(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（Ｉ）
【化１】
0003754785.tif 000008
（式中、Ｒ1 及びＲ2 は水素原子を表し、ＡはCHを表す。）で表されるニコチン酸に、ロドコッカス・ロドクラス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）ＡＴＣＣ １４３５０、ロドコッカス・ロドクラス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）ＡＴＣＣ １９１５０、ロドコッカス・エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ）ＡＴＣＣ ２１３２９、ロドコッカス・エスピー（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）ＩＦＯ １３１６１及びロドコッカス・エスピー（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）ＭＣＩ ２９５６（ＦＥＲＭ ＢＰ−５８１３）の群から選ばれる菌株の菌体及び／又は該菌体調製物を作用させることを特徴とする、一般式（II）
【化２】
0003754785.tif 000009
（式中、Ｒ1 、Ｒ2 及びＡは式（Ｉ）と同義である。）で表される３−ヒドロキシ含窒素六員環化合物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、微生物の菌体、及び／又は該菌体調製物による３−ヒドロキシ含窒素六員環化合物の製造方法に関するものである。３−ヒドロキシ含窒素六員環化合物は医薬の中間原料として有用な物質である。
【０００２】
【従来の技術】
３−ヒドロキシ含窒素六員環化合物を製造する方法はこれまでに多数の報告がなされているが、全て化学合成法によるものである。２−アセチルフランをアンモニア存在下で加熱する方法（ジャーナル  オヴ  メディシナル  ケミストリー（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．），１１，７９２ (１９６８））、メラノイヂンを熱分解する方法（アグリカルチュラル  アンド  バイオロジカル  ケミストリー（Ａｇｒ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．），４０，２０５１ (１９７６））、２−アミノメチルフランを低温条件下で光酸化する方法（ケミカル  アンド  ファーマス−ティカル  ビュルティン（Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，３９，１８１（１９９１））等がある。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
従来の化学合成による製造法は原料が高価であったり、塩素系有機溶媒を使用したり、不純物が多く回収精製の工程に問題がある等の点で、工業的な製法として必ずしも満足できる方法ではない。
本発明の課題は、工業的に安価に３−ヒドロキシ含窒素六員環化合物を製造する方法を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するべく鋭意検討した結果、ニコチン酸から３−ヒドロキシ含窒素六員環化合物を生成しうる微生物を見出し、本発明を完成した。即ち、本発明の要旨は、一般式（Ｉ）
【化３】
0003754785.tif 000002
（式中、Ｒ1 及びＲ2 は、それぞれ独立して水素原子、ハロゲン原子、水酸基、アミノ基、カルボキシル基、シアノ基、オキシム基又は炭素数１〜５のアルキル基を表し、ＡはCH又は窒素原子を表す。）で表されるニコチン酸誘導体又は２−ピラジンカルボン酸誘導体に、該誘導体のカルボキシル基の脱炭酸を伴う水酸化能力を有する微生物の菌体及び／又は該菌体調製物を作用させることを特徴とする、一般式（II）
【化４】
0003754785.tif 000003
（式中、Ｒ1 、Ｒ2 及びＡは式（Ｉ）と同義である。）で表される３−ヒドロキシ含窒素六員環化合物の製造方法にある。
【０００５】
本発明は、好ましい実施の形態として、
（１）ニコチン酸に、ニコチン酸のカルボキシル基の脱炭酸を伴う水酸化能力を有する微生物の菌体及び／又は該菌体調製物を作用させることを特徴とする３−ヒドロキシ含窒素六員環化合物の製造方法、ならびに
（２）６−クロロニコチン酸に、６−クロロニコチン酸のカルボキシル基の脱炭酸を伴う水酸化能力を有する微生物の菌体及び／又は該菌体調製物を作用させることを特徴とする３−ヒドロキシ含窒素六員環化合物の製造方法、
を提供する。
尚、上記の微生物としては、ロドコッカス属に属する微生物が好ましいものとして挙げられる。
以下、本発明の方法について詳細に説明する。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明においては、原料として上記一般式（Ｉ）で表されるニコチン酸誘導体又は２−ピラジンカルボン酸誘導体を用い、これに上記特定の微生物の菌体又は該菌体調製物を作用させて、上記一般式（II）で表される３−ヒドロキシ含窒素六員環化合物を製造する。式中、Ｒ1 及びＲ2 が示す炭素数１〜５のアルキル基とは、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｉｓｏ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｉｓｏ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基を表す。好ましい例としては、Ｒ1 、Ｒ2 が水素原子又はハロゲン原子である場合、及びＡがCHである場合が挙げられる。特に好ましい例としては、Ｒ1 、Ｒ2が水素原子を表し、ＡがCHを表す場合、及びＲ1がハロゲン原子を表し、Ｒ2が水素原子を表し、ＡがCHを表す場合が挙げられる。
