(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
６−アミジノ−２−ナフチルｐ−グアニジノベンゾアート・二メタンスルフォン酸塩、メシル酸ガベキサート、ウリナスタチン、アプロチニンから選ばれる蛋白分解酵素阻害剤溶液を送液する手段、該蛋白分解酵素阻害剤溶液と血漿とを混合する手段、該蛋白分解酵素阻害剤溶液と血漿との混合液を、表面に０．５μ等量／ｍｌ以上１００μ等量／ｍｌ以下のアニオン性基を有する低キニン血漿の製造のための多孔質の吸着材に灌流する手段、血漿中の被吸着物質を該吸着材で吸着除去する手段とを有し、且つ該蛋白分解酵素阻害剤溶液を送液する手段により供給される蛋白分解酵素阻害剤溶液の量が１時間当たり１０μＭ以上６０μＭ以下であることを特徴とする低キニン血漿の製造装置。
【請求項２】
蛋白分解酵素阻害剤溶液と血漿との混合比が１：１００以上１：５０００以下である請求項１記載の低キニン血漿の製造装置。
【請求項３】
蛋白分解酵素阻害剤溶液と血漿とを混合する手段と、表面にアニオン性基を有する多孔質の吸着材との間に、血漿を貯留する手段を有する請求項１記載の低キニン血漿の製造装置。
【請求項４】
使用に先立ってあらかじめ６−アミジノ−２−ナフチルｐ−グアニジノベンゾアート・二メタンスルフォン酸塩、メシル酸ガベキサート、ウリナスタチン、アプロチニンから選ばれる蛋白分解酵素阻害剤含有前処理溶液で処理された、多孔質担体表面に０．５μ等量／ｍｌ以上１００μ等量／ｍｌ以下のアニオン性基を有し、血漿中の被吸着物質を該吸着材で吸着除去する低キニン血漿の製造のための吸着材。
【請求項５】
前処理用蛋白分解酵素阻害剤含有前処理溶液の量が、吸着材の１／２容量以上５容量以下である請求項４記載の吸着材。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、血漿中の被吸着物質を、キニンを上昇することなく吸着除去するための吸着材と、低キニン血漿の製造装置に関する。
【０００２】
【従来技術とその問題点】
血漿中の低比重リポ蛋白質や極低比重リポ蛋白質などの吸着材として多孔質担体表面にデキストラン硫酸等のポリアニオンを共有結合等の手段によって不溶化したものが、臨床の場で利用されている。
これら吸着材で血漿を処理する際、血液中のキニン（ブラジキニン）量が増加することが知られている（Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｏｒｇａｎ  ５（４）、１９９１）。例えばキニン量の多い血漿製剤が生体に投与された場合、アナフィラキシーショック症状を誘発することが知られており、血漿中のキニン量が増加する事は実用上の非常に大きな問題点であった。本発明者らの研究によると、このキニン量の増加は正常な状態に比べて数十倍から時には数百倍以上にも達することがわかった。例えばキニンの正常濃度が１０〜２０ｐｇ／ｍｌであるのに対して、低比重リポ蛋白質吸着材として市販されている架橋合成したセルロース多孔質担体にデキストラン硫酸を共有結合した吸着材では８０００ｐｇ／ｍｌから時には数万ｐｇ／ｍｌにも達するのである。
一般にガラスなどの非常に多くのアニオン性基を表面に有する材料では血液凝固ＸＩＩ因子とカリクレインが活性化され、高分子量キニノーゲンを分解して血液キニンを生じることが知られている。しかしこのアニオン性基とキニン生成量との関係は知られていない。
【０００３】
一方、６−アミジノ−２−ナフチルｐ−グアニジノベンゾアート・二メタンスルフォン酸塩（Ｎａｆａｍｏｓｔａｔ  Ｍｅｓｉｌａｔｅあるいはフサンともよばれる）などの蛋白分解酵素阻害剤は、活性化血液凝固ＸＩＩ因子、プラスミン、カリクレイン、活性化血液凝固ＩＩ因子、活性化血液凝固Ｘ因子などの活性を阻害することが知られている。このため抗凝固作用を示すため、中空糸膜での透析、あるいは肝不全患者での表面にカチオン性基を有する吸着材での血漿浄化において、体外循環用抗凝固剤として６−アミジノ−２−ナフチルｐ−グアニジノベンゾアート・二メタンスルフォン酸塩が利用されることがある。
更に、多孔質担体表面にポリアニオンを不溶化した吸着材での血漿成分吸着において、７０μＭ／時以上の高濃度で６−アミジノ−２−ナフチルｐ−グアニジノベンゾアート・二メタンスルフォン酸塩を使用し、キニンの上昇を抑制しようとした試みはある（Ｓ・ＫＯＪＩＭＡ等、１９９１）。
