(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
フェノール、カテコール、およびレゾルシンから成る群から選ばれる芳香族化合物から芳香族カルボン酸を生成する能力を有する微生物の培養菌体および／または該菌体処理物を、水系溶媒中で前記芳香族化合物に接触させて反応させ、反応液中に芳香族カルボン酸を蓄積せしめ、これを採取することを特徴とする芳香族カルボン酸の製造方法。
【請求項２】
芳香族化合物から芳香族カルボン酸を生成する能力を有する微生物が、好気下での培養が可能である微生物であることを特徴とする、請求項１に記載の芳香族カルボン酸の製造方法。
【請求項３】
好気下での培養が可能である微生物が、絶対嫌気条件を作る必要がない好気性菌または通性嫌気性細菌であることを特徴とする、請求項２に記載の芳香族カルボン酸の製造方法。
【請求項４】
培養菌体が好気下での培養により得られたものであることを特徴とする、請求項１〜３の何れか１項に記載の芳香族カルボン酸の製造方法。
【請求項５】
エンテロバクター属、バチルス属、マイコプラナ属、シュードモナス属、キサントモナス属またはアクロモバクター属に属する微生物を使用する、請求項１〜４の何れか１項に記載の芳香族カルボン酸の製造方法。
【請求項６】
エンテロバクター属細菌が、エンテロバクター・クロアカエ(Enterobacter cloacae IAM No.12349)、バチルス属細菌がバチルス・サチリス(Bacillus subtilis IAM No.12021)、マイコプラナ属細菌がマイコプラナ・ディモルファ(Mycoplana dimorpha IAM No.13154)、シュードモナス属細菌がシュードモナス・エスピー(Pseudomonas sp. IAM No.12642)、キサントモナス属細菌がキサントモナス・マルトフィリア(Xanthomonas maltophilia IAM No.12672)、アクロモバクター属細菌がアクロモバクター・シクロクラステス(Achromobacter cycloclastes IAM No.1013)である、請求項５に記載の芳香族カルボン酸の製造方法。
【請求項７】
芳香族化合物から芳香族カルボン酸を生成する能力を有する微生物を培養する際に、培地に安息香酸誘導体を添加することを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の芳香族カルボン酸の製造方法。
【請求項８】
添加する安息香酸誘導体が、パラアミノ安息香酸又はパラニトロ安息香酸である、請求項７記載の芳香族カルボン酸の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、微生物を利用する芳香族化合物を原料とした芳香族カルボン酸の製造方法に関する。パラオキシ安息香酸をはじめとする芳香族カルボン酸は合成樹脂、合成繊維、染顔料等の原料、あるいは食品、化粧品、医薬品用の防腐剤の原料として用いられ、産業上有用な化合物である。
【０００２】
【従来の技術】
パラオキシ安息香酸は、従来工業的にはフェノールを原料として製造されている。すなわち、フェノールをカリウム塩として脱水後、加圧、加熱条件下で二酸化炭素と化学的に反応させる方法により製造されているが、この方法は工程が複雑であり、高温、高圧下で大量の有機溶媒を用いるため爆発などの危険が伴うほか環境への影響も無視できない。
【０００３】
微生物培養環境においてフェノールがパラオキシ安息香酸に変換されたという報告はあるが、それらはいずれも偏性嫌気性細菌による嫌気的分解代謝産物としてその存在が推測されている程度であり、積極的にパラオキシ安息香酸の製造を目的としたものではなく、定性的な研究にとどまっている [P.J.Chapmanら, Biodegradation (1990) 1:65-74、G.Fuchsら, Arch Microbiol (1987) 148:213-217、J.Winterら, Appl Microbiol Biotechnol (1989) 30:318-324 参照] 。また、微生物による芳香族化合物の脱炭酸反応は公知であるが、その反応が可逆であることを証明した報告はこれまでにない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、常温、常圧の条件下で実施でき、かつ絶対嫌気条件を作る必要がない好気性菌または通性嫌気性細菌を利用して、安全かつ極めて単純な工程で芳香族化合物から芳香族カルボン酸を製造する方法を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を解決するべく検討を重ねた結果、エンテロバクター属、バチルス属、マイコプラナ属、シュードモナス属、キサントモナス属またはアクロモバクター属に属する微生物の中にパラオキシ安息香酸をフェノールに脱炭酸する菌が存在することを見いだした。この菌を用い、無機の炭素化合物の存在下で反応条件を検討した結果、極めて安全で単純な方法で芳香族カルボン酸を製造できることを見いだし、本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち、本発明は、
