(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一級アミド結合の加水分解速度を増大できる抗体。
【請求項２】
一級アミド結合の形成速度を増大できる抗体。
【請求項３】
一級アミド結合はポリペプチド中に含有されている請求項１または２の抗体。
【請求項４】
一級アミド結合はＣ−末端カルボキサミド中に含有されている請求項１または２の抗体。
【請求項５】
一級アミド結合はアルギニンまたはグルタミンの側鎖中に含有されている請求項１または２の抗体。
【請求項６】
一級アミド結合はカルシトニン中に含有されている請求項１または２の抗体。
【請求項７】
一級アミド結合はカルシトニン遺伝子関連ペプチド中に含有されている請求項１または２の抗体。
【請求項８】
一級アミド結合はビッグガストリン中に含有されている請求項１または２の抗体。
【請求項９】
一級アミド結合はボンベシン様ペプチド中に含有されている請求項１または２の抗体。
【請求項１０】
（ｉ）ハプテンに対する抗体の作成
（ii）上記抗体の固定化
（iii）上記抗体に対する基質の添加，および
（iv）上記基質の生成物への変換を触媒できる抗体の同定
からなる方法によって得られる，一級アミド結合の加水分解または形成の速度を増大できる抗体。
【請求項１１】
方法は工程（ｉ）ののちに
（ｉ）上記抗体の濃縮，および
（ii）上記抗体の精製
を行う請求項１０の抗体。
【請求項１２】
抗体は、式
0003822231.tif 000031
（式中，Ｙはポリペプチドであり，
Ｒ1はＹのＮ末端に結合し，水素，または分岐状もしくは直鎖状，置換もしくは非置換のＣ1-21アルキル，アルキレンもしくはアルキン基であり，
Ｒ2は天然に存在するアミノ酸の側鎖であり，
Ｘは
0003822231.tif 000032
である）のハプテンを使用することにより生じたものである、請求項２の抗体。
【請求項１３】
抗体は、式
0003822231.tif 000033
（式中，Ｙはポリペプチドであり，
Ｒ1はＹのＮ末端に結合し，水素，または分岐状もしくは直鎖状，置換もしくは非置換のＣ1-21アルキル，アルキレンもしくはアルキン基であり，
Ｒ2は天然に存在するアミノ酸の側鎖であり，
Ｘは
0003822231.tif 000034
である）のハプテンを使用することにより生じたものである、請求項１２の抗体。
【請求項１４】
抗体は、ＮＡ−１ハプテン
0003822231.tif 000035
を使用することにより生じたものである請求項１３の抗体。
【請求項１５】
ポリペプチドは２〜20個の天然に存在するアミノ酸から構成される請求項１２の抗体。
【請求項１６】
ポリペプチドはＣ末端カルボキサミドを含有するタンパク質のポリペプチド配列から構成されるがＣ末端アミノ酸は除かれている配列である請求項１２の抗体。
【請求項１７】
側鎖はフェニルアラニンの側鎖である請求項１２の抗体。
【請求項１８】
Ｒ1は
0003822231.tif 000036
（式中，ｎは1〜21の整数である）である請求項１２の抗体。
【請求項１９】
Ｒ1が担体分子に更に結合している請求項１２の抗体。
【請求項２０】
一級アミド結合の加水分解速度又は形成速度を増大できる抗体であって、該抗体は
（ｉ）加水分解反応の反応試剤，反応中間体または生成物の類縁体から選ばれた成分を含む組成物による動物の免疫処置，
（ii）上記動物からの抗体産生リンパ球の摘出，
（iii）リンパ球の骨髄腫細胞との融合およびそれによる抗体産生ハイブリドーマ細胞の製造，および
（iv）一級アミド結合の加水分解又は形成における触媒活性に関する抗体産生ハイブリドーマ細胞のスクリーニング
の諸工程を含む方法によって産生されたものであり、
上記成分は式
Ｒ-Ｙ-[(ＣＨ2)n-Ｘ］m
（式中，Ｒは水素，または分岐状もしくは直鎖状，置換もしくは非置換のＣ1-21アルキル，アルキレンもしくはアルキン基であり，
Ｙはポリペプチドであり，
-(ＣＨ2)n-Ｘ基は上記ポリペプチドのアスパラギンまたはグルタミンの側鎖を置換し，
ｎは１または２であり，
ｍは１以上の整数であるが，上記ポリペプチド中のアスパラギンおよびグルタミンアミノ酸の総数以下であり，
Ｘは
0003822231.tif 000037
である）を有するものである上記抗体。
【請求項２１】
ｍは１である請求項２０の抗体。
【請求項２２】
Ｒ1は
0003822231.tif 000038
（式中，ｎは1〜21の整数である）である請求項２０の抗体。
【請求項２３】
Ｒ1が担体分子に更に結合している請求項２０の抗体。
【請求項２４】
一級アミド結合の加水分解速度を増大できる抗体であって、該抗体は
（ｉ）加水分解反応の反応試剤，反応中間体または生成物の類縁体から選ばれた成分を含む組成物による動物の免疫処置，
（ii）上記動物からの抗体産生リンパ球の摘出，
（iii）リンパ球の骨髄腫細胞との融合およびそれによる抗体産生ハイブリドーマ細胞の製造，および
（iv）一級アミド結合の加水分解又は形成における触媒活性に関する抗体産生ハイブリドーマ細胞のスクリーニング
の諸工程を含む方法によって産生されたものであり、
上記成分は式
0003822231.tif 000039
（式中，Ｒ1は分岐状もしくは直鎖状，置換もしくは非置換のＣ1-21アルキル，アルキレンもしくはアルキン基であり，
Ｒ2は天然に存在するアミノ酸の側鎖であり，
Ｘは
0003822231.tif 000040
である）を有するものである上記抗体。
【請求項２５】
Ｒ1は
0003822231.tif 000041
（式中，ｎは1〜21の整数である）である請求項２４の抗体。
【請求項２６】
側鎖はフェニルアラニンの側鎖である請求項２４または２５の抗体。
【請求項２７】
Ｒ1が担体分子に更に結合している請求項２５の抗体。
【請求項２８】
一級アミド結合の加水分解速度または形成速度を増大できる触媒抗体の製造方法であって、
（ｉ）加水分解反応の反応試剤，反応中間体または生成物の類縁体から選ばれた成分を含む組成物による動物の免疫処置，
（ii）上記動物からの抗体産生リンパ球の摘出，
（iii）リンパ球の骨髄腫細胞との融合およびそれによる抗体産生ハイブリドーマ細胞の製造，
（iv）該一級アミド結合の加水分解または形成における触媒活性についての抗体産生ハイブリドーマ細胞のスクリーニング，
を含んでなる上記方法。
【発明の詳細な説明】
関連出願の引照
特許協力協定に基づいて出願された本国際特許は，1988年５月４日の出願に係わる米国特許出願一連番号07/190,271号の一部継続出願として1993年４月23日に出願された米国特許出願一連番号08/052,490号に基づくパリ条約による優先権を主張し，その一部継続出願である．米国特許出願一連番号08/052,490号はまた，1991年８月５日付出願の米国特許出願一連番号07/740,501号の一部継続出願として1991年10月10日に出願された米国特許出願一連番号07/773,042号の一部継続出願でもある．米国特許出願一連番号08/052,490号はまた，1988年５月４日付出願の米国特許出願一連番号07/190,271号の一部継続出願として1991年９月３日に出願された米国特許出願一連番号07/761,868号の一部継続出願でもある．上述のこれらの米国特許はすべて，参考として本明細書に導入される．
発明の分野
本発明は，一級アミド結合の類縁体および，たとえば一級アミド結合の加水分解用触媒抗体を誘導するための上述のような類縁体の使用方法に関する．本発明はまた一級アミド結合の加水分解または形成を触媒できる触媒抗体に関する．
本発明はさらに，ペプチドおよびタンパク質の一級アミド結合の加水分解を引き起こす上記触媒抗体の治療剤としての新規な使用方法に関する．
本発明はまた，化学物質の合成における一級アミド結合の加水分解または形成の触媒としての上記触媒抗体の新規な使用方法に関する．
さらにまた，本出願は，抗体ならびに他の生物学的分子を含有するサンプルにおける触媒活性を触媒抗体によって選択またはスクリーニングするための新規な方法に関する．この場合の選択またはスクリーニング方法は迅速かつ効率的であり，したがって多数の潜在的触媒抗体のルーチンなスクリーニングを可能にするものである．
発明の背景
本開示の全文を通して多数の文献が括弧内に引用され，これらの文献の完全な記述は請求の範囲の欄の前に一覧表として掲げる．他の引用文献はこの開示の本文中に括弧を付して完全に記述してある．これらの文献は本発明の分野に関するものであり，これらの文献はそれぞれ参考として本明細書に導入される．
最も頻繁に言及されてきた触媒抗体研究の最終目標の一つは，アミド結合の効率的かつ特異的な加水分解が可能な抗体の産生である（1〜14）．この目標は，一部には速度論的に比較的不活性な反応を触媒する抗体の産生に対する科学的挑戦であり，また一部はタンパク分解性抗体に考えられる極めて広い実用的適用範囲よるものである．
現在まで，活性化されていないアミドを，補因子による補助によらないで加水分解する抗体を明確に誘発するハプテンは設計されていない．
アミド加水分解抗体の誘発における困難性は，主として，抗体の触媒作用のスクリーニングに伴う難かしさに由来するものである．アミド加水分解の非接触時の速度［Ｋuncat，中性ｐＨにおける半減期は７年のオーダーである（15）］は典型的なエステル（16），カルボネート（17）または活性化アミド（8，18）の場合に比較してはるかに遅い．したがって，アミドの加水分解を触媒する抗体の検出は，はるかに困難である．非接触時の速度（Ｋuncat）が異なる２つの別個の反応が同一の加速率（Ｋcat／Ｋuncat）を有する２種類の抗体で触媒される場合，絶対的速度（Ｋcat）で遅い方の抗体を検出することはさらに困難である．これには２つの主たる理由がある．一つの理由は，反応が遅いほど単位時間あたりの変換もわずかで，検出系は極めて低レベルの形成された生成物を検出できるものでなければならないことである．第二の理由は，Ｋuncat値が遅い反応は通常，速い反応の場合（分または時間）に比べて長期間（日または週）の抗体−基質インキュベーションを必要とすることである．インキュベーション時間が長くなると，副生物の出現の可能性や，とくに非中性ｐＨでは抗体が変性することも考えられ，また痕跡の混入酵素が問題の反応を触媒する可能性もあって，誤った結果を導く可能性が生じる．
上述のように，現在まで活性化されていないアミド結合の非補助接触加水分解を可能にする触媒抗体は産生されていない．論理的に設計された触媒抗体によるアミド結合の変換に関するこれまでの論文は，活性化アミドの加水分解（８），金属補因子の補助によるアミドの加水分解（20）およびアミド結合の転位（21）に限られている．また，天然に存在するペプチドの自己抗体による加水分解の報告がある（22）．この最後の列において報告された抗体は設計されたというより発見されたものであることが指摘できる．本発明者らはここに，不活性化アミド結合の非補助加水分解が可能な触媒抗体の設計における最初の成功例を記述するものである．
天然において最も一般的に遭遇するアミド結合はペプチドおよびタンパク質中に見出される．ペプチドおよびタンパク質中には３つの基本的な種類のアミド結合が見出される．すなわち，個々のアミノ酸を連結するペプチド結合としての，アスパラギンおよびグルタミンのアミノ酸側鎖中の，および一部のペプチド（すなわちＣ末端カルボキサミド）のＣ末端におけるアミドである．ペプチド結合および一級アミド結合（アスパラギン，グルタミンおよびＣ末端アミド）の両種類のアミド結合の加水分解は，活性化のギブス自由エネルギーが同一かまたは極めて類似している（23〜25）．したがって，それらが同一の加速で触媒されるためには，同量の遷移状態安定化が要求される．
