(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
レトロウイルスによる標的細胞への遺伝子導入方法において、レトロウイルスと標的細胞とを共配置させることにより標的細胞のレトロウイルスによる遺伝子導入効率を向上させることができる有効量の機能性物質の存在下に、低密度リポプロテインを含有する無血清培養培地中でレトロウイルスを標的細胞に感染させることを特徴とする標的細胞への遺伝子導入方法。
【請求項２】
機能性物質が、レトロウイルス結合部位と標的細胞結合部位とを同一分子中に有する物質である請求項１記載の方法。
【請求項３】
機能性物質が、レトロウイルス結合部位を有する分子と、標的細胞結合部位を有する他の分子との混合物である請求項１記載の方法。
【請求項４】
機能性物質が、フィブロネクチン、フィブロネクチンフラグメントまたはこれらの混合物である請求項１記載の方法。
【請求項５】
機能性物質が、配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドである請求項４記載の方法。
【請求項６】
機能性物質が、培養容器に固定化されている請求項１〜５いずれか１項記載の方法。
【請求項７】
培養培地が、サイトカインを含有する請求項１〜６いずれか１項記載の方法。
【請求項８】
培養培地が、ＩＬ−３、ＩＬ−６およびＳＣＦから選択されるサイトカインを含有する請求項７記載の方法。
【請求項９】
標的細胞が、造血系細胞である請求項１〜８いずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
標的細胞が、ＣＤ３４＋細胞である請求項９記載の方法。
【請求項１１】
レトロウイルスが、外来遺伝子を含有する組換えレトロウイルスである請求項１〜１０いずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
レトロウイルスが、複製能を欠損した組換えレトロウイルスである請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
請求項１〜１２いずれか１項記載の方法で得られる遺伝子導入細胞。
【請求項１４】
レトロウイルスによる標的細胞への遺伝子導入に使用される培養培地であって、血清を含有せず、かつレトロウイルスと標的細胞とを共配置させることにより標的細胞のレトロウイルスによる遺伝子導入効率を向上させることができる有効量の機能性物質ならびに低密度リポプロテインを含有することを特徴とする標的細胞の培養培地。
【請求項１５】
機能性物質が、レトロウイルス結合部位と標的細胞結合部位とを同一分子中に有する物質である請求項１４記載の培養培地。
【請求項１６】
機能性物質が、レトロウイルス結合部位を有する分子と、標的細胞結合部位を有する他の分子との混合物である請求項１４記載の培養培地。
【請求項１７】
機能性物質が、フィブロネクチン、フィブロネクチンフラグメントまたはこれらの混合物である請求項１４記載の培養培地。
【請求項１８】
機能性物質が、配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドである請求項１７記載の培養培地。
【請求項１９】
サイトカインを含有することを特徴とする請求項１４〜１８いずれか１項記載の培養培地。
【請求項２０】
ＩＬ−３、ＩＬ−６およびＳＣＦから選択されるサイトカインを含有することを特徴とする請求項１９記載の培養培地。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、無血清培地を用いた遺伝子導入方法、さらに詳しくは、医学、細胞工学、遺伝子工学、発生工学などの分野において標的細胞への遺伝子導入効率を向上させ、標的細胞の形質転換を効率良く行うことを可能にする方法およびそれに関連する一連の技術に関する。
発明の背景
多数のヒト疾病についてその機構が解明され、また、組換えＤＮＡ技術および細胞への遺伝子導入技術が急速に進歩したことより、近年、重篤な遺伝病を治療するための体細胞遺伝子治療法のプロトコールの開発が進められている。また、最近では遺伝病のみならず、ＡＩＤＳのようなウイルス感染症やガンの治療にも遺伝子治療を適用しようという試みがなされている。
これまでに米国食品医薬品局（ＦＤＡ）が承認したヒトでの遺伝子導入試験の大部分は、組換えレトロウイルスベクターを用いて細胞への遺伝子導入を行うものである。レトロウイルスベクターは目的の外来遺伝子を細胞内に効率的に導入し、その染色体ＤＮＡ中に安定に組み込むので、特に長期にわたる遺伝子発現が望まれる遺伝子治療にとって好ましい遺伝子導入手段である。該ベクターは遺伝子導入された生物に悪影響を与えないように様々な工夫が施されている。
例えば、遺伝子導入に用いられたベクター自体が細胞内で複製を行い、無制限な感染（遺伝子導入）を繰り返さないよう、ベクター中の複製機能は欠損させてある。これらのベクター（複製能欠損レトロウイルスベクター）は自己複製できないため、一般的にはレトロウイルス産生細胞（パッケージング細胞）を使用して該ベクターがウイルス粒子に包まれたレトロウイルスを調製する。
