(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
炭水化物の試料を２種以上の蛍光標識化剤の組の各々と接触させて標識化剤を炭水化物に結合せしめることを含む炭水化物の分離又は識別方法であって、２種以上の蛍光標識化剤の組の各々が炭水化物と結合し得る反応性基を有しており、各蛍光標識化剤が他の蛍光標識化剤のいずれとも異なる電荷を有しており、蛍光標識化剤の電荷の差によって炭水化物を分離する、方法。
【請求項２】
蛍光標識化剤が炭化水素に結合したときに正電荷を有する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記炭水化物がヒドラジンで開裂又は放出されたものである、請求項１又は請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記分離が、標識化した炭水化物を電気泳動マトリックスに載せ、電気泳動を行って異なる標識化炭水化物間で異なる泳動度を生じせしめることによって、実施される、請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
前記電気泳動が、異なる標識化炭水化物種間で陰極方向及び／又は陽極方向に異なる泳動度を生じるように実施される、請求項４記載の方法。
【請求項６】
異なる標識化炭水化物類の分離がｐＨ勾配中の等電点電気泳動で実施される、請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
前記ｐＨ勾配が、両性担体により生成される及び／又は固定化される、請求項５記載の方法。
【請求項８】
炭水化物に結合し得る反応性基が、第一アミン、ヒドラジン、アミノキシ、第二アミン又はピラゾロンである、請求項１乃至請求項７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
前記標識化剤が、第三アミノ基、第二アミノ基、第四級アミン、グアニジニウム基、イミダゾール又はピリジニウム基の与える正電荷を有する、請求項１乃至請求項８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
前記蛍光標識化剤がシアニン染料である、請求項１乃至請求項９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
前記各蛍光標識化剤が各々異なる蛍光構造を有する、請求項１乃至請求項１０のいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
前記炭水化物の試料を混合してから、異なる標識化炭水化物を分離する、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
異なる標識化炭水化物の分離が、ｐＨ勾配中の等電点電気泳動による第一工程と、ゲル電気泳動による第二工程との二段階工程で実施され、この二段階工程で、標識化炭水化物が垂直な２つの方向に泳動される、請求項１乃至請求項１２のいずれか１項記載の方法。
【請求項１４】
前記電気泳動後にさらに標識化炭水化物の画像形成を行う、請求項３乃至請求項１３のいずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、炭水化物の分析に関する。
発明の背景
ウェン（Ｗｅｎｎ）による報告（Ｗｅｎｎ，Ｒ．Ｖ．（１９７５）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１４５，２８１−２８５）には、特に、蛍光標識化剤、例えばダンシルカダベリンでグリコペプチドを標識化し、そしてそれらをペーパーマトリックスに塗布後、そのペーパーマトリックス上での電気泳動（ペーパー電気泳動）によりそれらを分離することを含む、炭水化物の構造物解析法もしくは炭水化物の識別もしくは分離法が開示されている。この蛍光標識化剤は、その炭水化物に電荷を付与して、それらの電気泳動による分離を可能にし、そしてまた、電気泳動後のその物質の可視化をも可能にする。
ウエスト（Ｗｅｓｔ）による報告［Ｗｅｓｔ，Ｍ．Ｈ．Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ３，１３３−１３８］には、アミノ酸およびそれらのオリゴマのような比較的低分子量の電荷物質を、アクリルアミドの重合体から造られた電気泳動用ゲル、即ちポリアクリルアミドゲルに塗布し、そしてそのゲルに電圧を印加することにより、それら物質を分離することを含む、比較的低分子量の電荷物質の電気泳動による分離法が開示されている。この方法は、ＰＡＧＥとして知られている。ウエストによるこの報告には、比較的高濃度のポリアクリルアミドの電気泳動用ゲルマトリックスが、アミノ酸：ロイシンを、その二量体：ロイシルロイシンから分離することができ、さらに、その二量体は、その同族三量体：ロイシルロイシルロイシンから分離でき、以下同じように分離できることも開示されている。ウエストによるこの報告では、そのアミノ酸は、それらの構造中に放射性同位元素原子を含んでいるアミノ酸を使用することにより検出可能にされた。
ワイツマン達の報告［Ｗｅｉｔｚｍａｎ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．（１９７９），Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，９７，４３８−４３９］には、比較的低分子量の炭水化物は、ホウ酸塩イオンを含む電気泳動緩衝溶液系を使用すれば、ポリアクリルアミドゲル中での電気泳動により分離できることを示している。
ポレッツおよびピエツェニークによる報告（Ｐｏｒｅｔｚ，Ｒ．Ｄ．ａｎｄ  Ｐｉｅｃｚｅｎｉｋ，Ｇ．（１９８１）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１５，１７０−１７６）には、蛍光標識化剤によるグリコペプチドの標識化が開示されており、そして、ポリアクリルアミドゲル中での電気泳動後のそれらの分離およびその組み込まれた蛍光標識によるそれらの検出も開示されている。
プラカシュおよびブィジェイによる報告［Ｐｒａｋａｓｈ，Ｃ．ａｎｄ  Ｖｉｊａｙ，Ｉ．Ａ．（１９８３）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２８，４１−４６］には、蛍光標識化剤による炭水化物の標識化が開示されている。
トウビン達による報告［Ｔｏｗｂｉｎ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ａｎａｌ．１７３，１−９］には、発色団による炭水化物の標識化が開示されている。
ヘイズ達による報告［Ｈａｓｅ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．８５，９８９−９９４］には、蛍光標識化剤アミノピリジンにより標識化された炭水化物の二次元ペーパー電気泳動による電気泳動分離が開示されている。
ジャクソンによる報告［Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｐ．，（１９９０）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ，２７０，７０５−７１３  ａｎｄ  Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｐ．，（１９９２）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９６，２３８−２４４］および、国際公告特許、第ＷＯ８８／１０４２２号，第ＷＯ９１／０５２５６号，第ＷＯ９３／０２３５６号，および第ＷＯ９２／１１５３１号、には特に、炭水化物を電気泳動用ゲルに塗布して、異なる物質の示差マイグレーションを起こさせることを含む炭水化物構造の解析法または、炭水化物の識別もしくは分離法が開示されている。この炭水化物は、蛍光標識化剤、例えば８−アミノナフタレン−１，３，６−トリスルホン酸（略してＡＮＴＳとして知られている）で前−標識化されて、電荷を付与され、それにより電気泳動法による分離が可能になり、そしてそのゲルの泳動後に、その炭水化物の可視化が可能になる。可視化は裸眼で観てもよいが、写真もしくは電子造影法を用いてもよい。
上に引用されている特許中に実施例として説明されている方法は、負に電荷された、もしくは電荷を持たない蛍光標識化剤の使用を含んでいる。これまでに報告されている蛍光標識化された炭水化物の分離では、炭水化物の分離の程度が比較的限定されており、そのかなりの割合が、有用な程度に電気泳動で、お互いに分離されない。特に、これは、スタックおよびサリバンによる報告［Ｓｔａｃｋ，Ｒ．Ｊ．，ａｎｄ  Ｓｕｌｌｉｖａｎ，Ｍ．Ｔ．（１９９２）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２，８５−９２］中に示されているように、解析されているアスパラギン結合グルカン（多糖類）の場合に当てはまる。本明細書に説明されている本発明は、上に引用されている報告および特許中に説明されている方法に関連する新規で、革新的な発展である。
本発明の簡単な要約
本発明の主題は、蛍光標識化された炭水化物の異なる電荷／質量比もしくは他のファクターに基づくそれら炭水化物の分離であり、これまでに可能であったよりも、遥かに大きい数の異なる蛍光標識化炭水化物を電気泳動的にお互いに分離できるようにし、そしてそれにより、それらの構造決定と同定を可能にすることである。本発明は特に、しかし排除的では無しに、グリコプロテイン（糖蛋白質類）、プロテオグルカン（ムコ多糖類）およびグリコリピド（糖脂質類）から放出された炭水化物を分離することを意図するものである。説明される方法の幾つかは、電気泳動的な分離を含んでいないが、それに関連はしており、そして炭水化物の追加的分析もしくは同定法を提供するものである。
望ましくは、炭水化物を分離もしくは識別するためのこの方法は、ナフタレン環構造、またはそれに結合する、還元性の糖と反応する能力を持つ反応性基を置換基として有し、反応性基でもある少くとも一つの置換基をも有し、その蛍光標識化された炭水化物上に存在し、そしてその標識化剤の蛍光を消光させない、少くとも一つの正の電荷を担持する能力がある、他の蛍光性構造を含んでなる蛍光標識化剤で、炭水化物を標識化し；その標識化物を電気泳動用ゲルもしくは、電気泳動による分離を支持するために用いられる他のマトリックスに塗布し、そして電気泳動させて、異なる物質の示差マイグレーションを起こさせることを含んでなる。この標識化剤は、若し必要なら、付いている生体分子からの放出後にその炭水化物上の複数の部位に付けられる場合もある。或いはまた、その生体分子は、既知の方法で、その標識化剤の組込みを可能にするように修飾される場合もある。炭水化物は、表１に示したような標識化剤で、その炭水化物をその標識化剤と共に常温静置することにより標識化される。アミノ基で反応する標識化剤のような幾つかの標識化剤の場合には、還元剤［例えばナトリウム・シアノボロヒドリド（ｓｏｄｉｕｍ  ｃｙａｎｏｂｏｒｏｈｙｄｏｒｉｄｅ）を添加するのが望ましい。このナトリウム・シアノボロヒドリドは、ジメチルスルホキシドもしくは、この技術分野の習熟者に知られている他の適切な溶媒に溶かした溶液中でうまく用いられる。
図面の説明
図１は、標識化および負極に向っての電気泳動用のシステムのダイヤグラムである。
図２は、標識化および正極に向っての電気泳動用のシステムのダイヤグラムである。
図３は、ヒドラジンと、生体高分子に結合されている炭水化物との反応を示すスキームである。
図４から７は、それぞれ、分子動力学フルオロマージャーＳＩ（ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  Ｆｌｕｏｒｌｍａｇｅｒ  ＳＩ）で記録した蛍光映像である。
本発明の詳細な説明
蛍光標識化
