(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルカリゲネス・フェカリス（Alcaligenes fecalis）No.４株（FERM P-18114）にアンモニア態窒素化合物を接触せしめることによりアンモニア態窒素を窒素ガスの変換する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は微生物を利用する脱窒方法に関し、この方法は、種々の由来の排水等に含まれるアンモニア態窒素を窒素ガスに変えて脱窒する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
アンモニア態窒素(NH4+ ) を他の形態の窒素に変化させる方法としては、NH3 →(HH2OH)-NO2 - →NO3 - と変化する硝化反応と、NO3 - →NO2 - →NO→N2O →N2と変化する脱窒反応が知られている。硝化反応は硝酸菌と称する独立栄養細菌により行われる。この細菌は二酸化炭素を炭素源として利用し、この際に二酸化炭素の還元のためにアンモニウムの酸化を行う。このため、硝化反応の反応速度は一般に非常に低い。
【０００３】
脱窒反応は脱窒菌と称する細菌により行われる。この細菌は、嫌気状態においてエネルギーを獲得する手段として硝酸イオンなどを還元するので、脱窒反応は嫌気的条件下においてのみ進行する。
上記２種類の反応を別々の細菌（硝化菌及び脱窒菌）により行う場合には、上記のごとく硝化作用の反応速度が非常に低い、硝化反応のための好気的条件と脱窒反応のための嫌気的条件とを同時に使用する必要がある等の問題点があり、排水処理等のための実用化は困難である。
【０００４】
他方、Y.Inamori ら、Wat.Sci.Tech.Vol.36, No.10, p.65-72(1997) には、１種類の細菌アルカリゲネス・フェカリス(Alcaligenes faecalis)を用いて、好気的条件下で硝化反応と脱窒反応とを同時に行い、アンモニウムイオンを脱窒(N2Oまでの酸化）することが記載されている。しかしながら、この反応の速度は非常に低く８．３mg N2O／日／リットルである。また、T.Nishioら、J, Ferment. Bioeng., Vol.86, No.2, p.351-356(1998)には、固定化したアルカリゲネス・フェカリスOKK17 細菌が、０．２８mmol／時／ｇ蛋白質の速度でアンモニウムイオンの脱窒を行うことが記載されている。
【０００５】
しかしながら、上記いずれの場合の、アンモニウムイオンの脱窒速度が低く、実用性に乏しい。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
従って本発明は、実用的な高速でアンモニウムイオンの脱窒を行うことができる方法を提供しようとするものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記の課題を解決すべく種々検討した結果、アルカリゲネス・フェカリス種に属する細菌株に、従来知られていた微生物よりもはるかに高い速度でアンモニウムイオンからの脱窒反応を行うことができるものが存在することを見出し、本発明を完成した。
【０００８】
従って本発明は、アルカリゲネス・フェカリス(Alcaligenes faecalis)細菌にアンモニア態窒素化合物を接触せしめることによりアンモニア態窒素を窒素ガス（N2）に変換する方法において、前記細菌が少なくとも１５２mg N2O／日／リットル又は少なくとも０．６mmol／時／ｇ蛋白質の脱窒速度を有することを特徴とする方法を提供する。本発明はさらに、アルカリゲネス・フェカリスNo. ４株(FERM P-18114 ）細菌をアンモニア態窒素化合物に接触せしめることを特徴とする、アンモニア態窒素の脱窒方法を提供する。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明の方法において使用する微生物としては、アルカリゲネス・フェカリス種に属し、少なくとも１５２mg N2O／日／リットル又は少なくとも０．６mmol／時／ｇ蛋白質の脱窒速度でアンモニウムイオンの脱窒を行うことができるものであればよいが、その具体例として、細菌株No. ４が挙げられる。この菌株は、アルカリゲネス・フェカリス種に属するものと同定され、２０００年１１月９日にFERM P-18114として生命工学工業技術研究所に寄託された。
