(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）プリオンタンパク質を含むと予測される試料を、Ｈｓｐ６０およびＧｒｏＥＬからなる群から選択されるシャペロンと接触させ、
（ｂ）プリオンタンパク質がこのシャペロンと結合するかどうかを決定する
工程からなることを特徴とするプリオンタンパク質の検出方法。
【請求項２】
（ａ）プリオンタンパク質を含む試料を、Ｈｓｐ６０およびＧｒｏＥＬからなる群から選択されるシャペロンと接触させ、
（ｂ）シャペロンに結合したタンパク質をシャペロンから単離する
工程からなることを特徴とするプリオンタンパク質の単離方法。
【請求項３】
Ｈｓｐ６０およびＧｒｏＥＬからなる群から選択されるシャペロンの断片、同族体または誘導体を用いる請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
シャペロンが融合タンパク質の一部である請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
プリオンタンパク質がＰｒＰcおよび／またはＰｒＰcのイソ型である請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
シャペロンが検出可能にラベルされている請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
シャペロンが固相に結合している請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
（ａ）プリオンタンパク質を含むと予測される試料を、Ｈｓｐ６０およびＧｒｏＥＬからなる群から選択されるシャペロンと接触させ、
（ｂ）該プリオンタンパク質と該シャペロンとの結合の強さを、該シャペロンのＰｒＰcのイソ型およびＰｒＰc基準物に対する結合性の強さとそれぞれ比較することにより、ＰｒＰcのイソ型が該試料中に存在するか否かを決定する
工程を含んでなる伝染性海綿様脳症のインビトロ診断方法。
【請求項９】
ＰｒＰcのイソ型がＰｒＰscである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれかに規定するシャペロンとプリオンタンパク質との複合体。
【発明の詳細な説明】
本発明は、プリオンタンパク質に特異的に結合するシャペロンを用いて、プリオンタンパク質を検出または単離する方法に関するものである。本発明はさらに、伝染性海綿様脳症のインビトロ診断法および好ましくは該疾患の予防または処置用医薬組成物に関する。
伝染性海綿様脳症（ＴＳＥｓ）は、例えば羊スクラピー、ウシのウシ海綿様脳症（ＢＳＥ）およびヒトのクロイツフェルト−ヤコブ病（ＣＪＤ）のような神経退化疾患である（３４）。感染脳から得た感染性調製物は、紫外線および電離放射および核酸を不活性化する他の手法に対して抵抗性であり、このことは核酸が感染能に必要とされないことを示す。脳から感染性調製物を精製することにより、感染能に必要とされるタンパク質の存在が示された（３６）。これらの実験的観察は「タンパク質単独」仮説を導き、これはタンパク質感染性粒子（「プリオン」）がＴＳＥｓの伝染の原因であることを提示するものである（３，４，３６）。プリオンは主に、ＰｒＰSc（プリオンタンパク質、「Ｓｃ」はスクラピー）と呼称されるプロテアーゼ耐性タンパク質、翻訳後修飾型のプロテイナーゼＫ感受性宿主コード化ＰｒＰc（「ｃ」は細胞）から構成される（８，９，１１，３４）。両方のイソ型は同じアミノ酸配列を有するが、その二次構造は異なる（３１，４２）。円二色性（ＣＤ）およびフーリエ変換赤外（ＦＴＩＲ）分光器の使用により、ＰｒＰcが高いαヘリックス含有量を示したのに対し、ＰｒＰScは有意に高いβシート含有量を示した（１７，３１，３８）。ＰｒＰcの構造予測からアミノ酸残基１０９−１２２、１２９−１４１、１７８−１９１および２０２−２１８の４つのドメインがαヘリックスを形成することを示すモデルが導かれている（２４）。プリオンの伝搬にはＰｒＰcのαヘリックスドメインのＰｒＰScのβシートへの変換が関係していることが示唆されている（２６，３０，３１）。ＰｒＰcからＰｒＰScへのインビトロ変換がプロテイナーゼＫ耐性アッセイを用いて示された（２８）。最近、ＰｒＰcが部分的にほどかれ、再び折りたたまれてオリゴマ−ＰｒＰScシードの指揮下にＰｒＰScとなるにちがいないことに準拠した１つの修正モデルが示されている（２９）。このモデルはスクラピー種障壁（２７）およびプリオンの株特異的性質（７）に対し、説明を与えるものである。さらにトランスジェニックマウスを用いた実験によりプリオンの伝搬には「プロテインＸ」という種特異的な巨大分子が必要とされることが提唱されている（４３）。
今までに、天然プリオンタンパク質を直接的に検出または単離する方法は記載されていない。先行文献（３１）に記載のＰｒＰcの単離は時間がかかり、効率が悪く、最少量のタンパク質しか得ることができなかった。先行文献（３１，３５，６４）に記載のＰｒＰScの単離もまた、時間がかかり、非効率的で、ＰｒＰScの純度は不確かなものである。さらに従来は、簡便かつ信頼性のある伝染性海綿様脳症の診断アッセイの開発に欠くことのできない、細胞のイソ型ＰｒＰcおよびイソ型ＰｒＰscまたはＰｒＰ２７−３０を識別することは不可能であった。
