(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アマドリ化合物を含む試料に単一波長の励起光を照射してその試料からの散乱光を受光し分光して光散乱スペクトルを得、その光散乱スペクトルのうち、励起波長に対するシフト波数にして８２０〜８４０ｃｍ-1、１６５５〜１６６０ｃｍ-1、２０００〜２０２０ｃｍ-1、２０８０〜２１００ｃｍ-1、２４６０〜２４７０ｃｍ-1又は２５３０〜２６００ｃｍ-1に存在する光散乱ピークを用いてアマドリ化合物の定量測定を行なうことを特徴とするアマドリ化合物の測定方法。
【請求項２】
前記光散乱スペクトルから蛍光スペクトル部分を除去する演算操作を施した後、前記光散乱ピークのいずれかのピークのピーク強度又は積分値に基づいてアマドリ化合物の定量測定を行なう請求項１に記載のアマドリ化合物の測定方法。
【請求項３】
前記光散乱ピークのいずれかのピークのピーク強度又は積分値Ｉと、前記光散乱スペクトルのうち、励起波長に対するシフト波数にして８２０〜８４０ｃｍ-1、１６５５〜１６６０ｃｍ-1、２０００〜２０２０ｃｍ-1、２０８０〜２１００ｃｍ-1、２４６０〜２４７０ｃｍ-1及び２５３０〜２６００ｃｍ-1を除いて任意に定めた波数領域の積分値Ｓとの比Ｉ／Ｓに基づいてアマドリ化合物の定量測定を行なう請求項１に記載のアマドリ化合物の測定方法。
【請求項４】
励起光源としてＨｅ−Ｎｅレーザを使用する請求項１，２又は３に記載のアマドリ化合物の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は糖化アルブミン、糖化ヘモグロビン、糖化グロブリンなどのアマドリ化合物の定量測定を行なう方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
アマドリ化合物は、タンパク質、ペプチド又はアミノ酸のようなアミノ基を有する物質（以下、タンパク質等という）と、アルドースのような還元性の糖が共存する場合、一部のアミノ基とアルデヒド基が非酵素的に、かつ非可逆的に結合し、アマドリ転移することにより生成される。アマドリ化合物の生成速度は、反応性物質の濃度、接触時間、温度などの関数で表わされる。したがって、その生成量からそれらの反応性物質を含有する物質に関する様々な情報を得ることができると考えられている。アマドリ化合物を含有する物質としては、醤油などの食品や、血液などの体液がある。
【０００３】
例えば、生体ではグルコースとアミノ酸が結合し、アマドリ化合物であるフルクトシルアミン誘導体が生成している。血液中のヘモグロビンが糖化されたフルクトシルアミン誘導体はグリコヘモグロビン、アルブミンが糖化されたフルクトシルアミン誘導体はグリコアルブミン、血液中のタンパク質が糖化されたフルクトシルアミン誘導体はフルクトサミンと呼ばれる。これらのフルクトシルアミン誘導体の血中濃度は、過去の一定期間の平均血糖値を反映しており、その測定値は糖尿病の病状の診断及び病状の管理の重要な指標となりうるため、アマドリ化合物の測定手段の確率は、臨床上、きわめて有用である。また、食品中のアマドリ化合物を定量することにより、その食品の製造後の保存状況や期間を知ることができ、品質管理に役立つと考えられる。
このように、アマドリ化合物の定量分析は、医学及び食品を含む広範な分野で有用である。
【０００４】
従来、アマドリ化合物の定量法としては、高速液体クロマトグラフィーを利用する方法（Chromatogr. Sci., 10, 659 (1979)参照）、ホウ酸を結合させた固体をつめたカラムを用いる方法（Clin. Chem., 28, 2088 (1982)参照）、電気泳動（Clin. Chem., 26, 1598 (1980)参照）、抗原−抗体反応を利用する方法（JJCLA, 18, 620 (1993)，機器・試薬, 16, 33-37 (1993)参照）、フルクトサミンの測定法（Clin. Chem. Acta, 127, 87-95 (1982)参照）、チオバルビツール酸を用いて酸化後に比色定量する方法（Clin. Chem. Acta, 112, 179-204 (1981)参照）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）法などが知られている。
