(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
タイプＩリボソーム不活性化タンパク質の類似体であって、前記類似体が、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質での分子間ジスルフィド結合のために自然には存在しない位置に対応するアミノ酸位置にて、分子間ジスルフィド結合のために使用できるシステインを有しており、そして、前記システインが、配列番号：１の２５１位に対応する位置から前記類似体のカルボキシ末端位置に至る前記類似体のアミノ酸配列中の位置にて位置し、前記タイプＩリボソーム不活性化タンパク質が、ゲロニンおよび大麦リボソーム不活性化タンパク質からなる群より選択される、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質の類似体。
【請求項２】
前記タイプＩリボソーム不活性化タンパク質が、ゲロニンである請求の範囲第１項に記載の類似体。
【請求項３】
前記システインが、前記類似体の２４４位からカルボキシ末端位置の前記類似体内の位置にある請求の範囲第２項に記載の類似体。
【請求項４】
前記システインが、前記類似体の２４７位からカルボキシ末端位置の前記類似体内の位置にある請求の範囲第３項に記載の類似体。
【請求項５】
前記システインが、前記類似体のアミノ酸配列の２４４位にある請求の範囲第３項に記載の類似体。
【請求項６】
前記システインが、前記類似体のアミノ酸配列の２４７位にある請求の範囲第４項に記載の類似体。
【請求項７】
４４位および５０位での天然ゲロニンシステイン残基が、アラニン残基と置換されている請求の範囲第２項に記載の類似体。
【請求項８】
前記システインが、前記類似体のアミノ酸配列の２４８位にある請求の範囲第４項に記載の類似体。
【請求項９】
前記タイプＩリボソーム不活性化タンパク質が、大麦リボソーム不活性化タンパク質である請求の範囲第１項に記載の類似体。
【請求項１０】
前記システインが、前記類似体の２５６位からカルボキシ末端位置の前記類似体内の位置にある請求の範囲第９項に記載の類似体。
【請求項１１】
前記システインが、前記類似体の２６０位からカルボキシ末端位置の前記類似体内の位置にある請求の範囲第１０項に記載の類似体。
【請求項１２】
前記システインが、前記類似体のアミノ酸配列の２５６位にある請求の範囲第１０項に記載の類似体。
【請求項１３】
前記システインが、前記類似体のアミノ酸配列の２７０位にある請求の範囲第１１項に記載の類似体。
【請求項１４】
前記システインが、前記類似体のアミノ酸配列の２７７位にある請求の範囲第１１項に記載の類似体。
【請求項１５】
前記類似体のアミノ酸配列での前記システインの前記位置が、配列番号：１の２５９位にあるアミノ酸の位置に対応する請求の範囲第１項に記載の類似体。
【請求項１６】
前記タイプＩリボソーム不活性化タンパク質が、ゲロニンである請求の範囲第１５項に記載の類似体。
【請求項１７】
前記タイプＩリボソーム不活性化タンパク質が、大麦リボソーム不活性化タンパク質である請求の範囲第１５項に記載の類似体。
【請求項１８】
前記類似体のアミノ酸配列での前記システインの前記位置が、配列番号：１の２５９位に対応する請求の範囲第１項に記載の類似体。
【請求項１９】
前記タイプＩリボソーム不活性化タンパク質が、大麦リボソーム不活性化タンパク質である請求の範囲第１８項に記載の類似体。
【請求項２０】
タイプＩリボソーム不活性化タンパク質の類似体であって、前記類似体が、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質での分子間ジスルフィド結合のために自然には存在しない位置に対応するアミノ酸位置にて、分子間ジスルフィド結合のために使用できるシステインを有しており、そして、前記システインが、配列番号：１の２５１位に対応する位置から前記類似体のカルボキシ末端位置に至る前記類似体のアミノ酸配列中の位置にて位置し、前記タイプＩリボソーム不活性化タンパク質が、ゲロニンおよび大麦リボソーム不活性化タンパク質からなる群より選択される、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質の類似体をコードするポリヌクレオチド。
【請求項２１】
前記タイプＩリボソーム不活性化タンパク質が、ゲロニンである請求の範囲第２０項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２２】
前記システインが、前記類似体の２４４位からカルボキシ末端位置の前記類似体内の位置にある請求の範囲第２１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２３】
前記システインが、前記類似体の２４７位からカルボキシ末端位置の前記類似体内の位置にある請求の範囲第２２項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２４】
前記システインが、前記類似体のアミノ酸配列の２４４位にある請求の範囲第２２項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２５】
前記システインが、前記類似体のアミノ酸配列の２４７位にある請求の範囲第２３項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２６】
４４位および５０位での天然ゲロニンシステイン残基が、アラニン残基と置換されている請求の範囲第２１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２７】
前記システインが、前記類似体のアミノ酸配列の２４８位にある請求の範囲第２３項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２８】
前記タイプＩリボソーム不活性化タンパク質が、大麦リボソーム不活性化タンパク質である請求の範囲第２０項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２９】
前記システインが、前記類似体の２５６位からカルボキシ末端位置の前記類似体内の位置にある請求の範囲第２８項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３０】
前記システインが、前記類似体の２６０位からカルボキシ末端位置の前記類似体内の位置にある請求の範囲第２９項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３１】
前記システインが、前記類似体のアミノ酸配列の２５６位にある請求の範囲第２９項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３２】
前記システインが、前記類似体のアミノ酸配列の２７０位にある請求の範囲第３０項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３３】
前記システインが、前記類似体のアミノ酸配列の２７７位にある請求の範囲第３０項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３４】
タイプＩリボソーム不活性化タンパク質の類似体であって、前記類似体が、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質での分子間ジスルフィド結合のために自然には存在しない位置に対応するアミノ酸位置にて、分子間ジスルフィド結合のために使用できるシステインを有しており、そして、前記システインが、配列番号：１の２５１位に対応する位置から前記類似体のカルボキシ末端位置に至る前記類似体のアミノ酸配列中の位置にて位置し、前記タイプＩリボソーム不活性化タンパク質が、ゲロニンおよび大麦リボソーム不活性化タンパク質からなる群より選択される、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質の類似体をコードするベクター。
【請求項３５】
タイプＩリボソーム不活性化タンパク質の類似体であって、前記類似体が、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質での分子間ジスルフィド結合のために自然には存在しない位置に対応するアミノ酸位置にて、分子間ジスルフィド結合のために使用できるシステインを有しており、そして、前記システインが、配列番号：１の２５１位に対応する位置から前記類似体のカルボキシ末端位置に至る前記類似体のアミノ酸配列中の位置にて位置し、前記タイプＩリボソーム不活性化タンパク質が、ゲロニンおよび大麦リボソーム不活性化タンパク質からなる群より選択される、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質の類似体をコードするポリヌクレオチドを含むＤＮＡベクターを含む宿主細胞。
【請求項３６】
前記タイプＩリボソーム不活性化タンパク質が、ゲロニンである請求の範囲第３５項に記載の宿主細胞。
【請求項３７】
前記システインが、前記類似体のアミノ酸配列の２４７位にある請求の範囲第３６項に記載の宿主細胞。
【請求項３８】
前記宿主細胞が、ＡＴＣＣ受託Ｎｏ．６９００９として寄託されたタイプの細胞である請求の範囲第３７項に記載の宿主細胞。
【請求項３９】
前記タイプＩリボソーム不活性化タンパク質が、大麦リボソーム不活性化タンパク質である請求の範囲第３５項に記載の宿主細胞。
【請求項４０】
前記システインが、前記類似体のアミノ酸配列の２７７位にある請求の範囲第３９項に記載の宿主細胞。
【請求項４１】
前記宿主細胞が、ＡＴＣＣ受託Ｎｏ．６８７２２として寄託されたタイプの細胞である請求の範囲第４０項に記載の宿主細胞。
【請求項４２】
細胞に毒性を呈する接合体であって、システインを介して前記細胞に特異的に結合する分子にジスルフィド結合によって連結されたタイプＩリボソーム不活性化タンパク質の類似体を含み、前記システインが、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質での分子間ジスルフィド結合のために自然には存在しない位置に対応するアミノ酸位置にて位置しており、そして、前記システインが、配列番号：１の２５１位に対応する位置から前記類似体のカルボキシ末端位置に至る前記類似体のアミノ酸配列中に位置し、前記タイプＩリボソーム不活性化タンパク質が、ゲロニンおよび大麦リボソーム不活性化タンパク質からなる群より選択される、細胞に毒性を呈する接合体。
【請求項４３】
前記タイプＩリボソーム不活性化タンパク質が、ゲロニンである請求の範囲第４２項に記載の接合体。
【請求項４４】
前記システインが、前記類似体の２４７位からカルボキシ末端位置の前記類似体内の位置にある請求の範囲第４３項に記載の接合体。
【請求項４５】
前記システインが、前記類似体のアミノ酸配列の２４７位にある請求の範囲第４４項に記載の接合体。
【請求項４６】
４４位および５０位での天然ゲロニンシステイン残基が、アラニン残基と置換されている請求の範囲第４３項に記載の接合体。
【請求項４７】
前記システインが、前記類似体のアミノ酸配列の２４８位にある請求の範囲第４４項に記載の接合体。
【請求項４８】
前記タイプＩリボソーム不活性化タンパク質が、大麦リボソーム不活性化タンパク質である請求の範囲第４２項に記載の接合体。
【請求項４９】
前記システインが、前記類似体の２６０位からカルボキシ末端位置の前記類似体内の位置にある請求の範囲第４８項に記載の接合体。
【請求項５０】
前記システインが、前記類似体の２７０位からカルボキシ末端位置の前記類似体内の位置にある請求の範囲第４９項に記載の接合体。
【請求項５１】
前記システインが、前記類似体のアミノ酸配列の２５６位にある請求の範囲第４９項に記載の接合体。
【請求項５２】
前記システインが、前記類似体のアミノ酸配列の２７０位にある請求の範囲第５０項に記載の接合体。
【請求項５３】
前記システインが、前記類似体のアミノ酸配列の２７７位にある請求の範囲第５０項に記載の接合体。
【請求項５４】
前記タイプＩリボソーム不活性化タンパク質が、抗体に結合している請求の範囲第４３項に記載の接合体。
【請求項５５】
前記タイプＩリボソーム不活性化タンパク質が、Ｈ６５抗体に結合している請求の範囲第５４項に記載の接合体。
【請求項５６】
前記タイプＩリボソーム不活性化タンパク質が、抗体断片に結合している請求の範囲第４３項に記載の接合体。
【請求項５７】
前記タイプＩリボソーム不活性化タンパク質が、キメラおよびヒト型化抗体断片からなるグループから選択された抗体断片に結合している請求の範囲第５６項に記載の接合体。
【請求項５８】
前記抗体断片が、Ｆａｂ抗体断片、Ｆａｂ’抗体断片、およびＦ（ａｂ’）２抗体断片からなるグループから選択される請求の範囲第５６項に記載の接合体。
【請求項５９】
前記抗体断片が、Ｆａｂ抗体断片、Ｆａｂ’抗体断片、およびＦ（ａｂ’）２抗体断片からなるグループから選択される請求の範囲第５７項に記載の接合体。
【請求項６０】
タイプＩリボソーム不活性化タンパク質での分子間ジスルフィド結合のために自然には存在しない位置に対応するアミノ酸位置にて、分子間ジスルフィド結合のために使用できるシステインに置換した、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質の類似体であって、そして、前記システインが、配列番号：１の２５１位に対応する位置から前記類似体のカルボキシ末端位置に至る前記類似体のアミノ酸配列中の位置にて位置する、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質の類似体をコードするポリヌクレオチドを、適切な宿主細胞にて発現する工程を含むタイプＩリボソーム不活性化タンパク質の類似体の製造方法であって、ここで、前記タイプＩリボソーム不活性化タンパク質が、ゲロニンおよび大麦リボソーム不活性化タンパク質からなる群より選択される、方法。
【請求項６１】
タイプＩリボソーム不活性化タンパク質での分子間ジスルフィド結合のために自然には存在しない位置に対応するアミノ酸位置にて、分子間ジスルフィド結合のために使用できるシステインに置換した、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質の類似体であって、そして、前記システインが、配列番号：１の２５１位に対応する位置から前記類似体のカルボキシ末端位置に至る前記類似体のアミノ酸配列中の位置にて位置する、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質の類似体をコードするポリヌクレオチドを、適切な宿主細胞にて発現する工程を含む方法により調製された、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質の類似体であって、ここで、前記タイプＩリボソーム不活性化タンパク質が、ゲロニンおよび大麦リボソーム不活性化タンパク質からなる群より選択される、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質の類似体。
【請求項６２】
タイプＩリボソーム不活性化タンパク質の類似体であって、前記類似体が、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質での分子間ジスルフィド結合のために自然には存在しない位置に対応するアミノ酸位置にてシステインを有しており、そして、前記システインが、配列番号：１の２５１位に対応する位置から前記類似体のカルボキシ末端位置に至る前記類似体のアミノ酸配列中の位置にて位置する、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質の類似体を、システインを介して細胞に特異的に結合する分子に結合する工程を含む細胞に毒性を呈する接合体の製造方法であって、ここで、前記タイプＩリボソーム不活性化タンパク質が、ゲロニンおよび大麦リボソーム不活性化タンパク質からなる群より選択される、方法。
【請求項６３】
システインを介して細胞に特異的に結合する分子を結合したタイプＩリボソーム不活性化タンパク質の類似体を含む細胞毒性治療剤であって、前記類似体が、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質での分子間ジスルフィド結合のために自然には存在しない位置に対応するアミノ酸位置にて、分子間ジスルフィド結合のために使用できるシステインを有しており、そして、前記システインが、配列番号：１の２５１位に対応する位置から前記類似体のカルボキシ末端位置に至る前記類似体のアミノ酸配列中の位置にて位置する接合体であって、ここで、前記タイプＩリボソーム不活性化タンパク質が、ゲロニンおよび大麦リボソーム不活性化タンパク質からなる群より選択される、接合体。
【請求項６４】
ジスルフィド結合を利用するための前記システインが、前記類似体のアミノ酸配列の２４７位にある請求の範囲第７項に記載の類似体。
【発明の詳細な説明】
本願出願は、放棄された1991年11月４日に出願された米国特許出願No.07/787,567の一部継続出願である、係属している1992年７月19日に出願された米国特許出願No.07/901,707の一部継続出願である。
背      景
本発明は、一般には、細胞毒性治療剤の組成物として有用な物質に関する。より具体的には、本発明は、リボソーム不活性化タンパク質をコードするポリヌクレオチド、目標分子への接合のために特異的に修飾されたリボソーム不活性化タンパク質の類似体をコードするポリヌクレオチド、および目標分子をコードするポリヌクレオチドへのリボソーム不活性化タンパク質をコードするポリヌクレオチドの遺伝子融合に関する。
リボソーム不活性化タンパク質（RIPs）は、高等植物に偏在するタンパク質クラスを含む。RIPsは、細菌からも単離されている。RIPsは、真核タンパク質合成の阻害剤である。アデニン塩基に特異的なＮ−グリコシド結合は、真核リボソームの288rRNAの高度に保存されたループ領域において、RIPsによって加水分解的に開裂され、これにより、翻訳を促進する。
Strip et al., FEBS Lerr., 195（1,2）, 1-8（1986）では、植物RIPsを二つのタイプに分類している。タイプＩタンパク質はそれぞれ一本鎖ペプチドから構成され、リボソーム不活性化を有しており、そして、タイプIIタンパク質はそれぞれ、実質的にタイプＩタンパク質と同等の、Ｂ鎖にジスルフィド結合したＡ鎖から構成されており、細胞結合特性を有している。
ゲロニン、ドデカンドリン、トリコサンチン、トリコキリン、ブリオディン、Mirabilis抗ウィルスタンパク質（MAP）、大麦リボソームを不活性化するタンパク質（BRIP）、ヨウシュヤマゴボウ抗ウィルスタンパク質（PAPs）、サポリン、ラフィン、およびモモルディンは、タイプＩRIPsの例であり、そして、リシンとアブリンが、タイプII RIPsの例である。少なくとも活性部位の三次構造が、タイプＩRIPs、細菌RIPs、およびタイプII RIPsのＡ鎖の中に保存されており、そして多くの場合、一次構造相同体が認められる。Ready et al., J.Biol.Chem., 259（24）, 15252-15256（1984）および他の報告は、RIPsの二つのタイプが発展的に関連していることを示唆している。
それらの固有の性質とは別に、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質は、細胞毒性治療剤の組成物としての使用に特に適している。RIPは、in vivoにて、RIPを特定の細胞型に誘導する目標分子へ、これら細胞を選択的に殺傷するために接合する。典型的には、標的物質（例えば、抗体）は、タンパク質毒性のin vivoでの誘導抗体からの分離、および細胞間での活性化を抑制するジスルフィド結合により毒素へ結合される。細胞毒性物質を製造するための他の方法として、標的物質部分をコードする遺伝子を融合したRIPをコードする遺伝子を発現する方法がある。得られるタンパク質生成物は、例えば、抗体の少なくとも一つの鎖に結合したRIPを含んだ一本鎖ポリペプチドである。タンパク質毒素配列を含んだ様々な遺伝子融合物は、最近のPasten et al., Science, 254, 1173-1177（1991）の論文にて議論されている。
タイプＩRIPゲロニンのようなある種のRIPsは、希少植物物質のみからしか入手できないので、そのタンパク質の組み換え生成を可能にするために、RIPsをコードする遺伝子をクローニングするのが望ましい。ほとんどのタイプＩRIPsには目標物質の接合するための天然部位（すなわち、利用可能なシステイン残基）が備わっていないので、目標物質に容易に接合しつつも、その固有の生物学的活性を保持している天然タンパク質の類似体を開発することも望ましい。あるいは、毒素としてのタイプＩRIPsおよび目標部分としての抗体基質を含んだ遺伝子融合物を作成するのが望ましい。
このように、目標分子へ容易に接合されるタイプＩRIPsの類似体およびタイプＩRIPsを含む遺伝子融合生成物のための、タイプＩRIPsをコードするクローニングした遺伝子が、当該技術分野では要望されているのである。
発明の概要
本発明は、目標分子およびタイプＩRIPsを含む融合生成物へジスルフィド結合するための利用可能なシステインを有するタイプＩRIPs、タイプＩRIPsをコードする精製および単離したポリヌクレオチドを提供する。そのポリヌクレオチドを含むベクター、およびそのベクターで形質転換された宿主細胞も提供される。
ゲロニンの固有配列をコードする精製および単離したポリヌクレオチド、およびATCC受託No.68721として寄託されたタイプのゲロニンをコードするベクターを含んだ宿主細胞が提供される。大麦リボソーム不活性化タンパク質の固有配列をコードする精製および単離したポリヌクレオチド、およびモモルディンIIをコードする精製および単離したポリヌクレオチドもさらに提供される。
タイプＩ植物RIPの類似体を、本明細書では、天然タンパク質のリボソーム不活性化活性を有する非自然発生のポリペプチドであり、天然タンパク質のアミノ酸配列とは異なるものとして定義している。本発明による好ましい類似体は、配列番号：１の251位に相当する位置から類似体のカルボキシ末端までのアミノ酸配列内に位置するジスルフィド結合のためのシステインを有しているタイプＩ植物RIPの類似体である。本発明による他の好ましい類似体は、自然配座におけるタンパク質表面にあり、固有の折り畳み構造ならびにリボソーム不活性化タンパク質の生物学的活性が付与されていない類似体においてジスルフィド結合が利用可能なシステインを有するタイプＩRIPsである。最近RIPsの類似体も、本願発明にて意図されている。
本発明は、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質の類似体を提供するものであり、その類似体とは、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質での分子間ジスルフィド結合のために自然には存在しない位置に対応するアミノ酸位置にて、分子間ジスルフィド結合のために使用できるシステインを有しており、そして、当該システインは、配列番号：１の259位に対応する類似体のアミノ酸の位置、あるいは配列番号：１の251位に対応する位置から類似体のカルボキシ末端に至る位置に対応する類似体におけるアミノ酸配列内の位置に存在している。
本発明の類似体は、ゲロニンの類似体である。本発明によるゲロニンの類似体では、システインは、244位から類似体のカルボキシ末端に至る類似体における位置、より好ましくは、247位から類似体のカルボキシ末端に至る類似体における位置、そして、これら領域において、最も好ましくは、類似体のアミノ酸配列の244位、247位、あるいは248位に位置する。44位および50位でのゲロニン・システイン残基が、アラニン残基と置換されるのが好ましい。
本発明の類似体は、大麦リボソーム不活性化タンパク質の類似体である。かような類似体では、好ましくは、システインは、256位から類似体のカルボキシ末端に至る類似体における位置、より好ましくは、システインは、260位から類似体のカルボキシ末端に至る類似体のアミノ酸配列内に位置する。最も好ましくは、これら領域において、類似体のアミノ酸配列の256位、270位、あるいは277位にシステインは位置する。本発明の類似体は、モモルディンIIの類似体である。
本発明の類似体は、配列番号：１の259位の一つのアミノ酸に対応する位置での類似体のアミノ酸配列においてシステインを有する。かような類似体は、ゲロニン、大麦リボソーム不活性化タンパク質、あるいはモモルディンIIの類似体である。本発明は、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質の類似体をコードするポリヌクレオチドも提供するものであり、その類似体とは、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質での分子間ジスルフィド結合のために自然には存在しない位置に対応するアミノ酸位置にて、分子間ジスルフィド結合のために使用できる。システインを有しており、そして、当該システインは、配列番号：１の251位に対応する位置から類似体のカルボキシ末端に至る位置に対応する類似体におけるアミノ酸配列内の位置に存在している。このポリヌクレオチドは、ゲロニンの類似体をコードし、システインが、244位から類似体のカルボキシ末端に至る類似体における位置、より好ましくは、247位から類似体のカルボキシ末端に至る類似体における位置、そして、最も好ましくは、類似体のアミノ酸配列の244位、247位、あるいは248位に位置する類似体が好ましい。本発明によるポリヌクレオチドは、44位および50位でのゲロニン・システイン残基がアラニン残基と置換されているゲロニン類似体をコードするものが好ましい。
本発明のポリヌクレオチドは、大麦リボソーム不活性化タンパク質の類似体をコードし、システインが、256位から類似体のカルボキシ末端に至る類似体における位置、より好ましくは、260位から類似体のカルボキシ末端に至る類似体における位置、そして、最も好ましくは、類似体のアミノ酸配列の256位、270位、あるいは277位に位置する類似体が好ましい。
本発明のポリヌクレオチドは、モモルディンIIの類似体をコードする。
本発明は、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質の類似体をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを提供するものであり、その類似体とは、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質での分子間ジスルフィド結合のために自然には存在しない位置に対応するアミノ酸位置にて、分子間ジスルフィド結合のために使用できるシステインを有しており、そして、当該システインは、配列番号：１の251位に対応する位置から類似体のカルボキシ末端に至る位置に対応する類似体のアミノ酸配列内の位置に存在している。
本発明は、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質の類似体をコードするDNAベクターを含む宿主細胞をさらに提供するものであり、その類似体とは、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質での分子間ジスルフィド結合のために自然には存在しない位置に対応するアミノ酸位置にて、分子間ジスルフィド結合のために使用できるシステインを有しており、そして、当該システインは、配列番号：１の251位に対応する位置から類似体のカルボキシ末端に至る位置に対応する類似体のアミノ酸配列内の位置に存在している。かような宿主細胞にて、ベクターは、ゲロニンの類似体をコードし、特に、ATCC受託No.69009として寄託された宿主細胞のような類似体のアミノ酸配列の247位にシステインがある類似体をコードする。