(1)  芳香族化合物から芳香族カルボン酸を生成する能力を有する微生物の培養菌体および／または該菌体処理物を、水性溶媒中で芳香族化合物に接触させて液中に芳香族カルボン酸を蓄積せしめ、これを採取することを特徴とする芳香族カルボン酸を製造方法、および
(2)  芳香族化合物から芳香族カルボン酸を生成する能力を有する微生物を培養する際に、パラアミノ安息香酸を添加することを特徴とする上記の芳香族カルボン酸の製造方法である。
以下に本発明を詳細に説明する。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明において、芳香族化合物は、フェノール類、ナフトール類等の水酸基含有芳香族化合物、アミノ基含有芳香族化合物をいい、具体的には、フェノール類としては、フェノール、（ｏ−，ｍ−，ｐ−）クレゾール、３，５−キシレノール、カルバクロール、チモール、カテコール、レゾルシン、ヒドロキノン、ピロガロール、フロログルシノール等が、ナフトール類としては、α−ナフトール、β−ナフトール等が、アミノ基含有芳香族化合物としては、アニリン、（ｏ−，ｍ−，ｐ−）トルイジン、（2,3-, 2,4)−キシリジン、（ｏ−，ｍ−，ｐ−）アニシジン、（ｏ−，ｍ−，ｐ−）フェネチジン、２−ナフチルアミン等が、アルコキシ基含有芳香族化合物としてはアニソール、エトキシベンゼン等が、Ｎ−アルキル基置換アミノ基含有芳香族化合物としてはメチルアニリン、Ｎ−エチルアニリン等が挙げられる。
【０００８】
本発明で使用する微生物はエンテロバクター属、バチルス属、マイコプラナ属、シュードモナス属、キサントモナス属、および、アクロモバクター属に属する細菌であって芳香族化合物を芳香族カルボン酸に変換する能力のある菌株であればよい。特にエンテロバクタークロアカエ種およびアクロモバクターシクロクラステス種に属する細菌が好ましい。
【０００９】
また、本発明では、絶対嫌気条件を作る必要がない好気性菌または通性嫌気性細菌を用いることが望ましい。
具体的には、エンテロバクター属細菌としてはエンテロバクター・クロアカエ(Enterobacter cloacae IAM No.12349)、バチルス属細菌としてはバチルス・サチリス(Bacillus subtilis IAM No.12021)、マイコプラナ属細菌としてはマイコプラナ・ディモルファ(Mycoplana dimorpha IAM No.13154)、シュードモナス属細菌としてはシュードモナス・エスピー(Pseudomonas sp. IAM No.12642)、キサントモナス属細菌としてはキサントモナス・マルトフィリア(Xanthomonas maltophilia IAM No.12672)、アクロモバクター属細菌としてはアクロモバクター・シクロクラステス(Achromobacter cycloclastes IAM No.1013) が挙げられる。
【００１０】
また、同菌種に突然変異処理を施し、芳香族カルボン酸生産性が増大したものを選択して用いてもよい。
このような突然変異体としては、例えば、芳香族カルボン酸に対する耐性の向上した変異株、芳香族カルボン酸に対する耐性の向上した変異株、芳香族カルボン酸を分解しなくなった変異株、芳香族カルボン酸生成に関与するフェノールカルボキシラーゼの生産性の高い変異株などが挙げられる。
【００１１】
次に本発明で用いる微生物の培養について説明する。細菌を増殖させる培地としては通常、これらの細菌が生育し得る培地であれば良く、具体的にはＳＣＰ培地「ダイゴ」（日本製薬株式会社製）等が例示される。
炭素源としては菌体が資化し生育できる炭素化合物であればいずれでも使用可能である。
【００１２】
窒素源としては、例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム等の無機窒素源、酵母エキス、ペプトン、肉エキスなどの有機窒素源を使用することができる。これらの他に、必要に応じて、無機塩類、金属塩、ビタミンなどを添加することもできる。
培養は、温度20〜40℃、より好ましくは25〜35℃でpH５〜９で行うことが好ましい。
【００１３】
