(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記(a)〜(d)の変異の少なくとも１つの変異を有するアプラタキシン遺伝子DNAまたは該変異部位を少なくとも１つ含むその断片。
(a) 配列番号１の95番目または配列番号３の617番目のCのTへの置換
(b) 配列番号１の167番目または配列番号３の689番目のTと配列番号１の168番目または配列番号３の690番目のGの間へのTの挿入
(c) 配列番号１の266番目または配列番号３の788番目のTのGへの置換
(d) 配列番号１の318番目または配列番号３の840番目のTの欠失
【請求項２】
眼球運動失行と低アルブミン血症を伴う早期発症型脊髄小脳変性症(EAOH)の診断のための、請求項１記載のアプラタキシン遺伝子DNAまたは請求項１記載の変異部位を少なくとも１つ含むその断片。
【請求項３】
被験体の生物学的試料から得た配列番号２または４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列、配列番号１で表される塩基配列のうち、塩基番号1〜507からなる塩基配列または配列番号３で表される塩基配列のうち、塩基番号7〜1032からなる塩基配列を含むアプラタキシン遺伝子の変異を検出することにより、該被験体が眼球運動失行と低アルブミン血症を伴う早期発症型脊髄小脳変性症(EAOH)の原因となる遺伝子変異の保因者であるか否かを検出する方法。
【請求項４】
アプラタキシン遺伝子の変異が下記(a)〜(d)の変異の１つ以上である請求項３記載の方法。
(a) 配列番号１の95番目または配列番号３の617番目のCのTへの置換
(b) 配列番号１の167番目または配列番号３の689番目のTと配列番号１の168番目または配列番号３の690番目のGの間へのTの挿入
(c) 配列番号１の266番目または配列番号３の788番目のTのGへの置換
(d) 配列番号１の318番目または配列番号３の840番目のTの欠失
【請求項５】
以下の（１）または（２）のアプラタキシン遺伝子DNAまたはその断片を試料と接触させることを含む、眼球運動失行と低アルブミン血症を伴う早期発症型脊髄小脳変性症(EAOH)の検出法：
（１）  配列番号２または４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列、配列番号１で表される塩基配列のうち、塩基番号1〜507からなる塩基配列または配列番号３で表される塩基配列のうち、塩基番号7〜1032からなる塩基配列を含むアプラタキシン遺伝子；ならびに
（２）  下記(a)〜(d)の変異の少なくとも１つの変異を有するアプラタキシン遺伝子DNAまたは該変異部位を少なくとも１つ含むその断片：
(a) 配列番号１の95番目または配列番号３の617番目のCのTへの置換；
(b) 配列番号１の167番目または配列番号３の689番目のTと配列番号１の168番目または配列番号３の690番目のGの間へのTの挿入；
(c) 配列番号１の266番目または配列番号３の788番目のTのGへの置換；および
(d) 配列番号１の318番目または配列番号３の840番目のTの欠失。
【請求項６】
以下の（１）または（２）のアプラタキシン遺伝子DNAまたはその断片を含む、眼球運動失行と低アルブミン血症を伴う早期発症型脊髄小脳変性症(EAOH)の検出キット：
（１）  配列番号２または４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列、配列番号１で表される塩基配列のうち、塩基番号1〜507からなる塩基配列または配列番号３で表される塩基配列のうち、塩基番号7〜1032からなる塩基配列を含むアプラタキシン遺伝子；ならびに
（２）  下記(a)〜(d)の変異の少なくとも１つの変異を有するアプラタキシン遺伝子DNAまたは該変異部位を少なくとも１つ含むその断片：
(a) 配列番号１の95番目または配列番号３の617番目のCのTへの置換；
(b) 配列番号１の167番目または配列番号３の689番目のTと配列番号１の168番目または配列番号３の690番目のGの間へのTの挿入；
(c) 配列番号１の266番目または配列番号３の788番目のTのGへの置換；および
(d) 配列番号１の318番目または配列番号３の840番目のTの欠失。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、眼球運動失行と低アルブミン血症を伴う早期発症型脊髄小脳変性症（EAOH）に関連したアプラタキシン遺伝子および該遺伝子がコードするタンパク質、並びにEAOH発症に関与する変異アプラタキシン遺伝子および該変異遺伝子がコードするタンパク質の疾病治療および診断への利用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
フリードライヒ失調症（FRDA）は、コーカソイドの中で、最も普通に認められる常染色体劣性神経変性疾患である。該病気は、早期、通常25歳以前の早期に発症し、進行性の失調症、感覚消失、腱反射の欠如、錐体路障害による下肢の筋力低下により特徴付けられる(Friedreich N, Virchows Arch. Pathol. Anat., 68, 145-245 (1876); Freidreich N, Virchows Arch. Pathol. Anat., 70, 140-142 (1877); Harding, A.E., Brain 104, 589-620 (1981); Durr, A. et al., N Engl J Med 335, 1169-75 (1996))。FRDAは、染色体9q13上の遺伝子の変異がその原因であることがわかっている。
【０００３】
本発明者らは、常染色体劣性遺伝性であり、若年で発症し、FRDA様の臨床症状および低アルブミン血症により特徴付けられる患者群を新たに同定したが、連鎖解析の結果、該疾患の原因遺伝子はFRDA遺伝子座とは連鎖していないことがわかった。
該疾患は、また9p13に関連した「眼球運動失行を伴う失調症、AOA(ataxia with oculmotor aprataxia)」と呼ばれている疾患の臨床症状に似ていた(do Ceu Moreira, M et al., Am J Hum Genet 68, 501-8 (2001))。
【０００４】
本発明者らが見出した常染色体劣性遺伝性で、若年で発症し、FRDA様の臨床症状および低アルブミン血症により特徴付けられる該疾患は、新規な疾患であり、その原因遺伝子も解明されていなかった。従って、従来は、臨床的な観察に基づく診断しかできなかった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、常染色体劣性遺伝性であり、若年で発症し、FRDA様の臨床症状および低アルブミン血症により特徴付けられる疾患、すなわち眼球運動失行と低アルブミン血症を伴う早期発症型脊髄小脳変性症（EAOH）に関連したアプラタキシン遺伝子および該遺伝子がコードするタンパク質、並びにEAOH発症に関与する変異アプラタキシン遺伝子および該変異遺伝子がコードするタンパク質の疾病治療および診断への利用を提供することを課題とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは新規疾患が上述のAOAと同じ遺伝子座に関連していることを確認し、強い連鎖不平衡に基づいて、効率的に原因遺伝子の候補領域を絞込んだ。その結果、原因遺伝子としてhistidine triad（HIT）スーパーファミリーに属する新規遺伝子、アプラタキシン遺伝子を同定し、明確な遺伝子型と表現型の相関を見出した。
【０００７】
既に多くのHITタンパク質が同定されているが、アプラタキシンはこれらとは異なる表現型に関連していた。
このようにして、本発明者らは、アプラタキシン遺伝子（APTX）を見出し、アプラタキシン遺伝子の変異が眼球運動失行と低アルブミン血症を伴う早期発症型脊髄小脳変性症（EAOH）の原因であることを見出すとともに、EAOH発症に関与するアプラタキシン遺伝子の変異を特定し本発明を完成させるに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
（１）  眼球運動失行と低アルブミン血症を伴う早期発症型脊髄小脳変性症(EAOH)の治療のための、ヒトアプラタキシンタンパク質。
