(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ロドコッカス・ロドクラウスＮＣＩＭＢ  ４０７５７又はＮＣＩＭＢ  ４０８３３を培養することによって得られ、ｐＨ７．０においてアクリロニトリルに対し５００μＭ以下のＫｍを有し、かつ、ｐＨ７．０においてアクリル酸アンモニウムに対し少なくとも１００ｍＭのＫｉを有することを特徴とするニトリラーゼ酵素。
【請求項２】
ｐＨ７．０においてアクリロニトリルに対し１００μＭ以下のＫｍを有する請求項１記載のニトリラーゼ。
【請求項３】
ｐＨ７．０においてアクリロニトリルに対し５０μＭ以下のＫｍを有する請求項１記載のニトリラーゼ。
【請求項４】
ｐＨ７．０においてアクリル酸アンモニウムに対し少なくとも２５０ｍＭのＫｉを有する請求項１記載のニトリラーゼ。
【請求項５】
少なくとも２００の（ｐＨ７．０におけるアクリル酸アンモニウムに対するＫｉ）／（ｐＨ７．０におけるアクリロニトリルに対するＫｍ）比値を有する請求項１記載のニトリラーゼ。
【請求項６】
少なくとも５０００の前記比の値を有する請求項５記載のニトリラーゼ。
【請求項７】
ｐＨ６．８においてその最適ｐＨにおけるアクリロニトリラーゼ活性の少なくとも８０％であるアクリロニトリラーゼ活性を有する請求項１記載のニトリラーゼ。
【請求項８】
５０℃においてその２５℃におけるアクリロニトリラーゼ活性の少なくとも８０％を保持している請求項１記載のニトリラーゼ。
【請求項９】
以下の通り、冷却条件下に架橋ポリアクリルアミドビースに固定化した後にその元の比アクリロニトリラーゼ活性の少なくとも８０％を保持している請求項１記載のニトリラーゼ：
ニトリラーゼを含有する細胞から成るペーストを冷却緩衝液中に懸濁させ、冷却緩衝液中のアクリルアミド単量体及びメチレンビスアクリルアミド架橋剤の混合物に添加し、次に、レドックス開始剤系の水溶性成分を即座に添加し、次に、混合物を冷却鉱油及び界面活性剤を含有する攪拌樹脂ポットに移し、そして、両液相に可溶性の第二のレドックス開始剤成分を添加して重合を開始して、細胞を架橋重合体ビーズ中に閉じ込める。
【請求項１０】
前記架橋ポリアクリルアミドビースを６０℃で１２％の水分に乾燥及び／又は２４時間０．１ｍｂａｒで凍結乾燥した後、その固定化アクリロニトリラーゼ比活性の少なくとも９０％を保持している請求項９記載のニトリラーゼ。
【請求項１１】
前記架橋ポリアクリルアミドビーズを２０℃で１７日間貯蔵した後に、その固定化アクリロニトリラーゼ比活性の少なくとも９０％を保持している請求項９又は請求項１０記載のニトリラーゼ。
【請求項１２】
１２５〜１７５ｍＭのアクリロニトリル及び２，４７５〜２，５２５ｍＭのアクリル酸アンモニウムを含有する水溶液中で測定して、少なくとも５日の半減期を有している請求項１記載のニトリラーゼ。
【請求項１３】
ニトリラーゼを産生する能力を有するロドコッカス・ロドクラウスＮＣＩＭＢ  ４０７５７又はＮＣＩＭＢ  ４０８３３あるいはその変異体である微生物。
【請求項１４】
触媒としての請求項１〜１２のいずれか１項に記載のニトリラーゼの存在下、及び水の存在下に、アクリロニトリルをアクリル酸アンモニウムに転化する方法。
【請求項１５】
水の存在下にニトリルを検出する方法であって、
ａ）  請求項１〜１２のいずれか１項に記載のニトリラーゼを、水の存在下にニトリルと接触させ、
ｂ）  ニトリルをその対応するアンモニウム塩に転化させ、そして
ｃ）  ニトリルの転化に関連する変化を検出することから成ることを特徴とするニトリルを検出する方法。
【請求項１６】
アクリロニトリル単量体を含有する単量体ブレンドから生成される、また未反応のアクリロニトリル単量体を含有する重合体の、触媒としての請求項１〜１２のいずれか１項に記載のニトリラーゼの存在下に前記未反応のアクリロニトリル単量体をアクリル酸アンモニウムに転化することによる精製方法である請求項１４記載の方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は、アクリル酸アンモニウムを製造するための酵素的方法及びこれらの方法に有用な新規の微生物類と酵素類に関する。
アクリル酸（又はその塩）は、一般に、プロピレンオキサイドからの一段化学転化法、あるいはアクリロニトリルから硫酸アクリルアミド中間体を経る二段転化法によって製造される。この化学転化法は、若干量の二量体アクリル酸の生成を含む副反応による望ましくない不純物を含有する生成物を与え、これは、製造条件下に生成アクリル酸が高濃度で存在する場合に形成しやすい。
アクリルアミドをアクリル酸（アンモニウム塩として）に転化するために、アミダーゼを使用することは、文献に頻繁に記載されている。それは、主にアクリルアミド重合体中の残留単量体不純物をアクリル酸アンモニウムに転化するために記載されているが、アクリルアミドからアクリル酸アンモニウムを商業的に製造するのに、アミダーゼを使用するのが望ましいことも提案されている。
ニトリルヒドラターゼによって、アクリロニトリルからアクリルアミドを製造する方法は公知であり、例えば、ＥＰ−Ａ−３０７，９２６、及びＡｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９３，４０，第１８９〜１９５頁に記載されている。この後者の文献は、ニトリルヒドラターゼが、とりわけロドコッカス・ロドクラウス（Ｒ ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）Ｊ１から得られることを示している。ＥＰ−Ａ−１８８３１６は、ニトリルヒドラターゼを用いるアクリロニトリルのアクリルアミドへの転化を記載している。１種のニトリルヒドラターゼが、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）ｓｐ．Ｓ−６から得られる。ＷＯ９５／０４８２８は、ニトリルヒドラターゼ類を記載し、コマモナス（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ）ＮＩ１から得られるその１種が、アクリロニトリルをアクリルアミドに転化させると説明されている。アクリル酸アンモニウムの製造に応用した場合に、そのような方法は、二段、すなわち第一工程としてのアクリルアミドの製造、及び第二工程としてのこの生成物のアクリル酸への加水分解を必要とする。二段法の使用は、一般に２種類の不純物の存在の元である。これらは、第一工程からの未反応の出発原料、及び第二工程の出発原料である第一工程の生成物の未反応物である。