したがって本発明の根底にある技術的課題は、プリオンタンパク質を効率的に単離し、検出する単純な方法であって、好ましくは異なるイソ型ＰｒＰを識別できる方法を提供できないか、である。
この技術的課題は請求の範囲にその特徴を示した態様によって解決できる。
すなわち、本発明は、以下の工程を特徴とする、プリオンタンパク質を検出する方法に関する：
（ａ）プリオンタンパク質を含むと予測されるプローブをシャペロンと接触させ；
（ｂ）プリオンタンパク質がシャペロンと結合するかどうかを決定する。
さらに本発明は以下の工程を特徴とする、プリオンタンパク質の単離方法に関する：
（ａ）プリオンタンパク質を含むプローブをシャペロンと接触させ；
（ｂ）シャペロン結合タンパク質をシャペロンから単離する。
ＰｒＰcと相互作用できるタンパク質を同定するための実験を行ったところ、驚くべきことにシャペロンがプリオンタンパク質に特異的に結合することを発見した。観察されたインビボ相互作用の特異性が組換えプリオンタンパク質を用いたインビトロ結合試験によって確認された。組換えプリオンＧＳＴ融合ペプチドを用いて、分子シャペロンとＰｒＰc間の相互作用部位のマッピングを行った。この結果、ＧＳＴ−ＰｒＰc融合タンパク質はＳ．セレビシエ環境およびインビトロでＨｓｐ６０と特異的に結合することが示された。Ｈｓｐ６０ファミリーは、ポリペプチド鎖のＡＴＰ依存性の折りたたみを媒介する、最もよく特徴が知られている分子シャペロンの１つであって（１３，１８，２２，２３）、原核生物から哺乳類まで広く分布し、保存されているものである。ヒトＨｓｐ６０（５４４アミノ酸）は原核生物の相同体ＧｒｏＥＬの結晶構造中に見られるように、インビボで１４量複合体を形成することが示されている（１０）。Ｓ．セレビシエにおける２−ハイブリッドスクリーンによって単離されたｃＤＮＡ（１５，１９，２１）は、少なくともＨｓｐ６０単量体の先端ドメインを部分的に含む３９９、３１７および２４６アミノ酸長のＮ−末端切断タンパク質をコードする。この先端ドメインはＧｒｏＥＬの場合には、ペプチド結合を特異的に媒介するいくつかのアミノ酸残基を含む（１４）。ＰｒＰc／Ｈｓｐ６０インビボ相互作用の特異性は「擬似おとり」のＬｅｘＡ−bicoidとＬｅｘＡ−ＮＦＩ／ＣＴＦ２および本物のＬｅｘＡとＬｅｘＡ−ＧＳＴを用いて確認された。インビトロにおけるこの相互作用は組換えＧＳＴ−ＰｒＰcと組換え完全長Ｈｓｐ６０およびＧｒｏＥＬを用いて確認された。この結果は、ＰｒＰc／Ｈｓｐ６０相互作用には追加の因子は関係せず、それゆえシャペロンはプリオンタンパク質の検出および単離に用いることができることを示している。組換えｒＰｒＰ２７−３０（４７）はスクラピー調製物から単離されるプロテイナーゼＫ耐性コアＰｒＰ２７−３０のプロテイナーゼＫ感受性イソ型である。このｒＰｒＰ２７−３０とＨｓｐ６０間のインビトロ相互作用の結果は、Ｈｓｐ６０と結合するのにＰｒＰのコア領域（アミノ酸９０−２３１）だけで十分であることを明らかにした。
ＰｒＰcペプチドをマッピングしてアミノ酸１８０およびアミノ酸２１０間の相互作用部位を同定することにより、Ｈｓｐ６０とＰｒＰcの結合がアミノ酸１８０、１９８、２００および２１０を含むプリオンタンパク質の高度に保存された領域に存在することが示された。これらの残基の突然変異はヒトの遺伝性プリオン疾患を差別化にする（３３）。さらに、シャペロン結合性断片ＧＳＴ::Ｐ１８０−２１０は少なくとも２つの推定α−ヘリックスドメインＨ３（アミノ酸１７８−１９１）およびＨ４（アミノ酸２０２−２１８）を部分的に含む（２４）。ＰｒＰにおけるα−ヘリックス領域のβ−シート領域への変換は、ＰｒＰScの形成に関与すると考えられる。Ｈｓｐ６０／ＰｒＰ相互作用のあり得る生理学的関連性を示唆するいくつかの可能性が存在する。（ｉ）酵母プリオン様因子［ｐｓｉ+］と分子シャペロンＨｓｐ１０４との相互作用に示されているように、Ｈｓｐ６０はＰｒＰScの伝搬に関与するかもしれない（１２，５０）。最近、トランスジェニックマウスの研究に基づいて、「プロテインＸ」と呼ばれる種特異的巨大分子がプリオン形成に関与することが示唆されている（４３）。プロテインＸは、ＰｒＰイソ型を変換させる分子シャペロンとしてように機能することが提唱されている。この未知の因子「Ｘ」は実際にはＨｓｐ６０であるかもしれない。（ii）あるいは、Ｈｓｐ６０は、例えばまちがって折りたたまれた形態のＰｒＰcをトラップすることによって、ＰｒＰcがＰｒＰScアミロイドへ凝集するのを防いでいるかもしれない。
より最近のデータはいわゆる「化学シャペロン」、例えばグリセロール、トリメチルアミンＮ−オキシド（ＴＭＡＯ）およびジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）が、ＰｒＰcのα−ヘリックスコンフォメーションを安定化させてＰｒＰSc形成を妨げることを示唆している（６７）。
本発明の方法によるプリオンタンパク質の検出または単離は、組換え的に生産したプリオンタンパク質または天然源由来のプリオンタンパク質に関係する。プリオンタンパク質は、例えばスクロース中への組織の懸濁、ホモジナイズおよび遠心による不純物の除去が含まれる文献（３１，６４）に記載の方法によって天然源から抽出できる。
