(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
非ヒト哺乳動物トランスジェニック胚を得るための方法であって、以下の工程：
外因性核酸を、非ヒト哺乳動物由来の膜崩壊精子頭部または脱膜精子頭部と、一定時間インキュベートする工程；
該外因性核酸、および該頭部を非ヒト哺乳動物由来の未授精卵母細胞に共挿入して、トランスジェニック授精卵母細胞を形成する工程；ならびに
該トランスジェニック授精卵母細胞から、トランスジェニック胚を生じさせる工程；
を包含する、方法。
【請求項２】
前記共挿入工程が、圧電気的に作動される微量注入によって達成される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記外因性核酸および前記膜崩壊精子頭部が、前記未授精卵母細胞の細胞質に共注入される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記膜崩壊精子頭部が、凍結および融解された精虫から得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記膜崩壊精子頭部が、再水和された凍結乾燥精虫から得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記精子頭部が、核および核周囲物質を含む脱膜頭部である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記膜崩壊精子頭部が、界面活性剤で処理した精虫から得られる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記未授精卵母細胞が、第ＩＩ分裂中期卵母細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記時間が、３０秒間〜５分間である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記時間が、４５秒間〜３分間である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記時間が、１分間〜２分間である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記外因性核酸が、１より多い導入遺伝子を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記トランスジェニック胚から生きた子孫を生じさせる工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記可能にする工程が、前記トランスジェニック胚を代理母に移植する部分工程を包含する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記哺乳動物が、霊長類、ヒツジ、ウシ、ブタ、クマ、ネコ、イヌ、ウマおよび齧歯類からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
非ヒト哺乳動物トランスジェニック胚を得るための方法であって、以下の工程：
非ヒト哺乳動物由来の膜崩壊精子頭部または脱膜精子頭部を得る工程；
該膜崩壊精子頭部または該脱膜精子頭部を、所望の遺伝子を含む外因性核酸と混合する工程；
該混合物を、単離された、非ヒト哺乳動物由来の未授精の第ＩＩ分裂中期卵母細胞に共挿入して、トランスジェニック授精卵母細胞を形成する工程；ならびに
該トランスジェニック授精卵母細胞から、トランスジェニック胚を生じさせる工程、
を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願は、１９９８年８月１１日に出願した米国仮特許出願第６０／０９６，０７８号および１９９９年５月１３日に出願した同第６０／１３３，９７０号の利益を請求する。
【０００２】
米国政府は、本発明、およびＮａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｃｈｉｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔによって与えられた連絡番号第ＨＤ−３４３６２の期間によって提供されるような、合理的な期間に、他者へ実施承諾することを特許権者に要求する限定された状況における権利において、支払済みの実施承諾を有する。
【０００３】
（発明の背景）
トランスジェニック動物は、科学的、薬学的および農業的な目的に重要である。遺伝子操作された家畜（ｌｉｖｅｓｔｏｃｋ）を使用しての、乳汁における外来タンパク質の産生は、治療用組換えタンパク質を作製するに適切なシステムであると考えられている。さらに、ヒト遺伝子の動物（例えば、ブタ）ゲノムへの挿入は、そのような動物を、ヒト免疫系によって拒絶されないヒト器官または細胞のための生器官または生細胞「工場」として作用させ得る。
【０００４】
外来ＤＮＡをその体細胞および生殖細胞に導入することによりトランスジェニック哺乳動物を得るいくつかの方法が報告されている。これらの方法の１つは、前核（ｐｒｏｎｕｃｌｅａｒ）微量注入であり、これは幅広く使用されており、そして１９８０年代初期にマウスモデルにおいて最初に開発された。前核微量注入は、導入遺伝子（ｔｇ）ＤＮＡの、単一細胞（ｏｎｅ−ｃｅｌｌ）胚の前核への注入を伴う（Ｊ．Ｗ．Ｇｏｒｄｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７７、７３８０（１９８０）；Ｊ．Ｗ．ＧｏｒｄｏｎおよびＦ．Ｈ．Ｒｕｄｄｌｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２１４，１２４４（１９８１）；Ｒ．Ｄ．ＰａｌｍｉｔｅｒおよびＲ．Ｌ．Ｂｒｉｎｓｔｅｒ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．２０，４６５（１９８６）；ならびにＪ．Ｗ．Ｇｏｒｄｏｎ、Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌ．１１５，１７１（１９８９））。前核接合体の生成は、マウスにおいては簡単でったのに対し、このことは、大きな商業用動物品種によって例示される種に必ずしも当てはまらない。例えば、接合体は、ウシおよびブタにおいてのようにその脂質の豊富さが接合体を不透明にする場合、前核注入には困難な基質である；対照的に、マウス接合体は半透明である。
【０００５】
トランスジェニック胚性幹（ＥＳ）細胞（ＤＮＡ構築物でのトランスフェクションによって得られる）は、ウシ、ヒツジなどにおけるキメラ動物を得るために使用されてきた。この方法は、所望の変異を保有する遺伝子操作されたＥＳ細胞の授精胚への注入を含む。この胚は、胚発生の桑実胚期（約２０〜５０細胞）または胚盤胞期（約１００細胞）にある。移植の際に、このような胚は、しばしば、キメラ動物を生じ、野生型動物とこのキメラ動物の続く交雑は、可変頻度（しばしば０に等しい）で、ＥＳ細胞誘導ゲノムの生殖細胞系伝達を生じる。遺伝子移入の効率は低く、そして多数のレシピエント動物が胚移入に必要なので、この方法による大きなトランスジェニック動物の産生は困難であった。
【０００６】
前核微量注入方法もＥＳ細胞トランスフェクション方法（上記）も、未だ、ｔｇ挿入の結果を制御または予測し得ない。なぜなら、異種ＤＮＡの細胞への導入は、しばしば、準ランダム様式によってもたらされる有害な「位置」効果またはコピー数効果を生じるからであり、この様式においては、導入遺伝子（またはその複数のコピー）は宿主ゲノムに組み込まれる（Ｊ．Ｗ．Ｇｏｒｄｏｎ、前出）。それゆえ、大きなトランスジェニック動物を産生することにおけるこれらの方法の効率は低かった。
【０００７】
導入遺伝子の組込みの結果を超える大きな制御が、同種組換えし得るＤＮＡ構築物でトランスフェクトされたマウスＥＳ細胞株を使用することによって達成され得ることが報告されている（Ｍ．Ｊ．ＥｖａｎｓおよびＭ．Ｈ．Ｋａｕｆｍａｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ２９２，１５４（１９８１）；Ｍ．Ｋｕｅｈｎら（同書）、３２６，２９５（１９８７））。これらの「遺伝子標的化」ＥＳ細胞は、１つ以上の特定の遺伝子が、他の遺伝子座（ゲノム全体）には全く影響しない非常に正確な様式でノックアウトされるかまたは改変されるものである。「不死化」トランスジェニックＥＳ細胞株は確立されており、かつインビトロで十分特徴付けられて、構築物の組込み部位が確認されている。しかし、遺伝子標的化は、現在、確立された生殖細胞系に寄与するＥＳ細胞系が存在する１つの種（マウス）に制限される。
【０００８】
哺乳動物の生殖細胞系を改変するために利用可能なストラテジーの限定は、代替方法についての探索をあおり、この方法としては、卵母細胞または移植前胚を感染するための組換えレトロウイルスの使用（Ｄ．Ｊａｈｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８２，６９２７（１９８５）；Ａ．Ｗ．Ｓ．Ｃｈａｎら（同書）、９５，１４０２８（１９９８））および複製欠損アデノウイルス媒介性送達系の使用（Ｙ．Ｋａｎｅｇａｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３，３８１６（１９９５））が挙げられる。しかし、ウイルスプロトコルは、クローニングにおける特別な工程を含み、操作されなければならない組換えアデノウイルスおよびレトロウイルスについて特別の封じ込め設備を必要とする。これらの方法によるウイルスの送達はさらに、微量注入装置または卵母細胞の透明帯の除去のいずれかを必要とする。
【０００９】
精虫はインビトロでの授精（ＩＶＦ）の間のＤＮＡ送達のためのビヒクルとして使用され得ることもまた報告されている（Ｍ．Ｌａｖｉｔｒａｎｏら、Ｃｅｌｌ  ５７，７１７（１９８９））。このアプローチにおいて、生精虫は、組換えＤＮＡをインビトロで卵母細胞に導入するためのベクターとして使用される。子孫（ｏｆｆｓｐｒｉｎｇ）への精子媒介性ＤＮＡ移入は、トランスジェニック動物の生成を顕著に単純化する能力を有するが、一貫したトランスジェニック動物の産生におけるその信頼性の欠如のために、トランスジェネシス（ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓｉｓ）を促進する際の生精虫方法の効率についてのかなりの論争が存在している（Ｍ．Ｌａｖｉｔｒａｎｏら、１９８９、前出；Ｒ．Ｎ．Ｂｒｉｎｓｔｅｒら、Ｃｅｌｌ  ５９、２３９（１９８９）；Ｂ．Ｍａｉｏｎｅら、Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．５０，４０６（１９９８））。１つの報告において、外因性ＤＮＡは、可逆性様式においてインタクトな精虫を装飾することが実証されており（Ｍ．Ｌａｖｉｔｒａｎｏら、Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．，３１，１６１（１９９２））、このことは、膜構造が、異質の組換えＤＮＡと精子頭部（ｓｐｅｒｍ  ｈｅａｄ）の安定な会合に対する障壁として作用し得ることを示す。別の報告において、生マウス精虫は、核への外因性ＤＮＡのいくらかの取り込みを示したプラスミドＤＮＡ、ならびに形質膜と２時間インビトロでインキュベートした。プラスミドＤＮＡが６時間前に注入されているｖａｓ  ｄｅｆｅｒｅｎｓからの精子もまた、いくらかの核の取り込みを示した。しかし、これらの精虫を卵母細胞を授精するために使用したものはない（Ｅ．ＨｕｇｕｅｔおよびＰ．Ｅｓｐｏｎｄａ，Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．５１，４２（１９９８））。
【００１０】
それゆえ、トランスジェニック動物を産生するために信頼性をもって使用され得る効率的な導入遺伝子移入方法に対する必要性がなお存在する。より詳細には、薬学的「工場」として、および異種移植のためのヒト器官または細胞の供給源として使用するための遺伝子操作された家畜または他の大きな動物を得る効果的な方法に対する必要性が存在する。
【００１１】
（発明の要旨）
