(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試薬成分として、少なくとも以下の成分(1)〜(3)を含有することを特徴とする、体液中のマグネシウム測定用試験片。
(1)ｏ−クレゾールフタレインコンプレキソン
(2)Ｏ，Ｏ’−ビス（２−アミノフェニル）エチレングリコール−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸
(3)ｐＨ８．５〜１１．０に緩衝するｐＨ緩衝剤
【請求項２】
ｐＨ緩衝剤は、さらに好ましくはｐＨ９．５〜１０．０に緩衝する、特許請求の範囲第１項に記載の試験片。
【請求項３】
さらにイオン性界面活性剤を含有する、特許請求の範囲第１項に記載の試験片。
【請求項４】
水非透過性支持体と該支持体上に担持された検出部位とからなる試験片であり、該検出部位は、水不溶性の多孔性素材からなる試料保持層と、水溶性ポリマーからなるバインダー層とからなり、請求項１記載の試薬成分を該試料保持層とバインダー層の片層のみか、又は両層にまたがって存在させることを特徴とする、体液中のマグネシウム測定用試験片。
【請求項５】
さらにイオン性界面活性剤を含有する、特許請求の範囲第４項に記載の試験片。
【請求項６】
検出部位における各構成成分の乾燥重量％比率が以下のものである、特許請求の範囲第５項に記載の試験片。
・ｏ−クレゾールフタレインコンプレキソン；０．０５〜０．３％
・Ｏ，Ｏ’−ビス（２−アミノフェニル）エチレングリコール−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸；０．３〜５．０％
・ｐＨ緩衝剤；０．３〜５．０％
・イオン性界面活性剤；０．３〜２０％
・水溶性ポリマー；０．５〜２０％
・水不溶性の多孔性素材；６５〜９５％
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は液体試料、特に血清・血漿といった体液中のマグネシウムを簡便に測定するための乾式の試験片に関する。
【０００２】
【従来の技術】
生体内においてマグネシウムはカルシウムに次いで含有量の多い２価金属であり、種々の生体内の反応に深く関与する重要な必須元素である。血清・血漿中のマグネシウム濃度はカルシウム濃度と拮抗的に変動し、中枢神経系や心臓の機能不全時、あるいは腎不全、急性膵炎時などにその変動が観察されることから、マグネシウムの測定は重要な検査項目の一になりつつある。
【０００３】
２価金属キレート指示薬を用いて液体試料中のマグネシウム濃度を比色定量・測定する方法は従来から種々知られている。最も利用されている金属キレート指示薬はキシリジルブル−Ｉである。また、（株）同仁化学カタログ第１９版（平成６年５月３１日発行）によると、エリオクロームブラックＴ，カルシクローム，カルボキシアルセナゾ，カルマガイト，クロロホスホナゾＩＩＩ，メチルチモールブルー，Ｏ−クレゾールフタレインコンプレキソン，スパンズ，キシレノールオレンジ等もマグネシウムの比色定量が可能であると記載されている。
【０００４】
上記の先行技術で使用されている金属キレート指示薬において、ホルマザン誘導体を除くいずれの指示薬も、キレート作用機能部分がアリルアゾ構造であり、色素部分はナフトール構造である。
【０００５】
これらの金属キレート指示薬で生体試料中のマグネシウムを比色定量する場合、いずれの指示薬を使用する場合でも、共存するカルシウムの影響を回避するためにカルシウムに対してのマスキング剤を添加する必要がある。
【０００６】
