(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホスホリパーゼＡの活性を示すポリペプチドであって、
（ａ）  大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＤＳＭ１１２９９の中に存在するプラスミドｐＹＥＳ２．０の中にクローン化されたＤＮＡ配列のホスホリパーゼＡをコードする部分によりコードされるポリペプチド、
（ｂ）  配列番号：２中の位置３１−３４６に示すアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｃ）  配列番号：２中の位置３１−３０３に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドおよび
（ｄ）  （ａ）、（ｂ）または（ｃ）において定義された前記ポリペプチドと９０％以上相同性であるポリペプチド
から成る群より選択されるポリペプチド。
【請求項２】
ホスホリパーゼＡ１である、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
次の
（ａ）  大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＤＳＭ１１２９９の中に存在するプラスミドｐＹＥＳ２．０の中にクローン化されたホスホリパーゼＡをコードする配列、
（ｂ）  配列番号：１中の２３−１０６３のヌクレオチド、
（ｃ）  配列番号：１中の１１３−１０６３のヌクレオチド、
（ｄ）  配列番号：１中の位置１１３−９３１のヌクレオチド、
（ｅ）  配列番号：２の３１−３４６のアミノ酸をコードするポリヌクレオチド、
（ｆ）  配列番号：２の位置３１−３０３のアミノ酸をコードするポリヌクレオチド、
（ｇ）  上記ポリヌクレオチドのいずれかに９０％以上相同性であり、ホスホリパーゼＡ活性を示すポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
から成る群から選択されるポリヌクレオチド。
【請求項４】
ホスホリパーゼＡ１をコードする、請求項３のポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求項３または４のポリヌクレオチドを含んでなるベクター。
【請求項６】
請求項５のベクターを含んでなる宿主細胞。
【請求項７】
真核細胞である、請求項６の宿主細胞。
【請求項８】
アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）またはフザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属の細胞である、請求項７に記載の宿主細胞。
【請求項９】
ａ）ホスホリパーゼＡの発現に適当な条件下に請求項６〜８のいずれか一項に記載の宿主細胞を培養し、
ｂ）前記ホスホリパーゼＡを回収することを含む、ホスホリパーゼＡを生産する方法。
【請求項１０】
リン脂質またはリゾリン脂質を請求項１または２のポリペプチドで処理して脂肪族アシル基を加水分解することを含む方法における、前記ポリペプチドの使用。
【請求項１１】
食用油を請求項１または２のポリペプチドで処理してリン脂質の主要部分を加水分解し、そして加水分解されたリン脂質を含有する水性相を前記油から分離することを含む、５０〜２５０ｐｐｍのリン含量を有する食用油中のリン脂質の含量を減少する方法における、前記ポリペプチドの使用。
【請求項１２】
請求項１または２のポリペプチドを練り粉に添加し、前記練り粉を焼いて焼かれた製品を製造する方法における、前記ポリペプチドの使用。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、ホスホリパーゼを使用して、高い量の非水和性リンを含む食用油中のリン含有成分の含量を減少する方法に関する。
さらに、本発明は、ホスホリパーゼ活性を有する酵素、ホスホリパーゼ活性を有する酵素をコードするクローン化ＤＮＡ配列、前記酵素を製造する方法、および多数の工業的用途のための前記酵素の使用に関する。
発明の背景
比較的高い量の非水和性リン含量を含む食用油の酵素的脱ガム化（ｄｅｇｕｍｍｉｎｇ）
水−脱ガム化された食用油
0003824174.tif 000002
を酵素的に脱ガム化して、前記水−脱ガム化された食用油のリン含量を減少するためにホスホリパーゼを用いることは知られている。
しかしながら、この方法は、特に高い量の非水和性リン（ＮＨＰ）および／または比較的高い量の粘質物を含む食用油の酵素的脱ガム化を実施するために、なお改良することができる。
結局、本発明の目的は、ホスホリパーゼを使用することを含む、このような油のリン含有成分の含量を減少する方法を提供することである。
本発明のホスホリパーゼ
リン脂質、例えば、レシチンまたはホスファチジルコリンは、外側位置（ｓｎ−１）および中央位置（ｓｎ−２）においておよび２つの脂肪酸でエステル化されかつ第３位置においてリン酸でエステル化されたグリセロールから成る；引き続いて、リン酸をエステル化してアミノ−アルコールにすることができる。ホスホリパーゼは、リン脂質の加水分解に関与する酵素である。いくつかの型のホスホリパーゼ活性を区別することができ、これらの型は下記のものを包含する：ホスホリパーゼＡ1（ＰＬＡ1）およびＡ2（ＰＬＡ2）、これらは１つの脂肪族アシル基を加水分解して（それぞれ、ｓｎ−１およびｓｎ−２位置において）リゾリン脂質を形成する；およびリゾホスホリパーゼ（またはホスホリパーゼＢ（ＰＬＢ））、これはリゾリン脂質中の残りの脂肪族アシル基を加水分解することができる。
本発明は、なかでも、リン脂質中の一方または双方の脂肪族アシル基を加水分解する能力を有する（すなわち、ＰＬＡおよび／またはＰＬＢ活性を示す）糸状菌のホスホリパーゼに関する。
以前に特性決定された真菌のＰＬＡおよび／またはＰＬＢ酵素
真菌のホスホリパーゼの特性決定は多数の参考文献に記載されている。先行技術の水準を概観することを容易にするために、参考文献を２つの区分にグループ化した。
第１区分において、現在、本発明の真菌のホスホリパーゼに関係すると考えられない真菌のホスホリパーゼの同定を記載している参考文献を取り扱う。主に、真菌のホスホリパーゼの特性決定の分野の範囲内の技術水準を要約するために、これらの参考文献を含める。
第２区分において、本発明の真菌のホスホリパーゼに多少関係すると考えられる真菌のホスホリパーゼの特性決定を記載する参考文献を取り扱う。
第１区分：
ホスホリパーゼＡおよび／またはＢ活性を有する酵素は、下記のものを包含する種々の真菌源において見出されてきている：ペニシリウム・ノタツム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｎｏｔａｔｕｍ）（また、ペニシリウム・クリソゲヌム（Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）として知られている；Ｎ．Ｋａｗａｓａｋｉ、「Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．」、７７、１２３３−４４、１９７５；Ｎ．Ｍａｓｕｄａ他、「Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．」、２０２、７８３−７８７、１９９１）、ペニシリウム・シクロピウム（Ｐ．ｃｙｃｌｏｐｉｕｍ）（「Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」３０（５）；３９３−４０１（１９９５））、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（Ｍ．Ｉｃｈｉｍａｓａ他、「Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．」、４９（４）、１０８３−８９、１９８５；Ｆ．Ｐａｕｌｔａｕｆ他、「Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．」、２６９、１９７２５−３０、１９９４）、トルラスポラ・デルブルエキイ（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）（古い名称サッカロマイセス・ロセイ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｓｅｉ）；Ｙ．Ｋｕｗａｂａｒａ、「Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．」、５２（１０）、２４５１−５８、１９８８；「ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔｅｒｓ」、１２４、２９−３４）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）（Ｈ．Ｏｉｓｈｉ他、「Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．」、６０（７）、１０８７−９２、１９９６）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）〔「Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｂｌｌｅｔｉｎ、Ｇ−ｚｙｍｅ（商標）Ｇ９９９」、Ｅｎｚｙｍｅ  Ｂｉｏ−Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｌｔｄ．；「Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」３０（５）：３９３−４０１（１９９５）〕およびコルチウム・セントリフグム（Ｃｏｒｔｉｃｉｕｍ  ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｕｍ）（Ｓ．Ｕｅｈａｒａ他、「Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．」、４３（３）、５１７−５２５、１９７９）。
第２区分：
ＥＰ５７５１３３（Ａ２）号には、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）から得られた真菌のホスホリパーゼＡ1の単離および特性決定および工業的用途のためのそれらの使用が記載されている。
配列の情報（ＤＮＡまたはアミノ酸）は前記出願に記載されていず、また、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）のホスホリパーゼのクローン化の戦略または示唆は前記出願に記載または示されていない。
Ｔｓｕｎｇ−Ｃｈｅ他（「Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ  ｎｏｔｅｓ」５８：１４３７−３８（１９６８））は、フザリウム・ソラニ（Ｆ．ｓｏｌａｎｉ）からのホスホリパーゼの特性決定を簡単に記載している。
ＥＰ１３０，０６４号には、フザリウム・オキシスポラム（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）ＤＳＭ２６７２株から得られたリパーゼ活性を示す発酵ブロスの単離された画分が記載されている。さらに、洗剤組成物におけるその使用が開示されている。しかしながら、ＥＰ１３０，０６４号には、この画分がホスホリパーゼ活性を示すことは記載されていない。
ＷＯ９６／１３５７９号には、フザリウム・クルモラム（Ｆ．ｃｕｌｍｏｒｕｍ）株、ＣＢＳ５１３．９４から得られたリパーゼ、およびそのＮ−末端の配列が記載されている。
しかしながら、ＷＯ９６／１３５７９号には、ホスホリパーゼ活性を示す酵素は記載されていない。
フザリウム・ヘテロスポラム（Ｆ．ｈｅｔｅｒｏｓｐｏｒｕｍ）からのリパーゼをコードするｃＤＮＡ配列が記載されている（Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ａ  ｌｉｐａｓｅ  ｆｒｍ  Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｈｅｔｅｒｏｓｐｏｒｕｍ、「Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．」、１１６、５３６−５４０、１９９４）。この配列は、現在、本発明のクローン化ＤＮＡ配列に比較して最も関係するＤＮＡ配列であると考えられる（下記の「先行技術との比較」の節を参照のこと）。しかしながら、この参考文献にはホスホリパーゼ活性を示す酵素は記載されていない。
ペニシリウム・ノタツム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｎｏｔａｔｕｍ）からのホスホリパーゼＢをコードするｃＤＮＡ配列は記載されている（「Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．」２０２：７８３−７８７、１９９１）。しかしながら、このクローン化されたＤＮＡ配列は、本発明のＤＮＡ配列に対して非常に制限された相同性を有する（下記の「先行技術との比較」の節を参照のこと）。
ホスホリパーゼの工業的用途
ホスホリパーゼの多数の使用がこの分野において知られており、これらは下記のものを包含する：水脱ガム化された油の酵素的脱ガス化
0003824174.tif 000003
澱粉加水分解物（特にコムギ澱粉からの）を処理して濾過性を改良すること（ＥＰ２１９，２６９号、ＣＰＣ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）；パンの弾性を改良するためのパン生地に対する添加剤として（米国特許第４，５６７，０４６号、協和発酵）；および特定の乳化特性を有するリゾレシチンの製造におけるホスホリパーゼの使用。
現在、ホスホリパーゼＬｅｃｉｔａｓｅ（登録商標、Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ  Ａ／Ｓ）は、例えば、油の脱ガム化について商業的に使用されている。Ｌｅｃｉｔａｓｅ（登録商標）はブタ膵臓から得られた哺乳動物の酵素である。
工業的、経済的に許容される収率で、特に糸状菌から、真菌の酵素を組換え的に製造できることはよく知られている。
結局、本発明の目的は、例えば、前述の方法において使用するための、改良されたホスホリパーゼを提供することである。
さらに、本発明の目的は、工業的に許容される収率で、糸状菌から得られるホスホリパーゼを組換え的に製造するプロセスおよび方法を記載することである。
発明の要約
食用油の水脱ガム化は水を使用する抽出により実施される。その処理において、ホスファチドの一部分はその油の中に残る。その部分は一般用語「非水和性リン脂質」（ＮＨＰ）により記載される。油の製造において、ＮＨＰ含量を除去することは必須である（米国特許第５，２６４，３６７号）。
本発明は、比較的高い量のＮＨＰを含む油中のＮＨＰ含量を除去する方法を提供する。
したがって、第１面において、本発明は、食用油中のリン含有成分の含量を減少する方法に関し、前記油は少なくとも５０ｐｐｍの非水和性リン含量を含み、前記非水和性リン含量は、
ｉ）  ６０℃において、水中のクエン酸一水和物を含んでなる溶液の添加（添加された水／油＝４．８％ｗ／ｗ；水相中の［クエン酸］＝１０６ｍＭ、水／油エマルジョン中の［クエン酸］＝４．６ｍＭ）により、食用油を３０分間前処理し、
ｉｉ）  １０ｍｌの前処理された油中水型エマルジョンを管に移し、
ｉｉｉ）  前記エマルジョンを沸騰する水浴中で３０分間加熱し、
ｉｖ）  ５０００ｒｐｍにおいて１０分間遠心し、
ｖ）  約８ｍｌの上（油）相を新しい管に移し、それを２４時間沈降させ、そして
ｖｉ）  沈降後、上方の透明な相から２ｇを抜き出して、食用油中の非水和性リン含量を測定する、ことによって測定され、そして前記方法は、前記油を、ｐＨ１．５〜８において、ホスホリパーゼＡ1、ホスホリパーゼＡ2、またはホスホリパーゼＢの水溶液と接触させ、これを前記油のリン含量が１１ｐｐｍより低く減少するまで前記油中で乳化させ、次いで水性相を処理された油から分離することを含む。
他の面において、本発明は新規なクローン化されたホスホリパーゼに関する。
フザリウム・オキシスポラム（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）ＤＳＭ２６７２の中に見出される（そしてＥＰ１３０，０６４号に記載されている）リパーゼ活性の特質のそれ以上の研究において、単離された画分がリパーゼ活性を有するいくつかの成分を含み、それらの１つはホスホリパーゼ活性を示した。
多数の技術的困難にかかわらず（下文参照）、本発明はフザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属、さらに詳しくはフザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）の株からホスホリパーゼＡ活性を示す酵素をクローン化することができた。
これは糸状菌のホスホリパーゼＡがクローン化された最初であり、結局、本発明は糸状菌のホスホリパーゼＡ酵素をコードするクローン化されたＤＮＡ配列を提供する。
したがって、本発明の１つの面は、ＤＮＡ配列が糸状菌から得られる、ホスホリパーゼＡ活性を有するポリペプチドをコードするクローン化されたＤＮＡ配列に関する。
ペニシリウム・ノタツム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｎｏｔａｔｕｍ）からのホスホリパーゼＢをコードするｃＤＮＡ配列は、「Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．」２０２：７８３−７８７、１９９１に記載されている。
しかしながら、このＤＮＡ配列は本発明のＤＮＡ配列（配列番号：１  ２３−１０６０）に対して非常に制限されたＤＮＡの同一性を示すだけであり、そしてさらに、物理的特性、例えば、分子量は前記ペニシリウム・ノタツム（Ｐ．ｎｏｔａｔｕｍ）からのＰＬＢ（６６ｋＤａ）と本発明のホスホリパーゼ（２９±１０ｋＤａ（下文参照））との間でかなり変化する。
さらに、先行技術のヌクレオチドおよびアミノ酸配列と比較すると、本発明のＤＮＡ配列および／または対応するコードされたアミノ酸配列が先行技術のＤＮＡおよび／またはアミノ酸配列に対してほんのわずかの相同性を有することが示された（下文参照）。
結局、この出願において提供されるＤＮＡ配列の情報は、例えば、他の関係する／相同的ホスホリパーゼをコードするＤＮＡ配列をクローン化するために、高度に価値があると現在考えられる。なぜなら、特定のハイブリダイズプローブおよび／またはＰＣＲプライマーは現在本発明の前記ＤＮＡ配列に基づいて容易に構築することができるからである。
さらに、この出願において提供されるＤＮＡ配列の情報に基づいて関係する／相同的ホスホリパーゼＡおよび／またはホスホリパーゼＢをコードするＤＮＡ配列をクローン化することができると現在考えられる。
したがって、他の面において、本発明は、ホスホリパーゼＡおよび／またはホスホリパーゼＢの活性を示す酵素をコードするクローン化されたＤＮＡ配列に関し、前記ＤＮＡ配列は、
（ａ）  大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＤＳＭ１２９９の中に存在するプラスミドｐＹＥＳ２．０の中にクローン化されたＤＮＡ配列のホスホリパーゼＡをコードする部分、
（ｂ）  配列番号：１中の位置２３−１０６３、より好ましくは配列番号：１中の位置１１３−１０６３、なおより好ましくは配列番号：１中の位置１１３−931に示されるＤＮＡ配列、またはその相補的鎖、
（ｃ）  （ａ）または（ｂ）において定義された前記ＤＮＡ配列と少なくとも７０％相同性であるＤＮＡ配列、
（ｄ）  ホスホリパーゼ活性を示すポリペプチドをコードし、かつ配列番号：２の位置３１−３４６に示されるポリペプチド配列と90％以上相同性であり、より好ましくは配列番号：２の位置３１−３０３に示されるポリペプチド配列と少なくとも７０％相同性である、（ａ）または（ｂ）において定義された前記ＤＮＡ配列、
（ｅ）  配列番号：１中の位置２３−１０６３に示されるＤＮＡ配列を含んでなる二本鎖ＤＮＡプローブと低いストリンジェンシイにおいてハイブリダイズするＤＮＡ配列、
（ｆ）  配列番号：２の１〜３４６、３１〜３０３または３１〜３０３の位置残基のアミノ酸配列あるいは（ｅ）のＤＮＡ配列のいずれかによりコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、および
（ｇ）  （ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）または（ｆ）において特定されたＤＮＡ配列のフラグメントであるＤＮＡ配列、から成る群より選択される。
さらに、本発明のホスホリパーゼは集中的に特定決定され、そしてそれは低いｐＨにおいてホスホリパーゼ活性を有することが見出された；この性質により、それは油の脱ガム化において使用するために非常に適当である。ホスホリパーゼは膜結合されていず、これによりそれは商業的生産および精製に適する。
したがって、他の面において、本発明は、ホスホリパーゼＡ活性を有する単離されたポリペプチドに関し、前記ポリペプチドは、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属の株から得られ、そして
ｉ）  ４０℃において測定された、ｐＨ範囲３〜１０におけるＰＬＡ活性、
ｉｉ）  ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定して、２９±１０ｋＤａの分子量、
ｉｉｉ）  範囲４．５〜８の等電点（ｐＩ）、
ｉｖ）  ｐＨ５において基質としてレシチンを使用して測定された、２５〜５５℃の範囲のホスホリパーゼ活性のための温度最適値、および／または
ｖ）  ３７℃において基質としてレシチンを使用して測定された、６〜１２のｐＨ範囲のホスホリパーゼ活性のためのｐＨ最適値、を有する。
本発明の単離されたホスホリパーゼの推定されたアミノ酸配列は、配列番号：２に示されている。
成熟分泌された単離されたホスホリパーゼのＮ−末端のアミノ酸配列が決定された。前記Ｎ−末端の配列は、配列番号：２に示すアミノ酸配列を有する、本発明のホスホリパーゼの成熟部分が、配列番号：２中のアミノ酸Ｎｏ．３１において開始することを示した。それ以上の詳細については本明細書中の実施例を参照のこと（下文参照）。
さらに、配列番号：２に示すアミノ酸配列を有する、本発明の活性な分泌されたホスホリパーゼのＣ−末端のアミノ酸配列が決定された。前記Ｃ−末端の決定されたホスホリパーゼは、糸状菌の株アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）において組換え的に発現された。それ以上の詳細については本明細書中の実施例を参照のこと。
これらの結果により、酵素はアスペルギルス・オリゼ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）からの発現の間にＣ−末端でプロセシングされることが示され、そしてこれらの結果は配列番号：２中のＳｅｒ３０３が発現された成熟活性酵素中のＣ−末端の残基である可能性が最も高いことを示す。しかしながら、なおそれ以上のＣ−末端のプロセシングが起こりうること（すなわち、前記配列のフラグメントを与えること）、およびなお発現された成熟活性酵素を有することが予測される。
したがって、他の面において、本発明は、ホスホリパーゼＡおよび／またはＢの活性を示す単離されたポリペプチドに関し、前記ポリペプチドは、
（ａ）  大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＤＳＭ１２９９の中に存在するプラスミドｐＹＥＳ２．０の中にクローン化されたＤＮＡ配列のホスホリパーゼＡおよび／またはＢ酵素をコードする部分によりコードされるポリペプチド、
（ｂ）  配列番号：２中の位置３１−３４６に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｃ）  配列番号：２中の位置３１−３０３に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｄ）  （ａ）、（ｂ）または（ｃ）において定義された前記ポリペプチドの類似体、前記類似体は前記ポリペプチドと90％以上相同性である、および
（ｅ）  （ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）のフラグメント、から成る群より選択される。
なお他の面において、本発明は、本発明の酵素の異種組換え生産を可能とする、組換え発現ベクターを提供する。これにより、相同的不純物を含有しないことを特徴とする、高度に精製されたホスホリパーゼ組成物を製造することができる。これは多数の工業的用途に対して高度に有利である。
フザリウム・クルモラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｕｌｍｏｒｕｍ）およびフザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）の株の双方から得られるホスホリパーゼが工業的に関係する用途において使用するために改良された性質を有することを、本発明は実験的に証明する（下文参照）。フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属の株から得られるホスホリパーゼは、工業的に関係する用途において使用するために改良された性質を有することが予測される。
したがって、なお他の面において、本発明は、リン脂質またはリゾリン脂質をホスホリパーゼで処理して脂肪族アシル基を加水分解することを含む方法における、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属の株、例えば、フザリウム・クルモラム（Ｆ．ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、フザリウム・ヘテロスポラム（Ｆ．ｈｅｔｅｒｏｓｐｏｒｕｍ）、フザリウム・ソラニ（Ｆ．ｓｏｌａｎｉ）の株、特にフザリウム・オキシスポラム（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）の株から得られたホスホリパーゼの使用に関する。
最後に、本発明は、糸状菌のフザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）の株から得られるホスホリパーゼをコードするＤＮＡ配列（大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＤＳＭ１１２９９の中に存在するプラスミドｐＹＥＳ２．０の中にクローン化されたＤＮＡ配列のホスホリパーゼをコードする部分）を収容する大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＤＳＭ  Ｎｏ．１１２９９株、あるいはホスホリパーゼをコードする能力を保持した前記大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の突然変異体の、単離された、実質的に純粋な生物学的培養物に関する。
先行技術との配列の相同性の比較
