゼを検出することができる。ＲＩＡについての好ましい記載は、Ｗｏｒｋ，Ｔ．Ｓ．らによるＬａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｎｏｒｔｈ  Ｈｏｌｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，ＮＹ（１９７８）に見られ、とくにＣｈａｒｄ，Ｔ．による“Ａｎ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｅ  Ａｓｓａｙ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”というタイトルの章に言及されている。これは「参考文献」の欄によりここに取り入れられている。放射性アイソトープも、γカウンターまたはシンチレーションカウンターを用いてまたはオートラジオグラフィーを用いて検出することができる。
本発明の抗体を蛍光化合物で標識することも可能である。蛍光的に標識された抗体が適切な波長の光にさらされると、その存在は蛍光により検出することができる。通常最もよく用いられている蛍光標識化合物は、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒドおよびフルオレスカミンである。
抗体は、152Ｅまたはランタニド系のほかのものなどの蛍光発光金属を用いて検出可能に標識することもできる。これらの金属は、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＥＴＰＡ）などの金属キレート基を用いて抗体に付着させることができる。
抗体は、化学発光化合物を結合させることにより検出可能に標識することもできる。化学発光が付された抗体の存在は、化学反応の過程の間に生ずる発光体の存在を検出することにより測定される。とくに有用な化学発行標識化合物の具体例は、ルミノール、イソルミノール、サーマティック  アクリジニウムエステル（ｔｈｅｒｏｍａｔｉｃ  ａｃｒｉｄｉｎｉｕｍ  ｅｓｔｅｒ）、イミダゾール、アクリジニウム塩およびオキシレートエステルである。
同様に、バイオ発光化合物が本発明の抗体の標識に用いられてもよい。バイオ発光体は、触媒性タンパク質が化学発光反応の効率を増加させる生物学的なシステムに見出されるタイプの化学発光体である。バイオ発光タンパク質の存在は、発光体の存在を検出することにより測定される。標識の目的のための重要なバイオ発光化合物は、ルシフェリン、ルシフェラーゼおよびエクオリンである。
本発明の抗体分子は「ツーサイト」アッセイまたは「サンドイッチ」アッセイとしても知られている、免疫的定量アッセイに利用するために適応させてもよい。典型的な免疫的定量アッセイでは、一定量の未標識抗体（または抗体のフラグメント）を固体支持体またはキャリヤーに結合させ、検出可能に標識した一定量の可溶性抗体を加えて、固相抗体、抗原および標識抗体間で形成された３成分の複合体を検出および／または定量する。
典型的で好まれる免疫定量アッセイは「フォーワード（ｆｏｒｗａｒｄ）」アッセイであり、そこでは固相に結合した抗体がまず試験されるサンプルに接触し、２成分の固相抗体−抗原複合体の形成によりサンプルから抗原を抽出する。適切なインキュベーション期間ののち、固相支持体またはキャリヤーを洗浄して未反応の抗原を含む残った液体サンプルを除去し、未知の量の標識抗体（「レポーター分子」として働く）を含む溶液を接触させる。未標識抗体を介して固体支持体またはキャリヤーに結合した抗原と標識抗体とを複合体とするために２回目のインキュベーションをしたのち、固体の支持体またはキャリヤーを２回洗浄し、未反応の標識抗体を除去する。
本発明の抗原を用いると有用なアッセイでもあるほかのタイプの「サンドイッチ」アッセイ、いわゆる「同時に（ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ）」および「リバース（ｒｅｖｅｒｓｅ）」のアッセイ、が用いられる。同時のアッセイは、固体支持体またはキャリヤーに結合した抗体および標識抗体が試験されるサンプルに同時に加えられるので、１つのインキュベーションステップからなる。インキュベーションが完了すると、固体支持体またはキャリヤーを洗浄して残った液体サンプルおよび複合化されなかった標識抗体を除去する。固体支持体またはキャリヤーに結合した標識抗体の存在は、通常の「フォーワード」サンドイッチアッセイのようにして測定される。
「リバース」アッセイでは、標識抗体の溶液をまず液体サンプルに段階的に加え、つづいて固体支持体またはキャリヤーに結合する未標識の抗体を、適切なインキュベーションを行なったのちに加える。２回目のインキュベーションののちに、固相を通常の様式で洗浄し、試験されるサンプルおよび未反応の標識抗体の溶液の残りからそれを解放する。固体支持体またはキャリヤーに連結した標識抗体は、「同時に」および「フォーワード」アッセイで行なうようにして測定される。
本発明の新規なタンパク質およびペプチドは当技術において知られる標準的なスクリーニング操作のいずれか、たとえば酵母ツーハイブリッド方法、アフィニティークロマトグラフィー、およびほかのいずれかのよく知られる方法によりひとたび単離、同定および特徴付けされ、つぎに標準的な組換えＤＮＡ操作（たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ.，１９８９参照）により産生されてもよい。その操作では、タンパク質をコードする配列を含む適切な真核生物または原核生物のベクターにより、適切な真核生物または原核生物の宿主細胞が形質転換される。したがって、本発明は本発明のタンパク質を産生するためのそのような発現ベクターおよび形質転換された宿主にも関する。前述のように、これらのタンパク質はそれらの生物学的活性を有する類似体および誘導体を含み、したがってそれらをコードするベクターもこれらのタンパク質の類似体をコードするベクターを含み、形質転換された宿主は前記類似体を産生する宿主を含む。これらのタンパク質の誘導体は形質転換された宿主により産生されるタンパク質またはそれらの類似体を標準的に修飾することにより産生される誘導体である。
