(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の式(I)で示される新規生理活性物質、ＳＮＦ4435及びその薬理学的に許容される塩。
0003851661.tif 000010
【請求項２】
26℃におけるナトリウムＤ線による比施光度が−105.6°（C 0.10, CHCl3）である、請求項１記載の新規生理活性物質、ＳＮＦ4435Ｃ及びその薬理学的に許容される塩。
【請求項３】
26℃におけるナトリウムＤ線による比施光度が＋84.8°（C 0.10, CHCl3）である、請求項１記載の新規生理活性物質、ＳＮＦ4435Ｄ及びその薬理学的に許容される塩。
【請求項４】
ストレプトミセス（Streptomyces）属に属し、請求項１〜３のいずれかに記載の新規生理活性物質を産生することのできる微生物。
【請求項５】
ストレプトミセス属に属する微生物が、ストレプトミセス・スペクタビリス（Streptomyces spectabilis）ＳＮＦ4435株（FERM BP-5915）又はその変異株である請求項４記載の微生物。
【請求項６】
ストレプトミセス（Streptomyces）属に属する請求項４又は５記載の微生物を培養し、請求項１〜３のいずれかに記載の新規生理活性物質を培養物中に産生せしめ、これを採取することを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の新規生理活性物質の製造方法。
【請求項７】
スペクチナビリンのテトラエン部を閉環させることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の新規生理活性物質の製造法。
【請求項８】
請求項１〜３のいずれかに記載される新規生理活性物質またはその薬理学的に許容される塩を有効成分とする医薬。
【請求項９】
免疫抑制剤である請求項８記載の医薬。
【請求項１０】
アレルギー疾患治療剤である請求項８記載の医薬。
【請求項１１】
感染症治療剤である請求項８記載の医薬。
【請求項１２】
自己免疫疾患治療剤である請求項８記載の医薬。
【請求項１３】
制癌剤耐性克服剤である請求項８記載の医薬。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、新規なニトロフェニルピロン系の生理活性物質、それを産生及び製造するために用いる微生物並びにその新規生理活性物質を製造する方法に関する。さらに、本発明は、このような新規生理活性物質を有効成分とする医薬、特に、臓器移植等による免疫拒絶反応の抑制剤、全身性エリテマトーデス、慢性関節リウマチ、ブドウ膜炎等の自己免疫疾患の治療剤、アトピー性皮膚炎等のアレルギー疾患の治療剤、各種微生物による感染症の抗菌剤、或いは制癌剤耐性克服剤に関する。
背景技術
免疫抑制剤は、免疫応答の低下を必要とする疾患や病態の予防治療に有効である。例えば腎臓、肝臓、骨髄、心臓及び角膜移植といった移植の拒絶反応の予防、又は全身性エリテマトーデス、慢性関節リウマチ、ブドウ膜炎等の自己免疫疾患の治療や、アチピー性皮膚炎のようなアレルギー疾患等、多くの免疫病の治療薬として適応される。1983年に米国食品医薬局（ＵＳＦＤＡ）がシクロスポリンを承認して以来、免疫抑制剤の開発が活発に行われ、プログラフ、スパニジン等の薬剤が実用化されるに至り、それらの薬剤は臓器移植外科領域において高い評価を得ている。しかしながら、既存の薬剤は使用に伴う腎障害の多発や、自己反応性リンパ球の生成等の新たな問題が指摘されるとともに、自己抗体を生成して発症する自己免疫疾患に対してはその効力が必ずしも満足できるものではなかった。
発明の開示
本発明者らは上述の状況に鑑み、優れた免疫抑制活性を有し且つ副作用の少ない物質を自然界に広く求め鋭意探索の結果、ストレプトミセス属に属する菌株の培養物中に、該活性を有する新規なニトロフェニルピロン系の生理活性物質を見出した。従って本発明は、新規なニトロフェニルピロン系の生理活性物質、この新規生理活性物質を産生及び製造するために用いる微生物、及びその新規生理活性物質を製造する方法を提供することを課題とする。
詳しくは、免疫抑制活性、抗アレルギー活性、抗菌活性及び制癌剤耐性克服効果を有し且つ副作用の少ない新規生理活性物質、該生理活性物質を産生及び製造するために用いる微生物、及びその微生物を培養して該生理活性物質を得る該生理活性物質の製造方法を提供することを課題とする。
さらに、本発明は、前記したような生理活性を利用して種々の疾患を予防あるいは治療する医薬を提供することを課題とする。
すなわち、本発明は、次の式(I)で示される新規生理活性物質及びその薬理学的に許容される塩に関する。
