(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
２−ケト−Ｌ−グロン酸及び２−ケト−Ｌ−グロン酸のエステルから成る群から選択される化合物を加水分解酵素触媒と接触させてアスコルビン酸を生成することを特徴とする、アスコルビン酸の製造方法。
【請求項２】
該加水分解酵素触媒が、プロテアーゼ、エステラーゼ、リパーゼ及びアミダーゼから成る群から選択される、請求項１の方法。
【請求項３】
該プロテアーゼが、バチルス（Bacillus）属又はアスペルギルス（Aspergillus）属から成る群から選択される属から得られる、請求項２の方法。
【請求項４】
該エステラーゼがブタ肝臓抽出物から得られる、請求項２の方法。
【請求項５】
該リパーゼが、アスペルギルス（Aspergillus）属、ケカビ（Mucor）属、カンジダ（Candida）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、フミコーラ（Humicola）属、クモノスカビ（Rhizopus）属、クロモバクテリウム（Chromobacterium）属、アルカリゲネス（Alcaligenes）属、ゲオトリクム（Geotricum）属及びペニシリウム（Penicillium）属から成る群から選択される属から得られる、請求項２の方法。
【請求項６】
該リパーゼが、配列番号：３に示す配列を有するCandida Antartica Ｂ型リパーゼである、請求項５の方法。
【請求項７】
該アミダーゼがペニシリウム（Penicillium）属から得られる、請求項２の方法。
【請求項８】
該加水分解酵素触媒が活性部位セリン残基を含有する、請求項１の方法。
【請求項９】
さらに、該化合物を該加水分解酵素触媒と接触させる前に、水、Ｃ1〜Ｃ6アルコール又はそれらの混合物から選ばれた溶媒を用いて該化合物の溶液を形成させ、そして該化合物を該加水分解酵素触媒とｐＨ１．５〜１０及び温度５℃〜１２０℃の範囲内で接触させる、請求項１の方法。
【請求項１０】
該化合物を該加水分解酵素触媒と接触させる前に、該加水分解酵素触媒をin vivoで宿主生物から自然発現させる、請求項１の方法。
【請求項１１】
該化合物を該加水分解酵素触媒と接触させる前に、該加水分解酵素触媒をコードする遺伝子配列を宿主生物中に挿入し、そして該宿主生物を培養することによりin vivoで該加水分解酵素触媒を発現させる、請求項１の方法。
【請求項１２】
（ａ）２−ケト−Ｌ−グロン酸と、生成する２−ケト−Ｌ−グロン酸のエステルのアルキル部分に対応するアルコールとのアルコール性溶液を調製し、そして
（ｂ）該溶液中の２−ケト−Ｌ−グロン酸を加水分解酵素触媒と接触させて２−ケト−Ｌ−グロン酸のエステルを生成する
工程を含む、２−ケト−Ｌ−グロン酸のエステルの製造方法。
【請求項１３】
（ａ）２−ケト−Ｌ−グロン酸の一次エステルと、生成する２−ケト−Ｌ−グロン酸の二次エステルのアルキル部分に対応するアルコールとのアルコール性溶液を調製し、そして
（ｂ）該溶液中の２−ケト−Ｌ−グロン酸の一次エステルを加水分解酵素触媒と接触させて２−ケト−Ｌ−グロン酸の二次エステルを生成する
工程を含む、２−ケト−Ｌ−グロン酸のエステルの製造方法。
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は、アスコルビン酸、２−ケト−Ｌ−グロン酸（ＫＬＧ）及びＫＬＧのエステルの製造方法に関する。さらに、本発明はアスコルビン酸、ＫＬＧ又はＫＬＧのエステルの製造における酵素触媒の使用に関する。
発明の背景
ビタミンＣとしても公知のアスコルビン酸は、壊血病を防止するためにヒトの食事中に存在しなければならない、そして感染に対する抵抗力を増大する薬剤として確認されている食物因子である。アスコルビン酸は、例えば食肉及びその他の食品中の栄養補足剤、色止剤、風味剤及び防腐剤、パン生地中の酸化体、収穫時の柑橘類果実の離層酸、及び分析化学における還元剤として、商業的に用いられる。
アスコルビン酸の製造のための最新の一方法は、Reichstein-Grossner合成（Reichstein et al., Helv. Chim. Acta, 17:311（1934）；米国特許第２，３０１，８１１号（Reichstein）。これらの記載内容は全て、参照により本明細書中に含まれる）の変法を利用する。この方法では、グルコース供給源はアスコルビン酸に変換される。変換中に、ＫＬＧのジアセトニドの中間体が生成される。
いくつかの二段階法が、アスコルビン酸の製造のために存在する。第一段階では、グルコースが発酵工程を経てＫＬＧの単離中間体（Sonoyama et al., Applied and Envil. Microbiology, 43:1064-1069（1982）；Anderson et al., Science, 230:144-149（1985）;Shinjoh et al., Applied and Envtl. Microbiology, 61:413-420（1995））又はReichstein-Grossner合成の中間体であるＫＬＧのジアセトニドに変換される。