６−アミジノ−２−ナフチルｐ−グアニジノベンゾアート・二メタンスルフォン酸塩にはキニンの上昇に抑制的な作用もあることが知られているが、多孔質担体表面にアニオン性基を不溶化した吸着材での血漿成分の吸着においては、表面のアニオン性基の量とキニン上層に対する６−アミジノ−２−ナフチルｐ−グアニジノベンゾアート・二メタンスルフォン酸塩の効果との関係についての十分な検討はされていない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らの研究によると、キニン濃度の上昇度と、材料表面のアニオン性基との間には正の相関があり、表面アニオン性基の量の増加と共に、該材料での血漿処理に際してのキニンの上昇は増加することがわかった。この時アニオン性基の量を例えば１μ当量／ｍｌ（吸着材湿潤状態の容積当たりの量）以下とする事でキニン上昇をおこさなくできることがわかった。しかし、一方でアニオン性基の量を減らすことで被吸着物質、例えば低比重リポ蛋白質の吸着量は低下し、やはり問題であった。
そこでアニオン性基の量を減らすことなくキニン上昇を抑制することを目的に研究し、本発明を成すに至った。
本発明の目的は、キニン上昇を伴わず、且つ吸着能力を下げることなく血漿中の被吸着物質を吸着除去するための吸着材と、該吸着材を使用した低キニン血漿の製造装置を提供するにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明の要旨は下記のとおりのものである。
６−アミジノ−２−ナフチルｐ−グアニジノベンゾアート・二メタンスルフォン酸塩、メシル酸ガベキサート、ウリナスタチン、アプロチニンから選ばれる蛋白分解酵素阻害剤溶液を送液する手段、該蛋白分解酵素阻害剤溶液と血漿とを混合する手段、該蛋白分解酵素阻害剤溶液と血漿との混合液を、表面に０．５μ等量／ｍｌ以上１００μ等量／ｍｌ以下のアニオン性基を有する低キニン血漿の製造のための多孔質の吸着材に灌流する手段、血漿中の被吸着物質を該吸着材で吸着除去する手段とを有し、且つ該蛋白分解酵素阻害剤溶液を送液する手段により供給される蛋白分解酵素阻害剤溶液の量が１時間当たり１０μＭ以上６０μＭ以下であることを特徴とする低キニン血漿の製造装置。
使用に先立ってあらかじめ６−アミジノ−２−ナフチルｐ−グアニジノベンゾアート・二メタンスルフォン酸塩、メシル酸ガベキサート、ウリナスタチン、アプロチニンから選ばれる蛋白分解酵素阻害剤含有前処理溶液で処理された、多孔質担体表面に０．５μ等量／ｍｌ以上１００μ等量／ｍｌ以下のアニオン性基を有し、血漿中の被吸着物質を該吸着材で吸着除去する低キニン血漿の製造のための吸着材。
以下に、本発明を項目別に説明する。
【０００６】
低キニン血漿の説明
本発明者らの研究によると、キニン濃度が４０００ｐｇ／ｍｌ以上、特に１００００ｐｇ／ｍｌを越える血漿が使用されて体内に入ると、血圧低下や顔面紅潮、粘膜腫脹などの重篤な副作用を誘発することが分かった。しかしこのキニン濃度が２０００ｐｇ／ｍｌ以下、特に１０００ｐｇ／ｍｌ以下であると重篤な副作用を誘発しないことが分かった。
本発明でいう低キニン血漿とは、重篤な副作用を誘発しない血漿であり、具体的にはキニン濃度が２０００ｐｇ／ｍｌ以下のものをいう。更にキニン濃度が１０００ｐｇ／ｍｌ以下の時、特に好ましい。
【０００７】
血漿のキニン活性化率
本発明の血漿は、吸着材での処理を終了する前の血漿を言い、ヘパリンなどの抗凝固材やクエン酸を成分として含む水溶液などと混合したもの、或いは血球成分を含むものであっても良い。
何れの血漿でも、先のデキストラン硫酸を不溶化した固定吸着材や或いはガラスビーズと接触することによって、キニン濃度は大きく増加する。が、本発明者らの研究によると、血漿のキニン濃度の活性化性は種或いは個体により異なる場合があることがわかった。この、血漿のキニン濃度の活性化性は実用時と同じ方法で毎回測定することは困難であり、より簡便に測定できることが望ましい。この目的のためにキニン活性化率を利用できる。
本発明の吸着材と低キニン血漿の製造装置は何れの血漿においても良好に使用できるし、予防のために全ての血漿に対して使用することが望ましい。しかし、特にキニン活性化率が２０以上の血漿に対して高い効果が得られ、好ましく用いられる。更に好ましくはキニン活性化率が５０以上の血漿であり、キニン活性化率が１００以上の血漿に対して用いるのに最も適している。
血漿のキニン活性化率とは、次の方法によって測定することができる。
測定する血漿にＡＣＤ−Ａ  １１．１％を混合して被検血漿とする。この被検血漿５ｍｌをガラス製三角フラスコに入れ、３７℃で５分間静置する。この時被検血漿と三角フラスコはあらかじめ３７℃に加温しておく。静置後常法に従って被検血漿にトラジオール、大豆トリプシンインヒビター、硫酸プロタミン、エチレンジアミン四酢酸−２ナトリウム塩を加えてカリクレインとキニナーゼの活性を阻害し、キニン濃度を測定して活性化値とする。
上記においてガラス製三角フラスコ添加前の被検血漿を、同様にカリクレインとキニナーゼの活性を阻害し、キニン濃度を測定した時の値を対照値とする。この時対照は通常２０ｐｇ／ｍｌから２００ｐｇ／ｍｌの間にあることが好ましい。
