(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ハイブリドーマ３Ｄ５（DSM ACC2120）によって生産されるモノクローナル抗体ＡＣＡ１２５である抗イディオタイプモノクローナル抗体。
【請求項２】
組換えによって生産される請求項１記載の抗イディオタイプモノクローナル抗体。
【請求項３】
以下の特徴を有する請求項１または２記載の抗イディオタイプモノクローナル抗体：
（ａ）抗ＣＡ１２５抗体と反応する、
（ｂ）該抗ＣＡ１２５抗体との結合において、ＣＡ１２５と競合する、
（ｃ）抗−抗イディオタイプ抗体（Ａｂ３）の誘導を引き起こす、並びに
（ｄ）抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）及び細胞媒介性細胞障害を誘導する。
【請求項４】
さらに以下の特徴を有する請求項３記載の抗イディオタイプモノクローナル抗体：
（ｅ）ＣＡ１２５に対するモノクローナル抗体ＯＣ１２５との結合定数が少なくとも２．３×１０9Ｍ-1。
【請求項５】
該抗イディオタイプモノクローナル抗体の結合特異性を有する請求項１〜４いずれか記載の抗イディオタイプモノクローナル抗体のフラグメント。
【請求項６】
該抗イディオタイプモノクローナル抗体のｆ（ａｂ）又はｆ（ａｂ）2フラグメントである請求項５記載のフラグメント。
【請求項７】
請求項１〜４いずれか記載の抗イディオタイプモノクローナル抗体を生産する細胞株。
【請求項８】
ハイブリドーマである請求項７記載の細胞株。
【請求項９】
ハイブリドーマ３Ｄ５（DSM ACC2120）である請求項８記載の細胞株。
【請求項１０】
請求項２記載の抗イディオタイプモノクローナル抗体を生産する請求項９記載の細胞株。
【請求項１１】
請求項１〜４いずれか記載の抗イディオタイプモノクローナル抗体、又は請求項５若しくは６記載のフラグメント、及び必要に応じて薬学的に許容できる担体を含有する、ＣＡ１２５陽性の悪性腫瘍の治療用の医薬組成物。
【請求項１２】
悪性腫瘍が上皮卵巣癌である請求項１１記載の医薬組成物。
【請求項１３】
ＣＡ１２５陽性の悪性腫瘍の治療のための医薬組成物の製造のための、請求項１〜４いずれか記載の抗イディオタイプモノクローナル抗体、又は請求項５若しくは６記載のフラグメントの使用方法。
【請求項１４】
悪性腫瘍が上皮卵巣癌である請求項１３記載の使用方法。
【請求項１５】
サンプル中のＣＡ１２５の測定のためのキットにおける標準としての、請求項１〜４いずれか記載の抗イディオタイプモノクローナル抗体、又は請求項５若しくは６記載のフラグメントの使用方法。
【請求項１６】
サンプルが血清、血漿又は滲出液である請求項１５記載の使用方法。
【請求項１７】
抗ＣＡ１２５抗体の生産のための抗原としての、請求項１〜４いずれか記載の抗イディオタイプモノクローナル抗体、又は請求項５若しくは６記載のフラグメントの使用方法。
【請求項１８】
（ａ）抗ＣＡ１２５抗体を調製し、
（ｂ）工程（ａ）の抗ＣＡ１２５抗体を用いてヒトを除く哺乳動物を免疫し、
（ｃ）工程（ｂ）において免疫された哺乳動物の脾臓細胞とミエローマ細胞株を融合し、及び
（ｄ）該抗イディオタイプモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマを選択する工程、
を有する請求項１〜４いずれか記載の抗イディオタイプモノクローナル抗体の生産方法。
【請求項１９】
（ａ）請求項１〜４いずれか記載の抗イディオタイプモノクローナル抗体をコードする発現ベクターを用いて宿主細胞をトランスフェクトし、
（ｂ）該発現ベクターによりコードされたポリペプチドが効果的に発現するために、及び組換え抗体分子が正しい構造をとるために、トランスフェクションを受けた宿主細胞を処理し、並びに
（ｃ）分泌された抗体分子を培地から回収する工程、
を有する請求項２記載の抗イディオタイプモノクローナル抗体の組換え的生産方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は、抗ＣＡ１２５抗体と反応し、該抗ＣＡ１２５抗体との結合においてＣＡ１２５と競合するモノクローナル抗イディオタイプ抗体に関連する。
さらに、本発明は、該モノクローナル抗イディオタイプ抗体を産生するハイブリドーマに関連する。本発明はまた、該モノクローナル抗ＣＡ１２５抗体を生産する方法およびこれらを含有する医薬組成物に関連する。これらの医薬組成物は、ＣＡ１２５陽性悪性腫瘍、とくに上皮卵巣癌の治療に有用である。
