(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
成熟雌ラットを発情期に交配させ、その翌日の前核期に受精卵を採卵し、前核が明瞭になった時に、化合物の変異原性の指標となる遺伝子群を有するベクターをマイクロインジェクション法によって該受精卵に導入し、その受精卵を偽妊娠雌ラットの卵管に移植することにより産仔として得ることを特徴とする、突然変異検出用トランスジェニックラットを作製する方法であって、前記遺伝子群の導入は雄性前核が前記受精卵の中央に寄ってきて融合する時に行われ、前記ベクターは４８ｋｂｐ以上の遺伝子群を有し、前記マイクロインジェクションにおける該遺伝子群の濃度は１２．５μｇ／ｍｌである、前記方法。
【請求項２】
ベクターがラムダファージであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ベクターがラムダファージＥＧ１０であることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
請求項１〜３に記載のいずれかの方法によって作製した、突然変異検出用トランスジェニックラット。
【請求項５】
請求項４に記載の突然変異検出用トランスジェニックラットに試験物質を暴露する物質暴露工程、試験物質を暴露した該突然変異検出用トランスジェニックラットから導入遺伝子を含む核酸を回収する核酸回収工程、該核酸より導入遺伝子を特異的に原核細胞に導入する原核細胞導入工程、導入遺伝子が導入された該原核細胞を培養する工程および培養した原核細胞を用いて突然変異を検出する工程とを含むことを特徴とする、化合物の変異原性を検出する方法。
【請求項６】
突然変異を検出する工程が、欠失変異検出遺伝子群にわたり欠失変異を有する導入遺伝子のみを検出する工程であることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
導入遺伝子が導入された原核細胞を培養する工程を該原核細胞に導入して選択薬剤を添加した培地において行い、突然変異を検出する工程が、ポジティブ選択遺伝子に変異を有する原核細胞のみを検出することを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
突然変異を検出する工程が欠失変異検出工程およびポジティブ選択遺伝子に変異を有する原核細胞のみを選択的に検出する突然変異検出工程を含み、さらに試験物質の変異原性における性質を判定する判定工程として、前記欠失変異検出工程における結果と、前記突然変異検出工程における結果とを比較する工程を含むことを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、突然変異検出用トランスジェニックラット、該トランスジェニックラットを作製するための方法、および該突然変異検出用トランスジェニックラットを用いて化合物の変異原性を検出する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ラットはマウスより体が大きく扱いが比較的容易であるため、慢性毒性試験などの各種毒性試験に用いられている。一方、化合物の変異原性の検出に用いるトランスジェニック哺乳動物としては、現在までマウスのみが開発され使用されている（特許第２５８０５３３号、同第２６１８９７３号）。この理由として、マウスとラットに同じ手法によって遺伝子を導入する場合、その効率面においてラットはマウスに大きく劣ることが挙げられる。それは、ラットの受精卵は細胞膜が脆弱で、前核膜が弾力性に富んでいるため、遺伝子をインジェクションをすることが困難であることに起因する。また、マイクロインジェクション法によって外来遺伝子を注入できても、その受精卵の生存率は、マウスの場合に比べて大きく劣ることもその一因である。
【０００３】
しかし、マウスは体が小さいため、取り扱いの容易さの面においてラットに劣り、モデル動物としては必ずしも好適ではない面がある。また、発癌性や毒性の発現には種差がみられることも多い。そのため、変異原性試験にも用いることができるトランスジェニックラットの開発が望まれている。
【０００４】
ある種の遺伝子を導入したトランスジェニックラットおよびその作製方法は既に知られている（特許第２９６６０１６号）。しかし、該トランスジェニックラットの作製方法は、長いＤＮＡ（約５０ｋｂ以上）を導入するのには必ずしも好適ではないため、導入操作を行うコピー数を多くせざるを得ないこと、および卵胞成熟誘発剤や排卵誘発剤を用いなければならないため作業が煩雑であるなどの欠点がある。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
