(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
支持体上に、クレアチンキナーゼのＭサブユニット活性を特異的に阻害する抗体、クレアチンキナーゼＭＢアイソザイムの存在下で、アデノシン三リン酸を生成するクレアチンリン酸とアデノシン二リン酸、そしてそのアデノシン三リン酸の生成のためのｐＨ環境を提供するｐＨ５．５〜８．５の領域において緩衝能を示す緩衝性化合物を含有し、更に、生成したアデノシン三リン酸との反応により分光的測定方法で検出が可能な化合物を生成させる指示薬組成物を含有するクレアチンキナーゼＭＢアイソザイム検出試薬層を積層してなるクレアチンキナーゼＭＢアイソザイム定量用乾式分析素子であって、該指示薬組成物が、ヘキソキナーゼ、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（リン酸）酸化型及びグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼを含むものであり、一方、該指示薬組成物の機能の発現に必要な量のグルコースは含まないことを特徴とするクレアチンキナーゼＭＢアイソザイム定量用乾式分析素子。
【請求項２】
指示薬組成物が、更にテトラゾリウム塩を含むものである請求項１に記載のクレアチンキナーゼＭＢアイソザイム定量用乾式分析素子。
【請求項３】
指示薬組成物が、グルコースを含むことのない請求項１もしくは２に記載のクレアチンキナーゼＭＢアイソザイム定量用乾式分析素子。
【請求項４】
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（リン酸）酸化型がニコチンアミドアデニンジヌクレオチド酸化型である請求項１乃至３のうちのいずれかの項に記載のクレアチンキナーゼＭＢアイソザイム定量用乾式分析素子。
【請求項５】
指示薬組成物が、更に乳酸デヒドロゲナーゼ活性阻害剤を含む請求項４に記載のクレアチンキナーゼＭＢアイソザイム定量用乾式分析素子。
【請求項６】
指示薬組成物が、更にオキサロ酢酸、シュウ酸、およびオキサミン酸からなる群より選ばれた乳酸デヒドロゲナーゼ活性阻害剤を含む請求項４に記載のクレアチンキナーゼＭＢアイソザイム定量用乾式分析素子。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、クレアチンキナーゼのＭＢアイソザイムの定量用の乾式分析素子に関する。
【０００２】
【従来の技術】
被験者から採取した血液に含まれているクレアチンキナーゼ（ＣＫ、クレアチンホスホキナーゼ（ＣＰＫ）とも云われる）を定量することにより、進行性筋萎縮症、皮膚筋炎、心筋梗塞などの診断が可能なことは以前より知られており、臨床検査に利用されている。また、クレアチンキナーゼ（ＣＫ）には、クレアチンキナーゼＭＭ（ＣＫＭＭ）、クレアチンキナーゼＭＢ（ＣＫＭＢ）、そしてクレアチンキナーゼＢＢ（ＣＫＢＢ）という三種のアイソザイムが存在すること、そしてＣＫＭＭは主として骨格筋中に、ＣＫＭＢは主として心筋中に、そしてＣＫＢＢは主として脳や脊髄中に存在することも知られている。さらにＣＫＭＢは、心筋梗塞症が発生すると、心筋より血液中に排出され、その結果、血液中のＣＫＭＢ量が増加することも判明している。従って、被験者の血液中のＣＫＭＢの定量は、心筋梗塞症の発生の有無を検査するために有力な手段とされている。
【０００３】
上記のように、臨床検査に於て、クレアチンキナーゼの定量（すなわち、総クレアチンキナーゼの定量）、及び／又はクレアチンキナーゼＭＢアイソザイムの定量によって、被験者についての進行性筋萎縮症、皮膚筋炎、心筋梗塞などの診断に有力な手掛かりを得ることができるため、従来より、それらの定量方法についての研究が進められ、現在では精度の高い定量方法が確立されている。
【０００４】
すなわち、クレアチンキナーゼの測定方法としては、被験者から採取した血液から血清あるいは血漿を得て、この血清や血漿中に含まれるクレアチンキナーゼの酵素活性を利用することにより、分光的方法により検出できる化学種を定量的に生成させ、その化学種の生成量から、血清あるいは血漿中のクレアチンキナーゼの存在量を定量する方法である。さらに詳しく云えば、この定量方法に利用される検出反応系は次の二つに分けることができる。
