(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
リン酸化タンパク質の同定法であって、
(1)  試料蛋白質を可溶化し、
(2)  試料蛋白質溶液に、界面活性剤とMnCl2を含有する保存緩衝液を添加して蛋白質の沈殿とホスファターゼの失活を防止し、
(3)  試料蛋白質溶液を二分して、一方をホスファターゼにより脱リン酸化し、
(4)  それぞれの試料蛋白質溶液を同条件で二次元電気泳動を行ない、
(5)  ２つの二次元電気泳動像を比較して、等電点電気泳動上のアルカリ側に移動したスポットをリン酸化蛋白質として検出する、
ことを特徴とするリン酸化蛋白質の同定方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この出願の発明は、リン酸化蛋白質の同定方法に関するものである。さらに詳しくは、この出願の発明は、試料蛋白質からリン酸化蛋白質のみを検出、分離し同定する方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術とその課題】
蛋白質は、ゲノムから転写・翻訳された後、酵素活性等の機能に直接影響するリン酸化等の翻訳後修飾を受ける。蛋白質は、生命の発生や分化、疾病の進行、環境の変化等に伴って質的、あるいは量的に変動するため、ゲノムによってコードされた蛋白質の１セット（プロテオーム）を解析できれば、このような蛋白質を網羅的に把握し、生命情報の解析、疾病の診断、医薬品開発において重要な知見が得られると期待される。中でも遺伝子の翻訳後修飾のひとつである蛋白質のリン酸化は、シグナル伝達や酵素の活性化等において重要なステップである。したがって、リン酸化された蛋白質を同定することは、蛋白質の機能を理解する上で重要といえる。
【０００３】
従来より、蛋白質の同定方法としては、ゲル電気泳動が一般的に用いられている。とくに二次元ゲル電気泳動法は、高い分離能で蛋白質を分離できるため、広く用いられている。そして、二次元ゲル電気泳動上に展開された多種の蛋白質の中からリン酸化蛋白質を特定するには、抗体による免疫染色法と放射性同位元素によるラベル法が知られている。具体的には、電気泳動で分離した蛋白質を疎水性の膜に固定化し、目的とするリン酸化蛋白質を抗原とする抗体を接触させ、膜上で抗原抗体複合体を形成させた後、これを酵素や放射性同位元素で標識した二次抗体で検出するというものである。
【０００４】
しかし、これらの方法はいずれも煩雑で長時間を要する上、放射性同位元素を用いる方法では、特殊な設備が必要で、危険をも伴うという問題があった。
そこで、この出願の発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであり、従来技術の問題点を解消し、簡便に短時間でリン酸化タンパク質を同定する方法を提供することを課題としている。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
この出願の発明は、上記の課題を解決するものとして、まず第１には、リン酸化蛋白質の同定方法であって、試料蛋白質の二次元電気泳動を行った後、試料蛋白質をホスファターゼにより脱リン酸化し、再び同条件で二次元電気泳動を行い、等電点電気泳動上のアルカリ側に移動したスポットをリン酸化蛋白質として検出するリン酸化蛋白質の同定方法を提供する。
【０００６】
この出願の発明は、第２には、前記のリン酸化蛋白質の同定方法において、脱リン酸化は、試料蛋白質を可溶化し、保存緩衝液を添加して蛋白質の沈殿とホスファターゼの失活を防止した後に行うことを態様として提供する。
【０００７】
そして第３には、この出願の発明は、保存緩衝液が、界面活性剤とともに遷移金属塩を含有するものである前記のリン酸化蛋白質の同定方法をも提供する。
【０００８】
【発明の実施の形態】
この出願の発明のリン酸化蛋白質の同定方法は、まずリン酸化蛋白質を含む試料蛋白質の二次元電気泳動を行った後、ホスファターゼによって蛋白質の脱リン酸化を行い、再び二次元電気泳動を行えば、脱リン酸化された蛋白質に対応するスポットのみが等電点電気泳動上でアルカリ側に移動するという原理に基づくものである。したがって、ホスファターゼ処理前後での二次元電気泳動の結果を比較するだけで簡便にリン酸化蛋白質を検出、同定できるのである。
【０００９】
しかし、このような同定方法にも新たな問題が発生した。つまり、通常のプロテオーム解析に用いられる試料蛋白質の濃度は非常に高いため、蛋白質の沈殿が起こり易く、ホスファターゼが作用しないのである。
【００１０】
発明者らは鋭意研究を進め、蛋白質をＳＤＳ（Sodium dodecyl sulfate）等の界面活性剤による一般的な方法で可溶化した後、保存緩衝液を添加することにより、蛋白質の沈殿を防止でき、ホスファターゼを失活させることなく、脱リン酸化を行うことができることを見出した。まず、蛋白質の沈殿を防止する成分として、ＳＤＳに着目した。しかし、ＳＤＳ等の界面活性剤は高濃度に用いることによりホスファターゼを失活させてしまうため、ホスファターゼを安定化させるためのものとして、遷移金属塩を添加することが有効であることを見出した。
【００１１】
このようにして蛋白質の沈殿とホスファターゼの失活の双方を防止できる保存緩衝液であって、界面活性剤とともに遷移金属の塩を含有するものとしては種々のものが検討される。発明者らが鋭意検討した結果、界面活性剤としては、ＳＤＳ等のアルキル硫酸塩、アルキルスルホン酸塩であることが好ましく、また遷移金属の塩としては、多原子価の遷移金属、なかでも周期律表の第III族から第VIII族のもの、たとえば、Ｍｎ、Ｓｎ、Ｖ、Ｗ、Ｍｏ、Ｔａ、Ｇａ、Ｓｂ、Ｆｅ、Ｎｉ、希土類元素等の遷移金属のハロゲン化物、硫酸塩等が好ましい。
