(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
エンドトキシンを含む検体液を、複数の測定セルを含む測定系に順次自動的に取込みながら、発色合成基質を含むリムルス試薬を用いて検体液中のエンドトキシン濃度を連続的に測定するための装置であって、
複数の測定セルと、リムルス試薬を注入する手段と、検体液を取込み注入する手段と、測定セルに注入されたリムルス試薬と検体液を混合する手段と、該測定セルに導入された混合液中に遊離する発色基に起因する吸光度の変化量又はその経時変化率、又は、所定の変化量に到達する時間を測定し、検量線に基づいて検体液中のエンドトキシン濃度を算定する吸光度測定手段と、測定後に混合液を測定セルから排出して洗浄する手段とからなり、かつ、複数の測定系を検体液の流路に並列に切換え可能に結合して、順繰りに自動切換えて、吸光度の測定と測定セルの洗浄を並行して行い、１検体に要する測定時間よりも短い間隔で検体液のエンドトキシン濃度を連続して測定することを特徴とするエンドトキシン濃度の測定装置。
【請求項２】
測定セルの形状を、断面が光源からの光束の断面に等しいか、それ以下の細長い筒形にするか、又は、光束が測定セル内面を複数回反射する多角形の柱体にすることにより、光路長を１ｃｍ以上としたことを特徴とする請求項１に記載のエンドトキシン濃度の測定装置。
【請求項３】
複数の測定系は、単一の光源とそれに対応する光検出器を中心として相対的に回転する複数の測定セルとからなることを特徴とする請求項１に記載のエンドトキシン濃度の測定装置。
【請求項４】
複数の測定系は、複数の測定セルに対して相対的に併進往復する単一の光源とそれに対応する光検出器とからなることを特徴とする請求項１に記載のエンドトキシン濃度の測定装置。
【請求項５】
複数の測定系は、複数の光源とそれに対応する光検出器とからなることを特徴とする請求項１に記載のエンドトキシン濃度の測定装置。
【請求項６】
光源からの光束を、直径０．４ｃｍ以下に細く絞って、測定セルに入射することを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載のエンドトキシンの濃度測定装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、エンドトキシン濃度の測定装置に関し、更に詳しくは注射液、輸液、透析液などの医薬品と、その中間製品、これらの原料の一部となる精製水中に存在すると、多彩な生物活性を示し弊害があるエンドトキシンの濃度を測定し、医療に使用中、或いは医薬品として製造中、または貯蔵中の注射液、輸液、透析液などの医薬品と、その中間製品、又はこれらの原料の一部となる精製水の品質管理等に役立てるために使用するエンドトキシン濃度の測定装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
エンドトキシンは、グラム陰性細菌の外膜に存在する耐熱性の毒素であり菌体内毒素と言われ、本体はリポ多糖であるとされている。
リポ多糖はリピドＡとよばれる脂質と糖鎖からなるが、エンドトキシンとしての活性中心はリピドＡにあり、分離したリピドＡでほぼすべての活性が再現される。
【０００３】
エンドトキシンは血液凝固線の反応促進、血小板・白血球の減少、血圧の低下、ショックなど循環系への影響、発熱、サイトカインの誘導、免疫系への影響など多彩な生物活性を示す（竹沢真吾編、透析液エンドトキシンがよくわかる本、１５〜２４頁及び４５〜５１頁（１９９５）、東京医学社）。
エンドトキシンを一構成成分としているグラム陰性細菌は、空気中、水中あるいは食品中に存在し、菌体が機械的損傷を受けたり、死菌が溶解したりあるいは菌体の分裂に際してエンドトキシンが溶液中に放出され、溶液中に存在することとなる。
【０００４】
したがって、エンドトキシンは、直接的または間接的に、注射液、輸液、透析液などの医薬品と、その中間製品、これらの原料の一部となる精製水中に混入したり、存在したりすると、上記した多彩な生物活性を示す弊害があるので、エンドトキシンの濃度を測定することは、医療に使用中、或いは医薬品として製造中または貯蔵中の注射液、輸液、透析液などの医薬品と、その中間製品、又はこれらの原料の一部となる精製水の品質管理に必要である。また、エンドトキシンの濃度をモニターすることは、生菌の増殖を早期に検出する手段としても有効である。
しかし、現状ではエンドトキシン濃度をモニターする装置は存在せず、検体液を採取してオフラインでエンドトキシン濃度を測定して、これらの品質管理に役立てている。
【０００５】
エンドトキシンの濃度を定量測定する方法としては、唯一リムルス試験（Ｌｉｍｕｌｕｓ  ｔｅｓｔ）がある。  この方法は、カブトガニ（Ｌｉｍｕｌｕｓ  ｐｏｌｙｐｈｅｍｕｓ）の血球中に存在する前凝固性酵素（Ｐｒｏｃｌｏｔｔｉｎｇ  Ｅｎｚｙｍｅ）をエンドトキシンが活性化し、凝固酵素（Ｃｌｏｔｔｉｎｇ  Ｅｎｚｙｍｅ）とする反応を利用したものであり、カブトガニ血球抽出成分（Ｌｉｍｕｌｕｓ  ａｍｅｂｏｃｙｔｅ  ｌｙｓａｔｅ）を試薬として使用する方法であり、ゲル化法と、高感度測定法として比濁法と比色法との三つの方法がある。
【０００６】
