(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
検査対象のサンプルを含む溶液に複数種類のプライマーを含むプライマー群を入れ，検査しようとする複数のターゲットの核酸配列を含む領域のそれぞれで同時に相補鎖合成を行う工程と，
前記ターゲットの核酸配列の変異の有無により相補鎖伸長が影響を受ける配列を持つＤＮＡプローブを前記ターゲットの種類だけ含むプローブ群と前記ターゲットとの間で相補鎖伸長を行う工程と，
前記ターゲット又は前記ターゲットの相補配列を鋳型とした相補鎖伸長反応，及び，前記相補鎖伸長反応で生成するピロリン酸をＡＴＰに変えて化学発光基質と反応させて発光を生じる反応を，前記ターゲット毎に区画された，反応槽の複数のサブセルの中で行なう工程と，
前記発光を検出することにより，前記ターゲットの核酸配列の変異を検出する工程とを有し、
前記ＤＮＡプローブは、前記複数のサブセルの各々に前記ＤＮＡプローブの種類毎に固定され、前記溶液は、前記サブセルからあふれるように前記反応槽へ供給され、かつ余分が除去されるものであり、前記相補鎖伸長反応と前記発光を生じる反応とは、前記ＤＮＡプローブの種類毎に前記複数のサブセルの各々の内部で行なわれることを特徴とする核酸配列の検査方法。
【請求項２】
請求項１に記載の核酸配列の検査方法に於いて，前記プライマー群は，前記ターゲットにハイブリダイズしない任意の第１のアンカー配列を５'末端に持つ第１のアンカープライマー群であり，前記相補鎖合成の後，余剰の前記プライマー群を除去した後，前記ターゲットにハイブリダイズしない任意の第２のアンカー配列を５'末端に持ち，前記相補鎖合成により合成された相補鎖の一部に相補的な配列をもつ第２のアンカープライマー群を用いて相補鎖合成を行い，少なくとも片方の末端に前記第１又は前記第２のアンカー配列を持つＤＮＡ鎖を作製する工程と，前記第１又は前記第２のアンカー配列をプライミング領域として前記ＤＮＡ鎖のコピー数を増幅する工程とを有することを特徴とする核酸配列の検査方法。
【請求項３】
請求項１に記載の核酸配列の検査方法に於いて，増幅された前記ＤＮＡ鎖の片方の１本鎖を鋳型として，前記ターゲットの前記変異の部位と前記ＤＮＡプローブの３'末端とが一致する形で前記ターゲットに前記ＤＮＡプローブをハイブリダイズさせ，前記変異が想定される位置の塩基種により前記ＤＮＡプローブの相補鎖伸長が制御されることを特徴とする核酸配列の検査方法。
【請求項４】
請求項１に記載の核酸配列の検査方法に於いて，前記プライマー群は，前記ターゲットにハイブリダイズしない任意のアンカー配列を５'末端に持つアンカープライマー群であり，該アンカープライマ群の各プライマーは，３'末端が前記ターゲットにハイブリダイズした時に，前記変異が想定される位置に来るように設計されたプライマーであり，前記変異の有無により前記アンカープライマ群の各プライマーの相補鎖伸長が制御されることを特徴とする核酸配列の検査方法。
【請求項５】
請求項４に記載の核酸配列の検査方法に於いて，前記アンカープライマー群の各プライマーが，どの前記ターゲットの配列，及び，３'末端が変異種又は野生種のＤＮＡに，対応するかを相互に識別できるように，前記アンカー配列を変化させていることを特徴とする核酸配列の検査方法。
【請求項６】
請求項１に記載の核酸配列の検査方法に於いて，前記プライマー群は，前記ターゲットにハイブリダイズしない任意の第１のアンカー配列を５'末端に持つアンカープライマー群であり，前記相補鎖合成の後，余剰の前記プライマー群を除去した後，前記ターゲットにハイブリダイズしない任意の第２のアンカー配列を５'末端に持ち，残りの部分が前記相補鎖合成により合成された相補鎖の一部に相補的な配列を持ち，３'末端を変異が期待される前記ターゲット部位にハイブリダイズするべく設計されている第２のアンカープライマーを用いて相補鎖合成を行ない，生成したＤＮＡ鎖を，前記第１アンカー配列の相補鎖部分，又は，前記第２のアンカー配列にハイブリダイズするプライマーを用いて相補鎖合成を行い，ＤＮＡ鎖のコピー数を，ＰＣＲ増幅，ローリングサイクル増幅，ループ構造を利用した増幅の何れかにより増幅することを特徴とする核酸配列の検査方法。
【請求項７】
請求項１に記載の核酸配列の検査方法に於いて，前記ＤＮＡプローブは前記ターゲットの種類に特異的な配列を持ち，前記サブセルに予め保持されており，増幅された前記ＤＮＡ鎖を１本鎖とし，該１本鎖ＤＮＡと前記ＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーションにより，前記１本鎖ＤＮＡを前記サブセルに捕獲することを特徴とする核酸配列の検査方法。
【請求項８】
請求項１に記載の核酸配列の検査方法に於いて，前記ＤＮＡプローブは前記ターゲットの種類に特異的な配列を持ち，前記サブセルにマトリックスと共に予め保持されており，増幅された前記ＤＮＡ鎖を１本鎖とし，該１本鎖ＤＮＡと前記ＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーションにより，前記１本鎖ＤＮＡを前記サブセルに捕獲することを特徴とする核酸配列の検査方法。
【請求項９】
請求項１に記載の核酸配列の検査方法に於いて，前記ＤＮＡプローブは前記ターゲットの種類に特異的な配列を持ち，前記サブセルに予め保持されており，増幅された前記ＤＮＡ鎖を１本鎖とし，該１本鎖ＤＮＡと前記ＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーションにより，前記１本鎖ＤＮＡは前記サブセルに捕獲されており，捕獲された前記１本鎖ＤＮＡ，又は，前記１本鎖ＤＮＡの相補鎖の３'末端を含むアンカー配列をプライマー配列とし，前記サブセルに加えたサークル状ＤＮＡを鋳型として相補鎖合成反応を行なうことを特徴とする核酸配列の検査方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の核酸配列の検査方法に於いて，前記各サブセルに於ける相補鎖合成に使われるプライマーは，複数の前記サブセルで共通であることを特徴とする核酸配列の検査方法。
【請求項１１】
請求項１記載の核酸配列の検査方法に於いて，前記各サブセル内に捕獲されたＤＮＡ鎖又はその相補鎖の３'末端を含むアンカー配列をプライマーの配列として，別途加えられたループ配列を持ったＤＮＡを鋳型として相補鎖合成を行うことを特徴とする核酸配列の検査方法。
【請求項１２】
請求項９に記載の核酸配列の検査方法に於いて，相補鎖合成の対象となるＤＮＡ鎖の捕獲が，前記サブセルを構成する固体表面又は前記サブセルに入れられたビーズの表面に固定された前記ＤＮＡプローブと前記ＤＮＡ鎖との結合によることを特徴とする核酸配列の検査方法。
【請求項１３】
請求項１に記載の核酸配列の検査方法に於いて，対象となる前記ターゲットＤＮＡと関連のない配列を持つＤＮＡ鎖の相補鎖合成により，ピロリン酸を生成することを特徴とする核酸配列の検査方法。
【請求項１４】
請求項１に記載の核酸配列の検査方法に於いて，サンプルから第１の相補鎖を作製するプローブは第１のアンカープライマーであり，アンカー部分は自己ハイブダイズリしたループ状の相補鎖を与える形をしており，前記サブセル内で第２のアンカープライマー及び第３のプライマーを用いた第２の相補鎖合成の鋳型として機能し，前記第２の相補鎖合成により生成するループ状ＤＮＡ鎖の生成により生成したピロリン酸をＡＴＰに変換して化学発光反応を行うことを特徴とする核酸配列の検査方法。
【請求項１５】
検査対象となるサンプルを含む溶液に複数種類のプローブを含むプローブ群を入れ，それぞれの異なるターゲット配列に２つの前記プローブをハイブリダイズさせ，検査しようとするＤＮＡ塩基の変異等の有無で，２つの前記プローブのライゲーション反応による結合反応が影響を受けるＤＮＡプローブ対を含む前記プローブ群を用いて，２つの前記プローブのライゲーション反応により長いＤＮＡ鎖を作製し，前記ＤＮＡ鎖又はその相補鎖を鋳型として少なくとも１回の相補鎖合成を反応相の複数のサブセル内で行う工程と，
前記各サブセル内で生成した相補鎖合成産物のピロリン酸をＡＴＰに変え，化学発光基質と反応させて発光を生じる反応を前記ターゲット配列毎に区画された前記複数のサブセルの各々の中で行い，前記発光を検出する工程とを有し，前記ＤＮＡ鎖又はその相補鎖は，前記サブセル内に種類毎に固定されたサブセル内プローブに結合するものであり，前記溶液は，前記サブセルからあふれるように前記反応槽へ供給供給され、かつ余分が除去されるものであり，前記相補鎖合成と前記発光を生じる反応とは、前記サブセル内プローブの種類毎に前記複数のサブセルの各々の内部で行なわれ、前記検出により遺伝子又はＤＮＡの変異等を検出することを特徴とする核酸配列の検査方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の核酸配列の検査方法に於いて，前記ライゲーション反応に用いる一対の前記プライマー群はそれぞれ，前記ターゲット配列にハイブリダイズしないアンカー配列を３'末端又は５'末端に持ち，前記アンカー配列又はそれらの相補鎖を用いてライゲーション産物を前記アンカー配列の部分をプライミング領域に利用してＰＣＲ増幅して，全ての対象ＤＮＡ部位を一度に増幅して化学発光検出の為の相補鎖合成反応の鋳型として用いることを特徴とする核酸配列の検査方法。
【請求項１７】
請求項１５に記載の核酸配列の検査方法に於いて，増幅された前記ＤＮＡ鎖を１本鎖とし，前記ターゲット配列の種類に特異的なＤＮＡ塩基配列を利用してサブセルに予め保持されたそれぞれの特異配列を認識できるＤＮＡプローブで捕獲し，前記サブセル内でそれぞれの前記ターゲット配列の相補鎖合成を行うことを特徴とする核酸配列の検査方法。
【請求項１８】
請求項１５に記載の核酸配列の検査方法に於いて，増幅された前記ＤＮＡ鎖を１本鎖とし，前記ターゲット配列の種類に特異的なＤＮＡ塩基配列を前記サブセルに分配し，前記サブセルに予めマトリックス等と共にプローブを保持しておき，前記プローブは前記サブセル毎に異なる前記ターゲット配列を認識する特異配列を持ち，前記サブセル内でそれぞれの前記ターゲット配列の相補鎖合成を行うことを特徴とする核酸配列の検査方法。
【請求項１９】
請求項１５に記載の核酸配列の検査方法に於いて，前記各サブセルに捕獲された前記ＤＮＡ鎖又はその相補鎖の３'末端を含むアンカー配列をプライマーの配列とし，前記サブセルに加えたサークル状ＤＮＡを鋳型として相補鎖合成反応を行うことを特徴とする核酸配列の検査方法。
【請求項２０】
請求項１９に記載の核酸配列の検査方法に於いて，前記各サブセルに於ける相補鎖合成に使われるプライマーは少なくとも複数の前記サブセルにおいて共通のプライマーであることを特徴とする核酸配列の検査方法。
【請求項２１】
請求項１５に記載の核酸配列の検査方法に於いて，前記各サブセル内に捕獲された前記ＤＮＡ鎖又はその相補鎖の３'末端を含むアンカー配列をプライマーの配列として，別途加えられたループ配列を持ったＤＮＡを鋳型として相補鎖合成を行うことを特徴とする核酸配列の検査方法。
【請求項２２】
請求項１９に記載の核酸配列の検査方法に於いて，相補鎖合成の対象となる前記ＤＮＡ鎖の捕獲が前記サブセルを構成する固体表面又は前記サブセルに入れられたビーズの表面に固定されたＤＮＡプローブによることを特徴とする核酸配列の検査方法。
【請求項２３】
請求項１５に記載の核酸配列の検査方法に於いて，対象となる前記ターゲット配列と関連のない配列を持つＤＮＡ鎖の相補鎖合成により，ピロリン酸を生成することを特徴とする核酸配列の検査方法。
【請求項２４】
請求項１５に記載の核酸配列の検査方法に於いて，サンプルからライゲーション産物を作製する一対のプローブはアンカープライマーであり，アンカー部分は自己ハイブリダイズしたループ状の相補鎖を与える形をしており，前記一対のプローブの前記ライゲーション産物のＤＮＡ鎖はサブセル内で第３のプライマーを用いた相補鎖合成の鋳型として機能し，相補鎖合成の工程で生成するループ状ＤＮＡ鎖の生成によりピロリン酸を生成することを特徴とする核酸配列の検査方法。
