(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
呼吸器シンシチウムウイルス（ＲＳＶ）蛋白質もしくはその免疫学的断片、ならびにＱＳ−２１、モノホスホリルリピドＡ、３−脱アシル化モノホスホリルリピドＡおよびそれらの組み合わせ物からなる群より選択されるアジュバントを生理学的に許容される賦形剤内に含むワクチン製剤。
【請求項２】
呼吸器シンシチウムウイルス（ＲＳＶ）蛋白質もしくはその免疫学的断片、ならびにＱＳ−２１を生理学的に許容される賦形剤内に含むワクチン製剤。
【請求項３】
更にａｌｕｍを含む、請求項１記載のワクチン製剤。
【請求項４】
更にａｌｕｍを含む、請求項２記載のワクチン製剤。
【請求項５】
呼吸器シンシチウムウイルス（ＲＳＶ）蛋白質もしくはその免疫学的断片、ａｌｕｍ、および３−脱アシル化モノホスホリルリピドＡを生理学的に許容される賦形剤内に含むワクチン製剤。
【請求項６】
ＲＳＶ蛋白質が、ＲＳＶ糖蛋白質Ｇ、ＲＳＶ糖蛋白質Ｆ、ＲＳＶ糖蛋白質ＦおよびＧの両方からの少なくとも一つの免疫学的断片を含むキメラポリペプチド、ならびにそれらの組み合わせ物からなる群より選択される、請求項１記載のワクチン製剤。
【請求項７】
ＲＳＶ蛋白質が、ＲＳＶ糖蛋白質Ｇ、ＲＳＶ糖蛋白質Ｆ、ＲＳＶ糖蛋白質ＦおよびＧの両方からの少なくとも一つの免疫学的断片を含むキメラポリペプチド、ならびにそれらの組み合わせ物からなる群より選択される、請求項２記載のワクチン製剤。
【請求項８】
ＲＳＶ蛋白質が、ＲＳＶ糖蛋白質Ｇ、ＲＳＶ糖蛋白質Ｆ、ＲＳＶ糖蛋白質ＦおよびＧの両方からの少なくとも一つの免疫学的断片を含むキメラポリペプチド、ならびにそれらの組み合わせ物からなる群より選択される、請求項３記載のワクチン製剤。
【請求項９】
ＲＳＶ蛋白質が、ＲＳＶ糖蛋白質Ｇ、ＲＳＶ糖蛋白質Ｆ、ＲＳＶ糖蛋白質ＦおよびＧの両方からの少なくとも一つの免疫学的断片を含むキメラポリペプチド、ならびにそれらの組み合わせ物からなる群より選択される、請求項４記載のワクチン製剤。
【請求項１０】
ＲＳＶ蛋白質が、ＲＳＶ糖蛋白質Ｇ、ＲＳＶ糖蛋白質Ｆ、ＲＳＶ糖蛋白質ＦおよびＧの両方からの少なくとも一つの免疫学的断片を含むキメラポリペプチド、ならびにそれらの組み合わせ物からなる群より選択される、請求項５記載のワクチン製剤。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
呼吸器シンシチウムウイルス（ＲＳＶ）は、乳児期および初期幼児期における下気道炎の主要因である（ＭｃＩｎｔｏｓｈ  ａｎｄ  Ｃｈａｎｏｃｋ、１９８５、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、Ｆｉｅｌｄｓ、Ｂ．（ｅｄ）、Ｒａｖｅｎ、ＮＹ、ｐｐ．１２８５−１３０４）。全ての地理領域において、このウイルスは乳児および年少児における気管支梢炎および肺炎の主要因である。この作用物質は幼児期間中に頻繁に再感染するが、再感染により生じる疾患は一般的に最初の感染に関連するものよりも緩和であり、そして大きな問題を生じることは滅多にない。
ＲＳウイルスはパラミクソウイルス（パラミクソビリダエ（Ｐａｒａｍｙｓｖｉｒｉｄａｅ））科であり、かつニューモウイルス属であるエンベロープ型ＲＮＡウイルスである。２つの主要エンベロープ蛋白質は、このウイルスの宿主細胞膜への接着の原因となるＧ蛋白質、およびこのウイルスと細胞膜との融合の原因となる融合蛋白質（Ｆ蛋白質）である。ウイルス−細胞融合は感染には必須の段階である。融合蛋白質は、感染化細胞から非感染化細胞へと感染を蔓延させるためのもう一つの方法である細胞−細胞融合をも必要とする。
融合蛋白質もしくはＧ蛋白質に対する抗体はそのウイルスを中和することができる。しかしながら融合蛋白質に対する抗体のみが細胞間のウイルスの蔓延を遮断し、すなわち抗融合活性を有するであろう。従って融合蛋白質に対する抗体は循環型ウイルスを予防し、そして細胞間での慢性感染の蔓延を阻害するであろう。融合蛋白質に対する抗体（精製化融合蛋白質に対するポリクローナル抗血清およびモノクローナル抗体の両方であって、中和活性および抗融合活性の両方を含む）は動物モデルにおいて感染に対して予防的であることが見いだされている（Ｗａｌｓｈ  ｅｔ  ａｔ、１９８４、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．４３：７５６−７５８）。
乳児および年少児の上気道炎および下気道炎に対する予防のための現実的手段はＲＳウイルスに対する予防ワクチン接種であろう。妊婦のワクチン接種（能動免疫法）は、経胎盤的もしくは母乳を通じてかのいずれかによる免疫の受動移入により年少児を保護するであろう。ＲＳウイルスワクチンに向けての数々のアプローチが可能であるが、それらの内の幾つかは不成功であることが過去に証明されている。
死菌ＲＳウイルスワクチンでのワクチン接種が試されており、そしてそれは無効であることが見いだされている（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．、１９６９、Ａｍ．Ｊ．Ｅｐｉｄ．８９：４２２）。子供が保護されないばかりでなく、幾つかの事例においては結果として生じるＲＳウイルスでの感染が、非定型でありかつ非免疫化対照におけるものと比較すると一層重篤な疾患をもたらした。この現象はＲＳウイルスに特有という訳ではなく、そして例えば麻疹のような死菌パラミクソウイルスワクチンにおいても見いだされている。過去の不活化ＲＳウイルスワクチンの失敗の理由は、ウイルスエンベローブ糖蛋白質のいずれかもしくは両方における生物学的機能性エピトープの不活化に起因することが示唆されている。これはつまり、死菌ウイルスワクチン上の中和用かつ融合用のエピトープが「変性」してしまったということである。その結果、ワクチン接種を施した被験体は生物学的に機能的な中和用かつ融合用エピトープを経験していなかった。従って、ワクチン接種を施した被験体が生ワクチンに遭遇した際には、結果として生じる抗体応答は予防免疫を生じることがなかった。その代わりに、より重篤な疾患をもたらすことがよくある抗体媒介性炎症性応答が生じた（Ｃｈｏｐｐｉｎ  ａｎｄ  Ｓｃｈｅｉｄ、１９８０、Ｒｅｖ．Ｉｎｆ．Ｄｉｓ．２：４０−６１）。