比色法は、発色合成基質法とも呼ばれ、エンドトキシンとリムルス・アメボサイト・ライセート中のＣ因子系反応によって最終的に活性化された凝固酵素が、コアグロゲンをコアグリンに変換する際のコアグロゲンの水解部位のアミノ酸配列と類似の配列をもつ合成ペプチドに、発色基として例えばパラニトロアニリン（ｐＮＡ）を結合させた発色合成基質（Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡなど）を用い、活性化された凝固酵素のアミダーゼ活性によって遊離するパラニトロアニリン（ｐＮＡ）の吸光度を測定してエンドトキシン量を定量する方法である。
比色法には、一定時間内に遊離するｐＮＡの量が検体液中のエンドトキシン濃度に比例することに基づき、反応を所定時間で停止してｐＮＡの吸光度を測定するエンドポイント法と、吸光度の経時変化率、又は、所定の吸光度に達する時間を測定するカイネティック法がある。
カイネティック法の内、前者は吸光度の経時変化率が検体液中のエンドトキシン濃度に比例することに基づくもので比色反応速度法、後者は、所定の吸光度に達する時間の対数が検体液中のエンドトキシン濃度の対数に逆比例することに基づくもので比色反応時間法と、それぞれ呼ばれている。カイネティック法が感度、精度ともに高く、エンドトキシン濃度の低い検体液に適した方法である。
【０００７】
しかしながら、既存のエンドトキシン濃度測定機器では、濃度１ＥＵ／Ｌまで検出するには９０〜１５０分の反応時間が必要である（竹沢真吾、石崎允監修、南東北水質検討会編集、透析液エンドトキシン実測集、９３頁（１９９７）、（株）メディカ出版）。
濃度５０ＥＵ／Ｌ以下の低濃度液、特に１０〜＜１ＥＵ／Ｌレベルが要求されるＨＤＦ透析液のエンドトキシン濃度のモニターとしては時間がかかりすぎ不充分であった。
また、測定検体量は、リムルス試薬量（０．１〜０．０５ｍｌ）と等量が通常であり、この制約から測定セルなどの容積が制限され、光路長を長く取ることも反応液を循環することも困難であった。したがって、エンドトキシン濃度が低濃度の場合に測定が困難であり、また短時間に測定することは困難であった。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記の従来技術の問題点に鑑み、注射液、輸液、透析液などの医薬品と、その中間製品、精製水などの検体液の貯蔵タンク又は供給ラインから、検体液の一部をパイプで取込みエンドトキシンの濃度を連続的にモニターすることができ、かつエンドトキシンの濃度が５０ＥＵ／Ｌ以下の低濃度液、特に１０〜＜１ＥＵ／Ｌレベルの極低濃度液であってもモニターでき、しかもエンドトキシンの濃度を短時間にモニターできるエンドトキシン濃度の測定装置の提供を課題とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、上記の課題に鑑み、注射液、輸液、透析液などの医薬品、その中間製品、精製水などの検体液の貯蔵タンク又は供給ラインから、検体液の一部を取込み、エンドトキシンが低濃度でも短時間に測定できる特定形状の測定セルを有する吸光度測定手段を採用し、各手段を特定に結合すると、良好な結果が得られることを見出し、本発明を完成させた。
【００１０】
すなわち、本発明の第１の発明によれば、エンドトキシンを含む検体液を、複数の測定セルを含む測定系に順次自動的に取込みながら、発色合成基質を含むリムルス試薬を用いて検体液中のエンドトキシン濃度を連続的に測定するための装置であって、
複数の測定セルと、リムルス試薬を注入する手段と、検体液を取込み注入する手段と、測定セルに注入されたリムルス試薬と検体液を混合する手段と、該測定セルに導入された混合液中に遊離する発色基に起因する吸光度の変化量又はその経時変化率、又は、所定の変化量に到達する時間を測定し、検量線に基づいて検体液中のエンドトキシン濃度を算定する吸光度測定手段と、測定後に混合液を測定セルから排出して洗浄する手段とからなり、かつ、複数の測定系を検体液の流路に並列に切換え可能に結合して、順繰りに自動切換えて、吸光度の測定と測定セルの洗浄を並行して行い、１検体に要する測定時間よりも短い間隔で検体液のエンドトキシン濃度を連続して測定することを特徴とするエンドトキシン濃度の測定装置が提供される。
【００１１】
また、本発明の第２の発明によれば、第１の発明において、測定セルの形状を、断面が光源からの光束の断面に等しいか、それ以下の細長い筒形にするか、又は、多角形の柱体として光束が測定セル内面を複数回反射することにより、光路長を１ｃｍ以上としたことを特徴とするエンドトキシン濃度の測定装置が提供される。
【００１２】
また、本発明の第３の発明によれば、第１の発明において、複数の測定系は、単一の光源とそれに対応する光検出器を中心として相対的に回転する複数の測定セルとからなることを特徴とするエンドトキシン濃度の測定装置が提供される。
【００１３】
さらに、本発明の第４の発明によれば、第１の発明において、複数の測定系は、複数の測定セルに対して相対的に併進往復する単一の光源とそれに対応する光検出器とからなることを特徴とするエンドトキシン濃度の測定装置が提供される。
【００１４】
さらに、本発明の第５の発明によれば、第１の発明において、複数の測定系は、複数の光源とそれに対応する光検出器とからなることを特徴とするエンドトキシン濃度の測定装置が提供される。
【００１５】
さらに、本発明の第６の発明によれば、第１〜５の発明において、光源からの光束を、直径０．４ｃｍ以下に細く絞って、測定セルに入射することを特徴とするエンドトキシンの濃度測定装置が提供される。
【００１８】
【発明の実施の形態】
