(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＡＣ−ＰＫ（ＲＡＣキナーゼ）の少なくとも一つのセリンおよび／またはスレオニン残基に関与したリン酸化／脱リン酸化反応の平衡をリン酸化の方向へ移動させることにより活性ＲＡＣ−ＰＫを製造するにあたり、ＲＡＣ−ＰＫをバナデートまたはオカダ酸で処理することを特徴とする方法。
【請求項２】
活性ＲＡＣ−ＰＫを単離する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ＲＡＣ−ＰＫを少なくとも一つのセリンおよび／またはスレオニン残基でリン酸化できる少なくとも一つのキナーゼを、信号伝達経路においてＲＡＣ−ＰＫの上流に含む細胞でインビボでまたは細胞本来の場所で行う、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
(ａ)ＲＡＣ−ＰＫ、セリン／スレオニンキナーゼおよびバナデートまたはオカダ酸を共にインキュベートし、そして(ｂ)インキュベーション混合物から活性ＲＡＣ−ＰＫを精製することを含む、インビトロで行う、請求項１または２記載の方法。
【請求項５】
セリン／スレオニンキナーゼが信号伝達経路でＲＡＣ−ＰＫの上流に存在する少なくとも一つのキナーゼである、請求項４記載の方法。
【請求項６】
ＲＡＣ−ＰＫのセリン残基Ｓ４７３がリン酸化される、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
ＲＡＣ−ＰＫのスレオニン残基Ｔ３０８がリン酸化される、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
(ａ)セリン残基Ｓ４７３および／またはスレオニン残基Ｔ３０８が酸性アミノ酸残基で置換されているＲＡＣ−ＰＫをコードするヌクレオチド配列で適当な宿主細胞を形質転換または形質導入し、(ｂ)組換えＤＮＡ発現システム中で(ａ)のＲＡＣ−ＰＫを発現させ、(ｃ)構成的に（constitutively）活性なＲＡＣ−ＰＫを宿主細胞から単離することを特徴とする、活性ＲＡＣ−ＰＫの製造法。
【請求項９】
酸性アミノ酸残基がアスパラギン酸およびグルタミン酸からなる群から選択される、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
(ａ)のヌクレオチド配列がインビトロ部位特異的変異誘発により発生させたものである、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
インビボリン酸化を介したＲＡＣ−ＰＫの活性化に関与している少なくとも一つのセリンおよび／またはスレオニン残基が酸性アミノ酸残基で置換されている、組換えＲＡＣ−ＰＫ。
【請求項１２】
セリン残基がＳ４７３である、請求項１１記載の組換えＲＡＣ−ＰＫ。
【請求項１３】
スレオニン残基がＴ３０８である、請求項１１記載の組換えＲＡＣ−ＰＫ。
【請求項１４】
酸性アミノ酸残基がアスパラギン酸およびグルタミン酸からなる群から選択される、請求項１１〜１３のいずれかに記載の組換えＲＡＣ−ＰＫ。
【請求項１５】
請求項１１〜１４のいずれかに記載のＲＡＣ−ＰＫを発現することができる、形質転換または形質導入宿主細胞。
【請求項１６】
(ａ)ＲＡＣ−ＰＫを含む細胞とバナデートまたはオカダ酸を共にインキュベートし、(ｂ)候補化合物を添加し、そして(ｃ)ＲＡＣ−ＰＫの活性を測定することを特徴とする、候補化合物についてインビボまたは本来の場所でＲＡＣ−ＰＫの阻害剤としての活性をスクリーニングする方法。
【請求項１７】
（ａ）請求項１〜７のいずれかに記載の方法により得られる活性ＲＡＣ−ＰＫをインキュベートするか、または請求項８〜１０のいずれかに記載の方法により得られる構成的に活性なＲＡＣ−ＰＫをインキュベートするか、または請求項１１〜１４のいずれかに記載の組換えＲＡＣ−ＰＫをインキュベートし、（ｂ）候補化合物を添加し、そして（ｃ）ＲＡＣ−ＰＫの活性を測定することを特徴とする、ＲＡＣ−ＰＫ阻害剤としての活性について候補化合物をスクリーニングする方法。
【請求項１８】
バナデートまたはオカダ酸を工程（ａ）で加える、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
（ａ）ＲＡＣ−ＰＫを請求項１７（ａ）または請求項１８（ａ）によりインキュベートし、(ｂ)ＲＡＣ−ＰＫの潜在的調節剤を添加し、そして（ｃ）当該調節剤の活性を評価することを特徴とする、直接的または間接的にＲＡＣ−ＰＫの活性化に影響を与えるＲＡＣ−ＰＫの潜在的調節剤をスクリーニングする方法。
【請求項２０】
