(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
オオムギ組織より誘導したカルスより、懸濁細胞を作出することなく直接プロトプラストを単離し、当該プロトプラストを１．８〜５．０％のアガロースを含むプロトプラスト培地にて培養して得られたコロニーを、体細胞胚形成を促進する培地へ置床することによりカルスを誘導し、更に当該カルスを培養して稔性植物体を得ることを特徴とするオオムギ植物体の再生方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、オオムギ植物体の再生方法に関し、詳しくはオオムギのプロトプラストから稔性植物体を効率よく再生させる方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、細胞融合や遺伝子導入等の手法により、新形質を持った植物の作出方法が検討されている。この技術を植物細胞に応用する場合、細胞壁を除いたプロトプラストが用いられ、新形質を導入したプロトプラストから稔性植物体が得られることが要求される。
しかし、ムギ類のプロトプラストからの稔性植物体再生技術は、未だ十分に確立されておらず、特にオオムギに関しては、「Regeneration of fertile plantsfrom protoplasts derived from embryogenic cell suspensions of barley (Hordeum vulgare L.), Jahne et al. 1991, Plant Cell Rep. 10: 1-6 」「Use of feeder cells to improve barley protoplast culture and regeneration, Funatsuki et al. 1992, Plant Science 85: 179-187 」「Protoplast preparation without centrifugation plant regeneration of barley (Golds et al. Plant Cell Rep. 13(1994):188-192 」「Fertile plant regeneration from barley (Hordeum vulgare L.) protoplasts isolated from long-term suspension culture」(Kihara and Funatsuki, Breeding Science 44(1994):157-160) の４例の報告があるだけである。これらの成功例においてプロトプラストは葯あるいは未熟胚由来カルスより作出された懸濁細胞より単離されている。
【０００３】
しかしながら、誘導したカルスからプロトプラストの材料になりうる懸濁細胞を作出するには、長期にわたる培養期間を必要とする上、懸濁細胞系の作出、維持作業によって様々の問題が生じる。すなわち、従来技術においては懸濁細胞の再分化能力の急速な消失に伴うプロトプラストからの植物体再生率の低さ、培養変異に伴う再生植物体の稔性の低さが問題となる。
また、プロトプラストの培養時にプロトプラストの支持体としてアガロースなどの寒天がよく用いられる。イネでは、プロトプラスト培地中に含まれるアガロース濃度がプロトプラストの分裂率に及ぼす影響が調べられているが（Thompson et al, 1986, Plant Science, 47; 123-133) 、オオムギプロトプラスト培養におけるアガロース濃度の効果は未だ報告されていない。
【０００４】
本発明者らは、前述のような状況に鑑みて鋭意検討した結果、カルス誘導から約１カ月後のカルスより直接オオムギのプロトプラストを単離し、１．８〜５．０％のアガロースを含むプロトプラスト培地で培養することにより、短期間にオオムギプロトプラストから稔性植物体を効率的に再生する方法を見出し、本発明を完成した。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、懸濁細胞を作出せずにカルスから直接オオムギプロトプラストを単離し、１．８〜５．０％のアガロースを含むプロトプラスト培地で培養することによって、短期間にオオムギプロトプラストから稔性植物体を作出する方法に関する。また、懸濁細胞系の作出、維持に伴う培養変異の出現をなくして効率よく正常な植物体のみを再生する方法を提供しようとするものである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明は、オオムギ組織より誘導したカルスより、懸濁細胞を作出することなく直接プロトプラストを単離し、当該プロトプラストを１．８〜５．０％のアガロースを含むプロトプラスト培地で培養して得られたコロニーを、体細胞胚形成を促進する培地へ置床することによりカルスを誘導し、更に当該カルスを培養して稔性植物体を得ることを特徴とするオオムギ植物体の再生方法を提供するものである。