【請求項２５】
ゲノム又は複数のターゲットＤＮＡを鋳型として，（１）同一反応容器内で複数種類の第１のプローブを前記鋳型にハイブリダイズさせ，第１の相補鎖合成により複数種類の第１の相補鎖を得る工程と，
（２）余剰の第１のプローブを合成された前記第１の相補鎖から分離して除去する工程と，
（３）前記第１の相補鎖を鋳型とし，複数種類の第２のプローブを用いて，第２の相補鎖合成を行い，前記ターゲットＤＮＡと部分的に同じ配列を持つ第２の相補鎖を得る工程と，
（４）前記第１の相補鎖の種類毎に区画された複数の領域に於いて，前記第２の相補鎖合成の際，又は，前記第２の相補鎖を鋳型とした相補鎖合成の際に生成するピロリン酸をＡＴＰに変換して生じる化学発光反応を検出する工程を有し，前記第１のプローブは，前記複数の区画された領域の各々に前記第１のプローブの種類毎に固定され，前記ゲノム又は複数のターゲットＤＮＡを含む溶液は，前記複数の区画された領域の各々からあふれるように供給供給され、かつ余分が除去されるものであり，前記相補鎖伸長反応と前記発光を生じる反応とは，前記Ｄ第１のプローブの種類毎に前記区画された領域の各々の内部で行なわれ，前記ターゲットＤＮＡの塩基配列中の特定配列又は変異を検出することを特徴とする核酸配列の検査方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はＤＮＡの検査又は遺伝子診断のための核酸配列の検査方法に関する。特に，ゲノムＤＮＡ中に含まれる種々の変異を複数同時に検査する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヒトゲノム解析計画の進展にともなって病気又は医薬品感受性と遺伝子の関連が解明されつつある。病気や医薬品感受性に関連した遺伝子は単独と言うよりは幾つかが関連し合って作用することが判明してきた。特にヒトゲノムに含まれる１塩基変異（ＳＮＰ）は１０００塩基に一つあると言われ，個人の個性や医薬品に対する感受性又は病気に対する抵抗力等に関与していると言われ，ＳＮＰｓの位置とその種々事象との関連が解明されつつある。実際の病気に関する診断や遺伝子情報に基づくコンサルティングが始まりつつあるが，複数の遺伝子部位のＳＮＰｓ等を効率よくまた，安価に調べる方法の開発が急務となっている。
【０００３】
このような状況下でＳＮＰｓの種々分析方法が提案されている。例えば，ＰＣＲ増幅に際してマーカープローブの分解に伴う蛍光の増加を検出するＴａｑｍａｎアッセイ（文献１：Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88,7276-7280(1991)），３本鎖ＤＮＡの形成とミスマッチを認識する酵素を組み合わせて蛍光標識プローブを分解して蛍光検出するＩｎｖａｄｅｒアッセイ(文献２：Nature Biotech. 17,292-296(1999))，変異を含むＤＮＡ鎖が変異により電気泳動スピードに差ができることを利用してゲル分離検出するＳＳＣＰ(Single Strand Conformation Polymorphisms)(文献３：Genomics 5,874-879(1989))，ＤＮＡチップ（平面にプローブが固定されたＤＮＡプローブアレー）(文献４：Genomics Research 10,853-860(2000))，カラーコードしたビーズにＤＮＡプローブを固定してこれらを集めてプローブアレーとして用いる方法(文献５：Science 287,451-452(2000))等がある。これらは何れもレーザー励起による蛍光の検出を用いている。更に，化学発光を用いたパイロシーケンシング等の方法(文献６：Analytical Biochem. 280,103-110(2000))等が報告されている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
上記したいずれの方法も，安いランニングコスト，簡便で短時間に検査できる，信頼度が高い，等の基本点を全て満たしておらず，新しい方法が望まれていた。発明者等は先に簡便で安価なＤＮＡ変異検出方法(ＢＡＭＰＥＲ:Bioluminometric Assay with Modified Primer Extension Reaction(文献７：Nucl.Acid Res. 29,e93(2001)）を提案し，良好な結果を得ていた。しかし，この方法も測定に先立ってＰＣＲ等で対象となるＤＮＡのコピー数を増やしてから測定する必要があり，更に，測定対象毎に試料を調整し，検査する等手間のかかる課題もあった。
【０００５】
化学発光検出ではピロリン酸をＡＰＳと反応させ，ＡＴＰに変えてる。ＡＴＰはルシフェリンと反応して化学発光を行う。化学発光は感度が高いと言われているがピロリン酸をＡＴＰに変換するＡＰＳもルシフェリンと反応するので通常の検出限界はＤＮＡのコピー数でフェムトモル（ｆｍｏｌ）オーダーである。このため，ターゲットＤＮＡを検査に先立ち増幅することが必要となる。
【０００６】
一方，病気に関連する診断では幾つかの検査部位を調べて診断を下すことが望まれている。そこで複数の検査部位を増幅する必要があるが，検査部位毎に増幅するとコストが高くなりすぎて実用的でない。最近遺伝子発現プロフィール分析に用いられているＤＮＡプローブアレー（ＤＮＡチップ）は複数のターゲット領域を検査するのに適しているが，ターゲットとプローブのハイブリダイゼーションを利用しているため，１塩基の違いを認識することは難しい。このような課題を解決する方法が望まれている。
【０００７】
これまでに開発された又は使用されている方法の多くは検査対象毎にコピー数を増やしたり，試料調製を行い測定する方法であるため，多くの測定部位を持つ検査対象には手間と時間と費用のかかる問題点があった。
【０００８】
本発明の目的は，装置及び検査試薬が安い化学発光を用いた検査方法に基づいて，多数の計測部位をもつ試料の効率よい安価な調製法を含む核酸配列の検査方法を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するために本発明では，複数の測定対象のターゲット（ＤＮＡ断片）を含む試料溶液を反応槽に設けた複数のサブセルに均一に加え，サブセル毎にそれぞれ異なるターゲットにハイブリダイズすべく用意された配列がそれぞれ異なるＤＮＡプローブとターゲットを各サブセル内でハイブリダイズさせ，サブセル内の溶液が混合しない条件下で，相補鎖合成とピロリン酸を原料とした化学発光を行い，全ての測定部位のＳＮＰｓ等を簡便に計測する手段を開示している。
【００１０】
また，アンカープライマーを用いた測定対象となるＤＮＡ断片の相補鎖合成に続き，全てのＤＮＡ断片に共通のユニバーサルプライマー１対を用いて一括して全てのＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅したり，検査部位を含むＤＮＡ相補鎖をアンカー付きプライマーで一括して合成し，ＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅産物，検査部位を含むＤＮＡ相補鎖をもとに，サブセルで繰り返し相補鎖合成を起こして多くのピロリン酸を生成して，ピロリン酸をＡＴＰに変換し化学発光試薬と反応させて光学的に，高感度でＤＮＡ変異を一括検出しうる手法も開示している。また，ターゲットとなるＤＮＡとは別に信号増幅用のＤＮＡ鎖を活用して化学発光の元になるピロリン酸を多量発生させる方法を開示している。
【００１１】
本発明の方法では，ＤＮＡに含まれるターゲットＤＮＡの検出，特にＤＮＡ中の１塩基変異の検出を，ＤＮＡ相補鎖合成の際に生成するピロリン酸をＡＴＰに変換してルシフェリン及びルシフェラーゼと反応させ，生成する化学発光を検出することにより行う。検出感度向上のため，ターゲットが検体中に存在する時にはこれを鋳型とした相補鎖合成反応をトリガーとして多くの相補鎖合成反応が起こるように反応系が構築されている。化学発光を活用して遺伝子変異を調べる方法にパイロシーケンシングがあるが，本発明の方法はこれに比べると４−５桁の高感度が達成され，数百コピーのＤＮＡでも検出可能な方法を提供する。また，これらは多数の検査箇所を同時に調べることを可能とするように反応槽内に多くの反応セルを設けた。
【００１２】
本発明の方法では，ターゲット領域を一括して増幅した後，反応槽内で相互に分離された分割可能なセルに固定したプローブとハイブリダイズさせ，相補鎖合成を行い多くのピロリン酸を各セル内で生成して化学発光反応をそれぞれ独立に行わせることで上記の課題を解決している。即ち，各セルのなかでターゲットとなるＤＮＡ鎖を鋳型として相補鎖合成を行うがその時に１塩基変異が有るか否かによって相補鎖合成が制御されるように工夫する。変異がある時だけ相補鎖合成が起こり，さらにこの相補鎖が次の相補鎖合成の引き金になるように反応をさせることにより膨大な量のピロリン酸を生成して高感度でターゲットＤＮＡの存在と変異の有無を調べることを可能としている。
【００１３】
本発明の代表的な構成を以下に説明する。本発明の第１の構成では，検査対象のサンプルを含む溶液に複数種類のプライマーを含むプライマー群を入れ，検査しようとする複数のターゲットの核酸配列を含む領域のそれぞれで同時に相補鎖合成を行う。検査しようとするターゲットの核酸配列の変異の有無により相補鎖伸長が影響を受ける配列を持つＤＮＡプローブをターゲットの種類だけ含むプローブ群の各ＤＮＡプローブとターゲットとの相補鎖の相補鎖伸長を行う。ターゲット又はターゲットの相補配列を鋳型とした相補鎖伸長反応，及び，相補鎖伸長反応で生成するピロリン酸をＡＴＰに変えて化学発光基質と反応させて発光を生成する反応を，ターゲット毎に区画された，反応槽のサブセルの中で行なう。この発光を検出することにより，ターゲットの核酸配列の変異を検出する。
【００１４】
本発明の第２の構成では，検査対象となるサンプル溶液に複数種類のプローブを含むプローブ群を入れ，それぞれの異なるターゲット配列に２つのプローブをハイブリダイズさせ，検査しようとするＤＮＡ塩基の変異等の有無で，２つのプローブのライゲーション反応による結合反応が影響を受ける形のＤＮＡプローブ対を含むプローブ群を用いて，２つのプローブのライゲーション反応により長いＤＮＡ鎖を作製し，ＤＮＡ鎖又はその相補鎖を鋳型として少なくとも１回の相補鎖合成を反応相槽のサブセル内で行う。各サブセル内で生成した相補鎖合成産物のピロリン酸をＡＴＰに変え，化学発光基質と反応させて発光を生成する反応をターゲット配列毎に区画されたサブセルの中で行い，発光を検出することにより，遺伝子又はＤＮＡの変異等を検出する。
【００１５】
本発明の第３の構成では，ターゲットとなるＤＮＡ鎖を鋳型として変異の有無により相補鎖合成反応が制御可能なプライマーであり，５’末端に共通配列を持つ複数のプライマーを用いて相補鎖合成を行った後，相補鎖合成の産物を増幅して得られたＤＮＡ鎖又はそれらの相補鎖を鋳型とする相補鎖合成により生成するピロリン酸をＡＴＰに変換し，化学発光を行い発光強度からＤＮＡ変異の有無又はターゲットＤＮＡの有無を調べる。
【００１６】
本発明の第４の構成では，ゲノム又は複数のターゲットＤＮＡを鋳型として，同一反応容器内で複数種類の第１のプローブを鋳型にハイブリダイズさせ，第１の相補鎖合成により複数種類の第１の相補鎖を得る。次に，余剰の第１のプローブを合成された第１の相補鎖から分離して除去する。次に，第１の相補鎖を鋳型とし，複数種類の第２のプローブを用いて，第２の相補鎖合成を行い，ターゲットＤＮＡと部分的に同じ配列を持つ第２の相補鎖を得る。次に，第１の相補鎖の種類毎に区画された領域に於いて，第２の相補鎖合成の際，又は，第２の相補鎖を鋳型とした相補鎖合成の際に生成するピロリン酸をＡＴＰに変換して生じる化学発光反応を検出して，ターゲットＤＮＡの塩基配列中の特定配列又は変異を検出する。
【００１７】
本発明の代表的な構成によれば，多量のピロリン酸ＰＰｉを生成して高感度でターゲットＤＮＡの存在と変異の有無を調べることが可能となる。
【００１８】
【発明の実施の形態】