セリン／スレオニンキナーゼおよび／またはバナデートまたはオカダ酸を工程（ａ）で加える、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
セリン／スレオニンキナーゼがＲＡＣ−ＰＫの上流にあるキナーゼである、請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２２】
ＲＡＣ−ＰＫのセリン残基Ｓ４７３がリン酸化される、請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２３】
ＲＡＣ−ＰＫのスレオニン残基Ｔ３０８がリン酸化される、請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２４】
工程(ａ)および(ｂ)を同時に行う、請求項１６〜２０のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は、インシュリン依存的信号伝達経路に関与するキナーゼの活性形を製造する方法、およびスクリーニング法における活性キナーゼの使用に関する。
発明の背景
タンパク質リン酸化および脱リン酸化は細胞性機能の調節に重要である。タンパク質リン酸化は、タンパク質リン酸化および脱リン酸化のカスケードにより細胞外信号が伝達され、増幅される、信号伝達に顕著に関与する。二つの最も良く特徴付けされた信号伝達経路はｃ−ＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ(ＰＫＡ)およびプロテインキナーゼＣ(ＰＫＣ)が関与する。各経路は異なる二次メッセンジャー分子を使用し、プロテインキナーゼを活性化し、そして次に特異的標的分子を活性化する。
セリン／スレオニンキナーゼの新規サブファミリーが近年同定され、クローンされており、それを本明細書ではＲＡＣキナーゼ(ＲＡＣ−ＰＫ；Jones, et al. (1991) Proc. Natrl. Acad. Sci. USA 88, 4171-4175;Jones, et al. (1991) Cell Regulation 2, 1001-1009)と呼ぶが、またＰＫＢまたはＡｋｔとしても既知である。ＲＡＣキナーゼは二つの密接に関連したアイソフォーム、ＲＡＣαおよびＲＡＣβとして同定され、それらは遺伝子配列で９０％相同性を有する。マウスＲＡＣα(ｃ−ａｋｔ)はウイルス癌遺伝子ｖ−ａｋｔの細胞性相同物であり、ＡＴＫ８レトロウイルス由来のＧａｐタンパク質をマウスｃ−ａｋｔのＮ−末端に融合することにより製造する。ヒトＲＡＣβは約１０％の卵巣癌に関与することが判明しており、細胞生育調節におけるＲＡＣキナーゼの関与を示唆する。
細胞生育コントロールに関与する他のキナーゼはｐ７０S6Kとして既知のＳ６キナーゼである。Ｓ６キナーゼは、タンパク質合成を上方制御する事象である、４０Ｓリボソームタンパク質Ｓ６をリン酸化し、細胞サイクルのＧ1相を経由した進行に必要であると信じられている。ｐ７０S6Kの活性はセリン／スレオニンリン酸化により調製され、それ自身セリン／スレオニンキナーゼである。ｐ７０S6K信号伝達経路は、セリン／スレオニンキナーゼのシリーズから成ると信じられ、順番に互いに活性化し、細胞増殖および生育に関連する種々の効果を導く。ＲＡＣ−ＰＫはｐ７０S6Kと同じ信号伝達経路に属するが、その上流であると信じられている。
１９９５年１１月１６日出願のＵＫ特許出願９５２３３７９.９(チバ−ガイギー・アクチエンゲゼルシャフト)に明記してあるように、ＲＡＣ−ＰＫは、細胞生育およびグリコーゲン代謝の調節を含む多くの機能に重要なインシュリン依存的信号伝達に主要な役割を担う。例えば、グリコーゲンシンターゼの活性化を担うグリコーゲンシンターゼキナーゼ−３（ＧＳＫ３）はＲＡＣ−ＰＫの標的である。
天然源、特に組織培養細胞のような簡便な起源から単離した時、ＲＡＣ−ＰＫおよび他の信号伝達キナーゼは、通常不活性状態である。活性キナーゼタンパク質を単離するために、活性キナーゼを所得するための信号伝達経路のスイッチを入れるために細胞を刺激する必要がある。更に、キナーゼ酵素を発現する細胞をキナーゼ活性アッセイに使用するとき、アッセイを開始する前に活性化剤を使用する必要がある。従って、細胞を通常マイトージェンおよび／または活性化剤、例えばＩＬ−２、血小板由来成長因子(ＰＤＧＦ)、インシュリン、表皮成長因子(ＥＧＦ)および塩基性線維芽細胞成長因子(ｂＦＧＦ)で刺激する。このような薬剤は高価であり、大量の活性キナーゼを製造させるかまたは大量の細胞を活性化することが必要な場合、このような薬剤の使用は不利である。
