(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒアルロン酸と亜鉛との複合体（会合物）を含んで成る、関節性疾患治療剤。
【請求項２】
前記ヒアルロン酸と亜鉛との複合体（会合物）が100 kD〜2,000 kDの分子量を有する、請求項１に記載の関節性疾患治療剤。
【請求項３】
前記ヒアルロン酸と亜鉛との複合体（会合物）が1,000 kDの分子量を有する、請求項２に記載の関節性疾患治療剤。
【請求項４】
ヒアルロン酸と亜鉛との重量比が5:1〜20:1である請求項１〜３のいずれか１項に記載の関節性疾患治療剤。
【請求項５】
ヒアルロン酸と亜鉛との重量比が10:1である、請求項４に記載の関節性疾患治療剤。
【請求項６】
前記関節性疾患が、慢性関節リウマチ、変形性関節症、関節水症又は急速性破壊型股関節症である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の関節性疾患治療剤。
【請求項７】
前記関節性疾患が慢性関節リウマチである、請求項６に記載の関節性疾患治療剤。
【請求項８】
ヒアルロン酸と亜鉛との複合体（会合物）を含んで成る、組織破壊酵素MMP-9抑制剤。
【請求項９】
前記ヒアルロン酸と亜鉛との複合体（会合物）が100 kD〜2,000 kDの分子量を有する、請求項８に記載の組織破壊酵素MMP-9抑制剤。
【請求項１０】
前記ヒアルロン酸と亜鉛との複合体（会合物）が1,000 kDの分子量を有する、請求項９に記載の組織破壊酵素MMP-9抑制剤。
【請求項１１】
ヒアルロン酸と亜鉛との重量比が5:1〜20:1である請求項８〜10のいずれか１項に記載の組織破壊酵素MMP-9抑制剤。
【請求項１２】
ヒアルロン酸と亜鉛との重量比が10:1である、請求項11に記載の組織破壊酵素MMP-9抑制剤。
【請求項１３】
前記組織破壊酵素MMP-9抑制剤が、インスリン依存性増殖糖尿病網膜症治療剤、又は悪性腫瘍浸潤もしくは転移に対する抑制剤である請求項８〜12のいずれか１項に記載の組織破壊酵素MMP-9抑制剤。
【請求項１４】
関節性疾患治療剤の製造のための、ヒアルロン酸と亜鉛との複合体（会合物）の使用。
【請求項１５】
前記ヒアルロン酸と亜鉛との複合体（会合物）が100 kD〜2,000 kDの分子量を有する、請求項14に記載の使用。
【請求項１６】
前記ヒアルロン酸と亜鉛との複合体（会合物）が1,000 kDの分子量を有する、請求項15に記載の使用。
【請求項１７】
ヒアルロン酸と亜鉛との重量比が5:1〜20:1である、請求項14〜16のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１８】
ヒアルロン酸と亜鉛との重量比が10:1である、請求項17に記載の使用。
【請求項１９】
前記関節性疾患が慢性関節リウマチ、変形性関節症、関節水症又は急速性破壊型股関節症である、請求項14〜18のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２０】
前記関節性疾患が慢性関節リウマチである、請求項19に記載の使用。
【請求項２１】
組織破壊酵素MMP-9抑制剤の製造のための、ヒアルロン酸と亜鉛との複合体（会合物）の使用。
【請求項２２】
前記ヒアルロン酸と亜鉛との複合体（会合物）が100 kD〜2,000 kDの分子量を有する、請求項21に記載の使用。
【請求項２３】
前記ヒアルロン酸と亜鉛との複合体（会合物）が1,000 kDの分子量を有する、請求項22に記載の使用。