したがって、本発明は、変異原性試験に用いることができるトランスジェニックラット、該トランスジェニックラットの効率的な作製方法、および該トランスジェニックラットを用いて化合物の変異原性を検出する方法を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意研究を重ねた結果、突然変異検出用トランスジェニックラットを作製することが可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、原核細胞内で複製可能な複製開始点およびレポーター遺伝子を含む遺伝子を導入したことを特徴とする、突然変異検出用トランスジェニックラットに関する。
また、本発明は、レポーター遺伝子が、欠失変異検出遺伝子群を含むことを特徴とする、前記突然変異検出用トランスジェニックラットに関する。
さらに、本発明は、レポーター遺伝子が、少なくとも２つの、隣接して配置された欠失変異検出遺伝子群を含むことを特徴とする、前記突然変異検出用トランスジェニックラットに関する。
また、本発明は、レポーター遺伝子が、ｒｅｄ遺伝子及びｇａｍ遺伝子からなる欠失変異検出遺伝子群を含むことを特徴とする、前記突然変異検出用トランスジェニックラットに関する。
【０００８】
さらに、本発明は、レポーター遺伝子が、原核細胞としてのＰ２ファージ溶原化大腸菌において複製可能であることを特徴とする、前記突然変異検出用トランスジェニックラットに関する。
また、本発明は、レポーター遺伝子が、ポジティブ選択遺伝子を含むことを特徴とする、前記突然変異検出用トランスジェニックラットに関する。
さらに、本発明は、レポーター遺伝子が、ポジティブ選択遺伝子としてｇｐｔ
遺伝子を含むことを特徴とする、前記突然変異検出用ラットに関する。
また、本発明は、レポーター遺伝子が、ラムダファージのレポーター遺伝子であることを特徴とする、前記突然変異検出用ラットに関する。
さらに、本発明は、レポーター遺伝子が、ラムダファージＥＧ１０のレポーター遺伝子であることを特徴とする、前記突然変異検出用トランスジェニックラットに関する。
【０００９】
また、本発明は、成熟雌ラットを発情期に交配させ、その翌日の前核期に受精卵を採卵し、前核が明瞭になった時に、化合物の変異原性の指標となる遺伝子群を有するベクターをマイクロインジェクション法によって該受精卵に導入し、その受精卵を偽妊娠雌ラットの卵管に移植することにより産仔として得ることを特徴とする、突然変異検出用トランスジェニックラットを作製する方法に関する。さらに、本発明は、ベクターがラムダファージであることを特徴とする、前記方法に関する。
また、本発明は、ベクターがラムダファージＥＧ１０であることを特徴とする、前記方法に関する。
さらに、本発明は、前記方法によって作製した、突然変異検出用トランスジェニックラットに関する。
【００１０】
また、本発明は、突然変異検出用トランスジェニックラットに試験物質を暴露する物質暴露工程、試験物質を暴露した該突然変異検出用トランスジェニックラットから導入遺伝子を含む核酸を回収する核酸回収工程、該核酸より導入遺伝子を特異的に原核細胞に導入する原核細胞導入工程、導入遺伝子が導入された該原核細胞を培養する工程および培養した原核細胞を用いて突然変異を検出する工程とを含むことを特徴とする、化合物の変異原性を検出する方法に関する。
【００１１】
さらに、本発明は、本発明の突然変異検出用トランスジェニックラットを用いることを特徴とする、前記方法に関する。
また、本発明は、突然変異を検出する工程が、欠失変異検出遺伝子群にわたり欠失変異を有する導入遺伝子のみを検出する工程であることを特徴とする、前記方法に関する。
さらに、本発明は、導入遺伝子が導入された原核細胞を培養する工程を該原核細胞に導入して選択薬剤を添加した培地において行い、突然変異を検出する工程が、ポジティブ選択遺伝子に変異を有する原核細胞のみを検出することを特徴とする、前記方法に関する。
また、本発明は、突然変異を検出する工程が欠失変異検出工程およびポジティブ選択遺伝子に変異を有する原核細胞のみを選択的に検出する突然変異検出工程を含み、さらに試験物質の変異原性における性質を判定する判定工程として、前記欠失変異検出工程における結果と、前記突然変異検出工程における結果とを比較する工程を含むことを特徴とする、前記方法に関する。
