(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
同条件で栽培した天然のトマトと比べて、果実における１以上の遊離アミノ酸をより多く蓄積するトランスジェニックトマトを作出する方法であって、ミトコンドリアへのトランジットペプチドを含むトマトのNAD依存型グルタミン酸デヒドロゲナーゼを過剰発現させる遺伝子構築物でトマトを形質転換し、該遺伝子構築物に連結されたマーカー遺伝子により付与された形質に基づいて前記形質転換トマトを選択または同定し、１以上のアミノ酸をより多く果実中に蓄積するトマトについて前記形質転換トマトをスクリーニングし、前記形質転換トマトを選別することを含む、前記方法。
【請求項２】
遺伝子構築物が、強力な構成的プロモーターまたは果実特異的プロモーターに機能可能に連結されたミトコンドリアへのトランジットペプチドを含むトマトのNAD依存型グルタミン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
構成的プロモーターがCaMV35Sプロモーターであり、果実特異的プロモーターが2A11プロモーターである、請求項２記載の方法。
【請求項４】
遺伝子構築物が下記のいずれかである、請求項１記載の方法：
i) CaMV 35Sプロモーターの下流に接続された配列番号２記載の配列を有する核酸を含む遺伝子構築物、
ii）CaMV 35Sプロモーターの下流に接続された配列番号２記載の配列を有する核酸を含む遺伝子構築物であって、配列番号２中の267-269番に位置する配列aagが配列gcgに置換されている、前記遺伝子構築物。
【請求項５】
遊離アミノ酸が、アスパラギン、アスパラギン酸、セリン、スレオニン、アラニン、ヒスチジンおよびグルタミン酸からなる群より選ばれる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
遊離アミノ酸の一つが遊離グルタミン酸である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法により作出されたトランスジェニックトマトおよび、ミトコンドリアへのトランジットペプチドを含むトマトのNAD依存型グルタミン酸デヒドロゲナーゼを過剰発現させる遺伝子構築物を含有する前記トマトの子孫。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法により作出された、果実のグルタミン酸含量が２倍以上に増加したトランスジェニックトマトおよび、果実のグルタミン酸含量が２倍以上に増加したその前記トマトの子孫。
【請求項９】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法により作出された、果実の全遊離アミノ酸含量が２倍以上に増加したトランスジェニックトマトおよび、果実の全遊離アミノ酸含量が２倍以上に増加した前記トマトの子孫。
【請求項１０】
請求項７〜９のいずれか１項に記載のトランスジェニックトマトまたはその子孫トマトの種子であって、ミトコンドリアへのトランジットペプチドを含むトマトのNAD依存型グルタミン酸デヒドロゲナーゼを過剰発現させる遺伝子構築物を含有する前記種子。
【請求項１１】
同条件で栽培した天然のポテトと比べて、塊茎における１以上の遊離アミノ酸をより多く蓄積するトランスジェニックポテトを作出する方法であって、ミトコンドリアへのトランジットペプチドを含むアスペルギルス・ニズランス(Aspergillus nidulans)のNADP依存型グルタミン酸デヒドロゲナーゼを過剰発現させる遺伝子構築物でポテトを形質転換し、該遺伝子構築物に連結されたマーカー遺伝子により付与された形質に基づいて前記形質転換ポテトを選択または同定し、１以上のアミノ酸をより多く塊茎中に蓄積するポテトについて前記形質転換ポテトをスクリーニングし、前記形質転換ポテトを選別することを含む、前記方法。
【請求項１２】
遺伝子構築物が、強力な構成的プロモーターに機能可能に連結されたミトコンドリアへのトランジットペプチドを含むアスペルギルス・ニズランスのNADP依存型グルタミン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を含む、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
構成的プロモーターがCaMV35Sプロモーターである、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
遺伝子構築物が下記のいずれかである、請求項１１記載の方法：
i）CaMV 35Sプロモーターの下流に、5’から3’側へトマトグルタミン酸デヒドロゲナーゼ由来のミトコンドリアへのトランジットペプチドをコードする配列および配列番号１記載の配列が接続された配列を有する核酸を含む遺伝子構築物であって、配列番号１中の323-375番塩基が欠失している、前記遺伝子構築物、
ii）トマト2A11プロモーターの下流に、5’から3’側へトマトグルタミン酸デヒドロゲナーゼ由来のミトコンドリアへのトランジットペプチド配列および配列番号１記載の配列が接続された配列を有する核酸を含む遺伝子構築物であって、配列番号１中の323-375番塩基が欠失している、前記遺伝子構築物。
【請求項１５】
遊離アミノ酸が、アスパラギン、アスパラギン酸、セリン、スレオニン、アラニン、ヒスチジンおよびグルタミン酸からなる群より選ばれる、請求項１１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
遊離アミノ酸の一つが遊離グルタミン酸である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１１〜１６のいずれか１項に記載の方法により作出されたトランスジェニックポテトおよび、ミトコンドリアへのトランジットペプチドを含むアスペルギルス・ニズランスのNADP依存型グルタミン酸デヒドロゲナーゼを過剰発現させる遺伝子構築物を含有する前記ポテトの子孫。
【請求項１８】
請求項１１〜１６のいずれか１項に記載の方法により作出された、塊茎のグルタミン酸含量が２倍以上に増加したトランスジェニックポテトおよび、塊茎のグルタミン酸含量が２倍以上に増加した前記ポテトの子孫。
【請求項１９】
請求項１１〜１６のいずれか１項に記載の方法により作出された、塊茎の全遊離アミノ酸含量が２倍以上に増加したトランスジェニックポテトおよび、塊茎の全遊離アミノ酸含量が２倍以上に増加した前記ポテトの子孫。
【請求項２０】
請求項１７〜１９のいずれか１項に記載のトランスジェニックポテトまたはその子孫ポテトの種子であって、ミトコンドリアへのトランジットペプチドを含むアスペルギルス・ニズランスのNADP依存型グルタミン酸デヒドロゲナーゼを過剰発現させる遺伝子構築物を含有する前記種子。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、遊離アミノ酸が増強されたトランスジェニック植物およびその作成方法に関する。より具体的には、本発明は、アスパラギン、アスパラギン酸、セリン、スレオニン、アラニン、ヒスチジンおよびグルタミン酸の少なくとも１つを高蓄積するトランスジェニック植物およびその作製方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
植物に特定の遺伝子を導入し形質転換させる技術が世界で初めて報告されたのは土壌細菌、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓを用いてタバコに遺伝子を導入した研究であり、その後多くの有用農業形質を付与した作物が作出され、植物に有用成分を作らせる試みも行われてきた。このようなトランスジェニック植物作成技術を用いた植物育種法は、交配等による従来の伝統的な育種に代わるものとして有望視されている。その中で、窒素同化に関する植物の特性改良の研究も進められてきており、特に、アミノ酸は窒素代謝産物の中でも、果実、根菜類の根、種子などにおいて重要な成分であり、また食味にも大きく影響を与えることから盛んに研究が行われてきている。
【０００３】
アミノ酸の生合成に関する研究としては、例えば、大腸菌由来ＤＨＤＰＳ遺伝子をタバコに導入し、遊離リジンが２００倍上昇したという報告（米国特許第５２５８３００号、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｒｅｓ．＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）、ＡＫ遺伝子の導入により遊離リジンが増加したという報告（ＥＰ４８５９７０，ＷＯ９３１９１９０）、ＡＳ遺伝子をタバコに導入し、アスパラギン含量が１００倍上昇したという報告（ＷＯ  ９５０９９１１，Ｕｎｉｖ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＷＯ  ９０１３５３３，Ｕｎｉｖ  Ｒｏｃｋｆｅｌｌｅｒ）、アントラニル酸合成酵素をイネに導入しトリプトファン含量が９０倍上昇したという報告（ＷＯ  ９７２６３６６，ＤＥＫＡＬＢ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｒｐ）がなされている。遺伝子導入の対象となる植物はタバコ、シロイヌナズナ等のモデル植物に限られず、トマトなどの果実をもつ植物も利用されている。例えば、トマトについては１９８６年にアグロバクテリウム法を用いて形質転換体が作出され（Ｓ．ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ，Ｊ．Ｎｉｅｄｅｒｍｅｙｅｒ，Ｊ．Ｆｒｙ，Ａ．Ｂａｒｎａｓｏｎ，Ｒ．Ｈｏｒｓｃｈ  ａｎｄ  Ｒ．Ｆｒａｌｅｙ，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ，５，８１−８４（１９８６）；Ｙ．Ｓ．Ｃｈｙｉ，Ｒ．Ａ．Ｊｏｒｇｅｎｓｏｎ，Ｄ．Ｇｏｌｄｓｔｅｒｎ，Ｓ．Ｄ．Ｔａｒｋｓｌｅｙ  ａｎｄ  Ｆ．Ｌｏａｉｚａ−Ｆｉｇｕｅｒｏｅ，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２０４，６４−６９（１９８６））、それ以来形質転換系の改良がなされてきている。また、アミノ酸生合成、窒素同化に関与する遺伝子は上述の他にも多数知られており、アスパラギナーゼ、ＧＯＧＡＴ等が含まれ、これらの塩基配列も報告されている。
【０００４】