本発明の宿主細胞は、大麦リボソーム不活性化タンパク質をコードするベクターを含み、特に、ATCC受託No.68772として寄託された宿主細胞のような類似体のアミノ酸配列の277位にシステインがある宿主細胞である。
本発明は、細胞に特異的に結合した分子へのシステインを介したジスルフィド結合により結合したタイプＩリボソーム不活性化タンパク質の類似体を含む細胞に毒性を呈する薬剤も提供するものであり、そのシステインは、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質での分子間ジスルフィド結合のために自然には存在しない位置に対応する類似体のアミノ酸位置にあり、そして、当該システインは、配列番号：１の251位に対応する位置から類似体のカルボキシ末端に至る位置に対応する類似体におけるアミノ酸配列内の位置に存在している。この薬剤は、ゲロニンの類似体を含み、システインが、247位から類似体のカルボキシ末端に至る類似体における位置、そして、類似体のアミノ酸配列の247もしくは248位に位置するのがより好ましい。44位および50位での本来のゲロニン・システイン残基が、アラニン残基と置換されている類似体を含む薬剤が好ましい。
本発明の薬剤は、大麦リボソーム不活性化タンパク質の類似体を含み、システインが、260位から類似体のカルボキシ末端に至る類似体における位置、より好ましくは、270位から類似体のカルボキシ末端に至る類似体における位置、そして、最も好ましくは、類似体のアミノ酸配列の256位、270位、あるいは277位に位置する類似体が好ましい。
本発明の薬剤は、モモルディンIIの類似体を含む。
本発明は、抗体、特に、H65抗体あるいは抗体断片、より好ましくは、キメラおよびヒト型化抗体からなるグループから選択された抗体断片、そして最も好ましくは、Fab抗体断片、Fab'抗体断片、あるいはF（ab'）2抗体断片にタイプＩリボソーム不活性化タンパク質が結合している薬剤を提供する。本発明の薬剤が、Fab抗体断片、Fab'抗体断片、あるいはF（ab'）2抗体断片からなるグループから選択されたキメラあるいはヒト型化抗体を含むのが非常に好ましい。
タイプＩリボソーム不活性化タンパク質の類似体を調製するための本発明の方法は、配列番号：１の251位に対応する位置から類似体のカルボキシ末端に至る位置に対応する類似体におけるアミノ酸配列内の位置に存在し、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質での分子間ジスルフィド結合のために自然には存在しない位置に対応する類似体のアミノ酸位置にて（例えば、RIPをコードする天然DNA配列の特定部位の突然変異誘発あるいはRIP類似体をコードするDNA配列の化学的合成により）置換された分子間ジスルフィド結合のために利用可能なシステインを有する、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質をコードするポリヌクレオチドを適切な宿主細胞で発現する工程を含んでいる。
本発明による生成物は、配列番号：１の251位に対応する位置から類似体のカルボキシ末端に至る位置に対応する類似体におけるアミノ酸配列内の位置に存在し、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質での分子間ジスルフィド結合のために自然には存在しない位置に対応する類似体のアミノ酸位置にて置換された分子間ジスルフィド結合のために利用可能なシステインを有する、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質をコードするポリヌクレオチドを適切な宿主細胞で発現する工程を含んだ方法による生成物である。
本発明は、細胞に特異的に結合した分子へシステインを介してタイプＩリボソーム不活性化タンパク質の類似体を結合する工程を含んだ細胞に毒性を呈する薬剤の製造方法を提供するものであり、その類似体は、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質での分子間ジスルフィド結合のために自然には存在しない位置に対応するアミノ酸位置にシステインを有しており、そして、当該システインは、配列番号：１の251位に対応する位置から類似体のカルボキシ末端に至る位置に対応する類似体におけるアミノ酸配列内の位置に存在している。
本発明によると、特定の細胞の消失が目標とする疾患の治療方法は、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質での分子間ジスルフィド結合のために自然には存在しない位置に対応するアミノ酸位置にシステインを有しており、そして、当該システインは、配列番号：１の251位に対応する位置から類似体のカルボキシ末端に至る位置に対応する類似体におけるアミノ酸配列内の位置に存在している、細胞に特異的に結合した分子へシステインを介して結合したタイプＩリボソーム不活性化タンパク質の類似体を含んだ細胞に毒性を呈する薬剤の治療上有効量を投与を患者に投与する工程を含む。
本発明はまた、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質での分子間ジスルフィド結合のために自然には存在しない位置、およびその自然配座においてリシンＡ鎖表面位置に対応するアミノ酸位置に、分子間ジスルフィド結合のためのシステインを有し、そして、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質のリボソーム不活性化活性を保持しているタイプＩリボソーム不活性化タンパク質の類似体を提供する。
かような類似体は、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質がゲロニンである類似体、そして好ましくは、ATCC受託No.69008として寄託された宿主細胞におけるベクターにてコードされた類似体のアミノ酸配列の10位にシステインがあるゲロニンの類似体である。他のかようなゲロニン類似体には、ゲロニン類似体のアミノ酸配列における60、103、146、184および215位にシステインがあるゲロニンの類似体がある。44および50位のゲロニンシステインが、これら類似体にて、アラニン残基と置換されたものが好ましい。
本発明は、単一システインのみを含んだ類似体である、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質の類似体をさらに提供する。かような類似体は、ゲロニンの類似体であり、好ましくは、類似体のアミノ酸配列の10、44、50もしくは247位に単一システインが位置し、さらに本発明によって規定した他の位置にシステインがある類似体が好ましい。
本発明は、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質での分子間ジスルフィド結合のために自然には存在しない位置、およびその自然配座においてリシンＡ鎖表面位置に対応するアミノ酸位置に、分子間ジスルフィド結合のためのシステインを有し、そして、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質のリボソーム不活性化活性を保持しているタイプＩリボソーム不活性化タンパク質の類似体をコードするポリヌクレオチドを提供する。
本発明によると、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質の類似体を調製する方法は、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質での分子間ジスルフィド結合のために自然には存在しない位置にて置換された分子間ジスルフィド結合のために利用でき、およびその自然配座においてリシンＡ鎖表面位置に対応するアミノ酸位置に分子間ジスルフィド結合のためのシステインを有し、そして、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質のリボソーム不活性化活性を保持しているタイプＩリボソーム不活性化タンパク質の類似体をコードするポリヌクレオチドを適切な宿主細胞で発現する工程を含んでいる。
本発明は、細胞に特異的に結合した分子へシステインを介してタイプＩリボソーム不活性化タンパク質の類似体を含んだ細胞に毒性を呈する薬剤を提供するものであり、その類似体は、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質での分子間ジスルフィド結合のために自然には存在しない位置、およびその自然配座においてリシンＡ鎖表面位置に対応するアミノ酸位置にシステインを有しており、そして、当該類似体は、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質のリボソーム不活性化活性を保持している。
細胞に毒性を呈する薬剤を調製するための本発明の方法は、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質での分子間ジスルフィド結合のために自然には存在しない位置、およびその自然配座においてリシンＡ鎖表面位置に対応するアミノ酸位置にシステインを有し、そして、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質のリボソーム不活性化活性を保持している、細胞に特異的に結合した分子へシステインを介してタイプＩリボソーム不活性化タンパク質の類似体を結合する工程を含む。
特定の細胞の消失が目標とする疾患の治療のための本発明の方法は、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質での分子間ジスルフィド結合のために自然には存在しない位置、およびその自然配座においてリシンＡ鎖表面位置に対応するアミノ酸位置にシステインを有し、そして、タイプＩリボソーム不活性化タンパク質のリボソーム不活性化活性を保持している、細胞に特異的に結合した分子へシステインを介したジスルフィド結合によって結合したタイプＩリボソーム不活性化タンパク質の類似体を含んだ細胞に毒性を呈する薬剤の治療上有効量を投与を患者に投与する工程を含む。
RIP類似体は、細胞毒性治療用薬剤の組成物としての用途に特に適している。本発明による細胞毒性用薬剤は、RIP組成物を第二成分の特異的結合能力によって標的とするタイプの細胞を、in vivoにて選択的に消失させるために使用できる。細胞毒性RIP類似体を形成するために、キメラ、およびCDR-移植した抗体、および抗体領域／断片（例えば、Fab、Fab'、F（ab'）2、一本鎖抗体、およびFvあるいは単一可変領域）へ接合すること、ならびに遊離システイン残基を含むように遺伝子工学的に調製したモノクローナル抗体へ接合することも、本発明の範疇に含まれる。本発明にて有用なFab'およびF（ab'）2断片の例が、本明細書に参考までに組み込んだ、係属中の共願に係る1991年６月14日に出願した米国特許出願No.07/714,175および1989年２月９日付発行の国際公開No.Wo 89/00999に記載されている。本発明によるRIPsは、抗体以外の他の目標物質、例えば、特定の表面炭水化物を有する細胞に結合するレクチン、あるいは、ホルモン、リンフォカイン、成長因子、あるいは特定のレセプターを有する細胞に特異的に結合する他のポリペプチドにも接合する。RIPsを含む免疫接合を、免疫毒素として記している。免疫毒素は、免疫接合よりもむしろ、融合タンパク質から構成されている。
本発明は、抗体の抗原結合部分（例えば、抗体Ｌ鎖あるいは切除したＨ鎖、もしくは一本鎖抗体）、あるいはタイプＩRIPに結合した、先のパラグラフに列挙した目標物質の遺伝子融合物を提供する。遺伝子融合物は、抗体遺伝子の５'端あるいは３'端のいずれかに結合したRIP遺伝子を含む。ペプチドセグメントをコードするDNAリンカーは、毒素と抗体遺伝子の間に挿入あるいは挿入されない。好ましくは、リンカーは、ジスルフィド結合に関与し、プロテアーゼ感受性アミノ酸配列（例えば、配列番号：58）を形成する二つのシステイン、あるいは幾つかのカテプシン開裂部位（例えば、配列番号：59）を含むウサギ筋肉アルドラーゼのセグメントを含んだE. coliシガ様毒素のセグメントをコードする。融合した遺伝子のタイプＩRIP部分は、好ましくは、ゲロニン、BRIP、あるいはモモルディンIIをコードする。さらに好ましくは、融合した遺伝子の抗体部分は、抗体Fab断片の鎖の一つ（すなわち、カッパあるいはFd）をコードする配列を含み、そして融合した遺伝子は、他のFab遺伝子によって宿主細胞にて共発現され、あるいは抗体部分は、一本鎖抗体をコードする配列を含む。
本発明は、陰イオン交換カラムに免疫毒素を含む溶液を通し、プロテインＧカラムに流し込み、そして、プロテインＧカラムから免疫毒素を溶出する工程を含むリボソーム不活性化タンパク質と抗体部分を含む免疫毒素を精製する方法も提供する。この方法はさらに、陰イオン交換カラムでの流体を陽イオン交換カラムに導入し、前記タンパク質を効果的に溶出するために陽イオン交換カラムを溶離剤に曝し、そして、陰イオン交換カラムでの流体を直接プロテインＧカラムに適用するよりもむしろ、流体をプロテインＧカラムに適用する工程を含む。
本発明による免疫毒素は細胞毒性物質を含み、そして、融合タンパク質は、自己免疫疾患、癌、および対宿主性移植片病のような、特定の細胞型の消失を目標とする疾患の治療に適している。免疫毒素はまた、免疫抑制の発生への使用、ならびにヒト免疫不全ウィルスなどのウィルスによる感染の治療での使用に適している。
本発明にて特に説明したポリヌクレオチドは、共に、12301パークローン  ドライブ、ロックビル、メリーランドに所在のAmerican Type Culture Collection（ATCC）に、1991年10月２日に寄託され、A.T.C.C.受託No.68721および68722がそれぞれ付与された、E. coli MC1061（G274株と称する）中のプラスミドpING3731およびE. coli E104（G275株と称する）中のプラスミドpING3803での挿入体である。本発明にてさらに説明を行ったポリヌクレオチド配列は、ATCCに、1992年６月９日に寄託され、A.T.C.C.受託No.69008および69009がそれぞれ付与された、E. coli E104（G277株と称する）中のプラスミドpING3746およびE. coli E104（G276株と称する）中のプラスミドpING3737での挿入体である。本発明にてさらに説明を行っているポリヌクレオチド配列は、ATCCに、1992年10月27日に寄託され、A.T.C.C.受託No.69101、69102、69103および69104がそれぞれ付与された、E. coli E104（G278株と称する）中のプラスミドpING3747、E. coli E104（G279株と称する）中のプラスミドpING3754、E. coli E104（G280株と称する）中のプラスミドpING3758、およびE. coli E104（G281株と称する）中のプラスミドpING3759での挿入体である。
【図面の簡単な説明】
図１は、リシンＡ鎖（RTA）（配列番号：１）のアミノ酸配列とタイプＩリボソーム不活性化タンパク質ゲロニン（配列番号：２）のアミノ酸配列をコンピュータにて調製・整列させたものであり、星印位置は、リシンＡ鎖とタイプＩRIPsのアミノ酸が一致していることを示す。
図２は、リシンＡ鎖（RTA）（配列番号：１）のアミノ酸配列とタイプＩリボソーム不活性化タンパク質BRIP（配列番号：３）のアミノ酸配列をコンピュータにて調製・整列させたものであり、星印位置は、リシンＡ鎖とタイプＩRIPsのアミノ酸が一致していることを示す。
図３は、リシンＡ鎖（RTA）（配列番号：１）のアミノ酸配列とタイプＩリボソーム不活性化タンパク質モモルディンII（MOMOII）（配列番号：４）のアミノ酸配列をコンピューターにて調製・整列させたものであり、星印位置は、リシンＡ鎖とタイプＩRIPsのアミノ酸が一致していることを示す。
図４は、リシンＡ鎖（RTA）（配列番号：１）のアミノ酸配列とタイプＩリボソーム不活性化タンパク質ラフィン（配列番号：５）のアミノ酸配列をコンピューターにて調製・整列させたものであり、星印位置は、リシンＡ鎖とタイプＩRIPsのアミノ酸が一致していることを示す。
図５は、リシンＡ鎖（RTA）（配列番号：１）のアミノ酸配列とタイプＩリボソーム不活性化タンパク質αトリコサンチン（TRICHO）（配列番号：６）のアミノ酸配列をコンピューターにて調製・整列させたものであり、星印位置は、リシンＡ鎖とタイプＩRIPsのアミノ酸が一致していることを示す。
図６は、リシンＡ鎖（RTA）（配列番号：１）のアミノ酸配列とタイプＩリボソーム不活性化タンパク質モモルディンＩ（MOMOI）（配列番号：７）のアミノ酸配列をコンピューターにて調製・整列させたものであり、星印位置は、リシンＡ鎖とタイプＩRIPsのアミノ酸が一致していることを示す。
図７は、リシンＡ鎖（RTA）（配列番号：１）のアミノ酸配列とタイプＩリボソーム不活性化タンパク質Mirabilis抗ウィルスタンパク質（MAP）（配列番号：８）のアミノ酸配列をコンピューターにて調製・整列させたものであり、星印位置は、リシンＡ鎖とタイプＩRIPsのアミノ酸が一致していることを示す。
図８は、リシンＡ鎖（RTA）（配列番号：１）のアミノ酸配列と種から採取したタイプＩリボソーム不活性化タンパク質ヨウシュヤマゴボウ抗ウィルスタンパク質（PAPS）（配列番号：９）のアミノ酸配列をコンピューターにて調製・整列させたものであり、星印位置は、リシンＡ鎖とタイプＩRIPsのアミノ酸が一致していることを示す。
図９は、リシンＡ鎖（RTA）（配列番号：１）のアミノ酸配列と種から採取したタイプＩリボソーム不活性化タンパク質サポニン６（SAP6）（配列番号：10）のアミノ酸配列をコンピューターにて調製・整列させたものであり、星印位置は、リシンＡ鎖とタイプＩRIPsのアミノ酸が一致していることを示す。
詳細な説明
三つの植物型RIPsをコードする遺伝子のヌクレオチド配列、およびその遺伝子を含む発現ベクターが、本発明によって提供される。最初の植物RIP、ゲロニンは、東アジアの熱帯雨林に自生するトウダイグサ科のGelonium multiflorumの種によって生成され、そして、第二の植物RIP、BRIPは、穀物グレインによって一般にわずかに合成される。モモルディンII、三番目の植物RIPは、Momordica balsaminaの種に生成される。BRIPの類似体は、本発明によって提供される。分子間ジスルフィド結合に関与させるために、遊離システインを含めるよう、類似体は遺伝子工学的に処理され、そして、架橋剤によるRIPの非特異的化学誘導無しに、抗体分子の接合される。
本発明のタイプＩRIP類似体は、免疫毒素の組成物として有用な天然タンパク質との顕著な相違を示す。遊離システインが欠如した天然タンパク質における遊離メルカプト基を導入するための化学処理は通常、アミノ酸側鎖の非選択的修飾を含む。非選択性はしばしば、異なるRIP分子（例えば、接合体の異種集団）の異なる部位に接合した抗体をもたらす結果となり、また、抗体がRIPの重要領域あるいはその近傍（例えば、細胞膜を横断する位置にて含まれる活性部位あるいは領域）に接合した場合には、RIP活性が減少することになる。これに対して、本発明のRIP類似体は、類似体の特異的残基へのジスルフィド結合を介して単一抗体に接合でき、免疫接合の態様に対応した変異体の減少を招き、場合によっては、向上した性質（例えば、大きな細胞毒性あるいは溶解性）を備えた免疫接合体をもたらす。
タイプＩ植物RIPs、ならびにシガおよびシガ様毒素Ａ鎖のような細菌RIPsは、リシンＡ鎖と相同であり、そして、本発明において有用である。
タイプＩRIPsは決定され、RIPにおけるシステインの置換のための部位も、RIPの一次アミノ酸配列と天然リシンＡ鎖アミノ酸配列との比較により同定され、その三次構造は、本明細書に参考までに組み込んだKatzin et al., Proteins, 10, 251-259（1991）に記されている。
アミノ酸配列の比較は、タイプＩRIPsを、リシンＡ鎖とタイプＩ植物RIPsが、同一の九つのアミノ酸を有することで定義している。リシン配列に基づくと、同一のアミノ酸は、チロシン21、アルギニン29、チロシン30、チロシン123、ロイシン144、グルタミン酸177、アラニン178、アルギニン180、およびトリプトファン211であった。リシンＡ鎖は、タイプＩRIPsの三次元構造のためのモデルとして使用できる。接合のために利用できるシステインが欠落しているものの、リボソーム不活性化活性、ならびにその一次配列がリシンＡ鎖の一次配列と〔Atlas of Protein Sequence and Structure, ５補遺版３、National Biochemical Research Foundation、ワシントンD.C.（1978）のSchwartz et al., pp.353-358に記載のDayhoff Mutation Data Matrix（MDM-78）を用いて、PC/GENEプログラムPALIGN（インタージェネティック社、マウンテイン・ビュー、カリフォルニア州）によって提供されたMeyers et al., CABIOS COMMUNICATIONS, （4）1, 11-17（1988）に従って〕比較した時に九つの同一のアミノ酸を有しているタンパク質を、タイプＩRIPとして定義され、そして、本発明においての有用性が期待される。本明細書にて使用している「対応する」の語彙は、前出のMeyers et alの方法によって二つのアミノ酸配列を比較したときの相対するアミノ酸位置を意味する。
タイプＩRIPsゲロニン、BRIP、モモルディンII、ラフィン〔Islam et al., Agricultural Biological Chem., 54（5）, 1343-1345（199）を参照〕、αトリコサンティン〔Chow et al., J. Biol. Chem., 265, 8670-8674（1990）を参照〕、モモルディンＩ〔Ho et al., BBA, 1088, 311-314（1989）を参照〕、Mirabilis抗ウィルスタンパク質〔Habuka et al., J．Biol. Chem., 264（12）, 6629-6637（1989）を参照〕、種から単離したヨウシュヤマゴボウ抗ウィルスタンパク質〔Kung et al., Agric. Biol. Chem., 54（12），3301-3318（1990）を参照〕、およびサポリン〔Benatti et al., Eur. J. Biochem., 183, 456-470（1989）を参照〕の一次アミノ酸配列を、上述したように、前出のMeyers et alの方法によって、図１〜９それぞれに、リシンＡ鎖の一次配列との比較を個別に行った。
図１〜９は、システイン残基が置換されるであろうタイプＩRIPsのアミノ酸位置の予測に役立つであろう。システイン置換のための好ましいアミノ酸は、分子表面に存在し、システインと置換された時にタンパク質の折り畳みを妨げない親溶媒性のアミノ酸を含む。かようなアミノ酸を含むリシンＡ鎖の領域は、カルボキシ末端領域である。置換のために使用を避けなければならないアミノ酸は、プロリンのような、適切なタンパク質の折り畳みが不安定であるもの、および非溶媒性のアミノ酸である。さらに使用を避けるべきものとしては、RIPs中で不変の九つのアミノ酸、および前出のKatzin et al.,の図６に記載されたようなリシンＡ鎖の活性部位を含む領域あるいはその近傍にあるアミノ酸がある。
それ故、タイプＩRIPsのための置換の好ましい領域は、親溶媒性で、タイプIIRIP A-鎖およびB-鎖が、ジスルフィド結合により自然に結合されたカルボキシ末端領域に対応するカルボキシ末端領域である。実施例に示した通り、配列番号：１の251位に対応する位置からタイプIIRIPのカルボキシ末端位置に至るアミノ酸配列内にてシステインは置換され、そして、酵素活性を保持し、ジスルフィド架橋能力を備えたRIP類似体が得られるのである。ある好ましいシステイン置換位置は、リシンＡ鎖の259位のシステインの相当する位置の近傍である。
本発明で特に説明した免疫毒素は細胞毒性物資を含み、遺伝子融合生成物は、Ｔ細胞機能が関連するヒト自己免疫疾患の治療における使用に特に適している。免疫毒素による自己免疫疾患の治療は、本明細書に参考までに組み込んだ、共願に係る、1991年９月13日出願の米国特許出願No.07/306,433および1989年８月10日発行の国際公開No.Wo 89/06968に記載されている。自己免疫疾患の例として、全身系紅斑性狼瘡、（苔蘚硬化症、形態および苔蘚プラナスを含む）硬皮症、慢性関節リューマチ、慢性甲状腺炎、天疱瘡、真性糖尿病タイプＩ、進行性全身系硬化症、再生不能性貧血、重症性筋無力症、筋緊張症、ショーグレン疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、および胆汁硬変症がある。自己免疫は、多重硬化症、ブドウ膜炎、乾蘚、およびメニエーラ病のも関連している。様々な自己免疫疾患の一般的な記述が、Rose & Mackey, Eds., The Autoimmune Diseases, Academic Press（1985）に寄せられている。
免疫毒素は、患者に対して、単独に、あるいは、次のものに限定されるものではないが、免疫抑制剤、耐性誘発剤、薬効強化剤および副作用緩和剤を含む、二種類以上の免疫毒素、他の治療剤、組成物などを含んだ混合物として投与できる。宿主のアレルギー反応の抑制に有用な免疫抑制剤が、特に好ましい。好ましい、免疫抑制剤としては、プレドニソン、プレドニソロン、DECADRON（Merck, Sharp & Dohme社、ウェストポイント、ペンシルベニア州）、サイクロホスファミド、サイクロスポリン、6-メルカプトプリン、メトトリキシエート、アザチオプリン、およびi.v. γグロブリンあるいはこれらの混合物がある。好ましい薬効強化剤としては、モネンシン、塩化アンモニウム、ペルヘキシリン、ベラパミル、アマンタジン、およびクロロキンがある。これら薬剤のすべては、Edward R. Barnhartの発行に係るPhysician's Desk Reference, 41st Ed., New Jersey（1987）に開示されたような、一般的に効果が認められた用量にて投与される。本明細書に参考として組み込んだ、1989年８月10日に発行された国際（PCT）出願WO 89/069767は、免疫抑制剤として免疫毒素の投与を開示している。
抗Ｔ細胞免疫毒素は、注射用あるいは局所用製剤として調製される。非経口用製剤は公知であり、本発明において、好ましくは、筋肉あるいは血管内投与での使用に適している。抗Ｔ細胞免疫毒素の治療上効果的な量を含む製剤は、滅菌水溶液、懸濁液、あるいは凍結乾燥体のいずれかであり、任意に、安定剤あるいは賦形剤を含む。凍結乾燥した組成物は、網状赤血球溶解物分析にて測定した際に20ng/ml以下の生物学的活性を有し、約0.01mg／宿主体重kg〜10mg/kgのレベルになるように、適切な希釈液、例えば、注射用水、生理食塩水、0.3％グリシンなどで復元する。抗Ｔ細胞免疫毒素を含む薬学的組成物は、典型的には、約0.01mg／kg〜5mg／患者kgの範囲における治療上効果的な量が投与される。抗Ｔ細胞免疫毒素を含む薬学的組成物の治療上効果的な量は、好ましくは、患者への投与量を段階的に増大する方法にて、数日間から二週間にわたる毎日の約１時間の点滴によって投与された患者において、約0.01mg／kg〜0.5mg／患者体重kgの範囲にある。
