(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
サイトカイン遺伝子を導入したエフェクター細胞とサイトカイン遺伝子を腫瘍細胞に導入した腫瘍ワクチンとを含む、癌転移抑制のための遺伝子治療剤であって、前記エフェクター細胞に導入するサイトカイン遺伝子がインターロイキン(IL)−２遺伝子又はインターフェロン(IFN)−γ遺伝子であり、前記腫瘍細胞に導入するサイトカイン遺伝子がインターロイキン(IL)−２遺伝子及び/又は顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)遺伝子である、前記遺伝子治療剤。
【請求項２】
エフェクター細胞が癌細胞の破壊に関与するリンパ球である請求項１記載の遺伝子治療剤。
【請求項３】
リンパ球が腫瘍浸潤リンパ球(TIL)、リンホカイン活性化キラー細胞(LAK)、または細胞障害性Ｔ細胞(CTL)である、請求項２記載の遺伝子治療剤。
【請求項４】
腫瘍細胞がメラノーマ細胞、腎癌細胞、乳癌細胞、偏平上皮癌、腺癌、移行上皮癌、肉腫、または神経膠腫（グルコーマ）である、請求項１に記載の遺伝子治療剤。
【請求項５】
サイトカイン遺伝子がアデノウイルスベクターによりエフェクター細胞に導入された請求項１記載の遺伝子治療剤。
【請求項６】
サイトカイン遺伝子がレトロウイルスベクターにより腫瘍細胞に導入された請求項１記載の遺伝子治療剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は癌の遺伝子治療剤に関し、さらに詳細には、サイトカイン遺伝子を導入したエフェクター細胞とサイトカイン遺伝子を腫瘍細胞に導入した腫瘍ワクチンを含む癌の遺伝子治療剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
サイトカインは抗腫瘍効果を発揮するが、その作用機序により主に以下の３つに大別される。すなわち、▲１▼腫瘍壊死因子(TNF)-α, β、インターフェロン(IFN)-α, β, γ、インターロイキン(IL)-1などのように、癌細胞に対してin vitroで直接的な増殖抑制ないし障害活性を示すもの、▲２▼インターロイキン(IL)-2, 4,6, 7, 8, 9, 10, 11, 12などのように生体の免疫エフェクター機構を介して間接的に抗腫瘍効果を示すもの、▲３▼IL-3、IL-6、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF) 、幹細胞因子(SCF) などのように他の制癌療法に伴う生体の副作用の防止や治療に用いられているものである。
【０００３】
さらに、近年サイトカイン遺伝子導入による癌治療も試みられている。これらの一つはサイトカイン遺伝子をリンパ球、例えばリンホカイン活性化キラー細胞（LAK)、細胞障害性Ｔ細胞 (CTL)、腫瘍浸潤リンパ球(TIL) などに導入し、導入細胞から分泌されるサイトカインによりオートクラインあるいはパラクラインでリンパ球を活性化して受動免疫能を高めたり、TIL に直接抗腫瘍性のあるIFN またはTNF 遺伝子を導入することにより腫瘍局所での抗腫瘍性を高めようという試みがなされている(Nishihara et al., Cancer Res., 48, 4730, 1988、Miyatake et al., J. Natl. Cancer Inst., 82, 217, 1990 、Itoh et al., Jpn. J. Cancer Res., 82, 1203, 1991) 。TIL へのサイトカイン遺伝子導入は、これまでレトロウイルスが利用されているが、導入効率が非常に悪く、当アプローチに対する障害となっている。
【０００４】
もう一つはレトロウイルスベクターなどにより腫瘍細胞にサイトカイン遺伝子を導入して腫瘍ワクチンとして用い、宿主の腫瘍特異的免疫細胞を誘導するものである。例えば、FearonらはIL-2遺伝子を導入したマウス大腸癌、悪性黒色腫を同系マウスに移植すると生着後自然退縮し、そのマウスはIL-2遺伝子非導入腫瘍細胞の再移植に対して抵抗性をもつ免疫能を獲得することを報告している (Fearon et al., Cell, 60, 397, 1990) 。
