(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の一般式で表わされるヘテロ芳香族カルボン酸またはその生理的に許容される塩を製造する微生物学的方法において、
【化１】
0003810860.tif 000008
【化２】
0003810860.tif 000009
［式中、Ｒ1およびＲ2は同一または異なるものであって、水素またはハロゲンの原子を表わし、Ｘは窒素原子または−ＣＨ−を著わす。］
下記の一般式のヘテロ芳香族ニトリルを基質とし、
【化３】
0003810860.tif 000010
【化４】
0003810860.tif 000011
［式中、Ｒ1、Ｒ2およびＸは、上記した意味を有する。］
これを、２−シアノピリジンを利用するアルカリゲネス属の微生物であって、生物学的転換に先立って０．１〜２０重量％のジカルボン酸、トリカルボン酸または炭水化物の存在下に培養されたものを使用して対応するカルボン酸に転化し、適切であればこれをさらに生理的に許容し得る塩に転化することを特徴とする方法。
【請求項２】
生物学的転換を、アルカリゲネス・フェーカリス種に属する寄託番号ＤＳＭ６３３５の微生物またはその機能的に同等な変異種および突然変異種を用いて実施することを特徴とする請求項１の方法。
【請求項３】
生物学的転換を、ｐＨ４〜１０および温度１０〜５０℃において実施することを特徴とする請求項１または２の方法。
【請求項４】
ピコリン酸またはその生理的に許容し得る塩を製造する方法であって、基質としての２−シアノピリジンを、２−シアノピリジンを利用するアルカリゲネス属の微生物であって、生物学的転換に先立って０．１〜２０重量％のジカルボン酸、トリカルボン酸または炭水化物の存在下に培養されたものを使用して対応するカルボン酸に転化し、適切であればこれをさらに生理的に許容し得る塩に転化することを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、下記の一般式で表わされる
【０００２】
【化５】
0003810860.tif 000002
【０００３】
【化６】
0003810860.tif 000003
【０００４】
〔式中、Ｒ1 およびＲ2 は、同一または異なるものであって、水素またはハロゲンの原子を表わし、Ｘは窒素原子または−ＣＨ−を表わす。〕
ヘテロ芳香族カルボン酸またはその生理的に許容される塩の、新規な微生物学的製造方法に関する。
【０００５】
たとえば６−ヒドロキシピコリン酸のようなヘテロ芳香族カルボン酸は、医薬品製造の中間体、たとえば２−オキシピリミジン（ベリヒテ・デア・ドイッチェン・ヒェミッシェン・ゲゼルシャフト  １９１２，４５，ｐ．2456〜2467）または除草剤製造の中間体として重要である。
【０００６】
一般に、ニトリルヒドラターゼおよびアミダーゼまたはニトリラーゼを含有する微生物は、ニトリルを対応する酸に転換することが知られている。  たとえばＥＰ−Ａ０１８７６８０には、コリネバクテリウム属、ノカルディア属、バチルス属、バクテリジウム属、ミクロコッカス属およびブレビバクテリウム属の微生物を利用してニチコン酸を製造する、微生物学的方法が記載されている。  この反応は、光のエネルギーの存在下に実施することを要する。  ＥＰ−Ａ０４４４６４０には、たとえばロドコッカス属の微生物を利用してニコチン酸を製造する微生物学的方法が開示されている。  この反応は、ラクタムの存在下に実施することが必要である。
【０００７】