この蛍光標識化剤は、例えば、次の中から選ばれる構造を含んでなる：ナフタレン、アントラセン、フェナントレン、ピレン、アクリジン、インドール、ベンズオキサゾール、キノリン、イサト酸無水物、１，８−ナフタルイミド、２，３−ナフタルイミド、５−フェニル−４−ピリジル−２−オキサゾール、クマリン、ビマン（ｂｉｍａｎｅ）、６−Ｎ−（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）アミン、４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−Ｓ−インダセン、エチジウムクロリド、プロピジウムジクロリド、フルオレセイン、レゾルフィン、ナイル・ブルーＡ（Ｎｉｌｅ  Ｂｌｕｅ  、ジヒドロテトラメチルローザミン、ジヒドロ−Ｘ−ローザミン、ベンズイミダゾール、ピリジンおよびシアニン染料類である。これら環構造上で置換され得る炭素原子は、この技術分野の習熟者には知られているであろう。炭水化物と反応せず、電荷を担持することができず、そして蛍光を消光しない一種またはそれ以上の置換基が、この標識化剤上に担持されている場合もある。このような一つもしくは複数の基は、以下の性質：蛍光性、電荷、その反応性基などの他の置換基の反応性、溶解度のような物理的性質、を含む標識化剤の様々な特性を修飾する効果を有する。考えられる非−反応性の置換基に含まれるのは、ハロゲン、脂肪族基、アセチル基、メトキシ基、などである。その他の適した基は、この技術分野の習熟者には明らかであろう。このような一個もしくは複数の置換基は、ナフタレンもしくは、他の環構造の任意の利用可能な炭素に直接、またはスペーサもしくは、連結グループを経由して間接的に付いていてもよい。
反応性の還元性炭水化物と反応することができる現在推奨される反応基は、第１アミノ基（−ＮＨ2）もしくはヒドラジノ基（−ＮＨ−ＮＨ2）もしくはアミノキシ基（−ＯＮＨ2）のいずれかであるが、第２アミノ基（−ＮＨＲ）もしくはピラゾロン基も代りに使用される。さらに考えられる基は、この技術分野の習熟者には明らかであろう。
この反応性基は、ナフタレンの１から８の任意の炭素に、もしくは他の適した蛍光環構造物の適した炭素原子に、またはシアニン染料の場合には窒素原子に、付いていてもよい。この反応性の基は、ナフタレンもしくは、他の環構造の炭素原子に直接付いていてもよく、或いは一つまたは一連の連結脂肪族基（例えばメチレン基）のような連結基もしくはスペーサを経由して間接的に付いていてもよい。便宜上、この連結基は、反応性−連結基と呼ばれる。さらに、この反応性基は、その連結基分子中の必ずしも一つの末端でなくて、任意の位置に所在していてよく、その炭水化物の標識化工程後に正電荷を担持する能力があればよい。標識化剤の各分子に唯一つの炭水化物分子が結合するように、唯一つの反応性の基を含んでいるのが望ましい。
第１アミノ基もしくは第２アミノ基のような、炭水化物と反応することができて炭水化物の標識化に関与する基、以外の追加の基は、その標識化工程の間は、保護された、マスキングされた、もしくは誘導体化された状態でその蛍光標識化剤の構造を部分的に構成している。幾つかの方法では、その反応性基を保護化、マスキングもしくは誘導体化する複数の手段と、可逆化もしくは除去できる保護化、マスキングもしくは誘導体化を可能にする方法を持っているのが望ましい。このような保護化基は、蛍光標識化剤の環構造もしくは反応性連結基或いは任意の非−反応性連結基に付いていてもよい。
その反応性基（反応性連結基）に付いているが、それ自身は、その所定の反応性基が反応する条件下では、炭水化物と反応しない連結基もしくはスペーサを含んでなる、一つもしくは複数の化学基は、任意の大きさもしくは構造であってよく、そしてその連結基は、正電荷を担持する能力のある基を含まないか、または一つ或いはそれ以上の基を含んでいる。それ故、この連結基は、その反応性基上に存在する可能性のある任意の電荷以外に、正電荷を担持しないか、または一つ或いはそれ以上の正電荷を担持している。その標識化剤上の、電荷を担持する能力のある任意の置換基は、出発時には、基本的に無荷電の形もしくは塩素酸塩のような塩の形で存在し、そして、適切な条件下でイオン化して正荷電形の基を生成する。
この標識化剤の一つの態様では、その標識化工程後の反応性基によって担持されるであろう電荷以外には、正電荷を担持することができる基を含んでいないのが望ましい。この標識化剤のもう一つの態様では、個々の基それぞれは、炭水化物と反応する能力のある基を含んでいない連結基と直接、もしくはスペサーを経由して間接的に、ナフタレン環もしくは他の適切な蛍光環構造中の利用できる炭素原子に付いている、一つもしくは複数の基が存在するのが望ましい。便宜上、この連結基は、炭水化物と反応する能力のある上に説明した基から区別するために、非−反応性連結基と呼ばれる。非−反応性連結基を構成する、一つもしくは複数の化学基の大きさと構造は任意でよい。それぞれ、正電荷を担持する能力のある置換基は、出発時には、基本的に、その基の無電荷の形もしくは塩素酸塩のような塩の形で存在し、そして、適切な条件下でイオン化して正荷電形の基を生成する。電荷を担持し得るこの蛍光標識化剤の分子の任意の集団では、幾らかの割合は非荷電であってもよく、そして幾らかは、単一つもしくは多重に荷電していてもよく、その割合は、その分子の構造と分子が存在する条件に依存する。それぞれ、正電荷を担持する任意の数の基は、その構造の有用な性質を維持するすることと矛盾しない蛍光性環構造に直接または間接に結合されている。非−反応性連結基は、正電荷を担持する能力のある一つ以上の基を有していてもよく、それ故、希望によっては一つ以上の正電荷を担持する能力を有する。
正電荷を担持する能力を有するが、炭水化物とは反応しない、現時点で推奨される置換基は、第３アミノ基（−ＮＲ1Ｒ2）、第２アミノ基（−ＮＨＲ1）、第４級アンモニウム基（−Ｎ+Ｒ1Ｒ2Ｒ3Ｘ-）、グアニジニウム基［−ＮＨ（ＮＨ＝）ＣＮＨ2］、イミダゾール基およびピリジニウム基である。さらに考えられる基は、この技術分野の習熟者には明らかであろう。
この蛍光標識化剤もまた、反応性連結基或いは非−反応性連結基のいずれかである連結基によってナフタレン環もしくは存在している可能性のある他の適当な蛍光環構造に直接付いている任意の他の置換基に加えて、それぞれ、負電荷（例えば、硫酸塩もしくはスルホン酸塩）を担持する能力のある一つもしくは複数の化学性基から構成されていてもよい。この蛍光標識化剤の構造はどんな構造であっても、その炭水化物の標識化の効果は、蛍光標識化された炭水化物に実質的な正電荷を付与することであるのが望ましい。付与されるこの実質的な正電荷は、その電気泳動のｐＨにおいて存在し、そして例えば、その電気泳動用緩衝溶液のｐＨが変化すると、電気泳動中に或る程度変動する可能性がある。この標識化法により、炭水化物に付与される実質的な正電荷は、標識化工程前に炭水化物上に存在しているであろう正もしくは負の電荷より数値的に大きくても、より小さくても或いは等しくても良い。この蛍光標識化工程前に炭水化物上に存在することができる任意の電荷は、その後も、そこに存在することができるであろう。その結果としての、その標識化炭水化物上の総電荷が、その電気泳動性に影響するであろう。
炭水化物用蛍光標識化剤として使用できるように化学的に修飾できる蛍光染料の望ましい例は、シアニン染料である。シアニン染料はその化学構造に関連のある一群の蛍光物質である。シアニン染料は、米国特許第５，２６８，４８６号および第５，４８６，６１６号明細書に説明されている。塩基性構造のシアニン染料は、＋１の総電荷を有しており、例えば：
0003852483.tif 000002
式中、ｎは１〜３である。ｎ＝１の染料はＣｙ３染料である。ｎ＝２の染料はＣｙ５染料である。この塩基性染料構造の多くの変形が上述の米国特許中に説明されている。
本発明の方法において有用なシアニン染料は、次の構造（１）を有している：
0003852483.tif 000003
このシアニン染料は、＋１より大きい総正電荷を有しており、少くとも一個の反応性基もしくは官能性基を有し、式中、
点線は、各環中に５或いは６個の炭素原子を有する一つの環もしくは２個或いは３個の縮合環系に必要な炭素原子を示し、そしてＲ3、Ｒ4、Ｒ5およびＲ6が環に付いている。
ＸおよびＹは、独立にＯ、ＳおよびＣＲ28から選ばれ、ここでＲ8は、Ｃ1-4アルキルであり、
ｎは１，２もしくは３であり、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6およびＲ7の少くとも一つは、反応性基もしくは官能性基を含んでなり、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6およびＲ7の少くとも一つは、１から５個の正に荷電した窒素或いはリン或いは硫黄原子を含んでおり、
残りのＲ3、Ｒ4、Ｒ5およびＲ6の任意の基は、独立に、Ｈ、ＳＯ3-、Ｃｌ、Ｂｒ、ＯＲ9およびＳＲ9から選ばれ、ここでＲ9は、Ｃ1-10アルキルまたはアリールまたはアラルキル基であり、
残りのＲ1およびＲ2の任意の基は、未置換もしくはＳＯ3-で置換されているＣ1-10アルキルまたはアリールまたはアラルキル基であり、
残りのＲ7の任意の基は、Ｈおよび未置換もしくはＳＯ3-で置換されているＣ1-10アルキルまたはアリールまたはアラルキル基である。
これらのシアニン染料の大半は、新規化合物でありＥＰ９７３０５５５０．２（１９９７年７月２３日出願）などに記載され、特許請求されており、その開示内容の全部が、本明細書中に参照引用されている。これら染料を製造する化学的方策が以下に提示される。
本発明の方法により、この群のシアニン染料の各染料は、異なる各シアニン染料を、その反応（炭水化物との反応）に利用できるアルデヒド系還元性基を有する炭水化物と反応しそして結合することができる連結基を組込むように化学的に修飾し得る。各シアニン染料分子に唯一つの反応性連結基が組込まれるのが望ましい。炭水化物反応性連結基を組込むために修飾されたシアニン染料も、さらに、反応性連結基とは別で、離れた、非−反応性連結基を組込むことにより修飾され得る。この非−反応性連結基は、そのシアニン染料分子に化学的もしくは物理的方法によって、そのシアニン染料分子中の任意の適した位置に結合され得る。非−反応性連結基は、一つまたはそれ以上の正のイオン性電荷を担持する性質を有している。一つの例では、この非−反応性連結基は、それが単一の正のイオン性電荷を担持しうるような化学構造を有している。もう一つの例では、この非−反応性連結基は、二つの正電荷を担持しうるような異なる化学構造を有していることもある。一群の構造的に異なる非−反応性連結基が存在し、その群の各メンバーが、その群の他の任意のメンバーによって担持されている電荷とは異なる特定数のイオン性正電荷を担持しているのが望ましい。その構造もしくは電荷がどのようなものであっても、任意の非−反応性連結基が、任意のシアニン染料分子に組込まれ、そして、それを修飾するであろう。任意の単一の非−反応性連結基により担持される正電荷の数は、任意の数でよい。反応性連結基を有する任意のシアニン染料も非−反応性連結基を付加することなしに、炭水化物を標識化するために用いられる。反応性連結基を有する任意のシアニン染料は、その非−反応性連結基の構造に無関係に炭水化物を標識化する能力を有するであろう。
幾つかの場合には、シアニン染料は、非−反応性連結基および反応性連結基とは異なりそして離れているところの、そのシアニン染料の性質を、本発明での有用性、例えば特定の溶媒或いは溶液中でのその溶解度を増大させることにより、高めるように変えることができる追加の化学基、例えばスルホン酸塩基を組込むことにより修飾されるであろう。このような追加の基は、そのシアニン染料上の総電荷変える可能性があるが、このような追加の基は、本発明におけるこの染料の適応性を変えることはないであろう。