以下、本発明のエンドトキシンの濃度測定装置について、各項目毎に詳細に説明する。
【００１９】
１．  エンドトキシンを含む検体液を測定セル、又は測定回路内に取込む手段
【００２０】
１．１  エンドトキシンを含む検体液
本発明においてエンドトキシンを含む検体液とは、注射液、輸液、透析液などの医薬品と、その中間製品、又はこれらの原料の一部となる精製水などであり、検体液は貯糟、タンク、ガラス瓶、プラスチック容器、プラスチックバッグ等の貯蔵手段に貯蔵されており、或は連続的に輸送されており、検体液を本来の目的で使用するときは、貯蔵手段又は輸送手段の一部を出発点とするパイプ、管、ホース等の輸送手段（１）で検体液が使用される使用場所や使用機器に送られる。上記貯留液の一部又は輸送手段（１）中を流れる検体液の一部を、本発明のエンドトキシンの濃度測定装置に導入しエンドトキシンの濃度を測定するが、サンプリングするためには、上記輸送手段（１）の一部に別のパイプ、管、ホース、検定液の取込みポンプ（定量ポンプ）等の輸送手段（２）（図２の７）を設け、支流として検体液の一部を本発明のエンドトキシンの濃度測定装置の測定回路（図３（Ａ）の１５）内に取込む。なお、検定液の取込みポンプ（定量ポンプ）４を省略することもでき、その場合は、減圧弁と定流量弁を設けることが好ましい。
【００２１】
１．２  測定セル
本発明において測定セル（図３（Ａ）の１６、図３（Ｂ）の１６、図３（Ｃ）の１６、図４（Ａ）の１６、図（Ｂ）の１６）とは、検体液中のエンドトキシンの濃度を測定するセル（部屋）であり、本発明で使用する吸光度測定手段の一部を構成し、ここにおいて混合液に光源からの光束を照射しエンドトキシンと発色合成基質を含むリムルス試薬が反応して遊離した発色基パラニトロアニリンによる吸光度を計測する。
測定セルの素材としては、光束を透過させる部分は透明性が要求されるので、高純度ガラス、石英ガラスなどが好ましい。
測定セルを、測定毎に更新するディスポーザブル部品とする場合は、ポリメチルメタクリレート、ポリ４メチルペンテン１、ポリエチレンテレフタレート等の透明なプラスチックを使用することが好ましい。
【００２２】
１．３  測定回路
本発明において測定回路（図３（Ａ）の１５、図４（Ｂ）の１５）とは、検体液とリムルス試薬を反応させる流路であり、検体液の取込み封鎖手段とリムルス試薬注入手段に各々接続し、上記した測定セルを一部に含み、測定後混合液を排出する手段に接続した構造であれば如何なる構造であってもよいが、円形、楕円形、正方形又は長方形のパイプ（管）で構成されていることが好ましい。パイプ（管）の材質については、上記した測定セル以外の部分では、特に限定されないが、弗素樹脂、ポリ四弗化エチレン、ライニングした金属、ＳＵＳのような非ライニング金属、セラミックス等が挙げられ、非汚染性、洗浄性等の観点からポリ四弗化エチレン、弗素樹脂が特に好ましい。
なお、本発明においては、測定回路を循環できる構成にして、検体液とリムルス試薬をリサイクル（循環）させ、測定中も両者を均一に混合させ反応させることもできる。
【００２３】
１．４  取込み手段
本発明において取込みとは、エンドトキシンを含む検体液を測定セルに取込むことであり、その手段としては、上記１．１にて説明したパイプ、管、ホース、検体液の取込みポンプ（定量ポンプ）４等の輸送手段（２）（図２の７）である。
輸送手段（２）の構造は、検体液を輸送できる構造であれば如何なる構造であってもよいが、円形のパイプ（管）で構成されていることが好ましい。パイプ（管）の材質については、特に限定されないが、ガラス、弗素樹脂、ポリ四弗化エチレン、ライニングした金属、ＳＵＳのような非ライニング金属、セラミックス等が挙げられ、非汚染性、洗浄性等の観点から弗素樹脂、特にポリ四弗化エチレンが好ましい。
なお、検体液の取込みポンプ４は、検体液が圧送されているラインから取り込む場合は省略できる。
【００２４】
１．５  封鎖する手段
本発明において封鎖とは、エンドトキシンを含む検体液を測定セルを含む測定回路内に封鎖することであり、測定回路の入口と出口を封鎖し、測定回路を形成させ、必要に応じてエンドトキシンを含む検体液を測定回路内で循環できるようにするものであり、封鎖手段としては、測定回路の入口と出口を封鎖できれば如何なる構造のものであってもよいが、仕切弁（ゲートバルブ）、球形弁（グローブバルブ）、コック（プラグバルブ）、ボールバルブ等が挙げられる。
洗浄液を注入する弁９とリムルス試薬を注入する弁１２は、チェックバルブまたは注射針などの細管による穿孔を、細管を抜去すれば自己閉鎖する能力を持つ仕切りにすることができる。
具体的には、図３において、Ｖ１、Ｖ３、Ｖ４等のバルブ、または、開閉可能な仕切りを閉じた状態にしておけばよい。
【００２５】
２．  検体液に所定量のリムルス試薬を注入して両液を混合させる手段
本発明において、検体液に所定量のリムルス試薬を注入して両液を混合し混合液をつくる手段としては、マイクロポンプ、マイクロシリンジ、バイブレータや揺動器を使用する。
【００２６】
３．  吸光度測定手段
本発明において、吸光度測定手段とは、測定セルに導入された混合液中に遊離する発色基パラニトロアニリン（ｐＮＡ）によって混合液に起こる吸光度の経時的変化、又はその経時変化率、又は所定時間に達する時間を連続的に測定して、予め作成した検量線と比較してエンドトキシン濃度を算出して表示、記録、出力する手段であり、光源（図４の１３、図５の１３）と、光検出器（図４の１４、図５の１４）と、電子回路（図示せず）と、測定セルから構成される。
