(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
凍結乾燥工程を受けた水生動物起源コラーゲンゲルから調製される多孔性マトリックスからなる組織工学用担体であって、
前記多孔性マトリックスは、ジフェニルホスホリルアジドすなわちＤＰＰＡ、及び、カルボジイミドから選択される化学的架橋剤を用いた化学的方法によって架橋されたものであり、かつ、生きた繊維芽細胞を含むものである組織工学用担体。
【請求項２】
生きた繊維芽細胞が、正常、遺伝子操作型又は悪性の繊維芽細胞から選択されるものである請求項１に記載の組織工学用担体。
【請求項３】
水生動物起源コラーゲンが、硬骨魚類の皮膚に由来するものである請求項１又は２に記載の組織工学用担体。
【請求項４】
水生動物起源コラーゲンが、カレイ目の魚類の皮膚に由来するものである請求項１〜３のいずれかに記載の組織工学用担体。
【請求項５】
水生動物起源コラーゲンが、シタビラメ（ｓｏｌｅ）、マコガレイ（ｄａｂ）、ターボット（ｔｕｒｂｏｔ）及びブリル（ｂｒｉｌｌ）から選択される産業的に漁獲されている魚類の皮膚に由来するものである請求項１〜４のいずれかに記載の組織工学用担体。
【請求項６】
多孔性マトリックスが、キトサン及び必要に応じて少なくとも１つのグリコサミノグリカンと混合された水生動物コラーゲンからなるものである請求項１〜５のいずれかに記載の組織工学用担体。
【請求項７】
多孔性マトリックスは、少なくとも１つの面が、空気中又はガス流体中でコラーゲンゲルを乾燥することによって調製されたコラーゲンフィルム、及び、圧縮されたコラーゲン海綿状体から選択される本質的には目の詰まったコラーゲン膜で覆われたものである請求項１〜６のいずれかに記載の組織工学用担体。
【請求項８】
多孔性マトリックスが、正常な生きた細胞、遺伝子操作された生きた細胞、及び、悪性の生きた細胞からなる群から選択される、繊維芽細胞以外の生きた細胞をさらに含む請求項１〜７のいずれかに記載の組織工学用担体。
【請求項９】
繊維芽細胞以外の生きた細胞が、ケラチノサイト、メラノサイト、血液に由来するランゲルハンス細胞、血液に由来する内皮細胞、血液細胞、マクロファージ、リンパ球、脂肪細胞、皮脂細胞（ｓｅｂｏｃｙｔｅ）、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、及び、血液に由来するメルケル細胞からなる群から選択されるものである請求項８に記載の組織工学用担体。
【請求項１０】
本質的には目の詰まったコラーゲン膜が、ケラチノサイト、メラノサイト、血液に由来するメルケル細胞、血液に由来するランゲルハンス細胞、皮脂細胞（ｓｅｂｏｃｙｔｅ）、血液に由来する細胞、及び、神経細胞から選択される正常、遺伝子操作型又は悪性の生きた細胞を含有する請求項７、８又は９に記載の組織工学用担体。
【請求項１１】
生きた細胞が、ヒトに由来するものである請求項１〜１０のいずれかに記載の組織工学用担体。
【請求項１２】
生きた細胞が、若年の個体に由来するものである請求項１〜１１のいずれかに記載の組織工学用担体。
【請求項１３】
生きた細胞が、中高年の個体に由来するものである請求項１〜１１のいずれかに記載の組織工学用担体。
【請求項１４】
圧縮されたコラーゲン海綿状体の圧縮が、少なくとも５０ｂａｒ（５０×１０５Ｐａ）の圧力で、２０℃〜８０℃の温度で行われる請求項７〜１３のいずれかに記載の組織工学用担体。
【請求項１５】
本質的には目の詰まったコラーゲン膜が、多孔性マトリックスとの組合せに先立って、目の詰まったコラーゲン膜を調製して、それを水生動物起源コラーゲンゲルの上に置き、その後、目の詰まったコラーゲン膜とコラーゲンゲルとを組み合わせたものを凍結及び凍結乾燥することによって調製される請求項７〜１４のいずれかに記載の組織工学用担体。
【請求項１６】
生体材料、再生用結合組織又は再生皮膚の形をとる請求項７〜１５のいずれかに記載の組織工学用担体。
【請求項１７】
実質的に若年の個体のみに由来する細胞又は実質的に中高年の個体のみに由来する細胞のいずれかを含み、皮膚の老化プロセスを研究し、皮膚の老化プロセスにおける活性な成分の効力を試験するための、請求項７〜１６のいずれかに記載の組織工学用担体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、本質的には、組織工学用担体を製造するための水生動物起源のコラーゲンの使用、並びに、それにより得られる担体及び生体材料に関する。
【０００２】
コラーゲンは、細胞の成長に特に好ましい基質である。これは、このタンパク質が、生きた細胞を含有する再生組織を生産するために、いくつかの形態（すなわち、マトリックス、ゲル又はフィルム）で非常に広く使用されているからである。
【０００３】
すばらしい未来があることを期待させる技術である組織工学の分野では、コラーゲンは、特に人工皮膚又は人工軟骨の生産をもたらしている。満足できる結果を達成するためには、コラーゲンは、物理的若しくは化学的な架橋プロセスによって、又は、このタンパク質と強く相互作用する天然高分子を存在させることによって、又は、最終的に両方のシステムの組合せによって、細胞の代謝による酵素分解から保護されなければならない。
【０００４】
従来、このような組織工学への適用の場合、細胞を受容するために担体で使用されているコラーゲンは、哺乳動物から、最も頻繁にはウシの皮膚から抽出されていた。抽出後に得られるタンパク質の良好な機械的性質、酵素分解に対するその抵抗性、そして最後に、ヒトコラーゲンのアミノ酸組成と非常に類似しているそのアミノ酸組成によってこの供給源は選択されていた。これらのすべての理由から、このコラーゲンがヒト細胞の培養に適した唯一のものであると考えることは妥当であった。
