(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）、（ｂ）および（ｃ）からなる群より選ばれるポリペプチド。
（ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号２記載のアミノ酸配列の３９〜３４２番目のアミノ酸配列を含むポリペプチド
（ｃ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされるポリペプチドであり、かつα１，３−フコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチド
【請求項２】
以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）からなる群より選ばれるＤＮＡ。
（ａ）請求項１の（ａ）または（ｂ）に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ
（ｂ）配列番号１で表される塩基配列を有するＤＮＡ
（ｃ）配列番号１で表される塩基配列の１２３〜１１４８番目の塩基配列を有するＤＮＡ
（ｄ）配列番号１で表される塩基配列の２７３〜１１４８番目の塩基配列を有するＤＮＡ
（ｅ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであり、かつα１，３−フコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
【請求項３】
請求項２記載のＤＮＡを有する組換え体ベクター。
【請求項４】
動物細胞から抽出したｍＲＮＡを鋳型として合成したｃＤＮＡを発現クローニングベクターに組み込むことによりｃＤＮＡライブラリーを構築し、該ｃＤＮＡライブラリーを細胞に導入し、得られる細胞よりシアリルルイスｘ（Sialyl-Lewis x）糖鎖に対する抗体と強く反応する細胞を選別し、該細胞より請求項１記載のポリペプチドをコードするｃＤＮＡを採取することを特徴とする請求項２記載のＤＮＡの製造法。
【請求項５】
動物細胞から抽出したｍＲＮＡを鋳型として合成したｃＤＮＡを発現クローニングベクターに組み込むことによりｃＤＮＡライブラリーを構築し、該ｃＤＮＡライブラリーを細胞に導入し、得られる細胞よりシアリルルイスｘ（Sialyl-Lewis x）糖鎖に対する抗体と強く反応する細胞を選別し、該細胞より請求項１記載のポリペプチドをコードするｃＤＮＡを単離し、該ｃＤＮＡをベクター中のプロモーターの下流に導入することを特徴とする請求項３記載の組換え体ＤＮＡの製造法。
【請求項６】
請求項３記載の組換え体ＤＮＡを保有する細胞を培地に培養し、培養物中に請求項１記載のポリペプチドを生成蓄積させ、該培養物から該ポリペプチドを採取することを特徴とする請求項１記載のポリペプチドの製造法。
【請求項７】
組換え体ベクターが、プラスミドｐＵＣ１１９−ＴＨ２１Ｒである請求項３記載の組換え体ベクター。
【請求項８】
請求項３記載の組換え体ベクターを含有する細胞。
【請求項９】
請求項８記載の細胞を用いて、糖タンパク質または糖脂質の糖鎖、またはオリゴ糖に含まれるＮ−アセチルグルコサミンにα１→３結合でフコースを付与する方法。
【請求項１０】
請求項８記載の細胞を用いて、糖タンパク質または糖脂質の糖鎖上、またはオリゴ糖上にシアリルルイスｘ（Sialyl-Lewis x）構造を導入する方法。
【請求項１１】
請求項１記載のポリペプチドを用いて、糖タンパク質または糖脂質の糖鎖、またはオリゴ糖に含まれるＮ−アセチルグルコサミンにα１→３結合でフコースを付与する方法。
【請求項１２】
請求項１記載のポリペプチドを用いて、糖タンパク質または糖脂質の糖鎖上、またはオリゴ糖上にシアリルルイスｘ（Sialyl-Lewis x）構造を導入する方法。
【請求項１３】
請求項２記載のＤＮＡを用いるハイブリダイゼーション法により、請求項１記載のポリペプチドの生産を検出する方法。
【請求項１４】
請求項２記載のＤＮＡの一部の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用いるポリメラーゼ・チェイン・リアクション法により、請求項１記載のポリペプチドの生産を検出する方法。
【請求項１５】
請求項２記載のＤＮＡ、または該ＤＮＡの翻訳開始領域にある10〜50塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いる請求項１記載のポリペプチドの生産を抑制する方法。
【請求項１６】
請求項３または７に記載の組換え体ベクターを含有する大腸菌。
【請求項１７】
大腸菌が、Escherichia coli JM105/pUC119-TH21R（FERM BP-4193）である請求項１６記載の大腸菌。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、新規α１，３−フコシルトランスフェラーゼ、該フコシルトランスフェラーゼをコードするｃＤＮＡ、該ｃＤＮＡが組み込まれた組換え体ベクターおよび該組換え体ベクターを含有する細胞ならびにそれらの製造法に関する。また、該フコシルトランスフェラーゼを用いる糖鎖の製造法および該フコシルトランスフェラーゼを形質転換細胞内に生産させることによる糖鎖の製造法に関する。さらに、本発明のα１，３−フコシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡを用いる、該フコシルトランスフェラーゼの検出方法および生産の抑制方法に関する。本発明のα１，３−フコシルトランスフェラーゼは、シアリルルイスｘ（Sialyl-Lewis x）等の有用生理活性を有する糖鎖とその修飾物の製造等に有用である。
背景技術
大腸菌などの原核生物によって生産されるタンパク質が糖鎖を有していないのに対し、酵母、カビ、植物細胞、動物細胞等の真核生物によって生産されるタンパク質および脂質には糖鎖が結合している場合が多い。
動物細胞の糖鎖としては、タンパク質に付加するものとして、タンパク質中のアスパラギン（Ａｓｎ）残基に結合するＮ−グリコシド結合型糖鎖（Ｎ−グリカンとも呼ばれる）、およびセリン（Ｓｅｒ）またはスレオニン（Ｔｈｒ）残基に結合するＯ−グリコシド結合型糖鎖（Ｏ−グリカンとも呼ばれる）が知られている。最近、数多くのタンパク質には糖鎖を含むある種の脂質が共有結合しており、この脂質を介してそれらのタンパク質は細胞膜に付着していることが明らかとなった。糖鎖を含むこの脂質はグリコシル・ホスファチジルイノシトール・アンカー（glycosyl phosphatidylinositol anchor）と呼ばれる。
他に、動物細胞の糖鎖としては、グリコサミノグリカン（glycosaminoglycan）があげられる。タンパク質とグリコサミノグリカンが共有結合している化合物はプロテオグリカン（proteoglycan）と呼ばれる。プロテオグリカンの糖鎖を構成するグリコサミノグリカンは、糖タンパク質糖鎖であるＯ−グリカンと構造が類似しているが化学的には異なっている。グリコサミノグリカンは、グルコサミン（glucosamine）またはガラクトサミン（galactosamine）とウロン酸〔但し、ケラタン硫酸（keratan sulfate）はウロン酸を有していない〕を含む２糖単位の繰り返し構造から成り、硫酸基が共有結合している〔但し、ヒアルロン酸（hyaluronicacid）は硫酸基を有していない〕という特徴を有している。
さらに、動物細胞の糖鎖として、糖脂質（glycolipid）と呼ばれる物質に含まれる糖鎖が挙げられる。動物細胞の糖脂質としては、糖と長鎖脂肪酸と長鎖塩基であるスフィンゴシン（sphingosine）が共有結合したスフィンゴ糖脂質（sphingoglycolipid）と、糖質がグリセロールに共有結合したグリセロ糖脂質（glyceroglycolipid）とが知られている。
最近、糖鎖の機能については分子生物学や細胞生物学の進歩とともに急速に解明が進んでおり、現在までに糖鎖の多様な機能が明らかにされてきている。まず、血中における糖タンパク質のクリアランスに糖鎖は重要な役割を果たしている。大腸菌に遺伝子を移入して作られたエリスロポイエチン（erythropoietin）は、生体外（in vitro）では活性を示すが、生体内（in vivo）では急速にクリアランス（clearance）されることが知られている〔ドーダル（Dordal）ら：エンドクリノロジー（Endocrinology），116，2293（1985）およびブローネ（browne）ら：コールド・スプリング・ハーバー・シンポジア・オン・クアンティテェイティブ・バイオロジー（Cold Spr.Harb.Symp.Quant.Biol.），51，693（1986）〕。ヒト顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（human granulocyte-macrophage colony stimulation factor；ｈＧＭ−ＣＳＦ）は、天然ではＮ−グリコシド結合型糖鎖を２本持っているが、糖鎖の本数を減らすとそれに比例してラット血漿中のクリアランス速度が速まることが知られている〔ドナヒュー（Donahue）ら：コールド・スプリング・ハーバー・シンポジア・オン・クアンティテェイティブ・バイオロジー（Cold Spr.Harb.Symp.Quant.Biol.），51，685（1986）〕。クリアランスの速度およびクリアランスされる部位は糖鎖の構造によっても変化し、シアル酸がついたｈＧＭ−ＣＳＦは腎臓でクリアランスされるのに対し、シアル酸を除去したｈＧＭ−ＣＳＦはクリアランス速度が速まり、肝臓でクリアランスされることが知られている。ラット肝初代培養の系で各種のＮ−グリコシド型糖鎖生合成阻害剤存在下に生合成された、糖鎖構造の異なるα1-acid glycoproteinについて、ラットの血漿中のクリアランス速度及びラット灌流液からのクリアランス速度を調べたところ、どちらの場合も、高マンノース型、糖鎖欠損型、ハイブリッド型、複合型（天然型）の順でクリアランス速度が遅くなった。血栓溶解剤としてすでに医薬品として用いられている組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ；tissue-type plasminogen activator）の血中でのクリアランスもその糖鎖の構造が大きく影響を与えることが知られている。
糖鎖がタンパク質にプロテアーゼ抵抗性を付与することが知られており、例えば、フィブロネクチン（fibronectin）の糖鎖形成をツニカマイシンで阻害すると、得られた糖鎖欠損フィブロネクチンの細胞内分解速度が増進する。糖鎖の付加により、熱安定性や抗凍結性が増大することも知られている。エリスロポイエチンやβ−インターフェロンなどにおいては、タンパク質の溶解性の増大に糖鎖が寄与していることが知られている。
糖鎖は、タンパク質が正しい立体構造を保持するのにも役立っている。水泡性口内炎ウイルスの膜結合糖タンパク質の天然に存在する２本のＮ−グリコシド結合型糖鎖を除去すると、タンパク質の細胞表面への輸送が阻害されるが、そのタンパク質に新たな糖鎖が付加されるとそれが回復することが知られている。この場合、糖鎖の除去により、ジスルフィド結合によるタンパク質分子間の会合が誘起され、その結果タンパク質の輸送が阻害されることが明らかとなった。新たに糖鎖を付加すると、この会合が阻害されることによりタンパク質の正しい立体構造が保持されるため、タンパク質の輸送が可能になる。その際新たな糖鎖が付加される位置については、かなりの融通性があることが示されている。その反面、糖鎖が導入される位置によっては天然の糖鎖を有するタンパク質の輸送をも完全に阻害する場合があることも明らかとなった。
糖鎖がポリペプチド上の抗原部位をマスクしている例も知られている。ｈＧＭ−ＣＳＦ、プロラクチン（prolactin）、インターフェロン−γ、ラウシャー（Rauscher）白血病ウィルスgp70およびインフルエンザヘマグルチニン（influenza hemagglutinin）において、ポリクローナル抗体またはペプチド上の特定の領域に対する単クローン抗体を用いた実験から、これらタンパク質の糖鎖が、抗体との反応を阻害していると考えられている。糖鎖自身が糖タンパク質の活性発現に直接かかわっている場合があることも知られており、例えば、黄体形成ホルモン、濾胞刺激ホルモン、絨毛性性腺刺激ホルモン等のような糖タンパク質ホルモンの活性発現に糖鎖が関与していると考えられている。
糖鎖の重要な機能として、糖鎖が、細胞間、タンパク質間または細胞とタンパク質間の認識現象に関与していることが挙げられる。例えば、糖鎖の構造の違いにより生体内でクリアランスされる場所が異なることが知られている。最近、炎症反応に対し、特異的に血管内皮細胞上に発現し、好中球との接着を促すタンパク質ELAM-1（E-セレクチン（selectin）とも呼ばれる）のリガンドがSialyl-Lewis xと呼ばれる糖鎖〔NeuAcα2-3Galβ1-4（Fucα1-3）GlcNAc、NeuAc：シアル酸；Gal：ガラクトース；Fuc：フコース；GlcNAc：Ｎ−アセチルグルコサミン〕であることが判明し、糖鎖自体あるいは糖鎖の修飾物が医薬品などに利用できる可能性が出てきた〔フィリプス（Phillips）ら：サイエンス（Science）, 25, 1130（1990）、ゲルツ（Goelz）ら：トレンズ・イン・グライコサイエンス・アンド・グライコテクノロジー（Trends in Glycoscience and Glycotechnology），4，14-24（1992）〕。一部のＴリンパ球や好中球に発現しているL-セレクチン（L-selectin）や炎症刺激によって血小板や血管内皮細胞の膜表面に発現するGMP-140（P-セレクチンとも呼ぶ）はELAM-1と同じく炎症反応に関係しており、それらのリガンドもELAM-1のリガンドであるSialyl-Lewis x糖鎖に類似した糖鎖であることが示唆されている〔ローゼン（Rosen）ら：トレンズ・イン・グライコサイエンス・アンド・グライコテクノロジー（Trends in Glycoscience and Glycotechnology），4，1-13（1992）、ラーセン（Larsen）ら：トレンズ・イン・グライコサイエンス・アンド・グライコテクノロジー（Trends in Glycoscience and Glycotechnology），4，25-31（1992）、アルフォ（Aruffo）ら：トレンズ・イン・グライコサイエンス・アンド・グライコテクノロジー（Trends in Glycoscience and Glycotechnology），4，146-151（1992）〕。ELAM-1、GMP-140、L-セレクチンは構造が互いに類似しており、これらは総称してセレクチン（selectin）と呼ばれる。
炎症反応と同様に、癌の転移においても、ELAM-1やGMP-140は癌細胞の血管内壁への接着や癌細胞と血小板との凝集を引き起こすことにより癌転移を促進していることが示唆されている〔ゲルツ（Goelz）ら：トレンズ・イン・グライコサイエンス・アンド・グライコテクノロジー（Trends in Glycoscience and Glycotechnology），4，14-24（1992）、ラーセン（Larsen）ら：トレンズ・イン・グライコサイエンス・アンド・グライコテクノロジー（Trends in Glycoscience and Glycotechnology），4，25-31（1992）〕。このことは転移能の高い癌細胞ではSialyl-Lewis x糖鎖の発現量が高いという知見とも符合する〔入村（Irimura）ら：実験医学（Experimental Medicine），6，33-39（1988）〕。ELAM-1はSialyl-Lewis x糖鎖だけでなく、Sialyl-Lewis aと呼ばれる糖鎖〔NeuAcα2-3Galβ1-3（Fucα1-4）GlcNAc〕とも結合し、しかもSialyl-Lewis a糖鎖との結合力の方がむしろ強いことが知られている〔バーグ（Berg）ら：ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J.Biol.CHem.），266，14869-14872（1991）、高田（Takada）ら：バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーション（Biochem.Biophys.Res.Commun.），179，713-719（1991）、ラーキン（Larkin）ら：ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J.Biol.Chem.），267，13661-13668（1992）〕。このSialyl-Lewis a糖鎖も細胞が癌化すると発現する糖鎖抗原であり、癌の転移との相関を示す報告がされている〔神奈木（Kannnagi）と高田（Takada）：実験医学（Experimental Medicine），10，96-107（1992）〕。
これらの知見から、Sialyl-Lewis x糖鎖、Sialyl-Lewis a糖鎖あるいはそれらの誘導体は、ELAM-1、L-セレクチンまたはGMP-140に結合することにより優れた抗炎症効果を発揮すること、および癌転移を抑制することが期待される。
上述の炎症反応と癌転移の機構を考慮すると、ELAM-1、L-セレクチン、GMP-140が認識するリガンド糖鎖の合成を司る糖転移酵素の発現を抑制することによっても炎症反応を抑制したり、癌転移を防止できることが期待される。ある特定の遺伝子の発現を抑制するには、アンチセンスＲＮＡ／アンチセンスＤＮＡ技術〔徳久（Tokuhisa）：バイオサイエンスとインダストリー，50，322-326（1992）、村上（Murakami）：化学，46，681-684（1991）〕またはトリプル・ヘリックス（Triple helix）技術〔チュブ（Chubb）とホーガン（Hogan）：トレンズ・イン・バイオテクノロジー（Trends in Biotechnology），10，132-136（1992）〕が有用である。このアンチセンスＲＮＡ／ＤＮＡ技術を用いて所望の糖転移酵素の発現を抑制するには、その遺伝子あるいは遺伝子の塩基配列情報が必要であるから、所望の糖転移酵素の遺伝子をクローン化すること、およびその塩基配列情報を解析することは重要である。
炎症性白血球や癌細胞での特定の糖転移酵素の発現を調べることにより、炎症性疾患や癌の悪性度を診断することもできる。所望の糖転移酵素遺伝子の発現を調べるには、該遺伝子を放射能などで標識したものをプローブとするノーザンハイブリダイゼーション法〔サンブルック（Sambrook）、フリッチ（Fritsch）、マニアチス（Maniatis）（モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（Molecular Cloning, A laboratory manual）、第２版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Cold Spring Harbor Laboratory Press）、１９８９年刊〕やポリメラーゼ・チェイン・リアクション法（以下、ＰＣＲ法と略記する）〔イニス（Innis）ら：ＰＣＲプロトコールズ（PCR Protocols）、アカデミック・プレス（Academic Press）、1990年刊〕が有用である。これらの手法を適用するには、所望の糖転移酵素遺伝子あるいは遺伝子の塩基配列情報が必要である。この点からも、所望の糖転移酵素の遺伝子をクローン化すること、およびその塩基配列情報を解析することは重要である。
特開平2-227075に顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ；granulocyte colony-stimulating factor）やプロウロキナーゼ（pro-UK；pro-urokinase）等の有用生理活性タンパク質に、組換えＤＮＡ技術を用いて人為的に糖鎖を導入することにより、これらのタンパク質の性質を改善することができることが開示されている。
以上のように、糖タンパク質の糖鎖の構造を改変したり、特定の糖鎖あるいはその修飾物を大量に調製することは産業上極めて重要な課題である。
糖鎖の構造を改変する手段については近年著しく進展している。特に糖鎖を逐次解離してゆく特異性の高い酵素（エキソグリコシダーゼ）やペプチド鎖との結合点をペプチド鎖と糖鎖の双方を変化させずに解裂させるグリコペプチダーゼやエンド型グリコシダーゼによって、糖鎖の構造を改変させることができ、糖鎖の生物学的な役割についても詳細な研究ができるようになった。
さらに、最近、糖脂質の糖鎖とセラミドの間を解裂するエンドグリコセラミダーゼ（endoglycoceramidase）が見出され〔伊東と山形：ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J.Biol.Chem.），261，14278（1986）〕、これにより、糖脂質の糖鎖の調製が容易になっただけでなく、糖脂質、特に細胞表層糖脂質の機能を解明する研究が進展した。また、糖転移酵素により、新たな糖鎖を付加することも可能となってきた。例えば、シアリルトランスフェラーゼにより、糖鎖の末端にシアル酸を新たに付加することができる〔サベサン（Sabesan）とポールソン（Paulson）：ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサエティー（J.Am.Chem.Soc.），108，2068（1986）〕。その他種々の糖転移酵素やグリコシダーゼの阻害剤〔アランら：アニュアル・レビュー・オブ・バイオケミストリー（Annu. Rev. Biochem.），56，497（1987）〕を用いることにより、付加する糖鎖を変化させることも可能である。しかしながら、糖鎖の合成に用いる糖転移酵素を大量に製造する方法はない。組換えＤＮＡ技術を用いて糖転移酵素をクローン化し、糖転移酵素を宿主細胞内で効率よく発現させることにより、糖転移酵素を大量に製造することが望まれる。
Sialyl-Lewis x糖鎖あるいはSialyl-Lewis a糖鎖の合成に関与する可能性を有するα1,3あるいはα1,4-フコシルトランスフェラーゼに関しては、これまでに５種類の酵素活性の存在が示唆されている〔モリコン（Mollicone）ら：カーボハイドレイト・リサーチ（Carbohydrate Research），228，265-276（1992）、ウェストン（Weston）ら：ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J.Biol.Chem.），267，24575-24584（1992）〕。α1,3あるいはα1,4-フコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子のうち、単離が報告されているものは、ルイス式血液型抗原糖鎖の合成に直接関与しているα（1,3/1,4）−フコシルトランスフェラーゼ（以下、Fuc-TIIIと略記する）〔クコウスカ−ラタロ（Kukowska-Latallo）ら：ジーンズ・アンド・ディベロップメント（Genes & Development），4，1288-1303（1990）〕、EFLTと名付けられたα１，３−フコシルトランスフェラーゼ（以下、Fuc-TIVと略す）〔ゲルツ（Goelz）ら：セル（Cell），63，1349-1356（1990）〕、ハイブリダイゼーション法によりウェストン（Weston）らが単離したα１，３−フコシルトランスフェラーゼ（以下、Fuc-TVと略記する）〔ウェストン（Weston）ら：ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J.Biol.Chem.），267，4152-4160（1992）〕、およびウェストン（Weston）らがハイブリダイゼーション法により単離したα１，３−フコシルトランスフェラーゼ（以下、Ruc-TVIと略記する）〔ウェストン（Weston）ら：ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J.Biol.Chem.），267，24575-24584（1992）〕の４種類である。
医薬分野において、顆粒球などの炎症性白血球において、ELAM-1ゃGMP-140のリガンドであるシアリルルイスｘ関連糖鎖の合成に直接関与するα１，３−フコシルトランスフェラーゼを同定することは重要である。
上記４種類のα１，３−フコシルトランスフェラーゼのうち、Fuc-TIVだけではELAM-1のリガンドであるSialyl-Lewis x糖鎖およびSialyl-Lewis a糖鎖を合成できないことが示唆されており〔ロウ（Lowe）ら：ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J.BIol.Chem.），266，17467-17477（1991）、クマー（Kumar）ら：ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J.Biol.Chem.），266，21777-21783（1991）〕、ELAM-1への接着が報告されているヒト顆粒球系細胞株HL-60〔ロブ（Lobb）ら：ジャーナル・オブ・イムノロジー（J. Immunol.），147，124-129（1991）〕等のヒト顆粒球系あるいは単球系細胞から、ELAM-1のリガンド合成に直接関与するα１，３−フコシルトランスフェラーゼは得られていない。
以上のことから、ヒト顆粒球系あるいは単球系細胞からELAM-1のリガンド合成に直接関与するα１，３−フコシルトランスフェラーゼを同定・単離することは、生体内でELAM-1との接着に直接関与する糖鎖リガンドをインビトロ（in vito）あるいはインビボ（in vivo）で効率よく生産するために重要であり、しかも該α１，３−フコシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡを利用したＰＣＲ法などにより、炎症部位でのそのフコシルトランスフェラーゼを検出したり、その生産を抑制したりすることに有用である。
本発明の目的は、動物細胞、特にナマルバ細胞において、ELAM-1などのセレクチンのリガンド糖鎖を有する糖タンパク質あるいは糖脂質の効率的生産を行うことができる新規α１，３−フコシルトランスフェラーゼおよび該フコシルトランスフェラーゼをコードするｃＤＮＡおよび該ｃＤＮＡを含有するベクターを提供することにある。また、上述のアンチセンスＲＮＡ／ＤＮＡ技術を用いて該フコシルトランスフェラーゼの活性発現を抑制することにより炎症などの疾病を治療するため、およびノーザンハイブリダイゼーション法またはＰＣＲ法を用いてそれらの疾病の診断を行うための該フコシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡを提供することにある。