疾病状態に重要なアミド化ペプチドホルモンとしては，カルシトニン（29），カルシトニン遺伝子関連ペプチド（30，31），ビッグガストリン（32，33），およびボンベシン様ペプチド［ＢＬＰ，またボンベシン関連ペプチド（ＢＲＰ）またはガストリン放出ペプチド（ＧＲＰ）としても知られる］（34，35）がある．カルシトニンレベルの上昇が髄様甲状腺癌，Ｃ細胞過形成，慢性腎不全，膵炎，電解質および骨疾患，ならびに甲状腺機能亢進症を含めた数種の疾患状態に関連づけられている（29）．ガストリンの上昇がガストリン産生腫瘍に，ＢＬＰが小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）に関連づけられている（33）．疾患状態におけるこれらのホルモンの作用を，モノクローナル抗体（抗−ＢＬＰ）（36）中性エンドペプチダーゼ24.11（ＢＬＰ加水分解）（37），および合成アンタゴニスト（ＢＬＰ）（38〜41）を用いて中和する実験的処置が進行中である．
アミド側鎖を有するアミノ酸（たとえば，アスパラギンおよびグルタミン）を含有するペプチドおよびタンパク質にも治療との関連が考えられる．遊離アスパラギンの側鎖カルボキサミドを加水分解する細菌性アルギナーゼの投与が有効な抗−白血病剤のあることが明らかにされている（42）．
本出願がその一部継続出願である米国特許出願一連番号第190,271号には，ペプチド結合の類縁体およびこのようなペプチド結合を加水分解する触媒抗体の誘発方法が記載されている．そこに記載された類縁体および抗体は二級アミド結合であるペプチド結合の修飾に向けられたものであるが，本出願は一級アミド結合の修飾に関するものである．
国際特許出願ＷＯ92/01047（ＰＣＴ／ＧＢ91/01134）の一部継続出願である米国特許出願一連番号第08/007,684号には，バクテリオファージ上に表示される触媒抗体の単離および産生ならびにヒト触媒抗体の単離および産生が記載されている．これらの両出願の開示は参考として本明細書に導入する．
以上記載した観察に基づき，ペプチドおよびタンパク質における一級アミド結合を切断できる触媒抗体を誘発するために一級アミドの遷移状態類縁体の開発が望まれる．
一級アミド結合の加水分解または形成を触媒する触媒抗体を，生存生物体に投与することにより治療剤として使用することが望まれる．標的ペプチドおよびタンパク質の一級アミド結合の修飾は，それらの生理学的機能を期待のように変更させ，その結果，生存生物体に有益な治療効果を与えることが考えられる．
発明の概要
ここに記載される発明は一級アミド結合を加水分解できる触媒抗体の製造方法を提供する．このような抗体には選択されたペプチドおよび他の分子に特異的な一級アミドの加水分解および／または形成を指図することができる．本発明の直接的な結果は，従来技術に基づいては開発できなかった，公益を有する，多くの様々な治療用生成物である．
本発明の化合物は驚くべきことに，アミド結合の加水分解（切断）または形成速度を上昇させる抗体を誘発すること，ならびにこのような触媒抗体は治療的および工業的有用性を有することが見出された．
すなわち，本発明は，式（Ｉ）
0003822231.tif 000002
（式中，Ｙはポリペプチドであり，
Ｒ1はＹのＮ末端に結合し，水素，または分岐状もしくは直鎖状，置換もしくは非置換のＣ1-21アルキル，アルキレンもしくはアルキン基であり，
Ｒ2は天然に存在するアミノ酸の側鎖であり，
Ｘは
0003822231.tif 000003
である）の化合物を提供する．
本発明はさらに，式（Ｉ）において，ポリペプチドＹはＣ末端カルボキシアミドを含有するタンパク質のポリペプチド配列であり，そのＣ末端アミノ酸を除いた配列からなる化合物を提供する．
本発明ではまた，式（Ｉ）においてＲ1が，式（Ｉ）の化合物が担体分子と化学的に反応してそれに結合できるようにポリペプチドのＮ末端アミノ酸に結合した反応性の残基，たとえば
0003822231.tif 000004
（式中，ｎは1〜21の整数である）である式（Ｉ）の化合物も意図される．
すなわち，本発明においては，式（Ｉ）の化合物が担体分子に結合した免疫原が意図される．
本発明はまた，式（II）
Ｒ-Ｙ-[(ＣＨ2)n-Ｘ］m           （II）
（式中，Ｒは水素，または分岐状もしくは直鎖状，置換もしくは非置換のＣ1-21アルキル，アルキレンもしくはアルキン基であり，
Ｙはポリペプチドであり，
-(ＣＨ2)n-Ｘ基は上記ポリペプチドのアスパラギンまたはグルタミンの側鎖を置換し，
ｎは１または２であり，
ｍは１以上の整数であるが，上記ポリペプチド中のアスパラギンまたはグルタミンアミノ酸の総数以下であり，
Ｘは
0003822231.tif 000005
である）の化合物を提供する．
本発明ではまた，式（II）においてＲ1が，式（II）の化合物が担体分子と化学的に反応してそれに結合できるようにポリペプチドに結合した反応性の残基，たとえば
0003822231.tif 000006
（式中，ｎは1〜21の整数である）である式（II）の化合物も意図される．
すなわち，本発明においては，式（II）の化合物が担体分子に結合した免疫原が意図される．
本発明はさらに，式（III）
0003822231.tif 000007
（式中，Ｒ1は分岐状または直鎖状，置換または非置換のＣ1-21アルキル，アルキレンもしくはアルキン基であり，
Ｒ2は天然に存在するアミノ酸の側鎖であり，
Ｘは
0003822231.tif 000008
である）の化合物を提供する．
本発明ではさらに，式（III）において，Ｒ1が，式（III）の化合物が担体分子と化学的に反応してそれに結合できるように反応性の残基，たとえば
0003822231.tif 000009
（式中，ｎは1〜21の整数である）である式（III）の化合物も意図される．
すなわち，本発明においては，式（III）の化合物が担体分子に結合した免疫原が意図される．
本発明はさらに，一級アミド結合の加水分解速度および／または形成速度を上昇させることができる抗体を意図するものである．
本発明はまた，一級アミド結合の加水分解速度および／または形成速度を上昇させることができる抗体であって，
（ｉ）抗体誘導ドメインの遺伝子ライブラリーの発生
（ii）上記ドメインのコード配列のファージ発現ベクターへの挿入，および
（iii）上記触媒抗体の単離
の工程からなる方法によって製造される抗体を意図するものである．
さらに，一級アミド結合の加水分解速度および／または形成速度を上昇させることができる抗体であって，
（ｉ）加水分解反応の反応試剤，反応中間体または生成物の類縁体からなる組成物による動物の免疫処置
（ii）上記動物からの抗体産生リンパ球の摘出，および
（iii）リンパ球の骨髄腫細胞との融合，およびそれによる抗体産生ハイブリドーマ細胞の産生
の工程からなる方法によって製造される抗体が意図される．
さらに，一級アミド結合の加水分解速度および／または形成速度を上昇させることができる抗体であって，
（ｉ）ハプテンに対する抗体の作成
（ii）上記抗体による免疫処置
（iii）上記抗体に対する基質の添加，および
（iv）上記基質の生成物への変換を触媒できる抗体の同定
からなる方法によって得られる抗体が意図される．
さらに工程（ｉ）ののちに
（ｉ）上記抗体の濃縮，および
（ii）上記抗体の精製
を行う上記方法によって得られる抗体が意図される．
本発明はまた，個体または動物に一級アミド結合の加水分解速度および／または形成速度を上昇させることができる抗体を投与することからなる治療を，それを必要とする動物または個体に施す方法を意図する．動物または個体は患者であってよい．
【図面の簡単な説明】
以下の本発明の詳細な説明は添付の図面を参照すれば一層よく理解できるものと考えられる．
図１はハプテンとして使用される分子，ならびに触媒抗体の誘発，スクリーニングおよび選択，ならびに特性解明に使用される阻害剤の化学構造を示す．
図２は触媒抗体のスクリーニングおよび選択，ならびに特性解明に使用される基質として用いられる分子の化学構造を示す．
図３〜13は触媒抗体の誘発，スクリーニングおよび選択，ならびに特性解明に使用されるハプテン，阻害剤および基質の合成のための反応図である．
図14は触媒および非触媒アミド加水分解に対する緩衝剤濃度の影響を示す．
発明の詳細な説明
明確にするためと便宜上，本発明の説明には以下の定義を使用する．
抗体誘導ドメインの語は，抗体分子に由来する配列に物理的または化学的に関連するペプチド配列または個々のペプチドの多重配列を意味する．単一鎖抗体および単一鎖ドメインは抗体誘導ドメインの意味に包含される．
本出願を通じて，抗体の語は一般的な意味において使用され，抗体誘導ドメインを包含するものである．
アミノ酸は，アミノ基，カルボキシル基，水素原子，および「側鎖」と呼ばれる弁別的な基が結合する四面体炭素原子から構成される．天然に存在するアミノ酸は生存生物体によって合成され，縮合を介して重合してペプチドおよびタンパク質を形成できるアミノ酸である．例としてはアラニン，アルギニン，アスパラギン，アスパラギン酸，システイン，グルタミン，グルタミン酸，ヒスチジン，イソロイシン，ロイシン，リジン，メチオニン，フェニルアラニン，プロリン，セリン，スレオニン，トリプトファン，チロシン，バリン，4-ヒドロキシプロリン，5-ヒドロキシリジン，ε-Ｎ-メチルリジン，3-メチルヒスチジン，β-アラニン，γ-アミノ酪酸，ホモシステイン，ホモセリン，シトルリン，オルニチン，カナバリン，ジェンコール酸，およびβ-シアノアラニンがある．
タンパク質またはペプチドのＣ末端はアミノ酸の線状ポリマーの末端であり，そこには最後のアミノ酸がそのアミノ基を介するアミド結合によってポリマーに結合している．
タンパク質またはペプチドのＮ末端はアミノ酸の線状ポリマーの末端であり，そこには最後のアミノ酸がそのカルボン酸基を介するアミド結合によりポリマーに結合している．
Ｃ末端カルボキシアミドは，ペプチドまたはタンパク質のＣ末端カルボン酸においてカルボン酸の-ＯＨが-ＮＨ2によって置換されている最終アミノ酸の誘導体である．
一級アミド結合は，アミド窒素が中性ｐＨにおいては２個の水素原子に共有結合しているアミド結合である．
本明細書で用いられるペプチドの語は，ジペプチドおよびポリペプチドを包含する．
ハプテンでの免疫処置に用いられる担体分子は高分子量（＞10,000ダルトン）の分子であり，これに小分子（ハプテン）を共有結合させて小分子の生物体に対する免疫原性を増大させることができる．担体分子の例にはキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）およびウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）がある．
Ｃ末端カルボキシアミドを含有するペプチドのポリペプチド配列であり，そのＣ末端アミノ酸を除いた配列とは，最終Ｃ末端アミノ酸が最終ペプチド結合の加水分解により除去されるかまたはそれが除去されて-ＯＨ基で置換されている正常にはＣ末端カルボキシアミドを含有するタンパク質またはペプチドのアミノ酸配列を意味する．
本発明の化合物は，置換または非置換のアルキル，アルケン，またはアルキン基を含有することができる．「置換」の語は，１個または２個以上の炭素または水素原子が置換基によって置換されていることを意味する．適当な置換基の例としては，本発明はこれらに限定されるものではないが，-ＯＨ，アルキル，クロロ，フルオロ，ブロモ，ヨード，-ＮＨ2，-ＮＨ(ＯＨ），-ＮＨ-ＮＨ2，-Ｎ=ＮＨ，-ＮＯ2，-ＯＰ（Ｏ)(ＯＨ)2，-Ｐ（Ｏ)(ＯＨ)2，-ＳＯ3Ｈ，-ＳＯ2Ｈ，アリール，-ＳＨ，-Ｓ-，-Ｃ（Ｏ）ＯＨ，-Ｃ(Ｏ）Ｈ，アミド基，エステル基，アルケニル，アルキニル，-Ｃ（Ｏ)-，シアノ，エポキシド基，および異項環基を挙げることができる．