この群のシアニン染料の各メンバーは、その化学構造が異なることによって、任意の他のメンバーと区別される。このシアニン染料の各々は、特定の最大蛍光波長を有し、その値は、その二つの環構造を繋ぐ炭素原子鎖の化学構造により強く影響される。その炭素連結基鎖がより長い方が、最大蛍光波長が長いことが多い。本発明の一つの例では、特定数の炭素原子で構成されている二つの環構造を繋ぐ炭素鎖を有するシアニン染料は、一つのイオン性正電荷を担持することができる非−反応性連結基を組込むこともできる。本発明のもう一つの例では、異なる比最大蛍光波長を有するシアニン染料は、二つのイオン性正荷電を担持する性質を有するであろう。一群のシアニン染料が存在し、その各々は化学構造が異なり、その各々は異なる最大蛍光波長を有し、そしてその各々は、特定数のイオン性正電荷を担持する異なる非−反応性連結基を有していることが望ましい。かくして、所定構造を有する任意のシアニン染料の最大発光波長は、そのシアニン染料構造が担持することができるイオン性正電荷と相関性を有する。かくして、その蛍光発光の最大波長を測定することにより、特定のシアニン染料構造により担持される正電荷の数を求めることができる。
電気泳動法
電気泳動による分離は、この技術分野の習熟者に知られている一般的な常用法で行われる。ポリアクリルアミドゲル電気泳動法が用いられるが、毛管ゾーン電気泳動のような、自由溶液中もしくは他の支持マトリックスまたは相互作用マトリックス中での他の電気泳動法も用いられる。
ポリアクリルアミドゲル電気泳動法の場合、その電気泳動用ゲルは、５％（ｗ／ｖ）から６０％（ｗ／ｖ）、望ましくは、１５％（ｗ／ｖ）から４０％（ｗ／ｖ）の範囲の濃度を有する比較的密なポリアクリルアミドゲルを含んでいるのが望ましい。
或いはまた、この電気泳動用ゲルもしくはマトリックスは、アクリルアミドとそのゲルの調製もしくは大量製造或いは取扱い、またはそのゲルの電気泳動操作または、そのゲル中で分離される炭水化物の分析もしくは観察において、有利な性質を付与する一種またはそれ以上の他の物質との共重合体であってもよい。電気泳動用ゲルを作るためのアクリルアミドと共重合される得る物質の例は、適切な任意の分子量を有するポリエチレングリコールである。このゲルを作るために用いられるアクリルアミドに対するポリエチレングリコールの比は、有利な性質を付与するのに適した任意の比でよい。
この電気泳動用ゲルもしくはマトリックスはポリアクリルアミドから調製され、そしてアクリルアミドと重合もしくは共重合しないがその調製中にそのゲル中に存在し、その電気泳動中にそこに残留する一種またはそれ以上の物質を含んでいてもよい。これら物質の目的は、そのゲルの調製もしくは大量製造或いは取扱い、またはそのゲルの電気泳動操作または分析される物質の分離またはそのゲル中で分離される炭水化物の分析もしくは観察において、有利な性質を付与することである。このような物質の例はジメチルスルホキシドおよび尿素である。
電気泳動用支持マトリックスとして用いられる得るポリアクリルアミド以外の物質は、例えば紙である。
このゲルもしくはマトリックスもしくは任意の組込まれた物質は、均一な濃度または勾配の付いた形である。
このポリアクリルアミドゲルは、例えばＮ，Ｎ′−メチレンビスアクリルアミドで橋架けされているのが望ましい。
良好な分離性能と感度を得るために、この電気泳動は、例えば、成書“Ｇｅｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ：ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ”（“蛋白質の電気泳動：実用的方法”）［編集：ビー．デー．ヘイムズおよびデー．リックウッド（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｄ．Ｒｉｃｋｗｏｏｄ）、出版：ＩＲＬプレス］の中に説明されているような、蛋白質およびＤＮＡフラグメントで操作するための方法を用いる、積層緩衝溶液系（ｓｔａｃｋｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ  ｓｙｓｔｅｍ）（移動境界電気泳動法、多相ゾーン電気泳動法およびその他の名前でも知られている）を用いて行われるのが望ましい。
この電気泳動法の一つの態様では、その積層緩衝溶液系は、そのゲル中で、正に荷電した物質の電気泳動を可能にするように設計されている。一つのゲルもしくは複数のゲル中もしくは電極区画中に所在する任意の緩衝溶液のｐＨは、その分離用ゲルのｐＨが、ｐＨ１〜１３の範囲になるような値である。ポリアクリルアミドゲル中で、正に荷電した物質の分離を可能にするこのような一つの系が、トーマスおよびホーデスの報告［Ｔｈｏｍａｓ，Ｊ．Ｍ．ａｎｄ  Ｈｏｄｅｓ，Ｍ．Ｅ．（１９８１）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１８，１９４−１９６］の中に説明されている。他の有用な緩衝溶液系は、クラムバッハおよびジョヴァンによる報告［Ｃｈｒａｍｂａｃｈ，Ａ．ａｎｄ  Ｊｏｖｉｎ，Ｔ．Ｍ．（１９８３）Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，４，１９０−２０４］の中に説明されており、その他の系はこの技術分野の習熟者には知られているであろう。
この電気泳動後、この標識化された炭水化物は、適切な波長の光（例えば、紫外線）を照射すると、場合によっては、裸眼で観ることが可能であるが、冷却した荷電結合素子（ＣＣＤ）による造影により、より良好な感度が得られる。ＣＣＤを利用すると、定量的結果と高い感度が容易に得られるという利点もある。さらに。ＣＣＤｓは、電気泳動が進行している途中でそのゲルを観察するために用いることができる。
−２５℃もしくは、それより高い温度で作動する、ノイズの小さいシリコン・チップを有する冷却二次元ＣＣＤを使用するのが望ましい。低水準で光を検出できる他のディジタル造影系が、この技術分野の習熟者に知られている。
組み合わせて用いられる、一群の正荷電蛍光標識化剤の利用
本発明中で前に（上に）説明されている蛍光標識化剤を、以下に説明されるようにして利用することができる：一種以上の標識化剤が、炭水化物の混合物の構成成分を、一つの標識化剤を単独で用いる場合に可能であるよりも、より良く分離するために、そして炭水化物の構造に関するより多くの知見を得るために、一つのグループとして一緒に用いられる。（便宜上、分析用蛍光性グループと呼ばれる）一群の標識化剤の例は、四つ異なった、しかし恐らく関連する標識化剤から構成されている。このような四つの標識化剤のグループのメンバーは、次のような性質を有している。その群の標識化剤のメンバーの一つは、標識化された炭水化物に一つの正電荷を付与する能力がある。もう一つのメンバーは、その炭水化物に二つの正電荷を付与する能力があり、もう一つは三つの正電荷を付与する能力があり、そしてもう一つは四つの正電荷を付与する能力がある。その標識化反応後に、各標識化炭水化物は荷電状態にある。その正電荷は、その電気泳動のｐＨで存在するが、分析される標識化された炭水化物の任意の一つの構造の分子全体の上の正味の平均電荷は、その電気泳動用緩衝溶液系のｐＨもしくは他の性質が電気泳動中に変動すると、電気泳動中に或る程度変動する可能性がある。それ故、任意の標識化された炭水化物上のこの正味の平均電荷は、総体的である場合も部分的である場合もある。総体的であれ部分的であれ、分析される任意の一つの蛍光標識化された炭水化物の分子全体上のこの正味の平均電荷は、任意の他の分子と比べて、その電気泳動工程中、大体同じである。この方法の一つのフォーマットでは、分析される蛍光標識化された炭水化物の電気泳動は、そのゲル中で、陰極（即ち、負に荷電した電極）の方に向って進行するのが望ましい。
各標識化剤は、別々に、炭水化物もしくは炭水化物の混合物を標識化するために用いられる。かくして、一例を示すと、電気泳動で分析されるべき炭水化物の単一混合物は、四つの大体当量の部分に分割され、そして各々は、その分析用蛍光基を構成するように選ばれた四つの標識化剤の一つだけで標識化される。四つの異なる標識化剤のグループの場合、分析されるべき炭水化物の各単一混合物試料の四つの異なって標識化された部分が生成する。各標識化部分は、同じ単一の電気泳動用ゲルに塗布することにより分析される。個別に塗布される各部分、即ち、その別々に標識化された部分はお互いに混合されることはなく、別々に、しかし同じゲル中で、望ましくは異なるレーンで、同時に電気泳動される。分析されるべき標識化炭水化物の電気泳動は、カチオン性（即ち負に荷電した）極に向かって進行する。この分析結果は、図１にダイヤグラムとして示され、そして次のように説明される。
分析されるべき炭水化物の混合物（１０）は、四つの部分に分割される。第１の部分は、分子当たり一つの正電荷を付与する蛍光標識化剤Ａで標識化された。第２の部分は、分子当たり二つの正電荷を付与する蛍光標識化剤Ｂで標識化された。第３の部分は、分子当たり三つの正電荷を付与する蛍光標識化剤Ｃで標識化された。第４の部分は、分子当たり四つの正電荷を付与する蛍光標識化剤Ｃで標識化された。標識化された炭水化物の各部分は、電気泳動用ゲル（１２）の上部の正端に塗布された。負極に向かっての電気泳動により、そのゲルを通って下方（図中）に動いて、バンドが形成される。
各ラインにマークが付いているが、そのゲル上のバンドとして示されている蛍光標識化された炭水化物を表す。１とマークされたバンドは、分子当たり一つ未満の負電荷を有する。２とマークされたバンドは、分子当たり二つ未満の負電荷を有する。３とマークされたバンドは、分子当たり三つ未満の負電荷を有する。４とマークされたバンドは、分子当たり四つ未満の負電荷を有する。
蛍光標識化剤で標識化される前には電荷を持つていない炭水化物の分子は、その標識化で得られる炭水化物誘導体に任意の正電荷または部分的正電荷を付与する任意に蛍光標識化剤で標識化されると、電気泳動され得るようになるであろう。
単一の、または部分的な（単位量未満の）負電荷を有する炭水化物分子、例えば分子当たり単一のシアル酸を有する炭水化物分子は、標識化で得られる炭水化物誘導体に一つ以上の正電荷を付与する任意の蛍光標識化剤で標識化すると、カチオン性（即ち負に荷電した）電極に向かって電気泳動される能力を得るであろう。
二つもしくは、それ以下の負電荷を有する炭水化物分子は、標識化で得られる炭水化物誘導体に二つ以上の正電荷を付与する任意の蛍光標識化剤で標識化すると、カチオン性（即ち負に荷電した）電極に向かって電気泳動される能力を持つであろう。
三つもしくは、それ以下の負電荷を有する炭水化物分子は、標識化で得られる炭水化物誘導体に三つ以上の正電荷を付与する任意に蛍光標識化剤で標識化すると、カチオン性（即ち負に荷電した）電極に向かって電気泳動される能力を持つであろう。
四つもしくは、それ以下の負電荷を有する炭水化物分子は、標識化で得られる炭水化物誘導体に四つ以上の正電荷を付与する任意に蛍光標識化剤で標識化すると、カチオン性（即ち負に荷電した）電極に向かって電気泳動される能力を持つであろう。
各試料中、正味の負電荷を有する任意の標識化剤炭水化物は、炭水化物上に負電荷が存在するためにそのゲル中に電気泳動されないで、従って、そのゲルの中で観測されないであろう。
幾つかの場合には、標識化前の多くの蛍光標識化剤分子上での、または標識化後蛍光標識化された炭水化物分子上での、分子当たりの正味の平均電荷は、総体的でない場合もある。この平均電荷は、蛍光標識化剤、炭水化物の性質および、それらが存在する条件（例えば、その溶液のｐＨ）に依存する。
各異なる蛍光標識化剤は、任意の他の適した蛍光標識化剤と組合わせて使用することが可能である。
陰極に向かっての電気泳動による分離で得られるパターン
上に説明した電気泳動の全体としての結果は、存在する全ての炭水化物類そして特に、異なる電荷を担持している炭水化物類の分離を促進するものである。電気泳動用ゲルの各レーンで、特定の大きさで、より多い電荷を有する炭水化物類は、より迅速にマイグレーションし、そして、電荷のより少ない炭水化物から分離されるであろう。一例として、一つの蛍光標識化剤で標識化した炭水化物の混合物をその上に塗布した電気泳動用ゲルの一つのレーンに注目することは有益である。共通の問題として、分析される混合物が多くの異なる炭水化物類から構成されており、その大きさが大体同じであるこれら炭水化物の誘導体が、標識化前には各分子上に電荷を担持していない場合には、一つの電荷を有する炭水化物から実質的に、分離され、この一つの電荷を有する炭水化物は、二つの電荷を有する炭水化物から分離され、そして以下同じように続く。同時に、同じ電荷を担持しているが、電気泳動的移動度が異なる標識化された炭水化物類もお互いに分離されるであろう。