以下，核酸配列の検査方法の例として，遺伝子検査方法をとり，本発明を実施例により説明する。最初に理解を容易とするためにＢＡＭＰＥＲ法による遺伝子検査及び変異の検査について述べる。ＤＮＡプローブを用いた検査ではターゲットをプローブにハイブリダイズさせて蛍光検出するＤＮＡチップ等が用いられるが，１塩基変異等の場合には一つの塩基が変異することによるハイブリダイゼーション能力の違いで変異種と野生種を識別することはかなり難しい場合が多い。そこでハイブリダイズしたプローブを相補鎖合成プライマーとして相補鎖合成して識別することが行われている。
【００１９】
例えば，変異のある部位の直前にプライマーの３’末端が来るようにして，蛍光標識付きのｄＮＴＰをプローブに付加して質量分析したり（この場合は蛍光標識付きでなくて良い），ゲル電気泳動したり又はＤＮＡプローブアレーに捕獲して蛍光検出することが行われている。
【００２０】
更に，簡便な方法として，相補鎖合成に伴うピロリン酸生成を化学発光でモニターする方法も注目されている。この化学発光を用いる方法の一つは発明者等が提案したＢＡＭＰＥＲ法である。ＤＮＡプローブの３’末端をターゲットＤＮＡの変異の有る位置に一致させておく。一般に，相補鎖合成に使用するプライマーの３’末端がターゲットに相補的で完全にハイブリダイズしていると相補鎖合成は起こるが，一致してない（プライマーの３’末端がターゲットに相補的でない）と相補鎖合成は起こらないか，起こりにくいことが知られている。
【００２１】
即ち，プライマーの３’末端の一致，不一致（プライマーの３’末端がターゲットに相補的であるか，相補的でないか）で，相補鎖合成を制御（スイッチング）できることになる。プライマーの３’末端近傍の塩基種を，ターゲットに相補的である塩基種と異なる別の塩基種にすると，プライマーの３’末端のハイブリダイゼーションは弱くなり，プライマーの３’末端がターゲットに相補的な時は相補鎖合成が元のプライマー同様行われるが，一致してない（プライマーの３’末端がターゲットに相補的でない）とプライマーの３’末端はほぼ完全にはがれる形となり相補鎖合成は全く行われなくなる。このように人工的なミスマッチを３’末端近傍に持つプライマーを用いた相補鎖合成により生成するピロリン酸をＡＴＰに変換して，化学発光を起こして検出するのがＢＡＭＰＥＲ法である。
【００２２】
図２６は，ＢＡＭＰＥＲ法に於ける，人工的なミスマッチプローブの例を説明する図である。試料ＤＮＡ２００５にプライマー２０００がハイブリダイズする。プライマの３’末端２００２’が試料ＤＮＡ２００２と相補な時に伸長反応２００３が起きる。伸長反応の起こる起こらないは，試料ＤＮＡの２００２とプライマ２００２’が相補であるかどうかで決まるので，ＮのＳＮＰを調べることができる。ここで，伸長反応の起きる起きないの正確性を上げるため，参照番号２００１の位置のプライマー側に人工的なミスマッチを入れてある。
【００２３】
相補鎖合成により合成するＤＮＡ鎖の長さ分だけのピロリン酸が生成するので，一つの塩基が相補鎖合成で鎖伸長に使われる時に発生するピロリン酸を検出するパイロシーケンシングに比べると２桁近い高感度が期待できる。しかし，ゲノムに含まれる変異を調べる時に用いるＤＮＡコピー数は約１０３−１０５個である。相補鎖合成により１００塩基の伸長が行われたとして生成するピロリン酸の個数は１０５−１０７であり，直接検出するにはまだ不十分で，ＰＣＲ等によりＤＮＡコピーの増幅を第一段階として行っている。
【００２４】
また，変異種と野生種を正確に区別するためにプローブ（プライマー）として末端が変異種又は野生種に相補的な２種のプローブをそれぞれ独立に用いて反応を行い発生する発光強度の比較から変異種の有無及びホモ，ヘテロを判定している。以下に，相補鎖合成に伴うピロリン酸生成，化学発光に関する反応の概略を以下に示した。詳細は文献６に記載されている。なお，─(X)→は，反応に共存させる酵素Ｘを意味する。
ssDNA + primer + dNTP ─(polymerase)→ ssDNA + primer-(dNTP)ｎ + nPPi
PPi + APS ─(ATPsulfurylase)→ ATP + SO４２−
ATP + luciferin + O２ ─(luciferase)→ AMP + PPi + oxyluciferin + CO２ + hν
dNTP ─(ATPase)→ dNDP + Pi ─(ADPase)→ dNMP + Pi
ATP ─(ATPase)→ ADP + Pi ─(ADPase)→ AMP + Pi
実施例１
本発明の遺伝子検査方法（核酸配列の検査方法）の概略を図１，図２，図３に示した。図１は，本発明の遺伝子検査法の実施例１に於いて，複数のＳＮＰｓ領域を含むＤＮＡ断片の同時調製法を説明する図である。図２は，本発明の遺伝子検査法の実施例１に於いて，複数のＳＮＰｓ領域を含むＤＮＡ断片の同時調製法を説明する，図１に続く図である。図３は，本発明の遺伝子検査法の実施例１に於いて，使用される反応容器と検出部を説明する図である。
【００２５】
実施例１ではゲノム２をサンプルとし，複数のＳＮＰｓを計測する。ターゲットがｍＲＮＡ又はｃＤＮＡの場合も以下の議論は同様である。まず，文献(文献８：Molecular Cloning Third Edition (2001) pp6.8-6.11(Cold Spring Harbor Laboratory Press))に記載の方法に従って，ゲノムを血液から抽出する。これには市販のＤＮＡ抽出機や抽出キットを用いても良い。測定しようとするＳＮＰｓの近傍の３’末端側にハイブリダイズするアンカー付きのプローブ１を測定しようとするＳＮＰｓの数だけ用意する。以下に説明で，プローブ１と記載した時にはこれら複数のアンカー付きプローブ１の総称として用いている。従って，このアンカープローブ１には種々の配列（任意配列部分）４とアンカー配列３を持つ複数のプライマー１−１，１−２，…１−ｎが含まれることになる。アンカー配列３はゲノム２の２本鎖が一本鎖になったターゲット２−１，２−２にハイブリダイズせず，全てのプローブ１について共通の配列である。後に，このアンカー配列３の相補鎖がプライミング領域として使用される。
【００２６】
各プローブの終濃度がおのおの終濃度0.25μMのプローブ１をゲノム（直前に９５℃３０秒間変性したもの）にハイブリダイズ（５５℃で１分間アニール）させ７２℃３分間で相補鎖合成（第１の相補鎖合成）を１回行う。相補鎖合成された部分を５−１，５−２，…５−ｎで示す。ＰＣＲのように繰り返し行わないので種々の配列のプライマーが共存しても障害となる相補鎖合成副産物は生成しない。相補鎖合成を行った直後に余剰のプライマー１を洗浄除去する。相補鎖合成で長くなったプライマー６−１，６−２，…６−ｎはゲノム２−１，２−２にハイブリダイズした状態で残る。相補鎖合成で長くなったプライマー６−１，６−２，…６−ｎを，溶液の温度を９５°Ｃ〜１００°Ｃに上げてゲノムから分離し回収する。測定しようとするＤＮＡ領域を含み，５’末端にアンカー配列を持つ種々な配列のＤＮＡ断片群（相補鎖−１）６−１，６−２，…６−ｎが得られる。
【００２７】
検査しようとする相補鎖−１のＳＮＰｓ部位より３’末端側にハイブリダイズするアンカープライマー２１（終濃度0.25μM）を用意する。アンカープライマー２１は，２１−１，２１−２，…２１−ｎの混合物である。アンカープライマー２１は，任意配列部分２３とアンカー配列２２からなり，アンカー配列２２は，ＤＮＡ断片群（相補鎖−１）６−１，６−２，…６−ｎにハイブリダイズせず，全てのＤＮＡ断片群（相補鎖−１）について共通の配列である。図１で調製した相補鎖６−１，６−２，…６−ｎの混合物にアンカープライマー２１をハイブリダイズさせ，相補鎖合成（第２の相補鎖合成）２４（２４−１，２４−２，…２４−ｎ）を行う。
【００２８】
プライマー２１を除去した後，相補鎖合成２４の産物を含む溶液に，更に，プライマー１のアンカー配列３と同じ配列を持つプライマー２５（終濃度0.2μM），及び，プライマー２１のアンカー配列２２と同じ配列を持つプライマー２６（終濃度1μM）を加えてＰＣＲ増幅を行う。PCR条件は、0.25ｍMのMgCl2、10倍濃度のPCR緩衝液（キットに付属）、0.0625ユニット/μLのTaq  DNAポリメラーゼを含む溶液で、９５℃で３０秒間(変性)、５５℃で３０秒間(アニール)、７２℃で１分間（伸長反応）のサイクルを３５回繰り返した後に、７２℃５分間インキュベートして途中で反応が停止した伸長産物の伸長反応を完全に末端まで伸びるようにする。プライマー１と２１はプライマー２５と２６によるＰＣＲを競争阻害する可能性がある。これを解決するには，プライマー２１を効率よく除去するために，プライマー１の５’末端にビオチンをつけておきアビジンのついた磁気ビーズ等で相補鎖合成した産物を釣りだす。あるいは，上記のようにプライマー２５，２６の濃度をプライマー２１に比べて多くしておくことによりプライマー２１を除去せずに行っても良い。この条件のPCRを10μLで行うと数十ｆmolの一本鎖DNAが得られる。
【００２９】
プライマー２５，２６は全てのＤＮＡ鎖のアンカー部分にそれぞれ同じ効率でハイブリダイズする。即ち，ターゲットとなる種々断片の配列によらず均質なＤＮＡ鎖の増幅ができる。プライマー２５，２６の片方を上記条件のように高濃度にしておき，非対称ＰＣＲにより一本鎖ＤＮＡを得たり，プライマー２５，２６の片方にビオチンをつけておき，相補鎖合成後にアビジンを表面に持つ磁気ビーズ等を利用してＤＮＡ１本鎖２８（２８−１，２８−２，…２８−ｎ）を得て検査用の試料２８とする。ＤＮＡ１本鎖２８は，５’末端側にアンカー配列２２を持ち，３’末端側にアンカー配列３に相補な配列を持つ。
【００３０】
このようにして得た１本鎖ＤＮＡ試料２８の溶液２９を図３の反応槽に入れる。図３では一つの反応槽を示しているが，実際には，反応槽は，タイタープレートの一つのウエル（直径６ｍｍ）に相当する。反応槽には小さなサブセル３１−１，３１−２，…３１−ｎがあり，それぞれサブセル毎に異なるＤＮＡプローブ３２−１，３２−２，…３２−ｎが固定されている（図４に示すように，試料ＤＮＡ２８の変異部位Ｎ３４に３’末端３３がハイブリダイズするように設計されたプライマー配列３２を持つＤＮＡオリゴマーが各サブセル３１に固定されている）。即ち，タイタープレートに設けられた一つ一つのウエル内に複数のサブセルが有り，それそれのサブセルに異なるプローブが固定されている。
【００３１】
図４は，本発明の遺伝子検査法の実施例１に於いて，反応容器に固定されたＳＮＰ検出用のＤＮＡプローブを説明する図である。図５は，本発明の遺伝子検査法の実施例１に於いて，ＤＮＡプローブにＳＮＰを含むＤＮＡ断片がハイブリダイズしたモデル体を示す図である。図４，図５にＤＮＡプローブ３２の構造を示す。プローブ３２は，ターゲット２８に特異的にハイブリダイズする部分３２’と変異を見分ける部分３３からなる。ターゲット２８をモデル遺伝子として変異のある部位とした時には，対象となる配列は（配列１）である。
（配列１）
５’−ＣＴＴＴＣＴＴＧＣＧＧＡＧＡＴＴＣＴＣＴＴＣＣＴＣＴＧＴＧＣＧＣＣＧＧＴＣＴＣＴＣＣＣＡＧＧＡＣＡＧＧＣＡＣＡＡＡＣＡＣＧＣＡＣＣＴＣＡＡＡＧＣＴＧＴＴＣＣＧＴＣＣＣＡＧＴＡＧＡＴＴＡＣＣＡ−３’
である。これに対応して用いるプローブ３２の配列は（配列２），（配列３）である。
（配列２）
５’−ａａｃａｇｃｔｔｔｇａｇｇｔｇｃｇｔｇＡｔＡ−３’
（配列３）
５’−ａａｃａｇｃｔｔｔｇａｇｇｔｇｃｇｔｇＡｔＴ−３’
である。此処で，（配列２）の３’末端のＡ，（配列３）の３’末端のＴは変異を見分ける部分であり野生型に対してＡ，変異種に対してＴの塩基種を持ったプライマーを使用していることを示す。また３’末端から３塩基目の塩基Ａ３９は人工的にミスマッチを入れたことを表す。図５に示すＤＮＡ１本鎖２８（（配列１）を持つ）の（配列４）の部分がプローブの配列（（配列２），又は（配列３）を持つ）に相補結合する。
（配列４）
５’−ＡＡＡＣＡＣＧＣＡＣＣＴＣＡＡＡＧＣＴＧＴＴ−３’