【０００７】
本発明のオオムギ植物体の再生方法について、以下に詳しく述べる。まず、第一段階として、オオムギ組織から分化能の高いカルスを誘導する。ここで、用いる材料は特に制限されないが、好ましくは受粉後８〜２０日目のオオムギ未熟胚を用いる。また、カルス誘導培地としては、ＭＳ（Murashige and Skoog 1962, Physiol. Plant. 15: 473-497)、Ｂ５（Gamborg et al. 1968, Exp. Cell Res. 50: 151-158 ）、Ｋａｏ８ｐ（Kao and Michayluk 1975, Planta 126: 105-110 ）、Ｌ１・Ｌ２（Lazzeri et al.1991, Theor. Appl. Genet. 81: 437-444)、ＡＡ（Muller and Grafe 1978, Mol. Gen. Genet.161:67-76）等の基本培地に、０〜１００μＭのＩＡＡ、２，４−Ｄ、ピクローラム、ダイカンバ等のオーキシン、０〜１００μＭのカイネチン、ＢＡＰ、ゼアチン等のサイトカイニンおよび１〜１５％のマルトース、スクロース、グルコース等の糖を含む培地を用いる。なお、培地はアガロースを添加して固化する。アガロースの添加量は１．5 〜３．０％が好適である。
【０００８】
本発明では、誘導したカルスより実質的に液体振盪培養工程を経ることなく、すなわち懸濁細胞を作出することなく直接プロトプラストを単離する。ここで、液体振盪培養とは寒天培地で誘導したカルスを、ある一定の容器で無菌状態に保った液体培地に移植後、この容器に水平旋回または往復の振盪を加え、細胞の増殖を促進する培養法である。この培養法によって作出された細胞（すなわち懸濁細胞）は、寒天培地上のカルスに比べ栄養素の供給に差がなく、均一な栄養条件が得られ、増殖率もよい。そのため、これまでオオムギプロトプラストを分裂させるためには、液体振盪培養細胞よりプロトプラストを単離することが必要であると考えられていた。
したがって、本発明において「実質的に液体振盪培養工程を経ることなく」とは、該工程により懸濁細胞を作出させるような液体振盪培養を行わないことを意味し、懸濁細胞の状態にまで到達しないように液体振盪培養を行うことは、本発明に包含される。
【０００９】
次に、第２段階として、カルスよりプロトプラストを単離する。プロトプラストの単離は、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、ペクチナーゼ等の細胞壁分解酵素を含み、浸透圧を調整した酵素液中で行う。浸透圧の調整には、マンニトール、ソルビトール等の糖アルコール、グルコース等の糖あるいはＣＰＷ液（Frearson et al. 1965, Dev. Biol. 18: 100-127）のように無機塩類で行うことができる。
細胞をこの酵素液で処理すると、多数のプロトプラストが分離される。酵素液中より未消化の細胞を篩で除いた後、酵素液と同様に浸透圧を調整した洗浄液でプロトプラストを洗浄後、回収する。
【００１０】
次に、第３段階として回収したプロトプラストの培養を行い、コロニーを形成させる。回収したプロトプラストは、例えば0.４〜0.６Ｍのマルトース、0.１〜１０．０ｍｇ／ｌの２，４−Ｄ、１．８〜５．０％のアガロースを含む１ｍｌのＬ１培地に懸濁し、速やかにシャーレ上に広げる。このとき、直径４〜５ｃｍの円盤状にすることが望ましい。固化した後、シャーレより剥離し１０〜８０ｍｇ／ｍｌの割合でオオムギ液体懸濁細胞を含む液体培地（プロトプラストを懸濁したものと同成分）中で振盪培養を行う。なお、アガロース濃度を５．０％より高くすると、シャーレ上で固化させることが困難となり、培地を形成できない可能性がある。
振盪は３０〜６０ｒｐｍの低速で行うのが好ましい。培養開始後１〜４週間目に共存懸濁細胞を取り除き、新鮮な培地でさらに培養を続けると、１〜２週間で直径１．０〜２．０ｍｍ程度のコロニーが形成される。
【００１１】
第４段階として、前述のようにして得られたコロニーからカルスを形成させ、器官分化を経て植物体へ再分化させる。この段階においてコロニーから健全な植物体のみを簡便に再分化させるために、本発明では以下の方法を用いる。
まず、１．０〜２．０ｍｍ程度に成長したコロニーを含むアガロースブロックを、Ｌ３培地（Jahne et al. 1991, Plant Cell Rep. 10: 1-6）等の体細胞胚形成を促進する培地へ置床することによって、いわゆるエンブリオジェニック（胚発生的）なカルスを誘導する。移植後３〜１５日目にエンブリオジェニックなカルスまたは胚様体の形成が観察される。
【００１２】
次に、これらのカルスまたは胚様体を固体培地に移植する。この培地は２．０ｍｇ／ｌ以下の低濃度のオーキシンおよび／またはサイトカイニンを含むか、全く植物ホルモンを含まないことが望ましい。約３〜１５日後で植物体（地上部）の再分化がみられる。ここまでは、弱照明下（約５００ルクス）で培養するのが好ましい。シュートの十分な成長がみられた時点で、強照明下（5,０００〜３0,０００ルクス）に移動させる。
