(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アデノシン５′−二リン酸及びアデノシン５′−三リン酸を添加しない反応系で、アデノシン５′−一リン酸に微生物由来のポリリン酸キナーゼ、微生物由来のアデニレートキナーゼ及びポリリン酸を作用せしめることを特徴とするアデノシン５′−三リン酸の製造法。
【請求項２】
アデノシン５′−三リン酸を消費する酵素反応を利用した化合物の製造法において、アデノシン５′−二リン酸及びアデノシン５′−三リン酸を添加しない反応系で、アデノシン５′−一リン酸に微生物由来のポリリン酸キナーゼ、微生物由来のアデニレートキナーゼ及びポリリン酸を作用せしめてアデノシン５′−三リン酸を生成させ、当該酵素反応に供給することを特徴とする当該化合物の製造法。
【請求項３】
アデノシン５′−三リン酸を消費する酵素反応を利用した化合物の製造法において、アデノシン５′−二リン酸及びアデノシン５′−三リン酸を添加しない反応系で、アデノシン５′−一リン酸に微生物由来のポリリン酸キナーゼ、微生物由来のアデニレートキナーゼ及びポリリン酸を作用せしめて、消費したアデノシン５′−三リン酸を再生しながら当該酵素反応を行うことを特徴とする当該化合物の製造法。
【請求項４】
微生物由来のポリリン酸キナーゼ、微生物由来のアデニレートキナーゼ及びポリリン酸を組み合わせてなる、アデノシン５′−二リン酸及びアデノシン５′−三リン酸を添加することなく、アデノシン５′−一リン酸からアデノシン５′−三リン酸を合成するための試薬。
【請求項５】
微生物由来のポリリン酸キナーゼ、微生物由来のアデニレートキナーゼ及びポリリン酸を組み合わせてなる、アデノシン５′−二リン酸及びアデノシン５′−三リン酸を添加することなく、アデノシン５′−一リン酸からアデノシン５′−三リン酸を再生するための試薬。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、アデノシン５′−一リン酸（ＡＭＰ）にポリリン酸キナーゼ、アデニレートキナーゼ及びポリリン酸を作用せしめ、アデノシン５′−三リン酸（ＡＴＰ）を製造する方法及びその応用に関するものである。
背景技術
近年の遺伝子操作技術の進展により、さまざまな酵素の安価な大量調製が可能となり、従来、微生物菌体を用いた微生物変換あるいは発酵生産により合成されてきた有用生理活性物質が直接酵素反応により安価に製造することが可能となってきている。
ところで、リン酸化反応、アミノ化反応などの高エネルギーを必要とする酵素反応には、ＡＴＰがエネルギー供与体あるいはリン酸供与体として必要である。従来の微生物変換あるいは発酵生産においては、ＡＴＰは用いた微生物の生体内より供給されるが、酵素法においてはＡＴＰを反応系に添加したり、効率的なＡＴＰの再生系を開発することが不可欠である。現在、ＡＴＰは化学合成法あるいは微生物もしくは酵母菌体を用いてＡＭＰもしくはアデニンから合成されている。しかしながら、ＡＴＰの安価な合成法は現時点で確立されておらず、市販されているＡＴＰは極めて高価である。また、ＡＴＰの再生系としてはホスホクレアチンとホスホクレアチンキナーゼとの組み合わせが実験室レベルで使用されるが、基質、酵素とも極めて高価であるため実用的ではない。また、ポリリン酸キナーゼとポリリン酸の組み合わせも検討されているが、依然高価なＡＴＰあるいはＡＤＰの使用は不可欠であり、実用化には至っていない。
このようにＡＴＰは極めて高価であるのに対し、ＡＭＰは比較的安価に製造されうる。そのため、ＡＴＰを使用する酵素反応系において、高価なＡＴＰを添加するのではなく、安価なＡＭＰからＡＴＰを製造する方法、あるいは消費されたＡＴＰを効率的に再生する方法の開発が望まれていた。
従って、本発明は高価なＡＴＰをＡＭＰより効率的に製造または再生する方法を提供することを目的とするものである。
発明の開示