ここに開示される発明は，一級アミド結合の加水分解または形成を触媒できる触媒抗体の構造を包含する．このような一級アミド結合は天然には，ペプチドおよびタンパク質中に，たとえばアスパラギンおよびグルタミンの側鎖中にそして時にはカルボキシ末端中に見出される．様々な生理学的機能を有する天然に存在する多くのペプチドおよびタンパク質が，このような一級アミド結合を含有することが知られている．このような一級アミド結合を修飾できる触媒抗体の治療剤としての投与は，ペプチドの生理学的機能を変化させて，患者に治療的利益を与える．
したがって，非活性化アミド結合の非補助加水分解が可能な触媒抗体の最初に成功した設計がここに記載される．
本発明の触媒抗体は，一級アミド結合の加水分解または一級アミド結合の形成のいずれかに使用できる．化学反応はすべて可逆的であるから，反応を一つの方向に刺激する触媒（たとえば触媒抗体）はまた，その反応を逆方向にも触媒することになる．触媒は反応媒体中に包含された場合最終の平衡濃度を変えることはないが，平衡状態に到達する速度のみを変化させる．それゆえ，触媒抗体（または他の触媒）が反応を促進する方向（正または逆方向）は，反応試剤および生成物の濃度ならびに反応条件に依存する．「正」反応を意図された触媒機能として製造された触媒抗体は，同一反応を「逆」方向にも同等に触媒できる．
本発明はＣ末端アミド結合を加水分解できる抗体を誘発するハプテンの設計によって例示する．このような活性をもつ抗体は，治療的および工業的適用を有する．多くのペプチドホルモンが生物学的に活性なカルボキシアミド基によって終結し（表Ｉ），これらの加水分解は各種疾患の処置に価値がある（26〜28）．ペプチド中のアスパラギンまたはグルタミン側鎖を加水分解する抗体も多くの他の治療標的の一つである．さらに以下に述べるように，触媒抗体は治療的価値のあるアミド化ペプチドの工業的合成に有用である．
0003822231.tif 000010
ＳＣＬＣは，脱アミド化抗体のとくに興味のある治療標的である．現在行われている慣用の化学療法基準にもかかわらず，大多数のＳＣＬＣ患者が死亡している（34）．ＳＣＬＣには「神経内分泌」的性格を伴うことが明らかにされてきた（34，43，44）．ＳＣＬＣ細胞は多数のＣ末端アミド化ペプチド成長因子ホルモン類を放出する．表IIに示すように，ＳＣＬＣ細胞はペプチドホルモン類のみではなく，それらのホルモンの受容体も産生する（34）．すなわち，ＳＣＬＣ腫瘍は多分，自己分泌機構によって，それら自身の増殖を促進するものと考えられる（43）．これらのペプチドの１種または２種以上を脱アミド化できる触媒抗体，または好ましくはＳＣＬＣ細胞によって発現される様々なペプチドをそれぞれ脱アミド化できる様々な触媒抗体を組み合わせて用いれば，治療的価値があるものと考えられる．このような抗体は，腫瘍結合物質，たとえば腫瘍抗原結合モノクローナル抗体と接合させることによって腫瘍部位に標的化させれば，格別の有効性が期待できる．
0003822231.tif 000011
工業的合成においては，アミド化ペプチドの新しい製造方法の要求がある（46〜50）．成長ホルモン放出因子（48），カルシトニン（49，50），カルシトニン遺伝子関連ペプチド（30），およびニューロキニンＡ（51，52）のようなペプチドは治療的価値を有し，工業的な触媒合成法は極めて有用である．組み換えラットαアミド化酵素（48，49）および酵母カルボキシペプチダーゼ（50）を使用する方法が検討されている．アミドの加水分解が可能な触媒抗体は工業的にはＣ末端ペプチドアミドの製造に使用できる．ペプチドの加水分解は熱力学的には可逆反応であり，したがって逆（合成）方向に進めることもできる．逆反応は無水有機溶媒または有機／水性溶媒を用いることによって促進される．水中では熱力学的に不適当な酵素反応を促進するための有機溶媒の使用に関しては多くの文献がある（53，54）．実際，触媒抗体が有機溶媒中で触媒機能することを示す他の研究もある（56）．エステル交換反応において触媒抗体を用いるアミド合成が報告されている（57，58）が，この場合には移送される一級アミンに特異的な結合部位が必要になる．この方法を用いる一級アミド合成は，極めて小さい分子の水酸化アンモニウムに特異的な結合部位をもつ抗体を設計する必要があることから，極めて困難である．
式（Ｉ），（II）および（III）の化合物に対する抗体は任意の形態でたとえば経口的，静脈内，皮下，経皮的，腫瘍内等に投与することができる．式（Ｉ），（II）および（III）の化合物に対する抗体は任意の適当な担体たとえば食塩水中に加えて投与できる．これらの製剤は他の処置とともに投与することができる．たとえば，式（Ｉ），（II）および（III）の化合物に対する抗体は抗生物質とともに投与することができる．さらに，式（Ｉ），（II）および（III）の化合物に対する抗体は他の抗体，たとえば式（Ｉ），（II）および（III）の他の化合物との混合物として投与することができる．すなわち，本発明の抗体は「カクテル」として投与することができる．このカクテルには，ＩｇＧおよびＩｇＭ両抗体ならびに結合および触媒両抗体を包含させることができる．「抗体」の語には，抗体の結合もしくは触媒活性フラグメントおよび／または単一鎖抗体および抗体の単一鎖フラグメントを包含するものである．
さらに，本発明は，式（Ｉ），（II）および（III）の化合物に対する抗体が，最終的な使用者によって希釈される濃縮形態または凍結乾燥形態に製剤化可能であることも意図している．これらの製剤はキットの形態とすることができる．キットの形態には，本発明に従って投与するための適当な指示書を包含させることもできる．
以下の非限定的実施例は，例示のためのみに掲げられるものであって，発明を限定するものと解すべきではない．
ハプテン，阻害剤および基質化合物の合成および製造
図１および２に記載の化合物の合成は，添付の図3〜13に記載の反応式に従って達成された．
一部の合成方法および化合物は特定の立体化学に関して特定されているが，これは，異なる立体化学または立体化学的混合物（またはステレオアイソマー混合物）の方法および化合物を排除する意味ではないことを銘記すべきである．
ここでハプテンまたは阻害剤として用いられる図１に記載の化合物は，すべて一級アミド結合のカルボニル炭素原子の位置における遷移状態の類縁体として四面体原子を包含する．化合物１〜６はすべて，この四面体原子としてリンを包含するが，化合物７および８中の四面体幾何学的配置はトリフルオロケトンの水和によって与えられる．このようなトリフルオロケトンはそれらの水和四面体形態と平衡状態で存在することが知られている［Begueら，Tetrahedron，47（1991):3207-3258］．
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含水状態での平衡は著しく右側にあることが知られている．すなわち大部分の化合物は水和型で存在する．したがって，トリフルオロケトンは，エステルおよびアミド結合の加水分解に際しては四面体遷移状態として働くことができる．
図１および２に記載の化合物の合成は一般に以下の記述に従って行われる．
（±）1-アミノ-2-フェニルエチルホスフィン酸（phosphonous acid）（19，図３）の合成はE.Baylisら,J.Chem.Soc.Perkin Trans.I，12(1984):2845-2853の記載にほぼ従って行われた．
ＮＡ-1ハプテンは図４に略述したようにして製造された．（±）1-アミノ-2-フェニルエチルホスフィン酸（19）を，クロロギ酸ベンジルを用いてアミノ保護して，（±）Ｎ-ＣＢＺ-1-アミノ-2-フェニルエチルホスフィン酸（20）を得た．化合物20はＮ，Ｏ-ビス(トリメチルシリル）アセトアミドおよびヨウ化メチルを使用する直接法によって化合物22に変換した．この反応は予測できないものであることから，別のさらに信頼できる方法が見出された．化合物20をまず，トリメチルシリルジアゾメタンついでメタノールを用いてＯ-メチル化し，次に水素化ナトリウムおよびヨウ化メチルを用いてＰ-メチル化すると化合物21が得られた．化合物21を水酸化リチウムで加水分解すると同一の中間体，化合物22（図４）が得られた．接触水素化により化合物22からＣＢＺ基を除去し，ついで6-マレイミドカプロン酸対称無水物（24）でアシル化すると最終のＮＡ-1ハプテン（１）が生成した．
6-マレイミドカプロン酸対称無水物（化合物24，図５）は，酢酸の存在下に無水マレイン酸とε-アミノ-n-カプロン酸の反応により6-マレイミドカプロン酸化合物23）を得，これをついでジシクロカルボジイミド（ＤＣＣＩ）を用いて化合物24に変換することによって製造された．
（±）1-(Ｎ-ベンジルオキシカルボニル)-アミノ-2-フェニルエチルホスホン酸ジフェニルエステル25（図６）の合成は，J.Oleksyszynら，Synthesis(1979):985-98に記載された操作に従った．ホスホン酸メチル26（図６）の製造には，Y.Vo-Quangら，Tetrahedron Letters, 28(1987):6167-6170の報告を適用した．接触水素化による化合物26からのＣＢＺ基の除去，ついで6-マレイミドカプロン酸対称無水物（24）によるアシル化によって最終のＲＴ-2ハプテン（３，ＲＴ-2）が得られた．
中間体27を経由するβ−アミノトリフルオロフルコール28（図７）の合成は，B.Imperiali & R.H.Abeles，Tetrahedron Letters, 27(1986):135-138に記載の操作に従った．化合物28を6-マレイミドカプロン酸対称無水物（24）でアシル化するとアルコール化合物29が得られ，これをデス−マーチン酸化剤で酸化すると最終のＷＨ-2ハプテン（８）が得られた．
ダンシル化ε-アミノ-n-カプロン酸（30，図８）はダンシルクロリドとε-アミノ-n-カプロン酸のカップリングによって製造した．化合物30をＤＣＣＩおよびＮ-ヒドロキシコハク酸イミドで活性化すると，化合物31が得られた．ＢＯＣ-Ｌ-Ｐｈｅ-ＮＨ2（32，図８）の製造はShui-Tein Chenら，Synthesis, 1(1988):37-38に報告された操作に従った．化合物32をトリフルオロ酢酸で脱保護して化合物33を得て，これをついでトリエチルアミンの存在下に化合物31と反応させると，最終生成物，化合物９（図８）が得られた．
10（図９）の合成は，32に代えてＢＯＣ-Ｄ-Ｐhe-ＮＨ2（34，図９）を用いた以外は，９の合成（図８）の場合と同じ反応の組み合せに従った．化合物34は，Shui-Tein Chenら，Synthesis(1988): 37-38の操作によって製造した．
（±）1-アミノ-2-フェニルエチルリン酸（19）を最初にその（±）Ｎ-ベンジルオキシカルボニル誘導体（20，図10）に変換し，ついでE.Baylisら，J．Chem.Soc.Perkin Trans I，12(1984): 2845-2853に記載されているその（＋）（Ｒ)-および（−)(Ｓ)-α-メチルベンジルアミン塩を再結晶することによって分割された．酸性にしたのち，化合物20の純粋なエナンチオーマーを図４に示したのと同じ方法によって別個に，化合物22の２つのエナンチオーマーに変換された．化合物22から接触水素化によってＣＢＺ基を除去し，ついでＮ-アセチル-6-アミノ-n-カプロン酸（35）の対称無水物でアシル化すると，ＮＡ-1ハプテンの純粋なエナンチオーマー（４および５，図10）が生成した．
６（図１）の合成は，6-マレイミドカプロン酸の対称無水物（24）に代えて無水酢酸を用いた以外は化合物３（図６）の合成の場合と同じ化学工程に従った．同様に，化合物24に代えて無水酢酸を用いた以外は化合物８（図７）の合成の場合と同じ化学工程に従った．
