(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験医薬およびSarcophagaレクチンの存在下においてヒト腸管のマクロファージを培養し、被験医薬によるマクロファージのＴＮＦ産生の阻害をモニターすることを含む、クローン病の治療及び／又は予防のための医薬のスクリーニング法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、クローン病の治療及び／又は予防のための医薬のスクリーニング法に関する。より詳細には、本発明は、被験医薬によるヒト腸管マクロファージのＴＮＦ産生の阻害をモニターすることを含む、クローン病の治療及び／又は予防のための医薬のスクリーニング法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
レクチンは炭水化物を認識するタンパク質の一種であり、動物および植物に広く分布して多くの機能を担っている。レクチンは、生体の発達において細胞間相互作用及び細胞基質間相互作用の仲介、並びに免疫応答に関与していると考えられる。免疫応答への関与について言えば、レクチンは免疫系にシグナルを送り、そのシグナルにより生物は自己決定基と、非自己決定基または修飾自己決定基とを識別していると考えられている。
本発明者らはこれまでにSarcophaga peregrina及びDrosophila melanogasterの体液レクチンについて研究し、Sarcophaga及びDrosophila由来の２種類のレクチンを単離している（H.Komano,他、J.Biol.Chem.(1981)256,7087-7089；S.Haq.他、J.Biol.Chem.(1996)271,20213-20218;及びY.Fujita他、J.Biol.Chem. (1998) 273, 9667-9672）。これらのレクチンのうち、Sarcophagaレクチンは昆虫の先天性免疫で一定の機能を有することが示された（S.Natori他、In New Directions in Invertabrate Immunology, pp.175-187, SOS Publications, Fair Haven(1996)）。これまでのレクチンの研究を通じて、Sarcophagaレクチンは生体内で防御と発達において２つの独立した機能を有していることが判明しており、具体的には、Sarcophagaレクチンは防御分子として機能するだけではなく、成体構造への分化におけるエフェクター分子としても機能することが分かっている（N.Kawaguchi他、Dev.Biol.  (1991)144,86-93）。
【０００３】
先天性免疫の大部分は脊椎動物と非脊椎動物との間で共通していると考えられるので、Sarcophagaレクチンが血液細胞を活性化して非自己羊赤血球を摂取するならば、哺乳動物のマクロファージを活性化する可能性もあった。
そこで、本発明者らはマウス免疫系に対するSarcophagaレクチンの作用を詳細に調べた。その結果、マウス同質遺伝子腫瘍ＭＭ４６細胞がインビトロでSarcophaga レクチンの存在下において腹腔マクロファージによって殺傷されることが判明した。この殺傷のメカニズムを研究した結果、Sarcophaga レクチンはマウスのマクロファージを活性化してＴＮＦ−αを産生し、これにより腫瘍細胞が選択的に殺傷されていること、さらに、マクロファージとＭＭ４６細胞は共にその細胞表面上にSarcophaga レクチンのレセプターを有することが判明した（Y.Ohkuma,他、Cancer Res.(1985)45, 288-292；及びY.Ohkuma,他、Cancer Res.(1985)45, 4397-4400）。Sarcophaga レクチンは二価分子であり、一分子は２個の炭水化物結合部位を含む。Sarcophaga レクチンはレセプターに結合することによってマクロファージと腫瘍細胞との間に華僑を形成している可能性が高い。Sarcophagaレクチンがそのレセプターに結合するとマクロファージは活性化し、ＴＮＦ−αが分泌され、接着している腫瘍細胞が殺傷されるものと考えられる。
【０００４】