【００１０】
本発明の脱窒用細菌は、少なくとも１５２mg N2O／日／リットル、好ましくは３００mg N2O／日／リットル、さらに好ましくは、６００mg N2O／日／リットル、そしてさらに好ましくは１２００mg N2O／日／リットルの脱窒速度を有する。
アルカリゲネス・フェカリス（Alcaligenes faecalis）を用いた脱窒反応に関する今までの報告の値と本菌との比較を以下に示す。
【００１１】
（１）IFO14479株を用いた報告（Water Science and Technology 36(1997)65-72)
IFO14479株を用いた実験の脱窒は培養初期（１０日くらいまで）は、ほとんど、N2O が生産されず、その後、徐々に、N2O が生産されている。従って、３０日以後の値を比較する。IFO14479株の最大N2O 放出量（すなわち最大の脱窒量）Fig.2 から３５日付近で、４．８mg-N／日である。この値は、培養液５８０mLの値であるから、培養液１Ｌ（リットル）に換算すると８．３mg-N／日／Ｌとなる。一方、No.4株の脱窒量は、表２および表３から培養３０時間後から５０時間後の２０時間の脱窒量は１５２mg-N／日／Ｌとなり、No.4株の方が約２０倍高い脱窒能を持つ。
【００１２】
（２）OKK17 株を用いた報告（Journal of Fermantation and Bioengineerimg 86(1998)351-356)
OKK17 株（PVA ゲルで菌を固定化）の脱窒量は最大で０．２８mmol／時／ｇ蛋白質でありNo.4株は０．６mmol／時／ｇ蛋白質となる。No.4株はOKK17 株の２倍の活性を示した。OKK17 株はPVA により包括したため高い脱窒能を示したと考えられる。No.4株もPVA による包括を行うとさらに高い脱窒能を示すと予想される。
【００１３】
本発明の微生物は、ペプトン、酵母エキス等を主成分とする有機培地及びリン酸カリウム、硫酸マグネシウム等を主成成分とすいる無機培地のいずれにおいても増殖することができ、脱窒反応のための菌体の生成のための培地としても有機培地及び無機培地のいずれも使用することができる。有機培地の例としては、ペプトン（ポリペプトン商標名）  １０ｇ／Ｌ、酵母エキス  ５ｇ／Ｌ及びNaCl  ５ｇ／Ｌ含有するＬ培地、無機培地の例として、K2HPO4  １４ｇ／Ｌ、KH2PO4  ６ｇ／Ｌ、(NH4)2SO4   ２ｇ／Ｌ、クエン酸三ナトリウム・二水和物  １５ｇ／Ｌ及びMgSO4 ・7H2O  ０．２ｇ／Ｌを含むＭＭ培地等を使用することができる。
【００１４】
さらには、最も脱窒速度が大きい培地組成（表１）が望ましい。
培養条件としては、微生物自体の高い増殖速度及び高い脱窒速度を得るために好気的条件が好ましい。好気的条件を確保するためには、小規模培養のためには振とう培養が用いられるが、大規模な培養においては通気及び撹拌培養が好ましい。細菌の通気・撹拌培養等の好気培養の技術はすでに確立されており、常用の技術を用いることができる。
【００１５】
培養温度は１５〜３７℃であり、好ましくは２５〜３０℃である。培地のpHは、５〜８であり、好ましくは中性附近である。本発明において使用する細菌の増殖速度は比較的高く、培養条件や、接種する菌体量等によっても異るがおよそ回分式培養においては半日〜１日で最高菌体濃度に達する。
