(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
飽和環状ポリオレフィン系樹脂からなり該表面にカルボキシル基が導入されていることを特徴とする生化学的活性物質を固定化するための支持体であって、飽和環状ポリオレフィン系樹脂にノルボルネン又はノルボルネン誘導物の少なくとも一つがモノマー単位として含まれ、酸素または酸素を含むガス雰囲気下の低温プラズマ放電処理による酸化処理を用いて飽和環状ポリオレフィン系樹脂の表面にカルボキシル基を導入されていることを特徴とする生化学的活性物質の支持体。
【請求項２】
飽和環状ポリオレフィン系樹脂からなり該表面にカルボキシル基が導入されていることを特徴とする生化学的活性物質を固定化するための支持体の製造方法であって、飽和環状ポリオレフィン系樹脂にノルボルネン又はノルボルネン誘導物の少なくとも一つがモノマー単位として含まれ、酸素または酸素を含むガス雰囲気下の低温プラズマ放電処理による酸化処理を用いて飽和環状ポリオレフィン系樹脂の表面にカルボキシル基を導入することを特徴とする生化学的活性物質の支持体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、生化学的活性物質を固定するための支持体になるプラスチックとその製造方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
通常、各種疾患と関連して生体中に出現するタンパク質等の検出を行なう場合、酵素標識免疫測定法が広く利用されている。ポリスチレン等の水不溶性支持体に結合された生化学的活性物質である抗体に測定されるべき成分である抗原を結合する、あるいは支持体に直接抗原を結合し、最終的に免疫反応を通じて支持体と結合した標識成分と支持体に結合していない標識成分を分けるいわゆるＢ／Ｆ分離操作（バウンド／フリー分離操作）の後、そのいずれか一方の標識成分量を定量するものである。
【０００３】
近年では、ますます高感度の免疫学的測定法が要望されており、酵素免疫測定法においても改善が行われている。例えば、特開昭６０−１５５６０号公報ではプラスチック製の支持体にアミノシラン化剤をコートすることでアミノ基を導入し、官能基として利用する方法が示されている。免疫測定の支持体として使用するときには、抗体を結合する前に架橋剤としてグルタルアルデヒドを含む緩衝剤を接触させ、グルタルアルデヒドに２つ存在するアルデヒド基の一方を支持体のアミノ基と共有結合して固定化する。そして固定化されたグルタルアルデヒドの残りのアルデヒド基と固定する抗体に含まれるアミノ基が共有結合することにより抗体の固定化が行なわれている。
【０００４】
特開２０００−１４６９７１公報では支持体にイソシアネート基を有する基材をコートし、生化学的活性物質を固定している。また特開平６−５０９５０９号公報では官能基としてアズラクトン基やその他にエポキシ基を有するポリマーを原料として共重合体を支持体とする方法が開示されている。
これら以外にも種々の処方が考えられており、支持体表面に付与された官能基の高い反応性によって、抗体を直接あるいはグルタルアルデヒドなどの架橋剤を介して強固に固定することが可能となり、高い測定感度が得られ、より微量の生化学的活性物質を含む検体の測定を行うことが可能となった。
しかしながら、このような反応性が高い官能基を有する支持体には、以前より幾つかの課題が存在した。
【０００５】
まず第一の課題は、支持体の抗体や蛋白を固定化する性能が失われやすい。簡便にかつ短時間で抗体を固定する為に、特にビオチン等の低分子量の生化学低活性物質を架橋剤を用いずに固定化する為には、官能基には高い反応性が要求さる。しかし、それでは支持体に化学的に不安定な状態の官能基を導入することとなり、支持体製造から免疫測定に使用されるまでの保管期間に失活しやすく、支持体に導入されたこれらの官能基の反応性を高い状態で保持することは困難である。
【０００６】
これに対処する方法として、特開平８−１６６３８６号公報では支持体を乾燥した状態で一定に維持することより、生化学的活性物質に対する吸着の機能の低下を防止できるが、支持体を個々に包装する必要がある。このため臨床の現場において大量に使用する場合、個々の支持体を開封し袋から取り出して準備する工数が必要になる。
【０００７】