ニトリルのその対応する酸へのさらなる転化が、英国特許第１，４７５，５４０号に記載されている。この転化は、アクリロニトリルを含む種々のニトリル類に対して、特定の菌株によって実施される。これらの菌株は、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、バクテリジウム（Ｂａｃｔｅｒｉｄｉｕｍ）、ミクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）またはブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属のものである。例示された転化は、ラクトニトリル、グリシノニトリル、アミノプロピオニトリル塩酸塩、アミノ−３−プロピオニトリル，及びα−アミノ−γ−メチルチオブチロニトリルに関するものである。これらの微生物は、ニトリルをアミドに転化するニトリルヒドラターゼ酵素、及びその後アミドを酸に転化するアミダーゼ酵素を産生することによって、加水分解を行っているものと思われる。
アクリロニトリラーゼを用いて、アクリロニトリルから単一工程で、酵素的な商業的に便利な方法によって、アクリル酸アンモニウムを製造することが望ましい。
ニトリラーゼを用いて、アクリロニトリルをアクリル酸アンモニウムに転化する方法は、ロドコッカス・ロドクラウスＪ１（上記ＥＰ−Ａ−３０７，９２６に記載された同一の微生物）から得られるニトリラーゼを使用している文献、例えば、ＥＰ−Ａ−１８７，６８０、特公昭６３−２５９６号公報、及びＡｐｐＬ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ．１９９０，３４，第３２２〜３２４頁に記載されており、そして、ＥＰ−Ａ−４４４，６４０にも、ロドコッカス・ロドクラウスＪ１からのニトリラーゼが好ましいと記載されている。
アクリロニトリルをアクリル酸アンモニウムに転化する方法として、ロドコッカス・ロドクラウスＫ２２を使用することが、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２，９，第４８０７〜４８１５頁に記載されている。
フザリウム・オキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）ｆ．ｓｐ．メロニス（ｍｅｌｏｎｉｓ）からのニトリラーゼは、６０ｍＭまでのアクリロニトリルに作用してアクリル酸を生産するとＢｉｏｔｅｃｈ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９８９，１１，第５８１〜６０１頁に示されている。
Ｂｉｏｔｅｃｈ．ａｎｄ  Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１５，第２８３〜３０２頁（１９９２）において、スティーブンソン等は、ロドコッカス  ＡＴＣＣ  ３９４８４によって産生されたニトリラーゼに関する研究について述べている。この酵素は、芳香族ニトリル類の加水分解に最も効果的であり、また、アクリロニトリル等の多くの脂肪族ニトリル類にほとんど又は全く活性を示さない。この酵素は、７．５の最適ｐＨを有し、５．０〜９．０のｐＨ範囲以外では全く不活性であり、４０℃以上での前保温によって不可逆的に不活性化されると言われている。この酵素は、また、基質、特にベンゾニトリルの存在下に活性化を示した。この文献の著者は、これは、サブユニットの凝集のためであると思っている。
あいにく、ニトリラーゼを使用する公知の方法は、いずれも商業的に満足できない。例えば、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３４，１９９０，第３２２〜３２４頁に記載された方法は、ロドコッカス・ロドクラウスＪ１が、最適な活性のために７．８のｐＨを必要とし、３０〜５０℃でわずかに、６０℃でほとんど全て失活し、２００ｍＭ以上のアクリロニトリル濃度で阻害され、そして、生成物（アクリル酸アンモニウム）によって阻害されることを示している。ロドコッカス・ロドクラウスＫ２２のＫｍ値が、上記Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ文献に１．１４ｍＭであると報告されているが、アクリロニトリルに関する微生物によって生産されるニトリラーゼのＫｍ値、又はアクリル酸アンモニウムに関するそのＫｉ値を示すその文献のデータは不十分である。Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９８９，１１，第５８１〜６０１頁には、アクリロニトリラーゼに関する１７ｍＭの値が報告されており、そして、約４〜６％のアクリルアミドが反応中に生成されたと報告されている。
経済的な方法で、高濃度で、良好な収率のアクリル酸アンモニウムを得ることができることが望ましい。これを可能とする微生物及び酵素を提供することが望ましい。
並みはずれた、非常に望ましい活性を有するニトリラーゼが、確認された。したがって、このニトリラーゼは、全細胞の形で又は抽出酵素としてのいずれかで、アクリロニトリルからアクリル酸アンモニウムへの反応を触媒するのに使用することができる。それは、他のニトリル類、例えば、アジポニトリルの類似反応を触媒するのにも使用することができる。
新規のニトリラーゼは、５００μＭ以下のアクリロニトリルに対するＫｍを有することによって特徴付けられる。本明細書全体を通して、Ｋｍは、ｐＨ７．０で測定したＫｍを指す。Ｋｍは、酵素がミカエリス−メンテン反応速度論を示す条件下に測定する。特に、我々は、以下の実施例６の条件を使用する。初期の実験を行った好ましいニトリラーゼは、全細胞の形で３０．６μＭのアクリロニトリルＫｍを有しているので、我々は、標準の技術及び選択手順、例えば、シルマン等の（１９８９）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１３５，第３１５３〜３１６４頁においてアミダーゼに対して記載されたもの、及びワグナーの（１９９０）Ｔｉｂｔｅｃｈ．，８，第２６２〜２７０頁によってラクテートデヒドロゲナーゼに対して記載されたものの適用によって、６０又は１００、おそらく３００μＭ以下のＫｍ値、及び９．４、さらには３．８μＭ以上のＫｍ値を有するニトリラーゼを得ることを予測する。
５００μＭ以下のＫｍを有する新規のニトリラーゼの主なる利点は、したがって、それが非常に低いレベルのニトリル基質に効果的であることにある。Ｋｍの約１０倍である濃度の基質を用いて、酵素触媒反応を行うのが便利である。したがって、本発明の新規のニトリラーゼを用いて、５００μＭ以下、さらには、３００μＭと低い、多くの場合４０〜１００μＭの濃度のアクリロニトリルを用いて、アクリロニトリルのアクリル酸アンモニウムへの転化を行うことが可能である。反応器中、したがってアクリル酸アンモニウム生成物中３００ｐｐｍ以下のレベルのアクリロニトリルを有する方法によって、アクリル酸アンモニウムの連続製造を可能とするので、これは、有利である。
本発明の酵素の低Ｋｍのさらなる利点は、酵素の優れた掃去能力である。ニトリラーゼは、非常に低い濃度のアクリロニトリルに活性であるので、この酵素は、例えば、残留アクリロニトリルを含むアクリル酸アンモニウム生成物から非常に低レベルの残留アクリロニトリルを掃去することができる。
