(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
カゼイン及び／又はカゼインを蛋白質加水分解酵素で加水分解したカゼイン分解物を有効成分とする腸管保護剤。
【請求項２】
カゼインがβ−カゼインである請求項１記載の腸管保護剤。
【請求項３】
蛋白質加水分解酵素がトリプシンである請求項１又は２記載の腸管保護剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、カゼイン及び／又はカゼインを蛋白質加水分解酵素で加水分解したカゼイン分解物を有効成分とする腸管保護剤に関する。本発明の腸管保護剤は、腸管に存在するタイト・ジャンクション(Tight Junction)の弛緩を打ち消す作用を有し、アレルゲン物質等の透過を抑制するので、アレルギー疾患等の予防や治療に有用である。
【０００２】
【従来の技術】
腸管の上皮細胞間には、粘膜表層細胞同士を洩れなくシールし、表層細胞の周囲を鉢巻き状に取り囲んでいるタイト・ジャンクションが存在しており、イオン等の低分子物質は、このタイト・ジャンクションの間を通り抜けて体内に吸収されることが知られている。また、消化されずに残った細菌、ウイルス、蛋白質等の巨大分子も腸管の上皮細胞間を通り抜けて体内に吸収される場合があり、これが感染症や食物アレルギーを誘発し、増悪する要因の一つと考えられている。特に、乳幼児においては、腸管及びそれに付属する器官の発達が充分でないので、巨大分子が腸管の上皮細胞間を通り抜けて体内に吸収されてしまう機会が多く、これが感染症や食物アレルギーの原因となっている。そこで、先に本発明者らは、経口的に摂取することができ、タイト・ジャンクションの形成を促進するような物質を有効成分とする腸管透過抑制剤を提案した (特願平6-234282号公報) 。
【０００３】
一方、食品成分中には、グルコース、サイトカラシンＤ等のようにタイト・ジャンクションを弛緩する作用を有するものがある。また、アレルギー性炎症においては炎症性サイトカイン等、生体側の炎症作用によってもタイト・ジャンクションが弛緩されると考えられる。このように、タイト・ジャンクションは食品成分や炎症作用により弛緩される危険に常に曝されている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らは、食品成分や炎症作用による腸管上皮細胞間のタイト・ジャンクションの弛緩を防止し、感染症や食物アレルギーの予防及び治療を行うという観点から、タイト・ジャンクションの弛緩を防止することができる物質を求めて鋭意研究を進めたところ、カゼイン及び／又はカゼインを蛋白質加水分解酵素で加水分解したカゼイン分解物にタイト・ジャンクションの弛緩を防止する作用があることを見出した。そして、これらの物質を使用して動物実験を行ったところ、タイト・ジャンクションの弛緩を防止してアレルゲン物質の透過を抑制することができることを見出し、本発明を完成するに至った。したがって、本発明は、カゼイン及び／又はカゼインを蛋白質加水分解酵素で加水分解したカゼイン分解物を有効成分とする、食品成分や炎症作用によるタイト・ジャンクションの弛緩を防止し、アレルゲン物質の透過を抑制して感染症や食物アレルギーを予防及び治療する効果を有する腸管保護剤を提供することを課題とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明では、食品成分や炎症作用によるタイト・ジャンクションの弛緩を防止し、アレルゲン物質の透過を抑制して感染症や食物アレルギーを予防及び治療する効果を有する腸管保護剤の有効成分として、β−カゼイン等のカゼイン及び／又はカゼインを蛋白質加水分解酵素で加水分解したカゼイン分解物を使用する。また、カゼイン及び／又はカゼインを蛋白質加水分解酵素で加水分解したカゼイン分解物は、通常行われているように、蛋白質加水分解酵素で蛋白質を加水分解する。
【０００６】
なお、これらの物質の腸管保護効果については、先に本発明者らが確立したタイト・ジャンクションの物質透過性を定量する実験系を用いて行った。以下、その実験系について説明する。
【０００７】
