(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）；
【化１】
0003822479.tif 000004
(式中、ｎは１〜１２の整数を表す)で表される還元型補酵素Ｑを含有する水溶液であって、その水溶液中にキレート剤としてエチレンジアミンテトラ酢酸及びその塩からなる群より選択される１種以上を含有することを特徴とする水溶液。
【請求項２】
請求項１の還元型補酵素Ｑを含有する水溶液であって、その水溶液中に抗酸化剤を含有することを特徴とする水溶液。
【請求項３】
抗酸化物質が、クエン酸、クエン酸誘導体、ビタミンＣ、ビタミンＣ誘導体、グルタチオン、及び、チオ硫酸ナトリウムからなる群より選択される１種以上であることを特徴とする請求項２記載の水溶液。
【請求項４】
還元型補酵素Ｑが、基剤を用いてリポソームで被覆されたものであるか、又は、界面活性剤若しくは油脂によって可溶化若しくは乳化されたものであることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の水溶液。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、還元型補酵素Ｑを構成成分とする溶液に関し、特に還元型補酵素Ｑを酸化に対して安定的に維持するために抗酸化剤および／またはキレート剤を添加した水溶液に関する。
【０００２】
【従来の技術】
補酵素Ｑは、細菌から哺乳動物まで広く生体に分布する必須成分であり、生体内の細胞中におけるミトコンドリアの電子伝達系構成成分として知られている。補酵素Ｑは、ミトコンドリア内において酸化と還元を繰り返すことで、電子伝達系における伝達成分としての機能を担っているほか、還元型補酵素Ｑは抗酸化作用をもつことが知られている。ヒトでは、補酵素Ｑの側鎖が繰り返し構造を１０個持つ、補酵素Ｑ10が主成分であり、生体内においては通常４０〜９０％程度が還元型で存在している。補酵素Ｑの生理的作用としては、ミトコンドリア賦活作用によるエネルギー生産の活性化、心機能の活性化、細胞膜の安定化効果、抗酸化作用による細胞の保護効果などが挙げられている。
【０００３】
補酵素Ｑは種々の用途での使用が知られており、例えば、酸化型補酵素Ｑ10はその心臓に対する効果から鬱血性心不全薬として用いられている。医薬用途以外でも、ビタミン類同様、栄養剤、栄養補助剤として経口的に使用されている。しかし、補酵素Ｑは脂溶性が強く水に溶けにくいため、実際の用途は経口剤および皮膚用剤のみしか知られていなかった。
【０００４】
近年、血中の酸化ストレスの増加による疾患の増悪が種々報告されるようになった。代表的なものとして、動脈硬化、糖尿病合併症などが挙げられる。これらの疾患では、血液中に存在する種々の酸化ストレスによる脂質変性などにより、疾患の発生あるいは増悪が起こっている。このような酸化ストレスによる影響を減少させるためには抗酸化剤の投与による抗酸化能の賦活が有効である。脂質過酸化の抑制により有効であると考えられる脂溶性の抗酸化物質の代表的な化合物であるビタミンＥは抗酸化物質として疾患の予防などに幅広く用いられている。近年、ビタミンＥの抗酸化活性を充分に発揮させるためには還元型補酵素Ｑ10の共存が重要であることが報告され（Ｂｏｗｒｙ等、１９９３、Ｊ．Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ、  １１５、６０２９−６０４４）、補酵素Ｑの脂溶性抗酸化物質としての重要性が明らかになりつつある。
【０００５】