現在まで、卵巣癌の腫瘍関連抗原または腫瘍細胞を使用した免疫療法の有効性はまだ証明されていない。多くのユニークな腫瘍関連抗原が記載され、ワクチンに使用されたが、時に腫瘍拒絶（tumor rejection）が見られたのみで、何故免疫系が腫瘍細胞を破壊できないのかについては明確には理解されていない；レイチャウドリ(Raychaudhuri)ら、J.Immunology 139(1987),271。この理由の一つとして、利用できる腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）が異なったクラスであるために、効果的な抗腫瘍応答を起こすことができないでいる可能性がある；ダルグレイシュとケネディ（Dalgleish and Kennedy）,Vaccine 6(1988),215およびリー(Lee)ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82(1985),6286。最も多いＴＡＡはクラスIII腫瘍関連抗原に属しており、悪性細胞と多くの正常細胞の両方で見られるが、これらは通常悪性細胞においてより高い濃度で発現する。
従って、患者における抗腫瘍免疫の欠如の理由としては、腫瘍関連抗原（クラスIII）と自己抗原の緊密な関係、および宿主の免疫系が、抗原量の緩徐な増加により腫瘍抗原にトレランスを持っていることが考えられる。さらに、癌に罹患している患者は、ほとんど免疫抑制の状態にある；ワグナー（Wagner）ら、Tumordiagnostik & Therapie 11(1990),1。
実験的に誘発したトレランスを克服する有効な方法は、異なった分子環境における関連する抗原をトレンランスを持った免疫系に与えるることであるが、これは、よく定義され容易に精製できる抗原についてのみ行うことができる：レイショウドリ(Raychaudhuri)ら、J.Immunology 137(1986),1743。ニールス・ヤーン（Niels Jerne）のネットワーク仮説によると、免疫系は、相補的構造を介して相互作用する抗体とリンパ球から成っている；ヤーン(Jerne)、Ann.Immunol.(Paris)125C(1974),373。リンパ球間の関連は、抗体分子上に存在する可変領域構造または特異的受容体によって決まる。この系においては、「内部イメージ」抗体は、元来の抗原エピトープによく似た特別のイディオタイプを発現し、従って、そのような抗体分子の可変領域によって免疫系に提示されることができる。このような抗体は、もしこれらが特定抗原の内部イメージを持っている場合には、これらは抗イディオタイプ抗体−ベータ（Ａｂ２β）と定義される；サーニイおよびヒールナウホ(Cerny and Hiernaux)、「イディオタイプネットワークの概念：イディオタイプネットワークと疾病の概説と機能」("Concept of Idiotypic Network:Description and Functions in Idiotypic Network and Diseases)、サーニイおよびヒールナウホ(Cerny and Hiernaux)、Eds.,American Society for Microbiology,Washington,1990;レイシャウドリ(Raychaudhuri)ら、J.Immunology,139(1987),271。
免疫トレランスを克服するための別の方法は、腫瘍関連抗原に対する抗体（Ａｂ１と呼ばれる）を用いてイディオタイプネットワークを開始させることである。このことは、腫瘍関連抗原の「内部イメージ」によく似た抗イディオタイプ抗体（Ａｂ２β）の産生を誘発する。この原理は、ＴＡＡの重要なエピトープから、抗体の抗原結合領域の表面上に腫瘍関連抗原のミラーイメージ（mirror image）を発現させるイディオタイプ決定基にトランスフォームするというものである；サーニイおよびヒールナウホ(Cerny and Hiernaux)、同上。Ａｂ１はＡｂ２を誘発すると考えられ、これは次にＩｄ+（Ａｂ１+）Ｂ細胞またはＩｄ+ＴH細胞を誘発するか、あるいは予定される抗−腫瘍反応をＩｄ+ＴS細胞を誘発して抑制する原因となる；サーニイおよびヒールナウホ(Cerny and Hiernaux)、同上、レイシャウドリ(Raychaudhuri)ら、J.Immunology,137(1987),2096、ウェッテンドロフ(Wettendorff)ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86(1989),3787。