血漿中のキニン濃度は、キニン濃度測定の最も一般的な方法であるラジオアイソトープを用いたＲＩＡ法（ＰＥＧ沈殿ＲＩＡ法）によって測定することができる。酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）の測定試薬キットも市販されているが、検出感度がＲＩＡ法よりもやや劣るため、ＲＩＡ法で測定することが好ましい。
血漿のキニン活性化率は、活性化値を対照値で割った値をいう。
【０００８】
蛋白分解酵素阻害剤の説明
本発明でいう蛋白分解酵素阻害剤とは、蛋白分解酵素、特にセリンプロテアーゼ活性を有する酵素の機能を阻害する化合物であって合成化合物や天然化合物がある。蛋白分解酵素としては活性化血液凝固ＸＩＩ因子或いはカリクレイン等が例示できる。
蛋白分解酵素阻害剤の具体例を示すと、６−アミジノ−２−ナフチルｐ−グアニジノベンゾアート・二メタンスルフォン酸塩、メシル酸ガベキサート、ウリナスタチン、アプロチニン、ジイソプロピルフルオロフォスフェート、ダイズトリプシンインヒビター、塩基性膵トリプシンインヒビター、アンチトロンビンＩＩＩ、α2 −プラスミンインヒビター、α2 −マクログロブリン、Ｃｌ′エステラーゼインヒビター、リマ豆インヒビター、トゥモロコシインヒビターなどがあげられる。この中でより好ましくは６−アミジノ−２−ナフチルｐ−グアニジノベンゾアート・二メタンスルフォン酸塩、メシル酸ガベキサート、ウリナスタチン、アプロチニンなどである。更に６−アミジノ−２−ナフチルｐ−グアニジノベンゾアート・二メタンスルフォン酸塩が特に好ましく使用できる。
【０００９】
蛋白分解酵素阻害剤の濃度
蛋白分解酵素阻害剤は溶液状態、特に水溶液として使用することが好ましい。最も好ましくは１から１０％のブドウ糖水溶液、または生理食塩液などの生理的な水溶液に溶解して用いることである。この時カルシウムイオンを２ｍ当量／ｍｌ以上５ｍ当量／ｍｌ以下含む液であってもよい。生理的な水溶液とは塩化ナトリウムなどの塩を含み、氷点降下法で測定される浸透圧が２００ｍＯｓｍ以上４００ｍＯｓｍ以下、特に２５０ｍＯｓｍ以上３５０ｍＯｓｍ以下、最も好ましくは２８０ｍＯｓｍ以上３００ｍＯｓｍ以下の水溶液をいう。
この時血漿と混合する場合と使用に先立って吸着材を処理する場合とで、溶液中の蛋白分解酵素阻害剤の好ましい濃度は異なる。以下、血漿と混合する場合の蛋白分解酵素阻害剤を溶解した液を蛋白分解酵素阻害剤溶液、使用に先立って吸着材を処理する場合の蛋白分解酵素阻害剤を溶解した液を蛋白分解酵素阻害剤含有前処理溶液と称す。
蛋白分解酵素阻害剤溶液は、濃度が低いと、血漿に十分な量の蛋白分解酵素阻害剤を混合するに際して、血漿が希釈されるため好ましくない。また濃度が高いと、必要量の蛋白分解酵素阻害剤を混合するに際して、蛋白分解酵素阻害剤溶液に対する血漿の混合比が小さくなりすぎ、十分に混合されないためやはり好ましくない。蛋白分解酵素阻害剤溶液での蛋白分解酵素阻害剤の好ましい濃度は、１ｍＭ／Ｌ以上１００ｍＭ／Ｌ以下である。更に５ｍＭ／Ｌ以上５０ｍＭ／Ｌ以下であることがより好ましい。
蛋白分解酵素阻害剤含有前処理溶液では、濃度が低過ぎると、十分な量の蛋白分解酵素阻害剤で吸着剤を前処理するに際して、液量が多くなり、しかも処理時間を要するため、工業的に好ましくない。また濃度が高すぎると、蛋白分解酵素阻害剤の使用量が増加するため経済上好ましくないし、多量の蛋白分解酵素阻害剤が残存して、次に血漿処理時に血漿中に許容範囲を越えて多量に混入するために血漿或いは血球に悪影響を及ぼすことがあるため好ましくない。蛋白分解酵素阻害剤含有前処理溶液での蛋白分解酵素阻害剤の好ましい濃度は、１μＭ／Ｌ以上１ｍＭ／Ｌ以下である。更に、５μＭ／Ｌ以上０．５ｍＭ／Ｌ以下であることがより好ましい。
【００１０】
使用に先立っての処理
吸着材は、使用に先立ってあらかじめ蛋白分解酵素阻害剤で処理されていることが好ましい。ここで言う使用に先立つこととは、血漿が吸着材と接触する以前であればいずれの時点であってもよい。が、吸着材製造時の滅菌処理において、蛋白分解酵素阻害剤が悪影響を受ける場合があるため、滅菌処理後であることが好ましい。更に、滅菌後に蛋白分解酵素阻害剤で処理後、吸着材を長期に保存する場合は、蛋白分解酵素阻害剤での処理を無菌的に実施しなければならず手間がかかり、更に保存時に紫外線、熱等でやはり蛋白分解酵素阻害剤が悪影響を受ける場合がある。よって使用直前に蛋白分解酵素阻害剤で処理することが実用上最も好ましい。ここでいう使用直前とは特に規定は不要であるが、処理後の吸着材を室温で保存する時は、２４時間以内、２℃から８℃程度の冷蔵で保存する時は７２時間以内が１つの目安となる。
血漿を吸着材で断続的に吸着処理する場合は、血漿の各分画が吸着材で吸着処理される以前は、その分画については使用に先立つと考える。