ＲＳウイルスワクチンへの第二のアプローチは生ウイルスを弱毒化することであった。温度感受性突然変異体（Ｗｒｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．、１９８２、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．３７：３９７−４００）および継代弱毒化ウイルス（Ｂｅｌｓｈｅ  ｅｔ  ａｌ．、１９８２、Ｊ．Ｉｎｆ．Ｄｉｓ．１４５：３１１−３１９）はＲＳウイルスワクチンにおける免疫原として用いた際には感染性がほとんど無く、かつ疾患の予防には効力がないことが証明された。しかしながらこれらの事例においては、ワクチン接種の結果としての非定型疾患は存在しなかった。
ＲＳウイルスの構造および感染に対する免疫応答の我々の最近の知見に基づくと、このウイルスに対する有用なワクチンが融合蛋白質および／またはＧ蛋白質に対する抗体の産生を誘導するのに有用であるはずであることは明白である。融合を阻害し、そしてそのため気道における細胞間のウイルスの蔓延を停止することができる抗体の産生は予防免疫にとっては特に重要である。その上、ＲＳウイルス感染化細胞に対して有用である細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の刺激化を初めとする細胞媒介性免疫応答を誘導することは有用である。本発明の様々なワクチン製剤はこれらの目的の両方を満たすことを目的とする。
発明の要約
本発明は、呼吸器シンシチウムウイルスのエンベロープ蛋白質、特にＲＳＶ糖蛋白質ＦおよびＲＳＶ糖蛋白質Ｇへの免疫学的応答を増加させることが可能な所定のアジュバントの発見に関する。具体的に本明細書では、アジュバントＱＳ−２１、あるいは別法では３Ｄ−モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）およびａｌｕｍが、ＲＳＶ糖蛋白質Ｆおよび／またはＧに対して作成された抗体のウイルスを中和させる能力を有意に増加させ、かつそのウイルスに対する細胞媒介性応答を介する免疫学的防御を提供することが開示される。その上、これらのアジュバントはウイルス感染細胞における合胞体形成を予防することが示されている。これらの所見に基づき、ＲＳＶのエンベロープ蛋白質（一つもしくは複数）、ならびにＱＳ−２１、ＭＰＬ、３Ｄ−ＭＰＬ、およびそれらの組み合わせ物から選択される一つのアジュバントを含むワクチン製剤を作成することができる。この製剤は場合によってはａｌｕｍを含むことができる。ａｌｕｍの添加は、これらのアジュバントと共に投与される場合にはＲＳＶ抗原（一つもしくは複数）に対する免疫学的応答を更に増強することが可能である。これらのアジュバントの存在はａｌｕｍと比較する際に、免疫応答、具体的には補体媒介性プラーク減少性中和反応の増大による抗原に対する免疫原性の亢進を提供する。その上、アジュバントの存在は、ワクチンを抗原（一つもしくは複数）の量を減少させて作成することを可能にする。
【図面の簡単な説明】
図１は、本明細書に論議される実施例５の実験からの細胞媒介性細胞障害反応の結果を示す。
発明の詳細な記述
本発明は、ＲＳＶ感染の予防のための新規のワクチン製剤およびそのための治療的使用に関する。本発明のワクチン製剤は、ＲＳＶ蛋白質もしくはその免疫学的断片、ならびにＲＳＶ蛋白質に対する免疫学的応答を増強することが示されているアジュバントを含む。このアジュバントは、ＱＳ−２１およびモノホスホリルリピドＡ、ならびにそれらの組み合わせ物、および場合によってはａｌｕｍから選択される。ワクチン中のａｌｕｍの存在がＭＰＬと協同的に作用してＲＳＶに対する中和応答を誘導する。
本発明の一つの態様においては、ＲＳＶエンベロープ蛋白質Ｇおよび／またはＦを用いてＱＳ−２１を製剤する。ＱＳ−２１は粗生成のクイラジャ  サポナリア（Ｑｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａ）抽出物から精製されるサポニンであり、そしてＫｅｎｓｉｌおよびＭａｒｃｉａｎｉ、米国特許第５，０５７，５４０号により記載されている。ＱＳ−２１、ならびにＲＳＶ蛋白質ＦあるいはＲＳＶ蛋白質ＧおよびＦを含む製剤に対して作成された抗体はＲＳウイルスを中和することができる。ＱＳ−２１をアジュバントとして使用すると、アジュバントを用いなかった製剤か、あるいは例えばａｌｕｍ（アジュバントとして単独で使用した際）のような他の既知のアジュバントを含む製剤と比較してＲＳＶＦおよびＧ蛋白質の免疫原性がかなり増加する。
本発明の他の態様は、これらのアジュバントを、ＲＳＶ  Ｇ蛋白質もしくはＦ蛋白質を含むワクチンに利用してＲＳＶウイルスの亜群Ａおよび亜群Ｂの両方を中和する免疫応答（例えば抗体反応）を誘導することができる。これは重要な発見であり、それはＧ蛋白質と一緒に用いる際には他のアジュバント、特にａｌｕｍは、その蛋白質が精製されてきた亜群のみを中和することが見いだされているためである。
他の態様では、ＭＰＬおよび特に３Ｄ−ＭＰＬをａｌｕｍと組み合わせて用いて、ＲＳＶに対する補体依存的中和用抗体の刺激化を亢進することが可能なワクチン製剤を産生することができる。ＲＳＶサブユニット構成成分の免疫原性は、アジュバントを用いない製剤、もしくは単一アジュバントとしてａｌｕｍを含む製剤と比較して、このアジュバントを用いると非常に増加する。