免疫抑制剤または抗増殖剤の候補を同定するために、ＲＡＣ−ＰＫ、または他の信号伝達キナーゼの阻害剤としての活性についての候補化合物のスクリーニングはキナーゼタンパク質の大量の供給を必要とする。近年の方法を使用して、大量の実質的にすべての所望のタンパク質を組換えＤＮＡ発現システムにより製造することが可能である。出願人が現在考慮しているようなキナーゼの場合、しかしながら、このようなシステムは製造されたタンパク質が非リン酸化であり、従って不活性であるため、不十分である。従って、スクリーニング法に使用できるリン酸化キナーゼタンパク質を製造する安価な方法を決定することが必要である。
バナデートがｐ７０S6K自体を活性化できることが既知である(Jan et al., (1988) Biochemistry, 85, 406-410)。活性化の機構は、しかしながら未知である。出願人は、バナデートが一般的に信号伝達キナーゼに作用し、それらを活性化し、ホスファターゼによる脱活性化を防止することを発見した。更に、出願人は、異なるタンパク質と相互作用するバナデートの他のクラスの化合物であるオカダ酸を同様の作用に使用し得ることを発見した。
発明の要約
本発明により、ホスファターゼ阻害剤で処理することを含む、信号伝達経路のキナーゼを活性化する方法を提供する。更に、本発明は活性化キナーゼを使用した免疫抑制剤および抗増殖剤の候補物のスクリーニング法を提供する。
発明の詳細な説明
出願人は、ＲＡＣ−ＰＫ活性の調節がリン酸化／脱リン酸化反応の平衡が不活性形に対する活性ＲＡＣ−ＰＫのレベルを変化させるために移動する、可逆性リン酸化により行われるようであることを観察している。活性化形の構築は、従って、脱リン酸化反応の阻害により促進され、ホスファターゼ阻害剤での処理により達成される。
本発明の驚くべき態様は、バナデートのようなチロシンホスファターゼ阻害剤が、ＲＡＣ−ＰＫを、本明細書に記載のように、このキナーゼがスレオニンおよびセリン残基のリン酸化により活性化されるという事実にも関わらず、活性化できることである。
バナデートがｐ７０S6Kを活性化することは既知である。本発明は、従って、ｐ７０S6Kを活性化するためのバナデートの使用は意図しない。しかしながら、全く異なる機構を介して作用するオカダ酸のようなホスファターゼ阻害剤の使用は本発明の一部である。
本明細書に記載する限り、信号伝達経路は、信号伝達を最終的に調節する活性化カスケードであり、これらの経路のキナーゼはそのインビボ標的が信号伝達に付与する少なくとも一つのものを含むキナーゼである。好ましくは、本発明の信号伝達経路は、インシュリンおよび他の成長因子の信号の伝達を担うインシュリン依存的信号伝達経路である。本発明をいかなる方法でも限定する意図はなく、このような経路の一つは、インシュリン等のような成長因子をそれらのレセプターに結合させることによりインビボで引き金を引くと信じられ、それはとりわけホスファチジルイノシトール−３−ＯＨキナーゼ(PI-3K)を刺激する。続いて、PI-3Kは直接的または間接的にＲＡＣ−ＰＫをリン酸化し、それは間接的にｐ７０S6Kの最終的リン酸化を導く。
本発明のキナーゼを活性化するための処理は、キナーゼを、信号伝達経路の他のキナーゼのようなリン酸化剤およびホスファターゼ阻害剤にさらすことを必要とする。これは、例えば、インビトロで
(ａ)信号伝達経路のキナーゼ、キナーゼを活性化するためにリン酸化できる薬剤およびホスファターゼ阻害剤を共にインキュベートする；そして
(ｂ)インキュベーション混合物からキナーゼを精製する
ことにより達成し得る。
リン酸化剤は、活性化を導く残基でキナーゼをリン酸化するものでなければならない。ＲＡＣ−ＰＫの場合、リン酸化剤は有利にはセリンおよびスレオニン残基を標的とする。
好ましくは、リン酸化剤は、適当な活性化因子の存在下でリン酸化に作用し、従って興味のキナーゼを活性化する、信号伝達経路の１個またはそれ以上のキナーゼである。好ましくは、これは活性キナーゼ酵素を、必要な信号伝達経路キナーゼを含むホスファターゼ阻害剤処理細胞から回収することにより達成される。
本発明の説明において、インビトロは実験を生存生物または細胞の外で行うことを意味する。インビボは細胞培養物を含む。細胞のホスファターゼ阻害剤でのインビボ処理は、特に活性ＲＡＣ−ＰＫの製造に有効である。しかしながら、ＲＡＣ−ＰＫおよび他の信号伝達キナーゼ、例えばｐ７０S6Kが同じ経路に存在するため、ＲＡＣ−ＰＫの活性化が同様の信号伝達経路の他のキナーゼ、例えば、ｐ７０S6K自体の活性化をもたらす。本発明は、従って、一般に信号伝達経路に存在するｐ７０S6K以外のキナーゼ、特に経路でＲＡＣ−ＰＫの下流にあるキナーゼを活性化する方法を提供する。
本発明で使用し得るキナーゼを製造する細胞は、一般的に哺乳類起源の細胞系を含み、特にＲＡＴ−１、ＣＯＳまたはＮＩＨ３Ｔ３のような線維芽細胞である。スイス３Ｔ３細胞が特に好ましい。ヒト細胞系を使用する場合、ヒト胚芽腎臓２９３細胞が好ましい。