吸着材の処理に際しての蛋白分解酵素阻害剤含有前処理溶液の好ましい量は、処理しようとする吸着材の１／２容量以上５容量以下の量である。吸着材に対して蛋白分解酵素阻害剤含有前処理溶液が少なすぎると吸着材の処理むらが生じ、多すぎると処理に時間を要するため好ましくない。
この時の還流速度は、早すぎると蛋白分解酵素阻害剤含有前処理溶液の流れの片寄りができて吸着材の処理むらができるため好ましくない。遅すぎると処理時間の点でやはり実用上好ましくない。よって１０ｍｌ／分以上２００ｍｌ／分以下であることが実用上好ましい。
【００１１】
吸着材の蛋白分解酵素阻害剤との結合性
吸着材は蛋白分解酵素阻害剤との結合性を有することが望ましい。ここでいう結合性は、物理的吸着、静電的吸着、沈澱、共有結合など何れの結合様式であってもかまわないが、血漿成分と置換されて少なくとも一部が血漿中に遊離されることがキニン濃度の上昇を抑制する点でより好ましく、この点で静電的結合であることが好ましい。
吸着材の蛋白分解酵素阻害剤との結合性は次のようにして評価することができる。濃度がおよそ１００μＭ／Ｌとなるように蛋白分解酵素阻害剤を生理食塩液に溶解して試験液を調整する。ポリカーボネート製の三角フラスコに、吸着材１容と試験液３容を加え、３７℃で１５分間振とうしながら反応させる。対照として吸着材を加えずに同様に反応したものを準備する。反応後の上清中の蛋白分解酵素阻害剤濃度を測定し、対照濃度に対する減少率を算出する。この時、吸着材共存による蛋白分解酵素阻害剤濃度の減少率が３０％以上の時、本発明において好ましい。更に５０％以上の時最も好ましい。
蛋白分解酵素阻害剤の濃度は、ガスクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィーなどの、各蛋白分解酵素阻害剤の測定に用いられる通常の測定法が利用できる。この中で、実施が容易であることより、波長２００ｎｍでの吸収より算出することができる。この時、吸着材からの溶出物があり、該溶出物が波長２００ｎｍで吸収を有するときは、試験液に代えて生理食塩液で同様の処理をした上清で補正する。
【００１２】
吸着器形状
本発明の吸着材は、体液の導出入口を備えた容器内に充填保持された吸着器として使用されるのが一般的である。本吸着材を単独で充填しても良く、他の吸着材と混合もしくは、積層しても良い。吸着器の容量は、体外循環に用いる場合１０ｍｌから１０００ｍｌ程度が適当である。
【００１３】
蛋白分解酵素阻害剤溶液の送液手段
蛋白分解酵素阻害剤溶液の送液は、シリンジポンプ、シリンダー式ポンプ、ペリスタポンプ、フィンガーポンプ或いはタッピングポンプ、マグネティックポンプなどが例示できる各種ポンプによって行える。この中でシリンジポンプなどのインフュージョンポンプが一定流量を連続して送液できるため、特に好ましい。ペリスタポンプなどでは脈流があるため、血漿と蛋白分解酵素阻害剤溶液との間の圧力が変動し、例えば蛋白分解酵素阻害剤溶液の供給用チューブに血漿が逆流して十分な量の蛋白分解酵素阻害剤が血漿に供給されない、あるいは逆に過剰な量の蛋白分解酵素阻害剤が血漿に供給されるなどするため、結果血漿中の蛋白分解酵素阻害剤濃度の不均一が起こる場合があるのに対して、インフュージョンポンプでは濃度を均一に保てるため好ましい。更に流量の正確性の点でもインフュージョンポンプであることが好ましい。
尚、蛋白分解酵素阻害剤含有前処理液の場合は、蛋白分解酵素阻害剤溶液と異なり、いずれのポンプであってもよい。好ましい灌流速度を容易に得られるという点で、ペリスタポンプなどのシゴキポンプが実用上好ましい。
【００１４】
蛋白分解酵素阻害剤溶液の流量
蛋白分解酵素阻害剤溶液の送液は、血漿の流量に対して少なすぎると血漿との混合が十分に行われず、また多すぎると血漿が希釈されるため、好ましくない。よって好ましい蛋白分解酵素阻害剤溶液と血漿との混合比は１：１００以上であり且つ１：５０００以下である。更に１：５００以上１：３０００以下であることがより好ましい。
【００１５】
蛋白分解酵素阻害剤と血漿とを混合する手段
蛋白分解酵素阻害剤と血漿との混合は、血漿流路と蛋白分解酵素阻害剤溶液の導管とがＶ字型、或いはＴ字型などに直接接続することで行える。或いはチャンバーなどの溶液溜部分で血漿流路と蛋白分解酵素阻害剤溶液の導管とが接続されていても良い。
この時、血漿流量に対して蛋白分解酵素阻害剤溶液の導管が太すぎると、
蛋白分解酵素阻害剤溶液の流量が血漿に対して少ないため、血漿が蛋白分解酵素阻害剤溶液の導管に逆流する危険性が生じるため好ましくない。細すぎると蛋白分解酵素阻害剤溶液の流れ抵抗が大きくなり、圧力が上昇して導管或いはその接続部などで液漏れをおこす危険性が生じるためやはり好ましくない。好ましい導管の太さは、（導管の太さ）／（血漿流路）で表す時１／１００以上１／１０以下である。