さらに、ロドコッカス・ロドクラス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）Ｊ１種は、たとえば２−シアノピラジンをピラジンカルボン酸に転換することが知られている。（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  ｏｆＡｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，４３，No.１０，１９９０，p. 1316〜1320）  しかしながら、この微生物は２−シアノピリジンをピコリン酸に転換する能力はない（Ｍａｔｈｅｗ  ｅｔ  ａｌ．  Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ, ５４，No．４，１９８８，p. 1030〜1032）。
【０００８】
２−シアノピリジンを利用するアルカリゲネス属の微生物は２−シアノピリジンを６−ヒドロキシピコリン酸に変換することも、知られている（ＥＰ−Ａ０５０４８１８）。  この方法の不利益な点は、６−ヒドロキシピコリン酸が中程度の収率でしか生成しないことである。
【０００９】
本発明の目的は、ヘテロ芳香族カルボン酸またはその生理的に許容し得る塩、たとえばピラジンカルボン酸、ピコリン酸またはピコリン酸クロムを、アルカリゲネス属の微生物を利用して、より経済的な微生物学的製造方法であって、生成するカルボン酸またはその生理的に許容し得る塩が高収率で得られるような製造方法を提供することにある。
【００１０】
この目的は、請求項１に記載の方法により達成される。
【００１１】
本発明の製造方法は、下記の一般式で表わされるヘテロ芳香族ニトリル
【００１２】
【化７】
0003810860.tif 000004
【００１３】
【化８】
0003810860.tif 000005
【００１４】
〔式中、Ｘ，Ｒ1 およびＲ2 は前記した意味を有する。〕
を基質とし、これを２−シアノピリジンを利用するアルカリゲネス属の微生物であって、生物学的転換に先立ってジカルボン酸、トリカルボン酸または炭水化物の存在下に培養したものを利用して、一般式ＩまたはIIのヘテロ芳香族カルボン酸に転換するような手法で実施される。  ヘテロ芳香族カルボン酸は、ついで、所望によりその生理的に許容できる塩に転化される。  これらカルボン酸の「生理的に許容できる塩」とは、以下、たとえばクロム、カルシムまたはアンモニウムの塩である。
【００１５】
実際の生物学的転換に先立って、本発明の方法に使用するアルカリゲネス属の微生物は、通常の培養をして、その有効な酵素を２−シアノピリジンで好都合に誘起させる。  ２−シアノピリジンは、この培養および誘起のために、０．０１〜２０重量％の濃度で、好ましくは０．１〜１重量％の濃度で使用する。
【００１６】
「ジカルボン酸」の語は、以下、フマール酸、コハク酸、マレイン酸、グルタル酸、マロン酸またはそれらの塩および誘導体たとえばエステルを意味する。
【００１７】
「トリカルボン酸」の語は、以下、クエン酸、イソクエン酸またはそれらの塩および誘導体たとえばエステルを意味する。  これらジカルボン酸およびトリカルボン酸の塩および誘導体であって使用に適するものは、フマレート、マレート、マロネート、オキサルアセテート、サイトレート、アコニテート、イソサイトレート、２−オキソグルタレート、サクシネートまたはサクシニル−ＣｏＡである。  フマレート、マレートまたはサクシネートが好ましく使用される。
【００１８】
「炭水化物」の語は、以下、グルコースのようなモノサッカライド、シュクロース、トレハロースまたはマルトースのようなジサッカライド、ラフィノースのようなトリサッカライド、さらにはグリセロールのようなシュガーアルコールを意味する。  グリセロールが、炭水化物としては好ましく使用される。
【００１９】
ジカルボン酸、トリカルボン酸または炭水化物は、０．１〜２０重量％の濃度、好ましくは０．５〜５重量％の濃度で好都合に使用される。
【００２０】
培地としては、当業者の間に常用されているもの、たとえばＫｕｌｌａ  ｅｔａｌ．のミネラル塩培地（Ａｒｃｈ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， １３５，１−７，１９８３）の低モル度リン酸緩衝液、または下記の表１に示されたものを使用することができる。  好ましくは表１に記載のものを使用する。