しかしながら、これらはいずれも抗腫瘍性に対して必ずしも満足のいく成績が得られるものではなかったり、また転移抑制効果という面からは検討がなされておらず、癌転移に対し有望と思われるものは現状では報告されていない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の目的は、上記のような問題を解決すべく、より高い抗腫瘍活性を発揮し得、かつ癌転移の抑制にも有効な癌の遺伝子治療剤を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは前記のような課題について鋭意研究を行った結果、サイトカイン遺伝子を導入したエフェクター細胞とサイトカイン遺伝子を腫瘍細胞に導入した腫瘍ワクチンを併用すれば、効率よく全身免疫が誘導されて抗腫瘍効果と転移抑制効果が増強されることを見出し、本発明を完成した。
【０００７】
すなわち、本発明は、サイトカイン遺伝子を導入したエフェクター細胞とサイトカイン遺伝子を腫瘍細胞に導入した腫瘍ワクチンを含む癌の遺伝子治療剤を提供する。
本発明にいう癌の遺伝子治療とは、サイトカイン遺伝子による抗腫瘍作用ならびに転移抑制作用の両面からの癌治療を企図するものである。
【０００８】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明において使用されるサイトカイン遺伝子とは、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、インターロイキン(IL)-2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15、インターロイキン-1α (IL-1α) 、インターロイキンレセプター1 アンタゴニスト(IL-1RA)、腫瘍壊死因子(TNF) −α、リンホトキシン(LT)−β、顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF) 、マクロファージコロニー刺激因子(M-CSF) 、インターフェロン (IFN)−γ、マクロファージ遊走阻止因子 (MIF)、白血病抑制因子 (LIF)、Ｔ細胞活性化共刺激因子B7 (CD80) 並びにB7-2(CD86)、キット・リガンド、オンコスタチンＭ等の各種サイトカインをコードする遺伝子をいう。既に種々のサイトカインｃＤＮＡがクローニングされている [ヒト GM-CSF cDNAについては Wong et al., Science, 228, 810-815 (1985)、ヒト IL-2 cDNAについては Taniguchi et al., Nature, 302, 305-310 (1983)] 、ヒト IFN-γ cDNA については Gray et al., Nature, 298, 859-863 (1982)]。本発明において使用されるサイトカイン遺伝子は、公知の技術を用いて細胞から単離して得られたｃＤＮＡであっても、また上記の文献等に開示される情報よりポリメレース連鎖反応（ＰＣＲ）等の方法に従って化学的に合成されたものであってもよいが、免疫的拒絶反応を最小に抑えるために、また、治療効果を上げるために、ヒト由来のものが望ましい。
【０００９】
本発明においてエフェクター細胞とは、癌細胞の破壊の最終段階を担当し、破壊に直接携わる細胞集団をいい、具体的には腫瘍浸潤リンパ球(TIL）、リンホカイン活性化キラー細胞（LAK)、細胞障害性Ｔ細胞 (CTL)等をいう。
これらエフェクター細胞へのサイトカイン遺伝子の導入は、アデノウイルスベクターを用いることにより非常に効率良く行うことができる。ここで使用されるアデノウイルスベクターとしては、サイトカイン遺伝子のための挿入部位を含み、導入されたエフェクター細胞においてサイトカインを発現できるものであれば特に限定されないが、ヒト５型アデノウイルス由来のAdex1 [Saito, I. et al., J. Viol., 54, 711-719 (1985)]が好適に使用される。
【００１０】
一方、本発明にいう腫瘍ワクチンとは、上記のサイトカイン遺伝子をレトロウイルスベクターにより単離（培養）腫瘍細胞に導入し、これにＸ線照射を行って、サイトカインの産生は阻害せずに増殖のみを停止させたものである。この腫瘍ワクチンを宿主に投与することにより、宿主の腫瘍特異的免疫細胞を誘導することができる。
【００１１】
