(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養液から、ラクトンを形成しうるカルボン酸及び融合型の二環式の環を含んで成るスタチン化合物を単離するための方法であって；
(a)非極性不純物を除去するために、培養液を前処理し、ここで当該前処理は、培養液をアルカリ条件下で処理し、次に非極性不純物を前処理用疎水性有機抽出溶媒に抽出することを含んでなり；
(b)培養液を抽出溶媒と接触させ、そしてスタチン化合物を培養液から疎水性有機抽出溶媒である抽出溶媒に抽出することによってスタチン化合物を培養液から抽出し；
(c)疎水性有機抽出溶媒を培養液から分離し；
(d)抽出されたスタチン化合物を含む疎水性有機抽出溶媒の溶液を濃縮し；そして
(e)抽出されたスタチン化合物を結晶化によって精製する、
段階を含んで成る方法。
【請求項２】
スタチン化合物がHMG-CoAレダクターゼの阻害剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
スタチン化合物がロバスタチン、コンパクチン及びプラバスタチンから成る群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
培養液の前処理段階の間、培養液が
(a)15℃〜100℃の温度で、
(b)7.0〜13.9のpHで、そして
(c)15分〜48時間の期間、
維持される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
培養液の前処理段階の間、培養液が
(a)55℃〜65℃の温度で、
(b)9.0〜9.6のpHで、そして
(c)２時間の期間、
維持される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
水酸化アンモニウム、NaOH、KOH、LiOH及びCa(OH)2から成る群から選択される無機性塩基を用いて培養液のpHを調節する段階を更に含んで成る、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前処理用疎水性有機抽出溶媒が、酢酸i−ブチル、酢酸n−ブチル、酢酸t−ブチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、ギ酸エチル、ブチルメチルケトン、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、ジクロロエタン、トルエン、アセトニトリル、ギ酸メチル、メタノール、エタノール、i−プロパノール、n−プロパノール、n−ブタノール、i−ブタノール、t−ブタノール、アミルアルコール及びベンジルアルコール、並びにそれらの混合物から成る群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
疎水性有機抽出溶媒が酢酸i−ブチル、酢酸n−ブチル、酢酸t−ブチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、ギ酸エチル、ブチルメチルケトン、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、ジクロロエタン、又はトルエンである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
培養液からスタチン化合物を抽出する段階が、培養液のpHを1.0〜6.4に調節することを更に含んで成る、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
培養液のpHが2.0〜4.5に調節される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
培養液のpHが、硫酸及びリン酸から成る群から選択される酸を用いて調節される、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
培養液からスタチン化合物を抽出する段階が、段階(b)の疎水性有機抽出溶媒のpHをpH1.0〜6.4に調節することを含んで成る、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
段階(b)の疎水性有機抽出溶媒が酢酸i−ブチル、酢酸n−ブチル、酢酸t−ブチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、ギ酸エチル、ブチルメチルケトン、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、ジクロロエタン及びトルエンから成る群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
