(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の工程からなる、黄体形成ホルモン、卵胞刺激ホルモン、絨毛性ゴナドトロピン、および甲状腺刺激ホルモンからなる群から選択されるダイマー性蛋白質ホルモンの製造方法：
ａ）プロモーター、上記ダイマー性蛋白質のα−サブユニットをコードする構造遺伝子、およびターミネーター配列を含む第一のベクターを提供し、該プロモーター、構造遺伝子およびターミネーター配列は機能可能に連結されていて、宿主細胞が該ベクターによって適正に形質転換されたとき該遺伝子の発現を可能にし、該構造遺伝子はコード領域および少なくとも一つのイントロンを含み、その一つは該α−サブユニットのコード領域の直ぐ５’側に存在し、但し該α−サブユニットをコードする構造遺伝子はウシ黄体形成ホルモンのα−サブユニットをコードする遺伝子の全ゲノム配列ではなく；
ｂ）該ダイマー性蛋白質のβ−サブユニットをコードする構造遺伝子を提供し、該β−サブユニット構造遺伝子は、イ）前記αサブユニットを含む第一のベクター内に存在し、そして該αサブユニットに機能可能に連結していて、宿主細胞が第一のベクターで適当に形質転換されたときβ−サブユニット構造遺伝子の発現を可能にするか、または、ロ）プロモーター、β−サブユニット構造遺伝子およびターミネーター配列を含む第二のベクター中に存在し、該プロモーター、β−サブユニット構造遺伝子およびターミネーター配列は機能可能に連結していて、宿主細胞が第二のベクターで適当に形質転換されたとき該β−サブユニット構造遺伝子の発現を可能にしており；
ｃ）宿主細胞を第一のベクターで形質転換し、またはもしβ−サブユニットをコードする構造遺伝子が第二のベクター中に存在する場合は、宿主細胞を第一および第二のベクターで形質転換し；そして、
ｄ）該形質転換細胞をダイマー性蛋白質が生産される条件で培養する、
ここにおいて、α−サブユニットのコード領域の直ぐ５’側のイントロンは、イントロンを含まないｃＤＮＡであるα−サブユニットをコードする構造遺伝子を用いて同じ条件下で生産できるよりも多量のダイマー性蛋白質が生産されるように、コード領域のＡＴＧに対して間隔をあけて配置されている。
【請求項２】
β−サブユニットをコードする構造遺伝子が、該β−サブユニットをコードする遺伝子のゲノム配列である、請求項１の方法。
【請求項３】
α−サブユニットをコードする構造遺伝子が、複数のイントロン、３’および５’側部領域、内在性の５’非翻訳配列およびポリアデニル化シグナルが付加された該α−サブユニットをコードするＤＮＡを含む、請求項１の方法。
【請求項４】
ダイマー性蛋白質がヒト卵胞刺激ホルモンであり、第一のベクターが該α−サブユニットをコードする遺伝子のゲノム配列を含む、請求項１の方法。
【請求項５】
ダイマー性蛋白質がヒト黄体形成ホルモンであり、第一のベクターが該α−サブユニットをコードする遺伝子のゲノム配列を含む、請求項１の方法。
【請求項６】
ダイマー性蛋白質がヒト絨毛性ゴナドトロピンホルモンであり、第一のベクターが該α−サブユニットをコードする遺伝子のゲノム配列を含む、請求項１の方法。
【請求項７】
ダイマー性蛋白質が非ヒト絨毛性ゴナドトロピンホルモンであり、第一のベクターが該α−サブユニットをコードする遺伝子のゲノム配列を含む、請求項１の方法。
【請求項８】
ダイマー性蛋白質が非ヒト卵胞刺激ホルモンであり、第一のベクターが該α−サブユニットをコードする遺伝子のゲノム配列を含む、請求項１の方法。
【請求項９】
α−サブユニットが下記の配列
【化１】
0003814156.tif 000008
を含む請求項１の方法。
【請求項１０】
β−サブユニットが下記の配列
【化２】
0003814156.tif 000009
を含む請求項４の方法。
【請求項１１】
α−サブユニットをコードする構造遺伝子が、該α−サブユニットをコードする遺伝子の全ゲノム配列ではない、請求項１の方法。
【請求項１２】
β−サブユニットをコードする構造遺伝子が、第二のベクター中に存在する請求項１の方法。
【請求項１３】
β−サブユニットをコードする構造遺伝子が少なくとも一つのイントロンを含む請求項１の方法。
【請求項１４】
α−サブユニットをコードする構造遺伝子においてα−サブユニットのコード領域の直ぐ５’側に存在するイントロンが、生産すべきダイマー性蛋白質に相当する天然のダイマー性蛋白質のα−サブユニットをコードする遺伝子のゲノム配列中に天然に存在するものである、請求項１の方法。
【請求項１５】
ダイマー性蛋白質がヒト甲状腺刺激ホルモンであり、第一のベクターが該α−サブユニットをコードする遺伝子のゲノム配列を含む、請求項１の方法。
【請求項１６】
α−サブユニットをコードする構造遺伝子がただ一つのイントロンを含む、請求項１の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する分野】
本発明は、形質転換された哺乳動物細胞からヘテロポリマー性タンパク質を産生するための発現システムに関するもので、特に二量体の糖タンパク質ホルモン産生の新しい発現システムおよびベクターに関する。
【０００２】
【従来の技術】
αとβサブユニットｃＤＮＡクローンの培養哺乳動物細胞へのトランスフェクションにより、特徴的に低いゴナドトロピン（ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ）の発現レベルが結果として見られた。このことはこれらのホルモンの商業的スケールでの産生を深刻に妨げていた。
【０００３】
本発明の一つの観点はこのようなホルモンの産生のために商業上実用的な方法を提供することである。