ここで、特にα−アミノ酸の一種であるグルタミン酸は、一般にタンパク質中に広く分布し、調味用途として使用されている、トマトのうま味成分や、ダイズではその醸造食品（例えば、醤油、ミソなど）中のうま味成分は、いずれもグルタミン酸であることが知られており、高等植物では窒素代謝の最初の段階で合成されることが知られている。また、グルタミン酸より生じたグルタミン、アスパラギンが篩管を経由して各組織に分配されその他のアミノ酸合成、タンパク質合成に用いられることが分かっている。植物においては、スクロースやアミノ酸などの光合成産物の輸送経路である篩管には高濃度に存在する例が報告されている（茅野充男ら、植物栄養・肥料学ｐ１２５（１９９３））が、可食部分に高濃度に含まれる例としては、トマト果実に０．２５ｇ／１００ｇ  ｆ．ｗ．程度含まれる例（ときめき２号、日本食品工業学会誌、第３９巻、ｐ６４−６７（１９９２））が知られている。しかしながら、グルタミン酸の場合は、ソース器官での生合成能が向上できたとしてもアミノ基供与の出発物質であり、前述のように種々の生合成経路で代謝されるため、植物体中でグルタミン酸を高濃度に蓄積させるのは容易ではない。交配育種、遺伝子操作を問わず、これまでグルタミン酸の濃度を植物体中で飛躍的に高めるのに成功した例は出願人の知る限り見当たらない。
【０００５】
無機窒素を有機体に同化する第一段階は、上述したように主にグルタミンを生成するためのグルタミン酸へのアンモニアの取り込みであり、これはグルタミンシンテターゼ酵素（ＧＳ）により触媒される。次いで、このグルタミンは、グルタミン酸シンターゼ（ＧＯＧＡＴ）に触媒され、α−ケトグルタル酸とから２分子のグルタミン酸が生成される。このＧＳ／ＧＯＧＡＴサイクルが、植物における窒素同化の主要な経路と考えられている（文献：ＭｉｆｌｉｎおよびＬｅａ，１９７６，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１５；８７３−８８５）。一方、アンモニアの取り込みが、ＧＳにより触媒される経路以外の代謝経路により進行する事が知られている（Ｋｎｉｇｈｔ  ａｎｄ  Ｌａｎｇｓｔｏｎ−Ｕｎｋｅｆｅｒ，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４１：９５１−９５４）。即ち、グルタミン酸を生成するためのα−ケトグルタル酸へのアンモニアの取り込みであり、これはグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）により触媒される。しかし、植物のＧＤＨは、アンモニアに対して高いＫｍ値を有しており、一方、アンモニアは毒性があり、細胞内アンモニアは通常低濃度であるため、正常な生育条件下でのこの窒素同化経路の役割については未だ充分には明らかにされていないが、ある研究では、細胞内のアンモニウム濃度が正常レベルを越えて上昇した時の窒素同化に寄与しているとの報告がある（Ｋｎｉｇｈｔ  ａｎｄ  Ｌａｎｇｓｔｏｎ−Ｕｎｋｅｆｅｒ、前掲）。
【０００６】
植物におけるグルタミン酸デヒドロゲナーゼ酵素（ＧＤＨ）は上記の様にグルタミン酸を生成するためα−ケトグルタル酸へアンモニアを取り込ませる場合と逆にα−ケトグルタル酸を生成するためにグルタミン酸からアンモニアを解離させる場合と可逆的な反応を触媒する。前者はアンモニア量が高い場合に、また後者は窒素含量が高い場合に機能すると考えられており（Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、１９９１，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．９５；８０９−８１６：Ｒｏｂｉｎｓｏｎら，１９９２，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．９８；１１９０−１１９５）、微生物に見られるようなグルタミン酸を合成する方向に機能する酵素ＧＤＨ−Ａや分解する方向に機能する酵素ＧＤＨ−Ｂ等のように方向性が明確でない。また、植物ではクロロプラストで機能するＮＡＤＰ依存型ＧＤＨとミトコンドリアで機能するＮＡＤ依存型ＧＤＨの２種類があると考えられているが、ＧＤＨはアンモニアに対して高いＫｍ値を示し、また、光呼吸時におけるアンモニアレベルとの相関性が高いことから、ミトコンドリアに局在するＮＡＤ依存型ＧＤＨがアンモニアの同化に重要な働きをしていると考えられている（ＳｒｉｖａｓｔａｖａおよびＳｉｎｇｈ  ＲＰ，１９８７，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６；５９７−６１０）。
【０００７】
植物のＧＤＨは、２種類の異なるポリペプチド（α−サブユニット、β−サブユニット）がランダムに結合し、ヘキサマーを形成し、さらに、結合の程度により７つのアイソザイムパターンを示すことが知られている。Ｇｒａｐｅｖｉｎｅのカルス細胞を用いた研究において、硝酸塩やグルタミン酸を加えた培地で培養したカルスは、電気泳動した際β−サブユニットから成るアイソザイムが陰極側に増加し、アンモニアやグルタミンを加えた培地で培養したカルスはα−サブユニットから成るアイソザイムが陽極側に増加すること、さらに、硝酸塩培地からアンモニア源培地に移した場合、ＧＤＨ活性が３倍増加し（α−サブユニット４倍増加し、β−サブユニット減少）、活性が陰極側から陽極側に移行したことが報告され（ＬｏｕｌａｋａｋｉｓおよびＰｏｕｂｅｌａｋｉｓ−Ａｎｇｅｌａｋｉｓ，１９９６，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．９７；１０４−１１１１）、アンモニアの同化にα−サブユニットが重要な働きをしていると考えられている。
【０００８】
１９９５年Ｓａｋａｋｉｂａｒａら（Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ，３３；１１９３−１１９８）によりトウモロコシの根から７つのアイソザイムバンドのうち陰極側の２つのバンドを元にＧＤＨ遺伝子が植物で初めて単離され、その後Ｇｒａｐｅｖｉｎｅ（Ｓｙｎｔｉｃｈａｋｉら，１９９６，Ｇｅｎｅ  １６８；８７−９２）、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ（Ｍｅｌｏ−Ｏｌｉｖｅｒａら、１９９６，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９３；４７１８−４７２３）、トマト（Ｐｕｒｎｅｌｌら、１９９７，Ｇｅｎｅ  １８６；２４９−２５４）からＧＤＨ遺伝子が単離されてきた。特に、Ｇｒａｐｅｖｉｎｅのカルスから単離された遺伝子はアンモニア処理した細胞において発現してきたアイソザイムを元に単離されており、α−サブユニットをコードする遺伝子であると考えられている。いずれの遺伝子においてもミトコンドリアで機能するためのトランジェットペプチドを有しているが、トウモロコシやトマトのＧＤＨ遺伝子は根で多量に発現しているのに対し、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓでは葉や花での発現が高い。またトウモロコシ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ、Ｇｒａｐｅｖｉｎｅでは複数個の遺伝子の存在が示唆されているのに対し、トマトでは１コピーであることが報告されているように植物においても遺伝子構成や機能に違いを有しており、複雑であることが予測されている。
【０００９】
このＧＤＨ遺伝子を導入したトランスジェニック植物も作製されており、大腸菌由来グルタミン酸デヒドロゲナーゼ酵素ＧＤＨ（ＮＡＤＰ−ＧＤＨ）を除草剤フォスフィノスリシン耐性付与を目的としてタバコとトウモロコシに導入したところ、根でグルタミン酸含量が１．３〜１．４倍増加したことが報告されている（Ｌｉｇｈｔｆｏｏｔ  Ｄａｖｉｄら、ＣＡ２１８０７８６（１９９６）。この報告では、タバコの根において、１４．７ｍｇ／１００ｇｆ．ｗ．であったグルタミン酸含量が２０．６ｍｇ／１００ｇｆ．ｗに、トウモロコシの根において１６．２ｍｇ／１００ｇｆ．ｗであったグルタミン酸含量が１９．１ｍｇ／１００ｇｆ．ｗ．に増大した。これ以外に、ＧＤＨ遺伝子の利用について記載された報告もあるが、実施例は示されていない（ＷＯ９５０９９１１、クロレラ由来のα、β−サブユニット（ＷＯ９７１２９８３））。またグルタミン酸族アミノ酸についての分析値も示されていない。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、植物の貯蔵器官の遊離アミノ酸含量、特に根、果実、種子を含む植物の可食部分における遊離アミノ酸、特にグルタミン酸、アスパラギン、アスパラギン酸、セリン、スレオニン、アラニンおよびヒスチジンの少なくとも１つの蓄積を増強する方法、および、遊離アミノ酸が高度に蓄積されたトランスジェニック植物を提供することである。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明の目的は、窒素の同化および利用に関わる主要な酵素の発現レベルおよび／または細胞特異的な発現バランスを変化させた植物およびその作製方法を提供することによって達成される。このような植物は、窒素同化または利用酵素をコードする１以上の遺伝子を適切な制御配列と共に導入し、これを過剰発現または発現抑制することによって作製される。
本発明の方法による遊離アミノ酸を高度に蓄積するトランスジェニック植物、特にグルタミン酸、アスパラギン、アスパラギン酸、セリン、スレオニン、アラニンおよびヒスチジンの少なくとも１つ、とりわけグルタミン酸を高度に蓄積する植物は、真核生物由来のグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）遺伝子を適切な制御配列と共に植物に導入し、これを過剰発現させることによって得られる。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明は、植物における窒素代謝の遺伝子操作に関する。特に、本発明は、果実、根菜類の根、種子など有用植物の可食部分の遊離アミノ酸、特にうま味成分であるグルタミン酸の高蓄積を図るために窒素同化および利用に関与する酵素の発現量を変化させることに関する。これらの酵素はその発現が増強され、あるいは修飾され、あるいは抑制され、所望の性質を有する植物が作製される。
本発明において使用される標的遺伝子は、アンモニアのアミノ酸への同化に関係する酵素をコードする遺伝子である。標的遺伝子としては例えば、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）が挙げられる。この酵素はその発現が増進され、またそれ以外に修飾（例えばトランジット配列付加による異所性発現）されて所望の性質を有する植物が作製される。操作は植物を本明細書に記載された核酸構築物で形質転換することにより行うことができる。形質転換された植物またはそれらの子孫は所望の改変された酵素を発現し、相当するｍＲＮＡの発現変化、窒素同化または利用能の変化、および／または植物の遊離アミノ酸含量増加についてスクリーニングされる。
【００１３】
