(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：３のアミノ酸配列からなる大腸菌の熱安定性エンテロトキシンＩＩシグナル配列において、下記グループから選択されるアミノ酸置換のいずれかが行われた変形された熱安定性エンテロトキシンＩＩシグナル配列をコードするポリヌクレオチドおよびその３'−末端に連結されたヒトインターフェロンα（ｈＩＦＮα）をコードするポリヌクレオチドを含むｈＩＦＮαの分泌生産用発現ベクター：
４番アスパラギンがトレオニンへ置換；
４番アスパラギンおよび２２番チロシンが各々トレオニンおよびグルタミンへ置換；
４番および２０番アスパラギンが各々トレオニンおよびバリンへ置換；および
４番アスパラギン、２０番アスパラギンおよび２２番チロシンが各々トレオニン、バリンおよびグルタミンへ置換。
【請求項２】
hIFNαをコードするポリヌクレオチドが配列番号：１のIFNα-2aまたは配列番号：２のIFNα-2bをコードすることを特徴とする請求項１記載の発現ベクター。
【請求項３】
変形された熱安定性エンテロトキシンIIシグナル配列をコードするポリヌクレオチドの５'−末端前に大腸菌の熱安定性エンテロトキシンIIのシャイン−ダルガーノ配列（SD sequence. 配列番号：８）またはその変形体をさらに含むことを特徴とする請求項１記載の発現ベクター。
【請求項４】
前記変形体は、配列番号：８の配列において５'−末端のＧＡＧＧ以降に１個または２個のヌクレオチドが欠損されたものであることを特徴とする請求項３記載の発現ベクター。
【請求項５】
ＳＤ配列の変形体が配列番号：９のヌクレオチド配列を有することを特徴とする請求項３記載の発現ベクター。
【請求項６】
ベクターpT14SSIα-2a-4T、pT14OSSIα-2a-4T、pT14SSIα-2a-4T22Q、pT14OSSIα-2a-4T22Q、pT14OSSIα-2a-4T20V22Q、pT14NSSIα-2a-4T22Q、pT14MSSIα-2a-4T22Q、pT14SSIα-2b-4T、pT14OSSIα-2b-4T、pT14OSSIα-2b-4T22QおよびpT14OSSIα-2a-4T20V22Qからなる群から選ばれることを特徴とする請求項１記載の発現ベクター。
【請求項７】
請求項１記載の発現ベクターで形質転換された微生物。
【請求項８】
大腸菌であることを特徴とする請求項７記載の微生物。
【請求項９】
大腸菌BL21(DE3)/pT14SSIα-2a-4T (HM 10602)、大腸菌BL21(DE3)/pT14OSSIα-2a-4T (HM 10603；寄託番号：KCCM-10175)、大腸菌BL21(DE3)/pT14SSIα-2a-4T22Q (HM 10604)、大腸菌BL21(DE3)/pT14OSSIα-2a-4T22Q (HM 10611；寄託番号：KCCM-10176)、大腸菌BL21(DE3)/pT14OSSIα-2a-4T20V22Q(HM 10612)、大腸菌BL21(DE3)/pT14NSSIα-2a-4T22Q(HM 10613)、大腸菌BL21(DE3)/pT14MSSIα-2a-4T22Q(HM 10614)、大腸菌BL21(DE3)/pT14SSIα-2b-4T(HM 10702)、大腸菌BL21(DE3)/pT14OSSIα-2b-4T(HM 10703；寄託番号：KCCM-10177)、大腸菌BL21(DE3)/pT14OSSIα-2b-4T22Q (HM 10711；寄託番号：KCCM-10178)、および大腸菌BL21(DE3)/pT14OSSIα-2b-4T20V22Q (HM 10712)からなる群から選ばれることを特徴とする請求項８記載の微生物。
【請求項１０】
配列番号：３のアミノ酸配列からなる大腸菌の熱安定性エンテロトキシンＩＩシグナル配列において、下記グループから選択されるアミノ酸置換のいずれかが行われた変形された熱安定性エンテロトキシンＩＩシグナル配列をコードするポリヌクレオチドおよびその３'−末端に連結されたｈＩＦＮαをコードするポリヌクレオチドを含むｈＩＦＮαの分泌生産用発現ベクターで微生物を形質転換し、形質転換された微生物を適切な条件下で培養することによりアミノ末端にメチオニンが添加されていない活性ｈＩＦＮαを分泌生産する方法：
４番アスパラギンがトレオニンへ置換；
４番アスパラギンおよび２２番チロシンが各々トレオニンおよびグルタミンへ置換；
４番および２０番アスパラギンが各々トレオニンおよびバリンへ置換；および
４番アスパラギン、２０番アスパラギンおよび２２番チロシンが各々トレオニン、バリンおよびグルタミンへ置換。
【請求項１１】
hIFNαをコードするポリヌクレオチドが配列番号：１のIFNα-2aまたは配列番号：２のIFNα-2bをコードすることを特徴とする請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前記発現ベクターは、変形された熱安定性エンテロトキシンIIシグナル配列をコードするポリヌクレオチドの５'−末端前に大腸菌の熱安定性エンテロトキシンIIのシャイン−ダルガーノ配列(SD sequence, 配列番号：８)またはその変形体をさらに含むことを特徴とする請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
前記変形体は、配列番号：８の配列において５'−末端のＧＡＧＧ以降に１個または２個のヌクレオチドが欠損されたものであることを特徴とする請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
ＳＤ配列の変形体が配列番号：９の配列を有することを特徴とする請求項１２記載の方法。
【請求項１５】
前記発現ベクターがベクターpT14SSIα-2a-4T、pT14OSSIα-2a-4T、pT14SSIα-2a-4T22Q、pT14OSSIα-2a-4T22Q、pT14OSSIα-2a-4T20V22Q、pT14NSSIα-2a-4T22Q、pT14MSSIα-2a-4T22Q、pT14SSIα-2b-4T、pT14OSSIα-2b-4T、pT14OSSIα-2b-4T22QおよびpT14OSSIα-2a-4T20V22Qからなる群から選ばれることを特徴とする請求項１０記載の方法。
