(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
トリコデルマ（Trichoderma)属に属する微生物に由来し、ｏ−、ｐ−位の少なくとも何れかに塩素原子を有するハロゲン化フェノールをハロゲン化アニソールにＯ−メチル化する反応を触媒する活性を有するハロゲン化フェノール  Ｏ−メチルトランスフェラーゼであって、至適作用温度が４０℃〜５０℃であり、至適ｐＨが８．５付近であり、分子量が約５０，０００であり、さらに、銀、銅、またはニッケルによって阻害されることを特徴とするハロゲン化フェノール  Ｏ−メチルトランスフェラーゼ。
【請求項２】
請求項１記載のハロゲン化フェノール  Ｏ−メチルトランスフェラーゼの製造方法であって、ハロゲン化フェノール  Ｏ−メチルトランスフェラーゼ生産能を有するトリコデルマ（Trichoderma)属に属する微生物を培地で培養し、菌体もしくは培養液からハロゲン化フェノール  Ｏ−メチルトランスフェラーゼを採取することを特徴とするハロゲン化フェノール  Ｏ−メチルトランスフェラーゼの製造方法。
【請求項３】
培地にハロゲン化フェノールを添加することを特徴とする請求項２記載の製造方法。
【請求項４】
培地にトリクロロフェノールを添加することを特徴とする請求項２または３に記載の製造方法。
【請求項５】
ハロゲン化フェノールを含有する木材、木製品または紙を、請求項１記載のハロゲン化フェノール  Ｏ−メチルトランスフェラーゼと接触させ、生成したハロゲン化アニソールを除くことを特徴とする木材、木製品または紙の防臭方法。
【請求項６】
ハロゲン化フェノールを含有する木材、木製品または紙を、銀、銅またはニッケルを含有する化合物と接触させることにより、請求項１記載のハロゲン化フェノール  Ｏ−メチルトランスフェラーゼの活性を阻害することを特徴とする木材、木製品または紙の防臭方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はハロゲン化フェノール  Ｏ−メチルトランスフェラーゼ、その製造方法、および木材、木製品または紙の防臭方法に関する。本発明のハロゲン化フェノール  Ｏ−メチルトランスフェラーゼは、ハロゲン化フェノールをハロゲン化アニソールにＯ−メチル化する反応を触媒する酵素である。本酵素を利用することにより、または本酵素を阻害することにより、ハロゲン化フェノールに起因する紙などの異臭の発生を防止することができる。また本酵素は、発癌性のあるといわれるハロゲン化フェノールを比較的無害なハロゲン化アニソールに変換するために利用することができる。
【０００２】
【従来の技術】
近年になって、木材用抗カビ剤として使用される２，４，６−トリクロロフェノール（以下、ＴＣＰという）などのハロゲン化フェノールを微生物がＯ−メチル化することにより、異臭の原因物質である２，４，６−トリクロロアニソール（以下、ＴＣＡという）などのハロゲン化アニソールが生成することが報告されている（下記反応式を参照）。
【０００３】
【化１】
0003836180.tif 000002
【０００４】
ＴＣＡは、木材および木製品の異臭の原因物質であると共に、木材を出発原料とする段ボールなどの紙製包装資材に製紙工程後もＴＣＰが含まれることがあるため、ＴＣＰがＴＣＡに変換されて異臭を発生する。包装資材から商品への異臭の移行は、商品価値を大きく低下させるため極めて重要な問題となっている。
【０００５】
Ｏ−メチル化に関する酵素の研究により、植物のリグニン合成のヒドロキシ桂皮酸代謝に関与するＯ−メチルトランスフェラーゼ、副腎髄質ホルモンや神経伝達物質の代謝に関与するカテコール  Ｏ−メチルトランスフェラーゼ、フェノールをメチル化するフェノール  Ｏ−メチルトランスフェラーゼなどが報告されている。しかし、ハロゲン化フェノールをメチル化するＯ−メチルトランスフェラーゼはこれまで報告されていない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
