(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列をコードする単離されたＢａｌＩ制限酵素遺伝子。
【請求項２】
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＥＲ１６４８／ｐＢＳＲ１／ｐＳＲＢ８（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５２２９）の保有するプラスミドから取得可能な請求項１記載の遺伝子。
【請求項３】
配列表の配列番号２で表される塩基配列を有する請求項１記載の遺伝子。
【請求項４】
配列表の配列番号２で表される塩基配列の塩基番号１のＧがＡに置換された塩基配列を有する請求項１記載の遺伝子。
【請求項５】
配列表の配列番号２で表される塩基配列を有する遺伝子と厳密な条件下でハイブリダイズ可能な単離されたＢａｌＩ制限酵素遺伝子。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項記載の遺伝子を含むベクター。
【請求項７】
請求項６記載のベクターで形質転換されたＢａｌＩ制限酵素を生産することのできる形質転換体。
【請求項８】
請求項７記載の形質転換体を培養し、該培養物からＢａｌＩ制限酵素を採取することを特徴とするＢａｌＩ制限酵素の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、遺伝子工学試薬として有用な制限酵素および修飾酵素の遺伝子、さらに詳細には、ＢａｌＩ 制限・修飾系酵素遺伝子およびそれらを用いたＢａｌＩ制限酵素の遺伝子工学的製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＢａｌＩ 制限・修飾系酵素は、ブレビバクテリウム・アルビダム（Brevibacterium albidum）ＡＴＣＣ１５８３１（以下、Ｂａｌ菌と略記する）により生産され、ＤＮＡを切断する活性を有するＢａｌＩ 制限酵素と、ＢａｌＩ制限酵素による切断からＤＮＡを保護するＢａｌＩ修飾酵素（メチラーゼまたはメチルトランスフェラーゼともいう）により構成される。ＢａｌＩ制限酵素は典型的ＩＩ型制限酵素であり、ＤＮＡ塩基配列中、二回転対称構造の６塩基からなる配列（５’−ＴＧＧＣＣＡ−３’）を認識し、その認識配列のＧとＣの間を平滑末端となるように切断する酵素である〔ゲリナス(Gelinas)ら、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー (Journal of Molecular Biology) 第１１４巻、第４３３〜４４０頁（１９７７）〕。一方、ＢａｌＩ修飾酵素は、認識配列の５’側から４番目のシトシン塩基（Ｃ）にメチル基を導入する作用を有し、ＢａｌＩ制限酵素による切断よりＤＮＡを保護する機能を有する酵素である。
【０００３】
Ｂａｌ菌からのＢａｌＩ制限酵素の製造方法としては、上記のゲリナスらのジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジーの報文に記載されている。しかしながら、Ｂａｌ菌より得られるＢａｌＩ制限酵素の含量は少なく、当該酵素を大量に得ることは困難である。そこで、ＢａｌＩ制限酵素遺伝子をクローニングし、遺伝子工学的に大量に製造することが考えられる。このとき、ＢａｌＩ制限酵素遺伝子とＢａｌＩ修飾酵素遺伝子の両方が必要とされる。
ＢａｌＩ修飾酵素遺伝子については、ウイルソン(Wilson)が、ジーン（Ｇｅｎｅ）第７４巻、第２８１〜２８９頁（１９８８）においてクローニングされた種々の修飾酵素遺伝子の一つとして挙げている。しかしながら、その具体的なクローニング方法や、クローニングされた遺伝子の遺伝子構造や塩基配列など、遺伝子を特定するに足る記載はなく、その詳細は明らかではない。また、ＢａｌＩ制限酵素遺伝子についての報告はない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、ＢａｌＩ 制限・修飾系酵素遺伝子を提供し、ＢａｌＩ制限酵素の工業的製造に適したＢａｌＩ制限・修飾系酵素遺伝子を含むプラスミドを導入した新規微生物、特に、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）を創製し、該微生物を用いたＢａｌＩ制限酵素の製造方法を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、Ｂａｌ菌よりＢａｌＩ制限・修飾系酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片をクローニングすることに成功し、さらに、これらのＤＮＡ断片全体あるいは一部が同一または個別のプラスミドに組み込まれたプラスミドを導入した微生物、特に、エシェリヒア・コリを培養することにより、菌体中に著量のＢａｌＩ制限酵素が蓄積し、これらの培養物より大量のＢａｌＩ制限酵素を取得できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち、本発明の第１の態様は、単離されたＢａｌＩ制限酵素遺伝子およびそれとハイブリダイズ可能な遺伝子に関する。