別の観点では、本発明は天然の「デス・ドメイン」モチーフ含有タンパク質により媒介される細胞内効果を増大（機能の獲得）するための作用物として、様々な異なる「デス・ドメイン」モチーフまたは合成して産生された「一般的な」「デス・ドメイン」モチーフ（多くの異なる「デス・ドメイン」モチーフに共通の構造的特徴を有する）の使用に関する。この観点では「デス・ドメイン」モチーフは「デス・ドメイン」モチーフの全てまたはその活性を有する部分を含むペプチドの形態で、前記細胞内へ導入される（たとえば、ワクシニアウイルスアプローチ）。これに関して、用語「デス・ドメイン」は、ｐ５５  ＴＮＦ−ＲおよびＦＡＳ−Ｒの細胞内ドメインの領域は、リガンドに依存せずに自己会合し、これらの受容体によって介される細胞障害性の誘導に関与していたという発見（共に係属中の前述の特許出願参照）に続いて作り出されたものである、ということを記載しておくべきであろう。事実、ｐ５５  ＴＮＦ−Ｒの遊離「デス・ドメイン」（ｐ５５  ＤＤ）は自己会合でき、細胞に細胞障害を誘導することができる。さらに、ＦＡＳ−Ｒ結合タンパク質であるＭＯＲＴ１タンパク質の発見の際に、このタンパク質が自己会合でき、リガンドに依存せずかつＦＡＳ−Ｒにも依存せずに細胞に細胞障害活性を誘導することができる、ということも見出された。そののち、ＭＯＲＴ１タンパク質はｐ５５  ＴＮＦ−ＲおよびＦＡＳ−Ｒの「デス・ドメイン」または「デス・ドメイン」モチーフと相同な「デス・ドメイン」モチーフを含有することが観察され（図１参照）、その「デス・ドメイン」がＭＯＲＴ１とＦＡＳ−Ｒとの会合に関与し、かつＭＯＲＴ１タンパク質の細胞に対する細胞障害性効果を誘導する能力とも関連していることがわかった。
したがって、前述のようにｐ５５  ＴＮＦ−Ｒ、ＦＡＳ−ＲおよびＭＯＲＴ１ならびに細胞障害性効果の誘導二関与するほかのタンパク質などのタンパク質の「デス・ドメイン」モチーフを用いると、自然に生じるこれらタンパク質の一部分によって介される通常の細胞に対する細胞障害性効果を増大することが可能となる。すなわち、腫瘍細胞、ＨＩＶ感染細胞およびほかの疾患の細胞などの細胞を殺すことを増大することができ、それは前記細胞にこれら受容体／タンパク質の「デス・ドメイン」モチーフを導入することによりｐ５５  ＴＮＦ−Ｒ、ＦＡＳ−Ｒ、ＭＯＲＴ１、ＲＩＰまたはＴＲＡＤＤを介して通常行われる。
さらに、「デス・ドメイン」モチーフの作用をさらに増大させる、すなわち細胞への細胞障害性を増大させる、これら「デス・ドメイン」モチーフの類似体を産生することもできる。これら類似体は自然に生ずる配列に対して１またはそれより多くのアミノ酸が付加、欠失または置換されている。
同様に、前述の手段によって、ＮＧＦ−Ｒまたはアンキリン１によって介される細胞内の効果を増大するよう望まれる細胞へ、ＮＧＦ−Ｒまたはアンキリン１の「デス・ドメイン」モチーフまたはその類似体を導入することもできる。
同様に、本発明は、「デス・ドメイン」モチーフ含有タンパク質の「デス・ドメイン」モチーフの活性をブロックすることにより、たとえば「デス・ドメイン」モチーフの発現をブロックするであろうアンチセンスオリゴヌクレオチドを（前述の）細胞に導入することにより、これらタンパク質によって介される効果を特異的にブロックすることにも関する。
本発明者のさらなるほかの観点では、１またはそれより多くの「デス・ドメイン」モチーフ含有タンパク質の「デス・ドメイン」モチーフに特異的に結合できる有機化合物、たとえば複素環式化合物が提供される。これらの有機化合物は医薬の分野でよく知られており、細胞に入って様々な細胞内タンパク質や膜貫通タンパク質の細胞内の部分を結合することができ、それによりそれらの効果を発揮する治療薬として広く用いられている。この有機化合物は、「デス・ドメイン」モチーフ含有タンパク質の「デス・ドメイン」モチーフ、たとえばｐ５５  ＴＮＦ−Ｒ、ＦＡＳ−Ｒ、ＮＧＦ−Ｒ、ＭＯＲＴ１、アンキリン１のものを用いて、標準的なアフィニティクロマトグラフィーの操作やこの分野でよく知られている方法で、容易にスクリーンされて同定されることができる。
「デス・ドメイン」モチーフは、様々な前記モチーフのすべてに共通する概括的な特徴、共通のスカホールド（ｓｃａｆｆｏｌｄ）、と各「デス・ドメイン」モチーフに特定の、特定の構造の特徴との両者からなることも記載しておくべきである。したがって、本発明の好ましい薬物または薬学的に活性な分子は、活性成分として、自然に生ずるタンパク質またはペプチド、相補的なペプチドを含有する合成により製造されるタンパク質またはペプチド、抗体またはスクリーニングやデザインによりえられる化学化合物、これらすべては概括的な「デス・ドメイン」の特徴と１またはそれより多くの特定の「デス・ドメイン」の特徴を認識できるということにより特徴付けらる、を含有するであろう。
本発明は、「デス・ドメイン」モチーフ結合タンパク質もしくはペプチドまたは「デス・ドメイン」モチーフ配列そのものをコードする組換え動物ウイルスベクターであり、特定の標的細胞（たとえば、癌細胞）の表面タンパク質と結合して「デス・ドメイン」モチーフ結合タンパク質もしくはペプチドまたは「デス・ドメイン」モチーフ配列を細胞に直接挿入できるウイルス表面タンパク質もコードするベクターからなる。同様に、本発明は、「デス・ドメイン」モチーフ含有タンパク質の「デス・ドメイン」モチーフに結合できる有機化合物からなる薬学的組成物にも関する。