ヒト結腸癌由来の培養細胞株であるCaco-2（ATCC HTB37）を 100μg/ml濃度のタイプＩコラーゲン（新田ゼラチン製）溶液でコーティングした透過性膜（ミリセルＣＭ、ポアサイズ;0.4μm, 0.6cm2 、ミリポア製）上に撒き、10％ウシ胎児血清（バイオセラム製）を含むＤＭＥＭ培地（日水製薬製）で一定期間培養した後、培地を洗浄してハンクス液に置き換え、ミリセルＥＲＳ（ミリポア製）で経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）を測定したところ、培養開始48時間で 550Ω・cm2 となった。これは、タイト・ジャンクションが形成されて安定化したことを示す。
【０００８】
次に、ハンクス液に10mM過酸化水素水を加えて形成されたタイト・ジャンクションを30分間処理したところ、ＴＥＥＲは７割以下にまで低下し、タイト・ジャンクションが弛緩した状態となった。なお、タイト・ジャンクションを弛緩する物質として過酸化水素水を使用した理由は、腸管内で発生した炎症で生じたケミカルメディエーターによりタイト・ジャンクションが弛緩されるのと同様の状況を想定したためである。すなわち、炎症においては、炎症部位周辺の細胞は炎症性サイトカインやケミカルメディエーターを放出するが、特に、この際に細胞から放出される過酸化水素水は腸管壁に影響を及ぼし、タイト・ジャンクションを弛緩する。そして、弛緩したタイト・ジャンクションの間を通り抜けてアレルゲンが体内に吸収され、食物アレルギーが発症又は増幅する。
【０００９】
そこで、過酸化水素水をハンクス液に加える前に、タイト・ジャンクションの弛緩を防止する作用を有する物質の検索に供する物質をハンクス液に加えて形成されたタイト・ジャンクションを30分間処理した後、ハンクス液に10mM過酸化水素水を加えてタイト・ジャンクションを30分間処理し、ＴＥＥＲを測定して、タイト・ジャンクションの弛緩が抑制されたか否かを調べた。
なお、ＴＥＥＲを測定する実験系のモデルを図１に示す。
【００１０】
【試験例１】
本発明のβ−カゼイン、カゼイン、比較例としてβ−ラクトグロブリン、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及びホエー蛋白濃縮物 (ＷＰＣ）を使用してタイト・ジャンクションの弛緩を防止する作用を調べた。すなわち、上記した実験系により、ハンクス液に、10μM β−カゼイン、２％カゼイン、10μM β−ラクトグロブリン、10μM ＢＳＡ又は２％ＷＰＣを加えて形成されたタイト・ジャンクションを30分間処理した後、ハンクス液に10mM過酸化水素水を加えてタイト・ジャンクションを30分間処理し、ＴＥＥＲを測定した。また、過酸化水素水をハンクス液に加える前に処理を行わなかったものを対照とした。その結果を図２に示す。なお、図にある相対ＴＥＥＲとは、タイト・ジャンクションを過酸化水素水で処理する前のＴＥＥＲ値に対する過酸化水素水で処理した後のＴＥＥＲ値である。
【００１１】
このように、形成されたタイト・ジャンクションをβ−カゼイン、カゼイン、β−ラクトグロブリン、ＢＳＡ又はＷＰＣで処理することにより、ＴＥＥＲの低下が抑制されたので、これらの物質が過酸化水素水によるタイト・ジャンクションの弛緩を抑制することが判った。
【００１２】
【試験例２】
β−ラクトグロブリンを使用してタイト・ジャンクションの弛緩を防止する作用の濃度依存性を調べた。すなわち、試験例１と同様の方法により、ハンクス液に５〜 500μM の各濃度に調整したβ−ラクトグロブリンを加えて形成されたタイト・ジャンクションを30分間処理した後、ハンクス液に10mM過酸化水素水を加えてタイト・ジャンクションを30分間処理し、ＴＥＥＲを測定した。また、過酸化水素水をハンクス液に加える前に処理を行わなかったものを対照とした。その結果を図３に示す。なお、図にあるＴＥＥＲ値の幅は、繰り返し６回行った実験の標準誤差である。
【００１３】
このように、形成されたタイト・ジャンクションを５μM β−ラクトグロブリンで処理することによってもＴＥＥＲの低下が抑制され、 500μM β−ラクトグロブリンで処理することによってＴＥＥＲの低下は完全に抑制されることが判った。なお、ＢＳＡ及び本発明のβ−カゼインを使用して行った実験でもほぼ同様の傾向が見られた。