ＴＣＰをＴＣＡに変換する酵素を用いれば、段ボールなどの紙製包装資材または木材に含まれているＴＣＰを予めＴＣＡに変換して除去することにより、ＴＣＡによる異臭を防止することができると考えられる。逆に、ＴＣＰをＴＣＡに変換する酵素を阻害することにより、段ボールなどの紙製包装資材または木材でのＴＣＡの発生を抑制し、異臭を防止することができると考えられる。
本発明の目的は、ＴＣＰをＴＣＡに変換する新規なＯ−メチルトランスフェラーゼを提供することにある。
また本発明の目的は、かかる新規な酵素の製造方法を提供することにある。
さらに本発明の目的は、段ボールなどの紙製包装資材、木材または木製品からのＴＣＡによる異臭の発生を防止する方法を提供することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決すべく研究を重ねた結果、ハロゲン化フェノールをハロゲン化アニソールにＯ−メチル化するハロゲン化フェノール  Ｏ−メチルトランスフェラーゼを微生物から単離することに成功した。さらに本発明者らは、ハロゲン化フェノール  Ｏ−メチルトランスフェラーゼを阻害することにより異臭を防止することを見出した。
本発明は、次のものに関する。
（１）  トリコデルマ（Trichoderma)属に属する微生物に由来し、ｏ−、ｐ−位の少なくとも何れかに塩素原子を有するハロゲン化フェノールをハロゲン化アニソールにＯ−メチル化する反応を触媒する活性を有するハロゲン化フェノール  Ｏ−メチルトランスフェラーゼであって、至適作用温度が４０℃〜５０℃であり、至適ｐＨが８．５付近であり、分子量が約５０，０００であり、さらに、銀、銅、またはニッケルによって阻害されることを特徴とするハロゲン化フェノール  Ｏ−メチルトランスフェラーゼ。
（２）  上記（１）に記載のハロゲン化フェノール  Ｏ−メチルトランスフェラーゼの製造方法であって、ハロゲン化フェノール  Ｏ−メチルトランスフェラーゼ生産能を有するトリコデルマ（Trichoderma)属に属する微生物を培地で培養し、菌体もしくは培養液からハロゲン化フェノール  Ｏ−メチルトランスフェラーゼを採取することを特徴とするハロゲン化フェノール  Ｏ−メチルトランスフェラーゼの製造方法。
（３）  培地にハロゲン化フェノールを添加することを特徴とする上記（２）に記載の製造方法。
（４）  培地にトリクロロフェノールを添加することを特徴とする上記（２）または（３）に記載の製造方法。
（５）  ハロゲン化フェノールを含有する木材、木製品または紙を、上記（１）に記載のハロゲン化フェノール  Ｏ−メチルトランスフェラーゼと接触させ、生成したハロゲン化アニソールを除くことを特徴とする木材、木製品または紙の防臭方法。
（６）  ハロゲン化フェノールを含有する木材、木製品または紙を、銀、銅またはニッケルを含有する化合物と接触させることにより、上記（１）に記載のハロゲン化フェノール  Ｏ−メチルトランスフェラーゼの活性を阻害することを特徴とする木材、木製品または紙の防臭方法。
【０００８】
本発明のハロゲン化フェノール  Ｏ−メチルトランスフェラーゼは、微生物の菌体もしくは培養液から得ることができる。本発明で用いる微生物は、ハロゲン化フェノール  Ｏ−メチルトランスフェラーゼを生産しうる微生物であれば、特に限定されない。例えば、トリコデルマ属、アスペルギルス属に属する微生物を使用することができ、好ましくはトリコデルマ・ビルガツム(Trichoderma virgatum)、トリコデルマ・シュウドコニンギ(Trichoderma pseudokoningii)のようなトリコデルマ属に属する微生物が用いられる。具体的な例としては、トリコデルマ・ビルガツム(Trichoderma virgatum)ＡＴＣＣ２４９６１、トリコデルマ・シュウドコニンギ(Trichoderma pseudokoningii)ＡＴＣＣ２６８０１が挙げられる。
【０００９】
本発明の酵素を製造するためには、ハロゲン化フェノール  Ｏ−メチルトランスフェラーゼ生産能を有する微生物を、酵素を生産する通常の方法で培養する。使用する培地としては、使用する菌株が資化しうる炭素源、窒素源、無機物、その他の必要な栄養素を適量含有するものであれば、合成培地、天然培地のいずれも使用できる。