ＲＳウイルスの融合蛋白質および／またはＧ蛋白質の中和用および／または融合用エピトープ（一つもしくは複数）に関与する蛋白質およびポリペプチドは、下気道炎およびＲＳウイルス感染の他の疾患症状に対する予防を行うためのサブユニットワクチン中の免疫原として有用であり、そして本発明のワクチン中に製剤することができる。サブユニットワクチンは、宿主およびそれらのアジュバント（これは本明細書では有望な免疫モジュレーターとして同定される）を免疫化するのに必要な適切な免疫原性物質を含む。遺伝子工学的に作成された免疫原、化学的に合成された免疫原、および／または本物であり実質的に純粋なＲＳウイルス融合蛋白質もしくはその断片を単独でか、あるいは類似方法で調製されたＲＳウイルスＧ蛋白質もしくはその断片と組み合わせて含む免疫原から調製されたワクチンは防御免疫応答を誘導することが可能であり、そしてこれらのワクチンは特に有利であり、それはレシピエントの感染の危険が全くないためである。ＲＳＶ糖蛋白質ＦおよびＧの両方からの少なくとも一つの免疫原性断片を含むキメラポリペプチドを本発明のワクチン製剤に使用することもできる。このようなキメラＲＳＶポリペプチドはＷａｔｈｅｎ、米国特許第５，１９４，５９５号により記載されており、その教示は引用により本明細書に取り込まれる。
ＲＳウイルス融合蛋白質および／またはＧ蛋白質、ならびにポリペプチドは、中和用および／または融合用エピトープを発現する組換え体から精製することができる。このような組換え体には、いずれかの細菌形質転換体、イースト形質転換体、組換えバキュロウイルスに感染している培養昆虫細胞、もしくは例えばＲＳウイルス融合蛋白質エピトープを発現するチャイニーズ（Ｃｈｉｎｅｓｅ）ハムスター卵巣細胞のような当該技術分野で知られる培養哺乳類細胞が含まれる。組換え蛋白質もしくはポリペプチドは、該当するエピトープの多重コピーを含むことができる。
ＲＳウイルス融合蛋白質および／またはＧ蛋白質に関連する蛋白質もしくはポリペプチドを化学的に合成することができる。別法では、ＲＳウイルス融合蛋白質に関連する蛋白質もしくはポリペプチド、あるいはＧ関連性蛋白質をＲＳウイルスもしくはＲＳウイルスに感染している細胞の培養物から実質的に純粋に単離し、そして新規のアジュバントと共にＲＳＶに対するワクチンとして製剤することができる。
産生の方法にはかかわらず、ＲＳウイルス融合蛋白質もしくはＧ蛋白質に関連する蛋白質もしくはポリペプチドを適切な濃度に調節し、そしてＱＳ−２１、あるいはＭＬＰとａｌｕｍから選択されるアジュバントと共に製剤することができる。ＭＰＬおよびその誘導体３−脱アシル化ＭＰＬ（３Ｄ−ＭＰＬ）をＴＤＭおよびスクアレンと共に共製剤し、そして本発明のワクチン製剤に用いることができる。３Ｄ−ＭＰＬは、英国特許第２２２０２１１号（Ｒｉｂｉ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅ．社）において記載される方法に従って取得することができる。
各ワクチン投与剤中の蛋白質の量は、明らかに不利な副作用を伴わずに免疫防御応答を誘導する量として選択される。このような量は用いられる免疫原に依存して変化するであろう。一般的には各投与剤は、約０．１〜約１００μｇの蛋白質を含み、約５〜約５０μｇが好ましく、そして別法では約５〜約２５μｇ／投与剤が好ましいであろう。アジュバントの量は、明らかに不利な副作用を伴うことなく免疫調節的応答を誘導するであろう量であろう。具体的なワクチン用の至適量は、ワクチンの抗体力価およびそれらのウイルス中和能の観察を必要とする標準的調査により確認することができる。アジュバントの量は、約１〜約１００μｇ／投与剤であり、約５〜約５０μｇ／投与剤が好ましく、そして別法では約２０〜約５０μｇ／投与剤が好ましいであろう。
ＲＳウイルスの融合蛋白質もしくはＧ蛋白質、あるいはその免疫学的断片、およびその遺伝子的もしくは物理的混合物を含むワクチンの免疫賦活力は、精製化蛋白質、合成ペプチド、もしくは組換え蛋白質での免疫後のテスト動物の免疫応答をモニターすることにより測定することができる。テスト動物には、マウス、ラット、ウサギ、霊長類、および最終的にはヒト被験体が含まれるが、これらには限定されない。免疫原の導入の方法には、皮内的、筋肉内的、腹膜内的、静脈内的、皮下的、経鼻的、もしくは免疫化の他の標準的経路が含まれるが、これらには限定されない。テスト被験体の免疫応答を複数の研究方法により分析することができ、それらは（ａ）取得される免疫血清の、例えば酵素免疫アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫ブロット、放射免疫沈殿などの既知の技術によりアッセイした際の本物のＲＳウイルス抗原に対する反応性、（ｂ）インビトロでＲＳウイルスの感染性を中和する免疫血清の能力、（ｃ）インビトロでウイルス融合を阻害する免疫血清の能力、（ｄ）抗原依存的細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）活性を生じる免疫化動物の能力、ならびに（ｅ）ＲＳウイルス感染からの予防、である。
多くの方法を用いて本明細書に記載されるワクチン製剤を予防目的でヒトを投与することができる。これらの方法には、皮内的、筋肉内的、腹膜内的、静脈内的、皮下的、および経鼻的経路が含まれるが、これらには限定されない。粘膜関連リンパ組織により産生される分泌性ＩｇＡ抗体はＲＳウイルス感染に対する防御における主要な役割を演じている可能性があり、それは粘膜表面との病原体の初期相互作用を妨害することによるか、あるいは感染および／または疾患の蔓延に関係する病原体の重要なエピトープを中和することによる。分泌性ＩｇＡ抗体の産生を初めとする粘膜免疫応答の刺激化は、下気道炎および上気道炎に対する防御を付与する際にも最も重要である可能性がある。
ポリペプチドおよび蛋白質は、一般的には投与剤当たり約０．１μｇ〜約１００μｇの範囲内の濃度で製剤することができる。生理学的に許容される培地を担体として使用することができる。これらには、滅菌水、食塩水、およびリン酸緩衝化食塩水などが含まれるが、これらには限定されない。他の適切なアジュバントを本発明の新規のワクチン製剤に添加することができ、そしてそれらのアジュバントには、例えば水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムなどの無機性ゲルが含まれる。免疫原はリポソーム内に取り込ませるか、あるいは多糖類および／またはワクチン製剤の際の使用のための他の重合体に結合させることができる。
