(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ基供与体存在下、ピルビン酸とグリオキシル酸から光学活性γ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸を生成する活性を有するシュウドモナス属、パラコッカス属、プロビデンシア属、リゾビウム属、モルガネラ属、エンテロバクター属、アースロバクター属、カウロバクター属、ミクロバクテリウム属、クロトバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、クラビバクター属またはバチルス属に属する微生物の培養物、菌体またはそれらの処理物、アミノ基供与体、ピルビン酸およびグリオキシル酸を水性媒体中に存在させることにより、水性媒体中に光学活性γ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸を生成させ、生成した光学活性γ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸を該水性媒体中より採取することを特徴とする光学活性γ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸の製造法。
【請求項２】
アミノ基供与体存在下、光学活性４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を光学活性γ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸に変換する活性を有するエシェリヒア属、セラチア属、シュウドモナス属、アースロバクター属またはコリネバクテリウム属に属する微生物の培養物、菌体またはそれらの処理物、アミノ基供与体および光学活性４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を水性媒体中に存在させることにより、水性媒体中に光学活性γ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸を生成させ、生成した光学活性γ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸を該水性媒体中より採取することを特徴とする光学活性γ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸の製造法。
【請求項３】
光学活性γ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸がスレオ−γ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸[(2S,4S)-4-hydroxyglutamic acid]またはエリスロ−γ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸[(2S,4R)-4-hydroxyglutamic acid]である請求項１または２記載の製造法。
【請求項４】
ピルビン酸の代わりに、該微生物の培養物、菌体またはそれらの処理物によりピルビン酸に転換され得る化合物を用いる請求項１記載の製造法。
【請求項５】
該微生物の培養物、菌体またはそれらの処理物によりピルビン酸に転換され得る化合物がグルコース、フラクトース、マルトース、グリセロール、乳酸または乳酸アンモニウムである請求項４記載の製造法。
【請求項６】
光学活性γ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸がスレオ−γ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸であり、微生物が、シュウドモナス属、パラコッカス属、プロビデンシア属、リゾビウム属、モルガネラ属、エンテロバクター属、アースロバクター属、カウロバクター属、ミクロバクテリウム属、クロトバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属またはクラビバクター属に属する微生物である請求項１記載の製造法。
【請求項７】
光学活性γ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸がエリスロ−γ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸であり、微生物がバチルス属に属する微生物である請求項１記載の製造法。
【請求項８】
光学活性４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸が、Ｌ−４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸[(S)-4-hydroxy-2-ketoglutaric acid] またはＤ−４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸[(R)-4-hydroxy-2-ketoglutaric acid] である請求項２記載の製造法。
【請求項９】
微生物が、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ（α-ketoglutarate dehydrogenase）活性および光学活性４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸分解活性の少なくとも一種の活性が低下または欠失した菌株である請求項２または８記載の製造法。
【請求項１０】
微生物が、グルタミン酸デヒドロゲナーゼを増強された菌株である請求項１〜９のいずれか1項に記載の製造法。
【請求項１１】
光学活性４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸が、ピルビン酸とグリオキシル酸から光学活性４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を生成する活性を有するバチルス属、シュウドモナス属、パラコッカス属、プロビデンシア属、リゾビウム属またはモルガネラ属に属する微生物の培養物、菌体またはそれらの処理物、ピルビン酸およびグリオキシル酸を水性媒体中に存在させることにより、生成した光学活性４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸である、請求項２、８、９または１０記載の製造法。
【請求項１２】
ピルビン酸の代わりに、該微生物の培養物、菌体またはそれらの処理物によりピルビン酸に転換され得る化合物を用いる請求項１１記載の製造法。
【請求項１３】
微生物がバチルス属に属し、かつピルビン酸およびグリオキシル酸からＤ−４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を生成する能力を有する微生物である請求項１２記載の製造法。
【請求項１４】
微生物が、シュウドモナス属、パラコッカス属、プロビデンシア属、リゾビウム属またはモルガネラ属に属し、かつピルビン酸およびグリオキシル酸からＬ−４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を生成する能力を有する微生物である請求項１２記載の製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、光学活性γ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸、すなわちスレオ−γ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸[(2S,4S)-4-hydroxyglutamic acid]またはエリスロ−γ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸[(2S,4R)-4-hydroxyglutamic acid]の製造法に関する。
【０００２】
光学活性γ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸は、グルタミンシンターゼ[Khim-Farm. Zh., 18, 655(1984)]やシナプス前顆粒(Plesynaptic Vesicle)のグルタミン酸取り込みを阻害する作用[Neurochem. Res., 18,79(1993)]が知られており、これらの酵素や器官の研究用試薬として有用である。また、この作用に基づく医薬品として有用である。
【０００３】
【従来の技術】
従来の光学活性γ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸の製造法としては、エチル−α−アセトキシ−β−クロロプロピオン酸とエチルアセトアミドシアン酸から化学合成したγ−ヒドロキシグルタミン酸の４種異性体混合物から分離する方法、ＤＬ−４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸とアンモニアにＮＡＤＰＨ存在下哺乳動物の肝臓由来のグルタミン酸デヒドロゲナーゼを作用させ合成したスレオ／エリスロ−γ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸の混合物から分離する方法[ バイオケミ・バイオフィズ・アクタ（Biochem. Biophis. Acta. ）, 77, 133(1963)]、クサキョウチクトウ（Phlox decussata）からスレオ−γ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸[(2S,4S)-4-hydroxyglutamic acid]を抽出する方法[メソッズ・イン・エンザイモロジー(Methods in Enzymology), 17 partB, 277]、Ｌ−４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸とシステイン・スルフィン酸にトランスアミナーゼを作用させスレオ−γ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸を合成する方法[テトラヘドロン  レター(Tetrahedron Lett.), 28, 1277 (1987)] 、Δ1-pyrroline-3-hydroxy-5-carboxylate に牛肝臓由来のΔ1-pyrroline dehydrogenaseを作用させて合成する方法[ジャーナル・オブ・バイオケミストリー(J. B. C.), 235, 3504(1960)] が知られている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
