(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原および／または抗原組成物、ＱＳ２１および３デ−Ｏ−アシレーテッドモノホスホリルリピドＡ（3Deacylated monophosphoryl lipid A）（３Ｄ−ＭＰＬ）からなるワクチン組成物。
【請求項２】
ＱＳ２１：３Ｄ−ＭＰＬの割合が１：１０ないし１０：１である請求項１記載のワクチン。
【請求項３】
哺乳動物において抗原または抗原組成物に対する細胞溶解性Ｔ細胞の応答を誘導することのできる請求項１または２記載のワクチン組成物。
【請求項４】
インターフェロンγの産生を刺激することのできる請求項１ないし３のいずれかに記載のワクチン組成物。
【請求項５】
ＱＳ２１：３Ｄ−ＭＰＬの割合が１：１ないし１：２．５である請求項１ないし４のいずれかに記載のワクチン組成物。
【請求項６】
アラム（alum）、水中油エマルジョン、リポソーム、ミクロスフェア、またはカプセルに封入された抗原粒子を担体としてさらに含む、請求項１ないし５のいずれかに記載のワクチン組成物。
【請求項７】
担体がアラムまたは水中油エマルジョンである、請求項６に記載のワクチン組成物。
【請求項８】
ヒト・免疫不全ウイルス、ネコ・免疫不全ウイルス、１型単純ヘルペスウイルス、２型単純ヘルペスウイルス、ヒト・サイトメガロウイルス、Ａ、Ｂ、ＣまたはＥ型肝炎ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、ヒト乳頭腫ウイルス、インフルエンザウイルス、サルモネラ（Salmonella）、ネイセリア（Neisseria）、ボレリア（Borrelia）、クラミジア（Chlamydia）、ボルデテラ（Bordetella）、プラスモジウム（Plasmodium）またはトキソプラズマ（Toxoplasma）のいずれかに由来する抗原または抗原組成物からなる請求項１ないし７のいずれかに記載のワクチン組成物。
【請求項９】
抗原が腫瘍抗原である請求項１ないし７のいずれかに記載のワクチン。
【請求項１０】
ウイルス、細菌、または寄生虫の感染に対する予防的治療用ワクチンの製造のための請求項１ないし７のいずれかにおいて定義した組成物の使用方法。
【請求項１１】
ウイルス、細菌、または寄生虫の感染あるいは癌に対する免疫療法用ワクチンの製造のための請求項１ないし７のいずれかにおいて定義した組成物の使用方法。
【請求項１２】
病原体に感染しているかまたは感染しやすい哺乳動物を治療するための、請求項１ないし７いずれかに記載のワクチン組成物。
【請求項１３】
癌にかかっている哺乳動物を治療するための、請求項１ないし７いずれかに記載のワクチン組成物。
【請求項１４】
ＱＳ２１および３Ｄ−ＭＰＬを抗原または抗原組成物と混合することからなる請求項１ないし５のいずれかに記載のワクチン組成物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は、新規ワクチン処方、その製造方法および医薬品におけるその使用に関する。詳細には、本発明は、Ｈｐｌｃで精製されたキラジャ・サポナリア・モリナ（Quillaja Saponaria Molina）の樹皮由来の無毒フラクションであるＱＳ２１、および３デ−Ｏ−アシレーテッドモノホスホリルリピドＡ（3De-O-acylated monophosphoryl lipid A）（３Ｄ−ＭＰＬ）を含有するワクチンに関する。
３デ−Ｏ−アシレーテッドモノホスホリルリピドＡは、ＧＢ２２２０  ２１１（リビ（Ribi））により知られている。化学的には、それは、４、５または６個のアシル化された鎖を有する３−デアシレーテッドモノホスホリルリピドＡで、リビ・イムノケム・モンタナ（Ribi Immunochem Montana）により製造されている。