本発明者らは、上記目的を達成すべく研究を重ねた結果、ポリリン酸キナーゼが、ポリリン酸の存在下でアデニレートキナーゼと共役することによりＡＭＰからＡＴＰを合成する活性を有することを見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、アデノシン５′−二リン酸及びアデノシン５′−三リン酸を添加しない反応系で、アデノシン５′−一リン酸に微生物由来のポリリン酸キナーゼ、微生物由来のアデニレートキナーゼ及びポリリン酸を作用せしめることを特徴とするアデノシン５′−三リン酸の製造法を提供するものである。
また、本発明は、アデノシン５′−三リン酸を消費する酵素反応を利用した化合物の製造法において、アデノシン５′−二リン酸及びアデノシン５′−三リン酸を添加しない反応系で、アデノシン５′−一リン酸に微生物由来のポリリン酸キナーゼ、微生物由来のアデニレートキナーゼ及びポリリン酸を作用せしめてアデノシン５′−三リン酸を生成させ、当該酵素反応に供給することを特徴とする当該化合物の製造法を提供するものである。
さらに、本発明は、アデノシン５′−三リン酸を消費する酵素反応を利用した化合物の製造法において、アデノシン５′−二リン酸及びアデノシン５′−三リン酸を添加しない反応系で、アデノシン５′−一リン酸に微生物由来のポリリン酸キナーゼ、微生物由来のアデニレートキナーゼ及びポリリン酸を作用せしめて、消費したアデノシン５′−三リン酸を再生しながら当該酵素反応を行うことを特徴とする当該化合物の製造法を提供するものである。
さらにまた、本発明は、微生物由来のポリリン酸キナーゼ、微生物由来のアデニレートキナーゼ及びポリリン酸を組み合わせてなる、アデノシン５′−二リン酸及びアデノシン５′−三リン酸を添加することなく、アデノシン５′−一リン酸からアデノシン５′−三リン酸を合成するための試薬を提供するものである。
さらに、また、本発明は、微生物由来のポリリン酸キナーゼ、微生物由来のアデニレートキナーゼ及びポリリン酸を組み合わせてなる、アデノシン５′−二リン酸及びアデノシン５′−三リン酸を添加することなく、アデノシン５′−一リン酸からアデノシン５′−三リン酸を再生するための試薬を提供するものである。
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明のＡＴＰ合成系におけるＡＭＰ、ＡＤＰ、ＡＴＰの消長を示したものである。
発明を実施するための最良の形態
本発明で使用するポリリン酸キナーゼ（Ｅ．Ｃ．２．７．４．１）及びアデニレートキナーゼ（Ｅ．Ｃ．２．７．４．３）はいずれも公知の酵素であり、動物由来、植物由来、微生物由来などのものを使用することができる。このうち、酵素の調製の簡便さなどの点から微生物、特に大腸菌由来のポリリン酸キナーゼ及びアデニレートキナーゼが使用に好都合である。また、近年の遺伝子組み換え技術を利用してポリリン酸キナーゼ遺伝子またはアデニレートキナーゼ遺伝子をクローン化し、大腸菌などを宿主としてポリリン酸キナーゼまたはアデニレートキナーゼを大量生産させ、当該組み換え菌より上記２種類の酵素をそれぞれ調製することも可能である（J.Biol.Chem.,267,22556-22561(1992)、Nucleic Acids Res.,13,7139-7151(1985))。
反応系に添加するポリリン酸キナーゼ及びアデニレートキナーゼは、当該活性を有する限りどのような形態であってもよい。具体的には、微生物の菌体、該菌体の処理物または該処理物から得られる酵素調製物などを例示することができる。微生物の菌体の調製は、当該微生物が生育可能な培地を用い、常法により培養後、遠心分離等で集菌する方法で行うことができる。具体的に、バシラス属または大腸菌類に属する細菌を例に挙げ説明すれば、培地としてはブイヨン培地、ＬＢ培地（１％トリプトン、０．５％イーストエキス、１％食塩）または２×ＹＴ培地（１．６％トリプトン、１％イーストエキス、０．５％食塩）などを使用することができ、当該培地に種菌を接種後、３０〜５０℃で１０〜５０時間程度必要により攪拌しながら培養し、得られた培養液を遠心分離して微生物菌体を集菌することによりポリリン酸キナーゼ活性またはアデニレートキナーゼ活性を有する微生物菌体を調製することができる。