β−グロビン（１，２）や免疫グロブリン遺伝子（３−５）のようないくつかの遺伝子は、至適ｍＲＮＡ産生にイントロンを要求するが、一方、チミジンキナーゼ（ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ）（６）のような他の遺伝子では要求しない。遺伝子発現のイントロン依存性上昇は非転写性（例えばグロビン遺伝子）あるいは転写性（例えば免疫グロブリン遺伝子）メカニズムのいずれからも結果され得る。
【０００４】
ヒトとウシ共通のα、ＦＳＨβ、ＬＨβ、そしてヒトＴＳＨβサブユニットをコードする遺伝子の単離が報告されている（８−１４）。ラマバートランら（Ｒａｍａｂｈａｄｒａｎ  ｅｔ ａｌ．）ははじめてヒトアルファサブユニットｃＤＮＡを用いたマウス（ｍｏｕｓｅ）細胞でのトランスフェクションとそれに続く発現について述べた。それ以来いくつかのグループが培養哺乳動物細胞へのトランスフェクションによる二量体糖タンパク質ホルモン発現の成功を報告している。それらのグループのいくつか（１６，１７）はｃＤＮＡクローンを用い、一方他のグループ（１４，１８，１９）はイントロン含有ｃＤＮＡまたはゲノム（ｇｅｎｏｍｉｅ）の配列を用いた。
【０００５】
米国特許出願第５４８，２２８号と第６９６，６４７号は培養哺乳動物細胞でのゴナドトロピン産生のためのｃＤＮＡクローン（イントロンなし）の使用について述べている。これらの発現システムは生物学的に活性のある分子を産生する一方、形質転換された哺乳動物細胞の産生率は述べられたものより一般に低い。
【０００６】
より高い産生をもたらすような、ゴナドトロピンに有効な改良された発現システムを提供することが本発明のもう一つの観点である。
マツーク（Ｍａｔｚｕｋ）とボイメ（Ｂｏｉｍｅ）（１８ａ）は、ヒトαサブユニットｃＤＮＡのコーディング領域に挿入されたイントロンは、ｃＤＮＡクローンの使用に比較してより高い発現をもたらすと述べているがこの主張を、あるいは彼らの特別な方法の記述を支持するデータは得られていない。最近の発表ではキーツェル（Ｋａｅｔｚｅｌ）とニールソン（Ｎｉｌｓｏｎ）（７）がＣＨＯ細胞で比較的高いレベルのウシＬＨ発現を報告した。彼らのシステムはαとＬＨβサブユニット両者の発現にゲノム配列を用いた。しかしながらＬＨ発現におけるｃＤＮＡ配列に対するゲノム配列の効果は彼らの論文中で論じられていない。
【０００７】
本発明のもう一つの観点は、現在までの状況によって起こる混乱を克服することおよび、二量体糖タンパク質をコードする改良されたベクターを駆使することに必要な、重要な情報とそのようなベクターを用いた生産方法を提供することである。
【０００８】
ウサギβ−グロビン（１，２，２０）、大腸菌ｇｐｔ（２０）、マウスＤＨＦＲ（２０，２１）などの組織培養細胞内でイントロンはｍＲＮＡの蓄積の増加につながっている。転写を上昇させるエンハンサー要素（ｅｎｈａｎｃｅｒ  ｅｌｅｍｅｎｔ）を持つイントロンを含む遺伝子の例は免疫グロブリン遺伝子（３−５）、ラットチトクローム（ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ）ｃ遺伝子（２２）、ヒトプローα１（Ｉ）コラーゲン遺伝子などである。イントロンはまた次のような遺伝子：ラット成長ホルモン、マウスメタロチオネイン（ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ）−Ｉ、およびヒトβ−グロビンなどのトランスジェニック・マウスにおける転写効率の上昇をもたらすことが示された（２４）。しかしながらこれら３つの遺伝子が培養哺乳動物細胞にトランスフェクトされた時にはイントロンはそれらの発現に何ら効果を持たない。
【０００９】
発現レベルは、さまざまな３´非転写性ポリアデニレーション領域によって影響され得ることが示されている（２４，２５）。例えばｇａｌ  Ｋマーカー遺伝子のより高い発現レベルは、転写の終結（ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ）にＳＶ４０の初期部位（ｅａｒｌｙ  ｒｅｇｉｏｎ）またはヒトコラーゲンポリアデニレーション領域ではなく、ウシ成長ホルモンポリアデニレーション領域を用いた場合にもたらされる（２４）。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の様々な主旨と観点に従って、αサブユニットゲノム配列、あるいは哺乳動物細胞において、二量体タンパク質ホルモンの産生を著しくかつ驚異的に上昇させるイントロンを加えたαサブユニットｃＤＮＡ構築物を使用する新しい発現システムを提供する。
【００１１】
この発見は共通のαサブユニットを持つ二量体糖タンパク質ホルモンを高収率生産するための工程の開発を容易にする。それらは絨毛膜性（ｃｈｏｒｉｏｎｉｃ）ゴナドトロピン（ＣＧ）、卵胞（ｆｏｌｌｉｃｌｅ）刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体形成（ｌｕｔｅｉｎｉｚｉｎｇ）ホルモン（ＬＨ）、そして甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）を含む。
【００１２】
更にまたＴＳＨのβサブユニット遺伝子の発現がイントロン依存性であることが期せずして発現された。ＴＳＨβサブユニットの至適な発現に必要なゲノム領域の特定は、当発明によって二量体ＴＳＨを効率よく産生するための工程の開発に関する重要で特別な情報を提供することにより可能となった。
【００１３】
本発明のさまざまな観点および主旨は図面によりさらに理解されるであろう。
【００１４】
【実施例】
実施例１：共通αとＦＳＨβサブユニット発現のためのプラスミドの構築。