【００２７】
かかる吸光度測定手段の一例としては、下記の手段が挙げられる。
すなわち、本発明にて用いる吸光度測定手段は光源１３と、この光源からの光を光束とする光学系と、この光学系からの光束が透過する混合液を容れた測定セル１６と、測定セル１６からの透過光の光路上に配置された光検出器１４と、この光検出器１４からの電気信号から混合液中の遊離発色基パラニトロアニリン（ｐＮＡ）に起因する吸光度を連続的に計測して、その変化量、又はその経時変化率、又は所定変化量に達する時間を算定し、予め作成した検量線と比較することによってエンドトキシン濃度を算定する電気回路２３とによって構成することができる。
【００２８】
測定セルはガラス等任意の材料で作ることができるが、光束が通過する部分は透明でなければならない。
測定セルの形状としては、円筒状、又は多角柱体が好ましく、光束が直進透過するタイプでは、内径が光束の径に等しく、長さが１ｃｍ以上、好ましくは２ｃｍ以上の円筒形が好ましく、光束が測定セル内で多重反射するタイプでは高さが光束の径に等しいか、それ以下の多角形柱体が好ましい。
測定セルの内面は光が多重に反射するように鏡面とすることが好ましい。
光源としては、ハロゲンランプを用いることができ、光検出器は、高感度の光電子増倍菅（フォトマル）が好ましい。
【００２９】
４．  排出する手段
本発明において排出とは、エンドトキシンを含む検体液を測定セルを含む測定回路内に取込み、取込み封鎖された検体液に所定量のリムルス試薬を注入して両液を混合させ、混合液の吸光度の経時変化を連続的に測定後に、該混合液を測定回路内から排出することであり、その手段としては、パイプ、管、ホース、検定液の取込みポンプ（定量ポンプ）４等の輸送手段（図３の２０）である。
なお、排出パイプの開閉バルブは、測定時は閉じた状態になっており、排出させる場合は、開いた状態になっている。
【００３０】
輸送手段の構造は、検体液を輸送できる構造であれば如何なる構造であってもよいが、円形のパイプ（管）で構成されていることが好ましい。パイプ（管）の材質については、特に限定されない。軟質チューブ（シリコーンゴム、軟質ＰＶＣなど）の使用も可能である。
【００３１】
５．  複数測定系の自動切換え連続測定手段
本発明において、複数測定系の自動切換え連続測定手段とは、第１の発明に係る「複数の測定セルと、リムルス試薬を注入する手段、検体液を取込み注入する手段、測定セルの混合液を混合する手段、吸光度測定手段に順次自動接続して、エンドトキシン濃度を連続測定する手段」と、第１の発明に係る「複数の測定系を検体液の流路に並列に切換え可能に結合して、順繰りに自動切換えて連続測定する手段」であり、それぞれ２つのケースがある。第３の発明に係るケースは、下記の５．１に、第４の発明に係るケースは、下記の５．２に更に詳細に説明する。
【００３２】
ここにおいて、複数の測定系とは、単数の測定系が２つ以上並列に配置されたものを意味する。単数の測定系とは、図１の（Ａ）に概念図を示すように、検体液を取込み封鎖する手段１、検体液の測定手段２及び検体液を排出し封鎖する手段３からなる１ユニットのエンドトキシンの濃度測定装置における測定手段２であり、２つの測定系とは図１の（Ｂ）に示すように、１つ（単数）の測定系が２系列あり、並列になっているものであり、これを更に具体的に構成したものとして、本発明に関連するものを図４（Ａ）に、第１の発明に対応するものを図４（Ｂ）に示す。３つの測定系とは図１の（Ｃ）に示すように、１つ（単数）の測定系が３系列あり、並列になっているものである。また、本発明に関連する複数の測定系を具体的に構成したものを図１０に示す。
【００３３】
なお、検体液を取込み封鎖する手段１とは、上記した各手段の結合構造であり、図２（Ａ）に示した結合構造であり、検体液取込みパイプ７と、検体液の取込みポンプ（定量ポンプ）４、検体液開閉バルブ６と、洗剤液注入パイプ８（オプション）と、洗剤液開閉バルブ９（オプション）から構成される。
検体液の測定手段２とは、図３（Ａ）、図３（Ｂ）と、図３（Ｃ）に示したに示した結合構造であり、測定回路１５と、測定セル１６と、光源１３と、光検出器１４と、電子回路（図示せず）と、リムルス試薬注入パイプ１１と、開閉バルブ１２と、から構成される。
検体液を排出し封鎖する手段３（オプション）とは、図３（Ａ）に示した、排出パイプ２０と、排出パイプの開閉バルブ１９との結合構造である。
【００３４】
なお、複数の測定系の場合、検体液の取込み手段の一部は兼用できるので、図２の（Ｂ）や（Ｃ）のように、検体液開閉バルブより上流は、１つの検体液の取込みパイプ７より構成され、これらより複数の測定系の数が増すほど、図６に示すように複数のエンドトキシンの濃度測定時刻の間隔を短縮することが可能となり、連続的にエンドトキシンの濃度モニターが可能となる効果がある。
【００３５】
５．１  単一の光源とそれに対応する検出器を中心として相対的に回転する関係の複数の測定セル
本発明においては、原則として１つの測定系（測定セル）に対して、一組の光源と光検出器を用いるが、光源と光検出器は高価格のものであるから、複数の測定系（測定セル）の場合に各測定系（測定セル）に一組の光源と検出器を付けるとコストアップとなるので、単一の光源とそれに対応する光検出器を特定場所に固定し、その同心円周上に等間隔に配置した複数の測定セルのどちらかを回転・移動し単一の光源とそれに対応する光検出器に順次取りつけ付け、測定セル内の発色基パラニトロアニリンの吸光度を測定してエンドトキシン濃度を算定する。コストダウンと濃度測定装置の容積や重量を省き、小型化し、省スペースと持ち運びを容易にし、メインテナンスの回数も減らせる効果がある。
