(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞外軟骨基質を産生する能力を有する生体細胞から出発して、軟骨組織または軟骨組織を含有するインプラントを生体外で製造する方法であって、細胞が細胞領域１ｃｍ3当り約５×１０7〜１０9ｃｅｌｌの細胞密度で三次元の人工基質を含まない細胞領域（１）に持ち込まれること、細胞外基質を形成するために細胞が細胞領域（１）に残されること、その際、前記細胞領域（１）がこれを取り囲んでいる培地領域（２）から少なくとも部分的に半透性壁（３）又は対流障壁として機能する開放気孔壁によって分離されていることを特徴とする前記方法。
【請求項２】
細胞領域（１）に持ち込まれる細胞が軟骨細胞、間葉幹細胞、線維芽細胞又は前記細胞種の混合物であること、又は少なくとも１種の前記細胞を含有する組織粒子が細胞領域（１）に持ち込まれることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
細胞が細胞領域（１）に持ち込まれる前に細胞培養で増殖させられることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
培養期間中に細胞領域（１）が培地領域（２）内で動かないように配置されているか又はその中で移動させられること、及び少なくとも細胞領域壁の一部が１０．０００〜１００．０００ダルトンの透過性を有する半透膜からなることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
骨代用物質から作られている開放気孔性の剛性的に又は可塑的に変形可能なプレート（７）が細胞領域（１）に配置されていることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
培養期間中に細胞領域（１）が培地領域（２）内で動かないように配置されていること、及び少なくとも細胞領域壁の一部が約２０μｍの径の気孔を有する開放気孔層として設計されていることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
開放気孔層が骨代用物質から作られているプレート（７）であること、及び細胞領域（１）に持ち込まれた細胞がプレート（７）上で定着するようにプレート（７）が配置されるように細胞領域（１）が配置されていることを特徴とする請求の範囲項６に記載の方法。
【請求項８】
少なくとも部分的に半透膜（３）によって又は対流障壁として機能する開放気孔層によって、細胞領域（１）を取り囲んでいる培地領域（２）から分離されている細胞領域（１）を含むことを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法を実施するための装置。
【請求項９】
半透膜（３）が１０．０００〜１００．０００ダルトンの透過性を有することを特徴とする請求項８に記載の装置。
【請求項１０】
対流障壁として機能する層が１〜２０μｍの開放気孔率及び０．５〜３ｍｍの厚さを有することを特徴とする請求項８に記載の装置。
【請求項１１】
細胞領域（１）が実質的に平行な２つの面を備えた扁平な形状を有すること、及びこれら２つの面が半透膜（３）又は開放気孔層によって形成されていることを特徴とする請求項８〜１０のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１２】
開放気孔層が生物学的に分解可能な又は分解不可能な骨代用物質から作られた剛性的に又は可塑的に変形可能なプレート（７）であること、代用骨プレート（７）が細胞領域（１）の底部を形成するように培地領域（２）内に細胞領域（１）が配置されていることを特徴とする請求項１０又は１１に記載の装置。
【請求項１３】
代用骨プレート（７）が細胞領域（１）の内側に面する、少なくとも２０μｍの範囲の粗さを備えた表面を有することを特徴とする請求項１２に記載の装置。
【請求項１４】
代用骨プレート（７）が細胞領域（１）に面していない側で３００〜７００μｍの気孔率を有することを特徴とする請求項１２又は１３に記載の装置。
【請求項１５】
細胞領域（１）が代用骨プレート（７）の外側でさらに透過性壁を含むことを特徴とする請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１６】
請求項１２〜１５のいずれか１項に記載の装置の一部であって、少なくとも部分的に開放気孔性骨代用物質からなる壁によって規定される細胞領域。
【請求項１７】
その表面が生体外で培養された軟骨層（１０）で少なくとも部分的に被覆されている開放気孔性骨代用物質から作られているプレート（７）を含有し、その際、前記軟骨層（１０）の軟骨組織が骨代用物質の気孔内及び表面の凹凸で成長することによって固定されていることを特徴とする請求項５〜７のいずれか１項に記載の方法を用いて製造されるインプラント。
【請求項１８】
骨代用物質から作られているプレート（７）が、少なくとも軟骨層（１０）に面する領域において、１〜２０μｍ径の気孔を含有しており、かつ０．５〜３ｍｍの厚さを有することを特徴とする請求項１７に記載のインプラント。
【請求項１９】