ＱＳ２１は、南アメリカの樹木キラジャ・サポナリア・モリナの樹皮由来のサポニンのＨｐＬｃ精製無毒フラクションであって、その製造方法は、米国特許第５，０５７，５４０号に（ＱＡ２１として）開示されている。
本発明は、ＱＳ２１および３Ｄ−ＭＰＬの混合物を含有する処方が、ある種の抗原に対して相乗的に免疫応答を促進するという驚くべき発見に基づく。
例えば、３Ｄ−ＭＰＬおよびＱＳ２１と混合したマラリア抗原ＲＴＳ，Ｓからなるワクチン処方は、脾臓において、ＣＳ蛋白特異的細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の強力な相乗的誘導を引き起こす。
ＲＴＳは、Ｂ型肝炎ウイルスの表面（Ｓ）抗原にＢ型肝炎表面抗原のプレＳ2部分の４個のアミノ酸により連結したピー・ファルシパルム（P.falciparum）のサーカムスポロゾイト（circumsporozoite）のすべてのＣ−末端部分から実質的になるハイブリッド蛋白である。その全構造が、英国特許出願第９１２４３９０．７を優先権主張の基礎としたＷＯ９３／１０１５２として公開された同時係属の国際特許出願ＰＣＴ／ＥＰ９２／０２５９１に開示されている。酵母において発現される場合には、ＲＴＳはリポ蛋白粒子として産生され、ＨＢＶ由来のＳ抗原とともに同時発現される場合には、それはＲＴＳ，Ｓとして知られる混合粒子を生じる。
強力な細胞毒性Ｔリンパ球を誘導することが可能であるという知見が重要である。なぜなら、これらの応答は、ある種の動物モデルにおいて、疾病に対する防御を誘導することが示されているからである。
本発明は、組み換え型粒子状抗原ＲＴＳ，ＳとアジュバントＱＳ２１および３Ｄ−ＭＰＬとの混合により、脾臓におけるＣＳ蛋白の強力な誘導が得られるということを示すものである。ＱＳ２１もまた単独でＣＴＬ誘導を促進するが、３Ｄ−ＭＰＬは促進しない。混合は、相乗的に作用すると言える。なぜならば、個々のアジュバントの合計の効果よりも大きな効果が得られるからである。ＣＴＬ誘導に関するこれらの２つのアジュバントの間の相乗効果は、ＣＴＬにより媒介される免疫性の誘導に関するワクチンとしての組換え分子の使用についての重要な示唆をする驚くべき知見である。
標的抗原が細胞内で合成された場合（例えばウイルスによる感染、細胞内細菌または腫瘍による）、ＣＴＬの誘導は容易に見られる。なぜならば、抗原を蛋白分解することにより得られたペプチドは、適当なプロセッシング経路を通って侵入でき、細胞膜上にクラスＩの分子を出現させるからである。しかしながら、一般的には、前以て形成された可溶性抗原はこのプロセッシングおよび出現経路には到達せず、クラスＩの制限ＣＴＬを誘導しない。それゆえ、慣用的な生きていないワクチンは、抗体およびＴヘルパーの応答を誘導するが、一般的にはＣＴＬにより媒介される免疫性を誘導しない。２つのアジュバントＱＳ２１および３Ｄ−ＭＰＬの混合により、ワクチンに起因する、あるいは組換え蛋白のこの重大な限界を克服し、広スペクトルの免疫応答を誘導する。
ＣＳ蛋白に特異的なＣＴＬは、マウスのモデル系において、マラリアから防御することが示されている。（ロメロ（Romero）ら，ネイチャー（Nature）第３４１巻：３２３頁（１９８９年））。放射線照射したピー・ファルシパルムのスポロゾイトを用いて志願者を免疫化し、ついで、マラリアの攻撃に対して防御を示すというヒトにおける試みにおいて、ＣＳ特異的ＣＴＬの誘導が示された（マリク（Malik）ら，プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユーエスエイ（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）第８８巻：３３００頁（１９９１年））。