微生物の菌体処理物としては、上記微生物菌体を機械的破壊（ワーリングブレンダー、フレンチプレス、ホモジナイザー、乳鉢などによる）、凍結融解、自己消化、乾燥（凍結乾燥、風乾などによる）、酵素処理（リゾチームなどによる）、超音波処理、化学処理（酸、アルカリ処理などによる）などの一般的な処理法に従って処理して得られる菌体の破壊物または菌体の細胞壁もしくは細胞膜の変性物を例示することができる。
酵素調製物としては、上記菌体処理物からポリリン酸キナーゼ活性またはアデニレートキナーゼ活性を有する画分を通常の酵素の精製手段（塩折処理、等電点沈殿処理、有機溶媒沈殿処理、透析処理、各種クロマトグラフィー処理など）を施して得られる粗酵素または精製酵素を例示することができる。
本発明で使用するＡＭＰは、市販のものが使用できる。使用濃度としては、例えば１〜２００mM、好ましくは１〜５０mMの範囲から適宜設定することができる。また、添加するポリリン酸も市販のものが使用できる。使用濃度としては、例えば無機リン酸に換算して１〜１０００mM、好ましくは１０〜１００mMの範囲から適宜設定することができる。
ＡＴＰの製造法は、例えばpH４〜９の範囲の適当な緩衝液中にＡＭＰ及びポリリン酸を添加し、さらに０．００１ユニット／ml以上、好ましくは０．００１〜１０ユニット／mlのポリリン酸キナーゼ、及び０．０１ユニット／ml以上、好ましくは０．０１〜１００ユニット／mlのアデニレートキナーゼを添加し、２０℃以上、好ましくは３０〜４０℃で１〜５０時間程、必要により攪拌しながら反応させることにより実施できる。
このようにして調製したＡＴＰは、公知の方法にて単離精製することができる。
また、ＡＴＰを消費する酵素反応を利用した化合物の製造法においては、ＡＭＰに上記ポリリン酸キナーゼ、アデニレートキナーゼ及びポリリン酸を作用せしめて生成させたＡＴＰを当該酵素反応に供給しながら反応を行うことにより、当該化合物を製造することができる。特に、ＡＴＰを消費する酵素反応を利用した化合物の製造法においては、当該酵素反応により生じたＡＭＰ及び／またはＡＤＰを原料としてＡＴＰを再生しながら反応を行うことが可能なため、効率的に目的とする化合物を製造することができ、例えば、ガラクトキナーゼを用いたガラクトース−１−リン酸合成系、ＵＭＰキナーゼを用いたＵＤＰ合成系、コリンキナーゼを用いたホスホコリン合成系などＡＴＰを消費するあらゆる酵素反応に応用することができる。
このようなＡＴＰ合成系と酵素反応との反応条件は、小規模試験にて適宜決定すればよく、また目的化合物の単離精製も公知の方法により行うことができる。
実施例
以下、実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明がこれに限定されないことは明らかである。また、実施例におけるＤＮＡの調製、制限酵素による切断、Ｔ４ＤＮＡリガーゼによるＤＮＡ連結、並びに大腸菌の形質転換法は全て「Molecular cloning」（Maniatisら編、Cold spring Harbor Laboratory,Cold Spring Habor,New York(1982))に従って行った。また、制限酵素、ＡｍｐｌｉＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼは宝酒造（株）より入手した。さらに、反応液中のヌクレオチド類の定量はＨＰＬＣ法により行った。具体的には、分離にはＹＭＣ社製のＯＤＳ−ＡＱ３１２カラムを用い、溶出液として０．５Ｍ  リン酸−カリウム溶液を用いた。
実施例１；ＡＴＰの合成
（１）大腸菌ポリリン酸キナーゼ遺伝子のクローニング