従来の光学活性γ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸の製造法は、(1) 原料が高価である、(2) 異性体の分離工程を要し割高になる、(3) 収量が低い、などの欠点があるため、工業的により有利な製造法の開発が求められている。本発明の目的は工業的に有利に光学活性γ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸を製造する方法を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明によれば、アミノ基供与体存在下、ピルビン酸とグリオキシル酸から光学活性γ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸を生成する活性を有する生体触媒（以下、生体触媒Ｉという。）、アミノ基供与体、ピルビン酸およびグリオキシル酸を水性媒体中に存在させることにより、水性媒体中に光学活性γ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸を生成させ、生成した光学活性γ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸を該水性媒体中より採取することを特徴とする光学活性γ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸の製造法（以下、製造法Ｉという。）およびアミノ基供与体存在下、光学活性４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を光学活性γ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸に変換する活性を有する生体触媒（以下、生体触媒IIという。）、アミノ基供与体および光学活性４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を水性媒体中に存在させることにより、水性媒体中に光学活性γ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸を生成させ、生成した光学活性γ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸を該水性媒体中より採取することを特徴とする光学活性γ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸の製造法（以下、製造法IIという。）を提供することができる。
【０００６】
なお、光学活性γ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸は、スレオ−γ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸[(2S,4S)-4-hydroxyglutamic acid]またはエリスロ−γ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸[(2S,4R)-4-hydroxyglutamic acid]のことをいい、光学活性４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸は、Ｌ−４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸[(S)-hydroxy-2-ketoglutaric acid] またはＤ−４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸[(R)-hydroxy-2-ketoglutaric acid] のことをいう。
【０００７】
さらに詳しくは、生体触媒Ｉ、アミノ基供与体、ピルビン酸およびグリオキシル酸を水性媒体中に存在させることにより、水性媒体中にスレオ−またはエリスロ−γ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸を生成させ、生成したスレオ−またはエリスロ−γ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸を該水性媒体中より採取することを特徴とするスレオ−またはエリスロ−γ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸の製造法、および生体触媒II、アミノ基供与体およびＬ−またはＤ−４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を水性媒体中に存在させることにより、水性媒体中にスレオ−またはエリスロ−γ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸を生成させ、生成したスレオ−またはエリスロ−γ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸を該水性媒体中より採取することを特徴とするスレオ−またはエリスロ−γ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸の製造法を提供することができる。
【０００８】
以下に本発明を詳細に説明する。
製造法Ｉにおいて、生体触媒Ｉ、アミノ基供与体、ピルビン酸およびグリオキシル酸を水性媒体中に存在させることにより、水性媒体中にスレオ−γ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸を生成させ、生成したスレオ−γ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸を該水性媒体中より採取することを特徴とするスレオ−γ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸の製造法を以下、製造法Ｉ−(1) といい、生体触媒Ｉ、アミノ基供与体、ピルビン酸およびグリオキシル酸を水性媒体中に存在させることにより、水性媒体中にエリスロ−γ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸を生成させ、生成したエリスロ−γ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸を該水性媒体中より採取することを特徴とするエリスロ−γ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸の製造法を以下、製造法Ｉ−(2) という。
【０００９】
製造法Ｉで用いられる生体触媒Ｉとしては、微生物の培養物、菌体、菌体処理物、精製酵素または粗酵素のいずれでも用いることができる。該微生物としては、アミノ基供与体存在下、ピルビン酸とグリオキシル酸から光学活性γ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸を生成する活性を有する微生物であればいずれの微生物でも用いることができる。
【００１０】
このような微生物として、シュウドモナス属、パラコッカス属、プロビデンシア属、リゾビウム属、モルガネラ属、エンテロバクター属、アースロバクター属、カウロバクター属、ミクロバクテリウム属、クロトバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、クラビバクター属またはバチルス属に属する微生物あるいはこれら微生物の突然変異体もしくは誘導体等があげられる。
【００１１】
製造法Ｉ−(1) において、生体触媒Ｉとして用いられる微生物として好ましくは、シュウドモナス属、パラコッカス属、プロビデンシア属、リゾビウム属、モルガネラ属、エンテロバクター属、アースロバクター属、カウロバクター属、ミクロバクテリウム属、クロトバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属またはクラビバクター属に属し、アミノ基供与体存在下、ピルビン酸とグリオキシル酸からスレオ−γ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸を生成する能力を有する微生物をあげることができる。
【００１２】
具体的には、シュウドモナス  プチダ（Pseudomonas putida）ATCC795株、同ATCC4359株、シュウドモナス  オレオボランス（Pseudomonas oleovorans）ATCC8062株、シュウドモナス  サッカロフィラ（Pseudomonas saccharophila）ATCC15946株、シュウドモナス  ボレオポリス（Pseudomonas boreopolis）ATCC15452 株、シュウドモナス  タエトロレンス（Pseudomonas taetorolens）ATCC17466株、パラコッカス  デニトリフィカンス（Paracoccus denitrificans）ATCC19367株、プロビデンシア  ルスチギアニ（Providencia rustigianii）ATCC13159株、リゾビウム  メリロティ（Rhizobium meliloti）FERM BP-4582株、モルガネラ  モルガニ（Morganella morganii）ATCC25830株、エンテロバクター  アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ATCC13048株、アースロバクター  クリスタロポイエテス（Arthrobacter crystallopoietes）ATCC154821株、カウロバクター  クレセンタス（Caulobacter crescentus）ATCC19089株、ミクロバクテリウム  インペリアレ（Microbacterium imperiale）ATCC8365株、クロトバクテリウム  シトレウム（Curtobacterium citreum）ATCC15828株、ブレビバクテリウム  アンモニアゲネス（Brevibacterium ammoniagenes）ATCC6871株、クラビバクター ミシガネンセ（Clavibacter michiganense）ATCC10202株、クラビバクター  ラチャイ（Clavibacter rathayi）ATCC13659株、クラビバクター  トリティチ（Clavibacter tritici）ATCC11402 株などがあげられる。
【００１３】
