(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
多重層リポソームを含有し、ヒト又は動物に投与するための診断用組成物であって、該組成物は場合によって一枚膜リポソームが共存することもあり、前記リポゾームは少なくとも１種の造影剤を含みそしてこの造影剤を含む水性媒体中に懸濁しており、ここで前記造影剤は１又は複数のヨウ化フェニル基又は重金属クラスターもしくはキレートを含むＸ−線造影剤及び超音波造影剤をから選択され、この超音波造影剤は生体内で気体を生成する液体、固体又は半固体の化合物であり、前記リポソームは中性リン脂質及び荷電リン脂質を含んで成り、該リポソームの平均粒子直径は50〜3000 nmであり、そして該リポソームの内部を満たす水性相中の造影剤の濃度は、リポソームがその中に懸濁している水性媒体中のそれと実質的に同じである、ことを特徴とする診断用組成物。
【請求項２】
前記リポソームが懸濁している水性媒体が等張性である、請求項１に記載の診断用組成物。
【請求項３】
前記中性リン脂質及び／又は荷電リン脂質が、少なくとも14個の炭素原子を含有する実質的に胞和された少なくとも１個の脂肪酸残基を含んで成る、請求項１又は２に記載の診断用組成物。
【請求項４】
前記中性リン脂質及び／又は荷電リン脂質が、28個以下の炭素原子を含有する実質的に胞和された少なくとも１個の脂肪酸残基を含んで成る、請求項１〜３のいずれか１項に記載の診断用組成物。
【請求項５】
前記中性リン脂質がホスファチジルコリンである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の診断用組成物。
【請求項６】
前記荷電したリン脂質がホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、又はホスファチジン酸とアミノアルコールとのエステルである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の診断用組成物。
【請求項７】
ホスファチジル基が合成又は半合成のジパルミトイルホスファチジル又はジステアロイルホスファチジル基である、請求項５又は６に記載の診断用組成物。
【請求項８】
前記リポソームの平均粒子直径が150 nm〜1000 nmである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の診断用組成物。
【請求項９】
前記リポソームの封入容量が少なくとも５ml／ｇである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の診断用組成物。
【請求項１０】
前記リポソームの封入容量が少なくとも６ml／ｇである、請求項９に記載の診断用組成物。
【請求項１１】
前記中性リン脂質と荷電リン脂質との重量比が60:1〜4:1である、請求項１〜10のいずれか１項に記載の診断用組成物。
【請求項１２】
全脂質の濃度が20 mg／ml〜100 mg／mlである、請求項１〜11のいずれか１項に記載の診断用組成物。
【請求項１３】
全脂質の濃度が50 mg／ml〜80 mg／mlである、請求項１〜12のいずれか１項に記載の診断用組成物。
【請求項１４】
前記Ｘ線造影剤が、１又は複数のヨウ化フェニル基又は重金属クラスターもしくはキレートを含むＸ−線造影剤である、請求項13に記載の診断用組成物。
【請求項１５】
前記造影剤がイオジキサノールである、請求項14に記載の診断用組成物。
【請求項１６】
前記造影剤が、生体内で気体を形成する液体、固体又は半固体の化合物を含む超音波造影剤であるである、請求項１に記載の診断用組成物。
【請求項１７】
全脂質の濃度が少なくとも20 mg／mlである、請求項16に記載の診断用組成物。
【請求項１８】
診断における造影法において使用するための、請求項１〜17のいずれか１項に記載の診断用組成物。
【請求項１９】
請求項１に記載の診断用組成物の製造方法において、中性リン脂質及び荷電リン脂質を溶剤中に溶解し、溶剤を除去して残渣を得、そして前記残渣を造影剤含有水溶液と混合し、そして造影剤を封入するリポソームを形成することを特徴とする方法。
【請求項２０】
前記のごとくして形成されたリポゾームをメンブランフィルターを通して押し出し、リポゾームの粒子径を小さくする、請求項19に記載の方法。
【請求項２１】
請求項１〜17のいずかれ１項に記載された診断用組成物をオートクレーブ滅菌して無菌の診断用組成物を製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は１又は複数の造影剤を封入したリポソームを含んで成る注射用の診断用組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
造影剤は画像のコントラストを増強するために様々な分野の画像診断において使用されており、それらのうちの最も重要なものはＸ線画像診断、磁気共鳴画像診断（ＭＲＩ）、超音波画像診断および核医学画像（Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ｉｍａｇｉｎｇ）診断である。
【０００３】
コンピューター断層撮影（ＣＴ）やデジタルサブトラクションアンギオグラフィ（ＤＳＡ）などの応用を含むＸ線画像診断では、造影は電子密度の差を基にしている。現在使用されているＸ線造影剤は一般に重元素を基剤としており、その例として胃腸系の視覚化を増進するのに用いることができる硫酸バリウムなどのバリウム塩、胃腸系の視覚化や非経口投与に用いることができるヨウド系造影剤が挙げられる。
【０００４】
ヨウド系Ｘ線造影剤は、最も一般的にはヨウ化フェニル基を含み、典型的には３位および／または５位にカルボキシル、カルバモイル、Ｎ−アルキルカルバモイル、Ｎ−ヒドロキシアルキルカルバモイル、アシルアミノ、Ｎ−アルキルアシルアミノおよびアシルアミノメチルから成る群から選ばれた基を有する２，４，６−トリヨードフェニル基を少なくとも１個持つ。この型のイオン性Ｘ線造影剤としては、メトリゾ酸、ジアトリアゾ酸、イオタラム酸、イオキサグル酸およびそれらの酸の塩が挙げられる。
【０００５】
浸透圧が低くその結果として血行力学作用が低いためにイオン性造影剤よりも一般に実質的に毒性が低い非イオン性ヨウド系造影剤としては、イオヘキソール、イオペントール、イオパミドール、イオジキサノール、イオプロミド、イオトロランおよびメトリザミドが挙げられる。例えばイオジキサノールやイオトロランといったいわゆる二量体もそれらの中に含まれ、それらはその等張化によって３００mgＩ／mlを越える濃度で血液と等張になるように製剤化することができる。
【０００６】
