(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）(1)非反復領域に相補的な第１のセグメントと、隣接反復領域に相補的であり、かつ定められた数の反復（ｎ反復）からなる第２のセグメントとからなる１種の、１００ヌクレオチド以下のポリヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブと、(2)試料中の標的核酸とのハイブリダイゼーションを行なうステップ；及び
ｂ）該標的核酸と前記ハイブリダイゼーションプローブとの間で形成されたハイブリッドの融解点温度を決定するステップ
を含む、０〜ｎ間の数の反復をもつ反復配列と非反復配列とからなる標的核酸の解析方法。
【請求項２】
ａ）(1)非反復領域に相補的な第１のセグメントと、隣接反復領域に相補的であり、かつ定められた数の反復（ｎ反復）からなる第２のセグメントとからなる１種の、１００ヌクレオチド以下のポリヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブと、(2)試料中の標的核酸とのハイブリダイゼーションを行なうステップ、
ｂ）ステップａ）と同じポリヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブと、参照試料における標的核酸とをハイブリダイズさせるステップ、
ｃ）試料と参照試料とにおいて、標的核酸と前記ハイブリダイゼーションプローブとの間で形成されたハイブリッドの融解点温度を決定するステップ、並びに
ｄ）試料における標的核酸と参照試料における標的核酸との間の反復数の差異の基準として、前記の２つの融解点温度の差異を決定するステップ
を含む、試料中における、０〜ｎ間の数の反復をもつ反復配列と非反復配列とからなる標的核酸の解析方法。
【請求項３】
マイクロサテライトの解析のための、請求項１又は２記載の方法の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、核酸ハイブリダイゼーション技術に関する。
【０００２】
【従来の技術】
分子生物学分野において、ハイブリダイゼーション技術がよく知られている。かかるハイブリダイゼーション技術によれば、特異的なハイブリダイゼーションプローブが使用できる場合、特異的な配列の検出が可能になる。通常、前記ハイブリダイゼーションプローブは、検出可能な部分、例えば、放射活性標識、蛍光標識などにより標識される。
【０００３】
また、ポリメラーゼ  チェーン  リアクション（ＰＣＲ）は、核酸の解析のための強力で、かつ広く行きわたった技術となっている。ＰＣＲの原理は、米国特許第４，６８３，１９５号明細書及び米国特許第４，６８３，１０２号明細書〔ムリス（Ｍｕｌｌｉｓ）ら〕に開示されている。ＰＣＲにおける主要な改良点は、オンライン検出によりＰＣＲ時の反応のカイネティックスを測定する可能性から得られる。これは、蛍光モニターを介してアンプリコンを検出することにより、可能になっている。
【０００４】
一方、増幅反応の間にすでに存在する好適な蛍光標識ハイブリダイゼーションプローブは、ついで、温度依存融解曲線解析を行なうために、反応容器を考えない均一系アッセイ（ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ  ａｓｓａｙ）に用いられうる。かかる解析のために、試料の温度を連続的に上昇させ、（増幅された）標的核酸とハイブリダイゼーションプローブとの間の先に生じたハイブリッド複合体が、解離する正確な融解温度を測定する。かかるアプローチは、１塩基多型により他と異なるにすぎない標的分子間の融解温度の差異を検出するために用いられうる。すなわち、融解曲線解析は、点変異の検出又は同定にも用いられうる。
【０００５】
かかる技術の例示は、国際公開第９７／４６７０７号パンフレット、国際公開第９７／４６７１２号パンフレット及び国際公開第９７／４６７１４号パンフレット〔ウィットワー（Ｗｉｔｔｗｅｒ）ら〕に詳細に開示されており、その教示は、参照により本明細書に取り込まれる。
【０００６】
つづく融解曲線解析に際する、ＰＣＲ増幅産物の生成又は変異の同定を連続的にモニターしうる、標的依存蛍光シグナルの発生に基づくいくつかの検出様式が開示されている〔ウィットワー（Ｗｉｔｔｗｅｒ）ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、第２２巻、第１号、１３０−１３８、（１９９７）に概説されている〕。これらの検出様式としては、特に限定されないが、ａ）ハイブリダイゼーションにおける蛍光共鳴エネルギー転移の増加に基づく検出様式、及びｂ）分子ビーコンに基づく検出様式などが挙げられる。
【０００７】
前記ａ）の検出様式において、増幅産物の一方の鎖の隣接するがオーバーラップしていない領域にハイブリダイズしうる、蛍光部分で標識された２種のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブが用いられる。好ましくは、一方のオリゴヌクレオチドの５’末端を標識し、もう一方のオリゴヌクレオチドの３’末端を標識する。標的ＤＮＡにハイブリダイズする場合、２つの蛍光標識を、２つの蛍光部分の間の蛍光共鳴エネルギー転移が起こりうるように、近接に接触させる。結果として、ハイブリダイゼーションは、ドナー部分の励起、ついで別のアクセプター部分の蛍光発光の測定を介してモニターされうる（国際公開第９７／４６７１４号パンフレット）。
【０００８】
同様の態様として、特異的ＦＲＥＴペアとしても働くであろう１つの適切に標識されたプライマーとともに、１つの蛍光標識プローブのみが用いられる〔バーナード（Ｂｅｒｎａｒｄ）ら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２３５，１０１−１０７（１９９８）〕。
【０００９】
前記ｂ）の検出様式において、分子ビーコンオリゴヌクレオチドを、分子の２次構造により互いに近接している蛍光化合物と消光化合物とで標識する。標的ＤＮＡへの結合に際して、分子内水素結合が破壊され、プローブの一方の末端に結合した蛍光化合物が、該プローブの反対側の末端に結合した消光化合物から分離される〔リザーディ（Ｌｉｚａｒｄｉ）ら、米国特許第５，１１８，８０１号明細書〕。