アクリロニトリル及び他のニトリル類は、高い濃度で存在する場合にニトリラーゼ類を失活させる傾向があるので、非常に低ニトリルレベルで作用することができることも有利である。より高いＫｍを有する公知の酵素は、それらが有効活性にある最低レベルのニトリルを必要とし、このレベルが、失活に至るに十分な高さであるという点で、従来限定された。本発明のニトリラーゼは、効果的に作用して、酵素の実質的な失活を避けるのに十分低い濃度のアクリロニトリル又は他のニトリルからアクリル酸アンモニウム又は他の塩を製造することができる。
本発明の新規のニトリラーゼは、少なくとも１００ｍＭ、好ましくは少なくとも１５０又は２００、より好ましくは少なくとも２５０ｍＭのアクリル酸アンモニウムに対するＫｉを有することによって特徴付けられる。本明細書全体を通して、Ｋｉは、ｐＨ７．０で測定したＫｉを指す。この酵素は、測定条件下にミカエリス−メンテン反応速度論を示す。好ましくは、測定は、以下の実施例７に示した条件下をで行う。初期の実験を行った好ましいニトリラーゼは、３０９ｍＭと推定したアクリル酸アンモニウムに対するＫｉを有している。標準の技術及び選択手順、例えば、異変誘発によって、３００ｍＭまで、さらには８００ｍＭ以上のアクリル酸アンモニウムに対するＫｉを有するニトリラーゼを得る。
本発明のニトリラーゼのこの高いＫｉ値は、この酵素に高濃度のアクリル酸アンモニウム（１０％ｗ／ｖ以上、例えば３０又は４０％まで）を製造するアクリロニトリルの反応を触媒させることができるので、有利である。そのような反応において、生成物による酵素の作用の阻害度は低い。
本発明の新規ニトリラーゼは、少なくとも２００の（アクリル酸アンモニウムに対するＫｉ）／（アクリロニトリルに対するＫｍ）比を有することによって特徴付けられる。好ましくは、この比は、少なくとも３００、より好ましくは少なくとも５００、特に少なくとも１０００である。本発明のニトリラーゼは、少なくとも５０００、さらには９０００以上のＫｉ／Ｋｍ比を有することができ、また、我々が初期の実験を行ったニトリラーゼは、１００００より高いこの比の値を有している。
この高い特定比の値の利点は、ニトリラーゼが、高濃度の対応する塩、例えばアクリル酸アンモニウムが存在する条件下に、非常に低いレベルのアクリロニトリル等のニトリルの加水分解を触媒することができることである。
新規ニトリラーゼは、ｐＨ６．８において、最適ｐＨにおけるその活性の少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９５％である比アクリロニトリラーゼ活性を有することによって特徴付けられる。至適ｐＨは、ニトリラーゼが最高の比アクリロニトリラーゼ活性を有するｐＨである。その最適ｐＨは、一般に６．５〜７の範囲、多くの場合約６．８であるので、ニトリラーゼは、アクリル酸アンモニウムの中性ｐＨにおいて最適活性を有するという利点がある。したがって、緩衝又は一定監視及び調節は不要である。
本発明の新規のニトリラーゼは、以下の通り改良した温度安定性を有していることによって特徴付けられる。５０℃において、２５℃おけるそのアクリロニトリラーゼ活性の少なくとも８０％を保持している。活性は、要求温度において５分間水中で細胞を保温し、次に５０ｍＭの濃度でアクリロニトリルを添加し、１５分間アクリル酸アンモニウムへの転化率を観測することによって測定される。また、ニトリラーゼは、５５℃及び６０℃において、２５℃におけるそのアクリロニトリラーゼ活性の少なくとも８０％を保持しているのが好ましい。５０℃、５５℃及び６０℃での活性は、２５℃における活性よりなおさらに高く、例えば、２５℃における活性の少なくとも１００％、さらには２００％又は３００％でありうる。
本発明の新規ニトリラーゼは、次の通り、架橋ポリアクリルアミドビーズに固定化した後に、その元の比アクリロニトリラーゼ活性の少なくとも８０％を保持している：
ニトリラーゼを含有する細胞から成るペーストを冷却緩衝液中に懸濁させ、冷却緩衝液中のアクリルアミド単量体及びメチレンビスアクリルアミド架橋剤の混合物に添加する。レドックス開始剤系の水溶性成分を即座に添加する。次に、混合物を冷却鉱油及び界面活性剤を含有する攪拌樹脂ポットに移し、両液相に可溶性の第二のレドックスを開始剤成分を添加して重合を開始する。重合に際し、細胞が架橋重合体ビーズ中に閉じ込められる。これらの条件下に架橋ポリアクリルアミドビースに固定化した場合に、ニトリラーゼが、６０℃で１２％の水分に乾燥及び／又は２４時間０．１ｍｂａｒで凍結乾燥した後に、その固定化アクリロニトリラーゼ比活性の少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは実質的に全てを保持しているのが好ましい。「固定化比活性」とは、架橋ポリアミドビーズに固定化した後に示される酵素の比活性を意味する。架橋ポリアミドビーズに固定化し、必要に応じて、乾燥しかつ２０℃で１７日間貯蔵したニトリラーゼの比活性が、固定化比活性の少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは実質的に全てであるのも好ましい。
したがって、本発明のこの態様のニトリラーゼは、非常に化学的及び物理的に安定である。このことは、重合体材料のビーズに取込むために、この酵素を非常に安定にする。便利に使用可能な形態にするために、酵素を全細胞の形で架橋重合体材料、特にポリアクリルアミドのビーズに固定化することは公知である。本発明のニトリラーゼは、この形態に取込まれた場合に、変性されない（即ち、比活性の顕著な低下を受けない）。さらに、ニトリラーゼを架橋ポリアクリルアミドビーズに取込んだ後に、これらのビーズ中の酵素の活性は、ビーズの乾燥又は貯蔵に際して顕著に低下されないのが好ましい。
本発明の新規ニトリラーゼは、１２５〜１７５ｍＭのアクリロニトリル及び２，４７５〜２，５２５ｍＭのアクリル酸アンモニウムを含有する水溶液中で測定して、少なくとも５日、好ましくは少なくとも７日、より好ましくは少なくとも７．５日の半減期を有していることによって特徴付けられる。アクリロニトリル及びアクリル酸アンモニウムの正確な含有量は、試験中に変化しうるが、特定の濃度範囲内に常に保持する。アクリロニトリルは、ニトリラーゼによってアクリル酸アンモニウムに転化されるので、アクリロニトリルの濃度は次第に低下する。濃度が１２５ｍＭの下限に達したら、さらにアクリロニトリルを添加して、濃度を１７５ｍＭの上限まで上昇させる。同様に、アクリル酸アンモニウムの量は、アクリル酸アンモニウムの濃度を調節して特定量の間で変化させて、濃度が２５２５ｍＭの特定した最大値より高くなるのを防止する。我々が予備実験した特定の微生物は、これらの条件下に７．６日の半減期を有しているので、少なくとも１０〜１５日の半減期を有する酵素を生産することができると予想する。
この有利は半減期は、本発明のニトリラーゼが、基質及び生成物（アクリロニトリル及びアクリル酸アンモニウム）の両方、特に高濃度の生成物による変性に対し、高い安定性を有していることを示している。
本発明のこの態様のアクリロニトリラーゼ酵素の長い半減期は、長期の商業的な使用に特に有利である。１回分の酵素を反応器に添加して、変性酵素を補充するためにさらに酵素を反応器に添加する必要なしに、数日、例えば１０日以上、さらには２０又は３０日までそこに保持することができる。
