(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記化学式[８]で表されるモノマーユニットを有するポリヒドロキシアルカノエートの製造方法であって、
下記化学式[３]で表される置換脂肪酸エステル化物を含む培地で、該置換脂肪酸エステル化物を取り込み、該ポリヒドロキシアルカノエートを合成しうる微生物である、シュードモナス・チコリアイ・ＹＮ２株(Ｐseudoｍonas cichorii ＹＮ２、ＦＥＲＭ ＢＰ-7375)、シュードモナス・チコリアイ・Ｈ45株(Ｐseudoｍonas cichorii Ｈ45、ＦＥＲＭ ＢＰ-7374)、及びシュードモナス・ジェッセニイ・Ｐ161株(Ｐseudoｍonas jessenii Ｐ161、ＦＥＲＭＢＰ-7376)からなる群から選択された少なくとも１株を培養する工程と、
前記微生物が産生した前記ポリヒドロキシアルカノエートを単離する工程とを有することを特徴とする、ポリヒドロキシアルカノエートの製造方法。
【化１】
0003768799.tif 000018
(ここで、xおよびyは０〜８から選ばれた任意の整数を示す。また、Ｒは、フェニル基、フェノキシ基、ベンゾイル基、シクロヘキシル基及びチエニル基からなる群から選択された少なくとも一つ、もしくは該選択された基の化学構造中の任意の部位が化学修飾されたものの少なくとも何れか一つを含む)
【化２】
0003768799.tif 000019
(ここで、xは０〜８から選ばれた任意の整数を示す。また、Ｒは、フェニル基、フェノキシ基、ベンゾイル基、シクロヘキシル基及びチエニル基からなる群から選択された少なくとも一つ、もしくは該選択された基の化学構造中の任意の部位が化学修飾されたものの少なくとも何れか一つを含む)
【請求項２】
微生物の培養が、前記化学式[３]で表される置換脂肪酸エステル化物と増殖基質とを含む培地による培養と、これに続く、前記化学式[３]で表される置換脂肪酸エステル化物と増殖基質とを含む窒素源を制限した培地による培養の２段階で行われる請求項１に記載のポリヒドロキシアルカノエートの製造方法。
【請求項３】
微生物の培養が、前記化学式[３]で表される置換脂肪酸エステル化物と増殖基質とを含む培地による培養のみの１段階で行われる請求項１に記載のポリヒドロキシアルカノエートの製造方法。
【請求項４】
増殖基質がグルコースである請求項２または３に記載のポリヒドロキシアルカノエートの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ポリヒドロキシアルカノエート(以下、ＰＨＡと略す)を微生物によって極めて効率的に生産する方法に関する。より具体的には、置換脂肪酸エステル化物を原料として、当該原料に由来する置換基を側鎖に有するＰＨＡを生産し、菌体内に蓄積する能力を有する微生物を用いて、所望の化学構造を呈するＰＨＡを従来法より効率的に生産する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
これまで、多くの微生物がポリ-３-ヒドロキシ酪酸(以下、ＰＨＢと略す)あるいはその他のＰＨＡを生産し、菌体内に蓄積することが報告されてきた(「生分解性プラスチックハンドブック」,生分解性プラスチック研究会編,(株)エヌ・ティー・エス,Ｐ178-197)。これらのポリマーは従来のプラスチックと同様に、溶融加工等により各種製品の生産に利用することができる。さらに、生分解性であるがゆえに、自然界で微生物により完全分解されるという利点を有している。従って、従来用いられている多くの合成高分子化合物のように自然環境に残留して汚染を引き起こすことがなく、また、焼却処分を行う必要もないため、大気汚染や地球温暖化の防止の観点からも有用な材料となり得る。また、生体適合性にも優れており、医療用軟質部材等としての応用も期待されている。
【０００３】
微生物産生ＰＨＡは、その生産に用いる微生物の種類や培地組成、培養条件等により、様々な組成や構造のものとなり得ることが知られており、これまで主に、ＰＨＡの物性の改良という観点から、このような組成や構造の制御に関する研究がなされてきた。
【０００４】
