(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
親水性の多孔性シートの片面の一部に撥水性の絶縁膜が形成され、この絶縁膜上から多孔性シート上に延在するようにカソードおよびカソードが外部との電気コンタクトをとるためのパッドを有するカソードパターンが形成され、また該多孔性シートの反対側の面の一部に撥水性の絶縁膜が形成され、この絶縁膜上から多孔性シート上に延在するようにアノードおよびアノードが外部との電気コンタクトをとるためのパッドを有するアノードパターンが形成され、バイオセンサの側面およびカソードの形成された面がパッド部分を残して酸素透過性材料で被覆され、アノードの形成された面がパッド部分を残して酸素透過性材料またはプラスチックシートで被覆され、感応部に生体関連物質固定層が形成され、該親水性の多孔性シート中に電解液がしみこまされていることを特徴とする小型バイオセンサ。
【請求項２】
親水性の多孔性シートの片面の一部に撥水性の絶縁膜が形成され、この絶縁膜上から多孔性シート上に延在するようにカソードおよびカソードが外部との電気コンタクトをとるためのパッドを有するカソードパターンならびにアノードおよびアノードが外部との電気コンタクトをとるためのパッドを有するアノードパターンが形成され、また該多孔性シートの反対側の面は全面に撥水性の絶縁膜が形成されるかプラスチックシートで被覆されており、バイオセンサの側面ならびにカソードおよびアノードの形成された面がそれぞれのパッド部分を残して酸素透過性材料で被覆され、感応部に生体関連物質固定層が形成され、該親水性の多孔性シート中に電解液がしみこまされていることを特徴とする小型バイオセンサ。
【請求項３】
親水性の多孔性シートの片面の一部に撥水性の絶縁膜が形成され、この絶縁膜上から多孔性シート上に延在するようにカソードおよびカソードが外部との電気コンタクトをとるためのパッドを有するカソードパターンが形成され、また該多孔性シートの反対側の面の一部に撥水性の絶縁膜が形成され、この絶縁膜上から多孔性シート上に延在するようにアノードおよびアノードが外部との電気コンタクトをとるためのパッドを有するアノードパターンが形成され、バイオセンサの側面およびカソードの形成された面が
パッド部分を残して酸素透過性材料で被覆され、アノードの形成された面がパッド部分を残して酸素透過性材料またはプラスチックシートで被覆され、該親水性の多孔性シート中に電解液がしみこまされた構造体が２個並列的に配置されており、片方の感応部には生体関連物質固定層を形成し、他方の感応部はそのまま露出させておくかまたは前記生体関連物質固定層を形成したのと同じ担体材料のみを固定したことを特徴とする差動型小型バイオセンサ。
【請求項４】
親水性の多孔性シートの片面の一部に撥水性の絶縁膜が形成され、この絶縁膜上から多孔性シート上に延在するようにカソードおよびカソードが外部との電気コンタクトをとるためのパッドを有するカソードパターンが２つ形成され、また該多孔性シートの反対側の面の一部に撥水性の絶縁膜が形成され、この絶縁膜上から多孔性シート上に延在するようにアノードおよびアノードが外部との電気コンタクトをとるためのパッドを有するアノードパターンが形成され、バイオセンサの側面およびカソードの形成された面がパッド部分を残して酸素透過性材料で被覆され、アノードの形成された面がパッド部分を残して酸素透過性材料またはプラスチックシートで被覆され、該親水性の多孔性シート中に電解液がしみこまされ、片方の感応部には生体関連物質固定層を形成し、他方の感応部はそのまま露出させておくかまたは前記生体関連物質固定層を形成したのと同じ担体材料のみを固定したことを特徴とする差動型小型バイオセンサ。
【請求項５】
親水性の多孔性シートの片面の一部に撥水性の絶縁膜が形成され、この絶縁膜上から多孔性シート上に延在するようにカソードおよびカソードが外部との電気コンタクトをとるためのパッドを有するカソードパターンならびにアノードおよびアノードが外部との電気コンタクトをとるためのパッドを有するアノードパターンが形成され、また該多孔性シートの反対側の面は全面に撥水性の絶縁膜が形成されるかプラスチックシートで被覆されており、バイオセンサの側面ならびにカソードおよびアノードの形成された面がそれぞれのパッド部分を残して酸素透過性材料で被覆され、該親水性の多孔性シート中に電解液がしみこまされた構造体が２個並列的に配置されており、片方のカソード付近には生体関連物質固定層を形成し、他方のカソード付近はそのまま露出させておくか、前記生体関連物質固定層を形成したのと同じ担体材料のみを固定したことを特徴とする差動型小型バイオセンサ。
【請求項６】
親水性の多孔性シートの片面の一部に撥水性の絶縁膜が形成され、この絶縁膜上から多孔性シート上に延在するようにカソードおよびカソードが外部との電気コンタクトをとるためのパッドを有するカソードパターンが独立して２つとアノードおよびアノードが外部との電気コンタクトをとるためのパッドを有するアノードパターンとが形成され、また該多孔性シートの反対側の面は全面に撥水性の絶縁膜が形成されるかプラスチックシートで被覆されており、バイオセンサの側面ならびにカソードおよびアノードの形成された面がそれぞれのパッド部分を残して酸素透過性材料で被覆され、該親水性の多孔性シート中に電解液がしみこまされ、片方のカソード付近には生体関連物質固定層を形成し、他方のカソード付近はそのまま露出させておくか、前記生体関連物質固定層を形成したのと同じ担体材料のみを固定したことを特徴とする差動型小型バイオセンサ。
【請求項７】
前記多孔性シートが紙である請求項１〜６のいずれか１項に記載の小型バイオセンサ。
【請求項８】
前記のカソードおよびアノードのいずれもが銀である請求項１〜７のいずれか１項に記載の小型バイオセンサ。
【請求項９】
前記カソードパターンは前記カソードと前記パッドの間にカソード用リード線を有し、該カソード用リード線が２層の絶縁膜に挟まれており、さらにその上を酸素透過性材料が覆っている請求項１〜８のいずれか１項に記載の小型バイオセンサ。
【請求項１０】
前記酸素透過性材料がシリコーンゴムである請求項１〜９のいずれか１項に記載の小型バイオセンサ。
【請求項１１】
前記アノードの一部分が電解液と接触し、その他の部分が絶縁膜で被覆されている請求項１〜１０のいずれか１項に記載の小型バイオセンサ。
【請求項１２】
前記生体関連物質固定層が、酵母Trichosporon cutaneumを固定した層である請求項１〜１１のいずれか１項に記載の小型バイオセンサ。
【請求項１３】
以下の工程を含む小型バイオセンサの製造方法。
（１）親水性の多孔性シートの両面に、該多孔性シートの一部が露出するようにして撥水性の絶縁膜を形成する。
（２）前記絶縁膜から前記多孔性シート上に延在するように、カソードおよびカソードが外部との電気コンタクトをとるためのパッドを有するカソードパターンを片面に、アノードとアノードが外部との電気コンタクトをとるためのパッドを有するアノードパターンをその反対側の面に形成する。
（３）カソードパターンの形成された面を前記パッド部分を除いて酸素透過性材料で被覆するとともに、アノードパターンが形成された面を前記パッド部分を除いて酸素透過性材料またはプラスチックシートで被覆する。
（４）得られた多孔性シートからバイオセンサを切り出し、前記バイオセンサの側面を酸素透過性材料で被覆する。
（５）感応部に生体関連物質を固定して生体関連物質固定層を形成する。