【００１０】
しかしながら、本発明がなされる前、反復配列における配列反復の数の定量を可能にする使用可能な均一系（ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ）の検出様式はなかった。それでもなお、かかる反復数の解析は、例えば、マイクロサテライト解析の分野において、重要である。
【００１１】
マイクロサテライト（ＭＩＳ）は、全ヒトゲノムに散在する短い縦列配列である。マイクロサテライトは、統計的に、１００，０００塩基対毎に約１回見出される。現在までに、モノヌクレオチドリピート、ジヌクレオチドリピート、トリヌクレオチドリピート、テトラヌクレオチドリピート、又はペンタヌクレオチドリピートとしてその最も短い反復単位の長さで他と異なる５クラスのＭＩＳが、述べられている。通常、これらの反復単位は、縦列配列において、１０〜４０回繰り返して起こる。同じ個体の正常ＤＮＡと腫瘍材料由来のＤＮＡとを比較した場合、多くの腫瘍患者において、小さい欠失又は挿入の形でのマイクロサテライト不安定性（ＭＩＮ）が検出されうる〔チボドー（Ｔｈｉｂｏｄｅａｕ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６０，８１６−８１９（１９９３）；国際公開第９４／１９４９２号パンフレット〕。これは、ＰＣＲによりＤＮＡを増幅し、ついで、ゲル電気泳動により、増幅産物を分離することにより、達成される。腫瘍細胞の永続的な複製の欠損は、ＭＩＮの原因であると見なされる〔パーソンズ（Ｐａｒｓｏｎｓ）ら、Ｃｅｌｌ、７５、１２２７−１２３６（１９９３）；シバタ（Ｓｈｉｂａｔａ）ら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，６，２７３−２８１（１９９４）〕。かかる腫瘍は、『複製エラー陽性』（ＲＥＲ＋）として分類される。ＲＥＲ＋表現形質は、ＨＮＰＣＣ（遺伝性非ポリープ性結腸癌；ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ  ｎｏｎ−ｐｏｌｙｐｏｓｉｓ  ｃｏｌｏｎ  ｃａｎｃｅｒ）のファミリーの結腸直腸癌に特有である〔アールトネン（Ａａｌｔｏｎｅｎ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６０，８１２−８１６（１９９３）〕。
【００１２】
マイクロサテライトの解析は、診断用途のため及びＲＥＲ＋腫瘍の腫瘍発生の判定のための非常に興味深い方法である。シークエンスする前に、ＭＩＮの決定を行なうことは簡単であるため、ＨＮＰＣＣファミリーのミスマッチ修復遺伝子は、潜在的なＲＥＲ＋患者を同定するに適した助けである。また、ＭＩＮの発生は、よりよい予後に関連するため、ＭＩＮ解析は、散発性結腸癌の予後診断に重要である〔ローテ（Ｌｏｔｈｅ）ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５３，５８４９−５８５２（１９９３）；チボドー（Ｔｈｉｂｏｄｅａｕ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６０，８１６−８１９（１９９３）；バッブ（Ｂｕｂｂ）ら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１２，２６４１−２６４９（１９９６）〕。
【００１３】
ＭＩＮは、散発性結腸癌においては、１０〜２０％の頻度で生じるに過ぎない〔チボドー（Ｔｈｉｂｏｄｅａｕ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６０，８１６−８１９（１９９３）；イオノフ（Ｉｏｎｏｖ）ら，Ｎａｔｕｒｅ，３６３，５５８−５６１（１９９３）；アールトネン（Ａａｌｔｏｎｅｎ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６０，８１２−８１６（１９９３）；ローテ（Ｌｏｔｈｅ）ら、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．，５３，５８４９−５８５２（１９９３）〕が、全ＨＮＰＣＣ腫瘍の９０％を超える症例において、検出されうる〔リウ（Ｌｉｕ）ら、ＮａｔｕｒｅＭｅｄ．，２，１６９−１７４（１９９６）〕。しかしながら、ＭＩＮは、結腸癌に限定されず、他の癌においても検出されており、特に、膵臓癌〔ハン（Ｈａｎ）ら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５３，５０８７−５０８９（１９９３）〕、胃癌〔ハン（Ｈａｎ）ら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５３，５０８７−５０８９（１９９３）；ペルトマキ（Ｐｅｌｔｏｍａｋｉ）ら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５３，５８５３−５８５５（１９９３）；ミロノフ（Ｍｉｒｏｎｏｖ）ら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５４，４１−４４（１９９４）；リュウ（Ｒｈｙｕ）ら，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，９，２９−３２（１９９４）；チョン（Ｃｈｏｎｇ）ら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５４，４５９５−４５９７（１９９４）〕、精巣癌〔ガオ（Ｇａｏ）ら，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，９，２９９９−３００３（１９９４）〕、子宮内膜腫〔ライジンジャー（Ｒｉｓｉｎｇｅｒ）ら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５３，５１００−５１０３（１９９３）；ペルトマキ（Ｐｅｌｔｏｍａｋｉ）ら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５３，５８５３−５８５５（１９９３）〕、乳癌〔ペーテル（Ｐａｔｅｌ）ら，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，９，３６９５−３７００（１９９４）〕などが挙げられる。
