(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号１で表わされるＤＮＡ。
【請求項２】
配列表の配列番号２で表わされるＤＮＡ。
【請求項３】
配列表の配列番号１または配列番号２で表わされるＤＮＡの配列において１若しくは数個のヌクレオチドが挿入、付加、若しくは欠失された配列で表わされるＤＮＡであって、プロモーター活性を有するＤＮＡ。
【請求項４】
請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載のＤＮＡを含む組換えＤＮＡ。
【請求項５】
請求項４に記載の組換えＤＮＡを含むベクター。
【請求項６】
プラスミドである請求項５に記載のベクター。
【請求項７】
請求項５または請求項６に記載のベクターにより形質転換された形質転換体。
【請求項８】
請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載のＤＮＡと該ＤＮＡの下流に連結された構造遺伝子を含む組換えＤＮＡ。
【請求項９】
構造遺伝子が、生理活性物質をコードする遺伝子または遺伝子転写の機能解析に用いられる遺伝子である、請求項８に記載の組換えＤＮＡ。
【請求項１０】
遺伝子転写の機能解析に用いられる遺伝子が、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子、アルカリフォスファターゼ遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、およびルシフェラーゼ遺伝子からなる群から選択される１つの遺伝子である、請求項９に記載の組換えＤＮＡ。
【請求項１１】
請求項８〜１０のいずれか１項に記載の組換えＤＮＡを含むベクター。
【請求項１２】
プラスミドである請求項１１に記載のベクター。
【請求項１３】
請求項１１または請求項１２に記載のベクターにより形質転換された形質転換体。
【請求項１４】
請求項８〜１０のいずれか１項に記載の組換えＤＮＡまたは請求項１１もしくは請求項１２に記載のベクターにより形質転換されたラットまたはマウス。
【請求項１５】
請求項１３に記載の形質転換体を培養した培養物から構造遺伝子によりコードされるペプチドを分離し、採取するペプチドの製造方法。
【請求項１６】
請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載のＤＮＡを含む発現キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は遺伝子発現用の強い（転写効率の高い）プロモーター活性を有するＤＮＡに関する。
【０００２】
【従来の技術】
プロモーターとは、ＤＮＡを鋳型にしてｍＲＮＡの転写を開始するＤＮＡ上の特定塩基配列として知られている。また、ｍＲＮＡの合成酵素であるＲＮＡポリメラーゼは、プロモーターを認識してｍＲＮＡの合成をおこなう。プロモーターは転写の効率を決定しており、強いプロモーターの下流にある遺伝子のｍＲＮＡは大量に合成され、その結果、その遺伝子の遺伝子産物も大量に生産される。
【０００３】
したがって、遺伝子工学的手法により、ペプチドを大量にかつ経済的に生産するには、強力なプロモーターを利用する必要がある。
【０００４】
現在、強力なプロモーターとして、ラクトースオペロンのプロモーター、トリプトファンのプロモーター、ラムダファージのＰL プロモーター、ＳＶ４０のプロモーター、メタロチオネインのプロモーターおよびサイトメガロウイルスのプロモーター等が知られている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、ペプチドを大量にかつ経済的に生産するために有用な強力なプロモーター活性を有するＤＮＡを提供することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、あるＤＮＡが強力なプロモーター活性を有することを見いだした。
【０００７】
【発明の実施の形態】
すなわち、本発明は次の発明１．から発明１７．に関する。
【０００８】
発明１．  配列表の配列番号１で表わされるＤＮＡ。
【０００９】
発明２．  配列表の配列番号２で表わされるＤＮＡ。
【００１０】
発明３．  配列表の配列番号１または配列番号２で表わされるＤＮＡにハイブリダイズするＤＮＡ。
