(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
有用物質を菌体内に蓄積する微生物であって、溶菌遺伝子とグルコースが消費し尽くされることにより溶菌遺伝子を発現させる調節遺伝子とが導入されている微生物を培地中で培養し、培地中に含まれるグルコースが消費され尽くした時期に微生物を自己破砕させ、その菌体破砕液から有用物質を単離する有用物質の生産方法。
【請求項２】
グルコースが消費し尽くされることにより溶菌遺伝子を発現させる調節遺伝子が、xylR遺伝子とxylAプロモーターとを含むDNA断片であり、微生物を培養する培地がグルコースとキシロースを含む培地である請求項１記載の有用物質の生産方法。
【請求項３】
有用物質が、ポリヒドロキシアルカン酸である請求項１又は２に記載の有用物質の生産方法。
【請求項４】
溶菌遺伝子と培地中に含まれるグルコースが消費し尽くされることにより溶菌遺伝子を発現させる調節遺伝子とが導入されており、有用物質を菌体内に蓄積する微生物であって、培養した際、その培地中に含まれるグルコースが消費され尽くした時期に自己破砕する微生物。
【請求項５】
グルコースが消費し尽くされることにより溶菌遺伝子を発現させる調節遺伝子が、xylR遺伝子とxylAプロモーターとを含むDNA断片である請求項４記載の微生物。
【請求項６】
有用物質が、ポリヒドロキシアルカン酸である請求項４又は５に記載の微生物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、有用物質を菌体内に蓄積する微生物を利用して有用物質を生産する方法に関し、より詳しくは、有用物質を菌体内に蓄積する微生物を、培地中に含まれる炭素源の一つが消費され尽くした時期に、自己破砕させて有用物質を単離する有用物質の生産方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
生分解性プラスチックの一種であるポリヒドロキシアルカン酸（PHA）は、汎用ポリマーに近い物性を持ち、環境適合型の材料として期待されている。PHAを産生する細菌は幾つか知られており、これらの細菌を利用した工業スケールでのPHA生産も検討されている。
【０００３】
しかし、PHAは菌体細胞内に生産されるため、生産物を回収するには、まず、菌体を破壊しなければならない。そのためには、有機溶媒や次亜塩素酸を使用する化学処理（薬剤処理）、熱処理、超音波破砕、酵素処理などの方法を組み合わせた処理が必要であるが、このような方法を工業スケールで実施すると、大量の薬剤や酵素を使用することとなり、生産コストが非常に高くなる。
【０００４】
最近、PHA生合成系の遺伝子を組み込んだ組換え大腸菌に、さらにファージの溶菌遺伝子を導入する手法が報告された（Fidler S, Dennis D (1992) FEMS Microbiol Rev 103: 231-236; Resch S, Gruber K, Wanner G, Slater S, Dennis D, Lubitz W (1998) J. Biotechnol 65: 173-182;; Yu H, Yin J, Li H, Yang S, Shen Z (2000) J Biosci Bioeng 89: 307-311; 特許02641326号公報）。これらの手法では、大腸菌は自己破砕能を賦与されており、有機溶媒や次亜塩素酸のような化学薬剤や酵素を使用しなくても、PHAを培養液中に放出させることができる。ファージの溶菌遺伝子を利用する際に重要なポイントは自己破砕のタイミングである。自己破砕は、十分量のPHAが菌体内に蓄積されてから誘導せねばならず、通常、細胞増殖が定常期になってから発現させることになる。しかしながら、効率的な溶菌を達成するには、ファージの溶菌遺伝子の発現は、対数増殖期に誘導せねばならないのが一般的であり、定常期に誘導したのでは溶菌効率が極端に落ちることが知られている。つまり、ファージ溶菌遺伝子の発現とPHA回収のタイミングの差異を解決せねばならない。これまでに報告されたものには、温度感受性プロモータの制御下に組み込んだ溶菌遺伝子を対数増殖期に発現させる前に、溶菌タンパクの働きを抑える作用を持つ硫酸マグネシウムを添加する方法がある。この方法では、PHAを蓄積した後に集菌し、菌体を純水または低イオン濃度の水溶液に再懸濁することにより硫酸マグネシウムを除き、自己破砕（溶菌）に導く（Resch S, Gruber K, Wanner G, Slater S, Dennis D, Lubitz W (1998) J. Biotechnol 65: 173-182）。また、ファージによる溶菌では、複数の酵素タンパクがセットになって働き、セットのうちの一つが欠けると溶菌に至らないのが普通である。そこで、故意に酵素の一つを欠損させた溶菌遺伝子のセットを組み込み、恒常的に残りの遺伝子が発現してタンパクが作られても溶菌しない組換え菌が開発された（Yu H, Yin J, Li H, Yang S, Shen Z (2000) J Biosci Bioeng 89: 307-311）。この方法では、PHAが蓄積された後、集菌し、EDTA/トリス溶液に再懸濁することによって溶菌が引き起こされた。欠損したタンパクの代わりに金属のキレート剤であるEDTAが膜構造を弱め、菌体内で作られた残りの溶菌タンパクが作用することにより溶菌に至ったものと考えられる。
