(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｌ−リジンのアミノメチル基を、フラボバクテリウム属に属する微生物の培養物を用いてカルボキシル基に変換することを特徴とするＬ−２−アミノアジピン酸の製造方法。
【請求項２】
フラボバクテリウム属に属する微生物がFlavobacterium sp ７−１株（FERM BP-5457）である請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
フラボバクテリウム属に属する微生物の培養物に、Ｌ−リジンを添加して２０〜４０℃で１８時間〜７日培養し、得られたＬ−２−アミノアジピン酸を単離する請求項１記載の製造方法。
【請求項４】
フラボバクテリウム属に属する微生物の培養物が、液体培地にフラボバクテリウム属に属する微生物を接種した後、２０〜４０℃で１２〜１２０時間培養したものである請求項３記載の製造方法。
【請求項５】
Ｌ−リジンを濃度が０．５〜３０mg／mlになるように添加する請求項３記載の製造方法。
【請求項６】
Ｌ−リジンを添加した後、pH５〜９、好気的条件下で培養を行う請求項３記載の製造方法。
【請求項７】
フラボバクテリウム属に属する微生物を液体培地に接種して２０〜４０℃で１２〜１２０時間培養し、次いでＬ−リジンを添加して２０〜４０℃で１８時間〜７日、pH５〜９、好気的条件下で培養した後、得られたＬ−２−アミノアジピン酸を単離することを特徴とするＬ−２−アミノアジピン酸の製造方法。
【請求項８】
フラボバクテリウム属に属する微生物がFlavobacterium sp ７−１株（FERM BP-5457）である請求項７記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、微生物を利用したＬ−２−アミノアジピン酸の製造方法に関する。Ｌ−２−アミノアジピン酸は、非蛋白性のアミノ酸であり、抗リウマチ剤、乾癬治療剤及び制癌剤として有用なメトトレキセート誘導体（WO92/09436）等の医薬品製造の中間体として重要である。また、ペプチド性抗生物質やペプチドホルモンなどの生理活性ペプチドの末端修飾剤として用いることができ、ペニシリンやセファロスポリンに代表されるβ−ラクタム系抗生物質の発酵生産において前駆体としても利用できる。
発明の背景
Ｌ−２−アミノアジピン酸は、細菌であるCholera vibrio、トウモロコシをはじめとする植物体、カエルの胚など、生物界に広く見いだされている。また、真菌類などにおいてはリジン生合成の中間体として、また、β−ラクタム系抗生物質の生合成においては前駆体としての位置を占めている。その化学合成による製造は光学分割や多段階反応を必要とすることから、コスト的に有効な手段とはなっていない。微生物による生産としては、アルカリゲネス、シュードモナス、クルチアに属する微生物を用いて、Ｌ−ピペコリン酸から製造する方法（特開平１−９８４９５号公報）が知られ、また、アグロバクテリウム、クレブシエラ、アルカリゲネス、ブレビバクテリウム、バチルスに属する微生物を用いて、Ｌ−リジンから製造する方法（特開平６−１８１７８７号公報）が知られている。しかし、前者では原料であるＬ−ピペコリン酸が高価であること、後者では反応効率が一般に低く、大量製法としての問題を残している。
発明の開示
本発明は、Ｌ−リジンから直接Ｌ−２−アミノアジピン酸を高収率で得ることができ、大量製法として用いうる微生物的方法を提供することを目的とする。
本発明は、微生物としてリジンのα−アミノ基を変化させることなく、アミノメチル基を酸化によりカルボキシル基に変えることができる特定の属の微生物を利用することによりＬ−リジンから直接的かつ効率的にＬ−２−アミノアジピン酸を得ることができるとの知見に基づいてなされたものである。
すなわち、本発明は、Ｌ−リジンのアミノメチル基を、フラボバクテリウム属の微生物の培養物を用いてカルボキシル基に変換することを特徴とするＬ−２−アミノアジピン酸の製造方法を提供する。
発明を実施するための最良の形態
本発明の方法により製造されるＬ−２−アミノアジピン酸は、下記式１：