【００１１】
発明４．  発明１．〜発明３．のいずれか１つの発明に記載のＤＮＡの一部分であるＤＮＡ。
【００１２】
発明５．  プロモーター活性を有する発明１．〜発明４．のいずれか１つの発明に記載のＤＮＡ。
【００１３】
発明６．  発明１．〜発明５．のいずれか１つの発明に記載のＤＮＡを含む組換えＤＮＡ。
【００１４】
発明７．  発明６．に記載の組換えＤＮＡを含むベクター。
【００１５】
発明８．  プラスミドである発明７．に記載のベクター。
【００１６】
発明９．  発明７．または発明８．に記載のベクターにより形質転換された形質転換体。
【００１７】
発明１０．  発明１．〜発明５．のいずれか１つの発明に記載のＤＮＡと該ＤＮＡの下流に連結された構造遺伝子を含む組換えＤＮＡ。
【００１８】
発明１１．  発明１０．に記載の組換えＤＮＡを含むベクター。
【００１９】
発明１２．  プラスミドである発明１１．に記載のベクター。
【００２０】
発明１３．  発明１１．または発明１２．に記載のベクターにより形質転換された形質転換体。
【００２１】
発明１４．  発明１０．に記載の組換えＤＮＡまたは発明１１．もしくは発明１２．に記載のベクターにより形質転換された動物。
【００２２】
発明１５．  発明１３．に記載の形質転換体を培養した培養物から構造遺伝子によりコードされるペプチドを分離し、採取するペプチドの製造方法。
【００２３】
発明１６．  発明１．〜発明５．のいずれか１つの発明に記載のＤＮＡを含む発現キット。
【００２４】
発明１７．  発明１０．に記載の組換えＤＮＡまたは発明１１．もしくは発明１２．に記載のベクターを含む遺伝子治療用組成物。
【００２５】
以下に、本発明について説明する。
【００２６】
本発明の配列表の配列番号１または配列番号２で表わされるＤＮＡは、ラットの脳の染色体より抽出されたものである。本発明者らは、このＤＮＡがプロモーター活性を有することを見いだした。
【００２７】
一般に、新規なＤＮＡが見いだされると、当業者はそのＤＮＡの一部分または全部をプローブとして、ハイブリダイズするＤＮＡを種々のライブラリーを用いて探索する。配列表の配列番号１または配列番号２で表わされるＤＮＡにハイブリダイズするＤＮＡまたはその一部分は、プロモーター活性を有することが予測される。
【００２８】
したがって、本発明のＤＮＡには、配列表の配列番号１または配列番号２で表わされるＤＮＡのみならず、その一部分、配列表の配列番号１または配列番号２で表わされるＤＮＡにハイブリダイズするＤＮＡおよびハイブリダイズするＤＮＡの一部分も含まれるものである。特に、プロモーター活性を有するものは本発明に含まれる。
【００２９】
ハイブリダイズするＤＮＡとは、配列表の配列番号１もしくは配列番号２で表わされるＤＮＡまたはその一部分をプローブにして、一般的な条件下で、ハイブリダイズするものをいう。ハイブリダイズの条件は適宜検討すればよいが、例えば、０．７５Ｍ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、０．２ｍＭ  エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、０．２％牛血清アルブミン、０．２％ポリビニルピロリドン、０．２％Ｆｉｃｏｌｌ  ４００（ファルマシア社製）、０．１％ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、５０μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ、６５℃、１６時間反応させるといった条件を挙げることができるが、特にこの条件に限定されるべきものではない。
【００３０】
また、本発明においてハイブリダイズするＤＮＡとは、配列表の配列番号１または配列番号２で表わされるＤＮＡの誘導体としても表現することができる。すなわち、配列表の配列番号１または配列番号２で表わされるＤＮＡに対して、少なくとも約７０％の配列同一性を有するものであり、例えば、ＤＮＡの配列に１つまたは２つ以上のヌクレオチドが挿入されたもの、ＤＮＡの配列のどちらかの末端に１つまたは２つ以上のヌクレオチドが付加されたもの、ＤＮＡの配列のどちらかの末端もしくは内部の１つまたは２つ以上のヌクレオチドを欠失させたもの、さらにこれらが組合わさったものを挙げることができる。