培養は、嫌気下でも好気下でもいずれも行うことができるが、増殖速度が速いことから好気下での振盪培養が好ましく、また常圧下で行いうる。
但し、培養条件は、用いる微生物や培地組成などに応じて芳香族カルボン酸の生産量が最大になるように設定することが重要であることは当然である。
また、芳香族化合物から芳香族カルボン酸に変換する酵素（フェノールカルボキシラーゼ）を多量に生産させるためには、安息香酸誘導体、具体的にはパラニトロ安息香酸、パラアミノ安息香酸を添加すると良い。添加量は培地に対して10〜200 ppm 、好ましくは50〜100ppmとなるように添加することができる。
【００１４】
本菌を用いて芳香族化合物から芳香族カルボン酸を生産する工程はバッチ式でも、また、バイオリアクターを用いた連続式でも可能である。上記の方法で増殖させた菌体をろ過または遠心分離により回収する。、得られた菌体はそのまま芳香族化合物との反応に供してもよいし、破砕菌体、菌体培養液、粗酵素、精製酵素等の菌体処理物としてもよい。培養菌体または該菌体処理物は、芳香族化合物を含む水系溶媒に懸濁させるか、または公知の固定化法で固定化し、固定化物を芳香族化合物を含む水系溶媒を接触させることによって、芳香族カルボン酸を液中に蓄積せしめ、これを採取する。水性溶媒としては、例えば、炭酸緩衝液等の緩衝液を用いることができる。
【００１５】
反応に用いる芳香族化合物は100 〜10000ppm、好ましくは1000〜5000ppm の濃度で供給する。反応時の菌体濃度は乾物重ベースで１〜100g/lの範囲で行われる。カルボキシル基源としては二酸化炭素、種々の炭酸塩を用いることが出来るが、好ましくは50〜500mM の濃度の重炭酸ナトリウム／炭酸ナトリウム緩衝液中で反応させるのが良い。
【００１６】
反応液中の芳香族カルボン酸は常法に従い精製すれば良い。すなわち、反応液をろ過、遠心分離等により処理した後、得られた溶液に塩酸や硫酸等の酸溶液を加えて酸性化することにより、芳香族カルボン酸を回収することができる。また、溶剤抽出等の方法により回収することも可能であり、クロマトグラフィー等公知の精製方法を適宜併用することができる。
【００１７】
なお、本発明の製造法においては芳香族カルボン酸の検出及び定量は、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって行われる。すなわち、オクタデシル基を有したシリカゲルパックドカラムなどを固定相に用い、水とアセトニトリルの混合物にトリフロロ酢酸を添加したものを移動相とする一般的な逆相クロマトグラフィーによって分析が可能である。検出は紫外部分光検出器によって波長250nm 付近で行う。
【００１８】
【実施例】
以下に代表的な実施例を示し本発明の具体的な説明を行うが、これらの実施例は本発明の範囲を限定するものではない。
〔実施例１〕
市販のＳＣＤ培地「ダイゴ」（日本製薬株式会社製）を所定濃度に調整し、100ml 容の三角フラスコに50ml入れ、モルトン栓をし、121 ℃、1.2 気圧にて15分間オートクレーブ滅菌を行った。これにＢ１スラント培地で維持している菌体（アクロモバクター・シクロクラステス IAM No.1013）を１白金耳接種した。25℃の恒温室にて１〜３日間振盪培養を行い、菌体の増殖を認めた後、50ml分の菌体（乾物重換算で50mg）を遠心分離（3000rpm で10分間）によって回収した。
【００１９】
回収した菌体をPhOH 500ppm を含む炭酸緩衝液（Na2CO3/NaHCO3 ＝15/85 500mM)1ml に懸濁し、15ml容のネジ口式遠沈管に懸濁液を移し、気相部を100% CO2で置換した後、25℃恒温室にて１日間振盪しながら反応させた。
反応終了後、菌体を除去するために遠心分離（3000rpm で10分間）し、上清を取り、1N HClで中和したものを下記の条件で高速液体クロマトグラフィーにより、分析した結果、標品のパラオキシ安息香酸と一致するピークが認められた。また、このピークをGC/MS で分析した結果、確かにパラオキシ安息香酸であることが確認された。
【００２０】
カラム：Inertsil ODS-2 (GL Sciences Inc.製)
移動相：水：アセトニトリル（85：15）
送液：0.6ml/min
カラム温度：40℃
検出方法：ＵＶ吸収波長255 nm
本方法でパラオキシ安息香酸の生成量を定量した結果、最大生産時で7ppmの生成が認められた。
〔実施例２〕