本発明のニトリラーゼは、アクリロニトリル及び／又はアクリル酸アンモニウムに暴露した場合に、それらの比活性を増大する特性を有しているのが好ましい。それらは、４〜１７５ｍＭのアクリロニトリル水溶液及び／又は１．２〜２．５Ｍのアクリル酸アンモニウム水溶液の存在下に１〜３時間保温した後に、少なくとも１．７倍、好ましくは少なくとも２又は３倍、通常は１０倍以下の比活性の増大を示すのが好ましい。アクリロニトリル及びアクリル酸アンモニウムの正確な含有量は、試験中に変化しうるが、特定の濃度範囲内に常に保持する。アクリロニトリルは、ニトリラーゼによってアクリル酸アンモニウムに転化されるので、アクリロニトリルの濃度は次第に低下する。濃度が１２５ｍＭの下限に達したら、さらにアクリロニトリルを添加して、濃度を１７５ｍＭの上限まで上昇させる。同様に、アクリル酸アンモニウムの量は、アクリル酸アンモニウムの濃度を調節して特定量の間で変化させて、濃度が２５２５ｍＭの特定した最大値より高くなるのを防止する。
したがって、この種の改良ニトリラーゼ類は、それらを使用する反応環境に暴露された場合に、それらの活性を増大するという重要な利点を有している。
本発明は、上に述べた特性のいずれか１つを有する新規のニトリラーゼ類を提供するけれど、本発明のニトリラーゼは、特定特性を２つ以上所持しているのが好ましい。特に、本発明のニトリラーゼは、５００μＭ以下のアクリロニトリルに対するＫｍを所持し、さらに好ましくは少なくとも１００ｍＭのアクリル酸アンモニウムに対するＫｉも所持しているのが好ましい。
ニトリラーゼは、少なくとも２００の（アクリル酸アンモニウムに対するＫｉ）／（アクリロニトリルに対するＫｍ）比値も所持しているのが特に好ましい。
本発明のアクリロニトリラーゼは、これらのＫｍ、Ｋｉ及びＫｉ／Ｋｍ特性に加えて、上に特定した他の特性の少なくとも２つ、より好ましくは、上に特定した全ての特性を有しているのがより好ましい。
我々は、新しい微生物、上記特性全てを所持するニトリラーゼを産生することができるロドコッカス・ロドクラウスの菌株を単離した。この微生物は、受託番号ＮＣＩＭＢ  ４０７５７を受けて、ブダペスト条約の規定に従って、１９９５年８月８日にＮＣＩＭＢに寄託された。我々は、ロドコッカス・ロドクラウスの菌株ＮＣＩＭＢ４０８３３を１９９６年１２月１１日に新たに寄託した。これも上記特性全てを所持しており、以下「新寄託菌株」と称する。
従って、本発明のさらに他の態様は、微生物、ロドコッカス・ロドクラウスＮＣＩＭＢ  ４０７５７、又は新たに寄託したＮＣＩＭＢ  ４０８３３、又はニトリラーゼを産生することができるいずれかの変異体を提供する。
本発明は、ロドコッカス・ロドクラウスＮＣＩＭＢ  ４０７５７又は新寄託菌株ＮＣＩＭＢ  ４０８３３を培養することによって得ることができる新規のニトリラーゼ酵素も提供する。
受託番号ＮＣＩＭＢ  ４０７５７を受けて受託された菌株は、以下の分析結果を示した：
細胞壁ジアミノ酸はメソＤＡＰである。脂肪酸プロフィールは、表示したパーセントで、以下の酸を示している：
テトラデカン酸                ２．１％
ペンタデカン酸                ２．８％
ヘキサデセン酸              ２４．７％
ヘキサデカン酸              ２５．９％
ヘプタデセン酸                ６．２５
ヘプタデカン酸                ３．１％
オクタデセン酸              ２５．０％
オクタデカン酸                １．９％
ツベルクロステアリン酸        ７．０％。
生化学試験は、以下の結果を示した：
以下の物質の分解：
アデニン                    −
チロシン                    ＋
尿素                        −
以下の物質の存在下の増殖：
５％ＮａＣｌ                ＋
アジ化デキストロース        （＋）
単一炭素源での増殖：
イノシトール                （＋）
マルトース                  ＋
マンニトール                ＋
ラムノース                  −
ソルビトール                ＋
ｍ−ヒドロキシ安息香酸      ＋
アジピン酸ナトリウム        ＋
安息香酸ナトリウム          ＋
クエン酸ナトリウム          ＋
乳酸ナトリウム              ＋
グルタミン酸ナトリウム      −
Ｌ−チロシン                ＋
グリセリン                  ＋
トレハロース                ＋
ｐ−ヒドロキシ安息香酸      ＋
Ｄ−マンノース              ＋
アセトアミド                ＋
Ｄ−ガラクトース            （＋）    （＋）弱陽性
酵素試験：ロスコ（Ｒｏｓｃｏ）ディスク、４時間、３７℃
α−グルコシダーゼ            −
システインアリールアミダーゼ  −
バリンアリールアミダーゼ      −
ロドコッカス・ロドクラウスＮＣＩＭＢ  ４０７５７及びＮＣＩＭＢ  ４０８３３から得られたニトリラーゼ、及び本発明の全てのニトリラーゼを、ニトリルの対応するアンモニウム塩への転化法に使用することができる。したがって、本発明のさらに他の態様に従って、我々は、水溶液中のニトリルを、加水分解触媒としての本発明のニトリラーゼ、好ましくはＮＣＩＭＢ  ４０７５７又はＮＣＩＭＢ  ４０８３３を培養することによって得られるニトリラーゼの存在下に、対応するアンモニウム塩に転化する方法を提供する。
ニトリルは、アクリロニトリルであるのが好ましく、したがって対応するアンモニウム塩は、アクリル酸アンモニウムである。以下に、本方法は、アクリロニトリル及びアクリル酸アンモニウムに関して述べる。他のニトリル、例えば、アジポニトリル、メタクリロニトリル、α−アミノニトリル類、アセトニトリル、ｎ−ブチロニトリル、イソブチロニトリル、ｎ−バレロニトリル、ベンゾニトリル、シアノピリジン、マロノニトリル、スクシノニトリル、フマロニトリル、クロルアセトニトリル、及びβ−ヒドロキシプロピオニトリルもこの方法で転化することができる。
本発明のニトリラーゼの種々の特異な特性により、連続的に低濃度のアクリロニトリルを、連続的に高濃度のアクリル酸アンモニウムに転化する方法を実施することが可能となる。
したがって、本発明において、３．０ｍＭ以下、しばしば２．０ｍＭ以下、さらには１．５ｍＭ以下のアクリロニトリル水溶液を、少なくとも５％、多くの場合、少なくとも８又は１０％の濃度のアクリル酸アンモニウム水溶液に転化することが可能である。３．０〜６．０，ｍＭ、多くの場合４．０〜５．０ｍＭの濃度のアクリロニトリル水溶液を、少なくとも２０％、多くの場合、少なくとも２５又は３０％、さらには４０％まで又はそれ以上の濃度のアクリル酸アンモニウムに転化することも可能である。最高アクリル酸アンモニウム濃度は、通常約４８〜５０％（ｗ／ｖ）である。