本発明の脱窒は、本発明の微生物と脱窒の対象となる窒素化合物とを接触せしめることにより行われる。具体的には、脱窒の対象となるアンモニウムイオン等を含有する培地中で脱窒用微生物を好気的条件下で培養すればよい。この培養は回分式又は連続式に行うことができる。微生物の回分式培養のみならず、連続式培養もすでに確立された技術である。上記の方法に代えて、一旦脱窒微生物を増殖させて菌体を得た後、これを好気的条件下で脱窒対象となる窒素化合物と接触せしめることができる。
【００１６】
例えば、培養により菌体を得た後、その培地中に脱窒対象化合物を加えて、さらに通気・撹拌、振とう等の手段により好気的条件を生成する。あるいは、培養により菌体を増殖せしめた後、培地から菌体を分離し、それを別の反応媒体に懸濁した後、それに脱窒対象となる窒素化合物を添加するか、あるいは、脱窒対象となる窒素化合物を含有する媒体中に前記のごとき分離した微生物菌体を懸濁する。次に、こうして形成した、菌体及び脱窒対象化合物を含有する反応媒体に、通気・撹拌、振とう等の常用手段により好気的条件を付与すればよい。
【００１７】
あるいは、培地から分離した菌体を固定化して使用することもできる。生きた微生物菌体、特に細菌菌体を担体に固定化し、あるいは菌体間を連結することにより固定化し、それを好気的条件下で反応に用いる技術はすでに確立しており、常用の方法により菌体の固定化、及び反応を行うことができる。例えば、脱窒用菌の菌体を担体に固定し、その表面に脱窒対象窒素化合物を含有する媒体を流過させ、その際に、好気的条件を確保するために通気を行えばよい。
【００１８】
本発明における脱窒は、NH4 + →NH2OH →NO2 - →NO3 - と変化する硝化反応と、NO3 - →NO2 - →NO→N2O →N2と変化する脱窒反応との組合わせによって行われると考えられる。従って、本発明の方法においては、上記中間体窒素化合物のいずれもが脱窒対象化合物となり得る。しかしながら、実用上最も重要なのは、アンモニア態窒素（アンモニウムイオン）(NH4+ ）の脱窒である。アンモニウムイオンの脱窒においては、脱窒反応媒体中の初期アンモニウムイオンの濃度は３００〜１５００mg／Ｌが好ましい。
【００１９】
従って、例えば、アンモニウムイオンを含有する排液の脱窒においては、アンモニウムイオン濃度が所定の濃度となる量の排液を培地に添加して脱窒用細菌を培養するか、あるいは排液により脱窒用媒体を調製し、これに脱窒用菌体を添加すればよい。あるいは、排液を所望により希釈した後に、固定化菌体表面と接触させればよい。
【００２０】
【実施例】
次に、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。
実施例１．
ＭＭ培地（K2HPO4  １４ｇ／Ｌ、KH2PO4  ６ｇ／Ｌ、(NH4)2SO4   ２ｇ／Ｌ、クエン酸三ナトリウム・二水和物  １ｇ／Ｌ及びMgSO4 ・H2O   ０．２ｇ／Ｌ）５mlを試験管（直径１８mm×長さ１８０mm）に入れて蒸気殺菌し、アルカリゲネス・フェカリスNo. ４株(FERM P-18114 ）を接種し、３０℃にて１６時間１２０spm （ストローク／分）で培養し、前培養物として、５００mLの三角フラスコに表１の培地３００mLを入れ、蒸気殺菌し、これに上記の前培養物を１％（ｖ／ｖ）植菌し、５００mL／分の通気を行い、培地に空気が均一に行きわたるようにスターラーを用いて撹拌した。
【００２１】
【表１】
0003750053.tif 000002
【００２２】
培養を５０時間行い、その間に経時的にサンプリングを行い、生菌数、NH4 + ，NH2OH ，NO2 - ，NO3 - ，NO及びN2O を測定した。また３０時間後にまたは５０時間後に培養を終了し、菌体の元素分析を行い、各中間体窒素化合物及び菌体成分の窒素収支からN2生産量を算出した。
各測定は次のようにして行った。
【００２３】
生菌数の測定
培養中の生菌数の測定は、平板希釈法により測定した。
NH4 + の定量
