(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記のアミノ酸配列（１文字表記）（Ｉ）：
ＶＩＬＰＮＮＤＲＨＱ  ＩＴＤＴＴＮＧＨＹＡ  ＰＶＴＹＩＱＶＥＡＰ
ＴＧＴＦＩＡＳＧＶＶ  ＶＧＫＤＴＬＬＴＮＫ  ＨＶＶＤＡＴＨＧＤＰ
ＨＡＬＫＡＦＰＳＡＩ  ＮＱＤＮＹＰＮＧＧＦ  ＴＡＥＮＩＴＫＹＳＧ
ＥＧＤＬＡＩＶＫＦＳ  ＰＮＥＱＮＫＨＩＧＥ  ＶＶＫＰＡＴＭＳＮＮ
ＡＥＴＱＶＮＱＮＩＴ  ＶＴＧＹＰＧＤＫＰＶ  ＡＴＭＷＥＳＫＧＫＩ
ＴＹＬＫＧＥＡＭＱＹ  ＤＬＳＴＴＧＧＮＳＧ  ＳＰＶＦＮＥＫＮＥＶ
ＩＧＩＨＷＧＧＶＰＮ  ＥＦＮＧＡＶＦＩＮＥ  ＮＶＲＮＦＬＫＱＮＩ
ＥＤ
を含む天然型スタフィロコッカス・アウレウスＶ８プロテアーゼのアミノ酸配列において、上記アミノ酸配列（Ｉ）の44位の置換D（Asp）→Glu、71位の置換N（Asn）→Ser及び147位の置換K（Lys）→Argの少なくとも１個を有する変異型スタフィロコッカス・アウレウスＶ８プロテアーゼ。
【請求項２】
前記置換の数が１個、２個又は３個である、請求項１に記載の変異型スタフィロコッカス・アウレウスＶ８プロテアーゼ。
【請求項３】
前記置換の数が１個である、請求項１又は２に記載の変異型スタフィロコッカス・アウレウスＶ８プロテアーゼ。
【請求項４】
44位の置換Asp→Gluと71位の置換Asn→Ser、44位の置換Asp→Gluと147位の置換Lys→Arg、又は71位の置換Asn→Serと147位の置換Lys→Arg、のいずれかを有する請求項１又は２に記載の変異型スタフィロコッカス・アウレウスＶ８プロテアーゼ。
【請求項５】
71位の置換Asn→Serと147位の置換Lys→Argとを有する、請求項４に記載の変異型スタフィロコッカス・アウレウスＶ８プロテアーゼ。
【請求項６】
44位の置換Asp→Glu、71位の置換Asn→Ser及び147位の置換Lys→Argの全てを有する、請求項１又は２に記載の変異型スタフィロコッカス・アウレウスＶ８プロテアーゼ。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の変異型スタフィロコッカス・アウレウスＶ８プロテアーゼをコードする遺伝子。
【請求項８】
請求項７に記載の遺伝子を有する発現ベクター。
【請求項９】
請求項８に記載の発現ベクターにより形質転換された組換え細胞。
【請求項１０】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の変異型スタフィロコッカス・アウレウスＶ８プロテアーゼの製造方法において、請求項９に記載の組換え細胞を培養した後、当該培養物から目的のプロテアーゼ蛋白質を採取することを特徴とする当該プロテアーゼの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は蛋白変性をもたらす環境条件下においても酵素活性を有する変異型スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus ）Ｖ８プロテアーゼ（以下、スタフィロコッカス・アウレウスＶ８プロテアーゼを天然型Ｖ８プロテアーゼと称する）、当該酵素蛋白をコードする遺伝子、当該遺伝子を有する発現ベクター、当該発現ベクターにより形質転換された組換え細胞及び当該酵素の製造方法に関する。
【０００２】
さらに詳細には、本発明に係る酵素蛋白は、蛋白変性剤または温度等により蛋白変性をもたらす環境条件下においても、従来知られている天然型Ｖ８プロテアーゼと比較して、より安定に酵素活性を有する変異型Ｖ８プロテアーゼに関する。
【０００３】
【従来の技術】
天然型Ｖ８プロテアーゼはS. aureus Ｖ８株が培地中に分泌するセリンプロテアーゼの一種である。１９７２年にDrapeau, G. R.  等によりS. aureus Ｖ８株の培地より、グルタミン酸及びアスパラギン酸のＣ末端側のペプチド結合を特異的に切断するセリンプロテアーゼの一種として単離精製され（Jean Houmard and Gabriel R. Drapeau(1972) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 3506-3509),  １９８７年にはCynthia Carmona 等によりＤＮＡ塩基配列が明らかになっている（Cynthia Carmona and Gregory L. Gray (1987) Nucleic. Acid. Res.15, 6757) 。
【０００４】
当該酵素は３３６個のアミノ酸残基からなる前駆体として発現された後、Ｎ末端から６８個のアミノ酸残基からなるプレプロ配列が除去されて成熟蛋白として分泌される。さらに当該酵素にはそのＣ末端領域（Ｎ末端からのアミノ酸配列番号；２２１−２５６）にプロリン−アスパラギン酸−アスパラギンのリピート（繰り返し）配列が存在しているが、当該配列は酵素活性には必要ないことを本発明者等は既に見いだしている（特願平６−２９６０２８、ＥＰ７００９９５Ａ）。
【０００５】
天然型Ｖ８プロテアーゼは酵素としての機能解析は不十分であるにも拘わらず、当該酵素はグルタミン酸及びアスパラギン酸のＣ末端側のペプチド結合を特異的に切断することから蛋白のアミノ酸配列の決定に汎用されている。また、天然型Ｖ８プロテアーゼは蛋白の変性を起こさせるような蛋白変性剤の一つである尿素の存在下（２Ｍ尿素程度）でも基質にある程度作用することから、遺伝子組換え技術で宿主内に大量に発現させた目的ペプチドを含む不溶性融合蛋白を尿素で可溶化した後、尿素存在下に当該酵素を作用させて目的ペプチドを融合蛋白から遊離させる工程にも使用されている。
【０００６】
一方、本発明者等はヒトカルシトニンの遺伝子組換え法による製造に関して、上記の方法を用いて効率良くヒトカルシトニンを製造することに成功している（特開平５−３２８９９２）。また、ヒトグルカゴンを大腸菌発現系で融合蛋白として発現させた例においても、天然型Ｖ８プロテアーゼが当該融合蛋白からヒトグルカゴンの切り出しに使用されている（Kazumasa Yosikawa et al. (1992) Journal of Protein Chemistry 11, 517-525) 。
【０００７】
以上のように、天然型Ｖ８プロテアーゼは非常に多くの生化学的研究又は遺伝子組換えによるペプチドの製造に用いられている。天然型Ｖ８プロテアーゼは蛋白の変性を起こさせることで知られている尿素を含む酵素反応液中（２Ｍ程度の尿素を含む）においてもある程度の切断反応を行なうため、遺伝子組換え法による有用ペプチド等の製造に用いられている。
【０００８】