（２）  以下の(a)または(b)である、（１）のヒトアプラタキシンタンパク質。
(a) 配列番号２または４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(b) 配列番号２または４で表されるアミノ酸配列において１個または数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつヒトアプラタキシンタンパク質の機能と同等の機能を有しEAOHの発症に関連するタンパク質
（３）  眼球運動失行と低アルブミン血症を伴う早期発症型脊髄小脳変性症(EAOH)の治療のための、ヒトアプラタキシン遺伝子。
（４）  以下の(a)または(b)のタンパク質をコードする、（３）のヒトアプラタキシン遺伝子。
(a) 配列番号２または４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(b) 配列番号２または４で表されるアミノ酸配列において１個または数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつヒトアプラタキシンタンパク質の機能と同等の機能を有しEAOHの発症に関連するタンパク質
（５）  以下の(c)または(d)のDNAを含む、（３）の遺伝子。
(c) 配列番号１で表される塩基配列のうち、塩基番号1〜507からなる塩基配列を含むDNA
(d) 配列番号１で表される塩基配列のうち、塩基番号1〜507からなる塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつヒトアプラタキシンタンパク質の機能と同等の機能を有しEAOHの発症に関連するタンパク質をコードするDNA
【０００９】
（６） 以下の(e)または(f)のDNAを含む、（３）のヒトアプラタキシン遺伝子DNAまたはその断片。
(e) 配列番号３で表される塩基配列のうち、塩基番号7〜1032からなる塩基配列を含むDNA
(f) 配列番号３で表される塩基配列のうち、塩基番号7〜1032からなる塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつヒトアプラタキシンタンパク質の機能と同等の機能を有しEAOHの発症に関連するタンパク質をコードするDNA
（７）  眼球運動失行と低アルブミン血症を伴う早期発症型脊髄小脳変性症(EAOH)の治療のための、（３）〜（６）のいずれかのヒトアプラタキシン遺伝子を含むベクター。
（８）  眼球運動失行と低アルブミン血症を伴う早期発症型脊髄小脳変性症(EAOH)の診断のための、ヒトアプラタキシン遺伝子DNAまたはその断片。
（９）  以下の(a)または(b)のタンパク質をコードする、（８）のヒトアプラタキシン遺伝子DNAまたはその断片。
(a) 配列番号２または４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(b) 配列番号２または４で表されるアミノ酸配列において１個または数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつヒトアプラタキシンタンパク質の機能と同等の機能を有しEAOHの発症に関連するタンパク質
（１０）  以下の(c)または(d)のDNAを含む、（８）のヒトアプラタキシン遺伝子DNAまたはその断片。
(c) 配列番号１で表される塩基配列のうち、塩基番号1〜507からなる塩基配列を含むDNA
(d) 配列番号１で表される塩基配列のうち、塩基番号1〜507からなる塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつヒトアプラタキシンタンパク質の機能と同等の機能を有しEAOHの発症に関連するタンパク質をコードするDNA
【００１０】
（１１） 以下の(e)または(f)のDNAを含む、（８）のヒトアプラタキシン遺伝子DNAまたはその断片。
(e) 配列番号３で表される塩基配列のうち、塩基番号7〜1032からなる塩基配列を含むDNA
(f) 配列番号３で表される塩基配列のうち、塩基番号7〜1032からなる塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつヒトアプラタキシンタンパク質の機能と同等の機能を有しEAOHの発症に関連するタンパク質をコードするDNA
（１２）  EAOH発症の原因となるアプラタキシン遺伝子の変異を有するアプラタキシン遺伝子DNAまたは該変異部位を少なくとも１つ含むその断片。
（１３）  下記(g)〜(j)の変異の少なくとも１つの変異を有するアプラタキシン遺伝子DNAまたは該変異部位を少なくとも１つ含むその断片。
(g) 配列番号１の95番目または配列番号３の617番目のCのTへの置換
(h) 配列番号１の167番目または配列番号３の689番目のTと配列番号１の168番目または配列番号３の690番目のGの間へのTの挿入
(i) 配列番号１の266番目または配列番号３の788番目のTのGへの置換
(j) 配列番号１の318番目または配列番号３の840番目のTの欠失
（１４）  眼球運動失行と低アルブミン血症を伴う早期発症型脊髄小脳変性症(EAOH)の診断のための、（１２）もしくは（１３）のアプラタキシン遺伝子DNAまたは（１２）もしくは（１３）の変異部位を少なくとも１つ含むその断片。
（１５）  被験体の生物学的試料から得たアプラタキシン遺伝子の変異を検出することにより、該被験体が眼球運動失行と低アルブミン血症を伴う早期発症型脊髄小脳変性症(EAOH)の原因となる遺伝子変異の保因者であるか否かを診断する方法。
【００１１】
（１６）  アプラタキシン遺伝子の変異が下記(g)〜(j)の変異の１つ以上である（１５）の方法。
(g) 配列番号１の95番目または配列番号３の617番目のCのTへの置換
(h) 配列番号１の167番目または配列番号３の689番目のTと配列番号１の168番目または配列番号３の690番目のGの間へのTの挿入
(i) 配列番号１の266番目または配列番号３の788番目のTのGへの置換
(j) 配列番号１の318番目または配列番号３の840番目のTの欠失
（１７）  （８）〜（１４）のいずれかのアプラタキシン遺伝子DNAまたはその断片を試料と接触させることを含む、眼球運動失行と低アルブミン血症を伴う早期発症型脊髄小脳変性症(EAOH)の診断法。
【００１２】
さらに、アプラタキシン遺伝子またはアプラタキシンタンパク質を用いるEAOHの治療法、および本発明のアプラタキシン遺伝子またはアプラタキシンタンパク質をEAOHの治療用薬剤を製造するための使用も本発明の範囲である。
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１３】
【発明の実施の形態】
１．アプラタキシン遺伝子の取得
cDNAライブラリーの作製、遺伝子のクローニング及びスクリーニング、塩基配列の決定等の技術はJ. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (1989): Molecular Cloning, a laboratory manual, second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press及び Ed Harlow and David Lanc (1988): Antibodies, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press等の当業者に良く知られた文献に記載された方法に従って行えばよい。
【００１４】
本発明の遺伝子は、mRNAを抽出し、cDNAを合成して単離することができる。mRNAの供給源としてはリンパ芽球細胞等のヒト細胞を用いることができる。mRNAの調製は、グアニジンチオシアネート／塩化セシウム法などにより全RNAを抽出した後、オリゴdT−セルロースやポリU−セファロース等を用いたアフィニティーカラム法により、あるいはバッチ法によりポリ（A）+RNA（mRNA）を得ることにより行える。このようにして得られたmRNAを鋳型として、オリゴdTプライマー及び逆転写酵素を用いて一本鎖cDNAを合成した後、該一本鎖cDNAから二本鎖cDNAを合成する。
