(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
オウレオバシディウム属に属し、下式(I)：
【化１】
0003833352.tif 000010
（式(I)中、ｍ/ｎは２．４以上２．９以下である）
で表され、分子量が１万以上１０００万以下のα−１，３−１，４−グルカン生産能を有する微生物を培地中で培養し、該培養液からα−１，３結合が２以上連続する部位を有さないα−１，３−１，４−グルカンを採取することを特徴とする、前記α−１，３−１，４−グルカンの製造方法。
【請求項２】
微生物が、オウレオバシディウム・プルランスＡＰＷ−１（ＦＥＲＭ Ｐ−１５０９６）である請求項１記載の方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の方法により製造されたα−１，３結合が２以上連続する部位を有さないα−１，３−１，４−グルカンをα−アミラーゼで分解して、Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−Ｄ−グルコースを製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、α−１，３−１，４−グルカン、その製造方法及び前記α−１，３−１，４−グルカンからＯ−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−Ｄ−グルコースを製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、α−１，３−１，４−グルカンとしては、アスペルギルス属に属する微生物アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger ）、ペニシリウム・エクスパンシム（Penicillium expansum）が生産するニゲランが知られている（Reese, E. T. & M. Mandels, Can. J. Microbiol., 10, 103-114(1964), Tung, K. K. & J. H. Nordin, Biochem. Biophys. Res. Commun., 28, 519-524(1967), Bobitt, T. F. & J. H. Nordin, Mycologia, 70, 1201-1211(1978) ）。このグルカンはグルコースがα−１，３−結合とα−１，４−結合で交互に連結されている。しかし、ニゲランは生産菌の菌体内に蓄積するグルカンであるため、グルカンを分離するためには抽出操作を必要とすることや大量に生産することが困難であることから工業的な生産には適していないものであった。
【０００３】
またエルシノエ属に属する微生物を用いた培養法により、マルトトリオースとマルトテトラオースがα−１，３結合しているエルシナン、つまり２個または３個のα−１，４−結合で重合した３糖または４糖をα−１，３−結合で結合させることによって重合しているグルカンも知られているが（Misaki, A., Y. Tsumuraya & S. Takaya, Agr. Bio. Chem., 42, 491-493, Tsumuraya, Y., A. Misaki, S. Takaya & M. Torii, Carbohydr. Res., 66, 53-65(1978)）、工業生産には至っていない。
【０００４】
その他のα−グルカンとしては、α−１，４結合２個で重合した３糖がα−１，６結合によって重合したプルランが知られている（Bender, H., J. Lehmann & K. Wallenfels, Biochim. Biophys. Acta, 36, 309-316(1959) ）。プルランはオウレオバシディウム属に属する微生物から産生し、可食性フィルム、生体に無害で加工の容易な透明の高分子材料、耐酸性・耐アルカリ性の強力な接着剤などとして工業的に生産されている。