発明の開示
本発明者らは、単球系細胞株THP-1から抽出したｍＲＮＡを鋳型として合成したｃＤＮＡを発現クローニングベクターに組み込むことによりｃＤＮＡライブラリーを構築し、該ｃＤＮＡライブラリーを細胞に導入し、得られる細胞をフルオレッセンス・アクティベーテッド・セル・ソーター（Fluorescence Activated Cell Sorter；以下、FACSと略記する）を利用して、ELAM-1のリガンドであるシアリルルイスｘ糖鎖に対する抗体と強く反応する細胞を単離することによりα１，３−フコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子をクローン化した。さらに、該フコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子をナマルバ細胞に導入して発現させたところ、新規なα１，３−フコシルトランスフェラーゼを発現すること、さらにELAM-1のリガンドであるシアリルルイスｘ糖鎖の細胞表面での存在量が増加すること、および該フコシルトランスフェラーゼがシアリルルイスｘ糖鎖を生産している顆粒球系細胞あるいは単球系細胞に局在していることを見い出し、本発明を完成させた。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、配列番号２で示されるアミノ酸配列を含む新規α１，３−フコシルトランスフェラーゼおよび該フコシルトランスフェラーゼをコードするｃＤＮＡおよび該ＤＮＡを含有する組換え体ベクターに関する。本発明のα１，３−フコシルトランスフェラーゼは、Ｎ−アセチルグルコサミニド（N-acetulglucosaminide）フコシルトランスフェラーゼ活性を有する糖転移酵素であり、受容体糖鎖に含まれるＮ−アセチルグルコサミンにα１→３結合様式でフコースを付加する活性を有する。本発明のα１，３−フコシルトランスフェラーゼは、ナマルバ細胞で発現させた場合に、ELAM-1のリガンドであるシアリルルイスｘ糖鎖の量を増加させる活性を有する。
本発明のα１，３−フコシルトランスフェラーゼをコードするｃＤＮＡとしては、（ａ）配列番号１で示される塩基配列を含むＤＮＡ、（ｂ）一つのアミノ酸に対して複数種の遺伝暗号が存在するため、あるいはヒトを含む動物個々に起こる自然変異などのため配列番号１で示される塩基配列とは異なる塩基配列を含むＤＮＡ、（ｃ）（a）および（b）で定義されるＤＮＡに対して、本発明のα１，３−フコシルトランスフェラーゼ活性を失わない範囲内で置換変異、欠失変異、挿入変異などの変異が導入されたＤＮＡ、例えば、（a）または（b）で定義されるＤＮＡがコードするα１，３−フコシルトランスフェラーゼと相同性を有するＤＮＡなどを包含する。この相同性を有するＤＮＡとは、配列番号１で示される塩基配列を含むＤＮＡをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法あるいはプラーク・ハイブリダイゼーション法を用いることにより得られるＤＮＡを意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、0.7〜1.0Mの塩化ナトリウムの存在下で65℃でハイブリダイゼーションを行った後、0.1倍濃度から２倍濃度までの間の濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、150mM塩化ナトリウム、15mMクエン酸ナトリウムである）の中、65℃でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡを意味する。なお、ハイブリダイゼーションの実験法は、モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（Molecular Cloning, A laboratory manual）、第２版〔サンブルック（Sambrook）、フリッチ（Fritsch）、マニアチス（Maniatis）編集、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Cold Spring Harbor Laboratory Press）、１９８９年刊〕に記載されている。本発明のα１，３−フコシルトランスフェラーゼは上記（a）、（b）および（c）で定義されるＤＮＡによってコードされる全てのα１，３−フコシルトランスフェラーゼを包含する。
以下に、本発明のα１，３−フコシルトランスフェラーゼをコードするｃＤＮＡの製造法を上記（a）で定義されるｃＤＮＡの製造法を例にして示す。
単球系細胞株THP-1から抽出したｍＲＮＡを鋳型として合成したｃＤＮＡを発現クローニングベクター（Expression Cloning Vector）に組み込むことにより、ｃＤＮＡライブラリーを構築する。このｃＤＮＡライブラリーを動物細胞あるいは昆虫細胞に導入した後、FACSを利用して、ELAM-1のリガンドであるシアリルルイスｘ糖鎖に対する抗体と強く反応する細胞を濃縮・単離した後、該細胞から所望のα１，３−フコシルトランスフェラーゼをコードするｃＤＮＡを得る。
上記の方法で用いられる動物細胞は、本発明のα１，３−フコシルトランスフェラーゼを発現している動物細胞であればいかなる細胞でも用いることができる。例えば、ヒト単球系細胞株THP-1（ATCC TIB 202）、ヒト単球系細胞株U-937（ATCC CRL 1593）、またはヒト顆粒球系細胞株HL-60（ATCC CCL 240）などが用いられる。これらの細胞から抽出したｍＲＮＡを鋳型として合成したｃＤＮＡを組み込むベクターは、該ｃＤＮＡを組み込み発現できるベクターであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ｐＡＭｏＰＲＣ３Ｓｃ等が用いられる。該ベクターにより構築されるｃＤＮＡライブラリーを導入する動物細胞あるいは昆虫細胞は、該ｃＤＮＡライブラリーを導入し、発現できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ヒトナマルバ（Namalwa）細胞〔細井ら：サイトテクノロジー（Cytotechnology），1，151（1988）〕などが用いられる。とくに、宿主としてナマルバ細胞を用いる直接発現クローン化系は、宿主であるナマルバ細胞へのｃＤＮＡライブラリーの導入効率が極めて高く、しかも導入されたプラスミド（ｃＤＮＡライブラリー）は、染色体外で存在可能であり、糖鎖特異的抗体とFACSを用いたスクリーニングにより取得した細胞からのプラスミドの回収が容易であるという利点を有しているため、好適に用いられる。また、本発明で用いられるシアリルルイスｘ糖鎖に対する抗体としては、シアリルルイスｘ糖鎖と反応する抗体であれば、いかなるものでも用いることができる。例えば、抗シアリルルイスｘ抗体であるKM93〔アンチキャンサー・リサーチ（Anticancer Res.），12，27（1992）〕が好適に用いられる。ｃＤＮＡライブラリーを導入した動物細胞を抗シアリルルイスｘ抗体を用いて蛍光染色した後、FACSを用いて抗体の結合量が増加した細胞を分離濃縮する。このようにして得られた細胞から公知の方法、例えば、ハート法〔ロバート・エフ・マーゴルスキー（Robert F.Margolskee）ら：モレキュラー・アンド・セリュラー・バイオロジー（Mol. Cell. Biol.），8，2837（1988）〕により、本発明のα１，３−フコシルトランスフェラーゼをコードするｃＤＮＡを含むプラスミドあるいは該ｃＤＮＡ部分を含むＤＮＡ断片を回収する。本発明の酵素をコードするｃＤＮＡを含むプラスミドとしては、例えば、pUC119-TH21Rが挙げられる。pUC119-TH21Rを含む大腸菌であるEscherichia coli JM105/pUC119-TH21Rは、平成５年２月18日付で工業技術院生命工学工業技術研究所にFERM BP-4193として寄託されている。
上記（b）および（c）で定義されるＤＮＡは上記の製造法で得られるα１，３−フコシルトランスフェラーゼをコードするｃＤＮＡをもとに、ハイブリダイゼーション法やＤＮＡに変異を導入する方法などの周知の組換えＤＮＡ技術〔特開平2-227075；モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（Molecular Cloning, A laboratory manual）、第２版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Cold Spring Harbor Laboratory Press）、１９８９年刊等〕を用いて製造することができる。また、本発明のα１，３-フコシルトランスフェラーゼをコードするｃＤＮＡは化学合成法を用いても製造することができる。
上記の方法により得られる本発明のα１，３−フコシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡを適当なベクターのプロモーター下流に挿入した組換え体ベクターを造成し、それを宿主細胞に導入し、得られた細胞を培養することにより、本発明のα１，３−フコシルトランスフェラーゼを製造することができる。ここで、用いられる宿主細胞としては、原核細胞、動物細胞、酵母、カビ、昆虫細胞など、これまで組換えＤＮＡ技術で用いられた宿主細胞ならば、いかなる細胞でも用いることができる。例えば、原核細胞としては大腸菌、動物細胞としてはチャイニーズ・ハムスターの細胞であるＣＨＯ細胞、サルの細胞であるＣＯＳ細胞、ヒトの細胞であるナマルバ細胞等が挙げられる。
本発明のα１，３−フコシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡを導入するベクターとしては、該フコシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡを組み込むことができ、宿主細胞で発現できるものであればいかなるベクターでも用いることができる。例えば、ｐＡＧＥ１０７〔特開平3-22979,Miyajiら：サイトテクノロジー（Cytotechnology）,3,133（1990）〕，ｐＡＳ３−３（特開平2-227075），ｐＡＭｏＥＲＣ３Ｓｃ，ＣＤＭ８〔ブライアン・シード（Brian Seed）ら：ネイチャー（Nature）,329,840（1987）〕等が挙げられる。また、大腸菌内で本発明の酵素を発現するためには、trpプロモーターなどの強力な転写活性を有するプロモーターの下流に外来ＤＮＡを挿入することができ、しかもシャイン−ダルガノ（Shine-Dalgarno）配列（以下、ＳＤ配列と略記する）と開始コドンの間を適当な距離（例えば、６〜１８塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。具体的には、ｐＫＹＰ１０（特開昭58-110600）、ｐＬＳＡ１〔宮地ら：アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー（Agric.Biol.Chem.），53，277（1989）〕、ｐＧＥＬ１〔関根ら：プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proc.Natl.Acak.Sci.）,USA，82,4306（1985）〕等が挙げられる。
本発明で用いる組換えＤＮＡ技術の一般的手法については、特開平2-227075あるいはサンブルック（Sambrook）、フリッチ（Fritsch）、マニアチス（Maniatis）らの方法〔モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（Molecular Cloning, A laboratory manual）、第２版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Cold Spring Harbor Laboratory Press）、１９８９年刊〕に記載されている方法を用いることができる。ｍＲＮＡの単離およびｃＤＮＡライブラリーの合成は、上記の方法の他、市販されている多くのキットを用いて行なうことができる。動物細胞へのＤＮＡの導入法としては、現在までに知られているいかなる方法も用いることができる。例えば、エレクトロポーレーション法〔Miyajiら：サイトテクノロジー（Cytotechnology），3，133（1990）〕、リン酸カルシウム法（特開平2-227075）、リポフェクション法〔フィリップ・エル・フェルグナー（Philip L. Felgner）ら：プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proc.Natl.Acad.Sci.），USA，84，7413（1987）〕等を用いることができる。形質転換株の取得および培養は、特開平2-227075あるいは特開平2-257891に記載されている方法に準じて行なうことができる。
クローン化したα１，３−フコシルトランスフェラーゼの生産方法としては、宿主細胞内に生産させる方法、宿主細胞外に分泌させる方法、あるいは宿主細胞外膜上に生産させる方法がある。生産部位は、使用する宿主細胞の種類、生産させる糖転移酵素の形によって変わってくる。動物細胞を宿主細胞として糖転移酵素を天然型のまま生産させる場合は、一般的に、宿主細胞内あるいは宿主細胞外膜上に生産され、一部は、プロテアーゼにより切断されて細胞外に分泌される。宿主細胞外に積極的に分泌させる場合は、ポールソンらの方法〔C. Paulsonら：ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J.Biol.Chem.），264，17619（1989）〕およびロウらの方法〔John. B. Loweら：プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proc.Natl.Acad.Sci.），USA，86，8227（1989）、John. B. Loweら：ジーンズ・アンド・ディベラプメント（Genes Develop.），4，1288（1990）〕に準じて遺伝子組換えの手法を用いて、糖転移酵素の活性部位を含む部分にシグナルペプチドを付加した形で生産させる。
特開平2-227075に記載されている方法に準じて、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子等を用いた遺伝子増幅系を利用して生産量を上昇させることもできる。
このようにして生産させた本発明のα１，３−フコシルトランスフェラーゼは、通常の糖転移酵素の精製方法〔J. Evan. Sadlerら：メソッド・イン・エンザイモロジー（Methods of Enzymology），83，458〕に準じて精製できる。また、大腸菌内に生産させる場合は、上記の方法と特開昭63-267292に記載された方法を組合わせることにより効率的に精製することができる。また、本発明の酵素を他のタンパク質との融合タンパク質として生産し、融合したタンパク質に親和性をもつ物質を用いたアフィニティークロマトグラフィーを利用して精製することもできる。例えば、ロウらの方法〔John. B. Loweら：プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proc.Natl.Acad.Sci.）,USA，86，8227（1989）、John. B. Loweら：ジーンズ・アンド・ディベラプメント（Genes Develop.），4，1288（1990）〕に準じて、本発明の酵素をプロテインＡとの融合タンパク質として生産し、イムノグロブリンＧを用いるアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる。また、該酵素自身に対する抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーで精製することもできる。
フコシルフェラーゼの活性は、公知の測定法〔J. Evan. Sadlerら：メソッド・イン・エンザイモロジー（Methods in Enzymology），83，458、Naoyuki Tanigutiら：メソッド・イン・エンザイモロジー（Methods in Enzymology），179，397〕に準じて測定する。
本発明のα１，３−フコシルトランスフェラーゼを用いて、イン・ビトロ（in vitro）で、糖鎖を合成することができる。例えば、糖タンパク質、糖脂質またはオリゴ糖が有するラクトサミン構造（Galβ１→４GlcNAc構造）中のGlcNAcにα１→３結合でフコースを付与することができる。また、基質となる糖タンパク質、糖脂質またはオリゴ糖に本発明のα１，３−フコシルトランスフェラーゼを作用させることにより、非還元末端の糖鎖の構造をシアリルルイスｘ構造にすることができる。
本発明のα１，３−フコシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡを用いて、該フコシルトランスフェラーゼの受容基質である糖鎖を生産している動物細胞あるいは昆虫細胞の中で、該フコシルトランスフェラーゼと有用生理活性を有する糖タンパク質、糖脂質またはオリゴ糖とを同時に生産させることにより、生産したα１，３−フコシルトランスフェラーゼを細胞の中で糖タンパク質、糖脂質またはオリゴ糖に作用させ、糖鎖構造が変化した糖タンパク質、糖脂質またはオリゴ糖を細胞の中で生産させることができる。
さらに、上記の方法により生産される糖鎖構造が変化した糖タンパク質、糖脂質またはオリゴ糖から公知の酵素的手法または化学的手法によりオリゴ糖の一部を切り出すこともできる。
本発明のα１，３−フコシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡは、タンパク質や糖脂質の糖鎖の改変および特定の糖鎖の効率的生産に用いることができるだけでなく、アンチセンスＲＮＡ／ＤＮＡ技術を用いて炎症や癌転移などの疾病の治療に利用すること、ならびにノーザンハイブリダイゼーション法またはＰＣＲ法を用いてそれらの疾病の診断に利用することも可能である。
例えば、本発明のα１，３−フコシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡを用いて、アンチセンスＲＮＡ／ＤＮＡ技術〔徳久（Tokuhisa）：バイオサイエンスとインダストリー，50，322-326（1992）、村上（Murakami）：化学、46，681-684（1991）、ミラー（Miller）：バイオテクノロジー（Biotechnology），9，358-362（1992）、コーエン（Cohen）：トレンズ・イン・バイテクノジー（Trendsin Biotechnology），10，87-91（1992）、アグラワル（Agrawal）：トレンズ・イン・バイオテクノジー（Trends in Biotechnology），10，152-158（1992）〕あるいはトリプル・ヘリックス技術〔チュブ（Chubb）とホーガン（Hogan）：トレンズ・イン・バイオテクノジー（Trends in Biotechnology），10，132-136（1992）〕により該フコシルトランスフェラーゼの活性発現を抑制することができる。具体的には、本発明のα１，３−フコシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡの一部の塩基配列、好ましくは翻訳開始領域にある10〜50塩基の塩基配列を基にしてオリゴヌクレオチドを設計・調製し、生体内に投与するにより、該フコシルトランスフェラーゼの生産を抑制することができる。合成オリゴヌクレオチドの塩基配列としては、本発明で開示されるアンチセンス鎖の塩基配列の一部と完全に一致するもの、あるいは該フコシルトランスフェラーゼの活性発現を抑制する活性を失わない範囲内で改変したものを利用できる。トリプル・ヘリックス技術を用いる場合、センス鎖およびアンチセンス鎖の双方の塩基配列の塩基配列情報をもとに、合成オリゴヌクレオチドの塩基配列を設計する。
また、ノーザンハイブリダイゼーション法またはＰＣＲ法により、本発明のα１，３−フコシルトランスフェラーゼの生産を検出することができる。ノーザンハイブリダイゼーション法またはＰＣＲ法を用いて本発明のα１，３−フコシルトランスフェラーゼの生産を検出するために、本発明のα１，３−フコシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡの塩基配列に基づいて合成オリゴヌクレオチドを調製する。ノーザンハイブリダイゼーション法およびＰＣＲ法は、それぞれ公知の方法〔サンブルック（Sambrook）、フリッチ（Fritsch）、マニアチス（Maniatis）（モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（Molecular Cloning, A laboratory manual）、第２版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Cold Spring Harbor Laboratory Press）、１９８９年刊およびイニス（Innis）ら：ＰＣＲプロトコールズ（PCR Protocols）、アカデミック・プレス（Academic PRress）、1990年刊〕に従って行う。
【図面の簡単な説明】
第１図は、プラスミドpAGEL106の造成工程を示す図である。
第２図は、プラスミドpASLB3-3-1の造成工程を示す図である。
第３図は、プラスミドpASLB3-3の造成工程を示す図である。
第４図は、プラスミドpASLBE3-3の造成工程を示す図である。
第５図は、プラスミドpASLBCの造成工程を示す図である。
第６図は、プラスミドpASLBECの造成工程を示す図である。
第７図は、プラスミドpASLBEC2の造成工程を示す図である。
第８図は、プラスミドpAMoEC2の造成工程を示す図である。
第９図は、プラスミドpAMoEC3の造成工程を示す図である。
第10図は、プラスミドpAMoERC3の造成工程を示す図である。
第11図は、プラスミドpAGE207の造成工程を示す図である。
第12図は、プラスミドpAGE207ScNの造成工程を示す図である。
第13図は、プラスミドpAMoC3Scの造成工程を示す図である。
第14図は、プラスミドpAMoERC3Scの造成工程を示す図である。
第15図は、プラスミドpAMoPRC3Scの造成工程を示す図である。
第16図は、プラスミドpUC119-TH21およびpUC119-TH21Rの造成工程を示す図である。
第17図は、間接蛍光抗体染色後、エピックス・エリート・フローサイトメーター［EPICS Elite Flow Cytometer；コールター（COULTER）社製］で解析を行なった結果を示す図である。ａは、pAMoPRC3Sc（コントロールプラスミド）あるいはpAMoPRTH21（α１，３−フコシルトランスフェラーゼ発現プラスミド）を導入したＫＪＭ−１株についてＣＳＬＥＸ１を用いて間接蛍光抗体染色を行なった結果を示す。ｂは、pAMoPRC3Sc（コントロールプラスミド）あるいはpAMoPRTH21（α１，３−フコシルトランスフェラーゼ発現プラスミド）を導入したＫＪＭ−１株についてＫＭ９３を用いて間接蛍光抗体染色を行なった結果を示す。いずれの場合も、pAMoPRC3Sc（コントロールプラスミド）を導入したＫＪＭ−１株について、正常マウス血清を用いて間接蛍光抗体染色を行なった結果を対照として示した。
第１８図は、プラスミドpAGE147の造成工程を示す図である。
第１９図は、プラスミドpAGE247の造成工程を示す図である。
第２０図は、プラスミドpAMN6hygの造成工程を示す図である。
第２１図は、プラスミドpAMoERSAの造成工程を示す図である。
第２２図は、プラスミドpAMoPRSAの造成工程を示す図である。
第２３図は、プラスミドpUC119-WM17の造成工程を示す図である。
第２４図は、プラスミドpAMoPRSAW17-31Fの造成工程を示す図である。
第２５図は、プラスミドpUC119-WM16およびpUC119-WM16Rの造成工程を示す図である。
第２６図は、プラスミドpAMoPRSAW16の造成工程を示す図である。
第２７図は、プラスミドpUC119-MAL4およびpUC119-MAL4Rの造成工程を示す図である。
第２８図は、プラスミドpAMoPRSAFT6の造成工程を示す図である。
第２９図は、プラスミドpAMoPRSAT21の造成工程を示す図である。
第３０図は、プラスミドpUC119-ACTの造成工程を示す図である。
第３１図は、プラスミドpUC119-ACTdの造成工程を示す図である。
第３２図は、プラスミドpUC119-TH21dの造成工程を示す図である。
各図における符号の意味は以下の通りである。
dufr：ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子
hG-CSF：ヒト顆粒球コロニー刺激因子遺伝子
bp：塩基対（base pairs）
kb：キロ塩基対（kilobase pairs）
G418/Km：トランスポゾン５（Tn5）由来G418、カナマイシン耐性遺伝子
hyg：ハイグロマイシン耐性遺伝子
Ap：pBR322由来アンピシリン耐性遺伝子
Tc：pBR322由来テトラサイクリン耐性遺伝子
P1：pBR322由来P1プロモーター
Ptk：ヘルペス・シンプレックス・ウイルス（Herpes simplex virus；HSV）チミジンキナーゼ（tk）遺伝子プロモーター
Sp.βG：ラビットβグロビン遺伝子スプライシングシグナル
A.βG：ラビットβグロビン遺伝子ポリＡ付加シグナル
A. SE：シミアン・ウィルス（simian virus）40（SV40）初期遺伝子ポリＡ付加シグナル
Atk：ヘルペス・シンプレックス・ウイルス（Herpes simplex virus；HSV）チミジンキナーゼ（tk）遺伝子のポリＡ付加シグナル
Pse：シミアン・ウィルス（simian virus）40（SV40）初期遺伝子プロモーター
Pmo：モロニー・マウス白血病ウイルスのロング・ターミナル・リピート（long terminal repeat：LTR）プロモーター
HTLV-1：ヒトＴ細胞白血病ウイルス（human T-cell leukemia virus type-1：HTLV-1）遺伝子