Ａ．完全なヒトαサブユニットゲノムクローンは多くの原材料（ｓｏｕｒｃｅ）からｐＢＲ３２２への１７キロ塩基対（ｋｂ）ＥｃｏＲＩ挿入部として都合よく得ることが可能である。αプロモーターは組織特異的であることが示されており、様々な遺伝子発現に共通して用いられる培養組織細胞中では効率良く機能しないので、すべての５´側面配列をとり除くステップが入れられた。内部にあるＥｃｏＲＩ部位は、処理をしたゲノム配列の組み立てに先がけて、数回のサブクローニング段階を必要とした。有利に用いられた工学的方法が図１に示されている。２つのｐＵＣ１８サブクローン、１つは８．０ｋｂのＢａｍＨＩ−ＳａｃＩ５´部分（ｐＵＣ  ｂｓ８．０）を用いて、そして２つめは２．７ｋｂの３´ＳａｃＩ−ＥｃｏＲＩ部分（ｐＵＣｓｅ２．７）を用いて、構築された。我々の発現ベクターにあるＸｈｏＩクローニング部位に合う末端を作るためｐＵＣｓｅ２．７はＥｃｏＲＩで消化され、その端は大腸ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー（Ｋｌｅｎｏｗ）断片での処理によって平滑化されて、その後ＳａｌＩリンカーがライゲーション（ｌｉｇａｔｉｏｎ）反応で接着された。その反応混合液を更に続いてＳａｌＩ制限エンドヌクレアーゼ分解し、２．６ｋｂのベクター断片に加えて２．７ｋｂヒトαＳａｌＩ部分を生成した。この２．７ｋｂヒトαＳａｌＩ部分はゲル精製されｐＵＣ１８（ｐＵＣｓｓ２．７）のＳａｌＩ部位に再挿入された。２．７ｋｂα断片をＳａｃＩ部分として単離できるような方向にあるＳａｌＩ挿入部を含むクローンが選択された。これはゲル精製され、その後ｐＵＣｂｓ８．０のＳａｃＩに挿入されてｐＵＣ１８における１１ｋｂ挿入部として完全なヒトα遺伝子のコーディング配列が構築された。その挿入部は遺伝子の５´末端のｐＵＣ１８ポリリンカーにある既存のＳａｌＩ部位と、遺伝子の３´末端の変換ＳａｌＩ部位（ＥｃｏＩ由来）の効果によりＳａｌＩ断片として切り出すことができた。完成されたゲノムα発現構築物は、今後“全長ゲノムα”配列と呼ぶが、エクソンＩ（ｅｘｏｎＩ）の一部（ｍＲＮＡの５´非翻訳領域を含む最初の３５ヌクレオチド短い）、エクソンＩＩ、ＩＩＩ、およびＩＶの全てを介在配列（ｉｎｔｅｒｖｅｎｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）と同様に、そして３´側面配列の約２キロ塩基対（ｋｂ）を含んだ。これは転写がマウスメタロチオネインＩ（ｍｏｕｓｅ  ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ−Ｉ、ＭＴ−Ｉ）プロモーターによって支配されるように、ＣＬＨ３ＡＸＳＶ２ＤＨＦＲ発見ベクター（図２）のＸｈｏＩ部位に挿入された。この発現ベクターはまたマウスのジハイドロフォレート（ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ）還元酵素（ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）（ＤＨＦＲ）遺伝子を選択と増幅のマーカーとして含んでいた。
Ｂ．ヒトαサブユニットｃＤＮＡは、発現のために全長クローンを開始ＡＴＧに及ぶＮｃｏＩおよびＴＡＡ終止コドンの２１５塩基対（ｂｐ）下流の３´非翻訳領域で切断するＨｉｎｄＩＩＩで分解することにより工作された。５´ＳａｌＩ部位とコザック（ｋｏｚａｋ）コンセンサス配列（２７）は合成オリゴヌクレオチドにより、３´ＳａｌＩ部位は上記のようにリンカーを付着することによって供給された。工作されたαサブユニットｃＤＮＡクローンのＤＮＡ配列は、長さ約６００ｂｐで、本願の親出願から成立した特許第３４０２６０４号の表７に示されている。これはＣＬＨ３ＡＸＳＶ２ＤＨＦＲ発現ベクター（図２）のＸｈｏＩ部位に挿入された。内因性の５´非翻訳領域と３´ポリアデニレーションシグナルが工作過程においてｃＤＮＡクローンから除かれ、それ故にＭＴ−Ｉプロモーターとサル（ｓｉｍｉａｎ）ウィルス４０（ＳＶ４０）初期ポリアデニレーションシグナルがそれぞれベクター配列によって供給された。
【００１５】
Ｃ．この研究において使用されたヒトＦＳＨβ部分ゲノムクローンは２．０ｋｂのＤｄｅＩ−Ｓａｕ３Ａ切片であり、それは開始ＡＴＧ上流の４０ｂｐ配列に加えたエクソンＩＩのタンパクコーディング領域、エクソンＩＩＩのタンパクコーディング領域、およびこの２つのエクソンを分けている１．６ｋｂのイントロンを含んでいた（本願の親出願から成立した特許第３４０２６０４号の表８参照）。５´ＤｄｅＩ部位と３´Ｓａｎ３Ａ部位は前もってそれぞれＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩに変換されており、それ故現状の発現ベクターとの互換性はない。ＦＳＨβゲノムクローンの部分はそれ故上記のように平滑化したＳａｌＩ末端に商業的に製造されているＳａｌＩリンカーを付着して供給された。ＳａｌＩ部分はそれからＤＨＦＲコーディング領域がネズミ（ｍｕｒｉｎｅ）オルニチン脱炭酸酵素（ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ  ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ，ＯＤＣ）のコーディング領域に入れ替わっていること以外は構造的にＣＬＨ３ＡＸＳＶ２ＤＨＦＲと同様の発現ベクターであるＣＬＨ３ＡＸＳＶ２０ＤＣ（図２）のＸｈｏＩ部位に挿入された。
【００１６】
実施例２：安定なトランスフェクションにおける全長ゲノムαとｃＤＮＡαＣＬＨ３ＡＸＳＶ２ＤＨＦＲの転写単位の比較。
ゲノムαとｃＤＮＡαＣＬＨ３ＡＸＳＶ２ＤＨＦＲ構造物は、それぞれのα発現プラスミドをヒトＦＳＨβＣＬＨ３ＡＸＳＶ２０ＤＣ発現プラスミドとコートランスフェクション（ｃｏｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）させ、ＦＳＨ二量体産生を測定することによって比較された。