つぎに本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はつぎの実施例およびそれにともなう図面に限られるものではない。
実施例１
受容体ｐ５５  ＴＮＦ−Ｒ、ＦＡＳ−ＲおよびＮＧＦ−Ｒならびにタンパク質ＭＯＲＴ１およびアンキリン１に共通な「デス・ドメイン」モチーフ
ＭＯＲＴ１の発見（共に係属中ＩＬ  １０９６３２，ＩＬ  １１２００２および１１２６９２参照）の結果、ＭＯＲＴ１は先に同定されたｐ５５  ＴＮＦ−ＲおよびＦＡＳ−Ｒの「デス・ドメイン」（（それぞれｐ５５ＤＤおよびＦＡＳ−ＤＤ）ＩＬ  １０９６３２およびＩＬ  １１１１２５参照）に相同性を有する領域を含むことも発見された。前記の未知のタンパク質における「デス・ドメイン」のこの驚くべき発見は、ほかのタンパク質におけるそのような「デス・ドメイン」の存在を調査することに至らせた。驚くべきことに、このような「デス・ドメイン」モチーフは低親和性ＮＧＦ−Ｒにおいておよび明らかに関係しない、細胞骨格タンパク質、アンキリン１において発見された。ｐ５５  ＴＮＦ−Ｒ、ＦＡＳ−Ｒ、ＭＯＲＴ１、低親和性ＮＧＦ−Ｒおよびアンキリン１の調節ドメインのＣ末端部分（全てヒト由来）の「デス・ドメイン」モチーフの配列比較を示す図１に模式的に説明するように、全てのこれら異なるタンパク質の「デス・ドメイン」モチーフは顕著な相同性を共有する。これらの「デス・ドメイン」モチーフの相同性は、ＧＣＧパッケージのＬＩＮＥＵＰおよびＰＲＥＴＴＹプログラムにより明らかにされた。タンパク質の３またはそれより多くにおいて一致および類似した残基は囲んだ。整列線（ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）を最大化するために導かれたギャップは、点により記した。この相同性の意義は以下のように確認された。（ａ）ＰｒｅｄｉｃｔＰｒｏｔｅｉｎ  ＳｅｒｖｉｃｅのＨＳＳＰプログラム（Ｓａｎｄｅｒ  ａｎｄ  Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，１９９１）を用いると、「デス・ドメイン」モチーフ配列の多様な整列線は２１〜３８％の配列一致および３０〜４８％の配列類似を示した。（ｂ）既知のｐ５５  ＲおよびＦＡＳ−Ｒ（ヒト、マウス、ラット）、ＮＧＦ受容体（ヒト、ラットおよびニワトリ）およびアンキリン類（ヒトおよびマウス  アンキリン１ならびにヒト  アンキリン類ｃおよびｇ）の配列ならびにＭＯＲＴ１における「デス・ドメイン」モチーフ配列のコンセンサスから創作された（ＧＣＧパッケージのＰＩＬＥＵＰ、ＬＩＮＥＵＰおよびＰＲＯＦＩＬＥＭＡＫＥ  プログラムを用いた）プロフィールでのＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  ｄａｔａ  ｂａｎｋの調査は、プロフィールを創作するために用いたそれらの配列のみに高いスコアをだした（Ｚｓｃｏｒｅｓ＞８．５“Ｂｉｏａｃｃｅｌｅｒａｔｏｒ”Ｃｏｍｐｕｇｅｎ、イスラエル国でのそれら全ての調査について）。
ＰｒｅｄｉｃｔＰｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅ（ＰＨＤｓｅｃ）およびＧＣＧパッケージのＰＲＯＤＯＭプログラムを用いた前記相同性調査は、ＦＡＳ−Ｒに結合する分子の部分内の、ＭＯＲＴ１における約６５残基の領域とＦＡＳ−Ｒおよびｐ５５−Ｒの「デス・ドメイン」内の同じ長さの領域との間に顕著な類似性を示した（図１）。「デス・ドメイン」のこの部分は、低親和性ＮＧＦ受容体（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ.，１９８６）、細胞外ドメインがＦＡＳ−Ｒ、ＴＮＦ−Ｒｓに共通な別の保存された配列モチーフを含むことが知られる受容体およびＴＮＦ／ＮＧＦ受容体ファミリーのほかのメンバーの細胞内ドメインにおける領域にも類似性を示す。また、スペクトリンベースの膜骨格タンパク質を内在性細胞膜タンパク質の細胞質ドメインに連結する構造タンパク質である、アンキリンの「デス・ドメイン」のこの部分と保存された領域との間に、前記知られない類似性があることも示した。その領域はアンキリン調節ドメインのＮ末端部分、選択的スプライシングにより発現がモジュレーションされるドメインの部分のすぐ上流および下のスペクトリン−結合および膜結合ドメインに位置する（後者のドメインは別の既知配列モチーフ「アンキリンリピート」を含む。）「デス・ドメイン」モチーフはアンキリンの膜結合ドメインで見出されるアンキリンリピートモチーフとは異なる。
異なる細胞内の効果を有するタンパク質における「デス・ドメイン」の発見は、このモチーフは名称「デス・ドメイン」に意味されるよりもより一般的な役割を果たし、すなわちこのモチーフは細胞の細胞傷害性を媒介するｐ５５  ＴＮＦ−Ｒ、ＦＡＳ−Ｒのような受容体および関係するタンパク質ＭＯＲＴ１だけでなく、細胞死を誘導する際、リガンドの不存在下でのみ媒介するＮＧＦ−Ｒ（Ｒａｂｉｚａｄｅｈ  ｅｔ  ａｌ.，１９９３）および細胞傷害性効果と関連しない、細胞骨格アンキリンのようなタンパク質において生じる。この「デス・ドメイン」に一般的な活性の１種は、それを含むタンパク質の現在までのところ３つ、すなわちＦＡＳ−Ｒ、ｐ５５  ＴＮＦ−ＲおよびＭＯＲＴ１で見出された、自己会合またはこのモチーフを含むほかのタンパク質と相互作用する能力である。
