(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも下記の反応式１
【化１】
0003852991.tif 000011
（式中、ＮＡＤＰ＋は酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、ＮＡＤＰＨ＋Ｈ＋は還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸を意味する）にて表される反応を触媒する１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸デヒドロゲナーゼであって、分子量が７８０００±６０００Ｄａ、等電点が４．７±０．５、１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸に対するＫｍ値が２５±５ｍＭ、至適ｐＨが９〜１０、ｐＨ安定性が６〜９、至適温度が３７〜５０℃、熱安定性が４５℃付近までである１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸デヒドロゲナーゼ。
【請求項２】
１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸デヒドロゲナーゼを生産する能力を有する微生物を培養し、その培養物から請求項１記載の１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸デヒドロゲナーゼを採取することを特徴とする１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸デヒドロゲナーゼの製造法。
【請求項３】
１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸を含有する被検液に補酵素の存在下に請求項１記載の１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸デヒドロゲナーゼを作用せしめ、次いで反応によって消費された成分または生成された成分を測定することを特徴とする被検液中の１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸の測定法。
【請求項４】
１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸が、１，５−アンヒドログルシトールから変換されたものである請求項３記載の１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸の測定法。
【請求項５】
被検液が、生体液である請求項３記載の１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸の測定法。
【請求項６】
補酵素が、酸化型（チオ）ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（リン酸）類である請求項３記載の１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸の測定法。
【請求項７】
酸化型（チオ）ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（リン酸）類が、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ＋）、酸化型チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドまたは酸化型チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸である請求項６記載の１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸の測定法。
【請求項８】
生成された成分が、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ＋Ｈ＋）、還元型チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドまたは還元型チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸である請求項３記載の１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸の測定法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、少なくとも下記の反応式１
【０００２】
【化４】
0003852991.tif 000002
【０００３】
（式中、ＮＡＤＰ+ は酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、ＮＡＤＰＨ＋Ｈ+ は還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸を意味する）にて表される反応を触媒する１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸デヒドロゲナーゼおよびその製造法、さらに１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸デヒドロゲナーゼを用いてなる１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸の測定法に関する診断用酵素およびこれを用いる分析分野に属する。
【０００４】
【従来の技術】
１，５−アンヒドログルシトールはヒト髄液、血清、尿などの生体液中に存在し、糖尿病などの疾患において著しく濃度が低下することから、糖尿病の診断マーカーになることが報告されている（赤沼安夫、戸辺一之：日本内科学会誌８０巻、１１９８〜１２０４頁、１９９１）。従来、その測定法としてはガスクロマトグラフィー法（吉岡ら、糖尿病、２５巻、１１１５〜１１１８頁、１９８２年）、１，５−アンヒドログルシトール酸化酵素、ピラノースオキシダーゼ、Ｌ−ソルボースオキシダーゼ、Ｄ−グルコシド−３−デヒドロゲナーゼなど１，５−アンヒドログルシトールを酸化する酵素を利用する酵素法が報告されている（特開昭６２−７９７８０号公報、特開昭６３−１８５３９７号公報、特開平７−６７６９７号公報）。
【０００５】