簡単には本発明の方法は以下の手順を含み、また本発明のトランスジェニック植物はこのような方法によって作製されたトランスジェニック植物である：
ａ）目的とする遺伝子をクローニングするステップ；
ｂ）得られた遺伝子を必要により適切なベクターへ再クローニングするステップ；
ｃ）植物細胞へ上記ベクターを導入し、形質転換体を得るステップ；
ｄ）得られた形質転換体を植物体へ再生させ栽培するステップ；
【００１４】
本発明の実施態様の一つにおいては、窒素同化または利用酵素をコードする１個または数個の遺伝子が強力な構成的プロモーター制御下に置かれ、植物体中で過剰発現される。このような発現の改変は、例えば、
ａ）酵素のコーディング配列が強力な構成プロモーターに機能し得る状態で結合されているトランスジーン、
ｂ）所望の酵素をコードする、多コピー数の天然遺伝子、
ｃ）窒素同化または利用のための目的遺伝子の発現を活性化する調節遺伝子、
ｄ）発現を高めるように修飾され調節領域を有する１コピーの天然遺伝子、および、
ｅ）変異型、改変型またはキメラ型の窒素同化または利用酵素を発現するトランスジーン、
の少なくとも１つを用いて植物を遺伝子操作することによって達成され得る。
【００１５】
本発明の別の実施態様においては、窒素同化または利用酵素の発現パターンが改変される。このような発現パターンの改変は、例えば、
ａ）酵素のコーディング配列が所望の発現パターンを有するプロモーター（例えば、器官特異的または生育ステージ特異的発現パターンを示すプロモーター）に機能し得る状態で結合されているトランスジーン、
ｂ）酵素をコードする遺伝子の好ましいパターンでの発現を活性化する修飾調節遺伝子、
ｃ）好ましいパターンで発現するように修飾された調節領域を有する、１コピーの天然遺伝子、
の少なくとも１つを用いて植物を遺伝子操作することによって達成され得る。
【００１６】
本発明のさらに別の実施態様においては、窒素同化または利用経路において改変された酵素または異なる型の酵素が発現される。この型の実施態様には、宿主植物の窒素同化または利用酵素の触媒作用とは異なる触媒作用を有する対応酵素をコードする、植物細胞中で発現可能な遺伝子構築物を作製し、これにより植物を遺伝子操作することが含まれる。このような手段をとることにより、増強された遊離アミノ酸を含有する植物が得られる。
また、このような植物を育成するために伝統的な作物育種法では大きな分離集団のスクリーニングを必要とし、多大の時間を要するところ、本発明によればこのような手段をとることによりこうしたことを回避することができる。
【００１７】
以下は本明細書において使用される用語および略語の定義である。
ＣａＭＶ３５Ｓ    ＝  カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター
ＮＡＤＰ−ＧＤＨ  ＝  ＮＡＤＰ依存型グルタミン酸デヒドロゲナーゼ
ＮＡＤ−ＧＤＨ    ＝  ＮＡＤ依存型グルタミン酸デヒドロゲナーゼ
遺伝子融合体      ＝  異種遺伝子が連結されたプロモーターを含む遺伝子構築物（前記プロモーターは異種遺伝子の転写を調節する）
異種遺伝子        ＝  遺伝子構築において、異種遺伝子はその遺伝子が自然に連結されていないプロモーターに連結されていることを意味する。異種遺伝子は前記プロモーターを寄与する生物からのものであってもよく、またそうでなくてもよい。
ＧＡＢＡ          ＝  γ−アミノ酪酸
【００１８】
本発明に使用できる酵素遺伝子は、細菌、酵母、藻類、動物および植物由来であってよく、これらに限定されず、様々な供給源から得ることができる。そのような供給源から得られた配列は植物細胞内で機能する適切なプロモーターと機能可能に連結させることができ、また宿主植物におけるそれらの翻訳効率を高めるため、あるいはコードされた酵素の触媒作用を変えるためにｉｎ  ｖｉｔｒｏ突然変異誘発またはｄｅ  ｎｏｖｏ合成によって改変してもよい。これらの改変には基質および／または触媒作用に関与する残基の修飾が含まれるが、これらに限られない。さらに、導入遺伝子は発現される宿主あるいはオルガネラのコドン使用頻度に応じて最適なコドンを有するように改変してもよい。また、必要に応じてこれらの遺伝子配列に適切なトランジットペプチドをコードする核酸配列を連結してもよい。
好ましい改変には、ハイブリッド酵素の構築も含まれる。例えば、同一の、または異なる生物から得られた関連酵素の異なるドメインを組み合わせて新規な性質を有する酵素が作製されることもある。
さらに、所望の活性を有する限り、上述した様々な核酸配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸断片も本発明に使用することができる。したがって、１以上のアミノ酸が欠失、付加、置換されたタンパク質をコードする核酸断片が含まれる。「ストリンジェントな条件」とはＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９、前述）に記載されているような、当業者によく知られた一般的な条件をいう。そのような条件でハイブリダイズする核酸配列は一般に６０％、好ましくは８０％、特に好ましくは９０％以上のホモロジーを互いに有しているであろう。
【００１９】
本発明に使用できる窒素同化または利用酵素遺伝子には既に述べたような種々の遺伝子が含まれるが、グルタミン酸を蓄積させるために利用できる好ましい遺伝子の一つの例としては、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）遺伝子が挙げられる。ＧＤＨ遺伝子が使用される場合はセンス方向で発現される。ＧＤＨ遺伝子が選ばれる場合は、５’側にトランジットペプチドを結合した融合遺伝子として発現させるのが好ましく、特に好ましいトランジットペプチドはミトコンドリアへのトランジットペプチドおよびクロロプラストへのトランジットペプチドである。
本発明の好ましい実施態様の一つにおいては、カビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｄｕｌａｎｓ）由来のＮＡＤＰ依存型ＧＤＨ遺伝子（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２１８，１０５，１９８９）または、トマト由来のＮＡＤ依存型ＧＤＨ遺伝子（Ｐｕｒｎｅｌｌら、１９９７，Ｇｅｎｅ  １８６；２４９−２５４）をコードする配列に、機能的に連結された強力な構成的植物プロモーターであるカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーターをコードする組換え構築物を用いて、トマト植物を遺伝子工学的に操作した実施例により説明される。ＧＤＨを過剰発現する系統は、対象の親植物よりも遊離アミノ酸含量の増加、特にグルタミン酸含量の増加（２〜３倍）が見られる。
【００２０】
本発明に使用し得る核酸構築物は当業者に公知の方法を使用して作成し得る。例えば、構築物の成分を単離、特性決定、その操作および構築物それ自体を作るのに使用しうる組換えＤＮＡ法については、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ−Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓのような出典を参考にし得る。所望の成分の塩基配列が知られているような場合には生物起源からそれを単離するのではなく合成することが有利である。この様な場合当業者はＣａｒｕｔｈｅｒｓら、１９８０，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．７：２１５−２３３及びＣｈｏｗ及びＫｅｍｐｅ，１９８１，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．９：２８０７−２８１７のような文献を参考にすることができる。その他の場合、所望の成分はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅により有利に生産しうる。ＰＣＲ法については、当業者は、Ｇｅｌｆａｎｄ，１９８９，ＰＣＲ技術、ＤＮＡ増幅に関する原理及び応用、Ｈ．Ａ．Ｅｒｌｉｃｈ編集、ストックトンプレス，Ｎ．Ｙ．、分子生物学における現行のプロトコル、２巻、１５章、Ａｕｓｕｂｅｌら編集、ジョンウイリイ＆サンズ，１９８８を参考にし得る。
【００２１】
本発明に使用される遺伝子構築物は、一般に、目的遺伝子の他に植物細胞内で機能する適切なプロモーター、ノパリン合成酵素遺伝子ターミネーターのような適切なターミネーター、その他の発現制御に有用なエレメント、および、形質転換体を選抜するための適切なマーカー遺伝子、例えばカナマイシン耐性、Ｇ４１８耐性、ハイグロマイシン耐性などの薬剤耐性遺伝子を含んでいる。この構築物に含まれるプロモーターは構成的プロモーターであっても器官特異的若しくは生育特異的であってもよく、使用する宿主、遺伝子、必要とする発現量、発現させるべき器官、生育ステージ等に応じて選択することができる。
本発明によれば、窒素同化または利用酵素の過剰発現を示す植物は、所望の酵素をコードする配列に連結された植物プロモーターを含む遺伝子構築物で植物細胞を形質転換することにより作製することができる。本発明の好ましい実施態様において使用される関連プロモーターは強力かつ非器官特異的または非生育ステージ特異的プロモーター（例えば、多くまたは全ての組織中で強く発現するプロモーター）である。この様な強力な構成的プロモーターの例として、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターが挙げられる。
【００２２】
本発明の別の実施態様において、器官特異的または生育ステージ特異的プロモーターを所望の酵素をコードする配列に結合させた遺伝子構築物で植物を操作するのが有利なことがある。例えば、光合成組織及び器官中の発現が所望される場合は、リブロースビスフォスフェートカルボキシラーゼ（ＲｕＢｉｓＣＯ）遺伝子又は葉緑体ａ／ｂ結合蛋白質（ＣＡＢ）遺伝子のプロモーターが使用しうる。種子中の発現が所望される場合は、種々の種子貯蔵蛋白質遺伝子のプロモーターを使用することができ、果実中での発現が所望される場合は、果実特異的プロモーター（例えばトマトの２Ａ１１）を使用することができ、塊茎中での発現が所望される場合は、塊茎貯蔵蛋白質遺伝子のプロモーター（例えばポテトのパタチン）を使用することができる。
【００２３】
本発明の更に別の実施態様において、誘導プロモーターを所望の酵素をコードする配列に結合させた遺伝子構築物で植物を形質転換する事が有利であり得る。この様なプロモーターの例は多岐にわたる。例えば、熱ショック遺伝子、防御応答遺伝子（例：フェニルアラニンアンモニアリアーゼ遺伝子）、傷害応答遺伝子（例：ヒドロキシプロリンに富む細胞壁蛋白質遺伝子）、化学誘導遺伝子（例：ニトレート還元酵素遺伝子、キチナーゼ遺伝子）、暗所誘導遺伝子（例：アスパラギンシンテターゼ遺伝子（ＣｏｒｕｚｚｉおよびＴｓａｉ、ＵＳ５，２５６，５５８）が挙げられるがこれらに限定されない。