骨代用物質から作られているプレート（７）が骨代用物質から作られている別の部分（１２）にセメント層（１３）によって連結されていることを特徴とする請求項１７又は１８に記載のインプラント。
【請求項２０】
剛性的に又は可塑的に変形可能であることを特徴とする請求項１７又は１８に記載のインプラント。
【請求項２１】
軟骨内欠損又は骨軟骨関節欠損を修復するためのインプラントを製造するための請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法の使用。
【請求項２２】
耳介骨、鼻軟骨、眼窩底、耳甲介又はそれらの部分を製造するための請求項１〜４又は６のいずれか１項に記載の方法の使用。
【請求項２３】
軟骨内欠損又は骨軟骨関節欠損の修復のための請求項１７〜２０のいずれか１項に記載のインプラントの使用。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は医療工学の分野にあり、請求項１の前提部分に記載の方法、つまり軟骨内及び骨軟骨欠損を修復するための軟骨組織及びインプラントの製造方法に関する。さらに、本発明は当該方法を実行するための装置及び当該方法に従って製造されたインプラントに関する。
背景技術
軟骨組織は、実質的に軟骨細胞と細胞外基質とからなる。細胞外基質は主としてＩＩ型コラーゲンとプロテオグリカン類とから成り、それらの構成要素は細胞間隙に浸出し、そこで集合して巨大分子を形成している。軟骨細胞は、成人の軟骨細胞の体積の約５％を占めている。
柔軟に接合した骨の末端を被覆している関節軟骨は、負荷がかかる関節において負荷配分の機能を引き受けている。この機能のために、軟骨組織は圧力下で水分を吸収したり再び放出したりすることができる。さらに、軟骨面は関節における滑面として機能する。
軟骨には血管が分布していないため、特に成人において、そして再生されなければならない軟骨片が少量を超えた場合には、再生能力は極めて不良である。しかし、関節軟骨はしばしば、自然に再生される可能性がある量よりはるかに多量に、摩耗又は加齢による変性を示したり、あるいは事故のための損傷することがある。軟骨層のこの種の欠損は罹患した関節に疼痛性の運動及びひずみを作り出し、さらに骨を被覆している軟骨層の欠損のために関節滑液が骨組織と接触するようになることから引き起こされる、例えば炎症のような合併症をもたらすことがある。
これらの理由からこれまでは、欠けている又は損傷した軟骨、特に関節軟骨を相応の手術によって取り替える又は修復するための努力が払われてきた。
関節軟骨又は関節軟骨とその下にある骨組織とに関する欠損を、できる限り精密な形状の穴を形成するために欠損場所を研磨し、中ぐり（ボーリング）又は穴あけ（パンチング）によって例えば同一関節のよりひずみの少ない場所から同一形状の軟骨及び骨の柱を切除し、この柱を穴の中に挿入することによって修復することは知られている。同様の方法で、数個の穴があるもっと大きな欠損が修復される（モザイク形成術）。これらの方法は成功が得られるが、実際の問題が関節のひずみの生じた部分からその関節のよりひずみの少ない部分へ実質的に移動するのであって、従って現実的には解決されない。
さらにまた、例えば出版物ＵＳ−３７０３５７５（Ｔｈｉｅｌｅ）には、純粋に人工のインプラント（例、タンパク質及び多糖類を含有するゲル）を用いて軟骨の欠損を修復することが提案されている。しかし、限定された成功しか達成されないことが証明されており、このため、近年の開発では特に活気のある自己又は同族細胞を基礎とする様々な方向でこの問題に対する解決策が考えられてきた。生体軟骨細胞又は軟骨細胞の機能を引き受けることのできる活気のある細胞は、例えば生体外（in vitro）で培養され、その後に植え込まれる；又は活気のある軟骨細胞が人工インプラントに導入される；又は活気のある軟骨細胞が少なくとも部分的に生体外で培養され、その後に植え込まれる。これは、これらの近年の開発における目的が活気のある軟骨を生体外で製造し、そうした軟骨を植え込む、又は欠損部位に軟骨形成細胞を移植し、その後それらの細胞が少なくとも軟骨に類似する組織を作り上げることにあることを意味している。
そうした方法の例は下記の出版物に記載されている：
ＵＳ−４８４６８３５（Ｇｒａｎｄｅ）に記載の方法に従うと、患者から採取された軟骨細胞が単層培養で増殖させられるが、さらにそれ以上増殖させるためには、その後ゲル又はスポンジの形状の三次元コラーゲン基質内に導入され、それらはその基質内で定着して固定化する。細胞増殖の約３週間後には、軟骨欠損場所はコラーゲン基質と細胞からなる物質で充填されている。インプラントを欠損場所に保持するためには、骨膜片をそれらに被せて縫合する。この種の移植組織片領域での軟骨再生は移植組織片を用いない場合よりかなり良好である。
ＵＳ−５０５３０５０（Ｉｔａｙ）に記載されている方法に従うと、軟骨細胞又は軟骨細胞の機能を引き受けることのできる細胞が生体適合性吸収性基質（３
２×１０6〜１２０×１０6ｃｅｌｌ／ｃｍ3）内に導入され、その基質内で細胞が固定化される。この基質が植え込まれると、それによって軟骨様組織が生体内で形成する。インプラントのために使用される軟骨細胞は、まず最初に単層培養で、その後に懸濁させられて前もって培養され、それによって集合して３０〜６０ｃｅｌｌの集合体を形成する。