抗Ｔ細胞免疫毒素は、皮膚用の担体に抗Ｔ細胞免疫毒素の治療上効果的な量を含有せしめることで、局所療法用の局所用製剤が調製される。投与すべき抗Ｔ細胞免疫毒素の量、および局所用製剤における抗Ｔ細胞免疫毒素の濃度は、選択した担体、患者の臨床状態、全体的毒性、および製剤中の抗Ｔ細胞免疫毒素の安定性に依存している。このように、投与対象の患者あるいは同様の疾患の患者の臨床状態によって、医師は、製剤中の抗Ｔ細胞免疫毒素の適切な濃度ならびに投与する製剤の適切な量を含んだ製剤を使用するのである。局所用製剤のための抗Ｔ細胞免疫毒素の濃度は、約0.1mg/ml〜25mg/ml以上の範囲にある。典型的には、局所用製剤のための抗Ｔ細胞免疫毒素の濃度は、約１mg/ml〜20mg/ml以上の範囲にある。抗Ｔ細胞免疫毒素の固形分散液ならびに安定化製剤が使用できる。そして、治療効果を最高ならしめるために、担体に使用される正確な濃度は、適当な実験的操作の対象となる。約10mg抗Ｔ細胞免疫毒素/100ｇ担体以上を、１％w/w水和ゲル担体と併用すれば、皮膚炎症の治療において有用である。ゲルに加えて、適切な担体としては、鉱物油、石油などを用いた水中油あるいは油中水エマルジョンがある。
抗Ｔ細胞免疫毒素は、経皮治療システムを使用することで、局所的に効果的に投与される〔Barry, Dermatological Formulations, p.181（1983）およびそこで引用された文献〕。かような局所的誘導システムは、低分子量薬剤の経皮投与のために設計されたものであるが、経皮誘導することができる。それらは、抗Ｔ細胞免疫毒素あるいはその誘導体の投与に非常に適しており、律速御微小孔膜の適切な選択による治療用タンパク質と関連する。
全身もしくは局所誘導用いずれかの抗Ｔ細胞免疫毒素の局所用製剤が使用され、上述したような非経口投与用の賦形剤、および共溶媒、界面活性剤、油、湿潤剤、緩和薬、防腐剤、安定化剤、および抗酸化剤のような局所用調製物に使用される他の賦形剤を含む。薬学的に許容される緩衝液、例えば、Trisあるいは燐酸緩衝液が使用される。局所用製剤は、強化剤、界面活性剤、促進剤、吸着増進剤、あるいは抗Ｔ細胞免疫毒素または他の薬剤の皮膚への浸透を促進する薬剤のような浸透促進剤と称する様々な薬剤の一つ以上も任意に含む。かような薬剤は、当業者に周知の下記特性のすべてあるいはいずれかを備えているのが望ましい。すなわち、薬理学的不活性、体液の不活化あるいは電界質損失、抗Ｔ細胞免疫毒素（非不活性化）との拮抗性、およびクリーム、ゲル、あるいは他の所望の局所用誘導システムへの調剤のなじみやすさ。
抗Ｔ細胞免疫毒素は、肺への局所的誘導のためにエアロゾルとして投与することができる。これは、水溶性エアロゾル、リポソーム調製物、あるいは免疫毒素を含んだ固形粒子を調製することで得られる。通常は、水溶性エアロゾルは、抗Ｔ細胞免疫毒素の水溶液あるいは懸濁液を、従来の薬学的に許容される担体と安定化剤と共に調剤することで作られる。担体と安定化剤は、特定の抗Ｔ細胞免疫毒素の要求によって変化するが、典型的には、非イオン性界面活性剤（Tweens、Pluronicsあるいはポリエチレングリコール）；血清アルブミン、ソルビン酸エステル、オレイン酸、レシチンのような無害のタンパク質；グリシンなどのアミノ酸；および、緩衝液、塩類、糖類、あるいは糖アルコールなどが含まれる。製剤には、ムコ多糖類分解酵素剤ならびに気管支拡張剤が含まれる。製剤は滅菌している。一般にエアロゾルは、等張液から調製される。粒子は、標準的な肺の界面活性剤を任意に含む。
エアロゾルは、水溶性あるいは非水溶性懸濁液（例えば、過フッ化炭化水素薬剤）中の粒子から形成される。かような粒子は、例えば、抗Ｔ細胞免疫毒素、またはその誘導体、またはリポソーマル、またはマイクロカプセル封入した抗Ｔ細胞免疫毒素、またはその誘導体、の分子間凝集体を含む。エアロゾルは、肺の刺激物、例えば、急性気管支収縮、咳、肺浮腫、あるいは組織破壊を引き起こす物質、を含んではならない。しかしながら、非刺激性吸着促進剤は、本発明での使用において好適である。音波振動噴霧器は、抗Ｔ細胞免疫毒素またはその誘導体を剪断する状態下への暴露を最小限にし、抗Ｔ細胞免疫毒素の分解を可能にする。
抗Ｔ細胞免疫毒素は、筋肉、皮下、包膜内、あるいは腹膜内、あるいは管内空間、特に、関節内へ、例えば、約１μg/関節の体液cc/day以上の用量の関節内注射などの注射により、局所的よりもむしろ、全身的に投与される。用量は、使用する抗Ｔ細胞免疫毒素の特性、例えば、その活性おとび生物学的半減期、抗Ｔ細胞免疫毒素の製剤中の濃度、投与部位および速度、患者の容体、患者が患っている自己免疫疾患など、医師の裁量に関わるものにもよる。
本発明の抗Ｔ細胞免疫毒素は、溶液にて投与される。溶液のpHは、pH５〜9.5、好ましくは、pH6.5〜7.5である。抗Ｔ細胞免疫毒素またはその誘導体は、燐酸、Tris（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸、あるいはクエン酸などの薬学的に許容される緩衝液を含んだ溶液中に置く。緩衝液濃度は、１〜100mMの範囲とする。抗Ｔ細胞免疫毒素の溶液は、50〜150mMの濃度の塩化ナトリウム、塩化カリウムのような塩類も含む。アルブミン、グロブリン、ゼラチン、プロトアミンあるいはプロトアミンの塩類のような安定化剤の効果的な量も含ませることができ、また、抗Ｔ細胞免疫毒素を含んだ溶液、あるいは溶液から調製した組成物に添加することもできる。
抗Ｔ細胞免疫毒素の全身的投与は、管内注入も可能であるが、一般には、筋内注射によって毎日行われる。抗Ｔ細胞免疫毒素は、ミクロスフェア、リポソーム、あるいは血液を含む特定の組織にある他の微粒子誘導システムを経由しても投与される。局所用調製物は、肌あるいは粘膜に直接、毎日、適用され、そして好ましくは遮蔽、すなわち、絆創膏、ポリオレフィンフィルム、または他の局所用調製物への浸透を阻害する被覆材によって保護される。
下記の実施例は、本発明の実施を説明するものであり、発明を限定する旨のものではない。実施例１には、タイプＩRIPゲロニンをコードするcDNAのクローニングを記載している。実施例２は、ゲロニン遺伝子を含む組み換え発現ベクターの構築を記載している。実施例３に記載したのは、ジスルフィド結合に利用できる単一システインを含むゲロニンの様々な類似体である。実施例４には、網状赤血球溶解分析における、タンパク合成の阻害能力に関する組み換えゲロニンおよびゲロニン類似体に関して行った試験について記載している。実施例５は、様々なゲロニン免疫接合体調製物の記載がなされている。実施例６は、全細胞殺傷検定における、細胞毒性剤として機能する能力に関する免疫接合体に関して行った試験について記載している。実施例７では、免疫接合体の溶解および安定特性に関して説明している。実施例８では、ゲロニン免疫接合体のin vivo薬物動力学および免疫原性試験の結果に関して説明を行い、そして、実施例９では、ヒト末梢血リンパ球復元した厳正に組み合わせた免疫不全マウスモデルでのヒトＴ細胞を消耗する能力に関する免疫接合体の試験の結果に関して説明を行っている。実施例10に記載したのは、ゲロニンDNA配列の様々な遺伝子融合と抗体断片をコードする配列である。遺伝子融合生成物の生成物の発現と、網状赤血球および全細胞殺傷検定における生成物の試験を、実施例11に記した。実施例12には、一本鎖抗体に対するゲロニン遺伝子融合体の構築に関して記載している。実施例13には、タイプＩRIP BRIPをコードするcDNAのクローニング、BRIP遺伝子を含む発現ベクターの構築、ジスルフィド結合を利用できる単一システインを有するBRIP類似体の生成、網状赤血球分析における類似体の試験、およびBRIPの構築ならびに全細胞殺傷検定におけるその活性の試験に関して記載している。実施例14には、モモルディンIIをコードするcDNAおよびモモルディンII遺伝子を含む発現ベクターの構築に関して記載している。
実施例１
本発明によるゲロニン遺伝子のクローニングは、比較的稀な天然採取源であるG. multiflorumの種から、RIP遺伝子生成物の精製を不要にすると共に、先行する化学的誘導ならびにゲロニン遺伝子融合生成物の調製無しに、抗体に接合可能なゲロニン類似体の生成を許容する。遺伝子のクローニングにおける厄介な問題は、入手可能なGelonium種子が古く、生存不能であり、種子からの無傷のメッセンジャーRNAの調製ができないことにある。メッセンジャーRNAから調製したcDNAからの遺伝子のクローニングは実行できず、よって、cDNAを得るために、全RNAを使用した。全RNAは通常、約95％のリボソームRNAを含んでいるので、正常環境下にて、すなわち、mRNAを使用する時に、cDNAを作製するために全RNAを使用することは望ましくない。
G. multiflorum種子からのRNAの調製
全RNAを、Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley & Sons, 1989に記載された植物RNAの調製のための手順の変法によって、Gelonium種子（Dr. Michael Rosenblum, M.D.アンダーソン癌センター、ヒューストン、テキサス州）から調製した。要約すれば、4.0グラムの種子を、液体窒素で予冷した（−70℃）モーターと乳棒で微粉末に粉砕した。この粉末に、25mlの粉砕用緩衝液（0.18M Tris、0.09M塩化リチウム、4.5mM EDTA、１％ SDS、pH8.2）を、TLE（0.2M Tris、0.1M塩化リチウム、5mM EDTA、pH8.2）で平衡化した8.5mlのフェノールと共に加えた。混合物を、（#5にセットした）Polytron PT-1035を用いて均質化した。8.5mlのクロロホルムを加え、混合し、50℃で、20分間インキュベートした。混合物を、４℃に予冷したローターに置き、3Kで、20分間遠心分離し、水層を新しい試験管に移した。8.5mlのフェノールに続いて、8.5mlのクロロホルムを加え、混合物を再度遠心分離した。この抽出を三度繰り返した。水層中のRNAを、1/3容の8M塩化リチウムを加えて沈殿させ、４℃で、16時間インキュベートした。次に、RNAを４℃で、20分間遠心分離することでペレットにした。このペレットを、５mlの2M塩化リチウムで洗浄し、再遠心し、そして2mlの水中で再懸濁した。0.3Mまでの蟻酸ナトリウムおよび２容のエタノールの添加により、RNAを沈殿させた。RNAを−70℃にて、70％エタノール中にて保存した。
cDNAの調製
cDNAは、全GeloniumRNAから同様の二つの方法によって調製された。
第一の方法は、LibrarianIIcDNAライブラリー構築システムキット（Invitrogen社）を用いて細菌発現プラスミドpcDNAIIにてcDNAライブラリーを作製することを含んでいた。約５μgの全RNAを、ランダムプライマーとオリゴ-dTの1:1混合物で、第一鎖状cDNAに変換した。DNAポリメラーゼＩによる第二鎖の合成は、システムの使用説明書に従って行った。二本鎖cDNAを、BstXIリンカーに連結して、特定の大きさに断片化した。約500bp以上の大きさの断片を、キットに備え付けられていた発現ベクターに連結した。各ベクターを、非常に効果的な反応能を有する細胞への形質転換あるいは電気的反応能を有する細胞への電気泳動のいずれかにより、E. coliに導入された。電気泳動は、Dower et al., Nucleic Acids Res., 16,6127-6145（1988）の方法に基づいてBTX社が勧めるようにして、0.56μフラットパック細胞中のBTX100ユニツト（BTX社、サンジエゴ、カリフォルニア州）で、850Vの電圧ならびに5nSのパルス長にて行った。得られたライブラリーは、約150,000コロニーから構成されていた。
第二の方法は、Perkin-Elmer-Cetus社が販売しているRNA-PCRキットを用いてcDNAを生成することを含んでいる。
ゲロニンタンパク質配列の決定
天然ゲロニンタンパク質の部分的配列を、Applied Biosystems model 470Aタンパク質配列分析器を用いて、製造業者によって勧められるようにして、自動化Edman分解による、直接アミノ酸配列分析により決定した。（全RNAと同じ種子のバッチから単離した）ゲロニンのタンパク質分解ペプチド断片を、配列決定した。
ゲロニン遺伝子のクローニング
三つの重複するゲロニンcDNA断片をクローニングし、三つの断片から混成ゲロニン遺伝子を作製した。
（1）ベクターpING3823中のゲロニンの中間アミノ酸をコードする断片のクローニング
部分的ゲロニンアミノ酸配列に基づいた変性DNAプライマーを、Perkin-Elmer-Cetusキットで生成したcDNAのセグメントを、PCRによる増幅のために用いた。プライマーの変性が最も小さい、ゲロニンアミノ酸配列の領域に基づいて、六つのプライマーがデザインされた。プライマーの適切な対が、ゲロニン遺伝子断片の増幅に関して試験された。予想していたDNAサイズの生成物が、アガロースゲル上での臭化エチジウム染色したDNAバンドとして同定された時に、DNAをT4 DNAポリメラーゼで処理し、そしてアガロースゲルから精製した。gelo-7とgelo-5と称するプライマーから構成されるプライマー対のみが、予想された大きさの比較的純粋な生成物を生成していた。変性プライマーgelo-7とgelo-5の配列を、IUPACヌクレオチド表記を用いて下記に示した。
0003759163.tif 000002
プライマーgelo-7は、ゲロニンのアミノ酸87〜97に対応し、一方、プライマーgelo-5は、アミノ酸226〜236に対応する。プライマーgelo-7とgelo-5で生成した、平滑末端化したDNA断片（ゲロニンのアミノ酸87〜236に対応する）を、pUC18（BRL社、ゲティスバーグ、メリーランド州）にクローニングした。挿入体のDNA配列を決定し、得られたDNA配列に基づいた推定アミノ酸配列は、実験的に決定したゲロニンアミノ酸配列と符号した。このゲロニンセグメントを含むクローンを、pING3726と命名した。
クローンpING3726の挿入体を32Ｐで標識し、150,000個のゲロニンcDNAライブラリーをスクリーニングするために用いた。ただ一つのクローンだけが、複製しておいたライブラリーとハイブリダイズした。このクローンをライブラリーから精製し、そのDNA配列を決定した。このクローンは、ゲロニン（残基25〜209）のアミノ酸270個の内の185個をコードする断片を含んでおり、pING3823と命名した。
（2）ゲロニンのＮ末端アミノ酸をコードする断片のクローニング
pING3726中のゲロニン遺伝子セグメントに関して決定された配列に基づいて、正確なオリゴヌクレオチドプライマーを、5'ゲロニン遺伝子断片を増幅するための変性プライマーおよび3'ゲロニン遺伝子断片を増幅するための非特異性プライマーでの接合に用いるためのPCR増幅用プライマーとしてデザインした。Perkin-Elmer-Cetus RNA-PCRキットを用いて生成したcDNAを増幅した。
ゲロニン遺伝子の5'端を増幅するために、変性プライマーgelo-1と正確なプライマーgelo-10を用いたPCR増幅を行った。プライマーの配列を以下に示した。
0003759163.tif 000003
プライマーgelo-1は、ゲロニン遺伝子のアミノ酸１〜11に対応し、一方で、プライマーgelo-10は、アミノ酸126〜133に対応する。反応による生成物は、反応生成物に特異性を付与するために、gelo-1（配列番号：16）とgelo-11（ゲロニンのアミノ酸119〜125をコードする配列を含む正確なプライマー）で再増幅した。
0003759163.tif 000004
中間プローブによるハイブリダイゼーションが、所望の特異的なゲロニンDNA断片が増幅されていたことを確認した。この断片をpUC18にクローニングし、生成したベクターをpING3727と命名した。断片が配列決定され、プライマーgelo-1を根幹を成しているアミノ酸配列を生成する、変性プライマーgelo-1の一部に対応する断片（最初の27個のヌクレオチド）の領域が翻訳されていないことが示された。これは予期していなかったことでなく、プライマーの変性によるものと考えられる。この断片は、正確なプライマーgelo-11（配列番号：18）とgelo-5'（ゲロニンの16個のアミノ酸のコードに加え、ゲロニン遺伝子の5'端の上流にまで延びている）で、ゲロニンcDNAから再増幅された。プライマーgelo-5'の配列を、以下に示した。
0003759163.tif 000005
得られたDNA断片は、ゲロニンの最初の125個のアミノ酸をコードする。配列の大半は天然ゲロニン遺伝子と同一であるが、DNA断片の最初の32個のヌクレオチドは相違していた。本出願において、N-末端断片を断片GEL1-125と称する。
（3）ゲロニンのＣ末端アミノ酸をコードする断片のクローニング
ゲロニン遺伝子の3'端ならびに3'非翻訳配列を増幅するために、正確なプライマーgelo-9とXE-dTを用いたPCR増幅を行った。これらプライマーの各配列を、以下に示した。
0003759163.tif 000006
プライマーgelo-9は、ゲロニンのアミノ酸107〜113に対応する。プライマーXE-dTは、制限部位HindIIIおよびXhoIを含む3'オリゴ-dT部分および5'部分から構成され、cDNAを含むポリＡと相補する。反応生成物を、正確なプライマーgelo-8およびXEで再増幅した。プライマーgelo-8およびXEの配列を、以下に示した。
0003759163.tif 000007
プライマーgelo-8は、ゲロニンのアミノ酸115〜120をコードする配列から構成され、そして、プライマーXEは、HindIIIおよびXhoI制限部位を含むXE-dTプライマーの5'部分に対応する。内部プローブでのハイブリダイゼーションは、所望のゲロニン遺伝子断片が増幅されたことを確認した。この断片は、二つの異なる方法によってpUC18へクローニングされた。すなわち、平滑末端化した断片としてpUC18のSmaI部位にクローニグする方法（得られたベクターを、pING3728と命名した）と、EcoRI-HindIII断片としてpUC18にクローニグする方法（得られたベクターを、pING3729と命名した）である。双方のベクター挿入体を配列決定した。pING3728の挿入体は、ゲロニンのアミノ酸114〜270をコードし、一方で、pING3729の挿入体は、ゲロニンと一方の3'配列ののアミノ酸184〜270をコードする。
（4）重複ゲロニンＤＮＡ断片の混成ゲロニン遺伝子への組み込み
ゲロニン遺伝子のＣ末端の2/3を再構築するために、ベクターpING3729をSspI（一つのSspI部位がベクター内にあり、二つ目がベクターへの挿入体の終始コドンの約80bp下流に位置している）で切断し、得られた自由端にXhoIリンカー（8bp、New England Biolabs社）を連結した。そして、DNAをXhoIとEcoRIで切断し、ゲロニンのアミノ酸185〜270をコードする350bp断片が生成し、単離された。この350bp断片は、pING3730と称する中間ベクター内にあるゲロニンのアミノ酸37〜185をコードするpING3823からのNcoI-EcoRI断片の近傍に連結され、そして、ゲロニン遺伝子（アミノ酸37〜270）の末端の87％を再構築した。
次に、断片GEL1-125をSmaIとNcoIで切断し、pING3730のNcoI-XhoI断片にてベクターpIC100へ連結されたゲロニンのアミノ酸１〜36をコードする断片が得られた。〔pIC100は、pclBリーダー配列の37bp上流が欠如している以外は、Better et al., Science, 240, 1041-1043（1988）に記載されたpING1500と同一である。37bpは、SphIとEcoRIによるpING1500の消化、T4ポリメラーゼによる処理、およびベクターの再結合により消失される。この操作で、ベクター中のEcoRI部位が再生され、他の不要な制限部位が消失する。〕連結する以前に、pIC100は、予めSstIで消化され、T4ポリメラーゼで処理され、そしてXhoIで切断される。この連結で、プラスミドpING3731（ATCC受託No.68721）と称する全ゲロニン遺伝子を含む新しいベクターが生成した。ゲロニン遺伝子の全DNA配列を、配列番号：11に示した。
実施例２
ゲロニン遺伝子を含む発現ベクターの構築
最初のE. coli発現ベクターは、Erwinia carotovara pelBリーダー配列、およびSalmonella tryphimurium araBプロモーターに結合したゲロニン遺伝子を含むようにして構築された。araBプロモーターを含む基本ベクターは、本明細書に参考として組み込んだ、共願に係る、1991年７月２日発行の米国特許No.5,028,530に記載されている。araBプロモーターを含むベクターは、EcoRIとXhoIで切断された。そして、二つのDNA断片は、プロモーターの下流側近傍に連繋して結合された。プロモーターに近接して結合された断片は、SstI消化、T4ポリメラーゼ処理、E. carotovora pelB遺伝子のリーダー配列を含むpIC100ベクターのEcoRI消化によって誘導された131bp断片であった。翻訳したリーダー配列は、細胞質膜を通して各タンパク質の分泌のためのシグナルである。リーダー配列の下流に連結した断片は、全ゲロニン遺伝子を含むpING3731からのSmaI-XhoI断片であった。このように、発現ベクターは、pelBリーダー配列およびaraBプロモーターに結合したゲロニン遺伝子を含んでいる。このプラスミドを、pING3733と命名した。
二つ目の発現ベクターは、ゲロニンの19個のＣ末端アミノ酸をコードするゲロニン遺伝子配列を含まない以外は、最初のベクターと同一になるように構築した。ゲロニン遺伝子のcDNA配列から、ゲロニンアミノ酸配列の決定のために生成したペプチド断片にて検出されなかった19個のＣ末端セグメントを想到された。これら19個のアミノ酸は、翻訳後の、すなわち、天然タンパク質には存在しない成熟毒素から開裂されたペプチドセグメントを意味する。同様のＣ末端アミノ酸セグメントが、植物毒素αトリコサンティンにおいて同定されている〔Chow et al., J. Biol. Chem., 265, 8670-8674（1990）〕。それ故、Ｃ末端断片を含まない発現生成物は重要である。
ゲロニンの19個のＣ末端アミノ酸を有さないゲロニン発現ベクターの構築のために、遺伝子の3'端を増幅および改変するためにPCRを用いた。pING3728を、プライマーgelo-14およびgelo-9（配列番号：20）を用いて増幅した。プライマーgelo-14の配列を、以下に示した。
0003759163.tif 000008
ゲロニンアミノ酸245〜256に対応すプライマーgelo-14は、ゲロニンの末端の19個のアミノ酸をコードする配列の手前の遺伝子の転写を停止するゲロニン遺伝子配列における（プライマー配列中に下線を付した）停止コドンを導入し、また、終始コドンの下流近傍にXhoI部位も導入した。PCR生成物を、XhoIおよびEcoRIで切断し、そして、得られたゲロニンのアミノ酸185〜251をコードする208bp断片を、アガロースゲルから精製した。この断片を、プラスミドpING3732を生成するために、ゲロニンのアミノ酸37〜185をコードするpING3823のNcoI-EcoRI断片の近傍に結合した。改変した3'端を備えたゲロニン遺伝子を含む最終発現ベクター、pING3734を、pING3732からのゲロニンのアミノ酸37〜251をコードするNcoI-XhoI断片を、pING3733へ置換した。
天然ゲロニン5'端の同定
成熟ゲロニン遺伝子の5'端をコードするcDNAクローンを同定するために、逆PCRを用いた。全G. multiflorum RNAの５μgを、プライマーとしてGelo-11（配列番号：18）とSuperscript Plasmid System（BRL社、ゲティスバーグ、メリーランド州）を用いて、cDNAに変換した。ゲロニンcDNAを、共有環状DNAを生成するために自己結合させ、結合したDNAを、オリゴヌクレオチドGelo-9（配列番号：20）およびGelo-16を用いたPCRで増幅した。プライマーGelo-16の配列を、以下に示した。
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PCR生成物はアガロースゲルにてサイズ画分化され、300bpより大きいDNAsを、SmaI切断したpUC18へクローニングした。いくつかのクローンを、下記に示す配列を有するプライマーGelo-18で配列決定した。
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最も大きなゲロニン特異的挿入体を有する同定したクローンを、pING3826と命名した。pING3826のDNA配列は、ゲロニン発現プラスミドpING3733およびpING3734に存在する必要の無い天然の成熟ゲロニン遺伝子の最初の32個のヌクレオチドを含んでいた。天然ゲロニン遺伝子の全DNA配列を、配列番号：57に示した。
天然5'端を有するゲロニン遺伝子を含む発現ベクターの構築
天然5'配列を有するゲロニン遺伝子を含んだ（上述した）発現ベクターpING3733およびpING3734の誘導体を、以下のようにして作製した。ゲロニンの5'端を、PCRプライマーGelo-16（配列番号：２４）および、下記の配列を備えたGelo-17により、pING3826から増幅した。
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285bpのPCR生成物を、T4ポリメラーゼで処理し、NcoIで切断した。得られた100bp5'端DNA断片を、アガロースゲルより単離し、（SstIで切断し、T4ポリメラーゼで処理し、およびPstIで切断した）pIC100からの120bp pelBリーダー断片の近傍を、PstIおよびNcoIで消化したpING3733あるいはpING3734のいずれかに結合した。得られたプラスミドpING3824およびpING3825それぞれは、pelBリーダーに結合し、そして、araBプロモーターの制御条件下にて、19個のアミノカルボキシル伸長を除く全天然ゲロニン遺伝子を含んでいる。pING3734およびpING3825双方において、19個のアミノカルボキシル伸長を含まない遺伝子構築物は、本願にて「組み換えゲロニン」と称するタンパク質生成物をコードする。
組み換えゲロニンの精製
組み換えゲロニンを、以下のようにして精製した。E. coli培養用肉汁を濃縮し、DC10ユニット（Amicon社）のS10Y10カートリッジを用いてpH7.0にて、10mM燐酸ナトリウムで緩衝液交換を行い、濃縮および緩衝液交換した物質を、CM52カラム（100g、５×10cm）に適用した。カラムを、１Ｌの出発緩衝液で洗浄し、出発緩衝液（全容750ml）での、０〜300mM塩化ナトリウム勾配で溶出した。画分を含む純粋ゲロニンをプールし（100〜250mM塩化ナトリウムからの溶出）、Amicon YM10膜にて濃縮し、10mM、pH7.0の燐酸ナトリウム緩衝液で平衡化し、−20℃で凍結して保存した。さらなる精製工程を、Blue Toyopearlクロマトグラフィーを用いて試みた。しかしながら、この手順は、物質の純度を向上させずに、出発部室の約50％の損失をもたらした。
実施例３
接合のために利用できるシステイン残基によるゲロニン遺伝子の組み立て