【０００５】
ファージの溶菌遺伝子を利用した自己破砕菌にPHAを生産させる研究については、現在までに報告されているものは、この二つの研究グループによるものだけであり、これらの研究では、いずれも組換え体としてグラム陰性菌である大腸菌を利用している。グラム陽性菌であるバチルス（Bacillus）属の細菌にはPHAを生産するものが幾つか知られているが、グラム陽性菌で自己破砕菌によるPHAの生産に成功した例はない。また、グラム陰性菌と陽性菌では膜構造が全く異なるため、溶菌のメカニズムも異なる。したがって、上述した大腸菌に適用した自己破砕システムをそのままグラム陽性菌に適用しても、同様の結果が得れるとは限らない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
ところで、バッチ培養によるPHAの生産では、PHAの菌体内蓄積量は培地中の炭素源がちょうど消費された時点が最大であり、それ以降培養を続けるといったん蓄積されたPHAが消費減少してしまうことが知られている。しかしながら、早い時期で培養を止め、生産物の回収工程に入ると、十分量のPHAが生産される前に合成を止めてしまう可能性がある。したがって、培養から回収工程に移るタイミングを適切に把握することが重要である。このためには、グルコースセンサーなど炭素源の濃度をモニターするシステムを新たに付加せねばならず、生産プロセスのコストアップの要因に成り得る。
【０００７】
炭素源濃度をモニターするシステムがなくても、適切な時期に培養工程から回収工程へ移行できる方法を確立できれば、PHAの効率的な発酵生産が可能になる。また、このような方法は、PHAだけでなく、微生物の菌体内に蓄積される他の有用物質の生産にも応用可能である。
【０００８】
本発明は、このような技術的背景の下になされたものであり、微生物の菌体内に蓄積される有用物質を低コストで効率的に生産する手段を提供することを目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、炭素源の枯渇を感知し、炭素源が消費され尽くすと自発的に溶菌に至る自己破砕菌を開発し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
即ち、本発明は、有用物質を菌体内に蓄積する微生物を培地中で培養し、培地中に含まれる炭素源の一つが消費され尽くした時期に微生物を自己破砕させ、その菌体破砕液から有用物質を単離する有用物質の生産方法である。
【００１１】
また、本発明は、有用物質を菌体内に蓄積する微生物であって、培養した際、その培地中に含まれる炭素源の一つが消費され尽くした時期に自己破砕する微生物である。
【００１２】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１３】
本発明の有用物質の生産方法は、有用物質を菌体内に蓄積する微生物を培地中で培養し、培地中に含まれる炭素源の一つが消費され尽くした時期に微生物を自己破砕させ、その菌体破砕液から有用物質を単離する方法である。
【００１４】
この方法では、微生物の破砕が、有用物質の蓄積が最大量に達したときに自発的に発動するため、回収工程を適切な時期に実施することができ、また、他の余分な操作は全く必要としないため、回収工程自体の簡略化を図ることもできる。
【００１５】
本発明で生産する有用物質としては、PHAを挙げることができる。PHAとしては、例えば、ポリヒドロキシ酪酸（PHB）、3-ヒドロキシ酪酸と3-ヒドロキシ吉草酸の共重合体（P(3HB-co-3HV)）、3-ヒドロキシオクタン酸を中心とする共重合体（mcl-PHA）などを挙げることができる。PHA以外の有用物質としては、菌体内酵素、インシュリン等の組換え外来タンパク質などを例示できる。
【００１６】
使用する微生物は、有用物質を菌体内に蓄積するものであればどのような微生物でもよいが、PHAを生産する場合にはバチルス属に属する微生物を使用するのが好ましい。PHA生産に使用可能な微生物の例を下表に示す。
【００１７】
【表１】
0003799402.tif 000002
【００１８】
また、表１に示した微生物だけでなく、それらの微生物の有するPHA合成遺伝子を導入した微生物を使用することも可能である。
【００１９】