更に血漿と蛋白分解酵素阻害剤溶液との混合後、直ちに吸着材で処理することも可能ではあるが、本発明のように連続的に血漿と蛋白分解酵素阻害剤溶液とを混合する場合は、混合後、一定長を灌流した後に吸着材で処理することが、血漿と蛋白分解酵素阻害剤との混合をより促進できる点で好ましい。即ち、血漿と蛋白分解酵素阻害剤溶液との混合部から吸着材を充填した容器までの血漿流路の長さで表したとき、０．２ｍ以上であり且つ２ｍ以下であることが好ましい。０．２ｍ未満では期待する混合促進の効果が得られず、また２ｍを越えると逆に血漿中で蛋白分解酵素阻害剤が消費されて吸着材処理時に十分な蛋白分解酵素阻害剤としての機能が得られない場合があるため、好ましくない。最も好ましくは０．６ｍ以上１．６ｍ以下である。
尚、蛋白分解酵素阻害剤含有前処理液での吸着材の前処理に当たっては、特に規定は不要である。
【００１６】
血漿を貯留する手段
血漿流路と蛋白分解酵素阻害剤含有溶液の導管とが直接接続されている場合は、血漿と蛋白分解酵素阻害剤含有溶液との混合性をより上げるために、接続部の下流側に溶液溜を設けることが好ましい。この溶液溜は小さすぎると混合が上手く行かず、また大きすぎても混合性が低下し、また血漿の淀みが生じて血漿が劣化する可能性もあり、よって容積が１ｍｌ以上３００ｍｌ以下であることが好ましい。溶液溜には例えば圧力の測定などの目的で他の導管が設けられていてもよく、また、フィブリン凝集物などの固形物の除去用の多孔性の隔壁が設けられていても良い。
【００１７】
血漿中での蛋白分解酵素阻害剤の混合量
蛋白分解酵素阻害剤の量は、本来は血漿中の濃度で示すことが好ましいが、血漿中では直ちに分解されて濃度は逐次低下すること、血漿流量が一定しない場合があることより、本発明においては一定時間当たりの添加量で表現することが実用上好ましい。蛋白分解酵素阻害剤の好ましい添加量は、１０μＭ／時以上である。１５μＭ／時以上の時より好ましく、３０μＭ／時以上の時最も好ましい。上限は特に規定は不要であるが、過剰な使用は他の血液成分等への本目的以外の影響を生じる場合があること、経済的にも好ましくないことより、６０μＭ／時以下であることが好ましい。本発明でいう、表面のアニオン性基の量が１００μ当量／ｍｌ以下であるとき、上記添加量で低キニン血漿を得ることができる。
蛋白分解酵素阻害剤と血漿とを混合した際の、血漿中の蛋白分解酵素阻害剤の濃度をあえて示すと、５μＭ／Ｌ以上であることが好ましい。５μＭ／Ｌ未満ではキニン上昇に対する十分な抑制効果が得られず、好ましくない。上限をあえて示すと３０μＭ／Ｌ以下であることがよい。最も好ましい血漿中の蛋白分解酵素阻害剤の濃度の下限は１０μＭ／Ｌであり、また最も好ましい血漿中の蛋白分解酵素阻害剤の濃度の上限は２０μＭ／Ｌである。
【００１８】
使用方法
本発明の製造装置は蛋白分解酵素阻害剤含有溶液の送液手段、血漿の送液手段、蛋白分解酵素阻害剤と血漿とを混合する手段、蛋白分解酵素阻害剤と血漿との混合液を吸着処理するための吸着材の充填された吸着器からなる。更に吸着器の上流側に、血液から遠心分離もしくは膜型血漿分離器などによる血漿成分の分離手段と、吸着器の下流側に血漿成分と血球成分との混合手段とを有していても良い。血漿の通過方法としては、使用上の必要に応じ、あるいは設備の装置状況に応じて、連続的に通過してもよいし、また断続的に通液しても良い。
【００１９】
多孔質担体表面にアニオン性基を有する吸着材
本発明で言う吸着材は、多孔質の担体表面にアニオン性基を有するものであって、多孔質担体を構成する高分子鎖の主鎖あるいは側鎖にアニオン性基を有するものであってもよく、或いは多孔質担体表面にアニオン性基を有する化合物を不溶化したものであってもよい。
何れであっても良いが、高いキニン上昇性を有する吸着材である時、本発明の有用性はより高い。
吸着材のキニン上昇性は次のようにして測定できる。
キニン活性化率２０以上の血漿をヘパリン５０００ＩＵ／Ｌ存在下で採取する。吸着材３ｍｌを５ｍｌ容量のディスポーザブルシリンジに充填して試験カラムとする。この試験カラムに血漿を流速０．２３ｍｌ／分で灌流し、試験カラム流出血漿を３ｍｌを１フラクションとしてポリカーボネート製試験管に採取する。採取後直ちに各フラクションの血漿中のキニン濃度をキニン活性化率での測定と同様にして測定し、第２フラクションから第６フラクションの中で最も高値のキニン濃度を、吸着材によるキニン上昇性とする。同時に灌流前の血漿のキニン濃度を測定した時、２００ｐｇ／ｍｌ以下であることが望ましい。以上においてガラス製の容器は、その容器自体がキニン濃度の上昇を引き起こすため、使用してはならない。
本発明の低キニン血漿の製造装置及び蛋白分解酵素阻害剤で処理された吸着材は、キニン上昇性の測定で１０００ｐｇ／ｍｌ以上を示す吸着材において高い効果が得られ、更には２０００ｐｑ／ｍｌ以上であり、最も好ましくは４０００ｐｇ／ｍｌ以上の吸着材において用いられる時である。