【００１２】
本発明の突然変異検出用トランスジェニックラットを用いれば、化合物のラットに対する変異原性を検出することができる。また、レポーター遺伝子の種類を適宜選択することにより、欠失突然変異やポジティブ選択遺伝子における突然変異のような、種々の要因による突然変異を生体レベルで検出することができる。さらに、本発明の突然変異検出用トランスジェニックラットを用いれば、複数の異なる要因による突然変異の有無を同時に検出し、化合物の変異原性における性質を判定することも可能である。
【００１３】
本発明の突然変異検出用トランスジェニックラットを用いて化合物の変異原性を検出するには、前記各工程を経ればよい。
また、突然変異を検出する工程は、導入した遺伝子の種類に応じて適切なものを選択すればよい。
【００１４】
本発明の突然変異検出用トランスジェニックラット作製方法においては、遺伝子の導入を行う時期を、前核が明瞭になった時に設定することによって最適化し、さらに遺伝子を導入する方法を改良することによって、卵胞成熟誘発剤や排卵誘発剤の使用を不要としている。したがって、本発明の突然変異検出用トランスジェニックラット作製方法によれば、従来法に比して、遺伝子の導入を高い効率で、かつ簡便に行うことができる。
複数の異なる要因による突然変異の有無を同時に検出するための突然変異検出用トランスジェニックラットを作製するには、通常導入される遺伝子より約１０倍長い５０ｋｂ程度の、複数の遺伝子を導入する必要がある。本発明の方法によれば、このような突然変異検出用トランスジェニックラットを作製することも可能である。
【００１５】
【発明の実施の形態】
本発明の好適な実施の形態を図面を用いて説明する。
トランスジェニックラット作製用導入遺伝子の構築図１に導入遺伝子として用いたラムダファージベクターＥＧ１０（以下、ラムダＥＧ１０という）の構造を示す。このラムダＥＧ１０は、ラムダファージ２００１を基本とし、ラムダファージの右腕と中間のスタッファー領域との間に、ｐＢＲ３２２の複製開始点（Ｏｒｉ）を含むプラスミドＤＮＡが挿入されている。前記ラムダファージ２００１は、スタッファー領域に欠失変異検出遺伝子群であるｇａｍ遺伝子及びｒｅｄ遺伝子が備えられ、また、右腕には、ｃｈｉＣ配列が備えられている。このラムダファージ２００１に含まれているｇａｍ遺伝子及びｒｅｄ遺伝子は、その配列が完全な場合には、前記ラムダファージ２００１をＰ２ファージが溶原化しているＰ２溶原化大腸菌に感染させるとプラーク形成は観察されないが（Ｓｐｉ（sensitive to Ｐ２ interference）表現型）、前記ｇａｍ遺伝子及び前記ｒｅｄ遺伝子の配列が共に欠失を有している場合には、前記Ｐ２溶原化大腸菌に感染させると、プラーク形成が観察される（Ｓｐｉ−表現型）ことが明らかになっている  （Molecular  Cloning, laboratory manual,（eds. J. Sambrook, E. F. Fritsch, T．Maniatis）．２．１１−２．１４  Cold  Spring Harbor Laboratory Press １９８９）。
【００１６】
前記ｃｈｉＣ配列は、ｇａｍ遺伝子及びｒｅｄ遺伝子に欠失を有するファージ（Ｓｐｉ−ファージ）のＰ２溶原化大腸菌でのプラークサイズを大きくし、より明確にＳｐｉ−表現型を判定させることを可能にするＤＮＡ配列である。また、前記ラムダファージ２００１に挿入されているプラスミド由来の領域には、複製開始点の上流にクロラムフェニコール耐性遺伝子（Ｃｈｌ耐性遺伝子、Ｃｈｌ）がラムダファージ２００１の左腕に向かって配置されている。通常の大腸菌は、クロラムフェニコール存在下では成育することができないが、このＣｈｌ耐性遺伝子を備えた大腸菌は、クロラムフェニコール存在下でも成育することが可能となる。
【００１７】
前記Ｃｈｌ耐性遺伝子の下流には、ポジティブ選択遺伝子である大腸菌由来のｇｐｔ遺伝子が前記Ｃｈｌ  耐性遺伝子と同方向に配置されている。このｇｐｔ遺伝子がコードするグアニンフォスフォリボシル転移酵素は、前述した通り６−チオグアニン（６−ＴＧ）を代謝し、その代謝産物はＤＮＡに取り込まれてＤＮＡ合成を阻害する性質を有するため、このｇｐｔ遺伝子を保持した大腸菌は、６−ＴＧ存在下では成育することができない。また、前記プラスミド由来の領域の両端部には、同方向に配置されたｌｏｘＰ配列が一つずつ挿入されている。このｌｏｘＰ配列は、部位特異的組換え酵素の一つであるＣｒｅの認識配列であり、このＣｒｅは、二つのｌｏｘＰ配列を認識して、これらの間で部位特異的組換えを起こす。そのため、このラムダＥＧ１０とＣｒｅ  組み換え酵素とを共存させると、ラムダＥＧ１０のプラスミド領域が切り出されて環状化し、プラスミドを形成させることが可能となる。一方のラムダファージ配列は一本の直鎖状に形成される。
