(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記のアミノ酸配列：ｐＧｌｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｎを有するノナペプチド又はその薬学的に許容し得る塩を有効成分として含有することを特徴とする、肺炎、肺臓炎、間質性肺炎、肺線維症、気管支肺胞の障害の予防・治療剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【技術分野】
本発明は、人間用又は動物用の新規な医薬に関するものであり、さらに詳しく言えば、外来異物・薬物による肺臓組織・細胞の損傷・破壊あるいは肺炎、肺線維症、肺気腫等の各種疾患により生ずる障害・肺機能の低下に対し、それらを予防・治療する薬剤に関するものであり、さらに、肺臓移植手術の際の移植肺の摘出および保存中に生じる組織・細胞の損傷、肺機能の低下に対し、それを予防・治療する薬剤に関するものであり、また、移植後の肺臓の生着を向上させる薬剤、あるいは、骨髄等の移植後に惹起される間質性肺炎を予防・治療する薬剤に関するものである。
【０００２】
【背景技術】
肺臓は高度に分化したガス交換器官で、呼吸器系の中枢器官である。肺臓の組織・細胞の損傷・破壊、炎症等による肺の障害、肺機能の低下、呼吸不全は生体にとり重大・危急の問題である。
【０００３】
１９５０年代までは、呼吸器系疾患の最大の致死疾患は肺結核であった。この肺結核は、抗結核薬・抗生物質の出現により、患者は漸次、減少の一途をたどり、プラトウーに達したが、なお潜在患者は１００万人レベルと警戒は必要である。
【０００４】
近時臨床の場で、サイトメガロウイルス肺炎やインフルエンザウイルスなどによるウイルス性肺・呼吸器疾患とは別に、真菌、原虫、細菌による肺疾患の症例がふえてきている。ニューモシスチス・カリニ肺炎、マイコプラズマ感染症、レジオネラ肺炎、肺真菌症である肺アスペルギルス症、肺カンジダ症またクリプトコッカス肺炎、クラミジア感染症などは、その例である。
【０００５】
また、自己免疫疾患によって惹起される、たどえば膠原病性間質性肺炎、過敏性肺臓炎、あるいは癌治療、特に肺癌治療の際、放射線照射によって惹起される肺臓炎、間質性肺炎、あるいはまた、ブレオマイシン、シクロホスファミドなどの抗癌剤、インターフェロン、小柴胡湯、アミオダロンなどの薬剤投与によって生じる肺臓炎、間質性肺炎、さらにそれら疾患に続いて生ずる肺線維症が、従来から処置困難な疾患として知られている。また骨髄等の移植後に惹起される間質性肺炎も大きな問題となっている。さらに、外来異物である金剤、粉塵などによる金剤肺臓炎等も存在する。
【０００６】
この他、肺間質の浮腫性病変である、成人型呼吸窮迫症候群（ａｄｕｌｔ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｄｉｓｔｒｅｓｓ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ，ＡＲＤＳ）、新生児呼吸窮迫症候群（ｉｎｆａｎｔ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｄｉｓｔｒｅｓｓ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ，ＩＲＤＳ）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ，肺気腫と慢性気管支炎）、サルコイドーシスなどの難治な呼吸器疾患が存在する。
【０００７】
また肺の末期的機能の障害に対しては肺移植が今日行われているが、最も多い対象肺疾患は、肺気腫と特発性肺線維症（ＩＰＦ）であり、他に原発性肺高血圧がある。
【０００８】
これら先天的・遺伝的な肺臓障害あるいは細菌・原虫・真菌ウイルスの感染、放射線照射、さらには抗癌剤や各種疾患の治療剤などの薬物、粉塵、汚染物質などの化学物質等による肺臓組織・細胞の損傷・破壊、炎症あるいは、肺臓の機能低下から肺臓等呼吸器を防護し、これら障害を予防・治療するための薬剤の開発が望まれてきている。しかしながら、これまでその目的を満足に達成するような薬剤は出現していない。薬物投与等により惹起される肺臓組織・細胞の損傷・破壊、炎症、および肺臓等呼吸器機能の低下等の副作用を防護し得る予防・治療剤の開発は、薬物療法においてヒトあるいは動物に使用し得る薬剤の投与量を増量することを可能とし、感染症、炎症、心疾患、癌、各種の肺疾患ほかの薬物療法また肺臓移植などの治療効果を更に高めることを可能にするので、極めて重要なことである。
