(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物工学的に得られる培養ブロスの後処理からの有用物質の液体水性調製物から臭気物質を除去するための方法であって、該液体調製物を、噴霧物質として、噴霧ゾーンの操作条件下で過熱蒸気として存在する蒸気で処理することを特徴とする方法。
【請求項２】
対応する発酵ブロスの調製物を、噴霧ゾーンにおいて、蒸気による処理にかけることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
噴霧ゾーンが減圧下で操作されることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
臭気物質を、生物工学的に製造した細胞外有用物質の回収中に、その水性調製物から、特に洗剤に使用するための酵素を回収するように後処理した調製物から、除去することを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
プロテアーゼ水溶液を脱臭し、この目的のために、噴霧ゾーンにおいて蒸気による処理にかけることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
プロテアーゼ水溶液を、真空濃縮した後に噴霧ゾーンにおいて蒸気による処理にかけることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
噴霧ゾーンにおける最高物質温度を、該ゾーンにおける真空を予め決定し、そしてそれをモニターすることによって制御することを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
少なくとも１５重量％の含水量を有する有用物質の水性調製物を脱臭することを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
温度感受性の有用物質の水性調製物を処理し、操作ゾーンの物質温度を高くても４５℃の値に維持することを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
蒸気の入口温度が２５０℃までであることを特徴とする請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
噴霧ゾーンにおける脱臭を、出発物質の含水量のわずかな減少と組合せることを特徴とする請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
有用物質の水性調製物を、噴霧ゾーンにおいて複数処理にかけることを特徴とする請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
蒸気が噴霧液相に対して逆に流れることを特徴とする請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
選択した微生物集団の培養による有用物質およびその混合物の生物工学的な製造は、現在では大きな工業的重要性を有している。これに関する単なる例示として、洗浄および／または清浄活性な酵素、より具体的にはプロテアーゼ、セルラーゼ、リパーゼおよびアミラーゼの群からの酵素の製造、ならびに、薬理学的に活性な有用物質の製造が挙げられる。多くの不純物、例えば栄養培地の一部で汚染された細胞内および／または細胞外有用物質の水性調製物が、一次的な過程の生成物として蓄積する。このような培養ブロスの後処理については、多くの従来技術の文献が入手可能である。例えば、「発酵ブロスの微細濾過
0003841429.tif 000002
」と題するレーゼ
0003841429.tif 000003
らの論文[Chem.-Ing.-Techn.57(1985), No.9,747-753中]およびこれに引用された一次文献を参照。関連特許の例には、例えば、EP-B1 0 200 032、WO 93/16173ならびに先行するドイツ特許出願DE 43 10 506およびDE 43 22 229が含まれる。
