(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
製紙工程において白水中にペルオキシダーゼ及び過酸化水素を添加して２，４，６−トリクロロフェノールを分解することを特徴とする異臭を発生しない紙の製造方法。
【請求項２】
ペルオキシダーゼが、微生物由来のペルオキシダーゼ又は西洋わさび（Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ）由来のペルオキシダーゼである請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記微生物由来のペルオキシダーゼが、アルスロマイセス（Ａｒｔｈｒｏｍｙｃｅｓ）属微生物由来のペルオキシダーゼ又はコプリヌス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ）属微生物由来のペルオキシダーゼである請求項２に記載の方法。
【請求項４】
微生物由来のペルオキシダーゼの濃度が、白水に対して４０ユニット／リットル以上である請求項２ないし３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
西洋わさび由来のペルオキシダーゼの濃度が、白水に対して７２００ユニット／リットル以上である請求項２記載の方法。
【請求項６】
過酸化水素が０．１mMないし３mM濃度の範囲である請求項１ないし５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
過酸化水素が０．２mMないし１mM濃度の範囲である請求項６に記載の製造方法。
【請求項８】
前記の紙が板紙である、請求項１ないし７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記の板紙が段ボール用原紙又は紙器用板紙である、請求項８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は製紙方法に関し、さらに詳しくは例えば再生紙等において異臭を発生しない紙の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
商品等の物品を収納する段ボール箱は、非常に多用されている。しかし、たまに段ボール箱が異臭を放つことがあり、その異臭が段ボール箱に収納されている物品にまで及び、物品の商品価値を著しく低める場合がある。これらの異臭原因の一つが、２，４，６−トリクロロアニソールであることは知られており、２，４，６−トリクロロアニソールは製紙工程又は製紙原料から直接に混入するものではなく、製紙原料に混入した２，４，６−トリクロロフェノールが、ある種のカビ等によりメチル化され、生成されるものである。
【０００３】
この２，４，６−トリクロロフェノールは、過去にパルプ原料の木材等に防虫、防カビ剤の目的で使用されていた時期があってパルプに混入し、また古紙が製紙原料の一部として使用されているため、製紙工程で混入してくる。段ボール箱用の板紙には、必ず原料の一部として古紙が使用されるために、異臭を放つ製品が見られる。例えば、平成８年度に日本国内の１２メーカーの段ボール箱及び段ボール原紙８８件を試料としてランダムに選び、その試料中における２，４，６−トリクロロフェノール濃度を分析したところ、検出限界３ppb で検出しなかったのが１件であり、残り８７件では２，４，６−トリクロロフェノールが検出された。
【０００４】
２，４，６−トリクロロフェノールの検出値は、最大値で４８．４ppb であり、平均で１６．１ppb であった。このように、段ボール原紙或は段ボール箱のほとんどには２，４，６−トリクロロフェノールが含まれていた。また、以前に過去にも数回同様の分析を行ったが、最高値で３７１ppb を検出した。なお、本発明における白水中、段ボール原紙及び段ボール箱中の２，４，６−トリクロロフェノールの分析は、水蒸気蒸留後、ｎ−Ｈｅｘａｎｅ抽出、減圧濃縮したものをガスクロマトグラフィーにより定量した（馬場等、日本包装学会誌、３，１，３５（１９９４））。
【０００５】
また、発明者らの先の研究では、段ボール箱中での２，４，６−トリクロロフェノールから２，４，６−トリクロロアニソールへの変換率が約１０％であり、段ボール箱中の２，４，６−トリクロロアニソールより段ボール箱に詰められた容器内の飲料への異臭の移行率が約０．１％であり、容器内の飲料の２，４，６−トリクロロアニソール異臭の官能閾値が１〜２ppt であるため、段ボール箱中の２，４，６−トリクロロフェノールの濃度は１０〜２０ppb 以下としなければ、段ボール箱内の容器内の飲料の異臭発生の恐れがある。