【０００９】
【発明の開示】
本発明者らは、生体に本来存在する生体防御能を増強するような薬剤を開発することを目的として、安全性の高い天然由来の各種ペプチド類につき、肺臓組織・細胞の損傷・破壊、炎症および肺・呼吸器機能の低下等を防護するための予防・治療剤として有用な物質を鋭意探索した結果、血清胸腺因子（Ｆａｃｔｅｕｒｔｈｙｍｉｑｕｅ  ｓｅｒｉｑｕｅ：ＦＴＳ）として知られるノナペプチドおよびその誘導体又はそれらの塩類又はそれら各化合物と金属との結合物が、ニューモシスチス・カリニ（ｐｎｅｕｏｃｙｓｔｉｓ  ｃａｒｉｎｉｉ）、マイコプラズマ・ニューモニエ  （Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、アスペルギルス、カンジダ、クリプトコックス、クレブシェラ等の感染したマウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ等に惹起される肺臓組織・細胞の損傷・破壊、炎症および肺臓機能の低下を防護し、障害を予防・治療すること、肺組織毒性を軽減し、さらにはこれら動物の死亡を阻止することを見出した。
【００１０】
またこれらノナペプチドをはじめとする各化合物等がブレオマイシン、シクロホスファミドなどの抗癌剤、インターフェロン、アミオダロンのような心疾患用剤、放射線照射、粉塵吸入等によるマウス、ラット、ハムスター、スナネズミ、モルモット、ネコ、イヌ、ニワトリ、ブタ等の肺臓組織・細胞の損傷・破壊、肺炎および肺・呼吸器機能の低下を予防・治療すること、さらにはこれら動物の死亡を阻止することを見出した。あるいは上記のノナペプチド他の化合物が先天的、自己免疫的に自然に発症する呼吸器疾患を防護し、傷害を予防・治療すること、さらにはこれら動物の死亡を阻止することを見出した。
【００１１】
本発明はかかる知見に基づいてなされたものであり、細菌、原虫、真菌類の感染、粉塵、放射線照射、抗癌剤や各種薬剤の生体投与等により外来的に惹起される肺臓の障害を防護するための予防・治療剤を提供するものである。更に本発明は肺臓の虚血時また虚血後の再灌流時におこる組織・細胞の損傷・破壊および肺臓機能の低下あるいは先天的、自然発生的肺臓障害たとえば特発性肺線維症など、さらに呼吸窮迫症候群、慢性閉塞性肺疾患ほかの呼吸器疾患の悪化を防護する予防・治療剤を提供するものである。更に本発明は肺臓移植手術の際の肺臓保存中に生じる組織・細胞の傷害、肺臓の機能低下を防護する薬剤、そして移植後の肺臓の生着を向上させる薬剤を提供するものである。
【００１２】
ＦＴＳとして知られるノナペプチドが、自己免疫性の、また、ニューモシスチスカリニ、マイコプラズマ、クリプトコックス等の細菌・原虫・真菌類の感染、各種の薬剤投与、放射線照射などによる外来性の、さらに虚血、肺臓移植等により惹起される肺臓障害たとえば、肺臓炎・間質性肺炎、肺線維症、肺気腫、呼吸窮迫症候群などの肺・呼吸器疾患を防護するための予防、治療効果を有するという事実はまた肺臓移植手術の際、肺浮遊液にノナペプチドを添加することにより肺臓の傷害を低減できるという事実は、本発明者らによって初めて見出されたことであり、従来技術からは全く予期し得ないことである。
【００１３】
かくして本発明は、下記のアミノ酸配列：
ｐＧｌｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ
を有するノナペプチド又はそのＣ末端のアスパラギンのカルボキシル基におけるエステル又はアミド又はそれら各化合物の薬学的に許容し得る塩又はそれら各化合物と金属との結合物を有効成分として含有することを特徴とする呼吸器疾患の予防・治療剤を提供するものである。
【００１４】
本発明において使用される前記のノナペプチドは公知物質であって、通常ペプチド合成に慣用されている液相又は固相におけるペプチド合成法例えば、特開昭５４−１６４２５号公報、ＵＳＰ４，３０１，０６５記載の方法により、困難なく製造することができる。あるいはまた、このノナペプチドは、遺伝子工学的方法、細胞工学的方法によっても調製することができる。
【００１５】