【請求項１６】
前記形質転換された微生物が大腸菌BL21(DE3)/pT14SSIα-2a-4T (HM 10602)、大腸菌BL21(DE3)/pT14OSSIα-2a-4T(HM 10603；寄託番号：KCCM-10175)、大腸菌BL21(DE3)/pT14SSIα-2a-4T22Q(HM 10604)、大腸菌BL21(DE3)/pT14OSSIα-2a-4T22Q (HM 10611；寄託番号：KCCM-10176)、大腸菌BL21(DE3)/pT14OSSIα-2a-4T20V22Q (HM 10612)、大腸菌BL21(DE3)/pT14NSSIα-2a-4T22Q(HM 10613)、大腸菌BL21(DE3)/pT14MSSIα-2a-4T22Q(HM 10614)、大腸菌BL21(DE3)/pT14SSIα-2b-4T(HM 10702)、大腸菌BL21(DE3)/pT14OSSIα-2b-4T(HM 10703；寄託番号：KCCM-10177)、大腸菌BL21(DE3)/pT14OSSIα-2b-4T22Q(HM 10711；寄託番号：KCCM-10178)、および大腸菌BL21(DE3)/pT14OSSIα-2b-4T20V22Q(HM 10712)からなる群から選ばれることを特徴とする請求項１０記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、大腸菌の変形された熱安定性エンテロトキシンIIシグナル配列をコードするポリヌクレオチドおよびその３'−末端に連結された、ヒトインターフェロンアルファ(human Interferon α：hIFNα)をコードするポリヌクレオチドを含むヒトインターフェロンαの分泌生産用発現ベクター、前記発現ベクターで形質転換された細胞株、および前記細胞株を培養することによりアミノ末端に追加のメチオニンが添加されていないヒトインターフェロンαを大腸菌菌体のペリプラズムに分泌させて大量生産する方法に関する。
【０００２】
背景技術
アイザックス（Isaacs）とリンデンマン(Lindenmann)は、１９５７年鶏をインフルエンザウイルスＡで感染させるとウイルスの複製を阻害する因子であるインターフェロンが生産されることを発見し、報告した(Isaacs, K. and Lindenmann, J., Proc. R. Soc. Lond., B147, 258-267, 1957)。
【０００３】
ヒトインターフェロンは一種のサイトカインであり、生体内免疫反応またはウイルスの増殖を阻害するタンパク質であって、これらを生成する細胞の種類によってインターフェロンアルファ（IFNα）、インターフェロンベータ(IFNβ)およびインターフェロンガンマ(IFNγ)に分けられる(Kirchner, H., et al., Tex. Rep. Biol. Med., 41, 89-93, 1981; Stanton, G. J., et al., Tex. Rep. Biol. Med., 41, 84-88, 1981)。
【０００４】
これらのインターフェロンは、抗ウイルス機能、抗癌機能、ＮＫ(Natural Killer)細胞の活性化および骨髄細胞の抑制機能において互いに相乗作用を有していることが知られている（Klimpel, et al., J. Immunol., 129, 76-78, 1982; Fleischmann, W. R., et al., J. Natl. Cancer Inst., 65, 863-966, 1980; Weigent., et al., Infec. Immun., 40, 35-38, 1980）。また、インターフェロンは細胞内遺伝子の発現、構造、そして機能の調節因子として作用し、直接的な抗増殖効果（anti-proliferating effect）を示す。
【０００５】
インターフェロンαはＢ細胞分裂因子(mitogen)、ウイルスまたは癌細胞によって白血球が刺激されたとき生成するもので、現在まで２０種以上のインターフェロンをコードする遺伝子が報告され、これは各々１６５個または１６６個のアミノ酸からなると知られている。
【０００６】
初期の臨床試験に用いられたインターフェロンαはセンダイウイルス (Sendai virus)で刺激されたバッフィ・コート白血球(buffy coat leukocyte)から得られたもので、この際の純度はわずか１％程度に過ぎなかった(Cantell, K. and Hirvonen., Tex. Rep. Biol. Med., 35, 138-144, 1977)。
【０００７】
８０年代に入り、遺伝子組換え技術によって生理活性を有するインターフェロンαを大量生産できるようになり(Goedell, D. V. et al., Nature, 287, 411-416, 1980)、このような組換えヒトインターフェロンαを用いた臨床試験の結果、種々の固形癌の治療に効果があること、特に、膀胱癌、腎臓癌と後天性免疫欠乏症に係るカポジ肉腫などに効果があることが示された(Torti, F.M., J. Clin. Oncol., 6, 476-483, 1988; Vugrin, D., et al., Cancer Treat. Rep., 69, 817-820, 1985; Rios, A., et al., J. Clin. Oncol., 3, 506-512, 1985)。また、最近は、Ｃ型肝炎ウイルスの治療にも効果があることが報告されており(Davis, G. G., et al., N. Engl. J. Med., 321, 1501-1506, 1989)、その治療剤としての適用範囲が日増しに拡大されている。
【０００８】
白血球からのインターフェロンα遺伝子をクローニング(cloning)した結果、インターフェロンαが少なくとも１０個の異なる遺伝子で構成された遺伝子群によってコードされると明らかになったが、これは、ＤＮＡ配列の遺伝子生成物が一つの均一なタンパク質を生成することではなく、インターフェロンαが類似する構造を有するサブタイプタンパク質の混合物であることを意味する。このようなサブタイプタンパク質はインターフェロンα−１、２、３…などと称する(Nature 290, 20-26, 1981)。