一方、これまでにオウレオバシディウムに属する微生物からα−１，３−１，４−グルカンを産生したという報告はない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、新規なα−１，３−１，４−グルカン、該化合物を微生物を用いて製造する方法及びα−１，３−１，４−グルカンからＯ−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−Ｄ−グルコースを製造する方法を提供することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、安全性において問題のないオウレオバシディウム属に属する微生物を用いてα−１，３−１，４−グルカンを製造する方法について鋭意検討を行った結果、オウレオバシディウム属に属する微生物を突然変異処理して得られた変異株を所定の条件下に培養することによりα−１，３−１，４−グルカンが産生すること、さらには得られるα−１，３−１，４−グルカンが新規な構造を有していることを見いだし、本発明を完成するに至ったものである。
【０００７】
また、本発明らは上記方法により得られたα−１，３−１，４−グルカンをα−アミラーゼで分解することにより、３糖のオリゴ糖であるＯ−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−Ｄ−グルコースを製造し得ることを見いだしたものでもある。
すなわち、本発明は、式
【０００８】
【化２】
0003833352.tif 000002
で表される共重合体であって、式(I) 中のｍ／ｎが２．４以上２．９以下であり、分子量が１万以上１０００万以下である前記共重合体である。ここでいう共重合体は、ランダム共重合体およびブロック共重合体の双方を含む。
【０００９】
さらに、本発明はオウレオバシディウム属に属し、α−１，３−１，４−グルカン生産能を有する微生物をを培地中で培養し、該培養液からα−１，３−１，４−グルカンを採取することを特徴とする請求項１記載の共重合体の製造方法である。
さらに、本発明は請求項１記載の共重合体をα−アミラーゼで分解して、Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−Ｄ−グルコースを製造する方法である。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下に本発明を詳細に説明する。
本発明に用いる、オウレオバシディウム（Aureobasidium ）属に属する微生物としては、該微生物を変異させて得られる変異株のうちα−１，３−１，４−グルカン生産能を有する変異株である。
【００１１】
この変異株を得るための親株として用いるオウレオバシディウム（Aureobasidium ）属に属する微生物としては、特に限定しないが、例えばオウレオバシディウム・プルランス（Aureobasidium pullulans ）を用いることができる。そして、その例としてオウレオバシディウム・プルランスATCC9348株、ATCC3092株、ATCC433023株、IFO4466株、IFO6353株あるいはIFO7757株を用いることができる。
【００１２】
突然変異処理としては公知の方法を用いることができるが、ＵＶ照射若しくはγ線照射による方法、または変異剤により化学的処理する方法を用いることが好ましい。変異剤としては公知のもの、例えばニトロソグアニジン、エチジウムブロミド、メタスルホン酸エチルまたは亜硝酸ナトリウムなどが用いられる。
【００１３】
本発明において用いるオウレオバシディウム属に属する微生物の変異株とは、オウレオバシディウム属に属する微生物を突然変異処理して得られる、実質的にメラニン色素を産生せず、α−１，３−１，４−グルカンを生産する変異株をいう。かかる菌株は、オウレオバシディウム属に属する微生物を突然変異処理し、実質的にメラニン色素を産生しない菌株を選別し、その中からα−１，３−１，４−グルカンを生産する変異株を選別することにより得ることができる。この変異株の具体的菌株はとしては、オウレオバシディウム・プルランスＡＰＷ−１が挙げらる。
【００１４】
本発明で使用する菌株の培養に使用する培地は、炭素源、窒素源、リン、カリウム、マグネシウム等の炭素化合物、窒素化合物、無機塩などの必要な栄養成分を適宜含有する液体培地である。炭素源としてはグルコース、スクロース、キシロース、マンノース、フルクトースなどを使用する。窒素源としては硝酸ナトリウム、硝酸アンモニウム、アンモニウムなどを使用し、無機塩としてはリン酸カリウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸鉄などを使用する。
