(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の（ａ）〜（ｃ）を含有するワクチン組成物：
（ａ）ｉ）ガングリオシドの誘導体であって、該ガングリオシドは（１）ＧＭ２、ＧＭ３、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＤ３ラクトン、Ｏ−アセチルＧＤ３、またはＧＴ３ガングリオシドであり、且つ（２）改変されていないスフィンゴシン塩基を含み、前記誘導体は、前記ガングリオシドの改変されていないスフィンゴシン塩基に由来するＣ1〜Ｃ4のみを保持する改変されたスフィンゴシン塩基を有する点だけが前記ガングリオシドとは異なるガングリオシド誘導体と、
ｉｉ）キーホールリンペットヘモシアニン
との複合体；ここで、前記ガングリオシド誘導体は、前記改変されたスフィンゴシン塩基のＣ4炭素と前記キーホールリンペットヘモシアニンのε-アミノリシル基の窒素との間の安定なアミン結合によって前記キーホールリンペットヘモシアニンに結合されている；
（ｂ）ＱＳ−２１；および
（ｃ）薬剤的に許容可能なキャリア；
ただし、前記（ａ）の複合ガングリオシド誘導体の量は１μｇ〜２００μｇであり、前記（ｂ）のＱＳの量は１０μｇ〜１００μｇであり、前記ガングリオシド：キーホールリンペットヘモシアニンのモル比は２００：１〜１４００：１であり、また前記（ａ）の複合体および前記（ｂ）のＱＳ−２１の相対的量は、患者において、前記複合体にその誘導体が存在している前記ガングリオシドに対する抗体産生を刺激または増強するのに有効である。
【請求項２】
請求項１に記載のワクチン組成物であって、前記ガングリオシドがＧＭ２、またはＧＤ２である組成物。
【請求項３】
請求項１に記載のワクチン組成物であって、前記ガングリオシドがＧＭ２である組成物
【請求項４】
請求項１に記載のワクチン組成物であって、前記ガングリオシドがＧＤ２のである組成物。
【請求項５】
請求項１〜４の何れか１項に記載のワクチン組成物であって、前記複合体の量が50μg〜90μgの間の量である組成物。
【請求項６】
請求項１〜５の何れか１項に記載のワクチン組成物であって、前記複合体の量が70μgである組成物。
【請求項７】
請求項１〜５の何れか１項に記載のワクチン組成物であって、前記複合体の量が1μg〜10μgの間の量である組成物。
【請求項８】
請求項１〜４および７の何れか１項に記載のワクチン組成物であって、前記複合体の量が7μgである組成物。
【請求項９】
請求項１〜４の何れか１項に記載のワクチン組成物であって、前記ＱＳ−２１の量が50μgである組成物。
【請求項１０】
請求項１〜４の何れか１項に記載のワクチン組成物であって、前記ＱＳ−２１の量が100μgである組成物。
【請求項１１】
請求項１〜４の何れか１項に記載の組成物であって前記ＱＳ−２１の量が200μgである組成物。
【請求項１２】
請求項１〜１１の何れか１項に記載のワクチン組成物を使用する方法であって、対象において、前記ガングリオシドに対する抗体の産生を刺激または増強するための、前記複合体の中に前記ガングリオシド誘導体が存在する薬学的組成物を製造するために使用する方法。
【請求項１３】
請求項１〜１１の何れか１項に記載のワクチン組成物を使用する方法であって、対象において、癌の再発を防止するための薬学的組成物を製造するために使用する方法。
【請求項１４】
請求項１〜１１の何れか１項に記載のワクチン組成物を使用する方法あって、対象において、癌を予防または治療するための薬学的組成物を製造するために使用する方法。
【請求項１５】
請求項１３または１４に記載の方法であって、前記癌が上皮起源である方法。
【請求項１６】
請求項１３または１４に記載の方法であって、前記癌が神経外胚葉起源である方法。
【請求項１７】
請求項１６に記載の方法であって、前記神経外胚葉起源の癌がメラノーマである方法。
【請求項１８】
請求項１２〜１４何れか１項に記載の方法であって、前記薬学的組成物が二以上の部位で投与される方法。
【請求項１９】
請求項１８に記載の方法であって、前記投与が三つの部位で行われる方法。
【請求項２０】
請求項１２〜１４の何れか１項に記載の方法であって、前記薬学的組成物が皮下で前記対象に投与される方法。
【請求項２１】
請求項２０に記載の方法であって、前記薬学的組成物が２週間の間隔で前記患者に投与される方法。
【請求項２２】
請求項２１に記載の方法であって、前記薬学的組成物が１週間の感覚で前記患者に投与される方法。
【請求項２３】
請求項１２〜１４の何れか１項に記載の方法であって、投与される前記薬学的組成物は、前記対象に投与する前に、前記複合体およびＱＳ−２１を混合することによって調製される方法。
【請求項２４】
請求項２３に記載の方法であって、前記複合体およびＱＳ−２１は、前記対象に投与する当日に混合される方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は、政府の補助金ＲＯ１・ＣＡ４０５３２号の支援の下になされたものである。従って、合衆国政府は本発明に関する一定の権利を有する。
〔発明の背景〕
ガングリオシドは、疎水性セラミドタンパクに結合した複雑な糖鎖部分で構成される糖スフィンゴミエリン脂質を含んだシアル酸である。その糖鎖部分は、細胞膜の外片（outer leaflet）に埋設された状態で、細胞外マトリックスに露出しされている。細胞の分化および増殖の際におけるガングリオシド組成の質的および量的変化が観察されており、これは神経外胚葉起源の癌の悪性転換の状態を反映すると思われる（Hakomori, 1985）。悪性メランノーマ細胞は、正常なメラニン細胞での主要なガングリオシドであるＧＭ３に加えて、種々の複雑なガングリオシド類を発現する（Carubia et al., 1984）。メラノーマにおけるガングリオシド代謝の変化は、更に、ＧＤ３，ＧＤ２，ＧＭ２，９−Ｏ−アセチル−ＧＤ３およびＧＴ３の発現を生じさせる（Hamilton et al.,1993 ; Tsuchida et al.,1987）。抗ＧＤ３モノクローナル抗体を用いた患者の治療によって、腫瘍部位での炎症が生じ、また時として転移の部分的な退行がみらることから、ガングリオシドが免疫攻撃の適切な標的であることが示唆される（Houghton et al.,1985）。メラノーマ患者由来のＧＤ３に反応するヒトＭＡｂの生成（Yamaguchi et al.,1987）は、ガングリオシドは同様に潜在的な免疫原であるとの考えを指示する。
能動免疫感作による、メラノーマ患者でのガングリオシドに対する体液性応答をの誘導を目的とした研究においては、ＧＭ２／ＧＢＣワクチンが最も有効であると思われた（Livingston et al.,1987; Livingston et al.,1989）。１２２人のメラノーマ患者（手術後の疾患のない患者）でのランダムな研究において、ＢＣＧのみで治療された患者６４人およびＧＭ２／ＧＢＣで治療された患者５８人のうち、ＧＭ２ワクチンを投与された大部分（８６％）が抗体を産生した。抗ＧＭ２抗体を産生した患者は、抗体陰性の患者よりも顕著に長い疾患なし状態および全体に亘る生存を示した。二つの実験群を比較すると、ＧＭ２／ＢＣＧワクチンを受けた患者は、ＢＣＧ対照群と比較したとき、疾患のない期間について１７％の改善および生存について９％の改善がみられたが、何れも統計的に有意ではなかった（Livingston et al.,1993a）。不都合なことに、免疫応答は持続期間が短く、殆どがＩｇＭであり、また中程度の力価を有する。これによって、ＧＭ２は、糖鎖抗原であることの結果として（Livingston et al.,1989）、またガングリオシド類はある種の正常組織に発現する自己抗原であることから（Hamilton ea al.,1989）、Ｔ細胞に依存しない抗原として認識されることを示唆した。患者にＧＤ２および９−Ｏ−アセチル−ＧＤ３ワクチンを用いた同様な方法は時として低力価をもたらし、ＧＤ３に対する抗体応答を検出できななかった（Livingston, 1991）。
新規な強いアジュバントは、幾つかの症例においてガングリオシドに対する免疫応答を増大することができたが、特に腫瘍関連ガングリオシドのような自己抗原については、異なった方法を利用しなければならなかった。ハプテン−キャリア複合体を用いたランドスタイナーの古典的実験（Landsteiner and Chase, 1942）に基づいて、免疫原性の乏しい抗原を免疫原性キャリアタンパクに結合することが、免疫応答を増強するために成功裡に用いられている。例えば、ガングリオシド以外の糖鎖に対する応答性は、適切なキャリアタンパクに結合することによって確立することができた。バクテリアの莢膜多糖類（capsular polysaccharides）を免疫原性タンパクに結合することによって、免疫応答および防御が顕著に増大することが示された（Eskola et al.,1990）。最近、キーホールリンペットヘモシアニン（Keyhole limpet hemocyanin）に結合された合成トンプソン−フリーデンライヒ腫瘍抗原（synthetic Tompson Friedenreich Tumor antigen）を用いて卵巣癌患者をワクチン接種することにより、体液性のＩｇＭおよびＩｇＧ応答が誘起された。これらの研究に共通した重要な発見は、短期のＩｇＭ応答から長期に亘る高親和性のＩｇＧ応答へのアイソタイプの切替えであり、これは糖鎖に対してＴ細胞依存性経路の活性化が生じ易いことを示している。この方法は、ガングリオシド−タンパク複合体ワクチンを合成し、また異なったＧＤ３−タンパク複合体のマウスにおける免疫原性を試験する方法を開発するために、メラノーマ腫瘍抗原ＧＤ３に適用される。
〔発明の概要〕
本発明は、ワクチンの投与対象において、ガングリオシドを認識する抗体の産生を刺激または増強するためのワクチンであって、前記対象における抗体の産生を刺激または増強するために効果的な量の、免疫原性タンパクに結合したガングリオシド又はそのオリゴ糖部分と、有効量のアジュバントと、薬剤的に許容可能な担体とを含有するワクチンを提供する。
本発明はまた、対象においてガングリオシドを認識する抗体の産生を刺激または増強する方法であって、前記対象に対して、ワクチンの投与対象においてガングリオシドを認識する抗体の産生を刺激または増強するために有効な量のワクチンを投与することを具備し、該ワクチンは、前記対象における抗体の産生を刺激または増強するために効果的な量の、免疫原性タンパクに結合したガングリオシド又はそのオリゴ糖部分と、有効量のアジュバントと、薬剤的に許容可能な担体とを含有する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
図  １：オゾン開裂および還元アミノ化の後の、ＧＤ３タンパク複合体の合成。挿入されている図は、開裂前（Ａ）および開裂後（Ｂ）のＧＤ３のＨＰＴＬＣを示している。
図２Ａおよび２Ｂ：
ＧＤ３−ＫＬＨ抗血清のＩｇＭ抗体（ａ）およびＩｇＧ抗体（ｂ）の経時変化。図の各記号はマウスを表す。
図３Ａおよび３Ｂ：
ＧＤ３−ＫＬＨでワクチン接種した後の、三つのマウス抗血清の免疫薄層クロマトグラフィー。ＩｇＧ抗体（ａ）およびＩｇＭ抗体（ｂ）の反応性を、Ａ，ヒト脳ガングリオシド、Ｂ，神経芽細胞腫、Ｃ，メラノーマガングリオシド、およびＤ，ＧＤ３抗原に対して試験した。
図  ４：免疫応答の特異性を示す、四匹の異なったマウスの免疫ブロット。純粋のガングリオシドをドットブロットし、マウス由来の血清とインキュベートした。
図  ５：メラノーマ細胞ラインＳＫ−ＭＥＬ−２８に対して試験された、ＧD3−ＫＬＨおよびＱＳ−２１を用いた免疫感作の前（３でのピーク）および後（５０でのピーク）の、マウス血清反応性の代表的なＦＡＣＳ分析
図６Ａおよび６Ｂ：
ＧＭ２−ＫＬＨ抗血清ＩｇＭ抗体（ａ）およびＩｇＧ（ｂ）抗体の経時変化。図の各記号は患者を表す。
図  ７：ドットブロット免疫染色による、ＧＭ２複合体ワクチン＋アジュバンドでワクチン接種した患者から得た血清中のＧＭ２抗体の検出。ガングリオシド標準をニトロセルロースのストリップ上にスポットし（垂直軸上に示した）、個々の患者から得たワクチン接種前血清およびピーク力価のワクチン接種後血清、並びにパーオキシダーゼで標識したヤギ抗ヒトＩｇＭ抗体またはＩｇＧ抗体と反応させた。ストリップは、０〜３＋の目盛り上で等級付けした。ＭＡｂ 696をＧＭ２の陽性対照として用いた。
図８Ａ−１および８Ａ２：
以前に発表された免疫薄層クロマトグラフィー（３，第三実験シリーズの参照文献）によって測定された、ＧＭ２−ＫＬＨ  ＋  ＱＳ−２１で免疫感作した患者由来のピーク血清力価の特異性。ＧＭ２（Ａ）およびメラノーマ組織ガングリオシド抽出物（Ｂ）をＴＬＣプレートに塗布し、個々の患者から得た血清と共にインキュベートし、パーオキシダーゼで標識したヤギ抗ヒトＩｇＭまたはＩｇＧ抗体で染色した。ＧＭ２の陽性対照およびガングリオシドのレゾルシノール染色の陽性対照として、ＭＡｂ 696を用いた。
図８Ｂ：ＧＭ２およびＧＤ２に対する患者血清のＩｇＧ反応性の阻害。ＧＭ２（Ａ）およびメラノーマ組織ガングリオシド抽出物（Ｂ）をＴＬＣプレートに塗布し、患者Ｎｏ．２から得た血清と共にインキュベートし、パーオキシダーゼで標識したヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体で染色した。免疫染色に先立って、1：50に希釈した３ｍｌの患者血清を、150μｇのＧＭ２または150μｇのＧＤ２と共に予備インキュベートした。
図９Ａおよび９Ｂ：
ＧＭ２−ＫＬＨプラスＱＳ−２１ワクチンでの免疫感作の後の、メラノーマ患者におけるＩｇＭおよびＩｇＧ抗体応答。100μｇのＱＳ−２１投与を受けた６人の患者についての連続的な結果が、図９Ａに示されており、また200μｇの投与を受けた６人の患者についての結果が図９Ｂに示されている。なお、各群において一人の患者は４回のワクチン接種のみを受け、病気が進行したため研究を中止した。図中の矢印は、シクロホスファミド（Ｃｙ）及びＧＭ２−ＫＬＨ  ＋  ＱＳ−２１ワクチンの注射を示している。
図１０Ａおよび１０Ｂ：
ＧＭ２−ＫＬＨでワクチン接種した患者１０人から得た血清を用いた、ドットブロット免疫染色によるＧＭ２の検出。ガングリオシド標準をニトロセルロースのストリップに塗布し（左側に示す）、先ず血清と共にインキュベートし、次いで洗浄した後に、パーオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＭまたはＩｇＧ抗体と共にインキュベートした。異なった量のＱＳ−２１（上段に示した）を投与された５群のうち、各群の患者２人の血清についての結果が示されている。各患者について、免疫感作前（ａ）および免疫感作後（ｂ）の血清が示されている。ネズミ・モノクローナル抗体６９６および３Ｆ８は、夫々ＧＭ２およびＧＤ２に対するＩｇＭ抗体およびＩｇＧ抗体である。ＧＭ１に対するＩｇＭ抗体は、ワクチン接種の前後における殆どの患者の血清中に検出された。これら患者の何れにおいても、ＧＭ２に対するＩｇＭ抗体およびＩｇＧ抗体は検出されなかった。ワクチン接種の後には、ＧＭ２に対するＩｇＭおよびＩｇＧ抗体が全ての患者の血清中で検出された。反応は０、１＋、２＋または３＋に等級付けされた。この試験についての反応等級の一例は次の通りである。患者１（100μｇＱＳ−２１）ＩｇＭ（免疫感作の前／後）について：  ＫＬＨ  １＋／２＋；
ＧＭ３  ０／０；  ＧＭ２  ０／３＋；
ＧＭ１  １＋／１＋；  ＧＤ３  ０／０；
ＧＤ２  ０／１＋；  ＧＤ１ｂ  ０／０。
図１１Ａおよび１１Ｂ：
ＧＭ２／ＢＣＧワクチンで免疫感作した後の、メラノーマ患者におけるＩｇＭ抗体応答。プロトコールの初めの４ケ月の間に治療された患者５人（Ａ群）と、プロトコールの終りの４ケ月の間に治療された患者５人（Ｂ群）についての連続的な結果。矢印は、シクロホスファミド（Ｃｙ）及びＧＭ２／ＢＣＧワクチンの注射を示している。
図１２：ＧＭ２／ＢＣＧワクチン接種された１０人のメラノーマ患者の血清における、ドットブロット免疫染色によるＧＭ２抗体の検出。ガングリオシド標準をニトロセルロースのストリップ上に塗布し（左側に示す）、先ず血清と共にインキュベートし、次いで洗浄した後に、パーオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＭ抗体と共にインキュベートした。ＧＭ２−ＭＥＬはメラノーマ生検サンプルから抽出された精製ＧＭ２を示し、ＧＭ２を含む他の全てのガングリオシドはウシ脳から誘導された。患者の番号（６〜５８）が示されており、各患者について、免疫感作の前（ａ）および後（ｂ）の血清が示されている。６９６および３Ｇ６は、夫々ＧＭ２およびＧＤ２に対するＩｇＭネズミ・モノクローナル抗体である。ＧＭ２抗体は、これら患者１０人から得たワクチン感作後の血清中で検出された。ＧＭ１抗体は、患者５３から得た治療前および治療後の血清、並びに患者５７の治療後の血清中にみられた。反応は、０、１＋、２＋または３＋に等級付けされた。反応等級の一例は次の通りである。患者８について：ＧＭ２  ３＋、ＧＭ２−ＭＥＬ  ２＋；患者５４：ＧＭ２  ３＋、ＧＭ２−ＭＥＬ  １＋；および患者５７：ＧＭ２３＋、ＧＭ２−ＭＥＬ  ３＋。ワクチン後の血清およびネズミ・モノクローナル抗体６９６についてみられた、ＧＭ２に比較したときのＧＭ２−ＭＥＬに対する低反応性は、ストリップに塗布されたＧＭ２−ＭＥＬガングリオシドの量が少ないことを反映している。
図１３：ワクチン接種後のＧＭ２抗体産生を有する患者の、疾患なし及び全体に亘る生存のカプラン−メイヤー（Kaplan-Meier）プロット。ＣＭ２反応性が、ａ）ＥＬＩＳＡ力価≧１／２０のドットブロットで２＋または３＋のとき、或いはｂ）ＥＬＩＳＡ力価≧１／８０のドットブロットで１＋であるときに、患者は陽性として分類された。
図１４：免疫感作の前にＧＭ２抗体を産生した６人の患者（ＢＣＧ接種群の５人と、ＧＭ２／ＢＣＧ接種群の１人）を除いて、ランダムにＢＣＧを受けた患者５９人およびランダムにＧＭ２／ＢＣＧを受けた患者５７人の、疾患なし及び全体の生存のカプラン−メイヤープロット。
図１５：ランダムにＢＣＧを受けた患者６４人およびランダムにＧＭ２／ＢＣＧを受けた患者５８人の、疾患なし及び全体の生存のカプラン−メイヤープロット。
図１６：ランダクニＧＭ２／ＢＣＧを受けたＧＭ２陰性患者５７人（□または■）と比較して、ランダムにＢＣＧを受けたＧＭ２抗体陰性患者５９人（△または▲）の疾患なしでの生存を示すカプラン−メイヤープロット。患者は二つの群、即ち、一つの陽性リンパ節を有する患者（△または□）および二以上の陽性リンパ節を有する患者（▲または■）に分けられた。
〔発明の詳細な説明〕
この出願を通して、括弧内に種々の文献が参照される。これら刊行物の開示は全体として、本発明が属する技術の状態をより完全に既述するために、参考としてこの出願の一部をなす。これら参照文献の略記による完全な引用は、請求の範囲の前の本明細書の末尾に列記されている。
本発明は、ワクチンの投与対象において、ガングリオシドを認識する抗体の産生を刺激または増強するためのワクチンであって、前記対象における抗体の産生を刺激または増強するために効果的な量の、免疫原性タンパクに結合したガングリオシド又はそのオリゴ糖部分と、有効量のアジュバントと、薬剤的に許容可能な担体とを含有するワクチンを提供する。
ガングリオシドのオリゴ糖部分は、ガングリオシドの開裂によって誘導してもよく、また直接に合成してもよい。ここで用いる免疫原性タンパクは、ガングリオシドまたはそのオリゴ糖部分と結合したときに、前記対象における抗体産生を刺激または増強するタンパクである。
本発明の一つの態様において、前記対象はヒトである。
本発明はまた、上記ワクチンにおいて、前記ガングリオシドまたはそのオリゴ糖部分がキーホールリンペットヘモシアニンまたはキーホールリンペットヘモシアニンの誘導体に結合されているワクチンを提供する。
キーホールリンペットヘモシアニンは周知のタンパクである。キーホールリンペットヘモシアニンの誘導体は、モノホスホリピドＡ若しくは非イオン性ブロック共重合体のような少なくとも一つの免疫学的アジュバントまたはサイトカインを、キーホールリンペットヘモシアニンに直接結合することによって生成され得る。サイトカイン類は、当業者に周知である。サイトカインの一例は、インターロイキン２である。当該技術では他のインターロイキン類が知られており、これらはキーホールリンペットヘモシアニンに結合されて、キーホールリンペットヘモシアニン誘導体を形成し得る。
上記ワクチンの一つの態様において、前記アジュバントはＱＳ−２１である。
本発明に適用し得る他のアジュバントが知られている。本発明に従って同様に使用し得る、ＱＳ−２１の同類またはＱＳ−２１様の化学物質が存在し得る。
本発明は更に、上記のワクチンにおいて、前記ガングリオシドがＧＭ２、ＧＭ３、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＤ３ラクトン、Ｏ−アセチルＧＤ３およびＧＴ３からなる群から選択されるワクチンを提供する。
本発明の好ましい一態様において、前記ガングリオシドはＧＭ２である。別の態様においては、前記ガングリオシドはＧＤ３である。更に別の態様においては、前記ガングリオシドはＧＤ２である。
異なった有効量の複合ガングリオシドまたはそのオリゴ糖部分が、本発明に従って使用され得る。この技術の当業者は、有効な免疫感作に必要な有効量を決定するために、単純な滴定実験を行うことができる。このような滴定実験の一例は、異なった量の複合ガングリオシドまたはその複合オリゴ糖部分を対象に注射し、次いで免疫応答を調べることである。
一つの態様において、複合ガングリオシドまたはその複合オリゴ糖部分の有効量は、約１μｇ〜約２００μｇの量である。