最近、重金属クラスター／キレートを基材とした非経口用Ｘ線造影剤が着目されている。例えば、ＷＯ−Ａ−９１１４４６０とＷＯ−Ａ−９２１７２１５を参照のこと。
親水性の点から見て、前述のＸ線造影剤はいずれもほぼ同じ細胞外生体分布を有し、従って類似した臨床上の適応を示し、腎で排出される。従ってより一層臓器特異的な造影剤を見出す試みがなされている。例えば、ヨウド系造影剤の血中半減期の改善を期待して、ヨウ素化フェニル基がデンプンなどの高分子支持体に結合された。
【０００７】
生体内で分解可能な粒子を基にした可能性ある肝造影剤が提唱され（例えばＷＯ−Ａ−８９００９８８とＷＯ−Ａ−９００７４９１を参照のこと）、イオン性または非イオン性のＸ線造影剤を含有するリポソームが提案された（下記参照）。そのような製剤は安定性や毒性の問題のためまだ販売されていなし後期の臨床開発段階に達しておらず、従ってより安定で無毒で且つ臓器特異的なＸ線造影剤への要求はいまだ満たされていない。
【０００８】
造影剤によって操作することができるＭＲＩの主たる造影パラメーターは、スピン−格子緩和時間（Ｔ1 ）とスピン−スピン緩和時間（Ｔ2 ）である。例えばマンガン（２＋）、ガドリニウム（３＋）および鉄（３＋）を基剤とした常磁性キレートはスピン−格子緩和時間（Ｔ1 ）を減少させ、それによってシグナル強度を増加させる。磁性／超常磁性粒子を基剤としたＭＲＩ造影剤はスピン−スピン緩和時間（Ｔ2 ）を減少させ、シグナル強度の減少を引き起こす。
【０００９】
ジスプロシウムを基材とした常磁性キレートや常磁性化合物の大投与量もまたＭＲシグナル強度を減少させるだろう。ＭＲＩ造影剤（その幾つかは開発中であるかまたは市販されている）の総説については、例えばD.D.Stark およびW.G.Bradley:Magnetic Resonance Imaging, Mosby 1992, Chapter １４を参照のこと。
【００１０】
GdDTPA, GdDOTA, GdHPDO3AおよびGdDTPA-BMAといった親水性キレートは細胞外に分布され腎で排出される。そのような化合物は、例えば、中枢神経系の病変を視覚化するのに有用である。他に、より一層臓器または組織特異的な薬剤としては、MnDPDP, GdBOPA, GdEOB-DTPA、常磁性ポルフィリン、高分子化合物、粒状物およびリポソームが挙げられる。
【００１１】
よって様々な常磁性金属イオンやキレートがリポソーム中に封入されている。例えば、多様な脂質組成、表面電荷および大きさを有する小さな一枚膜リポソーム（ＳＵＶ）、大きな一枚膜リポソーム（ＬＵＶ）および多重層リポソーム（ＭＬＶ）がＭＲＩ造影剤として提案されている〔例えば、S.E.Seltzer, Radiology 171（1989）ｐ．19; S.E.Seltzer ら、Invest. Radiol. 23（1988）P.131; C.Tilcockら、Radiology 171 （1989）p.77; C.Tilcock ら、Biochim Biophys.Acta  10222 （1990）p.181; E.C.Ungerら、Invest. Radiol. 25（1990）p.638 ; E.C. Ungerら、Invest.Radiol.23（1988）p.928; E.C.Ungerら、Radiology 171 （1989）p.81; E.C.Unger ら、Magn.Reson.Imaging  7 （1989）p.417 およびJ.Vion-Dury ら、J.Pharmacol.Exp.Ther.  250（1989）p.1113を参照のこと〕。しかしながら、リポソームＭＲＩ造影剤に関する豊富な報告にもかかわらず、そのような製品は１つも今日市販されていないし、また後期臨床開発段階にない。
【００１２】
超音波画像診断は、例えば１〜１０MHz の周波数域の超音波を、変換器を介して人間または動物被検体中に浸透させ、超音波が体組織や体液の界面と相互作用することに基づいている。超音波画像の造影はそのような界面における音波の示差的反射／吸収に由来する。血流を評価するためのカラードプラ（ＣｏｌｏｕｒＤｏｐｐｌｅｒ）の使用を含むドップラー技法を使って結果を倍増させることができる。
【００１３】
造影剤を使って異なる組織／体液の音響特性の差を増幅せしめることが有利であるだろうと長い間理解されており、そして最初の超音波造影剤として１９６８年にインドシアニングリーンが使われて以来、可能性ある造影誘導剤が他に多数実験されている。それらとしては、エマルジョン、固体粒状物、水溶性化合物、遊離気泡および様々な型の封入気体含有系が挙げられる。造影剤が生ずる音響の後方散乱の点から容易に圧縮できる低密度造影剤が特に効果的であることが一般に認められている。よって気体含有系および気体発生系は他の型の造影剤よりも著しく大きい効能を示す傾向がある。
【００１４】
３つの超音波造影剤が現在市販されているかまたは後期臨床開発段階にある。それらは気体含有ガラクトース微結晶を基剤としたＥｃｈｏｖｉｓｔ（商標）、脂肪酸でコーティングした気体含有ガラクトース微結晶を含んで成るＬｅｖｏｖｉｓｔ（商標）、および部分変性されたヒト血清アルブミンにより封入された気泡を含んで成るＩｎｆｏｓｏｎ（商標）である。しかしながら、短い造影半減期（すなわち生体内での安定性の相対的欠失）および／または限定された貯蔵安定性のため、それらの剤の臨床用途は制限される。
【００１５】
従って、優れた貯蔵安定性と生体内安定性（好ましくは心臓および非心臓灌流分析の場合には少なくとも数回の循環の通過の間）を合わせ持つ超音波造影剤、特に心臓および非心臓灌流研究用の超音波造影剤への要求が引き続き存在している。
【００１６】
【発明が解決しようとする課題】
リポソーム製剤の使用や様々な型の造影剤の組織または臓器特異性を増加させる他の技術を提案する多数の刊行物にもかかわらず、市販されているかまたは後期臨床開発段階にあるこの種の製品は現在１つもない。これは低い封入率、毒性、不十分な貯蔵安定性および／または生体内での不安定性または短い造影半減期に関係する問題の結果であると考えられる。従ってそれらの問題を解決する造影剤への要求が残存している。超音波画像診断の分野では、心臓および非心臓灌流での使用のため十分に高い生体内安定性を示す造影剤、および効率的な肝画像診断を可能にするのに十分安定である製剤への特別な要求が存在する。
【００１７】
一般に、脂質可溶性薬剤はリポソーム中に容易に封入される。他方、水溶性薬剤のうち水溶性電解質は、薬剤の電荷と荷電した脂質の電荷の相互作用により（特開平２−１８７３７０）またはリポソームの外側と内側のpH勾配により（ＷＰＩ  ８８−２７１０２２／３８）リポソームの内部水相中に封入することができる。
【００１８】
