(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ストレプトマイセス属に属する微生物又はその変異株に由来し、以下の理化学的性質を有するリンゴ酸脱水素酵素。
１）作用
次の反応を触媒する。
【化１】
0003745803.tif 000007
２）基質特異性
オキザロ酢酸に対するＫｍが２．７×１０-5Ｍである。
３）至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲
オキザロ酢酸還元反応における、至適ｐＨが８〜９であって、ｐＨ７〜１１で安定である。
４）分子量
セファデックスＧ−１００ゲルクロマトグラフィーによる測定で７２，０００である。５）保存安定性
１００ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９）中、室温（２５℃）で２０日間放置した後、９５％以上の残存活性を有する。
６）熱安定性
１００ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９）中、５０℃で１５分間の処理で失活は見られない。
７）比活性
オキザロ酢酸還元反応において、１０００Ｕ／ｍｇ蛋白質以上である。
【請求項２】
ストレプトマイセス属に属する微生物又はその変異株を培養し、培養物からリンゴ酸脱水素酵素を採取することを特徴とする請求項１記載のリンゴ酸脱水素酵素の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はリンゴ酸脱水素酵素及びその製造方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
リンゴ酸脱水素酵素は、オキザロ酢酸の定量に使用されており、また、臨床検査試薬の分野においては、現在リンゴ酸脱水素酵素を用いたＧＯＴ（グルタミン酸−オキザロ酢酸−トランスアミナーゼ）の測定が肝機能の診断に利用されている。
【０００３】
従来、リンゴ酸脱水素酵素としては、ウシやブタ等の臓器由来のものと、シュードモナス・テストステロニ（Pseudomonas testosteroni）〔ジャーナル  オブバクテリオロジー（J. of Bacteriol.） 123, 704(1975) 〕、バチルス・サチルス（Bacillus subtilis ）〔ジャーナル  オブ  バクテリオロジー（J. of Bacteriol.） 240, 1118(1965)〕、プロピオニバクテリウム・シェルマーニ（Propionibacterium schermanii）〔フェデレーション  プロシーディング（Federation Proceeding ）33, 1490(1974)〕、エシェリキア・コリ（Escherichia coli）〔ジャーナル  オブ  バイオロジカル  ケミストリー（J. Biol. Chem.） 242, 1548(1967)〕、ニューロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa ）〔アーキブ  バイオケミストリー  バイオフィジックス（Arch. Biochem. Biophys. ）109, 466(1965)〕、サーマス・サーモフィラス（Thermus thermophilus）（特開昭５５−９９１８８号公報）等の微生物由来のものが知られている。
【０００４】
しかし、ブタやウシ等の高等動物の臓器由来のリンゴ酸脱水素酵素は、比活性においては満足できるもの、その保存安定性において十分満足できるものではなく、特に近年の臨床検査試薬の液状試薬への移行に対応できるだけの保存安定性を備えていないという欠点があった。また、高等動物の臓器を材料としているため、原材料の確保、大量精製の困難さ等にも問題点を有していた。
【０００５】
また、微生物由来のリンゴ酸脱水素酵素は、原材料の確保や大量精製が容易であり、さらに、例えばサーマス・サーモフィラス由来の酵素は非常に保存安定性に優れていることが報告されている（特開昭５５−９９１８８号公報）が、その比活性は精製酵素標品であってもせいぜい数十Ｕ／ｍｇ蛋白質程度であるため、これらの酵素を臨床検査試薬に組み込む場合、添加する酵素量が多くなり、この結果、測定結果が酵素中に含まれる夾雑蛋白質の影響を受け易くなるという問題点があった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、保存安定性に優れ、かつ比活性の高いリンゴ酸脱水素酵素及びその製造方法を提供することを目的とするものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、このようなリンゴ酸脱水素酵素を求めて多数の微生物を対象に鋭意研究した結果、従来見いだされていなかったストレプトマイセス属に属する放線菌に上記の性能を有するリンゴ酸脱水素酵素が存在するということを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、第１の発明は、ストレプトマイセス属に属する微生物又はその変異株に由来し、以下の理化学的性質を有するリンゴ酸脱水素酵素を要旨とするものである。