他の態様において、複合ガングリオシドまたはその複合オリゴ糖部分の有効量は、約５０μｇ〜約９０μｇの量である。一つの態様において、複合ガングリオシドまたはその複合オリゴ糖部分の有効量は、約７０μｇである。
別の態様において、複合ガングリオシドまたはその複合オリゴ糖部分の有効量は、約１μｇ〜約１０μｇである。より具体的な態様において、複合ガングリオシドまたはその複合オリゴ糖部分の有効量は、約７μｇ〜約１０μｇである。一つの態様において、複合ガングリオシドまたはその複合オリゴ糖部分の有効量は、約７μｇである。
更に、アジバントと有効量もまた同様に決定され得る。即ち、前記複合体と共に異なった量のアジバントを投与し、免疫応答を調べて、如何なる量が有効であるかを決定する。アジュバントとしてＱＳ−２１を用いるとき、ＱＳ−２１の有効量もまた同様に決定し得る。
好ましい態様において、ＱＳ−２１の有効量は約１０μｇ〜約２００μｇの量である。一つの態様では、ＱＳ−２１の有効量は約１００μｇである。他の態様においては、ＱＳ−２１の有効量は約２００μｇである。
本発明は更に、ワクチンの投与対象において、ガングリオシドを認識する抗体の産生を刺激または増強するためのワクチンであって、前記対象における抗体の産生を刺激または増強するために効果的な量の、免疫原性タンパクに結合したガングリオシド又はそのオリゴ糖部分と、有効量のアジュバントと、薬剤的に許容可能な担体とを含有するワクチンにおいて、前記対象は癌に冒されており、また当該ワクチンの投与に際して前記対象で産生される抗体は前記癌を効果的に治療するようなワクチンを提供する。
本発明はまた、ワクチンの投与対象において、ガングリオシドを認識する抗体の産生を刺激または増強するためのワクチンであって、前記対象における抗体の産生を刺激または増強するために効果的な量の、免疫原性タンパクに結合したガングリオシド又はそのオリゴ糖部分と、有効量のアジュバントと、薬剤的に許容可能な担体とを含有するワクチンにおいて、前記対象は癌に罹り易く、また当該ワクチンの投与に際して前記対象で産生される抗体は前記癌を効果的に予防するようなワクチンを提供する。
本発明は更に、癌のためのワクチンであって、癌細胞がその表面にガングリオシドを有するような癌のためのワクチンを提供する。
本発明はまた、癌のためのワクチンであって、ガングリオシドが癌のストロマ中に存在する癌のためのワクチンを提供する。
本発明は、上皮、中胚葉または神経外胚葉を起源とする癌のためのワクチンを提供する。上皮癌の例は、乳癌および子宮の子宮内膜癌である。中胚葉起源の癌の例は肉腫（サルコーマ）である。神経外胚葉気炎の癌の一例はメラノーマである。
本発明はまた、対象においてガングリオシドを認識する抗体の産生を刺激または増強する方法であって、前記対象に対して、ワクチンの投与対象におけるガングリオシドを認識する抗体の産生を刺激または増強するために有効な量のワクチンを投与することを具備し、該ワクチンは、前記対象における抗体の産生を刺激または増強するために効果的な量の、免疫原性タンパクに結合したガングリオシド又はそのオリゴ糖部分と、有効量のアジュバントと、薬剤的に許容可能な担体とを含有する方法を提供する。
上記方法の一態様において、前記ガングリオシドはＧＭ２である。
本発明は更に、癌に冒された対象において癌を治療する方法であって、前記対象に対して、ワクチンの投与対象においてガングリオシドを認識する抗体の産生を刺激または増強するために有効な量のワクチンを投与することを具備し、該ワクチンは、前記対象における抗体の産生を刺激または増強するために効果的な量の、免疫原性タンパクに結合したガングリオシド又はそのオリゴ糖部分と、有効量のアジュバントと、薬剤的に許容可能な担体とを含有する方法において、前記対象が癌に冒されており、また前記ワクチンの投与に際して前記対象で産生される抗体が前記癌を効果的に治療するような方法を提供する。
本発明は更に、癌に罹り易い対象において癌を予防する方法であって、前記対象に対して、ワクチンの投与対象においてガングリオシドを認識する抗体の産生を刺激または増強するために有効な量のワクチンを投与することを具備し、該ワクチンは、前記対象における抗体の産生を刺激または増強するために効果的な量の、免疫原性タンパクに結合したガングリオシド又はそのオリゴ糖部分と、有効量のアジュバントと、薬剤的に許容可能な担体とを含有する方法において、前記対象が癌に罹り易く、また前記ワクチンの投与に際して前記対象で産生される抗体が前記癌を効果的に予防するような方法を提供する。
本発明はまた、前記ガングリオシドまたはそのオリゴ糖部分がキーホールリンペットヘモシアニン又はキーホールリンペットヘモシアニン誘導体に結合されている、上記ワクチンを使用する方法を提供する。本発明は更に、前記アジュバントがＱＳ−２１である、上記ワクチンを使用する方法を提供する。
本発明は更に、上記ワクチンを癌の治療または予防のために使用する方法であって、前記癌の細胞がその表面にガングリオシドを有する方法を提供する。
本発明は更に、上記ワクチンを癌の治療または予防のために使用する方法であって、前記癌のストロマにガングリオシドが存在する方法を提供する。
本発明は更に、上記ワクチンを癌の治療または予防のために使用する方法であって、前記癌は上皮起源または神経外胚葉起源である方法を提供する。このような神経外胚葉起源の癌の一つはメラノーマである。
本発明の目的のために、「薬剤的に許容可能な担体」とは、標準的な薬剤担体の何れかを意味する。適切な担体は当該技術において周知であり、リン酸緩衝生理食塩水溶液、ポリソルブ８０（polysolb 80）を含有するリン酸緩衝生理食塩水、水、油／水エマルジョン等のエマルジョン、および種々のタイプの湿潤剤のような標準的な薬剤担体の何れかが含まれるが、これらに限定されるものではない。
本発明のワクチンは、皮膚内、皮下および筋肉内に投与され得る。また、当業者に周知の他の方法を用いてもよい。
好ましい態様において、本発明は、対象においてガングリオシドを認識する抗体の産生を刺激または増強するための方法であって、前記対象に対して、ワクチンの投与対象においてガングリオシドを認識する抗体の産生を刺激または増強するために有効な量のワクチンを投与することを具備し、該ワクチンは、前記対象における抗体の産生を刺激または増強するために効果的な量の、免疫原性タンパクに結合したガングリオシド又はそのオリゴ糖部分と、有効量のアジュバントと、薬剤的に許容可能な担体とを含有する方法において、前記投与は二以上の部位で有効量を投与することを具備した方法を提供する。特定の態様において、前記投与は三つの部位での投与を含む。
本発明は、以下の実験の詳細の内容を参照することによって更に良く理解されるであろう。しかし、以下で述べる特定の方法および結果は、後述の請求範囲により完全に記述される本発明の単なる例示であることを、当業者は容易に承認するであろう。
〔実験の詳細〕
第一実験シリーズ
ＧＤ３複合体ワクチンの増大した免疫原性：種々のキャリアタンパクの比較と、更なる試験のためのＧＤ３−ＫＬＨの選択。
腫瘍に関連したガングリオシド類は、癌に対する免疫攻撃の適切な標的として知られているが、これらは免疫原性に乏しい。能動的免疫感作は、持続時間の短い低力価のＩｇＭ抗体応答をもたらす。免疫原性の乏しい抗原を免疫原性タンパクに共有結合することは、液性応答を向上するための有力な方法である。悪性メラノーマの主要なガングリオシドであるＧＤ３が、二つの方法によってキャリアタンパクに結合された。第一の方法では、ＧＤ３オリゴ糖のグルコースによって結合されたが、これは抗原性の喪失をもたらし、ＧＤ３またはＧＤ３発現メラノーマ細胞と反応しない抗体の誘導をもたらした。第二の方法では、セラミド骨格中の二重結合をオゾン開裂することによってＧＤ３を化学修飾し、アルデヒド基を導入し、この基を還元的アミノ化によってタンパクのアミノリシル基に結合させた。この方法を利用することによって、マラリアＴ細胞エピトープの繰り返し、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）の外膜タンパク（ＯＭＰ）、陽イオン化ウシ血清アルブミン（ｃＢＳＡ）、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）およびポリリシンを表す合成多重抗原性ペプチドとの複合体を構築した。複合体の抗原性を種々の抗体との反応性によって確認し、免疫原性をマウスで試験した。免疫血清中の抗体レベルを、精製ガングリオシド上でのＥＬＩＳＡおよびドットブロット免疫染色によって分析した。更に、主要組織抽出物を用いた免疫薄層クロマトグラフィーによって、血清反応性の特異性を分析した。ＧＤ３複合体ワクチン、特にＧＤ３−ＫＬＨ複合体は、顕著に改善された抗体応答をもたらした。ＧＤ３に対する高力価のＩｇＭ応答およびＩｇＧ応答が誘導された。この方法は、他のガングリオシド類にも適用されて、ガングリオシドに富む種々のヒト癌に対するガンクリオシドワクチンの構築に適切であり得る。
＜材料および方法＞
ガングリオシド類：  ウシ脳から抽出されたＧＭ３、ＧＭ２およびＧＤ１ｂは、Fidia Research Laboratory（Abano Terme, Italy）から提供された。ＧＤ２は、ＧＤ１ｂをβガラクトシダーゼで処理することによって作成された（Cahan et al.,1982）。ＧＤ３（ｍｅｌ）はヒト・メラノーマ組織から単離され（Ritter et al.,1991）、ＧＤ３（ｂｂｍ）（ワクチン製剤に用いる）およびＧＴ３はウシ・バターミルクから単離されて、R. K. Yu博士（バージニア医科大学、リッチモンド、ＶＡ）の好意により提供された。ジシアリルラクトース（ＧＤ３オリゴ糖）は、以前に公表されたようにして（Nicolai et al.,1978）、ウシ初乳から単離された。
化学品類：  ＨＰＬＣシリカゲルプレートはＥ．メルク社（ダルムシュタット、ＦＲＧ）から；Sep-Pak C18カートリッジはウオーターズアッソシエイツ社（マイルドフォード、ＭＡ）から；４−クロロ−１−ナフトール、リン酸ｐ−ニトロフェニル二ナトリウム、シアノヒドロ硼酸ナトリウムはシグマケミカル社（セントルイス、ＭＯ）から；シクロホスファミド（Cytoxan）はミードジョンソン（Mead Johnson）社（サイラキュース（Syracuse）、ＮＹ）から；サポニンQuil A成分を含むＱＳ−２１はケンブリッジバイオテック者（ワーセスター、ＭＡ）から夫々入手した。
タンパク類：  ポリ−Ｌ−リシン臭化水素酸塩（MW（vis）3800）はシグマ社から；キーホールリンペットヘモシアニン、（ＫＬＨ）はカルバイオケム（Calbiochem）（ラジョラ、ＣＡ）から；cBSA-Imjectスーパーキャリア免疫調節剤はピアス社（ロックフォート、ＩＬ）から夫々入手し；髄膜炎菌外膜タンパク（ＯＭＰ）はM. S. Blake博士（ロックフェラー大学、ニューヨーク、ＮＹ）の好意により提供された。マラリアＴ細胞エピトープの４反復を含む多重抗原性エピトープ（ＭＡＰ）YAL-IV-294-Iは、J. P. Tam博士（ロックフェラー大学、ニューヨーク、ＮＹ）から贈呈された。
モノクローナル抗体：ＩＴＬＣ用の、西洋ワサビパーオキシダーゼに結合したウサギ抗マウス免疫グロブリンと；ＥＬＩＳＡ用の、アルカリホスファターゼに結合したウサギ抗マウスＩｇＭおよびＩｇＧとは、ザイメド（Zymed）社（サンフランシスコ、ＣＡ）から入手した。抗ＧＤ３・ｍＡｂであるＲ２４は文献に従って作成された（Houghton et al.,1985）。
血清学的分析：酵素結合免疫吸着試験（ＥＬＩＳＡ）は、以前に公表されているようにして行った（Liingston et al.,1989）。非特異的な「粘着」を制御するために、免疫血清は、同じ処理を行ったがガングリオシドを添加しなかったプレート上でも試験され、その読みをガングリオシドの存在下で得られた値から差し引いた。力価は、0.1以上の修正吸光度を生じる最も高い希釈度として定義された。高性能薄層クロマトグラフィー（ＨＰＴＬＣ）のシリカゲルガラスプレート上で分離した後に、以前に公表されているようにして（Hamilton et al.,1993）、モノクローナル抗体またはマウス血清を用いたガングリオシドの免疫染色を行った。プレートを溶媒１［クロロホルム／メタノール／水（0.25% ＣａＣｌ2）＝50:40:10（v/v）］または溶媒２［エタノール／ｎ−ブタノール／ピリジン／水／酢酸＝100:10:10:30:3（v/v）］中で現像し、レゾルシノール／ＨＣｌ試薬で同様に可視化した。
免疫感作：  ６週齢の雌BALB/c×C57BL76のＦ１マウス（ジャクソンラボラトリー、バーハバー、ＭＥ）に対して、最初の免疫感作の３日前にシクロホスファミド（15mg/kg）をi.p.注射し、これらをランダムに三つの治療群に分けた。４群および５群のマウスには、別段の指示がない限り、２週間隔で所定の三つのワクチンをs.c.注射した。夫々のワクチンは、0.1 ml PBS／マウスの合計容量中に、２０μｇのＧＤ３または１５μｇのジシアリルラクトースと、１０μｇのＱＳ−２１とを含んでいた。別段の指示がない限り、免疫感作の前および免疫感作の２週間後に、マウスは後眼窩洞（retro-orbital sinus）から脱血された。
ＧＤ３複合体の調製：  音波処理によってＧＤ３（２ｍｇ）をメタノール２ｍｌ中に溶解し、エタノール／ドライアイス浴中で−７８℃に冷却した。オゾン発生器内（Ｄｅｌインダストリーズ、San Luis Obispo、ＣＡ）でオゾンを発生させ、激しく撹拌しながら３０分間サンプルに通した（Criegee, 1957; Wiegandt and Baschang, 1965）。１０分間に亘って過剰のオゾンを窒素で置換した。１００μｌのＳ（ＣＨ3）2を添加し（Pappas et al.,1966）た後、サンプルを−７８℃で３０分間保持し、次いで激しく撹拌しながら室温で９０分間保持した。サンプルを窒素気流下で乾燥し、ＨＰＴＬＣによってモニターした。この乾燥サンプルに２ｍｌのｎ−ヘキサンを添加することによって長鎖アルデヒドを分離し、続いて５分間の音波処理を行い、2000Ｇで１５分間遠心した。ｎ−ヘキサンを注意深く抜き取って捨て、サンプルを窒素気流下で乾燥した。Ｃ１８逆相カラム（10×250 mm、Rainin Instruments、リッジフィールド、ＮＪ）を用いることにより、開裂したＧＤ３および本来のＧＤ３をＨＰＴＬＣ（ウオーターズ社、システム501、マイルドフォード、ＭＡ）で分離した。ガングリオシドをメタノールで溶出し、214 nmでモニターし、画分をＨＰＴＬＣで同様に分析した。開裂したＧＤ３を含む画分を合わせ、ロタベーパ（rotavapor）（Buch、スイス国）を用いて３７℃で蒸発させた。開裂したＧＤ３、ＢＰＳ中のタンパクキャリアおよび２ｍｇのシアノヒドロ硼酸ナトリウムを、温和に撹拌しながら３７℃で４８時間インキュベートした。１６時間後、更に１ｍｇのＮａＣＮＢＨ3を添加した。カップリングの進行をＨＰＴＬＣ上でモニターした。溶媒１および溶媒２中において、ＧＤ３−タンパク複合体は移動せず、元の位置でレゾルシノール陽性の一つのバンドとして現れた。この混合物を、各４ｌのＰＢＳを３回交換しながら４℃で４８時間、1000 MWCO透析チューブを通して透析した。また、未結合のＧＤ３を最終的に精製するために、エクストラクティゲル洗浄剤除去ゲル（Extractigel detergent removal gel）（ピアス社）に通した。このサンプルを凍結乾燥し、そのタンパク含量およびガングリオシド含量を、バイオラッド社のタンパク試験およびノイラミン酸測定（Svennerholm, 1957）によって測定した。
以前公表されているようにして（Nicolai et al.,1978）、ジシアリルラクトースをウシ初乳から単離した。還元的アミノ化（Gray, 1974）により糖鎖がタンパクに結合され、１０ｍｇのジシアリルラクトースが、３７℃で１４日間、２ｍｌのＰＢＳ中で２ｍｇのタンパクと共にインキュベートされた。シアノヒドロ硼酸ナトリウムを初めに２ｍｇ加え、更に３日毎に１ｍｇを追加して添加した。溶媒２の中でのＨＰＴＬＣによってカップリングをモニターした。このジシアリルラクトース複合体を1000 MWCO膜を介しての透析によって精製し、続いて凍結乾燥した。タンパク含量およびノイラミン酸含量を上記のようにして測定した。ジシアリルラクトースはまた、文献記載の方法（Roy and Laferriere, 1990）に従ってタンパクに結合された。この方法を行うに際し、先ずオリゴ糖のＮ−アクロロイル化されたグリコピラノシルアミン誘導体が形成され、続いてマイケル付加によりタンパクのアミノ基に結合された。精製、並びにタンパクおよびノイラミン酸の測定は上記のようにして行った。
ＩｇＧサプクラスの測定：  ＩｇＧサブクラスの測定は、サブクラス特異的な二次ＭＡｂ類を用いたＥＬＩＳＡによって行なった。二次ＭＡｂ類は、前血清または陰性対象血清との反応性を示さない最低希釈で用いた。ヤギ抗マウス抗体に結合されたアルカリホスファターゼを、1:200の希釈度で、三次抗体として用いた。
マウス抗血清のＦＡＣＳ分析：  ＰＢＳ中の0.1％ＥＤＴＡで処理し、２６1/2ゲージの針を通した後に、メラノーマ細胞ラインであるＳＫ−ＭＥＬ−２８の単一の細胞懸濁液が得られた。細胞（３×１０5）を、４０ｍｌの1:20希釈した免疫感作前または免疫感作後の血清と共に、氷上で３０分間インキュベートした。この細胞を、ＰＢＳ中の３％子ウシ血清で３回洗浄した。二次抗体として、希釈（1:50）フルオレセインイソチオシアネートで標識したヤギ抗マウスＩｇＧ（サザンバイオテクノロジーアソシエーツ社、バーミンガム、ＡＬ）３０μｌを添加し、続いて氷上で３０分間インキュベートした。細胞を上記のようにして３回洗浄し、ＰＢＳ中の３％子ウシ血清500μｌに再懸濁し、フローサイトメトリー（ＦＡＣスキャン、ベクトン・ディッキンソン社、San Jose、ＣＡ）によって分析した。
＜結果＞
ウシ・バターミルクからのＧＤ３を、オゾンを用いて、セラミドタンパク中のＣ４−Ｃ５二重結合で選択的に開裂させた。メタノール中において、メトキシパーオキシドはジメチルサルファイトで容易に還元される中間体生成物であると思われる。この開裂の結果物は、セラミド部分における先の二重結合の位置にアルデヒド官能基を有し、長鎖アルデヒドが脱離したＧＤ３誘導体であった（図１）。成功裡に開裂したＧＤ３は本来のＧＤ３よりも下に移動し、同時に開裂した不飽和脂肪酸に起因して、ＨＰＴＬＣ上では二重バンドとして現れる（図１に挿入されたＨＰＴＬＣを参照のこと）。ＨＰＴＬＣのデンシトメータによる測定によって、ウシ・バターミルクから単離されたＧＤ３の７０％超が開裂されたことが明らかになった。最初の実験のオゾン処理時間を延長しても、この比率は変化せず、これはこの供給源に由来するＧＤ３の−３０％がスフィンガニンまたはフィトスフィンゴシン類縁体からなることを示した。使用したＧＤ３の量に依存して、ＧＤ３の開裂は−７８℃で１時間の反応時間が最適であることが分かった。開裂されたＧＤ３は、酸性および中性のリン酸緩衝液中で７２時間に亘ってのみ存在するが、複生成物の量は増大する。β−脱離反応のために、ＧＤ３のオリゴ糖部分の放出は、塩基性ｐＨで容易に起きると先に公表されているように（Wiegandt and Baschang, 1965）、時間と共に増大した。ＧＤ３から放出された糖鎖部分は、溶媒１中では移動しなかったが、オリゴ糖の分離に用いた溶媒２中では、ウシから単離されたジシアリルラクトースと共に移動した（図示せず）。開裂したＧＤ３は、本来のＧＤ３に比較して疎水性が減少するので、Ｃ１８逆相カラム上でのＨＰＬＣによる分離が可能であった。メタノールでのアイソクラチック溶出を用いることにより、タンパクを伴う開裂したＧＤ３は、修飾されたガングリオシドおよびｅ−アミノリシル基との間でシッフ塩基を形成した。これらはシアノヒドロ硼酸ナトリウムを用いることにより還元されて（Borch et al.,1971）、ガングリオシドとタンパクとの間の安定な二級アミン結合を形成した。ｐＨ＝6.5-7.5のリン酸緩衝液中において、この還元剤は選択的であり、アルデヒド基は還元されなかった。この反応をＨＰＴＬＣによってモニターしたところ、開裂したＧＤ３と元の位置に現れるレゾルシノール陽性バンドとの間の比率の変化がみられた。このバンドによって、新たな糖複合体（neo-glycoconjugates）の形成が示された。この反応は、３７℃で４８時間インキュベートした後に正規に完結された。ジシアリルラクトースは透析によって容易に除去され、過剰の開裂されたＧＤ３は洗浄剤除去カラムを通すことによって容易に除去された。カップリングの程度は、シアル酸およびタンパクの測定によって決定された。複合体におけるＧＤ３のタンパクに対する重量比は、異なったタンパクにおけるリシン基の接近可能性に依存した。タンパクに結合したＧＤ３の全体の平均収率は、３０％であった。
ＧＤ３の糖鎖部分、即ち、ジシアリルラクトースは、二つの異なった方法を用いてタンパクに結合された。ジシアリルラクトースの結合は還元的アミノ化によって行われ、タンパクに結合したグルコースの開環形をもたらした（Gray et al.,1978）。この方法は、オリゴ糖をタンパクと共に長期間のインキュベーションを行うこと必要とし、収率は２０％未満であった。第二のオリゴ糖複合体形成方法（Roy and Laferriere, 1990）では、タンパクに結合した閉館した末端グルコースが生じた。
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ＧＤ３−タンパク複合体ワクチンをワクチン接種した後の、ＧＤ３に対する血清学的応答：