【請求項２４】
ヒアルロン酸と亜鉛との重量比が5:1〜20:1である、請求項21〜23のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２５】
ヒアルロン酸と亜鉛との重量比が10:1である、請求項24に記載の使用。
【請求項２６】
前記組織破壊酵素MMP-9抑制剤が、インスリン依存性増殖糖尿病網膜症治療剤、又は悪性腫瘍浸潤もしくは転移に対する抑制剤である請求項21〜25のいずれか１項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、慢性関節リウマチ等の関節性疾患治療剤に関する。
背景技術
慢性関節リウマチ、変形性関節症、外傷性関節炎等を含む関節性疾患は、関節滑膜の炎症を介して軟骨や骨の破壊を惹起する炎症性疾患である。炎症滑膜には、血管新生、リンパ球湿潤、並びに滑膜細胞の増殖及び活性化が認められる。活性化した滑膜細胞はサイトカイン、プロスタグランジン、組織破壊酵素などのケミカルメディエーターを産生し、軟骨や骨の破壊を惹起すると考えられている（Harris, B. D., New England Journal of Medicine），Vol.322, p.1277-1289,（1990）；Cash, J. M., et. al., New England Journal of Medicine），Vol.330, p.1368−1375（1994））。
関節性疾患の治療のために、一般にナトリウム塩の型のヒアルロン酸が有効であることが知られている（文献：山本真他“高分子ヒアルロン酸ナトリウム（ＮＲＤ１０１）の変形性膝関節症に対する臨床評価”、薬理と治療、Vol.21, No.3, p.894−970, 199）。また、亜鉛が関節炎の治療のために有効であることが知られている（A. Frigo et al.,“Copper and Zinc in Inflammation”, Inflammation and drug therapy series, Vol.IV, Kluwer Academic Publishers, P.132−142（1989））。
しかしながら、ヒアルロン酸（一般に、ナトリウム塩の形で）は、その生物適合性（biocompatibility）及び流動特性が好都合であるために若干の関節性疾患の治療のために知られているが、滑膜細胞の増殖や活性化に対する抑制効果は実質的に有しない。また、亜鉛の使用においても満足すべき治療効果は得られていない。
発明の開示
従って、本発明は、慢性関節リウマチなどの関節性疾患の発症機作を構成する滑膜細胞の増殖及び活性化、特に組織破壊酵素の抑制を介して関節性疾患を効果的に治療することができる医薬組成物並びにその製造及び使用を提供しようとするものである。
本発明者らは、上記の課題を解決すべく種々検討した結果、ヒアルロン酸（ナトリウム塩）は滑膜細胞の増殖及び活性化に対する抑制効果をほとんど有さず、また亜鉛の滑膜細胞の増殖及び活性化に対する抑制、特に組織破壊酵素に対する抑制効果は非常に低いのに対して、ヒアルロン酸と亜鉛との複合体（会合物）は、両構成成分の相乗作用すなわち増強相乗作用又は相互作用により、非常に強力な滑膜細胞増殖抑制作用及び組織破壊酵素抑制作用を有するという驚くべき事実を見出し、本発明を完成させた。
従って本発明は、ヒアルロン酸と亜鉛との複合体（会合物）を含んで成る関節性疾患治療剤を提供する。
本発明はまた、ヒアルロン酸と亜鉛との複合体（会合物）を含んで成る組織破壊酵素ＭＭＰ−９抑制剤を提供する。