【００１８】
注入するＤＮＡ濃度は、その粘度および注入針の開口によって制限される。すなわち、DNA濃度を上げると溶液の粘度が高くなるためマイクロインジェクションが非常に困難になる一方、注入針の開口を大きくして高濃度のＤＮＡ溶液に対応すると卵へのダメージが大きくなり、小さくするとＤＮＡ溶液が出にくくなってしまう。そのため、ＤＮＡ溶液の濃度は１２．５μg／ｍｌ以下の濃度範囲において調整可能である。
また、必要なＤＮＡ溶液の注入量はＤＮＡ溶液濃度に依存するが、典型的には０．５〜３ｐｌであり、好適には１〜２ｐｌである。
【００１９】
インジェクションは、前核が明瞭になっている間に行う。特に、精子と卵子が受精後雌性および雄性前核が発生、発達（明瞭化）後、卵の中央に寄ってきて融合するまでの数時間において好適に行われる。
【００２０】
【実施例】
以下に本発明の態様を実施例を用いてより詳細に述べるが、本発明はこれらに限定されるものではない。
トランスジェニックラットの作製
本発明のトランスジェニックラットの作製方法を以下に述べる。
受精卵を得るためには雌ラットの性周期観察を行い、発情期の雌を的確に選別し、雄と交配させることで効率よく受精卵を得ることが出来る。性周期の観察は、一般的には膣スメアによる顕微鏡観察にて行われるが、一度に数十匹の検査を行うには時間がかかりすぎることより、電極プローブを膣内に挿入して数値を読みとるインピーダンスチェッカーを用いることで迅速に発情期のメスを選別する方法をとった。インピーダンス値が５Ω以上を示した６週齢以上の雌ラットを同系統の雄ラットと交配にかけ、その翌日の朝、膣プラグがあった雌を交配成立とみなして卵管膨大部からの受精卵採取に用いた。
【００２１】
遺伝子注入用受精卵の供給源としてＦ３４４、ＳＤおよびWistar系ラット用いて検討を行った。Ｆ３４４系は性周期が不安定であり、かつ得られる受精卵の数も平均１２個と他の系統に比べ少ないものであった。ＳＤおよびWistar共に規則正しく４日周期で発情期が観察された。しかし、ＳＤ系では１２週齢を越えた頃より性周期に乱れが認められ、受精卵の採取が行えない個体も現れた。
Wistarを用いた場合にはそのような個体は認められず、長期に渡って受精卵が確保できた。雌ラットより採取した受精卵はシグマＭ１６培養液に入れ、卵の前核が明瞭になるまでＣＯ２インキュベーター内で培養を行った。数時間後、前核がよく観察できる受精卵をスライドグラス上に培養液と共に取りマイクロインジェクションを行った。脆弱なラット受精卵にマイクロインジェクションを効率的に行えるガラスキャピラリーは、プーラーの最大力で先端が細くなるように引き切り、その先端をフッ化水素にて数秒処理することで脆くした後にマイクロインジェクション操作時に卵保持用のキャピラリーと擦りあわせることで先端部に亀裂を生じさせ、鋭さを保ったままでＤＮＡ溶液を排出できるようにした。本方法により約２００個の受精卵にマイクロインジェクションしたところ約３０％程度の卵生存率が得られた。
【００２２】
ノマルスキー微分干渉装置を備えた倒立顕微鏡下（×４００）で自作したマイクロインジェクション用ガラスキャピラリーを用いて雄性前核内にＤＮＡ溶液（ラムダＥＧ１０）を注入した。マイクロインジェクション操作後に正常な形態を保持した受精卵は精管切断した雄ラットと交配させた偽妊娠雌ラットの卵管に速やかに移植した。移植後の偽妊娠雌ラットから２１〜２５日後に自然分娩により、産仔を得た。産仔は離乳後に採血を行い、ＤＮＡ検査を行った。
産仔より採血した血液からゲノムＤＮＡを抽出し、ラムダＥＧ１０内のｇｐｔ遺伝子コード領域（４５６ｂｐ）を挟むプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行った。ＰＣＲ産物についてアガロース電気泳動を行い、ｇｐｔ遺伝子を含む増幅産物（約５９０ｂｐ）のバンドの有無により導入遺伝子の有無を検査した。ｇｐｔ遺伝子が確認された産仔は、  同系統の正常ラットとの交配によって次世代を得た。
【００２３】