【００１４】
従来、マイクロサテライトの解析は、増幅産物の大きさを検出し、それにより反復構造の長さについての情報を得るために、いかなる場合のゲル電気泳動による断片分離にも時間がかかっていた。
【００１５】
したがって、当該技術分野において、断片分離することなく、反復構造の長さを解析する方法を提供することが望まれている。かかる方法は、迅速かつ簡便に行ないうることが要求されている。また、かかる方法が、原理的に自動化されうる場合、有利である。
【００１６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、断片分離することなく、反復構造の長さを解析する方法を提供することを目的とする。さらに、本発明は、断片分離することなく、迅速かつ簡便に、反復構造の長さを解析する方法を提供することを目的とする。
【００１７】
【課題を解決するための手段】
本発明は、試料中に存在する反復配列の数を、融解温度解析により決定する方法に関する。即ち、本発明は、
〔１〕 ａ）(1)非反復領域に相補的な第１のセグメントと、隣接反復領域に相補的であり、かつ定められた数の反復（ｎ反復）からなる第２のセグメントとからなる１種の、１００ヌクレオチド以下のポリヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブと、(2)試料中の標的核酸とのハイブリダイゼーションを行なうステップ；及び
ｂ）該標的核酸と前記ハイブリダイゼーションプローブとの間で形成されたハイブリッドの融解点温度を決定するステップ
を含む、０〜ｎ間の数の反復をもつ反復配列と非反復配列とからなる標的核酸の解析方法、
〔２〕 ａ）(1)非反復領域に相補的な第１のセグメントと、隣接反復領域に相補的であり、かつ定められた数の反復（ｎ反復）からなる第２のセグメントとからなる１種の、１００ヌクレオチド以下のポリヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブと、(2)試料中の標的核酸とのハイブリダイゼーションを行なうステップ、
ｂ）ステップａ）と同じポリヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブと、参照試料における標的核酸とをハイブリダイズさせるステップ、
ｃ）試料と参照試料とにおいて、標的核酸と前記ハイブリダイゼーションプローブとの間で形成されたハイブリッドの融解点温度を決定するステップ、並びに
ｄ）試料における標的核酸と参照試料における標的核酸との間の反復数の差異の基準として、前記の２つの融解点温度の差異を決定するステップ
を含む、試料中における、０〜ｎ間の数の反復をもつ反復配列と非反復配列とからなる標的核酸の解析方法、
〔３〕 マイクロサテライトの解析のための、前記〔１〕又は〔２〕記載の方法の使用
に関する。

【００１８】
したがって、第１の概念において、本発明は、ａ）▲１▼非反復領域に相補的な第１セグメントと、隣接反復領域に相補的であり、かつ定められた数の反復からなる第２セグメントとを含有した少なくとも１種のポリヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブと、
▲２▼試料中の標的核酸と
のハイブリダイゼーションを行なうステップ、及び
ｂ）標的核酸と該少なくとも１種のハイブリダイゼーションプローブとの間に形成されたハイブリッドの融解点温度を決定するステップ
を含む、反復配列と非反復配列とからなる標的核酸の解析方法に関する。
【００１９】
本発明によれば、融解点温度は、標的核酸に存在する反復の数に相関しうる。
【００２０】
通常、決定された融解温度値と、参照核酸について得られた融解温度値とを比較することが有利である。したがって、本発明は、
ａ）▲１▼非反復領域に相補的な第１セグメントと、隣接反復領域に相補的であり、かつ定められた数の反復からなる第２セグメントとを含有した少なくとも１種のポリヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブと、
▲２▼試料中の標的核酸と
のハイブリダイゼーションを行なうステップ、
ｂ）ステップａ）と同じポリヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブと、参照試料における標的核酸とをハイブリダイズさせるステップ、
ｃ）試料と参照試料とにおいて、標的核酸と少なくとも１種のハイブリダイゼーションプローブとの間で形成されたハイブリッドの融解点温度を決定するステップ、並びに
ｄ）試料における標的核酸と参照試料における標的核酸との間の反復数の差異の基準として、前記試料及び参照試料のそれぞれにおける融解点温度の差異を決定するステップ
を含む、試料中における反復配列と非反復配列とからなる標的核酸の解析方法に関する。
【００２１】
感度を増加させるために、ハイブリダイゼーション前に、標的核酸を増幅する場合、有利であることがわかっている。増幅は、例えば、ポリメラーゼチェーンリアクションにより、容易に達成されうる。
【００２２】
通常、少なくとも１種のハイブリダイゼーションプローブが標識される。ここで、標識は、好ましくはフルオロフォア（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ）である。よりさらに好ましい態様において、ＦＲＥＴ／Ｈｙｂｐｒｏｂｅによる検出原理が行なわれる。この場合において、両方のプローブが標的核酸にハイブリダイズされる場合、蛍光共鳴エネルギー転移（Ｆｌｏｕｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ）が起こりうるような異なるフルオロフォアで標識された隣接的にハイブリダイズする２つのプローブを用いて、ハイブリダイゼーションを行なう。