ここで使用されるレトロウイルスベクターは、サイトカイン遺伝子のための挿入部位を含み、導入された腫瘍細胞においてサイトカインを発現できるものであれば特に限定されないが、例えば、特表平 6-503968 号公報に開示される、MFG 、α-SCG、PLJ 、pEm 等が挙げられる。サイトカイン遺伝子を挿入したレトロウイルスベクターは、目的の遺伝子が導入されたことを選択するマーカーとしてネオマイシン耐性遺伝子を持つプラスミドとミックスして、Ψ2 、Ψ-Am 、ΨCRIP、ΨCRE [Danos et al., PNAS, 85, 6460-6464 (1988)]等のパッケージング細胞にカルシウム共沈殿法により導入する（コトランスフェクション）。さらにこれを薬剤Ｇ４１８の存在下で培養し、生存してコロニーを形成してくる細胞を採取することによって、目的とする遺伝子の導入されている細胞のみを採取することができる。次にこれらの細胞の培養上清を用いてNIH3T3マウス繊維芽細胞、B16 マウスメラノーマ細胞など各種腫瘍細胞に感染させ、最終的には細胞の染色体に導入された安定な遺伝子導入細胞として、サザンハイブリダイゼーションによって確認することができる。また、感染細胞から分泌されるサイトカインの量は、ＥＬＩＳＡ等の免疫学的アッセイにより測定することができる。
【００１２】
次に、サイトカイン遺伝子が導入された腫瘍細胞を、通常10,000〜150,000 rad のＸ線を照射後、これを腫瘍ワクチンとして用いる。
ここでいう腫瘍細胞は、メラノーマ細胞ないし腎癌細胞であるが、他の腫瘍細胞、例えば乳癌細胞、偏平上皮癌、腺癌、移行上皮癌、肉腫、神経膠腫（グリオーマ）等も用いることができる。
上記のようにしてそれぞれ調製したサイトカイン遺伝子導入エフェクター細胞と腫瘍ワクチンはそのまま用いることができるが、医薬的に許容できる賦形剤とともに医薬組成物として、溶液、懸濁液、ゲル等の形態に製剤化して投与することもできる。
【００１３】
本発明の遺伝子治療剤の投与形態としては、通常の静脈内、動脈内等の全身投与の他に、癌原病巣に対して、または癌種に対応した予想転移部位に対して、局所注射、経口投与等の局所投与を行うことができる。さらに、本発明の遺伝子治療剤の投与にあたっては、カテーテル技術、遺伝子導入技術、または外科的手術等と組み合わせた投与形態をとることもできる。
本発明の遺伝子治療剤の投与量は、年齢、性別、症状、投与経路、投与回数、剤型によって異なるが、一般に、成人では一日当たりサイトカイン遺伝子の重量にして、約 0.1〜100 mgの範囲が適当である。
【００１４】
【発明の効果】
本発明によれば、ヒト、またはマウス、サル、イヌ、ネコ、ウマ、ブタ等の動物に高い抗腫瘍性を発揮し得、かつ癌転移の抑制にも有効な遺伝子治療剤が提供され、微小転移の癌治療に有用である。
【００１５】
【実施例】
本発明を以下の実施例によりさらに詳細に説明する。これらの実施例は説明のためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。
〔参考例１〕
マウスIL-2、マウスGM-CSF、及びマウスIFN-γのcDNAは、マウスの脾リンパ球のｍＲＮＡを用いてRT-PCR (Reverse transcripiton-polymerase chain reaction)法により調製した。PCR を行うに際し、マウスIL-2に対しては以下に示すプライマー#479, #480、マウスGM-CSFに対しては以下に示すプライマー#477, #478、マウスIFN-γに対しては以下に示すプライマー#485, #486をそれぞれ使用した。
【００１６】
プライマー(#479) : CCGAATTCTAGACACC ATG TAC AGC ATG CAG CTC GCA TCC TGT G
プライマー(#480) : C TGT CAA AGC ATC ATC TCA ACA AGC CCT CAA TAA GGATCC CC
プライマー(#477) : CCGAATTCTAGACACC ATG TGG CTG CAG AAT TTA CTT TTC CTG GGC
プライマー(#478) : C CCC TTT GAA TGC AAA AAA CCA AGC CAA AAA TGA GGATCC GG
プライマー(#485) : CC GAA TTC TAGA CACC ATG AAC GCT ACA CAC TGC ATC TTG GC
プライマー(#486) : C AGG AAG CGG AAA AGG AGT CGC TGC TGA GGATCCGG
【００１７】
〔実施例１〕  サイトカイン遺伝子導入エフェクター細胞 (TIL/IL-2) の調製
(1) マウスメラノーマB16F10由来TIL の調製