一方、例えばラット組織内の１，５−アンヒドログルシトールは、その５〜１０％がリン酸化された形にて存在し、またヒト骨髄腫由来の培養細胞においてもリン酸化された形にて存在することが報告されており、ラット組織におけるリン酸化物の濃度は２〜５ｎｍｏｌ／ｇ（組織）として存在し（水野ら、第６７回  日本生化学会大会発表抄録集ｐ．９８９、１９９４）、推定するにリン酸化物とは１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸と判断でき、その存在意義についての究明が必要とされているが、その測定法はＧＣ／ＭＳによるものであり、非常に煩雑になっており、正確性に欠ける。  従来、１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸に特異的に作用して、酸化せしめる酵素は報告されていない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
１，５−アンヒドログルシトールがリン酸化されて形成される１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸のヒト髄液、血清、尿などの生体液中の濃度を測定することによって、糖尿病などの疾患を従来より正確に診断できる可能性がある。本発明は１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸を含有する被検液において、１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸を簡便かつ高精度に測定することのできる方法および試薬を提供することを目的とし、また生体液中の１，５−アンヒドログルシトールをリン酸化し、これを測定することにより糖尿病診断マーカーとしての１，５−アンヒドログルシトールを測定することのできる方法および試薬を提供するものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは鋭意研究の結果、エシェリヒア属に属するエシェリヒア・コリＤＨ１株（ＡＴＣＣ  ３３８４９）が１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸に基質特異性を有し、少なくとも下記の反応式１
【０００８】
【化５】
0003852991.tif 000003
【０００９】
（式中、ＮＡＤＰ+ は酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、ＮＡＤＰＨ＋Ｈ+ は還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸を意味する）にて表される反応を触媒する全く新規な酵素を生産することを見い出し、本酵素を１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸デヒドロゲナーゼと命名、かつこの１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸デヒドロゲナーゼを単離、精製し、さらに該酵素および補酵素を１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸を含有する被検液に作用せしめたことにより１、５−アンヒドログルシトール−６−リン酸を簡便かつ正確に測定する方法を見い出した。
【００１０】
本発明は上記の知見に基づいて完成されたもので（１）少なくとも下記の反応式１
【００１１】
【化６】
0003852991.tif 000004
【００１２】
にて表される反応を触媒する１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、（２）エシェリヒア属に属する当該反応を触媒する１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸デヒドロゲナーゼを生産する能力を有する微生物を培養し、その培養物から１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸デヒドロゲナーゼを採取することを特徴とする１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸デヒドロゲナーゼの製造法、（３）１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸を含有する被検液に補酵素の存在下に当該反応を触媒する１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸デヒドロゲナーゼを作用せしめ、次いで反応によって消費された成分または生成された成分を測定することを特徴とする被検液中１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸の測定法である。
【００１３】
以下、本発明をより詳細に説明する。
まず、本発明の１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸デヒドロゲナーゼとしては下記の反応式１
【００１４】
【化７】
0003852991.tif 000005
【００１５】
で示される１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸を基質とし、例えば補酵素ＮＡＤＰ+（以下ＮＡＤＰと記することもある）を消費してＮＡＤＰＨ＋Ｈ+（以下ＮＡＤＰＨと記することもある）を生成するものであればよく、また補酵素について一般的に述べれば酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（リン酸）〔以下ＮＡＤ（Ｐ）と記することもある〕を消費して還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（リン酸）〔以下ＮＡＤ（Ｐ）Ｈと記することもある〕を生成するか、または酸化型チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（リン酸）〔以下チオＮＡＤ（Ｐ）と記することもある〕を消費して還元型チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（リン酸）〔以下チオＮＡＤ（Ｐ）Ｈと記することもある〕を生成する１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸デヒドロゲナーゼであればなんら限定されるものではない。
【００１６】