PHA以外の有用物質の生産に使用可能な微生物としては、グルコキナーゼを生産するBacillus stearothermophilus IFO 12550 T（委託先：（財）発酵研究所）などを例示できる。さらに、有用タンパクの生産のために、外来遺伝子を導入した組換え大腸菌も使用可能である。有用タンパクと大腸菌に組み込む遺伝子の例を表２に記載する。
【００２０】
【表２】
0003799402.tif 000003
【００２１】
微生物を培養する培地は、その微生物が菌体内に有用物質を蓄積可能なものであれば特に限定されない。Bacillus megaterium IAM13418Tの場合、炭素源を他の栄養基質に比べ過剰に含む培地で培養することにより、PHAを菌体内に蓄積する。培地中に含まれる炭素源は、微生物の自己破砕との関係で決める。例えば、xylR遺伝子とxylAプロモーターとを含むDNA断片（xylR-xylA'）を利用して自己破砕させる場合には、炭素源はグルコースとキシロースにする。
【００２２】
菌体破砕液から有用物質の単離は、各有用物質の単離に常用される手段によって行うことができる。例えば、PHAを単離する場合、遠心分離などによって菌体破砕液から単離することができる。
【００２３】
培地中に含まれる炭素源の一つが消費され尽くした時期に微生物を自己破砕させる手段としては、溶菌遺伝子と、前記炭素源が消費し尽くされることにより溶菌遺伝子を発現させる調節遺伝子とを微生物に導入する手段を挙げることができる。
【００２４】
ここで使用する溶菌遺伝子は、宿主となる微生物を溶菌させ得るものであればどのようなものでもよく、例えば、宿主に感染するバクテリオファージの溶菌遺伝子、さらに具体的にはholinやendolysin等をコードする遺伝子を挙げることができる。
【００２５】
炭素源が消費し尽くされることにより溶菌遺伝子を発現させる調節遺伝子としては、xylR遺伝子とxylAプロモーターとを含むDNA断片を例示できる。このDNA断片の下流に配置された遺伝子は、キシロースによって発現が誘導されるが、グルコースの存在下では、この発現誘導は阻害される。従って、このDNA断片と溶菌遺伝子が導入された微生物をグルコースとキシロースを含む培地中で培養すると、グルコースの消費され尽くした時期に、微生物が自己破砕する。
【００２６】
溶菌遺伝子等の導入は、常法に従って行うことができる。例えば、溶菌遺伝子、xylR遺伝子とxylAプロモーターとを含むDNA断片をBacillus megaterium IAM13418Tに導入する場合は、xylR遺伝子とxylAプロモーターを含むベクターであるpXに、溶菌遺伝子を挿入し、これをBacillus megateriumに導入すればよい。
【００２７】
なお、上述した遺伝子等は、下表に示すように既に公知であり、当業者はこれらの遺伝子等を必要に応じ適宜使用することができる。
【００２８】
【表３】
0003799402.tif 000004
【００２９】
なお、holin遺伝子の塩基配列およびそれから推定されるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１および配列番号２に示した。
【００３０】
【実施例】
以下、実施例より本発明を更に詳細に説明する。
【００３１】
＜材料と方法＞
1.1. 微生物とプラスミド、および培地
使用した微生物株はB. megaterium IAM13418Tと大腸菌Escherichia coli JM109である。溶菌遺伝子挿入ベクターの構築に使用したプラスミドベクターpXは、開発者であるドイツ、Bayreuth大学のWolfgang Schumann博士から分譲された（Kim L, Mogk A, Schumann W (1996) Gene 181: 71-76）。
【００３２】
ポリヒドロキシ酪酸（PHB）を生産させる時は、M4培地（McCool et al. 1996）に炭素源としてグルコースまたはフルクトースを添加した培地でB. megateriumを培養した。それ以外の時は、Nutrient Broth (NB) (Difco Lab. USA)または10 g/lの酵母エキス、10 g/l のポリペプトン、5 g/lの肉エキス、 5 g/lの硫安を含む富栄養培地でB. megateriumを増殖させた。大腸菌はLuria-Bertani (LB)培地で増殖させた。寒天培地の調製には、15 g/lの寒天を培地に加えた。また、必要に応じて、32μg/mlのクロラムフェニコールまたは50μg/mlのアンピシリンを加えた。
【００３３】
1.2. 溶菌遺伝子挿入ベクターの構築とB. megateriumの形質転換