【０００９】
種々のインターフェロンのうち、ヒトの白血球から精製されたヒトインターフェロンαは分子量が１７，５００〜２１，０００程度であり、タンパク質ｍｇ当り２ｘ１０8  ＩＵ程度の非常に高い固有活性を有している。生体内インターフェロンαは１６５個のアミノ酸で構成されたタンパク質で、２３番目アミノ酸がリジンの場合がインターフェロンα−２ａ(配列番号：１)、２３番目アミノ酸がアルギニンの場合がインターフェロンα−２ｂ(配列番号：２)である。ヒトインターフェロンαを生産する方法として、初期には細胞培養法を用いる方法が知られていたが、この方法は生産性が１リットル当り２５０μｇ程度に過ぎないため、大量生産には適していない。
【００１０】
したがって、その後は遺伝子組換え技術によって微生物から比較的簡便な方法で多量のインターフェロンを生産する技術が開発され、現在まで使用されている。
【００１１】
最も一般的に使用されている大腸菌を用いた製造方法においては、大腸菌細胞の特性によって開始コドンの位置に存在するＡＴＧコドンの作用によってＮ−末端にメチオニン残基がもう一つ添加された１６６個または１６７個アミノ酸からなるインターフェロンαが製造されるようになるが、ヒト成長ホルモンの場合は、付加されたメチオニン残基によって人体に有害な免疫反応が誘発され得ることが報告されている(ヨーロッパ特許公開第２５６，８４３号)。
【００１２】
さらに、発現されたインターフェロンαの大部分が不溶性封入体の形で細胞質内に蓄積されるので、発現されたインターフェロンαは精製工程中に必ずリフォールディング工程を経て活性化された形態に転換されなければならない。このようなリフォールディング工程は非常に非効率的であり、インターフェロンαが部分的に還元された状態に存在するか、分子間ジスルフィド結合体または誤ったジスルフィド結合体などを形成するので、これを精製工程で再度除去しなければならないという難しさがあり、この際力価の損失が多くなる。特にミスフォールディング(misfolding)されたインターフェロンのような望ましくないインターフェロンを除去することが難しい。
【００１３】
このような問題を解決するために、最近では菌体内生産よりＮ−末端にメチオニンの付加なしに可溶化状態で有用タンパク質を分泌生産する方法が開発されている。
【００１４】
このような方法において、目的とする組換えタンパク質はＮ−末端にシグナルペプチドが付加された融合タンパク質として発現される。この融合タンパク質が細胞質膜を通過するとき、シグナルペプチドは大腸菌内の酵素によって除去され、天然型の目的タンパク質が分泌される。
【００１５】
分泌生産方法では、アミノ酸配列および高次構造とも野生型と同様なタンパク質が得られるので、菌体内生産方法より有利である。しかし、分泌生産方法は菌体内生産方法に比べて、膜通過および連続精製工程の効率が低いので、生産量が少ない。特に、哺乳類由来のタンパク質を原核生物を用いて分泌生産すると、原核生物由来のタンパク質を分泌生産した場合に比べて生産効率が非常に低いと知られている。いきおいより効率的な分泌生産方法の開発が望まれていた。そして、韓国特許公告第９３−１３８７号は、大腸菌のアルカリンホスファターゼのシグナルペプチドを用いてインターフェロンαの大量生産を試したが、その生産量が培養液リットル当り１０9  ＩＵ(１０ｍｇ／培養液Ｌ)程度と非常に少なかった。したがって、微生物を用いてアミノ末端にメチオニン残基が付加されていない可溶性インターフェロンαを大量生産できる方法が切実に要求されている。
【００１６】
そこで、本発明者らは前記問題を解決しようと鋭意研究した結果、既知の大腸菌(E. coli)の分泌タンパク質である熱安定性エンテロトキシンIIのシグナルペプチドを変化して高い発現率を示す新たなシグナルペプチドを製造し（韓国特許出願第９８−３８０６１号および韓国特許出願第９９−２７４１８号）、これを用いて大量の天然型インターフェロンαが得られることを発見した。すなわち、変形された大腸菌シグナルペプチドにエンテロトキシンIIコード遺伝子の代りにインターフェロンαコード遺伝子を連結させた遺伝子を含む発現ベクターを製造し、この発現ベクターにより形質転換した形質転換微生物を培養することにより、天然型生物学的活性を有するインターフェロンαを大量分泌生産するのに成功した。
【００１７】
発明の要約
したがって、本発明の目的は、ヒトインターフェロンαを分泌生産できる発現ベクターを提供することである。
【００１８】
本発明の他の目的は、前記発現ベクターで形質転換された微生物を提供することである。
【００１９】
本発明のまた他の目的は、前記微生物を用いてアミノ末端にメチオニン残基が付加されていない可溶性ヒトインターフェロンαを大量生産する方法を提供することである。
【００２０】
発明の詳細な説明
本発明の一実施態様によれば、大腸菌の変形された熱安定性エンテロトキシンIIシグナル配列 (以下、STII変異体と称す)をコードするポリヌクレオチドおよびその３'−末端に連結された、ヒトインターフェロンα(human Interferon α: hIFNα)をコードするポリヌクレオチドを含むヒトインターフェロンαの分泌生産用の発現ベクターが提供される。
【００２１】
本発明の発現ベクターの製造のために使用されるヒトインターフェロンαをコードするポリヌクレオチドは、天然型ヒトインターフェロンα−２ａ(配列番号：１)、インターフェロンα−２ｂ(配列番号：２)、インターフェロンα−１、インターフェロンα−３など任意のヒトインターフェロンαのサブタイプをコードするポリヌクレオチドであってもよく、このヒトインターフェロンαサブタイプのいずれか一つをコードする変形された塩基配列を有する組換えポリヌクレオチドであってもよい。
【００２２】