異なるタンパク質のこのように広い範囲での「デス・ドメイン」モチーフの発見は、異なる（１またはそれより多くの）「デス・ドメイン」モチーフに結合することができるタンパク質またはペプチドをえるための方法（前記および後記実施例２に記載）を提供し、そのタンパク質およびペプチドは、細胞の細胞傷害性（ｐ５５  ＴＮＦ−Ｒ、ＦＡＳ−Ｒ）または成長性（ＮＧＦ−Ｒ）効果に関与するサイトカイン受容体または細胞の細胞傷害性に関与する関係するタンパク質（ＭＯＲＴ１）または細胞の形状／形態調節に関与する構造タンパク質（アンキリン）の調節部分といった、広い範囲の調節タンパク質のモジュレーター／メディエーターとして用いられるであろう。同様に、これらの様々なタンパク質の「デス・ドメイン」モチーフは、前記モチーフを含むタンパク質のモジュレーション／媒介に直接的に用いられることもあろう。
実施例２
ヒト  ｐ５５−ＴＮＦ−Ｒ、ＦＡＳ−Ｒ、ＴＲＡＤＤ、ＭＯＲＴ−１およびＲＩＰの「デス・ドメイン」の相互作用
ａ）実験手順
ツーハイブリッド  β−ガラクトシダーゼ発現試験−ｃＤＮＡ挿入物は、我々の研究室で先にクローン化した全長ｃＤＮＡｓからか、購入したｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲによりクローン化した。ｃＤＮＡ挿入物によりコードされるタンパク質における残基の番号付けはＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋにならう。点突然変異体をオリゴヌクレオチド−指示突然変異誘発（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（Ｋｕｎｋｅｌ，１９９４）により生産した。ｐＧＢＴ−９およびｐＧＡＤ−ＧＨベクターにおけるこれらのｃＤＮＡｓを形質転換（それぞれＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）および活性化ドメイン（ＡＤ）構築物）した酵母におけるβ−ガラクトシダーゼ発現（ＳＦＹ５２６  レポーター株（Ｂａｒｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ.，１９９３））はフィルターアッセイにより評価した（Ｂｏｌｄｉｎ  ｅｔ  ａｌ.，１９９５）。ｐＧＡＤ−ＧＨベクターで発現されると、ＲＩＰおよびそのＤＤは酵母にいくらかの細胞傷害性効果を有し、酵母コロニーの低い収率を明示した。ｐＧＢＴ−９ベクターで発現された（低い程度で）ばあいは、前記細胞傷害性効果は何ら有さなかった。
タンパク質の誘導された発現、代謝的標識および免疫沈降法−ＤＤｓのサイズ類似性のため、ゲル電気泳動でそれらを区別することは難しく、我々は全長ＭＯＲＴ−１タンパク質をＴＲＡＤＤおよびＲＩＰのＤＤｓと同時発現することによりＭＯＲＴ−１、ＴＲＡＤＤおよびＲＩＰの相互作用を調べることを選択した。ＦＬＡＧオクタペプチドに（Ｅａｓｔｍａｎ−Ｋｏｄａｋ，Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ，ＣＴ）またはインフルエンザ血球凝集素エピトープ（ＨＡエピトープ、ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ（Ｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ.，１９８８））にＮ末端結合したタンパク質を、テトラサイクリン−制御発現ベクターを用いて、ＨｅＬａ細胞で発現させ、前記（Ｂｏｌｄｉｎ  ｅｔ  ａｌ.，１９９５）のように［35Ｓ］−Ｍｅｔ（５５μＣｉ／ｍｌ）および［35Ｓ］−Ｃｙｓ（１０μＣｉ／ｍｌ）（ＥＸＰＲＥ35Ｓ35Ｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｍｉｘ，ＤｕＰｏｎｔ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）で代謝的に標識した。つぎに細胞をＲＩＰＡ緩衝液（１ｍｌ／５×１０5細胞）に溶解し、溶解質を無関係な抗血清（３μｌ／ｍｌ）およびプロテインＧセファロースビース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ、６−μｌ／ｍｌ）とのインキュベーションにより前清浄した。免疫沈降法はＦＬＡＧオクタペプチド（Ｍ２、Ｅａｓｔｍａｎ  Ｋｏｄａｋ）に対するマウスモノクローナル抗体（５μｇ／アリコート）とともに溶解質の０．３ｍｌアリコートを４℃で１時間インキュベートすることにより行なった。続いて、コントロールとしてＨＡエピトープ（１２ＣＡ５（Ｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ.，１９８８））、またはｐ７５  ＴＮＦ−Ｒ（＃９、（Ｂｉｇｄａ  ｅｔ  ａｌ.，１９９４））をプロテインＧセファロースビーズ（３０μｌ／アリコート）とともにさらに１時間インキュベートした。免疫沈降物をＲＩＰＡ緩衝液で３度洗浄し、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析した。
ｂ）評価
ヒト  ｐ５５  ＴＮＦ−Ｒ、ＦＡＳ−Ｒ、ＴＲＡＤＤ、ＭＯＲＴ−１およびＲＩＰのＤＤｓの相互作用はまず酵母ツーハイブリッド試験により評価した。これらのドメインをコードするｃＤＮＡｓを酵母ＳＦＹ５２６レポーター株においてＧａｌ４ＤＮＡ結合および活性化ドメイン（ＤＢＤおよびＡＤ構築物）とともに融合タンパク質として発現させ、これらの融合タンパク質の互いの結合を酵母によるβ−ガラクトシダーゼ発現を明らかにすることにより評価した。これらの試験の結果を図１に要約し、図３に概略的に表す。
ｐ５５  ＴＮＦ−Ｒ、ＦＡＳ−Ｒ、ＴＲＡＤＤおよびＲＩＰのＤＤｓは自己会合することができる。かりに全長ＭＯＲＴ−１タンパク質は自己会合するとしても（Ｂｏｌｄｉｎ  ｅｔ  ａｌ.，１９９５）、明らかにそのＤＤの上流領域に関与する相互作用によって、ＭＯＲＴ−１のＤＤはこの能力に欠いている。