0003851661.tif 000002
また、本発明は、ストレプトミセスに属し、式(I)で示される新規生理活性物質を産生及び製造するために用いることのできる微生物に関する。
このような微生物としては、具体的には本発明者らによって沖縄本島の土壌から分離採取されたストレプトミセス・スペクタビリス（Streptomyces  spectabilis）ＳＮＦ4435株（FERM BP-5915）を挙げることができる。
また、本発明は、前記微生物を培養し、培養物中に前記新規生理活性物質を産生せしめ、これを採取することよりなる新規生理活性物質の製造法に関する。
また、本発明は、前記微生物を培養し、培養物中に類縁体のスペクチナビリンを産生し、このテトラエン部を閉環させて合成化学的な手段で新規生理活性物質を製造する方法に関する。
さらに、本発明は、前記式(I)で示される新規生理活性物質またはその薬理学的に許容される塩を有効成分とする医薬に関する。
本発明の医薬は、臓器移植による免疫拒絶反応あるいは自己免疫疾患の治療剤、アレルギー疾患の治療剤、感染症の抗菌剤、或いは制癌剤耐性克服剤等として用いられる。
すなわち、本発明の生理活性物質は、新規なニトロフェニルピロン系の化合物であって、その活性からみて臓器移植等による免疫拒絶反応の抑制剤、全身性エリテマトーデス、慢性関節リウマチ、ブドウ膜炎等の自己免疫疾患の治療剤、アトピー性皮膚炎等のアレルギー疾患の治療剤、各種微生物による感染症の抗菌剤、或いは制癌剤耐性克服剤等の医薬として有用である。
【図面の簡単な説明】
第１図は、本発明化合物ＳＮＦ4435Ｃのメタノール中（15.4μｇ／ml）での紫外線吸収スペクトルを示す。
第２図は、本発明化合物ＳＮＦ4435Ｃの臭化カリウム錠での赤外線吸収スペクトルを示す。
第３図は、本発明化合物ＳＮＦ4435Ｃの重クロロホルム溶液中での500MHz 1ＨＮＭＲスペクトル（ＴＭＳ基準）を示す。
第４図は、本発明化合物ＳＮＦ4435Ｃの重クロロホルム溶液中での125MHz13ＣＮＭＲスペクトル（重クロロホルム基準）を示す。
第５図は、本発明化合物ＳＮＦ4435Ｄのメタノール中（18.0μｇ／ml）での紫外線吸収スペクトルを示す。
第６図は、本発明化合物ＳＮＦ4435Ｄの臭化カリウム錠での赤外線吸収スペクトルを示す。
第７図は、本発明化合物ＳＮＦ4435Ｄの重クロロホルム溶液中での500MHz 1ＨＮＭＲスペクトル（ＴＭＳ基準）を示す。
第８図は、本発明化合物ＳＮＦ4435Ｄの重クロロホルム溶液中での125MHz13ＣＮＭＲスペクトル（重クロロホルム基準）を示す。
発明を実施するための最良の形態
本発明の新規生理活性物質（以下、本発明化合物という）は、微生物を培養することにより得られる。この時、用いる微生物としては、本発明化合物を産生する菌であれば特に限定されないが、好ましくはストレプトミセス属（Streptomyces sp.）に属する菌、特に好ましくはストレプトミセス・スペクタビリス（Streptomyces  spectabilis）ＳＮＦ4435株を挙げることができる。このストレプトミセス・スペクタビリスＳＮＦ4435株は、本発明者らが、沖縄本島から採取した土壌より分離した菌株であり、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号ＦＥＲＭ P-15476として、平成８年２月27日に受託し、その後、この原寄託よりブダペスト条約に基づく寄託に移管し、受託番号ＦＥＲＭ BP-5915が付されている。
ストストレプトミセス・スペクタビリス（Streptomyces  spectabilis）ＳＮＦ4435株の分離は、沖縄本島の土壌を放線菌の分離に通常用いられている方法、例えばGoodfellow, M.；Actinomycetologica Vol. 2, No.1 13〜29(1988)に記載の方法によって容易に実施することができる。
このようにして分離されたストレプトミセス・スペクタビリスＳＮＦ4435株の性状を示すと次のとおりである。
１．形態
気菌糸はうっすらと着生し、わずかに疑似輪生分岐が見られるが菌糸の分断は認められない。気菌糸は赤色系まれには白色系の色調を呈し、10個以上の胞子の連鎖が形成されて屈曲性の直線型をしている。胞子の表面はほぼ平滑で、大きさが0.4×0.8μm位の円柱状である。菌核、胞子のう、遊走子等の特殊な器官は見出されない。
２．各種培地における生育状態
各種寒天平板培地において、27℃、14日間培養した結果を表１に示す。尚、色の記載については、ＪＩＳ色名帳（JIS Z 8102準拠、日本規格協会、平成５年４月15日、第１版第３刷発行）に従った。