大腸菌Ｋ１２株ＪＭ１０９菌（宝酒造（株）より入手）の染色体ＤＮＡを斉藤と三浦の方法（Biochim.Biophys.Acta.,72,619(1963))で調製した。このＤＮＡをテンペレートとして、以下に示す２種類のプライマーＤＮＡを常法に従って合成し、ＰＣＲ法により大腸菌ポリリン酸キナーゼ（ｐｐｋ）遺伝子を増幅した。
0003764755.tif 000002
ＰＣＲによるｐｐｋ遺伝子の増幅は、反応液１００ml中（５０mM  塩化カリウム、１０mM  トリス塩酸（pH８．３）、１．５mM  塩化マグネシウム、０．００１％ゼラチン、テンペレートＤＮＡ  ０．１μｇ、プライマーＤＮＡ（Ａ）（Ｂ）各々０．２μＭ、ＡｍｐｌｉＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ  ２．５ユニット）をＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社製ＤＮＡ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒを用いて、熱変性（９４℃、１分）、アニーリング（５５℃、１．５分）、ポリメライゼーション（７２℃、１．５分）のステップを２５回繰り返すことにより行った。
遺伝子増幅後、反応液をフェノール／クロロホルム（１：１）混合液で処理し、水溶性画分に２倍容のエタノールを添加しＤＮＡを沈殿させた。沈殿回収したＤＮＡを文献（Molecular cloning、前述）の方法に従ってアガロースゲル電気泳動により分離し、１．０kb相当のＤＮＡ断片を精製した。該ＤＮＡを制限酵素ＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩで切断し、同じく制限酵素ＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩで消化したプラスミドｐＴｒｃ９９Ａ（Pharmacia Biotech社より入手）とＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。連結反応液を用いて大腸菌ＪＭ１０９菌を形質転換し、得られたアンピシリン耐性形質転換体よりプラスミドｐＴｒｃ−ＰＰＫを単離した。ｐＴｒｃ−ＰＰＫは、ｐＴｒｃ９９Ａのｔｒｃプロモーター下流のＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩ切断部位に大腸菌ｐｐｋ遺伝子を含有するＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩ  ＤＮＡ断片が挿入されたものである。
（２）大腸菌ポリリン酸キナーゼの調製
プラスミドｐＴｒｃ−ＰＰＫを保持する大腸菌ＪＭ１０９菌を、１００μｇ／mlのアンピシリンを含有する２×ＹＴ培地３００mlに植菌し、３７℃で振とう培養した。４×１０8菌／mlに達した時点で、培養液に終濃度１mMになるようにＩＰＴＧを添加し、さらに３０℃で５時間振とう培養を続けた。培養終了後、遠心分離（９，０００×ｇ、１０分）により菌体を回収し、６０mlの緩衝液（５０mM  トリス塩酸（pH７．５）、５mM  ＥＤＴＡ、０．１％トライトンＸ−１００、０．２mg／mlリゾチーム）に懸濁した。３７℃で１時間保温した後、超音波処理を行い、菌体を破砕し、さらに遠心分離（２０，０００×ｇ、１０分）により菌体残さを除去した。このように得られた上清画分を５mM  塩化マグネシウム及び１mM  ２−メルカプトエタノールを含有する５０mMトリス塩酸（pH７．８）に対して透析を行い、粗酵素液とした。
粗酵素液におけるポリリン酸キナーゼ比活性は、０．１９ユニット／mg蛋白質であり、対照菌（ｐＴｒｃ９９Ａを保持する大腸菌ＪＭ１０９菌）の比活性（０．０００１８ユニット／mg蛋白質）の約１０００倍であった。次に粗酵素液をＤＥＡＥトヨパール６５０Ｍ（トーソー（株））を用いて０〜０．５ＭＮａＣｌの濃度勾配にて分画し、ポリリン酸キナーゼ画分を得た。この画分をポリリン酸キナーゼ酵素標品とした。なお、この酵素標品におけるポリリン酸キナーゼの比活性は、０．６ユニット／mg蛋白質であった。