ゲロニンタンパク質は、44および50位に、内因性ジスルフィド結合により結合された二つのシステイン残基を有している。このタンパク質は、抗体あるいは他のタンパク質への接合に直接利用できる遊離システイン残基を含んでいない。接合のために利用できる遊離システイン残基を含むゲロニンの類似体を、三つの異なる方法によって生成した。最初の方法において、ゲロニンの一次配列に沿った様々な残基を、システイン残基と置換し、奇数のシステイン残基を含んだ一連の類似体を生成した。他の方法では、二つの内因性システイン残基の一つを、アラニンと置換し、鎖間ジスルフィド結合が欠落し、単一の無対のシステインを含む分子を生成した。さらに他の方法は、双方の内因性システインがアラニンによって置換され、三番目の非システイン残基がシステインによって置換され、単一の無対のシステインを生成した。
ゲロニンの15個の類似体を構築した。ゲロニンの10個の非システイン残基を、システイン残基との置換のための目標に据えた。ゲロニンのアミノ酸配列と、天然アミノ酸配列およびリシンＡ鎖（図１参照）の三次構造との比較は、これら位置が分子表面上にあり、接合のために利用できることを示唆している。10個のゲロニン類似体のそれぞれは、下記残基の一つと置換されたシステインを含んでいる。すなわち、リシン10、アスパラギン60、イソロイシン103、アスパラギン酸146、アルギニン184、セリン235、アスパラギン239、リシン244、アスパラギン酸247、およびリシン248、そして、GelC10、GelC60、GelC103、GelC146、GelC184、GelC215、GelC239、GelC244、GelC247、ならびにGelC248と称する各々の類似体である。
内因性ジスルフィド結合に関与している天然ゲロニンシステインの一つが、非システイン残基で置換された、ゲロニンの二つの類似体を構築した。特に、50位のシステインをアラニン残基で置換したものは、44位でのジスルフィド結合のために利用できるシステインを含んだ（GelC44と称する）ゲロニン類似体を生成した。逆に言えば、44位のシステインは、アラニン残基と置換され、50位でのジスルフィド結合のために利用できるシステインを有する（GelC50と称する）類似体を生成するのである。前述した12個の類似体の結合は、成熟ゲロニンタンパク質の全長に達するのである。
本来のゲロニンシステイン双方がアラニンと置換された他のゲロニンタンパク質（GelC44AC50A）を構築した。本来のシステイン双方の代わりに置換されたアラニン残基と、10位での本来のリシンの代わりに置換されたシステイン残基（GelC10C44AC50A）あるいは247位での本来のアスパラギンの代わりに置換されたシステイン残基（GelC247C44AC50A）のいずれかを有する、他の二つの類似体が構築された。
組み換えゲロニンの変異体を、制限断片操作あるいは合成オリゴヌクレオチドを用いた重複伸長PCRによって構築した。PCRのために用いたプライマーの配列を、以下に示した。各突然変異誘発用のプライマー配列において、システインあるいはアラニン残基のいずれかに改変したアミノ酸に対応するヌクレオチドに下線を付した。
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（1）特に、プライマーHINDIII-2（pING3734あるいはpING3825のベクター部分に位置する）、GeloC-9およびGeloC-8と連繋した突然変異誘発用プライマーGeloC-3-2およびGeloC-4を用いたPCRによって、ゲロニンの247位のアミノ酸（リシンＡ鎖の259位のシステインに対応するアスパラギン酸）にシステインが導入された。鋳型DNA（pING3734）を、GeloC-3-2およびHINDIII-2で増幅し、GeloC-4およびGeloC-9で同時に反応させた。これら反応の生成物を混合し、外部プライマーGelo-8およびHINDIII-2で増幅した。反応生成物を、EcoRIおよびXhoIで切断し、精製し、三片結合にてプラスミドpING3825へ挿入した。GelC247変異体のDNA配列が、検証された。
GelC247をコードする配列を含むプラスミドを、pING3737（ATCC受託No.69009）と命名した。
（2-3）同様の方法で、プラスミドpING3741中の類似体GelC248を生成するために、突然変異誘発用GeloC-1およびGeloC-2で、ゲロニンの248位のアミノ酸（リシン）の代わりにシステイン残基を導入し、そして、プラスミドpING3744中の類似体GelC239を生成するために、突然変異誘発用GeloC-9およびGeloC-10で、ゲロニンの239位のアミノ酸（リシン）の代わりにシステイン残基を導入した。
（4）さらに同様の方法で、pING3736と称するプラスミド中の類似体GelC244を生成するために、突然変異誘発用GeloC-5およびGeloC-6で、ゲロニンの244位のアミノ酸（リシン）の代わりにシステイン残基を導入した。この変異体は、pING3825よりもむしろ、プラスミドpING3734を鋳型DNAとして用いたPCRによって調製された。それ故、それは、プラスミドpING3737、pING3741、およびpING3744と同様のＮ末端ゲロニンアミノ酸配列をコードするが、天然ゲロニン5'ヌクレオチドの代わりに、PCRプライマー誘導5'端の32個のヌクレオチドを含む。
（5）同様の方法によって、ゲロニンの10位のアミノ酸（リシン）の代わりにシステイン残基を導入した。システインは、araB2（ベクタープライマー）およびGeloC-14でpING3824を増幅することで、突然変異誘発用プライマーGeloC-13およびGeloC-14で、そして、GeloC-13およびGeloC-11によって他の反応によって導入した。これら反応生成物を混合し、外部プライマーara B2およびGelo-11で増幅した。PCR生成物をPstIおよびNcoIで切断し、精製し、そして、pING3746（ATCC受託No.69008）と称するプラスミドにて類似体GelC10を生成するために、pING3825へクローニングのために戻した。
（6）ゲロニンの60位のアスパラギンを、GelC10変異体に関する方法と同様にして、オリゴara B2およびGelo-11と連繋した二つの突然変異誘発用オリゴGeloC-15およびGeloC-16を用いてシステインと置換した。GelC60類似体をコードするプラスミドを、pING3749と命名した。
（7）プライマーara B2およびHINDIII-2と連繋した二つの突然変異誘発用プライマーGeloC-20およびGeloC-21を用いたPCRによって103位のアミノ酸（イソロイシン）の位置にシステインを導入した。鋳型DNA（pING3733）を、GeloC-21およびara B2で、そして、GeloC-20およびHUINDIII-2で別途増幅した。これら反応の生成物を混合し、外部プライマーara B2およびHINDIII-2で増幅した。反応生成物を、NcoIおよびBcIIで切断し、精製し、NcoIおよびBcIIで消化したpING3825へ挿入した。
103位の残基にシステインを置くためにオリゴヌクレオチドも、クローニングした遺伝子にて実証されたAflIII制限部位に導入した。GelC103類似体を含むプラスミドを、pING3760と命名した。
（8）同様の方法によって、146位（アスパラギン酸）にシステインを導入した。鋳型DNA（pING3733）を、突然変異誘発用GeloC-22およびGelo-14で、そして、突然変異誘発用GeloC-23およびGelo-19で別途増幅した。これら反応の生成物を混合し、突然変異誘発用プライマーGeloC-23およびGelo-19で増幅した。反応生成物を、BglIIおよびEcoRIで切断し、そして、三片結合にてpING3825へ挿入することができた。146位の残基にシステインを置くために用いたオリゴヌクレオチドも、クローニングした遺伝子にて実証されたNdeI制限部位に導入した。
（9）ゲロニンの184位（アルギニン）にシステインを導入するために、鋳型DNA（pING3733）を、突然変異誘発用GeloC-25およびara B-2で、そして、突然変異誘発用GeloC-24およびHindIII-2で別途増幅した。これら反応の生成物を混合し、ara B2およびGelo-14で増幅した。反応生成物を、NcoIおよびBclIで切断し、そして、NcoIおよびBclIで予め消化したpING3825へ挿入した。184位の残基にシステインを置くために用いたオリゴヌクレオチドも、クローニングした遺伝子にて実証されたNslI制限部位に導入した。GelC184変異体をコードする配列を含むプラスミドを、pING3761と命名した。
（10）同様の方法によって、215位（セリン）にシステインを導入した。鋳型DNA（pING3733）を、突然変異誘発用GeloC-27およびara B2で、そして、突然変異誘発用GeloC-26およびHindIII-2で別途増幅した。これら反応の生成物を混合し、ara B2およびHindIII-2で増幅した。反応生成物を、EcoRIおよびBclIで切断し、そして、三片結合にてpING3825へ挿入することができた。
（11）遊離システイン残基を含まない他のゲロニン変異体を、自然に生成する二つのゲロニンシステイン残基の一つ、50位のシステインをアラニンと置換することにより生成した。プラスミドpING3824を、プライマーGeloC-19およびara B2で、そして、突然変異誘発用GeloC-19およびara B2で別途同時に増幅した。反応生成物を混合し、ara B2およびGelo-11で増幅した。この生成物をNcoIおよびBglIIで切断し、pING3747（ATCC 69101）を生成するために、pING3825のベクター部分にクローニングするために戻した。44位のアミノ酸位置にジスルフィド結合のために利用できるシステインを有していたので、この類似体をGelC44と命名した。
（12）44位の天然システインをアラニンに改変したゲロニン変異体を、プライマーara B2およびHINDIII-2と連繋した突然変異誘発用オリゴGeloC-28およびGeloC-29を用いてpING3733によって増幅することで構築した。増幅したDNAを、NcoIおよびBglIIで切断し、ゲロニンベクターへクローニングし、そして、pING3756を生成した。生成した変異体を、GelC50と命名した。
（13）ゲロニンの44位のシステインと50位のシステイン双方がアラニンに改変されたゲロニン変異体を、プライマーara B2およびGelo-11と連繋した突然変異誘発用オリゴGeloC-17およびGeloC-18を用いてpING3824の重複PCRによって構築した。天然ゲロニンタンパク質と同様、この類似体は、接合のために利用できるシステイン残基を有していなかった。生成した類似体を、GelC44AC50Aと命名した。
（14）三箇所変異させたゲロニンC247C44AC50Aを、プラスミドpING3824、pING3750、およびpING3737から構築した。この変異体は247位に導入されたシステインを有しており、44位および50位に自然に発生したシステイン残基の双方がアラニンと置換されており、そして、抗体へのジスルフィド結合が、ゲロニン類似体の単一システイン残基にのみ確保されるので好ましい。プラスミドpING3824は、NcoIおよびXhoIで切断され、ベクター断片がアガロースゲルにて精製された。pING3750が、NcoIおよびEcoRIで切断され、そして、pING3737が、EcoRIおよびXhoIで切断された。NcoI-EcoRI断片は、44位および50位のアラニンをコードし、一方で、EcoRI-XhoI断片は、247位のシステインをコードする。これら断片の各々は精製され、そして、NcoI-XhoIベクター断片に結合された。得られたプラスミドを、pING3752と名付けた。
（15）三箇所変異させたゲロニンC10C44AC50Aも、先に構築したプラスミドからの構築物から構築した。この場合、pING3746が、PstIおよびNcoIで切断され、そして、pING3750が、NcoIおよびXhoIで切断された。挿入断片の各々を、アガロースゲル中の電気泳動で精製し、そして、PstIおよびXhoI消化したベクター断片に、その断片を連結した。得られたベクターを、pING3753と命名した。
構築したゲロニン変異体の各々を、E. coli株E104に形質転換した。アラビノースで細菌培養を誘発次第、ゲロニンポリペプチドは、ゲロニン特異性抗体で培養上清において検出することができる。プラスミドpING3734およびpING3825からのゲロニンの発現レベルあるいはゲロニン変異体からのレベルには、顕著な相違は認められなかった。各タンパク質は、約1g/1のレベルでE. coliにて生成された。
実施例４
ゲロニンおよび組み換えゲロニン類似体の、in vitroでのタンパク合成阻害能力を、Press et al., Immunol. Letters, 14,37-41（1986）に記載された網状赤血球溶解物検定（RLA）を用いて試験した。分析では、ウサギ赤血球細胞溶解物からの内因性グロブリンmRNAを用いた細胞を含まないシステムにて、タンパク合成の阻害を測定した。トリチウム化したロイシン（3H-Leu）の減少した取り込みが、毒素濃度の機能として測定された。標準毒素（RTA30と略称される、リシンＡ鎖の30kD形態）、天然ゲロニン、組み換えゲロニン（rGelonin）、およびゲロニン類似体の連続対数希釈、１μg/ml〜１pg/mlの範囲にわたって試験された。氷上にて試料を三つずつ作成し、37℃で、30分間インキュベートし、そして、Inotec Trace 96カスケードイオン化計測器で計測を行った。非阻害試料との比較により、タンパク合成の50％阻害（IC50）に対応する毒素（pM）のピコモル単位の濃度を算出した。下記表２に示したように、組み換えゲロニンおよびその大半の類似体のRLAにおける活性は、天然ゲロニンの活性に匹敵するものである。ある種の類似体（GelC239のような）では、RLA活性は、減少していた。
0003759163.tif 000015
実施例５
ゲロニン免疫接合体の調製
本発明のゲロニン類似体を、マウス（ATCC HB9286）、およびキメラH65抗体、ヒトＴ細胞決定基CD5に特異的な反応性を有する（CH65）および（cFab、cFab’およびcF（a'b）2断片を含む）cH65抗体領域などに、多様に接合させた。H65抗体は、前出の米国特許出願No.07/306,433および前出の国際公開No.WO89/06968に記載された方法に従って調製および精製された。キメラH65抗体は、Robinson et al., Human Antibodies and Hybridomas, 2, 84-93（1991）に記載されたのと同様の方法に従って調製された。
（1）H65抗体への接合
反応性メルカプト基を露出するために、ゲロニン類似体の非対システイン残基を、0.1〜2mM DTTを用いたインキュベーション（室温にて30〜60分間）により先ず還元し、そして、サイズ篩クロマトグラフィーによって脱塩した。
具体的には、GelC248類似体（3.8mg/ml）を、0.1M燐酸ナトリウム、0.25M塩化ナトリウム、pH7.5緩衝液中の2mM DTTで60分間処理した。GelC244変異体（7.6mg/ml）を、0.1M燐酸ナトリウム、0.25M塩化ナトリウム、pH7.5緩衝液中の2mM DTTで30分間処理した。GelC247類似体（4mg/ml）を、0.1M燐酸ナトリウム、0.5M塩化ナトリウム、pH7.5緩衝液中の2mM DTTで、0.5mM EDTAと共に30分間処理した。GelC239変異体（3.2mg/ml）を、0.1M燐酸ナトリウム、0.5M塩化ナトリウム、pH7.5緩衝液中の2mM DTTで、0.5mM EDTAと共に30分間処理した。GelC44類似体（4.2mg/ml）を、0.1M燐酸ナトリウム、0.1M塩化ナトリウム、pH7.5緩衝液中の0.1mM DTTで、0.5mM EDTAと共に30分間処理した。最後に、GelC10変異体（3.1mg/ml）を、0.1M燐酸ナトリウム、0.1M塩化ナトリウム、pH7.5緩衝液中の１mM DTTで、１mM EDTAと共に20分間処理した。
遊離メルカプト基の存在は、DTNBとの反応によって証明され、1.4±0.65 SH/分子の平均値が得られた。還元されなかった場合には、遊離チオールは検出されなかった。
Goff et al., Bioconjugate Chem., 1, 381-386（1990）に記載されたようにして、反応性メルカプト基を、リシン部位に導入するために、H65抗体およびキメラ抗体を、遮蔽リンカー5-メチル-2-イミノチオレン（M2IT）で化学的に修飾した。
具体的には、GelC284およびGelC244による接合のために、4mg/mlのマウスH65抗体を、25mM TEOA中の18×M2ITおよび2.5mM DTNB、150mM塩化ナトリウム、pH8緩衝液にて、23℃にて、１時間誘導させた。この反応により、DTNB分析によって決定された、抗体当たり1.9リンカーが得られた。
GelC247およびGelC239による接合のために、4.7mg/mlのH65抗体を、25mM TEOA中の20×M2ITおよび2.5mM DTNB、150mM塩化ナトリウム、pH8緩衝液にて、23℃にて、50分間誘導させた。この反応により、DTNB分析によって決定された、抗体当たり1.6リンカーが得られた。
GelC44との反応前に、5.8mg/mlのH65抗体を、25mM TEOA中の20×M2ITおよび2.5mM DTNB、150mM塩化ナトリウム、pH8緩衝液にて、23℃にて、30分間誘導させた。この反応により、DTNB分析によって決定された、抗体当たり1.5リンカーが得られた。GelC10による接合のために、2.2mg/mlのH65抗体を、25mM TEOA中の10×M2ITおよび2.5mM DTNB、150mM塩化ナトリウム、pH8緩衝液にて、23℃にて、１時間誘導させた。この反応により、DTNB分析によって決定された、抗体当たり1.4リンカーが得られた。
キメラH65抗体を、マウスH65抗体と同様の方法にて接合のために調製した。
免疫接合体の調製における組み換えゲロニンとの接合効率に関して、先ず、二つの方法が比較された。最初に、組み換えゲロニン中の天然ジスルフィド結合を、室温にて、30分間かけて２mM DTTを添加することで還元した。還元したゲロニンを、Sephadex CF-05LSのカラムにてサイズ篩クロマトグラフィーにて再生し、そして、DTNB分析による遊離メルカプトの存在に関して検定した。1.4遊離SH基が検出された。そして、この還元したゲロニンを、H65-(M2IT)-S-S-TNB（1.8TNB基/H65）と反応させた。これら実験条件下にて、還元ゲロニンとチオール活性化したH65抗体との間には接合はほとんど形成されなかった。
これに対して、組み換えゲロニンおよびH65抗体が、まず、架橋剤M2IT（ゲロニン-(M2IT)-SHおよびH65-(M2IT)-S-S-TNBを生成する）で誘導し、そして、一緒に混合した場合には、H65-(M2IT)-S-S-(M2IT)-ゲロニンが良好な収率（1.6の毒素／抗体比率）で調製される。この接合のための出発物質（ゲロニン-(M2IT)-SHおよびH65-(M2IT)-S-S-TNBは、それぞれ、1.2および1.4のリンカー／タンパク質比率を有する。マウスもしくはキメラH65抗体への接合に先行して、同様の方法にて、天然ゲロニンを誘導した。
還元ゲロニン類似体を、接合を許容するためにH65-(M2IT)-S-S-TNBと共に混合した。各類似体のための下記の接合反応を設定した。すなわち、（7.2ml中の）H65-M2IT-TNBの23mgを、室温にて、２時間、そして、４℃にて、18時間一晩、５倍モル過剰のGelC248（６ml中の23mg）と混合し；（7.3ml中の）H65-M2IT-TNBの23mgを、室温にて、３時間、そして、４℃にて、18時間一晩、５倍モル過剰のGelC244（３ml中の23mg）と混合し；（2.8ml中の）H65-M2IT-TNBの９mgを、室温にて、２時間、そして４℃にて、５昼夜、５倍モル過剰のGelC247（2.25ml中の９mg）と混合し；（2.8ml中の）H65-M2IT-TNBの９mgを、室温にて、２時間、そして、４℃にて、３日間、５倍モル過剰のGelC239（2.6ml中の９mg）と混合し；（1.9ml中の）H65-M2IT-TNBの12mgを、室温にて、4.5時間、そして、４℃にて、一晩、5.6倍モル過剰のGelC44（3.2ml中の13.44mg）と混合し；そして、H65-M2IT-TNBの11mgを、室温にて、４時間、そして、４℃にて、一晩、５倍モル過剰のGelC10（3.5ml中の11mg）と混合した。
接合に続いて、抗体の非反応性M2ITリンカーを、15分間、室温にて、リンカーに対して1.1モルのシステアミンで冷却した。冷却した反応溶液は、ゲル濾過カラムに適用した〔GelC248、GelC247、GelC244およびGelC239の場合には、Seophadex G-150（Pharmacia社）を、GelC44およびGelC10の場合には、AcA-44カラム（IBF Biotechnics社、フランス）を使用した〕。ゲル濾過カラムにて反応を進行させ、そして、10mM Tris、0.15M塩化ナトリウム、pH７で溶出した。各カラムで得られた最初のピークを、10mM Tris、30mM塩化ナトリウム、pH７中のBlue Toyopearl（登録商標）樹脂（TosoHaas社、フィラデルフィア、ペンシルベニア州）に適用し、そして、生成物を10mM Tris、0.5M塩化ナトリウム、pH7.5で溶出した。
最終接合生成物の試料を、５％非還元SDS  PAGEに適用し、クーマシー染色し、そして、抗体当たりの毒素の数（T/A比）を定量するために、島津社のレーザー濃度計で走査した。各類似体の接合体に関する最終生成物の収率は、以下の通りであった。GelC248、17mgでの1.6のT/A比；GelC247、1.1mgでの１のT/A比；GelC244、4.5mgでの1.46のT/A比；GelC239、2.9mgでの2.4のT/A比；GelC44、7.3mgでの1.22のT/A比；およびGelC10、6.2mgでの1.37のT/A比。接合効率（すなわち、遊離抗体の免疫接合体への変換）は、ある類似体（GelC10、GelC44、GelC239、GelC247、およびGelC248では、その他の類似体（GelC244、〜10％）より非常に（〜80％）大きかった。
（2）抗体断片への接合
類似体GelC247およびGelC44を、様々なキメラ［cFab、cFab，およびcF(ab')2］ならびに「ヒト型化」［he1 Fab、he2 Fab、he3 Fab、he1 Fab'およびhe1 F(ab')2］抗体断片に接合した。キメラH65抗体断片を、前出の米国特許出願No.07/714,175および前出の国際公開No.Wo89/00999に記載された方法に従って調製した。本明細書に参照として組み込んだ、1991年12月13日出願の、係属中で、共願に係る米国特許出願No.07/808,454に記載された（ヒトに対して免疫原性の小さいH65抗体を作成するための選択したマウスをコードするアミノ酸の置換を述べた）方法に従ってヒト型化したH65抗体断片の可変領域をコードするDNA配列を、配列番号：71（he1およびhe2のカッパ鎖）、配列番号：72（he1のガンマ鎖）、配列番号：73（he2およびhe3のガンマ鎖）、および配列番号：74（he3のカッパ鎖）に示した。
キメラH65抗体断片を、基本的に、GelC247およびGelC244へのヒト型化したFabおよびFab'断片の接合に関して述べた下記手順に従って、GelC247類似体に接合した。
（a）he1 Fab-GelC247
he1 Fabを、25mM TEOA緩衝液、250mM塩化ナトリウム、pH８にて透析し、M2IT架橋剤での誘導に先行して6.8mg/mlにまで濃縮した。リンカー反応のために、2.5mM DTNBの存在下にて、20倍過剰モルのM2ITを用いた。室温にて、30分間、反応を進行せしめ、GF05（ゲル濾過用樹脂）にて脱塩し、そして、0.1Mリン酸ナトリウム、0.2M塩化ナトリウム、pH7.5にて平衡化した。DTNB分析に基づいて、Fab当たり1.8のリンカー数が算出された。he1 Fab-M2IT-TNBを、GelC247での接合に先行して、3.7mg/mlにまで濃縮した。
10mMリン酸ナトリウム、0.3M塩化ナトリウム中の12.8mg/mlのGelC247を、接合のための反応性メルカプト基を露出させるために、室温にて、20分間、１mM DTT、0.5mM EDTAで処理し、GF05にて脱塩し、そして、0.1Mリン酸ナトリウム、0.2M塩化ナトリウム、pH7.5にて平衡化した。遊離チオール含量を、DTNB分析法を用いて、GelC247のモル当たりの遊離SHが0.74モルになるよう決定した。活性化抗体との接合に先行して、ゲロニンを、8.3mg/mlにまで濃縮した。
GelC247に関する遊離チオールと誘導したhe1 Fab-M2IT-TNBとの間の接合反応の条件は、以下の通りである。５倍過剰量のゲロニン類似体を、活性化he1 Fab-M2IT-TNB（双方のタンパク質を、0.1Mリン酸ナトリウム、0.2M塩化ナトリウム、pH7.5中にある）に添加し、そして、反応混合物を、室温にて、3.5時間、そして、４℃にて、一晩インキュベートした。接合に続いて、未処理M2ITリンカーを、室温にて、15分間、１：１モル比のシステインとリンカーで冷却した。冷却した反応溶液を、10mM Tris、150mM塩化ナトリウム、pH７で平衡化したゲル濾過カラム（G-75）に適用した。このカラムで生じた最初のピークを、10mM Tris、pH７で30mM塩化ナトリムにまで希釈し、そして、Blue Toyopearl（登録商標）に適用した。生成物を、10mM Tris、0.5M塩化ナトリム、pH7.5で溶出した。
（b） he1 Fab'-GelC247
同様に、H65 he1 Fab'を、M2IT架橋剤での誘導に先行して、25mM TEOR緩衝液、400mM塩化ナトリウム、pH８にて透析した。リンカー反応のために、2.5mM DTNBの存在下にて、20倍過剰モルのM2ITを用いた。室温にて、１時間、反応を進行せしめ、GF05（ゲル濾過用樹脂）にて脱塩し、そして、0.1Mリン酸ナトリウム、0.2M塩化ナトリウム、pH7.5にて平衡化した。DTNB分析に基づいて、Fab'当たり1.6のリンカー数が算出された。he1 Fab'-M2IT-TNBを、GelC247での接合に先行して、3.7mg/mlにまで濃縮した。
10mMリン酸ナトリウム、0.1M塩化ナトリウム中の77mg/mlのGelC247を、接合のための遊離チオールを露出させるために、室温にて、30分間、１mM DTT、0.5mM EDTAで処理し、GF05にて脱塩し、そして、0.1Mリン酸ナトリウム、0.2M塩化ナトリウム、pH7.5にて平衡化した。遊離チオール含量を、DTNB分析法を用いて、GelC247のモル当たりの遊離SHが1.48モルになるよう決定した。活性化he1 Fab'-M2IT-TNBとの接合に先行して、GelC247を、10mg/mlにまで濃縮した。
GelC247に関する遊離チオールと誘導したhe1 Fab'-M2IT-TNBとの間の反応の条件は、以下の通りである。5.7倍過剰量のゲロニンを、活性化he1 Fab'-M2IT-TNBに添加し、そして、最終塩濃度を0.25Mに調整した。反応混合物を、室温にて、1.5時間、そして、４℃にて、一晩インキュベートした。接合に続いて、未処理M2ITリンカーを、室温にて、15分間、１：１モル比のシステインとリンカーで冷却した。冷却した反応溶液を、10mM Tris、250mM塩化ナトリウム、pH７で平衡化したゲル濾過カラム（AcA54）に適用した。このカラムで生じた最初のピークを、10mM Tris、pH７で20mM塩化ナトリムにまで希釈し、そして、10mM Tris、20mM塩化ナトリム、pH７で平衡化したBlue Toyopearl（登録商標）に適用した。次いで、カラムを、10mM Tris、30mM塩化ナトリム、pH7.5で洗浄した。生成物を、10mM Tris、１Ｍ塩化ナトリム、pH7.5で溶出した。
（c）he2 Fab- GelC247
