(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
尿中に含まれる膀胱癌マーカーである基底膜成分を測定する方法であって、基底膜成分が抗基底膜成分抗体を感作させていないカルボキシル化ラテックス微粒子との凝集能を有している条件下において、基底膜成分と抗基底膜成分抗体を感作させていないカルボキシル化ラテックス微粒子とを共存させ、基底膜成分とカルボキシル化ラテックス微粒子との凝集反応を利用して基底膜成分を測定する方法において、ヒトＩｇＧに起因する非特異的凝集を抑制するために反応系のｐＨをアルカリ側にすることを特徴とする、基底膜成分の測定方法。
【請求項２】
ｐＨが８．０〜１２．０の範囲である、特許請求の範囲第１項に記載の測定方法。
【請求項３】
さらに好ましくは、ｐＨが８．５〜９．０の範囲である、特許請求の範囲第２項に記載の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、尿中の基底膜成分といった膀胱癌マーカーを定量的に測定するための方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
膀胱癌のうち侵入型膀胱癌と呼ばれるタイプは、膀胱を覆う粘膜において始まり、基底膜を浸食して筋肉に及ぶ。この侵入型膀胱癌（以下、単に膀胱癌と呼称することもある）を検査する方法として、細胞学的検査や膀胱鏡検査があるが、これら方法はいずれも非常に煩雑で、特に膀胱鏡検査は肉体的危険さえある。また、これらの検査では、たとえ陰性であったとしても、それが即ち膀胱癌の非存在を裏付ける証拠には成り得ないのである。
【０００３】
そういった欠点を有さない、簡易な膀胱癌の検査方法として、種々の腫瘍マーカーの利用が研究され、実用化されて来ている。これら腫瘍マーカー検査は、腫瘍マーカーを免疫学的に検出したり、公知の手法で乾式の試験片に適用させたりしたものであり、スクリーニング検査にも応用できる。
【０００４】
さて、基底膜は、複数の特定の基底膜成分のコラーゲン（例えばタイプＩＶ及びタイプＶ）、ラミニン、細胞接着分子、プロテオグリカン、フィブロネクチンを含む、少なくとも複数の同定された蛋白質及びペプチド誘導体を含む。先述の侵入型膀胱癌は、その浸食作用により、基底膜成分を尿中へ遊離させ、遊離した基底膜成分及びそのフラグメント（断片）は、さらに細かいフラグメントへと分解される。
【０００５】
特表平４−５０２３６３号に記載の発明は、膀胱癌患者の尿検体中に、上記のような細かなフラグメントの他に、独特の複合体形状を有する基底膜成分が検出可能な濃度で残存していることに着目した発明である。開示された一つの方法として、それら基底膜成分の断片複合物に対する標識か非標識のいずれかのモノクローナル抗体を利用し、凝集反応やサンドイッチ測定法等の、常用の手法で定性的に検出させている。
【０００６】
開示されたもう一つの方法として、上記基底膜成分が、通常のラテックス凝集で用いられるような微粒子の懸濁物を凝集させるという能力特性に基づいて、凝集反応を観察する方法がある。その凝集機構は不明だが、ラテックス微粒子の表面に抗基底膜成分抗体を感作させていなくとも、基底膜成分を含む断片複合体が存在する尿サンプルと接触させることで、ラテックス微粒子の凝集が生じるのである。ここで、特表平４−５０２３６３号では、牛血清アルブミンにより微粒子の葱濁液を処理し、粒子の表面土の部位をブロックすることで、非特異的相互作用を軽減化している。さらに、基底膜成分のラテックス凝集活性を改善するために、特表平９−５００９６５号では、ラテックス微粒子の表面をヒト・ガンマ・グロブリン（以下ヒトＩｇＧ）で修飾する方法を開示している。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、本発明者らが、上記凝集反応系における数々の共存物質の影響を調査した結果、ヒトＩｇＧにより、ラテックス微粒子が非特異的に凝集してしまうことが判明した。
【０００８】
ヒトＩｇＧ（分子量：約１６万ダルトン）は、血清中に８００〜２０００ｍｇ／ｄｌ程度の量で含まれる蛋白質であり、尿を測定対象とする膀胱癌には関連性がないものの、腎糸球体基底膜が損傷した腎疾患患者では血清中のヒトＩｇＧが尿中に漏出することが知られている。このヒトＩｇＧは微量の存在で、多くの凝集塊を生み出してしまう。これは、上記凝集反応系では膀胱癌を患っていない腎疾患患者で偽陽性を示すことを意味しており、特異性が低いと言わざるを得ない。
【０００９】