しかしながら、上記方法を使っても封入される薬剤の量はそれ程多くない。特に、薬剤が水溶性非電解質物質である場合、上述の手段を適用することはできず、従ってリポソーム中に水溶性非電解質を効率的に封入することは容易ではない。水溶性非電解質を効率的にリポソームの内部水相中に封入するための手段として、逆相蒸発法（Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 75(9) 巻、4194頁、1978) 、エーテル注入法（同書、４４３巻、６２９頁、１９７５）等が提唱された。
【００１９】
しかしながら、そのような方法は低い発火点を有するエーテルを使用するため、多量のリポソームの工業生産に利用することができない。更に、それらの方法によって製造されるリポソームは主に一枚膜リポソームである。多重層リポソームに比べると、一枚膜リポソームは血中での安定性が低いという欠点を有する。
【００２０】
国際特許出願Ｗ８８／０９１６５は、リポソーム中のＸ線造影剤溶液及びリポソームが懸濁されている緩衝化生理食塩水連続相を含む注射用リポソーム調製物を記載している。Ｘ線造影剤を含有する水性媒体中にリポソームが形成されるが、注射のためにはそれを遠心分離により単離し、そして緩衝液に再懸濁しなければならない。注射用無菌組成物を調製するためにリポソーム調製物をオートクレーブ滅菌することができれば非常に便利である。無菌条件下で混合物の個々の成分から製剤を調製することは高コストであり確実でない。又、該リポソーム懸濁液は濾過滅菌も可能であるが、そのような滅菌法はリポソームの粒子径を小さくし、その結果保持率も低くなる。
【００２１】
更に、オートクレーブ温度（１２１℃）より非常に低い相転移温度（Tc）を有するため、リポソーム懸濁液のオートクレーブ処理は成功しなかった。すなわち、リポソームの内部にのみＸ線造影剤を有する、ＷＯ８８／０９１６５のリポソーム調製物のごときリポソーム調製物をオートクレーブ殺菌する際に、Ｘ線造影剤がリポソームから出てしまうことを本発明者らは見出した。本発明者らはまた、リポソームの外側の溶解したＸ線造影剤の濃度が脂質層の内水相のそれと実質的に同一であるような、連続相中のリポソームをオートクレーブ滅菌することにより、上記の問題を回避することができることを見出した。この様なオートクレーブ滅菌は通常、冷却及び貯蔵の後注射の直前に開放されるまで維持されるシールされた容器中で行われる。
【００２２】
本発明はまた、リポソーム膜を形成するために中性脂質及び荷電脂質を使用し、そしてリポソームの平均粒子径を比較的小さく、例えば５０〜３００nmのサイズ範囲に保つことにより、封入効率、毒性、製造工程及び／又は製品寿命に関して、造影における使用のためにリポソーム造影剤が改良され得るという知見に基いている。このリポソームは、例えば５ml／ｇ以上の高い封入容量をもたらすリポソーム膜間の静電的反発を提供する正味負電荷又は正味正電荷を担持する。
【００２３】
本発明の１つの特徴によれば、本発明者らは、多重層リポソームを含有し且つ水性媒体中に懸濁した少なくとも１種の造影剤を含有するヒト又は動物に投与するための診断組成物であって、該組成物は場合によって一枚膜リポソームが共存することもあり、前記リポソームは中性リン脂質及び荷電リン脂質から成り、該リポソームの平均粒子径は５０〜３０００nmであり、そして該リポソームの内部を満たす水性相中の造影剤の濃度が、リポソームがその中に懸濁している水性媒体中のそれと同じであることを特徴とする診断組成物を提供する。
【００２４】
従って、液で満たされたリポソームを含んで成る本発明の組成物は、肝臓及び脾臓に集りそしてこれらの造影を助ける造影剤を含んで成るリポソームと共に、全身的造影剤として常用の血液プール造影要求を満たす常用の造影媒体の外部連続相を含んで成る。
本発明のリポソーム懸濁液は、内部水相での高い封入容量（例えば５ml／ｇ以上、好ましくは６ml／ｇ以上）を有し、そしてそれ故に多量の水溶性薬物を保持することができ、そして血液中及び貯蔵の際並びにオートクレーブ滅菌に対して安定である。
【００２５】
Ｘ線画像診断に使われる本発明の組成物は、例えば、当業界で公知である例えば上述したようなヨウド系Ｘ線造影剤および重金属クラスター／キレートＸ線造影剤のいずれも取り込むことができる。
本発明の組成物中のヨウド系Ｘ線造影剤は、好ましくは１分子あたり３個以上のヨウ素原子を含有し、そして通常１個又は複数個のヨード化されたフェニル基を含有する。非イオン性造影剤、特に高度に親水性であり且つ高濃度でも低い浸透圧しか生じないいわゆる非イオン性二量体、例えばイオジキサノールやイオトロランが好ましい。組成物中の該造影剤の濃度は広範囲に異なることができ、該造影剤の性質、意図する最終組成物の投与経路および臨床上の指標といった因子により影響されるだろう。
【００２６】
典型的な濃度は、例えば、組成物１mlあたり封入ヨウ素１０〜３００mg（好ましくは６０〜１８０mg、さらに好ましくは７０〜１１０mg）の範囲内であろう。組成物ml当りの全ヨウ素の濃度は好ましくは４０〜４５０mg、さらに好ましくは１６０〜３２０mgである。本発明の組成物は通常静脈内に投与され、その投与量も同様に例えば臨床上の指標に応じて広範囲に異なることができるが、一般には血管または肝臓画像診断に典型的な用量は、例えば体重１kgあたりヨウ素５〜３００mgの範囲内であることができる。
【００２７】
本発明のリポソーム製剤中の重金属クラスター／キレートは、好ましくはヨウ素の原子番号よりも大きい原子番号を有する少なくとも２つの金属原子を含む。この型の代表的造影剤としては、例えば、ＷＯ−Ａ−９１１４４６０およびＷＯ−Ａ−９２１７２１５中に記載されたタングステンクラスター／キレートが挙げられる。非イオン性クラスター／キレートが好ましいだろう。
【００２８】
ＭＲ画像診断用の本発明の組成物は、例えば、当業界において公知の例えば上述したような常磁性剤のいずれも含むことができる。そのような常磁性造影剤は、例えば、小胞中に封入するかまたは共有結合させることができ、あるいは脂質膜中に非共有結合的に取り込むことができる。
【００２９】
常磁性造影剤は、例えば、生理学的に許容される常磁性金属塩もしくはキレートであることができ、または遊離基、好ましくはニトロキシド型の遊離基を含むことができる。常磁性剤が遊離金属イオンである場合、マンガン（２＋）塩が好ましい。キレートは好ましくはマンガン（２＋）、ガドリニウム（３＋）、ジスプロシウム（３＋）または鉄（３＋）を基礎にしており、文献（例えばＷＯ−Ａ−９１１０６４５を参照のこと）中に記載されたようなキレート化剤、例えばＮＴＡ，ＥＤＴＡ，ＨＥＤＴＡ，ＤＴＰＡ，ＤＴＰＡ−ＢＭＡ，ＢＯＰＴＡ，ＴＴＨＡ，ＮＯＴＡ，ＤＯＴＡ，ＤＯ３Ａ，ＨＰ−ＤＯ３Ａ，ＥＯＢ−ＤＴＰＡ，ＴＥＴＡ，ＨＡＭ，ＤＰＤＰ、ポルフィリンおよびそれらの誘導体を含むことができる。