he2 Fabを、M2IT架橋剤での誘導に先行して、25mM TEOA緩衝液、0.25M塩化ナトリウム、pH８にて一晩透析した。リンカー反応のために、2.5mM DTNBの存在下にて、20倍過剰モルのM2ITを用いた。室温にて、20分間、反応を進行せしめ、GF05-LS（ゲル濾過）カラムにて脱塩し、そして、0.1Mリン酸ナトリウム、0.2M塩化ナトリウム、0.02％アジドナトリウムで平衡化した。誘導およびゲル濾過後のhe1 Fab濃度は、5.2mg/mlであった。
10mMリン酸ナトリウム、pH7.2中の8.33mg/mlのGelC44を、接合のための遊離チオールを露出させるために、室温にて、30分間、５mM DTT、0.5mM EDTAで処理し、0.1Mリン酸ナトリウム、0.2M塩化ナトリウムにて平衡化したGF05-LS樹脂を、0.5mM EDTAと0.02％アジドナトリウム、pH7.5で脱塩した。遊離チオール含量を、DTNB分析法を用いて、GelC247のモル当たりの遊離SHが0.83モルになるよう決定した。活性化he2 Fabとの接合に先行して、ゲロニンを、11.4g/mlにまで濃縮した。
GelC44に関する遊離チオールと誘導したhe2 Fab-M2IT-TNBとの間の反応の条件は、以下の通りである。３倍過剰量のゲロニン類似体を、活性化he2 Fab-M2IT-TNB（双方のタンパク質を、0.1Mリン酸ナトリウム、0.1M塩化ナトリウム、pH7.5中にあるが、ゲロニン溶液はさらに0.5mM EDTAを含んでいた）に添加した。反応混合物を、当初の容量の半分にまで濃縮し、そして、室温にて、４時間、次いで、４℃にて、72時間インキュベートした。インキュベーションに続いて、接合効率を、SDS PAGEによる検定で、70〜75％と見積もった。
接合に続いて、過剰のM2ITリンカーを、室温にて、15分間、１：１モル比のシステインとリンカーで冷却した。冷却した反応溶液を、10mM Tris、0.15M塩化ナトリウム、pH７で平衡化したゲル濾過カラム（G-75）に適用した。このカラムで生じた最初のピークを、10mM Tris、pH７で30mM塩化ナトリムにまで希釈し、そして、Blue Toyopearl（登録商標）カラムに適用した。生成物を、10mM Tris、１Ｍ塩化ナトリム、pH7.5で溶出した。
（d）he3 Fab-GelC44
同様に、he3 Fabを、M2IT架橋剤での誘導に先行して、25mM TEOA、0.25M塩化ナトリウム、pH８にて一晩透析した。リンカー反応のために、2.5mM DTNBの存在下にて、10倍過剰モルのM2ITを用いた。室温にて、45分間、反応を進行せしめ、GF05-LS（ゲル濾過）カラムにて脱塩し、そして、0.1Mリン酸ナトリウム、0.2M塩化ナトリウム、0.02％アジドナトリウムで平衡化した。DTNB分析に基づいて、Fab-M2IT-TNB当たり１のリンカー数が算出された。誘導およびゲル濾過の後のhe3 Fab濃度は、5.3mg/mlにまで濃縮した。
0.1Mリン酸ナトリウム、0.1M塩化ナトリウム、pH7.5中の7.8mg/mlのGelC44を、接合のための遊離チオールを露出させるために、室温にて、30分間、1.5mM DTT、１mM EDTAで処理し、0.1Mリン酸ナトリウム、0.2M塩化ナトリウム、および0.02％アジドナトリウム、pH7.5で平衡化したGF05-LS樹脂にて脱塩した。遊離チオール含量を、DTNB分析法を用いて、GelC44のモル当たりの遊離SHが0.66モルになるよう決定した。活性化he3 Fabとの接合に先行して、ゲロニンを、5.2mg/mlにまで濃縮した。
GelC44に関する遊離チオールと誘導したhe3 Fab-M2IT-TNBとの間の接合反応の条件は、以下の通りである。５倍過剰量のゲロニン類似体を、活性化he3 Fab-M2IT-TNB（双方のタンパク質は、0.1Mリン酸ナトリウム、0.1M塩化ナトリウム、pH7.5中にある）に添加した。反応混合物を、室温にて、２時間、そして、４℃にて、72時間インキュベートした。インキュベーションに続いて、接合効率を、SDS PAGEによる検定で、70〜75％と見積もった。
接合に続いて、過剰のM2ITリンカーを、室温にて、15分間、１：１モル比のシステインとリンカーで冷却した。冷却した反応溶液を、10mMリン酸ナトリウム、0.15M塩化ナトリウム、pH７で平衡化したGammmaBind G(Genex社、ゲテスバーグ、メリーランド州から入手した固定化タンパクＧ親和性樹脂）に適用した。これを、0.5M蟻酸ナトリウム、pH３で溶出し、Trisで中和した。そして、これを10mM Tris、0.15M塩化ナトリム、pH７にて一晩透析し、10mM Tris、pH７で30mM塩化ナトリムにまで希釈し、Blue Toyopearl（登録商標）カラムに適用した。生成物を、10mM Tris、１Ｍ塩化ナトリム、pH7.5で溶出した。
実施例６
全細胞殺傷検定
ゲロニンおよびゲロニン類似体で調製した免疫接合体を、急性リンパ球白血病Ｔ細胞系（HGB2細胞）およびヒト末梢血単核細胞（PBMCs）に対する細胞毒性に関して試験した。リシンＡ鎖とH65抗体（H65-RTA）および抗体断片との免疫接合体も試験された。リシンＡ鎖（RTA）ならびにH65-RTA免疫接合体を、前出の米国特許出願No.07/306,433および前出の国際公開No.Wo89/06989に記載された方法に従って調製および精製した。
要約すれば、HSB2細胞を免疫毒素と共にインキュベートし、免疫毒素の存在下でのタンパク質合成の阻害を、非処置対照細胞との比較にて測定した。標準H65-RTA（RTAに結合したSPDPで誘導したH65）、H65-ゲロニンならびにH65-rゲロニン、H65断片免疫接合体、およびゲロニン免疫接合体試料を、ロイシンを用いずに、2000〜0.632ng/mlの範囲の半減期濃度でのRPMIで希釈した。すべての希釈物を、１×105HSB2細胞を含むマイクロ滴定用プレートに、それぞれ三つずつ加えた。HSB2プレートを、37℃にて、20時間インキュベートし、そして、回収前に3H−ロイシンを適用した。試料を、Inotec Trace 96カスケードイオン化計測器で計測した。非処置試料との比較により、タンパク合成の50％阻害（IC50）に至る免疫毒素のピコモル濃度（pM）を算出した。異なる量の毒素あるいは毒素類似体を含む接合体を標準化するために、細胞毒素データを、各接合体調製物に固有の毒素／抗体比率を、接合体IC50（pM）をかけることで、ピコモルの毒素（pM T）濃度に変換した。
Fishwild et al., Clin. and Exp. Immunol., 86, 506-513（1991）による記載と、PBMCsでの免疫接合体の合計で90時間のインキュベーションを含めて、PBMC検定を行った。インキュベーションの最後の16時間の間に、3H−チミジンを添加し、添加が完了次第、DNA合成の免疫接合誘導した阻害を定性検定した。HSB2細胞およびPBMC細胞に対して接合するH65およびキメラH65抗体の活性を、下記表２に示した。
0003759163.tif 000016
HSB2細胞に対して、多くのゲロニン類似体免疫接合体は、天然ゲロニンあるいは組み換え、非修飾ゲロニンで調製した接合体より、低いIC50値に加え、大きな細胞殺傷レベルにおいて、はるかに良好な成績を示している。ヒトPBMCsに対して、ゲロニン類似体接合体は、少なくとも、天然および組み換えゲロニン接合体と同様の活性を示している。しかしながら、重要なことに、接合体のいくつか（例えば、GelC10、GelC44およびGelC247）は、天然および組み換えゲロニン接合体と比較して、PBMCsに対して向上した値を示し、また、向上した細胞殺傷レベルも示した（データ示さず）。
HSB2細胞およびPBMC細胞に対するH65抗体断片接合体の活性を、下記表３および４に示し、表４の殺傷の程度は、試験した内で最も高い免疫毒素濃度（１μg/ml）でのHSB2細胞における阻害されたタンパク合成の百分率で表している。
0003759163.tif 000017
0003759163.tif 000018
cFab'-GelC247免疫接合体は、組み換えゲロニンあるいはRTA30とのcFab’接合体よりも、明らかに細胞毒性が大きい。
実施例７
溶解性
組み換えゲロニンおよびゲロニン類似体は、天然ゲロニンおよびRTA 30双方との比較において、向上した溶解性を示した。加えて、組み換えゲロニンおよびゲロニン類似体免疫接合体は、天然ゲロニンおよびRTA30で調製した免疫接合体と比較して、向上した溶解性を示した。この向上した溶解性は、キメラFab断片で調製した組み換えゲロニンおよび類似体において、特に顕著であった。
ジスルフィド結合安定性検定
RIPを（抗体のような）目標分子に結合するジスルフィド結合の安定性が、免疫接合体のin vivoでの残存期間に影響を与えることは周知のことである〔Thorp et al., Cancer Res., 47, 5924-5931（1987）を参照のこと〕。例えば、ジスルフィド結合が、in vitroでの還元によって容易に壊される接合は、安定性が小さく、また、動物モデルでの効果も小さくなる。
〔Thorp et al., Cancer Res., 48, 6396-6403（1988）を参照のこと〕。
それ故、天然ゲロニン、組み換えゲロニン、およびゲロニン類似体で調製した免疫接合体は、Wawrzynczak et al., Cancer Res., 50, 7519-7526（1990）に記載されたのと同様のin vitroでのジスルフィド結合安定性検定に供した。接合体を、高い濃度のグルタチオンにて、37℃にて、１時間インキュベートし、ヨードアセトアミドとの反応を終えてから、放出されたRIPの量を、TosoHaas TSK-G2000SWカラムでのサイズ篩HPLCによって定量した。
高濃度の2-メルカプタノール（100％放出を決定するめの）によって、放出したRIPの量を比較することで、RIPの50％放出のために求められるグルタチオンの濃度（RC50）を算出した。H65抗体接合体の検定結果を、下記表５に示した。
0003759163.tif 000019
前記した結果は、異なるゲロニンタンパク質とH65抗体の間の結合の安定性が、多様に変化していることを示している。
GelC10とGelC239の例外を除けば、ゲロニン類似体の大半が、このin vitro分析において、その結合により生じた接合体が、二重リンカー化学接合よりもやや劣る安定性を有している旨の結果に至った。しかしながら、GelC239類似体の安定性は、際立って向上している。
H65抗体断片接合体に関する分析結果を、下記表６に示した。
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表５および６に示したRC50の値から、各免疫毒素の特定のRIP類似体の要素が、in vitroにて、免疫毒素ジスルフィド結合の安定性に関与しているものと思われる。
実施例８
H65抗体に対する接合体の薬物動力学
全H65抗体に結合したゲロニン類似体の薬物動力学を、ラットを用いて研究した。125Ｉ−標識した免疫接合体H65-(M2IT)-S-S-GelC247、H65-(M2IT)-S-S-GelC44、あるいはH65-(M2IT)-S-S-GelC10の0.1mg/kgのIV丸薬を、体重134〜148ｇのオスのSprague-Dawleyラットに投与した。３、15、30および45分、そして、1.5、２、４、６、８、18、24、48、72および96時間目にて、ラットから血清試料を採取した。各試料の放射能活性（cpm/ml）を測定し、そして、全免疫接合体に関連する放射能活性の画分を決定するためにSDS-PAGEを行った。血清放射能活性に関連した免疫接合体を、コンピューター・プログラムPCNONLIN（SCI Software社、レキシントン、ケンタッキー州）を用いて解析した。下記表７には、免疫接合体の薬物動力学のパラメーターを列挙している。表において、各数値の標準誤差を示し、そして、変数の片側解析を示し、ICとは（免疫接合体の一部であるゲロニン変異体に関する略語によって特定した）免疫接合体であり、ｎとは研究に用いた動物の数であり、Vcとは分散の中間値であり、Clとは浄化値、MRTとは中間残存時間の総計であり、αとは免疫接合体のα半減期を、そして、βとは免疫接合体のβ半減期を示している。
0003759163.tif 000021
GelC247免疫接合体が、2.3および20時間のαおよびβ半減期をそれぞれ有しており、中間残存時間の総計が17時間に及ぶことが判明した。血清試料に関するSDS-PAGEゲルでの放射能活性に関連した免疫接合体の取得が乏しかったので、72および96時間目での試料を、分析対照から除外した。
In vitro研究が、GelC10免疫接合体が大きなジスルフィド結合安定性を有していることを示唆していたので、そのin vivoでの半減期が、免疫接合体のcys247形態に深く関与しているものと考えられる。GelC247接合体の20時間に対して、免疫接合体のβ半減期は約33時間であった。中間残存時間の総計も、GelC10免疫接合体のそれとほぼ同様であった（GelC247接合体の42時間に対して、42時間）。加えて、GelC10免疫接合体の浄化値も2.5ml/hr/kgと、GelC247接合体のそれ（11ml/hr/kg）よりも４倍程度小さかった。In vitroジスルフィド結合安定性のデータから読み取れるように、GelC44免疫接合体の浄化値は、GelC10およびGelC247接合体のそれの中間である。
これら研究に基づいて、GelC44免疫接合体の特性が、GelC247免疫接合体よりもむしろ、GelC10免疫接合体の特性に近似しているにもかかわらず、H65抗体に接合したGelC10類似体が（長い残存時間と浄化値によって決定したように）、H65抗体に接合したGelC10およびGelC247接合体よりも大きなin vivoでの安定性を有している。
H65抗体断片に対する接合体の薬物動力学
ヒト型化H65 Fab断片に結合したゲロニンGelC247およびGelC44類似体の薬物動力学も、ラットを用いて研究した。125Ｉ−標識したhe1 H65-Fab-GelC247、he2 H65-Fab-GelC44、あるいは、he3 H65-Fab-GelC44の0.1mg/kgのIV丸薬を、体重150〜180ｇのオスのSprague-Dawleyラットに投与した。３、15、20、30および40分、そして、１、1.5、３、６、８、18、24、32、48、および72時間目にて、ラットから血清試料を採取し、そして、捕獲抗体としてのウサギ抗ゲロニン抗体と、二次抗体としてのビオチン標識したヤギ抗ヒトカッパＬ鎖抗体を用いたELISAによって解析を行った。下記表８に、その結果を示した。表において、各数値の標準誤差を示し、ICとは免疫接合体であり、ｎとは研究に用いた動物の数であり、Vcとは分散の中間値であり、Vssとは分散値の定常状態であり、Clとは浄化値、MRTとは中間残存時間の総計であり、αとは免疫接合体のα半減期を、そして、βとは免疫接合体のβ半減期を示している。
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三つの免疫接合体を比較すると、he1 H65-Fab-GelC247、he2 H65-Fab-GelC44、あるいはhe3 H65-Fab-GelC44の薬物動力学は非常に近似しており、特に、ELISA分析曲線から得たパラメーターを比較した際に、αおよびβ半減期、中間残存時間および浄化値が非常に近接していた。このことは、GelC247免疫接合体の浄化値（11ml/kg/hr）が、GelC44免疫接合体（４ml/kg/hr）の三倍以上あったという、これら抗体免疫接合体対応物の結果とは対照的である。このことは、Fab断片を結合するジスルフィド結合の開裂と、全抗体免疫接合体に関して、Fab免疫接合体の血清浄化値にとってゲロニンが重要でないことを示唆している。
免疫接合体の免疫原性
異系交配したSwiss/Websterマウスに、RTA、RTA30および組み換えゲロニンで調製したマウスH65抗体接合体（各注射にて0.2mg/kgを）を再三注射した。第１日目および第２日目に各動物に注射を行い、そして、28および29日後に注射を繰り返しすサイクルとした。動物に、かような注射のサイクルを５回行った。各一連の注射後の一週間および三週間後に、採血を行い、存在する抗-RIP抗体の量をELISAにより決定し、各サイクルでの各滴定量を表９に示した。RTAとRTA30は、注射の一回目のサイクル後に直ちに始まる強力な応答を示し、そして、実験期間中にわたってその強力な応答が維持された。これに対して、注射を５サイクルを経た後でも、ゲロニン接合体に関する応答は検出されなかった。接合体を完全フロインドアジュバンドと共に混合し、そして、腹膜にてマウスに注射した場合、抗-RTAおよびRTA30抗体は、数週間後には容易に検出された。これらデータは、抗ゲロニン抗体がもし生成されれば、ELISA分析によって検出されることを示し、そして、組み換えゲロニンが、RTAよりも、動物において免疫原性が小さいことを示唆するものである。
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実施例９
ヒト末梢血リンパ球（PBL）を再構成し、厳正に結合した免疫不全マウスモデルを、ゲロニン類似体GelC247およびGelC44を含む様々な免疫接合体のin vivoでの効果を評価するために用いた。免疫接合体を、CD5抗原を発現するヒト血液細胞を消耗する能力に関して試験した。
ヒトPBLドナーおよび細胞単離
ヒト末梢血細胞を、リンパ球試料（HemaCare社、シェルマンオークス、カリフォルニア州）あるいは健康なドナーから採取した静脈血液試料（Stanford University Blood Bank、パロアルト、カリフォルニア州）から取得した。血液細胞を、Ficoll-Hypaque密度勾配遠心分離（Ficoll-Paque（登録商標）；Pharmacia社、ピスカータウェイ、ニュージャージー州）を用いてPBLsを豊富に含ませ、PBSで４回連続して洗浄した。残留赤血球を、二回目の洗浄において、BBC溶解用緩衝液（16μl塩化アンモニウム、１mM重炭酸カリウム、12.5μl EDTA）で溶解した。最終懸濁液での細胞生存度は、トリパンブルー染色による＞95％と評価された。
動物およびPBL転移
CB.17 scid/scid（SCID）マウスを、Taconic社（ゲルマンタウン、ニューヨーク）から購入、あるいは、特定の病原が存在しない動物用施設における無菌状態下での採血（飼育用動物は、Hana Biologics社、アラメダ、カリフォルニア州から入手した）によって取得した。動物を濾過装置を供えたカゴに入れ、予防用の抗生物質処置を施さなかった。動物に対するすべての操作を、層流フード中にて行った。
非処置SCIDマウスを、マウスIgレベルの決定のために採血した。ヒトPBLを注射したマウスを、ヒトIgおよびsIL-2Rの定量のために様々な間隔で採血を行った。採取した血液を、眼窩後片腔から凝血防止加工したチューブに送られた。血液試料を、300×ｇにて、10分間、遠心分離し、そして、血漿を回収し、−70℃にて保存した。マウスとヒトIgを、標準的なサンドウィッチELISAsを用いて定量した。要約すれば、平底マイクロ滴定用プレート（MaxiSorp Immuno-Pates、Nunc社、ロスキルド、カリフォルニア州）を、重炭酸塩緩衝液、pH9.6中のヤギ抗マウスIgG+IgA+IgM（Zymed Laboratories社、サウスサンフランシスコ、カリフォルニア州）あるいは、ヤギ抗ヒトIgs（Tago社、バーリンゲーム、カリフォルニア州）でコートし、４℃で、一晩インキュベートした。プレートを、Tris緩衝化生理食塩水、pH7.5（TBS）中の１％BSAで、室温にて、２時間ブロックし、そして、標準試薬あるいはTBS/1% BSA/0.05% Tween 20で連続的に希釈した試料で、37℃で、１時間インキュベートした。使用した標準試薬は、モノクローナルマウスIgG2a（IND1抗メラノーマ；ゾーマ社、バークレイ、カリフォルニア州）およびポリクローナルヒトIg（Sigma Chemical社、セントルイス、ミズーリー州）であった。続いて、プレートを、TBS/Tween 20で洗浄し、アルカリ性フォスファターゼ接合したヤギ抗マウスIgG+IgA+IgM、あるいはヤギ抗ヒトIgs（Caltag Laborartoris社、サウス、サンフランシスコ、カリフォルニア州）で、37℃で、１時間インキュベートした。10％ジエタノールアミン緩衝液、pH9.8、中の１mg/ml p-ニトロフェニルホスフェート（Sigma社）でのインキュベートに続いて、405nmでの吸収の測定により検出を行った。正常BALB/cマウスからの血漿を、マウスIg EDTAでの正の対照として用いた。天然SCIDマウスあるいは正常BALB/cマウスからの血漿試料は、検出可能なレベルのヒトIgを有していなかった。ヒトsIL-2Rを、ELISAキット（Immunotech S.A., マルセイユ、フランス）を、その使用説明書に従って使用して定量した。
低血漿レベル（＜１０μg/ml）のマウスIgを有する５〜７週齢のマウスを、200mg/kgのサイクロホスファミド（Sigma社）の腹膜注射によって前処置した。二日後、それらマウスに、0.8mlのPBS中に懸濁させた25〜40×106の新たに単離したヒトPBLを腹膜注射した。
免疫接合体処置
ヒトPBL移植後、約２週間の時点でSCIDマウスの採血を行った。検出できない10pM未満のヒトsIL-2Rあるいは低血漿レベルのマウスを研究対象から除外した。検出可能であるが、ヒトsIL-2Rのレベルが低いマウスの除外の基準は、各研究において経験的に決定されるものであるが、概ね20pMである。残ったマウスをグループ分けし、５日間連続して、毎日、静脈用薬剤（0.2mg/kg）としての担体あるいは免疫接合体を投与した。組織中のヒトＴ細胞および血漿中のヒトsIL-2Rの定量のために、処置を中止して１日後に、動物を屠殺した。
組織の回収およびPBL消耗の解析
血液を眼窩後片腔から回収し、凝血防止加工したチューブに送った。頸部脱臼によりマウスを屠殺し、無菌的に脾臓を除去した。脾臓細胞の単一細胞懸濁液を、無菌顕微鏡スライドの凍結した端の間で脾臓を押圧することによりHBSS中に調製した。回収した細胞を、PBSで二度洗浄した。RBC溶解用緩衝液を用いて、血液および脾臓細胞懸濁液から赤血球を除去した。次いで、計測のために、細胞をPBS中に再懸濁した。復元した細胞を、血球計算器を用いてAg発現に関して検定を行った。
PBS/1% BSA/0.1%アジドナトリウムの100μl中の20〜50万個の細胞を、氷上にて、30分間、様々なFITC-あるいはフィコエリトリン（PE）-接合した抗体（Becton-Dickinson社、マウンティン  ビュー、カリフォルニア州）の飽和量を用いてインキュベートした。染色のために用いた抗体としては、HLe-1-FITC(IgG抗CD45)、Leu 2-FITC(IgG1抗CD8)、Leu 3-PE(IgG1抗CD4)、およびLeu M3-PE(IgG2a抗CD14)がある。対数増幅器を用いたFACscan（Becton-Dickinson社）にて試料を分析した。陽性細胞を定量するための領域を、天然SCIDマウスから取得した細胞の染色に基づいて設定した。SCID組織から復元したヒトAg-陽性細胞の絶対数を、各組織試料から復元した細胞の総数に、陽性細胞の百分率を乗じることで決定された。血液中の白血球の総数を、1.4ml/マウスの血液体積理論値を用いて算出した。SCIDマウス組織中のヒト細胞の正確な定量のための検出限界は、0.05％であった。処置グループ間の統計学的比較を、Mann-Whitney U試験を用いて行った。ｐ値が0.05未満であれば、処置グループは緩衝液対照グループから有為の相違があるとした。その結果を、下記表10に示し、その表において、＋は対照との間に有為の相違が認められたこと、−は有為の相違が認められなかったこと、そして、NTは接合体が試験されなかったことを意味する。CD5 Plus（ゾーマ社、バークレー、カリフォルニア州）は、化学的にRTAに結合したマウスH65抗体であり、また、正の対照でもある。OX19 Fab-GelC247は、負の対照免疫接合体である。OX19抗体（ECACC No.84112012）は、ヒトCD5と交差反応しない、マウス抗ラットCD5抗体である。
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すべてのゲロニン免疫接合体は、マウスモデルにおいて、ヒト細胞の消失能力があった。
実施例10
それぞれが、末端を切除したH65 Ｈ鎖遺伝子（Fd）あるいはH65 Ｌ鎖遺伝子（カッパ）に融合した天然配列ゲロニン遺伝子を含んでいる、９つの遺伝子構築物を作製した。H65 Fd配列は、マウスH65 Ｌ鎖可変（L）、共有（J）ならびにヒトIgG1、定常（C）ドメイン１領域をコードするヌクレオチドから構成されている。H65 FdのＶおよびＪ領域およびpelBリーダーに結合したカッパ断片遺伝子のDNA配列は、GenBank（Los Alamos National Laboratories、ロス  アラモス、ニューメキシコ州）から、受託No.M90468およびM90467それぞれから入手した。遺伝子融合体の４つが、H65 Fd断片遺伝子の5'端に結合したゲロニン遺伝子を含み、そして、他のものは、H65 Fd断片遺伝子の3'端に結合したゲロニン遺伝子を含んでいた。ジスルフィド結合に関与する二つのシステイン残基を含み、プロテアーゼ感受性アミノ酸配列を含んだループを形成するE. coliシガ様毒素（SLT）（配列番号：58）、あるいは、いくつかのカテプシン開裂部位を含んだウサギ筋肉アルドラーゼ（RMA）（配列番号：59）のペプチドセグメントをコードするDNAリンカーを、ゲロニン遺伝子および構築物中の抗体遺伝子の間に挿入した。あるいは、ゲロニン遺伝子とペプチドリンカーセグメントを含まないH65 Fab断片遺伝子の間にて直接融合体を作製した。下記表11には、各遺伝子融合体の名称と、遺伝子融合体が含む発現ベクターを示した。各プラスミドはまた、各特定の遺伝子融合体が共発現する（表11にて括弧内に示した）Fab断片遺伝子を含む。
0003759163.tif 000025
抗体遺伝子のカルボキシル末端でのゲロニンの融合
（13Fd::SLT::ゲロニン（カッパ）
23個のアミノ酸SLTリンカー配列を有するH65 Fd鎖の3'端へのゲロニン遺伝子融合体を、プラスミドpVK1、pING3731（ATCC68721）、およびpING4000からの三片連結にて作製した。プラスミドpVK1は、SLTリンカー配列の枠内に結合したFd遺伝子を含み、PING3731はゲロニン遺伝子を含み、そして、PING4000はジシストロンメッセージとしてのaraBプロモーターの制御下でpelBリーダー配列にそれぞれ結合したH65カッパおよびFd遺伝子を含んでいる。
鎖内ジスルフィド結合を形成する二つのシステイン残基によって結合されたSLT遺伝子のプロテアーゼ感受性セグメントに、ヒトIgG Fd1定常領域枠内の3'端を結合するように、プラスミドpVK1を設計した。SLT遺伝子セグメント（クローニングを促進するために導入した三つのアミノ酸とシステイン残基によって結合したSLTからの20個のアミノ酸）を、二つのオリゴヌクレオチド、SLTリンカー１およびSLTリンカー２から作製した。
0003759163.tif 000026
二つのオリゴヌクレオチドをアニールし、PstIおよびXhoI粘着末端を含むベクターに結合し、PstI部位を壊し、そして、XhoI部位を残した。ベクター、pING3185は、Fd遺伝子の3'端に加工したPstI部位を、また、Fd遺伝子の下流にXhoI部位を有していた。この結合による生成物、pVK1は、SLTリンカーセグメントと共に枠内に（pelBリーダーに融合した）H65 Fd遺伝子と、SLTリンカーの3'端に、FspIおよびScaIの二つの制限部位を含んでいた。