本発明は、トランスジェニック胚を得るための方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する：外因性核酸、および膜崩壊精子頭部または脱膜（ｄｅｍｅｍｂｒａｎａｔｅｄ）精子頭部を未授精卵母細胞の細胞質に共挿入（ｃｏｉｎｓｅｒｔ）して、トランスジェニック授精卵母細胞を形成する工程；ならびにこのトランスジェニック授精卵母細胞が、トランスジェニック胚、および所望であれば、生子孫へと発生することを可能にする工程。共挿入工程は、好ましくは、この膜崩壊精子頭部または脱膜精子頭部を、外因性核酸と、約３０秒間〜約５分間、代表的には約４５秒間〜約３分間、より代表的には約１分間〜約２分間の時間、プレインキュベートする部分工程を包含する。この精子頭部および外因性核酸の卵母細胞への共挿入は、微量注入により、好ましくは、圧電気的に作動される（ｐｉｅｚｏ  ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌｌｙ−ａｃｔｕａｔｅｄ）微量注入による。この膜崩壊精子頭部または脱膜精子頭部と混合された外因性核酸は、１つより多い導入遺伝子についてのトランスジェニックである胚を産生するために、１つより多い導入遺伝子を含み得る。
【００１２】
本発明における使用に適切な膜崩壊精子頭部は、凍結−融解された精虫または再水和された凍結乾燥精虫から得られ得る。凍結乾燥により精虫を保存し、そして得られた再構成した凍結乾燥精虫を使用して、インビトロで卵母細胞を授精させて、胚および生子孫を産生するための方法は、本発明者らの１９９８年１０月２３日に出願した同時係属中の米国特許出願番号第０９／１７７，３９１号（この開示は、本明細書中で参考として援用される）の主題である。本発明における使用に適切な脱膜精子頭部（核および核周囲物質を含む）は、以下に記載のように、新鮮な精虫の界面活性剤処理によって得られ得る。
【００１３】
本発明の方法は、哺乳動物（例えば、霊長類、ヒツジ、ウシ、ブタ、クマ、ネコ、イヌ、ウマおよび齧歯類）のトランスジェニック胚または生子孫を産生するために使用され得る。この方法はまた、トランス無脊椎動物（例えば、限定されないが、ウニ、ロブスター、アワビ、または甲殻類）を産生するために使用され得る。この方法はまた、トランスジェニック魚類、両生類、爬虫類および鳥類を産生するために使用され得る。本発明のプロセスによって産生される生トランスジェニック子孫（創始動物）は、それ自体、トランスジェニック子孫を産生し得ることが本明細書中で見出され、このことは、ｔｇの創始ゲノムへの安定な組込みおよび創始体の繁殖力を示す。
【００１４】
本明細書中に記載される哺乳動物トランスジェネシスの方法は、外因性ＤＮＡの授精卵母細胞への前核注入、またはインタクトな生精虫を外因性ＤＮＡを混合し、そしてこれらの処理した精虫を使用して卵母細胞を授精させてトランスジェニック胚を形成することを含む以前のインビトロ方法とは対照的である。本発明の方法における未授精の第ＩＩ分裂中期（ｍｅｔａｐｈａｓｅ  ＩＩ）卵母細胞の使用は、接合体を必要とする方法を超える、非常に単純かつ促進的な方法を提示する。さらに、細胞質内精子注入（ＩＣＳＩ）によるトランスジェネシスは、前核微量注入に対する特定の弱点を回避し得る。例えば、約１００倍大きなチップ口径（例えば、直径１０μｍのＩＣＳＩチップについての約７８μｍ2と比較して、直径１μｍの前核微量注入チップについて約０．７８μｍ2）を有する微量注入ピペットの使用は、大きな構築物（例えば、酵母人工染色体間または哺乳動物人工染色体）の取り扱いを容易にする。さらに、本発明の方法により、膜崩壊精子頭部または脱膜精子頭部とのｔｇ  ＤＮＡの会合は、メガベースおよびサブメガベースの構築物のさらなる安定化および保護を示唆する。
【００１５】
（発明の詳細な説明）
本発明は、外因性核酸および膜崩壊精子頭部または脱膜精子頭部を未授精卵母細胞に共挿入することによって、トランスジェニック胚を得るための方法を提供する。本発明の方法は、以下の工程を包含する：（ｉ）膜崩壊精虫または脱膜精子頭部を得る工程；（ｉｉ）この膜崩壊精虫または脱膜精子頭部を、所望の遺伝子を含む外因性核酸と混合する工程；ならびに（ｉｉｉ）この外因性核酸およびこの膜崩壊精子頭部または脱膜精子頭部を、単離された未授精母細胞に共挿入して、所望の導入遺伝子を発現するトランスジェニック胚を形成する工程。この方法はさらに、トランスジェニック胚を代理母の子宮に移植する工程およびこの胚が生トランスジェニック子孫に発生することを可能にする工程を包含し得る。
【００１６】
本発明の方法の個々の工程および部分工程（ｓｕｂｓｔｅｐ）の実施態様は、ここで、より詳細に提示される。
【００１７】
（新鮮な精虫の調製）
無脊椎動物および脊椎動物由来の新鮮な精虫は、当業者に公知の方法によって収集される。例えば、げっ歯類（例えば、マウス、ゴールデン（シリアン）ハムスター、モルモット、ウサギなど）の成熟精虫は、精巣上体尾から収集され得；一方、他の種（例えば、ヒト、ブタ、ウマ、雄ウシ、ヤギ、家禽など）において、成熟精虫は、繁殖力のある雄の射精した新鮮な精液から単離され得る。魚類（例えば、メカジキ（ｓｗｏｒｄｔａｉｌ）、Ｘｉｐｈｏｐｈｏｒｕｓ  ｈｅｌｌｅｒｉ）および無脊椎動物（例えば、ウニ（Ｔｒｉｐｎｅｕｓｔｅｓ  ｇｒａｔｉｌｌａ））の精虫は、成熟した雄の精巣から収集され得る。
【００１８】
精巣上体尾から精虫を得るための方法の例は、以下である。精巣上体尾を、成熟した雄性マウス（誕生後およそ８週齢以上）から取り出す。血液および脂肪組織を、精巣上体尾の表面から取り出す。次いで、これを、精虫の濃厚な集団（ｍａｓｓ）を放出させるために圧縮する。精虫の集団の液滴（約２マイクロリットル、μｌ）を、１．５ｍｌミリリットル（ｍｌ）のポリプロピレン遠心管の底に置き、そして０．５ｍｌの温かい生理学的培地（例えば、ＣＺＢ培地（以下に記載される組成物）、リン酸緩衝化生理食塩水、または等張生理食塩水）でｍａｓｓ）重層する。３７℃で約１０〜２０分後、運動性精虫を、この上清から収集し得る。
【００１９】
精液から精虫を得るための方法の例は、以下である。射精された新鮮なヒト精液を、室温（約２５℃）で約３０分間液化させる。次いで、この精液を、約１０ｍｌの生理食塩水で希釈し、そして細片を取り除くためにおよそ２層の組織ペーパーを通じて濾過する。次いで、この濾液を、４００×ｇで約１０分間遠心分離し得、そして沈降した精虫を、所望の濃度で生理学的溶液中に再懸濁し得る。
【００２０】
精巣から精虫を得るための方法の例は、以下である。切り出した精巣を、赤血球溶解緩衝液（例えば、１５５ミリモル濃度（ｍＭ）ＮＨ4Ｃｌ、１０ｍＭ  ＫＨＣＯ3、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．２〜７．４）中に置き、細密なはさみを使用してミンスし、そして細片を取り除くためにおよそ２層の組織ペーパーを通じて濾過する。次いで、濾液を、遠心分離し（例えば、７００×ｇ、５分）、そしてこのペレットを、生理学的溶液中に所望の濃度で再懸濁する。
【００２１】
インタクトな血漿および先体膜を有する、そのように回収されたマウス精虫は、図１（Ａ）に例示される。この図は、マウス精子の頭部を通じる代表的な矢状の切片の顕微鏡写真であり、ここで「ａｃ」は先体キャップを表し、「ｅｑ」は、赤道セグメントを表し、そして「ｐａ」は、先体後（ｐｏｓｔａｃｒｏｓｏｍａｌ）領域を表す。精虫は、凍結−融解または凍結−乾燥プロセスのための調製において、以下に記載される生理学的培地中に懸濁される。あるいは、精虫は、脱膜精子頭部を得るためにさらに処理する工程を受け得る。
【００２２】
（膜崩壊精虫の調製）
（膜崩壊新鮮な精虫）
上記のように得られた新鮮な精虫の膜を、機械的手段によって（例えば、以下にさらに記載されるように、圧−電気的（ｐｉｅｚｏ−ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌｌｙ）に作動する微量注入ユニットの単一パルスの適用による微量注入ピペットにおける精子頭部の尾部からの転位によって）崩壊し得る。本明細書中で使用される場合、用語「新鮮な」精虫とは、未受精卵母細胞中への微量注入のために膜を崩壊された精虫をいい、そしてこれらは、ＩＶＦの以前の報告におけるＤＮＡ送達のビヒクルとして使用される「生きている」精虫（生精虫（ｌｉｖｅ  ｓｐｅｒｍａｔｏｚｏａ））から識別可能であり、そしてそれとは相違を示す。
【００２３】
（凍結−融解した精虫）
精虫の凍結およびその後の融解は、以下により詳細に記載されるように、形質膜−インタクト（生きている）細胞と形質膜−損傷した（死んでいる）細胞との間を識別し得る生死判別（ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）染色技術によってアッセイされるように、形質膜の崩壊を生じる。このような凍結−融解で膜を崩壊された精虫は、従来の感覚では、「死んだ」とみなされる。凍結−融解された精虫は、Ｔ．Ｗａｋａｙａｍａら、Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔ．１１２、１１（１９９６）およびＳ．Ｋｕｒｅｔａｋｅら、Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ５５、７８９（１９９６）に記載される方法に従って、調製され得る。特に、マウス精巣上体精虫は、１８％（ｗ／ｖ）ラフィノースのような凍結保護剤を用いてかまたは用いずに、−２０℃または−５０℃あるいは−１９０℃に冷却する前にＣＺＢ培地中に懸濁され、そして融解する前に１〜２８日間凍結したまま貯蔵され、それらの頭部が未受精卵母細胞中に微量注入される場合に、正常な繁殖力のある生子孫（ｌｉｖｅ  ｏｆｆｓｐｒｉｎｇ）の発生を支持する。
【００２４】
マウス精巣上体の精虫を凍結するための例示的な方法において、ＣＺＢ培地中の精子濃度は、１ｍｌ当たり約３〜１０×１０6である。１００μｌの精子懸濁液のアリコートは、１．５ｍｌのポリプロピレン遠心管（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）に移され、そして３６％（ｗ／ｖ）Ｄ（＋）−ラフィノース（１８％ラフィノースの最終濃度を生じる）とともにか、またはそれなしで、等容量のＣＺＢ培地と徹底的に混合される。この懸濁液の５０μｌのアリコートは、ラベルを貼った１ｍｌの凍結用バイアル（Ａ／Ｓ  ＮＵＮＣ、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ）中に分配される。このバイアルは、完全に蓋を閉められ、そして−２０℃または−５０℃のフリーザーあるいは液体窒素（−１９６℃）中に直接置かれる。このサンプルは、１日〜４週間にわたる期間、貯蔵され得る。
【００２５】
融解のために、バイアルは、フリーザーまたは液体窒素から取り出され、そして２４℃〜２６℃で約１０分間、水または空気中に置かれる。ここで、融解した精子懸濁液は、以下に記載されるような、細胞質内精子注入（ＩＣＳＩ）の使用に準備が整う。
【００２６】
マウス精巣上体精子の凍結−融解した精虫を得る方法は、本明細書に記載されているが、当業者は、過度の実験を行うことなく、他の脊椎動物および無脊椎動物に由来する精虫に対して、この方法を採用し得る。
【００２７】
（凍結−乾燥した精虫の再水和）
精虫の凍結乾燥は、形質膜−インタクト（生きている）細胞と形質膜−損傷（死んでいる）細胞との間を識別し得る生死判別染色技術によってアッセイされるように（以下に記載）、形質膜の崩壊を生じる。このような凍結−乾燥された膜を崩壊された精虫は、従来の感覚では、「死んだ」とみなされる。凍結−乾燥された精虫は、Ｔ．ＷａｋａｙａｍａおよびＲ．Ｙａｎａｇｉｍａｃｈｉ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １６、６３９、（１９９８）および本発明者らの係属米国特許出願第０９／１７７，３９１号（１９９８年１０月２３日に出願）に記載される方法に従って調製され得る。特に、この特許出願は、脊椎動物および無脊椎動物由来の凍結−乾燥された精虫について使用され得る一般的な方法を開示する。例示的な方法において、マウス精巣上体精虫は、液体窒素中で凍結し、そしてほぼ０％の水分含量まで乾燥する前に、（１）４ｍｇ/ｍｌのＢＳＡを含む、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含まないＣＺＢ培地、または（２）１０％（ｖ/ｖ）仔ウシ血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ）で補充されたダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中に懸濁され、そして再水和する前に、６ヶ月まで凍結−乾燥したまま貯蔵され、それらが再水和され、かつそれらの頭部が未受精卵母細胞中に微量注入される場合に、正常な繁殖力のある生きている子孫の発生を支持する。