中間体のいずれかをアスコルビン酸に変換する第二段階は、２つの報告された経路のうちの１つにより進行する。第一の経路、即ちReichstein-Grossner合成の後期工程の変法は、中間体を強酸性条件下でメタノールでエステル化してメチル−２−ケト−Ｌ−グロネート（ＭｅＫＬＧ）を生成する多数の工程を必要とする。ＭｅＫＬＧを次に塩基と反応させて金属アスコルビン酸塩を生成する。最後に、金属アスコルビン酸塩を酸性化体で処理して、アスコルビン酸を得る。第二の経路は、元々英国特許第４６６５４８号（Reichstein）に開示され、後にYamazaki（Yamazaki, J. Agri. Chem. Soc. Japan, 28:890-894（1954）及びChem. Abs., 50:5992d）により、そしてさらにYodice（ＷＯ  ８７／００８３９）によって修正されたような、ＫＬＧの酸触媒性環化から成る一工程法である。Yodice法は、多量の塩化水素ガスを使用し、非常に高価な工程装備を要し、そして大規模な精製を要するアスコルビン酸生成物を生成するために、商業的に望ましくない。
加水分解酵素の一群であるリパーゼは、有機酸のエステルの合成に用いられて何らかの成功を収めている。特に、リパーゼは、例えば酢酸ビニルがエステル化剤として用いられる場合のようにエステル化剤が不可逆性であるアルコールのエステル交換反応に用いられてきた（Thiel, Catalysis Today, 517-536（1994））。Gutman等（Tetrahedron Lett., 28:3864（1987））は、触媒としてブタ膵臓リパーゼを用いたガンマヒドロキシメチルエステルからの簡単な５員環ラクトンの製造方法を記載している。しかしながら、Gutman等（Tetrahedron Lett., 28:3861-5367-5368（1987））は後に、ガンマヒドロキシメチルエステルをデルタヒドロキシメチルエステルに代え、そしてポリマーだけを生成する同一触媒を用いることを報告した。欧州特許第０５１５６９４  Ａ１号（Sakashita等）では、第一ヒドロキシル基上でアシル化されるアスコルビン酸のエステルの合成は、リパーゼの存在下で、極性有機溶媒中でアスコルビン酸を種々の脂肪酸活性エステル（即ち、脂肪酸ビニルエステル）と反応させることを包含する。
したがって、（ａ）ＫＬＧ又はＫＬＧのエステルからアスコルビン酸又はその金属塩を、（ｂ）ＫＬＧのエステルからＫＬＧを、そして（ｃ）ＫＬＧからＫＬＧのエステルを製造する方法であって、高収率及び高純度で且つ副産物がほとんど又は全く生成されず、そして穏やかな条件下で実行される方法が、当業界で必要である。したがって、本発明は主に前記事項に向けられる。
発明の要約
本発明は、アスコルビン酸の製造方法がＫＬＧ及びＫＬＧのエステルを加水分解酵素触媒と接触させることを包含する化学的及び生物学的業界における進歩を開示する。
本発明の別の実施態様では、ＫＬＧの製造方法が、水性溶液中のＫＬＧのエステルを加水分解酵素触媒と接触させることを包含する。
本発明のさらに別の実施態様では、ＫＬＧからのＫＬＧエステルの製造方法は、ＫＬＧのアルコール溶液を加水分解酵素触媒と接触させることを包含する。アルコール溶液は、調製されるＫＬＧのエステルのアルキル部分に対応するアルコールを含有する。
本発明のさらに別の実施態様では、ＫＬＧのエステルからのＫＬＧのエステルの製造方法は、ＫＬＧの一次エステルのアルコール溶液を加水分解酵素触媒と接触させることを包含する。アルコール溶液は、調製されるＫＬＧの二次エステルのアルキル部分に対応するアルコールを含有する。
発明の詳細な説明
本発明は、アスコルビン酸が、触媒として加水分解酵素を用いて、ＫＬＧ又はＫＬＧのエステルの閉環を誘導することにより、ＫＬＧ又は、好ましくはＫＬＧのエステルから生成される、という予期せぬ発見に向けられる。アスコルビン酸の製造方法は、溶融液中で、又は溶液中で実行される。本方法はさらに、in vivo又はin vitroで実行し得る。in vivo法に関しては、加水分解酵素触媒は宿主細胞内に自然に存在するか、又は組換えＤＮＡ法により宿主細胞又は生物体内に導入される。
本発明はさらに、ＫＬＧが、触媒として加水分解酵素を用いて水性溶液中でＫＬＧのエステルを反応させることによる可逆的反応で調製され得る、という予期せぬ発見に向けられる。さらに本発明は、ＫＬＧのエステルが、触媒として加水分解酵素を用いてアルコール溶液中でＫＬＧ又はＫＬＧの別のエステルを反応させることにより調製され得る、という予期せぬ発見に向けられる。溶液を調製するために用いられるアルコールは、調製されるＫＬＧのエステルのアルキル部分に対応する。