標識化前に、負電荷を担持する能力のない、これらの炭水化物は、一つのグループに属すると考えられる。標識化前に、一つの負電荷を担持する能力のある、これらの炭水化物は、第２のグループに属すると考えられる。標識化前に、二つの負電荷を担持する能力のある、これらの炭水化物は、第３のグループに属すると考えられ、以下同様である。そのゲル上の一つのレーン中に現れるこのようなグループの数は、蛍光標識化された炭水化物により担持される正電荷の数に依存する。例えば標識化工程の結果として四個の正電荷を付与する蛍光標識化剤は、四つ以下の任意の数を有する標識化された炭水化物を、そのような成分を含む混合物を塗布されたレーンでゲル中に移動させることができるであろう。より多い正味の正電荷を有する標識化された炭水化物のグループの中のメンバーは、より少ない正味の正電荷を有する電荷グループの中のメンバーより、より迅速に電気泳動する傾向があるであろう。各電荷グループの中で、複数のメンバー間での分離も起きるであろう。各種グループの分子の間での或る程度の重なり合いが見られる。かくして、より移動度の小さい一つの電荷を有する分子の或る物は、二つの電荷を有する分子に似た移動度を有することもある。しかし各荷電グループの大半のメンバーの他のグループのメンバーからの分離は、達成される。
天然起源の炭水化物の分析では、異なる負電荷を有する炭水化物（即ち、異なる荷電グループに属する）が存在するのが普通であり、従って、各荷電グループ中の成分の数は、分析される任意の完全な混合物中の成分の総数に等しいか、または、大半の場合、より少ない。かくして、その電気泳動用ゲルの任意の一部分に現れるであろう完全な混合物の成分の数は、その炭水化物の複数の部分を、それぞれ異なる数の電荷を担持する異なる蛍光標識化剤によって別々に標識化し、そしてそのゲルの別のレーンに、その蛍光標識化された炭水化物を塗布することにより減少する。このゲル中に入って行くことができる混合物の炭水化物成分の数は、各異なる蛍光標識化剤により付与された正電荷の数が減るにつれて、唯一つの正電荷を付与する標識化剤を含むレーン中で、電荷を持たないか或いは一つ未満の負電荷を有する炭水化物だけが、そのゲル上に現れるであろうまで、ゲルレーンからゲルレーンにわたって次第に減少する。この分離の結果は、電気泳動用ゲルの各試料レーン中の蛍光標識化された炭水化物の蛍光バンドの分離パターンを非常に単純化することを示す。任意の一つのレーンでの分離パターンの複雑さは、例えば、標識化剤としてＡＮＴＳを利用して、一つのレーンで、混合物の総ての成分が一つのレーンで電気泳動される、前文（発明の背景）中で説明した方法に比べて単純化される。かくして、電気泳動される、混合物の各炭水化物成分が、任意の他の成分と類似の電気泳動移動度を有する可能性は、有意に減少する。
追加の情報を得るための、正電極に向かっての追加電気泳動
正味の負電荷を有する標識化された炭水化物が、そのゲルもしくはマトリックス中を、アニオン性（正に荷電した）電極に向かって移動するところの本発明の方法のもう一つのフォーマットで電気泳動を行うことにより、追加の情報を得るのが望ましいこともある。即ち、分析用蛍光性基を構成する蛍光標識化剤の任意の一つで標識化されている、蛍光標識化炭水化物の各試料の一部が、前に説明したのと極性が反対である電気泳動系で電気泳動される。この分離に用いられる電気泳動用緩衝溶液系は積層系である。このような系の一例は、レムリーにより説明された系である［Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｕ．Ｋ．（１９７０）Ｎａｔｕｒｅ  ２２７，６８０−６８５］。このような系では、各標識化された炭水化物分子上の正味の平均電荷が負であるように、蛍光標識化剤で標識化されている炭水化物は、アノード（正に荷電された電極）に向かって電気泳動的に移動するであろう。標識化された炭水化物に正電荷を付与しない蛍光標識化剤の場合には、任意の負の電荷を担持している炭水化物は、陽極に向かって移動するであろうが、負の電荷を持たない炭水化物は陽極に移動しないで、その誘導体が電荷を持たないなら元の位置に残るか、もしくは、陰極に向かって移動するであろうし、そしてその誘導体が正味の正電荷を担持していると、ゲルから離れるであろう。かくして、荷電していない、および一つの電荷を有する炭水化物分子の蛍光標識化された炭水化物誘導体は、それに一つの正電荷を付与する蛍光標識化剤で標識化されるとゲル中に入らないであろう。
炭水化物分子が、炭水化物に一つの正電荷を付与する蛍光標識化剤で標識化される場合、一つ以上の負電荷を有する炭水化物だけが、正電極に向かって電気泳動的に移動するであろう。類似の状況は、二つまたはそれ以上の正電荷を付与する蛍光標識化剤でも生じる。より多くの正電荷を有する構成成分は、より少ない正電荷を有する成分よりより迅速に移動する傾向がある。
得られた分離のパターンは、分析される炭水化物の混合物の任意の二つの成分の位置が一致する可能性がさらに低下することを示す。この系を示すダイヤグラムは、図２に示される。
図１におけるように、各ラインに付いているマークは、そのゲル上のバンドとして示されている蛍光標識化された炭水化物を表す。１とマークされたバンドは、分子当たり一つ以上の負電荷を有する。２とマークされたバンドは、分子当たり二つ以上の負電荷を有する。３とマークされたバンドは、分子当たり三つ以上の負電荷を有する。４とマークされたバンドは、分子当たり四つ以上の負電荷を有する。
蛍光標識化剤Ａは分子当たり一つの正電荷を付与する。螢光標識化剤Ｂは分子当たり二つの正電荷を付与する。蛍光標識化剤Ｃは分子当たり三つの正電荷を付与する。蛍光標識化剤Ｄは分子当たり四つの正電荷を付与する。
総合分析の要約
炭水化物の混合物の単一総合分析は、試料を複数の部分に分割し、各部分を異なる蛍光標識化剤で標識化し、各標識化部分を二つに分割し、一つの部分をゲル電気泳動システムで（アニオン性誘導体を分離し分析するために）正に荷電した電極に向けて電気泳動し、そしてもう一つの部分を（カチオン性誘導体を分離し分析するために）負に荷電した電極に向けて電気泳動することからなる。それ故、任意の一つの標識化炭水化物を、混合物中に存在するかも知れない全ての他の炭水化物から分割する可能性が高められる。
即ち、この方法の効果は、他の方法に比べて、複数の異なる炭水化物誘導体の共電気泳動もしくは近似共電気泳動が起きる可能性を減らすことである。この効果は、その同一性が知られていない複数の炭水化物の電気泳動移動度を、その同一性が知られている炭水化物の電気泳動移動度と比較することを可能にし、かくして、未知の炭水化物を同定することが容易になるであろう。電気泳動する物質の移動速度は、物質の大きさ（分子量）と構造により変動するから、本発明は、それら炭水化物の大きさと形状に関する知見を得るために利用できるし、結果を既知の標準試料と比較することにより、未知の炭水化物を部分的に、もしくは、完全に特性化することが可能になるであろう。本発明の一つの利用法は、試料を特定のグルコシダーゼ酵素で、小さいフラグメントに切断し、得られるフラグメントを本明細書で説明する電気泳動システムにより同定することにより、炭水化物の構造を明らかにすることである。
既知および未知の炭水化物のこの移動度の比較は、適切な試料を隣接レーンに並べて電気泳動することにより、もしくは共電気泳動により達成することができる。毛細管ゾーンの電気泳動のような非−平面電気泳動システムの場合、移動度の比較は、それらの移動度を正確に測定することにより行われる。従って、本明細書で説明される本発明は、ジャクソンによる報告［Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｐ．（１９９４）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，２１６，２４３−２５２］に説明されているように、（ＧＥＭＩとしても知られている）グルカン電気泳動移動度指数（Ｇｌｙａｎ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ  Ｍｏｂｉｌｉｔｙ  Ｉｎｄｅｘ）を参照することにより、一定の炭水化物の同定に利用できる電気泳動移動度のデータを集積する手段として用いられる。
単一ゲル・レーンまたはカラムまたはチューブまたは毛細管中での分離を含む方法のより広範囲な応用
分析される炭水化物の一つの試料を標識化するのに用いられる異なる蛍光標識化剤から発光される光の波長が、次の試料に用いられる蛍光標識化剤から発光される光の波長と異なる場合には、全ての試料を同じレーンで同時に電気泳動するのが望ましい。後者の場合、それらの吸光係数に適合する波長の光でその蛍光物質が励起されることにより、そして、それら発蛍光体の各々から発光される光の波長を区別するために適したフィルターを利用することにより、その異なる蛍光標識化剤で標識化される炭水化物類はそれぞれ他から区別される。本発明を本明細書で説明するのに用いられる分析用蛍光体グループの望ましい例は、その最大蛍光波長が、その特定構造によって担持されているイオン性特定電荷と相関性を有する化学構造を有するシアニン染料である。標準的には、この分析用蛍光体グループのメンバーは、１から５個の範囲のイオン性総正電荷を有している。それらの最大蛍光波長、従って、正味のイオン性正電荷が異なることにより、異なるシアニン染料を区別できる利点は、分離が単一のカラムもしくはチューブの中で行われ、そして分析できるので、電気泳動操作が単純化されることである。かくして、単一ゲル・レーンまたはカラムまたは管または毛細管中での分離を含む毛細管電気泳動および他の電気泳動分離法の場合、異なる蛍光標識化剤で標識化した後のその炭水化物試料の一部を混合し、そして、それらを単一ゲル・レーンまたはカラムマまたはチューブまたは毛細管中で同時に分離し、そして異なる蛍光標識化剤で標識化されているこの分離された成分を、任意の一つの蛍光標識化剤を任意の他の標識化剤から区別することが可能である励起光の波長および発光フィルターの波長、を用いることにより区別する方法を利用することが推奨される。この励起光は、常法により、または適切な波長（一つまたは複数）で操作される  一つもしくは複数のレーザにより発生させられる。この放射光は、市場から入手できる適した蛍光スペクトルメータまたは他のこの技術分野の習熟者に知られている感光性装置もしくは検出装置を用いて検出される。
等電点電気泳動による分離を含む本発明のさらなる態様
本明細書で説明される本発明の方法により、炭水化物の構造解析と同定は、特許：ジャクソン，ピー．［（Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｐ．）（１９９３）Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｙｅｓ］中に説明されている方法の新規の発展によりさらに容易になるであろう。この特許公報：ＷＯ９２／１１５３１は、その還元性末端を蛍光標識化剤：２−アミノアクリドンで標識化した酸性炭水化物を二つの二次元ポリアクリルアミドゲルにより分離する方法が開示されている。
本明細書で説明される本発明の方法により、標識化前に酸性基を含んでいる炭水化物、即ち、例えばシアール酸または硫酸塩もしくはリン酸塩、またはこの技術分野の習熟者に知られている他の酸性基の存在によって、部分的負のイオン性基、或いは一つまたはそれ以上の負のイオン性基を担持する能力のある炭水化物は、標識化される炭水化物に対し、その分子当たり、部分的或いは一つまたはそれ以上の全体としての正電荷を付与する蛍光標識化剤により標識化され得る。この蛍光標識化剤により付与される電荷は、その蛍光標識化剤の分子の適切な任意の部分に担持され得る。本発明の他の部分に説明されている蛍光標識化剤および方法と技術は、適しておれば当然、本発明のこの部分に適用できる。