プラスミドpVK1をSauIおよびScaIで消化し、Fd定常領域部分とSLT遺伝子全セグメントを含んだ217bpの断片を、アガロースゲルでの電気泳動で精製した。pING3731を、SmaIおよびXhoIで消化し、760bpのゲロニン遺伝子を同様に精製した。プラスミドpING4000をSauIおよびXhoIで消化し、全カッパ遺伝子とFd遺伝子部分を含むベクターセグメントも精製した。これら三つのDNA断片の結合にて、Fd::SLT::ゲロニン（カッパ）遺伝子融合ベクターを含んだpING4406が得られた。
（2）カッパ::SLT::ゲロニン（Fd）
25個のアミノ酸SLTリンカー配列（クローニングを促進するために導入した５つのアミノ酸とシステイン残基によって結合したSLTから20個のアミノ酸）を有するH65カッパ鎖の3'端へのゲロニン遺伝子融合体を、pING3731（ATCC68721）、およびpING3713中のDNAセグメントから作製した。
プラスミドpING3731は、H65 Fdおよびカッパ遺伝子が、カッパ遺伝子の3'端にて枠内でクローニングしたSLTリンカーセグメントを含んだジシストロン転写ユニットにて結合しているFab発現ベクターである。このプラスミドは、以下のようにして構築した。H65 Fdおよびカッパ遺伝子を含んだ起源プラスミドにて、コードしたアミノ酸を改変せずに、特定部位の突然変異誘発によって、カッパ遺伝子の3'端にEagI部位を置いた。pVK1からのSLT遺伝子セグメントは、カッパ遺伝子の3'端でのEagI部位への枠内結合のためのプライマーSLT-EagI5'およびSalIで増幅した。
0003759163.tif 000027
140bpのPCR生成物をEagIおよびXhoIで消化し、SLT遺伝子セグメントを含んだ75bpの断片を、pING3713を生成するために、起源プラスミドでのFdおよびカッパ遺伝子近傍にてクローニングした。
ゲロニンへの遺伝子融合体の構築のために、pING3731をScaIおよびXhoIで消化し、Fd遺伝子およびカッパ::SLT融合体を含んだベクター断片を精製した。pING3731を、SmaIおよびXhoIで消化し、ゲロニン遺伝子を含むDNA断片も精製した。これら二つの断片の結合による生成物、pING4407は、Fdおよびカッパ::SLT::ゲロニン遺伝子を含んでいる。
（3）Fd::RMA::ゲロニン（カッパ）
21個のアミノ酸RAMリンカー配列（クローニングを促進するために導入した１つのアミノ酸を有するRMAからの20個のアミノ酸）を有するH65 Fd鎖の3'端へのゲロニン遺伝子融合体を、プラスミドpSH4、pING3731（ATCC68721）、およびpING4000からの三片結合によって作製した。
プラスミドpSH4は、RMAリンカー配列に枠内にて結合したFd遺伝子を有している。RMA遺伝子セグメントを、以下のようにして、重複延伸PCRによって、Fdの3'端に結合した。Fd遺伝子の3'端（定常領域）を、プライマーKBA-γ２およびRMAG-1を有する起源プラスミドから、PCRによって増幅した。すべてのヒトIgG1抗体の定常領域は同一であるので、どのFd定常領域でも使用できる。
0003759163.tif 000028
この反応の生成物を、第一反応の増幅生成物にアニールするためのプライマーRMA-76と共に混合し、混合物をKBA-γ２およびRMAK-2で増幅した。
0003759163.tif 000029
このPCR生成物は、RMA遺伝子セグメントに枠内にて結合したFd定常領域の部分を含んでいた。この生成物は、ゲロニンのようなタンパク質への枠内での融合に有用なScaI制限部位、および後続のクローニングに有用なXhoI部位も含んでいた。このPCR生成物をSauIおよびXhoIで切断し、pSH4を生成するために、Fdの残りの部分の近傍に連結した。
FD::RMA::ゲロニン、カッパ遺伝子を含んだ遺伝子融合ベクターの作製のために、pSH4をSauIおよびScaIで切断し、Fd::RMAセグメントを精製した。プラスミドpING3731を、SmaIおよびXhoIで切断し、ゲロニン遺伝子を含む760bpDNA断片を精製し、そして、pING4000をSauIおよびXhoIで切断し、さらに、ベクターを精製した。これら断片の連結による生成物、pING4408は、Fd::RMA::ゲロニンとカッパ遺伝子を含んでいた。
（4）カッパ::RMA::ゲロニン（Fd）
21個のアミノ酸RMAリンカー配列を有するH65カッパ鎖の3'端へのゲロニン遺伝子融合体を、プラスミドpSH6、pING4408（先のパラグラフを参照）、およびpING3713からの三片結合によって作製した。
プラスミドpSH6は、RMAリンカー配列に枠内にて結合したカッパ遺伝子を有している。RMA遺伝子セグメントを、以下のようにして、重複延伸PCRによって、カッパの3'端に結合した。カッパ遺伝子の3'端（定常領域）を、プライマーKBA-K2およびRMAK-1を有する起源プラスミドから、PCRによって増幅した。
0003759163.tif 000030
この反応の生成物を、第一反応の増幅生成物にアニールするためのプライマーRMA-76（配列番号：81）と共に混合し、混合物をKBA-K2およびRMAK-2（配列番号：82）で増幅した。このPCR生成物は、RMA遺伝子セグメントに枠内にて結合したカッパ定常領域の部分を含んでいた。この生成物は、ゲロニンのようなタンパク質への枠内での融合に有用なScaI制限部位、および後続のクローニングに有用なXhoI部位も含んでいた。このPCR生成物をSatIおよびXhoIで切断し、pSH6を生成するために、カッパ遺伝子の残りの部分の近傍に連結した。
Fd::RMA::ゲロニン、Fd遺伝子を含んだ遺伝子融合ベクターの作製のために、pSH6をHindIIIおよびPstIで切断し、カッパ定常領域とRMAリンカーセグメント（PstI RMAリンカーセグメントは、PstI部位を含む）部分を含んだDNA断片を精製した。プラスミドpING4408を、PstIおよびSalIで切断し、RMAリンカーのセグメント、ゲロニン遺伝子、およびベクターセグメント中のテトラサイクリン耐性遺伝子部分を含む断片を精製した。これら三つの断片の連結による生成物、pING4410は、カッパ::RMA::ゲロニンとFd遺伝子を含んでいた。
抗体遺伝子のアミノ末端におけるゲロニンの融合
（1）ゲロニン::SLT::Fd（カッパ）
25個のアミノ酸SLTリンカー配列（クローニングを促進するために導入した５つのアミノ酸とシステイン残基によって結合したSLTからの20個のアミノ酸）を有するH65 Fd鎖の5'端へのゲロニン遺伝子融合体を、プラスミドpING3748、pING3217、およびpING3217のFd遺伝子の可変領域であるH65γ可変領域（VH）遺伝子セグメントをコードするPCR断片からの三片連結にて作製した。プラスミドpING3748は、SLTリンカー配列の枠内にて結合したゲロニン遺伝子を含み、pING3217はジシストロン転写ユニットのH65 Fdおよびカッパ遺伝子を含んでいる。
プラスミドpING3825（実施例２参照）を、ゲロニン遺伝子の3'端にEagI部位をPCR変異法にて導入するために、PCRプライマーgelo3'-Eagおよびgelo-9を用いて増幅した。
0003759163.tif 000031
このPCR生成物をBclIおよびEagIで切断し、56bpのDNA断片を精製した。プラスミドpING3713をEagIおよびXhoIで切断し、SLTリンカーを含む77bpのDNA断片を精製した。56bpのBclI-EagI断片および77bpのEagI-XhoI断片を、SLTリンカー配列に枠内にて結合したゲロニン遺伝子を含むPING3748を生成するために、BclIおよびXhoIで消化したpING3825に連結した。
ゲロニン::SLT::Fdおよびカッパ遺伝子を含んだ遺伝子融合ベクターの作製のために、H65 VHを、プライマーH65-G1およびH65-G2を用いてpING3217からPCRによって増幅し、そして、生成物を、T4ポリメラーゼ処理し、そしてNdeIで消化した。
0003759163.tif 000032
H65 Ｈ鎖Ｖ領域の5'-端を含んだ176bpの断片を精製した。同時に、pING3217をNdeIとXhoIで消化し、Fd遺伝子部分と全カッパ遺伝子を含んだ1307bpのDNA断片を精製した。ゲロニン::SLT:Fdおよびカッパ遺伝子を含む、三片結合にてpING3754（ATCC 69102）を生成する、ScaIとXhoIで消化されたPING3784にこの二つの断片を連結した。
（2）ゲロニン::SLT::カッパ（Fd）
25個のアミノ酸SLTリンカー配列を有するH65カッパ鎖の5'端へのゲロニン遺伝子融合体を、pING3748（前節を参照）、pING4000、およびH65カッパ可変領域（VL）遺伝子セグメントをコードするPCR断片からの三片連結にて作製した。
pING3713中のDNAセグメントから作製した。
ゲロニン::SLT::カッパおよびFd遺伝子を含んだ遺伝子融合ベクターの作製するために、H65 VLを、プライマーH65-K1およびJK1-HindIIIを用いてpING3217からPCRによって増幅し、そして、生成物を、T4ポリメラーゼ処理し、そしてHindIIIで消化した。
0003759163.tif 000033
Ｌ鎖Ｖ領域を含んだ306bpの断片を精製した。同時に、pING4000をHindIIIとXhoIで消化し、カッパ定常領域と全Fd遺伝子を含んだ1179bpのDNA断片を精製した。ゲロニン::SLT::カッパおよびFd遺伝子を含む、三片結合にてpING3748を生成する、ScaIとXhoIで消化されたPING3748にこの二つの断片を連結した。
（3）ゲロニン::RMA::Fd（カッパ）
24個のアミノ酸RMAリンカー配列（クローニングを促進するために導入した４つのアミノ酸とシステイン残基によって結合したRMAからの20個のアミノ酸）を有するH65 Fd鎖の5'端へのゲロニン遺伝子融合体を、pING3755、pING3217、およびH65 VH遺伝子セグメントをコードするPCR断片からの三片連結にて作製した。プラスミドpING3755は、RMAリンカー配列に枠内にて結合したゲロニン遺伝子を含み、また、pING3217は、ジシストロン転写ユニットでのH65 Fdおよびカッパ遺伝子を含んでいる。
プラスミドpING3755を、RMAリンカー遺伝子セグメントに結合したゲロニン遺伝子を含むように作製した。RMAリンカー遺伝子セグメントを、プライマーRMA-EagIおよびHindIII-2を用いてpSH4からPCRによって増幅した。
0003759163.tif 000034
198bpのPCR生成物を、EagIおよびHindIIIで切断し、得られた153bpのDNA断片を精製した。pING3748からのPstI-EagI断片およびpING3825からのPstI-HindIIIベクター断片を用いて、このRMA遺伝子セグメントを、ゲロニン近傍にクローニングした。この三片連結の生成物は、pING3217であった。
ゲロニン::RMA::Fdおよびカッパ遺伝子を含んだ遺伝子融合ベクターを作製するために、H65 VHを、プライマーH65-G1（配列番号：86）およびH65-G2（配列番号：87）を用いてpING3217からPCRによって増幅し、そして、生成物を、T4ポリメラーゼ処理し、そしてNdeIで消化した。Ｈ鎖Ｖ領域の5'端を含んだ186bpの断片を精製した。同時に、pING4000をNdeIとXhoIで消化し、Fd遺伝子と全カッパ定常領域を含んだ1307bpのDNA断片を精製した。ゲロニン::RMA::Fdおよびカッパ遺伝子を含む、三片結合にてpING3759（ATCC 69104）を生成する。ScaIとXhoIで消化されたPING3755にこの二つの断片を連結した。
（4）ゲロニン::RMA::カッパ（Fd）
24個のアミノ酸RMAリンカー配列を有するH65カッパ鎖の5'端へのゲロニン遺伝子融合体を、pING3755、pING4000、およびH65 VL遺伝子セグメントをコードするPCR断片からの三片連結にて作製した。
ゲロニン::RMA::カッパおよびFd遺伝子を含んだ遺伝子融合ベクターを作製するために、H65 VLセグメントを、プライマーH65-1（配列番号：88）およびJK1-HindIII（配列番号：89）を用いてpING3217からPCRによって増幅し、そして、生成物をT4ポリメラーゼ処理し、そしてHindIIIで消化した。Ｌ鎖Ｖ領域の5'端を含んだ360bpの断片を精製した。同時に、pING4000をHindIIIとXhoIで消化し、カッパ定常領域と全Fd遺伝子を含んだ1179bpのDNA断片を精製した。ゲロニン::RMA::カッパおよびFd遺伝子を含む、三片結合にてpING3758（ATCC 69103）を生成する、ScaIとXhoIで消化されたPING3755にこの二つの断片を連結した。
（５）ゲロニン::Fd（カッパ）
pING3754から、ゲロニン遺伝子融合体を直接構築した。pING3754を、BglIとXhoIで消化し、ベクターセグメントを精製した。同時に、pING3754を、EagIで消化し、T4ポリメラーゼ処理し、BglIで切断し、そして、ゲロニン遺伝子セグメントを精製した。pING3754はまた、FspIとXhoIで切断し、Fdおよびカッパ遺伝子セグメントを精製した。カッパ遺伝子と関連するFdへのゲロニンの直接遺伝子融合体を含む、三片結合にてpING3334を生成するために、これら断片を組み合わせた。
実施例11
実施例10に記載した構造を有する８つのゲロニン遺伝子融合体のそれぞれを、H65 Fab遺伝子との組み合わせにて、アラビノース誘導したE. coli株E104にて共発現した。
遺伝子融合体の発現生成物は、ELISAによる誘導培養の上清から検出された。典型的には、プレートを抗体を認識するゲロニンで被覆した。培養上清を適用し、結合したFabをセイヨウワサビペルオキシダーゼを結合したヒト・カッパを認識する抗体で検出された。ゲロニンに化学的に接合されたH65 Fab断片を、標準として用いた。他のELISA方法は、カッパあるいはFdのいずれかを認識する抗体によるプレートの被覆、あるいは同様の結果を招く抗ヒトカッパよりもむしろ、抗ヒトFdによる検出工程を含んでいる。ゲロニン、カッパおよびFdを含んだ適切に作製された融合タンパク質だけが、この方法によって検出される。非会合鎖は検出されなかった。
誘導した培養基から生成した融合タンパク質は、約20〜25ng/mlの濃度にてE. coli E104に蓄積された、発現ベクターpING4406、4407、4408および4410を含んでいた。pING3754、3334、3758および3759（pING3757ではなく）の誘発次第に発現した融合タンパク質は、約100〜500ng/mlという高いレベルで発現した。抗ヒトカッパあるいは抗ゲロニン抗体のいずれかを用いたウェスターンブロットの免疫染色によって、濃度E. coli培養上清中にて、約70,000Kdの融合タンパク質を検出した。
pING3754（ATCC 69102）からのゲロニン::SLT::Fd（カッパ）融合タンパク質を、誘導した10Ｌ醗酵培養基から精製した。10Ｌの醗酵培養基は濃縮され、そして、S10Y10カートリッジ（Amicon者）とDC10濃縮器を用いて10mM燐酸緩衝液、pH7.0に緩衝液交換された。10mM燐酸ナトリウム緩衝液、pH7.0で平衡化したDE52カラム（20×５cm）に濃縮した上清を通すことで、上清を精製した。10mM燐酸緩衝液中のCM52（５×10cm）のカラムクロマトグラフィーによって、流出液をさらに精製および濃縮した。塩化ナトリウムの0〜0.2M直線勾配を、融合タンパク質を溶出するために用い、融合タンパク質を含んだ画分をプールし、それを、プロテインＧカラム（１ml）に適用した。融合タンパク質は、0.2MのグリシンでプロテインＧから溶出した。CM52カラム工程を省略し、DE52カラムを100mM燐酸ナトリウム緩衝液、pH7.0で平衡化したこと以外は同様である方法によって、醗酵用培養基からゲロニン::RMA::Fd（カッパ）およびゲロニン::RMA::カッパ（Fd）融合タンパク質を精製した。
融合タンパク質は、均質化するまでは精製されなかった。
三つの精製融合タンパク質のそれぞれを、RLA分析にて活性を、そして、Ｔ細胞系HSB2に対する細胞毒性に関して分析した。（T細胞は、H65抗体によって認識されるCD5抗原を発現する。）RLA分析は実施例４に従って行い、その結果を、下記表12に示した。
0003759163.tif 000035
実施例６に従って行った全細胞・細胞毒性分析にて、融合タンパク質は活性を呈し、そして、二つのＴ細胞、HSB2およびCEMを、それぞれ、H65に化学的に結合したゲロニンよりも、２倍（HSB2）あるいは10倍（CEM）も低いIC50にて死滅せしめた。各試料での融合タンパク質の量に比例して調製したIC50値を示した結果を、下記表13に示した。
0003759163.tif 000036
融合タンパク質は、末梢血単各細胞に関しても同様の活性を示した（データ示さず）。
実施例12
天然配列ゲロニン遺伝子も、ヒト型化he3 H65可変領域の一本鎖形態に融合した。ゲロニン遺伝子は、融合遺伝子のＮ末端に位置し、そして、SLTあるいはRMAリンカーペプチドを、後続のゲロニンのサイトソル放出によって、融合タンパク質の細胞間処理できるように、ゲロニンと抗体領域との間に位置させた。
he3 H65可変領域の一本鎖抗体（scAb）形態を、先に構築した遺伝子から作製した。この一本鎖抗体セグメントは、15個のアミノ酸可撓性ペプチド[(Gly4)Ser]3を介して他方の鎖（ＨあるいはＬ）からのＶあるいはＬの全セグメントに結合した一方の鎖（ＨあるいはＬ）のＶあるいはＬの全領域から構成されている。このペプチドは、Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 5879-5883(1988);Glockshuber et al., Biochemistry, 29, 1362-1367(1990);およびCheadle et al., Molecular Immunol., 29, 21-30(1992)に記載されたものと同一である。この一本鎖抗体は、V-JKappa::[(Gly)4Ser]3::V-JGammaおよびV-JGamma::[(Gly)4Ser]3::V-JKappaの二つの配向で作製した。各一本鎖抗体セグメントが作製され、そして、ゲロニンに融合された。
一本鎖抗体セグメントV-JKappa::[(Gly)4Ser]3::V-JGammaの作製のために、10mM塩化カリウム、20mM Tris、pH8.8、10mM硫酸アンモニウム、２mM硫酸マグネシウム、0.1％ Triton X-100., 100ng/ml BSA、200μMの各dNTP、および２単位のVentポリメラーゼ（New England Biolabs社、バークレイ、マサチューセッツ州）を含む全量100μlの反応液にて、PCRによって、pING4627から、he3 V/Jカッパ配列を含む352bpのDNA断片を増幅するために、プライマーHUK-7およびSCFV-1を用いた。
0003759163.tif 000037
同時に、pING4623からhe3 Ｈ鎖V/Jガンマセグメントを増幅するために、プライマーSCFV-2およびSCFV-3を用い、400bpの断片を生成した。
0003759163.tif 000038
これら反応からの生成物を混合し、そして外部プライマーHUK-7とSCFV-3を用いて増幅した。この反応の生成物を、T4ポリメラーゼで処理し、そして、XhoIで切断した。得られた728bpの断片を、アガロースゲルでの電位泳動で精製した。この断片を、ScaIおよびXhoIで消化したベクターpING3755およびpING3748（実施例10参照）に連結した。得られたベクターpING4637およびpING4412は、ゲロニン::RMA::一本鎖抗体V-JKappa::[(Gly)4Ser]3::V-JGammaとゲロニン::SLT::一本鎖抗体V-JKappa::[(Gly)4Ser]3::V-JGamma融合遺伝子のそれぞれを含んでいた。
同様に、he3 V/Jカッパ配列を含む367bp断片を生成する、一本鎖抗体V-JGamma::[(Gly)4Ser]3::V-JKappaを、プライマーSCFV-5およびSCFV-6を用いてpING4627の増幅により作製し、
0003759163.tif 000039
そして、he3ガンマV/J配列を含む385bp断片を生成する、pING4623を、プライマーH65-G3およびSCFV-4を用いて、Ventポリメラーゼを用いたPCRにより作製した。
0003759163.tif 000040
これら反応からの生成物を混合し、そしてH65-G3とSCFV-6を用いて増幅した。737bpの断片を、T4ポリメラーゼで処理し、そして、XhoIで切断した。（ScaIおよびXhoIで消化した）pING3755およびpING3748（実施例10参照）への連結により、ゲロニン::RMA::一本鎖抗体V-JGamma::[(Gly)4Ser]3::V-JKappaとゲロニン::SLT::一本鎖抗体V-JGamma::[(Gly)4Ser]3::V-JKappa融合遺伝子のそれぞれが作製された。
開裂可能なリンカーを含まないゲロニン::一本鎖抗体融合体が、制限酵素EagIおよびFspIを用いてpING4412中のSLTリンカーを削除することで構築された。これら部位での消化ならびにプラスミドの再連結は、SLT配列の枠内削除をもたらした。
実施例13
BRIPは、免疫毒素の有力な候補に成りうる特性を保持している。BRIPは、肝臓や健全な循環器系におけるin vivoでの残留時間を減縮するという天然非グリコシル化タンパク質である。加えて、BRIPは、リシンのＡ鎖よりも、動物に対する毒性、ならびに免疫原性が小さい。E. coli発現系でのBRIP遺伝子のクローニング及び組み換えBRIPの発現は、大麦から直接取り出した天然BRIPの精製の必要性を解消し、抗体への接合のために利用できるシステイン残基と接合するBRIPの類似体の発生を可能ならしめる。
BRIPの生成およびBRIPに対するポリクローナル抗体の生成
天然BRIPは、精白玉麦粉から精製した。４キログラムの小麦粉を、16リットルの抽出緩衝液（10mM燐酸ナトリウム、25mM塩化ナトリウム、pH7.2）により、４℃で、20時間かけて抽出した。沈殿物を遠心分離機により除去し、200mlの装填したS-セファロース（Pharmacia社、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）を、BRIPを吸収するために添加された。４℃で、20時間撹拌したのち、樹脂を除去し、抽出用緩衝液で数回洗浄し、そして、2.6×4.0cmのカラムに装填された。一旦装填すれば、カラムは、抽出用緩衝液（150ml/h）で排出物の吸収度が零に接近するまで洗浄した。そして、BRIPを、抽出用緩衝液中の0.025〜0.3Mの塩化ナトリウムの直線勾配で溶出され、５mlの画分が回収された。BRIPを含むピーク（カラム画分のウェスターン分析により同定された）をプールし、約20mlにまで濃縮したものを、10mM燐酸ナトリウム、125mM塩化ナトリウム、pH7.4（10ml/hr）で平衡化した2.6×1400cm Sephacry1 S-200HR（Pharmacia社）カラムにてクロマトグラフィーに適用した。BRIPを含むピークは再度プールされ、濃縮され、−70℃で保存された。
得られた精製BRIPタンパク質は、クーマシー染色タンパク質バンドの移動度、およびそれに続くSDS-PAGEの結果からして、約30,000ダルトンの分子量を有していた。アミノ酸組成は、Asano et al., Carlsberg Res. Comm., 49, 619-626(1984)の記載と一致していた。
ポリクローナル抗血清を生成するために、ウサギを精製したBRIPで免疫処置した。
BRIP遺伝子のクローニング
ファージλ発現ベクターλZAPIIの発芽大麦種子から調製したcDNA発現ライブラリーを、Stratagene社、ラヨラ、カリフォルニア州から購入した。およそ700,000ファージプラークが、抗BRIPポリクローナル抗血清でスクリーニングされ、６個の免疫反応性プラークが同定された。ひとつのプラークが選択され、それを含有するcDNAがEcpRIを用いてλZAPIIから切り出し、ベクターpBS1を生成するpUC18にサブクローニングした。cDNA挿入体は、Sequenase（United States Biochemical社、クリーブランド、オハイオ州）で配列決定された。天然BRIP遺伝子のDNA塩基配列を、配列番号：12に示した。cDNAが天然のBRIP遺伝子をコードすることを確認するために、cDNAをE. coliプラスミドpKK233-2（Pharmacia社）中で発現させた。BRIPタンパク質が、プラスミドで形質転換したIPTG誘発細胞にて、前述のウサギ抗BRIP抗血清を用いたウェスターン分析によって検出された。
BRIP遺伝子を含むE.coli発現ベクターの構築
BRIP遺伝子を含む大麦cDNAをpelBリーダー配列に連結され、バクテリア分泌ベクター中にて、araBプロモーターの制御下に置かれた。
pelBリーダー配列に連結したBRIP遺伝子を含む中間ベクターが生成した。プラスミドpBS1をNcoIで切断し、マング  ビーン  ヌクリーゼ処理され、BamHIで切断され、BRIPのアミノ酸１〜256に対応する760bp断片がアガローズゲルから精製された。同時に、唯一のXhoI部位が、pUC18ベクタープライマー（NEBまたはBRLによって販売されているReverse（登録商標）同一であるが、Cyclone Model 8400 DNA合成装置で合成した）および特異性プライマーBRIP 3'Xhoを用いたPCR増幅により、pBS1中のBRIP遺伝子の3'端の下流に導入した。それぞれのプライマーの塩基配列を、以下に示した。
0003759163.tif 000041
プライマーBRIP 3'Xhoは、BRIP遺伝子の最後の８bpに対応する部分、BRIP遺伝子下流の終始コドン及びいくつかの塩基対、そして、PCR断片をXhoI部位に導入する他の部分を含む。PCR反応生成物は、BamHIおよびXhoIで消化され、BRIP遺伝子の3'末端を含む87bp断片が、５％アクリルアミド上で精製された。760および87bpの精製BRIP断片が、pelBリーダー配列近傍のpING1500ベクターに連結された。pING1500は予めSstIで切断され、T4ポリメラーゼで処理され、XhoIで切断され、そして精製されていた。pelBリーダー連結点およびBRIP遺伝子の5'末端のDNA配列を、DNA塩基配列解析によって確認した。このベクターを、pING3321-1と命名した。
誘発可能なaraBプロモーターの制御下で、BRIP遺伝子を置くことで、最終発現ベクターを作製した。プラスミドpING3321-1を、PstIおよびXhoIで切断し、pelBリーダーに連結したBRIP遺伝子を、アガローズゲルから精製した。araBプロモーターを含む発現ベクターpING3217を、PstIおよびXhoIで切断し、BRIP遺伝子に連結した。この発現ベクターを、pING3322と命名した。
発酵装置内でのプラスミドpING3322を含むE. coli細胞のアラビノース誘導は、１リットルあたり約100mgの組み換えBRIPの生成をもたらした。E. coliが産生したBRIPは、大麦の種から直接精製されたBRIPと同等の特性を示した。
遊離システイン残基によるBRIP類似体の構築