段階(b)後に、疎水性有機抽出溶媒が塩基を含む水溶液と接触される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
塩基が水酸化アンモニウム、NaHCO3及びNa2CO3から成る群から選択される、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
疎水性有機抽出溶媒が酢酸i−ブチルであり、そしてスタチン化合物がコンパクチンである、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
抽出されたスタチン化合物を含む疎水性有機抽出溶媒の溶液を濃縮する段階が、低圧下で実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
抽出されたスタチン化合物を含む疎水性有機抽出溶媒の溶液を濃縮する段階が、90℃以下の温度での蒸発によって実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
結晶化の段階が、−10℃〜20℃の温度で実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
結晶化の段階が、０℃〜５℃の温度で実施される、請求項19に記載の方法。
【請求項２１】
結晶化の段階が、−10℃〜０℃の温度で実施される、請求項19に記載の方法。
【請求項２２】
抽出されたスタチン化合物の結晶化による精製段階が、エタノール、i−プロパノール、n−プロパノール、i−ブタノール、n−ブタノール、t−ブタノール、酢酸エチル、アセトン、メタノール、アセトニトリル、ギ酸エチル、酢酸i−ブチル、酢酸t−ブチル、酢酸n−ブチル、トルエン、酢酸プロピル、及びブチルメチルケトン、並びにそれらの混合物から成る群から選択される溶媒を用いて実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
培養液から、ラクトンを形成しうるカルボン酸及び融合型の二環式の環を含んで成るスタチン化合物を単離するための方法であって；
(a) 非極性不純物を除去するために、培養液を前処理し、ここで当該前処理は、培養液をアルカリ条件下で処理し、次に非極性不純物を前処理用疎水性有機抽出溶媒に抽出することを含んでなり；
(b)培養液を疎水性有機抽出溶媒と接触させ、そしてスタチン化合物を培養液から疎水性溶媒に抽出することによって培養液からスタチン化合物を抽出し；
(c)疎水性有機抽出溶媒を培養液から分離し；
(d)抽出されたスタチン化合物を含む疎水性有機抽出溶媒の溶液を濃縮し；
(e)疎水性溶媒の濃縮溶液を、塩基を含む水溶液で洗浄し；そして
(f)抽出されたスタチン化合物を結晶化によって精製する、
段階を含んで成る方法。
【請求項２４】
水性塩基性溶液が水酸化アンモニウム、NaHCO3及びNa2CO3を含んで成る、請求項23に記載の方法。
【請求項２５】
スタチン化合物がHMG-CoAレダクターゼの阻害剤である、請求項23に記載の方法。
【請求項２６】
単離されたスタチン化合物の濃度が98.5％以上である、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
単離されたスタチン化合物の濃度が98.5％以上である、請求項23に記載の方法。
【請求項２８】
段階(b)において、前記培養液を酸性条件下で前記抽出溶媒と接触させる、請求項１又は23に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願に対するクロスリファレンス
本出願は、引用によってその全体が本明細書に組み入れられる、２０００年２月２日に出願された、仮特許出願番号60/184,522に対し優先権を主張するものである。
【０００２】
本発明の分野
本発明は、培養液から化合物を精製するための方法に関する。更に具体的には、本発明は結晶型での培養液からのスタチン類の単離に関する。
【０００３】
本発明の背景