本発明の第２の態様は、単離されたＢａｌＩ修飾酵素遺伝子およびそれとハイブリダイズ可能な遺伝子に関する。
本発明の第３の態様は、第１の態様の遺伝子を含むベクターに関する。
本発明の第４の態様は、第２の態様の遺伝子を含むベクターに関する。
本発明の第５の態様は、第１の態様の遺伝子と第２の態様の遺伝子両方を含むベクターに関する。
【０００７】
本発明の第６の態様は、第３および第４の態様の両方のベクターで形質転換され、ＢａｌＩ制限酵素を生産することができる形質転換体に関する。
本発明の第７の態様は、第５の態様のベクターで形質転換され、ＢａｌＩ制限酵素を生産することができる形質転換体に関する。
本発明の第８の態様は、ＢａｌＩ制限酵素の製造方法に関し、第６または第７の態様の形質転換体を培養し、該培養物からＢａｌＩ制限酵素を採取することを特徴とする。
【０００８】
本明細書においては、ＢａｌＩ制限酵素活性を有するポリペプチドの総称としてＢａｌＩ制限酵素、ＢａｌＩ修飾酵素活性を有するポリペプチドの総称としてＢａｌＩ修飾酵素なる用語を使用する。
ＢａｌＩ制限・修飾系酵素遺伝子には ＤＮＡ を切断する活性を有するＢａｌＩ制限酵素をコードする遺伝子と、ＢａｌＩ制限酵素による切断よりＤＮＡを保護する修飾酵素をコードする遺伝子が含まれている。ここで、制限・修飾系酵素遺伝子とは、制限および修飾の両酵素遺伝子をもつ遺伝子とその各個別の遺伝子との両者を統合した意味の用語である。換言すれば、制限および／または修飾酵素遺伝子を意味する。これらの遺伝子は、単独あるいは複合体の形で利用できる。  また、上記の両遺伝子を組み込んだプラスミドを用いる場合、そのプラスミドは両遺伝子を同一のプラスミドに組み込んだものでも、あるいは両遺伝子を各個別に複数のプラスミドに組み込んだもののいずれであってもよい。
【０００９】
本発明において、制限・修飾系酵素遺伝子をクローニングする方法としては、ベクター修飾法あるいはメチラーゼ選択法と呼ばれる方法がよく用いられている〔上記ウイルソン、ジーン、第７４巻、第２８１〜２８９頁（１９８８）〕。この方法は、制限酵素遺伝子と修飾酵素遺伝子がゲノム上で互いに近傍に存在し発現しているという仮定に基づいている。すなわち、修飾酵素活性を有するクローンの中には対応する制限酵素遺伝子も合わせて持つものがあるはずである。
しかし、ＢａｌＩ制限・修飾系酵素遺伝子のクローニングに関しては、この方法をそのまま適用することはできなかった。
すなわち、ＢａｌＩ修飾酵素活性を有するクローンの中からは、ＢａｌＩ制限酵素活性は検出されなかった。ＢａｌＩ制限酵素活性が検出されない理由としては、ＢａｌＩ制限酵素遺伝子がＢａｌＩ修飾酵素遺伝子に隣接して存在していない、あるいは、隣接はしているが全長がクローニングされていない、あるいは、全長がクローニングされているが宿主内で発現されない、等の理由が考えられるが、この時点では３つのうちのどの理由によるものかは予想できない。
【００１０】
ウイルソンは上記のジーンで、メチラーゼ選択法をさらに発展させた多段階クローニング法（Multi-step cloning）も報告している。しかし、全長がクローニングされているが発現されない場合は、この方法もそのまま適用できない。
結果的に、ＢａｌＩ制限酵素遺伝子はそのままの形ではエシェリヒア・コリ内で発現しないことが判明し、本発明者らは、ＢａｌＩ制限酵素遺伝子の全塩基配列を決定した後に、遺伝子の開始部分を改変して発現ベクターに結合し、別途発現系を構築した。また、用いるエシェリヒア・コリの株によっては、ＢａｌＩ制限・修飾系酵素遺伝子をクローニングすることができないことも明らかとなった。
【００１１】
ＢａｌＩ制限・修飾系酵素遺伝子をクローニングし、発現させるための手順を以下に例示する。
（１）  ＤＮＡ供与体であるＢａｌ菌から染色体ＤＮＡを抽出してＳａｕ３ＡＩ制限酵素で部分消化し、ＢａｌＩ認識配列をもつベクターに結合させる。
（２）  （１）で作製したプラスミドライブラリーでエシェリヒア・コリＥＲ１６４８株を形質転換し、プラスミド抽出法によりプラスミドライブラリーを得る。
（３）  （２）で作製したプラスミドライブラリーをイン・ビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）でＢａｌＩ制限酵素で消化する。このとき、ＢａｌＩ修飾酵素遺伝子を含有しかつ発現しているプラスミドは消化されない。
（４）  （３）のプラスミドライブラリーをエシェリヒア・コリＥＲ１６４８株に再び戻して形質転換させる。このとき、消化されていない環状のプラスミドのみが効率よく選択的に導入され、ＢａｌＩ修飾酵素遺伝子が発現している形質転換体のみを選択できる。
（５）  （４）で得られた形質転換体についてＢａｌＩ制限酵素活性をイン・ビトロの方法で測定する。
【００１２】
もし、ＢａｌＩ制限酵素活性が検出されたなら、ＢａｌＩ制限酵素遺伝子もそのクローン中に存在し、かつ発現していることになり、以下の手順（６）〜（１０）は不要である。しかしながら、本発明によれば、ＢａｌＩ制限酵素活性は検出されず、さらに以下の手順が必要であった。
（６）  Ｂａｌ菌より上記のゲリナスの方法等によりＢａｌＩ制限酵素をできるだけ高純度に精製し、そのＮ末端側よりアミノ酸配列を決定する。さらに、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を行い、分子量の情報を得る。