ホスファターゼ阻害剤は、ホスファターゼ酵素の活性を阻害することによりタンパク質脱リン酸化を阻害する薬剤である。ホスファターゼは本質的にキナーゼの逆の活性を有し、リン酸基を除去する。
ホスファターゼ阻害剤の例は、バナデートおよびオカダ酸であり、ＲＡＣ−ＰＫの場合、バナデートがより有効な薬剤である。しかしながらバナデートの作用は、それが特異的チロシンホスファターゼであり、ＲＡＣ−ＰＫがチロシンリン酸化により刺激されるように見えないため、間接的であると信じられている。ホスファターゼＰＰ２Ａに直接作用することが知られているオカダ酸は、一方、ＲＡＣ−ＰＫの脱リン酸化を直接阻害するように見える。
他のホスファターゼ阻害剤の使用が予測されるが、それは使用する特定の細胞系へのこのような阻害剤の適用の適合性によってのみ限定される。バナデートおよびオカダ酸は一般的に適用可能であると信じられているが、当業者は他のホスファターゼ阻害剤が利用可能であり、その活性および適合性を慣用の実験により容易に決定し得ることを認識する。例えば、本発明に適当であり得るホスファターゼ阻害剤は、カリクリンＡ、カンタリジン酸、カンタリジン、ＤＴＸ−１、ミクロシスチン、ノドゥラリンおよびタウトマイシンを含む。これらおよび他のホスファターゼ阻害剤が商品として、例えばカルバイオケムから入手可能である。
ホスファターゼ阻害剤を、無血清であり得る通常の生育培地中の細胞に添加する。血清はそれ自体キナーゼ活性を阻害すると観察されるが、それは高価であり、その機能は本発明のホスファターゼ阻害剤により置き換え得る。ホスファターゼ阻害剤の適当な濃度は、０.０１ｍＭから１０ｍＭ、好ましくは０.１ｍＭから１ｍＭのレベルを含む。バナデートのもっとも好ましい濃度は０.１ｍＭである。
本発明の方法は、所望の活性キナーゼをそれが製造された細胞から単離することを意図した付加的段階を含み得る。このような段階は当業者に一般的な慣用法であり、本発明の範囲内で同等な他の方法に置き換え得る。しかしながら、好ましい方法は、細胞を均質化し、細胞残骸を(例えば遠心により)除去し、所望のキナーゼを親和性精製により分離する段階を含む。
均質化は、有利にはフェニルメチルスルホニルフロリド(ＰＭＳＦ)のようなプロテイナーゼ阻害剤および精製中のキナーゼの脱リン酸化を阻害するためのホスファターゼ阻害剤を含む標準等張性融解緩衝液で行い得る。細胞を破壊し、それにより細胞質性および核内容物が緩衝液中に融解する。
次いで、細胞残骸を有利には融解細胞性調整物から、好ましくは全粒子状物物質をペレット化するために混合物を遠心して回収する。可溶性フラクションのみが上清に残る。
次いで、上清を必要であれば興味のキナーゼを単離するために標準精製法に付すことができる。好ましい方法は、特に、相対的に低い容量の調整物には、アフィニティークロマトグラフィーを含む。このような方法は、適当なマトリックスに固定化された抗キナーゼ抗体または抗血清を使用し得る。基質アナログのような他の固定化結合剤を使用し得る。
本発明の活性化キナーゼの免疫分離に有用な抗体は、当分野で既知の方法で製造し得る。例えば、ポリクローナル血清を製造するために、所望によりアジュバント存在下またはキーホールリンペットヘモシアニンのような免疫刺激剤と結合した、Ｃ−末端ペプチドのようなキナーゼ由来のペプチドを含む所望のキナーゼの抗原性部分または全キナーゼを、マウスまたはウサギのような哺乳類に注射し、固相結合キナーゼまたはその抗原性部分を使用した親和性精製により回収する。モノクローナル抗体は確立された方法で製造し得る。
あるいは、特に大規模製造のために、アフィニティークロマトグラフィーを含まない分離法を使用し得る。
更に、クロマトグラフィーおよびゲル電気泳動のようなサイズを基本にしてポリペプチドを分離する多くの方法が当分野で利用可能である。精製機能およびサイズ分画機能を果たすが、許容されない汚染物を導入しない方法が好ましい。従って、特にシュークロース勾配を使用した段階的または連続勾配遠心、制御された孔膜を使用した透析および膜(アミコン)遠心のような方法が好ましい。しかしながら、特に好ましいのはサイズ排除クロマトグラフィー、特に多孔性ビーズをクロマトグラフィー支持体として使用して行うものである。サイズ排除クロマトグラフィーは、例えば、Stellwagen, Deutscher (1990) Guide to Protein Purification, Academic Press, Inc., San Diego, CA, USA, 317-328に記載されている。