本発明において使用される前記のノナペプチドのＣ末端のアスパラギンのカルボキシル基におけるエステルは、薬学的に許容し得るカルボン酸のエステル類であり、その例としては、メチルエステル、エチルエステル、プロピルエステル、イソプロピルエステル、ｎ−ブチルエステル、イソブチルエステル、ｔｅｒｔ−ブチルエステル、ｎ−ペンチルエステル、イソペンチルエステル、ネオペンチルエステル、ｔｅｒｔ−ペンチルエステル、ｎ−ヘキシルエステル、ｓｅｃ−ヘキシルエステル、ヘプチルエステル、オクチルエステル、ｓｅｃ−オクチルエステル、ｔｅｒｔ−オクチルエステル、ノニルエステル、デシルエステル、ウンデシルエステル、ドデシルエステル、トリデシルエステル、テトラデシルエステル、ヘキサデシルエステル、オクタデシルエステル、ノナデシルエステル、エイコシルエステル、シクロペンチルエステル、シクロヘキシルエステル、シクロヘプチルエステル、シクロオクチルエステル、アリルエステル、イソプロペニルエステル、ベンジルエステル、
【００１６】
ｏ−、ｍ−、又はｐ−クロルベンジルエステル、ｏ−、ｍ−、又はｐ−フルオルベンジルエステル、ｏ−、ｍ−、又はｐ−ブロムベンジルエステル、ｏ−、ｍ−、又はｐ−ヨードベンジルエステル、ｏ−、ｍ−、又はｐ−メチルベンジルエステル、ｏ−、ｍ−、又はｐ−エチルベンジルエステル、ｏ−、ｍ−、又はｐ−イソプロピルベンジルエステル、シンナミルエステル、アミノエチルエステル、ｏ−、ｍ−、又はｐ−アミノベンジルエステル、ｏ−、ｍ−、又はｐ−ニトロベンジルエステル、ｏ−、ｍ−、又はｐ−メトキシベンジルエステル、ｏ−、ｍ−、又はｐ−エトキシベンジルエステル、ｏ−、ｍ−、又はｐ−アミノフエネチルエステル、α−フルフリルエステル、α−チエニルメチルエステル、α−ピリジルメチルエステル、α−ビリジルエチルエステル、ピペリジノメチルエステル、α−ピペリジルメチルエステル、モルホリノエチルエステル、α−モルホリニルメチルエステルなどがあげられる。
【００１７】
また、本発明において使用される前記のノナペプチドのＣ末端のアスパラギンのカルボキシル基におけるアミドは、薬学的に許容し得るカルボン酸のアミド類であり、その例としては、アミド、メチルアミド、エチルアミド、プロピルアミド、イソプロピルアミド、ｎ−ブチルアミド、イソブチルアミド、ｔｅｒｔ−ブチルアミド、ｎ−ペンチルアミド、イソペンチルアミド、ネオペンチルアミド、ｔｅｒｔ−ペンチルアミド、ｎ−ヘキシルアミド、ｓｅｃ−ヘキシルアミド、ヘプチルアミド、オクチルアミド、ｓｅｃ−オクチルアミド、ｔｅｒｔ−オクチルアミド、ノニルアミド、デシルアミド、ウンデシルアミド、ドデシルアミド、トリデシルアミド、テトラデシルアミド、ヘキサデシルアミド、オクタデシルアミド、ノナデシルアミド、エイコシルアミド、シクロペンチルアミド、シクロヘキシルアミド、シクロヘプチルアミド、シクロオクチルアミド、アリルアミド、イソプロペニルアミド、ベンジルアミド、
【００１８】
ｏ−、ｍ−、又はｐ−クロルベンジルアミド、ｏ−、ｍ−、又はｐ−フルオルベンジルアミド、ｏ−、ｍ−、又はｐ−ブロムベンジルアミド、ｏ−、ｍ−、又はｐ−ヨードベンジルアミド、ｏ−、ｍ−、又はｐ−メチルベンジルアミド、ｏ−、ｍ−、又はｐ−エチルベンジルアミド、ｏ−、ｍ−、又はｐ−イソプロピルベンジルアミド、シンナミルアミド、アミノエチルアミド、ｏ−、ｍ−、又はｐ−アミノベンジルアミド、ｏ−、ｍ−、又はｐ−ニトロベンジルアミド、ｏ−、ｍ−、又はｐ−メトキシベンジルアミド、ｏ−、ｍ−、又はｐ−エトキシベンジルアミド、
【００１９】
ｏ−、ｍ−、又はｐ−アミノフエネチルアミド、α−フルフリルアミド、α−チエニルメチルアミド、α−ピリジルメチルアミド、α−ピリジルエチルアミド、ピペリジノメチルアミド、α−ピペリジルメチルアミド、モルホリノエチルアミド、α−モルホリニルメチルアミド、メトキシカルボニル−（α−メルカプトメチル）メチルアミド、エトキシカルボニル−（α−メルカプトメチル）メチルアミドなどがあげられる。
【００２０】
また、前述の薬学的に許容し得る塩としては、前記のノナペプチドのアミノ基における酸付加塩およびカルボキシル基における塩基塩があげられる。酸付加塩としては、有機酸又は無機酸との各塩があげられ、それらの例としては、例えば、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、トリフルオロ酢酸、酒石酸、フマル酸、りんご酸、マレイン酸、しゅう酸、ナフトエ酸などのカルボン酸との塩、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸などのスルホン酸との塩、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸などの無機酸との塩、があげられる。