例えば、アルカリゲネス・ユウトロファス Ｈ１６株(Ａlcaligenes eutrophusＨ１６、ＡＴＣＣ Ｎo.17699)並びにその変異株は、培養時の炭素源を変化させることによって、３-ヒドロキシ酪酸(以下、３ＨＢと略す)と３-ヒドロキシ吉草酸(以下、３ＨＶと略す)との共重合体を様々な組成比で生産することが報告されている(特表平６-１５６０４号公報、特表平７-１４３５２号公報、特表平８-１９２２７号公報 等)。
【０００５】
また、特開平９-１９１８９３号公報では、コマモナス・アシドボランス・IＦＯ 13852株(Ｃoｍaｍonas acidovorans IＦＯ 13852)が、炭素源としてグルコン酸及び１,４-ブタンジオールを用いた培養により、３ＨＢと４-ヒドロキシ酪酸とをモノマーユニットに持つポリエステルを生産することが開示されている。
【０００６】
なお、これらの文献に記載されたＰＨＡはメチレン側鎖、エチレン側鎖以外の側鎖を有しないもので、ここでは「usual ＰＨＡ」とする。
【０００７】
一方、特許公報第２６４２９３７号では、シュードモナス・オレオボランス・ＡＴＣＣ 29347株(Pseudoｍonas oleovorans ＡＴＣＣ 29347)に、炭素源として非環状脂肪族炭化水素を与えることにより、炭素数が６から１２までの３-ヒドロキシアルカノエート(以下、３ＨＡと略す)をモノマーユニットとするＰＨＡを生産することが開示されている。
【０００８】
特開平５-７４４９２号公報では、メチロバクテリウム属(Ｍethylobacteriuｍ sp.)、パラコッカス属(Paracoccus sp.)、アルカリゲネス属(Ａlcaligenes sp.)、シュードモナス属(Pseudoｍonas sp.)の微生物を、炭素数３〜７の第一級アルコールに接触させることにより、３ＨＢと３ＨＶとの共重合体を生産させる方法が開示されている。
【０００９】
特開平５-９３０４９号公報、及び、特開平７-２６５０６５号公報では、アエロモナス・キャビエ(Ａeroｍonas caviae)を、オレイン酸やオリーブ油を炭素源として培養することにより、３ＨＢと３-ヒドロキシヘキサン酸(以下、３ＨＨxと略す)の２成分共重合体を生産することが開示されている。
【００１０】
さらに、ある種の微生物では、様々な置換基、例えば、不飽和炭化水素、エステル基、アリル基、シアノ基、ハロゲン化炭化水素、エポキシド等が導入されたＰＨＡを生産することが報告されており、このような手法によって微生物産生ＰＨＡの物性改良を目指す試みもなされ始めている。
【００１１】
例えば、Ｍakroｍol.Ｃheｍ.,１９１, 1957-1965, 1990、 Ｍacroｍolecules,２４, 5256-5260, 1991、 Ｃhirality,３, 492-494, 1991 等では、シュードモナス・オレオボランスが３-ヒドロキシ-５-フェニル吉草酸(以下、３ＨＰＶと略す)をモノマーユニットとして含むＰＨＡを生産することが報告されており、３ＨＰＶが含まれることに起因すると思われる、ポリマー物性の変化が認められている。
【００１２】
なお、これらの文献に記載されたような、側鎖を有するＰＨＡを、ここでは「unusual ＰＨＡ」とする。
【００１３】
従来、微生物産生ＰＨＡにおいては、その生産に用いる微生物の種類や培地組成、培養条件等を変えることにより、何通りかの組成・構造のものが得られているが、それらの試みの目的は、専らＰＨＡに含まれる複数の３ＨＡの比率を変え、プラスチックとしての物性の改良を図ることであった。
【００１４】
一方、前記のような置換基を側鎖に導入した「unusual ＰＨＡ」は、導入した置換基の特性等に起因する、極めて有用な機能・特性を具備した「機能性ポリマー」としての展開も期待できる。生分解性に加えて、そのような機能性をも兼ね備えた新たなポリマーと、そのようなポリマーを生産し菌体内に蓄積し得る微生物、並びに、そのような微生物を用いた当該ポリマーの効率的製造方法の開発は極めて有用かつ重要であると考えられる。
【００１５】
ところで、様々な置換基を側鎖に導入した「unusual ＰＨＡ」、即ち、下記化学式[２]で表されるモノマーユニットを含むＰＨＡを微生物により生産する方法としては、先に挙げたシュードモナス・オレオボランスの報告例等に示される通り、導入しようとする置換基を有した下記化学式[６]で表される置換脂肪酸を化学合成したのち、これを微生物に与えて培養し、生産されたＰＨＡを抽出する方法が一般的である。