【００３０】
組成物中のそのような常磁性剤の濃度は、例えば、１mM〜０．５Ｍの範囲内であることができる。本発明のＭＲ画像診断用組成物は、通常静脈内に投与され、その典型的な用量は、例えば、体重１kgあたり封入金属キレート０．０２ミリモルであろう。上記と同様、濃度と用量は該常磁性剤の性質、意図する投与経路および臨床上の指標といった因子により影響されるだろう。
【００３１】
ＭＲ画像診断用のリポソーム製剤はまた、例えば封入により、超常磁性剤または強磁性剤、例えば当業界で公知のもの、も含むことができる。この型の好ましい剤としては、磁鉄鉱、γ−Ｆｅ2 Ｏ3 、混合フェライト、および有機強磁性材料を包含する磁性を有する他の鉄含有化合物が挙げられる。封入される剤は、遊離であるかまたは例えばデキストラン、脂肪酸もしくは磁性材料を安定化することが知られている他の生体に無害な化合物でコーティングすることができる。生成物が非経口用である場合、該コーティング皮膜は生体内で分解されなければならない。該剤は４nm〜１μｍ、好ましくは４〜４０nmの範囲内の粒径を有する粒子の水性懸濁液の形であるのが好都合である。
【００３２】
そのような診断剤の濃度は、例えば０．０１mM〜０．１Ｍの範囲内であることができ、その用量は薬剤の性質、その生体分布および臨床上の指標により影響されるだろう。血管画像診断（灌流を含む）または肝画像診断用の典型的用量は、例えば、静脈内投与の場合体重１kgあたり封入された鉄０．１〜１００μモルの範囲内であることができる。
超音波画像診断用のリポソーム組成物は、ドップラー技術を包含するあらゆる型の超音波技術において用いることができる。そのような組成物は、好ましくは生理学的に許容される気体が中に封入されているリポソームまたは気体前駆体が中に封入されているか共有結合されているリポソームを含んで成る。
【００３３】
一般にいずれの生体適合性気体でも本発明に係る超音波組成物中に存在することができ、例えば空気、窒素、酸素、水素、亜酸化窒素、二酸化炭素、あるいはさらに好ましくは、水に不溶性の気体、例えばヘリウム、アルゴン、六フッ化硫黄、および任意にフッ素化されることがある低分子量の炭化水素、例えばパーフルオロアルカン（Ｃ2 〜Ｃ7 ）、アセチレンまたは四フッ化炭素あるいはこれらの混合物が存在することができる。本明細書中で使用する「気体」なる用語は、３７℃の正常体温で気体形態である任意物質を包含し、従ってジエチルエーテル又はある種のパーフルオロアルカン類のような低温で沸騰する液体を包含する。
【００３４】
気体前駆体としては、アミノマロン酸塩；炭酸塩および炭酸水素塩、例えば炭酸リチウム、炭酸水素リチウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸アンモニウム、炭酸カルシウムおよび炭酸水素マグネシウム；生理学的に許容されるジアゾニウム化合物；ＣＯ−Ｏ−ＣＲ1 Ｒ2 −Ｏ−ＣＯ−ＯＲ3 の型の基を含有する炭酸エステル；並びにβ−ケト酸が挙げられる。
【００３５】
それらは様々な形式で反応して気体含有リポソームを生成することができる。例えば、炭酸塩と炭酸水素塩は投与後に体内で一般的である酸性pH値によって生体内で二酸化炭素を発生することができ；ジアゾニウム化合物は例えばＵＶ光を照射すると窒素を発生することができ；炭酸エステルは生体内で非特異的エステラーゼと相互作用して二酸化炭素の発生をもたらし；β−ケト酸は自然に脱炭酸するであろう。
【００３６】
本発明に係る超音波組成物は、例えば、経口的または非経口的に投与することができるが、ファローピウス管のような体腔中への直接投与における特定適用に有利であるかもしれない。しかしながら一般には、心臓および心臓外灌流を包含する血管画像診断を増進するために、おそらく最も普通には静注による血管内投与が用いられるだろう。その安定性のため、そのように投与される組成物のほとんどが最終的には細網内皮細胞系による取込み、主として肝臓中への取込みを受け、良好な肝臓超音波造影強化を与えるだろう。
【００３７】
圧縮性の容易さは低密度超音波造影剤の望ましい性質である。本発明の組成物中のリポソームは本質的に非固体のマトリックスを含んで成るので、それらは相当な程度の柔軟性を示すだろう。これは従って圧縮性を増加させ、それにより本発明の気体充填型超音波組成物のエコー源性（ｅｃｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）を増加させるだろう。
【００３８】
本発明のリポソームの膜形成のための必須成分の１つは、実質的に飽和された脂肪酸残基を含んで成る中性リン脂質である。脂肪酸残基中の炭素原子の数は通常少なくとも１４、好ましくは少なくとも１５、より好ましくは少なくとも１６である。脂肪酸残基中の炭素原子の数が１４未満であると、内部水相を収容するリポソームの能力は低く、投与後の血中でのリポソームの安定性も低い。他方、通常、脂肪酸残基中の炭素原子の数が２８以上であると、生体適合性が低くなり、リポソームの製造時に非常に高い温度が必要となる。
【００３９】
「実質的に飽和された」という用語は、使用する中性リン脂質中の脂肪酸残基が完全に飽和されている（Ｃ−Ｃ二重結合を全く含まない）か、または不飽和の程度が非常に低いことを意味する。実質的に飽和されている脂肪酸残基よりなる中性リン脂質については、ヨウ素価によって示される不飽和度が２０以下であり、好ましくはヨウ素価が１０以下であることが必要である。不飽和度が高すぎると、保持率が低くなり、又リポソームが容易に酸化され、加熱滅菌するのが困難になる。
【００４０】
本発明において使われる中性リン脂質は、例えば中性グリセロリン脂質、例えば、部分的にもしくは完全に水素添加された天然、例えば大豆もしくは卵黄由来、または合成のホスファチジルコリン、特に半合成または合成のジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）またはジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）を好ましい例としてあげることができる。
【００４１】
本発明のリポソームの膜形成のための必須成分のもう１つは、実質的に飽和された脂肪酸残基を含んで成る荷電リン脂質である。脂肪酸残基中の炭素原子の数は通常少なくとも１４、好ましくは少なくとも１５、より好ましくは少なくとも１６である。脂肪酸残基中の炭素原子の数が１４未満であると、内部水相を収容するリポソームの能力は低く、投与後の血中でのリポソームの安定性も低い。他方、通常、脂肪酸残基中の炭素原子の数が２８以上であると、生体適合性が低くなり、リポソームの製造時に非常に高い温度が必要となる。
【００４２】