【０００９】
１）作用
次の反応を触媒する。
【００１０】
【化２】
0003745803.tif 000002
【００１１】
２）基質特異性
オキザロ酢酸に対するＫｍが２．７×１０-5Ｍである。
【００１２】
３）至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲
オキザロ酢酸還元反応における、至適ｐＨが８〜９であって、ｐＨ７〜１１で安定である。
【００１３】
４）分子量
セファデックスＧ−１００ゲルクロマトグラフィーによる測定で７２，０００である。
【００１４】
５）保存安定性
１００ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９）中、室温（２５℃）で２０日間放置した後、９５％以上の残存活性を有する。
【００１５】
６）熱安定性
１００ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９）中、５０℃で１５分間の処理で失活は見られない。
【００１６】
７）比活性
オキザロ酢酸還元反応において、１０００Ｕ／ｍｇ蛋白質以上である。
【００１７】
また、第２の発明は、ストレプトマイセス属に属する微生物又はその変異株を培養し、培養物からリンゴ酸脱水素酵素を採取することを特徴とする上記のリンゴ酸脱水素酵素の製造方法を要旨とするものである。
【００１８】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
まず、本発明のリンゴ酸脱水素酵素の理化学的性質を示す。
【００１９】
（１）作用
下記の反応を触媒する。
【００２０】
【化３】
0003745803.tif 000003
【００２１】
（２）基質特異性
０．５〜２０×１０-5Ｍのオキザロ酢酸を含む９５ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９）に、最終濃度が１Ｕ／ミリリットルとなるように酵素を加えて３０℃で反応させて反応速度を求め、Lineweaver-Burk プロットを作成した。この結果、オキザロ酢酸に対するＫｍ値は２．７×１０-5Ｍであった。
【００２２】
また、０．５〜２０×１０-5ＭのＮＡＤＨを含む９５ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９）に、最終濃度が１Ｕ／ミリリットルとなるように酵素を加えて３０℃で反応させて反応速度を求め、Lineweaver-Burk プロットを作成した。この結果、ＮＡＤＨに対するＫｍ値は１．４×１０-5Ｍであった。
【００２３】
（３）至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲
０．５ｍＭのオキザロ酢酸及び０．２５ｍＭのＮＡＤＨからなるアッセイミクスチャーを基質とし、各ｐＨの１００ｍＭの緩衝液中で３０℃で５分間反応させた結果、図１に示すとおり、至適ｐＨは８〜９であった。また、各ｐＨの１００ｍＭの緩衝液中で４℃で２４時間放置した後の残存活性を測定した結果、図２に示すとおり、ｐＨ７〜１１で優れた安定性を示し、ｐＨ９付近で最も安定であった。なお、緩衝液としては、ｐＨ４〜６は酢酸緩衝液、ｐＨ６〜８は燐酸緩衝液、ｐＨ８〜９はトリス−塩酸緩衝液、ｐＨ８．５〜１１はグリシン緩衝液を用いた。また、本発明においてリンゴ酸脱水素酵素の活性は、以下の方法により測定した。
０．５ｍＭのオキザロ酢酸及び０．２５ｍＭのＮＡＤＨを含む９５ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９）１ミリリットルに１０マイクロリットルの酵素溶液を加えて３０℃で５分間反応させ、この間の３４０ｎｍの吸光度の減少値を測定した。１分間当たりの吸光度の減少値をΔＡ340 とし、次式により活性値を算出した。なお、本発明において１Ｕとは、１分間に１μＭのＮＡＤＨをＮＡＤに変換する酵素量をいう。