要するに、Ａｂ２βは２つの方法によって特異的な腫瘍免疫を誘発することができる。第一は、Ａｂ２βは重要なエピトープをある異なった方法で提供することができ、その結果、患者の免疫系を調節する。第二は、Ａｂ２βは、それ自体で腫瘍抗原に結合するＡｂ３の産生をを誘発することができる（Ｆｉｇ．１参照）；サーニイおよびヒールナウホ(Cerny and Hiernaux)、同上。新しい「抗原模倣（Antigen Mimicry）」概念は、全てのイディオタイプは調節作用を持つとしており、また外部抗原およびイディオタイプの両方が、特異的な応答を起こす同じ調節性相互作用の引き金となるだろうと予測している；サーニイおよびヒールナウホ(Cerny and Hiernaux)、同上。
卵巣癌は、全ての婦人科系癌の中で、明らかに最も死亡頻度が高い。卵巣の癌は、毎年100.000名の女性において、新規に15名の癌患者が発生するという頻度である。生存率、およびこのタイプの癌患者の予後は非常に悪い；グロークラー−リーズ（Gloeckler-Ries）、Cancer 71(1993),524、シュミット−マチーセンおよびバスタート（Schmidt-Matthiesen and Bastert):”Gynaekologische Onkologie”,Schattauer,New York,1987、ザンダー(Zander)ed.:”Ovarialkarzinom-Fortschritte fuer das diagnostische und thera peutische Handeln”,Urban & Schwarzenberg,Munich,1982。これらの癌の約80％が、進行した段階になってやっと発見され、全ての卵巣癌患者の６０％が、手術時に１０ｃｍより大きな腫瘍塊を持っている。しかし、卵巣癌はまた、しばしば急速に増殖する腫瘍のようで、化学療法抵抗性の腫瘍の生存率（survival rate）は約６ヶ月である；グロークラー−リーズ（Gloeckler-Ries）、同上、シュミット−マチーセンおよびバスタート（Schmidt-Matthiesen and Bastert）、同上、ザンダー(Zander)、同上。全ての病期についての全体的５年間生存率は、２０から３０％の間である。進行した(extended)病期(IIIからIV）、癌が全腹腔に拡大および/またはリンパ節転移(IIIa-c)または肺や肝臓内への転移のような他臓器への転移（ＶＩ）をふくむ病期においては、生存率は、わずかに約１０％である；シュミット−マチーセン（Schmidt-Matthiesen）。
ＣＡ１２５と呼ばれる高分子量の糖タンパク質が、全卵巣癌患者中の８０％に検出された。この糖タンパク質は腫瘍組織において発現されるので、この分子の患者血漿への分泌は、腫瘍の量(burden)と相関させることができる。ＣＡ１２５の濃度を調査することは、疾患の臨床状態の観察および緩解と進行についての情報を得るためのツールとなる；シュミット−マチーセンおよびバスタース（Schmidt-Matthiesen and Basters）、同上。このような分子は「腫瘍マーカー」と定義され、糖タンパク質自体はいわゆる「腫瘍関連抗原」（ＴＡＡ）である。腫瘍関連抗原は、生物の正常組織にも少量であるが発現し、腫瘍関連抗原クラスIIIと定義されている。ＣＡ１２５腫瘍関連抗原は、子宮と子宮内膜、およびファローピウス管、卵巣などの骨盤内臓器、腹腔および胸腔内の漿膜などの正常な組織においても検出された。
この腫瘍関連抗原に対するネズミモノクローナル抗体は、１９８１年および１９８８年に開発された；バスト(Bast)ら、J.clin.Invest.68(1981),1331、クランツ（Krantz）ら、J.Cell Biochem.(Suppl.)12 E(1988),139。これらの抗体は、インビトロ試験においてＣＡ１２５の濃度の測定に使用されたほか、腫瘍患者の診断および治療後の検査として、放射標識抗体の分布をシンチグラフィーによって検知する放射免疫検査(radioimmunodetection)を実施するために、放射標識抗体としてヒトで使用された。
根治外科手術の技術や複合化学療法(polychemotherapeutical treatment regimes)の発展にもかかわらず、この癌の全般予後は満足できるほど改善していない。従って、治療方法の新しい技術を開発することが必要である；ザンダー(Zander)同上。従って、この技術分野においては、根治的外科手術や複合化学療法などの既知の方法の否定的な効果を克服する技術に基づいた、卵巣癌の有効な治療が必要とされている。
本発明の技術的課題は、ＣＡ１２５腫瘍関連抗原が出現することを特徴とする悪性疾患を治療するための新規な化合物を提供すること、この化合物を含む医薬組成物を提供すること、およびこの化合物を生産する方法を提供することである。
この技術的課題の解決は、請求の範囲において特徴づけられる態様を提供することによって達成される。
