(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のアミノ酸配列：
0003811733.tif 000002
からなるＤＮアーゼ活性を有する蛋白質または該アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が付加、置換または欠失したアミノ酸配列からなるＤＮアーゼ活性を有する蛋白質。
【請求項２】
請求項１記載の蛋白質をコードするＤＮＡ。
【請求項３】
該ＤＮＡが、
（ａ）以下のＤＮＡ：
0003811733.tif 000003
、または
（ｂ）ＤＮＡの融点の２０℃以下で（ａ）のＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡを含有してなる、請求項２記載のＤＮＡ。
【請求項４】
請求項２または３記載のＤＮＡを含有してなる発現プラスミド。
【請求項５】
請求項４記載の発現プラスミドを含む形質転換体。
【請求項６】
好適な条件下で請求項５記載の形質転換体を培養する工程を含む、請求項１記載の蛋白質の調製方法。
【請求項７】
請求項１記載の蛋白質に対する抗体。
【請求項８】
診断用試薬としての請求項１記載の蛋白質の使用。
【請求項９】
診断用試薬としての請求項２または３記載のＤＮＡの使用。
【請求項１０】
診断用試薬としての請求項９記載の抗体の使用。
【発明の詳細な説明】
本発明は、ＤＮアーゼ活性を有する蛋白質、該蛋白質をコードするＤＮＡおよびそれらの調製方法に関する。また、本発明は、該ＤＮＡおよび該蛋白質の使用ならびに該蛋白質に対する抗体に関する。
多くの細胞がプログラムされた細胞死を被ることは公知である。この細胞死は、アポトーシスと呼ばれている。例えば、器官形成及び変態、組織萎縮及び腫瘍退縮の場合にそれが見出される。アポトーシスは、細胞質の凝縮、原形質膜の絨毛の損失、核の分裂および特に染色体ＤＮＡの広範囲にわたる分解を伴う。後者は、詳細には６００ｋｂを超えるサイズ、５０〜３００ｋｂおよび５０ｋｂのサイズを有するＤＮＡ断片の「ラダー」が、アポトーシス細胞に存在するという点で明確になる。染色体ＤＮＡの分解にどのメカニズムが寄与するかということは、今日まで知られていない。しかしながら、このことは、任意にそのためにまたはそれに対して対策を講じることを可能にするために、アポトーシスのよりよい理解に必要である。
従って、本発明の目的は、アポトーシス細胞における染色体ＤＮＡの分解を研究することが可能な製品を提供することにある。
本発明によれば、このことは、請求の範囲に定義された主題を提供することにより達成される。
従って、本発明の主題は、図１のアミノ酸配列を含有するＤＮアーゼ活性を有する蛋白質またはその機能的誘導体またはその断片に関する。
「ＤＮアーゼ活性」という用語は、蛋白質が一本鎖および／または二本鎖ＤＮＡを切断する事実をいう。
「機能的誘導体または断片」という用語は、ＤＮアーゼ活性を有する図１のアミノ酸配列のいかなる誘導体または断片も含むものである。図１のアミノ酸配列は、その機能的誘導体またはその断片にも適用する１以上のアミノ酸の付加、置換および／または欠失も含んでよい。
本発明のさらなる主題は、前記蛋白質をコードする核酸に関する。これは、ＲＮＡまたはＤＮＡであってもよい。後者は、例えば、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡであってもよい。以下のものを含有するＤＮＡが好ましい：
（ａ）図１のＤＮＡもしくはその断片、
（ｂ）（ａ）のＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡ、または
（ｃ）縮重遺伝コードを介して（ａ）もしくは（ｂ）のＤＮＡと関連するＤＮＡ。
「ハイブリダイズするＤＮＡ」という用語は、通常の条件下、具体的にはＤＮＡの融点の２０℃以下の条件下で、（ａ）のＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡをいう。
図１のＤＮＡは、１９９５年５月２３日にＤＳＭ９９９３でＪＦＣ４として、ＤＳＭ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen；微生物および培養細胞のドイツタイプコレクション）に寄託された。
本発明のＤＮＡは、以下、ｃＤＮＡ型で記載する。それは、本発明に該当するすべてのＤＮＡに対する標本である。