【０００５】
１）検出反応系１
クレアチンリン酸（ＣＰ）とアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）とを、ｐＨ５．５〜８．５の領域にて緩衝能を示す緩衝性化合物を用いて酵素反応のｐＨ環境を調整しながら、被検液（血清や血漿など）中の存在するクレアチンキナーゼ（ＣＫ）と接触させることにより反応させ、そのクレアチンキナーゼ（ＣＫ）の量に比例する量のアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）を生成させ、ついで、そのＡＴＰとグルコース（Ｇｌｕ）とをヘキソキナーゼ（ＨＫ）の存在下に反応させてグルコース−６−リン酸（Ｇ６Ｐ）を生成させ、次にこのＧ６Ｐをニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（リン酸）酸化型（ＮＡＤ（Ｐ））と、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤＨ）の存在下に反応させてニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（リン酸）還元型（ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ）を生成させ、最後に、このＮＡＤ（Ｐ）Ｈの生成量を分光的測定方法により測定し、別に調製した検量線を利用して、クレアチンキナーゼ（ＣＫ）を定量する方法である。
【０００６】
なお、生成したＮＡＤ（Ｐ）Ｈの分光的定量の精度が充分でない傾向があるため、そのＮＡＤ（Ｐ）Ｈを更にテトラゾリウム塩と反応させてホルマザン色素を生成させて、そのホルマザン色素の生成量を定量することによって、被検液中のクレアチンキナーゼを定量する方法も既に開発されている（特開昭６３−３２４９９号公報参照）。
この検出反応系１を反応式により次に示す。
【０００７】
0003750956.tif 000002
【０００８】
２）検出反応系２
クレアチンリン酸（ＣＰ）とアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）とを、ｐＨ５．５〜８．５の領域において緩衝能を示す緩衝性化合物にて酵素反応のｐＨ環境を調整しながら、被検液（血清や血漿など）中の存在するクレアチンキナーゼ（ＣＫ）と接触させることにより反応させ、そのクレアチンキナーゼ（ＣＫ）の量に比例する量のアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）を生成させ、ついで、そのＡＴＰとグリセロールとをグリセロールキナーゼ（ＨＫ）の存在下に反応させてＬ−α−グリセロリン酸を生成させ、次にこのＬ−α−グリセロリン酸をＬ−α−グリセロリン酸オキシダーゼの存在下に酸素と反応させて過酸化水素を発生させ、最後に過酸化水素とロイコ色素とを反応させて青色の色素を生成させ、この青色色素の生成量を分光的測定方法により測定し、別に調製した検量線を利用して、クレアチンキナーゼ（ＣＫ）を定量する方法である。
この検出反応系２を反応式により次に示す。
【０００９】
0003750956.tif 000003
【００１０】
一方、前記のように、クレアチンキナーゼには、三種類のアイソザイムが存在するため、クレアチンキナーゼＭＢアイソザイムの定量は容易ではない。すなわち、原理的には、ＭＭアイソザイムとＢＢアイソザイムとからＭＢアイソザイムを分離して定量する必要がある。ただし、ＢＢアイソザイムは、本来的に脳や脊髄中に存在するものであるため、血液中の存在量は非常に少なく、その存在は無視することができる。従って、ＭＢアイソザイムの定量には、ＭＭアイソザイムを分離することができれば可能となるが、その分離は非常に困難である。このため、クレアチンキナーゼを含む血液試料（血清や血漿など）中のＭＭアイソザイムを分離する代わりに、ＭＢアイソザイムの活性に影響を与えること無く、ＭＭアイソザイムの活性を阻害させる方法により、実質的なＭＢアイソザイムの分離を実現する方法が既に開発されている（特公昭５６−１９２３９号公報参照）。