還元型補酵素Ｑはそれ自身でも強い抗酸化作用を持つため、可溶化して血中に充分量の還元型補酵素Ｑを送り込むことにより、血中の抗酸化活性を効果的に増加させることが可能となる。血中の抗酸化活性を増加させることは、虚血再還流時の血管障害、動脈硬化の再狭窄防止、脳梗塞後の血管障害の防止、動脈効果の予防、糖尿病の合併症の予防など活性酸素種によって増悪が示唆されている多くの疾患に対して幅広い有用性が考えられる。更に、新たな補給形態として点滴により体内へ送りこむことにより、経口による摂取ができない重症患者あるいは脳疾患患者への補酵素Ｑの供給が可能となる。このように補酵素Ｑを可溶化することは多くのメリットを生み出すことが予想される。
【０００６】
補酵素Ｑには酸化型と還元型が知られており、酸化型補酵素Ｑ10（ユビデカレノンまたはユビキノン）の可溶化方法に関しては従来から数多くの研究が行われてきた。酸化型補酵素Ｑ10の可溶化方法としては、リポソームによる被覆、界面活性剤あるいは油脂による懸濁など種々の方法が報告されている（特開平５−１８６３４０、特開平７−６９８７４、特表２０００−５１０８４１）が、実用に供された例は少ない。その理由のひとつとして、酸化型補酵素Ｑ10が抗酸化活性を示すためには還元酵素などによって還元型に変換される必要があるが、血中には還元酵素が存在しないため注射などによる投与では血中の酸化ストレスに対する抗酸化活性が期待できないことが挙げられる。一方、還元型補酵素Ｑ10はそれ自体が抗酸化活性を有することから、上記のような疾患に対する有用性が大いに期待できる物質ではあるが、酸化を受けやすく不安定であるという欠点があり実用には供しえなかった。還元型補酵素Ｑ10のリポソーム被覆体を酸化還元酵素などの研究のために作製したという研究報告はあるが（Ｋｉｓｈｉ等、１９９９、ＢｉｏＦａｃｔｏｒｓ、１０、１３１−１３８）、用いられているリポソームは実験毎の用時調製例であり、安定的に還元型補酵素Ｑを維持できる可溶化方法については全く知られていなかった。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、還元型補酵素Ｑの酸化安定性を改良した水溶液を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は上記の課題を克服するために研究を行った結果、還元型補酵素Ｑの安定性を高めるために適した水溶液の組成を見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
即ち本発明は、リン脂質及び／又は糖脂質で構成されるリポソームで被覆し、、リン脂質及び／又は糖脂質を用いて乳化し、界面活性剤により可溶化もしくは乳化し、又は油脂により乳化した還元型補酵素Ｑ10の水溶液中における酸化に対する安定性をより増加させるために、抗酸化剤および／またはキレート剤を添加した水溶液に関する。
【００１０】
【発明の実施の形態】
補酵素Ｑは、下記式（１）；
【００１１】
【化２】
0003822479.tif 000002
（式中、ｎは１〜１２の整数を表す）および下記式（２）；
【００１２】
【化３】
0003822479.tif 000003
（式中、ｎは１〜１２の整数を表す）で表され、式（１）は還元型補酵素Ｑを表し、式（２）は酸化型補酵素Ｑを表す。
【００１３】
本発明で用いる補酵素Ｑ含有組成物は、式（１）で表される還元型補酵素Ｑを含有し、補酵素Ｑ全量中、還元型補酵素Ｑを２０重量％以上含有するのが好ましく、４０重量％以上含有するのがより好ましい。
【００１４】
上記還元型補酵素Ｑを得る方法としては特に限定されないが、例えば、合成、発酵、天然物からの抽出等の従来公知の方法により補酵素Ｑを得た後、クロマトグラフィーにより流出液中の還元型補酵素Ｑ区分を濃縮する方法などを採用することができる。この場合には、必要に応じて上記補酵素Ｑに対し、水素化ほう素ナトリウム、亜ジチオン酸ナトリウム(ハイドロサルファイトナトリウム)等の一般的な還元剤を添加し、常法により上記補酵素Ｑ中に含まれる酸化型補酵素Ｑを還元して還元型補酵素Ｑとした後にクロマトグラフィーによる濃縮を行っても良い。また、既存の高純度補酵素Ｑに上記還元剤を作用させる方法によっても得ることができる。