【００１７】
Ａ．トランスフェクションの行われる２４時間前に１００ｍｍ皿に７×１０5のＤＵＫＸ  ＣＨＯ細胞（ＤＨＦＲ−マイナス）が植えられた。リン酸カルシウム沈殿は５００マイクロリッター（μｌ）のトランスフェクション用バッファー〔１４ミリモル（ｍＭ）ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＫＣｌ、０．７ｍＭ  Ｎａ2ＨＰＯ4、５．５ｍＭデキストロース，２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）〕に浮遊させたプラスミドＤＮＡに３１μｌの２モル（Ｍ）ＮａＣｌ2を加えて得た。用いられたプラスミドＤＮＡの量は、α（ｃＤＮＡ又はゲノム）：１０μｇ、そしてＦＳＨβ：３０μｇであった。沈殿生成のため室温で４５分間放置された。培養培地が細胞から除かれ、ＤＮＡ沈殿物が入れられた。室温で２０分間放置して細胞を落ちつかせた後、各皿に培養培地５ｍｌが加えられ、３７℃で４時間インキュベーションを続けた。細胞はそれから１５％グリセロールにて３７℃で３．５分間ショックを受けた。培養培地で３７℃４８時間のインキュベーションの後細胞は１：１０に分けられ０．０２メトトレキセイト（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ，ＭＴＸ）を含む選択培地が加えられた。使われた選択培地は、１０％の透析ウシ胎児血清と１％のＬ−グルタミンを追加した、α−マイナス改良イーグル培地（Ｅａｇｌｅ´ｓ  ｍｅｄｉｕｍ）であった。１０日から１４日後にフォーカス（ｆｏｃｉ）が可視化したとき２４溝のプレートに移した。そこから得られた培養培地は、特異的モノクローナルに基く放射性免疫アッセイ（セローノ  ダイアグノスティックスＳｅｒｏｎｏ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、ランドルフＲａｎｄｏｌｐｈ、マサチューセッツＭＡ）を用いてＦＳＨ二量体発現についてアッセイされた。陽性のクローンは、Ｔ−２５フラスコ内の、濃度を０．１μＭに増加したＭＴＸを含む選択培地に移された。培養が密集状（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）になった時培地はＦＳＨ二量体について再びアッセイされ、細胞は１個あたり２４時間の発現レベルのピコグラム数を計算するために数を数えられた。
【００１８】
Ｂ．ヒトαゲノム／ＦＳＨβおよびヒトαｃＤＮＡ／ＦＳＨβの各コートランスフェクションより任意に選択された７つのクローンにおいて測定されたヒトＦＳＨ二量体分泌レベルが表１に記されている。
【００１９】
【表１】
0003814156.tif 000002
【００２０】
この結果はＦＳＨ二量体発現が全長ゲノムαサブユニット配列でトランスフェクションされた細胞において著しく増加することを示している。平均発現レベルは、この特定の実験において見られた驚く程の大幅な上昇が約３０倍であったことを示している。
【００２１】
Ｃ．全長ゲノムα配列の優越性を更に証明するため、安定な細胞系がヒトαｃＤＮＡかあるいはヒトαゲノムクローンのいずれかを含むＣＬＨ３ＡＸＳＶ２ＤＨＦＲ発現ベクターでトランスフェクションされた。フリーのαサブユニット発現の割合が比較された。ヒトαサブユニットの発現は、高感度のかつ特異的放射性免疫アッセイで決定され、ｃＤＮＡ含有細胞系についてはすべてのケースに０．０５ｐｇ／細胞／２４時間を上まわることはなかった。表２に詳しく示されている通り、ゲノムαクローンでトランスフェクションされた細胞は５−２０倍上昇したタンパク質レベルを表わした。
【００２２】
【表２】
0003814156.tif 000003
【００２３】
実施例３：甲状腺刺激ホルモンの構築。
本発明の有効性と幅広い応用性を証明するため、ＣＬＨ３ＡＸＳＶ２ＤＨＦＲの全長ヒトゲノムα配列をＣＬＨ３ＡＸＳＶ２０ＤＣの部分ゲノムＴＳＨβ配列とコートランスフェクションさせて安定にトランスフェクションされたＣＨＯ細胞系が調製された。この実験に用いられたゲノムの部分ＴＳＨβ断片は、エクソンＩＩとＩＩＩのタンパク質コーディング領域および、この２つのエクソンを分けている０．５ｋｂのイントロンから成る（本願の親出願から成立した特許第３４０２６０４号の表９参照）。ＴＳＨβのタンパク質コーディング配列をはさむすべての５´と３´領域は、この特定の構築においてとり除かれた。引き続きこの２つの発現ベクターのコートランスフェクションが行われ、安定な細胞系が培養されて、それらのＴＳＨ発現能について分析が行われた。感度の高い、かつ特異的な放射性免疫アッセイで決定された二量体の発現レベルが表３に挙げられる。ゲノムＴＳＨβクローンとαサブユニットのｃＤＮＡとのコートランスフェクションについての以前の研究は、発現レベルが通常、放射性免疫アッセイの感度以下、即ちたいてい０．０２ｐｇ／細胞／２４時間以下であることを示していた。
【００２４】
【表３】
0003814156.tif 000004
【００２５】
つまりＴＳＨ産生はＦＳＨ産生と同様、哺乳動物細胞のトランスフェクションにおいてαｃＤＮＡ配列よりむしろ全長ゲノムα配列の使用によって大きく上昇され得る。この実験におけるＴＳＨ産生上昇範囲は６から１００倍であった。
【００２６】
実施例４：イントロンと発現の上昇
ヒトαゲノム構築は、それがイントロンを含むということのみならず、内因性の５´非翻訳配列、末端ポリアデニレーションシグナル、そして付加的な３´側面配列（３´ｆｌａｎｋｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を含むという点においてもヒトαｃＤＮＡ構築とは異なっている。それ故に以前のいくつかの実験からはどのゲノム領域が発現の上昇に貢献するかを推定するのは不可能であった。