【００２３】
新規な方法が、反復配列における反復構造の数が決定される必要がある多くの異なる実験計画に応用できる。
【００２４】
結果として、本発明の特定の概念は、マイクロサテライト、特にマイクロサテライト不安定性（Ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ  Ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ；ＭＩＮ）の新規な解析方法の応用に関する。かかる解析は、遺伝性の腫瘍、特に、ＨＮＰＣＣミスマッチ修復遺伝子の欠損により引き起こされる結腸癌を検出するために、よく応用されうる。
【００２５】
同様に、本発明の他の概念は、例えば、法医学問題の解決のために、本発明の新規な方法の、集団における個体の同定のための使用に焦点があてられる。
【００２６】
さらなる概念において、さらに、本発明は、非反復領域に相補的な第１セグメントと、隣接反復領域に相補的であり、かつ定められた数の反復からなる第２セグメントとを含有した各ポリヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブに関する。本発明の特定の態様において、プローブに存在する反復の数は、野生型の標的配列における反復の数と同一である。特定の野生型がない場合、プローブ内の反復の数は、調査対象の反復遺伝子座に見出される反復の最大数と好ましくは同一である。
【００２７】
さらに、本発明は、かかるハイブリダイゼーションプローブの非反復セグメントが、３−１０ヌクレオチド長、よりさらに好ましくは、３、４、５又は６ヌクレオチド長である場合、おおいに有利であることがわかっている。
【００２８】
他の概念において、本発明は、第１のプローブが、非反復性配列からなり、第２のプローブが、非反復性領域と、隣接反復領域に相補的であり、かつ定められた数の反復からなる第２のセグメントとを含有する、ＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブのペアに関する。
【００２９】
さらなる概念において、本発明は、上記に開示されたプローブ特性に従ったＢＡＴ２６の解析のための配列番号：４の配列を有する特異的ポリヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブ及びＢＡＴ２５の解析のための配列番号：７の配列を有する特異的ポリヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブに関する。
【００３０】
すなわち、本発明は、
〔１〕  ａ）▲１▼非反復領域に相補的な第１のセグメントと、隣接反復領域に相補的であり、かつ定められた数の反復からなる第２のセグメントとを含有した少なくとも１種のポリヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブと、▲２▼試料中の標的核酸と
のハイブリダイゼーションを行なうステップ；及び
ｂ）該標的核酸と該少なくとも１種のハイブリダイゼーションプローブとの間で形成されたハイブリッドの融解点温度を決定するステップ
を含む、反復配列と非反復配列とからなる標的核酸の解析方法、
〔２〕  融解点温度が、標的核酸に存在する反復の数と相関する、前記〔１〕記載の方法、
〔３〕  ａ）▲１▼非反復領域に相補的な第１のセグメントと、隣接反復領域に相補的であり、かつ定められた数の反復からなる第２のセグメントとを含有した少なくとも１種のポリヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブと、▲２▼試料中の標的核酸と
のハイブリダイゼーションを行なうステップ、
ｂ）ステップａ）と同じポリヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブと、参照試料における標的核酸とをハイブリダイズさせるステップ、
ｃ）試料と参照試料とにおいて、標的核酸と少なくとも１種のハイブリダイゼーションプローブとの間で形成されたハイブリッドの融解点温度を決定するステップ、並びに
ｄ）試料における標的核酸と参照試料における標的核酸との間の反復数の差異の基準として、前記の２つの融解点温度の差異を決定するステップ
を含む、試料中における反復配列と非反復配列とからなる標的核酸の解析方法、〔４〕  ハイブリダイゼーション前に、標的核酸を増幅する、前記〔１〕〜〔３〕いずれか１項に記載の方法、
〔５〕  少なくとも１種のハイブリダイゼーションプローブが、標識されたプローブであり、標識が、好ましくは、フルオロフォアである、前記〔１〕〜〔４〕いずれか１項に記載の方法、
〔６〕  異なるフルオロフォアでそれぞれ標識された２種の隣接してハイブリダイズするプローブを用いて、ハイブリダイゼーションを行ない、ここで、両方のプローブが標的核酸にハイブリダイズされる場合、蛍光共鳴エネルギー転移が起こりうる、前記〔５〕記載の方法、
〔７〕  非反復領域と、隣接反復領域に相補的な第２のセグメントとを含有したプローブのフルオロフォアが、プローブの非反復領域に結合されたものである、前記〔６〕記載の方法、
〔８〕  マイクロサテライト、特にマイクロサテライト不安定性の解析のための、前記〔１〕〜〔７〕いずれか１項に記載の方法の使用、
〔９〕  遺伝性腫瘍の検出の手段としての、前記〔８〕記載の使用、
〔１０〕  集団における個体の同定のための、前記〔１〕〜〔７〕いずれか１項に記載の方法の使用、
〔１１〕  非反復領域に相補的な第１のセグメントと、隣接反復領域に相補的であり、かつ定められた数の反復からなる第２のセグメントとを含有してなるポリヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブ、
〔１２〕  反復の数が、野生型の標的配列の反復の数と同一又は特定の反復遺伝子座に存在する反復の最大数と同一である、前記〔１１〕記載のハイブリダイゼーションプローブ、
〔１３〕  非反復セグメントの長さが、３〜１０ヌクレオチド長、好ましくは、４〜６ヌクレオチド長である、前記〔１１〕又は〔１２〕記載のハイブリダイゼーションプローブ、