【００２８】
マウス精巣上体の精虫を凍結するための例示的な方法において、ＣＺＢまたはＤＭＥＭ培地中の精子濃度は、１ｍｌ当たり約３〜１０×１０6である。精子懸濁液のアリコート（１００μｌ）は、液体窒素中に直接入れられる、２ｍｌアンプル（Ｗｈｅａｔｏｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｍｉｌｌｖｉｌｌｅ、ＮＪ、カタログ番号６５１５０６）中に置かれる。１０分後、アンプルは、凍結−乾燥システム（Ｍｏｄｅｌ  １０−０２０、ＶｉｒＴｉｓ  Ｃｏ．、Ｇａｒｄｎｅｒ、ＮＹ）に付属の予め冷却された（−５０℃）凍結フラスコ中に置かれる。この入口圧力は、およそ１ミリＴｏｒｒである。およそ１２時間後、このフラスコを、気体−乾燥ジャー（Ｆｉｓｈｅｒ、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｐｉｔｔｓｕｂｕｒｇｈ、ＰＡ  カタログ番号０９−２０４の様式により供給されるアルゴンで充填された後に、このシステムから取り出した。各アンプルを、真空ポンプに接続し、そして９９％よりも多くの気体がそれから排出された後にフレームを密封した。アンプルを、アルミホイルで個別に包装し、そして室温（約２５℃）または４℃にて暗室で、使用するまで１年までの間貯蔵した。
【００２９】
前述の凍結−乾燥された精虫の再水和のために、上記のように調製された凍結−乾燥精虫を含むアンプルを、崩壊し、そして１００μｌの蒸留水をアンプルに加えて、再構成された精子懸濁液を形成させた。
【００３０】
マウス精巣上体の精虫について再水和された凍結−乾燥精虫を得る方法は、本明細書中に記載されているが、当業者は、米国特許出願第０９/１７７，３９１に教示されるように、過度の実験を行うことなく、他の脊椎動物および無脊椎動物に由来する精虫に対して、この方法を採用し得る。
【００３１】
精子頭部の注入後の卵母細胞活性化の頻度および正常な受精は、凍結−乾燥された精虫の再水和後の時間が経つにつれて減少するようであることが留意されている。再水和と注入との間の許容期間は、種の間で変動し得るが、例としては、マウス精虫のこの期間は、好ましくは、１時間以下である。
【００３２】
（脱膜精子頭部の調製）
脱膜精子頭部は、全ての膜（形質膜ならびに先体内膜および先体外膜を含む）を欠く、洗剤で抽出された頭部であるが、核および核周囲の物質を保持する。例えば、精子頭部は、ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）とともにかまたはそれなしで、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００での処理によって脱膜され得る。Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００は、非変性条件下で、膜成分の除去に広汎に使用される、周知の非イオン性界面活性剤である。ＳＤＳは、種々のタンパク質（膜タンパク質を含む）を可溶化するために使用されるアニオン性洗剤である。マウスにおいて、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の使用により脱膜される精子頭部は、卵母細胞を活性化して、正常な胚発生を導き得ることが示されている。
【００３３】
精子頭部を脱膜するための例示的な方法は、以下である。上記のように調製された精子懸濁液のアリコートを、超音波処理する。例えば、上記のように、精巣上体尾、精巣または精液から収集された精虫は、５ｍｌ  ＢＭ緩衝液（７５ｍＭ  ＮａＣｌ、２４ｍＭ  ＥＤＴＡ、および５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．２）中に懸濁され得、そしてＢｉｏｓｏｎｉｋソニケーター（Ｂｒｏｎｗｉｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）の７０〜８０％出力で３０秒間超音波処理され得る。９５％を超える精虫を、この処理によって剪断する。精子頭部の脱膜するために、超音波処理した精子懸濁液を、７００×ｇで５分間遠心分離し、そしてこのペレットを、ＢＭ緩衝液で洗浄し、次いで、ＮＩＭ培地（１２３．０ｍＭ  ＫＣｌ、２．６ｍＭ  ＮａＣｌ、７．８ｍＭ  ＮａＨ2ＰＯ4、１．４ｍＭ  ＫＨ2ＰＯ4，３ｍＭ  Ｎａ2ＥＤＴＡ（ｐＨ７．２を有する）からなるＮＩＭ培地）において、１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を用いて、室温にて５分間処理された。次いで、頭部を、ＮＩＭ培地で徹底的にリンスし、そして精子懸濁液培地中に再懸濁した。
【００３４】
（精虫の生死判別の評価）
図１（Ｂ）、（Ｃ）および（Ｄ）の顕微鏡写真は、精子頭部の前領域を通じる長軸方向の断面図を表し、これは、赤道領域における形質膜および先体膜を除いて、それらの膜がＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（洗剤）（Ｂ）、凍結−融解（Ｃ）または凍結−乾燥（Ｄ）により処理される精虫において存在しないかまたは崩壊されることを示す。精虫の生死判別は、従来の感覚で生きているかまたは死んでいる精虫の間を識別し得る、任意の染色方法を使用することによって評価され得る。本発明での使用のために適切な市販の生死判別キットは、Ｌｉｖｅ／ｄｅａｄ  ＦｅｒｔｉＬｉｇｈｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ、Ｅｕｇｅｎｅ、Ｏｒｅｇｏｎから入手可能）であり、このキットは、ヨウ化プロピジウム／ＳＹＢＲ１４での染色後に、紫外線（ＵＶ）顕微鏡下での蛍光パターンに従って、形質膜−インタクト（生きている）細胞と形質膜−損傷（死んでいる）細胞との間を区別する。インタクトな形質膜を有する生きている「精虫」の核は、緑の蛍光を発し、一方、「死んでいる」精虫の核は、明るい橙赤色の蛍光を発する。上記の、物理的な膜崩壊によってか、または凍結−融解、凍結−乾燥および脱膜手順によって調製された全ての精虫は、従来の感覚では、「死んでいる」と予期される。
【００３５】
（導入遺伝子を含む外因性核酸の選択および調製）
本発明に従う遺伝子の形質転換は、接合体のゲノム中への外因性外来ＤＮＡの安定な組み込みであり、そして宿主細胞の核ＤＮＡおよび／またはミトコンドリア中の核外ＤＮＡ中への外来ＤＮＡの組み込みを含む。外来ＤＮＡは、形質転換前に接合体に常在性ではない（通常は存在しない）か、または通常は、１よりも多いコピーで存在しない遺伝物質である。しかし、「外来」ＤＮＡは、共抑制の目的のために導入される、常在性遺伝子または遺伝子配列のさらなるコピーを含み得る。
【００３６】
外来遺伝物質は、任意の起源（植物、細菌、ウイルス、バクテリオファージ、プラスミド、プラスチド、哺乳動物および合成ＤＮＡ構築物を含むがこれらに制限されない）に由来するＤＮＡを含み得る。このＤＮＡは、環状形態であっても線状形態であってもよく、そして一本鎖であっても二本鎖であってもよい。このＤＮＡは、センスまたはアンチセンスの構成で宿主細胞のＤＮＡ中に挿入され得、そして一本鎖であっても二本鎖であってもよい。宿主細胞中に挿入されたＤＮＡの全てまたは一部は、宿主のゲノム中に組み込まれ得る。
【００３７】
プラスミドおよび特定の遺伝子を含む他のクローニングベクターの選択および／または合成構築は、当該分野において周知である。キメラプラスミドの合成構築物は、遺伝子または目的の遺伝子を含み、そしてしばしば、多様な供給源に由来するプロモーターおよび／またはリーダー配列を含み、宿主ゲノム中への挿入を容易にする。原核生物クローニングベクター配列は、微量注入された遺伝子の取り込み頻度に明らかな効果を有さないが、それらは、哺乳動物（例えば、マウス）の生殖系列中に導入された真核生物遺伝子の発現を厳格に阻害し得ることが留意されている（Ｂ．Ｈｏｇａｎら、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ、第Ｅ節、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、２２頁（１９９４））。従って、遺伝子の最適な発現が所望される場合、哺乳動物（例えば、マウス）の生殖系列中に遺伝子を導入する前に、クローニングされた遺伝子に由来する全てのベクター配列を実質的に取り除くことが賢明であり得る。ベクター配列は、当業者に公知の方法によって、ベクター上に存在する制限酵素部位に従い、制限酵素を使用することによって除去され、所望の遺伝子、プロモーター、エンハンサーなどを含むフラグメントを生成し得る。
【００３８】
導入された遺伝子の発現レベルは、トランスフェクトされた細胞内でのプロモーターの強度および組み込まれたＤＮＡのコピー数に最も依存する。従って、発現ベクターは、非常に強力なプロモーター（例えば、ＳＶ４０初期または後期プロモーター、サイトメガロウイルス即時型初期（ＣＭＶ−ＩＥ）プロモーター、細胞質β−アクチンプロモーター、およびアデノウイルス主要後期プロモータ）を利用する。
【００３９】
細胞中へのＤＮＡの首尾よい送達は、「レポーター」遺伝子の発現によって予備的に評価され得る。レポーター遺伝子は、形質転換に使用されるＤＮＡの成分であり、そして別の所望の特性を付与する導入遺伝子と同じであってもよいし、異なっていてもよい。レポーター遺伝子により形質転換された細胞または組織に付与される特性は、通常、組織化学アッセイまたは蛍光アッセイによって容易に検出可能である。トランスフェクション効率を定量するために、インビトロで多くのレポーター遺伝子が、通常、使用され、そしてレポーター導入遺伝子を含む多数のプラスミドおよびクローニングベクターが、当業者に公知の市販の供給源（例えば、Ｓｒａｔａｇｅｎｅ，Ｉｎｃ．ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ、およびＣｏｌｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｐａｌｏ、Ａｌｔｏ、ＣＡ）から入手可能である。本発明における使用のための例示的なレポーター遺伝子には、分泌アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ；β−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）；ホタルルシフェラーゼ、およびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ））が挙げられるがこれらに限定されない。インビボでのレポーターアッセイ（例えば、インサイチュβ−ｇａｌ染色、インサイチュβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、およびインサイチュルシフェラーゼアッセイ）もまた、固定化した細胞または組織切片のいずれかにおける遺伝子の移入を検出するために利用可能である。これらの手順は、酵素基質または抗体での染色後に、トランスフェクトされた細胞の可視化を可能にする。これらの手順の中で、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＬａｃＺ遺伝子の発現後のインサイチュβ−ｇａｌ染色は、その簡単さおよび感度のために広汎に使用されている方法である。この手順において、Ｘ−ｇａｌ基質とのβ−ｇａｌの反応は、濃青色を生じ、これは、光学顕微鏡下で容易に可視化され得、そしてトランスフェクション効率の直接的な評価を提供する。
【００４０】
クラゲＡｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ由来緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）は、種々の細胞および生物中での遺伝子発現およびタンパク質局在化をモニターするために重要なレポーターとなっている（Ｒ．Ｙ．Ｔｓｉｅｎ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６７、５０９（１９９８）；Ｇ．Ｚｈａｎｇら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ２２７、７０７〜７１１（１９９６）；Ｔ．Ｔａｋａｄａら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １５、４５８〜４６０（１９９７））。ＧＦＰは、検出のために任意の基質を全く必要としないので、これは、トランスジェニック胚の選択についての適切なマーカーであり得る。真核生物細胞中で発現されたＧＦＰは、細胞がＵＶまたは青い光により励起される場合に、緑色の蛍光を発する。ＧＦＰ内の発色団は、このタンパク質の一次構造に固有であり、そしてＧＦＰからの蛍光は、さらなる補因子、基質、またはさらなる遺伝子産物を必要としない。ＧＦＰ蛍光は、安定で、種とは無関係であり、そして蛍光顕微鏡、フローサイトメトリー、および肉眼検査での画像化の技術を使用して非侵襲的にモニターされ得る。青い光により励起される場合、ＧＦＰの蛍光強度を増大させるために、増強されたＧＦＰ（ＥＧＦＰ）改変体が構築されており（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手可能なｐＥＧＦＰ−Ｃ１）、これは、哺乳動物細胞中のＥＧＦＰ遺伝子の発現を駆動する、ヒトＣＭＶおよびＳＶ４０ポリアデニル化シグナルの即時型初期プロモーターを含む。
【００４１】
（所望の導入遺伝子を含むベクターフラグメントと精虫との混合）
上記のように調製された精虫は、上記に記載される、さらなる調製物（新鮮）なしでか、またはそれらが３つの膜崩壊プロトコルのうちの１つに供される後に、ベクターフラグメントとともに混合され得る。代表的な混合手順において、ベクターフラグメント（約２５ｎｇ／μｌ）を含む、１μｌのＤＮＡ溶液は、生理学的培地（例えば、ＣＺＢまたはＮＩＭ）において、約２〜５×１０5の精虫を含む、９μｌの懸濁液と混合され、そしてピペッティングにより混合されて、７ｎｇ／μｌの最終ＤＮＡフラグメント濃度が得られた。この混合液は、室温（約２５℃）または氷上で約３０秒〜約５分、代表的には約４５秒〜約３分、より代表的には約１〜３分、好ましくは約１分の間インキュベートされる。精子およびＤＮＡフラグメントの濃度、ならびにインキュベーション時間および温度は、当業者に公知のように、フラグメントのサイズまたは精虫のサイズなどに依存して変更され得る。
【００４２】
精虫およびＤＮＡフラグメントの混合液の微量注入は、通常、室温で、１時間以内の精虫−ＤＮＡ混合、または１時間の精子の脱膜によって実行される。
【００４３】
（レシピエントの卵母細胞）
本発明の方法に使用され得るレシピエントの卵母細胞は、インビトロでその後に成熟する未成熟（例えば、ＧＶ期）卵母細胞、および動物から回収されている成熟（すなわち、Ｍｅｔ  ＩＩ期）卵母細胞の両方を含む。成熟卵母細胞は、例えば、性腺刺激ホルモンまたは他のホルモンの注入により動物の過剰排卵を誘導すること（例えば、ウマおよびヒト絨毛性性腺刺激ホルモンの連続投与）、および排卵のすぐ後（例えば、飼いネコにおける発情期の発生の８０〜８４時間後、雌ウシにおける発情期の発生の７２〜９６時間後、およびマウスにおける発情期の発生の１３〜１５時間後）に、卵子を外科的に回収することによって得られ得る。未成熟な卵母細胞を得ることが唯一可能である場合、これらは、Ｍｅｔ  ＩＩ（これは、インビトロ成熟（「ＩＶＭ」）として公知である）に進行するまで、成熟促進培地中で培養される。未成熟なウシ卵母細胞のＩＶＭについての方法は、ＷＯ９８／０７８４１に記載され、そして未成熟なマウス卵母細胞についての方法は、Ｅｐｐｉｇ＆Ｔｅｌｆｅｒ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２２５、７７〜８４、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９９３）に記載される。
【００４４】
受精での、卵母細胞のインビボ成熟のステージは、胚を生成するためのインビトロ核移入法の成功に対して重要であることが以前に報告されている。卵母細胞の細胞質の化学は、成熟プロセスを通じて変化することが公知である。例えば、成熟と関連する細胞質活性（中期促進因子（「ＭＰＦ」）は、１回目の減数分裂の中期での未成熟な卵母細胞で高く、これは、第１極体の形成および排除を低下し、そして再度、Ｍｅｔ  ＩＩで高レベルに達する。ＭＰＦ活性は、Ｍｅｔ  ＩＩで停止している卵母細胞では高いままであり、卵母細胞の活性化の際に迅速に低下する。一般に、哺乳動物の核移入の報告は、レシピエントとしてのＭｅｔ  ＩＩ卵母細胞の使用を記載する。Ｍｅｔ  ＩＩ卵母細胞は、精虫を受精させることによって容易に活性化される型である。細胞核が、未受精Ｍｅｔ  ＩＩ卵母細胞（すなわち、高いＭＰＦ活性を有する卵母細胞）の細胞質中に導入される場合、細胞の核エンベロープ（核エンベロープが存在する場合）は、崩壊し、そしてクロマチンが濃縮し、中期染色体の形成を生じる。
【００４５】
レシピエント卵母細胞が、卵母細胞−丘細胞（ｃｕｍｕｌｕｓ  ｃｅｌｌ）複合体として卵管から外科的に回収され、そして緩衝化培地（例えば、Ｈｅｐｅｓ−ＣＢＺ培地（以下に記載される））に置かれる。丘細胞は、分散化酵素（例えば、０．１％ウシ精巣ヒアルロニダーゼ（例えば、３００ＵＳＰユニット／ｍｇ、ＩＣＮ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｃｏｓｔａ  Ｍｅｓａ、ＣＡ）を用いて分散される。丘を含まない（ｃｕｍｕｌｕｓ−ｆｒｅｅ）卵母細胞は、さらなる処置の１時間よりも前の間、空気中５％（ｖ／ｖ）ＣＯ2、３７．５℃、ミネラルオイル（Ｅ．Ｒ．Ｓｑｕｉｂｂ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、ＮＪから入手可能）下で平衡化された培地（例えば、ＣＺＢ培地）中で維持されることが好ましい。
【００４６】
（首尾よいインビトロ授精のために必要な精子成分）
マウスにおいて、正常な授精が、卵母細胞内に単離された精子の頭部を注射することによって達成され得ること、および形質膜および先体膜ならびに全ての尾部成分が、正常な胚の発生に必須ではないが公知である。マウス、およびおそらく大部分の一般の実験げっ歯目は、精子中心体が正常な授精に必要ではなく、そして正常な授精の間、精虫の頸部領域中の精子中心体が、授精後の卵母細胞内で変性することが運命付けられるという点で、「例外的」である。
【００４７】
対照的に、他のほとんどの真獣類哺乳動物（ウシおよびヒトを含む）において、精子中心体は、雄性前核および雌性前核の結合に必須である微小管の形成、ならびに胚発生の間の引き続く切断において、中心的役割を果たす。従って、これらの種において、精子の核（頭部）および中心体の両方の卵母細胞内への導入は、正常な子孫の産生に必須であると思われる。全ての種由来の精子中心体が、凍結融解、凍結乾燥または界面活性剤による脱膜（ｄｅｍｅｍｂｒａｎａｔｉｏｎ）を生存し得るか否かは、この時点で分からない。もしそうでない場合、正常な胚発生を確実にするために、非凍結精子由来の中心体が、凍結融解、凍結乾燥または脱膜された精子頭部と共に、卵母細胞内へ注射されなければならない。しかし、過度の数の中心体の導入は、異常な前核の発生および異常な胚発生を生じる。
【００４８】
中心体は、精子頭部の後末端または精子尾部の前末端のいずれかに、その頭部および尾部が分離されたときに、正常に結合する。従って、精子中心体は、精子頭部と同時に卵母細胞内に挿入され得るか、精子尾部の同時または連続挿入によって挿入され得る。
【００４９】
（レシピエント卵母細胞内への精虫核の挿入）
精虫全体は、レシピエント卵母細胞の細胞質内に外来の核酸と共注入され得るが、精子が大きい種において、単離された精子頭部（核）は、好ましくは、微量注入技術によってレシピエント卵母細胞の細胞質内に直接注入される。凍結融解精子頭部、再水和された凍結乾燥精子頭部または脱膜精子頭部との、外来性核酸のレシピエント卵母細胞内への微量共注入の好ましい方法において、圧電駆動マイクロピペットを使用する。
【００５０】
適切な圧電駆動ユニットは、Ｐｉｅｚｏ  Ｍｉｃｒｏｍａｎｉｐｕｌａｔｏｒ／Ｐｉｅｚｏ  Ｉｍｐａｃｔ  Ｄｒｉｖｅ  Ｕｎｉｔ  ｂｙ  Ｐｒｉｍｅ  Ｔｅｃｈ  Ｌｔｄ．（Ｔｓｕｋｕｂａ，Ｉｂａｒａｋｉ−ｋｅｎ，Ｊａｐａｎ）の名前の下で市販されている。このユニットは、圧電効果を利用して、高度に制御された迅速な様式で、その（注入）ピペットホルダーを極めて短い距離（約０．５μｍ）で前進させる。各パルスの強度および持続時間は、制御ユニットによって変化および調節され得る。
【００５１】
卵母細胞内への注入のために、単一の精虫は、精子／精子頭部および外来核酸の混合物で、販売者の説明に従って圧電気的に作動されるユニット中で、約５μｍの内部直径を有する短い、平らなチップを有する注入ピペット内に、尾部（この精子が尾部を有する場合）が最初に吸引される。精子の頭部および尾部は、単一または数個のＰｉｅｚｏパルスを頸部領域に適用することによって、分離される。次いで、頭部は、ピペット内に深く引き込まれる。あるいは、精子／精子頭部および外来核酸の混合物で、単一の精子頭部が、卵母細胞内への注入のために、その注入ピペット内に吸引され得る。
【００５２】
精子頭部（核）および外来核酸の共注入を通して、卵母細胞は、従来のホールディングピペットによって固着される。選択された精子頭部を含む注入ピペットのチップは、卵母細胞の透明帯と密接に接触され、そしていくつかの圧電パルス（強度１〜５、速さ４〜６のコントローラー設定規模を使用して）を適用して、軽度の陰圧を内で維持しながらピペットを前進させる。ピペットのチップが、透明帯を通過したとき、生じた帯プラグは、卵黄周囲腔内に放出され、そして精子頭部は、ピペットのチップ近辺まで、前に押出される。次いで、ピペットチップは、形質膜に並置され、そして前進（卵母細胞の反対側の面に向かって）され、そしてホールディングピペットは、卵母細胞の反対側の皮質にほとんど到達する。ここで、この卵母細胞の形質膜は、注入針の先端周辺に深く陥入される。１〜２の圧電パルス（強度１〜２、速さ１）の適用の際に、卵細胞膜はピペットチップで穿刺され、これは、卵細胞膜の迅速な弛緩によって示されるように、明らかに可視的であり得る。次いで、精子頭部が、外来核酸を含む最小量（約６ｐｌ）の添加培地で、卵質内に放出される。次いで、ピペットは、ゆっくり引きぬかれ、これによって、卵母細胞の細胞質内に新たに導入された頭部が残される。この方法は、代表的に、他の全ての時点で培養条件中で維持される１０〜１５の卵母細胞のバッチにおいて、迅速に行われる。
【００５３】
従来の注入ピペットが使用される、代替的な微量注入の変形が、共注入手順に使用され得る。従来のピペットを使用する適切な微量注入方法の例は、ハムスターの卵母細胞内への精子頭部の注入について、Ｙａｎａｇｉｄａ，Ｋ．Ｙａｎａｇｉｍａｃｈｉ，Ｒ．，Ｐｅｒｒｅａｕｌｔ，Ｓ．Ｄ．およびＲ．Ｇ．Ｋｌｅｉｎｆｅｌｄ，Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｕｉｏｎ  ４４，４４０−４４７（１９９１）に記載され、このような方法に関する開示は、本明細書に参考として援用される。
【００５４】
外来核酸および精虫／精子頭部／脱膜精子頭部の微量共注入は、いくつかの利点を提供する。第１に、微量注入による精虫／精子頭部送達は、広範な精虫型に、大きさ、形態などに無関係に適用可能である。第２に、微量注入は、この注入時に、上記の外来核酸に加えて、他の薬剤の卵母細胞への（ドナー精虫／精子頭部との）注意深く制御された共注入を可能にする。これらは、以下に例示される。第３に、精虫／精子頭部の挿入が圧電気的に作動された微量注入による、本発明の実施態様において、サンプルの迅速かつ効率的なプロセシングが行われ、これによって、操作を受け尾部精子および卵母細胞に対する外傷を減少する。いくつかの種（例えば、マウス）の卵母細胞は、従来の針を使用する微量注入を受け入れられないが、圧電気的に作動された微量注入は、高い成功率を与える。