EBNA-1：エプシュタイン・バール・ウイルス（Epstein-Barr virus）のEBNA-1遺伝子
oriP：エプシュタイン・バール・ウイルス（Epstein-Barr virus）の複製開始点
ori：pUC119の複製開始点
lac'Z：大腸菌のβガラクトシダーゼ遺伝子の一部
IG：M13ファージDNAのインタージェニック領域（intergenic region）
G-CSF der.：ヒト顆粒球コロニー刺激因子誘導体の遺伝子
S：ヒト顆粒球コロニー刺激因子のシグナルペプチドをコードする遺伝子部分
AまたはProA：黄色ブドウ球菌Staphylococcus aureusのプロテインＡのＩｇＧとの結合領域をコードする遺伝子部分
TH21：THP-1細胞より取得したα１，３−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子（全長あるいは活性領域部分の遺伝子）
発明を実施するための最良の形態
実施例１  ヒト単球系細胞株THP-1細胞からのα１，３−フコシルトランスフェラーゼｃＤＮＡのクローン化
１．直接発現クローニングベクター（Expression Cloning Vector）ｐＡＭｏＥＲＣ３ＳｃおよびｐＡＭｏＰＲＣ３Ｓｃの造成
ｐＡＭｏＥＲＣ３Ｓｃを以下に示す（１）〜（１４）の工程に従って造成した。
（１）ｐＡＧＥＬ１０６の造成（第１図参照）
シミアン・ウィルス（simian virus）40（SV40）初期遺伝子プロモーターとヒトＴ細胞白血病ウイルス（human T-cell leukemia virus type-1：HTLV-1）のロング・ターミナル・リピート（long terminal repeat：LTR）のR領域とU5領域の一部を融合したプロモーターを有するプラスミドｐＡＧＥＬ１０６の造成を行なった。R領域とU5領域の一部を含むDNA断片［BanII-Sau3AI断片（0.27kb）］をｐＡＴＫ０３〔清水ら：プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミィ・オブ・サイエンス（Proc. Natl. Acad. Sci.），USA，80，3618（1983）〕から切り出し、合成リンカーを介してｐＡＧＥ１０６のBglI-BamHI間に挿入した。
ｐＡＧＥ１０６（特開平2-227075）１μｇを10mMトリス−HCl（pH7.5）、6mM MgCl2、100mM塩化ナトリウム、6mM ２−メルカプトエタノールからなる緩衝液（以下、Ｙ−１００緩衝液と略記する）30μｌに溶解し、10単位のBglI（宝酒造社製、以下、特に断らないかぎり制限酵素は宝酒造社製のものを用いた）と10単位のBamHIを加え、37℃で２時間消化反応を行なった。該反応液をアガロースゲル電気泳動に供した後、約4.9kbのＤＮＡ断片を回収した。
また、ｐＡＴＫ０３の１μｇをＹ−１００緩衝液30μｌに溶解し、10単位のBanIIを加え、37℃で２時間消化反応を行ない、アガロースゲル電気泳動に供した後、約0.4kbのＤＮＡ断片を回収した。回収したＤＮＡ断片は30μｌのＹ−１００緩衝液に溶解し、10単位のSau3AIを加え37℃で２時間消化反応を行ない、アガロースゲル電気泳動に供した後、約0.27kbのＤＮＡ断片を回収した。
また別に、BglI切断部位とBanII切断部位を連結するためのリンカーとして以下のＤＮＡリンカー合成した。
0003756946.tif 000002
このＤＮＡリンカーの5merと6merの１本鎖ＤＮＡはそれぞれアプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）社３８０Ａ・ＤＮＡ合成機を用いて合成した。合成したＤＮＡはそれぞれ0.2μｇずつ、50mMトリス−HCl（pH7.5）、10mM MgCl2、5mMジチオスレイトール（以下、DTTと略記する）、0.1nM EDTA、および1mM ATPを含む緩衝液（以下、Ｔ４キナーゼ緩衝液と略記する）40μｌに溶解し、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造社製、以下同じ）30単位を加えて、37℃で２時間リン酸化反応を行なった。
上記で得られたｐＡＧＥ１０６由来のBglI-BamHI断片（4.9kb）0.2μｇとｐＡＴＫ０３由来のBanII-Sau3AI断片（0.27kb）0.01μｇを66mMトリス-HCl（pH7.5）、6.6mM MgCl2、10mM DTTおよび0.1mMアデノシン３リン酸（以下、ATPと略記する）からなる液（以下、Ｔ４リガーゼ緩衝液と略記する）30μｌに溶解し、上記ＤＮＡリンカーを0.01μｇとＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製、以下同じ）175単位を加えて、12℃で16時間結合反応を行なった。
該反応液を用いて大腸菌HB101株ボリバー〔（Bolivar）ら：ジーン（Gene），2，75（1977）〕をコーエンらの方法〔エス・エヌ・コーエン（S.N.Cohen）ら：プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proc. Natl. Acad.Sci.）USA，69，2110（1972）］（以下、大腸菌の形質転換にはこの方法を用いた）によって形質転換し、アンピシリン耐性株を得た。この形質転換株から公知の方法〔エイチ・シー・バーンボイム（H.C.Birnboim）ら：ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Nucleic Acids Res.），7，1513（1979）］（以下、プラスミドの単離はこの方法を用いた）に従ってプラスミドを単離した。このプラスミドをｐＡＧＥＬ１０６と名付け、その構造を制限酵素消化により確認した。
（２）ｐＡＳＬＢ３−３−１の造成（第２図参照）
SV40初期遺伝子プロモーターとHTLV-1のロング・ターミナル・リピート（LTR）のR領域とU5領域の一部を融合したプロモーターを有する、ヒト顆粒球コロニー刺激因子（hG-CSF）の発現プラスミドｐＡＳＬＢ３−３−１の造成を以下のようにして行なった。
（１）で得られたｐＡＧＥ１０６の0.5μｇを10mMトリス−HCl（pH7.5）、6mM MgCl2、20mM KCl、6mM ２−メルカプトエタノールからなる緩衝液（以下、Ｋ−２０緩衝液と略記する）30μｌに溶解し、10単位のSmaIを加え、37℃で２時間消化反応を行なった。エタノール沈殿後、30μｌのＴ４リガーゼ緩衝液に溶解し、SalIリンカー（5'pGGTCGACC-3'：宝酒造社製）を0.01μｇとＴ４ＤＮＡリガーゼ175単位を加えて、12℃で16時間結合反応を行なった。エタノール沈殿後、10mMトリス−HCl（pH7.5）、6mM MgCl2、175mM塩化ナトリウム、6mM ２−メルカプトエタノールからなる緩衝液（以下、Ｙ−１７５緩衝液と略記する）30μｌに溶解し、10単位のSalIと10単位のMluIを加え、37℃で２時間消化反応を行なった。該反応液をアガロースゲル電気泳動に供した後、約1.7kbのＤＮＡ断片を回収した。
一方、ｐＡＳ３−３（特開平2-227075）１μｇをＹ−１７５緩衝液30μｌに溶解し、10単位のSalIと10単位のMluIを加え、37℃で２時間消化反応を行なった。該反応液をアガロースゲル電気泳動に供した後、約6.7kbのＤＮＡ断片を回収した。
上記で得られたｐＡＧＥＬ１０６由来のMluI-SalI断片（1.7kb）0.1μｇとｐＡＳ３−３由来のMluI-SalI断片（6.7kb）0.2μｇをＴ４リガーゼ緩衝液30μｌに溶解し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ175単位を加えて、12℃で16時間結合反応を行なった。該反応液を用いて大腸菌HB101株をコーエンらの方法によって形質転換し、アンピシリン耐性株を得た。この形質転換株から公知の方法に従ってプラスミドを単離した。このプラスミドをｐＡＳＬＢ３−３−１と名付け、その構造を制限酵素消化により確認した。
（３）ｐＡＳＬＢ３−３の造成（第３図参照）
pASLB3-3-1にアンピシリン耐性遺伝子を導入したプラスミドｐＡＳＬＢ３−３の造成を行なうため、以下のようにして、ｐＡＳ３−３のアンピシリン耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片［XhoI-MluI断片（7.26kb）］をｐＡＳＬＢ３−３−１のXhoI-MluI間に導入した。
（２）で得られたｐＡＳＬＢ３−３−１の１μｇを10mMトリス−HCl（pH7.5）、6mM MgCl2、150mM塩化ナトリウム、6mM ２−メルカプトエタノールからなる緩衝液（以下、Ｙ−１５０緩衝液と略記する）30μｌに溶解し、10単位のXhoIと10単位のMluIを加え、37℃で２時間消化反応を行なった。該反応液をアガロースゲル電気泳動に供した後、約7.26kbのＤＮＡ断片を回収した。
一方、ｐＡＳ３−３（特開平2-227075）の１μｇをＹ−１５０緩衝液30μｌに溶解し、10単位のXhoIと10単位のMluIを加え、37℃で２時間消化反応を行なった。該反応液をアガロースゲル電気泳動に供した後、約2.58kbのＤＮＡ断片を回収した。
上記で得られたｐＡＳＬＢ３−３−１由来のXhoI-MluI断片（7.26kb）0.2μｇとｐＡＳ３−３由来のXhoI-MluI断片（2.58kb）0.1μｇをＴ４リガーゼ緩衝液30μｌに溶解し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ175単位を加えて、12℃で16時間結合反応を行なった。該反応液を用いて大腸菌HB101株をコーエンらの方法によって形質転換し、アンピシリン耐性株を得た。この形質転換株から公知の方法に従ってプラスミドを単離し、その構造を制限酵素消化により確認した。このプラスミドをｐＡＳＬＢ３−３と呼ぶ。
（４）ｐＡＳＬＢＥ３−３の造成（第４図参照）
ｐＡＳＬＢ３−３中のジヒドロ葉酸還元酵素（dhfr）発現ユニットを除去し、エプシュタイン・バール・ウイルス（Epstein-Barr virus）の複製開始点（oriP）とEBNA-1遺伝子（oriPにトランスに作用し複製を引き起こす働きを有する遺伝子）を導入したプラスミドｐＡＳＬＢＥ３−３の造成を以下のようにして行なった。oriPとEBNA-1遺伝子は、ｐ２０１〔ビル・ズグデン（Bill Sugden）ら、ネイチャー（Nature），313，812（1985）〕のNarI部位にｐＵＣ１２〔メッシング（Messing）ら：メソッド・イン・エンザイモロジー（Methods in Enzymology），101，20（1983）〕由来のマルチクローニングサイトを含むSmaI-HaeIII断片が組み込まれたプラスミドｐ２２０．２から切り出して使用した。
ｐ２２０．２の１μｇをＹ−１００緩衝液30μｌに溶解し、20単位のEcoRIを加え、37℃で２時間消化反応を行なった。エタノール沈殿後、30μｌのＤＮＡポリメラーゼＩ緩衝液［50mMトリス−HCl（pH7.5）、10mM MgCl2、0.1mM dATP（デオキシアデノシン３リン酸）、0.1mM dCTP（デオキシシチジン３リン酸）、0.1mMdGTP（デオキシグアノシン３リン酸）、0.1mM TTP（チミジン３リン酸）］に溶解し、６単位の大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩクレノー断片を加え、37℃で60分間反応させ、EcoRI消化によって生じた５’突出末端を平滑末端に変えた。反応をフェノール抽出によって止め、クロロホルム抽出とエタノール沈澱の後、20μｌのＴ４リガーゼ緩衝液に溶解し、XhoIリンカー（5'-ｐＣＣＴＣＧＡＧＧ-3'：宝酒造社製）を0.05μｇとＴ４ＤＮＡリガーゼ175単位を加えて、12℃で16時間結合反応を行なった。エタノール沈殿後、Ｙ−１００緩衝液30μｌに溶解し、10単位のBamHIを加え、37℃で２時間消化反応を行なった。エタノール沈殿後、30μｌのＤＮＡポリメラーゼＩ緩衝液に溶解し、６単位の大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩクレノー断片を加え、37℃で60分間反応させ、BamHI消化によって生じた５’突出末端を平滑末端に変えた。反応をフェノール抽出によって止め、クロロホルム抽出とエタノール沈澱の後、Ｙ−１００緩衝液30μｌに溶解し、10単位のXhoIを加え、37℃で２時間消化反応を行なった。該反応液をアガロースゲル電気泳動に供した後、約4.9kbのＤＮＡ断片を回収した。
また、（３）で得られたｐＡＳＬＢ３−３（１μｇ）をＹ−１００緩衝液30μｌに溶解し、20単位XhoIを加え、37℃で２時間消化反応を行なった。エタノール沈殿の後、30μｌのＤＮＡポリメラーゼＩ緩衝液に溶解し、６単位の大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩクレノー断片を加え、37℃で60分間反応させ、XhoI消化によって生じた５’突出末端を平滑末端に変えた。反応をフェノール抽出によって止め、クロロホルム抽出とエタノール沈澱の後、10mMトリス−HCl（pH7.5）、6mM MgCl2、6mM ２−メルカプトエタノールからなる緩衝液（以下、Ｙ−０緩衝液と略記する）30μｌに溶解し、20単位のKpnIを加え、37℃で２時間消化反応を行なった。該反応液をアガロースゲル電気泳動に供した後、約1.3kbのＤＮＡ断片を回収した。
また、ｐＡＧＥ１０７［特開平3-22979、Miyajiら：サイトテクノロジー（Cytotechnology），3，133（1990）］１μｇをＹ−０緩衝液30μｌに溶解し、20単位のKpnIを加え、37℃で２時間消化反応を行なった。その後、塩化ナトリウム濃度が100mMになるように塩化ナトリウムを添加し、20単位のXhoIを加え、さらに37℃で２時間消化反応を行なった。該反応液をアガロースゲル電気泳動に供した後、約6.0kbのＤＮＡ断片を回収した。
上記で得られたｐ２２０．２由来のXhoI-BamHI（平滑末端）断片（4.9kb）0.2μｇとｐＡＳＬＢ３−３由来のXhoI（平滑末端）-KpnI断片（1.3kb）0.1μｇおよびｐＡＧＥ１０７由来のKpnI-XhoI断片（6.0kb）0.2μｇをＴ４リガーゼ緩衝液30μｌに溶解し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ175単位を加えて、12℃で16時間結合反応を行なった。該反応液を用いて大腸菌HB101株をコーエンらの方法によって形質転換し、アンピシリン耐性株を得た。この形質転換株から公知の方法に従ってプラスミドを単離した。このプラスミドをｐＡＳＬＢＥ３−３と名付け、その構造を制限酵素消化により確認した。
（５）ｐＡＳＬＢＣの造成（第５図参照）
ｐＡＳＬＢ３−３中のhG-CSF遺伝子を除去し、そのかわりにマルチクローニングサイトを導入したプラスミドｐＡＳＬＢＣを以下のようにして造成した。マルチクローニングサイトは、合成ＤＮＡを用いて作成した。
（３）で得られたｐＡＳＬＢ３−３の１μｇをＹ−１７５緩衝液30μｌに溶解し、20単位のSalIと20単位のMluIを加え、37℃で２時間消化反応を行なった。該反応液をアガロースゲル電気泳動に供した後、約3.1kbのＤＮＡ断片を回収した。
また、同プラスミド１μｇをＹ−０緩衝液30μｌに溶解し、20単位のKpnIを加え、37℃で２時間消化反応を行なった。その後、塩化ナトリウム濃度が150mMになるように塩化ナトリウムを添加し、20単位のMulIを加え、さらに37℃で２時間消化反応を行なった。該反応液をアガロースゲル電気泳動に供した後、約6.0kbのＤＮＡ断片を回収した。
また別に、SalI切断部位とKpnI切断部位を連結するためのリンカーとして以下のＤＮＡリンカーを合成した。なお、このリンカー中にはHindIII、EcoRV、SfiI、StuI、NotIの各制限酵素切断部位が組み込まれている。
0003756946.tif 000003
このＤＮＡリンカーの52mer（配列番号３）と44mer（配列番号４）の１本鎖ＤＮＡはそれぞれアプライド・バイオシステムズ社３８０Ａ・ＤＮＡ合成機を用いて合成した。合成したＤＮＡはそれぞれ0.2μｇずつ、Ｔ４キナーゼ緩衝液20μｌに溶解し、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造社製、以下同じ）30単位を加えて、37℃で２時間リン酸化反応を行なった。
上記で得られたｐＡＳＬＢ３−３由来のSalI-MluI断片（3.1kb）0.1μｇと同プラスミド由来のKpnI-MluI断片（6.0kb）0.2μｇをＴ４リガーゼ緩衝液30μｌに溶解し、上記ＤＮＡリンカーを0.01μｇとT4 ＤＮＡリガーゼ175単位を加えて、12℃で16時間結合反応を行なった。該反応液を用いて大腸菌HB101株をコーエンらの方法によって形質転換し、アンピシリン耐性株を得た。この形質転換株から公知の方法に従ってプラスミドを単離した。このプラスミドをｐＡＳＬＢＣと名付け、その構造を制限酵素消化により確認した。
（６）ｐＡＳＬＢＥＣの造成（第６図参照）
ｐＡＳＬＢＣ中のジヒドロ葉酸還元酵素（dhfr）発現ユニットを除去し、oriPとEBNA-1遺伝子を導入したプラスミドｐＡＳＬＢＥＣを造成した。
（４）で得られたｐＡＳＬＢＥ３−３の１μｇをＹ−１５０緩衝液30μｌに溶解し、20単位のMluIと20単位のXhoIを加え、37℃で２時間消化反応を行なった。該反応液をアガロースゲル電気泳動に供した後、約1.3kbのＤＮＡ断片を回収した。
また、同プラスミド１μｇをＹ−０緩衝液30μｌに溶解し、20単位のKpnIを加え、37℃で２時間消化反応を行なった。その後、塩化ナトリウム濃度が150mMになるように塩化ナトリウムを添加し、５単位のMluIを加え、さらに37℃で20分間部分消化反応を行なった。該反応液をアガロースゲル電気泳動に供した後、約9.6kbのＤＮＡ断片を回収した。
また別に、ｐＡＳＬＢＣ（１μｇ）をＹ−０緩衝液30μｌに溶解し、20単位のKpnIを加え、37℃で２時間消化反応を行なった。その後、塩化ナトリウム濃度が100mMになるように塩化ナトリウムを添加し、20単位のXhoIを加え、さらに37℃で２時間消化反応を行なった。該反応液をアガロースゲル電気泳動に供した後、約0.6kbのＤＮＡ断片を回収した。
上記で得られたｐＡＳＬＢＥ３−３由来のMluI-XhoI断片（1.3kb）0.2μｇと同プラスミド由来のKpnI-MluI断片（9.6kb）0.2μｇ、およびｐＡＳＬＢＣ由来のKpnI-XhoI断片（0.6kb）0.05μｇをＴ４リガーゼ緩衝液30μｌに溶解し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１７５単位を加えて、12℃で16時間結合反応を行なった。該反応液を用いて大腸菌HB101株をコーエンらの方法によって形質転換し、アンピシリン耐性株を得た。この形質転換株から公知の方法に従ってプラスミドを単離した。このプラスミドをｐＡＳＬＢＥＣと名付け、その構造を制限酵素消化により確認した。
（７）ｐＡＳＬＢＥＣ２の造成（第７図参照）
ｐＡＳＬＢＥＣのマルチクローニングサイト中のStuIサイトにBamHIリンカーを導入したプラスミドｐＡＳＬＢＥＣ２を以下のようにして造成した。ｐＡＳＬＢＥＣ２では、マルチクローニングサイト中のStuIサイトは消失している。
（６）で得られたｐＡＳＬＢＥＣの１μｇをＹ−１００緩衝液30μｌに溶解し、５単位のStuIを加え、37℃で20分間部分消化反応を行なった。該反応液をアガロースゲル電気泳動に供した後、約11.5kbのＤＮＡ断片を回収した。回収したＤＮＡ断片を30μｌのＴ４リガーゼ緩衝液に溶解し、BamHIリンカー（5'-pＣＣＧＧＡＴＣＣＧＧ-3'：宝酒造社製）を0.01μｇとＴ４ＤＮＡリガーゼ175単位を加えて、12℃で16時間結合反応を行なった。エタノール沈殿後、Ｙ−１００緩衝液30μｌに溶解し、20単位のBamHIを加え、37℃で２時間消化反応を行なった。該反応液をアガロースゲル電気泳動に供した後、約11.5kbのＤＮＡ断片を回収した。回収したＤＮＡ断片を20μｌのＴ４リガーゼ緩衝液に溶解し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ175単位を加えて、12℃で16時間結合反応を行なった。該反応液を用いて大腸菌HB101株をコーエンらの方法によって形質転換し、アンピシリン耐性株を得た。この形質転換株から公知の方法に従ってプラスミドを単離した。このプラスミドをｐＡＳＬＢＥＣ２と名付け、その構造を制限酵素消化により確認した。
（８）ｐＡＭｏＥＣ２の造成（第８図参照）
ｐＡＳＬＢＥＣ２中のプロモーター［SV40初期遺伝子プロモーターとHTLV-1のロング・ターミナル・リピート（long terminal repeat：LTR）のR領域とU5領域の一部を融合したプロモーター］をモロニー・マウス白血病ウイルスのロング・ターミナル・リピート（long terminal repeat：LTR）のプロモーターにすげかえたプラスミドｐＡＭｏＥＣ２の造成を以下のようにして行なった。モロニー・マウス白血病ウイルスLTRのプロモーターは、プラスミドＭｏｌｐ−１［アキノリ・イシモト（Akinori Ishimoto）ら、ビロロジー（Virology），141，30（1985）］から切り出して使用した。
（７）で得られたｐＡＳＬＢＥＣ２の１μｇを10mMトリス−HCl（pH7.5）、6mM MgCl2、50mM KCl、6mM ２−メルカプトエタノールからなる緩衝液（以下、Ｋ−５０緩衝液と略記する）30μｌに溶解し、20単位のHindIIIと20単位のAstII（東洋紡績社製）を加え、37℃で２時間消化反応を行なった。該反応液をアガロースゲル電気泳動に供した後、約4.8kbのＤＮＡ断片を回収した。
また、同プラスミド１μｇをＫ−５０緩衝液30μｌに溶解し、20単位のAstIIを加え、37℃で２時間消化反応を行なった。その後、５単位のXhoIを加え、さらに37℃で20分間部分消化反応を行なった。該反応液をアガロースゲル電気泳動に供した後、約6.1kbのＤＮＡ断片を回収した。
次に、XhoI切断部位とClaI切断部位を連結するためのリンカーとして以下のＤＮＡリンカーを合成した。
0003756946.tif 000004
上記ＤＮＡリンカーの9merと7merの１本鎖ＤＮＡはそれぞれアプライド・バイオシステムズ社３８０Ａ・ＤＮＡ合成機を用いて合成した。合成したＤＮＡはそれぞれ0.2μｇずつ、Ｔ４キナーゼ緩衝液40μｌに溶解し、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ30単位を加えて、37℃で２時間リン酸化反応を行なった。
また別に、Ｍｏｌｐ−１［アキノリ・イシモト（Akinori Ishimoto）ら、ビロロジ−（Virology），141，30（1985）］１μｇを10mMトリス−HCl（pH7.5）、6mM MgCl2、50mM塩化ナトリウム、6mM ２−メルカプトエタノールからなる緩衝液（以下、Ｙ−５０緩衝液と略記する）30μｌに溶解し、20単位のClaIを加え、37℃で２時間消化反応を行なった。エタノール沈殿後、30μｌのＴ４リガーゼ緩衝液に溶解し、上記ＤＮＡリンカー0.01μｇとＴ４ＤＮＡリガーゼ175単位を加えて、12℃で16時間結合反応を行なった。エタノール沈殿後、Ｋ−２０緩衝液30μｌに溶解し、20単位のSmaIを加え、37℃で２時間消化反応を行なった。該反応液をアガロースゲル電気泳動に供した後、約0.6kbのＤＮＡ断片を回収した。回収したＤＮＡ断片を30μｌのＴ４リガーゼ緩衝液に溶解し、HindIIIリンカー（5'-pＣＡＡＧＣＴＴＧ-3'：宝酒造社製）を0.03μｇとＴ４ＤＮＡリガーゼ175単位を加えて、12℃で16時間結合反応を行なった。エタノール沈殿後、Ｙ−５０緩衝液30μｌに溶解し、10単位のHindIIIを加え、37℃で２時間消化反応を行なった。その後、塩化ナトリウム濃度が100mMになるように塩化ナトリウムを添加し、10単位のXhoIを加え、さらに37℃で２時間消化反応を行なった。該反応液をアガロースゲル電気泳動に供した後、約0.6kbのＤＮＡ断片を回収した。
上記で得られたｐＡＳＬＢＥＣ２由来のHindIII-AstII断片（4.8kb）0.2μｇと同プラスミド由来のAstII-XhoI断片（6.1kb）0.2μｇ、およびＭｏｌｐ−１由来のHindIII-XhoI断片（0.6kb）0.05μｇをＴ４リガーゼ緩衝液30μｌに溶解し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ175単位を加えて、12℃で16時間結合反応を行なった。該反応液を用いて大腸菌HB101株をコーエンらの方法によって形質転換し、アンピシリン耐性株を得た。この形質転換株から公知の方法に従ってプラスミドを単離した。このプラスミドをｐＡＭｏＥＣ２と名付け、その構造を制限酵素消化により確認した。
（９）ｐＡＭｏＥＣ３の造成（第９図参照）
ｐＡＭｏＥＣ２のマルチクローニングサイト中のBamHIサイトに、詰め込みＤＮＡ（Stuffer DNA）として、ｐＢＲ３２２のテトラサイクリン耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片［DraI-PvuII断片（2.5kb）］を以下のようにして挿入し、プラスミドｐＡＭｏＥＣ３を造成した。
（８）で得られたｐＡＭｏＥＣ２の１μｇをＹ−１００緩衝液30μｌに溶解し、20単位のBamHIを加え、37℃で２時間消化反応を行なった。エタノール沈殿後、30μｌのＤＮＡポリメラーゼＩ緩衝液に溶解し、６単位の大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩクレノー断片を加え、37℃で60分間反応させ、BamHI消化によって生じた５’突出末端を平滑末端に変えた。該反応液をアガロースゲル電気泳動に供した後、約11.5kbのＤＮＡ断片を回収した。
また、ｐＢＲ３２２［ボリバー（Bolivar）ら：ジーン（Gene），2，95（1977）］１μｇをＹ−５０緩衝液30μｌに溶解し、20単位のDraIと20単位のPvuIIを加え、37℃で２時間消化反応を行なった。該反応液をアガロースゲル電気泳動に供した後、約2.5kbのＤＮＡ断片を回収した。
上記で得られたｐＡＭｏＥＣ２由来のBamHI（平滑末端）断片（11.5kb）0.1μｇとｐＢＲ３２２由来のDraI-PvuII断片（2.5kb）0.2μｇをＴ４リガーゼ緩衝液30μｌに溶解し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ175単位を加えて、12℃で16時間結合反応を行なった。該反応液を用いて大腸菌HB101株をコーエンらの方法によって形質転換し、アンピシリンとテトラサイクリンに耐性な株を得た。この形質転換株から公知の方法に従ってプラスミドを単離した。このプラスミドをｐＡＭｏＥＣ３と名付け、その構造を制限酵素消化により確認した。