組換え分子として投与された抗原に特異的なＣＴＬを誘導する能力は、マラリアワクチンの開発と相関関係がある。なぜならば、放射線照射したスポロゾイトが、製造および免疫応答の性質の面から実用的でないからであろう。
マラリアワクチンの他に、ＣＴＬ応答を誘導する能力は、単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、ヒト・免疫不全ウイルスに対するワクチン、および一般的に病原体が細胞内生活段階を有するすべての場合に恩恵を与えるであろう。
同様に、知られた使用抗原に特異的なＣＴＬが、組み換え型腫瘍抗原と２つのアジュバントとの混合物により誘導され得るであろう。このことは、抗癌ワクチンの開発を可能にするであろう。
ある種の系においては、３Ｄ−ＭＰＬとＱＳ２１との混合により、インターフェロンγ産生が相乗的に促進された。本発明により、ｇＤ2ｔとして知られる単純ヘルペス抗原を用いることによって３Ｄ−ＭＰＬとＱＳ２１との相乗的能力が示される。ｇＤ2ｔはＨＳＶ−２由来の切形された可溶性グリコプロテインＤであって、ベルマン（Berman）ら，サイエンス（Science）第２２２巻，５２４〜５２７頁の方法論によりＣＨＯ細胞において産生される。
ＩＦＮ−γ分泌は、寄生虫、細菌およびウイルスをはじめとする細胞内病原体に対する防御的応答に関連している。ＩＦＮ−γによるマクロファージの活性化により細胞内での微生物殺菌が促進され、Ｆｃ受容体の発現が促進される。特にリンフォトキシン（ＴＨ１細胞のもう１つの生産物）と相乗的な直接的細胞毒もまた発生しうる。またＩＦＮ−γはＮＫ細胞のインデューサーかつ生産物であり、防御のための主要で本質的なエフェクターである。ＩＦＮ−γまたは他の機構いずれによっても、ＴＨ１タイプの応答は、ＩｇＧ２ａ免疫グロブリンイソタイプに対して好ましい援助を提供する。
グリコプロテインＤはウイルス外套上に存在し、感染細胞の細胞質中にも見い出される（アイゼンベルグ，アール・ジェイ（Eisenberg R.J.）ら，ジャーナル・オブ・ウイロロジー（J.of Vilol.），１９８０年，第３５巻，４２８〜４３５頁）。それはシグンナルペプチドを含む３９３個のアミノ酸からなり、約６０ｋＤａの分子量を有する。すべてのＨＳＶ外套のグリコプロテインのうち、おそらくこの蛋白が最も特徴が調べられている（コーエン（Cohen）ら，ジャーナル・オブ・ウイロロジー，第６０巻，１５７〜１６６頁）。インビボにおいて、この蛋白が、細胞膜へのウイルスの付着に中心的な役割を果たしていることが知られている。さらに、グリコプロテインＤは、インビボにおいて中和抗体を誘導しうることが示されている（エイング（Eing）ら，ジャーナル・オブ・メディカル・ウイロロジー（J.Med.Virol.）第１２７巻：５９〜６５頁）。しかしながら、潜在的なＨＳＶ２ウイルスは、さらに活性化され、患者血清中に高力価の中和抗体が存在しているにもかかわらず疾病の再発を引き起こし得る。それゆえ、中和抗体を誘導する能力のみが疾病の十分な抑制をするには不十分であることが明らかである。
疾病の再発を防止するためには、いかなるワクチンであっても、中和抗体のみならず、Ｔ細胞、特に細胞毒性Ｔ細胞により媒介される細胞免疫性を刺激することが必要とされる。
本発明の場合、ｇＤ2ｔは、１ないし３０６番目のアミノ酸は天然グリコプロテイン由来であり、その切形蛋白のＣ末端にアスパラギンおよびグルタミンを付加した３０８個のＨＳＶ２グリコプロテインＤである。この形態の蛋白はシグナルペプチドを有し、これが開裂されて２８３個のアミノ酸からなる成熟蛋白が得られる。チャイニーズ・ハムスターの卵巣細胞におけるかかる蛋白の産生は、ジェネンテック（Genentech）の欧州特許公告ＥＰ−Ｂ−１３９  ４１７に記載されている。