【０００５】
Ｆａｃｅｂ  Ｊｏｕｒｎａｌ（第１４巻第４号、２０００年３月１５日）におけるＹｅｈらの論文（「組織工学用の新規な天然マトリックス：細胞−マトリックス相互作用の分析」）により、生体適合性を研究するために、ヒト皮膚のケラチノサイト及び繊維芽細胞とのその相互作用の研究にジンベイザメの無細胞コラーゲンのマトリックスの使用が誘起された。
【０００６】
ＤｅｒｗｅｎｔアブストラクトＸＰ００２１６１５９８は、培養材料として魚類由来のコラーゲンを使用する方法を記載する特願平０７−０７５５６６（マリノフォーラム、１９９５年３月２０日公開）を参照している。
しかし、この培養は魚類細胞を取り扱っている。
【０００７】
欧州特許ＥＰ−０７５３３１３  Ａ１には、海洋生物を使用して、軟体動物又はイカから抽出したキチンの層又はシートを含む積層体の皮膚代用物が記載されている。この場合、キチン溶液が冷凍乾燥（凍結乾燥）されたとき、不溶性の非生分解性海綿状体を構成するキチン構造体が得られることから、キチンの使用は不可欠である。これは、キチンが、ヒト皮膚に存在する酵素によって分解されないからである。魚類皮膚のコラーゲンゲルはキチンの層又はシートの上に注ぐことができ、そして両者は約１週間にわたって冷蔵庫において乾燥される。実際、このコラーゲン層は緻密であり、多孔性ではない。このコラーゲン層には、生きた細胞を植え付けることができない。ここに記載した積層体は不活性な積層体であり、従って、下記の本発明とは対照的に、生きた細胞を植え付けることができず、そしてこれらの細胞の生存性を保つことができないと予想される。
【０００８】
今回、本発明者らは、予想もしなかったことに、ヒト細胞が、魚類コラーゲン（好ましくは、架橋された魚類コラーゲン）からなるいくつかの担体の表面又はその内部で非常によく成長することに注目した。この海産コラーゲンは、好ましくは硬骨魚類の皮膚に由来し、より具体的には無着色の皮膚領域を有する魚類に由来し、より詳細にはカレイ目の魚類に由来し、特に、例えば、シタビラメ（ｓｏｌｅ）、マコガレイ（ｄａｂ）、ターボット（ｔｕｒｂｏｔ）、ブリル（ｂｒｉｌｌ）などのような産業的に漁獲されている魚類に由来する。それらの切り身（ｆｉｌｅｔ：フィレ）調製物は切り分けたものを含意する。より好ましいカレイ目の魚類は、無着食の腹側部分を容易に薄く切ることができるシタビラメである。
【０００９】
さらに、本発明者らは、このような生体材料で培養されたヒト細胞が正常な代謝を保持していることを明らかにすることができた。硬骨魚類の皮膚から抽出されたコラーゲンを用いて生きた細胞の保存及び増殖能を可能にする生体適合性と共に、さらにコラーゲンが架橋され、特筆すべきことに化学的に架橋されていることも、当業者には特に自明ではなかった。これは、一般に、コラーゲンを架橋することにより、架橋されたコラーゲンは、生きた細胞に対して、特にヒトの生きた細胞に対して、生体適合性を有しなくなり、毒性を有するからである。
【００１０】
これらの生体材料は、フィルム、又は圧縮された海綿状体、又は多孔性マトリックスのいずれにもすることができる。これらは、下記に示される実施例においてその調製方法と一緒に記載される。
【００１１】
本発明の１つの目的は、新規な生体材料を形成させるために好適な組織工学用の新規な担体、すなわち、上記担体で培養される正常な生きた細胞又は遺伝子操作されている生きた細胞又は悪性の生きた細胞の良好な増殖、及び、インビトロ又はインビボでのその後の増殖のために上記生きた細胞を含有するこれらの新規な生体材料の枠内で使用されるべき上記細胞類の良好な増殖を可能にするために好適な、組織工学用の新規な担体を提供することにある、新しい技術的問題を解決することである。
【００１２】
本発明のさらなる目的は、製造コストが低く、そしてまた汚染の危険性が低い組織工学用の新規な担体を提供すること、従って、新規な生体材料を提供するために特に好適なそのような担体を生産することにある、新しい技術的問題を解決することである。
【００１３】
本発明のさらなる主要な目的は、正常な生きた細胞又は遺伝子操作されている生きた細胞又は悪性の生きた細胞のインビトロ又はインビボでの増殖を可能にするために特に好適な組織工学用の新規な担体を提供することにある新しい技術的問題を解決することである。この場合、その構造は、哺乳動物、特に動物又は好ましくはヒトにおけるインビボでの使用に関して十分な適合性を有しているが、一方で同時に、動物又は好ましくはヒトなどの上記哺乳動物の組織の構造と異なり、その結果、上記動物（好ましくはヒト）の新しく合成された組織と古い組織との間のその後の識別が可能になっている。
【００１４】
本発明は、低コストで、汚染の危険性が低く又は汚染を伴うことなく、同時に、新しく合成された組織を同定することを容易に可能にするという、これらの技術的問題のすべてを満足できる様式で初めて解決する。このことは、当業者には特に自明ではなく、かつ予想できることでもない。
【００１５】
従って、第１の特徴によれば、本発明は、組織工学用担体を製造するための水生動物起源のコラーゲンの使用に関する。
【００１６】
「水生動物起源のコラーゲン」という表現は、水生動物起源の生物のコラーゲン含有組織に由来するコラーゲンを意味するとして理解される。このような生物は当業者には十分公知であり、これらには、限定されるわけではないが、例えば、水生哺乳動物（特に海洋哺乳動物）、クラゲ及び海水又は淡水の魚類が含まれる。当業者にとってはさらに、これらの生物の皮膚が本質的にコラーゲンを含有することは公知である。好ましくは、「水生動物起源のコラーゲン」は、硬骨魚科の魚類から、より具体的には、無着色の領域を有する魚類から、より具体的にはカレイ目の魚類から、特に上記に示した魚類から抽出される。最も好ましいカレイ目の魚類はシタビラメである。
