(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の特定核酸の配列に相補的な配列を含むインターカレーター性蛍光色素で標識されたプローブを用い、該プローブを試料に添加しその反応液の蛍光強度を温度を変化させながら測定する工程、標的核酸を含まない反応液の蛍光強度を温度を変化させながら測定する工程、及び標的核酸を含む反応液の蛍光強度から標的核酸を含まない反応液の、各温度における蛍光強度を差し引く工程からなることを特徴とする核酸融解温度測定法。
【請求項２】
前記インターカレーター性蛍光色素で標識されたプローブが、試料中の標的核酸と結合し複合体を形成し、複合体を形成していない場合と比較して蛍光特性が変化することを特徴とする請求項１に記載の分析方法。
【請求項３】
前記インターカレーター性蛍光色素が、試料中の標的核酸と結合し複合体を形成した場合、該インターカレーター性蛍光色素が生成した該複合体にインターカレーションする性質を有することを特徴とする請求項１に記載の分析方法。
【請求項４】
前記複合体が、試料中の標的核酸と前記プローブとの相補結合によって形成されたものであることを特徴とする請求項２及び３に記載の分析方法。
【請求項５】
前記試料の特定核酸を測定行程に先立ってポリメレースチェインリアクション（ＰＣＲ）法によって増幅する工程を含む請求項１に記載の分析方法。
【請求項６】
前記試料の特定核酸を測定行程に先立ってＮＡＳＢＡ法によって増幅する工程を含む請求項１に記載の分析方法。
【請求項７】
前記測定工程に先立って、前記試料の特定核酸を鋳型として、ＲＮＡポリメレースのプロモーター配列及びその下流域に前記特定核酸の核酸配列（特定核酸配列）を有する二本鎖ＤＮＡを生成するＤＮＡ生成工程を含む請求項１に記載の分析方法。
【請求項８】
前記ＤＮＡ生成工程に引き続き、該反応液に少なくともＲＮＡポリメレース、リボヌクレオシド三燐酸及び生成されるＲＮＡに相補的な配列を含むインターカレーター性蛍光色素で標識されたプローブを添加し、一定温度において特定核酸配列を有する一本鎖ＲＮＡを生成するＲＮＡ生成工程を含む請求項５、６又は７に記載の分析方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＤＮＡやＲＮＡ等の遺伝子混合中に含まれると予想される特定核酸配列の分析方法に関し、遺伝子診断等の臨床診断分野での利用、並びに未知遺伝子の探索等の分野での利用に有用であり、特に未知遺伝子の対照遺伝子配列に対する相同性を評価する方法、並びに遺伝子の変異を検出する方法として有用である。
【０００２】
【従来の技術】
核酸は、特定の塩基間で相補結合を形成し安定化する性質を有し、その安定性は温度に鋭敏に依存することが知られている。そこで、核酸の融解温度（Ｔｍ）の測定から、未知遺伝子の対照遺伝子に対する核酸配列上の類似性を評価することが可能となる。例えば、遺伝子の同定を行う必要のある分子進化学や細菌学の領域では、生物試料から得られた長い核酸配列を対象にするが、その核酸配列を決定することは実際上容易ではないことから、未知核酸と既知核酸の混合溶液において形成された相補結合複合体の融解温度を測定することによって既知の核酸配列に対する相同性を明らかにすることが行われる。また、遺伝病には特定の核酸配列の一部に変異が生じたことに起因する場合が知られているが、試料中の核酸のその注目する核酸配列に相補的な配列からなるオリゴマー（核酸プローブ）を用い、これと試料中の標的核酸との複合体の融解温度を測定し、その値を対象とする変異のない核酸の場合のそれと比較することによって標的核酸配列中の変異の有無を判定することも行われてきた。
【０００３】