（６）電解液をバイオセンサの一部から前記多孔性シートにしみこませる。
【請求項１４】
以下の工程を含む小型バイオセンサの製造方法。
（１）バイオセンサの境界となる部分の一部を切り出し除去した親水性の多孔性シートの両面に、該多孔性シートの一部が露出するようにして撥水性の絶縁膜を形成する。
（２）前記絶縁膜から前記多孔性シート上に延在するように、カソードおよびカソードが外部との電気コンタクトをとるためのパッドを有するカソードパターンを片面に、アノードとアノードが外部との電気コンタクトをとるためのパッドを有するアノードパターンをその反対側の面に形成する。
（３）カソードパターンの形成された面を前記パッド部分を除いて酸素透過性材料で被覆するとともに、アノードパターンが形成された面を前記パッド部分を除いてプラスチックシートで被覆する。
（４）得られた多孔性シートからバイオセンサを切り出す。
（５）感応部に生体関連物質を固定して生体関連物質固定層を形成する。
（６）電解液をバイオセンサの一部から前記多孔性シートにしみこませる。
【請求項１５】
以下の工程を含む小型バイオセンサの製造方法。
（１）親水性の多孔性シートの片面に、該多孔性シートの一部が露出するようにして撥水性の絶縁膜を形成する。
（２）前記絶縁膜から前記多孔性シート上に延在するように、カソードおよびカソードが外部との電気コンタクトをとるためのパッドを有するカソードパターンと、アノードとアノードが外部との電気コンタクトをとるためのパッドを有するアノードパターンとを絶縁膜を形成した面に形成する。
（３）カソードパターンおよびアノードパターンが形成された面を前記パッド部分を除いて酸素透過性材料で被覆するとともに、その反対側の面の全面に撥水性の絶縁膜を形成するかまたはプラスチックシートで被覆する。
（４）得られた多孔性シートからバイオセンサを切り出し、前記バイオセンサの側面を酸素透過性材料で被覆する。
（５）感応部に生体関連物質を固定して生体関連物質固定層を形成する。
（６）電解液をバイオセンサの一部から前記多孔性シートにしみこませる。
【請求項１６】
以下の工程を含む小型バイオセンサの製造方法。
（１）バイオセンサの境界となる部分の一部を切り出し除去した親水性の多孔性シートの片面に、該多孔性シートの一部が露出するようにして撥水性の絶縁膜を形成する。
（２）前記絶縁膜から前記多孔性シート上に延在するように、カソードおよびカソードが外部との電気コンタクトをとるためのパッドを有するカソードパターンと、アノードとアノードが外部との電気コンタクトをとるためのパッドを有するアノードパターンとを絶縁膜を形成した面に形成する。
（３）カソードパターンおよびアノードパターンが形成された面を前記パッド部分を除い
て酸素透過性材料で被覆するとともに、その反対側の面の全面に撥水性の絶縁膜を形成するかまたはプラスチックシートで被覆する。
（４）得られた多孔性シートからバイオセンサを切り出す。
（５）感応部に生体関連物質を固定して生体関連物質固定層を形成する。
（６）電解液をバイオセンサの一部から前記多孔性シートにしみこませる。
【請求項１７】
前記生体関連物質が微生物であり、該微生物を光硬化性樹脂と混合し、前記感応部に塗布した後、紫外線を照射して光硬化性樹脂を硬化させることによって前記生体関連物質固定層を形成する請求項１３〜１６のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１８】
以下の工程を含む小型バイオセンサの製造方法。
（１）親水性の多孔性シートの両面に、該多孔性シートの一部が露出するようにして撥水性の絶縁膜を形成する。
（２）前記絶縁膜から前記多孔性シート上に延在するように、カソードおよびカソードが外部との電気コンタクトをとるためのパッドを有するカソードパターンを片面に、アノードとアノードが外部との電気コンタクトをとるためのパッドを有するアノードパターンをその反対側の面に形成する。
（３）カソードパターンの形成された面を前記パッド部分を除いて酸素透過性材料で被覆するとともに、アノードパターンが形成された面を前記パッド部分を除いて酸素透過性材料またはプラスチックシートで被覆し、その際、微生物の懸濁液をメンブランフィルターにより濾過し、該微生物を該メンブランフィルター上に吸着固定した後、これを自然乾燥して得たメンブランフィルターの該微生物の吸着固定されている面を、酸素透過性材料の塗布直後かつ硬化前に酸素透過性材料上に接着することにより感応部に生体関連物質固定層を形成する。
（４）多孔性シートからバイオセンサを切り出し、バイオセンサの側面を酸素透過性材料で被覆する。
（５）電解液をバイオセンサの一部から前記多孔性シートにしみこませる。
【請求項１９】
以下の工程を含む小型バイオセンサの製造方法。
（１）バイオセンサの境界となる部分の一部を切り出し除去した親水性の多孔性シートの両面に、該多孔性シートの一部が露出するようにして撥水性の絶縁膜を形成する。
（２）前記絶縁膜から前記多孔性シート上に延在するように、カソードおよびカソードが外部との電気コンタクトをとるためのパッドを有するカソードパターンを片面に、アノードとアノードが外部との電気コンタクトをとるためのパッドを有するアノードパターンをその反対側の面に形成する。
（３）カソードパターンの形成された面を前記パッド部分を除いて酸素透過性材料で被覆するとともに、アノードパターンが形成された面を前記パッド部分を除いてプラスチックシートで被覆し、その際、微生物の懸濁液をメンブランフィルターにより濾過し、該微生物を該メンブランフィルター上に吸着固定した後、これを自然乾燥して得たメンブランフィルターの該微生物の吸着固定されている面を、酸素透過性材料の塗布直後かつ硬化前に酸素透過性材料上に接着することにより感応部に生体関連物質固定層を形成する。
（４）多孔性シートからバイオセンサを切り出す。
（５）電解液をバイオセンサの一部から前記多孔性シートにしみこませる。
【請求項２０】
以下の工程を含む小型バイオセンサの製造方法。
（１）親水性の多孔性シートの片面に、該多孔性シートの一部が露出するようにして撥水性の絶縁膜を形成する。
（２）前記絶縁膜から前記多孔性シート上に延在するように、カソードおよびカソードが外部との電気コンタクトをとるためのパッドを有するカソードパターンと、アノードとアノードが外部との電気コンタクトをとるためのパッドを有するアノードパターンとを絶縁膜を形成した面に形成する。
（３）カソードパターンおよびアノードパターンが形成された面を前記パッド部分を除いて酸素透過性材料で被覆するとともに、その反対側の面の全面に撥水性の絶縁膜を形成するかまたはプラスチックシートで被覆し、その際、微生物の懸濁液をメンブランフィルターにより濾過し、該微生物を該メンブランフィルター上に吸着固定した後、これを自然乾燥して得たメンブランフィルターの該微生物の吸着固定されている面を、酸素透過性材料の塗布直後かつ硬化前に酸素透過性材料上に接着することにより感応部に生体関連物質固定層を形成する。
（４）多孔性シートからバイオセンサを切り出し、前記バイオセンサの側面を酸素透過性材料で被覆する。
（５）電解液をバイオセンサの一部から前記多孔性シートにしみこませる。
【請求項２１】
以下の工程を含む小型バイオセンサの製造方法。
（１）バイオセンサの境界となる部分の一部を切り出し除去した親水性の多孔性シートの片面に、該多孔性シートの一部が露出するようにして撥水性の絶縁膜を形成する。