【００２１】
上記の塩基塩としては、無機塩基との塩すなわち、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、アンモニウム塩、あるいは有機塩基との塩すなわち、アミンとの塩があげられ、それらの例としては、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、アンモニウム塩、トリエチルアミン塩、エタノールアミン塩、トリス塩、ジシクロヘキシルアミン塩などがあげられる。
前記の各化合物と金属との結合物における金属としては亜鉛、鉄、マグネシウム、コバルト、ニッケル、クロム、金、ゲルマニウム、ガリウム、カリウム、カルシウム、アルミニウム、銅、マンガン、セレンなどの１価、２価、３価又は４価の金属が例示される。
【００２２】
本発明に係わる肺臓組織・細胞の損傷・破壊、肺炎、肺臓等呼吸器機能の低下等の障害の予防・治療剤は、その剤型に応じて通常慣用の製剤手段を用いて調製される。すなわち、上記のノナペプチドならびにそのエステル又はアミド誘導体もしくはそれらの塩類又はそれら各化合物と金属との結合物から選ばれた有効成分物質を、適宜、薬学的に許容し得る担体、賦形剤、希釈剤などを用いて、適当な剤形に調製する。剤形は外用、経口投与、非経口投与等々の投与経路に適した種々の剤形とすることができる。
【００２３】
本発明に係わる肺臓組織・細胞の損傷・破壊、肺炎、肺臓等呼吸器機能の低下、肺組織毒性等の障害の予防・治療剤の効果は下記の如き生物試験により確認されている。すなわち、マウス、ラット、ハムスター、スナネズミ、モルモット、イヌ、ブタ、サル等、哺乳動物を用い、これら動物に対し、ニューモシスチスカリニ、マイコプラズマ・ニューモニエ、アスペルギルス、カンジダアルビカンスあるいはクリプトコッカス、クレブシェラなどの細菌、原虫、真菌類を感染せしめ、あるいはブレオマイシンを投与し、またはＸ線やγ線などの放射線を照射し、その際、上記のノナペプチドの所定量をこれら薬剤の投与に先立って、あるいは投与直後から、連日あるいは隔日に、所定の期間、腹腔内注射、皮下注、筋注、静注、経口などの各種の投与ルートで投与し、一定期間経時的に血液検査、尿検査などを行い、対照群とノナペプチド投与群との間のラクテートデヒドロゲナーゼ（乳酸脱水素酵素、ＬＤＨ）、α−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ（ＨＢＤ）、トロンボモジュリンなどの測定値、肺ヒドロキシプロリン量測定値、ＣＲＰ測定値、血沈値、ＩＣＡＭ−１測定値、肺湿重量測定値、体重測定値、肺体重比の算出また肺線維化の発生頻度、発生程度、病理学的所見・スコア、さらには生存率などを比較・観察した。
【００２４】
また肺組織中の菌体由来のＤＮＡ量、ＢＡＬＦ中の各種細胞数なども測定した。さらにまた自己免疫性の肺臓炎を惹起させたマウス、ラット、モルモットなどを実験動物として用意し、上記と同様の試験を行った。これら試験結果によると、対照群マウス、ラット、ハムスター、モルモットが、菌体や薬剤の投与量の増加に応じて、肺臓組織損傷・破壊、炎症の程度が増し、肺臓逸脱酵素の量の増大あるいは減少が一定の期間認められ、更には死亡に至るものが現れるのに対して、ノナペプチド投与群においては、肺臓逸脱酵素の量の増大あるいは減少が抑制されるか、正常化すること、さらに死亡を阻止することが認められた。一方、肺臓組織を病理学的に検討することによっても、また各動物の肺臓中の菌体由来ＤＮＡ量を測定することによっても、ノナペプチド投与群において各パラメーターは、対照群に比べて、正常コントロール動物に近いか正常化した値をとることが示された。
【００２５】
さらに肺臓を虚血にしたラット、イヌにおいて、再灌流し、その時の肺機能の回復の状況およびＬＤＨ、ＨＢＤ、ヒドロキシプロリン、トロンボモジュリンなどを測定すると、これらの量の正常化がノナペプチド投与群には見られた。また肺臓標本の組織化学的病理学的検査においても、ノナペプチド投与群に正常化が見られた。
【００２６】