マグネシウムとカルシウムの共存下でのカルシウムの選択的マスキング剤としては、Ｏ，Ｏ’−ビス（２−アミノメチル）エチレングリコール−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（略名ＧＥＤＴＡ）がよく用いられるが、その他には、トランス−１，２−ジアミノシクロヘキサン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，−テトラ酢酸（略名ＣｙＤＴＡ）、Ｏ，Ｏ’−ビス（２−アミノフェニル）エチレングリコール−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（略名ＢＡＰＴＡ）などが知られている。
【０００７】
その他の２価金属、たとえば鉄・銅・亜鉛をマスキングするために、トリエタノールアミンやシアン化化合物を添加する方法もまた公知である。
【０００８】
これらの組み合わせによるマグネシウム測定用試薬成分を調製することは、当業者にとってはもはや容易に考え得ることであり、数多くのマグネシウム測定用試薬成分が考案・実施されている。例えば、最も汎用されている組み合わせはキシリジルブルーＩとＧＥＤＴＡの組み合わせであり、多くの試薬キットが市販されている。特許では、クロロホスホナゾＩＩＩとＧＥＤＴＡまたはＢＡＰＴＡの組み合わせ（特開平４−１２０４６４号）、アルセナゾＩとＧＥＤＴＡまたはＢＡＰＴＡの組み合わせ（欧州特許５９７９００号）、ホルマザン誘導体を使用する方法（特開平５−１１９０８号）等が開示されている。
【０００９】
また米国特許５３９７７１０号は、血球分離能を備えた全血用乾式試験片に関するものであり、そこに開示の組み合わせは、指示薬がエリオクロムブラックＴ，カルマガイト，マゴン，クロロホスホナゾＩＩＩ，ヒドロキシナフトールブルー，アルセナゾＩ，スパンズ等で、マスキング剤はＧＥＤＴＡを使用している。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
さて、乾式試験片といったドライ化試薬は、臨床的診断において従来の液系試薬よりも迅速で、簡単で、安価なため、多用されている。試験片を使用して液体試料中の対象物質を臨床的診断する際、その試料は多くの場合希釈されない血清・血漿又は尿などであり、分析対象物質はかなりの高濃度で含まれている場合が多い。マグネシウムの場合も例外ではなく、血清・血漿の場合はヒトの正常値でも１．８〜２．０ｍｇ／ｄｌ、異常高濃度の場合では５．０〜６．０ｍｇ／ｄｌに達する場合もある。試験片は、これらの異常値をも測定できる性能を有していなければならない。
【００１１】
つまり、異常値をも測定できる性能を有するマグネシウム測定用乾式試験片を金属キレート指示薬を用いて作製する場合、試料中のマグネシウム濃度（異常値を含めた、目標とする測定レンジ上限濃度）に対して必要十分量のキレート指示薬を試薬成分としてあらかじめ含ませる必要がある。
【００１２】
ところが、前述のキレート指示薬をそのように必要十分量添加した場合には、マグネシウムと錯体を形成していないフリーで末発色の状態でも、かなりの着色が認められることが判明した。すなわち、初期値において試薬のバックグラウンドの濃い着色を示してしまう（以下、バックグラウンド値が高いと表現する）ために、マグネシウム低濃度試料の測定精度が悪くなるという欠点を有していた。
【００１３】
生体試料、特に血清・血漿のマグネシウム濃度は極めて恒常性が高く、正常値はごく狭い範囲内に限られている。疾病の診断においては、その狭い範囲からのわずかなズレの検出が重要であるために、測定精度の悪さは致命的欠点であった。
【００１４】
また更に本発明者らは、従来のマグネシウムキレート指示薬とカルシウムマスキング剤の考えられる試薬成分の組み合わせをドライ化加工し、種々のマグネシウム測定用試験片を作製したが、先行技術と全く同じ組み合わせを含めた全ての組み合わせにおいて、カルシウムの影響を必ず受けてしまうことが判明している。
【００１５】
そして、そのように得られた乾式試験片の保存安定性についても、冷蔵保存状態（摂氏４〜８度条件下）でも不安定なものが多かった。
【００１６】
よって本発明の目的は、バックグラウンド値が低く、広い測定レンジ全域で良好な測定精度を有し、カルシウムの影響も一切受けず、しかも保存安定性の良い、乾式のマグネシウム測定用試験片を提供することである。