これらの生物工学的に得られる水性培養液の多段階後処理は、特に、所望による多段階濾過および／または洗浄と、通常はそれに続く固体担体を用いる水性調製物の固化によって、望ましくない構成成分を除去しようとするものである。産業上特に関係の深い洗浄および清浄活性な酵素の細菌学的な製造においては、特別の問題が以下の状況下で存在する：即ち、発酵過程における代謝により、バイオマスを含む発酵ブロスが、少量の低分子量化合物、より具体的には対応する窒素化合物を含有する(これら化合物は、非常に邪魔になる不快な臭気によって区別され、生物工学的に有用な物質の分解を促進して他の悪臭化合物を生成させることができる)。これら現象の典型例は、洗剤における使用、より具体的には洗濯用洗剤における混合成分としての使用が意図されているプロテアーゼまたはプロテアーゼ溶液の生物工学による製造の際に見ることができる。既に挙げた従来技術の文献に加えて、国際特許出願WO 91/2792がこれに関連して挙げられる。約７０，０００プロテアーゼ単位／グラム(ＰＵ／ｇ)を含有するバイオマス含有の発酵ブロスが、ドイツ特許DE 29 25 427に記載された方法に類似した方法により、選択した微生物[バシラス・リケニフォルミス(Bacillus licheniformis)、ＡＴＣＣ５３９２６]を用いて得られる。溶解したプロテアーゼ、塩、タンパク質および代謝産物に加えて、この発酵ブロスは、溶解しない構成成分、例えばバシラス細胞、栄養培地の残留物および粘液物質をも含有する。発酵ブロスの後処理(WO 92/11347)中に、プロテアーゼが安定化され、比較的粗い粒子および溶解しない構成成分がデカンテーションまたは微細濾過によって除去される。このプロテアーゼ溶液を、限外濾過とその後の真空蒸発によって濃縮する。この得られたプロテアーゼ溶液を固体担体物質および顆粒化助剤と混合し、洗剤において使用するための酵素顆粒を調製する。
これら苦心した精製および後処理工程にもかかわらず、濃縮したプロテアーゼ溶液は、不快な臭気を有する少量の低分子量窒素化合物をなお含有し、これら窒素化合物が貯蔵中にプロテアーゼの分解をさらに促進して他の悪臭イオウ化合物、例えばメルカプタンまたはチオエーテルを生成させることができる。
本発明の教示が指向する課題は、これら低分子量臭気化合物を、追加のしかし単純な工程で、特に有用物質またはその混合物の通常の封入後に、実質的に識別できない臭気を有する生成物が得られる程度にまで除去し、同時に、自己開始型の分解過程を排除するか、または少なくとも大部分を抑制することであった。対応する生物工学的に得られる発酵ブロスから、対応する処理された洗浄および清浄活性なプロテアーゼを製造することを参考にして、本発明の教示を以下に開示する。しかし、本発明の教示は、いかなる意味においても、この特定の例に限定されるものではない。本発明の説明において記載した原理を、生物工学による製造に由来する有用物質およびその溶液の上記した分野に、ならびに関連の分野に広く適用することができる。
発明の対象
第１の態様において、本発明は、有用物質の液体調製物から、より具体的には生物工学的に得られる培養ブロスからの有用物質の回収の際に、臭気化合物を除去するための方法であって、該液体調製物を、噴霧物質として、噴霧ゾーンの操作条件下で過熱蒸気として存在する蒸気で処理することを特徴とする方法に関する。
本発明の方法は、生物工学的な培養ブロス、より具体的には対応する発酵ブロスの後処理からの水性調製物を脱臭および安定化するのに特に適しており、噴霧ゾーンにおける過熱蒸気による噴霧液体相の処理は減圧下で行うのが好ましい。噴霧ゾーンにおけるこの減圧の工程パラメーターの選択は、過熱蒸気と接触する、噴霧ゾーンにおいて小滴として噴霧される物質の最大温度が、以下において詳しく説明するように安全に制御されることを可能にする。
別の態様において、本発明は、溶解および／または分散した生物工学的に得られた有用物質を含有する出発物質、より具体的には含水出発物質から臭気物質を除去するための、および、有用物質の活性の長期安定化のために噴霧ゾーンにおいて過熱蒸気で処理することによって有用物質の液体調製物を脱臭するための方法の使用に関する。
本発明の教示の詳細
先行する未公開の国際特許出願PCT/EP94/00563は、蒸気処理による多成分混合物の蒸留に基づく分離のための改良法を記載している。第１の態様において、この先行出願の教示は、出発物質の蒸気揮発性成分の除去を容易にするために、操作圧力下で過熱した蒸気で処理することによって、少なくとも部分的に有機起源の多成分混合物の蒸留に基づく分離を強化および／または促進するための方法に関する。この方法は、操作条件下で液体である出発物質を微細小滴の形態で噴霧した後に蒸気処理すること、出発物質を推進ガスを用いて噴霧すること、および過熱蒸気を推進ガスとして用いることを特徴とする。