この方法では、予め調製したクレアチンキナーゼＭＢアイソザイム中のサブユニットＢの酵素活性を阻害することなく、クレアチンキナーゼのＭＭアイソザイムおよびＭＢアイソザイム中のサブユニットＭの酵素活性を完全に阻害する抗体を使用する。すなわち、被検液を先ずこのＭサブユニット不活性化抗体で処理することによってクレアチンキナーゼの活性をクレアチンキナーゼＭＢアイソザイムに起因するもののみに限定させ、この酵素活性を前記の検出反応系１あるいは検出反応系２を利用して測定することによって、クレアチンキナーゼＭＢアイソザイムの定量が可能となる。
【００１１】
以前のクレアチンキナーゼＭＢアイソザイムの臨床検査では、これまでに述べてきた方法を利用して、検出反応を試薬溶液中で実施する湿式法が一般的に利用されていた。しかしながら、湿式法による定量分析操作は、結果を得るまでにかなりの長時間を必要とするという欠点があった。すなわち、例えば、心筋梗塞については、梗塞の発症から治療開始までの時間が短いほど治療の効果が高いことが知られており、このため特に心筋梗塞発症の診断については緊急性の要求が非常に高い。従って、検査の開始から検査結果の入手までの時間が長いことは、治療の開始の遅れを引き起こすことになり、好ましくない。
【００１２】
臨床検査の結果を短時間に得る手段として、透明支持体のうえに検出反応に関与する試薬組成物を含む試薬層を積層した構成の各種の乾式分析素子が以前より知られている。そして、上記のクレアチンキナーゼＭＢアイソザイム検査反応に関与する試薬組成物を含む試薬層を積層したクレアチンキナーゼＭＢアイソザイム定量用の乾式分析素子も既に開発され、実際に使用されている。このようなクレアチンキナーゼＭＢアイソザイム定量用の乾式分析素子の構成については、下記の特許公開公報に詳しい記載がある。
特開平６１−２５４１９８号公報、特開平６１−２５４１９９号公報、特開平６１−２６０１６４号公報。
【００１３】
上記の公知のクレアチンキナーゼＭＢアイソザイム定量用の乾式分析素子は、それぞれクレアチンキナーゼＭＢアイソザイムの短時間での定量分析のために利用できる優れた分析用具であるが、分析素子製造後から実際の定量分析に使用するまでの間における保存性に劣ると云う問題があった。すなわち、それぞれの分析素子を通常の保存条件にて保存を行なうと、製造後短い期間の内に、感度の低下が発生することが見出されている。従って、これらの乾式分析素子を良好な保存状態に維持するためには、分析素子を冷凍保存する必要があった。このような分析素子の保存に、冷凍保存が必要であると云うことは、その冷凍保存の設備が必要である上に、実際の臨床検査の開始に際しても時間的遅れが発生しやすいという問題がある。
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、これまでに知られているクレアチンキナーゼＭＢアイソザイム定量用の乾式分析素子の低い保存性を解決することを目的とする。
本発明は特に、常温で保存しても感度低下が少なく、従って常温での保存が可能なクレアチンキナーゼＭＢアイソザイム定量用の乾式分析素子を提供することを目的とする。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
本発明は、支持体上に、クレアチンキナーゼのＭサブユニット活性を特異的に阻害する抗体、クレアチンキナーゼＭＢアイソザイムの存在下で、アデノシン三リン酸を生成するクレアチンリン酸とアデノシン二リン酸、そしてそのアデノシン三リン酸の生成のためのｐＨ環境を提供するｐＨ５．５〜８．５の領域において緩衝能を示す緩衝性化合物を含有し、更に、生成したアデノシン三リン酸との反応により分光的測定方法で検出が可能な化合物を生成させる指示薬組成物を含有するクレアチンキナーゼＭＢアイソザイム検出試薬層を積層してなるクレアチンキナーゼＭＢアイソザイム定量用乾式分析素子であって、該指示薬組成物が、ヘキソキナーゼ、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（リン酸）酸化型及びグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼを含むものであり、一方、該指示薬組成物の機能の発現に必要な量のグルコースは含まないことを特徴とするクレアチンキナーゼＭＢアイソザイム定量用乾式分析素子にある。