製造法I-(2) において、生体触媒Ｉとして用いられる微生物として好ましくは、バチルス属に属し、アミノ基供与体存在下、ピルビン酸とグリオキシル酸からエリスロ−γ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸を生成する能力を有する微生物をあげることができる。
具体的には、バチルス  エスピー（Bacillus sp.）S16株（FERM BP-4647）をあげることができる。
【００１４】
製造法IIで用いられる生体触媒IIとしては、微生物の培養物、菌体、菌体処理物、精製酵素または粗酵素のいずれでも用いることができる。該微生物としては、アミノ基供与体存在下、光学活性４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を光学活性γ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸に変換する活性を有する微生物であればいずれでも用いることができる。
【００１５】
このような微生物として、エシェリヒア属、セラチア属、シュウドモナス属、アースロバクター属またはコリネバクテリウム属に属する微生物あるいはこれら微生物の突然変異体もしくは誘導体等があげられる。
具体的には、エシェリヒア  コリ（Escherichia coli）ATCC33625株、セラチア  マルセセンス(Serratia marcesens) ATCC13880株、シュウドモナス  クロロラフィス(Psudomonas chlororaphis) ATCC9446株、アースロバクター  プロトフォルミアエ(Arthrobacter protophormiae)ATCC19271株、コリネバクテリウム  グルタミクム(Corynebacterium glutamicum) ATCC13032株をあげることができる。
【００１６】
より好ましくは、これら菌株の有するα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ( α-ketoglutarate dehydrogenase) 活性および光学活性４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸分解活性の少なくとも一種の活性を欠失あるいは低下させた変異株をあげることができる。
このような変異株は、親株に通常の変異誘起剤処理、たとえば、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）などの変異剤処理、ＵＶ照射、γ線照射による変異処理を施した後、適当な寒天平板培地上に塗布し、生育した変異株を取得し、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性および光学活性４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸分解活性の少なくとも一種の活性が欠失または親株に比べて低下した菌株を選択することにより得ることができる。
【００１７】
このような変異株を取得するための親株としては光学活性４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を光学活性γ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸に変換する活性を有する微生物であればいずれでも用いることができる。とくにEscherichia coliが好ましく、例えばEscherichia coli K-12 株の亜株Escherichia coli ATCC33625をあげることができる。
【００１８】
変異株として具体的には、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ欠損変異株Escherichia coli HKK2株（sucA, iclR, trp ）、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ欠損とＬ−４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸分解活性低下の両変異を有するEscherichia coli HKK27株をあげることができる。Escherichia coli HKK27株は、ブダペスト条約に基づいて平成６年５月３１日付で工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ  ＢＰ−４６８１として寄託されている。
【００１９】
生体触媒Ｉまたは生体触媒IIで用いられる微生物を親株として、該親株の有するグルタミン酸デヒドロゲナーゼ(Glutamate dehydrogenase)活性よりも強化されたグルタミン酸デヒドロゲナーゼ活性を有する変異株を取得し、該変異株を用いることにより、親株よりもより効率的な光学活性γ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸の製造を行うことができる。
【００２０】
このような変異株は、親株に通常の変異誘起剤処理、たとえば、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）などの変異剤処理、ＵＶ照射、γ線照射による変異処理を施した後、適当な寒天平板培地上に塗布し、生育した変異株を取得し、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ活性が親株に比べて強化された菌株を選択することにより得ることができる。また更に、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ活性を有する菌株由来のグルタミン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片とベクターＤＮＡとの組換え体ＤＮＡを用いて親株を形質転換することによっても得られる。
【００２１】
例えば、このような形質転換株は、エシェリヒア属、とくにエシェリヒア  コリ由来のグルタミン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片とベクターＤＮＡとの組換え体ＤＮＡを用いて大腸菌を形質転換することにより得ることができる。
グルタミン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の供給源となる微生物としては、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ活性を有する微生物であればいずれでも用いることができる。とくにEscherichia coliが好ましく、例えばEscherichia coli K-12株の亜株Escherichia coli ATCC33625株が好ましい。
【００２２】
微生物からのグルタミン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の単離は、常法〔バイオキミカ・エ・バイオフィジカ・アクタ（Biochim. Biophys. Acta）, 72, 619(1963)、モレキュラー・クローニング：ア・ボラトリー・マニュアル（Molecular Cloning, A laboratory manual）, 第２版, コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Cold Spring Harbor Laboratory Press）(1989)〕に準じて行うことができる。
【００２３】
ベクターとしては宿主微生物中で自律複製できるものであれば、ファージ・ベクター、プラスミド・ベクターなどいずれでも用いることができる。たとえば、pBR322をあげることができる。
グルタミン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片とベクターＤＮＡとの組換え体ＤＮＡは、試験管内で両ＤＮＡを同一切断末端を与える制限酵素で切断した後、ＤＮＡリガーゼで連結反応をおこなうことによって得ることができる。
【００２４】
宿主微生物としては、ＤＮＡ取り込み能を有する微生物であれば、野生株の他に薬剤耐性、栄養要求性などを有する変異株などいかなる菌株を用いてもよい。
グルタミン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片とベクターＤＮＡとの組換え体ＤＮＡを用いて、宿主微生物を形質転換し、該組換え体ＤＮＡを保有する形質転換株を選択し、その株よりプラスミドを単離することにより、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を含む組換え体プラスミドを取得することができる。形質転換は、マニアチスらの方法〔モレキュラー・クローニング（Molecular Clorning, A Laboratory Manual ）, 250(1982)〕等に従っておこなうことができる。出現した形質転換株の培養菌体から組換え体プラスミドの単離はマニアチスらの方法〔モレキュラー・クローニング（Molecular Clorning, A Laboratory Manual ）, 86(1982)〕等に従っておこなうことができる。
【００２５】
得られた組換え体プラスミドを用いて、生体触媒Ｉまたは生体触媒IIとして用いることのできる微生物をマニアチスらの方法に従って形質転換することにより、目的のグルタミン酸デヒドロゲナーゼ活性の強化された形質転換株を得ることができる。
具体的には、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ欠損とＬ−４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸分解活性低下の両変異を有し、更に、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ活性の増強されたEscherichia coli HKK27/pHK10株をあげることができる。Escherichia coli HKK27/pHK10株は、ブダペスト条約に基づいて平成６年５月３１日付で工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ  ＢＰ−４６８２として寄託されている。
【００２６】
生体触媒Ｉまたは生体触媒IIとして用いられる微生物の培養は、通常の培養方法に従って行うことができる。
培養に用いられる培地は、用いる微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、該微生物の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれでもよい。
