(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するペプチドを有効成分とする免疫増強剤。
【請求項２】
配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するペプチドを有効成分とする免疫増強剤。
【請求項３】
配列番号３で示されるアミノ酸配列を有するペプチドを有効成分とする免疫増強剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、免疫増強剤に関するもので、より詳しくは、免疫活性を有する特定ペプチドを有効成分とする免疫増強剤に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
アポトーシスとして知られるプログラム細胞死が起こっている細胞は、単球由来大食細胞によって急速に除去される。このような現象は、 プログラム細胞死が起っている細胞から特定因子が分泌され、 この分泌された因子が白血球及び単球に対して走化性（Chemotaxis）を引き起こすためであろうと推定されている。内皮単球活性化ポリペプチド（Endothelial Monocyte-Activating Polypeptide II、以下ＥＭＡＰIIとする）は、プログラム細胞死が起こっている細胞から分泌されて走化性を引き起こすため、上記の特定因子のうちの一つとして知られている。
【０００３】
ＥＭＡＰIIは、前駆体である３１２個のアミノ酸から成るｐ４３蛋白質のＣ末端ドメインであり、プログラム細胞死が起こっている細胞においてｐ４３蛋白質の１４６番目アミノ酸であるアスパラギン酸が、活性化されたカスパーゼ−７によって切断されることにより生成される(Quevillion,S.et al., J.Biol.Chem., 272: 32573-32579, 1997; Behrensdorf, M. A. et al.,FEBSLett., 466:143-147, 2000) 。上記したＥＭＡＰIIの構造と成熟は、炎症誘発反応に関与する他のサイトカインであるＩＬ−１βのそれと類似している。１４．５ｋＤａのＩＬ−１βは、３３ｋＤａの不活性プレＩＬ−１βをＩＣＥ（カスパーゼ−１) で切断することにより生成される。
【０００４】
ＥＭＡＰIIは、単核性大食細胞及び多形核白血球内で組織因子、腫瘍壊死因子（tumor necrosis factor 、以下ＴＮＦとする）及びインターロイキン−８（以下ＩＬ−８とする）の発現を誘導する、炎症誘発反応媒介因子である。
【０００５】
また、ＥＭＡＰII  ｍＲＮＡが高く発現する組織では大食細胞が蓄積するが、これはＥＭＡＰIIが大食細胞を死んだ細胞の所まで誘導する走化性の物質であることを意味する。
【０００６】
ＥＭＡＰIIはサイトカインとして作用し、ＥＭＡＰIIのＮ末端の１５個のアミノ酸が反応において重要な役割をすると知られている（Quevillion, S.et al.,J. Biol. Chem., 272: 32573-32579,1997;Kao,J.et al.,J. Biol.Chem.,269: 9774-7982,1994; Kao,J. et al.,J. Biol.Chem., 267: 20239-20247,1992; Kao, J. et al.,J. Biol. Chem., 269: 25106-25119, 1994; Knies, U.E.et al.,PNAS USA, 95:12322-12327, 1998) 。また、米国特許第５，６４１，８６７号には、ＥＭＡＰIIのアルギニン−イソロイシン−グリシン−アルギニン−イソロイシン−スレオニンを含むＮ末端が、ＥＭＡＰIIのサイトカイン機能についての重要な残基であることが記載されている。最近報告されたものによると、ＥＭＡＰIIは、正常細胞には別に副作用を起こさないが、増殖している内皮細胞での初期の転移した腫瘍の成長を抑制するものであることが認められた（Schwarz, M.A.et al., J.Exp.Med.,190: 341-353,1999 ）。
【０００７】