染色体およびプラスミドDNAの単離精製、PCR、コンピテントセルの調製、大腸菌の形質転換、DNAクローニングは標準の手順(Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T (1989) Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York)に従った。holinとendolysinの遺伝子カセットは、Bacillus amyloliquefaciensファージの染色体DNAを鋳型にしてPCRにより増幅した。その際にプライマーとして使用した二つのオリゴヌクレオチドの配列は以下の通りである(BamHI 切断用のタグ部分に下線を付する)。
【００３４】
5'-CGGGATCCGATGACAATGATAGCGTGGATG-3'
5'-CGGGATCCCTTGTCCATGATTTACACCTCA-3'
PCR産物をBamHIで処理した後、一連の反応と処理によって得られたB. amyloliquefaciensファージのholin-endolysinカセットを含む制限断片を、プラスミドベクターpXのxylR-xylA'領域の下流に存在するBamHIサイトに挿入した。その結果得られたプラスミドpXcassetteをE. coli JM109細胞中で増幅し、これをB. megaterium細胞中にエレクトロポーレーションにより導入した。pXcassetteを得るまでの手順を図１に示す（図中のamyEはα-アミラーゼ遺伝子、xylAはキシロースイソメラーゼ遺伝子、xylRはXylリプレッサー遺伝子、catはクロラムフェニルコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子、blaはアンピシリン耐性遺伝子をそれぞれ表す）。ベクターpXは、キシロース誘導性の染色体挿入型ベクターとして、もともとはBacillus subtilis用に開発されたものである。外来遺伝子の挿入部位とマーカー遺伝子であるcat（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）を含む転移領域は、B. subtilisのα-アミラーゼをコードするamyEの5'と3'領域に挟まれている。染色体のamyE領域にholin-endolysinのカセットが挿入された形質転換体を、クロラムフェニコールを含むNBプレート上で選択した。実際に、形質転換体の染色体に溶菌遺伝子が挿入されていることを確認するために、先述したプライマーを用いてPCRを行った。挿入配列の向きは、形質転換体の染色体DNAを制限酵素処理して得られた断片の長さより決定した。
【００３５】
1.3. ポリヒドロキシ酪酸の生産
野生株または形質転換体を、20 g/lのグルコースと8 g/lのキシロースを含むM4培地にて好気的に培養した。培養は2 Lのファーメンター中で、30℃、pH 7.0にて行った。培養中、定期的に培養液をサンプリングし、Triton-X 100を終濃度2%になるように添加し、重力加速度400 gで10分間遠心することにより、培養上清を菌体細胞と細胞破砕片から分離した(遠心1回目)。得られた培養上清は、培養液中に放出されたPHBを沈殿させるため、重力加速度4,500 gでさらに10分間の遠心分離に供した（遠心2回目）。1回目と2回目の遠心により得られたペレットは、凍結乾燥後、PHBの分析に用いた。2回目の遠心により最終的に得られた培養上清からは、一連の操作により培養液中に放出されたDNAを回収した。
【００３６】
1.4. 自己破砕システムによる溶菌効率の定量化
自己破砕システムによる溶菌効率を定量するために、細胞破砕によって培養液中に放出されたDNA量と未破砕細胞中に存在するDNA量を比較した。培養液中に放出されたDNAについては、2回目の遠心によって最終的に得られた培養上清をフェノール/クロロホルムで処理後、エタノール沈殿を行うことによって得た。DNA量は260 nmの紫外吸光測定によって決定し、得られた値を(a)とした。一方、未破砕の細胞中に含まれるDNAを得るため、1回目の遠心で得られたペレットを、1時間、超音波処理にかけ、その後重力加速度4,500 gで10分間遠心した。ここで得られた上清をフェノール/クロロホルムで処理し、エタノール沈殿によりDNAを得た。DNA量は260 nmの紫外吸光測定によって決定し、得られた値を(b)とした。自己破砕システムによる溶菌効率は、超音波処理による破砕効率を基準として、それと比較することにより評価した。B. megateriumの細胞を超音波処理により完全に破壊するには、本実施例で採用した実験条件では1時間を要することを予備実験により確認した。1回目の遠心により得られた野生株細胞のペレットを、1時間、超音波処理することにより破砕し、重力加速度4,500 gで10分間遠心した。得られた上清とペレットからDNAをフェノール/クロロホルム処理、エタノール沈殿により得た。上清とペレットに含まれていたDNA量は260 nmの紫外吸光測定によって決定し、得られた値をそれぞれ(c)、(d)とした。最終的に、自己破砕システムによる相対破砕効率を以下の式によって算出した。
【００３７】