【００２７】
Ａ．ゲノムα配列内のイントロンがαサブユニットレベルの上昇の原因となっているかどうかを決定するため我々はヒトαイントロンＡのＸｂａＩ−ＰｓｔＩ部分２ｋｂをＣＬＨ３ＡＸＳＶ２ＴＰＡベクター（図２）のマウスＭＴ−Ｉ５´非翻訳領域とαｃＤＮＡ配列の間に挿入した。短くされたイントロンは内因性のスプライスアクセプター（ｓｐｌｉｃｅ  ａｃｃｅｐｔｏｒ）を保持していたが、スプライスドナー（ｓｐｌｉｃｅ  ｄｏｎｏｒ）は合成オリゴヌクレオチドにて供給された。
【００２８】
Ｂ．αサブユニット発現における異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）イントロンの効果をテストするため、もう１つのプラスミドが構築された。この構築においてＭＯＰＣ４１免疫グロブリンＫ遺伝子（５）由来のイントロン１３０ｂｐがマウスＭＴ−Ｉ５´非翻訳領域とαｃＤＮＡ配列の間に挿入された。この特定の介在（ｉｎｔｅｒｖｅｎｉｎｇ）配列には転写エンハンサーエレメント（ｅｎｈａｎｃｅｒ  ｅｌｅｍｅｎｔ）は含まれていなかった。
【００２９】
Ｃ．これらイントロン含有αｃＤＮＡ構築物は、プラスミドＤＮＡのＣＯＳ−７細胞への一過性トランスフェクションおよびノザンブロッティング（ｎｏｒｔｈｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ）によるｍＲＮＡレベルの解析によって、本来のαｃＤＮＡ構築物および全長ゲノムα配列と比較された。この実験において組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔｉｓｓｕｅ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ，ｔＰＡ）ｃＤＮＡは内部標準（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｓｔａｎｄａｒｄ）として用いられ、異なるプラスミド構築物のトランスフェクション効率のばらつきを修正し、すなわち、測定αサブユニットｍＲＮＡレベルを標準化（ｎｏｒｍａｌｉｚｅ）するのに使用された。トランスフェクションはシードとアルフォ（Ｓｅｅｄ  ａｎｄ  Ａｒｕｆｆｏ）のＤＥＡＥ−デキストランプロトコール（２８）を使って二連に（ｉｎｄｕｐｌｉｃａｔｅ）行われた。トランスフェクション２日後に細胞性全ＲＮＡが細胞から分離された。このＲＮＡ（５マイクログラム）はフォルムアルデヒド（ｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）ゲルで分画され、標準的なノザンブロッティング技術を用いてナイロン膜に転写された。膜はそれから32Ｐ標準ヒトα又は32Ｐ標準ｔＰＡプローブのいずれかとハイブリダイズされ、結果として得られたシグナルはベータスコープ（Ｂｅｔａｓｃｏｐｅ）モデル６０３のブロット分析機（ベータジェン社、ワルサム、マサチューセッツ、Ｂｅｔａｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）で定量された。相対的比較のための標準化（ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ）αｍＲＮＡ値は、αカウント数をｔＰＡカウント数で割り、二連のサンプルから得られた数字を平均して計算された。この実験の結果が表４に示されている。
【００３０】
【表４】
0003814156.tif 000005
【００３１】
この結果はαサブユニットｍＲＮＡの蓄積に関してヒトαイントロン（Ｎｏ．２）又は免疫グロブリンイントロン（Ｎｏ．３）のいずれかを含むｃＤＮＡ構築物は全長ゲノム配列（Ｎｏ．１）のように効率がより良いことを示した。特に標準化αサブユニットｍＲＮＡレベルは、イントロンなしのｃＤＮＡ対照（Ｎｏ．４）によって産生されたものより７から２１倍高かった。我々はそれ故、αサブユニットタンパク質コーディング配列に隣あわせた５´又は３´領域ではなく、イントロンが増加発現レベルに対する第１の原因であり、その効果は少なくとも一部はαサブユニットｍＲＮＡ蓄積の増加によるものであることを期せずして発見したのである。
【００３２】
実施例５：増加した転写率によらない、発現の上昇
核ランオフ（ｒｕｎ  ｏｆｆ）転写アッセイは、ゲノムα誘導性ｍＲＮＡ蓄積の高レベルが増加した転写の割合によるものであるかどうかを決定するために用いられた。αゲノムあるいはαｃＤＮＡ含有ＣＬＨ３ＡＸＳＶ２ＴＰＡプラスミドによるＣＯＳ−７細胞の、一過性トランスフェクションが実施例４にのべられているように行われた。核の調製とランオフ転写アッセイには標準的な方法が用いられた（カレント  プロトコール  イン  モレキュラー  バイオロジー；マウスベル、Ｆ．Ｍ．ら編；ジョンウィリー  アンド  サンズ，ニューヨーク，ニューヨーク  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ，ＮＹ）。α、ＤＨＦＲ、ｔＰＡ用のＤＮＡプローブはゲル精製された挿入配列で、それぞれの約０．２５μｇがニトロセルロース膜上で二重スロットブロットされた。その膜は、ＤＮＡなし（モックｍｏｃｋ）、ＣＬＨ３ＡＸＳＶ２ＴＰＡの全長ヒトαゲノムクローン、あるいはＣＬＨ３ＡＸＳＶ２ＴＰＡのヒトαｃＤＮＡクローンにてトランスフェクションされたＣＯＳ−７細胞から調製されて、［32Ｐ−ＵＴＰ］で標識された核ランオフＲＮＡにハイブリダイズされた。ハイブリダイゼーションシグナルはベータスコープモデル６０３ブロット分析機（ベータージェン社，ワルサム，マサチューセッツ  Ｂｅｔａｇｅｎ，Ｃｏｒｐ．，Ｗａｌｔｈａｍ，，ＭＡ）で定量された。転写率の標準化された値（ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ  ｖａｌｕｅ）は平均αカウントを平均ｔＰＡカウントで割って得られた。サル（ｍｏｎｋｅｙ）ＤＨＦＲ核ランオフＲＮＡは、この実験で使われた条件ではマウス（ｍｏｕｓｅ）ＤＨＦＲ  ＤＮＡプローブ配列にハイブリダイズしないはずであり、それ故負の対象として使われている。相対的転写率の結果は下の表５にまとめられている。