（２）前記絶縁膜から前記多孔性シート上に延在するように、カソードおよびカソードが外部との電気コンタクトをとるためのパッドを有するカソードパターンと、アノードとアノードが外部との電気コンタクトをとるためのパッドを有するアノードパターンとを絶縁膜を形成した面に形成する。
（３）カソードパターンおよびアノードパターンが形成された面を前記パッド部分を除いて酸素透過性材料で被覆するとともに、その反対側の面の全面に撥水性の絶縁膜を形成するかまたはプラスチックシートで被覆し、その際、微生物の懸濁液をメンブランフィルターにより濾過し、該微生物を該メンブランフィルター上に吸着固定した後、これを自然乾燥して得たメンブランフィルターの該微生物の吸着固定されている面を、酸素透過性材料の塗布直後かつ硬化前に酸素透過性材料上に接着することにより感応部に生体関連物質固定層を形成する。
（４）多孔性シートからバイオセンサを切り出す。
（５）電解液をバイオセンサの一部から前記多孔性シートにしみこませる。
【請求項２２】
前記酸素透過性材料がシリコーンゴムである請求項１３〜２１のいずれか１項に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、常温で安定に動作が可能であるクラーク型酸素電極をトランスデューサとしたバイオセンサおよびその製造方法に関する。詳しくは、安価な材料を用いて一括大量生産できるバイオセンサに関する。
【０００２】
【従来の技術】
酸素電極は、その感応部に酵素や微生物などの生体関連物質を固定することにより、さまざまなバイオセンサを作製するのに用いることが可能である。例えば、感応部にグルコースオキシダーゼを固定すれば、グルコースを測定するセンサができ、糖尿病診断用測定器などに使用することができる。また、感応部に酵母の一種のTrichosporon cutaneumを固定すれば、河川等の汚染の重要な指標の一つであるＢＯＤ値を測定するセンサを作ることができる。クラーク型酸素電極は感応部が撥水性のガス透過性膜で覆われているため、バイオセンサを構成した場合、他種のセンサに比べて、妨害物質の影響が少ないという利点がある。
【０００３】
バイオセンサのトランスデューサとして用いられる酸素電極は、このように多くの用途に使用が可能である。しかし、現在市販されているものは、基本的には個別に作られるものであるため、典型的にはボールペン程度の大きさであり、価格も数万円もするものである。従って、これを用いてバイオセンサを作製した場合、１回ないし数回の使用の後に使い捨てにすることは費用的に難しい。また、バイオセンサでは、感応部に固定される生体関連物質の寿命がしばしば問題となる。現在の酸素電極、従来型のトランスデューサを使用する場合には、この問題は生体関連物質固定膜を交換することにより解決されている。しかし、ユーザーにとってはこのような操作は面倒であり、センサごと使い捨てにできる方が望ましい。また、センサの大きさは小さい方が望ましい。
【０００４】
このような問題を解決するために、フォトリソグラフィーなどの半導体微細加工技術を利用して、トランスデューサとなる酸素電極を一括してシリコンやガラスの基板上に形成し、微小化する試みがなされている。しかし、この技術により酸素電極のある程度の低価格化、一括大量生産は実現されるが、通常の半導体微細加工技術を利用している限り、例えば１チップ１００円以下のものを作製するのは難しい。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明はこのような従来の技術の問題点に鑑みてなされたものであり、安価な材料を用いて一括大量生産でき、しかも応答性に優れた小型のバイオセンサおよびその製造方法を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、特定の構造を採用することにより、前記課題が解決されることを見い出し、本発明を完成した。
【０００７】
すなわち、本発明の第１の態様のバイオセンサは、親水性の多孔性シートの片面の一部に撥水性の絶縁膜が形成され、この絶縁膜上から多孔性シート上に延在するようにカソードおよびカソードが外部との電気コンタクトをとるためのパッドを有するカソードパターンが形成され、また該多孔性シートの反対側の面の一部に撥水性の絶縁膜が形成され、この絶縁膜上から多孔性シート上に延在するようにアノードおよびアノードが外部との電気コンタクトをとるためのパッドを有するアノードパターンが形成され、バイオセンサの側面およびカソードの形成された面がパッド部分を残して酸素透過性材料で被覆され、アノードの形成された面がパッド部分を残して酸素透過性材料またはプラスチックシートで被覆され、感応部に生体関連物質固定層が形成され、該親水性の多孔性シート中に電解液がしみこまされていることを特徴とする小型バイオセンサである。
【０００８】
また、本発明の第２の態様のバイオセンサは、親水性の多孔性シートの片面の一部に撥水性の絶縁膜が形成され、この絶縁膜上から多孔性シート上に延在するようにカソードおよびカソードが外部との電気コンタクトをとるためのパッドを有するカソードパターンならびにアノードおよびアノードが外部との電気コンタクトをとるためのパッドを有するアノードパターンが形成され、また該多孔性シートの反対側の面は全面に撥水性の絶縁膜が形成されるかプラスチックシートで被覆されており、バイオセンサの側面ならびにカソードおよびアノードの形成された面がそれぞれのパッド部分を残して酸素透過性材料で被覆され、感応部に生体関連物質固定層が形成され、該親水性の多孔性シート中に電解液がしみこまされていることを特徴とする小型バイオセンサである。
【０００９】
本発明のバイオセンサはその作製に必要な材料を最小限にしたものである。本発明のバイオセンサでは、紙のような安価な材料を基板として使用でき、また、絶縁膜等のパターン形成においても、スクリーン印刷やスプレーなどを適用でき、安価に作製できる。第１の態様のバイオセンサは、カソードとアノードをそれぞれ別の面に形成したものであり、第２の態様のバイオセンサは、カソードとアノードが同じ面に形成したものである。
【００１０】
また、本発明は上記のバイオセンサの基本構造を二つ有する差動型バイオセンサを提供する。
すなわち、本発明の第３の態様のバイオセンサは、親水性の多孔性シートの片面の一部に撥水性の絶縁膜が形成され、この絶縁膜上から多孔性シート上に延在するようにカソードおよびカソードが外部との電気コンタクトをとるためのパッドを有するカソードパターンが形成され、また該多孔性シートの反対側の面の一部に撥水性の絶縁膜が形成され、この絶縁膜上から多孔性シート上に延在するようにアノードおよびアノードが外部との電気コンタクトをとるためのパッドを有するアノードパターンが形成され、バイオセンサの側面およびカソードの形成された面がパッド部分を残して酸素透過性材料で被覆され、アノードの形成された面がパッド部分を残して酸素透過性材料またはプラスチックシートで被覆され、該親水性の多孔性シート中に電解液がしみこまされた構造体が２個並列的に配置されており、片方の感応部には生体関連物質固定層を形成し、他方の感応部はそのまま露出させておくかまたは前記生体関連物質固定層を形成したのと同じ担体材料のみを固定したことを特徴とする差動型小型バイオセンサである。
【００１１】