従って、本発明は、抗ＣＡ１２５抗体と反応し、該抗ＣＡ１２５抗体との結合においてＣＡ１２５抗原と競合する、イディオタイプ抗体に関連する。このような抗イディオタイプ抗体は、ＣＡ１２５腫瘍関連抗原に対する免疫応答を誘発する能力、すなわち特異的抗腫瘍免疫を誘発する能力があると信じられている。
この意味で、「競合する」という用語は、該抗イディオタイプ抗体はＣＡ１２５のエピトープに対応するエピトープを持っているために、抗ＣＡ１２５抗体に対して、少なくともＣＡ１２５と同等の親和性を持っているということを意味している。
本発明は次の臨床観察に基づいている。進行した病期の卵巣癌に罹患している患者の生存率に及ぼす、腫瘍関連抗原に対する抗イディオタイプ抗体の誘導の効果を、発明者等の最初の研究で評価した。すなわち、ヒトＩｇＧ  抗−ｍＡｂ−ＯＣ１２５応答を誘発するために、患者をＴＡＡ  ＣＡ１２５に対するｍＡｂ−ＯＣ１２５のＦ（ａｂ）2−フラグメントに数回曝露した；レインスバーグ(Reinsberg)ら、Clin.Chem.36(1990),164)。これらの生存率を、ネットワーク系を誘導していないが、同じ手術および化学療法を受けた同様の患者群と比較した；ワグナー(Wagner)ら。
１９８５年と１９９０年の間に、診断目的の放射免疫検知（ＲＩＤ）のために、２８名の進行卵巣癌の患者（病期IIからIV  ＦＩＧＯ）に、腫瘍関連抗原ＣＡ１２５に対するＯＣ１２５ｍＡｂの１３１−Ｉ−標識−Ｆ（ａｂ）2−フラグメント（ＩＭＡ−ＣＩＳ−２）（国際ＣＩＳ、ＧＩＦ−ＳＵＲ−ＹＶＥＴＴＥ、フランス）を投与した（１ｍｇ、静脈内投与）；ワグナー（Wagner）ら、Biotechnology Therapeutics 3(1992),81。
抗体は、患者の内の９名に３回以上投与された。これらの患者の全てが、腫瘍関連抗原ＣＡ１２５によく似たＯＣ１２５−フラグメントに対するイディオタイプ抗体（Ａｂ２β）を高い血漿レベルで示した；レインスバーグ(Reinsberg)ら、同上。
イディオタイプネットワークの活性化は、根治的な腫瘍減縮術（radical tumor-reduction）や複合化学療法から成る通常の治療を受けており、術前のＴＡＡ  ＣＡ１２５の血漿値が高い卵巣腺癌の患者において実施した。
下記の適用スケジュールを実施した後、抗イディオタイプ抗体の誘導において最も高い応答が検知された。最初のＲＩＤは、根治手術後に複合化学療法を３クール行った後に実施し、２回目は６週間後に、追加（boostering）投与はさらに３ヶ月後に行った。
認められた唯一の副作用は、Ａｂｂｏｔｔ  ＣＡ１２５  ＥＩＡ  モノクローナル（Abbott Diagnostic,Wiesbaden-Delkenheim,Germany）により測定され、抗イディオタイプ抗体により誘導された、ＣＡ１２５腫瘍マーカー濃度の擬陽性値の極端な増加であった；レインスバーグ(Reinsberg)ら、同上。アナフィラキシー反応などのその他の副作用は観察されなかった。発明者の最初の結果は、たとえ病期が進行していても、ＴＡＡクラスIIIのＣＡ１２５に似たＯＣ１２５に対する抗イディオタイプ抗体（Ａｂ２β）の誘導により、生存率が延長することを示している。同様の背景を持つ患者の生存率と比較して、抗イディオタイプ抗体を産生したこれらの患者において著しい差がみられた；Ｆｉｇ．２参照、ワグナー（Wagner）ら、同上。従って、本発明の抗イディオタイプ抗体は、ＣＡ１２５陽性癌の患者において抗−腫瘍免疫誘導のための免疫療法におけるワクチンとして有益に使用できると結論される。
本発明の好ましい態様においては、抗イディオタイプ抗体は、ワグナー（Wagner）ら、J.Immunol.130(1983),2302の修正方法により測定したモノクローナル抗体ＯＣ１２５に対する結合定数が少なくとも２．３×１０9Ｍ-1である。
別の好ましい態様においては、抗イディオタイプ抗体は、例えばラット、マウス、ヤギなど、全ての哺乳類動物から、例えばケーラーとミルステイン(Koehler and Milstein)、Nature 256 (1975),495およびガルフレ(Glfre)、Meth.Enzymol.73(1981)、３に記載される通常の技術により得られるモノクローナル抗体である。好ましくは、マウス由来の抗イディオタイプ抗体である。
特に好ましい態様においては、本発明の抗イディオタイプ抗体は、ハイブリドーマ３Ｄ５によって産生される抗体ＡＣＡ１２５である。以下、参照。