インターフェロンαを分泌生産するための目的で本発明のベクターにおいてヒトインターフェロンαをコードするポリヌクレオチドの５'−末端の前に連結される、大腸菌の変形された熱安定性エンテロトキシンIIシグナル配列をコードするポリヌクレオチドは、配列番号：３のアミノ酸配列を有する大腸菌の熱安定性エンテロトキシンIIシグナル配列のうち一つ以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換された変形体、好ましくは４、２０および２２番目アミノ酸のうち一つ以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換された変形体をコードするポリヌクレオチドであってもよい。そのようなポリヌクレオチドは、たとえば、配列番号：３のアミノ酸配列を有する大腸菌の熱安定性エンテロトキシンIIシグナル配列 (STII)から４番アミノ酸がトレオニンに置換されるか([Thr4] STII)；４番アミノ酸がトレオニンに、２２番アミノ酸がグルタミンに各々置換されるか([Thr4, Gln22] STII)；４番アミノ酸がトレオニンに、２０番アミノ酸がバリンに、２２番アミノ酸がグルタミンに各々置換されるか([Thr4, Val20, Gln22] STII)；４番アミノ酸がトレオニンに、２０番アミノ酸がバリンに各々置換された（[Thr4, Val20] STII）変形体をコードするもので、好ましくは各々配列番号：４、５、６および７のポリヌクレオチド配列を有する。しかし、コドンの縮退性(degeneracy)によって本発明の変異体をコーディングする様々なポリヌクレオチドが存在してもよく、特にアミノ酸配列に影響を及ぼさず、大腸菌の好むコドンを選択して変化されたポリヌクレオチドを使用することにより、インターフェロンαの発現量を遥かに増加させることができる。
【００２３】
さらに、本発明の発現ベクターは、インターフェロンαの発現および分泌量をさらに増加させるために、大腸菌の熱安定性エンテロトキシンIIシャイン−ダルガーノ配列（Shine-Dalgarno sequence；ＳＤ配列）(配列番号：８)またはその変形体を変形された熱安定性エンテロトキシンIIシグナル配列をコードするポリヌクレオチドの５'−末端の前にさらに含んでもよい。前記ＳＤ配列の変形体は配列番号：８の大腸菌の熱安定性エンテロトキシンII  ＳＤ配列のうち５'−末端のＧＡＧＧ以下の塩基数が正常の７つ(TGATTTT)より減少した６個または５個を有するもので、これらを用いるとインターフェロンαの分泌発現率が増加する。しかし、塩基数が４個より少なくなる場合は発現率が著しく減少する。本発明では、配列番号：９の配列を有する大腸菌の熱安定性エンテロトキシンII  ＳＤ配列の変形体を使用することが特に好ましい。
【００２４】
本発明の発現ベクターの製造に用いられるプロモーターとしては、微生物において異種タンパク質を発現できる任意のプロモーターであり得、特に大腸菌で異種タンパク質を発現させる場合ｌａｃプロモーター、Ｔａｃプロモーター、アラビノースプロモーターなどが好ましい。
【００２５】
また、本発明では前記発現ベクターで微生物、たとえば、大腸菌BL21(DE3) (Novagen, USA)、大腸菌 XL-1 blue (Novagen, USA)のような大腸菌菌株を形質転換して製造された形質転換微生物が提供される。このような形質転換微生物としては、大腸菌 BL21(DE3)/pT14OSSIα-2a-4T(「HM 10603」)、大腸菌BL21(DE3)/pT14OSSIα-2a-4T22Q (「HM 10611」)、大腸菌BL21(DE3)/pT14OSSIα-2b-4T (「HM 10703」)および大腸菌BL21(DE3)/pT14OSSIα-2b-4T22Q (「HM 10711」)を例示することができ、これらは微生物寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の規定により、１９９９年１２月２３日付で韓国微生物保存センター (KCCM) (住所：120-221大韓民国ソウル西大門区弘濟1洞Yurim B/D  361-221)寄託番号：第KCCM-10175号、第KCCM-10176号、第KCCM-10177号および第KCCM-10178号として各々寄託された。
【００２６】
さらに、本発明では前記形質転換体を適切な条件下で培養することにより、アミノ末端に追加のメチオニンが添加されていないインターフェロンαを大腸菌ペリプラズム内に大量分泌生産する方法が提供される。培養条件は微生物形質転換体の通常の培養条件と同様である。
【００２７】
本発明の方法を用いて分泌生産できるインターフェロンαには、１６５個のアミノ酸からなる天然型ヒトインターフェロンα−２ａ(配列番号：１)およびインターフェロンα−２ｂ(配列番号：２)だけでなく、インターフェロンα−１、インターフェロンα−３など任意のヒトインターフェロンαサブタイプが含まれる。また、本発明の方法はインターフェロンβおよびインターフェロンγなど他のインターフェロンの分泌生産に適用してもよい。
【００２８】
本発明によれば、大腸菌形質転換体によって生産されたインターフェロンαのうち８０％以上がペリプラズム内に分泌されるので、インターフェロンαを培養培地１リットル当たり１ｇ以上の高い収率で分泌生産でき、このように生産されたインターフェロンαはアミノ末端部位に他のアミノ酸の付加なしに天然型と同様なアミノ酸配列を有し、細胞内で天然型のインターフェロンαと同様の生物学的力価を示す。
【００２９】
以下、本発明を下記実施例によってさらに詳細に説明するが、かかる実施例は本発明の範囲を制限するものではない。
【００３０】
参考例：インターフェロンα-2a遺伝子およびそれを含むベクターの製作
ヒトインターフェロンα-2a遺伝子を得るために、ヒトゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号：１０および１１の塩基配列を有するオリゴプライマーとして用いた重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。配列番号：１０のプライマーは天然型hIFNαの一番アミノ酸であるシステインの上流に制限酵素Nde I認識部位（5'-CATATG-3'）を設けるようにデザインし、配列番号：１１のプライマーは終了コドンの後側に制限酵素BamH I認識部位（5'-GGATCC-3'）を設けるようにデザインされた。