本発明に係わる薬剤における有効成分物質の毒性を検討するため、マウスに対し、有効成分物質ノナペプチド１００ｍｇ／ｋｇを連日１４日間皮下投与したが外見的に何ら異常は見られなかった。また、ラットに対し、有効成分物質３０ｍｇ／ｋｇを連日２１日間、皮下投与したが、外見的にも血清生化学的にも、また病理解剖を行った結果でも、何ら異常は見られなかった。このように、本発明に係わる薬剤は、きわめて毒性の少ない安全な薬剤であり、長期間投与することが可能である。
【００２７】
本発明に係わる薬剤を投与することができる対象動物としては、例えばヒト及びウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコなどの家畜、ライオン、ゾウ、キリン、クマ、ゴリラ、サル、チンパンジーなどの動物園等で飼育されている哺乳類動物、マウス、ラット、ハムスター、スナネズミ、モルモットほか各種の実験動物、ニワトリ、七面鳥などの家禽類、ペット用の鳥類、爬虫類、両棲類、魚類などがあげられる。その投与量はこれら動物の体重１ｋｇあたり通常、０．１μｇ〜５００ｍｇ／日で、これらは、例えば、１日１回〜６回に分割投与してもよく、また投与対象者の年齢、病状などにより適宜投与量を増減することができる。
【００２８】
その投与経路は特に限定されないが、静脈内、筋肉内、皮内、皮下に注射投与することもできる。また軟膏剤を調製することにより、眼部、口腔内、鼻腔内、皮膚などに塗布することができ、坐薬やゼリー剤、点眼剤、点鼻剤、鼻口腔吸収剤、エアロゾル剤、噴霧剤、経口剤などとして投与することもできる。有効成分物質の生体内での急速な分解あるいは不活性化を阻止するために、有効成分物質を適当な製剤成分、たとえば、アルコール性、レシチンなどの油性、脂肪性の生理的に無害な固体または液体材料あるいはそれらの懸濁物リポソームなどを用いて製剤とし長時間活性が持続する製剤とすることもできる。
【００２９】
本発明に係わる薬剤は、他の薬剤、たとえば免疫賦活剤等のｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｍｏｄｉｆｉｅｒや呼吸器疾患治療剤、各種の心臓病薬、血圧調節薬、化学療法剤、ステロイド剤などとともに投与することができ、また、これらを製剤中に添加し、合剤として臨床効果を高めることができる。
【００３０】
以下に実施例および実験例を記載し、本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれら各例によって限定されるものではない。なお、例中の記載において、前記のノナペプチドを便宜上、ＦＴＳと略記する。
【００３１】
【実施例】
実施例１  注射用バイアル製剤
ＦＴＳ・ＣＨ３ＣＯＯＨ・２Ｈ２Ｏ（三井製薬工業社製）１ｍｇを蒸留水に溶解し、除菌濾過し、バイアル内に充填し、凍結乾燥した。
【００３２】
実施例２  注射用アンプル製剤
ＦＴＳ・ＣＨ３ＣＯＯＨ・２Ｈ２Ｏ（三井製薬工業社製）５ｍｇを生理食塩水に溶解し、除菌濾過し、アンプル内に充填した。
【００３３】
実施例３  皮下注射用注射剤
ＦＴＳ・ＣＨ３ＣＯＯＨ・２Ｈ２Ｏ（三井製薬工業社製）を単位投与量あたり２ｍｇを２％カルボキシメチルセルロースＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）溶液中に懸濁し、大豆ホスフアチドからなるＬｉｐｏｍａｌ（Ｈｕｈｔａｍａｋｉ  Ｏｙ／Ｌｅｉｒａｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社製）あるいは静脈用水中油型乳濁液であるＩｎｔｒａｌｉｐｉｄ（Ｃｕｔｔｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）と混合した。Ｌｉｐｏｍａｌを用いる場合は、ＦＴＳ溶液ＰＢＳ溶液とＬｉｐｏｍａｌは等量ずつ混ぜ合わせた。Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄを用いる場合は、ＦＴＳ溶解ＰＢＳ溶液２．５ｍｌ、Ｔｗｅｅｎ  ８０（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）０．１ｍｌ及びＩｎｔｒａｌｉｐｉｄ４．６ｍｌを混ぜ合わせた。
【００３４】
実施例４  リポソーム製剤
リポソーム製剤には、電荷の異なる３種類があり、それらが、更に構造上から、４種類に分類される。