別の精製法は、一般にDeutscher(1990)に記載され、セルロース、デキストラン、アガロースまたはポリスチレンのような固相充填物質に結合したＤＥＡＥまたはＣＭのような交換基を使用したイオン交換クロマトグラフィーのような電荷差異による分離を基にしたクロマトグラフィーを含む。他の方法はヒドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィー(例えば、Gorbunoff, (1985) Methods in Enzymology, 117, 370-380参照)およびガラスビーズまたは反応性色素を親和性薬剤として使用した一般的アフィニティークロマトグラフィーを含む。
有利には、プロテイン溶出が問題のキナーゼの既知のまたは推定のｐ１を考えることに適合できるカチオンクロマトグラフィーを使用し得る。キナーゼのｐ１は実験的に、等電点フォーカシングにより実験的に測定し得る。この方法において、キナーゼと同じｐ１またはその付近のｐ１を有するタンパク質をカチオン交換樹脂から流出するように選択することが可能であり、これは高い程度の精製をもたらす。
本発明は更に、本発明により製造した活性キナーゼの、信号伝達経路の調節剤の可能性のある物質のスクリーニング法における使用を提供する。従って、請求の方法は、キナーゼを阻害剤の可能性のある物質にさらし、続いて調節剤の効果を測定するためにキナーゼの活性を評価する付加的段階を含み得る。
本発明は、従って：
(ａ)信号伝達経路のキナーゼとホスファターゼ阻害剤を共にインキュベートする；
(ｂ)信号伝達経路の調節剤候補物を添加する；そして
(ｃ)キナーゼの活性を測定する
ことを含む伝達経路の調節剤候補物のスクリーニング法を提供する。
調節剤への暴露は、所望により粗細胞性集団からキナーゼを精製した後に無細胞性環境で、またはホスファターゼ阻害剤活性化の後にキナーゼを製造する細胞それ自体で、活性化または非活性化キナーゼで行い得る。段階(ａ)および(ｂ)は従って逆になるかまたは同時に行い得る。
段階(ａ)において、特にアッセイをインビトロで行う場合、キナーゼをリン酸化できる薬剤をインキュベーション混合物に添加し得る。ホスファターゼ阻害剤は脱リン酸化を予防することによりキナーゼを活性化し、従ってリン酸化薬剤が必要となる。有利には、リン酸化薬剤はインシュリン依存的信号伝達経路またはそのアナログのキナーゼである。更に、因子が信号伝達経路の信号伝達の開始または補助に必要である。例えば、ＦＫＢＰに結合するラパマイシンアナログが試験化合物である場合、ＦＫＢＰがインキュベーション混合物に必要である。
しかしながら、好ましくは、製造を信号伝達経路のキナーゼを含む細胞でインビボで行う。このようなアッセイにおいて、ホスファターゼ阻害剤を外的刺激剤としての血清または先に使用した薬剤に置き換え、信号伝達経路のキナーゼを活性化する。
キナーゼの活性はキナーゼの基質を使用したキナーゼ活性アッセイの手段で評価し得る。例えば、確立されたアッセイ法においてミエリン基本タンパク質を使用し得る。４０ＳリボソームサブユニットまたはＳ６のような生理学的基質も使用し得る。あるいは、キナーゼ活性をキナーゼのリン酸化の程度を測定することにより評価し得る。有利には、通常キナーゼ活性化に関与する残基のリン酸化を評価する。本発明の一部であるこのような残基の同定を下記に示す。
本発明のアッセイは、アッセイされたキナーゼにおける候補化合物の直接の作用を測定するのに使用し得るか、または信号伝達経路におけるその上流で作用するキナーゼにおける化合物の作用を測定するのに使用し得る。後者の状況において、アッセイされたキナーゼは上流キナーゼの基質として作用し、上流キナーゼの活性をリン酸化状態またはアッセイされたキナーゼの活性により測定することにより評価する。
有意義な結果を得るために、信号伝達経路の調節剤の候補物にさらされたアッセイされたキナーゼの活性をその薬剤にさらされていないキナーゼの活性を比較しなければならず、キナーゼ活性の阻害は免疫抑制剤または抗増殖剤としての可能性を示唆する。
増加したレベルのキナーゼ阻害を示す化合物を、次いで、更に例えば、細胞増殖阻害アッセイの手段により、直接免疫抑制または抗増殖特性を測定することにより評価し得る。このようなアッセイは好ましくはホスファターゼ阻害剤によるキナーゼ活性化に付され、キナーゼ阻害剤候補物にさらされ、所望により続いて成長因子、ＩＬ−２またはＰＭＡのようなマイトージェンで刺激された細胞におけるＴ−細胞増殖の物理的測定を含む。より単純に、アッセイは非刺激細胞の阻害剤候補物への暴露、続くホスファターゼ阻害剤での刺激を含み得る。
本発明の更なる態様に従い、出願人は、キナーゼ、特に、ｐ７０S6K／ＲＡＣ−ＰＫファミリーのリン酸化にどの部位が重要であるかを測定することができた。驚くべきことに、活性化リン酸化の大半は、セリンおよびスレオニン残基で起こっているように見える。リン酸化が、ある場合は、リン酸化アミノ酸のアスパラギン酸またはグルタミン酸のような酸性アミノ酸による置換により模倣され得ることが知られている。