【００５５】
（授精卵母細胞の活性化）
マウス卵母細胞は、単一のインタクトなマウス精虫またはその単離された頭部の注入によって達成され得ることが公知である。単離された精子尾部は、卵母細胞を活性化し得ない。活性な精子保有卵母細胞活性化因子は、代表的に、球形の精子細胞の精虫へ形質転換中に現れる。これらの因子の作用は、高度に種特異的ではない。なぜなら、マウス卵母細胞は、外来種（例えば、ハムスター、ウサギ、ブタ、ヒト、および魚類でさえも）由来の精虫の注入によっても活性化されるからである。このような活性化因子の１つは、先体赤道セグメント領域に存在する３３キロダルトンのタンパク質であることが報告されている。このタンパク質は、オシーリン（ｏｓｃｉｌｌｉｎ）と呼ばれ、成熟（ハムスター）精虫から、単純な凍結融解によって容易に抽出可能である。オシーリンに加えて、成熟精虫は、容易には抽出可能ではないが、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００およびＳＤＳでの精虫の連続的な処理によって得られ得る、別の活性化因子を保持するようである。容易に抽出可能なオシーリンおよび凍結／融解抽出耐性因子が、生物学的および化学的に同一であるか否かは分かっていない。
【００５６】
Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の存在下で超音波処理した精子頭部は、核および核周囲成分以外の全ての成分を損失することが公知である。しかし、微量外科的に卵母細胞内へ注入される場合、このようなＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００処理した精子頭部（核および核周囲成分を有するが、形質膜を全く有さない）は、インタクトな精虫と同じく効率的に卵母細胞を活性化し得る。
【００５７】
本発明者の同時係属米国特許出願第０９／１７７，３９１号およびＴ．Ｗａｋａｙａｍａら、１９９７、前出に記載されるように、少なくともマウスにおいて、精子保有卵母細胞活性化分子は、凍結融解および凍結乾燥に耐性であるはずである。なぜなら、凍結融解または凍結乾燥された精子頭部の注入を生存する、この卵母細胞の大部分は、正常に活性化および授精されたからである。
【００５８】
他の種において、精子頭部の注入が卵母細胞を活性化に働かない場合、活性化は、例えば、電子活性化（ｅｌｅｃｔｒｏａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）、１以上の卵母細胞活性物質の注入、または１以上の卵母細胞活性化物質を含む培地中への卵母細胞の転移のような、単為生殖的手段によって生じ得る。活性化の刺激（または活性化の刺激の組み合わせ）を提供し得る試薬としては、精子細胞質活性化因子、および特定の薬学的化合物（例えば、Ｃａ2+および他のシグナル伝達モジュレーター）が挙げられるが、これらに限定されない。これらは、精子頭部および外来核酸の共注入後または共注入と同時に、微量注入によって導入され得る。いくつかの活性化の刺激は、以下を含む、活性化化合物のサブセットの１つまたはメンバーを含む培地への、授精卵母細胞の転移後に提供される：Ｃａ2+放出の刺激因子（例えば、カフェイン、Ｃａ2+イオノフォア（例えば、Ａ２３１８７およびイオノマイシン）、ならびにエタノール）、リンタンパク質シグナル伝達のモジュレーター（例えば、２−アミノプリン、スタウロスプリン（ｓｔａｕｒｏｓｐｕｒｉｎｅ）、およびスフィンゴシン）、タンパク質合成のインヒビター（例えば、Ａ２３１８７、シクロヘキシミド）、６−ジメチルアミノプリン、または上記の組み合わせ（例えば、６−ジメチルアミノプリンおよびイオノマイシン）。例示的な方法において、マウス卵母細胞の活性化は、２〜１０ｍＭ  Ｓｒ2+を含有するＣａ2+を含まないＣＺＢ培地中での、１〜６時間の培養によって達成される。
【００５９】
（生存胎児および子孫を産生するための胚の発生）
前核形成の後、胚は、２〜８細胞段階または桑実胚／胚盤胞段階に到達するまで、インビトロで培養され得、この時点で、この胚は、乳母の卵管または子宮内に転移され得る。
【００６０】
（生物学的に興味深い物質の精子頭部との共注入）
本発明の１つの実施態様において、精子頭部および外来核酸の卵母細胞内への微量共注入は、精子頭部の卵母細胞内への注入前、注入中、または注入後に、胚発生の結果を変更する可能性を有する１以上の薬剤の導入を可能にする。例えば、さらなるリボ核酸（ＲＮＡ）またはＤＮＡは、精子頭部および外来核酸の共注入前または共注入後の微量注入によって、卵母細胞に導入され得る。例えば、シス作用性シグナルを保持する組換えＤＮＡの注入は、既存または共注入された転写因子によるこの組換えＤＮＡに存在する配列の転写、および引き続く、発生阻害因子に対する拮抗効果または胚発生に対する陽性効果を有する、コードタンパク質の発現を生じ得る。さらに、転写物は、発生阻害タンパク質をコードするｍＲＮＡに対するアンチセンス活性を保持し得る。あるいは、アンチセンス調節は、卵母細胞内での先の転写を伴わずに、それらの核酸標的と直接的に相互作用することによって阻害効果を発揮し得る核酸（またはその誘導体）の注入によって達成され得る。
【００６１】
本発明の方法によって導入された（直鎖状または他の）組換えＤＮＡは、何らかの狭小〜広範な発生発現プロフィールを示すプロモーターの制御下に、１以上の発現される機能的遺伝子を有する機能的レプリコンを含み得る。例えば、プロモーターは、このプロモーターが初期接合体中でのみ活性である場合、短い発現であるが、直接的に媒介し得る。導入されたＤＮＡは、胚発生のいくつかの時点で損失されるか、または１以上のゲノムの遺伝子座に組み込まれ、生じたトランスジェニック個体の生存を通して安定に複製されるかのいずれかであり得る。１つの実施態様において、推定「抗加齢」タンパク質（例えば、テロメラーゼまたはスーパーオキシドジスムターゼ）をコードするＤＮＡ構築物は、微量注入によって卵母細胞に導入され得る。あるいは、このようなタンパク質は、直接注入され得る。
【００６２】
（実施例）
本発明の方法を例示するために、膜崩壊および／または脱膜された精虫が未授精の卵母細胞内に、発現されるレポーター遺伝子を含むプラスミドの複製欠損フラグメントを転移する能力、ならびにトランスジェニックマウス胚およびそれ由来の生存トランスジェニック子孫の発生を、評価した。レポーター遺伝子の使用は、導入遺伝子を発現する胚および生存子孫の直接的な同定を可能にした。
【００６３】
本明細書中に記載される実施例は、限定することを意図されず、当業者は、マウス以外の供給源由来の他の導入遺伝子、精虫および卵母細胞、ならびに他の生理学的培地または試薬が、本発明の方法に使用され得ることを認識する。
【００６４】
（培地および試薬）
全ての無機化合物および有機化合物は、他に言及されない限り、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した。
【００６５】
回収した卵母細胞は、外来ＤＮＡおよび膜崩壊精子または脱膜精子頭部の共注入前に、ＣＺＢ培地（Ｃｈａｔｏｔら、１９８９、Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔ．８６，６７９−６８８）中で維持した。ＣＺＢ培地は、８１．６ｍＭ  ＮａＣｌ、４．８ｍＭ  ＫＣｌ、１．７ｍＭ  ＣａＣｌ2、１．２ｍＭ  ＭｇＳＯ4、１．８ｍＭ  ＫＨ2ＰＯ4、２５．１ｍＭ  ＮａＨＣＯ3、０．１ｍＭ  Ｎａ2ＥＤＴＡ、３１ｍＭ  乳酸Ｎａ、０．３ｍＭ  ピルビン酸Ｎａ、７Ｕ／ｍｌ  ペニシリンＧ、５Ｕ／ｍｌ  ストレプトマイシンサルフェート、および４ｍｇ／ｍｌ  ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む。卵管からの卵母細胞収集、引き続く処理および微量操作のための培地は、２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、還元量のＮａＨＣＯ3（５ｍＭ）およびＢＳＡ（３ｍｇ／ｍｌ）を含む、改変ＣＺＢであった。この培地を、本明細書中Ｈｅｐｅｓ−ＣＺＢと称する。微量注入目的のために、Ｈｅｐｅｓ  ＣＺＢ中のＢＳＡを０．１ｍｇ／ｍｌ  ポリビニルアルコール（ＰＶＡ、冷水可溶性、平均分子量１０×１０3）で置換することが好ましかった。なぜなら、ＰＶＡは、ＢＳＡよりも長期間にわたって、注入ピペット壁へのより低い粘着性を維持し、そして複数回の精子頭部／卵母細胞転移のための単一のピペットの繰り返しの使用の間で有利であるからである。両方の培地のｐＨは、約７．４であった。全ての卵母細胞操作を、大気中、室温（２３℃〜２５℃）で鉱油下の、Ｈｅｐｅｓ−緩衝化ＣＺＢ（Ｈｅｐｅｓ−ＣＺＢ）中で行った。
【００６６】
新鮮な精虫の単離のために使用した培地は、ＣＺＢ培地であった。凍結融解精虫および再水和凍結乾燥精虫は、ＣＺＢ培地または核単離培地（ＮＩＭ）（１２３．０ｍＭ  ＫＣｌ、２．６ｍＭ  ＮａＣｌ、７．８ｍＭ  ＮａＨ2ＰＯ4、１．４ｍＭ  ＫＨ2ＰＯ4、３ｍＭ  Ｎａ2ＥＤＴＡを含む）のいずれかに懸濁させた。このｐＨ値を、少量の１Ｍ  ＨＣｌの添加によって７．２に調整した。脱膜のための新鮮な精虫をＮＩＭ中で回収し、そしてまた、ＮＩＭ中でのＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００抽出によって処理した。洗浄後、脱膜精子頭部を、ＮＩＭまたはＣＺＢ培地中に懸濁させた。外来ＤＮＡとの精子のインキュベーション（ＣＺＢまたはＮＩＭ中での）後、この混合物を、ＰＶＰ（平均分子量３６０，０００、ＩＣＮ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｃｏｓｔａ  Ｍｅｓａ，ＣＡ）を補充した。
【００６７】
（動物）
これらの実施例で使用した動物は、Ｕｎｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ＨａｗａｉｉのＬａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｓｅｒｖｉｃｅのガイドラインに従って維持し、そしてこれらは、Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｕｎｃｉｌ（ＤＨＥＷ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ番号［ＮＩＨ］８０−２３、１９８５年改訂）によって準備した。動物の操作および処置のプロトコルは、Ｕｎｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ＨａｗａｉｉのＡｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって総説および承認された。
【００６８】
（実施例１）
（卵母細胞調製）
成熟Ｂ６Ｄ２Ｆ１（Ｃ５７ＢＬ／６ＸＤＢＡ／２）雌マウスを、７．５国際単位（ＩＵ）の妊娠中の雌ウマ血清ゴナドトロピンおよび７．５ＩＵのヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）の、４８時間間隔での連続注入によって過排卵するように誘導させた。ｈＣＧ注入の１４時間後、卵丘−卵母細胞（ｃｕｍｕｌｕｓ−ｏｏｃｙｔｅ）複合体を卵管から収集し、そしてＨｅｐｅｓ−ＣＺＢ培地中のウシ精巣ヒアルロニダーゼ（３００  ＵＳＰ  Ｕ／ｍｌ；ＩＣＮ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｃｏｓｔａ  Ｍｅｓａ，ＣＡ）で３分間処理して、卵丘細胞を分散させた。精子核の注入前に、この卵母細胞をリンスして、そして空気中５％（ｖ／ｖ）ＣＯ2下で鉱油平衡化下のＣＺＢ培地中、３７℃、最大４時間保存した。
【００６９】
（実施例２）
（新鮮な精虫の調製）