〔１４〕  第１のプローブが、非反復領域にハイブリダイズするプローブであり、第２のプローブが、前記〔１１〕〜〔１３〕いずれか１項に記載のプローブである、ＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブのペア、
〔１５〕  第２のプローブの標識が、該プローブの非反復領域に結合されたものである、前記〔１４〕記載のＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブのペア、並びに、
〔１６〕  配列番号：４又は配列番号：７の配列を有してなる、ポリヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブ、
に関する。
【００３１】
【発明の実施の形態】
本明細書において、下記用語が、さらに定義される必要がある。
【００３２】
本明細書における『反復』は、ＤＮＡのより長い断片若しくは時々ＲＮＡ分子においても何回も見出される短い核酸配列である。１つの反復において、ヌクレオチド塩基は、常に同じ順番で存在する。これらの反復は、ゲノムの利己的、非コード領域にしばしば見出される。多くの場合、これらの反復構造は、マイクロサテライトと称される。
【００３３】
１つの反復を生じるヌクレオチドの数は、変化してもよい。モノヌクレオチド反復は、１種類のヌクレオチド塩基、すなわち、Ａ、Ｇ、Ｃ又はＴからなり、モノヌクレオチドのストレッチをもたらす。ジヌクレオチド反復は、２つのタイプのヌクレオチド塩基、例えば、ＣＡなどからなり、交互の配列、すなわち、（ＣＡ）ｎのストレッチをもたらす。３ヌクレオチド反復、４ヌクレオチド反復及び５ヌクレオチド反復も、しばしば観察されている。本明細書において、ｎ−ヌクレオチド反復は、長さｎ（ｎは、１〜１０、好ましくは、１〜５、最も好ましくは、１又は２ヌクレオチドである）を有する反復を含有する反復構造であると理解される。
【００３４】
反復配列は、連続した配列又は逆方向配列で存在する複数の反復を有する配列である。ある場合、反復配列は、特有の（ｕｎｉｑｕｅ）非反復配列により中断されていてもよい。また、複数のタイプの反復、とくに複数のタイプのモノヌクレオチド反復を含む反復配列が同定されている。
【００３５】
ハイブリダイゼーションプローブは、標的核酸の配列と完全に同一又は厳密に相補的な配列を有するポリヌクレオチドである。なお、前記プローブが１若しくは複数のミスマッチを含む場合、該プローブが、適切なハイブリダイゼーション条件下において、分析対象物にハイブリダイズしうるものであれば、本発明の範囲に含まれる。いかなる場合においても、配列同一性又は相補性が少なくとも１０個の隣接する残基の範囲にわたって１００％である場合、特に有利であることがわかる。また、プローブの長さが、１００ヌクレオチド以下、好ましくは４０ヌクレオチド以下である場合、有利であることがわかる。
【００３６】
しかしながら、特に本明細書においては、ハイブリダイゼーションプローブは、標的核酸にハイブリダイズしない５’突出部分又は３突出部分を有してもよい。すなわち、本発明は、標的核酸に存在する反復の数を検出する方法に関するので、プローブにおける反復の数が、標的核酸に予期されうる反復の最大数と同一であることを必要とする。
【００３７】
ハイブリダイゼーションプローブは、ハイブリダイゼーションの結果を当該技術分野に公知の方法で検出できるように、検出可能な部分（ｅｎｔｉｔｙ）、例えば、蛍光化合物などを結合させてもよい。
【００３８】
「ＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブ」は、両方のプローブが、標的分子に隣接してハイブリダイズする場合、ともにＦＲＥＴペアとして働き、それにより、核酸の検出を可能する、蛍光化合物をそれぞれ保持するハイブリダイゼーションプローブのペアとして定義される。
【００３９】
「ポリヌクレオチド」は、（デオキシ）−オリゴ−リボヌクレオチドだけでなく、当該技術分野に公知の全てのＤＮＡ誘導体又はＲＮＡ誘導体、例えば、メチルホスホネート；ホスホチオエート；２’−Ｏ−アルキル誘導体並びにペプチド核酸；７−デアザ−プリンなどの修飾塩基を含有したアナログなどに要約される。
【００４０】
ハイブリダイゼーションプローブと標的核酸とのハイブリダイゼーション後、本発明によれば、融解点温度の決定が行なわれる。融解点温度は、標的／プローブハイブリッドの２本鎖領域のサイズに優先的に依存する。反復配列を含有するハイブリダイゼーションプローブを用いる場合、ハイブリダイゼーション温度は、標的ＤＮＡに存在する反復の数に依存し、相関しうる。
【００４１】
また、融解温度は、▲１▼二本鎖領域のＧＣ含量、▲２▼二本鎖領域内のミスマッチの有無、及び▲３▼例えば、試料の塩濃度などの比較的重要性の低い他の因子、に依存することが当該技術分野に公知であり、無視すべきではない。
【００４２】
融解点温度は、通常、試料を、温度の構成的な上昇に供し、続いて、ハイブリダイゼーション複合体の一本鎖への解離を測定することにより、実験的に決定される。解離は、例えば、ＵＶ吸収のシフト、表面プラズモン共鳴、又は好ましくは蛍光などの種々の方法により、検出されうる。蛍光により検出される場合、ハイブリダイゼーションプローブは、通常、蛍光部分で標識され、蛍光シグナルの生成は、ハイブリダイゼーション複合体の形成になんらかの形で依存する。なお、本明細書において、温度の構成的な上昇とは、直線的で中断されない温度の上昇をいう。
【００４３】