0003851661.tif 000003
(1)生育温度範囲
イースト・麦芽寒天培地を用い、７℃、12℃、17℃、22℃、27℃、32℃、37℃、42℃及び47℃の各温度で試験した結果、７℃、42℃及び47℃を除き、そのいずれの温度でも生育した。最適生育温度は27℃〜32℃付近と思われる。
(2)ゼラチンの液化
グルコース・ペプトン・ゼラチン培地、27℃培養あるいは単純ゼラチン培地、20℃培養において、いずれの培地でも培養10日後頃より液化が始まり、21日後の観察での液化作用は中程度であった。
(3)スターチの加水分解
スターチ・無機塩寒天培地、27℃培養において、培養３日後頃より水解性が認められ、その作用は比較的強い。
(4)脱脂牛乳の凝固・ペプトン化
脱脂牛乳培地、37℃培養において、凝固は認められなかったが、培養７日後頃よりペプトン化が観察された。
(5)メラニン様色素の生成
トリプトン・イースト・ブロス培地、ペプトン・イースト・鉄寒天培地またはチロシン寒天培地を用いた27℃培養において、ペプトン・イースト・鉄寒天培地のみに培養３日後頃からメラニン様色素の生成が認められた。
(6)炭素源の利用性
プリドハム・ゴドリーブ寒天培地、27℃培養において、Ｄ−グルコース、Ｄ−キシロース、Ｄ−フラクトース、ラフィノース、イノシトール、Ｄ−マンニトール、マンノース、Ｄ−ガラクトースを利用し、Ｌ−アラビノース、シュクロース、Ｌ−ラムノースは利用しない。
以上の性状を要約すると、ＳＮＦ4435株の菌学的性状は、気菌糸が直線状で胞子のうは形成しないが、わずかに疑似輪生分岐が認められる。気菌糸の先端には10個程度の胞子を連鎖し、その表面は平滑である。種々の培地で、気菌糸の色調はピンクから赤色系を呈す。可溶性色素はペプトン・イースト・鉄寒天培地でメラニン様色素が生成され、またスターチの水解性及び蛋白の分解力は中程度である。
尚、細胞壁に含まれる2，6−ジアミノピメリン酸はＬＬ−型であった。これらの性状より、ＳＮＦ4435株はストレプトミセス（Streptomyces）属に属すると考えられ、「バージーズ・マニュアル・オブ・デターミナティブ・バクテリオロジー（Bergey's Manual of Determinative Bacteriology）」第８版、及びＩＳＰ報告「インターナショナル・ジャーナル・オブ・システマティック・バクテリオロジー（International Journal of Systematic Bacteriology）」第18巻、69頁、279頁（1968年）、同19巻、391頁（1969年）、同22巻、265頁（1972年）より検索した結果、ストレプトミセス・スペクタビリス（Streptomyces spectabilis）を近縁種として挙げられる。そこで、ＳＮＦ4435株とストレプトミセス・スペクタビリス（Streptomyces spectabilis IFO 13424）とを比較した。結果を第２表に示す。
0003851661.tif 000004
この結果より、気菌糸の色調及び生育温度範囲等に若干の差異が認められる以外、気菌糸の形態、胞子の表面、生育状態やメラニン様色素を生成する点及び炭素源の利用性などで両者はよく一致する。従って、ＳＮＦ4435株をストレプトミセス・スペクタビリス（Streptomyces spectabilis）と同定した。
本発明で用いられる微生物は、Ｘ線、紫外線等の照射処理、又は亜硝酸、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニン（ＮＴＧ）等の変異誘起剤による処理、形質転換、形質導入又は融合等の通常用いられる菌種変換処理方法により変異させた微生物であっても良い。
本発明化合物は、通常の微生物が利用しうる栄養源含有培地にこれらの本発明化合物の産生菌を接種して発育させることにより、その培養物中に産生され、あるいは化合物を製造するために用いられる微生物を接種して発育させその培養物を原料として有機合成により、目的とする本発明化合物を製造することができる。栄養源としては、放線菌の栄養源に利用されているのものであれば良く、合成培地、半合成培地、天然培地などいずれも使用できる。例えば、炭素源としてはグルコース、グリセロール、麦芽糖、デンプン、シュクロース、糖蜜、水飴又はデキストリンなどが単独又は混合物として用いられる。窒素源としては、大豆粉、コーングルテンミール、コーンスティープリカー、肉エキス、酵母エキス、綿実粕、ペプトン、小麦胚芽、魚粉、尿素などの有機窒素源、硫酸アンモニウム、硝酸ナトリウムなどの無機窒素源が単独又は混合物として用いられる。無機塩としては、炭酸カルシウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウム又は各種リン酸塩等を使用することができ、さらに必要に応じて、鉄、銅、コバルト、モリブデン、マンガン又は亜鉛などの重金属塩を微量添加することもできる。又、培養中発泡の著しい時には、消泡剤として公知の各種消泡剤を適宜培地中に添加しても良い。この他に、該生産菌が利用し、本発明化合物の生産に有用な有機及び無機物を、適宜用いることができる。