ＨＯＯＣＣＨ（ＮＨ2）ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＯＨ      （１）
で表わされ、本発明の方法にはその塩を製造する場合も含まれる。
塩としては、酢酸、酒石酸などの有機酸塩、塩酸、硫酸等の無機酸塩、トリエチルアミン、Ｎ−メチルモルホリンなどの有機塩基塩、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどの無機塩基塩があげられる。
本発明で使用するフラボバクテリウム属の微生物としては、リジンのアミノメチル基を酸化によりカルボキシル基に変え、リジンから直接Ｌ−２−アミノアジピン酸を製造できる能力がある限り、フラボバクテリウム属の微生物の任意の株を用いることができる。好ましい一例として、土壌より採取したフラボバクテリウム属の細菌No．７−１株を挙げることができる。このNo．７−１株は、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（住所：日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号）にFlavobacterium sp.7-1として寄託されている（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−５４５７：寄託日  １９９５年１月１７日）。
このNo．７−１株は、菌体の幅が０．５μｍ、長さが２μｍのグラム染色陰性の好気性桿菌で、内生胞子は生じず、カタラーゼ、オキシダーゼ、フォスフアターゼ陽性で、黄色色素を分泌した。鞭毛は持たず運動性がなかった。これらの生理的性質から、バージェイズマニュアルオブシステマチックバクテリオロジーにもとづきフラボバクテリウム属と同定した。
上記、微生物を培養する培地は、特に限定されず、通常の微生物の培養に用いられるものであればよく、
例えば、炭素源としては、上記微生物の利用可能なものであればいずれも使用でき、具体的には、グルコース、フルクトース、シュクロース、デキストリンなどの糖類、グリセロール、ソルビトールなどの糖アルコール、フマル酸、クエン酸等の有機酸を使用でき、これらの炭素源の培地への添加量は、通常、０．１〜１０重量％（以下、％と略称する）程度とすることが望ましい。
窒素源としては、例えば、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸アンモニウム塩やフマル酸アンモニウム、クエン酸アンモニウム等の有機酸アンモニウム塩ないし、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカー、カゼイン加水分解物等の天然窒素源を使用でき、これらの窒素源の培地への添加量は、通常、０．１〜１０％程度とすることが望ましい。
又、無機塩類としては、例えば、リン酸カリウム、リン酸ナトリウム等のリン酸アルカリ金属や塩化カリウム、塩化ナトリウム、等の塩化アルカリ金属、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄等の硫酸金属塩を使用でき、これらの無機塩類の培地への添加量は、通常、０．００１〜１％程度とすることが望ましい。
これらのうち、通常の細菌用の増殖培地を用いた液体培養が好ましく、炭素源としてはグルコース、マルトース、澱粉などが、窒素源としては硫酸アンモニウム、ペプトン、酵母エキス、大豆粉などが特に有効である。その他に、無機塩としてリン酸カリウム、硫酸マグネシウム、食塩などが通常用いられる。
微生物の培養は、上記の培地で２０〜４０℃、好ましくは２８〜３７℃でpHは５〜９、好ましくは６〜８で好気的条件下で実施すればよい。
本発明に利用できる微生物の培養物としては、その微生物の全培養液、菌体、培養濾液およびそれらの処理物があげられる。菌体の処理物としては、乾燥菌体やアセトン、トルエン、メタノール等の有機溶媒で処理した菌体、菌体抽出物、固定化処理物等をあげることができる。また、培養濾液の処理物としては、その培養液の濃縮物、乾燥粉末があげられる。更に、その培養菌体および培養濾液より酵素を分離精製して用いることもできる。
