(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つのリガンド結合ドメインおよび少なくとも１つの作用ドメインを含むキメラタンパク質をコードしている遺伝子構築物であって、
（ａ）リガンド結合ドメインは、下記のうち１以上の特性を有する選択された多価リガンドに結合し：
（ｉ）リガンドはタンパク質ではない；
（ｉｉ）リガンドは５ｋＤ未満の分子量を有する；および
（ｉｉｉ）リガンドは細胞膜に対して透過性である；
（ｂ）作用ドメインは、リガンド結合ドメインに対して異種のシグナリングドメイン、小胞融合ドメインまたは細胞ターゲティングドメインであり；
（ｃ）２個またはそれ以上のキメラタンパク質分子を含むリガンド依存性複合体は、キメラタンパク質分子の作用ドメインの活性を示す；
遺伝子構築物。
【請求項２】
それぞれリガンド結合ドメインおよび作用ドメインを含むキメラタンパク質をコードしている少なくとも２つの遺伝子構築物を含む組成物であって、
（ａ）各リガンド結合ドメインは、下記のうち１以上の特性を有する選択された多価リガンドに結合し：
（ｉ）リガンドはタンパク質ではない；
（ｉｉ）リガンドは５ｋＤ未満の分子量を有する；および
（ｉｉｉ）リガンドは細胞膜に対して透過性である；
（ｂ）１つのキメラタンパク質の作用ドメインはＤＮＡ結合ドメインであり、他のキメラタンパク質の作用ドメインは転写活性化ドメインまたは転写不活性化ドメインである；
組成物。
【請求項３】
５０〜３５０個のアミノ酸残基を有する少なくとも１つのリガンド結合ドメインを含むキメラタンパク質をコードしている、請求項１に記載の遺伝子構築物。
【請求項４】
２００個未満のアミノ酸残基を有する少なくとも１つのリガンド結合ドメインを含むキメラタンパク質をコードしている、請求項３に記載の遺伝子構築物。
【請求項５】
イムノフィリンドメイン、シクロフィリンドメイン、ステロイド結合ドメイン、抗体結合ドメインまたは抗体ドメインを含めた少なくとも１つのリガンド結合ドメインを含むキメラタンパク質をコードしている、請求項１、３または４のいずれかに記載の遺伝子構築物。
【請求項６】
ＦＫ５０６、ＦＫ５２０、ラパマイシン、シクロスポリン、ステロイドもしくは抗生物質、またはこれらのいずれかの誘導体に結合する少なくとも１つのリガンド結合ドメインを含むキメラタンパク質をコードしている、請求項１、３，４または５のいずれかに記載の遺伝子構築物。
【請求項７】
少なくとも１つのリガンド結合ドメインを含むキメラタンパク質をコードし、該リガンド結合ドメインがＦＫ５０６結合タンパク質（”ＦＫＢＰ”）１２ドメインに由来する、請求項１に記載の遺伝子構築物。
【請求項８】
Ｔｙｒ２６、Ｐｈｅ３６、Ａｓｐ３７、Ｔｒｙ８２およびＰｈｅ９９のうち１個以上が異なるアミノ酸で置換された少なくとも１つのＦＫＢＰ１２ドメイン変異体を含むポリペプチドをコードする、請求項７に記載の遺伝子構築物。
【請求項９】
異なるアミノ酸が、独立してＶａｌ、Ａｌａ、ＧｌｙおよびＭｅｔから選択される、請求項８に記載の遺伝子構築物。
【請求項１０】
Ｐｈｅ３６もしくはＡｓｐ３７または両者が独立してＶａｌまたはＡｌａから選択される異なるアミノ酸で置換された少なくとも１つのＦＫＢＰ１２変異体を含むポリペプチドをコードする、請求項８に記載の遺伝子構築物。
【請求項１１】
Ｐｈｅ３６がバリンで置換された少なくとも１つのＦＫＢＰ１２変異体を含むポリペプチドをコードする、請求項１０に記載の遺伝子構築物。
【請求項１２】
２個またはそれ以上のタンパク質分子を含むリガンド依存性複合体を形成すると細胞において生物学的過程を開始することができる細胞表面受容体またはその変異タンパク質の細胞質ドメインを含む作用ドメインを有するキメラタンパク質をコードしている、請求項１または請求項３〜１１のいずれかに記載の遺伝子構築物。
【請求項１３】
作用ドメインが、チロシンキナーゼ受容体、サイトカイン受容体および成長因子受容体の細胞質ドメインであるか、あるいはそれに由来する、請求項１２に記載の遺伝子構築物。
【請求項１４】
受容体が、ＣＤ３ファミリー、ＴＧＦ−ベータファミリーの細胞表面受容体、Ｉｇ受容体ファミリー、リンホカインベータ鎖ファミリー、または神経栄養性チロシンキナーゼのメンバーである、請求項１２に記載の遺伝子構築物。
【請求項１５】
受容体が下記のものから選択される、請求項１３に記載の遺伝子構築物：ＣＤ３ゼータ；ＣＤ３イータ；インターロイキン受容体（ＩＬ−２Ｒ、ＩＬ−３Ｒなど）；ＥＧＦ−Ｒ；ＡＴＲ２／ｎｅｕ；ＨＥＲ２／ｎｅｕ；ＨＥＲ３／ｃ−ｅｒｂＢ−３；Ｘｍｒｋ；インスリン−Ｒ；ＩＧＦ−１−Ｒ［インスリン様成長因子受容体］；ＩＲＲ；ＰＤＧＦ−Ｒ−Ａ；ＰＤＧＦ−Ｒ−Ｂ；ＣＳＦ−１−Ｒ（Ｍ−ＣＳＦ／ｃ−Ｆｍｓ）；ｃ−ｋｉｔ；ＳＴＫ−１／Ｆｌｋ−２；ＦＧＦ−Ｒ；ｆｌｇ［酸性ＦＧＦ］；ｂｅｋ［塩基性ＦＧＦ］）；ＮＧＦ−Ｒ；Ｒｏｒ１，２）；ＦｃεＲＩのベータまたはガンマ鎖；ＦｃγＲＩ  ＩＩ／ＣＤ１６のガンマ鎖；ＣＤ３ガンマ；ＣＤ３−デルタ；ＣＤ３イプシロン；Ｉｇ−アルファ／ＭＢ−１；Ｉｇ−ベータ／Ｂ２９；ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３およびＩＬ−５受容体に共通のベータサブユニット；ＩＬ−６、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、オンコスタチンＭおよびＩＬ−１１に対する受容体と関連するベータ鎖ｇｐ１３０；ＩＬ−４、ＩＬ−７およびＩＬ−１３に対する受容体とも関連するＩＬ−２受容体ガンマサブユニット；ＩＬ−２受容体のベータ鎖；アルファ、ベータまたはガンマインターフェロンに対するいずれかの受容体；ならびに成長ホルモン、エリスロポエチンまたはプロラクチンに対するいずれかの受容体。
【請求項１６】
１以上の他のキメラタンパク質とオリゴマー化すると検出可能な遺伝子転写、チャンネル開放、イオン放出、アシル化、メチル化、加水分解、リン酸化、脱リン酸化、シクロオキシゲネーション、プロテアーゼ活性、タンパク質の分解もしくは不活性化、酸化還元状態の変化、または再配列反応を引き起こすキメラタンパク質をコードしている、請求項１または請求項３〜１５のいずれかに記載の遺伝子構築物。
【請求項１７】
キメラタンパク質がリガンド依存性オリゴマー化すると細胞死を開始する、請求項１または請求項３〜１６のいずれかに記載の遺伝子構築物。
【請求項１８】
１以上のリガンド結合ドメイン、およびリガンド依存性複合体形成すると細胞死を開始するのに十分なＦａｓタンパク質またはＴＮＦ受容体の部分を含むキメラタンパク質をコードしている、請求項１７に記載の遺伝子構築物。
【請求項１９】
キメラタンパク質がリガンド依存性オリゴマー化すると遺伝子転写を開始する、請求項１または請求項３〜１８のいずれかに記載の遺伝子構築物。
【請求項２０】
キメラタンパク質がオリゴマー化すると、ｃＡＭＰ応答性要素、ＳＲＥ、ＶＬ３０、ＲＳＲＦ、ＩＳＲＥ、ＧＡＳ、ＡＲＲＥ−１およびＡＲＲＥ−２よりなる群から選択されるＤＮＡ要素を含む遺伝子からの遺伝子転写を開始する、請求項１または請求項３〜１９のいずれかに記載の遺伝子構築物。
【請求項２１】
キメラタンパク質を特定の細胞区分へ向ける細胞内標的ドメインを含むキメラタンパク質をコードしている、請求項１または請求項３〜２０のいずれかに記載の遺伝子構築物。
【請求項２２】
細胞内標的ドメインが、分泌リーダー配列、膜保持ドメイン、核標的ドメインまたは小胞ターゲティングドメインを含む、請求項２１に記載の遺伝子構築物。
【請求項２３】
膜保持ドメインが、膜スパニングまたは脂質膜結合ドメインを含む、請求項２２に記載の遺伝子構築物。
【請求項２４】
少なくとも２つの遺伝子構築物がそれぞれ請求項１または請求項３〜２３のいずれかに記載のものから選択される、請求項２に記載の組成物。
【請求項２５】
（ａ）第一キメラタンパク質が、転写活性化ドメインおよびそれに対して異種である少なくとも１つのリガンド結合ドメインを含み、
（ｂ）第二キメラタンパク質が、ＤＮＡ結合ドメインおよびそれに対して異種である少なくとも１つのリガンド結合ドメインを含む、
請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
請求項１または３のいずれかに記載の少なくとも１つの遺伝子構築物あるいは請求項２，２４または２５のいずれかに記載の組成物を含むベクター。
【請求項２７】
遺伝子構築物または組成物を細胞特異的に発現する、請求項２６に記載のベクター。
【請求項２８】
真核細胞におけるキメラタンパク質発現のためのプロモーターを含む、請求項２６または２７に記載のベクター。
【請求項２９】
ベクターがウイルスベクターである、請求項２６〜２８のいずれかに記載のベクター。
【請求項３０】
ウイルスベクターが、アデノウイルスベクター、アデノ関連性ウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターである、請求項２９に記載のベクター。
【請求項３１】
請求項１または請求項３ないし２２のいずれかに記載の遺伝子構築物によりコードされた、キメラポリペプチド。
【請求項３２】
請求項１〜３１のいずれかに記載の遺伝子構築物、核酸組成物またはベクターを含む、培養細胞。
【請求項３３】
細胞が哺乳動物細胞である、請求項３２に記載の細胞。
【請求項３４】
細胞が、造血細胞、神経細胞、間充識細胞、皮膚細胞、粘膜細胞、ストローマ細胞、筋細胞、脾細胞、細網内皮細胞、上皮細胞、内皮細胞、肝細胞、腎細胞、消化管細胞または肺細胞である、請求項３２〜３３のいずれかに記載の細胞。
【請求項３５】
細胞が、リンパ球または骨髄単球系列の造血細胞である、請求項３４に記載の細胞。
【請求項３６】
細胞が、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージおよび単球よりなる群から選択される造血細胞である、請求項３５に記載の細胞。
【請求項３７】
細胞が、幹細胞または前駆細胞である、請求項３２〜３６のいずれかに記載の細胞。
【請求項３８】
リガンド依存性複合体の形成に対して応答性である転写制御要素の発現制御下にあるターゲット遺伝子を更に含み、選択されたリガンドに対する曝露後にターゲット遺伝子を発現する、請求項３２〜３７のいずれかに記載の細胞。
【請求項３９】
転写制御要素がＤＮＡ結合ドメインと結合しており、転写活性化ドメインに対して応答性であり、細胞がリガンドを有する物質に対する曝露後に標的遺伝子を発現する、請求項３８に記載の細胞。
【請求項４０】
請求項１〜３０のいずれかに記載の遺伝子構築物、核酸組成物またはベクター、およびこれらによりコードされる２個またはそれ以上のキメラタンパク質分子に結合して２個またはそれ以上のタンパク質分子を有するリガンド依存性複合体を形成するリガンドを含む、キット。
【請求項４１】
細胞において生物学的過程を開始することができる選択されたリガンドに対して応答性の宿主細胞を調製する方法であって、請求項１〜３０のいずれかに記載の少なくとも１つの遺伝子構築物またはベクターを、細胞培養中の細胞に導入することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、キメラタンパク質とダイマーまたはマルチマー、好ましくは非ペプチド有機分子とのオリゴマー化に関する材料、方法および用途に関する。本発明の態様は、宿主細胞の組換え修飾および遺伝子療法におけるそれらの使用または誘導遺伝子発現の他の用途によって例証される。
序論
生物学的特異性は、通常、タンパク質間の極めて特異的な相互作用に起因する。この原理は、細胞外分子が細胞内現象に影響を及ぼす過程であるシグナル形質導入によって例証される。多数の経路は、細胞表面受容体に対する細胞外リガンドの結合によって始まる。多くの場合、受容体ダイマー化は、リン酸基転移および、シグナリングカスケードを継続するタンパク質の補充をもたらす。膜受容体はホモダイマー化によって活性化されうるという認識は、二つの受容体に架橋した抗体によって受容体が活性化されうるという知見に起因した。次に、多数の受容体は、それらの性質を共有することが分かった。多数の受容体の細胞外および貫膜部分は、リガンド依存性ダイマー化またはオリゴマー化によって受容体の細胞質ドメインをごく接近させることによって機能すると考えられるが、受容体の細胞質ドメインは、細胞の内部区分に対して特定のシグナルを伝達する。
他にも、種々の系においてリガンド−受容体相互作用が研究されてきた。例えば、クラーク（Ｃｌａｒｋ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９２）２５８，１２３は、Ｂ細胞抗原受容体複合体の細胞質エフェクターを記載している。デュラン（Ｄｕｒａｎｄ）ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８８）８，１７１５、バーウェイ（Ｖｅｒｗｅｉｊ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９０）２６５，１５７８８およびショウ（Ｓｈａｗ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２４１，２０２は、ＮＦ−ＡＴに支配された転写が、厳密に抗原受容体の制御下にあることを報告している。シクロスポリンＡおよびＦＫ５０６によるＮＦ−ＡＴに支配された転写の阻害は、エメル（Ｅｍｍｅｌ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８９）２４６，１６１７およびフラナガン（Ｆｌａｎａｇａｎ）ら、Ｎａｔｕｒｅ（１９９１）３５２，８０３によって報告されている。デュランら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８８）８，１７１５およびマティラ（Ｍａｔｔｉｌａ）ら、ＥＭＢＯ  Ｊ．（１９９０）９，４４２５は、ＮＦ−ＡＴ結合部位を記載している。ζ鎖を記載している参考文献としては、オルロフ（Ｏｒｌｏｆｆ）ら、Ｎａｔｕｒｅ（１９９０）３４７，１８９〜１９１；キニト（Ｋｉｎｅｔ）ら、Ｃｅｌｌ（１９８９）５７，３５１〜３５４；ワイスマン（Ｗｅｉｓｓｍａｎ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８８）８５，９７０９〜９７１３およびラニア（Ｌａｎｉｅｒ）、Ｎａｔｕｒｅ（１９８９）３４２，８０３〜８０５がある。ＣＤ４免疫粘着は、バーン（Ｂｙｒｎ）ら、Ｎａｔｕｒｅ（１９９０）３４４，６６７〜６７０によって記載されている。ＣＤ８−ζ融合タンパク質は、アービング（Ｉｒｖｉｎｇ）ら、Ｃｅｌｌ（１９９２）６４，８９１によって記載されている。レトゥルナー（Ｌｅｔｏｕｒｎｅｒ）およびクラウスナー（Ｋｌａｕｓｎｅｒ）、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９２）２５５，７９も参照されたい。
プロモーター部分との転写因子結合並びに転写因子の個別の活性化およびＤＮＡ結合を記載している代表的な論文としては、キーガン（Ｋｅｅｇａｎ）ら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８６）２３１，６９９；フィールズ（Ｆｉｅｌｄｓ）およびソング（Ｓｏｎｇ）、同書（１９８９）３４０，２４５；ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）、Ｃｅｌｌ（１９９０）６１，９；レヴィン（Ｌｅｗｉｎ）、Ｃｅｌｌ（１９９０）６１，１１６１；プタシュン（Ｐｔａｓｈｎｅ）およびガン（Ｇａｎｎ）、Ｎａｔｕｒｅ（１９９０）３４６，３２９；アダムス（Ａｄａｍｓ）およびワークマン（Ｗｏｒｋｍａｎ）、Ｃｅｌｌ（１９９３）７２，３０６がある。
小胞集中および融合を記載している代表的な論文としては、ソルナー（Ｓｏｌｌｎｅｒ）ら（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  ３６２，３１８〜３２４；並びにベネット（Ｂｅｎｎｅｔｔ）およびシェラー（Ｓｃｈｅｌｌｅｒ）（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０，２５５９〜２５６３がある。
調節的タンパク質分解を記載している代表的な論文としては、ホフストラッサー（Ｈｏｃｈｓｔｒａｓｓｅｒ）ら（１９９０）Ｃｅｌｌ  ６１，６９７；シェフナー（Ｓｃｈｅｆｆｎｅｒ），Ｍ．ら（１９９３）Ｃｅｌｌ  ７５，４９５；ロジャース（Ｒｏｇｅｒｓ）ら（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３４，３６４〜３６８がある。
ＦＫ５０６および関連化合物に適切な合成技術および修飾に関する追加情報を提供する代表的な刊行物としては、ＧＢ２２４４９９１Ａ号；ＥＰ０４５５４２７Ａ１号；ＷＯ９１／１７７５４号；ＥＰ０４６５４２６Ａ１号、ＵＳ５，０２３，２６３号およびＷＯ９２／００２７８号明細書がある。
しかしながら、この開示から明らかであるように、前述の著者はだれも、本発明を記載していないし示唆してもいない。本発明は、以下に詳細に開示されるが、生細胞中においてタンパク質ホモダイマー化、ヘテロダイマー化およびオリゴマー化を用いるための一般的に利用可能な方法および材料に関する。キメラ応答個体タンパク質は、特異的受容体ドメインとの融合タンパク質として細胞内で発現される。受容体ドメインに対して結合する細胞透過性多価リガンド試薬による細胞の処理は、キメラのダイマー化またはオリゴマー化をもたらす。他のキメラ受容体を類推して（例えば、ワイス（Ｗｅｉｓｓ）、Ｃｅｌｌ（１９９３）７３，２０９を参照されたい）、キメラタンパク質は、所望の連続的結果、例えば、連続的タンパク質−タンパク質相互作用による細胞内シグナルの伝達およびそれによる転写因子の特異的サブセットの活性化をオリゴマー化が引き起こすように設計される。合成リガンドによるキメラタンパク質の細胞内架橋は、様々な細胞性過程の基本的研究においておよび治療用または農業用に重要なタンパク質の合成の調節において可能性がある。更に、リガンドに媒介されたオリゴマー化は、現在、調節的遺伝子療法を可能にしている。そのような場合、それは、安全性、発現レベルおよび遺伝子療法によって得られる全体の有効性の増加に対する新たなアプローチを提供する。
発明の概要
本発明は、新規のキメラ（すなわち「融合」）タンパク質および該キメラタンパク質をオリゴマー化することができる小形有機分子を提供する。キメラタンパク質は、以下に詳細に記載のように、追加（「作用」）ドメインに融合した少なくとも１個のリガンド結合性（すなわち「受容体」）ドメインを含む。更に記載のように、キメラタンパク質は、追加ドメインも同様に含むことができる。これらのキメラタンパク質は、種々のドメインが異なる源に由来しているセンスでの組換え体であり、天然においてそのままで一緒に見出されることはない（すなわち、異種である）。
遺伝子、すなわち、本明細書中において「遺伝子」または「ＤＮＡ」構築物と称するＲＮＡまたは好ましくはＤＮＡ分子は、新規のキメラタンパク質、および場合により標的遺伝子をコードし、宿主細胞の遺伝子工学のために提供される。更に、このような修飾された細胞を生産するおよび用いるための方法および組成物が提供される。本発明の工学処理された細胞は、少なくとも一つのこのようなキメラタンパク質または１個または複数のキメラタンパク質をコードしている第一列の遺伝子構築物を含む。これら構築物は、例えば、特定のドメインまたは発現制御配列をコードしている成分部分が天然において互いに直接結合して見出されることがない（すなわち、異種である）センスでの組換え体である。
本発明の一つのＤＮＡ構築物は、（ａ）少なくとも一つの受容体ドメイン（ある選択されたリガンドに対して結合することができる）を、（ｂ）異種の追加（「作用」）タンパク質ドメインに対して融合して含むキメラタンパク質をコードしている。重要なことに、リガンドは、２種類（またはそれ以上）の受容体ドメインに対して、すなわち、このような受容体ドメインを含むキメラタンパク質に対して、順にまたは同時に、好ましくは約１０-6Ｍ未満、更に好ましくは約１０-7Ｍ未満、なお一層好ましくは約１０-8Ｍ未満、そして若干の実施態様において約１０-9Ｍ未満のＫｄ値で結合することができる。リガンドは非タンパク質であるのが好ましく、分子量は約５ｋＤａ未満である。そのようにオリゴマー化されたキメラタンパク質の受容体ドメインは、同じであってよいしまたは異なってよい。キメラタンパク質は、リガンドに対する暴露によって、すなわち、互いのオリゴマー化によって生物学的過程を開始することができる。コード化されたキメラタンパク質は、更に、キメラタンパク質を望ましい細胞区分に対して向けることができる細胞内標的ドメインを含むことができる。該標的ドメインは、分泌リーダ配列、膜スパニング（ｓｐａｎｎｉｎｇ）ドメイン、膜結合ドメインまたは、例えば、小胞若しくは核と結合するようにタンパク質を支配する配列でありうる。
キメラタンパク質の作用ドメインは、１種類または複数のキメラタンパク質のオリゴマー化によって望ましい生物学的結果をもたらすことができる広範囲のタンパク質ドメインから選択することができる。例えば、作用ドメインは、リガンドに対する暴露および引続きのオリゴマー化によって、検出可能な細胞内シグナル；Ｇａｌ４などのＤＮＡ結合タンパク質；またはＶＰ１６などの転写活性化ドメインを開始することができるＣＤ３ゼータサブユニットなどのタンパク質ドメインを含むことができる。多数の他の例を本明細書中において提供する。検出可能な細胞内シグナルの一つの例は、オリゴマー化に応答する転写制御要素（例えば、エンハンサー／プロモーター要素等）の転写制御下の遺伝子の転写を活性化するシグナルである。
以下に更に詳細に論及されるように、本発明の種々の実施態様において、キメラタンパク質は、ＦＫ５０６型リガンド、シクロスポリンＡ型リガンド、テトラサイクリンまたはステロイドリガンドに対して結合することができる。このようなリガンドは、キメラタンパク質と、同じであってよいしまたは異なってよい他のキメラタンパク質分子とのオリゴマー化をもたらす。
場合により、細胞は、リガンドに媒介されたキメラタンパク質のオリゴマー化によって引き起こされたシグナルに対して、すなわち、リガンドに対する暴露に対して応答性の転写制御要素（例えば、プロモーター／エンハンサー）の転写制御下の標的遺伝子を含む第二組換え遺伝子構築物または１種類若しくは複数のこのような構築物の第二列を更に含む。これらの構築物は、標的遺伝子が本来は応答性転写制御要素の転写制御下にないセンスでの組換え体である。
本発明の一つの態様において、ＤＮＡ構築物は、（ａ）上記のようなキメラタンパク質のオリゴマー化に応答性の転写制御要素および（ｂ）標的遺伝子との結合において宿主細胞中への転写制御要素の相同的組換えを可能にする標的遺伝子からのフランキングＤＮＡ配列を含む。もう一つの実施態様において、構築物は、望ましい遺伝子座中への標的遺伝子の相同的組換えを可能にする標的遺伝子座からの望ましい遺伝子およびフランキングＤＮＡ配列を含む。構築物は、更に、応答性転写制御要素を含むことができるし、または応答性要素は遺伝子座によって提供されることができる。標的遺伝子は、表面膜タンパク質、分泌タンパク質、細胞質タンパク質またはリボザイム若しくはアンチセンス配列をコードすることができる。
本発明の構築物は、更に、宿主細胞中への構築物のトランスフェクションおよび構築物を有するトランスフェクタントの選択を可能にする選択可能なマーカーを含むことができる。本発明は、更に、宿主染色体中へのエピソームトランスフェクションのためであろうとまたは組込みのためであろうと、このような構築物を含むＤＮＡベクターを包含する。ベクターは、例えば、アデノウイルス、アデノ関連性ウイルスまたはレトロウイルスのベクターを含むウイルスベクターであってよい。
本発明は、更に、本発明者のＤＮＡ構築物のいずれかによってコードされたキメラタンパク質、並びに該ＤＮＡ構築物を含むおよび／または発現する細胞を包含し、凍結されていようと活発に増殖中であろうと、培養中であろうとそれらを含む完全な生物であろうと、様々な種および系統の原核細胞および真核細胞、特に、酵母、蠕虫、昆虫、マウス若しくは他の齧歯類動物およびヒト細胞を含む他の哺乳動物細胞を包含する。
例えば、一つの態様において、本発明は、好ましいが必ずしも哺乳動物ではない細胞であって、（ｉ）本発明のある選択されたオリゴマー化リガンドに対して結合することができる少なくとも一つの受容体ドメインおよび（ｉｉ）受容体ドメインに関しては異種であるが、１種類またはそれ以上の他の類似のドメインとのオリゴマー化によって、前記オリゴマー化に応答性の転写制御要素の転写制御下の標的遺伝子の転写活性化を引き起こすことができるもう一つのタンパク質ドメインを含むキメラタンパク質をコードしている第一ＤＮＡ構築物を含む上記細胞を提供する。細胞は、更に、前記オリゴマー化リガンドに応答性の転写制御要素の発現制御下の標的遺伝子を含む。選択されたリガンドに対する引続きの暴露は標的遺伝子を発現する。
もう一つの態様において、本発明は、ＤＮＡ結合ドメインおよび第一の選択されたリガンド残基に対して結合することができる少なくとも一つの受容体ドメインを含む第一キメラタンパク質をコードしているＤＮＡ構築物の第一セットを含む細胞を提供する。細胞は、更に、転写活性化ドメインおよび第二の選択されたリガンド（第一の選択されたリガンド残基と同じであってよいしまたは異なってよい）に対して結合することができる少なくとも一つの受容体ドメインを含む第二キメラタンパク質を含む。細胞は、更に、細胞が１個または複数の選択されたリガンド残基を含む物質に対する暴露後に標的遺伝子を発現するように、ＤＮＡ結合ドメインと結合し且つ転写活性化ドメインに対して応答性である異種転写制御配列の転写制御下の標的遺伝子をコードしているＤＮＡ構築物を含む。
更に提供されるのは、オリゴマー化リガンドに対する暴露によって、すなわち、キメラタンパク質のオリゴマー化によって生物学的過程を開始することができる異種追加タンパク質ドメインに融合された、ある選択されたリガンドに対して結合することができる少なくとも一つの受容体ドメインを含むキメラタンパク質をコードしている第一ＤＮＡ構築物；およびオリゴマー化リガンドに応答性の転写制御要素の転写制御下の標的遺伝子をコードしている第二ＤＮＡ構築物を含むＤＮＡ組成物である。
本発明のもう一つの典型的なＤＮＡ組成物は、第一および第二キメラタンパク質をコードしているＤＮＡ構築物の第一列並びにキメラタンパク質分子のオリゴマー化に応答性の転写制御要素の転写制御下の標的遺伝子をコードしている第二ＤＮＡ構築物を含む。第一キメラタンパク質をコードしているＤＮＡ構築物は、（ａ）ある選択された第一リガンド残基に対して結合することができる少なくとも一つの第一受容体ドメインを、（ｂ）オリゴマー化リガンドに対する暴露によって、すなわち、第二キメラタンパク質分子に対する第一キメラタンパク質のオリゴマー化によって生物学的過程を開始することができる異種追加タンパク質ドメインに対して融合して含む。第二キメラタンパク質をコードしているＤＮＡ構築物は、（ｉ）ある選択された第二リガンド残基に対して結合することができる少なくとも一つの受容体ドメインを、（ｉｉ）オリゴマー化リガンドに対する暴露によって、すなわち、第一キメラタンパク質に対するオリゴマー化によって生物学的過程を開始することができる異種追加タンパク質ドメインに対して融合して含む。このような場合の第一および第二受容体残基は同じであってよいしまたは異なっていてよいし、選択された第一および第二リガンド残基も同様に同じであってよいしまたは異なっていてよい。
本発明者のリガンドは、それらのオリゴマーを生成するための本発明の２種類またはそれ以上のキメラタンパク質分子に対して結合することができる分子であり、式
リンカー−｛ｒｂｍ1，ｒｂｍ2，・・・ｒｂｍn｝
（式中、ｎは、２〜約５の整数であり、ｒｂｍ(1)〜ｒｂｍ(n)は、同じであってよいしまたは異なっていてよいし且つ１種類または複数のキメラタンパク質に対して結合することができる受容体結合残基である）