一方、骨髄細胞はイン−ビトロ（in vitro）での取り扱いが可能なこと、および自己複製能を有する造血幹細胞を含有していることから、体細胞遺伝子治療法の良好な標的細胞である。また、臍帯血液も造血幹細胞を含む多数の原始前駆細胞を含有していることがこれまでに証明されている。これらの標的細胞に遺伝子を導入して生体に移植する遺伝子治療を行うことにより、導入された遺伝子が血液細胞中で長期にわたり発現され、疾病を生涯治癒することができる。
しかし、多数のグループによって研究が進められているにもかかわらず、造血幹細胞は高効率の遺伝子導入の難しい細胞の一つである。これまで、マウスやその他の動物の造血幹細胞に関して最も効率のよい遺伝子導入のプロトコールは、造血幹細胞をレトロウイルス産生細胞とともに共培養するという方法であったが、安全性についての懸念から、ヒトにおける臨床的な遺伝子治療法にはレトロウイルス産生細胞の混入の危険性の低い無細胞系での遺伝子導入が望まれている。残念ながら、レトロウイルス産生細胞との共培養を行わずに造血幹細胞に効率的に遺伝子を導入することは容易ではない。
最近、細胞外マトリックスの成分であるフィブロネクチンやそのフラグメントが、単独でレトロウイルスによる細胞への遺伝子導入効率を向上させることが報告されている［ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション（J.Clin.Invest.、第９３巻、第１４５１〜１４５７頁（１９９４年）、ブラッド（Blood）、第８８巻、第８５５〜８６２頁（１９９６年）］。また、遺伝子工学的に生産されたフィブロネクチンフラグメントも同様の性質を有しており、これを利用して造血幹細胞に効率よく外来遺伝子を導入させることが可能であることも示された（ＷＯ９５／２６２００号）。
さらに、ＷＯ９７／１８３１８号公報には、線維芽細胞増殖因子やコラーゲン等のフィブロネクチン以外の機能性物質が遺伝子導入効率を向上させること、およびレトロウイルス結合活性を有する機能性物質と標的細胞結合活性を有する他の機能性物質とを混合して使用した場合にも同様な遺伝子導入効率の向上が起こることが示されている。
これらの機能性物質による遺伝子導入効率の向上は、該物質がレトロウイルスと標的細胞とを近接した状態に共配置し、両者の相互作用の機会が増加することに起因すると考えられている。
発明の目的
上記のようなレトロウイルスを用いた遺伝子導入においては、レトロウイルスを含む培地中で標的細胞を培養することにより、レトロウイルスの感染、すなわち、遺伝子の導入が起こる。このステップに使用される培地としては動物血清、多くの場合にはウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含有するものが使用されている。血清中には細胞の栄養源となりうる成分や各種成長因子が含まれており、生体外での細胞の維持には高い効果を有するとされている。
血清は動物由来のものであり、そこに含まれる成分やその含量等は該血清が採取された動物個体の健康状態等によって変動すると考えられる。したがって、ロットの異なる血清を使用して細胞の培養および／または遺伝子導入が行われた場合には再現性のある結果を得られるとは限らない。また、例えば、ヒト以外の異種生物由来の血清は、ヒトに対して抗原性を有する物質を含有しており、このような血清存在下で維持された細胞をヒトに移植する際には抗原性物質の含量が低下するような適当な洗浄操作が必要である。さらに、血清はウイルスやマイコプラズマ等を含まないように厳重な品質管理がなされていなければならない。
このように、血清を含有する培地を使用する遺伝子導入法は問題を有しており、その解決が望まれている。
発明の概要
本発明者らは、鋭意研究の結果、意外にも無血清培地を用いた場合に従来の血清含有培地に比べて遺伝子導入効率が向上すること、また、低密度リポプロテインを添加した培地では特に高い遺伝子導入効率が得られることを見いだし、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明の第１の発明は、レトロウイルスによる標的細胞への遺伝子導入方法において、レトロウイルスと標的細胞とを共配置させることにより標的細胞のレトロウイルスによる遺伝子導入効率を向上させることができる有効量の機能性物質の存在下に、無血清培養培地中でレトロウイルスを標的細胞に感染させることを特徴とする。
本発明に使用される機能性物質には特に限定はなく、例えば、レトロウイルス結合部位と標的細胞結合部位とを同一分子中に有する物質またはレトロウイルス結合部位を有する分子と標的細胞結合部位を有する他の分子との混合物を使用することができる。レトロウイルス結合部位を有する機能性物質としては、例えば、フィブロネクチン、線維芽細胞増殖因子、コラーゲン、ポリリジンといった機能性物質またはこれらと同等のレトロウイルス結合活性を有する物質、例えば、上記以外のヘパリン結合性物質を使用することができる。また、標的細胞結合部位を有する機能性物質としては、例えば、標的細胞に結合するリガンドを有する物質を使用することができる。