「実質的に飽和された」という用語は、使用する荷電リン脂質の脂肪酸残基が完全に飽和されている（Ｃ−Ｃ二重結合を全く含まない）か、または不飽和の程度が非常に低いことを意味する。実質的に飽和されている脂肪酸残基よりなる荷電リン脂質については、ヨウ素価によって示される不飽和度が２０以下であり、好ましくはヨウ素価が１０以下であることが必要である。不飽和度が高すぎると、保持率が低くなり、又リポソームが容易に酸化され、加熱滅菌するのが困難になる。
【００４３】
本発明において使われる荷電リン脂質は、例えば正または負に荷電したグリセロリン脂質である。負に荷電したリン脂質としては、例えば、ホスファチジルセリン、例えば部分的にもしくは完全に水素添加された天然、例えば大豆もしくは卵黄由来、または半合成のホスファチジルセリン、特に半合成または合成のジパルミトイルホスファチジルセリン（ＤＰＰＳ）またはジステアロイルホスファチジルセリン（ＤＳＰＳ）を；
【００４４】
ホスファチジルグリセロール、例えば部分的にもしくは完全に水素添加された天然（例えば大豆または卵黄由来）または半合成のホスファチジルグリセロール、特に半合成または合成のジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）またはジステアロイルホスファチジルグリセロール（ＤＳＰＧ）を；ホスファチジルイノシトール、例えば部分的にもしくは完全に水素添加された天然（例えば大豆または卵黄由来）または半合成のホスファチジルイノシトール、特に半合成または合成のジパルミトイルホスファチジルイノシトール（ＤＰＰＩ）またはジステアロイルホスファチジルイノシトール（ＤＳＰＩ）を；
【００４５】
ホスファチジン酸、例えば部分的にもしくは完全に水素添加された天然（例えば大豆または卵黄由来）または半合成のホスファチジン酸、特に半合成または合成のジパルミトイルホスファチジン酸（ＤＰＰＡ）またはジステアロイルホスファチジン酸（ＤＳＰＡ）が挙げられる。このような荷電リン脂質は通常単独で使用されるが、２種以上使用してもよい。但し、２種以上使用した場合には、負電荷のリン脂質同士又は正電荷のリン脂質同士で使用することが、リポソームの凝集防止の観点から望ましい。
【００４６】
正に荷電したリン脂質は、例えば、ホスファチジン酸とアミノアルコールとのエステル、例えばジパルミトイルホスファチジン酸またはジステアロイルホスファチジン酸とヒドロキシエチレンジアミンとのエステルを好ましい例としてあげることができる。
本発明によれば、中性リン脂質と荷電したリン脂質の重量比は、通常は２００：１〜３：１、好ましくは６０：１〜４：１、より好ましくは４０：１〜５：１、例えば約１０：１である。
【００４７】
本発明のリポソームは、上述の２つの必須成分に加えて様々な任意化合物を含むことができる。例えば、酸化防止剤としてビタミンＥ（α−トコフェロール）および／またはビタミンＥ酢酸エステルを脂質の総量に関して０．０１〜２モル％、好ましくは０．１〜１モル％の量で添加することができる。
このような脂質からなる本発明のリポソームからなる診断用組成物においては、総脂質濃度として一般に２０mg／ml〜１００mg／ml、好ましくは４０mg／ml〜９０mg／ml、更に好ましくは５０mg／ml〜８０mg／mlとすることが造影剤のリポソーム内への保持率の向上の点から好ましい。
【００４８】
上述の造影剤は、投与後にリポソームが体内に安定に維持されるように、好ましくは等張溶液または懸濁液（体内の生理学的浸透圧に関して）の形でリポソーム中に封入される。媒質として、水、緩衝液、例えばＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液等を使うことができる。
【００４９】
室温での好ましいpH範囲は６．５〜８．５、さらに好ましくは６．８〜７．８である。Ｘ線造影剤が多ヒドロキシル基を担持する非イオン性造影剤、例えばイオヘキソール、イオジキサノール又はイオパミドールである場合、緩衝液は好ましくは、米国特許No. ４２７８６５４に記載されているような、負の温度係数を有するものである。アミン緩衝液は要求される性質を有しており、好ましくはＴＲＩＳである。このタイプの緩衝液はオートクレーブ温度において低いpHを有し、このことがオートクレーブ中のＸ線造影剤の安定性を増し、他方室温においては生理的に一層許容されるpHにもどる。
【００５０】
等張溶液または懸濁液を得るためには、等張溶液を提供する濃度で造影剤を媒質中に溶解または懸濁させる。例えば造影剤の溶解性が低いために造影剤が単独では等張溶液を提供できない場合、等張溶液が形成されるように他の非毒性水溶性物質、例えば塩化ナトリウムの如き塩類、マンニトール、グルコース、ショ糖、ソルビトール等の糖類を媒質に添加することができる。
【００５１】
上述のごとく、本発明の組成物の１つの利点はオートクレーブに対して耐えることである。これらは、その脂質組成のためによい封入容量及び封入率を有する。
又、後述する如く、本発明のリポソームからなる診断用組成物は優れた造影効果を有すると共に、副作用の面でも優れている。
【００５２】
次に、本発明のリポソームの製造方法について説明する。本発明のリポソームは、多重層リポソームの形成に使われる常法によって製造することができる。それらの方法としては、Ｂａｎｇｈａｍ法（J.Mol.Dial. 13, 238-252, 1965)、多価アルコール法（特公平４−３６７３４）、脂質溶解法（特公平４−３６７３５）、メカノケミカル法（特公平４−２８４１２）が挙げられる。
【００５３】
一般的には、上記のごときリン脂質をクロロホルム、メタノール、ジクロロメタン、エタノール等の揮発性有機溶媒や該有機溶媒と水との混合溶媒に溶解の後、該溶媒を除去し、得られる残渣と造影剤を含有した水相とを混合し、振とうまたは攪拌することにより、目的とする多重層リポソームを製造することができる。  該製造法における溶媒の除去工程につき、除去手段としてエバポレーションを用いた場合には該製造法はバンガム法となり、また噴霧乾燥を用いた場合には上記製造法は噴霧乾燥法となり、更に凍結乾燥を用いることも可能である。
【００５４】
上記のごときリポソームの製造法において、脂質に対する溶媒の使用量は特に限定されず、脂質を十分溶解できる量であればよい。得られた脂質と溶媒との混合物より、エバポレーションにより溶媒を除去するには常法、具体的には減圧下、所望によっては不活性ガスの雰囲気下で溶媒を蒸発させればよく、その際具体的に使用する溶媒としては上記のごとき揮発性有機溶媒や該有機溶媒１０容量部と多くとも水１容量部との混合溶媒を例示することができる。
【００５５】