培養は、温度０℃〜６０℃、好ましくは１０℃〜４０℃にて、１〜１０日間、好ましくは２〜５日間、通気下で行う。培養液中の溶存酸素量には特に制限はないが、１０％以上にすることが好ましく、特に１５％以上に保つことがα−１，３−１，４−グルカンの生産量を増加させるうえで好ましい。
【００１５】
本発明の培養においては、培地を攪拌しながら培養を行う。攪拌回転数は菌の生育とグルカンの生産が増大するに従い、増加させる方法を採用するのが好ましい。この方法により溶存酸素量を通常１０％以上に保つことができる。培養液の攪拌翼としては、トルクの大きな攪拌翼を使用することが好ましく、例えば、ヘリカルリボン翼、マックスブレンド翼、フルゾーン翼、アンカー翼などを用いることが好ましい。このような攪拌翼を使用することにより、グルカンの生産に従い培養液の粘度が増加しても攪拌が可能となる。攪拌回転数と通気量を調整することによって溶存酸素濃度を１５％以上に保持して培養を行うこともできる。
【００１６】
本発明においては培養中のｐＨを５．５以下、好ましくは４．０〜５．５の範囲に制御する。より好ましくはｐＨを４．５〜５．０に制御する。本発明の変異株を上記範囲内のｐＨで培養することによりプルランやβ−１，３−１，６−グルカンの生産が著しく抑制されるため、実質的にα−１，３−１，４−グルカンのみが生産される。ｐＨが５．５より大きくなるとプルランやβ−１，３−１，６−グルカンなどの他の生産物が生産されるようになる。またｐＨが４．０より低くなるとα−１，３−１，４−グルカンの生産が減少する。なお、培養中は培地のｐＨの変動を抑えることが好ましく、ｐＨの変動値を好ましくは±０．２以内、より好ましくは±０．１以内に制御する。
【００１７】
培養終了後、遠心分離や濾過などの分離手段を用いて培養液から菌体を除去し、培養上清からα−１，３−１，４−グルカンを採取する。採取方法は特に限定されないが、培養上清に有機溶媒を加えて沈殿させる方法を用いることが好ましい。有機溶媒としては特に制限はないが、例えぱメタノール、エタノール、イソプロパノールなどのアルコール類、アセトンなどのケトン類、アセトニトリルなどのニトリル類等を用いることが好ましい。また培養上清を透析することによってα−１，３−１，４−グルカンのみを含む液体として、溶液状態で使用することや、水分を蒸発乾固することによって固形物として得ることもできる。
【００１８】
本発明の方法により得られるα−１，３−１，４−グルカンは、次式で示される共重合体である。ここでいう共重合体には、ランダム共重合体およびブロック共重合体の双方が含まれる。
【００１９】
【化３】
0003833352.tif 000003
【００２０】
そして、このα−１，３−１，４−グルカンは、α−１，４結合：α−１，３結合の比（すなわち、ｍ：ｎの比）が２．４〜２．９：１、特に２．５〜２．８：１であり、α−１，４結合の比率が大きいという特徴を有しており、新規な化合物である。
そして、このα−１，３−１，４−グルカンは以下の理化学的性質を有する。
１）平均分子量  １万〜１，０００万（ゲル濾過法による測定）
２）比旋光度［α］Ｄ２５＝＋１８０−２６０°（Ｌ＝１，Ｃ＝１．０ in ０．５Ｎ  ＮａＯＨ）
３）13Ｃ−ＮＭＲスペクトル
i)δ値７９ ppm、８３ ppm、１００ ppm付近にシグナルを有する
ii)δ値７９ ppmのシグナル強度が８３ ppmのシグナル強度の２，４〜２．９倍である。
iii)δ値７９ ppmおよび８３ ppmのシグナルが数本に分裂している。
【００２１】
さらに、本発明のα−１，３−１，４−グルカンは、好ましくは、α−１，３結合が２以上連続する部位を有さない。
本発明のα−１，３−１，４−グルカンから調製されたフィルムは従来公知のプルランフィルムやその他の多糖フィルムと比較して耐酸性に優れており、また、このα−１，３−１，４−グルカンは、透明で、生体に無害で、酸素透過率の低い水溶性フィルムの原料として優れた特性を有している。この特性を利用して薬物を小腸まで到達させるための保護フィルムやカプセルとしての用途や食品、化粧品、農業用としての包装フィルムとしての広い範囲での用途が期待される。
また、本発明のα−１，３−１，４−グルカンはα−アミラーゼで分解することにより３糖のオリゴ糖であるＯ−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−０−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−Ｄ−グルコースを製造することができる。この３糖のオリゴ糖は甘味料、機能性食品、医薬品または化粧品などの原材料として有用なオリゴ糖である。