本発明はまた、関節性疾患治療剤の製造のための、ヒアルロン酸と亜鉛との複合体（会合物）の使用に関する。
本発明はさらに、組織破壊酵素ＭＭＰ−９抑制剤の製造のための、ヒアルロン酸と亜鉛との複合体（会合物）の使用に関する。
本発明はさらに、関節性疾患を有する患者に、ヒアルロン酸と亜鉛との複合体（会合物）を投与することを特徴とする関節性疾患の治療方法を開示する。
本発明はさらに、組織破壊酵素ＭＭＰ−９の産生が亢進している患者に、ヒアルロン酸と亜鉛との複合体（会合物）を投与することを特徴とする、組織破壊酵素ＭＭＰ−９の生産亢進を抑制する方法を開示する。
【図面の簡単な説明】
図１は、慢性関節リウマチ患者からの滑膜細胞（ＲＡＳＣ）に対する、ＨＡ／Ｚｎ、Ｎａ−ＨＡ及びＺｎの増殖阻害効果を示すグラフである。
図２は、変形性関節症患者からの滑膜細胞（ＯＡＳＣ）に対する、ＨＡ／Ｚｎ、Ｎａ−ＨＡ及びＺｎの増殖阻害効果を示すグラフである。
図３は、外傷患者からの滑膜細胞（ＴＡＳＣ）に対するＨＡ／Ｚｎ、Ｎａ−ＨＡ及びＺｎの増殖阻害効果を示すグラフである。
発明の実施の形態
本発明の活性成分は、ヒアルロン酸と亜鉛との複合体（会合物）である。ヒアルロン酸は通常ナトリウム塩として存在し、Meyerら、J. Biol. Chem. Vol.107, p.629 (1934)により記載された巨大分子である。ヒアルロン酸は、β１，３−グルクロン酸成分とβ１，４−グルコサミン成分とを交互に有する高粘性グルコサミノグリカンであり、その分子量は５０kD〜数百万Ｄである。ヒアルロン酸はすべての哺乳類の結合組織に見出され、皮膚、目のガラス体、滑液、臍帯及び軟骨組織に高レベルで存在する。ヒアルロン酸は結合組織の基礎的な成分であるため、生物適合性であり、生物吸着性であり、且つ免疫原性でない。このため、ヒアルロン酸は、関節軟骨の潤滑性及び保護のごとき多くの生物学的機能を演じている。
本発明のヒアルロン酸と亜鉛との複合体（会合物）において、ヒアルロン酸と亜鉛との比率は、これらの成分が、滑膜細胞の増殖及び組織破壊酵素ＭＭＰ−９抑制について相乗的作用を発揮する範囲であり、重量比として、ヒアルロン酸：亜鉛が５：１〜２０：１の範囲であり、好ましくは約１０：１である。本発明において使用するヒアルロン酸と亜鉛との複合体の分子量は好ましくは１００kD〜２，０００kDであり、約１０００kDの分子量が好ましい。本発明の、ヒアルロン酸と亜鉛との複合体（会合物）は、例えばヒアルロン酸ナトリウムの水溶液と亜鉛塩、例えば塩化亜鉛の水溶液とを混合することにより製造することができる（ヨーロッパ特許明細書No.EP 0413016）。
多くの炎症性関節性疾患が、なんらかの原因による滑膜細胞の増殖と活性化により惹起されると考えられている。活性化された滑膜細胞はサイトカイン、プロスタグランジン、組織破壊酵素などのケミカルメディエーターを産生し、軟骨や骨の破壊を引き起こし、関節の炎症を生じさせる。組織破壊酵素（matrix metalloproteinase（ＭＭＰ）には、Ｉ型コラーゲン及びII型コラーゲンを分解するＭＭＰ−１、これらのコラーゲンに加えてさらに軟骨型プロテオグリカンをも分解するＭＭＰ−３、Ｉ型又はII型コラーゲンのゼラチン化したものをさらに低分子型コラーゲンに分解し、IV型コラーゲン、Ｖ型コラーゲン、XI型コラーゲン及び軟骨型プロテオグリカンを分解するＭＭＰ−９（Sapata, I., et al., Biochem. Biophys. Acta. Vol 370, p.510−523, 1974；Murphy, G. et