ＴＲＡＤＤのＤＤはｐ５５  ＴＮＦ−ＲのＤＤには結合したが、ＦＡＳ−ＲのＤＤには結合せず、一方、ＭＯＲＴ−１のＤＤは反対の様式を示した。
全長ＲＩＰタンパク質のような（Ｓｔａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ.，１９９５）、ＲＩＰのＤＤはＦＡＳ−Ｒおよびｐ５５  ＴＮＦ−ＲのＤＤｓに共に結合することができた。といっても結合はこれらの受容体へのＴＲＡＤＤおよびＭＯＲＴ−１のＤＤｓの結合よりも顕著に弱かった。ＲＩＰはＦＡＳ−Ｒへのツーハイブリッドスクリーンにおける結合の効力により初め同定されたが（Ｓｔａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ.，１９９５）、この結合はかなり弱く、ＡＤ構築物へそれを導入することにより、ＲＩＰのＤＤが酵母で高く発現されたときのみ観察できた。ＲＩＰのＤＤがＤＢＤ構築物へ導入されたときは、より低い発現の有効性を有し、測定可能な結合はなかった。タンパク質のアミノ酸１６１〜３７２に相当するより長いＲＩＰ挿入物はＦＡＳ−Ｒへより有効には結合しなかった（示さず）。
ｐ５５  ＴＮＦ−ＲまたはＦＡＳ−ＲのＤＤｓへのそれらの観察された結合とは別に、試験した３つの細胞内タンパク質のそれぞれのＤＤｓはまた互いに結合した。これらの相互作用は全て有効であった。明白に、ＲＩＰのＤＤのＭＯＲＴ−１およびＴＲＡＤＤのＤＤｓへの結合の有効性はｐ５５  ＴＮＦ−ＲおよびＦＡＳ−ＲのＤＤｓへ結合の有効性より顕著に大きかった。
相互作用の類似のパターンが、ツーハイブリッドスクリーンのために発明者の研究室で通常用いられるＨＦ７ｃ酵母レポーター株で観察された。実際、ツーハイブリッドスクリーンによりＭＯＲＴ−１へ結合するタンパク質をクローン化しようとする最近の試みでは、クローン化したｃＤＮＡｓの顕著なプロポーションはＴＲＡＤＤまたはＲＩＰをコードすることが見出された（示さず）。
ツーハイブリッドアッセイのための特異性試験では、ＳＮＦ１、ヒト  ｐ７５  ＴＮＦ受容体の細胞内ドメイン、ラミン、サイクリンＤおよびラット低親和性ＮＧＦ受容体のＤＤを含む、多数の無関係なタンパク質のいずれにもＤＤモチーフの結合は観察されなかった。さらに結合の特異性を評価するために、マウス  ＦＡＳ−Ｒ配列のＩ−２２５の部位に相当する部位で、ｐ５５  ＴＮＦ−Ｒ、ＦＡＳ−Ｒ、ＭＯＲＴ−１およびＲＩＰ  ＤＤｓに点突然変異を導入した。ｌｐｒcgマウスで見出される、この残基の自然に生じる置換突然変異はＦＡＳ−Ｒによるシグナリング（Ｉｔｏｈ  ａｎｄ  Ｎａｇａｔａ，１９９３；Ｗａｔａｎａｂｅ−Ｆｕｋｕｎａｇａ  ｅｔ  ａｌ.，１９９２）だけでなく、ＭＯＲＴ−１とのその相互作用（Ｂｏｌｄｉｎ  ｅｔ  ａｌ.，１９９５；Ｃｈｉｎｎａｌｙａｎ  ｅｔ  ａｌ.，１９９５）も廃止する。ヒト  ｐ５５  ＴＮＦ−Ｒ（Ｌ３５１Ｎ）およびＦＡＳ−Ｒ（Ｖ２３８Ｎ）のＤＤｓにおける相当する残基の突然変異は類似の効果を有した。突然変異したタンパク質は自己会合できず、ＴＲＡＤＤ、ＭＯＲＴ−１またはＲＩＰに結合することもできなかった。また、ｌｐｒcgの置換突然変異に相当する部位でのＲＩＰのＤＤへの置換突然変異（Ｆ３０８Ｎ）の導入は、たとえ突然変異したタンパク質が正常なＲＩＰ  ＤＤに結合するとしても、ＦＡＳ−Ｒ、ＭＯＲＴ−１およびＴＲＡＤＤへの結合だけでなく自己会合するための能力にも欠くという結果になった。他方では、ＭＯＲＴ−１でのｌｐｒcgのような突然変異（Ｖ１２１Ｎ）は限られた効果しか有さなかった。突然変異したタンパク質がＡＤ構築物へは導入されるがＤＢＤ構築物へは導入されないときのみ、いくつかの理由で、ＦＡＳ−Ｒへのより低い効果の結合が観察されるという結果になった。
酵母ツーハイブリッド試験においてＴＲＡＤＤ、ＭＯＲＴ−１およびＲＩＰの間に観察された相互作用は真核細胞でも生じるかどうかを試験するために、トランスフェクトしたＨｅＬａ細胞内でＭＯＲＴ−１ならびにＴＲＡＤＤおよびＲＩＰのＤＤｓを同時に発現し、細胞の溶解質からそれらを免疫沈降することを試みた。免疫沈降は、ＨｅＬａ細胞内で互いに結合することを示す、同時発現したタンパク質の沈降という結果なった（図４）。
たとえ証拠がなお主として間接的だとしても、ＴＲＡＤＤ、ＭＯＲＴ−１およびＲＩＰはｐ５５  ＴＮＦ−ＲおよびＦＡＳ−Ｒの細胞致死性効果の開始に重要な役割を果たすと思われる（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ  ａｎｄ  Ｉｈｌｅ，１９９５）。これらのタンパク質の受容体への結合は、そのＤＤｓを通じて生じ、明らかにシグナリングへの寄与に要求されている。細胞でのＦＡＳ−Ｒの刺激はＭＯＲＴ−１のこの受容体への結合を換起することを示す最近の研究は、トランスフェクトされた酵母において観察されるＤＤ相互作用はホ乳類の細胞においても生じ、シグナリング誘導の過程に係わることを示唆する（Ｋｉｓｃｈｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ.，１９９５）。たとえ調べた全てのタンパク質のＤＤｓがほかのＤＤｓに結合する能力を有するとしても、この相互作用には明らかな特異性がある。ＴＲＡＤＤのＤＤはｐ５５  ＴＮＦ−ＲのＤＤには結合するが、ＦＡＳ−ＲのＤＤには結合しない。ＭＯＲＴ−１のＤＤはＦＡＳ−ＲのＤＤには結合するが、ｐ５５  ＴＮＦ−ＲのＤＤには結合しない。ｐ５５  ＴＮＦ−ＲおよびＦＡＳ−Ｒのシグナリング活性に係わるタンパク質の活動におけるこの特異性は２つの受容体の機能における違いに寄与しているであろう。