本発明の方法で触媒として用いるための加水分解酵素は、あらゆる適切な供給源生物から得られるか又は単離される。その例としては、植物、微生物及び動物、例えば酵母菌、細菌、糸状菌類、真菌類、鳥類、爬虫類、魚類、及び哺乳類が挙げられるが、これらに限定されない。本発明のための加水分解酵素は、Enzyme Nomenclature（Academic Press, 1992）に定義されているように酵素クラスＥ．Ｃ．３．−．−．−で一般に明示され、市販されている。
好ましい加水分解酵素は、カルボニル又はホスフェート基を含有する分子の加水分解を実行し得るものである。さらに好ましい加水分解酵素は、異種原子単一結合を保有するカルボニル炭素で加水分解を実行し得る。異種原子単一結合を保有するこのようなカルボニル炭素の例としては、エステル、チオエステル、アミド、酸、酸ハロゲン化物等が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい加水分解酵素としては、エステル結合で作用する加水分解酵素を含む酵素クラスＥ．Ｃ．．３．１．−．−．の酵素、例えばエステラーゼ及びリパーゼ；酵素クラスＥ．Ｃ．３．２．−．−．の酵素、例えばグリコシダーゼ加水分解酵素；酵素クラスＥ．Ｃ．３．４．−．−．の酵素、例えばペプチド加水分解酵素、例えばプロテアーゼ；並びに酵素クラスＥ．Ｃ．３．５．−．−の酵素、例えばペプチド結合以外の結合で作用するアミダーゼが挙げられる。最も好ましい加水分解酵素としては、プロテアーゼ、アミダーゼ、リパーゼ及びエステラーゼが挙げられる。
さらに好ましい加水分解酵素は、ＫＬＧ又はＫＬＧのエステルとのエステル化又はエステル交換を受け得る活性部位セリン残基を含有する。さらに好ましいのは、セリン、ヒスチジン及びアスパラギン酸の触媒三つ組を含有する加水分解酵素である。
好ましいプロテアーゼとしては、バチルス属又はアスペルギルス属の細菌から得られるものが挙げられる。特に好ましいプロテアーゼは、バチルス属の細菌であるBacillus licheniformisから得られるものである。好ましいプロテアーゼは、サブチリシンと少なくとも７０％の配列相同性を有するものである。サブチリシンとの配列相同性を有するプロテアーゼは洗剤産業に用いられ、したがって容易に入手可能である。さらに好ましいのは、サブチリシンと少なくとも８０％の配列相同性を有するプロテアーゼであり、もっと好ましいのはサブチリシンと少なくとも９０％の配列相同性を有するプロテアーゼで、特に少なくとも９５％の配列相同性を有するものである。非常に好ましいプロテアーゼは、Smith等（J. Biol. Chem., 243:2184-2191）（1968）が記載したアミノ酸配列（配列番号：１）を有するサブチリシンそれ自体であって、その配列を以下に示す：
0003759621.tif 000002
読者に便利なように、表１に前記並びに後述の明細書中で用いられるアミノ酸速記法の要約を示す。
0003759621.tif 000003
前記の配列の１〜６つの部位特異的突然変異体、配列付加及び配列欠失に対応するプロテアーゼも本発明の範囲に含まれる。前記のサブチリシン配列の０〜２つの特定部位の突然変異体に対応するプロテアーゼがさらに好ましい。
本発明に適したエステラーゼとしては、ブタ肝臓抽出物から得られるものが挙げられる。好ましいエステラーゼは、Matsushima等（FEBS Lett., 293:37（1991））が記載したアミノ酸配列（配列番号：２）を有するブタ肝臓エステラーゼと少なくとも７０％の配列相同性を有するものであって、その配列を以下に示す：
0003759621.tif 000004
エステラーゼは、さらに好ましくは、前記のブタ肝臓エステラーゼの配列と少なくとも８０％の相同性を有し、もっと好ましくは少なくとも９０％の、特に好ましくは少なくとも９５％の配列相同性を有する。非常に好ましいのは、前記配列を有するブタ肝臓エステラーゼである。
前記の配列の１〜６つの部位特異的突然変異体、配列付加及び配列欠失に対応するエステラーゼも本発明の範囲に含まれる。前記のブタ肝臓エステラーゼ配列の０〜２つの特定部位の突然変異体に対応するエステラーゼがさらに好ましい。
好ましいリパーゼとしては、ブタ及びその他の哺乳類、微生物及び植物から単離されるリパーゼが挙げられる。この例としては、アスペルギルス属、ケカビ属、カンジダ属、シュードモナス属、Humicola属、クモノスカビ属、クロモバクテリウ属、アルカリゲネス属、ゲオトリクム属及びペニシリウム属から得られるリパーゼが挙げられるが、これらに限定されない。好ましいリパーゼとしてはさらに、細胞外リパーゼ、例えばクチナーゼも挙げられる。さらに好ましいリパーゼは、Candida Antartica Ｂ型リパーゼと、少なくとも７０％の配列相同性を有し、より好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも９０％、もっと好ましくは少なくとも９５％の配列相同性を有する。非常に好ましいリパーゼは、Uppenberg等（Structure, 2:293, 453（1994））が記載したアミノ酸配列（配列番号：３）を有するCandida Antartica Ｂ型リパーゼそれ自体であって、その配列を以下に示す：