【０００６】
紙に２，４，６−トリクロロフェノールが混入しないように、製紙原料中の２，４，６−トリクロロフェノールの濃度を検査して、多量の２，４，６−トリクロロフェノールを含有する原料は用いないことも考えられるが、２，４，６−トリクロロフェノールの濃度は原料毎に非常にばらつきがあり、この検査に膨大な時間と設備と費用を要し、また濃度が高く使用に適さないと判断された原料を使用しないようにすることは資源を非常に無駄にすることになる。
そこで、特別な装置や設備を必要とせず、また特にその処理のために時間も要せず、通常の製紙工程に適用でき、費用も安価な方法が望まれていた。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
従って本発明は、特別な装置や設備を必要とせず、また特に処理のための時間も必要とせず、通常の製紙工程を変更することなくそれに適用でき、且つ安価な、２，４，６−トリクロロフェノールの除去方法を提供しようとするものである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記の課題を解決するため種々検討した結果、（１）製紙原料により持ち込まれた２，４，６−トリクロロフェノールは白水中に遊離すること、（２）白水中の２，４，６−トリクロロフェノールを分解するのに、種々の酵素の中でペルオキシダーゼが特に好ましいこと、（３）ペルオキシダーゼは白水環境、すなわち製紙工程における白水の通常のｐＨ、温度等、において十分に作用すること、（４）２，４，６−トリクロロフェノールの酸化生成物は不溶化して、紙製品中に混入しないことを見出し、本発明を完成した。
【０００９】
我々は、パルプ或は製紙原料中の２，４，６−トリクロロフェノールが製紙工程において白水中に遊離することを初めて見出し、その知見に基づき、白水中の予想される濃度の範囲の２，４，６−トリクロロフェノールを特異的に分解する酵素としてペルオキシダーゼを白水に適用することを見出した。
【００１０】
石油化学工場の排水の処理、パルプ排水の処理に対して、酵素による処理が検討されている。これらの排水中に含まれる有害物質或は有害物質の前駆体として含まれる有機塩素化合物のフェノール類或はアニリン類を酸化させる酵素を用いて分解させようという試みである。パルプの排水の場合には、パルプの漂白に塩素を用いるために塩素化合物が生成され排水中に含まれるため、その処理を行うものである。
【００１１】
また、一方パルプ排水の脱色処理として、排水中のリグニンを分解するために、リグニン分解酵素である白色腐朽菌Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ  ｃｈｒｙｓｉｓｏｉｒｉｕｍ、リグニンペルオキシダーゼや、マンガンペルオキシダーゼを用いての処理、あるいは、フェノール類を酸化する酵素としてチロシナーゼ、ラッカーゼ、ヘモグロビンや西洋わさび由来のペルオキシダーゼによる排水脱色処理も報告されている。また、これらの酵素による脱色処理において、パルプ排水中の塩素有機化合物をも分解するとも報告されている。
【００１２】
しかしこれらの各酵素は塩素基を含むフェノール類の種類により、分解率がそれぞれ異なり、また分解したい塩素化合物の濃度によっても分解率が異なっていた。また、２，４，６−トリクロロフェノールの分解を対象とした報告はほとんどなかった。その中でKenji Tatsumi らの文献（Biotechnology and Bioengineering, Vol.51, pp126-130, 1996)によると、排水からのクロロフェノール類の除去に西洋わさび由来のペルオキシダーゼを用い、２，４，６−トリクロロフェノールについての除去を報告しているが、１．５時間の反応時間で２，４，６−トリクロロフェノール２００μＭに対して９７％の除去率であると報告している。
【００１３】
この実験で用いられているペルオキシダーゼは、２，２−’アジノービス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）ジアンモニウム塩溶液の４０５nmの吸光度変化から求めた活性が１００ユニット／mgであり、このペルオキシダーゼを用いて０．２ユニット／mlの条件で処理を行っている。しかしながら、この文献では、製紙工程における白水でのペルオキシダーゼの分解は確認されておらず、また反応時間も１．５時間と非常に長く、製紙工程に適用できることを示唆するものではなかった。更に、このような高濃度の２，４，６−トリクロロフェノールでの除去率が９７％であっても、除去されない２，４，６−トリクロロフェノールの残存量は非常に多く、製紙原料に残存した場合異臭を発生する可能性が非常に高い。