【００１０】
菌株を培養するためには、その菌株の胞子、菌糸あるいは予め培養して得られた前培養液を液体培地に接種し培養する。液体培地の場合に、炭素源としては、グルコース、フラクトース、キシロース、サッカロース、マルトース、可溶性澱粉、糖蜜、グリセロール、マンニトールなどの一般的に使用されるものがいずれも使用できる。窒素源としては、ペプトン、酵母エキス、麦芽エキス、肉エキス、カザミノ酸、大豆粉、コーンスティープリカーなどの天然窒素源、尿素等の有機窒素源、および硝酸ナトリウム、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム等の無機窒素源を用いることができる。この他に必要に応じてリン酸塩、硫酸マグネシウム、硫酸鉄、硫酸銅などの無機塩、およびビタミンなども微量栄養素として使用できる。これらの培地成分は微生物の生育を害しない濃度であれば特に制限はない。一般的に炭素源は０．１〜２０％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．５〜５％（ｗ／ｖ）、窒素源は０．０１〜５％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．１〜２％（ｗ／ｖ）の濃度とする。
【００１１】
また、ハロゲン化フェノール  Ｏ−メチルトランスフェラーゼの生産誘導物質として、ＴＣＰ、２，３，４−トリクロロフェノール、２，３，６−トリクロロフェノール、２，４，５−トリクロロフェノール、２，３−ジクロロフェノール、２，４−ジクロロフェノール、２，５−ジクロロフェノール、２，６−ジクロロフェノール、３，４−ジクロロフェノール、３，５−ジクロロフェノール、ｏ−クロロフェノール、ｐ−クロロフェノール、４−ブロモ−２−クロロフェノール、ｏ−ブロモフェノールなどのハロゲン化フェノールを培地に添加することが好ましい。誘導物質としては、トリクロロフェノールが好ましく、特にＴＣＰが好適である。ハロゲン化フェノールの濃度は通常０．０００１〜０．００５％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．００１〜０．００２％（ｗ／ｖ）とする。ハロゲン化フェノールの添加により酵素の生産量が増大する。
【００１２】
培養は通常、通気攪拌培養、振盪培養または静置培養で行う。培養温度は１０〜４０℃、好ましくは２５〜３５℃とし、培地のｐＨは４〜９、好ましくは６〜８とする。培養は通常、１〜１４日間行われる。
必要に応じて、培養中、培地に炭素源、窒素源、無機塩類、微量栄養素を添加することができる。大量培養のためには、液体培地を用いることが好ましい。
【００１３】
このようにして、菌体内あるいは培養液中にハロゲン化フェノール  Ｏ−メチルトランスフェラーゼが蓄積される。菌体および培養液からのハロゲン化フェノール  Ｏ−メチルトランスフェラーゼの採取は、一般に使用される酵素精製法を用いることができる。
【００１４】
例えば、酵素が菌体内に生産される場合は次のようにして行うことができる。培養液より遠心分離または濾過などの分離手段により菌体を回収し、菌体を溶菌することによって粗酵素液を得る。溶菌の方法としては、超音波破砕、ガラスビーズを用いる機械的な破壊、フレンチプレス、界面活性剤など、いずれの方法を用いてもよい。得られた粗酵素液から、有機溶媒分画法、硫安分画法、透析、等電点沈殿法、カラムクロマトグラフィー（ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィーなど）などの通常の酵素精製方法を単独であるいは組合わせて用いることにより精製された本発明の酵素を得ることができる。
【００１５】
本発明のハロゲン化フェノール  Ｏ−メチルトランスフェラーゼの活性は次のようにして測定できる。