【０００５】
電気泳動法やクロマトグラフィー法は測定に時間がかかり、操作が煩雑であるうえ、タンパク質の絶対量の測定値が混在物質の中の親和力の大きさの近い物質の影響を受け、正確に定量測定するのが難しい。
ＲＩＡ法は感度、特異性及び再現性に優れているが、標識する過程が複雑で煩雑である。
フルクトサミン測定法はフルクトサミンのアルカリ溶液中での還元力を利用する方法であるが、他の還元物質の影響を受け、測定誤差を生じやすい欠点がある。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
光を物質に照射してその光散乱スペクトルを用いて糖化タンパクなどのアマドリ化合物を定量できれば、簡便で有効であるが、そのような光散乱スペクトルを利用してアマドリ化合物を測定した例は報告されていない。
そこで、本発明は光散乱を利用した簡便な光学的方法により、アマドリ化合物を定量測定する方法を提供することを目的とするものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明では、アマドリ化合物を含む試料に単一波長の励起光を照射してその試料からの散乱光を受光し分光して光散乱スペクトルを得、その光散乱スペクトルのうち、励起波長に対するシフト波数にして８２０〜８４０ｃｍ-1、１６５５〜１６６０ｃｍ-1、２０００〜２０２０ｃｍ-1、２０８０〜２１００ｃｍ-1、２４６０〜２４７０ｃｍ-1又は２５３０〜２６００ｃｍ-1に存在する光散乱ピークを用いてアマドリ化合物の定量測定を行なう。
【０００８】
アマドリ化合物を含む試料に単一波長の励起光を照射して得られる光散乱スペクトルは、光散乱ピークと蛍光スペクトルとが重なったものとなる。その蛍光スペクトル部分を除去する演算操作を施すと、光散乱ピークのいずれかのピークのピーク強度又は積分値を求めるのが容易になる。このようにして求めた光散乱ピークのピーク強度又は積分値に基づいてアマドリ化合物を定量測定することができる。
ここでの定量測定は、試料中のアマドリ化合物の量を測定する場合も、試料中のタンパク質等の糖化率を測定する場合も含んでいる。糖化率は
（アマドリ化合物）／（アマドリ化合物＋タンパク質等）
と定義される。いずれの測定値も検量線を用いて求めることができる。
【０００９】
得られた光散乱スペクトルのうち、蛍光スペクトルは（アマドリ化合物＋タンパク質等）の総和を反映したものである。そこで、タンパク質等の糖化率を測定する好ましい方法では、光散乱スペクトルの光散乱ピークのいずれかのピークのピーク強度又は積分値Ｉと、光散乱スペクトルのうち、励起波長に対するシフト波数にして８２０〜８４０ｃｍ-1、１６５５〜１６６０ｃｍ-1、２０００〜２０２０ｃｍ-1、２０８０〜２１００ｃｍ-1、２４６０〜２４７０ｃｍ-1及び２５３０〜２６００ｃｍ-1を除いて任意に定めた波数領域の積分値Ｓとの比Ｉ／Ｓを用いることにより正確に測定することができる。
【００１０】
図１に示す光散乱スペクトルは、濃度が１０ｍｇ／ｄｌのヒト血清アルブミン水溶液にＨｅ−Ｎｅレーザ装置（日本科学エンジニアリング株式会社の製品、出力７ｍＷ）のレーザ光（波長６３２.８ｎｍ）を照射して励起して得たものである。（Ａ）は糖化率が２４.１％、（Ｂ）は糖化率が５８.２％のヒト血清アルブミン水溶液である。横軸はＨｅ−Ｎｅレーザ光の波長からの光散乱シフトを波数で表わしたもの、縦軸は散乱光強度である。