【００１４】
また、我々は製紙工業における白水中にペルオキシダーゼを適用することで、その白水中の循環中の短時間内に、白水中においても有効に２，４，６−トリクロロフェノールを分解できることも見出した。更に、白水中のペルオキシダーゼにより分解された化合物が、再度、パルプ、製紙原料或は製品に再付着しないことを見出し、本発明を完成させたものである。
従って本発明は、製紙工程において白水中にペルオキシダーゼ及び過酸化水素を添加して２，４，６−トリクロロフェノールを分解することを特徴とする、異臭を発しない紙の製造方法を提供する。
【００１５】
【作用・効果】
製紙原料により製紙工程に持ち込まれた２，４，６−トリクロロフェノールは白水中に遊離し、白水に添加されたペルオキシダーゼ及び過酸化水素により酸化分解され、フェノキシラジカルを生成し、生成したラジカルが不均化反応によってキノンを生成するか、ラジカルカップリングによって二量化され、不溶性の高分子化合物となる。従って、２，４，６−トリクロロフェノールの分解物が紙に混入することはなく、異臭を発生しない紙を製造することができる。
【００１６】
【発明の実施の形態】
製紙工業では、製紙原料を調成し抄紙するという工程を経て製品を製造しているが、その工程はまず原料であるパルプや古紙をパルパーに投入し離解し、必要に応じた除塵を行った後に、製品の品質特性を付与させるための叩解を行う。その後、助剤の添加、濃度調整や配合を行うことで製紙原料として調成する。製紙原料は、抄紙機で抄紙され、搾水工程・乾燥工程、製品の品種によっては塗工工程を経て、製品に仕上げられる。これらの一連の製紙工程では、多量の水を必要とするため、その使用される水は循環して再利用されている。この循環して使用されている水を、一般に白水と呼んでいる。白水は、循環して再利用されると共に、工程での多少の損失があるため、順次一定量の新しい水が補給されている。
【００１７】
本発明によれば、過酸化水素とペルオキシダーゼの白水への添加は製紙工程のどのような工程においても行えるが、操作性の面からは、白水タンク中にペルオキシダーゼと過酸化水素を添加する方法が好ましい。
白水中の２，４，６−トリクロロフェノールの酸化分解という観点から、分解させる酵素類としてヘモグロビン、チロシナーゼ、ラッカーゼの使用も検討されたが、これらは実験の結果、白水中の２，４，６−トリクロロフェノールの分解を行うことが出来なかった。
【００１８】
本発明で用いるペルオキシダーゼとしては、西洋わさび（Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ；ホースラディッシュ、Ａｒｍｏｒａｃｉａ  ｒｕｓｔｉｃａｎａ）由来のペルオキシダーゼ又は微生物由来のペルオキシダーゼなどを用いることができる。特に微生物由来のペルオキシダーゼで、例えば、アルスロマイセス（Ａｒｔｈｒｏｍｙｃｅｓ）属微生物由来のペルオキシダーゼ、例えばアルスロマイセス・ラモサス（Ａｒｔｈｒｏｍｙｃｅｓ  ｒａｍｏｓｕｓ）由来のペルオキシダーゼ、コプリヌス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ）属微生物由来のペルオキシダーゼ、例えばコプリヌス・シネレウス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ  ｃｉｎｅｒｅｕｓ）由来のペルオキシダーゼなどが好ましく用いられる。
【００１９】
これらの微生物由来のペルオキシダーゼは精製されたものも一部市販されているが、微生物を培養し、その培養液あるいはさらに数種のイオン交換クロマトグラフィーを組み合わせて、高度に精製させたものを用いても良い。工業技術院に寄託されているＦＥＲＭ  ＢＰ−８３８号であるアルスロマイセス・ラモサス（特公平３−９９６号）、財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）に保管されているコプリヌス・シネレウスＩＦＯ８３７１、コプリヌス・シネレウスＩＦＯ３０６２７、コプリヌス・シネレウスＩＦＯ３０１１４、コプリヌス・シネレウスＩＦＯ３０６２８、コプリヌス・シネレウスＩＦＯ３１３３３（特公平３−１９４９号）等の微生物を用いることができる。西洋わさび由来のペルオキシダーゼも精製されたものも市販されており、それを用いても良く、またすり潰した西洋わさびより得て、用いても良い。