本発明に好適な機能性物質としては、例えば、ヘパリン−II結合領域のようなレトロウイルス結合部位と、例えば、ＶＬＡ−５および／またはＶＬＡ−４への結合領域のような細胞結合部位とを有するフィブロネクチンフラグメントが挙げられる。例えば、配列表の配列番号１にアミノ酸配列を示したポリペプチド（ＣＨ−２９６）はヘパリン−II結合領域、ＶＬＡ−５およびＶＬＡ−４への結合領域を有するフィブロネクチンフラグメントである。
また、本発明の方法に使用される培養培地は血清を含有しないものであれば特に限定はなく、血清以外の細胞の維持、生育に必要な成分を混合して作製された培地を使用することができ、例えば、市販の無血清培地であってもよい。これらの培地は適当なタンパク質やサイトカイン類を含んでいてもよい。特に本発明には低密度リポプロテイン（ＬＤＬ）を含有する培地が好適である。
本発明の第２の発明は遺伝子が導入された細胞に関し、第１の発明の方法により、遺伝子を導入されていることを特徴とする。遺伝子の導入される細胞には特に限定はなく、入手可能な種々の細胞を標的として遺伝子導入を行うことができる。
また、本発明の第３の発明は遺伝子導入された細胞の脊椎動物への移植方法に関し、第２の発明の遺伝子導入細胞を脊椎動物に移植することを特徴とする。
さらに、本発明の第４の発明は遺伝子導入に使用される培養培地に関し、血清を含有せず、かつレトロウイルスと標的細胞とを共配置させることにより標的細胞のレトロウイルスによる遺伝子導入効率を向上させることができる有効量の機能性物質を含有することを特徴とする。
第４の発明に使用される機能性物質としては上記したものが使用でき、特に好適には、例えば、配列表の配列番号１にアミノ酸配列を示したポリペプチドを使用することができる。
また、第４の発明の培地は血清を含有しないものであれば特に限定はなく、例えば、血清を含有しない市販の細胞培養培地、特に好適には、低密度リポプロテインを添加した培地を使用することができる。さらに、必要に応じて適当なサイトカイン類を含有する培地であってもよい。
発明の詳細な説明
本発明の遺伝子導入方法には、通常、組換えレトロウイルスベクターが使用され、特に、複製能欠損組換えレトロウイルスベクターが好適である。該ベクターは感染した細胞中で自己複製できないように複製能を欠損させてあり、非病原性である。これらのベクターがパッケージングされたレトロウイルスは脊椎動物細胞、特に、哺乳動物細胞のような宿主細胞に侵入し、その染色体ＤＮＡ中にベクターに挿入された外来遺伝子を安定に組み込むことができる。
本発明では、細胞に導入しようとする外来遺伝子は適当なプロモーター、例えば、レトロウイルスベクター中に存在するＬＴＲのプロモーターや外来プロモーターの制御下に、レトロウイルスベクター内に挿入して使用することができる。また、外来遺伝子の転写を達成するためにはプロモーターおよび転写開始部位と共同する他の調節要素、例えば、エンハンサー配列がベクター中に存在していてもよい。さらに、好ましくは、導入された遺伝子はその下流にターミネーター配列を含有することができる。
導入される外来遺伝子は天然のものでも、または人工的に作製されたものでもよく、あるいは起源を異にするＤＮＡ分子が、ライゲーションや当該技術分野で公知の他の手段によって結合されたものであってもよい。
レトロウイルスベクターに挿入される外来遺伝子は、細胞中に導入することが望まれる任意の遺伝子を選ぶことができる。例えば、外来遺伝子は治療の対象となる疾患に関連している酵素やタンパク質、アンチセンス核酸もしくはリボザイムまたはフォルスプライマー（例えば、ＷＯ９０／１３６４１号参照）、細胞内抗体（例えば、ＷＯ９９４／０２６１０号参照）、増殖因子等をコードするものを使用することができる。
本発明で用いるレトロウイルスベクターは、遺伝子導入された細胞の選択を可能にする適当なマーカー遺伝子を有していてもよい。マーカー遺伝子としては、例えば、細胞に抗生物質に対する耐性を付与する薬剤耐性遺伝子や、酵素活性の検出によって遺伝子導入された細胞を見分けることができるレポーター遺伝子が利用できる。
使用できるベクターには、例えば、公知のＭＦＧベクター（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．６８７５４）やα−ＳＧＣ（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．６８７５５）等のレトロウイルスベクターがある。また、本明細書の下記の実施例において使用したＭＦＧ−ｎｌｓＬａｃＺベクター［ヒューマン・ジーン・セラピー（Human Gene Therapy）、第５巻、第１３２５〜１３３３頁（１９９４年）］はマーカー遺伝子としてβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を含有している。したがって、該ベクターによって遺伝子導入された細胞は、該遺伝子産物の酵素活性を適当な基質、例えば、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド（Ｘ−Ｇａｌ）を用いて調べることにより、確認することができる。