0003759621.tif 000005
前記の配列の１〜６つの部位特異的突然変異体、配列付加及び配列欠失に対応するリパーゼも本発明の範囲に含まれる。前記のCandida Antartica Ｂ型リパーゼ配列の０〜２つの特定部位の突然変異体に対応するリパーゼがさらに好ましい。
好ましいアミダーゼとしては、ペニシリウム属の細菌から単離されたものが挙げられる。さらに好ましいアミダーゼは、Penicillin acylaseと少なくとも８０％の配列相同性を有する。特に好ましいアミダーゼは、Penisillin amidohydrolase, Ｅ．Ｃ．３．５．１．１１（Duggleby et al., Nature, 373:264-266（1995））とも呼ばれれるPenicillin acylaseである。
その活性部位にセリンを含有する加水分解酵素に関しては、ＫＬＧ又はＫＬＧのエステルの反応の第一工程は、活性部位のセリンのＫＬＧによるアシル化を経てＫＬＧ−酵素エステルが生成されることを包含すると考えられる。分子内閉環はアスコルビン酸（又はその塩）を産生するが、一方アルコーリシスはＫＬＧのエステルを生じ、加水分解はＫＬＧを生じると考えられる。
本発明の方法は、ＫＬＧ又はＫＬＧのエステルを加水分解酵素と接触させてアスコルビン酸を生成することを包含する。好ましくは、この反応は、有機溶媒系、水性溶媒系又はその混合物の存在下で実行される。有機溶媒は、好ましくはＣ1〜Ｃ6アルコールである。アスコルビン酸、ＫＬＧ及びＫＬＧのエステルは一般に水性溶媒系により可溶性であるために、水性溶媒系又は水性及び有機溶媒混合系がより好ましい。ＫＬＧのエステルからのアスコルビン酸のin vitro生成に関しては、副産物としてＫＬＧを生成し得る競合する加水分解反応を最小限にするために、水性及び有機溶媒混合系又は有機溶媒系が選択される。水性溶媒系は、in vivoでのアスコルビン酸の生成のために全細胞系を利用する場合に、特に選択される。
本発明の一局面では、アスコルビン酸は、加水分解酵素触媒の存在下で、in vivoの全細胞及び全生物生成系で、ＫＬＧ又はＫＬＧのエステルから生成される。一実施態様では、加水分解酵素は宿主生物により自然に産生される。別の実施態様では、加水分解酵素は、組換えＤＮＡ技術により宿主生物が産生する。例えば、加水分解酵素をコードする遺伝子配列が、加水分解酵素を発現し得る宿主生物中に挿入され、この場合、宿主生物は微生物、植物又は動物である。加水分解酵素を産生する宿主生物は、ＫＬＧ又はＫＬＧのエステルの存在下で培養され、即ち、生長のための養分及び適切な環境を提供されて、アスコルビン酸を生成する。好ましくは、宿主生物は、米国特許第５，００８，１９３号（Anderson等）に開示されているように従来はErwinia herbicolaと呼ばれたPantoea citreaである。
さらに好ましくは、宿主生物は、加水分解酵素を産生するほかに、ＫＬＧを産生するものである。代表的生物は、例えばPantoea属又はShinjoh等（Applied and Envtl. Microbiology, 61:413-420（1995））が開示したようなグルコノバクター属、及びShinjoh等（Applied and Envtl. Microbiology, 43:1064-1069（1995））が開示したようなコリネバクテリウム属からである。
本明細書中で用いる場合、組換えＤＮＡ技術はin vitro組換えＤＮＡ技術、合成技術及びin vivo組換え体／遺伝子組換えを含み、当業界で十分公知である（例えば、Maniatis et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y.（1989）；Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience, N.Y.（1989）；Anderson et al., Science, 230:144-149（1985）:及び米国特許第５，４４１，８８２号（Estell等）に記載された技術を参照）。
ＫＬＧのエステルからＫＬＧを調製するには、ＫＬＧのエステルの水性溶液を加水分解酵素と反応させる。補助溶媒がＫＬＧの調製には用いられ、それは好ましくはＣ1〜Ｃ6アルコールである。
ＫＬＧからの又はＫＬＧの他のエステルからのＫＬＧの調製に関しては、出発物質はアルコール性溶液中に存在し、この場合、アルコールが調整されるＫＬＧのエステルのアルキル部分に対応する。ＫＬＧの好ましいエステルが得られるアルコール  ＲＯＨのアルキル部分Ｒは、分枝鎖又は直鎖の飽和又は不飽和アルキル、アリールアルキル、アリール及び置換アリールから選択される。好ましいＲ基としては、Ｃ1〜Ｃ6直鎖又は分枝鎖の飽和又は不飽和アルキルが挙げられる。アルキル部分に関して得られるさらに好ましいＫＬＧのエステルとしては、ＭｅＫＬＧ、エチル−ＫＬＧ、ｎ−プロピル−ＫＬＧ、イソプロピル−ＫＬＧ、ｎ−ブチル−ＫＬＧ、イソブチル−ＫＬＧ、ｔ−ブチル−ＫＬＧ及びｎ−ペンチル−ＫＬＧが挙げられる。生成される最も好ましいＫＬＧのエステルは、その製造容易性によりＭｅＫＬＧ、そして水中除去におけるブタノール水共沸混合物の有益な使用によりブチル−ＫＬＧである。補助溶媒は、ＫＬＧのエステルの調製に用いられ、それは、好ましくは水、Ｃ1〜Ｃ6アルコール又はその混合物である。