【００２０】
吸着材のアニオン性基の量
吸着材の表面のアニオン性基の量は、多すぎるとキニンの活性化がより強くおこり、これを抑制するには、例えばより大量の蛋白分解酵素阻害剤の使用が必要であるなど、実用上好ましくない。一方、アニオン性基の量が少なすぎると、キニン濃度の上昇は十分に抑制できるが、被吸着物質の吸着能力が十分に得られず、やはり好ましくない。本発明が最も優れた効果を発揮する、膨張した吸着材容量当たりの好ましい吸着材表面のアニオン性基の量は、中性塩分解法で測定する時、０．５μ当量／ｍｌ以上１００μ当量／ｍｌ以下である。特に１．０μ当量／ｍｌ以上５０μ当量／ｍｌ以下の時、最も好ましい結果が得られる。
【００２１】
担体形状
本吸着材の形状としては、球状、粒状、糸状、中空糸状、平膜状等何れも有効に用いられるが、実用時の血漿の流通面より球状または粒状が最も好ましく用いられる。球状または粒状の平均粒径は、１０μｍから２５００μｍのものが使いやすいが、２５μｍから１０００μｍの範囲が好ましく、より好ましくは５０μｍから６００μｍである。
【００２２】
担体ポアサイズ
多孔質担体は、有害成分の吸着面積を大きくとれ、実用的な吸着能力を出せるという観点から、多孔性であることがよい。多孔性の排除限界分子量は、吸着しようとする有害成分の分子量によって異なるが、１×１０4 以上、１×１０8 以下のものが好ましい。更に限定するならば、１×１０5 以上、５×１０7 以下のものがより好ましい。
【００２３】
担体材質
多孔質担体の具体例を上げると、例えばアガロース、デキストラン、ポリアクリルアミド等からなる軟質ゲル、メチルメタクリレート、ポリビニルアルコール、スチレン、ジビニルベンゼン、ビニルエーテル、無水マレイン酸、ポリアミド等の内の１つまたは複数を構成成分とする合成高分子、及び（または）セルロース等の天然高分子を原料とする多孔質ポリマーからなる硬質ゲルなどである。更に、ヒドロキシエチルメタクリレート、ヒドロキシエチルアクリレート等のヒドロキシ基を有する高分子材料、ビニルアミン、ジメチルアミノエチル（メタ）アクリレート等の塩基性含窒素官能基を有する単量体と塩基性含窒素官能基を有さない重合性単量体との共重合体、スルフォン酸基、カルボン酸基等の負電荷官能基を有する高分子材料、セグメント化ポリウレタン、セグメント化ポリエステル等のブロック共重合体、ポリエチレンオキサイド鎖を有する単量体と他の重合性単量体との共重合体の様なグラフト共重合体等のコーティング層を有していても良い。
これらの内、硬質ゲルが体液の流通性の観点より好ましく用いられる。更により好ましくはセルロファインなどの架橋合成セルロースや、ポリビニルアルコール等からなる合成高分子のゲルが、硬質であり、且つゲル表面に活性基を比較的容易に得られるため実用上好ましい。
【００２４】
担体の活性化方法
アニオン性基を多孔体担体に導入する方法には、アニオン性基を有する化合物を溶解した液中に浸漬、あるいは該液を噴霧することによってコーティングする方法、化学的に或いは放射線や電子線を用いてのグラフト法によって水不溶性多孔体表面に共有結合する方法、或いは化学的方法により多孔体担体表面の官能基を介して共有結合する方法などがある。また多孔質担体にクロル硫酸などで直接硫酸基を導入することでアニオン性基を得ることもできる。この中でグラフト法、官能基を介しての共有結合法が使用時のアニオン性基或いはアニオン性基を有する化合物が溶出する危険性がなく、好ましい。多孔体担体が被覆層を有する場合はその被覆層表面に不溶化することもできる。
多孔質担体表面の活性基は高分子化合物のアミノ基、水酸基、カルボキシル基などの活性水素を有する求核反応基と置換及び／または付加反応できるものであれば良い。
多孔質担体に活性基を得る方法の１例としてはハロゲン化シアン法、エピクロルヒドリン法、ビスエポキシド法、ブロモアセチルブロミド法等が知られている。具体的にはアミノ基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、チオール基、酸無水物基、サクシニルイミド基、塩素基、アルデヒド基、アミド基、エポキシ基、トレシル基などがあげられる。
この中で加熱滅菌時の安定性よりエポクロルヒドリン法で誘導されるエポキシ基が特に好ましい例としてあげられる。
【００２５】
リガンドの種類
以上の活性基を介して本発明下で共有結合される高分子リガンドには、アニオン性基を有する化合物、例えばポリペプチドや多糖、或いは合成有機物などがあげられる。