しかし、この天然型Ｖ８プロテアーゼの当該性質に加えて更に蛋白変性をもたらす環境条件下においても酵素活性を有する変異型Ｖ８プロテアーゼを作製し、用いることができれば、当該環境条件下においても酵素活性の失活が抑えられることになる。従って、当該性質を有する変異型Ｖ８プロテアーゼを用いることができれば、（１）蛋白変性剤存在下の反応系に加える酵素量が少なくてすむ、（２）または反応時間の短縮が行なえる、（３）更には高濃度の蛋白変性剤存在下や高温下で蛋白切断が行なえることにより今まで得られなかったペプチド断片が得られる等の利点があげられるために、研究上及び産業上、当該変異型Ｖ８プロテアーゼが非常に望まれていた。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、蛋白変性をもたらすような環境条件においても酵素活性を有する変異型Ｖ８プロテアーゼを得ることを目的とし、更に本発明は、当該酵素蛋白をコードする遺伝子、当該遺伝子を有する発現ベクター、当該発現ベクターにより形質転換された組換え細胞及び当該酵素蛋白の製造方法に関するものである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、天然型Ｖ８プロテアーゼ遺伝子からＰＣＲ法で取得した野性型Ｖ８プロテアーゼ誘導体遺伝子にＰＣＲ法でランダム変異を起こさせ、適当な宿主を選択して、蛋白変性をもたらすような環境条件下でもより安定に酵素活性を示す変異型Ｖ８プロテアーゼ誘導体を発現する遺伝子を取得し、当該遺伝子によりコードされる遺伝子産物（蛋白質）が上記に述べた目的を十分に達成し、産業上非常に有用であることを確認することにより本発明を完成した。
【００１１】
本明細書において、変異型Ｖ８プロテアーゼとは天然型Ｖ８プロテアーゼが蛋白変性をもたらすような環境条件においても酵素活性を有する酵素蛋白を意味し、野性型Ｖ８プロテアーゼ誘導体とは天然型Ｖ８プロテアーゼから当該蛋白のＣ末端の一部分を欠失させた酵素蛋白を意味し、変異型Ｖ８プロテアーゼ誘導体とは野生型Ｖ８プロテアーゼ誘導体に変異を起こさせた酵素蛋白を意味する。
なお、野性型Ｖ８プロテアーゼ誘導体にはＣ末端アミノ酸配列の異なる３種類の野性型Ｖ８プロテアーゼ誘導体が作製され、それらは各々（１）  野性型Ｖ８プロテアーゼ誘導体ＲＰＴ（−）（略称、Ｖ８ＲＰＴ（−））、（２）野性型Ｖ８プロテアーゼ誘導体Ｄ（略称、Ｖ８Ｄ) 、（３）野性型Ｖ８プロテアーゼ誘導体Ｆ（略称、Ｖ８Ｆ）と記載する。また、これらの野性型Ｖ８プロテアーゼ誘導体に変異が導入された変異型Ｖ８プロテアーゼ誘導体については、各誘導体の末尾に変異の種類を示す番号を記載することにより（例えば、Ｖ８ＲＰＴ（−）１、Ｖ８Ｄ５、Ｖ８Ｆ１５８等）、導入されている変異の種類を表わす。
【００１２】
従来知られている天然型Ｖ８プロテアーゼが変性をもたらすような環境条件としては、蛋白変性剤又は温度等により蛋白構造が変化する場合が挙げられるが、本明細書においては蛋白変性剤による場合、特に蛋白変性剤としての高濃度の尿素に対して十分な耐性を有する酵素蛋白を例に挙げて詳細に説明する。
前述のように天然型Ｖ８プロテアーゼのアミノ酸配列とＤＮＡ塩基配列は既に明らかになっているが、蛋白の高次構造は明らかになっていない。従って、どのアミノ酸を変えれば高濃度の尿素に対して耐性を有する性質が付加されるのかは全く不明である。
【００１３】
そこで本発明者等は尿素耐性を示す本酵素の変異遺伝子を単離するには、本遺伝子をコードする遺伝子にランダムに変異を起こさせ、変異を持った遺伝子を発現プラスミドに組み込み、宿主細胞を組換えプラスミドで形質転換し、遺伝子発現を行なった後、天然型Ｖ８プロテアーゼが失活する５Ｍ尿素存在下でも酵素活性を示す酵素を発現する組換え体をスクリーニングする方法が適切であろうと考え本発明に係る以下の研究を行なった。
【００１４】
まず、天然型Ｖ８プロテアーゼ遺伝子からＰＣＲ法で取得した野性型Ｖ８プロテアーゼ誘導体ＲＰＴ（−）遺伝子を組み込んだプラスミドｐＶ８ＲＰＴ（−）を作製した。なお野性型Ｖ８プロテアーゼ誘導体ＲＰＴ（−）とは天然型Ｖ８プロテアーゼのＣ末端の４８アミノ酸を欠失した誘導体であり、プラスミドｐＶ８ＲＰＴ（−）はこの野性型Ｖ８プロテアーゼ誘導体ＲＰＴ（−）と大腸菌β−ガラクトシダーゼ誘導体（β−ｇａｌ９７Ｓ４Ｄ）との融合蛋白を発現するプラスミドである。
【００１５】
次に、ｐＶ８ＲＰＴ（−）上の野生型Ｖ８プロテアーゼ誘導体ＲＰＴ（−）遺伝子に対しＰＣＲ法によるランダム変異処理を行い、変異処理された野生型Ｖ８プロテアーゼ誘導体ＲＰＴ（−）遺伝子のプールを調製した。この変異処理を受けた遺伝子プールをｐＶ８ＲＰＴ（−）上の野性型Ｖ８プロテアーゼ誘導体ＲＰＴ（−）遺伝子と置換し、大腸菌ＪＭ１０１に形質転換を行ない、多数の組換え体を得た。これらの組換え体を培養し、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（以下ＩＰＴＧ）を添加し融合蛋白の遺伝子発現を行なった。培養液に最終濃度が約５Ｍになるように尿素を添加した後、本酵素の合成基質であるZ-Phe-Leu-Glu-4-nitroanilideを用いて酵素反応を行なった。
【００１６】
約７００株の組換え体をスクリーングした結果、上記の反応条件で酵素活性を有する４株の組換え体Ｕ１、Ｕ５、Ｕ７及びＵ８株が得られた。これらの変異株を用い５Ｍ尿素存在下での酵素活性を天然型Ｖ８プロテアーゼと比較したところ、いずれも天然型Ｖ８プロテアーゼよりはるかに高い尿素抵抗性を示した。
【００１７】
更にこれらの組換え体よりプラスミドを単離し、変異型Ｖ８プロテアーゼ誘導体ＲＰＴ（−）遺伝子のＤＮＡ塩基配列を決定したところ、Ｕ１株では１４７番目のアミノ酸のリジンがアルギニンに、Ｕ５株では７１番目のアミノ酸のアスパラギンがセリンに、Ｕ７株では７１番目のアミノ酸のアスパラギンがセリン及び１４７番目のアミノ酸のリジンがアルギニンに、Ｕ８株では４４番目のアミノ酸のアスパラギン酸がグルタミン酸に置換される変異を起こしていた。すなわちアミノ酸置換として３種類が得られ、とくにＵ７株由来のものはＵ１株とＵ５株由来のアミノ酸置換を組み合わせた２重変異であることが明らかとなった。
【００１８】
野生型Ｖ８プロテアーゼ誘導体ＲＰＴ（−）が尿素耐性を示すには上記の位置のアミノ酸変異が必要であることが本発明者等により始めて明らかにされた。これらのアミノ酸の位置はＶ８プロテアーゼ蛋白の構造を保つうえで重要な位置と考えられる。従って、これらの位置に他のアミノ酸を導入することにより本発明に係る酵素の蛋白構造が変化し、尿素耐性が上がることが十分に考えられる。
【００１９】
得られた変異型Ｖ８プロテアーゼ誘導体ＲＰＴ（−）において、２重変異を持つＵ７株由来のものが最も尿素耐性に優れていることから、本発明者等は、上記の３種類の変異を組み合わせて野生型Ｖ８プロテアーゼ誘導体ＲＰＴ（−）遺伝子に導入すれば、個々の変異型Ｖ８プロテアーゼ誘導体ＲＰＴ（−）が示す尿素耐性より更に耐性が増すのではないかと考え、３重変異を有する変異型Ｖ８プロテアーゼ誘導体ＲＰＴ（−）遺伝子を作製し、その融合蛋白を発現させて尿素耐性を検討した。その結果、３重変異を有する変異型Ｖ８プロテアーゼ誘導体ＲＰＴ（−）は、個々の変異型Ｖ８プロテアーゼ誘導体ＲＰＴ（−）より高い尿素耐性を示すことが明らかになった。
【００２０】
次に、本発明者等は上記の変異型Ｖ８プロテアーゼ誘導体の生産について検討した。この際、変異型Ｖ８プロテアーゼ誘導体ＲＰＴ（−）とはＣ末端のアミノ酸配列が異なる変異型Ｖ８プロテアーゼ誘導体Ｄあるいは同Ｆを用い、まずそれらを不活性な封入体として発現させ、その後、活性ある変異型Ｖ８プロテアーゼ誘導体Ｄあるいは同Ｆを得る方法による生産を試みた。これは変異型Ｖ８プロテアーゼ誘導体ＲＰＴ（−）では発現量が低く生産には不利なことによる。なお変異型Ｖ８プロテアーゼ誘導体Ｄおよび同Ｆを作製するにあたり使用した野生型Ｖ８プロテアーゼ誘導体Ｄ及び同Ｆは、それぞれ天然型Ｖ８プロテアーゼのＣ末端の５６アミノ酸及び５３アミノ酸を欠く誘導体である。