式（Ｉ），（II）および（III）の定義内の置換またはアルケンもしくはアルキン化合物の製造は，適当な置換または非置換アルキル，アルケンまたはアルキン前駆体化合物がその化学合成において置換される場合を除いて以下に示した．本技術分野の通常の熟練者であれば，繁雑な実験を行うことなく，本明細書の実施例および説明に基づいて容易に必要な合成操作を開発できるものである．
例１−ＮＡ-1ハプテン，化合物１の合成および製造
（±）Ｎ-ＣＢＺ-1-アミノ-2-フェニルエチルホスフィン酸（20）の合成
（±）1-アミノ-2-フェニルエチルホスフィン酸（19）（12.95g，70mmol）のジオキサン（200ml）および１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（75ml）中溶液に０℃でクロロギ酸ベンジル（20ml）を滴下した．この添加時には同時に１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（75ml）を滴下して溶液のｐＨを８〜９に維持した．反応混合物を室温でさらに16時間攪拌し，ついで真空中で半分の容量に濃縮した．ジエチルエーテル（２×75ml）で洗浄し，ついで濃塩酸水溶液を加えてｐＨ１の酸性とした．酢酸エチル（３×80ml）で抽出し，有機相を合わせ水（１×20ml）で洗浄し，無水硫酸マグネシウム上で乾燥し，ろ過し，真空中で蒸発させ，酢酸エチル−軽油から再結晶すると，（±）Ｎ-ＣＢＺ-1-アミノ-2-フェニルエチルホスフィン酸（20）（15.44g）（融点136-137℃）が得られた（Baylis,E.K.,Campbell,C.D.,Dingwall,J.G.:J.Chem.Soc.Perkin Trans.1．1984，12，2845では融点137℃と報告されている）．
これは分光検査法により以下のように確認された．
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化合物21の製造
（±）Ｎ-ＣＢＺ-1-アミノ-2-フェニルエチルホスフィン酸（20）（510mg，1.60mmol）をメチレンクロリド（5ml）およびメタノール（1ml）中に溶解し，トリメチルシリルジアゾメタンの溶液（ヘキサン中10重量％）を黄色が消えなくなるまで添加した．ついで氷酢酸を黄色が消失するまで添加した．この溶液を真空中で蒸発乾固した．残留物を乾燥ＴＨＦ（2ml）に再溶解し，この溶液を０℃に冷却したＴＨＦ（2ml）中水素化ナトリウム（37mg，1.53mmol）の懸濁液に加えた．反応混合物を室温で30分間攪拌したのち，ヨードメタン（2.25mmol）を加えた．さらに３時間攪拌したのち，飽和塩化アンモニウム溶液（35ml）を加えて反応を静め，酢酸エチル（75ml）で抽出した．有機相を水（5ml）で洗浄し，無水硫酸ナトリウム上で乾燥し，ろ過し，真空中で濃縮し，シリカゲル上メタノール：メチレンクロリド（8：92）を用いてクロマトグラフィーに付すと，化合物21（0.190g）が得られた．
これは，分光検査法により，以下のようにジアステレオーマーの混合物として確認された．
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化合物22の製造
化合物21（178mg，0.530mmol）をジオキサン（0.55ml）と水（0.50ml）に溶解した．この溶液に２Ｍ水酸化リチウム水溶液（0.55ml）を加え室温で48時間烈しく攪拌した．水（25ml）を加え，この水溶液を酢酸エチル（１×25ml）で洗浄し，ついで濃塩酸でｐＨ０の酸性とし，水相を酢酸エチル（２×40ml）で抽出した．有機抽出液を合わせて無水硫酸ナトリウム上で乾燥し，ろ過し，真空中で蒸発させ，酢酸エチルから再結晶すると，化合物22（0.153g）が得られた（融点153-154℃）．
これは分光検査法により以下のように確認された．
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化合物１，ＮＡ-１の製造
10％Ｐｄ-Ｃ（30mg）および化合物22（103mg，0.31mmol）のメタノール（30ml）中混合物を水素雰囲気下に室温で，薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）で観察して出発原料が消費されるまで（４時間）攪拌した．触媒をセライトのパッドを通してろ過し，メタノール（20ml）および水：メタノール（1：9，10ml）で洗浄した．溶媒をすべて合わせて，真空中で蒸発させると固体（40mg）が得られた．固体をＤＭＦ（2ml）に溶解し，6-マレイミドカプロン酸の対称無水物（24）（0.20mmol）のＤＭＦ（2ml）中溶液を加え，ついでトリエチルアミン（0.10ml）を加えた．反応混合物を16時間攪拌したのち，１Ｍリン酸カリウム水溶液，ｐＨ６（2ml）を加えて反応を停止させた．逆相Ｃ18ｈｐｌｃを用い，生成物，化合物12（12mg）が純粋に単離された．緩衝液Ａは水，緩衝液Ｂはアセトニトリル：水（95:5），流速3.5ml/分，勾配は30分で２〜30％緩衝液Ｂとした．
これは，分光検査法により，以下のように確認された．
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例２−ハプテンＲＴ-２，化合物３の合成および製造
6-マレイミドカプロン酸23の製造
無水マレイン酸（0.05mole）の酢酸（20ml）中溶液をε-アミノ-n-カプロン酸（0.05mole）の酢酸（50ml）中溶液と混合し，室温で２時間攪拌した．酢酸（150ml）を追加し，反応混合物を18時間還流した．反応混合物を真空下に蒸発させて油状物とし，ついでクロロホルム（50ml）を添加した．この溶液を室温に16時間放置すると，不純物が溶液から沈殿した．沈殿をろ過し，ろ液を集め，真空下に蒸発させ，シリカゲル上クロロホルム：酢酸（95:5）を用いてクロマトグラフィーに付すと，6-マレイミドカプロン酸23（8g）が得られた．
これは分光検査法により以下のように確認された．
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化合物24の製造
6-マレイミドカプロン酸23（9.8mmol）を乾燥メチレンクロリド（10ml）に溶解し，ＤＣＣＩ（4.10mmol）を加えた．室温で３時間攪拌したのち，反応混合物をろ過し，ろ液を真空中で蒸発させると化合物24（1.9g）が得られた．
ＲＴ−２ハプテン（３）の製造
10％Ｐｄ-Ｃ（10重量％，40mg）およびメチル-Ｎ-ＣＢＺ-1-アミノ-2フェニルエチルホスフィン酸（26）（0.43mmol）のメタノール（5ml）中混合物を水素雰囲気下に室温で２時間攪拌した．触媒をセライトのパッドを通してろ過し，メタノール：水（1:1，20ml）で洗浄し，溶媒をすべて合わせて，真空中で蒸発させると固体（87mg）が得られた．この固体を13mgの５部分に分割した．各部分を別個にＤＭＦ（0.2ml）中化合物（0.12mmol）の溶液，ついでトリエチルアミン（0.02ml）で処理した．反応混合物を烈しく攪拌し，１Ｍリン酸カリウム水溶液，ｐＨ5.5（0.20ml）を加えて反応を停止させた．反応を停止させたのち，生成物を合わせ，逆相Ｃ18ｈｐｌｃを用い，生成物，化合物ＲＴ−２ハプテン（３）（60mg）がそのトリエチルアンモニウム塩として純粋に単離された．緩衝液Ａは水，緩衝液Ｂはアセトニトリル：水（95:5），流速3.5ml/分，勾配は30分で１〜60％緩衝液Ｂとした．生成物のピークは保持時間19分で溶出した．
これは分光検査法により確認された．
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例３−ハプテンＷＨ−２，化合物８の合成および製造
化合物29の製造
β-アミノトリフルオロアルコール塩酸塩28（0.082mmol）を１Ｍリン酸カリウム水溶液，ｐＨ６（1ml）およびアセトニトリル（2ml）の混合物中に溶解した．化合物24（0.164mmol）を添加し，反応混合物を室温で16時間攪拌した．混合物を真空中で蒸発させて固体とした．アセトニトリル（2ml）を加え，上清を逆相Ｃ18ｈｐｌｃによって精製すると，保持時間16.36分および16.58分の２つのピークとして化合物（29）（20mg）が得られた．緩衝液Ａは25ｍＭ酢酸トリエチルアンモニウム水溶液，ｐＨ5.5，緩衝液Ｂはアセトニトリル：水（95:5），流速3ml/分，勾配は35分で５〜80％緩衝液Ｂとした．
これは分光検査法でジアステレオーマーの混合物として確認された．
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ＷＨ−２ハプテンの製造
化合物29（0.0485mmol）をジクロロメタン（1ml）に溶解し，デス−マーチン酸化剤（0.179mmol）を加えた．室温で３時間攪拌したのち，反応混合物を真空中で蒸発させた．水（1ml）およびアセトニトリル（2ml）の混合物を加え，遠心分離後，上清を逆相Ｃ18ｈｐｌｃによって精製すると，保持時間が15.33分の単一のピークとしてＷＵ-ハプテン（８）（10mg）が得られた．緩衝液Ａは25ｍＭの酢酸トリエチルアンモニウム水溶液，ｐＨ5.5，緩衝液Ｂはアセトニトリル：水（95:5），流速3ml/分，勾配は35分で５〜80％緩衝液Ｂとした．
例４−基質化合物９の合成および製造
ダンシル化ε-アミノ-n-カプロン酸（30）の製造
ε-アミノ-n-カプロン酸（12.7mmol）とトリエチルアミン（70mmol）のメタノール（35ml）中溶液にダンシルクロリド（11.48mmol）を添加した．室温で２時間攪拌したのち，反応混合物を真空下に蒸発させた．１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（100ml）を加え，混合物をジエチルエーテル（２×75ml）で洗浄した．水相を濃塩酸でｐＨ２〜３の酸性とし，クロロホルム（２×100ml）で抽出した．有機相を合わせ水無水硫酸マグネシウム上で乾燥し，ろ過し，真空中で蒸発させると，化合物30（2.6g）が得られた．
これは分光検査法により確認された．
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化合物33の製造
ＢＯＣ-Ｌ-Ｐｈｅ-ＮＨ2（32）（1mmol）をメチレンクロリド（6ml）に溶解し，トリフルオロ酢酸（2ml）を添加した．室温で90分攪拌したのち，反応混合物を真空下に蒸発させた．メチレンクロリド（1ml）を加え，この溶液を攪拌したジエチルエーテル（100ml）に滴下した．得られた沈殿を集め，さらにジエチルエーテル（5ml）で洗浄した．沈殿を真空下に乾燥すると，化合物33（0.240g）が得られた．
これは分光検査法により確認された．
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化合物９の製造
化合物30（0.65mmol）およびＮ-ヒドロキシスクシンイミド（0.65mmol）メチレンクロリド（2ml）に溶解し，ＤＣＣＩ（0.65mmol）を添加した．室温で５時間攪拌したのち，反応混合物をろ過し，ろ液を濃縮して固体（31）を得た．固体をＤＭＦ（2ml）に溶解し，化合物33（0.54mmol），ついでトリエチルアミン（1.30mmol）を添加した．反応混合物を室温で16時間攪拌したのち，混合物を真空中で蒸発させて固体とした．この固体をメチレンクロリド（2ml）に溶解し，シリカゲル上，メタノール：メチレンクロリド（5:95）を用いてクロマトグラフィーに付すと，化合物９（0.230g）が得られた．
これは分光検査法により確認された．
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例５−阻害剤化合物４および５の合成および製造