酵素液４０μｌに、０．５Ｍリン酸緩衝液Ａ（０．５Ｍ  ＫＨ2 ＰＯ4 −Ｎａ2 ＨＰＯ4 ，１ｍＭ  ジチオトレイトール，１０％エタノール，ｐＨ７．９）４０μｌ，１０ｍＭ  ＴＣＰ溶液  ４０μｌ，１ｍＭ  Ｓ−アデノシル−L −（メチル−14Ｃ）メチオニン（１．０×１０6 ｄｐｍ／ｍｌ）４０μｌを加え、蒸留水で総量０．４ｍｌにする。これを２８℃で１０分間保温した後、ヘキサンを０．８ｍｌ加え３分間攪拌することにより生じたＴＣＡを抽出した。上清のヘキサン０．２ｍｌを５ｍｌの液体シンチレーター〔トルエン１Ｌ、１，４−ビス［２−（５−フェニルオキサゾリル）］ベンゼン（ＰＯＰＯＰ）０．１２５ｇ、２，５−ジフェニルオキサゾール（ＰＰＯ）４ｇ〕に加え、液体シンチレーション計数装置で放射能を測定する。ハロゲン化フェノール  Ｏ−メチルトランスフェラーゼの活性の単位（Ｕ）は、１分間に生成するＴＣＡ量（μモル）として表される。比活性はμモル／ｍｉｎ／ｍｇ蛋白（またはＵ／ｍｇ蛋白）で表示される。蛋白質濃度は、吸光度（Ａ280 ）または牛血清アルブミンを標準としてＬｏｗｒｙら [J. Biol. Chem. Vol. 193, 265-275 (1951)]の方法で定量する。
【００１６】
本発明のハロゲン化フェノール  Ｏ−メチルトランスフェラーゼの性質を以下に示す。
【００１７】
(1) 作用
本発明の酵素は、ハロゲン化フェノールの水酸基をＯ−メチル化してハロゲン化アニソールに変換する反応を触媒する。ハロゲン化フェノールは、ベンゼン環上の少なくとも１個の水素原子がハロゲン原子で置換されたフェノールであり、ハロゲン化アニソールは、ベンゼン環上の少なくとも１個の水素原子がハロゲン原子で置換されたアニソールである。ハロゲン原子は塩素、臭素、フッ素およびヨウ素である。
【００１８】
(2) 基質特異性
本発明の酵素はハロゲン化フェノールに基質特異性を有する。特にモノ−、ジ−およびトリハロゲン化フェノールに基質特異性を有する。本発明の酵素の各種フェノール化合物に対する基質特異性を表１に示す。
【００１９】
【表１】
0003836180.tif 000003
【００２０】
表１中の活性は、０．１ｍＭ  Ｓ−アデノシル−L −メチオニンおよび１ｍＭ基質を含有する５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．９）を２８℃で反応させたときのメチル化活性を、ＴＣＰを基質として用いたときの値を１００％として相対活性（％）で表したものである。
【００２１】
本発明の酵素はフェノールおよびカテコールをメチル化しないことから、従来知られているフェノール  Ｏ−メチルトランスフェラーゼあるいはカテコール  Ｏ−メチルトランスフェラーゼと相違することが明らかである。また、各種モノクロロフェノールに対する結果より、ｏ−、ｐ−位に塩素原子を有するハロゲン化フェノールに対してはメチル化速度が著しく速く、ｍ−位に塩素原子を有するハロゲン化フェノールに対してはメチル化速度が非常に遅い。さらに、ハロゲン化フェノール以外のフェノール化合物、あるいはナフトール化合物はメチル化しない。
【００２２】
(4) 至適ｐＨ
酢酸緩衝液（ｐＨ３．８〜６．２）、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．４〜７．９）、５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．７〜８．９）、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．７〜１１．２）を用いて酵素活性を測定した。結果を図１に示す。□は酢酸緩衝液、○は５０ｍＭリン酸緩衝液、△は５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液、●はグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液中、２８℃で測定した酵素活性を示している。本発明の酵素の至適ｐＨは８．５付近である。ｐＨ９．５以上では酵素は失活する。
【００２３】
(5) 至適作用温度