本発明者らは更に、マウスマクロファージと腫瘍細胞上のSarcophaga レクチンレセプターを精製し、それらに対する抗体を作製した。これらのレセプターはSarcophaga レクチンに対する親和性を示すものの、互いに免疫学的に交差反応しなかいため異分子であることが判明した。これらのレセプターは共に２つのサブユニットから成り、両レセプターの分子構造は類似している。マクロファージレセプターに対する抗体はSarcophaga レクチン依存性マクロファージ仲介腫瘍細胞殺傷反応を阻害し、同様に、腫瘍細胞レセプターに対する抗体もこの殺傷反応を阻害した。従って、これらレセプターは両方とも腫瘍殺傷反応に重要であり、腫瘍細胞の殺傷のためにはSarcophaga レクチンはマクロファージと腫瘍細胞の間に華僑を形成する必要があると考えられる。
【０００５】
昆虫レクチンに対するレセプターがマウスマクロファージの表面上に存在することは興味深い。マウスマクロファージは細菌由来のリポ多糖（ＬＰＳ）によって活性化されることが知られており、ＬＰＳによるマクロファージの活性化のためには、ＬＰＳを保持するＬＰＳ結合蛋白質がＣＤ１４と相互作用すると考えられており、このＣＤ１４が、Toll／ＩＬ−１受容体ホモロジードメイン（ＴＩＲ）を含有するＴＬＲ４（Toll様レセプター）と結合する。即ち、マウスマクロファージは、ＬＰＳによって活性化される経路とSarcophaga レクチンによって活性化される異なる情報伝達経路を有している。上記したようにマウスマクロファージ上のSarcophaga レクチンレセプターについては研究されていたが、ヒトマクロファージについての知見は未だ報告されていない。
【０００６】
マクロファージの活性化が関与するヒトにおける疾患の一つとしてクローン病が知られている。クローン病は局限性の腸管の炎症性疾患であり、日本ではそれほど多くの症例はないが、欧米では症例が多く、かなり深刻な疾病の一つである。クローン病では、炎症部位で腸管のマクロファージが活性化されてＴＮＦ-αを産生するために炎症が一層悪化する。従って、症状の緩和のために抗ＴＮＦ-α抗体の適用が考えられているが、対症療法に過ぎず十分な効果をあげるには至っていない。
ヒト腸管マクロファージを活性化してＴＮＦ−αの産生を誘導する物質とそのレセプターを解明することができれば、当該レセプターの作用をブロックする医薬をスクリーニングすることにより、クローン病の治療及び／又は予防のための医薬を開発することができる。しかしながら、ヒト腸管のマクロファージはＣＤ１４を欠いているため、バクテリアのリポ多糖(ＬＰＳ)では活性化されず、クローン病に見られる腸管マクロファージ活性化のメカニズムは不明であった。特にヒト腸管マクロファージ上に存在するＴＮＦ産生誘導物質のレセプターの存在に関する知見は、現在までに報告されていない。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ヒト腸管マクロファージを活性化してＴＮＦ−αを産生する物質を同定することを解決すべき課題の一つとした。
本発明はまた、ヒト腸管マクロファージを活性化してＴＮＦ−αを産生する物質のレセプターの存在を確認することを解決すべき課題の一つとした。
本発明はまた、被験医薬によるヒト腸管マクロファージのＴＮＦ産生の阻害をモニターすることを含む、クローン病の治療及び／又は予防のための医薬のスクリーニング法を提供することを解決すべき課題の一つとした。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、ＬＰＳでは活性化されないヒト腸管のマクロファージが、Sarcophagaレクチンによって活性化され、ＴＮＦを産生することを見出し、これによりヒト腸管のマクロファージ上のSarcophagaレクチンレセプターの存在が明らかになった。また、上記知見によりSarcophagaレクチンによるＴＮＦ産生を阻害する薬物をスクリーニングすることによりクローン病治療薬の探索を行うことができることが判明した。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。
【０００９】
即ち、本発明の一側面によれば、被験医薬およびSarcophagaレクチンの存在下においてヒト腸管のマクロファージを培養し、被験医薬によるマクロファージのＴＮＦ産生の阻害をモニターすることを含む、クローン病の治療及び／又は予防のための医薬のスクリーニング法が提供される。