本発明のｃＤＮＡの製造に関しては、例えば、クローンがヒトゲノムのＸｑ２７．３−Ｘｑｔｅｒ領域を含むｑ１Ｚ（Dietrich,A.ら、Nucleic Acids Res.19,(1991),2567-2572を参照）等のコスミドライブラリーを基礎として用いることが好ましい。かかるクローンをフィルター膜に固定して、脳、筋肉、肝臓等のブタ組織のｍＲＮＡから逆転写により得た標識ｃＤＮＡプールとハイブリダイズする(Coy,J.F.ら、Mammalian Genome 5,(1994)131-137を参照)。ｃＤＮＡプールとのハイブリダイゼーションシグナルを有するこれらのクローンを用いて、胎児脳組織等のヒトｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする。この目的のためには、具体的には、Stratagene社製のカタログ番号９３６２０６のｃＤＮＡライブラリーλ−Ｚａｐが適する。本発明のｃＤＮＡが得られる。
本発明のｃＤＮＡは、ベクターおよび発現ベクター中にそれぞれ存在することができる。当業者であれば、その実施例に精通している。大腸菌の発現ベクターの場合、これらは、例えば、ｐＧＥＭＥＸ、ｐＵＣ誘導体、ｐＧＥＸ−２Ｔ  ｐＥＴ３ｂおよびｐＱＥ−８であるが、後者が好ましい。酵母における発現に関しては、例えば、ｐＹ１００およびＹｃｐａｄ１が挙げられ、一方、動物細胞における発現に関しては、例えば、ｐＫＣＲ、ｐＥＦＢＯＳ、ｃＤＭ８およびｐＣＥＶ４が示される。昆虫細胞における発現に関しては、バキュロウイルス発現ベクターｐＡｃＳＧＨｉｓＮＴ−Ａが特に適する。
当業者であれば、発現ベクターに存在する本発明のｃＤＮＡを発現させるために好適な細胞を知っている。かかる細胞の例としては、大腸菌株ＨＢ１０１、ＤＨ１、ｘ１７７６、ＪＭ１０１、ＪＭ１０９、ＢＬ２１およびＳＧ  １３００９が挙げられ、後者が好ましく、酵母株サッカロミセスセレビシエならびにＬ、３Ｔ３、ＦＭ３Ａ、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＶｅｒｏおよびＨｅＬａ動物細胞ならびに昆虫細胞ｓｆ９が挙げられる。
当業者であれば、本発明のｃＤＮＡを発現ベクターに挿入すべきいかなる方法も知っている。当業者であれば、該ＤＮＡを他の蛋白質およびペプチドをそれぞれコードするＤＮＡと組み合わせて挿入し、本発明のｃＤＮＡが融合蛋白質の型で発現され得るという事実にも精通している。
また、当業者であれば、形質転換細胞およびトランスフェクト細胞をそれぞれ培養する条件を知っている。当業者であれば、本発明のｃＤＮＡにより発現された蛋白質を単離および精製するために供する方法にも精通している。従って、融合蛋白質であってもよいかかる蛋白質も、本発明の主題に属するものである。
本発明のさらなる主題は、前記蛋白質および融合蛋白質それぞれに対する抗体に関する。かかる抗体は、常法により調製される。それは、ポリクローナルおよびモノクローナルそれぞれであってもよい。その製造のためには、動物、具体的にはポリクローナル抗体に関してはウサギまたはニワトリおよびモノクローナル抗体に関してはマウスを、前記（融合）蛋白質またはその断片で免疫することが好ましい。動物のさらなる「ブースター」を、同じ（融合）蛋白質またはその断片で行なってもよい。次いで、ポリクローナル抗体を、動物血清および卵黄それぞれから得る。モノクローナル抗体に関しては、動物の脾臓細胞をミエローマ細胞と融合させる。
本発明の好ましい抗体、即ち、モノクローナル抗体１１／７８／１を、１９９５年４月２６日にＤＳＭ  ＡＣＣ  ２２１１でＤＳＭに寄託した。
本発明は、アポトーシス細胞において染色体ＤＮＡの分解の研究を可能にする。本研究は、ヒトの単離した体液で行なうことができる。前記分解に寄与するＤＮアーゼを、本発明の抗体により検出することができる。さらに、本発明のＤＮアーゼに対する自己抗体を、本発明の蛋白質により検出することができる。両検出は、常法、具体的には、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降法または免疫蛍光法により行なう。また、前記ＤＮアーゼをコードする遺伝子の発現を、本発明の核酸、具体的にはＤＮＡおよびそれから由来するプライマーにより検出することができる。この検出は、常法、具体的にはサザンブロットにより行なってもよい。
さらに、本発明は、アポトーシスのためにまたはアポトーシスに対して対策を講じるために適する。これらの対策は、本発明の製品をヒトに投与することを含む。染色体ＤＮＡの分解を予防するために、前記ＤＮアーゼを本発明の抗体により阻害することができる。他方、この分解は、特に、腫瘍細胞の治療に適すると思われる具体的にはトランスフェリンまたはＢＳＡ等の身体により外来性とは見なされない蛋白質との連結後、本発明の蛋白質により促進され得る。同様のことが、本発明の核酸、具体的には、腫瘍等のある種の組織において誘導可能なプロモーターにより制御され、その発現後それらの組織において本発明の蛋白質の貯蔵となるＤＮＡに対応してなされ得る。さらに、本発明の核酸、具体的にはＤＮＡを用いて前記ＤＮアーゼを阻害することもできる。この目的のために、例えば、前記ＤＮアーゼをコードする遺伝子の発現阻害のためのアンチセンスオリゴヌクレオチドの調製用の基礎として、核酸を使用する。