【００１５】
本発明で使用できる補酵素Ｑは、前記式（１）および（２）で表されるように、側鎖の繰り返し単位（式中ｎ）が１〜１２のものを使用することができるが、側鎖繰り返し単位が１０のもの、すなわち補酵素Ｑ10が特に好適に使用できる。
【００１６】
本発明の水溶液を得る方法としては特に限定されないが、例えば、還元型補酵素Ｑを含有する補酵素Ｑと適当な抗酸化剤および／またはキレート剤を、適当な基剤を用いてリポソームで被覆し可溶化することにより得ることができる。あるいは、還元型補酵素Ｑを含有するリポソームに適当な抗酸化剤および／またはキレート剤の水溶液を添加することにより得ることができる。あるいは、これらの組成物を適当な界面活性剤あるいは油脂によって可溶化もしくは乳化することによっても得ることができる。
【００１７】
この時に用いることができる抗酸化剤としては、クエン酸、クエン酸誘導体、ビタミンＣ、ビタミンＣ誘導体、プロブコール、リコペン、ビタミンＡ、カロテノイド類、ビタミンＢ、ビタミンＢ誘導体、フラボノイド類、ポリフェノール類、グルタチオン、セレン、チオ硫酸ナトリウム、ビタミンＥ，ビタミンＥ誘導体、スーパーオキサイドディスムターゼ（ＳＯＤ）、グルタチオンペルオキシダーゼ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、グルタチオン還元酵素、カタラーゼ、アスコルビン酸ペルオキシダーゼ、およびこれらの混合物が挙げられる。
【００１８】
また、キレート剤としては、エチレンジアミンテトラ酢酸およびその塩が挙げられる。
【００１９】
上記のようにして調製される水溶液には、更に、薬剤学的に許容されている他の製剤素材を常法により適宜添加混合してもよい。添加しうる製剤素材としては特に限定されず、例えば、乳化剤、緊張化剤、緩衝剤、溶解補助剤、矯臭剤、防腐剤、安定化剤などが挙げられる。更に、用途に即して他の有効成分、例えば薬剤、栄養補助成分などを加えても良い。
【００２０】
本発明による水溶液組成物の保存方法としては、特に限定されず、低温保存、密閉容器による嫌気的保存、遮光保存などを用いることができる。
【００２１】
上記のようにして調製される本発明の水溶液は、酸化に対してより安定に還元型補酵素Ｑを維持することができる。
【００２２】
本発明による還元型補酵素Ｑを含有する水溶液は、医療用、化粧用、食品用、園芸用、酪農用など広い範囲で使用できる。具体的な形態としては注射剤、輸液、液剤、点眼剤、内服用液剤、ローション剤、ヘヤートニック、化粧用乳液、スプレー液、エアロゾル、ドリンク液、液体肥料、保存溶液などが挙げられ、医療用としては更に臓器移植時の保存溶液などとして用いることもできる。更に、上記の形態は動物用として用いてもよく、飼料として用いてもよい。また、抗酸化溶液として肉、魚など生鮮食品の保存用に用いることもできる。
【００２３】
【実施例】
以下に実施例を挙げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。
【００２４】
（実施例１）抗酸化剤がリポソームで被覆された還元型補酵素Ｑ10に与える酸化安定性
リポソーム中での還元型補酵素Ｑ10の酸化安定性を評価するために、４０℃の保存条件で酸化安定性の悪い卵黄レシチン（レシチン、和光純薬工業社製）をリポソームの基剤として選択し、還元型補酵素Ｑ10（０．００５％含有）の酸化安定性を高められる物質の評価を実施した。
還元型補酵素Ｑ10の維持率はＨＰＬＣで還元型補酵素Ｑ10と酸化型補酵素Ｑ10を分離した後、電気化学的検出器によってそれぞれの量を定量し、全補酵素Ｑ10量に対する還元型の割合を算出した。