本発明のワクチン製剤中に取り込ませることができるポリペプチドおよび蛋白質を、可溶性巨大分子性担体に連結させることができる。その担体と、そのポリペプチドおよび蛋白質が連結後に５千ダルトンを越えることが好ましく、そしてその担体が５キロダルトンを越えることがより好ましい。その担体は、ヒトを初めとする動物において免疫原性である天然もしくは合成のいずれかのポリアミノ酸であることが好ましい。連結の様式は通常のものである。多くの連結用技術が米国特許第４．６２９，７８３号に開示されており、これは引用により本明細書に取り込まれる。多くの架橋試薬が１９８６−８７  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｃａｔａｌｏｇ、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ社、（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）のページ３１１−３４０に開示されている。
ＲＳウイルスの融合蛋白質および／またはＧ蛋白質に関連するエピトープを発現する組換えウイルスが調製される。これらのウイルスを用いて、下気道感染およびＲＳウイルスの他の疾患症状を予防するための不活化組換えウイルスワクチンを調製することができる。
不活化ワクチンは、それらの感染性が通常は化学的処理（例えばホルムアルデヒド）により破壊されているという観点では「死んでいる」。ウイルスの免疫原性に関連する蛋白質に影響を及ぼすことなくウイルスの感染性が破壊されることが理想的である。不活化ワクチンを調製する目的で、ＲＳウイルス融合蛋白質および／またはＧ蛋白質に関連する蛋白質もしくはポリペプチドを発現する大量の組換えウイルスを培養物中で増殖させて必要量の適切な抗原を提供する必要がある。異なるエピトープを発現する不活化ウイルスの混合物を「多価」ワクチンの製剤のために用いることができる。一定の事例においてはこれらの「多価」不活化ワクチンは、同時に投与される生ワクチンの相互妨害という潜在的な問題があるため生ワクチン製剤よりも望ましく可能性がある。いずれの場合にしても不活化組換えウイルスもしくはウイルスの混合物を、抗原に対する免疫学的応答を亢進させる目的で本発明のアジュバントと共に製剤することができる。
本発明のワクチンを個体に投与してＲＳＶに関連する感染もしくは疾患症状を予防することができる。このような投与は、個体内における初期免疫応答を誘導するための単回用量もしくは複式用量により達成することができる。典型的な複式ワクチン投与は、ヒトについては実質的に２カ月の間隔で３回投与されるであろう。事前のワクチン接種もしくは天然の感染からの現存の免疫応答を刺激化するためにブースター量を投与することができる。
以下の実施例は本発明を詳細に説明する目的で提供され、そして本発明の範囲を制限すると解釈されるのべきではない。
実施例
実施例１：ＲＳＶ蛋白質の調製
Ａ．  免疫親和性融合蛋白質−１（ＰＦＰ−１）
ＰＦＰ−１は、Ｗａｌｓｈら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ． ６６：４０９−４１５（１９８５）の方法により、以下の改変事項を加えて調製する。免疫親和性溶出化物質をＤＥＡＥカラムに通し、そして素通り分画を回収し、ＰＢＳ／０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００に対して透析し、そして０．２μｍのフィルターを通してフィルター滅菌する。
Ｂ．  イオン交換融合蛋白質−２（ＩＦ）
ＩＦは、清澄化させたＲＳＶ−感染化細胞溶菌物をＤＥＡＥカラムに通すことにより調製される。素通り分画を回収し、そしてヒドロキシアパタイト（ＨＡ）カラムに通す。ＨＡ溶出後には、溶出されるＦ蛋白質をＰＢＳ／０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００に対し透析し、そして０．２μｍのフィルターを通してフィルター滅菌する。
Ｃ．  免疫親和性Ｇ蛋白質（Ｇ）
Ｇ蛋白質は、Ｗａｌｓｈら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ． ６６：７６１−７６７（１９８４）の方法により、以下の改変事項を加えて調製する。溶出後には、Ｇ蛋白質をＲＳＶ  Ｆ蛋白質に特異的な免疫親和性カラムに通す。素通り分画を回収し、ＰＢＳ／０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００に対して透析し、そして０．２μｍのフィルターを通してフィルター滅菌する。
Ｄ．  Ｆ／Ｇ蛋白質キメラ
Ｆ／Ｇ蛋白質キメラは、米国特許第５，１９４，５９５号により調製され、そしてＵｐｊｏｈｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社により供給される。
実施例２：酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）
血清試料中の抗体力価は以下の要領で実施される酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）を用いて測定する。
ＲＳウイルス融合蛋白質を炭酸−重炭酸緩衝液、ｐＨ９．６中で２００ｎｇ／ｍｌに希釈する。１００μｌの希釈化抗原を平底９６−ウエルのＮＵＮＣ（商標）アッセイプレートのＢ−Ｇ列の各ウエルに添加する。Ａ列およびＨ列には１００μｌの炭酸−重炭酸緩衝液のみを各ウエルに添加する。このプレートに蓋を被せ、そして震盪させながら３７℃で２時間インキュベートし、そして４℃で一晩保存して抗原を固定化させる。
上清をＮＵＮＣ（商標）アッセイプレートから除去し、そしてこのプレートを０．１％のＴｗｅｅｎ／ＰＢＳ、ｐＨ７．４で洗浄し、そしてパット乾燥させる。
３つの抗体試料を各プレート上でアッセイする。各試料をまず０．２％のＴｗｅｅｎ、０．０１ＭのＥＤＴＡ／ＰＢＳ、ｐＨ７．５（０．２％  ＴＷＮ）中で初期希釈物に希釈する。この初期希釈物を９６ウエルのＵ底ＦＡＬＣＯＮ（商標）プレート内で以下のように更に系列希釈する。