【００１５】
合成した二本鎖cDNAを適当なベクターに組み込んで、該ベクターを用いて大腸菌等を形質転換してcDNAライブラリーを作製して本発明の遺伝子の一部を取得することができる。選択方法として、本遺伝子の既知cDNA配列（FLJ20157としてESTが報告されている。NCBI Accession No. NM#017692）に基づいて合成したプローブを用いてのプラークハイブリダイゼーション法、コロニーハイブリダイゼーション法やイムノスクリーニング法等の方法を用いることができる。得られたcDNA断片はPCR法で増幅し、マキサム・ギルバート法（Maxam, A. M. and Gilbert,  W., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 74, 560, 1977）又はジデオキシ法（Messing, J. et al., Nucl. Acids Res., 9, 309, 1981）等により塩基配列を決定することができる。
全長cDNAは、cDNA断片より作製したプライマーを用いたRACE（Rapid Amplification of cDNA ends）法、特に5' RACEにより取得することができる。
【００１６】
アプラタキシン遺伝子は、図２に示すゲノム構成を有しており、スプライシングパターンが２種類存在する。すなわち、168アミノ酸からなるアプラタキシンタンパク質を産生するパターン(short form)と、さらにこの168アミノ酸からなるアプラタキシンタンパク質のアミノ末端側に174アミノ酸が付加された342アミノ酸からなるアプラタキシンタンパク質を産生するパターン(long form)がある。
【００１７】
配列番号１に168アミノ酸からなるアプラタキシンタンパク質を発現する、アプラタキシン遺伝子のエキソン部分をコードするcDNAを含む塩基配列を例示する。該塩基配列中、配列番号1〜507番の塩基配列が168アミノ酸のアプラタキシンタンパク質をコードする。配列番号３には、さらに174アミノ酸がN末端に付加されたアプラタキシンタンパク質を発現する、アプラタキシン遺伝子のエキソン部分をコードするcDNAを含む塩基配列を例示する。該塩基配列中、配列番号7〜1032番の塩基配列が342アミノ酸のアプラタキシンタンパク質をコードする。
また、本願明細書の開示および上述のESTについての公知の遺伝子情報に基づけば、イントロン部分を含むアプラタキシン遺伝子の全長配列を得ることができる。
【００１８】
本願発明で利用するアプラタキシン遺伝子はイントロンを含む全長配列であってもよいし、エキソン部分のみを含むDNA配列であってもよい。また、これらの一部配列も本願発明に利用することができる。
さらに、アプラタキシン遺伝子のイントロンを含む配列またはエキソン部分をコードするcDNA配列ならびにそれらの一部配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアプラタキシンタンパク質の機能を有するタンパク質をコードするDNA配列も本発明に利用することができる。ここで、アプラタキシン遺伝子のコードするタンパク質をアプラタキシンタンパク質と呼ぶ。
【００１９】
「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、相同性が高いDNA同士、すなわち60％以上、好ましくは80％以上、さらに好ましくは90％以上の相同性を有するDNA同士がハイブリダイズし、それより相同性が低い核酸同士がハイブリダイズしない条件が挙げられる。より具体的には、ナトリウム濃度が150〜900mM、好ましくは600〜900mMであり、温度が60〜68℃、好ましくは65℃での条件をいう。ここで、「アプラタキシンタンパク質の有する機能」とは、野生型アプラタキシン遺伝子がコードするアプラタキシンタンパク質の有する機能をいい、その一つとしてHITモチーフの有する機能、すなわちリン酸結合ループを形成し得る機能がある。「同等の機能を有する」とは、アプラタキシンタンパク質の機能が失われることもなく、減じられることもなく、EAOHを発症させないことをいう。該機能を有するアプラタキシンタンパク質をコードするDNAは、EAOHの原因となる変異を有し本来のアプラタキシンタンパク質の機能が失われるかまたは減じられたタンパク質をコードする変異アプラタキシン遺伝子とは同一ではない。具体的には、配列番号１のアプラタキシン遺伝子の塩基配列の167番目のTと168番目のGの間にTが挿入された変異遺伝子(167-168insT)、塩基配列95番目のCがTに置換した変異遺伝子(95C→T)、塩基配列318番目のTが欠失した変異遺伝子(318delT)および塩基配列の266番目のTがGに置換した変異遺伝子(266T→G)は、アプラタキシンタンパク質の有する機能と同等の機能を有しないので、配列番号１で表される塩基配列のうち、塩基番号1〜507からなる塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつヒトアプラタキシンタンパク質の機能を有しEAOHの発症に関連するタンパク質をコードするDNAには該当しない。同様に、配列番号３のアプラタキシン遺伝子の塩基配列の689番目のTと690番目のGの間にTが挿入された変異遺伝子(689-690insT)、塩基配列617番目のCがTに置換した変異遺伝子(617C→T)、塩基配列840番目のTが欠失した変異遺伝子(840delT)および塩基配列の788番目のTがGに置換した変異遺伝子(788T→G)配列番号３で表される塩基配列のうち、塩基番号7〜1032からなる塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつヒトアプラタキシンタンパク質の機能を有しEAOHの発症に関連するタンパク質をコードするDNAには該当しない。また、「EAOHの発症に関連する」とは、特定の塩基に変異が生じた時にEAOH発症の原因となることをいう。
【００２０】
一旦遺伝子の塩基配列が確定されると、その後は化学合成によって、又はクローニングされたcDNAを鋳型としたPCRによって、あるいは該塩基配列を有するDNA断片をプローブとしてハイブリダイズさせることによって、本発明の遺伝子を得ることができる。
【００２１】
２．アプラタキシンタンパク質の取得
得られたアプラタキシン遺伝子を入手可能な適当な発現ベクターに組み込んで、さらに適当な宿主細胞に形質転換し、適当な培地中で培養、発現させ、目的蛋白質を回収、精製することができる。この際のベクターとして、プラスミド、ファージ、ウイルス等の宿主細胞において複製可能である限りいかなるベクターも用いることができる。例えば、pBR322、pBR325、pUC118、pUC119、pKC30、pCFM536等の大腸菌プラスミド、pUB110等の枯草菌プラスミド、pG-1、YEp13、YCp50等の酵母プラスミド、λgt110、λZAPII等のファージのDNA等が挙げられ、哺乳類細胞用のベクターとしては、バキュロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス等のウイルスDNA、SV40とその誘導体等が挙げられる。ベクターは、複製開始点、選択マーカー、プロモータを含み、必要に応じてエンハンサー、転写終結配列（ターミネーター）、リボソーム結合部位、ポリアデニル化シグナル等を含んでいてもよい。
【００２２】
宿主細胞としては、大腸菌、ストレプトミセス、枯草菌等の細菌細胞、アスペルギルス属菌株等の真菌細胞、パン酵母、メタノール資化性酵母等の酵母細胞、ドロソフィラS2、スポドプテラSf9等の昆虫細胞、CHO、COS、BHK、3T3、C127等の哺乳類細胞等が挙げられる。
形質転換は、塩化カルシウム、リン酸カルシウム、DEAE-デキストラン介在トランスフェクション、エレクトロポレーション等の公知の方法で行うことができる。
【００２３】
得られたリコンビナント蛋白質は、各種の分離精製方法により、分離・精製することができる。例えば、硫酸アンモニウム沈殿、ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独でまたは適宜組合せて用いることができる。
【００２４】