【００２７】
炭素源としては、用いる微生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、シュークロース、マルトース、澱粉、澱粉加水分解物、糖蜜などの糖類や、酢酸、乳酸、グルコン酸などの有機酸、あるいはエタノール、プロパノールなどのアルコール類を用いることができる。
窒素源としては、用いる微生物が資化しうるかぎり、アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、等の各種無機酸や有機酸のアンモニウム塩、その他含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーン・スチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体およびその消化物等を用いることができる。
【００２８】
無機塩としては、用いる微生物が利用しうるかぎり、リン酸カリウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガンなどを用いることができる。他に微量元素としてカルシウム、亜鉛、ほう素、銅、コバルト、モリブデンなどの塩類を加えてもよい。また必要に応じてチアミン、ビオチンのようなビタミン、グルタミン酸、アスパラギン酸のようなアミノ酸、アデニン、グアニンのような核酸関連物質などを添加してもよい。
【００２９】
培養は、振盪培養または深部通気攪拌培養などの好気的条件下で行う。培養温度は１５〜３７℃がよく、培養時間は１０〜９６時間である。
培養中ｐＨは、５．０〜９．０に保持する。ｐＨの調整は、無機あるいは有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニアなどを用いて行う。
生体触媒ＩまたはIIとして用いられる微生物の菌体処理物としては、菌体の乾燥物、凍結乾燥物、界面活性剤または有機溶剤処理物、酵素処理物、超音波処理物、機械的摩砕処理物、溶媒処理物、菌体の蛋白質分画、菌体および菌体処理物の固定化物などがあげられる。
【００３０】
本発明の製造法Ｉおよび製造法IIにおいて、用いるアミノ基供与体としては、アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、尿素などの無機アンモニウム塩またはアスパラギン酸をはじめとする各種アミノ酸などをあげることができる。アミノ基供与体の濃度は０．１〜１００ｇ／ｌ、好ましくは１〜１０ｇ／ｌである。
【００３１】
水性媒体としては、水、リン酸塩、炭酸塩、酢酸塩、ほう酸塩、クエン酸塩、トリスなどの緩衝液、ならびに、メタノール、エタノールなどのアルコール類、酢酸エチルなどのエステル類、アセトンなどのケトン類、アセトアミドなどのアミド類などの有機溶媒を含有した水溶液があげられる。また必要に応じてトリトンＸ−１００（ナカライテスク社製）やノニオンHS204（日本油脂社製）などの界面活性剤やトルエンやキシレンなどの有機溶媒を０．１〜２０ｇ／ｌ  程度添加してもよい。
【００３２】
本発明の製造法Ｉにおいて、用いるピルビン酸およびグリオキシル酸の濃度は１〜２００ｇ／ｌ、好ましくは２０〜２００ｇ／ｌである。生体触媒Ｉによりピルビン酸に転換され得る化合物をピルビン酸の代替として用いることもできる。このような化合物として、グルコース、フラクトース、シュークロース、マルトース、澱粉、澱粉加水分解物、糖蜜などの糖類や、酢酸、乳酸、グルコン酸などの有機酸等をあげることができる。
【００３３】
生体触媒Ｉの濃度は０．１〜２００ｇ／ｌ、好ましくは５〜１００ｇ／ｌ（微生物菌体換算）である。
水性媒体に、生体触媒Ｉ、アミノ基供与体、ピルビン酸およびグリオキシル酸を上記濃度添加し、温度１５〜８０℃、好ましくは２５〜６０℃、ｐＨ３〜１１、好ましくはｐＨ５〜９の条件下で、３０分〜８０時間反応させ、光学活性γ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸を製造することができる。
【００３４】
製造法Ｉにおいて、生体触媒Ｉとして用いられる微生物の培養初発または途中に、アミノ基供与体、ピルビン酸およびグリオキシル酸を上記濃度添加し、光学活性γ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸を製造することもできる。
本発明の製造法IIにおいて、光学活性４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸として、精製標品、粗精製品等を用いることができる。また、微生物に由来する生体触媒反応を利用して生成された光学活性４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸および光学活性４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を含有する該反応液を利用することもできる。微生物に由来する生体触媒反応を利用した光学活性４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸の製造法については後述する。用いる光学活性４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸の濃度は１〜２００ｇ／ｌ、好ましくは２０〜２００ｇ／ｌである。
【００３５】
生体触媒IIの濃度は０．１〜２００ｇ／ｌ、好ましくは５〜１００ｇ／ｌ（微生物菌体換算）である。
水性媒体に、生体触媒II、アミノ基供与体および光学活性４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸グリオキシル酸を上記濃度添加し、温度１５〜８０℃、好ましくは２５〜６０℃、ｐＨ３〜１１、好ましくはｐＨ５〜９の条件下で、３０分〜８０時間反応させ、光学活性γ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸を製造することができる。
【００３６】
製造法IIにおいて、生体触媒IIとして用いられる微生物の培養初発または途中に、アミノ基供与体および光学活性４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を上記濃度添加し、光学活性γ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸を製造することもできる。
製造法Ｉまたは製造法IIにより製造された光学活性γ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸は、通常用いられるアミノ酸の精製法を用いて単離することができる。例えば、遠心分離により固形物を除いた反応液上清から、イオン交換樹脂や膜処理法などの操作を組み合わせて、光学活性γ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸を単離することができる。
【００３７】
〔微生物に由来する生体触媒反応を利用した光学活性４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸の製造〕
グリオキシル酸とピルビン酸から光学活性４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を生成する活性を有する生体触媒（以下、生体触媒IIIという。）、ピルビン酸およびグリオキシル酸を水性媒体中に存在させることにより、グリオキシル酸を光学活性４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸に変換することにより光学活性４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を製造することができる。
【００３８】
該製造で用いられる生体触媒IIIとしては、微生物の培養物、菌体、菌体処理物、精製酵素または粗酵素のいずれでも用いることができる。該微生物としては、グリオキシル酸とピルビン酸から光学活性４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を生成する活性を有する微生物であればいずれの微生物でも用いることができる。
【００３９】
具体的にはセルビブリオ属、バチルス属、シュウドモナス属、パラコッカス属、プロビデンシア属、リゾビウム属またはモルガネラ属に属する微生物があげられる。
Ｄ−４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を製造する場合にはとくにセルビブリオ属またはバチルス属に属する微生物が好ましい。
【００４０】
具体的にはセルビブリオ  ギルバス（Cellvibrio gilvus）ATCC13127株、バチルス  エスピー（Bacillus sp.）OC187株、バチルス  エスピー（Bacillus sp.）S16 株などがあげられる。ATCC13127株およびOC187株は６０〜９０℃、１５分〜２時間の熱処理を施すことにより、Ｌ−４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸の生成能を失活させることができる。また、Ｌ−４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸の生成能を失活した株は、セルビブリオ属またはバチルス属に属し、かつピルビン酸または該微生物によってピルビン酸に転換され得る化合物とグリオキシル酸からＤ−４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を生成する能力を有する微生物を通常の変異処理手段、たとえば、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）による通常の変異処理により変異させ、Ｌ−４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸の生成能が失活した変異株を選択することによっても得ることができる。S16株はOC187株より変異誘導され、Ｌ−４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸の生成能を失活した変異株である。
【００４１】
バチルス  エスピー（Bacillus sp.）OC187株は、本発明者らによって町田市の土壌より新たに分離された菌株であって、その菌学的性質を第１表〜第６表に詳述する。
(A) 形態
【００４２】
【表１】