新鮮な精虫を、Ｂ６Ｄ２Ｆ１雄マウスの精巣上体尾から収集した。各精巣上体に対して指圧を適用しながら、その遠位部分を、尖った鉗子で穿刺した。精巣上体から漏出する高密度の精子塊をペトリ皿に移した。精虫の液滴（約２μｌ）を、１．５ｍｌのポリプロピレン遠心管（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）の底に置き、そして０．２〜０．５ｍｌのＣＺＢ培地を上層した。約２０分のインキュベーション後、この培地の上部０．４ｍｌを収集し、そして試験した。この懸濁液（約３〜１０×１０6／ｍｌ）中の９０％を超える精虫が、活発に運動性であった。
【００７０】
（実施例３）
（凍結融解精虫の調製）
凍結融解精虫を、Ｔ．Ｗａｋａｙａｍａ，Ｄ．Ｇ．  Ｗｈｉｔｔｉｎｇｈａｍ  およびＲ．Ｙａｎａｇｉｍａｃｈｉ，Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔ．，１１２，１１−１７，１９９８中に記載される方法に従って調製した。手短に言えば、精巣上体尾から得られた精虫の液滴を、１．５ｍｌのポリプロピレン遠心管の底に置き、そして０．５ｍｌの温かいＣＺＢ培地を上層した。３７℃で約２０分後、この培地の上部０．２ｍｌを収集した。この懸濁液は、約３〜１０×１０6精子／ｍｌを含んだ。この精子懸濁液のアリコート（１００μｌ）を、１．５ｍｌのポリプロピレン遠心管に移し、そして３６％（ｗ／ｖ）Ｄ（＋）−ラフィノースを含むかまたは含まない、等量のＣＺＢ培地と激しく混合させた。ラフィノースの最終濃度は、それぞれ、１８％または０％（ｗ／ｖ）であった。各懸濁液のアリコート（５０μｌ）を、ラベルした１ｍｌの低温貯蔵バイアル（Ａ／Ｓ  ＮＵＮＣ，Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ）内に分配した。各バイアルをきつくキャップして、そして−２０℃〜−５０℃のフリーザーまたは液体窒素（−１９６℃）中に直接置いた。全てのサンプルを、１日〜４週間の範囲の期間保存した。
【００７１】
融解のために、バイアルを、フリーザーまたは液体窒素から取り出し、そして２４〜２６℃の水中または空気中に約１０分間置いた。本明細書中に上記されたように、融解させた精子懸濁液のサンプルを、運動性および「生存度」について、市販の精子生存性試験キット（Ｌｉｖｅ／ｄｅａｄ  ＦｅｒｔｉＬｉｇｈｔ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）によって試験した。ラフィノース非存在下で凍結させた全ての精虫は、非運動性であり、そして「死んで」（膜が崩壊されて）いた。いずれの温度でのラフィノース存在下で凍結させた精虫の少なくとも９７％は、非運動性であり、そして「死んで」いた。
【００７２】
融解させた精子懸濁液を、外来ＤＮＡとの混合前に、４００μｌのＣＺＢ培地中で、１度洗浄し、そして懸濁させた。
【００７３】
膜の崩壊を、図１（Ｃ）に示されるように、電子顕微鏡によって確認した。崩壊は、先体帽の膜において最も明らかである。
【００７４】
（実施例４）
（再水和した凍結乾燥精虫の調製）
再水和した凍結乾燥精虫を、Ｔ．ＷａｋａｙａｍａおよびＲ．Ｙａｎａｇｉｍａｃｈｉ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １６，６３８−６４０，１９９８、および本発明者らの同時係属米国特許出願第０９／１７７，３９１号に記載の方法に従って調製した。手短に言えば、上記に記載のように調製したマウス精虫の懸濁液のアリコート（１００μｌ）を、１．５ｍｌポリプロピレン微量遠心管に移し、そして４ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡを含む、ＥＤＴＡを含まないＣＺＢ培地か、または１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）を補充したＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ改変Ｅａｇｌｅ’ｓ培地（ＤＭＥＭ）のいずれかの１ｍｌと徹底的に混合した。３７．５℃で３０分間のインキュベーション後、この培地の上部０．３〜０．５ｍｌを、この管から取り出した。この懸濁液は、約３〜１０×１０6精子／ｍｌを含んだ。
【００７５】
この精子懸濁液のアリコート（１００μｌ）を、２ｍｌのアンプル（Ｗｈｅａｔｏｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｍｉｌｌｖｉｌｌｅ，ＮＪ）中に置き、これを、液体窒素中に直接落とし込んだ。１０分後、アンプルを、凍結乾燥システム（Ｍｏｄｅｌ  １０−０２０、ＶｉｒＴｉｓ，Ｇａｒｄｎｅｒ，ＮＹ）に取り付けた、予め冷却（−５０℃）した凍結フラスコに置いた。入口圧力は、約１ミリトルであった。約１２時間後、このフラスコを、ガス乾燥ジャー（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐｉｔｔｓｕｂｕｒｇｈ、ＰＡ，Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  Ｎｏ．０９−２０４）によって供給したアルゴンで満たした後、このシステムから取り外した。各アンプルを、真空ポンプに接続し、そして９９％を超えるガスがアンプルから吸引された後で、フレーム密封（ｆｒａｍｅ−ｓｅａｌｅｄ）した。アンプルを個々にアルミホイルでラップし、そして室温（約２５℃）または４℃で暗所に保存した。
【００７６】
再水和のために、上記のように調製した凍結乾燥精子を含むアンプルを割り、そして１００μｌの滅菌水をアンプルに添加して、再構成した精子懸濁液を形成させた。
【００７７】
膜の崩壊を、図１（Ｄ）に示されるように、電子顕微鏡によって確認した。崩壊は、先体帽の膜において最も明らかである。
【００７８】
（実施例５）
（脱膜精子頭部の調製）
Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００抽出のための精虫を、ＮＩＭ培地中０℃〜１℃で、２つの精巣上体尾を精巧に切り取ることによって単離し、そして得られた精子懸濁液を濾過して、最終容量９００μｌを生成した。Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００抽出のために、１００μｌの０．５％（ｖ／ｖ  ＮＩＭ中）のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を、ＮＩＭ中のこの９００μｌの精子懸濁液に添加し、そして３０秒間氷上で粉砕することによって混合した。細胞を、２℃、２０，０００×ｇでの１分間の遠心分離によってペレット化し、そして２ｍｌの氷冷ＮＩＭ中に徹底的に再懸濁させ、その後２℃、２０，０００×ｇ、２分間で再ペレット化した。最終ペレットを、４００μｌのＣＺＢまたはＮＩＭ中に再懸濁した。
【００７９】
精子頭部の脱膜を、図１（Ｂ）に示されるように、電子顕微鏡によって確認した。崩壊は、先体帽の膜において最も明らかである。
【００８０】
（実施例６）
（導入遺伝子の調製）
増強したグリーン蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）導入遺伝子は、プラスミドｐＣＸ−ＥＧＦＰの大きい（３．５ｋｂ）Ｓａｌ  ＧＩ−Ｂａｍ  ＨＩフラグメントであった。このフラグメントは、強力なサイトメガロウイルス−ＩＥ−ニワトリβ−アクチンエンハンサー−プロモーターコンビネーションから発現されるＥＧＦＰ遺伝子を有するが、真核生物複製起点を欠失する［Ｈ．Ｎｉｗａ，Ｋ．Ｙａｍａｍｕｒａ，Ｊ．Ｍｉｙａｚａｋｉ，Ｇｅｎｅ  １０８，１９３（１９９１）；Ｇ．Ｚｈａｎｇ，Ｇ．Ｖａｎｅｓｓａ，Ｓ．Ｒ．Ｋａｉｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２２７，７０７（１９９６）；Ｔ．Ｔａｋａｄａら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５，４５８（１９９７）］。ＥＧＦＰ遺伝子を含むこの３．５ｋｂフラグメントを、制限酵素Ｓａｌ  ＧＩおよびＢａｍ  ＨＩでのプラスミドｐＣＸ−ＥＧＦＰの消化によって得て、そして当業者に公知の方法によって精製した。
【００８１】
ｐｘ−ＣＡＮＬａｃＺの精製したｌａｃＺ保有直鎖化フラグメントを、Ｓａｌ  ＧＩまたはＸｈｏ  ＩおよびＳａｌ  ＧＩのいずれかでの消化によって得た。このｐｘ−ＣＡＮＬａｃＺ  Ｘｈｏ  Ｉ−Ｓａｌ  ＧＩフラグメントは、複製起点を欠失する。ｐｘ−ＣＡＮＬａｃＺにコードされるβ−ガラクトシダーゼは、核局在シグナルを含む。
【００８２】
以下に記載のいくつかの実験において、プラスミドｐＣＸ−ＬａｃＺのフラグメントを、Ｓａｌ  ＧＩおよびＰｓｔ  Ｉでの消化によって、ｐＣＸ−ＬａｃＺ  Ｓａｌ  ＧＩ−Ｐｓｔ  Ｉフラグメントを生成することによって得た。ｐＣＸ−ＬａｃＺは、ｐＣＸ−ＥＧＦＰの誘導体であり、ここで、ＥＧＦＰ遺伝子は、β−ガラクトシダーゼをコードする遺伝子によって置換されている。
【００８３】
（実施例７）
（ＤＮＡフラグメントと精虫の混合物の調製）
新鮮であるか、または３つの膜崩壊プロトコールである：凍結融解（ｆｒｅｅｚｅ−ｔｈａｗｉｎｇ）、凍結乾燥（ｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｙｉｎｇ）、またはＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００抽出のうちの１つに供された後のいずれかである、上記のように調製された精虫を、以下に記載のようにＤＮＡフラグメントと混合した。
【００８４】
ＧＦＰ遺伝子を含有する１μｌ容量の上記のフラグメントを、先に調製された９μｌの精子懸濁物（２〜５×１０5の精虫を含有する）とピペッティングにより混合して、７ｎｇ／μｌの最終ＤＮＡ  ＧＦＰフラグメント濃度を得た。同様に、１μｌ容量のＳａｌ  ＧＩフラグメントまたはＸｈｏ  Ｉ／Ｓａｌ  ＧＩフラグメントを、各々個々に９μｌアリコートの精子懸濁物と混合して、それぞれ４．５ｎｇ／μｌおよび９ｎｇ／μｌの最終Ｓａｌ  ＧＩ  ｐｘ−ＣＡＮＬａｃＺフラグメント濃度を得た。
【００８５】
単回発射の二重トランスジェネシス（ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓｉｓ）を使用して、単回の微量共注入（ｍｉｃｒｏ−ｃｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）後に２つのｔｇを同時発現する胚を作製したいくつかの実験では、注入前に、２つの導入遺伝子（すなわち、ｐＣＸ−ＥＧＦＰ  Ｓａｌ  Ｇｉ−Ｂａｍ  ＨＩフラグメント（最終濃度２．５ｎｇ／μｌ）およびｐＣＸ−ＬａｃＺ  Ｓａｌ  ＧＩ−Ｐｓｔ  Ｉフラグメント（最終濃度２．５ｎｇ／μｌ）を含有する単一のＤＮＡ溶液）と精子頭部を混合した。
【００８６】
上記のＤＮＡ−精子混合物を、室温（約２５℃）または氷上で１分間インキュベートし、次いでポリビニルピロリドン（ＰＶＰ、平均分子量３６０，０００）溶液と混合して、約１０％（ｗ／ｖ）ＰＶＰの最終濃度を得た。
【００８７】
いくつかの実験では、プラスミドフラグメントとのインキュベーション後に精子を洗浄することの効果を決定するために、ｐＣＸ−ＥＧＦＰ  ＤＮＡと１分間混合およびインキュベートした直後に、ＤＮＡ−精子混合物を２つの５μｌアリコートに分けた。１つのアリコート（洗浄精子）を、５０μｌの氷冷した新鮮なＣＺＢまたはＮＩＭと十分に混合することによって、希釈および洗浄した。次いで、両方のアリコートを、２分間２０，０００×ｇ、２℃でペレット化した。洗浄精子のアリコート由来の上清を注意深く取り除き、そして５μｌの新鮮なＣＺＢまたはＮＩＭで置換した。第２のアリコート由来の上清を用いて、その自身のペレットを再懸濁した（従って、このサンプルを洗浄しなかった）。
【００８８】
いくつかの実験では、精子の共注入を伴わない、ＤＮＡフラグメント単独の注入の効果を決定するために、プラスミドｐＣＸ−ＥＧＦＰのＳａｌ  ＧＩ−Ｂａｍ  ＨＩフラグメントの新鮮希釈液（ＮＩＭ中で７ｎｇ／μｌ）を、注入前に、等量のＰＶＰ２０％（ｖ／ｖ）と混合した。
【００８９】