【数１】
0003799402.tif 000005
【００３８】
1.5. ショ糖密度勾配遠心法
PHBを含む脂質を染色するために、培養液サンプルにズダンブラックBを添加した。容量13 mlの遠心チューブに底から2.00 M, 1.66 M, 1.33 M, 1.00 Mのショ糖溶液を2 mlずつ重層し、これに先に染色した培養液サンプルを載せた。これを重力加速度150,000 gで1時間の超遠心にかけた。遠心後、ズダンブラックにより黒く染まったバンドを回収し、顕微鏡で観察するとともに、凍結乾燥してPHB含率を求めた。
【００３９】
1.6. 分析方法
PHB含率は凍結乾燥物をメタノリシス後、ガスクロマトグラフィーにより求めた。培養液中のグルコース濃度は市販の測定キット（GLUneo, シノテスト）を使用して求めた。
【００４０】
＜結果＞
2.1. 自己破砕性B. megateriumの構築
基質枯渇感知型の自己破砕システムを構築するため、B. amyloliquefaciensファージの持つホスト溶菌システムであるholinとendolysinのカセットをpXベクターに組み込んだ。このベクターはB. megaterium由来のキシロース誘導プロモーターシステムであるxylR-xylA'を含む。このプロモーターの下流に挿入された目的遺伝子の発現は、キシロースによって誘導される。これは、xylRによってコードされているレプレッサー蛋白がキシロースの結合によって不活性化されるからである。しかしながら、目的遺伝子の発現は、XylR蛋白とキシロースを競合してアンチインデューサーとして働くグルコースによって阻害される。したがって、PHB合成のための炭素源としてグルコースを与えれば、グルコースが消費され尽くすと、キシロースの存在下でファージの溶菌システムが発現することが期待できる。その結果、PHB合成のための炭素源の枯渇後速やかに、PHBが培養液中に放出されることになる。pXはもともとは大腸菌と枯草菌（B. subtilis）のシャトルベクターとして開発されたが、枯草菌はPHAを生産することができないので、PHBの生産菌として古くから知られているB. megateriumをファージの溶菌遺伝子を運ぶベクターpXcassetteの受容菌とすることにした。このベクターはバチルスの細胞内では自立複製できないので、組換え菌は、シングルクロスオーバーまたはダブルクロスオーバーの結果、染色体のamyE領域に目的遺伝子が挿入されたものばかりである。このような形質転換体は、クロラムフェニコールを含む寒天培地上で選択した。得られた形質転換体の一つについては、実際にファージの溶菌遺伝子のカセットが染色体上に正しい方向に挿入されていることが、PCRとEcoRI消化の結果確認され、この株を自己破砕能を持つ組換え体としてこれ以降の実験に使用した。
【００４１】
2.2. 組換え菌の溶菌パターン
組み込まれたファージ溶菌遺伝子による自己破砕能を確認するため、20 g/lのフルクトースを含むM4培地で形質転換体を培養した。対数増殖期の初期および中期と、定常期に、ファージ溶菌遺伝子の発現を誘導するためにキシロースを添加した。図２にその結果を示す。図中の○がキシロース添加後のOD600を示す（●はキシロースを添加しないコントロールのOD600を示す）。矢印で示された時間にキシロースを添加した。菌体の増殖は、対数増殖期にキシロースを添加することにより阻害された。一方、定常期にキシロースを添加すると直ちにOD600の減少が認められた。このことは、B. amyloliquefaciensファージの溶菌システムがB. megateriumの細胞内で働いたことを意味する。こうして、自己破砕システムをPHAが蓄積された定常期に誘導することが可能であることがはっきりとした。また、自己破砕現象は顕微鏡観察によっても確認された（図３、Ａ：野生株、Ｂ：ファージ溶菌遺伝子を組み込んだ形質転換体）。OD600の減少後、破砕された形質転換体の細胞と細胞破砕片の凝集体が顕微鏡で観察された。なお、野生株では、キシロース添加後も正常な状態の細胞だけが観察された。
【００４２】
2.3. 放出されたポリヒドロキシ酪酸の確認
細胞破砕によるPHBの放出は、ショ糖密度勾配遠心法により確認された。形質転換体を20 g/lのフルクトースを含むM4培地で、定常期になるまで、3本のフラスコを用いて増殖させた。その後、一本目のフラスコには自己破砕を誘導するため8 g/lのキシロースを添加し、二本目のフラスコ中の培養液は、1時間の超音波処理に供した。また、3本目のフラスコ中の培養液は、何の処理も施さなかった。このようにして準備された細胞の自己破砕物、超音波処理により破砕された細胞、または未破砕細胞を含む培養液サンプルを、ズダンブラックBで染色後、ショ糖密度勾配遠心に処した。また、同様に形質転換体を富栄養培地で増殖させたものについても、キシロースを添加して自己破砕を誘導した。