(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
クロロキサンチンを有効成分とするアポトーシス誘導剤。
【請求項２】
クロロキサンチンを有効成分とする癌治療剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は細胞死の１つのタイプであるアポトーシスを誘導する医薬、及び癌治療剤に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
細胞が死に至る場合、２つのタイプの細胞死が考えられている。ひとつは、ネクローシスと呼ばれ、物理的外傷等によって引き起こされ、形態的にはミトコンドリアの膨化や細胞質の膨化とそれに続く、細胞の崩壊としてみられる。このタイプの細胞死は、細胞の生存条件が脅かされた環境において一般的に認められる。
【０００３】
これに対して、プログラムされた細胞死とも言うべき（Kerr.J.F.R.and Wyllie.A.H.,Br.J.Cancer,265.239(1972)）アポトーシスと呼ばれる細胞死は、胚発生過程や正常の細胞回転や成長因子欠乏時に見られる神経細胞死など、生理的に意義づけられる細胞死である。形態的にはエンドヌクレアーゼによるＤＮＡの断片化、周囲細胞からの遊離、細胞表面の平滑化等がみられ、炎症や繊維化は伴わない（Kerr,J.F.,et al.,Lancet,2. 827-828(1979)）。例えば、マイトジェンの作用によって肝細胞が増殖し過形成状態を引き起こした場合、これを正常化に導く肝細胞の脱落はアポトーシスの典型的特徴を示す。
【０００４】
一方、慢性肝炎が肝硬変や肝癌に移行する過程では、アポトーシスは抑制される。
従って、これらの組織の前癌細胞や癌細胞にアポトーシスを誘導することができれば、癌への進行を防止できると考えられ、すでに非環式レチノイドの１つである４，５−デヒドロゲラニルゲラノイン酸は、肝癌細胞に対して強いアポトーシス誘導活性を示し、肝癌根治療法後の肝癌の再発抑制に有効であることが確かめられている（Muto,Y.et al.,N.Engl.J.Med.334,1561-1567(1996)）。また癌細胞は、多種、多様であるため、様々な種類のアポトーシス誘導剤の開発が望まれる。
【０００５】
従って、本発明の目的は、新たなアポトーシス誘導剤を見出すことにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
斯かる実状に鑑み本発明者は鋭意研究を行った結果、カロチノイド類の１種であるクロロキサンチンが癌細胞に対し顕著なアポトーシス誘導活性を示すことを見出し本発明を完成した。
【０００７】
すなわち本発明は、クロロキサンチンを有効成分とするアポトーシス誘導剤を提供するものである。また、本発明は、クロロキサンチンを有効成分とする癌治療剤を提供するものである。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明の有効成分であるクロロキサンチンは、公知の化合物であるが、アポトーシス誘導作用は知られていない。
【０００９】
クロロキサンチンの製造法は特に限定されず、化学合成、天然物からの抽出及びこれらの生産菌を培養し得られた培養物からこれらを得る方法が挙げられるが、紅色非硫黄細菌を培養し、その培養物からこれらを得る方法が好ましい。
【００１０】
クロロキサンチンを生産する紅色非硫黄細菌としては、Rhodobacter sphaeroides、Rhodobacter capsulata、Rhodopseudomonas gelatinosaが挙げられるが、このうちRhodobacter sphaeroidesに属する菌株が好ましく、更に製造を効率的に行うためにメチルクロロキサンチン以外のカロチノイド生合成系が欠損しているか、弱い変異株が好ましい。このような変異株は、例えば、親株が増殖しうる液体培地を試験管中に調製し、滅菌した後にこの培地中に親株を接種し、培養後に得られた菌体を緩衝液で洗浄した後に物理的変異原、化学的変異原などを用いた公知の変異手法によって得ることができる。ここで物理的変異原としては紫外線、放射線などが挙げられ、化学的変異原としては、エチルメタンスルホネート、Ｎ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン等のアルキル化剤が挙げられる。得られた変異株より、クロロキサンチンを生産し、これ以外のカロチノイド類の生産量の少ない株を更に選択すれば好ましい菌株が得られる。このような変異により得られた変異株としてはRhodobactor sphaeroides ＣＲ−２８６株（ＦＥＲＭ Ｐ−１２５４２）が挙げられる。
【００１１】
紅色非硫黄細菌の培養法としては、菌体が増殖し得る方法であれば特に限定されず、また公知の方法を用いることもできる。一般的には菌体が増殖しうるための炭素源や窒素源等の栄養源を含む培地中でpHが中性付近、温度が１０〜４０℃の範囲で培養すればよい。
【００１２】