Wistar系ラットでは受精卵８７０個にマイクロインジェクションを行い、その内正常な形態を保った３０８個を仮親に移植した結果、４７匹の産仔を得た。得られた４７匹の産仔の血液よりＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ法によりｇｐｔ遺伝子の増幅を行い、アガロース電気泳動で分析した結果、７匹の仔ラットにｇｐｔ遺伝子の導入が確認された（表１）。
【００２４】
【表１】
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【００２５】
Wistar系ラットの受精卵を用いた１回目の検討によって得られた７ラインのWistar系トランスジェニックラットの骨髄からＤＮＡを抽出し、in  vitroパッケージングにより導入遺伝子をファージとして回収し、大腸菌に感染させてプラーク数を計測した。その結果、２ラインにおいてＤＮＡの回収が可能であったが、遺伝子突然変異を検出するためには１０６程度の回収効率が必要と考えられ、十分とは言えないレベルであった（表２）。
【００２６】
【表２】
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【００２７】
回収効率を上げるためにより高コピー数の導入を図ることを目的に、Wistar系ラット受精卵６４６個にラムダＥＧ１０溶液を先の検討より多くの量のマイクロインジェクションを行い、その内正常な形態を保った３１１個を仮親に移植した結果、２０匹の産仔を得た。得られた２０匹の産仔の血液よりＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ法によりｇｐｔ遺伝子の増幅を行い、アガロース電気泳動で分析した結果、３匹の仔ラットにｇｐｔ遺伝子の導入が確認された。しかしながら、上記の３ラインは不妊もしくは子への遺伝がなく、試験用ラインとして確立することは出来なかった（表３）。
【００２８】
【表３】
0003799445.tif 000004
【００２９】
ＳＤ系ラットの受精卵７１７個の受精卵にＤＮＡのマイクロインジェクションを行い、その内正常な形態を保った２７０個を仮親に移植した結果、１２匹の産仔を得た。離乳後に母ラットの剖検の結果では、計４５個の着床痕が観察された。得られた１２匹の産仔の血液よりＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ法によりｇｐｔ遺伝子の増幅を行い、アガロース電気泳動で分析した結果、１匹の仔ラットにｇｐｔ遺伝子の導入が確認された。ＳＤ−ＴＧ１ラインのＤＮＡ回収効率は先のWistar系トランスジェニックラインと比較して多少低い値であった（表４）。
【００３０】
【表４】
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【００３１】
マイクロインジェクション操作においてＳＤ系とWistar系の間で受精卵の質的違いがあった。すなわち、Wistar系では卵膜が柔軟で針が通りにくいが、移植までの形態保持は良好であった。ＳＤ系では卵膜は比較的堅く針は通りやすいが、膜がもろいためか移植までの形態保持が出来ないものが多くあった。
仮親に移植した受精卵が壊れてしまい着床数が少なくなった場合に、親が産後に出生児を食殺してしまうことを防ぐため、数個の無処理の受精卵と一緒に移植することで子供の数を一定化した。ＳＤ系ラットでは着床後の吸収胚の割合が高く、マイクロインジェクション等の処理胚の妊娠維持能力がWistar系より低いことが考えられたため、ＳＤ系ラット受精卵をWistar系ラットの仮親に移植した。
【００３２】
上記方法により、１９２個の受精卵にＤＮＡのマイクロインジェクションを行い、その内正常な形態を保った９２個を無処理卵２０個と合わせてWistar系の仮親に移植した結果、１６匹の産仔を得た。離乳後の母ラットの剖検結果では、計２０個の着床痕が観察された。得られた１６匹の産仔の血液よりＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ法によりｇｐｔ遺伝子の増幅を行い、アガロース電気泳動で分析した結果、新たに１匹の仔ラットにｇｐｔ遺伝子の導入が確認された（表５）。
【００３３】
【表５】
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【００３４】
このライン（ＳＤ−ＴＧ２）のＤＮＡ回収効率は１×１０５〜３×１０５／tubeと得られたラインの中で最も高い値を示し、実用性検討へ進めることとした（表６）。Wistar系トランスジェニックラット（ＴＧ６）においては、ヘテロ体同士を兄妹交配により、ホモ体を選別し、回収効率を確認したところ、１．４×１０５／tubeと実用可能な範囲内の値が得られたため、これも実用性の確認を実施した（表６）。