一方、ＥＭＡＰIIの前駆体と知られているｐ４３蛋白質は、広範囲に発現している。上記ｐ４３の発現水準については特に発育中のマウスにおいて時間的及び空間的に非常に異なるが、例えば生後８日乃至１６日目のマウスの肺でｐ４３の発現が急速に増加することが確認された。また、 ｐ４３は脳脊髄炎、神経炎及びブドウ膜炎のような自己免疫疾患部位にある神経膠細胞で高く発現する。このように、特定発生の段階及び特定組織でのｐ４３の発現レベルが高いという現象は、ｐ４３が血管形成、炎症反応、アポトーシスに関して予期せぬ機能を有する可能性があることを示唆している（Tas,M.P.R.,and Marray, J.C.,Int.J.Biochem. Cell.Biol., 28:837-841, 1996; Schwarz, M.J.et.,al., Glia, 20:365-372, 1997; Schuesner, H. J.et al., Glia, 20:365-372, 1997; Berger, A.C. et al., J. Immunother., 23:519-527,2000 ）。
【０００８】
上記に述べたように、ｐ４３のＣ末端ドメインであるＥＭＡＰIIのサイトカイン活性に関する研究は詳しく行われてきたが、ＥＭＡＰIIの前駆体であるｐ４３及びｐ４３のＮ末端ドメインに関する研究はまだ不十分である。そこで本発明者らはｐ４３に関する研究を行い、ＰＣＴ国際特許出願ＰＣＴ／ＫＲ００／００６３０号で、ｐ４３のサイトカイン活性とｐ４３のＣ末端であるＥＭＡＰIIのサイトカイン活性とを比較し、ｐ４３のほうがＥＭＡＰIIよりも効果的なサイトカイン及び免疫増強剤として作用することを明らかにした。
【０００９】
また、本発明者らは正常細胞とアポトーシス細胞におけるｐ４３及びＥＭＡＰIIの蛋白質分泌パターンを比較した。その結果、ＥＭＡＰII蛋白質は正常細胞において細胞が完全に破壊されるプログラム細胞死の末期に分泌されるので、プログラム細胞死の初期には実際作用できないが、ｐ４３蛋白質はプログラム細胞死に関係なく種々の細胞から一定量が分泌されるので、実際に生理的条件下で作用するサイトカインはＥＭＡＰIIではなくｐ４３であることが明らかとなった(Ko YG et al.,A cofactor of tRNA synthetase, p43, is secreted to up-regulate proinflammatory genes, J. Biol. Chem. 2001, Apl 5, 276)。
【００１０】
本発明者らはｐ４３に関する研究を行っているうちに、ｐ４３蛋白質の欠失突然変異蛋白質についてサイトカイン活性を測定し、ｐ４３のＮ末端ドメインを含むペプチドが優れたサイトカイン活性を示すのを発見することによって、本発明を完成することができた。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の目的は免疫活性が優れたｐ４３のＮ末端ドメインを含むペプチドを有効成分とする免疫増強剤を提供することである。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
上記のような目的を果たすために、本発明は、配列番号１乃至３で示されるアミノ酸配列を有するペプチドを有効成分とする免疫増強剤を提供する。
【００１３】
本発明によれば、ｐ４３蛋白質のＮ末端ドメインを含むｐ４３(1−147)、ｐ４３(1−108)及びｐ４３(91 −256)がサイトカインとして作用し、ＴＮＦ及びＩＬ−８の量を増大させる。それらのペプチドは結果として免疫反応を改善し、有効な免疫増強剤として使用され得る。
【００１４】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について詳しく述べる。
本発明における免疫増強剤の有効成分である配列番号１乃至３で示されるアミノ酸配列を有するペプチドは、ｐ４３蛋白質のＮ末端部位であって、具体的には、ｐ４３蛋白質の１乃至１４７番目のアミノ酸配列を有するペプチド、ｐ４３蛋白質の１乃至１０８番目のアミノ酸配列を有するペプチド及びｐ４３蛋白質の９１乃至２５６番目のアミノ酸配列を有するペプチドである。