【００１７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、金属キレート指示薬成分としてｏ−クレゾールフタレインコンプレキソン（略名ＯＣＰＣ）を用い、カルシウムのマスキング剤としてＯ，Ｏ’−ビス（２−アミノフェニル）エチレングリコール−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（略名ＢＡＰＴＡ）を用い、さらに、ｐＨ８．５〜１１．０に緩衝するｐＨ緩衝剤を併用し、乾式試験片の試薬成分とすることで、上記の問題を全て解決できるマグネシウム測定用試験片が作製できることを発見した。
【００１８】
【発明の実施の形態】
ＯＣＰＣを用いてカルシウム又はマグネシウムを測定する技術は既に公知の方法であるが、ＯＣＰＣとＢＡＰＴＡを選択的に組み合わせることにより、マグネシウムの特異的測定に応用した技術は従来なかったものである。本発明者らは、試薬成分として、金属キレート指示薬成分としてＯＣＰＣを、カルシウムに対するマスキング剤としてＢＡＰＴＡを使用して試験片を作製したとき、マグネシウム測定の感度を下げることなく、カルシウムの影響を完全に遮断できることを見い出した。
【００１９】
ＯＣＰＣとＢＡＰＴＡは両者とも２価金属に対するキレート剤であるために、マグネシウムとカルシウムの両者に対して反応する。しかし、マグネシウムに対してはＢＡＰＴＡよりＯＣＰＣの方がはるかに強固にキレート化し、カルシウムに対してはＯＣＰＣよりＢＡＰＴＡの方がはるかに強固にキレート化する。本発明はこの原理を応用し、ＯＣＰＣとＢＡＰＴＡとの組み合わせを特異的に選択することにより完成されたものである。
【００２０】
乾式試験片はその試薬部分の呈色を光学的に測定されるが故に、試薬部分のバックグラウンドの着色の度合いが低いことが好ましいことは当然である一方、キレート指示薬濃度が不十分であると測定レンジ上限付近の測定が不能となるために、高濃度に添加する必要がある。しかし先述のように、あまりに過剰に添加すると試薬部分のバックグラウンド値が高くなってしまう。ところが、本発明で使用されるＯＣＰＣは高濃度に添加しても他のキレート指示薬と比較してもバックグラウンド値が非常に低く、試験片にするために大量に添加しても反応前は淡い桃色で、無色に近い。よって、測定精度は保たれ、精密度の高い試験片を完成できる。
【００２１】
ＯＣＰＣによるマグネシウム測定時の感度は、反応系のｐＨが高ければ高いほど（アルカリ性であるほど）高くなる。しかし、ＯＣＰＣはマグネシウムが存在しなくてもアルカリ性側になると発色してしまう。つまり乾式試験片へ加工する際には、感度を上げるために強アルカリ性側にするとバックグラウンド値が高くなり、中性付近へすると感度が落ちるという問題が生じ、そのため現在まで実用化は見送られていた。しかし本発明では、反応系をｐＨ８．５〜１１．０に緩衝するｐＨ緩衝剤を使用することで、感度の低下もなく、バックグラウンドの低い試験片を得られた。これは同時に、試験片作製中の雰囲気中に含まれる炭酸ガスの影響によるｐＨの低下も抑えられる。
【００２２】
ｐＨ緩衝剤は、ｐＨ８．５〜１１．０の範囲で使用でき、かつ乾燥させても成分が揮発しないものであれば、この種の試験片で公知公用の緩衝剤の中から任意で使用できる。具体例を挙げれば、ホウ酸−水酸化ナトリウム緩衝剤、炭酸水素ナトリウム−炭酸ナトリウム緩衝剤、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝剤、ＣＨＥＳ緩衝剤、ＣＡＰＳＯ緩衝剤等である。ｐＨは８．５〜１１．０の範囲であればマグネシウムの測定が十分可能であるが、より好ましくは９．５〜１０．０の範囲がよい。
【００２３】