心血管疾患、例えば心筋梗塞、発作、及び末梢血管疾患の合併症は、米国の死亡原因の半分を占める。血流中の高レベルの低密度リポタンパク質(LDL)は、血流を妨害し、そして破裂させ、そして血栓症を促進しうる冠動脈の病変の形成と関連づけられている。Goodman and Gilman's, The Pharmacological Basis of Therapeutics 879(Joel G. Hardman et al.,eds, 9th ed. 1996).血漿LDLレベルの低下は、心血管疾患を有する患者及び心血管疾患ではないが高コレステロール血症を有する患者の臨床徴候の危険性を低下させることが示されている。Scandinavian Simvastatin Survival Study Group, 1994;Lipid Research Clinics Program, 1984a 1984b.
【０００４】
スタチン系薬は、心血管疾患の危険性がある患者の血流中のLDLレベルを低下させるのに利用可能な、現在最も治療的に有効な薬物である。この薬物のクラスは、特にコンパクチン、ロバスタチン、シンバスタチン、プラバスタチン及びフルバスタチンを含む。スタチン系薬の作用機構はある程度詳細に解明されている。それらは、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルcoAレダクターゼ酵素（「HMG-CoAレダクターゼ」）を競合的に阻害することによって肝臓におけるコレステロール及び他のステロールの合成を中断する。HMG-CoAレダクターゼは、コレステロールの生合成における速度制御段階である、HMG-CoAからメバロン酸塩への変換を触媒する。その結果、その阻害は肝臓におけるコレステロールの形成速度の低下を招く。
【０００５】
コンパクチンは、式
【化１】
0003740062.tif 000002
の化合物２−メチルブタン酸1,2,3,7,8,8a−ヘキサヒドロ−７−メチル−８−［２−（テトラヒドロ−４−ヒドロキシ−６−オキソ−２Ｈ−ピラノ−２−イル）エチル］−１−ナフタレニルエステルの一般的な医薬名である。
【０００６】
コンパクチンは、メバスタチンとも称されており、HMG-CoAレダクターゼ阻害剤であることが示された最初のスタチン系薬である。コンパクチンは、ペニシリウム・シトリナム(Penicillium citrinum)及びペニシリウム・アダメトジオデス(Penicillium adametsiodes)から精製された（引用によって本発明に組み入れられる米国特許第3,983,140号；第4,049,495号及び第5,691,173号を参照のこと）。
【０００７】
ロバスタチンは、式
【化２】
0003740062.tif 000003
の化合物２−メチルブタン酸1,2,3,7,8,8a−ヘキサヒドロ−３，７−ジメチル−８−［２−（テトラヒドロ−４−ヒドロキシ−６−オキソ−２Ｈ−ピラノ−２−イル）エチル］−１−ナフタレニルエステルの一般的な医薬名である。
【０００８】
ロバスタチンは、メビノリンとも称されており、メチル基の存在においてのみコンパクチンと異なり、そしてアスペルギルス・テレウス(Aspergillus terreus)から単離され得る（引用によって本発明に組み入れられる米国特許第4,294,926号；第4,420,491号、第4,319,039号及び第4,294,896号を参照のこと）。ロバスタチンは更に複数の他の微生物から単離されている（英国特許第GB2,046,737号、ドイツ特許第44 02 591号；カナダ特許第2,129,416号；及びハンガリー特許第HU 208,997号を参照のこと）。
【０００９】
コンパクチン及びロバスタチン、並びに他のスタチン類は、以下に示すように開環状のヒドロキシ酸として、且つラクトン型で存在する。
【化３】
0003740062.tif 000004
【００１０】
ラクトンとヒドロキシ酸との間の平衡が精製を困難にするのは、スタチン化合物の遊離酸とラクトン型が異なる極性を有するためである。一方の型を精製する方法は他方の型を除去しやすく、それによって全体の収率が低下する。その結果、高い収率で得るためにスタチン化合物を精製する場合には、通常多大な注意を働かせなければならない。
【００１１】
米国特許第5,202,029号は、HPLCを用いるスタチン化合物のラクトン型の精製方法に関する。粗製培養液（例えばロバスタチン、シンバスタチン、プラバスタチン、フルバスタチン及びメバスタチン）は有機溶媒中で溶解され、そしてHPLCカラムを介して溶出される。スタチンは、溶出液に溶解した溶質としてカラムから溶出する。当該溶出液は部分的に溶出され、そして次に水が加えられて結晶化を誘導する。工業的規模での製造についての主要な欠点は、クロマトグラフィーカラムが非常に高価なことである。
【００１２】