既知の方法により、例えば溶液中の、あるいは、例えばゲルまたは樹脂のようなクロマトグラフィー用マトリクスに固定したシャペロンを用い、プリオンタンパク質を含むと予測されるプローブをシャペロンと接触させることができる（６６）。
以下の実施例に記載のように、プローブをシャペロンと接触させ、シャペロン−プリオンタンパク質複合体を分析することもできる。
プリオンタンパク質に特異的に結合する適当なシャペロンはとりわけ、以下の実施例に記載のようにして、特定のシャペロンとプリオンタンパク質との結合を分析することによって当業者により決定することができる。
本発明の方法の１つの好ましい態様では、プリオンタンパク質との結合能を依然と有している該シャペロンの断片、同族体または誘導体を用いる。
本明細書中に用いる用語「誘導体」は、残基の側鎖またはＮ−もしくはＣ−末端基に存在する官能基から、当分野に既知の手段によって調製することができる誘導体を表す。
用語「断片」はプリオンタンパク質と相互作用することができるシャペロン断片を表し、このような断片は当業者に既知の技術によって調製できる。
本発明のもう１つの好ましい態様では、プリオンタンパク質の検出および／または単離方法に用いるシャペロンはＨｓｐ６０またはＧｒｏＥＬである。
さらに好ましい態様では、シャペロンは組換えタンパク質であり、すなわちシャペロンは組換えＤＮＡ技術、いわゆるクローン化ＤＮＡ配列からの発現によって生産する。
よりさらに好ましい態様では、シャペロンは融合タンパク質の一部であり、この融合タンパク質はシャペロンのほかにタンパク質、または好ましくは融合タンパク質に特異的結合能を与えるタンパク質ドメインを含む。組換えシャペロンはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼと融合しているのが好ましい。
いかなるプリオンタンパク質、このプリオンタンパク質のイソ型、断片または誘導体、またはこれら物質の混合物は、シャペロンが結合できる限り、本発明の方法によって検出し、あるいは単離できる。好ましい態様では、検出され、あるいは単離されるプリオンタンパク質はプリオンタンパク質ＰｒＰcおよび／またはＰｒＰcのイソ型である。プリオンタンパク質イソ型はイソ型ＰｒＰscまたはその断片もしくは誘導体であるのが好ましい。
さらに好ましい態様では、プリオンタンパク質は、ＰｒＰscのアミノ酸２３−２３１を含むプロセッシングＰｒＰc２３−２３１であり、ならびに／あるいはイソ型ＰｒＰscはＮ−末端切断誘導体ＰｒＰ２７−３０またはその断片である。
上記のように、プリオンタンパク質がシャペロンに結合するかどうかを決定するには、シャペロンは溶液状態にしても、あるいは固相に結合してもよい。
両者を溶液中でインキュベートした後、相互作用は共免疫沈降（５１）、次いで例えば（２０）に記載のＰｒＰ特異的抗体、シャペロン−特異的抗体、またはいずれかのタグに対する抗体、すなわちＧＳＴ−抗体、ＦＬＡＧ−抗体、Ｂタグ−抗体、またはカルモジュリン結合タンパク質、Ｓ−ペプチド、マルトース結合タンパク質、オリゴヒスチジンおよび緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）に対する抗体を用いるウエスタンブロッティングによって確認できる。さらに、この相互作用は、例えば（ｉ）スベルイミノ酸ジメチルのような試薬を用いて架橋すること（５２）、（ii）両方のパートナーの１つと融合したいずれかのタグに対する固定化リガンドを加えること（十字相互作用）によるアフィニティークロマトグラフィー（６６）、または（iii）非変性ポリアクリルアミドゲルにより（５３）もしくは大部分がＨＰＬＣ／ＦＰＬＣであるサイズ排除クロマトグラフィー（５４）により複合体を分析することによって確認することができる。
好ましい態様では、シャペロンは溶液状態でありかつ検出可能にラベルする。適当なラベルは当業者に既知であろうし、このようなラベルは通常の実験を行うことによって確かめることができるであろう。検出可能なラベルは放射性同位体、蛍光化合物、コロイド金属、化学発光化合物、生物発光化合物、燐光性化合物または酵素から選択されるのが好ましい。
一方、シャペロンはプリオンタンパク質の検出および／または単離用の固相に結合する。適当な物質は当業者に既知であり、これには、例えばゲルまたは樹脂（セファロース、アガロース、ニトロセルロース、ダイナビーズ（dynabeabs）R、ポリスチレンなど）が含まれる。
好ましい態様では、固相はグルタチオンセファロースのようなグルタチオンを含むマトリクスである。シャペロンとマトリクスの結合に用いるタンパク質ドメインはオリゴヒスチジン（５５）、カルモジュリン結合ペプチド（ＣＢＰ）（５６）、Ｓ−ペプチド、（リボヌクレアーゼＡ）（５７）、ＦＬＡＧ（５８）、緑色−蛍光タンパク質（ＧＦＰ、６５）、Ｂタグ（５９）またはマルトース−結合−タンパク質（ＭＢＰ；６１）とすることもできる。タグ付シャペロンはグルタチオン、ＩＭＡＣ−Ｎｉ2+、カルモジュリン、Ｓ−タンパク質 １０４ ａａ（５７）、抗−ＦＬＡＧ−抗体、抗ＧＦＰ−抗体、Ｂタグ−抗体（５９）またはマルトース（６０）に固定することができる。