特に好ましい態様においては、抗イディオタイプ抗体は遺伝子組換えによって生産される。該抗体は、通常の方法によって調製することができる。例えば、本発明の抗イディオタイプ抗体のＨ鎖とＬ鎖の可変領域をコードする遺伝子フラグメントは、例えば抗体産生マウスハイブリドーマ細胞に含まれる他の染色体遺伝子から、通常の方法（例えば、マニアチスら(Maniatis et al.)、”Molecular Cloning”,Cold Spring Harbor Lab.(1982)およびグローバー編(Glover ed.)”DNA Cloning Vol.I”IRL Press(1985)）に従ってゲノムライブラリーを構築し、例えばマウスＩＨプローブを使用して該抗体の可変領域をコードする遺伝子をスクリーニングすることにより、分離することができる。
目的とするクローンを分離した後、抗体Ｖ領域のヌクレオチド配列を決定することができる。
Ｈ鎖またはＬ鎖の可変領域をコードするＤＮＡ配列は、例えば、オイおよびモリソン(Oi and Morrison)、Biotechniques 4(1986),214およびEP-B1 0 194 276に開示されるように、宿主細胞内で複製および増幅する、Ｌ鎖とＨ鎖の遺伝子トランスフェクションベクターを別個に構築するのに使用できる。
本発明の別の目的は、本発明のモノクローナル抗イディオタイプ抗体を産生する細胞株を提供することである。このような細胞株の例は、３Ｄ５および５Ａ８であり、共にＣＡ１２５に似たモノクローナル抗体を産生する。
好ましい態様においては、該細胞株はハイブリドーマである。本発明では、特に、本発明のモノクローナル抗体を産生する能力のあるＢＡＬＢ／ｃマウス細胞とミエローマ細胞株Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８，６５３、Ｔ．Ａ．スプリンガー編（T.A.Springer(ed.)）：”Hybridoma Technology in the Biosciences and Medicine,”Plenum Press,New York,1985に詳しく記載されている、を融合して得られるるハイブリドーマが好ましい。
特に好ましいのは、ＡＣＡ１２５を産生するハイブリドーマ３Ｄ５である。このハイブリドーマは、ブダペスト条約の要項に従って１９９３年３月２２日付けでＤＳＭ”Deutsche Sammlung von Mikroorganismen”,3300 Braunschweig,Mascheroder Weg 1B,Germanyに、寄託番号DSM ACC2120で寄託された。
本発明のさらなる目的は、抗イディオタイプ抗体の組換え発現に適した細胞株を提供することである。適した宿主細胞には、トランスフェクション後に上記のベクターによりコードされたポリペプチドの発現を可能にし、さらに宿主細胞内において組換え抗体分子が正しく形成し、この抗体が培養培地に分泌されることを可能とする細胞ならば、真核あるいは原核のいずれの細胞も含まれることは当業者にとって明らかである。
別の態様では、本発明は本発明の抗イディオタイプ抗体のフラグメントに関連する。これらのフラグメントは、普通本発明の該抗イディオタイプ抗体の結合特異性を持っている。これらのフラグメントは、ボグスラブスキーら(Boguslawski,et al.),J.Immunol.Meth.120(1989),51およびヴァイア(Weir)(編),Handbook of Experimental Immunology,Blackwell Edinburgh,1986において記載されるような通常の技術によって作製することができる。
好ましい態様においては、これらのフラグメントはｆ（ａｂ）−またはｆ（ａｂ）2−フラグメントである。
本発明のさらなる目的は、本発明の抗イディオタイプ抗体のいずれかまたはそのフラグメントを、薬学的に許容できる担体（carrier）と共に含む医薬組成物を提供することである。これらの医薬組成物は、特に好ましい態様としての卵巣癌など、全てのＣＡ１２５−陽性の悪性腫瘍の治療およびこれらの腫瘍に対するワクチンとして適している。
このようなｐＨ、安定性等に関して生理学的に許容される組成物の調製および処方は、当業者の技術的範囲内にある。好適な薬学的に許容される担体(carriers)は当業者に良く知られるものであり、リン酸塩で緩衝化された食塩溶液、水、油／水型エマルジョンのようなエマルジョン、各種の湿潤剤、無菌溶液、錠剤、コート錠、およびカプセルなどを含む。通常、そのような担体は、デンプン、ミルク、砂糖、ある種の粘土、ゼラチン、ステアリン酸またはその塩、ステアリン酸マグネシウムまたはカルシウム、タルク、植物性脂肪または油、ゴム、グリコール、または他の既知の賦形剤を含んでいる。そのような担体は、調味および着色のための添加剤または他の成分を含んでいても良い。上記の担体を含む組成物は、良く知られた通常の方法で処方(formulate)される。これらの医薬組成物は、適切な用量で対象者に投与することができる。適切な用量は、本発明の抗イディオタイプ抗体が100μgから１ｍgの範囲で投与される用量である。適切な組成物の投与は、例えば静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、局所または皮内などの種々の方法で投与して良い。