BRIPタンパク質はシステイン残基を含まないので、抗体やその他のタンパク質へのジスルフィルド結合を形成する、直接利用可能な残基が無いことになる。タンパク質のＣ末端近くの遊離システイン残基を含む組み換えBRIPの類似体を生成した。BRIPタンパク質の三つのアミノ酸が、アミノ酸置換の対象となった。BRIPのアミノ酸配列とリシンＡ鎖（図２参照）の公知の三次構造との比較は、分子表面近くで、３つの利用可能な位置の存在を示唆している。この３つのBRIP類似体は、天然タンパク質のセリン277、アラニン270、ロイシン256の代わりに置換され、それぞれBRIPC277、BRIPC270、BRIPC256と命名した。
（1）BRIPC277類似体を発現する能力があるプラスミドベクターを、BRIP遺伝子の3'末端と、アミノ酸改変を起こすDNAセグメントとの交換によって構築した。pBS1からのBRIP遺伝子を含むEcoRI断片が、M13mp18へサブクローニングされ、一本鎖DNA（アンチセンス鎖）を、プライマーOBM2（BRIP遺伝子のヌクレオチド−11〜＋８に対応する）及びOMB4（BRIPの264〜280およびBRIPの終始コドンに対応し、天然BRIPのセリン277のための天然コドンのシステインの置換を組みこんでいる）を用いて、PCRにより増幅された。プライマーOBM2およびOMB4の配列は下記のとおりであり、下線部は置換したシステインをコードするヌクレオチドである。
0003759163.tif 000042
277位のアミノ酸のためのコドンが、システインコドンに変えたBRIP遺伝子を含む断片を増幅した。その断片を、pUC19（BRL）のSmaI部位にクローニングし、生成されたプラスミドをpMB22と命名した。pMB22を、EcoRIで消化し、EcoRI-XhoIリンカー（Cclonetech社、パロアルト、カリフォルニア州）をベクターに連結した。XhoIでの消化と再連結によって、ベクターpINGMB2Xを生成した。改変アミノ酸を伴ったBRIPの3'端をコードするBamHI-XhoI断片を、pMB2Xから切り出し、断片を５％アクリルアミドゲルにて精製した。pelBリーダー配列およびBRIPの最初の256個のアミノ酸をコードする配列を含むEcoRI-BamHI断片に沿ったこの断片を、EcoRIおよびXhoIで切断したpING3322での三片連結にて置換した。BRIPC277類似体を含む得られたベクターを、pING3803（ATCC受託No.68722）と命名した。
（2）256位に遊離システインを有するBRIP類似体を、アミノ酸置換を誘発するPCRを用いて構築した。発現プラスミドpING3322の部分を、プライマーBRIP-256およびHINDIII-2を用いて増幅した。各プライマーの配列を、以下に示した。
0003759163.tif 000043
プライマーBRIP-256のヌクレオチド４〜21は、BRIPの256〜262のアミノ酸をコードし、一方で、下線を付けたヌクレオチドは、天然BRIPタンパク質の対応するロイシンに置換されるシステインを特定する。プライマーHINDIII-2は、プラスミドの部分に対応する。BRIP類似体のカルボキシ末端部分をコードするPCR生成物を、T4ポリメラーゼ処理し、XhoIで切断し、そして、得られた断片を５％アクリアミドゲルにて精製した。同時に、プラスミドpING3322を、BamHIで切断し、T4ポリメラーゼ処理し、EcoRIで切断し、そして、pelBリーダー配列とBRIPの最初の256個のアミノ酸をコードする配列を含んだ断片を精製した。この二つの断片を、類似体BRIPC256をコードする遺伝子を生成するために、pING3322へ戻した。このプラスミドを、pING3801と命名した。
（3）270位にシステインを有するBRIP類似体も、PCRを用いて作製した。発現プラスミドpING3322の部分を、プライマーBRIP-270およびHINDIII-2プライマー（配列番号：50）を用いて増幅した。プライマーBRIP-270の配列を、以下に示した。
0003759163.tif 000044
プライマーBRIP-270は、270位の残基を除いて、BRIPの268〜276のアミノ酸に対応する。270位に対応するプライマーのコドンは、天然BRIPでの対応する位置に存在するアラニンの代わりのシステインを特定する。PCR生成物を、T4ポリメラーゼ処理し、XhoIで切断し、そして、類似体のカルボキシル末端部分をコードする51bpの断片を５％アクリアミドゲルにて精製した。（BRIPC270の268〜276のアミノ酸に対応する）断片を、プラスミドpING3322での（BRIPの217〜267のアミノ酸に対応する）SstII-MscIからの151bpの中間BRIP制限断片およびBRIP遺伝子の残りの部分を含むpING3322でのSstII-XhoIからの制限断片に沿った三片接合にてクローニングした。生成したプラスミドは、BRIPC270をコードする遺伝子を含み、pING3802と命名した。
組み換えBRIPおよびBRIP類似体の精製
遊離システイン残基を有する組み換えBRIP（rBRIP）およびBRIP類似体を、濃縮した培養基から調製したことを除いて、実質的に天然BRIPの場合と同様にて精製した。rBRIPのために、10Ｌ醗酵器からの濃縮培養基を、10mM Tris、20mM塩化ナトリウム、pH7.5にて交換し、Sephacry1 S-200カラムに適用し、そして、10mM Tris、pH7.5での20〜500mM塩化ナトリウム勾配で溶出した。プールしたrBRIPを、20mM塩化ナトリウムを加えたBlue Toyopearl（登録商標）カラム（TosoHaas社）にてさらに精製し、そして、10mM Tris、pH7.5での20〜500mM塩化ナトリウム勾配で溶出した。BRIP類似体のために、濃縮した醗酵用培養基を、10mM燐酸緩衝液、pH7.5を用いたCM52カラム（Whatman社）に適用し、そして、０〜0.3M塩化ナトリウム直線勾配で溶出した。Blue Toyopearl（登録商標）カラムでのクロマトグラフィーにより、さらに精製を行った。
網状赤血球溶解物分析
rBRIPとBRIP類似体のin vivoでのタンパク合成を阻害する能力を、実施例１に記載の網状赤血球溶解物分析によって試験した。標準毒素（RTA 30）、天然BRIP、rBRIP、およびBRIP類似体の連続対数希釈を、１μg/ml〜１pg/mlの範囲にわたって試験した。非阻害試料と比較して、タンパク合成の50％阻害（IC50）に対応する毒素のピコモル濃度（pM）を算出した。この分析の結果を、下記表14に示した。
0003759163.tif 000045
RLAの結果は、BRIP類似体が、組み換えおよび天然BRIP毒素に匹敵するリボソーム不活性化活性を呈したことを示している。タンパク合成を阻害する天然BRIPの本来の能力をすべての類似体が保持していることは、これら位置でのアミノ酸置換がタンパク質の折り畳みと活性に影響を与えるものでないことを示唆している。
BRIP免疫接合体の構築
天然BRIPと4A2（Morishita et al., J. Immunol., 129, 1091(1982)に記載された）およびＴ細胞決定基CD7とCD5それぞれを認識するH65抗体（ハイブリドーマATCC HB9286から取得した）との免疫接合体を構築した。リシンＡ鎖（RTAs）と4A2およびH65抗体との免疫接合体を、対照として構築した。H65抗体とリシンＡ鎖ならびにRTA免疫接合体を調製し、そして、前出の米国特許出願No.07/306,433および国際公開No.WO 89/06968に記載の方法に従って精製した。
天然BRIPの免疫接合体を調製するために、抗体（4A2またはH65）の双方と天然BRIPを、Goff et al., Bioconjugate Chem., 1, 381-386 (1990)に記載の反応性メルカプト基を誘発するために、リシン残基を、遮蔽リンカー5-メチル-2-イミノチオレン（M2IT）で化学的に修飾した。まず、BRIP（3mg/ml）を、25mMトリエタノールアミン、150mM塩化ナトリウム、pH8.0中にて、0.5mM M2ITと１mM DTNBで、25℃で、３時間インキュベートした。そして、誘導したBRIP-(M2IT)-S-S-TNBを、Sephadex GF-05LSのカラムで脱塩し、導入されたチオール基の数を、0.1mM DTTの添加により定量した。平均として、各BRIP分子は0.7SH/molを含んでいた。
トリエタノールアミン緩衝液中の4A2またはH65抗体（4mg/ml）を、同様に、M2IT（0.3mM）とDTNB（1mM）で、25℃で、３時間インキュベートした。そして、抗体-(M2IT)-S-S-TNBを脱塩し、TNB:抗体の比率を決定した。接合体を調製するために、BRIP-(M2IT)-S-S-TNBをまず、0.5mM DTTでの、25℃で、１時間の処理で、BRIP-(M2IT)-SHに還元し、還元剤を除去するためにSephadex（登録商標）GF-05LSのゲル濾過で脱塩し、そして、抗体-(M2IT)-S-S-TNBと共に混合した。
25℃での３時間、さらに４℃での18時間のインキュベーションに続いて、接合体を、AcA44（IBF社）とBlue Toyopearl（登録商標）での連続クロマトグラフィーによって精製した。最終生成物の試料を、５％非還元SDS-PAGEにかけ、クーマシー染色し、そして、抗体当たりの毒素の数を定量するために島津社のレーザー濃度計で走査した。
遊離システインを含むBRIP類似体は、4A2およびH65抗体にも接合した。類似体を、システインの反応性メルカプト基を露出させるために、25℃で、２時間、あるいは４℃で、18時間のいずれかの条件で、50mM DTTで処理し、そして、脱塩した。遊離メルカプト基の存在を、DNTBとの反応〔Ellman et al., Arch. Biochem. Biophys., 82, 70-77(1959)〕により確認した。上記したようにM2ITで誘導した4A2またはH65抗体を、１：５の比率の還元BRIPで、室温にて、３時間、および４℃にて、一晩インキュベートした。免疫接合体H65-BRIPc256、4A2-BRIPc256、H65-BRIPc277を、25mMトリエタノールアミン、150mM塩化ナトリウム、pH８にて調製し、一方で、免疫接合体H65-BRIPc270、4A2-BRIPc270、および4A2-BRIPc277を、0.1M燐酸ナトリウム、150mM塩化ナトリウム、pH7.5にて調製した。接合に続いて、抗体の未反応M2ITリンカーを凍結するために、10μlメルカプトエチルアミンを、25℃にて、15分間かけて添加した。凍結した反応溶液を、未接合リボソーム不活性化タンパク質を除去するために、迅速にゲル濾過カラム（AcA44）に適用した。Knowles et al., Analyt. Biochem., 160, 440 (1987)と同様の方法を用いた、Blue Toyopearl（登録商標）でのソフトゲルクロマトグラフィーを用いて、精製を完了した。最終生成物の試料を、５％非還元SDS-PAGEにかけ、クーマシー染色し、そして、抗体当たりの毒素の数を定量するために島津社のレーザー濃度計で走査した。接合効率は、二つの類似体BRIPc270およびBRIPc256（いずれも約10％程度）のいずれよりも、BRIPc277（78％）の方が実質的に良好であった。さらに、BRIPc277はポリ接合体、すなわち、一つの抗体に数個のBRIP分子が接合しているにの対し、BRIPc270およびBRIPc256生成物はモノ接合体であった。
全細胞殺傷分析
天然BRIPおよびBRIP類似体の免疫接合体を、実施例１に記載の全細胞殺傷分析法により、そのHSB2細胞でのタンパク合成阻害能力に関して試験を行った。標準免疫接合体H65-RTA（RTAに結合したSPDPで誘導したH65）、および4MRTA（RTAに結合したM2ITで誘導した4A2抗体）、およびBRIP免疫接合体試料を、2000〜0.632ng/mlの半減期濃度範囲のロイシンを含まないRPMIで希釈した。すべての希釈液を、１×105 HSB2細胞を含むマイクロ滴定プレートに三回ずつ添加した。試料を、Inotec Trace 96カスケードイオン化計測器にて計測を行った。未処理試料との比較により、タンパク合成の50％阻害（IC50）を招く免疫接合体のピコモル毒素濃度（pM T）を算出した。その分析結果を、下記表15に示した。
0003759163.tif 000046
BRIP類似体の接合体では、対照のリシン接合体程度の結果は得られなかった（データ示さず）。抗体4A2とBRIPC270あるいはBRIPC277類似体いずれかを含む免疫毒性は、天然BRIPを含む免疫毒性に匹敵する、目標細胞に対する向上した特異的な免疫毒性を示した。4A2-BRIPC256は、4A2-BRIP、4A2-BRIPC270よりも活性が小さかったが、4A2-BRIPC277は３〜４倍の活性を示した。同様に、BRIPC277に対するH65の免疫接合体は、天然BRIPに対するH65の免疫接合体よりも大きな、目標細胞に対する毒性を示した。このように、適切な位置に利用可能なシステイン残基を有するBRIP誘導体に対する抗体の結合は、天然BRIPとの接合に関する目標細胞への特異的毒性を供えた免疫毒性をもたらすのである。
ジスルフィド結合の安定性の検定
天然BRIPとBRIP類似体で調製した免疫接合体を、実施例１に記したジスルフィド結合の安定性分析によって検定した。要約すれば、接合体を、高濃度のグルタチオンで、37℃で、１時間インキュベートし、ヨードアセトアミドでの反応終了後に、放出されたRIPの量を、TosoHaas TSK-FG2000SWカラムでのサイズ篩HPLCによって定量した。
高濃度の2-メルカプトエタノールにより放出されたRIPの量と（100％放出を決定するために）比較することで、RIPの50％放出に必要なグルタチオン濃度（RC50）を算出した。下記表16に示したように、BRIPC270あるいはBRIPC277で調製した接合体は、RTA接合体あるいは天然BRIPで調製したものよりも有為に安定していた。
0003759163.tif 000047
これら予期していなかった結果は、本発明に従って、タイプＩRIP類似体で調製した接合体が、in vivoでの安定性と効率を向上させることを示唆するものである。
実施例14
Momordica属の植物は、タイプＩRIPsであるモモルディンあるいはモモチャリンスとして知られている多くの関連タンパク質を生成する。モモルディンIIをコードする遺伝子を、Momordica balsaminaの種からクローニングした。
M.balsamia RNAの調製
前出のAusubel et al.,文献記載の方法で、４ｇのM.balsamiaの種から、全RNAを調製した。RNAを含むPoly Aを、１mgの全RNAのオリゴ-(dT)-セルロース上でのクロマトグラフィーによって調製した。40mgのオリゴ-(dT)-セルロースタイプ７（Pharmacia社）に、0.1Nの水酸化ナトリウムを加え、そして、使い捨てカラム（Biorad社）へ注いだ。カラムを、溶出液がpH5.5になるまで水で洗浄し、そして、溶出液がpH7.0になるまで１×付加用緩衝液（50mMクエンナトリウム、0.5M塩化ナトリウム、１mM EDTA、0.1％ SDS、pH7.0）で洗浄した。１mgの全RNAを、300μlの水に懸濁し、65℃で、５分間加熱し、そして、２×付加用緩衝液（100mMクエンナトリウム、１Ｍ塩化ナトリウム、２mM EDTA、および0.2％ SDS）を添加した。RNAをカラムに適用し、カラム流出物を、65℃にて再加熱し、室温にまで冷却し、そしてカラムに再適用した。カラムに結合したRNAを、0.5mlの１×付加用緩衝液で５回洗浄し、そして、0.5mlの0.05Mクエンナトリウム、0.1M塩化ナトリウム、１mM EDTA、0.1％ SDSで二回洗浄した。RNAを含むポリAを、0.5mlの25mMクエン酸ナトリウム、１mMのEDTA、および0.5％SDSで２度洗浄してカラムから溶出した。
ライブラリー調製
M. blasamina RNAを含むポリAからのcDNAライブラリーを、SuperScriptプラスミドシステム（BRL社、ゲティスバーグ、メリーランド州）の細菌発現プラスミド中で調製した。２μｇのRNAを含むポリAからcDNAを合成し、サイズ画分し、NotI消化し、そして、ベクター製造社であるBRL社の使用説明書に従って、発現ベクターpSPORTへ連結した。
モモルディンII遺伝子のクローニング
モモルディンIIの最初の27個のアミノ酸をコードするDNA断片を、PCRによって、M. balsamina cDNAから増幅した。第一鎖cDNAを、RNAを含む100ngのポリAから、RNA-PCRキット（Perkin Elmer Cetus社）を用いて調製した。
二つの部分的に変性したプライマーを、Li et al., Experientia, 36, 524-527(1980)に記載のモモルディンIIの最初の27個のアミノ酸のアミノ基配列に基づいて合成した。モモルディンIIの１〜27のアミノ酸のアミノ酸配列は、モモルディンＩの１〜17のアミノ酸と52％が相同であるので〔Ho et al., BBA, 1088, 311-314(1991)］、変性プライマーのコドンの割当のいくつかは、対応するアミノ酸との相同性ならびにモモルディンＩ遺伝子のコドン選択性に基づく。IUPACヌクレオチド表示を用いたプライマーmomo-3およびびmomo-4の配列を、以下に示した。
0003759163.tif 000048
得られた81bpのPCR生成物を、５％アクリルアミドゲルにて精製し、そして、pUC18のSmaＩ部位にクローニングした。三つの候補クローンを配列決定し、モモルディンIIのＮ末端の27個のアミノ酸をコードする、一つのクローンpMO110を同定した。
pMO110モモルディンII DNA断片の配列に基づいて、モモルディンII cDNAライブラリーのスクリーニングのためのハイブリダイゼーション用のプローブを設計した。プライマーmomo-5の配列を、以下に示した。
0003759163.tif 000049
プライマーmomo-5は、成熟モモルディンIIの９〜18のアミノ酸に対応する。プライマーの下線部分のヌクレオチドは、モモルディンII遺伝子のDNA塩基配列と正確に適合すると思われる。この配列はA/Tが多くを占め、モモルディンII遺伝子とはわずかにしかハイブリダイズしないので、プライマーには近接するヌクレオチドをさらに含ませている。３および30位（下線部）の塩基は、モモルディンIIのそれぞれ９位（アラニン）および18位（イソロイシン）のアミノ酸という「不安定」な位置（すなわち、コドン中の三番目のヌクレオチド）にあり、天然遺伝子中のヌクレオチド塩基とは同一でない。
sSPORTの90,000個のcDNAライブラリーを、32Ｐキナーゼmomo-5でスクリーニングし、８つの陽性候補クローンを同定した。ひとつのクローン、pING3619を配列決定し、モモルディンIIの予想されるＮ末端の27残基に部分的に対応する読取枠を有していた。完全なモモルディン遺伝子は、286個のアミノ酸を有し、最初の23個はリーダーシグナルであると考えられる（成熟モモルディンIIは、263残基である）。モモルディンII遺伝子のDNA配列を、配列番号：13に示した。
モモルディンII遺伝子を含む発現ベクターの構築
モモルディンII遺伝子の細菌発現ベクターを、構築した。二つのPCRプライマーが合成され、一つのプライマー（momo-9）は、成熟モモルディンIIアミノ酸配列の＋１残基からプライムし、そして、もう一つは、XhoI制限部位に導入するモモルディンIIのＣ末端（momo-10）であった。
0003759163.tif 000050
pING3619を、momo-9およびmomo-10で増幅し、そして、生成物をT4ポリメラーゼ処理し、XhoIで切断し、アガローズゲルにて精製した。この遺伝子断片を、SstI消化、T4ポリメラーゼ処理、およびEcoRI消化によってpIC100から生成した131bp  pelBリーダー断片に沿って、EcoRIとXhoIで開裂したaraB発現ベクターに連結した。この三片連結での生成物を、pelB連結点とモモルディンIIコード配列が正しいことを確認するために配列決定を行った。モモルディンII発現プラスミドpING3621を含む細胞のアラビノース誘発は、E.coliでのモモルディンII生成を招いた。
モモルディンIIの類似体
モモルディンIIは、抗体に接合可能な天然システインを保持していない。抗体に接合するための遊離システインを有するモモルディンの類似体が構築された。システイン残基の置換に適切であると考えられる位置は、図３に示したように、リシンＡ鎖システイン259付近の位置、および親溶媒性のモモルディンIIの最後の26個のアミノ酸を含む位置である。例えば、モモルディンIIの242位のアルギニンは、259位のリシンＡ鎖システインに対応し、置換の好適な目標となる。モモルディンIIの他の好ましい置換位置は、241位のセリンおよび243位置のアラニンを含む。
本願発明は、好適な実施例に関して記述してきたが、修正や変更が当業者によってなされるものと考えられる。それ故、請求した発明の範疇と等価の発明をすべて包含する添付した請求の範囲を希求する次第である。
配列表
(1)一般情報
(i)出願人：バーンハード、スーザン、エル．ベター、マーク、ディ．キャロル、スティーブン、エフ．レイン、ジュリー、エー．レイ、ショ・ピング
(ii)発明の名称：リボソーム不活性化タンパク質を含む物質およびそれを調製ならびに使用する方法
(iii)配列の数：101
(iv)連絡先住所：
(A)名宛人：マーシャル、オトゥール、ジェースティン、マレー  アンド  ビックネル
(B)番地：トゥー  ファースト  ナショナル  プラザ、20  サウス  クラーク  ストリート
(C)都市名：シカゴ
(D)州名：イリノイ
(E)国名：米国
(F)郵便番号：60603
(v)コンピューター読取形式：
(A)媒体：フロッピー  ディスク
(B)コンピューター：IBM PC互換機
(C)操作システム：OC-DOS/MS-DOS
(D)ソフトウェア：パテント  イン  リリース #1.0、バージョン #1.25
(vi)現出願データ：
(A)出願番号：
(B)出願日：
(C)分類：
(vii)先行出願データ：
(A)出願番号：US 07/901,707
(B)出願日：19-6月-1992
(vii)先行出願データ：
(A)出願番号：US 07/787,567
(B)出願日：04-11月-1991
(viii)弁護士／弁理士情報：
(A)氏名：ノーランド、グレタ  イー
(B)登録番号：35,302
(C)参照／事件番号：31133
(ix)通信情報：
(A)電話：（312）346-5750
(B)ファックス：（312）984-9740
(C)テレックス：25-3856
(2)配列番号：１の情報
(i)配列特徴：
(A)配列の長さ：267アミノ酸
(B)配列の型：アミノ酸
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列：配列番号：１
0003759163.tif 000051
0003759163.tif 000052
0003759163.tif 000053
(2)配列番号：２の情報
(i)配列特徴：
(A)配列の長さ：251アミノ酸
(B)配列の型：アミノ酸
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列：配列番号：２
0003759163.tif 000054
0003759163.tif 000055
(2)配列番号：３の情報
(i)配列特徴：
(A)配列の長さ：280アミノ酸
(B)配列の型：アミノ酸
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列：配列番号：３
0003759163.tif 000056
0003759163.tif 000057
0003759163.tif 000058
(2)配列番号：４の情報
(i)配列特徴：
(A)配列の長さ：263アミノ酸
(B)配列の型：アミノ酸
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列：配列番号：４
0003759163.tif 000059
0003759163.tif 000060
(2)配列番号：５の情報
(i)配列特徴：
(A)配列の長さ：248アミノ酸
(B)配列の型：アミノ酸
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列：配列番号：５
0003759163.tif 000061
0003759163.tif 000062
0003759163.tif 000063
(2)配列番号：６の情報
(i)配列特徴：
(A)配列の長さ：255アミノ酸
(B)配列の型：アミノ酸
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列：配列番号：６
0003759163.tif 000064
0003759163.tif 000065
(2)配列番号：７の情報
(i)配列特徴：
(A)配列の長さ：263アミノ酸
(B)配列の型：アミノ酸
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列：配列番号：７
0003759163.tif 000066
0003759163.tif 000067
(2)配列番号：８の情報
(i)配列特徴：
(A)配列の長さ：250アミノ酸
(B)配列の型：アミノ酸
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列：配列番号：８
0003759163.tif 000068
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(2)配列番号：９の情報
(i)配列特徴：
(A)配列の長さ：261アミノ酸
(B)配列の型：アミノ酸
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列：配列番号：９
0003759163.tif 000070
0003759163.tif 000071
(2)配列番号：10の情報
(i)配列特徴：
(A)配列の長さ：259アミノ酸
(B)配列の型：アミノ酸
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列：配列番号：10
0003759163.tif 000072
0003759163.tif 000073
(2)配列番号：11の情報
(i)配列特徴：
(A)配列の長さ：813塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：cDNA
(xi)配列：配列番号：11
0003759163.tif 000074
0003759163.tif 000075
(2)配列番号：12の情報
(i)配列特徴：
(A)配列の長さ：846塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：cDNA
(xi)配列：配列番号：12
0003759163.tif 000076
0003759163.tif 000077
(2)配列番号：13の情報
(i)配列特徴：
(A)配列の長さ：913塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：cDNA
(xi)配列：配列番号：13
0003759163.tif 000078
(2)配列番号：14の情報
(i)配列特徴：
(A)配列の長さ：32塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：DNA
(xi)配列：配列番号：14
0003759163.tif 000079
(2)配列番号：15の情報
(i)配列特徴：
(A)配列の長さ：32塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：DNA