【００３１】
増幅されたＰＣＲ産物をNdeIとBamHIで切断してhIFNα-2aをコードするＤＮＡ断片を得た。前記ＤＮＡ断片をベクターpET-14b (Novagen, USA)のNde I/BamHI切断部位に挿入してベクターpT-IFNα-2aを得た。
図１は、ベクターpT-IFNα-2aの製作過程を示す。
【００３２】
比較例１：エンテロトキシンシグナル配列およびIFN α-2a遺伝子を含有するベクターの製作
大腸菌エンテロトキシンIIシグナル配列遺伝子を製造するために、大腸菌エンテロトキシンIIシグナル配列の公知のヌクレオチド配列に基づいて配列番号：１２および１３の相補的なオリゴヌクレオチド対を考案し、ＤＮＡシンセサイザ(Model 380B, Applied Biosystem, USA)を用いて合成した。前記オリゴヌクレオチドは、大腸菌エンテロトキシンIIの開始コドン前に制限酵素BspH I認識部位（制限酵素Nco I認識部位と相補的である）を有し、３'−末端にはアミノ酸の変化なしにコドンのみを変えて制限酵素Mlu I認識部位を有するように考案された。２つのオリゴヌクレオチドを９５℃でアニーリングして大腸菌エンテロトキシンIIシグナル配列遺伝子を含有する平滑−末端ＤＮＡ断片を製造した。該ＤＮＡ断片をベクターpUC19(Biolabs, USA)のSma I部位に挿入してベクターpUC19STを製作した。
【００３３】
また、エンテロトキシンシグナルペプチドとIFNα-2a遺伝子を連結するために、IFNα-2a遺伝子を含有する参考例のベクターpT-IFNα-2aを鋳型とし、配列番号：１４および１５のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてＰＣＲを行った。配列番号：１４のプライマーはIFNα-2a遺伝子の５'−末端に対応し、配列番号：１５のプライマーは終了コドン後に制限酵素BamH I認知配列（5'-GGATCC-3'）を挿入するように考案された。天然型IFNα-2aをコードするポリヌクレオチド配列を含有するＤＮＡ断片を前記ポリヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲによって増幅した。増幅されたＤＮＡ断片を制限酵素Mlu IとBamH Iで切断してMlu IとBamH I末端を有するIFNα-2a ＤＮＡ断片を製造した。
【００３４】
一方、エンテロトキシンシグナルペプチドを含有するベクターpUC19STを制限酵素MluIで切断した後制限酵素BamHIで消化してMluIとBamHI末端を有するベクター断片を得た。該ベクター断片を前記のIFNα-2aＤＮＡ断片と連結してベクターpUC19SIFNα-2aを製作した。
【００３５】
ベクターpUC19SIFNα-2aを制限酵素BspHIとBamHIでさらに切断してＤＮＡ断片（５６４ｂｐ）を回収した。ベクターpET-14b (Novagen)をNcoIとBamHIで切断してベクター断片を作った後、前記ＤＮＡ断片とベクター断片を互いに連結してベクターpT14SIα-2aを製作した。図２は、ベクターpT14SIα-2aの製作過程を示す。
【００３６】
次いで、大腸菌BL21(DE3)菌株を７０ｍＭ塩化カルシウム溶液で処理してコンピテント大腸菌に製造し、１０ｍＭトリス緩衝溶液（ｐＨ７.５）中のベクターpT14SIα-2aの懸濁液を加えた。ベクターによって伝達された抗生物質に対する耐性および感受性を用いて通常の方法で形質転換株を選択することにより、IFN α-2aを発現する大腸菌形質転換株HM 10600を製造した。
【００３７】
また、ベクターpT14SIα-2aを鋳型とし、配列番号：１６および１７の合成オリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲ法によってエンテロトキシンのシャイン−ダルガーノ配列、エンテロトキシンシグナルペプチドおよびIFNα-2a遺伝子が順番に連結されたＤＮＡ断片を得た後、これをXbaIとBamHIで切断して挿入体を得た。   ベクターpET-14b (Novagen)をXbaIとBamHIで切断したベクター断片と前記の挿入体を連結してベクターpT14SSIα-2aを製作した。図３は、ベクターpT14SSIα-2aの製作過程を示す。大腸菌BL21(DE3)をベクターpT14SSIα-2aで形質転換して大腸菌形質転換株HM 10601を製造した。
【００３８】
比較例２：エンテロトキシンシグナル配列およびIFN α-2b遺伝子を含有するベクターの製作
特定部位置換法(site directed mutagenesis)(Papworth, C. et al., Strategies, 9, 3(1996))に従って、ベクターpT14SSIα-2aに含まれたINFα-2a遺伝子の２３番位置のリジンコドンをアルギニンコドンに置換することにより、INFα-2b遺伝子を含む発現ベクターを製作した。鋳型としてベクターpT14SSIα-2aを置換されたコドンを含有する下記配列番号：１９および２０の合成オリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションしてハイブリッド分子を形成し、このオリゴヌクレオチドを経て５'→３'方向に延長したｐｆｕ(Stratagene)と４つのヌクレオチドトリホスフェート(ATP, GTP, TTP, CTP)を用いてＤＮＡ増幅を行った。
0003751883.tif 000002
【００３９】
増幅されたＤＮＡ断片を回収し、これに制限酵素DpnIを加えて転換されていないベクターを完全に除去した。
変形されたプラスミドを用いて大腸菌 XL-1 blue (Novagene)を形質転換した後、形質転換されたコロニーから回収されたＤＮＡの塩基配列を決定し、IFNα-2aの２３番アミノ酸のリジンがアルギニンに置換された遺伝子を含むベクターpT14SSIα-2bを製造した。
【００４０】