【００１７】
１つの好適な実施形態において、コラーゲンは、魚類の皮膚から、好ましくはその天然体で得られる。
【００１８】
本発明の別の好適な実施形態において、コラーゲンの機械的強度又は酵素分解に対するコラーゲンの抵抗性が、化学的及び／又は物理的な架橋、又は、コラーゲンと強く相互作用する天然高分子の付加、又は、両方のプロセスの組合せのいずれかによって増大する。
【００１９】
本発明のさらに別の好適な実施形態において、コラーゲンは、凍結乾燥工程を好ましくは受けたコラーゲンゲルから調製される多孔性マトリックスの形で使用される。
【００２０】
さらに別の好適な変形形態において、上記の多孔性マトリックスは、物理的方法によって、好ましくは熱脱水又はＴＤＨによって架橋される。
【００２１】
さらに別の好適な変形形態において、上記の多孔性マトリックスは、化学的方法によって、好ましくは、ジフェニルホスホリルアジド若しくはＤＰＰＡを用いた化学的方法によって、又は、カルボジイミド及び／又はＮ−ヒドロキシスクシンイミドを用いた化学的方法によって、又は、グルタルアルデヒドを用いた化学的方法によって架橋される。
【００２２】
ある好適な実施形態において、上記のコラーゲンは、キトサン及び必要に応じて少なくとも１つのグリコサミノグリカン（好ましくはコンドロイチン硫酸）と混合された海産コラーゲン（好ましくは天然型）から調製された多孔性マトリックスの形態を取ることできる。
【００２３】
本発明のさらに別の好適な実施形態において、上記のコラーゲンは、コラーゲンゲルから調製された多孔性マトリックスの形態を取ることでき、上記多孔性マトリックスは、少なくとも１つの面が（好ましくは空気中又はガス流体中で）コラーゲンゲルを乾燥することによって調製されたコラーゲンフィルム、又は、非常に大きく圧縮されたコラーゲン海綿状体のいずれかからなる本質的に目の詰まったコラーゲン膜で覆われる。
【００２４】
別の好適な変形形態において、非常に大きく圧縮されたコラーゲン海綿状体の上記の圧縮が、少なくとも約５０ｂａｒ（約５０×１０５パスカル（Ｐａ））の圧力で、好ましくは５０ｂａｒ（５０×１０５Ｐａ）〜２００ｂａｒ（２００×１０５Ｐａ）の間の圧力で行われる。この場合、この圧縮は、必要に応じて２０℃〜８０℃の温度で、好ましくは４０℃〜６０℃の温度で行われる。
【００２５】
本発明のさらに別の好適な特徴によれば、２つの層（すなわち、多孔性の層及び本質的に目の詰まった膜）の少なくとも１つは、特に若年の個体又は中高年の個体に由来する、正常な生きた細胞又は遺伝子操作されている生きた細胞又は悪性の生きた細胞を含む。
【００２６】
１つの好適な実施形態において、生きた細胞は、繊維芽細胞、ケラチノサイト、メラノサイト、血液に由来するランゲルハンス細胞、血液に由来する内皮細胞、血液細胞（特に、マクロファージ又はリンパ球）、脂肪細胞、皮脂細胞（ｓｅｂｏｃｙｔｅ）、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、及び、血液に由来するメルケル細胞からなる群から選択される。この場合、上記細胞は正常であるか、又は、遺伝子操作されているか、又は、悪性である。
【００２７】
１つの特に好適な実施形態において、多孔性の層は、正常又は遺伝子操作型又は悪性の繊維芽細胞を含有し、且つ、本質的には目の詰まった膜は、ケラチノサイト、メラノサイト、血液に由来するメルケル細胞、血液に由来するランゲルハンス細胞、皮脂細胞、血液に由来する細胞、及び、神経細胞から特に選択される正常又は遺伝子操作型又は悪性の生きた細胞を含有する。
【００２８】
本発明のさらに別の好適な実施形態により、本発明は、若年の個体から採取された細胞を使用する「若い」再生皮膚、又は中高年の個体から採取された細胞から得られる「老化している」再生皮膚のいずれかを調製するために特に有益であると考えられる。これらのモデルにより、皮膚の老化プロセスの我々の知識を改善させ、かつ、このプロセスに対する活性な薬剤の影響を研究することが可能になる。
【００２９】
別の特に好適な実施形態において、上記の本質的に目の詰まった膜は、コラーゲン海綿状体を含むことが好ましい多孔性の層との組合せに先立って、具体的には、膜を調製して、それをコラーゲンゲルの上に置き、その後、全体を凍結及び凍結乾燥することによって調製される。
【００３０】
第２の特徴によれば、本発明はまた、上記に規定されるような水生動物起源のコラーゲン又はその全体を通して理解され、且つ、その一般性において本発明の不可欠な部分を形成する実施例を含む下記の説明から得られるような水生動物起源のコラーゲンを含む組織工学用の担体を包含する。従って、この特徴は、いずれかの技術と比較することにより新規性があると考えられるあらゆる特徴に関して、実施例の内容にかかわらず、その機能及びその一般性が理解される。
【００３１】
第３の特徴によれば、本発明はまた、生体材料、例えば再生結合組織又は再生皮膚の形をとる生体材料を包含する。このような生体材料は、上記の第２の特徴の担体に関して、特徴のすべてが上記に規定され、さらにまた下記の説明から得られるような水生動物起源のコラーゲンから調製されている。
【００３２】