（１０）ｐＡＭｏＥＲＣ３の造成（第１０図参照）
ｐＡＭｏＥＣ３中のoriPとEBNA-1遺伝子のユニットの向きを逆にしたプラスミドｐＡＭｏＥＲＣ３を以下のようにして造成した。
（９）で得られたｐＡＭｏＥＣ３の１μｇをＹ−１００緩衝液30μｌに溶解し、20単位のXhoIを加え、37℃で２時間消化反応を行なった。その後、１Ｍトリス−HCl（pH8.0）を30μｌと大腸菌アルカリフォスファターゼ（宝酒造社製）１単位を加え、37℃で２時間脱リン酸化反応を行なった。エタノール沈殿後、10mMトリス−HCl（pH8.0）、1mM EDTA（エチレンジアミン４酢酸ナトリウム）からなる緩衝液（以下、ＴＥ緩衝液と略記する）30μｌに溶解し、アガロースゲル電気泳動を行ない、約9.1kbのＤＮＡ断片を回収した。
また、同プラスミド１μｇをＹ−１００緩衝液30μｌに溶解し、20単位のXhoIを加え、37℃で２時間消化反応を行なった。該反液をアガロースゲル電気泳動に供した後、約4.9kbのＤＮＡ断片を回収した。
上記で得られたｐＡＭｏＥＣ３由来のXhoI断片（9.1kb）0.1μｇと同プラスミド由来のXhoI断片（4.9kb）0.2μｇをＴ４リガーゼ緩衝液30μｌに溶解し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ175単位を加えて、12℃で16時間結合反応を行なった。該反応液を用いて大腸菌HB101株をコーエンらの方法によって形質転換し、アンピシリン耐性株を得た。この形質転換株から公知の方法に従ってプラスミドを単離した。このプラスミドをｐＡＭｏＥＲＣ３と名付け、その構造を制限酵素消化により確認した。
（１１）ｐＡＧＥ２０７の造成（第１１図参照）
ｐＡＧＥ１０７中のG418耐性遺伝子をハイグロマイシン（hyg）耐性遺伝子にすげかえたプラスミドｐＡＧＥ２０７を以下のようにして造成した。hyg耐性遺伝子は、ｐ２０１〔ビル・ズグデン（Bill Sugden）ら、ネイチャー（Nature），313，812（1985）〕より切り出して使用した。
ｐＡＧＥ１０７（特開平3-22979）の１μｇをＹ−５０緩衝液30μｌに溶解し、20単位のClaIを加え、37℃で２時間消化反応を行なった。その後、塩化ナトリウム濃度が150mMになるように塩化ナトリウムを添加し、20単位のMluIを加え、さらに37℃で２時間消化反応を行なった。該反応液をアガロースゲル電気泳動に供した後、約4.6kbのＤＮＡ断片を回収した。
ｐ２０１の0.5μｇをＹ−５０緩衝液30μｌに溶解し、20単位のNarI［ニュー・イングランド・バイオラボ（New England Biolab）社製］を加え、37℃で２時間消化反応を行なった。エタノール沈殿後、30μｌのＤＮＡポリメラーゼＩ緩衝液に溶解し、６単位の大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩクレノー断片を加え、37℃で60分間反応させ、NarI消化によって生じた５’突出末端を平滑末端に変えた。反応をフェノール抽出によって止め、クロロホルム抽出とエタノール沈殿の後、20μｌのＴ４リガーゼ緩衝液に溶解し、ClaIリンカー（5'pＣＡＴＣＧＡＴＧ3'：宝酒造社製）を0.05μｇとＴ４ＤＮＡリガーゼ175単位を加えて、12℃で16時間結合反応を行なった。エタノール沈殿後、Ｙ−５０緩衝液30μｌに溶解し、10単位のClaIを加え、37℃で２時間消化反応を行なった。その後、塩化ナトリウム濃度が150mMになるように塩化ナトリウムを添加し、10単位のMluIを加え、さらに37℃で２時間消化反応を行なった。該反応液をアガロースゲル電気泳動に供した後、約1.6kbのＤＮＡ断片を回収した。
上記で得られたｐＡＧＥ１０７由来のClaI-MluI断片（4.6kb）0.2μｇとｐ２０１由来のClaI-MluI断片（1.6kb）0.1μｇをＴ４リガーゼ緩衝液30μｌに溶解し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ175単位を加えて、12℃で16時間結合反応を行なった。該反応液を用いて大腸菌HB101株をコーエンらの方法によって形質転換し、アンピシリン耐性株を得た。この形質転換株から公知の方法に従ってプラスミドを単離した。このプラスミドをｐＡＧＥ２０７と名付け、その構造を制限酵素消化により確認した。
（１２）ｐＡＧＥ２０７ＳｃＮの造成（第１２図参照）
ラビットβグロビン遺伝子中に存在するSfiIサイトの類似配列を除去するため、ｐＡＧＥ２０７のBalIサイトにScaIリンカーを挿入したプラスミドｐＡＧＥ２０７ＳｃＮを以下のようにして造成した。なお、ｐＡＧＥ２０７ＳｃＮにおいては、挿入されたScaIリンカーの数は明らかではない。
（１１）で得られたｐＡＧＥ２０７の0.5μｇをＹ−０緩衝液30μｌに溶解し、10単位のBalIを加え、37℃で２時間消化反応を行なった。エタノール沈殿後、20μｌのＴ４リガーゼ緩衝液に溶解しScaIリンカー（5'pＡＡＧＴＡＣＴＴ3'：宝酒造社製）を0.01μｇとＴ４ＤＮＡリガーゼ175単位を加えて、12℃で16時間結合反応を行なった。該反応液を用いて大腸菌HB101株をコーエンらの方法によって形質転換し、アンピシリン耐性株を得た。この形質転換株から公知の方法に従ってプラスミドを単離した。このプラスミドをｐＡＧＥ２０７ＳｃＮと名付け、その構造を制限酵素消化により確認した。
（１３）ｐＡＭｏＣ３Ｓｃの造成（第１３図参照）
ｐＡＭｏＥＲＣ３中のラビットβグロビン遺伝子中に存在するSfiIサイトの類似配列を除去するため、以下のようにしてｐＡＭｏＥＲＣ３中のラビットβグロビン遺伝子を、すでにその類似配列を除去してあるｐＡＧＥ２０７ＳｃＮ中のラビットβグロビン遺伝子にすげかえ、プラスミドｐＡＭｏＥＲＣ３Ｓｃを造成した。造成の都合上、まずｐＡＭｏＣ３Ｓｃを造成し、次いでｐＡＭｏＥＲＣ３Ｓｃの造成を行なった。前記のｐＡＧＥ２０７ＳｃＮにおいては、SfiIサイトの類似配列を除去するために挿入されたScaIリンカーの数は明らかではないが、ｐＡＭｏＥＲＣ３Ｓｃの場合は、造成の際にｐＡＧＥ２０７ＳｃＮを一度ScaIで切断しているため、挿入されたScaIサイトの数は１つであると推定される。
（１２）で得られたｐＡＧＥ２０７ＳｃＮの１μｇをＹ−０緩衝液30μｌに溶解し、20単位のKpnIを加え、37℃で２時間消化反応を行なった。その後、塩化ナトリウム濃度が100mMになるように塩化ナトリウムを添加し、20単位のScaIを加え、さらに37℃で２時間消化反応を行なった。該反応液がアガロースゲル電気泳動に供した後、約0.7kbのＤＮＡ断片を回収した。
また、同プラスミド１μｇをＹ−１００緩衝液30μｌに溶解し、20単位のScaIと20単位のClaIを加え、37℃で２時間消化反応を行なった。該反応液をアガロースゲル電気泳動に供した後、約0.9kbのＤＮＡ断片を回収した。
また、別に（１０）で得られたｐＡＭｏＥＲＣ３の１μｇをＹ−０緩衝液30μｌに溶解し、20単位のKpnIを加え、37℃で２時間消化反応を行なった。その後、塩化ナトリウム濃度が100mMになるように塩化ナトリウムを添加し、20単位のXhoIを加え、さらに37℃で２時間消化反応を行なった。該反応液をアガロースゲル電気泳動に供した後、約3.2kbのＤＮＡ断片を回収した。
次に、ｐＡＧＥ１０７（特開平2-227075）の１μｇをＹ−１００緩衝液30μｌに溶解し、20単位のXhoIと20単位のClaIを加え、37℃で２時間消化反応を行なった。該反応液をアガロースゲル電気泳動に供した後、約4.3kbのＤＮＡ断片を回収した。
上記で得られたｐＡＧＥ２０７ＳｃＮ由来のKpnI-ScaI断片（0.7kb）0.1μｇと同プラスミド由来のScaI-ClaI断片（0.9kb）0.1μｇ、ｐＡＭｏＥＲＣ３由来のKpnI-XhoI断片（3.2kb）0.3μｇ、およびｐＡＧＥ１０７由来のXhoI-ClaI断片（4.3kb）0.3μｇをＴ４リガーゼ緩衝液30μｌに溶解し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ175単位を加えて、12℃で16時間結合反応を行なった。該反応液を用いて大腸菌HB101株をコーエンらの方法によって形質転換し、アンピシリン耐性株を得た。この形質転換株から公知の方法に従ってプラスミドを単離した。このプラスミドをｐＡＭｏＣ３Ｓｃと名付け、その構造を制限酵素消化により確認した。
（１４）ｐＡＭｏＥＲＣ３Ｓｃの造成（第１４図参照）
（１０）で得られたｐＡＭｏＥＲＣ３の１μｇをＹ−０緩衝液30μｌに溶解し、20単位のKpnIを加え、37℃で２時間消化反応を行なった。その後、塩化ナトリウムの濃度が150mMになるように塩化ナトリウムを添加し、20単位のMluIを加え、さらに37℃で２時間消化反応を行なった。該反応液をアガロースゲル電気泳動に供した後、約6.8kbのＤＮＡ断片を回収した。
また、同プラスミド１μｇをＹ−１５０緩衝液30μｌに溶解し、20単位のXhoIと20単位のMluIを加え、37℃で２時間消化反応を行なった。該反応液をアガロースゲル電気泳動に供した後、約1.3kbのＤＮＡ断片を回収した。
また、別にｐＡＭｏＣ３Ｓｃの１μｇをＹ−０緩衝液30μｌに溶解し、20単位のKpnIを加え、37℃で２時間消化反応を行なった。その後、塩化ナトリウム濃度が100ｍＭになるように塩化ナトリウムを添加し、20単位のXhoIを加え、さらに37℃で２時間消化反応を行なった。該反応液をアガロースゲル電気泳動に供した後、約5.9kbのＤＮＡ断片を回収した。
上記で得られたｐＡＭｏＥＲＣ３由来のKpnI-MluI断片（6.8kb）0.2μｇと同プラスミド由来のXhoI-MluI断片（1.3kb）0.05μｇ、およびｐＡＭｏＣ３Ｓｃ由来のKpnI-XhoI断片（5.9kb）0.2μｇをＴ４リガーゼ緩衝液30μｌに溶解し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ175単位を加えて、12℃で16時間結合反応を行なった。該反応液を用いて大腸菌HB101株をコーエンらの方法によって形質転換し、アンピシリン耐性株を得た。この形質転換株から公知の方法に従ってプラスミドを単離した。このプラスミドをｐＡＭｏＥＲＣ３Ｓｃと名付け、その構造を制限酵素消化により確認した。
ｐＡＭｏＥＲＣ３Ｓｃは、異種遺伝子発現用のプロモーターとして、モロニー・マウス白血病ウイルスのロング・ターミナル・リピート（long terminal repeat）を有している。また、異種遺伝子の効率良い発現のために、ラビットβグロビン遺伝子スプライシングシグナル、ラビットβグロビン遺伝子ポリＡ付加シグナルおよびＳＶ４０初期遺伝子ポリＡ付加シグナルが、挿入した異種遺伝子の後ろに付加するようにデザインされている。また、動物細胞用の薬剤耐性マーカーとしてG418耐性遺伝子を、大腸菌用の薬剤耐性マーカーとしてカナマイシン耐性遺伝子（G418耐性遺伝子と同じもの）とアンピシリン耐性遺伝子を有している。さらに、エプシュタイン・バール・ウイルス（Epstein-Barr virus）の複製開始点（oriP）とoriPにトランスに作用し複製を引き起こす働きをもつEBNA-1遺伝子を有するため、ナマルバ細胞をはじめとしてゲッ歯類を除く多くの細胞中で、染色体に組み込まれることなくプラスミド状態で存在することができる。
ｐＡＭｏＥＲＣ３Ｓｃを用いたｃＤＮＡライブラリーの造成は、ｃＤＮＡの両末端にSfiIリンカーを付加した後、ｐＡＭｏＥＲＣ３Ｓｃ中のSfiI部位に組み込むことにより行なうことができる。
（１５）ｐＡＭｏＰＲＣ３Ｓｃの造成（第１５図参照）
ナマルバ細胞のようにEBNA-1をもともと発現している細胞を宿主として用いる際には、プラスミドｐＡＭｏＥＲＣ３Ｓｃ中のEBNA-1遺伝子がなくても、宿主に導入したプラスミドは染色体に組み込まれることなくプラスミド状態で存在することが可能であると考えられる。そこで、ｐＡＭｏＥＲＣ３Ｓｃ中のEBNA-1遺伝子を除去したプラスミドｐＡＭｏＰＲＣ３Ｓｃの造成を以下のようにして行なった。ｐＡＭｏＰＲＣ３Ｓｃは、ｐＡＭｏＥＲＣ３Ｓｃと同様にして直接発現クローニングベクターとして使用することができる。
（１４）で得られたｐＡＭｏＥＲＣ３Ｓｃの２μｇをＹ−５０緩衝液30μｌに溶解し、20単位のNsiI［ニュー・イングランド・バイオラブズ（New EnglandBiolabs）社製］を加え、37℃で２時間消化反応を行なった。エタノール沈殿後、30μｌのＤＮＡポリメラーゼＩ緩衝液に溶解し、６単位の大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩクレノー断片を加え、37℃で60分間反応させ、NsiI消化によって生じた３’突出末端を平滑末端に変えた。反応をフェノール抽出によって止め、クロロホルム抽出とエタノール沈殿の後、Ｙ−１００緩衝液30μｌに溶解し、20単位のNotIを加え、37℃で２時間消化反応を行なった。該反応液をアガロースゲル電気泳動に供した後、約8.1kbのＤＮＡ断片を回収した。
また、同プラスミド２μｇをＹ−１００緩衝液30μｌに溶解し、20単位のXhoIを加え、37℃で２時間消化反応を行なった。エタノール沈殿後、30μｌのＤＮＡポリメラーゼＩ緩衝液に溶解し、６単位の大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩクレノー断片を加え、37℃で60分間反応させ、XhoI消化によって生じた５’突出末端を平滑末端に変えた。反応をフェノール抽出によって止め、クロロホルム抽出とエタノール沈殿の後、Ｙ−１００緩衝液30μｌに溶解し、20単位のNotIを加え、37℃で２時間消化反応を行なった。該反応液をアガロースゲル電気泳動に供した後、約3.2kbのＤＮＡ断片を回収した。
上記で得られたｐＡＭｏＥＲＣ３Ｓｃ由来のNsiI（平滑末端）-NotI断片（8.1kb）0.1μｇと同プラスミド由来のXhoI（平滑末端）-NotI断片（3.2kb）0.1μをＴ４リガーゼ緩衝液30μｌに溶解し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ175単位を加えて、12℃で16時間結合反応を行なった。該反応液を用いて大腸菌HB101株をコーエンらの方法によって形質転換し、アンピシリン耐性株を得た。この形質転換株から公知の方法に従ってプラスミドを単離した。このプラスミドをｐＡＭｏＰＲＣ３Ｓｃと名付け、その構造を制限酵素消化により確認した。
２．ヒト単球系細胞株THP-1細胞からのα１，３−フコシルトランスフェラーゼｃＤＮＡのクローン化
（１）ヒト単球系細胞株THP-1細胞からのｍＲＮＡの取得
１×108個のTHP-1細胞（ATCC TIB 202）より、インビトロジェン（Invitrogen）社製のｍＲＮＡ抽出キットであるファーストトラック（Fast Track；商品番号K1593-02）を用いて、約30μｇのｍＲＮＡを取得した。具体的試薬および方法は、キットに添付されている説明書に従った。
（２）ｃＤＮＡライブラリーの作製
上記で得られたｍＲＮＡの８μｇから、GIBCO BRL社製のキットであるｃＤＮＡ合成システム（ｃＤＮＡ Synthesis System）を用いて、オリゴｄＴをプライマーとして２本鎖ｃＤＮＡを合成した。その際、逆転写酵素としてはキット中のMoloney Murine Leukemia Virus（M-MLV）reverse transcriptaseの代わりに、同社のSuper ScriptTM RNase H−Reverse Transcriptaseを使用した。その後、ｃＤＮＡの両末端に以下に示すSfiIリンカーを付与し、アガロースゲル電気泳動によりｃＤＮＡをサイズにより分画を行ない、約1.6kb以上のｃＤＮＡ断片を回収した。
0003756946.tif 000005
SfiIリンカーの11mer（配列番号５）と8merの１本鎖ＤＮＡはそれぞれアプライド・バイオシステムズ社３８０Ａ・ＤＮＡ合成機を用いて合成した。合成したＤＮＡはそれぞれ50μｇずつ、別々にＴ４キナーゼ緩衝液50μｌに溶解し、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造社製）30単位を加えて、37℃で16時間リン酸化反応を行なった。上記で合成した２本鎖ｃＤＮＡおよび上記でリン酸化したリンカー（11merのものを４μｇと8merのものを2.9μｇ）をＴ４リガーゼ緩衝液45μｌに溶解し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ1050単位を加えて、16℃で16時間結合反応を行なった。該反応液をアガロースゲル電気泳動に供した後、約1.6kb以上のｃＤＮＡ断片を回収した。
また、１項の（１５）で得られた直接発現クローニングベクター（Expression Cloning Vector）であるｐＡＭｏＰＲＣ３Ｓｃの24μｇをＹ−５０緩衝液590μｌに溶解し、80単位のSfiIを加え、37℃で16時間消化反応を行なった。その後、その一部（５μｌ）をアガロースゲル電気泳動に供し、切断が完了したことを確認後、ｃＤＮＡライブラリー造成時のバックグラウンド（ｃＤＮＡインサートが挿入されていないクローン）の量を減少させるために、40単位のBamHIを加え、さらに37℃で２時間消化反応を行なった。その後、該反応液をアガロースゲル電気泳動に供した後、約8.8kbのＤＮＡ断片を回収した。
上記で得られたｐＡＭｏＰＲＣ３Ｓｃ由来のSfiI断片（8.8kb）２μｇと上記で精製したｃＤＮＡをＴ４リガーゼ緩衝液250μｌに溶解し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ2000単位を加えて、16℃で16時間結合反応を行なった。その後、トランスファーＲＮＡ（tRNA）５μｇを添加し、エタノール沈殿後、ＴＥ緩衝液20μｌに溶解した。該反応液を用いて大腸菌LE392株［マニアティス（Maniatis）ら編集：モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）、第２版、Cold Spring Harbor 1989年刊行］をエレクトロポーレーション法［ウイリアム・ジェイ・ドゥワー（William J.Dower）ら：ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Nucleic Acids Res.），16，6127（1988）］により形質転換し、約56万個のアンピシリン耐性株を得た。
（３）α１，３−フコシルトランスフェラーゼｃＤＮＡ（TH21）のクローン化
上記で得られた約５６万個のアンピシリン耐性株（ｃＤＮＡライブラリー）を混合した後、キィアジェン（Qiagen）社製のプラスミド調製キットである>plasmid<maxi kit（商品番号41031）を用いてプラスミドを調製した。取得したプラスミドはエタノール沈殿後、１μg/μｌになるようにＴＥ緩衝液に溶解した。
上記プラスミドは、エレクトロポーレーション法［Miyajiら：サイトテクノロジー（Cytotechnology），3，133（1990）］により、無血清培地馴化ナマルバ細胞（ＫＪＭ−１株）［細井ら、サイトテクノロジー（Cytotechnology），1，151（1988）］に導入した。1.6×106細胞あたり４μｇのプラスミドを導入した後、8mlのＲＰＭＩ１６４０・ＩＴＰＳＧＦ培地［7.5% NaHCO3を1/40量、200mM L-グルタミン溶液（GIBCO社製）を3%、ペニシリン・ストレプトマイシン溶液（GIBCO社製、5000units/mlペニシリン、5000μg/mlストレプトマイシン）を0.5%、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−ヒドロキシプロパン−３−スルフォニック・アシッド（N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-hydroxypropane-3-sulfonic acid；HEPES）（10mM）、インシュリン（３μg/ml）、トランスフェリン（５μg/ml）、ピルビン酸ナトリウム（5mM）、亜セレン酸ナトリウム（125nM）、ガラクトース（1mg/ml）、プルロニック（Pluronic）Ｆ７８（0.1% w/v）を添加したＲＰＭＩ１６４０培地（日水製薬社製）］に懸濁し、CO2インキュベーターで37℃で24時間培養した。その後、G418（ギブコ社製）を0.5mg/mlになるように添加して、さらに７日培養し、形質転換株を得た。得られた形質転換株は、0.5mg/mlのG418を含むＲＰＭＩ１６４０・ＩＴＰＳＧＦ培地で培養後、約３×107個の細胞を、シアリル・ルイスｘ（Sialyl Lewis-ｘ）糖鎖に対する抗体であるＫＭ９３［Furuyaら：アンチ・キャンサー・リサーチ（Anticancer Res.），12，27（1992）］を用いた間接蛍光抗体染色に供した。具体的には、以下のとおり行った。
約３×107個の細胞を50mlの遠心チューブ（2059チューブ：ファルコン社製）にとり、遠心分離（130×g、10分間）により細胞を集めた。ついで、0.1%のアジ化ナトリウムを含むリン酸緩衝液ＰＢＳ（Ａ-ＰＢＳ；８g/l塩化ナトリウム、0.2g/l KCl、1.15g/l Na2HPO4（無水）、０．２ｇ/ｌ KH2PO4、0.1%アジ化ナトリウム）20mlで細胞の洗浄を行なった。集めた細胞に対しＫＭ９３を0.8ml（10μg/ml：Ａ-ＰＢＳに溶解）加えて懸濁し、４℃で１時間反応させた。ついで、細胞をＡ-ＰＢＳで２回洗浄した後、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）で蛍光標識した抗マウスＩｇＧ抗体／ＩｇＭ抗体［キルケガード・アンド・ペリー・ラボラトリーズ（KIREKEGAAD & PERRY LABORATORIES）社製；Ａ-ＰＢＳで16倍希釈して使用した］を320μｌ加えて懸濁し、４℃で30分間反応させた。ついで、細胞をＡ-ＰＢＳで２回洗浄した後、Ａ-ＰＢＳ 1mlに懸濁し、フルオレッセンス・アクティベーティド・セル・ソーター［エピックス・エリート・フローサイトメーター（EPICS Elite Flow Cytometer）；コールター（COULTER）社製］を用いて、蛍光強度の高い細胞（上位１％）を無菌的に分離回収した。回収した細胞は、0.5mg/mlのG418を含むＲＰＭＩ１６４０・ＩＴＰＳＧＦ培地で培養し増殖させた。増殖した細胞について、再度同様の操作を繰り返すことにより蛍光強度の高い細胞を分離濃縮した。２回目の操作では蛍光強度の高い細胞（上位１％）を、３回目の操作では蛍光強度の高い細胞（上位２０％）を分離回収した。その結果、蛍光強度の増加した細胞、すなわちシアリル・ルイスｘの発現量を増加した細胞を取得することができた。そこで、その細胞を0.5mg/mlのG418を含むＲＰＭＩ１６４０・ＩＴＰＳＧＦ培地で培養後、約5×106の細胞からハート法［ロバート・エフ・マーゴルスキー（Robert F.Margolskee）ら：モレキュラー・アンド・セリュラー・バイオロジー（Mol.Cell.Biol.），8，2837（1988）］によりプラスミドを回収した。回収したプラスミドは、エレクトロポーレーション法［ウイリアム・ジェイ・ドゥワー（William J.Dower）ら：ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Nucleic Acids Res.），16，6127（1988）］により大腸菌LE392株に導入し、アンピシリン耐性株を取得した。その形質転換株よりキィアジェン（Qiagen）社製のプラスミド調製キットを用いてプラスミドを調製し、その構造を各種制限酵素で切断して調べたところ、約1.7kbのｃＤＮＡを含んでいることが明らかとなった。このプラスミドをｐＡＭｏＰＲＴＨ２１と名付け、上記の方法で再度ＫＪＭ−１株に導入し、ＫＭ９３を用いた間接蛍光抗体染色を行なったところ、このプラスミドを有するＫＪＭ−１株では、コントロールプラスミド（ｐＡＭｏＰＲＣ３Ｓｃ）を導入したＫＪＭ−１株に比べ、シアリル・ルイスｘの発現量が約10倍に増加していることが判明した。以上の結果から、このｃＤＮＡがシアリル・ルイスｘの生産に関与するα１，３−フコシルトランスフェラーゼをコードするｃＤＮＡであることが明らかとなった。
３．α１，３−フコシルトランスフェラーゼをコードするｃＤＮＡ（TH21）の塩基配列の決定
（１）α１，３−フコシルトランスフェラーゼをコードするｃＤＮＡ（TH21）のｐＵＣ１１９への組み込み（第１６図参照）
ｐＡＭｏＰＲＴＨ２１（２μg）をＹ−０緩衝液50μｌに溶解し、30単位のSacIを加え、37℃で２時間消化反応を行なった。エタノール沈殿後、30μｌのＤＮＡポリメラーゼＩ緩衝液に溶解し、６単位の大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩクレノー断片を加え、37℃で60分間反応させ、SacI消化によって生じた３’突出末端を平滑末端に変えた。該反応液をアガロースゲル電気泳動に供した後、約1.8kbのＤＮＡ断片を回収した。
また、ｐＵＣ１１９［メッシング（Messing）ら：メソッド・イン・エンザイモロジー（Methods in Enzymology），153，3（1987）］1μgをＹ−１００緩衝液30μｌに溶解し、20単位のHincIIを加え、37℃で２時間消化反応を行なった。その後、１Ｍトリス−HCl（pH8.0）を30μｌと大腸菌アルカリフォスファターゼ（宝酒造社製）１単位を加え、37℃で２時間脱リン酸化反応を行なった。エタノール沈殿後、ＴＥ緩衝液30μｌに溶解し、アガロースゲル電気泳動を行ない、約3.16kbのＤＮＡ断片を回収した。
上記で得られたｐＡＭｏＰＲＴＨ２１由来のSacI（平滑末端）断片（1.8kb）0.05μgとｐＵＣ１１９由来のHincII断片（3.16kb）0.05μgをＴ４リガーゼ緩衝液30μｌに溶解し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ175単位を加えて、12℃で16時間結合反応を行なった。該反応液を用いて大腸菌JM105株［ヤニッシュ−ペロン（Yanisch-Perron）ら：ジーン（Gene），33，103（1985）］をコーエンらの方法によって形質転換し、アンピシリン耐性株を得た。これらの形質転換株から公知の方法に従ってプラスミドを単離し、その構造を制限酵素消化により確認した。ｐＡＭｏＰＲＴＨ２１由来のSacI（平滑末端）断片のｐＵＣ１１９中で向きが異なる２種のプラスミドを単離し、それぞれのプラスミドをｐＵＣ１１９−ＴＨ２１およびｐＵＣ１１９−ＴＨ２１Ｒと名付けた。