次いで、前記ベクターpT14SSIα-2bを用いて前記比較例１と同様の方法で大腸菌BL21(DE3)菌株を形質転換して大腸菌形質転換株HM 10701を得た。この形質転換株を培養して生産されたタンパク質のＮ−末端アミノ酸配列を分析した結果、天然型と同様なアミノ酸配列を有するインターフェロンα-2bの発現を確認した。
【００４１】
実施例１：エンテロトキシンシグナルペプチド変形体を含有するベクターの製作
（１）[Thr4] STIIを含むベクターの製作
エンテロトキシンシグナル配列ペプチド中の特定アミノ酸残基のみを変形させるために公知の方法である特定部位置換法（site directed mutagenesis方法）を用いてエンテロトキシン変形体シグナル配列をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを次の通りに製造した。
【００４２】
まず、比較例２のような特定部位置換法により、前記比較例１で製造されたベクターpT14SSIα-2aを配列番号：２２および２３のオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲに付し、エンテロトキシンシグナル配列の４番目アミノ酸をトレオニン（Thr）に置換した変形されたプラスミドを製造した。
0003751883.tif 000003
【００４３】
変形されたプラスミドを用いて大腸菌XL-1 blue (Novagene, USA)を形質転換した。形質転換されたコロニーから回収したＤＮＡの塩基配列を決定し、４番目アミノ酸がThrに変形されたエンテロトキシンシグナル配列ペプチドをコードするポリヌクレオチドが含まれたベクターを得た。前記ベクターをXbaIとMluIで切断し、次いで、ベクターpT14SSIα-2aのXbaI／MluI部位に挿入してベクターpT14SSIα-2a-4Tを製作した。
【００４４】
次いで、前記ベクターpT14SSIα-2a-4Tを用いて大腸菌BL21(DE3) (Stratagene, USA)を形質転換して大腸菌形質転換株HM 10602を得た。
また、同様の方法でpT14SSIα-2bを用いてpT14SSIα-2b-4Tベクターを製造した後大腸菌BL21(DE3)を形質転換して大腸菌形質転換株HM10702を得た。
【００４５】
（２）[Thr4, Gln22] STIIを含むベクターの製作
４番アミノ酸がThrに置換されたエンテロトキシンシグナル配列ペプチドの２２番目アミノ酸をGlnにさらに置換するために、前記段階（１）で製造されたベクターpT14SSIα-2a-4Tおよび配列番号：２５および２６のオリゴヌクレオチドを用いて比較例２のような特定部位置換法によって変形されたベクターを製造した。       Asn Ala Gln Ala Cys Asp Leu Pro     (配列番号：24)
5'-CA AAT GCC CAA GCG TGT GAT CTG CCT-3'  (配列番号：25)
3'-GT TTA CGG GTT CGC ACA CTA GAC GGA-5'  (配列番号：26)
【００４６】
変形されたプラスミドを用いて大腸菌XL-1 blue (Novagene, USA)を形質転換した。形質転換されたコロニーから回収したＤＮＡの塩基配列を決定し、４番目アミノ酸がThrに、２２番目アミノ酸がGlnに各々変形されたエンテロトキシンシグナル配列を含むベクターpT14SSIα-2a-4T22Qを得た。次いで、前記ベクターpT14SSIα-2a-4T22Qを用いて前記段階（１）と同様な方法で大腸菌BL21(DE3)(Stratagene, USA)を形質転換して大腸菌形質転換株HM 10604を得た。
【００４７】
前記のように変形されたエンテロトキシンシグナル配列のシャイン−ダルガーノ配列を配列番号：９のように変形させるために、前記で製造されたベクターpT14SSIα-2a-4TおよびpT14SSIα-2a-4T22Qを鋳型とし、配列番号：２７および２８のオリゴヌクレオチドを用いて段階（２）のような特定部位置換法によって変形されたベクターを製造した。
【００４８】
変形されたプラスミドを用いて大腸菌XL-1 blue(Novagene, USA)を形質転換した。形質転換されたコロニーから回収したＤＮＡの塩基配列を決定し、エンテロトキシンシグナル配列のシャイン−ダルガーノ配列を変形させたベクターpT14OSSIα-2a-4TとpT14OSSIα-2a-4T22Qを得た。図４は、ベクターpT14OSSIα-2a-4T22Qの製作過程を示す。
【００４９】
次いで、それぞれ前記ベクターpT14OSSIα-2a-4TとpT14OSSIα-2a-4T22Qを用いて大腸菌BL21(DE3)を形質転換して大腸菌形質転換株HM 10603とHM 10611を得、これを１９９９年１２月２３日付で韓国微生物保存センター(KCCM)に寄託番号第KCCM-10175号および第KCCM-10176号として寄託した。
また、同様の方法でpT14SSIα-2bを用いてpT14OSSIα-2b-4TとpT14OSSIα-2b-4T22Qのベクターを製造した後大腸菌BL21(DE3)を形質転換して大腸菌形質転換株HM 10703とHM 10711を得、これを１９９９年１２月２３日付で韓国微生物保存センター(KCCM)に寄託番号第KCCM-10177号および第KCCM-10178号として各々寄託した。
【００５０】
（３）[Thr4, Val20, Gln22] STIIを含むベクターの製作
４番アミノ酸がThrに、２２番アミノ酸がGlnに置換されたエンテロトキシンシグナル配列ペプチドの２０番目アミノ酸をValにさらに置換するために、前記段階（２）で製造されたベクターpT14OSSIα-2a-4T22QおよびpT14OSSIα-2b-4T22Qを各々鋳型とし、配列番号：２９および３０のオリゴヌクレオチドを用いて前記段階（２）のような特定部位置換法によって変形されたベクターpT14OSSIα-2a-4T20V22QとpT14OSSIα-2b-4T20V22Qを製造した。
【００５１】