を有する。ｒｂｍ残基は、２個またはそれ以上のｒｂｍ残基に対して共有結合（「−」）することができる二官能性または多官能性分子であるリンカー残基に対して共有結合している。好ましくは、リガンドは分子量が約５ｋＤａ未満であり、タンパク質ではない。このようなリガンドの例としては、ｒｂｍ残基が同じであるかまたは異なり且つＦＫ５０６型残基、シクロスポリン型残基、ステロイドまたはテトラサイクリンを含むものがある。シクロスポリン型残基としては、シクロスポリンおよび天然に存在するかまたは修飾された、好ましくはＫｄ値が約１０-6Ｍ未満の、シクロスポリンに対して結合することができるその誘導体がある。若干の実施態様において、リガンドは、天然に存在する受容体に対して約１０-6より大、更に好ましくは約１０-5より大のＫｄ値で結合することが好ましい。本発明の典型的なリガンドは、少なくとも一つのｒｂｍがＦＫ５０６、ＦＫ５２０、ラパマイシンまたはＣ９、Ｃ１０若しくは両方に修飾されたそれらのら誘導体の分子を含むものであり、そのリガンドは、天然に存在する受容体タンパク質に関するＫｄ値より少なくとも一桁、好ましくは２桁、更に好ましくは３桁、なお一層好ましくは４桁若しくは５桁またはそれ以上少ないＫｄ値の修飾受容体または修飾受容体ドメインを含むキメラ分子に対して結合する。リンカー残基は以下に更に詳細に記載されるが、例示のために、Ｃ２〜Ｃ２０アルキレン残基、Ｃ４〜Ｃ１８アザアルキレン残基、Ｃ６〜Ｃ２４Ｎ−アルキレンアザアルキレン残基、Ｃ６〜Ｃ１８アリーレン残基、Ｃ８〜Ｃ２４アルジアルキレン残基またはＣ８〜Ｃ３６ビスカルボキサミドアルキレン残基のような残基がある。
本発明のモノマーｒｂｍ、更には本発明者のキメラタンパク質に対して結合することができるが（個々のｒｂｍのモノマー性のために）それらのダイマー化または高次オリゴマー化に影響を与えないｒｂｍの単コピーを含む化合物は、オリゴマー化アンタゴニストである。
一つの実施態様において、本発明の遺伝子工学処理された細胞は、所望のタンパク質の調節的生産に用いることができる。その実施態様において、リガンドに誘導された調節下で望ましい遺伝子を発現するように本発明にしたがって工学処理された細胞を、慣用的手段による培養で増殖させる。培地に対するリガンドの添加は、所望の遺伝子の発現および所望の遺伝子タンパク質の生産をもたらす。次に、遺伝子の発現およびタンパク質の生産を、以下に詳細に記載のように、培地に対してオリゴマー化アンタゴニスト試薬を加えることによって止めることができる。或いは、本発明を用いて、リガンド誘導可能細胞死特性を細胞中に工学処理するのに用いることができる。次に、このような工学処理された細胞は、リガンドを培地に対して加えることによってそれらの目的（例えば、所望のタンパク質または他の生産物の生産）をかなえた後に、細胞培養から除去することができる。本発明の工学処理された細胞は、更に、インビボで用いて完全な生物、好ましくはヒトを含む動物を、例えば、このような細胞を含む動物中で望ましいタンパク質または他の結果を細胞が生じるように修飾することができる。このような用途としては遺伝子療法がある。或いは、キメラタンパク質およびオリゴマー化分子を細胞外で用いて、生理学的作用を開始するように協力して作用するタンパク質を集めることができる。
本発明は、したがって、オリゴマー化リガンドの添加に反応して細胞中の生物学的作用を達成するための材料および方法を提供する。該方法は、本発明によって工学処理された細胞を提供することおよび該細胞をリガンドに対して暴露することを必要とする。
例えば、本発明の一つの実施態様は、細胞中の標的遺伝子の転写を活性化するための方法である。該方法は、（ａ）本発明のキメラタンパク質をコードしている少なくとも一つのＤＮＡ構築物および（ｂ）標的遺伝子を含む且つ発現することができる細胞を提供することを必要とする。キメラタンパク質は、ある選択されたオリゴマー化リガンドに対して結合することができる少なくとも一つの受容体ドメインを含む。受容体ドメインは、オリゴマー化リガンドに対する暴露によって、すなわち、作用ドメインの別のコピーを含む１種類またはそれ以上の他のキメラタンパク質とのオリゴマー化によって、細胞内シグナルを開始することができる作用ドメインに対して融合される。そのシグナルは、遺伝子、例えばこの場合、そのシグナルに応答性の転写制御要素の転写制御下にある標的遺伝子の転写を活性化することができる。該方法は、したがって、標的遺伝子の発現を引き起こすのに有効な量のキメラタンパク質に対して結合することができるオリゴマー化リガンドに対する細胞の暴露を必要とする。細胞が培養中で増殖している場合、リガンドに対するそれらの暴露は、培地に対してリガンドを加えることによって行なわれる。細胞が宿主生物中に存在している場合、リガンドに対するそれらの暴露は、宿主生物に対してリガンドを投与することによって行なわれる。例えば、宿主生物が動物、特に（ヒトを含む）哺乳動物である場合、リガンドは、宿主動物に対して経口、頬、舌下、経皮、皮下、筋肉、静脈内、関節内または吸入投与によって、投与に適当なビヒクル中で投与される。
本発明は、更に、本発明の工学処理された細胞を包含する論題において、標的遺伝子の転写を活性化するための、例えば、本発明のもう一つの生物学的結果を達成するための、本発明のオリゴマー化リガンドを薬学的に許容しうる担体と一緒に、場合により１種類またはそれ以上の薬学的に許容しうる賦形剤と一緒に含む薬剤組成物を包含する。オリゴマー化リガンドは、他のところに詳細に記載のホモオリゴマー化試薬またはヘテロオリゴマー化試薬でありうる。同様に、本発明は、更に、問題の本発明の工学処理された細胞におけるキメラタンパク質のオリゴマー化レベルを全体としてまたは一部減少させるための、そしてそれによって標的遺伝子の転写を脱活性化するための、例えば、本発明の別の生物学的結果を停止させるための、本発明のオリゴマー化アンタゴニストを薬学的に許容しうる担体、場合により１種類またはそれ以上の薬学的に許容しうる賦形剤と一緒に含む薬剤組成物を包含する。したがって、薬剤組成物を製造するためのオリゴマー化試薬およびオリゴマー化アンタゴニスト試薬の使用は、本発明によって包含される。
本発明は、更に、本発明のオリゴマー化リガンドに応答性の宿主生物、好ましくは動物、多くの場合哺乳動物を提供する方法を提供する。該方法は、本発明にしたがって工学処理された、すなわち、これについてのキメラタンパク質をコードしているＤＮＡ構築物等を含む細胞を生物中に導入することを必要とする。或いは、本発明のＤＮＡ構築物を宿主生物、例えば、哺乳動物中に、１種類またはそれ以上の宿主哺乳動物細胞のトランスフェクションを可能にする条件下で導入することができる。
本発明者は、更に、本発明のリガンドに応答性の細胞を生産するためのキットを提供する。一つのキットは、少なくとも一つの受容体ドメインおよび作用ドメイン（他のところに記載されている）を含む本発明者のキメラタンパク質の一つをコードしている少なくとも一つのＤＮＡ構築物を含む。キットは、キットのＤＮＡ構築物によってコードされたキメラタンパク質分子をオリゴマー化することができる一定量の本発明のリガンドを含んでいてよいし、更に、モノマーリガンド試薬などの一定量のオリゴマー化アンタゴニストを含んでいてよい。唯一のキメラタンパク質が１種類または複数の構築物によってコードされている場合、オリゴマー化リガンドはホモオリゴマー化リガンドである。２種類以上のこのようなキメラタンパク質がコードされている場合、ヘテロオリゴマー化リガンドが含まれていてよい。キットは、更に、遺伝子標的および／またはキメラタンパク質分子のオリゴマー化に応答性の転写制御要素をコードしている「第二列」ＤＮＡ構築物を含んでいてよい。ＤＮＡ構築物は、好ましくは、トランスフェクタントの好都合な選択のための１種類またはそれ以上の選択マーカー、更には原核生物の複製、真核生物の発現等に有用な他の慣用的なベクター要素と結合している。選択マーカーは、それぞれ異なるＤＮＡ構築物に対して同じであってよいしまたは異なっていてよく、１種類または複数のこのようなＤＮＡ構築物それぞれを含む細胞の選択を可能にする。
例えば、本発明の一つのキットは、転写活性化因子ドメインに対して融合した（ある選択されたリガンドに対して結合することができる）少なくとも一つの受容体ドメインを含むキメラタンパク質をコードしている第一ＤＮＡ構築物；ＤＮＡ結合ドメインに対して融合した（ある選択されたリガンドに対して結合することができる）少なくとも一つの受容体ドメインを含む第二キメラタンパク質をコードしている第二ＤＮＡ構築物；並びにＤＮＡ結合ドメインが結合するＤＮＡ配列であって、第一および第二キメラタンパク質の存在下でのリガンドに対する暴露によって転写活性化される該ＤＮＡ配列を含む転写制御要素の制御下の標的遺伝子をコードしている第三ＤＮＡ構築物を含む。
或いは、応答性転写制御要素の制御下の標的遺伝子を導入するためのＤＮＡ構築物は、工学処理された細胞が、専門家によって与えられるべき遺伝子を誘発的に発現するキットを提供するように標的遺伝子の代わりにクローニング部位を含むことができる。
本発明の他のキットは、１種類またはそれ以上が作用ドメイン（転写開始シグナル発生因子、転写活性化因子、ＤＮＡ結合タンパク質等）の代わりにクローニング部位を含んでいるキメラタンパク質のための１種類または２種類（またはそれ以上）のＤＮＡ構築物を含むことができ、どの作用ドメインでも／使用者が望むものを挿入することを可能にする。このようなキットは、場合により、前記のような他の要素、例えば、応答性発現制御下の標的遺伝子のためのＤＮＡ構築物、オリゴマー化リガンド、アンタゴニスト等を含むことができる。
キットはいずれも、本発明の構築物によって安定して形質転換された陽性対照細胞を含むことができ、それらは、リガンドに対する細胞の暴露に応答してリポーター遺伝子（ＣＡＴのためのβ−ガラクトシダーゼまたは任意の好都合に検出可能な遺伝子産物）を発現する。リポーター遺伝子の発現を検出するおよび／または定量するための試薬を更に提供することができる。
【図面の簡単な説明】
図１は、プラスミドｐＳＸＮｅｏ／ＩＬ２（ＩＬ２−ＳＸ）の略図である。ＮＦ−ＡＴ−ＳＸにおいて、ＩＬ−２エンハンサー／プロモーターを有するＩＬ−２−ＳＸからのＨｉｎｄＩＩＩ−ＣｌａＩ  ＤＮＡフラグメントは、基礎転写を与える最小のＩＬ−２プロモーターおよび３個のタンデムＮＦＡＴ結合部位（以下に記載される）を含む誘導要素によって置き換えられる。
図２は、細胞内シグナリングキメラプラスミドｐ＃ＭＸＦｎおよびｐ＃ＭＦｎＺの製造のフローダイヤグラムであり、ｎは結合ドメインの数を示す。
図３Ａおよび３Ｂは、細胞外シグナリングキメラプラスミドｐ＃１ＦＫ３／ｐＢＪ５の製造のフローダイヤグラムである。
図４Ａ、４Ｂおよび４Ｃは、本発明において用いられるプラスミドの構築において用いられるプライマーの配列である。
図５は、受容体ＴＡＣ／ＣＤ３ζとリガンドとの反応に対する、異なるエンハンサー基を有するリポーター構築物の反応のチャートである。
図６は、実施例１に記載のＴＡｇジュルカット（Ｊｕｒｋａｔ）細胞による各種リガンドの活性のチャートである。
図７は、細胞外受容体１ＦＫ３（ＦＫＢＰｘ３／ＣＤ３ζ）によるリガンドＦＫ１０１２Ａ（８、図９Ｂ）の活性のチャートである。
図８は、ミリストイル化ＣＤ３ζ／ＦＫＢＰ１２キメラによるシグナリングによるＮＦＡＴリポーターの活性化のチャートである。
図９Ａおよび９Ｂは、アリル結合ＦＫ５０６変異型およびシクロヘキシル結合ＦＫ５０６変異型それぞれの化学構造である。
図１０は、ＦＫ５２０の誘導体の合成のフローダイヤグラムである。
図１１ＡおよびＢは、ＦＫ５２０の誘導体の合成のフローダイヤグラムおよびＦＫ５２０の化学構造であり、それらの下部構造は突然変異体ＦＫＢＰ１２に対して結合するように設計される。
図１２は、推定上の切片における修飾ＦＫ５２０を有する突然変異体ＦＫＢＰの図示である。
図１３は、ＦＫ５２０およびシクロスポリンのヘテロダイマーの合成のフローダイヤグラムである。
図１４は、受容体ドメインとしてイムノフィリン残基を有するキメラタンパク質によって図示されるキメラタンパク質のオリゴマー化の略図である。
図１５は、キメラタンパク質のリガンドに媒介されたオリゴマー化を表わし、転写開始シグナルの引き金を図式的に示す。
図１６は、ＦＫ−５０６型残基を基剤とするＨＥＤおよびＨＯＤ試薬についての合成スキームを表わす。
図１７は、ＣｓＡで開始する（ＣｓＡ）２の合成を表わす。
図１８は、融合ｃＤＮＡ構築物およびタンパク質ＭＺＦ３Ｅの概観である。
図１９は、ＦＫ１０１２存在下のＭＺＦ１ＥｈとＭＺＦ１Ｅｆとの共免疫沈降を表わす（Ｅｈ：Ｆｌｕ−エピトープ−ｔａｇ、Ｅｆ：−フラグ−エピトープ−ｔａｇ）。
図２０は、細胞の低下した転写活性によって示されるような、ミリストイル化Ｆａｓ−ＦＫＢＰ１２融合タンパク質（ＭＦＦ３Ｅ）によってトランスフェクトされたジュルカットＴ細胞系のＦＫ１０１２に誘導された細胞死を示す。
図２１Ａは、一時的トランスフェクション検定におけるシクロスポリン−Ｆａｓ（およびＦａｓ−シクロスポリン）融合構築物の分析である。ＭＣ３ＦＥはこの系列において最も有効であることが分かった。
図２１Ｂは、イムノフィリン−Ｆａｓ抗原キメラ、および大型Ｔ抗原によって安定して形質転換されたジュルカットＴ細胞における一時的発現実験結果を表わす。Ｍｙｒ：残基１〜１４をコードしているｐｐ６０c-srcから得られたミリスチル化配列（ウィルソン（Ｗｉｌｓｏｎ）ら、Ｍｏｌ  ＆  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ９  ４（１９８９）：１５３６〜４４）；ＦＫＢＰ：ヒトＦＫＢＰ１２；ＣｙｐＣ：残基３６〜２１２をコードしているネズミシクロフィリンＣ配列（フライドマン（Ｆｒｅｉｄｍａｎ）ら、Ｃｅｌｌ  ６６  ４（１９９１）：７９９〜８０６）；Ｆａｓ：残基１７９〜３１９をコードしているヒトＦａｓ抗原の細胞内ドメイン（オイム（Ｏｅｈｍ９ら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６７  １５（１９９２）：１０７０９〜１５）。細胞は、３個のタンデムＡＰ１プロモーターの制御下の分泌アルカリ性ホスファターゼリポーター遺伝子をコードしているプラスミドを、６倍モル過剰のイムノフィリン融合構築物と一緒に用いてエレクトロポレーションが行なわれた。２４時間後、リポーター遺伝子の合成および（ＣｓＡ）２を刺激するＰＭＡ（５０ｎｇ／ｍｌ）で細胞を刺激した。４８時間目に細胞のリポーター遺伝子活性を評価した。抗ＨＡエピトープ抗体を用いて、ウェスタンブロットを２４時間目に行なった。
図２２は、実施例８からのＣＡＴ検定結果を表わす。
図２３は、修飾ＦＫ−５０６型化合物の合成を表わす。
説明
Ｉ．総論
本発明は、キメラタンパク質、該キメラタンパク質をオリゴマー化するための有機分子およびそれらを用いるシステムを提供する。融合タンパク質は、（好ましくは小形の）有機オリゴマー化分子に対して結合するための結合ドメインおよびキメラタンパク質のオリゴマー化の結果としての生理学的作用または細胞性過程を果たすことができる作用ドメインを有する。
誘導タンパク質結合の基本的概念を図１４に図示する。ヘテロダイマー化（またはヘテロオリゴマー化、「ＨＥＤ」）およびホモダイマー化（またはホモオリゴマー化、「ＨＯＤ」）として機能しうるリガンドは、ダンベル形構造として表わされている。
（ホモダイマー化およびホモオリゴマー化とは、本発明のリガンドのそばにあるように結合された、ダイマーおよびオリゴマーを形成する類似成分の結合を意味する。ヘテロダイマー化およびヘテロオリゴマーとは、ダイマーまたはオリゴマーを形成する類似していない成分の結合を意味する。したがって、ホモオリゴマーは、特定の成分の多重コピーの結合を含むが、ヘテロオリゴマーは、異なる成分のコピーの結合を含む。接頭辞を伴ってまたは伴うことなく本明細書中で用いられる「オリゴマー化」、「オリゴマー化する」および「オリゴマー」という用語は、反対の明白な表示を欠いた「ダイマー化」、「ダイマー化する」および「ダイマー」を包含する意味である）
図１４で更に表わされているのは、目的の標的タンパク質ドメイン（「作用ドメイン」）およびリガンドに対して結合しうる１個またはそれ以上の受容体ドメインを含む融合タンパク質分子である。細胞内キメラタンパク質、すなわち、それらを生産する細胞中にあるタンパク質については、細胞標的配列（細胞小器官標的アミノ酸配列を含む）も存在するのが好ましい。受容体ドメインに対するリガンドの結合は、融合タンパク質をヘテロ−またはホモダイマー化する。オリゴマー化は、作用ドメインを互いに極めて接近させることによって、それぞれの作用ドメインが通常関与している細胞性過程、例えば、ＴＣＲに媒介されたシグナル導入などを引き起こす。
オリゴマー化によって引き起こされうる細胞性過程としては、物理的状態などの状態変化、例えば、立体配座変化、結合パートナーの変化、細胞死、転写の開始、チャンネル開口、Ｃａ+2などのイオン放出等または化学反応、例えば、アシル化、メチル化、加水分解、リン酸化若しくは脱リン酸化などの化学的状態の変化、酸化還元状態の変化、転位等がある。したがって、リガンドに媒介されたオリゴマー化によって引き起こされうるこのような過程はいずれも、本発明の範囲内に包含される。
本発明の最初の応用として、オリゴマー化分子に応答性であるように細胞を修飾する。修飾された細胞は、遺伝子療法において並びに誘導転写または翻訳（両方とも用語表現に包含される）が望まれる他の用途において用いることができる。細胞は、遺伝子構築物の少なくとも第一または第一列（該列は１種類の構築物のみを含むことができる）、および望ましくは構築物の第二または第二列（該列は１種類の構築物のみを含むことができる）を含むゲノムを特徴とする。
このような遺伝子構築物の性質および数は、キメラタンパク質の性質およびそれが細胞中で果たす役割に依存する。例えば、キメラタンパク質が遺伝子の発現に関係しているべきである（および細胞表面膜または細胞小器官、例えば、核若しくは小胞に関係するようにキメラタンパク質を支配する細胞内標的配列またはドメインを含むことができる）実施態様においては、通常、少なくとも２列の構築物、すなわち、リガンドに媒介されたオリゴマー化によって標的遺伝子発現を支配するシグナルを開始する１種類または複数のキメラタンパク質をコードしている第一列、および望ましくは、標的遺伝子および／またはそれについてのシグナルに応答性である発現制御要素を含む第二列が存在する。
ホモオリゴマー、通常ホモダイマーが関与している場合、第一列の単一構築物のみが必要とされるが、ヘテロオリゴマーが関与している場合、２個またはそれ以上、通常は３個以下の構築物が関与しうる。第一列の構築物によってコードされているキメラタンパク質は、遺伝子転写の発動作用に関係し、そして通常、オリゴマー化されたキメラタンパク質が直接的にまたは間接的に１種類またはそれ以上の標的遺伝子の転写を開始することができる場合、表面膜または核に対して向けられる。１種類または複数の外因性遺伝子が導入される場合、または外因性若しくは組換え体発現制御配列が（例えば、相同的組換えによって）導入される場合、どちらの場合にも、キメラタンパク質のオリゴマー化によって転写が活性化される内因性遺伝子の発現のために追加の構築物の第二列が必要とされる。
キメラタンパク質が細胞内であり且つ別の遺伝子の転写の開始を伴うことなく直接的に作用しうる場合、構築物の異なる第一列を用いる。例えば、オキソサイトーシスに関係したタンパク質は、該タンパク質がオリゴマー化分子の存在下以外は複合体でないのが普通である場合、誘導的または構成的に発現させることができる。宿主細胞中で複合体を作らない；他のタンパク質との複合体形成によって阻害され、その阻害はリガンドとのオリゴマー化によって克服することができ；宿主細胞中で利用できない過程による活性化を必要とするこれらの性質のいずれかまたは全てを有するタンパク質を用いることにより；または複合体形成および膜融合の程度がオリゴマー化分子存在で増大される場合に、小胞と原形質膜との融合を支配してキメラタンパク質を生成するタンパク質を修飾することにより、エキソサイトーシスは、オリゴマー化分子によって誘導されるべき能力であるまたはを有する。
他の細胞内タンパク質、例えば、キナーゼ、ホスファターゼおよび細胞周期調節タンパク質は、同様に修飾することができるし且つ用いることができる。
本発明の遺伝子構築物の種々のクラスを以下のように記載する。
（１）リガンドに媒介されたキメラタンパク質のオリゴマー化が、それ自体で（ホモオリゴマーを生成する）または異なる作用ドメインを含む異なる融合タンパク質と一緒に（ヘテロオリゴマーを生成する）、１種類またはそれ以上の遺伝子の転写活性化を引き起こす一連の結果を引き起こすシグナルを誘導するように、結合ドメインが細胞外または細胞内であり且つ作用ドメインが細胞内である場合、結合ドメインおよび作用ドメインを含むキメラタンパク質をコードする構築物；
（２）リガンドに媒介されたタンパク質のオリゴマー化が、それ自体で（ホモオリゴマーを生成する）または異なる作用ドメインを含む異なる融合タンパク質と一緒に（ヘテロオリゴマーを生成する）、１種類または複数のオリゴマーとＤＮＡ転写開始部分との複合体形成によって直接的に転写の開始を誘導するように、結合ドメインおよび作用ドメインが核内にある場合、結合ドメインおよび作用ドメインを有するキメラタンパク質をコードする構築物；
（３）リガンドに媒介されたタンパク質のオリゴマー化が、それ自体で（ホモオリゴマーを生成する）または異なる作用ドメインを含む異なる融合タンパク質と一緒に（ヘテロオリゴマーを生成する）オキソサイトーシスを引き起こすように、結合ドメインおよび作用ドメインが細胞質である場合、結合ドメインおよび作用ドメインを有するキメラタンパク質をコードする構築物；および
（４）結合ドメインおよび作用ドメインが細胞外であり且つ作用ドメインが、（非制限例として、作用ドメイン自体が物質、受容体または他の膜タンパク質に対して結合して、リガンドに媒介されたキメラのオリゴマー化によって、１種類またはそれ以上の類似のまたは類似していない分子または細胞の架橋を生じる）生物学的活性の開始と関係している場合、結合ドメインおよび作用ドメインを有するキメラタンパク質をコードする構築物；および
（５）タンパク質と、異なる作用ドメインを含む標的タンパク質とのリガンドに媒介されたオリゴマー化が、前記オリゴマー化された標的タンパク質の脱安定化および／または分解若しくは失活をもたらすように、結合ドメインおよび作用ドメインを有する脱安定性、不活性または短命のキメラタンパク質をコードする構築物。
ＩＩ．転写調節
前記グループ（１）および（２）の１種類または複数の構築物を最初に考える。グループ（１）構築物は、グループ（２）構築物と作用が異なる。グループ（１）構築物は、幾分多面的であり、すなわち、多数の野生型遺伝子並びに１種類または複数の標的遺伝子を活性化することができる。更に、リガンドに対するグループ（１）遺伝子の発現産物の応答は比較的遅い。グループ（２）構築物は、特異的標的遺伝子を支配することができ且つ転写される遺伝子数を制限することができる。リガンドに対するグループ（２）構築物の発現産物の応答は極めて速い。
グループ（１）および（２）のための問題のシステムとしては、キメラタンパク質をコードしているＤＮＡ配列を含む構築物の第一列があり、１〜３種類、通常は１〜２種類の異なる構築物が関与しているのが一般的である。通常、該システムは、１種類またはそれ以上の遺伝子、通常は外因性遺伝子を発現させる構築物の第二列を更に含む。「外因性遺伝子」とは、例えば、細胞の性質のために、細胞の遺伝的欠陥のために、遺伝子が異種に由来するかまたは突然変異若しくは合成遺伝子であるため或いはその同等の理由のために、他の状況では通常は細胞によって発現されない遺伝子を意味する。このような遺伝子は、タンパク質、アンチセンス分子、リボザイム等をコードすることができるし、または発現制御配列が通常通り結合していない内因性遺伝子に対して結合した若しくは結合されるべき発現制御配列を含むＤＮＡ配列でありうる。例えば、前述のように、構築物は、リガンドに誘導された内因性遺伝子の発現のための外因性または組換え体発現制御配列を含むことができる。
グループ（１）、（２）および（３）の構築物によってコードされたキメラタンパク質は、しばしば好ましいように、キメラタンパク質を所望の区分、例えば、所望の生物学的活性がリガンドに媒介されたキメラタンパク質のオリゴマー化、少なくともダイマー化によって開始されることができる表面膜、核、小胞膜または他の部位に対して向ける配列を含む細胞内標的ドメインを有することができる。
キメラタンパク質は、少なくとも一つのリガンド分子を結合することができる第二（「結合」または「受容体」）ドメインを含む。リガンドは２個以上の結合部位またはエピトープを含むことができるので、それは本発明のキメラタンパク質とダイマーまたは高次ホモ若しくはヘテロオリゴマーを生成することができる。キメラタンパク質の結合ドメインは、１個または複数の結合部位を有することができるので、ホモオリゴマーは二価リガンドと生成されることができる。この方法において、リガンドは、第二ドメインが結合しうる２個またはそれ以上のエピトープを有することによってキメラタンパク質をオリゴマー化し、それによってキメラタンパク質を高次オリゴマー化させることができる。
キメラタンパク質は、更に、リガンドに媒介されたキメラタンパク質分子のオリゴマー化の際に結合ドメインによって生物学的活性を開始することができる第三（「作用」）ドメインを含む。例えば、作用ドメインは、リガンドに媒介されたオリゴマー化の結果としてのシグナルの導入に関係していることがある。このようなシグナルは、例えば、シグナル導入に関与した特定の中間体成分に応じて、１種類またはそれ以上の遺伝子の転写開始を引き起こすことがある。細胞内標的ドメインがミリスチン酸残基を含み；受容体ドメインが３個のＦＫＢＰ１２残基を含み；そして作用ドメインがゼータサブユニットを含む典型的なキメラタンパク質を表わしている図１５を参照されたい。他のキメラタンパク質において、作用ドメインは、オリゴマー化によって１種類またはそれ以上の標的遺伝子の転写開始を引き起こす内因性および／または外因性の転写因子を含むことができる。作用ドメインは、小胞膜と表面または他の膜との融合に関係しているタンパク質またはそれらの部分、例えば、ＳＮＡＰおよびＳＮＡＲＥ群のタンパク質を含むことができる（ソルナー（Ｓｏｌｌｎｅｒ）ら（１９９３）３６２，３１８および３５３；Ｃｅｌｌ（１９９３）７２，４３）。
Ａ．表面膜受容体
本発明の一つの態様のキメラタンパク質は、表面膜に関与し且つ１種類またはそれ以上の遺伝子の転写をもたらすシグナルを導入することができる。その過程は、１種類または複数の標的遺伝子と結合したプロモーター部分に対する転写因子の結合が最高点に達する一連の相互作用において多数の補助タンパク質を必要とする。転写因子が、他の遺伝子と結合したプロモーター部分に対して結合する場合、転写はそこで同様に開始される。この実施態様のキメラタンパク質をコードしている構築物は、プロセッシングにされることがあり、したがって成熟キメラタンパク質中に存在していないかもしれないシグナル配列をコードすることができる。キメラタンパク質は、いずれにせよ、（ａ）予め決定されたリガンドを結合することができる結合ドメイン、（ｂ）細胞表面／膜に対して融合タンパク質を輸送し且つ細胞表面膜に対して結合したタンパク質を保持するための貫膜ドメインまたは付着脂質を含む（多くの実施態様において好ましいが）任意の膜結合ドメイン、および（ｃ）作用ドメインとしての細胞質シグナル開始ドメインを含む。細胞質シグナル開始ドメインは、転写開始領域において開始されたシグナルのための認識配列を有する遺伝子の転写を引き起こすシグナルを開始することができる。
キメラタンパク質からのシグナルによって発現が調節される遺伝子を、それが内因性または外因性（またはハイブリッド）発現制御配列の発現制御下の外因性遺伝子であろうと内因性遺伝子であろうと、本明細書中において「標的」遺伝子と称する。更に、膜に対して結合するキメラタンパク質の分子部分を「保持ドメイン」と称する。適当な保持ドメインとしては、膜の脂質層に対して直接的に、例えば、膜中の脂質関与または膜を介する延長等によって結合する残基がある。このような場合、図１５に示されたように、タンパク質は膜、特に細胞膜に対して輸送され且つ結合されるようになる。
Ｂ．核転写因子