TIL の調製は、Alexander, R.B. et al., J. Immunol., 145, 1615-1620 (1990)、Matis, L.A. et al., Methods Enzymol., 150, 342-351 (1987) 、Livingstone, A. et al., Methods  Enzymol., 150, 325-333 (1987)記載の方法に改良を加えて以下のようにして行った。6 〜10週令の雌性C57BL/6 マウス(Charles River Japanより購入) に移植したマウスメラノーマB16(ATCC CRL6322) の高転移株であるB16F10（Whitehead Institute Dr.Glenn Dranoffより入手) の新鮮な腫瘍塊を完全培養培地（ＣＭ）中に4 ℃で5 ×107cells/ml 懸濁した。ＣＭは、熱不活化した10% ウシ胎児血清、2mM L-グルタミン、5 ×10-5M  2- メルカプトエタノール、100U/ml ペニシリン、100 μg/mlストレプトマイシン、0.5 μg/ml  アンホテリシンB 、10mM 3-(N-モルホリノ) プロパンスルホン酸、及び70U/ml組み換えヒトIL-2（塩野義製薬（株）より入手）を添加したRPMI 1640 である。TIL を等量の抗CD-8- 結合免疫吸着ビーズと1 ×108/mlで混合し、4 ℃で2 時間インキュベートした。TIL が付着したビーズはペレット化し、冷ＣＭで3 回洗浄し、ＣＭ中に1 ×107beads/ml 懸濁し、24ウェルの組織培養プレートに播き、37℃、5%CO2 下でインキュベートした。培養１日後、TIL から分離したビーズをペレット化し、除去した。分離したTIL にウェル当たり2 ×105 個の照射(10,000rad) 腫瘍細胞、ならびに1 ×106 個の照射(3,000rad)正常脾細胞を用いて刺激した。in vitro刺激を7 日から14日毎に繰り返した。コンフルエントになったときにTIL を分取し、新たなCM中に2 ×105cell/ml再懸濁した。
【００１８】
(2) アデノウイルスによるマウスIL-2遺伝子のTIL への導入
組み換えアデノウイルスを調製する方法は、Saito,I. et al., J. Viol., 54, 711-719 (1985) の変法により行った。すなわち、サイトメガロウイルスエンハンサー、チキンβ−アクチンプロモーター、参考例１で調製したマウスIL-2のcDNA配列、ラビット−β−グロビンポリ（Ａ）シグナル配列からなる発現ユニット[Niwa, H. et al., J. Gene 108, 193-200 (1991)]を、E1A, E1B, およびE3遺伝子を欠く31kbのアデノウイルスタイプ5 を含む42kbコスミドであるpAdex1w （鐘ケ江裕美、原田志津子、斉藤泉、実験医学バイオマニュアル 4、189-204 、1994、羊土社) のSwaI制限酵素部位に挿入することによって発現用コスミドカセットを構築した（図１）。この発現用コスミドカセットとアデノウイルスＤＮＡ−ターミナル蛋白複合体（DNA-TPC)を293 細胞(ATCC CRL1573)にカルシウム共沈法によりコトランスフェクトした。発現カセットの入った組み換えウイルスは適当な制限酵素による消化によって確認した。組み換えウイルスは続いて293 細胞で増殖させ、ウイルス溶液を-80 ℃で貯蔵した。ウイルスストックのタイターは293 細胞上でのプラークアッセイによって決定した。(1) で調製したTIL へのアデノウイルスのin vitro感染のために、培養液を12−ウェル培養プレートに播いたTIL 細胞から除き、各ウェルにウイルスストック150 μl を加えた。37℃で1 時間インキュベーション後、増殖用培地を添加し、TIL 細胞を2 〜3 日培養し、マウスIL-2遺伝子導入TIL 細胞 (TIL/IL-2) を得た。
【００１９】
〔実施例２]   腫瘍ワクチン（B16F10/IL-2 ＋GM-CSFワクチン）の調製
(1)  マウスIL-2、マウスGM-CSF高タイター組み換えレトロウイルス産生クローンの調製
レトロウイルスベクターＭＦＧ（Dranoff, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 3539-3543, 1993)の2 つのLTR (Long Terminal Repeat)含むEagI/BamHIフラグメント(5200bp)、EagI/XbaI フラグメント(1000bp)、ならびに参考例１で調製したマウスIL-2、マウスGM-CSFの各cDNAのXbaI/BamHIフラグメントの３つをＴ４ＤＮＡライゲースでつないでプラスミドに組み込んだ（図２）。