本発明の反応を実行するための好ましい温度は、５℃〜１２０℃である。さらに好ましい温度は２５℃〜１００℃、特に好ましい温度は３８℃〜８０℃である。
本発明の工程のために好ましいｐＨは、１．５〜１０、さらに好ましいｐＨは３〜１０である。ＫＬＧのエステルからのアスコルビン酸塩の調製のためには、特に好ましいｐＨ範囲は６〜１０である。遊離酸としてのアスコルビン酸の調製に関しては、好ましいｐＨはアスコルビン酸のｐＫａ以下のｐＨで、さらに好ましいのは４．２以下である。ＫＬＧのエステルからのＫＬＧの調製に関しては、特に好ましいｐＨ範囲は５〜１０である。このｐＨ範囲では、一般的に酵素増強型加水分解の速度が高くなるためである。あるいは、１．５〜２．５のｐＨは、プロトン付加形態のＫＬＧの発生には特に望ましい。最後に、ＫＬＧからのＫＬＧのエステルの調製に関しては、特に好ましい範囲ｐＨ範囲は３〜６である。
加水分解酵素は各々、温度最適条件、ｐＨ最適条件、並びに活性に関連したｐＨ及び温度範囲を有する。したがって、既定の加水分解酵素に適したｐＨ及び温度範囲は、加水分解酵素の活性を可能にし、加水分解酵素を変性又は不活性化する条件を避けるものである。高温又は変性溶媒、例えばメタノール等の使用といった変性させ得る条件に関しては、既定条件下で活性を残存する加水分解酵素を限定するには、最小量の試験が必要である。
以下の実施例で本発明をさらに説明するが、これらは本発明の請求範囲を限定するものではない。
実施例
プロトン及び炭素核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトルを、プロトンモードで３００ＭＨＺ、炭素モードで７５ＭＨＺで操作するVarian Gemini 300 ＮＭＲ計器で記録した。ＮＭＲスペクトルはすべて、テトラメチルシラン（ＴＭＳ）（ｐｐｍ）を基準とし、ピーク周波数は、別記しない限りｐｐｍで記録した。ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）分析を、紫外線（ＵＶ）検出を用いて実施した。質量スペクトル（ＭＳ）は、ＦＤ（フィールドデソープション）モードのAutospec Mass Spectrometer （Fisons VG Analytical Ltd.）を用いて得られた。
実験に使用したＫＬＧは、Lazarus等（Science, 230:144-149（1985））の方法による発酵によって生成し、濃縮及び結晶化により精製した。ＫＬＧは、あるいは、当業界で十分公知の方法によりＬ−ソルボースから化学的変換により調製し得る（例えば、米国特許第２，３０１，８１１号（Reichstein）参照）。下記のブチル−ＫＬＧの調製に用いた手法と同様の方法によるＫＬＧのエステル化により調製される他に、メチル−２−ケト−Ｌ−グロネートの標準液は、Aldrich Chemical Company（Rare and Specialty Chemicals Catalog）から購入された。
加水分解酵素標本は、市販供給元、例えばSigma Chemical Company、Altus Biologics、Recombinant Biocatalysis、Boehringer Mannheim、Novo Nordisk、Genencor International、Thermogen及びFlukaから入手した。
実施例１
本実施例は、ブチル  ２−ケト−Ｌ−グロネートの調製及び精製を記載する。
ＫＬＧ水和物（５１．６２ｇ）をアルゴン下で５００ｍｌ反応容器に入れた。反応器は、Dean Starkとラップに取り付けられた３０．４８ｃｍ（１２“）Vigreuxカラムを装備した。次に、反応器にｎ−ブタノール（３１０ｇ）及びｐ−トルエンスルホン酸（２．３ｇ）を入れた。反応混合物を軽度真空下（約１９．９５ｋＰａ（１５０ｍｍＨｇ））で攪拌しながら還流（８１〜８２℃）させた。還流を総計２時間４０分間保持した。加熱を中止した。反応を冷却させて、室温で約３日間保持した。その結果生じた結晶を粗ガラス濾過器を通して濾過し、２部分のｎ−ブチルアルコール（１３９ｇその後３７ｇ）で洗浄した。その結果生じた固体（２４．４ｇ）を温酢酸エチル（２５０ｍｌ）に溶解し、室温で一夜放置して再結晶化した。再結晶化ブチル−ＫＬＧを濾過により単離し、一定量（１５．９７ｇ）に達するまで真空乾燥（０．１９９５ｋＰａ（１．５ｍｍＨｇ））した。