【００２０】
本発明の方法において用いられるペルオキシダーゼの濃度は、ペルオキシダーゼの種類、２，４，６−トリクロロフェノールの濃度などにより異なるが、例えば、微生物由来のペルオキシダーゼの場合は、白水に対して４０ユニット（units)／リットル以上であることが好ましく、１６０ユニット（units)／リットル以上であることが更に好ましい。西洋わさび由来のペルオキシダーゼの場合は、７２００ユニット（units)／リットル以上であることが好ましい。
【００２１】
ペルオキシダーゼは多量に使用することもできるが、白水中に含まれる２，４，６−トリクロロフェノールを分解するのに最低必要量を添加することが経済的であり、例えば微生物由来のペルオキシダーゼの場合は１０００ユニット（units)／リットル以下であることが好ましい。なお、ペルオキシダーゼ活性の力価の単位であるユニット（unit) は、４−アミノアンチピリン−フェノール系を水素供与体として用いて、５００nmの吸光度の変化を測定し（特公平３−９９６号）、１ユニット（unit) は１分間に１μモルの過酸化水素を消費する酵素量である。
【００２２】
微生物由来のペルオキシダーゼであるアルスロマイセス（Ａｒｔｈｒｏｍｙｃｅｓ）属微生物由来のペルオキシダーゼと、コプリヌス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ）属微生物由来のペルオキシダーゼは非常にその酵素の特異性が似ており、いずれも同様に用いることができる。微生物由来のペルオキシダーゼは、西洋わさび由来のペルオキシダーゼに比べ、同じ力価（ユニット）として比較しても、非常に少ない力価で２，４，６−トリクロロフェノールに対する反応性が高く、工業的に利用する場合、取り扱いも便利で安価に使用できる。
【００２３】
また、ペルオキシダーゼは水及び白水に対する溶解性も高く、使用に際して簡便に用いることが出来る。
白水は、循環して再利用されながらも、順次新しい水を補給されるため、またペルオキシダーゼが不活性化して減少していくため、ペルオキシダーゼの濃度が前述の濃度範囲より低くなった場合には、適宜白水にペルオキシダーゼを添加すればよい。
【００２４】
白水中の過酸化水素の濃度は、使用するペルオキシダーゼの種類、ペルオキシダーゼの添加量、２，４，６−トリクロロフェノールの濃度などにより異なるが、０．１mM〜３mMの範囲が好ましく、０．２mM〜１mMの範囲が、ペルオキシダーゼの活性を十分に活用するために特に好ましい。例えば、微生物由来のペルオキシダーゼの濃度を２００ユニット（units)／リットルないし４５０ユニット（units)／リットルとした場合、過酸化水素の濃度は、０．１mM〜３mMの範囲が好ましく、特に０．２mM〜０．８mMの範囲が好ましい。
【００２５】
ペルオキシダーゼの濃度及び過酸化水素の濃度は、補給水の添加のため、パルパー中又は白水タンク中で低減するために、添加すべきペルオキシダーゼ及び過酸化水素の量は、パルパー中又は白水タンク中のそれらの濃度を測定して判断することが好ましい。
白水は温度コントロールが行われないため、冬期で最低１０℃前後、夏期で最高４５℃程度の温度となる。ペルオキシダーゼの至適温度はペルオキシダーゼの種類によっても異なるが、白水の上記の温度範囲で、十分に作用することができる。また、白水のｐＨは通常４．０〜７．５であり、この範囲内でペルオキシダーゼは十分に作用することができる。
【００２６】
また、白水中には製紙工程からの懸濁物質、原料由来の各種金属が混在するが、これらによるペルオキシダーゼへの影響は認められず、ペルオキシダーゼの活性が損なわれることはない。
ペルオキシダーゼによる２，４，６−トリクロロフェノールの酸化分解に要する時間は、ペルオキシダーゼの種類によっても異なるが、５分以上であればよい。特に微生物由来のペルオキシダーゼの場合、短い時間での反応が行え、より効率的である。白水は循環して使用されているため、原料より遊離してくる２，４，６−トリクロロフェノールを十分に分解することが可能である。また、製紙工程の各工程においても、ペルオキシダーゼはほとんど失活しない。
【００２７】