得られたプラスミドとpPGKneo [H. Takeshima et al., Nature, 369, 556-559 (1994)]をカルシウム共沈殿法によりΨCRIP[Danos et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 6460 (1988)] に導入し、これをG-418(GIBCO, 1mg/ml)を含む培地にて１週間培養し、コロニーを形成してくる細胞を採取した。次にこれらの細胞の培養上清をpolybrene(Sigma, 8μg/ml) 存在下、NIH3T3マウス繊維芽細胞 (ATCC CRL 1658)に感染させた。感染細胞のゲノムＤＮＡを単離し、ウイルスのタイターをサザンブロット法で測定し、組み込まれたプロウイルスのコピー数として評価した。NIH3T3への導入効率は通常、1 細胞につきプロウイルスの組み込みで1 〜3 コピー数であった。また、感染細胞より分泌されるサイトカインは、培地10mlを含む10-cm ディッシュに1 ×106 細胞を播いた48時間後に、ELISA (Endogen) によりアッセイした（表１）。
【００２０】
【表１】
0003822261.tif 000002
【００２１】
(2)  腫瘍ワクチン(B16F10/IL-2＋GM-SCFワクチン) の調製
(1) で選択したマウスIL-2、マウスGM-CSFそれぞれの高タイター組み換えレトロウイルス産生クローンをマウスメラノーマB16(ATCC CRL 6322)の高転移株であるB16F10（Whitehead Institute Dr.Glenn Dranoffより入手) に導入した。該遺伝子導入細胞は、10% ウシ胎児血清および2mM グルタミンを添加したダルベッコのイーグル培地で維持し、トリプシン/EDTA で処理し、HITACHI MBR-1505R X-ray generator を用い、10,000rad のＸ線を照射した。照射細胞はHBSS(Hank's Balanced Salt Solution) で2 回洗浄し、5 ×106 cell/ml の濃度でHBSSに再懸濁し、腫瘍ワクチン（B16F10/IL-2 ＋GM-CSFワクチン）を得た。
【００２２】
〔実施例３〕  サイトカイン遺伝子導入エフェクター細胞 (TIL/IFN-γ) の調製(1) マウスメラノーマB16F10由来TIL の調製
実施例１（1)と同様の方法により調製した。
(2) アデノウイルスによるマウスIFN-γ遺伝子のTIL への導入
組み換えアデノウイルスを調製する方法は、Saito,I. et al., J. Viol., 54, 711-719 (1985) の変法により行った。すなわち、サイトメガロウイルスエンハンサー、チキンβ−アクチンプロモーター、参考例１で調製したマウスIFN-γのcDNA配列、ラビット−β−グロビンポリ（Ａ）シグナル配列からなる発現ユニット[Niwa, H. et al., J. Gene 108, 193-200 (1991)]を、E1A, E1B, およびE3遺伝子を欠く31kbのアデノウイルスタイプ5 を含む42kbコスミドであるpAdex1cw（鐘ケ江裕美、原田志津子、斉藤泉、実験医学バイオマニュアル 4、189-204 、1994、羊土社) のClaI制限酵素部位に挿入することによって発現用コスミドカセットを構築した（図１）。この発現用コスミドカセットとアデノウイルスＤＮＡ−ターミナル蛋白複合体（DNA-TPC)を293 細胞(ATCC CRL1573)にカルシウム共沈法によりコトランスフェクトした。発現カセットの入った組み換えウイルスは適当な制限酵素による消化によって確認した。組み換えウイルスは続いて293 細胞で増殖させ、ウイルス溶液を-80 ℃で貯蔵した。ウイルスストックのタイターは293 細胞上でのプラークアッセイによって決定した。(1) で調製したTIL へのアデノウイルスのin vitro感染のために、培養液を12−ウェル培養プレートに播いたTIL 細胞から除き、各ウェルにウイルスストック150 μl を加えた。37℃で1 時間インキュベーション後、増殖用培地を添加し、TIL 細胞を2 〜3 日培養し、マウスIFN-γ遺伝子導入TIL 細胞 (TIL/IFN-γ) を得た。
【００２３】
〔実施例４]   腫瘍ワクチン（B16F10/GM-CSF ワクチン）の調製
(1)マウスGM-CSF高タイター組み換えレトロウイルス産生クローンの調製
実施例２(1) と同様の方法により調製した。
(2)  腫瘍ワクチン(B16F10/GM-SCFワクチン) の調製