菌株の培養方法としては、一般の微生物代謝産物の生産法と同様に行えば良く、固体培養でも液体培養でも良い。液体培養の場合は、静置培養、攪拌培養、振とう培養又は通気培養等のいずれを実施しても良いが、ストレプトミセス・スペクタビリスＳＮＦ4435株を培養する場合には、特に振とう培養又は深部通気攪拌培養が好ましい。又、培養条件によっても異なるが、好ましい培地のpHは４〜８の範囲で、培養温度は22〜37℃、好ましくは25〜30℃が適当である。また培養時間は48〜168時間、好ましくは96〜144時間である。
培養物から目的とする本発明新規生理活性物質を単離、製造するには、微生物の生産する代謝物を単離するのに通常使用される分離手段を適宜利用すれば良い。また、必要があれば合成化学的な手段を適宜利用すれば良い。
培養により生成した本発明化合物は、通常培養物中の菌体内及び菌体外の両方に蓄積されることが多いので、例えば遠心分離、濾過等の手段により培養濾液及び菌体に分離し、培養濾液及び菌体より通常の分離手段、例えば、透析法、溶媒抽出法、不純物との溶解度差を利用する方法、イオン交換樹脂法又は吸着もしくは分配クロマトグラフィー法及びゲル濾過法などを単独又は適宜組み合わせて、場合によっては反復使用することによって分離精製することができる。
合成化学的な手段を利用して採取される本発明化合物は、微生物を培養して培養液中に生成された本発明化合物の類縁体（ニトロフェニルピロン系）について上記分離手段を使用することによって分離精製し、合成化学的な手段、例えば触媒を用いた閉環反応により製造させることができる。反応に用いられる有機溶媒としては、例えばメタノール、エタノール、第３ブチルアルコール、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、エチレングリコール、ジメチルエーテル、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ベンゼン、トルエン、キシレン、ジオキサン、塩化メチレン、クロロホルム、ジクロロエタン又はアセトニトリル等が挙げられる。閉環反応を光を用いて行う場合は、通常200nm〜800nmの波長の光を用いるが、必要に応じてこれ以上またはこれ以下の波長を選択できる。閉環反応の反応温度は、通常−20〜400℃であり、必要に応じてこれ以上またはこれ以下の温度を選択できる。閉環反応の反応時の圧力は、通常１〜10atmで、必要に応じてこれ以上またはこれ以下の圧力を選択できる。閉環反応に用いられる触媒としては、例えば塩化アルミニウム、塩化スズ、フッ化ホウ素、フッ化ホウ素酸銅およびヨウ素等が挙げられる。閉環反応の反応時間は、通常30分から２日の範囲であるが、必要に応じてこれ以上またはこれ以下の時間を選択できる。
本発明におけるスペクチナビリンのテトラエン部を閉鎖させる反応式を示す。
0003851661.tif 000005
上記反応条件により閉環反応を行った後、有機合成化学の分野における公知の方法、例えば溶媒抽出、再結晶、クロマトグラフィー、イオン交換樹脂、ＨＰＬＣ等を用いる方法によりＳＮＦ4435ＣおよびＳＮＦ4435Ｄを分離精製することができる。
得られた本発明化合物の性状を示す。尚、ＳＮＦ4435は平面構造（式(I)参照）は同一だが光学異性体が存在し、それぞれをＳＮＦ4435Ｃ又はＤとする。これらの光学異性体は、液体クロマトグラフィー等の常法の分離手段によってそれぞれの光学異性体に分離することができる。尚、医薬として用いる場合は光学異性体単体であっても良いし、ラセミ体であっても良い。
ＳＮＦ4435Ｃの物理化学的性状
（１）色及び性状：乳白色粉末
（２）分子式：Ｃ28Ｈ31ＮＯ6
（３）マススペクトル（ＦＡＢ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  478（Ｍ＋Ｈ）+
（４）比旋光度：［α］D26−105.6°（C 0.10, CHCl3）
（５）紫外線吸収スペクトル：図１に示す。
λmax MeOHnm（ε）：271（19322）
（６）赤外線吸収スペクトル：図２に示す。
νmax KBrcm-1：2950，2850，1670，1600，1520，1350，1255，1165，1040