５℃〜６５℃での酵素活性を測定した（測定条件５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．９）。結果を図２に示す。本発明の酵素の至適作用温度は４０℃〜５０℃である。５５℃以上で酵素は失活する。
【００２４】
(6) ｐＨ安定性
酢酸緩衝液（ｐＨ３．４〜５．２）、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．３〜７．９）、５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．２〜９．０）、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．８）を使用し、これらの緩衝液２．８ｍｌに酵素液０．２ｍｌを加えた後、４℃で３日間放置した。この処理酵素液を０．０５Ｍリン酸緩衝液で１０倍に希釈した後、活性を測定した。その結果を図３に示す。
【００２５】
(7) 金属イオンと阻害剤の酵素活性への影響
表２に記載の所定濃度で金属イオンを酵素に添加してすぐに酵素活性を測定した。添加剤を加えないときの活性を１００％とする。相対活性（％）を表２に示す。
【００２６】
【表２】
0003836180.tif 000004
表３に記載の所定濃度の阻害剤と酵素を１０分間保温した後、基質であるＴＣＰを添加して酵素活性を測定した。添加剤を加えないときの活性を１００％とする。相対活性（％）を表３に示す。
【００２７】
【表３】
0003836180.tif 000005
【００２８】
本発明の酵素はＣｕ2+、Ｎｉ2+、硝酸銀により阻害される。またＳＨ基試薬〔Ｎ−エチルマレイミド、５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）〕によっても阻害を受ける。カテコール  Ｏ−メチルトランスフェラーゼの阻害剤であるトロポロン（tropolone)は本発明の酵素の活性を阻害しない。また他のＯ−メチルトランスフェラーゼと同様にＳ−アデノシル−ホモシステインで活性が阻害される。
【００２９】
(8) 分子量
約５０，０００（ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法、ゲル濾過法）
(9) Ｋｍ
ＴＣＰに対するＫｍ  ０．８１μＭ
Ｓ−アデノシル−L −メチオニンに対するＫｍ  １．６μＭ
【００３０】
本発明の酵素は、木材、木製品または紙からＴＣＡによる異臭が発生するのを防止するために利用することができる。ＴＣＡは揮発性で室温で徐々に昇華する性質を有する。従って、予め製造段階でＴＣＰを含有する木材、木製品または紙（段ボールなどの紙製包装資材を含む）をハロゲン化フェノール  Ｏ−メチルトランスフェラーゼと接触させ、生成したＴＣＡを除くことによって、異臭の発生を防止することができる。
【００３１】
本発明の酵素を防臭目的で使用する場合、該酵素は適当な液体溶媒に溶解するかまたは懸濁させ、または適当な固体担体と混合するかまたはこれに吸着させ、液剤、懸濁剤、乳剤、噴霧剤（エアロゾル剤）、粉末剤などの使用に適した剤形に製剤化して用いられる。適当な液体溶媒としては水、緩衝液（リン酸緩衝液など）、エタノール水溶液などが挙げられる。必要に応じて、安定化剤、保存剤、乳化剤、懸濁化剤、ｐＨ調整剤、溶解補助剤などの添加剤を加えてもよい。
【００３２】
木材、木製品または紙をハロゲン化フェノール  Ｏ−メチルトランスフェラーゼと接触させる方法としては、添加、塗布（または噴霧）、被覆する方法などが挙げられる。紙の場合は抄紙工程で本酵素を添加することが好ましい。酵素反応により生成したＴＣＡは、例えば、加熱して揮発させたり、有機溶媒で抽出することによって除去することができる。ハロゲン化フェノール  Ｏ−メチルトランスフェラーゼの使用量は適宜変更することができるが、一般に木材、木製品または紙１ｋｇ当たり０．１〜１００Ｕ程度を使用するのが適当である。本発明の酵素のＴＣＰに対するＫｍは０．８１μＭであり、Ｋｍが低いため、木材、木製品または紙に存在するＴＣＰを短時間でＴＣＡに変換して除去できる。
【００３３】