【００２１】
野生型Ｖ８プロテアーゼ誘導体Ｄ及び野生型Ｖ８プロテアーゼ誘導体Ｆを発現させるプラスミドであるｐＶ８Ｄ又はｐＶ８Ｆに変異型Ｖ８プロテアーゼ誘導体遺伝子を組み込み、培養後、大腸菌β−ガラクトシダーゼ誘導体、変異型Ｖ８プロテアーゼ誘導体Ｄあるいは同Ｆ、及びアミノグリコシド３’−ホスホトランスフェラーゼ誘導体  （ｔＡＰＴ）からなる不溶性の融合蛋白を回収し、大腸菌の内因性ｏｍｐＴプロテアーゼによる融合蛋白の切断を尿素存在下に行い、変異型Ｖ８プロテアーゼ誘導体Ｄあるいは同Ｆを上記融合蛋白から切り出した。その後、各種の変異型Ｖ８プロテアーゼ誘導体Ｄあるいは同Ｆをリフォールディング工程、精製クロマト工程を経てを精製し工業スケールで生産が可能であることを示した。
【００２２】
さらに精製した各種の変異型Ｖ８プロテアーゼ誘導体Ｄ又は同Ｆを用い、各種の蛋白変性をもたらす環境条件下、例えば、尿素存在下、ＳＤＳ存在下及び高温における条件下における野性型との比較検討を行った。その結果、変異型は野性型に比べ尿素及びＳＤＳによる失活速度が減少し、これらの変性剤に対する耐性を示すことが明らかになった。
【００２３】
３重変異を持つ変異型Ｖ８プロテアーゼ誘導体ＦであるＶ８Ｆ１５８は５Ｍ尿素存在下においても天然型Ｖ８プロテアーゼより安定に酵素活性を有することから、融合蛋白からのペプチドの切断実験を行った。融合蛋白としては保護ペプチド（β−ｇａｌ９７Ｓ４Ｄ）とヒトＣ型心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰ−２２）がリンカーペプチドを介して融合され、Ｖ８プロテアーゼによりＣＮＰが遊離される構造を有するβ−ｇａｌ９７Ｓ４ＤｈＣＮＰ−２２Ｒ５−３を用いた。
【００２４】
５Ｍ尿素存在下にＶ８Ｆ１５８と天然型Ｖ８プロテアーゼのヒトＣ型心房性ナトリウム利尿ペプチド融合蛋白に対する切断効率を検討した結果、Ｖ８Ｆ１５８の方が非常に高い切断効率で上記融合蛋白を切断できることを実証した。
本発明者等の実施例から変異型Ｖ８プロテアーゼ誘導体Ｆ（Ｖ８Ｆ１、Ｖ８Ｆ５およびＶ８Ｆ８）は野性型Ｖ８プロテアーゼ誘導体Ｆに比べ、５Ｍ尿素濃度及び０．１％ＳＤＳ存在下の酵素反応において変性剤に対する耐性を示すことが明らかになった。しかし、高温（５０℃）での酵素反応の比較においては変異型Ｖ８プロテアーゼ誘導体Ｆ８（Ｖ８Ｆ８）は野性型Ｖ８プロテアーゼ誘導体Ｆ（Ｖ８Ｆ）に比べて熱安定性が低くなっていた。
【００２５】
尿素と高温という蛋白変性条件の違いにより、それら変性条件に対する酵素の抵抗性に異なる結果が得られたが、変異部位のアミノ酸残基が当該蛋白の高次構造を保つのに重要であることを改めて示唆する結果であるといえる。従って、変異型Ｖ８プロテアーゼ誘導体Ｆ８（Ｖ８Ｆ８）の変異位置のアミノ酸を他のアミノ酸に置換すれば、温度に対する抵抗性があがると当業者にとり容易に推測できると考えられることから、本発明の有用性をそこなうものではない。
【００２６】
本発明者等は、変異型Ｖ８プロテアーゼ誘導体、野性型Ｖ８プロテアーゼ誘導体及び天然型Ｖ８プロテアーゼについて、蛋白変性をもたらす環境条件下における酵素活性を比較することで、変異型Ｖ８プロテアーゼ誘導体の有用性を証明した。本発明者等により得られた結果から、これらの変異を天然型Ｖ８プロテアーゼに導入すれば蛋白変性をもたらす環境条件下においても天然型と同等以上の酵素活性を有することは当業者に容易に推測できることである。
従って、本発明に係る酵素蛋白は、蛋白変性もたらすような環境条件においても酵素活性を示す変異型Ｖ８プロテアーゼであり、望ましくは当該プロテアーゼが天然型Ｖ８プロテアーゼ中に少なくとも１つ以上の変異部位を有することを特徴とするプロテアーゼである。
【００２７】
また、更に具体的に好ましい態様としては変異部位が天然型Ｖ８プロテアーゼ中のＮ末端から４４番目のアスパラギン酸、７１番目のアスパラギン及び／又は１４７番目のリジンの部位であることを特徴とするプロテアーゼであり、この場合、変異部位を１箇所、２箇所乃至３箇所有する場合等が挙げられる。
【００２８】
そして、最も好ましい態様としては、
（１）変異部位が１箇所である場合、当該変異部位が天然型Ｖ８プロテアーゼ中のＮ末端から４４番目のアスパラギン酸がグルタミン酸に置換された場合、７１番目のアスパラギンがセリンに置換された場合又は１４７番目のリジンがアルギニンに置換された場合等が挙げられ、
【００２９】
（２）変異部位が２箇所である場合、当該変異部位が天然型Ｖ８プロテアーゼ中のＮ末端から４４番目のアスパラギン酸及び７１番目のアスパラギンの部位である場合（この場合、特に好ましのは４４番目のアスパラギン酸がグルタミン酸に、及び７１番目のアスパラギンがセリンに置換された場合が挙げられる）、４４番目のアスパラギン酸及び１４７番目のリジンの部位である場合（この場合、特に好ましのは４４番目のアスパラギン酸がグルタミン酸に、及び１４７番目のリジンがアルギニンに置換された場合が挙げられる）、又は７１番目のアスパラギン及び１４７番目のリジンの部位である場合（この場合、特に好ましのは７１番目のアスパラギンがセリンに、及び１４７番目のリジンがアルギニンに置換された場合）等が挙げられ、
【００３０】
（３）変異部位が３箇所である場合、当該変異部位が天然型Ｖ８プロテアーゼ中のＮ末端から４４番目のアスパラギン酸、７１番目のアスパラギン及び１４７番目のリジンの部位である場合（この場合、特に好ましのは４４番目のアスパラギン酸がグルタミン酸に、７１番目のアスパラギンがセリンに、及び１４７番目のリジンがアルギニンに置換された場合）等が挙げられる。
【００３１】
上記の変異型Ｖ８プロテアーゼをコードする遺伝子の作製法としては、S. aureus から遺伝子を単離する方法、例えば報告されている天然型Ｖ８プロテアーゼ遺伝子配列からプライマーをデザインし、S. aureus の遺伝子バンクから単離する方法、または本発明者等が行ったＰＣＲ法などが挙げられる。さらに、明らかになっているS. aureus の天然型Ｖ８プロテアーゼ遺伝子配列から遺伝子を化学合成することも可能であることは言うまでもない。
【００３２】
本明細書においてはＰＣＲ法で変異型Ｖ８プロテアーゼ誘導体遺伝子を作製したが、変異方法としては従来から知られている方法、例えばin vivo 法（変異誘発剤処理、紫外線及び放射線処理等）、種々のin vitro変異法を用い変異遺伝子を作製することができる。また、所謂自然突然変異選択法でも本発明に係る方法で変異株を選択できる。
【００３３】
蛋白の変性をもたらす酵素反応条件としては尿素、ＳＤＳを含む反応液及び高温（例えば４５℃以上）での酵素反応が上げられる、その他の蛋白変性剤としては塩酸グアニジンや界面活性剤等が挙げられる。蛋白変性作用を持つ酵素反応条件としては尿素の場合２〜５Ｍ、塩酸グアニジンの場合０、０１〜６Ｍ、ＳＤＳの場合０、０１〜１０％、温度の場合４５〜６５℃等が挙げられる。
【００３４】