免疫感作前の血清は、ＧＤ３とのＩｇＭ反応またはＩｇＧ反応を示さなかった。２０μｇのＧＤ３のみで、又は１０μｇのアジュバントＱＳ−２１と混合したもので免疫感作を行なったときは、ＧＤ３抗体を誘導することはできなかった（表１）。タンパクに結合した２０μｇのＧＤ３に１０μｇのＱＳ−２１を加えたもので免疫感作したマウスの幾つかの群は、ＧＤ３に対する免疫応答の増大を示した。ＧＤ３−ポリ−Ｌ−リジン複合体（高密度のＧＤ３エピトープを表す）は、中程度の力価のＩｇＭ応答（1/20 - 1/320の範囲）を誘導したが、ＩｇＧ応答を誘導しなかった。髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）の該膜タンパクに結合されたＧＤ３（ＧＤ３−ＯＭＰ）もまた、中程度の力価のＩｇＭ（1/20 - 1/320の範囲）を誘導し、低力価のＩｇＧ（1/2- - 1/80の範囲）を誘導した。１匹のマウスのみが、ＧＤ３−ＯＭＰで免疫感作した後、1/1280の高力価のＩｇＭ応答と、1/2560の高力価のＩｇＧ応答を示した。陽イオン化ＢＳＡに結合されたＧＤ３（ＧＤ３−ｃＢＳＡ）は、ＥＬＩＳＡによって、低力価のＩｇＭ（1/20 -1/80の範囲）および高力価のＩｇＧ（1/20 - 1/2560の範囲）を示した。マラリアＴ細胞エピトープを含む合成ＭＡＰペプチドは、そのアミノ末端に８つの遊離アミノ基を与え、その４つはＧＤ３に結合することができた。ＧＤ３−ＭＡＰは低力価のＩｇＭ（1/20 -1/160の範囲）を誘導し、１匹のマウスのみが1/40の低力価のＩｇＧ応答を生じさせた。ＫＬＨに結合されたＧＤ３（ＧＤ３−ＫＬＨは、他の複合体に比較して最も高い応答を誘導し、最も高い力価のＩｇＭ応答（1/20 -1/2560の範囲）と最も高い力価のＩｇＧ応答（1/40 -1/10240の範囲）を有していた。両タイプのジシアリルラクトース・タンパク複合体で免疫感作した場合には、ＧＤ３ガングリオシドと交差反応する低力価のＩｇＭ応答（1/20 - 1/160の範囲）のみが誘導され、有意なＩｇＧ応答は誘導されなかった。
免疫薄層クロマトグラフィーによるＧＤ３反応性血清の特異性：
免疫薄層クロマトグラフィー（ＩＴＬＣ）は、ヒト組織ガングリオシド抽出物に対するＧＤ３抗血清の試験を可能とし、また腫瘍に由来するガングリオシドの特異性を測定することを可能とする。ヒト組織抽出物、並びにＧＤ３−ＫＬＨ複合体での免疫感作によって誘導された高力価のＩｇＭおよびＩｇＧ血清とを用いたＩＴＬＣの例が、図３ａおよび３ｂに示されている。血清は、1/150の希釈度で、ウシ・バターミルクから単離された免疫原のＧＤ３（ｂｂｍ）に対してと同様に、ヒト脳、神経芽細胞腫およびメラノーマのガングリオシド抽出物に対して試験された。ＩＴＬＣ上での反応性は、これら組織に存在する全ガングリオシド組成を示すレゾルシノール染色されたＨＰＬＣと比較された。正常な脳はＧＭ１、ＧＤ１ａ、ＧＤ１ｂおよびＧＴ１ｂを主に含んでいるのに対して、神経芽細胞腫の抽出物は更に、ＧＤ２およびＧＭ２を主要なガングリオシドとして含んでおり、またメラノーマ抽出物は主にＧＭ３およびＧＤ３を含んでいる。ＩｇＧ抗血清は、対照ｍＡｂ・Ｒ２４と同様に、試験した三つの全ての組織においてＧＤ３とのみ特異的な反応性を示した（図３ａ）。一方、ＩｇＭ抗血清（図３ｂ）は、脳抽出物における構造的に関連したガングリオシド類およびサフファチドとの交差反応性を示した。他のＧＤ３複合体でのワクチン接種により誘導された免疫応答は、同じ特異的反応性を示したが、反応が弱く、より高濃度の抗血清を用いなければならなかった（図示せず）。ＧＤ３−ｃＢＳＡで免疫感作されたマウスにおいてＥＬＩＳＡにより同定された高力価の抗血清は、ＩＴＬＣによって高いバックグラウンドを示した。これら血清と共に種々のブロッキング剤が用いられたが、成功しなかった。組織抽出物にいて、ＧＤ３との特異的反応性は検出されなかった。
ドット・ブロット免疫染色による、ＧＤ３反応性血清の特異性：
ウシの脳またはバターミルクから単離された精製ガングリオシド類であるＧＭ３、ＧＤ２、ＧＤ１ｂ、ＧＤ３およびＧＴ３、並びにヒト・メラノーマ組織から単離されたＧＤ３を用いて、全ての高力価ＩｇＭ高血清および高力価ＩｇＧ高血清（ＥＬＩＳＡ＞ 1/160）の特異性を研究した。これらの構造的に関連したガングリオシド類を、同じ量でニトロセルロースのストリップ上にスポットし、免疫血清と反応させた。ＧＤ３−ＫＬＨおよびＧＤ３−ＯＭＰでマウスを免疫感作する前および後に得られた血清を用いた、ドットブロット免疫染色実験のサンプルが図４に示されている。免疫感作前の血清は、これらガングリオシド類とは何等の反応性も示さなかった。ＧＤ３−ＫＬＨでの免疫感作後に得られた血清は、ヒト・メラノーマ組織から単離されたＧＤ３と同様、ウシ・バターミルク由来のＧＤ３（免疫原）との特異的なＩｇＭおよびＩｇＧ反応性を示した。幾つかの場合においては、ＧＴ３との交差反応性が見られ、反応は陽性対照ｍＡｂ・Ｒ２４でも観察された（Houghton et al.,1985）ＧＤ３−ｃＢＳＡで免疫感作されたマウス由来の高力価血清は、バックグラウンド反応性のみを示し、何れのガングリオシド類に対しても特異的反応性は検出されなかった（図示せず）。他のＧＤ３複合体によって誘導されたドットブロット反応性は、ＧＤ３に対して特異的であった（図示せず）。これらの結果は、ＧＤ３−タンパク複合体を用いることにより、マウスにおいて、特異的な高力価のＩｇＭおよびＩｇＧ応答が誘導され得ること、並びにＧＤ３−ＫＬＨ複合体を用いて最も強い反応性が誘導されたことを示している。この複合体形成法は、ＧＤ３−オリゴ糖鎖上の重要なエピトープを保存するようであり、ＧＤ３−複合体類は構造的に関連したガングリオシド類との交差反応性を誘導しなかった。
ＦＡＣＳ分析によって測定された、免疫血清の細胞表面反応性：
メラノーマ細胞ラインＳＫ−ＭＥＬ−２８の細胞（細胞表面ＧD3を発現することが知られている細胞ライン）への結合について、マウス由来の血清を試験した。フルオレセインイソチオシアネートで標識した二次ヤギ抗マウス抗体を用いたＦＡＣＳ分析の代表的な例が、図５に示されている。ＧD3−ＫＨＬおよびＱＳ−２１による免疫感作の前および後の血清が試験された。免疫感作前の血清では標的細胞の８％が染色され、免疫感作後の血清では９２％が染色された。
＜考察＞
ここでは、１）異なる腫瘍ガングリオシド類に適用可能な、タンパクとの結合反応を確立するため、２）メラノーマに関連した主要なガングリオシドであるＧＤ３の免疫原性を増大するために、および３）最も効果的なタンパクキャリアを決定するために、ガングリオシド複合体ワクチンを構築するための方法が記載される。ガングリオシド複合体は、免疫ドメインの糖鎖部分を変更することなく達成されなければならない。ＧＤ３をその糖鎖部分で修飾すること、例えばカルボキシル基をアミド基に変換することによって、その合成抗原の免疫原性は増大されるが、本来のＧＤ３と交差反応する有意な抗体応答は生じないことが示されている（Ritter et al.,1990b）。その結果、本発明のアプローチでは、糖鎖部分を変更することなく、そのセラミド部分を介してＧＤ３を結合することを目的とした。全てのガングリオシド類に特徴的なセラミドは、オゾンによってスフィンゴシン塩基のＣ４位置で開裂され、機能的なアルデヒド基が導入された。タンパクへの結合は、還元的アミノ化によって実施され、ガングリオシドとタンパクのε−アミノリシル基との間に安定なアミン結合が形成された。オゾン分解によるガングリオシド類の開裂および引き続く結合は未だ公表されておらず、またガングリオシドのアルデヒド中間体が介在し得るように思われた。フラグメンテーションが報告されており、アルカリ性条件下での水酸イオンの攻撃によって開始されると、二重結合の移動が生じ、β−脱離によってオリゴ糖部分の放出が生じるように思われる（Kanfer and Hakomori, 1983; Wiegandt and Baschang, 1965）。アルデヒド官能基は中性ｐＨで十分に安定であり、タンパクのアミノ基とのシッフ塩基が容易に形成され、β−脱離は僅かしか起こらないことが見出された。全体の収率は３０％であり、これはガングリオシドのリソ誘導体類（lyso-derivatives）への変換について記述されたもの（Neuenhofer et al., 1985）と比肩し得るほどに効率的であった。ＧＤ３のアルデヒド誘導体は、免疫薄層クロマトグラフィー（ＩＴＬＣ）上において、ｍＡｂ・Ｒ２４とは何等反応しなかった。同様の現象が、ｍＡｂ・Ｍ2590のＧＭ３との反応性との関係で既に記述されており、また反応性はアシル鎖の長さに依存した（Itonori et al., 1989）。他方、ＧＤ３−タンパク複合体は、ＩＴＬＣおよびウエスタンブロットによりｍＡｂ・Ｒ２４との反応性を示し、これによりＧＤ３の新しい糖複合体（neoglykoconjugate）において免疫優勢エピトープが保存されたことが示された。
ガングリオシドワクチンを生成させるための結合方法が確立されれば、適切な担体タンパクを選択しなければならなかった。Lowell et al.（1988）は、バクｋｔエリア糖鎖およびペプチド抗原を、合成の疎水性フット（foot）を介して、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）の外膜タンパク（ＯＭＰ）中に複合化することによって、高力価の抗体応答を誘導する上手なワクチン系を説明し、更にアジュバントを追加しなくとも効果的である（Donnelly, 1991）。このシステムは、その両親媒性によって、ガングリオシドに直接適用可能であった。先の実験で、出願人は、疎水性相互作用によってガングリオシド類をこれらのタンパクに吸収させ、高力価のＩｇＭ応答を誘導することができた（Livingston et al.,1993b）。共有結合が用いられたが、ＧＤ３−ＯＭＰ複合体は偶然のＩｇＧ応答のみを誘導し、ＩｇＭ応答はＧＤ３を結合しない先の試みの結果を越えることはなかった。タンパク抗原に対する強い免疫調節剤であることが報告されている（Apple et al.,1988）陽イオン化ＢＳＡは、複合化した後に、免疫原性の乏しいタンパクに対する特異的免疫反応を増大することができた。ＧＤ３−ｃＢＳＡ複合体は、中程度のＩｇＭ応答のみを誘導したが、ＥＬＩＳＡによって高力価のＩｇＧ抗体が分析された。ＩＴＬＣまたはドットブロット免疫染色によるこれら高力価高血清の更なる試験によって、これらの応答がＧＤ３に対して特異的でないことが示された。ワクチンを構築するための別の魅力的な方法は、多重抗原エピトープ系（ＭＡＰ）として、J. Tam et al.（Tam, 1988; Tam and Lu, 1989）によって公表されている。オリゴマー分枝したシジンコアに基づいて、ＭＡＰｓはＢ細胞エピトープおよびＴ細胞エピトープを含む４または８の樹状ペプチドアームからなっている。これら構築物を用いると、Ｂ細胞エピトープまたはＴ細胞エピトープのみを有するペプチド類に比較して、ペプチド類に対する免疫応答は劇的に増大する。ＧＤ３がマラリアＴ細胞エピトープを含むＭＡＰ構造のアミノ末端に結合されると、ＧＤ３に対する中程度のＩｇＭ応答のみが検出され、ＩｇＧ応答は検出されなかった。この方法は、合成ペプチドについては非常に効果的であるが、ガングリオシドワクチンのためには僅かな使用価値しかないと思われる。抗ガングリオシド抗体は、それらの細胞表面密度が異なるので、腫瘍由来のＧＭ３と正常組織のＧＭ３とを区別することができる（Nores et al., 1987）。ポリリジンに対するＧＤ３の結合は、単一分子に結合した高密度のＧＤ３エピトープを表すと考えられている。ＧＤ３−ポリリジンに対する応答は中程度であり、中間の力価のＩｇＭ応答のみが検出可能で、ＩｇＧ応答は検出できなかった。最後に、キーホールリンペットヘモシアニンに結合したＧＤ３、即ちＣＤ３−ＫＬＨで免疫感作されたマウスは、最高力価のＩｇＭ応答およびＩｇＧ応答を生じることができ、これは以前のワクチンによって生じる応答よりも顕著に高かった。
これら血清は、免疫染色試験によって試験したときに、ヒト組織抽出物中のＧＤ３に対して高度に特異的であることが見出された。ＩｇＭ免疫応答の経時実験によって、以前の試験で観察されたのと同様の特徴が示された（図２）。二週間間隔で投与されたとき、第三回のワクチン接種の後にＩｇＭのピーク力価が得られた。この応答は迅速に減衰し、連続的にワクチン接種をしても抗体応答における顕著な追加免疫効果は誘導されなかった。本発明は、ガングリオシドワクチンを用いて高力価のＩｇＧ応答を誘導したことを示した初めての報告である。この応答はＩｇＭ応答よりも著しく長く持続し、また連続的なワクチン接種によって増強されたが、タンパク抗原についてしばしば見られる指数関数的な応答の増強に匹敵するものではなかった。サブクラスは主にＩｇＧ１と決定されたが、ガングリオシド複合体ワクチンによってＴ細胞依存性経路が活性化されたか否かは明らかではない。Ｂ細胞の成熟にいてＴ細胞の補助が重要であることに疑いはないが、抗体クラスの関係については議論のあるところであり、幾つかの報告はＴヘルパー細胞活性でアイソタイプの切替えが可能であることを示している（Teale and Abraham, 1987）。ＧＤ３のオリゴ糖部分を単独で含有する複合体は、ｍＡｂ・Ｒ２４と反応せず、またＧＤ３ガングリオシドに対して顕著な免疫応答を誘導できないことが見出された。複合化の際のガングリオシド鎖の還元末端でのグルコースの修飾、およびセラミドの喪失部分は、適性なエピトープ呈示および免疫系による検出に影響を与え得る。複合化に用いた二つの方法は何れも効率が低く、収率も低かった。患者において、低効率のワクチンを用いた腫瘍関連ガングリオシドに対する特異的な免疫応答は、既に免疫応答を誘導し、また良好な予後に関連していた。ガングリオシド複合体ワクチンは、マウスにおいて長期間持続する特異的なＩｇＧ応答を誘導する能力を示し、これによって、特にＣＤ３−ＫＬＨ複合体は、メラノーマ患者における腫瘍ワクチンとしての有用性が間もなく立証されるであろうことを示唆した。
第二実験シリーズ
メラノーマ患者内の免疫学的アジュバントＱＳ−２１のフェーズＩ試験は、ＫＬＨに共有結合敵に結合されたガングリオシドＧＭ２でワクチン接種した。
目的：ＧＭ２に対する抗体を誘導するための免疫学的アジュバントの最適安全投与量を決定すること。
＜背景＞
ＡＪＣＣステージIIIメラノーマを有する患者は、２年での再発率および３年での死亡率が６０〜７０％である（Hilal et al. 1981; Eilber et al. 1976）。外科手術後の疾患のないステージIVメラノーマを有する患者では、より不吉な予後となる。外科手術後のステージIIIメラノーマの標準的な治療は、診断と密接である。
メラノーマを有する幾人かの患者は、該患者の血清内に高度に制限されたメラノサイト分化抗原との反応が示される抗体を有する。幾つかの場合には、このような抗体の存在が予期しない優れた経路に関連することが示される（Livingston et al., 1987）。僅かな患者のみがこれらの抗体を血清中に有しているので、関連抗原を含有するメラノーマワクチンで患者を免疫することによって抗体生成を誘導する試みがなされる。全細胞から調製されたワクチンは、このことについて効果がない（Livingston et al., 1982）。全メラノーマ細胞よりも精製された抗原をワクチンの調製のために今回提供した。最近の完全な試験では、患者は、ＢＣＧ−ＧＭ２でワクチン接種され、短命のＩｇＭ抗体産生が４４人の患者のうち３３人にみられた（Livingston et al. 1989）が、ＩｇＧ抗体応答は滅多にみられなかった。
ＧＭ２のようなガングリオシドの免疫原生を増加するための強力なアジュバント若しくは他のアプローチ、特にＩｇＧ応答を誘導するためのアプローチが、探求され続けている。キーホールリンペットヘモシアニンに共有結合することが、マウス内でガングリオシドに応答するＩｇＧを誘導することに最も有効であることが見出された。これに対する根拠は、部分免疫寛容の概念である。免疫学的寛容性の研究およびこれを回避するための方法の研究は、種々の実験系において、Ｔ細胞非応答性がより迅速に誘導されること、およびＢ細胞非応答性よりも容易に維持されることを示している（Romball et al. 1984; Weight, 1977）。Ｔ細胞寛容性を維持するのに適切な抗原を循環するレベルは、しばしばＢ細胞を維持しない。従って、Ｔ細胞の助けが（例えば、所望の免疫源に共有結合的に結合したＫＬＨのような強力な不適切な抗原によって）提供される場合、抗体は、許容されたＴ細胞依存性抗原に対して誘導されうる。このアプローチは、実験動物内の種々の糖鎖抗原に対して（Kundu et al. 1980; Gray 1978; Chang and Rittenberg, 1981; Longenecker et al., 1987）、および最近では、幼児のＨ．インフルエンザ多糖抗原に対して、ＩｇＧ抗体を誘導するためにうまく使用されている。
ＫＬＨの分子量は、かなり変化しうるが、おおむね２×１０6ダルトンである。遅延型過敏性（ＤＴＨ）を誘導するために、これを幾人かの研究者が、１mgの投与量で患者に皮内的に注射した。パイロジェンフリーのＫＬＨがBiomira Inc. （Edomonton, Canada）によって調製され、高いエピトープ濃度（density）（１０００／１）でＧＭ２に共有結合的に結合された。マウス内で、免疫学的アジュバントと混合されたこれらの調製物を使用してＧＭ２に対して応答する高力価のＩｇＧを誘導した。
Ｔ抗原−ＫＬＨのようなＫＬＨ−複合体ワクチンを用いた前臨床研究において試験された免疫学的アジュバントの内では、ＱＳ−２１が最も効果的であった。１／４０００を越えるＩｇＧ抗体力価および強いＤＴＨがほとんどのマウスでみられた。Ｔ−ＫＬＨ単独ではＤＴＨを伴わない１／１６０の中間の力価であった。ＱＳ−２１は、南米の木、キラジャサポナリアモリナ（Quillaja saponaria Molina）の皮から抽出された糖鎖である。一連のこれらのサポニンに対する単糖組成、分子量、アジュバントの効果および毒性が開示されている（Kensil et al. 1991）。ＱＳ−２１をそのアジュバント活性と毒性のなさによって選択した。これは、無毒であり、ねこのＦｅＬＶサブニットワクチン（Marciani et al.）およびアカゲザルのＨＩＶ−１組換えワクチンの免疫原生を増大するのに非常に効果的であることが証明されている。
加えて、メラノーマを有する幾人かの患者は、免疫化を妨害しうる抑制細胞を有し、これらの細胞が低投与量のシクロホスファミドによって阻害されうることが示されるので（Livingston et al., 1987b）、各患者には、最初のワクチン接種に先立って低投与量のシクロホスファミドが投与される。この組み合わせアプローチは、実験動物およびメラノーマ患者の糖脂質および他の抗原の免疫原生を増加することが見出されている（Livingston et al. 1987a; Livingston et al., 1989）。
分布試験
外科切除後２から８カ月後に、非常に危険なＡＪＣＣステージIIIまたはIVの悪性メラノーマを有する患者であって、その病理学的断層がメモリアルホスピタルの病理学分門で再検査され、臨床的に疾患がない患者が望ましいであろう。該患者は、８０＞の目的達成状況を有し（Karnofsky）、少なくとも５年の（患者のメラノーマは別として）期待した生存をしなければならない。妊娠した女性、シーフードに対してアレルギーを持った患者、およびクレアチン若しくはビリルビン＞２．０を持った患者は除かれた。患者は、あらかじめ放射線治療、化学療法、または免疫治療をうけた（ワクチン接種前８週間で完了する）。
治療評価
患者は、メモリアルホスピタルで詳細な身体検査を行い、治療の三週間以内に、胸部Ｘ−線、ＣＢＣ、血清クレアチニンおよび肝臓機能検査を受けた。異常なＬＴＦ若しくは胸部Ｘ−線の結果を有する患者は、更なる試験（即ち、ＣＴＴ、断層写真等）がメラノーマのないことを示せば、容認した。
ワクチンの調製
化学的性質と製造
医薬品
名称と由来
固有名称：
ＧＭ２−ＫＬＨ  合成腫瘍関連糖複合体（glycoconjugate）（Ｓ−ＴＡＧ）−活性な特異的免疫治療に使用される。
ＧＭ２−ＨＳＡ  合成腫瘍関連糖複合体（Ｓ−ＴＡＧ）−ＧＭ２−ＫＬＨで活性な特異的免疫治療を受ける患者の皮膚試験に使用される。
化学的名称：
113NeuAc-GgOse3Cer-キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）
実験室コード：
ＧＭ２−ＫＬＨ  ロット＃５
ＧＭ２−ＨＳＡ  ロット＃１
製造元：Biomira Inc. Research Center One, Edmonton Reseach and Development Park, 9411-20 Avenue Edmonton, Alberta T6N1E5 Canada.
ＧＭ２ハプテンの調製に使用される材料
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複合体形成過程において使用される材料
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＜発生の化学（DEVELOPMENT CHEMISTRY）＞
ＧＭ２およびＧＭ２アルデヒドのデータ：
ＧＭ２およびＧＭ２アルデヒドの構造は、1Ｈ  ＮＭＲスペクトル、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、ＦＡＢ−ＭＡＳおよびＦＴ−ＩＲでBiomira Inc.によって特徴づけられた。
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構造データ
1H（DMSO-d6:D2）δ:9.84（d, 1H, J=2.0Hz）, 4.79（d, 1H, J=8.5Hz, III-1）, 4.26（d, 1H, J=8.0Hz, II-1）, 4.19（d, 1H, J=8.0Hz, I-1）, 2.54（dd, 1H, A-3e）, 1.88（s, 3H, Ac）, 1.78（s, 3H, Ac）, 0.85（t, 3H, J=6.6Hz, CH3）.