（７）  （５）のＢａｌＩ修飾酵素遺伝子を含んでいるクローンについて種々の欠失変異体を作製し、ＢａｌＩ修飾酵素遺伝子の位置を特定する。
（８）  （７）で作製した適当な欠失変異体について全塩基配列を決定する。次に、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を検索し、（６）および（７）の情報からＢａｌＩ制限酵素遺伝子、ＢａｌＩ修飾酵素遺伝子を特定する。
（９）  （８）で特定された（エシェリヒア・コリ内で発現しない）ＢａｌＩ制限酵素遺伝子を発現するように遺伝子工学的に改変した後、発現ベクターに結合し、ＢａｌＩ制限酵素遺伝子発現用ベクターを構築する。
（１０）  （７）で作製したＢａｌＩ修飾酵素遺伝子を含むベクターと、（９）で作製したＢａｌＩ制限酵素遺伝子を含むベクターでエシェリヒア・コリＥＲ１６４８株を形質転換し、ＢａｌＩ制限酵素を生産することができる形質転換体を作製する。
（１１）  （１０）で作製した形質転換体を培養し、該培養物からＢａｌＩ制限酵素を大量に得る。
【００１３】
（１）において使用するベクターとしては、ＢａｌＩ認識配列を含み、かつ当該配列がＢａｌＩ制限酵素で切断されるものであれば使用可能である。本発明者らは、ｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＶおよびＮｒｕＩ部位にＢａｌＩリンカー（５’−ＴＴＧＧＣＣＡＡ−３’）を挿入して、ＢａｌＩ認識配列を新たに導入したベクターを構築し、使用した。なお、このベクターをｐＢＢＢ１と命名した。
新たなＢａｌＩ認識配列を導入した理由は、もとからｐＢＲ３２２上にあるＢａｌＩ認識配列がｄｃｍメチラーゼの影響により切断されにくいことを考慮したものである。
【００１４】
（２）における形質転換に際しては、本発明者らの実験によれば、用いるエシェリヒア・コリ株の種類によっては安定した形質転換体が得られない。すなわち、ＥＲ１６４８株を用いたときのみ安定した形質転換体が得られ、ＨＢ１０１株やＭＣ１０６１株では得られない。
よって、以降の手順においてもＥＲ１６４８株を用いた。
（３）〜（４）において得られた形質転換体から、本発明者らはＢａｌＩ修飾酵素遺伝子を含む約５．２ｋｂのＤＮＡ断片を含むプラスミドを選択し、該プラスミドをｐＢＢ５と命名した。
（５）においては、得られたクローンのＢａｌＩ制限酵素活性を調べる。
ＢａｌＩ 制限酵素活性は、以下のようなイン・ビトロの方法により調べることができる。
すなわち、試験するクローンを培養し、その培養物を粉砕し、超遠心分離を行い残渣を除去した上清を用い、ラムダファージＤＮＡを基質として、３７℃で制限酵素反応を行いアガロースゲル電気泳動により解析することができる。本発明者らは、当該方法を用いてｐＢＢ５を有するエシェリヒア・コリＥＲ１６４８の抽出液についてＢａｌＩ制限酵素活性を調べたが、活性は検出されなかった。活性が検出されない理由としては上記の３つの理由が考えられたが、この時点ではどの理由によるものかは予想できない。この３つの可能性のうちのいずれであるかを決めるために以下の手順を進めた。
【００１５】
（６）において、ＢａｌＩ制限酵素のＮ末端側アミノ酸配列の決定は、精製したＢａｌＩ制限酵素をポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜に移し、自動アミノ酸シーケンサーにより行うことができる。当該方法によって決定したＢａｌＩ制限酵素のＮ末端側アミノ酸配列を配列表の配列番号５に示す。また、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果によれば、ＢａｌＩ制限酵素の分子量は約２９,０００であった。
（７）において、作製した各欠失変異体とＢａｌＩ修飾酵素活性の関係を図１に示す。この結果、約３．２ｋｂのＤＮＡ断片上にＢａｌＩ修飾酵素遺伝子が存在することが判明した。当該ＤＮＡ断片をｐＢＢＢ１に挿入したプラスミドを作製し、ｐＢＳＲ１と命名した。図２にｐＢＳＲ１の構築過程を示す。
【００１６】
（８）において、ｐＢＳＲ１に挿入されている約３．２ｋｂのＤＮＡ断片の全塩基配列を決定した。その塩基配列を配列表の配列番号６に示す。さらに、ＯＲＦを検索した結果、塩基番号４３７〜１２７６に正方向のＯＲＦ（ＯＲＦ１）およびび１２７９〜２０５８に逆方向のＯＲＦ（ＯＲＦ２）が存在した。ＯＲＦ１の塩基配列および推定されるアミノ酸配列を配列表の配列番号４に、アミノ酸配列のみを配列番号３に示す。ＯＲＦ２の塩基配列および推定されるアミノ酸配列を配列表の配列番号２に、アミノ酸配列のみを配列番号１に示す。（７）における各欠失変異体とＢａｌＩ修飾酵素活性の関係から、ＯＲＦ１がＢａｌＩ修飾酵素をコードしていると決定した。このことは、ＯＲＦ１のみをＰＣＲで増幅したＤＮＡ断片を組み込んだ発現ベクターが導入されたエシェリヒア・コリがＢａｌＩ修飾酵素活性を有していたことからも裏付けられた。また、（６）のＮ末端側アミノ酸配列がＯＲＦ２のそれと一致することから、ＯＲＦ２がＢａｌＩ制限酵素をコードしていると決定した。さらに、配列番号１のアミノ酸配列から計算される分子量は２９,０４３であり（６）のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果とよく一致した。図３にクローニングされたＢａｌＩ制限・修飾系酵素遺伝子の構造を示す。図中、Ｍは修飾酵素遺伝子を、Ｒは制限酵素遺伝子を、矢印はＯＲＦの方向を表す。