またこの１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸デヒドロゲナーゼ生産菌としてはエシェリヒア属に属する１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸デヒドロゲナーゼ生産菌であれば何ら限定されるものではなく、１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸デヒドロゲナーゼを生産する能力を有するその変異株であれば使用できるもので、好ましくはエシェリヒア・コリに属する生産菌であり、より好ましいものとしてエシェリヒア・コリＤＨ１株（ＡＴＣＣ  ３３８４９）はＡＴＣＣに保存され、ＡＴＣＣ（１８ｔｈ）カタログに記載されており、何人も入手可能であり、本菌株から得られた１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸デヒドロゲナーゼが好ましい。
【００１７】
次いで１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸デヒドロゲナーゼを得るに当たって好ましくはエシェリヒア．コリＤＨ１株（ＡＴＣＣ  ３３８４９）を培養するもので、この培養手段としては固体培養でも液体培養でもよいが好ましくはフラスコ、ジャー等による通気培養である。この培地としては微生物の培養に通常用いられるものが広く使用される。炭素源としてグルコース、グリセロール、ソルビトール、ラクトースなど、窒素源としては酵母エキス、肉エキス、トリプトン、ペプトンなど、無機塩としては塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化カルシウム等を用いればよい。培養条件としては例えばｐＨ６．５〜７．５、培養温度２５〜３７℃で目的とする酵素が最高力価となる培養時間、例えば１８〜３０時間にて目的とする酵素を採取すればよい。
【００１８】
次いで酵素を採取するに当たっては培養液から菌体を遠心分離等によって分離し、菌体をリン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液等の緩衝液に懸濁した後、リゾチーム、超音波、ガラスビーズ等によって破砕して遠心分離し、可溶性画分を粗酵素液として回収する。
このようにして得られた粗製の１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸デヒドロゲナーゼ含有液を公知の蛋白質、酵素の単離、精製手段を用いて処理することにより、精製された１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸デヒドロゲナーゼを得ることができる。例えばアセトン、エタノールなどの有機溶媒による分別沈殿法、硫安などによる塩析法、イオン交換クロマトグラフィー法、疎水クロマトグラフィー法、アフィニティクロマトグラフィー法、ゲル濾過法等の一般的な酵素精製法を適宜選択、組み合わせて精製１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸デヒドロゲナーゼを得ることができ、適宜安定化剤例えばショ糖、グリセロール等を５〜５０％程度、アミノ酸、補酵素等を０．０１〜０．１％程度として単独または２種以上適宜組み合わせて加えて凍結保存してもよい。
【００１９】
本発明によって得られる１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸デヒドロゲナーゼは以下に述べる理化学的性質を有するものである。
（１）作用
補酵素としてＮＡＤＰ+を用いて１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸を脱水素し、組成式（Ｃ6 Ｈ11Ｏ8 Ｐ1 ）の化合物とする下記の反応式１
【００２０】
【化８】
0003852991.tif 000006
【００２１】
で表される反応を触媒する。
また上記反応において、１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸を２５ｍＭとして用いた場合補酵素としてＮＡＤＰ+に対するＫｍ値は０．０８６±０．０４ｍＭ、ＮＡＤ+（ＮＡＤと記することもある）に対するＫｍ値は２．４±０．２３ｍＭ（生成物はＮＡＤＨ＋Ｈ+：ＮＡＤＨと記することもある）、チオＮＡＤＰ+（チオＮＡＤＰと記することもある）に対するＫｍ値は０．０８１±０．０３ｍＭ（生成物はチオＮＡＤＨＰ＋Ｈ+：チオＮＡＤＰＨと記することもある）であり、さらにチオＮＡＤも補酵素として作用する。
【００２２】
また、このことから、本酵素はＮＡＤＰやＮＡＤなどのＮＡＤ（Ｐ）を消費してＮＡＤ（Ｐ）Ｈを生成するか、チオＮＡＤ（Ｐ）を消費してチオＮＡＤ（Ｐ）Ｈを生成するものと認められる。
（２）力価の測定法
１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸デヒドロゲナーゼの酵素活性測定法
測定試薬
５０ｍＭ      ＣＡＰＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０．０）
１ｍＭ      ＮＡＤＰ（酸化型ニコチンアデニンジヌクレオチドリン酸）
５ｍＭ      １，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸
（ＣＡＰＳ：Ｎ−Ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ−３−ａｍｉｎｏｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）
測定試薬１ｍｌを光路長１ｃｍのセルに入れ３７℃で５分間予備加温した後、０．０１ｍｌの酵素液添加後０．５分後の波長３４０ｎｍにおける吸光度（Ａａ）と酵素液添加後１．５分後の吸光度（Ａｂ）を測定する。この吸光度（Ａａ）と（Ａｂ）の吸光度差（Ａｂ−Ａａ）より酵素活性を求める。なお、吸光度（Ａｂ）が０．２以上になる時は酵素液を５０ｍＭのＣＡＰＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０．０）で希釈して測定するものとする。酵素活性１単位は３７℃で１分間に１μモルの還元型ＮＡＤＰを生成させる酵素量とし、計算式は下記の通りである。
酵素活性（Ｕ／ｍｌ）＝（Ａｂ−Ａａ）×１６．０×酵素の希釈倍率
（３）基質特異性
上記の力価測定法において、その反応液中の１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸の代わりに、種々の基質を用いて、１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸に対する相対活性を求めた結果を表１に示す。
【００２３】
【表１】
0003852991.tif 000007