また、凍結乾燥により溶媒を除去するには凍結温度を使用した溶媒の凝固点以下、一般的には−３０〜−５０℃で凍結し次いで０．００５〜０．１Torr程度の減圧条件で除去可能な溶媒を選択し、これを除去すればよい。更に、噴霧乾燥により溶媒を除去するには一般的には空気圧を１．０kg／cm2 、風量を０．３５cm3 ／分とし、この時の入口温度は使用した溶媒の沸点以上とすればよく、例えば溶媒としてクロロホルムを使用した場合には６０〜９０℃として、以下常法に従って溶媒を除去すればよい。
【００５６】
かくして得られた脂質の残渣を、用いた脂質の相転移温度（Tc）以上の温度で造影剤含有水溶液と混合し、次いで該Tc以上の温度で激しくもしくは穏やかに振とうもしくは攪拌することにより目的とするリポソーム及びその製剤を製造することができる。
使用する水溶液の電解質イオン濃度は保持率等の点から可及的少量が望ましく、具体的には、薬物以外の陽イオン及び陰イオンを含めた総イオン濃度として約４０mM以下、より好ましくは約２０mM以下とすることが望ましい。
リポソームの粒子径の表示としては一般に重量平均粒子径と個数平均粒子径が用いられるが、リポソームの保持容量の観点からは重量平均粒子径で表わすことが望ましい。
【００５７】
本発明のリポソームの重量平均粒子径は一般に５０nm〜３，０００nm、好ましくは１５０nm〜１０００nm、より好ましくは２００nm〜５００nmである。上記の所望の粒径を得るためには、予め決められたポアサイズを有するフィルターを通して大きい粒径のリポソームを濾過するという押出濾過法〔Biochim.Biophys.Acta 557巻、第９頁(1979)〕を使用すればよい。
【００５８】
本発明のリポソームは多重膜を有するリポソームを一定の比率で含む。一般に、上記の方法により最初に形成されたとき、リポソームは多重膜であるが、上記の好ましい技法によれば、リポソーム懸濁液は例えば約１ミクロンの孔サイズを有する１又は複数の微孔フィルターに通され、脂質の外層が除去されて一枚膜リポソーム及び多重層リポソームの混合物が残る。一般に、多重層リポソームの比率は３０重量％以上であり、好ましくは４０重量％以上である。多重層リポソームは安定性の点で幾つか利点を有するが、比較的大比率の一枚膜リポソームも許容される。一枚膜リポソームは多重層リポソームよりも大きい封入容量を提供するからである。
【００５９】
こうして調製したリポソームは水性媒質（外液）中の懸濁液として存在し、診断用組成物として利用される。リポソームの形成中にリポソームの中に封入されなかった造影剤の溶液は外液中に存在する。あるいは、リポソームの外側に存在する溶液を別の外液で置換することができるが、内液及び外液中の造影剤の濃度は同じであるべきである。いずれの場合にせよ、外液（分散媒）はリポソームの内部水相に対して等張であるのが好ましい。
かくして製されたリポソーム懸濁液中における電解質イオン濃度は保存安定性や加熱滅菌での安定性の点から、可及的少量にすることが望ましく一般的には薬物以外の陽イオン及び陰イオンを含めた総イオン濃度として約４０mM以下、より好ましくは約２０mM以下とすることが望ましい。
【００６０】
本発明のリポソームの封入容量は少なくとも５ml／ｇ脂質、好ましくは少なくとも６ml／ｇである。
本発明の方法によってヨウド系Ｘ線造影剤を封入する時、比較的高いヨウ素／脂質比を有する生成物を与えることにより費用と潜在的毒性問題を削減するために、最初の水性溶液中の該造影剤の濃度は高い方が望ましい。しかしながら、本発明によれば、ヨウ素と脂質との重量比の好ましい範囲は１．３〜１．４５である。これは幾つかの従来技術の比率より低い。ＷＯ８８／０９１６５の場合、下限は１．５である。
【００６１】
本発明の最も好ましいＸ線造影組成物は中性リン脂質としての水素添加ホスファチジルコリン及び荷電脂質としての水素添加ホスファチジルセリンを、好ましくは１０：１の比率で含んで成る。この様な組成物は７ml／ｇを超える封入容量を有することができる。このような組成物において使用するための最も好ましいＸ線造影剤はイオジキサノールである。リポソームの内側及び外側の水性媒体は好ましくは約４００mg／mlのイオジキサノール、並びにソルビトールのごとき浸透圧調節剤、ＥＤＴＡＮａ2 −Ｃａのごとき安定化剤及びＴＲＩＳ緩衝剤（pH約７．４）を含有する。
【００６２】
ＭＲ画像診断用のリポソーム組成物は、この方法により、例えばＧｄＨＰＤ０３Ａのような常磁性ＭＲ造影剤の水性溶液または例えば約１０nmの粒度を有するＦｅ3 Ｏ4 のような超常磁性ＭＲＩ造影剤の水性懸濁液を封入することにより、調製することができる。前記のような懸濁液は、例えば、鉄（２＋）塩と鉄（３＋）塩の混合物からの磁鉄鉱の制御沈澱により調製することができる。
造影剤がリポソーム膜に共有結合されているリポソーム組成物は、例えば、ＵＳ−Ａ−５１３５７３７に記載のものと同様な方法を使って製造することができる。
【００６３】
超音波画像診断用の気体含有組成物は、様々な方法で、例えば気体含有一枚膜リポソームおよび多重層リポソームの調製について記載されているのと同様な技術を使って、調製することができる。そのような技術は、例えば、ＵＳ−Ａ−４５４４５４５，ＵＳ−Ａ−４９００５４０，ＷＯ−Ａ−９１０９６２９およびＷＯ−Ａ−９１１５２４４中に記載されている。例えば、pH感受性気体前駆体の溶液を封入し、次いで系のpHを変化させてリポソーム内部での気体の生成を促す。
【００６４】
そのような場合、膜を通過する水素イオンまたは水酸化物イオンの輸送を助け、それによってpH変化を促進させるために、小胞の膜の中に１または複数のイオノホアを組み込んでおくことが有利であるかもしれない。例えば、上述のＷＯ−Ａ−９１０９６２９を参照のこと。
あるいは、炭酸エステル溶液を非特異的ヒトエステラーゼと一緒に封入し、生じたリポソームを例えば３７℃で５日間インキュベートしてもよい。その後、浮んでいる二酸化炭素含有小胞を分離し、適宜製剤すればよい。
【００６５】
気体含有小胞の他の製造方法は、水性媒質を封入している予め形成されたリポソームの懸濁液に気体の外圧を適用することを含む。一般に気体は非常に高圧で、例えば少なくとも約５気圧で適用されるだろう。
【００６６】
他の製造方法は、水性媒体、又はグリセロール及びポリエチレングリコールのごときリン脂質を安定化することが知られている水溶性生体受容性有機溶剤と水との混合物に、選択されたリン脂質を分散せしめ、そしてこの溶液を、選択された気体又は気体混合物の存在下で激しく撹拌することを含む。あるいは、前記リン脂質溶液を選択された気体又は気体混合物の存在下で超音波処理することによりリポソームを形成することもできる。
本発明の超音波造影剤を製造するために任意の気体、例えば空気、窒素、酸素、水素、亜酸化窒素、二酸化炭素、又はさらに好ましくは水不溶性気体、例えばヘリウム、キセノン、アルゴン、六弗化硫黄、及び低分子量の場合によっては弗素化されている炭化水素、例えばメタン、アセチレン又は四弗化炭素、あるいはこれらの混合物を用いることができる。