【００３１】
本発明のＤＮＡは、公知の方法によって合成することにより製造することもできる。
【００３２】
本発明の組換えＤＮＡとは、プロモーター活性を有する本発明のＤＮＡの下流に、発現させたいペプチドをコードする構造遺伝子を、構造遺伝子が正しく転写される方向に連結されているものである。
【００３３】
さらに、本発明における組換えＤＮＡにおいては、プロモーター活性を有する本発明のＤＮＡの上流または下流の適当な箇所に、エンハンサーやターミネーター等の転写調節領域を連結することも可能である。なお、組換えＤＮＡは公知の製造方法により製することができる。
【００３４】
プロモーター活性を有する本発明のＤＮＡの下流に連結される発現させたいペプチドをコードする構造遺伝子は、特に限定されるべきものではないが、例えば、生理活性物質をコードする遺伝子、遺伝子転写の機能解析に用いられる遺伝子等を挙げることができる。構造遺伝子の１種または複数をプロモーター活性を有する本発明のＤＮＡに連結することができる。
【００３５】
生理活性物質をコードする遺伝子としては、例えば、プロスタグランジン、プロスタサイクリン、トロンボキサン、ロイトコリエン、インターフェロン、インターロイキン、組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔ−ＰＡ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、心房性利尿ペプチド（ＡＮＰ）およびエリスロポエチン等をコードする遺伝子を挙げることができるが、特にこれらのものに限定されるべきものではない。
【００３６】
遺伝子転写の機能解析に用いられる遺伝子としては、例えば、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子、アルカリフォスファターゼ遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子およびルシフェラーゼ遺伝子等を挙げることができるが、特にこれらのものに限定されるべきものではない。
【００３７】
発現させたいペプチドを得るためには、組換えＤＮＡをベクターに導入し、次いで、組換えＤＮＡを導入したベクターを用いて、宿主を形質転換することになる。宿主としては、例えば、ヒト、ウシ、マウス、ラット、カイコといった動物の細胞等を挙げることができる。
【００３８】
なお、宿主を形質転換するためのベクターは、宿主−ベクター系を考慮して、選択することが必要である。例えば、動物細胞用のベクターとしては、特に限定されるべきものではないが、レトロウイルスやｐＭＡＭ（クローンテック社製）等のプラスミド等を挙げることができる。なお、組換えＤＮＡを導入したベクターは公知の製造方法により製することができる。
【００３９】
組換えＤＮＡを導入したベクターを用いて、宿主を形質転換することによって、構造遺伝子によりコードされる発現させたいペプチドを形質転換体において発現させることができる。
【００４０】
ベクターを用いた宿主の形質転換は公知の方法により行うことができる。例えば、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、ＤＥＡＥ−Ｄｅｘｔｒａｎ法、プロトプラスト法等（Molecular Cloning,-A laboratory manual-,second edition Cold Spring Harbar Laboratory Press 1989）を挙げることができるが、特に限定されるべきものではない。
【００４１】
発現させたいペプチドを得るには、形質転換体を培地で培養し、培養物からペプチドを単離し、採取すればよい。発現させたいペプチドを考慮して、培養方法・条件等は適宜検討すればよいが、培地としては、例えば、約５〜２０％の牛血清（ＦＣＳ）を添加したＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地およびＲＰＭＩ１６４０培地（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）等を挙げることができる。
【００４２】
ペプチドの単離・採取方法としては、例えばゲル濾過法、イオン交換クロマトグラフィー法、逆相クロマトグラフィー法およびアフィニティークロマトグラフィー法等を挙げることができるが、特に限定されるべきものではない。