好ましくは、哺乳動物細胞から分泌される成熟切形グリコプロテインＤ（ｒｇＤ2ｔ）または等価な蛋白を本発明ワクチン処方に使用する。
本発明処方は、モルモットの生殖器ヘルペスにおける防御的免疫性の誘導に非常に効果的である。非常に抗原用量が少ない場合でも（例えばｒｇＤ2ｔを５μｇ程度）、該処方は、モルモットを初期の感染から防御し、また特異的中和抗体の応答を刺激する。本発明者らは、本発明処方を用いて、マウスにおけるエフェクター細胞により媒介されるＴＨ１タイプの応答をも示した。
したがって、本発明は、３デアシレーテッドモノホスホリルリピドＡおよびＱＳ２１と混合された抗原からなるワクチンまたは医薬処方を提供する。かかる処方は、広範囲の１価または多価ワクチンに適する。
好ましくは、該ワクチン処方は、ヒトまたは動物の病因に対する免疫応答を誘導しうる抗原あるいは抗原組成物を含有するものであり、抗原または抗原組成物は、ＨＩＶ−１（ｇｐ１２０またはｇｐ１６０のごとき）、ネコ・免疫不全ウイルスのいずれか、ＨＳＶ１またはＨＳＶ２由来のｇＤあるいはその誘導体もしくはＩＣＰ２７のごときイミジエイト・アーリー（Immediate Early）蛋白、サイトメガロウイルス（（特にヒトの）（ｇＢまたはその誘導体のごとき））、バリセラ・ゾスター・ウイルス（Varicella Zoster Virus）（ｇｐＩ、IIまたはIIIのごとき）のようなヒトまたは動物のヘルペスウイルス由来であるか、あるいは例えばＢ型肝炎表面抗原またはその誘導体のようなＢ型肝炎ウイルス由来、Ａ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルスおよびＥ型肝炎ウイルス由来であるか、あるいは呼吸器合胞体ウイルス、ヒト乳頭腫ウイルスまたはインフルエンザウイルスのごとき他のウイルス性病原体由来であるか、あるいはサルモネラ（Salmonella）、ネイセリア（Neisseria）、ボレリア（Borrelia）（例えばＯｓｐＡまたはＯｓｐＢあるいはそれらの誘導体）またはクラミジア（Chlamydia）もしくは例えばＰ．６９、ＰＴおよびＦＨＡのごときボルデテラ（Bordetella）のような細菌性病原体由来であるか、あるいはプラスモジウム（plasmodium）またはトキソプラズマ（Toxoplasma）のごとき寄生虫由来のものである。
該処方が、抗腫瘍性抗原を含んでいてもよく、免疫療法的な癌の治療に有用であろう。
また該処方は、国際特許出願ＰＣＴ／ＧＢ９２／００８２４および国際特許出願ＰＣＴ／ＧＢ９２／００１７９に記載されたようなヘルペス性ライト・パーティクル（light particles）との使用に有用である。
Ｂ型肝炎表面抗原の誘導体は当該分野でよく知られており、とりわけＰｒｅＳ1、ＰｒｅＳ2  Ｓ抗原が欧州特許出願公開ＥＰ−Ａ−４１４  ３７４；ＥＰ−Ａ−０３０４  ５７８およびＥＰ１９８  ４７４に記載されている。
本発明のさらなる態様において、医薬品に使用するための本明細書記載のワクチンが提供される。
ＱＳ２１：３Ｄ−ＭＰＬの割合は、典型的には、１：１０ないし１０：１、好ましくは１：５ないし５：１、そしてしばしば実質的には１：１である。最適な相乗作用にとり好ましい範囲は２．５：１ないし１：１（３Ｄ−ＭＰＬ：ＱＳ２１）である。典型的には、ヒトに投与するには、ＱＳ２１および３Ｄ  ＭＰＬがワクチン中に１回の投与あたり１μｇ〜１００μｇ、好ましくは１０μｇ〜５０μｇ存在するものとする。しばしばワクチンにはいかなる特別な担体も必要でなく、水溶液中あるいは他の医薬上許容される緩衝液中で処方される。いくつかの場合、本発明ワクチンがさらにアラム（alum）を含んでいるか、または水中油エマルジョンあるいは例えばリポソーム、ミクロスフェアのごとき他の適当な担体中に存在するかもしくはカプセルに封入された抗原粒子であるのが有利であろう。