本説明及び請求項の枠内において、「組織工学用の担体」という表現は、正常な生きた細胞又は遺伝子操作されている生きた細胞又は悪性の生きた細胞の培養及び増殖を、それがインビトロであってもインビボであっても行なうために使用される担体を意味する。この増殖は、動物及び好ましくはヒトを含む哺乳動物にインビボで適用されることが好ましい。本発明は、（例えば、再生結合組織又は再生皮膚の形をとる）生体材料を製造するための組織工学の枠内において、特に好ましい用途を有することが理解される。この枠内において、最初の工程は、一般には、上記生きた細胞を有する担体をインビトロで培養して、（例えば、再生結合組織又は再生皮膚の形をとる）生体材料を得ることであり、そして、次に二番目の工程は、損傷したか、若しくは、手術によって除去された結合組織を再生するために、又は、同様に皮膚を再生して、医学的理由が何であれ、損傷したか、又は手術によって除去された領域を再置換するために、哺乳動物において、例えば、動物又は好ましくはヒトにおいて、この生体材料を、再生結合組織又は再生皮膚としてインビボで使用することであろう。
【００３３】
好適なことに、このような組織工学用担体、又は、好ましくは（例えば再生結合組織又は再生皮膚の形をとる）生体材料は、具体的には、組織の老化プロセス及び特に皮膚の老化プロセスを研究するために、並びに、必要な場合には、このプロセスにおける活性な成分又は主成分の効力を試験するために、実質的に若年の個体のみから得られる細胞又は実質的に中高年の個体のみから得られる細胞のいずれかを含む。
【００３４】
従って、本発明は、特に簡便な方法で、低コストで、汚染の危険性が低く、そして水生動物コラーゲンと、インビボでの使用の過程で新しく合成された哺乳動物コラーゲン又は好ましくはヒトコラーゲンとを識別できる、上記の新しい技術的課題に対する一般的な解決策を提供していることが理解される。
【００３５】
実際、生きている人工組織を製造する際の魚類コラーゲンの使用は、哺乳動物源と比較して、３つの本質的な利点を有している。
・原材料として一般に使用される魚類皮膚は、非常に清浄な条件のもとで豊富に得ることができる。
・感染性汚染の危険が非常に低い。特に、プリオンタイプの伝染性病原体の危険性が全く知られてない。
・最後に、魚類コラーゲンのアミノ酸組成はヒトコラーゲンのアミノ酸組成とは比較的似ていないので、この２つのタンパク質は、特異的な抗体によって比較的容易に識別することができる。この方法論は、特に「インビトロ」試験又は「インビボ」治癒研究において非常に有益であろう。
【００３６】
さらに、海産コラーゲンを使用すれば、免疫標識が非常に効果的に行なえ、そして海産コラーゲンと新しく合成されたコラーゲンとの識別が可能になるであろう。
【００３７】
魚類コラーゲンは、プロテアーゼによる酵素分解からそれ自体を保護し、かつその機械的性質に主に関わる天然構造を有している。従って、抽出操作及び精製工程のときに使用される処理によってタンパク質構造ができる限り分解されないことは非常に重要であろう。これは、らせん構造並びに分子間及び分子内の架橋ができる限り保持されなければならないことを意味している。本発明者らは、より詳細には、１９９４年７月１９日に付与された米国特許第５３３１０９２号に記載される方法を実施することによってこれを達成した。それにもかかわらず、特定の適用のためには、部分的に架橋が開裂したコラーゲン、例えば、アテロコラーゲン（すなわち、そのテロペプチドの部分を失っているコラーゲン）の使用を想定することは可能であろう。
【００３８】
その場合、組織工学の適用例の大部分にとっては、コラーゲンの機械的性質が高められ、そして酵素消化に対する抵抗性が、化学的及び／又は物理的な架橋技術によって、又は、このタンパク質と強く相互作用する天然高分子の付加によって、又は、最終的には両方のプロセスの組合せによって、そのいずれでも大きくなるであろう。
【００３９】
魚類コラーゲンの保護は、その天然の安定性が哺乳動物コラーゲンの安定性よりも低いためにますます重要である。魚類コラーゲンの天然の安定性が低いという特徴は、ヒドロキシプロリン含有量がより低いことによるものである。
【００４０】
上記に記載の生体材料には、「インビトロ」試験の分野又は損傷組織を修復するための薬学的分野のいずれでも使用され得る生きた人工組織を作製するために、生きた細胞を植え付けることができる。
【００４１】
本発明の他の目的、特徴及び利点は、組織工学用担体の製造のための本発明の枠内並びに担体及び生体材料を構成する本発明の枠内で使用することができる水生動物起源のコラーゲンの様々な形態を調製する実施例を参照にしてなされた、下記の説明のための記載から明瞭に明らかになるであろう。この場合、実施例は、例示として単に示されているだけであり、従って本発明の範囲を決して限定するものではない。
【００４２】
実施例では、別途示されない限り、温度は℃の単位で示され、圧力は大気圧であり、百分率は重量％で示される。
【００４３】
実施例１〜１３は、当然のことではあるが、本発明による組織工学用担体として使用され得るコラーゲンを調製する実施例である。
【００４４】
実施例１４〜１６は、注目すべきことには、組織工学用担体の製造する観点から実施例１〜１３のうちの中でいくつかで調製された形態の本発明の水生動物起源のコラーゲンを使用するという観点からの比較試験である。
【００４５】
実施例１
水生動物の天然コラーゲンからなる多孔性マトリックスの調製
【００４６】
このコラーゲンは、１９９４年７月１９日に付与された米国特許第５３３１０９２号の技術によって得られる。
【００４７】
Ａ．水生動物の天然コラーゲンの調製