【００２４】
その結果、この酵素は少なくとも１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸に基質特異性を示した。
（４）至適ｐＨ
上記の力価測定法において、ｐＨ７．０〜９．０は５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（□−□）、ｐＨ９．５〜１０．５は５０ｍＭのＣＡＰＳ−ＮａＯＨ緩衝液（■−■）を用いた。至適ｐＨは９〜１０付近であり、結果を図１に示した。
【００２５】
（５）ｐＨ安定性
ｐＨ４．０〜５．５はクエン酸緩衝液（○−○）、ｐＨ５．５〜７．０はビストリス−塩酸緩衝液（●−●）、ｐＨ７．０〜９．０はトリス−塩酸緩衝液（□−□）、ｐＨ９．５〜１１．０はＣＡＰＳ−ＮａＯＨ緩衝液（■−■）を用いた。１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸デヒドロゲナーゼ１Ｕ／ｍｌを含有してなる５０ｍＭの各緩衝液において、５０℃、３０分処理でｐＨ６〜９において安定であり、結果を図２に示した。
【００２６】
（６）至適温度
上記の力価測定法において、その温度条件を変えて酵素反応を行った結果は図３に示す通りであって、その至適温度は３７〜５０℃であった。
（７）熱安定性
１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸デヒドロゲナーゼ１Ｕ／ｍｌを含有して成る５０ｍＭ  ＣＡＰＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９．５）を各温度に３０分間放置し、ついで上記の力価測定法に従って、１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸デヒドロゲナーゼの残存活性を測定した結果、図４に示す通りであって、酵素は４５℃付近までは安定であった。
【００２７】
（８）種々の物質による影響
上記の力価測定法において、種々の添加物を加えて、１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸デヒドロゲナーゼの１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸に対する酵素活性を測定した結果を表２に示す。
【００２８】
【表２】
0003852991.tif 000008
【００２９】
（９）分子量
７８０００±６０００Ｄａ（ＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷＸＬ（東ソー社製、日本国）ゲル濾過法による）
（１０）等電点
４．７±０．５（キャリアアンフォライトｐＨ３．５−ｐＨ１０．０（ファルマシア・バイオテク社製、スウェーデン国）を用いる電気泳動法により測定）
（１１）Ｋｍ値
１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸に対するＫｍ値  ２５±５ｍＭ
ＮＡＤＰに対するＫｍ値                                ０．０８６±０．０４ｍＭ
（１２）作用機序確認試験
１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸、ＮＡＤＰ、トリエチルアミン重炭酸緩衝液（ｐＨ１０．０）、１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸デヒドロゲナーゼを含む反応液を３７℃、８時間反応せしめる。１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸の分子内に形成されたカルボニル基を２，４−ジニトロフェニルヒドラジンとＨＣｌを加えて反応せしめてヒドラゾンとして分離し、マススペクトルを測定することで生成物が組成式（Ｃ6 Ｈ11Ｏ8 Ｐ1 ）で表されるものであることが確認された。
【００３０】
以上のように本発明の酵素１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸デヒドロゲナーゼはこれまでに報告がない全く新規な酵素と認められる。
本発明は上記の知見に基づき１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸デヒドロゲナーゼと補酵素の存在下、１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸を含有する被検液に作用せしめ反応生成物を測定することによって１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸を定量することが可能であり、次にその内容を説明する。
【００３１】
本発明における補酵素としては、好ましくはＮＡＤＰやチオＮＡＤＰが例示されるが一般的には酸化型（チオ）ＮＡＤ（Ｐ）類である、例えば酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤと記することもある）、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰと記することもある）などの酸化型ＮＡＤ（Ｐ）類の他に酸化型チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（チオＮＡＤと記することもある）、酸化型チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（チオＮＡＤＰと記することもある）などの酸化型チオＮＡＤ（Ｐ）類や酸化型３−アセチル−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、酸化型３−アセチル−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、酸化型デアミノ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、酸化型デアミノ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸などの酸化型ＮＡＤ（Ｐ）類が包含されるが、なんらこれらに限定されるものではない。
【００３２】