また、本発明の第４の態様のバイオセンサは、親水性の多孔性シートの片面の一部に撥水性の絶縁膜が形成され、この絶縁膜上から多孔性シート上に延在するようにカソードおよびカソードが外部との電気コンタクトをとるためのパッドを有するカソードパターンが２つ形成され、また該多孔性シートの反対側の面の一部に撥水性の絶縁膜が形成され、この絶縁膜上から多孔性シート上に延在するようにアノードおよびアノードが外部との電気コンタクトをとるためのパッドを有するアノードパターンが形成され、バイオセンサの側面およびカソードの形成された面がパッド部分を残して酸素透過性材料で被覆され、アノードの形成された面がパッド部分を残して酸素透過性材料またはプラスチックシートで被覆され、該親水性の多孔性シート中に電解液がしみこまされ、片方の感応部には生体関連物質固定層を形成し、他方の感応部はそのまま露出させておくかまたは前記生体関連物質固定層を形成したのと同じ担体材料のみを固定したことを特徴とする差動型小型バイオセンサである。
【００１２】
さらに、本発明の第５の態様のバイオセンサは、親水性の多孔性シートの片面の一部に撥水性の絶縁膜が形成され、この絶縁膜上から多孔性シート上に延在するようにカソードおよびカソードが外部との電気コンタクトをとるためのパッドを有するカソードパターンならびにアノードおよびアノードが外部との電気コンタクトをとるためのパッドを有するアノードパターンが形成され、また該多孔性シートの反対側の面は全面に撥水性の絶縁膜が形成されるかプラスチックシートで被覆されており、バイオセンサの側面ならびにカソードおよびアノードの形成された面がそれぞれのパッド部分を残して酸素透過性材料で被覆され、該親水性の多孔性シート中に電解液がしみこまされた構造体が２個並列的に配置されており、片方のカソード付近には生体関連物質固定層を形成し、他方のカソード付近はそのまま露出させておくか、前記生体関連物質固定層を形成したのと同じ担体材料のみを固定したことを特徴とする差動型小型バイオセンサ。
【００１３】
さらに、また、本発明の第６の態様のバイオセンサは、親水性の多孔性シートの片面の一部に撥水性の絶縁膜が形成され、この絶縁膜上から多孔性シート上に延在するようにカソードおよびカソードが外部との電気コンタクトをとるためのパッドを有するカソードパターンが独立して２つとアノードおよびアノードが外部との電気コンタクトをとるためのパッドを有するアノードパターンとが形成され、また該多孔性シートの反対側の面は全面に撥水性の絶縁膜が形成されるかプラスチックシートで被覆されており、バイオセンサの側面ならびにカソードおよびアノードの形成された面がそれぞれのパッド部分を残して酸素透過性材料で被覆され、該親水性の多孔性シート中に電解液がしみこまされ、片方のカソード付近には生体関連物質固定層を形成し、他方のカソード付近はそのまま露出させておくか、前記生体関連物質固定層を形成したのと同じ担体材料のみを固定したことを特徴とする差動型小型バイオセンサ。
【００１４】
第３および第５の態様のバイオセンサは、それぞれ、第１および第２の態様のバイオセンサの基本構造を２つ有し、一方に生体関連物質が固定されていない差動型バイオセンサである。これにより、測定溶液の溶存酸素濃度の変動の影響を減らすことができる。第４および第６の態様のバイオセンサは、それぞれ、第３および第５の態様のバイオセンサにおいてアノードを共通にしたものである。
【００１５】
本発明において、多孔性シートは好ましくは紙である。また、好ましくは、カソードおよびアノードのいずれもが銀である。
カソードパターンはカソードとパッドの間にカソード用リード線を有してもよく、該カソード用リード線が２層の絶縁膜に挟まれており、さらにその上を酸素透過性材料が覆っていることが好ましい。
【００１６】
酸素透過性材料は、好ましくは、シリコーンゴムである。
また、アノードの一部分が電解液と接触し、その他の部分が絶縁膜で被覆されていることが好ましい。
【００１７】
さらに、生体関連物質固定層が、酵母Trichosporon cutaneumを固定した層であることが好ましい。この場合にはＢＯＤセンサとして使用することができる。
また、本発明は、上記バイオセンサの好適な製造方法を提供する。
【００１８】
すなわち、本発明の第１の態様の製造方法は、以下の工程を含む小型バイオセンサの製造方法である。
（１）親水性の多孔性シートの両面に、該多孔性シートの一部が露出するようにして撥水性の絶縁膜を形成する。
（２）前記絶縁膜から前記多孔性シート上に延在するように、カソードおよびカソードが外部との電気コンタクトをとるためのパッドを有するカソードパターンを片面に、アノードとアノードが外部との電気コンタクトをとるためのパッドを有するアノードパターンをその反対側の面に形成する。
（３）カソードパターンの形成された面を前記パッド部分を除いて酸素透過性材料で被覆するとともに、アノードパターンが形成された面を前記パッド部分を除いて酸素透過性材料またはプラスチックシートで被覆する。
（４）得られた多孔性シートからバイオセンサを切り出し、前記バイオセンサの側面を酸素透過性材料で被覆する。
（５）感応部に生体関連物質を固定して生体関連物質固定層を形成する。
（６）電解液をバイオセンサの一部から前記多孔性シートにしみこませる。
【００１９】
また、本発明の第２態様の製造方法は、以下の工程を含む小型バイオセンサの製造方法である。
（１）バイオセンサの境界となる部分の一部を切り出し除去した親水性の多孔性シートの両面に、該多孔性シートの一部が露出するようにして撥水性の絶縁膜を形成する。
（２）前記絶縁膜から前記多孔性シート上に延在するように、カソードおよびカ有するアノードパターンをその反対側の面に形成する。
（３）カソードパターンの形成された面を前記パッド部分を除いて酸素透過性材料で被覆するとともに、アノードパターンが形成された面を前記パッド部分を除いてプラスチックシートで被覆する。
（４）得られた多孔性シートからバイオセンサを切り出す。
（５）感応部に生体関連物質を固定して生体関連物質固定層を形成する。
（６）電解液をバイオセンサの一部から前記多孔性シートにしみこませる。
【００２０】
さらに、本発明の第３の態様の製造方法は、以下の工程を含む小型バイオセンサの製造方法である。
（１）親水性の多孔性シートの一部が露出するようにして撥水性の絶縁膜を形成する。
（２）前記絶縁膜から前記多孔性シート上に延在するように、カソードおよびカソードが外部との電気コンタクトをとるためのパッドを有するカソードパターンと、アノードとアノードが外部との電気コンタクトをとるためのパッドを有するアノードパターンとを絶縁膜を形成した面に形成する。
（３）カソードパターンおよびアノードパターンが形成された面を前記パッド部分を除いて酸素透過性材料で被覆するとともに、その反対側の面の全面に撥水性の絶縁膜を形成するかまたはプラスチックシートで被覆する。
（４）得られた多孔性シートからバイオセンサを切り出し、前記バイオセンサの側面を酸素透過性材料で被覆する。
（５）感応部に生体関連物質を固定して生体関連物質固定層を形成する。
（６）電解液をバイオセンサの一部から前記多孔性シートにしみこませる。
【００２１】
さらに、また、本発明の第４の態様の製造方法は、以下の工程を含む小型バイオセンサの製造方法である。
（１）バイオセンサの境界となる部分の一部を切り出し除去した親水性の多孔性シートの片面に、該多孔性シートの一部が露出するようにして撥水性の絶縁膜を形成する。