上で引用した先行特許出願の方法の修飾された態様は、操作条件下で液体である少なくとも実質的に水を含まない出発物質を、推進ガスを用いることなく過熱蒸気流中に噴霧することを特徴とする。この特許出願は、蒸気処理によって脱臭するこの方法の多数の応用分野および具体的な応用例を挙げているが、本発明が関係する分野、即ち、生物工学的方法の分野からの有用物質の調製物、より具体的には含水調製物を挙げていない。従って、上記の先行出願の開示ならびにその中でのさらに先行する従来技術の出版物への言及は、本発明の開示の一部として含まれる。
この先行出願において意図されているような推進ガス、即ち過熱蒸気を用いて精製または脱臭しようとする液体調製物を噴霧する原理を、ここで議論している本発明の態様に当てはめることもできる。しかし、本発明の好ましい態様においては、液体出発物質を、推進ガスを用いることなく過熱蒸気流中に噴霧する。本発明の教示は、脱臭および／または安定化しようとする物質が通常は有用物質の水性調製物の形態で存在する点で、上記の先行出願の変法とは異なる。発酵ブロスおよび他の生物工学的に得られる一次産物は、含水量の高い含水調製物の形態で蓄積されるのが普通である。即ち、本発明に従って精製する出発物質の含水量は、通常は少なくとも１５重量％、好ましくは少なくとも３５〜４０重量％である。洗剤酵素の分野においては、少なくとも約５０重量％、例えば６０〜８０重量％の含水量を有する有用物質含有の水相が、一次および二次精製段階の生成物として得られるのが普通である。所望による多段階濾過によって精製し、さらに真空蒸発によって濃縮した細胞外洗剤プロテアーゼを含有する水溶液は、後に担体物質、より具体的には固体担体物質と混合する前に、約５５〜７５重量％の水相を含有しているのが普通である。これらの有用物質の含水調製物は、噴霧ゾーンにおいて過熱蒸気で処理することにより脱臭および安定化するための本発明の好ましい出発物質である。好ましい態様においては、推進ガスを使用しない。プロテアーゼ水溶液を、好ましくは逆流で、以下において詳しく説明する操作条件下で噴霧ゾーンを通って流れる過熱蒸気により処理する。この処理は、１またはそれ以上の段階で行ってよい。通常、噴霧ゾーンにおける多段階処理が好ましい。この多段階処理は、噴霧ゾーンへの水相の部分的再循環によって行うことができるが、いくつかの噴霧ゾーンを次々に配置することもできる。これらの段階的に配置した噴霧ゾーンは、同一または異なる条件下で操作してよい。プロテアーゼ水溶液の相応の脱臭および安定化のためには、噴霧ゾーンにおける出発水溶液の２〜５段階処理が満足な精製を導くことができる。
有用物質を含有する生存生物またはその構成成分、例えば酵素または他の生物工学培養物の産物、およびこのような有用物質の混合物は、温度に対する感受性が高いことが多い。このことは、特に洗剤酵素、例えば記載した種類のプロテアーゼに当てはまる。生物学的材料の後処理は、この温度感受性を考慮に入れなければならない。このことが、特に、本発明に係る過熱蒸気による処理段階にも当てはまるのは勿論である。本発明の教示は、噴霧ゾーンにおける圧力条件を確立および調節することによって該ゾーンにおける物質の最高温度を予め決定およびモニターすることにより、上記要求を極めて簡単に制御および満足させるものである。本発明によれば、この噴霧ゾーンを真空下に操作するのが普通である。噴霧ゾーンにおいて具体的に確立した真空は、水の沸点温度を決定する。また、液体出発物質とともに比較的大量に導入された水は、噴霧ゾーンの温度を調節する保護機能をも発揮する。沸点よりもかなり高い噴霧ゾーン温度で所望により導入された過熱蒸気は、小滴の液体水相の適切な濃度が保証されている限り、噴霧ゾーンにおける物質小滴の望ましくない加熱を導くことができない。過熱蒸気とともに導入された熱エネルギーは、小滴の大きな温度上昇を伴うことなく、対応する水の一部の蒸発に集まる。本発明に従って適用する操作条件は、この自然法則を利用するものである。噴霧ゾーンにおける好ましい操作条件は、出発水相の同時濃縮が、あったとしても極めてわずかであるような条件である。この法則は、少なくとも、洗剤プロテアーゼなどの温度感受性の高い有用物質に当てはまる。
しかし、所望により、生物工学的に有用な物質の比較的希釈度の高い出発溶液を噴霧ゾーンに供給して、ここで脱臭するだけでなく部分的に濃縮するように、方法全体を改変することもできる(先行出願PCT/EP94/00563を参照)。