一般的には、ワクチンの製造は、ニュー・トレンズ・アンド・ディベロップメンツ・イン・ワクチンズ（New Trends and Developments in Vaccines）（ボラー（Voller）ら編，米国メリーランド州ボルチモアのユニバーシティー・パーク・プレス（University Park Press），１９７８年）に記載されている。リポソーム中への封入は、例えば、フラートン（Fullerton）の米国特許第４，２３５，８７７号に記載されている。蛋白の巨大分子への抱合は、例えばライクハイト（Likehite）の米国特許第４，３７２，９４５号およびアーマー（Armor）らの米国特許第４，４７４，７５７号に開示されている。
各ワクチン用量を、典型的なワクチンに見られる有意な不利な効果なしに免疫防御応答を誘導する量から選択する。かかる量は、いかなる特別な免疫原を使用するのか、およびそれがどのようにして存在しているのかにより変更される。一般的には、各用量は、１〜１０００μｇ、好ましくは２〜１００μｇ最も好ましくは４〜４０μｇの蛋白からなる。特定のワクチンの最適量を、対象の適当な免疫応答の観察をはじめとする標準的な研究により確認することができる。最初のワクチン接種の後、適当間隔をおいて対象に１ないし数回の追加免疫を行ってもよい。
本発明処方は、おそらく、予防および治療双方の目的に使用されるであろう。
１の態様によれば、本発明は、有効量の本発明ワクチンを患者に投与することからなる治療方法を提供する。
実施例
１．０  インターフェロンγ分泌に対する３Ｄ  ＭＰＬとＱＳ２１との間の相乗効果
３Ｄ  ＭＰＬおよびＱＳ２１に基づくｒｇＤ2ｔアジュバント処方の、エフェクター細胞により媒介される応答を誘導する能力を試験するために、Ｂａｌｂ／ｃマウスの群にワクチン接種し、取り出したリンパ節細胞のＩＦＮ−γ分泌を下記のごとく試験した。
１．１  ｒｇＤ2ｔ処方
この実施例では３種のアジュバント処方を比較した。
i）３Ｄ−ＭＰＬ中のｒｇＤ2ｔ
ii）ＱＳ２１中のｒｇＤ2ｔ
iii）３Ｄ−ＭＰＬ／ＱＳ２１中のｒｇＤ2ｔ
これらの処方を以下のごとく製造した。ｒｇＤ2ｔはＣＨＯ細胞中で生産され、ＨＳＶ−２ｇＤの成熟１〜２８３アミノ酸に対応している。これをベルマン（上記）およびＥＰ第０１３９４１７号の方法論に従い製造した。
*ｒｇＤ2ｔ／３Ｄ−ＭＰＬ
ｒｇＤ2ｔ５μｇＤ／１回分を、室温で撹拌しながら１時間インキュベーションし、ついで、３Ｄ−ＭＰＬ懸濁液（２５μｇ／１回分）と混合した。塩化ナトリウム溶液（５Ｍ，ｐＨ６．５±０．５）および注射用水を用いて体積を７０μｌ／１回分に調節して塩化ナトリウム最終濃度０．１５Ｍとした。ｐＨを６．５±０．５に保った。
*ｒｇＤ2ｔ／ＱＳ２１
ｒｇＤ2ｔ５μｇ／１回分を室温で撹拌しながら１時間インキュベーションした。塩化ナトリウム溶液（５Ｍ，ｐＨ６．５±０．５）および注射用水を用いて体積を７０μｌ／１回分に調節した。ついで、ＱＳ２１（１０μｇ／１回分）を添加した。ｐＨを６．５±０．５に保ち、塩化ナトリウム最終濃度０．１５Ｍとした。
*ｒｇＤ2ｔ／３Ｄ−ＭＰＬ／ＱＳ２１
ｒｇＤ2ｔ５μｇ／１回分を室温で撹拌しながら１時間インキュベーションした。３Ｄ−ＭＰＬ（２５μｇ／１回分）を水溶液として添加した。ＱＳ２１（１０μｇ／１回分）の水溶液を添加することにより最終体積を７０μｌとし、ｐＨを６．５±０．５に保ち、塩化ナトリウム最終濃度０．１５Ｍとした。
１．２  接種
マウスの後脚の甲に処方３５μＬを注射した。かくして、それぞれのマウスに７０μＬを注射した。０および１４日目に接種を行った。２１日目に動物を屠殺した。
１．３  インターフェロンγアッセイ