ヌクレオチドおよびタンパク質のデータベースに対する本発明のホスホリパーゼとの相同性のサーチを実施した。相同性のサーチにおいて、最も密接に関係する既知の配列はフザリウム・ヘテロスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｈｅｔｅｒｏｓｐｏｒｕｍ）からのリパーゼであることが示された（アミノ酸の配列は第１図に図解されている）。
ホスホリパーゼをコードする本発明のＤＮＡ配列（配列番号：１の２３〜１０６０）は、フザリウム・ヘテロスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｈｅｔｅｒｏｓｐｏｒｕｍ）からの既知のリパーゼ配列（遺伝子バンクのデータバンクの参照Ｓ７７８１６）に対して、わずかに６２％の相同性を示し、そして本発明のホスホリパーゼの対応するアミノ酸配列（配列番号：２）は、前述の既知のＤＮＡ配列に基づいて推定されたアミノ酸配列に対して、わずかに６０％の相同性を示す（第１図参照）。
これが示すように、本発明のホスホリパーゼのＤＮＡおよび／またはアミノ酸配列は事実いずれの既知のＤＮＡおよび／またはアミノ酸配列とも異なる。
ペニシリウム・ノタツム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｎｏｔａｔｕｍ）からのホスホリパーゼＢをコードするｃＤＮＡ配列は記載されている（「Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．」２０２：７８３−７８７、１９９１）。しかしながら、このＤＮＡ配列（遺伝子バンクのデータバンクの参照Ｘ６０３４８）は、本発明のＤＮＡ配列（配列番号：１の２３〜１０６０）に対して、わずかに非常に制限されたＤＮＡの同一性３９％を示し、そして本発明のホスホリパーゼの対応するアミノ酸配列（配列番号：２）は、前述の既知のＰＬＢのＤＮＡ配列に基づいて推定されたアミノ酸配列に対して、わずかに２０％の同一性を示す。
相同性の計算はこの明細書において後述するように実施された。
図面：
第１図：配列番号：２に示すアミノ酸と、フザリウム・ヘテロスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｈｅｔｅｒｏｓｐｏｒｕｍ）からの先行技術のリパーゼの配列との整列。
第２図：Ｌｅｃｉｔａｓｅ（商標）と本発明によるフザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）からのホスホリパーゼとの酵素的脱ガム化能力の比較。
定義
本発明を詳細に論ずる前に、下記の用語を定義する。
「クローン化されたＤＮＡ配列」：  用語「クローン化されたＤＮＡ配列」は、ＤＮＡのセグメントをその自然の位置からそれが再現される異なる部位へ再配置するために遺伝子操作において使用される標準的クローン化手順に従い、クローン化されたＤＮＡ配列を意味する。クローン化プロセスは、所望のＤＮＡセグメントの切除および単離、ベクター分子の中へのＤＮＡ片の挿入、およびＤＮＡセグメントの多数のコピーまたはクローンが複製される細胞の中への組換えベクターの組込みを包含する。
本発明の「クローン化されたＤＮＡ配列」は、また、「ＤＮＡ構築物」または「ＤＮＡ配列を有するクローン化されたポリヌクレオチド」「単離されたＤＮＡ配列」と命名することができる。
「から得られる」：  本発明の目的に対して、用語「から得られる」は、特定の微生物源に関して本明細書において使用するとき、酵素および結局、前記酵素をコードするＤＮＡ配列が、特定の源によるか、あるいは前記源からの遺伝子が挿入された細胞により産生されることを意味する。
「単離されたポリペプチド」：  本明細書において定義するとき、用語「単離されたポリペプチド」または「単離されたホスホリパーゼ」は、本発明のホスホリパーゼについて使用するとき、他の非ホスホリパーゼを含有しない、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定して、少なくとも２０％の純度、好ましくは少なくとも４０％の純度、より好ましくは少なくとも６０％の純度、なおより好ましくは少なくとも８０％の純度、最も好ましくは少なくとも９０％の純度、なお最も好ましくは少なくとも９５％の純度であるホスホリパーゼまたはホスホリパーゼの部分である。
単離されたポリペプチドが少なくとも６０％の純度であるとき、用語「高度に単離されたポリペプチド」を使用することができる。「単離されたポリペプチド」は、また、「精製されたポリペプチド」と命名することができる。
「相同的不純物」：  本明細書において使用するとき、用語「相同的不純物」は、本発明の酵素が本来得られた相同的細胞から由来する、任意の不純物（例えば、本発明の酵素以外のポリペプチド）を意味する。本発明において、相同的細胞は、例えば、フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）の株であることができる。
「ホスホリパーゼをコードする部分」：  本明細書において使用するとき、ＤＮＡ配列に関して使用する「ホスホリパーゼをコードする部分」は、ポリペプチド配列に翻訳される領域に対応するＤＮＡ配列の領域を意味する。
配列番号：１に示すＤＮＡ配列において、それは第１「ＡＴＧ」開始コドン（ｍＲＮＡにおける「ＡＵＧ」コドン）と次に続く停止コドン（「ＴＡＡ」、「ＴＡＧ」または「ＴＧＡ」との間の領域である。
翻訳されたポリペプチドは、ホスホリパーゼ活性を示す成熟配列に加えて、Ｎ−末端のシグナルおよび／またはプロペプチドの配列をさらに含むことができる。シグナル配列は一般にポリペプチドの分泌をガイドし、そしてプロペプチドは一般にポリペプチドの折りたたみをガイドする。それ以上の情報については、下記の文献を参照のこと：Ｅｇｎｅｌｌ、Ｐ．他、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．」６（９）：１１１５−１９（１９９２）またはＳｔｒｙｅｒ、Ｌ．、「Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」Ｗ．Ｈ．、Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ／Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＩＳＢＮ  ０−７１６７−１９２０−７。
「ＤＮＡおよび／またはアミノ酸配列の修飾」：  本明細書において論ずるようにＤＮＡおよび／またはアミノ酸配列の修飾に関して使用する用語「修飾」は、化学的修飾ならびに遺伝的操作を包含するように定義される。修飾は、問題のアミノ酸の中の、あるいはアミノ酸における置換、欠失および／または挿入であることができる。
「ホスホリパーゼＡ」：本発明の酵素に関して本明細書おいて使用される用語「ホスホリパーゼＡ」は、ホスホリパーゼＡ1および／またはホスホリパーゼＡ2の活性を有する酵素をカバーすることを意図する。
ホスホリパーゼＡ1は、ＥＣ３．１．１．３２として標準的酵素ＥＣ−分類に従い定義される。
公式名称：ホスホリパーゼＡ1（ＰＬＡ1）。
触媒される反応：
ホスファチジルコリン＋Ｈ（２）Ｏ＜＞
２−アシルグリセロホスホコリン＋脂肪酸アニオン
所見
ｅｃ３．１．１．４よりも非常に広い特異性を有する。
ホスホリパーゼＡ2は、ＥＣ３．１．１．４として標準的酵素ＥＣ−分類に従い定義される。
公式名称：ホスホリパーゼＡ2（ＰＬＡ2）。
別名：ホスファチジルコリン２−アシルヒドロラーゼ。
レシチナーゼａ；ホスファチダーゼ；またはホスファチドリパーゼ。
触媒される反応：
ホスファチジルコリン＋Ｈ（２）Ｏ＜＞
１−アシルグリセロホスホコリン＋脂肪酸アニオン
所見：また、ホスファチジルエタノールアミン、コリンプラスミノゲンおよびホスファチドに作用して、２−位に結合した脂肪酸を除去する。
「ホスホリパーゼＢ：ホスホリパーゼＢ」は、ＥＣ３．１．１．５として標準的酵素ＥＣ−分類に従い定義される。
公式名称：リゾホスホリパーゼ。
別名：レシチナーゼｂ；リゾレシチナーゼ；ホスホリパーゼｂ；またはｐｌｂ。
触媒される反応：
２−アシルグリセロホスホコリン＋Ｈ（２）Ｏ＜＞
グリセロホスホコリン＋脂肪酸アニオン
「ホスホリパーゼ活性」：  本発明の酵素に関して本明細書おいて使用される用語「ホスホリパーゼ活性」または「ホスホリパーゼ活性を有する／を示す」は、下記において実験的に定義する量のホスホリパーゼ活性（ＰＬＡまたはＰＬＢの活性）を有する酵素を特定することを意図する。
したがって、ホスホリパーゼ活性を示す酵素は、本明細書中の実施例６に示す「単層ホスホリパーゼアッセイ」（下文参照）において、酵素の投与量：６０μｇ、２５℃において、少なくとも０．２５ｎｍｏｌ／分；より好ましくは酵素投与量：６０μｇ、２５℃において、少なくとも０．４０ｎｍｏｌ／分；より好ましくは酵素投与量：６０μｇ、２５℃において、少なくとも０．７５ｎｍｏｌ／分；より好ましくは酵素投与量：６０μｇ、２５℃において、少なくとも１．０ｎｍｏｌ／分；より好ましくは酵素投与量：６０μｇ、２５℃において、少なくとも１．２５ｎｍｏｌ／分；なおより好ましくは酵素投与量：６０μｇ、２５℃において、少なくとも１．５ｎｍｏｌ／分のホスホリパーゼ活性を有する、酵素として本発明において定義される。
このような有意なホスホリパーゼ活性を有する酵素のみは、例えば、脱ガム化（米国特許第５，２６４，３６７号）において使用するために、工業的重要性を有すると現在考えられる。
「ホスホリパーゼ副活性を有するリパーゼ」：  したがって、用語「ホスホリパーゼ副活性を有するリパーゼ」は、実施例６に示す「単層ホスホリパーゼアッセイ」におけるホスホリパーゼ副活性が前述の数値より小さい、ホスホリパーゼ副活性を有するリパーゼとして定義される。
多数のリパーゼは、このようなホスホリパーゼ副活性を有する。本明細書における実施例６（下文参照）において、ホスホリパーゼ副活性を有するリパーゼのあるものが示されている。
「粗製油」：  粗製油（また、非脱ガム化油と呼ぶ）は、例えば、ナタネ、大豆、またはヒマワリから、プレスされたまたは抽出された油またはその混合物であることができる。粗製油中のホスファチド含量は、２００〜１２００ｐｐｍの範囲、より好ましくは２５０〜１２００ｐｐｍの範囲のリン含量に対応して、０．５〜３％ｗ／ｗの範囲内で変化することができる。ホスファチドは別として、粗製油は、また、低濃度の炭水化物、糖化合物、およびＣａ、ＭｇおよびＦｅの金属／ホスファチド酸錯体を含有する。
「半粗製油」：  粗製油ではないが、２５０ｐｐｍ以上、より好ましくは５００ｐｐｍ以上のホスファチド含量を有するあらゆる油。このような油は、例えば、粗製油を後述する「水脱ガム化された油」に類似するプロセスに付すことによって、達成できるであろう。
「水−脱ガム化された油」：  水脱ガム化された油は、典型的には、１〜３％ｗ／ｗの熱水を温かい（６０〜９０℃）粗製油と混合することによって得られる。通常の処理時間は３０〜６０分である。水脱ガム化工程は、水和したとき油の中に不溶性となる、ホスファチドおよび粘質性ガムを除去する。水和したホスファチドおよびガムは、沈降、濾過または遠心により油から分離することができる−遠心はより一般的な実施である。
前記水−脱ガム化プロセスにおける本質的目的は、水和ホスファチドを油から分離することである。前述の熱水の油の中への混合は、本発明において、この分野における標準的水−脱ガム水プロセスに従い、水溶液を油の中に混合することとして広く理解すべきである。
また、本明細書において「水−脱ガム化された油」と命名するプロセスは「粘質物を除去する湿式精製」と呼ぶことができる（米国特許第５，２６４，３６７号参照）。
発明の詳細な説明
高い量の非水和性ホスファチド／リン脂質を含んでなる食用油の酵素的脱ガム化法
本発明について、食用油中の非水和性リンの量は、
ｉ）  ６０℃において、水中のクエン酸一水和物を含んでなる溶液の添加（添加された水／油＝４．８％ｗ／ｗ；水相中の［クエン酸］＝１０６ｍＭ、水／油エマルジョン中の［クエン酸］＝４．６ｍＭ）により、前記食用油を３０分間前処理し、
ｉｉ）  １０ｍｌの前処理された油中水型エマルジョンを管に移し、
ｉｉｉ）  前記エマルジョンを沸騰する水浴中で３０分間加熱し、
ｉｖ）  ５０００ｒｐｍにおいて１０分間遠心し、
ｖ）  約８ｍｌの上（油）相を新しい管に移し、それを２４時間放置し（沈降させ）、
ｖｉ）  沈降後、上方の透明な相から２ｇを抜き出して、食用油中の非水和性リン含量（ｐｐｍ）を測定する、
ことによって測定される。
それ以上の詳細は、本明細書における実施例を参照のこと。
本明細書における実施例に例示されているように、異なる食用油のリン脂質組成物（水和性／非水和性リン脂質）はかなり変化する。結局、異なる水−脱ガム化された油中の残留するリン脂質のレベルは広い範囲にわたって変化する（例えば、約３０ｐｐｍ〜２００ｐｐｍ）。
酵素的脱ガム化について、最適な酵素投与量は、上記において定義したように、水脱ガム化またはクエン酸／水前処理後に存在する非水和性ホスファチドの量に依存する。
さらに、油の中に存在する非水和性ホスファチドの量がより高くなるほど、酵素的脱ガム化法はいっそう効率よくなる。
本発明は、比較的高い量のＮＨＰを含んでなる油中のＮＨＰ含量を除去する方法を提供することである。
好ましくは、食用油は、少なくとも６０ｐｐｍの非水和性リン含量、より好ましくは少なくとも１００ｐｐｍの非水和性リン含量、なおより好ましくは少なくとも２００ｐｐｍの非水和性リン含量を有する。
より好ましくは、食用油は、６０〜５００ｐｐｍの範囲、より好ましくは１００〜５００ｐｐｍの範囲、なおより好ましくは２００〜５００ｐｐｍの範囲の非水和性リン含量を有する。
本明細書における記載に従い、比較的高い量の非水和性リンを有するとして定義された食用油は、水脱ガム化された油、より好ましくは粗製油または半粗製油であることができる。
したがって、本発明の態様は、前記食用油が粗製油であり、前記粗製油は、本発明の方法を実施する前において、２５０部／１０6部（ｐｐｍ）より大きいリン含量を有する油であり、前記油は本発明の方法を実施する前において水−脱ガム化されていない（水脱ガム化は水を温かい粗製油の中に混合し、次いで水和したとき油の中に不溶性となるホスファチドを除去することを含む）ことを特徴とする、本発明の第１の面に関する。
好ましくは、このような粗製食用油は、本発明の前記方法を実施する前において、３５０ｐｐｍ以上、より好ましくは４００ｐｐｍ以上、なおより好ましくは５００ｐｐｍ以上、最も好ましくは６００ｐｐｍ以上のリン含量を有する。
さらに、前記粗製食用油は、好ましくは、本発明の前記方法を実施する前において、２５０〜１５００ｐｐｍの範囲、より好ましくは３５０〜１５００ｐｐｍの範囲、なおより好ましくは５００〜１５００ｐｐｍの範囲、最も好ましくは５００〜１５００ｐｐｍの範囲のリン含量を有する。
本発明による粗製食用油の酵素的脱ガム化法は、先行技術の水脱ガム化された食用油の酵素的脱ガム化法（米国特許第５，２６４，３６７号）よりも有利である。なぜなら、本発明による、粗製油を処理するための直接的酵素的脱ガム化法は、油の水脱ガム化の前の工程を節約するからである。
これは時間および金銭の双方を節約する。水−脱ガム化された油は、典型的には、熱水を温かい（６０〜９０℃）粗製油の中に通常３０〜６０分間混合することによって得られる。対照的に、本発明による粗製油を酵素的に脱ガム化する完全なプロセスは１時間未満の時間内に実施することができ、実際の酵素的処理は約２５分である。それ以上の詳細については、本明細書における実施例を参照のこと。
さらに、本明細書における記載に従い、比較的高い量の非水和性リンを有するとして定義された食用油は半粗製油であることができる。
したがって、本発明の態様は、前記食用油が半粗製食用油であり、前記半粗製食用油が５００部／１０6部（ｐｐｍ）以上のリン含量を有し、そして前記油が本発明の方法を実施する前において水−脱ガム化されていることを特徴とする、本発明の第１の面に関する。
好ましくは、前記半粗製食用油は、前記方法を実施する前において、６００部／１０6部（ｐｐｍ）以上、最も好ましくは７５０部／１０6部（ｐｐｍ）以上のリン含量を有する。
一般に、食用油の水脱ガム化は油中のリン含量を５００ｐｐｍ以下のレベルに減少させる。
したがって、本明細書において記載する半粗製油は、例えば、本発明による食用油中のリン含有成分のレベルを減少させる方法を実施する前に、わずかに部分的に水−脱ガム化されていることができる。
用語「部分的に水脱ガム化された」は、油の水脱ガム化手順が標準的水−脱ガム化手順に比較して単なる部分的／短いプロセスであることを意味する。
「部分的水脱ガム化」プロセスは、わずかに０．５％の熱水を油の中に混合する（標準は１〜３％の熱水である。本明細書における「定義」の節を参照のこと）ことによるか、あるいは処理時間を１０分に減少する（標準は３０〜６０分である）ことによって実施することができる。
また、本明細書において定義する半粗製油は、粗製油と半粗製油との混合物であることができる。
本発明の態様は、下記の工程を含む、本発明の第１の面のいずれかに従う方法に関する：
ｉ）  食用油の温度を２５℃〜７０℃の温度に調節し、
ｉｉ）  上記調節された温度において、０．５〜６％（前記油に関する重量による）の少なくとも８５％の水を含んでなる水溶液の添加により、食用油を５〜１２０分間前処理し、ここで前記前処理後に、油中の水和された粘質物およびリン含量を除去せず、
ｉｉｉ）  前記水／油エマルジョンのｐＨをｐＨ１．５〜８に調節し（例えば、適当な量のＮａＯＨ溶液の添加により）、
ｉｖ）  前記水／油エマルジョンをホスホリパーゼの水溶液と接触させ（工程ｉ）に従い調節した温度（＋／−５℃）において）、このホスホリパーゼを前記油のリン含量が１１ｐｐｍより低く減少するまで前記油中で乳化させ、
ｖ）  水性相を処理された油から分離する。
前述の工程ｉ）における食用油の温度を、この方法において使用する酵素の最適ホスホリパーゼ活性温度である温度に調節することが好ましい。
商業的に入手可能なホスホリパーゼＬｅｃｉｔａｓｅ（商標、Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ  Ａ／Ｓ）について、これは約６０℃であり、そして糸状菌フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属から得られた本発明のホスホリパーゼについて、約４５℃である。この問題に関するそれ以上の詳細については、本明細書における実施例を参照のこと。
糸状菌のホスホリパーゼの大部分は温度最適値約３５〜５０℃を有するであろうことが予測される。
したがって、本発明の態様は、工程ｉ）における食用油の温度を３５℃〜５０℃に調節し、そして工程ｉｖ）において使用するホスホリパーゼが糸状菌株から得られる、前述の方法に関する。
前述の方法の工程ｉｉ）において、食用油を好ましくは調節された温度（工程ｉ））において、０．５〜６％（前記油に関する重量による）の少なくとも８５％の水を含んでなる水溶液の添加により、食用油を５〜１２０分間前処理し、ここで前記前処理後に、油中の水和された粘質物およびリン含量を除去しない。
この工程は食用油の酵素的脱ガム化における標準的前処理工程である（米国特許第５，２６４，３６７号；米国特許第５，５５８，７８１号）。工程ｉｉ）の目的は、水和したとき油の中に不溶性となる、食用油中の水和性／親水性成分（例えば、水和性リン含量）を水和することである。
しかしながら、この工程は本発明の関係における「食用油の水−脱ガム化」と呼ぶものと異なる。１つの主要な差は、前記前処理工程が水和したホスファチドおよび粘質物を油から除去しないことである。油からの前記水和した含量の除去は、食用油の水−脱ガム化の主要な目的である。
したがって、ホスホリパーゼを上記工程ｉｖ）において油と接触させるとき、油は前記水和したホスファチドおよび粘質物をまだ含む。
換言すると、食用油が非水脱ガム化食用油である場合、上記方法は簡素化された酵素的脱ガム化法であり、前記油とホスホリパーゼとの接触前に、水和したホスファチドおよび粘質物を油から除去しない。
好ましくは、少なくとも８５％の水を含んでなる水溶液（上記工程ｉｉ）はクエン酸をさらに含む。好ましくは、前記水溶液中に１〜１５％（ｗ／ｗ）のクエン酸が存在し、より好ましくは前記水溶液中に３〜１１％（ｗ／ｗ）のクエン酸が存在する。
好ましくは、工程ｉｉ）における時間は１５〜５０分、より好ましくは１５〜３０分である。
工程ｉｉ）における前記前処理に関するそれ以上の詳細については、本明細書における実施例を参照のこと。
上記工程ｉｉｉ）において、水／油エマルジョンのｐＨをｐＨ１．５〜８に調節する（例えば、適当な量のＮａＯＨ溶液の添加により）。これは、工程ｉｖ）においてホスホリパーゼを油と接触させる前に、実施して油のｐＨ値を調節する。一般に、実際の最適ｐＨ値は工程ｉｖ）において油と接触させるために使用する実際の酵素に依存するであろう。この問題に関するそれ以上の詳細については、本明細書における実施例を参照のこと。
一般に、本発明の第１の面およびそれらの態様に従い、前記油とホスホリパーゼを含んでなる水溶液との接触はｐＨ１．５〜６、より好ましくはｐＨ３〜６において実施することが好ましい。
油中水型エマルジョンにおける水中のｐＨ値は、２ｍｌの水を油エマルジョンから取り、それらを２ｍｌの水と混合することによって測定される。相分離後、生ずる上部の油層をピペットで取り、そしてｐＨを水性相中で測定する。下記式ｐＨ（真の）＝ｐＨ（測定）−０．３８により、測定値を「真の（ｒｅａｌ）」ｐＨ値に変換する。それ以上の詳細については、本明細書における実施例を参照のこと。
好ましくは、本発明による食用油中のリン含有成分の量を減少させる方法において、油中で乳化されるホスホリパーゼの量が０．１〜１５ｍｇの酵素（乾燥物質）／ｋｇの油、好ましくは０．２５〜５ｍｇの酵素（乾燥物質）／ｋｇの油、なおより好ましくは０．２５〜２．５ｍｇの酵素（乾燥物質）／ｋｇの油の範囲である。
一般に、食用油の酵素的脱ガム化に使用するホスホリパーゼの量および時間を最適化して、１１ｐｐｍ以下のリン含量を得ることが有利である。実際の最適な酵素の投与量および時間は、なかでも、使用する実際のホスホリパーゼに依存するであろう。この方法の酵素の投与量および時間の最適化に関するそれ以上の詳細については、本明細書における実施例を参照のこと。
好ましくは、本発明による食用油中のリン含有成分の量を減少させる方法において、前記油を０．５〜６ｍｇのホスホリパーゼ（乾燥物質）／ｋｇの油と接触させた後、油のリン含量は１１ｐｐｍより低く減少され、そしてホスホリパーゼを前記油と１〜６時間の間接触させ、より好ましくは前記油を０．２５〜２．５ｍｇのホスホリパーゼ（乾燥物質）／ｋｇの油と接触させた後、油のリン含量は１１ｐｐｍより低く減少され、そしてホスホリパーゼを前記油と１５分〜２時間の間接触させる。
個々のホスホリパーゼについての最適な温度の同定に関するそれ以上の詳細については、本明細書における実施例を参照のこと。
好ましくは、本発明による食用油中のリン含有成分の量を減少させる方法のすべての面および態様において、油のリン含量は５ｐｐｍより低く減少される。
油中のリン含量は、油エマルジョン中に存在する水の油相中の部／１０6部（ｐｐｍ）として測定される。リン含量の分析は、「Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｏｉｌｓ，Ｆａｔｓ，ａｎｄ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ，第７版（１９８７）」における手順２．４２１に従い実施される。それ以上の詳細については、本明細書における実施例を参照のこと。
本発明の態様は、ホスホリパーゼが哺乳動物種から得られ、特にホスホリパーゼが前記哺乳動物種の膵臓から得られ、最も好ましくはホスホリパーゼがブタの膵臓から得られる、本発明による食用油中のリン含有成分の量を減少させる方法に関する。
好ましくは、本発明による食用油中のリン含有成分の量を減少させる方法において、ホスホリパーゼは微生物、好ましくは糸状菌、酵母、または細菌から得られる。
好ましくは、前述の糸状菌がフザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属の範囲内の種であるとき、好ましい株は、フザリウム・クルモラム（Ｆ．ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、フザリウム・ヘテロスポラム（Ｆ．ｈｅｔｅｒｏｓｐｏｒｕｍ）、フザリウム・ソラニ（Ｆ．ｓｏｌａｎｉ）の株、特にフザリウム・オキシスポラム（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）の株のような株である。
さらに、前記糸状菌がアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属の範囲内の種であるとき、好ましい株は、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・フェチダス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｏｅｔｉｄｕｓ）、アスペルギルス・ジャポニカス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、特にアスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）の株のような株である。
さらに、本発明による食用油中のリン含有成分の量を減少させる方法において、食用油は好ましくは大豆油、ヒマワリ実油、より好ましくはナタネ油である。
フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）から得られるホスホリパーゼの特性決定
フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）から得られる本発明のホスホリパーゼは、集中的に特性決定されてきている。
したがって、本発明の１つの面は、好ましくは、単離されたホスホリパーゼＡである。このホスホリパーゼＡはフザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属の株から得られ、４０℃において測定してｐＨ３〜１０においてホスホリパーゼＡ活性、より好ましくは４０℃において測定してｐＨ３〜７においてホスホリパーゼＡ活性、より好ましくは４０℃において測定してｐＨ３．５〜６においてホスホリパーゼＡ活性、なおより好ましくは４０℃において測定してｐＨ４．５〜５．５においてホスホリパーゼＡ活性を有する。
ホスホリパーゼＡ活性は、基質として大豆レシチンを使用して（ＮＥＦＡ試験塩基アッセイ）、あるいは２％のレシチン、２％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、２０ｍＭのブリットン−ロビンソン（Ｂｒｉｔｔｏｎ−Ｒｏｂｉｎｓｏｎ）（ＢＲ）を含んでなる緩衝液中で測定される。それ以上の詳細については、本明細書における実施例を参照のこと。
本発明の他の態様において、単離されたホスホリパーゼＡは、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属の株から得られ、好ましくは２９±１０ｋＤａｎｏ分子量、より好ましくは２９±５ｋＤａの分子量、なおより好ましくは２９±３ｋＤａの分子量、最も好ましくは２９±２ｋＤａの分子量を有するものである。
分子量は、「材料および方法」の節（下文参照）にさらに記載するように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動により測定される。
