(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（１）
【化１】
0003745416.tif 000003
（式中、ｎは１２〜１８の数を示し、Ｒ1 、Ｒ2 及びＲ3 はそれぞれメチル基、エチル基又はベンジル基を示し、Ｘはハロゲン原子を示す。ただし、Ｒ1 、Ｒ2 、Ｒ3 のうち、２個以上がベンジル基となることはない）
で表わされる化合物を有効成分とするα2プラスミンインヒビタ不活性化剤。
【請求項２】
α2プラスミンインヒビタを含有する検体を、一般式（１）
【化２】
0003745416.tif 000004
（式中、ｎは１２〜１８の数を示し、Ｒ1 、Ｒ2 及びＲ3 はそれぞれメチル基、エチル基又はベンジル基を示し、Ｘはハロゲン原子を示す。ただし、Ｒ1 、Ｒ2 、Ｒ3 のうち、２個以上がベンジル基となることはない）
で表わされる化合物で処理した後、プラスミン又はプラスミノーゲン活性を測定することを特徴とするプラスミン又はプラスミノーゲンの測定方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、血漿中に存在するプラスミンに特異的なインヒビタであるα2プラスミンインヒビタの不活性化剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
血漿中には多くの種類のプラスミンインヒビタが存在し、そのうち、α2プラスミンインヒビタ（以下、α2ＰＩと示す）は、プラスミンに対して極めて特異性の高いインヒビタである（ジャーナル  オブ  バイオロジカル  ケミストリ
第２５１巻、第５９５６−５９６５頁、１９７６年）。
α2ＰＩ以外のインヒビタはプラスミンとの結合に数分から長い場合は数十分を要するのに対し、α2ＰＩはほぼ瞬時にプラスミンと結合してその酵素活性を失活させる。α2ＰＩの血漿中濃度は約６mg／dlといわれ、他のインヒビタの血漿中濃度の数分の一から数十分の一であるにもかかわらず、プラスミンはほぼ選択的にα2ＰＩと結合することができる。
【０００３】
このため、プラスミンやプラスミノーゲンの測定においては、α2ＰＩの存在による妨害により、正しい測定値が得られないという問題がある。
このようなα2ＰＩの妨害を回避する目的で、特異的な抗血清を用いる方法が検討されているが、使用する抗血清が極めて高価であることや、ロット間差、力価の調整など煩雑な前処理が必要であること、更に抗原抗体反応に起因する血液中の各種の酵素系の活性化などの点で実用的なものではなかった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の目的は、安価でかつ簡便にα2ＰＩの妨害を回避することができるα2ＰＩ不活性化剤を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
かかる実情において、本発明者らは鋭意研究を行った結果、後記一般式（１）で表わされる化合物が、α2ＰＩのプラスミン阻害活性を特異的に喪失させることを見出し、本発明を完成した。
【０００６】
すなわち、本発明は、一般式（１）
【０００７】
【化３】
0003745416.tif 000002
【０００８】
（式中、ｎは１２〜１８の数を示し、Ｒ1 、Ｒ2 及びＲ3 はそれぞれメチル基、エチル基又はベンジル基を示し、Ｘはハロゲン原子を示す。ただし、Ｒ1 、Ｒ2 、Ｒ3 のうち、２個以上がベンジル基となることはない）
で表わされる化合物を有効成分とするα2プラスミンインヒビタ不活性化剤を提供するものである。
【０００９】
また、本発明は、α2プラスミンインヒビタを含有する検体を、前記一般式（１）で表わされる化合物で処理した後、プラスミン又はプラスミノーゲン活性を測定することを特徴とするプラスミン又はプラスミノーゲンの測定方法を提供するものである。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明のα2ＰＩ不活性化剤は、前記一般式（１）で表わされるＣ12〜Ｃ18の直鎖アルキル基を有する化合物を有効成分とするものである。式中、ｎは１２〜１８の数を示し、Ｘで示されるハロゲン原子としては、臭素原子、塩素原子等が挙げられる。また、Ｒ1 、Ｒ2 及びＲ3 としては、全てがメチル基もしくはエチル基；いずれか２個がメチル基で残余がエチル基もしくはベンジル基；いずれか２個がエチル基で残余がメチル基もしくはベンジル基であるのが好ましい。