従って、本発明は、アポトーシスの診断および治療上の検出または登録に多大に寄与する。
【図面の簡単な説明】
図１は、ＤＮアーゼ活性を有する本発明の蛋白質に由来するアミノ酸配列および塩基配列を示す。
以下の実施例により、本発明を説明する。
実施例１：本発明の蛋白質の調製および精製
図１のＤＮＡを鋳型として用いて、本発明の蛋白質を調製した。ＰＣＲ法を行なった。用いたプライマー対は、5'-CAGGGATCCGATGACGATGACAAAATGCACTACCCAACTGCAC-3'および5'-GGGGGATCCTCAGGCAGCAGGGCACAG-3'であった。ＰＣＲは、バッチ法を維持し、ＰＣＲ条件は以下のようであった：
ＰＣＲバッチ
鋳型ＤＮＡ（図１）              ：１μｌ＝１ｎｇ
Ｐｆｕポリメラーゼ１０ｘ緩衝液  ：１０μｌ＝１ｘ
ＤＭＳＯ                        ：１０μｌ＝１０％
ｄＮＴＰｓ                      ：１μｌ＝各２００μＭ
オリゴヌクレオチド、各１．５μｌ：３μｌ＝各１５０ｎｇ
Ｈ2Ｏ再蒸留したもの             ：合計９９μｌ
ＰＣＲ条件
−  ９２℃  ５分
−  １μｌ  Ｐｆｕポリメラーゼの添加(Stratagene社)＝２．５ユニット
−  パラフィンの添加
ＰＣＲ
９２℃    １分
５８℃    １分    １サイクル
７２℃  １０分
９２℃    １分
５８℃    １分  ３９サイクル
７２℃    ２分
７２℃  １０分    １サイクル
増幅したＤＮＡをＢａｍＨＩで切断し、発現ベクターｐＱＥ−８(Diagen社)の唯一のＢａｍＨＩ部位に挿入した。発現プラスミドｐＱ／ＤＮａｓｅＸが得られた。該プラスミドは、６個のヒスチジン残基（Ｎ末端パートナー）および本発明の図１の蛋白質（Ｃ末端パートナー）からなる融合蛋白質をコードする。ｐＱ／ＤＮａｓｅＸを用いて、大腸菌ＳＧ  １３００９の形質転換を行なった(Gottesman,S.ら、J.Bacteriol.148,(1981),265-273を参照）。該細菌を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび２５μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ培地で培養し、６０μＭイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で４時間誘導した。該細菌の溶菌を、６Ｍ塩酸グアニジンの添加により行なった。その後、クロマトグラフィー材料の製造者(Diagen社)の指示に従って、８Ｍ尿素の存在下で溶菌液を用いてクロマトグラフィー（Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂）を行なった。結合した融合蛋白質を、ｐＨ３．５を有する緩衝液に溶出させた。その中和後、融合蛋白質を、１８％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に付し、クーマシーブルーで染色した(Thomas,J.O.とKornberg,R.D.,J.Mol.Biol.149(1975),709-733を参照）。
高度に精製された型の本発明の（融合）蛋白質が調製可能なことが示された。
実施例２：本発明の抗体の調製
本発明の実施例１の融合蛋白質を、１８％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付した。４Ｍ酢酸ナトリウムでゲルを染色後、３５ｋＤのバンドをゲルから切り出し、リン酸緩衝性の通常の塩溶液でインキュベートした。ゲル片を沈降させた後、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動、その後のクーマシーブルー染色により、上清の蛋白質濃度を測定した。ゲルで精製した融合蛋白質で、以下のように動物を免疫した：
ウサギにおけるポリクローナル抗体のための免疫化プロトコール
０．７ｍｌのＰＢＳならびにそれぞれ０．７ｍｌのフロイントの完全アジュバントおよびフロイントの不完全アジュバント中の３５μｇのゲルで精製した融合蛋白質を、１回の免疫につき用いた。
０日目：  第１回目の免疫（フロイントの完全アジュバント）
１４日目：第２回目の免疫（フロイントの不完全アジュバント；ｉｃＦＡ）
２８日目：第３回目の免疫（ｉｃＦＡ）
５６日目：第４回目の免疫（ｉｃＦＡ）
８０日目：死亡まで放血。