米国特許第5,616,595号は、接線(tangential)濾過によって、培養液から広範な水溶性化合物を回収するための連続方法に関する。当該方法は、ロバスタチン、プラバスタチン及びシンバスタチンのラクトン型に適用されうる。当該方法は、不溶性化合物を保持するフィルターを介して培養液を循環させることを含んで成る。当該化合物は溶媒に溶解され、そして溶液は濾過される。所望な化合物の溶液が濾液として回収され、そして次に、所望な化合物は更なる精製にかけてもよい。当該化合物の水における不溶性により、当該方法は溶解のための溶媒を必要とし、そして複数の濾過膜を必要とする。繰り返しの濾過は、当該方法を大規模な製造について非常に高価なものとする。
【００１３】
ラクトン型のロバスタチンを単離するための方法は、米国特許第5,712,130号に記載されている。この方法において、ロバスタチンは酢酸ブチルを用いて培養液から抽出される。次に、生じた溶液は遠心され、そして水相が廃棄される。有機相は４０℃以上で真空蒸留され、これは溶液の濃縮に加えて、水の除去によってラクトンの形成を促進する。ロバスタチンのラクトン型の結晶は冷却によって形成し、そして９０％の純度に再結晶かされる。しかしながら、医薬としての使用の前に、結晶化したロバスタチンは更に精製されなければならず、このことが全体的な収率を低下させ、そして当該手順に追加の支出を加える。
【００１４】
本発明の目的及び要約
培養液からスタチンを単離するための既知の方法は、工業的な規模での経済的な方法で、医薬として許容されるレベルの純度で達成されず、そして高純度を達成するためのクロマトグラフィー的な分離を必要とする。本発明の目的は、医薬として許容されるレベルの純度（すなわち９８．５％以上）での培養液からのスタチンの単離のための、単純で、迅速で、高収率の方法についての当業界での必要性を満たすことにある。
【００１５】
本発明の別の目的は、ラクトンを形成しうるカルボン酸及び融合型の二環式の環を含んで成るスタチン化合物を培養液から単離するための方法にある。当該方法は、培養液を抽出溶媒と接触させ、そして培養液由来のスタチン化合物を抽出溶媒に抽出することによって培養液からスタチン化合物を抽出し；疎水性有機抽出溶媒を培養液から分離し；抽出されたスタチン化合物を含む疎水性有機抽出溶媒の溶液を濃縮し；そして抽出されたスタチン化合物を結晶化によって精製する、段階を含んで成る。
【００１６】
本発明の別の目的は、ラクトンを形成しうるカルボン酸及び融合型の二環式の環を含んで成るスタチン化合物を培養液から単離するための方法であって、
(a)非極性不純物を除去するために、アルカリ性条件下で培養液を前処理し；
(b)スタチン化合物を培養液から疎水性有機抽出溶媒に抽出し；
(c)疎水性有機抽出溶媒を培養液から分離し；
(d)抽出されたスタチン化合物を含む疎水性有機抽出溶媒の溶液を濃縮し；
(e)ラクトンを精製するために、疎水性有機抽出溶媒の濃縮溶液を、塩基を含む水溶液で洗浄し；そして
(g)抽出されたスタチン化合物を結晶化によって精製する、
段階を含んで成る方法にある。
【００１７】
本発明の詳細な説明
本発明は、コンパクチン及びロバスタチンの精製によって例示したような、培養液からスタチン化合物の高度に精製された結晶を得るための方法である。当業者は、本発明の方法が微生物的又は酵素的方法によって産生され、そしてラクトン、例えばシンバスタチン、プラバスタチン及びフルバスタチンを含む他の化合物を精製するために使用され得ることを認識するだろう。当業者は更に、スタチン化合物を精製するための任意な条件が単離されるべき特定のスタチン化合物、培養液及び当該化合物を産生する微生物に依存して変更され得る事を認識するだろう。
【００１８】
本発明の好ましい態様は、(i)非極性不純物を除去するために、アルカリ性条件下で培養液を前処理し；(ii)酸性条件下で、ヒドロキシ酸又はラクトンとしてのスタチン化合物を培養液から疎水性有機抽出溶媒に抽出し；(iii)疎水性有機抽出溶媒を培養液から分離し；(iv)抽出されたスタチン化合物を含む疎水性有機抽出溶媒の溶液を濃縮し、同時にラクトンを形成し；(v)；そして抽出されたスタチン化合物を結晶化によって精製する、
段階を含む。
【００１９】
本発明の別の態様において、アルカリ性条件下での培養液の前処理段階は省略される。
【００２０】
別の態様において、結晶化の前に、濃縮された疎水性有機溶媒は、収率を増大せしめるために塩基を含む水性溶液を用いて洗浄される。好ましい塩基性溶液は、水酸化アンモニウム（NH4OH、約７．５〜約１０のpH）、あるいは約１〜５％(w/w)の炭酸水素ナトリウム(NaHCO3)又は炭酸ナトリウム(Na2CO3)を含む。
【００２１】