0003737157.tif 000002
【００４３】
(B) 培養学的性質
【００４４】
【表２】
0003737157.tif 000003
【００４５】
(C) 生理学的性質
【００４６】
【表３】
0003737157.tif 000004
【００４７】
【表４】
0003737157.tif 000005
【００４８】
(D) その他の諸性質
【００４９】
【表５】
0003737157.tif 000006
【００５０】
(E) 化学分類学的性質
【００５１】
【表６】
0003737157.tif 000007
【００５２】
以上の菌学的性質を有する菌について、バージェイのマニュアル（Bergey's Manual of Systematic Bacteriology） Vol.2（1986年）の記載と照合した結果、該菌株をバチルス属に属する細菌と同定し、OC187株をバチルス  エスピー（Bacillus sp.）OC187 と命名した。
バチルス  エスピー OC187株およびS16株は、ブダペスト条約に基づいて平成６年４月１９日付で工業技術院生命工学工業技術研究所に各々ＦＥＲＭ  ＢＰ−４６４６、ＦＥＲＭ  ＢＰ−４６４７として寄託されている。
【００５３】
Ｌ−４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を製造する場合にはとくにシュウドモナス属、パラコッカス属、プロビデンシア属、リゾビウム属またはモルガネラ属に属する微生物が好ましい。さらに詳しくはシュウドモナス属、パラコッカス属、プロビデンシア属、リゾビウム属またはモルガネラ属に属し、ピルビン酸または該微生物によってピルビン酸に転換され得る化合物とグリオキシル酸からＬ−４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を生成する能力を有する微生物であればよい。Ｄ−４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を実質的に生成しない微生物であればより好ましい。
【００５４】
具体的にはシュウドモナス  プチダ（Pseudomonas putida）ATCC 795株、シュウドモナス  プチダ（Pseudomonas putida）ATCC 4359株、シュウドモナス  サッカロフィラ（Pseudomonas saccharophila）ATCC 9114株〔＝ATCC 15946株；IAM Catalogue of Strains (1993) 〕、シュウドモナス  ボレオポリス（Pseudomonas boreopolis）ATCC 15452株、シュウドモナス  タエトロレンス（Pseudomonas taetrolens）ATCC 17466株、シュウドモナス  オレオボランス（Pseudomonas oleovorans）ATCC 8062株、パラコッカス  デニトリフィカンス（Paracoccus denitrificans）ATCC 19367株、プロビデンシア  ルスチギアニ（Providencia rustigianii）ATCC 13159株、リゾビウム  メリロッティ（Rhizobium meliloti）RCR 2001株（FERM BP-4582）、モルガネラ  モルガニ（Morganella morganii）ATCC 25830株などがあげられる。
【００５５】
リゾビウム  メリロッティ（Rhizobium meliloti）RCR 2001株は、ブダペスト条約に基づいて平成６年２月２４日付で工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ  ＢＰ−４５８２として寄託されている。
生体触媒III として用いられる微生物の培養は、通常の培養方法に従って行われる。
【００５６】
培養に用いられる培地は、用いる微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、該微生物の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれでもよい。
炭素源としては、用いる微生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、シュークロース、マルトース、澱粉、澱粉加水分解物、糖蜜などの糖類や、酢酸、乳酸、グルコン酸などの有機酸、あるいはエタノール、プロパノールなどのアルコール類が用いられる。セルビブリオ属またはバチルス属細菌を用いてＤ−４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を製造する場合にはＤ−ガラクトン酸が好ましい。
【００５７】
窒素源としては、用いる微生物が資化しうるかぎり、アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、等の各種無機酸や有機酸のアンモニウム塩、その他含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーン・スチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体およびその消化物等を使用することができる。
【００５８】
無機塩としては、用いる微生物が利用しうるかぎり、リン酸カリウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガンなどを使用できる。他に微量元素としてカルシウム、亜鉛、ほう素、銅、コバルト、モリブデンなどの塩類を加えてもよい。また必要に応じてチアミン、ビオチンのようなビタミン、グルタミン酸、アスパラギン酸のようなアミノ酸、アデニン、グアニンのような核酸関連物質などを添加してもよい。
【００５９】
培養は、振盪培養または深部通気攪拌培養などの好気的条件下で行う。培養温度は１５〜３７℃がよく、培養時間は１０〜９６時間である。
培養中ｐＨは、５．０〜９．０に保持する。ｐＨの調整は、無機あるいは有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニアなどを用いて行う。
生体触媒IIIとして用いられる微生物の菌体処理物としては、菌体の乾燥物、凍結乾燥物、界面活性剤または有機溶剤処理物、酵素処理物、超音波処理物、機械的摩砕処理物、溶媒処理物、菌体の蛋白質分画、菌体および菌体処理物の固定化物などがあげられる。
【００６０】
水性媒体としては、水、リン酸塩、炭酸塩、酢酸塩、ほう酸塩、クエン酸塩、トリスなどの緩衝液、ならびに、メタノール、エタノールなどのアルコール類、酢酸エチルなどのエステル類、アセトンなどのケトン類、アセトアミドなどのアミド類などの有機溶媒を含有した水溶液があげられる。また必要に応じてトリトンＸ−１００（ナカライテスク社製）やノニオンHS204（日本油脂社製）などの界面活性剤やトルエンやキシレンなどの有機溶媒を０．１〜２０g/l 程度添加してもよい。
【００６１】
用いるピルビン酸およびグリオキシル酸の濃度は１〜２００ｇ／ｌ、好ましくは２０〜２００ｇ／ｌである。生体触媒IIIによりピルビン酸に転換され得る化合物をピルビン酸の代替として用いることもできる。このような化合物として、グルコース、フラクトース、シュークロース、マルトース、澱粉、澱粉加水分解物、糖蜜などの糖類や、酢酸、乳酸、グルコン酸などの有機酸等をあげることができる。
【００６２】
生体触媒IIIの濃度は０．１〜２００ｇ／ｌ、このましくは５〜１００ｇ／ｌ（微生物菌体換算）である。
水性媒体に、生体触媒III、ピルビン酸およびグリオキシル酸を上記濃度添加し、温度１５〜６０℃、好ましくは２５〜４５℃、ｐＨ３〜１１、好ましくはｐＨ５〜９の条件下で、３０分〜８０時間反応させ、光学活性４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を製造することができる。
【００６３】
生体触媒IIIとして用いられる微生物の培養初発または途中に、ピルビン酸およびグリオキシル酸を上記濃度添加し、光学活性４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を製造することもできる。
光学活性４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸は、通常用いられるアミノ酸の精製法を用いて単離することができる。例えば、遠心分離により固形物を除いた反応液上清から、イオン交換樹脂や膜処理法などの操作を組み合わせて、光学活性４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を単離することができる。
【００６４】
以下に本発明の実施例を示す。
【実施例】
【００６５】
実施例１
バクトトリプトン１０ｇ／ｌ  、酵母エキス５ｇ／ｌ  および塩化ナトリウム５ｇ／ｌを含みＮａＯＨにてｐＨ７に調整した培地（Ｌ培地）３ｍｌを試験管に分注し、滅菌後、第７表に示した微生物を各々接種し、３０℃で１６時間振とう培養した。各菌株についてこの培養液１ｍｌずつを下記のＧＭＳ培地１０ｍｌを入れ滅菌した試験管に接種し３０℃で２０時間振とう培養した。
ＧＭＳ培地組成（１ｌあたり）：
ＫＨ2ＰＯ4                ２      ｇ
（ＮＨ4）2ＳＯ4             ２      ｇ
ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ        ５    ｍｇ
ＭｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ        ２    ｍｇ
ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ        ０．５  ｇ
ＣａＣｌ2               １０    ｍｇ
酵母エキス                １      ｇ
ペプトン                  １      ｇ
グルコース              ２０      ｇ
ｐＨ                      ７．０