配列番号２にアプラタキシン遺伝子のコードする174アミノ酸からなるタンパク質のアミノ酸配列を、配列番号４にアプラタキシン遺伝子のコードする342アミノ酸からなるタンパク質のアミノ酸配列を、例示するが、このアミノ酸配列を含むタンパク質がアプラタキシンタンパク質の有する機能と同等の機能を有する限り、当該アミノ酸配列において複数個、好ましくは数個のアミノ酸に欠失、置換、付加等の修飾が生じてもよい。配列番号２または４で表されるアミノ酸配列の１〜10個、好ましくは1〜5個、さらに好ましくは1個若しくは2個のアミノ酸が欠失してもよく、配列番号２または４で表されるアミノ酸配列の1〜10個、好ましくは1〜5個、さらに好ましくは1個若しくは2個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換してもよい。また、配列番号２または４で表されるアミノ酸配列に1〜10個、好ましくは1〜5個、さらに好ましくは1個若しくは2個のアミノ酸が付加していてもよい。
【００２５】
このような配列番号２または４のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列として、配列番号２または４のアミノ酸配列と、BLASTを用いて計算したときに、少なくとも60％以上、好ましくは80％以上、さらに好ましくは95％以上の相同性を有しているものが挙げられる。
【００２６】
ここで、「アプラタキシンタンパク質の有する機能」とは、野生型アプラタキシン遺伝子がコードするアプラタキシンタンパク質の有する機能をいい、その一つとしてHITモチーフの有する機能、すなわちリン酸結合ループを形成する機能がある。「同等の機能を有する」とは、アプラタキシンタンパク質の機能が失われることもなく、減じられることもなく、EAOHを発症させないことをいう。上述の複数個、好ましくは数個のアミノ酸の欠失、置換、付加等の修飾は、これらの修飾を有するタンパク質がアプラタキシンタンパク質の有する機能を保持しているので、EAOHの原因となるアプラタキシン遺伝子の変異により生じたアミノ酸の変異とは同一ではない。具体的には、配列番号１のアプラタキシン遺伝子の塩基配列の167番目のTと168番目のGの間にTが挿入され(167-168insT)フレームシフト変異が生じた未熟タンパク質、塩基配列95番目のCがTに置換し(95C→T)、配列番号２のアプラタキシンタンパク質の32番目のアミノ酸がProからLeuに変わった変異タンパク質(P32L)、塩基配列318番目のTが欠失し(318delT)フレームシフト変異が生じた未熟タンパク質および塩基配列の266番目のTがGに置換し(266T→G)、配列番号２のアプラタキシンタンパク質の89番目のアミノ酸がValからGlyに変わった変異タンパク質(V89G)は、配列番号２で表されるアミノ酸配列において１個または数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつヒトアプラタキシンタンパク質の機能と同等の機能を有しEAOHの発症に関連するタンパク質に該当しない。同様に、配列番号３のアプラタキシン遺伝子の塩基配列の689番目のTと690番目のGの間にTが挿入され(689-690insT)フレームシフト変異が生じた未熟タンパク質、塩基配列617番目のCがTに置換し(617C→T)、配列番号４のアプラタキシンタンパク質の206番目のアミノ酸がProからLeuに変わった変異タンパク質(P206L)、塩基配列840番目のTが欠失し(840delT)しフレームシフト変異が生じた未熟タンパク質および塩基配列の788番目のTがGに置換し(788T→G)、配列番号４のアプラタキシンタンパク質の263番目のアミノ酸がValからGlyに変わった変異タンパク質(V263G)は、配列番号４で表されるアミノ酸配列において１個または数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつヒトアプラタキシンタンパク質の機能と同等の機能を有しEAOHの発症に関連するタンパク質に該当しない。また、「EAOHの発症に関連する」とは、特定の塩基に変異が生じた時にEAOH発症の原因となることをいう。
【００２７】
従って、配列番号２または４で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質または配列番号２または４で表されるアミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつアプラタキシンタンパク質の有する機能を有するタンパク質をコードする遺伝子も本発明に利用することができる。
【００２８】
３．EAOHの原因となる変異を有するアプラタキシン遺伝子の取得
EAOH患者において認められる塩基配列に変異が認められるアプラタキシン遺伝子の変異部位を含む配列を含むDNA及び該変異部位を含むDNAによりコードされるアミノ酸配列が変化したポリペプチドも本発明に利用することができる。ここでEAOH患者において認められるアプラタキシン遺伝子の変異とは、塩基配列の一部が野生型のアプラタキシン遺伝子と異なっており、EAOH発症の原因となることをいう。遺伝子の変異には、塩基の置換、挿入、欠失等がある。遺伝子変異は、アプラタキシン遺伝子の変異頻度、アプラタキシンmRNAの転写量、アプラタキシンタンパク質発現量、アプラタキシンタンパク質の機能変化等の多角的な解析により、同定できる。また、EAOH患者の家系における解析から同定することが可能である。従って、これらの手法により同定される、EAOHの原因となりえるアプラタキシン遺伝子の変異は、本発明の「アプラタキシン遺伝子の変異」に含まれる。例えば、EAOH患者において認められる変異、すなわちEAOHの原因となる変異が認められるアプラタキシン遺伝子として、配列番号１のアプラタキシン遺伝子の塩基配列の167番目のTと168番目のGの間にTが挿入され(167-168insT)、未熟タンパク質を発現するフレームシフト変異が起こったもの、アプラタキシン遺伝子の塩基配列95番目のCがTに置換し(95C→T)、アプラタキシンタンパク質の32番目のアミノ酸がProからLeuに変わったもの(P32L)、アプラタキシン遺伝子の塩基配列318番目のTが欠失し(318delT)し、未熟タンパク質を発現するフレームシフト変異が起こったものおよびアプラタキシン遺伝子の塩基配列の266番目のTがGに置換し(266T→G)、アプラタキシンタンパク質の89番目のアミノ酸がValからGlyに変わったもの(V89G)、配列番号３のアプラタキシン遺伝子の塩基配列の689番目のTと690番目のGの間にTが挿入され(689-690insT)、未熟タンパク質を発現するフレームシフト変異が起こったもの、アプラタキシン遺伝子の塩基配列617番目のCがTに置換し(617C→T)、アプラタキシンタンパク質の206番目のアミノ酸がProからLeuに変わったもの(P206L)、アプラタキシン遺伝子の塩基配列840番目のTが欠失し(840delT)し、未熟タンパク質を発現するフレームシフト変異が起こったものおよびアプラタキシン遺伝子の塩基配列の788番目のTがGに置換し(788T→G)、アプラタキシンタンパク質の263番目のアミノ酸がValからGlyに変わったもの(V263G)が挙げられる。これらの変異部位のうち少なくとも一つを含むDNAまたはタンパク質は本発明の範囲である。
これらの変異遺伝子は、EAOH患者から単離することもできるし、また１．で得たアプラタキシン遺伝子に変異を導入することによっても得ることができる。
【００２９】
遺伝子に変異を導入するには、Kunkel法、Gapped duplex法等の公知の手法又はこれに準ずる方法を採用することができる。例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばMutant-K (TAKARA社製)やMutant-G (TAKARA社製)）などを用いて、あるいは、TAKARA社のLA PCR in vitro Mutagenesis シリーズキットを用いて変異導入が行われる。
【００３０】
さらに、これらのEAOHの原因となる変異部位以外の塩基配列の変異であり、EAOHの発症に関与しない変異を有するDNAであって、変異アプラタキシン遺伝子とストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAも本発明の技術的範囲に含まれる。ストリンジェントな条件とは上述の条件を意味する。