【００３６】
この項における手段の説明は、第３の発明に対応するものであり、図７（Ａ）と（Ｂ）に基づき更に詳細に説明する。図７（Ａ）では、１つの測定系（測定セル１６）に対して、一組の光源１３と光検出器１４を用いており、このペァーを１３＋１４を長方形で囲んで表現してある。図７（Ｂ）では、上段に回転移動可能な４つの測定系（測定セル１６が（１）（２）（３）（４）と４個並べてある。）が示してあり、中段に固定された一組の光源１３と光検出器１４があり、１３＋１４を長方形で囲んで表現してある。上段の左端にある一つの回転移動可能な測定系（測定セル１６（１））が、移動し中段に固定された一組の光源１３と光検出器１４に合体し、下段の（１）の状態になり、微粒子の数が測定される。次いで、上段の左から２番目の一つの回転移動可能な測定系（測定セル１６（２））が、移動し中段に固定された一組の光源１３と検出器１４に合体し、下段の（２）の状態になり、発色基パラニトロアニリンの吸光度が測定される。順次、（３）及び（４）の発色基パラニトロアニリンの吸光度が測定される。
【００３７】
５．２  複数の測定セルに対して相対的に併進往復する関係の単一の光源とそれに対応する検出器
本発明においては、原則として１つの測定系（測定セル）に対して、一組の光源と光検出器を用いるが、光源と光検出器は高価格のものであるから、複数の測定系（測定セル）の場合に各測定系（測定セル）に一組の光源と光検出器を付けるとコストアップとなるので、複数の測定セルに対して併進往復する単一の光源とそれに対応する光検出器を付け、コストダウンと濃度測定装置の容積や重量を省き、小型化し、省スペースと持ち運びを容易にし、メインテナンスの回数も減らせる効果がある。
【００３８】
この項における手段の説明は、第４の発明に対応するものであり、図８（Ａ）と（Ｂ）に基づき更に詳細に説明する。図８（Ａ）では、１つの測定系（測定セル１６）に対して、一組の光源１３と光検出器１４を用いており、このペァーを１３＋１４を長方形で囲んで表現してある。図８（Ｂ）では、上段に移動可能な一組の光源１３と光検出器１４が示してあり、１３＋１４を長方形で囲んで表現してある。矢印で移動を示し、下段にそれぞれ固定されている４個所の測定系（測定セル１６が（１）（２）（３）（４）と４個並べてある。）に合体する。すなわち、移動可能な一組の光源１３と光検出器１４のペァー（１３＋１４）が、下段の（１）の状態にある測定系（測定セル１６）に合体し発色基パラニトロアニリンの吸光度が測定される。次いで、移動可能な一組の光源１３と光検出器１４のペァー（１３＋１４）が、下段の（２）の状態にある測定系（測定セル１６）に合体し発色基パラニトロアニリンの吸光度の経時変化率が測定される。さらに、（３）および（４）にある測定系（測定セル１６）に合体し発色基パラニトロアニリンの吸光度が測定される。
【００３９】
６．  エンドトキシンの濃度測定装置
本発明のエンドトキシンの濃度測定装置とは、上記した各手段を有機的に結合した構造体である。
上位概念的には、単数の測定系の場合、図１の（Ａ）に概念図を示すように、検体液を取込み封鎖する手段１、検体液の測定手段２及び検体液を排出し封鎖する手段３（オプション）からなる１ユニットのエンドトキシンの濃度測定装置である。
２つの測定系の場合は、図１の（Ｂ）に示すように、１つ（単数）の測定系が２系列あり、並列になっている２ユニットのエンドトキシンの濃度測定装置である。これを更に具体的に構成したものを図４に示す。
３つの測定系の場合は、図１の（Ｃ）に示すように、１つ（単数）の測定系が３系列あり、並列になっている３ユニットのエンドトキシンの濃度測定装置である。
【００４０】
７．  エンドトキシンの濃度測定方法
本発明において、本発明のエンドトキシンの濃度測定装置を用いて、下記の方法でエンドトキシンの濃度を測定する。
まず、エンドトキシンを含む検体液（注射液、輸液、透析液等の医薬品と、その中間製品、又はこれらの原料の一部となる精製水など）が貯蔵されている貯糟、タンク、ガラス瓶、プラスチック容器、プラスチックバッグ等の貯蔵手段から、又は、これらが流れている供給ラインからパイプなどの取込み手段により、検体液を測定セル又は測定回路にポンプで輸送する。
なお、流れている供給ラインからの場合は、ポンプを省略できる。
次いで、測定セル又は測定回路内に検体液を入れたのち、測定セル又は測定回路の入口と出口のバルブを閉じて測定セル又は測定回路を封鎖する。
【００４１】
次いで、リムルス試薬注入パイプのバルブ又は仕切りを開き、測定セル又は測定回路内の検体液にリムルス試薬を注入し、振動、又は揺動して、検体液とリムルス試薬の混合液をつくり、遊離した発色基パラニトロアニリンの吸光度を吸光度測定手段の光源と光検出器で測定する。
なお、測定セル又は測定回路へのリムルス試薬の導入を検体液導入の前に行ってもよい。
測定の終了後、混合液を測定回路内から排出パイプのバルブを開き、排出パイプから廃棄する。この場合、測定回路内及び排出パイプ内を洗浄するために、洗浄液パイプのバルブを開き、洗浄液を測定回路内に導入し、内部を洗浄しながら、測定回路内の混合液を洗浄液と共に流出させ廃棄してもよい。