（７）1Ｈ−核磁気共鳴スペクトル：図３に示す。（500MHz，CDCl3）
δ(ppm)：8.19(d,J=8.7Hz,2H)，7.55(d,J=8.7Hz,2H)，5.58(d,J=1.4Hz,1H)，4.95(S,1H)，4.78(t,J=8.2Hz,1H)，4.32(d,J=9.8Hz, 1H)，3.97(d, J=9.8Hz,1H)，3.96(S,3H)，3.64(S,1H)，2.84(S,1H)，2.43(d, J=8.2Hz,2H)，1.89(S,3H)，1.84(S,3H)，1.74(S,3H)，1.72（d, J=1.4Hz,3H)，1.30(S,3H)
（８）13Ｃ−核磁気共鳴スペクトル：図４に示す。（125MHz，CDCl3）
δ(ppm)：180.5(s)，162.2(s)，155.2(s)，146.9(s)，145.1(s)，131.0(s)，130.4(s)，129.1(d)，123.8(d)，123.6(d)，122.0(d)，119.6(s)，100.3(s)，73.5(d)，70.6(t)，63.7(d)，55.6(q)，51.8(s)，51.1(d)，46.4(t)，43.0(s)，30.4(q)，23.0(q)，22.2(q)，9.4(q)，7.0(q)
（９）溶解性：メタノール、クロロホルム、エタノール、アセトン、ピリジン、酢酸エチル、ジエチルエーテル、ジメチルスルホキシド等に可溶ヘキサン、水に不溶
（10）呈色反応：50％硫酸、ヨウ素に陽性
（11）ＨＰＬＣ：保持時間  14.6分
カラム；イナートシルＯＤＳ−２（φ4.6×250mm、ＧＬサイエンス社）
溶媒；80％メタノール・水、流速１ml／min、ＵＶ220nm
（12）酸性、中性、塩基性物質の区別：中性
ＳＮＦ4435Ｄの物理化学的性状
（１）色及び性状：乳白色粉末
（２）分子式：Ｃ28Ｈ31ＮＯ6
（３）マススペクトル（ＦＡＢ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  478（Ｍ＋Ｈ）+
（４）比旋光度：［α］D26＋84.8°（C 0.10, CHCl3）
（５）紫外線吸収スペクトル：図５に示す。
λmax MeOHnm（ε）：270（21462）
（６）赤外線吸収スペクトル：図６に示す。
νmax KBrcm-1：2950，2850，1670，1600，1520，1350，1255，1165，1040
（７）1Ｈ−核磁気共鳴スペクトル：図７に示す。（500MHz， CDCl3）
δ(ppm)：8.15(d,J=8.7Hz,2H)，7.47(d,J=8.7Hz,2H)，5.70(S,1H)，4.94(dd,J=7.0, 9.5Hz,1H)，4.89(S,1H)，4.18(d,J=9.2Hz,1H)，3.84(d,J=9.2Hz,1H)，3.74(S,1H)，3.54(S,3H)，2.74(S,1H)，2.48(dd,J=13.1,9.5Hz,1H)，2.28(dd,J=13.1,7.0Hz,1H)，1.97(S,3H)，1.84(S,3H)，1.80（S,3H)，1.74(d,J=1.5Hz,3H)，1.31(S,3H)
（８）13Ｃ−核磁気共鳴スペクトル：図８に示す。（125MHz，CDCl3）
δ(ppm)：180.5(s)，161.9(s)，154.9(s)，146.9(s)，144.0(s)，131.3(s)，131.2(s)，129.9(d)，124.4(d)，123.2(d)，121.9(d)，119.7(s)，100.0(s)，72.5(d)，70.6(t)，61.1(d)，55.2(d)，54.8(q)，51.1(s)，45.5(t)，43.0(s)，30.7(q)，22.2(q)，22.1(q)，9.4(q)，6.8(q)
（９）溶解性：メタノール、クロロホルム、エタノール、アセトン、ピリジン、酢酸エチル、ジエチルエーテル、ジメチルスルホキシド等に可溶ヘキサン、水に不溶
（10）呈色反応：50％硫酸、ヨウ素に陽性
（11）ＨＰＬＣ：保持時間  16.6分
カラム；イナートシルＯＤＳ−２（φ4.6×250mm、ＧＬサイエンス社）
溶媒；80％メタノール・水、流速１ml／min、ＵＶ220nm
（12）酸性、中性、塩基性物質の区別：中性