また第二の課題として、官能基を導入していない支持体に比べ、官能基を導入した支持体の製造コストが割高になりやすい。官能基を有する原材料を溶液状に調製して支持体にコートする手法がよく行なわれているが、１）官能基を有する原材料を含むコート溶液の調製、２）塗布、浸漬、滴下、分注、噴霧などによるコート溶液と支持体の接触、３）支持体の洗浄、４）乾燥といった手順を中心とした処理方法であり、操作が煩雑で非常に工数がかかる。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は前述した従来技術の問題点を解消して、生化学的活性物質を固定化する性能を保持し、簡便で安価な方法により製造することが可能な、生化学的活性物質の固定化に用いられる支持体とその製造方法を提供することである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決する検討する過程において、多種の官能基を導入をする処理の段階の一つとしてノルボルネン樹脂の支持体に酸素ガス低温プラズマ放電処理を行ない、この処理段階の支持体を他の検討試料と共に蛋白吸着性、生化学的活性を有する低分子物質吸着性の評価を行なったところ、従来のポリスチレン等の水不溶性支持体と比較して優れた吸着性能を示し、従来の知見からは想定できない機能を見出した。
【００１０】
即ち本発明は、
（１）飽和環状ポリオレフィン系樹脂の表面にカルボキシル基が導入されていることを特徴とする生化学的活性物質の支持体、
（２）飽和環状ポリオレフィン系樹脂にノルボルネンまたはノルボルネン誘導物の少なくとも一つがモノマー単位として含まれている（１）記載の生化学的活性物質の支持体、
（３）酸化処理を用いて飽和環状ポリオレフィン系樹脂の表面にカルボキシル基を導入することを特徴とする生化学的活性物質の支持体の製造方法、
（４）酸化処理が酸素または酸素を含むガス雰囲気下の低温プラズマ放電処理である（３）記載の生化学的活性物質の支持体の製造方法
である。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明で用いられる飽和環状ポリオレフィン系樹脂は、環状オレフィン構造を有する重合体単独または環状オレフィンとα−オレフィンとの共重合体を水素添加した飽和重合体であり、好適には、一般式（１）で表されるノルボルネンの開環重合体の水素添加物等が挙げられる。
一般式（１）
【００１２】
【化１】
0003810057.tif 000002
【００１３】
（ただし、上記式（１）中、Ｒ1およびＲ2は水素または炭素数１〜１０の炭化水素残基でそれぞれ同一または異なっていても良く、また、Ｒ1およびＲ2は互いに環を形成しても良い。）
【００１４】
一般式（１）で表せる構造単位を有する重合体は、モノマーとしてノルボルネン、及びそのアルキル又はアルキリデン置換体であり、具体的には、５−メチル−２−ノルボルネン、５，６−ジメチル−２−ノルボルネン、５−エチリデン−２−ノルボルネン等があり、これ以外にもジシクロペンタジエン、２，３−ジヒドロジシクロペンタジエン、及びこれらのメチル、エチル等のアルキル置換体を使用し、開環重合で得られる開環重合体を水素添加して製造される飽和重合体がある。
【００１５】
また、一般式（２）で示される環状オレフィン系モノマーの付加重合体、又は他のモノマー、例えばエチレン、プロピレン、イソプロピレン、１−ブテン、３−メチル−１−ブテン、１−ペンテン、１−ヘキセン等のα−オレフィン等との付加共重合体や、さらに開環重合後に水素添加することにより製造される飽和重合体を用いても良い。
一般式（２）
【００１６】
【化２】
0003810057.tif 000003
【００１７】
（ただし、上記式（２）中、Ｒ1およびＲ8は水素及びハロゲン原子及び炭化水素残基よりなる群から選ばれ、Ｒ5〜Ｒ8は互いに環を形成しても良い。）
【００１８】
さらには、一般式（３）で示される環状オレフィン系モノマーの重合体、或いは一般式（３）で示される環状オレフィン系モノマーをエチレン、プロピレン、イソプロピレン、１−ブテン、３−メチル−１−ブテン、１−ペンテン、１−ヘキセン等のα−オレフィンとランダムに付加共重合したり、開環重合後に水素添加することにより製造される飽和重合体を用いても良い。
一般式（３）
【００１９】
【化３】
0003810057.tif 000004
【００２０】
（ただし、上記式（２）中、Ｒ1およびＲ12は水素及びハロゲン原子及び炭化水素残基よりなる群から選ばれ、Ｒ9〜Ｒ12は互いに環を形成しても良い。）
【００２１】
一般式（１）〜（３）記載の飽和したポリオレフィン系樹脂を原材料として生化学的活性物質の固定化の支持体となる基材を成形するが、基材の成形方法、形状には特に制限はない。成形性を考慮すると、押出成形、圧縮成形、射出成形、エマルジョン成形等の方法が好適であり、また試験方法やハンドリングを考慮し、マイクロタイタープレート、フィルムシート、ビーズ、スライド板等を基材の形状とすることが好ましい。