アルカリ性条件下での培養液の前処理
培養液の前処理は、アルカリ性条件下での培養液の処理、それに続く疎水性有機抽出溶媒又は溶媒混合物への抽出、を含む。前処理段階のアルカリ性条件は、スタチンのラクトンを、相当するスタチンのヒドロキシ酸に加水分解する(Andrew Streitweiser, Jr. and Clayton Heathock, Introduction to Organic Chemistry, 858-60 MacMillan Publishing Co., 2d Ed. 1981)。スタチンのヒドロキシ酸は水性培養液中で保持され、一方培養液由来の脂肪性物質及び油性物質並びに他の非極性有機性不純物は、前処理用疎水性有機抽出溶媒又は溶媒混合物に分配される。このように、アルカリ性条件下での培養液の前処理は、不純物からスタチンのヒドロキシ酸を分離することによって、スタチンのヒドロキシ酸の全体的な精製をもたらす。
【００２２】
非極性不純物の除去は、培養液中の非極性不純物の存在が結晶化の収率を低下させると考えられているように、結晶化の全体的な収率を向上させる。従って、アルカリ性条件下での培養液の前処理は培養液から非極性不純物を除去し、それによって結晶化段階の全体的な収率を増大せしめる。
【００２３】
前処理段階の間、培養液、又は培養液と疎水性有機抽出溶媒の混合物は、アルカリ性のpHに調節される。好ましくは、当該pHは無機性塩基又は有機性アミンの添加によって調節される。好ましい無機性塩基又は有機性アミンは、NaOH、KOH、LiOH、Ca(OH)2、NH4OH及びトリエチルアミンを含む。最も好ましくは、当該塩基はNaOHである。pHは約７．０〜約１３．９である。コンパクチン及びロバスタチンにとって好ましくは、pHは約８．５〜約１０．０の範囲にある。コンパクチン及びロバスタチンにとって最も好ましくは、pHは約９．０〜約９．６である。
【００２４】
アルカリ性条件下での前処理のインキュベーションは、約１５℃〜約１００℃の温度で実施され得る。約１５〜２０℃の温度は、精製されたスタチンの全体的な収率の低下をもたらす。
【００２５】
約８０℃〜約１００℃での前処理のインキュベーションにとって好ましい条件は、約１２．０〜約１３．９のｐＨで約１５分である。約５５〜約６５℃での前処理のインキュベーションにとって好ましい条件は、約９．０〜約９．６のｐＨで２時間である。約１５〜約２５℃での前処理のインキュベーションにとって好ましい条件は、約９．０〜約９．６のｐＨで４８時間である。
【００２６】
前処理用疎水性有機抽出溶媒は、限定しないが酢酸i−ブチル、酢酸n−ブチル、酢酸t−ブチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、ギ酸エチル、ブチルメチルケトン、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、ジクロロエタン、トルエン、アセトニトリル、ギ酸メチル、メタノール、エタノール、i−プロパノール、n−プロパノール、n−ブタノール、i−ブタノール、t−ブタノール、アミルアルコール及びベンジルアルコールを含む。
【００２７】
あるいは、前処理用疎水性有機抽出溶媒は、上記溶媒のいずれかの混合物を含んで成ることもある。アルカリ抽出のための有機溶媒は、限定しないが酢酸i−ブチル、酢酸n−ブチル、酢酸t−ブチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、ギ酸エチル、ブチルメチルケトン、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、ジクロロエタン、トルエン、及びベンジルアルコールを含む。好ましい疎水性有機抽出溶媒は、酢酸i−ブチル、酢酸エチル及びトルエンである。最も好ましい疎水性有機抽出溶媒は酢酸i−ブチルである。アルコール類が使用されるが好ましくないのは、溶媒の再生のためである。それにも関わらず、アルコール類はアルカリ性pHでの酢酸塩の場合に存在する。アルコール類は、アルカリ性条件下でのラクトン環の開口を助ける。前処理も抽出溶媒無しで実施され得る。
【００２８】
この好ましい態様において、前処理の後、疎水性有機抽出溶媒は、脂肪性物質及び油性物質並びに他の非極性有機性不純物が培養液から実施的に除去されるまで、アルカリ性条件下で培養液と接触される。主観的判断を含む、薄層クロマトグラフィー又は任意な他の方法は、培養液からの非極性不純物の除去を評価するために使用され得る。複数回の抽出は、不純物の最適な除去のために実施され得る。しかしながら、１〜２回の抽出は、酢酸i−ブチルがアルカリ抽出に使用される場合に高度に効果的である。好ましくは、アルカリ抽出は、培養液の約２０％〜約５０％(v/v)の体積の溶媒を用いて実施される。