アニオン性基を有する化合物をより具体的に述べると、その分子中に硫酸基、カルボキシル基、リン酸基等を持つものであって、ヘパリン、デキストラン硫酸、コンドロイチン硫酸、コンドロイチンポリ硫酸、ヘパラン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパリチン硫酸、キシラン硫酸、カロニン硫酸、セルロース硫酸、キチン硫酸、キトサン硫酸、ペクチン硫酸、イヌリン硫酸、アルギン酸硫酸、グリコーゲン硫酸、ポリラクトース硫酸、カラゲニン硫酸、デンプン硫酸、ポリグルコース硫酸、ラミラリン硫酸、ガラクタン硫酸、レバン硫酸、メペサルフェート等の硫酸化多糖、リンタングステン酸、ポリ硫酸化アネトール、ポリビニルアルコール硫酸、ポリリン酸、ポリアクリル酸等があげられる。この中で特に硫酸化多糖において本発明の効果は大きい。更に、臨床での実用性の点より最も好ましい例としてヘパリンやデキストラン硫酸があげられる。
これらのアニオン性基を有する高分子化合物の分子量は１，０００以上であればいずれの分子量であっても良いが、分子量５，０００以上の物が好ましく、更に５０，０００以上のものが特に効果がある。分子量の上限は特に制限は必要ないが、実用性の点より１，０００，０００以下が利用しやすい。
本発明で固定されるアニオン性基を有する高分子化合物の量は、多孔質担体１ｍｌあたり、０．０１ｍｇ以上、１００ｍｇ以下が適する。吸着材としての目的物質の吸着性能と、使用するアニオン性基を有する化合物のコストの点より固定量は、多孔質担体１ｍｌあたり、０．１ｍｇ以上、１０ｍｇ以下が特に好ましい。
【００２６】
被覆層
本吸着材表面は血液との親和性をよくするために、親水性の、血小板の付着を制御するための重合体からなる被覆層を、本塩基性吸着材の血球と接触する表面に有していてもよい。被覆層は血液適合性を上げることが本来の目的であり、血液適合性の程度を示すことが必要であるが、血液の安定入手が困難であること、血液間差があることなどより、共通の安定した評価は困難である。一方本発明者らの研究によると、親水性の程度と血液適合性とは正の相関を示すこと、親水性の程度は簡便に表現できることより、親水性の程度で表すことが好ましい。親水性の程度の好ましい範囲を示せば、水中におけるシート状或いはフィルム状にした個体表面上の空気泡の２５℃での接触角で２０度以上である。
親水性被覆層は使用中の剥離を防ぐために重合体であることが望ましい。親水性被覆層の具体例をあげると、重合体単位を単量体としての名前で例示すれば、２−ヒドロキシエチルアクリレート、２−ヒドロキシプロピルアクリレート、  ２−ヒドロキシエチルメタクリレート、２−ヒドロキプロピルメタクリレート、２−ヒドロキシブチルメタクリレート、ジエチルアミノエチルメタクリレート、ジメチルアミノエチルメタクリレート、メトキシジエチレングリコールメタクリレート、メトキシトリエチレングリコールメタクリレート、グリセロールモノメタクリレート、などのアクリル酸或いはメタクリル酸及びその誘導体、メトキシトリエチレングリコールなどのメトキシポリエチレングリコール類、ジエチルアミノエチルスチレン、ヒドロキシスチレン、ヒドロキシメチルスチレン、などのスチレン誘導体、ビニルアミン、ビニルアルコールなどのビニル基を有する単量体、セグメント化ポリウレタン、セグメント化ポリエステル、モノ（２−メタクリロイルオキシエチル）アシッドフォスフェート、モノ（２−アクリロイルオキシエチル）アシッドフォスフェート等のいずれかの単量体１種以上を含む重合体、ブロック共重合体、グラフト共重合体や、ポリエチレンオキサイド鎖を有する単量体と他の重合単量体とのグラフト共重合体等が例示できる。特に重合体中にヒドロキシル基を有していることが好ましい。ヒドロキシル基の重合体中における結合様式に特に制限はない。
重合体は、上記重合体単位の単独重合体であってもよく、或いは２つ以上の共重合体であっても良い。また塩基性官能基を持つ重合体単位を０．１から２０重量％含む、ヒドロキシル基を有する重合体単位との共重合体であってもよい。これら重合体は線状重合体、グラフト重合体、架橋重合体などの重合形態には特に関係はない。
【００２７】
被覆層を得る方法
重合体の被覆層は、グラフト法や沈澱法、コーティング法、多孔体表面の官能基を利用した共有結合法など、いずれによって得られるものであってもよい。この中でも特にコーティング法が製造操作が容易であり、実用上好ましい。
【００２８】
被覆層の量
こうして得られた被覆層の量、即ち被覆量は、被覆層としての効果を発揮させるためには、吸着材乾燥重量あたりの被覆層の重量で表す時、１μｇ／ｇ以上１００ｍｇ／ｇ以下であり、より好ましくは１０μｇ／ｇ以上１０ｍｇ／ｇ以下である。
【００２９】
用途
以上の、表面にアニオン性基を有する多孔質の吸着材の用途としては、低密度及び／または極低密度リポ蛋白質、スルファチド付着性蛋白質、活性化補体成分、血清アミロイド蛋白Ａ（ＳＡＡ）、免疫複合体、抗ＤＮＡ抗体やリウマチ因子等の自己抗体及び／または該自己抗体を生産する免疫Ｂ細胞、免疫グロブリンＬ鎖、血液凝固第ＶＩＩＩ因子、血液凝固第ＩＸ因子、β2 ミクログロブリン等があげられる。この中でアニオン性基を有する高分子化合物を用いての低密度及び／または極低密度リポ蛋白質の体外循環治療用としての用途が有用性が高い。