（ａ）試料の初期希釈物を２００μｌ／ウエルで列２に接種する。試料１を例えばウエルＡ２、Ｂ２、およびＣ２のように三重検査として接種し、試料２は例えばウエルＤ２、Ｅ２のように二重検査として接種し、試料３は例えばウエルＦ２、Ｇ２、およびＨ２のように三重検査として接種する。
（ｂ）１００μｌの０．２％  ＴＷＮを列３〜１２の各ウエル内に接種した。
（ｃ）系列希釈物は、列２のウエルから列３の対応するウエルへと（例えばＢ２からＢ３へ、Ｃ２からＣ３へ）、列３のウエルを列４の対応するウエルへと、列１２に達するまで１００μｌを順次移動させることにより作成した。
（ｄ）列１には１００μｌの０．２％ＴＷＮを各ウエルに対照として添加した。
１００μｌの初期希釈物をＦＡＬＣＯＮ（商標）プレートの各ウエルからＮＵＮＣ（商標）プレートの対応するウエルへと、例えばＡ２（ＦＡＬＣＯＮ（商標））からＡ２（ＮＵＮＣ（商標））へ移す。ＮＵＮＣ（商標）アッセイプレートに蓋を被せ、そして震盪させながら３７℃で１時間インキュベートする。上清をアッセイプレートから除去し、そしてプレートを０．１％  Ｔｗｅｅｎ／ＰＢＳで洗浄し、そしてパット乾燥させた。
ヤギの抗マウスＩｇＧ−アルカリホスファターゼ複合体（ＴＡＧＯ（商標）を０．３％  Ｔｗｅｅｎ／ＰＢＳ、ｐＨ７．０（０．３％ＴＷＮ）で例えば１：１５００のような作業用希釈率に希釈した。希釈化複合体（１００μｌ）を列２〜１２の各ウエルに添加する。列１では１００μｌの０．３％  ＴＷＮを対照として各ウエルに添加する。このプレートに蓋を被せ、そして震盪させながら３７℃で１時間インキュベートする。その後に接種原を除去し、そしてプレートを０．１％  Ｔｗｅｅｎ／ＰＢＳ、ｐＨ７．４で洗浄し、そしてパット乾燥させる。
全ての各ウエルにジエタノールアミン緩衝液、ｐＨ９．８、中の１００μｌの基質溶液、１ｍｇ／ｍｌ（ＳＩＧＭＡ−１０４（商標））を添加する。酵素反応を室温で１時間行わせる。この反応は、各ウエルへの１００μｌの３Ｎ  ＮａＯＨの添加により停止させる。酵素反応の程度を４１０ｎｍの光学密度を計測することにより測定する。
列Ａおよび列Ｈは陰性対照として働き、それは抗原が全く存在しないことが理由であり、列１も陰性対照として働き、それは抗体が全く存在しないことが理由である。
実施例３：ウイルス中和アッセイ（プラーク減少性中和テスト、ＰＲＮＴ）
系列希釈したテスト血清試料および陽性対照血清を５６℃で３０分間非働化させる。その後に全ての血清をＲＳウイルスの約３０のプラーク形成性単位（ＰＦＵ）を含む等容量で希釈し、そして３７℃で１時間、５％のウサギ補体の添加有り（Ｃ’およびＰＲＮＴ）もしくは無し（ＰＲＮＴ）でインキュベートする。酵素免疫アッセイ、中和、および抗融合アッセイにより性質が予め決定されているヒト成人血清のプールを陽性対照に使用する。予め性質決定が行われ、かつ免疫されていないことが知られている血清を陰性対照として使用する。
インキュベーションした各血清−ウイルス混合物をＨＥｐ−２細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ２３）に対して、９６ウエルプレートの別のウエル内で接種し、そしてウイルス吸着を３７℃で２時間行わせる。接種原を除去する。細胞単層を洗浄し、そして５％のウシ胎仔血清および１％のＳＥＰＨＡＤＥＸ（商標）を添加してある改変化イーグル（Ｅａｇｌｅ’ｓ）培地を重層し、そして３７℃で３日間インキュベートする。この重層培地を除去し、そして細胞をリン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）で洗浄する。
２００μｌの冷却ＰＮＳ−メタノール（１：５）溶液を各ウエルに添加し、そして細胞を３０分間室温で固定する。ＰＢＳ−メタノール固定液を除去し、ウエル当たり２００μｌのＰＢＳ中の５％ＣＡＲＮＡＴＩＯＮ（商標）即席乳、ｐＨ６．８（ＢＬＯＴＴＯ）を添加する。このプレートを３７℃で３０分間インキュベートする。
ＢＬＯＴＴＯを除去する。ウエル当たり５０μｌの、ＲＳウイルスに対するモノクローナル抗体（事前に力価が決定され、そしてＢＬＯＴＴＯで作業用濃度にまで希釈されている）を添加し、そしてこのプレートを３７℃で１時間インキュベートする。抗体を除去し、そして固定化細胞をＢＬＯＴＴＯで、各場合３０分間で２度洗浄する。
５０μｌ／ウエルのセイヨウカラシパーオキシダーゼ結合化ヤギ抗マウスＩｇＧ（ＢＬＯＴＴＯ中で１：２５０に希釈される）を添加し、そしてそのプレートを３７℃で１時間インキュベートする。ヤギ抗体を除去し、そして固定化細胞を再度ＢＬＯＴＴＯで、各場合３０分間で２度洗浄する。
５０μｌ／ウエルのパーオキシダーゼ基質溶液（ＰＢＳ中の０．０５％の４−クロロ−１−ナフトール、０．０９％のＨ2Ｏ2、ｐＨ６．８）を添加し、そして色は１５〜３０分間室温で発色させる。この基質溶液を除去し、そしてウエルを水で洗浄し、そして空気乾燥させる。各ウエル中のプラークの数を測定する。
テスト血清試料の中和能は、非免疫対照血清と比較した際のプラーク形成における６０％減少をもたらす希釈率として表される。結果を表１〜４に表示する。
ＥＩＡおよびプラーク減少性中和テストの結果を表す表１、２、３、および４におけるデータは、ａｌｕｍ単独の場合と比較した際のこれらの新規のアジュバントの使用に伴う生物学的免疫応答における改善を示す。新規のアジュバントが添加されている（追加的ａｌｕｍを含む、もしくは含まない）ＲＳウイルス融合蛋白質、Ｇ蛋白質、それらの混合物、およびＦ／Ｇキメラ蛋白質のワクチン製剤は、ａｌｕｍのみを含む製剤と比較すると有意な亢進を示した。
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１  血清反応陰性スイスウエブスター（Ｓｗｉｓｓ  Ｗｅｂｓｔｅｒ）マウスを第０週目および第３週目に、様々なアジュバント中のＦおよびＧ蛋白質で免疫した（１００μｌ）。マウスは第０週目、第３週目、および第６週目に血清学的調査のために採血した。