【００２４】
【数１】
0003745803.tif 000004
【００２５】
図１は本発明の酵素の酵素活性に対するｐＨの影響を示すグラフであり、縦軸に酵素活性を、横軸にｐＨを示しており、酵素活性は測定値が最高値を示したときの活性を１００とした相対活性で表した。また、図２は、本発明の酵素の安定性に対するｐＨの影響を示すグラフであり、縦軸に残存活性を、横軸にｐＨを示しており、残存活性は測定値が最高値を示したときの活性を１００とした相対活性で表した。
【００２６】
（４）作用適温の範囲
０．５ｍＭのオキザロ酢酸及び０．２５ｍＭのＮＡＤＨからなるアッセイミクスチャーを基質とし、９５ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９）中で１０〜７０℃で５分間反応させた結果、作用適温は２０〜５０℃であった。
【００２７】
（５）分子量
セファデックスＧ−１００ゲルクロマトグラフィーによる測定で７２，０００である。
【００２８】
（６）保存安定性
１００ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９）中で室温（約２５℃）で２０日間放置した後、９０％以上の残存活性を有する。
【００２９】
（７）熱安定性
１００ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９）に酵素を１０Ｕ／ミリリットルになるように加え、２０〜６５℃の各温度において１５分間インキュベートした後の残存活性を測定した結果、図３に示すとおり、５０℃で１５分間の処理で失活は見られなかった。図３は本発明の酵素の安定性に対する温度の影響を示すグラフであり、縦軸に残存活性を、横軸に温度を示しており、残存活性は測定値が最高値を示したときの活性を１００とした相対活性で表した。
【００３０】
（８）比活性
ポリアクリルアミドゲル電気泳動で単一のバンドを与える本発明の酵素の精製標品の比活性はオキザロ酢酸還元反応において、１０００Ｕ／ｍｇ蛋白質以上である。
なお、本発明において蛋白量はプロテインアッセイキット（バイオラッド社製）を用いて測定した。
【００３１】
次に、本発明の酵素を得るには、本発明の酵素の産生能を有する微生物、例えば、ストレプトマイセス属に属する微生物又はその変異株を培養し、その培養物より目的とする酵素を採取すればよい。その具体的菌株として、ストレプトマイセス・エスピー(Streptomyces sp.)  Ｗ１０８〔以下、Ｗ１０８と略記する。（ＦＥＲＭ  Ｐ−１４９３５）〕が挙げられる。
【００３２】
このＷ１０８株の菌学的性質を放線菌の同定実験法（日本放線菌研究会編）に従って調べた結果を以下に示す。
【００３３】
（ａ）形態的性質
（１）菌糸
気菌糸形成                        有
基生菌糸の分断                    無
（２）胞子
胞子連鎖                          有
（ｂ）培養的性質
ＩＳＰ−２寒天平板培養    裏面の色相は淡黄色、気菌糸の色相は白色、色素の生産は認められない
ＩＳＰ−２寒天平板培養    裏面の色相は淡黄色、気菌糸の色相は白色〜灰色、色素の生産は認められない
（ｃ）生理学的性質
生育温度範囲                    ２０〜５５℃（至適生育温度４５℃）
メラニン様色素の合成                    無
炭素源の利用性
Ｌ−アラビノース                  可
Ｄ−フラクトース                  可
Ｄ−グルコース                    可
イノシトール                      可
Ｄ−マンニトール                  可
ラフィノース                      可
Ｌ−ラムノース                    不可
シュークロース                    可
Ｄ−キシロース                    可
（ｄ）化学分類学的性質
細胞壁タイプ                            Ｉ型
LL−ジアミノピメリン酸            有
meso−ジアミノピメリン酸          無
ジアミノ酪酸                      有
グリシン                          有
アスパラギン酸                    無
オルニチン                        無