本発明の新規生理活性物質を医薬として用いる場合、薬理学的に許容される塩としても良い。薬理学的に許容される塩として、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属塩、或いはマグネシウム、カルシウム等のアルカリ土類金属塩、アルミニウムその他の金属塩、及びアルキルアミン塩、ピリジン塩等の有機アミン塩が挙げられる。この化合物又はその薬理学的に許容される塩は、ヒト及び動物に対し、医薬として経口的及び非経口的に安全に投与される。非経口的投与には、例えば静脈注射、筋肉内注射、皮下注射、腹腔内注射、経皮投与、経肺投与、経鼻投与、経腸投与、口腔内投与、経粘膜投与等が挙げられ、これらの製剤が投与される。例えば注射剤、坐剤、エアゾール剤、経皮吸収テープなどが挙げられる。又、経口投与製剤として例えば錠剤（糖衣錠、コーティング錠、バッカル錠を含む）、散剤、カプセル剤（ソフトカプセルを含む）、顆粒剤（コーティングした物、丸剤、トローチ剤、液剤、又はこれらの製剤学的に許容され得る徐放化製剤等）が挙げられる。経口投与用液剤には懸濁剤、乳剤、シロップ剤（ドライシロップを含む）、エリキシル剤などが挙げられる。
これらの製剤は公知の製剤学的製法に準じ、製剤として薬理学的に許容され得る担体、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤等と共に医薬組成物として投与される。これらの製剤に用いる担体や賦形剤としては、例えば乳糖、ブドウ糖、白糖、マンニトール、馬鈴薯デンプン、トウモロコシデンプン、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、結晶セルロース、カンゾウ末、ゲンチアナ末など、結合剤としては例えばデンプン、トラガントゴム、ゼラチン、シロップ、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロースなど、崩壊剤としては例えばデンプン、寒天、ゼラチン末、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、結晶セルロース、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、アルギン酸ナトリウムなど、滑沢剤としては例えばステアリン酸マグネシウム、タルク、水素添加植物油、マクロゴールなど、着色剤としては医薬品に添加することが許容されているものを、それぞれ用いることができる。錠剤、顆粒剤は必要に応じ白糖、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、精製セラック、ゼラチン、グリセリン、ソルビトール、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、フタル酸セルロースアセテート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、メチルメタクリレート、メタアクリル酸重合体などで被膜しても良いし、２以上の層で被膜しても良い。さらにエチルセルロースやゼラチンのような物質のカプセルでも良い。又、注射剤を調製する場合は、主薬に必要に応じｐＨ調整剤、緩衝剤、安定化剤、可溶化剤などを添加して、常法により各注射剤とする。
本発明の新規生理活性物質を患者に投与する場合、症状の程度、患者の年齢、健康状態、体重などの条件によって異なり特に限定はされないが、成人１日当たり約10mg〜10gを経口或いは非経口的に１日１回若しくはそれ以上投与すれば良い。
急性毒性は、実施例６に示すようにほとんどみられなかった。
以下の実施例により本発明をより詳細に説明するが、これらは単に例示するのみであり、本発明はこれらにより何ら限定されるものではない。
〔実施例１〕
(1)微生物の分離
沖縄本島で採取した土壌を熱処理（60℃，10分間）することにより得られた乾燥土壌１gを10mlの滅菌水で懸濁した。該懸濁液を10-3倍に希釈し、寒天平板培地（硫酸アンモニウム0.05％、リン酸一カリウム0.05％、塩化カルシウム0.01％、硫酸マグネシウム0.01％、尿素0.01％、グルコース0.05％、可溶性デンプン0.1％、クロラムフェニコール0.008％、硫酸第一鉄0.0005％、硫酸マンガン0.00016％、硫酸亜鉛七水和物0.00014％、塩化コバルト(II)0.0002％、寒天1.8％、pH6.0）で分離培養（27℃、10日間）を行った。出現した集落を上記寒天平板培地に画線塗抹、純粋分離を行って、生理活性物質ＳＮＦ4435を生産する放線菌ストレプトミセス・スペクタビリスＳＮＦ4435株（FERM BP-5915）を得た。
(2)微生物の培養