本発明のハロゲン化フェノール  Ｏ−メチルトランスフェラーゼの酵素活性は、銀、銅またはニッケルを含有する化合物によって阻害される。従って、木材、木製品または紙を、銀、銅またはニッケルを含有する化合物と接触させてハロゲン化フェノール  Ｏ−メチルトランスフェラーゼの活性を阻害することにより、ＴＣＡの生成を抑制することができる。
【００３４】
銀、銅またはニッケルを含有する化合物は、銀イオン、銅イオンまたはニッケルイオンを含有する無機化合物であってもよいし、有機金属化合物であってもよい。銀、銅またはニッケルを含有する化合物をハロゲン化フェノール  Ｏ−メチルトランスフェラーゼを阻害する目的で用いる場合、該化合物は適当な液体溶媒に溶解するかまたは懸濁させ、または適当な固体担体と混合するかまたはこれに吸着させ、液剤、懸濁剤、乳剤、噴霧剤（エアロゾル剤）、粉末剤などの使用に適した剤形に製剤化して用いられる。適当な液体溶媒または固体担体としては、水、カルボキシメチルセルロース、ゼオライト、層状無機化合物などが挙げられる。例えば、硝酸銀は水溶液の形態で使用される。銀、銅またはニッケルを含有する化合物を固体担体に担持させた形態としては、カルボキシメチルセルロース銀塩、銀担持ゼオライト、銀担持層状化合物などが挙げられる。必要に応じて、安定化剤、保存剤、乳化剤、懸濁化剤、溶解補助剤などの添加剤を加えてもよい。
【００３５】
木材、木製品または紙を銀、銅またはニッケルを含有する化合物と接触させる方法としては、添加、塗布（または噴霧）、被覆する方法などが挙げられる。紙の場合には、抄紙工程時に該化合物をすきこむ方法で接触させてもよい。本発明の方法において銀、銅またはニッケルを含有する化合物は、ハロゲン化フェノール  Ｏ−メチルトランスフェラーゼの活性を阻害するのに有効な量で使用すればよい。
【００３６】
本発明の防臭方法は、段ボール、板紙などの紙製包装資材、木材、または木製パレット、家具などの木製品に対して適用することができる。
【００３７】
【実施例】
以下、実施例により本発明を説明する。
実施例１
（１）培養
トリコデルマ・ビルガツム(Trichoderma virgatum)ＡＴＣＣ２４９６１の培養は、０．５％（ｗ／ｖ）ポリペプトン、０．５％（ｗ／ｖ）グルコース、０．２％（ｗ／ｖ）酵母エキス、および０．００１％（ｗ／ｖ）ＴＣＰを含有し、ｐＨを７．０に調整したＰＹＧ培地を用いて、１５Ｌジャーファーメンターで２７℃にて２日間攪拌培養した。
【００３８】
（２）酵素の精製
培養液からガラス濾過器を用いて菌体だけを回収し、リン酸緩衝液Ｂ（０．５Ｍ  ＫＨ2 ＰＯ4 −Ｎａ2 ＨＰＯ4 ，ｐＨ７．９）に懸濁した。これをガラスビーズ（φ０．５ｍｍ）と共にＤＹＮＯ−ミル（Willy A Bachofen AG Maschinenfabrik 社製）に入れ破砕した（回転数３０００ｒｐｍ）。その破砕液を４℃、８，０００×ｇで３０分間遠心分離し、さらにその上清液を４℃、１２，０００×ｇで３０分間遠心分離を行った。この上清液を粗酵素液とした。
【００３９】
粗酵素液に硫酸アンモニウムを加え硫安飽和度を４１％にして、１７，０００×ｇで２０分間遠心分離した。次に、沈殿を除いた上清を硫安飽和度６７％にして１８，０００×ｇで２０分間遠心分離し、沈殿を回収した。その沈殿を緩衝液Ａ（０．５Ｍ  ＫＨ2 ＰＯ4 −Ｎａ2 ＨＰＯ4 ，１ｍＭ  ジチオトレイトール，１０％エタノール，ｐＨ７．９）に懸濁させ、緩衝液Ａで一夜透析した（画分Ａ）。
【００４０】
緩衝液Ａにて平衡化されたＤＥＡＥ−セルロースカラム（φ３．５×２０ｃｍ）に画分Ａを付した。これを塩化カリウムの０〜５００ｍＭ直線濃度勾配の緩衝液Ａ  １Ｌで溶出した（流速６０ｍｌ／ｈｒ，各フラクションは６．０ｍｌ）。各フラクションのＯ−メチルトランスフェラーゼ活性、蛋白質濃度（Ｌｏｗｒｙ法）を測定した。Ｏ−メチルトランスフェラーゼ活性を示すフラクションを回収し、これを緩衝液Ａで一夜透析した（画分Ｂ）。
【００４１】