【００３５】
【表６】
0003799445.tif 000007
【００３６】
ラット体内で起こるｇｐｔ遺伝子突然変異頻度およびｒｅｄおよびｇａｍ遺伝子の欠失変異頻度の測定
１）自然突然変異頻度測定
作製したWistar−６とＳＤ−２の２つのトランスジェニックラインについてｇｐｔ遺伝子における自然突然変異頻度およびｒｅｄおよびｇａｍ遺伝子の欠失変異頻度を測定した。トランスジェニックラットの肝臓または骨髄よりＤＮＡを抽出しin  vitroパッケージングにより導入遺伝子をファージとして回収した。自然突然変異頻度の測定は、ｇｐｔ遺伝子中の遺伝子突然変異をｇｐｔアッセイにより、ｒｅｄおよびｇａｍ遺伝子の欠失変異をＳｐｉ−アッセイによって共に能美らの方法に従い実施した。その結果、Ｓｐｉ−アッセイおよびｇｐｔアッセイともに自然突然変異頻度は１０−６オーダーと低頻度を示し、両ラインに導入された遺伝子コピーは正常であると考えられた。ラインの自然突然変異頻度は同じベクターが導入されているｇｐｔ  deltaマウスに比較してｇｐｔアッセイでは１／２程度、Ｓｐｉ−アッセイでは１／２〜同等であった（表７）。
【００３７】
【表７】
0003799445.tif 000008
【００３８】
２）エチルニトロソウレア（ＥＮＵ）処理による突然変異頻度測定
作製したトランスジェニックラットの変異原に対する感受性を評価するため、代表的なアルキル化剤であり、骨髄を用いた小核試験で陽性を示すN−ethyl−N−nitrosourea（ＥＮＵ）に対する反応性を検討した。動物はＳＤ−２の５週齢雄性hetero体ラットを用い、ＥＮＵはphosphate  buffered  saline（ｐＨ  ６．０）に溶解し、１００  ｍｇ／ｋｇを４  ｍＬ／ｋｇの用量で腹腔内単回投与した。７日後に屠殺し肝臓を摘出後直ちに凍結保存したものを用いて、ｇｐｔアッセイおよびＳｐｉ−アッセイを実施した。また同じ個体について投与４８時間後に尾静脈から末梢血を採血して塗抹標本を作製し、小核誘発頻度を測定した。その結果、Ｓｐｉ−アッセイでは遺伝子変異頻度に変化は認められなかったが、ｇｐｔアッセイではＥＮＵ処理群の遺伝子変異頻度がコントロール群の約５〜１３倍まで上昇した（表８）。また、末梢血を用いた小核試験においてもＥＮＵ処理群の小核誘発はコントロールに比べ約６〜１０倍の増加を示した。これらの結果から、ＳＤ−２トランスジェニックラットを用いたｇｐｔアッセイによってＥＮＵの変異原性を小核試験と同等に検出できることが明らかとなった。ＥＮＵ処理によりＳｐｉ−アッセイにおいて変異頻度が上昇しなかったのは、ＥＮＵが主に点突然変異を誘発するために欠失変異を選択的に検出するＳｐｉ−アッセイでは陰性結果が得られたと考えられる。また、同じ遺伝子ベクターを有するｇｐｔ delta  mouseにおいても同様に点突然変異を主に誘発するアルキル化剤による処理ではＳｐｉ−アッセイの結果が陰性であったことからもＳｐｉ−アッセイが欠失変異を特異的に検出することを反映したものと考えられる。
【００３９】
【表８】
0003799445.tif 000009
【００４０】
上記の通り、従来遺伝子突然変異を引き起こすことが知られているエチルニトロソウレアを一例として本発明のトランスジェニックマウスを用いた遺伝子突然変異検出系が、変異原性を検出し得ることが示された。当然のことながら、本発明は、エチルニトロソウレアに限らず他の変異原物質による変異原性をも検出し得ることはこのことから明らかである。
【００４１】
【発明の効果】
本発明の突然変異検出用トランスジェニックラットおよび変異原性を検出する方法によれば、化合物のラットに対する種々の変異原性を生体レベルで、個別にまたは同時に検出することができる。したがって、本発明は、慢性毒性試験などの各種毒性試験のみならず、変異原性試験におけるラットの使用をも可能にするため、試験動物種の一元化に多大なる寄与をなし得る。
また、本発明の突然変異検出用トランスジェニックラット作製方法によれば、通常導入される遺伝子より長い遺伝子を導入した突然変異検出用トランスジェニックラットの作製を効率よくかつ簡便に行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ラムダＥＧ１０の構造を示す図である。
【図１】
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