【００１５】
本発明による免疫活性が優れたｐ４３のＮ末端を含むペプチドを得るために、本発明では具体的に、ｐ４３蛋白質の欠失突然変異蛋白質を構築して、このような突然変異蛋白質を精製した後、培養哺乳類細胞に添加してサイトカイン生成の誘導度を測定した。測定の結果、ｐ４３蛋白質の多数の欠失突然変異蛋白質の中で、培養哺乳類細胞におけるサイトカイン生成誘導率が優れたペプチド類を分離することができた。
【００１６】
本明細書では、便宜上、ｐ４３の蛋白質又はこれらの欠失突然変異蛋白質を表記するのに、ｐ４３蛋白質のアミノ酸配列の最初と最後の番号を括弧に入れて使用した。例えば、ｐ４３の９１乃至２５６番目のアミノ酸配列を有するペプチドを“ｐ４３（91−256 ）”のように表記した。
【００１７】
本発明の１実施例では、ｐ４３であるｐ４３(1−312)と、ｐ４３のＣ末端であるｐ４３(148−312)即ちＥＭＡＰIIと、それからｐ４３のＮ末端部位を含むｐ４３(1−147)、ｐ４３(1−108)及びｐ４３(91 −256)をそれぞれコードする遺伝子を含む組換えベクターを公知の方法（Park, S.G.et al., J.Biol. Chem., 274: 16673-16676, 1999 ）に従って製造した。上記遺伝子のクローニングに使われるベクターには特に制限はないが、ｐＥＴ２８ａ(Novagen) を使うのが望ましいと思われる。このように製造されたｐ４３又はその欠失突然変異の遺伝子を含むベクターで菌株を形質転換させて、ｐ４３蛋白質及び欠失突然変異蛋白質を発現させることができる。上記形質転換に使われる菌株としては特に制限はないが、大腸菌（E.Coli）を使うのが望ましいと思われる。
【００１８】
また本発明の別の実施例では、上記ｐ４３及び欠失突然変異蛋白質のサイトカイン活性を調べた。無血清培地中で培養された哺乳類細胞に上記の発現蛋白質を添加して、異なるサイトカインの生産量を測定した。上記の哺乳類細胞としては成長因子依存細胞であれば特に制限はないが、ヒト単球ＴＨＰ−１細胞を利用するのが望ましいと思われる。ｐ４３又は欠失突然変異蛋白質によって誘導される公知のサイトカイン生産量を測定することにより上記の蛋白質における免疫活性の有無を調べることができるが、本発明では特に、サイトカインの中でもＴＮＦ及びＩＬ−８の生産量を測定した。このサイトカインの生産量を測定する方法としては、当業界で公知されている方法を利用することができるが、本発明では具体的にＥＬＩＳＡ（Enzyme-Linked Immuno Sandwich Assay ）法を利用した。
【００１９】
本発明による配列番号１乃至３で示されるアミノ酸の配列を有するペプチドであるｐ４３(1−147)、ｐ４３(1−108)及びｐ４３(91 −256)は、サイトカイン活性を示し、ＴＮＦとＩＬ−８の生産を誘導する。本発明で確認された結果によれば、上記ペプチドはＥＭＡＰIIよりもＴＮＦ及びＩＬ−８の生産量を２−３倍ほど高く誘導した。特に配列番号１で示されるペプチドによるＴＮＦ及びＩＬ−８の生産量は、ｐ４３による生産量より１．１倍ほど、ＥＭＡＰIIによる生産量より２．５乃至３倍ほど高かった。
【００２０】
ｐ４３のＮ末端部位のペプチドを有効成分とする本発明による免疫増強剤は、ヒト又は動物に投与できる形態ならば特に制限はないが、 キァリアに支持された投与の形態にし得る。
【００２１】
上記のキャリアとしては、固体、半固体、液状希釈剤、充填剤、他の製剤補助剤の中の少なくとも一つが、０．１乃至９９．５％の比率で使われる。上記の免疫増強剤は経口又は非経口に投与することができる。非経口投与とは組織内の局部、皮下、筋内、動脈又は静脈内、また直腸投与である。上記の投与経路に適した投与形態は従来の技術手段を用いて製造することができる。
【００２２】