本発明を実施するには、培地に微生物を接種した後、例えば、２０〜４０℃で１２〜１２０時間培養することにより、微生物を１ml中に１０6〜１０10個含む菌株培養液を得、その培養液に原料化合物であるＬ−リジンを通常、最終濃度が０．５〜３０mg／mlになるように水または補助溶剤に溶解して加えるか、または溶解せずにそのまま添加し、通常、２０〜４０℃で１８時間〜７日、好ましくは１８時間〜５日反応させ、陽イオン交換樹脂、陰イオン交換樹脂等を用いた各種イオン交換クロマトグラフィー、ＨＰ２０などの吸着クロマトグラフィー、溶媒や温度を利用しての沈殿化や結晶化等の通常の精製手段によりＬ−２−アミノアジピン酸を得ることができる。
添加するＬ−リジンの形状及び添加時期については特に制限されるものではないが、溶解性などの点から一塩酸塩として用いるのが好ましく、培養開始時の添加でもよく培養途中１〜５日目にも添加してもよい。
本発明によれば、抗リウマチ剤、乾癬治療剤および制癌剤として有用なメトトレキセート誘導体（WO92/09436）の合成における有用中間体であるＬ−２−アミノアジピン酸を、Ｌ−リジン又はその塩から簡単な操作により、直接かつ効率良く製造することができる。
次に本発明を実施例によって説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１
Brain Heart Infusion ３．７％の組成の液体培地３０ｍｌをいれた３００ｍｌフラスコを滅菌し、Ｌ−リジン一塩酸塩２０％液（水酸化ナトリウムでｐＨを８．０に調整）を１／１０量添加した。Ｎｏ．７−１株をスラントより植菌し、２８℃、２２０ｒｐｍで９６時間振とう培養した。遠心により上清液を得、以下に示す液体クロマトグラフィー及び薄層クロマトグラフィーにより、上清液中に含まれるＬ−２−アミノアジピン酸を定量した結果、５．０ｇ／ｌのＬ−２−アミノアジピン酸が生産されていることがわかった。
液体クロマトグラフィー法
カラム；Shim-pack ＩＳＣ−０７／Ｓ１５０４
移動相；Ａ液  ０．２Ｎクエン酸ナトリウム（ｐＨ３．２）７％エタノール
Ｂ液  ０．６Ｎクエン酸ナトリウム（ｐＨ１０．０）
Ｃ液  ０．２Ｎ水酸化ナトリウム
グラジエント溶出
流量；０．３ｍｌ／ｍｉｎ
温度；５５℃
検出器；蛍光検出器（Ｅｘ  ３４８ｎｍ，Ｅｍ  ４６０ｎｍ）
反応試薬；ａ液  ０．０４％次亜塩素酸ナトリウム
炭酸−ほう酸緩衝液
ｂ液  ０．０８％  ｏ−フタルアルデヒド
０．１％Ｎ−アセチルシステイン
炭酸−ほう酸緩衝液
反応試薬流量：ａ液、ｂ液  各０．２ｍｌ／ｍｉｎ
薄層クロマトグラフィー法
薄層；メルク社シリカゲル薄層  １．０５７１５
展開液；ｎ−ブタノール：酢酸：水＝３：１：１
発色；ニンヒドリン
得られた２−アミノアジピン酸について、Ｌ型体が１００％であることを以下の液体クロマトグラフィー分析で確認した。
カラム；ダイセル化学ＣＲ（＋）
移動相；過塩素酸水溶液  ｐＨ２．０
検出；示差屈折計
実施例２
１５０ｍｌのマルトース３％、バクトペプトン１％、酵母エキス０．５％、リン酸２カリウム０．１％、硫酸マグネシウム０．０５％、食塩０．８％（ｐＨ６．８）の培地を含む５００ｍｌフラスコを滅菌し、Ｎｏ．７−１株を植え、２８℃、２２０ｒｐｍで２４時間振とう培養した。このフラスコ培養液を１５リットルの同培地を含む３０リットルのジャーファーメンターに添加した。但しジャー培地には、３００ｇのＬ−リジン塩酸塩と消泡剤であるアデカノール（旭電化工業（株）製）０．７５ｇを加えた。通気、撹拌を行い５日間培養したところ９０ｇのＬ−２−アミノアジピン酸を生成した。
培養液をパーライト添加後濾過し、ロータリーエバポレイターにより１／１０液量に濃縮し塩酸でpHを３．２とし４℃に冷却した。得られた沈殿を濾過により得て、２％となるようにイオン交換水に溶かし、アンモニアでｐＨを１０とした。陰イオン交換樹脂ＩＲＡ−４０２（ＡｃＯ-型）７．９リットルを用いて吸着、水で洗浄後、０．５Ｎ酢酸で分画溶出した。濃縮後４℃に冷却し、得られた結晶を乾燥した。その結果、８２ｇのＬ−２−アミノアジピン酸の白色粉末を得た。