（２）前記絶縁膜から前記多孔性シート上に延在するように、カソードおよびカソードが外部との電気コンタクトをとるためのパッドを有するカソードパターンと、アノードとアノードが外部との電気コンタクトをとるためのパッドを有するアノードパターンとを絶縁膜を形成した面に形成する。
（３）カソードパターンおよびアノードパターンが形成された面を前記パッド部分を除いて酸素透過性材料で被覆するとともに、その反対側の面の全面に撥水性の絶縁膜を形成するかまたはプラスチックシートで被覆する。
（４）得られた多孔性シートからバイオセンサを切り出す。
（５）感応部に生体関連物質を固定して生体関連物質固定層を形成する。
（６）電解液をバイオセンサの一部から前記多孔性シートにしみこませる。
【００２２】
本発明の製造方法によれば、バイオセンサを一括して大量に製造することができる。特に第２および第４の態様の製造方法によれば、予め多孔性シートのバイオセンサの境界部分を切り出し除去しているので、多孔性シートからバイオセンサを切り出したときに、断面に多孔性シートがパッド部分を除いて露出せず、バイオセンサ側面が被覆された状態になっているので、バイオセンサ側面の被覆工程を省略できる。
【００２３】
生体関連物質が微生物である場合には、該微生物を光硬化性樹脂と混合し、前記感応部に塗布した後、紫外線を照射して光硬化性樹脂を硬化させることによって生体関連物質固定層を形成することができる。
【００２４】
好ましくは、酸素透過性材料はシリコーンゴムである。酸素透過性材料としてシリコーンゴム等の塗布可能な酸素透過性材料を用いた場合には、以下の（ａ）〜（ｄ）の製造方法のように、酸素透過性材料の塗布と生体関連物質固定層の形成を同時に行うことができ、独立した生体関連物質固定層作製の工程を省略できる。
【００２５】
（ａ）以下の工程を含む小型バイオセンサの製造方法。
（１）親水性の多孔性シートの両面に、該多孔性シートの一部が露出するようにして撥水性の絶縁膜を形成する。
（２）前記絶縁膜から前記多孔性シート上に延在するように、カソードおよびカソードが外部との電気コンタクトをとるためのパッドを有するカソードパターンを片面に、アノードとアノードが外部との電気コンタクトをとるためのパッドを有するアノードパターンをその反対側の面に形成する。
（３）カソードパターンの形成された面を前記パッド部分を除いて酸素透過性材料で被覆するとともに、アノードパターンが形成された面を前記パッド部分を除いて酸素透過性材料またはプラスチックシートで被覆し、その際、微生物の懸濁液をメンブランフィルターにより濾過し、該微生物を該メンブランフィルター上に吸着固定した後、これを自然乾燥して得たメンブランフィルターの該微生物の吸着固定されている面を、酸素透過性材料の塗布直後かつ硬化前に酸素透過性材料上に接着することにより感応部に生体関連物質固定層を形成する。
（４）多孔性シートからバイオセンサを切り出し、バイオセンサの側面を酸素透過性材料で被覆する。
（５）電解液をバイオセンサの一部から前記多孔性シートにしみこませる。
【００２６】
（ｂ）以下の工程を含む小型バイオセンサの製造方法。
（１）バイオセンサの境界となる部分の一部を切り出し除去した親水性の多孔性シートの両面に、該多孔性シートの一部が露出するようにして撥水性の絶縁膜を形成する。
（２）前記絶縁膜から前記多孔性シート上に延在するように、カソードおよびカソードが外部との電気コンタクトをとるためのパッドを有するカソードパターンを片面に、アノードとアノードが外部との電気コンタクトをとるためのパッドを有するアノードパターンをその反対側の面に形成する。
（３）カソードパターンの形成された面を前記パッド部分を除いて酸素透過性材料で被覆するとともに、アノードパターンが形成された面を前記パッド部分を除いてプラスチックシートで被覆し、その際、微生物の懸濁液をメンブランフィルターにより濾過し、該微生物を該メンブランフィルター上に吸着固定した後、これを自然乾燥して得たメンブランフィルターの該微生物の吸着固定されている面を、酸素透過性材料の塗布直後かつ硬化前に酸素透過性材料上に接着することにより感応部に生体関連物質固定層を形成する。
（４）多孔性シートからバイオセンサを切り出す。
（５）電解液をバイオセンサの一部から前記多孔性シートにしみこませる。
【００２７】
（ｃ）以下の工程を含む小型バイオセンサの製造方法。
（１）親水性の多孔性シートの片面に、該多孔性シートの一部が露出するようにして撥水性の絶縁膜を形成する。
（２）前記絶縁膜から前記多孔性シート上に延在するように、カソードおよびカソードが外部との電気コンタクトをとるためのパッドを有するカソードパターンと、アノードとアノードが外部との電気コンタクトをとるためのパッドを有するアノードパターンとを絶縁膜を形成した面に形成する。
（３）カソードパターンおよびアノードパターンが形成された面を前記パッド部分を除いて酸素透過性材料で被覆するとともに、その反対側の面の全面に撥水性の絶縁膜を形成するかまたはプラスチックシートで被覆し、その際、微生物の懸濁液をメンブランフィルターにより濾過し、該微生物を該メンブランフィルター上に吸着固定した後、これを自然乾燥して得たメンブランフィルターの該微生物の吸着固定されている面を、酸素透過性材料の塗布直後かつ硬化前に酸素透過性材料上に接着することにより感応部に生体関連物質固定層を形成する。
（４）多孔性シートからバイオセンサを切り出し、前記バイオセンサの側面を酸素透過性材料で被覆する。
（５）電解液をバイオセンサの一部から前記多孔性シートにしみこませる。
【００２８】
（ｄ）以下の工程を含む小型バイオセンサの製造方法。
（１）バイオセンサの境界となる部分の一部を切り出し除去した親水性の多孔性シートの片面に、該多孔性シートの一部が露出するようにして撥水性の絶縁膜を形成する。
（２）前記絶縁膜から前記多孔性シート上に延在するように、カソードおよびカソードが外部との電気コンタクトをとるためのパッドを有するカソードパターンと、アノードとアノードが外部との電気コンタクトをとるためのパッドを有するアノードパターンとを絶縁膜を形成した面に形成する。
（３）カソードパターンおよびアノードパターンが形成された面を前記パッド部分を除い
て酸素透過性材料で被覆するとともに、その反対側の面の全面に撥水性の絶縁膜を形成するかまたはプラスチックシートで被覆し、その際、微生物の懸濁液をメンブランフィルターにより濾過し、該微生物を該メンブランフィルター上に吸着固定した後、これを自然乾燥して得たメンブランフィルターの該微生物の吸着固定されている面を、酸素透過性材料の塗布直後かつ硬化前に酸素透過性材料上に接着することにより感応部に生体関連物質固定層を形成する。
（４）多孔性シートからバイオセンサを切り出す。
（５）電解液をバイオセンサの一部から前記多孔性シートにしみこませる。
【００２９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態を詳しく説明する。
＜１＞本発明のバイオセンサ
本発明で使用される親水性の多孔性シート１は、電解液をしみこませて保持するために用いられるものであり、その上に密着性よく絶縁膜を形成することができ、カソードおよびアノードとなるべき金属パターンの密着性が良好なものであれば特に制限はない。このような多孔性シート１としては、濾紙、ニトロセルロース製のメンブランフィルターが挙げられる。好ましくは濾紙であり、市販のものを使用できる。
【００３０】
多孔性シートの厚さは、通常、１００〜３００μｍであり、大きさは用途によって変わるが、通常、０．２〜０．５ｃｍ×１〜２ｃｍである。