ＵＳ−４９６３４８９（Ｎａｕｇｈｔｏｎ）に記載されている方法に従うと、やはり三次元人工基質がインプラントのための担体物質として使用される。この基質は植込みに先行する細胞培養のために使用され、培養される細胞のより良好な接着及びより良好な供給のために結合組織層で被覆される。三次元基質上での生体外細胞再生後に、この基質が植え込まれる。植え込まれた細胞は生体内（in vivo）で軟骨組織を形成する。
ＰＣＴ−ＷＯ９０／１２６０３（Ｖａｃａｎｔｉ  ｅｔ  ａｌ．）に記載されている方法に従うと、やはり三次元基質が使用され、その基質は分解可能なポリマー線維材料から構成されており、その基質上で細胞が定着する。基質上又は単層細胞培養中で培養されてその後基質内に導入される細胞は、基質に付着させて、従って固定化状態で植え込まれる。基質は生体内で分解され、細胞によって形成される細胞外基質に徐々に置きかえられる。
ＵＳ−５３２６３５７（Ｋａｎｄｅｌ）に記載されている方法に従うと、軟骨細胞は１．５×１０6ｃｅｌｌ／ｃｍ2の細胞密度を持つ単層のフィルター材料（０．４μｍの孔径を有するＭＩＬＬＩＣＥＬＬ（登録商標）−ＣＭ）層に塗布される。その単層の生体外培養は、その構造が明らかに天然軟骨に相当し、そうしたものとして植え込むことのできる薄い軟骨層を２〜４週間で産生する。
さらにまた、軟骨をいわゆる高密度細胞培養で培養できることも知られている。細胞は担体に塗布され、単層培養のために使用されるより高密度で培養される。培地は、細胞を担体上に載せてから、１〜２時間後にのみ添加される。１〜３日間の培養後、担体上の細胞層は収縮し、１ｍｍの範囲内の径を持ついわゆるミクロスフェア（中心体）が形成される。さらに培養すると、これらのミクロスフェアの内側で軟骨様組織が形成され、それらの表面上では線維性軟骨（軟骨膜）が形成される。インプラントのためには、この種の不均等質組織は適当ではない。
Ｓｉｔｔｉｎｇｅｒら（Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｖｏｌ．１７，Ｎｏ．１０，Ｍａｙ  １９９６，Ｇｕｉｌｆｏｒｄ  ＧＢ）は、生体外で軟骨を成長させるために活気のある細胞を三次元基質内に導入し、その後付加された基質を半透膜内に封入することを提案している。軟骨成長中、この膜は細胞によって産生され、細胞外基質を構成するために使用される化合物を培地が洗い流してしまうことを防止する。この種の膜内に封入された細胞培養の植込みは、また免疫反応を防止するためにも知られている。
上記に挙げた全ての方法は、少なくとも部分的に生体外で軟骨を製造する、つまり人工条件下で活気のある天然細胞を使用して軟骨を製造することを試みている。これらの試みにおいて遭遇する問題は、これらの生体外条件における軟骨細胞が比較的急速に線維芽細胞に脱分化する傾向を有しているという事実、又は極めて特異的な培養条件下で線維芽細胞を軟骨細胞機能へ分化させることが可能であるという事実にある。脱分化によって、軟骨細胞は中でも軟骨細胞の最も重要な化合物の１つであるＩＩ型コラーゲンを産生する能力を失う。
上記の方法に従うと、軟骨細胞の脱分化の問題は軟骨細胞を単層又は三次元基質における相応して密な培養中に固定化することによって解決される。この方法では軟骨細胞が実質的な脱分化を示すことなく繁殖し、天然軟骨の細胞外基質に少なくとも類似する細胞外基質を形成することが証明されている。三次元基質は主として細胞を固定化するためにだけ使用されるのではなく、上記の方法で製造された軟骨組織のいずれもがまさに大きく低下したひずみにさえ抵抗できる安定性を有していないので、植込み後に必要となる機械的安定性のためにも使用される。
発明の開示
本発明の目的は、適切な軟骨組織又は少なくとも部分的にそうした軟骨組織から構成されるインプラントを生体外で製造できる装置を作ることであり、軟骨又はインプラントは植込みのため、特に関節軟骨欠損における植込みに役立つ。この目的を達成するためには、生体外環境、つまりその環境において軟骨細胞又は軟骨細胞の機能を果たす能力のある他の細胞が長期の培養期間に渡って脱分化せずにそれらの機能を積極的に実行する、又はその環境において細胞が分化して活性な軟骨細胞になる、特に三次元のそうした環境を作ることが必要である。この環境の問題を解決することによって、それらの天然機能に従って脱分化しない活気のある軟骨細胞が軟骨に特徴的な細胞外基質を産生し、これと一緒に作られるべき軟骨組織を形成するので、目的の主要部分は達成される。
本発明に従って製造されるインプラントは、少なくとも部分的には生体外で製造された軟骨組織から成り、特に軟骨内又は骨軟骨関節欠損の修復に適している。それらはそうした欠損のあらゆる可能な深さに対して製造可能で、本発明のインプラントを用いて修復された欠損は植込み後可能な限りすぐに通常の負荷、つまり圧縮応力又はずり応力のいずれかによって作り出される負荷を支えることができるようになる。
この目的は請求の範囲に限定されている方法によって達成される。
