(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドからなり、レジオネラ（Legionella）属に属する細菌の16SrRNAの可変領域に相補的な配列を持つプローブであって、塩基配列5'AGC AAA CGC GAT AAG TTG AC3'からなることを特徴とするレジオネラ属に属する細菌検出用オリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項２】
請求項１記載のオリゴヌクレオチドプローブを放射性元素、酵素、蛍光物質または化学物質で標識してなることを特徴とするレジオネラ属に属する細菌検出用標識オリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項３】
請求項２記載の標識オリゴヌクレオチドプローブを含むことを特徴とするレジオネラ属に属する細菌検出用試薬。
【請求項４】
レジオネラ属に属する細菌、そのDNAまたはrRNAを含む検体に請求項２記載の標識オリゴヌクレオチドプローブまたは請求項３記載の試薬を接触させてハイブリダイゼーションを行った後、標識を指標にして検出することを特徴とするレジオネラ属に属する細菌の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、レジオネラ（Legionella）属に属する細菌（以下、レジオネラ属細菌という場合がある）を検出、同定または定量するためのオリゴヌクレオチドプローブおよび標識オリゴヌクレオチドプローブ、この標識オリゴヌクレオチドプローブを含むレジオネラ属細菌検出用試薬、ならびにこれらを用いたレジオネラ属細菌の検出方法である。
【０００２】
【従来の技術】
環境中からのレジオネラ検出では、通常低ｐＨ処理後WYOαなどのレジオネラ選択培地による培養によりレジオネラの定量を行っている。しかし、レジオネラ属に共通でかつ特異的な形態、生化学的性質は報告されておらず、このためコロニーが形成された後に栄養要求性やグラム染色、形態観察、抗体との反応性などを試験し、これらのいくつかの同定試験結果からレジオネラかどうか判断している。
【０００３】
すなわち培養による方法では、コロニーがレジオネラ特有の色、形、その他の特徴を示すまでには５〜１０日間必要であり、また完全な選択培地ではないため、生ずるコロニーの中にはレジオネラと類似するコロニーを形成する菌もあり、コロニーを釣菌して栄養要求性やグラム染色などの同定が必須である。このためレジオネラ細菌の検出に２週間程度の長期間を要するという問題点がある。
またレジオネラが生育していた環境中の生育条件と、選択培地を用いた生育条件とは大きく異なり、レジオネラの生理状態によっては培地上でコロニーを形成しない場合も十分考えられるという問題点もある。
【０００４】
レジオネラを検出、定量する別の手段として抗体を用いる方法があるが、レジオネラ属の広い範囲の種を検出できる抗体は報告されていない。また抗体を用いる方法は、抗体を得るまでに手間と時間がかかるという問題点がある。
【０００５】
ところで、特開昭61-88900号には、ＤＮＡプローブを用いたレジオネラの検出方法が記載されている。しかし、この方法はゲノムＤＮＡを制限酵素で部分分解して一定の分離操作後に得られるゲノムＤＮＡの断片混合物を用いているので、全く同様の断片混合物を繰返し得ることが困難であり、ロットにより特異性に差が生じるという問題点がある。また、いわゆるin situハイブリダイゼーションに用いることができないという問題点がある。さらに、ゲノムＤＮＡ断片混合物をプローブとして使用する場合、検出対象としている部分が明らかではなく、得られた結果の学問的意味付けが困難である。
【０００６】
また特公平5-78319号には、核酸プローブを用いて生物を検出、同定または定量する方法が記載されており、その実施例には２３種のレジオネラ種、具体的にはL. pnueumophila(PHA1), L. micdadei(HEBA), L. bozemanii(WIGA), L. dumoffi(TEX-KL), L. garmanii(LS-13), L. jordanis(BL540), L. longbeachae, L. MSH9, L. oakridgenis(オークリツジ10), L. lansing2, L. SC-32C-C8, L. WA-316, L. WO-44-3C(L. feeleii), L. phoenix 1, L. WA-270A, L. PF-209C-C2, L. SC 65C3(ORW), L. jamestown 26G1-E2, L. MSH-4, L. lansing 3, L. SC18-C9, L. SC63-C7, L-81-716(L. wadsworthii)を特異的に検出することができる例証的プローブが記載されている。しかし、この核酸プローブも混合物であり、前記と同様の問題点がある。またプローブの塩基の長さや配列が明らかではなく、ｒＲＮＡのどの部分を認識しているのか不明確であり、検出精度に問題がある。
【０００７】