10％Ｐｄ-Ｃ（100mg）および，（＋)(Ｒ)-α-メチルベンジルアミンを用いて分割した化合物22（0.683mmol）のメタノール（10ml）中混合物を水素雰囲気下に室温で３時間攪拌した．触媒をセライトのパッドを通してろ過し，メタノール（10ml）および水：メタノール（1：9，５ml）で洗浄した．溶媒をすべて合わせて，真空中で蒸発させると固体が得られた．
別のフラスコ中で，6-アセチル-n-カプロン酸（0.70g，4.05mmol）をメチレンクロリド（25ml）およびのＤＭＦ（3ml）の混合物中に溶解した．この溶液に，メチレンクロリド（10ml）中ＤＣＣＩ（0.412g，2mmol）を加えた．室温で１時間攪拌したのち，反応混合物を真空中で小容量（約3ml）に蒸発させた．この溶液を上述の固体に移し，トリエチルアミン（0.42ml，3mmol）を混合物に加えた．反応混合物を室温で３時間攪拌し，ついでこれに水：メタノール（1:2v/v，20ml）を加え，混合物を真空中で蒸発させた．メタノール（3ml）を加え，混合物をろ過し，ろ液を集めた．ろ液を製造用シリカプレート（1mm厚）上，メタノール：メチレンクロリド（20:80）を用いて精製したところ，化合物４（0.083g）が得られた．[α]D20−33.8°（ｃ＝0.157,メタノール）．10％Ｐｄ-Ｃ（100mg）および，(−)(Ｓ)-α-メチルベンジルアミンを用いて分割した化合物22（0.683mmol）のメタノール（10ml）中混合物を水素雰囲気下に室温で３時間攪拌した．触媒をセライトのパッドを通してろ過し，メタノール（10ml）および水：メタノール（1：9，５ml）で洗浄した．溶媒をすべて合わせて，真空中で蒸発させると固体が得られた．
別のフラスコ中で，6-アセチル-n-カプロン酸（4.05mmol）をメチレンクロリド（25ml）およびのＤＭＦ（3ml）の混合物中に溶解した．この溶液に，メチレンクロリド（10ml）中ＤＣＣＩ（2mmol）を加えた．室温で１時間攪拌したのち，反応混合物を真空中で小容量（約3ml）に蒸発させた．この溶液を上述の固体およびトリエチルアミン（0.42ml，3mmol）に移した．反応混合物を室温で３時間攪拌し，ついでこれに水：メタノール（1:2v/v，20ml）を加え，混合物を真空中で蒸発させた．メタノール（3ml）を加え，混合物をろ過し，ろ液を集めた．ろ液を製造用シリカプレート（1mm厚）上，メタノール：メチレンクロリド（20:80）を用いて精製したところ，化合物５（0.083g）が得られた．[α]D24＋33.5°（ｃ＝0.155,メタノール）．
化合物４および５の合成は分光検査法により以下のように確認された．
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例６−阻害剤化合物６の合成および製造
阻害剤化合物６の合成は，6-マレイミドカプロン酸対称無水物（24）に代えて無水酢酸を用いた以外は，ハプテン化合物３，ＲＴ−２の合成の場合と同じ化学反応順序によった．
６の正しい合成はそのトリエチルアンモニウム塩として分光検査法により確認された．
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例７−阻害剤化合物７の合成および製造
阻害剤化合物７の合成は，6-マレイミドカプロン酸対称無水物（24）に代えて無水酢酸を用いた以外は，ハプテン化合物８，ＷＨ−２の合成の場合と同じ化学反応順序によった．
７の正しい合成はそのトリエチルアンモニウム塩として1Ｈ-ＮＭＲスペクトルにより確認された．
例８−基質化合物11〜16の合成および製造
化合物11および12の製造は，Ｎ-ｔ-ＢＯＣ-Ｌ-フェニルアラニンアミド32ではなく，それぞれＮ-ｔ-ＢＯＣ-Ｌ-フェニルアラニンメチルエステルおよびＮ-ｔ-ＢＯＣ-Ｄ-フェニルアラニンメチルエステルを用いる以外は，化合物９（図８）について記載の合成操作によった．
化合物13の製造は，化合物31ではなく無水酢酸を用いた以外は，化合物９についての記載と同一の合成操作によった．
化合物14の製造は，Ｎ-ｔ-ＢＯＣ-Ｌ-フェニルアラニンアミド32に代えてＮ-ｔ-ＢＯＣ-Ｄ-フェニルアラニンアミドを用い，化合物31ではなく無水酢酸を用いた以外は，化合物９（図８）についての記載と同一の合成操作によった．
化合物15の製造は，化合物32に代えてＮ-ｔ-ＢＯＣ-Ｌ-フェニルアラニンメチルエステルを用い，化合物31に代えて無水酢酸を用いる以外は，化合物９にの場合と同じ合成操作によった．
化合物16の製造は，化合物32に代えてＮ-ｔ-ＢＯＣ-Ｄ-フェニルアラニンメチルエステルを用い，化合物31に代えて無水酢酸を用いる以外は，化合物９にの場合と同じ合成操作によった．
例９−他のアミノ酸に相当するハプテンの合成および製造
多くの様々なアミノ酸の脱アミノ化に特異的な触媒抗体の誘発のための遷移状態類縁体ハプテンの合成に有用な広範囲の様々な1-アミノアルキルホスフィン酸（たとえば化合物19，図３）はこれまで科学文献に記載されている［たとえば，E.Baylisら，J．Chem.Soc.Perkin Trans I，12(1984): 2845-2853］．このような1-アミノアルキルホスフィン酸は，天然に存在するアミノ酸それぞれに相当するハプテンの合成に，中間体として使用できる．図４に記載の19ではなく，これらの化合物をもちいるこのようなハプテンの合成における続く反応では，他のアミノ酸のＮＡ−１バージョンが生成する．別法として，E.Baylisらによって明らかにされているように，塩化水銀または臭素水による1-アミノアルキルホスフィン酸の酸化により，相当する1-アミノアルキルホスホン酸が産生する．後者を他のアミノ酸のＲＴ−２バージョンに変換は，１）クロロギ酸ベンジルエステルを用いるアミノ保護，２）メタノール中トリメチルシリルジアゾメタンを使用するＯ-メチル化，および３）水酸化ナトリウムでの加水分解による他のアミノ酸のメチルホスホン酸バージョン（化合物26の類縁体，図６）の作成の順序によって行われる．図６に記載の反応経路を続ければ，所望のアミ酸のＲＴ−２ハプテンバージョンが生成する．
他のアミノ酸に相当するハプテンのＷＨ−２バ−ジョンは，図７に記載の方法により，合成の第一段階で適正なニトロ化合物（所望のアミノ酸の側鎖に相当）を置換させることによって合成される．本発明の技術分野の通常の熟練者は，所望のアミノ酸類縁体を発生させるための適当なニトロ化合物を容易に製造することが可能である．
例10−ハプテンのペプチド中への導入
本明細書に記載したすべての遷移状態類縁体，すなわち式（Ｉ），（II）および（III）の化合物の導入は，本技術分野の通常の熟練者には，繁雑な実験を行うことなく容易に達成される．標準的な方法は科学文献に共通して記述されているが，たとえば本発明者らは，J．Jones，The Chemical Synthesis of Peptides，Clarendon Press: Oxford，1991を参照している．
例11−アミノ酸側鎖に遷移状態類縁体を含有するペプチドの合成および製造
アスパラギン側鎖類縁体
保護ジメチルホスホン酸アスパラギン化合物，すなわち（Ｓ)-3-（ジメチルホスホノ)-2-[(9-フルオレニル）メトキシカルバモイル］プロピオン酸の合成についてはJ.Hutchinsonら（Tet.Lett.，1992，33，7065-7066）に記載されている．この記載は参考として本明細書に導入する．このアスパラギン類縁体は，本技術分野の通常の熟練者にはよく知られている標準ペプチド合成技術（たとえばJ.Jones,The Chemical Synthesis of Peptides，Clarendon Press: Oxford，1991参照）によってペプチドまたはタンパク質中に導入される．ペプチドを水酸化リチウムで処理するとホスホネートから一方の-ＯＭｅ基が加水分解されて，ペプチド内のアスパラギンの側鎖におけるＲＴ−２型ハプテンが生成する．
類縁のＮＡ−１ハプテンのバージョンの合成は，J.Hutchinsonら（Tet.Lett.,1992,33,7065-7066）に記載の操作に従い，その合成操作における（Ｍｅ3ＳｉＯ）Ｐ（ＯＭｅ)2に代えてＣＨ3(Ｍｅ3ＳｉＯ）Ｐ（ＯＭｅ）を用いて達成される．標準技術によってペプチドを導入し，ついで水酸化リチウムで加水分解すると，アスパラギンの側鎖にＮＡ−１をもつペプチドが生成する．
アスパラギンの側鎖におけるトリフルオロケトン類縁体の合成は図11に示す．36の合成は，G．Coppolaらの操作に従って行う（Asymetric Synthesis，209頁，John Wiley; New York,1987）．この記載は参考として本明細書に導入する．36の所望のトリフルオロケトン化合物への変換は，P．Edwards（Tet.Lett.,1992，33，4279-4282）の操作に従って行う．この記載は参考として本明細書に導入する．すなわち，36を，最初ＣＦ3ＺｎＩで処理し，デス−マーチンのパーヨージネインで酸化するとトリフルオロケトン誘導体37が生成する．化合物37は，標準操作を用い，脱保護および標準ペプチド合成技術によりペプチド中に容易に導入できる（たとえばJ.Jones，The Chemical Synthesis of Peptides，Clarendon Press: Oxford，1991参照）．
グルタミン側鎖類縁体
グルタミンの側鎖におけるリン類縁体の合成は図12に記載する．ブロモ誘導体38の合成はG.Coppolaら（Asymetric Synthesis，222頁，John Wiley; New York,1987）によって報告されている．グルタミンの側鎖におけるＮＡ−１ハプテンバージョンの合成は，38のメチルホスフィン酸ジメチルとアルブーゾフ反応によって達成されて39が得られ，一方，ＲＴ−２バージョンはホスフィン酸トリメチルを用いて合成され，40が得られる．いずれのホスフィン酸誘導体も，Ｐｄ−Ｃを用いて接触水素化によって脱保護してＣＢｚ基を除き，水酸化ナトリウムでメチルエステル基を除去したのち，標準技術を用いてペプチドおよびタンパク質中に延長される．リンのメトキシ基の最終的な脱保護はトリメチルシリルブロミドによって行われ，グルタミンの側鎖における所望のハプテンが生成する．
グルタミンの側鎖におけるトリフルオロケトン類縁体の合成は図13に示す．アルデヒド41の合成は，G．Coppolaら（Asymetric Synthesis，220頁,John Wiley;New York，1987）に報告されている．P．Edwards（Tet.Lett.，1992，33，4279-4282）によって報告されているように41をＣＦ3ＺｎＩ試薬と反応させ，ついでデス−マーチンのパーヨージネインで酸化するとトリフルオロケトン誘導体42が生成する．開環は水酸化ナトリウムを用いて行い，10％Ｐｄ−Ｃを用いて接触水酸化後に完全に脱保護されたトリフルオロケトンアミノ酸が得られ，グルタミンのトリフルオロケトン類縁体，化合物43が生成する．
これらの側鎖類縁体のペプチド中の導入は，本技術分野の通常の熟練者には容易に実施できる（たとえばJ.Jones，The Chemical Synthesis of Peptides，Clarendon Press: Oxford，1991参照）．
触媒抗体の製造
ハプテン化合物の合成後，適当な担体タンパク質との接合体を調製し，マウスの免疫処置を実施した．免疫処置マウスの脾臓細胞からのハイブリドーマを作成して，ハプテンへの結合をスクリーニングした．ハプテンに結合親和性を示したクローンを触媒作用の初期スクリーニングならびに二次スクリーニングに付した．図２の基質における一級アミド結合の加水分解を触媒した抗体の一つからＦab’フラグメントを調製した．
例12−遷移状態類縁体ハプテン接合体の製造