接種マウスの膝の後ろのリンパ節細胞を、インビトロにおいて、１０、１、０．１、０μｇ／ｍｌのｒｇＤ2ｔを用いて刺激した。２ｘ１０5個の応答細胞および２ｘ１０5個の放射線照射（３０００ｒａｄ）した同系無処理脾臓細胞を用いて、９６ウェル（丸底）マイクロタイタープレート中で３系並列の培養（体積２００μｌ）を行った。培地は１０％子ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０であった。各レプリカから培養物１００μｌを取り、ＩＦＮ−γ測定用に蓄えておいた。培養物は７２時間培養時にアッセイした。すべてのアッセイに関して、５μｇ／ｍＬのＣｏｎＡ（ベーリンガー・マンハイム（Boehringer Mannheim））を用いた対照群を付けた。この対照群はつねに陽性である。
市販のＥＬＩＳＡアッセイ（ホーランド・バイオテクノロジー（Holland Biotechnology）社製，（ギブコ（Gibco）より発売））を用いてＩＮＦ−μ分泌を測定した。３系のウェルからの蓄えておいた１００μｌの上清についてアッセイを行った。
上記ＩＦＮ−γ分泌において、３種の処方の群すべてにおいてアッセイのバックグラウンド５０ｐｇ／μｌが観察された。さらに、ＱＳ２１と３Ｄ−ＭＰＬとの間の相乗作用が観察された。各アジュバントはそれ自体、ｒｇＤ2ｔに対する応答においてＩＦＮ−γを分泌する能力のある細胞を誘導したが、それらの組み合わせにより、それぞれのアジュバントによる応答の合計の２倍以上の応答を誘導された。
１．４  結果
ＩＮＦ−γ分泌に対するＱＳ２１と３Ｄ−ＭＰＬとの間の相乗作用
0003755890.tif 000002
ＩＮＦ−γをｐｇ／ｍＬで表す。
表より、混合ワクチンがＩＮＦ−γ分泌を相乗的に誘導することが明確に示される。
２．０  ＣＴＬｓの誘導に対するＱＳ２１と３Ｄ−ＭＰＬとの間の相乗作用
３Ｄ−ＭＰＬおよびＱＳ２１に基づくアジュバント処方においてＲＴＳ，Ｓ粒子がＣＴＬｓを誘導する能力を試験するために、１０．ＢＲマウスの群に接種し、その脾臓細胞をインビトロで刺激し、ＣＳ蛋白を発現しているＬ細胞に関する細胞毒性アッセイにおいて試験した。
２．１  ＲＴＳ，Ｓ粒子処方
ＲＴＳ，Ｓ粒子を３種の異なる組成物として処方した。
１．ＲＴＳ，Ｓ粒子（ＱＳ２１（１０μｇ）および３Ｄ−ＭＰＬ
（２５μｇ）とともに１０μｇ）；
２．ＲＴＳ，Ｓ粒子（ＱＳ２１（１０μｇ）とともに１０μｇ）
３．ＲＴＳ，Ｓ粒子（３Ｄ−ＭＰＬ（２５μｇ）とともに１０μｇ）；
以下のごとく処方した。
ＲＴＳ，Ｓ／３Ｄ  ＭＰＬ
ＲＴＳ，Ｓ粒子１０μｇ／１回分を室温で撹拌しながらインキュベーションし、ついで、３Ｄ−ＭＰＬ水溶液（２５μｇ／１回分）と混合した。ついで、注射用水および塩化ナトリウム溶液（５Ｎ，ｐＨ６．５±０．５）を用いて７０μｌ／１回分に調節して塩化ナトリウム最終濃度を０．１５Ｍとした（ｐＨを６．５±０．５に維持した）。
ＲＴＳ，Ｓ／ＱＳ２１
ＲＴＳ，Ｓ粒子１０μｇ／１回分を室温で撹拌しながらインキュベーションした。注射用水および塩化ナトリウム溶液（５Ｎ，ｐＨ６．５±０．５）を用いて体積を調節し、ＱＳ２１（１０μｇ／１回分）水溶液で最終体積７０μｌ／１回分とした。ｐＨを６．５±０．５に維持し、塩化ナトリウム最終濃度を０．１５Ｍとした。
ＲＴＳ，Ｓ／３Ｄ  ＭＰＬ／ＱＳ２１
ＲＴＳ，Ｓ粒子１０μｇ／１回分を室温で撹拌しながら１時間インキュベーションし、ついで、３Ｄ−ＭＰＬ水溶液（２５μｇ／１回分）と混合した。ついで、注射用水および塩化ナトリウム溶液（５Ｎ，ｐＨ６．５±０．５）を用いて体積を調節した。ＱＳ２１（１０μｇ／１回分）水溶液を添加することにより最終体積とした。ｐＨを６．５±０．５に維持し、塩化ナトリウム最終濃度を０．１５Ｍとした。