図４（Ａ）の装置では、測定セル、又は測定回路をディスポーザブル部品にでき、混合液の排出と測定セル又は測定回路の洗浄は不要である。
【００４２】
８．  検体液中のエンドトキシン濃度が低レベルの場合の測定方法
通常は、検体液量とリムルス試薬量は１：１の比率で両液を混合して得られる混合液を用いてエンドトキシンの濃度測定を行う。測定セルの光路長を１ｃｍ以上、好ましくは２ｃｍ以上にした場合、一過性の測定セルとしては容量／光路長の比が最も小さい細管型よりも更に小さい本発明の多重反射型の特殊な形状の測定セルであっても、断面積を０．１ｃｍ２より小さくしなければ測定セルの内容積が既存のエンドトキシン濃度測定装置で使用する０．１ｍｌよりも大きくなるため、測定セルを満たすには、混合液量を増量することが必要となる。しかしながら、リムルス試薬は高価なものであるから、検体量の増量に合わせて増量することは経済的な負担が非常に大きくなり、エンドトキシン濃度を連続的にモニターする場合に大きい障害となる。本発明の対象となる検体液は、注射液、輸液、透析液などの医薬品と、その中間製品、又はこれらの原料の一部となる精製水であって、エンドトキシン濃度が低いため、通常の使用条件である検体液と等量のリムルス試薬は、その大部分がエンドトキシンと未反応で残るであろうことに注目して、リムルス試薬量に対して２倍量〜２０倍量の検体量を混合しても、検体液中のエンドトキシンがリムルス試薬と反応する量は、等量混合の場合と殆ど変わらないであろうことに想到して本発明に至った。検体液量をリムルス試薬量に対して２倍量〜２０倍量とした後、両液を混合して得られる混合液を使用して遊離した発色基パラニトロアニリンを測定することによって、エンドトキシン濃度が低い検体液のエンドトキシンの濃度を短時間で測定することが、始めて可能となった。
【００４３】
９．  光源からの光束を細く集光して測定セルに入射する測定方法
光路長を１ｃｍ以上、好ましくは２ｃｍ以上にすると、測定セルの容積を発色合成基質を含む高感度のリムルス試薬であるエンドスペシーを使用する通常の混合液の容積である０．１ｍｌに収めるためには、本発明の、光路長／容積の比が大きい効率的な測定セルであっても、光束の直径を０．３５５ｃｍ以下、或は０．２５ｃｍ以下に絞ることが必要になり（表１）、光検出器が受ける光量を著しく減少させて感度低下と精度低下の原因となる。光検出器が受ける光量は、光束の面積と強度の積であることに着目すると、一つの方法として光源の出力を高くすることが考えられるが、装置内の限られた空間で発熱を伴なう光源の出力を高くすることは、装置内の温度を高くするので好ましくない。そこで、他の方法として光源は変えずにレンズで集光して測定セルに入射すれば、光源の消費電力を増やすことなく、強度を光束径に逆比例して高めることができることに想到した。レンズで集光した光束は並行光線ではなくなるが、測定セルの内面を光線が反射するよう鏡面にしておくことによって、入射した全光線が測定セルから入射した時と等しい角度の広がりで出射される。光検出器を測定セルから離れ過ぎない位置に設定することにより、測定セルから出射される全光線を受取ることができる。従って、混合液量を発色合成基質を含むリムルス試薬を使用する通常の混合溶液から増量することなく、光束径が大きい場合と同様に、高感度、高精度の測定を実施することができる。この項における方法の説明は、第６の発明に対応するものである。
【００４４】
１０．  並列の測定セルが３系列の場合の自動切替えダイアグラム
図１（Ｃ）に示すように、測定セルが３系列の場合には、第１系列、第２系列、及び第３系列が一定の時間の間隔をおいて、順次、遊離した発色基パラニトロアニリンに起因する吸光度の測定を行い、次いで各系列の洗浄液による洗浄を一定の時間の間隔をおいて、順次行う。洗浄がおわれば、また順次遊離した発色基パラニトロアニリンに起因する吸光度の測定を行う。
並列の測定セルが３系列の場合の自動切替えダイアグラムを図９に示した。
なお、本発明において、洗浄液は糖脂質と蛋白を溶解するものであって、微量が残留した場合でも、検体液、エンドトキシン、リムルス試薬などに悪影響を及ぼさず、エンドトキシンとリムルス試薬との反応を促進したり阻害しないものであれば、いかなるタイプのものであってもよく、塩酸水溶液や界面活性剤から選択することができる。
【００４５】
１１．  特に好ましい実施の形態
現存するリムルス試薬の中で最も感度、精度ともに高いものの一つとして発色合成基質を持つエンドスぺシー（生化学工業（株）製）があり、検体中のエンドトキシンと反応して、一定時間内に合成基質から遊離する発色基パラニトロアニリンの量がエンドトキシン濃度に比例する（竹沢真吾編、透析液エンドトキシンがよくわかる本、３８頁（１９９５）、東京医学社）ことから、反応液の吸光度係数（遊離した発色基パラニトロアニリン濃度に比例する）がエンドトキシン濃度に比例することになる。
【００４６】
従って、光検出器が検出する吸光度（＝透過光強度比の対数）が発色基パラニトロアニリンの濃度に比例する吸光度係数μと光路長ｄの積（μｄ）に比例することに着目して、光路長ｄを長くすることによって低い濃度の吸光度係数μを測定できることに想到して、その方法を鋭意研究した。測定する反応液の量が、試料と試薬の量が夫々、０．０５ｍｌ、合計０．１ｍｌと少量で光路長を単純に長くすることはできない。
【００４７】