【００２９】
酸性条件下での培養液の抽出前のpHの調節
好ましくは、精製された培養液のpHは、疎水性有機抽出溶媒へのスタチン化合物の抽出前に、強酸で約１．０〜約６．４に調節される。ロバスタチン及びコンパクチンの両方にとって好ましいpH範囲は約２．０〜約４．５である。プラバスタチンにとって好ましいpH範囲は約４．５〜約６．０である。pH調節にとって好ましい酸は硫酸及びリン酸である。あるいは、スタチン化合物の抽出は、疎水性抽出溶媒のpHを約１．０〜約６．４に調節することによって実施され得る。
【００３０】
酸性条件下でのヒドロキシ酸又はラクトンとしてのスタチン化合物の抽出
疎水性有機抽出溶媒は、ヒドロキシ酸及びラクトンが培養液から実施的に除去されるまで、酸性条件下で精製された培養液と接触される。主観的判断を含む、薄層クロマトグラフィー又は任意な他の方法は、疎水性有機抽出溶媒へのラクトンの回収を評価するために使用され得る。複数回の抽出が、最適な回収のために実施され得る。しかしながら、２〜３回の抽出は、疎水性有機抽出溶媒が酢酸i−ブチルであり、そしてpHが上文で開示した様な最適な範囲にある場合に高度に効果的である。好ましくは、当該抽出は有機抽出溶媒の体積の約２倍の体積の培養液を用いて実施される。
【００３１】
コンパクチンを抽出するために最も好ましい疎水性有機抽出溶媒は酢酸i−ブチルである。他の適当な疎水性有機抽出溶媒は、限定しないが酢酸n−ブチル、酢酸t−ブチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、ギ酸エチル、ブチルメチルケトン、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、ジクロロエタン、及びトルエンを含む。好ましい抽出溶媒は酢酸i−ブチル、酢酸n−ブチル、酢酸エチル及びブチルメチルケトンである。酸性抽出時に、溶媒混合物は使用しない。
【００３２】
培養液と疎水性有機抽出溶媒の相分離
培養液は、当業者に周知の方法で分離されうる。分離にとって好ましい方法は、向流(counter current)抽出を含む。デカンターはそのための既知の装置である。相分離後、溶媒の純度は、水で洗浄することによって向上し得る。
【００３３】
疎水性有機抽出溶媒の濃縮
疎水性有機抽出溶媒の体積は、相分離後に減少する。体積の減少は、約３０〜約９０℃の温度での、減圧下の蒸発によって達成されうる。好ましくは、蒸発は減圧下で、そして約４０〜約７０℃の温度で実施される。あるいは、疎水性溶媒の蒸発は、減圧下又は大気圧下で、高温（約９０℃以下）で実施される。
【００３４】
抽出したスタチン化合物の結晶化による精製
疎水性有機抽出溶媒は、結晶化されるべきスタチン化合物の濃度が５０〜２５０g/Lになるまで蒸発される。ロバスタチンは最適には８０〜１００g/Lの濃度で結晶化され；コンパクチンは最適には１３０〜１７０g/Lの濃度で結晶化され；そして、プラバスタチンは最適には８０〜１２０g/Lの濃度で結晶化される。
【００３５】
結晶化は、周囲温度で一晩実施され得る。好ましい温度範囲は約−１０℃〜約５℃である。結晶化は、最も好ましくは約−１０℃で約２０時間実施される。
【００３６】
結晶化は、次の溶媒のいずれかの中で、又は次の溶媒の組み合わせの中で実施され得る：エタノール、i−プロパノール、n−プロパノール、i−ブタノール、n−ブタノール、t−ブタノール、酢酸エチル、アセトン、メタノール、アセトニトリル、ギ酸エチル、酢酸i−ブチル、酢酸t−ブチル、酢酸n−ブチル、トルエン、酢酸プロピル及びブチルメチルケトン。好ましい溶媒はトルエン、イソプロパノール、酢酸i−ブチル又はエタノール−水混合物の混合物を含む。最も好ましい溶媒は、酢酸i−ブチル及びエタノール−水混合物である。
【００３７】
好ましい態様の方法を用いて得られた結晶は、３．６％(w/w)以下の不純物を含み、そして７５％w/w以上の収率である。水：エタノールからの再結晶化によって得られたスタチンの精製にとって好ましいエタノールに対する水の比率は、約０．８〜約２．０である。最も好ましいエタノールに対する水の比率は、０．９〜１．２である。好ましい態様を用いて得られた結晶は少なくとも９８．５％(w/w)純粋である。
【００３８】
本発明は更に、以下の実施例において説明される。特に断らない限り、全ての収率が％(w/w)で列記され、そして合計収率又は全段階の収率を表す。しかしながら、本発明はそれらによって限定されるものとみなされるべきではない。当業者は、所望の結果を得るために、例示した調製物をどのように変更するべきかを理解するだろう。