FT-IR（KBrキャスト，cm-1）:3439,3420,2952,2923,2851,1634,1070（おそらくgem-ジオール）。
ＴＬＣ  Ｒｆ＝０．５（5:4:1 CHCl3-CH3OH-0.2%CaCl2水溶液）
ＫＬＨ、ＧＭ２−ＫＬＨ、ＨＳＡおよびＧＭ２−ＨＳＡのデータ：
キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）は、多数のより小さな分子量のサブユニットから構成される大きな錯体タンパク質である。ＫＬＨはキーホールリンペット軟体動物（Megathura crenulata）から抽出され、精製される。ＫＬＨ、ＨＳＡおよび複合体は、セファロース  ＣＬ−４Ｂゲル濾過クロマトグラフィー、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、およびレゾルシノール−塩酸比色法（color metric resorcinol-hydrochloride method）（１）でBiomira Inc.によって特徴づけられている。
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１．L. Svennerholm, Bichimca et Biophysica Acta, 24, （1957）, 604-611.
２．セファロースＣＬ−４Ｂゲル濾過法を用いて、完全なＫＬＨタンパク質分子を、ボイド（void）に溶出した。
ＫＬＨの分子量が＞２×１０6であることを示すカラムの容積。この値は、このタンパク質に対して文献で与えられている重量の範囲と一致している。
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ＧＭ２−ＫＬＨ複合体の製造方法
ＡＳＩのためのＧＭ２−ＫＬＨ半合成糖複合体および皮膚試験のためのＧＭ２−ＨＳＡ半合成糖複合体の製造を５ステージで行った。
１．入手したＧＭ２（ウシ由来）（化合物＃１）の精製
２．キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）の精製
３．ＧＭ２アルデヒド（化合物＃２）の合成
４．ＫＬＨへのＧＭ２ハプテンの複合体形成
５．複合体の透析濾過
ステージ１：ＧＭ２（化合物＃１）の精製：
名称：          ＧＭ２ガングリオシド
記号化した名称：II3NeuAc-GgOse3Cer
FIDIAから供給された出発物質、ＧＭ２ガングリオシド（ウシ由来）のサンプルをウイルス試験に供した（８ＣＦＲプロトコール）。全てのガラス製品を蒸留したアセトン、次いで蒸留したエタノールで洗浄し、次に使用前に１８時間過剰乾燥させた（overdrive）（１３０℃）。６５：３５  クロロホルム：メタノールを溶媒として用い７５ psi（ＳＳＩモデル３００Ｌｏポンプ）で、シリカゲル（３０．５ｇ、Kieselgel60H、Art 7736、E. Merck）のカラム（Michel-Miller S795-10）を詰めた。ＧＭ２を、６５：３５  クロロホルム−メタノールの濃溶液として塗布し、溶出をこの溶媒、次いで５：３５：４  クロロホルム−メタノール−水で行った。フラクションをＴＬＣによって分析した（Ｒｆ０．６、５：４：１  クロロホルム−メタノール−０．２％ＣａＣｌ3水溶液）。ＧＭ２を含有するフラクションを集め、エバポレートし、クリーム色をした白色のアモルファス状固体を得た。
この材料（化合物１）に対する製造過程試験には、1Ｈ  ＮＭＲおよび薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）が含まれ、このガングリオシドの同一性（identity）と純度を確認した。製造過程試験の結果は、発生化学ので列挙した特性を満たさなければならない。この材料が不純であれば、上記精製を繰り返す。
ステージ２：無菌でパイロジェンフリーのキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）の調製
ＫＬＨの調製
クラス１００の生物学的に安全なキャビネット内でこの全手順を行った。Calbiochemから供給されたキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）を、１００mLの無菌でパイロジェンフリーのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳＰ  ｐＨ７．５）に溶解した。この溶液を２〜６℃で１８時間インキュベートし、ＫＬＨを溶液に溶解させた。次にこの溶液を２００rpmで３０分間スピンさせた。上清を集め、このサンプルをセファロースＣＬ−４Ｂゲルカラムにかけ、未加工のＫＬＨの分子量プロフィールを決定した。
ＫＬＨの透析に先立って、アミコン撹拌された限外濾過細胞を、ＫＬＨを最初に注射用無菌水（ＷＦＩ）で４回軽く洗浄し、次いで９５％エタノールでこれを満たし、更にこれを２時間撹拌することによって無菌でパイロジェンフリーにした。このユニットをＷＦＩ水で再度軽く洗浄し、次いで加圧滅菌処理した。
ＫＬＨを含有する上清を、ＹＭ３０（３０，０００の分子量を排除する）フィルターを備えた無菌でパイロジェンフリーの４００mLアミコン透析濾過ユニットにあけた。次に、ＫＬＨの全容積を無菌でパイロジェンフリー、またはパイロジェン含量の低いバッファーで順次３５０mLにした。
１．１つをＰＢＳ  ｐＨ７．５（無菌、パイロジェンフリー）で完全に交換した。
２．３つをトリス−ＨＣｌ、ＥＤＴＡ  ｐＨ７．６５（無菌、低いパイロジェン含量）で完全に交換した。
３．２つを０．５％のデオキシコール酸（ＤＯＣ）を含有するトリス−ＨＣｌ、ＥＤＴＡ  ｐＨ７．７５（無菌、低いパイロジェン含量）で完全に交換した。
４．４つをトリス−ＨＣｌ、ＥＤＴＡ  ｐＨ７．７５（無菌、低いパイロジェン含量）で完全に交換した。
５．３つをＰＢＳ  ｐＨ７．５（無菌、パイロジェンフリー）で完全に交換した。
各バッファーの交換は、アミコンユニット内の容積を５０mL以下に下げ、次いでバッファーを添加して該容積を３５０mLに戻すことよりなる。（無菌でパイロジェンフリーのＰＢＳを、１８０〜１８５℃で４．５時間ベーキングした化学物質を用いて調製した。該化学物質を注射用の無菌水（ＷＦＩ）に加え、無菌でパイロジェンフリーの容器内で混合した。化学物質または他のバッファーがこのような極端な温度で溶けてしまうことにより、これらからパイロジェンを除去するためにベーキングすることができない場合は、これらのバッファーを無菌でパイロジェンフリーの容器内で無菌のＷＦＩ水中で調製し、０．２２μｍのフィルターで無菌濾過する。ＰＢＳとトリス−ＨＣｌバッファーのｐＨを無菌でパイロジェンフリーの２Ｎ  水酸化ナトリウムを用いて必要なｐＨに調整した。
トリス、ＥＤＴＡ  ｐＨ７．７５バッファー内のＤＯＣは、ＫＬＨタンパク質がアミコンユニット（８．９）に保持される間に、パイロジェンをフィルターを通過するこれらの低分子量の８つのサブユニットに分解するために供給される。
ＫＬＨ溶液をアミコンユニットから無菌で除去し、２０００rpmで３０分間再度スピンさせた。次にこの溶液を、無菌でパイロジェンフリーの目盛りのついたシリンダーに移し、無菌でパイロジェンフリーのＰＢＳ  ｐＨ７．５で最終容積を７５mLに調節した。
次に上清を０．２２μｍの低タンパク質結合性フィルターを用いて無菌で濾過した。ＫＬＨのサンプルをセファロースＣＬ−４Ｂカラムにかけ、未処理のＫＬＨの最初のカラムクロマトグラフィーの結果と比較してバッファー（特にＤＯＣ）でのＫＬＨ処理が、ＫＬＨの分子量プロフィールに影響するかどうかを決定した。このプロフィールは実質的に変化するべきではない。ＫＬＨを分割してとり、BioRadタンパク質アッセイを、標準曲線用のＫＬＨを用いて行った。ＫＬＨ溶液の最終濃度を、無菌でパイロジェンフリーのＰＢＳ  ７．５で最終タンパク質濃度が１０mg/mLとなるように無菌で調節した。
ＬＡＬ試験を行い、精製したＫＬＨに存在するパイロジェンのレベルを決定した。パイロジェンの含量は、複合体形成過程で使用されうるＫＬＨに対して１０EU/mg以下にしなければならない。
等電点電気泳動（ＩＥＦ）を行い、ＫＬＨの純度と同一性をチェックした。ＫＬＨの以前のロットを、基準として並列に等電点電気泳動（ＩＥＦ）にかけた。
ＫＬＨを無菌でパイロジェンフリーの３０mL血清バイアルに１０mLのアリコートとして分配し、無菌でパイロジェンフリーのブチルストッパーで蓋をした。次に、ＫＬＨを、ハプテンと複合体を形成させるときまで、−２０±５℃で凍結した。
ステージ３：ＧＭ２アルデヒド（gem−ジオールのアルデヒド、化合物＃２）の合成
すべてのガラス製品を蒸留したメタノールで軽く洗浄し、使用する前に１８時間過剰乾燥（１３０℃）した。精製したＧＭ２ガングリオシド（化合物＃１）（４０mg）の蒸留したメタノール（１０mL）溶液を−１５℃（ドライアイス−エタノール）で撹拌し、オゾンガス（Orec 03V10-0オゾン発生器）をこの溶液に７分間通した。次に、反応をＴＬＣ（５：４：１  クロロホルム−メタノール−０．２％ＣａＣｌ2水）でチェックする間、アルゴンの気流をこの溶液に通した。次に溶媒を減圧下に除去し、生じた物質を蒸留したメタノールに溶解した。この溶液にメチルスルフィド（２００mL）を加え、反応混合物を室温で１時間撹拌した。次に溶媒を除去し、残渣をエチルエーテル（４×２５mL）で粉末化した。得られた白色固体（化合物＃２）を真空下で１５分乾燥し、残った何れかの溶媒を除去し、次いで引き続きの複合体形成ステップで直接に使用した。
得られたアルデヒド（化合物＃２）が不安定な性質であるので、化合物＃２はＴＬＣのみによるごく普通の操作を基準にして同定した。典型的なＴＬＣでは、一般に少量のスフィンガニンまたはファイトスフィンゴシンのアナローグ（化合物＃１と同じＲｆである）および少量の還元糖（Ｒｆ０．３２）の存在が示される。
ステージ４：ＫＬＨへのＧＭ２ハプテンの複合体形成
すべての操作はクラス１００の生物学的に安全なキャビネット内で行った。
各々１０mLの凍結した無菌でパイロジェンフリーのＫＬＨ（１０mg/mL）を含有する２つのバイアルを、使用する直前に室温で解凍した。
ＫＬＨタンパク質（１６mL）を無菌で計量し、凍結乾燥されたＧＭ２ハプテンと磁気撹拌棒を含有したフラスコに加えた。この溶液を穏やかに室温で、すべてのハプテンが溶液になるまで３分間撹拌した。
ナトリウムシアノボロハイドライド（NaBH3CN）（４０mg）をハプテン／ＫＬＨ溶液に加え、次いでフラスコを無菌のフィルター針を備えたストッパーで密封した。この溶液を穏やかに振蘯し、次いで室温で一夜インキュベートした。次にこの溶液を更に４０℃で４日間インキュベートした。
ステージ５：糖複合体（ＧＭ２−ＫＬＨ）の透析濾過：
ハプテン／ＫＬＨ反応バイアルの内容物を、無菌でパイロジェンフリーのＹＭ−３０フィルターを備えたアミコン限外濾過ユニットに無菌で移した。濾過された窒素を、アミコンユニットに１６psiの操作圧をかけるために使用した。次に複合体を、以下の無菌でパイロジェンフリーまたはパイロジェン含量の低いバッファーに対して順次透析濾過した。
１．２つをＰＢＳ  ｐＨ７．５（無菌、パイロジェンフリー）で完全に交換した。
２．２つをトリス−ＨＣｌ、ＥＤＴＡ  ｐＨ７．７５（無菌、低いパイロジェン含量）で完全に交換した。
３．２つを０．５％のデオキシコール酸（ＤＯＣ）を含有するトリス−ＨＣｌ、ＥＤＴＡ  ｐＨ７．７５（無菌、低いパイロジェン含量）で完全に交換した。
４．４つをトリス−ＨＣｌ、ＥＤＴＡ  ｐＨ７．７５（無菌、低いパイロジェン含量）で完全に交換した。
５．３つをｐＢＳ  ｐＨ７．５（無菌、パイロジェンフリー）で完全に交換した。
次に糖複合体を濾過ユニットから無菌で除去し、２００rpmで３０分スピンさせた。次に、上清を０．０２μｍの低タンパク質結合フィルターで無菌濾過した。
糖複合体のサンプルを得、以下の製造過程ＱＣ試験を行った。
１．セファロースゲル濾過
２．等電点電気泳動（ＩＥＦ）
３．BioRadタンパク質アッセイ
タンパク質アッセイの結果を基にして、糖複合体の最終容積を、無菌でパイロジェンフリーｐＨ７．５で調整し、１mg/mLのタンパク濃度を得た。
クラス１００の生物学的に安全なキャビネット内で、最終の糖複合体を、赤色のラバーストッパーをつけた１mLの無菌でパイロジェンフリーの透明なホウ硅酸塩血清バイアルに０．１mLのオーバーフィル容積（overfill volume）を伴って０．５mLアリコートで分注し、−２０℃で凍結した。充填工程の間に、２種類の血液寒天プレートを最低３０分間フード内の作業領域近辺の空気にさらすことによって充填領域内の空気をモニターした。次にこれらのプレートを３７℃のインキュベータに移し、１〜２日インキュベートした。次にプレートを何れかのバクテリアまたは菌類のコロニーに対して試験した。
バイアルを生成物名、ロット番号およびバイアルの数を記したラベルをつけ、箱の中に置いた。次に、この箱を密封し、同じ情報を持ったラベルをこの密封された箱の外側に貼った。次に、この箱を、これが標識されうるまで１〜２日、冷蔵庫内の隔離室（Quarantine）に置いた。最終のＱＣ試験が一度行われると、ラベルが要求される。製品が製造者によってラベルされ、次いでこのラベル付けが品質管理部または管理業務部で確認される。次に最終生成物のファイルは、管理業務の管理者によって、並びに免疫治療部門の副社長および最高業務執行責任者によってサインされる。次に製品がリリースされ、「リリースされた生成物」の冷凍庫内で−２０℃で保存される。
ＧＭ２−ＫＬＨおよびＧＭ２−ＨＳＡの各ロットに以下の最終品質管理試験を行った。
１．酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）
２．ＬＡＬパイロジェン試験
３．BioRadタンパク質試験
４．レゾルシノール−ＨＣｌ糖鎖試験
５．ウサギパイロジェン試験
６．一般安全性試験
７．無菌試験
８．シアニドに対する不純物試験
ＧＭ２−ＫＬＨはBiomira Inc.（Edmonton, Alberta）で調製され、米国食品医薬品局の治験新薬として使用された。ＧＭ２／ＫＬＨモル比は８００／１（実質（actual）：２００〜１４００）であり、複合体は、０．５mlのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）あたり０．５７mgの複合体の濃度で供給される。これは、０．５mlのＰＢＳあたり約７０ugのＧＭ２ガングリオシドと５００ugのＫＬＨに相当する。最初の５回の免疫処置のためのワクチン接種の当日では、０．５mlが各シリンジに置かれ、投与のためにクリニックに運ばれる。これは、７０ugのＧＭ２投与量に相当し、ＧＭ２と種々のアジュバントを用いた先の研究で効果が見出された投与量である。最後（６番目）の免疫処置はこの投与量の半分、即ち３５ugのＧＭ２および２５０のＫＬＨを含有する。
ＱＳ−２１は、先に開示されているように（１６）、シリカおよび逆相クロマトグラフィーによって、Cambridge Bioscience Inc.（Worcester, MA）によってキラジャサポナリアモリナの木皮から抽出された。精製されたＧＭ２−ＫＬＨ複合体およびＱＳ−２１を、細菌学研究室で標準の培養技術によって無菌性について、ウサギ内での発熱性（pyrogenicity）について、およびウサギとマウスでの安全性について試験した。これらをアリコートに分割し、−１５℃から−２５℃で保存した。ワクチン接種の当日、５７０ugのＧＭ２−ＫＬＨ（または第６番目のワクチン接種では２８５ug）をＱＳ−２１と混合し、個々のシリンジに置き、ラベルし、クリニックに運んだ。
１０、５０、１００および２００ugを各々ＰＢＳで０．２５mlの全容積に希釈した、ＱＳ−２１の４投与量を使用した。第一の３患者のグループには、１０ugのＱＳ−２１を含有する６種のワクチンを接種し、次の３患者には、５０ugのＱＳ−２１、次の３患者には１００ugのＱＳ−２１、そして最後の３患者には２００ugのＱＳ−２１を含有する６種のワクチンを接種した。患者は、先の投与を受けた３患者がすべて少なくとも２回のワクチン接種を受けるまで、次の投与には参加させない。２００ugの投与量でも毒性が全くみられず、ＧＭ２抗原とＫＬＨに対する免疫反応性が５０〜２００ugの範囲で安定水準に達しないならば、そのときは更に３患者を４００ugの投与量で処理しうる。一度、安全な投与量および最大免疫原生投与量が定義されたら、抗体応答をより明確にするために追加の６患者を免疫する。
ＧＭ２−ＫＬＨプラスＱＳ−２１を使用するための治験新薬はＭＳＫＣＣによって保管される。
治療
最初の免疫処置前の３から５日に２００mg／M2のシクロホスファミドをIVで投与した。これは、出願人が過去のワクチン試験で好結果で使用した投与量とスケジュールである。次に、すべての公知の疾患の外科的切除後２から３０週で開始して、４回のワクチン接種を２週間の間隔を置いて皮下的に投与した。２回の追加のワクチン接種を２カ月の間隔を置いて投与した。
評価
血清学的応答：この試験の最初の終点は血清学的な応答である。末梢血（３０ml）を各ワクチン接種の直後および４、５および６回のワクチン接種後の２週および５週で採取した。この後、ＧＭ２に対する抗体が検出され続ける限り、血液を３ヶ月の間隔で採取しうる。４、５および６回目のワクチン接種後２週間で得られた全ての患者からの血清を、ＧＭ２および関連ガングリオシドに対する抗体に対してＥＬＩＳＡで試験した。特異的に反応する種々のガングリオシドについてＥＬＩＳＡおよび免疫薄層クロマトグラフィーで示される１／８０またはそれ以上の力価を有する患者は、血清学的な応答者であるとみなされ、血清学的な応答者からの追加の血清をワクチン接種に対する抗体応答をより明確にするために試験した。出願人が高い力価のＩｇＧ抗ＧＭ２抗体誘導の証拠を見る場合には、クローンレベルでＧＭ２に対する免疫応答を試験するために、４回目のワクチン接種後２週間で追加の６０mlの末梢血を得た。
ＥＢＶ−形質転換されたリンパ芽球細胞からの上清および引き続き産生されたハイブリドーマをこの目的に使用した。
遅延型過敏性応答：ＫＬＨ、ＧＭ２およびヒト血清アルブミンに結合されたＧＭ２に対する遅延型過敏性応答の皮膚試験を５回目の免疫処置の時に行った。４８時間で５mm以上の硬化を示した反応が陽性とみなされ、ＧＭ２に対して反応した場合には、種々のガングリオシドを用いた皮膚試験で更に試験を行う。
治療経路：患者を４回および６回目のワクチン接種の時にメモリアルホスピタルで評価し、胸部Ｘ線およびスクリーニングプロフィールを６回目のワクチン接種の時に行った。追加のおよび引き続きの追跡調査を他の腫瘍学者が行った。
治療の停止のための基準
局所治療（手術または病変内注射）により通常通りに治療された局所的な再発は、患者に疾患がない場合には、治療の停止の理由とはならない。治療は、患者が系統的な治療または放射線治療を必要とする再発性の疾患を発生させた場合に停止される。
統計的な考察
これは、ワクチン接種後のＧＭ２およびＫＬＨに対する毒性とＩｇＧ応答の評価で先に考察したフェーズＩである。三人の患者に４種の増加した投与量で各ＱＳ−２１の投与量においてワクチン接種した。ＩｇＧ応答が継続し、個々の増加した量に従って増加するならば、僅かにグレードＩの全身性またはグレード２の局所性の毒性を生じる最も高い投与量が選択され、毒性が見られなければ、５回の投与量が試験される。マウスでの研究を基にして、ＩｇＧは、２回または３回の投与量の後、ピークまたは安定水準状態まで応答することが期待される。一度、安全な投与量範囲および免疫原生投与量範囲が定義されると、３〜６の追加の患者を、ほとんど免疫原生を現す投与量並びに次により高い投与量およびより低い投与量で免疫し、これらの投与量での毒性と免疫原生の程度の信頼性を増加させる。
危険率
ＧＭ２−ＫＬＨ：ＧＭ２に起因する毒性は、２００ugのＧＭ２を含有するワクチンで治療した１００人を越える患者に関して、全く観測されなかった。ＫＬＨは免疫するために１mgの投与量を使用し、毒性のない５０人の患者に関して免疫状態を試験した（１５）。１８人の患者を、ＧＭ２−ＫＬＨを含有するワクチンで免疫した。一人の患者が痛み、およびＧＭ２−ＫＬＨに起因する４８時間永続するワクチン部位での圧痛、おそらくはＫＬＨに対する遅延型過敏症を経験した。投与量の希釈は全く必要なかった。唯一予想されたＧＭ２−ＫＬＨの副反応は、数日間永続するワクチン接種部位での炎症である。正常な働きを制限する約３８℃の熱または重篤な局所的毒性が起こる場合は、以後のワクチン接種においてＧＭ２−ＫＬＨの投与量を３のファクターによって減少することができる。
サポニンはヒトには使用されない。これらは溶血性であることが知られているが、ＱＳ−２１フラクションが、マウス、猫およびアカゲザルにつき１２５ug程度の高さの投与量では明らかに毒性を有していないことが示されているので、これが選択された。Ｍ2およびkgを基にして、これは、ここで目的とした最大投与量の１０００倍である。
ワクチンの成分または皮膚試験抗原に対する自己免疫または過敏性反応は、理論上は存在するが、可能性は僅かである。
毒性に対する基準：毒性は、国立癌研究所（ＮＣＩ）によって開発された一般的な毒性基準（Common Toxicity Criteria）に従って等級付けした。これらの基準はＩＲＢに整理保管されている。
研究の意義