電荷は中性、陽性、陰性の３種であり、構造的には多重層リポソーム（ＭＬＶ、ｍｕｌｔｉｌａｍｅｌｌａｒ  ｖｅｓｉｃｌｅ）、小さな一枚膜リポソーム（ＳＵＶ、ｓｍａｌｌ  ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ  ｖｅｓｉｃｌｅ）、および大きな一枚膜リポソーム（ＬＵＶ、ｌａｒｇｅ  ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ  ｖｅｓｉｃｌｅ）、更にＬＵＶに近似の構造を有しながら数枚膜のもの（ＲＥＶ、ｒｅｖｅｒｓｅ−ｐｈａｓｅ  ｅｖａｐｏｒａｔｉｏｎ  ｖｅｓｉｃｌｅ）の４種類が知られている。
【００３５】
▲１▼  ＦＴＳ封入中性電荷リポソーム
ホスフアチジルコリン類、スフインゴミエリン等のリン脂質、およびコレステロールのクロロホルム溶液をモル比２：１、４：１、あるいは１：１となるように混合し、一旦溶媒を減圧留去したものに、脂質量に対し１／１００〜１／１０００当量のＦＴＳのＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）溶液を添加し、Ｖｏｒｔｅｘ  ｍｉｘｅｒにて十分混和すると、ＭＬＶが得られた。
【００３６】
更に、リン脂質の相転移温度（Ｔｃ）以上で超音波処理することによりＳＵＶが得られた。
得られたＳＵＶに塩化カルシウム水溶液を加え、３７℃で１時間インキュベートして融合させた後、ＥＤＴＡを添加し、３７℃で３０分間インキュベートしてＣａ＋＋を除くと、ＬＵＶが得られた。
【００３７】
ＲＥＶは以下の通りにして調製される。すなわち脂質のクロロホルム溶液から溶媒を減圧留去した後、ジエチルエーテルを適当量加えて充分に溶解したものに、ＦＴＳのＰＢＳ溶液を加え、超音波処理すると均一な単相の溶液となった。得られた溶液を室温にて減圧濃縮した後、ＰＢＳ溶液を加え、Ｖｏｒｔｅｘ  ｍｉｘｅｒにて充分に混和すると、ＲＥＶが得られた。
【００３８】
▲２▼  ＦＴＳ封入陽性電荷リポソーム
脂質の構成成分が異なるだけで、調製方法は上記中性電荷リポソームの場合と同様である。
ホスフアチジルコリン類、スフインゴミエリン等のリン脂質、コレステロール、およびステアリルアミン等の陽性電荷の高級脂肪族アミンをモル比で７：２：１又は４：１：１で混合して、脂質成分とし、同様の方法でＦＴＳを封入した。
【００３９】
▲３▼  ＦＴＳ封入陰性電荷リポソーム
ホスフアチジルコリン類、スフインゴミエリン等のリン脂質、コレステロールおよびジセチルホスフエート、スルフアチド等の陰性電荷の高級脂肪族エステル等をモル比で７：２：１又は４：１：１で混合して、脂質成分とし、同様の方法でＦＴＳを封入した。
【００４０】
実施例５  軟膏剤
ＦＴＳ・ＣＨ３ＣＯＯＨ・２Ｈ２Ｏ（三井製薬工業社製）２ｍｇを精製水に溶解した。次に白色ワセリン２５ｇ、ステアリルアルコール２０ｇ、ＨＣＯ−６０４ｇおよびモノステアリン酸グリセリン１ｇをとり、混和して予め調製したプロピレングリコール１２ｇ、パラオキシ安息香酸メチル０．１ｇ、パラオキシ安息香酸プロピル０．１ｇの水溶液（ＦＴＳ含有）を加えて充分に混和し、乳液とした後、冷却して固化するまで混和操作を続けて調製した。
【００４１】
実施例６  坐剤
ＦＴＳ・ＣＨ３ＣＯＯＨ・２Ｈ２Ｏ（三井製薬工業社製）１０ｍｇを予め加温したハードファットに分散し、全量を２ｇとした。
【００４２】
実施例７  経鼻用カプセル剤
ＦＴＳ  ０．０５ｍｇを無菌条件下で２９．９５ｍｇのミグリオル８１２中性油（ダイナマイトノーベル社製）に溶解した。この溶液を常用の単位投与用投与器に充填し、これを使用前に駆動カプセルに装着した。
【００４３】
実施例８    点鼻剤
蒸留水に以下の量のリン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、塩化ナトリウム及びＥＤＴＡ−ジナトリウム塩を室温にて溶解した。この溶液にＦＴＳを溶解し、メンブランフィルターにより濾過した。
【００４４】
ＦＴＳ・ＣＨ３ＣＯＯＨ・２Ｈ２Ｏ                      ０．１０ｍｇ
リン酸一水素ナトリウム・２Ｈ２Ｏ                      ０．３０ｍｇ
リン酸二水素ナトリウム・１２Ｈ２Ｏ                  １０．１０ｍｇ
塩化ベンザルコニウム                                  ０．１０ｍｇ
エチレンジアミン四酢酸−ジナトリウム塩（ＥＤＴＡ）    ０．５０ｍｇ