本発明の別の側面によれば、ヒト腸管のマクロファージ上に存在するSarcophagaレクチンレセプターのアンタゴニストを選択することを含む、クローン病の治療及び／又は予防のための医薬のスクリーニング法が提供される。
【００１０】
本発明のさらに別の側面によれば、ヒト腸管のマクロファージ上に存在するSarcophagaレクチンレセプターとSarcophagaレクチンとの相互作用をモニターすることを含む、クローン病の治療及び／又は予防のための医薬のスクリーニング法が提供される。
本発明にさらに別の側面によれば、上記した本発明のスクリーニング法により選択されるクローン病の治療及び／又は予防のための医薬が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、ヒト腸管のマクロファージ上に存在するSarcophagaレクチンレセプターから成る、クローン病の治療及び／又は予防のための医薬のスクリーニング試薬が提供される。ヒト腸管のマクロファージ上に存在するSarcophagaレクチンレセプターは、細菌由来のリポ多糖によっては活性化されないレセプターである。
【００１１】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施方法および実施態様について詳細に説明する。
本発明のスクリーニング法の一態様では、被験医薬およびSarcophagaレクチンの存在下においてヒト腸管のマクロファージを培養し、被験医薬によるマクロファージのＴＮＦ産生の阻害がモニターされる。
上記スクリーニング法は、Sarcophagaレクチンとヒト腸管マクロファージを用いることを特徴とする。本発明者らは今回、ヒト腸管マクロファージをSarcophagaレクチンによって刺激することにより、当該マクロファージのＴＮＦ産生能が上昇することを見出した。これは、Sarcophagaレクチンがマクロファージ上のレセプターと相互作用することによって、シグナルが細胞内へと伝達し、その結果としてマクロファージのＴＮＦ産生能を上昇するものである。なお、SarcophagaレクチンによってマクロファージのＴＮＦ産生能が増大する機構については、マウスマクロファージについては従来に報告されていたが、ヒトマクロファージについては今回初めて見出されたものである。
【００１２】
マクロファージは一般に、大食細胞とも呼ばれる径約１５〜２０μｍの単核細胞で、細胞質に富み、粘着しやすく偽足を出して運動する。マクロファージは下等動物から高等動物に至るまで広く分布し、生体防御機構の主役を担う細胞の一つである。本発明はクローン病の治療及び／又は予防のための医薬のスクリーニングをターゲットとしているため、ヒト腸管のマクロファージを使用する。
【００１３】
本明細書で言う「Sarcophagaレクチン」とは、Sarcophaga由来のレクチンを広く意味し、その構造は既知である（H.Komano,他、J.Biol.Chem.(1981)256, 7087-7089；Y.Fujita他、Biol.Chem.(1998)273,9667-9672；及びJ.Biol. Chem. (1985)260, 12228-12233）。Sarcophagaレクチンは、分子量３０ｋＤａを有するサブユニット蛋白質のホモ６量体から成り、６個のサブユニットのうちの４個のサブユニットはグリコシル化されている。サブユニット蛋白質は２６０アミノ酸残基から成り、Ｎ−グリコシル化部位を含有している。また、炭水化物認識ドメイン（ＣＲＤ）はアミノ末端側に位置している。
【００１４】
Sarcophagaレクチンは体腔内に侵入した外来細胞の排除に必要な物質であるが、それ自体は溶血活性を有しない。従って、Sarcophagaレクチンはカスケード系を活性化することによって侵入してくる外来細胞を最終的に溶解しているのか、あるいはこれらの細胞を貪食するように血液細胞を誘導しているものと考えられる。また、Sarcophagaレクチンの遺伝子は、幼虫に細菌を感染させた場合または幼虫の体壁を皮下針で傷つけた場合などに活性化される他、胚期初期および蛹期初期において一時的に活性化される。なお、Sarcophagaの発達中におけるこのレクチンの機能についてはS.Natori、Phylogenetic Perspectivies in Immunity: the Insect Host Defense, pp.67-75, R.G.Landes Company, Austin(1994)等にも記載されている。