経口投与は固体又は液体単位の投与形態、例えばバルク（Bulk）粉末剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、シロップ及び懸濁剤などを使用して実施することができる。経口投与の単位投与形態は必要な場合マイクロカプセル化することができる。このような製剤をコーティングするか、又は重合体やワックスに活性成分を含入させることによって、製剤の活性期間を延長させたり、製剤の徐放性を得たりすることができる。免疫増強剤の投与量は患者の年齢、体重、投与経路、疾病と、その程度及び他の因子を考慮して望ましく決定することができる。
【００２３】
以下に、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。但し、下記の実施例は本発明を例示するだけであって、本発明の範囲を限定するものではない。
【００２４】
（実施例１）
ここでは、ｐ４３(1−147)遺伝子を含む組換えベクターの製造、蛋白質の発現及び精製に関して示した。
ｐ４３(1−147)遺伝子を含む組換えベクターを公知の方法（Park、S ．G ．et al., J. Biol. Chem., 274:16673-16676,1999）に従って次のように製造した。財団法人癌研究所（Cancer Institute）の芝清隆博士より供与されたプラスミドｐＭ３３８を制限酵素NdeIとXhoIで切断してｐ４３遺伝子を得た後、これをテンプレートとして使用した。配列番号４及び５で各々示される正方向及び逆方向のプライマを利用して95℃ 1分、58℃ 1分、72℃ 1分の条件下でＰＣＲを遂行した。ＰＣＲ産物を制限酵素EcoRI 及びSalIで切断した後、ｐＥＴ２８ａ(Novagen, Madison, USA) に挿入して組換えベクターを製造した。
【００２５】
上記のｐ４３(1−147)遺伝子を含む組換えベクターで大腸菌ＢＬ２１( ＤＥ３) を形質転換させた。形質転換された大腸菌をＬＢ培地（Luria Broth; 1g NaCl, 1g Bactotryptone, 0.5g yeast extracts ）１００ｍｌで培養し、ｐ４３(1−147)遺伝子を His-Tag融合蛋白質の形で発現させた。発現させたｐ４３(1−147)蛋白質を公知の方法（Park、S ．G ．et al., J. Biol.Chem., 274:16673-16676,1999 ）に従ってニッケルアフィニティクロマトグラフィ及びモノＱ又はＳイオン交換クロマトグラフィにて精製した。炎症反応を誘発するリポ多糖を除去するために、精製された蛋白質を緩衝溶液（１０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ６．０）、 １００ｍＭ  NaCl、発熱物質を含まない）にて一晩透析した。透析完了後、蛋白質を上記と同じ緩衝溶液で平衡化させたポリミキシン樹脂（Bio-Rad ）にローディングして、２０分間インキュベーションした後、溶出させた。残存するリポ多糖の濃度を Limulus Amebocyte Lysate QCL-1000 kit（Bio Whittacker）を使用して測定した。その結果、リポ多糖の濃度は炎症反応を誘発しない濃度である２０ｐｇ／ｍｌ未満と示された。精製された蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分析した。その結果、図２に示したように、２１ｋＤａの分子量を有するｐ４３(1−147)蛋白質が純粋に分離されたのを確認することができた。
【００２６】
（実施例２）
ここでは、ｐ４３(1−108)遺伝子を含む組換えベクターの製造、蛋白質の発現及び精製に関して示した。
ｐ４３(1−108)遺伝子を含む組換えベクターを上記の実施例１に述べたのと同様な方法に従って次のように製造した。ｐ４３(1−312)遺伝子が挿入されたｐＥＴ２８ａ(Novagen) 組換えベクターを、制限酵素 AspI 及び SalI で切断した。切断された組換えベクターにクレノウ断片で処理してＤＮＡの末端を詰めた後、再結合させた。次にリガーゼ処理して、上記ベクターをセルフライゲーションさせて、ｐ４３(1−108)遺伝子を含む組換えベクターを製造した。上記の実施例１と同様ｐ４３(1−108)遺伝子を含む組換えベクターで大腸菌ＢＬ２１を形質転換させた。発現したｐ４３(1−108)蛋白質を精製してＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分析した。その結果、図２に示したように、２０ｋＤａの分子量を有するｐ４３(1−108)蛋白質が純粋に分離されたのを確認することができた。