一方、融合タンパク質によるシャペロン自体のカップリングは非酸化システインのチオール基、または遊離リジンもしくはα−アミノ基を介し、臭化シアンアガロースまたはα−ヒドロキシスクシンイミド活性化アガロースに対して行うことができる。
プリオンタンパク質とシャペロンとの相互作用は化合物の１つを固定している場合、ＩＡＳＹＳ（ＦＩＳＯＮＳ）によって決定できる。タンパク質−タンパク質相互作用はエバンセント場（evanescent field）を用いてプローブ表面近くの生体分子の質量および濃度を厳密に調べるバイオセンサーによって検出し、測定できる。あるいは、このような相互作用は、さらにウエスタンブロット／アフィニティーブロット（６２）によって決定できる：
タグ付か、付いていないかどちらかのプリオン−タンパク質またはタグ付か、付いていないかどちらかのシャペロンをニトロセルロースまたはＰＶＤＦのような膜にブロッティングする。溶液中の他の相互作用パートナーである、タグ付か、付いていないかどちらかのプリオンタンパク質またはタグ付か、付いていないかどちらかのシャペロンをタンパク質結合膜とインキュベートする。相互作用は溶液中のタンパク質自体またはタンパク質に融合させたタグに対する抗体を加えることによって確認する（６２）。
本発明のプリオンタンパク質単離方法のよりさらに好ましい態様では、シャペロンはアフィニティークロマトグラフィーカラム中に含まれるマトリックスの一部であり（６３，６６）、工程（ｂ）は以下のように改変する：
（ｉ）プリオンタンパク質を含むと予測されるプローブをカラムに通し、
（ii）洗浄後、任意にｐＨまたはイオン強度を変えて、プリオンタンパク質をカラムから溶出させ、集め；
（iii）要すれば、集めたプリオンタンパク質をさらに精製する。
例えば文献（５５，６３，６６）に記載のこの種のアフィニティークロマトグラフィーにより、プリオンタンパク質調製物中に含まれる不純物はカラムを通過する。プリオンタンパク質（群）はシャペロンによってカラムに結合するであろう。プリオンタンパク質とカラムを特異的に結合させ、プリオンタンパク質をゲルから溶出させるのに適当な条件は当業者が決定することができ、これは例えば文献（４７，４８）に記載されている。
別の態様では、プリオンタンパク質の単離は標準的手法に従い、あるいは以下の実施例に記載の手法（ここではプリオンタンパク質のかわりに、シャペロンをグルタチオン−セファロースビーズ、例えばグルタチオン−セファロース４Ｂビーズに結合させている）に修正を加え、バッチ（１回の）工程として行う。
本発明の方法にしたがって単離し、精製したプリオンタンパク質は例えば、抗体産生用免疫原、医薬組成物の活性成分として、あるいはＥＬＩＳＡのような診断アッセイの開発用に用いることができる。
プローブは種々の器官、好ましくは組織、例えば脳、回腸、皮質、硬膜、パーシンジェ（purcinje）細胞、リンパ節、神経細胞、脾臓、扁桃、筋肉細胞、胎盤、膵臓眼、脊髄もしくはパイエル斑、または体液、好ましくは血液、脳脊髄液、精液または乳から得ることができる。
実施例６に記載の結果から明らかなように、シャペロンＧｒｏＥＬのｒＰｒＰ２７−３０に対する結合はＰｒＰcに対する場合に比べて強い（図２Ｂのレーン３と図２Ｃのレーン２参照）。これらの結果はさらにＧｒｏＥｌおよびＨｓｐ６０で滴定実験することによって確認された（データは示していない）。これゆえ、プローブ中のプリオンタンパク質に対するシャペロンの結合の強さを同シャペロンのＰｒＰsc（またはｒＰｒＰ２７−３０）およびＰｒＰc基準物に対する結合強度と比較して決定することにより、伝染性海綿様脳症（ＴＳＥ）を引き起こすプリオンタンパク質がサンプル中に含まれているかどうかを決定できる。
したがって、本発明のさらに好ましい態様は、伝染性海綿様脳症のインビトロ診断方法であって、ＰｒＰcおよびイソ型のＰｒＰcそれぞれ、好ましくはＰｒＰscに対するシャペロンの結合性の差異を用いて、プローブ中にＰｒＰcのイソ型が存在するかどうかを決定するように工程（ｂ）を修正した方法に関する。
本発明はさらにシャペロンとプリオンタンパク質の複合体および、それに加え、プリオンタンパク質を検出および／または単離するための上記のシャペロンを含む組成物を提供する。
さらに本発明は上記のシャペロンを含む診断組成物に関する。このような組成物には診断目的に通常用いる添加剤を含ませることができる。このような組成物は、身体由来のプローブをシャペロンとインキュベートし、プローブに含まれるプリオンタンパク質に対するシャペロンの結合性の強さを決定する上記研究方法を適用して、伝染性海綿様脳症の診断用に用いることができる。脳をプローブとして用いる場合には、診断は死後に行われるのが多いが、特定の場合には、生きている生物でも行うことができる（生検）。血液、乳または脳脊髄液をプローブとして用いる場合には、生きている個体での診断が可能である。
もう１つの態様では、本発明は、上記シャペロンを含むか、あるいは該シャペロンを不活性化する物質を含む医薬組成物に関する。このような組成物には任意に製薬的に許容される担体を含ませることができる。
例えばＨｓｐ６０のようなシャペロンはＰｒＰcからＰｒＰscへの凝集を妨げることができると考えられるので、プリオンタンパク質に特異的に結合するこのようなシャペロンを投与することによってイソ型ＰｒＰcからプリオン関連性イソ型ＰｒＰscへの変換を遮断し、これゆえ伝染性海綿様脳症を予防し、あるいは処置することができるかもしれない。