また特表平1-503356号には、特定の配列を有する核酸プローブを用いたレジオネラの検出方法が記載され、実施例において３種の混合したプローブを用いて、２１種類（血清型を除く）のレジオネラ種を検出している。対象とされたレジオネラ種を表１に示す。
【０００８】
【表１】
0003814909.tif 000002
【０００９】
しかし上記検出方法では、３種類のプローブを調製して用いる必要があり、また知られている３８種のレジオネラ（１９９４）の約５５％しか試験されておらず、残り４５％を検出できるかどうか不明であるという問題点がある。
【００１０】
また特表平5-507206号にも、特定の配列を有するプローブを用いたレジオネラ種の検出方法が記載されている。しかしこのプローブは、レジオネラに特異的なプライマーを用いてＰＣＲで増幅された配列を検出するためのものであり、プローブのレジオネラ特異性が明らかではないという問題点がある。
【００１１】
また、In situ identification of Legionellaceae using 16S rRNA-targeted oligonucleotide probes and confocal laser scanning microscopy, Werner Manz, Rudolf Amann et. al. Microbiology(1995), 141, 29-39には、レジオネラファミリーを検出するためのプローブとして、２種類のプローブの評価結果が報告されている。一つは16SrRNAの226-243（大腸菌の16SrRNAナンバーリング）をターゲットとするプローブ、もう一つは同705-722をターゲットとするプローブである。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、短時間で多数の種のレジオネラ属細菌を一種類のプローブで特異的に高精度で検出することができ、しかも容易に調製することができるレジオネラ属細菌検出用のオリゴヌクレオチドプローブを提供し、これを用いてレジオネラ属細菌を短時間で多数の種のレジオネラ属細菌を特異的に高精度で検出することである。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明は、次のレジオネラ属細菌検出用のオリゴヌクレオチドプローブおよび標識オリゴヌクレオチドプローブ、この標識オリゴヌクレオチドプローブを含むレジオネラ属細菌検出用試薬、ならびにこれらを用いたレジオネラ属細菌の検出方法である。
（１）デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドからなり、レジオネラ（Legionella）属に属する細菌の16SrRNAの可変領域に相補的な配列を持つプローブであって、塩基配列5'AGC AAA CGC GAT AAG TTG AC3'からなることを特徴とするレジオネラ属に属する細菌検出用オリゴヌクレオチドプローブ。
（２）上記（１）記載のオリゴヌクレオチドプローブを放射性元素、酵素、蛍光物質または化学物質で標識してなることを特徴とするレジオネラ属に属する細菌検出用標識オリゴヌクレオチドプローブ。
（３）上記（２）記載の標識オリゴヌクレオチドプローブを含むことを特徴とするレジオネラ属に属する細菌検出用試薬。
（４）レジオネラ属に属する細菌、そのDNAまたはrRNAを含む検体に上記（２）記載の標識オリゴヌクレオチドプローブまたは上記（３）記載の試薬を接触させてハイブリダイゼーションを行った後、標識を指標にして検出することを特徴とするレジオネラ属に属する細菌の検出方法。
【００１４】
本発明のプローブは既知のレジオネラ16SrRNAの可変領域に相補的な配列のなかから、レジオネラ属に保存性の良く、かつ他の属と相違する部分を選び出すことによって得られたものである。すなわち本発明のプローブの配列は、レジオネラ  ニューモフィラ（Legionella pneumophila）および他のレジオネラの16SrRNAをコードするDNAの塩基配列871-890（大腸菌16SrRNAのナンバーリング）に相当する。従って本発明のプローブの配列は、レジオネラ  ニューモフィラ（Legionella pneumophila）および他のレジオネラの16SrRNAをコードするDNAの塩基配列871-890（大腸菌16SrRNAのナンバーリング）の相補的配列、または16SrRNAの塩基配列871-890（大腸菌16SrRNAのナンバーリング）をターゲットにし、これらの配列を認識するに足るものである。
【００１５】
Escherichia coli、Ps. aeruginosa、Legionella pneumophiliaおよび他のLegionellaの16SrRNA配列の一部の塩基配列を表２に示す。
【表２】
0003814909.tif 000003
【００１６】