本発明の他の態様において、単離されたホスホリパーゼＡは、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属の株から得られ、好ましくは範囲４．５〜８の等電点（ｐＩ）、より好ましくは範囲５〜７．５の等電点（ｐＩ）、なおより好ましくは範囲５．５〜７．５の等電点（ｐＩ）を有するものである。
等電点（ｐＩ）は、ファーマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）からのアンフォリン（Ａｍ−ｐｈｏｌｉｎｅ）ＰＡＧＥプレートを使用して測定した。それ以上の詳細については、本明細書における実施例を参照のこと（下文参照）。
本発明の他の態様において、単離されたホスホリパーゼＡは、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属の株から得られ、好ましくはｐＨ５において基質としてレシチンを使用して測定して、２５〜５５℃の範囲、より好ましくはｐＨ５において基質としてレシチンを使用して測定して、３０〜５０℃の範囲、なおより好ましくはｐＨ５において基質としてレシチンを使用して測定して、４０〜５０℃の範囲のホスホリパーゼ活性のための温度最適値を有するものである。
ホスホリパーゼ活性のための温度最適値は、２％のレシチン、２％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、２０ｍＭのブリットン−ロビンソン緩衝剤を含んでなる緩衝液中でｐＨ５において測定された。それ以上の詳細については、本明細書における実施例を参照のこと（下文参照）。
本発明の他の態様において、単離されたホスホリパーゼＡは、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属の株から得られ、好ましくは３７℃においてｐＨ範囲６〜１２、より好ましくは３７℃においてｐＨ範囲８〜１１、なおより好ましくは３７℃においてｐＨ範囲８．５〜１１のホスホリパーゼ活性のｐＨ最適値を有するものである。
ホスホリパーゼ活性のｐＨ最適値は、２％のレシチン、２％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、２０ｍＭのブリットン−ロビンソン（ＢＲ）を含んでなる緩衝液中で３７℃において測定された。それ以上の詳細については、本明細書における実施例を参照のこと。
好ましくは、本発明のホスホリパーゼは酵素の５つ（番号ｉ）〜ｖ））の前述の物理的特性のうちの少なくとも２つを有し、より好ましくは本発明のホスホリパーゼは酵素の５つ（番号ｉ）〜ｖ））の前述の物理的特性のうちの少なくとも３つを有し、なおより好ましくは本発明のホスホリパーゼは酵素の５つ（番号ｉ）〜ｖ））の前述の物理的特性のうちの少なくとも４つを有し、最も好ましくは本発明のホスホリパーゼは酵素の５つ（番号ｉ）〜ｖ））の前述の物理的特性のすべてを有する。
前述したように、本発明のホスホリパーゼはクローン化、組換え的に発現され、精製され、そして活性な分泌された酵素のＮ−末端およびＣ−末端の配列が決定された。
したがって、本発明の他の態様は、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属の株から得られ、そして
ｉ）  ４０℃において測定された、ｐＨ範囲３〜１０におけるＰＬＡ活性、
ｉｉ）  ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定して、２９±１０ｋＤａの分子量、
ｉｉｉ）  範囲４．５〜８の等電点（ｐＩ）、
ｉｖ）  ｐＨ５において基質としてレシチンを使用して測定された、２５〜５５℃の範囲のホスホリパーゼ活性のための温度最適値、および／または
ｖ）  ３７℃において基質としてレシチンを使用して測定された、６〜１２のｐＨ範囲のホスホリパーゼ活性のためのｐＨ最適値、を有し、そして、さらに
（ａ）  大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＤＳＭ１１２９９の中に存在するプラスミドｐＹＥＳ２．０の中にクローン化されたＤＮＡ配列のホスホリパーゼＡ酵素をコードする部分によりコードされるポリペプチド、
（ｂ）  配列番号：２中の位置３１−３４６に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｃ）  配列番号：２中の位置３１−３０３に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｄ）  （ａ）、（ｂ）または（ｃ）において定義された前記ポリペプチドと90％以上相同性であるポリペプチドの類似体、および
（ｅ）  （ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）のフラグメント、から成る群より選択されるアミノ酸配列を含んでなる、ホスホリパーゼＡ活性を有する単離されたポリペプチドに関する。
本発明の態様において、本発明によるホスホリパーゼ活性を有する単離されたポリペプチドは、ホスホリパーゼＡ1活性を有するホスホリパーゼである。
他の態様において、本発明によるホスホリパーゼ活性を有する単離されたポリペプチドはホスホリパーゼＡ2活性を有するホスホリパーゼであり、なお他の態様において、本発明によるホスホリパーゼ活性を有する単離されたポリペプチドはホスホリパーゼＢ活性を有するホスホリパーゼである。
好ましくは、本発明によるホスホリパーゼ活性を有する前記単離されたポリペプチドはホスホリパーゼＡ1活性を有するホスホリパーゼである。
個々のＰＬＡ1、ＰＬＡ2および／またはＰＬＢ活性を測定する標準的技術の特定の実施例については、本明細書における実施例を参照のこと。
他の態様において、本発明は、ホスホリパーゼがＣａ2+濃度に対して実質的に独立であるホスホリパーゼである、本発明によるホスホリパーゼ活性を有する単離されたポリペプチドに関し、前記Ｃａ2+濃度は、３７℃において１０分間インキュベートし、次いで９５℃において５分間反応を停止する、２％のレシチン、２％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、２０ｍＭのクエン酸塩を含んでなる緩衝液、ｐＨ５、中のレシチンからの遊離脂肪酸の解放を測定するホスホリパーゼ活性のアッセイにおいて５ｍＭのＥＤＴＡおよび５ｍＭのＣａ2+における相対ホスホリパーゼ活性として測定され、ここで５ｍＭのＥＤＴＡ／５ｍＭのＣａ2+における相対ホスホリパーゼ活性の比は０．２５より大きく、より好ましくは０．５より大きく、最も好ましくは０．８０より大きい。
Ｃａ2+濃度に対する酵素活性の依存性の測定に関するそれ以上の詳細については、本明細書における実施例を参照のこと。
いくつかのリパーゼは制限されたホスホリパーゼ活性を有する。本発明の関係において、前記リパーゼのこのような制限されたホスホリパーゼ活性は「ホスホリパーゼ副活性を有するリパーゼ」として定義される（本明細書における「定義」の節参照）。本発明は、前記単離されたポリペプチドのホスホリパーゼ活性がそれが工業的関連性を有するように高い、ホスホリパーゼ活性を有する単離されたポリペプチドに関する。
したがって、本発明は、下記のように単層ホスホリパーゼアッセイにおいて測定して、６０μｇの酵素投与量、２５℃において少なくとも０．２５ｎｍｏｌ／分、より好ましくは６０μｇの酵素投与量、２５℃において少なくとも０．４０ｎｍｏｌ／分であるホスホリパーゼ活性を有するホスホリパーゼである、本発明によるホスホリパーゼ活性を有する単離されたポリペプチドに関する：
ａ．  緩衝溶液（１０ｍＭのＴＲＩＳ、ｐＨ８．０、２５℃）の完全に精製された表面上の単層装置（ゼロ次トラフ）において、リン脂質ＤＤＰＣ（Ｄｉ  Ｄｉｃａｎｏｙｌ（Ｃ１０）ホスファチジルコリン）の単層をクロロホルム溶液から広げ、
ｂ．  単層を緩和させた（クロロホルムを蒸発させた）後、ほぼ６３Å2／分子のＤＤＰＣの平均分子面積に対応して、表面圧力を１５ｍＮ／ｍに調節し、
ｃ．  ６０μｇの酵素を含有する緩衝溶液（前述）を単層を通して「ゼロ次トラフ」中の反応区画室（面積１５２０ｍｍ2および体積３０４００ｍｍ3を有するシリンダー）の部分相の中に注入し、
ｄ．  不溶性基質分子がより水溶性の反応生成物に加水分解されるとき、一定の表面圧力を維持するために、単層を圧縮する移動性バリヤーの速度により酵素活性を測定し、ここで酵素により１分当たり加水分解されるＤＤＰＣ−分子の数をＤＤＰＣの平均分子面積（ＭＭＡ）から推定する。
本発明によるホスホリパーゼ活性を有する単離されたポリペプチドについてのホスホリパーゼ活性の好ましい量のそれ以上の説明については、「定義」の節および実施例を参照のこと。
さらに、本発明によるホスホリパーゼの比ホスホリパーゼ活性は、既知の標準的ホスホリパーゼ活性のアッセイにより測定することができる。
したがって、他の態様において、本発明は、ホスホリパーゼが、少なくとも７μｍｏｌの遊離脂肪酸／分／ｍｇの酵素、より好ましくは少なくとも１５μｍｏｌの遊離脂肪酸／分／ｍｇの酵素、なおより好ましくは少なくとも３０μｍｏｌの遊離脂肪酸／分／ｍｇの酵素、最も好ましくは少なくとも５０μｍｏｌの遊離脂肪酸／分／ｍｇの酵素を解放することができるホスホリパーゼ活性を有するホスホリパーゼである、本発明によるホスホリパーゼ活性を有する単離されたポリペプチドに関し、前記ホスホリパーゼ活性は、３７℃において１０分間インキュベートし、次いで９５℃において５分間反応を停止する、２％のレシチン、２％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、２０ｍＭのクエン酸塩を含んでなる緩衝液、ｐＨ５、中のレシチンからの遊離脂肪酸の解放を測定するアッセイにおいて測定される。
本発明のこの態様に関するそれ以上の詳細については、本明細書における実施例を参照のこと。
本発明によるホスホリパーゼ活性を有する単離されたポリペプチドは、食用油の酵素的脱ガム化を実施するために非常に適する。
したがって、下記の単離されたポリペプチドに関する：
１．  本発明に従い、少なくとも５０ｐｐｍの非水和性リン含量を含む食用油中のリン含有成分の量を減少するために、ホスホリパーゼは食用油の酵素的脱ガム化を実施することができる、本発明によるホスホリパーゼ活性を有する単離されたポリペプチド；および
２．  水−脱ガム化された食用油（５０〜２５０ｐｐｍのリン含量を有する）の酵素的脱ガム化を実施し、これにより前記油のリン含量を１１ｐｐｍより低く減少することができ、ここで酵素的脱ガム化プロセスが前記油をｐＨ１．５〜８においてホスホリパーゼの水溶液と接触させ、これを前記油のリン含量が１１ｐｐｍより低く減少するまで前記油中で乳化させ、次いで水性相を処理された油から分離することからなる、本発明によるホスホリパーゼ活性を有する単離されたポリペプチド。
好ましくは、本発明によるホスホリパーゼ活性を有する単離されたポリペプチドは、水脱ガム化された食用油（前述）の前記酵素的脱ガム化プロセスを１．５時間未満で実施することができ、そして２ｍｇ未満の少ないホスホリパーゼ（乾燥物質）／ｋｇの油を使用する。
好ましくは、本発明のホスホリパーゼ活性を示しかつ上に示した特性を有する単離されたポリペプチドは、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属の範囲内の糸状菌株から得られる。
しかしながら、いかなる理論にも制限されないで、本発明のホスホリパーゼは、また、他の微生物、好ましくは他の糸状菌株から得ることができる。それらの例は「微生物源」の節（下文参照）に記載されている。
クローン化されたＤＮＡ配列
多数の技術的困難（「糸状菌ホスホリパーゼのクローン化のプロトコール」の節、下文参照）にかかわらず、本発明はフザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属、さらに詳しくはフザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）の株からＰＬＡ活性を示すホスホリパーゼをクローン化することができる。
さらに、この出願の中に提供されている配列の情報に基づいてＤＮＡ配列をコードする関係するホスホリパーゼＡおよび／またはホスホリパーゼＢの両方をクローン化することが可能であると現在考えられる。
したがって、本発明の１つの面は、ホスホリパーゼＡおよび／またはホスホリパーゼＢの活性を示す酵素をコードするクローン化されたＤＮＡ配列に関し、このＤＮＡ配列は、
（ａ）  大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＤＳＭ１１２９９の中に存在するプラスミドｐＹＥＳ２．０の中にクローン化されたポリヌクレオチドのホスホリパーゼＡをコードする部分、
（ｂ）  配列番号：１中の位置２３−１０６３、より好ましくは配列番号：１中の位置１１３−１０６３、なおより好ましくは配列番号：１中の位置１１３−９２９に示すＤＮＡ配列、またはその相補的鎖、
（ｃ）  （ａ）または（ｂ）において定義された前記ＤＮＡ配列と少なくとも７０％相同性であるＤＮＡ配列、
（ｄ）  ホスホリパーゼ活性を示すポリペプチドをコードし、かつ配列番号：２の位置３１−３４６に示されたポリペプチド配列と少なくとも７０％相同性であり、より好ましくは配列番号：２の位置３１−３０３に示すポリペプチド配列と90％以上相同性である、（ａ）または（ｂ）において定義された前記ＤＮＡ配列、
（ｅ）  配列番号：１中の位置２３−１０６３に示すＤＮＡ配列を含んでなる二本鎖ＤＮＡプローブと低いストリンジェンシイにおいてハイブリダイズするＤＮＡ配列、
（ｆ）  配列番号：２の残基１〜３４６、３１〜３４６または３１〜３０３のアミノ酸配列あるいは（ｅ）のＤＮＡ配列のいずれかによりコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、および
（ｇ）  （ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）または（ｆ）において特定されたＤＮＡ配列のフラグメントであるＤＮＡ配列、から成る群より選択される。
この明細書において、ＤＳＭ１１２９９の中に存在するプラスミドｐＹＥＳ２．０の中にクローン化されたＤＮＡ配列のホスホリパーゼをコードする部分について言及するときはいつでも、このような言及は、また、配列番号：１の中に表されているＤＮＡ配列のホスホリパーゼをコードする部分を包含することを意図する。
したがって、用語「ＤＳＭ１１２９９の中に存在するプラスミドｐＹＥＳ２．０の中にクローン化されたＤＮＡ配列のホスホリパーゼをコードする部分」および「配列番号：１の中に表されているＤＮＡ配列のホスホリパーゼをコードする部分」を互換的に使用することができる。
ＤＮＡ配列は、ゲノム、ｃＤＮＡ、または合成由来またはそれらの任意の組合わせであることができる。
本発明は、また、配列番号：２の成熟部分として記載されたアミノ酸配列を有するホスホリパーゼＡおよび／またはＢの活性を示す酵素をコードし、遺伝暗号の縮退によって配列番号：１と異なる、クローン化されたＤＮＡ配列を包含する。
本発明の配列番号：１に示すＤＮＡ配列および／または類似体ＤＮＡ配列を、ホスホリパーゼ活性を有する酵素を産生する糸状菌フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）の株、あるいはさらに後述する（「微生物源」の節を参照のこと）他のまたは関係する微生物からクローン化することができる。
また、類似の配列は配列番号：１のホスホリパーゼをコードする部分として表わされるＤＮＡ配列をベースとして構築することができ、例えば、それらのサブ配列であり、および／またはＤＮＡ配列によりコードされるホスホリパーゼの他のアミノ酸配列を生じないが、酵素の産生に意図される宿主微生物のコドンの使用に対応するヌクレオチドの置換を導入するか、あるいは異なるアミノ酸配列（すなわち、本発明のホスホリパーゼの変異型）を生ずることができるヌクレオチドの置換の導入によるか、あるいは異なるアミノ酸配列（すなわち、本発明のホスホリパーゼの変異型）を生ずることができるヌクレオチドの置換を導入することによって構築することができる。
ヌクレオチドの置換を実施するとき、アミノ酸の変化は好ましくは小さい特質を有する、すなわち、タンパク質の折りたたみまたは活性に有意に影響を与えない、保存的アミノ酸の置換；小さい欠失、典型的には１〜約３０アミノ酸；小さいアミノ−またはカルボキシル−末端伸長、例えば、アミノ末端メチオニン残基；約２０〜２５残基までの小さいリンカーペプチド；または精製を促進する小さい伸長、例えば、ポリ−ヒスチジントラクト；抗原性エピトープまたは結合ドメインである。
保存的置換の例は、塩基性アミノ酸、例えば、アルギニン、リジン、ヒスチジン；酸性アミノ酸、例えば、グルタミン酸およびアスパラギン酸；極性アミノ酸、例えば、グルタミンおよびアスパラギン；疎水性アミノ酸、例えば、ロイシン、イソロイシン、バリン；芳香族アミノ酸、例えば、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン；および小さいアミノ酸、例えば、グリシン、アラニン、セリン、スレオニン、メチオニンのグループの範囲内である。ヌクレオチドの置換の一般的説明については、例えば、下記の文献を参照のこと：Ｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．、（１９９１）、「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ」２、９５−１０７。
当業者にとって明らかなように、このような置換は分子の機能に対して重大である領域の外側で実施することができ、なお活性ポリペプチドを生じさせることができる。本発明のクローン化されたＤＮＡ配列によりコードされ、したがって、好ましくは置換に付されないポリペプチドの活性に対して必須のアミノ酸は、この分野において知られている手順、例えば、部位特異的突然変異誘発またはアラニン走査突然変異誘発に従い同定することができる（例えば、ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍおよびＷｅｌｌｓ、（４９８９）、「Ｓｃｉｅｎｃｅ」２４４、１０８１−１０８５参照）。後者の技術において、突然変異は分子中のすべての残基に導入され、そして生ずる突然変異体分子を生物学的（すなわち、ホスホリパーゼ）活性について試験して、分子の活性に対して重大であるアミノ酸残基を同定する。基質−酵素の相互作用部位は、また、核磁気共鳴分析、結晶学または光アフィニティー標識化のような技術により決定される結晶構造により決定することができる（下記の文献を参照のこと：例えば、ｄｅ  Ｖｏｓ他、（１９９２）、「Ｓｃｉｅｎｃｅ」２５５、３０６−３１２；Ｓｍｉｔｈ他、（１９９２）、「Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．」２２４、８９９−９０４；Ｗｌｏｄａｖｅｒ他、（１９９２）、「ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．」３０９、５９−６４）。
本発明のポリペプチドは、また、他のポリペプチドがポリペプチドのＮ−末端またはＣ−末端またはそのフラグメントに融合されている、融合ポリペプチドまたは切断可能な融合ポリペプチドを包含する。融合ポリペプチドは、他のポリペプチドをコードする核酸配列（またはその一部分）を本発明の核酸配列（またはその一部分）に融合することによって製造される。融合ポリペプチドを製造する技術はこの分野において知られており、そしてポリペプチドをコードするコード配列をそれらをインフレームであるようにかつ融合ポリペプチドの発現が１または２以上の同一プロモーターおよびターミネーターの制御下にあるように結合することを包含する。
本発明のＤＮＡ配列を、例えば、下記の文献に記載されているような、標準的クローン化技術を使用して、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＤＳＭ  Ｎｏ．１１２９９株からクローン化することができる：Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、（１９８９）、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．。
本発明は本発明のホスホリパーゼをクローン化する発現クローン化技術において使用するために適当なスクリーニングアッセイを開発するという問題を解決したので（題目「糸状菌ホスホリパーゼのクローン化のプロトコール」の節を参照のこと）、本発明のＤＮＡ配列は、今回、下記の工程を包含する一般的方法によりクローン化することができる：
・  適当なベクターにおいて、問題のホスホリパーゼを産生することが期待される微生物からのｃＤＮＡライブラリーをクローン化し、
・  適当な酵母宿主細胞を前記ベクターで形質転換し、
・  ｃＤＮＡライブラリー中のクローンによりコードされる問題の酵素を発現させるために適当な条件下に、宿主細胞を培養し、
・  このようなクローンにより生産された酵素のホスホリパーゼ活性を測定することによって、陽性のクローンをスクリーニングし、そして
・  このようなクローンから酵素をコードするＤＮＡを単離する。
また、本発明は糸状菌ＰＬＡ酵素をコードするクローン化されたＤＮＡ配列を最初に提供するので、本発明のホスホリパーゼをコードするＤＮＡは、よく知られている手順に従い、適当な源、例えば、「微生物源」の節に記載されている微生物から、本明細書において開示するＤＮＡ配列をベースとして製造された合成オリゴヌクレオチドのプローブを使用して好都合にクローン化することができる。例えば、適当なオリゴヌクレオチドのプローブは配列番号：１に表すヌクレオチドの置換のホスホリパーゼをコードする部分またはそれらの任意の部分列をベースとして、あるいはアミノ酸配列配列番号：２をベースとして製造することができる。
さらに、本発明のクローン化されたＤＮＡ配列は本発明によるホスホリパーゼ活性を有するポリペプチドをコードするので、本発明のホスホリパーゼ活性を有する単離されたポリペプチドは、また、ホスホリパーゼ活性を有するポリペプチドをコードする本発明のクローン化されたＤＮＡ配列についての本発明の態様である。結局、前記ホスホリパーゼ活性を有する単離されたポリペプチドの参照および好ましいおよび最も好ましい態様は、また、本発明のクローン化されたＤＮＡ配列に関する。
したがって、本発明の態様は、前記ＤＮＡ配列によりコードされるホスホリパーゼがホスホリパーゼＡ1である、本発明によるクローン化されたＤＮＡ配列に関する。
他の態様において、本発明によるクローン化された配列は、前記ＤＮＡ配列によりコードされるホスホリパーゼがホスホリパーゼＡ2である、クローン化されたＤＮＡ配列であり、そしてなお他の態様において、本発明によるクローン化された配列は、前記ＤＮＡ配列によりコードされるホスホリパーゼがホスホリパーゼＢである、クローン化されたＤＮＡ配列である。
好ましくは、本発明による前記クローン化されたＤＮＡ配列は、ホスホリパーゼＡ1活性を有するポリペプチドをコードする。
さらに、本発明は、前記ＤＮＡ配列によりコードされるホスホリパーゼがＣａ2+濃度に対して実質的に独立である、本発明によるクローン化されたＤＮＡ配列に関し、前記Ｃａ2+濃度は、
３７℃において１０分間インキュベートし、次いで９５℃において５分間反応を停止する、２％のレシチン、２％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、２０ｍＭのクエン酸塩を含んでなる緩衝液、ｐＨ５、中のレシチンからの遊離脂肪酸の解放を測定するホスホリパーゼ活性のアッセイにおいて５ｍＭのＥＤＴＡおよび５ｍＭのＣａ2+における相対ホスホリパーゼ活性として測定され、ここで５ｍＭのＥＤＴＡ／５ｍＭのＣａ2+における相対ホスホリパーゼ活性の比は０．２５より大きく、より好ましくは０．５より大きい。
なおさらに、本発明は、前記ＤＮＡ配列によりコードされるホスホリパーゼが、下記のようにして単層ホスホリパーゼアッセイにおいて測定して、６０μｇの酵素投与量、２５℃において少なくとも０．２５ｎｍｏｌ／分、より好ましくは６０μｇの酵素投与量、２５℃において少なくとも０．４０ｎｍｏｌ／分であるホスホリパーゼ活性を有する、本発明によるクローン化されたＤＮＡ配列に関する：
ａ．  緩衝溶液（１０ｍＭのＴＲＩＳ、ｐＨ８．０、２５℃）の完全に精製された表面上の単層装置（ゼロ次トラフ）において、リン脂質ＤＤＰＣ〔ジ  デカノイル（Ｄｉｃａｎｏｙｌ）（Ｃ１０）ホスファチジルコリン〕の単層をクロロホルム溶液から広げ、
ｂ．  単層を緩和させた（クロロホルムを蒸発させた）後、ほぼ６３Å2／分子のＤＤＰＣの平均分子面積に対応して、表面圧力を１５ｍＮ／ｍに調節し、
ｃ．  ６０μｇの酵素を含有する緩衝溶液（前述）を単層を通して「ゼロ次トラフ」中の反応区画室（面積１５２０ｍｍ2および体積３０４００ｍｍ3を有するシリンダー）の部分相の中に注入し、
ｄ．  不溶性基質分子がより水溶性の反応生成物に加水分解されるとき、一定の表面圧力を維持するために、単層を圧縮する移動性バリヤーの速度により酵素活性を測定し、ここで酵素により１分当たり加水分解されるＤＤＰＣ−分子の数をＤＤＰＣの平均分子面積（ＭＭＡ）から推定する。
他の態様において、本発明は、前記ＤＮＡ配列によりコードされるホスホリパーゼが、少なくとも７μｍｏｌの遊離脂肪酸／分／ｍｇの酵素、より好ましくは少なくとも１５μｍｏｌの遊離脂肪酸／分／ｍｇの酵素を解放することができるホスホリパーゼ活性を有するホスホリパーゼである、本発明によるクローン化されたＤＮＡ配列に関し、前記ホスホリパーゼ活性は、３７℃において１０分間インキュベートし、次いで９５℃において５分間反応を停止する、２％のレシチン、２％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、２０ｍＭのクエン酸塩を含んでなる緩衝液、ｐＨ５、中のレシチンからの遊離脂肪酸の解放を測定するアッセイにおいて測定される。
他の態様において、本発明は下記のクローン化されたＤＮＡ配列に関する：
前記ＤＮＡ配列によりコードされるホスホリパーゼが、本発明の方法に従い食用油の酵素的脱ガム化を実施して、少なくとも５０ｐｐｍの非水和性リン含量を含む食用油中のリン含有成分の量を減少させることができる、本発明によるクローン化されたＤＮＡ配列；および
前記ＤＮＡ配列によりコードされるホスホリパーゼが、水−脱ガム化された食用油（５０〜２５０ｐｐｍのリン含量を有する）の酵素的脱ガム化を実施し、これにより前記油のリン含量を１１ｐｐｍより低く減少させることができ、ここで酵素的脱ガム化プロセスが前記油をｐＨ１．５〜８においてホスホリパーゼの水溶液と接触させ、これを前記油のリン含量が１１ｐｐｍより低く減少するまで前記油中で乳化させ、次いで水性相を処理された油から分離することからなる、本発明によるクローン化されたＤＮＡ配列。
好ましくは、本発明によるクローン化されたＤＮＡ配列は、前記ＤＮＡ配列によりコードされるホスホリパーゼが、２ｍｇより少ないホスホリパーゼ（乾燥物質）／ｋｇの油を使用することによって水−脱ガム化された食用油の前記酵素的脱ガム化を実施することができ、そして前記ホスホリパーゼを前記油と１５分〜２時間の間接触させる、クローン化されたＤＮＡ配列である。
糸状菌ホスホリパーゼをクローン化するプロトコール