【００２１】
培養期の後であって基質の添加の前に、微生物を常用の分離手段によって収穫してもよいし、あるいはまた、基質を直接微生物に対して加えてもよい。
【００２２】
生物学的転換に使用する基質である一般式III およびIVのヘテロ芳香族ニトリルたとえば２−シアノピリジンは、市場で入手できる化合物である。
【００２３】
一般式Ｉ〜IVにおけるＸは、窒素原子または−ＣＨ−を表わし、好ましくは−ＣＨ−である。  基Ｒ1 およびＲ2 は同一または異なるものであって、水素または、フッ素、塩素、臭素もしくはヨウ素のようなハロゲンを表わす。  あり得る基質は、従って、２−シアノピリジン、６−クロロ−２−シアノピリジン、５，６−ジクロロ−２−シアノピリジン、２−シアノピラジン、６−クロロ−２−シアノピラジン、５−ブロモ−６−クロロ−２−シアノピラジンである。  ２−シアノピリジン、２−シアノピラジンまたは６−クロロ−２−シアノピリジンが、基質として好都合に使用される。
【００２４】
基質は、生物学的転換のためには、一時的に加えてもよいし、連続的に加えてもよい。  基質は、培地中の基質濃度が２０重量％を超えないようなやり方で、好ましくは基質濃度が１０重量％を超えないようなやり方で加えるのがよい。
【００２５】
生物学的転換は、通常は静止した細胞で行なわれ、２−シアノピリジンを利用するアルカリゲネス・フェーカリス種の微生物（この微生物はＥＰ−Ａ０５０４８１８に記載され、ＤＳＭ６３３５の番号を与えられている）およびその機能的に同等な変異種および突然変異種を使用して実施する。  上記の微生物は１９９１年１月３日に、ドイツ国ブラウンシュヴァィク・Ｄ−３８１２４，マシェローダ・ヴェク１ｂのドイッチェ・ザムルング・フオン・ミクロオーガニスメン・ウント・ツェルクルトゥーレン・ＧｍｂＨに、ブタペスト条約の規定に従って寄託された。
【００２６】
「機能的に同等な変異種および突然変異種」とは、もとの微生物と本質的に同じ性質と機能を有する微生物を意味する。  このような変異種および突然変異種は、たとえば紫外線照射のような冒険的な方法によって得られる。
【００２７】
生物学的転換には、微生物の培養に用いたものと同じ培地を使用することができる。  生物学的転換はまた、上述したジカルボン酸、トリカルボン酸または炭水化物の存在下でも、不存在下でも起り得る。
【００２８】
ｐＨは好ましくは４〜１０の範囲、より好ましくは５〜９の範囲である。  生物学的転換は、温度１０〜５０℃において実施することができる。  好ましい温度は、２０〜４０℃である。
【００２９】
通常の転換時間である６〜１００時間を経過した後、式ＩまたはIIに従う適切なカルボン酸が、常用の処理操作たとえば酸性化によって得られる。  カルボン酸はまた、たとえばアンモニウム塩やクロム塩のような塩の形でも単離することができる。
【００３０】
製造されたヘテロ芳香族カルボン酸が６−位においてヒドロキシル化されているもの（一般式II）である場合、生物学的転換は好気的条件下に実施するのが有利である。  しかしながら、ヒドロキシル化されていないヘテロ芳香族カルボン酸たとえばピコリン酸を製造しようとする場合、生物学的転換は嫌気的条件下に実施するのが有利である。
【００３１】
【実施例】
〔実施例１〕
６−ヒドロキシピコリン酸の製造
アルカリゲネス・フェーカリスＤＳＭ６３３５株を使用する６−ヒドロキシピコリン酸製造の条件は、下記のとおりである。  操作容積が５リットルある７．５リットル発酵容器を使用した。  アルカリゲネス・フェーカリスＤＳＭ６３３５を、フマール酸ナトリウムを唯一の炭素源およびエネルギー源とするミネラル塩培地(表１)で、２−シアノピリジンをインデューサとして用い、３０℃で、撹拌速度６００rpm 、ｐＨ７．０で培養した。  その間、エアレーションの速度は約３リットル／分とした。  フマール酸ナトリウムの追加を、ｐＯ2 をコントロールしてｐＯ2 ＞３０％であるときに行なった。  濃度２０％のフマール酸ナトリウムのストック溶液に、０．５％の２−シアノピリジンを加えたものを使用した。  ６５０nm（ＯＤ650 ）で測定した光学密度が１６に至るまで、２３時間にわたって、生物学的転換がスタートするのに先立って細胞を培養した。  成長相において、約１６０ｇのフマール酸ナトリウムを、濃度２０％の溶液（約８００ml)として使用した。