【００４３】
また、発現させたいペプチドをコードする構造遺伝子を含む組換えＤＮＡまたはベクターを用いて、受精卵を形質転換すると、形質転換された動物（トランスジェニックアニマル）を作成することもできる。形質転換する動物としては、ウシ、ブタ、ヒヒ、マウス、ラット、モルモット、イヌといった動物を挙げることができる。
【００４４】
さらに、本発明のＤＮＡと発現させたいペプチドをコードする構造遺伝子を含むベクターは、ヒト等の遺伝子治療に用いることができる。
【００４５】
遺伝子治療に適した疾患としては、適用するのに適していれば特に限定すべきものではないが、例えば、遺伝的に特定の生理活性物質がまったく産生されない、あるいはその産生が異常に低いレベルにある遺伝病、腫瘍、がん等を挙げることができる。
【００４６】
遺伝的に特定の生理活性物質がまったく産生されない、またはその産生が異常に低いレベルにある遺伝病としては、例えば、アデノシンデアミナーゼ欠損症、血友病Ａ、血友病Ｂ、フェニルケトン尿症、成長ホルモン欠損症、Ｄｅｃｈｅｎｎｅ型筋ジストロフィー、オルニチントランスカルバモイラーゼ欠損症およびアンチトロンビンＩＩＩ欠損症等を挙げることができる。
【００４７】
これらの疾患についての遺伝子治療は、遺伝的に欠損している遺伝子または、がん遺伝子の発現を抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチドを、本発明のＤＮＡの下流に正しく転写される方向に連結した組換えＤＮＡをヒト等に投与することにより行われる。投与に際しては、組換えＤＮＡをベクターやリポソーム、リンパ球等に導入して行うことが好ましい。
【００４８】
したがって、本発明の遺伝子治療用組成物とは、組換えＤＮＡ、または組換えＤＮＡを導入したベクター、リポソーム、リンパ球等を含有した組成物をいう。
【００４９】
なお、本発明の遺伝子治療用組成物をヒト等に投与する方法としては、経口的または非経口的に投与する方法が挙げられるが、非経口的に投与するのが好ましい。また、投与量については、疾患や患者の状態等を考慮して検討すればよい。
【００５０】
経口的に投与するための製剤としては、例えば、丸剤、散剤、顆粒剤、細粒剤、カプセル剤、錠剤、液剤、ドライシロップ等を挙げることができる。また、非経口的に投与するための製剤としては、例えば、注射剤、坐剤、吸入剤、点眼剤、軟膏剤、貼付剤等を挙げることができる。
【００５１】
またヒト等に投与する際には、薬理学的または製剤学的に許容し得る添加物を本発明の遺伝子治療用組成物に添加することができる。
【００５２】
添加物としては、例えば、賦形剤、崩壊剤、崩壊補助剤、結合剤、滑沢剤、等張化剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、着色剤等種々のものを挙げることができる。
【００５３】
次に、本発明を実施例により説明するが、本発明はこれに限定されるべきものではない。
【００５４】
【実施例】
１．ＤＮＡの調製
Analytical Biochemistry.,219,131(1994)に記載の方法により８週令のウイスター系ラットの脳から、まず染色体ＤＮＡを抽出し、これをＭｓｅ  Ｉ（ＮｅｗＥｎｇｌａｍｄ  Ｂｉｏｌａｂ社製）、Ｂａｍ  ＨＩ（東洋紡績社製）の２種類の制限酵素で各々３７℃で２時間ずつ反応させ、ＤＮＡを低分子化した。低分子化したＤＮＡ断片をＫｌｅｎｏｗ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績社製）で３７℃で１時間反応させ、末端を平滑化した。
【００５５】
２．ベクターＤＮＡの調製
ｐＣＡＴベクター（プロメガ社製）をＰｓｔ  Ｉ（東洋紡績社製）を用い、３７℃で２時間反応させ、ＤＮＡを切断した。切断したＤＮＡ末端をＫｌｅｎｏｗＦｒａｇｍｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績社製）で３７℃で１時間反応させ、末端を平滑化した。更に、Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｃ７５：宝酒造社製）で６５℃で１時間反応させ、ＤＮＡの５’末端のリン酸を除去した。
【００５６】