コラーゲンゲルをシタビラメの腹側皮膚から調製する。皮膚を磨砕して、次いで下記の組成：０．７８ｇ／ｌのリン酸二水素カリウム及び２１．７ｇ／ｌのリン酸一水素二ナトリウムを有するリン酸緩衝液（ｐＨ７．８）で洗浄する。洗浄は、磨砕した材料１ｋｇあたり５ｌの緩衝液の割合で、撹拌しながら１時間行われる。その後、磨砕した材料１ｋｇあたり５ｌの水の割合で、軟水を用いて２回連続して洗浄を行い、その後引き続いて４０００ｒｐｍで連続遠心分離（Ｒｏｕｓｓｅｌｅｔ遠心分離）を行なってリン酸緩衝液を除去する。その後、０．２５Ｍの酢酸溶液を用いて、１０ｌの溶液に対して磨砕した材料１ｋｇの割合で、磨砕した材料を酸性化する。その後、ゲルを４０００ｒｐｍで５分間遠心分離する。使用されるゲルは、コラーゲン濃度が０．５％〜２％の間にある得られた上清からなる。
【００４８】
Ｂ．上記で得られたコラーゲンゲルからの多孔性マトリックスの調製
このゲルを凍結乾燥皿に２０ｇ／ｃｍ２の割合で注ぐ。その後、ゲルは、−３０℃で凍結し、そして＋３２℃で加熱した後、凍結乾燥される。総凍結乾燥時間は４００マイクロバールの圧力で１６時間である。その後、得られたマトリックスを加熱脱水（ＴＤＨ）によって架橋する。加熱脱水は、４００マイクロバールの真空度で１６時間にわたって１１０℃のオーブンで加熱することからなる。
【００４９】
実施例２
欧州特許第４６６８２９号（１９９６年７月２４日）に記載される技術によってジフェニルホスホリルアジド（ＤＰＰＡ）で架橋された多孔性マトリックスの調製
実施例１のコラーゲンマトリックスを、１００ｍｌのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に５μｌ〜２５０μｌのＤＰＰＡ／ｇコラーゲンを含有する溶液中で２４時間インキュベーションする。その後、コラーゲンを１００ｍｌのＤＭＦで洗浄して、ＤＰＰＡを除く。次いで、ＤＭＦを、ｐＨ８．９のホウ酸塩緩衝液溶液（０．０４Ｍ四ホウ酸ナトリウム、０．０４Ｍホウ酸）の１００ｍｌで洗浄することによって除去する。
最後に、コラーゲンを同じホウ酸緩衝液中で一晩インキュベーションし、その後、６時間にわたって軟水で連続的に洗浄することによってホウ酸緩衝液を除去する。
【００５０】
実施例３
カルボジイミド及びＮ−ヒドロキシスクシンイミドで架橋された多孔性マトリックスの調製
実施例１の水生動物コラーゲンマトリックスを、ＥＤＣ（エチルジメチルアミノプロピルカルボジイミド）をコラーゲン１ｇあたり０．２３ｇ〜０．６９ｇの濃度で、そしてＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）を０．４２ｇ／ｇコラーゲンの濃度で架橋する。
軟水で洗浄した後、コラーゲンを再び凍結乾燥する。
【００５１】
実施例４
グルタルアルデヒドで架橋された多孔性マトリックスの調製
実施例１の水生動物コラーゲンの多孔性マトリックスを、０．６％〜１％のＧＴＡを含有する溶液中で、２０℃で２４時間〜９６時間にわたって架橋する。
軟水で洗浄した後、コラーゲンを再び凍結乾燥する。
【００５２】
実施例５
欧州特許第２９６０７８号（１９９１年５月２９日）に記載されるような、キトサン及びグリコサミノグリカンと組み合わせて実施例１の水生動物天然コラーゲンを用いて調製される多孔性マトリックス
３５６ｍｌの水に２．５ｇのキトサンを含む溶液及び１．９ｍｌの酢酸、次いで４００ｍｌの軟水に１ｇのコンドロイチン４−硫酸を含む溶液を６００ｇの１．５％コラーゲンゲルに加える。続いて、約４．０のｐＨを有するこの混合物を撹拌して、凍結乾燥する。得られた海綿状体をＴＤＨによって架橋する。
【００５３】
実施例６
コラーゲンフィルムで被覆された実施例１に記載される多孔性マトリックス
Ａ．フィルムの調製
固体含有量が０．３％〜０．８％であるコラーゲンゲルを３０℃のオーブンで乾燥するか、又は０．５ｇゲル／ｃｍ２皿の割合でフード下で乾燥する。１０％〜４０％のグリセロールをコラーゲンゲルに添加することができる。
これらの条件のもとで乾燥したコラーゲンを透明なフィルムにする。
【００５４】
Ｂ．フィルムと上記に記載される多孔性マトリックスとの結合
固体含有量が０．５％〜２％である水生動物の天然コラーゲンゲルを凍結乾燥皿に０．５ｇ／ｃｍ２の割合で置き、その後、コラーゲンフィルムをこのゲルの上に置き、全体を凍結乾燥する。
得られた凍結乾燥物をＴＤＨによって架橋する。
【００５５】
実施例７
酸可溶性コラーゲンゲルを用いて調製され、コラーゲンフィルムで被覆された多孔性マトリックス
方法は、実施例６に示される方法であるが、唯一の違いは、フィルムに注がれたゲルの性質にある。このゲルは、当業者に十分に公知の技術によって調製される酸可溶性コラーゲンからなる。
【００５６】
実施例８
アテロコラーゲンゲルを用いて調製され、コラーゲンフィルムで被覆された多孔性マトリックス
方法は、実施例６に示される方法であるが、唯一の違いは、フィルムに注がれたゲルの性質にある。このゲルは、当業者に十分に知られている技術によって調製されるアテロコラーゲン（すなわち、テロペプチド非含有コラーゲン）からなる。
【００５７】
実施例９
キトサン及びグリコサミノグリカンと組み合わせたコラーゲンからなり、コラーゲンフィルムで被覆された多孔性マトリックス
方法は、この場合には、コラーゲンフィルムに注がれたゲルが、コラーゲン、キトサン及びグリコサミノグリカンからなることを除いて、実施例６に示される方法である。このゲルの調製は実施例５に記載される。
【００５８】
実施例１０
上記の多孔性マトリックスはすべて、コラーゲンフィルムで被覆されており、実施例２、３及び４に記載される技術によって架橋することができる。
【００５９】
実施例１１
圧縮されたコラーゲン海綿状体で被覆された、実施例１に記載したコラーゲンのみの多孔性マトリックス