ｐ５５  ＴＮＦ−ＲおよびＦＡＳ−ＲのＤＤｓへのそれらの異なる結合に加えて、ＴＲＡＤＤおよびＭＯＲＴ−１のＤＤｓもまた互いに有効に結合することができ、両者はＦＡＳ−Ｒまたはｐ５５  ＴＮＦ−ＲのＤＤｓへよりもより有効にＲＩＰのＤＤに結合することができる。このように、たとえ異なっていても、ＴＲＡＤＤおよびＭＯＲＴ−１により影響を及ぼされるシグナリングカスケードはそれらの互いの相互作用を通じてコーディネートされることになるであろう。このコーディネーションの性質は、与えられるタンパク質におけるＤＤの異なる相互作用が互いに影響を及ぼす方法に依存して、変わるであろう。これらの相互作用は共に生じるか排他的であろうし、また互いにモジュレートするであろう。前記モジュレーションのための１つの可能な方法はタンパク質キナーゼに特徴的な配列モチーフのＲＩＰでの存在により示される。かりにこのタンパク質がほんとうにタンパク質キナーゼ活性を有するならば、それらへの結合でＭＯＲＴ−１およびＴＲＡＤＤをリン酸化し、それによりそれらの機能をモジュレートすることができるようになろう。ＴＲＡＤＤおよびＭＯＲＴ−１の会合、およびＲＩＰの両タンパク質への結合の１つのもっともらしい結論は、少なくとも部分的な、これらの効果の統合である。この統合はｐ５５  ＴＮＦ−ＲおよびＦＡＳ−Ｒ出現による細胞死の誘導は、異なった特徴、また特定の類似性と並んで、これは２つの受容体のほかの活性を共有することにもなりうるという事実を説明するかもしれない。
実施例３
「デス・ドメイン」モチーフ−含有タンパク質の「デス・ドメイン」モチーフに結合するタンパク質のクローニングおよび単離
「デス・ドメイン」モチーフ−含有タンパク質の「デス・ドメイン」モチーフ、たとえばｐ５５  ＴＮＦ−Ｒ、ＦＡＳ−Ｒ、ＮＧＦ−Ｒ、ＭＯＲＴ１およびアンキリン１の「デス・ドメイン」モチーフと相互作用するタンパク質を単離するために、共に係属中のイスラエル国特許出願番号  １０９６３２、１１２００２および１１２６９２に記載されるような酵母ツーハイブリッドシステム（Ｆｉｅｌｄｓ  ａｎｄ  Ｓｏｎｇ（１９８９））を用いた。要約すると、このツーハイブリッドシステムは、２つの別のドメイン、ＤＮＡ結合ドメインおよび活性化ドメインを有するＧＡＬ４のような真核転写アクチベーターの回復を利用して、ｉｎ  ｖｉｖｏでの特異的なタンパク質−タンパク質相互作用を検出するための酵母を用いる遺伝子アッセイである。それらドメインが発現し、結合して回復したＧＡＬ４タンパク質を形成すると、ドメインは上流の活性化配列に結合することができ、ｌａｃＺまたはＨＩＳ３などのレポーター遺伝子の発現を制御するプロモーターを順に活性化する。レポーター遺伝子の発現は培養された細胞中に容易に観察される。このシステムでは、タンパク質と相互作用する候補の遺伝子は別々の発現ベクターへクローン化される。一方の発現ベクターでは、ＧＡＬ４ＤＮＡ−結合ドメインとハイブリッドタンパク質を生成するように、ある候補タンパク質の配列がＧＡＬ４ＤＮＡ−結合ドメインの配列と同位相で（ｉｎ  ｐｈａｓｅ  ｗｉｔｈ）クローン化され、他方のベクターでは、ＧＡＬ４−活性化ドメインとハイブリッドタンパク質を生成するように、第２候補タンパク質の配列がＧＡＬ４−活性化ドメインの配列と同位相でクローン化される。つぎに２つのハイブリッドベクターは、上流のＧＡＬ４結合部位が制御されているｌａｃＺまたはＨＩＳ３レポーター遺伝子を有する酵母宿主株中へ同時に形質転換される。２つのハイブリッドタンパク質が発現しかつそれらのタンパク質が互いに相互作用しうる、形質転換されたそれらの宿主細胞（同時形質転換体）のみが、レポーター遺伝子を発現することができるであろう。ｌａｃＺレポーター遺伝子のばあい、Ｘ−ｇａｌが培地に加えられると、この遺伝子を発現している宿主細胞は色が青くなるであろう。したがって、青いコロニーは２つのクローン化された候補タンパク質が互いに相互作用することができるという事実を示す。
このツーハイブリッドシステムを用いて、「デス・ドメイン」モチーフは、別々に、ベクターｐＧＢＴ９（ＧＡＬ４ＤＮＡ−結合配列を担持する、ＣＬＯＮＴＥＣＨ、米国より入手、以下参照）へ、ＧＡＬ４ＤＮＡ−結合ドメインとの融合タンパク質を作製するために、クローン化されるであろう。ひとたび「デス・ドメイン」モチーフの配列が、たとえば図１に示されるものと知られれば、ベクターの多くのクローニング部位領域（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｓｉｔｅ  ｒｅｇｉｏｎ）（ＭＣＳ）を用いてｐＧＢＴ９ベクターへ標準的な操作により、これらのモチーフをコードするＤＮＡ配列は容易に単離およびクローン化されるであろう。
つぎに前記ハイブリッド（キメラの）ｐＧＢＴ９ベクターは、ＧＡＬ４活性化ドメインを有する、ｐＧＡＤＧＨベクターへクローン化されたヒトまたはほかのホ乳類由来のｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡライブラリー、たとえばヒトＨｅＬａ細胞由来ｃＤＮＡライブラリーとともに、ＨＦ７ｃ酵母宿主株へ、各「デス・ドメイン」モチーフ−含有ハイブリッドとの同時トランスフェクションを、別々に、同時トランスフェクトされよう（全ての前記ベクター、ｐＧＢＴ９およびＨｅＬａ細胞ｃＤＮＡライブラリーを担持するｐＧＡＤ  ＧＨ、ならびに酵母株は、ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ  ツーハイブリッドシステム  ＃ＰＴ１２６５−１の一部として、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ.，米国より購入した）。つぎに、同時トランスフェクトされた酵母をヒスチジン欠損培地（Ｈｉｓ-培地）中でのそれらの増殖能により選択した。