ＮＡ−１ハプテンをハプテンのリンカーに結合したマレイミド基を介してウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）およびキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）に接合させた．これは，リジンのようなＮ末端アミノ基をアミジン連結スルフヒドリル基で置換するトラウト試薬（2-イミノチオラン塩酸塩）によりＢＳＡおよびＫＬＨ担体タンパク質を修飾し，ついで修飾タンパク質をマレイミド−ハプテンと混合することによって達成された．
さらに詳細に説明すれば，各タンパク質約５mgを１mlの50ｍＭリン酸ナトリウム，ｐＨ8.4に溶解した．ＢＳＡを，１Ｍトリエタノールアミン，ｐＨ8.1中トラウト試薬８mg/mlの溶液0.25mlと混合した．ＫＬＨは0.5mlのトラウト試薬と混合した．ＢＳＡは室温で90分間インキュベートし，ＫＬＨは室温で120分間インキュベートした．反応を停止し，修飾されたタンパク質を，0.1Ｍリン酸緩衝液，ｐＨ6.5で平衡化したＰＤ−10カラム（Pharmacia）上で脱塩によって回収した．修飾された各タンパク質の小サンプルを遊離チオールのアッセイのために保存した．ハプテン（5mg）を0.1Ｍリン酸緩衝液，ｐＨ6.5に溶解し，ついで２つのタンパク質間に分割した．混合物を室温で２時間攪拌し，ついでリン酸緩衝食塩溶液（ＰＢＳ）に対して４℃で透析し，２回透析液を交換した．
透析後，修飾タンパク質およびハプテン−タンパク質接合体のタンパク質濃度を，ＢＳＡをタンパク標準として用いて，微量ビシンコニン酸アッセイにより測定した．４種すべての修飾タンパク質について遊離チオール濃度を，標準としてシステインを用い，エルマン試薬で測定した．ハプテンとの接合前には，１モルの修飾ＢＳＡあたり遊離チオール33モルを含有し，ハプテンに接合後には10モルが残存した．接合前には，１モルの修飾ＫＬＨあたり遊離チオール20モルを含有し，ハプテンに接合後には５モルが残存した．したがって，ハプテンとタンパク質の比は両タンパク質の分子量を64,000として，ＮＡ-1-ＢＳＡ接合体の場合23:1，ＮＡ-1-ＫＬＨ接合体の場合15:1と計算された．
例13−免疫処置
11週齢のＢＡＬＢ／ｃＡｎＮ雌性マウスに，20μgのＮＡ-1-ＫＬＨを完全フロイントアジュバントに乳化して腹腔内に注射した．不完全フロイントアジュバントに乳化した20μgのＮＡ-1-ＫＬＨを４週後にブースター投与した．２回目の注射後の免疫応答をＥＬＩＳＡによって測定した．ＮＡ-1-ＢＳＡに対する抗血清のＩｇＧ力価逆数は51,200であった（50％最大光学密度を与える希釈）．マウスには７カ月後にＰＢＳ中10μgの抗原をブースター投与した．
例14−ハイブリドーマの製造およびスクリーニング
最後の注射から３日後に１匹のマウスを屠殺し，脾臓をハイブリドーマ作成のための脾臓細胞の原料とした．融合パートナーとしては，ＳＰ2/0細胞を使用した．生育11日後に，ハイブリドーマの上清液についてＮＡ-1-ＢＳＡに対する特異的抗体をＥＬＩＳＡによりアッセイした．得られた4149のコロニー中，384のハイブリドーマが接合体と反応するＩｇＧ抗体を産生した．これらの細胞を膨張させ，７日後にＮＡ-1-ＢＳＡ，ＢＳＡおよびＫＬＨへの結合を再検定した．71のハイブリドーマがＮＡ-1-ＢＳＡに結合できる抗体を産生したが，ＢＳＡまたはＫＬＨとは反応しなかった．これらのハイブリドーマをさらに膨張させて凍結した．これらのハイブリドーマからの上清液を細胞から集めて触媒活性をアッセイした．
触媒活性をもつ抗体を産生していると思われるハイブリドーマを限界希釈によってクローニングした．予め0.5mlのプリスタン（2,6,10,14-テトラメチルペンタデカン）でプライミングしたＢＡＬＢ／ｃＡｎＮマウス内での腹水産生のためにクローンを膨張させた．各マウスに５×105個のハイブリドーマを注射し，腹水を集めてプールした．
例15−13Ｄ11Ｆab' フラグメントの調製
一級アミドの加水分解を触媒することが示されている触媒抗体，13Ｄ11（5.8mg/ml）１mlを１Ｍクエン酸緩衝液，1.5Ｍ食塩，ｐＨ3.6，0.11mlと混合した．不溶性ペプシン−アガロース（15mg; 21 単位/ml 固体）を0.1Ｍクエン酸緩衝液，0.15Ｍ食塩，ｐＨ4.2に再懸濁して洗浄した．抗体とペプシン−アガロースを37℃で15時間混合した．３Ｍトリス緩衝液，0.15Ｍ食塩，ｐＨ8.5によりｐＨを7.5に調整して反応を停止させた．Superose 12を予め充填したＨＲ10/30カラム上ＦＰＬＣゲルろ過クロマトグラフィーによって消化の程度をチェックした．一夜のインキュベーションによってすべての抗体はＦab'2に消化された．Ｆab'2を，10ｍＭシステインと室温で１時間の段階的還元および30ｍＭヨードアセトアミドと室温で２時間のアルキル化によりＦab’に変換した．Ｆab’フラグメントを0.1ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液，0.14Ｍ食塩，ｐＨ7.0で平衡化したSuperose 12カラム上ゲルろ過によって精製した．すべてのカラム分画について，ペルオキシダーゼで標識したＦab’特異的二次抗体を用い，ＥＬＩＳＡでＮＡ-1-ＢＳＡに結合する抗体をアッセイした．ピークＦab’分画をプールし，Centriprep-10濃縮器で濃縮した．
例16−ＷＨ−２およびＲＴ−２接合および抗体発生
ＷＨ−２およびＲＴ−２ハプテンをＢＳＡおよびＫＬＨに，ＮＡ−１の場合と同様にして接合させた．ＷＨ−２の接合比は，ＷＨ−２：ＢＳＡの場合に38:1，ＷＵ−２：ＫＬＨの場合には11.5:1であった．ＲＴ−２の接合比は，ＲＴ−２：ＢＳＡの場合には22:1，ＲＴ−２：ＫＬＨの場合には8:1であった．ＮＡ−１とＫＬＨの場合と同様に，ＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫処置して免疫応答を発生させた．ＮＡ−１について上述したようにハイブリドーマを産生させて選択した．
例17−初期のＮＡ−１抗体触媒選択
ハプテン親和性に基づいて選択された多数の抗体から，可能性ある触媒抗体のサブセットを選択するために，初期スクリーニングプロトコールを使用した．操作は，ハイブリドーマの上清液中に存在する抗体の触媒活性についてのスクリーニングを包含する．培養上清中の抗体は極めて希薄で（通常１〜10μg/ml）不純である（反応を触媒する偶発的な酵素を含む可能性がある）ことから，前のアッセイの時よりも抗体が濃縮され精製されると操作の結果は通常，改善される．濃縮および精製は抗−マウスＩｇＧアフィニティーゲル上での固定化および洗浄によるのが，迅速で便利である．
ａ）固定化のための上清の調製：
計68のハイブリドーマの上清を乾いた培養体から抽出し，２Ｎ水酸化ナトリウムでそれぞれのｐＨを7.0〜7.5に調整した．細胞屑を2700rpmで30分間遠心分離して除去し上清をポリプロピレン管に傾瀉した．上清の総容量は4.0〜13.2mlの間で変動した（平均＝10.8ml）．ついで各上清をそれぞれ15-mlのポリプロピレン管に４つの等しいアリコートに分割した（４×68＝272管）．68の上清４セットをアフィニティーゲル上に固定化するまで−70℃に凍結した．
ｂ）抗体の固定化：
以下の固定化操作を４回行い，各回，上述の68に小分けした上清の４セットの一つを使用した．抗−マウス免疫グロブリンアフィニティーゲル（Calbiochem，結合能0.5〜2.0mg免疫グロブリン／mlゲル）を各チューブに，ＰＢＳ中50％スラリー（140μl，70μlのゲル含有）として加えて，得られた懸濁液を室温で16時間穏やかに混合した．16時間後に，96ウエル付きのMillititer GVフィルタープレート（Millipore）を0.05％Tweem-20含有ＰＢＳ中で予め湿潤させ，洗浄した．アフィニティーゲル懸濁液を遠心分離器中，2500rpmで15分間回転させ，大部分の上清を吸引により取出し，各ポリプロピレン管からの残留スラリー（250μl）はフィルタープレートの別のウエルに移した．残留した上清を全プレートから吸引により除去し，固定化された抗体を４℃でＰＢＳ／Tween（５×200μl），ＰＢＳ（３×200μl）および25ｍＭのＨＥＰＥＳ，ｐＨ7.2（３×200μl）で洗浄した．
ｃ）固定化抗体と基質のインキュベーション
所望のアッセイ数が極めて大きいため（68抗体×８基質×３ｐＨ値＝1632アッセイ），スクリーニング過程を加速し，固定化抗体を節約するために以下の戦略を採用した．上述のように，それぞれ68の固定化抗体を含む４個のフィルタープレートを準備した．必要なアッセイ数を半分に減らすために，４種類の基質それぞれのＤおよびＬ異性体を混合し，各基質のＤＬ混合物を一緒に検定した（したがって８個の基質が４つの混合物に減少した）．各プレートは１種類の基質のＤＬ混合物に割り当てたが，異なる３つのｐＨ値，すなわちｐＨ7.0，5.0および9.0で３回使用した．ろ過プレートに洗浄抗体を固定化するためには，100μlのＤおよび100μlのＬ基質を，いずれも25ｍＭのＨＥＰＥＳ，ｐＨ7.0，140ｍＭ食塩，0.01％ナトリウムアジド中200μＭ保存溶液中に調製して添加した．プレートは室温で（約22℃）で約24時間（アミドおよびエステルとも）インキュベートした．インキュベーション後，基質溶液を吸引し（ビーズは吸引しない），下記のようにＴＬＣまたはＨＰＬＣのいずれかで後に分析するまで凍結（−20℃）した．まだ固定化抗体を含有する同じ96ウエルプレートを，25ｍＭのＭＥＳ，ｐＨ5.0，140ｍＭ食塩により，４×200μl/ウエルで洗浄した．再び200μＭのＤおよびＬ両基質100μlを加え（計200μl容量），この場合はｐＨ5.0の緩衝液中とした．室温でのインキュベーションは約24時間（アミド基質）または14時間（エステル基質）行った．基質溶液を吸引し，生成物形成の分析までｐＨ7.0で凍結した．最後に，同じ固定化抗体を用いて，操作を25ｍＭトリス，140ｍＭ食塩中，ｐＨ9.0で反復した．基質混合物を固定化抗体と24時間（アミド）または３時間（エステル）インキュベートし，ついで基質溶液を吸引し，分析まで凍結した．
ｄ）生成物の形成について反応混合物の分析：
反応混合物を，生成物の形成について，ＴＬＣ（ダンシル化された基質）またはＨＰＬＣ（アセチル化された基質）のいずれかによって分析した．
ｉ）ＴＬＣ：基質混合物をエッペンドルフ遠沈管中で短時間遠心分離してアフィニティービーズの持込みを防止した．サンプルをＴＬＣプレート［ＨＰＴＬＣシリカゲル60プレコートプレート（E.Merck，Darmstadt）濃縮ゾーン付き］にスポットし，90％アセトン，８％メタノール，および２％トリエチルアミン（容量％）の溶媒系で展開した．風乾したのち，プレートにイソプロパノール中20％エタノールアミンに浸漬し，再び風乾した．蛍光スポットを暗室で紫外線を照射して可視化した．生成物の実質的に非触媒形成が，とくにｐＨ9.0でのエステル基質の場合に認められる場合があり，陽性の判定は主観的に行われた．陽性の結果は，ＴＬＣ生成物スポットの強度が，基質を含むが抗体は含まない反応混合物のレーンの生成物スポットより実質的に大きいと判断された結果とした．
ii）ＨＰＬＣ：基質混合物をエッペンドルフ遠沈管中で短時間遠心分離してアフィニティービーズＧがＨＰＬＣ系に持込まれることを防止した．分析用の逆相カラム（Vydac 218TP54 C18）を用いて，Waters HPLC系で基質と生成物を分離した．被検物質は20分で85％水／15％アセトニトリルから28％水／72％アセトニトリルの直線勾配を用いて分離した．ＨＰＬＣ溶液にはすべて0.1％のＴＦＡを含有させた．生成物は，Waters 490多重波長検出器を用い，通常は215および／または260nmにセットして分光測光法により検出および定量を行った．生成物のピーク面積は定量的で，実質的に変動した．
ｄ）さらにスクリーニングする抗体の選択：