【００２２】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明する。ただし、本発明はこれらに限定されるものではない。
〔実施例１〕
オウレオバシディウム・プルランス（Aureobasidium pullulans ）をポテトデキストロース寒天斜面培地で培養して保存菌株とし、表１に示す組成を有する液体培地Ａ１０mLを試験管に入れたものに接種して、２８℃で一夜培養した。
【００２３】
【表１】
0003833352.tif 000004
【００２４】
該培養液１mLを集菌し、０．２ mol／L 酢酸緩衝液（ｐＨ５．６）１mLで２回洗浄後、０．０４重量％のＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンを含む０．２ mol／L 酢酸緩衝液（ｐＨ５．６）を調製し、該溶液中に３０℃で６０分間静置して突然変異を行った。次に、この変異処理液を集菌し、０．２ mol／L 酢酸緩衝液（ｐＨ５．６）で洗浄した後、寒天培地（表２に示す組成を有する液体培地Ｂに寒天を１．５重量％添加したもの）上に塗布して２８℃で２〜３日間培養後、さらに４〜１０℃の低温中に１〜２日静置した。
【００２５】
【表２】
0003833352.tif 000005
【００２６】
低温に静置するとほとんどの菌株は緑黒色のコロニーを形成するが、無色あるいは着色の少ないコロニーを選択した。この選択したコロニーについて５００mL容の坂口フラスコ中で培地Ａ２００mLを用いて、３０℃、１２０ｒｐｍで４日間振とう培養した後にα−１，３−１，４−グルカン量を次のようにして重量法（および比旋光度法）により測定した。培養液５mLを採取し、１０mLの水を加えてよく攪拌して均一化した後、20,000×ｇでの遠心分離により菌体を除去した培養上清に同量のエタノールを添加することによってグルカンを沈殿させた。該沈殿物をスパチュラでかき集め、あらかじめ重量を測定しておいたマイクロチューブに入れて、凍結遠心濃縮機（東京理科機械製、CVE-200D型）を用いて恒量となるまで乾燥した。こうして得られた沈殿物の重量を測定した。その結果を表３に示す。
【００２７】
【表３】
0003833352.tif 000006
【００２８】
ここで取得した変異株をオウレオバシディウム・プルランスＡＰＷ−１と命名した。そして、この変異株は工業技術院生命工学工業技術研究所（茨城県つくば市東１丁目１番３号）に受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１５０９６として寄託している。
〔実施例２〕
表４に示す組成の培地を調製し、ｐＨ５．０に調整した。
【００２９】
【表４】
0003833352.tif 000007
【００３０】
次に、実施例１で得られた変異株を２〜３白金耳を掻き取り、試験管中に入れた上記培地１０mLに植菌し、２５℃、１２０ｒｐｍで往復振とう培養を３日間行い、さらに５００mL容の坂口フラスコを用いて同様の培地２００mL中に２重量％になるように植菌して３０℃，１２０ｒｐｍで３０時問振とう培養した。次いで、２段のディスクタービン翼付き５Ｌ容小型発酵槽中の同様の培地２．５Ｌに、該フラスコ培養液を１０重量％となるように植菌して、通気量１ｖｖｍ、攪拌回転数を２００ｒｐｍから６００ｒｐｍまで徐々に上げて溶存酸素量を１５％以上に保持し、２８℃で４日間培養した。培養の間、５ mol／L 酢酸、アルカリとして炭酸ナトリウムを用いて、ｐＨを５．０±０．１に調整して培養を行った。
【００３１】
培養後、約１．５Ｌの水を加え、遠心分離機を用いて菌体を取り除いた。次いで、得られた培養上清を、１２０℃、２０分間オートクレーブにより加熱滅菌した。その後、同量のエタノールを加えて室温で数時間攪拌した。得られた沈殿物を遠心分離機にかけて分取し、得られたα−１，３−１，４−グルカンの収量は１５ｇ／Ｌであった。得られたα−１，３−１，４−グルカンのＤＭＳＯ溶液中での13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを図１に示す。
【００３２】