NH4 + の定量には、インドフェノール法を使用した。No. ４株の培養液１mLを遠心分離（８０００rpm ×５min)し、さらにフィルターろ過（ADVANTEC；pore size ０．２μｍ）して、除菌液を得た。この除菌液を１／１０００希釈したもの１mLに、吸収液（ホウ酸５ｇを１リットルの蒸留水に溶かしたもの）２００μＬ、フェノール・ニトロプルシドナトリウム溶液（フェノール５ｇとニトロプルシドナトリウム２５mgを５００mLの蒸留水に溶かしたもの）６００μＬ、次亜塩素酸ナトリウム溶液（次亜塩素酸ナトリウム２０mLとNaOH１５ｇを１リットルの蒸留水に溶かしたもの）６００μＬを順に添加し、試薬を添加する度にボルテックスにより十分撹拌した。この溶液１ｈ静置し反応させた後、波長６４０nmの吸光度を測定した。
【００２４】
Ｌ培地中では、インドフェノール法の阻害物質が存在するためNH4 + の定量はＭＭ培地のみ行った。
NH2OH の定量
NH2OH の定量には、R.C.Burrell(2)らの方法を使用した。No. ４株の培養液の除菌液２００μＬに０．０５Ｍリン酸バッファー（pH６．８）２００μＬと滅菌水１６０μＬを加えた。次にトリクロロ酢酸水溶液（１２％）４０μＬ、８−キノリノール溶液（１ｇ／１００ml脱水エタノール）２００μＬ、１．０Ｍ  NaCO3 水溶液２００μＬを順に添加した。試薬を添加する度にボルテックスにより十分撹拌した。合計１mLになった溶液を熱水（８０℃）で１min 加熱し、１５min 冷却後、波長７０５nmの吸光度を測定した。NH2OH の検量線は、NH2OH の標準液を用いて吸光度とNH2OH 量との関係から作成した。
【００２５】
NO2 - およびNO3 - の定量
NO2 - およびNO3 - の定量は、イオンクロマトグラフィー（ＩＣ）を用いた。No. ４株の培養液の除菌液から、さらにフィルター（C18CARTRIDGES, SEP-PACK)で有機物を除去した後、ＩＣ（HIC-6A, SHIMAZU)で定量分析した。ＩＣの運転条件は、次の通りである。
ＩＣの運転条件
カラム：Shim-pack IC-A1, SHIMAZU
移動相：２．５mM  フタル酸
２．４mM  トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン
流速：１．５mL／min
温度：４０℃
検量線は、NO2 - は(NaNO2) のおよびNO3 - は(NaNO3) の標準液を用いて、NO2 - およびNO3 - とピーク面積との関係から作成した。
【００２６】
NOの測定
NOの測定は、NOX 計（AP1 200A型分析計 RIKEN KEIKI CO., LTD.) を用いて行った。NOX 計は、試料ガス中のNOとO3の反応によって生じる化学発光強度がNO濃度に比例関係にあることを利用してNOを測定する分析計である。また、NOの濃度は、３０７０ppb のNO標準ガスとの相関性により算出される。
【００２７】
NOの測定は、通気培養中の排気を直接NOX 計に送り込むことによって測定した。NOは、空気中では、すぐにNO2 に酸化されるため、NO＋NO2 でNOの値とした。また、NO生産量は、サンプリング時のNO濃度を積分することによって算出した。
N2O の測定
N2O の測定には、ECD ガスクロマトグラフィー（GC-14B, SHIMAZU)により測定した。通気実験中の排気をCaCl2 管でH2O を除き、NaOH管でCO2 を除き(CO2の除去は、N2O のピークに影響を与えるためを行った。）１００mLサンプリング瓶に収集し測定を行った。また、N2O 生産量は、サンプリング時の経時変化のN2O 濃度を積分することによって算出した。また、N2O の濃度は、３５０ppb のN2O 標準ガスとの相関性を用いて算出した。ECD ガスクロマトグラフィーの運転条件は次の通りである。
ECD ガスクロマトグラフィーの運転条件
GCカラム：Unibeads C, 1/8 ”＊2m ss tube, 70℃恒温
キャリヤーガス：窒素、４０mL／min
ECD ：定電流１nA、レンジ１０0 、３００℃                                ECD makeup gas：高純度メタン、４．２％ｖ／ｖ