【００１６】
【化６】
0003768799.tif 000002
【００１７】
【化７】
0003768799.tif 000003
【００１８】
例えば、Ｐolyｍer Ｐrepr.,３５, 627-628, 1994 や、Ｃan.Ｊ.Ｍicrobiol.,４１, 32-43, 1995 では、下記化学式[７]で表される方法でＰＨＡを生産したと報告されている。
【００１９】
【化８】
0003768799.tif 000004
【００２０】
即ち、まず４-シアノフェノールと６-ブロモヘキサン酸エチルエステルとのＷilliaｍson反応により、６-(４-シアノフェノキシ)ヘキサン酸エチルエステルを合成する。続いて、この６-(４-シアノフェノキシ)ヘキサン酸エチルエステルをアルカリ条件下で加水分解して、６-(４-シアノフェノキシ)ヘキサン酸を合成する。最後に、得られた６-(４-シアノフェノキシ)ヘキサン酸を、ＰＨＡ生産菌の一つであるシュードモナス・オレオボランスに与えて培養し、ＰＨＡを抽出することにより、３-ヒドロキシ-６-(４-シアノフェノキシ)ヘキサン酸をモノマーユニットとして含むＰＨＡを合成することができると報告されている。
【００２１】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、前記のような、置換脂肪酸を化学合成して微生物に与えることからなる「unusual ＰＨＡ」の一般的な製造方法においては、原料である置換脂肪酸の化学合成工程が数段階にも渡る化学反応を要するため、「unusual ＰＨＡ」を製造するための工程が極めて煩雑となる上、その製造に多くの時間、手間及び費用が費やされることが多かった。さらに、導入しようとする置換基の種類や数、位置等によっては、原料である置換脂肪酸の合成工程における、エステル化物からの加水分解反応が容易に進行しないなどの障害がある可能性があり、これらが、工業レベルでの「unusual ＰＨＡ」の製造やそのための装置開発の上での課題となっていた。
【００２２】
【課題を解決するための手段】
そこで本発明者らは、置換脂肪酸と比較して合成、あるいは、入手の容易な原料を用いた、「unusual ＰＨＡ」を微生物生産させることからなるＰＨＡ製造方法を開発すべく、鋭意研究を重ねてきた。その結果、従来の原料である置換脂肪酸の化学合成工程における中間体であり、また、置換脂肪酸と比較して化学合成が容易でかつその自由度も高い、下記化学式[３]で表される置換脂肪酸エステル化物を含む培地を微生物の培養に用いることによって、所望の「unusual ＰＨＡ」を効率的に取得できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００２３】
【化９】
0003768799.tif 000005
【００２４】
(ここで、xおよびyは０〜８から選ばれた任意の整数を示す。また、Ｒは、フェニル基、フェノキシ基、ベンゾイル基、シクロヘキシル基及びチエニル基からなる群から選択された少なくとも一つ、もしくは該選択された基の化学構造中の任意の部位が化学修飾されたものの少なくとも何れか一つを含む)
即ち、本発明は、  下記化学式[８]で表されるモノマーユニットを有するＰＨＡのの製造方法であって、上記化学式[３]で表される置換脂肪酸エステル化物を含む培地で、該置換脂肪酸エステル化物を取り込み、該ポリヒドロキシアルカノエートを合成しうる微生物である、シュードモナス・チコリアイ・ＹＮ２株(Ｐseudoｍonas cichorii ＹＮ２、ＦＥＲＭ ＢＰ-7375)、シュードモナス・チコリアイ・Ｈ45株(Ｐseudoｍonas cichorii Ｈ45、ＦＥＲＭＢＰ-7374)、及びシュードモナス・ジェッセニイ・Ｐ161株(Ｐseudoｍonas jessenii Ｐ161、ＦＥＲＭＢＰ-7376)からなる群から選択された少なくとも１株を培養する工程と、前記微生物が産生した前記ポリヒドロキシアルカノエートを単離する工程とを有することを特徴とする、ＰＨＡの製造方法に関するものである。
【００２５】
【化３】
0003768799.tif 000006
【００２６】