本発明の方法は、一般に、５〜７０℃、好ましくは２０〜６０℃の温度で行われる。ｐＨ条件は、通常３〜９．５、好ましくは５〜９、より好ましくは６〜８である。
上記転化を行う場合、本発明の方法を連続法として行うことができる。すなわち、アクリロニトリルを反応器中に連続的に供給して一定のアクリロニトリル濃度を保持し、そして、一定濃度のアクリル酸アンモニウムを含有する反応液を連続的に抜き取る。
水も反応物として必要である。水は、反応の初めから必要な全量で存在してもよい。あるいは、水を反応中に反応器に供給することもできる。例えば、アクリロニトリルを、溶液、通常は飽和溶液、すなわち約７重量％溶液の形で供給することができる。あるいは、水を別個に供給してもよく、そして、アクリロニトリルを生のまま又は溶液として供給する。
この種の連続反応は、例えば、連続攪拌槽反応器、流動床反応器、充填床反応器、抜取り−充填型反応器又はプラグ流れ反応器中で行うことができる。
上記条件下の方法は、流加法として行うこともできる。流加法において、アクリロニトリルの濃度は、アクリル酸アンモニウムへの転化の結果として、所定の最低レベルに達するまで減少させる。この時点で、さらにアクリロニトリルを反応混合物に添加して、濃度を所定の最高レベルまで上昇させる。次に、アクリロニトリルを所定の最低レベルに再度減少させる。アクリル酸アンモニウムの量が所定の最高レベルに達したら、反応混合物を回収し、そして、新規バッチのアクリロニトリルを反応器及び酵素に添加する。連続法と同じように、必要ならば、水を反応中に反応器中に供給してもよい。
あるいはまた、本発明のニトリラーゼを使用して、回分法でのアクリロニトリルのアクリル酸アンモニウムへの転化を触媒することもできる。すなわち、比較的高濃度のアクリロニトリルを出発原料として使用する。アクリロニトリラーゼは、出発原料をさらに添加することなく、このアクリロニトリルをアクリル酸アンモニウムに転化させる。アクリロニトリルの転化が終了したら、反応混合物を回収、使用し、そして、新しい反応混合物を供給する。
しかしながら、本発明の方法は、連続又は流加法であるのが好ましい。特に好ましい方法は、ＧＢ９５２５３７４．６及び９５２５３７２．０から優先権を主張する本日出願した本願の同時係属国際出願第・・・号（参照番号ＰＲＬ０３６２６ＷＯ）に記載されている。
そのような方法は、水、及び加水分解に際し少なくとも３０重量％の濃度の（メタ）アクリル酸又はその塩を与えるのに十分な量の（メタ）アクリロニトリルを供給し、そして、（メタ）アクリロニトリルを（メタ）アクリル酸アンモニウムに転化し、かつ、５００μＭ以下の（メタ）アクリロニトリルに対するＫｍ、及び１００，０００μＭ以上の（メタ）アクリル酸アンモニウムに対するＫｉを有する酵素を、工程中に（メタ）アクリロニトリルと接触して供給し、反応液が０．２％以下の（メタ）アクリロニトリル濃度、及び３０％以上の（メタ）アクリル酸アンモニウム濃度になるまで、（メタ）アクリロニトリルの加水分解を生じさせ、そして、３０％以上の（メタ）アクリル酸アンモニウム及び０．２％以下のアクリロニトリルの溶液を回収することから成る、少なくとも３０重量％の（メタ）アクリル酸又はその塩及び０．２％以下のアクリロニトリルを含有する水溶液を製造することを包含する。これらの方法において、（メタ）アクリロニトリルを化学的に加水分解して、（メタ）アクリル酸アンモニウム及びアクリロニトリルを含有する溶液にし、次に、得られた溶液を前記酵素と接触させ、そして、反応液が０．２％以下の（メタ）アクリロニトリル濃度になるまで（メタ）アクリロニトリルの加水分解を生じさせてもよい。あるいは、（メタ）アクリロニトリルの実質的に全ての加水分解を、前記酵素を用いる酵素加水分解によって行ってもよい。
これらの方法は、一段法又は二段法として行うことができる。一段法は、工程中に（メタ）アクリロニトリルを（メタ）アクリル酸アンモニウムに転化するための、５００μＭ以下の（メタ）アクリロニトリルに対するＫｍ及び１００ｍＭ以上の（メタ）アクリル酸アンモニウムに対するＫｉを有する酵素、水、及び加水分解に際し少なくとも３０重量％の濃度の（メタ）アクリル酸アンモニウムを与えるのに十分な量の（メタ）アクリロニトリルを反応器に供給し、そして、反応器中の溶液が０．２％以下の（メタ）アクリロニトリル濃度及び３０％以上の（メタ）アクリル酸アンモニウム濃度になるまで、反応器中で加水分解を生じさせることから成る方法によって、少なくとも３０重量％の（メタ）アクリル酸アンモニウム及び０．１％以下のアクリロニトリルを含有する水溶液を作成し、そして、反応器からこの溶液を回収することから成る。
この好ましい方法において、（メタ）アクリロニトリルの最終濃度は、おそらく０．１％以下、より好ましくは０．０５％以下である。この濃度は、好ましくは０．０３％以下、より好ましくは０．０２又は０．０１％である。
（メタ）アクリル酸アンモニウムの最終濃度は、少なくとも３０重量％、多くの場合、少なくとも３５重量％、好ましくは、少なくとも４０又は４５重量％である。（メタ）アクリル酸アンモニウムの最高濃度は、通常４８〜５０重量％である。なぜならば、これ以上の濃度では、（メタ）アクリル酸アンモニウムが溶液から沈殿しがちとなるためである。
好ましい方法において、酵素を反応器中で所望の活性を与えるように、反応混合物に含有させる。反応器に加えるこの種の触媒は、通常５０〜１００，０００ニトリラーゼ単位／グラム、典型的に５００〜５，０００ニトリラーゼ単位／グラムの活性を有している。この場合、１ニトリラーゼ単位は、５０ｍＭリン酸緩衝液中、３０℃、ｐＨ７．０及び５０ｍＭアクリロニトリルの条件で、アクリロニトリルを１μモル／分の速度でアクリル酸アンモニウムに転化する活性と定義される。触媒は、菌細胞の形態、より一般的には、重合体ゲルマトリックスに固定化した形態でありうる。定義された活性を有する触媒は、反応混合物の１〜５０重量％の量で反応器中に含有させる。
特に、酵素を、１リットルの反応混合物当たり３，０００〜５０，０００ニトリラーゼ単位の活性を示すように、反応混合物に添加するのが好ましい。
好ましい方法において、通常、必要な酵素の全量を反応の初め、すなわち（メタ）アクリロニトリル反応物を添加する前に反応器に供給する。しかしながら、反応中に連続的に又は定期的に追加の酵素を加えて、好ましい方法を実施することも可能である。
同様に、反応物並びに溶剤でもある水も、反応の初めに全量で反応器に含有させる。あるいは、（メタ）アクリロニトリル反応物で可能であると同様に、反応中に連続的に反応器に供給することもできる。
反応は、水溶液中で行う。水溶液の最良の成分は、水、酵素（菌細胞、重合体マトリックス等を含む）、（メタ）アクリロニトリル及び（メタ）アクリル酸アンモニウムである。