２．２  ＲＴＳ，Ｓ粒子でのマウスへの接種
Ｂ１０．ＢＲ（Ｈ−２k）株の４ないし６週齢のメスのマウスをイファ・クレド（ＩＦＦＡ  ＣＲＥＤＯ）（フランス）から購入した。後脚の甲に３５μＬの抗原処方を注射することにより３匹からなる群に接種した。２週間後、同じ体積の抗原を注射して追加免疫した。
２．３  抗ＣＳ  ＣＴＬに対するインビトロ刺激
追加免疫の２週間後、脾臓細胞を取り、ピー・ファルシパルム・サーカムスポロゾイト蛋白（P.falciparum circumsporozoite protein）遺伝子（７Ｇ８クローン）で形質転換した相乗的繊維芽細胞を用いてインビトロで刺激した。これらのＣＳ−形質転換細胞は、クマー，エス（Kumar,S.）ら，（１９８８年），ネイチャー（Nature）第３３４巻：２５８〜２６０頁に記載されている。
当業者によく知られた条件下で、１０％熱失活子ウシ胎児血清および通常の添加物を含むＰＲＭＩ１６４０培地中で培養を行った。
応答細胞を、１０5個のＣＳ−形質転換細胞の存在下、１０6個／ｍＬになるまで培養した。ＣＳ−形質転換細胞の増殖のために、これらの２ｘ１０4ｒａｄの放射線を照射した。３および６日目に培地の半分を置換することにより培養物を供給し、７日目に細胞溶解活性を試験した。
２．４  抗−ＣＳ  ＣＴＬに対する細胞毒性アッセイ
応答細胞培養物を収穫し、洗浄し、ついで、標的細胞数を２０００個一定に保ちながら１００：１ないし０．３：１の種々の割合で混合し、Ｖ底９６ウェルプレート中２００μＬの体積とした。標的細胞は、51Ｃｒで標識された同系の繊維芽細胞であった。
２種の異なるタイプの標的細胞を用いた。
１．Ｌ細胞
２．ＣＳで形質転換されたＬ細胞
これらは、クマー，エス（Kumar,S.）ら，（１９８８年），ネイチャー（Nature）第３３４巻：２５８〜２６０頁に記載されている。
アッセイ物を３７℃で６時間インキュベーションし、ついで、標的細胞の溶解により上清中に放出された放射活性量を測定した。細胞毒性活性を、特異的溶解の％値として表す。
結果：
0003755890.tif 000003
アジュバントＱＳ２１および３Ｄ−ＭＰＬを伴ったＲＴＳ，Ｓ（処方番号１）でのマウスへの接種により、脾臓において、ＲＴＳ，Ｓのサーカムスポロゾイト成分に対して特異的な高レベルのＣＴＬが誘導された。アジュバントＱＳ２１を伴ったＲＴＳ，Ｓ（処方番号２）でのマウスへの接種によっても、脾臓においてＣＴＬが誘導されたが、処方番号１による誘導の約１／３０のレベルであった。３Ｄ−ＭＰＬを伴ったＲＴＳ，Ｓ（処方番号３）はＣＴＬを誘導しなかった。
このアッセイに使用した標的細胞はＭＨＣクラスIIの分子を発現しないため、エフェクター細胞はＣＤ８+（クラスＩの制限されたＣＴＬ）であろうと考えられる。
３．他の情報
Ｂ型肝炎表面抗原、アラム３Ｄ−ＭＰＬおよびＱＳ２１
Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）の製造は十分に開示されている。例えばハーフォード（Harford）ら，ディベロップ・バイオロ・スタンダード（Develop.Biol.Standard）第５４巻，１２５頁（１９８３年）、グレッグ（Gregg）ら，バイオテクノロジー（Biotechnology）第５巻４７９頁（１９８７年）、ＥＰ−Ａ−Ｏ  ２２６  ８４６およびＥＰ−Ａ−２９９  １０８ならびにこれらに引用された文献参照。
３Ｄ−ＭＰＬをリビ・イミュノケム（Ribi Immunochem）から得た。ＱＳ２１をケンブリッジ・バイオテク（Cambridge Biotech）から得、水酸化アルミニウム（アルヒドロゲル）をスーパーフォス（Superfos）から得た。
マウスにおける細胞性免疫の研究およびレサス・モンキー（Rhesus monkey）における研究のために多くの異なる処方を製造した。