(ここで、xは０〜８から選ばれた任意の整数を示す。また、Ｒは、フェニル基、フェノキシ基、ベンゾイル基、シクロヘキシル基及びチエニル基からなる群から選択された少なくとも一つ、もしくは該選択された基の化学構造中の任意の部位が化学修飾されたものの少なくとも何れか一つを含む)
【００２７】
【発明の実施の形態】
本発明の方法に用いる、化学式[１]で表される置換脂肪酸エステル化物としては、微生物による「unusual ＰＨＡ」生産の原料として用いられ得るものであれば特に限定されないが、例えば、フェニル基、フェノキシ基、ベンゾイル基、シクロヘキシル基、チエニル基等の官能基や、これら官能基の任意の部位が各種の化学修飾を受けたものを含む脂肪酸を用いることができる。さらに具体的には、例えば、５-フェニル吉草酸メチルエステル、５-(４-フルオロフェニル)吉草酸メチルエステル、６-フェニルヘキサン酸メチルエステル、４-フェノキシ-n-酪酸メチルエステル、４-(３-フルオロフェノキシ)-n-酪酸メチルエステル、４-(４-フルオロフェノキシ)-n-酪酸メチルエステル、４-(４-シアノフェノキシ)-n-酪酸メチルエステル、４-(４-ニトロフェノキシ)-n-酪酸メチルエステル、５-フェノキシ吉草酸メチルエステル、５-(４-フルオロフェノキシ)吉草酸メチルエステル、５-ベンゾイル吉草酸メチルエステル、４-シクロヘキシル酪酸メチルエステル、５-(２-チエニル)吉草酸メチルエステル、５-フェニル吉草酸エチルエステル、５-(４-フルオロフェニル)吉草酸エチルエステル、６-フェニルヘキサン酸エチルエステル、４-フェノキシ-n-酪酸エチルエステル、４-(３-フルオロフェノキシ)-n-酪酸エチルエステル、４-(４-フルオロフェノキシ)-n-酪酸エチルエステル、４-(４-シアノフェノキシ)-n-酪酸エチルエステル、４-(４-ニトロフェノキシ)-n-酪酸エチルエステル、５-フェノキシ吉草酸エチルエステル、５-(４-フルオロフェノキシ)吉草酸エチルエステル、５-ベンゾイル吉草酸エチルエステル、４-シクロヘキシル酪酸エチルエステル、５-(２-チエニル)吉草酸エチルエステル等の置換脂肪酸エステル化物を用いることができる。
【００２８】
以下に、本発明において利用される微生物、培養工程等について説明する。
【００２９】
(微生物)
本発明の方法に用いる微生物としては、化学式[１]で表される置換脂肪酸エステル化物を原料(基質)にして、化学式[２]で表されるモノマーユニットを含むＰＨＡを生産する能力を有する微生物を用いることができるが、例えば、特願平１１-３７１８６３号記載のＰＨＡ生産微生物である、シュードモナス・チコリアイ・ＹＮ２株(Ｐseudoｍonas cichorii ＹＮ２)、シュードモナス・チコリアイ・Ｈ45株(Ｐseudoｍonas cichorii Ｈ45)、シュードモナス・ジェッセニイ・Ｐ161株(Ｐseudoｍonas jessenii Ｐ161)を用いることができる。なお、ＹＮ２株は寄託番号「ＦＥＲＭ Ｐ-17411」として、Ｈ45株は寄託番号「ＦＥＲＭ Ｐ-17410」として、Ｐ161株は寄託番号「ＦＥＲＭ Ｐ-17445」として、通商産業省 工業技術院 生命工学工業技術研究所(特許微生物寄託センター)にそれぞれ寄託されている。
【００３０】
前記のＨ45株、ＹＮ2株およびＰ161株の菌学的性質を列挙すれば以下の通りである。
【００３１】
0003768799.tif 000007
0003768799.tif 000008
0003768799.tif 000009
0003768799.tif 000010
0003768799.tif 000011
また、シュードモナス属に属する微生物に加えて、アエロモナス属(Ａeroｍonas sp.)、コマモナス属(Ｃoｍaｍonas sp.)、バークホルデリア属(Ｂurkholderia sp.)などに属し、化学式[１]で表される置換脂肪酸エステル化物を原料(基質)として用いて、化学式[２]で表されるモノマーユニットを含むＰＨＡを生産する微生物を用いることも可能である。
【００３２】
(培養工程)
本発明にかかるＰＨＡの製造方法に用いる微生物の通常の培養、例えば、保存菌株の作成、ＰＨＡの生産に必要とされる菌数や活性状態を確保するための増殖などには、用いる微生物の増殖に必要な成分を含有する培地を適宜選択して用いる。例えば、微生物を通常増殖させる場合、微生物の生育や生存に悪影響を及ぼすものでない限り、一般的な天然培地(肉汁培地、Ｌ-培地 など)や、栄養源を添加した合成培地など、いかなる種類の培地をも用いることができる。温度、通気、攪拌などの培養条件は、用いる微生物に応じて適宜選択する。