【００１１】
一般式（１）で表わされる化合物としては、例ばドデシルトリメチルアンモニウムブロミド、テトラデシルトリメチルアンモニウムブロミド、セチルトリメチルアンモニウムブロミド、ステアリルトリメチルアンモニウムブロミド、セチルトリエチルアンモニウムブロミド、セチルトリメチルアンモニウムクロリド、セチルジメチルエチルアンモニウムブロミド、セチルジメチルベンジルアンモニウムブロミド等が好ましいものとして挙げられ、特にテトラデシルトリメチルアンモニウムブロミド、セチルトリメチルアンモニウムブロミド、セチルトリメチルアンモニウムクロリドが好ましい。
【００１２】
本発明のα2ＰＩ不活性化剤は、極めて低濃度でα2ＰＩのプラスミン阻害活性を喪失させることができ、その使用量は特に制限されないが、化合物（１）の緩衝液中の濃度が、好ましくは０．００５〜０．１重量％、特に好ましくは０．０１５〜０．０５重量％となる範囲で使用することができる。
【００１３】
本発明のα2ＰＩ不活性化剤は、α2ＰＩのプラスミン阻害活性を喪失させるが、プラスミンの酵素活性や、ウロキナーゼ等のプラスミノーゲン活性化物質による活性化には何等影響を与えることがない。このため、α2ＰＩを含有する検体中、例えば血漿等におけるプラスミン又はプラスミノーゲンの測定に極めて有用なものである。すなわち、α2ＰＩを含有する検体を本発明のα2ＰＩ不活性化剤で処理した後、通常の方法により、プラスミン又はプラスミノーゲン活性を測定すれば、α2ＰＩの妨害を受けることなく、プラスミン又はプラスミノーゲン濃度を正確に測定することができる。
【００１４】
ここで、検体をα2ＰＩ不活性化剤で処理する方法としては、例えば検体がα2ＰＩを含有する血漿サンプルの場合には、血漿の希釈液に添加しておく等の方法が挙げられる。
【００１５】
血漿の希釈液に添加しておく場合には、化合物（１）の濃度が希釈液中に０．０１５〜０．０５重量％となるように添加するのが好ましい。
【００１６】
このように検体を処理した後に行うプラスミン又はプラスミノーゲン活性の測定方法としては、通常行われているものであれば特に制限されず、例えばプラスミンに特異的な発色基質又は蛍光基質を用いる方法等が挙げられる。
【００１７】
【発明の効果】
本発明のα2ＰＩ不活性化剤は、極めて低濃度でα2ＰＩのプラスミン阻害活性を喪失させることができ、しかもプラスミンの酵素活性やプラスミノーゲン活性化物質による活性化には何等影響を与えない。また、安価であり、品質も一定である。特にα2ＰＩを含有する検体中のプラスミン又はプラスミノーゲンの測定に有用である。
【００１８】
【実施例】
次に、実施例を挙げて本発明を更に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００１９】
実施例１
０〜０．０５重量％のセチルトリメチルアンモニウムブロミド（Ｃ16Ｍｅ3Ｂｒ）を含有する０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．４）−０．１Ｍ  メチルアミン緩衝液２００μl に５０μl のプラスミン（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ，Ｓｗｅｄｅｎ）を加えたものを対照溶液とし、同様のＣ16Ｍｅ3Ｂｒを含有する緩衝液で４０倍に希釈した正常血漿２００μl を試験溶液として調製した。
これらを３７℃で５分間インキュベートした後、６mMのプラスミン測定用色原性基質Ｈ−Ｄ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−ｐＮＡ（Ｓ−２２５１，Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ，Ｓｗｅｄｅｎ）５０μl をそれぞれ添加し、３７℃で１０分間インキュベートした。次いで、反応停止液１mlを加えた後、４０５nmにおける吸光度を測定した。結果を図１に示す。
Ｃ16Ｍｅ3Ｂｒを含む緩衝液で希釈した血漿に添加したプラスミン活性は一定であったが、Ｃ16Ｍｅ3Ｂｒ濃度が０．０１％以下では、α2ＰＩによって阻害を受けた。
【００２０】
実施例２
Ｃ16Ｍｅ3Ｂｒの代わりに０．０２重量％の以下に示す化合物を用いる以外は実施例１と同様にして、プラスミン活性を測定した。またＣ16Ｍｅ3Ｂｒを含まないものを比較とした。対照を１００％としたときの結果を図２に示す。