また、これらのベクターは公知のパッケージング細胞株、例えば、公知のＰＧ１３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１０６８６）、ＰＧ１３／ＬＮｃ８（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１０６８５）、ＰＡ３１７（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−９０７８）や米国特許５，２７８，０５６号に記載の細胞株、ＧＰ＋Ｅ−８６（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ９６４２）やＧＰ＋ｅｎｖＡｍ−１２（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ９６４１）、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・ザ・ＵＳＡ（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）、第８５巻、第６４６０〜６４６４頁（１９８８年）に記載のＰｓｉ−Ｃｒｉｐ等の細胞株を使用することにより、該ベクターがパッケージングされたウイルス粒子として調製することができる。
本発明の方法には培地として無血清培地が使用される。本明細書に記載の無血清培地とは、ヒトを含む動物由来の血清を含有せず、化学的に成分の明らかになっている物質によって構成されている動物細胞の培養のための培地を意味する。なお、血清を構成する成分であって精製、同定された物質が添加された培地は、本発明においては無血清培地に包含される。このような培地の基本的な成分としてはアミノ酸、糖類、有機酸のようなエネルギー源、ビタミン類、pＨ調整のための緩衝成分、無機塩類等があげられる。また、フェノールレッドのようなpＨ指示薬を含有していてもよい。このような基本的培地には公知の培地、例えば、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、イスコブ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）等が使用でき、これらは、例えば、ギブコＢＲＬ社から市販品として入手することができる。
これらの培地には、遺伝子導入の標的となる細胞の種類やその他の目的に応じて種々の成分を添加して用いることができる。例えば、標的細胞の生育や分化を促進または抑制する目的で各種のサイトカイン類を添加して使用することができる。このようなサイトカインとしては、インターロイキン類（ＩＬ−３、ＩＬ−６等）、コロニー刺激因子類（Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ等）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、エリスロポエチンや種々の細胞増殖因子等があり、その多くのものについてヒト由来のものが市販されている。これらのサイトカイン類を使用するにあたっては、目的に応じた作用を有するものを選択し、また、必要に応じてこれらを組み合わせて使用すればよい。
さらに、本発明者らは低密度リポプロテイン（Low Density Lipoprotein、ＬＤＬ）を培地に添加した場合に、特に良好な遺伝子導入効率が得られることを明らかにした。低密度リポプロテインはヒト由来のものが市販されており、例えば、シグマ（Ｓｉｇｍａ）社より入手することができる。下記実施例に示すように、低密度リポプロテインを含有する無血清培地中でレトロウイルス上清による細胞への遺伝子導入を行った場合には、従来使用されていた血清を含有する培地に比べて高い遺伝子導入効率が得られる。また、下記の機能性物質を共存させた場合にはさらに高い効率で遺伝子導入を行うことが可能である。
本発明はレトロウイルスと標的細胞とを共配置させることにより標的細胞のレトロウイルスによる遺伝子導入効率を向上させることができる機能性物質の共存下にレトロウイルスを標的細胞に感染させることを特徴とする。
これらの機能性物質の有効量をレトロウイルスを細胞に感染させる際に共存させておくことにより、高い効率で遺伝子導入細胞を得ることができる。これらの機能性物質としては、例えば、ＷＯ９５／２６２００号公報およびＷＯ９７／１８３１８号公報に記載された機能性物質を使用することができる。
本明細書において、有効量とはレトロウイルスによる標的細胞への遺伝子導入により標的細胞の形質転換が生じるのに有効な量であり、用いる機能性物質および標的細胞の種類により適切な量を選択する。この量は、例えば、本明細書記載の方法により遺伝子導入効率を測定し、決定することができる。また、遺伝子導入効率とは形質転換効率を意味する。
本発明に使用されるレトロウイルス結合部位を有する機能性物質としては、特に限定はなく、例えば、フィブロネクチンのヘパリン−II結合領域、線維芽細胞増殖因子、コラーゲン、ポリリジン等があり、また、これらの機能性物質と機能的に同等な物質、例えば、ヘパリン結合性部位を有する機能性物質も使用することができる。また、該機能性物質の混合物、該機能性物質を含有するポリペプチド、該機能性物質の重合体、該機能性物質の誘導体等を使用することができる。
また、本発明に使用される標的細胞結合部位を有する機能性物質も、特に限定はないが、標的細胞に結合するリガンドを有する物質であり、該リガンドとしては細胞接着性のタンパク質、ホルモンやサイトカイン、細胞表面の抗原に対する抗体、多糖類や糖タンパク、糖脂質中の糖鎖、標的細胞の代謝物などが挙げられる。また、該機能性物質を含有するポリペプチド、該機能性物質の重合体、該機能性物質の誘導体、該機能性物質の機能的同等物等を使用することもできる。