増殖しているコロニーは陽性の形質転換体であることを示す。選択した酵母クローンは、つぎにそのｌａｃＺ遺伝子発現能、すなわちそのＬＡＣＺ活性について試験した。これは、ｌａｃＺ遺伝子によりコードされる酵素、β−ガラクトシダーゼにより異化され、青く着色した生産物を形成するＸ−ｇａｌを培地に加えることにより行なった。このように、青いコロニーは活性ｌａｃＺ遺伝子を示す。ｌａｃＺ遺伝子の活性には、ＧＡＬ４転写アクチベーターが形質転換されたクローンにおいて活性型で存在すること、すなわち前記ハイブリッドベクターの１つによりコードされるＧＡＬ４ＤＮＡ−結合ドメインが他方のハイブリッドベクターによりコードされるＧＡＬ４活性化ドメインと正確に結合することが必要である。このような組み合わせは、ＧＡＬ４ドメインのそれぞれに融合した２つのタンパク質が互いに安定に相互作用（結合）するばあいに限り可能である。このように、単離されたＨｉｓ+および青い（ＬＡＣＺ+）コロニーは、「デス・ドメイン」モチーフをコードするベクターおよびたとえば、「デス・ドメイン」モチーフに安定に結合しうるヒトＨｅＬａ細胞起源のタンパク質産物をコードするベクターとともに同時トランスフェクトされたコロニーである。
つぎに、前記Ｈｉｓ+、ＬＡＣＺ+酵母コロニー由来のプラスミドＤＮＡを単離し、標準的操作で大腸菌株ＨＢ１０１へ電気穿孔し、つづいてＬｅｕ+およびアンピシリン耐性形質転換体を選択してもよい。これらの形質転換体はＡｍｐRおよびＬｅｕ2の両コード配列を有するハイブリッドｐＧＡＤ  ＧＨベクターを担持するものである。したがって、このような形質転換体は、「デス・ドメイン」モチーフに結合しうる新たに同定されたタンパク質およびペプチドをコードする配列を担持するクローン類である。つぎにプラスミドＤＮＡをこれらの形質転換した大腸菌から単離し、
（ａ）前述のように、それらをもとの「デス・ドメイン」モチーフ−含有ハイブリッドプラスミドとともに酵母株ＨＦ７へ再形質転換すること。コントロール群として、たとえばｐＡＣＴ−ラミンまたはｐＧＢＴ９単独の配列をコードする無関係なタンパク質を担持するベクターを、「デス・ドメイン」モチーフ−結合タンパク質またはペプチドをコードするプラスミドとともに同時形質転換のために用いることもできる。つぎに同時形質転換した酵母はＨｉｓ-培地単独、または３−アミノトリアゾールの異なる濃度を含む培地で増殖について試験した、および
（ｂ）プラスミドＤＮＡおよびもとの「デス・ドメイン」モチーフハイブリッドプラスミドおよび（ａ）に記載のコントロールプラスミドを酵母宿主細胞株ＳＦＹ５２６に再形質転換することおよびＬＡＣＺ+活性（β−ｇａｌ形成の有効性、すなわち青色形成）を決定すること
により再試験した。
実施例４
クローン化したタンパク質の結合における「デス・ドメイン」モチーフに特有の配列特徴の関与の評価
「デス・ドメイン」モチーフを含むタンパク質をコードするｃＤＮＡをこのモチーフを構成する様々なアミノ酸で突然変異させてもよい。たとえば、ヒト  低親和性神経成長因子受容体（ＮＧＦ−Ｒ）の細胞内ドメインにおけるトリプトファン  ３８０をアラニンに置換するであろう。このような突然変異は、たとえばクンケル  オリゴヌクレオチド−指示突然変異誘発（Ｋｕｎｋｅｌ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）操作により行なうことができよう。変異したタンパク質だけでなく野生型タンパク質もグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合体としてバクテリア内で産生されよう。クローン化したタンパク質のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの突然変異したＮＧＦ−Ｒとの融合体への結合はＧＳＴ−野生型ＮＧＦ−Ｒ細胞内ドメイン融合体へのその結合と比較されよう。突然変異による結合の廃止は、クローン化したタンパク質はほんとうに「デス・ドメイン」モチーフに関与する配列の特徴を認識するということを示すであろう。類似のアプローチがこのモチーフを含むタンパク質と相互作用するほかの試薬、すなわち抗体、ペプチドまたは有機化合物の機能における「デス・ドメイン」に特有の配列特徴の関与を評価するために用いられよう（実施例４参照）。
実施例５
「デス・ドメイン」モチーフ−含有タンパク質に、「デス・ドメイン」と相互作用する能力の効力により影響を及ぼす薬物のデザイン
このモチーフを含むタンパク質の１つの「デス・ドメイン」モチーフと相互作用する生体分子またはペプチドはスクリーニングかデザインにより明らかにされよう。つぎに、さらなる変化が、特定の「デス・ドメイン」とその相互作用の有効性およびデザインされた化合物の「デス・ドメイン」を含むタンパク質の機能に影響を及ぼす（増大するまたは阻害する）能力を増加するために、この分子に導入されよう。ひとたびこのような分子を創作し、「デス・ドメイン」が認識する配列特徴（実施例３参照）だけでなくこの認識に関与する「デス・ドメイン」の形態的特徴を（ＮＭＲ、Ｘ線結晶解析などにより）決定すれば、この知識は「デス・ドメイン」モチーフを含むほかのタンパク質に影響を及ぼすであろう薬剤をデザインするための起点として適用されうる。そうするためには、デザインしたペプチドまたは生体分子に、さらに「デス・ドメイン」に共通な構造的特徴の認識を与える構造的特徴、またタンパク質を含む特定の「デス・ドメイン」の特定の認識を命令するであろう構造的特徴を導入すべきである。
実施例６
「デス・ドメイン」モチーフ結合タンパク質、ペプチド、抗体または生体分子の生物学的活性の分析