培養物からのクロロキサンチンの分離、精製も常法により行うことができる。すなわち、培養液から遠心分離や濾過等の通常の方法により集菌し、次いで有機溶媒にてクロロキサンチンを抽出精製する方法等により行うことができる。なお、この場合、抽出前に菌体を破砕しておいてもよい。また、菌体からの抽出に用いる有機溶媒としては、エタノール、メタノール、プロパノール、ブタノール等のアルコール類；ペンタン、ヘキサン、シクロヘキサン、ヘプタン、オクタン、ジクロロメタン等のアルカン類；あるいはジエチルエーテル、ジメチルエーテル等のエーテル類及びベンゼン、クロロホルム、トルエン、キシレン等の芳香族系溶剤類から選ばれる１種または２種以上が挙げられる。
【００１３】
具体的な抽出方法としては、例えば遠心により集めた菌体を重量比１０倍以上の有機溶媒混合し、５時間以上共存させ、その後、遠心等により菌体と溶媒を分離する方法が好ましい。また抽出ははじめにエタノール、メタノール、プロパノール、ブタノールから選ばれる１種以上のアルコール類でカロチノイド類を含む色素類を抽出し、その後上記記載のアルカン類、あるいはエーテル類あるいは芳香族系溶剤類に転溶する方法が好ましい。このようにして得られたアルカン類、あるいはエーテル類あるいは芳香族系溶剤類の溶液は、目的とするカロチノイド類を含有するがそれ以外の成分も含んでいる。このため溶液を適当量に濃縮し、シリカゲルカラムを用いて通常の方法で分画分離することが好ましい。この場合、カロチノイド類の特徴を示す吸光度４００nmから５００nmの吸光度によりモニターすることでカロチノイド画分を単離することができる。これらの菌体からの分離精製は、通常の条件下において実施できるが、収量を高めるには窒素雰囲気、弱光条件下、５０℃以下で操作することがより好ましい。
【００１４】
このようにして得られたクロロキサンチン画分をアポトーシス誘導剤として用いる場合、上記カラムクロマトで用いた溶媒を再結晶、窒素気流、真空乾燥等を用いて完全に除去、精製することが更に好ましい。クロロキサンチンは、自然界に存在する物質であるため比較的安全であることから癌治療剤等の医薬の有効成分として有用である。従って、クロロキサンチンは、常法に従って薬学的に許容される担体とともに種々の剤型の医薬組成物、すなわちアポトーシス誘導剤または癌治療剤とすることができる。また投与形態は特に限定されず、治療目的に応じて適宜選択でき、例えば経口剤、注射剤、坐剤、軟膏剤、貼付剤等のいずれでも良く、これらの投与形態は、各々当業者に公知慣用の製造方法により製造できる。経口用固形製剤を調製する場合は、クロロキサンチンに賦形剤、必要に応じて結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味剤、矯臭剤等を加えた後、常法により錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等を製造することができる。そのような添加剤としては、当該分野で一般的に使用されるものでよく、例えば、賦形剤としては、乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、微結晶セルロース、珪酸等を、結合剤としては、水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン液、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロース、エチルセルロース、シェラック、リン酸カルシウム、ポリビニルピロリドン等を、崩壊剤としては乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、乳糖等を、滑沢剤としては精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ砂、ポリエチレングリコール等を、矯味剤としては白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸等を例示できる。
【００１５】
経口用液体製剤を調製する場合は、クロロキサンチンに矯味剤、緩衝剤、安定化剤、矯臭剤等を加えて常法により内服溶液、シロップ剤、エリキシル剤等を製造することができる。この場合矯味剤としては上記に挙げられたもので良く、緩衝剤としてはクエン酸ナトリウム等が、安定化剤としてはトラガント、アラビアゴム、ゼラチン等が挙げられる。
【００１６】
注射剤を調製する場合は、クロロキサンチンにpH調節剤、緩衝剤、安定化剤、等張化剤、局所麻酔剤等を添加し、常法により皮下、筋肉内及び静脈内用注射剤を製造することができる。この場合のpH調節剤及び緩衝剤としてはクエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム等が挙げられる。安定化剤としてはピロ亜硫酸ナトリウム、ＥＤＴＡ、チオグリコール酸、チオ乳酸等が挙げられる。局所麻酔剤としては塩酸プロカイン、塩酸リドカイン等が挙げられる。等張化剤としては、塩化ナトリウム、ブドウ糖等が例示できる。坐剤を調製する場合は、クロロキサンチンに当業界において公知の製剤用担体、例えば、ポリエチレングリコール、ラノリン、カカオ脂、脂肪酸トリグリセライド等を、更に必要に応じてツイーン（登録商標）のような界面活性剤等を加えた後、常法により製造することができる。軟膏剤を調製する場合は、クロロキサンチンに通常使用される基剤、安定剤、湿潤剤、保存剤等が必要に応じて配合され、常法により混合、製剤化される。基剤としては、流動パラフィン、白色ワセリン、サラシミツロウ、オクチルドデシルアルコール、パラフィン等が挙げられる。