ＯＣＰＣを含めた一般の金属キレート反応系において、体液特に血清・血漿試料中のマグネシウムを測定する場合、試料中のタンパク質、特にアルブミンの影響を受けることも知られている。これはマグネシウムがアルブミンに吸着される性質によるものであるが、血清・血漿中のマグネシウムのうち、アルブミンに吸着するマグネシウムの割合は約３０％とほぼ一定しており、測定時には数値化して容易にキャンセルされるために実用上は通常問題ない。
【００２４】
しかし、まれに起こりうる極端なアルブミン高濃度の試料の場合、影響を無視できない場合も生じてくる。本発明では、イオン性界面活性剤を更に添加することにより、極端なアルブミン高濃度値の試料を含む複数検体間のばらつきを抑え、回避することが可能になった。イオン性界面活性剤の例として、アニオン系界面活性剤ではドデシル硫酸ナトリウム、カチオン系ではテトラデシルトリメチルアンモニウムブロミドが具体例として挙げられるが，同様の作用を有するイオン性界面活性剤であればいずれの化合物を使用してもよいことは当業者ならば明らかであろう。
【００２５】
本発明の試薬成分を含むマグネシウム測定用試験片のうち、好ましく適用できる形態は、本発明の試薬成分を含む検出部位と、該検出部位の土台となる水不透過性支持体から形成されてなる、一般的な試験片である。検出部位は、支持体上に積層される水溶性のバインダー層と水不溶性の多孔性素材からなる試料保持層とにより構成される。本発明の試薬成分は、該バインダー層か該試料保持層の片層のみか、又は両層にまたがって存在させる。
【００２６】
検出部位全体に対して、ＯＣＰＣは乾燥重量％で０．０５〜０．３％の範囲で含まれることが好ましい。
【００２７】
カルシウムをマスキングするためのＢＡＰＴＡは、共存が予想されるカルシウムの濃度に対して充分量添加しておけばよい。血清・血漿を測定する場合であれば、検出部位全体に対して、ＢＡＰＴＡは乾燥重量％で０．３〜５．０％の範囲で含まれることが好ましい。
【００２９】
アルカリ性側へ緩衝するｐＨ緩衝剤は、検出部位全体中で乾燥重量％で０．３〜５．０％が好ましい。
【００３０】
バインダー層が試薬成分を含む場合、このバインダー層は、検出部位の製造時においては試料保持層のラミネート時の接着剤になると同時に、試薬成分をむらなく均一に存在させ、また測定時には発色を均一に保つための層である。
【００３１】
試料は血清・血漿といった水性の液体なので、バインダー層の材質は水溶性ポリマーを使用し、マグネシウムやカルシウムが実質的に含有されないものであれば任意のものが使用できる。具体例を挙げれば、ポリアクリルアミド、ポリビニルピロリドンなどである。試薬成分を含む水溶液中へこれらポリマーを添加し、水溶液が適度な粘度になるように調製して塗布液を得る。塗布液状態での濃度は、ポリアクリルアミドであれば４．０〜６．０重量％、ポリビニルピロリドンであれば１０〜１５重量％である。適度な粘度に調製するために使用されるポリマーの量は、検出部位全体に対し、その種類により乾燥後の重量％で０．５〜２０％の範囲内で大きく変化する。上記のバインダー層には試薬成分を含まず、下記に示す試料保持層にのみ試薬成分を含浸形態で存在させることもできる。
【００３２】
試料保持層は、試料の適用時には試料を検出部位面に均一に横方向に展延させ、試料を保持しつつ試薬と試料を反応させ、反応後の試薬を光学的に検出できる態勢にする目的で使用されるものである。試料保持層に使用する不溶性の多孔性素材は、セルロースあるいはガラス繊維製の濾紙、メンブレンフィルター、天然繊維や化学繊維よりなる織物生地などを、必要に応じて洗浄・乾燥して使用する。好ましい具体例としては、織物生地を用い、これを湿らせた状態，又は乾燥したままの状態でバインダー層上に圧着・ラミネートさせる。試料保持層となる水不溶性の多孔性素材の乾燥時の重量％は、検出部位全体に対して６５〜９５％を占める。
【００３３】
検出部位の土台として使用される水不透過性支持体は、この種の乾式試験片で使用されるポリエチレンテレフタレートやポリスチレンなどのプラスチックからなる、厚さ５０μｍから１ｍｍ、好ましくは１００μｍから３００μｍの白色のフィルムで、表面を粗面処理したものが用いられる。