３．ＤＮＡの連結（組換えＤＮＡの構築）
上記１．で調製したＤＮＡと２．で調製したベクターＤＮＡをＤＮＡライゲーションキット（宝酒造社製）を用いて、両ＤＮＡを連結した。すなわち、両ＤＮＡの混合液１溶に対し、４倍溶のＡ液（Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ）と１倍溶のＢ液（Ｅｎｚｙｍｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を加えて、１６℃で１６時間反応させ、組換えＤＮＡを含有するベクターを作製した。
【００５７】
４．形質転換体の作製
上記３．で得た組換えＤＮＡを含有するベクターをコンピテント細胞（大腸菌：ＤＨ５、ＢＲＬ社製）に導入し、形質転換を行い、形質転換体を得た。この形質転換体はアンピシリン耐性を持つものであったので、組換えＤＮＡを含有するベクターであることが確認できた。
【００５８】
５．プラスミドＤＮＡの抽出
各々の形質転換体から、プラスミドＤＮＡを抽出した。
【００５９】
６．プラスミドＤＮＡのマウス繊維芽細胞（Ｌ細胞）への導入
上記５．で得られたプラスミドＤＮＡ２０μｇをリン酸カルシウム法により約１０6 細胞のＬ細胞に導入し、３日間反応させた。このとき、コントロールとして、サイトメガロウイルスのプロモーターを有するｐＣＡＴプロモーターベクター（プロメガ社製）を用いた。
【００６０】
７．クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）アッセイ
上記６．で作成した細胞をＰＢＳで洗った後、剥がし、スピッツ試験管で２０００ｒｐｍで５分間、遠心分離して細胞を集めた。集めた細胞をｐＨ７．８の１００ｍＭトリス−塩酸緩衝液１００μｌに懸濁した。細胞の懸濁液を凍結−融解（液体窒素−３７℃水槽）−攪拌を３回繰り返し、細胞を壊した。４℃において、１５０００ｒｐｍで５分間、遠心分離して上清を得た。この溶液の蛋白質濃度を定量し、シンチレーションカウンター用チューブに５０μｇの蛋白質に相当する量（最大容量５０μｌ）をとり、１．２５ｍＭのクロラムフェニコール２００μｌと１４Ｃ−ブチリルコエンザイムＡ（ＮＥＮ  リサーチ  プロダクツ社製）１０μｌを混合し、エコノフロアー（Ｅｃｏｎｏｆｌｕｏｒ）（ＮＥＮ  リサーチ  プロダクツ社製）５ｍｌを重層し、室温で３時間反応させた。その後、液体シンチレーションカウンター（ベックマンＬＳ３８０１）にてＣＡＴ活性を測定した。
【００６１】
８．結果
多数の組換えＤＮＡを含有するベクターのＣＡＴ活性を解析したところ、コントロールのサイトメガロウイルスのプロモーターを挿入したｐＣＡＴプロモーターベクター（プロメガ社製）と同等のＣＡＴ活性を有するＤＮＡ（配列表の配列番号１および配列番号２）を含むベクターを見いだした。結果を図１に示す。なお、配列表の配列番号１および２は、センスとアンチセンスの関係にある。
【００６２】
【発明の効果】
本発明のＤＮＡは、強力なプロモーター活性を有しており、ペプチドを大量にかつ経済的に生産するために有用である。
【００６３】
また、プロモーター活性を有する配列表の配列番号１および配列番号２で表わされるＤＮＡは、センスとアンチセンスの関係にあるため、プロモーターと発現させたいペプチドの構造遺伝子の連結において、転写の方向に留意せずに、組換えＤＮＡ等の構築を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明のプロモーター活性を有するＤＮＡを含有するベクターのＣＡＴ活性を示すものである。
【配列表】
配列番号：１
配列の長さ：２２６
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Genomic ＤＮＡ
起源
生物名：ラッテス  ナーベジカス（Rattus nervegicus ）
組織の種類：脳
配列
0003754499.tif 000002
配列番号：２
配列の長さ：２２６
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Genomic ＤＮＡ
起源
生物名：ラッテス  ナーベジカス（Rattus nervegicus ）
組織の種類：脳
配列
0003754499.tif 000003
【図１】
0003754499.tif 000004