(xi)配列：配列番号：15
0003759163.tif 000080
(2)配列番号：16の情報
(i)配列特徴：
(A)配列の長さ：32塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：DNA
(xi)配列：配列番号：16
0003759163.tif 000081
(2)配列番号：17の情報
(i)配列特徴：
(A)配列の長さ：23塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：DNA
(xi)配列：配列番号：17
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(2)配列番号：18の情報
(i)配列特徴：
(A)配列の長さ：23塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：DNA
(xi)配列：配列番号：18
0003759163.tif 000083
(2)配列番号：19の情報
(i)配列特徴：
(A)配列の長さ：53塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：DNA
(xi)配列：配列番号：19
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(2)配列番号：20の情報
(i)配列特徴：
(A)配列の長さ：23塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：DNA
(xi)配列：配列番号：20
0003759163.tif 000085
(2)配列番号：21の情報
(i)配列特徴：
(A)配列の長さ：46塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：DNA
(xi)配列：配列番号：21
0003759163.tif 000086
(2)配列番号：22の情報
(i)配列特徴：
(A)配列の長さ：18塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：DNA
(xi)配列：配列番号：22
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(2)配列番号：23の情報
(i)配列特徴：
(A)配列の長さ：25塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：DNA
(xi)配列：配列番号：23
0003759163.tif 000088
(2)配列番号：24の情報
(i)配列特徴：
(A)配列の長さ：35塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：DNA
(xi)配列：配列番号：24
0003759163.tif 000089
(2)配列番号：25の情報
(i)配列特徴：
(A)配列の長さ：22塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：DNA
(xi)配列：配列番号：25
0003759163.tif 000090
(2)配列番号：26の情報
(i)配列特徴：
(A)配列の長さ：21塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：DNA
(xi)配列：配列番号：26
0003759163.tif 000091
(2)配列番号：27の情報
(i)配列特徴：
(A)配列の長さ：23塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：DNA
(xi)配列：配列番号：27
0003759163.tif 000092
(2)配列番号：28の情報
(i)配列特徴：
(A)配列の長さ：25塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：DNA
(xi)配列：配列番号：28
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(2)配列番号：29の情報
(i)配列特徴：
(A)配列の長さ：28塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：DNA
(xi)配列：配列番号：29
0003759163.tif 000094
(2)配列番号：30の情報
(i)配列特徴：
(A)配列の長さ：32塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：DNA
(xi)配列：配列番号：30
0003759163.tif 000095
(2)配列番号：31の情報
(i)配列特徴：
(A)配列の長さ：27塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：DNA
(xi)配列：配列番号：31
0003759163.tif 000096
(2)配列番号：32の情報
(i)配列特徴：
(A)配列の長さ：25塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：DNA
(xi)配列：配列番号：32
0003759163.tif 000097
(2)配列番号：33の情報
(i)配列特徴：
(A)配列の長さ：27塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：DNA
(xi)配列：配列番号：33
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(2)配列番号：34の情報
(i)配列特徴：
(A)配列の長さ：32塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：DNA
(xi)配列：配列番号：34
0003759163.tif 000099
(2)配列番号：35の情報
(i)配列特徴：
(A)配列の長さ：32塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：DNA
(xi)配列：配列番号：35
0003759163.tif 000100
(2)配列番号：36の情報
(i)配列特徴：
(A)配列の長さ：29塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：DNA
(xi)配列：配列番号：36
0003759163.tif 000101
(2)配列番号：37の情報
(i)配列特徴：
(A)配列の長さ：33塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：DNA
(xi)配列：配列番号：37
0003759163.tif 000102
(2)配列番号：38の情報
(i)配列特徴：
(A)配列の長さ：25塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：DNA
(xi)配列：配列番号：38
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(2)配列番号：39の情報
(i)配列特徴：
(A)配列の長さ：32塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：DNA
(xi)配列：配列番号：39
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(2)配列番号：40の情報
(i)配列特徴：
(A)配列の長さ：36塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：DNA
(xi)配列：配列番号：40
0003759163.tif 000105
(2)配列番号：41の情報
(i)配列特徴：
(A)配列の長さ：41塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：DNA
(xi)配列：配列番号：41
0003759163.tif 000106
(2)配列番号：42の情報
(i)配列特徴：
(A)配列の長さ：23塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：DNA
(xi)配列：配列番号：42
0003759163.tif 000107
(2)配列番号：43の情報
(i)配列特徴：
(A)配列の長さ：18塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：DNA
(xi)配列：配列番号：43
0003759163.tif 000108
(2)配列番号：44の情報
(i)配列特徴：
(A)配列の長さ：21塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：DNA
(xi)配列：配列番号：44
0003759163.tif 000109
(2)配列番号：45の情報
(i)配列特徴：
(A)配列の長さ：16塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：DNA
(xi)配列：配列番号：45
0003759163.tif 000110
(2)配列番号：46の情報
(i)配列特徴：
(A)配列の長さ：29塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：DNA
(xi)配列：配列番号：46
0003759163.tif 000111
(2)配列番号：47の情報
(i)配列特徴：
(A)配列の長さ：19塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：DNA
(xi)配列：配列番号：47
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(2)配列番号：48の情報
(i)配列特徴：
(A)配列の長さ：64塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：DNA
(xi)配列：配列番号：48
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(2)配列番号：49の情報
(i)配列特徴：
(A)配列の長さ：21塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：DNA
(xi)配列：配列番号：49
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(2)配列番号：50の情報
(i)配列特徴：
(A)配列の長さ：21塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：DNA
(xi)配列：配列番号：50
0003759163.tif 000115
(2)配列番号：51の情報
(i)配列特徴：
(A)配列の長さ：27塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：DNA
(xi)配列：配列番号：51
0003759163.tif 000116
(2)配列番号：52の情報
(i)配列特徴：
(A)配列の長さ：29塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：DNA
(xi)配列：配列番号：52
0003759163.tif 000117
(2)配列番号：53の情報
(i)配列特徴：
(A)配列の長さ：29塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：DNA
(xi)配列：配列番号：53
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(2)配列番号：54の情報
(i)配列特徴：
(A)配列の長さ：32塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：DNA
(xi)配列：配列番号：54
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(2)配列番号：55の情報
(i)配列特徴：
(A)配列の長さ：22塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：DNA
(xi)配列：配列番号：55
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(2)配列番号：56の情報
(i)配列特徴：
(A)配列の長さ：33塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：DNA
(xi)配列：配列番号：56
0003759163.tif 000121
(2)配列番号：57の情報
(i)配列特徴：
(A)配列の長さ：813塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：cDNA
(xi)配列：配列番号：57
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0003759163.tif 000123
(2)配列番号：58の情報
(i)配列特徴：
(A)配列の長さ：20アミノ酸
(B)配列の型：アミノ酸
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ペプチド
(xi)配列：配列番号：58
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(2)配列番号：59の情報
(i)配列特徴：
(A)配列の長さ：20アミノ酸
(B)配列の型：アミノ酸
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ペプチド
(xi)配列：配列番号：59
0003759163.tif 000125
(2)配列番号：60の情報
(i)配列特徴：
(A)配列の長さ：22塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：DNA
(xi)配列：配列番号：60
0003759163.tif 000126
(2)配列番号：61の情報
(i)配列特徴：
(A)配列の長さ：28塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：DNA
(xi)配列：配列番号：61
0003759163.tif 000127
(2)配列番号：62の情報
(i)配列特徴：
(A)配列の長さ：36塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：DNA
(xi)配列：配列番号：62
0003759163.tif 000128
(2)配列番号：63の情報
(i)配列特徴：
(A)配列の長さ：30塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：DNA
(xi)配列：配列番号：63
0003759163.tif 000129
(2)配列番号：64の情報
(i)配列特徴：
(A)配列の長さ：39塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：DNA
(xi)配列：配列番号：64
0003759163.tif 000130
(2)配列番号：65の情報
(i)配列特徴：
(A)配列の長さ：33塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：DNA
(xi)配列：配列番号：65
0003759163.tif 000131
(2)配列番号：66の情報
(i)配列特徴：
(A)配列の長さ：33塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：DNA
(xi)配列：配列番号：66
0003759163.tif 000132
(2)配列番号：67の情報
(i)配列特徴：
(A)配列の長さ：26塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：DNA
(xi)配列：配列番号：67
0003759163.tif 000133
(2)配列番号：68の情報
(i)配列特徴：
(A)配列の長さ：34塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：DNA
(xi)配列：配列番号：68
0003759163.tif 000134
(2)配列番号：69の情報
(i)配列特徴：
(A)配列の長さ：24塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：DNA
(xi)配列：配列番号：69
0003759163.tif 000135
(2)配列番号：70の情報
(i)配列特徴：
(A)配列の長さ：35塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：DNA
(xi)配列：配列番号：70
0003759163.tif 000136
(2)配列番号：71の情報
(i)配列特徴：
(A)配列の長さ：321塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：DNA
(xi)配列：配列番号：71
0003759163.tif 000137
(2)配列番号：72の情報
(i)配列特徴：
(A)配列の長さ：354塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：DNA
(xi)配列：配列番号：72
0003759163.tif 000138
(2)配列番号：73の情報
(i)配列特徴：
(A)配列の長さ：354塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：DNA
(xi)配列：配列番号：73
0003759163.tif 000139
(2)配列番号：74の情報
(i)配列特徴：
(A)配列の長さ：321塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：DNA
(xi)配列：配列番号：74
0003759163.tif 000140
(2)配列番号：75の情報
(i)配列特徴：
(A)配列の長さ：70塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：DNA
(xi)配列：配列番号：75
0003759163.tif 000141
(2)配列番号：76の情報
(i)配列特徴：
(A)配列の長さ：78塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：DNA
(xi)配列：配列番号：76
0003759163.tif 000142
(2)配列番号：77の情報
(i)配列特徴：
(A)配列の長さ：30塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：DNA
(xi)配列：配列番号：77
0003759163.tif 000143
(2)配列番号：78の情報
(i)配列特徴：
(A)配列の長さ：15塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：DNA
(xi)配列：配列番号：78
0003759163.tif 000144
(2)配列番号：79の情報
(i)配列特徴：
(A)配列の長さ：18塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：DNA
(xi)配列：配列番号：79
0003759163.tif 000145
(2)配列番号：80の情報
(i)配列特徴：
(A)配列の長さ：37塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：DNA
(xi)配列：配列番号：80
0003759163.tif 000146
(2)配列番号：81の情報
(i)配列特徴：
(A)配列の長さ：76塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：DNA
(xi)配列：配列番号：81
0003759163.tif 000147
(2)配列番号：82の情報
(i)配列特徴：
(A)配列の長さ：20塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：DNA
(xi)配列：配列番号：82
0003759163.tif 000148
(2)配列番号：83の情報
(i)配列特徴：
(A)配列の長さ：36塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：DNA
(xi)配列：配列番号：83
0003759163.tif 000149
(2)配列番号：84の情報
(i)配列特徴：
(A)配列の長さ：18塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：DNA
(xi)配列：配列番号：84
0003759163.tif 000150
(2)配列番号：85の情報
(i)配列特徴：
(A)配列の長さ：31塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：DNA
(xi)配列：配列番号：85
0003759163.tif 000151
(2)配列番号：86の情報
(i)配列特徴：
(A)配列の長さ：22塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：DNA
(xi)配列：配列番号：86
0003759163.tif 000152
(2)配列番号：87の情報
(i)配列特徴：
(A)配列の長さ：20塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：DNA
(xi)配列：配列番号：87
0003759163.tif 000153
(2)配列番号：88の情報
(i)配列特徴：
(A)配列の長さ：19塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：DNA
(xi)配列：配列番号：88
0003759163.tif 000154
(2)配列番号：89の情報
(i)配列特徴：
(A)配列の長さ：21塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：DNA
(xi)配列：配列番号：89
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(2)配列番号：90の情報
(i)配列特徴：
(A)配列の長さ：31塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：DNA
(xi)配列：配列番号：90
0003759163.tif 000156
(2)配列番号：91の情報
(i)配列特徴：
(A)配列の長さ：21塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：DNA
(xi)配列：配列番号：91
0003759163.tif 000157
(2)配列番号：92の情報
(i)配列特徴：
(A)配列の長さ：723塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：DNA
(xi)配列：配列番号：92
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(2)配列番号：93の情報
(i)配列特徴：
(A)配列の長さ：723塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：DNA
(xi)配列：配列番号：93
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(2)配列番号：94の情報
(i)配列特徴：
(A)配列の長さ：51塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：DNA
(xi)配列：配列番号：94
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(2)配列番号：95の情報
(i)配列特徴：
(A)配列の長さ：19塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：DNA
(xi)配列：配列番号：95
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(2)配列番号：96の情報
(i)配列特徴：
(A)配列の長さ：49塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：DNA
(xi)配列：配列番号：96
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(2)配列番号：97の情報
(i)配列特徴：
(A)配列の長さ：35塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：DNA
(xi)配列：配列番号：97
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(2)配列番号：98の情報
(i)配列特徴：
(A)配列の長さ：30塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：DNA
(xi)配列：配列番号：98
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(2)配列番号：99の情報
(i)配列特徴：
(A)配列の長さ：37塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：DNA
(xi)配列：配列番号：99
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(2)配列番号：100の情報
(i)配列特徴：
(A)配列の長さ：22塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：DNA
(xi)配列：配列番号：100
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(2)配列番号：101の情報
(i)配列特徴：
(A)配列の長さ：49塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：DNA
(xi)配列：配列番号：101
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【図１】
0003759163.tif 000168
【図２】
0003759163.tif 000169
【図３】
0003759163.tif 000170
【図４】
0003759163.tif 000171
【図５】
0003759163.tif 000172
【図６】
0003759163.tif 000173
【図７】
0003759163.tif 000174
【図８】
0003759163.tif 000175
【図９】
0003759163.tif 000176