本発明のさらなる目的は、例えば卵巣癌患者において、ＣＡ１２５濃度検査用の試料中の、ＣＡ１２５の存在または濃度を測定する診断キットの検量標準として、該抗イディオタイプ抗体またはそのフラグメントを使用することである。好ましい態様においては、試料は血清、血漿、または滲出液である。
本発明のさらなる目的は、該抗イディオタイプ抗体またはそのフラグメントを、抗ＣＡ１２５抗体を調製するための抗原として使用することである。この生産は、例えばミトライ(Mitrahi)(編):Monoclonal Antibodies:Production and Application,Alan R.Liss,New York,1989に記載されるような当業者に良く知られた方法により行われる。
本発明はまた、次の工程を含んで成る、抗イディオタイプ抗体を産生するための方法を提供する：
（ａ）抗ＣＡ１２５抗体を作製する
（ｂ）工程（ａ）の抗ＣＡ１２５抗体で哺乳動物を免疫する
（ｃ）免疫された哺乳動物の脾細胞とミエローマ細胞とを融合する
（ｄ）該抗イディオタイプ抗体を産生するハイブリドーマを選択する。
最後に、本発明は、抗イディオタイプ抗体を遺伝子組換えにより生産する方法を提供する。この方法は、上記のポリペプチドをコードする発現ベクターで、適切な宿主細胞をトランスフェクトし、該発現ベクターによりコードされたポリペプチドを発現し、宿主細胞内に組換え抗体分子を適切に形成し、該抗体を培養培地の中に分泌するようにトランスフェクトした細胞を処置し、分泌された抗体分子を培養培地から回収することから成る。
図面の説明：
図１：腫瘍関連抗原に対するモノクローナル抗体（Ａｂ１）の適用によって引き起こされたイディオタイプ応答及び抗イディオタイプ応答。Ａｂ１は、抗イディオタイプ抗体（Ａｂ２）を患者中で生産するイディオタイプ陽性Ｂ細胞の誘導を引き起こす。これらのＡｂ２は続いて２通りの反応をすると考えられる：第一は、Ａｂ３の生産を誘導し、そして再び、腫瘍関連抗原に対して向けられる反応。第二は、新規の抗原の発現を引き起こし、それによりイディオタイプ陽性Ｔ細胞の誘導による免疫応答の調節を引き起こす反応；サーニーとヒールナウホ（Cerny and Hiernaux）、同上。
図２：この図は上皮卵巣癌の患者の生存率を示す。Ｘ軸は月で示した生存期間を表し、Ｙ軸は進行卵巣癌患者の生存率を示す。
Ｉ群（抗イディオタイプ抗体を生産する）（太線）は２８名の患者からなる。II群（抗イディオタイプ抗体を生産しない）（中間の太さの線）は病期分布が同程度（ＦＩＧＯ  III〜IV）で、同じ手術及び同じ化学療法を行われており、免疫治療法を実施していない３２名の患者からなる。細線は、１９８５年から１９９２年の間の全サンプルの総生存率を示す。Ｉ群とII群との間の差異は極めて有意である（ｐ＜０．００１、Wilcoxon）。
図３：ネズミモノクローナル抗体の生産。
図４：この図は、抗イディオタイプｍＡｂ  ＡＣＡ１２５による免疫化後のラットにおける、ＣＡ１２５抗原との競合による抗ＣＡ１２５抗体（Ａｂ３）の結合の阻害を示す。
図５：この図は、誘導されたＡｂ３によるＣＡ１２５陽性標的細胞の補体依存性溶解(complement dependent lysis)を示す。
図６：ラットにおけるＡｂ２を用いての免疫化後の、抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）。
図７：非免疫化動物（左）及びｍＡｂ  ＡＣＡ１２５のＦ（ａｂ’）２フラグメントの投与後の動物からの効果細胞の細胞媒介性溶解。上図（superior graph）はＣＡ１２５非発現ＳＫ−ＯＶ３細胞株についての溶解を示し、下図（inferior graph）はＣＡ１２５発現ＮＩＨ−ＯＶＣＡＲ３についてのグラフで、約６０％の最大溶解が示されている。
以下の実施例により本発明を説明する：
実施例１：モノクローナル抗体の作成
モノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ細胞は常法により得た；ガルフレとミルスタイン（Galfre and Milstein)、同上、ケーラーとミルスタイン、同上、Springer,ed.,”Hybridome Technology in the Biosciences and Medicine”,Plenum Press,New York,1985。図３は、ハイブリドーマ細胞の誘導によるモノクローナル抗体の生産の原理を示す。