本発明の方法は、細胞によって産生して細胞外間隙内に隔離される化合物の十分な高濃度が短期間の初期に達成され、これが全培養期間に渡って維持されることが可能になれば、軟骨細胞は申し分のない軟骨組織を形成できるという所見に基づいている。これらの条件下では、軟骨細胞の分化した機能が十分に保持される（それらが線維芽細胞に脱分化しない）、及び／又は相応する細胞、特に間葉幹細胞又はその他の間葉細胞又は線維芽細胞さえ相応の機能へ分化させることが可能である。
第１の条件は、少なくとも培養期間の開始時に細胞が細胞間隙内で上記の濃度のために必要な量の化合物を製造できるような密度の細胞が存在する細胞集団を作ることによって満たされる。第２の条件は、上記の化合物が細胞外間隙から洗い流されることが防止される限定された細胞用空間に細胞集団を収容することによって満たされる。
上記の化合物は特に、細胞外構造を作り上げるための構成要素として役立つ自己分泌因子類及び物質類である。これらの構成要素は特に、プロテオグリカン凝集体を作り上げるためのアグレカン類、結合タンパク質類及びヒアルロン酸塩類、及び最終的にはＩＩ型コラーゲン原線維を形成する予備段階のコラーゲン類である。
本発明に従うと、細胞は生体外培養に対して固定化されておらず、自由にできる領域、三次元の人工基質を含まずに上記の２つの条件が満たされている領域、しかし細胞が相互に対してどのように定着するかについては大きく細胞に任されている領域を有している。この種の自由な細胞領域においては、細胞はそれらの軟骨細胞機能を十分に実践し、植込みのために十分な安定性を有していて植込み後には通常の負荷の少なくとも一部を支えることのできる軟骨細胞が培養され得ることが明らかである。
本発明の方法に従うと、軟骨細胞機能を実践することのできる細胞が空の細胞領域内に、つまり細胞領域において約５×１０7〜１０9ｃｅｌｌ／ｃｍ3の細胞密度となるように培地だけを含有している領域内に導人される。この密度はおよそ１０3μｍ3の細胞容量で約５％〜１００％の空間占有率になる。
細胞領域は少なくとも部分的に透過性の壁を有しており、全培養期間を通して培地が満たされている空間部内に導人され、培地は既知の方法で定期的に更新される。培養期間中、細胞領域は培地内に動かないように配置されるか、又はその中で移動させられる（細胞領域と細胞領域を取り囲んでいる培地との間の相対移動）。
細胞領域壁の透過性部分の透過性及び相対移動は、洗い流しの防止の条件が満たされるように細胞領域の相対寸法（再生される軟骨に依存する）に適合させられなければならない。
全ての場合において、１０．０００〜１００．０００ダルトン（１０〜１００ｋＤａ）の透過性を有する半透性壁領域（半透膜）が、特に攪拌培養及び大きな寸法の細胞領域の三次元形態にとって適当である。細胞外軟骨基質の巨大分子を作り上げるための上記の自己分泌因子及び構成要素は、上記の透過性を有する膜を通過できないような分子量を有している。
静止培養及び少なくとも１つの小さな寸法（薄層）を備えた細胞領域のためには、半透性壁としてではなく単に対流障壁として有効である相当に大きな気孔（１０〜２０μｍの領域まで）を有する開放気孔壁で十分であること、そして可能ならば細胞領域は一方の側で開放していてよいことが明らかである。
特に、移動させられず、所定密度範囲より下の領域内の密度で細胞を含有している細胞領域では、細胞は重力の方向で定着し、層の形で軟骨組織を形成する。より多くの三次元軟骨形状を産生させるためには、細胞領域の攪拌が有利であることが明らかである。
特異的培養及び特に特異的形状及びサイズの細胞領域に対しては、実験によって最適配置（培地中での細胞領域の移動を伴うか、又は伴わない）及び細胞領域の壁又はこの壁の透過性部分各々の最適条件が決定されなければならない。
細胞領域は実質的に３つの機能を有している：
−−細胞領域は、細胞が細胞の特異的機能性を失わないように十分な密度で（固定化されていない）細胞の集団を１つにまとめて保持する；
−−細胞領域は、その形状を選択することによって形成される軟骨の形状が制御されるように軟骨の増殖を制限する；
−−細胞領域壁は、細胞への培地の供給を許容するが、細胞によって産生され、軟骨の成長のために必要な物質の洗い流しを防止する。
部分的にのみ軟骨組織からなるインプラントを製造するためには、細胞領域の透過壁の一部は下記により詳細に記載されるインプラント部分の機能を追加して有することができる。
細胞領域内に持ち込まれるべき細胞は、軟骨細胞、間葉幹細胞又は他の間葉細胞である。これらの細胞種は、軟骨組織、骨もしくは骨髄又は結合組織もしくは脂肪組織から既知の方法で単離される。線維芽細胞の軟骨細胞への分化に影響を及ぼす因子類が培地又は細胞領域に添加される場合、又はそれらが細胞領域に持ち込まれる前に細胞がこの種の因子を用いて処理される場合は、線維芽細胞もまた適している。細胞はまた、細胞領域内に持ち込まれる前に生体外で増殖させることもできる。
ドナー組織から特定の細胞種を単離することは必要ではない、つまりそうした組織に通常含有されている種々の細胞の混合物をそのまま細胞領域内に持ち込むことができる。さらにまた、ドナー組織の細胞内基質からの細胞の完全な分離もまた必要とされず、従っておそらく組織粒子又は分離された細胞と組織粒子との混合物を細胞単独の代わりに細胞領域内に持ち込むことができることも明らかである。しかし、例えば短時間の酵素分解により可能ならば細胞外基質から細胞を部分的に分離することによって細胞領域内で必要な細胞密度を達成することに注意を払わなければならない。