【００１１】
（Ａ）と（Ｂ）の両光散乱スペクトルで、同じ光散乱シフトの位置に鋭いピークが現われており、それらのピーク強度は糖化率が大きいものほど大きくなっている。また、図１の試料と同程度の濃度のグルコース水溶液の光散乱スペクトルを測定したが、ピークらしいものは観測されなかった。グルコース水溶液の濃度を１００００ｍｇ／ｄｌという高濃度にしてその光散乱スペクトルを測定すると、図２に示されるスペクトルが得られ、そこにはいくつかのピークが現われているが、図１に示された鋭いピークとは位置が異なっている。その結果、図１の鋭い光散乱ピークは、グルコースによる光散乱ピークではなく、糖化アルブミンによる光散乱ピークであることがわかる。
図１のスペクトルで、山形の大きくてなだらかなピークはアルブミンと糖化アルブミンからの螢光であり、糖化アルブミンによる光散乱ピークはその大きな蛍光ピークと重なって蛍光ピークから突出して現れている。
【００１２】
糖化アルブミンによる光散乱ピークはＨｅ−Ｎｅレーザ光の波長からのシフト波数にして、８３０ｃｍ-1、１６５８ｃｍ-1、２００９ｃｍ-1、２０８２ｃｍ-1、２４６３ｃｍ-1及び２５４４ｃｍ-1の付近に存在している。
図１の光散乱スペクトルから螢光スペクトル部分をバックグラウンド信号として除去したものを図３に示す。（Ａ），（Ｂ）はそれぞれ図１の（Ａ），（Ｂ）に対応したものである。このように、螢光スペクトル部分を除去することにより、光散乱ピークのピーク強度やピーク積分値（面積）を求めるのが容易になる。
【００１３】
図４は、糖化率の異なるヒト血清アルブミン水溶液の標準試料について、糖化率と、図３のように螢光スペクトル部分を除去した後のピーク高さとの関係を示したものである。測定を行ったピークは、Ｈｅ−Ｎｅレーザ光の波長からのシフト波数にして１６５８ｃｍ-1付近のピークである。標準試料のヒト血清アルブミン水溶液は、糖化率が２４.１％のものと５８.２％のものが市販品として入手できる。その他の糖化率の標準試料は、それらの市販の標準試料を調合することにより調製したものである。図４に示されている標準試料の糖化率は、２４.１％、３１.３％、３８.７％、４５.５％、５１.９％及び５８.２％である。これらの標準試料の糖化率の数値は、全自動グリコアルブミン分画定量装置ＧＡＡ−２０００（株式会社京都第一科学の製品）で測定した値である。
【００１４】
図４によれば、糖化率と光散乱ピークのピーク強度との間には直線関係があるので、この結果を糖化率の検量線として用いることができる。また、この検量線用のデータを測定した標準試料の（糖化アルブミン＋アルブミン）濃度は一定であるので、この検量線を糖化アルブミン濃度と光散乱ピークのピーク強度との関係を表わす検量線に転用することもできる。したがって、この検量線を用いると、未知試料について光散乱スペクトルのピーク強度を測定して糖化率又は糖化アルブミン濃度を求めることができる。
【００１５】
同じ標準試料による光散乱スペクトルの同じピークの積分値を用いて、糖化率と光散乱ピーク積分値の関係を測定した結果を図５に示す。この場合も糖化率とピーク積分値の間に直線関係が得られ、この関係も検量線として利用することができる。そのため、未知試料について光散乱スペクトルのピークのピーク強度の測定に代えてピーク積分値を測定しても、糖化率又は糖化アルブミン濃度を求めることができる。
【００１６】
図４及び図５の直線関係は、図３に示された他の光散乱ピークについても同様に成立している。