【００３３】
当該微生物を用いて、化学式[２]で表されるモノマーユニットを含むＰＨＡを生産・蓄積させる場合は、化学式[１]で表される置換脂肪酸エステル化物と、グルコース、ポリペプトン、酵母エキス等の微生物の増殖基質とを含んだ無機培地等で対数増殖後期から定常期の時点まで培養し、菌体を遠心分離等で回収したのち、化学式[１]で表される置換脂肪酸エステル化物と上記増殖基質とを含んだ、無機窒素源を制限した無機培地で更に培養する２段階培養法を用いることができる。また、化学式[１]で表される置換脂肪酸エステル化物と上記増殖基質とを含んだ無機培地等で対数増殖後期から定常期の時点まで培養する１段階培養法を用いることもできる。
【００３４】
前記の培養方法に用いる無機培地としては、リン源(例えば、リン酸塩など)、無機窒素源(例えば、アンモニウム塩、硝酸塩など)など、当該微生物が増殖し得る成分を含んでいるものであればいかなるものでも良く、例えば、ＭＳＢ培地、Ｍ９培地などを挙げることができる。なお、本発明における実施例で用いるＭ９培地の組成は以下の通りである。
Ｎa2ＨＰＯ4        :６.２ g
ＫＨ2ＰＯ4         :３.０ g
ＮaＣl             :０.５ g
ＮＨ4Ｃl           :１.０ g
(培地１リットル中、pＨ７.０)
また、培地に添加する原料の置換脂肪酸エステル化物の濃度は、微生物の属種、菌体密度、あるいは培養方法に応じて適宜選択するものであるが、通常、培地中の含有率を 0.01％から 0.5％程度に選択して添加するとよい。ただし、前記の２段階培養法においては、１段階目の培養時に置換脂肪酸エステル化物を添加せずに培養することも可能である。
【００３５】
加えて、グルコース、フルクトース、マンノース、ポリペプトン、酵母エキス等の微生物の増殖基質を添加する際は、その濃度は、微生物の属種、菌体密度、あるいは培養方法に応じて適宜選択するものであるが、通常、培地中の含有率を 0.1％から 1.0％程度に選択して添加するとよい。ただし、前記の２段階培養法においては、２段階目の培養時に増殖基質を添加せずに培養することも可能である。
【００３６】
前記の培養方法は、バッチ式培養、流動バッチ式培養、連続培養、リアクター形式培養、固体培養など、通常の微生物の培養に用いるいかなる方法をも用いることができる。その際の培養温度は、微生物の属種、菌体密度、あるいは培養方法に応じて適宜選択するものではあるが、通常、使用する微生物が生育・増殖可能な範囲、例えば１４〜４０℃、好ましくは２０〜３５℃程度に維持することが好ましい。
【００３７】
本発明における、微生物の菌体からのＰＨＡの回収は、通常行われているクロロホルムなどの有機溶媒による抽出が最も簡便ではあるが、有機溶媒が使用しにくい環境中においては、ＳＤＳ等の界面活性剤による処理、リゾチーム等の酵素による処理、ＥＤＴＡ、次亜塩素酸ナトリウム、アンモニア等の薬剤による処理によって菌体成分を除去して、ＰＨＡを回収する方法を用いることもできる。
【００３８】
なお、本発明の微生物の培養、本発明の微生物によるＰＨＡの生産と菌体内への蓄積、並びに、本発明における菌体からのＰＨＡの回収は、上に例示した具体的な方法に限定されるものではない。
【００３９】
【実施例】
以下に具体例を示し、本発明のＰＨＡ製造方法をより詳しく説明する。これらの具体例は、本発明における最良の態様の一例ではあるが、本発明は以下の具体例によって何ら限定されるものではない。
【００４０】
[実施例１]
Ｄ-グルコース 0.5％と、５-フェニル吉草酸メチルエステル 0.1％とを含むＭ９培地 200ｍLに、シュードモナス・チコリアイ・ＹＮ２株、シュードモナス・チコリアイ・Ｈ45株、シュードモナス・ジェッセニイ・Ｐ161株のうち何れか１株を植菌し、３０℃、125ストローク/分で振盪培養した。６６時間後、菌体を遠心分離によって回収し、 Ｄ-グルコース 0.5％と、５-フェニル吉草酸メチルエステル 0.1％とを含む、無機窒素源(ＮＨ4Ｃl)を含まないＭ９培地 200ｍLに再懸濁して、更に３０℃、125ストローク/分で振盪培養した。４４時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥した。