【００３４】
バインダー層のもととなる塗布液は、水不透過性支持体上に濡れ厚さ５０μｍ〜３００μｍの範囲で均一に塗布する。好ましくは濡れ厚さ１００〜２００μｍの範囲がよく、塗布方法は公知の方法を用いればよい。塗布されたバインダー層は、４０〜６０℃の温風により送風乾燥させる。
【００３５】
試料保持層をバインダー層上へラミネートする際、バインダー層中の試薬成分がポリマーごと試料保持層へ移動することもあり、本発明において定義される検出部位においては、両者が明確に分離していない場合もあり得る。いずれにせよ、検出部位中の試料保持層とバインダー層の両者には任意に、本発明で使用されるＯＣＰＣとＢＡＰＴＡの組み合わせと、ｐＨ緩衝剤を含む。
【００３６】
高濃度アルブミン試料に対してイオン性界面活性剤を添加する際、検出部位全体の中でイオン性界面活性剤の量は、乾燥重量％で０．３〜２０％が好ましい。界面活性剤の添加が乾燥重量％で１．０％までは、アルブミン影響回避効果が如実に現れるが、１．０％を過ぎたあたりからは、界面活性剤を添加する量に対して回避効果がそれほど大きく現れない。しかし、添加すればするほど効果はあるので、飽和するまで（乾燥重量％で２０％）添加しても差し支えはない。
【００３７】
検出部位にはこれら以外の成分、例えばカルシウム以外の金属をマスキングするためのシアン化化合物や、金属キレート指示薬の安定化剤なども添加可能である。
【００３８】
上記のようにして得られる本発明の乾式試験片の検出部位原反を水不透過性支持体と共に小片に裁断し、指で持つための短冊状ベースフィルム上へ水不透過性支持体側をフィルム側にして貼り付け、持ちやすい試験片として完成させる。この状態の断面図を図１に示す。このベースフィルムは単なる取っ手であり、本発明の必須構成要素ではない。検出部位原反を不透過性支持体と共にそのまま短冊状に裁断すれば、ベースフィルムなしに本発明による試験片は得られる。
【００３９】
試験片の検出部位上へ液体試料を適当量点着し、反応が終了した後に検出部位側、又は支持体側から反射率を測定する（ただし、支持体側から測定する際には、支持体と取っ手の材質が光透過性である必要がある）。波長は、マグネシウムとＯＣＰＣとのキレート錯体の吸収ピークに近い波長であればよい。好ましくは５６５〜５７５ｎｍである。
【００４０】
【実施例】
本発明の試薬成分を含むマグネシウム測定用乾式試験片の作製手順と、得られた試験片を使用しての測定結果を以下に示す。
【００４１】
●試薬成分溶液（塗布液）の調製
（処方）
ｏ−クレゾールフタレインコンプレキソン（同仁化学）；１．５０ｍｍｏｌ／ＬＯ，Ｏ’−ビス（２−アミノフェニル）エチレングリコール−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸四カリウム塩（同仁化学）；１６ｍｍｏｌ．Ｌ
ホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．５）（和光純薬）；３００ｍｍｏｌ／Ｌ
ドデシル硫酸ナトリウム（和光純薬）；１０．０重量％
１０％ポリアクリルアミド（ナカライテスク）；５．０重量％
【００４２】
●検出部位の原反の形成
上記の溶液を厚さ２００μｍの白色ポリエチレンテレフタレートフィルム上に厚さ１２０μｍ（ウエット状態）に塗布し、４５℃で１５分間送風乾燥した。これに、０．１重量％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（ナカライテスク）の水溶液で均一に湿らせた厚さ約２５０μｍの織物生地を圧着し、再び４５℃で１５分間送風乾燥させた。
【００４３】
乾燥後の検出部位原反は１ｍ２あたり以下の成分を含有することになる。
ｏ−クレゾールフタレインコンプレキソン；  ０．０９％