【００１６】
本発明の発明者の研究によると、従来のクレアチンキナーゼＭＢアイソザイム定量用の乾式分析素子の低い保存安定性は、それらの保存中において、試薬組成物中の試薬が、クレアチンキナーゼＭＢアイソザイム（ＣＫＭＢ）が存在しない状態で、徐々に反応を起こすことに起因するものであることが判明した。特に、前記の検出反応系１では、ＣＫやＣＫＭＢが存在しなくても、ＣＰとＡＤＰとが部分的に反応してＡＴＰが生成し、またＣＰとＧｌｕとが反応してＧ６Ｐを生成させる現象が確認された。従って、このクレアチンキナーゼＭＢアイソザイムの不存在下で発生する反応が分析精度の大きな低下をもたらす結果となる。
【００１７】
上記の理由から、本発明者は、上記の様な乾式分析素子の常温での保存中に発生する望ましくない反応の抑制を目的として研究した。そして、その結果、上記の検出反応系１を利用する分析素子において、分析素子の保存中の副反応に関与するグルコースを分析素子から排除することにより、問題の副反応の阻止あるいは抑制が可能なことが判明した。そして、検出反応系１の実際の検出反応の進行を開始させるためには勿論、グルコースの存在が必要となるが、そのグルコースとしては、被検液となる血清や血漿に原料の血液から必然的に持込まれるグルコースが利用できるため、分析素子中の指示薬組成物からグルコースを取り除いても実際の定量分析には何等差し支えないことが判明した。
【００１８】
なお、上記の考え方は、クレアチンキナーゼ（ＣＫ）定量用分析素子にも原理的には適用できるが、通常の被検液（血清や血漿）中のクレアチンキナーゼの存在量がクレアチンキナーゼＭＢアイソザイムに比べて多く、従って、その多量のクレアチンキナーゼの存在下での酵素反応により発生するＡＴＰの量が多くなることから、その後の反応に必要なグルコース量を被検液から充分に供給することは困難であるため、本発明の適用は実用的にはあまり有利と言えない。また、検出反応系２においては、指示薬組成物の成分の性質上、被検液から供給できるものがないため、本発明の考え方を利用することはできない。
【００１９】
すなわち、本発明のクレアチンキナーゼＭＢ定量用の乾式分析素子は、クレアチンキナーゼのＭサブユニット活性を特異的に阻害する抗体と前記の検出反応系１を組合せて利用することにより、クレアチンキナーゼＭＢアイソザイムの定量を行なうものであるが、その検出反応系１で必要とするグルコースとして、血液中に存在するグルコースを利用することを特徴としている。すなわち、分析素子中にグルコースを全く導入しないか、あるいは少なくとも検出反応系の進行に必要な量までのグルコースを導入しないことを特徴とする。本発明の分析素子は、検出反応系１を利用する分析素子でありながら、このようにグルコースを導入していないか、あるいは少なくとも多量のグルコースを導入していないため、保存中にグルコースが関与して発生する副反応を回避あるいは抑制することができ、従って向上した保存性を示すようになる。
【００２０】
【発明の実施の形態】
本発明の分析素子の好ましい態様を次に記す。
１）指示薬組成物が、更にテトラゾリウム塩を含むものである上記のクレアチンキナーゼＭＢアイソザイム定量用乾式分析素子。
２）指示薬組成物が、グルコースを含むことのない上記のクレアチンキナーゼＭＢアイソザイム定量用乾式分析素子。
３）ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（リン酸）酸化型が、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド酸化型（ＮＡＤ）である（すなわち、ＮＡＤＰを用いない）上記のクレアチンキナーゼＭＢアイソザイム定量用乾式分析素子。