なお、本発明におけるポリリン酸キナーゼ活性の単位（ユニット）は、以下に示す方法で測定、算出したものである。すなわち、５mM塩化マグネシウム、１００mM硫安、５mM  ＡＤＰ、及びポリリン酸（無機リン酸として１００mM）を含有する２５mMトリス塩酸緩衝液（pH７．８）に酵素標品を添加して、３７℃で保温することで反応を行い、１００℃、１分間の熱処理により反応を停止させる。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて反応液中のＡＴＰを定量し、３７℃で１分間に１μmoleのＡＴＰを生成する活性を１単位（ユニット）とする。
（３）大腸菌アデニレートキナーゼのクローニング
大腸菌Ｋ１２株ＪＭ１０９菌（宝酒造（株）より入手）の染色体ＤＮＡを斉藤と三浦の方法（Biochim.Biophys.Acta.,72,619(1963))で調製した。このＤＮＡをテンペレートとして、以下に示す２種類のプライマーＤＮＡを常法に従って合成し、ＰＣＲ法により大腸菌アデニレートキナーゼ（ａｄｋ）遺伝子を増幅した。
0003764755.tif 000003
ＰＣＲによるａｄｋ遺伝子の増幅は、反応液１００ml中（５０mM  塩化カリウム、１０mM  トリス塩酸（pH８．３）、１．５mM  塩化マグネシウム、０．００１％ゼラチン、テンペレートＤＮＡ  ０．１μｇ、プライマーＤＮＡ（Ａ）（Ｂ）各々０．１μＭ、ＡｍｐｌｉＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ２．５ユニット）をＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社製ＤＮＡ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒを用いて、熱変性（９４℃、１分）、アニーリング（５６℃、１．０分）、ポリメライゼーション（７２℃、３．０分）のステップを２５回繰り返すことにより行った。
遺伝子増幅後、反応液をフェノール／クロロホルム（１：１）混合液で処理し、水溶性画分に２倍容のエタノールを添加しＤＮＡを沈殿させた。沈殿回収したＤＮＡを文献（Molecular cloning、前述）の方法に従ってアガロースゲル電気泳動により分離し、１．０kb相当のＤＮＡ断片を精製した。該ＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄIIIで切断し、同じく制限酵素ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄIIIで消化したプラスミドｐＵＣ１８（宝酒造（株）より入手）とＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。連結反応液を用いて大腸菌ＪＭ１０９菌を形質転換し、得られたアンピシリン耐性形質転換体よりプラスミドｐＵＣ−ＡＤＫを単離した。ｐＵＣ−ＡＤＫは、ｐＵＣ１８のｌａｃプロモーター下流のＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄIII切断部位に大腸菌ａｄｋ遺伝子を含有するＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄIII ＤＮＡ断片が挿入されたものである。
（４）大腸菌アデニレートキナーゼの調製
プラスミドｐＵＣ−ＡＤＫを保持する大腸菌ＪＭ１０９菌を、１００μｇ／mlのアンピシリンを含有する２×ＹＴ培地３００mlに植菌し、３７℃で振とう培養した。４×１０8菌／mlに達した時点で、培養液に終濃度１mMになるようにＩＰＴＧを添加し、さらに３０℃で５時間振とう培養を続けた。培養終了後、遠心分離（９，０００×ｇ、１０分）により菌体を回収し、６０mlの緩衝液（５０mMトリス塩酸（pH７．５）、５mM  ＥＤＴＡ、０．１％トライトンＸ−１００、０．２mg／mlリゾチーム）に懸濁した。３７℃で１時間保温した後、超音波処理を行い、菌体を破砕し、さらに遠心分離（２０，０００×ｇ、１０分）により菌体残さを除去した。