【００１５】
本明細書で言う「ＴＮＦ」とは、腫瘍壊死因子（tumor necrosis factor）を略したものである。ＴＮＦは蛋白質性の高分子物質であり、ある種の固形癌や試験管内の培養腫瘍細胞に対して障害活性を有する物質である。
マクロファージによるＴＮＦ産生の阻害をモニターする方法は当業者に公知である。即ち、被験医薬の添加から一定時間毎にマクロファージの培養上清を回収し、回収した培養上清中におけるＴＮＦ量を測定すればよい。ＴＮＦの定量法は当技術分野で公知である。例えば、インビトロでＴＮＦ活性を測定する方法としては、「Lymphokines ２」ｐ．２３５〜ACADEMIC PRESS(1981)に記載の方法（培養細胞Ｌ−９２９細胞に対する増殖抑制活性によって測定する方法）などが挙げられ、またインビボで測定する方法としては、Carswell,E.A.他、Proc.Nat.Acad.Sci.USA., 72, 3666-3670(1975)（ＢＡＬＢ／Ｃマウス皮内のＭｅｔｈＡ内腫の壊死で判定する方法またはｄｄＹマウスのＥｈｒｌｉｃｈ癌に対する壊死活性によって判定する方法）に記載の方法などが挙げられる。また、このようなＴＮＦの定量は市販の定量キットを使用して行うこともできる。
【００１６】
本発明は、クローン病の治療及び／又は予防のための医薬のスクリーニング法に関する。クローン病とは、局限性の腸管の炎症性疾患（局限性回腸炎、終末回腸炎、局限性腸炎、局限性小腸結腸炎、回腸末端炎、瘢痕形成性小腸結腸炎など）である。クローン病患者の炎症部位では、腸管のマクロファージが活性化されてＴＮＦ-αを産生するために炎症が一層悪化する。従って、このマクロファージの活性化によるＴＮＦ-αの産生をブロックする薬剤が見つかれば、クローン病の治療及び／又は予防に有用であると考えられる。
本発明者らの今回の研究により、Sarcophagaレクチンがヒトマクロファージを活性化してＴＮＦ産生を増大させることが判明した。従って、ヒトマクロファージ上に存在するSarcophagaレクチンレセプターをブロックする薬剤が見つかれば、その薬剤はクローン病の治療及び／又は予防に有用であると考えられる。
【００１７】
本発明はまた、ヒト腸管のマクロファージ上に存在するSarcophagaレクチンレセプターのアンタゴニストを選択することを含む、クローン病の治療及び／又は予防のための医薬のスクリーニング法に関する。
本発明で言う「レセプター」とは、Sarcophagaレクチンと結合することによってSarcophagaレクチンからのシグナルをマクロファージ細胞内に伝達するレセプターを意味する。レセプターは一般的には細胞表面に存在し、細胞外のSarcophagaレクチンがレセプターに結合することによって当該レセプターの構造、機能などに変化が生じ、その変化が細胞内のシグナル伝達経路に伝達され、最終的には当該マクロファージのＴＮＦ産生能が向上する。
本明細書で言う「アンタゴニスト」とは、ヒト腸管のマクロファージ上に存在するSarcophagaレクチンレセプターと相互作用して、SarcophagaレクチンなどのアゴニストによるＴＮＦ産生作用を阻害するが、アンタゴニスト自体は上記レセプターと結合してもＴＮＦ産生を増大させることはない物質を意味する。
【００１８】
本発明はまた、ヒト腸管のマクロファージ上に存在するSarcophagaレクチンレセプターとSarcophagaレクチンとの相互作用をモニターすることを含む、クローン病の治療及び／又は予防のための医薬のスクリーニング法に関する。
また、ここで言うレセプターには、ヒト腸管のマクロファージ上に存在する天然のレセプター蛋白質のみならず、遺伝子組み換え技術によって発現させた組み換え蛋白質、あるいは化学合成によって作製した合成蛋白質も含まれる。