（２）塩基配列決定用欠失変異プラスミドの造成
ｐＵＣ１１９−ＴＨ２１（２μg）およびｐＵＣ１１９−ＴＨ２１Ｒ（2μg）をそれぞれＹ−０緩衝液30μｌに溶解し、50単位のSacIを加え、37℃で16時間消化反応を行なった。その後、塩化ナトリウム濃度が100mMになるように塩化ナトリウムを添加し、40単位のBamHIを加え、さらに37℃で２時間消化反応を行なった。エタノール沈殿後、ExoIII緩衝液（宝酒造社製のキロシークエンス用デレーションキットに添付）100μｌに溶解した。
上記で得られたｐＵＣ１１９−ＴＨ２１由来のSacI-BamHI断片およびｐＵＣ１１９−ＴＨ２１Ｒ由来のSacI-BamHI断片より、宝酒造社製のキロシークエンス用デレーションキットを用いて合計２１種の欠失変異プラスミドを作製した。具体的な試薬および方法は、キットに添付されている説明書に従った。
上記で得られたデレーションプラスミドの塩基配列は、アプライド・バイオシステムズ社の塩基配列決定キット（Taq DyeDeoxyTM Terminator Cycle Sequencing Kit；商品番号401113）を用いて決定した。決定した塩基配列を配列番号１に示した。その結果、TH21は、342アミノ酸からなるタンパク質をコードしていることが明らかになった。またそのアミノ酸配列より、このタンパク質がグリコシルトランスフェラーゼ（GT）に共通な構造を有することが明らかになった。すなわち、Ｎ末端の14アミノ酸を細胞質側に出し、それに続く19アミノ酸からなる疎水性に富む領域で膜に結合し、残りの大半のＣ末端部分（触媒部位を含む）をゴルジ体内腔に露出するといった構造をとると考えられる。また、これまでに構造が明らかになっている公知のグリコシルトランスフェラーゼとアミノ酸配列を比較したところ、FucT-III、FucT-IV、FucT-VおよびFucT-VIと30％から40％の相同性があることが判明した。TH21をナマルバ細胞内で発現させるとシアリル・ルイスｘ糖鎖の発現が増加すること、TH21のコードするタンパク質がフコシルトランスフェラーゼと相同性を有すること、およびTH21のコードするタンパク質が上記の公知のグリコシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列と異なることからTH21は新規α１，３−フコシルトランスフェラーゼをコードしていることが明らかとなった。
実施例２．フコシルトランスフェラーゼ発現プラスミドを導入したＫＪＭ−１株におけるシアリル・ルイスｘ（Sialyl Lewis-ｘ）糖鎖の合成
プラスミドｐＡＭｏＰＲＣ３Ｓｃ（直接発現クローニングベクター；コントロール）およびｐＡＭｏＰＲＴＨ２１（フコシルトランスフェラーゼ発現用プラスミド）をキィアジェン（Qiagen）社製のプラスミド調製キットである>plasmid<maxi kit（商品番号  41031）を用いて調製した。取得したプラスミドはエタノール沈殿後、１μg/μｌになるようにＴＥ緩衝液に溶解した。その後、両プラスミドを、エレクトロポーレーション法［Miyajiら：サイトテクノロジー（Cytotechnology），3，133（1990）］により、それぞれナマルバＫＪＭ−１株に導入した。1.6×106細胞あたり４μgのプラスミドを導入後、8mlのＲＰＭＩ１６４０・ＩＴＰＳＧＦ培地に懸濁し、CO2インキュベーターで37℃で24時間培養した。その後、G418（ギブコ社製）を0.5mg/mlになるように添加して７日間培養した。その後、22mlのＲＰＭＩ１６４０・ＩＴＰＳＧＦ培地（0.5mg/mlのG418を含む）を添加し、さらに５日間培養し形質転換株を得た。取得した形質転換株を、G418を0.5mg/ml含むＲＰＭＩ１６４０・ＩＴＰＳＧＦ培地で培養した後、それぞれ1.0×106個の細胞をマイクロチューブ（1.5ml：エッペンドルフ社製）にとり、遠心分離（550×g、７分間）により細胞を集めた。ついで、0.1%のアジ化ナトリウムを含むリン酸緩衝液ＰＢＳ（Ａ-ＰＢＳ；８g/l NaCl、0.2g/l KCl、1.15g/l Na2HPO4（無水）、0.2g/l KH2PO4、0.1%アジ化ナトリウム）１mlで細胞の洗浄を行なった。集めた細胞に対し、シアリル・ルイスｘ糖鎖に対するＩｇＭクラスのマウス抗体であるＣＳＬＥＸ１［Fukushimaら：キャンサー・リサーチ（Cancer Res.），44，5279（1984）］およびＩｇＭクラスのマウス抗体であるＫＭ９３［Furuyaら：アンチ・キャンサー・リサーチ（Anticancer Res.），12，27（1992）］を用いて間接蛍光抗体染色を行ない、これらの細胞におけるシアリル・ルイスｘ糖鎖の発現を調べた。集めた細胞に対しＣＳＬＥＸ１あるいはＫＭ９３をそれぞれ50μｌ（10μg/ml）加えて懸濁し、4℃で１時間反応させた。ついで、細胞をＡ-ＰＢＳで３回洗浄した後、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）で蛍光標識した抗マウスＩｇＧ抗体／ＩｇＭ構体［キルケガード・アンド・ペリー・ラボラトリーズ（KIRKEGAAD & PERRY LABORATORIES）社製；Ａ-ＰＢＳで16倍希釈して用いた］20μｌを加えて懸濁し、４℃で30分間反応させた。細胞をＡ-ＰＢＳで３回洗浄した後、再度Ａ-ＰＢＳに懸濁し、エピックス・エリート・フローサイトメーター［EPICS Elite Flow Cytometer；コールター（COULTER）社製］で解析を行なった。
対照として、ＣＳＬＥＸ１またはＫＭ９３の代わりに正常BALB/cマウスより採取した血清（Ａ-ＰＢＳで500倍希釈して用いた）を用いて上記と同様の実験を行なった。
結果を第１７図に示す。直接発現クローニングベクターｐＡＭｏＰＲＣ３Ｓｃ（コントロールプラスミド）を導入したＫＪＭ−１株において、ＣＳＬＥＸ１あるいはＫＭ９３で染色した細胞の蛍光強度は、対照の蛍光強度と比較して強いことがわかる。このことは、ＫＪＭ−１株がもともとシアリル・ルイスｘ糖鎖を発現していることを意味している。また、ＣＳＬＥＸ１あるいはＫＭ９３による染色処理を施したｐＡＭｏＰＲＴＨ２１（フコシルトランスフェラーゼ発現プラスミド）を持つＫＪＭ−１株の蛍光強度は、ＣＳＬＥＸ１あるいはＫＭ９３による染色処理を施したｐＡＭｏＰＲＣ３Ｓｃ（コントロールプラスミド）を持つＫＪＭ−１株の蛍光強度よりさらに強くなっていることがわかる。このことは、TH21がコードするフコシルトランスフェラーゼを細胞内で発現させることにより細胞表面の糖タンパクあるいは糖脂質の糖鎖上にシアリル・ルイスｘ糖鎖を新たに合成できることを示している。また、このことはこのフコシルトランスフェラーゼを生産させた細胞から分泌される糖タンパクの糖鎖上にも、シアリル・ルイスｘ糖鎖を新たに合成できることを示している。したがって、このフコシルトランスフェラーゼを発現させた細胞を宿主として、有用な糖タンパクを分泌生産することにより、分泌生産される糖タンパクにシアリル・ルイス糖鎖を付与することが可能である。また、シアリル・ルイスｘ糖鎖の合成が可能なことから、このTH21がコードするフコシルトランスフェラーゼがα１，３−フコシルトランスフェラーゼ活性を有することが判明した。
実施例３．ＫＪＭ−１細胞によるα１，３−フコシルトランスフェラーゼ（TH21）の分泌生産
１．分泌発現ベクターｐＡＭｏＰＲＳＡの造成：
（１）ｐＡＧＥ１４７の造成（第１８図参照）
ｐＡＧＥ１０７のSV40初期遺伝子プロモーターをモロニー・マウス白血病ウイルスのLTRのプロモーターにすげかえたプラスミドｐＡＧＥ１４７の造成を以下のようにして行った。
プラスミドｐＰＭＯＬ１［特開平1-63394号公報］２μgをＹ−０緩衝液30μｌに溶解し、20単位のSmaIを加え、30℃で３時間消化反応を行った。その後、塩化ナトリウムを50mMになるように添加し、20単位のClaIを加えて37℃で２時間消化反応を行った。該反応液をアガロースゲル電気泳動に供した後、モロニー・マウス白血病ウイルスのLTRプロモーターを含む約0.6kbのＤＮＡ断片を回収した。
次に、実施例１の１項（８）で合成した２種の合成ＤＮＡリンカーをそれぞれ25ピコモル（pmoles）ずつＴ４キナーゼ緩衝液10μｌに溶解し、５単位のＴ４ＤＮＡキナーゼを加え、37℃で30分間反応させることにより５’末端をリン酸化した。
上記で得られたｐＰＭＯＬ１由来のClaI-SmaI断片（0.6kb）0.05μgと５’リン酸化された２種の合成ＤＮＡ（１ピコモルずつ）およびHindIIIリンカー（5'-pCAAGCTTG-3'；宝酒造社製）（１ピコモル）をＴ４リガーゼ緩衝液30μｌに溶解し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ200単位を加え、12℃で16時間結合反応を行った。エタノール沈澱により該ＤＮＡ断片を回収した後、Ｙ−１００緩衝液に溶解し、10単位のHindIIIおよび10単位のXhoIを加えて37℃で２時間消化反応を行った。反応をフェノール−クロロホルム抽出により停止させ、エタノール沈澱により該ＤＮＡ断片を回収した。
一方、ｐＡＧＥ１０７［特開平3-22979、宮地ら：サイトテクノロジー（Cytotechnology），3，133（1990）］１μgを30μｌのＹ−１００緩衝液に溶解し、10単位のHindIIIと10単位のXhoIを加えて37℃で２時間消化反応を行った。該反応液をアガロースゲル電気泳動に供した後、G418耐性遺伝子およびアンピシリン耐性遺伝子を含む約6.0kbのＤＮＡ断片を回収した。
上記で得たｐＡＧＥ１０７由来のHindIII-XhoI断片（6.0kb）0.3μgとｐＰＭＯＬ１由来のHindIII-XhoI断片（0.6kb）0.01μgをＴ４リガーゼ緩衝液20μｌに溶解し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ200単位を加え、12℃で16時間結合反応を行った。
該反応液を用いて大腸菌HB101株をコーエンらの方法によって形質転換し、アンピシリン耐性株を得た。この形質転換株から公知の方法に従ってプラスミドを単離した。このプラスミドをｐＡＧＥ１４７と名付け、その構造を制限酵素消化により確認した。
（２）ｐＡＧＥ２４７の造成（第１９図参照）
ｐＡＧＥ２０７のSV40初期遺伝子プロモーターをモロニー・マウス白血病ウイルスのLTRのプロモーターにすげかえたプラスミドｐＡＧＥ２４７の造成を以下のようにして行った。
上記で得られたｐＡＧＥ１４７（２μg）を30μｌのＹ−１００緩衝液に溶解し、10単位のHindIIIと10単位のXhoIを加えて37℃で２時間消化反応を行った。該反応液をアガロースゲル電気泳動に供した後、モロニー・マウス白血病ウイルスのLTRプロモーターを含む約0.63kbのＤＮＡ断片を回収した。
一方、実施例１の１項（１１）で構築したｐＡＧＥ２０７（２μg）を30μｌのＹ−１００緩衝液に溶解し、10単位のHindIIIと10単位のXhoIを加えて37℃で２時間消化反応を行った。該反応液をアガロースゲル電気泳動に供した後、ハイグロマイシン耐性遺伝子およびアンピシリン耐性遺伝子を含む約5.84kbのＤＮＡ断片を回収した。
上記で得られた、ｐＡＧＥ１４７由来のHindIII-XhoI断片（0.63kb）0.05μgとｐＡＧＥ２０７由来のHindIII-XhoI断片（5.84kb）0.1μgをＴ４リガーゼ緩衝液30μｌに溶解し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ100単位を加え、12℃で16時間結合反応を行った。
該反応液を用いて大腸菌HB101株をコーエンらの方法によって形質転換し、アンピシリン耐性株を得た。この形質転換株から公知の方法に従ってプラスミドを単離した。このプラスミドをｐＡＧＥ２４７と名付け、その構造を制限酵素消化により確認した。
（３）ｐＡＭＮ６ｈｙｇの造成（第２０図参照）
モロニー・マウス白血病ウイルスのLTRをプロモーターとし、ハイグロマイシン耐性遺伝子をマーカーとして有する、ヒト顆粒球コロニー刺激因子誘導体の発現プラスミドｐＡＭＮ６ｈｙｇの造成を以下のようにして行った。
上記で得られたｐＡＧＥ２４７（２μg）をＹ−５０緩衝液30μｌに溶解し、20単位のClaIを加え、37℃で２時間消化反応を行った。その後、塩化ナトリウムを175mMになるように添加し、20単位のSalIを加えて37℃で２時間消化反応を行った。該反応液をアガロースゲル電気泳動に供した後、モロニー・マウス白血病ウイルスのLTRプロモーター、アンピシリン耐性遺伝子およびハイグロマイシン耐性遺伝子を含む約4.8kbのＤＮＡ断片を回収した。
一方、特開平2-227075記載の方法により得られたプラスミドｐＡＳＮ６（２μg）をＹ−５０緩衝液30μｌに溶解し、20単位のClaIを加え、37℃で２時間消化反応を行った。その後、塩化ナトリウムを175mMになるように添加し、20単位のSalIと20単位のMluIを加えて37℃で２時間消化反応を行った。該反応液をアガロースゲル電気泳動に供した後、ヒト顆粒球コロニー刺激因子誘導体遺伝子を含む約5.0kbのＤＮＡ断片を回収した。
上記で得られたｐＡＧＥ２４７由来のClaI-SalI断片（4.8kb）0.1μgとｐＡＳＮ６由来のClaI-SalI断片（5.0kb）0.1μgをＴ４リガーゼ緩衝液20μｌに溶解し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ200単位を加え、12℃で16時間結合反応を行った。
該反応液を用いて大腸菌HB101株をコーエンらの方法によって形質転換し、アンピシリン耐性株を得た。この形質転換株から公知の方法に従ってプラスミドを単離した。このプラスミドをｐＡＭＮ６ｈｙｇと名付け、その構造を制限酵素消化により確認した。
（４）ｐＡＭｏＥＲＳＡの造成（第２１図参照）
α１，３−フコシルトランスフェラーゼを黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）プロテインＡの免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）結合領域と融合させた形で分泌発現するためのベクターｐＡＭｏＥＲＳＡの造成を以下のようにして行った。
（３）で得られたｐＡＭＮ６ｈｙｇ（２μg）をＹ−５０緩衝液30μｌに溶解し、20単位のSnaBIを加え、37℃で２時間消化反応を行った。その後、塩化ナトリウムを100mMになるように添加し、20単位のXbaIを加えて37℃で２時間消化反応を行った。該反応液をアガロースゲル電気泳動に供した後、ヒト顆粒球コロニー刺激因子のシグナル配列を含む約0.33kbのＤＮＡ断片を回収した。
また、ｐＰｒＡＳ１［斉藤ら：プロテイン・エンジニアリング（Protein Engineering），2，481（1989）］２μgをＹ−５０緩衝液30μｌに溶解し、20単位のClaIを加え、37℃で２時間消化反応を行った。エタノール沈殿の後、30μｌのＤＮＡポリメラーゼＩ緩衝液に溶解し、６単位の大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ・クレノー断片を加え、37℃で60分間反応させ、ClaI消化によって生じた５’突出末端を平滑末端に変えた。反応をフェノール抽出によって止め、クロロホルム抽出とエタノール沈澱の後、Ｙ−１００緩衝液30μｌに溶解し、20単位のBamHIを加え、37℃で２時間消化反応を行った。該反応液をアガロースゲル電気泳動に供した後、プロテインＡのＩｇＧ結合領域を含む約0.21kbのＤＮＡ断片を回収した。
また、実施例１の１項（１３）で得られたｐＡＭｏＥＲＣ３Ｓｃの２μgをＹ−１００緩衝液30μｌに溶解し、20単位のXbaIと20単位のBamHIを加え、37℃で２時間消化反応を行った。該反応液をアガロースゲル電気泳動に供した後、約12.1kbのＤＮＡ断片を回収した。
上記で得られたｐＡＭＮ６ｈｙｇ由来のSnaBI-XbaI断片（0.33kb）0.05μgとｐＰＲＡＳ１由来のClaI（平滑末端）-BamHI断片（0.21kb）0.05μg、およびｐＡＭｏＥＲＣ３Ｓｃ由来のXbaI-BamHI断片（12.1kb）0.1μgをＴ４リガーゼ緩衝液30μｌに溶解し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ175単位を加えて、12℃で16時間結合反応を行った。
該反応液を用いて大腸菌HB101株をコーエンらの方法によって形質転換し、アンピシリン耐性株を得た。この形質転換株から公知の方法に従ってプラスミドを単離した。このプラスミドをｐＡＭｏＥＲＳＡと名付け、その構造を制限酵素消化により確認した。
（５）ｐＡＭｏＰＲＳＡの造成（第２２図参照）
ｐＡＭｏＥＲＳＡ中のEBNA-1遺伝子を除去したプラスミドｐＡＭｏＰＲＳＡの造成を以下のようにして行った。ｐＡＭｏＰＲＳＡは、ｐＡＭｏＥＲＳＡと同様に分泌発現ベクターとして使用できる。
ｐＡＭｏＥＲＳＡの２μgを10mMトリス−HCl（pH7.5）、6mM MgCl2、80mM塩化ナトリウム、6mM ２−メルカプトエタノールからなる緩衝液（以下、これをＹ−８０緩衝液と略記する）30μｌに溶解し、20単位のXbaIと20単位のAsp718［ベーリンガー・マンハイム（Boehringer Mannheim）社製］を加え、37℃で２時間消化反応を行った。該反応液をアガロースゲル電気泳動に供した後、約1.3kbのＤＮＡ断片を回収した。
また、ｐＡＭｏＰＲＣ３Ｓｃの２μgをＹ−１００緩衝液30μｌに溶解し、20単位のXbaIと20単位のAsp718を加え、37℃で２時間消化反応を行った。該反応液をアガロースゲル電気泳動に供した後、約8.5kbのＤＮＡ断片を回収した。
上記で得られた、ｐＡＭｏＥＲＳＡ由来のXbaI-Asp718断片（1.3kb）0.05μgとｐＡＭｏＰＲＣ３Ｓｃ由来のXbaI-Asp718断片（8.5kb）0.1μgをＴ４リガーゼ緩衝液30μｌに溶解し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ175単位を加えて、12℃で16時間結合反応を行った。
該反応液を用いて大腸菌HB101株をコーエンらの方法によって形質転換し、アンピシリン耐性株を得た。この形質転換株から公知の方法に従ってプラスミドを単離した。このプラスミドをｐＡＭｏＰＲＳＡと名付け、その構造を制限酵素消化により確認した。
２．WM266-4細胞（ヒト・メラノーマ細胞株）からのα2,3-シアリルトランスフェラーゼ（WM17）ｃＤＮＡのクローン化とα2,3-シアリルトランスフェラーゼ（WM17）の分泌生産：
（１）ヒト・メラノーマ細胞であるWM266-4細胞からのα2,3-シアリルトランスフェラーゼ（WM17）ｃＤＮＡのクローン化
（ａ）ナマルバ細胞のヒママメレクチン１２０に対する耐性度の検討
ＫＪＭ−１株を種々の濃度のヒママメレクチン１２０存在下で培養し、ＫＪＭ−１株のヒママメレクチン１２０に対する耐性度を調べた。ＫＪＭ−１株をＲＰＭＩ１６４０・ＩＴＰＳＧＦ培地で５×104細胞/mlの濃度になるように懸濁し、96穴マイクロタイタープレートに200μｌずつ分注した。そこに各種濃度のヒママメレクチン１２０（生化学工業社製）を1/100量ずつ添加し、CO2インキュベーターで37℃で３週間培養した。その結果、ＫＪＭ−１株の成育を完全に阻止するヒママメレクチン１２０の最小濃度は50ng/mlであった。400万個のＫＪＭ−１株について調べたところ、この濃度において、ヒママメレクチン１２０耐性株の自然発生的な出現は見られなかった。
（ｂ）ヒト・メラノーマ細胞株であるWM266-4細胞からのｍＲＮＡの取得
１×108個のWM266-4細胞より、インビトロジェン（Invitrogen）社製のｍＲＮＡ抽出キットであるファースト・トラック（Fast Track；商品番号K1593-02）を用いて、約30μgのｍＲＮＡを取得した（具体的試薬および方法は、キットに添付されているプロトコールに従った）。
（ｃ）ｃＤＮＡライブラリーの作製
上記で得られたｍＲＮＡ ８μgから、インビトロジェン（Invitrogen）社製のｃＤＮＡ合成キットであるザ・ライブラリアンＩ（The Librarian I）を用いて、ランダム・プライマーをプライマーとして２本鎖ｃＤＮＡを合成した。合成した２本鎖ｃＤＮＡと実施例１の２項（２）と同様の方法で調製したSfiIリンカー（11merのものを４μgと８merのものを2.9μg）をＴ４リガーゼ緩衝液45μｌに溶解し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ1050単位を加えて、16℃で16時間結合反応を行った。該反応液をアガロースゲル電気泳動に供した後、約1.2kb以上のｃＤＮＡ断片を回収した。
また、発現クローニングベクターであるｐＡＭｏＰＲＣ３Ｓｃの24μgをＹ−５０緩衝液590μｌに溶解し、80単位のSfiIを加え、37℃で16時間消化反応を行った。この反応液から５μｌを取り、アガロースゲル電気泳動に供し、切断が完了したことを確認した後、ｃＤＮＡを保有していないクローンの割合を減少させるため、40単位のBamHIを加え、さらに37℃で２時間消化反応を行った。該反応液をアガロースゲル電気泳動に供した後、約8.8kbのＤＮＡ断片を回収した。
上記で得られたｐＡＭｏＰＲＣ３Ｓｃ由来のSfiI断片（8.8kb）２μgと上記で精製したｃＤＮＡをＴ４リガーゼ緩衝液250μｌに溶解し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ2000単位を加えて、16℃で16時間結合反応を行った。その後、トランスファーＲＮＡ（tRNA）５μgを添加し、エタノール沈殿の後、ＴＥ緩衝液20μｌに溶解した。該反応液を用いて大腸菌LE392株をエレクトロポーレーション法により形質転換し、約20万個のアンピシリン耐性株を得た。
（ｄ）ヒママメレクチン１２０に対する耐性化を利用したα2,3-シアリルトランスフェラーゼ（WM17）ｃＤＮＡのクローン化
上記で得られた約20万個のアンピシリン耐性株を混合後、キィアジェン（Qiagen）社製のプラスミド調製キットである>plasmid<maxi kit（商標番号  41031）を用いてプラスミドを調製した。取得したプラスミドはエタノール沈殿の後、１μg/μｌになるようにＴＥ緩衝液に溶解した。
上記プラスミドは、エレクトロポーレーション法［宮地ら：サイトテクノロジー（Cytotechnology），3，133（1990）］により、ＫＪＭ−１株に導入した。1.6×106細胞あたり４μgのプラスミドを導入した後、８mlのＲＰＭＩ１６４０・ＩＴＰＳＧＦ培地に懸濁し、CO2インキュベーター中で37℃で24時間培養した。その後、G418（ギブコ社製）を0.5mg/mlになるように添加して５〜７日培養し、形質転換株を得た。得られた形質転換株は、ヒママメレクチン１２０（50ng/ml）が含まれたＲＰＭＩ１６４０・ＩＴＰＳＧＦ培地で5×104細胞/mlになるように懸濁し、96穴マイクロタイタープレートに200μｌずつ分注した。CO2インキュベーター中で37℃で４週間培養後、ヒママメレクチン１２０耐性株を取得した。その耐性株を培養後、約5×106の細胞からハート法［ロバート・エフ・マーゴルスキー（Robert F. Margolskee）ら：モレキュラー・アンド・セリュラー・バイオロジー（Mol.Cell.Biol.），8，2837（1988）］によりプラスミドを回収した。回収したプラスミドは、エレクトロポーレーション法［ウイリアム・ジェイ・ドゥワー（William J. Dower）ら；ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Nucleic Acids Res.），16，6127（1988）］により大腸菌LE392株に導入し、アンピシリン耐性株を取得した。その形質転換株よりキィアジェン（Qiagen）社製のプラスミド調製キットを用いてプラスミドを調製し、その構造を各種制限酵素で切断して調べたところ、約1.9kbのｃＤＮＡを含んでいることが明かとなった。このプラスミドをｐＡＭｏＰＲＷＭ１７と名付け、上記と同じ方法で再度ＫＪＭ−１株に導入したところ、再びヒママメレクチン１２０耐性となったことから、このｃＤＮＡがレクチン耐性の原因遺伝子であることが明らかとなった。ｐＡＭｏＰＲＷＭ１７を導入したＫＪＭ−１株は200ng/mlのヒママメレクチン１２０存在下でも生育することができる。
（２）α2,3-シアリルトランスフェラーゼ（WM17）ｃＤＮＡの塩基配列の決定
（ａ）α2,3-シアリルトランスフェラーゼ（WM17）ｃＤＮＡのｐＵＣ１１９への組み込み（第２３図参照）
ｐＡＭｏＰＲＷＭ１７の１μgをＹ−１００緩衝液30μｌに溶解し、20単位のEcoRVと20単位のAsp718［ベーリンガー・マンハイム（Boehringer Mannheim）社製］を加え、37℃で２時間消化反応を行った。該反応液をアガロースゲル電気泳動に供した後、約1.9kbのＤＮＡ断片を回収した。
また、ｐＵＣ１１９［メッシング（Messing）ら：メソッド・イン・エンザイモロジー（Methods in Enzymology1)，153，3（1987）］１μgをＫ−２０緩衝液30μｌに溶解し、20単位のSmaIを加え、37℃２時間消化反応を行った。その後、塩化ナトリウム濃度が100mMになるように塩化ナトリウムを添加し、20単位のAsp718を加え、さらに37℃で２時間消化反応を行った。該反応液をアガロースゲル電気泳動に供した後、約3.16kbのＤＮＡ断片を回収した。
上記で得られたｐＡＭｏＰＲＷＭ１７由来のEcoRV-Asp718断片（1.9kb）0.2μgとｐＵＣ１１９由来のSmaI-Asp718断片（3.16kb）0.1μgをＴ４リガーゼ緩衝液30μｌに溶解し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ175単位を加えて、12℃で16時間結合反応を行った。
該反応液を用いて大腸菌HB101株をコーエンらの方法によって形質転換し、アンピシリン耐性株を得た。この形質転換株から公知の方法に従ってプラスミドを単離した。このプラスミドをｐＵＣ１１９−ＷＭ１７と名付け、その構造を制限酵素消化により確認した。
（ｂ）塩基配列決定用欠失プラスミドの造成
（ａ）で得られたｐＵＣ１１９−ＷＭ１７の２μgをＹ−１５０緩衝液30μｌに溶解し、20単位のBamHIと20単位のSphIを加え、37℃で２時間消化反応を行った。エタノール沈殿の後、ExoIII緩衝液（宝酒造社製のキロシークエンス用デレーションキットに添付）100μｌに溶解した。また、同プラスミド２μgをＹ−０緩衝液30μｌに溶解し、20単位のSacIを加え、37℃で２時間消化反応を行った。その後、塩化ナトリウム濃度が150mMになるように塩化ナトリウムを添加し、20単位のNotIを加え、さらに37℃で２時間消化反応を行った。エタノール沈殿の後、エキソヌクレアーゼIII緩衝液100μｌに溶解した。