別の第一構築物は、タンパク質を核に対して輸送させる細胞標的配列を含むキメラタンパク質をコードする。この（「シグナル共通」）配列は、二部分から成る塩基性反復と称される多数の塩基性アミノ酸を有する（ガルシア・バストス（Ｇａｒｃｉａ−Ｂｕｓｔｏｓ）ら、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ（１９９１）１０７１，８３〜１０１において論及された）。この配列は、Ｎ−またはＣ末端の内部またはそれに近い分子のいずれかの部分に現れることがあるし、そかも核の中にあるキメラタンパク質を生じる。本発明の一つの実施態様の実施は、少なくとも２種類の（「第一列」）キメラタンパク質、すなわち、（１）標的遺伝子と結合した転写開始領域のＤＮＡに対して結合する作用ドメインを有するものおよび（２）第一キメラタンパク質のＤＮＡ結合ドメインと一緒に、標的遺伝子の転写を開始することができる転写活性化ドメインを作用ドメインとして含む異なるキメラタンパク質を必要とする。２種類の作用ドメインまたは転写因子は、同じかまたは異なるタンパク質分子に由来しうる。
転写因子は、細胞宿主に対して内因性または外因性でありうる。転写因子が外因性であるが宿主中で機能性であり、しかも内因性ＲＮＡポリメラーゼと協同することができる（外因性ＲＮＡポリメラーゼを必要とするよりもむしろ、そのために遺伝子を導入しうる）場合、融合された転写因子によって機能性の外因性プロモーター要素は、標的遺伝子の転写を調節するための第二構築物と一緒に与えられることができる。これによって、転写の開始は、外因性プロモーター領域と結合した１種類または複数の遺伝子、すなわち、１種類または複数の標的遺伝子に限定されることができる。
活性に対して２種類のサブユニットを必要とする多数の転写因子が知られている。或いは、単一転写因子が二つの別個の機能性ドメイン（例えば、転写活性化ドメインおよびＤＮＡ結合ドメイン）に分割されることができる場合、それぞれのドメインは、極めて接近して集められた場合以外はそれ自体不活性であるので、転写活性が回復される。用いることができる転写因子としては、フィールズおよびソング、上記によって記載の二つのドメインに分割されることができる酵母ＧＡＬ４がある。著者らは、ＧＡＬ４（１〜１４７）−ＳＮＦ１およびＳＮＦ４−ＧＡＬ４（７６８〜８８１）の融合を使用しており、そこにおいてＳＮＦ１および−４は、結合ドメインとしての問題の結合タンパク質によって置き換えることができる。ＧＡＬ４およびＶＰ１６またはＨＮＦ−１の組合せを用いることができる。他の転写因子は、Ｊｕｎ、ＦｏｓおよびＡＴＦ／ＤＲＥＢ系列、Ｏｃｔ１、Ｓｐ１、ＨＮＦ−３、ステロイド受容体超系列等のメンバーである。
ＤＮＡ結合ドメインおよび天然に存在する活性化ドメインまたはその修飾された形の組合せを用いる代わりとして、活性化ドメインを、転写活性化ドメインと、制限されないがＲＮＡポリメラーゼＩＩが挙げられるＲＮＡポリメラーゼとの間の架橋によって結合した結合タンパク質の一つで置き換えることができる。これらのタンパク質としては、ＴＡＦと称するタンパク質、ＴＦＩＩタンパク質、特にＢおよびＤまたは類似のものがある。したがって、ＤＮＡ結合タンパク質とＲＮＡポリメラーゼとの間の架橋に役立ち且つ転写を開始させる融合タンパク質またはそれらの結合モチーフなどのタンパク質のいずれか１種類または組合せを用いることができる。好ましくは、ＲＮＡポリメラーゼに最も近いタンパク質をＤＮＡ結合ドメインと一緒に用いて転写を開始させる。所望ならば、問題の構築物は、３種類またはそれ以上、通常約４種類以下のタンパク質を集めて、転写開始複合体を提供することができる。
転写活性化ドメインを作用ドメインとして有するよりもむしろ、不活性化ドメイン、例えば、ｓｓｎ−６／ＴＵＰ−１またはクリュッペル（Ｋｒｕｐｐｅｌ）系列サプレッサードメインを用いることができる。この方法において、調節は、構成的に発現される遺伝子の転写を停止させる。例えば、遺伝子療法の場合、成長ホルモンなどのホルモン、血液タンパク質、免疫グロブリン等を構成的に発現させることができる。リガンド結合ドメインに対して結合したＤＮＡ結合ドメインを含む一つのキメラタンパク質およびリガンド結合ドメインに対して結合した不活性化ドメインを含む別のキメラタンパク質をコードしている構築物を用いることにより、遺伝子の発現はリガンドに媒介されたオリゴマー化によって阻害されることがある。
特に、転写活性化ドメイン若しくはサブユニットに対して融合したリガンド結合ドメイン、転写不活性化ドメインまたはＤＮＡ結合ドメインを含むキメラタンパク質をコードしている構築物は、他の構築物について記載されたのと同様に設計され且つ組み立てられる。しばしば、転写因子のＮ末端は、リガンド結合ドメインのＣ末端に対して結合されるが、いくつかの場合、例えば、単一転写因子の二つの個々のドメインが二つの異なるキメラ間に分かれている場合、逆も真である。
ＩＩＩ．エキソサイトーシス
リガンドに媒介されたオリゴマー化機序のもう一つの用途は、転写よりもむしろタンパク質の輸出がリガンドによって制御されているエキソサイトーシスである。これは、分泌シグナル配列によって目的の１種類または複数のタンパク質を分泌させる代わりとして、目的の１種類またはそれ以上のタンパク質の発現と一緒に用いることができる。この実施態様は、二つの異なる第一構築物を必要とする。一方の構築物は、ソルナーら、上記によって記載の小胞膜中に組込まれるようにタンパク質を小胞に対して向けるキメラタンパク質をコードする。小胞結合タンパク質として用いることができるタンパク質としては、別個にまたは組合せでのＶＡＭＰ（シナプトブレビン（ｓｙｎａｐｔｏｂｒｅｖｉｎ））、ＳＮＣ２、ｒａｂ３、ＳＥＣ４、シナプトタグミン（ｓｙｎａｐｔｏｔａｇｍｉｎ）等がある。細胞膜タンパク質としては、別個にまたは組合せでのシンタキシン（ｓｙｎｔａｘｉｎ）、ＳＳＯ１、ＳＳＯ２、ノイレキシン（ｎｅｕｒｅｘｉｎ）等がある。他の構築物は、前記のように、表面膜に対する輸送を提供し且つミリストイルシグナル配列、他の原形質膜標的配列（例えば、プレニル化のための）または貫膜保持ドメインを用いる。コードされたタンパク質は上記参考文献に記載されており、全部または機能的部分が作用ドメインとして役立ちうる。これらの構築物は、小胞に対する輸送についてまたは内因性タンパク質の輸出を促進するようにエンドサイトーシス内因性タンパク質について適切にコードされた外因性タンパク質の発現と一緒に用いることができると考えられる。
様々な機序をエキソサイトーシスに用いることができる。細胞種類および細胞中のエンドサイトーシスに対して制限されているそのタンパク質に応じて、１種類またはそれ以上の小胞に結合したタンパク質または細胞性タンパク質は、リガンドによって活性化される応答要素を有する１種類またはそれ以上の構築物によってコードされることができる。特に興味深いのは、ＶＡＭＰおよびシンタキシンの組合せである。或いは、エキソサイトーシスを制御する非制限タンパク質を構成的に発現させることができるし且つエキソサイトーシス制限タンパク質のリガンドに調節された発現を与えることができる。最終的に、エキソサイトーシスに関係したキメラタンパク質を構成的に発現させることができるので、エキソサイトーシスはキメラタンパク質とリガンドとをオリゴマー化することによって制御される。適当な結合ドメインを用いることにより、小胞表面上でオリゴマー化される種々のキメラタンパク質が、活性複合体および／またはリガンドを介する１種類または複数の小胞タンパク質と細胞膜表面タンパク質との結合を生成するようにすることができる。キメラタンパク質は、欠失、突然変異等のようなエキソサイトーシスを制御するタンパク質間の結合親和性を実質的に減少させるリガンドの修飾のために、リガンド不存在下ではエキソサイトーシスを与えることができない。これらの修飾は、個々のタンパク質の重複フラグメントを用い且つフラグメントが活性を保持していることを決定することによって容易に決定することができる。フラグメントは、結合に実質的に影響を与える個々のアミノ酸を決定するのにアラニン置換を用いることによって更に修飾することができる（ベーンケ（Ｂｅｏｈｎｃｋｅ）ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９３）１５０，３３１〜３４１；エバボルド（Ｅｖａｖｏｌｄ）ら、同書（１９９２）１４８，３４７〜３５３）。
小胞のルーメン中に組み立てられたタンパク質並びにエキソサイトーシスに関係した融合タンパク質は、前記のように、構成的にまたは誘導的に発現させることができる。エキソサイトーシスの目的に応じて、内因性または外因性タンパク質が関与しているかどうか、輸出されるタンパク質が構成的または誘導的に発現されるかどうか、エキソサイトーシスに関係した融合タンパク質および輸出されるタンパク質の転写を開始するのに同一リガンドを用いることができるかどうか、または異なるタンパク質が異なる誘導シグナルにしたがうべきであるかどうかが、発現が制御される方式を決定しうる。その他の態様において、少なくとも一つのタンパク質およびエキソサイトーシス両方の発現がリガンド制御にしたがうことがある。
種々のタンパク質は、タンパク質の生理学的活性を損なうことなくタンパク質を小胞に対して輸送するための細胞標的配列の導入によって修飾されることができる。デリバリー機序としてエキソサイトーシスを用いることにより、比較的高い用量を短時間で供給し、宿主の性質に応じて、小胞系においてタンパク質の高局在化レベルまたは高濃度を生じることができる。興味深いタンパク質としては、例えば、インスリン、組織プラスミノーゲン活性化因子、サイトカイン、エリトロポエチン、コロニー刺激因子、成長因子、炎症性ペプチド、細胞遊走因子がある。
タンパク質を小胞に向けるためのコーディング配列は、エキソサイトーシスに関係した小胞結合タンパク質から入手可能である。例えば、ソルナーら、上記を参照されたい。
オリゴマー化機序の別の用途は、タンパク質分解または不活性化の制御である。例えば、本発明の比較的安定なすなわち長命のキメラタンパク質は、半減期が比較的短いまたは他の状況では分解に対してオリゴマーを脱安定化させるかまたは集中させる本発明の異なるキメラタンパク質とのリガンドに媒介されたオリゴマー化によって、分解に対して脱安定化するかまたは集中することができる。この実施態様において、リガンドに媒介されたオリゴマー化は、タンパク質に対して短くされた半減期を輸送中に与えることによってその生物学的機能を調節する。後者のキメラタンパク質は、リソソームに対してタンパク質を集中させるドメインまたはタンパク質をサイトゾル若しくは核または非リソソーム細胞小器官におけるタンパク質分解開裂に対して感受性にするドメインを含むことができる。
細胞中のタンパク質の半減期は、アミノ酸残基プロリン、グルタミン酸、セリンおよびトレオニンに富む前記タンパク質中の短アミノ酸配列の存在、従って「ＰＥＳＴ」、同様の機能を有する他の配列、プロテアーゼ感受性開裂部位並びにユビキチン化状態を含む多数の因子によって決定される。ユビキチン化は、タンパク質を分解に対して集中させる短ポリペプチド鎖の１個またはそれ以上の単位ユビキチンによるタンパク質の修飾である。タンパク質のユビキチン化率は、処理されるタンパク質のＮ末端アミノ酸およびアミノ末端付近の１個またはそれ以上の独特のリシン残基の識別によって主に決定されると考えられる。
ＩＶ．他の調節システム
個々のタンパク質に関係した特定の活性についてオリゴマー化によって制御することができる他の生物学的機能は、プロテインキナーゼ若しくはホスファターゼ活性、レダクターゼ活性、シクロオキシゲナーゼ活性、プロテアーゼ活性またはサブユニット結合による任意の他の酵素反応である。更に、Ｇタンパク質と、細胞周期に関係した受容体タンパク質、例えば、サイクリンおよびｃｄｃキナーゼ、多単位解毒酵素との結合に備えることができる。
Ｖ．構築物の成分
グループ（１）および（２）キメラタンパク質に結合した第二のすなわち追加の構築物（標的遺伝子）は、転写および適当に翻訳によってタンパク質の発現および／または他の遺伝子の調節、例えば、アンチセンス、転写因子の発現、膜融合タンパク質の発現等を引き起こすことができる目的の１種類または複数の配列、通常はＲＮＡに対して転写される目的の少なくとも１種類の遺伝子を生じる活性受容体または活性転写因子からのシグナル開始に対して応答性であるように、指定された標的認識配列または応答性要素を有する転写開始領域を含む。
異なる目的および異なる部位に対して、異なる結合ドメインおよび異なる細胞質ドメインを用いる。表面膜に結合したキメラタンパク質受容体に対して、リガンド結合ドメインが細胞外である場合、キメラタンパク質は、種々の表面膜タンパク質から選択された細胞外ドメインを含むように設計されることができる。同様に、シグナルを導入することができる表面膜タンパク質の異なる細胞質または細胞内ドメインを、内因性遺伝子が細胞質部分によって調節されることに応じて用いることができる。キメラタンパク質が内在している、表面膜タンパク質に対して内在している、または細胞小器官、例えば、核、小胞等に結合している場合、リガンド結合ドメインタンパク質は、適当に、表面膜または他の膜を越えることができる分子を結合することができるドメインに限定される。したがって、これらの結合ドメインは、概して、タンパク質または核酸を含まない小形の天然に存在するかまたは合成のリガンド分子に対して結合する。
Ａ．細胞質ドメイン
グループ（１）のキメラタンパク質受容体は、細胞変異タンパク質を含む種々の細胞表面膜受容体の一つからの細胞質ドメインを含むことができ、そこにおいて、細胞質ドメインに関係した転写の開始に関与した認識配列は知られているしまたはこのような配列に対して応答性の遺伝子は知られている。目的の突然変異受容体は、有害な副作用、例えば、脱調節細胞増殖またはサイトカインの不適当な放出に関係することがある遺伝子の活性化から標的遺伝子の転写活性化を分離する。特に興味深い受容体結合細胞質ドメインは、以下の特性を有する。すなわち、受容体活性化は、細胞宿主中の比較的少ない（望ましくは１００未満の）、概して無害の遺伝子の転写の開始をもたらし；受容体活性化によって開始される転写に必要な他の因子は細胞宿主中に存在し；標的遺伝子以外を活性化させる遺伝子は、これらの細胞が用いられている目的に影響を与えないし；細胞質ドメインのオリゴマー化または他の利用可能な機序はシグナル開始を引き起こし；そして望ましいリガンド結合ドメインに対する細胞質ドメインの結合はシグナリングを妨げない。多数の異なる細胞質ドメインが知られている。これらドメインの多くはチロシンキナーゼであるかまたはチロシンキナーゼと複合体を形成し、例えば、ＣＤ３ζ、ＩＬ−２Ｒ、ＩＬ−３Ｒ等である。論及についてはカントリー（Ｃａｎｔｌｅｙ）ら、Ｃｅｌｌ（１９９１）６４，２８１を参照されたい。架橋、例えば、ダイマー化によって活性化されるチロシンキナーゼ受容体（ヤーデン（Ｙａｒｄｅｎ）およびウーリッヒ（Ｕｌｒｉｃｈ），Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８８）５７，４４３によって最初に提唱された命名法に基づき、サブクラスＩ：ＥＧＦ−Ｒ、ＡＴＲ２／ｎｅｕ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＥＲ３／ｃ−ｅｒｂＢ−３、Ｘｍｒｋ；サブクラスＩＩ：インスリン−Ｒ、ＩＧＦ−１Ｒ［インスリン様成長因子受容体］、ＩＲＲ；サブクラスＩＩＩ：ＰＤＧＦ−Ｒ−Ａ、ＰＤＧＦ−Ｒ−Ｂ、ＣＳＦ−１−Ｒ（Ｍ−ＣＳＦ／ｃ−Ｆｍｓ）、ｃ−ｋｉｔ、ＳＴＫ−１／Ｆｌｋ−２；およびサブクラスＩＶ：ＦＧＦ−Ｒ、ｆｌｇ［酸性ＦＧＦ］、ｂｅｋ［塩基性ＦＧＦ］がある）；神経栄養チロシンキナーゼ：Ｔｒｋ系列としては、ＮＧＦ−Ｒ、Ｒｏｒ１、２がある。架橋によってチロシンキナーゼと結合する受容体としては、ＣＤ３ζ系列：ＣＤ３ζおよびＣＤ３η（主としてＴ細胞中で見出され、Ｆｙｎと結合する）；ＦｃεＲＩのβおよびγ鎖（主としてマスト細胞および好塩基性細胞中で見出される）；ＦｃγＲＩＩＩ／ＣＤ１６のγ鎖（主としてマクロファージ、好中球およびナチュラルキラー細胞中で見出される）；ＣＤ３γ、−δおよび−ε（主としてＴ細胞中で見出される）；Ｉｇ−α／ＭＢ−１およびＩｇ−β／Ｂ２９（主としてＢ細胞中で見出される）がある。多数のサイトカインおよび成長因子キナーゼは、チロシンキナーゼおよび／または他のシグナリング分子と相互作用し且つ本発明のキメラタンパク質中で細胞質ドメインとして用いることができる共通のβサブユニットと結合する。これらには、（１）ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３およびＩＬ−５受容体によって共有された共通のβサブユニット；（２）ＩＬ−６、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、毛���体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、オンコスタチンＭおよびＩＬ−１１受容体に結合したβ鎖ｇｐ１３０；（３）ＩＬ−４、ＩＬ−７およびＩＬ−１３（およびおそらくはＩＬ−９）の受容体にも結合したＩＬ−２受容体γサブユニット；（４）Ｇ−ＣＳＦ受容体の細胞質ドメインに対して相同であるＩＬ−２受容体のβ鎖がある。
インターフェロンα／βおよびγ（チロシンキナーゼのＪＡＫ、Ｙｙｒ系列の１種類またはそれ以上のメンバーを活性化しうる）を含む受容体のインターフェロン系列並びに成長ホルモン、エリトロポエチンおよびプロラクチン（ＪＡＫ２を更に活性化しうる）の受容体は、更に、細胞質ドメイン源として用いることができる。
他の細胞質ドメイン源としては、細胞表面受容体のＴＧＦ−β系列がある（キングスリー（Ｋｉｎｇｓｌｅｙ），Ｄ．、Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １９９４  ８  １３３によって論及された）。受容体のこの系列は、架橋によって活性化されると考えられるそれらの細胞質ドメイン中にセリン／トレオニンキナーゼ活性を含む。
転写因子の活性化および不活性化に関係したチロシンキナーゼは、外因性遺伝子の発現を開始するまたは阻害するように制御されうるし且つ用いられうる特定の経路を提供する場合に特に興味深い。
下記の表は、多数の受容体および受容体に関係した特性並びに遺伝子を活性化するそれらの核応答要素を提供する。表は完全ではないが、本発明において用いるための典型的なシステムを提供する。
多くの場合、突然変異細胞質ドメインは、導入されるシグナルが野生型とは異なることがある場合に得られ、１種類または複数の野生型経路と比較して限定されたまたは異なる経路を生じる。例えば、ＥＧＦおよびＦＧＦなどの成長因子の場合、突然変異は、シグナルが細胞増殖から切り離されているがなおｃ−ｆｏｓによって維持されている場合に報告された（ピーターズ（Ｐｅｔｅｒｓ）ら、Ｎａｔｕｒｅ（１９９２）３５８，６７８）。
チロシンキナーゼ受容体は、広範囲の全身にわたる細胞で見出しうる。対照的に、ＣＤ３ζ−系列、Ｉｇ系列およびリンホカインβ鎖受容体系列は、主として造血系細胞、特に、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マスト細胞、好塩基性細胞、マクロファージ、好中球およびナチュラルキラー細胞で見られる。ＮＦ−ＡＴ転写に必要なシグナルは、主として抗原受容体のゼータ（ζ）鎖に、そしてそれより少ないが、ＣＤ３γ、δ、εに由来する。
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細胞質ドメインは、それが天然に存在するようにまたはそれが切断され、修飾され若しくは突然変異しうるように、少なくとも約１０アミノ酸、通常少なくとも約３０アミノ酸、更に通常は少なくとも約５０アミノ酸、そして一般的には約４００アミノ酸以下、通常約２００アミノ酸以下である。（ロメオ（Ｒｏｍｅｏ）ら、Ｃｅｌｌ（１９９２）６８，８８９〜８９３を参照されたい。）いずれの種も用いることができるが、通常、宿主細胞に対して内因性の種が好ましい。しかしながら、多くの場合、異なる種からの細胞質ドメインを有効に用いることができる。上記に示した細胞質ドメインはいずれも、更には現在知られているまたは引続き発見されるかもしれない他のものも用いることができる。
大部分は、転写因子に結合した他のキメラタンパク質は、主として、キメラタンパク質を核膜の内側に向ける細胞標的配列を有することおよび転写因子またはそれらの作用ドメインとしての部分を有することが異なる。通常、転写因子作用ドメインは、「ＤＮＡ結合ドメイン」および「活性化ドメイン」に分けることができる。ＤＮＡ結合ドメインには１種類またはそれ以上のリガンド結合ドメインおよび活性化ドメインには１種類またはそれ以上のリガンド結合ドメインを与えることができる。この方法で、ＤＮＡ結合ドメインを、多数の結合ドメインおよび／または活性化ドメインに対して結合させることができる。それ以外の場合、シグナル導入のために表面膜と結合したキメラタンパク質についての議論は、ゲノムＤＮＡに対する直接結合のためのキメラタンパク質にあてはまる。同様に、エキソサイトーシスに関係したキメラタンパク質は、主として、形質導入性細胞質タンパク質の代わりに、小胞膜と表面膜との融合に関係したタンパク質に関して異なる。
Ｂ．細胞標的ドメイン
シグナルペプチドまたは配列は、細胞表面膜に対してキメラタンパク質を輸送し、そこにおいて同一のまたは他の配列は、細胞表面膜に対するキメラタンパク質の結合をコードして入る。シグナル配列、２個または３個のＮ末端極性アミノ酸、続いて約１５〜２０個の主として疎水性のアミノ酸についての一般的なモチーフは存在するが、個々のアミノ酸は広範囲に変化しうる。したがって、宿主中で機能性であり且つキメラタンパク質の他のドメインの一つと結合していてよいしまたはしていなくてよいほとんど全てのシグナルペプチドを用いることができる。通常、シグナルペプチドはプロセッシングされ、成熟キメラタンパク質中に保持されない。シグナルペプチドをコードしている配列は、コーディング配列の５′末端にあり、開始メチオニンコドンを含んでいる。
膜保持ドメインの選択は、このような膜保持ドメインが実質的に代替可能であり、しかも活性化のための別の膜部分に対して結合するまたは接着するのに必要な臨界的アミノ酸は存在しないことが分かったので、本発明に対して臨界的ではない。したがって、膜保持ドメインは、宿主細胞に対して内因性であろうとなかろうと、任意の好都合な表面膜または細胞質タンパク質から単離することができる。
少なくとも２種類の異なる膜保持ドメイン、すなわち、膜を越えて伸長するアミノ酸配列である貫膜保持ドメイン；および脂質が細胞表面膜の脂質と結合している脂質膜保持ドメインが存在する。
大部分は、構築の容易さのために、融合タンパク質の構築を単純化する性質がある細胞質ドメインまたは受容体ドメインの貫膜ドメインを用いることができる。しかしながら、脂質膜保持ドメインのために、通常、プロセッシングシグナルは、膜に対するＮ末端結合のコーディング配列の５′末端におよびＣ末端結合の３′末端近くに加えられる。脂質膜保持ドメインは、グリシンに結合した約１２〜２４個の炭素原子、具体的には１４個の炭素原子を有する脂質、更に具体的にはミリストイルを有する。脂質結合ドメインのシグナル配列はＮ末端配列であり、しかも広範囲に変化することができ、通常、残基２にグリシンおよび残基７にリシンまたはアルギニンを有する（カプラン（Ｋａｐｌａｎ）ら、Ｍｏｌｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８８）８，２４３５）。脂質膜結合を与えるように翻訳後プロセッシングを必要とするペプチド配列は、カル（Ｃａｒｒ）ら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ（１９８８）７９，６１２８；エイトケン（Ａｉｔｋｅｎ）ら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．（１９８２）１５０，３１４；ヘンダーソン（Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ）ら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ（１９８３）８０，３１９；シュルツ（Ｓｃｈｕｌｚ）ら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９８４），１２３，２１３１；デルマン（Ｄｅｌｌｍａｎ）ら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８５）３１４，３７４によって記載され；そしてＡｎｎ．Ｒｅｖ．ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８８）５７，６９において論及されている。興味深いアミノ酸配列としては、配列Ｍ−Ｇ−Ｓ−Ｓ−Ｋ−Ｓ−Ｋ−Ｐ−Ｋ−Ｄ−Ｐ−Ｓ−Ｑ−Ｒがある。種々のＤＮＡ配列を用いて、融合受容体タンパク質中のこのような配列をコードすることができる。
概して、貫膜ドメインは、約１８〜３０アミノ酸、更に通常は約２０〜３０アミノ酸を有し、その中心部分は主として中性の無極性アミノ酸であり、ドメインの末端は極性アミノ酸、しばしば荷電アミノ酸であり、概して、貫膜ドメインの末端に約１〜２個の荷電した、主として塩基性アミノ酸、続いてらせん切断残基、例えば、ｐｒｏ−またはｇｌｙ−を有する。
Ｃ．リガンド結合ドメイン
本発明のキメラタンパク質のリガンド結合（「ダイマー化」）ドメインは、天然または非天然リガンド、好ましくは非天然合成リガンドを用いて誘導を可能にする任意の好都合なドメインでありうる。結合ドメインは、構築物の性状およびリガンドの選択に応じて、細胞膜に対して内部または外部でありうる。受容体を含む広範囲の結合タンパクが知られており、上記に示した細胞質部分と結合した結合タンパク質がある。特に興味深いのは、そのためのリガンド（好ましくは小形有機リガンド）が知られているまたは容易に製造されうる結合タンパク質である。これらの受容体またはリガンド結合ドメインとしては、ＦＫＢＰおよびシクロフィリン受容体；ステロイド受容体；テトラサイクリン受容体；上記に示された他の受容体：並びに類似のもの；更には抗体、特に、重鎖または軽鎖サブユニット、その突然変異配列、確率法、組合せ合成等によって得られたランダムアミノ酸配列から得ることができる「非天然」受容体がある。大部分は、受容体ドメインは、天然ドメインとしてかまたはその切断された活性部分として少なくとも約５０アミノ酸〜約３５０アミノ酸未満、通常２００アミノ酸未満である。好ましくは、結合ドメインは、小形の（＜２５ｋＤａ、ウイルスベクター中での有効なトランスフェクションを可能にする）、モノマー性（これはアビジン−ビオチン系を除外する）非免疫原であり、しかもダイマー化のための配置をとることができる合成的に利用可能な細胞透過性の無毒性リガンドを有するべきである。
受容体ドメインは、キメラタンパク質をコードしている構築物の設計および適当なリガンドの利用可能性に応じて、細胞内または細胞外でありうる。疎水性リガンドについては、結合ドメインは膜の両側にありうるが、親水性リガンド、特に、タンパク質リガンドについては、結合に利用可能である形のリガンドを内部化するための輸送系が存在しなければ、通常、結合ドメインは細胞膜の外側にある。細胞内受容体については、構築物は、シグナルペプチドおよび受容体ドメイン配列の貫膜ドメイン５′若しくは３′または受容体ドメイン配列の脂質結合シグナル配列５′を有するところまでコードすることができる。受容体ドメインがシグナルペプチドと貫膜ドメインとの間にある場合、受容体ドメインは細胞外である。