Ａ．圧縮された海綿状体の調製
固体含有量が０．３％〜１．５％である、実施例１のように調製されたコラーゲンゲルを凍結乾燥して、重量が０．５ｇ／ｃｍ２〜２ｇ／ｃｍ２である海綿状体を得る。
この凍結乾燥物を２０℃〜６０℃の温度及び５０ｂａｒ〜２００ｂａｒ（５０〜２００×１０５Ｐａ）の圧力で５秒間〜６０秒間圧縮する。
【００６０】
Ｂ．圧縮された海綿状体と多孔性マトリックスとの結合
実施例１に記載されるコラーゲンゲルを凍結乾燥皿に０．５ｇ／ｃｍ２の割合で置く。次いで、圧縮された海綿状体をこのゲルの上に置き、全体を凍結乾燥して、圧縮されたコラーゲン海綿状体で被覆された多孔性コラーゲン海綿状体を得る。全体を、実施例１に記載されるようにＴＤＨによって架橋する。
【００６１】
実施例１２
実施例５に記載するように、コラーゲン、キトサン及びグリコサミノグリカンからなり、圧縮された海綿状体で被覆された多孔性マトリックス
実施例５のプロセスによって調製された、コラーゲン、キトサン及びグリコサミノグリカンからなるゲルを凍結乾燥皿に０．５ｇ／ｃｍ２の割合で置き、次いで、圧縮された海綿状体をこのゲルの上に置き、全体を凍結乾燥する。その後、凍結乾燥物を、実施例１に記載されるようにＴＤＨによって架橋する。
【００６２】
実施例１３
上記の多孔性マトリックスはすべて、圧縮されたコラーゲン海綿状体で被覆されており、実施例２、３及び４に記載される技術によって架橋することができる。
【００６３】
実施例１４〜１６：ウシ及び水生動物のコラーゲンマトリックスの細胞代謝を比較するための試験
【００６４】
実施例１４：繊維芽細胞の細胞生存性に対する試験
Ｉ−真皮等価物の調製
この比較試験のために、実施例２に従ってＤＰＰＡ架橋された水生動物多孔性マトリックスが最初に調製される。
【００６５】
比較として、ウシマトリックスと呼ばれる比較用の多孔性マトリックスが、これもまたＤＰＰＡで架橋されるが、実施例２の条件と同じ条件のもとでウシ起源のコラーゲンを用いて調製される。
【００６６】
若年ドナープールから採取され、７代目の継代で使用される正常なヒト繊維芽細胞を、増殖及びタンパク質合成の研究の場合には２５０，０００細胞／ｃｍ２の割合で、そして組織化学的研究を目的とする水生動物及びウシのマトリックスの場合には３００，０００細胞／ｃｍ２の割合で、水生動物及びウシのマトリックスのそれぞれに播種する。
【００６７】
これらの水生動物マトリックス及びウシマトリックスは、１０％のウシ胎児血清、１００ＩＵ／ｍｌのペニシリン、２５μｇ／ｍｌのゲンタマイシン、１μｇ／ｍｌのアンホテリシンＢ及び５０μｇ／ｍｌのビタミンＣが補充された、５０／５０（ｖ／ｖ）の比のＤＭＥＭ／ＨＡＭ  Ｆ１２からなる培地で培養される。
この培養は１ヶ月間行われ、培養培地が１週間に３回交換される。
【００６８】
ＩＩ−行われた分析
１）ＭＴＴとの反応による細胞生存性の測定
１重量％のＭＴＴ（すなわち、３−（４−ジメチルチアゾル−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド）を培養培地に加える。
インキュベーションを３７℃で２．５時間行なう。
このインキュベーション期間の後、変換生成物（ホルマザンブルー）をＤＭＳＯに可溶化して、その光学密度を５５０ｎｍにおいて読み取る。
得られた光学密度は、明黄色のテトラゾリウム塩、ＭＴＴをホルマザンの青色結晶に変換することができるコハク酸デヒドロゲナーゼの活性に比例している。
細胞生存性が、培養の１日後、５日後、７日後及び２２日後並びに１ヶ月後に測定された。
平均値を求めるために、６つのサンプルがそれぞれのマトリックスについて調製された。
【００６９】
【表１】
0003747412.tif 000002
【００７０】
これらの結果はまた、添付の図１の曲線のために使用される。
ひし形の点の曲線が水生動物マトリックスで得られた曲線であり、四角の点の曲線がウシマトリックスで得られた曲線であることが認められる。
【００７１】
これらの結果は、全く驚くべきことに、水生動物マトリックスが、正常なヒト繊維芽細胞の生存だけでなく、これらの正常なヒト繊維芽細胞の増殖をも可能にしている担体を構成し、その一方で同時に、最初の３週間の間、はるかにより良好な培養担体を構成していることを示している。
従って、驚くべきことに、水生動物コラーゲンは、組織工学用担体を製造するために、特に、生きた細胞、特に、そして好ましくはヒトの生きた細胞を含有する生体材料を形成させるためのインビトロでの適用に、そしてとりわけインビボでの適用さえも特に好適であると、これらの試験から結論することができる。
【００７２】
２）タンパク質合成の測定
ウシ胎児血清を含まない培養培地に３日間わたって分泌されたタンパク質の合成を、真皮等価物の調製において上記に報告された条件のもとで１ヶ月の培養を行った後で得られるような真皮等価物の成熟化の１ヶ月後に評価した。
分析をＰｉｅｒｃｅのミクロＢＣＡ法により行なう。
細胞密度が、上記の条件下でのＭＴＴ試験で同時に評価された。
相対タンパク質含有量は、光学密度又はＯＤとして表される細胞密度の１ユニットあたりのタンパク質含有量に対応するので、問題としている細胞濃度は等しい。得られた結果を下記の表ＩＩに示す。
【００７３】
【表２】
0003747412.tif 000003
【００７４】
表Ｉのように、平均値は６つのサンプルに基づく。
【００７５】
３）組織化学
水生動物及びウシのコラーゲンマトリックスの２１日間の培養の後に得られた真皮等価物を２％パラホルムアルデヒド溶液で固定し、その後、四酸化オスミウム溶液で後固定し、脱水して、Ｅｐｏｎに封入し、切片化して、ＣＭＥＡＧＢ（Ｌｙｏｎ、フランス）において透過電子顕微鏡検査（Ｊｅｏｌ１２００）によって観察した。