実施例１に記載の方法と同様の手順で増殖させた菌体を、表１に示す組成の合成培地にパラアミノ安息香酸を100ppm加えた培地に置換して１日振盪した。この処理によってフェノールカルボキシラーゼが誘導された菌体を回収し、PhOH濃度が1000 ppmであること以外は実施例１と同様の条件で反応させた。反応後のパラオキシ安息香酸の定量は実施例１と同様の方法で行ったところ、最大生産時で130ppmの生成が認められた。
【００２１】
【表１】
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【００２２】
〔実施例３〕
実施例１に記載の方法と同様の手順で増殖させた菌体を、表１に示す組成の合成培地にパラニトロ安息香酸を100ppm加えた培地に置換して１日振盪した。この処理によってフェノールカルボキシラーゼが誘導された菌体を回収し、PhOH濃度が1000 ppmであること以外は実施例１と同様の条件で反応させた。反応後のパラオキシ安息香酸の定量は実施例１と同様の方法で行ったところ、最大生産時で25ppm の生成が認められた。
【００２３】
〔実施例４〕
実施例１に記載の方法と同様の手順で増殖させたエンテロバクター・クロアカエ(Enterobacter cloacae IAM No.12349)を用いる以外は、実施例２と同様にして反応を行い、反応後のパラオキシ安息香酸の定量を行ったところ、最大生産時で77ppm の生成が認められた。
【００２４】
〔実施例５〕
実施例１に記載の方法と同様の手順で増殖させたバチルス・サチリス(Bacillus subtilis IAM No.12021)を用いる以外は、実施例２と同様にして反応を行い、反応後のパラオキシ安息香酸の定量を行ったところ、最大生産時で82ppm の生成が認められた。
【００２５】
〔実施例６〕
実施例１に記載の方法と同様の手順で増殖させたマイコプラナ・ディモルファ(Mycoplana dimorpha IAM No.13154)を用いる以外は、実施例２と同様にして反応を行い、反応後のパラオキシ安息香酸の定量を行ったところ、最大生産時で63ppm の生成が認められた。
【００２６】
〔実施例７〕
実施例１に記載の方法と同様の手順で増殖させたシュードモナス・エスピー(Pseudomonas sp. IAM No.12642)を用いる以外は、実施例２と同様にして反応を行い、反応後のパラオキシ安息香酸の定量を行ったところ、最大生産時で23ppm の生成が認められた。
【００２７】
〔実施例８〕
実施例１に記載の方法と同様の手順で増殖させたキサントモナス・マルトフィリア(Xanthomonas maltophilia IAM No.12672)を用いる以外は、実施例２と同様にして反応を行い、反応後のパラオキシ安息香酸の定量を行ったところ、最大生産時で 7ppm の生成が認められた。
【００２８】
〔実施例９〕
実施例１に記載の方法と同様の手順で増殖させた菌体を、表１に示す組成の合成培地にパラアミノ安息香酸を100ppm加えた培地に置換して１日振盪した。この処理によってフェノールカルボキシラーゼが誘導された菌体を回収しカテコール濃度が1000 ppmであること以外は実施例１と同様の条件で反応させた。反応後の３，４−ジヒドロキシ安息香酸の定量は実施例１と同様の方法で行ったところ、最大生産時で24ppm の生成が認められた。
【００２９】
〔実施例10〕
実施例１に記載の方法と同様の手順で増殖させたエンテロバクター・クロアカエ(Enterobacter cloacae IAM No.12349)を用いる以外は、実施例９と同様にして反応を行い、反応後の３，４−ジヒドロキシ安息香酸の定量を行ったところ、最大生産時で21ppm の生成が認められた。
【００３０】
〔実施例11〕
実施例１に記載の方法と同様の手順で増殖させた菌体を、表１に示す組成の合成培地にパラアミノ安息香酸を100ppm加えた培地に置換して１日振盪した。この処理によってフェノールカルボキシラーゼが誘導された菌体を回収しレゾルシン濃度が1000 ppmであること以外は実施例１と同様の条件で反応させた。反応後の２，４−ジヒドロキシ安息香酸の定量は実施例１と同様の方法で行ったところ、最大生産時で1.8ppmの生成が認められた。
【００３１】
〔実施例12〕
実施例１に記載の方法と同様の手順で増殖させたエンテロバクター・クロアカエ(Enterobacter cloacae IAM No.12349)を用いる以外は、実施例11と同様にして反応を行い、反応後の２，４−ジヒドロキシ安息香酸の定量を行ったところ、最大生産時で2.1ppmの生成が認められた。
【００３２】
【発明の効果】
本発明によれば、高温、高圧に調節する機能を具備しない簡便な装置を用い、常温、常圧の条件下で実施できる微生物の培養を利用して、安全かつ極めて単純な工程で芳香族化合物から芳香族カルボン酸を製造できる。