また、ラテックス微粒子の表面上に修飾されているヒトＩｇＧが、万が一ラテックス微粒子から遊離・漏出すると、試料中で反応し、非特異的な凝集を生じさせる要因ともなる。
【００１０】
そこで本発明の目的は、試料中にヒトＴｇＧが含まれていても擬陽性を示さない、基底膜成分を対象物としたラテックス凝集反応に基づく基底膜成分の測定方法を提供することにある。
【００１１】
また本発明のもう一つの目的として、凝集反応時の測定対象濃度の範囲を拡大することもある。
【００１２】
課題を解決するために、本発明は、尿中に含まれる膀胱癌マーカーである基底膜成分を測定する方法であって、基底膜成分が抗基底膜成分抗体を感作させていないカルボキシル化ラテックス微粒子との凝集能を有している条件下において、基底膜成分と抗基底膜成分抗体を感作させていないカルボキシル化ラテックス微粒子とを共存させ、基底膜成分とカルボキシル化ラテックス微粒子との凝集反応を利用して基底膜成分を測定する方法において、ヒトＩｇＧに起因する非特異的凝集を抑制するために反応系のｐＨをアルカリ側にすることを特徴とする、基底膜成分の測定方法である。
【００１３】
特表平４−５０２３６３号及び特表平９−５００９６５号に記載の、基底膜成分を対象物としたラテックス凝集反応は、通常、中性付近のｐＨで行われる。特表平９−５００９６５号では、ラテックス表面へ牛血清アルブミンを効率よく作用させるために、アルカリ性（ｐＨ８．５）のグリシン緩衝液（０．０１３Ｍ）で処理しているが、試料となる尿を中性（ｐＨ７．８）のＨＥＰＥＳ緩衝液（１．０Ｍ）で中和することが好ましいと記載されており、やはり中性付近で反応させることが好ましいとされている。
【００１４】
本発明者らの鋭意研究により、基底膜成分がラテックス微粒子との凝集能を有している条件下でラテックス試薬のｐＨをアルカリ側にすることで、ヒトＩｇＧはラテックス微粒子の凝集能を劇的に失う現象を見出したのである。
【００１５】
つまり、基底膜成分を腫瘍マーカーとしてスクリーニング試験を行った場合、もし凝集による濁りが発生したとしても、本発明を用いると、ヒトＩｇＧ由来の偽陽性を完全に排除でき、基底膜成分による濁りのみを得ることが出来るのである。
【００１６】
また、本発明において、ｐＨがアルカリになればなるほど、ヒトＩｇＧの影響を回避できるが、意外にも同時に測定対象濃度の範囲を拡大することができることも判明した。すなわち高濃度の基底膜成分を含む検体試料でも、良好な直線性の下で定量的測定が可能となるのである。
【００１７】
【発明の実施の形態】
本発明で使用されうるラテックス微粒子は、特表平４−５０２３６３号及び特表平９−５００９６５号に記載の微粒子に準ずればよい。すなわち、微粒子は約０．０１〜５μｍの直径を有し、約０．２５〜０．７μｍが好ましい。もちろん、非特異的相互作用を軽減するために、牛血清アルブミンで表面処理しても良い。
【００１８】
さらに、特表平９−５００９６５号に記載されているように、本発明でも、基底膜成分のラテックス凝集活性を改善するために、ラテックス微粒子の表面をヒトＩｇＧで修飾しても良い。万が一、修飾目的のヒトＴｇＧが反応系に漏出しても、本発明中では悪影響を及ぼさない。
【００１９】
本発明で利用できるラテックス微粒子の材質は、通常の凝集試験で用いられる極めて微細なプラスチック粒子、例えばポリスチレン及びその誘導体が好ましい。もちろん、その他の炭化水素ポリマー及び固形物質、例えばガラス等も（厳密にはラテックスではないが）使用することができる。これら微粒子は非誘導体又は誘導体の状態となることができ、例えばカルボキシル化、又はアミノ化の両者が好ましく使用できる。
【００２０】
本発明における反応系のｐＨは、ｐＨ８．０〜１２．０の範囲で使用でき、さらに好ましくはｐＨ８．０〜９．０である。
【００２１】
ラテックス微粒子を含有するラテックス試薬には、尿試料のｐＨに影響を受けない程度の緩衝液を使用することが望ましく、その濃度は低い方が良い。用いることのできる緩衝液としては、ｐＨ８〜１２において緩衝能を有するものであれば特に限定はされないが、例としてトリス緩衝液、トリエタノールアミン緩衝液、グリシン緩衝液等が好ましく使用できる。また、緩衝液の濃度は０．０１〜０．０５Ｍの範囲で使用でき、さらに好ましくは０．０５〜０．２Ｍで使用することが望ましい。
【００２２】
【実施例】
（実施例１）
基底膜成分としてヒト由来のＩＶ型コラーゲン（シグマ社製  Ｃ−５５３３）を、５ｍｇ／ｄｌ及び１０ｍｇ／ｄｌの濃度になるように、健常者から採取したプール尿に直接溶解した。また、腎疾患患者の尿中漏洩物としてヒト由来のヒト免疫グロブリンＧ、即ちヒトＩｇＧ（シグマ社製  Ｉ−４５０６）を、５０ｍｇ／ｄｌ及び１００ｍｇ／ｄｌの濃度になるように前記プール尿に直接溶解した。