好ましい態様において、アッセイは、均一系の検出様式で行なわれる。例えば、標的核酸は、融解温度決定に先立ち、適切な増幅プライマーによる典型的なＰＣＲの反応で増幅してもよい。適切なハイブリダイゼーションプローブは、既に増幅反応の際に存在する。ハイブリダイゼーションプローブは、好ましくは、適当な励起後に検出できる蛍光標識を担持する。例えば、ハイブリダイゼーションプローブは、好ましくは、分子ビーコン〔リザーディ（Ｌｉｚａｒｄｉ）ら、米国特許第５，１１８，８０１号明細書〕又はＦＲＥＴ−Ｈｙｂｐｒｏｂｅ様式〔国際公開第９７／４６７１４号明細書〕に従いともに働きうる蛍光標識されたオリゴヌクレオチドの対のいずれであってもよい。ＰＣＲの反応終了後、試料の温度を、構成的に上昇させる。ハイブリダイゼーションプローブが標的ＤＮＡに結合されるものであれば、蛍光が検出されうる。しかしながら、融解温度において、ハイブリダイゼーションプローブは、その標的から解離し、蛍光シグナルがバックグラウンドレベルにまで、直ちに減少する。この減少は、温度低下が観察される正確な温度値を決定しうるように、適切な温度−時間プロットでモニターされる。
【００４４】
本発明のハイブリダイゼーションプローブの設計には、いくつかの前提条件が要求される。
【００４５】
第１に、プローブは、該プローブの５’末端又は３’末端のいずれかに局在する非反復ハイブリダイズセグメントを含有しなければならない。非反復セグメントの長さは、特定のアッセイ条件に依存して変化してもよい。通常、標的配列にハイブリダイズする少なくとも３ヌクレオチドのセグメントが、十分であることがわかっている。かかる非反復ハイブリダイズ配列の存在は、標的配列における同一の反復の数と無関係である長所を有し、プローブは、いつも非反復領域と反復配列からなる領域との間のトランジションである標的核酸の決められた位置に正確にハイブリダイズするであろう。
【００４６】
第２に、標的核酸の配列に存在する反復が伸びるプローブに存在する反復の数は、非常に重要である。より具体的には、本発明の方法に用いられたｎ反復を含むハイブリダイゼーションプローブは、０〜ｎ間の数の反復を含むいくつかの標的核酸間を識別することができるであろう。対照的に、決定された融解点温度は、ｎ反復又はｎを超える数の反復を含む全ての標的核酸と等しいであろう。
【００４７】
第３に、ハイブリダイゼーションプローブに存在する反復の数は、融解点温度解析に用いられうるハイブリダイゼーションプローブの長さが限定されるという事実により限定される。本明細書において、ハイブリダイゼーションプローブの全体の長さが、１００ヌクレオチド以下、好ましくは、８０ヌクレオチド以下、最も好ましくは、６０ヌクレオチド以下である場合、有利であることがわかっている。
【００４８】
図１は、一方のハイブリダイゼーションプローブを適用する場合に用いてもよい２つの異なるプローブデザインを示す。これは、いかなる不均一なアッセイ様式であってもよく、蛍光部分が、プローブの５’末端若しくは３’末端のいずれかに結合又は近接し、消光部分が、プローブの逆の末端に結合若しくは近接する、別に均一系の分子ビーコン様式を用いる場合であってもよい。
【００４９】
ある場合、本発明のプローブは、内部の反復セグメントにより連結された５’末端及び３’末端の２つの非反復セグメントからなっていてさえもよい。
【００５０】
プローブは、その５’末端又は３’末端における反復領域に直接に隣接して局在する、標的配列における一方の非反復（ｕｎｉｑｕｅ）領域に相補的な非反復部分を含有する。ハイブリダイゼーションプローブよりも少ない反復を含む標的分子とのハイブリダイゼーションの結果の場合、ハイブリダイゼーションプローブにおける反復の数と標的配列における反復の数とが等しい状態と比較して、プローブの一本鎖突出部分が生じ、融解温度が減少する。より一般的には、融解温度は、標的に存在する反復の数に直接依存する、すなわち、試料により多くの反復が存在すればするほど、融解温度が一層高くなる。
【００５１】
図２は、３つの異なるＦＲＥＴ  Ｈｙｂｐｒｏｂｅデザインを示すが、本発明の範囲を限定するものではない。かかるプローブデザインについて、ＦＲＥＴプロセスは、あるプローブが、標的分子から解離するやいなや、中断されるので、反復領域を含有する第２のプローブは、反復配列を含まないプローブの融解温度と比較して、より高い融解温度を有することが必要である。
【００５２】
図２Ａは、第１のハイブリダイゼーションプローブが、独占的に、解析対象の反復領域の近接に接触した上流の領域に相補的な非反復配列からなる、ハイブリダイゼーションプローブのペアを開示する。蛍光標識は、プローブの３’末端に付加される。第２のプローブは、本発明によりデザインされ、非反復配列に相補的な第１の配列と標的核酸の反復配列に相補的な第２の配列とを有する。このプローブは、その５’末端において蛍光標識を保持し、両方のプローブを標的分子にハイブリダイズする場合、第１のプローブの標識に近接して接触する。
【００５３】
一方、独占的に非反復配列からなるプローブが、その５’末端に標識を保持し、反復領域の下流にハイブリダイズするが、本発明によりデザインされた第２プローブがその３’末端において標識されている態様も本発明の範囲内である。
【００５４】
図２Ｂは、本発明のプローブデザインの別のアプローチを示す。ここで、反復配列と非反復配列との両方を含むプローブの蛍光標識は、プローブの反復セグメントに付加される。相補的なハイブリダイゼーションプローブよりも反復がより少ない標的分子とのハイブリダイゼーションの場合、融解温度が減少するように、該プローブ内にループを生じるであろう。
【００５５】
また、本発明によりデザインされた２ペアのハイブリダイゼーションプローブを用いることもできる。ハイブリダイゼーションの結果に続く融解温度解析の際、２つの顕著な融解温度が観察され、ついで、標的に存在する反復の数が、両方の決定された融解温度を考慮して算出されうる。
【００５６】
図２Ｃは、本発明の範囲内のさらなる別法を開示する。両方のプローブは、非反復領域に相補的な第１セグメントと、隣接反復領域に相補的であり、かつ定められた数の反復からなる第２セグメントとを含有する。ついで、２つの蛍光標識を２つのプローブの反復領域内に付加する。この特定の場合、両方のプローブに存在する反復の数は、共に解析対象の標的核酸に期待されるであろう反復の最大数に対応する。さらに、標的核酸に存在する反復が、より少ない場合、ハイブリダイゼーションプローブ内にループ構造が、形成され、融解温度が低下する。
【００５７】