【００３１】
４．アプラタキシン遺伝子変異の検出によるEAOHの診断
アプラタキシン遺伝子の上述のEAOHの原因となる変異を検出することによりEAOHの病因遺伝子である変異アプラタキシン遺伝子を有する患者および保因者の診断、並びに出生前診断等を行うことができる。この際、EAOHの発症に関与する変異167-168insTもしくは689-690insT、95C→Tもしくは617C→T、318delTもしくは840delTおよび266T→Gもしくは788T→Gを単独で検出してもよいし、複数を同時に検出してもよい。167-168insTもしくは689-690insTならびに318delTもしくは840delTの挿入・欠失変異は早期発症に関与しており、 95C→Tもしくは617C→Tならびに 266T→Gもしくは788T→Gのミスセンス変異は比較的後期発症に関与していることがわかっており、変異の種類を検出することにより発症時期を予測することも可能になる。さらに、EAOH罹患者個体を用いた変異分析により、167-168insTもしくは689-690insTと 95C→Tもしくは617C→Tの２つの変異、167-168insTもしくは689-690insTと318delTもしくは840delTの２つの変異および 95C→Tもしくは617C→Tと 266T→Gもしくは788T→Gの２つの変異を同時に有している例が見つかっており、これら２つの変異を同時に検出してもよい。
【００３２】
診断のための生物学的試料としては、診断しようとする個体のいずれの組織細胞由来の核酸も用いることができるが、末梢血白血球、絨毛、羊水浮遊細胞由来の核酸を用いるのが好ましい。また試料として用いるDNAはゲノムDNAでもcDNAでもよい。
EAOHの原因となるアプラタキシン遺伝子の変異は、PCR法、ノーザンハイブリダイゼーション法、定量的PCR法、RT-PCR法、in situ ハイブリダイゼーション法、FISH等により、アプラタキシン遺伝子DNAまたはRNAの各組織における存在、発現、変異を定性的にまたは定量的に測定することにより検出することができる。
【００３３】
（１）EAOHの原因となる変異アプラタキシン遺伝子の検出
EAOHの原因となるアプラタキシン遺伝子の変異の存在を検出すれば、アプラタキシン遺伝子の変異を直接的に検出することができる。また、EAOHの原因となるアプラタキシン遺伝子の変異を有さない野生型DNAが存在しないことを検出してもよい。後者の場合は変異アプラタキシン遺伝子に関してホモ接合体、またはアプラタキシン遺伝子の異なる種類の変異についての複合ヘテロ接合体であることを示し、EAOHの確定診断が可能になる。
【００３４】
例えば、まず変異アプラタキシン遺伝子の変異塩基部分を含むヌクレオチド配列に相補的なプローブ、野生型遺伝子の該変異塩基部分に対応するヌクレオチド配列に相補的なプローブを調製する。用いるプローブの長さに制限はなく、後述の核酸増幅法で増幅しようとする核酸断片の全長でもよいが、通常は15bp〜50bpが好ましく、さらに18bp〜30bpが好ましい。プローブは、放射性同位元素、蛍光物質、酵素等で標識したものを用いることができる。次いで、検体試料中の変異塩基部分を含む遺伝子断片を核酸増幅法により増幅し、この増幅断片とプローブを反応させる。検体試料中のDNAが野生型、変異型のいずれのプローブとハイブリダイズするか調べることにより、アプラタキシン遺伝子が野生型か変異型かを検出することができる。核酸増幅の際に用いるプライマーとしては、アプラタキシン遺伝子のEAOH発症の原因となる変異を挟み増幅しようとする領域の端部と相補的な配列を用いることができる。増幅する領域の塩基長に制限はないが、数十から数百塩基とすることができる。増幅領域にアプラタキシン遺伝子のEAOHに関与する変異を一つだけ含むように増幅塩基長を設定してもよいし、二つ以上の変異を含むように設定してもよい。増幅領域はエキソン部分のみを含んでいてもよいし、イントロン部分を含んでいてもよい。cDNAを試料とした場合、エキソン部分のみを含んでいるのが好ましく、ゲノムDNAを試料とするときは、増幅塩基長がエキソン部分の長さを超える場合、イントロン部分を含んでいるのが好ましい。また、プライマーを変異部位を含む領域に設定することも可能である。プライマーの長さに制限はないが、好ましくは15bp〜50bp、さらに好ましくは20bp〜30bpである。
【００３５】
（２）アプラタキシン野生型遺伝子または変異遺伝子からの転写mRNAの測定によるEAOHの原因となる変異の検出
変異DNAまたは野生型DNAからの転写mRNAを定量的または定性的に測定しても、アプラタキシン遺伝子の変異を検出できる。
例えば、アプラタキシン遺伝子の挿入・欠失変異は、未熟mRNAを産生するフレームシフト変異を与え、野生型アプラタキシン遺伝子から転写されるmRNA量は少なくなる。従って、顕著なmRNAレベルの低下が認められた場合、アプラタキシン遺伝子の変異の検出が可能になる。
mRNA量はノーザンブロット法によっても測定できるし、また一旦cDNAを合成してからcDNA量を測定してもよい。
【００３６】
（３）アプラタキシンタンパク質の測定によるアプラタキシン遺伝子変異の検出
アプラタキシン遺伝子産物の分子量の測定やミスセンス変異によるアミノ酸変異を認識し得る抗体を用いた変異タンパク質の測定によっても遺伝子の変異を検出し得る。
【００３７】
５．アプラタキシン遺伝子またはアプラタキシンタンパク質を用いたEAOHの治療本発明のアプラタキシン遺伝子の配列を含むDNA若しくはRNAヌクレオチドを、遺伝子治療の技術を用いてEAOHの治療に利用することができる。
例えば、生体中でアプラタキシン遺伝子のコードするタンパク質を発現させ、EAOHを抑えることが可能である。この際、アプラタキシン遺伝子配列を含むDNA等をアデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター等の遺伝子治療に用い得るベクターに導入して投与することもできるし、またDNA等を注射等により直接導入することも、遺伝子銃法で導入することもできる。投与は、経口的にも注射によってもよく、体内にDNAを導入できるならばいかなる投与法も利用することができる。さらに、アプラタキシン遺伝子又はアプラタキシン遺伝子を含むベクターを直接体内に投与してもよい。
【００３８】
また、アプラタキシンタンパク質をEAOHの治療に用いることが可能である。
従って、アプラタキシン遺伝子またはアプラタキシンタンパク質を用いるEAOHの治療法も本発明の範囲である。さらに、本発明のアプラタキシン遺伝子またはアプラタキシンタンパク質をEAOHの治療用薬剤を製造するために使用することができる。
【００３９】
アプラタキシン遺伝子配列を含むDNA若しくはRNAまたはアプラタキシン遺伝子のコードするタンパク質を含む治療用製剤は、医薬上許容できる担体を含んでいてもよい。医薬上許容できる担体としては、懸濁剤及びシロップ剤のような経口液体調製物は、水、シュクロース、ソルビトール、フラクトース等の糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール等のグリコール類、ごま油、オリーブ油、大豆油等の油類、p-ヒドロキシ安息香酸エステル類等の防腐剤等を使用できる。粉剤、丸剤、カプセル剤及び錠剤は、ラクトース、グルコース、シュクロース、マンニトール等の賦形剤、デンプン、アルギン酸ソーダ等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルク等の滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチン等の結合剤、脂肪酸エステル等の表面活性剤、グリセリン等の可塑剤等を用いることができる。また、注射剤の溶液は、蒸留水、塩溶液、グルコース溶液等からなる担体を用いて調製することができる。この際、定法に従い適当な溶解補助剤および懸濁剤を用いて、溶液、懸濁液または分散剤として調製できる。
投与量、投与スケジュールは、治療的に有効な量でよく、患者の年齢、状態、性別および疾患の重篤度等により適宜決定すればよい。
【００４０】
【実施例】
以下、実施例により、本発明を具体的に説明する。但し、本発明の技術的範囲がこれらの実施例により限定されるものではない。