【００１７】
以上より、ＢａｌＩ制限・修飾系酵素遺伝子の構造が明らかとなり、かつＢａｌＩ制限酵素遺伝子はその全体がクローニングされているにもかかわらず、エシェリヒア・コリ内で発現しないことが明らかとなった。
（９）において、本発明者らは、ＯＲＦ２の開始コドンをＧＴＧからＡＴＧに改変し、さらに、エシェリヒア・コリ内で強力に働くｌａｃプロモーターの下流に遺伝子を結合することによって、ＢａｌＩ制限酵素遺伝子の発現系を構築した。まず、ＯＲＦ２をＰＣＲで増幅する。この際、開始コドンがＡＴＧになるようにプライマーの配列を工夫する。つぎに、増幅した遺伝子をｐＳＴＶ２８ベクター（宝酒造社）のｌａｃプロモーターの下流に結合させた。当該ベクターをｐＳＲＢ８と命名した。ｐＳＢＲ８およびＢａｌＩ修飾酵素を発現するｐＢＳＲ１をエシェリヒア・コリＥＲ１６４８株に導入した形質転換体は Escherichia coli ER1648/pBSR1/pSRB8 と命名、表示され、平成６年１１月１０日（原寄託日）から工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ  Ｐ−１４６２５の受託番号の下で寄託されており、平成７年９月１２日から工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ  ＢＰ−５２２９の受託番号の下で国際寄託されている。
【００１８】
（１０）において、Escherichia coli ER1648/pBSR1/pSRB8の培養菌体１ｇから約７０,０００単位のＢａｌＩ制限酵素活性が検出され、これはＢａｌ菌の生産量の約１,０００倍であった。形質転換体の培養物からＢａｌＩ制限酵素を採取するにあたっては、例えば、培養物より菌体を集菌後、超音波破砕、超遠心分離等により酵素を抽出し、ついで除核酸法、塩析法、アフィニティクロマトグラフィー法、ゲル濾過法、イオン交換クロマトグラフィー法等を組み合わせ精製すればよい。この方法により、ＢａｌＩ制限酵素を大量に得ることができる。
【００１９】
また、上記で得られた遺伝子をプローブとして厳密な条件下でハイブリダイゼーションを行えば、得られた遺伝子と配列は少し異なるが、同様な酵素活性を持つ類似の遺伝子を得ることができ、これも本発明範囲のものである。
かかる厳密な条件下とは、ＤＮＡを固定したナイロン膜を、６×ＳＳＣ（１×ＳＣＣは塩化ナトリウム８．７６ｇ、クエン酸ナトリウム４．４１ｇを１リットルの水に溶かしたもの）、１％ラウリル硫酸ナトリウム、サケ精子ＤＮＡ１００μｇ／ｍｌ、５×デンハルツ（Denhardt's）（ウシ血清アルブミン、ポリビニルピロリドン、フィコールを各々０．１％の濃度で含む）を含む溶液中で６５℃にて２０時間プローブとハイブリダイゼーションを行うことをいう。
【００２０】
ＢａｌＩ制限・修飾系酵素をコードする類似の遺伝子をハイブリダイゼーションにより得る方法としては、例えば、以下の方法が挙げられる。
まず、目的の遺伝子源から得た染色体ＤＮＡを常法に従い、プラスミドやファージベクターに接続して宿主に導入し、ライブラリーを作製する。そのライブラリーをプレート上で培養し、生育したコロニーまたはプラークをニトロセルロースやナイロンの膜に移し取り、変性処理によりＤＮＡを膜に固定する。この膜をあらかじめ32Ｐ等で標識したプローブ（使用するプローブとしては、配列表の配列番号１または３に記載したアミノ酸配列またはその一部をコードする遺伝子であればよく、例えば、配列表の配列番号２または４に記載した遺伝子またはその一部を使用することができる）を含む溶液中で保温し、膜上のＤＮＡとプローブとの間でハイブリッドを形成させる。例えば、ＤＮＡを固定化した膜を、上記の厳密な条件でプローブとハイブリダイゼーションを行う。
【００２１】
ハイブリダイゼーション後、非特異的吸着を洗い流し、オートラジオグラフィー等によりプローブとハイブリッド形成したクローンを同定する。この操作をハイブリッド形成したクローンが単一になるまで繰り返す。こうして得られたクローンの中には、目的の蛋白質をコードする遺伝子が挿入されている。
【００２２】
得られた遺伝子は、例えば、つぎのように塩基配列を決定し、遺伝子が目的のＢａｌＩ制限・修飾系酵素をコードする遺伝子であるかを確認する。
塩基配列の決定は、ハイブリダイゼーションにより得られたクローンの場合、組換体がエシェリヒア・コリであれば、試験管等で培養を行い、プラスミドを常法に従って抽出する。これを制限酵素により切断し、挿入断片を取り出し、Ｍ１３ファージベクター等にサブクローニングし、ジデオキシ法により塩基配列を決定する。組換体がファージの場合も基本的に同様な操作により塩基配列を決定することができる。
これら培養から塩基配列決定までの基本的な実験法については、例えば、ティ・マニアティス（T. Maniatis）らのモレキュラー・クローニング・ア・ラボラトリー・マニュアル（Molecular Cloning A Laboratory Manual、１９８２年、コールドスプリングハーバーラボラトリー発行）等に記載されている。