本発明に係る蛋白変性をもたらす環境条件下においても酵素活性を有する変異型Ｖ８プロテアーゼ遺伝子の発現方法としては以下の方法が挙げられる。本明細書の実施例においては大腸菌を宿主細胞として用いたが、宿主細胞としては原核細胞においてはブドウ球菌、サルモネラ菌、放線菌、枯草菌等を挙げることができ、また、真核細胞においては糸状菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞等の宿主細胞を挙げることができる。これらの宿主細胞に通常用いられている形質転換法により、変異型Ｖ８プロテアーゼ遺伝子を導入することができる。
【００３５】
形質転換に用いる発現プラスミドとしては、その宿主細胞で機能的に下流の遺伝子発現をコントロールできるプロモーターを有し、直接発現法や所謂融合蛋白発現法などを行える発現プラスミドが望ましい。また、ベクターとして遺伝子相同組換えを行えるベクターを用い、適当な宿主細胞の染色体に当該遺伝子を組み込み、当該蛋白を発現させることも可能である。さらには、当該遺伝子を組み込んだウイルスやファージを宿主細胞に感染させ当該遺伝子を発現させる方法も可能である。
【００３６】
また、本発明に係る蛋白変性をもたらす環境条件下においても酵素活性を有する変異型Ｖ８プロテアーゼの製造方法に関して、本発明者等は非常に効率よい製造方法を実施例で示したが、この方法に限定されるだけでなく、既に知られている一般の遺伝子組換え技術により製造することができる。
【００３７】
例えば、上述の発現方法を用いて（１）宿主細胞内で当該蛋白のＮ末端から直接発現させ可溶性あるいは不溶性蛋白として分離精製する製造する方法（２）宿主細胞内で融合蛋白として当該蛋白を可溶性あるいは不溶性融合蛋白として発現させ、プロセッシング酵素が切断できる条件で融合蛋白を切断し、当該蛋白を分離精製する製造方法、（３）宿主細胞外に当該蛋白を分泌させ、当該蛋白を分離精製する製造方法、（４）宿主菌のペリプラスムに可溶性及び不溶性の蛋白として当該蛋白を分離精製する製造方法等が挙げられる。当該蛋白を直接発現法及び融合蛋白法で発現させる場合、不溶性蛋白になった場合には適当なリフォールディング工程を経て分離精製し製造することは言うまでもない。
【００３８】
本明細書の実施例においては、本発明に係る変異型Ｖ８プロテアーゼ誘導体の精製の為に、リフォールディング後、疎水性クロマトグラフィーを用いているが、他の精製方法でも、例えばゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー等の通常の蛋白の精製操作により高純度に精製できる。更に、リフォールディング反応終了時には当該酵素蛋白が活性化され夾雑蛋白を分解していまい、その結果、反応終了後の主要蛋白成分が変異型Ｖ８プロテアーゼ誘導体であることから、精製が非常に容易であることは述べるまでもない。
【００３９】
【実施例】
以下に実施例により本発明を詳細に説明する。
実施例１ 野生型Ｖ８プロテアーゼ誘導体ＲＰＴ（−）遺伝子の単離
ＰＣＲ  法により野生型Ｖ８プロテアーゼ誘導体ＲＰＴ（−）遺伝子の単離を行った。図１（ｂ）に示す配列を持つ２種のＰＣＲプライマーを設計し、ＤＮＡ合成機（アプライド・バイオシステム社製３９２型）により合成した。プライマーＡ及びＢは、図１（ａ）に示すＶ８プロテアーゼ遺伝子領域に対応し、各々の５’側にはXho I あるいはSal I 制限酵素認識配列を設けている。
【００４０】
Jayaswal, R. K. ら（J. Bacteriol. 172:5783-5788 (1990)）の方法により単離調製したS. aureus Ｖ８株（ATCC27733 ）の染色体とこれらのＰＣＲプライマーを用いてＰＣＲを行った。1.0 μＭのプライマー、１μｇの染色体ＤＮＡ、50mM KCl、10mM Tris-HCl, pH8.3、1.5mM MgCl2 、0.01% ゼラチン、200 μＭのdNTP（dATP、dGTP、dCTP、dTTPの混合物）を含む50μl の反応液に2.5 ユニットのＴａｑＤＮＡポリメラーゼを添加し、９４℃・１分、７２℃・２分、５５℃・２分のＰＣＲを３０サイクル行った。その結果、プレプロ配列及びＣ末端の４８アミノ酸を欠く野生型Ｖ８プロテアーゼ誘導体ＲＰＴ（−）遺伝子が得られた。
【００４１】
次に、これらの遺伝子を寒天ゲル電気泳動し、SUPREP-2（宝酒造（株））を用いて精製した後、制限酵素Xho I 及びSal I で切断し、Xho I 、Sal I の粘着末端をもつ野生型Ｖ８プロテアーゼ誘導体ＲＰＴ（−）遺伝子断片を調製した。
【００４２】
実施例２ 発現ベクターｐＶ８ＲＰＴ（−）  の作製及び野生型Ｖ８プロテアーゼ誘導体ＲＰＴ（−）の発現
本実施例で用いるｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＴ〔Ｇ〕Ｒ６（Appl. Microbiol. Biotechnol. (1995) 42, 703-708 ）は、大腸菌β−ガラクトシダーゼ誘導体とヒトカルシトニン前駆体（ｈＣＴ〔Ｇ〕）との融合蛋白質を高発現するプラスミドであり、当該プラスミドはプラスミドｐＢＲ３２２とプラスミドｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＴ〔Ｇ〕より作製することができる（図２）。
【００４３】
なお、プラスミドｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＴ〔Ｇ〕を含有する大腸菌Ｗ３１１０株はブダペスト条約に基づいて工業技術院生命工学技術研究所にEscherichai coli SBM323 として１９９１年８月８日に寄託されており、受託番号微工研条寄第３５０３号（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３５０３）が付与されている。
【００４４】
ＰＣＲにより得られた野生型Ｖ８プロテアーゼ誘導体ＲＰＴ（−）遺伝子を発現させるため、ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＴ〔Ｇ〕Ｒ６をXho I 及びSal I で処理し、ヒトカルシトニン前駆体遺伝子部を欠いたＤＮＡ断片（3.1kb ）を寒天ゲル電気泳動により調製した。このＤＮＡ  断片と先に得られたXho I 、Sal I の粘着末端をもつ野生型Ｖ８プロテアーゼ遺伝子断片をＴ４ＤＮＡリガーゼにより連結し、ＪＭ１０１（本菌株は、例えばStratagene社等より入手できる）に形質転換を行い、ｐＶ８ＲＰＴ（−）を作製した（図３）。このプラスミドより発現される野生型Ｖ８プロテアーゼ誘導体ＲＰＴ（−）とβ−ガラクトシダーゼ誘導体との融合蛋白質（βG97V8RPT(-) ) のアミノ酸配列を図４に示す。
【００４５】
ＪＭ１０１／ｐＶ８ＲＰＴ（−）を１００ｍｌのＬＢ培地（0.5 ％酵母エキス、1.0 ％トリプトン、0.5 ％NaCl）を用い３７℃でＯＤ６６０が１．０になるまで培養後、ＩＰＴＧを最終濃度が２ｍＭになるように添加し発現の誘導を行った。添加後さらに２時間培養を継続した後、菌体を遠心分離により回収し、ＯＤ６６０が５となるようにＴＥバッファー（10mM Tris-HCl(pH8.0),1mM EDTA ）に懸濁した。当該懸濁液を超音波破砕機（Cellruptor; 東湘電気（株））で破砕後、12000rpm、５分の遠心分離により不溶性画分を除去し、上清画分を粗酵素液として使用した。