保存剤としては、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル等が挙げられる。貼付剤を製造する場合は、通常の支持体に前記軟膏、クリーム、ゲル、ペースト等を常法により塗布すれば良い。支持体としては、綿、スフ、化学繊維からなる織布、不織布や軟質塩化ビニル、ポリエチレン、ポリウレタン等のフィルムあるいは発泡体シートが適当である。上記の各投与単位形態中に配合されるべきクロロキサンチンの量は、これを適用すべき患者の症状によりあるいはその剤型等により一定ではないが、一般に投与単位形態あたり経口剤では約１〜５００mg、注射剤では約０．１〜５００mg、坐剤では約０．１〜５００mgとするのが望ましい。また、上記投与形態を有する薬剤の１日あたりの投与量は、患者の症状、体重、年齢、性別等によって異なり一概には決定できないが、通常成人１日あたり約１〜１０００mg／kg、好ましくは約１０〜１０００ml／kgとすれば良く、これを１日１回または２〜４回程度に分けて投与するのが好ましい。
【００１７】
【実施例】
次に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれに何ら限定されるものではない。
【００１８】
実施例１
紅色非硫黄細菌Rhodobacter sphaeroides ＣＲ−２８６株を、２１mm径の試験管内で調製した表１に示す組成からなる培地１０mlに植菌し、暗所、３２℃で振とう培養した。培養４８時間後、振とうフラスコ内に調製した同培地２００mlに植菌した。培養４８時間後、菌体を集め、１０mlのエタノールに懸濁させ静置した。２０分後、遠心分離により菌体を除き、得られた上清に１０％の水を加えた。このようにして得られた含水エタノールに等量のヘキサンを加え分液した。得られたヘキサン層を１／１０に濃縮した。次に、シリカゲルをヘキサンにて湿潤してカラムを調製し、上記ヘキサン溶液をクロロホルム：ベンゼン＝３：１に調製した溶媒にて展開し、４４０nmの吸光度でモニターして２つの画分Ａ、Ｂを得た。吸光スペクトル（ＵＶ・ＶＩＳ）分析、質量分析、ＮＭＲ分析の結果、画分Ａは、メチルクロロキサンチン（一般式（１）中Ｒ＝ＣＨ3）、画分Ｂは、クロロキサンチン（一般式（１）中Ｒ＝Ｈ）であることがわかった。
【００１９】
【化１】
0003745477.tif 000002
【００２０】
〔式中、Ｒは水素原子またはメチル基を示す〕
【００２１】
比較例１
メチルクロロキサンチン画分を窒素気流下にて風乾し、２．５mM、１mM、０．５mMとなるようにテトラヒドロフランに溶解した溶液をそれぞれ調製した。次に、ヒト肝癌細胞由来樹立株ＨｕＨ７（ＨＳＲＲＢ，登録番号ＪＣＲＢ ０４０３（ＨｕＨ７））を１０mlの培地ＲＰＭＩ １６４で２日間、３７℃で培養した。３日目に上記テトラヒドロフラン溶液及びメチルクロロキサンチンを含まないテトラヒドロフランを０．１ml添加した１０mlの培地ＲＰＭＩ １６４に交換した。各添加濃度に対して５回の反復試験を行った。３７℃で２４時間培養し、培養後の細胞を顕微鏡にて観察した後、トリパン青排除法により生細胞数を計測した。メチルクロロキサンチン濃度と生細胞数の関係を図１に示した。メチルクロロキチンを用いたものは表層が平滑化した細胞が多数観察された。更に、ヘキスト３３２５を用いる蛍光染色によりクロマチンの濃縮分断化した細胞も観察された。
【００２２】
実施例２
用いる画分をクロロキサンチン画分とし、予め調製するテトラヒドロフラン溶液２０mM、１０mM、５mMとする以外は、比較例１と同様に行った。培養後の細胞を顕微鏡にて観察し、生細胞数を計測した。クロロキサンチン濃度と生細胞数の関係を図１に示した。クロロキサンチンを用いたものも表層が平滑化した細胞が多数観察された。更に、ヘキスト３３２５を用いる蛍光染色によりクロマチンの濃度分断化した細胞も観察された。
【００２３】
比較例２
市販のβ−カロチンを用いる以外実施例２と同様に行った。β−カロチン濃度と生細胞数の関係を図１に示した。
【００２４】
【表１】
0003745477.tif 000003
【００２５】
図１から明らかなように、クロロキサンチンは、ヒト肝癌細胞に対してβ−カロチンには見られない顕著な細胞の死滅効果を示していることがわかる。
【００２６】
実施例３
実施例２で細胞の死滅が観察された培養液から細胞を集め、フェノール／クロロフォルム、プロテナーゼＫを用いてゲノムＤＮＡを抽出した。得られたＤＮＡを１％アガロースを用いて電気泳動に供し、エチジウムブロマイドで染色して、ゲノムＤＮＡの断片化を観察した。結果を図２に示す。この図２に示すようにクロロキサンチンの濃度に応じてヌクレオソーム単位のＤＮＡの切断が確認された。
【００２７】
図２から明らかなようなＤＮＡの断片化の観察事実、及び実施例２のクロマチンの濃縮分断化の観察事実からこれらの細胞死がアポトーシスであることがわかる。
【００２８】
【発明の効果】
本発明のアポトーシス誘導剤は、前癌細胞や癌細胞にアポトーシスを誘導することができるので癌治療剤の有効成分として有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】カロチノイド類の濃度と生存細胞数を示す図である。
【図２】ＤＮＡの断片化を示す電気泳動写真である。
【図１】
0003745477.tif 000004
【図２】
0003745477.tif 000005