炭水化物の蛍光標識化の結果として、その標識化された炭水化物を両性イオン化させる正および負のイオン電荷の両方が、その蛍光標識化された炭水化物上に生じ、全体としては電荷を持たない状態で存在することが起こり得る。全体としては電荷を持たないこの条件は、その中にその標識化された炭水化物が存在する水溶液のｐＨを調整することによりもたらされる。全体としては電荷を持たないｐＨは、標識化された炭水化物の等電点として知られている。このような標識化炭水化物は、同じ、もしくは他の蛍光標識化剤で標識化された他の炭水化物から、両性担体の使用によるか、または固定化ｐＨ勾配（ｉｍｍｏｂｉｌｉｓｅｄ  ｐＨ  ｇｒａｄｉｅｎｔ）（ＩＰＧ）、例えばファルマシア−バイオテク社（ｔｈｅ  ｃｏｍｐａｎｙ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ−Ｂｉｏｔｅｃｈ）から入手できる固定化試薬を使用することにより発生させることができる適切なｐＨ勾配、での等電点電気泳動法（ＩＥＦ）により、分離することができる。本発明のもう一つの態様では、分析されるべき標識化炭水化物の分離を改善するように、その固定化ｐＨ勾配に、両性担体が組込まれる。
固定化試薬を使用することの効果は、これらの誘導体化された炭水化物の分離における再現性と分離性をより大きくできることであり、そして特に、両性担体だけを使用する常用のＩＥＦで普通可能であるよりも、より塩基性のｐＨにまでｐＨ勾配の範囲をより広くできることである。
ＩＥＦに利用されるマトリックスは、標準的にはポリアクリルアミドゲルであるが、この技術分野の習熟者に知られているアガロースゲルのような他の透過性の材料であってもよい。ＩＰＧの場合、固定化両性化合物を付けるマトリックスは普通ポリアクリルアミドゲルであるが、アガロースゲルのような他の適した透過性の材料も用いられる。取扱いおよび／または安定性を良くする目的で、その中で分離が行われるゲルもしくはマトリックスは、ガラスもしくはプラスチックスまたはこの技術分野の習熟者に知られている他の材料のような支持用バッキング材に取付けられることもある。このＩＥＦは、チューブまたは毛細管を含んでいる他の適当な容器中またはポリアクリルアミドゲルのような適切なマトリックス或いはゲルを充填したチューブもしくは毛細管中で行われてもよい。この蛍光標識化炭水化物の分離は、本来、この技術分野の習熟者に良く知られている方法により、ポリアクリルアミドゲル中での電気泳動が可能であるように設計されている装置中でも行われる。場合により蛍光染料で標識化されている核酸の分離も行われる。このような装置は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）のシーケンス構造の決定に応用されるが、蛍光標識化炭水化物の電気泳動用に適当に改良される。
酸性炭水化物を、ＩＥＦによる分離ができるように標識化するために、任意の適切な蛍光標識化剤が用いられる。炭水化物の標識化剤として用いられる蛍光性物質の推奨される例は、本発明中で前に説明されたように、適切に化学修飾されているシアニン染料である。この蛍光標識化剤は、ＩＥＦ後に使用したゲルもしくは他のマトリックス中で、または、そのｐＨ勾配により発生する任意のｐＨで、チューブ或いは毛細管中で電気泳動した後に、任意の適した波長の光を照射した時にその蛍光が容易に検出できる性質を有している。任意の形状のチューブの中で行われる分離は、この技術分野の習熟者に知られている方法により適切な検出器を用いて、観測できる。
かくして、実際には、分析されるべき炭水化物の混合物は、蛍光標識化剤で標識化され、次いでＩＥＦにかけられ、元の混合物中の異なる炭水化物類が、標識化された後それらの等電点に従って分離される。本発明の方法に従って、例えば、異なる数のシアール酸残基または他の負に荷電した基を含んでなる場合、負のイオン性電荷の数により少くとも部分的にはお互いに区別される標識化された酸性の炭水化物は、異なる等電点を有しているであろうし、そして異なるｐＨで電気泳動されるであろう。それ故、標識化された異なる炭水化物、例えば、生体源から得られる混合物で見られる炭水化物類がそれぞれ分離できる。同じ数の負のイオン性荷電基を有するが、構造は異なる炭水化物異性体も、それらの等電点が異なるために、それぞれ分離できる。何故なら、それらの等電点は、蛍光標識化剤で標識化された後の同じ分子上の荷電基の構造上の位置とイオン性荷電基間の相互作用によって或る程度決まるからである。
ＩＥＦ分離法の物理的基礎は本発明で前に説明した電気泳動とは異なり、異なる分離パターンが得られるであろうし、従って、炭水化物の混合物の任意の一つの成分が任意の他の成分から分離され得る確率が増大する。
本発明のもう一つの態様では、分析されるべき炭水化物の試料は、この発明で前に説明したような分析用蛍光体グループを共に構成し、そのグループの各メンバーが、標識化でその炭水化物に付与する総電荷が異なる数種の異なる蛍光標識化剤で別々に標識化される。従って、一つの例として、ＩＥＦで分析されるべき炭水化物の単一混合物を大体等量の四つのに分割し、各部分を、分析用蛍光体グループを構成するために選ばれている四つの標識化剤の一つだけで標識化する。一つのグループの四つの異なる標識化剤で、分析されるべき各単一炭水化物試料の四つの異なって標識化された部分が得られる。各標識化された部分は、ＩＥＦゲルに塗布することにより分析される。個々の様式で塗布される各部分、即ち、別々に標識化された部分を一緒に混合することなく別々に、しかし同じゲルでの、望ましくは異なるレーンで同時に電気泳動する。この分離パターンは、その分離パターンを含んでいるＩＥＦゲルもしくは他のマトリックスを適した波長の光を照射すると、観察される。
炭水化物を標識化し、そしてＩＥＦでそれらを分離できるようにするために用いられる分析用蛍光体グループを構成する、蛍光標識化剤のグループの一つの望ましい例は、本明細書で前に説明された適切な炭水化物反応性基を含んでいるシアニン染料である。
この分離の結果、異なる標識化剤で標識化された炭水化物は、使用された標識化剤の電荷に依存するｐＨ勾配の異なる部分に移動するであろう。これは、異なる炭水化物に由来する電荷を、それらの構造に依存する様式で変化させ、そして炭水化物の任意の一つ混合物での分離パターンが、各標識化剤に対応して形成されるであろう確率が増大するであろう。この方法の結果、元の混合物中の任意の一つの炭水化物成分の任意の他の成分からの分離、を達成する可能性が増大するであろう。
ヒドラジンによる放出もしくは開裂または処理後の炭水化物試料の分析
本発明のもう一つの態様では、ヒドラジンの作用により、グリコプロテイン（糖蛋白質類）もしくはグリコリピド（糖脂質類）または他のグリココンジュゲート（ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）から切り放された炭水化物を分離する方法を提供することが望まれる。また、（それらの構造を改変するようにヒドラジンで処理された）グルカン類およびグルコサミングルカン（ＧＡＧＳ）のようなグリココンジュゲートを含んでいない炭水化物を分離する方法を提供することも望まれる。ヒドラジンは、多くの文献中に、これまでに記載されている、この技術分野の習熟者に良く知られている方法に従って、炭水化物の開裂または放出または処理用に用いられる。この開裂もしくは放出または処理された炭水化物は、ヒドラゾンとして知られている誘導体の形で知られる。他の生体分子と共役していない炭水化物（例えば、グルカンとして知られて物質）のヒドラジン分解もしくは放出反応中、そしてまたヒドラジンによる処理の場合にも、普通多くの炭水化物類の構成部分であるアセチル化アミノサッカライド残基（ヘキソースアミン残基のような）のあセチル基は、アミノ基から切離されて、その開裂した炭水化物類上にフリーの脂肪族第１アミノ基を残す。図３に、代表的なヒドラジン分解炭水化物の構造を図式的に示した。
この図で、ヒドラジン分解炭水化物は、開裂炭水化物生成物Ａとして示されている。生成物Ａは、ＡＮＴＳのような蛍光標識化剤で標識化されて、シアノボロハイドライドで還元すると、生成物Ｂを与える。ＡＮＴＳの代りに、アミノフルオレセインのような他の標識化剤を用いることもできる。
本発明の方法により、ヒドラジンにより、開裂または放出または処理された炭水化物類は、イオン的に負に荷電される得る蛍光標識化剤、望ましくは、イオン的に負に荷電され得る、一つもしくは複数の基によって一部が構成されている蛍光標識化剤によつて標識化される。この様な基の例は、カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、サルフェート基（−ＳＯ4）およびホスフェート基（−ＰＯ4）およびこの技術分野の習熟者に知られている他の適した基である。表２に適した蛍光標識化剤のリストが示されている。グリココンジュゲートからヒドラジンで開裂された炭水化物類を蛍光標識化する方法は、ジャクソンの報告［Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｐ．（１９９３）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２３０，２５０−２６５］の中に説明されている。
部分的にもしくは全体として任意の一個または複数の負の電荷を担持し得る一つまたは複数の化学的基を含んでなる蛍光標識化剤は、その標識化される炭水化物類に、その電荷を付与するであろう。それ故、この標識化された炭水化物類は、ヒドラジンの作用で開裂されたアミノ基による正の電荷、そしてその蛍光標識化剤に由来する負の電荷の両方を担持することができる。それ故、この標識化された炭水化物類は両性イオン的性質を持ち、そして本明細書で前に説明したように、全体として電荷を持たない状態で存在することもあり、そしてＩＥＦで分離することもできる。
本発明のもう一つの態様では、ヒドラジンにより、開裂または放出または処理された炭水化物類は、イオン的に正に荷電され得る蛍光標識化剤で標識化され、そして本明細書で前に説明したように、標識化される炭水化物類にイオン的正電荷を付与する。それ故、この標識化された炭水化物類は、ヒドラジンの作用で開裂されたアミノ基による正の電荷、そしてその蛍光標識化剤に由来し、そしてその蛍光標識化剤で付与される正電荷そしてまた、その炭水化物類上に存在し、そしてシアール酸もしくは、この技術分野の習熟者に知られている化学的基のような、ヒドラジン処理により除去されない任意の負に荷電した基に由来する他の負電荷、の両方を担持し得る。それ故、この標識化された炭水化物類は、両性イオン的性質を持ち、そして、本明細書で前に説明したように、全体として電荷を持たない状態で存在することもあり、ＩＥＦで分離することもできる。
本発明のもう一つの態様では、この炭水化物ヒドラゾンは、イオン的電荷を持たず、その標識化される炭水化物類に電荷を付与しない蛍光標識化剤で標識化される。この標識化された炭水化物類は、ヒドラジンの作用で開裂されたアミノ基による正の電荷と、炭水化物類上に存在する任意の負に荷電した基に由来し、そしてシアール酸もしくは、この技術分野の習熟者に知られている化学的基のような、ヒドラジン処理により除去されない任意の負に荷電した基に由来する他の負電荷、の両方を担持し得る。それ故この標識化された炭水化物類は、両性イオン的性質を持ち、そして全体として電荷を持たない状態で存在することもあり、そしてＩＥＦで分離することもできる。
本発明の一つの態様では、分析用蛍光体グループは、炭水化物類に一つまたはそれ以上の正の電荷を付与することができる一種またはそれ以上の蛍光標識化剤および、その炭水化物類に一つまたはそれ以上の負の電荷を付与することができる一種またはそれ以上の蛍光標識化剤、そしてまたその炭水化物類に負の電荷を付与しない一種またはそれ以上の蛍光標識化剤、から構成される。
本発明の一つの態様では、その蛍光標識化された炭水化物類を、それらを単一の二次元ＩＥＦで分離した後で、適した波長の光で照射して観測するのが望ましい。分離のパターンは、写真もしくは電子造影のような任意の常用の方法で記録される。
異なるスペクトル特性を有する異なる蛍光標識化剤で標識化された炭水化物類の分離は、ゲルの同じレーンで、またはＩＥＦで用いられるチューブもしくは毛細管中で同時に分離される。特異の蛍光標識は、適した波長の光を照射し、そして、異なる蛍光体を他から区別できるようにする適切な光学フィルターを使用して、特異の波長の発光を検出することにより、個々に検出される。
ＩＥＦによる分離の結果、ヒドラジン処理にかけて、次いで蛍光標識化剤で標識化した炭水化物の混合物は、それらが標識化された後、それらの等電点に従って分離され得る。この分離の物理的性基礎は、電気泳動とは異なり、異なる分離パターンが得られ、従って、炭水化物の混合物の任意の一つの成分を任意の他の成分から分離きる確率が増大するであろう。