多孔性シート１上に形成される撥水性の絶縁膜２は、通常、撥水性のポリマーで構成され、使用されるポリマーは以下の条件を満たす必要がある。
▲１▼紙などの多孔性シート１にしみこんで、多孔性シート１を撥水性にしない。
▲２▼絶縁膜２上に形成される金属の電極パターンとの密着性が実用上十分である。
【００３１】
このようなポリマーの例としては、ポリイミド、シリコーンゴム（酸素透過性材料）等が挙げられる。
絶縁膜２は、上記ポリマーを塗布して形成されたものでもよいし、上記ポリマーから成るシートを接着剤等で接着して形成されたものでもよい。シートに接着剤を塗布したものとしては、テープがある。なお、テープを用いた場合には、上記▲１▼および▲２▼の条件に加えて次の条件を満たす必要がある。
▲３▼多孔性シートに電解液がしみこみ、テープが水に濡れてもはがれない。この条件は完璧に満たされる必要はないが、少なくともユーザー電解液を多孔性シートにしみこませ、バイオセンサを使用する間には剥がれないようなものでなければならない。
【００３２】
絶縁膜２の厚さは、それを構成する材料によるが、通常には、５０〜１００μｍである。
カソード３およびカソード３が外部との電気コンタクトをとるためのパッド５を有するカソードパターンは絶縁膜２上から多孔性シート１上に延在する。すなわち両方の上にまたがって存在する。なお、アノード６についても同様である。
【００３３】
カソード３およびアノード６を構成する材料は導電性のものであって、測定溶液等と反応しないものであれば特に制限はないが、銀が好ましく用いられる。
カソードパターンおよびアノードパターンの形状に特に制限はなく、カソード３とアノード６を別の面に形成する場合、特にパターニングをせずに全面に形成するだけですますことができる。本明細書で使用する「パターン」という用語はこのような全面に形成された形状も包含するものである。いずれにおいても、多孔性シート１（多孔性シート中の電解液）に接触する部分がカソード３およびアノード６として機能する。好ましくは、カソード３とパッド５の間にリード線４の部分を設け、カソード３およびリード線４の部分の幅を細く形成する（図１（ｂ））。この幅は、通常には、０．０５〜０．２ｍｍである。
【００３４】
カソード３およびアノード６をそれぞれ別の面に形成すると（第１の態様のバイオセンサ）、デッドスペースを減らすことができ、レイアウトの点で有利な上、絶縁膜とカソードおよびアノードのパターンがより単純になり、作りやすくなる。一方、カソード３およびアノード６を同一の面に形成してもよい（第２の態様のバイオセンサ）（図２）。この場合には、裏面の絶縁層が、多孔性シートが露出しないように全面に形成されるか、または、プラスチックシートで全面が被覆される。プラスチックシートによる被覆は該シートを接着剤等で接着することによって行うことができる。必要に応じ、さらに酸素透過性材料を絶縁膜として形成してもよい。
【００３５】
なお、ここで、カソードリード線４は絶縁層２と酸素透過性材料８に挟まれる形で絶縁されているが、酸素透過性材料８だけでは絶縁が不十分な場合には、リード線４の上にもう１層絶縁膜を形成することが好ましい（図３）。
【００３６】
酸素透過性材料８としては、特に制限はないが、シリコーンゴムが好ましく使用される。酸素透過性材料８の層の厚さは、その種類によるが、通常、カソード３上の厚さが５０〜２００μｍである。
【００３７】
生体関連物質とは、試料中の測定物質に作用できる微生物、酵素等である。これらは、バイオセンサの用途によって適宜選択される。生体関連物質の感応部への固定は公知の方法によって行うことができ、例えば、微生物を光硬化性樹脂と混合し、感応部に塗布し、硬化させることによって固定できる。あるいは、メンブランフィルターで微生物の培養液を濾過し、乾燥させて、メンブランフィルター上に微生物を吸着固定したものを感応部に接着してもよい。なお、感応部とは、カソード３付近の酸素透過性材料８の膜上を意味し、そこで生じた生体関連物質の作用の影響が十分に、トランスデューサである酸素電極、一層具体的にはカソード３に及ぶ部位のことである。この感応部で試料中の測定物質の反応が生じ、測定物質の定量がなされる。
【００３８】
電解液には特に制限はなく適宜のものが使用される。例えば、塩化カリウム水溶液が使用できる。
本発明のバイオセンサの使用にあたっては、アノード６に対し、カソード３に、例えば、−１．０Ｖの一定電圧を印加すればよい。これにより、カソード３表面で酸素の還元反応が起こるようになり、酸素濃度に比例した電流値が信号として得られるようになる。アノード側では主に塩化銀の形成される反応が進行し、安定な基準電位が得られる。このバイオセンサを緩衝液中に浸漬し、安定させた状態で、試料液を一定量加えると、生体関連物質が酵母等の微生物の場合には試料液中の栄養分等の測定物質を資化し、その際呼吸活性が高まり、酸素の消費量が増える。この変化は電流値の減少となって現れるので、例えば、これを指標としてＢＯＤ値を求めることができる。
【００３９】
本発明のバイオセンサにおいて、カソードを形成した部分は、酸素透過膜−カソード−電解質層（電解液を含む多孔性シート）の配置になっており、酸素は、まず酸素透過膜を通過した後、電解質層に入り、電解質層側から回り込んでカソードに達し、カソードで還元される。このような構造を採用することで、小型で応答性に優れたバイオセンサを安価な材料を用いて大量一括生産することが可能になる。
【００４０】
なお、典型的にはアノード６はカソード３の形成される面と反対側の面の全面にパターニングせずに形成される。しかし、カソード３に対してアノード６の面積比が大きいと、塩化銀層がなかなか形成されず、アノード電位が安定しない場合がある。この場合には、図４のようにアノード６の一部のみを露出させて、大部分を絶縁膜で覆うようにすればよい。露出する部分の面積はカソード３と同程度でよいが、アノード側の反応が律速にならないように図１（ｂ）のＡの幅を十分に取ることが好ましい。塩化銀の形成は銀の露出している部分にとどまらず絶縁膜で覆われた部分にも進行する。このため、安定化時間の短縮と長寿命化の利点を両立できる。
【００４１】
上記バイオセンサの変形例として、差動型センサを作製することができる。すなわち、トランスデューサとなるべき酸素電極を２個並列的にならべ、一方の感応部に生体関連物質を固定し、他方には生体関連物質を固定しない（第３の態様のバイオセンサ）（図７）。これにより、測定溶液の溶存酸素濃度の変動の影響を減らすことができる。なお、固定に光硬化性樹脂などの担体を使用する場合には、生体関連物質のない方にも担体の層を形成しておくと、２個の感応部の特性がそろいやすくなり、センサの精度が向上する。また、トランスデューサとして２個の独立した酸素電極を使用するのではなく、１個のバイオセンサ内にカソード３を２個有し、１個のアノード６を共有する構造とすることもできる（第５の態様のバイオセンサ）（図８）。また、これらのカソードとアノードを同じ面に形成することもできる（第４および第６のバイオセンサ）。
【００４２】
次に、上記に説明した本発明のバイオセンサの製造方法について説明する。なお、以下の説明においては、製造途中のバイオセンサをチップともいう。
【００４３】
＜２＞本発明の製造方法