【０００７】
本発明においては、上記一般式（Ｉ）で表されるニコチン酸誘導体又は２−ピラジンカルボン酸誘導体のカルボキシル基の脱炭酸を伴う水酸化能力を有する微生物であれば、いずれの微生物も使用し得る。特に好ましい微生物としては、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属あるいはセラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属に属する微生物が挙げられる。本発明において使用するロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属あるいはセラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属に属する微生物は、例えばロドコッカス・ロドクラス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）ＡＴＣＣ  １４３５０、ロドコッカス・ロドクラス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）ＡＴＣＣ  １９１５０、ロドコッカス・エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ）ＡＴＣＣ  ２１３２９、ロドコッカス・エスピー（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）ＩＦＯ  １３１６１及びロドコッカス・エスピー（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）ＭＣＩ  ２９５６、セラチア・プリムチカ（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｐｌｙｍｕｔｈｉｃａ）ＩＡＭ  １３５４３及びセラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）ＩＡＭ  １２１４２等が挙げられる。上記菌株はロドコッカス・エスピー（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）ＭＣＩ  ２９５６を除き全て公知の菌株であり、それぞれ工業技術院生命工学工業技術研究所、（財）発酵研究所（ＩＦＯ）、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）及び東京大学分子生物学研究所（ＩＡＭ）から容易に入手することができる。ロドコッカス・エスピー（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）ＭＣＩ  ２９５６は本発明者等により天然土壌から分離された細菌であり、１９９６年１月２９日に工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ  Ｐ−１５４０４として寄託され、１９９７年２月６日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、ＦＥＲＭ  ＢＰ−５８１３の受託番号で寄託されている。また、上記微生物は、野生株、ＵＶ照射、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）処理、エチルメタンスルホネート（ＥＭＳ）処理、亜硝酸処理、アクリジン処理等による変異株、或いは細胞融合若しくは遺伝子組換え法等の遺伝学的手法により誘導される組換え株等のいずれの株であってもよい。尚、以下に土壌分離菌であるロドコッカス・エスピー（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）ＭＣＩ  ２９５６の菌学的性状を記す。
【０００８】
１．形態的性質
ハートインフュージョン寒天培地上、３０℃、培養９時間後及び３０時間後に顕微鏡観察を行った。ＭＣＩ  ２９５６株は培養初期に細胞が不均一に伸張し分枝した菌糸状になる。その後時間の経過と共に細胞は分断（ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ）し、短桿状〜不均一な桿状になる。分断した細胞は運動性を有しない。気菌糸、胞子及び胞子嚢は観察されなかった。
【０００９】
２．培養的性質
ＩＳＰ〔インターナショナル・ストレプトマイセス・プロジェクト（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  Ｐｒｏｊｅｃｔ）〕規定の培地上、３０℃、１０日間培養後のＭＣＩ  ２９５６株の性状を以下の第１表に示した。
【００１０】
【表１】
0003754785.tif 000004
【００１１】
３．生理学的性質
ＭＣＩ  ２９５６株の生理学的性質を以下に示した。
（１）生育温度範囲                      ２０〜４０℃
（２）ゼラチンの液化                        陰性
（３）スターチの加水分解                    陰性
（４）スキムミルクの凝固、ペプトン化        陰性
（５）メラニン様色素の生成                  陰性
（６）炭素源の利用（プリドハム・ゴトリーブ寒天培地上で３０℃、１４日間培養）