【００２３】
得られた遺伝子が目的のＢａｌＩ制限・修飾系酵素であるかどうかを確認するには、決定された塩基配列を配列表の配列番号２または４に記載した塩基配列および配列表の配列番号１または３に記載したアミノ酸配列と比較してその遺伝子構造およびアミノ酸配列を知ることができる。
得られた遺伝子がＢａｌＩ制限・修飾系酵素をコードする領域の全てを含まない場合には、得られた遺伝子を基にして合成ＤＮＡプライマーを作製し、ＰＣＲによって足りない領域を増幅したり、得られた遺伝子の断片をプローブとして、さらにＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、全コード領域を得ることができる。
【００２４】
ＢａｌＩ制限・修飾系酵素活性を持つポリペプチドを遺伝子工学的に得るには、まず、得られたＢａｌＩ制限・修飾系酵素遺伝子を適当な宿主細胞、例えば、エシェリヒア・コリ、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）、放線菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等において発現できるような発現ベクターに常法に従い接続して、それを宿主細胞に導入し、形質転換体を作製する。この形質転換体を培養することによりＢａｌＩ制限・修飾系酵素活性を有するポリペプチドを生産させることができる。
【００２５】
用いる発現系によっては、形質転換体中で発現されたポリペプチドが不溶物［封入体（inclusion body）］として蓄積される場合がある。この場合は、この不溶物を回収し、穏和な条件、例えば、尿素等で可溶化した後に、変性剤を除くことによって回復させることができる。発現は、ＢａｌＩ制限酵素活性またはＢａｌＩ修飾酵素活性を測定することにより確認できる。ＢａｌＩ制限酵素活性は上記のイン・ビトロ法により測定でき、ＢａｌＩ修飾酵素活性は形質転換体のＤＮＡのＢａｌＩ認識配列がＢａｌＩ制限酵素によって消化されないことにより確認することができる。
【００２６】
形質転換体からのＢａｌＩ制限・修飾系酵素活性を有するポリペプチドを精製するには、上記と同様なクロマトグラフィーの手法を用いることができる。発現産物が不溶物として蓄積されている場合も、上記と同様に、例えば、細胞を破砕後、沈殿を回収し、尿素等の変性剤で可溶化する。ついで、変性剤を除き、リフォールディングさせた後、上記のようなクロマトグラフィーにより目的の活性を有するポリペプチドを得ることができる。
【００２７】
さらに、本発明においては、ＢａｌＩ制限酵素遺伝子とＢａｌＩ修飾酵素遺伝子の両方を含み、かつ発現可能なベクターで宿主を形質転換することによっても、ＢａｌＩ制限酵素を生産することのできる形質転換体を得ることができ、該形質転換体を培養することによって、ＢａｌＩ制限酵素を製造することができる。このようなベクターは、例えば、ｐＢＳＲ１上のＢａｌＩ制限酵素遺伝子を宿主内で発現するように改変したベクターを作製することによって得ることができる。ｐＢＳＲ１上のＢａｌＩ制限酵素遺伝子がエシェリヒア・コリ内で発現しない理由として、例えば、制限酵素の構造遺伝子上流にエシェリヒア・コリ内での転写に適したプロモーター配列がないこと、翻訳の開始コドンがエシェリヒア・コリでは比較的効率のよくないＧＴＧであること等が考えられる。したがって、ＢａｌＩ制限酵素遺伝子の上流に試験管内遺伝子操作法を用いて適当なプロモーター配列を挿入したり、試験管内部位特異的変位導入法を用いて開始コドンをＧＴＧからＡＴＧに変換することにより、目的のベクターを得ることができる。
【００２８】
さらに、図３に示すように、ｐＢＳＲ１上では制限酵素遺伝子と修飾酵素遺伝子が翻訳の終始点が見合う形で、転写、翻訳の方向が逆向きであり、両遺伝子の間で発現過程において互いに阻害しあう可能性がある。したがって、両遺伝子の方向をそろえることによって発現しやすくなることも考えられる。このような改変の方法としては、例えば、まず、制限酵素遺伝子、修飾酵素遺伝子のそれぞれ全長を含む領域をＰＣＲ法によって増幅する。このとき、プライマーの配列を工夫し、増幅された遺伝子の末端に適当な認識配列を導入する。ついで、その部位を利用して両遺伝子を同方向に連結し、ｌａｃプロモーター等の適当なプロモーターを有する発現ベクターに組み込むことにより目的のベクターを得ることができる。
これらのベクターによる宿主細胞の形質転換、得られた形質転換体の培養、発現された酵素の精製も上記と同様に行うことができる。
【００２９】
【実施例】
つぎに、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１
Ｂａｌ菌染色体ＤＮＡの調製