すべての実験について、次いで、上記で得られた混合物を、以下に記載されるように微量注入のための顕微鏡ステージ上に配置した。すべての注入を、Ｈｅｐｅｓ−ＣＺＢ培地中で室温にて、１時間の精子−ＤＮＡ混合、または１時間の精子−Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００混合において実施した。
【００９０】
（実施例８）
（卵母細胞内への精子核の微量注入）
調製された卵母細胞内への精子頭部および外因性ＤＮＡの共注入のために、微量注入チャンバーを、プラスチックディッシュ（１００ｍｍ×１５ｍｍ；Ｆａｌｃｏｎ  Ｐｌａｓｔｉｃｓ、Ｏｘｎａｒｄ、ＣＡ、カタログ番号１００１）の蓋（深さ１０ｍｍ）を用いることによって調製した。２つの円形の液滴および１つの細長い液滴からなる列を、このディッシュの中心線に沿って配置した。第１の液滴（２μｌ；直径２ｍｍ）は、ピペット洗浄（１２％［ｗ／ｖ］ＰＶＰ（平均分子量３６０、０００ダルトン）を含有するＨｅｐｅｓ−ＣＺＢ）用であった。第２の液滴（２μｌ；直径２ｍｍ）は、上記のように調製された精虫およびＤＮＡフラグメントの混合物であった。第３の細長い液滴（６μｌ；２ｍｍ幅および６ｍｍ長）は、卵母細胞のためのＨｅｐｅｓ−ＣＺＢ培地であった。これらの液滴の各々を、鉱油（Ｅ．Ｒ．Ｓｑｕｉｂｂ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、ＮＪ）で被覆した。このディッシュを、倒立顕微鏡の干渉コントラストオプティクス（ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｃｏｎｔｒａｓｔ  ｏｐｔｉｃｓ）のステージ上に配置した。
【００９１】
卵母細胞内への精子核および外因性ＤＮＡの微量共注入を、Ｐｒｉｍｅ  Ｔｅｃｈ  Ｌｔｄ．（Ｔｓｕｋｕｂａ、Ｉｂａｒａｋｉ−ｋｅｎ、Ｊａｐａｎ）によるＰｉｅｚｏ  Ｍｉｃｒｏｍａｎｉｐｕｌａｔｏｒ  Ｍｏｄｅｌ  ＭＢ−Ｕを使用して、以前に記載された圧電気的マイクロインジェクター法（ｐｉｅｚｏ−ｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｏｒ  ｍｅｔｈｏｄ）によって達成した。この装置は、圧電効果を使用して、非常に短い距離（例えば、０．５μｍ）を一度に非常に高速で、ピペットホルダー（ｈｏｌｄｅｒ）を前進させる。パルスの強度および速度を、制御装置によって調整した。
【００９２】
上記のように調製された卵母細胞内への注入について、外因性ＤＮＡとの混合物中の単一の精子頭部を、Ｐｉｅｚｏ電気ピペット駆動装置に接続された注入ピペット（先端で約５μＭ  Ｉ．Ｄ．）内に吸引した。精虫全体を用いる場合、単一の精虫は、尾部を最初に注入ピペット内に吸引された。精子頭部および尾部を、頸部領域に単一または少数のＰｉｅｚｏパルスを適用することによって分離した。パルスの強度および速度（振動数）を、ＰＭＡＳ−ＣＴ０１制御装置（制御装置設定目盛り：強度２、速度１）によって調節した。次いで、頭部をピペット内に深く吸い込み、そして少量（約５μｌ）の水銀を、注入ピペットの近位端に配置した。尾部からの精子頭部の転置は膜を崩壊し、このようにして、これらの実施例において用いられた新鮮な精虫と、ＩＶＦによるトランスジェネシスを促進する生精虫についての以前の報告で用いられた新鮮な精子との間の差異を表す。
【００９３】
一方で、成熟未授精卵母細胞を、Ｈｅｐｅｓ−ＣＺＢ培地内の顕微鏡ステージ上に位置付けた。卵母細胞を、ホールディングピペット（ｈｏｌｄｉｎｇ  ｐｉｐｅｔｔｅ）によって保有し、そして注入ピペットの先端を、３時の位置で、透明帯と密接に接触させた。いくつかのｐｉｅｚｏパルス（強度１〜２、速度１〜２）を与えて、ピペットを前進させる一方で、軽度の陰圧をそれに適用した。ピペットの先端が透明帯を通過した時点で、ピペット内の透明帯の円筒切片を、卵黄周囲腔内に発射した。精虫の頭部を、それが注入ピペットの先端付近になるまで前方に押した後、その先端が卵母細胞皮質の反対側にほぼ到達するまで、ピペットを機械的に前進させた。１または２のＰｉｅｚｏパルス（強度１〜２、速度１）を適用することによって卵細胞膜を穿刺し、そして精虫の頭部を卵細胞膜内に押し出した。注入あたり、外因性ＤＮＡを含有する約１ピコリットル（ｐｌ）の混合物がピペット内部から移動されたと推定される。次いで、ピペットを穏やかに引き抜き、精虫の頭部を卵質内に残した。
【００９４】
すべての注入を、Ｈｅｐｅｓ−ＣＺＢ中で室温にて実施した。各卵母細胞に１つの精子頭部を注入した。約５〜２０の卵母細胞を、この方法により１０〜１５分間以内で微量注入した。注入後直ぐに溶解した卵母細胞を廃棄した。
【００９５】
精虫の共注入を伴わない、ＤＮＡフラグメント単独の注入の効果を決定するための実験では、１卵母細胞あたり、約１ｐｌの上記のＰＶＰ中のプラスミドｐＣＸ−ＥＧＦＰのＳａｌ  ＧＩ−ＢａｍＨＩフラグメントを注入した。室温での５〜１０分間の回収時間の後、注入した卵母細胞を、１０ｍＭのＳｒＣｌ2および細胞質分裂ブロッキング剤であるサイトカラシンＢ（５μｇ／ｍｌ）を含有するＣａ2を含まないＣＺＢに移し、そして６時間、３７℃にてインキュベートした。精虫または精子頭部によって活性化されていない卵母細胞は、胚発生を起こさせるために、他の手段によって活性化されなければならない。ストロンチウムイオンによる活性化は、当業者に公知の多くの単為生殖活性化方法のうちの１つであり、そしてこれは、本発明者らの同時係属中の米国特許出願番号第０９／１３２，１０４号（１９９８年８月１０日出願；卵母細胞活性化に関するこの開示は、本明細書中で参考として援用される）において詳述される。染色体の排出を回避するための細胞質分裂ブロッキング剤の使用は、当業者に周知である。卵母細胞における細胞質分裂のブロッキングに関する米国特許出願番号第０９／１３２，１０４号の開示もまた、本明細書中で参考として援用される。
【００９６】
次いで、単為生殖的に活性化された卵母細胞をＣＺＢ培地に移し、そしてインキュベーションを、以下に記載される標準的な胚培養条件下で継続した。胚によるＧＦＰの発現を、以下に記載の方法によって、３．５日後に培養物中でスコア付けした。
【００９７】
（実施例９）
（卵母細胞試験、胚培養、および代理母への移入）
精子頭部外因性ＤＮＡを注入した卵母細胞を、大気中５％（ｖ／ｖ）ＣＯ2の下で平衡化された鉱油の下で、３７℃でＣＺＢ中でインキュベートし、そして５〜６時間後に倒立顕微鏡で試験した。２つの異なる前核および１つの第２極体を有する卵母細胞を、正常に授精したとみなし、そしてＣＺＢ中で４日間培養した。桑実胚ステージまたは未分化胚芽細胞ステージに達した卵母細胞を、レシピエントの雌（代表的には、ＣＤ−１白子雌）の子宮角に移した。このレシピエントの雌は、胚発生ステージを子宮の子宮内膜のそれと同期化（ｓｙｎｃｈｒｏｎｉｚｅ）するように、３日前に精管切除した（ＣＤ−１）雄と交配されている。平均数８つの桑実胚／未分化胚芽細胞を、各々の角に移した。雌は、それらの代理子孫を出産し、そして養った。いくつかの成熟雄子孫および成熟雌子孫を無作為に選択し、そしてそれらの繁殖性を試験するために交雑した。
【００９８】
（実施例１０）
（導入遺伝子の発現についての胚の試験）
微量共注入の３〜３．５日後、胚を、フルオレセインイソチオシアネートフィルターと共にＵＶ光源（４８０ｎｍ）を備えるエピ蛍光顕微鏡（ｅｐｉｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）によってＧＦＰの発現について試験した。これは、非蛍光性（非ＧＦＰ発現）、弱蛍光性、および強蛍光性の胚およびモザイク（これらは、それに応じてスコア付けされた）の明白な同定を可能にした。
【００９９】
ｐｘ−ＣＡＮＬａｃＺ  β−ガラクトシダーゼの発現を、１％（ｖ／ｖ）ホルムアルデヒド、０．２％（ｖ／ｖ）グルタルアルデヒド、およびＢＳＡ（５ｍｇ／ｍｌ）を含有するリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７．６）において、室温で５分間固定した後、Ｔ．Ｔｓｕｋｕｌら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４、９８２（１９９６）に記載のように、３日目の胚において評価した。固定した胚をＢＳＡ（５ｍｇ／ｍｌ）を含有するＰＢＳ中で徹底的に洗浄し、そしてＢＳＡ（５ｍｇ／ｍｌ）、４ｍＭのフェリシアン化カリウム、４ｍＭのフェロシアン化カリウム、２ｍＭのＭｇＣｌ2、および５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ）（１ｍｇ／ｍｌ）を含有するＰＢＳ中で、５時間３７℃でのインキュベーションによって染色した。胚を、光学顕微鏡によって試験およびスコア付けした。
【０１００】
精子頭部と共に２つの導入遺伝子を共注入した実験では、３〜３．５日目の胚を、上記の方法によって、最初にＧＦＰ発現についてスコア付けし、次いでβ−ガラクトシダーゼ発現についてスコア付けした。写真のために、顕微鏡スライドとカバーガラスとの間に胚をマウントし、そして画像を収集して、固定およびＬａｃＺ発現を示すための染色の前に顕色およびＧＦＰ発現を示した。
【０１０１】
（実施例１１）
（導入遺伝子発現についての生子孫の試験）
上記のように、代理母に移植された胚から得られた生子孫を、異所性ＧＦＰの発現について、出産の１〜４日後に試験した。ＧＦＰ発現は、ＵＶ光源（４８０ｎｍ）からの入射照明（ｉｎｃｉｄｅｎｔａｌ  ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ）の下で緑色の皮膚色として明白に観察可能であった。
【０１０２】
（実施例１２）
（導入遺伝子のゲノム組込みの分析）
サザンブロッティングによるか、またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による、尾部端（ｔａｉｌ−ｔｉｐ）のゲノムＤＮＡの物理的分析を実施した。尾部端生検を、３〜６週齢の無作為に選択された緑色の子マウス、およびそれらの非緑色同腹子で実施した。尾部端の組織を、当業者に周知の方法による総ゲノムＤＮＡの抽出のために使用した。その尾部の写真は、４８０／４４０ｎｍフィルターを備えた蛍光実体顕微鏡の下であった。
【０１０３】
サザンブロット分析のために、１サンプルあたり１０μｇのゲノムＤＮＡを、ＥｃｏＲＩで消化し、そしてｐＣＸ−ＥＧＦＰの７３３塩基対のＥｃｏＲＩフラグメントでプローブした。ＧＦＰ遺伝子の検出のために、順方向（ＴＴＧＡＡＴＴＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＴＧＡＧＣ）オリゴヌクレオチドプライマーおよび逆方向（ＴＴＧＡＡＴＴＣＴＴＡＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣＴＣＧ−ＴＣＣ）オリゴヌクレオチドプライマーを使用して、１反応あたり１μｇのゲノムＤＮＡでＰＣＲを実施した。反応パラメーターは、９５℃で９分間（１サイクル）、および９４℃で４５秒間、６０℃で３０秒間、７２℃で４５秒間（４０サイクル）であった。ＰＣＲ産物を電気泳動によって分離し、そしてエチジウムブロマイドでの染色後に可視化した。
【０１０４】
（ＤＮＡをコードする外因性レポーターもしくは精子頭部、またはその両方による第ＩＩ分裂中期卵母細胞の微量注入後に産生された、胚における導入遺伝子の発現）