【００３３】
【表５】
0003814156.tif 000006
【００３４】
この特定の実験においてαｃＤＮＡのランオフ転写率（０．１２）はゲノムα配列のそれ（０．０７）と較べ驚く程高かった。それ故、ゲノムα配列が高いαサブユニット発現レベルを生じるメカニズムは、転写率の増加のためではない。
【００３５】
実施例６：ＴＳＨβサブユニット発現はイントロン依存性である。
Ａ．全長ゲノムＴＳＨβ遺伝子（１４ａ）が図３Ａに図解されている。３つのエクソン（Ｉ，ＩＩ，ＩＩＩ）、２つのイントロン（ａ，ｂ）、開始ＡＴＧ、終止コドン（ＴＡＡ）の位置が示されている。ＰｖｕＩＩ部位はエクソンＩＩとＩＩＩを含む約２ｋｂのＤＮＡ配列によってわけられており、ＴＳＨβの完全なタンパク質コーディング領域を含有する。この研究において使われたＴＳＨβ部分ゲノム構築物はこの２ｋｂ  ＰｖｕＩＩ断片に由来しており図３Ｂに図解されている。ＴＳＨβ０．９（０．９ｋｂ）は実施例１の安定なトランスフェクションにおいて使用されたものと同様の構築物で、内因性の介在（ｉｎｔｅｒｖｅｎｉｎｇ）配列によって分けられた２つのコーティングエクソンから成り、開始ＡＴＧの上流とＴＡＡ下流の全配列は除かれている。ＴＳＨβ１．２（１．２ｋｂ）およびＴＳＨβ２．０（２．０ｋｂ）はさらに加えてイントロンＡの約３００塩基対を含み、短くなったイントロンをスプライラスさせるための合成スプライス供給部（ｄｏｎｏｒ）を加えて構築した。ＴＳＨβ２．０は末端のポリアデニレーションシグナルと約０．８ｋｂの付加的３´側面配列（ｆｌａｎｋｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を保持している。
【００３６】
Ｂ．実施例４に述べているプロトコールを用いてＣＯＳ−７細胞の二連のカルチャー（Ａ，Ｂ）が以下の部分ゲノム断片のうちの１つを含むＣＬＨ３ＡＸＳＶ２ＤＨＦＲプラスミドでトランスフェクションされた：（１）ＴＳＨβ０．９、（２）ＴＳＨβ１．２、または（３）ＴＳＨβ２．０。遺伝子は転写がＭＴ−Ｉプロモーターで開始されるように、そしてＴＳＨβ０．９とＴＳＨβ１．２の場合はＳＶ４０初期ポリアデニレーションシグナルで終止するようにＸｈｏＩクローニング部位に挿入された。インキュベーション４８時間後に細胞性全ＲＮＡが細胞から分離された。ＲＮＡ（９マイクログラム）はホルムアルデヒドゲルにて分画され、それから標準ノザンブロッティング技術を用いてナイロン膜に移された。膜は32Ｐ標識されたマウスＭＴ−Ｉプローブ（約５０塩基対のＭＴ−Ｉ５´非翻訳配列も含むようなＴＳＨβｍＲＮＡを検出するため）、または32Ｐ標識されたＤＨＦＲプローブ（トランスフェクション効率の比較のため）のいずれかでハイブリダイズされた。結果として得られたシグナルはベータスコープ（Ｂｅｔａｓｃｏｐｅ）モデル６０３ブロット分析機（ベータジェン社，ワルサム，マサチューセッツＢｅｔａｇｅｎ，Ｃｏｒｐ．，Ｗａｌｔｈａｍ，，ＭＡ）で定量された。相対的比較のために標準化された（ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ）ＴＳＨβｍＲＮＡ値はＭＴ−Ｉカウント数をＤＨＦＲカウント数で割って計算された。２つのトランスフェクションで得られた標準化された値はそれから平均化されてＴＳＨβ０．９について得た数字で割られた。ｍＲＮＡの蓄積に関して得られた比較の結果は表６にまとめられている。
【００３７】
【表６】
0003814156.tif 000007
【００３８】
Ｃ．この結果は最初のイントロンの一部を保持する２つの構築物（ＴＳＨβ１．２とＴＳＨβ２．０）は最初のイントロン由来の配列をまったく含まない構築物に較べて５−６０倍高いｍＲＮＡの蓄積を生ずることを示している。それ故ＴＳＨβ遺伝子発現はαサブユニット遺伝子発現と同様イントロン依存性である。すべての構築物とタンパク質コーディング領域に存在するイントロンＢが最適な上昇を与えていない、という予想外の観察結果は興味深い。このことはＴＳＨβ遺伝子の最初のイントロンにｍＲＮＡの蓄積を増加させるような特異的な配列が存在するか、あるいはより高い可能性としては、イントロンの位置（ｍＲＮＡの５´末端に近い）が重要な要素であるかのいずれかを示唆している。イントロン依存性遺伝子発現が転写単位内のイントロンの配置によって影響され得るということはヒトαｃＤＮＡを用いた予備実験によっても支持されている。κ免疫グロブリン遺伝子のイントロンをｍＲＮＡの３´非翻訳領域、即ちαｃＤＮＡとＳＶ４０ポリアデニレーション領域の間に挿入した場合、変えられていないαｃＤＮＡと比較してｍＲＮＡ蓄積の増加は起こらなかった。
【００３９】
Ｄ．ＴＳＨβ１．２はＴＳＨβ２．０より１０倍高いｍＲＮＡ量を生じたことから、ＴＳＨβ２．０にある末端ポリアデニレーションシグナルと３´側面配列は効率よいｍＲＮＡ産生に必要ではないということはあり得ることで実際不利益なものであるのかもしれない。その代わりに、ＴＳＨβ１．２とＴＳＨβ２．０の間のｍＲＮＡ蓄積の不均等は２つのプラスミド構築物におけるＭＴ−ＩプロモーターとＳＶ４０初期プロモーター（ＤＨＦＲを操作する）間の距離の違いに関係しているのかもしれない。ＴＳＨβ１．２構築物内でのふたつのプロモーターの近接（０．８ｋｂ）がＳＶ４０エンハンサーエレメントおよびＭＩ−プロモーター間の相互関係を増加させ、それによって後者の転写率が増加するのであろう。