Ｂａｌ菌を、Ｌ培地（１０ｇ／リットル  トリプトン 、５ｇ／リットル  酵母エキス、５ｇ／リットル  ＮａＣｌ）１００ｍｌ中３７℃で１晩培養した後、遠心分離により集菌した。当該菌体を１０ｍｌの溶液Ａ〔２５ｍＭ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ  グルコース、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ〕に懸濁し、リゾチームを同液に２ｍｇ／ｍｌになるように溶かしたものを１．０ｍｌ加えて撹拌し、３７℃で１５分静置した。つぎに、当該溶液に２８ｍｌの溶液Ｂ〔１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１００ｍＭ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）〕を加え、撹拌し、さらに４ｍｌの１０％ＳＤＳ溶液を加え、撹拌し、３７℃で１時間静置した。当該溶液に１ｍｌの溶液Ｃ〔１０％  ＳＤＳ、８％  サルコシル(Sarcosyl)〕を加えて撹拌し、６０℃で１５分静置した。当該溶液を静置後、等容量のフェノール：クロロホルム（１：１）混液を加え、１０分間穏やかに撹拌した後、遠心分離（５０００ｇ、１０分）により、水層とクロロホルム層を分離した。分離後水層を取り、これに等量のイソプロピルアルコールを加え、撹拌し、０℃で１０分間静置した後、遠心分離（１３５００ｇ、１０分)により沈殿を回収した。これを７０％エタノールで洗浄し、１０ｍｌの ＴＥ溶液〔１０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ〕に溶解させ、４℃で保存した。
【００３０】
実施例２
クローニングベクターの構築
ＢａｌＩ制限・修飾系酵素遺伝子をスクリーニングするためのクローニングベクターとして、ｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＶ制限酵素切断部位およびＮｒｕＩ制限酵素切断部位にＢａｌＩリンカー（５’−ＴＴＧＧＣＣＡＡ−３’）（宝酒造社製）を導入したベクターを以下のように新たに構築した。
まず、２５μｇのｐＢＲ３２２を制限酵素ＥｃｏＲＶ１５０ユニットと緩衝液〔１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、７ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、７ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、０．０１％ウシ血清アルブミン〕中、３７℃で１時間反応させ、エタノール沈殿によりプラスミドＤＮＡを回収した。このＤＮＡを１００ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に溶解し、２．５ユニットのアルカリホスファターゼ（宝酒造社）を加え、５５℃、１時間反応させ、フェノール処理、エタノール沈殿を行いＤＮＡを回収した。一方、１００ｐｍｏｌのＢａｌＩ リンカーの５’末端を、１０ユニットのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造社）を用いてリン酸化し、エタノール沈殿後リンカーＤＮＡを回収した。リン酸化したＢａｌＩ リンカー５０ｐｍｏｌとＥｃｏＲＶで切断したｐＢＲ３２２ＤＮＡ１μｇをＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社）７００ユニットを用い、リガーゼ緩衝液〔６６ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、６．６ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）、０．１ｍＭ  ＡＴＰ〕中、５℃で１６時間反応させ結合させた後、７０℃で５分間加熱してから、２０ユニットのＥｃｏＲＶで消化した。こうして得られたプラスミドＤＮＡでエシェリヒア・コリＨＢ１０１株を形質転換し、アンピシリン１００μｇ／ｍｌを含むＬ寒天培地に塗布した。３７℃で生育したコロニーを分離し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２ｍｌのＬ培地で３７℃で１６時間培養した後、集菌し、アルカリ−ＳＤＳ法によりプラスミドを分離した。
【００３１】
すなわち、集菌体に０．２ｍｌの溶液Ｉ〔５０ｍＭグルコース、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５ｍＭ  ＥＤＴＡ〕を加え、懸濁し、０．４ｍｌの溶液ＩＩ（０．２Ｎ  ＮａＯＨ、１％ＳＤＳ）を加え、０℃で５分間保持した。これに０．３ｍｌの溶液ＩＩＩ〔５Ｍ酢酸カリウム（ｐＨ４．８）〕を加え、０℃で１５分間保持した後、遠心分離し、上清を回収した。イソプロピルアルコール０．６ｍｌを加え０℃で１０分間保持した後、遠心により沈殿を回収し、これを７０％エタノールで洗浄し乾燥した。これに２０μｇ／ｍｌのＲＮａｓｅＡを０．１ｍｌ加え、３７℃で４０分間反応させ、０．０３ｍｌの１Ｍ  ＭｇＣｌ2を加え０℃で１０分間保持した。遠心分離により、上清を回収しこれに０．０６ｍｌの溶液ＩＶ〔２０％ポリエチレングリコール＃6000、２Ｍ  ＮａＣｌ〕を加え、攪拌し、０℃で６０分間保持した。遠心分離で沈殿を回収後、ＴＥ溶液に溶解した。このＤＮＡ溶液にＢａｌＩ制限酵素を作用させ、アガロースゲル電気泳動を行いＢａｌＩリンカーを含むプラスミドを選択した。