【００３９】
例
例１：コンパクチンの単離
３５０ｋｇのコンパクチンを含む培養液（７０ｍ3）を、当業者に周知の方法によって調製した（例えば、米国特許第3,983,140号；第4,049,495号及び第5,691,173号を参照のこと）。酢酸i−ブチル（３５ｍ3）及び水（３５ｍ3）を連続的に水性の培養液（７０ｍ3）に加えた。pHは、濃水酸化ナトリウムの添加によって約９．０〜９．６に調節した。次に、混合物を６０℃に加熱し、そしてその温度で２時間維持した。次に、生じた有機相と水相は、向流分離を用いて分離した。ラウリル硫酸ナトリウムが、分離の間の混合物の脱乳化を助けるために添加された。
【００４０】
精製した培養液は、硫酸を用いて約２．０〜４．５のpHに酸性化された。次に、酢酸i−ブチル（３５ｍ3）を連続的に添加し、そしてin situでの混合後に、コンパクチンを含む酢酸i−ブチル相を連続的に分離した。
【００４１】
酢酸i−ブチル相を真空下で２，１５０Ｌの体積に濃縮した。濃縮溶液を０〜５℃で一晩放置し、それによってコンパクチンが７８％(w/w)の収率及び９３％(w/w)の純度で結晶化された。次に、粗製コンパクチンが、７５％(w/w)の収率及び９９．０％(w/w)の純度で、１．２：０．９のエタノール：水の混合物から再結晶された。
【００４２】
例２：アルカリ性条件下での培養液の予備精製段階無しでのコンパクチンの単離
コンパクチンを含む培養液を例１の様に調製した。培養液（５０Ｌ）を硫酸で約２．０〜４．５のpHに酸性化した。次に酢酸i−ブチル（２５Ｌ）及び水（２５Ｌ）を添加し、そして約０．５時間混合した後、コンパクチンを含む酢酸i−ブチル相を分離した。抽出は純粋な酢酸i−ブチル（２５Ｌ）を用いて繰り返した。一緒にした酢酸i−ブチル相を真空下で約１．５Ｌの体積に濃縮した。濃縮溶液を０〜５℃で一晩放置し、それによってコンパクチンを３３％(w/w)の収率及び９４．５％(w/w)の純度で結晶化した。例１はアルカリ抽出の使用を例示したが、例２はそれがアルカリ抽出を用いない技術の使用を例示する点で異なる。
【００４３】
例３：コンパクチンの単離；濃縮した酢酸i−ブチルのアルカリ性条件下での培養液の前処理及びNaHCO3を用いる洗浄
培養液を例１の様に調製した。酢酸i−ブチル（２５Ｌ）及び水（２５Ｌ）を水性の培養液（５０Ｌ）に加えた。pHは、濃水酸化ナトリウムの添加によって約９．０〜約９．６に調節した。次に、混合物を約６０℃に加熱し、そしてその温度で約２時間維持した。次に、相を分離した。塩化ドデシルトリメチルアンモニウムが、分離の間の混合物の脱乳化を助けるために添加された。精製した培養液は、硫酸を用いて約２．０〜４．５のpHに酸性化された。次に、酢酸i−ブチル（２５Ｌ）を添加し、そして約０．５時間混合した後に、コンパクチンを含む酢酸i−ブチル相を分離した。酸抽出は純粋な酢酸i−ブチル（２５Ｌ）を用いて繰り返した。
【００４４】
一緒にした酢酸i−ブチル相を真空下で約１．５Ｌの体積に濃縮した。濃縮溶液を約８Ｌの体積に希釈し、そして飽和炭酸水素ナトリウムで洗浄した。洗浄溶液を再び１．５Ｌに濃縮し、そしてそれを０〜５℃で一晩放置し、それによってコンパクチンを７６．５％(w/w)の収率及び９８．９％(w/w)の純度で結晶化した。
【００４５】
予備的なアルカリ抽出を行わなかった場合、コンパクチンはわずかに３９％(w/w)の収率及び９９．１％(w/w)の純度で得られた。
【００４６】
例４：コンパクチンの単離；アルカリ性条件下での培養液前処理の間の温度の低下の効果
培養液を例１の様に調製した。酢酸i−ブチル（２５Ｌ）及び水（２５Ｌ）を水性の培養液（５０Ｌ）に加えた。pHは、濃水酸化ナトリウムの添加によって約９．０〜約９．６に調節した。混合物を約１５〜約２０℃の温度で約２時間維持した。次に、相を分離した。塩化ドデシルトリメチルアンモニウムが、分離の間の混合物の脱乳化を助けるために添加された。精製した培養液は、硫酸を用いて約２．０〜４．５のpHに酸性化された。次に、酢酸i−ブチル（２５Ｌ）を添加し、そして約０．５時間混合した後に、コンパクチンを含む酢酸i−ブチル相を分離した。酸抽出は純粋な酢酸i−ブチル（２５Ｌ）を用いて繰り返した。一緒にした酢酸i−ブチル相を真空下で約１．５Ｌの体積に濃縮した。濃縮溶液を０〜５℃で一晩放置し、それによってコンパクチンを結晶化した。次に、粗製コンパクチンを１．２：０．９のエタノール：水の混合物から再結晶化した。合計の収率は６７％(w/w)の収率及び９９．１％(w/w)の純度であった。