【００３０】
【発明の効果】
本発明の低キニン血漿の製造装置と吸着材によって、キニン濃度の上昇していない、安全な血漿を得ることができる。
【００３１】
【実施例】
以下に具体的例をあげて説明するが、これらに限定されるものではない。
【００３２】
【実施例１】
平均粒径１００μｍ、単位重量あたりのビニルアルコール単位（ｑＯＨ）が６．０ｍｅｑ／ｇ、排除限界分子量５×１０6 のポリビニルアルコールゲルを多孔質担体として用いた。この多孔質担体に、ジメチルスルフォキシド中でエピクロルヒドリンを用いてエポキシ基を導入した。この時のエポキシ当量は吸着材１ｍｌあたり１２０．３μｅｑであった。
次に上記エポキシ基導入ポリビニルアルコールゲル１００ｍｌを、分子量５００，０００、硫黄含量１８．２ｗｔ％のデキストラン硫酸８ｇ（５ｗ／ｖ％）を含む、ジメチルアセトアミド１６ｍｌ（１０ｖ／ｖ％）、０．１モル水酸化ナトリウム液１２８ｍｌの混合液中に懸濁し、５０℃で１６時間反応させて、デキストラン硫酸を不溶化した吸着材を得た。吸着材表面の硫酸基量は、中性塩分解法で４３．１μ当量／ｍｌであった。
この吸着材の排除限界分子量は５００万、粒子径が１００μｍであった。活性化値３８２０ｐｇ／ｍｌ、対照値６１．４ｐｇ／ｍｌ、よってキニン活性化率６２．２の血漿をヘパリン下で入手し、吸着材のキニン上昇性を測定したところ、６２７０ｐｇ／ｍｌであった。
この吸着材を血漿の入口と出口とを有し両端に吸着材の漏れ防止用メッシュを有する、内容積１００ｍｌの容器に充填して吸着器とした。ヘパリン５０００ＩＵ／Ｌを含む、キニン活性化率１６１．２の血漿１０００ｍｌを充填したバッグからの血漿流路用チューブをＴ字管の右手部につなぎ、又、蛋白分解酵素阻害剤溶液として６−アミジノ−２−ナフチルｐ−グアニジノベンゾアート・二メタンスルフォン酸塩７４０μＭ／Ｌを溶解した５％ブドウ糖注射液を充填したシリンジからの導管をＴ字管の足部にそれぞれ接続した。Ｔ字管の左手部は、内径５ｍｍ、長さ１．２ｍのチューブで吸着器入口と接続した。この時血漿流路用チューブは内径５ｍｍ、導管の内径は１ｍｍとした。
Ｔ字管と吸着器との間には血漿灌流用のシゴキポンプを設置した。蛋白分解酵素阻害剤溶液を充填したシリンジはシリンジポンプに装着した。ポンプと吸着器との間には血漿と６−アミジノ−２−ナフチルｐ−グアニジノベンゾアート・二メタンスルフォン酸塩との混合を促進するために内容量１０ｍｌの血漿溜を設けた。
又チューブのＴ字部とバッグの間にもＴ字部を設けてプライミング液として生理食塩液を充填したバッグを接続した。
はじめにプライミング液５００ｍｌを、流速６０ｍｌ／分で吸着器に灌流し、吸着材を前処理した。続いて血漿を流量３０ｍｌ／分で、蛋白分解酵素阻害剤溶液を４５μＭ／時で混合して、該混合液を吸着器に灌流した。この時血漿中の６−アミジノ−２−ナフチルｐ−グアニジノベンゾアート・二メタンスルフォン酸塩の濃度は２５μＭ／Ｌであった。
バッグ内の血漿中のキニン濃度と、吸着器容量の６倍の血漿量を吸着器容積単位で経時的に吸着器流出血漿のキニン濃度を測定したところ、バッグ内の血漿中のキニン濃度が８４．２ｐｇ／ｍｌであったのに対して、吸着器流出血漿中の最大キニン濃度は１７１．９ｐｇ／ｍｌと、上昇はほとんどなかった。
【００３３】
【実施例２】
プライミング液として６−アミジノ−２−ナフチルｐ−グアニジノベンゾアート・二メタンスルフォン酸塩を生理食塩液で７０μＭ／Ｌ濃度に溶解した液を用いて、吸着材を蛋白分解酵素阻害剤で前処理したこと、及び、血漿には蛋白分解酵素阻害剤を混合しなかった以外は、実施例１と同様にして行った。
結果は、バッグ内の血漿中のキニン濃度が８４．２ｐｇ／ｍｌであったのに対して、吸着器流出血漿中の最大キニン濃度は４８３．３ｐｇ／ｍｌと、上昇はほとんどなかった。
【００３４】
【実施例３】
リポソーバＬＰ−１５（鐘淵化学社製、ロット９１０３０６０６５）を用いて実施例１と同様にして、キニン活性化率が２８８の血漿を用いてキニン濃度を測定したところ、バッグ内の血漿中のキニン濃度は１２５．０ｐｇ／ｍｌであったのに対して、吸着器流出血漿中の最大キニン濃度は２１４．６ｐｇ／ｍｌと、上昇はほとんどなかった。
【００３５】
【比較例】
プライミング液として６−アミジノ−２−ナフチルｐ−グアニジノベンゾアート・二メタンスルフォン酸塩を含まない生理食塩液を用い、蛋白分解酵素阻害剤を血漿に混合しなかった以外は、実施例１と同様に試験したところ、バッグ内の血漿中のキニン濃度が８４．２ｐｇ／ｍｌであったのに対して、吸着器流出血漿中の最大キニン濃度は４９５０ｐｇ／ｍｌと大幅に上昇して、キニン濃度は危険域にまで達した。