反復配列にハイブリダイズする２つのプローブが用いられるので、さらには、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブの最大長が、慣用のオリゴヌクレオチド合成化学法の能力により限定されるため、本発明の本態様は、非常に長い反復構造の解析に特に有益である。しかしながら、目的の反復遺伝子座と、それとは異なるゲノムの遺伝子座とが同じタイプの反復からなる場合、これらのプローブは、目的の反復遺伝子座とは異なるゲノムの遺伝子座に共に結合するであろうため、かかるプローブデザインは、特異性の減少をもたらすであろう。
【００５８】
本発明は、反復配列の解析、特に、マイクロサテライト反復の解析のための多様な用途に適する。例えば、本発明のマイクロサテライト反復解析は、癌抑制遺伝子のゲノム不安定性の指標として、異型接合性の欠損を評価して、そうして、いくつかのタイプの腫瘍の指標とするのに適用されうる〔クヌッドソン（Ｋｎｕｄｓｏｎ），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ、９０、１０９１４−１０９２１頁（１９９３）〕。
【００５９】
特に、新規な発明は、ミスマッチ修復遺伝子における変異の指標であり、そのため、遺伝性非ポリープ性結腸癌（ＨＮＰＣＣ）の指標となることが知られているマイクロサテライト不安定性〔ペルトマキ（Ｐｅｌｔｏｍａｋｉ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０，８１０−８１２頁（１９９３）〕の解析に応用されうる。また、例えば、小細胞肺癌などの他のタイプの癌も事前診断することができる。
【００６０】
最後に、本発明は、個人認識、組織タイピング及び集団遺伝子解析を含むあらゆるタイプの集団研究及び法医学用途〔ケス（Ｋｏｅｔｈ）ら、Ｊ．Ｐａｔｈ．，１７８，２３９−２４８頁（１９９６）〕に一般的に応用可能である。
【００６１】
【実施例】
以下の実施例、参考文献、配列表及び図面は、本発明の理解を助けるために提供され、その本来の範囲は、添付の請求項に示される。本発明の意図を逸脱することなく、示された手順において改変が成されうることが理解される。
【００６２】
実施例１  試料材料及び調製
７０症例のマイクロサテライト安定性（ＭＳＳ）腫瘍及び８症例のマイクロサテライト不安定ＭＳＩ−Ｈ腫瘍（＞＝２０％不安定性マーカー，高ＭＳＩ）を、モノヌクレオチド反復遺伝子座ＢＡＴ２５及びＢＡＴ２６によるＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒマイクロサテライト融解点解析に用いた。これらのマーカーは、ＭＳＩ検出の最も高感度なマーカーとして述べられている〔ホアン（Ｈｏａｎｇ）ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，（１９９７）；デットマイヤー（Ｄｉｅｔｍａｉｅｒ）ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，（１９９７）；クラボ（Ｃｒａｖｏ）ら，Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ（１９９９）〕。ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ解析のために、ホルマリン固定パラフィン包埋組織の５μｍ切片から、レーザー支援ミクロディセクション〔ＰＡＬＭ社製，バーンリエト，ドイツ〕又はマニュアルミクロディセクションにより、腫瘍組織領域及び正常組織領域をミクロディセクトした。ミクロディセクトした組織由来のＤＮＡをＨｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  ＰＣＲ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ロッシュ社製）により調製した。
【００６３】
実施例２  ＢＡＴ２６のリアルタイムＰＣＲ
２μｌ  ＤＮＡ（５０〜２００ｎｇ）を、最終濃度３ｍＭ  ＭｇＣｌ2 、各０．５μＭのＢＡＴ２６−Ｕｐｓｔｒｅａｍ増幅プライマー（配列番号：１；tga cta ctt ttg act tca gcc ）及びＢＡＴ２６−Ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ増幅プライマー（配列番号：２；aac cat tca aca ttt tta acc)、３’末端をフルオレセインで標識した０．１５μＭ  ＢＡＴ２６−ドナー−ハイブリダイゼーションプローブ（配列番号：３；gca gca gtc aga gcc ctt aac ct）、５’末端をＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｄｙｅ  ＬＣ−Ｒｅｄ−６４０（ロシュモレキュラーバイオケミカルズ社製）で０．１５μＭ  ＢＡＴ２６−アクセプター−ハイブリダイゼーションプローブ（配列番号：４；tca ggt aaa aaa aaa aaa aaa aaa aaa aaa aa）及び１×ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒTMＤＮＡ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｂｅｓ−Ｍｉｘ（ロシュモレキュラーバイオケミカルズ社製）をもたらす１３μｌの増幅混合物と混合した。
【００６４】
ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（ロシュモレキュラーバイオケミカルズ社製）を、続くリアルタイムＰＣＲ増幅のモニターに用いた。ＢＡＴ２６  ＰＣＲ増幅プログラムを、９５℃９０秒で１回の変性ステップで開始し、シグナル検出のために、９５℃／０秒−６０℃／１０秒−５０℃／３秒の５０サイクルを行ない、ついで、７２℃／１０秒を行なった。その後、９５℃／０秒、３５℃／３０秒でアンプリコンをインキュベートし、連続的な管Ｆ２検出をしながら、０．２℃／秒ずつ９５℃まで温度を上昇させることにより融解プロファイルを行なった。
【００６５】