受容体をコードしている構築物の一部分は、様々な理由で突然変異を誘発させることができる。突然変異が誘発された部分は、より高い結合親和性を与えることができるし、天然に存在する受容体および突然変異が誘発された受容体のリガンドによる識別を可能にすることができるし、受容体−リガンド対を設計する機会を与えること等ができる。受容体の変化は、結合部位において組合せ技術を用いてランダム突然変異誘発であることが知られているアミノ酸変化を伴うことがあり、その場合、結合部位と結合したアミノ酸または立体配座変化に関係した他のアミノ酸のコドンは、既知の変化によってかまたはランダムに、特定のアミノ酸の１種類または複数のコドンを変化させ、適当な原核細胞宿主において得られたタンパク質を発現させた後、得られたタンパク質の結合をスクリーニングすることによって突然変異を誘発することができる。この状態を代表するものは、ＦＫＢＰ１２のＰｈｅ３６をＡｌａおよび／またはＡｓｐ３７をＧｌｙまたはＡｌａに変更して、ＦＫ５０６またはＦＫ５２０の９位または１０位の置換基を調節することである。特に、Ｔｙｒ２６、Ｐｈｅ３６、Ａｓｐ３７、Ｔｙｒ８２およびＰｈｅ９９の内の一つまたはそれ以上の代わりにＶａｌ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｍｅｔまたは他の小形アミノ酸を含む突然変異体ＦＫＢＰ１２部分は、Ｃ９および／またはＣ１０に修飾を含むＦＫ５０６型およびＦＫ−５２０型の受容体ドメインとして特に興味深い。
抗体サブユニット、例えば、重鎖または軽鎖、具体的にはフラグメント、更に具体的には可変部全部若しくは一部分または高親和性結合を生じる重鎖および軽鎖の融合体は、結合ドメインとして用いることができる。抗体は、生理学的に許容しうるハプテン分子および結合親和性についてスクリーニングされた個々の抗体サブユニットに対して製造することができる。サブユニットをコードしているｃＤＮＡを単離し、そして不変部の欠失、可変部の一部分、可変部の突然変異誘発等によって修飾して、リガンドに対して適当な親和性を有する結合タンパク質ドメインを得ることができる。この方法において、ほとんど全ての生理学的に許容しうるハプテン化合物を、リガンドとしてまたはリガンドにエピトープを与えるように用いることができる。結合ドメインが知られており、しかも結合に有用なリガンドが存在する場合、抗体単位の代わりに天然受容体を用いることができる。
タンパク質をコードしている配列のインビトロ突然変異誘発または組合せ修飾を用いる能力は、異なるリガンドの結合親和性についてスクリーニングされうるタンパク質のライブラリーの製造を可能にする。例えば、結合タンパク質をコードしているＤＮＡ配列中の１か所またはそれ以上の部位において１〜５種類、１０種類またはそれ以上のコドンの配列を全くランダムにし、発現構築物を製造し且つ該発現構築物を単細胞微生物中に導入し、そしてライブラリーを生じさせることができる。次に、１種類または望ましくは多数のリガンドに対する結合親和性についてライブラリーをスクリーニングすることができる。次に、それらが導入される細胞と適合しうる最良の親和性配列を結合ドメインとして用いることができる。リガンドは、内因性タンパク質に対するリガンドの結合レベルを決定するのに用いられる宿主細胞によってスクリーニングされる。結合プロフィールは、内因性タンパク質に対する結合親和性による突然変異が誘発された結合ドメインに対する結合親和性比率の増加を明確にすると考えられる。次に、最良の結合プロフィールを有するこれらのリガンドをリガンドとして用いうる。ファージ表示技術は、非制限実施例と同様、前述の実施において用いることができる。
Ｄ．マルチマー化
導入されたシグナルは、通常、キメラタンパク質分子のリガンドに媒介されたオリゴマー化に起因する、すなわち、リガンド結合後のオリゴマー化の結果として得られるが、他の結合結果、例えば、アロステリック活性化は、シグナルを開始するのに用いることができる。キメラタンパク質の構築物は、各種ドメインの順序および個々のドメインの反復数に関して変化する。５′〜３′方向の転写における細胞外受容体ドメインについて、構築物は、シグナルペプチド、受容体ドメイン、貫膜ドメインおよび細胞内（細胞質）であるシグナル開始ドメインを含むタンパク質をコードする。しかしながら、受容体ドメインが細胞内である場合、違った順序を用いることができ、その場合、シグナルペプチドの後に受容体かまたはシグナル開始ドメイン、続いて残りのドメインが続くことができ、或いは、多数の受容体ドメインを含み、シグナル開始ドメインは受容体ドメインの間に挟まれることができる。通常、シグナル開始ドメインの活性部位は、配列に対して内部にあり、遊離カルボキシル末端を必要としない。ドメインはそれぞれマルチマー化されることができ、特に、受容体ドメインは、通常約５回反復以下、更に通常は約３回反復以下である。
受容体をマルチマー化するために、キメラ表面膜タンパク質の受容体ドメインのリガンドは、通常、それが少なくとも二つの結合部位を有し、その結合部位それぞれが受容体ドメインに対して結合することができるセンスでマルチマー化される。望ましくは、問題のリガンドは、ダイマーまたは高次オリゴマー、通常はほぼテトラマー以下の小形合成有機分子であり、典型的に、個々の分子は少なくとも約１５０Ｄ〜約５ｋＤ未満、通常は約３ｋＤ未満である。合成リガンドおよび受容体の各種対を用いることができる。例えば、天然受容体を必要とする実施態様において、ダイマーＦＫ５０６をＦＫＢＰ受容体と一緒に用いることができ、ダイマー化されたシクロスポリンＡをシクロスポリン受容体と一緒に用いることができ、ダイマー化されたエストロゲンをエストロゲン受容体と一緒に用いることができ、ダイマー化されたグルココルチコイドをグルココルチコイド受容体と一緒に用いることができ、ダイマー化されたテトラサイクリンをテトラサイクリン受容体と一緒に用いることができ、ダイマー化されたビタミンＤをビタミンＤ受容体と一緒に用いること等ができる。或いは、トリマーなどの高次リガンドを用いることができる。非天然受容体、例えば、抗体サブユニット、修飾抗体サブユニットまたは修飾受容体等を必要とする実施態様において、種々様々な化合物のいずれも用いることができる。これらのリガンドの重要な特徴は、それらが高親和性によって（好ましくはＫｄ▲−▼１０-8Ｍで）受容体を結合し且つ化学的にダイマー化されうることである。
リガンドは、同一のまたは異なる結合ドメインを有するキメラタンパク質のヘテロダイマー化またはヘテロオリゴマー化を媒介することができるので、それらは、異なるエピトープ（「ＨＥＤ」試薬とも称される）と一緒に異なる受容体結合分子を有することができる。例えば、リガンドは、ＦＫ５０６またはＦＫ５０６型残基およびＣｓＡまたはシクロスポリン型残基を含んでいてよい。両方の残基は、共通のリンカー残基に対して共有結合している。このようなリガンドは、第一キメラタンパク質が、ＦＫ５０６型残基に対して結合することができるＦＫＢＰ１２などの受容体ドメインを含み且つ第二キメラタンパク質が、シクロスポリンＡ型残基に対して結合することができるシクロフィリンなどの受容体ドメインを含んでいる場合、第一および第二キメラタンパク質のオリゴマー化を媒介するのに有用であると考えられる。
ＶＩ．細胞
細胞は原核細胞であってよいが、好ましくは、植物、酵母、蠕虫、昆虫および哺乳動物を含む真核細胞である。現在のところ、細胞は、哺乳動物細胞、具体的には霊長類、更に具体的にはヒトであるが、目的の動物、具体的には家畜動物、例えば、ウマ、ウシ、ネズミ、ヒツジ、イヌ、ネコ等のいずれとも組合せることができることが特に好ましい。これらの種の中からの各種細胞、例えば、造血系、神経系、間葉、皮膚、粘膜、支質、筋、脾臓、細網内皮、上皮、内皮、肝臓、腎臓、胃腸、肺等が関与しうる。特に興味深いのは、リンパ系または骨髄単球系統に関与しうる有核細胞を全て含む造血系細胞である。特に興味深いのは、Ｔ−およびＢ細胞系統、マクロファージおよび単球、筋芽細胞並びに繊維芽細胞のメンバーである。更に、特に興味深いのは、造血系、神経系、支質、筋、肝臓、肺、胃腸等の幹細胞および前駆細胞である。
細胞は、オートロガス細胞、同系細胞、同種異系細胞および若干の場合としても異種細胞でありうる。細胞は、主要組織適合性遺伝子複合体（「ＭＨＣ」）プロフィールを変化させることによって、機能性クラスＩ  ＭＨＣ分子の生成を妨げるβ2−ミクログロブリンを失活させ、クラスＩＩ分子の失活、１種類またはそれ以上のＭＨＣ分子を発現させ、細胞障害活性に関係した遺伝子の発現を促進するまたは阻害することによって細胞障害能力を促進するまたは失活させること等によって修飾することができる。
若干の場合、特異的クローンまたはオリゴクローン細胞が興味深いことがあり、その場合、細胞は特定の特異性を有し、例えば、特定の抗原特異性またはホーミング標的部位特異性を有するＴ細胞およびＢ細胞である。
ＶＩＩ．リガンド
天然に存在する物質および合成物質両方を含む広範囲のリガンドを本発明において用いて、キメラタンパク質分子のオリゴマー化を行なうことができる。リガンドを選択するための利用可能なおよび容易に観察可能なまたは測定可能な判定基準は、（Ａ）リガンドが生理学的に許容しうる（すなわち、それが用いられる細胞または動物に対して過度の毒性がない）、（Ｂ）それが適当な薬用量範囲を有する、（Ｃ）望ましくは（遺伝子療法用途を含む全ての動物における用途に対して）それを経口で与えることができる（胃腸系において安定であり且つ血管系に吸収される）、（Ｄ）それが細胞膜および他の膜を必要に応じて通過しうる、そして（Ｅ）所望の用途に適当な親和性によって受容体ドメインに対して結合することである。第一の望ましい判定基準は、化合物が、受容体によるその活性化能力に対する以外は比較的生理学的に不活性であることである。天然受容体に対して結合するリガンドが少なく且つ天然受容体に対して結合する全リガンドの比率が低いほど、応答は優れているのが一般的である。特に、リガンドは、天然のタンパク質に対して強力な生物学的作用を持つべきではない。大部分は、リガンドは非ペプチドであり且つ非核酸である。
問題の化合物は、大部分は、２個またはそれ以上の単位を有し、該単位は、同じでありうるしまたは異なりうるし、中心の結合基によって互いに結合していることができる。「単位」とは、受容体ドメインを結合することができる個々の残基（例えば、ＦＫ５０６、ＦＫ５２０、シクロスポリンＡ、ステロイド等）である。通常、単位はそれぞれ、少なくともホモダイマーまたは高次オリゴマーにおける同一反応性基によって結合基に結合している。
前記のように、小形の非タンパク質性有機分子であって、上気判定基準を満たし、しかも本発明によるリガンドを提供するように様々な部位でダイマー化することができる該小形有機分子に対して、種々の天然に存在する受容体が存在する。これらの化合物の実質的な修飾は、結合能力が保持され且つ望ましい特異性を有する限りにおいて許される。化合物の多くは大環式化合物、例えば、マクロライドである。適当な結合親和性は、適当に１０-4未満、好ましくは１０-6未満、更に好ましくは約１０-7未満のＫｄ値に反映されるが、１０-9または１０-10未満の結合親和性は可能であり且つ若干の場合最も望ましい。
現在のところ好ましいリガンドは、ＦＫＢＰタンパク質および／またはシクロフィリンタンパク質に対して結合することができる化合物のオリゴマー、通常はダイマーを含む。このようなリガンドとしては、天然のまたは突然変異が誘発された結合ドメインに対する結合能力を保持しているシクロスポリンＡ、ＦＫ５０６、ＦＫ５２０およびラパマイシン並びにそれらの誘導体のホモ−およびヘテロマルチマー（通常、２〜４単位、更に通常は２〜３単位）を含む。このような化合物の多数の誘導体はすでに知られており、本発明の実施において用いることができる合成高親和性ＦＫＢＰリガンドがある。例えば、ホルト（Ｈｏｌｔ）ら、Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  １９９３，１１５，９９２５〜９９３５を参照されたい。ＦＫ５０６およびその類似体の結合にとって興味深い部位としては、約１７〜２４個の環状炭素原子を包含する位置およびこのような環状原子に結合した置換基位置、例えば、２１位（アリル）、２２位、３７位、３８位、３９位および４０位または３２位（シクロヘキシル）があるが、２１を除く同様の位置はＦＫ５２０にとって興味深い。シクロスポリンにとって興味深い部位としては、ＭｅＢｍｔ、３位および８位がある。
特に興味深いのは、特に、リガンドの天然に存在する受容体に関してその結合特性を変化させるリガンドに対する修飾である。同時に、結合タンパク質を変化させてリガンドの変化を調節することが考えられる。例えば、ＦＫ５０６の９位または１０位の基を（ヴァン・デュイン（Ｖａｎ  Ｄｕｙｎｅ）ら（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２，８３９）、それらの立体的必要条件を増加させるように、ヒドロキシルをより大きい立体的必要条件を有する基で置き換えることによって、或いは１０位のカルボニルを修飾し、そのカルボニルをより大きい立体的必要条件を有するかまたはカルボニルを機能化する、例えば、Ｎ置換シッフ塩基若しくはイミンを生成する基で置き換えて、その位置の嵩を増加させることによって修飾することができる。このような部位に好都合に導入されうる各種官能基は、エーテルを生成するアルキル基、アシルアミド基、Ｎ−アルキル化アミン（但し、２−ヒドロキシエチルイミンも１，３−オキサゾリンを生成することができる）または類似のものである。概して、置換基は、通常、酸素、硫黄、窒素等である１〜３個、通常は１〜２個のヘテロ原子を含む約１〜６個、通常１〜４個、そして更に通常は１〜３個の炭素原子である。基本的構造を有する異なる誘導体を用いることにより、結合のための異なるコンホメーションの必要条件を有する異なるリガンドを生成することができる。受容体に突然変異を誘発させることによって、構造がほとんど違わない修飾されたリガンドに対して異なる親和性を有する実質的に同様の配列を有する異なる受容体を得ることができる。
用いることができる他のリガンドはステロイドである。ステロイドはオリゴマー化することができるので、それらの自然の生物学的活性は、１種類またはそれ以上のステロイド受容体ドメインを含むキメラタンパク質に関するそれらの結合能力を損なうことなく実質的に減少する。非制限実施例により、グルココルチコイドおよびエストロゲンをそのように用いることができる。各種薬剤も、該薬剤が特定の受容体に対して高親和性で結合することが知られている場合に用いることができる。これは、特に、受容体の結合ドメインが知られていて、それによって完全な天然受容体タンパク質よりもむしろ結合ドメインのみの本発明のキメラタンパク質の使用が許されるような場合である。この目的には酵素および酵素阻害剤を用いることができる。
Ａ．リンカー
カルボン酸誘導体を含むアミド基、エーテル、有機および無機エステルを含むエステル、アミノ等のような各種官能基は、結合に関与することができる。結合させるためには、特定のモノマーを、酸化、ヒドロキシル化、置換、還元等によって修飾して、カップリングのための部位を提供することができる。モノマーに応じて、様々な部位をカップリングの部位として選択することができる。
マルチマーリガンドは、任意の好都合な手段によって合成することができ、その場合の結合基は、受容体に対するリガンドの結合部位の結合を妨げない部位である。生理学的活性のための活性部位および受容体ドメインに対するリガンドの結合部位が異なる場合、通常、リガンドを失活させるように活性部位で結合することが望ましい。二つの分子（水素以外）間の鎖中に、通常、１〜３０原子、更に通常は約１〜２０原子の各種結合基を用いることができ、その場合、該結合基は主として炭素、水素、窒素、酸素、硫黄およびリンから成る。結合基は、広範囲の官能基、例えば、アミドおよびエステル、有機および無機両方のアミン、エーテル、チオエーテル、ジスルフィド、第四アンモニウム塩、ヒドラジン等を包含しうる。鎖としては、脂肪族基、脂環式基、芳香族基または複素環式基がある。鎖は、合成の容易さおよびマルチマーリガンドの安定性に基づいて選択される。したがって、長期活性を維持することが望ましい場合、比較的不活性な鎖を用いて、マルチマーリガンド結合が開裂されないようにする。或いは、血流中での短い半減期のみが望ましい場合、容易に開裂される様々な基、例えば、エステルおよびアミド、特にペプチドを用いることができ、その場合、循環性および／または細胞内プロテアーゼが結合基を開裂することができる
リガンド間の結合基として、様々な基、例えば、通常２〜２０個の炭素原子を有するアルキレン、通常４〜１８個の炭素原子を有するアザアルキレン（但し、窒素は通常二つの炭素原子間である）、通常６〜２４個の炭素原子を有するＮ−アルキレンアザアルキレン（上記を参照されたい）、通常６〜１８個の炭素原子を有するアリーレン、通常８〜２４個の炭素原子を有するアルジアルキレン、約８〜３６個の炭素原子を有するビス−カルボキサミドアルキレン等を用いることができる。典型的な基としては、デシレン、オクタデシレン、３−アザペンチレン、５−アザデシレン、Ｎ−ブチレン−５−アザノニレン、フェニレン、キシレン、ｐ−ジプロピレンベンゼン、ビス−ベンゾイル−１，８−ジアミノオクタン等がある。前記のリンカー分子を含む多価または他の（以下を参照されたい）リガンド分子は、対応する受容体ドメインを有する本発明のキメラタンパク質によって、下記の実施例に記載の材料および方法を用いて評価することができる。
Ｂ．リガンド特性
細胞内結合ドメインに対して、リガンドは、生物活性の形で膜を越えて移動するように選択される、すなわち、それは膜透過性である。各種リガンドは疎水性であり、またはリポフィリン基による適当な修飾によってそのようにされることができる。特に、結合橋は、約１２〜２４個の炭素原子を有する脂肪族側鎖を提供することによってリガンドの親油性を増大させるのに役立つことができる。或いは、望ましくは、エンドソーム形成を伴うことなく、膜を越える輸送を促進する１個またはそれ以上の基を提供することがてきる。
例えば、２種類の異なる結合部位が受容体のダイマー化に用意されている若干の場合、マルチマーリガンドを用いる必要はない。他の場合において、リガンドの結合は、受容体ドメインのコンホメーション変化を引き起こし、受容体の活性化、例えば、オリゴマー化を引き起こすことができる。他の機序は、更に、細胞質ドメインの活性化を引き起こすコンホメーションの変化と共に、単一受容体の結合などのシグナルの誘導に対して機能することができる。
Ｃ．リガンドアンタゴニスト
モノマーリガンドは、マルチマーリガンドの作用を逆行させる、すなわち、オリゴマーの形成または維持を阻害するまたは破壊するのに用いることができる。したがって、細胞活性化作用を急速に終結させることが望ましい場合、モノマーリガンドを用いることができる。便宜上、親リガンド残基は、マルチマーと同様の部位で、多官能性化合物の代わりに一官能性化合物を置換する以外は同様の方法を用いて修飾することができる。ポリアミンの代わりに、特に、２〜２０個の炭素原子（それらはそれより長いことがあるが）、通常２〜１２個の炭素原子を有するモノアミン、例えば、エチルアミン、ヘキシルアミン、ベンジルアミン等を用いることができる。或いは、一価の親化合物が過度の望ましくない生理学的活性（例えば、免疫抑制、有糸分裂誘発、毒性等）を有していない場合、該親化合物を用いることができる。
Ｄ．代償性突然変異を含む突然変異受容体に対して結合することができる、「隆起部分」を有する典型的なヘテロオリゴマー化（ＨＥＤ）およびホモオリゴマー化（ＨＯＤ  試薬
前記で論及されたように、受容体の結合ポケット中の側鎖残基と立体的に衝突する試薬上の置換基（「隆起部分（ｂｕｍｐｓ）」）の存在ゆえに、野生型受容体（例えば、ＦＫＢＰ１２）に対してあまり結合できない修飾ＨＥＤ／ＨＯＤ試薬を製造することができる。更に、干渉性残基に突然変異を含む（代償性突然変異）対応する受容体を製造し、それによってリガンドを隆起部分と一緒に結合する能力を得ることができる。「隆起付き（ｂｕｍｐｅｄ）」リガンド残基および代償性突然変異を有する受容体ドメインの使用は、本試薬の特異性、例えば力価を増大させるべきである。隆起付き試薬は、他の場合は天然リガンド残基を基剤とするダイマーライザーに対して「緩衝剤」として作用しうる内因性野生型受容体に対して結合すべきではない。更に、新規の受容体−リガンド対の生成は、ヘテロダイマー化が必要とされる場合に用いられるＨＥＤ試薬を同時に生じるべきである。例えば、調節された小胞融合は、ＨＥＤ試薬を用いてシンタキシン（原形質膜融合タンパク質）およびシナプトブレビン（小胞膜融合タンパク質）のヘテロダイマー化を誘導することによって活性化することができる。これは、研究手段を提供するのみならず、適当に修飾された分泌細胞を用いる糖尿病の遺伝子療法の根拠として役立ちうると考えられる。
典型的な「隆起付きＦＫ１０１２」として、本発明者は、ＦＫ５０６のＣ１０アセトアミドおよびホルムアミド誘導体を製造した。ＦＫ１０１２Ａ−ＣおよびＦＫ５０６Ｍの合成に関する更に詳細については、図１６Ａおよび本報告、スペンサー（Ｓｐｅｎｃｅｒ）ら、「合成リガンドによるシグナル導入の制御（Ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｌｉｇａｎｄｓ）」、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６２  ５１３６（１９９３）：１０１９〜１０２４を参照されたい。本発明者は、隆起付きＦＫ１０１２の２種類のクラス、すなわち、Ｃ１０に隆起部分を有する一つおよびＣ９に有する一つを生成するように選択する。ＦＫ５０６のＣ１０アセトアミドおよびホルムアミドのＲ−およびＳ−異性体は、図０５Ｂの配列反応にしたがって合成された。これらの隆起付き誘導体は、ＦＫＢＰ１２に対するそれらの結合親和性が少なくとも３桁減少した（図１６Ｂ）。親和性は、ＦＫＢＰ１２のロータマーゼ活性を阻害する誘導体の能力を測定することによって決定された。
Ｃ９隆起付き誘導体の第二クラスの典型的なメンバーは、既知の方法の適応によって製造されたスピロ−エポキシド（図１６Ｃに表された）である。例えば、フィシャー（Ｆｉｓｈｅｒ）ら、Ｏｒｇ  Ｃｈｅｍ  ５６  ８（１９９１）：２９００〜７およびエドムンズ（Ｅｄｍｕｎｄｓ）ら、Ｔｅｔ  Ｌｅｔｔ  ３２  ４８（１９９１）：８１９〜８２０を参照されたい。Ｃ９誘導体の特に興味深い系列は、それらのｓｐ３ハイブリッド形成を特徴とし、Ｃ９位の酸化状態を減少させる。いくつかのこのような化合物は、図１６Ｃに示された反応にしたがって合成された。
ヘテロダイマー（および他のヘテロオリゴマー）は、少なくとも、ホモダイマー混入がそれらの成功した使用に悪影響を及ぼすことがある用途に対して、ホモダイマーとは異なるように構築される必要があるということは理解されるべきである。この問題を克服するように開発された一つの典型的な合成計画は、図１６Ｄに概説されている。過剰のトリエチルアミン含有塩化メチレン中におけるモノアロク保護１．６−ヘキサンジアミン（シュタール（Ｓｔａｈｌ）ら、Ｊ  Ｏｒｇ  Ｃｈｅｍ  ４３  １１（１９７８）：２２８５〜６）とＦＫ５０６の誘導体とのカップリングは、アロク−アミン置換ＦＫ５０６を４４％収率で生成した。この中間体は、現在、任意の活性ＦＫ５０６（または隆起付きＦＫ５０６）分子とのカップリングにおいて用いることができる。ＴＨＦ中の適当な所のジメドンの存在下における触媒テトラキス−トリフェニルホスフィンパラジウムによる脱保護は、アミン保護基を除去する。活性ＦＫ５０６誘導体による迅速な処理に続くデシル化は、ダイマー生成物をもたらす。この技法を用いて、例示されたＨＯＤおよびＨＥＤ試薬を合成した。
Ｅ．典型的なシクロスポリン基剤試薬
シクロスポリンＡ（ＣｓＡ）は、高親和性（６ｎＭ）によってその細胞内受容体シクロスポリンである１８ｋＤａモノマータンパク質に対して結合する環状ウンデカペプチドである。得られた複合体は、ＦＫＢＰ１２−ＦＫ５０６複合体と同様、薬剤の免疫抑制性を引き起こすタンパク質ホスファターゼカルシニューリンに対して結合し且つそれを失活させる。本発明のもう一つの例証として、本発明者は、ＣｓＡをそのＭｅＢｍｔ１側鎖によって６段階でおよび総収率３５％でダイマー化して、（ＣｓＡ）２を生成した（図１７、工程１〜４はエバール（Ｅｂｅｒｌｅ）ら、Ｊ  Ｏｒｇ  Ｃｈｅｍ  ５７  ９（１９９２）：２６８９〜９１に報告されたように行なわれた）。ＦＫ１０１２と同様、ダイマー化のための部位は、得られたダイマーがシクロフィリン２分子に対して結合しうるが、シクロフィリン結合後のカルシニューリンに対して結合することができないように選択された。本発明者は、（ＣｓＡ）２がシクロフィリンＡに対して１：２化学量論によって結合することを実証した。したがって、（ＣｓＡ）２は、ＦＫ１０１２と同様、シグナリング経路を阻害しないし、したがって免疫抑制性でも毒性でもない。
ＩＩＩ．標的遺伝子
Ａ．転写開始領域
第二構築物または第二系列の構築物は、キメラ受容体タンパク質のリガンドに媒介されたオリゴマー化に対して、おそらくは、以下に論及されるように転写開始シグナルの発生および導入によって応答する応答性要素を５′領域に有する。したがって、少なくとも一つの転写開始システム、例えば、細胞質ドメインによって直接的にか若しくは間接的に活性化されるまたは二つのドメインの結合によって活性化されうる因子を知る必要がある。更に、得られた転写開始システムに対して応答性である少なくとも一つのプロモーター領域を知る必要がある。その転写制御下のプロモーター領域かまたは遺伝子を知る必要がある。言い換えると、作用ドメインは、ある与えられたプロモーターまたは応答性要素によって転写を開始する場合のその作用ドメインの役割に基づいて（「第一」系列構築物によってコードされた）キメラタンパク質のために選択されうる。例えば、上記項目Ｖ（Ａ）「細胞質ドメイン」を参照されたい。
応答性要素が知られている場合、それを標的遺伝子構築物中に包含させて、（エピソームによろうと染色体取込みによろうと）ゲノム中への組込み用の発現カセットを提供することができる。細胞質ドメインを含むタンパク質に対する天然リガンド結合の際に細胞質ドメインによって転写的に活性化される遺伝子が知られている限りにおいて、応答性要素の特定の配列が単離されている必要はない。次に、相同的組換えは、内因性プロモーター領域の転写調節下にあるプロモーター領域から下流に目的の遺伝子を挿入するために用いることができる。特異的応答性要素配列が知られている場合、それは、他の態様、例えば、転写、特定の転写因子の結合等の速度に関して高いまたは低い活性を有することができる異なる転写開始領域と一緒に用いることができる。
したがって、発現構築物は、転写方向のその５′末端に、応答性要素および通常は治療用遺伝子である目的の標的遺伝子の誘導転写開始を可能にするプロモーター配列を有する。転写終結領域はさほど重要ではないが、ｍＲＮＡの安定性を低下させ、したがってタンパク質の作用期間を制限するのに役立つＡＵ配列を挿入することによってｍＲＮＡの寿命を増加させるかまたは半減期を短くするのに用いることができる。不可欠な転写終結および適当に翻訳終結を与えるいずれの領域も用いることができる。
応答性要素は単一配列でありうるしまたは通常はオリゴマー化されて約５回反復以下、通常約３回反復を有することができる。
更に、相同的組換えを用いて、プロモーターおよび／またはオリゴマー化結果に応答性である応答性要素を含む内因性転写制御配列を除去するか若しくは失活させる、および／またはこのような応答性転写制御配列を望ましい内因性遺伝子上流に挿入することができる。
Ｂ．生成物
目的のタンパク質または目的のアンチセンス配列または目的のリボザイムをコードする遺伝子を含む広範囲の遺伝子を必要的遺伝子として用いることができる。標的遺伝子は、望ましい表現型を与える目的の配列のいずれでもありうる。標的遺伝子は、表面膜タンパク質、分泌タンパク質、細胞質タンパク質を発現することができるし、または異なる種類の生成物を発現することができる多数の標的遺伝子が存在しうる。標的遺伝子は、転写調節タンパク質を阻害することによって特定の経路を変調するかまたは特定の経路の阻害剤の翻訳を阻害することによって該経路を作動させることができるアンチセンス配列であってよい。標的遺伝子は、適切な転写調節剤の発現または特定の経路の阻害剤の発現をＲＮＡレベルで妨げることによって特定の経路を変調しうるリボザイムをコードすることができる。単独でまたは組合せで発現されるタンパク質は、ホーミング、細胞毒性、増殖、免疫応答、炎症性応答、血餅の形成若しくは溶解、ホルモン調節等を伴うことがある。発現されたタンパク質は、天然に存在する、天然に存在するタンパク質の突然変異体、独特の配列またはそれらの組合せであると考えられる。