２  血清学的アッセイ：ＲＳＶの亜群Ａ株（すなわちＡ２）およびＲＳＶの亜群Ｂ株（すなわち１８５３７）に対するＥＩＡ−Ｆ（Ｆ蛋白質特異的酵素免疫アッセイ）、ＥＩＡ−Ｇａ（Ｇａ蛋白質特異的酵素免疫アッセイ）、ＰＲＮＴ（プラーク減少性中和テスト）。Ｃ’−ＰＲＮＴ（５％の補体が添加されているプラーク減少性中和テスト）も、ＲＳＶ株Ａ２および１８５３７に対して実施した。ＥＩＡアッセイを個々の血清について実施し、そして幾何学的平均力価（ＧＭＴ）を算出かつ報告した。ＰＲＮＴおよびＣ’−ＰＲＮＴアッセイはプール血清について実施した（群当たり一つのプール、ｎ−５）。
３  免疫原：ＩＦ−イオン交換精製化ＲＳＶ  Ｆ蛋白質、Ｇ−親和性精製化ＲＳＶ  ＧＭＴ蛋白質、ＰＦＰ−１−親和性精製化ＲＳＶ  Ｆ蛋白質、Ｆ／Ｇキメラ−バキュロウイルス感染化Ｓｆ９培養物から精製されたＦ／Ｇキメラ蛋白質。
４  免疫原を以下のアジュバントと共に投与した。ａｌｕｍ−１μｇ／ｍｌの水酸化アルミニウム、ＯＳ−２１−２００μｇ／ｍｌのＯＳ−２１、３Ｄ−ＭＰＬ−２５０μｇ／ｍｌの３Ｄ−ＭＰＬ、３Ｄ−ＭＰＬ＋ａｌｕｍ−２５０μｇ／ｍｌの３Ｄ−ＭＰＬと１μｇ／ｍｌの水酸化アルミニウムとの組み合わせ物。
５  ｎｄ−未測定。
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１  血清反応陰性Ｂａｌｂ／Ｃマウスを第０週目および第４週目に、様々な免疫原の０．５μｇ用量で免疫した（１００μｌ）。マウスは第０週目、第４週目、および第８週目に血清学的調査のために採血した。
２  血清学的アッセイ：ＲＳＶの亜群Ａ株（すなわちＡ２）およびＲＳＶの亜群Ｂ株（すなわち１８５３７）に対するＥＩＡ−Ｆ（Ｆ蛋白質特異的酵素免疫アッセイ）、ＥＩＡ−ＧＡ（ＧＡ蛋白質特異的酵素免疫アッセイ）、ＰＲＮＴ（プラーク減少性中和テスト）。全てのアッセイはプール血清について実施した（１プール／群、ｎ−５）。追加的に第８週目のプールを、５％のウサギ補体の添加による補体増強化ＰＲＮＴによりテストした。
３  ａｌｕｍ：水酸化アルミニウム、１ｍｇ／ｍｌ。
４  ３Ｄ−ＭＰＬ：３Ｄ−モノホスホリピド  Ａ、２５０μｇ／ｍｌ（２５μｇ／用量）。
５  ＯＳ２１：２００μｇ／μｌ（２０μｇ／用量）。
６  ａｌｕｍ＋３０−ＭＰＬ：１ｍｇ／ｍｌの水酸化アルミニウムと２５０μｇ／ｍｌの３Ｄ−ＭＰＬとの混合物。
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１  血清反応陰性スイスウエブスター（Ｓｗｉｓｓ  Ｗｅｂｓｔｅｒ）マウスを第０週目および第３週目に、様々なアジュバント中のイオン交換精製化ＲＳＶ  Ｆ蛋白質（ＩＦ）もしくはＰＢＳで免疫した（１００μｌ）。マウスは第０週目、第３週目、および第６週目に血清学的調査のために採血した。
２  血清学的アッセイ：ＲＳＶの亜群Ａ株（すなわちＡ２）およびＲＳＶの亜群Ｂ株（すなわち１８５３７）に対するＥＩＡ−Ｆ（Ｆ蛋白質特異的酵素免疫アッセイ）、ＥＩＡ−Ｇａ（Ｇａ蛋白質特異的酵素免疫アッセイ）、ＰＲＮＴ（プラーク減少性中和テスト）。Ｃ’−ＰＲＮＴ（５％の補体が添加されているプラーク減少性中和テスト）も、ＲＳＶ株Ａ２および１８５３７に対して実施した。ＥＩＡアッセイを個々の血清について実施し、そして幾何学的平均力価（ＧＭＴ）を算出かつ報告した。ＰＲＮＴおよびＣ’ＰＲＮＴアッセイはプール血清について実施した（群当たり一つのプール、ｎ−５）。
３  イオン交換精製化Ｆ蛋白質（ＩＦ）を以下のアジュバントと共に投与した。ａｌｕｍ＝１μｇ／ｍｌの水酸化アルミニウム、ＯＳ−２１＝２００μｇ／ｍｌのＯＳ−２１、３Ｄ−ＭＰＬ＝２５０μｇ／ｍｌの３Ｄ−ＭＰＬ、３Ｄ−ＭＰＬ＋ａｌｕｍ＝２５０μｇ／ｍｌの３Ｄ−ＭＰＬと１ｍｇ／ｍｌの水酸化アルミニウムとの組み合わせ物。
４  ＮＤ＝未測定。
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１  血清反応陰性マウスを第０週目および第３週目に、ａｌｕｍ（ＡＬ（ＯＢ）3、１ｍｇ／ｍｌ）もしくはＯＳ−２１（２５０μｇ／ｍｌ）のいずれかのアジュバント添加を行ってある１μｇの蛋白質で免疫した（１００μｌ、ＩＭ）。マウスは第０週目、第３週目、および第６週目に血清学的調査のために採血した。
２  血清学的アッセイ：５％のウサギ補体の添加を伴うＲＳＶの亜群Ａ株（すなわちＡ２）およびＲＳＶの亜群Ｂ株（すなわち１８５３７）についてのＥＩＡ−Ｆ（Ｆ蛋白質特異的酵素免疫アッセイ）、ＰＲＮＴ（プラーク減少性中和テスト）。ＥＩＡアッセイを個々の血清について実施し、そして幾何学的平均力価（ＧＭＴ）を算出かつ報告した（マウス数／群＝５）。
３  等量の親和性精製化Ｇ蛋白質（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００／デオキシコール酸溶菌）と合わせたイオン交換精製化Ｆ蛋白質（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００溶菌）。
４  イオン交換精製化Ｆ蛋白質。
実施例４
ウイルスおよび細胞株。ＲＳＶのＡ２および１８５３７株を用い、そしてウイルス保存物は標準方法に従ってＶｅｒｏ［Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｉｏｎ（ＡＴＣＣ）番号ＣＣＬ８１］もしくはＨＥｐ−２（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ２３）細胞のいずれかの内で増殖させ、ソルビトール密度勾配にかけて精製し、そして使用するまで−７０℃で保存する。ＲＳＶのＬｏｎｇ株に永続的に感染しているＢＣＨ４細胞株および非感染化ＢＡＬＢ／ｃ細胞株（両方の細胞株については、Ｆｅｒｎｉｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．、１９８１、１６７：８３−８６、を参照せよ）はＢｒｕｃｅ  Ｆ．Ｆｅｒｎｉｅ博士から寄贈された。後者の細胞株は、１０％（ｖ／ｖ）の非働化ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．社、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ）を添加してあるダルベッコーの改変化イーグル（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ）培地中で維持する。