al., Biochem. J. Vol.203, p.209−221, 1982；Morel, F., et al., Biochem.Biophys. Res. Commun. Vol.191, p.269−274, 1993；Hibbs, M.S., Matrix Supple. Vol.1, p.51−57, 1992；Murphy, G. et al., Biochem. J. Vol.277, p.277−279, 1991；Hibbs, M. S., et al., J. Biol. Chem. Vol.260, p.2493−2500, 1995）等が含まれ、これらが関節破壊に関与するものと考えられる。
慢性関節リウマチ、変形性関節症、及び外傷患者からの滑膜細胞はインビトロにおいて増殖するが、これらの滑膜細胞の増殖が１００〜３００μｇ／mlの濃度の本発明のヒアルロン酸／亜鉛複合体により濃度依存的に阻害される。従って、本発明のヒアルロン酸／亜鉛複合体は、慢性関節リウマチ、変形性関節症、外傷性関節疾患、関節水症、急速性破壊型股関節症等の関節性疾患の治療のために有用である。滑膜細胞の増殖を阻害することができれば慢性関節リウマチの対症的な治療が可能であると考えられる（Jae Unexcad Pats Publication No. 7-145062）。
慢性関節リウマチ、変形関節症、及び外傷患者からの滑膜細胞のインビトロ培養において、慢性関節リウマチ由来の滑膜細胞からの組織破壊酵素ＭＭＰ−９は１００μｇ／ml以下の本発明のヒアルロン酸／亜鉛複合体（会合物）により抑制される。従って、本発明のヒアルロン酸／亜鉛複合体（会合物）は、慢性関節リウマチにおける滑膜細胞からの組織破壊酵素ＭＭＰ−９抑制剤として有用である。ここで、前記組織破壊酵素ＭＭＰ−９抑制剤は、例えば、インスリン依存性増殖糖尿病網膜症治療剤、又は悪性腫瘍浸潤もしくは転移に対する抑制剤である。
実施例において示すごとく、ヒアルロン酸ナトリウムは、滑膜細胞の増殖を実質的に阻害せず、また組織破壊酵素ＭＭＰ−９を実質的に抑制しない。また、亜鉛塩は、滑膜細胞の増殖を阻害し、且つ組織破壊酵素ＭＭＰ−９を抑制するが、本発明のヒアルロン酸／亜鉛複合体（会合物）は亜鉛塩より強力に滑膜細胞の増殖を阻害し、且つ組織破壊酵素ＭＭＰ−９を抑制する。このことは、上記の効果の場合に増強相乗作用を示すことを意味する。
本発明のヒアルロン酸／亜鉛複合体（会合物）としては、通常医薬品で行なわれている投与方法を用いることができる。すなわち経口投与及び非経口投与が可能であり、注射により投与するのが特に好ましい。本発明のヒアルロン酸／亜鉛複合体（会合物）の有効投与量は１人１回各関節当り、０．０１ｇ〜１mg、好ましくは０．０３mg〜０．５mgである。本発明のヒアルロン酸／亜鉛複合体（会合物）は、物理的最大投与量２００mg／kgでラット及びマウスに皮下投与しても、全身性の毒性症状は認められなかった。
本発明の関節性疾患治療剤及び組織破壊酵素ＭＭＰ−９抑制剤は、常用の医薬キャリヤーと共に、本発明のヒアルロン酸／亜鉛複合体（会合物）を０．００１％〜１％、好ましくは０．０１％〜０．５％含有することができる。常用の医薬キャリヤーとしては、例えば、キトサン、でんぷん、ペクチン、ＨＰＭＣ、アルギン酸ナトリウムなどの医療用に一般的に用いられる基剤、トラガント末、アラビアゴム、トウモロコシデンプン又はゼラチンのような結合剤、結晶セルロース、マンニトールのような賦形剤、トウモロコシデンプン、アルファ化デンプン、アルギン酸などのような崩壊剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖又はサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、ハッカ油又はチェリーのような香味剤、防腐剤等が挙げられる。