４）指示薬組成物が、更に乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）活性阻害剤を含む上記のクレアチンキナーゼＭＢアイソザイム定量用乾式分析素子。
５）指示薬組成物が、更にオキサロ酢酸、シュウ酸、およびオキサミン酸からなる群より選ばれた乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）活性阻害剤を含む上記のクレアチンキナーゼＭＢアイソザイム定量用乾式分析素子。
【００２１】
本発明のクレアチンキナーゼＭＢ定量用の乾式分析素子において利用される検出反応系は前記の検出反応系１である。従って、アデノシン三リン酸との反応によって分光的測定方法により検出可能な化合物を生成させる指示薬組成物としては、前記の検出反応系に利用される指示薬組成物が使用することができる。すなわち、指示薬組成物の例としては、下記の指示薬組成物を挙げることができる。
【００２２】
１）ヘキソキナーゼ、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（リン酸）酸化型およびグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼを含み、グルコースを含まないか、或は微量のグルコースを含む指示薬組成物。
２）ヘキソキナーゼ、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（リン酸）酸化型、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ及びテトラゾリウム塩を含み、グルコースを含まないか、或は微量のグルコースを含む指示薬組成物。
【００２３】
本発明のクレアチンキナーゼＭＢアイソザイム定量用の乾式分析素子の構成、及びそれらを構成する各種試薬は既に知られており、本発明の乾式分析素子に於ても、グルコースを導入しないか、あるいは少なくとも必要量のグルコースを導入しないかの点を除けば、同様の構成と同様の各種試薬が利用される。このような乾式分析素子の構成と試薬の例は、前述の特許公告公報および公開公報に詳しく記載されているので、ここに改めて詳しく記載しない。
【００２４】
なお、本発明の分析素子に於て使用する、アデノシン三リン酸の生成のためのｐＨ環境を提供するｐＨ５．５〜８．５の領域において緩衝能を示す緩衝性化合物としては、この目的で従来のクレアチンキナーゼＭＢアイソザイム定量用の乾式分析素子で一般的に用いられているＢｉｓ−Ｔｒｉｓ（ビス−トリス）はイミダゾールを用いることができるが、スルホン酸基を有する緩衝性化合物、特にグッドの緩衝剤のリストに含まれ、かつ分子構造中にスルホン酸基を有する化合物を用いることが好ましい。すなわち、グッドの緩衝剤には、スルホン酸基を持つもの、そしてスルホン酸基を持たないもののいずれもがあるが、本発明で有利に用いられる緩衝性化合物は、それらの内のスルホン酸基を持つ緩衝性化合物である。このスルホン酸基を有する緩衝性化合物の使用は、前記の分析素子の保存中の副反応の発生をさらに効果的に抑制する。なお、グッドの緩衝剤（あるいは、グッドの緩衝液とも呼ばれる）については、例えば、「化学辞典」（森北出版株式会社、１９８１年発行）、「化学大辞典」（株式会社東京化学同人、１９８９年発行）などに簡単な記載があり、また更に多くの臨床検査試薬に関する成書に詳しい記載がある。
【００２５】
グッドの緩衝剤に属し、かつ本発明の乾式分析素子に於ける使用に適した緩衝性化合物としては、ＴＥＳ，ＴＡＰＳＯ，ＭＯＰＳＯ，ＭＥＳ，ＤＩＰＳＯ，ＨＥＰＥＳ，ＨＥＰＳＯと名付けられている化合物を挙げることができる。これらの化合物の中でも、ＴＥＳ、ＴＡＰＳＯ、ＭＯＰＳＯ、およびＭＥＳと名付けられている化合物が好ましい。特に好ましいのは、ＴＥＳとＴＡＰＳＯである。
【００２６】
本発明の分析素子における緩衝性化合物の使用量については特に制限はない。すなわち、グッドの緩衝剤の一般的な使用の態様を参考にし、使用量を変動させての試験的使用などの一般的な使用量決定方法を利用することにより、容易に適当な使用量を決定することができる。なお、緩衝性化合物は、二種以上のものを組合せて使用することも可能であり、たとえば、スルホン酸基を持たない緩衝性化合物あるいは他の緩衝剤組成物と組合せて使用することもできる。