本発明のホスホリパーゼを単離するか、あるいはそれをコードするポリヌクレオチドをクローン化しようと試みるとき、多数の困難に直面した。酵素を単離することは不可能であるように思われ、そしてポリヌクレオチドをクローン化するという問題が追求された。
本明細書において記載するように、糸状菌ホスホリパーゼＡをコードする先行技術のＤＮＡ配列は入手可能ではなかった。結局、本発明は、酵母技術において発現クローン化に基づくクローン化戦略を開発した（Ｈ．Ｄａｌｂｏｅｇｅ他、「Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．」（１９９４）２４３：２５３−２６０；ＷＯ９３／１１２４９号；およびＷＯ９４／１４９５３号）。
この技術に直面した主要な問題は、酵母がプレートアッセイに対してホスホリパーゼのバックグラウンドを生ずる内部活性を産生することであった。このバックグラウンドはアッセイプレート中の基質の量に対して高度に依存性であることが見出され、したがって、バックグラウンドが発現クローン化スクリーニング手法の間においてアッセイが信頼性であるために十分に低いけれども、反応が起こるのに十分に高いレベルに、基質の量を注意して滴定しなくてはならなかった。
さらに、糸状菌株は一般に多数の異なるリパーゼを含み、それらのいくつかは制限されたホスホリパーゼ活性を示す。このようなリパーゼは本明細書において「ホスホリパーゼ副活性を有するリパーゼ」として定義される（本明細書における「定義」の節を参照のこと）。
プレートアッセイにおいて、このようなホスホリパーゼ副活性を有するリパーゼのバックグラウンドは、また、アッセイプレートにおける基質の量に対して高度に依存性であることが見出され、したがって、酵母細胞および糸状菌の双方のホスホリパーゼ副活性を有するリパーゼからバックグラウンドの活性を排除するように、基質の量をいっそう注意して滴定しなくてはならなかった。
最初に、基質を注意して選択しなくてはならないことが見出された。なぜなら、ホスホリパーゼ活性をもたないリパーゼは、基質に対して反応することができたので、試験した多数のホスホリパーゼ基質はバックグラウンドの活性を与えたからである。したがって、極めて多い数の基質を試験し、滴定して、適当な基質を同定しなくてはならなかった。
ホスホリパーゼをコードするポリヌクレオチドの発言クローン化の実施を可能とすることが見出されたた解決法は、注意してモニターした濃度でリポイド（Ｌｉｐｏｉｄ）Ｅ８０（Ｌｉｐｏｉｄ  ＧｍｂＨから）を使用することであった。本明細書における材料および方法の節において、前述の問題を解決するプレートアッセイを含む、酵母のプロトコールにおける完全な発現クローン化の詳細な説明が開示されている。ＤＮＡ配列の相同性／同一性
前述のＤＮＡ配列の相同性／同一性は、第１配列から第２配列への偏りを示す２つの配列の間の同一性の程度として決定される。相同性は、この分野において知られているコンピュータープログラム、例えば、ＧＣＧプログラムパッケージで提供されるＧＡＰにより適当に決定することができる（Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｍａｎｕａｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８、Ａｕｇｓｔ  １９９４、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ  ５３７１１）（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ、Ｓ．Ｂ．およびＷｕｎｃｓｈ、Ｃ．Ｄ．、（１９７９）、「Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、４８、４４３−４５３）。ＤＮＡ配列の比較のための下記の設定を有するＧＡＰを使用する：５．０のＧＡＰクリエーション・ペナルティーおよび０．３のＧＡＰ発現ペナルティー、ＤＮＡ配列コーディング領域は、配列番号：１に示すＤＮＡ配列のホスホリパーゼをコードする部分（すなわち、配列番号：１中の位置２３−１０６３）と；より好ましくは配列番号：１中の位置１１３−１０６３に示すＤＮＡ配列（成熟酵素のＮ−末端の残基に対応する位置１１３）と；なおより好ましくは配列番号：１中の位置２３−９２９に示すＤＮＡ配列（Ｃ−末端のプロセシング、分泌された活性酵素中のＣ−末端の残基に対応する位置９２９）と、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７％の同一性の程度を示す。
ハイブリダイズ
前述のハイブリダイズは類似のＤＮＡ配列を含むことを意図し、前記類似のＤＮＡ配列は、配列番号：１に示すＤＮＡ配列のホスホリパーゼをコードする部分、すなわち、ヌクレオチド２３−１０６３に対応する二本鎖ＤＮＡプローブと、より好ましくは配列番号：１中の位置１１３−１０６３に示すＤＮＡ配列（成熟酵素のＮ−末端の残基に対応する位置１１３）に対応する二本鎖ＤＮＡプローブと、なおより好ましくは配列番号：１中の位置２３−９２９に示すＤＮＡ配列（Ｃ−末端のプロセシング、分泌された活性酵素中のＣ−末端の残基に対応する位置９２９）に対応する二本鎖ＤＮＡプローブと、下記において詳細に説明するように、少なくとも低いストリンジェンシイの条件下に、ハイブリダイズする。
ヌクレオチドのプローブと、相同性ＤＮＡまたはＲＮＡとの間の、低い、中程度、または高いストリンジェンシイにおけるハイブリダイズを決定するために適当な実験的条件は、ＤＮＡフラグメントまたはＲＮＡを含有するフィルターを前ソーキングして５×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、１９８９）中で１０分間ハイブリダイズし、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液（Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、１９８９）、０．５％のＳＤＳおよび１００μｇ／ｍｌの変性超音波処理したサケ精子ＤＮＡ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、１９８９）の溶液中でフィルターをプレハイブリダイズし、次いで１０ｎｇ／ｍｌのランダム−プライムド（Ｆｅｉｎｂｅｒｇ、Ａ．Ｐ．およびＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎ、Ｂ．（１９８３）「Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．」１３２：６−１３）、32Ｐ−ｄＣＴＰ−標識化（比活性＞１×１０9ｃｐｍ／μｇ）プローブを含有する同一溶液中で約４５℃において１２時間ハイブリダイズすることを包含する。次いで、フィルターを２×ＳＳＣ、０．５％のＳＤＳ中で３０分間、少なくとも５５℃（低いストリンジェンシイ）、より好ましくは少なくとも６０℃（中程度のストリンジェンシイ）、なおより好ましくは少なくとも６５℃（中程度／高いストリンジェンシイ）、なおより好ましくは少なくとも７０℃（高いストリンジェンシイ）、なおより好ましくは少なくとも７５℃（非常に高いストリンジェンシイ）の温度において２回洗浄する。
これらの条件下にオリゴヌクレオチドのプローブがハイブリダイズする分子は、Ｘ線フィルムを使用して検出される。
２つの所定のＤＮＡ配列がある種の特定した条件下にハイブリダイズするか否かを理論的に予測できることが見出された。
したがって、前述の実験的方法に対する別法として、類似のＤＮＡ配列が前述のヌクレオチドのプローブにハイブリダイズするか否かの決定は、既知の配列を有する２つの異種ＤＮＡ配列が特定した条件下に（例えば、カチオン濃度および温度に関して）ハイブリダイズするＴｍ（溶融温度）の理論的計算に基づくことができる。
異種ＤＮＡ配列のための溶融温度（Ｔｍ（ヘテロ））を決定するために、相同ＤＮＡ配列のための溶融温度（Ｔｍ（ホモ））を最初に決定することが必要である。
２つの完全に相補的なＤＮＡ鎖（ホモ二本鎖の形成）の間の溶融温度（Ｔｍ（ホモ））を、下記の式を使用して決定することができる：
Ｔｍ（ホモ）＝８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇＭ）＋０．４１（ＧＣ％）−０．６１（ｆｏｒｍ％）−５００／Ｌ（「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、１９９５）、ここで、
「Ｍ」は、洗浄緩衝液中のカチオンのモル濃度である。
「ＧＣ％」は、ＤＮＡ配列中の塩基の合計数のグアニン（Ｇ）およびシトシン（Ｃ）の％である。
「ｆｏｒｍ％」は、洗浄緩衝液中のホルムアミドの％である。
「Ｌ」は、ＤＮＡ配列の長さである。
この式および前述の実験の洗浄条件を使用して、配列番号：１に示すＤＮＡ配列、すなわち、ヌクレオチド２３−１０６０に対応するヌクレオチドのプローブのホモ二本鎖の形成のためのＴｍ（ホモ）は、下記の通りである：
Ｔｍ（ホモ）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ０．３０）＋０．４１（５６）−０．６１（０）−（５００／１０３８）
Ｔｍ（ホモ）＝１０３．５℃。
「Ｍ」：２×ＳＳＣは０．３Ｍのカチオン濃度に相当する。
「ＧＣ％」：配列番号：１の位置２３−１０６０中のＧＣ％は５６％である。
「ｆｏｒｍ％」：洗浄緩衝液の中にホルムアミドは存在しない。
「Ｌ」：配列番号：１の長さ配列番号：１位置２３−１０６３  １０３８ｂｐ。
上記の式により決定されたＴｍは、２つの完全に相補的なＤＮＡ配列の間のホモ二本鎖の形成のＴｍ（Ｔｍ（ホモ））である。Ｔｍ値を２つの異種ＤＮＡ配列のＴｍに適合させるために、２つの異種配列の間のヌクレオチド配列の１％の差はＴｍの１℃の減少に等しいと仮定する（「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、１９９５）。したがって、異種二本鎖の形成についてのＴｍ（ヘテロ）は、問題の類似の配列と前述のヌクレオチドのプローブとの間の相同性％の差をＴｍ（ホモ）から減ずることによって見出される。減ずべきＤＮＡの相同性の百分率は、本明細書において記載するように計算される（下文参照）。
アミノ酸配列に対する相同性
前述のポリペプチドの相同性は、第１配列の第２配列からの偏りを示す、２つの配列の同一性の程度として決定される。相同性は、この分野において知られているコンピュータープログラム、例えば、ＧＣＧプログラムパッケージで提供されるＧＡＰにより適当に決定することができる（Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｍａｎｕａｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８、Ａｕｇｓｔ  １９９４、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ  ５３７１１）（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ、Ｓ．Ｂ．およびＷｕｎｃｓｈ、Ｃ．Ｄ．、（１９７０）、「Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、４８、４４３−４５３）。ポリペプチド配列の比較のための下記の設定を有するＧＡＰを使用する：３．０のＧＡＰクリエーション・ペナルティーおよび０．１のＧＡＰ発現ペナルティー、類似のＤＮＡ配列によりコードされるポリペプチドの成熟部分は、配列番号：２に示すアミノ酸配列の成熟部分、すなわち、配列番号：２中の位置３１−３４６と、より好ましくは配列番号：２の位置３１−３０３に示すアミノ酸配列（位置３０３はＣ−末端のプロセシング、分泌された活性酵素中のＣ−末端の残基である）と、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、特に少なくとも９７％の同一性の程度を示す。
本発明は、また、配列番号：２に記載するアミノ酸配列の成熟部分と３以下のアミノ酸、好ましくは２以下のアミノ酸、より好ましくは１以下のアミノ酸だけ異なるアミノ酸配列を有するホスホリパーゼの変異型に関する。
さらに、前述の好ましいアミノ酸の同一性は、また、ホスホリパーゼ活性を示し、かつ配列番号：２の位置３１−３４６に示すポリペプチド配列と少なくとも７０％の相同性、より好ましくは配列番号：２の位置３１−３０３を構成するポリペプチド配列と少なくとも７０％の相同性を有するポリペプチドをコードする、本発明のクローン化されたＤＮＡ配列の類似体に関連する。
免疫学的交差反応性
免疫学的交差反応性を決定するとき使用すべき抗体は、精製されたホスホリパーゼを使用して製造することができる。さらに詳しくは、下記の文献に記載されている手順に従い、ウサギ（または他の齧歯類）を免疫化することによって、本発明のホスホリパーゼに対して抗血清を発生させることができる：Ｎ．Ａｘｅｌｓｅｎ他、「Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｉｍｍｎｕｎｏｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ」、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、１９７３、Ｃｈａｐｔｅｒ  ２３、またはＡ．ＪｏｈｎｓｔｏｎｅおよびＲ．Ｔｈｏｒｐｅ、「Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｉｎ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ」、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、１９８２（さらに詳しくは、ｐ．２７−３１）。得られた抗血清から、例えば、塩沈降（（ＮＨ4）2ＳＯ4）、引き続く透析およびイオン交換クロマトグラフィー、例えば、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘのイオン交換クロマトグラフィーにより、精製された免疫グロブリンを単離することができる。タンパク質の免疫化学的特性決定は、アウトシェルロニイ（Ｏｕｔｃｈｅｒｌｏｎｙ）二重拡散分析（Ｏ．Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ、「Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ、編）、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、１９６７、ｐｐ．６５５−７０６）、交差免疫電気泳動（Ｎ．Ａｘｅｌｓｅｎ他、前記、Ｃｈａｐｔｅｒ  ３および４）、またはロケット免疫電気泳動（Ｎ．Ａｘｅｌｓｅｎ他、Ｃｈａｐｔｅｒ  ２）により、実施することができる。
微生物源
本発明の優先権主張日において、下記において適用した分類学は、ワールド・ワイド・ウェブ（ＷＷＷ）ＮＣＢＩ分類学ブラウサー（ｂｒｏｗｓｅｒ）に従う。
本発明のホスホリパーゼ活性を有する単離されたポリペプチドおよび対応するクローン化されたＤＮＡ配列は、任意の微生物、好ましくは糸状菌、酵母細胞、または細胞から得ることができる。
好ましくは、本発明のホスホリパーゼおよび対応するクローン化されたＤＮＡ配列は糸状菌株から得ることができ、ここで好ましい門は子嚢菌門（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）であり、ここで好ましい網は好ましいアカツグダケ科（Ｎｅｃｔｒｉａｃｅａｅ）を含む核菌網（Ｐｙｒｅｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）である。
より好ましくは、本発明のホスホリパーゼおよび対応するクローン化されたＤＮＡ配列は、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属の株、例えば、フザリウム・クルモラム（Ｆ．ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、フザリウム・ヘテロスポラム（Ｆ．ｈｅｔｅｒｏｓｐｏｒｕｍ）、またはフザリウム・ソラニ（Ｆ．Ｓｏｌａｎｉ）の株、特にフザリウム・オキシスポラム（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）の株から得ることができる。
さらに、本発明のホスホリパーゼおよび対応するクローン化されたＤＮＡ配列は、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属の範囲内の株、例えば、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・フェチダス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｏｅｔｉｄｕｓ）、アスペルギルス・ジャポニカス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、特にアスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）の株から得ることができる。
本発明のホスホリパーゼを得ることができるフザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）の株の単離物は、特許手続きの目的のための微生物の寄託の国際的承認についてのブダベスト条約の規定に従いドイツ国の微生物株保存機関（Ｄｅｕｔｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ．、Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ  Ｗｅｇ  １ｂ、Ｄ−３８１２４  Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、ドイツ国（ＤＳＭ））に寄託された。
寄託日          ：１９８３年６月６日
寄託番号        ：ＮＮ０１４７５９
ＤＳＭ  Ｎｏ．  ：フザリウム・オキシスポラム（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）
ＤＳＭ  Ｎｏ．２６７２
さらに、本発明のホスホリパーゼをコードする全長のｃＤＮＡ配列からなる発現プラスミドｐＹＥＳ２．０は大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）の株の中に形質転換され、特許手続きの目的のための微生物の寄託の国際的承認についてのブダベスト条約の規定に従いドイツ国の微生物株保存機関（Ｄｅｕｔｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ、Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ  Ｗｅｇ  １ｂ、Ｄ−３８１２４  Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、ドイツ国（ＤＳＭ））に寄託された。
寄託日          ：１９９６年１１月２５日
寄託番号        ：ＮＮ０４９２７９
ＤＳＭ  Ｎｏ．  ：大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）
ＤＳＭ  Ｎｏ．１１２９９
発現ベクター
本発明の発現ベクターは組換えＤＮＡ手順に好都合に付される任意の発現ベクターであることができ、ベクターの選択はベクターを導入すべき宿主細胞にしばしば依存する。したがって、ベクターは自律的に複製するベクター、すなわち、染色体外の実在物として存在するベクターであることができ、その複製は染色体の複製、例えば、プラスミドに対して独立である。また、ベクターは、宿主細胞の中に導入されたとき、宿主細胞の遺伝子操作の中に組込まれ、それが組込まれた染色体と一緒に複製されるものであることができる。
発現ベクターにおいて、ホスホリパーゼをコードするＤＮＡ配列は適当なプロモーターおよびターミネーターの配列に作用可能に接続されているべきである。プロモーターは選択した宿主細胞においてホスホリパーゼ活性を示す任意のＤＮＡ配列であることができ、そして宿主細胞に対して相同または異種であるタンパク質をコードする遺伝子から誘導することができる。ホスホリパーゼをコードするＤＮＡ配列、プロモーターおよびターミネーターを結合し、そしてそれらを適当なベクターの中に挿入する手順は当業者によく知られている（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、（１９８９）、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、を参照のこと）。
糸状菌の宿主細胞において使用するために適当なプロモーターの例は、例えば、ＡＤＨ３プロモーター（ＭｃＫｎｉｇｈｔ他、「Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊ．」、４（１９８５）、２０９３−２０９９）またはｔｐｉＡプロモーターである。他の有用なプロモーターの例は、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼ、リゾムコル・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）アスパラギン酸プロテイナーゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）中性α−アミラーゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）酸安定性α−アミラーゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）またはアスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ）グルコアミラーゼ（ｇｌｕＡ）、リゾムコル・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）リパーゼ、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）アルカリ性ホスファターゼ、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）トリオースホスフェートイソメラーゼまたはアスペルギルス・ニヅランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）アセトアミダーゼをコードする遺伝子に由来する。
宿主細胞
本発明は、また、本発明の核酸配列を含む組換え宿主細胞に関し、前記細胞はホスホリパーゼの組換え生産において好都合に使用ことができる。用語「宿主細胞」は、複製の間に起こる突然変異のために親細胞と同一ではない親細胞の子孫を包含する。
細胞は好ましくは本発明の核酸配列を含んでなるベクターで形質転換され、次いでベクターは宿主染色体の中に挿入される。
「形質転換」は、ベクターが染色体の組込み体として、または自己複製する染色外ベクターとして維持されるように、本発明の核酸配列を含んでなるベクターを宿主細胞の中に導入することを意味する。核酸配列は細胞において安定に維持された可能性が高いので、組込みは一般に有利であると考えられる。宿主染色体の中へのベクターの組込みは、前述したように相同的または非相同的組換えにより起こることがある。
好ましい態様において、宿主細胞は真菌細胞である。「真菌」は、本明細書において使用するとき、子嚢菌門（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）、担子菌門（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）、ツボカビ門（Ｃｈｙｔｒｉｄｏｍｙｃｏｔａ）、および接合菌門（Ｚｙｇｏｍｙｃｏｔａ）（Ｈａｗｋｓｗｏｒｔｈ他、「Ｉｎ、Ａｉｎｓｗｏｒｔｈ  ａｎｄ  Ｂｉｓｂｙ’ｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｆｕｎｇｉ」、第８版、１９９５、ＣＡＢ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、英国ケンブリッジ、において定義されている）ならびに卵菌門（Ｏｏｍｙｃｏｔａ）（Ｈａｗｋｓｗｏｒｔｈ他、１９９５、上記、ｐ．１７１、に記載されている）およびすべての有糸分裂性真菌（Ｈａｗｋｓｗｏｒｔｈ他、１９９５、上記）を包含する。子嚢菌門（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）の代表的なグループは、例えば、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、エウペニシリウム（Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）（＝Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、エメリセラ（Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ）（＝Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、ユーロチウム（Ｅｕｒｏｔｉｕｍ）（＝Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、および前述の真の酵母を包含する。担子菌門（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）の例は、キノコ菌、銹病菌、およびクロボ病菌を包含する。ツボカビ門（Ｃｈｔｒｉｄｏｍｙｃｏｔａ）の代表的なグループは、例えば、アロミセス（Ａｌｌｏｍｙｃｅｓ）、ブラクトクラヂエラ（Ｂｌａｓｔｏｃｌａｄｉｅｌｌａ）、セロモミセス（Ｃｏｅｌｏｍｏｍｙｃｅｓ）、および水生菌類を包含する。卵菌門（Ｏｏｍｙｃｏｔａ）の代表的なグループは、例えば、サプロレグニオミセタス（ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉｏｍｙｃｅｔｏｕｓ）水生菌類（水かび）、例えば、アキリア（Ａｃｈｌｙａ）を包含する。栄養胞子性真菌の例は、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、およびアルテルナリア（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ）を包含する。接合菌門（Ｚｙｇｏｍｙｃｏｔａ）の代表的なグループは、例えば、リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）およびムコル（Ｍｕｃｏｒ）を包含する。