【００４６】
Ｖ８プロテアーゼの活性測定には合成基質（Z-Phe-Leu-Glu-4-nitroanilide；ベーリンガーマンハイム社製）を用いた。940 μl の100mM Tris-HCl（pH8.0 ）緩衝液に20μl の10mM Z-Phe-Leu-Glu-4-nitroanilide 溶液（ＤＭＳＯ溶液）を混合後、40μl の粗酵素液を添加し、室温５分間の反応による405nm の吸収増加を測定した。測定には日立分光光度計U-3200を使用した。
【００４７】
その結果、ＪＭ１０１／ｐＶ８ＲＰＴ（−）においては、それらの菌体より調製した粗酵素液には８μｇ／ｍｌの天然型Ｖ８プロテアーゼに相当する活性が認められ、β−ガラクトシダーゼ誘導体との融合蛋白質の形で、かつプレプロ配列及びＣ末端リピート配列を欠いた状態で活性があることが判明した。
【００４８】
実施例３ ＰＣＲによるＶ８プロテアーゼ誘導体ＲＰＴ（−）遺伝子の変異処理
尿素に対して耐性を持つＶ８プロテアーゼを得るため、ＰＣＲにより野生型Ｖ８プロテアーゼ誘導体ＲＰＴ（−）遺伝子を変異処理した。実施例２で得られたｐＶ８ＲＰＴ（−）（図３）は、Ｃ末端の４８アミノ酸が欠失した野生型Ｖ８プロテアーゼ誘導体（Ｖ８ＲＰＴ（−））を、大腸菌βーガラクトシダーゼ誘導体（β−ｇａｌ９７Ｓ４Ｄ）との融合蛋白質として発現するプラスミドであり、菌体内の可溶性画分に発現した融合蛋白質（以後、本融合蛋白質をβＧ９７Ｖ８ＲＰＴ（−）と表記する）はＶ８プロテアーゼ活性を持つ。
【００４９】
当該プラスミドのβＧ９７Ｖ８ＲＰＴ（−）遺伝子に対し、図５（ａ）に示すプライマーを用いて、ＰＣＲを行った（図５（ｂ））。１μmol のプライマー、50ngのｐＶ８ＲＰＴ（−）、50mM KCl、10mM Tris-HCl (pH8.3) 、1.5mM MgCl2 、0.01% ゼラチン、10% ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、各1mＭの dGTP, dCTP, dTTP 、200 μＭ dATP を含む50μl の反応液に２．５ユニットのＴａｑＤＮＡポリメラーゼを添加し、９４℃・１分、７２℃・２分、５５℃・２分のＰＣＲを３０サイクル行った。得られたＰＣＲ産物（１Ｋｂｐ）はクロロホルム処理、エタノール沈殿処理の後、50μl のＴＥバッファー（10mM Tris-HCl (pH8.0),
1mM EDTA ）に溶解した。
【００５０】
実施例４ 尿素耐性をもつ変異型Ｖ８プロテアーゼ誘導体ＲＰＴ（−）のスクリーニング（１次スクリーニング）
実施例３で得られたＰＣＲ産物を制限酵素Bgl II及びSal I で切断後、変異処理を受けた野生型Ｖ８プロテアーゼ誘導体ＲＰＴ（−）遺伝子を含む0.8KbpのＤＮＡ断片を0.8 ％アガロースゲル電気泳動の後単離し、これをライゲーションキット（宝酒造（株）製）を用いて、ｐＶ８ＲＰＴ（−）由来のBgl II-Sal I 3.0Kbp 断片と連結した（図６）。反応終了後、塩化カルシウム法により大腸菌ＪＭ１０１（本菌株はIn Vitrogen Catalog No. c660-00 より入手可）に形質転換し、10μg/mlのテトラサイクリンを含むＬＢ寒天培地（1 ％トリプトン、0.5 ％酵母エキス、0.5 ％NaCl、1.5 ％寒天）で形質転換体を取得した。なお、制限酵素反応、アガロースゲル電気泳動、形質転換の各操作は常法に従った。
【００５１】
次に、5 mg/ml グリセリン、6 mg/ml Na2HPO4 、3 mg/ml KH2PO4、0.5 mg/ml NaCl、1.0mg/ml NH4Cl、2 mM MgSO4・7H2O、0.1mM CaCl2 , 40μg/mlの各アミノ酸（２０種類）、1 μg/ml塩酸チアミン、5 μg/mlテトラサイクリンを含む培地（pH 7.4）を調製し、９６ウェル培養プレート（コーニング社製；製品番号25860 ）に50μl ずつ分注した。この培地に先の形質転換体を1 株ずつ接種し、３７℃で培養した。１晩静置培養後、各ウェルに同組成の新鮮な培地を50μl 分注し、さらに３７℃で３時間静置培養した。その後、50mMのＩＰＴＧ溶液を10μl 分注し、３７℃で１時間、遺伝子発現を誘導した。
【００５２】
次に、10mg/ml のリゾチーム水溶液を30μl 添加し、１０分放置後、0.1 ％トリトンX-100, 5mM EDTA (pH8.0) を含む溶液を30μl 添加し、溶菌処理を行った。
続いて、10M 尿素を含む0.1M Tris-HCl (pH8.0) を160 μl 添加し（最終尿素濃度4.85M ）、３０℃で３０分間放置後、10μl の20mMの Z-Phe-Leu-Glu-4-nitroanilide （ベーリンガーマンハイム社製）を含むＤＭＳＯ溶液を添加し、３０℃で１晩反応させた。
【００５３】
約７００個の形質転換体に対して上記のスクリーニングを行ったところ、酵素基質である Z-Phe-Leu-Glu-4-nitroanilide の分解より生ずる黄色の発色が、他に比べ強いものが４株得られ、これらの名称をＵ１、Ｕ５、Ｕ７及びＵ８とした。
【００５４】
実施例５ 尿素耐性をもつ変異型Ｖ８プロテアーゼ誘導体ＲＰＴ（−) のスクリーニング（２次スクリーニング）
この４株（Ｕ１、Ｕ５、Ｕ７及びＵ８）を10mlのＬＢ培地（0.5 ％酵母エキス、1.0 ％トリプトン、0.5 ％NaCl）でＯＤ６６０が１．０になるまで３７℃で培養後、ＩＰＴＧを最終濃度が２mMになるように添加し、さらに２時間培養を継続した後、菌体を遠心分離により回収した。
【００５５】
次に、菌体をＯＤ６６０が５となるようにＴＥバッファー（10mM Tris-HCl  (pH8.0),1mM EDTA ）に懸濁し、超音波破砕機（Cellruptor; 東湘電気（株））により菌体を破砕した。破砕液を12000rpm  、５分の遠心分離により不溶性画分を除去し、上清画分を粗酵素液として用いた。
【００５６】
プロテアーゼ活性の測定は940 μl の50mM Tris-HCl(pH8.0)緩衝液に20μl の20mM Z-Phe-Leu-Glu-4-nitroanilide 溶液を混合後、40μl の粗酵素液を添加し、室温５分間の反応による405nm の吸収増加を日立分光光度計U-3200により測定した。４株由来の粗酵素液についてＶ８プロテアーゼ活性を測定した後、次に天然型Ｖ８プロテアーゼ（例えば、エンドプロテイナーゼGlu-C ；ベーリンガーマンハイム社製）0.2 μg の酵素活性に相当する粗酵素液を用いて、尿素存在下における反応の経時変化を調べた。実験操作は、5M尿素、50mM Tris-HCl (pH8.0) 、0.4mM Z-Phe-Leu-Glu-4-nitroanilide、２％ＤＭＳＯを含む反応液１mlで行い、405nm の吸収増加により反応の経時変化を測定した（日立分光光度計U-3200使用）。図７にその結果を示す。
【００５７】