Ｔｍの測定には、核酸の濃色効果（ｈｙｐｅｒｃｈｒｏｍｉｃｉｔｙ）を用いる方法が従来から一般的に行われてきた。核酸は波長２６０ｎｍに分光学的な吸収を有するが、１本鎖核酸から２本鎖核酸を形成するとその割合に応じて吸光度が顕著に減少することから、試料温度を変化させながら吸光度を測定し、得られた吸光度の温度に対するＳ字型の曲線からその中点をＴｍとする。
【０００４】
Ｔｍは、核酸の相補結合を形成する配列の長さ（ｎ）、それに占めるＧ及びＣの割合（％ＧＣ）、溶液中の塩（μ）及び変成剤の濃度（％ＦＡ）に依存していることが知られ、より一般的には、Ｔｍ＝８１．５＋１６．６ｌｏｇ（μ）＋０．４１（％ＧＣ）−５００／ｎ−０．６１（％ＦＡ）なる経験式が得られている。
【０００５】
しかしながら、吸光度の測定からＴｍを求める上記の方法は、試料中の比較的微量の核酸に対しては、有効な手段とは言えない。ひとつには、吸光度測定は、Ｌａｍｂｅｒｔ−Ｂｅｒｒの法則から一般的に２．０ＯＤ以下で測定すべきであるとされ、一方一般的な測定器の性能上の制約から０．１ＯＤ付近が感度の限界とされているからである。これは、核酸の濃度にして、およそ３―１００μｇ／ｍｌの範囲に限定されることを意味する。
【０００６】
近年、ポリメレースチェインリアクション（ＰＣＲ）法が開発されたことにより、試験管内条件下で試料中の特定核酸の特定領域を増幅することが可能となった。そこで、ＰＣＲ法を用いて試料中の特定核酸の特定領域を増幅した後、その反応液を試料として用いることが可能であるが、その場合でも数１０コピーの核酸からはng程度の増幅産物で吸光度を用いた上記の方法を適用するには十分とはいえない。
【０００７】
さらに詳細な熱力学的な検討からは、Ｔｍが核酸の濃度自身にも依存していることも明らかにされている（Breslauer et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 83, 3746-50, 1986 ）。Breslauer らの研究成果によれば、例えば配列atgcatgcatgcatgcatgcの場合、塩濃度５０ｍＭの条件下で、核酸濃度が５０ｎＭ、５ｎＭ、０．５ｎＭ及び０．０５ｎＭのそれぞれに対して融解温度６７．５、６３．５度Ｃ、５９．５度Ｃ及び５５．６度Ｃを与える。
【０００８】
そこで、より感度の良好なＴｍの測定方式が求められる。
【０００９】
例えば従来より、インターカレーター性蛍光色素が２本鎖核酸に配位して蛍光を増感する性質を用いて試料中に低濃度で存在する標的核酸に対しても高感度にＴｍを求める方法が知られている。この方法では、試料溶液にプローブとともにインターカレーター性色素を加え、溶液の温度を変化させながら蛍光強度を測定する。高温では核酸は相互に遊離しているが、溶液の温度を下げるに従い標的核酸とプローブとの複合体が形成され、これに伴い蛍光強度が増大が観測される。しかしながら、この方式では、たとえば試料溶液を降温させながら蛍光を測定する場合、試料中には標的核酸以外の核酸が含まれていること、また本来室温では２本鎖として存在する相補鎖どうしが再会合することや、標的核酸が１本鎖の場合であっても内部に２次構造を形成して安定化することから、それらの相補結合領域にもインターカレーターが配位し、これらに由来するバックグラウウンド蛍光が対象とする核酸とプローブとの複合体の融解温度の正確な決定を阻害することとなる。
【００１０】
そこで、核酸吸着膜を用いたドットハイブリダイゼーション法による融解温度の測定も試みられている。すなわち、核酸を容易に吸着固定することが可能な膜が商業的に流通しているが、この表面に予め蛍光色素やアイソトープを標識したプローブと標的核酸との複合体を含む溶液をスポットし、乾燥した後、膜を所定の塩濃度のバッファーに浸し、温度を変化させては膜を取り出し膜表面に残った標識の蛍光強度あるいは放射活性を測定する。
【００１１】