好ましい態様において、真菌の宿主細胞は糸状菌の細胞である。「糸状菌」は、再分割真菌門（Ｅｕｍｙｃｏｔａ）および卵菌門（Ｏｏｍｙｃｏｔａ）のすべての糸状形態を包含する（Ｈａｗｋｓｗｏｒｔｈ他、１９９５、上記、により定義されている）。糸状菌は、キチン、セルロース、グルカン、キトサン、マンナン、および他の複雑な多糖類から構成された栄養菌糸により特徴づけられる。栄養増殖は菌糸の伸長により、そして炭素の異化は偏性好気性である。対照的に、酵母、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）による栄養増殖は単細胞の葉状体の発芽により、そして炭素の異化は発酵性である。より好ましい態様において、糸状菌の宿主細胞は下記の種の細胞であるが、これらに限定されない：アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、フミコラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、ムコル（Ｍｕｃｏｒ）、ミセリオフトラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、チエラビア（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、トリポクラジウム（Ｔｏｌｙｐｏｃａｄｉｕｍ）、およびトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）またはそれらのテレオモルフまたはシノニム。なおいっそう好ましい態様において、糸状菌の宿主細胞はアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）の細胞である。他のなおいっそう好ましい態様において、糸状菌の宿主細胞はアクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）の細胞である。他のなおいっそう好ましい態様において、糸状菌の宿主細胞はフザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）の細胞である。他のなおいっそう好ましい態様において、糸状菌の宿主細胞はフミコラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）の細胞である。他のなおいっそう好ましい態様において、糸状菌の宿主細胞はムコル（Ｍｕｃｏｒ）の細胞である。他のなおいっそう好ましい態様において、糸状菌の宿主細胞はミセリオフトラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）の細胞である。他のなおいっそう好ましい態様において、糸状菌の宿主細胞はニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）の細胞である。他のなおいっそう好ましい態様において、糸状菌の宿主細胞はペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）の細胞である。他のなおいっそう好ましい態様において、糸状菌の宿主細胞はチエラビア（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）の細胞である。他のなおいっそう好ましい態様において、糸状菌の宿主細胞はトリポクラジウム（Ｔｏｌｙｐｏｃａｄｉｕｍ）の細胞である。他のなおいっそう好ましい態様において、糸状菌の宿主細胞はトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）の細胞である。最も好ましい態様において、糸状菌の宿主細胞は、アルペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・フェチダス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｏｅｔｉｄｕｓ）、アスペルギルス・ジャポニカス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）またはアスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）の細胞である。他の最も好ましい態様において、糸状菌の宿主細胞はディスカラー（Ｄｉｓｃｏｌｏｒ）のセクションのフザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）細胞である（フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）のセクションとしても知られている）。他の好ましい態様において、糸状菌の宿主細胞はエレガンス（Ｅｌｅｇａｎｓ）のセクションのフザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）株、例えば、フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）である。他の最も好ましい態様において、糸状菌の宿主細胞はフミコラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ）またはサーモミセス・ラヌギノスス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）の細胞である。他の最も好ましい態様において、糸状菌の宿主細胞はリゾムコル・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）の細胞である。他の最も好ましい態様において、糸状菌の宿主細胞はミセリオフトラ・サーミフィルム（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ）の細胞である。他の最も好ましい態様において、糸状菌の宿主細胞はニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）の細胞である。他の最も好ましい態様において、糸状菌の宿主細胞はニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）の細胞である。他の最も好ましい態様において、糸状菌の宿主細胞はペニシリウム・プルプロゲヌム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｐｕｒｐｕｒｏｇｅｎｕｍ）の細胞である。他の最も好ましい態様において、糸状菌の宿主細胞はチエラビア・テレストリス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）の細胞である。他の最も好ましい態様において、トリコデルマの細胞はトリコデルマ・ハルジアナム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコデルマ・コニンギイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｋｏｎｉｎｇｉｉ）、トリコデルマ・ロンギブラキアツム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）、トリコデルマ・リーシエ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｉｅ）またはトリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ）の細胞である。
真菌の細胞は、それ自体知られている方法におけるプロトプラストの形成、プロトプラストの形質転換、および細胞壁の再生を包含するプロセスにより形質転換することができる。アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）宿主細胞の形質転換に適当な手順は、ＥＰ２３８，０２３号およびＹｅｌｔｏｎ他、１９８４、「Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ」８１：１４７０−１４７４に記載されている。フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）種を形質転換する適当な方法は、Ｍａｌａｒｄｉｅｒ他、１９８９、「Ｇｅｎｅ」７８：１４７−１５６または同時継続米国出願第０８／２６９，４４９号に記載されている。酵母は下記の文献に記載されている手順を使用して形質転換することができる：ＢｅｃｋｅｒおよびＧｕａｒｅｎｔｅ、Ｉｎ  Ａｂｅｌｓｏｎ、Ｊ．Ｎ．およびＳｉｍｏｎ、Ｍ．Ｉ．、編、「Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」、Ｖｏｌ．１９４、ｐｐ．１８２−１８７、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｉｔｏ他、１９８３、「Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ」１５３：１６３；およびＨｉｎｎｅｎ他、１９７８、「Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ」７５：１９２０。哺乳動物細胞は、ＧｒａｈａｍおよびＶａｎ  ｄｅｒ  Ｅｄ（１９７８、「Ｖｉｒｏｌｏｇｙ」５２：５４６）のリン酸カルシウム沈澱法による直接的吸収により形質転換することができる。
ホスホリパーゼを生産する方法
本発明は、酵素の産生を可能とする条件下に、酵素をコードするＤＮＡ配列で形質転換された適当な宿主細胞を培養し、そして生ずる酵素を培養物から回収する、本発明による単離された酵素を製造する方法を提供する。
酵素をコードするＤＮＡ配列を含んでなる発現ベクターを異種宿主細胞の中に形質転換するとき、本発明の酵素の異種組換え製造を可能とすることができる。
これにより、相同的不純物を含有しないことを特徴とする、高度に精製されたホスホリパーゼ組成物を得ることができる。
本発明において、相同宿主細胞はフザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）の株であることができる。
形質転換された宿主細胞を培養するために使用する培地は、問題の宿主細胞の成長に適当な任意の慣用の培地であることができる。発現されたホスホリパーゼは好都合に培地の中に分泌され、そしてよく知られた手順により培地から回収することができ、例えば、遠心または濾過により培地から細胞を分離し、硫酸アンモニウムのような塩により培地からタンパク質成分を沈降させ、次いでクロマトグラフィー手順、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、またはその他により培地から回収することができる。
ホスホリパーゼの使用
高い量の非水和性リンを含む食用油を酵素的脱ガム化する本発明の新規な方法におけるホスホリパーゼの使用の外に、ホスホリパーゼの多数の他の使用がこの分野において知られている。
ホスホリパーゼのこのようなこの分野において知られている使用／用途を後述する。
本発明のホスホリパーゼは、リン脂質またはリゾリン脂質、例えば、レシチンまたはリゾレシチンの脂肪族アシル基を加水分解しようとする、任意の用途において使用することができる。好ましくは、ホスホリパーゼはｐＨ３〜１０および３０〜７０℃（特に４０〜６０℃）において使用される。必要に応じて、ホスホリパーゼを、反応後、それを、例えば、ｐＨ７、８０℃において１時間、あるいは９０℃において１０分間熱処理することによって不活性化することができる。
１例として、本発明のホスホリパーゼを、たとえば、パンまたはケーキの弾性を改良するために、練り粉、パンおよびケーキの製造に用いることができる。
このように、本発明のホスホリパーゼを練り粉（ｄｏｕｇｈ）の成分に添加し、練り粉を混練し、焼いてパンを製造する方法において、本発明のホスホリパーゼを使用することができる。これは米国特許第４，５６７，０４６号（協和発酵）、特開昭６０−７８５２９号（キューピー  Ｃｏｒｐ．）、特開昭６２−１１１６２９号（キューピー  Ｃｏｒｐ．）、特開昭６３−２５８５２８号（キューピー  Ｃｏｒｐ．）またはＥＰ４２６２１１号（Ｕｎｉｌｅｖｅｒ）と同様に実施することができる。
本発明のホスホリパーゼは、リン脂質を含有する炭水化物由来の水性溶液またはスラリーをホスホリパーゼで処理することによって、その濾過性を改良するためにも使用することができる。これは、特に、澱粉の加水分解物、特にコムギ澱粉の加水分解物を含有する溶液またはスラリーに適用可能である。なぜなら、これは濾過が困難でありかつ曇った濾過液を与える傾向があるからである。この処理はＥＰ２１９，２６９号（ＣＰＣ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）と同様に実施することができる。
さらに、本発明のホスホリパーゼは、改良されたリン脂質の乳化剤を得るために、リン脂質、好ましくはレシチンを部分的加水分解するために使用することができる。この用途は、さらに、それに関するＬｅｃｉｔａｓｅ（商標）（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ  Ａ／Ｓ）の製品のカタログ、およびウルマンのＵｌｌｍａｎｎ’ｓ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（発行所：ＶＣＨ  Ｗｅｉｎｈｅｉｍ（１９９６））に記載されている。
さらに、本発明のホスホリパーゼは、ホスホリパーゼを飼料物質および少なくとも１つのリン脂質と混合することからなる、動物飼料を製造する方法において使用することができる。これはＥＰ７４３，０１７号と同様に実施することができる。
この分野において知られている手順に従う植物油／食用油の脱ガム化
この分野において知られている手順に従い、食用油をホスホリパーゼで処理してリン脂質の主要部分を加水分解し、そして加水分解されたリン脂質を含有する水性相を前記油から分離することからなる、食用油中のリン脂質の含量を減少する方法において、本発明のホスホリパーゼを使用することができる。このプロセスは、リン脂質を含有する任意の食用油、例えば、植物油、例えば、大豆油、ナタネ油、およびヒマワリ油の精製に適用可能である。
酵素処理の前に、植物油を前処理して、例えば、湿式精製により、粘液（物質粘）を除去することが好ましい。典型的には、油はホスホリパーゼを使用する処理の開始において、リン脂質として５５〜２５０ｐｐｍのリンを含有するであろう、そして本発明の方法はこの値を１１ｐｐｍ以下、より好ましくは５ｐｐｍ以下に減少させることができる。
酵素処理は、ホスホリパーゼの水溶液を、好ましくは１０μ（マイクロ）ｍ以下の平均直径の液体粒子として、分散させることによって実施される。水の量は油に関して好ましくは０．５〜５重量％である。必要に応じて、乳化剤を添加することができる。機械的撹拌を加えてエマルジョンを維持することができる。
酵素処理は、１．５〜８の範囲の任意のｐＨにおいて実施することができる。ｐＨはクエン酸、クエン酸塩の緩衝剤またはＨＣｌの添加により調節可能である。
適当な温度は、一般に３０〜７０℃（特に４０〜６０℃）である。反応時間は典型的には０．５〜１２時間（例えば、２〜６時間）であり、そして酵素の適当な投与量は通常１００〜５０００ＩＵ／ｌの油、特に２００〜２０００ＩＵ／ｌであろう。
酵素処理は、バッチ式に、例えば、撹拌しながらタンク中で実施することができるか、あるいはそれは連続的に、例えば、１連の撹拌されたタンクの反応器中で実施することができる。
酵素処理後、水性相と油相との分離を行う。この分離は慣用手段、例えば、遠心により実施することができる。
他の面において、このプロセスはこの分野において知られている原理に従い、例えば、下記の文献に記載されているように実施することができる：米国特許第５，２６４，３６７号（Ｍｅｔａｌｌｇｅｓｅｌｓｃｈａｆｔ、Ｒ  ｈｍ）；Ｋ．Ｄａｈｌｋｅ  ＆  Ｈ．Ｂｕｃｈｏｌｄ、「ＩＮＦＯＲＭ」、６（１２）、１２８４−９１（１９９５）；Ｈ．Ｂｕｃｈｏｌｄ、「Ｆａｔ  Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．」、９５（８）、３００−３０４（１９９３）；特開平２−１５３９９７号（昭和産業）；またはＥＰ６５４，５２７号
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ベーキングにおける本発明のホスホリパーゼの使用
本発明のホスホリパーゼは、また、パンまたは他の焼かれた製品の性質を改良するためにパンまたは他の焼かれた製品の製造プロセスの間に粉または練り粉に通常添加される、パン改良添加剤、例えば、練り粉組成物、練り粉添加剤、練り粉コンディショナー、プレミックス、および同様な調製物において使用することができる。
したがって、本発明の態様は、パン改良および／または練り粉改良組成物に関し、さらに、このような組成物における本発明のホスホリパーゼの使用、および本発明のパン改良および／または練り粉改良組成物を含んでなる練り粉または焼かれた製品に関する。
本発明の関係において、用語「パン改良組成物」および「練り粉改良組成物」は、酵素成分に加えて、練り粉および／または焼かれた製品の性質を改良するために通常使用される他の物質を含むことができる、組成物を示すことを意図する。このような成分の例を下に示す。
本発明の関係において、用語「改良された性質」は、本発明のホスホリパーゼ酵素の作用により改良することができる性質を示すことを意図する。特に、ホスホリパーゼを使用すると、焼かれた製品の体積が増加しかつパンの中身の構造が改良され、品質変化の防止性が得られ、ならびに練り粉の強度、サザンブロットが増加しかつ粘着性が減少し、これにより機械加工性が改良される。練り粉に対する効果は、低い品質の粉を使用したとき、特にすぐれることが見出された。この機械加工性の改良は、工業的にプロセシングすべき練り粉と関連して、特に重要である。
性質の改良は、本発明によるホスホリパーゼを添加しないで製造された練り粉および／または焼かれた製品との比較により評価される。
本発明のパン改良および／または練り粉改良組成物は、他の酵素をさらに含むことができる。他の酵素の例は下記の通りである：セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、ペントサナーゼ（練り粉の伸長性を増加するペントサンの部分的加水分解に有効である）、グルコースオキシダーゼ（練り粉の強化に有効である）、リパーゼ（練り粉を軟化するために練り粉または練り粉成分の中に存在する脂質の変性に有効である）、ペルオキシダーゼ（練り粉のコンシステンシーの改良に有効である）、プロテアーゼ（特に固いコムギ粉を使用するとき、グルテンの弱化に有効である）、ペプチダーゼおよび／またはアミラーゼ、例えば、α−アミラーゼ（酵母により発酵可能な糖類を提供するために有効である）。
他の酵素成分に加えて、またはそれらの代替物として、練り粉改良および／またはパン改良組成物は通常に使用されているベーキング剤、例えば、下記の成分１または２以上を含むことができる：
ミルク粉末（表面の色を提供する）、グルテン（弱い粉のガス保持力を改良するため）、乳化剤（練り粉の伸長性を改良しかつ生ずるパンのコンシステンシーをある程度改良するため）、粒状化された脂肪（練り粉の軟化およびコンシステンシーのため）、酸化体（グルテン構造を強化するために添加される；例えば、アスコルビン酸、臭素酸カリウム、ヨウ素酸カリウムまたは過硫酸アンモニウム）、アミノ酸（例えば、システイン）、糖、および塩（練り粉を固くするために、例えば、塩化ナトリウム、酢酸カルシウム、硫酸ナトリウムまたは硫酸カルシウム）、粉または澱粉）。
適当な乳化剤の例は、モノグリセリドまたはジグリセリド、モノグリセリドまたはジグリセリドのジアセチル酒石酸エステル、脂肪酸の糖エステル、脂肪酸のポリグリセロールエステル、モノグリセリドの乳酸エステル、モノグリセリドの酢酸エステル、ポリオキシエチレンステアレート、リン脂質およびレシチンである。
本発明の関係において、用語「焼かれた製品」は、柔らかいか、あるいはさくさくした特性の、練り粉から製造された任意の製品を包含することを意図する。白色、淡いまたは暗色であり、好都合には本発明により製造することができる、焼かれた製品の例は、典型的には一塊またはロールの形態の、パン（特に白色、完全小麦粉またはライムギのパン）、フレンチバゲット型のパン、ピタパン、タコス、ケーキ、パンケーキ、ビスケット、かりかりするパンおよびその他である。
本発明の練り粉は前述の型の任意のものであり、かつ新鮮であるか、あるいは凍結されていることができる。
上記の開示から明らかなように、本発明の練り粉は通常発酵を起こさせた練り粉または発酵すべき練り粉である。練り粉は種々の方法で、例えば、重炭酸ナトリウムまたはその他を添加するか、あるいはパン種（発酵している練り粉）を添加することによって発酵させることができるが、適当な酵母培養物、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（パン酵母）の培養物の添加により練り粉を発酵させることができる。商業的に入手可能なサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の任意のものを使用することができる。
最終の態様において、本発明は、好ましくはマカロニコムギ粉または匹敵する品質の粉から製造された、パスタ練り粉を製造するための本発明のホスホリパーゼの使用に関する。慣用技術および前述したものに類似する投与量でホスホリパーゼを使用することによって、練り粉を製造することができる。ホスホリパーゼは好ましくは微生物由来、例えば、本明細書において開示した由来のものである。パスタの製造において使用するとき、ホスホリパーゼはグルテン構造を強化し、こうして、練り粉の粘着性を減少しかつ練り粉の強度を増加させると考えられる。
本発明の酵素のリパーゼ活性の使用
本明細書における実施例において示すように、本発明のホスホリパーゼはリパーゼ活性をさらに示す。
したがって、本発明は、リパーゼの標準的使用において、特にクリーニングおよび洗剤組成物において使用するための、このリパーゼ活性の使用に関する。このようなクリーニングおよび洗剤組成物はこの分野においてよく記載されており、そして適当なクリーニングおよび洗剤組成物のそれ以上の説明については、ＷＯ９６／３４９４６号、ＷＯ９７／０７２０２号およびＷＯ９５／３００１１号を参照のこと。
下記の実施例により、本発明をさらに詳細に説明する。これらの実施例はいかなる方法おいても本発明の範囲を限定することを意図しない。
材料および方法
寄託された微生物：
フザリウム・オキシスポラム（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）ＤＳＭ
Ｎｏ．２６７２は、本発明のホスホリパーゼをコードするＤＮＡ配列を含んでなる。
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＤＳＭ１１２９９は、シャトルベクターｐＹＥＳ２．０中の、本発明のホスホリパーゼをコードする、全長のｃＤＮＡ配列を含んでなるプラスミドを含有する。他の株：
酵母株：使用したサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）は、Ｗ３１２４であった（ＭＡＴａ；ｕｒａ  ３−５２；ｌｅｕ  ２−３、１１２；ｈｉｓ  ３−Ｄ２００；ｐｅｐ  ４−１１３７；ｐｒｃｌ：：ＨＩＳ３；ｐｒｂ１：：ＬＥＵ２：ｃｉｒ＋）。
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株：ＤＨ１０Ｂ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）
プラスミド：
アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）発現ベクターｐＨＤ４１４は、プラスミドｐ７７５の誘導体である（ＥＰ２３８，０２３号に記載されている）。ｐＨＤ４１４の構築は、ＷＯ９３／１１２４９号にさらに記載されている。
ｐＹＥＳ２．０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
ｐＡ２ＰＨ１０（実施例７参照）
一般的分子生成学の方法
特記しない限り、ＤＮＡの操作および形質転換は分子生物学の標準的方法を使用して実施した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、（１９８９）、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ；Ａｕｓｕｂｅｌ、Ｆ．Ｍ．他（編）「Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、１９９５；Ｈａｒｗｏｏｄ、Ｃ．Ｒ．およびＣｕｔｔｉｎｇ、Ｓ．Ｍ（編）「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、１９９０）。
ＤＮＡの操作のための酵素は、供給会社の規格書に従い使用した。
ＤＮＡの操作のための酵素
特記しない限り、ＤＮＡの操作のためのすべての酵素、例えば、制限エンドヌクレアーゼ、リガーゼおよびその他は、ニュー・イングランド・バイオラブス・インコーポレーテッド（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｉｎｃ．）から入手した。
ＮＥＦＡ−ｃ試験をベースとするホスホリパーゼ活性のアッセイ
基質：Ｌ−α−リゾホスファチジルコリン（Ｓｉｇｍａ）。
基質：大豆レシチン（Ｓｉｇｍａ  ＃Ｐ３６４４）。ホスホリパーゼＡ活性を測定するために使用する。
Ｎｅｆａ−ｃ試験キットは、ワコ・ケミカルス・ジャーマニー（Ｗａｋｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手した。
緩衝液：２０ｍＭのＮａＯＡｃ  ｐＨ４．５。
基質溶液：１ｍｌのミリＱ水および１ｍｌの緩衝液中の１０ｍｇの基質（すべての試料に対して十分な基質溶液を調製する）。
１．  １５μｌの酵素を１５０μｌの基質溶液に添加する。
２．  ４０℃において１０分間インキュベートする。
３．  ３０μｌを３００μｌの試薬１に添加する（Ｎｅｆａキットから）。
４．  ３７℃において１０分間インキュベートする。
５．  ６００μｌの試薬２を添加する（Ｎｅｆａキットから）。
６．  ３７℃において１０分間インキュベートする。
７．  Ｎｅｆａキットの使用説明書に従い、最終反応生成物の吸収を５５０ｎｍにおいて測定する。
酵素反応の１分当たり１μｍｏｌの脂肪酸を生産するために必要な酵素活性を１単位として定義した。酵母中の発現クローン化
酵母中の発現クローン化を下記の文献に包括的に記載されているように実施した：Ｈ．Ｄａｌｂｏｅｇｅ他、「Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．」（１９９４）２４３：２５３−２６０；ＷＯ９３／１１２４９号；ＷＯ９４／１４９５３号）、これらは引用することによって本明細書の一部とされる。
全体のＲＮＡの抽出、ｃＤＮＡの合成、ヤエナリ（ｍｕｎｇ  ｂｅａｎ）ヌクレアーゼの処理、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを使用する平滑末端化、およびライブラリーの構築のすべての個々の工程は、前述の参考文献に従い実施した。ｍＲＮＡの単離のためのフザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）ＤＳＭ  Ｎｏ．２６７２の発酵手順：
フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）ＤＳＭ  Ｎｏ．２６７２を、ＹＰＤ培地中で３０℃において４日間培養した。後述するプレートアッセイにおいて、１０μｌの上清をホスホリパーゼ活性について試験した。