有利にも５〜１５％の血清が添加されている、例えばＨＡＭ−Ｆ１２のような既知の培地を用いると良好な結果を達成できることが明らかである。さらに、既知の成長因子及び細胞の再生及び軟骨基質の形成を支援するその他の培地の構成要素を培地に添加することができる。
本発明に従って作られた培養条件においては、軟骨細胞は生体活性のままであって脱分化しないので空間部が約３週間の範囲内の培養期間中は軟骨細胞で満たされていることが明らかである。形成されつつある軟骨組織は十分な機械的強さを獲得するとすぐに細胞領域から取り出すことができ、例えばさらに培地中で自由に浮遊させて培養することができる、又は使用直前まで細胞領域にとどまらせておくことができる。
本発明の方法に従って製造される軟骨組織は、インプラント部分としてのインプラントとして、もしくは自己細胞を含有しているときは細胞自己組織移植片として使用される、又は科学的な生体外試験目的にも使用することができる。
下記の図は本発明、本発明を実行するための装置並びに本発明の方法によって製造するインプラントの例を図示している。図示されている実施例は、関節における軟骨内及び骨軟骨欠損の修復のためのインプラントである。しかし、本発明を使用すると、さらにまた形成手術のための例えば耳介骨又は軟骨のようなその他のインプラント、例えば鼻軟骨、眼窩底、耳甲介又はそれらの部分を製造することも可能である。
【図面の簡単な説明】
図１〜４は、軟骨組織の生体外製造のために本発明の方法を実行するための４種の例示的な装置（断面）を示している。
図５〜７は、天然関節軟骨と比較した種々の実験的軟骨培養物（本発明に従った培養及び既知の方法に従った参照培養）のコンドロイチン及びコラーゲン含量を示している。
図８及び９は、本発明の方法に従って製造された軟骨の機械的特性を例示するために、そうした軟骨を歪ませる力（図８）及び天然軟骨を歪ませる力（図９）を示している。
図１０〜１３は、本発明に従って製造された軟骨及び天然軟骨の光学顕微鏡写真及び電子顕微鏡写真を示している。
図１４は、図２又は３に図示されている本発明に従って製造されたインプラントの断面を示しており、このインプラントは担体層と軟骨層とを含んでいる（２つの層の間の境界領域でのこれらの層に垂直な断面）。
図１５及び１６は、図１４に従った本発明のインプラントの実施態様を軟骨層に垂直な断面で示している。
図１７〜２０は、本発明の方法に従って製造されたインプラントの軟骨内及び骨軟骨関節欠損の修復のための適用の実施例を示している（軟骨層に垂直な断面）。
発明を実施するための最良の形態
図１は、本発明による軟骨組織の生体内製造のために、例示的な装置の断面を示している。この装置は実質的に、その中に細胞が導入されており、培地領域２内に配置されている限定された細胞領域１から構成される。細胞領域１と培地領域２との間の境界の少なくとも一部は透過性壁、例えば半透膜３によって形成されている。細胞領域１を培地領域２から分離している境界の残り部分は透過性ではなく、細胞領域１に所定の形状を与え、半透膜を適所に保持する例えばプラスチック成分から構成されている。
図示した実施例では、１個のインナーリング４と２個のアウタースナップリング５及び６が半透膜の２つの例えば実質的に円形部分と一緒に円形デイスクの形状で細胞領域１を取り囲んでいる。
半透膜３は１０．０００〜１００．０００ダルトンの透過性を有している。これは例えば相応する透析用チューブと同一材料から構成される。
図１に示したのと同一方法でほとんどの様々な形状の細胞領域を作ることができ、その空間部内に細胞を導入すると、その空間においてこれらの細胞が軟骨組織を作り上げ、軟骨組織が実質的に細胞領域１の形状又は培養期間中に重力の方向へ下方に向く細胞領域１の一部分の形状を呈することは明白である。
培地領域２は、既知の方法で培地が定期的に交換される自由に選択可能な空間である。細胞領域１を培地領域２内で動かさなければならない場合は、培地領域は例えばスピナーボルトである。
図１に従った装置を用いると、本発明の方法は例えば下記のように実行される：
−−上記で詳細に説明した細胞、組織粒子又は細胞及び／又は組織粒子の混合物を例えば培地中に懸濁させ、細胞密度が５×１０7〜１０9ｃｅｌｌ／ｃｍ3の範囲内となるように空の細胞領域に導入する。
−−細胞領域を閉鎖し、培地領域内に導入し、約３週間の範囲内の期間に渡ってそこに放置する。
−−細胞領域内で形成された軟骨組織を細胞領域から取り出し、培地上で自由に泳がせながら培養するか、又はインプラントもしくは組織移植片として又は科学的研究のために各々直接に使用する。
図１に従った細胞領域においては、軟骨組織からなるインプラント、例えば耳介骨、鼻軟骨、眼窩低又はそれらの部分が製造される。
図２は、本発明の方法を実行するための別の細胞領域の実施形態を示している。細胞領域１は扁平で、一方の側は可能ならば生物学的に分解可能な骨代用物質から作られた開放気孔性の剛性的に又は可塑的に変形可能なプレート７によって限定されており、他方の側は透過性壁、例えば半透膜３又はより粗い多孔性壁によって限定されている。細胞領域は高さが例えば約３〜５ｍｍで、あらゆる扁平な形状及び範囲を有している。