実施例５
抗Ｆ蛋白質抗体のサブクラス決定。ＱＳ−２１、ＡＬＯＨと混合してある５μｇのＦ蛋白質か、もしくは天然の感染物で初回免疫を行ったマウスの抗Ｆ蛋白質抗体サブクラスの力価はＥＬＩＳＡにより測定する。簡潔に記載すると、９６ウエルプレートを２０ｎｇのＦ蛋白質もしくは５μｇのＲＳＶ  Ａ２を用いて以下の要領で調製する。炭酸／重炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）中の精製化Ｆ蛋白質（２００ｎｇ／ｍｌ）もしくはＲＳＶ  Ａ２（５０μｇ／ｍｌ）を９６ウエルプレート（Ｎｕｎｃ社、Ｒｏｓｋｉｌｄｅ、Ｄｅｎｍａｒｋ）上に３７℃で２時間コートし、そして４℃で一晩保存する。その後にこのプレートをＰＢＳ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０（Ｓｉｇｍａ社）で５回洗浄し、次いでＰＢＳのみで２回追加的にすすぐ。ＰＢＳ／０．３％  Ｔｗｅｅｎ  ２０／０．０１Ｍ  ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ７．０）中で調製された血清の３倍系列希釈物をその後にウエルに添加し、そして室温で１時間インキュベートする。ＰＢＳ／０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０での５回の洗浄後に、１００μｌのビオチニル化ヤギ抗マウスＩｇＧ（１：４０００、Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ  ａｎｄ  Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）、ＩｇＧ１（１：３０００、Ｚｙｍｅｄ社）、もしくはＩｇＧ２ａ（１：５０００、Ｚｙｍｅｄ社）を添加し、そしてそのプレートを１時間室温でインキュベートする。更に一連の洗浄を行った後に、セイヨウカラシパーオキシダーゼに対して結合させてある１００μｌのストレプトアビジン（ＰＢＳ／０．３％  Ｔｗｅｅｎ  ２０中の１：１０，０００希釈物、Ｚｙｍｅｄ社）をそれらのウエルに添加し、そして室温で更に３０分間インキュベートする。パーオキシダーゼ基質（２，２’−アジノ−ジ［３−エチル−ベンズチアゾリン硫酸エステル（６）］、Ｋｅｒｋｅｇａａｒｄ  ａｎｄ  Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を洗浄後にそれらのウエルに添加し、そして室温で２０分間インキュベートし、その時点でこの反応を１００μｌの１％ドデシル硫酸ナトリウム（Ｐｉｅｒｃｅ社、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）で停止させる。最終点力価を４１０ｎｍで測定する。
ウイルス中和アッセイ（ＰＲＮＴ）は実施例３における要領で実施する。
Ｆ／ＱＳ−２１により誘導された補体増強化血清中和性抗体力価の増大はＩｇＧ２ａサブクラスの抗Ｆ蛋白質抗体の誘導に関連していた（表５）。初回免疫後３週間目には蛋白質特異的ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ１抗体におけるＱＳ−２１の用量依存的増加が存在する。それとは対照的に、食塩水単独中に混合されるＦ蛋白質もしくはＦ／ＡＬＯＨの単回注射は最初にＩｇＧ１サブクラスの蛋白質特異的抗体を誘導する（表５）。このデータはＦ／ＱＳ−２１が、実験的感染によって生じるものに類似し、かつ補体結合性ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ１抗体の両方からなる液性免疫応答を誘導することを示す。
実施例６
交差中和性抗体の力価およびＲＳＶ感染性の決定。血清中和性抗体の滴定を、実施例３に記載される要領で９６ウエルの組織培養用プレート中のＨＥｐ−２細胞単層についての二重検査として実施する。この実験では以下の表に示されるように、アジュバントはＲＳＶ蛋白質が亜群Ａおよび亜群Ｂウイルス（これらの亜群は以下の表では各々Ａ２および１８６３７として同定される）の両方を中和する補体依存的ＩｇＧ抗体応答を誘導することを可能にさせることが観察される。異種サブタイプのＲＳウイルスの交差中和性免疫応答は精製化Ｇ蛋白質を単独で使用する前は達成されなかった。ＱＳ−２１アジュバントおよびＲＳウイルスＧ蛋白質を用いて製剤されるワクチンは所望されるヘテロタイプの中和性抗体応答を生じ、この応答はａｌｕｍ単独もしくは天然感染により誘導されるものと比較して相当大きい。
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実施例７：局所的Ｆ蛋白質依存性キラー細胞活性を誘導する能力についてのＱＳ−２１対ＡＬＯＨの比較
局所的Ｆ蛋白質依存性キラー細胞活性を誘導するＱＳ−２１の能力も調査し、そしてＦ／ＡＬＯＨでの免疫化もしくは実験的感染により生じる細胞媒介性細胞障害反応と比較する。
肺単球細胞（ＰＭＣ）の単離。