図４又は図５に示された糖化率に対するピーク強度又はピーク積分値の関係の検量線から未知試料の糖化率を求めるには、未知試料の（糖化アルブミン＋アルブミン）濃度を標準試料の（糖化アルブミン＋アルブミン）濃度と同一になるように未知試料の濃度を調製するか、又は（糖化アルブミン＋アルブミン）濃度が同一になるように測定値を換算しなければならない。一方、図１の光散乱スペクトルでは、光散乱ピークの他に螢光スペクトルも同時に検出されている。図６は、この螢光スペクトルのうち、Ｈｅ−Ｎｅレーザ光の波長からのシフト波数にして４１６.５０８〜１４３４.７４ｃｍ-1の領域の積分値（縦軸の強度）を（糖化アルブミン＋アルブミン）濃度の異なる標準試料について測定した結果を表わしたものである。（糖化アルブミン＋アルブミン）濃度と螢光スペクトルの積分値との間には直線関係が得られているので、螢光スペクトルの積分値に基づいて（糖化アルブミン＋アルブミン）濃度を求めることによって、糖化アルブミンの光散乱ピークのピーク強度やピーク積分値から得られた糖化率を補正することができる。螢光スペクトルの積分を行なう波数領域は、螢光スペクトルが現われている領域であれば任意に選ぶことができ、上記の一例に限定されるものではない。
【００１７】
また、光散乱ピークのいずれかのピークのピーク強度又は積分値Ｉと、光散乱スペクトルの蛍光スペクトル部分の任意に定めた波数領域の積分値Ｓとの比Ｉ／Ｓをパラメータとし、糖化率の異なる複数の標準試料について糖化率とＩ／Ｓ値との関係を示す検量線を求めておき、未知試料について検量線作成時に使用した光散乱ピークのＩ／Ｓ値を測定し、その検量線に当てはめると、アルブミン濃度による補正のなされた糖化率を求めることができる。
【００１８】
以上の例は糖化タンパクのうちの糖化アルブミンについて測定を行ったものであるが、これらの光散乱ピークは、他の糖化タンパクを初め、糖化ペプチドや糖化アミノ酸などのアマドリ化合物で共通して観測される。アマドリ化合物の中で臨床的に重要なものは、糖化タンパクの糖化アルブミン、糖化ヘモグロビン及びフルクトサミンであるが、本発明は他のアマドリ化合物にも同様に適用することができる。
【００１９】
例として、ヒト血中ヘモグロビン水溶液（糖化率は不明）にＨｅ−Ｎｅレーザ光を照射して光散乱スペクトルを得、蛍光スペクトル部分をバックグラウンドとして除去したものを図１２（Ａ）に示す。図３（Ａ），（Ｂ）と同じラマンシフトの位置に鋭いピークが見られる。ヘモグロビンについても、図６と同様にして、蛍光スペクトルの適当な領域の積分値（縦軸の強度）をヘモグロビン濃度の異なる標準試料について測定した結果を図１２（Ｂ）に示す。ここでも、蛍光スペクトルの積分値とヘモグロビン濃度の間に直線関係が見られる。
【００２０】
図１の６個の光散乱ピークがアマドリ化合物に特有のピークであることを示す例として、グルコースとアミノ酸の結合部位（フルクトース構造）に特異的に反応する酵素フルクトシルアミノ酸オキシダーゼなどを用いてアマドリ化合物である糖化アミノ酸を分解し、それらのピークの変化を調べた結果を図７（Ａ）と（Ｂ）に示す。図７（Ａ）はそのような酵素を反応させる前の糖化アミノ酸であるNε-Fructosyl-Nα-Z-lysine（ＦＺＬ）水溶液のＨｅ−Ｎｅレーザ励起による光散乱スペクトルである。その試料溶液に糖化アミノ酸分解酵素を反応させた後の光散乱スペクトルは（Ｂ）に示されるものであり、（Ａ）のスペクトルと比べるとアマドリ化合物に特有のピークのピーク強度が減少している。ＦＺＬが糖化アミノ酸分解酵素により分解して生成するアミノ酸であるNα-Z-lysine（αＺＬ）の標準試料にＨｅ−Ｎｅレーザ光を照射し励起して得た光散乱スペクトルは、図８に示されるものであり、図７に現れている特異的な光散乱ピークは観測されない。
【００２１】
図７において、糖化アミノ酸分解酵素を添加してからの時間に対し、Ｈｅ−Ｎｅレーザ波長からのシフト波数１６５８ｃｍ-1のピークのピーク強度の変化を測定した結果が図９である。時間の経過にともなって分解酵素による糖化アミノ酸の分解が起こり、ピーク強度が減少している。このことによって、これらの特徴的な光散乱ピークは、糖とアミノ酸との結合によるピークであることがわかる。