通常グルカンの１位の炭素は、１００〜１０５  ppm に検出され、この結合様式により数 ppmシフトする（α型では１００ ppm付近にβ型では１０３ ppm付近に検出される）。本サンプルの場合、１００ ppm付近に数本のシグナルが観察されていることから、α型のグルコース残基で構成されていることがわかった。７９ ppmおよぴ８３ ppmシグナルは、その特徴的な化学シフトから、それぞれα−１，４結合の４位の炭素、α−１，３結合の３位の炭素に帰属できる。すなわち、本実施例で生産したグルカンの構造は、式（Ｉ）に示したα−１，３−１，４グルカンと推定される。７９ ppmおよぴ８３ ppmシグナル強度から、式（Ｉ）のｍ／ｎの値は平均で２．７５と算出された。７９ ppmおよぴ８３ ppmのシグナルが数本に分裂している理由は、連続するα−１，４結合のユニット数が異なる部位が混在するためと考えられる。つまりα−１，４結合とα−１，３結合の比が２．７５：１であることを示した。
【００３３】
また分子量を以下の条件でのゲル濾過法により測定した。
0003833352.tif 000008
その結果、分子量は約１００万であった。比旋光度［α］Ｄ２５は＋２２０。（Ｌ＝１，Ｃ＝１．６ in ０．５ＮＮａＯＨ）であった。
【００３４】
〔実施例３〕
実施例２で得られたα−１，３−１，４−グルカン５mgに豚の膵臓由来のα−アミラーゼ（Typel A phenylmethylsulfonyl fluoride 処理）を３mg加え、５０mmol／L 酢酸緩衝液（ｐＨ５．８）１．０mL中、２５℃で３０時間分解させた。反応液を減圧下で濃縮乾固し、５０％アセトニトリル水溶液１．５mLを添加して未反応生成物のグルカンを沈殿させて取り除いた。該溶液にさらに９０％アセトニトリル水溶液１．０mLを加えることによって単糖と３糖を分離して薄層クロマトグラフ（ＴＬＣ、薄層：シリカゲル、展開溶媒：８０％アセトニトリル、発色法：２０％硫酸噴霧（加熱発色））で３糖と推定されるスポットを示すサンプルについて、 1Ｈ−ＮＭＲ（ＵＮＩＴＹplus600 型（米国バリアン社製）、６００ＭＨｚ、溶媒：重水／ＤＭＳＯ（20mg/0.6mL）、温度：室温）、２Ｄ−ＴＯＣＳＹ（スピンロック、混合時間：１２０ｍｓ、出力：６ＫＨｚ、観測幅：６０００Ｈｚ、データサイズ：５１２×５１２、繰り返し時間：２ｓｅｃ）およぴＨＳＱＣ with ＰＦＧ（観測幅： 1Ｈ  ４０００Ｈｚ、13Ｃ  １８０００Ｈｚ、データサイズ：５１２×１Ｋ、繰り返し時間：３ｓｅｃ、Ｊ（Ｃ−Ｈ）：１４０Ｈｚ）分析を行った。 1Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図２に示す。
その結果、３糖はα−１，３−結合およぴα−１，４−結合からなる式(II)に示されるオリゴ糖であることがわかった。
また、このサンプルはマススペクトルにより式(II)に示される３糖であることを確認した。
【００３５】
【化４】
0003833352.tif 000009
【００３６】
以上のことから、実施例２で生産したα−１，３−１，４−グルカンからα−アミラーゼ分解によって生じたオリゴ糖は３糖のみであり、その構造も式(II)に示した構造を有するもののみであったことが確認された。これにより、本発明のα−１，３−１，４−グルカンの結合様式においてα−１，３−結合が２個以上連続した箇所はないことが明らかとなった。
【００３７】
【発明の効果】
本発明により、透明で、生体に無害で、酸素透過率の低い水溶性フィルムの原料として有用な新規なα−１，３−１，４−グルカンを提供する。また、この化合物の微生物を用いた製造法を提供する。さらに、この新規なα−１，３−１，４−グルカンを原料として３糖のオリゴ糖であるＯ−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−０−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−Ｄ−グルコースを製造する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【図１】α−１，３−１，４−グルカンの13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図２】α−１，３−１，４−グルカンをα−アミラーゼで分解した生成物の 1Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図１】
0003833352.tif 000011
【図２】
0003833352.tif 000012