さらにまた、上記レセプターは、少なくともSarcophagaレクチンと結合することができる部分蛋白質でもよく、またSarcophagaレクチンと結合することができる限りは、天然又は非天然のレセプター蛋白質の誘導体または変異体でもよい。例えば、天然のSarcophagaレクチンレセプター蛋白質又はその断片のアミノ酸の１つ以上が、結合活性の消失なしに置換又は欠失したタンパク質を用いてもよい。このような変異体は、ペプチド化学の既知の方法により、又は組換えＤＮＡ法により生成することができる。
【００１９】
なお、ヒト腸管のマクロファージ上に存在するSarcophagaレクチンレセプターは、Sarcophagaレクチンとの免疫沈降法など当業者に公知の方法によって単離することができる。あるいはマウス等の類縁動物におけるホモログ遺伝子が単離されれば、それをプローブとして用いてヒト腸管マクロファージ由来のｃＤＮＡライブラリー等をスクリーニングすることによってヒトマクロファージのSarcophagaレクチンレセプターをコードする遺伝子も単離できると考えられる。
SarcophagaレクチンレセプターとSarcophagaレクチンとの相互作用をモニターする方法は当業者に公知であり、例えば以下のような方法がある。
【００２０】
（１）免疫沈降法
例えば、各濃度の被験医薬の存在下において、SarcophagaレクチンとSarcophagaレクチンレセプターを適当な溶液中で混合し相互作用させた後、これらの複合体を免疫沈降させる。次いで、沈降物をイムノブロットした後、複合体を検出するのに適した抗体を用いて検出し、沈降物の量を定量することによりSarcophagaレクチンとSarcophagaレクチンレセプターとの相互作用に及ぼす被験医薬の影響を調べることができる。
（２）ＥＬＩＳＡ法
担体（プレート、ナイロンフィルター、ニトロセルロースフィルター等）にSarcophagaレクチンを固定し、標識したSarcophagaレクチンレセプターとの結合阻害を被験医薬の存在下においてモニターすることができる。あるいは逆にSarcophagaレクチンレセプターをプレートに固定しておき、標識したSarcophagaレクチンとの結合阻害を被験医薬の存在下でモニターしてもよい。
【００２１】
（３）酵母2-hybrid系の応用
Sarcophagaレクチン及びSarcophagaレクチンレセプターを酵母内で同時に発現させておき、その細胞に被験医薬（ｃＤＮＡライブラリー又はペプチドライブラリー等）を導入することにより、Sarcophagaレクチン及びSarcophagaレクチンレセプターの相互作用に影響を与えるようなｃＤＮＡを保持する酵母クローンをスクリーニングする。得られたアミノ酸配列から低分子化合物をデザインすることができる。
（４）動物細胞の利用
ＣＡＴやルシフェラーゼのような動物細胞での活性測定が容易なレポーター遺伝子を利用して、Sarcophagaレクチン及びSarcophagaレクチンレセプターの相互作用が存在する場合に活性を有する系（細胞）を構築する。この細胞にｃＤＮＡ、ペプチドライブラリーあるいは細胞膜透過性の高い低分子ケミカルライブラリーを与え、Sarcophagaレクチン及びSarcophagaレクチンレセプターの相互作用に影響を与えるような物質をレポーター遺伝子発現の変化としてスクリーニングする。
【００２２】
本発明のスクリーニング法で使用するSarcophagaレクチンレセプターは、蛋白質の形態でアッセイ系に供給してもよいし、あるいは発現ベクター等に組み込んだＤＮＡの形態でアッセイ系に供給し、アッセイ系内で発現させたものでもよい。このように、Sarcophagaレクチンレセプターは、本発明のクローン病の治療及び／又は予防のための医薬のスクリーニング法で用いるためのスクリーニング試薬として使用することができる。
また、蛋白質の形態で供給する場合でもＤＮＡの形態で供給する場合でも、Sarcophagaレクチンレセプター、被験医薬、及び所望によりSarcophagaレクチンを供給する順序は限定されず、同時に供給してもよいし、何れかを先に供給してもよい。
【００２３】
SarcophagaレクチンレセプターとSarcophagaレクチンとの相互作用に対する被験医薬の影響は、被験医薬を添加しないコントロールと比較して測定することが好ましい。また、被験医薬の添加量を変化させて相互作用への影響が添加量に依存しているかどうかを調べたり、あるいは継続的にアッセイを行い蛋白質間相互作用に対する影響の経時的変化を調べることが好ましい。