癌に対する免疫応答の意義の拡大が、２つの基本的なアプローチ、即ち癌の免疫治療における過去および現在の努力の大部分をなす非特異的免疫強化、および癌の治療には実際には評価されていないが、感染症のコントロールには非常に貢献する特異的免疫処置によって試みられうる。これは、感染に対して有効な特異的免疫処置の開発を可能にする細菌抗原の知識である。一方、ヒト癌抗原に対する知識の欠如が、癌に関連した特異的免疫処置の調査を妨げており、従って、目的の癌の抗原性の制限されたワクチンを使用し、癌患者のこれらの免疫原生を示して特異的免疫処置を調査するべきである。メラノーマ細胞表面抗原を同定することの最近の進歩は、特異的免疫処置の研究を可能にする。
＜結果＞
ＧＭ２−ＫＬＨをＱＳ−２１を用いたフェーズＩ試験で抗原として使用した。全ての公知の疾患の外科的切除の後、疾患のないＡＪＣＣステージIIIおよびIVのメラノーマ患者を、５００ugのＧＭ２−ＫＬＨ（ＧＭ２／ＫＬＨ比２００〜１４００／１、ＧＭ２投与量７０ug）と１０、５０、１００または２００ugのＱＳ−２１を用いて、３患者ごとのグループで免疫処置した。全ての患者は、全部で６回の免疫処置を受ける。１０または５０ugのＱＳ−２１の投与量については毒性はなかった。１００ugの投与量でも適切に耐性があるが、この投与量で治療された３患者の各々は、６回のワクチン接種の少なくとも１回で２４〜４８時間診断しうるしこりと圧痛を起こし、これらの患者の２人は６回の免疫処置の２回でこれを起こした。全身性の副反応は全く検出されなかった。ワクチン当たり２００ugで治療された３患者は、２〜１０日間持続する注射位置での圧痛と痛み、および問題とならない程度の熱と、穏和な頭痛を含むインフルエンザに見出される兆候、並びにほとんどのワクチン接種後に８〜２４時間続く広汎性の痛みおよび苦痛を経験した。これらの１２人の患者のＧＭ２およびＫＬＨに対する血清学的応答は、表２の下部にまとめられている。２００ugの投与量での毒性が、実際に最大許容投与量ではないが、これは重大な毒性であり、これが１００ugの投与量に比較して増加したアジュバント活性に関連するという証拠はない。追加の９人の患者を、３人ごとに５０、１００または２００ugの投与量で、これらの毒性および免疫原生の結果を確認するためにあまねく免疫処置した。ＧＭ２−ＫＬＨと１００ugまたは２００ugのＱＳ−２１を投与された６患者のＩｇＧおよびＩｇＧ力価を図６に示した。ＧＭ２−ＫＬＨプラスＱＳ−２１（１００ug）は、すばらしい免疫原生ワクチンであり、力価およびＩｇＭおよびＩｇＧ抗原の持続の両方に関してＧＭ２／ＢＣＧまたはＧＭ２−ＫＬＨプラスＤＥＴＯＸ若しくはＢＣＧよりも遥かに優れている。
ＧＭ２−ＫＬＨおよびＧＤ３−ＫＬＨプラスＱＳ−２１のワクチンは、先のガングリオシド／ＢＣＧワクチンよりも免疫原生が有意に高いことが示されているので、これらの新たな複合体ワクチン内のＧＤ２、ＧＤ３、およびＧＤ３ラクトンの免疫原生を臨床で試験するであろう。メラノーマの免疫源としてこれらのガングリオシドを選択することの根拠は、メラノーマおよび種々の正常組織のこれらのガングリオシドのレベルを定量するための免疫薄層クロマトグラフィーを用いた２０のメラノーマ生検の定量分析である。
６から１２のメラノーマ患者を、調製され、ＫＬＨに共有結合的に結合されたこれらガングリオシド複合体の各々でワクチン接種する。次に、これらの予備研究で免疫源であることが示された複合体を貯蔵し、再生率および生存率に関して免疫源多価メラノーマガングリオシドワクチンの悪影響を決定することを意図した大規模な多施設での試験の前段階として１２の患者の追加のグループで試験した。
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第３実験系
悪性メラノーマでは、しばしば、細胞表面ガングリオシドＧＭ２、ＧＤ２およびＧＤ３が過剰発現する。出願人は、既に、メラノーマ患者をＧＭ２およびＢＣＧで免疫することによりほとんどの患者でＩｇＭ抗体応答が誘発され、高力価ＧＭ２抗体を有する患者の生存が高まることを示している。（Ｔ依存性の）炭水化物抗原で普通に見られるように、ＩｇＭ応答は短命であり、ＩｇＧ応答は希にしか観察されない。抗原性を増加させるために、出願人はＧＭ２をキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）と共有結合的に結合させた。ＧＭ２−ＫＬＨワクチンを３種のアジュバント−ＢＣＧ、ＤＥＴＯＸまたはＱＳ−21のうちの１種と共に与えた。これにより、力価がより高く、より長期間持続するＩｇＭ  ＧＭ２抗体応答および一貫したＩｇＧ応答（イソタイプＩｇＧ１およびＩｇＧ３）が誘発された。また、最も力価が高い抗ＫＬＨ応答も誘発された。この結果は、複合体ＧＭ２−ＫＬＨプラスＱＳ−21ワクチンがＴ細胞の有意の助力を引き出したことを示唆する。深刻な毒性は見られないので、このワクチンによるアプローチは、ＧＤ２およびＧＤ３のような他のガングリオシドの免疫原性の増加およびメラノーマの過程に対するガングリオシド抗体の効果の決定に魅力的である。加えて、ＱＳ−21がＧＭ２−ＫＬＨの免疫原性を有意に増加させたという知見は、それが、多くは現在アジュバントなしで用いられている他の複合体ワクチンに対して同様に作用するであろうことを示唆している。
序論
悪性転換のプロセスにおいて発生する変化の１つは、悪性メラノーマを含む特定の型のガンにおける細胞表面ガングリオシド発現のパターンの変化である（１）。正常メラノサイトでは、ＧＭ33が優勢ガングリオシドである。ＧＤ３、ＧＭ２、ＧＤ1aおよびＧＤ1bを含む他のガングリオシドは全体の１０％未満を構成するにすぎない。悪性メラノーマにおいては、グリコシル化酵素を活性化することによりＧＤ３、ＧＤ２、ＧＭ２および9-0-アセチルＧＤ３の発現が増加する（３、４）。これらの過剰発現したガングリオシドは、ガングリオシドワクチンを用いる活性免疫化を含む免疫療法の誘引標的である。悪性メラノーマ患者におけるＧＭ２ワクチンに関わる一連の研究において、出願人は、（シクロホスファミドの低量投与の後に、アジュバントとしてのＢＣＧと共に）ワクチン接種することにより、ほとんどの患者でＧＭ２に対するＩｇＭ抗体が誘発され（５）、高力価ＧＭ２抗体を産生する患者では疾患なしの期間および生存が拡大することを示している（６、７）。しかしながら、誘発されたＧＭ２に対する抗体応答は、Ｔ−依存性応答（ＩｇＭ優勢、短い持続期間、一貫性のないＩｇＧ応答、追加免疫効果の欠如）の特徴を有し、他のメラノーマガングリオシド、ＧＤ３およびＧＤ２は、同様に投与された場合、免疫原性を示さない（８）。関連エピトープが炭水化物なので、出願人は、バクテリア感染に対する炭水化物ワクチンの開発の成功により示唆される、免疫原性を増加させるアプローチを調べた。出願人は、マウスにおいて、キーホールリンペットヘモシアニンと共有結合させることによりＧＤ３の免疫原性が著しく増加し、ＧＤ３−ＫＬＨ複合体およびアジュバントＱＳ−21で免疫されたマウスが高力価１ｇＭ応答を示し、続いて強く長時間持続するＩｇＧ応答を示すことを示した（９）。出願人は今や臨床でのガングリオシド複合体ワクチンの試験を開始しており、悪性メラノーマ患者をＧＭ２−ＫＬＨ複合体ワクチンで免疫した初期の結果をここに報告する。
材料および方法
患者
最近４か月以内に転移性の疾患に全く罹患していないのであれば、悪性メラノーマ・ステージIIIの患者が適当であると考えられた。事前に化学療法または放射線治療を受けた患者はいなかった。
ワクチン調製および投与
ＧＭ２−ＫＬＨワクチン：ＧＭ２−ＫＬＨ複合体は、従前にＧＤ３−ＫＬＨ複合体ワクチンについて記述されている（９）ように、Biomira Inc.（Edmonton, Alberta）によって調製された。簡潔に述べると、この結合手順には、ＧＭ２のセラミド二重結合のオゾン開裂、アルデヒド基の導入および還元アミノ化によるＫＬＨのアミノリシル基への結合が含まれる。ＧＭ２／ＫＬＨモル比は約８００／１であり、ワクチンは通常の生理食塩水0.5ｍｌ中に複合体0.57ｇの濃度で供給した。この量は、患者一人の投与量を表わし、ＧＭ2 70μｇおよびＫＬＨ500μｇを含む。６名の患者からなる群には、各々、アジュバントなしでＧＭ２−ＫＬＨ複合体を、ＤＥＴＯＸと共にＧＭ２−ＫＬＨを、ＢＣＧと共にＧＭ２−ＫＬＨを、並びにＱＳ−21と共にＧＭ２−ＫＬＨを投与した。
完全なリンパドレナージを行ないながら、２週間隔で４回手足の皮内にワクチン接種し、次いで８週間隔で２回追加のワクチン接種を行なった。第１回のワクチン接種の４ないし６日前に、全ての患者にシクロホスファミド（Cytoxan, Mead Johnson and Co., Evansville, IN）２００ｍｇ／ｍ２を静脈内投与した。
免疫学的アジュバント：ＤＥＴＯＸはRibi Immunochem Research Inc.（Hamilton, MT）によって製造、供給され、凍結乾燥された油滴エマルジョンとして処方されていた。これは、bacille Calmette-Guorin由来の細胞壁骨格（ＣＷＳ）およびSalmonella minnesota R595由来のモノホスホリルリピットＡ（ＭＰＬＡ）からなる。ワクチン接種の当日、0.25ｍｌのＤＥＴＯＸ（ＣＷＳ250μｇおよび25μｇ  ＭＰＬＡ）をＧＭ２−ＫＬＨ調製品と混合した。このワクチン（最終容積0.75ｍｌ）を2-3分間激しく撹拌し、15分以内に患者に投与した。ＢＣＧはBionetics Research lnc.（Rockville, MD）から購入した。ワクチン接種の当日、正常生理食塩水0.1ｍｌ中107生育可能単位［viable units］のＢＣＧを、各々別個のシリンジにおいてＧＭ２−ＫＬＨワクチンに添加した（最終容積0.6ｍｌ）。この中身を混合し、15分以内に患者に投与した。ＱＳ−21アジュバント（Quillaja saponaria Molinaの樹皮から精製された均質サポニン）（10、11）は、Cambridge Biotech Inc.（Worcester, MA）のご厚意に甘えた。100μｇもしくは200μｇのＱＳ−21を正常生理食塩水0.25mlに希釈し、ＧＭ２−ＫＬＨと混合した。このワクチン（最終容積0.75ｍｌ）を2-3分間激しく撹拌し、15分以内に投与した。
ガングリオシド
ウシ脳由来のＧＭ２およびＧＤ 1ｂは、Fidia Research Laboratory（Abano Terme, Italy）からの贈物であった。ウシ脳由来のＧＭ３、ＧＭ１およびＧＤ 1ａはSigma Chemical Co.（St. Louis, MO）から購入した。アシアロ−ＧＭ２［Asialo-GM2］はＧＭ２を0.1Ｍトリフルオロ酢酸で100℃、１時間処理し、その後Sep-Pak C18逆相カラム（Waters, Milford, MA）で分離することにより調製した。ＧＤ２は、ＧＤ 1ｂからβ−ガラクトシダーゼで処理することにより作製した（12）。ウシバターミルクから単離したＧＤ３は、Ｒ．Ｋ．Ｙｕ博士（Medical College of Virginia, Richmond, VA）のご厚意に甘えた。
試薬およびモノクローナル抗体
高速薄層クロマトグラフィー（ＨＰＴＬＣ）シリカゲルプレートはE.Merck（Darmstadt, Germany）より得た。4-クロロ-1-ナフトールおよびp-ニトロフェニルリン酸二ナトリウム塩はSigmaより得た。アルカリホスファターゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇＭ（Kierkegaard and Perry Labs, Gaithersburg, MD）および精製マウス抗ヒトＩｇＧ（Southern Biotech, Birmingham, AL）、次いでアルカリホスファターゼ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（Southern Biotech）を酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）に用いた。TAGO（Burlingame, CA）から購入した西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇＭもしくはＩｇＧをドットブロット免疫染色および免疫薄層クロマトグラフィー（ＩＴＬＣ）に用いた。ＩＴＬＣのための西洋ワサビペルオキシダーゼに結合したウサギ抗マウス免疫グロブリン、およびＥＬＩＳＡのためのアルカリホスファターゼに結合したウサギ抗マウスＩｇＭおよびＩｇＧは、対照モノクローナルマウス抗体と共に用い、Zymed（San Francisco, CA）から得たものであった。抗ＧＭ２ ｍＡｂ 696は協和発酵工業（東京、日本）から得たものであり、抗ＧＤ３ ｍＡｂ  Ｒ24が生成した（13）。
血清学的アッセイ
ＥＬＩＳＡは、従来記述されている通りに行なった（６）。非特異的“粘着性［stickiness］”を制御するために、免疫血清を、同様に処理されているもののガングリオシドは添加されていないプレート上で試験し、その読取値をガングリオシドの存在下で得られた値から差引いた。力価は、補正された吸光度が0.1以上になる最も高い希釈度と定義した。ニトロセルロース細片上へのスポッティング（14）または従来記述されている通りのＨＰＴＬＣシリカゲルガラスプレート上での分離（３）の後、モノクローナル抗体もしくはヒト血清でのガングリオシドの免疫染色を行なった。クロロホルム／メタノール／水（0.25％ＣａＣｌ2）50：40：10（ｖ／ｖ）中でプレートを現像し、レゾルシノール／ＨＣｌ試薬またはモノクローナル抗体を用いて染色することによりガングリオシドを可視化した。
ＩｇＧサブクラスの決定
ＩｇＧサブクラスの決定は、サブクラス特異的二次マウス抗ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４ｍＡｂを用いるＥＬＩＳＡによって行なった。異なる供給先からの二次ｍＡｂ（表４）を用いた。アルカリホスファターゼ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（Southern Biotech, Birmingham, AL）を１：200の希釈率で三次抗体として用いた。
補体介在細胞毒性アッセイ
補体介在細胞毒性アッセイを、４ｈ  51Ｃｒ放出アッセイ［4h 51Cr release assay］により行なった。ＧＭ２−陽性メラノーマ細胞株ＳＫ−ＭＥＬ−173からの細胞を標的細胞として供した。ＣＯ2インキュベータ中において、10％ＦＣＳ  ＲＰＭＩ中、37℃で１時間、２×106個の細胞を100μＣｉ  Ｎａ２ 51ＣｒＯ４（New England Nuclear, Boston, MA）で標識した。これらの細胞を２回洗浄し、96ウェル丸底プレート（Corning, New York, NY）に入れた104細胞／ウェルを標識して、１：５希釈したワクチン接種前もしくは後血清と共に、または培地のみと共に、ＣＯ2インキュベータ中において３７℃で１時間インキュベートした。これらの細胞を洗浄し、希釈率１：４のヒト補体（Sigma）と共に37℃で４時間インキュベートした。このプレートを500ｇで５分間回転させ、各ウェルの上清のアリコート125μｌを放出された51Ｃｒを測定するために回収した。全てのアッセイは３回繰り返して行ない、１％ＮＰ-40（Sigma）における最大放出および補体が存在しない状態での自発的な放出についての対照を含めた。
特異的溶解の割合は以下の通りに算出した：
0003852945.tif 000016
結果
ワクチン投与および副作用
24名の患者をＧＭ２−ＫＬＨワクチンで免疫した。患者６名の群の各々には、免疫学的アジュバントなしで、あるいはＤＥＴＯＸ、ＢＣＧもしくはＱＳ−21と共に、ＧＭ２−ＫＬＨを接種した。ＧＭ２−ＫＬＨを単独で投与した後には、局所もしくは全身的な毒性は検出されなかった。ＤＥＴＯＸを含有するワクチンでは、６名の患者のうちの４名で、ワクチン接種部位に小瘤が形成され、これが２−10週間続いた。４名の患者のうちの３名には、３−10ｃｍの紅斑および硬化が生じたが、圧痛は最小のもののみであった。患者の一人では、それに関連して、１回の免疫化の後に25ｃｍの紅斑および硬化が生じ、第２の患者においては、第１の免疫化の72時間後に問題のない熱［low grade fever］および不快感が生じた。この患者は、後に続く免疫化では、ＤＥＴＯＸ投与量をＣＷＳ50μｇおよびＭＰＬＡ５μｇに減少した。ＢＣＧは、全ての患者において、局所的な炎症と幾らかのかさぶたを生じ、これは２−12週間後に治癒した。これが生じたとき、ＢＣＧの投与量を１×107生育可能単位から４名の患者で最終投与量３×106単位まで、１名の患者で１×106まで減少させた。第６の患者は、結核の病歴があってＰＰＤ試験陽性であった。従って、彼は１×106単位の投与量から開始して、これは最終的に１×105単位に減少された。ＱＳ−21は、100μｇの投与量で、全ての患者に、24−48時間持続する穏やかな局所的紅斑と圧痛を誘発した。ＱＳ−21の200μｇの投与量は、全ての免疫化の後の２−10日続く局所的な圧痛および炎症の他、18回の免疫化のうちの３回目の後に８−24時間続く、問題とはならない熱、頭痛および筋肉痛を含む穏やかなインフルエンザ様の症状に関連付けられた。神経学的な異常または他の副作用は見られなかった。
ＧＭ２−ＫＬＨ複合体ワクチンに対する抗体応答
免疫化の前にはＧＭ２に対するＩｇＧ抗体は見出されず、ＩｇＭ抗体は、１：80の力価で２名に、１：320の力価で１名に、合わせて３名の患者に見出されるのみであった。残りの21名の患者は、免疫化の前にはＧＭ２反応性は示さなかった。免疫化前後に得られた血清を用いたＥＬＩＳＡおよびドットブロット免疫染色の結果を表３にまとめる。ＧＭ２−ＫＬＨを用いた免疫化、またはＧＭ２−ＫＬＨとＢＣＧもしくはＧＭ２−ＫＬＨとＤＥＴＯＸを用いた免疫化の後のＩｇＭ抗体力価は非常に類似していた（メディアン力価１：80−１：160）。対称的に、ＧＭ２−ＫＬＨとＱＳ−21を用いて免疫化した６名の患者のうちの５名は、１：1280以上のＩｇＭ抗体力価を示し、他の群またはそれ以前に非複合ＧＭ２およびＢＣＧワクチンで免疫された患者（６）の力価よりも著しく高かった。加えて、ＧＭ２−ＫＬＨとＱＳ−21とで免疫化することにより、初めて全ての患者に一貫したＩｇＧ応答が誘発された；ＧＭ２−ＫＬＨワクチンを受ける他の18名の患者のうちの２名のみが比肩し得るＩｇＧ力価を生じた。
ＧＭ２−ＫＬＨおよびＱＳ−21を受ける患者におけるＧＭ２に対するＩｇＭおよびＩｇＧ抗体力価を連続的に図６に示す。ＩｇＭピーク力価は、第３もしくは第４の免疫化の後に見られ、ほとんどの患者において少なくとも20週間高いまま留まった。第14週および第22週での追加免疫では、ＩｇＭ力価がさらに増加することはなかった。１：160以上のＩｇＧ力価は、６名の患者のうちの５名で、第４の免疫化の２週間後にみられた。この力価は１：40以下にまで減少したが、追加免疫の後には再び以前のレベル（メディアン１：160）まですぐに増加し、11週間を越えてこのレベルに留まった。第２の追加免疫は、ほとんどの場合において、抗体力価に明らかな効果は及ぼさなかった。したがって、追加免疫に対する応答は古典的な二次免疫応答の２つの特徴のうちの１つを示したにすぎない。応答はより迅速に生じるが、抗体力価は最初の免疫かの後よりも高くは上がらなかった。
ＫＬＨ抗体は処理前の血清中には検出されなかった。免疫化の後には、全ての患者の血清が、表３に示されるように、ＫＨＬとの反応性を示した。最も高いＩｇＧ抗体の力価は、”ＱＳ−21と共に投与した後に見られ、次に最良の、ＧＭ２−ＫＬＨおよびＢＣＧをワクチン接種された患者の群を含めて、有意に高いものであった（ｐ＜0.005）。ＱＳ−21群においては、ＧＭ２応答の強度とＫＬＨ応答の強度との間には相関は見られなかった。
ＧＭ２抗体の特異性分析
免疫化前後の患者の血清中に検出されたガングリオシド抗体の特異性を、ガングリオシド標準ＧＭ３、アシアロ−ＧＭ２、ＧＭ２、ＧＭ１、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＤ 1ａおよびＧＤ 1ｂを用いるドットブロット免疫染色により決定した（図７）。ほとんどの患者の免疫前のＩｇＭおよびＩｇＧ抗体はアシアロ−ＧＭ２との弱い反応性を示し、幾人かの患者はＧＭ１およびＧＭ 1ｂに対するＩｇＭ抗体をも有していた。これらのガングリオシドとの反応性は免疫化によっては変化しなかった。ワクチンによって誘発された変化は、ＧＭ２との強い反応性とＧＤ２との弱い反応性のみであった。ドットブロット免疫染色は0、1+、2+、または3+と等級付けられた。ＧＭ２に対するＩｇＭ抗体の3+反応性は、ＧＭ２−ＫＬＨおよびＱＳ−21で処置された６名の患者のうちの５名、ＧＭ２−ＫＬＨおよびＢＣＧで処置された６名の患者のうちの１名、およびアジュバントなしのＧＭ２−ＫＬＨまたはＧＭ２−ＫＬＨおよびＤＥＴＯＸで処置された６名の患者のうちの２名の血清中に見られた。ＩｇＧ抗体の3+反応性は、ＧＭ２−ＫＬＨおよびＱＳ−21で免疫された６名の患者のうちの５名に見られ、他の処置群の患者には見られなかった。
また、ＧＭ２−ＫＬＨおよびＱＳ−21で免疫した患者からの免疫後血清を、免疫薄層クロマトグラフィー（図８Ａ）によって、ＧＭ２およびメラノーマ組織抽出物の他のガングリオシドとの反応性について試験した。ほとんどの患者の血清は、ウシ脳またはメラノーマから単離されたＧＭ２との強いＩｇＭおよびＩｇＧ反応性を示した。また、精製ＧＤ２標準とのＲｆ値の比較によりおそらくＧＤ２であろうと推測される、メラノーマ抽出物中のゆっくり移動するバンドとの反応性も見られた（図示せず）。