【００２４】
本発明の組換え核酸構築物は、その構築物の伝達追跡のための選択可能なマーカーを含んでもよい。例えば、細菌中で伝達される構築物は抗生物質耐性遺伝子、例えばカナマイシン、テトラサイクリン、ストレプトマイシン、またはクロラムフェニコール対する耐性を与える遺伝子を含むことが好ましい。構築物を伝達するのに適したベクターとして、プラスミッド、コスミド、バクテリオファージまたはウイルスが挙げられる。加えて、組換え構築物は、これらの構築物により形質転換された植物細胞の単離、同定または追跡のための植物発現性の選択可能なマーカー遺伝子又はスクリーニング可能なマーカー遺伝子を含んでも良い。選択可能なマーカーとして、抗生物質耐性（例えば、カナマイシンまたはハイグロマイシンに対する耐性）、または除草剤耐性（例えば、スルフォニル尿素、フォスフィノスリシン、またはグリフォセートに対する耐性）を与える遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。スクリーニング可能なマーカーとして、β−グルクロニダーゼをコードする遺伝子（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ，１９８７，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ  ５：３８７−４０５）、ルシフェラーゼをコードする遺伝子（Ｏｗら、１９８６，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３４：８５６−８５９）、アントシアニン色素産生を調節するＢ及びＣ１遺伝子産物（Ｇｏｆｆら、１９９０，ＥＭＢＯ  Ｊ，９：２５１７−２５２２）が挙げられるがこれらに限定はされない。
【００２５】
本発明に使用できる遺伝子導入法は特に限定されず、植物細胞あるいは植物体への遺伝子導入法として当業者に知られるいずれの方法を使用してもよい。例えば、本発明の実施態様の一つにおいて、アグロバクテリウムが遺伝子構築物を植物に導入するのに用いられる。この様な形質転換は２成分アグロバクテリウムＴ−ＤＮＡベクター  （Ｂｅｖａｎ，１９８４，Ｎｕｃ．ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１２：８７１１−８７２１）、および同時培養操作（Ｈｏｒｓｃｈら、１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７：１２２９−１２３１）を使用することが望ましい。一般に、アグロバクテリウム形質転換系が双子葉植物を操作するのに使用される（Ｂｅｖａｎｓら、１９８２，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．，１６  ：３５７−３８４；Ｒｏｇｅｒｓら、１９８６，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１１８：６２７−６４１）。アグロバクテリウム形質転換系はまた単子葉植物および植物細胞を形質転換するのに使用することもできる（Ｈｅｒｎａｌｓｔｅｅｎら、１９８４，  ＥＭＢＯ  Ｊ．，３：３０３９−３０４１；Ｈｏｙｋａｓｓ−Ｖａｎ  Ｓｌｏｇｔｅｒｅｎら、１９８４，Ｎａｔｕｒｅ，３１１：７６３−７６４；Ｇｒｉｍｓｌｅｙら、９８７，Ｎａｔｕｒｅ，３２５  ：１６７−１６７９；Ｂｏｕｌｔｏｎら、１９８９，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１２：３１−４０；  Ｇｏｕｌｄら、１９９１，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，９５：  ４２６−４３４）。植物を形質転換するためにアグロバクテリウム系を利用する場合は、組換えＤＮＡ構築物は植物細胞に導入すべきＤＮＡ配列に隣接する位置に、Ｔ−ＤＮＡ領域の少なくとも右ボーダー配列を更に含む。好ましい実施態様においては、移入される配列は左右のＴ−ＤＮＡボーダー配列の間に挿入される。この様なＴ−ＤＮＡをベースとする形質転換ベクターの適切な設計及び構築は当業者に公知である。
【００２６】
別の実施態様において、組換え核酸構築物を植物および植物細胞に導入する為の種々の別法を使用することができる。別の遺伝子導入法および形質転換方法として、裸のＤＮＡの、カルシウム、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはエレクトロポレーション介在性取り込みによるプロトプラスト形質転換（Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉら、１９８４，ＥＭＢＯ  Ｊ．，３：２７１７−２７２２；Ｐｏｔｒｙｋｕｓら、１９８５，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１９９：１６９−１７７；Ｆｒｏｍｍら、１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：５８２４−５８２８  ；Ｓｈｉｍａｍｏｔｏら、１９８９，Ｎａｔｕｒｅ，３３８：２７４−２７６）が挙げられる。本発明によれば、多種の植物及び植物細胞系が本発明の核酸構築物および上記の形質転換方法を使用して本明細書に記載された所望の生理学的特性につき操作しうる。これらの方法は、標的が単子葉植物または植物細胞である場合に特に有益である。好ましい実施態様において、操作のための標的植物および植物細胞として、トマト、ポテト、ビート、ダイズ、アラビドプシス、トウモロコシ、小麦、イネ、サトウキビ等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２７】
本発明によれば、本明細書に開示されたような遺伝子構築物を、プロトプラスト、組織培養細胞、組織及び器官外殖体、花粉、胚ならびに植物全体を含むがこれらに限定されない種々の植物細胞型に導入および操作することにより所望の植物が得られる。本発明の実施態様において、操作された植物体は下記のアプローチおよび方法に従って形質転換体につき選択又はスクリーニングされる。次に単離された形質転換体を植物個体に再生させてもよい。植物細胞、組織または器官から植物個体に再生するための方法は、多くの植物種において当業者に公知である。
【００２８】
形質転換された植物細胞、カルス、組織または植物は、形質転換に用いた遺伝子構築物に存在するマーカー遺伝子によりコードされた形質につき選択又はスクリーニングする事により同定され、単離することができる。例えば、形質転換遺伝子構築物が耐性を与えるような抑制量の抗生物質または除草剤を含む培地で操作された植物体を生育させることにより、選択を行うことができる。更に形質転換された植物細胞および植物は、本発明の組換え核酸構築物に存在しうる可視のマーカー遺伝子（例えば、β−グルクロニダーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、Ｂ遺伝子またはＣ１遺伝子）の活性につきスクリーニングする事により同定しうる。この様な選択方法およびスクリーニング方法は当業者に公知である。
【００２９】
また、本発明の遺伝子構築物を含む植物または植物細胞形質転換体を同定するために物理的方法および生化学的方法が使用しうる。そのような方法として、
１）組換えＤＮＡインサートの構造を検出および測定するためのサザン分析またはＰＣＲ増幅；
２）遺伝子構築物のＲＮＡ転写産物を検出および測定するためのノーザンブロット、Ｓ１ＲＮａｓｅ保護、プライマー伸長ＰＣＲ増幅または逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）増幅；
３）遺伝子構築産物が蛋白質である場合は、蛋白質ゲル電気泳動、ウエスタンブロット、免疫沈殿、またはエンザイムイムノアッセイが挙げられるが、これらに限定されない。これらのアッセイ方法は全て当業者に公知である。
【００３０】
本発明によれば、改良された成分特性を有する植物を得るため、形質転換された植物を所望の生理学的変化に関してスクリーニングしてよい。例えば、ＧＤＨ酵素の過剰発現に関して操作した場合、形質転換された植物は、所望のレベルで所望の組織および生育段階でＧＤＨ酵素を発現する植物について試験されるであろう。次に、所望の生理学的変化、例えば、ＧＤＨ遺伝子の過剰発現を示す植物を、所望の成分変化について引き続きスクリーニングすることができる。
本発明によれば、窒素同化プロセスまたは利用プロセスの変化で操作された植物は、改良された成分特性、すなわち、遊離アミノ酸高含有、特にグルタミン酸、アスパラギン、アスパラギン酸、セリン、スレオニン、アラニン、ヒスチジン、とりわけうま味成分であるグルタミン酸高含有を示しうる。この様な改良された特性を有する操作された植物および植物系統は、植物の遊離アミノ酸含量を測定する事により同定しうる。この分析のための操作および方法は当業者に公知である。
本発明によって得られる植物は、遊離アミノ酸含量において対照植物（非形質転換植物）に対して増加した植物である。好ましい実施態様において、所望の植物は、その果実、根、種子等の可食部分での遊離アミノ酸含量、とりわけうま味成分であるグルタミン酸含量が２倍以上の増加を示し、全アミノ酸量も２〜４倍に増加する。グルタミン酸以外のアミノ酸については、特に、アスパラギン酸、アスパラギン、アラニン、セリン、スレオニンおよびヒスチジンの増加が著しい。
【００３１】
【実施例】
本発明は、ＮＡＤＰ−ＧＤＨ遺伝子またはＮＡＤ−ＧＤＨ遺伝子の過剰発現につき操作された植物の作製に関する以下の実施例により具体的かつ詳細に説明される。
実施例１：Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓおよびトマトのＧＤＨ遺伝子の単離とＴｉプラスミッドの構築
（１）Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ由来ＮＡＤＰ依存型ＧＤＨ遺伝子（ＡＮ−ｇｄｈ−１７）およびトマト由来ＮＡＤ依存型ＧＤＨ遺伝子（Ｔ−ｇｄｈ−４）の単離
Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓをポテトデキストロース寒天培地にまき、一晩３０℃で培養し、さらに得られたコロニーをデキストロース液体培地で２日間培養した。増殖した菌よりＴｏｔａｌ  ＲＮＡを調製した。
７０％エタノール（３０秒）、２％次亜塩素酸ナトリウム（１５分）を用いて表面殺菌したトマト種子を植物ホルモンを含まないＭＳ寒天培地（ＭｕｒａｓｈｉｇｅおよびＳｋｏｏｇ、１９６２，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ．１５：４７３−４７９）に植え、１６時間日長、２５℃で１週間培養し、無菌植物を得た。得られた幼植物の根よりＴｏｔａｌ  ＲＮＡを調製した。