【００２２】
他のアミノ酸としてのバリンと、その糖化アミノ酸としての糖化バリンの光散乱スペクトルをそれぞれ図１３Ａ，図１３Ｂに示す。糖化バリンのスペクトルもアマドリ化合物に特有のピークを備えている。
【００２３】
【実施例】
図１０に本発明で光散乱スペクトルを測定する装置の一例を説明する。１は励起光源であり、例えばレーザ装置が用いられる。レーザ装置としては、連続発振をするＡｒイオンレーザ、Ｋｒイオンレーザ、Ｈｅ−Ｎｅレーザ、Ｈｅ−Ｃｄレーザ、Ｎｄ：ＹＡＧレーザ、又はパルスレーザを用いることができ、近紫外域から近赤外域に渡る広い波長範囲のレーザから選択して利用することができる。レーザ装置以外の光源としてハロゲンランプなどを用いることもできる。ここでは光源１としてＨｅ−Ｎｅレーザを用いるものとする。２は光源１の出力を制御する電源装置である。
【００２４】
４はバンドパスフィルタで、光源１から発生するレーザ光１２からそのサイドバンドをカットするためのものである。レーザ光１２はハーフミラー５によって試料側の励起光１２ｓと対照側の対照光１２ｒに分離され、励起光１２ｓはハーフミラー５により発生する波長光をカットするためのバンドパスフィルタ７を経てレンズ９でセル３に集光して入射させられる。
【００２５】
セル３は石英製の角筒状の散乱光セルであり、反応溶液が収容され、一定温度、例えば２５℃に保たれている。セル３の反応溶液から発生する散乱光を増強するために、励起光１２ｓの入射方向にはミラー１１ａが配置されており、励起光１２ｓがセル３を透過した後、ミラー１１ａで反射されて再びセル３に入射することにより光散乱が増強される。また、励起光１２ｓの入射方向と９０°方向で、分光器２２側に反射する方向にミラー１１ｂが配置されており、セル３から発生する散乱光はミラー１１ｂで反射されたものも含めて励起光及びレイリ散乱光とともに集光レンズ１６，２０で集光され、フィルタ２１を経て分光器２２に集光される。フィルタ２１は励起光及びレイリ散乱光の成分をカットして励起波長から波長シフトした散乱光や蛍光成分のみを分光器２２に入射させるためのものである。分光器２２と検出器２３としては、分光器２２の分散方向に沿って複数の検出素子を配置したポリクロメータによるマルチチャネル検出方式のものを用いる。２４はマルチチャネル検出器２３から波長ごとに出力を取り出すための検出器制御部である。
【００２６】
分光器２２としては走査型分光器を用い、検出器２３として単一の検出素子を備えた検出器とすることもできる。その際、分光器２２を波長走査するために、分光器制御部２５が必要になる。
一方、ハーフミラー５で励起光１２ｓと分割された対照光１２ｒはミラー６で検出器３０方向に折り曲げられ、ミラー６で発生する波長光をカットするためのバンドパスフィルタ８を経て検出器３０に入射し、光源強度が検出される。
【００２７】
データ処理演算・出力部３１は分光器２２と検出器２３による光散乱光検出値を光源強度を示す対照光側の検出器３０の検出値で補正して光散乱スペクトルを得る。定量測定を行なうときは、データ処理演算・出力部３１は予め測定して作成された検量線データを保持しており、未知試料を測定して得られたピーク強度もしくはピーク面積、又はそれらを蛍光スペクトルの面積値で補正した値から、検量線に基づいて糖化物濃度又は糖化率を算出して出力する。分光器２２が波長走査を行なう場合にはデータ処理演算・出力部３１は分光器制御部２５を介して波長走査を行なう。
【００２８】
励起光による光散乱の増強をさらに効果的に行なうためのセルの例を図１１（Ａ），（Ｂ）に示す。