下記の文献に記載されているように、ｍＲＮＡをこの培養からの菌糸体から単離した：Ｈ．Ｄａｌｂｏｅｇｅ他、「Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．」（１９９４）２４３：２５３−２６０；ＷＯ９３／１１２４９号；ＷＯ９４／１４９５３号）、
陽性の酵母のクローンの同定（プレートアッセイ）：
陽性の酵母のクローン（すなわち、ホスホリパーゼ活性をコードする遺伝子を含むクローン）の同定を、後述するように実施した。
２％のグルコースを含有するＳＣ寒天上に酵母の形質転換体をプレートし、３０℃において３日間インキュベートした。酢酸セルロースのフィルター（ＯＥ６７、Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ）を細胞の上部に配置し、次いでフィルターの上部上の細胞とともにＳＣ寒天および２％のガラクトースを含有するプレートに移す。３０℃において３日間インキュベートした後、細胞を有するフィルターを基質プレートに移す。陽性のクローンは、コロニーの下に基質プレート中の青−緑色ゾーンを生ずるコロニーとして同定される。
基質プレートを下記の方法でつくる：２．５ｇの寒天（ＢＡ−３０ＩＮＡ  Ａｇａｒ（登録商標）、Ｆｕｎａｋｏｓｉ  Ｃｏ．Ｌｔｄ．）を１３７．５ｍｌのＨ2Ｏに添加し、電子レンジ中で加熱沸騰させる。約６０℃に冷却した後、３０ｍｌの下記の混合物を添加する：６２．５ｍｌの０．４ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）および５０ｍｌの３％のＬｉｏｉｄ  Ｅ８０（Ｌｉｏｉｄ  ＧｎｂＨ、Ｄ−６７０６５  Ｌｕｄｗｉｇｓｈａｆｅｎ、ドイツ国）と２％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（ｖ／ｖ）および０．５ｍｌのＨ2Ｏ中の２％のブリリアント・グリーン溶液との溶液。基質の濃度は重要である。この濃度が高い場合、それは酵母細胞からおよび／またはホスホリパーゼ副活性を有する糸状菌のリパーゼからバックグラウンドの活性を生ずることがある。
アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）中の発現のためのｃＤＮＡ遺伝子の単離
ホスホリパーゼを産生する酵母コロニーを、５０ｍｌのガラス製試験管中の２０ｍｌのＹＰＤブロスの中に接種する。試験管を３０℃において２日間震盪する。３０００ｒｐｍにおいて１０分間遠心することによって、細胞を収集する。
ＤＮＡをＷＯ９４／１４９５３号に従い単離し、５０ｍｌの水中に溶解する。ＤＮＡを標準的手順により大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の中に形質転換する。プラスミドＤＮＡを標準的手順により大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から単離し、制限酵素分析により分析する。適当な制限酵素を使用してｃＤＮＡインサートを切除し、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）の発現ベクターの中に結合する。
アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）またはアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）の形質転換
ＷＯ９５／０２０４３号、第１６ページ、第２１行〜第１７ページ、第１２行（これは引用することによって本明細書の一部とされる）に記載されているようにして、プロトプラストを調製する。
１００μｌのプロトプラストの懸濁液を５〜２５μｌの適当なＤＮＡと１０μｌのＳＴＣ（１．２Ｍのソルビトール、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ＝７．５、１０ｍＭのＣａＣｌ2）中で混合する。プロトプラストをｐ３ＳＲ２（プラスミドを有するアスペルギルス・ニヅランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）のａｍｄＳ遺伝子）と混合する。この混合物を室温において２５分間放置する。０．２ｍｌの６０％のＰＥＧ４０００（ＢＤＨ２９５７６）、１０ｍＭのＣａＣｌ2および１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ＝７．５を添加し、注意して混合し（２回）、最後に０．８５ｍｌの同一溶液を添加し、注意して混合する。この混合物を室温に２５分間放置し、２５００ｇにおいて１５分間回転し、ペレットを２ｍｌの１．２Ｍのソルビトールの中に再懸濁させる。さらに１回沈降させた後、プロトプラストを１．０Ｍのスクロース、ｐＨ７．０、窒素源として１０ｍＭのアセトアミドおよびバックグラウンドの生長を阻止するために２０ｍＭのＣｓＣｌを含有する最少プレート（Ｃｏｖｅ、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １１３（１９６６）５１−５６）上に広げる。３７℃において４〜７日間インキュベートした後、胞子を取り上げ、単一のコロニーについて広げる。この手順を反復し、第２回の再単離後の単一のコロニーの胞子を規定された形質転換体として貯蔵する。
アスペルギルス・オリゼ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）またはアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）の形質転換体の試験
アスペルギルス・オリゼ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）の形質転換体の各々を１０ｍｌのＹＰＭ（下記を参照）の中に接種し、増殖させる。３０℃において２〜５日間インキュベートした後、上清を取出す。２０μｌの上清を基質プレート（上を参照）の中に押抜いた孔の中に負荷する。１〜２４時間後、ホスホリパーゼ活性は孔の回りの青−緑色のゾーンとして現れる。
流加発酵
炭素源としてマルトデキストリン、窒素源として尿素および酵母エキスを含んでなる培地中で、流加発酵を実施した。問題のアスペルギルス・オリゼ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）宿主細胞の震盪フラスコの培養物を３．５％の炭素源および０．５％の窒素源を含んでなる培地の中に接種することによって、流加発酵を実施した。ｐＨ７．０および３４℃において２４時間培養した後、追加の炭素源および窒素源の連続的供給を開始した。炭素源を制限因子として保持し、そして酸素が過剰量で存在するようにした。流加培養法を４日間続けた。
配列番号：１に示すＤＮＡ配列の単離
本発明のホスホリパーゼをコードする配列番号：１に示すＤＮＡ配列のホスホリパーゼをコードする部分は、この分野において知られている方法によりプラスミドＤＮＡの抽出により、寄託された微生物大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＤＳＭ１１２９９から得ることができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ他（１９８９）「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ）。
培地
ＹＰＤ：１０ｇの酵母エキス、２０ｇのペプトン、９００ｍｌとするＨ2Ｏ。
オートクレーブ処理し、１００ｍｌの２０％のグルコース（滅菌濾過した）を添加する。
ＹＰＭ：１０ｇの酵母エキス、２０ｇのペプトン、９００ｍｌとするＨ2Ｏ。
オートクレーブ処理し、１００ｍｌの２０％のマントデキストリン（滅菌濾過した）を添加する。
１０×基礎塩：７５ｇの酵母窒素塩基、１１３ｇのコハク酸、６８ｇのＮａＯＨ、１０００ｍｌとする水を滅菌濾過した。
ＳＣ−ＵＲＡ：１００ｍｌの１０×基礎塩、２８ｍｌの２０％のカサミノ酸、ビタミンを含まない、１０ｍｌの１０％のトリプトファン、９００ｍｌとする水をオートクレーブ処理し、３．６ｍｌの５％のスレオニンおよび１００ｍｌの２０％のグルコースまたは２０％のガラクトースを添加する。
ＳＣ寒天：ＳＣ−ＵＲＡ、２０ｇ／ｌの寒天を添加する。
ＳＣ−変異型寒天：２０ｇの寒天、２０ｍｌの１０×基礎塩、９００ｍｌとする水をオートクレーブ処理する。
ＰＥＧ４０００（ポリエチレングリコール、分子量＝４０００）（ＢＤＨ、英国）。
実施例
実施例１
フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）ホスホリパーゼの発酵
寒天斜面上のフザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）ＤＳＭ２６７２の培養物を、各々が１００ｍｌのＢｏｕｉｌｌｏｎ−３培地を有する、５本の５００ｍｌの震盪フラスコに移し、３０℃において１日間震盪した（２００ｒｐｍ、振幅２．５ｃｍ）。
Ｂｏｕｉｌｌｏｎ−３培地の組成は下記の通りであった：
ペプトン                        ６ｇ／ｌ
トリプシン消化カゼイン          ４ｇ／ｌ
酵母エキス                      ３ｇ／ｌ
肉エキス                        １．５ｇ／ｌ
グルコース                      １ｇ／ｌ
培地を１２１℃において４０分間オートクレーブ処理した。
これらのＢｏｕｉｌｌｏｎ−３震盪フラスコの培養ブロスを、各々がＰＬ−１培地を含む、２０本の５００ｍｌの震盪フラスコのための種培養物として使用した。
ＰＬ−１培地の組成は下記の通りであった：
ペプトン                        １０ｇ／ｌ
Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−８０    １２ｇ／ｌ
ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ              ２ｇ／ｌ
ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ              ０．１ｇ／ｌ
オートクレーブ処理前のｐＨ      ６．０
培地を１２１℃において４０分間オートクレーブ処理した。
各ＰＬ−１震盪フラスコを０．５〜２ｍｌのＢｏｕｉｌｌｏｎ−３培養ブロスで接種し、２００ｒｐｍ（振幅２．５ｃｍ）で３０℃において５日間震盪した。震盪フラスコからの培養ブロスを収集時にプールした、合計３．９リットル、酵素収量５３ＬＵ／ｍｌ。
実施例２
ホスホリパーゼの精製
工程１）−  １リットルの発酵上清を遠心し、生ずる沈澱を廃棄した。次いで、固体の酢酸アンモニウムの添加により、上清を０．８Ｍの酢酸アンモニウムに調節した。
工程２）−  疎水性クロマトグラフィー  −  トヨパール（Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）ブチル６５０Ｃマトリックスをトソ・ハス（Ｔｏｓｏ  Ｈａｓｓ）
0003824174.tif 000005
から購入した。５０ｍｌのカラムにマトリックスを詰めた。カラムを５０％のエタノールで洗浄し、次いで水で洗浄した。次いでカラムを０．８Ｍの酢酸アンモニウムと平衡化した。次いで、０．８Ｍの酢酸アンモニウムで調節した発酵上清をカラムに適用した。次いで未結合の物質を０．８Ｍの酢酸アンモニウムで洗浄して、すべての紫外線吸収物質（２８０ｎｍ）を除去した。
次いでカラムを水で溶離し、引き続く５０％のエタノールで溶離した。
前述したＮＥＦＡキットを使用して、ホスホリパーゼ活性をｐＨ４．５および４０℃において測定した。水およびアルコールの溶出液の中に活性を含有する画分をプールした。ＮＥＦＡキットアッセイを使用して、活性をｐＨ４．５においてアッセイした。
次いでホスホリパーゼ活性を含有する画分をプールし、透析し、１０ｋＤａのカットのアミコン（Ａｍｉｃｏｎ）限外濾過膜を使用して濃縮した。
工程３）−  ＤＥＡＥ高速クロマトグラフィー上の陰性の吸収。
ＤＥＡＥ  ＦＦをファーマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）から購入し、５０ｍｌのカラムにマトリックスを詰めた。
次いでカラムを製造業者が記載するように洗浄し、２５ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液ｐＨ７と平衡化した。
透析し、濃縮した試料をｐＨ７、コンダクタンス２ｍＳｉに調節し、アニオン交換体ＤＥＡＥ  ＦＦカラムに適用した。
活性を流出液として集めた。活性はアニオン交換体にｐＨ７において結合しない。
活性を含有するＤＥＡＥ  ＦＦからの流出液を濃縮し、１０ｋＤａのカットのアミコン膜を使用して透析し、２５ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６で緩衝化した。
スーパーデックス（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ）７５上のゲル濾過。
ファーマシアからのスーパーデックス７５を前もって充填したカラムＨｉｌｏａｄ  Ｔｍ１６／２０を洗浄し、１５０ｍＭのＮａＣｌを含有する２５ｍＭの酢酸ナトリウムｐＨ６と平衡化した。
ｐＨ４．５および４０℃においてホスホリパーゼ活性を示すアニオン交換体からの濃縮された流出液の２ｍｌを、スーパーデックスカラム上に適用した。
活性を１ｍｌ／分の流速のゲル濾過により分離した。
実施例３
フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）から得られた精製されたホスホリパーゼの特性決定
実施例１に記載したように発酵させ、実施例２に記載したように精製したフザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）のホスホリパーゼについて、後述する特性決定を実施した。
ノベックス（Ｎｏｖｅｘ）Ｔｍからの４〜２０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥプレキャストプレートを使用することによって、ホスホリパーゼ酵素の分子量を測定した。前述したように還元性条件下に、このタンパク質の分子量を測定した。
フザリウム・オキシスポラム（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）のホスホリパーゼについて、分子量は還元性条件下に２９〜３０ｋＤａであることが見出された。
ファーマシアからのアンフォライン（Ａｍｐｈｏｌｉｎｅ）ＰＡＧＥプレートを使用することによって、等電点を測定した。
フザリウム・オキシスポラム（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）について、タンパク質のｐＩは、ほぼ中性のｐＨにおいて、好ましくは５．８〜６．８の範囲である。
ホスホリパーゼの熱安定性
フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）からのホスホリパーゼの熱安定性をＤＳＣ（示差走査熱量計）により試験した。一定の、プログラミングされた加熱速度において酵素溶液を加熱した後に得られたサーモグラム（Ｃｐ／Ｔ）中の変性ピークの頂部として、熱変性温度、Ｔｄ、を取った。
実験：
ハート・サイエンティフィック（Ｈａｒｔ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）（米国ユタ州、１９９３）からのＤＳＣ  ＩＩを実験に使用した。
ｐＨ１０（５０ｍＭのグリシン緩衝液）、ｐＨ７（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液＋１０ｍＭのＥＤＴＡ）またはｐＨ４（５０ｍＭのクエン酸塩緩衝液）において、５０ｍＭの緩衝化溶液を酵素（ほぼ２ｍｇ／ｍｌ）のための溶媒として使用した。前述の実施例２に従い、酵素を精製した。
７５０μｌの酵素溶液をハート・サイエンティフィックからの標準的１ｍｌの密閉可能なハステロイのアンプルの中に移した。アンプルを熱量計の中に入れ、５℃に１５分間冷却した。ＤＳＣ走査の前に、熱的平衡化を実施した。ほぼ９０Ｋ／時の走査速度で５℃から９５℃まで、ＤＳＣ走査を実施した。ほぼ＋／−２℃の正確度で、変性温度を測定した。
結果：
0003824174.tif 000006
酵素の安定性に影響を有意に及ぼすことがある油マトリックスの非存在において、これらの実験を実施したことに注意すべきである。ＤＳＣの結果は、中性のｐＨ付近における最大の安定性を示す。
不可逆的熱変性を仮定すると、工業的用途、例えば、油の脱ガム化（米国特許第５，２６４，３６７号）における関係する実施温度は、上記表１に記載するＴｄ温度よりも少なくとも１０°低い。
アミノ末端の配列
製造業者の記載するようにアプライド・バイオシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）の装置（ＡＢＩ  ４７３Ａタンパク質配列決定装置、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ、米国）を使用して、エドマン分解法によりアミノ末端の分析を実施した。
Ｎ−末端の配列：
フザリウム・オキシスポラム（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）のホスホリパーゼについて、Ｎ−末端の配列は下記の通りである：
Ｎ−末端Ａ−Ｖ−Ｇ−Ｖ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｄ−Ｆ−Ｓ−Ｎ−Ｆ−Ｋ−Ｆ−Ｙ−Ｉ
Ｎ−末端のアミノ酸「Ａ」（Ａｌａ）は、配列番号：２中の位置３１である。これにより示されるように、本発明の成熟ホスホリパーゼ酵素は配列番号：２中の位置３１において開始する。
結局、成熟配列は配列番号：２において３１−３４６である。
実施例４
ホスホリパーゼＡ活性
前述したようにｐＨ４．５、４０℃において基質として大豆レシチンを使用して、ホスホリパーゼＡ活性を測定した（ＮＥＦＡ試験塩基アッセイ）。
フザリウム・オキシスポラム（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）のホスホリパーゼは、前述の条件において有意なホスホリパーゼＡ活性を示した。
実施例５
Ｌ−α−リゾホスファチジルコリンに向かう活性
前述したようにｐＨ４．５、４０℃において基質としてＬ−α−リゾホスファチジルコリンを使用して、ホスホリパーゼＡ活性を測定した（ＮＥＦＡ試験塩基アッセイ）。
フザリウム・オキシスポラム（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）のホスホリパーゼは、前述の条件においてＬ−α−リゾホスファチジルコリンに対して有意な活性を示した。
実施例６
単層の構成におけるホスホリパーゼ活性
単層装置（ゼロ次トラフ、ＫＳＶ５０００、ＫＳＶ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、フィンランド国）を使用して、ホスホリパーゼＤＤＰＣ（Ｄｉ  Ｄｉｃａｎｙｌ（Ｃ１０）ホスファチジルコリン）に対する種々の酵素の活性を評価した。
実験
緩衝溶液（１０ｍＭのＴＲＩＳ、ｐＨ８．０、２５℃）の完全に精製された表面上で、ＤＤＰＣの単層をクロロホルム溶液から広げた。単層の緩和（クロロホルムの蒸発）後、ほぼ６３Å2／分子のＤＤＰＣの平均分子面積に対応して、表面圧力を１５ｍＮ／ｍに調節する。ほぼ６０μｇの酵素を含有する緩衝溶液（前述）を単層を通して「ゼロ次トラフ」中の反応区画室（面積１５２０ｍｍ2および体積３０４００ｍｍ3を有するシリンダー）の部分相の中に注入しする。不溶性基質分子がより水溶性の反応生成物に加水分解されるとき、一定の表面圧力を維持するために、単層を圧縮する移動性バイヤーの速度により、酵素活性は発現される。反応生成物（カプロン酸およびＤＤＰＣ）の溶解度がＤＤＰＣについてよりかなり高いことが確認されると、酵素により１分当たり加水分解されるＤＤＰＣ−分子の数はＤＤＰＣの平均分子面積（ＭＭＡ）から推定される。
結果
0003824174.tif 000007
表２中の「フザリウム・オキシスポラム（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）からの酵素」は、実施例２に記載するように精製された、本発明のホスホリパーゼである。
結論
小さいホスホリパーゼ活性を示すモルモットのリパーゼから得られたリパーゼを除外して、酵素の大部分についてホスホリパーゼ活性は検出されなかった。
フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）から得られた本発明のホスホリパーゼは、驚くほどに高い有意なホスホリパーゼ活性を示した。
結局、本発明において、本発明のホスホリパーゼに関して本発明において使用する用語「ホスホリパーゼ活性」は、上に示した「単層ホスホリパーゼアッセイ」において、少なくとも０．２５ｎｍｏｌ／分、酵素投与量：６０μｇ；より好ましくは少なくとも０．４０ｎｍｏｌ／分、酵素投与量：６０μｇ；より好ましくは少なくとも０．７５ｎｍｏｌ／分、酵素投与量：６０μｇ；より好ましくは少なくとも１．０ｎｍｏｌ／分、酵素投与量：６０μｇ；より好ましくは少なくとも１．２５ｎｍｏｌ／分、酵素投与量：６０μｇ；なおより好ましくは少なくとも１．５ｎｍｏｌ／分、酵素投与量：６０μｇ；である活性として定義される。
用語「ホスホリパーゼ副活性を有するリパーゼ」は、それに応じて、実施例６に示す「単層ホスホリパーゼアッセイ」におけるホスホリパーゼ副活性がホスホリパーゼ活性を特定する前述の数値より低い、ホスホリパーゼ副活性を有するリパーゼとして定義される。
本明細書における定義に従うホスホリパーゼ副活性を有するリパーゼの１例は、上記表２に示すモルモットのリパーゼである。前記モルモットのリパーゼは、「単層ホスホリパーゼアッセイ」において、０．２５ｎｍｏｌ／分、酵素投与量：６０μｇ、より低いホスホリパーゼ副活性を有する。
実施例７
フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）ＤＳＭ  Ｎｏ．２６７２からのホスホリパーゼのクローン化および発現
前述した酵母技術における発現クローン化を使用することによって、クローン化および発現を実施した。
前述したように十分なエアレーションを保証するための撹拌を含めて上記の増殖させた、フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、ＤＳＭ  Ｎｏ．２６７２から、ｍＲＮＡを単離した。３〜５日間増殖させた後、菌糸体を収集し、直ちに液体窒素中で凍結させ、−８０℃において貯蔵した。１％のベクターのバックグラウンドをもつ前述の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で、ほぼ９×１０5の個々のクローンから成るフザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、ＤＳＭ  Ｎｏ．２６７２からのライブラリーを構築した。プールのいくつかからのプラスミドＤＮＡを酵母の中に形質転換し、２５０〜４００の酵母コロニーを含有する５０〜１００のプレートが各プールから得られた。
ホスホリパーゼ陽性コロニーを基質プレート（上を参照）上で同定し、単離した。ｃＤＮＡインサートを酵母のコロニーから直接増幅し、前述の材料および方法の節に記載するように特性決定した。ホスホリパーゼをコードするｃＤＮＡのＤＮＡ配列を配列番号：１に示し、そして対応するアミノ酸配列を配列番号：２に示す。配列番号：１において、Ｎｏ．２３からＮｏ．１０６０までのＤＮＡヌクレオチドはホスホリパーゼをコードする領域を定める。ホスホリパーゼの成熟部分をコードする配列番号：１中のＤＮＡ配列の部分は、配列番号：２におけるアミノ酸位置３１−３４６に相当する、位置１１３−１０６０からなる。
ｃＤＮＡはＤＳＭ１１２９９中のプラスミドから得ることができる。
全体のＤＮＡを酵母のコロニーから単離し、そして前述したように大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の形質転換によりプラスミドＤＮＡをレスキューした。アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）中でホスホリパーゼを発現させるために、ＤＮＡを適当な制限酵素で消化し、ゲル上でサイズ分画し、ホスホリパーゼ遺伝子に対応するフラグメントを精製した。遺伝子を引き続いてｐＨＤ４１４に結合し、適当な制限酵素で消化すると、プラスミドｐＡ２ＰＨ１０が得られた。
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中のＤＮＡを増幅した後、プラスミドを前述したようにアスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）の中に形質転換した。
アスペルギルス・オリゼ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）の試験
形質転換体の各々を前述したように酵素活性について試験した。形質転換体のいくつかは、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）のバックグラウンドよりも有意に高い、ホスホリパーゼ活性を有した。これはアスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）中のホスホリパーゼの効率よい発現を証明する。
実施例８
フザリウム・オキシスポラム（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）のホスホリパーゼの組換え発現
アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）の発現ベクターｐＡ２ＰＨ１０を含むアスペルギルス・オリゼ(Ａ．ｏｒｙｚａｅ）の形質転換体（実施例７参照）を、前述したように流加発酵させた。組換え的に生産されたフザリウム・オキシスポラム（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）のホスホリパーゼの精製を、実施例２に記載するように実施した。
実施例９
フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）から得られた組換え的に発現させ、精製したホスホリパーゼの特性決定
組換え的に発現させ、引き続いて精製したホスホリパーゼ（実施例８参照）を特性決定した。
本発明の組換えフザリウム・オキシスポラム（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）のホスホリパーゼに関するこれらの特性決定の結果は、実施例３に示す特性決定の結果と完全に相関し、ここで組換え的に発現させ、精製した酵素は、実施例３において特性決定した非組換え的に発現させ、精製したホスホリパーゼと同一であった。
フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）から得られた組換え的に生産されたホスホリパーゼを特性決定するために使用した一般的アッセイ
ホスホリパーゼのアッセイ：