Ｏ，Ｏ’−ビス（２−アミノフェニル）エチレングリコール−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸四カリウム塩；                    ０．８８％
ホウ酸；                                  １．８０％
水酸化ナトリウム；                        ０．７８％
ドデシル硫酸ナトリウム；                １０．８６％
ポリアクリルアミド；                      ０．７１％
ＴｒｉｔｏｎＸ−１００；                  ０．０３％
織物生地；                              ８４．８６％
【００４４】
●試験片の作製
得られた試験片原反は５ｍｍ×７ｍｍの小片に裁断し、取っ手となる短冊状（５ｍｍ×８０ｍｍ）の厚さ０．５ｍｍの白色ポリエチレンテレフタレート製のベースフィルムの先端に両面テープで貼り付け、試験片とした。この時点での検出部位付近の断面図は図１と同様である。
【００４５】
●測定操作
測定装置として、（株）京都第一科学の卓上反射率測定装置スポットケムＳＰ−４４１０を使用した。３７℃に温度調整されたテーブル上に試験片を乗せ、上から５．０μｌの血清試料を点着した。３分後に波長５７５ｎｍにおける反射率（Ｒ）を測定した。反射率（Ｒ）はクベルカームンクの式（※）によりＫ／Ｓ値に換算した。
※クベルカームンクの式：Ｋ／Ｓ＝（１−Ｒ）２／２Ｒ
【００４６】
既知濃度試料を測定することにより、「Ｋ／Ｓ値−マグネシウム濃度」間の検量線をあらかじめ作製した。検量線を図２に示す。それをもとに試料中のマグネシウム濃度を算出した。
【００４７】
●同時再現性の確認
本発明の試験片における同時再現性を示すために、マグネシウムの低濃度（試料１），正常濃度（試料２），高濃度（試料３）の３種類の血清試料をそれぞれ１２回ずつ同時測定した結果を表１に示す。それぞれの試料で変動係数が３％以内という、非常に良好な同時再現性を示した。
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【００４８】
●カルシウムの影響の確認
本発明の試験片においてカルシウムの影響を受けないことを示すために、塩化カルシウムをマグネシウム正常値血清及び高濃度血清へ添加し、マグネシウム測定値へ与える影響を調べた。結果、図３に示すとおりに、カルシウム添加濃度２０ｍｇ／ｄｌまで全く影響を受けないことが分かった。
【００４９】
●保存安定性の確認
本発明の試験片を乾燥剤とともにガラス瓶中に密封し、冷蔵状態（４℃）で保存した場合の安定性を調べた。図４の横軸に示した日数（初期，６，１２，１８ヶ月）経過した後に、保存後の試験片を利用してマグネシウム正常値血清と高濃度血清を各６回ずつ測定した。６回の平均を取りグラフを描いたところ、図４に示したとおり感度の変化はほとんど認められず、非常に安定な試験片であることが確認された。
【００５０】
【発明の効果】
以上詳述したように、本発明によれば、従来の試薬成分を含む試験片と異なり、測定レンジ全域で良好な測定精度を有し、バックグラウンド値が低く、共存するカルシウムの影響も一切受けない、保存安定性が良い、使用が非常に簡便な、体液中のマグネシウムを短時間に測定するための乾式試験片を得ることができた。
【００５１】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明の試験片の検出部位付近の断面図である。
【図２】図２は、本発明の試験片で実際に光学測定する際の検量線を示したグラフである。
【図３】図３は、本発明の試験片に対するカルシウムの影響を示したグラフである。
【図４】図４は、本発明の試験片の保存安定性を示したグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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