このようにして調製したブチル−ＫＬＧは、水中で少なくとも５０重量％の溶解度を有し、水中で５０重量％以下の全ての濃度で可溶性であった。本実施例の再結晶化ブチル−ＫＬＧは、満足すべきプロトン及び炭素ＮＭＲスペクトルを有し、フィールドデソープション質量スペクトル測定による予測分子量を示した。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ、デジタル分解能＝０．１１Ｈｚ、半分の高さでのＴＭＳ＝０．５Ｈｚ）：６．４９（ＯＨ，ｄ，Ｊ＝１．４Ｈｚ），４．９６（ＯＨ，ｄ，Ｊ＝５．０Ｈｚ），４．８４（ＯＨ，ｄ，Ｊ＝４．８Ｈｚ），４．７８（ＯＨ，ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ），４．１７−４．０（ｍ，２Ｈ），３．５−３．２（ｍ，約５Ｈ），１．６４−１．５（ｍ，２Ｈ），１．４−１．３５（ｍ，２Ｈ），０．８９（ＣＨ３，ｔ，Ｊ＝７．３）．
１３Ｃ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ，脱カップリング）：１６９．４，  ９６．３，  ７３．８，  ７２．６  ６９．６  ６４．５  ６２．８  ３０．０  １８．４  １３．５．
ＦＤＭＳ：Ｍ＝２５０．
実施例２
以下の手法を用いて、特定ｐＨ及び水性溶媒組成条件下での活性に関して酵素を実証した。
初期酵素スクリーニングを以下のように実行した。酵素（典型的には１０ｍｇ）、水性緩衝液（典型的には８６０μｌ又は５５０μｌ）、水性０．２ＭＣａＣｌ２（１０μｌ）、メタノール（典型的には９０μｌ又は４００μｌ）、及び基質の水性溶液（典型的には９０μｌの１１０，０００ｐｐｍの典型的濃度のブチル−ＫＬＧ）を２ｍｌのポリプロピレン遠心分離管に付加した。その結果生じた溶液を手短にかき混ぜて、３８℃で３００ｒｐｍで振盪浴上に置いた（典型的には１８時間又はそれ以上）。インキュベーション後、試料を１４，０００Ｇ（１４，０００倍重力）で２０分間遠心分離して、酵素を除去し、標本抽出（３００μｌ）して、蒸留水で１ｍｌに希釈した。その日のうちにＨＰＬＣで分析しない場合には、分析前に試料を凍結させた。
ブチル−ＫＬＧ（ＢｕＫＬＧ）と種々の加水分解酵素とを水／メタノール溶液中で反応させた時の生成物（及び残存基質）のＨＰＬＣデータを、以下の表２に要約した。データは、ＫＬＧ、ＭｅＫＬＧ、アスコルビン酸（ＡＳＡ）及びブチル−ＫＬＧについてｐｐｍで報告されている。０（ゼロ）という報告は、存在する物質の量が計器の検出閾値以下であったことを示した。「酵素なし」と標識された試料は、既定作業内の対照であった。対照は基質は含有したが酵素を含有せず、したがって実験的及びＨＰＬＣバックグラウンドデータを示した。
0003759621.tif 000006
表２は、Recombinant Biocatalysisにより提供された加水分解酵素（ＥＳＬ−００１−０１〜ＥＳＬ−００１−０７）が、５．５〜６の制御ｐＨで、モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）ヘミナトリウム塩で緩衝した３８％メタノール−水溶液中で、ブチル−ＫＬＧのアスコルビン酸、ＭｅＫＬＧ及びＫＬＧへの評価可能な変換を示したことを説明する。これらの加水分解酵素は、クローンザイムCloneZyme（商標）の商品名で好熱性生物からの組換えエステラーゼ及びリパーゼとしてRecombinant Biocatalysisから市販されている。
実施例３
下記の表３は、種々のアシラーゼ、エステラーゼ、リパーゼ及びプロテアーゼがＭＥＳ緩衝液でｐＨ４．８〜５．８に緩衝された３８％メタノール−水溶液中でのブチル−ＫＬＧのアスコルビン酸、ＭｅＫＬＧ及びＫＬＧへの評価可能な変換を示したことを説明する。ChiroClec（商標）と標識された酵素は、Altus Biologicsから市販されている結晶架橋酵素である。ChiroClec−ＣＲはCandida rugosaからのリパーゼであり、ChiroClec−ＰＣはPseudomonas cepaciaからのリパーゼである。Candida Antartica Ｂ（リパーゼ）、ブタ肝臓エラステラーゼ（加水分解酵素）及びバチルス種プロテアーゼは特に高レベルの活性を示した。
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実施例４
下記の表４は、種々のアシラーゼ、エステラーゼ、リパーゼ及びプロテアーゼがＭＥＳ緩衝液でｐＨ５〜５．８に緩衝された３８％メタノール−水溶液中でのブチル−ＫＬＧのアスコルビン酸、ＭｅＫＬＧ及びＫＬＧへの評価可能な変換を示したことを説明する。ブタ肝臓エステラーゼ、Subtillisin Carlsberg（プロテアーゼ）、バチルス種プロテアーゼ、ChiroClec−ＢＬ及びCandida Antartica  Ｂ  リパーゼはすべて、特に高レベルの活性を示した。
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実施例５