多くの抗体がすくなくとも１種の基質に対して活性の可能性を示した．多数の実験で活性を示した抗体についてさらに追跡することを決定した．この決定を容易にするために，表IIIを作成した．抗体は，陽性の総数（表に示した）と，与えられた種類の反応（たとえばエシテル分解）に対する一貫した陽性結果または与えられたｐＨに対する一致性の両者によって選択した．さらに検討を継続するために選択された８種の抗体には星印を付した．
0003822231.tif 000025
例18−ＮＡ−１抗体の触媒活性の二次スクリーニング
触媒活性についての初期スクリーニングから選択された抗体をさらに検討するために，初期スクリーニングで確認されたタンパク質を個別に腹水中で増殖させて精製した．８種の選ばれた細胞系中の２種は残念ながら，さらに試験するための抗体を産生できなかった（16Ｅ9および2Ｅ1）．最初次の４種の抗体が調製されスクリーニングされた．125 ＮＡ-1Ｋ-13 Ｄ11-2Ｆ9（13Ｄ11），125 ＮＡ-1Ｋ-14 Ａ8-1 Ａ2（14Ａ8），125 ＮＡ-1Ｋ-23 Ｈ5-2 Ｃ7（23Ｈ5），および125 ＮＡ-1Ｋ-11 Ｄ10-4Ｆ6（11Ｄ10）である．アッセイは初期スクリーニングと同じ緩衝系およびｐＨ値で実施したが，抗体は個別に試験し，固定化しないで溶液中に遊離させた．
モノクローナル抗体（反応液中13.5〜15.0μＭ）を最初に37℃，ｐＨ7.0（25ｍＭのＨＥＰＥＳ，140ｍＭ食塩，0.01％ナトリウムアジド）において9（500μＭ），10（500μＭ），13（1.0ｍＭ），14（1.0ｍＭ），15（1.0ｍＭ），および16（1.0ｍＭ）で個別にアッセイした．上述のようにダンシル基質はＴＬＣで，アセチル基質はＨＰＬＣでスクリーニングした．９または10に対しては３日後もバックグラウンド以上の加水分解を示した抗体はなかった．一つの抗体，11Ｄ10は15および16に対してある程度の活性を示したが，この活性は６によって阻害されず，この活性は夾雑するエステル分解酵素によることが示唆された．ハプテン１に極めて類似する化合物６は，ハプテンベースの阻害剤４および５がその時点で利用できなかったので，使用された．４日後には，13Ｄ11単独が10に対して活性を示した．９に対して活性を示す抗体はなかった．
４種のＮＡ−１抗体は，４種のアミド基質９，10，13および14に対して，ｐＨ5.0，7.0および8.8で再スクリーニングした．抗体結合部位濃度は13Ｄ11＝14.5μＭ，14Ａ8＝14.8μＭ，23Ｈ5＝15.0μＭ，および11Ｄ10＝6.8μＭであった．反応は室温で進行させ，生成物の形成は13または16日に測定した．16日後，13または14に対しては，いずれのｐＨでも，いずれの抗体も活性を示さなかった．13Ｄ11のみが，10に対してｐＨ8.8でのみ活性を示した（13日）．９に対してはいずれのｐＨでも活性を示す抗体はなかった（13日）．
抗体13Ｄ11（14.5μＭ）は，63μＭ（ＲＴ−２ハプテン）（ＤＬ混合物）の不存在下または存在下に，10に対して（名目上500μＭ）活性を再スクリーニングされた．活性は３，ＲＴ−２によって約50％阻害されると評価されたが，CHES緩衝液のトリスへの変更を試みたところ，13Ｄ11による10の加水分解の阻害は見出されなかった．抗体23Ｈ5を13Ｄ11とともに再スクリーニングしたが，10に対する活性は示さなかった．
この時点までに，13Ｄ11はプロテインＡおよびＤＥＡＥクロマトグラフィーによって精製されていた．10に対する活性が夾雑酵素によるものか否かを決定するために，13Ｄ11をさらにMono Qカラム（Pharmacia）上ＦＰＬＣによってさらに精製した．この抗体は６によって阻害可能な10に対する活性を維持していたが，一部の加水分解は対照中にも認められた．その後の実験では対照の加水分解は見られず，これが多分，対照の実験室汚染によることを指示している．
13Ｄ11による10加水分解の速度をWatersのＨＰＬＣシステムを用いて定量する試みは失敗した．単一の生成物ピークに代わりに，多くの小ピークが検出された．基質10はその貧弱な分子吸光係数（ε328＝2100Ｍ-1cm-1）ではなく，その強力な蛍光に基づく早期検出のために設計された．それをＨＰＬＣで測定した．多重ピークの存在は非極性ダンシル基のＨＰＬＣ条件下における異常な挙動によるものと考えられる．
初期のスクリーニングから選択された最後の２つの試験されていなかった抗体を，腹水で増殖させて，精製し，個別にアッセイした．125 ＮＡ-1Ｋ-11 Ｆ3-1Ａ8（11Ｆ3），および125 ＮＡ-1Ｋ-13 Ｆ12-2Ｆ3（13Ｆ12）と命名された抗体は，ｐＨ5.0（100ｍＭ酢酸ナトリウム，140ｍＭ食塩，0.01％ナトリウムアジド），ｐＨ7.0（100ｍＭのＨＥＰＥＳ，140ｍＭ食塩，0.01％ナトリウムアジド），およびｐＨ9.0（100ｍＭトリス，140ｍＭ食塩，0.01％ナトリウムアジド）においてアッセイした．各抗体をダンシル化基質９，10，11，および12（×ｐＨ値＝12アッセイ）でアッセイした．基質初期濃度は200μＭ，抗体濃度は18.4μＭ（11Ｆ3）および3.4（13Ｆ12）とした．エステル加水分解アッセイの結果は，ｐＨ9.0で３時間後またはｐＨ7.0で24時間後および５日後には，いずれの抗体もバックグランド以上の活性を示さなかった．ｐＨ5.0で24時間後には明白な活性はなかったが，ｐＨ5.0で５日後には11Ｆ3による12の一部の加水分解が認められた．いずれの抗体も，ｐＨ5.0，7.0または9.0で６日後にアミド10に対して活性を示さなかったが，11Ｆ3はｐＨ5.0，9.0および多分7.0で６日後に９に対して活性を示した．
13Ｄ11の第二の腹水プレパレーションは精製して10に対する活性を検定した．最初はこの新しい抗体プレパレーションを用いてｐＨ9.0で10の加水分解は認められなかった．抗体は誤ってＰＢＳ（10.0ｍＭリン酸塩）中に透析されたことが分かった．リン酸塩による阻害の可能性に対する注意から，ＰＢＳは四面体リンハプテン基に対して産生される抗体の触媒活性のアッセイには通常回避される．リン酸塩をすべて除去するために，10ｍＭのＨＥＰＥＳ，ｐＨ7.5，140ｍＭ食塩，0.01％ナトリウムアジドへの透析後，13Ｄ11を再アッセイに付した（トリス検定緩衝液中ｐＨ9.0において）．今回は，13Ｄ11を10と７日間インキュベートして，加水分解活性が認められた．この抗体はＤエステル12とも再アッセイに付した．ｐＨ9.0で，バックグランド加水分解を越える（比較的速い）活性は見られなかった．
例19−抗ＷＨ−２抗体の触媒活性の部分スクリーニング
ＷＨ−２ハプテン（２）に対して誘導された抗体の初期スクリーニングは単一のｐＨ（7.0）で，利用できた基質のサブセットのみについて実施した．96ウエルフィルタープレートを用いる初期スクリーニングの一般的方法は上述した．計48のハイブリドーマ上清（各４ml）を一夜４℃で抗−マウス抗体ビーズ（Calbiochem，上述）20μlと振盪した．緩衝液で洗浄後，ビーズをダンシル化エステル11および12の溶液（ＨＥＰＥＳ緩衝液，ｐＨ7.0中各約100μＭ）25μlで洗浄した．ビーズはついでこの基質混合物50μlと37℃で１時間インキュベートした．反応混合物を上述のようにＴＬＣプレート上で分析し，蛍光性のダンシル化生成物の形成を紫外線照射によって検出した．バックグランド生成物の形成はすべてのレーンで検出されたが，触媒活性は明白ではなかった．ビーズを緩衝液で洗浄後，第二のスクリーニング（同一のビーズで）を，アミド９（106μＭ）および10（100μＭ）（ｐＨ7.0で総容量50μl）の混合物について実施した．37℃で６時間後のＴＬＣ分析では，すべてのレーンで薄いバックグランドを示したが，いずれの抗体についても触媒活性は認められなかった．
例20−抗ＲＴ−２抗体の触媒活性の部分スクリーニング
ＲＴ−２ハプテン（３）に対して誘導された抗体の初期スクリーニングは単一のｐＨ（7.0）で，利用できた基質のサブセットのみについて実施した．96ウエルフィルタープレートを用いる初期スクリーニングの一般的方法は上述した．計11のハイブリドーマ上清（各４ml）を一夜４℃で抗−マウス抗体ビーズ（ヤギ抗−マウス抗体でコートしたAffi-gelビーズ）20μlと振盪した．混合物を４℃に２週間保存したのち，ビーズを上述のように96ウエルフィルタープレートに移し，リン酸緩衝食塩溶液（ＰＢＳ）で洗浄した．ＰＢＳはツイーン界面活性剤（３回洗浄）およびＭＴＥＮ，ｐＨ7.0（３回洗浄）を含有する．ＭＴＥＮ緩衝液は50ｍＭのＭＥＳ，25ｍＭトリス，25ｍＭエタノールアミン，100ｍＭ食塩から構成される．
ａ）ダンシル化Ｄエステル：ビーズは２×50μlの18μＭダンシル化Ｄエステル12（ＭＴＥＮ緩衝液，ｐＨ7.0）で洗浄した．ビーズ（および対照ウエル）を50μlの18μＭ12と25℃で12時間インキュベートした．５および12時間後，サンプルをウエルから取り出し，カルボン酸生成物の出現をＴＬＣでスクリーニングした．５時間後には生成物は認められず，12時間後には生成物が対照も含めてすべてのレーンに見られた．
ｂ）ダンシル化Ｌエステル：Ｄエステルと12時間インキュベートしたのち，ビーズをさらに10時間４℃に保存し，ついで基質溶液を真空ろ過によって除去し，ビーズを２×50μlのダンシル化Ｌエステル11（24μＭ）で洗浄した．ビーズおよび対照ウエルを50μlの24μＭ11と25℃で13時間インキュベートした．13時間後，生成物の形成はＴＬＣで，対照を含めたすべての反応混合物中に認められた．触媒作用は明瞭でなかった．
ｃ）ダンシルＤＬアミド：11と25℃で13時間インキュベートしたのち，ビーズをろ過し，乾燥し，ＭＴＥＮ，ｐＨ7.0（３×200μl）で洗浄し．アミド加水分解のスクリーニング用に準備した．ＤおよびＬアミド（９および10）も混合物をＭＴＥＮ緩衝液（ｐＨ7.0）中に調製した．この溶液は２つの可能性のある基質をそれぞれ50μＭ含有した．ビーズおよび対照ウエルを９／10混合物（２×50μl）で洗浄し，50μlの混合物と25℃で15時間インキュベートした．15時間後，抗体および対照のすべてのレーンにＴＬＣによりバックグランド生成物が可視化された．対照の場合より明白な生成物スポットを生じた抗体はなかった．
ＲＴ−２抗体には，４種のダンシル化基質９〜12とｐＨ7.0で活性を示すものはなかった．
触媒抗体の特性
例21−13Ｄ11触媒抗体の検証および特性
ａ）速度論的特性：抗体は，0.01％ｎナトリウムアジドを含むＭＴＥＮ緩衝液（50ｍＭのＭＥＳ，25ｍＭトリス，25ｍＭエタノールアミン，100ｍＭ食塩）中ｐＨ9.0，37.0℃でルーチンに検定した（Morrison,J.F．& Ellis,K.J.:Methods Enzymol.,1982,87,405）．この緩衝液のｐＨに対する温度の影響を考慮した．
ダンシル化基質10の加水分解を，溶媒Ａは25ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ6.5）-アセトニトリル-メタノール（70:20:10，v/v/v），溶媒Ｂは25ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ6.5）-アセトニトリル-メタノール（10:45:45，v/v/v）とした以外は，上述（例17-d-i）と同様にＨＰＬＣで定量した．溶出は２つの直線勾配，０〜50％Ｂ（０〜20分）から50〜100％Ｂ（20〜27分），ついで100％Ｂ（27〜32分）とした．
13Ｄ11の2bの加水分解の速度論パラメーターは初期基質濃度（57〜1000μＭ）と速度（一般に６日後）をミカエリス−メントンの式の触媒濃度は無視できる形式に適用して決定した．
Ｖ/[Ｅt］＝（Ｋcat［Ｓ］）/（［Ｓ］＋［Ｅt］＋Ｋm）