一般に、いずれかの画像診断方式で使われる本発明の組成物は、所望であればリポソームの循環半減期を増加させるためにポリエチレングリコールのような物質で改質せしめることができる。これは心血管画像診断を含む用途において特に有利であろう。
下記の非限定的実施例は本発明を例証するためのものである。
【００６７】
【実施例】
実験
（１）粒径の測定
得られたリポソームの重量平均粒子径は、ダイナミック光散乱測定器ＤＬＳ−７００（大塚電子株式会社）を使って準弾性光散乱法によって測定した。
【００６８】
（２）封入容量の測定
リポソームの内部水相の容積は、リポソーム製剤中に収容された水溶性非電解質であるイオジキサノールの比率により算出した。即ち、１mlのリポソーム製剤のうち内部水相の容積が０．４mlである時、イオジキサノールの封入率は４０％である。封入容量はグラム単位の脂質あたりの内部水性相の容積として定義される。例えば、リポソーム製剤の脂質の濃度が０．０５６ｇ／mlであり、リポソーム中イオジキサノールの封入率が４０％である時、リポソーム１ml中に０．０５６ｇの脂質が０．４mlの内部水相を収容するので、封入容量は７１ml／ｇ脂質となる。
【００６９】
リポソーム製剤中のイオジキサノールの封入率はゲル濾過法によって測定した。すなわち、移動相として生理的食塩水を使ってゲル濾過カラム（担体：Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ５０；カラム直径１６mm；カラム高さ３００mm）を通してリポソーム製剤をゲル濾過し、溶出液を分画した（２．５ml／分画）。各分画より０．８mlを採取し、メタノール２mlを加えて攪拌した後、クロロホルム１mlを加えて攪拌し、いったん全体を澄明に溶解させた。
【００７０】
これにクロロホルム１mlを加えて攪拌し、更に蒸留水１．２mlを加えて攪拌後、冷却遠心分離機（久保田商事（株）ＫＲ−７０２型）にて遠心分離（３５００rpm 、１０分、室温）し、分離した二層の上層（水及びメタノール相）に回収されるイオジキサノール濃度を２４６nmでの吸光度により測定した。溶出液中のイオジキサノール濃度が高い場合には、蒸留水にて適宜希釈した後、０．８mlを採取し、メタノール、クロロホルム及び蒸留水による抽出操作を行った。
【００７１】
Ｖｏｉｄ  ｖｏｌｕｍｅに溶出するリポソーム分画中のイオジキサノール量を溶出液に回収されたイオジキサノール量の総量（２５フラクションまでに回収されたイオジキサノール量）で除し、主薬保持率とした。なおリポソーム分画の終点は、イオジキサノール濃度が極小となる分画とした。
【００７２】
実施例１：Ｘ線造影剤イオジキサノールの封入
卵黄由来の水素添加ホスファチジルコリン（ＨＥＰＣ）０．６４０ｇ、ＨＥＰＣから合成した水素添加ホスファチジルセリン（ＨＥＰＳ）０．０６４ｇ、およびクロロホルムとメタノールと水の混合物（重量比１００：２０：０．１）６０mlをフラスコ中で混合した。この混合物を湯浴（６５℃）上で加熱してリン脂質を溶解させ、そして生じた溶液をロータリーエバポレーター中で６０℃で加熱して溶剤を蒸発させた。
【００７３】
残渣を更に２時間真空乾燥し、脂質フィルムを形成せしめた。イオジキサノール（１，３−ビス（アセチルアミノ）−Ｎ，Ｎ′−ビス〔３，５−ビス（２，３−ジヒドロキシプロピルアミノカルボニル）−２，４，６−トリヨードフェニル〕−２−ヒドロキシプロパン０．４ｇ／ml）とショ糖（０．０５ｇ／ml）を含む水溶液を６５℃に加熱し、この加熱した溶液１０mlを脂質フィルムと混合し、この混合物を６５℃に加熱しながらミキサーで１０分間攪拌した。この混合物を１．０μｍのポアサイズを有するポリカーボネートメンブランフィルターを通して加圧下で１回濾過し、多重層リポソーム（ＭＬＶ）を調製した。
【００７４】
こうして調製したＭＬＶをガラスバイアル中に入れ、１２１℃で２０分間オートクレーブ滅菌した。その結果を表１に示す。
尚、保持容量の測定は、実験例の（３）と同様に行なった。重量平均粒子径の測定は実験例の（１）と同様に行なった。
【００７５】
【表１】
0003759765.tif 000002
【００７６】
実施例２：イオジキサノールの封入
実施例１に記載の方法に従って、イオジキサノールを含有するリポソーム製剤を調製した。結果を表２に示す。
【００７７】
【表２】
0003759765.tif 000003
実施例３．
実施例１で得られたリポソーム懸濁液を等張グルコースにより希釈して５０mg封入ヨウ素／mlの濃度とした。希釈の後、懸濁液は乳白色に変わった。この乳懸液の顕微鏡分析の際にリポソームの凝集体は観察されなかった。乳濁液を１年間貯蔵した後、封入されたイオジキサノールの量及びサイズ分布への影響は観察されなかった。
【００７８】
実施例４．
実施例３の乳濁液をラットに静脈内注射した。封入されたイオジキサノールの大部分が、注射後に肝臓に分布することを確認したが、脾臓にも高濃度のイオジキサノール濃度が検出された。注射後、組織に分布したイオジキサノールは時間と共に減少し、最終的にはこれら２つの器官中にイオジキサノールは見られなくなった。他のすべての器官のイオジキサノールのレベルは血中イオジキサノールのレベルと平行して低下した。注射されたイオジキサノールの大部分は尿中に回収された。
【００７９】
実施例５．
実施例３の乳濁液を多数の肝癌転移を有するラットに静脈内注射した。封入ヨウ素５０mg及び１００mg／kgの投与量において、それぞれ４２及び６２HUCT値のＸ線減衰が肝臓の正常領域で観察されたが、腫瘍転移部での減衰への影響は最小であった。肉視的観察により、検出された腫瘍が直径５mm未満であることが示された。
【００８０】
実施例６．
実施例３の乳濁液を、封入ヨウ素２００〜７５００mg／kg体重の投与量においてマウスの群に静脈内注射した。体重増加及び死亡を１４日間にわたり追跡した。分析の結果により、すべての動物は、リポソーム封入イオジキサノール３ｇ／kgの注射に対して生存したことが示された。これらの動物は、注射されなかった動物に比べて、観察期間にわたり体重増加の鈍化を示さなかった。リポソーム封入イオジキサノール４ｇ及び５ｇ／kgの投与量において、体重増加のわずかな投与量依存的減少が存在し、そして死が観察された。ＬＤ50はリポソーム封入イオジキサノール５ｇ／kgと推定された。
【００８１】
実施例７．
ラットでの封入ヨウ素１００〜１０００mg／kgの投与量での実施例１の乳濁液の１回の又は反復（３注射／週、３週間）静脈内注射の後、種々の組織結合酵素の血中レベルを測定し、そしてすべての主要器官の組織を種々の時点で分析した。血清酵素について、食塩水を注射した対照動物と比べてわずかな効果のみが観察された。肝臓及び脾臓中の貪食細胞の投与量依存的な空胞変性の増加とは別に、リポソームによる組織学的変化は検出されなかった。貪食細胞の空胞変性の程度は、肝臓及び脾臓に分布するイオジキサノールの減少と平行して低下した。