【００２３】
ラテックス原液として、１０％濃度の粒径２５０ｎｍのカルボキシル化ラテックス（商品名：ＩＭＭＵＴＥＸ、日本合成ゴム製  Ｇ０２０５）を用意し、特表平９−５００９６５号に記載されるのと同様の手法でヒトＩｇＧ（シグマ社製Ｉ−４５０６）で修飾し、牛血清アルブミン（シグマ社製  Ａ−８０２２）で表面処理を行った。このラテックス微粒子を８００ｎｍにおける吸光度（濁度）が０．８〜１．２になるように、０．１Ｍのトリス緩衝液で希釈した溶液をラテックス試薬とした。
【００２４】
前記ラテックス試薬溶液の希釈時には、ｐＨ８．６（アルカリ性）に調製したトリス緩衝液を使用した。また、比較対照用としてｐＨ７．６（中性）に調製したトリス緩衝液も使用した。
【００２５】
上記ラテックス試薬溶液２００μｌに対し、ＩＶ型コラーゲンあるいはＩｇＧ含有プール尿を試料として５μｌ混合し、その後の１０分間の吸光度（濁度）の変化を、汎用自動分析装置ＣＯＢＡＳ−ＭＩＲＡ（Ｒｏｓｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）を使用し追跡した。その結果を、各図に示す。
【００２６】
図１は、ＩＶ型コラーゲンを含有した試料を測定した際の反応タイムコースを示したものである。（Ａ）（Ｂ）両図とも、縦軸には８００ｎｍにおける吸光度を、横軸には反応時間（秒）を採用している。（Ａ）はラテックス希釈時にｐＨ７．６の緩衝液を使用しており、一方（Ｂ）ではｐＨ８．６の緩衝液を使用している。図１から判るように、（Ａ）（Ｂ）とも経時的に吸光度が上昇していることから、ラテックス試薬中のラテックス微粒子と試料中のＩＶ型コラーゲンとが凝集反応を起こしていることが判る。
【００２７】
図２は、ヒトＩｇＧを試料として測定した際の反応タイムコースを示したものである。（Ａ）（Ｂ）両図とも、縦軸には８００ｎｍにおける吸光度を、横軸には反応時間（秒）を採用している。（Ａ）はラテックス試薬の希釈時にｐＨ７．６の緩衝液を使用しており、一方（Ｂ）ではｐＨ８．６の緩衝液を使用している。図２から判るように、（Ａ）即ちｐＨが中性付近（７．６）の緩衝液を使用した場合にのみ経時的な吸光度の上昇が確認され、（Ｂ）即ちｐＨがよりアルカリ性（８．６）の緩衝液を使用した場合にはほとんど吸光度が上昇していないこと分かる。即ち、（Ｂ）の条件下において、ヒトＩｇＧはラテックス微粒子との凝集能を失うことを意味する。
【００２８】
図１、図２の結果を合わせると、ｐＨをよりアルカリ側にすることで、ラテックス微粒子の凝集反応を利用した、ＩＶ型コラーゲンを一例とする基底膜成分の測定方法において、特異性が向上したことが分かる。
【００２９】
（実施例２）
次に、図２のデータを利用し、試料中のＩＶ型コラーゲン濃度と吸光度の関係の解析を試みた。即ち、反応開始１０分後に測定した吸光度を測定値とし（１ポイントエンド法）検量線を作成した。図３にその結果を示すが、（Ａ）（Ｂ）両図とも、縦軸には１０分後の８００ｎｍにおける吸光度、横軸には試料中のＩＶ型コラーゲン濃度を採用している。
【００３０】
図３（Ａ）は、ｐＨ７．６の緩衝液使用時における、（Ｂ）はｐＨ８．６の緩衝液使用時における結果を元に作成した検量線である。図３から明らかなように、（Ｂ）ではＩＶ型コラーゲン濃度が１０ｍｇ／ｄｌまで直線性が確保出来ているのに対し、（Ａ）では同濃度までの直線性に欠けていることが判る。これはｐＨ８．６の緩衝液を使用したことで、測定範囲が拡大したことを示している。
【００３１】
【発明の効果】
以上のように、本発明を用いると、ヒトＩｇＧの影響を受けることなく、膀胱癌マーカーである基底膜成分を対象物としたラテックス凝集反応を行うことができる。高濃度の基底膜成分を含む検体試料でも、良好な直線性の下で定量的測定が可能となり、測定対象濃度の範囲を広げることができた。
【図面の簡単な説明】
【図１】  （Ａ）が従来技術、（Ｂ）が本発明の手法による、ＩＶ型コラーゲンを測定した際のグラフである。
【図２】  （Ａ）が従来技術、（Ｂ）が本発明の手法による、ヒトＩｇＧを測定した際のグラフである。
【図３】  （Ａ）が従来技術、（Ｂ）が本発明の手法による、ＩＶ型コラーゲンを測定した際の直線性を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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