ヒドラジンにより、開裂または放出または処理された任意の炭水化物は、若し必要なら本明細書で前に説明した任意の蛍光標識化剤で標識化され、そして本明細書で前に説明した任意の電気泳動法で分析される。
本発明で説明される方法は、その炭水化物の構造上の電荷の数を決定できるようにすることにより、その構造に関する情報を提供することもできる。この方法は、ヒドラジン分解により、グリココンジュゲートから切断された炭水化物類の分離に特に適している。何故なら、ヒドラジン分解中の脱アセチル化により発生する炭水化物類上のアミノ基の存在を利用すると同時に、続く分析の前に炭水化物のアミノ基を再アセチル化する通常の工程を必要としないからである。
二次元分離法
本発明のもう一つの態様では、両性物質担体を利用するＩＥＦ、もしくは固定化ｐＨ勾配またはその両者の組合せによる分離後、その分離された標識化炭水化物は、その等電点分離を含むそのマトリックスをポリアクリルアミドゲルに塗布し、そしてその焦点を当てている炭水化物を電気泳動させることにより、ＩＥＦに垂直な第２の次元でさらに分離される。本明細書で説明される本発明の方法では、本明細書で前に説明したように全体として正電荷を担持している蛍光標識化された炭水化物の第２の次元での分離に用いられるゲル中での電気泳動を可能にするために異なる電気泳動用緩衝溶液が用いられる。二次元法での分析の場合、その蛍光標識化剤は、第２の次元での電気泳動が行われた後にだけ蛍光性である必要がある。本発明の望ましい一つの例では、これら炭水化物類の蛍光標識化に用いられる任意のシアニン染料が、この二次元分離で用いられる。
二次元分離の結果、異なる標識化された炭水化物類の分離が達成されるであろう確率が増大する。
化学的方策
この項では、２から６個の正電荷を有するシアニン染料を合成する場合に意図される化学的方法が示される。各番号を付けたパラグラフの最初に、円の中の＋で示した単一の正電荷を有する、長方形で示したシアニン染料の一般的図式が示される。その長方形の二つの隅に、少くとも一個の正電荷および／または少くとも一つの官能基もしくは反応基：ＱまたはＱ′を含んでいる曲線が付いており；これらの曲線は、前に示した構造（１）中のＲ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6およびＲ7に、そして大抵の場合は、Ｒ1とＲ2に対応する。
＋２染料
0003852483.tif 000004
この染料は、本来＋１電荷を担持している。第２の＋電荷が、この染料のＮ原子の一つに付いている分子鎖上に所在する。官能基もしくは反応基Ｑは、もう一つの染料原子、例えば他のＮ原子の末端に付いている。
実例：
0003852483.tif 000005
２．
0003852483.tif 000006
この染料は、本来＋１電荷を担持している。第２の＋電荷が、この染料のＮ原子の一つに付いている分子鎖上に所在する。官能基もしくは反応基Ｑは、同じ分子鎖の末端に付いている。
実例：
0003852483.tif 000007
＋２中間体の合成：
0003852483.tif 000008
この中間体は、保護化染料を合成するために用いられる。そのフタルイミドは、塩酸による加水分解により除去され、そのアミン染料が得られる。
３．
0003852483.tif 000009
＋１モノ反応性染料が、それ自身、第２の＋電荷を含んでいる連結基で鎖長延長される。考えられる例は、次の通り：
0003852483.tif 000010
これは＋２インドリニウム中間体を必要としない。この合成も、収束タイプの合成に似ている。任意の数の＋電荷を含む連結基を“ボルト締め”（ｂｏｌｔ  ｏｎ”するのに適している。
提案としての＋１連結基の合成：
0003852483.tif 000011
＋３染料
これらの例は、＋２染料の場合に似ている。
１．
0003852483.tif 000012
この染料は、本来、＋１電荷を担持している。二つの付加的＋電荷が、この染料のＮ原子に付いている一つの分子鎖上に所在する。官能基もしくは反応基Ｑは他の染料原子、例えばＮ原子に付いている。
実例：
0003852483.tif 000013
２．
0003852483.tif 000014
この染料は、本来＋１電荷を担持している。一つの付加的＋電荷が、この染料のＮ原子に付いている各分子鎖上に存在する。官能基もしくは反応基Ｑはこれら分子鎖の一つの末端に付いている。
実例：
0003852483.tif 000015
３．
0003852483.tif 000016
この染料は、本来＋１電荷を担持している。他の二つの＋電荷は共に、染料のＮ原子の分子鎖上に所在し；この分子鎖も官能基もしくは反応基Ｑを含んでいる。これは、官能基もしくは反応基を含む＋３荷電中間体を必要とする。
実例：
0003852483.tif 000017
４．＋１連結基の付加による＋２染料の＋３染料への変換；
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実例；
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５．＋２連結基の付加による＋１染料の＋３染料への変換；
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合成；
0003852483.tif 000021
＋４染料
１．＋２連結基の付加による＋２染料の＋４染料への変換；
0003852483.tif 000022
２．＋３連結基の付加による＋１染料の＋４染料への変換；
0003852483.tif 000023
実例：
0003852483.tif 000024
３．
0003852483.tif 000025
反応性基を有する＋２中間体と＋３中間体を必要とする。
実例：
0003852483.tif 000026
＋５および＋６染料
１．＋３連結基の付加による＋２染料の＋５染料への変換：
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２．＋４連結基の付加による＋１染料の＋５染料への変換：
0003852483.tif 000028
＋４連結基：
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３．＋４連結基の付加による＋２染料の＋６染料への変換：
0003852483.tif 000030
ポリ−リジンをベースとする連結基分子鎖
リジン：
0003852483.tif 000031
も利用可能固体支持体上でオリゴマを調整し、＋１染料に結合してｎ＋染料を得る。
0003852483.tif 000032
実施例
緒言
蛋白質由来の炭水化物鎖もしくはオリゴ糖は、グルカンと呼ばれる。グルカンは、シアール酸基もしくは負電荷を付与する他の基が存在するか、しないかに依存して、中性または負（−）に荷電している。グルカンの各試料は、中性の、または荷電（＋１、＋２、＋３、＋４）した蛍光染料で標識化され得る。これらの実施例では、中性、＋１および＋２Ｃｙ３ヒドラジッドが、オリゴ糖のフリーの還元性末端を標識化するために用いられた。標識化されたグルカンの試料を、二つの部分に分割し、各部分を、正または負電極に向けて電気泳動させることにより分離した。正に荷電した蛍光染料を使用すると、このグルカン試料上の正味の電荷は変わる。これらの実施例では、そのグルカン上の元の電荷を蛍光バンドの有無に留意して測定した。これらバンドの位置は、それらの正味の質量／電荷比が異なることの影響を受ける。
染料合成
Ａ．正味でゼロ荷電の“Ｃｙ−３”ヒドラジッド
母体染料の合成
0003852483.tif 000033
これは、標準的な二工程法で合成された：１−エチル−２，３，３−トリメチルインドレニウムイオジドをＮ，Ｎ′−ジフェニルホルムアミジンと反応させ、その生成物を１−（カルボキシペンチル）−２，３，３−トリメチルインドレニウム−５−スルホネートと縮合させ、クロマトグラフィーで精製して、希望の母体染料を得た。
0003852483.tif 000034
保護化ヒドラジッドの合成
0003852483.tif 000035
上の母体染料（１１０ｍｇ）、ＨＢＴＵ（８３ｍｇ）およびｔ−ブチルカルバゼート（３３ｍｇ）を乾燥ジメチルホルムアミド（２ｍＬ）およびジイソプロピルエチルアミン（５０μＬ）と混合した。１５分後、この混合物をエーテルとクロロホルムで稀釈し、次いで減圧下で濃縮し、残留物をクロロホルムと水との間に分配させた。その有機層を稀ブラインで洗滌し、乾燥（ＭｇＳＯ4）し、ろ過し、そして減圧下で濃縮して、粘ちょうなゴム状物を得て、次いで、クロマトグラフィー（シリカ；５−２５％ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ3）で精製した。希望の生成物を含む複数のフラクションを併せて、減圧下で濃縮し、１０％ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ3に再溶解し、ろ過し、そして減圧下で濃縮した。次いで、この残留物を減圧下、３５℃で乾燥し、１３０ｍｇの生成物を得た。
0003852483.tif 000036
ヒドラジッドの合成
0003852483.tif 000037
上の保護化ヒドラジッドの、クロロホルム（０．５ｍＬ）とトリフルオロ酢酸（２ｍＬ）の溶液を、時々、振り動かしながら、３０分間、常温で放置した。次いで、この混合物を減圧下で濃縮し、そして、その残留物を１０％ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ3に溶かして、二度再濃縮し、次いでエーテルを加えて押し潰した。得られた固体を集め、減圧下３５℃で乾燥し、真鍮様赤褐色の粉末として、１７ｍｇの希望のヒドラジッドを得た。これは、さらに精製することなく使用された。
Ｂ．総＋１荷電の“Ｃｙ−３”ヒドラジッドの合成
母体染料の合成
0003852483.tif 000038
上のこの染料は、標準法を用いて、１−プロピル−２，３，３−トリメチルインドレニウムイオジド、Ｎ，Ｎ′−ジフェニルホルムアミジンおよび１−（５−カルボキシペンチル）−２，３，３−トリメチルインドレニウムブロミドから合成された。
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保護化ヒドラジッドの合成
0003852483.tif 000040
ジシクロヘキシルカルボジイミド（１２５ｍｇ）およびｔ−ブチルカルバゼート（１３０ｍｇ）を上記母体染料（３７０ｍｇ）のジクロロメタン（５ｍＬ）溶液に添加した。得られた混合物を、常温で一晩撹拌し、ろ過し、そのろ液を減圧下で濃縮した。この残留物にエーテルを加えて押し潰し、次いでクロマトグラフィー（シリカ；５−２５％ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ3勾配）で精製した。希望の生成物を含む複数のフラクションを併せて、ろ過し、そして減圧下で濃縮した。次いで、残留物を５％ＭｅＯＨ／ジクロロメタンに再溶解し、ろ過し、そして減圧下で濃縮した。次いで、得られた残留物にエーテルを加えて固体が得られるまで繰返し押し潰し、この固体を集め、減圧下５０℃で乾燥し、２３０ｍｇの生成物を得た。
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ヒドラジドの合成
0003852483.tif 000042
これは、上の保護化ヒドラジッド（５０ｍｇ）から、Ａに類似の方法で調製され、粘着性の固体として希望のヒドラジッドを得た。エーテルを加えて押し潰し、次いでジクロロメタン溶液から濃縮し、さらに精製しないで用いられる発泡体として、この染料を得た。
Ｃ．＋２Ｃｙ３ヒドラジッドの合成
母体＋２Ｃｙ３染料の合成
0003852483.tif 000043