塩化ナトリウム                                        ４．５０ｍｇ
蒸留水                                            ９８７．６０ｍｇ
ｐＨ値                                              ５．０±０．３
【００４５】
実施例９  経鼻用スプレー製剤
ＦＴＳ・ＣＨ３ＣＯＯＨ・２Ｈ２Ｏ（三井製薬工業社製）２ｍｇをヒドロキシプロピルセルロース又はヒドロキシプロピルメチルセルロースに懸濁し、噴霧製剤機にてスプレー用剤とした。
以下に、本発明の薬剤に関する薬理実験、毒性実験の例を掲げる。
【００４６】
【実験例】
実験例１  ブレオマイシン投与マウスにおける効果
８〜９週令雌性Ｃ５７ＢＬ／６マウスを４群に分け、第１〜３群のマウスに経気道的に２０〜２５μｇのブレオマイシンを投与した。第１群のマウスにはＦＴＳ・ＣＨ３ＣＯＯＨ・２Ｈ２Ｏ（以下各実験例の記載中において、ＦＴＳ物質と略記する）を１０μｇ、ブレオマイシン投与の−２４時間、−６時間、＋２時間に腹腔内投与した。第２群のマウスにはＦＴＳ物質を１０μｇ、ブレオマイシン投与の１日後から１日１回、７日間腹腔内投与した。第３群には−１日より７日目まで計９回生食を投与した。第４群は無処置コントロール群とした。２８日後に肺湿重量、体重を測定し、またＷｏｏｓｎｅｒらの方法により、肺内のヒドロキシプロリン量を測定し、線維化の指標とした。
【００４７】
無処置コントロール群の肺体重比が６．９×１０−３であるのに対し、生食投与の第３群は８．４×１０−３、第１群は７．３×１０−３、第２群は７．４×１０−３であり、ＦＴＳ物質のそれぞれの投与法により７３％、６７％の肺体重比の増加が抑制された。また肺ヒドロキシプロリン量は生食投与群がコントロール群に対して１８０％までに増加したのに対して、第１群では１３０％、第２群では１３５％までに減少しており、ＦＴＳ物質は肺臓炎、肺線維症を明らかに抑制することが示された。
【００４８】
実験例２  ブレオマイシン投与マウスにおける効果
１０週令の雄性ＩＣＲマウスを４群に分け、第１〜３群にブレオマイシンを１５０ｍｇ／ｋｇ体重静注した。第１群にはＦＴＳ１０μｇ、第２群にはＦＴＳ１００μｇをそれぞれブレオマイシン投与７日前から７日間、１日１回腹腔内投与した。第３群には生食を同様に投与した。第４群は正常コントロール群とした。ブレオマイシン投与後２８日目に体重、肺湿重量を測定し、肺を１０％ホルマリンにて２４時間固定した。パラフィン切片を作製し、それらにＭａｓｓｏｎ−ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ染色を施し、浴本らの方法（Ｅｋｉｍｏｔｏ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．，１０：２５５０，１９８３）により肺線維症の観察・評価を行った。
【００４９】
即ち線維化なし（−＝０）、ｆｏａｍｙ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅの増生が多く、線維化の疑わしい個所がある（±＝１）、明らかな線維化部位が１個所（＋＝２）、明らかな線維化部位が２個所以上（＋＋＝４）、明らかな線維化部位が１肺葉の半分以上（＋＋＋＝６）という指標をもうけ、肺葉ごとにスコア化した。実験例１と同様にして、肺体重比の増加の抑制率を算出すると、ＦＴＳ１０μｇでは４０％、ＦＴＳ１００μｇでは５０％抑制された。病理学的スコアは正常コントロール群は０、ブレオマイシンンのみ投与群は１６、第１群は１１、第２群は１０であった。実験例１同様、ＦＴＳは肺臓炎、肺線維症を明確に抑制することが認められた。
【００５０】
実験例３
実験例１と同様のプロトコールで実験を行い、各群の気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）中の細胞を測定・分析を行ったところ、好中球の増加が抑制されていることが認められた。
【００５１】
実験例４
Ｌｅｗｉｓラット１０匹に肺部のみに２５ＧｙのＸ線を照射したところ、１４日目には９匹死亡した。他方、ＦＴＳ１０μｇを照射２日前より５日連続、１日１回投与したところ、１４日目においても、９匹生存していた。ＦＴＳが放射線照射誘発の肺・呼吸器疾患を抑え、ラットを生存させることが確認された。
【００５２】
実験例５