〔実施例１〕  ゲノムDNAの収集ならびにゲノムDNAおよびRNAの単離
早期発症（10代または20代での発症）、進行性の失調症、腱反射の喪失、位置感覚の遠位喪失、前後運動、錐体路障害による下肢の筋力低下、および低アルブミン血症を特徴とする疾患、すなわちEAOHの7家族からの15人の罹患者個体を含む28個体からインフォームドコンセントの下にゲノムDNAを集めて連鎖解析を行った(Koike, R. et al., Neurological Medicie 48, 237-242 (1998); Uekawa, K. et al., Rinsho Shinkeigaku 32, 1067-74 (1992); Kubota, H. et al, J Neurol Sci 158, 30-7 (1998); Sekijima, Y. et al., J Neurol Sci 158, 30-7 (1998); Fukuhara, N. et al., J Neurol Sci 133, 140-51 (1995); Kawasaki, S., et al, Rinsho Shinkeigaku 22, 15-23 (1982))。このうち3家族では近親婚が認められた。また、罹患者個体は同胞の間でのみ認められ、これは該疾患が常染色体劣性遺伝性疾患であることを示している。それぞれの家系の罹患者個体は、5つの異なる機関のそれぞれ２人以上の神経科医の臨床検査を受けた。さらに、EAOH、FRDAまたはAOAであると診断された15の家系から罹患者個体のゲノムDNAを集めインフォームドコンセントの下に連鎖解析を行った(Aicardi, J. et al., Ann Neurol 24, 497-502 (1988); Inoue, N. et al., Rinsho Shinkeigaku 11, 855-861 (1971); Araie, M. et al., Jpn J Opthalmol 21, 355-365 (1977))。
【００４１】
高分子量ゲノムDNAは通常の手段で末梢血白血球から調製した(Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: a laboratory manual 3rd ed., Vol. 1 6.4-6.12 (Cold Spring Harbor, New york, 2001)。トータルRNAはEAOH患者からのリンパ芽球細胞株からRNeasy kit(Qiagen)を用いて抽出した。
【００４２】
〔実施例２〕  連鎖解析
9p13上のマイクロサテライトマーカーを用いて連鎖解析を行った。マーカーとしては、D9S1118、D9S165、D9S1788、D9S1845、D9S1817およびD9S276を用い、さらに詳細な連鎖不平衡解析を行うため、さらに２つのマイクロサテライトマーカー(462B18ms2および126M6ms2)をデータベース上の短いタンデムリピートを探索することにより新たに開発した。
【００４３】
この新しいマーカーのプライマーとして次の配列のものを設計し用いた。
126M6ms2 フォワードプライマー  5'-ATGTGGAGAAATTGGAGGCA-3'（配列番号５）、リバースプライマー  5'-TGTGAAGGAATTGAGCTGGT-3'（配列番号６）
462B18ms2 フォワードプライマー  5'-TGGGTTTTGATGTGCTTCCA-3'（配列番号７）、リバースプライマー  5'-GAAGCAGGTAGAAGAGGAGT-3'（配列番号８）。
【００４４】
また、BACコンティグ、EST、cDNA、ゲノムヌクレオチド配列およびマイクロサテライトマーカー配列の物理的地図は、Human Genome Recognition Project HGREP(Institute of Medical Science, University of Tokyo http://hgrep.ims.u-tokyo.ac.jp/cgi-bin/HTG_tool/view.cgi?layer=top)およびSanger Centre human Chromosome 9 Project( HYPERLINK "http://www.sanger.ac.uk/HGP/Chr9") およびMarshfield Medical Research Foundation(http://www.marshmed.org/genetics/)に基づいて作成した。エクソン-イントロン構造はデータベース上のFLJ20157およびBACクローンAL353717のヌクレオチド配列を比較することにより推定した。
【００４５】
染色体９番短腕に連鎖に関連したEAOHの日本人７家系の家系図を図１aに示す。図中、四角のシンボルは男性、丸いシンボルは女性を示し、黒く塗りつぶしたシンボルは罹患患者を示す。図にはD9S1118、462B18ms2、D9S165、D9S1788、D9S1845、126M6ms2、D9S1878、D9S1817およびD9S276を示してある。相が明確な対立遺伝子は、括弧中に記載した。７家系の日本人EAOH家族の中でEAOHと共分離するハプロタイプを図１bに示す。７家族で共有されているハプロタイプは、太字または斜字で示した。
【００４６】
Pair-wise lodスコアはLINKAGE(version5.2)(Lathrop, G.M. et al., Am J Hum Genet 36, 460-5 (1984); Lathrop, G.M. et al., Am J Hum Genet 37, 482-98 (1985))のMLINKプログラムおよびFASTLINK4.1Pパッケージ(Cottingham, R.W. et al., Am J Hum Genet 53, 252-63 (1993))を用いて計算した。この計算により、この疾患が20歳までには完全に浸透し、0.001の疾患遺伝子頻度を有する常染色体劣性遺伝性であることが推測された。マーカーの対立遺伝子頻度は、疾患に無関係な日本人個体少なくとも37個体を用いた分析により決定した。ハプロタイプはGENEHUNTERプログラム2.0β(Cottingham, R.W. et al., Am J Hum Genet 53, 252-63 (1993); Kruglyak, L. et al., Am J Hum Genet 58, 1347-63 (1996))を用いて、組換えの数が最小になるように決定した。
【００４７】
このマイクロサテライトマーカー分析により、D9S1845において7.71(θ=0)という最大のcumulative pair-wise lodスコアが得られた。
【００４８】
【表１】
表１  染色体9番短腕上の７つの座の2点lodスコア
0003740043.tif 000002
さらに、別のマーカー分析により罹患者個体においてD9S118(テロメア境界)およびD9S276（セントロメア境界）で組換えが認められた（図１）。
【００４９】
７家族中、D9S165、D9S1788およびD9S1845の３座において疾患-ハプロタイプの連関が認められ、このことはこれらの座間の強い連鎖不平衡を示唆する。462B18ms2および126M6ms2においては、連鎖不平衡の減少が観察された（図１）。この結果は、原因遺伝子が462B18ms2および126M6ms2の間の350kbセグメント中に位置していることを示す（図２）。
9p13のこの領域には、4つのESTと2つの遺伝子の存在が確認されており（図２）、stSG25778(FLJ20157 mRNA(NCBI Accession No. NM_017692)の一部)が中枢神経系で発現している。
【００５０】
EAOH遺伝子の重要な領域を含むゲノムDNAの物理的地図およびアプラタキシン遺伝子のゲノム構成を図２に示した。図2bは、染色体９番短腕（9p13）のEAOH候補領域に連結したマーカー遺伝子座の位置を示した。350kbpの領域中に、２つの遺伝子および４つのESTが同定された。462B18ms2と126M6ms2の間のBACコンティグを物理的地図の下に示した。図2bは、アプラタキシン遺伝子のゲノム構成を示す。エクソン５および６に４つの変異が見出された。
【００５１】
〔実施例３〕  変異分析
以下のプライマーペアーを用いてFLJ20157の総てのコードエクソンを増幅し、変異分析を行った。