本発明は、従って、インビボリン酸化を介したキナーゼの活性化に関与した少なくとも一つのスレオニン残基が酸性アミノ酸残基に置換されている組換えＲＡＣ−ＰＫタンパク質を提供する。更に、本発明は構造的に活性な組換えＲＡＣ−ＰＫで処理した細胞を化合物にさらすことを含む、ＲＡＣ−ＰＫによる信号伝達を阻害する化合物のスクリーニング法を提供する。
例えば、重要な活性化残基はＴ３０８であり、これはキナーゼのサブドメイン７および８の間のいわゆるＴ−ループに存在する。キナーゼ構造の一般的指針は、Woodgett (1994), Protein Kinases, IRL Press, UKに示される。Ｔ３０８のアスパラギン酸での置換は、キナーゼの基底活性の明らかな増加をもたらすが、更なる活性化の可能性を残す。本発明は、従って、Ｔｈｒ３０８がＡｓｐに変異したＲＡＣキナーゼタンパク質を提供する。
好ましくは、Ｓｅｒ４７３が更にＡｓｐに変異している。この残基のリン酸化は、インビボのＲＡＣ−ＰＫの完全な活性化のために必要であり、T308/S473二重変異体(両方の残基がＡｓｐに変換)は天然ＲＡＣ−ＰＫより１８倍高い構造的活性を示す。二重変異体は更なる活性化の可能性は保持しない。
変異は適当な方法により行い得る。しかしながら、ＲＡＣをコードするヌクレオチド配列のインビボ部位特異的変異誘発および続く組換えＤＮＡ発現システム中でのＲＡＣの発現が好ましい。この方法はクローンＤＮＡの領域内の決められた部位を置換できるインビトロ変異誘発法である(M. J. ZollerおよびM. Smith, Methods Enzymol. (1983), 100, 468;D. BotsteinおよびD. Shortle, Science (1985), 229, 1193参照)。部位特異的変異誘発の方法は、Sambrook (1989):Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Habor, NY, USAおよび多くの商品として入手可能なインビトロ変異誘発キットに例示されるように、当分野で周知である。
本発明の構造的に活性なキナーゼは、本明細書に記載のようにスクリーニング法においてホスファターゼ阻害剤活性化キナーゼに代わり使用し得る。有利にはこのような活性化キナーゼは外的刺激剤を必要としない。
本発明は、説明の目的のためのみに以下の実施例において更に詳述する。
実施例１
ＲＡＣ−ＰＫのマイトジェン刺激およびリン酸化
スイス３Ｔ３細胞系(Susa, M. & Thomas, G. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 7040-7044)を成長因子信号伝達におけるＲＡＣ−ＰＫの関連の可能性の調査のために使用する。活動していないスイス３Ｔ３細胞を２４時間血清枯渇させ、続いて１０％ＦＣＳで刺激する。
(ａ)キナーゼ活性をＲＡＣ−ＰＫを免疫沈降し、キナーゼを基質としてミエリン基本タンパク質を使用してアッセイする。簡単に、無細胞抽出物を前コンフルエント細胞を氷冷ＴＢＳにスクラップし、細胞を５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７.５、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１.０％トリトンＸ−１００、２ｍＭ  ＥＧＴＡ、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、２０μＭロイペプチン、２０μＭアプロテニンおよび１０μＭモリブデートを含む緩衝液に溶解させて調製する。溶解物を１５分、１２,０００×ｇで４℃で遠心する。ＲＡＣ−ＰＫを、ウサギに皮下的にキーホールリンペットヘモシアニンに結合したペプチドＦＰＱＦＳＹＳＡＳＳＴＡを注射して惹起させ、５０％(ＮＨ4)2ＳＯ4を使用した沈殿、続くＲＡＣ−ＰＫ結合アフィゲル(登録商標)１０カラム(Bio-Rad)でのアフィニティークロマトグラフィーにより精製した、パソルビン開裂抽出物から保存されたＣ−末端に特異的にウサギポリクローナル抗体(抗−ＲＡＣ469-480;Jones et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 4171-4175)を使用して免疫沈降させる。これらの抗血清は、そのＣ−末端が最後の３アミノ酸でＲＡＣ−ＰＫａと異なるため、またｂ／ＡＫＴ２アイソフォームも認識する。ＲＡＣ−ＰＫ活性を基質としてミエリン基本タンパク質を使用して、先に記載のようにアッセイする(Jones et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 4171-4175)。抽出物を２時間、４℃で抗血清(２μg／１００μl抽出物)とインキュベートし、免疫沈降物をプロテインＡセファロースを使用して回収し、溶解緩衝液で洗浄する。タンパク質セファロースビーズを１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７.５、１ｍＭ  ＤＴＴ、１０μmモリブデート１００μlに再懸濁し、３５μlを下記のようにキナーゼアッセイに使用する：