先ず、本発明の第１の態様の製造方法を工程毎に説明する。なお、説明の便宜のために図には１個のチップを示すが、実際には複数のチップが一括製造される。また、図１、図２、図６(a)、図７及び図８においては、図示の便宜のため、酸素透過膜８を省略している。
【００４４】
（１）絶縁膜の形成
親水性の多孔性シートの両面に、該多孔性シートの一部が露出するようにして撥水性の絶縁膜を形成する。
【００４５】
該多孔性シートの一部が露出するようにして絶縁膜を形成する方法としては、(a)多孔性シート上にマスクをした上で、絶縁膜の材料をスプレーで塗布し、乾燥する方法や、(b)絶縁膜としてテープを貼り付ける方法がある。(a)の方法の場合に使用されるマスクとしては、必ずしもスクリーン印刷に用いられるような高精度なものである必要はなく、プラスチックシートの一部を切り向いたようなもので十分である。(b)の方法の場合、テープの端部が次の工程のパターン形成において垂直に切り立った段差となり、パターンが十分に形成されないことがある。このような場合には、段差の付近のみに撥水性ポリマー（例えばシリコーンゴム）のパターンを形成しておけばよい。
【００４６】
（２）カソードおよびアノードのパターンの形成
前記絶縁膜から前記多孔性シート上に延在するように、カソードおよびカソードが外部との電気コンタクトをとるためのパッドを有するカソードパターンを片面に、アノードとアノードが外部との電気コンタクトをとるためのパッドを有するアノードパターンをその反対側の面に形成する。
【００４７】
パターンの形成は、スクリーン印刷、真空蒸着、スパッタなどの種々の方法で行うことができるが、費用の面からはスクリーン印刷のような簡便な方法を用いるのが好ましい。
【００４８】
（３）酸素透過膜の形成
カソードパターンの形成された面を前記パッド部分を除いて酸素透過性材料で被覆するとともに、アノードパターンが形成された面を前記パッド部分を除いて酸素透過性材料またはプラスチックシートで被覆する。
【００４９】
酸素透過性材料がシリコーンゴムの場合には、シリコーンゴムを塗布し、８０℃の水蒸気を飽和させた雰囲気下で１時間ベーキングするという方法が例示できる。膜形成にあたり、パッドの部分には、剥離の容易なテープを貼って保護し、シリコーンゴムが硬化後、パッド部分のテープを剥がす。あるいは（１）と同様にマスクを使用してパッド部分を除いた膜形成を行う。
【００５０】
この被覆によりカソード上に形成された部分が酸素透過膜として機能する。
アノードを形成した面では、酸素透過膜の機能は要求されないので、酸素透過性材料で被覆する代わりに、プラスチックシートを接着剤等で接着して被覆してもよい。
【００５１】
カソード側の面とアノード側の面の被覆はどちらを先に行っても、また、同時にしてもよい。
【００５２】
（４）チップの切り出し
得られた多孔性シートからチップを切り出し、前記チップの側面を酸素透過性材料で被覆する。
【００５３】
多孔性シート上に一括して形成された酸素電極をはさみまたはカッターナイフなどで切り離す。この際、切断面に多孔性シートが露出するので、電解液注入口として一部を残して（３）と同様の酸素透過性材料で側面も被覆する。
【００５４】
（５）生体関連物質の固定
感応部に生体関連物質を固定して生体関連物質固定層を形成する。
例えば、測定物質に適した微生物を培養し、菌体を遠心分離により分離し、分離した菌体を光硬化性樹脂等の担体と混合し、感応部（カソード付近の酸素透過性膜上）に塗布した後、紫外線を照射して硬化させる方法が好ましく使用される。ＢＯＤセンサの場合には、例えば、微生物として酵母Trichosporon cutaneumが使用できる。
【００５５】
なお、この工程は（４）の工程の前に一括して行ってもよい。
【００５６】
（６）電解質の注入
電解液をチップの一部から前記多孔性シートにしみこませる。
電解質注入口が設けてあるのでチップ全体を電解液に浸漬することにより電解液を注入できる。
【００５７】
以上の工程により、本発明のバイオセンサを得ることができる。また、親水性の多孔性シートを撥水性の絶縁膜をその上に形成する前に、チップの境界となる部分の一部を切り出し除去してもよい（第２の態様の製造方法）（図６）。通常、除去せずに残る部分はパッド部分になるようにし、ここが電解質液の注入工程で電解質液注入口となる。その他の工程は、基本的に、第１の態様の製造方法と同様であるが、この場合、チップの切り出し工程において、チップを切り出した際に、断面に多孔性シートが不必要に露出しないので、チップ側面の被覆工程を省略できるという利点がある。また、プラスチックシートを用いると強度的に優れたセンサが得られる。
【００５８】
また、カソードおよびアノードを同じ面に形成する場合には、上記の製造方法において、（１）〜（３）の工程を以下のように行えばよい。
（１）親水性の多孔性シートをそのまままたはチップの境となる部分の一部を切り出し除去して用い、該多孔性シートの片面に、該多孔性シートの一部が露出するようにして撥水性の絶縁膜を形成する。
（２）前記絶縁膜から前記多孔性シート上に延在するように、カソードおよびカソードが外部との電気コンタクトをとるためのパッドを有するカソードパターンと、アノードとアノードが外部との電気コンタクトをとるためのパッドを有するアノードパターンとを絶縁膜を形成した面に形成する。
（３）カソードパターンおよびアノードパターンが形成された面を前記パッド部分を除いて酸素透過性材料で被覆するとともに、その反対側の面の全面に撥水性の絶縁膜を形成するかまたはプラスチックシートで被覆する。
【００５９】
また、酸素透過性材料がシリコーンゴム等の塗布可能な酸素透過性材料であって、生体関連物質が微生物である場合には、微生物の懸濁液をメンブランフィルターにより濾過し、該微生物を該メンブランフィルター上に吸着固定した後、これを自然乾燥して得たメンブランフィルターの該微生物の吸着固定されている面を、酸素透過性材料の塗布直後かつ硬化前に酸素透過性材料上に接着することにより感応部に生体関連物質固定層を形成することができる。この場合は、シリコーンゴム等の塗布可能な酸素透過性材料の硬化条件として常温放置などの穏和な条件が採用される。メンブランフィルターは使用する微生物の細胞の大きさにあわせて適宜選択される。このようにした場合、切り出し後の生体関連物質の固定工程を行う必要がない。
【００６０】
なお、複数の工程において酸素透過性材料の被覆または塗布が行われる場合、各工程で使用される酸素透過性材料は同一でも異なっていてもよい。
差動型バイオセンサも上記の製造方法を応用して製造することができる。
【００６１】
【実施例】
以下、実施例を参照して本発明を説明する。なお、一枚のシート上に多数の小型バイオセンサが一括して作製されるが、便宜上、図面には１個（１チップ分）のバイオセンサを示す。
【００６２】
【実施例１】
（１）絶縁膜の形成
親水性の多孔性シート１として濾紙（ワットマン社製、厚さ１８０μｍ）を用い、その両面にマスクをして、濾紙の一部を露出させた状態で、撥水性ポリマー（ユニバーサル製、プラスティディップ）をスプレーで塗布し乾燥することにより、厚さ約５０μｍの絶縁膜２を濾紙の両面に形成した（図１（ａ））。
【００６３】
（２）カソードおよびアノードの形成
（１）で形成した絶縁膜を有する濾紙に、絶縁膜および濾紙の上に延在するように、カソード３、カソードリード線４およびカソード用パット５の部分を有するカソードパターンならびにアノード６およびアノード用パット７の部分を有するアノードパターンを形成した。カソードパターンおよびアノードパターンは銀から成り、それぞれスパッタで１μｍ厚になるように形成した（図１（ｂ））。