図７より明らかなように、変異株Ｕ１、Ｕ５、Ｕ７及びＵ８が生産する変異型Ｖ８プロテアーゼ誘導体ＲＰＴ（−）の融合蛋白質（以後、各々βＧ９７Ｖ８ＲＰＴ（−）１、βＧ９７Ｖ８ＲＰＴ（−）５、βＧ９７Ｖ８ＲＰＴ（−）７及びβＧ９７Ｖ８ＲＰＴ（−）８と表記する）は野生型のβＧ９７Ｖ８ＲＰＴ（−）に比べ基質の分解活性が持続し、尿素に対して耐性であることが示された。
【００５８】
実施例６ 変異部位の同定及び組み合わせの変異を持つ変異型V ８プロテアーゼ誘導体ＲＰＴ（−）融合蛋白質の作製
変異株Ｕ１、Ｕ５、Ｕ７及びＵ８より、常法に従い、プラスミドを単離・精製した。これらのプラスミドを以後、ｐＶ８ＲＰＴ（−）１、ｐＶ８ＲＰＴ（−）５、ｐＶ８ＲＰＴ（−）７及びｐＶ８ＲＰＴ（−）８とする。
次に、各々のプラスミド上の変異型V ８プロテアーゼ誘導体遺伝子のＤＮＡ塩基配列をPharmacia 製ＤＮＡシーケンサー（A.L.F. DNA Sequencer  ）により決定した。ＤＮＡ塩基配列の決定に際してはPharmacia 製 AutoRead Sequencing Kit  を用い、フロオロｄＵＴＰを用いた蛍光ラベル法により行ない、プライマーには以下に示すものを使用した。
【００５９】
プライマーＡ（図４に示された野生型Ｖ８プロテアーゼ誘導体ＲＰＴ（−）をコードする遺伝子の最初の塩基を番号１とした場合、番号１から２１の部位とアニールするセンスプライマー）； 5′ACCGCTCGAGGTTATATTACCAAATAACGAT  3′
プライマーＤ１（同様に番号２６６から２９４の部位とアニールするセンスプライマー）； 5′CAGGCGAAGGAGCGCTAGCAATAGTTAAA  3′
プライマーＤ２（同様に番号２６６から２９４の部位とアニールするアンチセンスプライマー）； 5′TTTAACTATTGCTAGCGCTCCTTCGCCTG  3′
【００６０】
ＤＮＡシーケンス操作はメーカーの手順書に従った。その結果、４種の変異株が生産する変異型Ｖ８プロテアーゼ誘導体ＲＰＴ（−）には図８に示す変異が生じていることが判明した。特にｐＶ８ＲＰＴ（−）７上の変異型Ｖ８プロテアーゼ誘導体は２重変異であり、ｐＶ８ＲＰＴ（−）１及びｐＶ８ＲＰＴ（−）５の変異を合わせたものであることも判明した。従って、図７において、βＧ９７Ｖ８ＲＰＴ（−）７が、βＧ９７Ｖ８ＲＰＴ（−）１やβＧ９７Ｖ８ＲＰＴ（−）５に比べ高い活性示した理由は２重変異のためと考えられた。これは変異を組み合わせることにより、さらに尿素に強い酵素を作り出せる可能性を意味している。
【００６１】
このことを確かめるため、得られた３種類の変異を全て持つｐＶ８ＲＰＴ（−）１５８を作製した。作製にはＶ８プロテアーゼ遺伝子に存在する制限酵素部位（Dra I 、EcoR I  ）を利用し、図９に示す手順により行った。ｐＶ８ＲＰＴ（−）７の0.4Kbp Dra I- EcoR I  断片をｐＶ８ＲＰＴ（−）８のそれと交換することによりｐＶ８ＲＰＴ（−）１５８を作製した。
【００６２】
本プラスミド由来の３重変異型Ｖ８プロテアーゼ誘導体ＲＰＴ（−）（βＧ９７Ｖ８ＲＰＴ（−）１５８）について先に示した手順により、５Ｍ尿素存在下における反応の経時変化を調べた（図１０参照）。その結果、βＧ９７Ｖ８ＲＰＴ（−）１５８はβＧ９７Ｖ８ＲＰＴ（−）７以上に合成基質の分解反応が持続することが判明し、３つの変異は加算的に尿素耐性を付与することが明らかとなった。
【００６３】
実施例７ 発現ベクターｐＶ８Ｄの作製
野生型Ｖ８プロテアーゼ誘導体Ｄ（Ｖ８Ｄ）を不活性な封入体として発現させるプラスミドｐＶ８Ｄは図１１及び図１２に示す手順で作製した。まず、ｐＶ８ＲＰＴ（−）よりBgl II-Sal I断片（3.0kb ）及びEcoRV-Bgl II断片（0.7kb ）を調製し、ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＴ〔Ｇ〕Ｒ１０より調製したNar I-Sal I 断片（0.2kb ）と連結させることによりｐＶ８ｈＣＴ〔Ｇ〕を得た（図１１）。なお、ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＴ〔Ｇ〕Ｒ１０(Appl. Microbiol. Biotechnol. (1995) 42, 703-708) は上記実施例２のｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＴ〔Ｇ〕Ｒ６と同様にプラスミドｐＢＲ３２２とプラスミドｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＴ〔Ｇ〕より作成することができる（図２）。
【００６４】
次に、得られたｐＶ８ｈＣＴ〔Ｇ〕のｈＣＴ〔Ｇ〕部分（0.1kb BstE II-Sal I 断片）をｐＵＣ４Ｋ（Vieira, J. and Messing, J., Gene 19, 259 (1982) ；ファルマシア  バイオテク社より製品番号27-4958-01として容易に入手できる）のアミノグルコシド３’−ホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ＡＰＴ）領域を含む0.8kb SmaI-Sal I断片と入れ換えｐＶ８Ｄを作製した（図１２）。当該プラスミドより発現される野生型Ｖ８プロテアーゼ誘導体Ｄ（Ｖ８Ｄ）の融合蛋白質のアミノ酸配列を図１３に示す。野生型Ｖ８プロテアーゼ誘導体Ｄは天然型プロテアーゼのＣ末端の５６アミノ酸を欠いた誘導体である。
【００６５】
当該融合蛋白においては、天然型Ｖ８プロテアーゼのＮ末端から２１２番目のアミノ酸（EcoRV 部位）までを用いて融合蛋白を作製した。即ち、当該融合蛋白質は、野生型Ｖ８プロテアーゼ誘導体Ｄ（Ｖ８Ｄ）のＮ末端及びＣ末端部においてＲ６リンカー配列を介してβーガラクトシダーゼ誘導体及びアミノグルコシド３’−ホスホトランスフェラーゼの一部（ｔＡＰＴ）と各々融合した構造をもつ。
なお、Ｒ６リンカーは、アミノ酸配列としてRLYRRHHRWGRSGSPLRAHEQFLEを有し、当該配列中のＲＲの中央のペプチド結合が大腸菌のｏｍｐＴプロテアーゼにより切断される構造を有している。
【００６６】
実施例８ 発現ベクターｐＶ８Ｆの作製
野生型Ｖ８プロテアーゼ誘導体Ｆ（Ｖ８Ｆ）を不活性な封入体として発現させるプラスミドであるｐＶ８Ｆは、上記野生型Ｖ８プロテアーゼ誘導体Ｄ（Ｖ８Ｄ）よりもＶ８プロテアーゼ部分がＣ末端側に３アミノ酸長い誘導体を融合蛋白質として発現するプラスミドであり、ＰＣＲ法と遺伝子クローニングを用いて以下の方法により作製した。
【００６７】
まず、プライマーＩＶ；
【化１】
0003852982.tif 000002
【００６８】
及びプライマーＶ；
【化２】
0003852982.tif 000003
【００６９】
を合成し、鋳型ＤＮＡとして実施例２で作製したｐＶ８ＲＰＴ（−）を0.1 μg 用いて野生型Ｖ８プロテアーゼ誘導体遺伝子側の増幅反応を行った後、EcoR I及びSac I で切断し0.1kb の遺伝子断片を調製した。
【００７０】
一方、プライマーＶＩ；
【化３】
0003852982.tif 000004
【００７１】
及びプライマーＶＩＩ；
【化４】
0003852982.tif 000005
【００７２】