ついで、このＥｃｏＲＶ切断部位にＢａｌＩリンカーが挿入されたプラスミドをＮｒｕＩ制限酵素で消化し、上記の方法に準じ、ＮｒｕＩ制限酵素切断部位にもＢａｌＩリンカーを導入した。その結果ｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＶ制限酵素切断部位及びＮｒｕＩ制限酵素切断部位にＢａｌＩリンカーを導入したベクターが得られた。当該ベクターをｐＢＢＢ１と命名した。
【００３２】
実施例３
ライブラリーの作製
実施例１で得られた Ｂａｌ菌の染色体ＤＮＡ２５μｇに１ユニットの制限酵素Ｓａｕ３ＡＩを緩衝液〔５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１ｍＭ  ＤＴＴ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ〕中、３７℃で１〜１０分間反応させて部分消化した後、アガロースゲル電気泳動を行い、 ゲルより３〜７ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。このＤＮＡ断片をあらかじめＢａｍＨＩで開裂しておいたｐＢＢＢ１に結合した後、これらのプラスミドでエシェリヒア・コリＥＲ１６４８を形質転換した。こうして得られた形質転換体からアルカリ−ＳＤＳ法によってプラスミドを抽出し、プラスミドライブラリーを調製した。
【００３３】
実施例４
修飾酵素遺伝子の単離
実施例３で得られたプラスミドライブラリー３μｇにＢａｌＩ制限酵素５０ユニットを緩衝液〔２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、７ｍＭ  ＭｇＣｌ2、７ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、０．０１％ウシ血清アルブミン〕中３７℃で３時間反応させた。このとき ＢａｌＩ修飾酵素が発現しているプラスミドはＢａｌＩ制限酵素で切断されない。反応後、フェノール処理、エタノール沈殿を行い、ＤＮＡを回収した。つぎに、このＤＮＡを１００ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に溶解し、２．５ユニットのアルカリホスファターゼを加えて５５℃で１時間反応させた後、フェノール抽出、エタノール沈殿を行い、再びＤＮＡを回収した。こうして得られた切断されている、あるいは切断されていないプラスミドＤＮＡの混合物でエシェリヒア・コリＥＲ１６４８を形質転換した。このとき、切断されていない環状のプラスミドのみが効率よくエシェリヒア・コリ中に導入され、アンピシリンを含むプレート上で形質転換体として選択される。この結果、約１０,０００個のコロニーが出現し、この中から１０個のコロニーを無作為に選択した。つぎに、それぞれのコロニーを１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２ｍｌのＬ培地で３７℃で１６時間培養した後に集菌し、アルカリ−ＳＤＳ法にてプラスミドを抽出して、ＢａｌＩ制限酵素で処理した。その結果、３個のプラスミドがＢａｌＩ制限酵素に対して耐性を示したが、このうち２個はプラスミド上のＢａｌＩ部位そのものが欠失しており、残りの１個のみがＢａｌＩ修飾酵素遺伝子を発現していた。このようにして、ＢａｌＩ修飾酵素遺伝子を含んでいる形質転換体が得られた。しかしながら、この形質転換体についてＢａｌＩ制限酵素活性を解析したところ、活性は認められなかった。
【００３４】
実施例５
修飾酵素遺伝子の解析
実施例４で得られたＢａｌＩ修飾酵素が発現しているプラスミドは約５．２ｋｂのＢａｌ菌由来のＤＮＡ断片を含んでいた。該プラスミドをｐＢＢ５と命名した。つぎに、ＢａｌＩ修飾酵素遺伝子の位置を限定するために、当該ＤＮＡ断片の制限酵素地図を作成し、これを用いて様々の領域を欠失させたＤＮＡ断片をもつプラスミドを作製し、修飾酵素活性を測定した。その結果を図１に示す。すなわち、ＢａｌＩ修飾酵素遺伝子は約３．２ｋｂのＤＮＡ断片上に存在することがわかった。この約３．２ｋｂのＤＮＡ断片を含むＥｃｏＲＶ−ＳｓｐＩ断片（約３．７ｋｂ）をｐＢＢ５から切り出し、ｐＢＢＢ１に結合させたプラスミドを作製し、ｐＢＳＲ１と命名した。図２にｐＢＳＲ１の構築過程を示す。
【００３５】
実施例６
ＢａｌＩ制限酵素のＮ末端側アミノ酸配列の決定
Ｂａｌ菌よりゲリナスの方法でＢａｌＩ制限酵素を精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した後、ＰＶＤＦ膜に移し、クマシーブリリアントブルーにより染色し、１０％酢酸−５０％メタノールで脱色した。分子量約２９,０００のＢａｌＩ制限酵素の部分を切り取り、アミノ酸シークエンサー４７０Ａ型（アプライドバイオシステムズ社製）に供し自動エドマン分解により、Ｎ末端側アミノ酸配列を決定した。そのアミノ酸配列を配列表の配列番号５に示す。
【００３６】
実施例７
ＢａｌＩ 制限・修飾系遺伝子の構造解析