【００１４】
【試験例３】
10％濃度となるようにＢＳＡを溶解した蟻酸アンモニウム緩衝液(pH 8.0)に、基質濃度の 1/100量のトリプシンを添加し、37℃で12時間反応させた後、トリプシンと等量の大豆トリプシンインヒビターを添加することにより反応を停止し、ＢＳＡ分解物を調製した。そして、このＢＳＡ分解物を使用してタイト・ジャンクションの弛緩を防止する作用の濃度依存性を調べた。すなわち、試験例１と同様の方法により、ハンクス液にＢＳＡ換算で５〜 500μM の各濃度に調整したＢＳＡ分解物を加えて形成されたタイト・ジャンクションを30分間処理した後、ハンクス液に10mM過酸化水素水を加えてタイト・ジャンクションを30分間処理し、ＴＥＥＲを測定した。また、過酸化水素水をハンクス液に加える前に処理を行わなかったものを対照とした。その結果を図４に示す。
【００１５】
このように、形成されたタイト・ジャンクションを５μM ＢＳＡ分解物で処理することによってもＴＥＥＲの低下が抑制され、 500μM ＢＳＡ分解物で処理することによってＴＥＥＲの低下は完全に抑制されることが判った。なお、同様にして調製したβ−ラクトグロブリン分解物及び本発明のβ−カゼイン分解物を使用して行った実験でもほぼ同様の傾向が見られた。また、酵素反応を停止するために使用した大豆トリプシンインヒビターについては、タイト・ジャンクションの弛緩を防止する作用は認められなかった。
【００１６】
【試験例４】
動物実験により、ＷＰＣ、ＢＳＡ、ＢＳＡ分解物、β−ラクトグロブリン分解物及び本発明のβ−カゼイン分解物を使用して、腸管保護効果を調べた。なお、ＢＳＡ分解物、β−ラクトグロブリン分解物及びβ−カゼイン分解物については、試験例３に示したＢＳＡ分解物の調製法に準じて調製した。
【００１７】
７週齢のＤＢＡ／２マウス（日本クレア）を１週間予備飼育した後、１群３匹として、１％ＷＰＣ、１％ＢＳＡ、 0.1％ＢＳＡ、１％ＢＳＡ分解物、 0.1％ＢＳＡ分解物、 0.1％β−ラクトグロブリン分解物又は 0.1％β−カゼイン分解物をそれぞれ市販ＣＥ−２粉末飼料（日本クレア製）に添加して調製した飼料を摂取させ、７日間飼育した。そして、24時間絶食、絶飲させた後、10mM過酸化水素水 200μl を経口ゾンデで２時間毎に５回投与した。さらに、 0.5％卵白アルブミン (ＯＶＡ、シグマ製）を含むＣＥ−２粉末飼料を自由摂取させてＯＶＡを経口投与した後、眼底静脈叢より 0.5週 (３日又は４日) 毎に 100μl 採血して血清中ＯＶＡ特異的抗体価の変動を測定した。また、ＣＥ−２粉末飼料のみで飼育した群を対照とした。その結果を図５に示す。
【００１８】
なお、血清中ＯＶＡ特異的抗体価の測定は、以下のように行った。
（１）ＯＶＡを生理的リン酸緩衝液（ＰＢＳ）10μg/mlに溶解した溶液 100μl をＥＬＩＳＡプレートの各ウエルに添加した後、室温で２時間放置してＯＶＡを固定した。
（２）0.05％Tween 20を含む生理的リン酸緩衝液（ＰＢＳＴ）でＯＶＡを固定した各ウエルを３回洗浄した後、10mg/ml 濃度としたＢＳＡを含む0.1Mクエン酸緩衝液(pH 6.4) 200μl を各ウエルに添加し、室温で２時間放置してブロッキングした。
（３）ＰＢＳＴでブロッキングした各ウエルを３回洗浄した後、１％ＢＳＡ及び0.05％Tween 20を含む生理的リン酸緩衝液（ＰＢＳＴＢ）で血清を 100倍に希釈した試料 100μl を各ウエルに添加した。
（４）４℃で17時間放置し、ＰＢＳＴで各ウエルを３回洗浄した後、ビオチン標識抗マウスＩｇＧ（シグマ製）を10,000倍にＰＢＳＴＢで希釈した溶液 100μl を各ウエルに添加した。
（５）室温で１時間放置し、ＰＢＳＴで各ウエルを３回洗浄した後、アビジン標識アルカリフォスファターゼ溶液を 5,000倍にＰＢＳＴＢで希釈した溶液 100μl を各ウエルに添加した。