実施例２：モノクローナル抗イディオタイプ抗体の生産
雌性のＢＡＬＢ／ｃマウス（６週齢）を、市販のＣＡ１２５測定キット（Enzymun-Test  ＣＡ１２５、ベーリンガーマンハイム、マンハイム、ドイツ）の抗ＣＡ１２５抗体を、スカシガイヘモシアニン（ＫＬＨ）に結合させて、３ヶ月間（最初の免疫化：１００μｇ、次いで５０μｇずつ３回ブースターする）かけて免疫化した。ミエローマ細胞株Ｐ３×６３Ａｇ８，６５３を融合パートナーとして用いた。得られたハイブリドーマ細胞を、ＦＣＳ及びＨＥＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地で培養した。
特異的抗体を生産する細胞は、常法により３回（限界希釈）サブクローニングされた。その結果、クローン３Ｄ５を得た。
実施例３：抗イディオタイプ抗体のスクリーニングアッセイ
ｍＡｂ  ＯＣ１２５抗体のＦ（ａｂ）2フラグメントでマイクロタイタープレートをコートした。ハイブリドーマ細胞の培養物の上清を加え、そしてＰＯＤ結合抗体（ヤギ抗マウスＩｇＧ、Ｆｃフラグメント特異的）を検出に用いた。結合活性はＣＡ１２５抗原の結合による阻害から求められた。
結合親和性の測定のために、ワグナー（Wagner）ら、同上の方法に変更を加えた。
５μｇ／ｍＬのコムギ胚芽レクチン、及び２μｇ／ｍＬのＡＣＡ１２５を、コスター−ＲＩＡ−ストリップ（Coster-RIA-strips）にコートした。Ｊ−１２５標識抗体の一連の希釈列（０．０２〜１０μｇ／ｍＬ）を一定の振盪状態のもと、室温で４時間インキュベートした。結合親和性は、スキャッチャードプロットにおける勾配から算出した（ワグナー（Wagner）ら：”Quantification of Carcinoembryonic Antigen in Serum and Analysis of Epitope Specificities of Monoclonal Antibodies”,Meth.Enzymol.184(1990),507-518）。
クローン３Ｄ５（DSM ACC2120）として寄託されたハイブリドーマクローンは、ＩｇＧ１Ｋ抗体（Ａｂ２）を生産する。この抗体のｍＡｂＯＣ１２５抗体（Ａｂ１）への結合は、ＣＡ125抗原によって完全に阻害される：
0003764165.tif 000002
ハイブリドーマ３Ｄ５（DSM ACC2120）によって生産される抗体ＩｇＧ１Ｋの、抗体ＯＣ１２５に対する結合定数は、少なくとも２．３×１０9Ｍ-1である。
さらに、ＣＡ１２５に対する抗−抗イディオタイプ抗体Ａｂ３（イディオタイプカスケードによる、抗ＣＡ１２５抗体（OC125）を用いての免疫化によって誘導された抗ＣＡ１２５抗体）を生産する数個のクローンが、サブクローニングを通じて検出された。このことにより、Ａｂ２生産細胞が生じたという我々の結果が確認された。
ハイブリドーマクローン３Ｄ５によって生産される腫瘍関連ＣＡ１２５抗原に似たモノクローナル抗イディオタイプ抗体は、ｍＡｂ「ＡＣＡ１２５」と名付ける。Ｆ（Ａｂ）２フラグメントは、ゴーディング（Goding）:Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,Academic Press London,1986等に記載された常法により精製した。「マウスモノクローナル抗体イソタイプキット」（Amersham International PLC,Amersham,U.K.）を、イソタイプの決定に用いた。この抗体はＩｇＧ１Ｋであることが分かった。
この抗体（ＡＣＡ１２５）は、ＣＡ１２５陽性腫瘍の患者へ、腫瘍に対する免疫性を誘導するためのワクチンとして用いることができる。
ネズミモノクローナル抗体（ＡＣＡ１２５）に似た、この抗イディオタイプＣＡ１２５は、エピトープＣＡ１２５のイディオタイプ決定基（determinant）へのトランスフォーメーションである；図１参照。ＡＣＡ１２５は、ＣＡ１２５陽性の悪性腫瘍に対する、Ｔ細胞特異的抗腫瘍免疫を誘導する。一方、ＡＣＡ１２５は、抗−抗イディオタイプ抗体（Ａｂ３）の誘導をも引き起こす。それはＣＡ１２５陽性の腫瘍組織と結合し得るものであり、抗体依存性細胞障害（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity）を誘導し得る。
実施例４：インビボ実験
（Ｉ）ｍＡｂ  ＡＣＡ１２５によるインビボ実験
ｍＡｂ  ＡＣＡ１２５によるインビボ実験は、ラット（IgM/IgG）において、抗ＣＡ１２５の形で、抗−抗イディオタイプ応答を誘導できることを示した（図４）。