【００１２】
もちろん、これらの界面活性剤と遷移金属塩に加えて、緩衝液成分として知られているＥＤＴＡ塩、ポリエーテル化合物、ポリエーテルエステル化合物やチオエーテル化合物等の各種のものが配合されてよい。特に、この出願の発明においては、ＳＤＳ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、Ｎａ2ＥＤＴＡ、ＤＴＴ、Ｂｒｉｊ３５、およびＭｎＣｌ2を含有するときに、高い蛋白質沈殿防止効果とホスファターゼの安定化効果が得られ、好ましい。具体的には、保存緩衝液の組成としては、例えば次の範囲とすることができる。
【００１３】
ＳＤＳ：０．１〜０．３％
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）：１．５〜３．５ｍＭ
Ｎａ2ＥＤＴＡ：２〜１０μＭ
ＤＴＴ：  １００〜３００μＭ
Ｂｒｉｊ３５：０．０００１〜０．００１％
ＭｎＣｌ2：０．０５〜０．２ｍＭ
以上のとおりの保存緩衝液の組成は、発明者らの鋭意研究によりその有効性が明らかにされたものであり、このような保存緩衝液を添加することにより、蛋白質の沈殿が防止され、ホスファターゼが効果的に作用し、処理前後の二次元電気泳動結果の比較から、簡便かつ確実に脱リン酸化された蛋白質を検出できるようになる。そして、二次元電気泳動上の位置が変化したスポットのみをゲルから切り出し、一般的な手法により洗浄すれば、リン酸化蛋白質を単離することも可能となる。また、このようなリン酸化蛋白質の具体的構造等についても、二次元電気泳動結果を各種の二次元電気泳動ゲルプロテオームデータベースと照合することにより判別、同定できるのである。
【００１４】
以下、実施例を示し、この発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、この発明は以下の例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることは言うまでもない。
【００１５】
【実施例】
＜実施例１＞
１．５ｍＬのエッペンドルフチューブに二次元電気泳動用に調整したラット皮膚線維芽細胞由来の蛋白質（１００μｇ／５０μｇ）と１０％ＳＤＳ（２０μｌ）を加えて激しく攪拌し、さらに超音波槽に１分間放置した。精製水（９２０μｌ）を加えて攪拌し、続いて保存緩衝液を加え、攪拌した。保存緩衝液の組成は次のとおりとした。
【００１６】
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）：５０ｍＭ
Ｎａ2ＥＤＴＡ：０．１ｍＭ
ＤＴＴ：５ｍＭ
Ｂｒｉｊ３５（０．０１％）：＞５μｌ
ＭｎＣｌ2（２０ｍＭ）：５μｌ
得られた蛋白質溶液を半分に分け、一方に組換えλプロテインホスファターゼ（ＰＰａｓｅ）（New England BioLabs社製  １μｌ：４００Ｕ）を加え、３０℃で１時間加温した。この溶液をMillipore Ultra Free centrifugal filterにより２０μｌまで濃縮した後、二次元電気泳動用緩衝液（５Ｍ Urea、２Ｍ thiourea、１％ＤＴＴ、２％ＣＨＡＰＳ、２％ＳＢ３−１０、１％ Ampldine）を加え、全量を５００μｌとして二次元電気泳動を行った。
【００１７】
１次元目の電気泳動はPharmacia Hoefer Multiple II electrophoresis chamberを用いて行った。二次元目のＳＤＳ−ＰＡＧＥは、Iso-Dalt system（Pharmacila Hoefer社製）を用いた９〜１８％アクリルアミド勾配下ゲルにおいて行った。
【００１８】
蛋白質は、銀染色により可視化し、二次元電気泳動ゲルはEpson BS800スキャナーにより画像化した。
イメージ分析と二次元電気泳動ゲルプロテオームデータベースの検索は、Melanie II 2-D Page Software Package（Bio-Rad社製version 2.2）により行った。
【００１９】
得られた二次元電気泳動ゲルの画像を図１に示した。ＰＰａｓｅ処理前（ａ）と処理後（ｂ）では、矢印で示したスポットの移動が確認された。
このスポットをゲルから切り出し、データベースの検索を行ったところ、次の表１の結果が得られた。
【００２０】
【表１】
0003822454.tif 000002
【００２１】
表より、これまでにリン酸化が報告されていない２種の蛋白質（＊）を含むラット皮膚繊維芽細胞のリン酸化蛋白質が候補蛋白質として検出された。
【００２２】
【発明の効果】
以上詳しく説明したとおり、この発明によって、精度高くリン酸化蛋白質を同定できる簡便な方法が提供される。蛋白質のリン酸化はシグナル伝達や酵素の活性化等における重要なステップであることから、リン酸化蛋白質を同定することにより蛋白質の機能に関する様々な知見が得られる。この発明の方法によりリン酸化蛋白質が短時間で確実に同定できることから、疾病の新しい診断法や新規医薬品の開発が期待される。
【図面の簡単な説明】
【図１】本願の実施例における二次元電気泳動ゲルの画像を示す図である。（ａ：ＰＰａｓｅ処理前、ｂ：ＰＰａｓｅ処理後、矢印：移動蛋白質）
【図１】
0003822454.tif 000003