FLJ20157: cds1  フォワードプライマー  5'-TTC ACA AGC AAC CCA GAA TA-3'（配列番号９）  リバースプライマー  5'-CCG TGA GAA TTA GTG GAG TT-3'（配列番号１０）、cds2  フォワードプライマー  5'-GTG AAA ACC AAG GAA CAC Tg-3'（配列番号１１）  リバースプライマー  5'-TAT AGG AAG GCA ATG GAG Tg-3'（配列番号１２）、cds3  フォワードプライマー  5'-GGG TCT CAG TGC AAT ATG Tg-3'（配列番号１３）  リバースプライマー  5'-ATT TCA GTG CTC TCC TCT CT-3'（配列番号１４）、cds4  フォワードプライマー  5'-TCT GTG GAG TGG TCA TTT AC-3'（配列番号１５）  リバースプライマー  5'-TAT AGG AAG GCA ATG GAG Tg-3'（配列番号１６）
PCR反応は、最初に95℃(3min.)で変性させ、95℃(30sec)での変性、55℃（30sec）でのアニーリングおよび72℃(1min.)での伸長反応を30サイクル行い、72℃(10min.)での追加伸長反応することにより行った。
【００５２】
PCR産物をアガロースゲル電気泳動で分離し、QIA quick Gel Extraction kit(Qiagen)を用いて精製した。精製PCR産物を次いでBigDye terminators(DNA シークエンスキット、PE Applied Biosystems)を用いてサイクルシークエンス反応に供した。反応産物をDyeEx Spin kit(Qiagen)を用いて精製し、ABI377 DNA シークエンサー(PE Applied Biosystems)を用いて分析した。
FLJ20157の変異体分析により、7家族総てにおいて３つの独立した変異が見出された（図２および表２）。
【００５３】
【表２】
表２  アプラタキシン変異と22の日本人家族中の関連したハプロタイプ
0003740043.tif 000003
家系295、7および279からの4-4-9ハプロタイプをホモ接合性状態で担持している罹患者個体は、挿入変異である167-168insTについてホモ接合性であることがわかった。この変異はアミノ酸残基96において未熟終始コドンとなるフレームシフトを与える。同じ変異が家系1462、666および2009の罹患者個体においてもヘテロ接合性状態のものとして認められる。
2番目の共通な変異はCからTへの置換(P32L)であった。この変異は、家系9、1462および666において5-7-4(D9S165-D9S1788-D9S1845)ハプロタイプと関連していた。
【００５４】
アミノ酸残基115において未熟終始コドンを与えるアミノ酸残基107におけるフレームシフトの原因となる単一ヌクレオチド欠失(318delT)が家系2009において認められた。家系1462、666および2009の罹患者個体は、複合ヘテロ接合性状態でこれらの変異を有していた。
総てのこれらの変異は200人の疾患に無関係な日本人対照群には認められなかった。
本発明者らは、さらにFLJ20157中に変異を有する13の家系を見出した。これらの家系の患者は類似した臨床症状を現した（表２）。
【００５５】
9p13への連鎖は、元来AOAの家族において報告されていた(do Ceu Moreira, M et al., Am J Hum Genet 68, 501-8 (2001))。眼球運動失行は、サッカード眼球運動の障害から始まりサッカードの障害の初期における代償としての頭部移動を伴う(Cogan D., Am J Ophthalmol 36, 433-441 (1953))。AOAにおいては、眼球運動失行が顕著な臨床症状であるのに対して(do Ceu Moreira, M et al., Am J Hum Genet 68, 501-8 (2001); Aicardi, J. et al., Ann Neurol 24, 497-502 (1988); Barbot, C. et al., Arch Neurol 58, 201-5 (2001))、本発明の病気においては低アルブミン血症が顕著な特徴である(koike, R et al., Neurological Medicie 48, 237-242 (1988); Uekawa, K. et al., Rinsho Shinkeigaku 32, 1067-74 (1992))。両方の症状がFLJ20157の変異に起因する可能性を調べるために、本発明者らは、AOAであると先に報告された２つの家族(Aicardi, J. et al., Ann Neurol 24, 497-502 (1988); Inoue, N. et al., Rinsho shinkeigaku 11, 855-861 (1971); Araie, M. et al., Jpn J Opthalmol 21, 355-365 (1977); Kurita-Takahashi, S. et al., Neuro-ophthalmology 12, 41-45 (1991))を分析した。このうちの１つの家族は、AOAが新しい疾患として報告された最初の文献に記載されている(Aicardi, J. et al., Ann Neurol 24, 497-502 (1988))。興味深いことに、EAOHに関連している167-168insT変異がAOHの家系2014および2021においても同定された（表２）。最初に報告されたAOA患者は、8および12歳の患者であり、これらの患者が48歳および28歳になったとき再調査を行ったところ、頭部移動は最初の報告時より緩和され、いずれの患者も低アルブミン血症を発症していた。このことは、臨床症状は年齢により変ることを示している。
【００５６】
本発明者らは、この新規な神経変性疾患を、「眼球運動失行と低アルブミン血症を伴う早期発症型脊髄小脳変性症（EAOH）」と名付けた。EAOHの臨床症状はFRDAのものと類似している。眼球運動失行および低アルブミン血症はEAOHをFRDA(Friedrich N, Virchows Arch. Pathol. Anat., 68, 145-245 (1876); Freidrich N, Virchows Arch. Pathol. Anat., 70, 140-142 (1877); Harding, A.E., Brain 104, 589-620 (1981); Durr, A. et al., N Engl J Med 335, 1169-75 (1996))またはAVED(Gotoda, T. et al., N Engl J Med 333, 1313-8 (1995); Ouahchi, K et al., Nat Genet 9, 141-5 (1995))と区別する顕著な特徴である。また、明らかに遺伝子型-表現型相関が認められる。すなわち、挿入または欠失変異は小児期における早期の重篤な表現型の原因となり、眼球運動失行は顕著な神経病学的な兆候である。しかしながら、ミスセンス変異は比較的後期に始まる（家系2637では発症は25歳であった）緩和された表現型の原因となる。
【００５７】
図５にEAOH患者４名および健常者ゲノムDNAを用いてアプラタキシン遺伝子の塩基配列を調べた結果を示す。EAOH患者4名においてそれぞれ異なる変異が検出された。
本発明者らは運動失調、眼球運動失行および低アルブミン血症を主要な臨床上の特徴とするこの疾患の原因遺伝子をアプラタキシン(APTX)と名付けた。
【００５８】
〔実施例４〕  ノーザンブロット解析
全長FLJ20157cDNAクローンからReady-To-Go DNA Labeling Bead(Amersham Pahrmacia Biotec)を用いて32P標識cDNAプローブを作製した。プローブは、ノーザンブロット膜上でハイブリダイズさせた（ヒト成人マルチ組織ノーザンブロット、ヒト脳マルチ組織ノーザンブロットIIおよびヒト脳マルチ組織ノーザンブロットIV(Clontech)。アプラタキシンとGAPDH mRNAバンドの相対放射性活性をFuji Bioimage Analyzer BAS2000にて可消リン光イメージングプレートを用いて測定した。
【００５９】