リジン                            無
アラビノール                      無
ガラクトース                      無
キノン系                           MK-9(H8,H6,H4)
以上の結果よりバージィーズ・マニュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジー〔Bergey's Mannual of systematic Bacteriology vol. 4(1989)〕を基に検索したところ、Ｗ１０８株はストレプトマイセス属に属する放線菌であると同定された。この菌株は新規なリンゴ酸脱水素酵素を生産する点において新規な菌株であると判断できることから、ストレプトマイセス・エスピー(Streptomyces sp.)  Ｗ１０８と命名し、平成７年５月２２日に通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託した。その寄託番号は、ＦＥＲＭ  Ｐ−１４９３５である。
【００３４】
本発明においては、この他にも、Ｗ１０８株の自然的及び人工的変異株は勿論、ストレプトマイセス属に属する菌種でリンゴ酸脱水素酵素産生能を有する菌株はすべて使用することができる。また、それらのリンゴ酸脱水素酵素遺伝子を組み入れた組換え微生物も生産菌として使用することができる。
【００３５】
これらの菌株を培養する際の培地としては、一般によく用いられる培地を使用することができる。具体的には、炭素源としては、グルコース、シュークロース、マルトース、グリセロール、廃糖蜜、クエン酸、リンゴ酸等の有機酸等が利用でき、窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカー等の無機及び有機の窒素源が利用できる。また、必要に応じて各種のミネラル、無機塩類、ビタミン等を添加して培養することもできる。
【００３６】
培養条件としては、通常、好気的条件で行われ、液体培養、固体培養のどちらでもよい。培養温度としては、２０〜５５℃、好ましくは３０〜５０℃、さらに好ましくは４０〜４５℃で行うのがよい。また、培養時のｐＨとしては、４〜９、好ましくは５〜８、さらに好ましくは６〜７がよい。また、培養時間としては、３〜４８時間、好ましくは６〜２４時間、さらに好ましくは８〜１６時間がよいが、培養の条件により最適条件が変わることは言うまでもない。このような条件で培養することにより、菌体内にリンゴ酸脱水素酵素を生成、蓄積させることができる。
【００３７】
このように培養して得られた培養物から本発明の酵素を精製取得する方法としては、通常の酵素精製手段を組み合わせて行えばよい。例えば、培養物から遠心分離、ろ過等の一般的な菌体回収方法により得た菌体を超音波、フレンチプレス、自己消化、有機溶媒処理、界面活性剤処理、リゾチーム等の酵素処理等により破砕し、緩衝液等で菌体内に含まれる酵素を抽出する。このようにして得られた粗酵素液をＤＥＡＥ−セルロース、ＤＥＡＥ−セファロース、Ｑ−セファロース、ホスホセルロース（以上、ファルマシア製）等のイオン交換樹脂、チバクロンブル−Ｈ−ＥＲＤ（ＩＣＩ社製）、チバクロンイエローＨＥ−３Ｇ、ブルーセファロースＣＬ−６Ｂ（ファルマシア製）等のアフィニティークロマト用樹脂、フェニルセファロース、オクチルセファロースＣＬ−４Ｂ（ファルマシア製）等の疎水クロマト用樹脂、セファデックスＧ１００、Ｇ２００等のゲルろ過用樹脂を組み合わせて用い、クロマトグラフィーにより目的の酵素を精製することができる。また、カラムクロマトグラフィーの前処理として硫酸ストレプトマイシンや硫酸プロタミンによる除核酸処理を行ってもよい。さらに、溶媒を用いる分別沈澱、硫酸アンモニウム等の塩類を用いる塩析を適宜組み合わせて精製に用いることができる。
【００３８】
【実施例】
次に、本発明を実施例によって具体的に説明する。なお、実施例中の％は重量％を示す。
【００３９】
実施例１
１％グルコース、１％シュークロース、１％ファーマメディア、０．５％大豆粉、１％変性でんぷん、０．５％ポリペプトン、０．２％炭酸カルシウムからなる培地（ｐＨ６．７）５００ミリリットルにＷ１０８株を接種し、４５℃で３日間振とう培養した。このようにして得た培養液を１．５％グルコース、１％酵母エキス、０．２％ポリペプトン、０．２％炭酸カルシウムからなる培地（ｐＨ６．７）２０リットルを仕込んだ３０リットルスケールのジャーファーメンターに接種し、４５℃、通気条件２０リットル／分、撹はん４００ｒｐｍで１２時間培養を行った後、遠心分離にて菌体を回収し、７８０ｇの湿菌体を得た。