【００２７】
（実施例３）
ここでは、ｐ４３(91 −256)遺伝子を含む組換えベクターの製造、蛋白質の発現及び精製に関して示した。
配列番号６及び７で各々示される正方向及び逆方向のプライマを利用して、ＰＣＲの反応条件を 95 ℃ 30 秒、50℃ 30 秒、72℃ 40 秒の条件で実施したのを除けば、上記の実施例１と同様な方法に従ってｐ４３(91 −256)遺伝子を含む組換えベクターを製造した。実施例１に述べたのと同様な方法に従ってｐ４３(91 −256)を含む組換えベクターで大腸菌ＢＬ２１を形質転換させた。発現したｐ４３(91 −256)蛋白質を精製し、精製蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分析した。その結果、図２に示したように、２９ｋＤａの分子量を有するｐ４３(91 −256)蛋白質が純粋に分離されたのを確認することができた。
【００２８】
（実施例４）
ここではサイトカイン活性の測定について示した。
上記の実施例１から３において精製したｐ４３の欠失突然変異蛋白質のサイトカイン活性を測定するために、次のような実験を行った。ヒト単球ＴＨＰ−１細胞（ＡＴＣＣで購入後、リポ多糖に対して敏感に反応する細胞を選択、培養する）を10％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）, 50μg/mlストレプトマイシン及びペニシリンを含むRPMI1640培地に接種して、5 ％ CO2  、37℃で培養した。無血清RPMI1640で上記の細胞を２回洗浄後、２×１０6細胞/ml を血清が含まれていない0.5ml RPMI1640が分注された２４ウェルプレートに接種した。２時間ほど上記と同様な条件下で細胞を培養した後、上記実施例１乃至３によって精製された蛋白質の各々100nM を添加して４時間細胞を刺激した。 培養上層液を回収して、ELISA Kit (PharMingen) を製造元の勧奨方法に従って使用してＴＮＦ及びＩＬ−８の濃度を測定した。上記細胞の刺激実験を２回繰り返した。その結果をそれぞれ図３及び４に示した。
【００２９】
（比較例１）
ここでは、ｐ４３(1−312)遺伝子を含む組換えベクターの製造、蛋白質の発現及びサイトカイン活性の測定について示した。
配列番号８及び９で各々示される正方向及び逆方向のプライマを利用して、テンプレートとしてｐＭ３３８、制限酵素としてNdeI及びXhoIを利用したのを除けば、上記の実施例１と同様な方法に従ってｐ４３蛋白質をコードするｐ４３(1−312)遺伝子を含む組換えベクターを製造した。実施例１に述べたのと同様な方法に従ってｐ４３(1−312)遺伝子を含む組換えベクターで大腸菌ＢＬ２１を形質転換させた。発現したｐ４３(1−312)蛋白質を精製し、精製蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分析した。その結果、図２に示したように、４２ｋＤａの分子量を有するｐ４３(1−312)蛋白質が純粋に分離されたのを確認することができた。
【００３０】
精製ｐ４３(1−312)蛋白質のサイトカイン活性を測定するために、上記の実施例４と同様な方法によりＴＮＦ及びＩＬ−８の生産量を測定し、 その結果をそれぞれ図３及び図４に示した。
【００３１】
（比較例２）
ここでは、ｐ４３(148−312)遺伝子を含む組換えベクターの製造、蛋白質の発現及びサイトカイン活性の測定について示した。
配列番号１０及び１１で各々示される正方向及び逆方向のプライマを利用して、テンプレートとしてｐＭ３３８を利用したのを除けば、上記の実施例１と同様な方法に従ってＥＭＡＰIIをコードするｐ４３(148−312)遺伝子を含む組換えベクターを製造した。実施例１に述べたのと同様な方法に従ってｐ４３(148−312)遺伝子を含む組換えベクターで大腸菌ＢＬ２１を形質転換させた。発現した蛋白質を精製し、精製蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分析した。その結果、図２に示したように、２６ｋＤａの分子量を有するｐ４３(148−312)蛋白質が純粋に分離されたのを確認することができた。