ＭＣＩ  ２９５６株は炭素源無添加の対照培地でも若干の生育が見られたため、対照を−とした相対的な資化性を第２表に示した。
【００１２】
【表２】
0003754785.tif 000005
【００１３】
４．化学分類学的性質
ＭＣＩ  ２９５６株の化学分類学的性質を第３表に示した。
【００１４】
【表３】
0003754785.tif 000006
【００１５】
５．分類学的考察
ＭＣＩ  ２９５６株はセルサイクル（ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ）に多形性を示す。培養初期に細胞は分枝した菌糸状に伸張し、経時的に分断し短桿状〜桿状になる。また、細胞壁にｍｅｓｏ−ジアミノピメリン酸を有し、全菌体糖にアラビノース及びガラクトースを含むことから細胞壁タイプはIV型であることが判明した。更に細胞壁ペプチドグリカンのＮ−アシル型はグリコリル型であった。これらの特徴から本菌株はノカルディア科（Ｎｏｃａｒｄｉａｃｅａｅ）或いはミコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属することが示唆された。これらの菌群は細胞壁にミコール酸（α位に長鎖アルキル基を有するβ−ハイドロキシ脂肪酸）を持つことが大きな特徴として知られており、その他の化学分類学的特徴によって属の定義が明確に行われている。
【００１６】
そこで本菌株とプロオカリオート〔Ｔｈｅ  Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ〕第２判（１９９２）、第２巻、１１８０〜１２７０頁に記載されているノカルディア科及びミコバクテリウム属の化学分類学的特徴を比較し属レベルの同定を行った。本菌株とノカルディア科に属する菌群及びミコバクテリウム属の形態及び化学分類学的特徴を比較し、第４表に示した。本菌株は培養初期に細胞が伸張し分枝した菌糸状になる。また、メナキノンＭＫ−８ (Ｈ2 ）を有し、ミコール酸の炭素数は４４〜５０、ＤＮＡ中のＧ＋Ｃ含量は６９．０％であった。表に示したようにこれらの特徴はロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属の特徴によく合致した。
従って、本菌株ＭＣＩ  ２９５６をロドコッカス  エスピー（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）と同定した。
【００１７】
【表４】
0003754785.tif 000007
【００１８】
本発明の製造方法においては、上記微生物の１種或いは２種以上が菌体及び／又は菌体調製物として用いられる。具体的には、上記微生物を培養して得られた菌体をそのまま、或いは培養して得られた菌体を公知の手法で処理して得られる調製物、即ち、アセトン処理したもの、凍結乾燥処理したもの、菌体を物理的又は酵素的に破砕したもの等の菌体調製物を用いることができる。また、これらの菌体又は菌体調製物から、上記一般式（Ｉ）で表されるニコチン酸誘導体又は２−ピラジンカルボン酸誘導体のカルボキシル基に作用しこれを脱炭酸及び水酸化して一般式（II）で表される３−ヒドロキシ含窒素六員環化合物へ変換する能力を有する酵素画分を粗製物或いは精製物として取り出して用いることも可能である。更には、このようにして得られた菌体、菌体調製物、酵素画分等をポリアクリルアミドゲル、カラギーナンゲル等の担体に固定化したもの等を用いることも可能である。そこで本明細書において、「菌体及び／又は該菌体調製物」の用語は、上述の菌体、菌体調製物、酵素画分、及びそれらの固定化物全てを含有する概念として用いられる。
【００１９】
次に、本発明の製造方法について具体的に説明する。
本発明の製造方法において微生物は、通常、培養して用いられるが、この培養については定法通り行うことができる。本微生物の培養の為に用いられる培地には本微生物が資化しうる炭素源、窒素源、及び無機イオン等が含まれる。炭素源としては、グルコース等の炭水化物、グリセロール等のアルコール類、有機酸その他が適宜使用される。窒素源としては、ＮＺアミン、トリプトース、酵母エキス、ポリペプトンその他が適宜使用される。無機イオンとしては、リン酸イオン、マグネシウムイオン、鉄イオン、マンガンイオン、モリブデンイオンその他が必要に応じ適宜使用される。更に、イノシトール、パルトテン酸、ニコチン酸アミドその他のビタミン類を必要に応じ添加することは有効である。培養は、好気的条件下に、ｐＨ約６〜８、温度約２０〜３５℃の適当な範囲に制御しつつ１５〜１００時間行う。
【００２０】
上記一般式（Ｉ）で表されるニコチン酸誘導体又は２−ピラジンカルボン酸誘導体に上記微生物を作用させて３−ヒドロキシ含窒素六員環化合物を製造する方法として、本微生物を培養し、得られた菌体懸濁液に上記一般式（Ｉ）で表されるニコチン酸誘導体又は２−ピラジンカルボン酸誘導体を添加し反応させ３−ヒドロキシ含窒素六員環化合物を得る方法、培地に上記一般式（Ｉ）で表されるニコチン酸誘導体又は２−ピラジンカルボン酸誘導体を添加し培養と反応を同時に行う方法、或いは培養終了後、上記一般式（Ｉ）で表されるニコチン酸誘導体又は２−ピラジンカルボン酸誘導体を添加して更に反応を行う方法等を用いることができる。反応温度は１５〜４０℃が好ましく、ｐＨ５〜１０の範囲である。上記一般式（Ｉ）で表されるニコチン酸誘導体又は２−ピラジンカルボン酸誘導体濃度は０．１〜１０％の範囲が望ましく、必要ならば上記一般式（Ｉ）で表されるニコチン酸誘導体又は２−ピラジンカルボン酸誘導体は反応の間、追補添加される。また、必要に応じて金属イオンを添加することにより反応が促進される場合がある。
培養及び反応で得られた３−ヒドロキシ含窒素六員環化合物の採取方法としては溶媒抽出、クロマトグラフィー等、通常の分離・精製方法により行うことができる。