（Ａ）では、セル３ａはガラス、石英又はポリエチレンテトラフタレートなどの透明な材料により作られた丸底フラスコ状のセルであり、試料溶液が入れられる。そのセル３ａは積分球状のセルホルダ１０ａに嵌め込まれている。セルホルダ１０ａはその内面が反射面となっているとともに、励起光１２ｓを入射させ、その入射方向と１８０°の方向に散乱光を取り出すための窓が開けられている。励起光１２ｓはミラー１４で折り曲げられてセルホルダ１０ａの窓からセル３ａに入射する。１６はセルホルダ１０ａの窓から出射した散乱光を励起光とともに集光させる集光レンズである。セル３ａ内の試料溶液に照射された励起光は、セルホルダ１０ａの内面で反射を繰り返し、光散乱を伴ってセルホルダ１０ａの窓から取り出され、分光器方向へ導かれる。
【００２９】
（Ｂ）は励起光の入射方向に対し９０°方向に散乱光を取り出すようにセルホルダ１０ｂに窓を開けた例である。セル３ａは内面が反射面となった積分球状のセルホルダ１０ｂに嵌め込まれ、セルホルダ１０ｂにはｙ方向から励起光１２ｓを入射させる窓と、その入射方向と９０°をなすｘ方向に散乱光１８を取り出す窓が開けられている。
【００３０】
【発明の効果】
本発明ではアマドリ化合物を含む試料に単一波長の励起光を照射してその試料からの散乱光を受光し分光して光散乱スペクトルを得、その光散乱スペクトルのうち、励起波長に対するシフト波数にして８２０〜８４０ｃｍ-1、１６５５〜１６６０ｃｍ-1、２０００〜２０２０ｃｍ-1、２０８０〜２１００ｃｍ-1、２４６０〜２４７０ｃｍ-1又は２５３０〜２６００ｃｍ-1に存在する光散乱ピークを用いることによって、簡便な光学的測定方法によりアマドリ化合物を定量測定することができる。
アマドリ化合物の糖化率の測定には光散乱ピークのピーク強度やピーク積分値を用いることができるが、螢光スペクトルの適当な波数領域の積分値を基準としてアマドリ化合物とタンパク質等との和による補正を行なうことによって、糖化率をより正確に求めることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ヒト血清アルブミンの光散乱スペクトルを示す図であり、（Ａ）は糖化率２４.１％、（Ｂ）は糖化率５８.２％のものである。
【図２】高濃度のグルコース水溶液の光散乱スペクトルを示す図である。
【図３】図１（Ａ），（Ｂ）のスペクトルから螢光スペクトルを除去する演算操作を行なった後のそれぞれの光散乱スペクトルを示す図である。
【図４】光散乱スペクトルの１つのピークのピーク強度と糖化率の関係を示す検量線である。
【図５】光散乱スペクトルの１つのピークのピーク積分値と糖化率の関係を示す検量線である。
【図６】アルブミン濃度と螢光スペクトルの積分値との関係を示す図である。
【図７】アマドリ化合物分解酵素によるアマドリ化合物の光散乱ピークの変化を示す光散乱スペクトルの図であり、（Ａ）は分解酵素添加前、（Ｂ）は分解酵素添加後の状態を示したものである。
【図８】  Nα-Z-lysineの光散乱スペクトルを示す図である。
【図９】図７の測定における光散乱ピークの時間による変化を示す図である。
【図１０】本発明を実施する測定装置の一例を示すブロック図である。
【図１１】同測定装置における他のセル部分の例を示す断面図であり、（Ａ）は１８０°増強散乱を取り出す例、（Ｂ）は９０°増強散乱を取り出す例である。
【図１２】（Ａ）は蛍光スペクトルを除いた後のヒト血中ヘモグロビンの光散乱スペクトルを示す図、（Ｂ）はヘモグロビン濃度と蛍光スペクトルの積分値との関係を示す図である。
【図１３】（Ａ），（Ｂ）はそれぞれバリン、糖化バリンの光散乱スペクトルを示す図である。
【符号の説明】
１      励起光源
３      石英製散乱光セル
１２ｓ    励起光
１８      励起光及び光散乱光
２２      分光器
２３      検出器
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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