実施例
次に、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。
実施例１．滑膜細胞増殖阻害作用
慢性関節リウマチ（ＲＡ）患者からの滑膜細胞（ＲＡＳＣ）、変形性関節症患者（ＯＡ）からの滑膜細胞（ＯＡＳＣ）及び外傷患者（ＴＡ）からの潤滑細胞（ＴＡＳＣ）の増殖に対する、本発明のヒアルロン酸と亜鉛との複合体（会合物）（ＨＡ／Ｚｎ）、並びに比較対照としてのヒアルロン酸ナトリウム塩（Ｎａ−ＨＡ）及び亜鉛（Ｚｎ）の影響を試験した。
被験物質としてＨＡ／Ｚｎ（Ｌｏｔ．No. Ａ６５２４２、１％溶液、ゲデオン・リヒター社）、ヒアルロン酸ナトリウム（Ｎａ−ＨＡ；Ｌｏｔ．No. ＫＫ４００１、キューピー）及び塩化亜鉛（Ｚｎ；Ｌｏｔ．No. ＥＳＨ１４１３、和光純薬工業）を使用した。上記ＨＡ／Ｚｎ溶液（比重；ｄ2020＝１．０１３４）に含まれるヒアルロン酸と亜鉛含量の定量値を予め求め、上記１％を１００としてヒアルロン酸が９９％（ヒアルロン酸ナトリウムとして換算した値は１０５．０％）、亜鉛が１．０７mg／mLであったことから、当該ＨＡ／Ｚｎ中のヒアルロン酸と亜鉛の重量比を１０：１（Ｎａ−ＨＡ：Ｚｎ）とみなした。被験物質の濃度はＨＡ／Ｚｎについては１０μｇ／ml、３０μｇ／ml、１００μｇ／ml、１５０μｇ／ml、２００μｇ／ml、２５０μｇ／ml及び３００μｇ／mlとし、Ｎａ−ＨＡはＨＡ／Ｚｎと同濃度とし、ＺｎはＨＡ／Ｚｎの濃度の１０分の１の濃度として、試験した。
滑膜組織は、慢性関節リウマチ（ＲＡ）患者（５例；６５．６±１０．６歳）及び変形性関節症（ＯＡ）患者（６例；７３．４±８．９歳）の膝関節滑膜組織は人工関節置換術施工時に、また外傷（ＴＡ）患者（６例；２５．６±６．７歳）の膝関節滑膜組織は関節鏡施工時に採取した。採取後、直ちにＤＭＥＭ（Dulbecco's modified Eagle's medium）の入ったチューブ（５０mL容遠沈管；ＩＷＡＫＩ）に入れ、４℃で保管した。その後、クリーンベンチ内で滑膜組織を洗浄し、滑膜以外の組織を除去し、滑膜を細切し、そして酵素処理（コラゲナーゼ、トリプシン；和光純薬工業）により滑膜細胞（ＳＣ）を単離させ試験に用いた。
ＳＣの培養は全て１０％の熱非動化（５６℃、３０分）したウシ胎児血清（ＦＣＳ；大日本製薬）及び抗生物質混液（ペニシリン１００ユニット／mL、ストレプトマイシン１００μｇ／mL、ファンギゾン（Fungizone）２５ng／mL）を含むＤＭＥＭを用いて行った。
滑膜細胞（ＳＣ）をマイクロプレート（９６ウエル；ＩＷＡＫＩ）に３．５５×１０3細胞／０．１mL／ウエル（１×１０4細胞／cm2）で播種し、５％ＣＯ2−９５％airの気相中３７℃にて２日間予備培養した。その後、種々の濃度に調製された前記薬物を含む培地に交換し、更に５％ＣＯ2−９５％空気の気相中３７℃にて薬物添加後１２日目まで培養した。培養期間中の培地交換は、薬物が含まれた培地を４日毎に交換した。増殖能の測定は薬物添加後、４，８及び１２日目に、ＭＴＴ法4)（新生化学実験講座１２、分子免疫学Ｉ−免疫細胞・サイトカイン−、３５８，１９８９）により行った。結果は細胞数と正の相関を示す吸光度で表した。