本発明による洗剤プロテアーゼの精製および安定化のためには、噴霧ゾーンにおける物質温度を、高くとも約４５〜５０℃、好ましくは高くとも約３５〜４０℃の範囲内に維持するのが有用となりうる。特に好ましい態様においては、高くとも約３０℃の物質温度を噴霧ゾーンに設定し、操作条件、特に噴霧ゾーンにおいて設定する真空を、約２０〜２５℃の水の最高沸点に合わせることが多い。噴霧ゾーンの操作圧力の具体的選択は、設定操作圧力に対する水沸点の自然依存によって決まる。実際的には、約１０〜２５mバール、好ましくは約１５〜５０mバールの範囲の噴霧ゾーンの操作圧力が有用でありうる。
精製処理のために噴霧ゾーンに導入する蒸気は、操作条件下の水の沸点よりもかなり高い温度で用いてよい。即ち、導入する蒸気の温度は、精製段階の操作圧力下の水の沸点よりも少なくとも５０℃、好ましくは少なくとも１００℃高い温度であってよい。精製段階の操作圧力下の水の沸点よりも少なくとも１５０〜２００℃高い温度が適当でありうる。常圧を基準にすると、本発明に係る蒸気の好ましい温度は、２５０℃まで、好ましくは２００℃までであり、約１３０〜２００℃の温度が特に好ましい。
好ましい態様においては、精製しようとする含水出発物質は、操作条件下の水の沸点に少なくとも実質的に一致する温度で噴霧ゾーンに供給してよい。しかし、この点に関して、生物学的有用物質の温度感受性から生じる制限因子を考慮に入れなければならないことは勿論であろう。従って実際上は、噴霧ゾーンに供給する液体出発物質の温度範囲、例えばプロテアーゼ水溶液の精製の際の温度範囲は、通常、約２０〜３５または４０℃の範囲内であろう。
また、本発明に従って処理する酵素水溶液の別の特徴が重要になることもある。生物工学的に有用な物質の水性培養液は、ある種のチキソトロピー挙動によって区別されることが多い。有用物質の水性混合物の流動性を、適当な補助手段によって、より具体的には精製すべき原料に剪断力を導入することによって確保することができる。さらに具体的には、噴霧ゾーンの設計および構成は、噴霧された物質が確実に排出されうることも確保すべきである。全体として、本発明の噴霧精製のための操作条件の設定は、当業者には自体既知であるように、この効果によって共同決定することができる。これに関連した特徴的な操作パラメーターを、以下の方法実施例において挙げる。
実施例
ドイツ特許DE 29 25 427に記載されている方法によりバシラス・リケニフォルミス(ＡＴＣＣ ５３９２６)の発酵によって調製した約７０，０００プロテアーゼ単位／グラム(ＰＵ／ｇ)の含有量のバイオマス含有発酵ブロスは、強い不快臭によって識別される。溶解したプロテアーゼ、塩、タンパク質および代謝産物の他に、この発酵ブロスは溶解していない構成成分、例えばバシラス細胞、栄養培地の残留物および粘液物質をも含有している。初めに蓄積するこの発酵ブロスをまず国際特許出願WO 92/1134に従って後処理し、比較的粗い粒子および未溶解の構成成分をデカンテーションまたは微細濾過によって除去する。このように予備精製したプロテアーゼ溶液を、限外濾過とその後の真空蒸発によって濃縮する。このように濃縮したプロテアーゼ溶液を、固体担体物質および顆粒化助剤と混合し、洗剤に使用するための酵素顆粒に調製することができる。
このように後処理したプロテアーゼ溶液および酵素顆粒も、望ましくない臭気によって識別される。さらに、少量で存在する原因の低分子量窒素化合物は、プロテアーゼの分解過程を促進し、次いで、他の悪臭イオウ化合物(例えば、メルカプタン、チオエーテル)の生成を導く。
これら臭気化合物を除去するために、プロテアーゼ水溶液を、真空蒸発後に本発明に従って行う追加工程の噴霧ゾーンにおいて脱臭する。以下のパラメーターをこの追加の工程に適用する。
この酵素水溶液は、３５％の乾燥物質含有量(酵素＋発酵残留物)および２５℃で以下のデータを有している。
密度：  １，１００kg／m3
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脱臭処理中に、酵素溶液を上からタンク中に噴霧した。この酵素溶液をタンクの底で集め、噴霧ノズルに再循環した。過熱蒸気は、液体に対して逆流させ均一に分布させて脱臭タンクに入れた。
蒸気および取込まれた臭気物質を、蒸気の凝縮とともに真空系から排出した。タンク内の圧力は２０mバール(絶対)であった。表２は、脱臭タンクおよびノズルの寸法および調節した操作パラメーターを示すものである。
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プロテアーゼ溶液を、脱臭工程に３回再循環させ、次いで上記のように酵素顆粒に調製した。この酵素顆粒の臭気の注記は４.５〜５から３に改善した(１〜５の学校採点系による評価)。