十分な溶液量２９（１０μL）を入れるとサブセルからあふれる程度に溶液が満たされ，ＤＮＡは拡散しながらサブセルのプローブにハイブリダイズして種類毎に区分けされてサブセルに捕獲される。溶液は２９のようにサブセルからあふれているので各サブセル間を流動でき，効率よいハイブリダイゼーションが行われる。十分ハイブリダイゼーションを行った後，余分な溶液２９を除去すると，ターゲットＤＮＡはプローブの種類毎に区分けされてサブセルに捕獲されており，サブセルに隔離される。次いで，相補鎖合成に必要な反応液（ＤＮＡポリメラーゼ及びｄＮＴＰを含む）を反応槽加えて，各サブセルの間で反応液が混合しないようにして相補鎖合成反応５１（図６）を行う。
【００３２】
図６は，本発明の遺伝子検査法の実施例１に於いて，反応容器に固定したＳＮＰ検出用ＤＮＡプローブにＳＮＰを含むＤＮＡ断片がハイブリダイズして，相補鎖伸長反応が特異的に起きていることを説明する図である。図６に示すように，プローブの３'末端が一致している試料２８では相補鎖合成は５１のように進行するが，相補的でない試料２８'では相補鎖合成は進まないか，殆ど進行しない。このようにして試料ＤＮＡ２８に於いてプローブの３'末端に対応する塩基の変異があるかないかを見分けることができる。通常，３'末端が変異種に相補的なプローブと野生種に相補的なプローブをそれぞれ別のサブセルに固定してそれぞれ相補鎖合成を行い生成するピロリン酸をＡＴＰに変換し，化学発光試薬と反応させて生成する発光強度を比較する。具体的には、各サブセルに判別用プライマー（1.25μM）Taq  DNAポリメラーゼ（0.05ユニット/μL）、MgCl2(0.15ｍM)、ｄNTP(0.125ｍM)を含む溶液を添加し、９４℃１０秒間、５０℃で１０秒間、７２℃で２０秒間のサイクルを５回繰り返し、ピロリン酸を得る。Nucl.Acid Res. 29,e93(2001)記載の方法で精製したピロリン酸を化学発光させて検出する。
以下の実施例においてPCRを用いた場合はすべて上記の条件で行った。また、ピロリン酸検出はNucl.Acid Res. 29,e93(20001)記載の方法に順じた。
【００３３】
実施例１では，全行程は，アンカープライマー１を用いた相補鎖合成で得られる種々のＤＮＡ断片をもとにアンカープライマー２１と相補的な配列を持つＤＮＡ断片を作製する工程，アンカー配列と同じ配列を持つプライマー２５，２６を用いて，全てのＤＮＡ断片を一括して均一に増幅する工程と，増幅により得られた個々のＤＮＡ断片を反応セルに入れ，反応セル内で化学発光を行う工程（化学発光工程）とからなる。
【００３４】
化学発光工程では，ＰＣＲ等で得られたＤＮＡ断片をサブセルに分配したり，サブセル毎に表面に固定されたプローブを用いてＤＮＡ断片をサブセルに捕獲したりして，サブセル内で変異特異的に種々のＤＮＡ断片の相補鎖を合成し，この結果，生成するピロリン酸をＡＴＰに変換しルシフェリン等の化学発光試薬と反応させて発生する化学発光を観測してＳＮＰｓを調べる。相補鎖合成に使用するｄＮＴＰ（Ｎ＝Ａ，Ｃ，Ｇ，Ｔ）のうちｄＡＴＰはルシフェリンと反応するのでｄＡＴＰの類似体であるｄＡＴＰαＳを代わりに用いる。
【００３５】
図６，図７，図８に示すように，個々のサブセルにターゲットとなるＤＮＡを捕獲する方法には幾つかある。第１の方法は，図３〜図６に示した方法であり，サブセルの表面にターゲット特異的なプローブを固定しておきハイブリダイゼーションによりターゲットをそれぞれサブセル内捕獲する。反応槽内のサブセルの容積は１μＬ程度でありＤＮＡ断片を含む液はこのサブセルから溢れる。この結果サブセル内の溶液は外部と混合してより効率の良いハイブリダイゼーションが可能で，ターゲットを区分けしてサブセルに捕獲できる。
【００３６】
ターゲットを種類毎に異なるサブセルに区分けして捕獲する第２の方法は，図７に示すように，それぞれのサブセル６１にプローブ６２を固定したビーズ６３を入れて，ビーズ６３の表面にターゲットをハイブリダイズする方法である。サブセルにプローブを固定するよりも簡便にプローブの固定ができる。図７では各サブセルにビーズが１個ずつ入った例を示したが，図８に示すように，複数のビーズ７３を各サブセルに入れてもよい。図８に示す例では，プローブ７２を固定した表面積を大きくできるので，多くのターゲットを特異的にサブセル６１内に捕獲できる利点がある。
【００３７】
サブセルにＤＮＡを捕獲した後，溶液２９を反応槽から除去して相補鎖合成及び化学発光反応試薬をサブセルに入れる。サブセルの間で今回は反応液２９’が移動しないように図３に示すような分離板３８を用いて分離したり，反応液が溢れないようにして反応を開始する。発生する発光３５を，透明な反応槽の下部から，又は，反応槽の上部から光センサー３６で観測する。
【００３８】
光センサーとしてはフォトマルチプライヤーやフォトセルをアレー状にならべ，反応セル３１に密着させて使用するのがよい。他の方法では，レンズを用いてＣＣＤに結像させることことが可能である。此処ではターゲットに特異的なプローブを固定してターゲットを捕獲してから反応を行ったが，ターゲットの配列に特異的なプライマーをグリセロールや多糖類を含む溶液に溶解しサブセルに入れ乾燥させることで，多糖類をマトリックスとしてプライマー等の試薬を安定して保持できる。これらマトリックスと共にサブセルに入れておき，ＤＮＡ断片群の含まれる溶液を各セルに分配してターゲット特異的な相補鎖反応を行っても良い。この場合，それぞれのプローブに対応するＤＮＡ断片に加えて余分のＤＮＡ断片が反応セルに存在するが，プローブは特異的でありターゲット検出の上で支障はない。ただ，ターゲットの濃度が各セルに分配されるのでターゲット増幅工程を十分に行う必要がある。
【００３９】
相補鎖合成反応はマトリックスに閉じこめられたプライマー等の試薬が溶液に溶けだして初めて有効に機能し始める。マトリックスの融解温度を４５°Ｃ〜５０°Ｃに設定しておき，反応に先立って昇温してから反応開始するように調整しておくと，ＤＮＡを各セルに分配する工程で一部が反応を始めることが無く便利である。
実施例２
実施例１では，相補鎖合成の開始に使用したアンカープライマーはターゲットの変異を識別することなく相補鎖合成を行ったが，実施例２では，実施例１での第１の相補鎖合成又は第２の相補鎖合成に於いて変異を識別するプライマーを用いる。図９は，本発明の遺伝子検査法の実施例２に於いて，使用されるプライマーの構造を示す図である。第１番目のプライマー８１（ターゲットに対応して複数種存在する）はターゲットに相補的な配列８２とターゲットにハイブリダイズしないユニバーサル配列８３を持つプライマーである。プライマー８１は，ターゲット８５にハイブリダイズした状態でその３’末端が変異のある部位８６に一致するように設計されている。変異の種類分だけプライマー８１を用意する。
【００４０】
通常のＳＮＰｓでは，それぞれの検査部位毎にワイルド及び変異株の２種に対応したプライマーを用意する。これらプライマーはターゲットにハイブリダイズしないユニバーサル配列（アンカー配列８３）を持っており，後の工程でアンカー配列８３をプライミング領域としてＰＣＲ等のＤＮＡ断片増幅を行なう。また，変異種を区別するために，ユニバーサル配列８３とターゲットに特異な配列８２との間に変異を識別する配列（標的配列８７）を入れておく。図１０，図１１にプライマー８１の構成と相補鎖合成を含む反応工程を示した。
【００４１】
図１０は，本発明の遺伝子検査法の実施例２に於いて，ＳＮＰを識別する様子を説明する図である。図１１は，本発明の遺伝子検査法の実施例２に於いて，ＤＮＡ断片を容器に固定したプローブで捕捉し，ＳＮＰを識別して伸長したＤＮＡプローブに伴い生成するピロリン酸が放出されることを説明する，図１０に続く図である。プライマー８１はターゲットＤＮＡ８５（ゲノム又はｍＲＮＡもしくはｃＤＮＡ）にハイブリダイズする。この例では，プライマー８１の５’末端にはビオチン９１が結合している。ハイブリダイズしたプローブ８１のうち３’末端が完全にターゲットとマッチ（プライマーの３’末端がターゲットに相補的である）しているプローブ８１−１は相補鎖合成により鎖長を伸長するが，一致しない（プライマーの３’末端がターゲットに相補的でない）プライマー８１−２は伸長しない。
【００４２】
このようにターゲットに変異があるかないかで相補鎖合成はスイッチングされるが，これをより一層ハッキリした物にするために，図１２に示すように，ターゲット８５の配列１０２に対しプライマーの３’末端近傍に人工的なミスマッチ１０３を入れることもある。配列部分８２，８２’はターゲット８５に相補的である。
【００４３】
相補鎖合成（第１の相補鎖合成）の後，未反応のプライマー及び余剰のプライマーを除去する。相補鎖合成によりプライマー８１の伸長鎖を持つ相補鎖９２は，ターゲット（ゲノム等）にハイブリダイズした形９３で残る。次いで，９５°Ｃ〜１００°Ｃに昇温して相補鎖９２をターゲットから遊離する。相補鎖９２の伸長鎖の部分にハイブリダイズするプライマー９４（ターゲットの種類だけ存在する）を加えて相補鎖合成（第２の相補鎖合成）を行い，相補鎖９７を作る。
【００４４】
プライマー９４は，相補鎖９２の伸長鎖の部分にハイブリダイズするターゲットに特異的（相補的）な部分９５と，プライマー９４の全てに共通のユニバーサルな部分（アンカー配列９６）とからなっている。相補鎖（伸長鎖）９７はターゲットの種類に応じて種々の物が有るが，両末端の配列はターゲットの種類によらず同じである。即ち，相補鎖（伸長鎖）９７は，５’末端側にプライマー９４の配列を持ち，３’末端側にプライマー８１の配列に相補な配列を持つ。
【００４５】
アンカー配列８３と同じ配列を持つプライマー９８と，アンカー配列９６と同じ配列を持つを持つプライマー９９とを用いてＰＣＲ増幅する。得られたＰＣＲ産物３１５（ＤＮＡ鎖３１５−１，３１５−２からなる）を変性して一本鎖とし，ＤＮＡ鎖３１５−２を反応槽に入れサブセル６１内のプローブ３２とハイブリダイゼーションさせ，ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰαＳ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ）を加えて相補鎖合成１０６をする。この際生成するピロリン酸ＰＰｉ１０７をＡＴＰに変え，ルシフェリンと化学発光反応を行う。以下の工程は実施例１と同じである。
【００４６】
此処で用いるプローブはターゲットを識別する物でよい。また，標的配列８７と同じ配列を持つプライマーを利用してワイルドタイプと変異タイプを識別して別々のサブセルに捕獲して発光反応を行う。この時，標的配列８７を持つプライマーをサブセルに固定したデバイスを準備しておけば，プライマー１（図９，図１０の８１で示したプライマー等）の配列の工夫によりこのデバイスは種々の遺伝子検査に利用できるので都合がよい。
実施例３
実施例２ではサブセルに保持したＤＮＡプローブが，ターゲット配列を含むＤＮＡ鎖を鋳型として，相補鎖合成する時に生成するピロリン酸を用いてＡＴＰを生成し，化学発光反応を行った。実施例３は，信号強度を増やすために，ターゲット配列でない配列を持ったＤＮＡ鎖を鋳型にした相補鎖合成を引き起こして，より多くのピロリン酸を生成する例である。
【００４７】
図１３は，本発明の遺伝子検査法の実施例３に於いて，ターゲット配列でない配列を持ったＤＮＡ鎖を用いた相補鎖伸長反応で多量のピロリン酸を生成する例を説明する図である。実施例３では，実施例２で使用したプライマー８１の構成に於いて，標的配列８７を除いた構成を持つプライマー８１’を使用して，実施例２と同様にして，ターゲット配列８５とアンカー配列８３，９６を持つＤＮＡ鎖１０５（ＤＮＡ鎖１０５−１，１０５−２からなる）を作製する。
【００４８】
ＤＮＡ鎖１０５を変性して一本鎖とし，ＤＮＡ鎖１０５−２を反応槽のサブセル６１又はサブセル内のビーズに固定したプライマー３２にハイブリダイズさせ，相補鎖１１１を合成する。余分のＤＮＡ鎖１０５−２を洗浄除去する。サブセルにはそれぞれ異なるＤＮＡ鎖が固定されて存在することになる。もちろん相補鎖合成の起こらなかったサブセルも存在する。
【００４９】