（G.D.Smithら，Anal.Biochem.,1977,79,643）抗体結合部位濃度は一般的に13μＭであった．記録した速度論パラメーターはすべて，緩衝液触媒基質加水分解によって補正した．
ハプテンＫiは13Ｄ11の2bの加水分解速度に対する１ｂまたは１ｃの濃度の影響を定量して決定した．固定した抗体および基質濃度において得られた速度を式にあてはめると，
Vi/V0＝(2[Ab]−[1]−Ki’＋｛([1]＋Ki’−2[Ab])2＋4Ki'2[Ab］｝0.5)/4[Ab]
式中，ViおよびV0はそれぞれハプテンの存在下および不存在下の速度であり，2[Ab]は抗体結合部位の総濃度であり，[1］はハプテン濃度であり，Ki’＝Ki/(1＋[Ｓ]/Kmであり，Kiは阻害定数である（S.Cha，Biochem.Pharmacol.,1975,24,2177）．
セルイン試験（M.J.Selwyn，Biochim.Biophys,Acta，1965，105，193）では，ＭＴＥＮ緩衝液，ｐＨ9.0，37.0℃，少なくとも６日間で抗体の不活性化は示さなかった．ｐＨ9.0における加水分解速度に対する基質濃度の影響の研究は，13Ｄ11のＫcat＝1.65(±0.24）×10-7sec-1，Km＝432(±132)μＭであることを示している．一般には反応中の少なくとも１回の基質のターンオーバーが測定されるが，長期のインキュベーションは13Ｄ11が実際に触媒であることを示している．
10には２つのアミド結合があるので，内部アミド結合または両アミド結合の多少の加水分解が所望の生成物の見掛けの形成速度を変化させることも考えられるところではある．しかしながら，記載した速度論実験ではわずかな割合の基質が加水分解に関与したのみであり，所望の生成物のＨＰＬＣピーク面積の二重加水分解による枯渇は殆どまたは全く起こっていない．実際，別のアミド結合が切断された証拠はＨＰＬＣによっては認められない．
ｂ）ｐＨの研究：速度論的特性から，13Ｄ11触媒による10の加水分解での至適ｐＨは9.5であることが分かった（データは示していない）．さらに高いｐＨでは，比較的長い反応時間では（通常３〜８日），13Ｄ11は変性してしまう可能性がある．
ｃ）ハプテン阻害：対照実験で加水分解活性が夾雑したプロテアーゼによるものではないことが証明された．ハプテンエナンチオーマー４および５の一方のみが，多分Ｌ異性体が13Ｄ11を阻害したと考えられる（Ｌハプテンは空間的にＤアミド基質に相当する）．阻害定数ＫiはＨＰＬＣアッセイにより，14.0(±1.6)μＭと測定された．
ｄ）基質特異性：13Ｄ11の基質特異性は，ダンシル化アミド９および10，ダンシル化エステル11および12，アセチル化アミド13および14，ならびにアセチル化エステル15および16に対するその活性を調べてより厳格に決定した．13Ｄ11のダンシル化またはアセチル化エステル（45μＭ〜1.0μＭ）でのエステル分解活性を，ＭＴＥＮ，0.1ｍＭのＥＤＴＡ，0.1ｍＭのＰＭＳＦ，0.1ｍＭナトリウムアジドおよび13Ｄ11（７〜14μＭ）を含有するアッセイ混合物中25℃で試験した．インキュベーション混合物から４時間毎にアリコートを採取し，分析まで氷中に保持した．ダンシル化エステルはＴＬＣで分析し，一方アセチル化エステルはＨＰＬＣ分析に付した．結果は，エステル12，15および16に対してはバックグランド以上の触媒加水分解は存在しなかった．生成物の形成はダンシル化エステル11で認められたが，この活性ハハプテン５で阻害されなかった．観察されたエステラーゼ活性は抗体プレパレーション中に夾雑した痕跡の酵素によるものかもしれない．
13Ｄ11のアミダーゼ活性は同様に，上述の一つと同じ緩衝系を用いて，13Ｄ11（17μＭ）およびアセチル化アミド13または14（0.5〜1.0μＭ）の存在下に試験した．ＨＰＬＣ分析では25℃で３日のインキュベーション後にも生成物の形成は認められなかった．13Ｄ11がダンシル化アミド９および10を識別する能力を，加水分解生成物の形成のＴＬＣによる測定によって検討した．上述の緩衝系中アミド９または10いずれか150μＭ，30μＭの13Ｄ11を含有し，ハプテン５（0,5ｍＭ）添加または添加しない反応サンプルを25℃で５日のインキュベーション後にアッセイした．分析により，アミド10では強力な蛍光を示す生成物が認められたのに対し，９では生成物は見られなかった．アミド10に対する13Ｄ11の嗜好性ならびにそのアミダーゼ活性のリン酸塩に推定されるハプテン５による阻害がさらに確認された．すなわち，触媒抗体の活性には，免疫処置の間に存在したアルキルリンカーを要求し，既知の天然のタンパク分解酵素とは反対の立体特異性を有する．
ｅ）他の対照実験：13Ｄ11  ＩｇＧ分子の触媒活性の検討における重要な対照はそのＦab’フラグメントのハプテンおよび基質結合能の維持である．したがって13Ｄ11のアミダーゼ活性（そのＩｇＧ分子）および13Ｄ11Ｆab’フラグメントを比較した．反応混合物にはＭＴＥＮ，１ｍＭのＥＤＴＡ，0.1ｍＭのＰＭＳＦ，0.01％ナトリウムアジド，150μＭのダンシル化アミド9もしくは10，30μＭの13Ｄ11（ＩｇＧ）またはＦab’を含有させ，ハプテン５（0,5ｍＭ）添加または添加しなかった．３日後（８日後に再度）に行ったＴＬＣ分析では，ＩｇＧおよびＦab’の両者とダンシル化アミド10の場合，陽性の結果を示した．両分子によって示されたアミダーゼ活性はリン酸塩ハプテン５によって阻害された．Ｆab’フラグメントのエステラーゼ活性も，100μＭのエステル11または12，ならびに７μＭの13Ｄ11（Ｆab’）を含む上記緩衝系で検討した．アリコートを様々な時点で採取してＴＬＣで分析した．ダンシル化エステル11および12の加水分解（バックグランド以上）は観察されなかった．抗体溶液中の夾雑酵素はＦab’フラグメントの精製時に除去されたのかもしれない．
同等に活性の13Ｄ11が２つの異なる腹水のバッチから精製された．13Ｄ11の徹底的な精製を行った．脂質抽出および硫酸アンモニウム沈殿ついでプロテインＡ，ＤＥＡＥ，Mono Qおよび最後にAlkyl Superose（Pharmacia，Piscataway,NJ）上カラムクロマトグラフィーの標準操作を用いてモノクローナル抗体を腹水から精製した．最後に，既知のプロテアーゼの９つの共通の阻害剤を，抗体触媒反応に対するそれらの効果が完全に消失するのに十分な濃度で試験した．アミド分解活性は，ＰＭＳＦ，ＥＤＴＡ，アプロチニン，アンチパイン，ロイペプチンおよびホスホラミドンによって本質的に影響されなかった．亜鉛アミノペプチダーゼ阻害剤ベスタチン，アスパラギンプロテアーゼ阻害剤ペプスタチン，およびシステインプロテアーゼの非可逆性阻害剤，Ｅ-64では部分的な阻害が見られた．抗体結合部位との非特異的相互作用によるものと思われる．
ｆ）緩衝液の影響：正常なアッセイ条件下に，抗体の不存在下，10の緩徐な分解が観察された．10（100μＭ）を様々な希釈度のアッセイ緩衝液中でインキュベーションしたところ，バックグランド加水分解の速度は緩衝液の濃度に直線的に依存し，緩衝液の濃度が０に近づくと実質的に消失した（図14，下の線）．これは，バックグランド加水分解が，ｐＨ9.0および37.0℃における10の固有の不安定性というよりも緩衝液の溶質にほぼ完全に依存することを指示あしている．緩衝液の加水分解性は抗体の触媒作用には影響を与えなかった．抗体（13μＭ）と基質（100μＭ）をある範囲の緩衝液の希釈度で反応させて得られた緩衝液希釈度対生成物形成のプロットは，基質単独の場合と平行な直線を与えた（図14，上の線）．緩衝液が基質の加水分解を触媒できるが，抗体の触媒作用には影響しないという観察は抗体触媒の機構における律速段階は求核試薬またはプロトンドナーとして働く緩衝液によっては加速できないことを示している．
10の加水分解の緩衝液濃度に対する直線的依存性のさらに厳格な研究が，緩衝液の０濃度における非触媒加水分解速度を決定するために実施された．一定の基質濃度（100μＭ）を７つの異なる一連の緩衝液希釈度中でインキュベートし，9.0日後に形成された生成物の量を測定した．速度の０緩衝液濃度への線状外挿法では（データは示していない）ｐＨ9.0および37.0℃において，非触媒速度，1.25（±0.23）×10-9sec-1が得られ，13Ｄ11の触媒性の加速（Ｋcat／Ｋuncat）は132であることを示した．一級アミド10の半減期は溶液中で遊離の場合の17年から，抗体13Ｄ11に結合した場合，42日に低下する．相当するメチルエステル16の非触媒速度は同様に，ｐＨ9.0および37℃において，1.06（±0.06）×10-5sec-1と測定された．10と16の間の非触媒加水分解速度の測定値の差はもっともらくし，酢酸メチル（J.M.Kovachら，J.Am.Chem.Soc.,1980,102,1991）とアセトアミド（J.Packerら，J.Chem.Soc.,1955,2601）の塩基加水分解速度のｐＨ9.0および37℃に外挿された値の予測された差とよく一致する．
一級アミドと典型的なペプチド結合に見出される二級アミドの加水分解のための活性化のギブスの自由エネルギーは類似しているが，構造反応性相関は，一級アミドが内部ペプチド結合よりも立体的理由である程度反応性が高いと思われる（H.Morawetz & P.S.Otali: J.Am.Chem.Soc.1963，85，463）．10のＫuncatの本発明者らの実験的測定値は以前の推定値およびｐＨ7.0および25℃におけるペプチド結合の加水分解の測定値（D.Kahn & W.C.Still，J.Am.Chem.Soc.,1988,110,7529）に近似した加水分解速度である．
アミド分解触媒抗体の治療的使用
例22−治療用アミド分解触媒抗体の特異的組織標的化
ａ）二特異性分子の製造：一級アミドを加水分解できる触媒抗体は，組織標的たとえば腫瘍に特異的に向けられた場合に，さらに効果が増強されることが考えられる．このような触媒抗体は，腫瘍のような組織によって生成されまたは消費されその分解が疾患状態の処置に有効性をもたらす一級アミドを分解することになる．一部の治療的に重要なアミドは発明の背景の項に記載した．抗体がその組織標的に特異的に結合できる分子，たとえば，その抗原，腫瘍関連抗原を認識するモノクローナル抗体に接合させる．接合はよく知られた多くの化学架橋剤のいずれかにより，また標的化剤がタンパク質である場合にはＤＮＡ技術によって行われる．後者の戦略の場合，触媒抗体（またはそのフラグメント）および標的化剤（たとえば抗腫瘍抗体）を単一の融合タンパク質として発現させる．化学架橋剤および融合タンパク質の発生方法は多く知られていて，本技術分野の熟練者には繁雑な実験を行うことなく実行できる．アルギナーゼ活性を有する触媒抗体を白血病の処置に使用するような場合には，抗体を治療的有効性のために特定の部位に向ける必要はない．
ｂ）治療用二特異性分子の投与：組織標的化分子たとえば抗腫瘍抗体および治療標的からの一級アミド希有合を加水分解できる触媒抗体からなる二特異性分子は，その分子が破壊されないような方法で（たとえば，静脈内注射は経口投与より好ましい）患者に投与される．投与量および投与頻度は，とくに他の因子，疾患の性質，疾患の重症度，患者の体重，年齢および状態によって決定される．投与量および投与頻度はとくに繁雑な実験をしないでも，本技術分野の熟練者には決定できるものである．
以上，本発明の好ましい実施態様を詳細に説明したが，本発明は特許請求の範囲によって定義される．上記の説明中に掲げられた特定の細部には本発明の精神および範囲から逸脱することなく多くの改変が可能なことは自明であり，これらの記載によって本発明は限定されるものではないことを理解すべきである．
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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