【００３２】
Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡはＰｏｌｙ（Ａ）Ｑｕｉｃｋ  ｍＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を用いてｍＲＮＡを精製した後、Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｈｅｃｈ社）を用いてＦｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡを作成した。作成したＦｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡをテンプレートに用いてＰＣＲ反応を行ったＰＣＲ反応条件は９４℃−３分；９４℃−４５秒、５９℃−３０秒、７２℃−９０秒、３５サイクル；７２℃−１０分とし、パーキンエルマー社のＰＣＲｓｙｓｔｅｍ  ２４００を用いて行った。用いたプライマーを表−１に示した。その結果、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ由来の約１．４ｋｂｐのバンド、およびトマト由来の約１．２ｋｂのバンドが増幅され、それぞれ予測される目的遺伝子サイズと一致した。得られたＰＣＲ産物はＴＡ−Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてクローニングした。
【００３３】
Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ由来の目的サイズの遺伝子がクローニングできたプラスミッド２クローンおよびトマトの根由来の目的サイズの遺伝子がクローニングできたプラスミッド５クローンの配列をシークエンサー（ＡＢＩ社３７７Ａ）を用いて決定し、既知のＡ．ｎｉｄｕｌａｎｓ由来ＮＡＤＰ依存型ＧＤＨ遺伝子（Ａｌａｓｔａｉｒら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ，１９８９，２１８；１０５−１１１）およびトマト由来ＧＤＨ遺伝子（Ｐｕｒｎｅｌｌら、１９９７，Ｇｅｎｅ１８６；２４９−２５４）との相同性について調査した。
Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ由来の２クローン中１クローン（ＡＮ−ｇｄｈ−１７）の塩基配列が既知のＮＡＤＰ−ＧＤＨ遺伝子配列と一致した（図１，２）．しかし、その遺伝子には２箇所存在するスプライシングサイトのうち、約５０ｂｐのスプライシングサイトが１つ残存していることが分かった。Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓは真核生物型のスプライシングサイト認識部位を持つため、本実験では残存するスプライシングサイトを残したまま次の操作に入ることにした。一方、トマトの根由来の５クローン中、２クローン（Ｔ−ｇｄｈ−４，Ｔ−ｇｄｈ−２２）の塩基配列が既知のｌｅｇｄｈ１配列と一致した。ＡＮ−ｇｄｈ−１７の塩基配列を配列表の配列番号１に、Ｔ−ｇｄｈ−４の塩基配列を配列表の配列番号２に示した。
【００３４】
【表１】
0003755146.tif 000002
ａ．ＮＡＤＰ−ＧＤＨ遺伝子特異的プライマー（Ａｌａｓｔａｉｒら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ，１９８９，２１８；１０５−１１１，ＰＣＲ産物、約１．４ｋｂｐ）
ｂ．ｌｅｇｄｈ１特異的プライマー（Ｐｕｒｎｅｌｌら、１９９７，Ｇｅｎｅ  １８６；２４９−２５４，ＰＣＲ産物、約１．２ｋｂｐ）
＜配列表フリーテキスト＞
配列番号３および４：ＮＡＤＰ−ＧＤＨ特異的ＰＣＲプライマー
配列番号５および６：ｌｅｇｄｈ１特異的ＰＣＲプライマー
【００３５】
（２）ＡＮ−ｇｄｈ−１７遺伝子のＴｉプラスミッド（ｐＭＡＴ０３７）へのサブクローニング
ＰＣＲ２．１ベクターにクローニングしたＡＮ−ｇｄｈ−１７遺伝子を、植物形質転換用ベクターである、Ｔｉプラスミッド（ｐＭＡＴ０３７）（Ｍａｔｓｕｏｋａおよび  Ｎａｋａｍｕｒａ，１９９１，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８８：８３４−８３８）にサブクローニングした。直接挿入するするのに適切な制限酵素サイトがｐＭＡＴ０３７に無いため、一度ｐＵＣ１８につなぎ（ＸｂａＩ，ＥｃｏＲＩサイト使用）、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９を形質転換した。さらにｐＵＣ１８中のＰｓｔＩサイトとＥｃｏＲＩサイトを用いてＴｉプラスミッドへ連結しプラスミッドｐＡＮ−ｇｄｈ−１７を得（図３、表２）Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αにトランスフォーメーションした。ＡＮ−ｇｄｈ−１７を導入したＴｉプラスミッドｐＡＮ−ｇｄｈ−１７（図３）でグロバクテリウム株ＥＨＡ１０１を形質転換し、得られたアグロバクテリウムをトマトに感染させるために用いた。
【００３６】
（３）ｐＣｔ−ＡＮ−ｇｄｈ、ｐＣｔ−ｄＡＮ−ｇｄｈ、ｐＭｔ−ｄＡＮ−ｇｄｈの構築
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｒａｎｓ由来ＮＡＤＰ−ＧＤＨ遺伝子には本来、スプライシングサイトが２箇所存在する。ｃＤＮＡを用いてＰＣＲ法によりＧＤＨ遺伝子の増幅を行ったので、これらのスプライシングサイトは除かれ、存在しないはずであるが、本実験で取得したＡＮ−ｇｄｈ−１７遺伝子には、約５０ｂｐのスプライシングサイトが１箇所残ったままであった（図１、塩基配列中に記載）。そこでＰＣＲ法を用いて、残ったままであった約５０ｂｐの塩基配列を取り除いた（表２、図４、５）
【００３７】
これらの遺伝子構築物の構築手順の概略は図５に示した通りである。すなわち、最初に、クローニングされた上記遺伝子配列の５’端を含むプライマーＰ１およびスプライシング領域の５’側と３’側を含むがスプライシング領域を含まないプライマーＰ２、およびスプライシング領域の５’側と３’側を含むがスプライシング領域を含まないプライマーＰ３とＡＮ−ｇｄｈ−１７遺伝子の３’端を含むプライマーＰ４を用いて、それぞれＡＮ−ｇｄｈ−１７遺伝子を鋳型としてＰＣＲによってＤＮＡ断片を増幅した。次に、電気泳動によりＰＣＲ産物のサイズの確認およびゲルからの再抽出を行った。それぞれの再抽出ＰＣＲ産物を混合し、プライマーＰ１およびＰ４を用いて再度ＰＣＲ反応を行った。得られたＰＣＲ産物をクローニングし、シークエンシングを行い、スプライシング領域が正しく除去されていることを確認した。
【００３８】
上述のＰ１〜Ｐ４の配列を以下に示す。
0003755146.tif 000003
これらの操作により、スプライシングサイトを除去したｄＡＮ−ｇｄｈ−１７遺伝子を得た（表２、図４、５）。
更に導入遺伝子を適所でより機能的に働かせるために、ミトコンドリアまたはクロロプラストへのトランジットペプチド配列をＡＮ−ｇｄｈ−１７遺伝子又はｄＡＮ−ｇｄｈ−１７遺伝子の開始コドンの上流側に連結させた（表２、図４）。用いたペプチド配列はミトコンドリアへのトランジットペプチド配列としてトマト由来ＧＤＨ遺伝子に付加している約７０ｂｐからなる塩基配列を、クロロプラストへのトランジットペプチド配列として、トマト由来ＲｕＢｉｓＣＯの小サブユニット遺伝子に付加している約１２０ｂｐからなる塩基配列を用いた。また、これらの遺伝子とＡＮ−ｇｄｈ−１７遺伝子又はｄＡＮ−ｇｄｈ−１７遺伝子の連結はＰＣＲ法を用いて行った。ミトコンドリアへのトランジットペプチド配列は、２種のプライマー（５’−ＧＧＡＴＣＣＡＴＧＡＡＴＧＣＴＴＴＡＧＣＡＧＣＡＡＣ−３’：配列番号１１、５’−ＴＣＴＡＧＡＴＡＡＡＣＣＡＡＧＡＡＧＣＣＴＡＧＣＴＧ−３’：配列番号１２）を使用しＰＣＲによって得た。クロロプラストへのトランジットペプチド配列は、２種のプライマー（５’−ＣＴＧＣＡＧＡＴＧＧＣＴＴＣＣＴＣＡＡＴＴＧＴＣＴＣＡＴＣＧ−３’：配列番号１３、５’−ＴＣＴＡＧＡＧＣＡＴＣＴＡＡＣＧＣＧＴＣＣＡＣＣＡＴＴＧＣＴ−３’：配列番号１４）を使用しＰＣＲによって得た。
【００３９】
これらのトランジットペプチド配列のＡＮ−ｇｄｈ−１７遺伝子又はｄＡＮ−ｇｄｈ−１７遺伝子への結合は図６に示したように行った。すなわち、トランジットペプチドの５’側に対応するプライマーＰ５とトランジットペプチドの３’端およびＡＮ−ｇｄｈ−１７遺伝子又はｄＡＮ−ｇｄｈ−１７遺伝子の５’端の配列を含むプライマーＰ６、およびトランジットペプチドの３’端およびＡＮ−ｇｄｈ−１７遺伝子またはｄＡＮ−ｇｄｈ−１７遺伝子の５’端の配列を含むプライマーＰ７およびＡＮ−ｇｄｈ−１７遺伝子またはｄＡＮ−ｇｄｈ−１７遺伝子の３’端配列を含むプライマーＰ８を用いてそれぞれのＤＮＡ断片を増幅後、電気泳動によりＰＣＲ産物のサイズの確認およびゲルからの抽出を行った。抽出したそれぞれの断片を混合し、プライマーＰ５とＰ８を用いて再度ＰＣＲを行った。増幅された断片をクローニングしシーケンシングを行い、トランジットペプチドの塩基配列がＡＮ−ｇｄｈ−１７遺伝子またはｄＡＮ−ｇｄｈ−１７遺伝子に正しく付加されていることを確認した（図６）。
【００４０】
ここで、Ｐ５からＰ８の配列は以下に対応する。
ミトコンドリアへのトランジットペプチド配列との連結の際に用いたプライマーの場合は
0003755146.tif 000004
であり、
クロロプラストへのトランジットペプチド配列との連結の際用いたプライマーの場合は
0003755146.tif 000005
である。
【００４１】
ここで、ＡＮ−ｇｄｈ−１７遺伝子はＴｉプラスミッドｐＭＡＴ０３７のマルチクローニングサイトにセンス方向に導入したが（図２）、ｐＣｔ−ＡＮ−ｇｄｈ、ｐＣｔ−ｄＡＮ−ｇｄｈ、ｐＭｔ−ｄＡＮ−ｇｄｈの構築に際してはＣａＭＶ３５Ｓプロモーターを用いた場合と後述する果実特異的プロモーター遺伝子（２Ａ１１）を用いた場合との導入遺伝子の効果を比較するためＴｉプラスミッドｐＩＧ１２１−Ｈｍを用いてクローニングを行い、遺伝子導入を行った（表２、図４）。
＜配列表フリーテキスト＞
配列番号７〜１０：スプライシング領域除去のためのＰＣＲプライマー
配列番号１１および１２：ミトコンドリアへのトランジットペプチドをコードする配列増幅用のＰＣＲプライマー
配列番号１３および１４：クロロプラストへのトランジットペプチドをコードする配列増幅用のＰＣＲプライマー
配列番号１５〜１８：ミトコンドリアトランジットペプチド−ＧＤＨをコードする配列の作製のためのＰＣＲプライマー