元素分析
窒素源であるNH4 + は、すべてが硝化反応、脱窒反応に使われるわけではない。NH4 + は菌体生成にも使われるため乾燥菌体の重量測定、元素分析をおこなった。培養３０時間後および５０時間後の培養液３００mLを遠心分離（８０００rpm ×２０min)し、沈澱した菌体懸濁液を滅菌水で２度十分に洗浄し、菌体の外部に付着している物質を取り除いた後、１０５℃で菌体を完全に乾燥させた。乾燥菌体の重量を測定し、元素分析にかけて菌体中の各元素（水素、炭素、窒素）の重量％を測定した。これより菌体の窒素量を算出した。
【００２８】
ブランク実験
窒素源であるNH4 + は、撹拌、通気などによってNH3 になり、気体となって放出される可能性がある。また、No. ４株がNH3 を放出している可能性もある。そこで、上記フラスコと同一のものを用意し、３０時間および５０時間、出口ガスから放出されるNH3 を３５mmol／Ｌの硫酸１００mLに溶かし、NH3 量を前記の方法で測定した。
【００２９】
結果は次の通りであった。
通気実験による菌数及び硝化産物(NH2OH，NO2 - ，NO3 - ）の変化
通気培養によるNo. ４株の生菌数、及び培地中に生産された硝化産物(NH2OH，NO2 - ，NO3 - ）の経時変化を図１に示す。培養初期から硝化産物が検出され、NO2 - ，NO3 - ともに培養５０時間まで増加した。
【００３０】
通気培養によるNH4 + および脱窒中間生成物（NO，N2O)の変化
通気培養によるNo. ４株のNH4 + と脱窒中間生成物（NO，N2O)の経時変化を図２に示す。NO及びN2O は、共に対数増殖期１０時間後より生産され、瞬間の濃度の最大値は、培養３５時間後であり、その値は、NOは２ppm 、N2O は１３ppm であった。この間、NH4 + の減少が続いた。硝化産物の生産の後、脱窒反応によりNO, NO2 が生産されていることを意味している。
【００３１】
乾燥菌体の元素分析
乾燥菌体の重量測定と元素分析を行った結果の１つを表２の培養１に示す。乾燥菌体の重量は、９５８mg／Ｌであった。また、元素分析により乾燥菌体は、水素６％、炭素４３％、窒素１２％を含んでいた。これらより、菌体中の窒素量を算出（９５８×０．１２／１４）すると、８．２１mmol／Ｌという値となった。これは、NH4 + の減少量１４．４mmol／Ｌの５７％であった。
【００３２】
ブランク実験
ブランク実験の結果、NH3 は０．８２mmol／Ｌ放出されていることがわかった。
通気培養による窒素収支
通気培養による培養３０時間と５０時間後の窒素収支をそれぞれ表２および表３に示す。培養前と培養後の窒素収支よりN2を算出した。２回の実験データを示した。
【００３３】
【表２】
0003750053.tif 000003
【００３４】
【表３】
0003750053.tif 000004
【００３５】
【発明の効果】
表２および表３の窒素収支により算出したNo. ４株の窒素生産量は今まで報告された値の２〜２０倍高い値であり、これらより、本発明の脱窒菌は、好気条件下でNH4 + を高い割合でN2に変換していると予想される。このことから、本発明の脱窒菌の利用法として、生物的汚水処理システムに導入することが考えられ、好気槽一槽のみの窒素除去を可能にし、施設の縮小、コストの削減が予想される。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明の脱窒菌No. ４株の表１に示す培地における培養での生菌数、及び培地中に生産された硝化産物(NH2OH，NO2 - 及びNO3 - ）の経時変化を示すグラフである。
【図２】図２は、本発明の脱窒菌No. ４株のＭ培地における培養でのNH4 + 濃度及び脱窒中間生成物（NO及びN2O)の濃度の経時変化を示すグラフである。
【図１】
0003750053.tif 000005
【図２】
0003750053.tif 000006