上記で得られたｐＵＣ１１９−ＷＭ１７由来のBamHI-SphI断片および同プラスミド由来のSacI-NotI断片より、宝酒造社製のキロシークエンス用デレーションキットを用いてそれぞれ数十種の欠失プラスミドを作成した。具体的な試薬および方法は、キットに添付されているプロトコールに従った。
上記で得られた欠失プラスミドの塩基配列は、アプライド・バイオシステムズ社の塩基配列決定用キット（Taq DyeDeoxyTM Terminator Cycle Sequencing Kit；商標番号401113）を用いて決定した。決定した塩基配列は、配列番号６に示した。1742ベースペア（bp）後はポリＡが付加している。この塩基配列より、このＤＮＡは、３２９アミノ酸からなる蛋白質をコードしていることが明らかになった。またそのアミノ酸配列より、この蛋白質が糖転移酵素に共通な構造を有することが明らかになった。すなわち、Ｎ末端側の細胞質領域（８アミノ酸）とそれに続く膜結合領域（１８アミノ酸）およびＣ末端の触媒活性を有する領域（３０３アミノ酸）からなると推定される。
（３）ＫＪＭ−１細胞によるα2,3-シアリルトランスフェラーゼ(ＷＭ１７）の分泌生産
（ａ）α2,3-シアリルトランスフェラーゼ分泌生産用プラスミドｐＡＭｏＰＲＳＡＷ１７-３１Ｆの造成（第２４図参照）
クローン化したα2,3-シアリルトランスフェラーゼ（ＷＭ１７）はその一次配列から、Ｎ末端側の細胞質領域（８アミノ酸）とそれに続く膜結合領域（１８アミノ酸）およびＣ末端の触媒活性を有する領域（３０３アミノ酸）からなると推定される。そこで、α2,3-シアリルトランスフェラーゼの膜結合領域までを除去し、かわりにヒト顆粒球コロニー刺激因子のシグナル配列ならびに黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）のプロテインＡのＩｇＧ結合領域を付加することによりα2,3-シアリルトランスフェラーゼを分泌生産させた。α2,3-シアリルトランスフェラーゼの触媒活性を有するＣ末端領域［配列番号６の３１番目のフェニルアラニンから３２９番目のフェニルアラニンまで］をコードする遺伝子部分をＰＣＲ法を用いて調製し、実施例１の１項（５）で造成した分泌発現ベクターｐＡＭｏＰＲＳＡに組み込んだ。
ＰＣＲ用のプライマーとして、以下に示す２種の合成ＤＮＡ［W17-A（31F）（44mer;配列番号７）およびW17-C（36mer；配列番号８）］をアプライド・バイオシステムズ社３８０Ａ・ＤＮＡ合成機を用いて合成した。
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W17-A（31F）にはEcoRVサイトがW17-CにはAsp718サイトが導入されるように構築されているため、ＰＣＲで増幅されたＤＮＡ断片はEcoRVとAsp718で切断した後に、ｐＡＭｏＰＲＳＡのStuIサイトとAsp718サイト間に組み込むことができる。ＰＣＲは、宝酒造社製のキット（GeneAmpTM DNA Amplification Reagent Kit With AmpliTaqTM Recombinant Taq DNA Polymerase）を用いて行った。反応液の調製はキットの方法にしたがって行い、ＤＮＡサーマルサイクラー（PERKIN ELMER CETUS DNA Thermal Cycler；宝酒造社販売）を用いて、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で３分間の反応を３０サイクル行った後、さらに７２℃で７分間反応させた。鋳型としては、（２）の（ａ）で造成したプラスミドｐＵＣ１１９−ＷＭ１７を１ng使用した。反応終了後、クロロホルム抽出およびエタノール沈澱を行った後、Ｙ−１００緩衝液30μｌに溶解し、20単位のEcoRVおよび20単位のAsp718を加え、37℃で２時間消化反応を行った。該反応液をアガロースゲル電気泳動に供した後、約0.91kbのＤＮＡ断片を回収した。
また、ｐＡＭｏＰＲＳＡの２μgをＹ−１００緩衝液30μｌに溶解し、20単位のStuIと20単位のAsp718を加え、37℃で２時間消化反応を行った。該反応液をアガロースゲル電気泳動に供した後、約9.06kbのＤＮＡ断片を回収した。
上記で得られた、ＰＣＲで増幅したＤＮＡ由来のEcoRV-Asp718断片（0.91kb）0.1μgとｐＡＭｏＰＲＳＡ由来のStuI-Asp718断片（9.06kb）0.1μgをＴ４リガーゼ緩衝液30μｌに溶解し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ175単位を加えて、12℃で16時間結合反応を行った。
該反応液を用いて大腸菌HB101株をコーエンらの方法によって形質転換し、アンピシリン耐性株を得た。この形質転換株から公知の方法に従ってプラスミドを単離した。このプラスミドをｐＡＭｏＰＲＳＡＷ１７−３１Ｆと名付け、その構造を制限酵素消化により確認した。
（ｂ）ナマルバＫＪＭ−１細胞を宿主としたα2,3-シアリルトランスフェラーゼ（ＷＭ１７）の分泌生産
実施例１の１項（５）で得られたプラスミドｐＡＭｏＰＲＳＡ（分泌発現ベクター）および上記で造成したｐＡＭｏＰＲＳＡＷ１７-３１Ｆ（α2,3-シアリルトランスフェラーゼ分泌発現用プラスミド）をキィアジェン（Qiagen）社製のプラスミド調製キット（>plasmid<maxi kit；商標番号41031）を用いて調製した。取得したプラスミドはエタノール沈殿の後、１μg/μｌになるようにＴＥ緩衝液に溶解した。その後、エレクトロポーレーション法［宮地ら：サイトテクノロジー（Cytotechnology），3，133（1990）］により、両プラスミドをそれぞれナマルバＫＪＭ−１株に導入した。1.6×106細胞あたり４μgのプラスミドを導入後、8mlのＲＰＭＩ１６４０・ＩＴＰＳＧＦ培地に懸濁し、CO2インキュベーター中で37℃で24時間培養した。その後、G418（ギブコ社製）を0.5mg/mlになるように添加してさらに７日から14日培養し、形質転換株を得た。取得した形質転換株は、それぞれG418を0.5mg/ml含むＲＰＭＩ１６４０・ＩＴＰＳＧＦ培地30mlに1×105細胞/mlになるように懸濁し、CO2インキュベーター中で37℃で８日間培養した。その後、遠心分離（160×g、10分間）により細胞を除き上清を回収し、再度遠心分離（1500×g、10分間）の後、その上清を回収した。このようにして取得した培養上清は、使用するまで-80℃で保存した。
プラスミドｐＡＭｏＰＲＳＡＷ１７-３１Ｆのコードするα2,3-シアリルトランスフェラーゼは黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）のプロテインＡのＩｇＧ結合領域との融合蛋白質として分泌発現されることになるため、ＩｇＧセファロース（Sepharose）を用いて、容易に精製できる。そこで、上記で得られた培養上清にアジ化ナトリウムを最終濃度0.1％になるように添加した後、製品説明書にしたがって前処理したＩｇＧセファロース［ファルマシア（Pharmacia）製］を100μｌ添加し、４℃で一晩ゆっくり攪拌した。その後、遠心分離（160×g、10分間）によりＩｇＧセファロースを回収し、ＲＰＭＩ１６４０・ＩＴＰＳＧＦ培地１mlで３回洗浄後、このＩｇＧセファロース５μlを直接用いて、α2,3-シアリルトランスフェラーゼ活性を測定した。
活性測定は30μｌのアッセイ溶液［0.1Mカコジル酸-HCl（pH6.5）、0.01M MnCl2、0.45%トライトンX-100、0.1mM基質、上記ＩｇＧセファロース（５μｌ）、5mM CMP-シアル酸（添加あるいは無添加）］中で37℃で２時間反応を行った後、高速液体クロマトグラフィー（以下、ＨＰＬＣと略記する）により生産物を同定することにより活性測定を行った。基質としてはラクト−Ｎ−ネオテトラオース（Lacto-N-neotetraose, Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc；以下、LNnTと略記する）、ラクト−Ｎ−テトラオース（Lacto-N-tetraose, Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc；以下、LNTと略記する）、ラクト−Ｎ−フコペンタオースIII（Lacto-N-fucopentaose III，Galβ1-4（Fucα1-3）GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc；以下、LNFP-IIIと略記する）およびラクト−Ｎ−フコペンタオースV（Lacto-N-fucopentaose V，Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4（Fucα1-3）Glc；以下、LNFP-Vと略記する）［いずれもオックスフォード・グライコシステムズ社製］をアミノピリジンで蛍光標識したものを使用した。基質の蛍光標識は、常法［近藤ら：アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー（Agric. Biol. Chem.)，54，2169（1990）］に従って行った。それぞれのＩｇＧセファロースについて、CMP−シアル酸（糖供与体）が含まれたアッセイ溶液と含まれないアッセイ溶液を用いて反応を行った後、ＨＰＬＣで解析し、CMP-シアル酸が含まれたアッセイ溶液でのみ出現するピークを生成物とした。反応が終了したアッセイ溶液は、100℃で５分間処理後、10000×g、10分間の遠心分離で得られた上清のうち10μｌをＨＰＬＣに供した。ＨＰＬＣは、ＴＳＫｇｅｌ  ＯＤＳ-８０ＴMカラム（4.6mm×30cm；東ソー社製）を使用し、0.02M酢酸緩衝液（pH4.0）を用い、溶出温度50℃、流速１ml/分で溶出を行った。生成物の検出は、島津製作所製の蛍光ＨＰＬＣモニター（Fluorescence HPLC Monitor（RF-535T））を用いて行った（励起波長320nm、放射波長400nm）。生成物の同定は、スタンダードの糖鎖と溶出時間が一致すること、および生成物のシアリダーゼ処理により基質が再生成することにより行った。生成物の定量は、アミノピリジル化したラクトースをスタンダードとして用い、蛍光強度を比較することにより行った。
ｐＡＭｏＰＲＳＡＷ１７-３１Ｆを導入したナマルバ細胞を培養上清由来のＩｇＧセファロースを使用した際には、いずれの糖鎖を基質とした場合もα2,3-シアリルトランスフェラーゼ活性が検出された。LNnTに対する活性を100とした時の相対活性は、LNT、LNFP-V、LNFP-IIIの順でそれぞれ42、32、８であった。一方、ベクターであるｐＡＭｏＰＲＳＡを導入したナマルバ細胞の培養上清由来のＩｇＧセファロースを使用した際には、いずれの糖鎖を基質とした場合も活性は検出されなかった。
以上の結果から、α2,3-シアリルトランスフェラーゼが黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）のプロテインＡのＩｇＧ結合領域との融合蛋白質として培養上清中に分泌生産可能なこと、およびその融合蛋白質がＩｇＧセファロースを用いて、容易に回収、精製されることが示された。
３．WM266-4細胞（ヒト・メラノーマ細胞株）からのα2,3-シアリルトランスフェラーゼ（WM16）ｃＤＮＡのクローン化とα2,3-シアリルトランスフェラーゼ（WM16）の分泌生産
（１）ヒト・メラノーマ細胞であるWM266-4細胞からのα2,3-シアリルトランスフェラーゼ（WM16）ｃＤＮＡのクローン化
（ａ）ヒト・メラノーマ細胞株であるWM266-4細胞からのｍＲＮＡの取得
1×108個のWM266-4細胞（ATCC CRL1676）より、インビトロジェン（Invitrogen）社製のｍＲＮＡ抽出キットであるファーストトラック（Fast Track；商品番号K1593-02）を用いて、約30μgのｍＲＮＡを取得した。具体的試薬および方法は、キットに付与されているプロトコールに従った。
（ｂ）ｃＤＮＡライブリーの作製
上記で得られたｍＲＮＡ８μgから、GIBCO BRL社製のキットであるｃＤＮＡ合成キット（cDNA Synthesis System）を用いて、オリゴｄＴをプライマーとして２本鎖ｃＤＮＡを合成した。その際、逆転写酵素としてはキット中の逆転写酵素（Moloney Murine Leukemia Virus（M-MLV）reverse transcriptase）の代わりに、同社の別の逆転写酵素（Super ScriptTM RNase H−Reverse Transcriptase）を使用した。ついで、合成した２本鎖ｃＤＮＡと実施例１の２項（２）と同様の方法で調製したSfiIリンカー（11merのリンカーを４μgと8merのリンカーを2.9μg）をＴ４リガーゼ緩衝液45μｌに溶解し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ1050単位を加えて、16℃で16時間結合反応を行った。該反応液をアガロースゲル電気泳動に供した後、約1.2kb以上のｃＤＮＡ断片を回収した。
また、実施例１の１項（５）で得られた発現クローニングベクター（Expression Cloning Vector）であるｐＡＭｏＰＲＣ３Ｓｃの24μgをＹ−５０緩衝液590μｌに溶解し、80単位のSfiIを加え、37℃で16時間消化反応を行った。この反応液から５μｌを取り、アガロースゲル電気泳動に供して切断が完了したことを確認した後、ｃＤＮＡを保有していないクローンの割合を減少させるため、40単位のBamHIを加え、さらに37℃で２時間消化反応を行った。該反応液をアガロースゲル電気泳動に供した後、約8.8kbのＤＮＡ断片を回収した。
上記で得られたｐＡＭｏＰＲＣ３Ｓｃ由来のSfiI断片（8.8kb）２μgと上記で精製したｃＤＮＡをＴ４リガーゼ緩衝液250μｌに溶解し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ2000単位を加えて、16℃で16時間結合反応を行った。その後、トランスファーＲＮＡ（tRNA）５μgを添加し、エタノール沈殿の後、ＴＥ緩衝液20μｌに溶解した。該反応液を用いて大腸菌LE392株をエレクトロポーレーション法により形質転換し、約26万個のアンピシリン耐性株を得た。
（ｃ）α2,3-シアリルトランスフェラーゼ（WM16）ｃＤＮＡのクローン化
上記で得られた約26万個のアンピシリン耐性株を混合した後、キィアジェン（Qiagen）社製のプラスミド調製キット（>plasmid<maxi kit；商標番号41031）を用いてプラスミドを調製した。取得したプラスミドはエタノール沈殿の後、１μg/μｌになるようにＴＥ緩衝液に溶解した。
上記プラスミドは、エレクトロポーレーション法により、ＫＪＭ−１株に導入した。1.6×106細胞あたり４μgのプラスミドを導入した後、８mlのＲＰＭＩ１６４０・ＩＴＰＳＧＦ培地に懸濁し、CO2インキュベーター中で37℃で24時間培養した。その後、G418（ギブコ社製）を0.5mg/mlになるように添加して、さらに７日間培養し、形質転換株を得た。得られた形質転換株は、ヒママメレクチン１２０（50ng/ml）が含まれたＲＰＭＩ１６４０・ＩＴＰＳＧＦ培地で５×104細胞/mlになるように懸濁し、96穴マイクロタイタープレートに200μｌずつ分注した。
CO2インキュベーター中で37℃で４週間培養した後、ヒママメレクチン１２０耐性株を取得した。その耐性株を培養した後、約５×106の細胞からハート法によりプラスミドを回収した。回収したプラスミドは、エレクトロポーレーション法により大腸菌LE392株に導入し、アンピシリン耐性株を取得した。その形質転換株よりキィアジェン（Qiagen）社製のプラスミド調製キットを用いてプラスミドを調製し、その構造を各種制限酵素で切断して調べたところ、約2.2kbのｃＤＮＡを含んでいることが明らかとなった。このｃＤＮＡを含むプラスミドをｐＡＭｏＰＲＷＭ１６と名付け、これを上記と同様の方法で再度ＫＪＭ−１株に導入したところ、再びヒママメレクチン１２０耐性となったことから、このｃＤＮＡがα2,3-シアリルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡであると推定される。
（２）α2,3-シアリルトランスフェラーゼ（WM16）ｃＤＮＡの塩基配列の決定
（ａ）α2,3-シアリルトランスフェラーゼ(WM16）ｃＤＮＡのｐＵＣ１１９への組み込み（第２５図参照）
上記で得られたｐＡＭｏＰＲＷＭ１６の２μgをＹ−１００緩衝液50μｌに溶解し、30単位のEcoRVおよび30単位のAsp718〔ベーリンガー・マンハイム（Boehringer Mannheim）社製〕を加え、37℃で２時間消化反応を行った。エタノール沈殿の後、30μｌのＤＮＡポリメラーゼＩ緩衝液に溶解し、６単位の大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ・クレノー断片を加え、37℃で60分間反応させ、Aap718消化によって生じた５’突出末端を平滑末端に変えた。該反応液をアガロースゲル電気泳動に供した後、約2.3kbのＤＮＡ断片を回収した。
また、ｐＵＣ１１９〔メッシング（Messing）ら：メソッド・イン・エンザイモロジー（Methods in Enzymology），153，3（1987）〕の１μgをＹ−１００緩衝液30μｌに溶解し、20単位のHincIIを加え、37℃で２時間消化反応を行った。その後、１Ｍトリス−塩酸（pH8.0）を30μｌと大腸菌アルカリフォスファターゼ（宝酒造社製）１単位を加え、37℃で２時間脱リン酸化反応を行った。エタノール沈殿の後、ＴＥ緩衝液30μｌに溶解し、アガロースゲル電気泳動を行い、約3.16kbのＤＮＡ断片を回収した。
上記で得られたｐＡＭｏＰＲＷＭ１６由来のEcoRV-Asp718（平滑末端）断片（2.3kb）0.05μgとｐＵＣ１１９由来のHincII断片（3.16kb）0.05μgをＴ４リガーゼ緩衝液30μｌに溶解し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ175単位を加えて、12℃で16時間結合反応を行った。該反応液を用いて大腸菌HB101株をコーエンらの方法によって形質転換し、アンピシリン耐性株を得た。これらの形質転換株から公知の方法に従ってプラスミドを単離した。ｐＡＭｏＰＲＷＭ１６由来のEcoRV-Asp718（平滑末端）断片の向きが異なる２種のプラスミドを単離した。それぞれのプラスミドをｐＵＣ１１９−ＷＭ１６およびｐＵＣ１１９−ＷＭ１６Ｒと名付け、その構造を制限酵素消化により確認した。
（ｂ）塩基配列決定用欠失プラスミドの造成
上記で得られたｐＵＣ１１９−ＷＭ１６の２μgおよびｐＵＣ１１９−ＷＭ１６Ｒの２μgをそれぞれＹ−０緩衝液30μｌに溶解し、50単位のKpnIを加え、37℃で16時間消化反応を行った。その後、塩化ナトリウム濃度が100mMになるように塩化ナトリウムを添加し、40単位のNotIを加え、さらに37℃で２時間消化反応を行った。エタノール沈殿の後、エキソヌクレアーゼIII緩衝液（宝酒造社製のキロシークエンス用デレーションキットに添付）100μｌに溶解した。
上記で得られたｐＵＣ１１９−ＷＭ１６由来のKpnI-BamHI断片およびｐＵＣ１１９−ＷＭ１６Ｒ由来のKpnI-BamHI断片より、宝酒造社製のキロシークエンス用デレーションキットを用いてそれぞれ数十種の欠失変異プラスミドを作製した。具体的な試薬および方法は、キットに添付されている説明書に従った。
上記で得られた欠失プラスミドの塩基配列は、アプライド・バイオシステムズ社の塩基配列決定キット（Taq DyeDeoxyTM Terminator Cycle Sequencing Kit；商標番号401113）を用いて決定した。決定した塩基配列は、配列番号９に示した。その結果、ヒママメレクチン１２０耐性遺伝子（WM16）は、３７５アミノ酸からなる蛋白質をコードしていることが明らかになった。またそのアミノ酸配列より、この蛋白質が糖転移酵素に共通な構造を有することが明らかになった。すなわち、Ｎ末端側の細胞質領域（８アミノ酸）とそれに続く膜結合領域（２０アミノ酸）およびＣ末端の触媒活性を有する領域（３４７アミノ酸）からなると推定される。
（３）ＫＪＭ−１細胞によるα2,3-シアリルトランスフェラーゼ（WM16）の分泌生産
（ａ）α2,3-シアリルトランスフェラーゼ分泌生産用プラスミドｐＡＭｏＰＲＳＡＷ１６の造成（第２６図参照）
クローン化したα2,3-シアリルトランスフェラーゼ（WM16）はその一次配列から、Ｎ末端側の細胞質領域（８アミノ酸）とそれに続く膜結合領域（２０アミノ酸）およびＣ末端の触媒活性を有する領域（３４７アミノ酸）からなると推定される。そこで、α2,3-シアリルトランスフェラーゼの膜結合領域までを除去し、かわりにヒト顆粒球コロニー刺激因子のシグナル配列ならびに黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureusのプロテインＡのＩｇＧ結合領域を付加することによりα2,3-シアリルトランスフェラーゼの分泌生産を試みた。α2,3-シアリルトランスフェラーゼの触媒活性を有するＣ末端領域［配列番号９の32番目のセリンから375番目のイソロイシンまで］をコードする遺伝子部分をＰＣＲ法を用いて調製し、実施例１の１項（５）で造成した分泌発現ベクターｐＡＭｏＰＲＳＡに組み込んだ。
ＰＣＲ用のプライマーとして、以下に示す２種の合成ＤＮＡ［W16-A（32L）（38mer；配列番号10）およびW16-C（37mer；配列番号11）］をアプライド・バイオシステムズ社３８０Ａ・ＤＮＡ合成機を用いて合成した。
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W16-A（32L）にはStuIサイトが、W16-CにはAsp718サイトがそれぞれ導入されるように構築されているため、ＰＣＲで増幅されたＤＮＡ断片はStuIとAsp718で切断した後に、ｐＡＭｏＰＲＳＡのStuIサイトとAsp718サイト間に組み込むことができる。ＰＣＲは、宝酒造社製のキット（GeneAmpTM DNA Amplification Reagent Kit with AmpliTaqTM Recombinant Taq DNA Polymerase）を用いて行った。反応液の調製はキットに添付の説明書に従って行い、パーキン・エルマー・シータス社のサーマル・サイクラー（PERKIN ELMER CETUS DNA Thermal Cycler；宝酒造社が販売）を用いて、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で３分間の反応を３０サイクル行った後、さらに７２℃で７分間反応させた。鋳型としては、１ngのプラスミドｐＵＣ１１９−ＷＭ１６を使用した。反応終了後、クロロホルム抽出およびエタノール沈澱を行った後、Ｙ−１００緩衝液30μｌに溶解し、20単位のStuIおよび20単位のAsp718を加え、37℃で２時間消化反応を行った。該反応液をアガロースゲル電気泳動に供した後、約1.0kbのＤＮＡ断片を回収した。
また、ｐＡＭｏＰＲＳＡの２μgをＹ−１００緩衝液30μｌに溶解し、20単位のStuIと20単位のAsp718を加え、37℃で２時間消化反応を行った。該反応液をアガロースゲル電気泳動に供した後、約9.06kbのＤＮＡ断片を回収した。
上記で得られたＰＣＲで増幅したＤＮＡ由来のStuI-Asp718断片（1.0kb）0.1μgとｐＡＭｏＰＲＳＡ由来のStuI-Asp718断片（9.06kb）0.1μgをＴ４リガーゼ緩衝液30μｌに溶解し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ175単位を加えて、12℃で16時間結合反応を行った。該反応液を用いて大腸菌HB101株をコーエンらの方法によって形質転換し、アンピシリン耐性株を得た。この形質転換株から公知の方法に従ってプラスミドを単離した。このプラスミドをｐＡＭｏＰＲＳＡＷ１６と名付け、その構造を制限酵素消化により確認した。
（ｂ）ナマルバＫＪＭ−１細胞を宿主としたα2,3-シアリルトランスフェラーゼ（WM16）の分泌生産
上記で得られたプラスミドｐＡＭｏＰＲＳＡ（分泌発現ベクター）およびｐＡＭｏＰＲＳＡＷ１６（α2,3-シアリルトランスフェラーゼ分泌発現用プラスミド）をキィアジェン（Qiagen）社製のプラスミド調製キット（>plasmid<maxi kit１；商標番号41031）を用いて調製した。取得したプラスミドはエタノール沈殿の後、１μg/μｌになるようにＴＥ緩衝液に溶解した。その後、エレクトロポーレーション法〔宮地ら：サイトテクノロジー（Cytotechnology），3，133（1990）〕により、両プラスミドをそれぞれナマルバＫＪＭ−１株に導入した。1.6×106細胞あたり４μgのプラスミドを導入した後、８mlのＲＰＭＩ１６４０・ＩＴＰＳＧＦ培地に懸濁し、CO2インキュベーター中で37℃で24時間培養した。その後、G418（ギブコ社製）を0.5mg/mlになるように添加して７日間培養した。その後、22mlのＲＰＭＩ１６４０・ＩＴＰＳＧＦ培地（0.5mg/mlのG418を含む）を添加し、さらに５日間培養し形質転換株を得た。取得した形質転換株は、それぞれG418を0.5mg/ml含むＲＰＭＩ１６４０・ＩＴＰＳＧＦ培地30mlに5×104細胞/mlになるように懸濁し、CO2インキュベーター中で37℃で８日間培養した。その後、遠心分離（160×g、10分間）により細胞を除き上清を回収し、再度遠心分離（1500×g、10分間）した後、その上清を回収した。このようにして取得した培養上清は、使用するまで-80℃で保存した。
プラスミドｐＡＭｏＰＲＳＡＷ１６がコードする蛋白質はプロテインＡのＩｇＧとの結合領域との融合蛋白質として分泌生産されるため、ＩｇＧセファロース（Sepharose）を用いて、容易に精製することができる。そこで、上記で得られた培養上清にアジ化ナトリウムを最終濃度0.1％になるように添加した後、添付の説明書に従って前処理したＩｇＧセファロース〔ファルマシア（Pharmacia）製〕を100μｌ添加し、４℃で一晩ゆっくり攪拌した。その後、遠心分離（160×g、10分間）によりＩｇＧセファロースを回収し、50mMトリス−塩酸（pH7.6）、150mM塩化ナトリウム、0.05%トゥイーン２０（Tween20）を含む緩衝液１mlで３回洗浄した。次いで、0.5M酢酸（酢酸アンモニウムでpHを3.4に調製したもの）100μｌでＩｇＧセファロースに吸着した蛋白質を溶出した後、遠心分離（160×g、10分間）によりＩｇＧセファロースを除いた。この溶出液に2Mトリス−塩酸（pH8.0）を添加することによりpHを7.0に調整後、水を加えて最終容量を１mlとした。このようにして調製した溶出液の５μｌを用いて、シアリルトランスフェラーゼ活性を測定した。