ｐＢＳＲ１に挿入されているＤＮＡ断片の塩基配列を、エキソヌクレアーゼＩＩＩ（宝酒造社製）、およびマングビーンヌクレアーゼ（宝酒造社製）を用いて種々の大きさの欠失変異体を作成した後、ジデオキシ法で決定した。その塩基配列を配列表の配列番号６に示す。さらに、ＯＲＦを検索した結果、塩基番号４３７〜１２７６に正方向のＯＲＦ（ＯＲＦ１）および１２７９〜２０５８に逆方向のＯＲＦ（ＯＲＦ２）が存在した。ＯＲＦ１の塩基配列および推定されるアミノ酸配列を配列表の配列番号４に、アミノ酸配列のみを配列番号３に示す。ＯＲＦ２の塩基配列および推定されるアミノ酸配列を配列表の配列番号２に、アミノ酸配列のみを配列番号１に示す。各欠失変異体とＢａｌＩ修飾酵素活性の関係から、ＯＲＦ１がＢａｌＩ修飾酵素をコードしていると決定した。また、Ｎ末端側アミノ酸配列がＯＲＦ２のそれと一致することから、ＯＲＦ２がＢａｌＩ制限酵素をコードしていると決定した。さらに、配列番号１のアミノ酸配列から計算される分子量は２９,０４３であり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果とよく一致した。
図３にクローニングされたＢａｌＩ制限・修飾系酵素遺伝子の構造を示す。図中、Ｍは修飾酵素遺伝子を、Ｒは制限酵素遺伝子を、矢印はＯＲＦの方向を表す。以上より、ＢａｌＩ制限・修飾系酵素遺伝子の構造が明らかとなり、かつＢａｌＩ制限酵素遺伝子はその全体がクローニングされているにもかかわらず、エシェリヒア・コリ内で発現しないことが明らかとなった。
【００３７】
実施例８
ＢａｌＩ制限酵素遺伝子の発現系構築
配列表の配列番号７で表されるＢＡＬ−Ｒ１プライマーと配列番号８で表されるＢＡＬ−Ｒ２プライマーをプライマー対とし、ｐＢＳＲ１をテンプレートとして、９４℃で１分間、５５℃で２分間、７２℃で２分間、２５サイクルのＰＣＲを行い、ＯＲＦ２の部分を増幅した。なお、ＢＡＬ−Ｒ１プライマーは１番目の塩基がＡになっているので増幅された遺伝子の開始コドンはＧＴＧからＡＴＧに変換される。つぎに、この増幅されたＤＮＡ断片をｐＳＴＶ２８ベクターのＳｍａＩ部位に挿入し、ｌａｃプロモーターの下流にＢａｌＩ制限酵素遺伝子が配置されるようにした。このベクターをｐＳＲＢ８と命名した。
ｐＢＳＲ１およびｐＳＲＢ８によりエシェリヒア・コリＥＲ１６４８株を形質転換し、得られた形質転換体の抽出液のＢａｌＩ制限酵素活性を測定したところ、活性が認められた。上記のごとく、この形質転換体を Escherichia coli ER1648/pBSR1/pSRB8と命名、表示し、工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託した（ＦＥＲＭ  Ｐ−１４６２５）。このようにして、ＢａｌＩ制限酵素を発現する形質転換体が得られた。
【００３８】
実施例９
ＢａｌＩ 制限酵素の形質転換体による生産
実施例８で得られたEscherichia coli  ER1648/pBSR1/pSRB8 （ＦＥＲＭ  Ｐ−１４６２５）をアンピシリン１００μｇ／ｍｌとクロラムフェニコール３０μｇ／ｍｌを含む１００ｍｌのＬ培地に接種し、３７℃で５時間培養した後、ＩＰＴＧを最終濃度が１ｍＭになるように添加し、更に３７℃で５時間培養した。集菌により得られた１ｇの菌体を、５ｍｌの１０ｍＭ  ２−メルカプトエタノールを含む２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）に懸濁し、超音波処理で菌を破砕し、超遠心分離（１０,０００ｇ、３０分）により上清を回収した。上清の活性を測定したところ、ＢａｌＩ 制限酵素は湿菌体１ｇ当り約７０,０００ユニット生産されており、これはＢａｌ菌からの生産量と比較して約１,０００倍の上昇であった。以上のように、ＢａｌＩ制限酵素の大量生産系が完成した。
【００３９】
【発明の効果】
以上詳細に説明したとおり、本発明によりＢａｌＩ制限・修飾系酵素遺伝子が単離された。該遺伝子を含有するプラスミドで形質転換したエシェリヒア・コリにより、遺伝子工学において有用なＢａｌＩ制限酵素を効率よく大量に製造することが可能となった。
【００４０】
【配列表】
【００４１】
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【００４２】
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【００４３】
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【００４４】
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【００４５】
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【００４６】
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【００４７】
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【００４８】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  各欠失変異体と修飾酵素活性の関係を示す図である。
【図２】  ｐＢＳＲ１の構築過程を示す図である。
【図３】  ＢａｌＩ制限・修飾系酵素遺伝子の構造を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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