遺伝子は、細胞によって分泌される全ての遺伝子でありうるので、コードされた生成物は、宿主によって望まれるかまたは必要とされる場合はいつでも、意のままに利用できるようになりうる。各種分泌生成物としては、ホルモン、例えば、インスリン、ヒト成長ホルモン、グルカゴン、下垂体放出因子、ＡＣＴＨ、メラノトロピン、リラキシン等；成長因子、例えば、ＥＧＦ、ＩＧＦ−１、ＴＧＦ−α、−β、ＰＤＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＦＧＦ、エリトロポエチン、巨核球刺激および成長因子等；インターロイキン、例えば、ＩＬ−１〜−１３；ＴＮＦ−αおよび−β等；並びに酵素、例えば、組織プラスミノーゲン活性化因子、補体カスケードのメンバー、ペルフォリン、スーパーオキシドジスムターゼ、凝固因子、抗トロンビンＩＩＩ、因子ＶＩＩＩｃ、因子ＶＩＩＩｖＷ、α−抗トリプシン、プロテインＣ、プロテインＳ、エンドルフィン、ダイノルフィン、骨形態形成タンパク質、ＣＦＴＲ等がある。
遺伝子は、天然の表面膜タンパク質であるかまたは適当なシグナルペプチドおよび貫膜配列を導入することによってそのように製造される任意の遺伝子でありうる。各種タンパク質としては、ホーミング受容体、例えば、Ｌ−セレクチン（Ｍｅｌ−１４）、血液関連タンパク質、特に、クリングル構造を有する、例えば、因子ＶＩＩＩｃ、因子ＶＩＩＩｖＷ、造血系細胞マーカー、例えば、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、Ｂ細胞受容体、ＴＣＲサブユニットα、β、γ、δ、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４１等、受容体、例えば、インターロイキン受容体ＩＬ−２Ｒ、ＩＬ−４Ｒ等、イオン、例えば、Ｈ+、Ｃａ+2、Ｋ+、Ｎａ+、Ｃｌ-等の流入または流出のためのチャンネルタンパク質等；ＣＦＴＲ、チロシン活性化モチーフ、ζ活性化タンパク質等がある。
タンパク質は、エキソサイトーシスのための小胞に対する輸送のために修飾されうる。小胞に対して向けられるタンパク質からの配列を加えることにより、配列が、一方の若しくはもう一方の末端近くが修飾されているかまたはタンパク質源と同様の位置にある場合、修飾タンパク質は小胞中にパッケージングするためにゴルジ装置に対して向けられる。エキソサイトーシスのためのキメラタンパク質の存在と関連したこの過程は、細胞外媒質および比較的高局在化濃度に対するタンパク質の迅速な輸送を可能にする。
更に、細胞内タンパク質、例えば、代謝経路中のタンパク質、調節タンパク質ステロイド受容体、転写因子等は、特に、宿主細胞の性状に応じて興味深いことがある。上記のタンパク質のいくつかは、細胞内タンパク質としても役立ちうる。
以下に、種々の遺伝子をいくつか例示する。Ｔ細胞中に、Ｔ細胞受容体の一方または両方の鎖をコードしている遺伝子を導入することを望むことができる。Ｂ細胞については、分泌のための免疫グロブリンの重鎖およ軽鎖を提供することができた。皮膚細胞、例えば、ケラチノサイト、特に幹細胞ケラチノサイトについては、α−、β−、γ−インターフェロン、抗走化性因子、細菌細胞壁タンパク質に特異的なプロテアーゼ等を分泌させることによって感染防御を与えることができた。
治療的価値がある遺伝子の発現を提供する他に、細胞を特定の部位に向けることを望みうる多数の状況が存在する。部位としては、解剖学的部位、例えば、リンパ節、粘膜組織、皮膚、滑膜、肺若しくは他の内部器官または機能性部位、例えば、血餅、損傷部位、外科手術部位、炎症、感染等を挙げることができる。宿主標的部位において天然に存在するエピトープに対して結合させることによって宿主細胞を特定の部位に向ける表面膜タンパク質を発現させることにより、分泌生成物の局在化濃度を達成することができる。目的のタンパク質としては、ホーミング受容体、例えば、Ｌ−セレクチン、ＧＭＰ１４０、ＣＬＡＭ−１等若しくはアドレッシン、例えば、ＥＬＡＭ−１、ＰＮＡｄ、ＬＮＡｄ等、血餅結合タンパク質、または走化性因子の局在化勾配に対して応答する細胞表面タンパク質がある。治療用生成物の放出の価値が大である場合、細胞を特定の部位に向けることを望む多数の状況が存在する。
多くの場合、修飾された細胞を死滅させることができることを望むことがあり、その場合、処理を終結させることが望ましく、細胞が存在した後の細胞の不存在が興味深い研究または他の結果において細胞は腫瘍性が適当である。この目的に対して、結合ドメインに対して融合されたＦａｓ抗原またはＴＮＦ受容体を発現させることができる。（ワタナベ（Ｗａｔａｎａｂｌｅ）−フクナガ（Ｆｕｋｕｎａｇａ）ら、Ｎａｔｕｒｅ（１９９２）３５６，３１４〜３１７）最初の修飾において、このような構築物を構成的に発現させることができるので、修飾された細胞はそれらの表面上かまたはそれらの細胞質中に存在するこのようなタンパク質を有する。或いは、同じかまたは異なるリガンドが発現を開始し且つアポプトシスを開始することができる場合、発現を制御することができる。目的の標的遺伝子の発現に関係した結合領域とは異なる結合領域に対して結合した細胞質中のＦａｓ抗原またはＴＮＦ受容体の細胞質部分が与えられることにより、修飾された細胞を制御された条件下で死滅させることができる。
Ｃ．典型的な実証
例示として、癌患者または発作を起こしやすい患者を以下のように治療することができる。本明細書中に記載のように修飾された細胞を患者に対して投与し且つ長時間保持させた。典型的な細胞としては、プラズマ細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞または他の造血系細胞がある。細胞は、血餅に対して結合する、例えば、クリングルドメイン構造を有するタンパク質または接着性相互作用性タンパク質、例えば、ＣＤ４１を発現するように、および血餅溶解性タンパク質、例えば、組織プラスミノーゲン活性化因子、ストレプトキナーゼ等を発現するように修飾された。この方法において、リガンドに媒介されたオリゴマー化によって、細胞は血餅の部分に蓄積し、高局在化濃度の血栓崩壊性タンパク質が得られた。
もう一つの実施例は再灌流損傷である。寿命が限られた細胞、例えば、マクロファージまたは多形核白血球（「好中球」）を用いることができた。細胞は、再灌流損傷部位に対して細胞を向ける好中球ホーミング受容体を有していた。細胞は、更に、一重項酸素を破壊し且つ組織に対するラジカル攻撃を阻害するスーパーオキシドジスムターゼを発現した。
第三の実施例は自己免疫患者である。寿命が延長された細胞、例えば、Ｔ細胞を用いることができた。構築物は、自己免疫損傷部位に対するホーミングのためのまたは損傷を引き起こした細胞に対する細胞障害性攻撃のための受容体を与えられた。次に、損傷を引き起こした細胞に対して治療を方向付けた。或いは、可溶性受容体または他のペプチド若しくはタンパク質を分泌させ、そこで分泌生成物は、損傷が生じた細胞の活性化を阻害しまたはアネルギーを誘導した。もう一つ別の場合は、変性作用を減少させるのに役立ちうる抗炎症性生成物を分泌させることであった。
第四の実施例は、被包によってエンドルフィンを用いる慢性痛の治療を包含する。ヒト繊維芽細胞系統を、キメラ転写調節タンパク質がヒトエンドルフィンの転写を制御している構築物によってトランスフェクトする。ＤＮＡ構築物は、ＴＡＴＡＡＡ部位および転写開始部位の上流のＨＮＦ−１転写因子ＧＴＴＡＡＧＴＴＡＡＣの結合部位の３コピーから成る。エンドルフィンｃＤＮＡを、開始部位の下流並びにポリアデニル化および終結配列の上流に挿入した。場合により、エンドルフィンｃＤＮＡに、タンパク質を不安定にさせる「ＰＥＳＴ」配列およびそれを速やかに分解させるｍＲＮＡの３′非翻訳部分のＡＵＵＡ配列を供給する。
繊維芽細胞は、更に、一方が、繊維芽細胞において機能性の調節開始および終結領域の転写および翻訳制御下のトリマーＦＫＢＰ結合ドメインに対して結合したアミノ酸１〜２５０からのＤＮＡ結合配列をちょうどコードするように切断されたＨＮＦ−１ ｃＤＮＡをコードすると考えられる二つの転写単位を有する構築物によってトランスフェクトされる。構築物は、トリマーＦＫＢＰ′に対して結合したＨＮＦ−４に由来する転写活性化ドメインの生産を支配する同様の調節領域によって駆動される追加の転写単位を含むと考えられる。（プライムは、修飾されたＦＫ５０６に対してｎＭ濃度で結合する変更されたＦＫＢＰを意味する。修飾は、内因性ＦＫＢＰに対する結合を阻害する。）
これらの遺伝学的に修飾された細胞は、免疫認識を阻害するように被包され且つ患者の皮膚または他の好都合な内部部位下におかれた。患者が痛みに投薬を必要とする場合、患者は、ダイマーリガンドＦＫ５０６−ＦＫ５０６′を与えられ、約１μｇ〜１ｍｇが十分であった。この方法において、注射または嗜癖の危険性を伴うことなく痛みを軽減することができた。
第五の実施例は骨粗しょう症の治療である。リンパ球はクローン発生させることができるしまたは皮膚繊維芽細胞は治療される患者から培養で増殖させることができる。細胞は前記のようにトランスフェクトされ、そこで、骨形態形成因子ｃＤＮＡ遺伝子がエンドルフィン遺伝子に取って代わった。リンパ球に対しては抗原特異的クローンが用いられ、それらはｓＩｇのイディオタイプに対する抗体によるそれらの破壊を可能にした。更に、ｓＩｇの抗原の投与は、細胞集団を増加させて、供給されうるタンパク質の量を増加させた。リンパ球クローンを注入し、リガンドを、骨形態形成因子の生産に必要とされる程度に投与した。リガンドに対する応答を監視することによって、投薬量を必要なレベルに調整するように、生産される骨形態形成因子の量を調整することができた。
第六の場合、破壊される必要があるかもしれない細胞に関与する遺伝子療法に関連した一般的な用途を有する。例えば、修飾された細胞は癌になることがあるしまたは別の病的状態を引き起こすことがある。構築物は、必要な転写および翻訳調節領域を有し且つオリゴマー化によって細胞死、例えば、アポプトシスを引き起こすタンパク質をコードしている修飾された細胞中にトランスフェクトされた。例えば、ｆａｓ抗原またはＡｐｏ−１抗原は、大部分の細胞種においてアポプトシスを誘導する（トラウス（Ｔｒａｕｔｈ）ら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４５，３０１〜３０５；ワタナベ（Ｗａｔａｎａｂａ）−フクナガら（１９９２）Ｎａｔｕｒｅ  ３５６，３１４）。この方法において、遺伝子療法または他の目的に用いられる細胞中に保護構築物を同時トランスフェクトすることにより、細胞の一部分または全部の死を確実にする必要性がありうる場合、リガンドによって細胞障害性が制御されるように、細胞を修飾することができる。
もう一つの状態は、抗原特異的Ｔ細胞を修飾することであり、そこでは、細胞を活性化するようにタンパク質産物の発現を活性化することができる。Ｔ細胞受容体は、腫瘍細胞、病原体、細胞性自己免疫等に対して向けられた。細胞を活性化させることにより、例えば、ＩＬ−２などのインターロイキンにより、リガンドに応答して修飾Ｔ細胞を増加させることができた。修飾Ｔ細胞の他の用途としては、細胞障害性、内皮細胞などの標的細胞の表面膜タンパク質のアップレギュレーションまたは他の生物学的結果が望まれる特異的部位に対してＴ細胞を向けるためのホーミング受容体の発現があると考えられる。
或いは、標的部位に対して高用量の細胞障害因子を供給することが望ましいことがある。例えば、ホーミング受容体による腫瘍抗原の認識によって、腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）は、障害濃度のＴＮＦまたは他の同様の生成物の供給を引き起こすことができる。
別の場合は、エキソサイトーシスで輸送されるホルモンまたは因子を輸出することである。エキソサイトーシスを促進することによって、多量のホルモンまたは因子が輸出され；更に、細胞質中のホルモンまたは因子の量に基づくフィードバック機序が存在する場合、ホルモンまたは因子の増加した生産が起こる。或いは、ホルモンまたは因子の発現を誘導することができるので、発現および輸出は付随的に誘導することができる。
更に、維持された体液、例えば、血管系、リンパ系、脳脊髄液等中のタンパク質を提供することができる。宿主中において長い寿命を有することができる細胞、例えば、造血系細胞、ケラチノサイト、筋細胞等、特に、幹細胞を修飾することにより、それらのタンパク質を体液中において長時間維持することができる。細胞は、分泌またはエンドサイトーシスを与える構築物によって修飾することができる。分泌のための構築物は、輸送ドメインとしてシグナルペプチド、続いて他のキメラタンパク質の場合と同様、結合ドメインおよび作用ドメインを有していた。作用ドメインは、同じかまたは異なるタンパク質に由来しうる。例えば、組織プラスミノーゲン活性化因子については、一つの作用ドメインとして血餅結合領域および別の作用ドメインとしてプラスミノーゲン活性部位を有していた。或いは、一つの作用ドメインとしてＬＦＡ−１および第二作用ドメインとしてセレクションなどの結合タンパク質を有することにより、ホーミングの阻止を促進することができた。タンパク質のサブユニット、例えば、インテグリン、Ｔ細胞受容体、ｓＩｇ等を修飾することにより、分子に対して互いに結合させることができる可溶型の表面膜タンパク質が得られた。他の機会は、補体タンパク質、血餅形成に関与する血小板膜タンパク質、細胞表面上の自己抗原および感染因子表面上の病原性分子である。
ＩＸ．細胞中への構築物の導入
通常、１個または複数の構築物を含む宿主細胞の選択を可能にする少なくとも一つのマーカーが存在し且つ２個またはそれ以上のマーカーが存在しうる場合、構築物は、１個またはそれ以上のＤＮＡ分子または構築物として導入することができる。構築物は、慣用的な方法で製造することができ、その場合、遺伝子および調節領域を単離し、適当な場合連結し、適当なクローニング宿主中にクローン化し、制限若しくは配列決定または他の好都合な手段によって分析することができる。特に、「プライマー修復」、連結反応、インビトロ突然変異誘発等を適切に用いて１種類またはそれ以上の突然変異を導入することができる場合、ＰＣＲを用いて、機能性単位の全部または一部分を含む個々のフラグメントを単離することができる。次に、いったん完成され且つ適当な配列を有することが実証された１個または複数の構築物を、宿主細胞中に任意の好都合な手段によって導入することができる。構築物は、非複製欠陥ウイルスゲノム様アデノウイルス、アデノ関連性ウイルス（ＡＡＶ）若しくは単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）、またはレトロウイルスベクターを含む、細胞中への感染若しくは形質導入のための他のものに組込まれ且つ包括されることができる。構築物は、所望ならば、トランスフェクションのためのウイルス配列を含むことができる。或いは、構築物は、融合、エレクトロポレーション、バイオリスティクス（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃｓ）、トランスフェクション、リポフェクションまたは類似のものによって導入することができる。通常、宿主細胞を、１個または複数の構築物を導入する前に培養中で増殖させ且つ増加させた後、１個または複数の構築物の導入および１個または複数の構築物の組込みに適当な処理を行なう。次に、細胞を増加させ、そして構築物中に存在するマーカーによってスクリーニングする。うまく用いることができる各種マーカーとしては、ｈｐｒｔ、ネオマイシン耐性、チミジンキナーゼ、ハイグロマイシン耐性等がある。
若干の場合において、構築物が特定の遺伝子座に組込まれることが望ましい場合、相同的組換えのための標的部位があってよい。例えば、相同的組換えについて当該技術分野において知られているような材料および方法を用いて、内因性遺伝子をノックアウトし且つそれを、構築物によってコードされた遺伝子で（同じ遺伝子座またはどこか他のところに）置き換えることができる。或いは、遺伝子を提供する代わりに、内因性遺伝子の転写開始領域を修飾して、シグナル開始ドメインに対して応答性であるようにすることができる。このような実施態様において、内因性遺伝子、例えば、ＥＰＯ、ｔＰＡ、ＳＯＤまたは類似のものの転写は、リガンドの投与によって制御された。相同的組換えのためには、ΩかまたはＯ−ベクターを用いることができる。例えば、トーマス（Ｔｈｏｍａｓ）およびカペッチ（Ｃａｐｅｃｃｈｉ）、Ｃｅｌｌ（１９８７）５１，５０３〜５１２；マンスール（Ｍａｎｓｏｕｒ）ら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８８）３３６，３４８〜３５２；およびジョイナー（Ｊｏｙｎｅｒ）ら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８９）３３８，１５３〜１５６を参照されたい。
構築物は、遺伝子全部をコードしている単一ＤＮＡ分子としてまたは１種類若しくはそれ以上の遺伝子を有する種々のＤＮＡ分子として導入することができる。構築物は、同時にまたは連続して、それぞれ同じであるかまたは異なるマーカーと一緒に導入することができる。典型的な実施例において、一つの構築物は、特異的応答性要素（例えば、ＮＦＡＴ）の制御下の治療用遺伝子を含み、受容体融合タンパク質をコードしているもう一つは、リガンド受容体ドメイン（例えば、ＭＺＦ３Ｅの場合と同様）に対して融合したシグナリング領域を含んでいた。治療用生成物の供給効率を増加させるホーミング受容体または他の生成物をコードしている第三のＤＮＡ構築物も更に導入することができる。
ＤＮＡ構築物源を製造するのにおよびトランスフェクションを行なうために用いることができる有用な要素、例えば、細菌または酵母の複製起点、選択可能なおよび／または増殖可能なマーカー、原核生物または真核生物における発現のためのプロモーター／エンハンサー要素等を有するベクターは当該技術分野において周知であり、多くは商業的に入手可能である。
Ｘ．細胞およびリガンドの投与
次に、ＤＮＡ構築物によって修飾された細胞を、選択的条件下の培養で増殖させた後、構築物を有するように選択される細胞を増加させ、そして更に、例えば、宿主細胞中の構築物の存在を決定するためのポリメラーゼ連鎖反応を用いて分析することができる。修飾された宿主細胞がいったん識別されたら、引続き、それらを計画されたように、例えば、培養中で増殖させるかまたは宿主生物中に導入するように用いることができる。
細胞の性状に応じて、広範囲の方法で細胞を宿主生物、例えば、哺乳動物中に導入することができる。造血系細胞は、血管系中に注射によって投与することができ、通常、少なくとも約１０4個〜概して約１０10個以下、更に通常は約１０8個以下の細胞が存在する。用いることができる細胞数は、多数の環境、導入の目的、細胞の寿命、用いられるプロトコル、例えば、投与回数、細胞の増殖能力、治療薬の安定性、治療薬に対する生理学的要求等に依る。或いは、移植片として用いることができる皮膚細胞についての細胞数は、熱傷または他の損傷に対して適用される層の寸法によると考えられる。概して、筋芽細胞または繊維芽細胞についての細胞数は、少なくとも約１０4個〜約１０8個以下であり、そして分散剤として適用することができ、一般的には目的の部位またはその付近に注射される。細胞は、通常、生理学的に許容しうる媒質中にある。
細胞のエクスビボ修飾の代わりに、多くの場合、細胞をインビボで修飾したいことがある。この目的で、標的組織および細胞のインビボでの修飾のための種々の技法が開発されてきた。宿主中へのウイルスのトランスフェクションおよびランダム組込みを可能にするアデノウイルスおよびレトロウイルスなどの多数のウイルスベクターが開発されてきた。例えば、ダベンスキー（Ｄｕｂｅｎｓｋｙ）ら（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１，７５２９〜７５３３；カネダ（Ｋａｎｅｄａ）ら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４３，３７５〜３７８；ハイバート（Ｈｉｅｂｅｒｔ）ら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６，３５９４〜３５９８；ハツォグル（Ｈａｔｚｏｇｌｕ）ら（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５，１７２８５〜１７２９３およびフェリー（Ｆｅｒｒｙ）ら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８，８３７７〜８３８１を参照されたい。ベクターは、脈管内若しくは筋肉内などの注射、吸入または他の非経口方式によって投与することができる。
インビボ遺伝子修飾にしたがって、修飾の方法は、組織の性状、必要な細胞修飾の効率、特定の細胞を修飾する機会の回数、導入されるＤＮＡ組成物に対する組織の接近容易性等に依る。標的転写開始領域を有する弱毒化または修飾されたレトロウイルスを用いることにより、所望ならば、問題の転写因子構築物の一つを用いて、ウイルスが生産され且つ隣接する細胞をトランスフェクトするようにウイルスを活性化させることができる。
ＤＮＡ導入は、いずれの場合にも組込みを生じる必要がない。若干の場合、導入されたＤＮＡの一時的維持は十分でありうる。この方法において、細胞を宿主中に導入した後、予め決定された時間後、例えば、細胞が特定部位にホーミングすることができた後に作動させることができた場合、短期効果が得られた。
次に、細胞質ドメインを活性化させるリガンドを所望のように投与することができる。リガンドの結合親和性に応じて、望まれる応答、投与方法、半減期、存在する細胞数、各種プロトコルを用いることができる。リガンドは非経口かまたは経口によって投与することができる。投与回数は前記の因子に依る。リガンドは、経口によって丸剤、散剤若しくは分散剤として；口腔によって；舌下によって；脈管内、腹腔内、皮下注射によって；吸入または類似のものによって摂取することができる。リガンド（およびモノマー化合物）は、各種投与経路のために、当該技術分野において周知の慣用的な方法および材料を用いて配合することができる。正確な投与量および具体的な投与方法は、上記因子に依るし且つ担当医師またはヒト若しくは動物の医療提供者によって決定される。大部分は、投与方法は経験的に決定される。
リガンドによる活性化が逆行する場合、モノマー化合物を投与してよいしまたはリガンドと競合しうる他の単一結合部位化合物であってよい。したがって、逆反応の場合すなわち治療効果を終結させる要求において、速やかな逆転が望まれるならば、モノマー結合化合物を何等かの好都合な方法で、特に脈管内に投与することができる。或いは、ＤＮＡ結合ドメインと一緒に不活性化ドメインを存在させることができるし、または構成的に発現された構築物として存在するＦａｓまたはＴＮＦ受容体を有することによってアポプトシスを与えることができる。
任意の用途に対する具体的なリガンド用量は、治療薬物モニタリングに用いられる手順にしたがって決定することができ、そこでは、特定の発現レベルの維持が長期間にわたって、例えば、約２週間を越えて望まれるかまたは個々の若しくは反復用量のリガンドを用いる反復治療が、例えば、２週間若しくはそれ以上の長期間隔を伴って短期間にわたって存在する。予め決定された範囲内のリガンド用量を与え、そして時間−発現レベル関係を得るようにその応答を監視し、更には治療応答も観察した。時間中に観察されたレベルおよび治療応答に応じて、応答後の次回により多いまたはより少ない用量を与えることができた。この方法を、治療的範囲内の用量が得られるまで何度も繰り返した。リガンドを長期にわたって投与して、リガンドの維持量がいったん決定されたら、次に、細胞系が適当な応答およびレベルの発現生物を与えていることを確実にするために長期間隔で検定を行なうことができた。
該系が、多数の変数、例えば、リガンドに対する細胞応答、発現効率および適当なところでは、分泌レベル、発現生成物の活性、患者の特別な要求（これらは時間および環境によって変化しうる）、細胞の損失または個々の細胞の発現活性の損失の結果としての細胞活性の減損速度によって左右されることは理解されるべきである。したがって、集団全体に投与されうる万能細胞がたとえ存在したとしても、個々の患者それぞれについて、それぞれの患者の個々に適当な用量を監視することが考えられる。
問題の方法論および組成物は、広範囲の症状および適応症の治療に用いることができる。例えば、Ｂ−およびＴ細胞は、癌、感染症、代謝欠損症、心臓血管病、遺伝性凝固欠損症、自己免疫疾患、関節変形症、例えば、関節炎、肺病、腎臓病、内分泌異常等の治療において用いることができる。繊維芽細胞および筋芽細胞などの構造に関係した各種細胞は、遺伝的欠損症、例えば、結合組織欠損症、関節炎、肝臓病等の治療において用いることができる。肝細胞は、多量のタンパク質が、欠損を補足するようにまたは肝若しくは門脈循環に対して治療生成物を供給するように製造される必要がある場合に用いることができる。
以下の実施例を例示として与えるが、制限としてではない。
実施例
細胞の形質転換および評価
実施例１：Ｔ細胞受容体のＣＤ３鎖を架橋することによる単離されたＩＬ−２エンハンサー結合転写因子の誘導。
ヒトＩＬ−２プロモーター（−３２５〜＋４７；ＭＣＢ（８６）６，３０４２）の制御下の胎盤分泌アルカリ性ホスファターゼ遺伝子を含むプラスミドｐＳＸＮｅｏ／ＩＬ−２（ＩＬ２−ＳＸ）（図１）、およびリポーター遺伝子が、種々のプロモーター要素（すなわち、ＮＦＡＴ、ＮＫ  Ｂ、ＯＡＰ／Ｏｃｔ−１およびＡＰ１それぞれ）を含む合成オリゴマーと組み合わされた最小限のＩＬ−２プロモーター（−３２５〜−２９４および−７２〜＋４７）の転写制御下である関連プラスミド変異型（すなわち、ＮＦＡＴ−ＳＸ、ＮＦ  Ｂ−ＳＸ、ＯＡＰ／Ｏｃｔ１−ＳＸおよびＡＰ−１−ＳＸ）は、（１）ＳｓｐＩおよびＨｉｎｄＩＩＩによって切断されたｐＰＬ／ＳＥＡＰ（バーガー（Ｂｅｒｇｅｒ）ら、Ｇｅｎｅ（１９８８）６６，１）；（２）ＮｄｅＩによって切断され、クレノウでブラントにされた後、ＰｖｕＩによって切断されたｐＳＶ２／Ｎｅｏ（サザン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）およびベルグ（Ｂｅｒｇ）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．（１９８２）１，３３２）；および（３）ＰｖｕＩおよびＨｉｎｄＩＩＩによって切断された各種プロモーター含有プラスミド（すなわち、ＮＦＡＴ−ＣＤ８、Ｂ−ＣＤ８、ｃｘ１２ｌａｃＺ−Ｏｃｔ−１、ＡＰ１−ＬＵＣＩＦ３Ｈまたはｃｘ１５ＩＬ２）（以下に記載された）の３部分連結反応によって製造された。ＮＦＡＴ−ＣＤ８は、ヒトＩＬ−２エンハンサーからのＮＦＡＴ−結合部位（−２８６〜２５７；Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖ．（１９９０）４，１８２３）の３コピーを含み且つｃｘ１２ｌａｃＺ−Ｏｃｔは、ＯＡＰ／Ｏｃｔ−１／（ＡＲＲＥ−１）結合部位（ＭＣＢ，（１９８８）８，１７１５）の４コピーを含み；Ｂ−ＣＤ８は、ネズミ軽鎖（ＥＭＢＯ（１９９０）９，４４２５）からのＮＦ  Ｂ結合部位結合部位の３コピーを含み、そしてＡＰ１−ＬＵＣＩＦ３Ｈは、メタロチオネンプロモーターからのＡＰ−１部位（５′−ＴＧＡＣＴＣＡＧＣＧＣ−３′）の５コピーを含む。