また本発明において、被検液中の１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸を測定するにあたって１、５−アンヒドログルシトール−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、酸化型（チオ）ＮＡＤ（Ｐ）類の使用量としては酵素反応が円滑に進行する量であればよく、被検液中の含量、共役させる酵素反応の種類、反応時間および温度などにより適宜調整されるが、１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸デヒドロゲナーゼの濃度は０．００１〜１００Ｕ／ｍｌ程度、好ましくは０．００２〜１０Ｕ／ｍｌ程度である。酸化型（チオ）ＮＡＤ（Ｐ）類の濃度は酵素反応を行うのに十分な濃度あればよく、０．１〜５０ｍＭ程度、好ましくは、１〜１０ｍＭ程度である。
【００３３】
測定対象となる被検液としては１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸が存在または形成された１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸を含有する生体試料が挙げられ、好ましくは例えば、血清、血漿、尿、髄液などにおける１，５−アンヒドログルシトールや１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸含有被検液が例示される。このような被検液としては通常５〜２００μｌを用いて上記反応系によって反応を行うもので、反応温度としては例えば１５〜４５℃、好ましくは２０℃〜４０℃の反応温度条件で行えばよく、反応時間としては１〜６０分程度で行えばよい。
【００３４】
本発明の方法は、酵素反応系に悪影響を及ぼさない適当な緩衝液（例えば、トリス−塩酸緩衝液、リン酸緩衝液、モノまたはジエタノールアミン緩衝液、グッド緩衝液等）（例えばｐＨ８〜１１、好ましくはｐＨ９〜１１）を用いて行われる。また、測定手法は特に限定されず、補酵素を定量する方法、反応生成物としてのカルボニル基を定量する方法などの手法を適宜用いることができる。
【００３５】
（１）補酵素を定量する方法
本発明において用いる補酵素として例えば酸化型（チオ）ＮＡＤ（Ｐ）類を用いた場合、生成される（チオ）ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ 〔以下、還元型（チオ）ＮＡＤ（Ｐ）類と称する〕の生成量は種々の方法により測定することができるが、通常、簡便かつ高精度で測定することのできる吸光度測定法により行われる。測定波長は還元型（チオ）ＮＡＤ（Ｐ）類の種類によって適宜選択され、好適には各還元型（チオ）ＮＡＤ（Ｐ）類の極大吸収波長域の波長に基づいて行えばよく、例えば還元型ＮＡＤ（還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド：ＮＡＤＨと記することもある）、還元型ＮＡＤＰ（還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸：ＮＡＤＰＨと記することもある）、還元型３−アセチル−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、還元型３−アセチル−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、還元型デアミノ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、還元型デアミノ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸などの場合には３４０ｎｍ付近の波長が選択され、また還元型チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（チオＮＡＤＨと記することもある）、還元型チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（チオＮＡＤＰＨと記することもある）の場合は４０５ｎｍ付近の波長が選択される。
【００３６】
また還元型（チオ）ＮＡＤ（Ｐ）類の生成量の測定法として、インドニトロテトラゾニウム（ＩＮＴ）やニトロブルーテトラゾニウム（ＮＢＴ）等のテトラゾニウム塩を用いて電子受容体としてフェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）やジアホラーゼ（ＥＣ１．８．１．４またはＥＣ１．６．９９．）の作用によりホルマザン色素を形成せしめ、このホルマザン色素の呈色を測定する方法を用いてもよい。また、還元型（チオ）ＮＡＤ（Ｐ）類の蛍光を測定してもよい。
【００３７】
（２）反応生成物としてのカルボニル基を定量する方法
反応終了後、反応液に２，４−ジニトロフェニルヒドラジン飽和エタノールと０．５ＮのＨＣｌを加えて撹拌し、３７℃、５分間加温後５ＮのＮａＯＨを加えて撹拌した後、５０５ｎｍ付近の吸光度を測定することにより生成したカルボニル基を定量することができる。
【００３８】
また、被検液中の１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸がごく微量である場合、下記の反応式２
【００３９】
【化９】
0003852991.tif 000009
【００４０】
（式中、Ａ１は酸化型チオＮＡＤ（Ｐ）類または酸化型ＮＡＤ（Ｐ）類を示し、Ａ２はＡ１の還元型生成物を示し、Ｂ１はＡ１が酸化型チオＮＡＤ（Ｐ）類のときは還元型ＮＡＤ（Ｐ）を、Ａ１が酸化型ＮＡＤ（Ｐ）類のときは還元型チオＮＡＤ（Ｐ）類を示し、Ｂ２はＢ１の酸化型生成物を示す）で表される酵素サイクリング反応を形成せしめ、該反応によって変化するＡ２またはＢ１の量を測定することで１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸を反応時間に基づくサイクリング反応により高感度に定量することができる。なお、還元型ＮＡＤ（Ｐ）は波長３４０ｎｍ付近、還元型チオＮＡＤ（Ｐ）は波長４０５ｎｍ付近での吸光度により定量することができ、この特徴に基づいてこれらを定量するものである。
【００４１】
上記反応における酸化型チオＮＡＤ（Ｐ）類としては、例えばチオＮＡＤ、チオＮＡＤＰが挙げられ、酸化型ＮＡＤ（Ｐ）類としては、例えばＮＡＤ、ＮＡＤＰや酸化型３−アセチル−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、酸化型３−アセチル−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、酸化型デアミノ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、酸化型デアミノ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸などが挙げられる。
【００４２】
また上記反応における還元型チオＮＡＤ（Ｐ）類としては、例えばチオＮＡＤＨ、チオＮＡＤＰＨが挙げられ、還元型ＮＡＤ（Ｐ）類としては、例えばＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨや還元型３−アセチル−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、還元型３−アセチル−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、還元型デアミノ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、還元型デアミノ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸などが挙げられる。
【００４３】
この酵素サイクリングの反応においては酵素反応系に悪影響を及ぼさない適当な緩衝液（例えば、トリス−塩酸緩衝液、リン酸緩衝液、モノまたはジエタノールアミン緩衝液、グッド緩衝液等でｐＨ８〜１１、好ましくはｐＨ９．５〜１０．５）が用いられ、Ａ１としては酸化型チオＮＡＤ（Ｐ）類、酸化型ＮＡＤ（Ｐ）類が挙げられ、例えば酸化型チオＮＡＤ（Ｐ）の場合には０．５〜５ｍＭ、またＢ１としてはＡ１がチオＮＡＤ（Ｐ）類のときは還元型ＮＡＤ（Ｐ）類を、Ａ１がＮＡＤ（Ｐ）類のときは還元型チオＮＡＤ（Ｐ）類を選択すればよく、例えばＡ１が酸化型チオＮＡＤ（Ｐ）のときにはＢ１としては好ましくは還元型ＮＡＤ（Ｐ）であり、この還元型ＮＡＤ（Ｐ）量としては０．０１〜５ｍＭ、好ましくは０．０１〜０．１ｍＭである。また１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸デヒドロゲナーゼ量としては０．１〜１００Ｕ／ｍｌ程度でよく、適宜ＫＣｌ、ＭｇＣｌ2 等の無機塩を０〜１００ｍＭの濃度加えて行ってもよい。反応温度としては例えば１５〜４５℃、好ましくは２０℃〜４０℃の反応温度条件で行えばよく、反応時間としては０．５〜６０分程度で行えばよい。
【００４４】
さらに、適宜Ｂ２を補酵素としてＢ１に再生できる酸化還元酵素、例えばアルコールデヒドロゲナーゼを基質のアルコールの存在下に反応せしめる第２のサイクリング反応を適宜形成せしめてもよく、この第２のサイクリング反応はアルコールデヒドロゲナーゼに限定することなく、公知の酸化還元酵素とその基質との組み合わせにて適宜選択組み合わせし得るものである。
【００４５】
また本発明における被検液中の１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸が１，５−アンヒドログルシトールから１，５−アンヒドログルシトールリン酸化酵素、例えばヘキソキナーゼ（ＥＣ２．７．１．１）の作用によって下記の反応式３
【００４６】
【化１０】
0003852991.tif 000010
【００４７】
のように変換されたものである場合、反応式１および反応式２で示される酵素反応系を共役させることにより生体液中の１，５−アンヒドログルシトールの量を、１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸を上記のように定量することにより測定することができる。この場合、前記反応式１または反応式２は反応式３とともに同一反応系としてもよく、また別反応系としてもよい。使用する１，５−アンヒドログルシトールリン酸化酵素は１，５−アンヒドログルシトールに作用するものであれば特に限定はされないが例えば酵母由来のヘキソキナーゼ（シグマ社製、米国）を用いることができ、その酵素量としては、０．１〜２００Ｕ／ｍｌ好ましくは１０〜１００Ｕ／ｍｌで、酵素反応系に悪影響を及ぼさない適当な緩衝液（例えば、トリス−塩酸緩衝液、リン酸緩衝液、モノまたはジエタノールアミン緩衝液、グッド緩衝液等でｐＨ６〜１１、好ましくはｐＨ７．０〜８．５）を用い、反応温度は２５〜４５℃、反応時間は１〜６０分間である。
【００４８】
【発明の実施の形態】
以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００４９】
【参考例】
１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸の合成
［Ｆｅｒｒａｒｉ，Ｒ．Ａ．  ｅｔ．ａｌ（１９５９）Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．８０，３７２−３７７］記載の方法で合成した。
【００５０】
【実施例１】
１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸デヒドロゲナーゼ生産菌の培養エシェリヒア・コリＤＨ１株（ＡＴＣＣ  ３３８４９）の培養
培地組成
０．５％            肉エキス
１．５％            ソルビトール
１．０％            トリプトン
１．５％            ビール酵母エキス
上記培地成分含む液体培地（ｐＨ７．５）５０ｍｌを３００ｍｌ容三角フラスコに分注したもの２本を、１２０℃、２０分間、加熱滅菌した後、これにエシェリヒア・コリＤＨ１株（ＡＴＣＣ  ３３８４９）の菌体懸濁液を各々１ｍｌづつ移植し、攪拌させながら、３０℃で１５時間培養し、種培養液とした。上記培地成分と消泡剤ＦＳアンチフォーム０２８（ダウコーニング・アジア社製、日本国）を０．３％含む液体培地５ｌを加えた１０ｌ容ジャー２基を滅菌した後に種培養液を移植し、３０℃で培養液のｐＨを５ＮのＮａＯＨで６．５以上になるよう制御して好気的に撹拌しながら２４時間培養し、培養力価１５ｍＵ／ｍｌの培養液１０ｌを得た。
【００５１】
１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸デヒドロゲナーゼの精製
得られた培養液１０ｌを遠心分離して、得られた菌体を５０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）で１回洗浄した。洗浄菌体を５０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）に懸濁して１．２ｌに調整し、ＤＹＮＯ−ＭＩＬＬ（Ｗｉｌｌｙ  Ａ．Ｂａｃｈｏｆｅｎ社製、スイス国）を用いて菌体破砕を行い、菌体破砕液を得た。
【００５２】