【００６４】
（３）酸素透過膜の形成
カソード３を形成した面にシリコーンゴム（信越化学製、KE4895）を塗布し、８０℃の水蒸気を飽和させた雰囲気下で１時間ベーキングした。次いで、同様にして、アノード６を形成した面にも同じシリコーンゴムを塗布しベーキングを施した。なお、それぞれの膜形成にあたっては、測定器に接続する際のコンタクトとなるパッド５、７の部分は剥離の容易なテープを貼って、シリコーンゴムがつかないように保護した。両面のシリコーンゴムが硬化した後、上記のパッド部分のテープをはがした（図１（ｃ））。
【００６５】
（４）チップの切り離し
濾紙上に一括して形成された酸素電極をはさみまたはカッターナイフにより切り離した。この際、切断面に濾紙が露出するので、電解液注入口９を残して（３）で用いたのと同じシリコーンゴムを側面にも塗布し、硬化させた。
【００６６】
（５）酵母の培養
酵母Trichosporon cutaneumをpH 7.0のBacto YM broth（DIFCO Laboratories製）培地中で３０℃で１８時間培養した。
【００６７】
（６）菌体の分離
培養した酵母を1500 rpmで１５分間遠心分離した後、リン酸緩衝液（100 mM、pH 7.0)で２回洗浄し、再度遠心分離を行った。
【００６８】
（７）酵母の固定
（６）で得られた酵母と光硬化性樹脂（関西ペイント製、ENT-3400）とリン酸緩衝液を１：１：１の重量比で混ぜ、カソード３を覆うように塗布し、窒素雰囲気下で紫外線を３分間照射して樹脂を硬化させ、酵母を固定した（図１（ｄ））。得られた酵母固定層を常温のリン酸緩衝液中に一晩浸漬した。
【００６９】
（８）電解液の注入
（７）までの工程で得られたチップ全体を電解液（塩化カリウム水溶液）中に浸漬し、濾紙が露出している部分すなわち電解液注入口９から電解液をしみこませた。
【００７０】
以上の工程により、ＢＯＤセンサが得られた。
【００７１】
【実施例２】
（１）絶縁膜の形成
親水性の多孔性シート１として濾紙（ワットマン社製、厚さ１８０μｍ）を用い、その両面に、絶縁膜２としてポリイミドテープ（住友スリーエム製、カプトンフィルムテープＮｏ．５４１３（商標）、厚さ７０μｍ）を位置合わせをした上で張り付けた。
【００７２】
（２）カソードおよびアノードの形成
実施例１と同様にして、（１）で形成した絶縁膜２上に銀のカソードパターンおよびアノードパターンを形成した。
【００７３】
（３）酵母の培養および吸着固定
実施例１と同様にして酵母を培養し、培養液１ｍｌをメンブランフィルター（ミリポア製、VMWP09025、孔径０．５μｍ）で濾過し、さらに、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で３回洗浄した。次いで、十分に乾燥して吸着固定した。
【００７４】
（４）酸素透過膜の形成および酵母の固定
カソード３を形成した面にシリコーンゴム（信越化学製、KE4895）を塗布し、その直後に、（３）で得られたメンブランフィルターを適当な形に切断し、酵母の吸着固定された面をシリコーンゴム上に貼り付け、酵母を固定した。シリコーンゴムの硬化は、水蒸気を飽和させた雰囲気下で常温で行った。メンブランフィルターを貼り付けないこと以外は同様にして、アノード６が形成された面にもシリコーンゴムを塗布し、硬化させた。なお、それぞれの膜形成にあたっては、測定器に接続する際のコンタクトを取るパッドの部分は、実施例１と同様にしてシリコーンゴムがつかないように保護した。
【００７５】
（５）チップの切り離し
濾紙上に一括して形成された酸素電極をはさみまたはカッターナイフにより切り離した。実施例１と同様、電解液注入口９を残して（４）と同じシリコーンゴムを側面にも塗布した。
【００７６】
（６）電解液の注入
実施例１と同様にして行った。
この方法で作成した小型ＢＯＤセンサの感応部を０．１Ｍリン酸緩衝液中に浸漬し、標準試料を添加したときの応答を図５に示す。
【００７７】
【実施例３】
（１）絶縁膜、カソードおよびアノードの形成
実施例１と同様にして、濾紙上に絶縁層２を形成し、その上にカソードパターンおよびアノードパターンを形成した。但し、パッド付近以外のチップ境界付近の部分を切り抜いた濾紙を使用した（図６（ａ））。
【００７８】
（２）プラスチックシートの接着
アノード用パッド７の部分を露出させる形状のポリエステルシート（厚さ１００μｍ）１０の全面に接着剤（エポキシ接着剤）１１をスピンコーティングし、直ちに（１）で得られた濾紙のカソード３の形成されていない方の面に接着した。
【００７９】
（３）酸素透過膜形成および酵母固定
実施例２と同様にして、カソード３の形成された面に酸素透過膜となるシリコーンゴムをパッド５の部分を除いて塗布した。酵母の固定は実施例２と同様にして行った。
【００８０】
（４）チップの切り離し
濾紙上に一括して形成された酸素電極をはさみまたはカッターナイフにより切り離した。チップのパッドの部分以外の境界の部分は、ポリエステルシート−接着剤−シリコーンゴムの積層構造となっており、外部の水溶液がしみ込まないようになっているため、シリコーンゴムを側面に塗布する必要はなかった（図６（ｂ））。
【００８１】
（５）電解液の注入
実施例２と同様に行った。パッドの部分の濾紙が露出している部分から電解液は注入された。
【００８２】
【実施例４】
トランスデューサとなる酸素電極を２個並列に並べ、一方に酵母を固定し、他方には光硬化性樹脂とリン酸緩衝液だけで固定層を作製する他は実施例１と同様にして差動型センサを作製する。
【００８３】
【実施例５】
トランスデューサとなる酸素電極を２個並列に並べ、一方に酵母を固定し、他方には酵母を吸着固定しないメンブランフィルターを用いる他は実施例２と同様にして差動型センサを作製する。
【００８４】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明によれば、安価な材料を用いて一括大量生産でき、しかも応答性に優れた小型のバイオセンサおよびその製造方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１および２による小型バイオセンサの構造および作製方法を示す。
【図２】カソードとアノードを同一面に形成した場合のレイアウトの例を示す。
【図３】カソードリード線用絶縁層を追加した態様の断面図を示す。
【図４】アノードの一部を露出させ、大部分を絶縁膜で被覆した態様の断面図を示す。
【図５】実施例２による小型バイオセンサの応答の様子を示す。
【図６】実施例３による小型バイオセンサの構造および作成方法を示す。（ａ）は平面図であり、（ｂ）は（ａ）のａ−ａ’線に沿った断面図である。
【図７】差動型バイオセンサの構造の一例を示す。
【図８】差動型バイオセンサにおいてアノードを共通にした構造の一例を示す。
【符号の説明】
１  多孔性シート
２  絶縁膜
３  カソード
４  カソードリード線
５  カソード用パッド
６  アノード
７  アノード用パッド
８  酸素透過膜
９  電解液注入口
１０  プラスチックシート
１１  接着剤
１２  生体関連物質固定層
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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