卵黄レシチンを基剤として作製した０．００５％還元型補酵素Ｑ10含有リポソームに、種々の抗酸化剤を０．０５％添加し、空気雰囲気下、４０℃保存での酸化安定性を評価した。その結果、抗酸化剤を添加しないリポソームでは、保存１〜２日後に維持率が１０％以下にまで酸化を受けたのに対し、酢酸ビタミンＥでは保存２日後で６３％の維持率、チオ硫酸ナトリウムでは保存３日後で７６％、クエン酸は保存８日後で５４％、ビタミンＣでは保存１５日後で６８％であった。しかし、ビタミンＥ（α−トコフェロール）の添加では、明らかな効果はみられなかった。このようにリポソーム中の還元型補酵素Ｑ10の安定化に対して抗酸化剤により、強い効果を示すものとマイルドな効果を示すものがあることが判った。ビタミンＣが最も効果が強く、以下、クエン酸、チオ硫酸ナトリウム、酢酸ビタミンＥ、ビタミンＥの順であった。
【００２５】
（実施例２）キレート剤がリポソームで被覆された還元型補酵素Ｑ10に与える酸化安定性
実施例１と同様にして還元型補酵素Ｑ10の維持率に対するキレート剤の効果を評価した。エチレンジアミンテトラ酢酸を０．０５％含有するリポソームを空気中、４０℃で保存し、キレート剤の安定化効果を評価した。キレート剤を添加しないリポソーム中の還元型補酵素Ｑ10は、保存１〜２日後に維持率が１０％以下にまで酸化を受けたのに対し、エチレンジアミンテトラ酢酸を添加したリポソームでは保存４３日後で７６％の維持率であった。
【００２６】
キレート剤であるエチレンジアミンテトラ酢酸は酸化を受けやすい物質に対する保護作用が知られてはいたが、今回の結果のように抗酸化剤以上の強い保護効果を示すことは全く予想外の結果であった。
【００２７】
（実施例３）界面活性剤溶液に対する抗酸化剤の効果（１）
０．００５％還元型補酵素Ｑ10の０．１％ポリソルベート８０溶液に対し、抗酸化剤またはキレート剤を０．０５％添加し、４０℃で保存した。抗酸化剤を添加しない無添加溶液では保存６日後に維持率が２７％になった。それに対し、ビタミンＣ添加溶液では、保存６日後でも８８％が還元型のままで維持されていた。クエン酸では保存６日後には２０％となり保護効果はみられなかった。
【００２８】
（実施例４）界面活性剤溶液に対する抗酸化剤の効果（２）
０．００５重量％の還元型補酵素Ｑ10 を含有する０．１％ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油溶液（ＨＣＯ−６０：日光ケミカルズ社製）に、抗酸化剤を０．０５重量％になるように添加し、４０℃で保存した。抗酸化剤を添加しない無添加溶液では保存７日後に維持率が１７％になった。それに対し、ビタミンＣ添加溶液では、保存１４日後でも７３％が還元型のままで維持されていた。クエン酸では保存７１日後でも６１％が還元型で維持されており、ポリソルベート溶液とは明らかに異なった強い保護効果を示した。
【００２９】
（実施例５）界面活性剤溶液に対するキレート剤の効果（１）
実施例３と同様にして、キレート剤の効果を評価した。キレート剤を添加しない無添加溶液では保存６日後に維持率が２７％になったのに対し、エチレンジアミンテトラ酢酸添加溶液では、リポソームと同様に強い保護効果が見られ、保存７８日後でも８０％が還元型で維持されていた。
【００３０】
（実施例６）界面活性剤溶液に対するキレート剤の効果（２）
実施例４と同様の系でキレート剤の効果を評価した。キレート剤を添加しない無添加溶液では保存７日後に維持率が１７％になったのに対し、エチレンジアミンテトラ酢酸添加溶液では、保存１６７日後でも７４％が還元型で維持されていた。このように４０℃の過酷条件下で、半年近い長期間に渡り、還元型補酵素Ｑ10を高い割合で維持できることは、全く予想外の結果であった。
【００３１】
【発明の効果】
本発明により抗酸化物質あるいは栄養補助成分として有用性の高い還元型補酵素Ｑの液剤をより安定に供給できる。