本発明のプローブは、前記のように塩基配列が明らかで、塩基配列の長さも２０塩基程度であるため、ヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドから化学合成により容易に合成することができる。このため、同一のプローブを何度でも容易に得ることができ、ロットにより特異性が異なるということはない。また本発明のプローブは塩基数が比較的短いことから、in situハイブリダイゼーションに用いることもでき、しかも一種類のプローブから検出できるレジオネラ属細菌の種類も多い。これらの点から、検出試薬として優れている。
【００１７】
本発明のレジオネラ属に属する細菌検出用標識オリゴヌクレオチドプローブは、前記プローブを放射性元素、酵素、蛍光物質または化学物質などの標識物質で標識したプローブである。このような標識物質としては従来から使用されている標識物質が使用でき、具体的なものとしては32Ｐ等の放射性元素；ＦＩＴＣ、ローダミン等の蛍光物質；ジコキシゲニン等のハプテン；アルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼ等の酵素；ビオチン等の生化学物質などがあげられる。これらの標識物質は、公知の方法でプローブに導入することができる。
【００１８】
本発明のレジオネラ属に属する細菌検出用試薬は上記標識オリゴヌクレオチドプローブを含むものであり、標識オリゴヌクレオチドプローブだけからなっていてもよく、また緩衝液などに溶解したものでもよく、またレジオネラ属細菌とのハイブリダイゼーションを容易に実施することができるようにキット化されたものでもよい。
【００１９】
本発明の標識オリゴヌクレオチドプローブまたはこれを含む試薬は、レジオネラ属細菌またはこのDNAを含む検体とハイブリダイゼーションを実施し、その後標識物質を指標にして検出することにより、例えば放射能、発色、蛍光、発光などを指標にして検出することにより、プローブがハイブリダイゼーションしたレジオネラ属細菌を特異的に高精度で、目視や顕微鏡等により容易に検出、同定または定量することができる。
【００２０】
本発明のプローブは一種類で検出、同定または定量することができるレジオネラ属細菌の種の種類が多く、少なくともレジオネラ３４種（後記表３参照）を検出することができる。このように本発明のプローブは、従来のプローブに比べて、一種類のプローブでより多くの種の種類のレジオネラを検出することができる。
【００２１】
本発明の検出方法は、前記標識オリゴヌクレオチドプローブまたは試薬を、レジオネラ属に属する細菌またはそのDNAを含む検体に接触させてハイブリダイゼーションを行った後、標識を指標にしてレジオネラ属細菌を検出する方法である。ハイブリダイゼーションは従来と同様の方法により行うことができる。例えば、細菌を対象とする場合は、ナイロンフィルターなどのフィルターに菌体をしみ込ませ、フィルター上で溶菌操作を行った後、紫外線照射または８０℃以上の高温にすることにより、レジオネラ属細菌のDNAをフィルター上に固定する。このフィルターをハイブリダイゼーション溶液に通常１時間以上浸したのち、さらに標識オリゴヌクレオチドを添加したハイブリダイゼーション溶液に浸漬し、２〜２４時間反応させる。ハイブリダイゼーション時の温度は、十分な特異性および検出感度を示す温度を選択するのが好ましく、通常プローブのＴｍ値マイナス５〜１０℃を目安にする。十分な特異性および検出感度を示す温度は、予め実験により求めることができる。プローブと反応が終了したフィルターは緩衝液で洗浄し、非特異的な結合をしているプローブを除去する。洗浄は緩衝液を新しいものに交換して２〜３回行うのが好ましい。洗浄時の温度は、十分な感度を保つ温度で行うのが好ましく、通常ハイブリダイゼーションの温度よりも低く設定される。十分な感度を保つ温度は、予め実験により求めることができる。
【００２２】
ハイブリダイゼーション後の検出は、標識物質の種類に応じて公知の方法により行うことができる。例えば、放射性元素で標識した場合は公知の方法で放射能を測定することにより検出できる。また酵素で標識した場合は公知の方法で酵素活性を測定することにより検出できる。また螢光物質で標識した場合は公知の方法により光量を測定することにより検出できる。また抗原または抗体で標識した場合は、標識した抗原または抗体と特異的に反応する抗体または抗原を用いて抗原抗体反応させ、反応生成物を公知の方法により測定することにより検出できる。
【００２３】
このように本発明のプローブを用いることにより、ハイブリダイゼーションによりレジオネラ属の広範囲のレジオネラ種を特異的に検出することができる。このため、従来行っていたレジオネラコロニーの複数の同定操作を省略することができ、検出を容易に行うことができる。すなわち、従来の培養方法では一つ一つのコロニーを釣菌して同定に供さなくてはならないが、本発明のプローブを用いてコロニーハイブリダイゼーションを行うことにより、例えば培地プレートに生育しているコロニーすべてについてレジオネラであるかどうか一度に判別することができる。また、原理的に培養による検出では、培養できないレジオネラは検出対象外であったが、本発明の検出方法では培養できないレジオネラ種も検出可能である。また、環境中の生物膜や生物組織中でレジオネラがどのように分布しているかということを明らかすることも可能である。さらにプローブがゲノムＤＮＡ断片混合物ではないので、同じ性能のプローブを容易に入手できる。