【００３２】
２−シアノピリジンの好気的な生物学的転換により６−ヒドロキシピコリン酸にする間、炭素およびエネルギーの源を別に与えなかった。  生物学的転換は、静止した細胞で行なわれた。
【００３３】
２−シアノピリジンの追加を、定量ポンプを使用して行なった。  ポンプ速度は、ＨＰＬＣにより「オンライン」でモニターした。  中間体であるピコリン酸の生成速度は、ピコリン酸を６−ヒドロキシピコリン酸に転換する速度に対して約２．５倍大きく（４ｇ／ｌ・ｈに対して１０ｇ／ｌ・ｈ）、ピコリン酸の濃度は２ｇ／ｌ未満に制限した。  そうしないと、ピコリン酸の６−ヒドロキシピコリン酸への転化が妨げられるからである。
【００３４】
２−シアノピリジンは室温で固体であるため、２−シアノピリジンを入れた貯蔵容器を５０℃に加熱して、２−シアノピリジンを液体の形で加えられるようにした。  このプロセスによって、７５ｇ／ｌの６−ヒドロキシピコリン酸を３１時間のうちに製造することができた。  中間体であるピコリン酸は、生物学的転換の末期においては、もはや検出されなかった。
【００３５】
この６−ヒドロキシピコリン酸を単離するため、細胞を濾過により分離した。細胞を除いた溶液を次に６０℃に加熱し、濃硫酸で酸性にしてｐＨを２〜２．５とした。  このｐＨにおいて、６−ヒドロキシピコリン酸が溶液から析出した。
【００３６】
撹拌下にゆっくり冷却して２４℃にし、濾過してその残渣を脱ミネラル水で洗浄して乾燥した（１００mbar，５５℃）。  約２ｇ／ｌの６−ヒドロキシピコリン酸が母液中に残っていた。  収率は、使用した２−シアノピリジン基準で８７％であった。
【００３７】
0003810860.tif 000006
〔実施例２〕
ピコリン酸の製造
バイオマスを、実施例１と同様にして培養した。  ピコリン酸の生成は、厳密に嫌気的な条件下で起った。  ゴム栓をそなえた５００mlのガラス瓶を使用し、ＯＤ650 ＝２０のバイオマス４００ｍｌを入れた。  保温培養を３０℃で行なった。  生物学的転換の開始に先立って、混合物は純窒素で嫌気条件下に置いた。この目的のために、窒素ガス（ゲージ圧５０mbar）を、撹拌されている混合物中に、針を通して約３０分間注入し、酸素を定量的に追い出した。  生物学的転換の間または２−シアノピリジンの添加の際に酸素が侵入するのを防ぐために、窒素ガスの導入を生物学的転換の操作の間、続けて行なった（ゲージ圧約１０mbarで）。  ２−シアノピリジンを１２回に分けて、各回１時間が経過するごとに１０ｇ／ｌずつ添加した。  しかし、添加は連続的に行なうこともできる。  ＨＰＬＣを使用して、２−シアノピリジンが完全にピコリン酸に転化したかどうかをチェックした上で、次の添加を行なった。  生物学的転換の間、検知されるほどのピコリン酸アミドの生成はなかった。  この方法によって、約１５０ｇ／ｌのピコリン酸を２６時間の間に製造することができた。  その間、６−ヒドロキシピコリン酸は生成しなかった。
【００３８】