このように得られた上清画分を５mM  塩化マグネシウム及び１mM  ２−メルカプトエタノールを含有する５０mMトリス塩酸（pH７．８）に対して透析を行い、粗酵素液とした。粗酵素液におけるアデニレートキナーゼの比活性は、１３４ユニット／mg蛋白質であり、対照菌（ｐＵＣ１８を保持する大腸菌ＪＭ１０９菌）の比活性（１．９ユニット／mg蛋白質）の約８５倍であった。次に粗酵素液をＤＥＡＥトヨパール６５０Ｍ（トーソー（株））を用いて０〜０．５ＭＮａＣｌの濃度勾配にて分画し、アデニレートキナーゼ活性のある画分を回収した。この画分をアデニレートキナーゼ酵素標品とした。なお、この酵素標品におけるポリリン酸キナーゼの比活性は、３４４ユニット／mg蛋白質であった。
なお、本発明におけるアデニレートキナーゼ活性の単位（ユニット）も次の方法で測定、算出した。すなわち、５mM塩化マグネシウム、５mM  ＡＴＰ、及び５mM  ＡＭＰを含有する５０mMトリス塩酸緩衝液（pH７．８）に酵素標品を添加して３７℃で保温することで反応を行い、１００℃、１分間の熱処理により反応を停止させる。ＨＰＬＣを用いて反応液中のＡＤＰを定量し、３７℃で１分間に２μmoleのＡＤＰを生成する活性を１単位（ユニット）とする。
（５）ポリリン酸キナーゼとアデニレートキナーゼによるＡＴＰの合成（その１）
１０mM  塩化マグネシウム、１００mM  硫酸アンモニウム、ポリリン酸（無機リン酸として７５mM）、４mM  ＡＭＰを含有する５０mM  トリス塩酸緩衝液（pH７．８）に酵素標品あるいは菌体抽出液を添加し、３７℃で１５０分保温した。反応終了後反応液中のヌクレオチドをＨＰＬＣを用いて定量した。その結果を表１に示す。
0003764755.tif 000004
表１に示すように、ポリリン酸キナーゼ並びにアデニレートキナーゼそれぞれ単独ではＡＭＰをリン酸化し、ＡＤＰ及びＡＴＰを生成する活性は存在せず、両者が同時に存在することで初めてＡＭＰのリン酸化が生じた。また、通常の大腸菌（ＪＭ１０９〔ｐＵＣ１８〕）より調製した粗酵素液とポリリン酸キナーゼを混合してもＡＭＰのリン酸化は生じないが、アデニレートキナーゼ高生産株（ＪＭ１０９〔ｐＵＣ−ＡＤＫ〕）より調製した粗酵素液をポリリン酸キナーゼと混合すると顕著なＡＭＰのリン酸化反応が生じた。以上のことからポリリン酸キナーゼとアデニレートキナーゼが共存することでＡＭＰのリン酸化が生じることは明らかである。
（６）ポリリン酸キナーゼとアデニレートキナーゼによるＡＴＰの合成（その２）
１０mM  塩化マグネシウム、１００mM  硫酸アンモニウム、ポリリン酸（無機リン酸としてそれぞれ０mM、３０mM、７５mM、１５０mM）、４mM  ＡＭＰを含有する５０mM  トリス塩酸緩衝液（pH７．８）に０．１ユニット／mlポリリン酸キナーゼ及び０．５ユニット／ml  アデニレートキナーゼを添加し、３７℃で１２０分保温した。反応終了後反応液中のヌクレオチドをＨＰＬＣを用いて定量した。その結果を表２に示す。
0003764755.tif 000005
表２に示すように、ポリリン酸キナーゼとアデニレートキナーゼによるリン酸化活性はポリリン酸濃度に依存しているが、高濃度ポリリン酸存在下ではその活性も阻害された。
（７）ポリリン酸キナーゼとアデニレートキナーゼによるＡＴＰの合成（その３）
１０mM  塩化マグネシウム、１００mM  硫酸アンモニウム、ポリリン酸（無機リン酸として７５mM）、４mM  ＡＭＰを含有する５０mM  トリス塩酸緩衝液（pH７．８）に０．１ユニット／mlポリリン酸キナーゼ及び様々な濃度のアデニレートキナーゼ酵素標品を添加し、３７℃で７０分保温した。反応終了後反応液中のヌクレオチドをＨＰＬＣを用いて定量した。その結果を表３に示す。