他方、シャペロンはＰｒＰcからＰｒＰscへの変換に関与することがあり得るかもしれない。これゆえ、プリオンタンパク質と特異的に相互作用するシャペロンを特異的に不活性化する物質の投与によるそのような変換の遮断は伝染性海綿様脳症の処置または予防に寄与できることもあり得る。このような物質は当業者が決まった実験によって選択でき、これにはシャペロンに結合することにより、シャペロンがプリオンタンパク質と相互作用するのを妨げるリガンドが含まれる。このようなリガンドの例には抗体、好ましくはモノクローナル抗体、またはシャペロンとの結合に寄与するドメインを含有するタンパク質断片、例えばアミノ酸１８０−２１０を含むＰｒＰc断片がある。
該組成物は伝染性海綿様脳症、例えばスクラピー、ウシ海綿様脳症（ＢＳＥ）、クロイツフェルト−ヤコブ病（ＣＪＤ）、
0003745380.tif 000002
−症候群（ＧＳＳ）、クルー、致死的家族性不眠症（ＦＦＩ）または伝染性ミンク脳症（ＴＭＥ）の処置に用いられる。
図面の説明
図１：２−ハイブリッドシステムを用いるＰｒＰc２３−２３１／Ｈｓｐ６０相互作用の同定
２つの異なる表現型によりこの相互作用を確認する。レポータープラスミドｐＳＨ１８−３４を含有する酵母細胞をＨｓｐ６０（アミノ酸１４６−５４４）をコードするｃＤＮＡクローンを保持するｐＪＧ４−５プラスミドおよびおとりプラスミドｐＳＨ２−１（１列）、ｐＳＨ２−１−ＧＳＴ（２列）、ｐＳＨ２−１−ＧＳＴ−ＰｒＰc（３列）、ｐＳＨ２−１−ＮＦＩ／ＣＴＦ２（４列）（４９）、ｐＥＧ２０２−bicoid（５列）（２１）およびｐＳＨ２−１−ＰｒＰc−ＧＳＴ（６列）で同時形質転換した。それぞれの形質転換体のうち５個をＴＥに再懸濁し、Ｘ−Ｇａｌを補足（Ａ）したか、あるいはロイシン欠乏性（Ｂ）かどちらかのガラクトースプレートにドットし、３０℃で５日間インキュベートした。
図２：ＧＳＴに融合させたＰｒＰの存在下におけるＨｓｐ６０およびＧｒｏＥＬのインビトロ相互作用を示すためのプル−ダウンアッセイの免疫ブロット分析
左側の数字はサイズ（ｋＤａ）を表す。（Ａ）グルタチオンセファロースに固定した組換えＧＳＴ（１ｍｇ）、ＧＳＴ−ｒＰｒＰ２７−３０（２ｍｇ）およびＧＳＴ−ＰｒＰc（２ｍｇ）をＨｓｐ６０ １０ｍｇとインキュベートした。遠心後、ビーズを洗浄し、サンプル緩衝液に再懸濁した。ＧＳＴ−ＰｒＰc（レーン２）、ＧＳＴ−ｒＰｒＰ２７−３０（レーン３）およびＧＳＴ（レーン４）の各４ｍＬおよびコントロールとしてＨｓｐ６０ ２００ｎｇ（レーン１）をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２．５％）、およびモノクローナルマウス抗−Ｈｓｐ６０抗体および化学的発光検出を用いる免疫ブロッティング法（ＰＶＤＦ）によって分析した。（Ｂ）グルタチオン−セファロースに固定した組換えＧＳＴ（１ｍｇ）およびＧＳＴ−ＰｒＰc（２ｍｇ）およびグルタチオン−セファロースのみをＧｒｏＥＬ２５ｍｇとインキュベートした。洗浄後、ビーズをサンプル緩衝液に再懸濁した。ビーズ（レーン２）、ＧＳＴ−ＰｒＰc（レーン３）およびＧＳＴ（レーン４）の１：１スラリー各４ｍＬおよびコントロールとしてＧｒｏＥＬ２ｍｇ（レーン１）を１２．５％ＳＤＳゲルで分析し、ＮＣ膜にブロッティングした。タンパク質の検出は抗−ＧｒｏＥＬ抗体および化学発光を用いて行った。（Ｃ）グルタチオン−セファロースに固定した組換えＧＳＴ（１ｍｇ）およびＧＳＴ−ｒＰｒＰ２７−３０（２ｍｇ）をＧｒｏＥＬ２５ｍｇとインキュベートした。洗浄後、ビーズをサンプル緩衝液に再懸濁した。ＧＳＴ−ｒＰｒＰ２７−３０（レーン２）およびＧＳＴ（レーン３）の各４ｍＬおよびコントロールとしてＧｒｏＥＬ１ｍｇ（レーン１）をＳＤＳ−ＰＡＧＥ、および抗−ＧｒｏＥＬ抗体および化学発光を用いた免疫ブロッティングによって分析した。
図３：ＧＳＴと融合させたＰｒＰc断片を用いたＰｒＰc／ＧｒｏＥＬ相互作用部位のマッピング
（Ａ）生化学的予測、例えば親水性、抗原性および二次構造に基づいて設計したＰｒＰcの６断片は、アミノ酸２３−５２、アミノ酸５３−９３、アミノ酸９０−１０９、アミノ酸１２９−１７５、アミノ酸１８０−２１０およびアミノ酸２１８−２３１である（４８）。（Ｂ）６つのＧＳＴ融合ＰｒＰ断片を用いるＰｒＰ／Ｈｓｐ６０相互作用部位のマッピング分析。グルタチオン−セファロースに結合した断片の各２ｍｇをＨｓｐ６０ １０ｍｇとインキュベートした。ビーズを洗浄し、サンプル緩衝液に再懸濁した。ＧＳＴ::Ｐ２３−５２（レーン１）、ＧＳＴ::Ｐ５３−９３（レーン２）、ＧＳＴ::Ｐ９０−１０９（レーン３）、ＧＳＴ::Ｐ１２９−１７５（レーン４）、ＧＳＴ::Ｐ２１８−２３１（レーン５）およびＧＳＴ::Ｐ１８０−２１０（レーン６）の断片各４ｍＬを１２．５％ＳＤＳゲルで分析し、ＰＶＤＦ膜にブロッティングし、続いて抗−Ｈｓｐ６０抗体および化学発光を用いて検出した。（Ｃ）ＰｒＰ／ＧｒｏＥＬ相互作用部位のマッピング分析。グルタチオン−セファロースに結合した断片の各２ｍｇをＧｒｏＥＬ１０ｍｇとインキュベートした。ビーズを洗浄し、サンプル緩衝液に再懸濁した。ＧＳＴ::Ｐ２３−５２（レーン１）、ＧＳＴ::Ｐ５３−９３（レーン２）、ＧＳＴ::Ｐ９０−１０９（レーン３）、ＧＳＴ::Ｐ１２９−１７５（レーン４）、ＧＳＴ::Ｐ２１８−２３１（レーン５）およびＧＳＴ::Ｐ１８０−２１０（レーン６）の断片各４ｍＬを１２．５％ＳＤＳゲルで分析し、ブロッティングした（ＰＶＤＦ）。ＧｒｏＥＬは抗−ＧｒｏＥＬ抗体を用いた化学発光によって検出した。