下記の表５は、種々のリパーゼ及びプロテアーゼがＭＥＳ緩衝液でｐＨ５．７〜６．１に緩衝された３８％メタノール−水溶液中でのブチル−ＫＬＧのアスコルビン酸、ＭｅＫＬＧ及びＫＬＧへの評価可能な変換を示したことを説明する。この表中の他の酵素と比較して、プロザイム  ６（Aspergillus oryzaeからのプロテアーゼ）、プロテアーゼ  ２Ａ（Aspergillus oryzaeから）及びＧＣ８９９（Genencor Internationalからの市販洗剤プロテアーゼ）は、高レベルの活性を示した。
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実施例６
下記の表６は、種々のリパーゼ及びプロテアーゼがＭＥＳ緩衝液でｐＨ５．３〜６に緩衝された８．６％メタノール−水溶液中でのブチル−ＫＬＧのアスコルビン酸、ＭｅＫＬＧ及びＫＬＧへの評価可能な変換を示したことを説明する。プロテアーゼ  Ｍ（Aspergillus oryzae）、プロザイム  ６（Aspergillus oryzaeからのプロテアーゼ）、プロテアーゼ  Ｎ（Subtilisin）及びプロテアーゼ２Ａ（Aspergillus oryzae）は、特に高レベルの活性を示した。
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実施例７
下記の表７は、種々のアシラーゼ、エステラーゼ、リパーゼ及びプロテアーゼがＭＥＳ緩衝液でｐＨ５〜６に緩衝された８．６％メタノール−水溶液中でのブチル−ＫＬＧのアスコルビン酸、ＭｅＫＬＧ及びＫＬＧへの評価可能な変換を示したことを説明する。Candida Antartica Ｂ  リパーゼ、ブタ肝臓エステラーゼ及びバチルス種プロテアーゼは、特に高レベルの活性を示した。
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実施例８
下記の表８は、種々のアシラーゼ、エステラーゼ、リパーゼ及びプロテアーゼがＭＥＳ緩衝液でｐＨ約５．８〜６．２に緩衝された８．６％メタノール−水溶液中でのブチル−ＫＬＧのアスコルビン酸、ＭｅＫＬＧ及びＫＬＧへの評価可能な変換を示したことを説明する。ブタ肝臓エステラーゼ、Candida Antartica  Ｂ  リパーゼ、バチルス種プロテアーゼ及び軽度架橋サブチリシン（ChiroClec−ＢＬ）は特に高レベルの活性を示した。
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実施例９
表９は、前記実施例で高活性酵素に関して検出された活性の統計学的際限を実証する。特に高レベルの活性を示すと確認された前記実施例からの８つの酵素を、厳重なｐＨ制御下で比較した。前に確認された高レベル活性を有する酵素はすべて、再分析でもこの高レベル活性を保持した。酵素は、０．２Ｍ  ＭＥＳ緩衝液でｐＨ約５．６〜６に緩衝された８．６％メタノール−水溶液中でのブチル−ＫＬＧのアスコルビン酸、ＭｅＫＬＧ及びＫＬＧへの評価可能な変換を示した。Candida Antartica  Ｂ  リパーゼ、ブタ肝臓エステラーゼ及びバチルス種プロテアーゼは、この比較実施例の中で特に高レベルの活性を示した。ブタ肝臓エステラーゼは、エステル交換に対する選択性並びにアスコルビン酸への有意の変換を示した。
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実施例１０
下記の表１０は実施例９と同一酵素を比較したが、但しより高濃度の有機溶媒を用いた。Candida Antartica  Ｂ及びバチルス種プロテアーゼは、この比較実施例の中で特に高レベルの活性を示した。この場合、それらは０．２Ｍ  ＭＥＳ緩衝液でｐＨ約５．６〜６．２に緩衝された３８％メタノール−水溶液中でのブチル−ＫＬＧのアスコルビン酸、ＭｅＫＬＧ及びＫＬＧへの評価可能な変換を示した。依然として評価可能であるが、しかしブタ肝臓エステラーゼに関しては、実施例９で示されたものに対して活性低減が観察された。
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実施例１１
下記の表１１は実施例９と同一酵素を比較したが、但し緩衝ｐＨは約５．２であった。Candida Antartica  Ｂ及びブタ肝臓エステラーゼは、特に高レベルの活性を示した。この場合、それらは０．２Ｍ  ピリジン／塩酸ピリジニウム緩衝液でｐＨ約４．９〜５．３に緩衝された８．６％メタノール−水溶液中でのブチル−ＫＬＧのＭｅＫＬＧ及びＫＬＧへの評価可能な変換を示した。依然として評価可能であるが、しかしバチルス種プロテアーゼに関しては、実施例９に対して活性低減が観察された。
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実施例１２
下記の表１２は実施例１１と同一酵素を比較したが、但しより高濃度の有機溶媒を用いた。Candida Antartica  Ｂは特に高レベルの活性を示した。この場合、それらは０．２Ｍ  ピリジン／塩酸ピリジニウム緩衝液でｐＨ約４．７〜５．１に緩衝された３８％メタノール−水溶液中でのブチル−ＫＬＧのＭｅＫＬＧ及びＫＬＧへの評価可能な変換を示した。酵素はすべて、実施例９及び１１に対して活性低減を示した。