培養終了後、遠心分離操作にて菌体を集め、各菌株について、滅菌した１ｍｌの反応液(a) 〔KH2PO4 3g 、NaH2PO4 6g、NH4Cl 1g、MgSO4 ・7H2O 0.16g、NaCl 5g 、CaCl2 11mg、ピルビン酸ナトリウム100mmol およびグリオキシル酸100mmol を純水１ｌに含みＮａＯＨにてｐＨ７. ０に調整した反応液〕の反応液に懸濁し、ファルコン社製2059チューブ中にて３０℃で振とうし５時間反応させた。反応終了後、遠心分離操作によって菌体を除き、上清のγ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸をＯＤＳカラム（メルク社製）を用いたＨＰＬＣにより定量した。定量値を第７表に示す。なお、スレオおよびエリスロ−γ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸の標準化合物は[ ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエテイ（J.A.C.S.）, 79, 6192(1957)] に記載の方法によって調製した。
【００６６】
【表７】
0003737157.tif 000008
【００６７】
実施例２
第８表に示した微生物を、実施例１と同様に培養し、実施例１で用いた反応液(a) に５ｇ／ｌのアスパラギン酸を含む反応液を用いる以外は実施例１と同様に反応を行った。反応終了後の反応液上清中のスレオ−γ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸量を第８表に示す。
【００６８】
【表８】
0003737157.tif 000009
【００６９】
実施例３
E. coli（大腸菌） K-12株亜株のATCC33625株およびα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ欠損変異株HKK2株（sucA、iclR、trp ）を３ｍｌのＬ培地を含む試験管で３７℃にて一晩培養した。この培養液２ｍｌを、グルコース０．４％、コハク酸０．０５％  、硫酸アンモニウム０．２％、Ｌ−トリプトファン１００ｍｇ／ｌ  、酵母エキス０．１％およびペプトン０．１％を加えたＭ９培地〔Na2HPO4 6g、KH2PO4 3g 、NaCl 0.5g およびNH4Cl 1gを１ｌに含みｐＨ７．４に調整した後、別途滅菌した1M MgSO4 2ｍｌおよび1M CaCl2 0.1ｍｌを加えた培地〕５０ｍｌを含む３００ｍｌ容三角フラスコに添加し、３７℃にて８時間培養した。こうして得た培養液から遠心分離によって上清を除去し、菌体を１００ｇ湿菌体／ｌとなるように滅菌水に懸濁した。
【００７０】
一方、実施例１と同様にシュウドモナス  サッカロフィラATCC15946株をＧＭＳ培地１０ｍｌを入れた試験管３本にて３０℃で２０時間培養した。遠心分離操作によってこれら試験管３本分の菌体を一つに集菌後３ｍｌの反応液に懸濁し、３０℃で５時間反応を行った。この反応液を遠心分離して得た上清をSUMICHIRAL OA-5000カラム（住友化学社製）を用いたＨＰＬＣにより分析したところ６０．５ｍＭのＬ−４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸が生成していた。Ｄ−４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸は認められなかった。なお、ＤおよびＬ−４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸の標準化合物は[ メソッズ・イン・エンザイモロジー（Methods in Enzymology ）, 17, partB, 275] に記載の方法によって調製した。
【００７１】
この反応上清をファルコン社製2059チューブ２本に０．４ｍｌづつ分注し、先に調製した大腸菌菌体懸濁液を８０μｌづつ加えさらに各チューブに２０％硫酸アンモニウム溶液４０μｌ、５０％グルコース溶液４８μｌおよびＭ９Ｃ溶液（Na2HPO4 60g 、KH2PO4 30g、NaCl 5g およびNH4Cl 10g を１ｌに含みｐＨ７．４に調整）８０μｌを添加し、滅菌水で総量を０．８ｍｌに合わせ、３７℃で振とうし３時間反応させた。反応終了後、遠心分離操作によって菌体を除き、上清のγ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸を実施例１と同様にＨＰＬＣにより定量した。定量値を第９表に示す。
【００７２】
【表９】
0003737157.tif 000010
【００７３】
実施例４
大腸菌Ｋ−12株由来のα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ欠損変異株HKK2株（sucA、iclR、trp ）からＬ−４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸分解活性の低下した変異株の誘導を行った。Ｌ培地中で対数増殖期まで培養したHKK2株の菌体を集め、０．０５Ｍトリスーマレイン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で洗浄後、菌体濃度が約１０9 細胞／ｍｌになるように同緩衝液に懸濁した。これにＮＴＧを終濃度が６００ｍｇ／ｌになるように加え、室温で２０分間保持して変異処理を行った。この変異処理菌体をＬ寒天培地（Ｌ培地に寒天２％を加えたもの）に塗布した。生じたコロニー約３０００株についてＬ−４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸分解活性を測定した。即ち、各株を３ｍｌのＬ培地で３７℃、１６時間培養し、遠心分離によって菌体を集め、５０ｍＭ KH2PO4（ｐＨ７）緩衝液０．５ｍｌに懸濁した。これに実施例３と同様にシュウドモナス  サッカロフィラATCC15946株を用いて調製したＬ−４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸含有ブロス０．５ｍｌを加え、３７℃で８時間インキュベートした。インキュベート前と後の４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸濃度を実施例３と同様に測定し、減少量の少ない株をＬ−４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸分解活性の低下した株として選択した。このようにしてα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ欠損とＬ−４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸分解活性低下の両変異を合わせもつHKK27 株を取得した。
【００７４】
α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ欠損およびＬ−４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸分解活性低下の両変異をあわせもつ菌株は、上記の方法に準じてHKK2株からＤ−４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸分解活性の低下した変異株を誘導することによっても得ることができる。
【００７５】
実施例５
大腸菌K-12株亜株ATCC33625株より常法[ バイオキミカ・エ・バイオフィジカ・アクタ(Biochim. Biophys. Acta), 72, 619(1963)]によりグルタミン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を単離した。ベクターとして使用したpBR322は宝酒造社製の市販品を用いた。pBR322プラスミドＤＮＡ １μｇおよびATCC33625 株染色体ＤＮＡ ３μｇを含む制限酵素反応液（宝酒造社製Ｈバッファー）１００μｌに各々１６単位のPstIとClaI（いずれも宝酒造社製）を添加し、３７℃で２時間反応後、６５℃で４０分間加温して反応を停止させた。該反応物に、１０倍濃度のT4リガーゼ緩衝液（660mM トリス、66mM MgCl2、100mM ジチオスレイトール、pH7.6 ）１２μｌ、１００ｍＭ  ＡＴＰ３μｌおよびT4リガーゼ（宝酒造社製）３５０単位を加え、１５℃で１６時間反応させた。このリガーゼ反応物をグルタミン酸デヒドロゲナーゼおよびグルタミン酸シンターゼ両遺伝子の欠損変異を有するPA340株〔J. Bacteriol., 133, 139 (1978)〕の形質転換に供した[マニアチスら；モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning, A Laboratory Manual）, 250(1982)]。選択培地には、Ｌ−スレオニン２５ｍｇ／ｌ、Ｌ−ロイシン２５ｍｇ／ｌ、Ｌ−ヒスチジン２５ｍｇ／ｌ、Ｌ−アルギニン２５ｍｇ／ｌ、チアミン１００μｇ／ｌ、テトラサイクリン１０ｍｇ／ｌおよびグルコース０．４％を含むＭ９最少寒天培地[マニアチスら；モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning, A Laboratory Manual）, 68（1982）] を用いた。出現した形質転換株の培養菌体から[ マニアチスら；モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning, A Laboratory Manual）, 86（1982）] に記載の方法によって、プラスミドＤＮＡを単離した。
【００７６】
形質転換株の１株から得られpHK10と命名されたプラスミドは、各種制限酵素での消化とアガロースゲル電気泳動による解析の結果、pBR322のPstIサイトとClaIサイトの間に、マックファーソンらの報告したグルタミン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子[ ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Nucleic Acid Res. ）, 11, 5257（1983）] と同一構造を有する約４．２キロベースのPstI、ClaI ＤＮＡ断片が挿入された構造であることが示された。pHK10を用いてPA340株を再形質転換した。選択培地には、テトラサイクリン１０ｍｇ／ｌを含むＬ−寒天培地を用いた。得られたテトラサイクリン耐性形質転換コロニーを任意に５０個選び、Ｌ−スレオニン２５ｍｇ／ｌ、Ｌ−ロイシン２５ｍｇ／ｌ、Ｌ−ヒスチジン２５ｍｇ／ｌ、Ｌ−アルギニン２５ｍｇ／ｌ、チアミン１００μｇ／ｌ、テトラサイクリン１０ｍｇ／ｌおよびグルコース０．４％を含むＭ９最少寒天培地にレプリカしたところ、すべて生育した。さらにこの再形質転換株と宿主に用いたPA340株について、サカモトらにより記述された方法[ ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（J. Bacteriol. ）, 124, 775 (1975)] に従ってグルタミン酸デヒドロゲナーゼ活性を測定した結果、PA340株には該酵素活性が認められなかったのに対し、pHK10を保有するPA340株には明瞭な該酵素活性が認められた。これらのことから大腸菌K-12亜株ATCC33625株のグルタミン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子がクローニングされたことが確認された。