相補鎖合成で伸長したＤＮＡ鎖の３’末端は共通の配列９６’（アンカー配列９６同じ配列を持つプライマー９９の相補鎖）が存在する。共通の配列９６’に相補的な配列９６”を含むリング状ＤＮＡ鎖１１２と相補鎖合成基質（ｄＮＴＰｓ）及び酵素類を加えて，各サブセル毎に分離した状態１１３で相補鎖合成１１４を行い，多量のピロリン酸（ｎＰＰｉ）１１５を生成する。勿論，この時使用する核酸基質（ｄＮＴＰｓ）としてｄＡＴＰのかわりにｄＡＴＰαＳを用いて，ルシフェリンと相補鎖合成基質の直接反応が起こらない様にする。
【００５０】
但し，リング状ＤＮＡ鎖１１２から合成される相補鎖が塩基種Ａを含まない場合，即ち，ＤＮＡ鎖１１２の配列９６”を除く配列が塩基種Ｔを含まない場合，相補鎖合成基質からｄＡＴＰを除いて相補鎖を行うことが出来，高価なｄＡＴＰαＳを使用しなくて済み低コスト化に有効である。ターゲットの配列を鋳型にするのでなく人工的なＤＮＡ鎖を鋳型にすることの利点はこのような点にもある。リング状ＤＮＡ鎖の鋳型は，相補鎖合成基質が反応液に存在し，ＤＮＡポリメラーゼが失活しない限り，際限なく相補鎖合成を行いえる特徴を持ち，非常に多くのピロリン酸を一つの鋳型ＤＮＡから生成できる。
【００５１】
此処ではまず固定された長いＤＮＡ鎖を用いたが，図１４に示すように，ターゲットＤＮＡ１０５−２をサブセルに固定したプローブ１２１で保持し，余剰のＤＮＡ１０５−２を除去した後に，リング状ＤＮＡ１２２とハイブリダイズさせ相補鎖合成１２３を開始しても良い。この場合，サブセルに固定したプローブ１２１は相補鎖合成１２３を開始し得るターゲットＤＮＡ１０５−２の釣り出しに用いている。配列１２１’はプライマー９４の配列であり，配列８３”はプライマー８１’の配列に相補な配列であり，配列８３’は配列８３”に相補な配列である。
【００５２】
リング状ＤＮＡに代わってデンドライド状のＤＮＡを用いて相補鎖合成を行い膨大なピロリン酸を生成しても良い。デンドライド状のＤＮＡは検出の信号を増加させるために用いる物であり，それらの配列はどのような物でも良く特に制限はない。人工的な配列を用いたり，簡単に得られる天然の配列を用いたりすることができる。
実施例４
実施例４はループ状ＤＮＡを作製してこれを鋳型として相補鎖合成を行い，相補鎖合成副産物のピロリン酸を効率よく生成する例である。図１５は，本発明の遺伝子検査法の実施例４に於いて，ＤＮＡ鎖の自己増殖形の反応により多量のピロリン酸を生成する際に使用するループ状ＤＮＡの例を説明する図である。
【００５３】
ターゲットＤＮＡ２００はＰＣＲで増幅しても良いが，此処では増幅しないでＤＮＡ検査する方式について述べる。アンカープライマーI（１３０）を用意する。アンカープライマーI（１３０）は，ターゲットにハイブリダイズしないアンカー部分１３２，ターゲットにハイブリダイズする配列４を持つ。アンカー部分１３２は，５’末端に配列１３３を持ち，配列４の５’末端に続く配列１３４，及び，配列１３４の５’末端に続く配列１３５を含む。配列１３３と配列１３４は相補である。Ｍは変異部分１３１を示し，Ｍ’は変異部分１３１の相補配列１３１−２を示す。
【００５４】
説明の都合で一つのターゲットを対象に話しを進めるが，複数のターゲットを対象にしても良く，此処での説明は何ら一般性を損なわない。
【００５５】
ターゲットＤＮＡ２００にハイブリダイズさせ相補鎖合成（第１の相補鎖合成）１３６を行う。相補鎖合成された相補鎖１３６の下流（３’末端側）には変異を調べようとする部分１３１−２が存在する。余剰のプライマーI（１３０）を除去し，合成した相補鎖１３６をもつＤＮＡ鎖を取り出す。アンカープライマーII（２１）を相補鎖１３６の変異を調べようとする部位Ｍ’（１３１−２）の５’末端側の部位２３にハイブリダイズさせ相補鎖１４０を合成する（第２の相補鎖合成）。アンカープライマーII（２１）は，相補鎖１３６にハイブリダイズしないアンカー部分１３２’と相補鎖１３６の配列２３にハイブリダイズする配列２３−２から構成される。アンカー部分１３２’は，５’末端に配列２３３を持ち，配列２３−２の５’末端に続く配列２３４，及び，配列２３４の５’末端に続く配列２３５を含む。配列２３３と配列２３４は相補である。
【００５６】
プライマーI（１３０）又はプライマーII（２１）を用いた相補鎖合成１３６，１４０の時にプライマーの３’末端を変異の有る部位１３１に一致させ，変異の有無により相補鎖合成反応をスイッチしても良いが，此処ではプライマーIII（１４４）を用いた相補鎖合成反応１４１が進行するか否かでピロリン酸の多量生成反応をスイッチングする方法を提示する。
【００５７】
プライマーII（アンカープライマー２１）を用いて相補鎖合成すると相補鎖１４０が合成され２本鎖ＤＮＡが生成するが，アンカー部分１３２’はまだ一本鎖の状態である。また，変異を調べようとする部位１３１−２も一本鎖の状態である。余剰のアンカープライマー２１を除去した後，合成された相補鎖１４０をもつＤＮＡ鎖を，反応槽に入れる。反応槽内のサブセル６１に固定されたプライマーIII（１４４）（プライマーIII（１４４）がサブセル６１に固定されてない場合には，ＤＮＡを含む液はサブセルの間を移動しないようにする）は，２本鎖ＤＮＡを構成する相補鎖１３６の一本鎖部分にハイブリダイズし，３’末端１４６が変異を調べようとする部位に一致するように設計されている。
【００５８】
反応槽のサブセル毎に異なるプライマーIIIを固定しておきターゲットとなる２本鎖ＤＮＡを捕獲する。捕獲後，余剰のＤＮＡ液を除去してサブセル間を分離板等で分離する。ＤＮＡポリメラーゼ，プライマーIV（２５０：図示せず），相補鎖合成基質，化学発光試薬を反応槽のサブセルに入れて，相補鎖合成とそれに続く化学発光をサブセル毎に行う。サブセルを用いてそれぞれを分離した形で反応させるので複数の変異をサブセルに分けて同時に検査できる。もちろん一カ所の変異の検査にも適用できるが，この場合にはプライマーIII（１４４）は固定しなくても良い。
【００５９】
２本鎖ＤＮＡを捕獲したプライマーIII（１４４）の３’末端１４６がターゲットの相補鎖１３６の調べようとする部分Ｍ’（１３１−２）にマッチ（プライマーの３’末端がターゲットに相補的である）している時には，相補鎖１３６を鋳型にして相補鎖１４１の合成（第３の相補鎖合成）が進行し，多量のピロリン酸（ａ×ＰＰｉ）が生成され，それまで２本鎖を形成していたＤＮＡ鎖１４３が相補鎖１３６を持つＤＮＡ鎖から離れる。このＤＮＡ鎖１４３は，５’末端の配列２３３が配列２３４と自己ハイブリダイズする形をしており，３’末端の配列１３３−２が配列１３４−２と自己ハイブリダイズする形をしており，それぞれ，ループ部分２４０，２４１を形成する。
【００６０】
ＤＮＡ鎖の複製を行なうＬＡＭＰ法(文献９：Nucl. Acids Res. 28,e63(2000))と同様にして，ＤＮＡ鎖１４３を出発物質として，自己ハイブリダイゼーションと相補鎖合成を繰り返し，多量のピロリン酸を生成する。ＬＡＭＰ法ではＤＮＡ鎖の複製を目的とするが，此処ではＳＮＰｓの変異検出と多量のピロリン酸生成が目的である。従って，相補鎖合成を繰り返す鋳型ＤＮＡは何でも良く，ターゲット配列を含まない人工的な配列を用いても良い。即ち，アンカープライマーＩ（１３０），アンカープライマーII（２１）に於いて，分子内自己ハイブリダーゼーションをおこす相補鎖配列１３３と１３４，２３４と２３３をそれぞれ導入することで，ターゲット配列を含まない任意配列のプライマを使用して大量のピロリン酸の生成が可能となる。
【００６１】
更に，生成したＤＮＡ鎖をエクソヌクレアーゼ等で分解したりして，相補鎖の再合成を行っても良い。ピロリン酸の検出は実施例１，２，３に記載の通りである。なお，ループ配列を利用してＤＮＡ鎖の増幅を行う通常のＬＡＭＰ法では，ＤＮＡ鎖１４３が自己ハイブリダイズした時にできるループ部分にハイブリダイズするプライマーIV（２５０）は，ターゲットに特異的な配列を選ぶことができる。多くの種類のターゲットを分析する時にはターゲット毎に多くの種類のプライマーを用意する必要があり，大変である。上記のように，ループ部分を人工的に作製した配列（ターゲットＤＮＡの持つ配列ではない配列）で構成し，ＤＮＡ鎖１４３が自己ハイブリダイズした時にできるループ部分にハイブリダイズするプライマーIV（２５０）を共通プライマーとすることもできる。この場合，ターゲットを選別し相補鎖合成をトリガーするのは各サブセルに保持したプライマーIII（１４４）である。
【００６２】
実施例４では，第２の相補鎖合成を行ってから２本鎖が形成されたＤＮＡ鎖１４３を持つ相補鎖合成産物を反応槽に入れて，引き続き第３の相補鎖合成以降の相補鎖合成と化学発光反応を行ったが，別法として図１６，図１７に示した様に，第２の相補鎖合成から後の全ての反応を反応槽又はサブセル内で行っても良い。即ち，相補鎖１３６を持つＤＮＡ鎖を反応槽に入れ，サブセル６１に保持したプローブII（プライマーII）４２１とハイブリダイズさせる。サブセルごとに異なるプローブIIを入れておき，サブセル内でそれぞれ異なるターゲットを対象に相補鎖合成が起こるように工夫する。
【００６３】
この時，プローブII（４２１）の３’末端は変異を調べようとするＤＮＡ鎖１３６の部位Ｍ’（１３１−２）にハイブリダイズするように工夫してある。プローブに相補的で予期した変異が有る場合にはプローブIIの伸長４２２が起こる。しかし，相補配列が無い場合や期待された変異がターゲットに無い（状況に応じて逆にすることもある）と相補鎖伸長は起こらない。相補鎖伸長がおこり部分的に２本鎖が形成される。プライマーIII（４２３）を用いて相補鎖１３６を持つＤＮＡ鎖の３’末端側の１本鎖部分にハイブリダイズさせ相補鎖合成４２４を行う。このため，プライマーIII（４２３）はプライマーII（４２１）を用いる相補鎖の合成の後に反応槽６１に加える。伸長反応２４２が起きると反応槽６１に固定されたループ部分２４１を持つヘアピン状ＤＮＡ２６０を生じる。
【００６４】
プライマーIII（４２３）は２本鎖を１本鎖にするためのプライマーであり，サブセルを加熱して１本鎖にしても良い。加熱して冷却すると自己ハイブリダイズする相補鎖（プライマーII（４２１）の相補鎖伸長による相補鎖）は相補鎖伸長を行い，ループ部分２４０，２４１を持ったヘアピン状となる（この場合，プライマーIIIは不要である）。ループ部分２４１にプライマーIV（２５０）をハイブリダイズさせ相補鎖合成を繰り返す以後の反応は，ＬＡＭＰ法と同じである。
【００６５】
プライマーIIをビーズやサブセルに固定しておき相補鎖合成を行ったのち，９５°Ｃ〜１００°Ｃに昇温して４０°Ｃ程度まで温度を下げてループ状の一本鎖を作り，繰り返し相補鎖合成をすることもできる。この時，末端のループ２４０，２４１の配列をＡＴ過多にしておき，少しの昇温で末端部にループを作り相補鎖合成を繰り返す様にしても良い。また，ループ部分にハイブリダイズするプライマーを用いて一本鎖を順次作製してループ配列を形成して相補鎖合成をしても良い。
【００６６】
この場合，ループ部分が種々ＤＮＡ断片について共通になるようにプライマーＩのアンカー配列を設計する。プライマーＩのアンカー配列の部分にハイブリダイズするのプライマーIIIを加えると相補鎖合成が始まり部分的に２本鎖となったＤＮＡを形成する。１本鎖部分は３’末端を持っており，自己ハイブリダイズしてループ状となり相補鎖合成を再度行う。これを繰り返すことにより多くのピロリン酸を生成できる。
実施例５
実施例５は，ターゲットの検出及び変異塩基の同定を，ライゲーション反応を用いて行う方法である。図１８は，本発明の遺伝子検査法の実施例５に於いて，２つのプライマーのアンカープローブのライゲーション反応を使用する例を説明する図である。ターゲット毎に検査しようとする遺伝子配列領域にハイブリダイズする，図１８に示す２つのアンカープローブ５０１，５０２を用意する。
【００６７】
アンカー部分５０３，５０４はそれぞれ３’末端又は５’末端に結合しているユニバーサル配列である。アンカープローブ５０１，５０２は，ライゲーション反応によりアンカー部分５０４の反対側の３’末端５０６と，アンカー部分５０３の反対側の５’末端とが結合し，一つのＤＮＡ断片にすることができる配置で５０５のように，配列５１３，５１４，５０６がターゲットにタンデムにハイブリダイズする。ライゲーション反応に預かるアンカープローブ５０２の３’末端又はアンカープローブ５０１の５’末端を変異のある部位Ｍ（５０７）に一致させる。