そこで測定セルの形状を円筒形にして、その内径を光源からの光束の直径に等しいか、それよりも細くすることによって容積を小さくして光路長を１ｃｍ以上、好ましくは２ｃｍ以上にすることができ、測定感度を高くすることで、測定可能なエンドトキシン濃度範囲を低い方に拡張し、測定時間を短縮することができる。
また、測定セルの断面を多面体にして、１辺から光束を導入して、内面で複数回反射させた後同じまたは他の１辺から導出することによって、等しい内容積の円筒形測定セルよりも５０％以上光路長を長くすることができ、測定感度を高くすることで、測定可能なエンドトキシン濃度範囲を低い方に拡張し、測定時間を短縮することができることに想到して本発明の好ましい発明の実施の形態に到った。
【００４８】
【発明の実施の形態】
［実施態様１］
測定セルとして、内径０．５ｃｍ、長さ１ｃｍ、内容積０．２ｍｌの硬質ガラス管を使用することで、０．２５ｍｌの反応液を光路長１ｃｍで測定した。
【００４９】
［実施態様２］
図５及び図６は、複数回反射により光路長を長くする多面体セル（吸光増幅セル）の例である。
多面体としては、図５に示すように、長方形の短い方の一辺から２ヶの等しい直角二等辺三角形を切り取ってできた５角形の柱体を選び、光束を該直角二等辺三角形を切り取ってできた一辺（高さと長さを光束径に等しいか、その１／２乗に等しい正方形にすることが好ましい）に垂直に入射し、内面で複数回の反射を往復させた後、もう一つの該直角二等辺三角形を切り取ってできた９０°の頂角を介して隣接するもう一つの、入射面と対を成す一面から垂直に導出することによって、光路長を１．５ｃｍ以上、好ましくは２ｃｍ以上にすることができる。
【００５０】
図５に示す５角柱で、９０°の頂角を介して隣接する２面が辺長０．５ｃｍの正方形、他の３面の辺長さが０．７１ｃｍ、内容積０．３１ｍｌの測定セルで３回反射させて光路長を２．５ｃｍにすることができる。
また、５角形の寸法はそのままで高さのみ０．３９ｃｍにすると、内容積０．２５ｍｌで光路長を２．５ｃｍにすることができる。この場合の光束が出入りする面の面積は直径０．５ｃｍの円形の面積に等しい。光束の断面を円形でなく、長方形にできるなら、光路長を等しく維持して、容積を約２０％削減することができる。
【００５１】
なお、多面体は図５に示したような５角柱に限られるものではなく、面数の多い多面体でも複数回の反射が可能であり、その例を図６に示す。
円筒型セルと多重反射型直方体の測定セルの光路長とその光束の直径の関係を表１に示す。
表１は、光束径を指定すると、多重反射回数が増す程光路長が長くなるが、容積も増すこと、また光路長を指定すると多重反射型の方が容積を小さくできることを示している。
【００５２】
【表１】
0003814564.tif 000002
【００５３】
筒型セルと多角柱セルの比較を、光路長と容積の比率で表２に示す。
等しい光束径で比較すると、多角柱セルの数値が大きく、多角柱セルの方が効率的であることが示されている。
【００５４】
【表２】
0003814564.tif 000003
【００５５】
複数の測定セルを、一定の間隔でエンドトキシン濃度の測定装置に順次接続して検体液のエンドトキシン濃度を自動的に連続測定する方式の基本的な例を図４（Ａ）に示す。
複数の測定セル（１６）を、移動手段（図示せず）によって、所定の間隔で順次リムルス試薬注入口（１２）に接続して所定量のリムルス試薬を注入し、次いで検体液取込み口（６）に接続して所定量の検体液を取込み、混合手段（図示せず）によってリムルス試薬と検体液を混合させた後、吸光度測定手段の吸光度測定部（１３＋１４）に接続して吸光度の測定を断続的に繰り返すことによって吸光度の経時変化の連続測定を所定の測定時間実施する。所定の間隔（測定セルが送られてくる間隔、例えば２０分）が所定の測定時間（例えば３０分）よりも短い場合は、複数の測定セルが順次交代して吸光度測定部（１３＋１４）に接続して交互に断続的な測定を繰り返して、所定の測定時間経過した測定セルから順に洗浄液供給口（９）と混合液排出口（１９）に接続して、測定済みの混合液を洗浄液で押出して測定セルを洗浄する。測定セルがディスポーザブルの場合は、排出洗浄手段（９＋１９）に接続することなく、装置から排出される。なお、検定液取込みバルブは、検体液が滞留することないように、測定セルと接続するとき以外は常時開いて検体液を流出させるよう制御する。
また、定量ポンプ４を停止させない場合は、Ｖ１２の直前にバイパスライン（図示せず）を設けて、Ｖ１２が開く時のみ同期して閉じるバルブ（図示せず）を設けるか、または、設定圧以上で開放するリリーフ弁（図示せず）を設けるかして検体液の流量と圧力の変動を防ぐように制御する。
【００５６】
［実施態様３］
複数の装置を測定対象液の流路に並列に切換え可能に結合して、順繰りに自動切換えて連続測定する方式の基本的な例として、２組の装置（一組の光源と受光器を共用することは可能）を対象液の流路に並列に切換え可能に結合して、順繰りに自動切換えて連続測定する装置の例を図４（Ｂ）に示す。
並列の装置が３系列の場合の自動切換え操作ダイアグラムの例を図９に示す。
【００５７】
［実施態様４］
光束径０．５ｃｍでは、光路長を１ｃｍ以上にするには、表１で示すように、円筒型セルで約０．２ｍｌの混合溶液が必要になり、光路長を２ｃｍ以上にするためには、円筒型セルで約０．４ｍｌ、３回反射型５角柱セルで約０．３ｍｌの混合溶液が必要になる。また、光路長を１ｃｍ以上で、且つ、測定セルの内容積をエンドスペシーの通常の混合液量である０．１ｍｌに保つには、光束径を円筒型セルで０．３５５ｃｍに、３回反射型５角柱セルで０．３４ｃｍ（但し、光路長は１．７ｃｍ）に絞ることが必要になる。