しかしながら、前記の方法は、操作が煩雑で信頼できる結果を得るには熟練を要する。例えば、より信頼性の高い結果を得る目的では、複合体をスポットした複数の膜を用意し所定温度に恒温したバッファーに所定時間膜を浸した後膜を取り出し蛍光強度あるいは放射活性の測定を行うことが行われるが、これによって操作がさらに煩雑となり労力も伴うことから、特に多数の検体を処理する必要のある臨床検査の現場では新たな課題を生じる。
【００１２】
また、プローブと標的核酸との相補結合を形成させるには、反応液へプローブを添加後、二本鎖ＤＮＡを一旦融解し一本鎖とするための加温操作（デネーチャーリング／denaturing）と、その後冷却してプローブＤＮＡに標的ＤＮＡとの二本鎖ＤＮＡを形成させるための操作( アニーリング／annealing ）も、実際上は不可欠である。さらに、条件の決定や結果の解析において、膜のインキュベーションの過程で複合体そのものの膜からの剥離の可能性にも十分留意する必要もある。
【００１３】
一方、発明者らによって、標的核酸の特定配列に相補的な核酸配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドにインターカレーター性蛍光色素を標識し、特定核酸と相補結合すると形成された二本鎖オリゴヌクレオチドにインターカレーションしその蛍光特性を変化するように設計した、特定の核酸配列の認識機能を具備するインターカレーター性蛍光色素標識プローブが開発された（特願平７−１８５５９９号公報／ＥＰ公開第７１４９８６号公報／Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２４（２４）、４９９２−４９９７（１９９６））参照）。このインターカレーター性蛍光色素標識を既知配列のプローブとして用いれば、プローブが特定核酸と相補結合を形成すると標識されているインターカレーター性蛍光色素の蛍光特性が変化することから、相補結合を形成していないプローブを分離することなく、その相補結合の形成の有無及び形成された相補結合体の定量が可能となる。そこで、該プローブを試料中の特定核酸配列の分析を目的とする融解温度の測定に対して用いる方法が考案されることとなる。
【００１４】
本発明は、以上の観点からなされたものであり、その目的はＤＮＡやＲＮＡ等の遺伝子混合中に含まれる特定核酸配列の分析方法に関し、核酸の融解温度（Ｔｍ）を簡便かつ高精度に決定することを可能とする均一系での一段階の方法であって、遺伝子診断等の臨床診断分野での利用、並びに未知遺伝子の探索等の分野での利用に有用で、未知遺伝子の対照遺伝子配列に対する相同性を評価する方法、並びに遺伝子の変異を検出する方法を提供するところにある。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
而して、かかる目的の実現のためになされた本発明よりなる核酸の融解温度測定法の特徴は、試料中の特定核酸の配列に相補的な配列を含むインターカレーター性蛍光色素で標識されたプローブを試料に添加し、該標識インターカレーター性蛍光色素が標的核酸と相補結合を形成するとその二本鎖オリゴヌクレオチドにインターカレーションし、その蛍光特性が変化することから、その反応液の蛍光強度を温度を変化させながら測定することによって融解温度を決定するところにある。
【００１６】
本発明によれば、プローブが標的核酸と相補結合を形成するとプローブに標識されているインターカレーター性蛍光色素の蛍光強度が増加することから、相補結合に寄与しなかった余剰プローブを分離する工程を必要とせずに、その相補結合の形成の有無の検出及び形成された相補結合体の定量が可能となり、反応液の温度を変えながらその蛍光強度を測定することによって特定の核酸の融解温度を決定することを可能とする均一系での簡便な一段階の分析方法が提供される。
【００１７】