上記のような機能性物質は天然起源の物質から得ることができ、また、人為的に作製する（例えば、遺伝子組換え技術や化学合成技術によって作製する）ことができ、さらに、天然起源の物質と人為的に作製された物質との組合せにより作製することもできる。また、ＷＯ９７／１８３１８号公報に記載のように、これらの機能性物質を使用して遺伝子導入を実施する場合にはレトロウイルス結合部位を有する機能性物質と標的細胞結合部位を有する他の機能性物質とを混合して使用するか、あるいはレトロウイルス結合部位と標的細胞結合部位とを同一分子上に有する機能性物質を選択または作製して使用することができる。
本発明の方法においては、例えば、フィブロネクチンやそのフラグメント、またはこれらの混合物を使用することができるが、これらの機能性物質は天然起源のもの、または化学的合成により作製されたものであることができ、例えば、ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（J.Biol.Chem.）第２５６巻、第７２７７頁（１９８１年）、ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー（J.Cell.Biol.）、第１０２巻、第４４９頁（１９８６年）、ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー、第１０５巻、第４８９頁（１９８７年）に記載された方法によって、天然起源の物質から実質的に純粋な形態で製造することができる。この点に関して、本明細書記載のフィブロネクチンまたはフィブロネクチンフラグメントとは、これらが天然においてフィブロネクチンと一緒に存在する他のタンパク質を実質的に含有していないことを意味する。
さらに、本明細書で使用できるフィブロネクチンフラグメント、またはこのようなフラグメントの作製に関する有用な情報は、ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（J.Biochem.）、第１１０巻、第２８４〜２９１頁（１９９１年）（これは上記の組換フラグメントに関してさらに報告している）；エンボ・ジャーナル（EMBO J.）、第４巻、第１７５５〜１７５９頁（１９８５年）（これはヒトフィブロネクチン遺伝子の構造を報告している）；およびバイオケミストリー（Biochemistry）、第２５巻、第４９３６〜４９４１頁（１９８６年）（これはヒトフィブロネクチンのヘパリン−II結合領域について報告している）中に記載されている。
本明細書に記載のフィブロネクチンまたはフィブロネクチンフラグメントは、例えば、米国特許第５，１９８，４２３号に一般的に記載されているようにして、遺伝子組換え体より製造することもできる。特に、レトロウイルス結合部位であるヘパリン−II領域を含むフィブロネクチンフラグメント、たとえば、下記実施例で使用されるＣＨ−２９６（配列表の配列番号１にそのアミノ酸配列を示す）、およびＨ−２７１、Ｈ−２９６、ＣＨ−２７１等の組換えポリペプチド、ならびにこれらを取得する方法はこの特許明細書に詳細に記載されている。これらのフラグメントは上記公報に記載されているように、日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号の通産省工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ  Ｐ−１０７２１（Ｈ−２９６）（原寄託日：平成１年５月１２日）、ＦＥＲＭ  ＢＰ−２７９９（ＣＨ−２７１）（原寄託日：平成１年５月１２日）、ＦＥＲＭ  ＢＰ−２８００（ＣＨ−２９６）（原寄託日：平成１年５月１２日）およびＦＥＲＭ  ＢＰ−２２６４（Ｈ−２７１）（原寄託日：平成１年１月３０日）の受託番号のもとで寄託された大腸菌を培養することによって入手することができる。また、これらのフラグメントから定型的に誘導できるフラグメントは上記の大腸菌に保持されているプラスミドを公知の遺伝子組換え手法で改変することにより、作製することができる。なお、上記のフィブロネクチンフラグメントのうち、Ｈ−２９６はＶＬＡ−４への結合領域ポリペプチドを、ＣＨ−２７１はＨＬＡ−５への結合領域ペプチドを、また、ＣＨ−２９６はその両方を有している［ネイチャー・メディシン（Nature Medicine）、第２巻、第８７６〜８８２頁（１９９６年）］。
下記実施例に記載のとおり、フィブロネクチンや上記のフィブロネクチンフラグメントＣＨ−２９６存在下では無血清培地中での遺伝子導入効率が向上する。また、ＷＯ９７／１８３１８号公報に記載のように、例えば、レトロウイルス結合領域を有するフィブロネクチンフラグメントである上記のＨ−２７１と細胞結合活性を有するフィブロネクチンフラグメントであるＣ−２７１とを混合して使用することによっても同様の遺伝子導入効率を得ることができる。