配列番号１９〜２２：クロロプラストトランジットペプチド−ＧＤＨをコードする配列の作製のためのＰＣＲプライマー
【００４２】
（４）果実特異的プロモーター（２Ａ１１プロモーター）を用いた遺伝子構築
果実特異的発現プロモーター（２Ａ１１）はトマトの幼植物より調製したＴｏｔａｌ  ＤＮＡをテンプレートに用いて、ＰＣＲ法により取得した。用いたプライマー（配列番号２３および配列番号２４）にはＴｉプラスミッドに導入する際に用いる制限酵素サイト、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩの配列を各々のプライマーに設計した。
プライマーの配列を以下に示す：
0003755146.tif 000006
得られたＰＣＲ産物はＴＡクローニングキットを用いてクローニングした後、シークエンス分析によって塩基配列の確認を行った。得られた２Ａ１１プロモーターは上記、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩを用いてＴｉプラスミッドｐＩＧ１２１−ＨｍのＧＵＳ遺伝子前のＣａＭＶ３５Ｓプロモーターと置換した。その後、ＧＵＳ部分とＣｔ−ｄＡＮ−ｇｄｈ遺伝子またはＭｔ−ｄＡＮ−ｇｄｈ遺伝子との置換を行った。Ｃｔ−ｄＡＮ−ｇｄｈ遺伝子またはＭｔ−ｄＡＮ−ｇｄｈ遺伝子の置換手順についてはＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーターを用いた場合と同様である。これにより、プラスミッドｐ２ＡＣｔ−ｄＡＮ−ｇｄｈおよびＰ２ＡＭｔ−ｄＡＮ−ｇｄｈを得た（図７）。
＜配列表フリーテキスト＞
配列番号２３および２４：２Ａ１１プロモーター配列増幅用ＰＣＲプライマー
上述した手順により作製したプラスミッドの重要な構造を以下の表２にまとめた。
【００４３】
【表２】
0003755146.tif 000007
【００４４】
（５）Ｔ−ｇｄｈ−４遺伝子のＴｉプラスミッド（ｐＩＧ１２１−Ｈｍ）へのサブクローニング
クローニングしたトマト由来ＧＤＨ遺伝子（Ｔ−ｇｄｈ−４）をＴｉプラスミッド（ｐＩＧ１２１−Ｈｍ）に導入しプラスミッドｐＴ−ｇｄｈ−４を得た。導入に際しては、単離の際に使用したプライマーに予め設けておいたＸｂａＩサイトおよびＳａｃＩサイトを用いた。Ｔ−ｇｄｈ−４遺伝子を導入したＴｉプラスミッド（図８）は、アグロバクテリウム株ＥＨＡ１０１に形質転換した。
【００４５】
（６）変異型トマトＧＤＨ遺伝子のＴｉプラスミッド（ｐＩＧ１２１−Ｈｍ）へのサブクローニング
トマト由来ＮＡＤ−ＧＤＨにおいて、グルタミン酸結合部位の９０番目のアミノ酸リジンをアラニンに置換し、その効果について調査した（図９）。これは、高等植物のＧＤＨ遺伝子がアンモニアイオン濃度や栄養条件によって、グルタミン酸を減少させる方向に働く可能性が有るため、結合できなくすることを目的とした改変である。１アミノ酸の置換はＰＣＲを利用した部位特異的変異導入により、ＬｙｓをコードするＡＡＧをＡｌａをコードするＧＣＧに変換することによって行った。得られた改変遺伝子をＴｄ−ｇｄｈと命名した。次に、Ｔｄ−ｇｄｈ遺伝子配列をＴｉプラスミッドへ導入してプラスミッドｐＴｄ−ｇｄｈを得た（図９）。この手順はＴ−ｄｇｈ−４遺伝子の場合と同様である。
【００４６】
実施例２．トマトの子葉片へのアグロバクテリウム感染による形質転換体の作製
トマト（栽培品種、ミニトマト）の種子を７０％エタノール（３０秒）、２％次亜塩素酸ナトリウム（１５分）を用いて表面殺菌した後、植物ホルモンを含まないＭＳ寒天培地に置床し、１６時間日長、２５℃で１週間培養した。得られた無菌幼植物より子葉を切り取り、２ｍｇ／ｌゼアチンと０．１ｍｇ／ｌインドール酢酸を加えたＭＳ寒天培地（再分化培地、９ｃｍシャーレ使用）に置床し２日間同条件で培養した。構築した遺伝子を含むアグロバクテリウム（ＥＨＡ１０１）はＹＥＰ培地（表−３）で一晩培養したものを感染に用いた。２日間培養した子葉を滅菌シャーレに集めアグロバクテリウム液を加え感染させた。滅菌したろ紙を用いて余分なアグロバクテリウム液を子葉から取り除き、さらに、アグロバクテリウムの急激な増殖を防ぐため、先に用いたシャーレ培地に滅菌ろ紙を敷き、その上に感染させた子葉を乗せ、２４時間共存培養した。
【００４７】
その後、子葉を５０ｍｇ／ｌカナマイシン、５００ｍｇ／ｌクラフォランを含むＭＳ再分化培地（選抜培地）に移し、形質転換体の選抜を行った。再分化したシュートを新しい選抜培地に移し再選抜を行った。緑色で旺盛に生育したシュートを茎の部分で切り取り、植物ホルモンを含まないＭＳ培地（発根培地，試験管）に移した。発根した再分化植物を順次土壌に馴化させた。
【表３】
0003755146.tif 000008
【００４８】
実施例３．減圧浸潤法によるアラビドプシスの形質転換
アラビドプシスへの遺伝子導入はＢｅｃｈｔｏｌｄ  Ｎ（Ｃ．Ｒ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｐａｒｉｓ，Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１６；１１９４−１１９９，１９９３）の方法を改編して用いた。培養土にアラビドプシスの種子をまき１０日間、１６時間日長、２２℃栽培した幼植物をロックウール（３ｃｍ×３ｃｍ）１個に１株ずつ移植し、３週間同条件で栽培した。植物が抽だいを始めたら摘心し、さらに一週間栽培を行った。アグロバクテリウムは抗生物質を含むＹＥＰ培地で２４時間、２８℃で培養し、遠心（７０００ｒｐｍ、１０分）によって集菌し、浸潤用懸濁培地（１／２  ＭＳ塩、１／２  Ｇａｍｂｏｒｇ  Ｂ５ビタミン、５％ショ糖、０．５ｇ／ｌ  ＭＥＳ、０．０４４μＭ  ベンジルアミノプリン、ｐＨ  ５．７）に懸濁した。すでに開花・結実している花を取り除き、アグロバクテリウム懸濁液に漬け、デシケーター中に入れ、１５分間減圧（４０ｍｍＨｇ）処理を行った。処理した植物は１カ月間栽培した後種子を収穫した。採取した種子は５０ｍｇ／ｌカナマイシン、２００ｍｇ／ｌクラフォランを添加したＭＳ培地にまき、形質転換体の選抜を行った。
【００４９】
実施例４．導入遺伝子の確認
ＡＮ−ｇｄｈ−１７遺伝子を含むアグロバクテリウムを感染させて得られた選抜個体４個体、Ｔ−ｇｄｈ−４遺伝子を含むアグロバクテリウムを感染させて得られた選抜個体４個体、目的遺伝子を含まないＴｉプラスミッドのみのアグロバクテリウムを感染させて得られた植物各々３個体、およびアグロバクテリウムで処理せずに子葉より直接再分化させた植物体２個体からそれぞれＴｏｔａｌ  ＤＮＡを本田らの方法に従い抽出した（ＨｏｎｄａおよびＨｉｒａｉ、１９９０、Ｊｐｎ  Ｊ  Ｂｒｅｅｄ  ４０，３３９−３４８）。抽出したＤＮＡはＲＮＡａｓｅ処理、フェノール／クロロホルム処理、さらにＰＥＧ沈殿させ精製した。０．０１μｇ／μｌになるように希釈し、ＰＣＲ用のテンプレートとした。ＰＣＲはＮｏｓ−ＰｒｏｍｏｔｅｒからＮＰＴＩＩの領域を増幅するプライマーＰ９およびＰ１０（ＰＣＲ産物、１．０ｋｂｐ）を用いて行なった。反応条件は、９４℃−１分、５５℃−１分、７２℃−２分、３５サイクルで行った。ＰＣＲ産物は１％アガロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色した（図１０および１１）。
使用したプライマーは以下の通りである。
0003755146.tif 000009
【００５０】
その結果、ＡＮ−ｇｄｈ−１７遺伝子を感染させた４系統に、Ｔ−ｇｄｈ−４遺伝子を感染させた４系統に目的サイズのバンド（１．０ｋｂ）が観察され、非形質転換体２系統には検出されなかった。以上の結果から、ＡＮ−ｇｄｈ−１７遺伝子を含むＴｉプラスミッドを用いて感染させた４系統およびＴ−ｇｄｈ−４遺伝子を含むＴｉプラスミッドを用いて感染させた４系統に各々の遺伝子が導入されていることが確認された。
＜配列表フリーテキスト＞
配列番号２５、２６：Ｎｏｓ−Ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ＮＰＴＩＩ領域増幅用ＰＣＲプライマー
【００５１】
実施例５．  導入遺伝子の発現の確認
次に、目的の遺伝子が導入されたことが確認できた形質転換トマトにつき、導入遺伝子が発現されていることをＲＴ−ＰＣＲによって確認した。ＡＮ−ｇｄｈ−１７またはＴ−ｇｄｈ−４遺伝子を含むアグロバクテリウムを感染させ、実施例５において遺伝子導入が確認された系統、および非形質転換トマトの葉または果実から全ＲＮＡを抽出し、Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡを作製した。次にＦｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡをテンプレートとして各々の遺伝子を単離する際に用いたプライマー（配列番号３と４、及び５と６）を用いてＰＣＲを行なった。反応条件は９４℃−１分、５５℃−１分、７２℃−２分、３０サイクルとした。その結果、それぞれにおいて、導入した遺伝子が葉および果実のいずれにおいても発現していることが確認された（図１２、１３）。
【００５２】
実施例６．  遊離アミノ酸の抽出と定量
馴化させた形質転換トマトの開花後６週目の果実を収穫し、−８０℃に保存した。果実は約１／６にカットし、重さを測定した後、乳鉢に入れ液体窒素で凍らせすりつぶした。さらに３ｍｌの８０％エタノールを加え、丁寧にすりつぶした後、遠心チューブに移し、８０℃で２０分間インキュベートした。１０，０００ｒｐｍで２０分間遠心し、上澄を新しいチューブに移し、残ったペレットに２ｍｌの８０％エタノールを加え、再度乳鉢ですりつぶし、８０℃で２０分間インキュベートした。遠心後、上澄をチューブに移し、先の上澄と併せ、８０％エタノールを用いて総量を５ｍｌに調製した。良く混合した後、２０μｌ取り乾燥させた後、０．０２Ｎ塩酸に溶解した。０．４５μｍのフィルターでろ過し、分析用サンプルとした。アミノ酸分析は日立高速アミノ酸分析計（Ｌ−８８００）を用いて行った。
ＡＮ−ｇｄｈ−１７遺伝子を導入した株の開花後６週間目の果実（赤色）を用いてアミノ酸分析を行った結果を非形質転換体植物（対照植物）の分析結果とともに表４に示した。顕著なグルタミン酸含量の増加が見られた系統においては、Ｎｏ．６で１．７５倍、Ｎｏ．１５で２．５４倍、Ｎｏ．１７で２．４８倍グルタミン酸含量が増加した（図１４）。グルタミン酸以外のアミノ酸、例えば、アスパラギン、アスパラギン酸、アラニン、セリン、スレオニン、ヒスチジン等の増加も見られた。
【００５３】
【表４】
0003755146.tif 000010
【００５４】
【表５】
0003755146.tif 000011
【００５５】