を合成し、鋳型ＤＮＡとしてｐＶ８Ｄを0.1 μg 用いてＲ６リンカー配列とアミノグルコシド３’−ホスホトランスフェラーゼ遺伝子部の増幅反応を行った後、EcoT22I 及びSac I で切断し0.3kb の遺伝子断片を調製した。なお、ＰＣＲは実施例１の条件に従った。
【００７３】
上記のようにして得られた0.1kb 及び0.3kb の遺伝子と、ｐＶ８ＤのEcoRI-EcoT22I 断片（4.2kb ）を連結しｐＶ８Ｆを作製した（図１４）。当該プラスミドより発現される野生型Ｖ８プロテアーゼ誘導体Ｆ（Ｖ８Ｆ）の融合蛋白質のアミノ酸配列を図１５に示す。野生型Ｖ８プロテアーゼ誘導体Ｆは天然型プロテアーゼのＣ末端の５３アミノ酸を欠いた誘導体である。
【００７４】
実施例９ 変異型Ｖ８プロテアーゼ誘導体Ｄ（Ｖ８Ｄ）及び同Ｆ（Ｖ８Ｆ）の生産、及び尿素耐性の確認
ｐＶ８Ｄ及びｐＶ８Ｆを用いて変異型Ｖ８プロテアーゼ誘導体Ｄ（Ｖ８Ｄ）及び同Ｆ（Ｖ８Ｆ）の高発現を試みた。
（１）変異型Ｖ８プロテアーゼ誘導体Ｄ
図１６に示すように、ｐＶ８ＲＰＴ（−）１、ｐＶ８ＲＰＴ（−）５及びｐＶ８ＲＰＴ（−）８由来の 0.7kbp Bgl II-EcoR I 断片を、ｐＶ８Ｄの3.9kbp Bgl II- EcoR I 断片にそれぞれ挿入してｐＶ８Ｄ１、  ｐＶ８Ｄ５及びｐＶ８Ｄ８を作製した。
【００７５】
これらのプラスミドを有するＪＭ１０１をファーメンター（小松川化工機製、30L Kit Fermenter ）を用いて、4 g/L K2HPO4、4 g/L KH2PO4、2.7 g/L Na2HPO4 、0.2 g/L NH4Cl 、1.2 g/L (NH4)2SO4 、4 g/L 酵母エキス、2 g/L MgSO4 ・7H2O、40 mg/L CaCl2 ・2H2O、40 mg/L FeSO4 ・7H2O、10 mg/L MnSO4 ・nH2O、10 mg/L AlCl3 ・6H2O、4 mg/L CoCl2・6H2O、2 mg/L ZnSO4・7H2O、2 mg/L Na2MoO4・2H2O、1 mg/L CuCl2・2H2O、0.5 mg/L H3BO4, 10mg/L  テトラサイクリンを含む培地（20L, pH7.0）でグリセリンを逐次添加しながら、３７℃でＯＤ６６０が１０になるまで培養後、最終濃度２mMのＩＰＴＧを添加し、さらに３時間培養をした。
【００７６】
培養液をマントンゴリーンホモジナイザー（マントンゴーリン社製、モデル15M-8TBA）により600Kg/cm2 の条件でホモジナイズ処理し、7000 rpm、３０分の遠心分離により沈殿画分を回収した。沈殿のＯＤ６６０値が１００となるように脱イオン水を添加した後、15 ml を採取し1M Tris-HCl （pH8.0 ）を2.5ml 、1 M ジチオスレイトール（ＤＴＴ）を250 μl 、及び尿素を１２ｇ加え封入体を溶解し、50 ml になるように脱イオン水を加え、３７℃で６時間加温した。
【００７７】
その後、0.4M (NH4)2SO4を含む 10 mMリン酸カリウムバッファー（pH7.5 ）で２１倍希釈し、氷中に一晩放置した。このリフォールディング操作により約80μg/mlの各々の変異型Ｖ８プロテアーゼ誘導体Ｄ、即ち、ｐＶ８Ｄ１、ｐＶ８Ｄ５及びｐＶ８Ｄ８由来の変異型Ｖ８プロテアーゼ誘導体ＤであるＶ８Ｄ１、Ｖ８Ｄ５及びＶ８Ｄ８が得られた。
【００７８】
次に、各々のプロテアーゼを精製するため、(NH4)2SO4 を最終1.8Mになるように添加した後、300ml をブチルトヨパール650M（東ソー株式会社製）を用いた精製に供した。1.8 M (NH4)2SO4 を含む 10 mMリン酸カリウムバッファー（pH7.5 ）で平衡化したφ16mmX62mm のカラムに試料を添加し、(NH4)2SO4 濃度1.8 M から0 M への直線濃度勾配により精製を行った。各々のプロテアーゼは(NH4)2SO4 濃度0.9 M の付近で溶出され、精製酵素が約２０ｍｇ得られた。
なお、精製酵素の活性は実施例３に記載の方法により測定した。
【００７９】
精製したＶ８Ｄ１、Ｖ８Ｄ５及びＶ８Ｄ８を用いて、尿素に対する耐性を再度調べた。３Ｍ尿素、50mM Tris-HCl (pH 8.0)、２％ＤＭＳＯを含む反応液 960  μl に各変異型酵素（Ｖ８Ｄ１、Ｖ８Ｄ５及びＶ８Ｄ８）を 40 μl （濃度150 μg/ml）添加し、３０℃で３０分放置後、合成基質(Z-Phe-Leu-Glu-4-nitroanilide)を最終濃度0.4mM になるように添加し、酵素添加直後の活性を１００％とした際の各酵素の残存活性を測定した。これらの対照としてｐＶ８Ｄ由来の野性型Ｖ８プロテアーゼ誘導体Ｄ（Ｖ８Ｄ）を同操作で生産したものを用いた。その結果、Ｖ８Ｄ１、Ｖ８Ｄ５及びＶ８Ｄ８はＶ８Ｄに比べ残存活性が高く、これらの変異の導入により、尿素に対する耐性が向上した変異型Ｖ８プロテアーゼ誘導体Ｄが生産できることが明らかになった（図１７）。
【００８０】
（２）変異型Ｖ８プロテアーゼ誘導体Ｆ
ｐＶ８Ｆへの変異の導入についても検討を行った。図１８に示す手順により、ｐＶ８ＲＰＴ（−）１、ｐＶ８ＲＰＴ（−）５、ｐＶ８ＲＰＴ（−）７、ｐＶ８ＲＰＴ（−）８及びｐＶ８ＲＰＴ（−）１５８由来の 0.7kbp Bgl II-EcoR I 断片を、ｐＶ８Ｆの3.9kbp Bgl II- EcoR I 断片に挿入してｐＶ８Ｆ１、ｐＶ８Ｆ５、ｐＶ８Ｆ７、ｐＶ８Ｆ８及びｐＶ８Ｆ１５８を作製した。
【００８１】
これらのプラスミドを持つＪＭ１０１株を用いて、各変異を持つ変異型Ｖ８プロテアーゼ誘導体Ｆ、即ち、ｐＶ８Ｆ１、ｐＶ８Ｆ５、ｐＶ８Ｆ７、ｐＶ８Ｆ８及びｐＶ８Ｆ１５８由来の変異型Ｖ８プロテアーゼ誘導体ＦであるＶ８Ｆ１、Ｖ８Ｆ５、Ｖ８Ｆ７、Ｖ８Ｆ８及びＶ８Ｆ１５８を上記の方法により分離した。
精製したＶ８Ｆ１、Ｖ８Ｆ５、Ｖ８Ｆ７、Ｖ８Ｆ８、Ｖ８Ｆ１５８、及びこれらの対照としてｐＶ８Ｆ由来の野性型Ｖ８プロテアーゼ誘導体Ｆ（Ｖ８Ｆ）を同操作で生産したものを用いて尿素に対する耐性を再度調べた。その結果、各変異酵素は５Ｍ尿素存在下において尿素耐性に優れていることが再確認され（図１９）、これにより尿素耐性に優れた変異型Ｖ８プロテアーゼ誘導体Ｆが生産できることが示された。
【００８２】
実施例１０ ドデシル硫酸ナトリウム（0.1 ％）及び熱（50℃）に対するＶ８Ｆ１、Ｖ８Ｆ５、Ｖ８Ｆ８の安定性のついての検討
実施例９で得られたＶ８Ｆ１、Ｖ８Ｆ５、Ｖ８Ｆ８を用いて、ドデシル硫酸ナトリウム（以下、ＳＤＳ）及び熱に対する安定性についての検討を行った。ＳＤＳの場合、0.1 ％ＳＤＳ、50mM Tris-HCl （pH8.0 ）、天然型Ｖ８プロテアーゼ 4.0μg ／mlの酵素活性に相当する各酵素（Ｖ８Ｆ１、Ｖ８Ｆ５、Ｖ８Ｆ８）を含んだ溶液を３０℃でインキュベートし、一定時間ごとにそれより900 μl 採取した後、100 μl の4mM Z-Phe-Leu-Glu-4-nitroanilide、２０％ＤＭＳＯ溶液を添加し、それらの残存活性を測定した。
【００８３】
また、５０℃に対する熱安定性については、50mM Tris-HCl （pH8.0 ）、天然型Ｖ８プロテアーゼ 4.0μg ／mlの酵素活性に相当する各酵素（Ｖ８Ｆ１、Ｖ８Ｆ５、Ｖ８Ｆ８）を含んだ溶液を50℃でインキュベートし、一定時間ごとにそれらより900 μl 採取後氷冷し、それらの残存活性を測定した。
【００８４】