こうして得られた植物体は、さらに植物ホルモンを含まない培地上に移植して発根を促す。鉢あげは十分な根系の発達がみられた後に行うのが望ましいが、健全な地上部が再分化していれば、鉢あげ後に発根、活着させることができる。鉢あげ後は、通常の栽培条件、例えば１６時間日長、１0,０００ルクス、１８℃の環境で栽培すると、オオムギ稔性植物体が得られる。
【００１３】
【実施例】
以下に実施例を示して本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１
植物体再生能をもったカルスの誘導
Funatsuki et al.（1992, Plant Science 85: 179-187)の方法に従い、オオムギ（品種：GOLDEN PROMISEおよびIGRI）の長さ約0.５〜１ｍｍの未熟胚をＬ２培地に植えつけてカルスを誘導した。
【００１４】
実施例２
プロトプラストの単離
実施例で得たカルス１ｇに対して、セルラーゼ（商品名：オノズカＲＳ；ヤクルト本社製）１％、ペクトリアーゼ（商品名：Ｙ−２３；Seishin Pharmaceutical製）0.１％、ＭＥＳ  ５ｍＭをＬＷ液（Lazzeri et al. 1991, Theor. Appl. Genet. 81: 437-444) に溶解した酵素液１０ｍｌを加え、２５℃で２〜３時間静置した。
こうして得られたプロトプラスト懸濁液を６４μおよび２６μメッシュで濾過したのち、遠心処理（５０×ｇ）してプロトプラストを回収した。次いで、ＬＷ液を用い３度洗浄を行った。
【００１５】
実施例３
プロトプラストの培養
回収したプロトプラストは、0.４Ｍのマルトース、２ｍｇ／ｌの２，４−Ｄ、0.６，１．２, １．８または２．４％のアガロースを含む１ｍｌのＬ１培地に懸濁し、速やかに６ｃｍシャーレ上に広げた。このとき、直径約4.５ｃｍの円盤状にした。固化した後、シャーレより剥離し、２００ｍｇ／ｍｌのオオムギ懸濁細胞を含む５ｍｌの液体培地（プロトプラストを懸濁したものと同成分）中で振盪培養を行った。
プロトプラストの培養開始後１５日目に液体培地および懸濁培養細胞を除去し、新鮮液体培地でさらに７日間振盪培養を行ったところ、アガロース中あるいはその表面にコロニーの発達が見られた。プロトプラストの分裂率を調査した結果、プロトプラスト培地中に含まれるアガロース濃度が高いほど、高い分裂率を示した（表１）。また、１．２％のアガロース濃度の培地でも実用上十分な分裂率が得られた。なお、振盪培養は５０ｒｐｍで実施した。
【００１６】
【表１】
0003806156.tif 000002
【００１７】
実施例４
植物体の再分化
実施例３で得られたコロニーを、植物ホルモンとして0.５ｍｇ／ｌの２，４−Ｄおよび１．０ｍｇ／ｌのベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）を含むＬ３培地に移植した。移植後３〜１５日目にエンブリオジェニックなカルスまたは胚様体の形成が観察された。
【００１８】
これらのカルスまたは胚様体を上記Ｌ３培地に移植した。未熟胚からのカルス誘導からこの段階までは弱照明下（約５００ルクス）、２５℃で培養した。約３〜１５日で植物体（地上部）の再分化が見られた。シュートの十分な成長が認められた時点で、強照明下（約7.０００ルクス）に移動させた。プロトプラスト培地中のアガロース濃度がシュート分化に与える影響を調べたところ、１．８％のアガロース濃度において最も高いシュート分化率が得られた（表２）。また、１．２％のアガロース濃度でも十分なシュート分化が確認できた。
【００１９】
【表２】
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【００２０】
こうして得られた植物体は、さらに植物ホルモンを含まないＬ３培地上に移植して発根を促した。約１カ月後に鉢あげを行った。鉢あげ後、GOLDEN PROMISE( オオムギ品種名) および１６時間日長、2,０００ルクス、４℃で２カ月間の低温処理を行ったIGRI（オオムギ品種名) の再生個体を、１６時間日長、１0,０００ルクス、１２℃の環境で栽培したところ、現在、最も生育のはやい植物体で稔性が確認されている。カルス誘導後、プロトプラストから稔性植物体が得られるまでの期間は約６カ月であり、これまでの成功例より４カ月以上速いものであった。また、アガロース濃度が１．２〜５．０％の高アガロース濃度でプロトプラストを培養することによって、効率的にプロトプラストから植物体を再生させることに成功した。
【００２１】
【発明の効果】
本発明のオオムギプロトプラストからの植物体の再生方法によれば、短期間にプロトプラストから健全な植物体を再生することができる。よって、本発明は遺伝子組換え、細胞融合などのバイオテクノロジーを利用した新品種の育成に利用されることが期待される。