トマト由来のＴ−ｇｄｈ−４遺伝子を導入した４株についても同じく開花後６週間目の果実を用いてアミノ酸分析を行った（表５）。顕著なグルタミン酸含量の増加が見られた系統においては、Ｎｏ．２で２．２８倍、Ｎｏ．７−２で３．５２倍、Ｎｏ．９−２で２．７４倍、Ｎｏ．１０で２．５３倍グルタミン酸含量が増加した（図１５）。グルタミン酸含量が高かった系統においては、他のアミノ酸、例えば、アスパラギン酸、アスパラギン、スレオニン、セリン、アラニン、ヒスチジンの含量も高く、Ｔｏｔａｌアミノ酸含量において、Ｎｏ．７−２は４倍も増加していることが分かった。これらの結果を以下の表５にまとめた。
【００５６】
【表６】
0003755146.tif 000012
【００５７】
【表７】
0003755146.tif 000013
【００５８】
実施例７．トマト形質転換体後代（Ｔ１）世代の解析
１）Ｔ１世代の選抜
アグロバクテリウム法により遺伝子導入を行ったトマト形質転換植物（Ｔ０世代）より得られた種子を、８０％エタノールで３０秒，２％次亜塩素酸ナトリウムで１５分間表面殺菌した後、カナマイシン３５０ｍｇ／ｌを含むＭＳ寒天培地に無菌播種した。１ヵ月後、生育の良い植物を選抜した結果、ＡＮ−ｇｄｈ−１７遺伝子導入系統では、Ｎｏ．１、Ｎｏ．３、Ｎｏ．１５、Ｎｏ．２．１から選抜個体が得られた。Ｔ−ｇｄｈ−４遺伝子導入系統では、Ｎｏ．１、Ｎｏ．３、Ｎｏ．８から選抜個体が得られた。株当たりの果実数を増加させるため、屋外の閉鎖系温室で栽培を行った。栄養条件を同じにするため、馴化時に１ｋｇの培養土（パワーソイル，サカタのタネ）に移植した後は、追肥を行わなかった。また、同化能を同一にするために以下の分析では葉を摘み取らず、腋芽を同一条件で栽培し，その葉組織を用いた。
【００５９】
２）サザン分析による導入遺伝子の確認
馴化させた植物の腋芽の葉組織より全ＤＮＡを抽出した（Ｈｏｎｄａ  ａｎｄＨｉｒａｉ  １９９０，Ｊｐｎ  Ｊ  Ｂｒｅｅｄ  ４０，３３９−３４８）。１５μｇのＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩの組み合わせとＸｂａＩで処理し、電気泳動後、ナイロンメンブランにトランスファーした。ＤＩＧ−Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を用いて、ＡＮ−ｇｄｈ−１７遺伝子またはＴ−ｇｄｈ−４遺伝子をプローブにし、サザンハイブリダイゼーションを行った。
ＡＮ−ｇｄｈ−１７遺伝子をプローブに用いてサザンハイブリダイゼーションを行った結果、ＡＮ−ｇｄｈ−１７遺伝子導入系統Ｎｏ．１、３、１５、２．１系統に目的サイズのバンド（１．８ｋｂ、０．８ｋｂ）が検出され、導入遺伝子が確認できた（図１６）。同様にＴ−ｇｄｈ−４遺伝子をプローブに用いてサザンハイブリダイゼーションを行った結果、Ｔ−ｇｄｈ−４遺伝子と同じサイズのバンド（１．２ｋｂｐ）が確認された。２０ｋｂｐ付近にバンドが見られるものもあり内在性のｇｄｈ遺伝子と考えられた（図１７）。
【００６０】
３）ＮＡＤＰ−ＧＤＨとＮＡＤ−ＧＤＨ活性の測定
形質転換トマト（Ｔ１）の腋芽の葉組織（０．２ｇ）を液体窒素で凍結させ、乳鉢で破砕した後、重量の５倍量の抽出緩衝液｛２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０），１４ｍＭ  β−メルカプトエタノール，１０ｍＭ  Ｌ−システイン−ＨＣｌ，０．５ｍＭ  ＰＭＳＦ，０．５％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００｝を加えた。遠心チューブに移し、４℃、１２，０００ｒｐｍで１０分間遠心した後、上清を限外ろ過（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ウルトラフリー０．５フィルターユニット、バオイマックス−１０）し、抽出緩衝液で３回洗浄した。
抽出した酵素は反応液｛１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０），２０ｍＭ  ２−α−ケトグルタル酸，１．０ｍＭ  ＣａＣｌ２，０．２ｍＭ  ＮＡＤＰＨ（ＮＡＤＰ−ＧＤＨ活性測定）又は０．２ｍＭ  ＮＡＤＨ（ＮＡＤ−ＧＤＨ活性測定），２００ｍＭ塩化アンモニウム｝に混合し、室温で反応させ、３４０ｎｍにおける吸光度の減少を測定した。
【００６１】
ＡＮ−ｇｄｈ−１７遺伝子を導入した形質転換トマト（Ｔ１）の葉組織を用いて、ＮＡＤＰ−ＧＤＨ活性を測定した結果、非形質転換体では活性が認められないのに対し、形質転換体は２３０−４００ｎｍｏｌ／（分・ｍｇタンパク質）の活性が測定できた（表６）。Ｔ−ｇｄｈ−４遺伝子を導入した系統ではＮＡＤ−ＧＤＨ活性が非形質転換体に比べて約２倍以上増加していた（表７）。
【００６２】
【表８】
0003755146.tif 000014
【００６３】
【表９】
0003755146.tif 000015
【００６４】
４）果実中のアミノ酸含量の測定
第一果房の開花後６週目の果実３個を分析に用いた。  果実に８０℃に熱した８０％エタノールを重量の３倍量加え、乳鉢ですりつぶした後、再度８０℃で２０分間加熱した。７、０００ｒｐｍで遠心して、上清を回収した後、再度８０％エタノールを加え、８０℃に加温した。エタノールによる抽出を３回行い、総量を８０％エタノールで１００ｍｌに合わせた。良く混合した後、抽出液２００μｌをエッペンドルフチューブに取り、乾燥させ、２００μｌの滅菌水に溶かした。エチルエーテル２００μｌ加え混合後、１２，０００ｒｐｍで遠心し、エーテル層を取り除いた。水層を再度乾燥させた後、２００μｌの０．０２Ｎ  ＨＣｌに溶解し、０．４５μｍのろ過フィルターを用いてろ過したろ液をサンプルとし、日立高速アミノ酸計測器（Ｌ−８８００）を用いて分析を行った。
【００６５】
結果は３個の果実の平均値を示した。ＡＮ−ｇｄｈ−１７遺伝子導入系統においては、非形質転換体に比べて、ＡＮ−ｇｄｈ−１７  Ｎｏ．１系統由来のＡＮ１−１−２、ＡＮ１−１−３のグルタミン酸含量がそれぞれ、２．１倍、２．８倍増加し、ＡＮ−ｇｄｈ−１７  Ｎｏ．３系統由来のＡＮ３−１−２、ＡＮ３−１−３が２．８倍，２．５倍それぞれ増加していた。ＡＮ−ｇｄｈ−１７  Ｎｏ．１５系統由来のＡＮ−ｇｄｈ−１７  Ｎｏ．２．１系統由来のＡＮ２．１−１−１も２．１倍、１．９倍増加していた（表８、図１８）。形質転換当代（Ｔ０）で高いグルタミン酸含量を示したＮｏ．１５系統の後代においても同様な傾向が示された。Ｍｔ−ｄＡＮ−ｇｄｈ遺伝子を導入した系統、ＭｔｄＡＮ−２４−４においては非形質転換体のグルタミン酸含量と有意差は認められなかった。
【００６６】
【表１０】
0003755146.tif 000016
【００６７】
【表１１】
0003755146.tif 000017
【００６８】
【表１２】
0003755146.tif 000018
【００６９】
Ｔ−ｇｄｈ−４遺伝子導入系統では、調査したＴ−ｇｄｈ−４  Ｎｏ．１，３，８系統の後代ＴＧＤＨ１−２、３−１、８−１で、非形質転換体のグルタミン酸含量に比べて、２．３倍，２．１倍、２．４倍増加していた。（表９、図１９）。また、グルタミン酸以外のアミノ酸ではアスパラギン酸、グルタミン、γ−アミノ酪酸含量の顕著な増加が見られ、結果として全遊離アミノ酸含量も非形質転換体と比較して２−３倍増加した。
【００７０】
【表１３】
0003755146.tif 000019
【００７１】
【表１４】
0003755146.tif 000020
【００７２】
【表１５】
0003755146.tif 000021
【００７３】
実施例８．ポテト形質転換体の作出と解析
１）形質転換体の作出（実施例４参照）
茎頂培養によってポテト（バレイショ）の無菌植物を得、茎頂を継代することによって材料を増やした。ＭＳ培地に２％ショ糖を加えた液体培地（１０ｍｌ）に茎頂を入れ、発根を誘導した。発根後、１６％ショ糖を含むＭＳ液体培地を１０ｍｌ加え、暗所培養を行い、マイクロチューバーを誘導した。６−８週後のマイクロチューバーをディスク状に切り、皮をむいた後、２８℃で一晩培養したアグロバクテリウム液（Ｔｉ−プラスミッド、ｐＭｔ−ｄＡＮ−ｇｄｈ又はｐＣｔ−ＡＮ−ｇｄｈを含む）を感染させた。滅菌ろ紙を敷いたＭＳ寒天培地（ＭＳ培地、２．０ｍｇ／ｌゼアチン，０．１ｍｇ／ｌインドール酢酸，０．３％ゲルライト）上に乗せ、２５℃、１６時間日長で２日間共存培養した。その後選抜培地｛ＭＳ培地、２．０ｍｇ／ｌゼアチン，０．１ｍｇ／ｌインドール酢酸，０．３％ゲルライト，５０ｍｇ／ｌカナマイシン，５００ｍｇ／ｌクラフォラン｝に移し、同条件で培養した。１週間ごとに新しい選抜培地に移し、再分化したシュートを植物ホルモンを含まない選抜培地に移し、発根を誘導した。Ｔｉ−プラスミッドｐＭｔ−ｄＡＮ−ｇｄｈおよびｐＣｔ−ＡＮ−ｇｄｈを持つアグロバクテリウムを感染させ、カナマイシン５０ｍｇ／ｌを含む培地で選抜を行った結果、Ｍｔ−ｄＡＮ−ｇｄｈ  Ｎｏ．２，５，８，Ｃｔ−ＡＮ−ｇｄｈ  Ｎｏ．１の４系統が選抜できた。
【００７４】
２）サザン分析による導入遺伝子の確認
馴化させた植物の葉組織よりＴｏｌａｌ  ＤＮＡを抽出した（Ｈｏｎｄａ  ａｎｄ  Ｈｉｒａｉ  １９９０、Ｊｐｎ  Ｊ  Ｂｒｅｅｄ  ４０，３３９−３４８）。１５μｇのＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩで処理し、電気泳動後、ナイロンメンブランにトランスファーした。サザンハイブリダイゼーションはＤＩＧ−Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  （Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を用いて行った。プローブにＡＮ−ｇｄｈ−１７遺伝子を用いた。
その結果、４系統すべてに導入遺伝子サイズのバンド（約１．５ｋｂ）が確認され（図２０）、トランジェットペプチドを付加したｇｄｈ遺伝子が導入されていることが示唆された。
【００７５】
３）ＮＡＤＰ−ＧＤＨ活性の測定
形質転換ポテトの葉組織（約０．１ｇ）を液体窒素で凍結させ、乳鉢で破砕した後、重量の５倍量の抽出緩衝液｛２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０），１４ｍＭ  β−メルカプトエタノール、１０ｍＭ  Ｌ−システイン−ＨＣｌ，０．５ｍＭ  ＰＭＳＦ，０．５％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００｝を加えた。遠心チューブに移し、１２，０００ｒｐｍで１０分間遠心した後、上清を限外ろ過（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ウルトラフリー０．５フィルターユニット、バオイマックス−１０）し、抽出緩衝液で３回洗浄した。抽出した酵素は反応液｛１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０），２０ｍＭ  ２−α−ケトグルタル酸，１．０ｍＭ  ＣａＣｌ２，０．２ｍＭ  ＮＡＤＰＨ，２００ｍＭ  塩化アンモニウム｝に混合し、室温で反応させ、３４０ｎｍにおける吸光度の減少を測定した。