それぞれのトランスフェクションにおいて、キメラ受容体ＴＡＣ／ＴＡＣ／Ｚ（ＴＴＺ）（ＰＮＡＳ  ８８，８９０５〜８９０９）をコードしている発現ベクターｐＣＤＬ−ＳＲ（ＭＣＢ  ８，４６６〜７２）（Ｔａｃ−ＩＬ２受容体鎖）５μｇを、ＴＡｇジュルカット細胞（ＳＶ４０ラージＴ抗原によって安定してトランスフェクトされたヒトＴ細胞白血病系ジュルカットの誘導体（ノースラプ（Ｎｏｒｔｈｒｕｐ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．［１９９３］）中において種々の分泌アルカリ性ホスファターゼ基剤リポータープラスミド（図１のｐＳＸＮｅｏ／ＩＬ２の地図を参照されたい）と一緒に同時トランスフェクさせた。各リポータープラスミドは、リポーター遺伝子上流の最小限のＩＬ−２プロモーターか、或いは完全なＩＬ−２エンハンサー／プロモーターの文脈中に、独特のＩＬ−２エンハンサー結合転写因子の結合部位のマルチマー化オリゴヌクレオチドを含む。２４時間後、細胞のアリコート（約１０5個）を、結合抗ＴＡＣ（ＣＤ２５）ｍＡｂ（３３Ｂ．１；ＡＭＡＣ，ウェストブルック（Ｗｅｓｔｂｒｏｏｋ），ＭＥ）の対数希釈が入っている微量滴定ウェルに入れた。陽性対照としておよびトランスフェクション効率を調節するために、イオノマイシン（１μｍ）およびＰＭＡ（２５ｎｇ／ｍｌ）を各トランスフェクションからのアリコートに対して加えた。更に１４時間インキュベーション後、上澄みのアルカリ性ホスファターゼ活性を検定し、そしてこれらの活性を陽性対照試料の活性と相対して表わした。ＦＫ５０６  １ｎｇ／ｍｌの添加は、ＮＦＡＴによる全部の活性をバックグラウンドレベルまで降下させ、脱活性化はＦＫ５０６によって遮断されたのと同様の経路であることが実証された。得られた各データポイントは二つの試料の平均であり、実験は同様の結果を伴って数回行なわれた。図５を参照されたい。データは、既知の細胞外受容体を用いて、リポーター遺伝子および異なるエンハンサーとの適当な反応が得られることを示している。ＴｃＲ複合体（すなわち、ＯＫＴ３）に対するＭＡｂを用いた場合、同様の結果が得られた。
実施例２：免疫抑制薬ＦＫ５０６並びにシクロスポリンＡ（ＣｓＡ）またはダイマー誘導体化合物ＦＫ１０１２Ａ（８）、ＦＫ１０１２Ｂ（５）およびＣｓＡダイマー（ＰＢ−１−２１８）の阻害活性。
イオノマイシン（１μｍ）およびＰＭＡ（２５ｎｇ／ｍｌ）を１０5個のＴＡｇ−ジュルカット細胞に対して加えた。更に、各種薬剤の滴定を加えた。５時間後、細胞を緩洗剤（すなわち、トリトンＸ−１００）中で溶解させ、そして抽出物をβ−ガラクトシダーゼ基質ＭＵＧ（メチルガラクトシジルウンベリフェロン）と一緒に１時間インキュベートした。グリシン／ＥＤＴＡ停止緩衝液を加え、そして抽出物の蛍光を検定した。得られた各データポイントは二つの試料の平均であり、実験は同様の結果を伴って数回行なわれた。意外にも、ＦＫ１０１２Ｂは、最高濃度（すなわち、５μｇ／ｍｌ）で僅かにマイトジェン活性を増加させるように見えるが；しかしながら、対照実験は、ＦＫ１０１２Ｂそれだけでは促進性でないことを示す。図６を参照されたい。
実施例３．キメラＦＫＢＰ１２／ＣＤ３（１ＦＫ３）受容体に対するダイマーＦＫ５０６誘導体ＦＫ１０１２Ａの活性。
キメラ受容体（１ＦＫ３）を有する真核生物発現ベクターｐＢＪ５（１６Ｓスプライス部位およびポリＡ部位間に挿入されたポリリンカーを含むｐＣＤＬ−ＳＲに基づく）５μｇを、ＮＦＡＴ誘導分泌アルカリ性ホスファターゼリポータープラスミドＮＦＡＴ−ＳＸの４μｇと同時トランスフェクトさせた。対照として、平行トランスフェクションにおいて１ＦＫ３／ｐＢＪ５の代わりにｐＢＪ５を５μｇ用いた。２４時間後、約１０5個の細胞を含む各トランスフェクションのアリコートを、指示通りに薬剤ＦＫ１０１２Ａの対数希釈と一緒にインキュベートした。陽性対照としておよびトランスフェクション効率を調節するために、イオノマイシン（１μｍ）およびＰＭＡ（２５ｎｇ／ｍｌ）を各トランスフェクションからのアリコートに対して加えた。更に１４時間インキュベーション後、上澄みのアルカリ性ホスファターゼ活性を検定し、そしてこれらの活性を陽性対照試料の活性と相対して表わした。ＦＫ５０６  ２ｎｇ／ｍｌの添加は、全部の刺激をバックグラウンドレベルまで降下させ、活性化はＦＫ５０６によって遮断されたのと同様の経路であることが実証された。したがって、ＦＫ５０６またはシクロスポリンは、これらの化合物の使用に対して有効な解毒薬として役立つ。得られた各データポイントは二つの試料の平均であり、実験は同様の結果を伴って数回行なわれた。図７を参照されたい。
実施例４Ａ．ミリストイル化キメラＤＣ３／ＦＫＢＰ１２（ＭＺＦ３Ｅ）受容体に対するダイマーＦＫ５０６誘導体ＦＫ１０１２Ｂの活性。
本発明者は、「ＦＫ１０１２」と称するＦＫ５０６基剤ＨＯＤ試薬による陽性結果を含むリガンド設計および合成に対する多数のアプローチをうまく実証した。本発明者は、ＦＫ１０１２が、２：１結合化学量論（Ｋｄ（１）＝０．１ｎＭ；Ｋｄ（２）＝０．８ｎＭ）の高親和性を達成し且つカルシニューリン媒介ＴＣＲシグナリングを阻害しないことを発見した。リガンドは、「免疫抑制性」でも毒性でもない（細胞培養中最大０．１ｍＭまで）。同様に、本発明者は、ＣｓＡ受容体シクロフィリンに対して１：２化学量論で結合するが、カルシニューリンに対して結合しないシクロスポリンＡ基剤ホモダイマー化試薬を製造した。したがって、ＦＫ１０１２と同様、（ＣｓＡ）２はシグナリング経路を阻害しないし、したがって免疫抑制性で毒性でもない。
リガンドに媒介されたタンパク質結合についてのこれらのおよび他の本発明者の実施例は、シグナル導入経路の制御を引き起こした。典型的な場合、これは、翻訳後ミリストイル化に十分なＳｒｃの小フラグメント（Ｍ）、ゼータの細胞質尾部（Ｚ；Ｂ細胞受容体の成分も用いた）、３個の逐次的ＦＫＢＰ１２（Ｆ３）およびｆｌｕエピトープ標識（Ｅ）から成る細胞内受容体を生成することによって達成された。ヒト（ジュルカット）Ｔ細胞における構築物ＭＺＦ３Ｅ（図１８）の発現によって、本発明者は、コード化されたキメラタンパク質が、ＦＫ１０１２に媒介されたオリゴマー化を行なうことを確証した。付随したゼータ鎖の凝集は、ＦＫ１０１２に応答したアルカリ性ホスファターゼの分泌（ＳＥＡＰ）によって実証されるように（ＥＣ50＝５０ｎＭ）、内因性ＴＣＲシグナリング経路（図１５）によるシグナリングをもたらした。ＳＥＡＰリポーター遺伝子のプロモーターは、ＴＣＲシグナリング後に核において組み立てられる活性Ｔ細胞の核因子（ＮＦＡＴ）によって転写活性化されるように構築された。ＦＫ１０１２に誘導されたシグナリングは、ＦＫ５０６−Ｍと称するリガンドの無毒性モノマー変型によって誘導された脱凝集過程によって終結させることができる。
具体的には、ミリストイル化キメラ受容体を有する真核生物発現ベクターｐＢＪ５の５μｇを、ＮＦＡＴ−ＳＸ  ４μｇと同時トランスフェクトさせた。ＭＺＥ、ＭＺＦ１Ｅ、ＭＺＦ２ＥおよびＭＺＦ３Ｅは、ミリストイル化ＣＤ３細胞質ドメインの下流にそれぞれＦＫＢＰ１２の０、１、２または３コピーを含む（図２を参照されたい）。対照として、ｐＢＪ５の５μｇを平行トランスフェクションにおいて用いた。２４時間後、約１０5個の細胞を含む各トランスフェクションのアリコートを、指示通りに薬剤ＦＫ１０１２Ｂの対数希釈と一緒にインキュベートした。陽性対照としておよびトランスフェクション効率を調節するために、イオノマイシン（１μｍ）およびＰＭＡ（２５ｎｇ／ｍｌ）を各トランスフェクションからのアリコートに対して加えた。更に１２時間インキュベーション後、上澄みのアルカリ性ホスファターゼ活性を検定し、そしてこれらの活性を陽性対照試料の活性と相対して表わした。ＦＫ５０６  １ｎｇ／ｍｌの添加は、全部の刺激をバックグラウンドレベル付近まで降下させ、活性化はＦＫ５０６によって遮断されたのと同様の経路であることが実証された。この結果は、問題の細胞活性の可逆性のもう一つの根拠である。得られた各データポイントは二つの試料の平均であり、実験は同様の結果を伴って数回行なわれた。図８を参照されたい。ミリストイル化誘導体は、約一桁までの低濃度のリガンドに応答し且つＮＦＡＴ依存性転写を同様のレベルまで活性化するが、リガンドが異なることに注目すべきである。図７および図８を比較されたい。
インビボＦＫ１０１２誘導タンパク質ダイマー化
本発明者は、次に、ＭＺＦ３Ｅ受容体の細胞内凝集がＦＫ１０１２によって実際に誘導されるのを確実にすることを望んだ。したがって、ＭＺＦ３Ｅ構築物のインフルエンザ血球凝集素エピトープ標識（ｆｌｕ）を、別のエピトープ標識（ｆｌａｇ−Ｍ２）と交換した。近縁関係のキメラＭＺＦ３ＥfluおよびＭＺＦ３Ｅflagを、ジュルカットＴ細胞において共発現させた。細胞をＦＫ１０１２Ａで処理した後、アガロースビーズに結合した抗Ｆｌａｇ抗体を用いて免疫沈降実験を行なった。ＦＫ１０１２Ａ（１μＭ）存在下において、タンパク質キメラＭＺＦ３Ｅflagは、ＭＺＦ３Ｅfluと相互作用し且つＭＺＦ３Ｅflagと一緒に共免疫沈降する。ＦＫ１０１２Ａ不存在下において、ＭＺＦ３Ｅfluとの共免疫沈降は観察されない。シグナルを与えないＦＫＢＰモノマー構築物ＭＺＦ１ＥfluおよびＭＺＦ１Ｅflagを用いる関連実験は、それらがＦＫ１０１２Ａによって更にダイマー化されることを示した（図１９Ａ）。これは、内因性Ｔ細胞受容体および本発明者の人工受容体ＭＺＦ３Ｅ両方で観察された凝集の必要条件を反映している。
ＦＫ１０１２誘導タンパク質チロシンリン酸化
ＴＣＲ、ＣＤ３およびゼータ鎖の細胞内ドメインは、抗原刺激後に細胞質タンパク質チロシンキナーゼと相互作用する。Ｓｒｃ系列の具体的なメンバー（ｌｃｋおよび／またはｆｙｎ）は、これらの細胞内ドメイン中の活性化モチーフ（チロシン活性化モチーフ、ＴＡＭ）の１個またはそれ以上のチロシン残基をリン酸化する。チロシンキナーゼＺＡＰ−７０は、（その２種類のＳＨ２ドメインによって）チロシンリン酸化Ｔ細胞受容体に対して補充され、活性化され、そしておそらくホスホリパーゼＣの更に下流の活性化に関与する。ＭＺＦ３Ｅによって安定してトランスフェクトされたジュルカット細胞に対する抗ＣＤ３  ＭＡｂかまたはＦＫ１０１２Ａの添加は、内因性Ｔ細胞受容体ゼータ鎖およびＭＺＦ３Ｅ構築物それぞれの免疫沈降後のインビトロキナーゼ検定によって測定されたように、ゼータ鎖に対するキナーゼ活性の強化をもたらした。抗ＣＤ３  ＭＡｂかまたはＦＫ１０１２による細胞の処理後のチロシンリン酸化は、単クローン性α−ホスホチロシン抗体を用いて検出された。全細胞溶解産物を、刺激後の種々の時間分析した。チロシンリン酸化タンパク質の同様のパターンは、抗ＣＤ３  ＭＡｂかまたはＦＫ１０１２による刺激後に観察された。パターンは、おそらくはＺＡＰ−７０である７０ｋＤａの主バンドおよび１２０ｋＤａ、６２ｋＤａ、５５ｋＤａおよび４２ｋＤａの副バンドから成った。
実施例４（Ｂ）：イムノフィリンＦａｓ抗原キメラによるプログラム化された細胞死の調節
Ｆａｓ抗原、細胞表面受容体の神経成長因子（ＮＧＦ）／腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体超系列のメンバーである。Ｆａｓ抗原と抗体との、その細胞外ドメインに対する架橋は、プログラム化された細胞死すなわちアポプトシスを引き起こすまだ十分に理解されていないシグナリング経路を活性化する。Ｆａｓ抗原およびそれに関係したアポプトシス性シグナリング経路は、おそらくは全部の腫瘍細胞を含む大部分の細胞に存在している。該経路は、壊死性細胞死においては見られない凝縮された細胞質、炎症反応の不存在およびヌクレオソームＤＮＡのフラグメント化を特徴とする急速且つ独特の細胞死（２時間）をもたらす。
本発明者は、更に、アポプトーシス性細胞死をもたらす第二の誘導シグナリングシステムを開発した。ＭＺＦ３Ｅ経路と同様、この一つは、構成的に発現された「応答個体」遺伝子の生成物である人工受容体を活性化することによって開始される。しかしながら、新しい経路は、本発明者のＨＯＤ試薬が、トランスフェクトされた誘導（例えば、リポーター）遺伝子産物よりもむししろ内因性経路の生成物を誘導する点で第一とは異なる。
Ｆａｓ経路に対する増加性制御は、将来の生物学的研究および医学にとって重要な意味がありうる。細胞特異的プロモーターの制御下の「死滅」応答個体遺伝子によって形質転換された動物が生じるかもしれない。次に、標的細胞は、動物成体をＨＯＤ試薬で処置することによってそこで化学的に除去されうる。この方法で、自己免疫疾患の誘導および維持における記憶若しくは認識または免疫細胞中の特定の脳細胞の役割を評価しうる。死滅応答個体遺伝子は、Ｍ．ブレーズ（Ｂｌａｅｓｅ）および共同研究者（カルバー（Ｃｕｌｖｅｒ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６  ５０６３（１９９２）；１５５０〜２）によって開発されたヒト遺伝子療法を用いて腫瘍中に導入された後、（脳腫瘍の治療に関して最近報告された「ガンシクロビア（ｇａｎｃｙｃｌｏｖｉｒ）」遺伝子療法臨床試験を類推して）ＨＯＤ試薬で患者を治療することによって引続き活性化されるかもしれない。最後に、本発明者は、死滅応答個体遺伝子と治療用遺伝子との共投与を包含する将来の遺伝子治療の成分を考えている。これは、遺伝子療法に対して「フェールセーフ」成分を提供すると考えられる。何かがうまくいかない場合（一般的に論及された問題は、癌をもたらす腫瘍サプレッサー遺伝子の組込みに誘導された減損である）、遺伝子療法患者は、トランスフェクトされた細胞全部を死滅させる「フェールセーフ」丸剤を服用しうる。この概念は、本発明者をＨＯＤ試薬の直交システムの開発に集中させた。したがって、本発明者は、第一と交差反応する可能性がなく、しかも治療用遺伝子の転写を開始させるまたは停止させるのに用いられると考えられる試薬の第二セットを望んだ。
Ｆａｓ抗原の細胞質シグナリングドメインに対して融合した３個のＦＫＢＰ１２ドメインから成るキメラｃＤＮＡを構築した（図２０）。この構築物は、ヒトジュルカット細胞およびネズミＤ１０Ｔ細胞において発現された場合、ＦＫ１０１２試薬によってダイマー化し且つシグナリングカスケードを開始するように誘導されて、ＦＫ１０１２依存性アポプトシスを引き起こすことがある。ＭＦＦ３Ｅによって一時的にトランスフェクトされた細胞の、ＦＫ１０１２Ａに媒介された死滅についてのＬＤ50は、リポーター遺伝子活性の減損によって決定したところ１５ｎＭである（図２０；検定の論及については。図２１の表題を参照されたい）。これらのデータは、安定してトランスフェクトされた細胞系における細胞死の測定値と一致する。安定なトランスフェクタントは均一な細胞集団を表わすので、それらは、死が壊死（膜ブレブ形成、ヌクレオソームＤＮＡフラグメント化）によるよりもむしろアポプトシスによることを確かめるのに用いられてきた。しかしながら、一時的トランスフェクションプロトコルは、はるかに少ない作業しか必要としないので、以下に記載のように、初期検定システムとして用いられてきた。
実施例４（Ｃ）：シクロフィリンＦａｓ抗原キメラによるプログラム化された細胞死の調節
本発明者は、更に、一連のシクロフィリンＣ−Ｆａｓ抗原構築物を製造し且つ一時的発現検定において（ＣｓＡ）２依存性アポプトシスを誘導するそれらの能力を検定した（図２１Ａ）。更に、（ＣｓＡ）２依存性アポプトシスは、系列ＭＣ３ＦＥ（Ｍ＝Ｓｒｃのミリストイル化ドメイン、Ｃ＝シクロフィリンドメイン、Ｆ＝Ｆａｓの細胞質尾部、Ｅ＝ｆｌｕエピトープ標識）中の最も活性な構築物によって安定してトランスフェクトされたヒトジュルカットＴ細胞を用いて実証された。Ｆａｓの細胞質尾部は、１、２、３または４個の逐次的シクロフィリンドメインの前か後に融合された。更に、Ｆａｓドメインを欠いている二つの対照構築物を製造した。この場合、本発明者は、シグナリングドメインが、ダイマー化ドメインの後におかれた場合にのみ機能することを観察した。（ゼータ鎖構築物は、ダイマー化ドメインの前か後におかれた場合にシグナルを与える。）ウェスタンブロッティングによって確かめたところ、８種類のシグナリング構築物の発現レベルおよびそれらの活性は両方とも定量的に異なった（図２１Ｂ）。これまでのところで、最適システムは、ＭＣ３ＦＥであることが分かった。ＭＣ３ＦＥによる（ＣｓＡ）２に媒介された細胞死のＬＤ50は約２００ｎＭである。これらのデータは、細胞内タンパク質結合を調節するためのシクロフィリン−シクロスポリン相互作用の有用性を実証し且つＫＦＢＰ１２−ＦＫ１０１２システムと交差反応しない直交試薬システムを例証する。更に、この場合、データは、Ｆａｓ細胞質尾部によるシグナル導入の開始にはダイマー化のみが必要とされ、凝集は必要とされないことを示している。
ミリストイル化シグナルのＮ末端グリシンのアラニンへの突然変異は、ミリストイル化を、したがって膜局在化を妨げる。本発明者は、更に、突然変異した構築物（ΔＭＦＦ３Ｅ）が、ＦＫ１０１２依存性アポプトシスの誘導物質として同様に強力であったことを観察しており、Ｆａｓに媒介された細胞死に膜局在化が不可欠ではないことが示された。
実施例５．ネズミシグナリングキメラタンパク質の構築
図４に記載のプライマーを用いることによって種々のフラグメントが得られた。プライマー番号の論及する場合、図４を参考にすべきである。
ネズミクラスＩＩ  ＭＨＣ受容体（Ｃｅｌｌ，３２，７４５）のＩ−Ｅ鎖を含む約１．２ｋｂ  ｋｃＤＮＡフラグメントをシグナルペプチド源として用い、Ｐ＃６０４８およびＰ＃６０４９を用い、供給者（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））によって記載のようにＰＣＲを用いて７０ｂｐ  ＳａｃＩＩ−ＸｈｏＩフラグメントを生成した。第二フラグメントは、ＣＤ３（ＰＮＡＳ，８８，８９０５）の貫膜および細胞質ドメインに対して結合したＴａｃ（ＩＬ２受容体鎖）を含むプラスミドを用いて得られた。Ｐ＃６０５０およびＰ＃６０５１を用い、ＣＤ３の貫膜および細胞質ドメインを含むＰＣＲによって３２０ｂｐ  ＸｈｏＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントが得られた。これら二つのフラグメントを連結し且つＳａｃＩＩ−ＥｃｏＲＩによって消化されたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））中に挿入してプラスミドＳＰＺ／ＫＳを提供した。
ＦＫ５０６のための結合ドメインを得るために、プラスミドｒｈＦＫＢＰ（Ｓ．シュライバー（Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ）、Ｎａｔｕｒｅ（１９９０）３４６，６７４によって提供された）をＰ＃６０５２およびＰ＃６０５３と一緒に用いて、ヒトＦＫＢＰ１２を含む３４０ｂｐ  ＸｈｏＩ−ＳａｌＩフラグメントを得た。このフラグメントを、ＸｈｏＩ−ＳａｌＩによって消化されたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ中に挿入して、プラスミドＦＫ１２／ＫＳを提供し、これがＦＫＢＰ１２結合ドメイン源であった。ＳＰＺ／ＫＳをＸｈｏＩによって消化し、ホスファターゼ処理して（細胞腸アルカリ性ホスファターゼ；ＣＩＰ）自己アニーリングを防止し、そしてＦＫ１２／ＫＳからの１０倍モル過剰のＸｈｏＩ−ＳａｌＩ  ＦＫＢＰ１２含有フラグメントと組合せた。ＦＫＢＰ１２のモノマー、ダイマーおよびトリマーを正しい配置で含むクローンを単離した。クローン１ＦＫ１／ＫＳ、１ＦＫ２／ＫＳおよび１ＦＫ３／ＫＳは、転写方向に、ネズミＭＨＣクラスＩＩ遺伝子Ｉ−Ｅからのシグナルペプチド、ヒトＦＫＢＰ１２のモノマー、ダイマーまたはトリマーそれぞれ、およびＣＤ３の貫膜および細胞質部分から成る。最後に、ＳａｃＩＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントを、制限酵素を用いてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔから切断し、そしてＳａｃＩＩおよびＥｃｏＲＩによって消化されたｐＢＪ５のポリリンカー中に連結して、プラスミド１ＦＫ１／ｐＢＪ５、１ＦＫ２／ｐＢＪ５および１ＦＫ３／ｐＢＪ５をそれぞれ生成した。図３および図４を参照されたい。
実施例６
Ａ．細胞内シグナリングキメラの構築。
ｃ−ｓｒｃからのミリストイル化配列は、ペルマン（Ｐｅｌｌｍａｎ）ら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１４，３７４から得られ、それをＣＤ３の相補的配列に対して結合して、Ｐ＃８９０８と称する貫膜ドメインの３′配列に対して相補的であるプライマーを提供した。このプライマーは、ミリストイル化配列の５′末端に隣接したＳａｃＩＩ部位および３′末端に隣接したＸｈｏＩ配列を有する。他のプライマーＰ＃８４６２は、ＣＤ３の３′末端に対して相補的な配列のＳａｌＩ認識部位３′、停止コドンおよびＥｃｏＲＩ認識部位を有する。ＰＣＲを用いて、４５０ｂｐ  ＳａｃＩＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントを得たが、これは５′〜３′方向に融合したミリストイル化配列およびＣＤ３配列から成った。このフラグメントをＳａｃＩＩ／ＥｃｏＲＩ消化ｐＢＪ５（ＸｈｏＩ）（ＳａｌＩ）中に連結し且つクローン化して、プラスミドＭＺ／ｐＢＪ５を生成した。最後に、ＭＺ／ｐＢＪ５をＳａｌＩによって消化し、ホスファターゼ処理し、そしてＦＫ１２／ＫＳからの１０倍モル過剰のＸｈｏＩ−ＳａｌＩ  ＦＫＢＰ１２含有フラグメントと組み合わせ且つ連結させた。クローニング後、５′〜３′方向にミリストイル化配列、ＣＤ３およびＦＫＢＰ１２マルチマーを有する所望の構築物を含むプラスミドを単離し、そして正しい構造を有すると立証した。図２および図４を参照されたい。
Ｂ．細胞内シグナリングキメラの発現カセットの構築。
構築物ＭＺ／ｐＢＪ５（ＭＺＥ／ｐＢＪ５）を、制限酵素ＸｈｏＩおよびＳａｌＩによって消化し、ＴＣＲζフラグメントを除去し、そして得られたベクターを１０倍モル過剰のＦＫＢＰ１２のモノマー、ダイマー、トリマーまたは高次マルチマーと連結して、ＭＦ１Ｅ、ＭＦ２Ｅ、ＭＦ３Ｅまたは、ＭＦnＥ／ｐＢＪ５を製造する。次に、和合性フランキング制限部位（すなわち、ＸｈｏＩおよびＳａｌＩ）を含むように設計された活性ドメインを、ＭＦnＥ／ｐＢＪ５の独特のＸｈｏＩまたはＳａｌＩ制限部位中にクローン化することができる。
実施例７．核キメラの構築
Ａ．ＧＡＬ４  ＤＮＡ結合ドメイン−１個または複数のＦＫＢＰドメイン−エピトープ標識。
ＧＡＬ４  ＤＮＡ結合ドメイン（アミノ酸１〜１４７）を、Ｋｏｚａｃ配列の上流のＳａｃＩＩ部位および翻訳開始部位を有する５′プライマー（＃３７）並びにＳａｌＩ部位を有する３′プライマー（＃３８）を用いてＰＣＲによって増幅させた。ＰＣＲ生成物を単離し、ＳａｃＩＩおよびＳａｌＩによって消化し、そしてＳａｃＩＩおよびＳａｌＩ部位においてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＫＳ（＋）中に連結して、構築物ｐＢＳ−ＧＡＬ４を生成した。構築物を配列決定によって確認した。ｐＢＳ−ＧＡＬ４からのＳａｃＩＩ／ＳａｌＩフラグメントを単離し、そしてＳａｃＩＩおよびＸｈｏＩ部位において構築物１ＦＫ１／ｐＢＪ５および１ＦＫ３／ｐＢＪ５（ミリストイル化配列を含む、実施例６を参照されたい）中に連結して、構築物ＧＦ１Ｅ、ＧＦ２ＥおよびＧＦ３Ｅを生成した。
ＰＣＲ増幅生成物の５′末端：
0003824633.tif 000003
ＰＣＲ増幅生成物の３′末端：
0003824633.tif 000004
Ｂ．ＨＮＦ１ダイマー化／ＤＮＡ結合ドメイン−１個または複数のＦＫＢＰドメイン−標識。
ＨＮＦ１ａダイマー化／ＤＮＡ結合ドメイン（アミノ酸１〜２８２）を、Ｋｏｚａｃ配列の上流のＳａｃＩＩ部位および翻訳開始部位を有する５′プライマー（＃３９）並びにＳａｌＩ部位を有する３′プライマー（＃４０）を用いてＰＣＲによって増幅させた。ＰＣＲ生成物を単離し、ＳａｃＩＩおよびＳａｌＩによって消化し、そしてＳａｃＩＩおよびＳａｌＩ部位においてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＫＳ（＋）中に連結して、構築物ｐＢＳ−ＨＮＦを生成した。構築物を配列決定によって確認した。ｐＢＳ−ＨＮＦからのＳａｃＩＩ／ＳａｌＩフラグメントを単離し、そしてＳａｃＩＩおよびＸｈｏＩ部位において構築物１ＦＫ１／ｐＢＪ５および１ＦＫ３／ｐＢＪ５中に連結して、構築物ＨＦ１Ｅ、ＨＦ２ＥおよびＨＦ３Ｅを生成した。
ＰＣＲ増幅生成物の５′末端：
0003824633.tif 000005
ＰＣＲ増幅生成物の３′末端：
0003824633.tif 000006
Ｃ．１個または複数のＦＫＢＰドメイン−１個または複数のＶＰ１６転写活性化ドメイン−エピトープ標識。
これらの構築物は三段階で、すなわち、（ｉ）ミリストイル化配列がＸｈｏＩ部位のすぐ上流の開始部位で置き換えられたＩＦＫ３／ｐＢＪ５から構築物を生成して、構築物ＳＦ３Ｅを生成し；（ｉｉ）核局在化配列を該ＸｈｏＩ部位中に挿入して構築物ＮＦ３Ｅを生成し；（ｉｉｉ）ＶＰ１６活性化ドメインを、ＮＦ３ＥのＳａｌＩ部位中にクローン化して構築物ＮＦ３Ｖ１Ｅを生成することで製造された。
（ｉ）ＳａｃＩＩおよびＸｈｏＩ部位に隣接したＫｏｚａｃ配列および開始部位をコードしている相補的オリゴヌクレオチド（＃４５および＃４６）をアニーリングし、リン酸化し、そしてＭＦ３ＥのＳａｃＩＩおよびＸｈｏＩ部位中に連結して構築物ＳＦ３Ｅを生成した。
一般的な開始部位の挿入
0003824633.tif 000007
（ｉｉ）５′ＳａｌＩ部位および３′ＸｈｏＩ部位に隣接されたＳＶ４０  Ｔ抗原核局在化配列をコードしている相補的オリゴヌクレオチド（＃４７および＃４８）をアニーリングし、リン酸化し、そしてＳＦ１ＥのＸｈｏＩ部位中に連結して、構築物ＮＦ１Ｅを生成した。構築物をＤＮＡ配列決定によって確認した。１２８位のリシンの代わりにトレオニンが置換されている核局在化配列の突然変異体または欠陥型を含む構築物を更に単離した。これをＮＦ１Ｅ−Ｍと称する。ＦＫＢＰ１２ドメインのマルチマーは、ＦＫＢＰ１２配列をｐＢＳ−ＦＫＢＰ１２からのＸｈｏＩ／ＳａｌＩフラグメントとして単離し且つこのフラグメントを、ＸｈｏＩによって直鎖状にされたＮＦ１Ｅ中に連結することによって得られた。これによって構築物ＮＦ２ＥおよびＮＦ３Ｅが生成された。
一般的な開始部位へのＮＬＳの挿入
0003824633.tif 000008
１２８位のトレオニンは欠陥ＮＬＳを生じる。
（ｉｉｉ）ＶＰ１６転写活性化ドメイン（アミノ酸４１３〜４９０）を、ＳａｌＩ部位を有する５′プライマー（＃４３）およびＸｈｏＩ部位を有する３′プライマー（＃４４）を用いてＰＣＲによって増幅させた。ＰＣＲ生成物を単離し、ＳａｌＩおよびＸｈｏＩによって消化し、そしてＸｈｏＩおよびＳａｌＩ部位においてＭＦ３Ｅ中に連結して、構築物ＭＶ１Ｅを生成した。構築物を配列決定によって確認した。マルチマー化されたＶＰ１６ドメインは、単一ＶＰ１６配列をＸｈｏＩ／ＳａｌＩフラグメントとしてＭＶ１Ｅから単離し、そしてこのフラグメントを、ＸｈｏＩによって直鎖状にされたＭＶ１Ｅ中に連結することによって生成された。構築物ＭＶ２Ｅ、ＭＶ３ＥおよびＭＶ４Ｅをこの方法で生成した。１種類またはそれ以上の多重ＶＰ１６ドメインをコードしているＤＮＡフラグメントは、ＸｈｏＩ／ＳａｌＩフラグメントとしてＭＶ１ＥまたはＭＶ２Ｅから単離され、そしてＳａｌＩによって直鎖状にされたＮＦ１Ｅ中に連結されて、構築物ＮＦ１Ｖ１ＥおよびＮＦ１Ｖ３Ｅを生成した。ＦＫＢＰ１２ドメインのマルチマーは、ＦＫＢＰ１２配列をＸｈｏＩ／ＳａｌＩフラグメントとしてｐＢＳ−ＦＫＢＰ１２から単離し、そしてこのフラグメントを、ＸｈｏＩによって直鎖状にされたＮＦ１Ｖ１Ｅ中に連結することによって得られた。これによって構築物ＮＦ２Ｖ１ＥおよびＮＦ３Ｖ１Ｅが生成された。
ＰＣＲ増幅生成物の５′末端：
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ＰＣＲ増幅生成物の３′末端：
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オリゴヌクレオチド：
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実施例８．転写誘導の実証。
ジュルカットＴＡｇ細胞を、エレクトロポレーション（９６０μＦ、２５０ｖ）によって指定された構築物（各構築物５μｇ）を用いてトランスフェクトした。２４時間後、細胞を新しい培地中に再懸濁させ且つ分別した。各トランスフェクションの半分を、最終濃度１μＭでのダイマーＦＫ５０６誘導体（実施例１４）と一緒にインキュベートした。１２時間後、細胞を洗浄し、そして細胞抽出物を反復凍結融解によって調製した。クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）活性を、標準的なプロトコルによって測定した。