【００６８】
図１８は，アンカープローブ５０２の３’末端５０６にターゲット上の変異部分Ｍ（５０７）が一致する例である。末端の塩基配列が完全にターゲットと相補的でない場合にはライゲーション反応は起こらない。即ち，ライゲーション反応が起こるか否かで変異の有無を判別している。ライゲーション反応を行ったあと，余分なプローブ５０１，５０２を洗浄除去し，２本鎖を１本鎖にしてライゲーションにより作られたＤＮＡ断片５１０を得る。
【００６９】
ユニバーサル配列５０３に相補的な配列５０３’を持ったプライマー及びユニバーサル配列５０４をもったプライマーとを用いて，これら断片５１０をＰＣＲ増幅する。増幅産物を非対称ＰＣＲ又はビオチンーアビジン結合を利用した一本鎖生成工程を通して一本鎖として取り出す。これを反応槽に入れ，サブセル内のプローブ５１１とハイブリダイズさせ相補鎖５１５の合成を行い生成するピロリン酸５１２を元にして化学発光を行い光検出により産物の有無従ってターゲット遺伝子の有無及び変異の有無を検出する。
【００７０】
図１９のように，アンカー配列６０１と，ターゲットにハイブリダイズする配列６０２との間にターゲットを識別する認識配列６０３をつけておき，図１８の場合と同じようにして，１本鎖のＤＮＡ断片５１０’を作成し，認識配列６０３を目印にサブセル６１に捕獲しても良い。サブセルに保持するプローブ５３０はターゲットの配列とは無関係に種々の認識配列を持つプローブをその配列毎にサブセルに保持又は固定しておく。ターゲットが変っても，ターゲットにハイブリダイズするプローブ６１４の部分配列としてサブセルに保持された釣りだし用の認識配列を持ったプローブ５３０と相補的な配列６０３を，ターゲットにハイブリダイズするプローブ６１４の部分配列として組み込むことにより，プローブ固定の反応セルをユニバーサルに用いることができる。
【００７１】
勿論，ＰＣＲ産物の釣り出しの為の認識配列６０３はターゲットにハイブリダイズするプライマーの片方に導入すれば良い。以下，化学発光の検出は前記の検出例と同じである。伸長反応５１１の時に生じるピロリン酸５１２をルシフェリンとルシフェラーゼを用いて検出する。この場合，既に変異の有無はライゲーションの時に判定しているので，単に相補鎖合成を行うプライマー６０１’を共存させて相補鎖合成をサブセル毎に行えばよい。釣り出し用のプローブをプライマーに用いてもまた別途ユニバーサルプライマーを加えて相補鎖合成しても良い。前述した検出のための種々バリエーションはこの場合にも適用できる。詳細は重複するので省略する。
実施例６
実施例６は，両末端がターゲット７０１にタンデムにハイブリダイズするプローブ７０２を用いる例である。図２０は，本発明の遺伝子検査法の実施例６に於いて，ライゲーション反応を用いてリング状となる，ＳＮＰを検出するプローブＤＮＡを使用する例を説明する図である。プローブ７０２は両末端にターゲットとハイブリダイズする配列７０３及び７０４（プローブI及びIIに相当）を持ち，中間にユニバーサル配列Ｉ（７０５）を持つ。
【００７２】
プローブ７０２をターゲット７０１にハイブリダイズさせ，ライゲーション反応を行う。プローブ７０２のどちらかの末端７１１が，丁度，変異のある部位７１０に来るように調整しておく。末端がターゲットと相補的である時にはライゲーション反応が起こりＤＮＡ鎖はリング状ＤＮＡ７１２となるが，相補的でない時にはライゲーション反応は起こらず，ＤＮＡ鎖は線形のままである。ライゲーションをしたあと未反応のプローブ７０２を洗浄除去する。
【００７３】
リング状ＤＮＡ７１２を反応槽に入れ，サブセルに固定された捕獲用のＤＮＡプローブ（プローブIII）の一部の配列７２０とハイブリダイズし捕獲する。捕獲用のＤＮＡプローブ（プローブIII）の一部の配列７２０として，ターゲットにハイブリダイズするプローブ７０２の５’末端側の配列に相補的であり，配列７０３部分にハイブリダイズし，相補鎖合成で配列７０４の相補鎖７１６を合成する配列を用いた。これはリング状にならないプローブ７０２が存在した場合に相補鎖合成が起こらないようにする為である。プローブ７２０は配列毎にそれぞれのサブセル内に固定するか又はマトリックス等と共に保持する。
【００７４】
リング状ＤＮＡ７１２にハイブリダイズする配列７２０に加えて，ユニバーサル配列II（８０１）をプローブIIIの５’末端に持つようにしておくと，後に述べる信号の増幅と言う観点から都合がよい（図２１，図２２）。図２１は，本発明の遺伝子検査法の実施例６に於いて，ライゲーション反応を用いてリング状となる，ＳＮＰを検出するプローブＤＮＡを用いる他の例を説明する図であり，図２２は，図２１に続く図である。
【００７５】
リング状ＤＮＡにハイブリダイズしたプローブIII（８０２）は，相補鎖８０３の合成でリング状ＤＮＡ７１２を繰り返し鋳型として，１番目の相補鎖８０４（相補鎖８０４はリング状でなく，鎖状の繰り返し配列を持つ）を生成する。これにともない多くのピロリン酸８０５が生成する。また，信号を強くするためにユニバーサル配列Ｉ（７０５）の一部を持つプライマーIV（８０６）を入れておくと，プライマーIV（８０６）は，生成した相補鎖８０４の中に繰り返し現れるユニバーサル配列Ｉ（７０５）と相補な配列７０５−２の一部にハイブリダイズして２番目の相補鎖（相補鎖８０７）を次々に合成する。
【００７６】
即ち，１本の相補鎖８０４’にはユニバーサル配列Ｉ（７０５）に相補的な部分７０５−２が複数存在するが，これら部分７０５−２に次々にプライマーIV（８０６）がハイブリダイズして相補鎖合成が進行する。相補鎖８０４の５’末端に近い部分から相補鎖合成を開始した２番目の相補鎖８０７を３’末端からより，３’末端に近い部分から相補鎖合成を始めた相補鎖８０７の合成の過程で８１０のように，３’末端からよりはがす形で，相補鎖合成８１１が進む。結果としてリングの長さに相当する分だけ異なる種々の長さを持った３番目の相補鎖８１２が沢山できる。
【００７７】
相補鎖８１２はリング状ＤＮＡ７１２にハイブリダイズしたプローブIII（８０２）の配列と相補的な配列８０２−２を３’末端に持つＤＮＡ群である。従って，ユニバーサル配列８０１と相補的な配列８０１−２を３’末端近傍に持つ。そこで，ユニバーサル配列II（８０１）を持つプライマーV（８０１）を加えておくと，３番目の相補鎖８１２を鋳型にして相補鎖合成が起こり４番目の相補鎖８２０が生成する。
【００７８】
このようにして膨大な量のピロリン酸を生成できる。これらは何れも５０°Ｃ〜６０°Ｃの定温で反応を行う。これら相補鎖合成の過程でｄＮＴＰが熱分解したりすることをかなり押さえることができる。ピロリン酸の検出では，ｄＮＴＰが熱分解して生じるピロリン酸は背景光を作るのでなるべく低減することが望ましい。
【００７９】
また，ルシフェリンと反応するｄＡＴＰの代わりにｄＡＴＰαＳ等反応性の低い又は反応しない基質を用いる。以下，ピロリン酸をＡＴＰに変換してルシフェリンと反応させ化学発光を得る。化学発光検出は前述の通り，種々の方法が可能である。
【００８０】
なお，プライマーV（８０１）の代わりにユニバーサル配列II（８０１）を含むリング状ＤＮＡを加えておくと一群の相補鎖２はこれにハイブリダイズしてさらに相補鎖を伸長するとともに膨大な相補鎖群を作製して検出感度を非常に高くできる。実施例７
実施例７では，５’末端にループ状の配列９５０と，５’末端側の配列９２０とハイブリダイズする配列９３０と，ターゲット９０３にハイブリダイズし３’末端９０５へと続く配列９４０とを持つプローブ９０１，及び，３’末端にループ状の配列９６０と，３’末端側の配列９７０とハイブリダイズする配列９８０と，ターゲット９０３にハイブリダイズする５’末端側の配列９９０とを持つプローブ９０２を使用する。実施例では，３’末端及び５’末端にそれぞれループ状の配列を持つ２つのプローブ９０１，９０２をライゲーション反応で結合し，第３のプライマーを用いて相補鎖合成を繰り返して多くのピロリン酸をサブセル内で生成する方法である。図２３は，本発明の遺伝子検査法の実施例７に於いて，ライゲーション反応を用いる反応で自己増殖形のプローブを用いる例を説明する図である。
【００８１】
図２３に示したような，自己ハイブリダイズするアンカープローブ９０１及び９０２をターゲット９０３毎に用意する。アンカープローブ９０１及び９０２をターゲット９０３にハイブリダイズさせライゲーション反応を行う。この時，プローブ９０１の３’末端９０５と変異を測定しようとする部位Ｍ（９０４）とを一致させておく。変異部分がプローブ９０１の３’末端に相補的でない時にはライゲーションは起こらない。
【００８２】
ライゲーションしたＤＮＡ鎖をターゲットに残し，余剰のプローブ９０１，９０２を洗浄して除去する。１本鎖のライゲーション産物を反応槽に入れて，サブセル６１に５’末端側で固定された特異プローブ９０６でこれらを捕獲する。余剰のＤＮＡ（１本鎖のライゲーション産物）を洗浄して除去する。配列９４０，９０５，９９０からなる配列が特異プローブ９０６に相補である場合に，ライゲーション産物は特異プローブ９０６で捕獲され，相補鎖合成９４５が行われる。
【００８３】
５’末端の配列９７０（アンカ部分）に続き，ループの一本鎖部分にハイブリダイズする配列９０７を持つアンカプライマー及び相補鎖合成基質（ｄＮＴＰ，但し，ｄＡＴＰの代わりにｄＡＴＰαＳを用いる），ＤＮＡポリメラーゼ等を加える。相補鎖伸長９０８が進行してピロリン酸９０９が多量に得られる。これを用いて化学発光反応を行い光検出する。これらは実施例４で詳しく述べたので省略する。なお，配列９２０−２，９３０−２，９４０−２，９０５−２，９９０−２はそれぞれ，配列９２０，９３０，９４０，９０５，９９０に相補な配列である。
【００８４】
実施例７では，ライゲーションされる二つのプローブはそれぞれ３’末端又は５’末端にループ配列を持つが，プローブ１００１はループのない配列であり，プローブ９０１の５’末端だけループ配列を持つプライマーを用いることもできる。図２４は，本発明の遺伝子検査法の実施例７に於いて，ライゲーション反応を用いる例で，容器の表面でＤＮＡ鎖の自己増殖反応が起きている様子を説明する図である。実施例７では，図２４に示すように，プローブ９０１，１００１をターゲット９０３にハイブリダイズさせ，ライゲーションで生成したＤＮＡはそれ自体ではこれ以上相補鎖合成は行わない。
【００８５】
サブセルには，プローブ１００１の３’末端側の配列１００３−２にハイブリダイズする配列１００３を３’末端側に持つプローブ１００２が用意されている。プローブ１００２は，配列９７０にハイブリダイズする配列９８０の５’末端側が固体表面６１に固定され，５’末端側にループ配列９６０を持ち，３’末端側の配列１００３が１本鎖のライゲーション産物１００４の３’末端側の配列１００３−２にハイブリダイズする。ライゲーション産物１００４にプローブ１００２をハイブリダイズをさせた後，相補鎖合成１００５を行う。
【００８６】
余分のＤＮＡ（ライゲーション産物１００４）を除去し，プローブ１００２にハイブリダイズしたＤＮＡを昇温して除去し，再度，相補鎖合成試薬，及び，ループ部分にハイブリダイズする配列１００６とアンカ配列９２０を持つプライマーを入れる。また，生成したピロリン酸を元に化学発光を行う試薬も加える。サブセルを相互に分離した区画とした後，相補鎖合成を開始する。ループ部分９５０にプライマーの配列１００６がハイブリダイズして相補鎖合成１００８を行う。この結果，ピロリン酸ＰＰｉが多量に得られる。
【００８７】
プライマーの配列１００６による相補鎖合成で生成されたＤＮＡ鎖の３’末端は一本鎖となる。この部分は実施例４と同様に自己ハイブリダイズして相補鎖合成を再度始める。以下，この反応を繰り返し非常に多くのピロリン酸を生成する。ピロリン酸はＡＴＰに変換され，ルシフェリン等の化学発光試薬と酵素の存在下で化学発光反応を行う。この化学発光を光学検出器で観測して，変異，又は，ターゲット遺伝子がサンプル中に有るか否か調べる。