【００７６】
結論
これらの結果は、マトリックスが水生動物又はウシであるかにかかわらず、三次元マトリックスの非常に良好なコロニー形成を示している。３週間の培養後、細胞密度は両タイプのマトリックスにおいて等しい。しかし、水生動物マトリックスは、第１週の培養における増殖研究によって示されるように、実験の初期におけるより良好な細胞接着、従って、短い培養期間のより良好なコロニー形成を可能にしているようである。
【００７７】
タンパク質合成に関する限り、繊維芽細胞の合成能力（相対タンパク質含有量）もまた１ヶ月の培養後において等しい。
【００７８】
これらの結果は、開発された水生動物コラーゲンマトリックスが、良好な性質を有する真皮等価物の調製を可能にしたことを示しており、そしてこれらのマトリックスを用いて得られる結果は、ウシのコラーゲンマトリックスを用いて得られた結果と匹敵し得る。
【００７９】
透過電子顕微鏡検査では、繊維芽細胞をウシ起源及び水生動物起源のマトリックスにおいて認めることができる。両タイプのマトリックスにおいて、多量の新しく合成された細胞外マトリックスの存在が認められる。新しく合成された細胞外マトリックスは、最初の海綿状体の三次元マトリックスを形成するコラーゲンクラスターと比較して、堆積したコラーゲン繊維の周期的な細い縞によって区別することができる。
【００８０】
実施例１５
細胞生存性に対する水生動物コラーゲンマトリックスの異なるタイプの架橋の影響
下記の試験が、細胞生存性に対する水生動物コラーゲンマトリックスの異なるタイプの架橋の影響を調べるために行われる。
【００８１】
Ｉ）真皮等価物の調製
ａ）使用される担体又はマトリックス
様々なコラーゲン担体又はマトリックスが、下記のように、多孔性の層又はマトリックスを製造するためのコラーゲンゲルにおいて異なる割合のコラーゲンを使用して、そして必要な場合には異なる架橋剤を使用して調製される。
【００８２】
１）試験１
この試験のために、多孔性海綿状体の形をとる多孔性マトリックスが、１．３重量％の水生動物コラーゲンから調製された水生動物コラーゲンゲルから製造される。これは、−８０℃で凍結され、実施例２による標準的な凍結乾燥に供され、その後、乾燥状態の海綿状体１ｇあたり２５０μｌの割合でＤＰＰＡを用いて架橋される。
【００８３】
２）試験２
この試験に、水生動物性海綿状体の形をとる多孔性マトリックスが、０．７重量％の水生動物コラーゲンを含む水生動物コラーゲンゲルから調製される。これは、試験１のように、−８０℃で凍結され、その後、標準的な凍結乾燥に供され、乾燥海綿状体１ｇあたり２５０μｌの割合でＤＰＰＡを用いて架橋される。
【００８４】
３）試験３
この試験について、手順は、架橋が、乾燥海綿状体１ｇあたり０．４６ｇの割合で実施例３に従ってＥＤＣを用いて行われることを除いて、試験１の通りである。
【００８５】
４）試験４
１．１重量％の水生動物コラーゲンを含む水生動物コラーゲンゲルから得られる水生動物コラーゲンの海綿状体を含む多孔性担体が調製される。これは、試験２のように、−８０℃で凍結され、その後、標準的な凍結乾燥に供され、乾燥海綿状体１ｇあたり２５０μｌの割合でＤＰＰＡを用いて架橋されるが、その違いは、水生動物コラーゲンの割合が１．１重量％であることにある。
【００８６】
これらの試験のすべてにおいて、水生動物コラーゲンは、実施例２のようにシタビラメの腹側皮膚に由来する。
【００８７】
ｂ）これらのマトリックスにおける繊維芽細胞の培養
正常なヒト繊維芽細胞が実施例１４のように使用されるが、繊維芽細胞は８代目の継代から採取される。
播種が２７５，０００細胞／ｃｍ２の割合で行われる。
培養培地は、１０重量％のウシ胎児血清、１００ＩＵ／ｍｌのペニシリン、２５μｇ／ｍｌのゲンタマイシン、１μｇ／ｍｌのアンホテリシンＢ及び５０μｇ／ｍｌのビタミンＣが補充された５０／５０（ｖ／ｖ）のＤＭＥＭ／ＨＡＭ  Ｆ１２からなる。
培養は１ヶ月間行われ、培地が１週間に３回交換される。
４つのマトリックスが、試験のそれぞれのタイプについて平均値が得られ、平均標準偏差が評価されるように、それぞれの試験について使用される。
【００８８】
ＩＩ）行われた分析
アラマーブルー（レドックスマーカー）との反応による細胞生存性の測定
培養培地から採取されるサンプルについて細胞生存性を測定することが所望されるときには、アラマーブルーが、使用された培養培地の２重量％の割合で添加される。
３７℃で２時間２０分にわたってインキュベーションした後、蛍光を、５３０ｎｍでの励起光及び５９０ｎｍでの放出光に基づいて読み取る。
得られる蛍光強度は細胞の代謝活性に比例している。
細胞生存性が、培養の１日後、４日後、６日後、１１日後及び１７日後に１０個のサンプルについて測定される。
結果は下記の表ＩＩＩに表される。
結果は、時間の関数として蛍光の国際単位（ＩＵ）で示されている。
【００８９】
【表３】
0003747412.tif 000004
【００９０】
表３の結果もまた、添付の図２のために使用される。
結果は、真皮等価物における繊維芽細胞の増殖曲線を示している。
黒ひし形の点を伴う曲線は試験１に対応し、黒四角の点を伴う曲線は試験２に対応し、三角の点を伴う曲線は試験３に対応し、十字の点を伴う曲線は試験４に対応する。
時間が横軸に日数で表され、蛍光が、１５，０００から始まり、１０，０００単位で５５，０００まで増大するスケールを用いてＩＵで表されている。
結果から、下記の結論を引き出すことができる。
【００９１】