図２に示した細胞領域は、特に骨軟骨欠損の修復のためのインプラント製造のために適している。インプラントは、扁平な細胞領域において増殖した軟骨組織だけではなく代用骨プレート７を含有している。従って、この代用骨プレート７は実質的に２つの機能を有している：軟骨の成長中には細胞領域のための透過膜として機能し、完成インプラントにおいては軟骨層のための付着基板として機能し、それによって植込み後、この骨代用物は隣接する生体骨組織から移入する細胞によって既知の方法で転移増殖される。
代用骨プレート７が上記の第２の機能を満たすことができるためには、培地領域内の細胞領域の相応する配置によって、少なくとも初期細胞密度が細胞が定着傾向を有するようなものである場合に対しては、細胞が代用骨プレート７の内面全体に定着するように注意を払わなければならない。このために、細胞領域１は例えば図２に示されているように、重力の影響のために細胞が代用骨プレート７上に定着するように代用骨プレート７を下方に向けて動かないように配置されている。
さらに、代用骨プレート７は、細胞領域１で成長する軟骨組織が中間領域にある代用骨プレート７と一緒に成長できるように、従ってずり応力に抵抗できる２パートインプラントを形成するように形成しなければならない。この種の一緒に成長することは、その上で軟骨が培養される代用骨プレートの少なくとも１つの面の気孔率を、細胞外軟骨基質内で作り上げられたコラーゲン原線維が気孔内へ増殖でき、骨代用板内に新規軟骨をそのように固定できるように選択することによって達成される。コラーゲン線維のこの種の固定のためには約１〜２０μｍの気孔が適切であることが明らかである。
さらに、軟骨を培養するために代用骨プレートの表面上に持ち込まれる細胞の一部が表面の凹凸又は気孔に定着する場合は、増殖しつつある軟骨組織増殖がある種の積極的な係合でこれらの凹凸のある場所及び気孔において骨代用物質に連結しているのが有利である。細胞は、凹凸のある場所又は少なくとも２０μｍ、理想的には２０〜５０μｍのサイズを有している気孔ではこれらが容易に定着することが明らかである。
このため、代用骨プレート７は下記の条件を満たしていなければならない：
−−細胞が代用骨プレートを通して培地から栄養供給を受けることができるために、代用骨プレートは連続管を形成する気孔を含有していなければならない（開放気孔性、open porosity）。
−−代用骨プレートが少なくとも大きな分子の洗い流しに対する対流障壁として役立つためには、気孔は大きすぎてはならず、プレートの厚さは小さすぎてはならない。
−−増殖している軟骨組織において作り上げられているコラーゲン原線維がプレートの気孔に付着させられるためには、気孔は２０μｍ以下でなければならない。
−−細胞が代用骨プレートの表面の凹凸のある場所又は気孔で定着できるためには、成長しつつある軟骨骨に面する表面の少なくとも一部分がそうした凹凸のある場所又は少なくとも約２０μｍのサイズを有する表面気孔（表面粗さ）を備えていなければならない。
相応して粗い表面を有し、２〜２０μｍの範囲内の孔径の開放気孔を有し、さらに０．５〜３ｍｍ、有利には０．５〜１．５ｍｍの厚さする代用骨プレートを用いると、申し分のない結果を達成できることが明らかである。約０．５〜１ｍｍより大きな厚さのプレートを用いた場合は、代用骨プレートに面していない領域もまたより粗い気孔率、例えば骨代用物質から既知であるような３００〜７００μｍまでのサイズの気孔を有することができる。この種の気孔率は骨代用材料の生体内血管分布に有利である。
骨代用物質としては、上記の開放気孔性を有し、剛性的に又は可塑的に変形可能なプレートへ加工処理できる有益にも生物学的に分解可能なそうした材料である、既知の骨誘導性及び／又は骨伝導性材料が適切である。可塑性的に変形可能なプレートは例えばＩ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン及びヒドロキシアパタイト、又はポリ乳酸から製造することができる。剛性プレートはリン酸三カルシウム、ヒドロキシアパタイト又は他の無機骨代用物質から形成することができる。
付着因子を用いての代用骨プレート７の処理は不必要である。
相応する開放気孔性の代用骨プレート７を含有する図２に従った細胞領域では、生体外で軟骨組織が成長するだけではなく、前形成された一緒に成長する軟骨／骨中間領域を含有するインプラントも製造される。
図３は、本発明の方法を実施するためのさらに別の例示的な装置を示している。原理的には、これは図１及び２に従った装置において実施される方法の組合せである。代用骨プレート７は細胞領域１の透過壁の一部としては配置されておらず、細胞用空間が例えば半透膜３によって限定されている細胞領域内に存在する。この種の装置においては、代用骨プレート７が対流障壁の機能を引き受ける必要がないこと、及びこのためにプレートの気孔率及び厚さを極めて自由に選択できることが明白である。
図３に示した装置は特に、細胞領域壁として取り扱うには複雑な、薄い、可塑性的に変形可能な代用骨プレート７に適切である。