ＩｇＧ抗体のＧＤ２交差反応性を確認するために、患者No.2のワクチン接種後の血清を、免疫染色を行なう前にＧＭ２またはＧＤ２のいずれかと共に予備インキュベートした（図８ｂ）。メラノーマガングリオシド抽出物中のＧＭ２との反応性およびＧＤ２との反応性は、ＧＭ２との予備インキュベーションによって完全に阻害された。一方、同じ血清とＧＤ２との予備インキュベーションでは、ＧＤ２反応性のみが阻害され、ＧＭ２との反応性は変化しなかった。これらの結果は、一方はＧＭ２のみと反応し、他方はＧＭ２およびＧＤ２に対する反応性を有する２種類のポピュレーションの存在を示唆している。
ＩｇＧ抗体のサブクラス決定
ＧＭ２−ＫＬＨおよびＱＳ−21で免疫した６名の患者の高力価ＩｇＧ血清を、ＩｇＧサブクラス特異的二次抗体のパネルを用いてＥＬＩＳＡにより試験した。結果を表４にまとめる。６つの血清中のＩｇＧ抗体の全てはＩｇＧ１およびＩｇＧ３サブクラスであった。
補体介在細胞毒性
ＧＭ２−ＫＬＨおよびＱＳ−21（１：５に希釈）をワクチン接種された患者の血清中の抗ＧＭ２抗体のエフェクター機能を、補体介在細胞毒性アッセイによって試験した。表５に示されるように、６名の患者全てのワクチン接種後血清は、ヒト補体の存在下において、ＧＭ２−陽性ＳＫ−ＭＥＬ−173メラノーマ細胞を溶解した。ワクチン接種前の血清は補体を加えても細胞毒性は示さず、ワクチン接種後の血清はＧＭ２陰性メラノーマ細胞には、あるいは補体を加えない場合には、細胞毒性はない。明らかに、これらは予備的な結果にすぎず、ワクチン誘発抗体およびそれらのサブクラスの細胞表面結合および細胞毒性エフェクター機能のより詳細な研究は現在進行中である。
考察
悪性メラノーマを有する患者の一連の研究における目的は、メラノーマにおいてしばしば過剰発現する３種のガングリオシド−ＧＭ２、ＧＤ２およびＧＤ３、に対する抗体を産生させるのに有効なワクチンの構築であった。最初のアプローチは、ＢＣＧに吸着した非複合ガングリオシドで患者を免疫することであった。この方法で、我々は、ＧＭ２に対する抗体の産生を誘発することは可能であった（５、６）が、ＧＤ２およびＧＤ３に対しては不可能であった。ＧＭ２−ＢＣＧワクチンによって誘発されたＧＭ２抗体は、ほとんどＩｇＭクラスのものであり、抗体応答の持続期間は短く、追加免疫もまた第１の応答と同様に短期間のＩｇＭ抗体産生という結果に終わった−これらは全て、他の炭水化物抗原の研究から周知のＴ細胞非依存性免疫応答の特徴である。それでも、ステージIIIメラノーマの患者による術後のＧＭ２抗体のワクチン誘発産生は、生存率の増加に関っていた（６、７）。この観察は、メラノーマガングリオシドがワクチン構築の適切な候補であり、免疫原性が高まったメラノーマガングリオシドワクチンが優れた臨床結果をもたらすに違いないことを示唆した。メラノーマガングリオシドの関連エピトープが炭水化物なので、他の炭水化物ワクチン、特に特定のバクテリア感染に対するワクチン、の免疫原性の増加を目的とした研究を考慮することは有益である。
蛋白質抗原と比較して、炭水化物抗原に対する免疫応答の主な相違は、それが胸腺に依存しないことである。炭水化物抗原が胸腺非依存性（ＴＩ）であるという概念は、胸腺マウス［thymic mice］だけではなく新生児胸腺切除マウス［neonatally thymectomized mice］のバクテリア多糖に対する体液性免疫応答が損なわれていないという観察（15）に基づいている。ＴＩ抗原に対して応答するＢ細胞は幾つかの特徴的な性質を示す。それらは、個体発生の後期に出現し、長期間生存し、少なくともイン・ビボでは活性化にＴ細胞を必要としない。イン・ビトロにおいてＢ細胞がＴＩ抗原に対して応答するためにＴ細胞が必要であるとしても、Ｔ細胞の効果の性質はほとんど理解されておらず、蛋白質抗原に対するＴ依存性抗体応答におけるＭＨＣ制限Ｔ細胞助力とは明らかに異なる。Ｔ細胞はイン・ビボにおけるＴＩ抗原に対する抗体応答に不可欠なものではないが、Ｔ細胞が存在する場合には抗体レベルはより高い。これもまた、未知の機構によるＴ細胞の一般的な増強活性を示唆する（16）。
炭水化物抗原の免疫原性を高める試みにおいて、多くのアプローチが検討されている。これらには、化学的修飾（17）、アジュバントを伴う投与、蛋白質との非共有結合的複合化、免疫原性蛋白質坦体への共有結合的付着（18）、および蛋白質レプリカ、すなわち初めから合成されたエピトープ（いわゆるミモトープ［mimotopes］、19）または抗イディオタイプ抗体（20）のいずれか、による炭水化物エピトープの置換が含まれる。これらのアプローチの多くは、炭水化物特異的抗体応答に対するＴ細胞の助力を増加させる結果となる。初期の実験においては各々見込みを示したが、免疫原性Ｔ依存性蛋白質坦体への炭水化物抗原の共有結合的付着は、最初にハプテン（21）で、次いで二糖（22）で示唆されたように、最も精力的に追求されている概念であり、最近の臨床試験において幾つかの事例でより有効性が高いことが示されているワクチンとして結実している。
優れた例は、Ｈ．インフルエンザｂ型（Ｈｉｂ）多糖蛋白質複合体ワクチンである。最近10年間で開発された４種類のワクチンは、炭水化物成分、蛋白質坦体および炭水化物と蛋白質との間のリンカーが異なる（23-27）。児童における比較研究では、複合体ワクチンは、非複合Ｈｉｂホスホリボシル／リビトールホスフェート多糖（ＰＲＰ）ワクチンよりも非常に強い抗体応答を誘発した（28）。特に興味深いのは、最初にＨｂＯＣ（オリゴ多糖−非毒性ジフテリア毒）またはＰＲＰ−ＯＭＰＣ（Ｂ型髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）の外膜蛋白複合体）ワクチンで免疫され、後に非複合ＰＲＰワクチンで追加免疫された若年の児童が、彼らが非複合ワクチンでの第１の免疫化に応答しない年齢で追加免疫されたとしても、既往１ｇＧ応答を示したという観察である（29、30）。Ｔ細胞がいかに関り、それらがＨＩｂ  ＰＲＰ−応答性Ｂ細胞といかに反応するかは未だ明らかではない。高まった免疫原性とＴ依存性がＰＲＰと蛋白質との共有結合を必要とするという事実は、少なくとも抗原処理過程の早期段階以外では、蛋白質とＰＲＰとの近接が妨げられてはならないことを示唆している。Ｈｉｂ  ＰＲＰおよびＨｉｂ  ＰＲＰ複合体によって誘発される抗体のイソタイプおよび生物学的活性が同じであるので、複合体誘発Ｔ細胞シグナルに応答するＢ細胞はＨｉｂ  ＰＲＰのみに関るＢ細胞と質的に同等であると思われる。
バクテリア感染の炭水化物ワクチンの開発において蓄積された実質的な経験を踏まえて、出願人は、過去数年にわたって、メラノーマガングリオシドの免疫原性を高める試みにおいて類似のアプローチを検討した。アミド、ラクトンもしくはガングリオシドールを形成する結果となるＧＤ３の化学修飾、またはＯ−アセチル化により、メラノーマ患者における抗体産生の誘発に非常に有効な誘導体が生成した。しかしながら、これらのＧＤ３誘導体によって誘発される抗体はＧＤ３とは交差反応しなかった（31、32）。ＧＤ３を認識するモノクローナル抗体Ｒ24でマウスを免疫することにより、ＧＤ３を模倣する抗イディオティピック抗体ＢＥＣ−２が開発されている。ＢＥＣ−２で免疫されたウサギは抗ＧＤ３抗体を産生しており（33）、ヒト患者におけるＢＥＣ−２の免疫原性の初期の研究が進行中である。
複合体ワクチンに関しては、マウスにおいてＧＤ３を用いた初期の研究は３つの問題−結合方法の開発、坦体蛋白質の選択およびアジュバントの選択、に関っていた（７）。最適の結合方法には、ＧＤ３のセラミド骨格における二重結合のオゾン開裂、アルデヒド基の導入、および還元性アミノ化による蛋白質アミノリシル基への結合が含まれていた。試験した５種類の坦体−ポリ-1-リシン、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、陽イオン化ウシ血清アルブミン、Neisseria meningitidis外膜蛋白複合体（ＯＭＰＣ）、および分岐ポリリシン核上にマラリアＴ細胞エピトープの４つのリピートを含む多重抗原性ペプチド構築体−のうち、ＫＬＨが最も有効であることが見出された。非共有結合ＧＤ３／ＫＬＨ複合体は免疫原性ではなかった。最良のアジュバントは、Quillaja saponaria Molinaの樹皮から精製された均質サポニン画分であるＱＳ−21であった。ＧＤ３−ＫＬＨ複合体とＱＳ−21での免疫化に対する抗体応答の特徴には、ａ）高い初期１ｇＭ抗体力価、ｂ）追加免疫化の後のＩｇＭ抗体力価の迅速な第２の上昇、ｃ）追加免疫化の後の10週までにわたるＩｇＭ抗体力価の維持、およびｄ）初期の２週間の遅れを除いてＩｇＭ抗体産生に並行する、ＩｇＧ抗体の高力価での一貫した産生、が含まれる。これらの知見は、今やヒトメラノーマ患者において、同じ結合方法を用いて、他のガングリオシドワクチン、ＧＭ２−ＫＬＨによって再現されている。マウスでの研究と同様に、ＱＳ−21はＤＥＴＯＸまたはＢＣＧよりも非常に効果的な、許容し得る毒性を有するアジュバントであることが確かめられた。
ＧＭ２抗体応答はＴ細胞依存性応答の多くの特徴を有していた。これは長時間持続し、（通常、Ｔ細胞依存性免疫応答に関連している）ＩｇＧ１およびＩｇＧ３サブクラスの抗体が誘発された。Ｈｉｂ−ＰＲＰワクチンを用いた場合に見られるように、これらのイソタイプは、非複合ＧＭ２／ＢＣＧワクチンを用いて時折低力価で誘発されるものと同じであった。最初の一連の免疫化に続く３および５ヵ月後の免疫化の後の維持された高力価１ｇＭおよびＩｇＧ応答における明らかな追加免疫効果の欠如は、最初に患者が２週間間隔で免疫化されたという事実によって説明できる。蛋白質抗原に対する二次応答を示す古典的実験においては、抗原の第２の注射は第１回目の４週間後に行われた。第１の免疫化の後の抗体レベルは注射後１ないし２週間は高く、その後４週間後に追加注射される前には非常に低レベルまで下がる。出願人が選んだ免疫化スケジュールにおいては、古典的な実験においてより劇的に見られる二次応答を先取りして、最初の２週間隔の４回の免疫化に応答して、初期抗体応答は低下することなく段階的に増加する。ほとんどの蛋白質抗原に対する抗体応答とは異なり、炭水化物抗原に対する特徴として、追加免疫化を繰り返した後であってもＩｇＭ応答が長期間持続し、ＩｇＭ抗体はＩｇＧ抗体よりも高力価に保持される。したがって、脂質骨格に連結する比較的短いオリゴ糖鎖を含み、かつ自己抗原であるガングリオシドに対する免疫応答が、Ｈｉｂ−ＰＲＰおよび他のバクテリア炭水化物に対する免疫応答と同様に見られる。
ＧＭ２−複合体ワクチンの開発は、より長い期間にわたって維持されるＧＭ２に対するＩｇＭおよびＩｇＧ抗体のより高いレベルが、非複合ＧＭ２で免疫された患者において短期間存在するほとんどの低レベルのＩｇＭよりも、メラノーマの再発の遅延により有効であるかどうかを決定することを可能にする。加えて、出願人は、今や免疫原性蛋白質坦体との結合が、非複合ワクチンとして与えられたときにメラノーマ患者において抗体応答を誘発したことがない主要ガンダリオシドであるＧＤ３およびＧＤ２に対する免疫原性を付与するかどうかをも試験することができる。これが達成されたならば、多価メラノーマガングリオシドワクチンを構築し、試験することは、魅力的な次のステップとなるであろう。
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第４実験シリーズ
フェーズＩの試験において、免疫学的アジュバントとして、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）に共有結合されたメラノーマ・ガングリオシドである一定量のＧＭ２の投与とともに、サポニン画分ＱＳ−２１を増量させながら投与した。手術後に疾病のない、ＡＪＣＣ段階IIIまたはIVのメラノーマ患者２８人が、５か月間にわたって皮下投与で６回のワクチン接種による治療を受けた。局所反応および全身反応は、ＱＳ−２１の投与量に関連していた。１００μｇ以下の投与では、２−４日続くワクチン接種部位での穏やかな局所的軟化および炎症、並びに時折の短時間の低度の発熱および不快感が誘起されたが、重大な衰弱は見られなかった。２００μｇの投与では、３０％のワクチン接種の後に、低度の発熱および不快感が誘起され、また５−１０日間、注射された四肢の使用に不自由が見られた患者においてはすべて、直径２０ｃｍほどの大きさの局所反応がみられた。ＧＭ２に対するＩｇＭおよびＩｇＧ抗体の力価、並びにＫＬＨに対するＩｇＧ抗体の力価は、１００および２００μｇのＱＳ−２１の投与において最大であった。ＱＳ−２１に対する抗体は、検出されなかった。この試験によって、ＱＳ−２１の１００μｇの投与が、メラノーマ患者のＧＭ２およびＫＬＨに対する抗体の誘起において最適な許容投与量であることが確認された。
序論
出願人らはこれまで、様々な糖タンパク質およびガングリオシド抗原の発現という点から選択された、一連の全メラノーマ細胞ワクチンによるワクチン接種をメラノーマ患者に対して行ってきた（１，２）。これまでのワクチン接種後の血清において、最も高頻度に抗体により認識されてきた抗原は、ガングリオシドＧＭ２であった。ＧＭ２ガングリオシドは、悪性のヒト・メラノーマの細胞表面上で過剰発現した分化抗原である。単独で注射されたＧＭ２は、免疫原性を有さないことが分かっていた。そのため、さまざまな免疫学的アジュバントを含むＧＭ２ワクチンが試験された（３，４）。カルメット−ゲリン桿菌（ＢＣＧ）に結合させた、精製されたＧＭ２ガングリオシドによる免疫感作により、ほとんどのメラノーマ患者においてＧＭ２に対するＩｇＭ抗体の産生が誘起された。そして、抗体を産生しなかった患者と比較したとき、抗体を産生した患者における非羅患期間および生存期間は長かった（４，５）。手術後に疾病のなかった１２２人のメラノーマ患者での無作為抽出の研究では、ＧＭ２／ＢＣＧワクチンの接種を受けた患者の多くは抗体を産生した（６）。抗ＧＭ２抗体を産生した患者は、抗体陰性の患者よりも、羅患していない期間および全体の生存期間があきらかに長かった。試験した２つの手段を比較すると、ＢＣＧの対照グループに比べて、ＧＭ２／ＢＣＧワクチンの接種を受けた患者では、羅患していない期間の長さにおいて１８％の改善、生存率において１１％の改善が見られたが、この違いは統計的に顕著とは言えない。免疫応答は短期間継続し、ほとんどがＩｇＭで、かっ中程度の力価であった。他のメラノーマガングリオシドであるＧＤ２、ＧＤ３および９−Ｏ−アセチルＧＤ３／ＢＣＧを用いて、患者への類似のアプローチを行ったところ、時折の低力価の抗体応答という結果しか得られなかった（７）。より有効なワクチンが必要なことは明らかであった。
ハプテンキャリヤ複合体によるラントシュタイナーの古典的な実験は、幼児において、細菌莢膜多糖を含む多くの種類の抗原に対するワクチン接種について、成功裡に応用されてきた（８）。この背景を基礎として、数種の異なる糖鎖の腫瘍抗原について、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）との複合体が作られ、これまで非複合体のワクチンで見られた（９−１１）よりも高い力価のＩｇＭ抗体応答およびＩｇＧ抗体応答を誘起することが示された。出願人らは、ハツカネズミを用いて様々なキャリア分子に結合したＧＤ３の免疫原性を試験し、ＫＬＨが最適のキャリアであることを確認した（１２）。ＧＭ２−ＫＬＨ複合体ワクチンは単独で、もしくは免疫学的アジュバントのＢＣＧおよびＤＥＴＯＸと混合して、メラノーマ患者に対して試験された。しかし、免疫応答は、ＧＭ２−ＢＣＧワクチンに誘起された場合に比べて顕著に異なるわけではなく、中程度の力価のＩｇＭ抗体が誘起されたに過ぎない。より強力な免疫学的アジュバントが必要とされた。
ＱＳ−２１は、キラヤ・サポナリア・モリナ（Quillaja saponaria Molina）の樹皮からほとんど均質になるまで精製され、かつ優れたアジュバント効果と低い毒性のゆえに選ばれたサポニン画分である（１４，１５）。サポニンは、様々な設定条件において免疫学的アジュバントとして用いられてきた（１５に概説）。ＱＳ−２１は、大腸菌の多糖に対する抗体応答（１６）、並びにＨＩＶ−１エンベロープタンパク（１７）、卵アルブミン（１８）、およびネコ科動物白血病ウイルス（１９）に対する抗体およびＴ細胞の応答を強化するために用いられてきた。細胞傷害性Ｔ細胞は、タンパク／ＱＳ−２１混合物による免疫感作により、ＨＩＶに感染した細胞および卵アルブミンによるＤＮＡ感染された細胞に対して誘導されてきた（１７，１８）。出願人は、様々な糖鎖抗原−ＫＬＨ複合体ワクチンについて多くの種類の新たな免疫学的アジュバントを試験した。そして、免疫学的アジュバントの、ＱＳ−２１およびＳＡＦmが、ＩｇＭおよびＩｇＧ抗体の力価を最も効果的に高めることを見出だした（９）。ＱＳ−２１の毒性が最も低く、複合体ワクチンを試験する上で有効であったことから、実験の焦点をこれに絞った。ＧＤ３ガングリオシド−ＫＬＨにＱＳ−２１を合わせたワクチンは、ハツカネズミの体内で持続的に高い力価のＩｇＭ抗体およびＩｇＧ抗体の応答を誘起した（１２）。これにより、メラノーマ患者について、このアプローチで試験をする上での基礎が与えられた。
ここでの記載は、一定の投与量のＧＭ２−ＫＬＨに組み合わせてＱＳ−２１の投与量を増大させながら用いたフェーズＩの試験の結果である。精製されたＱＳ−２１または、Ｑｕｉｌ  Ａのような部分的に精製されたサポニンは、これまでヒトに対して用いられたことがなかった。そのため、目標は、外来患者への反復投与に適う最大許容投与量およびＧＭ２に対する抗体応答を強化する上での最適投与量を決定することであった。
＜材料および方法＞
ガングリオシド
ウシ脳由来のＧＭ２およびＧＤ１ｂは、フィディア研究所（アバノ  テルメ、イタリア）から贈呈を受けたものである。ウシ脳由来のＧＭ３、ＧＭ１およびＧＤ１ａは、シグマケミカル社（セントルイス、ミズーリ州）から購入した。ＧＤ２は、ＧＤ１ｂをβ−ガラクトシダーゼで処理することにより得られた（２０）。ＧＤ３は、ウシのバターミルクから分離されたものであり、Ｒ．Ｋ．ユー博士（バージニア医科大学、リッチモンド、バージニア州）の好意により得られた。
試薬およびモノクローナル抗体
ＨＰＴＬＣシリカゲルプレートはＥ．メルク社（ダルムシュタット、ドイツ）から、４−クロロ−１−ナフトールおよびｐ−ニトロフェニルリン酸二ナトリウムはシグマ社から得た。アルカリフォスファターゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇＭ（キアカガード・アンド・ペリー研究所、ゲイザーズバーグ、メリーランド州）およびマウス抗ヒトＩｇＧ精製品（サザン・バイオテック社、バーミンガム、アラバマ州）、続いてアルカリフォスファターゼ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（サザン・バイオテック社）がＥＬＩＳＡに用いられた。ＴＡＧＯ社（バーリンゲーム、カリフォルニア州）より購入したホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇＭまたはＩｇＧは、ドットブロット法免疫染色および免疫薄層クロマトグラフィーに用いられた。ＩＴＬＣ（免疫薄層クロマトグラフィー）用のホースラディッシュペルオキシダーゼに結合したウサギ抗マウスイムノグロブリン、ならびにＥＬＩＳＡ用のアルカリフォスファターゼに結合したウサギ抗マウスＩｇＭおよびＩｇＧが、標準モノクローナル抗体として用いられた。これらは、ザイムド社（サンフランシスコ、カリフォルニア州）から入手された。抗ＧＭ２・ｍＡｂ６９６は協和発酵工業社（東京、日本）から入手し、抗ＧＤ３・ｍＡｂ・Ｒ２４は調製した（２１）。
患者
最近８か月以内に転移疾患の証拠が何も見られなければ、ＡＪＣＣステージがIIIまたはIVの病状のメラノーマ患者が最適であると考えられた。いづれの患者も、以前に化学療法または放射線療法を受けていなかった。患者について、それぞれのワクチン接種のときに毒性評価がなされた。加えて、患者には、局所反応を計り、体温を計測するように指導した。これらの結果は電話で報告され、次の来院の時に再調査された。それぞれ、第４投与レベルの４人の患者については、病状の進行のために他の処置を必要とすることから、免疫感作を４回しか受けなかった。
ワクチンの製造および投与
ＧＭ２−ＫＬＨ複合体は、バイオミラ社（エドモントン、アルバータ）により製造された。ＧＭ２／ＫＬＨのモル比は８００／１であり、正規生理的食塩水０．５ｍｌに対し複合体０．５７ｍｇの濃度で供給された。これが１回の患者投与量に相当し、７０μｇのＧＭ２、５００μｇのＫＬＨおよび０．５ｍｌの正規生理的食塩水が含まれる。キラヤ・サポナリア・モリナ（Quillaja saponaria Molina）の樹皮から、単離したサポニン成分を含むＱＳ−２１アジュバントは、ケンブリッジ・バイオテック社（ワーセスター、マサチューセッツ州）によって提供された。ＱＳ−２１の純度は、分析用逆相ＨＰＬＣにより９８％以上と測定された。１０、５０、１００または２００μｇのＱＳ−２１が０．２５ｍｌの正規生理的食塩水中に希釈され、ＧＭ２−ＫＬＨと混合された。最終体積０．７５ｍｌのワクチンがボルテックスミキサーで２−３分間攪拌され、１５分以内に投与された。４回のワクチン接種が２週間間隔で皮下投与によりなされ、さらに２回が８週間間隔でなされた。まず、１２人の患者が治療を受け、３人はそれぞれ４回のＱＳ−２１投与を受けた。ついで、もう一人追加の患者が１０μｇの投与で治療を受け、さらに３人の追加の患者が３回のより多い投与量で治療を受けた。シクロフォスファミド（サイトキサン、ミード・ジョンソン・アンドＣｏ．社、エバンズビル、インディアナ州）２００ｍｇ／Ｍ2が、最初のワクチン接種の３−６日前にＩＶからすべての患者に投与された。