上記のフィブロネクチン、フィブロネクチンフラグメントまたはこれらの混合物の有効量の存在下、無血清培地中で細胞にレトロウイルスを感染させることにより、遺伝子が導入された細胞を効率よく得ることができる。フィブロネクチン、フィブロネクチンフラグメントまたはこれらの混合物は、例えば、レトロウイルスの感染に用いられる培養容器の表面に固定化された状態で使用してもよい。レトロウイルスの感染は通常の方法、例えば、３７℃、炭酸ガス濃度５％の条件でのインキュベーションによって行うことができる。この条件やインキュベーションの時間は標的細胞や目的に応じて適宜変更してよい。
標的細胞がＧ0期の細胞である場合にはレトロウイルスが感染しないため、予備刺激によって細胞周期に誘導することが好ましく、この目的で、レトロウイルスの感染に先立って、標的細胞を適当な標的細胞増殖因子の存在下で培養する。例えば、骨髄細胞や造血幹細胞に遺伝子導入を行う場合の予備刺激には、インターロイキン（ＩＬ）−６や幹細胞因子等の標的細胞増殖因子が使用される。
本発明の方法による遺伝子導入の標的となる細胞も特に制限はなく、例えば、幹細胞（stem cells）、造血細胞、非接着性低密度単核細胞、接着性細胞、骨髄細胞、造血幹細胞、末梢血幹細胞、臍帯血液細胞、胎児性造血幹細胞、胚形成幹細胞、胚細胞、プライモディアル・ジャーム・セル（primordial germ cell）、卵母細胞、卵原細胞、卵子、精母細胞、精子、ＣＤ３４＋細胞、Ｃ−ｋｉｔ＋細胞、多能性造血前駆細胞、単能性造血前駆細胞、赤血球系前駆細胞、リンパ球母細胞、成熟血球、リンパ球、Ｂ細胞、Ｔ細胞、線維芽細胞、神経芽細胞、神経細胞、内皮細胞、血管内皮細胞、肝細胞、筋芽細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞、ガン細胞、骨髄腫細胞および白血病細胞等を使用することができる。血液や骨髄より得られる造血系の細胞は入手が比較的容易であり、また、その培養や維持の手法が確立されていることから、本発明の方法を利用するのに好適である。
特に、導入された遺伝子の長期にわたる発現が目的の場合には造血幹細胞、ＣＤ３４＋細胞、Ｃ−ｋｉｔ＋細胞、多能性造血前駆細胞等の血液系の前駆細胞が標的細胞に適している。
機能性物質として上記のフィブロネクチンやフィブロネクチンフラグメント、特に細胞結合部位としてＶＬＡ−５および／またはＶＬＡ−４への結合領域を有しているフィブロネクチンフラグメントを使用することにより、細胞表面にＶＬＡ−５およびＶＬＡ−４を発現している細胞、例えば、造血幹細胞やＣＤ３４＋細胞に効率よく遺伝子導入を行うことができる。
上記のように、本発明の方法によって遺伝子を導入された細胞は生体に移植することが可能であり、これによって生体内で外来遺伝子を発現させる遺伝子治療を行うことができる。本発明の方法によって得られる遺伝子導入細胞は異種動物血清由来のタンパクや不純物を含有しないため、生体への移植に好適である。例えば、造血幹細胞を標的細胞とした遺伝子治療は以下のような操作によって実施することができる。
まず、ドナーより造血幹細胞を含有する材料、例えば、骨髄組織、末梢血液、臍帯血液等を採取する。これらの材料はそのまま遺伝子導入操作に用いることも可能であるが、通常は、密度勾配遠心分離等の方法により造血幹細胞が含まれる単核細胞画分を調製するか、さらに、ＣＤ３４および／またはＣ−ｋｉｔといった細胞表面のマーカー分子を利用した造血幹細胞の精製を行う。これらの造血幹細胞を含有する材料について、必要に応じて適当な細胞増殖因子等を用いた予備刺激を行った後、本発明の方法により目的とする遺伝子を挿入された組換えレトロウイルスベクターを感染させる。こうして得られた遺伝子導入された細胞は、例えば、静脈内投与によってレシピエントに移植することができる。レシピエントは、好ましくはドナー自身であるが、同種異系移植を行うことも可能であり、例えば、臍帯血液を材料とした場合には同種異系移植が行われる。
造血幹細胞を標的とした遺伝子治療としては、患者において欠損しているか、異常が見られる遺伝子を補完するものがあり、例えば、ＡＤＡ欠損症やゴーシェ病の遺伝子治療がこれにあたる。この他、例えば、ガンや白血病の治療に使用される化学療法剤による造血細胞の障害を緩和するために、造血幹細胞への薬剤耐性遺伝子の導入が行われることがある。
また、ガンの遺伝子治療法としては、ガン細胞にサイトカイン類の遺伝子を導入した後にその増殖能力を奪って患者の体内に戻し、腫瘍免疫を増強させる腫瘍ワクチン療法が研究されている［ヒューマン・ジーン・セラピー（Human Gene Therapy）、第５巻、第１５３〜１６４頁（１９９４年）］。さらに、ＡＩＤＳを遺伝子治療法によって治療しようという試みも行われている。この場合には、ＡＩＤＳの原因であるＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）の感染するＴ細胞に、ＨＩＶの複製や遺伝子発現を妨げるような核酸分子（アンチセンス核酸やリボザイム等）をコードする遺伝子を導入することが考えられている［例えば、ジャーナル・オブ・ウイロロジー（J.Virol.）、第６９巻、第４０４５〜４０５２頁（１９９５年）］。