【００２７】
本発明の分析素子の試薬層には、ＬＤＨ（乳酸デヒドロゲナーゼ）の酵素活性の発現を阻害することのできる化合物を導入しておくことが望ましい。即ち、本発明者の研究によると、分析素子中にグルコースを導入しないか、あるいは必要量に達するまでの量のグルコースを導入しない場合には、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（リン酸）酸化型（ＮＡＤＰ）ではなく、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド酸化型（ＮＡＤ）を用いることが望ましいが、ＮＡＤを使用した場合には、被検液中に一般的に存在するＬＤＨ（乳酸デヒドロゲナーゼ）の量によってＣＫＭＢの分析値が変動しやすく、分析精度を低下させることが判明している。従って、そのＬＤＨの酵素活性を阻害あるいは抑制させることのできる化合物（例、オキサロ酢酸、シュウ酸、及びオキサミン酸）を分析素子の試薬含有層に導入しておくことことが望ましい。
【００２８】
クレアチンキナーゼＭＢアイソザイム定量用の乾式分析素子を用いてのクレアチンキナーゼＭＢアイソザイム（ＣＫＭＢ）の定量分析の操作は、前述の特許公告公報及び特許公開公報に記載されているように、既に知られており、本発明の乾式分析素子を用いてのＣＫＭＢの定量分析操作は、それらと同様な操作に従って実施することができる。
次に本発明の実施例と比較例とを記載する。
【００２９】
【実施例】
［実施例１］グルコースを導入しないＣＫＭＢ定量用分析素子の製造
透明ポリエチレンテレフタレートフィルム（厚さ１８０μｍ）の表面を親水化処理し、その処理表面上に下記の組成の塗布液を塗布、乾燥して、乾燥層厚が１２μｍの指示薬層を形成した。
【００３０】
脱イオンゼラチン                            ２００ｇ
水                                        １１００ｇ
５％非イオン系界面活性剤水溶液                ８０ｇ
ニトロテトラゾリウムブルー                    １０ｇ
【００３１】
上記指示薬層をゼラチン架橋剤を含む溶液で湿らせた後（約３０ｇ／ｍ2 ）、その指示薬層の上に、ポリエチレンテトラフタレート紡績糸からなるトリコット編み物を圧着し、乾燥させて展開層とした。
次に、上記展開層の表面に下記の組成の塗布液を、塗布量１３０ｇ／ｍ2 にて塗布、乾燥した。
【００３２】
水                                          ４６．６ｇ
抗ヒトＣＫ−Ｍヤギ抗体溶液                  ２０ｇ
（最終希釈倍率１５００倍時に２０００Ｕ／Ｌの
ＣＫＭＭを５０％以上阻害できる能力を持つ溶液）
１０％非イオン系界面活性剤水溶液              ２．９ｇ
１５％ポリアクリルアミド水溶液              ３３．８ｇ
（平均分子量３．７万）
２０％塩化マグネシウム水溶液                  ８．７ｇ
エチレンジアミン４酢酸・２Ｎａ塩              ０．５ｇ
クレアチンリン酸（ＣＫ）                      １．３ｇ
アデノシン−５’−ジホスフェート（ＡＤＰ）    ０．３ｇ
Ｐ1 ，Ｐ5 −ジ（アデノシン−５’−）
ペンタホスフェート（ＡＰ５Ａ）              ０．２５ｇ
アデノシン−５’−モノホスフェート（ＡＭＰ）  １．２ｇ
Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン                  ０．１ｇ
ニコチンアミドアデニンヌクレオチド酸化型
（ＮＡＤ）                              ０．６ｇ
オキサロ酢酸                                  ０．０７ｇ
Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−
アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ）            ５．１ｇ
１Ｎ  ＮａＯＨ                              １０．０ｇ
ジアホラーゼ                                １５００Ｕ
グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ    １４０００Ｕ
ヘキソキナーゼ（ＨＫ）                    １９４００Ｕ
アスコルビン酸オキシダーゼ                  ５０００Ｕ
【００３３】
最後に、上記にて形成した、支持体上に指示薬層と反応試薬含有展開層とが積層された積層体を１２ｍｍ×１２ｍｍの寸法に裁断して、グルコースを含有しないＣＫＭＢ定量用分析素子を得た。なお、得られたＣＫＭＢ定量用分析素子中の試薬の分布を調べたところ、指示薬層に導入したニトロテトラゾリウムブルーの大部分が展開層に移動していることが確認された。
【００３４】
［比較例１］グルコースを含有するＣＫＭＢ定量用分析素子の製造
展開層の表面に塗布する塗布液にグルコース０．６２ｇを添加した以外は実施例１と同様にしてＣＫＭＢ定量用分析素子を得た。
【００３５】
［ＣＫＭＢ定量用分析素子の評価：保存中のＡＴＰの生成］
実施例１そして比較例１で得られた分析素子を、それぞれ４５℃、１１％ＲＨの保存条件で１日間保存し、次いで微量の水を各分析素子の展開層の表面に点着し、３７℃で６分間インキュベーションした。次に、波長５４０ｎｍにて、各分析素子で発生した呈色を測定した。なお、並行して、製造直後の実施例１と比較例１の分析素子についても同様の呈色試験を行なった。この測定により判明した各分析素子の呈色を下記の第１表に示す。
【００３６】
【表１】
0003750956.tif 000004
【００３７】
上記の第１表の結果から、本発明で採用するグルコース不導入の分析素子に於ては、クレアチンキナーゼＭＢアイソザイムの不存在下でのＡＴＰの副生が効果的に抑制されていることが明らかである。
【００３８】
［実施例２］グルコースとオキサロ酢酸とを含有しないＣＫＭＢ定量用分析素子の製造
展開層の表面に塗布する塗布液成分からオキサロ酢酸を全量除いた以外は実施例１と同様にしてＣＫＭＢ定量用分析素子を得た。
【００３９】
［被検液中のＬＤＨ含有量の影響］
実施例１で得られた分析素子そして実施例２で得られた分析素子のそれぞれについて、３５℃、１１ＲＨ％の保存条件で１０日間保存した後のものを用意し、それぞれの分析素子について、ＣＫＭＢ含有量が一定で、ＬＤＨを含まない検体と、ＬＤＨ含有量が１０００Ｕ／Ｌの検体とを点着した。
検体が点着された分析素子から水分を蒸発させた後、３７℃でインキュベーションを行ない、次いで波長５４０ｎｍにて、インキュベーション開始後２分後、そして５分後に分光測定を行ない、予め作成しておいた検量線を参照して、反応速度法によりＣＫＭＢ量の定量を行なった。その結果を下記の第２表に示す。
【００４０】
【表２】
0003750956.tif 000005
【００４１】
上記の第２表の結果から、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）が相当量混在しているＣＫＭＢ含有検体中でのＣＫＭＢの定量のためには、ＣＫＭＢ定量用の分析素子へのＬＤＨ活性阻害剤の導入が有効であることが分る。
【００４２】
【発明の効果】
クレアチンキナーゼＭＢアイソザイム（ＣＫＭＢ）の定量分析用の乾式分析素子の検出反応系でグルコースを使用する場合、そのグルコースを予め分析素子に導入しないか、あるいはグルコースの導入量を微量に止めることにより、ＣＫＭＢ定量用分析素子の保存性が顕著に向上するため、従来のＣＫＭＢ定量分析用乾式分析素子の使用前の保存の際に必須とされていた分析素子の冷凍保存の必要が無くなり、実用において非常に有利となる。なお、ＬＤＨ（乳酸デヒドロゲナーゼ）の含有量が多い血清などの検体を用いる場合には、ＣＫＭＢ定量用乾式分析素子にＬＤＨ活性阻害化合物を導入しておくことが好ましい。