図４は、代用骨プレートと一緒に成長させられる極めて薄い軟骨層を培養するために特に適している細胞領域１のさらに別の実施形態を概略的に示している。図１〜３に記載の細胞領域とは反対に、図４における細胞領域は少なくとも初期１〜２週間中は培養が静止培養条件下でなされなければならないように上方に向かって開口している。類似の既知の装置（例えばＵＳ−５３２６３５７，Ｋａｎｄｅｌ）とは反対に、代用骨プレート７は細胞のための担体として備えられており、細胞は単層としての担体には塗布されておらず、付着因子の助けを借りて固定化されてもいない。
図５〜７は、本発明の方法（実質的に図１に略述した実験的装置）を用いた実験の結果を示している。半透膜として透析用チューブを使用した。
軟骨細胞は既知の分離方法を用いてウシ肩関節から分離した。これらの細胞を透析用チューブ内に導入し、これらを培養期間中にスピナー・ボトルに移動させたところ、それによって細胞はチューブの最も下の端部上に定着した。５〜１５％の血清を含有するＨＡＭ−Ｆ１２を培地として使用した。この培地は２日間おきに取り換えた。
図５は、本発明の方法に従って製造された軟骨組織の培養期間（２０、２９及び４９日間）の長さの関数としての硫酸コンドロイチン及びコラーゲン含量をウシ（年齢：１８月齢）肩関節から採取した軟骨の相応する数値と比較して示している。結果は、天然軟骨におけるより生体外製造軟骨における方が硫酸コンドロイチンの含量が高いこと、しかしコラーゲン含量は相当に低いことを示している。
図６及び７もまた、培養期間（０、７、２０及び４０日間）の長さの関数としての、参照培養Ａ及びＢ中、及び本発明の方法に従って製造された軟骨組織（Ｃ：定着した細胞の領域における細胞領域中の軟骨増殖；Ｄ：定着した細胞の上方の細胞領域中の培地）の４０日間の培養期間後の硫酸コンドロイチン（図６）及びコラーゲン（図７）含量を示している。参照のために、軟骨細胞をアルギン酸塩球中に包理し、静止培養（参照Ａ）及びスピナー・ボトル（参照Ｂ）中で培養した。
図６及び７により、本発明に従った実験装置における軟骨構造を用いると参照実験におけるより相当に大きな成功が得られることが明白である。
図８及び９は、本発明に従って製造された軟骨（培養条件については上記参照）の機械的特性を例示するために、本発明に従って製造された軟骨（図８）及び天然軟骨（図９）について実施された応力実験の結果を天然ウシ軟骨の機械的特性と比較して示している。実験は一定速度（１μｍ／ｓ）を用いて軟骨にパンチを押し入れ、パンチ力を記録しながら２００μｍの貫入深さでパンチを停止させることから構成されている。この力は最初は貫入深さにほぼ比例して上昇するが、パンチの停止後は減少する（軟骨組織の液体損失のための粘弾性力低下）。
２枚の図８及び９は、時間（ｓ）の関数としてのニュートン（Ｎ）で表したパンチ力を示している。図８では、貫入深さ（行程）の記録はμｍで示されている。
本発明に従って製造された軟骨を用いての応力実験（図８）を径２０ｍｍを有するパンチを用いて実行したところ、約０．８Ｎ×ｃｍ2の最大圧を示した。天然軟骨を用いた実験を径５ｍｍを有するパンチを用いて実行したところ、約３０Ｎ／ｃｍ2の最大圧を示した。
本発明に従って製造された軟骨の相当に小さな最大圧は、図１０〜１３と関連させて説明することができる。これらの図は本発明に従って製造された軟骨（図１０及び１１）及び中間帯からのヒト軟骨（図１２及び１３）の光学顕微鏡写真（図１０及び１１）及び電子顕微鏡写真（図１２及び１３）を示している。
図１０及び１１は明白に、本発明の方法に従って製造された軟骨が生体外で培養された軟骨にとっての成長段階と解釈できる天然軟骨より相当に多量の軟骨細胞を含有していることを示している。軟骨細胞中にオルガネラ（細胞小器官）（矢印でマークされている）を容易に視認できる図１２及び１３によって同様の解釈が示唆されている。天然軟骨においては、オルガネラは細く、合成活性がほとんどないことを示唆している。本発明に従って製造された軟骨においてはそれらは顕著に拡大しており、強度の合成活性を、つまり成長段階を示唆している。
本発明に従って製造された軟骨組織についてのさらに詳細な電子顕微鏡による検討では、コラーゲン原線維が密な網を形成しているが、それらは天然軟骨（成長完了後）におけるよりはまばらであること、そしてそれらは任意の方向に配列されていることが示されている。このため、本発明に従って製造される軟骨組織はある種の未発達の、しかし生体内で（植込み後に）「成熟」軟骨に発達する能力を有している軟骨組織であると見なされなければならない。
図１４は図２〜４のうちの１つに従っている装置において製造されたインプラントの軟骨組織と代用骨プレートの間の中間領域を通る組織学的切片（倍率約１００倍）を概略的に示している。軟骨組織１０及び代用骨プレート７は、代用骨プレート７の凹凸のある表面場所内に軟骨組織が増殖しているために積極的な係合手段で中間領域において相互に連結されている。
図１５及び１６は、図２〜４（軟骨層１０を通る断面）と結び付けて説明された方法に従って製造されているインプラントの実施形態を例示的に示している。これらのインプラントは、図１４に示されているように、軟骨組織が代用骨プレート７と一緒に増殖する中間領域を含んでいる。
２、３週間の培養期間後、その上に増殖した軟骨層１０を含んでいる代用骨プレート７が細胞領域の他の壁成分から分離される。植込み前に、軟骨層１０及び代用骨プレート７から構成されるインプラントは、必要な場合は望ましいサイズ及び形状に小さくされ、及び／又は骨代用物質の別の断片１２に固定させられる。