ＯＭＣを、コラーゲナーゼ消化により肺から単離する（Ｈａｎｃｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．、Ｖａｃｃｉｎｅ、１２：２６７−２７４、１９９４、およびＡｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．、７１：１５６１−１５７０、１９９０、を参照せよ）。簡潔に記載すると、切り出した肺を冷却ＤＭＥＭ中に入れ、そして末梢血の混入がないようにすすぐ。その後に肺を新鮮なＤＭＥＭ中で細片にほぐし、５０ｍｌの遠心管に移し、そして２ｍｇ／ｍｌの最終濃度のコラーゲナーゼ（コラーゲナーゼ  タイプＩＶ、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．社、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液、および１％（Ｖ／Ｖ）非働化ＦＢＳの存在下、３７℃で転倒させる。９０分のインキュベーションの後には断片を１００メッシュのステンレス鋼製培養物ふるい（Ｓｉｇｍａ社）に通す。得られる懸濁液をペレット化させ（４００ｇ）、メトリズアミド（１６％、ｗ／ｖ、Ａｃｃｕｒａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ＆  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏｒｐ．社、Ｗｅｓｔｂｕｒｙ、ＮＹ）中で再懸濁し、１０％の非働化ＦＢＳを含むＲＰＭＩ  １６４０（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ社）を重層し、そして５℃で２０分間遠心する（１５０ｇ）。その後にＰＭＣ層を回収し、密度勾配液が含まれないように洗浄し、そしてそれらの細胞障害能についてエックスビボでテストする。
パーセント細胞障害率の決定。抗原依存的細胞性細胞障害反応は、４時間の51Ｃｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｃｏｒｐ．社、Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ、ＩＬ）放出アッセイにおいて決定する。簡便に記載すると、５０μｌ（５０００細胞）の同系51Ｃｒ−ラベル化対照もしくはＲＳＶ−感染化（ＢＣＨ４）標的細胞株を、１００μｌの脾臓もしくは肺の単球細胞（１０％の非働化ＦＢＳ、Ｖ／Ｖ、を含むＲＰＭＩ  １６４０中で２倍系列希釈されている）を含む三重検査用のＶ−底マイクロウエル（Ｃｏｓｔｅｒ社、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）中でインキュベートする（３７℃、５％ＣＯ2）。最終容積はウエル当たり１５０μｌである。インキュベーション後に上清を回収し（Ｓｋａｔｒｏｎ  Ｈａｒｖｅｓｔｅｒ、Ｓｋａｔｒｏｎ  Ｉｎｃ．社、Ｓｔｅｒｌｉｎｇ、ＶＡ）、ＣｌｉｎＧａｍｍａ計数器（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ社）内で51Ｃｒ放出について計数し、そして自発的放出（培地単独でインキュベートした標的、２０〜２５％）および総放出（ＰＢＳ中の１．０％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ｖ／ｖ、を含む培養培地中でインキュベートした標的）と比較する。パーセント特異的放出率を、１００×［（平均ｃｍｐ実験値）−（平均ｃｍｐ自発的放出値）］／［（平均ｃｍｐ総放出値）−（平均ｃｍｐ自発的放出値）］により算出する。
抗体遮断性調査。主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）抗原  Ｈ２Ｋd（クローンＳＦ１．１、ＩｇＧ２ａ）、Ｈ−２Ｄd（クローンＡＦ４−６２．４、ＩｇＧ２ｂ）、およびＨ−２Ｋd（クローンＡＦ６−８８．５、ＩｇＧ２ａ）に対する精製化モノクローナル抗体をＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、から購入する。ジフテリアトキソイド抗原に対するモノクローナル抗体（Ｅ３７−１０、ＩｇＧ２ｂ）はサブクラス対照として働く。マウスＣＤ８表面分子に対するモノクローナル抗体（５３−６．７２、ＡＴＣＣ番号ＴＩＢ１０５）は、ハイブリーマ培養物上清から組換え蛋白質Ｇカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）を通して精製される。精製化ラットＩｇＧはＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ社（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から購入する。細胞媒介性細胞障害反応を遮断するためには、５０μｌの標的細胞の添加前に５０μｌのエフェクター細胞に対して５０μｌの抗体を添加する。標的に対する最終エフェクター比率は６０：１である。
Ｂａｌｂ／ｃマウスを２０μｇのＱＳ−２１（  ）もしくは１００μｇのＡＬＯＨ（△）のいずれかと混合した５μｇのＦ蛋白質で第０週目および第３週目にワクチン接種を行い、そして実験的感染（●）により免疫されたマウスと比較する。第二回目の免疫後２週間目に、マウスをウイルスで攻撃誘発させた。攻撃誘発後４日目には、Ｆ／ＱＳ−２１でワクチン接種したＢＡＬＢ／ｃマウスからのＰＭＣは抗原依存的様式でＲＳＶ感染化標的を殺すことが可能である（図中の実線）（図１Ａを参照せよ）。最も顕著であるのは、この細胞障害性活性は、予めＲＳＶに感染しているマウスからのＰＭＣと同じ位有能であり、かつＦ／ＡＬＯＨでワクチン接種したマウスのＰＭＣ内に誘導される活性と比較してほぼ３倍大きいことである。ＲＳＶに感染していない対照同系標的（破線）は殺されなかった（図１Ａ）。活性は局所的であり、それは同一マウスからの脾臓細胞は細胞障害性ではないためである。
この結果は更に、Ｆ／ＱＳ−２１ワクチンにより誘導される局所的キラー細胞活性がＣＤ８表現型のＴ細胞により媒介されることを示唆していた。細胞溶菌は、ＣＤ８表面決定基を保持する細胞に対するモノクローナル抗体（黒印）の増加用量をアッセイ混合物に添加する際に阻害された（図１Ｂ）。同様に、増加濃度の抗−Ｈ２ＤdおよびＨ２Ｋdモノクローナル抗体（黒印）は細胞溶菌を遮断する（図１Ｃ）。対照免疫グロブリン（白印）は阻害的ではない（図１ＢおよびＣ）。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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