本発明を適用できる紙には、新聞巻取紙、非塗工・塗工印刷用紙、ノーカーボン原紙やＰＰＣ用紙などの情報用紙、クラフト紙等の包装紙、ティッシュペーパー等の衛生用紙、加工原紙などの工業用雑種紙及び家庭用雑種紙から、板紙とも分類される、段ボール原紙、マニラボールや白板紙などの紙器用板紙、建材原紙、紙管原紙、及びワンプなど、製紙工業において製造される紙が全て含まれており、白水にペルオキシダーゼと過酸化水素を添加するだけで実施することができるため、いかなる紙の製造にも適用することができる。特に２，４，６−トリクロロフェノールを含有している可能性が高い古紙からの再生紙の製造において特に有用であり、特に板紙、例えば段ボール用原紙や紙器用板紙の製造のために特に有用である。
【００２８】
【実施例】
次に、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
実験例１． ２，４，６−トリクロロフェノールの白水への移行と製紙原料への定着
４００ppb の２，４，６−トリクロロフェノールを含有する半晒クラフトパルプ６０ｇを水２０００mlにより離解して３％パルプスラリーを調製し、これをさらに０．０５％パルプスラリーに調製し、ＪＩＳ規格（Ｐ８２０９）に準じて手すき紙を調製した。その後、手すき紙中の２，４，６−トリクロロフェノールの量を測定したところ元の含有濃度の約１０％未満に低下しており、クラフトパルプ中の２，４，６−トリクロロフェノールの大部分が手すき後の白水に移行したことが明らかになった。
【００２９】
同様に、２，４，６−トリクロロフェノールが検出されなかった未晒クラフトパルプ、及び段ボール古紙を用いて、水２０００mlに未晒クラフトパルプ、及び段ボール古紙をそれぞれ６０ｇずつ離解させ、３％パルプスラリーを調整した。この３％パルプスラリーに、水に２，４，６−トリクロロフェノールをそれぞれ０、１０、２０、５０、１００ppb となるように添加した疑似白水を添加して、０．０５％パルプスラリーを調整した。この０．０５％パルプスラリーを一定時間放置後、ＪＩＳ規格（Ｐ８２０９）に準じて手すき紙を調整した。なお、この工程は各原料毎に２回行った。その結果、疑似白水中の２，４，６−トリクロロフェノールが高くなるにつれ、手すき紙に２，４，６−トリクロロフェノールは定着し、１００ppb の疑似白水では未晒クラフトパルプでは約８０ppb に、段ボール古紙では約２８０ppb の２，４，６−トリクロロフェノールが定着していた。
【００３０】
実験例２． 白水中の酵素種類による活性比較と除去効果
０．１、１．０、１０又は１００ppm の濃度に調整したアルスロマイセス・ラモサス（Ａｒｔｈｒｏｍｙｃｅｓ ｒａｍｏｓｕｓ）由来のペルオキシダーゼ（ＡＲＰ）（サントリー）、西洋ワサビ（Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ）由来のペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（和光純薬）、ヘモグロビン（ヒト由来；ナカライテスク）、チロシナーゼ（マッシュルーム由来；和光純薬）、ラッカーゼ（大和化成）の各酵素濃度での白水中で２，４，６−トリクロロフェノールの分解を試みた。白水は製紙工場において採取したものを用い、予め２，４，６−トリクロロフェノール（ＴＣＰ）の濃度は３５１ppb に調整し、ｐＨは緩衝液により７．０に調整してから用いた。また、ＡＲＰ，ＨＲＰ及びヘモグロビンにおいては過酸化水素を添加し、その濃度は０．４mMとした。いずれも反応温度は４５℃、反応時間は５分とした。その結果を図１に示す。
【００３１】
なお、ここで用いたペルオキシダーゼ活性の力価の単位であるユニット（unit) は、４−アミノアンチピリン−フェノール系を水素供与体として用いて、５００nmの吸光度の変化を測定し（特公平３−９９６号）、１ユニット（unit) は１分間に１μモルの過酸化水素を消費する酵素量である。ＡＲＰは活性４４３ユニット（units)／mg、ＨＲＰは活性７２２ユニット（units)／mgであった。チロシナーゼは、活性は４００ユニット（units)／mgであり、この活性はＬ−チロシンに対する１分間当りのＡ280 nmの吸光度変化で求めた値である。ラッカーゼの活性は、５０ユニット（units)／mg（４−アミノアンチピリンフェノール法）であった。ヘモグロビンは、純度９５％のものを使用した。なお、図１中のデータについて、ＡＲＰとＨＲＰの濃度をユニット／リットルに換算した結果を図２に示す。
【００３２】