従って、本発明によれば、試料中の標的核酸以外の２本鎖核酸や、本来室温では２本鎖として存在する相補鎖どうしの再会合、ならびに標的核酸が１本鎖の場合でもみられる内部が２次構造が形成される場合においても、インターカレーター標識プローブが標的核酸を配列特異的に識別し標的核酸と複合体を形成することによって蛍光強度を増大することから、試料溶液にプローブとともに単にインターカレーター性色素を添加して溶液の蛍光強度の温度変化を測定する融解温度測定方式におけるバックグラウウンド蛍光に由来する課題を回避することが可能となる。
【００１８】
そこで、試料中の核酸のその注目する核酸配列に相補的な配列からなるインターカレーター標識プローブを用いて試料中の標的核酸との複合体の融解温度を測定すれば、その値を変異のない核酸との複合体の融解温度と比較することによって標的核酸配列中の変異の有無を判定することが可能となる。また、このようにして融解温度が得られれば、これとは逆に、インターカレーター標識プローブを含む試料溶液の蛍光を融解温度近傍で測定しその値を変異のない核酸試料の測定値と比較することによる変異の検出を目的とする簡便な一段階の分析方法も提供される。例えば、Ｃ型肝炎ウイルスにはそのＲＮＡの配列によって複数のタイプがあり、インターフェロンの治療効果がそれらのタイプに依存していることが知られている。このような場合には、特に、その治療計画を立案する上で臨床的に有効な手段を提供することとなる。
【００１９】
また、本発明によれば、複合体の存在を蛍光で検出することから、一般的に、吸光度の測定からＴｍを求める方法に比べて、試料中の比較的微量の核酸に対しても有効な手段を提供することになり、ＰＣＲ法によっても数ng程度の増幅産物しか期待できない標的核酸を数１０コピーしか含まない臨床試料も分析の対象とすることが可能である。
【００２０】
一方、本発明によれば、均一系での分析が可能で相補結合に寄与しなかった余剰プローブを分離する工程を必要としないことから、核酸吸着膜を用いたドットハイブリダイゼーション法による融解温度の測定における、複合体を保持した膜の調製、バッファー中でのインキュベーション、またその後の膜の洗浄等の操作が不要で、操作がより簡便で労力も軽減され、特に短時間に多数の検体の処理が要求される臨床検査の現場での適応も可能となる。
【００２１】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２２】
本発明で使用するプローブは、標的核酸に相補的な核酸配列を含むオリゴヌクレオチドに、二本鎖ＤＮＡにインターカレーションすることによって蛍光特性が変化するインターカレーター性蛍光色素で標識したものである（特願平７−１８５５９９号公報／ＥＰ公開第７１４９８６号公報／Ｎｕｃｌｅｉｃ  ＡｃｉｄＲｅｓｅａｒｃｈ、２４（２４）、４９９２−４９９７（１９９６）参照）。ここで、インターカレーター性蛍光色素としては、二本鎖ＤＮＡにインターカレーションし蛍光特性が変化するものであれば特に制限はないが、インターカレーションにより蛍光強度が増加する性質を有するものが測定の容易性等の点から好ましく、特に蛍光強度の変化の著しいチアゾールオレンジ、オキサゾールイエロー又はそれらの誘導体が好ましい。
【００２３】
インターカレーター性蛍光色素は、共有結合等によってオリゴヌクレオチドへ標識されるが、適当な分子長のリンカーを介して標識されてもよい。リンカーとしては、インターカレーター性蛍光色素が二本鎖ＤＮＡにインターカレーションすることを妨げない分子であれば特に制限はないが、両末端に官能基を有する二官能性炭化水素から選択されるリンカー分子は、オリゴヌクレオチドへの修飾を行う上で簡便で好ましい。また例えば、市販の試薬セット（Ｃ６−Ｔｈｉｏｌｍｏｄｉｆｉｅｒ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製）を使用することもできる。インターカレーター性蛍光色素のオリゴヌクレオチドへの標識部位は、オリゴヌクレオチドの５’末端、３’末端又は中央部分等、インターカレーター性蛍光色素の二本鎖ＤＮＡへのインターカレーションが妨げられず、かつ、オリゴヌクレオチドの標的核酸との相補結合を阻害しない限り、いずれの部位であっても良い。なお、プローブの標的核酸に相補的な塩基配列部分の長さは、標的核酸に対する特異性を担保するため、６―１００ヌクレオチド、特に１０―３０ヌクレオチドとすることが好ましい。