(1) で選択したマウスGM-CSFの高タイター組み換えレトロウイルス産生クローンをマウスメラノーマB16(ATCC CRL 6322)の高転移株であるB16F10（Whitehead Institute Dr.Glenn Dranoffより入手) に導入した。該遺伝子導入細胞は、10% ウシ胎児血清および2mM グルタミンを添加したダルベッコのイーグル培地で維持し、トリプシン/EDTA で処理し、HITACHI MBR-1505R X-ray generator を用い、10,000rad のＸ線を照射した。照射細胞はHBSSで2 回洗浄し、5 ×106 cell/ml の濃度でHBSSに再懸濁し、腫瘍ワクチン（B16F10/GM-CSF ワクチン）を得た。
【００２４】
〔実施例５〕  サイトカイン遺伝子導入エフェクター細胞 (TIL/IL-2, TIL/IFN-γ) の調製
(1) マウス大腸癌Colon 26由来TIL の調製
TIL の調製は、Alexander, R.B. et al., J. Immunol., 145, 1615-1620 (1990)、Matis, L.A. et al., Methods Enzymol., 150, 342-351 (1987) 、Livingstone, A. et al., Methods  Enzymol., 150, 325-333 (1987)記載の方法に改良を加えて以下のようにして行った。6 〜10週令の雌性BALB/Cマウス(Charles River Japanより購入) に移植したマウス大腸癌Colon 26の新鮮な腫瘍塊を完全培養培地（ＣＭ）中に4 ℃で5 ×107cells/ml 懸濁した。ＣＭは熱不活化した10% ウシ胎児血清、2mM L-グルタミン、5 ×10-5M  2- メルカプトエタノール、100U/ml ペニシリン、100 μg/mlストレプトマイシン、0.5 μg/ml  アンホテリシンB 、10mM 3-(N-モルホリノ) プロパンスルホン酸、及び70U/ml組み換えヒトIL-2（塩野義製薬（株）より入手）を添加したRPMI 1640 である。TIL を等量の抗CD-8- 結合免疫吸着ビーズと1 ×108/mlで混合し、4 ℃で2 時間インキュベートした。TIL が付着したビーズはペレット化し、冷ＣＭで3 回洗浄し、ＣＭ中に1 ×107beads/ml 懸濁し、24ウェルの組織培養プレートに播き、37℃、5%CO2 下でインキュベートした。培養１日後、TIL から分離したビーズをペレット化し、除去した。分離したTIL にウェル当たり2 ×105 個の照射(10,000rad) 腫瘍細胞、ならびに1 ×106 個の照射(3,000rad)正常脾細胞を用いて刺激した。in vitro刺激を7 日から14日毎に繰り返した。コンフルエントになったときにTIL を分取し、新たなCM中に2 ×105cell/ml再懸濁した。
【００２５】
(2) アデノウイルスによるマウスIL-2遺伝子のTIL への導入
実施例１(2) と同様の方法により上記(1) で調製したTIL へ参考例１で調製したマウスIL-2cDNAを導入し、マウスIL-2遺伝子導入TIL 細胞(TIL/IL-2)を得た。
(3) アデノウイルスによるマウスIFN-γ遺伝子のTIL への導入
実施例３(2) と同様の方法により上記(1) で調製したTIL へ参考例１で調製したマウスIFN-γcDNAを導入し、マウスIFN-γ遺伝子導入TIL 細胞(TIL/IFN-γ) を得た。
【００２６】
〔実施例６]   腫瘍ワクチン（Colon26/IL-2ワクチン）の調製
(1)マウスIL-2高タイター組み換えレトロウイルス産生クローンの調製
実施例２(1) と同様の方法により調製した。
(2)  腫瘍ワクチン（Colon26/IL-2ワクチン）の調製
(1) で選択したIL-2高タイター組み換えレトロウイルス産生クローンをマウス大腸癌Colon26 に導入した。該遺伝子導入細胞は、10% ウシ胎児血清および2mM グルタミンを添加したRPMI1640培地で維持し、HITACHI MBR-1505R X-ray generator を用い、10,000rad のＸ線を照射した。照射細胞はHBSSで2 回洗浄し、5 ×106 cell/ml の濃度でHBSSに再懸濁し、腫瘍ワクチン（Colon26/IL-2ワクチン）を得た。
【００２７】
〔試験例１〕    肺転移系における効果試験（１）