実施例８
実施例８は，ターゲットにハイブリダイズしたプローブ１２０１を相補鎖合成した後にライゲーションによりリング状ＤＮＡとしてこれを検出する例である。図２５は，本発明の遺伝子検査法の実施例８に於いて，相補鎖伸長反応とライゲーション反応で繰り返し配列を得る例を説明する図である。相補鎖合成した部分の配列はプローブに予め無かった配列であり，ここを認識配列にしてそれぞれのターゲット（相補鎖合成とライゲーションでリング状になったＤＮＡ）を区別しながらサブセル内で相補鎖合成してピロリン酸を検出する方式を適用する。単純なライゲーションに比べると，調べようとするＤＮＡ部位の選別がより確実に行く利点がある。
【００８８】
プローブ１２０１は，ターゲット９０３にハイブリダイズする配列１２２０と配列１２２０の５’末端に続く５’末端の配列１２０２と，３’末端側でターゲット９０３にハイブリダイズする配列１２３０を持つ。
【００８９】
反応工程にライゲーションに加えて相補鎖合成が一つ余分に加わるが，これは検査しようとする全ての検査部位に対応するターゲットを混ぜた状態で行うので手間が格段に増えるわけではない。変異部位の識別は，相補鎖合成の開始の時にプローブ１２０１の３’末端の一致，不一致（プライマーの３’末端がターゲットに相補的であるか，相補的でないか）で識別しても良くまた，ライゲーションするプローブ１２０１の５’末端１２０２を変異部位Ｍ（１２０３）に一致させてライゲーションが起こるか起こらないかによって識別しても良い。
【００９０】
更に，リング状ＤＮＡ作製では変異を識別せず，リングＤＮＡを鋳型にしたサークル相補鎖合成に用いるプライマーの３’末端が変異部位に一致するようにしておき，このプライマーの３’末端の一致，不一致（プライマーの３’末端がターゲットに相補的であるか，相補的でないか）で相補鎖合成をコントロールすることにより変異の識別を行っても良い。相補鎖合成１２４０の後，ライゲーションによりリング状ＤＮＡ１２０４を作製し，ライゲーション産物がターゲット（多くの場合ゲノムＤＮＡ）にハイブリダイズした状態で余剰のプローブ１２０１を洗浄除去する。
【００９１】
余剰のＤＮＡプローブ１２０１は洗浄除去されるが，リング状ＤＮＡ１２０４はターゲット９０３にハイブリダイズした状態で残る。洗浄後，リング状ＤＮＡ１２０４をターゲット９０３から遊離し，検査対象として用いる。このようにして生成したリング状ＤＮＡは元のプローブ１２０１には無い配列，即ち，相補鎖合成により付加された配列を持っている。そこで，相補鎖合成により付加された配列１２０５−２を指標にして各サブセルにそれぞれ種類の異なるプローブ１２０５を入れておき特定のＤＮＡリングを選択してサブセルの中で相補鎖合成１２０６を行う。プローブ１２０５は配列１２０５−２に相補である。この時にプローブ１２０１が残存していても新たな配列がプローブ１２０５により認識される様に工夫されているので邪魔にはならない。
【００９２】
合成される相補鎖１２０６に相補的なプライマーやこのプライマーが伸長してできるＤＮＡ鎖に相補的な配列を持つリング状ＤＮＡを加えておく。プローブ１２０５がリングＤＮＡ１２０６にハイブリダイズして相補鎖合成１２０６が起こると，相補鎖１２０６にプローブ１２０７がハイブリダイズして相補鎖１２０８を作る。これは相補鎖１２０６が伸長されるに従い何カ所からも相補鎖の合成が起こり，しかも先に合成された相補鎖は次にスタートした相補鎖合成により一本鎖状に離される形で相補鎖１２０８の合成が次々に進む。相補鎖１２０８は，予め加えられたリング状ＤＮＡにハイブリダイズしてやはりサークル相補鎖合成を始める。配列１２２０−２，１２０２−２，１２３０−２はそれぞれ，配列１２２０，１２０２，１２３０に相補である。
【００９３】
このように相補鎖合成がカスケード式に起こり，膨大な量のピロリン酸ＰＰｉが生成する。これをＡＴＰに変換し，ルシフェラーゼの存在下でルシフェリンと反応させ化学発光を発生する。なお，相補鎖合成基質はルシフェリンと反応しないｄＮＴＰ類似体を用いるのが良い。例えば，ｄＡＴＰに代わってｄＡＴＰαＳを用いる。また，人工的に作製したＤＮＡ配列をポリＡ配列で構成し，相補鎖合成で生成するのはポリＴ鎖にする等ルシフェリンと反応性の高い核酸基質を使わないようにするのも良い方法である。
【００９４】
以下，本発明のＤＮＡ検査方法の特徴について説明する。
１．  ＤＮＡあるいは遺伝子検査の方法であり，検査対象となるサンプルに複数種類のプライマーを含むプライマー群を入れ，同時に相補鎖合成を行うプロセス，検査しようとするＤＮＡの塩基変異などの有無で相補鎖伸長が影響を受ける形のＤＮＡプローブを少なくともターゲットの種類だけ含むプローブ群の相補鎖伸長を行うプロセスとを含み，種々ターゲットあるいはその相補配列を鋳型とした相補鎖合成反応，および相補鎖合成で得られるピロリン酸をＡＴＰに変えて化学発光基質と反応させて発光を得る反応をターゲット毎に区画されたサブセルの中で行い，得られる発光を検出する事により遺伝子あるいはＤＮＡの変異などを検出するプロセスを含むことに特徴を有する。
２．  １の方法に於いて，検体のＤＮＡサンプルにハイブリダイズせしめ相補鎖合成を行う第１のプライマー群は，５’末端に任意の配列を持つアンカープライマーであり，測定対象である全てのＤＮＡにそれぞれハイブリダイズして相補鎖合成を行うプロセスと，余剰のプライマーを除去した後，合成された第１の相補鎖の一部に相補的な配列をもつ第２のアンカープライマーを用いて相補鎖合成を行い少なくとも片方の末端に第１あるいは第２のアンカー配列を持つ検査用のＤＮＡ断片を作製するプロセスと末端のアンカー配列部分の少なくとも一つをプライミング領域としてこのＤＮＡ断片のコピー数を増幅するプロセスを含むことを特徴とする。
３．  １又は２の方法に於いて，増幅されたＤＮＡ鎖のうち，片方の１本鎖を鋳型として，測定対象である変異の部位とプライマーの３’末端とが一致する形でターゲットにプライマーをハイブリダイズさせ，変異が想定される位置の塩基種によりプライマーの相補鎖伸長が制御される状態で相補鎖合成が進行するプロセスを含み，これらの相補鎖合成反応がターゲット遺伝子あるいはＤＮＡの配列部位ごとに区画された微細な反応部（サブセル）で進行し，相補鎖合成の際に得られるピロリン酸を用いて化学発光をサブセル内でそれぞれ起こすプロセスを含み，これらの発光を光検出することによりＤＮＡを検出するプロセスを含むことを特徴とする。
４．  １の方法に於いて，プライマー群がプライマー群の５’末端がターゲットにハイブリしない任意配列を持つアンカープライマー群であり，該アンカープライマ群の３’末端がターゲットにハイブリダイズしたときに変異が想定される位置に来るように設計されたプライマーであり，変異の有無によりプライマーの相補鎖伸長が制御されるプロセスを含むことを特徴とする。
５．  ４の方法に於いて，サンプルにハイブリダイズするプライマー群はアンカープライマー群であり，各プライマーがどのターゲットの配列および３’末端が変異種あるいは野生種のＤＮＡに対応したプライマーであるかを相互に識別できるようアンカー部分の配列を変化させていることを特徴とするプライマーで有ることを特徴とする方法。
６．  １の方法に於いて，検体のＤＮＡサンプルにハイブリダイズせしめ，相補鎖合成を行う第１のプライマー群は５’末端に任意配列を持つアンカープライマーであり，測定対象である全てのＤＮＡにそれぞれハイブリダイズして相補鎖合成を行い，余剰のプライマーを除去した後，合成された第１の相補鎖の一部に相補的な配列をもち，３’末端を変異が期待される部位にハイブリダイズするべく設計されている第２のアンカープライマーを用いて相補鎖合成を行うプロセスを含み，生成したＤＮＡ鎖をアンカープライマーのアンカー部分あるいはその相補鎖部分にハイブリダイズするプライマーを用いて相補鎖合成を行い，ＤＮＡ鎖のコピー数をＰＣＲ増幅あるいはローリングサイクル増幅，あるいはループ構造を利用した増幅などで行うプロセスを含むことを特徴とする。
７．  １から６の何れかの方法において，増幅されたＤＮＡ鎖群を１本鎖とし，ターゲットの種類に特異的なＤＮＡ塩基配列を利用してサブセルにあらかじめ保持されたそれぞれの特異配列を認識できるＤＮＡプローブで捕獲し，サブセル内でそれぞれのターゲットの相補鎖合成を行い得られるピロリン酸をＡＴＰに変換し，化学発光反応を起こして得られた化学発光を検出する事を特徴とする。
８．  １から６の何れかの方法において，増幅されたＤＮＡ鎖群を１本鎖とし，ターゲットの種類に特異的なＤＮＡ塩基配列をサブセルに分配し，そこにあらかじめマトリックスなどと共にプローブを保持しておき，そのプローブはサブセル毎に異なるターゲットを認識する特異配列を持ち，サブセル内でそれぞれのターゲットの相補鎖合成を行い得られるピロリン酸をＡＴＰに変換し，化学発光反応を起こして得られた化学発光を検出する事を特徴とする。
９．  １から８の何れかの方法に於いて，各サブセルに捕獲されたＤＮＡ鎖あるいはその相補鎖の３’末端を含むアンカー配列部分をプライマー配列とし，サブセルに加えたサークル状ＤＮＡを鋳型として相補鎖合成反応を行い，得られたピロリン酸をＡＴＰに変換して化学発光反応を起こして得られる発光を光学的に検査する事を特徴とする。
１０．  ９の方法に於いて，各サブセルにおける相補鎖合成に使われるプライマーは少なくとも複数のセルにおいて共通のプライマーであることを特徴とする。
１１．  １から８の何れかの方法に於いて，各サブセル内に捕獲されたＤＮＡ鎖あるいはその相補鎖の３’末端を含むアンカー配列をプライマーとして，別途加えられたループ配列を持ったＤＮＡを鋳型として相補鎖合成を行い，得られたピロリン酸をＡＴＰに変換して化学発光反応を起こして得られる発光を光学的に検査する事を特徴とする。
１２．  ９の方法に於いて，相補鎖合成の対象となるＤＮＡ鎖の捕獲がサブセルを構成する固体表面あるいはサブセルに入れられたビーズの表面に固定されたＤＮＡプローブによることを特徴とする。
１３．  １から１２の何れかの方法に於いて，検出に用いるピロリン酸を対象となるターゲットＤＮＡと関連のない配列を持つＤＮＡ鎖の相補鎖合成により得ることを特徴とする。
１４．  １の方法に於いて，サンプルから第１の相補鎖を作製するプローブはアンカープライマーであり，アンカー部分は自己ハイブリしたループ状の相補鎖を与える形をしており，サブセル内で第２のアンカープライマーおよび第３のプライマーを用いた第２の相補鎖合成の鋳型として機能し，第２の相補鎖合成のプロセスで生成するループ状のＤＮＡ鎖作製プロセスにより生成したピロリン酸をＡＴＰに変換して化学発光反応を行うプロセス含むことを特徴とする。
１５．  ＤＮＡあるいは遺伝子検査の方法であり，検査対象となるサンプル溶液に複数種類のプローブを含むプローブ群を入れ，それぞれの異なるターゲット配列に２つのプローブをハイブリダイズさせ，検査しようとするＤＮＡ塩基変異などの有無でこれらプローブのライゲーション反応による結合反応が影響を受ける形のＤＮＡプローブ対を含むプローブ群を用いてライゲーション反応で長いＤＮＡ鎖を作製し，このＤＮＡ鎖あるいはその相補鎖を鋳型として少なくとも１回相補鎖合成をサブセル内で行うプロセスを含み，各サブセル区画内で相補鎖合成産物のピロリン酸をＡＴＰに変え，化学発光基質と反応させて発光を得る反応をターゲット毎に区画されたサブセルの中で行い，得られる発光を検出する事により遺伝子あるいはＤＮＡの変異などを検出する。
１６．  １５の方法に於いて，ライゲーションに用いる一対のプライマー群はそれぞれターゲットにハイブリダイズしないアンカー配列を３’末端あるいは５’末端に持ち，この配列あるいはそれらの相補鎖を用いてライゲーション産物をこのアンカー部分をプライミング領域に利用してＰＣＲ増幅し，全ての対象ＤＮＡ部位を一度に増幅して化学発光検出の為の相補鎖合成反応の鋳型として用いることを特徴とする。
１７．  １５又は１６の方法において，増幅されたＤＮＡ鎖群を１本鎖とし，ターゲットの種類に特異的なＤＮＡ塩基配列を利用してサブセルにあらかじめ保持されたそれぞれの特異配列を認識できるＤＮＡプローブで捕獲し，サブセル内でそれぞれのターゲットの相補鎖合成を行い得られるピロリン酸をＡＴＰに変換し，化学発光反応を起こして得られた化学発光を検出する事を特徴とする。