これは、１−（５−カルボキシペンチル）−２，３，３−トリメチルインドレニウムブロミド、Ｎ，Ｎ′−ジフェニルホルムアミジンおよび１−（トリエチルアミノプロピル）−２，３，３−トリメチルインドレニウムジブロミドから標準法を用いて合成され、そして部分的に精製された形で用いられた。一部をアルミナ上でのクロマトグラフィーで精製して分析用試料を得た。
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保護化ヒドラジッドの合成
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これは、ｔ−ブチルカルバゼートと上記母体染料酸から、Ａで概略を説明したのに類似した方法で合成された。最終的精製は、その粗生成物の中性アルミナ上、次いでシリカゲル上でのクロマトグラフィーにより達成された。
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ヒドラジッドの合成
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これは、その保護化ヒドラジッド（５０ｍｇ）から、Ａでの方法に類似した方法で合成され、さらに精製しないでも用いられる赤褐色の粉末（２４ｍｇ）を得た。
グルカン標識化プロトコル
個々のグルカン（〜２ｎｍｏＬ）（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｇｌｙｃｏｓｃｉｅｎｎｃｅｓ，Ａｂｉｎｇｄｏｎ  Ｏｘｆｏｒｄ  ＵＫ）もしくは、３０μｇのフェツイン・グルカン・ライブラリ（ｆｅｔｕｉｎ  ｇｌｙｃａｎ  ｌｉｂｒａｒｙ）（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｇｌｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を、Ｓａｖａｎｔ  Ｓｐｅｅｄ  Ｖａｃ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒの中で乾燥した。中性および荷電シアニン染料（Ｃｙ３）は、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｐｌｃ  Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＵＫ、で合成された。４μＬの１ｍＭＣｙ３ヒドラジッドもしくは、１μＬの２５ｍＭＣｙ３ヒドラジッドを、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｐｏｏｌｅ  Ｄｏｒｅｓｔ  ＵＫ）中で、グルカン試料と混合し、そして４２℃で９０分間定温静置した。対照試料は、グルカンを除く、染料を含めた全成分を含んでいる。次いで、これらの試料を、Ｓａｖａｎｔ  Ｓｐｅｅｄ  Ｖａｃ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ中で乾燥し、そして直接使用するか、もしくは、−７０℃で保存した。凍結乾燥された（ｄｒｉｅｄ  ｄｏｗｎ）材料を、２μＬのＤＭＳＯ中に再溶解し、そして３８μＬの試料の緩衝溶液［１０％グリセロール（Ｍｅｒｋ，Ｐｏｏｌｅ  Ｄｏｒｅｓｔ  ＵＫ）、２０％ＤＭＳＯおよび０．００１％ブロモフェノールブルー（Ｍｅｒｋ）］を添加した。個々のグルカンの〜２５０ｐｍｏＬに対応する各試料５μＬ、または３．７５μｇのグルカン・ライブラリを二つのゲルの各々に添加した。一つのゲルを、正味負に荷電した種の分離に使用し、そして他のゲルを正味正に荷電した種の分離に使用した。
電気泳動
ａ）正味負に荷電したグルカンの分離
４％の積層ゲルを有する２０％Ｔ／２．６６％Ｃポリアクリルアミドゲルを、レムリー（Ｌａｅｍｍｌｉ）により説明された方法（Ｎａｔｕｒｅ  ２２７：６８０−６８５．１９７０）に従い、ＳＤＳを排除した点を修正して、ＢＩＯＲＡＤ  ｍｉｎｉ−ＰＲＯＴＥＡＮR II電気泳動システムで、２５ボルトで電気泳動した。このゲルは、試料を乗せる前に約１時間、前−泳動された。試料を乗せた後、電気泳動は、そのブロモフェノールが、そのゲルの底部から０．２５ｃｍの位置に達した時に止められた。［予め混合され、予め秤量されているアクリルアミド／ビス（ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ／ｂｉｓ）をＢｉｏＲａｄ社から購入した。トリズマ−ベース（Ｔｒｉｚｍａ−ｂａｓｅ）は、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．から、そしてグリシンは、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ  ＵＳＡ、から購入された。］
ｂ）正味正に荷電したグルカンの分離
４％の積層ゲルを有する２０％Ｔ／２．６６％Ｃポリアクリルアミドゲルを、トーマスおよびホ−デス（Ｔｈｏｍａｓ  ａｎｄ  Ｈｏｄｅｓ）により説明された“システム  ｂ”（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １１８：１９４−１９６．１９８１）に従い、以下の点を修正して、２５ボルトで電気泳動した。負の電荷を持った場合と同じゲル泳動時間が用いられた。このゲルは、試料を乗せる前に約１時間、前−泳動された。ヒスチジンは、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ，から、水酸化カリウム、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパン−スルホン酸（ＭＯＰＳ）は、Ｍｅｒｋ社から購入した。
ａ）積層ゲルで、グリセロールの代りに水を使用した。
ｂ）リボフラビン−５′−ホスフェートの代りに、０，１％のペルオキソ硫酸アンモニウムを使用した。
図の説明
図４：グルカンＮＡ４およびＮＧＡ４の分離
ａ）正電極に向かって；
ｂ）負電極に向かって；
レーン１から３（ＮＡ４）および４から６（ＮＧＡ４）は、それぞれ、中性、＋１および＋２染料で標識化したグルカンを含み、そしてレーン７から９は、それぞれ、中性、＋１および＋２染料を含み、グルカンを含んでいない対照試料である。
図５：グルカンＡ１およびＡ２の分離
ａ）正電極に向かって；
ｂ）負電極に向かって；
レーン１から３（Ａ１）および４から６（Ａ２）は、それぞれ、中性、＋１および＋２染料で標識化したグルカンを含み、そしてレーン７から９は、それぞれ中性、＋１および＋２染料を含み、グルカンを含んでいない対照試料である。
図６：ネオカラヘキサオーズ・オリゴ糖の分離
ａ）正電極に向かって；
ｂ）負電極に向かって；
レーン１から３は、それぞれ、中性、＋１および＋２染料で標識化したオリゴ糖を含み、そしてレーン４から６は、それぞれ中性、＋１および＋２染料を含み、オリゴ糖を含んでいない対照試料である。
図７：グルカン・ライブラリーの分離
ａ）正電極に向かって；
ｂ）負電極に向かって；
レーン１から３は、それぞれ、中性、＋１および＋２染料で標識化したグルカンを含み、そしてレーン４から６は、それぞれ中性、＋１および＋２染料を含み、グルカンを含んでいない対照試料である。
実施例１
中性のグルカン類の分離
グルカンＮＡ４（分子量２３７３）およびＮＧＡ４（分子量１７２４）を中性、＋１および＋２荷電した蛍光Ｃｙ３染料誘導体を用いて、上に説明したように標識化した。同じ試料を、上のａ）およびｂ）に説明した電気泳動の両方の条件を用いて分離した。
結果を図４ａと４ｂに示す。レーン１から６は、標識化グルカンを含んでいる。レーン７から９は、負の対照資料としてのグルカンを含まないで、中性、＋１および＋２染料を含んでいる。レーン１と４のグルカンは、中性の染料で標識化された。レーン２と５のグルカンは、＋１の染料で標識化された。レーン３と６のグルカンは、＋２の染料で標識化された。
＋１および＋２染料で標識化されたグルカンは、正電極に向かって分離された場合には検出されなかった。レーン１、４および７で観測されるダブレットは、恐らく、Ｃｙ３染料の未変換の酸形が存在するためであろう。負電極に向かって分離された場合に、＋１および＋２染料で標識化されたグルカンを含むレーンで、フリーの染料を代表するバンドが観測された。
正電極に向かって電気泳動した場合、対照レーンと標識化グルカンレーンの間に差が無かったが、これは、これらグルカンは、最初、負に荷電していないことを確認させる。この標識化されたグルカンが、若し負に荷電しておれば、レーン１にバンドが見られるであろう。
負電極に向かって分離した場合に得られた結果は、負の対照試料に比べた場合、レーン２と３および５と６に追加のバンドを示した。レーン１および４には標識化剤グルカンを示すバンドは見られなかった。中性の染料は、中性のグルカンに電荷を付与しないであろう。正味の電荷が存在しない場合、標識化グルカンはゲルに入らないであろう。このグルカンは一つの正味一つの正電荷を持つているので、レーン２と５にバンドが見られる。レーン３および６のグルカンは、標識化の結果、二つの正電荷を得ており、従って、ゲル中にさらに、移動する。グルカンＮＧＡ４は、ＮＡ４より分子量が小さく、これが、それらの相対的移動度に反映する。
中性のグルカンは、正に荷電した染料で標識化さた場合だけ負電極に向かってゲルの中に入って行く。その相対的移動度は、分子量と総電荷に影響される。
実施例２
負に荷電したグルカン類の分離
グルカンＡ１およびＡ２は、それぞれシアール酸基を含んでいる。各グルカンは、中性、＋１および＋２荷電した蛍光Ｃｙ３染料誘導体で標識化された。これら標識化された試料は、上のａ）およびｂ）に説明した電気泳動の両方の条件を用いて分離された。
結果を図５ａと５ｂに示す。レーン１から６は、標識化グルカンを含んでいる。レーン７から９は、負の対照試料としてのグルカンを含まないで、中性、＋１および＋２染料を含んでいる。レーン１、２および３は、中性、＋１および＋２染料の染料で標識化されたＡ１グルカンを含んでおり、そしてレーン４、５および６は中性、＋１および＋２染料で標識化されたＡ２グルカンを含んでいる。
これら標識化されたグルカンが、正電極に向かって分離される場合、レーン１に単一のバンドが観測された。これら標識化されたグルカンが、負電極に向かって分離される場合には、レーン１にはバンドガ無かった。これらのデータは、グルカンＡ１が、中性染料で標識化された後、正味の−１電荷を有していることを予測させる。
正電極もしくは負電極に向かって分離される場合、レーン２には、標識化されたグルカンを示すバンドは観測されなかった。これらのレーンにバンドが存在しないことは、単一の正電荷を有する染料が、元のＡ１グルカン上の負電荷の対になっていることを予測させる。
これら標識化されたグルカンが、正電極に向かって分離される場合、レーン３にはバンドは観測されなかった。これら標識化されたグルカンが、負電極に向かって分離される場合には、レーン３に単一のバンドが存在した。これらのデータは、正味＋２の電荷を担持している染料が、単一の負電荷を担持する元のＡＩグルカンを標識化するために使用されていることを予測させる。この場合、この標識化されたグルカンは正味の＋１電荷を持ち、負電極に向かって移動するであろう。
これら標識化されたグルカンが、正電極に向かって分離される場合、レーン４に一つのバンドが観測された。これら標識化されたグルカンが、負電極に向かって分離される場合、レーン４にはバンドは観測されなかった。これらのデータは、元の形のグルカンＡ２は、正味−２の電荷を持っているから、中性の染料がグルカンＡ２を標識化するために使用されたことを予測させる。さらに、レーン５に観測されるバンドは、Ａ２は、正味＋１の電荷を担持している染料により標識化され、そして正電極に向かって分離されることを予測させる。何故なら、−２グルカンと＋１標識化染料からは、標識化後、正味−１の電荷が得られるからである。単一の負電荷を有する標識化されたＡ２グルカンは、レーン４で観測された標識化されたグルカンより、ゲル中で、より短い距離移動した。＋２電荷を有する染料で標識化されたこのグルカンは中性であると推定されるので、レーン６では、如何なる条件でも、バンドは、予想もしくは観測されない。
蛍光染料標識化Ａ１およびＡ２グルカンは、正または負電極のいずれかに向かって、電気泳動で分離される場合、予測されたバンド生成を示した。このバンド生成パターンは、天然のグルカンに電荷を付与する際に利用できる。