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ，サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら監修（１９８９）ＣＳＨラボラトリー、１６〜５９頁および次の数頁。データ（図２２）は、３７℃で１８時間インキュベーション後の抽出物（全抽出物量は１２０μＬ）７０μＬ中に存在するＣＡＴ活性を実証する。検定に用いられた試料は以下の通りである。
1.  G5E4TCAT(GAL4-CATリポータープラスミド)
2.  G5E4TCAT,GAL4-VP16
3.  G5E4TCAT,NF3V1E
4.  G5E4TCAT,GF2E
5.  G5E4TCAT,GF2E,NF3V1E
6.  G5E4TCAT,GF3E,NF3V1E
合成化学例
他の箇所で指摘したように、オリゴマー化剤として存在する特に重要な化合物は、以下の構造：
リンカー−｛rbm1，rbm2，…rbmn｝
［式中、“リンカー”は、同一または異なっていてもよい“n”（２〜約５の整数、通常、２もしくは３）レセプター結合部分（“rbm類”）に共有結合した、例えば、本明細書に記載するリンカー部分である。］
を有する。本明細書の他の箇所で検討したように、レセプター結合部分は、例えば、セクションＶ（Ｃ）に列挙したような公知のレセプターに対するリガンド（またはその類縁体）であり、ＦＫＢＰに結合することのできるＦＫ５０６、ＦＫ５２０、ラパマイシンおよびその類縁体、ならびに、それぞれのレセプターに結合することのできるシクロスポリン類、テトラサイクリン類、その他の抗微生物剤およびマクロライド類ならびにステロイド類を包含する。
リンカーは、二以上のレセプター結合部分に共有結合（“−”）することのできる二官能性または多官能性分子である。リンカー部分の例は、セクションＶＩ（Ａ）および種々の実施例で開示してあり、とりわけ、Ｃ２〜Ｃ２０アルキレン、Ｃ４〜Ｃ１８アザアルキレン、Ｃ６〜Ｃ２４Ｎ−アルキレンアザアルキレン、Ｃ６〜Ｃ１８アリーレン、Ｃ８〜Ｃ２４アルジアルキレンおよびＣ８〜Ｃ３６ビスカルボキサアミドアルキレンが挙げられる。
これらの化合物は、市販されている物質および／または当分野公知の方法を用いて製造することができる。これら化合物に対する人工のレセプターは、以降に記載するようにして得ることができる。特に重要な化合物は、ＫＤ１０-6未満、好ましくは、約１０-7未満、さらにより好ましくは、１０-8未満でレセプターに結合する化合物である。
重要なオリゴマー化剤の一つの亜類は、一以上のレセプター結合部分がＦＫ５０６、ＦＫ−５０６タイプの化合物またはその誘導体であるものであり、レセプター結合部分は、図２３Ａにおける化合物５または１３当たり（ＦＫ５０６ナンバリングを用いて）、Ｃ２１でアリル基を介するか、または、シクロヘキシル環（Ｃ２９〜Ｃ３４）、例えば、図２３Ｂにおける化合物８、１６、１７当たりＣ３２ヒドロキシルを介して、リンカー部分に共有結合される。この類の化合物は、以下の実施例も含め、本明細書に開示された方法を採用することによって製造することができる。
重要なオリゴマー化剤のもう一つの亜類は、レセプター結合部分の少なくとも一つがＦＫ５２０またはその誘導体であり、ＦＫ５２０またはその誘導体の分子が、図１０におけるＦＫ１０４０ＡまたはＦＫ１０４０Ｂのように、リンカー部分に共有結合しているものである。この類の化合物は、図１０のスキーム１もしくは図１１Ａおよび図１１Ｂのスキーム２または図１２および図１３のスキーム３を採用することによって製造することができる。
重要なオリゴマー化剤のさらなる亜類は、レセプター結合部分の少なくとも一つがシクロスポリンＡまたはその誘導体であるものである。
本発明のこれらおよびその他のオリゴマー化剤が、ホモオリゴマー化試薬（rbmが同一である）またはヘテロオリゴマー化剤（rbmが異なる）であってもよいことを理解する必要がある。ヘテロオリゴマー化剤は、本明細書中の処理方法、例えば、図１３のスキーム３および本明細書のその他の箇所で検討した処理方法に類似した方法によって製造することができる。
以下の合成例は、例として示すものである。
Ａ．  一般的な処理方法  反応は、全て、窒素またはアルゴン加圧下、オーブンで乾燥させたガラス器具中で行った。空気および水分に鋭敏な化合物は、ゴム栓を介して、シリンジまたはカニューレで導入した。
Ｂ．  物理的なデータ  プロトン核磁気共鳴スペクトル（1ＨＮＭＲ）は、Bruker AM-500(500MHz)およびAM-400(400MHz)分光器で記録した。ケミカルシフトは、内部標準としての溶剤共鳴（クロロホルム，７．２７ppm）を用いて、テトラメチルシランからのppmで報告する。データは、以下の通り、ケミカルシフト、多重度（s＝シングレット、d＝ダブレット、t＝トリプレット、q＝カルテット、br＝広がった、m＝マルチプレット）、カップリングコンスタント（Hz）、積分で報告する。低分解能および高分解能質量スペクトルが得られた。
Ｃ．  クロマトグラフィ  反応、E. Merkのシリカゲル60Fガラスプレート（０．２５mm）を用いて、薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）によりモニターした。成分は、長波長の紫外光による照射、ヨード蒸気への暴露、および／または、セリックアンモニウムモリブデート水溶液への浸漬、続く、加熱によって目視した。クロマトグラフィ用の溶剤は、ＨＰＬＣ等級であった。E. Merkシリカゲル60（２３０〜４００メッシュ）について指示された溶剤システムの強制流（フラッシュクロマトグラフィ）を用いて、液体クロマトグラフィを行った。
Ｄ．  溶剤および試薬  試薬および溶剤は、全て、分析用等級であり、以下、例外的と受け取られるように使用した。
テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ベンゼン、トルエンおよびジエチルエーテルは、ナトリウム金属ベンゾフェノンケチルから蒸留した。トリエチルアミンおよびアセトニトリルは、カルシウムハイドライドから蒸留した。ジクロロメタンは、五酸化リンから蒸留した。ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）は、減圧でカルシウムハイドライドから蒸留し、４Ａモレキュラーシーブ上で貯蔵した。
ＦＫ５０６誘導体の製造
実施例  ９  ＦＫ５０６−ＴＢＳ2のハイドロボレーション／酸化（１〜２）
ハイドロボレーションは、Evansの方法［Evans, et al., JACS(1992) 114, 6679; ibid. (1992) 6679-6685］に従い行った［ナンバリングについては、Harding, et al., Nature(1989) 341, 758参照］。１０mlのフラスコに、２４，３２−ビス［（ｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ］ＦＫ５０６（３３．８mg，０．０３３mmol）と［Rh(nbd)(diphos-4)］BF4（３．１mg，０．００４mmol，１３mol％）とを充填した。オレンジ色の混合物をトルエン（２．０ml）に溶解し、溶剤を減圧下４時間かけて除去した。フラスコを窒素で注意深くパージし、オレンジ色の油状物をＴＨＦ（３．０ml，最終濃度１０mM）に溶解し、氷冷バスで０℃に冷却した。カテコールボラン（９８μl，０．０９８mmol，ＴＨＦ１．０M溶液，３．０当量）をシリンジで加え、得られた溶液を０℃で４５分間撹拌した。０．２mlＴＨＦ／ＥｔＯＨ（１：１）で反応を０℃でクエンチし、続いて、ｐＨ７．０緩衝液（Fisher; 0.05Mリン酸塩）０．２mlを加え、ついで、３０％Ｈ2Ｏ2０．２mlを加えた。溶液を室温で少なくとも１２時間撹拌した。減圧下、溶剤を除去し、残る油状物をベンゼン（１０ml）に溶解し、炭酸水素ナトリウム飽和水溶液（１０ml）で洗浄した。相を分離し、水相をベンゼン（２×１０ml）で逆抽出した。有機相を合わせ、炭酸水素ナトリウム飽和水溶液（１０ml）で一回洗浄した。ベンゼン相をＭｇＳＯ4で乾燥し、濃縮し、フラッシュクロマトグラフィ（ヘキサン：酢酸エチル２：１）に付すと、透明無色の油状物（１２．８mg，０．０１２mmol，３７％）として、所望の第１級アルコールを与えた。
混合カーボネートの製造（２〜３）
混合カーボネートの製造は、Ghoshの方法［Ghosh, et l., Tetrahedron Lett. (1992) 33, 2781-2784］によって達成された。１０mlのフラスコに、第１級アルコール（２９．２mg，０．０２７８mmol）とベンゼン（４ml）とを充填した。減圧下、６０分間かけて、溶剤を除去した。油状物をアセトニトリル（２．０ml，最終濃度１４mM）に溶解し、トリエチルアミン（７７μl，０．５６mmol）を加えつつ、２０℃で撹拌した。Ｎ，Ｎ’−ジスクシンイミジルカーボネート（３６mg，０．１４mmol）を一度に加え、溶液を２０℃で４６時間撹拌した。反応混合物をジクロロメタンで希釈し、炭酸水素ナトリウム飽和水溶液（１０ml）で洗浄した。相を分離し、水層をジクロロメタン（２×１０ml）で逆抽出した（back-extracted）。有機相を合わせ、（ＭｇＳＯ4で）乾燥し、濃縮し、フラッシュクロマトグラフィ（ヘキサン：酢酸エチル３：１〜２：１〜１：１）に付した。所望の混合カーボネートは、透明な無色の油状物（１６．８mg，０．０１４mmol，５１％）として、単離された。
ＦＫ５０６の二量化（３〜４）
乾燥した１mlのコニカルガラスビーカー（Kontes Scientific Glassware）に、混合カーボネート（７．３mg，０．００６１mmol）とアセトニトリル（２５０μl，最終濃度２５mM）とを充填した。トリエチルアミン（１０μl，０．０７５mmol）を加え、続いて、ｐ−キシリーレンジアミン（８．３μl，０．００２７mmol，０．３２MＤＭＦ溶液）を加えた。反応物を２０℃で２２時間撹拌し、ジクロロメタン（１０ml）で希釈することによってクエンチした。溶液を炭酸水素ナトリウム飽和水溶液（１０ml）で洗浄した。相を分離し、水層をジクロロメタン（２×１０ml）で逆抽出した。有機相を合わせ、（ＭｇＳＯ4で）乾燥し、濃縮し、フラッシュクロマトグラフィ（ヘキサン：酢酸エチル３：１〜２：１〜１：１）に付すと、透明な無色の油状物（４．３mg，１．９μmol，７０％）として、所望の保護されたダイマーを与えた。
ＦＫ５０６ダイマーの脱保護（４〜５）
回転翼を取り付けた１．５mlのポリプロピレンチューブに、保護されたダイマー（３．３mg，１．４μmol）を入れた。アセトニトリル（０．５ml，最終濃度３mM）を加え、ＨＦ（５５μl，４８％水溶液；Fisher）を加えつつ、溶液を２０℃で撹拌した。溶液を室温で１８時間撹拌した。ついで、脱保護されたＦＫ５０６誘導体を、１５ml試験管中、ジクロロメタンと炭酸水素ナトリウム飽和水溶液との間で分配させた。両相を混合するために、試験管に激しい渦流を生じさせ、分離後、有機相をピペットで除去した。水相をジクロロメタン（４×２ml）で逆抽出し、合わせた有機相を（ＭｇＳＯ4で）乾燥し、濃縮し、フラッシュクロマトグラフィ（ヘキサン：ＴＨＦ：エーテル１：１：１〜ＴＨＦ：エーテル１:１）に付すと、透明な無色の油状物（１．７mg，０．９３μmol，６５％）として、所望のダイマーを与えた。
上記処理法に従い、他のモノアミン類およびジアミン類、例えば、ベンジルアミン（１４）、オクタメチレンジアミン、デカメチレンジアミン等を使用することができる。
実施例  １０  ＦＫ５０６のＬ−セレクトライドによる還元（ＦＫ５０６〜６）
Danishefskyと共同研究者達は、ＦＫ５０６をＬ−セレクトライドで処理すると、Ｃ２４およびＣ２２ヒドロキシル基で形成するボロネートエステルを有する２２−ジヒドロ−ＦＫ５０６を与えることを示した［Coleman and Danishefsky, Heterocycles (1989) 28, 157-161; Fisher, et al., J. Org. Chem. (1991) 56, 2900-2907］。
混合カーボネートの製造（６〜７）
１０mlのフラスコに、２２−ジヒドロ−ＦＫ５０６−sec-ブチルボロネート（１２５．３mg，０．１４４mmol）とアセトニトリル（３．０ml，最終濃度５０mM）とを充填し、トリエチルアミン（２００μl，１．４４mmol，１０当量）を透明な溶液に加えつつ、室温で撹拌した。Ｎ，Ｎ’−ジスクシンイミジルカーボネート（１８４．０mg，０．７１９mmol）を一度に加え、透明な溶液を室温で４４時間撹拌した。溶液を酢酸エチル（２０ml）で希釈し、炭酸水素ナトリウム飽和水溶液（１０ml）で洗浄し、相を分離した。ついで、水相を酢酸エチル（２×１０ml）で逆抽出し、有機相を合わせ、（ＭｇＳＯ4で）乾燥し、得られた油状物をフラッシュクロマトグラフィ（ヘキサン：酢酸エチル１：１〜１：２）に付すと、透明な無色の油状物（８９．０mg，０．０８８mmol，６１％）として所望の混合カーボネートを与えた。
ＦＫ５０６混合カーボネートの二量化（７〜８）
乾燥した１mlのコニカルガラスビーカー（Kontes Scientific Glassware）に、混合カーボネート（１５．０mg，０．０１４８mmol）とジクロロメタン（５００μl，最終濃度３０mM）とを充填した。トリエチルアミン（９μl，０．０６７mmol，１０当量）を加えつつ、溶液を室温で撹拌し、続いて、ｐ−キシリーレンジアミン（０．８mg，０．００５９mmol）を加えた。反応物を２０℃で１６時間撹拌し、ジクロロメタン（５ml）で希釈することによってクエンチした。炭酸水素ナトリウム飽和水溶液（５ml）で溶液を洗浄した。相を分離し、水層をジクロロメタン（２×５ml）で逆抽出した。有機相を合わせ、（ＭｇＳＯ4で）乾燥し、濃縮し、フラッシュクロマトグラフィ（ヘキサン：酢酸エチル１：１〜１：２）に付すと、透明な無色の油状物（７．４mg，３．８μmol，６５％）として、所望のダイマーを与えた。
上記処理法に従い、キシリーレンジアミンの代わりに、その他のモノアミン類、ジアミン類またはトリアミン類、例えば、ベンジルアミン（１５）、オクチレンジアミン、デカメチレンジアミン（１６）、ビス−ｐ−ジベンジルアミン、Ｎ−メチルジエチレンアミン、トリス−アミノエチルアミン（１７）、トリス−アミノプロピルアミン、１，３，５−トリアミノメチルシクロヘキサン等を使用することができる。
実施例  １１  ＦＫ５０６（１〜９）の酸化開裂および還元
Kellyの処理方法［VanRheenen et al., Tetrahedron Lett. (1976) 17, 1973-1976］に従い、オスミレーション（osmylation）を行った。Danishefskyの処理方法［Zell, et al., J. Org. Chem. (1986) 51, 5032-5036］に従い、開裂を行った。Krishnamurthyの処理方法［J. Org. Chem., (1981) 46, 4628-4691］に従い、アルデヒド還元を行った。１０mlのフラスコに、２４，３２−ビス［（ｔ−ブチルジメチルシリル）］オキシ］−ＦＫ５０６（８４．４mg，０．０８２mmol）、４−メチルモルホリンＮ−オキシド（４８mg，０．４１mmol，５当量）およびＴＨＦ（２．０ml，最終濃度４１mM）を充填した。オスミウムテトラオキシド（４５μl，０．００８mmol，０．１当量）をシリンジを介して加えた。透明な無色の溶液を室温で５時間撹拌した。ついで、反応物を５０％水性メタノール（１．０ml）で希釈し、過ヨウ素酸ナトリウムを一度に加えた。曇った混合物を室温で４０分間撹拌し、エーテル（１０ml）で希釈し、炭酸水素ナトリウム飽和水溶液（５ml）で洗浄した。相を分離し、水層をエーテル（２×５ml）で逆抽出した。合わせた有機層は、（ＭｇＳＯ4で）乾燥し、固体のナトリウムサルファイト（５０mg）で処理した。ついで、有機相を濾過し、濃縮し、油状物をフラッシュクロマトグラフィ（ヘキサン：酢酸エチル３：１〜２：１）に付すと、透明な無色の油状物として、中間体の不安定なアルデヒド（５３．６mg）を与えた。このアルデヒドを直ちにＴＨＦ（４．０ml）に溶解し、窒素雰囲気下、−７８℃に冷却し、リチウムトリス［（３−エチル−３−ペンチル）オキシ］アルミニウムハイドライド（０．６０ml，０．０８２mmol，０．１４MＴＨＦ溶液，１．０当量）で処理した。透明な溶液は、−７８℃で１０分間撹拌し、ついで、エーテル（４ml）で希釈し、塩化アンモニウム飽和水溶液を加えることによってクエンチした。混合物を室温まで暖め、溶液を乾燥するために、固体の硫酸ナトリウムを加えた。ついで、混合物を濾過し、濃縮し、得られた油状物をフラッシュクロマトグラフィ（ヘキサン：酢酸エチル２：１）に付すと、透明な無色の油状物（３９．５mg，０．０３８mmol，４７％）として、所望のアルコールを与えた。
混合カーボネート類の製造（９〜１０）
混合カーボネートの製造は、Ghosh,Tetrahedron Lett. (1992) 33, 2781-2784の方法によって達成された。１０mlのフラスコに、第１級アルコール（３８．２mg，０．０３６９mmol）とアセトニトリル（２．０ml，最終濃度１０mM）とを充填し、２，６−ルチジン（４３μl，０．３７mmol，１０当量）を加えつつ、室温で撹拌した。Ｎ，Ｎ’−ジスクシンイミジルカーボネート（４８mg，０．１８mmol）を一度に加え、溶液を室温で２４時間撹拌した。反応混合物をエーテル（１０ml）で希釈し、炭酸水素ナトリウム飽和水溶液（１０ml）で洗浄した。相を分離し、水層をエーテル（２×１０ml）で逆抽出した。有機相を合わせ、（ＭｇＳＯ4で）乾燥し、濃縮し、フラッシュクロマトグラフィ（ヘキサン：酢酸エチル２：１〜１：１）に付した。所望の混合カーボネートが、透明な無色の油状物（３２．６mg，０．０２８mmol，７５％）として単離された。
ベンジルカルバメートの製造（１０〜１１）
乾燥した１mlのコニカルガラスビーカー（Kontes Scientific Glassware）に、混合カーボネート１０（８．７mg，０．００７４mmol）とアセトニトリル（５００μl，最終濃度１５mM）とを充填した。トリエチルアミン（１０μl，０．０７４mmol，１０当量）を加えつつ、溶液を室温で撹拌し、続いて、ベンジルアミン（１．６μl，０．０１５mmol，２当量）を加えた。反応物を室温で４時間撹拌した。乾燥窒素流で溶剤を除去し、油状物を直接フラッシュクロマトグラフィ（ヘキサン：酢酸エチル３：１〜２：１）に付すと、透明な無色の油状物（６．２mg，５．３μmol，７２％）として、所望の保護されたモノマーを与えた。
回転翼を取り付けた１．５mlポリプロピレンチューブに、保護されたモノマー（０．２mg，５．３μmol）を入れた。アセトニトリル（０．５ml，最終濃度１１mM）を加え、ＨＦ（５５μl，４８％水溶液；Fisher，最終濃度３．０N）を加えつつ、溶液を室温で撹拌した。溶液を室温で１８時間撹拌した。ついで、１５ml試験管中、ジクロロメタンと炭酸水素ナトリウム飽和水溶液との間で、脱保護されたＦＫ５０６誘導体を分配させた。試験管に激しい渦流を生じさせて両相を混合し、分離後、有機相をピペットで除去した。ジクロロメタン（４×２ml）で、水相を逆抽出し、合わせた有機相を（ＭｇＳＯ4で）乾燥し、濃縮し、フラッシュクロマトグラフィ（ヘキサン：酢酸エチル１：１〜０：１）に付すと、透明な無色の油状物（３．９mg，４．１μmol，７８％）として、所望の脱保護されたベンジルカルバメートを与えた。
ベンジルカルバメート（１３）をジアミン、例えば、キシリーレンジアミン（１２）、ヘキサメチレンジアミン、オクタメチレンジアミン、デカメチレンジアミン（１３）またはその他のジアミン類で置き換えることによって、本発明のダイマー化合物類が製造される。
実施例  １２  ＦＫ５０６の混合カーボネート（１２）の製造
１０mlのフラスコに、２４，３２−ビス［（ｔ−ブチルジメチルシリル）］オキシ］−ＦＫ５０６（３３９．５mg，０．３２９mmol）、４−メチルモルホリンＮ−オキシド（１９３mg，１．６４mmol，５当量）、水（０．２０ml）およびＴＨＦ（８．０ml，最終濃度４１mN）を充填した。オスミウムテトラオキシド（０．１８３ml，０．０３３mmol，０．１当量，０．１８M水溶液）をシリンジを介して加えた。透明な無色の溶液を室温で４．５時間撹拌した。反応物を５０％水性メタノール（４．０ml）で希釈し、過ヨウ素酸ナトリウム（７００mg，３．２９mmol，１０当量）を一度に加えた。曇った混合物を室温で２５分間撹拌し、エーテル（２０ml）で希釈し、炭酸水素ナトリウム飽和水溶液（１０ml）で洗浄した。相を分離し、水層をエーテル（２×１０ml）で逆抽出した。合わせた有機相は、ＭｇＳＯ4および固体のナトリウムサルファイト（５０mg）上で乾燥させた。ついで、有機相を濾過し、濃縮し、得られたアルデヒドを直ちにＴＨＦ（８．０ml）に溶解し、窒素雰囲気下で、−７８℃に冷却し、リチウムトリス［（３−エチル−３−ペンチル）オキシ］アルミニウムハイドライド（２．３５ml，０．３２９mmol，ＴＨＦの０．１４M溶液，１．０当量）で処理した。透明な溶液は、−７８℃で６０分間撹拌し（ＴＬＣによって綿密にモニターした）、ついで、エーテル（５ml）で希釈し、塩化アンモニウム飽和水溶液（０．３ml）を加えることによってクエンチした。混合物を室温まで暖め、溶液を乾燥するために、固体の硫酸ナトリウムを加えた。混合物を２０分間撹拌し、濾過し、濃縮し、得られた油状物を直ちにアセトニトリル（１０ml）に溶解した。得られた第１級アルコールのＣＨ3ＣＮ溶液に、２，６−ルチジン（０．３８０ml，３．３mmol，１０当量）とＮ，Ｎ’−ジスクシンイミジルカーボネート（４２０mg，１．６５mmol，５当量）とを加えた。不均一な混合物を室温で１９時間撹拌し、その時点で、溶液をエーテル（３０ml）で希釈し、炭酸水素ナトリウム飽和水溶液（２０ml）で洗浄した。水相をエーテル（２×１０ml）で逆抽出した。有機相を合わせ、（ＭｇＳＯ4で）乾燥し、濃縮し、フラッシュクロマトグラフィ（ヘキサン：酢酸エチル３：１〜２：１〜１：１）に付した。所望される混合カーボネート１２は、透明な無色の油状物（２１７mg，０．１８４mmol，４工程を通して５６％）として単離された。
実施例  １３  ２４，２４’，３２，３２’−テトラキス［（ｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ］−ＦＫ１０１２−Ａ（ｐ−キシリーレンジアミン架橋）の製造
乾燥した１mlのコニカルガラスビーカーに、混合カーボネート（２３．９mg，０．０２３mmol）とアセトニトリル（５００μl，最終濃度４１mM）とを充填した。トリエチルアミン（２８μl，０．２０mmol，１０当量）を加え、続いて、ｐ−キシリーレンジアミン（４６μl，０．０１０１mmol，０．２２MＤＭＦ溶液）を加えた。反応物を室温で１８時間撹拌し、乾燥窒素流で溶剤を除去し、油状物を直接フラッシュクロマトグラフィ（ヘキサン：酢酸エチル３：１〜２：１〜１：１）に付すと、透明な無色の油状物（１１．９mg、５．３μmol，５２％）として、所望の保護されたダイマーを与えた。
実施例  １４  ＦＫ１０１２−Ａ（ｐ−キシリーレンジアミン架橋）（１３）の製造
回転翼を取り付けた１．５mlポリプロピレンチューブに、保護されたダイマー（１１．０mg，４．９μmol）を入れた。アセトニトリル（０．５０ml，最終濃度１０mM）を加え、ＨＦ（５５μl，４８％水溶液；Fisher，最終濃度３．０N）を加えつつ、溶液を２０℃で撹拌した。溶液を室温で１６時間撹拌した。ついで、１５ml試験管中、ジクロロメタンと炭酸水素ナトリウム飽和水溶液との間で、脱保護されたＦＫ５０６誘導体を分配させた。試験管に激しい渦流を生じさせて相を混合し、分離後、有機相をピペットで除去した。ジクロロメタン（４×２ml）で、水相を逆抽出し、合わせた有機相を（ＭｇＳＯ4で）乾燥し、濃縮し、フラッシュクロマトグラフィ（ヘキサン／ＴＨＦ／エーテル：１：１：１〜ＴＨＦ／エーテル１：１）に付すと、透明な無色の油状物（５．５mg，３．０μmol，６３％）として、ＦＫ１０１２−Ａを与えた。
実施例  １５  ２４，２４’，３２，３２’−テトラキス［（ｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ］−ＦＫ１０１２−Ｂ（ジアミノデカン架橋）の製造
乾燥した１mlのコニカルガラスビーカーに、混合カーボネート（５３．３mg，０．０４５３mmol）とアセトニトリル（２．０ml，最終濃度１１mM）とを充填した。トリエチルアミン（１６μl，０．１１mmol，５当量）を加え、続いて、ジアミノデカン（６１μl，０．０２２６mmol，０．３７MＤＭＦ溶液）を加えた。反応物を室温で１２時間撹拌し、乾燥窒素流で溶剤を除去し、油状物を直接フラッシュクロマトグラフィ（ヘキサン：酢酸エチル３：１〜２：１〜１：１）に付すと、透明な無色の油状物（１８．０mg，７．８μmol，３５％）として、所望の保護されたダイマーを与えた。
実施例  １６  ＦＫ１０１２−Ｂ（ジアミノデカン−１，１０架橋）（１４）の製造
撹拌翼を取り付けた１．５mlポリプロピレンチューブに、保護されたダイマー（１８．０mg，７．８μmol）を入れた。アセトニトリル（０．４５ml，最終濃度１６mM）を加え、ＨＦ（５５μl，４８％水溶液；Fisher，最終濃度３．６N）を加えつつ、溶液を２０℃で撹拌した。溶液を２３℃で１７時間撹拌した。ついで、１５ml試験管中、ジクロロメタンと炭酸水素ナトリウム飽和水溶液との間で、生成物ＦＫ１０１２−Ｂを分配させた。試験管に激しい渦流を生じさせて相を混合し、分離後、有機相をピペットで除去した。ジクロロメタン（４×２ml）で、水相を逆抽出し、合わせた有機相を（ＭｇＳＯ4で）乾燥し、濃縮し、フラッシュクロマトグラフィ（１００％酢酸エチル〜酢酸エチル／メタノール２０：１）に付すと、透明な無色の油状物（５．３mg，２．９μmol，３７％）として、ＦＫ１０１２−Ｂを与えた。
実施例  １７  ２４，２４’，３２，３２’−テトラキス［（ｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ］ＦＫ１０１２−Ｃ（ヒス−ｐ−アミノメチルベンゾイルジアミノデカン架橋）の製造
乾燥した２５mlテイア形（tear-shaped）フラスコに、ジアミンリンカー（１５．１mg，０．０３４４mmol）とＤＭＦ１．０mlとを充填した。別のフラスコで、混合カーボネートとトリエチルアミン（０．１００ml，０．７００mmol，２０当量）とをジクロロメタン２．０mlに溶解し、ついで、緩やかに（４×０．５０ml）、ヒス−ｐ−アミノメチルベンゾイルジアミノデカン−１，１０の撹拌溶液に加えた。混合カーボネート１２を入れたフラスコをジクロロメタン（２×０．５０ml）で洗浄し、混合カーボネート１２を完全に移した。反応物を２３℃で１６時間撹拌し、乾燥窒素流で溶剤を除去し、油状物を直接フラッシュクロマトグラフィ（ヘキサン／酢酸エチル１：１〜１：２）に付すと、透明な無色の油状物（２９．６mg，１１．５μmol，３４％）として、所望の保護されたダイマーを与えた。
実施例  １８  ＦＫ１０１２−Ｃ（１５）の製造
撹拌翼を取り付けた１．５mlポリプロピレンチューブに、保護されたダイマー（２９．６mg，１１．５μmol）（１７）を入れた。アセトニトリル（０．４５ml，最終濃度２３mM）を加え、ＨＦ（５５μl，４８％水溶液；Fisher，最終濃度３．６N）を加えつつ、溶液を室温で撹拌した。溶液を室温で１７時間撹拌した。ついで、１５ml試験管中、ジクロロメタンと炭酸水素ナトリウム飽和水溶液との間で、所望される対称なダイマーを分配させた。試験管に激しい渦流を生じさせて相を混合し、分離後、有機相をピペットで除去した。ジクロロメタン（４×２ml）で、水相を逆抽出し、合わせた有機相を（ＭｇＳＯ4で）乾燥し、濃縮し、フラッシュクロマトグラフィ（１００％酢酸エチル〜酢酸エチル／メタノール１５：１）に付すと、透明な無色の油状物（１１．５mg，５．５μmol，４７％）として、ＦＫ１０１２−Ｃを与えた。
ＣｓＡ誘導体の製造
実施例  １９  ＭｅＢｍｔ（ＯＡｃ）・・ＯＨ1ＣｓＡ（２）