ホスホリパーゼ活性（ＰＨＬＵ）を、レシチンからの遊離脂肪酸の放出として測定した。５０μｌの５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７、中の４％のＬ−α−ホスファチジルコリン（植物のレシチン、Ａｖｎｔｉ、米国）、４％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、５ｍＭのＣａＣｌ2を添加し、５０μｌの酵素溶液を５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７、中で適当な濃度に希釈した。試料を３０℃において１０分間インキュベートし、９５℃において５分間反応を停止させた後、遠心（７０００ｒｐｍにおいて５分）した。ワコ・ケミカル社（Ｗａｋｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ＧｍｂＨ）からのＮＥＦＡ  Ｃキットを使用して、遊離脂肪酸を定量した；２５μｌの反応混合物を２５０μｌの試薬Ａに添加し、３７℃において１０分間インキュベートした。次いで５００μｌの試薬Ｂを添加し、試料を再び３７℃において１０分間インキュベートした。ＨＰ８４５２Ａダイオード配列分光光度計を使用して、５５０ｎｍにおける吸収を測定した。試料を少なくとも二重反復実験において試験した。基質および酵素の盲検試料（予熱した酵素試料（９５℃において１０分）＋基質）を含めた。オレイン酸を脂肪酸の基準として使用した。１ＰＨＬＵは、これらの条件下に、１μｍｏｌの遊離脂肪酸／分を解放することができる酵素の量に等しい。
また、このアッセイを３７℃において２０ｍＭのクエン酸塩緩衝液、ｐＨ５（Ｃａ2+依存性）または２０ｍＭのブリットン−ロビンソン緩衝液（ｐＨ−プロフィル／温度−プロフィル／安定性）中で実施した。基質として１−（Ｓ−デカノイル）−２−デカノイル）−１−チオ−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（Ｄ３７６１  分子プローブ）を使用して、ホスホリパーゼＡ1活性（ＰＬＡ1）を測定した。２００μｌのクベット中の１９０μｌの基質（１００μｌのＤ３７６１（エタノール中の２ｍｇ／ｍｌ）＋５０μｌの１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００＋１．８５ｍｌの５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．３ｍＭのＤＴＮＢ、２ｍＭのＣａＣｌ2、ｐＨ７）を１０μｌの酵素に添加し、そして室温においてＨＰ８４５２Ａダイオード配列分光光度計により時間の関数として、４１０ｎｍにおける吸収を測定した。線状の範囲における曲線の勾配として、活性を計算した。ＰＬＡ1は、これらの条件下に、１μｍｏｌの遊離脂肪酸（チオール）／分を解放することができる酵素の量に等しい。
１−ヘキサデカノイル−２−（１−ピレンデカノイル）−１−チオ−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（Ｈ３６１  分子プローブ）を使用して、４０℃においてホスホリパーゼＡ2活性（ＰＬＡ2）を測定した。２ｍｌのクベット中の２ｍｌの基質（５０μｌの１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００＋２５μｌのメタノール中の０．１％のＨ３６１＋１０ｍｌの５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７）を撹拌しながら１０μｌの酵素に添加し、そしてパーキンエルマー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）ＬＳ５０装置を使用して時間の関数（１秒の間隔）として３７６ｎｍ（３４０ｎｍにおける励起）においてピレン蛍光放射を測定した。Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００／ホスホリパーゼの菌糸体において、ホスホリパーゼの濃度を励起二量体が形成する（４８０ｎｍにおいて放射する）ように調節した。切断が起こると、ピレン基を含有する２−位における脂肪酸は水性相の中に放出され、モノマーの放射が増加する。線状の範囲における曲線の勾配として、ＰＬＡ2活性を取った。
リパーゼアッセイ：
リパーゼ活性（ＬＵ）はノボ・ノルディス（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ）の刊行物ＡＦ９５に従い測定した。ｐＨスタット滴定実験において、３０℃、ｐＨ７においてトリブチリンの加水分解を追跡した。１ＬＵは、標準的条件下に、１μｍｏｌの酪酸／分を放出することができる酵素の量に等しい。
オリーブ油に対する活性（ＳＬＵ）を下記のようにして測定した：１２ｍｌの５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、４０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ2、ｐＨ９、を２．５ｍｌの（Ｓｉｇｍａ）リパーゼ基質に添加した。ｐＨをｐＨ９またはそれよりちょうど低い値に調節した後、０．５ｍｌのリパーゼ溶液（緩衝液中で希釈した）を添加し、そしてラジオメーター（Ｒａｄｉｏｍｅｔｅｒ  Ａ／Ｓ、デンマーク国コペンハーゲン）から商業的に入手可能であるチトララブ（Ｔｉｔｒａｌａｂ）を使用して、３０℃においてｐＨスタット滴定アッセイを実施した。１ＳＬＵはｐＨ９、３０℃において１μｍｏｌの遊離脂肪酸／分を放出することができる酵素の量に等しい。
本発明の組換え的に生産されたフザリウム・オキシスポラム（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）のホスホリパーゼの特性決定
後述する酵素を特性決定するために使用したアッセイは、直ぐ上に記載したアッセイであった。酵素：
配列番号：２に示すアミノ酸配列を有するフザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）からのＰＬ。
バッチＦ−９７００９８９、ＯＤ280  ０．８３（０．６９ｍｇ／ｍｌ）、純度＞９５％（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）。
前述したように、酵素を組換え的に発現させ、精製した。
Ｌｅｃｉｔａｓｅ（商標）バッチＬ５４６−Ｆ０６（１０３６８  ＩＵ／ｍｌ、ほぼｍｇ／ｍｌ）。
Ｌｉｐｏｌａｓｅ（登録商標）（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ  Ａ／Ｓ）。
フザリウム・オキシスポラム（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）リパーゼ／ホスホリパーゼのホスホリパーゼ活性に対するＣａ2+の影響を研究した。ＥＤＴＡまたはＣａ2+をアッセイに含めるか否かにかかわらず、主要な差は観察されず（下記表３参照）、こうして、酵素はＣａ2+に対して比較的独立であるように見える。
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基質として植物レシチンを使用して、ｐＨ−プロフィルをブリットン−ロビンソン緩衝液中で研究した（表４）。酵素はホスホリパーゼに対するアルカリ性のｐＨ−プロフィルを示し、最適値はｐＨ９以上であるが、活性は低いｐＨにおいて油を脱ガム化しかつベーキングにおける性能を提供するのに十分に高い（比活性の比較については下記を参照）。
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ホスホリパーゼについて温度のプロフィルをｐＨ５において得た：活性は４０℃以上の温度において下向し始める（表５）。これは酵素を前インキュベートし、次いで残留活性を測定することによって測定した温度安定性（表６）と合理的に一致し、ここで酵素はｐＨ５において４５℃までの温度において安定である。
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すべてのデータは、ｐＨ５、４０℃における活性に関する相対活性のデータとして示されており、１に正規化されている。
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すべてのデータは残留活性のデータとして示されており、ここで５℃における前インキュベーション後の活性は１に正規化されている。
酵素の低い安定性は究極的製品をプロセス助剤として記録するために有利であることがある。なぜなら、活性酵素は食用油の脱ガム化または焼かれた製品において最終生成物として期待されないであろうからである。
本発明のフザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）から得られたホスホリパーゼは、ホスホリパーゼ活性およびリパーゼ活性の双方を有する。
したがって、種々の異なるリパーゼおよびホスホリパーゼの基質に対する酵素活性を研究し、商業的に入手可能なホスホリパーゼＬｅｃｉｔａｓｅ（商標）、および商業的に入手可能なリパーゼＬｉｐｏｌａｓｅ（登録商標、Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ  Ａ／Ｓ）の活性と比較した。
フザリウム・オキシスポラム（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）のホスホリパーゼ／リパーゼはｐＨ７および９においてトリブチリンおよびオリーブ油の双方に対して高い活性を有する（表７）。比較の理由で、Ｌｉｐｏｌａｓｅ（登録商標）の比活性は約５０００ＬＵ／ｍｇである。しかしながら、Ｌｉｐｏｌａｓｅ（登録商標）と反対に、フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）のリパーゼは非常に広い特異性を示し、かなりのホスホリパーゼ活性およびまたチオエステラーゼ活性を有する〔上記単層の実施例を参照、Ｌｉｐｏｌａｓｅ（登録商標）は測定可能なホスホリパーゼ活性をもたない〕。
本発明のフザリウム・オキシスポラム（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）のホスホリパーゼ／リパーゼは、ｐＨ７においてホスホリパーゼＬｅｃｉｔａｓｅ（商標）（ブタ膵臓のＰＬＡ2）のそれよりかなり高いレシチンに対する比活性を有する（表７）。
Ｌｅｃｉｔａｓｅ（商標）に比較して、フザリウム・オキシスポラム（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）酵素はｐＨ７において１００倍高い活性を有する。フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）酵素についてホスホリパーゼ／リパーゼの比は、同様な条件（ｐＨ７および３０℃）下に、約０．２２５（１０００ＬＵ／ｍｇ／２２５ＰＨＬＵ／ｍｇ）である。
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ホスホリパーゼＡ1に対して特異的な基質を使用し、１−（Ｓ−デカノイル）−２−デカノイル）−１−チオ−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンの１−位におけるチオエステル結合の切断を測定することによって、フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）のリパーゼ／ホスホリパーゼの特異性を研究した。
この酵素はホスホリパーゼ中の１−位を明瞭に加水分解する（表７）が、Ｌｅｃｉｔａｓｅ（商標）（ブタ膵臓のＰＬＡ2）は期待されるようにこの基質に対して活性を示さなかった。
本発明のフザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）のホスホリパーゼのＣ−末端のアミノ酸配列
組換え的に発現された成熟ホスホリパーゼのタンパク質のＮ−末端のアミノ酸配列を実施例３に記載するように決定し、そしてこのＮ−末端の配列は非組換え的に生産され、精製された酵素（実施例３参照）について決定された配列と同一であると確証された。
Ｃｈｒｉｓｔｇａｕ他、「Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．」３１９、７０５−７１２、１９９６に記載されているように、ＶＧＴｏｆＳｐｅｃ質量分析計（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ、英国マンチェスター）を使用して、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦの質量分析を実施した。
バックグラウンド
ＤＮＡ配列から推定された、フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）のホスホリパーゼのＮ−末端のアミノ酸配列は、成熟ホスホリパーゼの既知のＮ−末端のアミノ酸配列と組み合わせて、３１５アミノ酸残基のタンパク質（配列番号：２中のアミノ酸３１−３４６）を予知する。この予測されるタンパク質の理論的分子量は３３，２５６．８Ｄａである。
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦの質量分析を使用して、我々はフザリウム・オキシスポラム（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）からの真性のリパーゼ／ホスホリパーゼの分子量が２８．２ｋＤａ（データは示されていない）であると以前に測定し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で、分子量は２９〜３０ｋＤａ（上を参照）であることが示された。
真性および組換えのフザリウム・オキシスポラム（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）のリパーゼのＮ−末端のアミノ酸配列は同一であるので、予測された分子量と実験の分子量との間の差はＣ−末端のプロセシングにより引き起こされるようである。
これを研究するために、我々はアスペルギルス・オリゼ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）において発現された組換えフザリウム・オキシスポラム（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）のリパーゼからＣ−末端のペプチドを単離し、そのＣ−末端を通してそれを配列決定した。
戦略
２８．２ｋＤａのフザリウム・オキシスポラム（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）からの真性のリパーゼ／ホスホリパーゼの平均分子量を使用して、最も期待できそうなＣ−末端の残基を予測することができ、これはＳｅｒ３０３であると判明する（配列番号：２）。
この推定は、酵素がグリコシル化されていないという仮定に基づく。Ａｓｎ１６３において配列の中に見出された単一の潜在的Ｎ−グリコシル化部位は、Ｐｒｏ残基が位置１６４に見出されるので、多分使用されない。Ｎ−グリコシル化のためのコンセンサス配列（Ａｓｎ−Ｘａａ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）中の第２残基としてのＰｒｏ残基の存在は、決して報告されていない。さらに、質量スペクトル中のピークの形状はグリコシル化を示さない。しかしながら、このピークは相同タンパク質について通常直面するピークよりも広く、サイズの異質性の可能性を示す。この酵素のＮ−末端はよく定められているので、サイズの異質性は異種Ｃ−末端のプロセシングにその基礎を有することが最も期待される。
配列番号：２（下記を参照のこと）を検査すると、予測されるＣ−末端は配列中の８つのＣｙｓ残基の最後に密接して位置することが明らかになる。これらのＣｙｓ残基上に放射性標識を導入すると、Ｃｙｓ残基を含有するペプチドをペプチド精製により追跡することが容易となる。放射性標識化と、Ａｓｐ残基の前において切断するＡｓｐ−Ｎプロテアーゼを使用するタンパク質分解とを組合わせると、標識化Ｃ−末端のペプチドが生ずる。さらに、３つの内部のペプチドが標識化されるであろう。すべての標識化ペプチドを配列決定すると、酵素のＣ−末端が明らかとなるであろう。
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配列番号：２：フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）のリパーゼ／ホスホリパーゼの予測されたアミノ酸配列
配列はＤＮＡ配列から推定され、真性および組換えの双方の酵素について実験的に決定されたＮ−末端において開始する。８つのＣｙｓ残基は
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で示されているが、真性酵素のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析から予測されたＣ−末端のＳｅｒ残基は↑で示されている。Ｎ−グリコシル化のためのコンセンサス配列（ＮＸＳ／Ｔ）の中に見出されるＡｓｎ残基は（◇）で示されているが、ＸはＰｒｏ残基であるので、すべての確度において使用されていない。
実験結果
実施例は、配列番号：２に示すアミノ酸配列を有するフザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）からのＰＬであった。
バッチＦ−９７００９８９、ＯＤ280  ０．８３（０．６９ｍｇ／ｍｌ）、純度＞９５％（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）。
前述したように、酵素を組換え的に発現させ、精製した。
酵素を変性し、ジスルフィド結合を還元した後、チオール基をＩ［１−14Ｃ］ＣＨ2ＣＯＮＨ2と反応させた。
Ｃｙｓ残基の放射性標識化後、リパーゼをＡｓｐ−Ｎプロテアーゼを使用して分解した。
発生したペプチドを逆相ＨＰＬＣにより分画した。収集した画分をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析し、シンチレーションカウンティングに付した。有意な量の反応性を含有する画分を、逆相ＨＰＬＣによる再精製のための選択した。
再精製した画分をシンチレーションカウンティングに付し、引き続いて放射性を含有する画分を配列決定した。
結果の要約を下に記載する。このスキームは、記載する多数の配列のために、混沌しているように見えることがある。しかしながら、このスキームは放射性画分から得られた配列のデータのすべてを含有し、したがって、引き出された結論のための基礎を表す。すべてのＣｙｓ残基は配列決定を通してカバーされていることに注意すべきである；それらの大部分は１回より大きくカバーされている。注意すべき他の事柄は、多数の小さい放射性的に標識化されたペプチドを生ずるように見られる異常な切断である。
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放射性標識化されたペプチドの配列決定により得られたアミノ酸配列は、組換えフザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）酵素から誘導された。これらの配列は、ＤＮＡ配列から推定された、予測されたアミノ酸に対して整列された。８つのＣｙｓ残基は  で示されているが、真性酵素のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析から予測されたＣ−末端のＳｅｒ残基は↑で示されている。
実験の結論
すべての放射性標識化されたペプチドの配列決定から、ＤＮＡにおいてコードされたアミノ酸のＣ−末端部分はフザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）からのリパーゼの発現の間にプロセシングされることが明らかである。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析からの結果に従い、ペプチドの配列は最も期待できそうなＣ−末端の残基としてＳｅｒ３０３を指示する。
しかしながら、データに基づいて、示差的Ｃ−末端のプロセシングが起こって異種Ｃ−末端に導くことは除外することができない；例えば、１つのペプチドはＰｈｅ２７２が、Ｃ−末端の残基としても見出されうることを示す。
実施例１０
食用油の酵素的脱ガム化についてのアッセイの一般的説明
酵素的脱ガム化を実施する装置
この装置は１リットルのジャケット付き鋼製反応器から成り、鋼製蓋、プロペラ（６００ｒｐｍ）、そらせ板、温度センサー、上部における入口管、上部における還流冷却器（４℃）、および下部における出口管を装備する。反応器のジャケットはサーモスタット浴に接続されている。出口管はシリコーン管を介してシルバーソン（Ｓｉｌｖｅｒｓｏｎ）インラインミキサーヘッドに接続されており、ミキサーヘッドはシルバーソンＬ４ＲＴ高剪断ラブミキサー（８５００ｒｐｍ、流速、約１．１リットル／分）により駆動される「正方形の孔の高剪断スクリーン」を装備する。ミキサーヘッドは冷却コイル（５〜１０℃）および出口管を装備し、出口管はシリコーン管を介して反応器の入口管に接続されている。温度センサーを、ミキサーヘッドの直後において、シリコーン管の中に挿入されている。反応器／ミキサーヘッドのシステムからの雰囲気への唯一の接続は、還流冷却器を通してである。
酵素的脱ガム化を実施する一般的手順
すべての冷却およびサーモスタット装置を始動させる。次いで０．６リットル（約５６０ｇ）の油を反応器の中に入れ、これを特定の実験のために必要な温度付近にする。ラブミキサーを始動させ、これにより油は反応器からミキサーヘッドに行き、反応器に戻るように循環し始める。このシステムを約１０分間平衡化させ、その間に温度を微細に調節する。前処理期間は２７ｇのＭｉｌｌｉＱ水中の０．６ｇ（２．８６ｍｍｏｌ）のクエン酸一水和物の添加とともに開始する（添加された水／油＝４．８％ｗ／ｗ；水相中の［クエン酸］＝１０６ｍＭ、水／油エマルジョン中の［クエン酸］＝４．６ｍＭ）、ここでｔ＝０に設定する。ｔ＝３０分において、適当な量の４ＭのＮａＯＨ溶液を添加する。
０．０当量の４ＭのＮａＯＨ                    →ｐＨ３．７
１．０当量の４ＭのＮａＯＨ（０．７１４ｍｌ）  →ｐＨ４．５
１．５当量の４ＭのＮａＯＨ（１．０７ｍｌ）    →ｐＨ５．０
２．０当量の４ＭのＮａＯＨ（１．４３ｍｌ）    →ｐＨ５．５
２．５当量の４ＭのＮａＯＨ（１．７９ｍｌ）    →ｐＨ６．２
３．０当量の４ＭのＮａＯＨ（２．１４ｍｌ）    →ｐＨ８．０
ｔ＝３５分において、試料をＰ−分析およびｐＨの測定のために抜き出す。この直後に、必要な量の酵素溶液を添加する（前処理期間の終わり）。Ｐ−分析およびｐＨの測定のための試料をｔ＝１、２、３．５、５、６時間に抜き出し、次いで反応を停止させる。
反応器／ミキサーのシステムを空にし、２×５００ｍｌの１０％のＤｅｃｏｎｅｓ／ＤＩ水溶液ですすぎ、最小３×５００ｍｌのＤＩ水ですすぐ。反応器の間の種々の添加およびサンプリングを表８に表す。
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リンの分析：
Ｐ−分析のためにサンプリング：
１０ｍｌの油中水型エマルジョンをガラス製遠心機の中に取る。沸騰水浴中でエマルジョンを３０分間加熱する。５０００ｒｐｍにおいて１０分間遠心する。８ｍｌの上方の（油）相を１２ｍｌのポリスチレン管に移し、１２〜２４時間放置する（沈降させる）。沈降後、約１〜２ｇを上方の透明相からＰ−分析のために抜き出す。
「Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｏｉｌｓ、Ｆａｔｓ、ａｎｄ  Ｄｅｒｖａｔｉｖｅｓ」、第７版（１９８７）の手順２．４２１に従い、Ｐ−分析を実施した：  １００ｍｇのＭｇＯ（ｌｅｉｃｈｔ、Ｍｅｒｃｋ＃５８６２）を磁器の皿の中で秤量し、ガスバーナーで加熱する。１〜２ｇの油を添加し、ガスバーナーで強熱して、黒色の固い塊にする。ベクスター（Ｖｅｃｓｔａｒ）炉中で８５０℃に２時間加熱して、白色の灰を得る。灰を５ｍｌの６ＭのＨＮＯ3の中に溶解し、２０ｍｌの試薬混合物を添加する。４６０ｎｍにおける吸収を測定する（ゼロ調節のためにブランク（５ｍｌのＨＮＯ3＋２０ｍｌの試薬混合物）を使用する）。検量線を使用して計算する。
ｐＨの測定
２ｍｌの油中水型エマルジョンを取り、２ｍｌのＭｉｌｌｉＱ水と混合する。相分離後、上部の油層をピペットで除去する。水性相中のｐＨをｐＨ電極オリオン（Ｏｒｉｏｎ）で測定する。測定値を下記式により「現実の（ｒｅａｌ）」ｐＨ値に変換する：
ｐＨ（真の）＝ｐＨ（測定）−０．３８
２７ｇのＤＩ水の中に０．６ｇのクエン酸一水和物を溶解することによって、検量線を作成した；この溶液のｐＨをｐＨ電極オリオンにより測定した〔ｐＨ（真の）〕。１００μｌを２ｍｌのＭｉｌｌｉＱ水と混合し、この溶液のｐＨをｐＨ電極オリオンにより測定した〔ｐＨ（測定）〕。ＮａＯＨ溶液の添加により、クエン酸溶液のｐＨを徐々に変化させ、各調節のために、希釈およびｐＨの測定を前述したように実施した。
実施例１１
Ｌｅｃｉｔａｓｅ（商標）のために最適な脱ガム化条件
実施例１０に記載するように、食用油の脱ガム化に関するすべての実験を実施した。
油：
アアルフス・オリエファブリク（Ａａｒｈｕｓ  Ｏｌｉｅｆａｂｒｉｋ、デンマーク国）からの水−脱ガム化されたナタネ油（Ｃｏｌｚｒｏ）。
バッチＣ００７３０／Ｂ０１２００、９ｋｇ、Ｐ含量１８６ｐｐｍ（０．４７％のホスファチド）。
この油は商業的に入手可能な製品ではなく、工場における生産ラインから直接取る。
酵素：
Ｌｅｃｉｔａｓｅ（商標）１０Ｌ。
バッチＬ６４６−Ｄ０２（１０１９０Ｕ／ｍｌ）、推定濃度２０ｍｇ／ｍｌ。Ｌｅｃｉｔａｓｅ（商標）を使用する１連のパラメーター最適化実験のための特定の条件を表９に記載する。標準的条件は次の通りである：酵素の投与量５３５Ｕ／ｋｇ油（１．１ｍｇ／ｋｇ油）、６０℃、２．０当量のＮａＯＨ（ｐＨ５．５）。酵素の投与量を２６８から１０７０Ｕ／ｋｇ油まで変化させ、温度を４０℃から７０℃まで変化させ、そして表９に示す種々のｐＨレベルに対応してＮａＯＨの添加量を１．０から３．０当量まで変化させた。
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別々の最適化研究を表１０に表す。
表１０における結果は、下記の事柄を示す：
ｉ）  投与量／応答の研究から、最適な酵素の投与量（６０℃および２．０当量のＮａＯＨにおいて）は約５３５Ｕ／ｋｇ油であることが理解される。半分の投与量は脱ガム化時間を約３．５時間から６時間に増加させ、そして２倍の投与量は脱ガム化の性能にほぼ変化をなんら引き起こさない。酵素のブランクの結果を比較のために挿入した。
ｉｉ）  最適なＮａＯＨの添加量は約２．０当量である（ｐＨ約５．５）、悪い性能は１．０当量（ｐＨ約４．５）および３．０当量（ｐＨ約８）である。
ｉｉｉ）  最適な温度は約６０℃である。なぜなら、７０℃はＰのレベルを完全には低下させず、５０℃は脱ガム化時間を約３．５時間から６時間に増加し、そして４０℃は悪い性能を与えるからである。
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実施例１２
本発明によるフザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）のホスホリパーゼについての最適な脱ガム化条件