図４：シリアンゴールデンハムスター由来のＦＬＡＧタグ付Ｈｓｐ６０およびＧＳＴタグ付プリオンタンパク質のバキュロウイルス系における同時発現
細胞溶解物を１２．５％ＳＤＳゲルで分析した。抗−Ｈｓｐ６０抗体（Sigmaカタログ＃Ｈ４１４９）を用いたウエスタンブロッティングにより、ＧＳＴ::ｈａＰｒＰc２３−２３１（レーン３）およびＧＳＴ::ｈａＰｒｐ９０−２３１（レーン４）と同時発現させた場合はＦＬＡＧ::Ｈｓｐ６０の量がＦＬＡＧ::Ｈｓｐ６０発現（レーン１）およびＧＳＴコントロールの同時発現（レーン２）と比べて減少することが示された。
以下の実施例は本発明を例示する。
実施例１：ベクターの構築
酵母ベクターの構築
クローニング手法は特に断らない限り、以前に記載されているように行った（４０）。異なるＬｅｘＡハイブリッド（アミノ酸１−８７およびアミノ酸１−２０２）を合成するためのシャトルベクターｐＳＨ２−１およびｐＥＧ２０２（１９，２１）を用いてＬｅｘＡ融合「おとり」を構築した。
（ｉ）ｐＳＨ２−１／ｐＥＧ２０２−ＧＳＴの構築
グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）をコードする６６６塩基対ＤＮＡ断片をｃＤＮＡクローンｐＡｃＳＧ２Ｔ::ＰｒＰc２３−２３１（４８）からＰＣＲ（３９）増幅した。断片をＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ制限部位を用いてプラスミドｐＳＨ２−１およびｐＥＧ２０２にサブクローニングし、ベクターｐＳＨ２−１／ｐＥＧ２０２−ＧＳＴを得た。
（ii）ｐＳＨ２−１／ｐＥＧ２０２−ＰｒＰcの構築
シリアンゴールデンハムスターＰｒＰcタンパク質のアミノ酸２３−２３１をコードするヌクレオチドを含む６４６塩基対のＤＮＡ断片をｃＤＮＡクローンｐＡｃＳＧ２Ｔ::ＰｒＰc２３−２３１からＰＣＲ増幅した。このＰｒＰcカセットをＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ制限部位を介してベクターｐＳＨ２−１およびｐＥＧ２０２にクローニングし、ｐＳＨ２−１／ｐＥＧ２０２−ＰｒＰcを得た。
（iii）ｐＳＨ２−１／ｐＥＧ２０２−ＧＳＴ−ＰｒＰcの構築
ＰｒＰcタンパク質のアミノ酸２３−２３１をコードする６４６塩基対のＤＮＡ断片をｃＤＮＡクローンｐＡｃＳＧ２Ｔ::ＰｒＰc２３−２３１からＰＣＲ増幅した。このＰｒＰc断片をＢａｍＨＩ／ＳａｌＩ制限部位を介してベクターｐＳＨ２−１−ＧＳＴにクローニングし、ｐＳＨ２−１−ＧＳＴ−ＰｒＰcを得た。ＧＳＴ−ＰｒＰcカセットをＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩ制限部位を用いてベクターから切り出し、ｐＥＧ２０２にクローニングし、ｐＥＧ２０２−ＧＳＴ−ＰｒＰcを得た。
（vi）ｐＳＨ２−１−ＰｒＰc−ＧＳＴの構築
ＰｒＰc２３−２３１カセットをｐＡｃＳＧ２Ｔ::ＰｒＰc２３−２３１からＰＣＲ増幅し、ＥｃｏＲＩ制限部位を介してｐＳＨ２−１−ＧＳＴにクローニングし、ｐＳＨ２−１−ＰｒＰc−ＧＳＴを得た。
ＰＣＲ増幅断片の正確な向き、読み枠および配列はジデオキシ配列決定によって確認した（４１）。
実施例２：Ｓ．セレビシエ株ＥＧＹ４８における「おとり」タンパク質ＬｅｘＡ−ＧＳＴ−ＰｒＰcの発現
「２−ハイブリッド」スクリーニングのために、細菌リプレッサーＬｅｘＡ結合ドメイン（１９，２１）およびグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）と融合させたシリアンゴールデンハムスタープリオンタンパク質ＰｒＰc２３−２３１（ａａ＝アミノ酸２３−２３１、ＰｒＰcと呼ぶ）（５）から構成される融合タンパク質「おとり」を試験した。最近報告されたように、ＧＳＴとの融合は組換えＰｒＰcの溶解性および安定度が大きく高める（４７，４８）。酵母株ＥＧＹ４８の細胞をレポータープラスミドｐＳＨ１８−３４および「おとり」プラスミドで同時形質転換し、レポーターシステムを活性化する本質的能力を試験した。ｐＳＨ−ＧＳＴ−ＰｒＰc構築物は低レベルの本質的活性化を示した。Ｓ．セレビシエにおけるＬｅｘＡ−ＧＳＴ−ＰｒＰc融合タンパク質の発現は、ａａ９５−１１０に対するポリクローナル抗−ＰｒＰ抗体（２０）を用いた免疫ブロッティングによって確認した（データは示していない）。
実施例３：２−ハイブリッドスクリーンによるＰｒＰc／Ｈｓｐ６０相互作用の同定