３．１  リン酸緩衝液（ｐＨ６．８）中で処方１を製造した。該処方は、６０μｌ用量あたり以下の成分からなる。
２０μｇ  ＨＢｓＡｇ
３０μｇ  Ａｌ（ＯＨ）3
３０μｇ  ３Ｄ−ＭＰＬ
１０μｇ  ＱＳ２１
１０ｍＭ  ＰＯ43-
０．１５Ｍ  ＮａＣｌ
以下の方法で処方を製造した。ＨＢｓＡｇ２０μｇ／１回分をＡｌ（ＯＨ）3とともにゆるやかに撹拌しながら室温で１時間インキュベーションした。３Ｄ−ＭＰＬを水性懸濁液として添加し、ＱＳ２１、リン酸緩衝液および塩化ナトリウムを添加し、室温で１時間インキュベーションすることにより処方を完成させた。最終処方のｐＨは６．５ないし７．０の間で、マウスの足の甲に使用した。
３．２  リン酸緩衝液（ｐＨ６．８）中で処方２を製造した。該処方は、２００μｌ用量あたり以下の成分からなる。
１μｇ  ＨＢｓＡｇ
１００μｇ  Ａｌ（ＯＨ）3
５０μｇ  ３Ｄ−ＭＰＬ
２０μｇ  ＱＳ２１
１０ｍＭ  ＰＯ43-
０．１５Ｍ  ＮａＣｌ
以下の方法で処方を製造した。ＨＢｓＡｇおよびＡｌ（ＯＨ）3を一緒にして、緩やかに撹拌しながら室温で１時間インキュベーションした。水性懸濁液としてＡｌ（ＯＨ）3、３Ｄ−ＭＰＬを、そしてリン酸緩衝液および塩化ナトリウム溶液とともにＱＳ２１を添加することにより処方を完成させた。処方のｐＨを６．５にし７．０の間に保ち、マウスにおける液性免疫試験に使用した。
３．３  リン酸緩衝液（ｐＨ６．５〜７．０）中で処方３を同様の方法で製造して１ｍｌ用量あたり以下の成分を含むようにした。
１０μｇ  ＨＢｓＡｇ
５００μｇ  Ａｌ（ＯＨ）3
５０μｇ  ３Ｄ−ＭＰＬ
１０μｇ  ＱＳ２１
処方をサルでの研究に使用した。
４．結論
２種のアジュバントＱＳ２１および３Ｄ−ＭＰＬを組換え型粒子状抗原ＲＴＳ，Ｓと混合した場合、脾臓において、ＣＳ蛋白に特異的なＣＴＬの強力な誘導が見られた。ＱＳ２１はそれ自体でＣＴＬの誘導を促進したが、３Ｄ−ＭＰＬは促進しなかった。混合は相乗的に作用すると言われる。なぜならば、個々のアジュバントの別々の効果の合成よりも大きな効果が得られるからである。ＣＴＬ誘導に対するこれら２種のアジュバント間の相乗作用は、可溶性組換え型蛋白ｇＤ2ｔでの刺激に応答してＩＦＮ−γを分泌しうるＴ細胞の誘導に関するＱＳ２１と３Ｄ−ＭＰＬとの間の相乗作用についての本発明者らの知見を支持する驚くべき知見である。この知見は、ＣＴＬにより媒介される免疫性の誘導をするためのワクチンとしての組換え型分子の使用に関する重大な示唆を含んでいる。なぜならば、２種のアジュバントＱＳ２１および３Ｄ−ＭＰＬの混合により、組換え型蛋白に起因するワクチンのかかる重大な限界が克服されうるからであり、従来よりも広いスペクトルの免疫応答が誘導されるからである。
マウス・細胞による免疫原性データは、ＱＳ２１を基礎としたｒｇＤ2ｔの処方が有意なＴＨ１タイプのＴ細胞の応答（ＩＮＦ−γ分泌）を誘導することを示す。
かかるＴＨ１タイプのＴ細胞は、マウスの遅延型過敏応答の誘導に必要であることが示されている。ＨＳＶ疾患の予防における本発明者ら自身のデータは、中和抗体力価および抗原特異的ＤＴＨ応答の同時誘導により、単純ヘルペス疾患に対する最良の防御が行われることを示す。
まとめると、これらのデータにより、ｒｇＤ2ｔのＱＳ２１処方は、ＨＳＶ疾患に対する防御的応答の誘導に効果的でありうることが示唆される。得られたデータにより、ＩＦＮ−γ分泌性抗原特異的ＴＨ細胞の誘導をはじめとする、３ＤモノホスホリルリピドＡとＱＳ２１との間の意外な相乗作用が示された。かかる相乗作用は、ＨＳＶ疾患に対する防御的応答を誘導する能力の改善であると解釈でき、実際に、これらの処方は、モルモットにおける疾患に対する防御に有効である。