リアルタイムＰＣＲによるＢＡＴ２６の増幅及び検出並びに融解点解析は、１２５／１５３（８２％）及び２６／３１（８３％）ホルマリン固定パラフィン包埋組織試料のそれぞれにおいて実行可能である。ＢＡＴ２６融解点解析は、正常組織、血液、又はＭＳＳ腫瘍について、５１−５１．８℃の融解温度（Ｔｍ）を表わした（図３Ａ）。対照的に、ｈＭＳＨ２タンパク質発現又はｈＭＬＨ１タンパク質発現を欠損する７種のＭＳＩ−Ｈ腫瘍のそれぞれ並びに１００％のＭＳＩ割合は、４３〜４６℃の範囲でＴｍ値が変化することを示した（図３Ｂ）。
【００６６】
実施例３  ＢＡＴ２５のリアルタイムＰＣＲ
示されたものを除いて、実施例２のように、増幅及び融解曲線解析を行なった。
【００６７】
各０．５μＭのＢＡＴ２５−Ｕｐｓｔｒｅａｍプライマー（配列番号：５；tcg cct cca aga atg taa gt）及びＢＡＴ２５−Ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍプライマー（配列番号：６；tct gca ttt taa cta tgg ctc ）、３’末端をフルオレセインで標識した０．１５μＭ  ＢＡＴ２５−ドナー−ハイブリダイゼーションプローブ（配列番号：７；caa aaa aaa aaa aaa aaa aaa aaa aat ca）、５’末端をＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｄｙｅ  ＬＣ−Ｒｅｄ−７０５（ロシュモレキュラーバイオケミカルズ社製）で標識した０．１５μＭ  ＢＡＴ２５−アクセプター−ハイブリダイゼーションプローブ（配列番号：８；aac aaa aca caa aac tct tta gag aat c ）を、ＢＡＴ２５  ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ増幅に用いた。
【００６８】
ＢＡＴ２５増幅プログラムは、９５℃９０秒の１回の変性ステップ及びシグナル検出のための９５℃／０秒−６０℃／１０秒の５０サイクル、及び７２℃／１０秒を含んだ。９５℃／０秒、３５℃／３０秒でアンプリコンをインキュベートし、連続的なＦ３検出をしながら０．２℃／秒ずつ９５℃まで温度を上昇させることにより融解プロファイルを行なった。結果を図４に示す。ＢＡＴ２５の融解点解析は、正常組織及びＭＳＳ腫瘍ＤＮＡにおいて、４４．５℃のＴｍ値を示した（図４Ａ）が、２つのＭＳＩ−Ｈ腫瘍のＢＡＴ２５−Ｔｍ値は、有意に低く４２℃であった（図４Ｂ）。
【００６９】
実施例４  ＢＡＴ２６及びＢＡＴ２５のリアルタイムデュプレックスＰＣＲ
１つのチューブ内でＢＡＴ２５とＢＡＴ２６とを解析するためのデュプレックス−ＰＣＲに関して、プライマーと、配列番号：１〜８のＢＡＴ２５及びＢＡＴ２６の両方のＦＲＥＴ−ハイブリダイゼーションプローブとを実施例２及び３に示された濃度で合わせた。
【００７０】
ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ増幅プログラムは以下のとおりである：９５℃９０秒の１回の変性ステップ及びシグナル検出のための９５℃／０秒−６０℃／１０秒−４５℃／２秒の５０サイクル、及び７２℃／１０秒。デュプレックス融解曲線プログラムは、：９５℃／０秒、３０℃／３０秒及びＦ２とＦ３における連続的な蛍光検出を用いて、０．２℃／秒ずつ９５℃までの温度上昇であった。
【００７１】
ＢＡＴ２５及びＢＡＴ２６のデュプレックスＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ増幅を行なった場合、ＢＡＴ２５及びＢＡＴ２６の別のＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ解析に比べてより高いＴｍ値が得られた（図５）。ＢＡＴ２５に関して、Ｔｍの差異は、４℃であった（図５Ａ）。ＢＡＴ２６のＴｍ値は、１℃高かった（図５Ｂ）。
【００７２】
【表１】
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【００７３】
【発明の効果】
本発明の反復配列と非反復配列とからなる標的核酸の解析方法によれば、ゲル電気泳動による断片分離を行なうことなく、迅速かつ簡便に標的核酸を解析することができるという優れた効果を奏する。また、本発明のポリヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブによれば、非常に長い反復構造の解析が可能になるという優れた効果を奏する。
【００７４】
【配列表】
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【００７５】
0003844996.tif 000004
【００７６】
0003844996.tif 000005
【００７７】
0003844996.tif 000006
【００７８】
0003844996.tif 000007
【００７９】
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【００８０】
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【００８１】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明のハイブリダイゼーションプローブの概略図を示す。反復は、矢印で示される。
【図２】図２は、本発明のＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブの概略図を示す。反復は、矢印で示される。
【図３】図３は、本発明のモノヌクレオチド反復遺伝子座ＢＡＴ２６のマイクロサテライト解析の結果を示す。
【図４】図４は、本発明のモノヌクレオチド反復遺伝子座ＢＡＴ２５のマイクロサテライト解析の結果を示す。
【図５】図５は、本発明のモノヌクレオチド反復遺伝子座ＢＡＴ２５及びＢＡＴ２６のマルチプレックスマイクロサテライト解析の結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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