0003764755.tif 000006
（８）ポリリン酸キナーゼとアデニレートキナーゼによるＡＴＰの合成（その４）
１０mM  塩化マグネシウム、１００mM  硫酸アンモニウム、ポリリン酸（無機リン酸として７５mM）、４mM  ＡＭＰを含有する５０mM  トリス塩酸緩衝液（pH７．８）に０．１ユニット／mlポリリン酸キナーゼ及び２．５ユニット／mlアデニレートキナーゼ酵素標品を添加し、３７℃で４００分保温した。反応終了後反応液中のヌクレオチドをＨＰＬＣを用いて定量した。その結果を図１に示す。反応終了時の反応液中のヌクレオチド濃度は、ＡＴＰ  ２．３mM、ＡＤＰ  １．３mM、ＡＭＰ  ０．４mMであった。
実施例２；ＡＴＰ再生系を利用したガラクトース−１−リン酸の製造
（１）大腸菌ガラクトキナーゼの調製
大腸菌ガラクトキナーゼ遺伝子を含有するプラスミドｐＤＲ５４０（Gene,20,231(1982)、ファルマシア社より入手）を保持する大腸菌ＪＭ１０９菌を、１００μｇ／mlのアンピシリンを含有する２×ＹＴ培地  ３００mlに植菌し、３７℃で振とう培養した。４×１０8菌／mlに達した時点で、培養液に終濃度１mMになるようにＩＰＴＧを添加し、さらに３０℃で５時間振とう培養を続けた。培養終了後、遠心分離（９，０００×ｇ、１０分）により菌体を回収し、６０mlの緩衝液（５０mM  トリス塩酸（pH７．５）、５mM  ＥＤＴＡ、０．１％トライトンＸ−１００、０．２mg／mlリゾチーム）に懸濁した。３７℃で１時間保温した後、超音波処理を行い、菌体を破砕し、さらに遠心分離（２０，０００×ｇ、１０分）により菌体残さを除去した。このように得られた上清画分を５mM  塩化マグネシウム及び１mM  ２−メルカプトエタノールを含有する５０mMトリス塩酸（pH７．８）に対して透析を行い、ガラクトキナーゼ酵素液とした。酵素液におけるガラクトキナーゼの比活性は、１．３９ユニット／mg蛋白質であった。
なお、ガラクトキナーゼ活性の単位（ユニット）は、以下に示す方法で測定、算出したものである。５mM塩化マグネシウム、１０mM  ＡＴＰ、１０mM  ガラクトースを含有する１００mMトリス塩酸緩衝液（pH７．８）に酵素標品を添加して、３７℃で保温することで反応を行い、１００℃、１分間の熱処理により反応を停止させる。糖分析装置（ダイオネックス社）を用いて反応液中のガラクトース−１−リン酸を定量し、３７℃で１分間に１μmoleのガラクトース−１−リン酸を生成する活性を１単位（ユニット）とする。
（２）ポリリン酸キナーゼとアデニレートキナーゼによるＡＴＰ再生とガラクトキナーゼによるガラクトース−１−リン酸の合成
１０mM  塩化マグネシウム、１００mM  硫安、ポリリン酸（無機リン酸として７５mM）及び４mM  ＡＭＰを含有する１００mM  トリス塩酸緩衝液（pH７．８）に０．１ユニット／mlポリリン酸キナーゼ及び２．５ユニット／mlアデニレートキナーゼ酵素標品を添加し、３７℃で１２０分保温した。該ＡＭＰリン酸化反応終了時の反応液中のヌクレオチド濃度は、ＡＴＰ  １．４mM、ＡＤＰ  １．７mM、ＡＭＰ  ０．９mMであった。この反応液に終濃度４０mMとなるようにＤ（＋）ガラクトースを添加し、さらに１．０ユニット／mlとなるようにガラクトキナーゼを添加し、３７℃で４．５時間保温した。反応終了液を糖分析装置（ダイオネックス社）を用いて分析したところ、２８．４mMのガラクトース−１−リン酸の生成が確認された。
産業上の利用可能性
本発明により、簡便かつ安価にＡＭＰからＡＴＰを製造することが可能となった。このＡＴＰ合成系をＡＴＰを消費する酵素反応系と組み合わせることにより、効率的に目的とする化合物を製造することが可能となった。
【図１】
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