精子およびＤＮＡを１分間プレインキュベートして、次いで共注入した後、３．５日間インビトロで培養された胚における、ＧＦＰおよびβ−ガラクトシダーゼの発現を記録した。上記のように、ＧＦＰをエピ蛍光顕微鏡によって検出し、そしてβ−ガラクトシダーゼを染色によって検出した。結果を表１に例証する。蛍光を発する割球を含む胚の比率は、ｐＣＸ−ＥＧＦＰ  ＤＮＡが新鮮な精虫と共注入された場合に最も低かった（２６％）が、これは、ＤＮＡがＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（６４％）、凍結融解（８２％）、または凍結乾燥（８７％）による膜崩壊に供された精虫と共に共注入された場合には、より高い値まで増加した。直鎖化ｐｘ−ＣＡＮＬａｃＺ  ＤＮＡフラグメントおよび凍結融解または凍結乾燥された精子のいずれかでの未授精卵母細胞の共注入はまた、高い割合（９２％〜９４％）のｌａｃＺ  ｔｇ産物であるβ−ガラクトシダーゼを発現する胚を産生した。さらに、２つの異なるｔｇ  ＤＮＡ（それぞれ、ＧＦＰおよびＬａｃＺをコードする）の混合物との精子頭部の共注入は、単回の微量注入から両方のｔｇを発現する胚を産生した。図２は、このような単回発射の二重トランスジェネシスによって産生されたトランスジェニック胚を例証する。卵母細胞を、ｐＣＸ−ＬａｃＺ  ｔｇ  ＤＮＡおよびｐＣＸ−ＥＧＦＰ  ｔｇ  ＤＮＡの混合物とプレインキュベートした精虫と共注入した。未染色（図２Ａ）、長波長（４８０ｎｍ）ＵＶ光下でのＧＦＰ発現について（図２Ｂ）、およびβ−ガラクトシダーゼ発現についてＸ−ｇａｌでの染色（図２Ｃ）を、ホフマン調整コントラスト顕微鏡（Ｈｏｆｆｍａｎ  ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｃｏｎｔｒａｓｔ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）によって調べた、３．５日後の同一の胚を示す（×４００倍率）。
【０１０５】
ひとまとめにして、前述のデータは、膜崩壊された精子頭部および外因性核酸の未授精卵母細胞内への共注入が、効率的にトランスジェニック胚を産生し得ることを示す。
【０１０６】
ｐＣＳ−ＥＧＦＰ  ＤＮＡと混合された後に新鮮培地で洗浄された精虫は、それらの洗浄されていない対応物と比較してわずかに低い効率（６３％対８０％）ではあるが、蛍光未分化胚芽細胞を産生する能力を保持していた（表１）。このことは、混合の間（注入前）の外因性ＤＮＡと精虫との間の迅速な会合を示唆する。
【０１０７】
同様の相互作用が卵母細胞内（注入後）で生じ得るか否かを探索するために、本発明者らは、注入前に混合することなく、連続的に精子頭部およびｐＣＸ−ＥＧＦＰ  ＤＮＡを注入した。本発明者らは、７５％の陽性コントロール胚（表１の場合、凍結融解精子頭部ｐＣＸ−ＥＧＦＰの共注入）が蛍光性であったにもかかわらず、結果として、外因性（ＧＦＰ）ＤＮＡ発現を観察することに失敗した。（５０ｐｇ／μｌではなく）５００ｐｇ／μｌでｐＣＸ−ＥＧＦＰと共注入された凍結融解精子頭部は、観察可能なＧＦＰを発現する未分化胚芽細胞を産生した。このＧＦＰ検出の閾値（１マイクロリットルあたり５０〜５００ｐｇのｐＣＸ−ＥＧＦＰ  ＤＮＡに対応する）は、注入された１ピコリットルあたり平均１５〜１５０分子を表す。
【０１０８】
精子頭部との共注入とは対照的に、類似量のＧＦＰ  ｔｇ  ＤＮＡ単独の注入は、良好な単為生殖発生を妨げなかった（注入を生存する９８％の卵母細胞が、桑実胚−未分化胚芽細胞ステージへと発生した）（表１）。さらに、結果として生じたいずれの胚も、検出可能なｔｇの発現を示さなかった。従って、精子頭部の非存在下では、ｔｇ発現または転写的に活性なｔｇ  ＤＮＡのエピ染色体（ｅｐｉｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ）存続はほとんどあり得なかった。
【０１０９】
表１のデータは、外因性ＤＮＡと、核周囲マトリクスの優勢な塩基性タンパク質をおそらく含む精子頭部の亜膜性構造との間の注入前会合の概念を支持する［Ｆ．Ｊ．Ｌｏｎｇｏら、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１０５、１１０５（１９８７）］。本発明者らの研究室での他の実験において、本発明者らは、精子核が少なくとも１つのエンドヌクレアーゼを含み、そして２５℃で脱膜（ｄｅｍｅｍｂｒａｎａｔｅ）した精虫が、完全な胚発生を支持するそれらの能力を迅速に喪失することを見出した［Ｂ．Ｍａｉｏｎｅら、ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１６、１０８７（１９９７）］。従って、卵母細胞媒介性のｔｇ組込みを容易にする一本鎖切断の存在と一致して、本明細書中で用いられる精子のゲノムＤＮＡは損傷を受けなかったようには思われない。
【０１１０】
奇妙にも、本発明者らは、ｐＣＸ−ＥＧＦＰ  ＤＮＡ単独の注入後ではなく、精子頭部ｐＣＸ−ＥＧＦＰの共注入後に、ＧＦＰ陽性割球およびＧＦＰ陰性割球（＋／−桑実胚−未分化胚芽細胞）の両方を含むモザイク胚を観察した（表１）。このような＋／−モザイクの頻度は、ＩＣＳＩ後の細胞周期の第１のＳ期の後まで、ｔｇ  ＤＮＡの組込みが時として遅延することを意味する。このような遅延した組込みは、ｔｇ  ＤＮＡが精子頭部と共注入された場合を除いて、明らかに生じていなかった。このことの１つの解釈は、精子由来の物質が、初期胚内の外因性ＤＮＡを安定化させ、それによって遅延した組込みを促進し；このような物質の非存在下（例えば、単為生殖生物内）では、外因性ＤＮＡは、それが組み込まれ得る前に分解される、というものである。
【０１１１】
精子頭部ｐＣＸ−ＥＧＦＰの共注入後、胚の発生能は、含有する蛍光割球の比率が上昇するにつれて、減少した（表１）。対照的に、精子頭部ｐｘＣＡＮＬａｃＺの共注入後のｔｇ発現は、胚発生を阻害しなかった（表１）。理論に制限されることなく、このことは、ＧＦＰ発現の有害効果を反映している可能性がある。すなわち、初期胚発生は、ＧＦＰ発色団の成熟に付随するＨ2Ｏ2の放出に対して非常に感受性であり得る（Ｒ．Ｙ．Ｔｓｉｅｎ、前出）。
【０１１２】
（ＤＮＡをコードする外因性レポーターもしくは精子頭部、またはその両方による第ＩＩ分裂中期卵母細胞の微量注入後に産生された、生子孫における導入遺伝子の発現）
ｔｇ  ＤＮＡ構築物のゲノム組込みが生子孫（創始マウス）において実証され得るか否かを決定するために、３つの膜崩壊手順のうちの１つに供された精子頭部をｐＣＸ−ＥＧＦＰ  ＤＮＡと共注入した。得られた胚を、上記のようにインビトロにて３．５〜４日間（桑実胚−未分化胚芽細胞ステージまで）培養し、次いで、非選択的（すなわち、蛍光性に基づかずに）に代理母に移した。ｔｇ組込みの表現型分析は、長波長ＵＶ光下での、それぞれ図３Ａ（ａ）および図３Ｂ（ｂ）に例示されるようなトランスジェニックマウスおよび非トランスジェニックコントロールマウス由来の尾部端生検の試験によるものであった。トランスジェニックマウスの緑色蛍光性の皮膚を、非緑色毛を通して可視化し得た。高い比率（１７％〜２１％）の子孫が、皮膚における観察可能なＧＦＰ発現に関してトランスジェニックであった（表２）。この発現の効率は、精虫を調製するために使用される膜崩壊方法に依存しなかった。満期（ｔｅｒｍ）への接合子発生の割合は、各３群の膜崩壊された精子頭部について同等（１２％〜１４％）であったが、外因性ＤＮＡの非存在下で同様に処理された頭部の微量注入後に得られた速度と比較すると比較的低かった。
【０１１３】
これらのデータは、表１で例証される結果を一致する。このデータは、ＧＦＰ陰性細胞を含む胚が、すべて陽性である細胞を有する胚よりも満期へ発生する可能性があることを示す。さらに、陰性とスコア付けされたいくつかの生子孫は、培養の３．５日目に、ＧＦＰ陽性細胞およびＧＦＰ陰性細胞の両方を含むモザイク胚から生じたようである。理論に束縛されることなく、共注入されたｐＣＸ−ＥＧＦＰ  ＤＮＡは、移植前および移植後の両方の胚発生に対して有害な効果を有し得ると考えられる。しかし、移植後発生の阻害が、ｔｇ発現または外因性ＤＮＡ自体の存在の結果であるか否かは未知である。
【０１１４】
サザンブロッティングによる（図３Ｂ）か、またはＰＣＲによる（図３Ｃ）尾部端の総ゲノムＤＮＡの物理的分析は、緑色蛍光を示したすべての創始マウス系統（最初に表現型的に陰性とスコア付けされたが、その生検された尾部端がＧＦＰ発現を示したものを含む）が、ｔｇを保有することを示した。３つの場合において、ｔｇは、検出可能な緑色蛍光を欠損した創始体でＰＣＲにより実証された。理論に束縛されることなく、ｔｇの非発現は、ｔｇ組込み遺伝子座での局所的なシス活性エレメントに起因すると考えられる。ｐＣＸ−ＥＧＦＰフラグメントをプローブとして使用する、コントロールＢ６Ｄ２Ｆ、（ｗｔ）（０）由来、および創始マウスメンバー３（５〜９）、１９（＞５０）、２８（５〜９）、および４１（２）由来の総ＤＮＡのサザンブロット分析を図３Ｂに例示する。ここでは、１ゲノムあたりの推定ｔｇコピー数を括弧内に示す。サザンブロット分析は、創始体におけるｔｇコピー数が１以下から５０を超えるまで範囲することを示した。この結果は、前核微量注入後のｔｇ組込みのパターンに類似する。ゲノムｐＣＸ−ＥＧＦＰ  ＤＮＡの物理的特徴およびＧＦＰ発現の効率の両方は、ｔｇ  ＤＮＡが組込みにおいてひどい再配列を受けなかったことを示唆する。
【０１１５】
マウス１６、１７、３０、３６、４７、４９、コントロールＢ６Ｄ２Ｆ１（ｗｔ）、３、１９、２８および４１由来の総ＤＮＡのＰＣＲ分析を、図３Ｃに例示する。これは、マウス１７、３、１９、および２８におけるＧＦＰ導入遺伝子の存在を確認する。
【０１１６】
無作為選択した１２のＧＦＰを発現する創始体（表２および類似系列由来の雌８匹、雄４匹）を、非トランスジェニック動物と交雑して、１つケース（雌）を除くすべてにおいて同腹子を産生した。１１匹の繁殖性創始体のうち、８匹が皮膚において異所的にＧＦＰを発現する子を産生した（２７％〜５０％の頻度（平均−４０％））。大半の場合におけるｔｇ遺伝のパターンは、単一遺伝子座ＧＦＰ遺伝子に関するメンデルの生殖細胞系伝達に一致した。
【０１１７】
本発明を、好ましい実施態様を参照して本明細書中で記載したが、開示される特定の形態に本発明を制限することは意図されないことが理解されるべきである反対に、本発明の精神および範囲内にあるすべての変更および改変形態を包含することが意図される。
【０１１８】
【表１】
0003830760.tif 000002
【０１１９】
【表２】
0003830760.tif 000003
*各列は、脱膜精子頭部およびプラスミドｐＣＸ−ＥＧＦＰのフラグメントで共注入された卵母細胞から産生された胚および子の発生を記録する。
†ｍ−ｂ、桑実胚−未分化胚芽細胞。括弧内の値は、胚移入においてレシピエントとして使用された代理母の数を示す。
§Ｔｇ発現：＋、陽性子は、皮膚において異所的にＧＦＰを発現する子である。
**値は、有意には異ならない。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、インタクトな（新鮮な）（Ａ）、またはその膜がＴｒｉｔｏｎＸ−１００（Ｂ）、凍結−融解した（Ｃ）、もしくは凍結乾燥（Ｄ）によって破壊されているかのいずれかのマウス精虫の頭部にわたる例示的な矢状切片を例示する顕微鏡写真である。ａｃ、先体；ｅｑ、赤道セグメント；ｐａ、先体後（ｐｏｓｔａｃｒｏｓｏｍａｌ）領域。
【図２】  図２は、シングルショットダブルトランスジェネシスによって産生されたトランスジェニック胚を例示する顕微鏡写真である。卵母細胞は、ｐＣＸ−ＬａｃＺおよびｐＣＸ−ＥＧＦＰ  ｔｇ  ＤＮＡの混合物とプレインキュベートされた精虫を微量注入した。同じ胚を、未染色（図２Ａ）、長波長（４８０ｎｍ）紫外（ＵＶ）光下のＧＦＰ発現（図２Ｂ）、およびβ−ガラクトシダーゼ発現のためのＸ−ｇａｌでの染色（図２Ｃ）で、Ｈｏｆｆｍａｎ調節対比顕微鏡よって３．５日後に観察したもの（４００倍率）を示す。
【図３】  図３は、トランスジェニック創始体および非トランスジェニックコントロールからの尾部端（ｔａｉｌ−ｔｉｐ）生検の分析を例示する顕微鏡写真である。（図３Ａ）非トランスジェニック（ａ）系統（マウス１６）およびトランスジェニック緑色蛍光（ｂ）系統（マウス３）からの尾部端の蛍光立体顕微鏡写真（４０倍率）。緑色蛍光皮膚は、非緑色毛によって視覚化され得る。（図３Ｂ）コントロールＢ６Ｄ２Ｆ１（野生型、ｗｔ）（０）ならびにマウス番号３（５〜９）、１９（＞５０）、２８（５〜９）、および４１（２）からの総ＤＮＡの、ｐＣＸ−ＥＧＦＰフラグメントをプローブとして使用する、サザンブロット分析。ゲノムあたりの推定されるｔｇコピー数を、括弧で示す。（図３Ｃ）マウス番号１６、１７、３０、３６、４７、４９、コントロールＢ６Ｄ２Ｆ１（ｗｔ）、マウス番号３、１９、２８、および４１からの総ＤＮＡのＰＣＲ分析。
【図１】
0003830760.tif 000004
【図２】
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【図３】
0003830760.tif 000006