【００８２】
実施例８．
次の成分：
イオジキサノール（全量）                      ４００mg／mL
封入されたヨウ素                                ８０mg／mL
ソルビトール                                    ２０mg／mL
トロメタモール（ＴＲＩＳ）                ０．０９７mg／mL
ＥＤＴＡＮａ2 Ｃａ                            ０．１mg／mL
水素添加ホスファチジルコリン                ５１．２mg／mL
水素添加ホスファチジルセリン                  ５．１mg／mL
注射用水（添加して右の量にする）                  １mL（約０．９mL）
を含んで成る診断組成物。
【００８３】
方法
リン脂質をクロロホルム／メタノール／水（容量比（４：１：０．０２５）に溶解し、そして溶剤を蒸発させた（ロータリーエバポレーション）。イオジキサノール及びソルビトールの等張液を作り、そして６０〜７０℃に加熱し、そしてその後の工程の間この温度を維持した。リン脂質混合物を撹拌しながら加え、そしてリポソームを形成した。リポソームのサイズを調整するため、この調製物をホモジナイズした（Ｒｏｔｏｒ／Ｓｔａｔｏｒホモジナイザー）。次に、リポソームを、直列に配置された７枚のポリカーボネートフィルター（孔直径１μｍ）を通して押出した。
生成物を、イオジキサノール及びソルビトールの等張溶液で希釈し、そしてトロメタモール及びＥＤＴＡを添加した。生成物を濾過してガラスバイアルに入れ、そして１２１℃にて１５分間オートクレーブ滅菌した。
【００８４】
実施例９．イオトロラン含有リポソーム
イオジキサノールの代りにイオトロラン（ｉｏｔｒｏｌａｎ）を用い、実施例８に記載したのと同様にしてリポソームを調製した。
実施例１０．水素添加ホスファチジルグリセロールによるイオジキサノール含有リポソーム
水素添加ホスファチジルセリンの代りに水素添加ホスファチジルグリセロールを使用し、実施例８に記載したのと同様にしてリポソームを調製した。
【００８５】
実施例１１．ＭＲＩ造影剤（ガドリニウム）
水素添加ホスファチジルコリン及び水素添加ホスファチジルセリンの脂質フィルムを、実施例１に記載したようにして調製する。１０mlのＧｄ  ＨＰＤＯ３Ａの０．５Ｍ溶液を６５℃に加熱する。この混合物を６５℃で加熱しながらミキサーにより１５分間攪拌する。この混合物を、孔サイズ１．０μｍのポリカーボネート膜フィルターを通して加圧下に濾過して多重層リポソーム（ＭＬＶ）を調製する。ＭＬＶをガラスバイアルに入れ、そして１２１℃にて２０分間オートクレーブ滅菌する。ＭＬＶはＧｄ  ＨＰＤＯ３Ａを含有している。
【００８６】
実施例１２．ＭＲＩ造影剤（マンガン）
Ｇｄ  ＨＰＤＯ３Ａの代わりに３，６−ビス〔Ｎ−（２，３−ジヒドロキシプロピル）−Ｎ−メチルカルバモイルメチル〕−３，６−ジアザスベリン酸のマンガンキレートの溶液（０．０７Ｍ）（ＷＯ  ９３／２１９６０（Ｎｙｃｏｍｅｄｌｍａｇｉｎｇ  ＡＳ）に従って調製）を用いて実施例１１に従ってリポソームを調製する。ＭＬＶはマンガンキレートを含有する。
【００８７】
実施例１３．ＭＲＩ造影剤（ジィスプロシウム）
Ｇｄ  ＨＰＤＯ３Ａの代わりにＤｙ  ＤＴＰＡ−ＢＭＡの溶液（０．５Ｍ）を用いて実施例１１に従ってリポソームを調製する。ＭＬＶはＤｙ  ＤＴＰＡ−ＢＭＡを含有する。
【００８８】
実施例１４．ＭＲＩ造影剤（酸化鉄）
Ｇｄ  ＨＰＤＯ３Ａの代わりに磁性酸化鉄の懸濁液（１０mM、粒子サイズ１０〜３０nm）を用いて実施例１１に従ってリポソームを調製する。ＭＬＶは磁性酸化鉄を含有する。
【００８９】
実施例１５．リポソーム性Ｇｄ  ＨＰＤＯ３Ａ（ＨＥＰＣ−ＨＥＰＳ）
卵黄由来の水素添加ホスファチジルコリン（ＨＥＰＣ）６４０mgと実施例１に記載したようにしてＨＥＰＣから合成した水素添加ホスファチジルセリン（ＨＥＰＳ）６４mgとの前調製混合物を、２５０mM  Ｇｄ  ＨＰＤＯ３Ａ（ガドテリドール）を含有するグルコースの５％水溶液（等張溶液）１０mlを収容したバイアルに加えた。この混合物を６５℃にて３０分間撹拌し、そしてさらに１時間、この温度に保持した。このリポソーム溶液を５回凍結−融解処理し、そして６５℃にて２枚重ねの４００nmポリカーボネートフィルターを通して５回押出し、標記生成物を得た。
【００９０】
実施例１６．リポソーム性Ｇｄ  ＨＰＤ３０Ａ（ＤＰＰＣ／ＤＰＰＧ）
ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）６４０mgと実施例１に記載したようにして調製したジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）との脂質ブレンドを、２５０mM  Ｇｄ  ＨＰＤＯ３Ａを含有するグルコースの５％水溶液（等張液）１０mlを収容したバイアルに加えた。この混合物を５０℃にて３０分間撹拌し、そしてさらに１時間この温度で保持した。リポソーム溶液を５回凍結−融解処理し、そして５０℃にて２枚重ねの４００nmポリカーボネートフィルターを通して５回押出した。
【００９１】
実施例１７．リポソーム性Ｇｄ  ＤＴＰＡ−ＢＭＡ
水溶液がＧｄ  ＨＰ−ＤＯ３Ａの代りに２５０mM  Ｇｄ  ＤＴＰＡ−ＢＭＡ（ガドジアミド）を含有した他は、実施例１５と同じ方法を用いた。
実施例１８．リポソーム性Ｄｙ  ＴＴＨＡ
溶液がＧｄ  ＨＰ−ＤＯ３Ａの代りに２５０mM  Ｄｙ  ＴＴＨＡ（トリエチレンテトラミン六酢酸のジスプロシウム錯体）を含有した他は、実施例１５と同じ方法を用いた。
【００９２】
実施例１９．超音波造影剤
Ｇｄ  ＨＰＤＯ３Ａの代わりに食塩水を用いて実施例８に従ってリポソームを調製する。混合物を窒素により１時間加圧する（７０psi)。過剰の窒素を除去し、そして生ずる混合物を、１．０μｍの孔サイズを有するポリカーボネート膜フィルターを通して濾過する。得られるＭＬＶは窒素ガスを含有する。
実施例２０．
実施例８の分散液をラットに注射（ｉ．ｖ）したところ、このラットは７５mgＩ（封入されたもの）／kgの４７ΔＨＵ及び１００mgＩ（封入されたもの）／kgの７０ΔＨＵにおいて、肝臓でＸ線減衰を与えた。
実施例２１．
実施例８の分散液を雄性及び雌性のラットに注射した。ラットにおける静脈投与のおよそのＬＤ５０は２０００mgＩ（封入されたもの）／kg体重であった。