６週令雌性Ｃ．Ｂ．−１７／ＳＣＩＤマウスにＰｃ重篤感染しているマウスの肺乳剤（Ｐｃシスト１．０×１．０５）を経鼻的に接種した。ＦＴＳ１０μｇ、マウス遺伝子組換え型ＩＦＮ−γ（ｒｍＩＦＮγ）１×１０３ＵをＰｃ接種後２９日目より２８日間腹腔内に単独もしくは併用投与した。対照群は、生理食塩水を同様に投与した。全ての作業はビニールアイソレーター内にて無菌的に行った。接種後５７日目に全てのマウスを屠殺し、各マウスの左肺の乳剤を作製。１０μｌをスライドグラスに塗抹し、シャルバルジャンのトルイジンブルーＯ（ＴＢＯ）染色後シスト数をカウントし、伊藤らの計算法により左肺当たりのＰｃシスト染色数を算定した。
【００５３】
対照群の左肺当たりのＰｃシスト数１０χは、５匹中１匹がχ（ｌｏｇ１０１０χ）＞６、３匹が４＜χ≦５、１匹が３＜χ≦４であるのに対し、ＦＴＳ投与群は、４匹中１匹が５＜χ≦６、１匹が３＜χ≦４、２匹がχ≦３であった。またｒｍＩＦＮγ投与群は、４匹中１匹がχ＞６であり、他３匹は３＜χ≦４であった。ついでＰｃシスト増殖抑制率を算定すると、対照群の平均値が４．４×１０５であるのに対し、ＦＴＳ投与群は５．６×１０４、ｒｍＩＦＮγ投与群は５．０×１０５であり、それぞれ８７．３％、−１３．６％の増殖抑制率を示した。この結果は、ＦＴＳがｒｍＩＦＮγより、ニューモシスチス・カリニの感染による感染症を軽減し、肺炎の激症化を抑制する効果があることを示すものである。
【００５４】
実験例６
８週令雌性ＩＣＲマウスを３群に分け、各群に、３７℃、７２時間培養したＭｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｕｌｍｏｎｉｓ（Ｍ．ｐｕｌ）の培養液（１．０×１０８ｃｏｌｏｎｙ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔ（ＣＦＵ）／ｍｌ）を、麻酔下０．０３ｍｌずつ経鼻接種した。第１群、第２群には、それぞれ生食に溶解したＦＴＳを感染２日前あるいは感染当日より、各マウスに１０μｇずつ連日２３日間皮下投与した。第３群はコントロールとして、生食のみを感染２日前より２３日間投与した。Ｍ．ｐｕｌ感染後２１日目に麻酔後、全採血して剖検を行った。肺の肉眼的観察を行い、健常部位と比べて、赤色に変化している部位を肉眼的肺病変部としてスコア化した。
【００５５】
病変部が全肺野の１／４未満の場合をスコア１として、１／４以上１／２未満の場合が２、１／２以上３／４未満の場合が３、３／４以上の場合を４とし、病変部が全く認められない場合をスコア０とした。また肺重量と体重とを測定し、この比を肺重量比として算出した。肉眼的肺病変は、コントロール群が１．６であったのに対し、第１群、第２群は、それぞれ、０．５および０．６であり、改善がみられた。また肺重量比も、コントロール群は１．４％であったのに対し、第１群、第２群は、それぞれ０．７％、０．８％であり、肉眼的病変に対応して改善がみられた。このようにＦＴＳが肺・呼吸器感染症による肺臓および気管支等呼吸器の各種障害を防護し、予防・治療するの有効であることが明らかにされた。
【００５６】
実験例７  毒性試験
ｄｄｙ系５週令雄性マウス１群５匹に、ＦＴＳ５０ｍｇ／ｋｇ及び１００ｍｇ／ｋｇをそれぞれ連日１４日間、皮下投与したが、何ら毒性は見られなかった。
【００５７】
実験例８  毒性試験
５週令のウイスターラット１群１０匹に、ＦＴＳ３０ｍｇ／ｋｇを連日２１日間、皮下投与したが、何ら毒性は見られなかった。
【００５８】
以上述べたように、各種の薬物療法、放射線照射、細菌・原虫・真菌感染などの外来異物に基づく、あるいは先天的・遺伝的な肺臓組織・細胞の損傷・破壊、また肺臓等呼吸器の機能低下などから肺臓を防護し、傷害を治療するための薬剤、より具体的には、各種の要因による、あるいは要因不明の種々の肺臓炎、間質性肺炎、肺線維症、肺気腫、呼吸窮迫症候群等を予防・治療する薬剤は少ない。
【００５９】
しかるに本発明に係わる薬剤は、直接的に、あるいは間接的に種々の作用を通して生体防御系を活性化して、上記のような肺臓組織・細胞の損傷・破壊、肺・呼吸器の機能低下等に対し優れた予防・治療効果をもたらす点で画期的なものである。また、本発明において使用するノナペプチドは動物由来のペプチドであり天然物質でもあるので、類似のアミノ酸配列を持つ他のＦＴＳ類縁体と異なり、生体においても全く無害であり、抗原性、アナフラキシーショックなどの問題も存在せず、安全性の点で問題は全く存在しない。