【００４７】
例５：コンパクチンの単離；酸性抽出における１．０〜２．０の酸性pHの効果及び温度の低下の効果
培養液を例１の様に調製した。酢酸i−ブチル（２５Ｌ）及び水（２５Ｌ）を水性の培養液（５０Ｌ）に加えた。pHは、濃水酸化ナトリウムの添加によって約９．０〜約９．６に調節した。混合物を約６０℃で２時間維持した。次に、相を分離した。塩化ドデシルトリメチルアンモニウムが、分離の間の混合物の脱乳化を助けるために添加された。精製した培養液は、硫酸を用いて約１．０〜２．０のpHに酸性化された。次に、酢酸i−ブチル（２５Ｌ）を添加し、そして約０．５時間混合した後に、コンパクチンを含む酢酸i−ブチル相を分離した。酸抽出は純粋な酢酸i−ブチル（２５Ｌ）を用いて繰り返した。
【００４８】
一緒にした酢酸i−ブチル相は、コンパクチンの濃度が約１５０ｇ／ｌとなるまで真空下で濃縮された。濃縮溶液を約−１０℃の温度で２０時間濃縮した。結晶を濾過し、そして酢酸i−ブチルで洗浄した。次に、粗製コンパクチンを１．２：０．９のエタノール：水の混合物から再結晶化した。コンパクチンは６７％(w/w)の収率及び９８．８％(w/w)の純度で得られた。酸性抽出（１．０〜２．０のpH)は収率を低下させた。
【００４９】
アルカリ性条件下での培養液の前処理を用いるこの例の手順が約１５℃で実施された場合、コンパクチンの合計の収率は６０％(w/w)及び９８．７％(w/w)の純度に低下した。
【００５０】
例６：ロバスタチンの単離
ロバスタチンを含む培養液を、当業者に周知の方法によって調整した（例えば、米国特許第5,403,728号；第4,420,491号；第4,342,767号、第4,319,039号及び第4,294,846号を参照のこと）。酢酸i−ブチル（２５Ｌ）及び水（２５Ｌ）を水性の培養液（５０Ｌ）に加えた。pHは、濃水酸化ナトリウムの添加によって約９．０〜約９．６に調節した。混合物を約６０±５℃に加熱し、そしてその温度で約２時間維持した。次に、相を分離した。塩化ドデシルトリメチルアンモニウムが、分離の間の混合物の脱乳化を助けるために添加された。
【００５１】
精製した培養液は、硫酸を用いて約２．０〜４．５のpHに酸性化された。次に、酢酸i−ブチル（２５Ｌ）を添加し、そして約２時間混合した後に、ロバスタチンを含む酢酸i−ブチル相を分離した。抽出は純粋な酢酸i−ブチル（２５Ｌ）を用いて繰り返した。
【００５２】
一緒にした酢酸i−ブチル相は、約２．７Ｌの体積となるまで真空下で濃縮された。濃縮溶液を約−１０℃の温度で３６時間濃縮し、それによってロバスタチンは７６％(w/w)の収率及び９６．４％(w/w)の純度で結晶化された。粗製ロバスタチンは、１．２：０．９のエタノール：水の混合物から、７１．４％(w/w)の収率及び９８．７％(w/w)の純度で再結晶化された。
【００５３】
例７：アルカリ性条件下での培養液の予備精製無しでのロバスタチンの単離
ロバスタチンを含む培養液を例６の様に調製した。培養液（５０Ｌ）を硫酸で約２．０〜４．５のpHに酸性化した。次に酢酸i−ブチル（２５Ｌ）及び水（２５Ｌ）を添加し、そして約２時間混合した後、ロバスタチンを含む酢酸i−ブチル相を分離した。抽出は純粋な酢酸i−ブチル（２５Ｌ）を用いて繰り返した。一緒にした酢酸i−ブチル相を真空下で約２．７Ｌの体積に濃縮した。濃縮溶液を−１０℃で３６時間放置し、それによってロバスタチンを２６％(w/w)の収率及び８８．０％(w/w)の純度で結晶化した。
【００５４】
例８：ロバスタチンの単離；NaHCO3を用いる洗浄の適用
培養液を例６の様に調製した。酢酸i−ブチル（２５Ｌ）及び水（２５Ｌ）を水性の培養液（５０Ｌ）に加えた。pHは、濃水酸化ナトリウムの添加によって約９．０〜約９．６に調節した。次に、混合物を約６０℃に加熱し、そしてその温度で約２時間維持した。次に、相を分離した。塩化ドデシルトリメチルアンモニウムが、分離の間の混合物の脱乳化を助けるために添加された。精製した培養液は、硫酸を用いて約２．０〜４．５のpHに酸性化された。次に、酢酸i−ブチル（２５Ｌ）を添加し、そして約２時間混合した後に、ロバスタチンを含む酢酸i−ブチル相を分離した。酸抽出は純粋な酢酸i−ブチル（２５Ｌ）を用いて繰り返した。
【００５５】
酢酸i−ブチル相を真空下で約２．７Ｌの体積に濃縮した。濃縮溶液を約１１Ｌの体積に希釈し、そして飽和炭酸水素ナトリウムで洗浄した。洗浄溶液を再び２．７Ｌに濃縮し、そしてそれを−１０℃で３６時間放置し、それによってロバスタチンが７３．４％(w/w)の収率及び９８．８％(w/w)の純度で得られた。