【００７７】
実施例６
実施例５で作成したグルタミン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子含有プラスミドpHK10をHKK2株および実施例４で作成したHKK27株に常法〔マニアチスら；モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning, A Laboratory Manual）, 68（1982）〕に従って形質転換し、各々HKK2/pHK10株、HKK27/pHK10株を得た。これらの形質転換株を実施例３と同様に培養した。なおこれら形質転換体の培養は、試験管、三角フラスコいずれにおいても１０ｍｇ／ｌのテトラサイクリンを添加して実施した。このようにして得られた培養液から遠心分離によって上清を除去し、菌体を１００ｇ湿菌体／ｌとなるように滅菌水に懸濁した。一方、実施例３と同様にシュウドモナス  サッカロフィラATCC15946株を用いて調製したＬ−４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸含有ブロス上清（５９．９ｍＭのＬ−４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を含む）をファルコン社製2059チューブ２本に０．４ｍｌづつ分注し、先に調製した大腸菌菌体懸濁液を８０μｌづつ加えさらに各チューブに２０％硫酸アンモニウム溶液４０μｌ、５０％グルコース溶液４８μｌおよびＭ９Ｃ溶液８０μｌを添加し、滅菌水で総量を０．８ｍｌに合わせ、３７℃で振とうし３時間反応させた。反応終了後、遠心分離操作によって菌体を除き、上清のγ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸を実施例１と同様にＨＰＬＣにより定量した。定量値を第９表（実施例３参照）に示す。
【００７８】
実施例７
第１０表に示した各微生物を実施例１と同様に培養し反応液１ｍｌに懸濁して３０℃で５時間反応を行った。反応液中に生成した４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸（表中ＫＨＧと略記）量を実施例３と同様に測定し、第１０表に示した。さらにこの反応液を遠心分離して得た上清０．４ｍｌに実施例６と同様にHKK27/pHK10株の菌体懸濁液、グルコース、硫酸アンモニウムおよびＭ９Ｃ溶液を加え、滅菌水で総量を０．８ｍｌに合わせ３７℃で３時間振とうし反応させた。反応終了後、遠心分離操作によって菌体を除き、上清のγ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸（表中ＨＧと略記）をＨＰＬＣにより定量した。定量値を第１０表に示す。
【００７９】
【表１０】
0003737157.tif 000011
【００８０】
実施例８
実施例１と同様にシュウドモナス  サッカロフィラATCC15946株をＧＭＳ培地１０ｍｌを入れた試験管１０本にて３０℃で２０時間培養した。遠心分離操作によってこれら試験管１０本分の菌体を一つに集菌後１０ｍｌの反応液に懸濁し、３０℃で５時間反応を行った。この反応液を遠心分離して得た上清をSUMICHIRAL OA-5000カラム（住友化学社製）を用いたＨＰＬＣにより分析したところ６８．８ｍＭのＬ−４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸が生成していた。Ｄ−４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸は認められなかった。
【００８１】
この反応上清を滅菌した太型試験管４本に２．５ｍｌづつ分注し、各試験管に滅菌した下記の組成のＭＳＣ培地０．５ｍｌ、５０％グルコース溶液０．５ｍｌ、１０％塩化アンモニウム溶液１ｍｌを添加した。さらにこの試験管の１本には、３ｍｌのＬ培地を含む試験管で３０℃にて一晩培養したアースロバクター  プロトフォルミアエATCC19271株の培養液０．５ｍｌを、１本には同様に培養したシュウドモナス  クロロラフィスATCC9446株の培養液０．５ｍｌを、１本には同様に培養したセラチア  マルセセンスATCC13880株の培養液０．５ｍｌを、残りの１本には同様に培養したコリネバクテリウム  グルタミクムATCC13032株の培養液０．５ｍｌを加え、３０℃にて４８時間培養した。培養終了後、遠心分離操作によって菌体を除き、上清のγ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸を実施例１と同様にＨＰＬＣにより定量した。定量値を第１１表に示す。
【００８２】
ＭＳＣ培地（１ｌあたり）：
ＫＨ2ＰＯ4            ２０    ｇ
（ＮＨ4）2ＳＯ4         ２０    ｇ
ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ    ５０  ｍｇ
ＭｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ    ２０  ｍｇ
ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ      ５    ｇ
ＣａＣｌ2           １００  ｍｇ
酵母エキス            １０    ｇ
ペプトン              １０    ｇ
ｐＨ                    ７．０
【００８３】
【表１１】
0003737157.tif 000012
【００８４】
実施例９
シュウドモナス  サッカロフィラATCC15946株をＬ培地９ｍｌに接種し３０℃で１６時間振とう培養した。この培養液全量を３００ｍｌのＧＭＳ培地に接種し２ｌ容の三角フラスコにて３０℃、２０時間振とう培養した。得られた培養液から菌体を遠心分離し、実施例１で用いた反応液６０ｍｌに懸濁し、３００ｍｌ容ビーカー中で撹拌しつつ反応を行った。反応開始６時間後にピルビン酸ナトリウム２Ｍ溶液３ｍｌとグリオキシル酸ナトリウム２Ｍ溶液３ｍｌを添加した。反応開始後２４時間目に遠心分離によって反応液から菌体を除き、１次反応液上清を得た。
【００８５】
一方、HKK27/pHK10株をテトラサイクリン１０ｍｇ／ｌを加えた１０ｍｌのＬ培地で３７℃にて一晩培養した。この培養液全量を、グルコース０．４％、コハク酸０．０５％、硫酸アンモニウム０．２％、Ｌ−トリプトファン１００ｍｇ／ｌ、酵母エキス０．１％、ペプトン０．１％およびテトラサイクリン１０ｍｇ／ｌを加えたＭ９培地７５０ｍｌを含む２ｌ容三角フラスコに添加し、３７℃にて８時間培養した。こうして得た培養液から遠心分離によって上清を除去し、菌体を１００ｇ湿菌体／ｌとなるように滅菌水に懸濁した。
【００８６】
上記のごとくして得たHKK27/pHK10懸濁液８ｍｌ、５０％グルコース溶液４．８ｍｌ、２０％硫酸アンモニウム溶液４ｍｌ、Ｍ９Ｃ溶液８ｍｌ、滅菌水５．２ｍｌを先に調製した１次反応液５０ｍｌに添加し、３００ｍｌ容ビーカー中で撹拌しつつ２次反応を行った。２次反応中は７％アンモニア水にてｐＨを７に維持した。１２時間反応後、遠心分離操作によって菌体を除き、上清のγ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸をＯＤＳカラム（メルク社製）を用いたＨＰＬＣにより定量した結果、１０.3ｇ／ｌのスレオ−γ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸が検出された。
【００８７】
実施例１０
実施例９で得た２次反応上清７５ｍｌを強酸性陽イオン交換樹脂[ダウエックス50 x 8（Na型）、ダウケミカル社製] のカラムに通塔し、アンモニアでスレオ−γ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸を溶出分離し、濃縮、晶出することにより、０．６ｇのスレオ−γ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸の結晶を得た。
【００８８】
実施例１１
バクトトリプトン１０ｇ／ｌ、酵母エキス５ｇ／ｌおよび塩化ナトリウム５ｇ／ｌを含みＮａＯＨにてｐＨ７に調整した培地（Ｌ培地）３ｍｌを試験管に分注し、滅菌後、バチルス  エスピー S16株(FERM BP-4647)を接種し、３０℃で１６時間振とう培養した。この培養液１ｍｌずつを下記のＧＭＳＧ培地１０ｍｌを入れ滅菌した試験管２本に接種し３０℃で２０時間振とう培養した。
【００８９】
ＧＭＳＧ培地組成（１ｌあたり）：
ＫＨ2ＰＯ4                    ２      ｇ
（ＮＨ4）2ＳＯ4                 ２      ｇ
ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ            ５    ｍｇ
ＭｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ            ２    ｍｇ
ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ            ０．５  ｇ
ＣａＣｌ2                   １０    ｍｇ
酵母エキス                    １      ｇ
ペプトン                      １      ｇ
Ｄ−ガラクトン酸カルシウム  ２０      ｇ
ｐＨ                          ７．０
培養終了後、遠心分離操作にて各々菌体を集め、滅菌した１ｍｌの反応液(a) に５ｇ／ｌになるようにアスパラギン酸を添加した反応液１ｍｌに懸濁し、ファルコン社製2059チューブ中にて３０℃で振とうし５時間反応させた。反応終了後、遠心分離操作によって菌体を除き、上清のγ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸を実施例１と同様に定量した。定量値を第１２表に示す。
【００９０】
【表１２】
0003737157.tif 000013
【００９１】
実施例１２