【００２１】
【実施例】
以下に実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、その要旨を越えない限り本発明の技術分野における通常の変更をすることができる。
【実施例１】
リン酸二カリウム  ３．０ｇ／Ｌ、リン酸一カリウム  １．０ｇ／Ｌ、２−クロロニコチン酸  ４．０ｇ／Ｌ、ソルビトール  １０．０ｇ／Ｌ、ポリペプトン４．０ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム七水和物  ０．５ｇ／Ｌ、硫酸マンガン四〜五水和物  ０．０１ｇ／Ｌ、イノシトール  ２０ｍｇ／Ｌ、ニコチン酸アミド２０ｍｇ／Ｌ、チアミン塩酸塩  ２０ｍｇ／Ｌ、パントテン酸カルシウム  ２０ｍｇ／Ｌ、水（ｐＨ７．０）の組成からなる液体培地４００ｍＬに、ロドコッカス・ロドクラス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）ＡＴＣＣ１４３５０を接種し、３０℃で９６時間好気的に培養した。得た培養液を遠心分離し、菌体を集め５０ｍＭ塩化カリウム水溶液で洗浄した。これに１５ｇ／Ｌのニコチン酸を含む２５ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）を加え、全量を４００ｍＬとし３０℃で好気条件下で２４時間反応させた。反応終了時の３−ヒドロキシピリジン生成蓄積量は０．８５ｇ／Ｌであった。
【００２２】
【実施例２】
リン酸二カリウム  ３．０ｇ／Ｌ、リン酸一カリウム  １．０ｇ／Ｌ、２−クロロニコチン酸  ４．０ｇ／Ｌ、サッカロース  １０．０ｇ／Ｌ、イーストエキス  ４．０ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム七水和物  ０．５ｇ／Ｌ、硫酸マンガン四〜五水和物  ０．０１ｇ／Ｌ、水（ｐＨ７．０）の組成からなる液体培地１００ｍＬに、ロドコッカス・ロドクラス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）ＡＴＣＣ  １９１５０を接種し、３０℃で４８時間好気的に培養した。得た培養液を遠心分離し、菌体を集め５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄した。これに１５ｇ／Ｌニコチン酸を含む２５ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を加え、全量１００ｍＬとし３０℃で好気条件下で２４時間反応させた。反応終了時の３−ヒドロキシピリジン生成蓄積量は０．４１ｇ／Ｌであった。
【００２３】
【実施例３】
使用菌株としてロドコッカス・エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ）ＡＴＣＣ  ２１３２９を用い、実施例２に記載した培養、反応方法を実施した。２４時間後、３−ヒドロキシピリジン生成蓄積量は０．２２ｇ／Ｌであった。
【００２４】
【実施例４】
使用菌株としてロドコッカス・エスピー（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）ＭＣＩ  ２９５６を用い、実施例２に記載した培養、反応方法を実施した。２４時間後、３−ヒドロキシピリジン生成蓄積量は０．２４ｇ／Ｌであった。
【００２５】
【実施例５】
使用菌株としてロドコッカス・エスピー（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）ＩＦＯ  １３１６１を用い、実施例２に記載した培養方法を実施した。得た培養液を遠心分離し、菌体を集め５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄した。これに１５ｇ／Ｌニコチン酸ナトリウム、及び２０ｍＭ硫酸マグネシウム・七水和物を含む２５ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を加え、全量１００ｍＬとし３０℃で好気条件下で２４時間反応させた。２４時間後、３−ヒドロキシピリジン生成蓄積量は０．１４ｇ／Ｌであった。
【００２６】
【実施例６】
リン酸二カリウム  ３．０ｇ／Ｌ、リン酸一カリウム  １．０ｇ／Ｌ、ニコチン酸ナトリウム  ６．０ｇ／Ｌ、ソルビトール  １０．０ｇ／Ｌ、ポリペプトン４．０ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム七水和物  ０．５ｇ／Ｌ、硫酸マンガン四〜五水和物  ０．０１ｇ／Ｌ、水（ｐＨ７．０）の組成からなる液体培地１００ｍＬに、ロドコッカス・ロドクラス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）ＡＴＣＣ  １４３５０を接種し、３０℃で９０時間好気的に培養した。得た培養液を遠心分離し、菌体を集め５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄した。これに１５ｇ／Ｌニコチン酸を含む２５ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）を加え、全量１００ｍＬとし３０℃で好気条件下で２４時間反応させた。反応終了時の３−ヒドロキシピリジン生成蓄積量は０．１１ｇ／Ｌであった。
【００２７】
【発明の効果】
本発明によって、医薬の中間原料として有用である３−ヒドロキシ含窒素六員環化合物を微生物を利用して、ニコチン酸誘導体又は２−ピラジンカルボン酸誘導体から簡便に製造することが可能になった。