ストレプトミセス・スペクタビリスＳＮＦ4435株（FERM BP-5915）の斜面培地（グルコース・スターチ・アスパラギン寒天培地）からマットごと１cm角を切り出し、70mlの前培養培地（硫酸アンモニウム0.14％、リン酸一カリウム0.2％、塩化カルシウム0.03％、硫酸マグネシウム0.03％、尿素0.03％、ポリペプトン0.5％、酵母エキス0.1％、大豆粉３％、グルコース１％、可溶性デンプン0.5％、硫酸第一鉄0.0005％、硫酸マンガン0.00016％、硫酸亜鉛七水和物0.00014％、塩化コバルト（II）0.0002％、pH無調整）を入れた500ml容の三角フラスコ10本に接種し、27℃で４日間回転振盪機上で培養して前培養液を得た。この前培養液700mlを本培養培地（可溶性デンプン１％、グルコース２％、大豆粉2.5％、乾燥酵母0.4％、肉エキス0.1％、リン酸二カリウム0.005％、塩化ナトリウム0.2％、pH7.2）120Lを含む200L容タンクに接種して、27℃で５日間通気攪拌培養（通気量120L/分、攪拌200回転／分、内圧0.1kg/cm2）を行った。
〔実施例２〕
(1)培養物の精製による本発明化合物の製造法
実施例１(2)で得られた培養物120Lを連続遠心分離（17,000rpm、20L/h）によって遠心分離し、得られた菌体を、アセトン36Lで抽出した。アセトン抽出液は、減圧濃縮してアセトンを除去した後、等量の酢酸エチルで二回抽出した。酢酸エチル層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧濃縮して粗抽出物70gを得た。これを少量のヘキサン−酢酸エチル（７：３）の溶媒に溶解し、同じ溶媒で平衡化した２Lのシリカゲルカラムに付した。このカラムを6Lのヘキサン−酢酸エチル（７：３）の溶媒で溶出した後、ヘキサン−酢酸エチル（１：１）で本発明化合物を溶出し、減圧濃縮して黄色粉末2.2gを得た。さらに、この粉末を少量のメタノールに溶解し、80％メタノール水溶液で平衡化したＨＰＬＣカラム（カプセルパックＣ18−ＳＧ120、φ20×250mm、資生堂社）に流速10ml／minで通し、同じ溶媒で溶出した。220nmの吸収を検出、本発明化合物ＳＮＦ4435の検出ピークを分取した。吸収が最初に大きくなる画分（保持時間約27分）をＳＮＦ4435Ｃとし、次いで吸収が大きくなる画分（保持時間約29分）をＳＮＦ4435Ｄとした。これらの画分を減圧濃縮し、化合物ＳＮＦ4435Ｃを18mg、ＳＮＦ4435Ｄを10mg、それぞれ乳白色粉末として得た。それらの粉末がＳＮＦ4435ＣおよびＳＮＦ4435Ｄであることは、それぞれの比旋光度を測定することによって確認され、前記した物理化学的性状を示した。
(2)合成による本発明化合物の製造法
実施例１(2)で得られた培養物４Ｌを遠心分離（5000rpm）し、得られた菌体をアセトン２Ｌで抽出した。アセトン抽出液は、減圧濃縮してアセトンを除去した後、等量の酢酸エチルで２回抽出、酢酸エチル層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧濃縮して粗抽出物2.5gを得た。これを少量のクロロホルムに溶解して、同じ溶媒で平衡化した100mlのシリカゲルカラムに付し、300mlのクロロホルムで溶出、減圧濃縮して乾固させ、50mlのメタノールを加えて一晩静置、スペクチナビリンを49.5mg析出、沈殿させた。これを５mlのクロロホルムに溶解、2.0mgのヨウ素を加え、室温中4.5時間攪拌した。反応液に水を加え、酢酸エチルで抽出後、10％チオ硫酸ナトリウム水溶液、飽和塩化ナトリウム水溶液で順次洗浄し、有機層を乾燥させた。溶媒を留去して得られた油状残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付し、ヘキサン−酢酸エチル（１：１）の混合液で処理、本発明化合物を溶出、減圧濃縮して黄色粉末30.5mgを得た。さらに、この粉末を少量のメタノールに溶解し、80％メタノール水溶液で平衡化したＨＰＬＣカラム（カプセルパックＣ18−ＳＧ120、φ20Ｘ250mm、資生堂社）に流速10ml/minで通し、同じ溶媒で溶出し、220nmの吸収を検出、本発明化合物ＳＮＦ4435のピークを分取した。吸収が最初に大きくなる画分（保持時間約27分）をＳＮＦ4435Ｃとし、次いで吸収が大きくなる画分（保持時間約29分）をＳＮＦ4435Ｄとした。これらの画分を減圧濃縮し、化合物ＳＮＦ4435Ｃを19.8mg、ＳＮＦ4435Ｄを2.2mg、それぞれ乳白色粉末として得た。それらの粉末がＳＮＦ4435ＣおよびＳＮＦ4435Ｄであることは、それぞれの比旋光度を測定することによって確認され、前記した物理化学的性状を示した。
〔実施例３〕
マイトジェンによる脾細胞の増殖反応に対する阻害活性