１８．  １５又は１６の方法において，増幅されたＤＮＡ鎖群を１本鎖とし，ターゲットの種類に特異的なＤＮＡ塩基配列をサブセルに分配し，そこにあらかじめマトリックスなどと共にプローブを保持しておき，そのプローブはサブセル毎に異なるターゲットを認識する特異配列を持ち，サブセル内でそれぞれのターゲットの相補鎖合成を行い得られるピロリン酸をＡＴＰに変換し，化学発光反応を起こして得られた化学発光を検出する事を特徴とする。
１９．  １５から１８の何れかの方法に於いて，各サブセルに捕獲されたＤＮＡ鎖あるいはその相補鎖の３’末端を含むアンカー配列部分をプライマー配列とし，サブセルに加えたサークル状ＤＮＡを鋳型として相補鎖合成反応を行い，得られたピロリン酸をＡＴＰに変換して化学発光反応を起こして得られる発光を光学的に検査する事を特徴とする。
２０．  １９の方法に於いて，各サブセルにおける相補鎖合成に使われるプライマーは少なくとも複数のセルにおいて共通のプライマーであることを特徴とする。
２１．  １５から１８の何れかの方法に於いて，各サブセル内に捕獲されたＤＮＡ鎖あるいはその相補鎖の３’末端を含むアンカー配列をプライマーとして，別途加えられたループ配列を持ったＤＮＡを鋳型として相補鎖合成を行い，得られたピロリン酸をＡＴＰに変換して化学発光反応を起こして得られる発光を光学的に検査する事を特徴とする。
２．  １９の方法に於いて，相補鎖合成の対象となるＤＮＡ鎖の捕獲がサブセルを構成する固体表面あるいはサブセルに入れられたビーズの表面に固定されたＤＮＡプローブによることを特徴とする。
２３．  １５から２２の何れかの方法に於いて，検出に用いるピロリン酸を対象となるターゲットＤＮＡと関連のない配列を持つＤＮＡ鎖の相補鎖合成により得ることを特徴とする。
２４．  １５の方法に於いて，サンプルからライゲーション産物を作製する一対のプローブ群はアンカープライマー群であり，アンカー部分は自己ハイブリしたループ状の相補鎖を与える形をしており，生成したＤＮＡ鎖はサブセル内で第３のプライマーを用いた相補鎖合成の鋳型として機能し，相補鎖合成のプロセスで生成するループ状のＤＮＡ鎖作製プロセスにより生成したピロリン酸をＡＴＰに変換して化学発光反応を行うプロセス含むことを特徴とする。
２５．  ＤＮＡ塩基配列中の塩基種変異を検出する方法であり，ターゲットとなるＤＮＡ鎖を鋳型として変異の有無により相補鎖合成反応が制御されるプライマーであり，５’末端に共通配列を持つ複数のプライマーを用いて相補鎖合成を行った後，このコピーＤＮＡ鎖あるいは相補鎖を鋳型とするＤＮＡ相補鎖合成により得られるピロリン酸をＡＴＰとし，化学発光を行い発光強度からＤＮＡ変異の有無あるいはターゲットＤＮＡの有無を調べる特徴とする。
２６．  ＤＮＡ塩基配列中の特定配列あるいは変異を検出する方法であり，ゲノムあるいは複数のターゲットＤＮＡを鋳型として，１）同一反応容器内で複数種類の第１のＤＮＡプローブ（プライマー）をハイブリダイズさせ相補鎖合成により複数種類の第１の相補鎖を得るプロセスと，２）余剰の第１のプローブを合成された相補鎖から分離・除去するプロセスと，３）第１の相補鎖を鋳型とし，複数種類の第２のプローブを用いて再度相補鎖合成を行い第２の相補鎖（元のＤＮＡと部分的に同じ配列を持つ）を得るプロセスと，４）相補鎖の種類毎に区画された領域に置いて，第２の相補鎖合成あるいは第２の相補鎖を鋳型とした相補鎖合成の際に得られるピロリン酸をＡＴＰに変え，化学発光反応により検出するプロセスを含むことを特徴とする。
【００９５】
【発明の効果】
本発明によれば，多くのＤＮＡ検査部位を含むＤＮＡ断片を一括して抽出し，必要に応じて増幅し，含まれる変異の有無を相補鎖合成が起きるか否かを指標として簡便に調べることができる。化学発光を活用しており高価な試薬や装置を必要とせず，ランニングコストの安いＤＮＡ検査方法を提供できる。ターゲットのコピー数を増幅する代わりに，相補鎖合成で生じるピロリン酸の量を増幅して検出を容易にすることで検出感度を格段に高めることができ，ＰＣＲ等の増幅を必ずしも必要としない方法を提示できる。
【配列表】
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配列表フリーテキスト
（１）配列番号１の配列に関する他の関連する情報の記載
変異を含むモデル遺伝子の配列部位。
（２）配列番号２の配列に関する他の関連する情報の記載
人工的にミスマッチを３’末端から３塩基目に持ち，野生型を検出するＤＮＡプローブ。
（３）配列番号３の配列に関する他の関連する情報の記載
人工的にミスマッチを３’末端から３塩基目に持ち，変異型を検出するＤＮＡプローブ。
（４）配列番号３の配列に関する他の関連する情報の記載
配列番号２又は３の塩基配列を持つプローブに相補結合する配列番号１の配列部分。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の遺伝子検査法の実施例１に於いて，複数のＳＮＰｓ領域を含むＤＮＡ断片の同時調製法を説明する図。
【図２】本発明の遺伝子検査法の実施例１に於いて，複数のＳＮＰｓ領域を含むＤＮＡ断片の同時調製法を説明する，図１に続く図。
【図３】本発明の遺伝子検査法の実施例１に於いて，使用される反応容器と検出部を説明する図。
【図４】本発明の遺伝子検査法の実施例１に於いて，反応容器に固定されたＳＮＰ検出用のＤＮＡプローブを説明する図。
【図５】本発明の遺伝子検査法の実施例１に於いて，ＤＮＡプローブにＳＮＰを含むＤＮＡ断片がハイブリダイズしたモデル体を示す図。
【図６】本発明の遺伝子検査法の実施例１に於いて，反応容器に固定したＳＮＰ検出用ＤＮＡプローブにＳＮＰを含むＤＮＡ断片がハイブリダイズして，相補鎖伸長反応が特異的に起きていることを説明する図。
【図７】本発明の遺伝子検査法の実施例１に於いて，１個のビーズを反応容器で用いる例を説明する図。
【図８】本発明の遺伝子検査法の実施例１に於いて，複数のビーズを反応容器で用いる例を説明する図。
【図９】本発明の遺伝子検査法の実施例２に於いて，使用されるプライマーの構造を示す図。
【図１０】本発明の遺伝子検査法の実施例２に於いて，ＳＮＰを識別する様子を説明する図。
【図１１】本発明の遺伝子検査法の実施例２に於いて，ＤＮＡ断片を容器に固定したプローブで捕捉し，ＳＮＰを識別して伸長したＤＮＡプローブに伴い生成するピロリン酸が放出されることを説明する，図１０に続く図。
【図１２】本発明の遺伝子検査法の実施例２に於いて，ＳＮＰの検出に使用するプライマーの構造を説明する図。
【図１３】本発明の遺伝子検査法の実施例３に於いて，ターゲット配列でない配列を持ったＤＮＡ鎖を用いた相補鎖伸長反応で多量のピロリン酸を生成する例を説明する図。
【図１４】本発明の遺伝子検査法の実施例３の変形例を説明する図。
【図１５】本発明の遺伝子検査法の実施例４に於いて，ＤＮＡ鎖の自己増殖形の反応により多量のピロリン酸を生成する例を説明する図。
【図１６】本発明の遺伝子検査法の実施例４に於いて，ＤＮＡ鎖の自己増殖形の反応の一部を容器表面で行う例を説明する図。
【図１７】本発明の遺伝子検査法の実施例４に於いて，ＤＮＡ鎖の自己増殖形の反応の一部を容器表面で行う例を説明する，図１６に続く図。
【図１８】本発明の遺伝子検査法の実施例５に於いて，２つのプライマーのアンカープローブのライゲーション反応を使用する例を説明する図。
【図１９】本発明の遺伝子検査法の実施例５の変形例であり，容器固相での反応を使用する例を説明する図。
【図２０】本発明の遺伝子検査法の実施例６に於いて，ライゲーション反応を用いてリング状となる，ＳＮＰを検出するプローブＤＮＡを使用する例を説明する図。
【図２１】本発明の遺伝子検査法の実施例６に於いて，ライゲーション反応を用いてリング状となる，ＳＮＰを検出するプローブＤＮＡを用いる他の例を説明する図。
【図２２】本発明の遺伝子検査法の実施例６に於いて，ライゲーション反応を用いてリング状となる，ＳＮＰを検出するプローブＤＮＡを用いる他の例を説明する，図２１に続く図。
【図２３】本発明の遺伝子検査法の実施例７に於いて，ライゲーション反応を用いる反応で自己増殖形のプローブを用いる例を説明する図。
【図２４】本発明の遺伝子検査法の実施例７に於いて，ライゲーション反応を用いる例で，容器の表面でＤＮＡ鎖の自己増殖反応が起きている様子を説明する図。
【図２５】本発明の遺伝子検査法の実施例８に於いて，相補鎖伸長反応とライゲーション反応で繰り返し配列を得る例を説明する図。
【図２６】従来技術のＢＡＭＰＡＥＲ法に於ける，人工的なミスマッチプローブの例を説明する図。
【符号の説明】
１…プローブ，２…ゲノム，３…アンカー配列部分，４…任意配列部分，５…相補鎖合成部分，６…相補鎖合成され長くなったプライマー，２１…第２のアンカープライマー，２２…アンカー配列部分，２３…任意配列部分，２４…相補鎖合成部分，２５，２６…プライマー，２７…ＰＣＲ産物，２８…１本鎖ＤＮＡ，２９…溶液，３１，６１…サブセル，３２，６２，７２…ＤＮＡプローブ，３３…末端部分，３４…ＳＮＰ配列部分，３５…光，３６…光センサー，３８…分離板，３９，１０３…人工的なミスマッチ配列，６３，７３…プローブ固定ビーズ，８１，８１’…プライマー，８３…共通配列部分，８４…３’末端塩基，８５…ターゲットＤＮＡ，８６，１０２…変異配列部分，８７…変異識別配列，９１…ビオチン，９２…伸長鎖，９３…伸長鎖とターゲットＤＮＡがハイブリダイズした状態，９４…プライマー，９５…ターゲットに特異的な部分，９６…共通配列部分，９７…伸長相補鎖，９８，９９…プライマー，１０５…ＰＣＲ産物，１０５−２…ターゲットＤＮＡ，１０６…相補鎖合成，１０７，１１５…ピロリン酸，１０５，１１１…伸長相補鎖，１１２，１２２…リング状ＤＮＡ鎖，１１３…反応液，１１４，１２３…相補鎖合成，１２１…プローブ，１３０…アンカープライマー，１３１…変異部分，１３１−２…変異部分の相補配列，１３２…任意配列部分，１３３…１本鎖ＤＮＡ，１３４…プライマー，１３６…ＤＮＡ，１３６，１４０，１４１…相補鎖合成，２００…ターゲットＤＮＡ，２３３…アンカープライマー，２４１…ループ部分，２４２，４２２…相補鎖合成，２６０…ヘアピン状のＤＮＡ鎖，４２１…プローブ，４２３…第３のプライマー，５０１，５０２…アンカープローブ，５０３，５０４…アンカー部分共通配列部分，５０５…アンカープローブがタンデムにターゲットにハイブリダイズした様子，５０６…アンカープローブの３’末端，５０７…ターゲットの変異部分，５１０ライゲーション産物，５１１…プローブ，５１２…ピロリン酸，５１３…伸長反応，６０１…アンカー配列，６０２…ターゲットハイブリダイズする任意配列，６０３…ターゲット認識配列，７０１…ターゲットＤＮＡ，７０２…プローブ，７０３，７０４…ターゲットにハイブリダイズする部分，７０５…ユニバーサル配列，７１０…変異配列部分，７１１…プライマーの末端，７１２…リング状ＤＮＡ，７２０…プローブ，８０１…ユニバーサル配列（共通配列），８０２…プローブ，８０３…相補鎖合成，８０４…合成された相補鎖，８０５…ピロリン酸，８０６…プライマー，８０７，８１１，８２０…相補鎖合成，８１０…相補鎖合成の様子，８１２…合成された相補鎖群，９０１，９０２…ループ状配列を持つプローブ，９０３…ターゲットＤＮＡ，９０５…プローブの３’末端，９０６…プローブ，９０８，１００５，１００８…相補鎖伸長，９０９…ピロリン酸，１００１…プローブ，１００２…プローブ，１００３…プローブの３’末端近傍部分，１００４，１２０４…ライゲーション産物，１２０１…プローブ，１２０２…変異部分に相補的な部分でプローブの３’末端の配列部分，１２４０…相補鎖伸長，１２０５…プローブ，１２０６…伸長産物，１２０７…プローブ，１２０８…伸長相補鎖。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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