この破砕液を透析チューブを用いて５０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）２０ｌに対して５℃で一夜透析した後、８０００ｒｐｍ、６０分間遠心分離し、１．０ｌ（酵素活性１２０Ｕ）の上清を得た。この上清を５０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）で緩衝化したＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（ファルマシア・バイオテク社製、スウェーデン国）１２００ｍｌ（４．６×７５ｃｍ）のカラムに通し、０〜０．２５ＭのＮａＣｌのリニアグラジエントで溶出を行った。その結果、約０．１５ＭのＮａＣｌ濃度で活性画分（７５Ｕ）が溶出された。この得られた活性画分に３ＭとなるようにＮａＣｌを溶解し、５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）、３ＭのＮａＣｌで平衝化されたＰｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−４Ｂ（ファルマシア・バイオテク社製、スウェーデン国）５００ｍｌ（４．６×３０ｃｍ）のカラムに通し、２．５〜０ＭのＮａＣｌのリニアグラジエントにより溶出を行った。その結果、約１．２ＭのＮａＣｌ濃度で活性画分（５０Ｕ）が得られた。
【００５３】
この得られた活性画分を２０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．５）で、一夜透析した後、２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）で緩衝化したＢｌｕｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−６Ｂ（ファルマシア・バイオテク社製、スウェーデン国）５０ｍｌ（１．５×３０ｃｍ）のカラムに通し、０〜１ＭのＮａＣｌ、２０％エチレングリコールのリニアグラジエントにより溶出を行った。その結果、約０．６ＭのＮａＣｌ、１２％エチレングリコールの濃度で活性画分（３０Ｕ）が溶出された。この得られた活性画分を５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）で一夜透析した後、５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）で緩衝化したＲｅｓｏｕｒｃｅ  Ｑ（ファルマシア・バイオテク社製、スウェーデン国）６ｍｌのカラムに通し、０〜０．３ＭのＮａＣｌのリニアグラジエントにより溶出を行った。その結果、約０．１５ＭのＮａＣｌ濃度で活性画分（２８Ｕ）が得られ、均質な酵素標品を得た。
【００５４】
【実施例２】
１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸の定量
測定試薬
１２５ｍＭ      グリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０．０）
２．５ｍＭ      ＮＡＤＰ
０．００６２５％      ニトロブルーテトラゾニウム
６．２５Ｕ／ｍｌ      ジアホラーゼ（ＮＡＤＰＨ）（旭化成工業社製、日本国）
１８．７５ｍＵ／ｍｌ  １，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸デヒドロゲナーゼ
測定方法
１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸を０．２ｍＭ、０．５ｍＭ，１ｍＭ、１．５ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭの水溶液に調整し、１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸サンプルを作成した。５分間、３７℃で予備加温した測定試薬０．４ｍｌに１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸サンプル０．１ｍｌ加え、３７℃、５分間加温後、０．１ＮのＨＣｌ１ｍｌを加えて５５０ｎｍの吸光度を１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸サンプルの代わりに蒸留水を用いたものを対照に測定した。図５に示すように１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸が定量的に測定できた。
【００５５】
【実施例３】
１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸の定量
測定試薬
５０ｍＭ      ＣＡＰＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０．５）
２ｍＭ      ＮＡＤＰ
５ｍＵ／ｍｌ  １，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸デヒドロゲナーゼ
測定方法
１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸を１ｍＭ、２ｍＭ，４ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭの水溶液に調整し、１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸サンプルを作成した。５分間、３７℃で予備加温した測定試薬１ｍｌに１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸サンプル０．０２ｍｌ加え、３７℃、５分間加温後の３４０ｎｍの吸光度を１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸サンプルの代わりに蒸留水を用いたものを対照に測定した。図６に示すように１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸が定量的に測定できた。
【００５６】
【実施例４】
１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸の定量
測定試薬
５０ｍＭ      ＣＡＰＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０．５）
２ｍＭ      ＮＡＤＰ
５ｍＵ／ｍｌ  １，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸デヒドロゲナーゼ
測定方法