血清学的および遅延型過敏反応（ＤＴＨ）検査
酵素結合免疫吸着試験（ＥＬＩＳＡ）が、ガングリオシドについて既に記載された方法で用いられた（５）。ＱＳ−２１のＥＬＩＳＡ試験に当たって、ＱＳ−２１：エチレンジアミン（ＱＳ−２１のグルクロン酸のカルボキシル基にエチレンジアミンを結合させて得たもの）による表面処理が、グルタールアルデヒド処理されたイミュロンプレート４枚（ダイナテック研究所、シャンティリー、バージニア州）に対してなされた。非特異的な、「スティッキネス」を抑制するために免疫血清もまた、同様に処理された（ただし、ガングリオシドＫＬＨまたはＱＳ−２１が加えられない条件で）プレート上で試験された。そして、読み取られた値が抗原の存在の下で得られた値から差し引かれた。力価は、０．１以上の補正吸光度を得られる最高希釈度として定義された。モノクローナル抗体またはヒト血清によるガングリオシドの免疫染色は、すでに記載されたように（２２）、ニトロセルロース片上にスポットしてから行った。患者は、５回目のワクチン接種のときに、ＧＭ２、ＧＭ２−ＨＳＡおよびＫＬＨについての皮膚検査を受けた。それぞれ２５マイクログラムが０．０５ｍｌのＰＢＳに希釈され、真皮内に投与された。結果は、すでに記載されたように解釈された（５）。
＜結果＞
毒性
ＧＭ２−ＫＬＨが単独、または種々の投与量のＱＳ−２１と組合わせて投与したワクチン接種、並びにこれらワクチン接種に関連した局所反応および全身反応についての数値を表６に示す。ＧＭ２−ＫＬＨ単独またはこれに１０μｇのＱＳ−２１を加えたものでは、時折穏やかな局所の紅斑および硬結が生じ、ＱＳ−２１の投与量を増やすに従い、局所反応の頻度および重度も大きくなった。１０および５０μｇの投与では、２４−４８時間継続する軽度の軟化ならびに２−４ｃｍの紅斑および硬結が導かれた（グレード１を超える毒性は検出されなかった）。より大きな投与量では、これらの反応は、殆どの反応においてより顕著になり、直径８−１０ｃｍ、ある場合（２００μｇの投与）には、直径２０ｃｍに達した。これらの反応は、１００μｇの投与では総じて２−４日間、ある例では７日間継続し、２００μｇの投与では総じて７日間、ある例では１０日間継続した。タイルノール（tylenol）よりも強力な鎮痛剤を必要とすることはなく、１０、５０および１００μｇの投与を受けた患者は、普通に活動を遂行し続けることができた。ワクチン接種された四肢の使用は、２００μｇのＱＳ−２１を含有する大部分のワクチンの投与を受けた後、５−８日間制限された。しかし、患者が次の試験を受けた２週間後までには、局所反応の痕跡はすべて消失していた。潰瘍および排膿または皮下の瘤（ほとんどの他のアジュバントで見られる）は検出されなかった。時折見られる短時間の、穏やかで低度の発熱または筋肉痛がＱＳ−２１含有量の小さい３種類のワクチン接種の後にみられたのに対して、ＱＳ−２１の含有量が２００μｇであるワクチン接種の場合には、約３分の１でこれらの症状がみられた。一般に、全身症状は２回目の免疫感作の後に最も顕著であった。２００μｇのＱＳ−２１を投与したグループの患者全員について、局所反応および全身反応の増大を考慮して、３回目および４回目の免疫感作ではＱＳ−２１の量を１００μｇまたは５０μｇに減少させた（この投与量を漸減した免疫感作での副作用は、表６の１００μｇおよび５０μｇの下に記録されている）。これらの投与量は十分に許容され、５人の患者全員（１名の患者では疾病の進行があったため４回目の免疫感作の後に実験計画より除いた）について、５回目の免疫感作では２００μｇに投与量を回復させた。５回目の免疫感作を受けた５人のうち２人は、発熱および流感様の症状を呈し、一人は２０ｃｍの局所紅斑および硬結の症状をも呈した。この患者のＱＳ−２１投与量は、６回目の免疫感作では１００μｇに減らされて、全身症状は現れず、局所反応も穏やかであった（３−４ｃｍの紅斑および硬結）。それ以外の４人では、２００μｇのＱＳ−２１を投与した６回目の免疫感作において、誰にも全身症状が現れなかった。全身症状は全体に亘ってまったく穏やかなものであったが、局所紅斑、硬結および軟化について２００μｇの投与で顕著だったので、出願人らは、ＱＳ−２１のより大きい投与量での実験を取り止めた。
ワクチン接種後のＧＭ２に対する抗体応答（表７参照）
ＧＭ２−ＫＬＨ単独での免疫感作の結果は、抗体の力価においては、ＢＣＧの表面に結合されたＧＭ２を含有するワクチンを用いたこれまでの研究に見られた結果とまったく同様であった。６人の患者のうち、５人ではＩｇＭ抗体を産生し、１人だけがＩｇＧ抗体（低力価）を産生した。ＩｇＭ抗体の力価は、ＱＳ−２１の投与量の増大に伴って大きくなった。逆数中間値換算のＩｇＭ抗体の力価は、ＧＭ２−ＫＬＨ単独での免疫感作の後では８０であり、１０または５０μｇのＱＳ−２１の投与の後では（それぞれ）４８０および２４０であり、１００または２００μｇのＱＳ−２１の投与の後では１２８０であった。ＩｇＧ抗体の力価は、投与量を増やすにしたがって大きくなっていった。すなわち、ＧＭ２−ＫＬＨを単独で接種された患者では０であったが、ＱＳ−２１を１０、５０、１００および２００μｇ投与された患者では、それぞれ１０、６０、２００および６４０であった。顕著な力価のＩｇＭ抗体および検出可能なＩｇＧ抗体（ＥＬＩＳＡおよびドットブロット法免疫染色による）が、ＧＭ２−ＫＬＨにＱＳ−２１を併せて接種した患者全員に見られた。ＱＳ−２１を１００および２００μｇ投与された、６人の患者群ごとのＩｇＭ抗体およびＩｇＧ抗体の力価の経時変化が、図９に示されている。全体として、ＩｇＧのＥＬＩＳＡ測定値は２００μｇ投与のグループのほうがわずかに高いが、抗体応答は２つのグループで全く同様である。ＧＭ２に対するドットブロット法免疫染色により、ＧＭ２への特異性ならびに１００および２００μｇの投与における反応が同様であることが確認された（表７および図１０参照）。ＧＭ２に対するＩｇＭドットブロット反応の中間値は、ＧＭ２−ＫＬＨ単独の接種を受けた患者では２＋であるが、ＱＳ−２１を１０または５０μｇ併せて接種された患者では２＋から３＋の間であり、ＱＳ−２１を１００または２００μｇ併せて接種された患者では３＋まで増加する。ＩｇＧの反応では、ＱＳ−２１を接種されなかった患者では０であるが、ＱＳ−２１を１０または５０μｇ接種された患者では２＋であり、ＱＳ−２１を１００または２００μｇ接種された患者では３＋まで増加する。
ＧＭ２抗体応答の特異性解析
５つの治療群のそれぞれの代表的患者２名について、免疫感作前後に得た血清のドットブロット法免疫染色の結果を図１０に示す。免疫感作に先立って、出願人がすでに記載したようにして、多くの患者血清においてＧＭ１に対するＩｇＭの反応性を明らかにされたが、ＧＭ２または他のガングリオシドへの反応性は検出されなかった。これに続く免疫感作によっても、ＧＭ１での反応に影響はなかったが、ＧＭ２に対するＩｇＭ抗体およびＩｇＧ抗体はすべての患者にみられた。出願人らがすでに報告したように（１３）、これらの誘起されたＧＭ２抗体は、ときにはＧＤ２との交差反応性を示す（患者１、１００μｇ投与）。
ＫＬＨおよびＯＳ−２１に対する血清学的応答
表７に示す通り、ＫＬＨに対する反応は、免疫感作以前には見られず、ＱＳ−２１投与量を増やすことによって次第に大きくなる。ＱＳ−２１を５０、１００および２００μｇ投与することにより、その投与量が０または１０μｇの場合よりも、ＫＬＨに対するＩｇＧ抗体の力価は著しく高く誘起されるが、５０、１００および２００μｇの投与で誘起された血清学的な力価の間には明確な相違はなかった。ＱＳ−２１に対する抗体の力価は、４種の免疫感作の後にＥＬＩＳＡにより測定された。免疫感作の前後の血清試料の間には、ＱＳ−２１に対する抗体の目立った増加は見られなかった（データ掲載せず）。
ＧＭ２およびＫＬＨに対するＤＴＨ応答
ＧＭ２またはＧＭ２−ＨＳＡの皮膚試験部位では、紅斑または硬結は検出されなかった。ほとんどのＫＬＨ皮膚試験部位では、２４および４８時間の時点で著しい紅斑反応が検出され、これらの反応は、２００μｇの投与を受けた患者で最大であった（直径の中間値は４．０から６．０ｃｍ）。これらは最小の硬結のみ関連する。このことは、ＤＴＨおよび抗体が共同で媒介する反応であることを示唆し、ＤＴＨ反応（在宅患者による）の正確な定量を困難にする。
さらなる臨床試験
上記のワクチン（バイオミラ社）を同じ投与量で用いて、さらに病状の進行した６人の患者の治療を行った。新たに加わった病状の進行した６人の患者に対しては、１００μｇのＱＳ−２１に１／１０量部増量したＧＭ２−ＫＬＨを併用して治療を行った。両グループの抗体の力価は、疾患早期の患者にみられるよりも小さかったが、７μｇのＧＭ２を投与することにより、７０μｇの投与に匹敵するだけの力価のＩｇＭ抗体およびＩｇＧ抗体を誘起する効果があることがあきらかとなった。
別の研究では、疾患早期の６人の患者がＧＭ２−ＫＬＨの構成物で治療された。ＩｇＭ抗体の力価は若干低く現れるが、ＩｇＧ抗体の力価は、バイオミラの構成物によるものを投与された後にみられた値に匹敵した。しかし、患者は全員が免疫感作により抗体を産生し、ワクチンは十分に受容された。
さらに進んだ研究が、初めに１週間のインターバルをおいて、ＧＭ２−ＫＬＨのワクチン接種を受けた患者により為される（ハツカネズミでの研究において、優れていることが示されたスケジュール）。患者は無作為抽出され、何人かの患者は少量のシクロホスファミド投与の前処理がなされず、そのほかの患者は少量のシクロホスファミド投与の前処理がなされた。このときまでに患者は１０人増えて、シクロホスファミドを投与された患者とシクロホスファミドを投与されない患者との差異は見られない。そして、この新たなスケジュールでの抗体の力価は、この時には同じ複合体を用いたこれまでの試験におけるよりも優れていることがわかる。
＜考察＞
この研究は、外来患者に対応して用いるためのＱＳ−２１の最大許容投与量（ＭＴＤ）、並びに最大の免疫強化効果を与えるＱＳ−２１の投与量を確かめることを意図したフェーズＩ試験であった。ワクチン接種によって、２００μｇのＱＳ−２１がおおよそのＭＴＤであることが確認された。２００μｇの投与での低度の発熱および不快感、並びに大きな局所炎症反応により、ＩＬ２の大量投与またはメラノーマが進行した入院患者に用いられる複合化学療法（２３，２４）といった背景があるときには、これがＭＴＤであると考えることはできないが、これらはアジュバントを設定してのガン患者の通院治療において重要であり、また健常な被接種者において感染病に対する免疫感作としては許容され得ないであろう。しかしながら、１００μｇの投与では、４４回の注射において低度の発熱が僅かに２回あっただけであり、局所の炎症応答は日常の行動の妨げとならず、それもおよそ２−４日に限られていた。この臨床試験において上記投与量は、患者集団に十分に許容された。１００μｇから２００μｇに投与量を増やすことにより明らかに、局所および全身に対する毒性が大きくなった。このことは、投与量を増やし続けることを躊躇させるものであった。最大投与量での発熱および不快感は、ＢＣＧおよびＤＥＴＯＸのような他の免疫学的アジュバントでときにみられた症状に似ていたが（１５，２５）、局所反応はまったく異なっていた。２００μｇのＱＳ−２１の皮下注射投与により、直径１０−２０センチメートルの範囲の、触れると発熱と軟化がわかる紅斑および硬結が起こった。この局所応答は、同じくらいの全身症状を発症させるＤＥＴＯＸまたはＢＣＧの投与で一般にみられる応答反応に比べてより弛緩したものといえる。上記のこれら応答の驚くべき特徴は、数日（または最大でも１０日）後には反応が完全に消失していたことであり、該症状のみられた部位にワクチン接種がなされたことの痕跡はなかった。いずれの患者でも、注射部位に、潰瘍、排膿または瘤の形成は見られなかった。
本研究における２つ目の驚くべき発見は、採用したあらゆる投与量において、ＱＳ−２１はＧＭ２ガングリオシドに対して質的に異なる免疫応答を引き出すことである。１０μｇの投与でさえ、すべての患者が、ドット・ブロット法免疫染色で検出可能なＧＭ２に対するＩｇＧ抗体を産生する。ＧＭ２−ＫＬＨワクチンを単独で、またはＢＣＧもしくはＤＥＴＯＸの最適量と共に投与した場合でも、或いはＧＭ２をＢＣＧ、サルモネラ・ミネソタ突然変異株Ｒ５９５もしくはプロテオゾームの表面に結合させたものを投与した場合でも、６人の免疫感作された患者について検出可能なＩｇＧ応答を２例以上得られたのはほんのわずかであった（２，４，５）。ＧＭ２に対するＩｇＭ抗体およびＩｇＧ抗体の力価は、ＱＳ−２１の投与量増加とともに増大したが、１００から２００μｇの投与量において限界に達することがわかった。ＫＬＨに対するＩｇＧ抗体も同様に、ＱＳ−２１の投与量増加とともに増大した。ＩｇＧ抗体のピーク力価は、０または１０μｇの投与にくらべて、５０、１００および２００μｇの投与の方が著しく高かった。しかし、３つのより高い投与量での力価のあいだには、お互いに有意な差異はなかった。これらの結果は、１００および２００μｇの投与量のＱＳ−２１はＧＭ２に対する最適の免疫応答を引き出し、患者の許容の点では１００μｇの投与量が優れていることを示す。ＧＭ２−ＫＬＨの単独投与または、ＧＭ２−ＫＬＨに種々の投与量のＱＳ−２１を併用して免疫感作された患者において、ＫＬＨに対する最初の紅斑状の皮膚の試験応答反応は予期しないものであった。これは、抗体に媒介されたアルツス様応答反応およびＤＴＨ応答反応の組み合わせを示すと思われる。また、皮膚試験でのＫＬＨの投与量が、他で行われた研究（２６）で用いられた量よりも小さかった（１００μｇに対して２５μｇ）ために、検出可能な強いＤＴＨ反応を生じるには不十分であったか、或いはワクチンのＫＬＨに結合したＧＭ２ガングリオシドのエピトープ密度が高すぎて、ＫＬＨへの古典的なＤＴＨ反応を誘導するのに必要な通常の抗原プロセシングおよび抗原呈示が得られなかった可能性もあり得る。
ＱＳ−２１およびそれ以外のサポニン含有アジュバントが実験動物および獣医学上の実践において広範に用いられているにも拘らず（１４−１９）、それらの作用機構はいまだに良くわかっていない。本研究から、ＱＳ−２１の作用機構について若干の推理を働かせることが可能である。注射部位に触診で分かるような瘤形成がないことから、肉芽腫形成におけるデポ効果（a depo effect）が起こらないことが示唆される。ＱＳ−２１はアジュバントとして強力であるにもかかわらず、抗原性に乏しいように思える。繰り返して免疫感作された後でさえ、抗体の応答は検出されなかった。それゆえ、Ｃパルブム（C parvum）、ＢＣＧおよびフロイントの完全アジュバントのような他のアジュバントと異なり、ＱＳ−２１の抗原性はそのアジュバント効果には寄与していないと思われる。２００μｇの投与でみられた低度の発熱および不快感、ならびに注射部位での拡散した紅斑および硬結から、サイトカインの放出もあることが示唆される。ＩＬ−２の真皮内注射では、生検したところ、古典的なＤＴＨ応答の特徴に大変よく類似した反応がもたらされた（２７，２８）。ＧＭ２抗体応答のＩｇＧ抗体での応答への部分的切り替えは、おそらく、このサイトカイン誘導の結果としてのＴ細胞補助の誘導を示唆する。
出願人らは最近、ガングリオシドの免疫原性を強化するために試みられたさまざまなキャリアよりも、ＫＬＨが優越していることを証明してきた（１２）。出願人らはここに、上記の効果をさらに強化するためのＱＳ−２１の最適投与量を示す。出願人らが、ＡＪＣＣステージIIIのメラノーマ患者におけるガングリオシドワクチンの大規模なフェーズIII試験を準備する際、未だ試験されていない多くの変数が残されている。出願人らは現在、このガングリオシド−ＫＬＨにＱＳ−２１を組み合わせたワクチンに、更に幾つかのその他の免疫学的アジュバントを併用することについて前臨床段階の研究を行っている。加えて、異なるスケジュールでの免疫感作および異なるＧＭ２−ＫＬＨの投与量での臨床試験を計画中である。ここに記載されたフェーズＩ試験での驚くべき発見は、１）いかなる投与量のＱＳ−２１に対しても肉芽腫形成の指標がみられなかったこと、および２）良好に許容された１００μｇの投与量のＧＭ２に対する血清学的応答は、量的にも質的にもこれまで試験されたＧＭ２ワクチンではまったく見られなかったほどに著しく優れていることである。
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第５実験シリーズ
＜序＞
悪性黒色腫の発生は、この十年間に急速に増加してきた。１９９２年には、合衆国において３２、０００以上の個人が黒色腫を発症し、６、７００人の黒色腫による死亡が記録された（１）。原発黒色腫を適切に切除した後、５年間の生存率は、厚さ≦０．７５ｍｍの原発腫瘍を持つ患者での９５％以上から、厚さ＞４．０ｍｍ原発腫瘍をもつ患者での５０％の範囲にわたる（２）。局所リンパ結節転移（ＡＪＣＣ段階III）の患者は、選択的または治療的な切除を行なった後の、５年間生存率は２５−３５％である（３）。これらの患者において、術後の再罹患率を減少させ生存率を増加させるアジュバンド治療はない事がわかっている。ケミカル治療、非特異的免疫刺激剤、インターフェロン、種々の黒色腫ワクチンを含めて、広範にわたる様々な試薬が、これらのアジュバンド試用試験でテストされてきた（引用４、５を参照）。黒色腫ワクチンについては、結果として起こる免疫反応の強さおよび特異性によって、ワクチンの免疫原性をモニターできる方法を開発する努力がなされてきた。ワクチンに対する体液免疫反応は、細胞性免疫反応によって現在になって可能になりつつある精度で定量、分析することができるので、出願人は、体液免疫性を誘発する黒色腫抗原に焦点をあてた。これらの血清学的に規定される抗原のうち、ガングリオシド、とりわけＧＭ２は、能動免疫の誘引ターゲットとして浮上してきた（５−８）。出願人が最近示したことろによると、低投与量のＣｙで前処理した後、ＢＣＧ付着性である精製されたＧＭ２によって免疫感作した結果、高パーセンテージの黒色腫患者において、ＩｇＭ抗体が誘導される事がわかった（８、９）。ＧＭ２抗体反応は、Ｔ細胞非依存性パターン；すなわち短持続期間、ＩｇＧ反応の欠如、ワクチン繰返し投与のブースター効果の欠如、であることがわかった。誘発された抗体は、ヒト補体存在下で、ＧＭ２発現黒色腫細胞に対して細胞毒性であり、免疫感作後にＧＭ２抗体を産生する患者は、しない患者よりも著しく長い、無疾患期間および生存を示した（９）。本研究の目的は、無作為抽出制御試験においてワクチン誘発性ＧＭ２抗体生産の利点を確認することである。
＜材料および方法＞
患者
局所スキンおよびリンパ結節（ＡＪＣＣ段階III）にのみに病理学的に証明された黒色腫転移を保持する患者は、スキン転移または局所的リンパ結節の完全切除後、２−１３週間にわたり適性であった。他の適性基準には、年齢＞１５、カラノフスキー性能段階≧９０、血清クレアチニン＜２．５ｍｇ／ｄｌ、血清ビリルビン＜２．５ｍｇ／ｄｌ、他の癌を保持していない事、化学治療または放射線治療をワクチン投与の前８週間の間受けていない事、が挙げられる。妊娠中の女性は排除された。無作為抽出以前２週間以内に全患者を調べ、適格性を決定した。引き続き臨床的追跡調査が、患者の主担当腫瘍学者によってなされた。
無作為抽出および追跡調査
インフォームドコンセントを全患者より得、陽性リンパ結節の数（１、２−４、≧５）、罹患途中の疾患の存在、および手術とワクチン投与の間の期間（２−６、７−１３週間）によって患者を層別した。患者はコンピュータによって（二本の腕の偶数を合理的に確保するに、適応したブロックサイズの割り当てで）無作為抽出され、ＧＭ２／ＢＣＧ、またはＢＣＧの単独でワクチン投与された。患者も医療職員も投与されるワクチンのタイプを最終ワクチン投与後２週間経つまで知らされなかった。全患者についての追跡情報は、４−６ケ月毎に１週間にわたって行なわれる彼等の主担当医による電話によって得られた。放射線学的にまたは病理学的に証明された再発のデータは、無疾病期間を決定するのに使用された。本ワクチンアプローチの二つの非特異的成分、ＢＣＧおよび低投与量の環状ホスファミド（cyclophosphamide）は、抗腫瘍活性（１０，１１，１２）を実証することが可能であるので、処理をしないで対照腕とすることよりも、これらの成分がより適切であると考えられた。
ＧＭ２／ＢＣＧワクチン
ワクチン生成に使用されるガングリオシドＧＭ２は、２つの源、すなわちテイ・サックス（常染色体劣性特性としてネコに遺伝する）病を保持するネコの脳組織から、またＧＭ１は、家畜牛の脳から調整されるかまたはスペルコ（Supelco, Bellefonte, PA）より購入した。テイ・サックス病ネコの脳（Dr. Mario Ratazzi, Mt. Sinai Hospital, New York, NYより提供）の切片を、クロロフォルム／メタノールで抽出し、その抽出物を過酢酸化し、フロリシルクロマトグラフィーにかけ、リン酸化脂質を除去し、脱アセチル化、透析を行い、ＤＥＡＥセファデックスカラムクロマトグラフィーにかけた（１３）。透析後、ＧＭ２、すなわち主要分画を分分取薄層クロマトグラフィーで分離した。ＧＭ２は、牛の脳ＧＭ１から、前述したように、βガラクトシダーゼを使用した末端ガラクトシダーゼの切断によって調整された（１４）。２つの源からのＧＭ２は、薄層クロマトグラフィー（ＴＣＬ）およびＧＭ２を認識するネズミのモノクローナル抗体を使用した免疫ＴＬＣによって区別することが出来ない（１３）。ＧＭ２の各バッチは、薄層クロマトグラフィーおよびデンシトメトリックスキャンで規定したところによると、９８％以上の純度であった。バッチは滅菌性について、およびギニアピッグ及びネズミにおける安全性について、標準テストによって試験された。