富栄養培地ではPHBは蓄積されない。さらに野生株についても20 g/lのフルクトースを添加したM4培地で定常期まで増殖させた後、キシロースを添加した。これらの培養液サンプルについても、ネガティブコントロールとしてズダンブラックBで染色後、ショ糖密度勾配遠心に処した。遠心の結果を図４に示す。自己破砕後のサンプルと超音波処理により破砕されたサンプルを含むもの（それぞれチューブ1、2）では、ズダンブラックBにより染まったPHBのバンドが一番上に見られた。このバンドは、PHBを蓄積していない形質転換体細胞の自己破砕物を含むチューブ3には見られなかった。また、キシロースを添加しない場合は、形質転換体細胞中に蓄積されたPHBは培地中に放出されず、その結果同じ位置にPHBのバンドは見られなかった（チューブ5）。野生株の場合は、キシロースを添加しても、もちろん、細胞中に蓄積されたPHBは放出されなかった（チューブ4）。各チューブの底に見られる黒く染まった層は、主として未破砕細胞または細胞破砕片であった。したがって、ショ糖密度勾配遠心により、形質転換体に組み込まれた自己破砕システムによってPHBが培養液中に放出されることと、細胞破砕片の比重はPHBの比重より大きいことが明確になった。
【００４３】
2.4. ポリヒドロキシ酪酸の生産と基質枯渇に伴う放出
形質転換体によるPHBの生産と基質の枯渇に伴うPHBの放出の様子を、培養時間の経過とともに詳細に解析した。形質転換体と野生株は、20 g/lのグルコースと8 g/lのキシロースを含むM4培地にて増殖させた。結果を図5に示す。ここで、上清中のPHBと沈殿物中のPHBとは、それぞれ培養液中に放出されたPHBと未破砕細胞中のPHBあるいは細胞破砕片に付着しているPHBを意味しており、1 Lの培養液から得られる量として表してある。図5(A)に示す野生株については、PHBは対数増殖期中期に蓄積され始め、グルコースが消費し尽くされた時に、細胞内含率は最高の32％に達した。約2 g/lのPHBが野生株細胞内に蓄積されたが、それらは培地中に放出されることはなかった。
【００４４】
図5(B)に示す形質転換体についても、PHBの生合成は対数増殖期中期に開始され、野生株と同様、最大2 g/lのPHBが細胞内に蓄積された。しかしグルコースが培地中にほとんどなくなった時点で、自己破砕が自発的に誘導され、その15時間後には、細胞の相対破砕効率は超音波破砕と比較して、100％に達した。培養30時間あたりで見られる細胞乾燥物重量の急落は、この溶菌を反映したものである。細胞破砕により、沈殿物中に含まれるPHBの量は減少し、培養上清中に含まれるPHB量は増加した。すなわち、基質枯渇によって誘導された自己破砕の結果、PHBが培養液中に放出されたことが示された。最終的に、細胞内に蓄積されたPHBの約3分の2が培養液中に放出された。
【００４５】
【発明の効果】
本発明は、菌体内に有用物質を蓄積する微生物を用いて有用物質を生産する新規な方法を提供する。この方法は、従来の方法に比べ、低コストで効率的に有用物質を生産することができる。
【００４６】
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> President of Tokyo Institute of Technology
<120> METHOD FOR PRODUCING USEFUL MATERIALS BY USE OF SELF-DESTRUCT MICROORGANISM
<130> P01-050
<160> 2
<170> PatentIn Ver. 2.1
<210> 1
<211> 378
<212> DNA
<213> Bacillus amyloliquefaciens phage
<400> 1
atg aca atg ata gcg tgg atg caa cac ttt ttg gaa acg gac gag aca  48
Met Thr Met Ile Ala Trp Met Gln His Phe Leu Glu Thr Asp Glu Thr
1              5                 10                 15
aag cta atc tac tgg cta aca ttc ctt atg gtt tgt atg gtt gtt gat  96
Lys Leu Ile Tyr Trp Leu Thr Phe Leu Met Val Cys Met Val Val Asp
20                 25                 30
aca gta ctg ggc gtc cta ttt gca aag ctt aac ccg aac att aaa ttt   144
Thr Val Leu Gly Val Leu Phe Ala Lys Leu Asn Pro Asn Ile Lys Phe