あるいは、本発明の方法は、アクリロニトリル単量体を含有する単量体ブレンドから生成され、未反応のアクリロニトリル単量体を含有する重合体を、本発明のアクリロニトリラーゼ触媒の存在下に未反応のアクリロニトリル単量体をアクリル酸アンモニウムに転化することにより精製する方法であってもよい。この方法は、アクリロニトリル単量体を、重合体の重量に基づいて１，０００ｐｐｍ以下、多くは５００ｐｐｍ以下、好ましくは３００ｐｐｍ以下、さらには１００ｐｐｍのレベルに低減することができる条件下に実施しうる。
本発明の方法は、いかなる方法、例えば、アクリロニトリルの化学的加水分解によって得られた残留アクリロニトリルを含有する単量体を精製する方法であってもよい。そのような方法において、アクリルアミドの出発濃度は、５％までであるが、普通は２％以下、例えば０．５〜１％である。
本発明の方法及びそれを使用するいかなる他の方法において、ニトリラーゼは、いかなる便利な形態で、例えば、触媒として使用する前に培養微生物から抽出した純粋な形で使用することができる。使用する抽出法は、酵素の活性及び安定性を失わないことを確実にするべきである。
酵素は、半純粋形、例えば、培養液又は処理をしていない細胞又は粉砕細胞のような細菌細胞分画として、使用することもできる。酵素は、粗不純酵素溶液の形で使用してもよい。酵素は、架橋重合体マトリックス、例えば、架橋ポリビニルアルコール又は架橋ポリアクリルアミド等の担体に支持又は固定してもよい。酵素は、表面に結合した酵素を有する非膨潤粒子の形で使用することもできる。酵素は、処理していない細菌細胞又は架橋重合体マトリックスに支持させた形で使用するのが好ましい。
我々は、流加式反応には、酵素を遊離細胞として、純粋又は半純粋の形で使用するのが特に有利であることを見出している。この形での使用は、細胞を担体に固定化する必要性を排除する。また、このような使用は、貯蔵に際し、又は反応混合物中で、過度の安定性の低下に至らないことがわかっている。
連続式方法に関し、我々は、酵素を固定化した形で使用する方を好む。なぜならば、このような使用は、使用する反応器でより大きな長期安定性を与える傾向があるためである。特に、ある環境において、固定化した形態の酵素は、貯蔵中と同様に、反応混合物中で安定であることがわかっている。最終生成物からの触媒の分離も、より容易になる傾向がある。
酵素を、特に重合体ビーズの形で固定化する場合、より大きなサイズの重合体ビーズの製造が、重合体中の酵素の安定性を改善することがわかっている。特に、８５０μｍより、好ましくは１ｍｍより大きなサイズのビーズが好ましい。
重合体マトリックスは、いかなる方法によっても、例えば、粒状重合又は懸濁重合によって製造することができる。単量体混合物に増粘剤を添加することも有効である。
製造中の酵素の安定性は、低い細胞添加率、すなわち重合体マトリックスに対する乾燥細胞の重量％、特に５％以下、好ましくは１％以下、例えば約０．５重量％で最高になることがわかっている。しかしながら、安定性は、例えば、３０又は２０℃以下、多くの場合１５℃以下の低い重合温度を使用することによっても達成することができる。これは、例えば、少なくとも４重量％、好ましくは少なくとも５重量％、例えば、約６．５又は６．８重量％のより高い細胞添加率と組み合せて使用することができる。
本発明のニトリラーゼ、特にロドコッカス・ロドクラウスＮＣＩＭＢ  ４０７５７及び新寄託菌株ＮＣＩＭＢ  ４０８３３によって産生されたニトリラーゼの利点は、低濃度、例えば１８．８６ｍＭ（１，０００ｐｐｍ）のアクリロニトリルを高濃度、例えば、３０％、４０％又はそれ以上のアクリル酸アンモニウムに転化するそれらの能力にある。これは、連続又は流加法を操作して、高濃度のアクリル酸アンモニウム、及び毒性のための表示を必要とするレベル（１，０００ｐｐｍ）より十分に低濃度のアクリロニトリルを含有する生成物を製造することができることを意味する。したがって、無毒性アクリル酸アンモニウム生成物を、さらに加工する必要なしに直接製造することができる。同様に、アクリロニトリル含有重合体を製造して、無毒性の生成物に転化することができる。
しかしながら、本発明において、ニトリラーゼを使用して、アクリロニトリルをアクリル酸アンモニウムに転化し、さらに処理してアクリロニトリルの濃度を低くすることができる１，０００ｐｐｍより高い濃度のアクリロニトリルを含有する生成物を製造することが可能である。
我々は、本発明の方法によって製造されたアクリル酸アンモニウム単量体（生合成アクルリ酸アンモニウム）が、プロピレンオキサイドから得られたアクリル酸などの別の化学的経路によって製造された単量体類の特性と、同等かそれより優れた特性を示すことを見出している。本発明の方法によって製造された単量体を使用して製造した重合体も、優れた特性を示す。本発明によって製造した生合成アクリル酸アンモニウムを、他の化学的形態、例えば、アクリル酸又はそのナトリウム又は他のアルカリ金属塩又は他の関連アクリル酸系単量体に転化して、アクリル酸系重合体の製造用出発単量体として使用することができる。あるいは、アクリル酸アンモニウムとして転化することなく使用することができる。それを使用して、単独重合体を形成し、あるいは他の単量体類と併用して、共重合体を製造することができる。
我々は、本発明の新規のニトリラーゼのさらに別の用途が、ニトリル、特にアクリロニトリルのバイオセンサーにあることを見出している。
したがって、本発明の方法によれば、
（ａ）  ニトリルを、水性環境下に本発明のニトリラーゼと接触させ、
（ｂ）  ニトリルをその対応するアンモニウム塩に転化させ、そして
（ｃ）  ニトリルの転化に関連する変化を検出する
ことによってニトリルを検出する。
この変化は、例えば、水性環境の導電率の変化でありうる。ニトリルは、非イオン性種であるので、導電率測定を用いて検出することができない。それらがイオン性種に転化されたならば、得られる導電率の変化を測定することができる。あるいは、アンモニウムイオン濃度を検出するか、又は結合酵素系を使用して変化を検出することができる。
バイオセンサーは、例えば、電極センサーとして、この種のセンサーの慣例のいかなるようにも構成することができる。例えば、ニトリラーゼを電極に被覆することができる。
酵素は、水性環境、例えば、水溶液環境又は含水ゲル中のバイオセンサー中に存在しうる。あるいは、検出すべきニトリルが水性環境中にあってもよい。ニトリル及びニトリラーゼを接触させて加水分解を生じさせる時に、水が存在することだけが必要である。蒸気状のニトリルを、本発明の方法を用いて検出することができる。
本発明のニトリラーゼは、特に極めて低濃度のニトリルに実質的に線形応答を示す能力のために、ニトリラーゼバイオセンサーに特に有用である。
一般に、酵素は、精製抽出した形で使用する。しかしながら、酵素を全細胞形又は細菌細胞画分として使用することもできる。
この方法は、いかなる環境中、例えば、未反応アクリロニトリル単量体を含有するかもしれない重合体中、スクラバー中のニトリル類で汚染された流出水中、さらにはアクリロニトリル含有蒸気と接触して、ニトリルを検出するために使用することができる。本発明のニトリラーゼは、これらの排出物を精製するためにも使用することができる。