画分Ｂを限外濾過（分画分子量１万）により濃縮して、緩衝液Ａで平衡化してあるＭｏｎｏ  Ｑ  ＨＲ  ５／５（ファルマシア社）カラムに付した。これを塩化カリウムの０〜３００ｍＭ直線濃度勾配の緩衝液Ａで溶出した（流速０．５ｍｌ／ｍｉｎ，各フラクションは０．５ｍｌ）。各フラクションのＯ−メチルトランスフェラーゼ活性、および蛋白質濃度として吸光度（Ａ280 ）を測定した。Ｏ−メチルトランスフェラーゼ活性を示すフラクションを回収し、これを緩衝液Ａで一夜透析した（画分Ｃ）。
【００４２】
画分Ｃを限外濾過（分画分子量１万）により濃縮した。その濃縮液を２００ｍＭ  ＮａＣｌを含む緩衝液Ａで平衡化してあるＳｕｐｅｒｏｓｅ  １２  ＨＲ  １０／３０（ファルマシア社）カラムに付し、緩衝液Ａで溶出した（流速０．５ｍｌ／ｍｉｎ，各フラクションは０．５ｍｌ）。各フラクションのＯ−メチルトランスフェラーゼ活性、および蛋白質濃度として吸光度（Ａ280 ）を測定した。Ｏ−メチルトランスフェラーゼ活性を示すフラクションを回収し、これを緩衝液Ａで一夜透析した（画分Ｄ）。画分Ｄを−２０℃で保存した。画分Ｄの比活性は０．１８４Ｕ／ｍｇであり、この精製処理により比活性は１１０倍まで精製された。
【００４３】
（３）電気泳動
画分Ｄを２％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）と０．５％  ２−メルカプトエタノールで１００℃、１０分間処理した。次にＬａｅｍｍｌｉの方法［Nature, Vol. 227, 680 (1970)] に準じて電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；濃縮ゲル：４％ポリアクリルアミドゲル，分離ゲル：１０％ポリアクリルアミド）を１％ＳＤＳを含むトリス緩衝液中で行い、酵素の分子量を測定した。電気泳動によるこの酵素の分子量は約５０，０００であり、これはゲル濾過による測定結果と一致した。
【００４４】
（４）ＴＣＰとＳ−アデノシル−L −メチオニンに対するＫｍ
ＴＣＰに対するＫｍは、Ｓ−アデノシル−L −メチオニンの濃度を一定（１００μＭ）にして、ＴＣＰの濃度（０．２５μＭ−２５μＭ）に変えて反応速度から求めた。同様にＳ−アデノシル−L −メチオニンに対するＫｍは、ＴＣＰの濃度を一定（２５μＭ）にして、Ｓ−アデノシル−L −メチオニンの濃度（２μＭ−１００μＭ）に変えて求めた。ＴＣＰとＳ−アデノシル−L −メチオニンに対するＫｍは、それぞれ０．８１μＭと１．６μＭであった。
【００４５】
【発明の効果】
本発明のハロゲン化フェノール  Ｏ−メチルトランスフェラーゼは、木材用抗カビ剤として使用されているＴＣＰなどのハロゲン化フェノールをＴＣＡなどのハロゲン化アニソールにＯ−メチル化する反応を触媒する。従って、本発明の酵素を用いて、木材、木製品または紙（段ボールなどの紙製包装資材を含む）に含まれているハロゲン化フェノールを予めハロゲン化アニソールに変換して除去することにより、ハロゲン化アニソールによる異臭を防止することができる。
本発明の酵素はまた、新規なハロゲン化フェノール  Ｏ−メチルトランスフェラーゼ阻害剤をスクリーニングしたり開発するための試薬としても用いることができる。また本発明の酵素は、発癌性のあるといわれるハロゲン化フェノールを比較的無害なハロゲン化アニソールに変換するために利用することができる。
さらに、本発明のハロゲン化フェノール  Ｏ−メチルトランスフェラーゼを阻害することにより、木材、木製品または紙（段ボールなどの紙製包装資材を含む）に含まれるＴＣＰなどのハロゲン化フェノールからＴＣＡなどのハロゲン化アニソールが生成するのを抑制し、ＴＣＡなどのハロゲン化アニソールによる異臭を防止することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の酵素の各ｐＨにおける酵素活性を示すグラフである。
【図２】本発明の酵素の各温度における酵素活性を示すグラフである。
【図３】本発明の酵素のｐＨ安定性を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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