実施例３
正味−３電荷を有するオリゴ糖・ネオカラヘキサオースの分離
ネオカラヘキサオース・オリゴ糖・トリホスフェート（総電荷：−３）は、Ｄｅｘｔｒａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｒｅａｄｉｎｇ  ＵＫ．から購入された。このオリゴ糖を、中性、＋１および＋２荷電した蛍光Ｃｙ３蛍光染料Ｃｙ３誘導体を用いて標識化した。これら標識化された試料は、上のａ）およびｂ）に説明した電気泳動の両方の条件を用いて分離された。
結果を図６ａと６ｂに示す。レーン１から３は、標識化オリゴ糖を含んでいる。レーン４から６は、負の対照試料としてのオリゴ糖を含まないで、中性、＋１および＋２染料を含んでいる。レーン１、２および３中のオリゴ糖は、それぞれ、中性の染料、＋１電荷を有する染料および＋２電荷を有する染料で標識化された。
正電極に向かって分離される場合、標識化オリゴ糖を示すバンドが、レーン１、２および３で観測されたが、標識化物質が負電極に向かって分離される場合、レーン１、２および３にバンドは観測されなかった。これら標識化オリゴ糖上にそれぞれ−３、−２および−１電荷が存在することを想定させるバンドが、レーン１、２および３に見られる。正電極に向かって分離される場合、レーン１に示されているように、標識化剤オリゴ糖の移動度は、−３の総電荷を持つ場合、最大になる。レーン１に三つのバンドが存在するが、レーン４に二のバンドが存在するから、追加のバンドは、標識化されたオリゴ糖である。
ネオカラヘキサオース・オリゴ糖・サルフェートは、中性もしくは、一連の正に荷電した蛍光染料で標識化された場合、予想通りのバンド生成パターンを示す。この実験のバンド生成パターンから、このオリゴ糖上の電荷は、−３もしくは、それ以上であると予測される。
実施例４
グルカン・ライブラリーの分離
このライブラリーのグルカンは、天然のグリコ蛋白質から、ヒドラジン分解で放出された。この放出されたグルカンは、負に荷電しており、−１から−４の範囲に荷電している。これらグルカンを、中性、＋１および＋２荷電した蛍光Ｃｙ３染料誘導体を用いて標識化した。これら標識化された試料を、上のａ）およびｂ）に説明した電気泳動の両方の条件を用いて分離した。
結果を図７ａと７ｂに示す。レーン１から３は、標識化グルカンを含んでいる。レーン４から６は、負の対照試料としてのグルカンを含まないで、中性、＋１および＋２染料を含んでいる。レーン１、２および３は、中性の染料、＋１染料および＋２染料で標識化されたグルカンを含んでいる。
これら標識化されたグルカンが、正電極に向かって分離される場合、レーン１に複数のバンドが観測された。これら標識化されたグルカンが、負電極に向かって分離される場合、レーン１にはバンドは観測されなかった。これらのデータは、これらグルカンは、中性の染料で標識化されることを予測させる。
これらグルカンを単一の電荷を担持する染料で標識化し、そして正電極に向かって分離した場合、レーン２におけるバンド生成パターンは、最初−１電荷を持っていたグルカンが排除されていることを反映している。同様に、レーン３におけるバンド生成パターンは、最初−１もしくは−２の電荷を持っていたグルカンが排除されていることを示した。この予測された通りのバンド生成パターンは、ゲルに入っていくグルカンが、段階的に減少することを示している。
これら標識化されたグルカンが、負電極に向かって分離された場合、レーン３にだけ複数のバンドが観測された。レーン３におけるバンドは、未標識化グルカンは−１電荷を持っており、次いで、＋２電荷を担持した染料で標識化後に、＋１の総電荷を得ることを予測させる。
蛋白質から化学的切断で放出され、そして中性もしくは正に荷電した蛍光染料で標識化されたグルカン・ライブラリー上の電荷は、そのゲルに入って行くこれらグルカンについて、電気泳動後のそのバンド生成パターンから予測することができる。
実施例５
等電点電気泳動に続いて第２次元ゲル電気泳動によるグルカン類の分離
グルカンＡ３は、３つのシアール酸基を含んでいるので、三つの負の電荷を持っている。このグルカンは、＋２電荷した蛍光Ｃｙ３染料誘導体で標識化された。この分子上の正味の総電荷は、−１であった。固定化ｐＨ勾配ストリップ：ｐＨ３−１０ＮＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｕｐｐｓａｌａ  Ｓｗｅｄｅｎ）を、０．５２％のｐＨ３−１０−Ｐｈａｒｍａｌｙｔｅｓ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）を含んでいる水のカセットの中で、２時間、再水和させた。１０μＬ（５００ｎｇ）の標識化されたＡ３を、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社からのＭｕｌｔｉｐｈｏｒ−IIシステムに乗せた。このストリップを、１００ボルトで１時間、次いで３００ボルトで２時間、そして最後に２０００ボルトで全部で３３００ボルト時間電気泳動した。
このＩＥＦ（等電点電気泳動した）ストリップを用いて、第１の方向に垂直な第２次元分離を行なった。このＩＥＦストリップを、次の点：Ｈｏｅｆｅｒ系１８×１６ｃｍのゲルを用いる；を修正して、ａ）で説明した電気泳動の条件を用いて分離処理した。このストリップを、長さ１２ｃｍの解像用ゲルと２ｃｍの積層ゲルを含む、厚み１ｍｍのゲルに乗せた。このゲルの最上部の２ｃｍの間隙を７０℃に加熱したＬＭＰアガロースで充填した。このＩＥＦストリップを、短時間でセット可能なこの加熱されたアガロースに乗せた。このゲルを、２５ｍＡの定常電流条件で陰極に向けて３時間電気泳動し、正味の負電荷を分離させた。
このＩＥＦの結果：このゲルの酸性領域に標識化Ａ３グルカンに対応する単一バンドが見られた。
第２次元分離の結果：ＩＥＦゲルの酸性領域からの標識化グルカンは、ポリアクリルアミドゲル中にマイグレーションした。
表１
本発明で説明された方法で用いられる蛍光標識化剤のリスト
２−アセトアミド−４−トリメチルアンモニオ・ビマニルメルカプト酪酸
２−アミノアクリドン
２−アミノピリジン
７−（アルギニルアミノ）−４−メチルクマリン
７−（アルギニルアルギニルアミノ）−４−メチルクマリン
７−（アルギニルアルギニルアルギニルアミノ）−４−メチルクマリン
７−（アルギニルグリシルアルギニルアルギニルアミノ）−４−メチルクマリン
７−（リシルアミノ）−４−メチルクマリン
７−（リシルリシルアミノ）−４−メチルクマリン
７−（リシルリシルリシルアミノ）−４−メチルクマリン
７−アミノ−４−メチルクマリン
アミノフルオレセイン
アミノローダミン
シアニン染料
クマリン１２０
クマリン１２０
クマリン１５１
ダンシルカダベリン
エチジウムブロミド
ルシファー・イエロー
ビオチニル化ルシファー・イエロー
ナイルブルーＡ
プロフラビンおよびモノアミノ誘導体
プロピジウムブロミド
ローダミン１０１メチルエステル
ローダミン１２３
２−アミノ安息香酸
表２
ヒドラジン分解炭水化物類で使用するための蛍光標識化剤のリスト
５−（（２−アミノエチル）チオウレイジル）フルオレセイン
４′−（アミノメチル）フルオレセイン・塩酸塩
５−（アミノメチル）フルオレセイン・塩酸塩
７−アミノ−４−メチルクマリン
１−アミノメチルピレン・塩酸塩
８−アミノナフタレン−１，３，６−トリスルホン酸・ジナトリウム塩（ＡＮＴＳ）
５−（および６）−（（Ｎ−％アミノペンチル）アミノ）カルボニル）テトラメチルローダミン（テトラメチルローダミン・カダベリン）
Ｎ−（５−アミノペンチル）−４−アミノ−３，６−ジスルホ−１，８−ナフタルイミド・ジカリウム塩（ルシファー・イエロー・カダベリン）
５−（（５−アミノペンチルチオウレイジル）エオジン・塩酸塩（エオジン・カダベリン）
５−（（５−アミノペンチルチオウレイジル）フルオレセイン・塩酸塩（フルオレセイン・カダベリン）
６−アミノキノリン
４′，５′−ビス−（アミノメチル）フルオレセイン・二塩酸塩
５−（（（２−（カルボヒドラジノ）メチル）チオ）アセチル）アミノエオシン
５−（（（２−（カルボヒドラジノ）メチル）チオ）アセチル）アミノフルオレセイン
カスケード・ブルー・カダベリン・トリナトリウム塩
カスケード・ブルー・エチレンジアミン・トリナトリウム塩
カスケード・ブルー・ヒドラジド・トリカリウム塩
カスケード・ブルー・ヒドラジド・トリナトリウム塩
１，２−ジアミノ−４，５−ジメトキシベンゼン・モノ塩酸塩（ＤＤＢ）
７−ジメチルアミノクマリン−３−カルボヒドラジド（ＤＣＣＨ）
４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオニルエチレンジアミン・塩酸塩（ＢＯＤＩＰＹR ＦＬＣ3 ＥＤＡ）
４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオニルヒドラジド
４，４−ジフルオロ−５，７−ジフェニル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオニルエチレンジアミン
４，４−ジフルオロ−５，７−ジフェニル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオニルヒドラジド（ＢＯＤＩＰＹR ５３０／５５０Ｃ3 ヒドラジド）
４，４−ジフルオロ−１，３，５，７−テトラメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオニルヒドラジド（ＢＯＤＩＰＹR ４９３／５０３Ｃ3 ヒドラジド）
５−ジメチルアミノナフタレン−１−（Ｎ−（２−アミノエチル）スルホンアミド（ダンシルエチレンジアミン）
５−ジメチルアミノナフタレン−１−（Ｎ−（２−アミノペンチル）スルホンアミド（ダンシルカダベリン）
５−ジメチルアミノナフタレン−１−スルホニルヒドラジン（ダンシルヒドラジン）
Ｎ−ε−（５−ジメチル）アミノナフタレン−１−スルホニル−Ｌ−リシン（ダンシルリジン）
Ｎ−（３−（（２，４−ジニトロフェニル）アミノ）プロピル）−Ｎ−（３−アミノプロピル）メチルアミン・二塩酸塩
エオシン−５−チオセミカルバジド
エチルエオシン−５−チオセミカルバジド
１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド・塩酸塩（ＥＤＡＣ）
フルオレセイン−５−チオセミカルバジド
リスサミンTM（ＬｉｓｓａｍｉｎｅTM）ローダミンＢ・スルホニルヒドラジン
リスサミンTMローダミンＢ・スルホニルエチレンジアミン
ルシファー・イエローＣＨ・アンモニウム塩
ルシファー・イエローＣＨ・リチウム塩
ルシファー・イエローＣＨ・カリウム塩
ｐ−ニトロフェニル−３−ジアゾピルベート
１−ピレンブチリルヒドラジン
スクシンイミジル−ｐ−ホルミルベンゾエート（ＳＦＢ）
スクシンイミジル−ｐ−ホルミルフェノキシアセタート（ＳＦＰＡ）
テキサス・レッドR（Ｔｅｘａｓ  ＲｅｄR）ヒドラジド
テキサス・レッドRスルホニルカダベリン
２−アミノ安息香酸
２−アミノ安息香酸アミド
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４（ａ）】
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【図４（ｂ）】
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【図５（ａ）】
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【図５（ｂ）】
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【図６（ａ）】
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【図６（ｂ）】
0003852483.tif 000056
【図７（ａ）】
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【図７（ｂ）】
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