下記実施例に記載のように、本発明の遺伝子導入方法を用いることにより、高い効率で遺伝子導入された細胞を得ることができる。こうして得られた細胞は異種生物由来の血清を含まないことから、特別な操作を加えることなく生体に移植することが可能である。さらに、従来法に用いられてきた培地に比べて培地中の成分の種類やその含量に変動がないため、再現性のよい遺伝子導入を行うことが可能になる。
以下に実施例を挙げて、さらに詳しく本発明を説明するが、本発明は下記実施例の範囲のみに限定されるものではない。
実施例１
ＣＨ−２９６の調製
ヒトフィブロネクチン由来のポリペプチド、ＣＨ−２９６（配列表の配列番号１にそのアミノ酸配列を示す）は該ポリペプチドをコードするＤＮＡを含む組換えプラスミドｐＣＨ１０２を含有する大腸菌、Escherichia coli ＨＢ１０１／ｐＣＨ１０２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２８００）より、米国特許第５，１９８，４２３号公報に記載の方法により調製した。
実施例２
フィブロネクチン、ＣＨ−２９６のプレートへの固定化
フィブロネクチン（シグマ社製）は５０μｇ／ｍｌとなるように、また、実施例１に記載のＣＨ-２９６は１００μｇ／ｍｌとなるように、それぞれリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、バイオウイッタカー社製）に溶かし、０．２２μｍのフィルター（ミニザルト・フィルター０．２２μｍ、ザルトリウス社製）で濾過した。１２−ウエルプレート（ファルコン社製）の１ウエル当たり１ｍｌのＣＨ-２９６溶液またはフィブロネクチン溶液を加え、室温で２時間インキュベートし、固定化を行った。固定化に供した溶液を１ウエル当たり２ｍｌの２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、シグマ社製）を含むＰＢＳに交換して、さらに、３０分室温でインキュベートした後、２５ｍＭヘペス（ＨＥＰＥＳ、ギブコＢＲＬ社製）を含むハンクスの緩衝塩溶液（ギブコＢＲＬ社製）で、プレートを２回洗浄した。
実施例３
ウイルス上清液の調製
レトロウイルスベクターＭＦＧ−ｎｌｓＬａｃＺ［ヒューマン・ジーン・セラピー（Human Gene Therapy）、５巻、１３２５-１３３３頁（１９９４年）］を産生するＰｓｉ−Ｃｒｉｐ細胞［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・ザ・ＵＳＡ（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）、第８５巻、第６４６０〜６４６４頁（１９８８年）］由来の細胞であるＡ７．２１細胞の培養には、１０％子ウシ血清（ＪＲＨバイオサイエンス社製）、１００単位／ｍｌペニシリン−１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（ギブコＢＲＬ社製）を含むＤＭＥＭ培地（バイオウイッタカー社製）を用いた。３×１０6個のＡ７．２１細胞を１００ｍｍ径の組織培養用のディッシュ（ファルコン社製）に植えて１晩培養した後、培地を取り除き、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ、バイオウイッタカー社製）を含む５ｍｌのＲＰＭＩ培地（バイオウイッタカー社製）、または４０μｇ／ｍｌ低密度リポプロテイン（ＬＤＬ、シグマ社製）を含む５ｍｌのＢＩＴ−９５００培地（ステム・セル・テクノロジーズ社製）に置換した。２４時間培養後、培養上清を集め、０．４５μｍのフィルター（ミニザルト・フィルター０．４５μｍ、ザルトリウス社製）で濾過した後、インターロイキン-３（ＩＬ−３、アムジェン社製）を１０ｎｇ／ｍｌ、インターロイキン-６（ＩＬ−６、アムジェン社製）を１０ｎｇ／ｍｌ、幹細胞因子（ＳＣＦ、アムジェン社製）を１００ｎｇ／ｍｌとなるようにそれぞれ添加した。
こうして得られたウイルス液のタイターを既報［キャンサー・ジーン・セラピー（Cancer Gene Therapy）、４巻、５〜８頁（１９９７年）］の方法に従い、Ｒａｔ２細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１７６４）を用いて測定したところ、１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ培地を用いたもので１．７×１０7ｐｆｕ／ｍｌ、また、４０μｇ／ｍｌ ＬＤＬを含むＢＩＴ−９５００培地を用いたもので１．８×１０6ｐｆｕ／ｍｌであった。
実施例４
ＣＤ３４＋細胞の単離
ＣＤ３４＋細胞は化学療法およびＧ−ＣＳＦで動員したヒト末梢血［ヒューマン・ジーン・セラピー（Human Gene Therapy）、５巻、１３２５-１３３３頁（１９９４年）］より、免疫磁気分離法（マグネティック・アクティベイテッド・セル・ソーディング、ミルテニ・バイオテック社製）を用いて単離した。得られたＣＤ３４＋細胞の純度は９５％であった。
実施例５
ＣＤ３４＋細胞への遺伝子導入
（１）上清法による遺伝子導入
ＣＤ３４＋細胞は、レトロウイルスの感染に先立って予備刺激を行った。