6〜10週令の雌性C57BL/6 マウス(Charles River Japanより購入) に4 ×105 個のマウスメラノーマB16F10細胞を尾静脈に接種し、肺転移を誘発させた。２日後にTIL 単独、あるいは実施例１にて調製したTIL/IL-2を4 ×106 個静脈より投与した[E/T ratio=10:E/T はエフェクター細胞(TIL/IL-2)数／腫瘍細胞(B16F10)数を表す] 。同時に実施例２にて調製したB16F10/IL-2 ＋GM-CSFワクチンを5 ×105 個皮下投与した。肺転移誘発より１６日後に解剖して肺に生じた転移結節数を数えた。比較としてTIL 単独、あるいはTIL/IL-2投与のみでワクチン投与を行わないものについても試験した。結果を表２ならびに図３に示す。
【００２８】
【表２】
0003822261.tif 000003
【００２９】
TIL/IL-2とB16F10/IL-2 ＋GM-CSFワクチンを併用して投与した群では特に顕著な転移結節数の減少が認められ、肺への癌転移抑制効果が最大となることが確認できた。
【００３０】
〔試験例２〕    肺転移系における効果試験（２）
6 〜10週令の雌性C57BL/6 マウス(Charles River Japanより購入) に3 ×105 個のマウスメラノーマB16F10細胞を尾静脈に接種し、肺転移を誘発させた。２日後にTIL 単独、あるいは実施例３にて調製したTIL/IFN-γを4.5 ×106 個静脈より投与した(E/T ratio=15)。同時に実施例４にて調製したB16F10/GM-CSF ワクチンを5 ×105 個皮下投与した。肺転移誘発より１６日後に解剖して肺に生じた転移結節数を数えた。比較としてTIL 単独、TIL/IFN-γ投与のみでワクチン投与を行わないもの、あるいはB16F10/GM-CSF ワクチン投与のみについても試験した。結果を表３ならびに図４に示す。
【００３１】
【表３】
0003822261.tif 000004
【００３２】
TIL/IFN-γと  B16F10/GM-CSF ワクチンを併用して投与した群では特に顕著な転移結節数の減少が認められ、肺への癌転移抑制効果が最大となることが確認できた。
【００３３】
〔試験例３〕    肺転移系における効果試験（３）
6 〜10週令の雌性BALB/Cマウス(Charles River Japanより購入) に2 ×104 個のマウスメラノーマ大腸癌Colon 26細胞を尾静脈に接種し、肺転移を誘発させた。２日後にTIL 単独、あるいは実施例５にて調製したTIL/IL-2またはTIL/IFN-γを1 ×106 個静脈より投与した(E/T ratio=50)。同時に実施例６にて調製したColon26/IL-2ワクチンを5 ×105 個皮下投与した。肺転移誘発より１８日後に解剖して肺に生じた転移結節数を数えた。比較としてTIL 単独、TIL/IFN-γ投与のみでワクチン投与を行わないもの、あるいはColon26/IL-2ワクチン投与のみについても試験した。結果を表４ならびに図５に示す。
【００３４】
【表４】
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【００３５】
TIL/IFN-γとColon26/IL-2ワクチン、あるいはTIL/IL-2と Colon26/IL-2 ワクチンを併用して投与した群では特に顕著な転移結節数の減少が認められ、肺への癌転移抑制効果が最大となることが確認できた。
【図面の簡単な説明】
【図１】  IL-2遺伝子導入に用いる発現用カセットの構築を示す。
【図２】  IL-2、またはGM-CSF遺伝子導入に用いる組み換えレトロウイルスベクターの構築を示す。
【図３】  サイトカイン遺伝子(IL-2)を導入したマウスメラノーマ(B16F10)由来エフェクター細胞(TIL) とサイトカイン遺伝子(IL-2 ＋GM-CSF) を導入したマウスメラノーマ(B16F10)ワクチンによる癌転移抑制効果の結果を示す。
【図４】  サイトカイン遺伝子(IFN-γ) を導入したマウスメラノーマ(B16F10)由来エフェクター細胞(TIL) とサイトカイン遺伝子(GM-CSF)を導入したマウスメラノーマ(B16F10)ワクチンによる癌転移抑制効果の結果を示す。
【図５】  サイトカイン遺伝子(IL-2 またはIFN-γ) を導入したマウス大腸癌(Colon26) 由来エフェクター細胞(TIL) とサイトカイン遺伝子(IL-2)を導入したマウス大腸癌(Colon26) ワクチンによる癌転移抑制効果の結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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