活性測定は30μｌのアッセイ溶液〔0.1Mカコジル酸−塩酸（pH6.5）、0.01M MnCl2、0.45%トライトンX-100、0.1mM基質、上記溶出液（５μｌ）、5mM CMP-シアル酸（添加あるいは無添加）〕中で37℃、30分間反応後、ＨＰＬＣにより生産物の同定を行うことにより行った。基質としてはLNnT、LNT、およびLNFP-V［いずれもオックスフォード・グライコシステムズ社製］をアミノピリジンで蛍光標識したものを使用した。基質の蛍光標識は、常法［近藤ら：アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー（Agric. Biol. Chem.），54，2169（1990）］に従って行った。それぞれのＩｇＧセファロースについて、CMP-シアル酸（糖供与体）が含まれたアッセイ溶液と含まれないアッセイ溶液を用いて反応を行った後、ＨＰＬＣで解析し、CMP-シアル酸が含まれたアッセイ溶液でのみ出現するピークを生成物とした。反応が終了したアッセイ溶液は、100℃で５分間処理後、10000×g、10分間の遠心分離で得た上清のうち10μｌをＨＰＬＣに供した。ＨＰＬＣは、ＴＳＫｇｅｌ  ＯＤＳ-８０ＴMカラム（4.6mm×30cm；東ソー社製）を使用し、0.02M酢酸緩衝液（pH4.0）を用い、溶出温度50℃、流速１ml/分で溶出を行った。生成物の検出は、島津製作所製の蛍光ＨＰＬＣモニター（Fluorescence HPLC Monitor（RF-535T））を用いて行った（励起波長320nm、放射波長400nm）。生成物の同定は、スタンダードの糖鎖と溶出時間が一致すること、および生成物のシアリダーゼ処理により基質が再生成することにより行った。生成物の定量は、アミノピリジル化したラクトースをスタンダードとして用い、蛍光強度を比較することにより行った。
ｐＡＭｏＰＲＳＡＷ１６を導入したナマルバ細胞の培養上清由来のＩｇＧセファロースを使用した際には、いずれの糖鎖を基質とした場合もα2,3-シアリルトランスフェラーゼ活性が検出された。LNTに対する活性を100とした時の相対活性は、LNFP-V、LNnTの順でそれぞれ98、４であった。一方、ベクターであるｐＡＭｏＰＲＳＡを導入したナマルバ細胞の培養上清由来のＩｇＧセファロースを使用した際には、いずれの糖鎖を基質とした場合も活性は検出されなかった。
以上の結果から、α2,3-シアリルトランスフェラーゼが黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）のプロテインＡのＩｇＧ結合領域との融合蛋白質として培養上清中に分泌生産されること、およびその分泌生産物がＩｇＧセファロースを用いて、容易に回収、精製されることが示された。
４．SW1116細胞（ヒト大腸癌細胞株）からのα１，３−フコシルトランスフェラーゼ（Fuc-TVI）ｃＤＮＡのクローン化とFuc-TVI発現プラスミドの造成
（１）SW1116細胞（ヒト大腸癌細胞株）からのα１，３−フコシルトランスフェラーゼ（Fuc-TVI）ｃＤＮＡのクローン化
（ａ）発現ベクターｐＡＭｏＰＲＣ３Ｓｃを導入したＫＪＭ−１株のMaacia amurensis lectin Iに対する耐性度の検討
実施例１の１項（１５）で得られた発現ベクターｐＡＭｏＰＲＣ３Ｓｃを導入したＫＪＭ−１株を種々の濃度のMaacia amurensis lectin I（以下、MAL-Iと略記する；ベクター（Vector）社製）存在下で培養し、MAL-Iに対する耐性度を調べた。ＫＪＭ−１株をＲＰＭＩ１６４０・ＩＴＰＳＧＦ培地で5×104細胞/mlの濃度になるように懸濁し、96穴マイクロタイタープレートに200μｌずつ分注した。そこに種々の濃度のMAL-Iを1/100量ずつ添加し、CO2インキュベーター中で37℃で３週間培養した。その結果、ＫＪＭ−１株の成育を完全に阻止するMAL-Iの最小濃度は10mg/mlであった。400万個のＫＪＭ−１株について調べたところ、この濃度において、MAL-I耐性株の自然発生的な出現は見られなかった。
（ｂ）SW1116細胞からのｍＲＮＡの取得
１×108個のSW1116細胞（ATCC CCL223）より、インビトロジェン（Invitrogen）社製のｍＲＮＡ抽出キットであるファーストトラック（Fast Track；商品番号K1593-02）を用いて、約30μgのｍＲＮＡを取得した。具体的試薬および方法は、キットに添付されているプロトコールに従った。
（ｃ）ｃＤＮＡライブラリーの作製
上記で得られたｍＲＮＡ ８μgから、実施例１の２項（２）と同様の方法によりｃＤＮＡライブラリーの造成を行い、約48万個のアンピシリン耐性株を得た。
（ｄ）α１，３−フコシルトランスフェラーゼ（Fuc-TVI）ｃＤＮＡのクローン化
上記で得られた約48万個のアンピシリン耐性株（ｃＤＮＡライブラリー）を混合した後、キィアジェン（Qiagen）社製のプラスミド調製キット（>plasmid<maxi kit；商品番号41031）を用いてプラスミドを調製した。取得したプラスミドはエタノール沈殿の後、１μg/μｌになるようにＴＥ緩衝液に溶解した。
上記プラスミドは、エレクトロポーレーション法によりＫＪＭ−１株に導入した。1.6×106細胞あたり４μｇのプラスミドを導入した後、８mlのＲＰＭＩ１６４０・ＩＴＰＳＧＦ培地に懸濁し、CO2インキュベーター中で37℃で24時間培養した。その後、G418（ギブコ社製）を0.5mg/mlになるように添加して、さらに７日間培養し、形質転換株を得た。得られた形質転換株は、MAL-I（10mg/ml）およびG418（0.5mg/ml）が含まれたＲＰＭＩ１６４０・ＩＴＰＳＧＦ培地で５×104細胞/mlになるように懸濁し、96穴マイクロタイタープレートに200μｌずつ分注した。
CO2インキュベーター中で37℃で３週間培養した後、MAL-I耐性株を取得した。その耐性株を培養した後、約5×106の細胞からハート法によりプラスミドを回収した。回収したプラスミドは、エレクトロポーレーション法により大腸菌LE392株に導入し、アンピシリン耐性株を取得した。その形質転換株よりキィアジェン（Qiagen）社製のプラスミド調製キットを用いてプラスミドを調製し、その構造を各種制限酵素で切断して調べたところ、約2.1kbのｃＤＮＡを含んでいることが明らかとなった。このｃＤＮＡを含むプラスミドをｐＡＭｏＰＲＭＡＬ４と名付け、これを上記と同様の方法で再度ＫＪＭ−１株に導入したところ、再びMAL-I耐性となったことから、このｃＤＮＡがＫＪＭ−１株にMAL-Iに対する耐性を与える遺伝子（MAL-I耐性遺伝子）であることが判明した。
（２）α１，３−フコシルトランスフェラーゼ（Fuc-TVI）ｃＤＮＡの塩基配列の決定
（ａ）α１，３−フコシルトランスフェラーゼ（Fuc-TVI）ｃＤＮＡのｐＵＣ１１９への組み込み（第２７図参照）
ｐＡＭｏＰＲＭＡＬ４（２μg）をＹ−０緩衝液50μｌに溶解し、30単位のSacIを加え、37℃で２時間消化反応を行った。その後、塩化ナトリウム濃度が150mMになるように塩化ナトリウムを添加し、20単位のEcoRVを加え、さらに37℃で２時間消化反応を行った。エタノール沈殿の後、30μｌのＤＮＡポリメラーゼＩ緩衝液に溶かし、６単位の大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ・クレノー断片を加え、37℃で60分間反応させ、SacI消化によって生じた３’突出末端を平滑末端に変えた。該反応液をアガロースゲル電気泳動に供した後、約2.1kbのＤＮＡ断片を回収した。
また、ｐＵＣ１１９（１μg）をＹ−１００緩衝液30μｌに溶解し、20単位のHincIIを加え、37℃で２時間消化反応を行った。その後、１Ｍトリス−HCl（pH8.0）を30μｌと大腸菌アルカリフォスファターゼ（宝酒造社製）１単位を加え、37℃で２時間脱リン酸化反応を行った。エタノール沈殿の後、ＴＥ緩衝液30μｌに溶解し、アガロースゲル電気泳動を行い、約3.16kbのＤＮＡ断片を回収した。
上記で得られたｐＡＭｏＰＲＭＡＬ４由来のSacI（平滑末端）-EcoRV断片（2.1kb）0.05μｇとｐＵＣ１１９由来のHincII断片（3.16kb）0.05μgをＴ４リガーゼ緩衝液30μｌに溶解し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ175単位を加えて、12℃で16時間結合反応を行った。
該反応液を用いて大腸菌JM105株をコーエンらの方法によって形質転換し、アンピシリン耐性株を得た。これらの形質転換株から公知の方法に従ってプラスミドを単離し、その構造を制限酵素消化により確認した。ｐＵＣ１１９に挿入されたｐＡＭｏＰＲＭＡＬ４由来のSacI（平滑末端）-EcoRV断片の向きが異なる２種のプラスミドを単離し、それぞれのプラスミドをｐＵＣ１１９−ＭＡＬ４およびｐＵＣ１１９−ＭＡＬ４Ｒと名付けた。
（ｂ）塩基配列決定用欠失変異プラスミドの造成
ｐＵＣ１１９−ＭＡＬ４（２μg）およびｐＵＣ１１９−ＭＡＬ４Ｒ（２μg）をそれぞれＹ−０緩衝液30μｌに溶解し、50単位のSacIを加え、37℃で16時間消化反応を行った。その後、塩化ナトリウム濃度が100mMになるように塩化ナトリウムを添加し、40単位のXbaIを加え、さらに37℃で２時間消化反応を行った。エタノール沈殿の後、エキソヌクレアーゼIII緩衝液（宝酒造社製のキロシークエンス用デレーションキットに添付）100μｌに溶解した。
上記で得られた、ｐＵＣ１１９−ＭＡＬ４由来のSacI-XbaI断片およびｐＵＣ１１９−ＭＡＬ４Ｒ由来のSacI-XbaI断片より、宝酒造社製のキロシークエンス用デレーションキットを用いて合計１８種の欠失変異プラスミドを作製した。具体的な試薬および方法は、キットに添付されている説明書に従った。
上記で得られた、デレーションプラスミドの塩基配列は、アプライド・バイオシステムズ社の塩基配列決定キット（Taq DyeDeoxyTM Terminator Cycle Sequencing Kit；商品番号401113）を用いて決定した。その結果、MAL-I耐性遺伝子は、本発明のα１，３−フコシルトランスフェラーゼとは異なる公知のα１，３−フコシルトランスフェラーゼ（Fuc-TVI）をコードしていることが明らかになった。
（３）ＫＪＭ−１細胞によるFuc-TVIの分泌生産
（ａ）Fuc-TVIを分泌発現させるためのプラスミドｐＡＭｏＰＲＳＡＦＴ６の造成（第２８図参照）
クローン化したFuc-TVIはその一次配列から、Ｎ末端側の細胞質領域（１４アミノ酸）とそれに続く膜結合領域（２０アミノ酸）およびＣ末端の触媒活性を有する領域（３２５アミノ酸）からなると推定される。そこで、Fuc-TVIの膜結合領域までを除去し、かわりにヒト顆粒球コロニー刺激因子のシグナル配列ならびに黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）のプロテインＡのＩｇＧ結合領域を付加することによりFuc-TVIの分泌生産を試みた。Fuc-TVIの触媒活性を示すＣ末端領域［40番目のアスパラギン酸から359番目のスレオニンまで］をコードする遺伝子部分をＰＣＲ法を用いて調製し、実施例１の１項（５）で造成した分泌発現ベクターｐＡＭｏＰＲＳＡに組み込んだ。
ＰＣＲ用のプライマーとして、以下に示す２種の合成ＤＮＡ〔F6-N（34mer；配列番号１２）およびF6-C（36mer；配列番号１３）〕をアプライド・バイオシステムズ社３８０Ａ・ＤＮＡ合成機を用いて合成した。
0003756946.tif 000008
F6-N（34mer）にはEcoRVサイトが、F6-C（36mer）にはNotIサイトが導入されるように構築されているため、ＰＣＲで増幅されたＤＮＡ断片はEcoRVとNotIで切断した後に、ｐＡＭｏＰＲＳＡのStuIサイトとNotIサイト間に組み込むことができる。ＰＣＲは、宝酒造社製のキット（GeneAmpTM DNA Amplification Reagent Kit with AmpliTaqTM Recombinant Taq DNA Polymerase）を用いて行った。反応液の調製はキットの方法に従って行い、パーキン・エルマー・シータス社のサーマル・サイクラー（PERKIN ELMER CETUS DNA Thermal Cycler；宝酒造社が販売）を用いて、９４℃で１分間、６５℃で１分間、７２℃で３分間の反応を２０サイクル行った後、さらに７２℃で７分間反応させた。鋳型としては、70ngのプラスミドｐＵＣ１１９−ＭＡＬ４を使用した。反応終了後、クロロホルム抽出およびエタノール沈澱を行った後、Ｙ−８０緩衝液30μｌに溶解し、20単位のEcoRVおよび20単位のNotIを加えて37℃で２時間消化反応を行った。該反応液をアガロースゲル電気泳動に供した後、約0.97kbのＤＮＡ断片を回収した。
また、ｐＡＭｏＰＲＳＡの２μgをＹ−１００緩衝液30μｌに溶解し、20単位のStuIを加え、37℃で２時間消化反応を行った。その後、塩化ナトリウムを150mMになるように添加し、20単位のNotIを加えて37℃で２時間消化反応を行った。該反応液をアガロースゲル電気泳動に供した後、約9.06kbのＤＮＡ断片を回収した。
上記で得られたＰＣＲで増幅したＤＮＡ由来のEcoRV-NotI断片（0.97kb）0.1μgとｐＡＭｏＰＲＳＡ由来のStuI-NotI断片（9.06kb）0.1μgをＴ４リガーゼ緩衝液30μｌに溶解し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ175単位を加えて、12℃で16時間結合反応を行った。該反応液を用いて大腸菌HB101株をコーエンらの方法によって形質転換し、アンピシリン耐性株を得た。この形質転換株から公知の方法に従ってプラスミドを単離した。このプラスミドをｐＡＭｏＰＲＳＡＦＴ６と名付け、その構造を制限酵素消化により確認した。
５．ＫＪＭ−１細胞によるα１，３−フコシルトランスフェラーゼ（TH21）の分泌生産
（１）α１，３−フコシルトランスフェラーゼ（TH21）を分泌発現させるためのプラスミドｐＡＭｏＰＲＳＡＴ２１の造成（第２９図参照）
クローン化したα１，３−フコシルトランスフェラーゼ（TH21）はその一次配列から、Ｎ末端側の細胞質領域（１４アミノ酸）とそれに続く膜結合領域（１９アミノ酸）およびＣ末端の触媒活性を有する領域（３０９アミノ酸）からなると推定される。そこで、α１，３−フコシルトランスフェラーゼ（TH21）の膜結合領域までを除去し、かわりにヒト顆粒球コロニー刺激因子のシグナル配列ならびに黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）のプロテインＡのＩｇＧ結合領域を付加することにより新規α１，３−フコシルトランスフェラーゼ（TH21）の分泌生産を試みた。α１，３−フコシルトランスフェラーゼ（TH21）の触媒活性を有するＣ末端領域［配列番号１あるいは配列番号２の３９番目のグリシンから３４２番目のアラニンまで］をコードする部分をｐＵＣ１１９−ＴＨ２１より切り出し、４項で造成した分泌型Fuc-TVI発現プラスミドｐＡＭｏＰＲＳＡＦＴ６のFuc-TVIをコードする領域と組換えることにより、プラスミドｐＡＭｏＰＲＳＡＴ２１を造成した。ｐＡＭｏＰＲＳＡＴ２１は、プロテインＡのＩｇＧ結合領域とα１，３−フコシルトランスフェラーゼ（TH21）（３９番目のグリシンから３４２番目のアラニンまで）をコードする領域の間にFuc-TVI由来の１５アミノ酸（４０番目のアスパラギン酸から５４番目のスレオニンまで）が付加した融合蛋白質を分泌生産する。
まず、ヒト顆粒球コロニー刺激因子のシグナル配列、プロテインＡのＩｇＧ結合領域およびFuc-TVI由来の１５アミノ酸（４０番目のアスパラギン酸から５４番目のスレオニンまで）をコードする領域をｐＡＭｏＰＲＳＡＦＴ６を鋳型として用いたＰＣＲにより調製した。ＰＣＲ用のプライマーとしては、以下に示す２種の合成ＤＮＡ〔Mo-1（24mer；配列番号１４）およびF6-F（31mer；配列番号１５）〕をアプライド・バイオシステムズ社３８０Ａ・ＤＮＡ合成機を用いて合成した。
0003756946.tif 000009
Mo-1（24merにはHindIIIサイト、F6-F（31mer）にはAsp718サイトが導入されるように構築されており、ＰＣＲで増幅されたＤＮＡ断片はHindIIIとAsp718で切断して使用した。ＰＣＲは、宝酒造社製のキット（GeneAmpTM DNA Amplification Reagent Kit with AmpliTaqTM Recombinant Taq DNA Polymerase）を用いて行った。反応液の調製はキットに添付の説明書に従って行い、パーキン・エルマー・シータス社のサーマル・サイクラー（PERKIN ELMER CETUS DNA Thermal Cycler；宝酒造社が販売）を用いて、９４℃で１分間、６５℃で１分間、７２℃で３分間の反応を２０サイクル行った後、さらに７２℃で７分間反応させた。鋳型としては、70ngのプラスミドｐＡＭｏＰＲＳＡＦＴ６を使用した。反応終了後、クロロホルム抽出およびエタノール沈澱を行った後、Ｙ−８０緩衝液30μｌに溶解し、20単位のAsp718を加え、37℃で２時間消化反応を行った。その後、５単位のHindIIIを加え、37℃で１０分間部分消化反応を行った。該反応液をアガロースゲル電気泳動に供した後、約0.4kbのＤＮＡ断片を回収した。
また、ｐＵＣ１１９−ＴＨ２１の２μgをＹ−１００緩衝液30μｌに溶解し、20単位のTaqIを加えて37℃で２時間消化反応を行った。エタノール沈殿の後、30μｌのＤＮＡポリメラーゼＩ緩衝液に溶解し、６単位の大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ・クレノー断片を加え、37℃で60分間反応させ、TaqI消化によって生じた５’突出末端を平滑末端に変えた。反応をフェノール抽出によって止め、クロロホルム抽出とエタノール沈澱の後、Ｙ−８０緩衝液30μｌに溶解し、20単位のAsp718を加え、37℃で２時間消化反応を行った。該反応液をアガロースゲル電気泳動に供した後、約1.0kbのＤＮＡ断片を回収した。
また、ｐＡＭｏＰＲＣ３Ｓｃの２μgをＹ−１５０緩衝液30μｌに溶解し、20単位のNotIを加え37℃で２時間消化反応を行った。エタノール沈殿の後、30μｌのＤＮＡポリメラーゼＩ緩衝液に溶かし、６単位の大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ・クレノー断片を加え、37℃で60分間反応させ、NotI消化によって生じた５’突出末端を平滑末端に変えた。反応をフェノール抽出によって止め、クロロホルム抽出とエタノール沈澱の後、Ｙ−８０緩衝液30μｌに溶解し、20単位のHindIIIを加え、37℃で２時間消化反応を行った。該反応液をアガロースゲル電気泳動に供した後、約8.7kbのＤＮＡ断片を回収した。
上記で得られたＰＣＲで増幅したＤＮＡ由来のHindIII-Asp718断片（0.4kb）0.05μgとｐＵＣ１１９−ＴＨ２１由来のAsp718-TaqI（平滑末端）断片（1.0kb）0.1μgおよびｐＡＭｏＰＲＣ３Ｓｃ由来のHindIII-NotI（平滑末端）断片（8.7kb）0.2μgをＴ４リガーゼ緩衝液30μｌに溶解し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ175単位を加えて、12℃で16時間結合反応を行った。該反応液を用いて大腸菌HB101株をコーエンらの方法によって形質転換し、アンピシリン耐性株を得た。この形質転換株から公知の方法に従ってプラスミドを単離した。このプラスミドをｐＡＭｏＰＲＳＡＴ２１と名付け、その構造を制限酵素消化により確認した。
（２）ナマルバＫＪＭ−１細胞を宿主としたα１，３−フコシルトランスフェラーゼ（TH21）およびFuc-TVIの分泌生産
Fuc-TVIは公知のα１，３−フコシルトランスフェラーゼであることから、Fuc-TVIも同時に調製し対照として用いた。
上記で得られたプラスミドｐＡＭｏＰＲＳＡ（分泌発現ベクター）、ｐＡＭｏＰＲＳＡＴ２１〔α１，３−フコシルトランスフェラーゼ（TH21）分泌発現用プラスミド〕およびｐＡＭｏＰＲＳＡＦＴ６（Fuc-TVI分泌発現用プラスミド）をキィアジェン（Qiagen）社製のプラスミド調製キット（>plasmid<maxi kit；商品番号41031）を用いて調製した。取得したプラスミドはエタノール沈殿の後、１μg/μｌになるようにＴＥ緩衝液に溶解した。その後、エレクトロポーレーション法により、両プラスミドをそれぞれナマルバＫＪＭ−１株に導入した。１．６×１０6細胞あたり４μgのプラスミドを導入後、８mlのＲＰＭＩ１６４０・ＩＴＰＳＧＦ培地に懸濁し、CO2インキュベーター中で37℃で24時間培養した。その後、G418（ギブコ社製）を0.5mg/mlになるように添加して７日間培養した。その後、22mlのＲＰＭＩ１６４０・ＩＴＰＳＧＦ培地（0.5mg/mlのG418を含む）を添加し、さらに５日間培養し形質転換株を得た。取得した形質転換株は、それぞれG418を0.5mg/ml含むＲＰＭＩ１６４０・ＩＴＧＳＧＦ培地30mlに５×１０4細胞/mlになるように懸濁し、CO2インキュベーターで37℃で８日間培養した。その後、遠心分離（160×g、10分間）により細胞を除き上清を回収し、再度遠心分離（1500×g、10分間）後、その上清を回収した。このようにして取得した培養上清は、使用するまで-80℃で保存した。
プラスミドｐＡＭｏＰＲＳＡＴ２１がコードするα１，３−フコシルトランスフェラーゼ（TH21）およびプラスミドｐＡＭｏＰＲＳＡＦＴ６がコードするFuc-TVIはプロテインＡのＩｇＧ結合領域との融合蛋白質として分泌発現されるため、ＩｇＧセファロース（Sepharose）を用いて、容易に精製することができる。そこで、上記で得られた培養上清にアジ化ナトリウムを最終濃度0.1％になるように添加した後、製品説明書にしたがって前処理したＩｇＧセファロース〔ファルマシア（Pharmacia）製〕を10μｌ添加し、４℃で一晩ゆっくり攪拌した。その後、遠心分離（160×g、10分間）によりＩｇＧセファロースを回収し、ＲＰＭＩ１６４０・ＩＴＰＳＧＦ培地１mlで３回洗浄後、10μｌのＲＰＭＩ１６４０・ＩＴＰＳＧＦ培地に懸濁した。このＩｇＧセファロース懸濁液５μｌを用いてフコシルトランスフェラーゼ活性を測定した。
活性測定は、30μｌのアッセイ溶液〔0.1Mカコジル酸-塩酸（pH6.8）、25mM塩化マンガン、10mM  L-フコース、5mM ATP、0.1mM基質、上記ＩｇＧセファロース（５μｌ）、1.5mM GDP-フコース（添加あるいは無添加）〕中で37℃で２時間反応後、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により生産物を同定することにより行った。基質としてはラクト−Ｎ−ネオテトラオース（Lacto-N-neotetraose, Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc；以下、LNnTと略記する）、ラクト−Ｎ−テトラオースＩ（Lacto-N-tetraose，Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc；以下、LNTと略記する）、シアリルラクト−Ｎ−テトラオース（Sialyllacto-N-tetraose a；以下、LSTaと略記する）、ラクト−Ｎ−フコペンタオース（Lacto-N-fucopentaose I，Fucα1-2Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc；以下、LNFP-Iと略記する）、ラクト−Ｎ−フコペンタオースII（Lacto-N-fucopentaose II，Galβ1-3（Fucα1-4）GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc；以下、LNFP-IIと略記する）、ラクト−Ｎ−フコペンタオースIII（Lacto-N-fucopentaose III，Galβ1-4（Fucα1-3）GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc；以下、LNFP-IIIと略記する）、ラクト−Ｎ−フコペンタオースV（Lacto-N-fucopentaose V，Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4（Fucα1-3）Glc；以下、LNFP-Vと略記する）［いずれもオックスフォード・グライコシステムズ社製］をアミノピリジンで蛍光標識したものを使用した。基質の蛍光標識は、常法〔近藤ら：アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー（Agric. Biol. Chem.），54，2169（1990）〕に従って行った。また、アミノピリジンで蛍光標識されたLNnTを基質として上記２項で調製した分泌型のα2,3-シアリルトランスフェラーゼ（WM17）を反応させることにより、アミノピリジンで蛍光標識されたシアリルラクト−Ｎ−ネオテトラオース（Sialyllacto-N-neotetraose，NeuAcα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc；以下、Sialyl-LNnTと略記する）を調製し基質として用いた。また、アミノピリジンで蛍光標識されたLNFP-Vを基質として上記３項で調製した分泌型のα2,3-シアリルトランスフェラゼ（WM16）を反応させることにより、アミノピリジンで蛍光標識されたシアリルラクト−Ｎ−フコペンタオースV（Sialyllacto-N-fucopentaose V，NeuAcα2-3Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4（Fucα1-3）Glc；以下、Sialyl-LNFP-Vと略記する）を調製し基質として用いた。それぞれの基質について、GDP-フコース（糖供与体）を含むアッセイ溶液と含まないアッセイ溶液を用いて反応後、ＨＰＬＣで解析しGDP-フコースを含むアッセイ溶液でのみ出現するピークを生成物とした。反応が終了したアッセイ溶液は、100℃で５分間処理後、10000×g、10分間の遠心分離で得た上清のうち10μｌをＨＰＬＣに供した。ＨＰＬＣは、ＴＳＫｇｅｌ  ＯＤＳ-８０ＴMカラム（4.6mm×30cm；東ソー社製）を使用し、溶出温度30℃、流速１ml/分の条件で0.02M酢酸アンモニウム緩衝液（pH4.0）を用いて溶出を行った。生成物の検出は、島津製作所製の蛍光ＨＰＬＣモニター（Fluorescence HPLC Monitor RF-535T）を用いて行った（励起波長320nm、放射波長400nm）。生成物の同定は、スタンダードの糖鎖と溶出時間が一致することを指標とした。スタンダードとしては、上記で調製したアミノピリジンで蛍光標識したLNFP-I、LNFP-II、LNFP-III、LNFP-V、およびアミノピリジンで蛍光標識されたSialyl-LNnTを基質としてFuc-TVIの分泌型酵素を反応させることにより調製したシアリルラクト−Ｎ−フコペンタオースIII（Sialyllacto-N-fucopentaose III，NeuAcα2-3Galβ1-4（Fuc��1-3）GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc；Sialyl-LNFP-III）を用いた。生成物の定量は、アミノピリジン化したタクトースをスタンダードとして用い、蛍光強度を比較することにより行った。