その結果、ヘモグロビン、チロシナーゼ及びラッカーゼには２，４，６−トリクロロフェノール分解効果は見られず、アルスロマイセス・ラモサス由来のペルオキシダーゼ（ＡＲＰ）、西洋ワサビ由来のペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に分解効果が見られた。反応時間５分間においては、アルスロマイセス・ラモサス由来のペルオキシダーゼにおいては４４３ユニット（units ）／リットルで、西洋ワサビ由来のペルオキシダーゼは７２，２００ユニット（units ）／リットルで満足できる分解活性を示した。ただし、西洋ワサビ由来のペルオキシダーゼにおいても反応時間を４０分間以上とれば７２２０ユニット（units ）／リットルにおいて満足できる分解活性を示すことが確認された。
【００３３】
実施例１． 白水中におけるペルオキシダーゼによる２，４，６−トリクロロフェノール分解
ペルオキシダーゼとして実験例２で用いた西洋ワサビ由来のペルオキシダーゼを用いて、白水中で２，４，６−トリクロロフェノールの分解を確認した。西洋ワサビ由来のペルオキシダーゼの濃度は７２２０ユニット（units ）／リットルとした。白水は、製紙工場において採取したものを用い、予め２，４，６−トリクロロフェノール（ＴＣＰ）の濃度は３１９ppb に調整し、ｐＨは緩衝液により７．０に調整してから用いた。また、過酸化水素濃度は０．４mMとし、反応温度は４５℃とした。その結果を図３に示す。
その結果、西洋ワサビ由来のペルオキシダーゼによる分解効果が確認された。
【００３４】
実施例２． 白水でペルオキシダーゼへの影響原因であると予想される懸濁物質の影響
製紙工程白水中で想定される範囲として、懸濁物質濃度を８１０mg／リットル、８５０mg／リットル、又は１０７０mg／リットルの濃度に調整した白水における、酵素反応に与える影響を調べた。分析は“ＪＩＳＫ０１０２の懸濁物質”に準じて行った。ペルオキシダーゼとして、実験例２において使用したＡＲＰを用い、濃度は４４３ユニット／リットルとした。
【００３５】
懸濁物質は、製紙工場において採取した白水を一定時間放置することにより沈降してきた物質を使用した。なお白水は、製紙工場において採取したものを用い、予め２，４，６−トリクロロフェノールの濃度は３１９ppb に調整し、ｐＨは緩衝液により７．０に調整してから用いた。また、過酸化水素濃度は０．４mMとし、反応温度は４５℃とし、反応時間は５分とした。
その結果、どの懸濁物質濃度においても十分な２，４，６−トリクロロフェノール分解活性が示され、２，４，６−トリクロロフェノールは全て分解された。
【００３６】
実施例３． 白水でペルオキシダーゼへの影響原因であると予想されるｐＨの影響
製紙工程で想定される範囲としてｐＨを４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０又は７．５に調整した白水における、酵素反応に与える影響を調べた。ペルオキシダーゼとして、実験例２において使用したＡＲＰを用い、濃度は４４３ユニット（units ）／リットルとした。ｐＨの調整には、ｐＨ４．５〜５．０の範囲では酢酸及び酢酸ナトリウム緩衝液を用い、ｐＨ５．５〜７．５の範囲ではリン酸二水素カリウム及びリン酸水素二ナトリウムを用いて調整した。なお白水は、製紙工場において採取したものを用い、予め２，４，６−トリクロロフェノール（ＴＣＰ）の濃度は３２９ppb に調整し、また、過酸化水素濃度は０．４mMとし、反応温度は４５℃、反応時間は５分とした。その結果を図４に示す。
その結果、どのｐＨにおいても十分な２，４，６−トリクロロフェノール分解活性が示された。
【００３７】
実施例４． 白水でペルオキシダーゼへの影響原因であると予想される温度の影響
製紙工程で想定される範囲として、液温を２０℃、３０℃、４０℃又は５０℃に調整した白水におけるその酵素反応に与える影響を調べた。ペルオキシダーゼとして、実験例２において使用したＡＲＰを用い、濃度は４４３ユニット（units ）／リットルとした。なお白水は、製紙工場において採取したものを用い、予め２，４，６−トリクロロフェノール（ＴＣＰ）の濃度は３１９ppb に調整し、ｐＨは緩衝液により７．０に調整したものを用いた。また、過酸化水素濃度は０．４mMとし、反応時間は５分とした。白水の温度調整は、三角フラスコに白水を入れ、それを恒温水槽中へ入れ行った。その結果を図５に示した。
その結果、どの白水の液温においても十分な２，４，６−トリクロロフェノール分解活性が示された。
【００３８】
実施例５． 白水でペルオキシダーゼへの影響原因と予想される金属の影響