最終量５０μl中に５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７.５、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭプロテインキナーゼ阻害剤、ＰＫＩペプチド、２５μgミエリン基本タンパク質(ＭＢＰ−シグマ)、５０μＭ(γ−32Ｐ)ＡＴＰ(３５００cpm/pmol)およびＲＡＣプロテインキナーゼの無細胞抽出物または精製フラクションの免疫沈降物３５μlを含む。３０℃で１０、３０および６０分インキュベーション後、サンプルを１２％ＳＤＳ／ＰＡＧＥ、続くオートラジオグラフィーで分析し、リン酸化ＭＢＰバンドをシンチレーション計数により定量する。
免疫沈降ＲＡＣ−ＰＫ活性は静止細胞と比較して血清刺激細胞で２から４倍高いことが判明した。活性化は５分以内に起こり、キナーゼ活性は少なくとも１２０分増加したままである。
(ｂ)活性化はＳＤＳ−ＰＡＧＥでのＲＡＣ−ＰＫの移動性の減少と同時に起こる。どの形がＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに存在するかを測定するために、上記のように免疫ブロッティングを抗−ＲＡＣ−ＰＫ抗血清を使用して行う。細胞抽出物および免疫沈降物を７.５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分解し、イモビロン−Ｐ膜(ミリポア)に移し、抗−ＲＡＣ469-480抗体とインキュベートする。検出をアルカリホスファターゼ結合抗ウサギ抗体を使用して行う。
少なくとも３種の異なる形が免疫ブロット分析で検出でき、ａ、ｂおよびｃと命名する。静止細胞由来のキナーゼはａ形とｂ形のダブレットとして移動し、刺激の間にゆっくり移動する形ｃが発現し、続いて形ａが消失する。これらの結果は、ＲＡＣ−ＰＫ活性が可逆性リン酸化により調節されていることを示す。
(ｃ)この可能性を試験するために、ホスファターゼ阻害剤オカダ酸およびバナデートのスイス３Ｔ３細胞由来のＲＡＣ−ＰＫにおける効果を試験する。細胞は２４時間血清枯渇させ、続いて０.１ｍＭ  Ｈ2Ｏ2で調整した１μＭオカダ酸または０.１ｍＭバナデート(Posner, et al. (1994) J. Biol. Chem. 269, 4596-4604)で、所望により１０％ＦＣＳと共に刺激する。ＰＰ２ＡおよびＰＰ１の特異的阻害剤であるオカダ酸での処理はＲＡＣ−ＰＫ活性の３倍の増加および電気泳動移動性の減少を誘導する。１μＭオカダ酸および１０％血清での同時の処理は、５倍の活性化および電気泳動移動性のより大きな変化をもたらす。１１倍の活性化が０.１ｍＭバナデートでの処理に続いて観察され、それはタンパク質の主要部分をもっとも遅い移動の形ｃに変える。
多数の電気泳動移動性形がキナーゼの異なるリン酸化状態を反映することを確認するために、ＲＡＣ−ＰＫを32Ｐ標識静止およびバナデート刺激スイス３Ｔ３細胞から免疫沈降させる。スイス３Ｔ３細胞を記載(Susa, M. & Thomas, G. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 7040-7044)のように無リン酸DMEM/FCS中に捕獲し、１６時間血清枯渇させた後に[32Ｐ]オルトリン酸で６−１０時間(２ｍＣｉ／１５cm皿)で標識する。刺激を０.１ｍＭバナデートで行う。リン酸化の定量をImageQuantソフトウエアを使用して行う。バナデート処理はリン酸化の３から４倍の増加をもたらし、移動性形ｂおよびｃがリン酸化ＲＡＣ−ＰＫを示すことを証明する。
(ｄ)どの残基が活性化ＲＡＣ−ＰＫでリン酸化されているかを調べるために、ホスホアミノ酸分析を上記のように、Boyle, et al. (1991) Methods Enzymol. 201, 110-149に従って標識した細胞で行う。捕獲細胞のキナーゼは、１２：１の比率で主にセリン残基および低いレベルでスレオニンでリン酸化されているように見える。バナデート刺激はホスホセリンの増加および特にホスホスレオニン含量の増加を導き、比率が４：１に低下する。ホスホチロシンは、バナデート刺激後に、ホスホアミノ酸分析、または抗ホスホチロシン抗体を使用した免疫ブロット分析により検出されない。これらの結果は、ＲＡＣ−ＰＫがリン酸化機構により活性化されることを示す。更に、出願人は、バナデートがチロシンホスファターゼの阻害剤であることが既知であるため、バナデートにより介在されるＲＡＣ−ＰＫ活性化がおそらく間接的であると結論付ける。