たとえば実施例１の操作により、ひとたび「デス・ドメイン」モチーフ結合タンパク質またはペプチドが単離されれば、その生物学的活性を試験することができる。共に係属中の出願ＩＬ  １０９６３２、１１１１２５、１１２００２および１１２６９２には、ｐ５５  ＴＮＦ−Ｒ、ＦＡＳ−ＲおよびＭＯＲＴ１（ＨＦ１）により媒介される細胞傷害性効果の細胞内ドメイン結合タンパク質の効果をアッセイする１つのこのような操作が記載されている。
このように、類似の操作を用いて、まず、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでｐ５５  ＴＮＦ−Ｒ、ＦＡＳ−Ｒ、ＮＧＦ−Ｒ、ＭＯＲＴ−１、ＲＩＰ、ＴＲＡＤＤおよびアンキリン１のような「デス・ドメイン」モチーフ−含有タンパク質と関連するそのような「デス・ドメイン」モチーフ−結合タンパク質またはペプチドの能力を決定し、そして２番目に標準的な細胞の細胞傷害性アッセイを用いて、そのような「デス・ドメイン」モチーフ結合タンパク質またはペプチドが前記ｐ５５  ＴＮＦ−ＲまたはＦＡＳ−Ｒのような受容体またはＭＯＲＴ１のようなタンパク質により誘導される細胞の細胞傷害性を増大または抑制することができるかどうかを、ｉｎ  ｖｉｖｏで評価することが可能である。
同様に、同様の試験が「デス・ドメイン」モチーフに結合することができる有機化合物（スクリーニングまたはデザインによりえられる、実施例４参照）、合成的に産生されるペプチド（実施例４参照）および抗体をアッセイするためにも適用されるであろう。
参考文献
0003860608.tif 000002
0003860608.tif 000003
配列表
（１）一般情報：
（ｉ）出願人：
（Ａ）名称：イエダ  リサーチ  アンド  ディベロップメント  カンパニー  リミテッド
（Ｂ）街路：ピーオー  ボックス  95
（Ｃ）都市：レホボト
（Ｅ）国：イスラエル国
（Ｆ）郵便番号（ZIP）：76100
（Ｇ）電話：011-972-8-382609
（Ｈ）ファクシミリ：011-972-8-407297
（Ａ）氏名：ワラック、デイビッド
（Ｂ）街路：ボロチョフ  ストリート  24
（Ｃ）都市：レホボト
（Ｅ）国：イスラエル国
（Ｆ）郵便番号（ZIP）：
（Ａ）氏名：ボルディン、マーク  ピー
（Ｂ）街路：ツェレノグラード  927-53
（Ｃ）都市：マスコウ
（Ｅ）国：ロシア連邦
（Ｆ）郵便番号（ZIP）：103575
（Ａ）氏名：バルフォロメーフ、ユージーン  イー
（Ｂ）街路：ピーオー  ボックス  26
（Ｃ）都市：レホボト
（Ｅ）国：イスラエル国
（Ｆ）郵便番号（ZIP）：76100
（Ａ）氏名：パンサー、ツィーフ
（Ｂ）街路：デューズベルクヴェーク  ６
（Ｃ）都市：マインツ
（Ｅ）国：ドイツ国
（Ｆ）郵便番号（ZIP）：D55099
（Ａ）氏名：メット、アイゴア
（Ｂ）街路：レビン  エプスタイン  ストリート60
（Ｃ）都市：レホボト
（Ｅ）国：イスラエル国
（Ｆ）郵便番号（ZIP）：
（Ａ）氏名：ゴンチャロフ、タンヤ  エム
（Ｂ）街路：シャピラ  ストリート  154、アパートメント  14
（Ｃ）都市：アシュケロン
（Ｅ）国：イスラエル国
（Ｆ）郵便番号（ZIP）：78210
（Ａ）氏名：ヴァインヴルツェル、ヘンリー
（Ｂ）街路：ヘルツル  ストリート  43
（Ｃ）都市：ラーナナ
（Ｅ）国：イスラエル国
（Ｆ）郵便番号（ZIP）：43353
（ii）発明の名称：調節タンパク質のモジュレーター
（iii）配列の数：５
（iv）コンピューター読取りフォーム：
（Ａ）媒体の形式：フロッピーディスク
（Ｂ）コンピュータ：ＩＢＭ製パーソナルコンピュータコンパチブル
（Ｃ）オペレーティングシステム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ
（Ｄ）ソフトウェア：PatentIn Release #1.0、バージョン #1.30（EPO）
（２）配列番号：１
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ：63
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：配列番号：１
0003860608.tif 000004
（２）配列番号：２
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ：63
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：配列番号：２
0003860608.tif 000005
（２）配列番号：３
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ：64
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：配列番号：３
0003860608.tif 000006
（２）配列番号：４
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ：56
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：配列番号：４
0003860608.tif 000007
（２）配列番号：５
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ：62
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：配列番号：５
0003860608.tif 000008
【図１】
0003860608.tif 000009
【図２】
0003860608.tif 000010
【図３】
0003860608.tif 000011
【図４】
0003860608.tif 000012