白水を製紙工場の２ラインから５日間にわたって、午前と午後の２回サンプリングを行い採取した２０試料を湿式灰化の後、蛍光Ｘ線分析を行い、白水中の無機元素を測定したところ、２０試料中に１試料でも５mg／kg以上検出された無機元素が、鉄とマンガンであった。鉄の濃度は平均で７．２mg／kgで、最大値１９．５mg／kgであり、マンガンは、平均で６．２mg／kgで、最大値が１１．８mg／kgであった。そこで、鉄とマンガンのペルオキシダーゼに与える影響を確認した。
【００３９】
ペルオキシダーゼにおいて最も影響を与えると予想される金属イオンである、鉄イオンについての影響を調べた。製紙工程で想定される範囲として、鉄イオンの濃度（Ｆｅ2+イオン）を０、１、１０又は２５ppm に調整した白水におけるその酵素反応に与える影響を確認した。ペルオキシダーゼとして、実験例２において使用したＡＲＰを用い、濃度は４４．３ユニット（units ）／リットルとした。なお白水は、製紙工場において採取したものを用い、予め２，４，６−トリクロロフェノールの濃度は１９８ppb に調整し、pHは緩衝液により５．５に調整したものを用いた。また、過酸化水素濃度は１mMとし、反応温度は４５℃、反応時間は５分とした。鉄としては、Ｆｅ（ＮＯ3 ）2 を用いた。その結果、鉄濃度（Ｆｅ2+イオン）が１、１０、又は２５ppm のどの濃度においても、０ppm とした対照例と同様に十分な２，４，６−トリクロロフェノール分解活性が示された。
【００４０】
更に、白水中に含まれる可能性が高いマンガンについての影響を調べた。製紙工程で想定される範囲として、マンガンの濃度（Ｍｎ）を０、１、５、又は１５ppm に調整した白水におけるその酵素反応に与える影響を確認した。ペルオキシダーゼとして、実験例２において使用したＡＲＰを用い、濃度は４４．３ユニット（units ）／リットルとした。なお白水は、製紙工場において採取したものを用い、予め２，４，６−トリクロロフェノールの濃度は１９８ppb に調整し、pHは緩衝液により５．５に調整したものを用いた。また、過酸化水素濃度は１mMとし、反応温度は４５℃、反応時間は５分とした。マンガンとしては、Ｍｎ（ＮＯ3 ）2 を用いた。その結果、マンガン濃度（Ｍｎ2+イオン）が１、５又は１５ppm のどの濃度においても、０ppm とした対照例と同様に十分な２，４，６−トリクロロフェノール分解活性が示された。
【００４１】
実験例３． ペルオキシダーゼと過酸化水素の好適範囲
過酸化水素濃度がそれぞれ０．０１mM、０．０５mM、０．１mM、０．２mM、０．４mM、０．８mM、１．６mM又は３．２mMとなるように調整した白水における、ペルオキシダーゼの好適過酸化水素濃度を確認した。ペルオキシダーゼとして、実験例２において使用したＡＲＰを用い、濃度は４４３ユニット（units ）／リットルとした。なお白水は、製紙工場において採取したものを用い、予め２，４，６−トリクロロフェノール（ＴＣＰ）の濃度は２７６ppb に調整し、ｐＨは緩衝液により７．０に調整したものを用いた。また、反応温度は４５℃とし、反応時間は５分とした。その結果を図６に示した。
その結果、白水におけるアルスロマイセス・ラモサス由来のペルオキシダーゼ（ＡＲＰ）の場合は、最適過酸化水素は０．４mMであることが判った。
【００４２】
実験例４． 白水中での好適ペルオキシダーゼ濃度
ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）濃度がそれぞれ４４．３ユニット（units ）／リットル、８８．６ユニット（units ）／リットル、１７７．２ユニット（units ）／リットル又は４４３ユニット（units ）／リットルとなるように調整し、白水におけるペルオキシダーゼの好適濃度を確認した。ペルオキシダーゼとしては実験例２において使用したＡＲＰを用いた。なお白水は、製紙工場において採取したものを用い、予め２，４，６−トリクロロフェノール（ＴＣＰ）の濃度は３２９ppb に調整し、ｐＨは緩衝液により７．０に調整したものを用いた。また、反応温度は４５℃とし、反応時間は５分とした。その結果を図７に示した。
その結果、１７７．２ユニット／リットルあれば２，４，６−トリクロロフェノールが３２９ppb と非常に高濃度でも、満足できる２，４，６−トリクロロフェノール分解活性を得ることができることが判った。
【００４３】
実験例５． 白水へのペルオキシダーゼの添加によるダイオキシン類の生成の確認