精製されたＧＭ２は、乾燥され、４℃で貯蔵され、マウス系ＢＣＧ（イリノイ大学、シカゴ、イリノイ州）の１０７の生存単位（または、陽性ＰＰＤテストで患者に使用する３ｘ  １０５生存単位）を、２００μｇの乾燥精製されたＧＭ２と一緒に蒸留水中に超音波で懸濁した。懸濁液は凍結乾燥し、−８０℃に貯蔵した。残査を、ワクチンを投与の少し前に、０．５ｍｌのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中に再懸濁させた。これらの条件下において、ＧＭ２が、おそらく疎水結合によってＢＣＧに付着することが、出願人が以前報告してあるとおりに（８）認められた。対照グループに使用されるＢＣＧはＰＢＳ中に懸濁された。ＧＭ２／ＢＣＧグループの全患者は、一回のワクチン投与につき２００μｇのＧＭ２が投与された。これらのワクチン及びワクチン投与のプロトコールは、記念病院協会審議委員会（Memorial Hospital Institutional Review Boardによって認可され合衆国食品医薬品局によるＩＮＤ下で使用される。最初の患者は、ネコの脳起源のＧＭ２を投与された。続いて、ＧＭ１由来のＧＭ２の比率を増やしながら、使用された。なぜならば、ネコの脳のＧＭ２は、もはや入手出来なかったからである。全患者は、完全なリンパ排出系（ドレナージ）をもった手足の６−１０部位に皮内ワクチン注射を受け、これを２週間間隔で二回、毎回異なる手足を使用して繰り返した。ブースター免疫は、最初の一連のワクチン投与後２ケ月のよび５ケ月後に投与した。
Ｃｙ投与
一回の投与量２００ｍｇ／Ｍ２（シトキサン、Mead Johnson and Co., Evansvine, In）を全患者に対して、最初と４回目のワクチン注入時の前に、５回から７回、皮下に投与した。
ガングリオシド試薬
ＧＤ１ｂをβガングリオシダーゼ（G.W.Jourdian, University of Michigan, Ann Arbor, MI）によって、公表の方法（１４）に従って処理して、ＧＤ２を調整した。ＧＭ１は、スペルコ（Supelco）（Bellafonte, PA）より購入した。ＧＤ３は、フィデイア研究所（Fidia Reseaarch Laboratories）（abano Terme Italy）から寄贈され、ＧＤ１ｂは同所より購入した。ＧＭ３は、犬赤血球より精製された（１３）。ドットブロット免疫染色用のＧＭ２は（図１１）、ＧＭ１よりβガラクトシダーゼによる処理で調整されたか、または先に述べたように（１３）、ヒト黒色腫生検標本から抽出された。
血清学的手法
血清は、各ワクチン投与時、ワクチン３、４、５を投与して２及び６週間後、及びワクチン５を投与して、３か月後にに得られた。ＧＭ２またはＢＣＧ抗体（９）に対するエリザ法は、患者の血清、ラビット抗ヒトＩｇＭあるいは抗ヒトＩｇＧ第二抗体、またはアルカリフォスファターゼ（Kirkegaad and Perry Labs, Gaithersburg, MD）と抱合したプロテインＡでおこなわれた。ＧＭ２反応性の無いドナー由来の正常血清で得られた読取り値を、患者の血清の読取り値から差し引いた。抗体価は、前述したように（９）、修正吸光度が、＞０．１０となる最大の血清希釈であると規定された。ドットブロット免疫染色は、前述したように行われ（８、９）、図１１に示したように、０、１＋、２＋または３＋と段階分けされた。ＧＭ２の反応性が、エリザ価≧１／２０で、ドットブロットが２＋あるいは３＋、またはエリザ価≧１／８０でドットブロットが１＋であるならば、陽性と類別された。補体依存性細胞毒性分析は、前述したように、正常ヒト血清（１／３希釈）を補体源として使用して行ない、ギムサ染色によって非生存細胞を肉眼で定量した（（８、１５）。
遅延型過敏症（ＤＴＨ）に対するスキンテスト
単層リポソームを、卵のフォスファチジルコリンから調整し、０．１ミクロンフィルターを１０回通した。スキンテストの日（第４回目のワクチン投与後２週間）、１．５ｍｇのフォスファチジル・コリン・リポソーム及び２５μｇＧＭ２をＰＢＳ中で混合し、ブランソン（Branson）２００水浴超音波機（Shelton, CT）で、超音波処理した。スキンテストを、０．１ｍｌ容量で、ａ）２５μｇＧＭ２、ｂ）２５μｇ／１．５ｍｇのＧＭ２／リポソームで行い、前述したように（１６、１７）、４８時間日に読み取った。
＜結果＞
患者の特徴
１９８７年３月１０日より１９８９年３月１７日の間に、全部で１２３患者が登録された。見てみると、患者一人は、ＡＪＣＣ第二段階の疾病（陽性リンパ結節無し）であることが分かったので、該分析には含めなかった。Ａ１１  １２２人の適格患者は、ワクチン授与人数にかかわらず、該分析に無作為抽出されるものとして包含された。２患者（各グループに一人）が、一回目の免疫感作後に不確実な実験的治療及び無作為抽出を行うことが非常に難しい事が判明したので、本研究よりはずされることが決定された。ＢＣＧグループの１患者は、疾病の進行が検出された時、たった二回の免疫感作しか受けておらず、処置の継続を中止した。他の全患者は、少なくとも最初のシリーズの３回の免疫感作を受けて、その完了まであるいは疾病の進行があるまで、プロトコール上に残された。ＢＣＧグループの１患者は、５回目のワクチン投与内に、偶然にＧＭ２／ＢＣＧを受けた。（彼は、ＧＭ２抗体を産生し、疾病にかからずに済んだ）。追跡調査平均は、無作為抽出手術後、５年と３ヶ月で、最小追跡調査は４年と３ヶ月であった。
１２２無作為抽出患者の特徴は、表８に示す。第三段階の黒色腫を持つ患者の単一で最も重要な予後判定指標は、陽性リンパ結節の数である（３）。他の小さな予後判定に関わる要因には、原発部位である頭、首または胴体および転移中の黒色腫がある（３）。ＧＭ２／ＢＣＧ及びＢＣＧグループを、これらの予後判定指標について比較した。
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副作用
Ｃｙによる前処理すると、２−２４時間にわたる穏やかな吐き気、または不快感をもたらすことが時々あったが、たいていは、十分耐えられるものであった。ＢＣＧの皮内注射の結果、３回以上の免疫感作を受けた全患者に炎症および、排液をともなった痂皮形成を起こした。炎症反応を許容できる程度に保つためには、痂皮形成および排液が最初に検出された時に、ＢＣＧの投与量をファクター３にまで減少させることである。その結果、両治療グループにおけるＢＣＧ投与量平均は、最終免疫感作時において３ｘ１０６生存細胞単位であった。１０７単位の投与量は、患者１０％においてのみ保持されており、在る患者では、さらに１０５までのｖ投与量の減少が見られた。ＧＭ２はＢＣＧ対する炎症反応において何の効果も示さず、他の副作用もおこさなかった。
ＧＭ２に対する血清学的反応
ＧＭ２／ＢＣＧ免疫感作の全シリーズを受けた最初の５処置患者（１９８７）、最後の５処置患者（１９８９）について、ＧＭ２／ＢＣＧによるワクチン投与の前後の、ＩＧＭ抗−ＧＭ２抗体価を継続して図１０に示す。前の研究にあるように（９）、抗体反応は、ＩｇＭ型が優勢で、各免疫感作後、しばしば力価に増加が見られ、記憶喪失の二次反応よりもむしろ反復性の第一時反応に類似していた。全患者からの免疫感作前、最高力価の免疫感作後血清は、ドットブロット免疫染色でもテストされ、エリザ法で検出された抗体の特異性を確認した。図１０に示された１０血清によるドットブロット免疫染色を図１１に示す。ＧＭ１に対する暫時の低力価前処理反応性を、先に記述したように（８，９）検出した。反応性を誘発するワクチンはＧＭ２に限られており、ＧＭ３、ＧＤ２，ＧＤ１ｂ，ＧＤ３とは何の反応性もみられなかった。いた。ＧＭ２抗体は、ＧＭ２発現腫瘍細胞とヒト補体のテストにおいて、補体依存性細胞毒性を与えることができた（表９）。２年の患者増加期間にわたって、このパターンの抗体反応における変化、および特異性はみられなかった。全患者についての血清学的分析の結果は表１０に要約されている。該６４患者の内７人が、ＢＣＧの腕に、エリザ（平均力価１／４０）及びドットブロット免疫染色（平均２＋）の両者によってＧＭ２抗体を示している事がわかった。抗体は５事例においては、あらかじめ存在しており、２事例においては、ＢＣＧワクチン投与後に、初めて検出された。ＢＣＧ免疫感作前にＧＭ２抗体をもっていた５人の患者の内３人においては、ＢＣＧ免疫感作後、ＧＭ２抗体の力価が、４倍以上に増加した。対照的に、ＧＭ２／ＢＣＧをうけた５８人の患者の内ただひとりのみが、免疫感作前に両アッセイによってＧＭ２反応性を示し、５８患者中５０人が免疫感作後の血清中に、ＧＭ２抗体（平均エリザ力価１／１６０）を示し、ドットブロット免疫染色（平均３＋）によって確認された。２つグループにおける全体のＩｇＭ抗−ＧＭ２血清学的反応率（２＋，３＋ドットブロット及びエリザ力価≧１／２０またはドットブロットで１＋およびエリザ力価≧１／８０）は、ＢＣＧのみに対して１１％、ＧＭ２／ＢＣＧに大して８６％であった。
ＩｇＧ抗体は、免疫感作前にはどの患者の血清中でも検出されず、ＢＣＧ免疫感作によってどの患者中でも誘導されなかった（表１０）。ＧＭ２／ＢＣＧによるワクチンを投与すると、８患者中に陽性ＩｇＧ抗体反応が誘導された（平均エリザ力価１／８０，平均ドットブロット２＋）。これらの反応は、短命（平均持続期間８週間）で、さらに免疫感作しても一般的には増加しない。すべても事例においてＩｇＧ反応性は、ＧＭ２に限っておこる（データ表示せず）。８患者はまた全て、高力価のＩｇＭ抗体をもっており、ＩｇＧ抗体よりも長期の持続時間をもっていた。
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ＧＭ２に対するＤＴＨ反応性
ＧＭ２及び他の抗原に対するＤＴＨについてのスキンテストは、３回の初期ワクチン投与シリーズ後に行われた。３回以上の免疫感作を受けた患者は全て、ＢＣＧに対する強力なＤＴＨ反応を発生させた。８患者（４人は、ＢＣＧでワクチン投与され、４人はＧＭ２／ＢＣＧでワクチン投与された）は、ＧＭ２及びＧＭ２リポソームに対して（ＧＭ２をスキンテスト部位に保持するために使用する）陽性のＤＴＨ反応を示し、硬化部分が１０から３３ｍｍの範囲にわたった。さらにテストでは、これら８患者が、無ガングリオシドのリポソーム及び他のガングリオシドとも同様の反応性を示した。この様に、どの患者においてもＧＭ２特異的ＤＴＨの形跡は、得られなかった。
ＢＣＧに対する血清学的反応
ガングリオシドについて述べた様に、全患者からの血清を、エリザプレート上に乾燥させた１０３生存有機体／ウエルＢＣＧに対するＩｇＧエリザ反応についてテストした。ワクチン投与前は反応性は見られなかった。ワクチン投与後の血清は、両処置グループで、患者がＧＭ２抗体を産生するか否か関係無く、ＢＣＧ抗体力価１／４０−１／８０を示した。
抗体反応および免疫感作と無疾病期間および生存との相関関係
２つの分析（≧１／１８０のエリザ力価およびドットブロット１＋、またはエリザ力価≧１／２０、ドットブロット≧２＋）で証明されたＧＭ２抗体を産生する全患者と、ＧＭ２抗体を産生しない全患者についての無疾病期間および全生存との比較が図１２に示されている。無疾病期間および全生存の両方において、顕著な差が見られる（対数ランクテストで、夫々ｐ＝０．０４および０．０２）。免疫感作前（５人はＢＣＧを受け、一人はＧＭ２／ＢＣＧを受ける）に、ＧＭ２抗体を産生した６患者の内、ただ一人（ＢＣＧグループの一人）が疾病の再発をみたことは、黒色腫罹患者においてＧＭ２抗体が自然に産生されることが、好ましい成り行きであることを示唆している。逆に、ＧＭ２／ＢＣＧによるワクチン投与した後ＧＭ２抗体を産生しない８患者の内、６人が黒色腫を再発し、死亡したことは、ワクチン投与後のＧＭ２抗体の産生における欠陥が好ましいからざる病気経過を示す事を示唆する。自然にＧＭ２抗体を産生する６患者平均ＢＣＧ抗体力価が、ＧＭ２／ＢＣＧ腕においてＧＭ２抗体陰性である８人の患者における力価と同じであったことは、これらの患者の、無関係な抗原に対する血清学的反応を起こす能力に差異が無かったことを示す。
無作為抽出前に、ＧＭ２抗体を産生する６患者（５人は腕にＢＣＧを、一人はＧＭ２／ＢＣＧ）を該分析から除外すると、ＧＭ２／ＢＣＧグループの無疾病間隔が、ＢＣＧグループ（対数級テストｐ＝０．０２）より著しく長く、全体の生存が長くなる傾向が、ＧＭ２／ＢＣＧグループに対してみられた（図１３）。カーブは、無疾病期間および全生存では、夫々２３％および１４％と差異をもって、４２−５３ヶ月で水平に達する。免疫感作後、ＧＭ２と反応性であるＩｇＧ抗体を産生する患者の数が少ない事で、ＧＭ２に対するＩｇＭおよびＩｇＧ抗体の相対的メリットについての結論を引き出すことが出来ない。ＩｇＧ・ＧＭ２抗体に対して陽性の８人中５人の患者が、このとき無疾病のままである。
無作為抽出した時の２つの処置グループの比較が図４に示されている。カーブは、４０−５２ヶ月で、無疾病期間で１８％の差異、ＧＭ２／ＢＣＧによるワクチン投与による全生存においては１１％の差異をもって水平に達する。これらの差異は統計学的には重篤ではない。ＢＣＧグループにおいて、５１ヶ月（追跡調査の最小期間）時点での無疾病期間（３０％）、全生存率（４６％）は、ＢＣＧを受けるかまたは無処置にするかで無作為抽出された患者において出願人が初期に観察した率と同じである（２８）。図１４に示したように、免疫感作の利点は、２つの処置グループが、陽性結節の数で階層分け（１対２以上）した時により顕著であった。免疫感作は、たった一つの陽性結節を持つ患者の無疾患期間率に対しての効果は少なかった。反対に、ＧＭ２／ＢＣＧを受けた２以上の陽性結節を持つ患者の無疾患期間は、ＢＣＧ単独（対数級テストでｐ＝０．０２）で免疫感作された患者よりも著しく長かった。同様の傾向が生存（対数級テストでｐ＝０．０８）についてもみられた。
＜考察＞
出願人は、高レベルの血清抗体を誘発するガングリオシドワクチンの開発に多大な努力を払った（18、19）。なぜならば、１）ガングリオシドはメラノーマ細胞の主要な細胞表面構成要素であり（14、20−25）、２）ガングリオシドに対する特異性を有するヒトモノクローナル抗体を比較的高い頻度でメラノーマ患者から単離することが可能であり（14、25−28）、および３）ガングリオシド抗原を発現するヒト腫瘍細胞をヒト補体の存在下で抗ガングリオシド抗体によって溶解することが可能である（13、29）からである。ＧＭ２ガングリオシドはヒトにおいて特に免疫原性であることが見出されており、精製されたＧＭ２とアジュバントとしてのＢＣＧとを含有するワクチンは低用量シクロホスファミドで予備処置されたメラノーマ患者においてＧＭ２抗体を引き出すことが示されている（８、９）。ここに報告される研究は、２つの質問−ＧＭ２／ＢＣＧワクチンを用いた免疫化が高いパーセンテージでメラノーマ患者にＧＭ２抗体を誘発するか、およびＧＭ２抗体の誘発が、全ての公知の腫瘍を完全に切除した後のステージIIIの患者において疾患の経過を変えるか？−に解答することを目的とした。
ＧＭ２抗体の誘発に関しては、ＧＭ２／ＢＣＧでの免疫化は患者の大多数において明らかに有効である。ＧＭ２／ＢＣＧワクチンを受けた58名の患者のうち50名が、ＥＬＩＳＡおよびドットブロット免疫染色アッセイの両者で検出されるＧＭ２抗体を産生した。初期の実験（９）と同様に、誘発されたＧＭ２抗体はほとんどＩｇＭクラスのものであった；ＩｇＧ抗体は頻繁には検出されなかった。ＧＭ２抗体産生とより好ましい臨床コースとの相関（９）もまたここで確認され、罹患していないＡＪＣＣステージIIIメラノーマ患者のより均質な母集団に広げられた。ＧＭ２抗体を産生する患者は（自然にもしくはワクチンに誘発されてに関らず）、抗体応答を示さない患者よりも、有意に長い期間病気にかからず、全て生存している。この一連の実験において、６名の患者においてＧＭ２抗体が予め（免疫化以前に）存在することが見出され、これは特に好ましい前兆に結び付くものと思われた。自発的なＧＭ２抗体産生の発生率は一般的な母集団とメラノーマ患者とで似ている（10％）と思われる（８、９）ので、メラノーマ発生と成長に対するそれらの関係は未知のままである。ワクチン誘発ＧＭ２抗体が一般に免疫化の後８−12週間のみ検出可能のままであるのに対して、予め存在するＧＭ２抗体の力価は９ヵ月の追跡期間にわたって変化しなかったことは注目に値する。この観察は、好ましい臨床成果をあげるためには抗体産生が永続することが重要である可能性を惹起し、これは長期間持続するＧＭ２抗体応答を産生するＧＭ２ワクチンの開発の必要性を示している。ＧＭ２抗体を産生するワクチン接種された患者と対照的に、ＧＭ２／ＢＣＧで免疫化した後であってもＧＭ２抗体を産生しない８名の患者は、特に迅速な疾患の進行、通常は５回の免疫化の完全なシリーズが投与される前に再発が検出される、を示した。他の前兆因子はこれらの患者に好ましいものではなく、彼らのＢＣＧに対する抗体応答もまたＧＭ２抗体陽性患者における応答よりも活発ではない。これは、一般的な免疫抑制が基礎的な機構ではないことを示している。
ＧＭ２抗体産生と予後が改善されることとが関連することも、ＯＦＡ-1と名付けられた抗体の研究（31）、すなわち多くのメラノーマによって発現する細胞表面抗原系の研究において示唆されている。幾つかの系統の証拠が、ＯＦＡに対する抗体反応性が主としてＧＭ２ガングリオシドに向けられることを示している（30、25）。予め存在するか、もしくは照射されたメラノーマ細胞で免疫された後に現われる、ＯＦＡ-1に対して増大したＩｇＭを有する患者は、生存期間が延びた（31）。
ＧＭ２抗体がメラノーマ患者の好ましい予後に関連するという論旨に力を与えるものではあるものの、この研究はまた、無作為ワクチン試験の設計に現われる問題をも示す。ＧＭ２／ＢＣＧ群においては１名であるのに対して、対照群の中の５名の患者に予めＧＭ２抗体産生が見られること、およびＧＭ２／ＢＣＧ群の８名のワクチン接種患者におけるＧＭ２抗体応答の欠如は、２つの無作為処置群の区別をＧＭ２／ＢＣＧ群における治療上の利点が重要ではなくなる点にまで鈍らせることに貢献した。明らかに、その先の研究においては、ＧＭ２に対する抗体を予め有する患者は除外し、もしくは、少なくとも層にする必要がある。ワクチンの免疫原性を高める必要性も同様に重要である。これに関して、出願人は、密接に関連した同種のものを得るためのガングリオシドの化学修飾（33、34）、免疫原性タンパク質担体とガングリオシドとの結合（35）、およびより能力の高いアジュバントの使用（36）を含む、バクテリア感染に対する炭水化物ワクチンの研究において成功裡に遂行されているアプローチ（32において評価されている）を検討した。出願人が最も効果的であることを見出したアプローチは、ＧＭ２をキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）と結合させ、このＧＭ２−ＫＬＨ複合体をアジュバントとしてのＱＳ−21（Saponaria Quillajaからのサポニン抽出物）と共に投与することである。メラノーマ患者での予備研究において、このワクチンを投与した結果、ＩｇＭ  ＧＭ２抗体の力価がＧＭ２／ＢＣＧの後に見られるものよりも高くなり、かつ、さらに重要なことには、ＩｇＧクラスに属するＧＭ２抗体が一貫して産生された。子のように、明らかに、Ｔ非依存性抗体応答がＴ依存性応答に変換された。
ここに記載されるＧＭ２／ＢＣＧワクチンの臨床的効力を改善するさらなるアプローチは、このワクチンに免疫原性メラノーマガングリオシドをさらに組み込むことである。マウスにおける実験では、ＫＬＨとの結合およびＱＳ−21アジュバントの使用もまた、現在のところメラノーマ患者において非常に低い免疫原性しか示さない、より高度に発現するメラノーマガングリオシドであるＧＤ３の免疫原性を増大させることが示されている（35）。これらの観察がヒトの研究において確かめられれば、出願人は、幾つかの主要メラノーマガングリオシドが組み込まれ、それ故にヒトメラノーマに見られるガングリオシド発現の不均一性を回避する多価ガングリオシド複合体ワクチンを構築する基礎を持つことができる。出願人は、ここに報告した研究結果がこのアプローチをさらに続けることを正当化するものと信じる。
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８Ａ−１】
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【図８Ａ−２】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ−１】
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【図９Ａ−２】
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【図９Ｂ−１】
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【図９Ｂ−２】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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