１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸を２０ｍＭ、５０ｍＭ，６２．５ｍＭ、１００ｍＭ、１２５ｍＭの水溶液に調整し、１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸サンプルを作成した。５分間、３７℃で予備加温した測定試薬０．５ｍｌに１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸サンプル０．０１ｍｌ加え、３７℃、５分間加温後、２，４−ジニトロフェニルヒドラジン飽和エタノール０．５ｍｌと１ＮのＨＣｌ０．１ｍｌを加え更に３７℃で５分間加温した後、５ＮのＮａＯＨを０．５ｍｌ加えよく撹拌した後に５０５ｎｍの吸光度を１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸サンプルの代わりに蒸留水を用いたものを対照に測定した。図７に示すように１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸が定量的に測定できた。
【００５７】
【実施例５】
サイクリング反応を用いた１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸の定量
測定試薬
５０ｍＭ      ＣＡＰＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０．２）
４０ｍＭ      ＫＣｌ
０．０５ｍＭ  ＮＡＤＰＨ
３ｍＭ        チオ−ＮＡＤＰ
１Ｕ／ｍｌ    １，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸デヒドロゲナーゼ
測定方法
１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸を０．１ｍＭ、０．５ｍＭ、１．２５ｍＭ、２．５ｍＭの水溶液に調整し、１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸サンプルを作成した。５分間、３７℃で予備加温した測定試薬０．９９ｍｌに１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸サンプル０．０１ｍｌ加え、３７℃、５分間加温後の４０５ｎｍの吸光度を試薬ブランクを対照に測定した。図８に示すように１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸が定量的に測定できた。
【００５８】
【実施例６】
１，５−アンヒドログルシトールの定量
一次反応測定試薬
５２．６ｍＭ      トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）
１０．５ｍＭ      ＡＴＰ
１０．５ｍＭ      ＭｇＣｌ2 
５２．６Ｕ／ｍｌ  ヘキソキナーゼ（パン酵母由来、シグマ社製、米国）
二次反応測定試薬
２３９ｍＭ        グリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０．０）
４．７７ｍＭ      ＮＡＤＰ
０．２４％        Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００
０．０１２％      ニトロブルーテトラゾニウム
１１．９Ｕ／ｍｌ  ジアホラーゼ（ＮＡＤＰＨ）（旭化成工業社製、日本国）
３６ｍＵ／ｍｌ    １，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸デヒドロゲナーゼ
測定方法
１，５−アンヒドログルシトールを１ｍＭ、２ｍＭ、５ｍＭ、７ｍＭ、１０ｍＭ、１２ｍＭ、１５ｍＭの水溶液に調整し、１，５−アンヒドログルシトールサンプルを作成した。５分間、３７℃で予備加温した一次反応測定試薬０．４７５ｍｌに１，５−アンヒドログルシトールサンプル０．０２５ｍｌを加え、３７℃、５分間加温した。次いで、反応終了液に５分間、３７℃で予備加温した二次反応測定試薬の０．５ｍｌを加えて更に３７℃、５分間加温後０．１ＮのＨＣｌ２ｍｌを加えた後の５５０ｎｍの吸光度を、１，５−アンヒドログルシトールサンプルの代わりに蒸留水を用いたものを対照として測定した。図９に示すように１，５−アンヒドログルシトールが定量的に測定できた。
【００５９】
【発明の効果】
本発明によれば、新規な１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸デヒドロゲナーゼが提供できる。また、本酵素を用いることにより従来は簡便に測定できなかった１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸を酵素法により容易に定量できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸デヒドロゲナーゼの至適ｐＨを示す。
【図２】図２は、１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸デヒドロゲナーゼのｐＨ安定性を示す。
【図３】図３は、１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸デヒドロゲナーゼの至適温度を示す。
【図４】図４は、１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸デヒドロゲナーゼの熱安定性を示す。
【図５】図５は、実施例２における検量線を、１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸濃度とΔＡ５５０ｎｍとの関係を示す。
【図６】図６は、実施例３における検量線を、１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸濃度とΔＡ３４０ｎｍとの関係を示す。
【図７】図７は、実施例４における検量線を、１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸濃度とΔＡ５０５ｎｍとの関係を示す。
【図８】図８は、実施例５における検量線を、１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸濃度とΔＡ４０５ｎｍとの関係を示す。
【図９】図９は、実施例６における検量線を、１，５−アンヒドログルシトール濃度とΔＡ５５０ｎｍとの関係を示す。
【図１】
0003852991.tif 000012
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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