統計解析はBartlett法による５％の有意水準で分散の一様性の検定を行った。分散が一様な場合は一元配置による分散分析（１wayＡＮＯＶＡ）を行い、有意差が認められた場合はDunnett法あるいはTukey法にて平均値の多重比較検定を行った。分散が一様でない場合は、Kruskal-Wallisの検定を行い順位についてnon-parametricのDunnett法あるいはTukey法にて多重比較検定を行った。
ＲＡＳＣ，ＯＡＳＣ及びＴＡＳＣについて得られた結果を、それぞれ図１、図２及び図３に示す。これらの図において、薬物無添加群に対してｐ＜０．０５で有意差がある場合を「＊」で示し、ｐ＜０．０１で有意差がある場合を「＊＊」で示す。
これらの図から明らかな通り、Ｎａ−ＨＡを添加してもいずれの滑膜細胞の増殖も有意に阻害されなかったが、ＨＡ／Ｚｎの添加においては添加量依存的に、滑膜細胞の増殖の有意な阻害が生じた。またＺｎの添加においても添加量依存的に滑膜細胞増殖の有意な阻害が生じた。しかしながら、Ｚｎに比べてＨＡ／Ｚｎの方が滑膜細胞増殖阻害が大きく、Ｎａ−ＨＡにおいて有意な増殖阻害が生じないことを考慮すれば、ＨＡ／Ｚｎは、Ｎａ−ＨＡ及びＺｎ単独使用の場合に比して相乗作用を有することが確認された。
実施例２．滑膜細胞培養上清中の組織破壊酵素ＭＭＰ−９に対する抑制効果
滑膜細胞を培養ディッシュ（φ３５mm；ＩＷＡＫＩ）に１０×１０4cells／２mL／dish（１×１０4cells／cm2）で播種し、５％ＣＯ2−９５％airの気相中３７℃にて２日間予備培養した。その後、薬物を含んだ培地に置き換え、更に同条件下で８日間培養した培養上清を採取し、測定まで−８０℃で保存した。ＨＡ／Ｚｎ及びＮａ−ＨＡの添加濃度は１００μｇ／mL（終濃度）とし、Ｚｎの濃度は１０μｇ／mL（終濃度）となるようにした。
上清中の組織破壊酵素としてマトリックスメタプロテイナーゼＭＭＰ−９をＥＩＡ法（Enzyme Immunoassay法）を用いて測定した。結果は培養上清中の濃度として算出されたものを細胞当たりで検討するため、この時点でのＭＴＴ法による培養細胞の吸光度値で割った値に換算した。また、この値をさらにコントロール（薬物非添加群）を１００％として薬物添加群の個々の値をコントロールに対する相対値で表した。
その結果、対照（薬物無添加）を１００％とした場合、ＭＭＰ−９の産生は、ＨＡ／Ｚｎ添加では０％、Ｎａ−ＨＡ添加では１００％、Ｚｎ添加では５０％であった。この結果、ＨＡ／ＺｎのＭＭＰ−９抑制作用は、その構成成分であるＮａ−ＨＡ及びＺｎ単独に対して相乗的であることが確認された。
以上の通り、本発明のヒアルロン酸と亜鉛との複合体（会合物）は、その構成成分であるヒアルロン酸及びＺｎに比較して、相乗的に、滑膜細胞の増殖に対する阻害作用及び滑膜細胞により生産される組織破壊酵素ＭＭＰ−９抑制作用を有し、慢性関節リウマチ等の関節性疾患の治療剤として有用である。
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調整法
注射用水８０mlにマンニトール又はブドウ糖を５ｇ加えて溶かした後、さらに、ヒアルロン酸亜鉛を少量ずつ加えて攪拌溶解した。溶液をろ過して、アンプルに充填した。このアンプルをシャワー減菌器（約１０５℃）により３０分間減菌して注射剤とした。
同様に実施例４の処方についても、本法に準じた操作で調整した。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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