ヒト組織におけるアプラタキシン遺伝子の発現解析を図３に示した。図3aは、マルチ組織ノーザンブロット膜をヒトFLJ20157ｃDNAプローブを用いて検査した結果を示す。2.2kbアプラタキシン転写物が総ての組織で検出された。さらに、より短い1.35kbのバンドも検出された。このより短いバンドは、高度にストリンジェントな条件で検出され、より小さいバンドはスプライシング変異体である可能性を示した。図3a下は、プローブを除いた後に、GAPDH cDNAをローディングコントロールとして用いて検査した結果を示す図である。
【００６０】
図３bは、EAOH患者(家系2009の患者No.3936）由来のリンパ芽球細胞株でのアプラタキシン遺伝子の発現を示す図である。トータルRNAは、EBV形質転換リンパ芽球細胞株から単離し、ノーザンブロットハイブリダイゼーションをヒトFLJ20157、次いでGAPDH cDNAを用いて行った。
【００６１】
ノーザンブロット分析によりアプラタキシンmRNAは、2.2kbmRNAとして遍在しており、mRNAレベルは、167-168insTおよび318delT変異を有する患者のリンパ系細胞で57％減少していた（図３）。このようなmRNAの減少は未熟終始コドンをもたらすフレームシフト変異において観察される。
【００６２】
〔実施例５〕  シークエンス解析、アラインメントおよび系統発生樹の構築
アミノ酸相同性検索を標準的なタンパク質-タンパク質BLASTを用いて行った。アプラタキシンの推定アミノ酸配列(NCBI accession NP_060162またはXP_005534)、アプラタキシンのマウスオーソログ(NCBI accession NP_079821)、ヒトHINT(NCBI accession NP_005331)、マウスHINT(Gene Bank accession AAC1076)、ハエ AAF51208(GeneBank accession AAF1208)、酵母HINT(NCBI accession NP_010158)、ヒトFHIT(NCBI accession NP_002003)およびマウスFHIT(NCBI accession NP_034346)をデフォールトパラメーターを使用したClustalWプログラム verion1.81(Thompson, J.D. et al., Nucleic Acids Res 22, 4673-80 (1994))を用いてアラインメントさせた。Neighbor-joining法(Saitou, N. et al., Mol Biol Evol 4, 406-25 (1987))により完全編集アラインメントに基づいて系統発生樹を構築し、Tree View 1.6.5プログラムで描いた。
【００６３】
図４は、アプラタキシンとHITスーパーファミリータンパク質とのマルチアミノ酸アラインメント（図４a）およびHITスーパーファミリータンパク質の系統発生樹（図４ｂ）を示す。図４aは、アプラタキシンとHINT（ヒスチジントリアドヌクレオチド結合タンパク質）およびFHIT（折り畳みヒスチジントリアドタンパク質）タンパク質のアミノ酸配列のCLUSTAL W アラインメントを示す。アプラタキシンの推定アミノ酸配列、アプラタキシンのマウスオーソログ、ヒトHINT、マウスHINT、ハエAAF51208、酵母HINT、ヒトFHITおよびマウスFHITをCLUSTALWにてアラインさせ、保存的アミノ酸残基をGeneDoc(Thompson, J.D. et al., Nucleic Acids Res 22, 4673-80 (1994))により網掛けした。網掛けの濃さは保存の強さを示す（黒は100％、濃いグレーは80％、薄いグレーは60%の保存度を示す）。HINTファミリータンパク質の推定2次構造(Lima, C.D. et al., Proc Natl Acad Sci USA 93, 5357-62 (1996))に従って、ヘリックス領域は黒矢印で、βストランド領域はグレー矢印で示し。変異はアラインメント上に記載した。ミスセンス変異はこれらのHINTファミリーの中で特に保存的なアミノ酸残基において認められた。
【００６４】
代表的HITスーパーファミリータンパク質の系統発生樹を図４aに示す。Neighbor-joining距離は、図５に示すHITスーパーファミリーのアミノ酸配列アラインメントに基づいて作成した(Saitou, N. et al., Mol Biol Evol 4, 406-25 (1987))。
【００６５】
アプラタキシンは高度に保存されたHITタンパク質の必須モチーフである、ヒスチジントリアド(HIT)モチーフ（His-φ-His-φ-His-φ-φ, φは疎水性アミノ酸）(Brenner, C. et al., J Cell Physiol 181, 179-87 (1999); Seraphin, B. DNA Seq 3, 177-9 (1992))を有し、HITタンパク質と高い相同性を有していた（図４）。HITタンパク質は、２つに分類されている、すなわち動物と真菌にのみ存在するFhit（fragile histidine triad）とタンパク質ファミリーと総ての細胞生物に存在する古代ヒスチジントリアドヌクレオチド結合タンパク質（Hint）である(Brenner, C. et al., J Cell Physiol 181, 179-87 (1999); Seraphin, B. DNA Seq 3, 177-9 (1992))。これらのデータと系統発生樹分析の結果から、アプラタキシンはHITファミリーの第３番目のファミリーであることが判明した。
【００６６】
ヌクレオチド結合およびジアデノシンポリリン酸加水分解酵素活性がHITタンパク質スーパーファミリーの作用とされていた(Brenner, C. et al., J Cell Physiol 181, 179-87 (1999); Seraphin, B. DNA Seq 3, 177-9 (1992))。しかし、本発明者らは、初めてHITタンパク質スーパーファミリーの変異に関連した異なる表現型を見出した。P32L変異は総てのサブファミリーの間で高度に保存されているプロリン残基に関連している（図４）。また、V89G変異はヒスチジントライアドの疎水性アミノ酸の一つに関連しており、同じくHITタンパク質スーパーファミリーの間で高度に保存されている（図４）。HITモチーフはリン酸結合ループの一部を形成するので、V89G変異はHITモチーフのリン酸結合活性に影響を及ぼす可能性がある。
【００６７】
【発明の効果】
実施例に示すように、アプラタキシン遺伝子の変異がEAOHの原因であることが明らかになり、アプラタキシン遺伝子の解析によりEAOHの確定診断が可能になる。また、遺伝子変異と表現型の間に一定の関係があることから、遺伝子診断に基づき臨床的な特徴および予後を判定することができる。さらに、アプラタキシン遺伝子の変異によるフレームシフト変異またはミスセンス変異による野生型アプラタキシンタンパク質の発現が阻害されてEAOHが発症することから、アプラタキシン遺伝子およびアプラタキシンタンパク質をEAOHの治療に用いることもできる。
さらにまた、アプラタキシン遺伝子のEAOHの原因遺伝子としての同定は、アプラタキシンだけではなくHITタンパク質スーパーファミリーの生理学的作用の重要な手がかりになる。
【００６８】
【配列表】
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【００６９】
【配列表フリーテキスト】
配列番号５〜１６：合成
【図面の簡単な説明】
【図１】  EAOH７家族の家系図を表す図である。
【図２】染色体９番短腕の物理地図（図２a）およびアプラタキシン遺伝子のゲノム構成（図２b）を示す図である。
【図３】ヒト組織におけるアプラタキシン遺伝子の発現解析の結果を示す図である。
【図４】アプラタキシンとHITスーパーファミリータンパク質とのマルチアミノ酸アラインメント（図４a）およびHITスーパーファミリータンパク質の系統発生樹（図４ｂ）を示す図である。
【図５】  EAOH患者４名および健常者ゲノムDNAを用いてアプラタキシン遺伝子の塩基配列を調べた結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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