酵母２−ハイブリッドシステムを用いるための詳細な手法はすでに詳述されている（１，６，１９，２１）。ＬＥＵ２遺伝子の上流にＬｅｘＡ結合部位の染色体挿入を保持しているＳ．セレビシエ株ＥＧＹ４８（ＭＡＴａ  ｕｒａ３  ｈｉｓ３  ｔｒｐ１  ＬＥＵ２::ＬｅｘＡｏｐ６−ＬＥＵ２）を受け入れ宿主として用いた（１９，２１）。簡単には、酵母株ＥＧＹ４８を、第２レポーターとしてＬｅｘＡ制御ｌａｃＺ遺伝子を含むレポータープラスミドｐＳＨ１８−３４で形質転換した。Ｓ．セレビシエ細胞を「おとり」−プラスミド、および酸性Ｂ４２トランス活性化ドメインと融合させたＨｅＬａ ｃＤＮＡライブラリーを含むｐＪＧ４−５で同時形質転換させた（１９，２１）。ｐＪＧ４−５プラスミドのｃＤＮＡ挿入はガラクトース誘導プロモーターによって制御される。それゆえ、２ハイブリッド間の相互作用はガラクトースの存在下にのみ起こる。ロイシンの不在下に生育可能（第１レポーター遺伝子）な２０００コロニーを５−ブロモ−４−クロロ−３−ヨードリル−ｂ−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−Ｇａｌ）を補足したガラクトースプレートにドットし、ｂ−ガラクトシダーゼ生成をスクリーニングした（青色、第２レポーター遺伝子）。
Ｓ．セレビシエ細胞培養物５ｍＬから５５個の陽性クローンのｃＤＮＡを回収した。細胞を３０℃で２日間インキュベートし、遠心（３０００ｒｐｍ、１０分間、４℃）によって集め、洗浄（１Ｍソルビトール、０．１Ｍ ＥＤＴＡ、ｐＨ８０）した。ＳＣＥ（１Ｍソルビトール、０．１Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ５．８、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１Ｍ ｂ−メルカプトエタノール）に再懸濁後、細胞をリティカーゼ（Lyticase）（５Ｕ／ｍＬ、Sigma）４０ｍＬと３７℃で１時間インキュベートした。遠心後、細胞をＴＥ−溶解緩衝液（５０ｍＭトリス／ＨＣｌ、ｐＨ７．４、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ＳＤＳ含有）に再懸濁し、６５℃３０分間インキュベートした。細胞溶解物をフェノール抽出し、ＤＮＡをエタノール沈澱させ、ＴＥに再懸濁した。このＤＮＡを大腸菌株ＫＣ８に形質導入し、これによりアンピシリン耐性およびそのトリプトファン要求性の相補に基づきｐＪＧ４−５プラスミドの選択が可能となる（１９，２１）。対照実験として、プラスミドをＥＧＹ４８中に再形質導入し、形質転換体をｂ−ガラクトシダーゼ生成およびそのＬｅｕ+−表現型について試験した。再形質転換体５つを対応するプレートにドットし、３０℃で５日間インキュベートし、最後に配列決定した。ｃＤＮＡ挿入体をジデオキシ法（４１）に基づくＴ７−配列決定用キット（Pharmacia）で配列決定した。このｃＤＮＡ配列に対する相同性サーチをNational Center for Biotechnology InformationでBLASTネットワークサービス（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Recipon/bs_seq.html）を用いて行った。およそ２０％（９つのｃＤＮＡに相当）が熱ショックタンパク質６０（Ｈｓｐ６０）をコードしていた。単離されたＨｓｐ６０ｃＤＮＡはそれぞれａａ１４６、ａａ２２８、およびａａ２９８位から出発する異なる長さの３つのＮ−末端切断タンパク質をコードする（ＥＭＢＬ Ｍ３４６６４）。これらはすべてＨｓｐ６０の推定ペプチド結合ドメイン（１４）の部分を含む。
実施例４：ＰｒＰc／Ｈｓｐ６０相互作用の特異性に関する試験
ＰｒＰcおよびＨｓｐ６０間に観察されたインビボ相互作用の特異性（図１、列３）をいくつかの再クローニング実験によって示した。特に逆融合ＰｒＰc::ＧＳＴ（図１、列６）およびＧＳＴを欠く完全なＰｒＰc（データは示していない）はＨｓｐ６０と強く相互作用することが示された。対照的にＬｅｘＡ−ＧＳＴ（図１、列２）、完全なＬｅｘＡ（図１、列１）および２つの「擬似−おとり」ＬｅｘＡ−ＮＦＩ／ＣＴＦ２（４７）（図１、列４）およびＬｅｘＡ−bicoid（図１、列５）はＨｓｐ６０との相互作用を示さなかった。
実施例５：組換えＨｓｐ６０はインビトロでＰｒＰc２３−２３１およびｒＰｒＰ２７−３０に特異的に結合する。
ＰｒＰc２３−２３１は成熟型の細胞性プリオンタンパク質を表す。スクラピープリオン単離物は主に、アミノ酸９０−２３１を含むサイズ２７ ３０ｋＤａのプロテアーゼ−耐性コア（ＰｒＰ２７−３０と表す）（３５，４２）からなる。我々はグルタチオン−セファロースビーズに結合した組換えＧＳＴ融合タンパク質を用い、組換え全長Ｈｓｐ６０とのインビトロ相互作用を確認した。ＧＳＴおよびＧＳＴに融合させたＰｒＰc２３−２３１およびｒＰｒＰ２７−３０（４７，４８）を固定し、Ｈｓｐ６０とインキュベートした。Ｈｓｐ６０はＧＳＴ-ＰｒＰc（図２Ａ、レーン２）、およびＧＳＴ−ｒＰｒＰ２７−３０（図２Ａ、レーン３）の存在下に検出されたが、ＧＳＴ単独（図２Ａ、レーン４）では検出されなかった。もう１つのヒトシャペロン、Ｈｓｐ７０はこれらのタンパク質のいずれとも相互作用せず（データは示していない）、ＰｒＰcとＨｓｐ６０の相互作用が高度に特異的であることが示された。
タンパク質および抗体