実施例２
インビトロプロテインホスファターゼ２ＡによるＲＡＣ−ＰＫの不活性化
ＲＡＣ−ＰＫがリン酸化により調節されることを確認するために、静止およびバナデート刺激スイス３Ｔ３細胞から免疫沈降したキナーゼのプロテインホスファターゼ２Ａ(ＰＰ２Ａ)処理の効果を試験する。１ｍＭオカダ酸で２時間の処理がＰＰ１よりむしろＰＰ２Ａを主に不活性化するため、ＲＡＣ−ＰＫを精製ＰＰ２Ａ触媒サブユニット(ＰＰ２Ａｃ)または触媒と調整ＰＲ６５サブユニットからなるＰＰ２Ａダイマー(ＰＰ２Ａ2)のいずれかとインキュベートする。
免疫沈降ＲＡＣ−ＰＫを、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ７.５、１％ｂ−メルカプトエタノール、１ｍＭ  ＭｎＣｌ2、１ｍＭベンズアミジンおよび０.５ｍＭフェニルメチルスルホニルフロリドを含む緩衝液中の０.３Ｕ／mlブタ筋肉ＰＰ２Ａｃまたは１.７Ｕ／mlウサギ筋肉ＰＰ２Ａ2と、３０℃で６０分インキュベートする(１単位(Ｕ)は１分当たりにホスホリラーゼａから遊離される１nmolのＰｉと定義される)。反応を５０ｎＭカリクリンＡの添加により停止させる。形成された免疫複合体を５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７.５、１ｍＭベンズアミジン、０.５ｍＭフェニルメチルスルホニルフロリドおよび５０ｎＭカリクリンＡで洗浄し、ＲＡＣ−ＰＫを上記のようにアッセイする。
活性化ＲＡＣ−ＰＫのインビトロでのＰＰ２Ａｃによる脱リン酸化はキナーゼ活性の８４％の減少および付随する電気泳動移動性の変化をもたらし、それを形ｃからｂに変える。ＰＰ２Ａ2処理は活性の９２％の減少をもたらし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでのタンパク質移動性をａ／ｂタブレットに戻す。これらの結果は、観察された活性の変化が可逆性リン酸化機構により達成されることを確認する。更に、ＰＰ２ＡはインビボでＲＡＣ−ＰＫ活性の調節剤の可能性のあることを示す。
実施例３
ＲＡＣ−ＰＫａはｐ７０S6K活性を刺激する
スイス３Ｔ３細胞においてＲＡＣ−ＰＫはインシュリンにより活性化（４.５倍）され、ｐ７０s6kで検出されるレベルと同等である。比較して、インシュリンはこれらの細胞においてｐ４２mapkおよびｐ４４mapkにわずかに作用するか作用せず、ＲＡＫ−ＰＫおよびｐ７０s6kがＭＡＰＫ経路と異なる経路である同じ信号伝達経路に属し得ることを示す。
この可能性を調べるために、二つのキナーゼの血清誘発活性化におけるウォルトマニンおよびラパマイシンの作用を試験する。ホスホイノシチド(ＰＩ)３−キナーゼ阻害剤であるウォルトマニンおよび免疫抑制剤ラパマイシンは、リン酸化部位の同じセットに作用することによりｐ７０S6K活性化を阻害する。
静止スイス３Ｔ３線維芽細胞の刺激は、ＲＡＣ−ＰＫ活性の〜４倍の誘導をもたらすが、血清刺激前のウォルトマニン処理はほとんど完全に活性化を阻止する。一方、ラパマイシン前処理はＲＡＣ−ＰＫ活性化に著しい作用は示さない。ウォルトマニンはまた血清処理後に見られるもっとも遅いＲＡＣ−ＰＫ移動性形の出現を阻止するが、ラパマイシンはＲＡＣ−ＰＫ移動性に影響を及ぼさない。同じ実験において、ウォルトマニンおよびラパマイシン前処理はｐ７０S6K活性化を消失させる。
これらの結果は、ＲＡＣ−ＰＫがｐ７０S6K信号伝達経路のｐ７０S6Kの上流に位置し、その経路がウォルトマニンによりＲＡＣ−ＰＫの上流でおよびラパマイシンによりその下流で阻害されることを示す。この可能性を試験するために、ｐ７０S6Kの調節をヒト２９３細胞を使用した一過性コトランスフェクションアッセイにより試験する。ＲＡＣ−ＰＫα構築物を、哺乳類発現ベクターｐＥＣＥ中でＲＡＣ−ＰＫａ  ｃＤＮＡ(Jones et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 4171-4175)をイニシエーターであるメチオニンのフレーム内にライゲートすることにより製造する。構築物をまたＣＭＶプロモーター由来発現ベクターにサブクローンする。構築物を制限分析および配列決定により確認する。Ｍｙｃ−タグ付加ｐ７０S6Kを発現する構築物をジー・トーマス博士(Friedrich Miescher Institut, Basel, Switzerland)から得る。構築物を標準法を使用してＣＯＳ細胞にトランスフェクトする。ＲＡＣ−ＰＫａとｐ７０S6K−Ｍｙｃの共発現は基底およびインシュリン刺激ｐ７０S6K−Ｍｙｃ活性のそれぞれ３.５および３倍の増加をもたらす。