【００４０】
得られた湿菌体のうち２０ｇを２ｍＭのＥＤＴＡ及び２ｍＭの２−メルカプトエタノールを含む２５ｍＭの燐酸緩衝液（ｐＨ８）１８０ミリリットルに懸濁し、超音波破砕機（KUBOTA INSONATOR 201M ）を用いて１２０ワットで１５分破砕した。その後、遠心分離により未破砕の菌体及び菌体残査を除き、粗酵素液を得た。このようにして得られた粗酵素液を上記の２５ｍＭの燐酸緩衝液で平衡化したＤＥＡＥセファロースＦＦ（ファルマシア社製）カラム（１００ミリリットル）にアプライした。このカラムを同緩衝液で洗浄した後、０〜０．５Ｍの塩化カリウムの直線濃度勾配により、リンゴ酸脱水素酵素を溶出した。活性画分を集め、１Ｍの硫酸アンモニウムを含む２５ｍＭの燐酸緩衝液（ｐＨ６）で平衡化したフェニルセファロースＣＬ−４Ｂ（ファルマシア社製）カラム（１００ミリリットル）にアプライした。１Ｍの硫酸アンモニウムを含む２５ｍＭの燐酸緩衝液（ｐＨ６）で洗浄後、０．５〜０Ｍの硫酸アンモニウムによる直線濃度勾配により、リンゴ酸脱水素酵素を溶出した。リンゴ酸脱水素酵素画分を集め、透析により硫酸アンモニウムを除いた後、２５ｍＭの燐酸緩衝液（ｐＨ６）で平衡化したブルーセファロースＣＬ−６Ｂ（ファルマシア社製）カラム（１００ミリリットル）にアプライした。同緩衝液で洗浄した後、０〜０．５Ｍの塩化カリウムの直線濃度勾配によりリンゴ酸脱水素酵素を溶出した。このようにして比活性１２５０．４（Ｕ／ｍｇ）のリンゴ酸脱水素酵素を得ることができた。このようにして得られたリンゴ酸脱水素酵素は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動で単一なバンドを与えた。以上に述べた精製の各ステップでの比活性、活性の回収率等を表１にまとめた。
【００４１】
【表１】
0003745803.tif 000005
【００４２】
参考例１、比較例１、２
実施例１で得たリンゴ酸脱水素酵素（参考例１）と、ブタ心臓由来のリンゴ酸脱水素酵素（ベーリンガーマンハイム社製、比較例１）及びサーマス・サーモフィラス由来のリンゴ酸脱水素酵素（天野製薬社製、比較例２）との比活性を測定した。
その結果を表２に示す。
【００４３】
【表２】
0003745803.tif 000006
【００４４】
参考例２、比較例３
実施例１で得たリンゴ酸脱水素酵素（参考例２）と、ブタ心臓由来のリンゴ酸脱水素酵素（ベーリンガーマンハイム社製、比較例３）の保存安定性を以下のようにして測定した。
それぞれの酵素を１０Ｕ／ミリリットルとなるように１００ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９）で希釈した後、２８℃の恒温槽で４２日間保存した。この間の残存活性を経時的に測定した。
【００４５】
その結果を図４に示す。図４は本発明のリンゴ酸脱水素酵素及びブタ心臓由来のリンゴ酸脱水素酵素の保存安定性を示すグラフであり、縦軸に残存活性を、横軸に日数を示した。なお、残存活性は、保存開始時の活性を１００とした相対活性で示した。
【００４６】
表２及び図４からわかるように、本発明のリンゴ酸脱水素酵素は比活性が高く、また保存安定性に優れている。これに対して、サーマス・サーモフィラス由来のリンゴ酸脱水素酵素は比活性が低く、また、ブタ心臓由来のリンゴ酸脱水素酵素は比活性は高いものの保存安定性がよくない。
【００４７】
【発明の効果】
本発明のリンゴ酸脱水素酵素は、保存安定性に優れ、かつ比活性が高い。このため、本発明のリンゴ酸脱水素酵素は、オキザロ酢酸の定量やＧＯＴ（グルタミン酸−オキザロ酢酸−トランスアミナーゼ）の検査用試薬に用いることに適している。
また、本発明の製造方法によれば、このような酵素を容易に製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のリンゴ酸脱水素酵素の活性に対するｐＨの影響を示すグラフである。
【図２】本発明のリンゴ酸脱水素酵素の安定性に対するｐＨの影響を示すグラフである。
【図３】本発明のリンゴ酸脱水素酵素の安定性に対する温度の影響を示すグラフである。
【図４】本発明のリンゴ酸脱水素酵素及びブタ心臓由来のリンゴ酸脱水素酵素の保存安定性を示すグラフである。
【図１】
0003745803.tif 000008
【図２】
0003745803.tif 000009
【図３】
0003745803.tif 000010
【図４】
0003745803.tif 000011