被験医薬が、SarcophagaレクチンレセプターとSarcophagaレクチンとの相互作用を低下させる作用を有していれば、当該被験医薬は有効な医薬の候補として選択することができ、こうして選択された医薬は、更なる試験に付して薬効を確認することができる。
【００２４】
本発明はまた、上記したスクリーニング法により選択されるクローン病の治療及び／又は予防のための医薬に関する。
医薬の種類は特に限定されないが、例えば、サイトカイン類、小分子医薬、（細胞透過性小分子医薬などを含む）、ホルモン、特異性抗体、ペプチド模倣物、アンチセンスオリゴヌクレオチド、および細胞機能またはタンパク質発現を改変する他の医薬のような任意の医薬などを挙げることができる。
【００２５】
【実施例】
以下の実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されることはない。
実施例１：ヒト大腸腸管マクロファージの調製
ヒト大腸組織から粘膜を剥離し、１ｍＭのＤＴＴで１５分間処理し、次いで、１ｍＭのＥＤＴＡで３７℃で１時間処理した。試料を５００Ｕ／ｍｌのコラゲナーゼと１０００Ｕ／ｍｌのジスパーゼにより３７℃で６０分間酵素消化処理し、細胞を回収した。遠心管（Ficoll-Paque）に重層し、遠心分離するこによって単核細胞を分離した。細胞を含む液を４〜５×１０6細胞／ｍｌに希釈し、０．５ｍｌを２４ウエルプレートにまいた。３７℃５％ＣＯ2インキュベーター内で細胞を一晩培養し、非付着細胞を除去することにより、ヒト大腸腸管マクロファージを調製した。
【００２６】
実施例２：Sarcophagaレクチン刺激によるヒト大腸腸管マクロファージのＴＮＦ産生の活性化試験
実施例１で調製したヒト大腸腸管マクロファージを１０％胎児ウシ血清と抗生物質を含むＲＰＭＩ１６４０培地中で３７℃で５％ＣＯ2の条件下で培養し、細菌由来のリポ多糖（１０μｇ／ｍｌ）、ポークウイード（porkeweed）マイトジェン（１０μｇ／ｍｌ）、Sarcophagaレクチン（１０μｇ／ｍｌ）、Sarcophagaレクチン（１μｇ／ｍｌ）及びSarcophagaレクチン（１００ｎｇ／ｍｌ）をそれぞれ添加してマクロファージを刺激した。また、刺激物質を添加しない細胞をコントロールとして用いた。刺激開始から３、６及び２４時間後に、培養上清中のＴＮＦ活性を、培養細胞Ｌ−９２９細胞に対する増殖抑制活性によって測定した（測定法の詳細は、「Lymphokines 2」ｐ．２３５〜ACADEMIC PRESS（１９８１）を参照）。
【００２７】
刺激開始から３、６及び２４時間後における培養上清中のＴＮＦ活性について測定した結果を図１に示す。図１において横軸は刺激開始後の時間を示し、縦軸は培養上清中のＴＮＦ活性（Ｕ／１０6細胞）を示す。なお、縦軸の単位の「Ｕ」は、一定量の既知の濃度の標準ＴＮＦ４×１０7Ｕ／ｍｇ（ジェネンティック社製）を希釈してＬ−９２９細胞に添加して作成した検量線をもとに、ＴＮＦ活性を算出し求めた。
【００２８】
図１から明らかなように、１μｇ／ｍｌ及び１００ｎｇ／ｍｌのSarcophagaレクチンを添加した場合に、マクロファージのＴＮＦ産生能が活性化されたが、リポ多糖（１０μｇ／ｍｌ）を添加してもマクロファージのＴＮＦ産生能はそれほど活性化されなかった。
これらの結果から、ヒト大腸腸管マクロファージ細胞上には、Sarcophagaレクチンレセプターが存在し、Sarcophagaレクチンはこのレセプターを介してマクロファージのＴＮＦ産生を促進していることが判明した。
【００２９】
【発明の効果】
本発明により、Sarcophagaレクチンによりヒト腸管マクロファージのＴＮＦ産生能が上昇することが明らかになった。従って、Sarcophagaレクチンによるヒト腸管マクロファージのＴＮＦ産生能の上昇をブロックする薬剤を探索することによりクローン病の治療及び／又は予防のための医薬をスクリーニングすることが可能になった。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、刺激開始後における培養上清中のＴＮＦ活性について測定した結果を示す図である。
【図１】
0003741252.tif 000002