【００２４】
【発明の実施の形態】
実施例および比較例
１）オリゴヌクレオチドプローブの調製
本発明のプローブを、公知の固相ホスホロアミダイド法により合成した。合成したプローブは高速液体クロマトグラフィーにより精製した。精製後は凍結乾燥して保管した。その後の操作には、脱イオン水に溶解して用いた。
【００２５】
上記プローブをDIG oligoprobe tailed label kit(ベーリンガーマンハイム社製)を用いてジコキシゲニンによりラベルした。このジコキシゲニンでラベルしたオリゴヌクレオチドプローブを0.3pmol/mlの濃度になるように、ハイブリダイゼーション溶液〔0.75M NaCl, 75mM sodium citrate, 1%(w/v) Blockingreagent, 0.1%(w/v)N-lauroylsarkosine, 0.02%(w/v) Sodium dodesyl sulfate(以下SDS), 0.1mg/l Poly(a)〕に溶解し、後述のハイブリダイゼーションで使用した。なお上記ジコキシゲニンはハプテンの１種であり、抗原として作用する化合物である。
【００２６】
２）検体の調製
報告されているレジオネラ属のうち、表３に示す３５種（うち二種はL. pneumophilaのサブスピーシズ）を入手し、DNA抽出後、ドットブロットを実施した。なお比較例としては、Enterobacter cloacae(ATCC 23355)、Escherichia coli(ATCC 25922)、Klebsiella pneumoniae(ATCC 13883)、Proteus vulgaris(ATCC 13315)、Pseudomonas aeruginosa(ATCC 27853)、Salmonella typhimurium(ATCC 14028)、Serratia marcescens(ATCC 8100)、Staphylococcus aureus(ATCC 12600)を用い、レジオネラと同様にDNAを抽出後、ドットブロットに供した。
【００２７】
すなわち、レジオネラをBCYEα寒天培地（Buffered charcoal-yeast extract agar supplemented with α-ketoglutarate、組成；蒸留水1000ml当たり酵母エキス10.0g、活性炭末1.5g、ＡＣＥＳバッファー10.0g、寒天15.0g、Ｌ−システイン一塩酸塩0.4g、可溶性ピロリン酸鉄0.25g、α−ケトグルタル酸一カリウム1.0gを含有するｐＨ６．９±０．０５の培地）で培養した後、プレート上から白金耳でかきとり使用した。DNAの抽出はCurrent Protocols in Molecular Biology. 2.4.1. Preparation of Genomic DNA form Bacteriaに従って実施した。
【００２８】
抽出したDNAのＡ260nmにおける吸収を測定し、それぞれのDNAを同一濃度になるよう調整した後、ナイロンフィルターに100ngずつドットブロットした。風乾後、次に示す各液で湿らせた濾紙の上に、フィルターを５分間ずつ順次置き、DNAを変性させた。（１）0.5N NaOH,0.5M NaCl, （２）1.5M NaCl, 0.5M Tris-HCl pH7.4, （３）0.3M NaCl, 30mM sodium citorate pH7.0。その後、120℃で30分間加温してDNAをフィルターに固定し、下記のハイブリダイゼーションに使用した。
【００２９】
３）ハイブリダイゼーション
ハイブリダイゼーションはDIG oligoprobe tailed label kitのStandard 5 x SSC procedureに基づき実施した。以下に手順を示す。
DNAを固定した前記フィルターをプラスチックバッグの中に入れ、100cm2あたり20mlのハイブリダイゼーション溶液〔0.75M NaCl, 75mM sodium citrate, 1%(w/v) Blockingreagent, 0.1%(w/v)N-lauroylsarkosine, 0.02%(w/v) Sodium dodesyl sulfate(以下SDS), 0.1mg/l Poly(a)〕を入れ、気泡を除いてシールした。ハイブリダイゼーションオーブンで緩やかに振とうしながら68℃で１時間以上反応させた。プレハイブリダイゼーション液を捨て、前記１）で調製したオリゴヌクレオチドプローブを0.3pmol/ml濃度で含む新しいハイブリダイゼーション液を100cm2あたり2.5mlになるようプラスチックバッグに入れた。気泡を除いてシール後、ハイブリダイゼーションオーブンで緩やかに振とうしながら50℃で２〜３時間反応させた。
【００３０】
その後、フィルターをプラスチックバッグから取出し、0.3M NaCl, 30mM sodium citrate pH7.0, 0.1%SDS溶液をタッパーなどの容器に100cm2あたり50ml入れ、フィルターを浸漬、振とうして洗浄し、結合の弱いプローブを除去した。５分後液を入替え、さらに５分間洗浄した。その後、15mM NaCl, 1.5 mM sodium citrate pH7.0, 0.1%SDS溶液をタッパーなどの容器に100cm2あたり50ml入れ、フィルターを浸漬、振とうして洗浄し、結合の弱いプローブを除去した。1５分後液を入替え、さらに1５分間洗浄した。