本発明のニトリラーゼは、ニトリルが非常に少ない量で存在しうる蒸気、例えば、スクラバー蒸気からニトリルを除去するためにも使用することができる。それは、０．３ｋｇ／ｍ3まで、多くの場合０．２ｋｇ／ｍ3、例えば０．０５〜０．１ｋｇ／ｍ3の量で存在しうる。この方法においては、ニトリル含有蒸気をニトリラーゼと接触させて、その対応するアンモニウム塩に転化させるので、ニトリルは、５ｍｇ／ｍ3、さらには２ｍｇ／ｍ3（２ｐｐｍ）に低減される。接触は、通常水性環境、例えば水溶液環境又は含水ゲル中で、あるいは単に湿った酵素となされる。
本発明のこの方法は、他の方法では検出できない非常に低濃度のニトリルを、オンラインで検出するために特に有用である。本発明の方法において、ニトリラーゼは、本発明のいかなるニトリラーゼでもよいが、そのニトリラーゼが５００μＭ以下、好ましくは１００μＭ以下、より好ましくは５０μＭ以下の検出されるニトリルに対するＫｍを有しているのが好ましい。ニトリラーゼは、ロドコッカス・ロドクラウスＮＣＩＭＢ  ４０７５７又は新寄託菌株ＮＣＩＭＢ  ４０８３３を培養することによって得ることができるものであるのが最も好ましい。
以下は、本発明の幾つかの実施例である。
実施例１
ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・アンド・マリン・バクテリアに培養コレクション番号ＮＣＩＭＢ  ４０７５７を受けて寄託された、ニトリラーゼ酵素を含有するか、あるいはニトリラーゼ酵素を誘発することができるロドコッカス・ロドクラウスの菌株の原分離菌を、以下の表に示す液体培養培地を含有するエーレンマイヤーフラスコに移す。
0003809192.tif 000002
エーレンマイヤーフラスコを、攪拌しながら２４時間保温する。次に、細胞を液から分離し、５０ｍＭ、ｐＨ７のリン酸ナトリウム緩衝液に再懸濁させた後、懸濁液から分離する。この細胞の一部を−２０℃で凍結貯蔵し、残りを５０ｍＭのアクリロニトリルを含有する５０ｍＭのｐＨ７のリン酸ナトリウム緩衝液に再懸濁する。細胞の比ニトリラーゼ活性を測定したところ、１０６０μモル／分／ｇ（細胞の乾燥重量）であった。
同様の結果が、新寄託菌株ＮＣＩＭＢ  ４０８３３を使用して得られる。
実施例２
実施例１で説明したように成長させたロドコッカス・ロドクラウス株の細胞を、架橋ポリアクリルアミドビーズに、次の通り固定化させる：
培養培地から分離した細胞から成るペーストを冷却緩衝液に懸濁させ、同様に冷却緩衝液中のアクリルアミドとメチレンビスアクリルアミド（ＭＢＡ）架橋剤との混合物に加える。レドックス開始剤系の水溶性成分をその後即座に加える。次に、細胞／単量体／開始剤混合物を、冷却鉱油及び界面活性剤を含有する攪拌樹脂ポットに移して、両液相に可溶性の第二のレドックス開始剤成分を添加し、重合を開始する。重合に際し、細胞が架橋重合体ビーズ中に閉じ込められる。
閉じ込められた細胞を、５０ｍＭのアクリロニトリルを含有する５０ｍＭ、ｐＨ７のリン酸ナトリウム緩衝液に移す。細胞の比ニトリラーゼ活性を測定したところ、８４５μモル／分／ｇ（細胞の乾燥重量）であった。
実施例３
実施例２で説明したように架橋重合体ビーズに閉じ込めたロドコッカス・ロドクラウス細胞を、実験室用流動床乾燥器中６０℃で１２％の水分に乾燥させた。次に、乾燥ビーズの半分を室温で気密容器に貯蔵した。閉じ込められた細胞を、５０ｍＭのアクリロニトリルを含有する５０ｍＭのｐＨ７のリン酸ナトリウム緩衝液に移す。細胞の比ニトリラーゼ活性を測定したところ、１０３８μモル／分／ｇ（細胞の乾燥重量）であった。
実施例４
実施例２で説明したように架橋重合体ビーズに閉じ込め、かつ、実施例３で説明したように実験室用流動床乾燥器中で乾燥したロドコッカス・ロドクラウス細胞を凍結乾燥器に移し、０．１ｍｂａｒで２４時間保持した。これらのビーズを、室温で気密容器に貯蔵した。
実施例５
実施例１で説明したように成長させたロドコッカス・ロドクラウス株の細胞を３０℃で精製水に懸濁させた。アクリロニトリルを細胞懸濁液に定期的に添加して、アクリロニトリルの濃度を１９０ｍＭに上昇させた。各添加前に試料を取り出し、細胞懸濁液中のアクリロニトリル、アクリルアミド及びアクリル酸アンモニウム濃度を測定した。以下の表は、初期、最高及び最終比ニトリラーゼ活性、最終アクリル酸アンモニウム濃度及びその濃度に達するのに要した時間を示す。
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比較のために、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，ナガサワ等（１９９０）において、２３８ｍｇの乾燥重量のロドコッカス・ロドクラウスＪ１細胞を５０ｍＬの５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．８）及び２００ｍＭアクリロニトリル中２０℃で保温した。それらのアクリロニトリル濃度を、アクリロニトリルを定期的に添加することによって約２００ｍＭに保持した。６ＭのＫＯＨ溶液を添加することによって、反応混合物をｐＨ７．８に維持することが必要であった。以下の表は、初期比アクリロニトリラーゼ活性、最終アクリル酸アンモニウム濃度及びその濃度に達するのに要した時間を示す。
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ナガサワ等（１９９０）は、“［ロドコッカス・ロドクラウスＪ１でのアクリル酸］の蓄積は、異なる濃度の・・・細胞を添加した場合でさえほとんど同じであった。したがって、［ロドコッカス・ロドクラウスＪ１でのアクリル酸の］蓄積の制限は、酵素の失活ではなくて生成物阻害に起因する”と主張した。このレベルの生成物阻害は、ＮＣＩＭＢ  ４０７５７酵素によっては示されない。
実施例６
実施例１で説明したように成長させたロドコッカス・ロドクラウス株の細胞を、３０℃で以下の表に示す濃度のアクリルニトリルを含有する５０ｍＭのｐＨ７リン酸ナトリウム緩衝液に懸濁させた。試料を終始取り出し、細胞懸濁液中のアクリロニトリル、アクリルアミド及びアクリル酸アンモニウム濃度を測定した。
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上記表のデータから、この株のニトリラーゼのＫｍを測定したところ、アクリロニトリルに対し３０．６μＭであった。
比較のために、以下の表は、文献において測定した２種類の他のニトリラーゼのＫｍを示す。
0003809192.tif 000006
この表は、ロドコッカス・ロドクラウスＮＣＩＭＢ  ４０７５７ニトリラーゼが、上記菌株のものよりはるかに高いアクリロニトリル掃去力を有していることを示している。
実施例７
実施例１で説明したように成長させたロドコッカス・ロドクラウス株の細胞を、３０℃で以下の表に示す濃度のアクリルニトリルを含有する１．２Ｍのアクリル酸アンモニウム溶液に懸濁させた。試料を終始取り出し、細胞懸濁液中のアクリロニトリル、アクリルアミド及びアクリル酸アンモニウム濃度を測定した。