【００３２】
精製ｐ４３(148−312)蛋白質のサイトカイン活性を測定するために、上記の実施例４と同様な方法によりＴＮＦ及びＩＬ−８の生産量を測定し、 その結果をそれぞれ図３及び図４に示した。
【００３３】
ｐ４３(1−312)( ｐ４３蛋白質) とｐ４３(148−312)( ＥＭＡＰII) 並びにｐ４３蛋白質の欠失突然変異蛋白質であるｐ４３(1−147)、 ｐ４３(1−108)及びｐ４３(91 −256)によって誘導されたＴＮＦ生産量を調べてみると、図３に示したようにｐ４３(1−312)の場合 1,500pg/ml 、ｐ４３(148−312)の場合 500pg/ml,ｐ４３(1−147)の場合 1,650pg/ml 、ｐ４３(1−108)の場合 1,000pg/ml またｐ４３(91 −256)の場合 2,200pg/ml と示された。この結果から、ＥＭＡＰIIであるｐ４３(148−312)よりもｐ４３蛋白質であるｐ４３(1−312)、ｐ４３蛋白質のＮ末端部位含む蛋白質すなわちｐ４３(1−147)、ｐ４３(1−108)又はｐ４３(91 −256)によって、ＴＮＦがより多く生産されることが認められた。
【００３４】
また、上記のそれぞれの蛋白質によって誘導されたＩＬ−８の生産量を調べてみると、 図４に示したようにｐ４３(1−312)の場合１,495pg/ml 、ｐ４３(148−312)の場合 650pg/ml 、ｐ４３(1−147)の場合 1,650pg/ml 、ｐ４３(1−108)の場合１,050pg/ml 、またｐ４３(91 −256)の場合 1,950pg/ml と示された。この結果から、ＥＭＡＰIIであるｐ４３(148−312)よりもｐ４３蛋白質であるｐ４３(1−312)、ｐ４３蛋白質のＮ末端部位を含む蛋白質すなわちｐ４３(1−147)、ｐ４３(1−108)又はｐ４３(91 −256)によって、ＩＬ−８がより多く生産されることが認められた。
【００３５】
上記の結果で、 ｐ４３蛋白質のＮ末端部位を含むｐ４３(1−147)、ｐ４３(1−108)及びｐ４３(91 −256)がＥＭＡＰIIよりも優れたサイトカイン活性を示すことが確認された。これによってｐ４３のＮ末端部位がサイトカイン活性に非常に重要な役割を果たしていることが示された。 従って、本発明のｐ４３のＮ末端部位を含むペプチドは、優れたサイトカイン活性を示す免疫増強剤として使用することが可能である。
【００３６】
【発明の効果】
本発明によれば、ｐ４３のＮ末端部位を含むペプチドであるｐ４３(1−147)、ｐ４３(1−108)及びｐ４３(91 −256)は、ＥＭＡＰIIよりも優れたサイトカイン活性を有し、ＴＮＦ及びＩＬ−８の生産量を増加させることにより免疫反応を向上させるので、優れた免疫増強剤として使用することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１】正常ｐ４３と比較した、本発明で製造したｐ４３の欠失突然変異蛋白質の相対的な位置及び大きさを示す。
【図２】本発明で製造したｐ４３の欠失突然変異蛋白質及びｐ４３蛋白質を精製した後の、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析結果を示す。
【図３】精製したｐ４３の欠失突然変異蛋白質及びｐ４３蛋白質の各々をヒト単球ＴＨＰ−１細胞に添加して細胞をインキュベートした後の、ＴＮＦの生産量を示す。
【図４】精製したｐ４３の欠失突然変異蛋白質及びｐ４３蛋白質の各々をヒト単球ＴＨＰ−１細胞に添加して細胞をインキュベートした後の、ＩＬ−８の生産量を示す。
【００３７】
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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