すなわち、実施例４で調製したＣＤ３４＋細胞を１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−３、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−６、１００ｎｇ／ｍｌのＳＣＦの存在下、１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ培地中、あるいは４０μｇ／ｍｌのＬＤＬを含むＢＩＴ−９５００培地中で４８時間インキュベートした。３×１０5個の予備刺激されたＣＤ３４＋細胞を実施例３で調製したウイルス液に懸濁した。なお、ウイルス液はそれぞれのＣＤ３４＋細胞の予備刺激に使用されたものと同じ培地で調製されたものを選んで使用した。この細胞懸濁液を何も固定化されていない１２−ウエルプレートのウエル（無処理ウエル）、および実施例２で作製されたフィブロネクチンが固定化されたウエル、ＣＨ−２９６が固定化されたウエルのそれぞれに添加し、細胞を５％炭酸ガス存在下、３７℃で、２時間培養した。無処理ウエル、およびフィブロネクチンが固定化されたウエルにはポリブレン（４μｇ／ｍｌ、シグマ社製）を添加した。２時間後、新たなウイルス液（上記の濃度のＩＬ−３、ＩＬ−６、ＳＣＦを含む）を添加し、５％炭酸ガス存在下、３７℃で、さらに２２時間培養した。培養後、細胞を細胞解離緩衝液を用いて回収し、１０％ＦＣＳを含有するＲＰＭＩ培地中あるいは４０μｇ／ｍｌのＬＤＬを含むＢＩＴ−９５００培地に懸濁して２４時間培養した。
（２）共培養法による遺伝子導入
共培養を始める前日、Ａ７．２１細胞を１０μｇ／ｍｌのアメタイシン（Ｃｈｏａｙ−Ｓａｎｏｆｉ社製）で２時間処理した後、トリプシン／ＥＤＴＡ（ギブコＢＲＬ社製）を用いて細胞を回収した。この細胞懸濁液２×１０5個細胞相当を１２−ウエルプレートに添加した。ＣＤ３４＋細胞は、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−３、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−６、１００ｎｇ／ｍｌのＳＣＦの存在下、１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ培地中あるいは４０μｇ／ｍｌのＬＤＬを含むＢＩＴ−９５００培地中で２４時間予備刺激した。１０5の予備刺激されたＣＤ３４＋細胞をそれぞれ上記のＡ７．２１細胞の添加されたウエルに添加し、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−３、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−６、１００ｎｇ／ｍｌのＳＣＦ、４μｇ／ｍｌのポリブレンの存在下、予備刺激に使用した培地（１ｍｌ／ウエル）中で培養した。７２時間後、非接着細胞を集め、ＩＭＤＭ培地（バイオウイッタカー社製）に懸濁した。
実施例６
遺伝子導入の評価
実施例５で得られた遺伝子導入細胞２５０個ずつを０．９％メチルセルロース、３０％ＦＣＳ、１％ＢＳＡ、０．１ｍＭメルカプトエタノール、２ｍＭグルタミンを含む半固形培地（メソカルトＨ４２３０、ステム・セル・テクノロジーズ社製）０．５ｍｌを含むプレートにそれぞれ加えた（操作は、各３連で行った）。なお、培地には２単位／ｍｌのエリスロポエチン（アムジェン社製）、１０ｎｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦ（アムジェン社製）、１０ｎｇ／ｍｌのＧ−ＣＳＦ（アムジェン社製）、１０ｎｇ／ｍｌのＳＣＦ、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−３、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−６を添加した。
遺伝子導入効率はｎｌｓＬａｃＺ遺伝子より発現されるβ−ガラクトシダーゼの酵素活性から求めた。２１日間培養した上記のプレートを直接Ｘ−Ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド）で染色した後、青く染色されたコロニーを計数し、その全コロニーに対する割合を調べた。
こうして得られたＸ−Ｇａｌ陽性コロニーの割合を表１に示す。
0003754090.tif 000002
上記の結果は、フィブロネクチンやそのフラグメントであるＣＨ−２９６と、ＬＤＬを含むＢＩＴ−９５００培地、すなわち、無血清培地との組み合わせが、高効率の遺伝子導入を可能ならしめることを示している。
配列表
SEQUENCE LISTING
<110>バグニ,クロード;アンベール,アン−マリー;
Bagnis,Claude;Imbert,Anne-Marie;
マノニ,パトリス;寶酒造株式会社
Mannoni,Patrice;Takara Shuzo Co.,Ltd.
<120>無血清培地を用いた遺伝子導入方法
<130>660837
<150>JP 9-196772
<151>1997-7-23
<160>1
<210>1
<211>５７４
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>1
0003754090.tif 000003
0003754090.tif 000004
0003754090.tif 000005
0003754090.tif 000006