２００リットルのパルパーに水１６８リットルを注水し、ヒーターで３８．６℃に加熱し、２，４，６−トリクロロフェノールを６０mg添加し、その後１５％過酸化水素水を４５ミリリットル添加し、１〜２分撹拌した。更にパルパーに３２リットルの５％パルプスラリーを投入した。この時、pHは７．０であった。その後、実験例２において使用したＡＲＰを１０μｇ／リットルの濃度で添加してから５分間撹拌した。得られたパルプスラリーを常法に従って抄紙した紙及びこの白水を試料とした。
【００４４】
白水は、ガラス繊維濾紙を用いて濾過し、通過液をジクロロメタンで抽出し、残留物は風乾後、トルエンでソックスレー抽出を行った。紙は、トルエンでソックスレー抽出を行った。いずれの抽出液もあわせてヘキサンに転溶し、硫酸洗浄を行い、シリカゲル、アルミナ及び活性炭埋蔵シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより妨害物を除去した。そして、ガスクロマトグラフー高分解能質量分析計を用いたマスフラグメントグラフィーで、内標準法によりダイオキシン類の分析を行った。なお、白水中のダイオキシン類の分析の検出限界は、０．０１ng／リットルで、紙中のダイオキシン類分析の検出限界は５ppt であった。
【００４５】
その結果、紙及び白水においてダイオキシン類である２，３，７，８−テトラクロロジベンゾ−ｐ−ジオキシン、１，２，３，７，８−ペンタクロロジベンゾ−ｐ−ジオキシン、１，２，３，４，７，８−ヘキサクロロジベンゾ−ｐ−ジオキシン、１，２，３，６，７，８−ヘキサクロロジベンゾ−ｐ−ジオキシン、１，２，３，７，８，９−ヘキサクロロジベンゾ−ｐ−ジオキシン、２，３，７，８−テトラクロロジベンゾフラン、１，２，３，７，８−ペンタクロロジベンゾフラン、２，３，４，７，８−ペンタクロロジベンゾフラン、１，２，３，４，７，８−ヘキサクロロジベンゾフラン、１，２，３，６，７，８−ヘキサクロロジベンゾフラン、１，２，３，７，８，９−ヘキサクロロジベンゾフラン、２，３，４，６，７，８−ヘキサクロロジベンゾフランのいずれも検出されなかった。
従って、白水にペルオキシダーゼと過酸化水素を添加して、２，４，６−トリクロロフェノールの分解を行っても、有害物質であるダイオキシン類は一切生成されていなかった。
実験例６． 白水中でペルオキシダーゼの安定性
白水を製紙工場から１０日間にわたって、１日１回サンプリングを行い採取した１０試料を用いて、白水中のペルオキシダーゼの安定性を確認した。白水には採取後にペルオキシダーゼとして、実験例２において使用したＡＲＰを濃度が４４．３ユニット（units ）／リットルになるように添加して撹拌し、４５℃で７日間保存した。毎日その１０試料から白水の一部を取り出し、２，４，６−トリクロロフェノールの濃度が３１９ppb になるように添加し、ｐＨは緩衝液により７．０に調整し、また、過酸化水素濃度は０．４mMとなるように調整した。反応温度は４５℃、反応時間は５分として、添加した２，４，６−トリクロロフェノールが分解されずに残存した量を測定した。１０試料のいずれも２日目までは、２，４，６−トリクロロフェノールを１００％分解した。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は各種酵素による白水中の２，４，６−トリクロロフェノール（ＴＣＰ）の分解の経過を示すグラフである。
【図２】図２はＨＲＰ及びＡＲＰによる白水中の２，４，６−トリクロロフェノール（ＴＣＰ）の分解の経過を示すグラフである。
【図３】図３は、白水中でのＡＲＰによる２，４，６−トリクロロフェノール（ＴＣＰ）の分解の経過を示すグラフである。
【図４】図４は、白水中でのＡＲＰによる２，４，６−トリクロロフェノール（ＴＣＰ）の分解に対するｐＨの影響を示すグラフである。
【図５】図５は、白水中でのＡＲＰによる２，４，６−トリクロロフェノール（ＴＣＰ）の分解に対する温度の影響を示すグラフである。
【図６】図６は、白水中でのＡＲＰによる２，４，６−トリクロロフェノール（ＴＣＰ）の分解に対する過酸化水素の濃度の影響を示すグラフである。
【図７】図７は、白水中の２，４，６−トリクロロフェノール（ＴＣＰ）の分解におけるペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）の好適濃度の範囲を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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