図２０に示すように変異型の酵素であるＶ８Ｆ１、Ｖ８Ｆ５、Ｖ８Ｆ８は対照である野性型のＦに比べ失活速度が減少し、0.1 ％ＳＤＳに対する安定性が上昇している。このことより３種の尿素耐性変異、Lys147Arg （Ｖ８Ｆ１）、Asn71Ser（Ｖ８Ｆ５）及びAsp44Glu (Ｖ８Ｆ８) の導入はＳＤＳに対する変性に対しても有効であることが判明した。また、５０℃における熱失活については、Ｖ８Ｆ１、Ｖ８Ｆ５が野性型Ｖ８Ｆに比べ失活速度が減少し、Lys147Arg 及びAsn71Serの変異は耐熱性も付与することが明らかとなった（図２１）。
【００８５】
実施例１１ Ｖ８Ｆ１５８による融合蛋白質の切断
Ｖ８Ｆ１５８（３重変異型Ｖ８プロテアーゼ誘導体Ｆ）を用い、尿素存在下における蛋白質の切断実験を行った。実験にはｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＮＰ−２２Ｒ５−３由来の融合蛋白質を基質として用いた。当該融合蛋白質β−ｇａｌ９７Ｓ４ＤｈＣＮＰ−２２Ｒ５−３は、保護ペプチド（β−ｇａｌ９７Ｓ４Ｄ）とヒトＣ型ナトリウムペプチド（ｈＣＮＰ）がリンカーを介して融合され、Ｖ８プロテアーゼによりｈＣＮＰが遊離される構造を有している（特開平５−３２８９９２）。
【００８６】
５Ｍ尿素存在下における融合蛋白質からのｈＣＮＰの切り出しについて天然型Ｖ８プロテアーゼとＶ８Ｆ１５８で比較した。ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＮＰ−２２Ｒ５−３由来の融合蛋白質、当該融合蛋白質の発現、当該発現封入体の回収、Ｖ８プロテアーゼの反応条件、融合蛋白質及び遊離したｈＣＮＰの分析は特開平５−３２８９９２に記載の条件に従った。但し、反応時の尿素濃度は５Ｍとし、Ｖ８Ｆ１５８は天然型Ｖ８プロテアーゼに換算して4 μg/mlの活性に相当する量を添加した。
【００８７】
３０分反応後、切断効率（切断された融合蛋白質の割合）をＨＰＬＣのピークから算出したところ、天然型Ｖ８プロテアーゼが６０％であったのに対し、Ｖ８Ｆ１５８は９８％であり、高濃度の尿素下におけるＶ８Ｆ１５８の有効性が融合蛋白質の切断反応においても示された。
【００８８】
【発明の効果】
従来公知の天然型Ｖ８プロテアーゼは２Ｍ程度の尿素を含む酵素反応液中でもある程度の切断反応を行なうために遺伝子組換え法による有用ペプチド等の製造に用いられているが、上述したように、本発明に係る酵素はこの天然型酵素の性質に更に尿素耐性が付加されている。従って、本発明に係る酵素を用いれば高濃度の尿素存在下でも酵素活性の失活が抑えられることにより、尿素存在下の反応系に加える酵素量が少なくてすみ、また、反応時間の短縮が行なえる。更には高濃度尿素存在下で蛋白切断が行なえることにより今まで得られなかったペプチド断片が得られる等の利点がある。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、（ａ）スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus ）Ｖ８プロテアーゼ遺伝子の構成と当該遺伝子におけるアニーリング部位、及び（ｂ）クローニングに用いたＰＣＲ用プライマーの塩基配列を示す図である。
【図２】図２は、プラスミドｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＴ［Ｇ］Ｒ６及びプラスミドｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＴ［Ｇ］Ｒ１０の作製過程を示す図である。
【図３】図３は、プラスミドｐＶ８ＲＰＴ（−）の作製過程を示す図である。
【図４】図４は、プラスミドｐＶ８ＲＰＴ（−）中にコードされている融合蛋白質のアミノ酸配列を示す図である。下線部は野生型Ｖ８プロテアーゼ誘導体ＲＰＴ（−）の配列部分を表し、二重下線部はＲ６リンカーのアミノ酸配列を示す。
【図５】図５は、（ａ）クローニングに用いたＰＣＲ用プライマーの塩基配列、及び（ｂ）プラスミドｐＶ８ＲＰＴ（−）の構成と当該プラスミドに係る遺伝子におけるアニーリング部位を示す図である。
【図６】図６は、プラスミドｐＶ８ＲＰＴ（−）へのＰＣＲ変異の導入を示す図である。
【図７】図７は、５Ｍ尿素存在下における変異型Ｖ８プロテアーゼ誘導体ＲＰＴ（−）の反応経時変化を示す図である。
【図８】図８は、変異型Ｖ８プロテアーゼ誘導体ＲＰＴ（−）における変異部位の同定結果を示す図である。
【図９】図９は、プラスミドｐＶ８ＲＰＴ（−）１５８の作製過程を示す図である。
【図１０】図１０は、２重変異及び３重変異を持つ変異型Ｖ８プロテアーゼ誘導体ＲＰＴ（−）の５Ｍ尿素存在下における反応経時変化を示す図である。
【図１１】図１１は、  プラスミドｐＶ８ｈＣＴ〔Ｇ〕の作製過程を示す図である。
【図１２】図１２は、  プラスミドｐＶ８Ｄの作製過程を示す図である。
【図１３】図１３は、プラスミドｐＶ８Ｄ中にコードされている融合蛋白質のアミノ酸配列を示す図である。下線部は野生型Ｖ８プロテアーゼ誘導体Ｄ（Ｖ８Ｄ）の配列部分を表し、二重下線部はＲ６リンカーのアミノ酸配列を示す。また、矢印はＯｍｐＴプロテアーゼにより切断される部位を表す。
【図１４】図１４は、プラスミドｐＶ８Ｆの作製過程を示す図である。Ｖ８Ｆ遺伝子は野性型Ｖ８プロテアーゼ誘導体Ｆ（Ｖ８Ｆ）をコードする遺伝子である。
【図１５】図１５は、プラスミドｐＶ８Ｆ中にコードされている融合蛋白質のアミノ酸配列を示す図である。下線部は野生型Ｖ８プロテアーゼ誘導体Ｆ（Ｖ８Ｆ）の配列部分を表し、二重下線部はＲ６リンカーのアミノ酸配列を示す。また、矢印はＯｍｐＴプロテアーゼにより切断される部位を表す。
【図１６】図１６は、プラスミドｐＶ８Ｄ１、ｐＶ８Ｄ５及びｐＶ８Ｄ８の作製過程を示す図である。
【図１７】図１７は、プラスミドｐＶ８Ｄ１、ｐＶ８Ｄ５及びｐＶ８Ｄ８由来の変異型Ｖ８プロテアーゼＤ（Ｖ８Ｄ１、Ｖ８Ｄ５、Ｖ８Ｄ８）とｐＶ８Ｄ由来の野性型Ｖ８プロテアーゼ誘導体Ｄ（Ｖ８Ｄ）の３Ｍ尿素存在下での残存活性を示す図である。
【図１８】図１８は、プラスミドｐＶ８Ｆ１、ｐＶ８Ｆ５、ｐＶ８Ｆ７、ｐＶ８Ｆ８及びｐＶ８Ｆ１５８の作製過程を示す図である。
【図１９】図１９は、プラスミドｐＶ８Ｆ１、ｐＶ８Ｆ５、ｐＶ８Ｆ７、ｐＶ８Ｆ８及びｐＶ８Ｆ１５８由来の変異型Ｖ８プロテアーゼ誘導体Ｆ（Ｖ８Ｆ１、Ｖ８Ｆ５、Ｖ８Ｆ７、Ｖ８Ｆ８及びＶ８Ｆ１５８）とｐＶ８Ｆ由来の野性型Ｖ８プロテアーゼ誘導体Ｆ（Ｖ８Ｆ) の５Ｍ尿素存在下での反応経時変化を示す図である。
【図２０】図２０は、プラスミドｐＶ８Ｆ１、ｐＶ８Ｆ５及びｐＶ８Ｆ８由来の変異型Ｖ８プロテアーゼ誘導体Ｆ（Ｖ８Ｆ１、Ｖ８Ｆ５及びＶ８Ｆ８）と野性型Ｖ８プロテアーゼ誘導体Ｆ（Ｖ８Ｆ）の０．１％ＳＤＳにおける安定性を示す図である。
【図２１】図２１は、プラスミドｐＶ８Ｆ１、ｐＶ８Ｆ５及ｐＶ８Ｆ８由来の変異型Ｖ８プロテアーゼ誘導体Ｆ（Ｖ８Ｆ１、Ｖ８Ｆ５及びＶ８Ｆ８）と野性型Ｖ８プロテアーゼ誘導体Ｆ（Ｖ８Ｆ）の５０℃における熱安定性を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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