大腸菌K-12株由来のATCC33625株およびα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ欠損変異株HKK2株（sucA、iclR、trp ）を３ｍｌのＬ培地を含む試験管で３７℃にて一晩培養した。この培養液２ｍｌを、グルコース０．４％、コハク酸０．０５％、硫酸アンモニウム０．２％、Ｌ−トリプトファン１００ｍｇ／ｌ、酵母エキス０．１％およびペプトン０．１％を加えたＭ９培地５０ｍｌを含む３００ｍｌ容三角フラスコに添加し、３７℃にて８時間培養した。こうして得た培養液から遠心分離によって上清を除去し、菌体を１００ｇ湿菌体／ｌとなるように滅菌水に懸濁した。
【００９２】
一方、実施例１１と同様にバチルス  エスピー S16株(FERM BP-4647)をＧＭＳＧ培地１０ｍｌを入れた試験管３本にて３０℃で２０時間培養した。遠心分離操作によってこれら試験管３本分の菌体を一つに集菌後３ｍｌの反応液(a) に懸濁し、３０℃で５時間反応を行った。この反応液を遠心分離して得た上清をSUMICHIRAL OA-5000カラム（住友化学社製）を用いたＨＰＬＣにより分析したところ３９．０ｍＭのＤ−４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸が生成していた。Ｌ−４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸は認められなかった。なお、ＤおよびＬ−４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸の標準化合物は[メソッズ・イン・エンザイモロジー（Methods in Enzymology ）, 17, partB, 275] に記載の方法によって調製した。
【００９３】
この反応上清をファルコン社製2059チューブ２本に０．４ｍｌづつ分注し、先に調製した大腸菌菌体懸濁液を８０μｌづつ加えさらに各チューブに２０％硫酸アンモニウム溶液４０μｌ、５０％グルコース溶液４８μｌおよびＭ９Ｃ溶液８０μｌを添加し、滅菌水で総量を０．８ｍｌに合わせ、３７℃で振とうし３時間反応させた。反応終了後、遠心分離操作によって菌体を除き、上清のγ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸を実施例１と同様にＨＰＬＣにより定量した。定量値を第１３表に示す。
【００９４】
【表１３】
0003737157.tif 000014
【００９５】
実施例１３
HKK2/pHK10株、HKK27/pHK10株を実施例１２と同様に培養した。なおこれら形質転換体の培養は、試験管、三角フラスコいずれにおいても１０ｍｇ／ｌのテトラサイクリンを添加して実施した。こうして得た培養液から遠心分離によって上清を除去し、菌体を１００ｇ湿菌体／ｌとなるように滅菌水に懸濁した。
【００９６】
一方、実施例１２と同様にバチルス  エスピー S16株(FERM BP-4647)を用いて調製したＤ−４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸含有ブロス上清（３８．８ｍＭのＤ−４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を含む）をファルコン社製2059チューブ２本に０．４ｍｌづつ分注し、先に調製した大腸菌菌体懸濁液を８０μｌづつ加えさらに各チューブに２０％硫酸アンモニウム溶液４０μｌ、５０％グルコース溶液４８μｌおよびＭ９Ｃ溶液８０μｌを添加し、滅菌水で総量を０．８ｍｌに合わせ、３７℃で振とうし３時間反応させた。反応終了後、遠心分離操作によって菌体を除き、上清のγ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸を実施例１と同様にＨＰＬＣにより定量した。定量値を第１３表（実施例１２参照）に示す。
【００９７】
実施例１４
バチルス  エスピー OC187株(FERM BP-4646)を実施例１１と同様に培養した。培養終了後、１本の試験管には８０℃で１時間加熱する処理を施し、もう一本は３０℃に保った。ついで遠心分離操作で各々菌体を集め、反応液(a) １ｍｌに懸濁して３０℃で５時間反応を行った。反応液中に生成した４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸（表中ＫＨＧと略記）量を実施例１２と同様に測定し、第１４表に示した。さらにこの反応液を遠心分離して得た上清０．４ｍｌに実施例１３と同様にHKK27/pHK10株の菌体懸濁液、グルコース、硫酸アンモニウム、Ｍ９Ｃ溶液を加え、滅菌水で総量を０．８ｍｌに合わせ３７℃で３時間振とうし反応させた。反応終了後、遠心分離操作によって菌体を除き、上清のγ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸（表中HGと略記）をＨＰＬＣにより定量した。定量値を第１４表に示す。
【００９８】
【表１４】
0003737157.tif 000015
【００９９】
実施例１５
実施例１１と同様にバチルス  エスピー S16株(FERM BP-4647)をＧＭＳＧ培地１０ｍｌを入れた試験管１０本にて３０℃で２０時間培養した。遠心分離操作によってこれら試験管１０本分の菌体を一つに集菌後１０ｍｌの反応液(a) に懸濁し、３０℃で５時間反応を行った。この反応液を遠心分離して得た上清をSUMICHIRAL OA-5000カラム（住友化学社製）を用いたＨＰＬＣにより分析したところ４０．６ｍＭのＤ−４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸が生成していた。Ｌ−４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸は認められなかった。
【０１００】
この反応上清を滅菌した太型試験管４本に２．５ｍｌづつ分注し、さらに各試験管に滅菌した下記の組成のＭＳＣ培地０．５ｍｌ、５０％グルコース溶液０．５ｍｌおよび１０％塩化アンモニウム溶液１ｍｌを添加した。さらにこの試験管の１本には、３ｍｌのＬ培地を含む試験管で３０℃にて一晩培養したアースロバクター  プロトフォルミアエATCC19271株の培養液０．５ｍｌを、１本には同様に培養したシュウドモナス  クロロラフィスATCC9446株の培養液０．５ｍｌを、１本には同様に培養したセラチア  マルセセンスATCC13880 株の培養液０．５ｍｌを、残りの１本には同様に培養したコリネバクテリウム  グルタミクムATCC13032株の培養液０．５ｍｌを加え、３０℃にて４８時間培養した。培養終了後、遠心分離操作によって菌体を除き、上清のγ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸を実施例１と同様にＨＰＬＣにより定量した。定量値を第１５表に示す。
【０１０１】
ＭＳＣ培地（１ｌあたり）：
ＫＨ2ＰＯ4                ２０    ｇ
（ＮＨ4）2ＳＯ4             ２０    ｇ
ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ        ５０  ｍｇ
ＭｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ        ２０  ｍｇ
ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ          ５    ｇ
ＣａＣｌ2               １００  ｍｇ
酵母エキス                １０    ｇ
ペプトン                  １０    ｇ
ｐＨ                        ７．０
【０１０２】
【表１５】
0003737157.tif 000016
【０１０３】
実施例１６
バチルス  エスピー S16株(FERM BP-4647)をＬ培地９ｍｌに接種し３０℃で１６時間振とう培養した。この培養液全量を３００ｍｌのＧＭＳＧ培地に接種し２ｌ容の三角フラスコにて３０℃、２０時間振とう培養した。得られた培養液から菌体を遠心分離し、反応液(a) ６０ｍｌに懸濁し、３００ｍｌ容ビーカー中で撹拌しつつ反応を行った。反応開始６時間後にピルビン酸ナトリウム２Ｍ溶液３ｍｌとグリオキシル酸ナトリウム２Ｍ溶液３ｍｌを添加した。反応開始後２４時間目に遠心分離によって反応液から菌体を除き、１次反応液上清を得た。
【０１０４】
一方、HKK27/pHK10株をテトラサイクリン１０ｍｇ／ｌを加えた１０ｍｌのＬ培地で３７℃にて一晩培養した。この培養液全量を、グルコース０．４％、コハク酸０．０５％、硫酸アンモニウム０．２％、Ｌ−トリプトファン１００ｍｇ／ｌ、酵母エキス０．１％、ペプトン０．１％、テトラサイクリン１０ｍｇ／ｌを加えたＭ９培地７５０ｍｌを含む２ｌ容三角フラスコに添加し、３７℃にて８時間培養した。こうして得た培養液から遠心分離によって上清を除去し、菌体を１００ｇ湿菌体／ｌとなるように滅菌水に懸濁した。
【０１０５】
上記のごとくして得たHKK27/pHK10懸濁液８ｍｌ、５０％グルコース溶液４．８ｍｌ、２０％硫酸アンモニウム溶液４ｍｌ、Ｍ９Ｃ溶液８ｍｌ、滅菌水５．２ｍｌを先に調製した１次反応液５０ｍｌに添加し、３００ｍｌ容ビーカー中で撹拌しつつ２次反応を行った。２次反応中は７％アンモニア水にてｐＨを７に維持した。１２時間反応後、遠心分離操作によって菌体を除き、上清のγ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸をＯＤＳカラム（メルク社製）を用いたＨＰＬＣにより定量した結果、８．６ｇ／ｌのエリスロ−γ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸が検出された。
【０１０６】
実施例１７
実施例１４で得た２次反応上清７５ｍｌを強酸性陽イオン交換樹脂〔ダウエックス50 x 8（Na型）、ダウケミカル社製〕のカラムに通塔し、アンモニアでエリスロ−γ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸を溶出分離し、濃縮、晶出することにより、０．５ｇのエリスロ−γ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸の結晶を得た。
【０１０７】
【発明の効果】
本発明によれば、グルタミンシンターゼやプレシナプス前顆粒のグルタミン酸取り込みを阻害する作用が知られ、これら酵素や器官の研究用試薬およびこれら作用に基づく医薬品として有用である光学活性−γ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸を工業的に有利に提供することができる。