変形されたプラスミドを用いて大腸菌 XL-1 blue（Novagen, USA）を形質転換した。形質転換されたコロニーから回収したＤＮＡの塩基配列を決定し、エンテロトキシンシグナル配列のうち４番目、２０番目および２２番目アミノ酸が各々アスパラギン、アスパラギン、チロシンからトレオニン、バリンおよびグルタミンに置換された配列を有するインターフェロンα発現ベクターpT14OSSIα-2a-4T20V22QおよびpT14OSSIα-2b-4T20V22Qを得、変形されたプラスミドを用いて大腸菌BL21(DE3)を形質転換して大腸菌形質転換株HM 10612およびHM 10712を各々得た。
【００５２】
実施例２：熱安定性エンテロトキシンIIシャイン−ダルガーノ配列変形体の製造  前記で製造された発現ベクターに含まれた熱安定性エンテロトキシンIIシャイン−ダルガーノ配列のうち、リボソーム結合部位と大腸菌の変形された熱安定性エンテロトキシンIIシグナル配列の開始コドンであるＡＴＧ配列間の塩基数を減らすために、前記の比較例２のような特定部位置換法によって変形されたベクターを製造した。
【００５３】
すなわち、リボソーム結合部位GAGGから開始コドンであるＡＴＧ配列までの塩基数を正常の７個から５個に減らすために、前記実施例１の（２）で製造されたベクターpT14OSSIα-2a-4T22Qを鋳型とし、配列番号：３１および３２のオリゴヌクレオチドを用いて比較例２のような特定部位置換法によって変形されたベクターpT14NSSIα-2a-4T22Qを製造した。また、リボソーム結合部位GAGGから開始コドンであるＡＴＧ配列までの塩基数を４個に減らすためにpT14NSSIα-2a-4T22Qを鋳型とし、配列番号：３３および３４のオリゴヌクレオチドを用いて比較例２のような特定部位置換法によって変形されたベクターpT14MSSIα-2a-4T22Qを製造した。
【００５４】
変形されたプラスミドを用いて大腸菌XL-1 blueを形質転換した。形質転換されたコロニーから回収したＤＮＡの塩基配列を決定し、リボソーム結合部位GAGGから開始コドンであるATG配列までの塩基数が５個と４個に各々減少した塩基配列を有するインターフェロンα発現プラスミドpT14NSSIα-2a-4T22QおよびpT14MSSIα-2a-4T22Qを得、この発現プラスミドで大腸菌BL21(DE3)を形質転換して大腸菌形質転換株HM 10613およびHM 10614を得た。
【００５５】
実施例３：インターフェロンα−２の発現量比較
前記比較例および実施例で得られた大腸菌形質転換体を各々ＬＢ培地で培養した後IPTGを加えて３時間培養した。各々の培養液を６，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した後、沈殿した細胞塊を浸透圧ショック法（Nossal, G. N., J. Biol. Chem., 241, 3055, 1966）に従って次のように処理した。
【００５６】
すなわち、沈殿物分画を元来培養液量の１０分の１容積の等張液（２０％スクロース、１ｍＭ  ＥＤＴＡを含有する１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁し、前記懸濁液を室温で３０分間放置した後、遠心分離して菌株を回収した。次に、回収された菌体を４℃の蒸留水に懸濁することにより、菌体のペリプラズムに存在するタンパク質を抽出した。懸濁液を遠心分離して菌体成分を除去し、上澄液をペリプラズム分画として回収した。ペリプラズム分画として回収されたインターフェロンα−２の濃度をインターフェロンα−２に対する抗体（R&D, USA）を用いた通常の酵素免疫測定法(Kato, K. et al., J. Immunol., 116, 1554, 1976)に従って測定し、その測定値から培養培地１リットル当たりのインターフェロンα−２の分泌量を換算した。前記結果を表１に示す。
【００５７】
【表１】
表１  インターフェロンα‐２の発現量比較
0003751883.tif 000004
0003751883.tif 000005
註）* IFN α mg / 100 O.D600nm / L培養液
【００５８】
実施例４：後処理および精製
実施例３と同様の方法で実施例１の（２）で得られた大腸菌形質転換株HM 10611を培養した後、培養液を６，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離して細胞を収穫し、浸透圧ショック法によってペリプラズム分画を収穫した。
収穫されたペリプラズム分画をｐＨ５．０〜５．５に調整した後ｐＨ５．３に予め平衡化されたＳ−セファロース（S-Separose; Pharmacia Inc., Sewden）カラムに結合させ、２５ｍＭ  ＮａＣｌ溶液で十分洗浄した。その後、各々５０ｍＭ、１００ｍＭ、２００ｍＭおよび１Ｍ  ＮａＣｌ溶液を含む酢酸緩衝溶液を連続的に加えてIFNα-2を溶離させ、IFNα-2を含む分画を集め、合せた。
【００５９】
合せた分画をブルーセファロース（Blue Separose;Pharmacia Inc., Sewden)カラムクロマトグラフィーに通し、２Ｍ以上のＮａＣｌを含むカラム緩衝溶液を加えて溶離させて活性分画を得た。
【００６０】
前記活性分画を緩衝液に透析した後、最終的にｐＨ５．８でＤＥＡＥ陰イオン交換樹脂カラムを用いた樹脂カラム分画を行って９９％以上の純度を有するインターフェロンα−２ａを得た。また、大腸菌形質転換株HM 10711を用いて同様の実験を繰り返してインターフェロンα−２ｂを精製した。
【００６１】
精製されたインターフェロンα−２ａおよび２ｂの純度と大略の濃度を決定するためにSDS-PAGEを行ってから実施例３のような通常の酵素免疫測定法を用いてペリプラズム溶液内インターフェロンαの正確な濃度を分析した。また、Ｎ−末端アミノ酸配列分析を通じてインターフェロンα−２ａおよび２ｂは追加のメチオニンを有しない天然型であることを確認した。
【００６２】
実施例５：組換え菌株から生成したインターフェロンα−２ａの分子量確認
SDS-PAGEおよびウェスタンブロッティングを用いて組換え菌株から生産されたインターフェロンα−２ａおよび２ｂの発現および分子量を確認した。