細胞領域から取り出したインプラントを加工処理するためには、例えば穴あけ、レーザー切断又は研磨のような一般的外科方法を使用する。代用骨プレートを拡大するには、既知の有益な生物学的に分解可能なセメントを用いて、類似の又は相違する骨代用物質の別の断片１２を軟骨層１０の反対側の代用骨プレート７の一方の側に付着させる。
植込み後には、天然環境からの骨形成細胞が代用骨プレート７及び付着させられた断片１２の開放気孔性骨代用物質内に移動し、微小血管が材料の気孔内へ増殖する。この結果、天然骨組織が発達し、徐々に分解する骨代用物質（７、１２、１３）に取って代わる。これによって、生体外で培養された軟骨が中間領域１１において鉱化する（mineralized）ことが予測される。
図１７〜２０は、本発明のインプラントの例示的な実施形態を用いて修復されている軟骨内及び骨軟骨欠損を示している。
図１７は、穿穴又は研磨によって作られた限定された形状を有する軟骨内欠損、つまり天然軟骨層２０内に存在し、軟骨層２０の下の骨組織には影響を及ぼしていない欠損を示している。この種の欠損は、ヒト症例では最大約３ｍｍの深さを有しており、ある程度の軟骨表面に影響を及ぼす可能性がある。１片の軟骨組織１０’が準備された欠損部内に挿入されているが、軟骨組織は例えば図１に従った装置において培養され、培養後に軟骨組織が必要なら切断又は穴あけによって欠損部の形状に適合させられた。
欠損部にインプラントを申し分のなく固定させるためには、少なくとも小さなインプラントについては植え込み時にインプラントを弾性的に僅かに変形させる（押して適合させる）ことで十分である。もっと大きな欠損部については、インプラントは既知の手段を用いて、例えば、インプラント上に縫合又は糊付けされている骨膜片を用いて、天然軟骨とインプラントの間に糊（例、フィブリン糊）を導入して、又はインプラントを周囲天然軟骨に縫合することによって固定する。
図１８は、植込みのために限定された形状（骨組織における約１０ｍｍまでの表面範囲、約３ｍｍまでの深さ）を有する開口部を穿孔することによって準備されている小さな骨軟骨欠損部、つまり天然軟骨組織２０だけではなくその下にある骨組織２１にまで影響を及ぼしている欠損部を示している。この欠損部は、１本又は数本のピンを用いてインプラントが固定される、図１５に従ったインプラントを用いて修復されている。２本のピンが示されている。１本のピン２２．１は外科医によってその表面からインプラントを通して打ち込まれており、もう１本のピン２２．２は前もってインプラントの代用骨プレート７に配置されていてインプラントの表面を押すことによって骨に打ち込まれる。
明らかに、図１８に従った欠損部においてはピン以外の他の固定手段を用いてインプラントを固定することもまた可能である。
図１８から、修復された領域においては関節を歪ませるときに骨２１と軟骨２０の間の中間領域上で作用する相当い大きなずり応力が、生体外で成長した軟骨層が代用骨プレート７と一緒に成長した場所である中間領域１１によって引き受けられることを見て取ることができる。
図１８に示されているような生体外で培養された軟骨層１０と代用骨プレート７からなるインプラントの代わりに、図１７に示されているのと同様の方法で、同一欠損を充填物質で満たし、さらに生体外で（代用骨プレートを使用せずに）培養された軟骨組織片を用いて修復することができる。そうした場合においてずり応力を引き受けるためには、例えばインプラントを通してまっすぐに到達するピン２２．１が用意されなければならない。
図１９は、深さ２０〜３０ｍｍを有し、図１６に従った本発明のインプラントの植込みによって修復されている準備された骨軟骨欠損を示している。ずり応力はやはり軟骨層１０と代用骨プレート７が一緒に増殖する領域によって引き受けられる。セメント結合部１３が天然骨２１内に配置されているので、ずりによって歪むことはなく、従ってピンによって強化される必要がない。
図１８に示されている修復は、孔の下部を骨代用物質で充填し、可能ならばセメント層１３によって図１５によるインプラントを植え込むことによっても実施できる。
より大きな骨軟骨欠損部に対しては、図１９に従った複数のインプラントを用意できる（モザイク形成術）。
図２０は、大きくて深い骨軟骨欠損部を示している。これは極めて大きいので修復されるべき軟骨領域をもはや均一な領域で近似することができない。この種の欠損部は、上記で指摘したように、モザイク形成術を用いて修復することができる。しかし、本発明のインプラントは表面サイズに関して限定されておらず、代用骨プレート７は可塑性的に変形可能な材料から作ることができるので、この欠損部は図２０に従って図１５によるインプラントを用いてより容易に修復されている。このために、欠損部は骨２１内に数ミリメートルの深さ及び限定された形状に切り開かれ、より深い領域にはプラスチック製骨代用物質が充填され、インプラントが欠損部に配置されて適切な手段を用いて固定されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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