実施例１０に記載するように、食用油の実験のすべての酵素的脱ガム化を実施した。
油：
アアルフス・オリエファブリク（Ａａｒｈｕｓ  Ｏｌｉｅｆａｂｒｉｋ、デンマーク国）からの水−脱ガム化されたナタネ油（Ｃｏｌｚｒｏ）。
バッチＣ００７３０／Ｂ０１２０８、Ｐ含量約２００ｐｐｍ
バッチＣ００７３０／Ｂ０１２０９、Ｐ含量約２００ｐｐｍ
バッチＣ００７３０／Ｂ０１４２９、Ｐ含量２２７ｐｐｍ
バッチＣ００７３０／Ｂ０１４３０、Ｐ含量２５２ｐｐｍ
この油は商業的に入手可能な製品ではなく、工場における生産ラインから直接取る。酵素：
配列番号：２に示すアミノ酸配列を有するフザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）からのＰＬ。
バッチＦ−９７００１２３、ＯＤ280  １．４８、純度約５８％、推定濃度０．９ｍｇ／ｍｌ。
前述したように、酵素を組換え的に発現させ、精製した。
フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）からのＰＬを使用する１連のパラメーター最適化実験のための特定の条件を表１１に記載する。標準的条件は次の通りである：酵素の投与量１．６ｍｇ／ｋｇ油、４０℃、１．５当量のＮａＯＨ（ｐＨ約５．５）。酵素の投与量を０．２から１．６ｍｇ／ｋｇ油まで変化させ、温度を３０℃から５０℃まで変化させ、そして表１１に示す種々のｐＨレベルに対応してＮａＯＨの添加量を１．０から２．５当量まで変化させた。
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実験結果を下記表１２に表す。時間のウインドウ３５分〜６時間におけるｐＨの偏りのすべては、期待した間隔の範囲内に入り、わずかの不規則性を伴う。
要約すると、表１２における結果は下記の事柄を示す：
ｉ）  投与量／応答の研究から、最適な酵素の投与量（４０℃および１．５当量のＮａＯＨにおいて）は約０．８ｍｇ／ｋｇ油であることが理解される。
ｉｉ）  最適なＮａＯＨの添加量は約１．５当量である（ｐＨ約５．０）、性能の非発揮１．０当量（ｐＨ約４．５）および；制限された性能２．０当量（ｐＨ約５．５）および２．５当量（ｐＨ約６．２）、そして
ｉｉｉ）  最適な温度は約４５℃であり、そして５０℃は制限された性能を与える。
0003824174.tif 000020
実施例１３
酵素的脱ガム化プロセスの間の標準的ｐＨの偏りの例示
実施例１０に記載するように実施した酵素的脱ガム化プロセスの間のｐＨの偏りの平均的例を、下記表１３に示す。
Ｌｅｃｉｔａｓｅ（商標）を使用して実験を実施する。それ以上の詳細については、実施例１１を参照のこと。
0003824174.tif 000021
本明細書において開示する酵素的脱ガム化実験の実施例においてそれ以上述べない場合、前記実験における標準的ｐＨの偏りは上記表に示す通りであった。
実施例１４
Ｌｅｃｉｔａｓｅ（商標）および本発明によるフザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）からのホスホリパーゼの酵素的脱ガム化能力の比較
第２図において、上記実施例１１および１２において測定した、それぞれの最適条件下ににおけるＰＬからの結果を示す。
第２図に示す実験条件：
Ｌｅｃｉｔａｓｅ（商標）：６０℃、ｐＨ５．２（２．０当量のＮａＯＨ）、および１ｍｇの酵素／ｋｇの油（約５３５Ｕ）（実験＃９）。
フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）のＰＬ：４０℃、ｐＨ５．０（１．５当量のＮａＯＨ）、および０．８ｍｇの酵素／ｋｇの油（実験＃３３）。
フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）のＰＬ：４５℃、ｐＨ５．０（１．５当量のＮａＯＨ）、および１．６ｍｇの酵素／ｋｇの油（実験＃６４）。
明らかなように、フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）からのＰＬは、Ｌｅｃｉｔａｓｅ（商標）に比較して、非常に速い脱ガム化作用を与える。
本発明によるフザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）からのＰＬは、酵素と油との２５分の接触後、ほとんんど完全な脱ガム化を与える。
実施例１５
異なる型の食用油の中に存在する非水和性リン脂質の定量
油：
アルフス・オリエファブリク（Åｒｈｕｓ  Ｏｌｉｅｆａｂｒｉｋ）（ＡＯＭ）、デンマーク国、からの粗製ナタネ油。バッチＣ００７４５／Ｂ０１１４６、Ｐ含量６０９ｐｐｍ。このバッチは固体残留物を含有する。
スカノラ（Ｓｃａｎｏｌａ）（デンマーク国）からの粗製ナタネ油。バッチＣ００７４５／Ｂ０１５９３、Ｐ含量３１５ｐｐｍ。
濾過した粗製ナタネ油。濾過したバッチＣ００７４５／Ｂ０１１４６、Ｐ含量２３１ｐｐｍ。この油は上記バッチＣ００７４５／Ｂ０１１４６（６０９ｐｐｍ）を１００μｍのジョンソン（Ｊｏｈｎｓｏｎ）フィルターを通して濾過した油である。
アルフス・オリエファブリク（Åｒｈｕｓ  Ｏｌｉｅｆａｂｒｉｋ）（ＡＯＭ）、デンマーク国、からの粗製ナタネ油。バッチＣ００７４５／Ｂ０１７００、Ｐ含量４５９ｐｐｍ。
ルルギ（Ｌｕｒｇｉ）、ドイツ国、からのナタネ油。バッチＣ００９３２／Ｂ０１３８１、Ｐ含量１４８ｐｐｍ。
アルフス・オリエファブリク（Åｒｈｕｓ  Ｏｌｉｅｆａｂｒｉｋ）、デンマーク国、からの粗製大豆油。バッチＣ００７４４／Ｂ０１１４５、Ｐ含量５９３ｐｐｍ。
上記実施例１０に記載するように水中のクエン酸一水和物を含んでなる溶液で油を前処理することによって、上に示した異なる型の食用油の中に存在する非水和性リン脂質の定量を実施した。
簡単に述べると、前処理プロセスは下記の工程からなる：
ｉ）  ６０℃において、水中のクエン酸一水和物を含んでなる溶液の添加（添加された水／油＝４．８％ｗ／ｗ；水相中の［クエン酸］＝１０６ｍＭ、水／油エマルジョン中の［クエン酸］＝４．６ｍＭ）により、前記食用油を３０分間前処理し、
ｉｉ）  １０ｍｌの前処理された油中水型エマルジョンを管に移し、
ｉｉｉ）  前記エマルジョンを沸騰する水浴中で３０分間加熱し、
ｉｖ）  ５０００ｒｐｍにおいて１０分間遠心し、
ｖ）  約８ｍｌの上（油）相を新しい管に移し、それを２４時間沈降させ、
沈降後、上方の透明な相から２ｇを抜き出して、食用油中の非水和性リン含量（ｐｐｍ）を測定する。ｐｐｍ値を上記実施例１０に記載するように測定した。
このプロセス後、上に示した異なる型の食用油の中に存在する非水和性リン脂質の量は、下記の通りであった：
ＡＯＭからの粗製ナタネ油＃１１４６は、部分的に高いＰレベル（６０９ｐｐｍ）の原因となる固体の粒子を含有する；１００μｍのジョンソン篩を通す濾過は２３１ｐｐｍのＰ含量を有する透明な油を与える。
粗製油および濾過した油の前処理は１４０ｐｐｍのＰレベルを与え、これは油の中に存在する非水和性リン脂質の測定である；
スカノラからの粗製ナタネ油のリン脂質含量は、前処理により３１５ｐｐｍから約３０ｐｐｍに減少した；
ルルギから入手したナタネ油（多分粗製油と完全に精製された油との任意の混合物）のリン脂質含量は、前処理プロセスにより６０ｐｐｍに減少した；
ＡＯＭからの粗製ナタネ油＃１７１０の前処理は、Ｐ含量を４５９ｐｐｍから２００〜２５０ｐｐｍに減少した；
ＡＯＭからの粗製大豆油＃１１４５では、前処理はＰレベルを５９３ｐｐｍから１０ｐｐｍに減少した。この大豆油は、水−脱ガム化／クエン酸塩の処理単独により脱ガム化することができる油の１例を構成する。前処理後のこの粗製大豆油への酵素の添加は、Ｐ含量をそれ以上減少しなかった。
これらのデータが示唆するように、粗製ナタネ油のリン脂質の組成（水和性／非水和性リン脂質）は１つのバッチから他のバッチに対して大きく変化し、結局酵素的脱ガム化されたナタネ油中の残留するリン脂質のレベルは広い範囲（３０ｐｐｍ（スカノラ）から２００〜２５０ｐｐｍ（ＡＯＭ）まで）にわたって変化するであろう。
酵素的脱ガム化について、最適な酵素の投与量は脱ガム化または前処理後に存在する非水和性リン脂質の量に依存する。
さらに、油の中に存在する非水和性リン脂質の量が高くなるほど、酵素的脱ガム化法はいっそう有効である。
これはまた下記の実施例１６において例示されており、ここで本発明は約１４０ｐｐｍの非水和性リン脂質のレベルを有する、粗製ナタネ油＃１１４６の酵素的脱ガム化を示す。
実施例１６
粗製ナタネ食用油の脱ガム化（Ｉ）
上記実施例１０に記載する「酵素的脱ガム化を実施する一般的手順」に従い、実験ＡおよびＢを実施した。
油：
アルフス・オリエファブリク（Åｒｈｕｓ  Ｏｌｉｅｆａｂｒｉｋ）（ＡＯＭ）、デンマーク国、からの粗製ナタネ油。バッチＣ００７４５／Ｂ０１１４６、Ｐ含量６０９ｐｐｍ。このバッチは固体残留物を含有する。
酵素：
Ｌｅｃｉｔａｓｅ（商標）１０Ｌ。
バッチＬ６４６−Ｆ０２（１０１９０Ｕ／ｍｌ）、推定濃度２０ｍｇ／ｍｌ。
配列番号：２に示すアミノ酸配列を有するフザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）からのＰＬ。
バッチＦ−９７００１２３、ＯＤ280  １．４８、純度約５８％、推定濃度０．９ｍｇ／ｍｌ。
この酵素は、前述したように、組換え的に発現させ、精製した。
実験Ａ（参照）
０．６リットル（５８０ｇ）の粗製ナタネ油を装置に入れ、６０℃に加熱する。ｔ＝３０分において、１．４３ｍｌ（５．７ｍｍｏｌ）の４ＭのＮａＯＨ溶液を添加し、これによりｐＨは約５．６となる。ｔ＝３５分において、３０μｌ（３００単位）のＬｅｃｉｔａｓｅ  １０Ｌ（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ  Ａ／Ｓから入手した）を添加する。遠心後の油相中の測定したリン含量ならびに水性相中のｐＨ値を表１４に示す。
0003824174.tif 000022
実験Ｂ
０．６リットル（５８１ｇ）の粗製ナタネ油を装置に入れ、４０℃に加熱する。ｔ＝３０分において、１．０７ｍｌ（４．３ｍｍｏｌ）の４ＭのＮａＯＨ溶液を添加し、これによりｐＨは約５．４となる。ｔ＝３５分において、１ｍｌ（０．９ｍｇ）のフザリウム・オキシスポラム（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）からのホスホリパーゼを添加する。遠心後の油相中の測定したリン含量ならびに水性相中のｐＨ値を表１５に示す。
0003824174.tif 000023
実施例１７
粗製ナタネ食用油の脱ガム化（ＩＩ）
上記実施例１０に記載する「酵素的脱ガム化を実施する一般的手順」に従い、実験ＡおよびＢを実施した。
油：
アルフス・オリエファブリク（Åｒｈｕｓ  Ｏｌｉｅｆａｂｒｉｋ）（ＡＯＭ）、デンマーク国、からの粗製ナタネ油。バッチＣ００７４５／Ｂ０１７１０、Ｐ含量４５９ｐｐｍ。
酵素：
Ｌｅｃｉｔａｓｅ（商標）１０Ｌ。
バッチＬ６４６−Ｆ０２（１０１９０Ｕ／ｍｌ）、推定濃度２０ｍｇ／ｍｌ。
配列番号：２に示すアミノ酸配列を有するフザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）からのＰＬ。
バッチＦ−９７００４７６、ＯＤ280  ０．８、純度約５８％、推定濃度０．４５ｍｇ／ｍｌ。
この酵素は、前述したように、組換え的に発現させ、精製した。
実験Ａ
０．６リットル（５８０ｇ）の粗製ナタネ油を装置に入れ、６０℃に加熱する。ｔ＝３０分において、１．４３ｍｌ（５．７ｍｍｏｌ）の４ＭのＮａＯＨ溶液を添加し、これによりｐＨは約５．６となる。ｔ＝３５分において、適当な量（例えば、１ｍｇの酵素／ｋｇの油について５０μｌ（５００単位））のＬｅｃｉｔａｓｅ  １０Ｌ（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ  Ａ／Ｓから入手した）を添加する。遠心後の油相中の測定したリン含量ならびに水性相中のリン含量を表１６に示す。
0003824174.tif 000024
実験Ｂ
０．６リットル（５８１ｇ）の粗製ナタネ油を装置に入れ、４０℃に加熱する。ｔ＝３０分において、１．０７ｍｌ（４．３ｍｍｏｌ）の４ＭのＮａＯＨ溶液を添加し、これによりｐＨは約５．０となる。ｔ＝３５分において、適当な量（すなわち、１．６ｍｇの酵素／ｋｇ、および３．２ｍｇの酵素／ｋｇの油））のフザリウム・オキシスポラム（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）からのホスホリパーゼを添加する。遠心後の油相中の測定したリン含量ならびに水性相中のリン含量表１７に示す。
0003824174.tif 000025
要約すると、結果は下記の事実を示す：
Ｌｅｃｉｔａｓｅ、６０℃、ｐＨ５．５
酵素の投与量を１．０から３．０ｍｇ／ｋｇ油まで変化させた。結果を上記表１６に記載する。１．０ｍｇ／ｋｇ油において、油の脱ガム化は遅く、６時間において約２０ｐｐｍを与えた。高い酵素の投与量では、脱ガム化の性能は改良され、３．０ｍｇの酵素／ｋｇ油を使用して約３．５時間において１０ｐｐｍのリン含量を与えた。
より高い酵素の投与量を使用する場合、性能はさらに改良されることが仮定される。
フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）のＰＬ、４５℃、ｐＨ５．０
酵素の投与量１．６および３．２ｍｇ／ｋｇ油を試験し、性能は等しくすぐれることが見出された（上記表１７）。１．６ｍｇの酵素／ｋｇ油−または多分これより低い−では、きわめてすぐれた脱ガム化が約２時間において観測され、９ｐｐｍのＰを与えた。なおより低い量のフザリウム・オキシスポラム（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）のホスホリパーゼ（例えば、０．９ｍｇ／ｋｇ油）を使用することができ、なおすぐれた脱ガム化性能が得られることが予測される。
実施例１８
フザリウム・クルモラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｕｌｍｏｒｕｍ）から得られるホスホリパーゼ調製物を使用する水脱ガム化された食用油の脱ガム化
上記実施例１０に記載する「酵素的脱ガム化を実施する一般的手順」に従い、実験を実施した。
油：
アルフス・オリエファブリク（Åｒｈｕｓ  Ｏｌｉｅｆａｂｒｉｋ）（ＡＯＭ）からの水−脱ガム化されたナタネ油。
バッチＣ００７３０／Ｂ０１７００、Ｐ含量２３１ｐｐｍ。
酵素：
フザリウム・クルモラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｕｌｍｏｒｕｍ）から発酵ブロス。
フザリウム・クルモラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｕｌｍｏｒｕｍ）株を培養し、遠心し、そして上清を後述するように精製した。
フザリウム・クルモラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｕｌｍｏｒｕｍ）ＣＢＳ５１３．９４株（寄託日：１９９４年１０月２５日）の種培養物を、１００ｍｌの下記の組成物を含有する５００ｍｌの震盪フラスコ中の生産した：
コーンスティープリカー（乾燥）  １２ｇ／ｌ
グルコース                      ２４ｇ／ｌ
各フラスコに０．５ｇのＣａＣＯ3および０．５ｍｌの油を添加する。
ｐＨを５．５に調節した後、オートクレーブ処理する。
２６℃および２５０ｒｐｍにおいて３日後、５ｍｌの種培養物の各々を１００ｍｌの下記の培地を含有する震盪フラスコの中に接種した：
ペプトン、Ｄｉｆｃｏ  ０１１８            ６ｇ／ｌ
ペプチカーゼ、Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄ
Ｐｒｏｄｕｃｔｓ                          ４ｇ／ｌ
酵母エキス、Ｄｉｆｃｏ  ０１２７          ３ｇ／ｌ
肉エキス、Ｄｉｆｃｏ  ０１２６        １．５ｇ／ｌ
デキストロース、Ｒｏｑｕｅｔｔｅ
１０１−０４４１                          １ｇ／ｌ
オリーブ油、Ｓｉｇｍａ                  １０ｇ／ｌ
ｐＨを７．３〜７．４に調節した後、オートクレーブ処理する。
２６℃および２５０ｒｐｍにおいて９日間培養する。ブロスを遠心し、濾過（０．４５μｍ）し、上清を収集し、下に示す脱ガム化実験のために供給する。
推定された活性：２００ＰＨＬＵ／ｍｌ。
実験：フザリウム・クルモラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｕｌｍｏｒｕｍ）から得られたホスホリパーゼ調製物を使用する水脱ガム化された油の酵素的脱ガム化
０．６リットル（５８１ｇ）の粗製ナタネ油を装置に入れ、４０℃に加熱する。ｔ＝３０分において、１．４３ｍｌ（５．７ｍｍｏｌ）の４ＭのＮａＯＨ溶液を添加し、これによりｐＨは約５．５となる。ｔ＝３５分において、適当な量（すなわち、１０７０ＰＨＬＵ／ｋｇ油）のフザリウム・クルモラム（Ｆ．ｃｕｌｍｏｒｕｍ）からのホスホリパーゼを添加する。遠心後の油相中の測定したリン含量ならびに水性相中のリン含量表１８に示す。
0003824174.tif 000026
実施例１９
デゴマ（Ｄｅｇｏｍｍａ）ＶＯＤを使用する粗製油の酵素的脱ガム化
油
粗製ナタネ油Ｃ００７４５／Ｂ０１７００、Ｐ含量４５９ｐｐｍ．
酵素
商業的に入手可能なホスホリパーゼ、デゴマ（Ｄｅｇｏｍｍａ）ＶＯＤ
0003824174.tif 000027
推定濃度１０ｍｇ／ｍｌ。
０．６リットル（５８１ｇ）の粗製ナタネ油を装置に入れ、５０℃に加熱する。ｔ＝３０分において、０．７１４ｍｌ（２．８６ｍｍｏｌ）の４ＭのＮａＯＨ溶液を添加し、これによりｐＨは約４．５となる。ｔ＝３５分において、適当な量（すなわち、３．６ｍｇ／ｋｇ油、または７．１ｍｇ／ｋｇ油）の精製されたデゴマ（Ｄｅｇｏｍｍａ）ＶＯＤホスホリパーゼを添加する。遠心後の油相中の測定したリン含量ならびに水性相中のリン含量表１９に示す。
0003824174.tif 000028
この実施例が例示するように、デゴマ（Ｄｅｇｏｍｍａ）ＶＯＤは食用油を脱ガム化することができる。しかしながら、前記油の満足すべき脱ガム化を得るためには、本発明のフザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）のホスホリパーゼに比較して、比較的高い量のデゴマ（Ｄｅｇｏｍｍａ）ＶＯＤを必要とする。比較のため、例えば、実施例１６および１７を参照。
実施例２０
パン改良剤としてのフザリウム・オキシスポラム（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）から得られたホスホリパーゼの使用
材料および方法
パンの製造
ヨーロッパのストレートの練り粉パンおよびロールを下記の基本的処方から製造した：
基本的処方
小麦粉（Ｍｅｎｅｂａ  ＢＢＺ）  １００％（２０００ｇ）
水                                ６１％
酵母                                ４％
塩                              １．５％
砂糖                            １．５％
アスコルビン酸                  ４０ｐｐｍ
ベーキング手順
混合（スパイラルミキサー）、６２５ＲＰＭ      ３分
混合（スパイラルミキサー）、１２５０ＲＰＭ    ３．５分
練り粉の評価                                  ７分
発酵（室温）                                  １５分
シーティング／成形                            ３分
室温における緩和                              ５分
フォルディング                                ２分
室温における緩和                              ５分
シーティング／成形／パンニング                ２分
プルーフィング（３２℃、８２％の相対湿度）
ロール：                                      ４５分
パンニングされたパン：                        ５５分
ベーキング（２３０℃）
ロール：                                      ２２分
パンニングされたパン：                        ３５分
練り粉および焼かれた製品の評価
練り粉および焼かれた製品の性質を下記のようにして測定した：
比体積指数：パンの一塊またはロールの体積を、伝統的ナタネ置換方法により測定する。比体積をパン１ｇ当たりの体積ｍｌとして計算する。対照（酵素を含まない）の比体積を１００として定義する。相対比体積指数を下記のように計算する：
比体積指数＝（パンの一塊の比体積）／（対照のパンの一塊の比体積）×１００
下記の目盛りに従い、練り粉の粘着性をマニュアルで評価する：
ロールの直立性          非常にフラット          １
フラット                ２
正常                    ３
すぐれる／丸い          ４
非常にすぐれる          ５
丸過ぎる                ６
結果
0003824174.tif 000029
レシチンを含有しない処方において、ロールおよびパンニングされたパンの双方に対して、フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）のホスホリパーゼは明瞭に体積を増加することを、結果は示す。処方にレシチンを添加する場合、なおいっそうすぐれた効果が得られるが、レシチンは体積それ自体に寄与しない。スタトグラフィックス・プラス（Ｓｔａｔｇｒａｐｈｉｃｓ  Ｐｌｕｓ）において実施された、統計学的解析（ＡＮＯＶＡ、α＝０．０５）は、ホスホリパーゼとレシチンとの間の有意な陽性の相乗性を示す。
処方におけるレシチンの存在および非存在の双方において、フザリウム・オキシスポラム（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）のホスホリパーゼを使用して、有意に改良されたロールの形状（ロールの直立性）が得られる。この実施例において、レシチンとホスホリパーゼ（１５００ＬＵ／ｋｇ小麦粉）を組合わせることによって、最良のロールの直立性が得られた。
実施例２１
パンにおける品質変化の防止剤としてフザリウム・オキシスポラム（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）から得られたホスホリパーゼの使用
材料および方法
パンの製造
ヨーロッパのストレートの練り粉パンおよびロールを下記の基本的処方から製造した：
基本的処方
小麦粉（Ｍｅｎｅｂａ  ＢＢＺ）  １００％（２０００ｇ）
水                                ６１％
酵母                                ５％
塩                              １．５％
砂糖                            １．５％
アスコルビン酸                  ４０ｐｐｍ
ベーキング手順
混合（スパイラルミキサー）、６２５ＲＰＭ      ３分
混合（スパイラルミキサー）、１２５０ＲＰＭ    ３．５分
練り粉の評価                                  ７分
発酵（室温）                                  １５分
シーティング／成形                            ３分
室温における緩和                              ５分
フォルディング                                ２分
室温における緩和                              ５分
シーティング／成形／パンニング                ２分
プルーフィング（３２℃、８２％の相対湿度）    ５５分
ベーキング（２３０℃）                        ３５分
この実施例において、パンの一塊を蓋付きパンの中でパンニングして、テキスチャーの分析の前における比体積の差を回避した。冷却後、パンの一塊を室温において貯蔵し、プラスチックのバッグの中の中に包装した。
焼かれた製品の評価
ＡＡＣＣ法７４−０９に従い、品質変化およびテキスチャーの評価を実施した。パンの品質変化のインジケーターとしてのパン小片の柔軟性の評価を、下記の手順に従い、ベーキング後、第０、１、３、および７日に実施した：
パンのスライスをテキスチャー分析装置（ＴＡ  ＴＸ−２）において一定速度で圧縮し、そして圧縮力（ｇ）を測定した。パンが品質を変化させるにつれて、パン小片の固さは増加する。
結果
固さの測定値の結果を貯蔵日数の関数として表２に示す。レシムルチン（Ｌｅｃｉｍｕｌｔｉｎ）を１ｇ／ｋｇ小麦粉の濃度で添加し、そしてフザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）のホスホリパーゼを５００Ｕ／ｋｇ小麦粉の投与量で添加した。表におけるすべての数値は６回の測定の平均値である（２つのパンの一塊、各々についての３回の測定）。
0003824174.tif 000030
表２１に示すように、ホスホリパーゼで処理したパンは３日までの貯蔵において対照よりもわずかに柔軟であった。レシチンと組み合わせると、有意な品質変化防止効果が貯蔵期間全体を通じて得られた（レシチンまたはホスホリパーゼの単独では得られない）。
配列表
配列番号１は、本発明のクローン化されたＤＮＡ配列を示し、ホスホリパーゼ活性を示す酵素をコードするＤＮＡ配列を含む。
（２）配列番号：１についての情報
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：１１７０塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（vi）起源：
（Ａ）生物名：フザリウム・オキシスポラム
（Ｂ）菌株：ＤＳＭ  ２６７２
（ix）特性
（Ａ）名称／鍵：ＣＤＳ
（Ｂ）位置：２３．．１０６３
（ｘｉ）配列の記載：配列番号：１
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0003824174.tif 000032
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配列番号２は、本発明のホスホリパーゼのアミノ酸配列を示す。
（２）配列番号：２についての情報
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：３４６アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（ｘｉ）配列の記載：配列番号：２
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【図１】
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【図２】
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