これらの、いわゆるＡｂ３は、抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）（図６）に加えて、補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）（図５）を誘導することができる。
さらに、腫瘍関連抗原ＣＡ１２５に似たｍＡｂ  ＡＣＡ１２５を用いて免疫化を繰り返すことにより、ＣＡ１２５発現細胞株に対して特異的な細胞媒介性細胞障害が誘導できることを示すことができた（図７）。
要約すれば、腫瘍関連抗原ＣＡ１２５に似た、このモノクローナル抗イディオタイプ抗体（ｍＡｂ  ＡＣＡ１２５）は、ＣＤＣ、ＡＤＣＣ及びＣＡ１２５発現細胞株に対する細胞媒介性細胞障害を誘導できることを示した。従って、この抗イディオタイプ抗体は、抗イディオタイプネットワークアプローチを用いるモノクローナル抗体での免疫療法における最近の免疫学的基準（ステプレフスキー（Steplewski）：Advances and Outlooks for Immunotherapy of Cancer,Hybridoma,12(1993),493-500）を満たす。
（II）Ｆ（ａｂ’）２フラグメントによるインビボ実験
インビボ試験のために、公表されている常法（ゴーディング（Goding）:Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,Acad.Press London,1986）に従ってＦ（ａｂ’）２フラグメントを調製した。抗−抗イディオタイプ応答の誘導のために、ｍＡｂ  ＡＣＡ１２５のＦ（ａｂ’）２フラグメントを用いてラット（ｎ＝３）を免疫化した。１００μｇのＡＣＡ１２５のＦ（ａｂ’）２フラグメント（３回のブースター）を用いての免疫化の後、抗−抗イディオタイプ応答が起こった（IgM/IgG）。いわゆるＡｂ３の特異的結合活性は、ＡＣＡ１２５の誘導に用いられた抗ＣＡ１２５抗体によって阻害された（図４）。免疫化されていないラットをコントロールとして用いた。
（III）ＣＤＣ
補体媒介性細胞障害の測定のために、免疫化された（Ｆ（ａｂ’）２  ｍＡｂ  ＡＣＡ１２５の投与後）ラットの血清及び免疫化されていないラットの血清を、常法（ゴーディング（Goding）:Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,Acad.Press London,1986）に従って１１１−インジウムで標識したＮＩＨ−ＯＶＣＡＲ３  ＣＡ１２５発現腫瘍細胞株を標的として、補体依存性溶解の検出に用いた。図５は、放出された放射能の計測により求められる、Ｆ（ａｂ’）２  ｍＡｂ  ＡＣＡ１２５を用いての免疫化により誘導される、抗ＣＡ１２５抗体の補体依存性溶解を示す。
（IV）ＡＤＣＣ
抗体依存性細胞障害の測定のために、末梢単核血球（ＰＭＢＣ）及び胸腺由来Ｔ細胞を、ＦＩＣＯＬＬグラジエントによって精製、濃縮し、効果細胞として用いた。標的細胞として、市販のＣＡ１２５発現腫瘍細胞株（ＮＩＨ−ＯＶＣＡＲ３）を用いた。効果細胞及び標的細胞を常法に従ってインキュベートし、免疫化動物及び非免疫化動物の血清を、一連の希釈列で加えた（クルーガー（Krueger）:Klinische Immunpathologie,Kohlhammer,Stuttgart 1985）。放出された放射能は抗体−細胞媒介性溶解（antibody-cell-mediated lysis）と相関性を有している（図６）。
（Ｖ）細胞媒介性細胞障害(cell-mediated cytotoxicity)
細胞媒介性細胞障害の測定のために、末梢単核血球（ＰＭＢＣ）及び胸腺由来Ｔ細胞を、ＦＩＣＯＬＬグラジエントによって精製、濃縮し、効果細胞として用いた。標的細胞として、市販のＣＡ１２５非発現細胞株（ＳＫ−ＯＶ３）及びＣＡ１２５高発現細胞株（ＮＩＨ−ＯＶＣＡＲ３）を用いた。濃度を高めた（in raising cell concentrations）放射標識された標的細胞とリンパ球浮遊液を、細胞媒介性溶解の測定のために常法（クルーガー（Krueger）、同上）に従ってインキュベートした。図７は、左側に非免疫化コントロール及び右側に免疫化動物の細胞溶解の百分率として求められた放出放射能を示す。上図（superior graph）は非発現ＳＫ−ＯＶ３細胞株による溶解を示し、下図（inferior graph）はＣＡ１２５発現ＮＩＨ−ＯＶＣＡＲ３に対するものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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