【００４１】
この凍結乾燥ペレットを 20ｍLのクロロホルムに懸濁し、６０℃で２４時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。得られたＰＨＡは、常法に従ってメタノリシスを行ったのち、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ,島津ＱＰ-5050、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。その結果、表１に示す通り、３-ヒドロキシ-５-フェニル吉草酸をモノマーユニットとして含むＰＨＡの生産が確認された。
【００４２】
【表１】
0003768799.tif 000012
【００４３】
[実施例２]
Ｄ-グルコース 0.5％と、５-フェニル吉草酸メチルエステル 0.01％とを含むＭ９培地 200ｍLに、シュードモナス・チコリアイ・ＹＮ２株、シュードモナス・チコリアイ・Ｈ45株、シュードモナス・ジェッセニイ・Ｐ161株のうち何れか１株を植菌し、３０℃、125ストローク/分で振盪培養した。４６時間後、菌体を遠心分離によって回収し、 Ｄ-グルコース 0.5％と、５-フェニル吉草酸メチルエステル 0.1％とを含む、無機窒素源(ＮＨ4Ｃl)を含まないＭ９培地 200ｍLに再懸濁して、更に３０℃、125ストローク/分で振盪培養した。４１時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥した。
【００４４】
この凍結乾燥ペレットを 20ｍLのクロロホルムに懸濁し、６０℃で２４時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。得られたＰＨＡは、常法に従ってメタノリシスを行ったのち、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ,島津ＱＰ-5050、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。その結果、表２に示す通り、３-ヒドロキシ-５-フェニル吉草酸をモノマーユニットとして含むＰＨＡの生産が確認された。
【００４５】
【表２】
0003768799.tif 000013
【００４６】
[実施例３]
Ｄ-グルコース 0.5％と、４-フェノキシ-n-酪酸エチルエステル 0.1％とを含むＭ９培地 200ｍLに、シュードモナス・チコリアイ・ＹＮ２株を植菌し、３０℃、125ストローク/分で振盪培養した。６７時間後、菌体を遠心分離によって回収し、 Ｄ-グルコース 0.5％と、４-フェノキシ-n-酪酸エチルエステル 0.1％とを含む、無機窒素源(ＮＨ4Ｃl)を含まないＭ９培地 200ｍLに再懸濁して、更に３０℃、125ストローク/分で振盪培養した。２１時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥した。
【００４７】
この凍結乾燥ペレットを 20ｍLのクロロホルムに懸濁し、６０℃で２４時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。得られたＰＨＡは、常法に従ってメタノリシスを行ったのち、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ,島津ＱＰ-5050、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。その結果、表３に示す通り、３-ヒドロキシ-４-フェノキシ-n-酪酸をモノマーユニットとして含むＰＨＡの生産が確認された。
【００４８】
【表３】
0003768799.tif 000014
【００４９】
[実施例４]