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実施例１３
下記の表１３は実施例９及び１１と同一酵素を比較したが、但し緩衝ｐＨは約２．３であった。０．２Ｍ  リン酸緩衝液でｐＨ約２．３〜２．７に緩衝された８．６％メタノール−水溶液中でのブチル−ＫＬＧのアスコルビン酸、ＭｅＫＬＧ及びＫＬＧへの評価可能な変換に関して、試験した酵素はすべて、実施例９及び１１に対して活性低減を示した。
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実施例１４
下記の表１４は、ＫＬＧのメチルＫＬＧ（ＭｅＫＬＧ）へのエステル化を触媒する能力、又はＫＬＧのアスコルビン酸への閉環を触媒する能力において、緩衝ｐＨ約６で、実施例９及び１１の最初の５つの酵素を比較した。実施例９及び１１に対して低レベルの活性が観察された。
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実施例１５
下記の表１５は、ｐＨ３〜３．２の８．６％水性メタノール中での触媒としてCandida Antartica Ｂリパーゼを用いたＫＬＧからのＭｅＫＬＧの生成を実証する。緩衝液は、ＫＬＧとそのナトリウム塩との混合物（約１／９）として選択された。最初の３つの記載項目は酵素触媒を含み、３つとも同一条件である。二番目の３つの記載項目も３つあるが、但し酵素は存在しなかった。最初の３つの項目は、Candida AntarticaＢリパーゼの存在下でＫＬＧのＭｅＫＬＧへの有意のエステル化を示す。第二の３項目は、Candida AntarticaＢリパーゼの非存在下では変換が進行しないことを実証する。
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実施例１６
本実施例は、ＨＰＬＣ分析の条件下でのアスコルビン酸のゆっくりした分解を実証する。ＫＬＧ、ＭｅＫＬＧ、アスコルビン酸（ＡＳＡ）及びブチル−ＫＬＧを水中に適切な濃度で溶解することにより、ＨＰＬＣ試料標準液を調製した。これら標準液の試料を充填密封バイアル中に入れ、室温で保存して、定期的に分析した。ＨＰＬＣを、標準液の調整後できるだけ早くＨＰＬＣ上に注入した標準液に対して反応性の面積で度盛りした。下記の表１６は、試料調製後０時間（度盛り時間）、約６．５時間及び約１２時間目の、５０、１００及び５００ｐｐｍのＫＬＧ、ＭｅＫＬＧ、アスコルビン酸及びブチル−ＫＬＧに関して記録された反応を示す。
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アスコルビン酸反応は、他の標準液に関して、特に１００ｐｐｍ又はそれ未満の標準液に関して、時間中、非線状であった。実施例２〜１６に関する処置がＨＰＬＣ分析前に振盪浴上で約１６時間又はそれ以上の場合、生成されたアスコルビン酸の実際レベルは報告されたものより多かった。
特に好ましい実施態様を参照しながら本発明を詳細に説明してきたが、本発明の精神及び範囲を逸脱しない限り、変更及び修正がなされ得ると理解される。
配列表
一般的資料
出願人： Hubbs, John C.
発明の名称：  アスコルビン酸、２−ケト−Ｌ−グロン酸及び２−ケト−Ｌ−グロン酸のエステルの製造のための酵素的方法
配列数：  ３
住所：
宛先：  イーストマンケミカルカンパニー
番地：  P.O.Box 511
都市名：  キングスポート
州名：  テネシー
国名：  アメリカ合衆国
郵便番号：  ３７６６２−５０７５
コンピューター読み取り形式：
媒体型：  ＊
コンピューター：  ＊
オペレーションシステム：  ＊
ソフトウエア：  ＊
最新出願データ：
出願番号：  ＊
提出日：  ＊
分類：  ＊
前出願データ：
出願番号：  米国特許第６０／０１７，８７９号
提出日：  １９９６年５月１７日
代理人／代理社情報：
名称：  Cheryl J. Tubach
登録番号：  ＊
参考／審理予定番号：  ７０４３２
通信情報：
電話：４２３−２２９−６１８９
テレファックス：  ４２３−２２９−１２３９
配列番号：１
配列の長さ：３７９
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
配列：
0003759621.tif 000023
0003759621.tif 000024
配列番号：２
配列の長さ：５８４
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
配列：
0003759621.tif 000025
0003759621.tif 000026
0003759621.tif 000027
配列番号：３
配列の長さ：３４２
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
配列：
0003759621.tif 000028
0003759621.tif 000029