結論
結果は、調製された種々のマトリックスが、１７日の培養後において繊維芽細胞の良好な増殖を可能にし得ることを示している。水生動物コラーゲンマトリックスの調製に関係なく、繊維芽細胞は、それらの三次元担体に良好に接着し、非常に迅速に分裂して、マトリックスにおいてコロニー形成する。
【００９２】
増殖プロフィールはマトリックスのタイプ毎に非常にわずかに変化しているが、繊維芽細胞の密度は、調製方法にかかわらず、１７日の培養後において匹敵し得る。
【００９３】
ＤＰＰＡ又はＥＤＣのいずれかを用いて行われた種々のタイプの架橋は細胞の再生に影響を及ぼしていないようである。実際には３週間の培養後において、マトリックスの安定性は優れており、ほとんど消化されず、そしてほとんど収縮していない。
【００９４】
実施例１６
新しく合成されたヒトコラーゲンの同定及びアッセイについて水生動物コラーゲンの利点を明らかにする試験
この試験は、組織化学が免疫標識とともに行われることを除いて、実施例１４の試験に類似している。
試験は下記のように行われる。
【００９５】
１）真皮等価物の調製
これらは実施例１４の真皮等価物であり、培養が実施例１４の条件のもとで行われる。
従って、この培養は、実施例１４に示されるように、正常なヒト繊維芽細胞が３００，０００細胞／ｃｍ２の割合で播種され、培地を１週間に３回交換しながら３週間にわたって行われる。
【００９６】
２）組織化学
ａ）従来的な組織化学
固定が、４重量％の濃度のパラホルムアルデヒドを用いて行われ、その後、材料は脱水され、パラフィンに封入される。
この後、７μｍの切片が調製され、そしてパラフィンの除去及び再水和の後にマロリー・ハイデンハイン染色が行われる。
ｂ）免疫標識
固定が、４重量％のパラホルムアルデヒドを用いて再び行われ、材料はＴｉｓｓｕｅ  Ｔｅｋ  ＯＣＴコンパウンド、すなわち、Ｍｉｌｅｓ（Ｅｌｋｈａｒｔ、Ｉｎｄｉａｎａ、米国）により供給される封入液に封入され、７μｍの切片が低温で調製される。
免疫標識は下記を用いて行われる：
ｉ．一次のウサギ抗ヒトＩ型コラーゲン抗体（希釈、１／４０）及び
ｉｉ．二次のＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアナート）結合抗ウサギ抗体（希釈、１／１６０）。
ＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドールジラクテート）が対比染色として使用される。
【００９７】
３）結果
水生動物マトリックス及びウシマトリックスからなる担体は、繊維芽細胞が接着する多少なりとも詰まっていない細孔を形成していることが見出される。
より大きい割合の繊維芽細胞が表面に認められ、再生皮膚を製造するために真皮等価体を覆う好適な被覆を形成している。繊維芽細胞の分布は水生動物の海綿状体及びウシの海綿状体において均質である。
免疫標識では、ウシコラーゲンから形成されたマトリックスが抗ヒトＩ型コラーゲン抗体によって標識されることが見出される（交差）。
一方、水生動物起源のマトリックスは抗ヒトコラーゲン抗体によって非常に弱く標識されるだけである。
従って、水生動物コラーゲンから構成される海綿状体は、新しく合成された細胞外マトリックスの同定には好都合である。
これらの結果は、下記の表ＩＶ又はＨａｒｔｍａｎｎの表に示される免疫標識後の光学密度測定値によって決定される、種々の抗体に対する種々の抗原の反応に関するＨａｒｔｍａｎｎ教授の研究によって説明される。
【００９８】
【表４】
0003747412.tif 000005
【００９９】
結果は、ＯＤ×１０３（λ＝４５０ｎｍにおける光学密度）で表されている。
記号：２０１１１（２２５）：抗ヒトＩ型コラーゲン
５０１２１（０３）：抗ウシＩ型コラーゲン
５０１７１（０１）：抗魚類（シタビラメ）Ｉ型コラーゲン
【０１００】
この表の結果は、免疫標識における抗体（抗ヒトＩ型コラーゲン、抗ウシＩ型コラーゲン、抗シタビラメＩ型コラーゲン）にかかわらず、ヒトコラーゲンとシタビラメコラーゲンとの差が、ヒトコラーゲンとウシコラーゲンとの差よりも大きいことを示している。従って、魚類コラーゲンマトリックスでは、ヒト繊維芽細胞によって合成されたコラーゲンをはるかに容易に同定することができる。このことは、魚類コラーゲンマトリックス中で合成されたコラーゲンを抗ヒトＩ型コラーゲン抗体で免疫標識することによって得られた上記の結果を確かなものにしており、従って、本発明の特に予想外で、好適な結果を構成している。
【図面の簡単な説明】
【図１】  真皮等価物における正常なヒト繊維芽細胞の増殖を示す。日数で表される時間が横軸にプロットされ、そして光学密度×１０００が縦軸にプロットされ、１００単位ごとに目盛りを付してある。ひし形の点を伴う曲線は、使用された担体が水生動物コラーゲン（この場合には魚類コラーゲン）の多孔性マトリックスであるときに得られた曲線である。四角の点を伴う曲線は、ウシコラーゲンで得られた曲線である。
【図２】  真皮等価物における正常なヒト繊維芽細胞の増殖に対する類似の曲線を示す。日数で表される時間が横軸にプロットされ、国際単位（ＩＵ）で表される蛍光が縦軸にプロットされ、１５，０００から始まり、１０，０００単位ごとに目盛りを付してある。黒ひし形の点を伴う曲線は、試験１で得られた蛍光を表し、四角の点を伴う曲線は、試験２で得られた曲線を表し、白三角の点を伴う曲線は、試験３で得られた曲線を表し、そして最後に、十字の点を伴う曲線は、試験４で得られた曲線を表す。
【図１】
0003747412.tif 000006
【図２】
0003747412.tif 000007