ｐＡＭｏＰＲＳＡＴ２１を導入したナマルバ細胞の培養上清由来のＩｇＧセファロースを使用した際には、Sialyl-LNnTを基質として用いた時にのみα１，３−フコシルトランスフェラーゼ活性が検出された。具体的には、Sialyl-LNnTと基質として、培地１ml中に生産された分泌型酵素を用いて１時間当たり3.2ピコモルのSialyl-LNFP-IIIが合成された。一方、ベクターであるｐＡＭｏＰＲＳＡを導入したナマルバ細胞の培養上清由来のＩｇＧセファロースを使用した際には、いずれの基質を用いても活性は検出されなかった。
以上の結果から、α１，３−フコシルトランスフェラーゼ（TH21）が黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）のプロテインＡのＩｇＧ結合領域との融合蛋白質として培養上清中に分泌生産されること、およびその分泌性産物がＩｇＧセファロースを用いて、容易に回収、精製できることが示された。
実施例４．α１，３−フコシルトランスフェラーゼ（TH21）転写産物のＰＣＲ法による定量および各種細胞における発現量の検討α１，３−フコシルトランスフェラーゼ（TH21）転写産物の定量は、常法〔ギリランド（Gilliland）ら：プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proc.Natl.Acad.Sci.），USA，87，2725（1990）〕にしたがって定量的ＰＣＲ法により行った。また、どの細胞でも同程度発現していると考えられるβ−アクチンの転写産物の定量も同時に行い、細胞間でのｍＲＮＡ量の相違や、サンプル間での逆転写酵素によるｍＲＮＡから一本鎖ｃＤＮＡへの変換効率の相違を補正した。すなわち、各細胞および細胞株におけるα１，３−フコシルトランスフェラーゼ（TH21）転写産物の量は、β−アクチン転写産物の量を100とした時の相対値として表示した。
（１）β−アクチンｃＤＮＡのクローン化
β−アクチンｃＤＮＡはU-937細胞（ヒト単核球系細胞株）の全ＲＮＡから逆転写酵素を用いて合成した一本鎖ｃＤＮＡを鋳型として用いたＰＣＲにより調製した。U-937細胞の全ＲＮＡは常法〔チルグウィン（Chirgwin）ら：バイオケミストリー（Biochemistry），18，5294（1977）〕にしたがって調製した。全ＲＮＡから一本鎖ｃＤＮＡの合成はキット（SUPERSCRIPTTMPreamplification System；ＢＲＬ社製）を用いて行った。ＰＣＲ用のプライマーとしては、以下に示す２種の合成ＤＮＡ〔Ac-Ｎ（40mer；配列番号１６）およびAc-N（40mer；配列番号１７）〕をアプライド・バイオシステムズ社３８０Ａ・ＤＮＡ合成機を用いて合成した。
0003756946.tif 000010
Ac-N（40mer）にはHindIIIサイトが、Ac-C（40mer）にはAsp718サイトが導入されるように構築されているため、ＰＣＲで増幅されたＤＮＡ断片はHindIIIとAsp718で切断した後に、ｐＵＣ１１９のHindIIIサイトとAsp718サイト間に組み込むことができる。ＰＣＲ反応は、宝酒造社製のキット（GeneAmpTM DNA Amplification Reagent Kit with AmpliTaqTM Recombinant Taq DNA Polymerase）を用いて行った。反応液の調製はキットの方法に従って行い、パーキン・エルマー・シータス社のサーマル・サイクラー（PERKIN ELMER CETUS DNA Thermal Cycler；宝酒造社が販売）を用いて、９４℃で３０秒間、６５℃で１分間、７２℃で３分間の反応を２０サイクル行った後、さらに７２℃で７分間反応させた。鋳型としては、U-937細胞の全ＲＮＡから逆転写酵素を用いて合成した一本鎖ｃＤＮＡ（約200ng分）を使用した。反応終了後、クロロホルム抽出およびエタノール沈澱を行った後、Ｙ−８０緩衝液30μｌに溶解し、20単位のHindIIIおよび20単位のAsp718を加え、37℃で２時間消化反応を行った。該反応液をアガロースゲル電気泳動に供した後、約1.2kbのＤＮＡ断片を回収した。
また、ｐＵＣ１１９の１μgを、Ｙ−８０緩衝液30μｌに溶解し、20単位のHindIIIおよび20単位のAsp718を加え、37℃で２時間消化反応を行った。その後、アガロースゲル電気泳動を行い、約3.1kbのＤＮＡ断片を回収した。
上記で得られたＰＣＲで増幅したＤＮＡ断片由来のHindIII−Asp718断片（1.2kb）0.05μgとｐＵＣ１１９由来のHindIII−Asp718断片（3.1kb）0.1μgをＴ４リガーゼ緩衝液30μｌに溶解し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ175単位を加えて、12℃で16時間結合反応を行った。
該反応液を用いて大腸菌HB101株をコーエンらの方法によって形質転換し、アンピシリン耐性株を得た。これらの形質転換株から公知の方法に従ってプラスミドを単離した。このプラスミドをｐＵＣ１１９−ＡＣＴと名付け、その構造を制限酵素消化により確認した。
（２）β−アクチンｃＤＮＡ内に欠失変異を有するプラスミドｐＵＣ１１９−ＡＣＴｄの造成
（１）で造成したｐＵＣ１１９−ＡＣＴの２μgをＹ−５０緩衝液30μｌに溶解し、20単位のEcoO109Iを加え37℃で２時間消化反応を行った。エタノール沈殿の後、30μｌのＤＮＡポリメラーゼＩ緩衝液に溶かし、６単位の大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ・クレノー断片を加え、37℃で60分間反応させ、EcoO109I消化によって生じた５’突出末端を平滑末端に変えた。反応をフェノール抽出によって止め、クロロホルム抽出とエタノール沈澱の後、Ｙ−８０緩衝液30μｌに溶解し、20単位のHindIIIを加え、37℃で２時間消化反応を行った。該反応液をアガロースゲル電気泳動に供した後、約0.3kbのＤＮＡ断片を回収した。
また、ｐＵＣ１１９−ＡＣＴの２μgをＹ−１００緩衝液30μｌに溶解し、20単位のBstEIIを加え60℃で２時間消化反応を行った。エタノール沈澱の後、30μｌのＤＮＡポリメラーゼＩ緩衝液に溶解し、６単位の大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ・クレノー断片を加え、37℃で60分間反応させ、BstEII消化によって生じた５’突出末端を平滑末端に変えた。反応をフェノール抽出によって止め、クロロホルム抽出とエタノール沈澱の後、Ｙ−８０緩衝液30μｌに溶解し、20単位のHindIIIを加え、37℃で２時間消化反応を行った。該反応液をアガロースゲル電気泳動に供した後、約3.8kbのＤＮＡ断片を回収した。
上記で得られたｐＵＣ１１９−ＡＣＴ由来のEcoO109I（平滑末端）-HindIII断片（0.3kb）0.1μgおよびｐＵＣ１１９−ＡＣＴ由来のBstEII（平滑末端）-HindIII断片（3.8kb）0.2μgをＴ４リガーゼ緩衝液30μｌに溶解し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ175単位を加えて、12℃で16時間結合反応を行った。該反応液を用いて大腸菌HB101株をコーエンらの方法によって形質転換し、アンピシリン耐性株を得た。この形質転換株から公知の方法に従ってプラスミドを単離した。このプラスミドをｐＵＣ１１９−ＡＣＴｄと名付け、その構造を制限酵素消化により確認した。
（３）α１，３−フコシルトランスフェラーゼｃＤＮＡ（TH21）内に欠失変異を有するプラスミドｐＵＣ１１９−ＴＨ２１ｄの造成
実施例２の第３項（１）で造成したｐＵＣ１１９−ＴＨ２１の２μgをＹ−０緩衝液30μｌに溶解し、20単位のApaIおよび20単位のNaeIを加え37℃で２時間消化反応を行った。エタノール沈殿の後、30μｌのＤＮＡポリメラーゼＩ緩衝液に溶解し、６単位の大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ・クレノー断片を加え、37℃で60分間反応させ、ApaI消化によって生じた３’突出末端を平滑末端に変えた。反応をフェノール抽出によって止め、クロロホルム抽出とエタノール沈澱の後、Ｙ−８０緩衝液30μｌに溶解し、20単位のHindIIIを加え、37℃で２時間消化反応を行った。該反応液をアガロースゲル電気泳動に供した後、約0.6kbのＤＮＡ断片を回収した。
また、ｐＵＣ１１９−ＴＨ２１の２μgを10mMトリス−HCl（pH7.5）、6mM MgCl2。200mM塩化ナトリウム、6mM ２−メルカプトエタノールからなる緩衝液（以下、これをＹ−２００緩衝液と略記する）30μｌに溶解し、20単位のBstXIを加え37℃で２時間消化反応を行った。エタノール沈殿の後、30μｌのＤＮＡポリメラーゼＩ緩衝液に溶解し、６単位の大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ・クレノー断片を加え、37℃で60分間反応させ、BstXI消化によって生じた３’突出末端を平滑末端に変えた。反応をフェノール抽出によって止め、クロロホルム抽出とエタノール沈澱の後、Ｙ−８０緩衝液30μｌに溶解し、20単位のHindIIIを加え、37℃で２時間消化反応を行った。該反応液をアガロースゲル電気泳動に供した後、約4.1kbのＤＮＡ断片を回収した。
上記で得られたｐＵＣ１１９−ＴＨ２１由来のApaI（平滑末端）−HindIII断片（0.6kb）0.1μgおよびｐＵＣ１１９−ＴＨ２１由来のBstXI（平滑末端）−HindIII断片（4.1kb）0.2μgをＴ４リガーゼ緩衝液30μｌに溶解し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ175単位を加えて、12℃で16時間結合反応を行った。該反応液を用いて大腸菌HB101株をコーエンらの方法によって形質転換し、アンピシリン耐性株を得た。この形質転換株から公知の方法に従ってプラスミドを単離した。このプラスミドをｐＵＣ１１９−ＴＨ２１ｄと名付け、その構造を制限酵素消化により確認した。
（４）定量的ＰＣＲ法を用いた各種細胞および細胞株におけるα１，３−フコシルトランスフェラーゼ（TH21）転写産物の定量
（ａ）各種細胞および細胞株由来の一本鎖ｃＤＮＡ（定量的ＰＣＲの鋳型として使用）の合成
細胞株としては、KJM-1細胞、WM266-4細胞（ATCC CRL 1676）、THP-1細胞（ATCC TIB 202)、HL-60細胞（ATCC CCL 240）、U-937細胞（ATCC CCL 1593)、Colo205細胞（ATCC CCL 222）、LS180細胞（ATCC CCL 187）、SW1116細胞（ATCC CCL 233）、Jurkat細胞、KATO III細胞（ATCC HTB 103）、Capan-1細胞（ATCC HTB 79）、PC-3細胞（ATCC CRL 1435）、SK-N-MC細胞（ATCC HTB 10）、PC-9細胞、HeLa細胞（Japan Cancer Research Resouses Bank CCL 2）、およびヒト・臍帯血管内皮細胞（HUVEC；ATCC CRL 1730）を用いた。
また、健康な人の末梢血よりナイコメッド・ファーマ（Nycomed Pharma）社製のキットであるPolymorphprepTMを用いて多形核白血球と単核球を分離取得した。取得した単核球は常法〔ゴナワ（Gonawa）ら：ジャーナル・オブ・イムノロジー（J. Immunol.），130，706（1983）〕に従ってさらに単球およびリンパ球に分離して取得した。
各細胞の全ＲＮＡは常法〔チルグウィン（Chirgwin）ら：バイオケミストリー（Biochemistry），18，5294（1977）〕に従って調製した。全ＲＮＡから一本鎖ｃＤＮＡの合成はキット（SUPERSCRIPTTM Preamplification System；ＢＲＬ社製）を用いて行った。細胞株については５μgの全ＲＮＡから、血球細胞については、１μgの全ＲＮＡから一本鎖ｃＤＮＡを合成し、それぞれ水で５０倍および１０倍希釈してＰＣＲの鋳型として使用した。
（ｂ）定量的ＰＣＲ用のスタンダードおよび内部コントロールの調製
ｐＵＣ１１９−ＴＨ２１およびｐＵＣ１１９−ＴＨ２１ｄをｃＤＮＡ部分を切り出す制限酵素で切断して直鎖状ＤＮＡに変換した後、それぞれα１，３−フコシルトランスフェラーゼ（TH21）転写産物定量用のスタンダードおよび内部コントロールとして用いた。ｐＵＣ１１９−ＴＨ２１およびｐＵＣ１１９−ＴＨ２１ｄをそれぞれ２μgずつＹ−８０緩衝液40μｌに溶解し、20単位のHindIIIおよび20単位のXbaIを加え、37℃で２時間消化反応を行った。該反応液の一部（５μｌ）をアガロースゲル電気泳動に供し、完全に切断された事を確認後、酵母のトランスファーＲＮＡを１μg/μｌで含む水を用いて段階的に希釈して使用した。
また、ｐＵＣ１１９−ＡＣＴおよびｐＵＣ１１９−ＡＣＴｄを、ｃＤＮＡ部分を切り出す制限酵素で切断して直鎖状ＤＮＡに変換した後、それぞれβ−アクチンの転写産物定量用のスタンダードおよび内部コントロールとして用いた。ｐＵＣ１１９−ＡＣＴおよびｐＵＣ１１９−ＡＣＴｄのそれぞれ２μgをＹ−８０緩衝液40μｌに溶解し、20単位のHindIIIおよび20単位のAsp718を加え、37℃で２時間消化反応を行った。該反応液の一部（５μｌ）をアガロースゲル電気泳動に供し、完全に切断された事を確認後、酵母のトランスファーＲＮＡを１μg/μｌで含む水を用いて段階的に希釈して使用した。
（ｃ）定量的ＰＣＲ法を用いたα１，３−フコシルトランスフェラーゼ（TH21）転写産物の定量
まず（ｂ）で調製した内部コントロール（HindIIIおよびXbaIで切断したｐＵＣ１１９−ＴＨ２１ｄ）10fgの存在下で、（ａ）で調製した各種細胞および細胞株由来の一本鎖ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。ＰＣＲ用のプライマーとしては、以下に示す２種の合成ＤＮＡ〔T21-2（23mer；配列番号１８）およびT21-4（24mer；配列番号１９〕をアプライド・バイオシステムズ社３８０Ａ・ＤＮＡ合成機を用いて合成した。
0003756946.tif 000011
ＰＣＲ反応は、宝酒造社製のキット（GenaAmpTM DNA Amplification Reagent Kit with AmpliTaqTM Recombinant Taq DNA Polymerase）を用いて行った。反応液（40μｌ）の調製はキットの方法に従った。その際、ジメチルスルホキシド（dimethyl sulfoxide）を最終濃度が５％になるように加えた。Taq DNAポリメラーゼ以外を加えた反応液（39μｌ）をパーキン・エルマー・シータス社のサーマル・サイクラー（PERKIN ELMER CETUS DNA Thermal Cycler；宝酒造社が販売）を用いて、９７℃で５分間処理した後、氷中で急冷した。次いで、該反応液に５分の１に希釈したＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを１μｌ加えた後、パーキン・エルマー・シータス社のサーマル・サイクラーを用いて、９４℃で３０秒間、６５℃で１分間、７２℃で２分間の反応を２０サイクル行った。該反応液の一部（15μｌ）をアガロースゲル電気泳動に供した後、増幅されたＤＮＡ断片のパターンを写真で記録した。次いで、そのネガフィルムをデンシトメーター（Shimazu Model CS-900）でスキャニングすることにより、増幅されたＤＮＡ断片の量を測定した。また、各種細胞および細胞株由来の一本鎖ｃＤＮＡのかわりに、（ｂ）で調製したスタンダード（HindIIIおよびXbaIで切断したｐＵＣ１１９−ＴＨ２１）を鋳型として同様にＰＣＲを行い、検量線を作成した。α１，３−フコシルトランスフェラーゼ（TH21）転写産物およびスタンダード由来のＤＮＡ断片の大きさは497bp、内部コントロール由来のＤＮＡ断片の大きさは336bpであり、両者のＤＮＡ断片の量比からα１，３−フコシルトランスフェラーゼ（TH21）転写産物の量（モル数）を算出した。
より正確な転写産物の定量を行なうため、上記のようにして求めた転写産物の量に近い量の内部コントロールを用いて、再度それぞれのサンプルについて同様のＰＣＲを行った。ＰＣＲのサイクル数は内部コントロールの量に応じて変化させた。
β−アクチンの転写産物の定量についても同様に２段階のＰＣＲにより行った。その際、内部コントロールとしては（ｂ）で調製したHindIIIおよびAsp718で切断したｐＵＣ１１９−ＡＣＴｄを、スタンダードとしては（ｂ）で調製したHindIIIおよびAsp718で切断したｐＵＣ１１９−ＡＣＴを用いた。ＰＣＲ用のプライマーとしては、以下に示す２種の合成ＤＮＡ〔Ac-1（24mer；配列番号２０）およびAc-3（24mer；配列番号２１）〕をアプライド・バイオシステムズ社３８０Ａ・ＤＮＡ合成機を用いて合成して使用した。
0003756946.tif 000012
また、１回目のＰＣＲは内部コントロールを10pg用いて、サイクル数１７で行った。また、β−アクチンの場合は、ＰＣＲ反応液にジメチルスルホキドは加えなかった。
α１，３−フコシルトランスフェラーゼ（TH21）転写産物の最終的な量は、β−アクチンの転写産物の量を100とした時の相対値として求めた。その結果を第１表に示す。
0003756946.tif 000013
第１表に示すように、α１，３−フコシルトランスフェラーゼ（TH21）は単球系／顆粒球系細胞株（THP-1細胞、HL-60細胞、U-937細胞）、および末梢白血球（特に多形核白血球）に特異的に発現していることが判明した。α１，３−フコシルトランスフェラーゼ（TH21）は白血球細胞に特異的に発現していること、また、試験官内（in vitro）および細胞内（in vivo）においてシアリル・ルイスｘ糖鎖を合成できることから、白血球におけるセレクチンの糖鎖リガンドの合成に関与していることが証明された。
以上の結果から、定量的ＰＣＲ法を用いることにより、α１，３−フコシルトランスフェラーゼ（TH21）転写産物を定量することができることが明らかとなった。
産業上の利用可能性
本発明により、シアリルルイスｘ等の有用生理活性を有する糖鎖とその修飾物の製造等に有用なα１，３−フコシルトランスフェラーゼが提供される。
配列表
配列番号：１
配列の長さ：1701
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
配列の種類：cDNA to mRNA
起源：
生物名：ヒト
株名：THP-1細胞
細胞の種類：単球系細胞
配列：
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0003756946.tif 000015
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配列番号：２
配列の長さ：342
配列の型：アミノ酸
鎖の数：直鎖状
配列の種類：タンパク質
起源：
生物名：ヒト
株名：THP-1細胞
細胞の種類：単球系細胞
配列：
0003756946.tif 000017
0003756946.tif 000018
配列番号：３
配列の長さ：52
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列
0003756946.tif 000019
配列番号：４
配列の長さ：44
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列
0003756946.tif 000020
配列番号：５
配列の長さ：11
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列
0003756946.tif 000021
配列番号：６
配列の長さ：1766
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
配列の種類：cDNA to mRNA
起源：
生物名：ヒト
株名：WM266-4細胞
細胞の種類：メラノーマ
配列：
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配列番号：７
配列の長さ：44
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列
0003756946.tif 000025
配列番号：８
配列の長さ：36
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列
0003756946.tif 000026
配列番号：９
配列の長さ：2232
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
配列の種類：cDNA to mRNA
起源：
生物名：ヒト
株名：WM266-4細胞
細胞の種類：メラノーマ
配列：
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0003756946.tif 000029
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配列番号：10
配列の長さ：38
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列
0003756946.tif 000031
配列番号：11
配列の長さ：37
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列
0003756946.tif 000032
配列番号：12
配列の長さ：34
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列
0003756946.tif 000033
配列番号：13
配列の長さ：36
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列
0003756946.tif 000034
配列番号：14
配列の長さ：24
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列
0003756946.tif 000035
配列番号：15
配列の長さ：31
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列
0003756946.tif 000036
配列番号：16
配列の長さ：40
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列
0003756946.tif 000037
配列番号17
配列の長さ：40
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列
0003756946.tif 000038
配列番号：18
配列の長さ：23
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列
0003756946.tif 000039
配列番号：19
配列の長さ：24
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列
0003756946.tif 000040
配列番号：20
配列の長さ：24
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列
0003756946.tif 000041
配列番号：21
配列の長さ：24
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列
0003756946.tif 000042
【図１】
0003756946.tif 000043
【図２】
0003756946.tif 000044
【図３】
0003756946.tif 000045
【図４】
0003756946.tif 000046
【図５】
0003756946.tif 000047
【図６】
0003756946.tif 000048
【図７】
0003756946.tif 000049
【図８】
0003756946.tif 000050
【図９】
0003756946.tif 000051
【図１０】
0003756946.tif 000052
【図１１】
0003756946.tif 000053
【図１２】
0003756946.tif 000054
【図１３】
0003756946.tif 000055
【図１４】
0003756946.tif 000056
【図１５】
0003756946.tif 000057
【図１６】
0003756946.tif 000058
【図１７】
0003756946.tif 000059
【図１８】
0003756946.tif 000060
【図１９】
0003756946.tif 000061
【図２０】
0003756946.tif 000062
【図２１】
0003756946.tif 000063
【図２２】
0003756946.tif 000064
【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
0003756946.tif 000068
【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
0003756946.tif 000074