ＭｅＢｍｔ（ＯＡｃ）・・ＯＡｃ1・ＣｓＡ（１）（１６１mg，１２４mmol）［Eberle and Nuninger, J. Org. Chem. (1992) 57, 2689参照。］をメタノール（１０ml）に溶解した。ＫＯＨ（１９６mg）を水（８ml）に溶解した。ＫＯＨ溶液２９７ml（０．１３０mmol，１．０５当量）を（１）のＭｅＯＨ溶液に加えた。この新たな溶液を不活性雰囲気下室温で４時間撹拌し、その時点で、反応を酢酸（２ml）でクエンチした。５cm×２５cm，１２μ，１００Ａ．Ｃ１８カラムを用い、０．１％（v/v）トリフルオロ酢酸を含有する７０％アセトニトリル／Ｈ2Ｏで溶離する逆相ＨＰＬＣによって反応混合物を精製すると、所望のモノアセテート（２）１１２mg（７２％）を与えた。
ＭｅＢｍｔ（ＯＡｃ）・・（ＯＣＯＩｍ1ＣｓＡ（３）
ＭｅＢｍｔ（ＯＡｃ）・・ＯＨ1ＣｓＡ（２）（５７mg，４５．５μmol）とカルボニルジイミダゾール（１５mg，２当量，９１μmol）とを５０ml丸底フラスコに移し、乾燥ＴＨＦ（６ml）に溶解した。ジイソプロピルエチルアミン（３２μl，４当量，１８２μmol）を加え、ついで、ロータリーエバポレータで、溶剤を室温で除去した。酢酸エチルを溶離液として用いるシリカゲル上、フラッシュクロマトグラフィによって残渣を精製すると、所望のカルバメート（３）４５mg（７３％）を与えた。
トリス（２−アミノエチル）アミンＣｓＡトリマートリアセテート（６）
ＭｅＢｍｔ（ＯＡｃ）・・ＯＣＯｌｍ1ＣｓＡ（３）（７．５mg，５．５４μmol，３．１当量）をＴＨＦ（１００μl）に溶解した。ジイソプロピルエチルアミン（６２μl，５当量，アミン１００μlをＴＨＦ４mlに含有する溶液８．９３μmol）を加え、続いて、トリス（２−アミノエチル）アミン（２６μl，１．７９μmol，トリスアミン１０１mgを１０mlＴＨＦに含有する溶液１当量）を加えた。この溶液をＮ2雰囲気下５日間撹拌した。反応混合物を蒸発させ、ついで、０〜５％メタノールクロロホルムを用いるシリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィにより精製すると、所望の生成物（６）４．１mgを与えた。
実施例  ２０  ジアミノデカンＣｓＡダイマー（８）
固体のＮａ金属（２００mg，過剰）を乾燥メタノール（１０ml）と０℃で反応させた。ジアミノデカンＣｓＡダイマージアセテート（５）（４．０mg）をＭｅＯＨ（５ml）に溶解させた。ＮａＯＭｅ溶液２．５mlを（５）の溶液に加えた。不活性雰囲気下室温で撹拌２．５時間後、酢酸（２ml）で溶液をクエンチし、５mm×２５mm，１２μ，１００Ａ．Ｃ１８カラムを用い、０．１％（v/v）トリフルオロ酢酸を含有する７０〜９５％アセトニトリル／Ｈ2Ｏで２０分間かけて溶離する逆相ＨＰＬＣによって反応生成物を精製すると、所望のジオール２．５mg（６０％）を与えた。
トリス（２−アミノエチル）アミンを０．４５当量の１，１０−ジアミノデカンで置き換えることによって、ジアミノデカンＣｓＡジアセテート（５）を製造した。
実施例  ２１  ｐ−キシリーレンジアミンＣｓＡダイマー（４）
トリス（２−アミノエチル）アミンを０．４５当量のｐ−キシリーレンジアミンで置き換えることによって、ｐ−キシリーレンジアミンＣｓＡダイマー（４）を製造した。
文献に記載された処理方法に従い、１（ＭｅＢｍｔ１）部位以外の部位をリンカーすることによって、シクロフィリンのその他の誘導体を製造した。
位置８Ｄ異性体類縁体は、生成有機体にＤ−アミノ類縁体を供給して特にその部位に組み込むことによって製造される。Patchett, et al., J. Antibiotics (1992) 45, 943(β-MeSO)D-Ala8-CsA): Traber, et al., ibid, (1989) 42, 591参照。位置３の類縁体は、特にＳａｃ３の炭素部位でのＣｓＡのポリリチエーション／アルキレーションによって製造される。（シクロフィリン結合および活性プロフィル、特に、D-MePhe3-CsAに対しては）Wenger, Transplant Proceeeding (1986) 18, 213, supp.5；および、（誘導体の製造に対しては）1987年10月27日に発行されたSeebachの米国特許No. 4,703,033参照。
シクロスポリンＡの代わりに、上記処理方法に従うと、ＣｓＡのその他天然産の変種を本発明での使用のために多量化（multimerized）することができる。
実施例  ２２  （Ａ）ＦＫ１０１２“バンプ（Bump）”化合物およびＦＫＢＰ１２類の代償性突然変異（Compensatory Mutations）による構造基体のデザインおよび合成
ＦＫ５０６のＣ９およびＣ１０における置換基は、合成によってもアクセスすることができ、合成によってアクセスされているが、異なる一連のＦＫＢＰ１２側鎖残基と相反する。かくして、このようなリガンドに対する突然変異によって生じるレセプターの一つの類は、異なる修飾基を含有し、あるものは、Ｃ１０置換基に対する代償穴を形成し、また、あるものは、Ｃ９置換基に対する代償穴を形成する。炭素１０は、選択的に修飾され、（ＦＫ５０６でのヒドロキシル基に対して）炭素から突出するＮ−アセチルまたはＮ−ホルミル基を有する。これら誘導体の結合性は、これらＣ１０バンプが固有のＦＫＢＰ１２に対する結合を有効に失うことを明瞭に現す。図２３は、追加のＣ９バンプを含有するＦＫ５０６−タイプ部分の合成のためのスキームを示す。このようなリガンドを本発明のリンカー部分と結合させることによって、代償性突然変異を有する対応結合領域を含有するキメラ蛋白質に対するＨＥＤおよびＨＯＤ（ならびに拮抗剤）を構成することができる。Ｃ９およびＣ１０に修飾基を含有するＨＥＤ試薬の例を図２３に示す。
かくして、本発明は、Ｃ９およびＣ１０のいずれか、もしくは、両方に、−ＯＲ、−Ｒ、−（ＣＯ）ＯＲ、−ＮＨ（ＣＯ）Ｈまたは−ＮＨ（ＣＯ）Ｒ［式中、Ｒは、直鎖、分岐または環式であってもよい、置換もしくは非置換パーオキシド類およびカーボネート類を含む、置換または非置換アルキルまたはアリールアルキルである。］を含む官能基を含有するＦＫ−５０６−タイプ部分を含む一つの類のＦＫ−５０６−タイプの化合物を包含する。“ＦＫ５０６−タイプ部分”としては、ＦＫ−５０６の環構造の少なくとも（置換もしくは非置換）Ｃ２〜Ｃ１５部分を保持し、天然または修飾ＦＫＢＰと結合することができ、好ましくは、約１０-6以下のＫｄ値を有する、（ラパマイシンをも含む）ＦＫ５０６、ＦＫ５２０、および、合成もしくは天然産の変種、類縁体およびその誘導体が挙げられる。
本発明は、さらに、本発明のリンカー部分に共有結合した、このような一以上のＦＫ−５０６−タイプの化合物を含有するホモダイマーおよびヘテロダイマーならびにそれより高次のオリゴマー類を包含する。これらＦＫ−５０６−タイプの化合物のモノマー類も、また、リンカー部分に共有結合されていてもいなくとも重要であり、あるいは、対応するＦＫＢＰに対するそれらの結合親和性が失われないように修飾されていてもいなくとも重要である。このようなモノマー化合物は、オリゴマー化拮抗試薬、すなわち、類似のＦＫ−５０６−タイプ化合物に基づくオリゴマー化試薬に対する拮抗剤として使用することができる。好ましくは、本発明に従うこれらを含む化合物およびオリゴマー類は、ＦＫＢＰ１２に対するＦＫ５０６の親和性よりも少なくとも０．１％、好ましくは、少なくとも約１％、さらに好ましくは、少なくとも約１０％大きい親和性を有する、天然、または、好ましくは、突然変異によって生ずる、ＦＫＢＰ類と結合する。例えば、以下のHolt et al.参照。
本発明のこれらおよびその他のリガンドに対するレセプター領域は、構造基体、部位指向またはランダム突然変異法によって得ることができる。我々は、Ｃ９および／またはＣ１０に修飾基を含有するＦＫ５０６−タイプおよびＦＫ−５２０−タイプのリガンドに対するレセプター領域として、一以上のＴｙｒ２６、Ｐｈｅ３６、Ａｓｐ３７、Ｔｙｒ８２およびＰｈｅ９９の代わりに、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｍｅｔまたはその他の小さなアミノ酸を含有するＦＫＢＰ１２部分の系統を考えている。
部位指向突然変異は、メガプライマー突然変異プロトコールを用いて行うことができる［例えば、Sakar and Sommer, Bio Techniques 84 (1990) : 404-407参照］。cＤＮＡシーケンスは、シーケナーゼキットで行われる。突然変異を生ずるＦＫＢＰ１２類の発現は、多くのＦＫＢＰ突然変異体がE. Coli菌株ＸＡ９０で発現されているので、E.Coli菌株ＸＡ９０中のプラスミド（plasmid）ｐＨＮ１+で行うことができる。突然変異を生ずる蛋白質は、便宜上、ＤＥ５２アニオン交換樹脂上で分画によって精製され、続いて、他の箇所で記載したように、セファロース上のサイズ排除によって精製される。例えば、Aldape et al, J. Biol. Chem 267 23 (1992) : 16029-32およびPark et al., J. Biol Chem 267 5 (1992) : 3316-3324参照。結合定数は、二つの方法のうちの一つによって、容易に決定することができる。突然変異を生ずるＦＫＢＰ類が十分なロータマーゼ（rotamase）活性を維持する場合には、標準ロータマーゼ分析法を利用することができる。例えば、Galat et al, Biochemistry 31 (1992) : 2427-2434参照。これとは別に、突然変異を生ずるＦＫＢＰ１２類は、我々が先にＦＫＢＰ類およびシクロフィリン類で使用した、ＬＨ２０樹脂と放射性標識したＴ２−ジヒドロＦＫ５０６およびＴ２−ジヒドロＣｓＡとを用いる結合分析法に付すことができる。Bierer et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87 4 (1993) : 555-69。
（Ｂ）  酵母の２−ハイブリッドシステムを用いるバンプ−ＦＫ５０６類に対するＦＫＢＰ１２中での代償性突然変異の選択
ＦＫＢＰ１２を含めて、レセプター蛋白質またはレセプター領域を得るための一つのアプローチは、強力な酵母の“２−ハイブリッド”または“相互作用トラップ”システムである。２−ハイブリッドシステムは、相互に相互作用する蛋白質を検出するために使用されている。転写活性領域に融合されたターゲット蛋白質からなる“ベイト（bait）”融合蛋白質は、ＤＮＡ結合領域に融合された強力な“フック（hooks）”のcＤＮＡライブラリーで共同発現される（co-expressed）。蛋白質−蛋白質（ベイト−フック）相互作用は、その合成がＤＮＡ結合の合体と活性領域とを必要とする、レポータージーン生成物の発現によって検出される。ここでいう酵母の２−ハイブリッドシステムは、本来、Elledgeと共同研究者によって開発された。Durfee et al, Genes & Development 74 (1993): 555-69およびHarper et al, Cell 75 4 (1993);805-816。
２−ハイブリッドシステムそれ自体は、小さな分子、有機リガンドを含むレセプター−リガンド相互作用に洞察を与えることができないので、我々は、（以下に記載する）新しいＦＫ１０１２誘発可能な転写活性システムを開発した。このシステムを用いると、小さな分子（例えば、本発明のＦＫ５０６類もしくはＦＫ１０１２類またはＦＫ５０６−タイプの分子）を調べることができるように、２−ハイブリッドシステムを拡張することができる。最初に、ＦＫ５０６のＣ９およびＣ１０を取り囲む部位に局所的に局在させた突然変異体で突然変異を生ずるＦＫＢＰ類（フック）のcＤＮＡライブラリーを発生させる。ベイトに対しては、二つの異なる方法を追及することができる。第１の方法は、ＦＫ５０６がＦＫＢＰ１２と結合し、カルシニューリンと結合する複合表面を形成する能力を使用する。かくして、シーケンス特異転写活性剤は、ＤＮＡ結合領域−突然変異体ＦＫＢＰ１２…バンプ−ＦＫ５０６…カルシニューリンＡ−活性化領域（ここで、…は、非共有結合相互作用を表す。）を構成する。第２の方法は、ＦＫ１０１２類が二つのＦＫＢＰに同時に結合することのできる能力を使用する。ＦＫ１０１２のＨＥＤバージョンは、以下のアンサンブルに対してスクリーニングするために使用される。ＤＮＡ−結合領域−突然変異体ＦＫＢＰ１２…バンプ−ＦＫ５０６−正常なＦＫ５０６…ワイルドタイプのＦＫＢＰ−活性化領域。
１．  ベイトとしてのカルシニューリンＧａ１４活性化領域融合
Ｇａ１４活性化領域とカルシニューリンＡサブユニット融合構造とを含有するｐＳＥ１１０７の誘導体を構成した。提案された様式でベイトとして機能するその能力は、カルシニューリンのＦＫＢＰ−ＦＫ５０６結合部位をマップ（map out）するための２−ハイブリッドシステムを用いる研究によって立証された。
２．  ベイトとしてのhＦＫＢＰ１２−Ｇａ１４活性化領域融合：
hＦＫＢＰ１２cＤＮＡは、開放読み取りフレーム（open reading frame）全体をカバーするＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントとして削除され、平滑末端化され、平滑末端化されたｐＳＥ１１０７のＸｈｏＩ部位に連結されて、全長にわたるhＦＫＢＰ−Ｇａ１４活性化領域蛋白質融合を生ずる。
３．  突然変異体hＦＫＢＰ１２cＤＮＡライブラリー
hＦＫＢＰ１２は、ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩとで消化され、平滑化され、ＮＣｏｌで切断され、平滑化されたpＡＳ１（Durfee et al. supra）にクローン化することができる。このプラスミドは、さらに、ＮｄｅＩで消化されて、ｐＡＳ１のポリリンカーシーケンスのＮｄｅＩ部位とhＦＫＢＰ１２の５’末端との間でＮｄｅＩフラグメントを脱離し、再度連結される。これは、hＦＫＢＰ１２−Ｇａ１４ＤＮＡ結合領域蛋白質融合を生ずる。hＦＫＢＰは、プライマー＃１１２０６および＃１１２１０で再度増幅された。プライマーの表：
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プライマーの表：  代償性突然変異をスクリーニングするのに使用される局所的に局在化したhＦＫＢＰ１２cＤＮＡライブラリーの構成に使用されるプライマー
ついで、ポリメラーゼ連鎖反応によって限られた位置にランダム化されたhＦＫＢＰの突然変異体シーケンスを含有する以下に掲示したプライマーを用いて、突然変異体hＦＫＢＰ１２cＤＮＡフラグメントを製造し、Ｇａ１４ＤＮＡ結合領域−hＦＫＢＰ（ＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩ）構造に挿入した。
４．  酵母菌株
S, cerevisiae Y153は、ゲノムに結合された二つの選択可能な標識ジーン（ｈｉｓ３／β−ガルクトシダーゼ）を担持し、Ｇａ１４プロモータによって駆動される（Durfee, supra）。
ベイトとしてのカルシニューリン−Ｇａ１４活性化領域の使用
ＦＫＢＰ１２−ＦＫ５０６錯体は、高い親和性で、カルシニューリンタイプ２Ｂ蛋白質ホスファターゼに結合する。我々は、２−ハイブリッドシステムで架橋として機能させるためにＣ９−またはＣ１０−バンプリガンドを使用するので、代償性突然変異を含有するcＤＮＡライブラリーよりのこれらＦＫＢＰ類のみが転写活性化剤を生成する。便宜上、各々、８，０００個の突然変異体ＦＫＢＰ１２類を含有する（プライマー表のプライマー１１２０７〜１１２０９を用いて）、少なくとも３種の異なるライブラリーを製造することができる。ＦＫＢＰ１２−ＦＫ５０６構造を点検することによって、ランダム化された部位が選択され、これは、その突然変異がバンプされたＦＫ５０６類上のＣ９またはＣ１０置換基に逆らって結合することを可能とする残基のクラスターを示唆する。ついで、ライブラリーは、Ｃ９−およびＣ１０−バンプＦＫ５０６類を用いて、個々に、スクリーニングされる。バンプ−ＦＫ５０６と代償性hＦＫＢＰ１２突然変異体との間の相互作用は、ホスト酵母のｈｉｓドロップアウト培地上で成長する能力とβ−ガラクトシダーゼジーンの発現とによって検出することができる。この選択は、バンプＦＫ５０６の存在に依存し、虚偽の陽性は、バンプＦＫ５０６リガンドを満たすか、満たさないレプリカプレートで消去スクリーニングすることによって除くことができる。
ベイトとしてのhＦＫＢＰ１２−Ｇａ１４活性化領域の使用
hＦＫＢＰ１２突然変異を生ずるcＤＮＡライブラリーをスクリーニングするためにカルシニューリンＡ−Ｇａ１４活性化領域を使用することは、ＦＫＢＰ１２上の代償性突然変異を同定する簡単な方法である。しかし、バンプＦＫ５０６類をhＦＫＢＰ１２と結合可能とする突然変異は、突然変異体ＦＫＢＰ１２…バンプＦＫ５０６錯体とカルシニューリンとの間の相互作用を妨げる。ベイトとしてカルシニューリンを用いる最初のスクリーニングが失敗した場合、ワイルドタイプのhＦＫＢＰ１２−Ｇａ１４活性化領域が、代わりに、使用される。固有のＦＫ５０６−バンプＦＫ５０６（図１６）からなるＦＫ１０１２ＨＥＤ試薬が合成され、フックとして使用することが可能である。ＦＫ１０１２のＦＫ５０６部分は、ＦＫＢＰ１２−Ｇａ１４活性化領域と結合することができる。ＦＫ１０１２のバンプＦＫ５０６部分とＦＫＢＰ１２の代償性突然変異体との間の相互作用は、ホスト酵母をｈｉｓドロップアウト培地上で成長可能とし、β−ガラクトシダーゼを発現する。このように、選択は、hＦＫＢＰ１２突然変異体のバンプＦＫ５０６と相互作用する能力にのみ基づく。虚偽の陽性を除くために、同様の消去スクリーニング法を使用することができる。
バンプ−ＦＫ５０６類の代償性hＦＫＢＰ１２突然変異体に対する結合親和性を決定するために、先に検討したインビトロの結合分析法以外に、インビボ分析法を使用することができる。酵母の２−ハイブリッドシステムにおいて、β−gal活性は、“ベイト（bait）”と“プレイ（prey）”との間の相互作用の度合いによって決定される。かくして、バンプＦＫ５０６と代償性ＦＫＢＰ１２突然変異体との間の親和性は、異なるＨＥＤ（固有のＦＫ５０６−バンプＦＫ５０６）濃度でホスト酵母によって生成される対応するβ−ガラクトシダーゼ活性によって評価することができる。
同様の方法を用いると、原型として低親和性代償性ＦＫＢＰ１２突然変異体を有する他のバンプ接触残基中に、さらにランダム化された突然変異を生ずるＦＫＢＰ１２cＤＮＡライブラリーを生成し、同様にスクリーニングすることができる。
高親和性代償性ＦＫＢＰ突然変異に対するファージデイスプレイスクリーニング
バンプＦＫ５０６に対するある種の高親和性hＦＫＢＰ１２突然変異体は、別個の蛋白質領域で数個の組み合わせ点突然変異を含有する。適当な組み合わせ突然変異を含有するライブラリーの寸法は、酵母の２−ハイブリッドシステムの容量に対しては大きすぎる（例えば、＞１０8突然変異）。全ての機能官能性蛋白質を暴露するためのビヒクルとしてのバクテリオファージの使用は、大多数の突然変異をスクリーニングする能力を著しく増大させる。例えば、Bass et al., Proteins: Structure, Function & Genetics 8 4 (1990):309-14; McCaffery et al., Nature 348 6301(1990): 552-4；および、Hoogenboom, Nucl Acid Res 19 15 (1991): 4133-7参照。所望の高親和性代償性突然変異体が酵母の２−ハイブリッドシステムで同定できない場合には、大多数の組み合わせ突然変異は、キャリヤーとしてのファージベクトルを有するhＦＫＢＰ１２上に形成することができる。突然変異を生ずるhＦＫＢＰ１２融合ファージは、親和性マトリックスとしてのバンプＦＫ５０６−セファロースでスクリーニングすることができ、これは、我々の独特のＦＫ５０６−基体親和性マトリックスに類似した方法で合成することができる。Fretz et al., J. Am. Chem. Soc. 113 4 (1991) : 1409-1411。結合およびファージ増幅を繰り返し行うと、高親和性の代償性突然変異体を同定することができる。
（Ｃ）  “バンプ（bumped）（ＣｓＡ）２類”の合成：ＭｅＶａｌ（１１）ＣｓＡの修飾
上記詳細に記載したように、我々は、二量化領域としてのシクロフィリンの使用および細胞死信号伝達路のコンテキスト中でのＨＯＤ試薬としての（ＣｓＡ）２の使用の実現を示した。しかし、（ＣｓＡ）２試薬の細胞活性をさらに最適化するために、ＦＫ１０１２類で記載したのと類似の方法に従うのがよい。かくして、特に、試薬がそのターゲットを識別できることが望ましい用途に、修飾された（バンプ）ＣｓＡ基体のオリゴマー化試薬を使用するのが好ましく、人工の蛋白質を内因性シクロフィリン類より構成する。
本発明の修飾ＣｓＡ誘導体の一つの類は、（ａ）ＮＭｅＶａｌ１１が、ＮＭｅＰｈｅ（置換もしくは非置換であってもよい）またはＮＭｅＴｈｒ（スレオニンβ−ヒドロキシル基が非置換もしくは置換であってもよい）で置換されているか、あるいは、（ｂ）ＮＭｅＶａｌ１１のpro−Ｓメチル基が、炭素原子少なくとも２個を有するか、好ましくは、３個以上を有する嵩高い基で置換されており、これは、直鎖、分岐であってもよく、および／または、環式部分を含有していてもよく、アルキル（エチル、もしくは、好ましくは、プロピル、ｔ−ブチル等のブチル）、アリール、または、アリールアルキルであってもよい、ＣｓＡ類縁体である。これらの化合物としては、ＭｅＶａｌ１１の代わりに、ＮＭｅＬｅｕ、ＮＭｅＩＩｅ、ＮＭｅＰｈｅ、または、特に、非天然産のＮＭｅ［β−ＭｅＰｈｅ］を含有するＣｓＡ類縁体が挙げられる。“（ｂ）”ＣｓＡ化合物は、式２：［式中、Ｒは、上記検討した官能基を表す。］の化合物である。
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本発明は、さらに、一以上のこのようなＣｓＡ類縁体を含有する、ホモダイマーおよびヘテロダイマーならびにそれより高次のオリゴマー類を包含する。好ましくは、本発明に従いこれらを含む化合物およびオリゴマー類は、天然、もしくは、好ましくは、突然変異体シクロフィリン蛋白質に、シクロフィリンに対するＣｓＡの親和性より少なくとも０．１％、好ましくは、少なくとも約１％、さらに好ましくは、少なくとも１０％大きい親和性で結合する。
ＣｓＡから出発して、修飾［ＭｅＶａｌ11］ＣｓＡ誘導体を製造するために、２工程法を使用することもできる。第１の工程では、残基ＭｅＶａｌ１１が、マクロサイクルから除かれる。第２の工程では、選択されたアミノ酸が、（前者の）ＭｅＶａｌ１１部位に導入され、鎖状のペプチドが環化される。この方法の利点は、全合成と比較して、数個の修飾［ＭｅＶａｌ11］ＣｓＡ誘導体に容易にアクセスすることができることである。合成スキームは、以下の通りである。
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アミド結合を識別するために、アミノ基とＭｅＢｍｔ１からのヒドロキシル基との間で、Ｎ，Ｏシフトを達成すると、ＩｓｏＣｓＡ［Ruegger et al., Helv. Chim. Acta. 59 4 (1976): 1075-91］を与えた（上記スキーム参照）。反応は、メタンスルホン酸の存在で、ＴＨＦ中で行った［Oliyai et al., Pharm Res 9 5 (1992) : 617-22］。ピリジンと無水酢酸とのワンポット処理法で、遊離のアミンをアセチル基で保護した。Ｎ−アセチル保護ＩｓｏＣｓＡの総収率は９０％である。ついで、エステルＭｅＢｍｔ１−ＭｅＶａｌ１１結合を、Ｎ−メチルアミド結合の存在中、例えば、ＤＩＢＡＬＨを用いて、選択的に還元する。ついで、得られるジオールをもう一つの酸誘導Ｎ，Ｏシフトで対応するジエステルに変換する。これは、新たに形成されたエステルの水性塩基による加水分解を通して除去するために、Ｎ−アセチル基とＭｅＶａｌ１１残基とを用意する。
遊離のアミノ基を保護した後、新たなアミノ酸残基を、例えば、ピブロップ（PyBrop）のカップリング剤で導入する。鎖状ペプチドのＤＭＡＰ［Alberg and Schreiber, Science 262 5131(1993):248-250］存在中でのＢＯＰによる脱保護および環化は、２の合成を完了させる。バンプＣｓＡ類のシクロフィリン類への結合は、ＦＫ５０６類およびＦＫ１０１２類に対して記載したのと同様の方法によって測定することができる。シクロフィリンを代償性突然変異で一度同定すると、バンプ（ＣｓＡ）２ＨＥＤおよびＨＯＤ試薬は、先に検討した方法に従い合成することができる。それら自体シクロフィリン蛋白質と１：２の化学量論比で結合することのできるダイマーを形成するバンプＣｓＡ化合物が特に重要である。少なくとも一つのこのようなＣｓＡまたは修飾ＣｓＡ部分を含有するホモダイマーおよびそれより高次のホモオリゴマー類、ヘテロダイマーおよびそれより高次のヘテロオリゴマー類は、ＦＫ１０１２Ａおよび（ＣｓＡ）２に対して開発された方法によってデザインされ、測定され、ＦＫ１０１２の研究に類似した方法でリンカー素子を最適化する。
リガンド上に特に嵩高い基を収容することによって、我々の位置１１ＣｓＡ変種（２）を結合する突然変異体シクロフィリン類を新たに製造することができる。これらの代償性突然変異を有するシクロフィリン類は、ＦＫ１０１２の研究で記載した構造基体部位指向およびランダム突然変異／スクリーニングプロトコールを介して同定することができる。
上記結果より、本方法および組成物が多種多様な目的のために細胞の生産において非常な融通性を与えることは明らかである。本構造物を使用することによって、治療目的に細胞を使用することが可能であり、この場合、細胞は、必要とされるまで不活性なままであり、ついで、安全な薬剤を投与することによって活性化される。細胞は、ホスト中で、多種多様の寿命を有することができるので、短期間または長期間の保護を付与するために、慢性および急性の徴候を処置する機会が存在する。また、特別な部位、例えば、解剖部位または官能部位に応じた細胞を提供することができ、それら部位で、治療効果を生ずる。
多種多様な蛋白質の分泌を生ずる細胞を提供することができ、これは、不足分を補ったり、望ましくない結果、例えば、破壊剤を失活させたり、限られた細胞ポピュレーションを殺したりする細胞溶解細胞の活性化を抑制する機能を果たす。ホスト中に限られた期間細胞を存在させることによって、細胞は、ホスト中の細胞の迅速な応答を生ずることのできる用量で薬剤を取り込み、容易に活性化することができる。発現したキメラレセプターが細胞内に存在する細胞が提供され、細胞表面上での異質蛋白質による免疫応答を回避することができる。さらに、細胞内キメラレセプター蛋白質は、リガンドが結合する際に、有効な信号変換を生じ、細胞外レセプター領域でのレセプター結合よりも明らかに有効である。キメラ膜に結合したレセプターに結合する比較的単純な分子を使用し、重要な生成物の発現を生じさせたり、生成物の発現を抑制したりすることによって、細胞治療処置法を提供することができる。投与することのできる化合物は、安全であり、種々の方法で投与することができ、極めて特異的な応答を確実に生じ、動的平衡を損なわない。
本明細書に引用した全ての刊行物および特許出願は、各個々の刊行物または特許出願を、参考のために、特別、かつ、個々に指摘して、本明細書中に引用した。
理解しやすくするために、本発明を図および実施例によって幾分詳細に説明したが、当業者であれば、本発明の請求の精神および範囲から逸脱することなく、ある種の変形および変更をなすことができることは、本発明の教示に照らして容易に理解できるであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【図１１Ｆ】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【図２２】
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【図２３】
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