雄性ＢＡＬＢ／ｃマウスの脾細胞を、10％牛胎児血清を含むＲＰＭＩ 1640培地中に懸濁し、本発明化合物ＳＮＦ4435Ｃ及びＳＮＦ4435Ｄを様々な濃度で添加し、マイトジェン（コンカナバリンＡ又はＬＰＳ）添加又は無添加にて、37℃、５％炭酸ガス濃度の条件下で48時間培養、細胞増殖を3Ｈ−チミジンの細胞内取り込み率を基準として判定した。結果を第３表（ＳＮＦ4435Ｃ）及び第４表（ＳＮＦ4435Ｄ）に示す。なお、第３表及び第４表中のＴ／Ｃは細胞増殖率（（Mean±SD）/Control）を表す。
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0003851661.tif 000007
〔実施例４〕
細胞毒性
(1)10％の牛胎児血清を加えたＲＰＭＩ 1640培地中に、Ｋ562（ヒト白血病）細胞を１×105個/ml接種し、37℃、５％CO2インキュベーター内で24時間培養した後、これに本発明化合物ＳＮＦ4435Ｃ及びＳＮＦ4435Ｄを各々１mg／mlになるように添加してさらに培養を続けた。４８時間後、培養したＫ562細胞を顕微鏡で観察したが、本発明化合物ＳＮＦ4435Ｃ及びＳＮＦ4435Ｄのいずれを添加しても生育阻害は認められなかった。
(2)10％の牛胎児血清を加えたＲＰＭＩ 1640培地中に、ＫＢ（ヒト鼻咽腔癌）細胞を１×105個／ml接種し、37℃、５％CO2インキュベーター内で24時間培養した後、これに本発明化合物ＳＮＦ4435Ｃ及びＳＮＦ4435Ｄを各々１mg／mlになるように添加してさらに培養を続けた。48時間後、培養したＫＢ細胞を顕微鏡で観察したが、本発明化合物ＳＮＦ4435Ｃ及びＳＮＦ4435Ｄのいずれを添加しても生育阻害は認められなかった。
〔実施例５〕
抗微生物活性
本発明化合物ＳＮＦ4435Ｃ及びＳＮＦ4435Ｄの各種微生物に対する抗菌活性を、ペーパーディスク法（直径８mm）による阻止円の大きさ（直径）で観察した。生理活性物質ＳＮＦ4435Ｃ及びＳＮＦ4435Ｄは各々メタノールに溶解した100μgをペーパーディスクに染み込ませ測定に供した。結果を第５表に示す。
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〔実施例６〕
制癌剤耐性克服効果
５％の牛胎児血清を加えたＲＰＭＩ 1640培地（ギブコ社）に、2780ＡＤ細胞（Rogan A M et al., Science, vol.224, pp994-996（1984））を1X106個／mlとなるように懸濁して37℃、５％CO2インキュベーター内で24時間培養した。
3Ｈ−ビンクリスチン（アマシャム社）含有ＲＰＭＩ 1640に培地置換した後、本発明化合物ＳＮＦ4435ＣあるいはＳＮＦ4435Ｄを種々の濃度で添加、さらに２時間培養を続けた後、ビンクリスチンの細胞内取り込みをscintillation system USER No.10（ベックマン社）により測定した。結果を第６表に示す。
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〔実施例７〕
急性毒性
本発明化合物ＳＮＦ4435Ｃ及びＳＮＦ4435Ｄを、それぞれ６週齢の雄性ＢＡＬＢ／ｃマウスに静脈内投与してその毒性を調べたところ、25mg／kgで異常は見られなかった。
産業上の利用可能性
以上の結果から、本発明により新規な生理活性物質、その生理活性物質を産生及び製造をするために用いる微生物ならびにその製造方法が提供される。詳しくは、免疫抑制活性、抗菌活性及び制癌剤耐性克服効果を有する新規生理活性物質、該生理活性物質を製造するために用いる微生物、及びその微生物を用いることにより該生理活性物質を採取する該生理活性物質の製造方法が提供される。本発明新規生理活性物質は、その効果より臓器移植等による免疫拒絶反応の抑制剤、全身性エリテマトーデス、慢性関節リウマチ、ブドウ膜炎等の自己免疫疾患の治療剤、アトピー性皮膚炎等のアレルギー疾患の治療剤、各種微生物による感染症の抗菌剤、或いは制癌剤耐性克服剤として有用である。
微生物への言及
寄託機関：通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所
住所：日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号
寄託日：平成８年２月２７日
（平成８年２月２７日に原寄託され、平成９年４月１４日にブダペスト条約に基づく国際寄託へ移管）
受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−５９１５
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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