（６）室温で 0.5時間放置し、ＰＢＳＴで各ウエルを３回洗浄し、1Mジエタノールアミン−塩酸緩衝液(pH 9.8)に0.02％塩化マグネシウム及びp-nitrophenyl phosphate 1mg/mlを溶解させた基質溶液 100μl を各ウエルに添加し、室温で発色させて吸光度(415 nm)を２連で測定した。
【００１９】
なお、試料の非特異的吸着の影響を見るために、ＯＶＡ溶液に代えて10mg/ml 濃度となるようＢＳＡをＰＢＳに溶解した溶液 100μl を各ウエルに添加してＢＳＡを固定したウエルも作成した。また、抗体価は、１群３匹の吸光値の相乗平均とした。
【００２０】
このように、対照群では、ＯＶＡ投与開始後１週でＯＶＡ特異的抗体価が上昇し始めたのに対して、１％ＷＰＣ、１％ＢＳＡ、 0.1％ＢＳＡ、１％ＢＳＡ分解物、 0.1％ＢＳＡ分解物、 0.1％β−ラクトグロブリン分解物又は 0.1％β−カゼイン分解物を添加した飼料を投与した各実験群では、ＯＶＡ特異的抗体価が上昇し始める時期が 0.5〜１週間遅れ、また、抗体価も低い値であった。したがって、これらの物質は、マウス腸管の透過性を減少させて腸管からのＯＶＡの生体内への進入を防止し、食物アレルギーを予防したことが判った。
【００２１】
【発明の実施の形態】
本発明では、腸管保護剤の有効成分として、カゼイン及び／又はカゼインを蛋白質加水分解酵素で加水分解したカゼイン分解物を使用する。そして、粉末、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、ドリンク剤等の形で製剤化し、腸管保護効果を有する医薬として使用しても良いし、各種栄養組成物や飲食品等に配合し腸管保護効果を賦与して使用しても良い。また、年齢、治療効果、病態等により異なるが、カゼイン及び／又はカゼインを蛋白質加水分解酵素で加水分解したカゼイン分解物に腸管保護効果を発揮させるためには、通常、１回に体重１kg当たり 130mg〜13g の範囲で、１日１回から数回経口投与すれば良い。
【００２２】
【実施例１】
カゼイン及び／又はカゼインを蛋白質加水分解酵素で加水分解したカゼイン分解物100gとラクトース 65gを混和し、60メッシュの篩を通した後、アルコール性ポリビニルピロリドン 20gで湿らせ、12メッシュの篩を通して乾燥した。そして、タルク 25gと澱粉 10gを加え、常法により打錠して重量 300mgの腸管保護作用を有する錠剤を製造した。
【００２３】
【実施例２】
カゼイン及び／又はカゼインの分解物100g、メチルセルロース 75g、コーンスターチ 40g及び香料少々を混和し、60メッシュの篩を通した後、アルコール性ポリビニルピロリドン 15gで湿らせ、0.7 mm径ステンレススチールの篩を通し、腸管保護作用を有する顆粒剤を製造した。
【００２４】
【発明の効果】
カゼイン及び／又はカゼインを蛋白質加水分解酵素で加水分解したカゼイン分解物は、タイト・ジャンクションの弛緩を防止する作用を有し、タイト・ジャンクションの間を通り抜けて体内に吸収されるアレルゲン等の物質の透過を防止する効果を有する。したがって、これらの物質を有効成分として含有する腸管保護剤を使用することにより、食物アレルギー等の予防及び治療の効果を発揮させることが可能となる。また、これらの物質は、食品素材として通常使用されている成分であり、安全性の面でも全く問題はない。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＴＥＥＲを測定する実験系のモデルを示す。
【図２】試験例１におけるβ−カゼイン、カゼイン、β−ラクトグロブリン、ＢＳＡ及びＷＰＣのタイト・ジャンクション弛緩防止効果を示す。
【図３】試験例２におけるβ−ラクトグロブリンの濃度の違いによるタイト・ジャンクション弛緩防止効果を示す。
【図４】試験例３におけるＢＳＡ分解物の濃度の違いによるタイト・ジャンクション弛緩防止効果を示す。
【図５】試験例４におけるＷＰＣ、ＢＳＡ、ＢＳＡ分解物、β−ラクトグロブリン分解物及びβ−カゼイン分解物の腸管保護効果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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