まず、実施例４で得られた大腸菌形質転換株HM 10611のペリプラズム分画およびこれを精製したIFNα-2aを、IFNα-2a商用対照品(３ｘ１０6  ＩＵ／ｍｌ)を対照群として、通常の方法に従ってSDS-PAGEで分析した。図５ａは前記SDS-PAGE結果を示すもので、ここでレーン（lane）１はIFNα-2a対照群であり、レーン２は大腸菌形質転換株HM 10611のペリプラズム分画であり、レーン３は精製されたIFNα-2aである。図５ａから分かるように、精製されたインターフェロンα-2aが天然型インターフェロンα-2aと同様の分子量を有し、大腸菌形質転換株HM 10611のペリプラズム分画に大量で含まれていることを確認した。
【００６３】
また、形質転換株HM 10711のペリプラズム分画、Ｓ−セファロースカラムカラムクロマトグラフィーで精製された分画および最終精製されたIFNα-2bを用いて通常の方法でSDS-PAGEを行った。
【００６４】
ニトロセルロース膜（Bio-Rad Lab, USA）をブロッティング（blotting）用緩衝液（１７０ｍＭグリシン(glicine)、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ(ｐＨ８)、２０％メタノール）に十分濡らした後ゲル上に分離されたタンパク質をブロッティングキットを用いて３時間にわたってニトロセルロース膜に移した。その後ニトロセルロース膜を１％カゼイン溶液に１時間放置し、０．０５％ツイーン２０（Tween 20）を含むＰＢＳ溶液で３回洗浄した。洗浄後、ウサギ抗−IFNα抗体(Chemicon, # AB1434, USA)をＰＢＳで稀釈して加えてから室温で２時間反応させた。反応が終了した後ＰＢＳＴ溶液で３回洗浄して反応しなかった抗体を除去した。これにＨＲＰ(horseradish peroxidase)−接合されたヤギ抗−ウサギＩｇＧ(Bio-Rad Lab, USA)溶液をＰＢＳで稀釈して加えた後、さらに室温で２時間反応させた。その後、膜をＰＢＳＴで洗浄し、ペルオキシダーゼ基質キット(Bio-Rad Lab, USA)溶液を加えて発色させた。前記ウェスタンブロッティング結果を図５ｂに示し、ここでレーン１は形質転換株HM 10711の醗酵後のペリプラズム分画、レーン２はＳ−セファロースカラムクロマトグラフィーで精製された分画、レーン３は最終精製されたIFNα-2bを示す。
【００６５】
本実施例の結果から、本発明の組換え大腸菌菌株から大量の可溶性インターフェロンαが発現されることを確認できる。
【００６６】
特許手続上の微生物寄託の国際的承認に関するブダペスト条約
国際様式
受領人：Hanmi Pharm. Co., Ltd
大韓民国京畿道華城郡八灘面下楮里893-5番地
下記国際寄託機関により、規則7.1に基づいて発行された原寄託に関する受託証
0003751883.tif 000006
１  規則６.４(ｄ)が適用される場合、この日は国際寄託機関の地位を獲得した日である：国際寄託機関の地位を獲得した後、ブダペスト条約の外で行われた寄託をブダペスト条約に基づく寄託に転換する場合、この日は国際寄託機関が微生物受領した日である。
【００６７】
特許手続上の微生物寄託の国際的承認に関するブダペスト条約
国際様式
受領人：Hanmi Pharm. Co., Ltd
大韓民国京畿道華城郡八灘面下楮里893-5番地
下記国際寄託機関により、規則7.1に基づいて発行された原寄託に関する受託証
0003751883.tif 000007
１  規則６.４(ｄ)が適用される場合、この日は国際寄託機関の地位を獲得した日である：国際寄託機関の地位を獲得した後、ブダペスト条約の外で行われた寄託をブダペスト条約に基づく寄託に転換する場合、この日は国際寄託機関が微生物受領した日である。
【００６８】
特許手続上の微生物寄託の国際的承認に関するブダペスト条約
国際様式
受領人：Hanmi Pharm. Co., Ltd
大韓民国京畿道華城郡八灘面下楮里893-5番地
下記国際寄託機関により、規則7.1に基づいて発行された原寄託に関する受託証
0003751883.tif 000008
１  規則６.４(ｄ)が適用される場合、この日は国際寄託機関の地位を獲得した日である：国際寄託機関の地位を獲得した後、ブダペスト条約の外で行われた寄託をブダペスト条約に基づく寄託に転換する場合、この日は国際寄託機関が微生物受領した日である。
【００６９】
特許手続上の微生物寄託の国際的承認に関するブダペスト条約
国際様式
受領人：Hanmi Pharm. Co., Ltd
大韓民国京畿道華城郡八灘面下楮里893-5番地
下記国際寄託機関により、規則7.1に基づいて発行された原寄託に関する受託証
0003751883.tif 000009
１  規則６.４(ｄ)が適用される場合、この日は国際寄託機関の地位を獲得した日である：国際寄託機関の地位を獲得した後、ブダペスト条約の外で行われた寄託をブダペスト条約に基づく寄託に転換する場合、この日は国際寄託機関が微生物受領した日である。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、ベクターpT-IFNα-2aの製作過程を示す。
【図２】  図２は、ベクターpT14SIα-2aの製作過程を示す。
【図３】  図３は、ベクターpT14SSIα-2aの製作過程を示す。
【図４】  図４は、ベクターpT140SSIα-2a-4T22Qの製作過程を示す。
【図５】  図５ａおよび図５ｂは、組換え細胞株からのインターフェロンα-2a(IFNα-2a)の発現如何と、発現されたINFα-2aの精製度を確認したSDS-PAGE結果および発現されたIFNα-2bの分子量を確認したウェスタンブロッティング結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
0003751883.tif 000012
【図４】
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【図５】
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