【００２２】
次に、これら基材に物理化学的に酸化処理を施して、基材の表面にカルボキシル基を導入する。酸化処理の方法には特に制限はなく、紫外線処理、コロナ放電処理、電子線処理、低周波及び高周波低温プラズマ放電処理、酸化反応剤を含む化学処理溶液を用いる方法などが考えられる。この中でも簡便かつ形状に制限されないで、酸化反応試薬の廃棄処理に問題なく、かつカルボキシル基の導入密度を調節しやすい、酸素ガス雰囲気下で低温プラズマ放電処理を行う方法が好適である。
【００２３】
上記記載の方法により、蛋白質等の高分子量からビオチン等の低分子量までの生化学的活性物質を固定化することに有用な、結合性が高く化学的に安定で、簡便で安価に製造することができる支持体が得られる。
【００２４】
【実施例】
次に本発明を実施例と比較例によりさらに詳細に説明する。
（実施例１）
エチレンとジシクロペンタジエンのランダム共重合体の水素添加物を用いてマイクロタイタープレートを射出成形した。その後、減圧下で酸素ガスを通気しながら高周波低温プラズマを発生させて１０分間の酸化処理を施した。
（実施例２）
実施例１のマイクロタイタープレートを水蒸気透過性のポリエチレンフィルムの袋に入れ、実験室内で２週間放置した。
【００２５】
（比較例１）
ポリスチレン樹脂を用いてマイクロタイタープレートを射出成形した。
（比較例２）
比較例１のマイクロタイタープレートに酸素ガスを通気しながら高周波低温プラズマを発生させて１０分間の酸化処理を施した。
（比較例３）
比較例２のマイクロタイタープレートを一級アミノシランカップリング剤５％メタノール溶液に浸漬し、２時間放置してアミノシラン処理を行ない、次にエタノール３％水溶液に浸漬し、４時間放置した後、エタノール０．５％水溶液及び純水で洗浄し乾燥し、アミノ基の導入を行なった。
【００２６】
（比較例４）
比較例３のマイクロタイタープレートを水蒸気透過性のポリエチレンフィルムの袋に入れ、実験室内で２週間放置した。
（比較例５）
ポリプロピレン樹脂を用いてマイクロタイタープレートを射出成形した。その後、減圧下で酸素ガスを通気しながら高周波低温プラズマを発生させて１０分間の酸化処理を施した。
【００２７】
▲１▼蛋白吸着
各実施例、各比較例のマイクロタイタープレートにアルカリホスファターゼ標識ヤギＩｇＧ（以後ＡＬＰ−ＩｇＧで表記）を０．１２５μｇ／ｍｌに調製した溶液を１００μｌづつ分注し、３７℃で６０分放置してウェル内面にＡＬＰ−ＩｇＧを固相化する。次に未固定のＡＬＰ−ＩｇＧを吸引除去し３回洗浄後、基質溶液（フェニルリン酸、４ーアミノアンチピリン）１００μｌを加え、アルカリホスファターゼと基質の酵素学的発色反応を３７℃で６０分間行い、フェリシアン化カリウム（３６ｍｍｏｌ／ｌ）を１００μｌ加えて発色反応を停止する。波長４９２ｎｍで吸光度を測定し、比較評価した。
【００２８】
▲２▼生化学的活性を有する低分子物質吸着
各実施例、各比較例のマイクロタイタープレートにビオチンヒドラジドを０．１ｍｇ／ｍｌに調製した溶液を１００μｌづつ分注し、３７℃で１２０分放置してウェル内面にビオチンヒドラジドを固相化する。次に未固定のビオチンヒドラジドを吸引除去し３回洗浄後、スキムミルクを１重量％に調製した溶液を３００μｌづつ分注し、３７℃で９０分放置してブロッキング処理する。未固定のスキムミルクを吸引除去し３回洗浄後、ペルオキシダーゼ標識アビジン（以後ＰＯＤ−アビジンで表記）を１μｇ／ｍｌに調製した溶液を１００μｌづつ分注し、３７℃で３０分放置してビオチンとＰＯＤ−アビジンの結合をおこなう。未固定のＰＯＤ−アビジンを吸引除去し３回洗浄後、ペルオキシダーゼ発色キットＳＵＭＩＬＯＮ−Ｔ（住友ベークライト社製）を用いて発色させ、吸光度を測定し、比較評価した。
【００２９】
表１に蛋白および生化学的活性を有する低分子物質の固相化により得られた吸光度の測定結果を示す。
蛋白の吸着量を評価した結果では、一級アミノシラン化剤でアミノ基を導入したポリスチレン樹脂の支持体と同等の性能を示し、また生化学的活性を有する低分子物質では架橋剤等を加えない条件下で吸着が認められた。
【００３０】
【表１】
0003810057.tif 000005
【００３１】
【発明の効果】
本発明の飽和環状ポリオレフィン系樹脂の表面にカルボキシル基が存在する生化学的活性物質の固定化に用いられる支持体は、生化学的活性物質を固定化する性能を保持し、簡便で安価な方法により製造することが可能である。