【００４０】
さまざまな哺乳動物の中でαおよびＴＳＨβ遺伝子構造は類似しているので、ヒトαおよびＴＳＨβサブユニットに基づく我々の発見は、ウシ、ウマ、ブタ、ヒヒおよびサルのよう他の種にも同様に応用できると思われる。同じく、ＬＨβおよびＦＳＨβサブユニット遺伝子も、至適な発現のためには、同様なゲノムＤＮＡ構造依存性を示すであろうし、このような要求は他の種間に於ても応用されるべきである。
【００４１】
発現ベクターの構築は、イントロンのようなｍＲＮＡの蓄積に重要であるゲノム領域に関する知識や、転写単位内のこのような領域の位置が重要であるという知見を応用して、有利に単純化されるであろう。
【００４２】
例えばこれらゲノム領域をサブクローン化又は合成してαとβサブユニットｃＤＮＡ配列を用いた構築物に含むこともできる。ｃＤＮＡクローンはしばしばそれよりはるかに大きなゲノムクローンより入手しやすく工作しやすい。かくしてこの発見は高レベルのホルモンを産生する細胞系の開発を単純化し、そして最終的には低いコストでこれらのタンパク質の大規模な生産を可能にするだろう。これらや他の観点および本発明の変法は当業者にとって今や明らかであり、本発明の意図あるいは範囲のいずれからも逸脱するものではない。
（参考文献）
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１８ａ．マツーク，Ｍとボイメ（Ｂｏｉｍｅ），Ｉ．（１９８８）Ｊ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．１０６，１０４９−１０５９
１９．カエツェル（Ｋａｅｔｚｅｌ），Ｄ．Ｍ．ら（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８２，７２８０−７２８３
２０．バッハマン（Ｂｕｃｈｍａｍ），Ａ．Ｒ．とバーグ（Ｂｅｒｇ），Ｐ．（１９８８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８，４３９５−４４０５
２１．リー（Ｌｅｅ），Ｆ．ら（１９８１）ネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ）２９４，２２８−２３２
２２．エバンズ（Ｅｖａｎｓ），Ｍ．Ｊ．とスカーピュラ（Ｓｃａｒｐｕｌｌａ），Ｒ．Ｃ．（１９８８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８，３５−４１
２３．ロウソ（Ｒｏｓｓｏｕｗ），Ｃ．Ｍ．Ｓ．ら（１９８７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２，１５１５１−１５１５７
２４．ブリンスター（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ），Ｒ．Ｌ．ら（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５，８３６−８４０
２５．プファール（Ｐｆａｒｒ），Ｄ．Ｓ．ら（１９８６）ＤＮＡ５，１１５−１２２
２６．ロス（Ｒｏｓ），Ｊ．とコブズ（Ｋｏｂｓ），Ｇ．（１９８６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８８，５７９−５９３
２７．コザック（Ｋｏｚａｋ），Ｍ．（１９８４）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１２，８５７−８７２
２８．シード（Ｓｅｅｄ）Ｂ．とアルフォ（Ａｒｕｆｆｏ），Ａ．（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４，３３６５−３３６５
２９．ボリバール（Ｂｏｌｉｖａｒ），Ｆ．，ロドリゲス（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ），Ｒ．Ｌ．，グリーン（Ｇｒｅｅｎ），Ｐ．Ｊ．，ベトラック（Ｂｅｔｌａｃｈ），Ｍ．Ｃ．，ハイネッカー（Ｈｅｙｎｅｃｋｅｒ），Ｈ．Ｌ．，ボイヤー（Ｂｏｙｅｒ），Ｈ．Ｗ．，クロサ（Ｃｒｏｓａ），Ｇ．Ｆ．とファルコー（Ｆａｌｋｏｗ），Ｓ．（１９７７）ジーン（Ｇｅｎｅ）２：９５
３０．グランビル（Ｇｒａｎｖｉｌｌｅ），Ｎ．，ダーナン（Ｄｕｒｎｈａｍ），Ｄ．Ｍ．とパーミター（Ｐａｌｍｉｔｅｒ），Ｒ．Ｄ．（１９８１）ネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ）２９２：２６７−２６９
３１．ヘイマー（Ｈａｍｅｒ），Ｄ．Ｈ．とワーリング（Ｗａｌｌｉｎｇ），Ｍ．（１９８２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎ．１：２７３−２８８
３２．ラスキー（Ｌｕｓｋｙ），Ｍ．とボッチャン（Ｂｏｔｃｈａｎ），Ｍ．（１９８１）ネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ）２８３：７９−８１
３３．レディ（Ｒｅｄｄｙ），Ｖ．Ｂ．，シンマパヤ（Ｔｈｉｍｍａｐａｙａ），Ｂ．，ダール（Ｄｈａｒ），Ｒ．サブラマニアン（Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ），Ｋ．Ｎ．，ツアイン（Ｚａｉｎ），Ｂ．Ｓ．，パン（Ｐａｎ），Ｊ．ゴーシュ（Ｇｈｏｓｈ），Ｐ．Ｋ．，セルマ（Ｃｅｌｍａ），Ｍ．Ｌ．とワイズマン（Ｗｅｉｓｓｍａｎ），Ｓ．Ｍ．（１９７８）サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃ）２００：４９４