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上記表のデータから、１．２Ｍアクリル酸アンモニウム中のこの菌株のニトリラーゼの見掛けＫｍを測定したところ、アクリロニトリルに対し１４５μＭであった。この見掛けＫｍ値から、この株のＫｉを測定したところ、アクリル酸アンモニウムに対し３０９ｍＭであった。この非常に高い値は、ロドコッカス・ロドクラウスＮＣＩＭＢ  ４０７５７ニトリラーゼで示される生成物阻害の程度が低いことを示している。
これは、上記実施例５に記載したＪ１酵素によって示される生成物阻害と比べて引き立っている。
実施例８
実施例１で説明したように成長させたロドコッカス・ロドクラウス株の細胞を、３０℃で以下の表に示す濃度のアクリルニトリルを含有する５０mMのｐＨ７リン酸ナトリウム緩衝液に懸濁させた。試料を終始取り出し、細胞懸濁液中のアクリロニトリル、アクリルアミド及びアクリル酸アンモニウム濃度を測定した。結果は、ロドコッカス・ロドクラウスＮＣＩＭＢ  ４０７５７ニトリラーゼに対し比較的低い水準の基質崩壊を示している。
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比較のために、ナガサワ等（１９９０）は、“［５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．８）に懸濁させたロドコッカス・ロドクラウスＪ１細胞の］反応混合物中のアクリロニトリル濃度のアクリル酸の生成速度に及ぼす効果を研究した［以下の表］。生成速度は、２５〜１００ｍＭで最高であった。しかしながら、２００ｍＭより高い濃度において、アクリロニトリルは、顕著な阻害を引き起こした。したがって、反応混合物中のアクリロニトリルの濃度は、２００ｍＭ以下の濃度に保持すべきである。”と述べている。ナガサワ等の結果を以下の表に示す。
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実施例９
実施例１で説明したように成長させたロドコッカス・ロドクラウス株の細胞を、５０ｍＭのアクリルニトリルを含有する５０ｍＭの緩衝液に、３０℃で、かつ、以下の表に示すｐＨ値で懸濁させた。試料を終始取り出し、細胞懸濁液中のアクリロニトリル、アクリルアミド及びアクリル酸アンモニウム濃度を測定した。
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この表は、［緩衝液に懸濁させたロドコッカス・ロドクラウスＪ１細胞の］最適ｐＨは、７．８であると言っているナガサワ等（１９９０）と比較して、ロドコッカス・ロドクラウスＮＣＩＭＢ  ４０７５７ニトリラーゼの最大の活性がアクリル酸ＮＨ4+の生成に起因する同様のｐＨ域６〜７にあり、苛性アルカリの添加の必要を排除することを示している。
実施例１０
実施例１で説明したように成長させたロドコッカス・ロドクラウス株の細胞を、５０ｍＭ、ｐＨ７のリン酸ナトリウム緩衝液に、以下の表に示す温度値で懸濁させた。細胞を、以下の表に示す温度で５０ｍＭの濃度になるようにアクリルニトリルを添加する前、５分間保温した。試料を１５〜３０分間にわたって取り出し、細胞懸濁液中のアクリロニトリル、アクリルアミド及びアクリル酸アンモニウム濃度を測定した。
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最適活性は、５５℃で達成されると思われ、また、高活性が１５〜３０分間にわたって、６０℃及び６５℃でさえ保持される。
比較として、ナガサワ等（１９９０）は、“［５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．８）に懸濁させたロドコッカス・ロドクラウスＪ１細胞の］熱安定性に関する研究によって、活性は、３０℃まで安定であり、３０〜５０℃でわずかに失活し、６０℃でほとんど全てが失活することが示された。”と言っている。
実施例１１
ａ）実施例２で説明したように架橋重合体ビーズに閉じ込めたロドコッカス・ロドクラウス細胞、ｂ）実施例２で説明したように架橋重合体ビーズに閉じ込め、かつ、実施例３で説明したように実験室用流動床乾燥器中で乾燥させたたロドコッカス・ロドクラウス細胞、及びｃ）実施例２で説明したように架橋重合体ビーズに閉じ込め、実験室用流動床乾燥器中で乾燥させ、さらに実施例４で説明したように凍結乾燥器中で乾燥させたロドコッカス・ロドクラウス細胞を室温で１７日間気密容器中に貯蔵した。次に、ビーズを５０ｍＭのアクリロニトリルを含有する５０ｍＭ、ｐＨ７のリン酸ナトリウム緩衝液に移した。各細胞の比ニトリラーゼ活性を測定したところ、ａ）の細胞は、１０２３μモル／分／ｇ（細胞の乾燥重量）であり、ｂ）の細胞は、１１６５μモル／分／ｇ（細胞の乾燥重量）であり、そしてｃ）の細胞は、１４５６μモル／分／ｇ（細胞の乾燥重量）であった。このことは、ロドコッカス・ロドクラウスｓｐ．１２９０ニトリラーゼが、細胞形での固定化及びその後の乾燥に対し、著しく高い耐性を有していることを示している。
実施例１２
実施例２で説明したように架橋重合体ビーズに閉じ込めたロドコッカス・ロドクラウス細胞を一定使用容積の反応器に移し、以下の表に示す濃度のアクリル酸アンモニウム中に３０℃で懸濁させる。アクリロニトリルを以下の表に示す濃度になるように添加する。固定化細胞形のニトリラーゼは、アクリロニトリルの加水分解を触媒し、アクリル酸アンモニウムを生産する。反応器のアクリロニトリル濃度が以下の表に示す下限濃度に低下したら、以下の表に示す上限の濃度にアクリロニトリルの濃度を上昇させるのに十分なアクリロニトリル及び水を反応器に自動的に加える。各添加前に、試料を取り出し、懸濁液中のアクリロニトリル、アクリルアミド及びアクリル酸アンモニウム濃度を測定した。閉じ込められた細胞の初期比ニトリラーゼ活性及びその活性が半分だけ低下されるのに要した時間を測定し、以下の表に示す。
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実施例１３
細胞物質を遠心分離及び濾過によって実施例５で製造したアクリル酸アンモニウム溶液から除去して、測定した溶液中のアクリロニトリル、アクリルアミド及びアクリル酸アンモニウムの濃度を以下の表に示す。
0003809192.tif 000013
この表は、ＮＣＩＭＢ  ４０７５７ニトリラーゼがアクリロニトリルに対し優れた掃去力を有し、かつ、不純物アクリルアミドの濃度を極めて低レベルにすることが達成できることを示している。
実施例１４
ａ）上記実施例１３で分析したアクリル酸アンモニウム試料、及びｂ）アンモニアで中和したアクリル酸試料を使用して、３０％の全単量体濃度になるように、アクリルアミドと共に２０％の単量体混合物を作成した。重合を２種類の異なるレドックス開始剤レベルで行った。生成した重合体の固有粘度（ＩＶ）値を、以下の表に示す。
0003809192.tif 000014
実施例１５
上記実施例１４で生成した重合体を使用して、カオリン粘土の懸濁液を凝集させた。重合体の凝集効率に何らの差異も見られなかった。