免疫ブロットでウサギ血清を試験した。この目的のために、本発明の実施例１の融合蛋白質をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に付し、ニトロセルロースフィルターに転写した(Khyse-Andersen,J.,J.Biochem.Biophys.Meth.10(1984),203-209を参照)。ボック(Bock,C.-T.)ら、Virus Genes 8,(1994),215-229に記載のように、ウエスタンブロット分析を行なった。この目的のために、ニトロセルロースフィルターを、３７℃で１時間、一次抗体とインキュベートした。該抗体は、ウサギ血清（ＰＢＳで１：１００００）であった。ＰＢＳで数回の洗浄工程の後、ニトロセルロースフィルターを二次抗体とインキュベートした。この抗体は、アルカリホスファターゼ結合モノクローナルヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体(Dianova社)(ＰＢＳで１：５０００)であった。ＰＢＳで数回の洗浄工程の後、３７℃で３０分間インキュベートし、次いで、発色溶液（３６μＭ  ５’−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート、４００μＭニトロブルーテトラゾリウム、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ９．５、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ2）を用いて、室温でバンドが見えるまでアルカリホスファターゼ検出反応をおこなった。
本発明のポリクローナル抗体が製造され得ることが示された。
ニワトリにおけるポリクローナル抗体のための免疫化プロトコール
０．８ｍｌのＰＢＳならびにそれぞれ０．８ｍｌのフロイントの完全アジュバントおよびフロイントの不完全アジュバント中の４０μｇのゲルで精製した融合蛋白質を、１回の免疫につき用いた。
０日目：  第１回目の免疫（フロイントの完全アジュバント）
２８日目：第２回目の免疫（フロイントの不完全アジュバント；ｉｃＦＡ）
５０日目：第３回目の免疫（ｉｃＦＡ）
卵黄から抗体を抽出し、ウエスタンブロットで試験した。本発明のポリクローナル抗体が検出された。
マウスモノクローナル抗体のための免疫プロトコール
０．２５ｍｌのＰＢＳならびにそれぞれ０．２５ｍｌのフロイントの完全アジュバントおよびフロイントの不完全アジュバント中の１２μｇのゲルで精製した融合蛋白質を、１回の免疫につき用いた。４回目の免疫では、融合蛋白質を０．５ｍｌ（アジュバントなし）に溶解した。
０日目：  第１回目の免疫（フロイントの完全アジュバント）
２８日目：第２回目の免疫（フロイントの不完全アジュバント；ｉｃＦＡ）
５６日目：第３回目の免疫（ｉｃＦＡ）
８４日目：第４回目の免疫（ＰＢＳ）
８７日目：融合。
ハイブリドーマの上清をウエスタンブロットで試験した。本発明のモノクローナル抗体が検出された。それらの１つである、１１／７８／１を、１９９５年４月２６日に、ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２２１１でＤＳＭに寄託した。
実施例３：本発明の蛋白質のＤＮアーゼ活性の検出
ローゼンタールとラックス(Rosenthal,A.L. & Lacks,S.A.,)のAnal.Biochem.80,(1977),76-90の方法を修正して、ＤＮアーゼ活性試験を行なった。この目的のために、分離用ゲルおよび回収用ゲルに、２ｍＭ  ＥＤＴＡおよび１０μｇ／ｍｌまでの最終濃度の変性サケ精巣ＤＮＡまたは酵母ＲＮＡを含む１８％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルを調製した。５％の２−メルカプトエタノールを含むラエムリ(Laemmli)サンプル緩衝液で４分間煮沸することにより、試料を変性させた。本発明の蛋白質（実施例１由来）およびウシＤＮアーゼ１（対照）を試料として用いた。１０ｋｄのラダー(Gibco BRL社)を蛋白質マーカーとして用い、同じゲルで分離させ、電気泳動後に切り出しでクーマシーブルーで染色した。電気泳動後ＳＤＳを除去するために、試料を含むゲルを、１００ｍｌの４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．６で４ｘ３０分間洗浄し、それぞれ、０．０２％アジ化ナトリウムおよび２ｍＭ  ＭｇＣｌ2、２ｍＭ  ＣａＣｌ2および２ｍＭ  ＭｇＣｌ2、２ｍＭ  ＺｎＣｌ2を有する４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．６中、室温で一晩インキュベートした。酵素活性を検出するために、緩衝液を交換し、臭化エチジウムを２μｇ／ｍｌの最終濃度まで添加した。ゲルを長波長Ｕ．Ｖ．光で定期的に調べて写真撮影を行なった。
本発明の蛋白質がＤＮアーゼ活性を有することが示された。
【図１】
0003811733.tif 000004