Ｄ-グルコース 0.5％と、４-フェノキシ-n-酪酸エチルエステル 0.1％とを含むＭ９培地 200ｍLに、シュードモナス・チコリアイ・Ｈ45株、シュードモナス・ジェッセニイ・Ｐ161株のうち何れか１株を植菌し、３０℃、125ストローク/分で振盪培養した。４５時間後、菌体を遠心分離によって回収し、Ｄ-グルコース 0.5％と、４-フェノキシ-n-酪酸エチルエステル 0.1％とを含む、無機窒素源(ＮＨ4Ｃl)を含まないＭ９培地 200ｍLに再懸濁して、更に３０℃、125ストローク/分で振盪培養した。４０時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥した。
【００５０】
この凍結乾燥ペレットを 20ｍLのクロロホルムに懸濁し、６０℃で２４時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。得られたＰＨＡは、常法に従ってメタノリシスを行ったのち、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ,島津ＱＰ-5050、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。その結果、表４に示す通り、３-ヒドロキシ-４-フェノキシ-n-酪酸をモノマーユニットとして含むＰＨＡの生産が確認された。
【００５１】
【表４】
0003768799.tif 000015
【００５２】
[実施例５]
Ｄ-グルコース 0.5％と、４-フェノキシ-n-酪酸エチルエステル 0.01％とを含むＭ９培地 200ｍLに、シュードモナス・チコリアイ・ＹＮ２株を植菌し、３０℃、125ストローク/分で振盪培養した。４８時間後、菌体を遠心分離によって回収し、 Ｄ-グルコース 0.5％と、４-フェノキシ-n-酪酸エチルエステル 0.1％とを含む、無機窒素源(ＮＨ4Ｃl)を含まないＭ９培地 200ｍLに再懸濁して、更に３０℃、125ストローク/分で振盪培養した。４２時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥した。
【００５３】
この凍結乾燥ペレットを 20ｍLのクロロホルムに懸濁し、６０℃で２８時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。得られたＰＨＡは、常法に従ってメタノリシスを行ったのち、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ,島津ＱＰ-5050、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。その結果、表５に示す通り、３-ヒドロキシ-４-フェノキシ-n-酪酸をモノマーユニットとして含むＰＨＡの生産が確認された。
【００５４】
【表５】
0003768799.tif 000016
【００５５】
[実施例６]
Ｄ-グルコース 0.5％を含むＭ９培地 200ｍLに、シュードモナス・チコリアイ・ＹＮ２株を植菌し、３０℃、125ストローク/分で振盪培養した。４８時間後、菌体を遠心分離によって回収し、Ｄ-グルコース 0.5％と、４-フェノキシ-n-酪酸エチルエステル 0.1％とを含む、無機窒素源(ＮＨ4Ｃl)を含まないＭ９培地 200ｍLに再懸濁して、更に３０℃、125ストローク/分で振盪培養した。４２時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥した。
【００５６】
この凍結乾燥ペレットを 20ｍLのクロロホルムに懸濁し、６０℃で２８時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。得られたＰＨＡは、常法に従ってメタノリシスを行ったのち、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ,島津ＱＰ-5050、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。その結果、表６に示す通り、３-ヒドロキシ-４-フェノキシ-n-酪酸をモノマーユニットとして含むＰＨＡの生産が確認された。
【００５７】
【表６】
0003768799.tif 000017
【００５８】
【発明の効果】
本発明により、微生物産生ポリヒドロキシアルカノエートの効率的な製造方法が提供される。これにより、機能性ポリマーとしても有用な、各種官能基を導入したポリヒドロキシアルカノエートが極めて効率的に生産でき、デバイス材料や医用材料等の各分野への応用が期待できる。