混合液量を増やすことは、高価なリムルス試薬を標準的な使用量の２〜４倍使用することで経済的な負担増が大きく、実施上の障害になる。また、光束を細く絞ることは、光検出器の出力信号増倍の負担を大きくするだけでなく、精度も低下させるので好ましくない。
【００５８】
本発明の対象となる検体液のエンドトキシン濃度は低いので、通常の検体液量と等量混合したリムルス試薬の大部分は、エンドトキシンと反応しないで残るであろうことに着目して、リムルス試薬量の２〜２０倍量の検体液を混合しても、検体液中のエンドトキシンがリムルス試薬と反応する量は、標準的な等量混合の場合と殆ど変わらないであろうことに想到した。即ち、本発明では、標準的な等量混合は０．２〜２ｍｌになり、光束の直径を太く、測定光道長を著しく長くしても、測定可能なエンドトキシン濃度を従来の一桁低い範囲まで拡張することができ、測定時間も実濃度の一桁高い濃度の検体液に相当する短時間に短縮することができる。
【００５９】
【実施例】
以下に、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００６０】
［実施例１］
検体液取込みパイプ７、開閉バルブ６、洗剤液注入パイプ８（図省略）、開閉バルブ９（図省略）、定量ポンプ（図省略）、リムルス試薬注入パイプ１１、開閉バルブ付リムルス試薬注入器２５、測定回路１５、測定セル１６、測定セル輸送器２６、２７、２８、２９、測定セル振動器３０、開閉バルブ１９、排出パイプ２０、恒温槽２１（図省略）、及び移動可能な光源１３と光検出器１４の結合体からなるエンドトキシン濃度の自動連続測定装置を作成した。これを図１０に示す。
【００６１】
【発明の効果】
本発明の装置によれば、注射液、輸液、透析液などの医薬品と、その中間製品、精製水などの検体液の貯蔵タンク又は供給ラインから、検体液の一部をパイプで取込みエンドトキシンの濃度を連続的にモニターすることができ、かつエンドトキシンの濃度が５０ＥＵ／Ｌ以下の低濃度液、特に１０〜＜１ＥＵ／Ｌレベルの極低濃度液であってもモニターでき、しかもエンドトキシンの濃度を短時間にモニターできる効果がある。
【図面の簡単な説明】
【図１】装置の構成を示す概念図
図（Ａ）は検体液を取込み封鎖する手段と、検体液の測定手段と、検体液を排出し封鎖する手段が１系列の場合、図（Ｂ）は２系列の場合、図（Ｃ）は３系列の場合。
【図２】検体液を取込み封鎖する手段の例。
図（Ａ）は混合液が測定回路を循環している場合であり、図（Ｂ）は測定回路の上部の一部は測定セルとなっていることを示す図。
【図３】検体液の測定手段。
図（Ａ）は１系列の場合であり、図（Ｂ）は２系列の場合、図（Ｃ）は３系列の場合。
【図４】複数の測定セル又は測定系を並列に設置して、自動切換えて順繰りに連続測定する装置の例。
図（Ａ）は請求項３に、図（Ｂ）は請求項４に対応する図。
【図５】複数回反射により光路長を長くした５角柱セル（吸光増幅セル）の形状を示す図。
図（Ａ）は平面図、図（Ｂ）は正面図。
【図６】複数回反射により光路長を長くした多面体セル（吸光増幅セル）の例を示す図。
【図７】単一の光源とそれに対応する検出器を中心として回転する複数の測定セルを示す図。
【図８】複数の測定セルに対して併進往復する単一の光源とそれに対応する検出器を示す図。
【図９】並列の測定セルが２系列の場合の自動切替えダイアグラムを示す図。
【図１０】請求項３の実施態様の詳細な装置図。
図（Ａ）は平面図、図（Ｂ）は側面図。
【符号の説明】
１          検体液を取込み封鎖する手段
２          検体液の測定手段
３          検体液を排出し封鎖する手段
４          検体液の取込みポンプ（定量ポンプ）
６          検体液取込みパイプの開閉バルブ
７          検体液取込みパイプ
８          洗剤液注入パイプ
９          洗剤液注入パイプの開閉バルブ
１１        リムルス試薬注入パイプ
１２        リムルス試薬注入パイプの開閉バルブ
１３        光源
１４        検出器
１５        測定回路
１６        測定セル
１７        循環ポンプ
１８        ミキサー
１９        排出パイプの開閉バルブ
２０        排出パイプ
２１        恒温槽
２２        光束
２３        電気回路（演算部）
２５        リムルス試薬注入口
２６        測定セル輸送器
２７        測定セル輸送器
２８        測定セル輸送器
２９        測定セル輸送器
３０        測定セル振動器
なお、図４において番号の上付きカンマは、異なる測定系を表わす。
【図１】
0003814564.tif 000004
【図２】
0003814564.tif 000005
【図３】
0003814564.tif 000006
【図４】
0003814564.tif 000007
【図５】
0003814564.tif 000008
【図６】
0003814564.tif 000009
【図７】
0003814564.tif 000010
【図８】
0003814564.tif 000011
【図９】
0003814564.tif 000012
【図１０】
0003814564.tif 000013