（１）オクチルトリメチルアンモニウムブロミド（Ｃ8Ｍｅ3Ｂｒ）
（２）デシルトリメチルアンモニウムブロミド（Ｃ10Ｍｅ3Ｂｒ）
（３）ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド（Ｃ12Ｍｅ3Ｂｒ）
（４）テトラデシルトリメチルアンモニウムブロミド（Ｃ14Ｍｅ3Ｂｒ）
（５）ステアリルトリメチルアンモニウムブロミド（Ｃ18Ｍｅ3Ｂｒ）
（６）セチルトリメチルアンモニウムブロミド（Ｃ16Ｍｅ3Ｂｒ）
（７）セチルトリメチルアンモニウムクロリド（Ｃ16Ｍｅ3Ｃｌ）
（８）セチルジメチルエチルアンモニウムブロミド（Ｃ16Ｍｅ2ＥｔＢｒ）
（９）セチルジメチルベンジルアンモニウムブロミド（Ｃ16Ｍｅ2ＢｚＢｒ）
（10）セチルトリエチルアンモニウムブロミド（Ｃ16Ｅｔ3Ｂｒ）
【００２１】
図２の結果から明らかなように、一般式（１）において、ｎ＝１２〜１８の化合物を添加することにより、プラスミン濃度を正確に測定することができる。
【００２２】
実施例３
プラスミノーゲン（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ，Ｓｗｅｄｅｎ）及びα2ＰＩ（Ｃｏｓｍｏｂｉｏ，日本）を、０、０．００５、０．０１５又は０．０３％のＣ18Ｍｅ3Ｂｒを含有する緩衝液で希釈し、それぞれプラスミノーゲン５μg ／ml及びα2ＰＩを０、２．５又は５．０μg ／mlとした。ウロキナーゼ（ミドリ十字）を０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．４）で希釈し、１００ｕ／mlに調製した。
プラスミノーゲン及びα2ＰＩの混合液５０μl にウロキナーゼ液５０μl を添加し、３７℃で５分間インキュベートした。次いで、Ｓ−２２５１液を５０μl 添加し、３７℃で５分間インキュベートした。１mlの２％クエン酸を加えて酵素反応を止めた後、４０５nmにおける吸光度を測定した。また、ウロキナーゼによってプラスミノーゲンから生成したプラスミン活性はＳ−２２５１でアミドリティック活性として測定した。
プラスミノーゲン／ウロキナーゼ系でのプラスミン活性とα2ＰＩの濃度との関係を図３に示す。
【００２３】
図３の結果より、α2ＰＩの濃度が増すとＣ18Ｍｅ3Ｂｒのない場合はプラスミン活性は下がっていく。しかし、０．００５％のＣ18Ｍｅ3Ｂｒでα2ＰＩの作用は減少し、０．０１５％では完全にプラスミノーゲン／ウロキナーゼ系からα2ＰＩの影響を除くことができた。
【００２４】
実施例４
プラスミノーゲンをプラスミノーゲン除去血漿に加え、プラスミノーゲン０〜４００μg ／ml・サンプル血漿とした。この液を０．０１５％のＣ14Ｍｅ3Ｂｒを含有する緩衝液及び含まない緩衝液で４０倍に希釈した。ウロキナーゼ液（１００ｕ／ml）５０μl を希釈したプラスミノーゲン／サンプル血漿５０μl に添加し、３７℃で１０分間インキュベートした。５mMのＳ−２２５１を５０μl 添加し、３７℃で１０分間インキュベートした。１mlの反応停止液を加え吸光度を測定した。結果を図４に示す。
【００２５】
図４の結果より、０．０１５％のＣ14Ｍｅ3Ｂｒを含む溶液で希釈したプラスミノーゲン／サンプル血漿及びα2ＰＩを除去した血漿の直線性は同一であり、生成したプラスミンが何等の妨害も受けていないことを示している。これに対しＣ14Ｍｅ3Ｂｒを含まない溶液で希釈した血漿は、下に湾曲した検量線であり血漿中のプラスミノーゲンの測定系において、α2ＰＩは大きな阻害要因として作用していた。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１において、Ｃ16Ｍｅ3Ｂｒ濃度と吸光度の関係を示す図である。
【図２】実施例２において、測定したプラスミン活性を比較した図である。
【図３】実施例３において、プラスミノーゲン／ウロキナーゼ系でのプラスミン活性とα2ＰＩ濃度の関係を示す図である。
【図４】実施例４において、各サンプルのプラスミノーゲン濃度と吸光度の関係を示す図である。
【図１】
0003745416.tif 000005
【図２】
0003745416.tif 000006
【図３】
0003745416.tif 000007
【図４】
0003745416.tif 000008