35                 40                 45
tcg tca ttc aaa atc aaa aca ggg gta tta att aaa gtt agt gaa atg  192
Ser Ser Phe Lys Ile Lys Thr Gly Val Leu Ile Lys Val Ser Glu Met
50                 55                 60
att cta gcg ttg ttg gct gtt ccg ttc gct gtt cct ttc cct gcg ggt  240
Ile Leu Ala Leu Leu Ala Val Pro Phe Ala Val Pro Phe Pro Ala Gly
65                 70                 75                 80
cta cct cta tta tac acg gtt tat acg gct ttg tgt gta tcg gaa ata  288
Leu Pro Leu Leu Tyr Thr Val Tyr Thr Ala Leu Cys Val Ser Glu Ile
85                 90                 95
tat tct att ttc ggt cat ctg aga tta gtt gat gat aag agt gac ttt  336
Tyr Ser Ile Phe Gly His Leu Arg Leu Val Asp Asp Lys Ser Asp Phe
100                105                110
ctt gaa ata ctt gaa aac ttc ttt aaa cgt aca tcc ggt taa           378
Leu Glu Ile Leu Glu Asn Phe Phe Lys Arg Thr Ser Gly
115                120                125
<210> 2
<211> 125
<212> PRT
<213> Bacillus amyloliquefaciens phage
<400> 2
Met Thr Met Ile Ala Trp Met Gln His Phe Leu Glu Thr Asp Glu Thr
1               5                 10                 15
Lys Leu Ile Tyr Trp Leu Thr Phe Leu Met Val Cys Met Val Val Asp
20                 25                 30
Thr Val Leu Gly Val Leu Phe Ala Lys Leu Asn Pro Asn Ile Lys Phe
35                 40                 45
Ser Ser Phe Lys Ile Lys Thr Gly Val Leu Ile Lys Val Ser Glu Met
50                 55                 60
Ile Leu Ala Leu Leu Ala Val Pro Phe Ala Val Pro Phe Pro Ala Gly
65                 70                 75                 80
Leu Pro Leu Leu Tyr Thr Val Tyr Thr Ala Leu Cys Val Ser Glu Ile
85                 90                 95
Tyr Ser Ile Phe Gly His Leu Arg Leu Val Asp Asp Lys Ser Asp Phe
100                105                110
Leu Glu Ile Leu Glu Asn Phe Phe Lys Arg Thr Ser Gly
115                120                125
【図面の簡単な説明】
【図１】  溶菌遺伝子挿入ベクターであるpXcassetteの構築手順を示す図
【図２】  形質転換体のOD600の経時変化を示す図
【図３】  キシロース添加後のBacillus megateriumの顕微鏡写真
【図４】  形質転換体の細胞破砕物等のショ糖密度勾配遠心の結果を示す写真。
【図５】  野生株及び形質転換体のPHB生産の経時変化を示す図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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