【００３１】
フィルターを100mlあたり160mlの100mM Maleic acid, 150mM NaCl pH7.5溶液に入れた。次に、フィルターを上記溶液に1% blockingreagentを加えた液に浸し、緩やかに振とうしながら20分間反応させた。抗ジコキシゲニンアルカリフォスファターゼ結合抗体を上記液量の1/10000量添加し、20分間緩やか振とうしながら反応させた。フィルターを取出し、新しい容器に100mM Maleic acid, 150mM NaCl pH7.5, 0.3% tween20を入れ、フィルターを浸漬し、緩やかに振とうしながら10分間洗浄した。新しい液に変え、繰返した。再度新しい液に変え、繰返した。
【００３２】
100mM Tris-HCl pH9.5, 100mM NaCl, 50mM MgCl2溶液にフィルターを入れ、２分間以上放置した。CDP-Star(ベーリンガーマンハイム社製)を上記溶液で1／100に希釈し、フィルターを浸漬し５分間放置した。フィルターの余分な液を切り、プラスチックバッグに入れて37℃で10分間反応させた。その後Ｘ線フィルム(ECLハイパーフィルム、アマシャム社製)に30分間露光し、現像した。プローブが反応した部分は黒いシグナルとなって現れるので、生じたシグナルを目視により、４段階に分けて反応性を判断した。その結果を表３に示す。
【００３３】
【表３】
0003814909.tif 000004
【００３４】
【表４】
0003814909.tif 000005
【００３５】
【表５】
0003814909.tif 000006
【００３６】
表３の注
Ｎｏ．１〜３６の菌が実施例、Ｎｏ．１０１〜１０８の菌が比較例
評価基準
＋＋：強いシグナルあり
＋：シグナルあり
±：わずかにシグナルが確認される
−：反応確認されず
＊１  DNAが抽出できず、ハイブリダイゼーションは実施せず
【００３７】
表３の結果から、本発明のプローブを用いると、試験に供したレジオネラのうちL. islaelensisを除く全てのレジオネラから強いシグナルが得られたことがわかる。またレジオネラ以外の菌からはほとんどシグナルが得られなかった。
このことから、本発明のプローブはほとんどのレジオネラ種を検出することが可能で、レジオネラ属特異性があることが確認された。
【００３８】
【発明の効果】
本発明のオリゴヌクレオチドプローブは、特定な塩基配列を有し、多数の種のレジオネラ属細菌の16SrRNAの特定の位置の配列および16SrRNAをコードするDNAの相補的配列と、特異的に相補的な塩基対を形成する。このため、短時間で多数の種のレジオネラ属細菌を一種類のプローブで特異的に高精度で検出するためのプローブとして好適に用いることができる。また塩基が短いので容易に調製することができる。
【００３９】
本発明の標識オリゴヌクレオチドプローブは上記オリゴヌクレオチドプローブを標識物質で標識しているので、ハイブリダイゼーションによりレジオネラ属細菌を短時間で多数の種のレジオネラ属細菌を一種類のプローブで特異的に高精度で検出することができる。
【００４０】
本発明の試薬は上記標識オリゴヌクレオチドプローブを含んでいるので、ハイブリダイゼーションによりレジオネラ属細菌を短時間で多数の種のレジオネラ属細菌を一種類のプローブで特異的に高精度で検出することができる。
【００４１】
本発明の検出方法は上記標識オリゴヌクレオチドプローブまたは試薬をレジオネラ属細菌またはそのDNAと接触させてハイブリダイゼーションを行った後、標識を指標にして検出するようにしているので、レジオネラ属細菌を短時間で多数の種のレジオネラ属細菌を一種類のプローブで特異的に高精度で検出することができる。
【００４２】
【配列表】
0003814909.tif 000007
【００４３】
0003814909.tif 000008
【００４４】
0003814909.tif 000009
【００４５】
0003814909.tif 000010
【００４６】
0003814909.tif 000011
【００４７】
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【００４８】
0003814909.tif 000013
【００４９】
0003814909.tif 000014
【００５０】
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【００５１】
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【００５２】
0003814909.tif 000017
【００５３】
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【００５４】
0003814909.tif 000019