３４．トーズ（Ｔｏｏｚｅ），Ｊ．（編）ＤＮＡ腫瘍ウィルス（Ｔｕｍｏｒ  Ｖｉｒｕｓｅｓ）：腫瘍ウィルスの分子生物学（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｔｕｍｏｒ  Ｖｉｒｕｓｅｓ）；２ｎｄ  Ｅｄ．，コールド・スプリング・ハーバー  ラボラトリー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ），ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）１９８１
３５．チャング（Ｃｈｉａｎｇ）Ｔ．−Ｒ．とマッコンログ（ＭｃＣｏｎｌｏｇｕｅ），Ｌ．（１９８８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：７６４−７６９
特に述べられている以外は使用された操作手順と技術は大体において従来報告されている通りであり、マニアテス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）らによるクローニング・マニュアル（Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｍａｎｕａｌ），コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ）（１９８２）に記載されているような従来通りの技法である。上に列挙されている、あるいは特記された参考文献のすべては参考として組みこまれている。
【図面の簡単な説明】
【図１】  組織培養細胞における、発現のためのヒトα遺伝子工作に用いた方法を示す。重要な制限エンドヌクレアーゼ部位を示す。黒ぬりの四角はα遺伝子のエクソン（ｅｘｏｎ）を、太実線はα遺伝子イントロンを、細実線はｐＢＲ３２２又はｐＵＣ１８ベクター、をそしてジグザグの線はｐＣＵ１８のポリリンカー領域を表す。
【図２】  安定な、あるいは一過性のトランスフェクションに用いられる基本的な発現ベクター、ＣＬＨ３ＡＸＳＶ２〔ＤＨＦＲ，ＯＤＣ又はＴＰＡ〕を示す。αまたはβサブユニットシーケンス挿入に使われたＸｈｏＩ部位の位置が示されている。二本の実線は哺乳動物細胞での発現に必要なシーケンスを表している。プロモーター、ポリアデニレーション、マーカー遺伝子の相対的位置が示されている。一本の実線は大腸菌における増殖と選択（アンピシリン抵抗性による）に必要な、ｐＢＲ３２２由来のｐＭＬ−１領域を表す。
【図３】  Ａ部は全ＴＳＨβ遺伝子を示す。3つのエクソン〔Ｉ，ＩＩ，ＩＩＩ〕、2つのイントロン（ａ，ｂ）、開始ＡＴＧ、終止コドン（ＴＡＡ）が図示されている。更に部分構築のもととなるものからの断片の単離に使われたＰｖｕＩＩ部位も図示されている。影のついた四角は非コード（ｎｏｎｃｏｄｉｎｇ）のエクソンシーケンスを表示している。Ｂ部は過渡的にトランスフェクトされたＣＯＳ−７細胞におけるＴＳＨβｍＲＮＡの蓄積を比較するために用いられた部分ゲノム構築物（ｐａｒｔｉａｌ  ｇｅｎｏｍｉｅ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ）を示している。ＴＳＨβ０．９は、内在性（ｅｎｄｏｇｅｎｏｎｓ）ＩＶＳによって分かれている２つのコード性（ｃｏｄｉｎｇ）エクソンから成り、開始ＡＴＧの上流とＴＡＡの下流すべての配列はとり除かれている（配列は表９に示されている）。ＴＳＨβ１．２およびＴＳＨβ２．０は更にイントロンＡの約３００塩基対を含み、先端を切った（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）イントロンのスプライシングができるよう合成スプライスドナー（    ）を加えることによって構築された。ＴＳＨβ２．０は内在性ポリアデニレーションシグナル（    ）と約０．８ｋｄの追加３´側面配列を保有する。
【図４】  ＣＬＨ３ＡＸＳＶ２ＤＨＦＲを示す。このベクターは以下の部分から組み立てられた：
（ｉ）ＳＶ４０初期領域（ｅａｒｌｙ  ｒｅｇｉｏｎ）プロモーター（３３，３４）、マウス（ｍｏｕｓｅ）ＤＨＦＲ遺伝子（ＲＥＦＳ）、ＳＶ４０小Ｔ（ｓｍａｌｌ  Ｔ）イントロンおよび初期領域ポリアデニレーションシグナル配列（３３，３４）から成るジハイドロフォレートリダクターゼ（ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ，ＤＨＦＲ）転写単位図４の核酸番号１から１９２５）；
（ｉｉ）ｐＢＲ３２２ベクター（２９）由来で、ｐＢＲ３２２から１３７０塩基対欠失させた（３２）細菌用プラスミドベクターｐＭＬの配列（図４の核酸番号２２０１から４５４２）；そして
（ｉｉｉ）マウスメタロチオネイン（ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ）−１遺伝子（３０，３１）由来で、そこからイントロンとポリアデニレーションシグナル配列がとり除かれたメタロチオネインプロモーター（図４の核酸番号４５４２から７５１４）；および
（ｉｖ）ＳＶ４０初期領域ポリアデニレーションシグナル配列（図４で核酸番号７５１４から７７５１）（３３，３４）。ｔＲＡアナローグがＳａｌＩ断片のように唯一のＸｈｏＩ部位でベクター内に挿入された。挿入部分の、プロモーターとアデニレーション配列に対する相対的方向性は制限酵素分析によって決定された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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