サザン分析で導入遺伝子が確認できた形質転換ポテトおよび非形質転換ポテトの葉組織を用いて、ＮＡＤＰ−ＧＤＨ活性を測定した結果、非形質転換体では活性が認められないのに対し、形質転換体では１５０−３００ｎｍｏｌ／（分ｍｇタンパク質）の活性が測定できた（表１０）。Ｃｔ−ＡＮ−ｇｄｈ系統よりＭｔ−ｄＡＮ−ｇｄｈ系統の方が高い活性を示した。
【００７６】
【表１６】
0003755146.tif 000022
【００７７】
４）マイクロチュバーのアミノ酸含量の測定
非形質転換体と形質転換体４系統の茎頂を液体培養し、発根誘導した後、１６％ショ糖を加え、暗所処理後６週目のマイクロチューバーを用いて、アミノ酸含量を測定した。
８０℃に熱した８０％エタノールを重量の３倍量加え、乳鉢ですりつぶした後、再度８０℃で２０分間加熱した。７，０００ｒｐｍで遠心して、上清を回収した後、再度８０％エタノールを加え、８０℃に加温した。エタノールによる抽出を３回行い、総量を８０％エタノールで５ｍｌに合わせた。よく混合した後、抽出液２００μｌをエッペンドルフチューブに取り、乾燥させ、２００μｌの滅菌水に溶かした。エチルエーテル２００μｌ加え混合後、１２，０００ｒｐｍで遠心し、エーテル層を取り除いた。水層を再度乾燥させた後、４００μｌの０．０２Ｎ  ＨＣｌに溶解し、０．４５μｍのろ過フィルターを用いてろ過したろ液をサンプルとし、日立高速アミノ酸計測器（Ｌ−８８００）を用いて分析を行った。
【００７８】
遺伝子導入系統より誘導したマイクロチューバーを用いてアミノ酸分析を行った。それぞれの株は２個以上のマイクロチュバーを分析し，統計処理を行った。Ｍｔ−ｄＡＮ−ｇｄｈ遺伝子を導入したＮｏ．２，５，８系統由来Ｍｔ２−２，Ｍｔ５−１，Ｍｔ５−２，Ｍｔ８−１，Ｍｔ８−２株はそれぞれグルタミン酸含量が非形質転換体に比べて、１．７倍，２．２倍，２．５倍，３．０倍，２．２倍増加していることが分かった（表１１、図２１）。Ｃｔ−ＡＮ−ｇｄｈ遺伝子導入系統においては、非形質転換体と比べてグルタミン酸含量に有意差は認められなかった。グルタミン酸以外のアミノ酸ではグルタミンやプロリンの顕著な増加が示され、結果として全遊離アミノ酸含量も非形質転換体と比較して２−３倍増加した。
【００７９】
【表１７】
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【００８０】
【表１８】
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【００８１】
【表１９】
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【００８２】
【発明の効果】
本発明により、遊離アミノ酸を高濃度に含有する植物が得られ、付加価値の高い原料作物および食品素材が提供される。本発明により全アミノ酸量が２〜４倍に増加し、特にグルタミン酸、アスパラギン、アスパラギン酸、セリン、スレオニン、アラニンおよびヒスチジンの少なくとも１つについてアミノ酸含量の高い作物が提供され、これらのアミノ酸の後添加を必要としない付加価値の高い原料作物が提供される。また、本発明により、直接調理するような野菜類で高濃度にグルタミン酸を蓄積したもの、すなわち、うま味の優れた食品素材が提供される。
さらに、本発明により、そのような遊離アミノ酸を高度に蓄積する植物を育種するための期間が大幅に短縮される。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ由来グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）遺伝子ＡＮ−ｇｄｈ−１７と既知のＮＡＤＰ−ＧＤＨ遺伝子配列を比較したものである。上段がＮＡＤＰ−ＧＤＨ遺伝子の塩基配列、下段がＡＮ−ｇｄｈ−１７遺伝子の塩基配列である。
【図２】Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ由来グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）遺伝子ＡＮ−ｇｄｈ−１７と既知のＮＡＤＰ−ＧＤＨ遺伝子配列の比較（図１続き）。上段がＮＡＤＰ−ＧＤＨ遺伝子の塩基配列、下段がＡＮ−ｇｄｈ−１７遺伝子の塩基配列。
【図３】ＡＮ−ｇｄｈ−１７遺伝子のＴｉプラスミッド（ｐＭＡＴ０３７）へのクローニング手順を示したものである。図中、３５Ｓ  ＰｒｏはＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーター、Ｔｅｒｍはターミネータを表す。
【図４】トランジットペプチドを結合したＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ由来ＮＡＤＰ−ＧＤＨＡ遺伝子をコードする配列を含む遺伝子構築物、ｐＣｔ−ＡＮ−ｇｄｈ、ｐＣｔ−ｄＡＮ−ｇｄｈ、ｐＭｔ−ｄＡＮ−ｇｄｈの構築手順およびそれらの構造を模式的に示したものである。
【図５】ＮＡＤＰ−ＧＤＨ遺伝子中のスプライシング領域を除去する手順の概略を示したものである。図中、太い線はスプライシング領域、Ｐ１〜Ｐ４はＰＣＲプライマーを表す。
【図６】Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ由来ＮＡＤＰ−ＧＤＨ  Ａ遺伝子配列へのトランジットペプチド配列結合手順の概略を示したものである。図中Ａはトランジットペプチドの塩基配列、ＢはＡＮ−ｇｄｈ−１７遺伝子の塩基配列を表す。Ｐ５〜Ｐ８はそれぞれＰＣＲプライマーを表す。
【図７】２Ａ１１プロモーターに接続されたＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ由来ＮＡＤＰ−ＧＤＨ遺伝子を有する、遺伝子構築物ｐ２ＡＣｔ−ｄＡＮ−ｇｄｈおよびｐ２ＡＭｔ−ｄＡＮ−ｇｄｈの構造を模式的に示したものである。
【図８】トマト由来ＮＡＤ−ＧＤＨ遺伝子（Ｔ−ｇｄｈ−４）のＴｉプラスミッド（ｐＩＧ１２１−Ｈｍ）へのクローニング手順を示したものである。図中、３５ＳはＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーター、ＮｏｓはＮｏｓ−ターミネーターを表す。
【図９】トマト由来ＮＡＤ−ＧＤＨ遺伝子、Ｔ−ｇｄｈ−４の改変手順の概略を示したものである。
【図１０】Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ由来ＡＮ−ｇｄｈ−１７遺伝子を導入した形質転換体のＰＣＲ解析。レーン２、３：非形質転換トマト、レーン４〜６：プラスミッド（ｐＭＡＴ０３７）遺伝子を導入した形質転換トマト；レーン７〜１０：ＡＮ−ｇｄｈ−１７遺伝子を導入した形質転換トマト（Ｎｏ−６，Ｎｏ−８−２，Ｎｏ−１５，Ｎｏ−１７）。
【図１１】トマト由来ＮＡＤ−ＧＤＨ遺伝子ＧＤＨ（Ｔ−ｇｄｈ−４）遺伝子を導入した形質転換体のＰＣＲ解析。レーン２，３：非形質転換トマト；レーン４〜６：プラスミッド（ｐＩＧ１２１−Ｈｍ）遺伝子を導入した形質転換トマト；レーン７〜１０：Ｔ−ｇｄｈ−４遺伝子を導入した形質転換トマト（Ｎｏ．２、Ｎｏ．７−２、Ｎｏ．９−２、Ｎｏ．１０）。
【図１２】Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ由来ＡＮ−ｇｈｄ−１７遺伝子を導入した形質転換体のＲＴ−ＰＣＲ分析。Ｎｏ．６、Ｎｏ．１５は形質転換トマトを表し、（）内は全ＲＮＡを抽出した組織を表す。
【図１３】トマト由来Ｔ−ｇｄｈ−４遺伝子を導入した形質転換体のＲＴ−ＰＣＲ分析。Ｎｏ．２、Ｎｏ．７−２、Ｎｏ．９−２、Ｎｏ．１０は形質転換トマトを表し、（）内は全ＲＮＡを抽出した組織を表す。
【図１４】ＡＮ−ｇｄｈ−１７遺伝子を導入した形質転換体（Ｎｏ．６、Ｎｏ．１５、Ｎｏ．１７）のアミノ酸（グルタミン酸−Ｇｌｕ、グルタミン−Ｇｌｎ、γ−アミノ酪酸−ＧＡＢＡ、リジン−Ｌｙｓ）含量を比較したグラフである。
【図１５】Ｔ−ｇｄｈ−４遺伝子を導入した形質転換体（Ｎｏ．２、Ｎｏ．７−２、Ｎｏ．９−２、Ｎｏ．１０）のアミノ酸（グルタミン酸−Ｇｌｕ、グルタミン−Ｇｌｎ、γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、リジン−Ｌｙｓ）含量を比較した結果である。
【図１６】ＡＮ−ｇｄｈ−１７遺伝子を導入した形質転換トマトのサザン分析の結果を示したものである。全ＤＮＡ（１５μｇ）をＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化した（Ａ）、または全ＤＮＡ（１５μｇ）をＸｂａＩで消化した（Ｂ）サンプルを使用した。レーン１：非形質転換トマト、レーン２：ＡＮ−ｇｄｈ−１７  Ｎｏ．１、レーン３：ＡＮ−ｇｄｈ−１７  Ｎｏ．３、レーン４：ＡＮ−ｇｄｈ−１７  Ｎｏ．１５、レーン５：ＡＮ−ｇｄｈ−１７  Ｎｏ．２．１。
【図１７】Ｔ−ｇｄｈ−４遺伝子を導入した形質転換トマト（Ｔ１）のサザン分析の結果を表す。全ＤＮＡ１５μｇをＸｂａＩおよびＳａｃＩで消化したサンプルを使用した。レーン１：非形質転換トマト、レーン２：Ｔ−ｇｄｈ  Ｎｏ．１−２、レーン３：Ｔ−ｇｄｈ  Ｎｏ．３−１、レーン４：Ｔ−ｇｄｈ  Ｎｏ．８−１。矢印は導入遺伝子（１．２ｋｂ）に対応するバンドの位置を示す。
【図１８】ＡＮ−ｇｄｈ−１７遺伝子を導入した形質転換トマトの後代（Ｔ１）における果実中のアミノ酸含量を比較したグラフである。対照は非形質転換トマトを使用した。測定は３個体ずつ行なった。
【図１９】Ｔ−ｇｄｈ−４遺伝子を導入した形質転換トマトの後代（Ｔ１）における果実中のアミノ酸含量を比較したグラフである。測定は３個体ずつ行なった。
【図２０】Ｃｔ−ＡＮ−ｇｄｈとＭｔ−ｄＡＮ−ｇｄｈ遺伝子を導入したポテトのサザン分析の結果を示したものである。全ＤＮＡ（１５μｇ）のＥｃｏＲＩ消化物を使用した。レーン１：非形質転換ポテト−１、レーン２：非形質転換ポテト−２、レーン３〜６はそれぞれの遺伝子構築物を導入した形質転換ポテトに対応する。レーン３：Ｃｔ−ＡＮ−ｇｄｈ  Ｎｏ．１、レーン４：Ｍｔ−ｄＡＮ−ｇｄｈ  Ｎｏ．２、レーン５：Ｍｔ−ｄＡＮ−ｇｄｈ  Ｎｏ．５、レーン６：Ｍｔ−ｄＡＮ−ｇｄｈ  Ｎｏ．８。矢印は導入遺伝子の断片に対応するバンドの位置を示す。
【図２１】Ｃｔ−ＡＮ−ｇｄｈとＭｔ−ｄＡＮ−ｇｄｈ遺伝子を導入したポテトのマイクロチューバー中のグルタミン酸（Ｇｌｕ）含量を示したグラフである。対照としては非形質転換ポテトを使用した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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