単離のため、細胞を除いたピコリン酸溶液にＣａＣｌ2 ／Ｈ2 ＳＯ4 を加えて沈でんを生じさせた。  この目的のため、実施例２の細胞を除いたピコリン酸溶液を３倍に稀釈し、この細胞除去発酵溶液を９０℃に加熱したのち、撹拌しながら、ピコリン酸の当量あたり０．５当量のＣａＣｌ2 を添加した。  その結果、カルシウム／ピコリン酸錯体が直ちに生成し析出した。  析出した錯体を撹拌下に４℃に冷却し、ガラスフリット(ポロシティ３)上で濾過し、脱ミネラル水で洗浄した。  フィルターケークを脱ミネラル水に分散し、濃硫酸で酸性化してｐＨを２．５にした。  この間、ピコリン酸は錯体から溶け出し、それと同時に不溶性の硫酸カルシウムが生成した。  遊離のピコリン酸は水によく溶けるので、硫酸カルシウムを濾過により除去することができた。  ピコリン酸溶液を蒸発して乾固し、分析した。  粗生成物は収率７０％、滴定により定めた純度８６％であった。  カール・フィッシャー法で測定した水分含有量は０．７％であった。
【００３９】
〔実施例３〕
ピコリン酸クロム（III)の製造
５００mlフラスコ中で、三塩化クロム六水塩の水溶液（２３．９５ｇ，水６３ml中にＣｒが０．０９モル）を、３．５時間かけて、ｐＨ７．１のピコリン酸アンモニウム溶液（２７１．４ｇ，０．３２５モル、１６．８％）に、７３℃で滴状にして加えた。  その結果生じた紫色の溶液をさらに１時間撹拌し、それからゆっくりと３℃に冷却した。  生成した赤色の固体が落ち着いたところで、上澄みの青色の液をデカントして除去した。  固体を１００mlの水中に３０分間懸濁させ、デカンテーションを繰り返した。  ５０mlの水中で２回目の懸濁の後、固体を吸引濾過し、５０℃で減圧下に乾燥した。  ３３．６４ｇの暗赤色結晶が得られた（収率９０％）。
【００４０】
〔実施例４〕
アルカリゲネス・フェーカリスＤＳＭ６３３５の種々の炭素源を使用しての培養Ａ＋Ｎ培地（表１、ただしフマール酸ジナトリウムを含まない）１００mlを入れた３００ml三角フラスコを使用して、アルカリゲネス・フェーカリス（ＤＳＭ６３３５）を培養した。  ２ｇ／ｌの２−シアノピリジンと１０ｇ／ｌの下記の炭素源のうちのひとつとを、培地に加えた。
【００４１】
フマール酸ジナトリウム
グリセロール
マロン酸ジナトリウム
コハク酸ジナトリウム
保温培養はシェーカー中、３０℃で行なった。  １６時間の成長の後、細胞を取り出し、新しいＡ＋Ｎ培地（炭素源を含まない）の１０ｇ／ｌの２−シアノピリジンを含有するものに再懸濁した。  細胞懸濁液６５０nm（ＯＤ650 ）で測定した光学密度は、１０であった。  細胞懸濁液（全容積は１０〜２０ml）を、再度３０℃で保温培養した。  ６−ヒドロキシピコリン酸の生成を、分光分析により、細胞を除いた液の３０８nm光の吸収を測定して追跡した。  ６−ヒドロキシピコリン酸に関して、下記の平均生産性が得られた：
0003810860.tif 000007
〔実施例５〕
６−ヒドロキシピラジンカルボン酸の製造
アルカリゲネス・フェーカリス（ＤＳＭ６３３５）を、炭素源としてフマール酸を使用して、実施例４と同様に培養した。  洗浄した細胞を、１０ｇ／ｌの２−シアノピリジンを含有するＡ＋Ｎ培地に再懸濁し（ＯＤ650 ＝１０）、３０℃で初期培養した。  ６−ヒドロキシピラジンカルボン酸の生成を、分光分析により、細胞を除いた溶液の３２０nm光の吸収を測定して追跡した。  ２−シアノピラジン（基質）濃度の減少を、２７０nm光の吸収を測定することにより決定することができた。  使用した２−シアノピラジンの全量が、７時間後に、６−ヒドロキシピラジンカルボン酸に転化していた。
【００４２】
〔実施例６〕
６−クロロピコリン酸およびピラジンカルボン酸の製造
アルカリゲネス・フェーカリス（ＤＳＭ６３３５）を、フマール酸を炭素源として、実施例４と同様に培養した。  洗浄した細胞を、ゴム栓のできるガラス容器中のＡ＋Ｎ培地に再懸濁し（ＯＤ650 ＝１０）、窒素ガスを針を通して注入して、溶存している酸素を追い出した。  続いて、２−シアノピリジンまたは６−クロロ−２−シアノピリジンを、細胞懸濁液に基質として加え、最終的な濃度を１０ｇ／ｌとして、３０℃で初期培養した。  ３時間後、出発原料である基質は、対応する酸に定量的に転化していた。  〔薄層クロマトグラフィーによる検出：シリカゲル６０、蛍光指示薬使用、移動相：クロロフォルム３０／エタノール５５／ＮＨ4 ＯＨ（２５％）１０／Ｈ2 Ｏ  ５〕