ＧＳＴ、ＧＳＴ::ＰｒＰc２３−２３１およびＧＳＴ::ＰｒＰc断片 ＧＳＴ::Ｐ２３−５２、ＧＳＴ::Ｐ５３−９３、ＧＳＴ::Ｐ９０−１０９、ＧＳＴ::Ｐ１２９−１７５、ＧＳＴ::Ｐ１８０−２１０およびＧＳＴ::Ｐ２１８−２３１を（４８）に記載のように調製した。ＧＳＴ::ｒＰｒＰ２７−３０（シリアンゴールデンハムスタープリオンタンパク質のａａ９０−２３１）を大腸菌およびバキュロウイルス発現系（４７）から発現、精製した。ＧｒｏＥＬおよび抗−ウサギ−ＩｇＧ−ＰＯＤおよび抗−マウス−ＩｇＧ−ＰＯＤはBoehringer Mannheimから入手した。組換えヒトＨｓｐ６０はStressGenから、モノクローナルマウス抗−Ｈｓｐ６０はSigmaから入手した。
ＳＤＳ ＰＡＧＥおよび免疫ブロッティング
タンパク質サンプルはすでに（４８）記載されているように１２．５％ＳＤＳファストゲル（Phastgels）（Pharmacia）で分析した。レインボーマーカー（Rainbow marker）（ＲＰＮ７５６、Amersham）をサイズ基準として用いた。電気泳動後、ゲルをニトロセルロース（ＮＣ、Schleicher＆Schuell）またはポリビニルジフルオライド膜（ＰＶＤＦ、Millipore）にブロッティングした（７０℃、４０分間）。このブロットをポリクローナル抗−ＧｒｏＥＬまたは抗−ＰｒＰ抗体と１：８００／１：４００希釈でインキュベートした。インキュベート工程はすでに（４４）記載されているように行った。抗体検出は化学発光（ＥＣＬシステム、Amersham）によって、あるいはＤＡＢ（Sigma）の存在下で行った。
実施例６：細菌ＧｒｏＥＬのＰｒＰc２３−２３１およびｒＰｒＰ２７−３０とのインビトロ結合
ＧｒｏＥＬすなわちＨｓｐ６０ファミリーの原核生物相同体がＰｒＰcと結合することができるかどうかを調べるため、対応するインビトロ結合実験に組換えＧｒｏＥＬを用いた。プル−ダウンアッセイは、０．５％トリトン−Ｘ−１００を含む再折りたたみ用緩衝液（ＲＦ）（３２）中、ＧＳＴまたはＧＳＴ融合タンパク質を結合したグルタチオン−セファロース４Ｂビーズ（Pharmacia）を平衡化することによって行った。この平衡化ビーズを０．５％トリトン−Ｘ−１００を含むＲＦの存在下に１０倍モル濃度過剰までのＧｒｏＥＬまたはＨｓｐ６０（単量体）と室温でインキュベートした。遠心（２５００ｒｐｍ、１０分間）後、ビーズをＲＦで洗浄し、１２．５％ＳＤＳファストゲルで分析し、ブロッティングし、ＧｒｏＥＬまたはＨｓｐ６０の存在を調べた。
ＧｒｏＥＬはＧＳＴ単独（図２Ｂ、レーン４および図２Ｃ、レーン３）の存在下では結合しないのに対し、ＧＳＴに結合したＰｒＰc（図２Ｂ、レーン３）およびｒＰｒＰ２７−３０（図２Ｃ、レーン２）との相互作用に特異性を示すことが発見された。しかし、結合の強度はＰｒＰcと比べ、ｒＰｒＰ２７−３０に対してのほうが強い。
実施例７：Ｈｓｐ６０およびＧｒｏＥＬに対するＰｒＰ中の相互作用部位のマッピング
分子シャペロン上のＰｒＰc−結合部位のわかりやすい地図を得るため、ＧＳＴに融合させたＰｒＰの６断片を用い、それらのＨｓｐ６０およびＧｒｏＥＬとの結合能を試験した。これらのペプチドは親水性、抗原性および二次構造に関する生化学的予測に基づいて設計され（４８）、ａａ２３−５２、ａａ５３−９３、ａａ９０−１０９、ａａ１２９−１７５，ａａ１８０−２１０およびａａ２１８−２３１（図３Ａ）である。固定化ペプチドをＨｓｐ６０およびＧｒｏＥＬそれぞれとインキュベートした。このマッピング分析では、ＧＳＴ::Ｐ１８０−２１０の存在下でのみＨｓｐ６０（図３Ｂ、レーン６）およびＧｒｏＥＬ（図３Ｃ、レーン６）が同定され、このことから分子シャペロンと相互作用するのは、アミノ酸１８０−２１０で表されるＰｒＰ領域だけであることが示された。
実施例８：ＧＳＴと融合されたハムスターＰｒＰc２３−２３１の存在下におけるＨｓｐ６０の下流調節
ＦＬＡＧタグ付Ｈｓｐ６０をバキュロウイルス系で６１ｋＤａタンパク質として合成した（図４、レーン１）。ＧＳＴの同時発現はＦＬＡＧ::Ｈｓｐ６０の発現に影響しない（レーン２）のに対し、ＧＳＴ::ｒＰｒＰc（ｒＰｒＰ２３−２３１）（レーン３）およびＧＳＴ::ｒＰｒＰ２７−３０（ｒＰｒ９０−２３１）（レーン４）の同時発現はＦＬＡＧ::Ｈｓｐ６０発現を下流調節する。
同時感染に次いでウエスタンブロット分析を行う。全タンパク質を標準的方法によってバキュロウイルス感染昆虫細胞から集め、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。それに続くウエスタンブロットには抗−Ｈｓｐ６０抗体（Sigma＃Ｈ４１４９）を用いた。
ＰｒＰcの存在下でのＨｓｐ６０の下流調節は転写または翻訳レベルどちらかにおいて生じる可能性がある。一方、ＰｒＰはＨｓｐ６０のタンパク質分解性のデグラデーションを引き起こし得る。最後にＰｒＰcは増加したＨｓｐ６０分泌工程を導くことができる。培養培地中のＨｓｐ６０の存在はこの仮説を立証するものであろう。ＰｒＰの存在下でのＨｓｐ６０の下流調節は、ＰｒＰ／Ｈｓｐ６０の直接相互作用がＨｓｐ６０の増加性下流調節を誘発することを説明することができるものである。プリオンタンパク質の部分にわたるＰｒＰ−ペプチドを適用することにより、Ｈｓｐ６０発現の下流調節に寄与するプリオンタンパク質の領域を同定することができる。
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