【００２４】
本発明における反応液の蛍光測定には、市販の蛍光分光光度計を用いればよく、反応液にインターカレーターの吸収波長で励起光を照射しその蛍光波長で蛍光強度の測定が可能であれば特に制限はない。反応液の温度を連続的に変えながら蛍光を測定するには、例えば、一旦反応液を完全融解温度に維持した後、反応液を室温に維持された蛍光分光高度計に移し、反応液が室温に向かって徐冷されていく過程にてその温度と蛍光強度を同時に測定すればよい。反応液の温度のモニターには、蛍光測定装置内部に保持された反応液の温度の測定が可能な手段であれば特に制限はない。この目的に、微少な感温端子を有し温度変化を電気信号として遠隔にて記録することが可能な例えば熱伝対等の手段が利用できる。当然のことながら、反応液の温度を希望の温度に維持可能な恒温そうを具備した蛍光光度計を用いることも可能である。
【００２５】
前記した試料は、目的とする特定核酸を含むと予想される試料を意味するが、本発明の実施に先立ち、試料について特定核酸の増幅等を実施することができる。かかる増幅は、特定核酸をとする増幅であれば特に制限はないが、例えば、ポリメレースチェインリアクション（ＰＣＲ）法やＮＡＳＢＡ法（例えばJournal of Virological Methods, 43, 177-188 頁、1993年参照）、特願平９−１０９９６号に示した増幅が特に好ましい。ＮＡＳＢＡ法による増幅を簡単に述べれば、図７に概略を示した通り、試料に２本の標的核酸特異的なプライマーとＡＭＶ逆転写酵素、ＲＮａｓｅＨ、ＲＮＡポリメレースからなる３種の酵素を含む溶液を添加し、一定温度でインキュベーションを行うことで、それらの酵素の協奏的な作用によって標的核酸配列に相補的な配列からなるＲＮＡを指数関数的に増幅するのである。ここで、用いる２本の標的核酸特異的なプライマーの一方は、その上流側にＲＮＡポリメレースのプロモーター配列を、下流側には前記特定核酸に相補的な配列を隣接して有する。このようにして生成されたＲＮＡについて本発明の測定を実施することが例示できる。なお、ポリメレースチェインリアクション（ＰＣＲ）法によって特定核酸を増幅する際に使用するＤＮＡポリメレース等の試薬も、一般に使用される試薬で良い。
【００２６】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を実施例により更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例によって限定されるものではない。
【００２７】
実施例１
本発明の分析法により、標的核酸がDNA とRNA の場合のそれぞれについて融解温度Ｔｍを求めた。
【００２８】
1)(1) インターカレーター性蛍光色素標識プローブ（YO-271）のみ、(2)YO-27  1 および標的DNA （TEMP271 ）、(3)YO-271 および標的RNA （TEMP271-RNA ）を含む反応液１４０μｌを蛍光測定用セルに分注した。ここで、用いた物質及び試薬組成は以下の通りである。
【００２９】
（インターカレーター性蛍光色素標識プローブ）
YO-271：5'-CTCGC＊GGGGGCTG-3' ；
＊はオキサゾールイエロー（YO）の標識位置
（標的DNA ）
TEMP271 ：5'-GTGCCCCCGCGAG-3' ；
HCV cDNA塩基配列番号２２１〜２３３（塩基番号は加藤ら（Kato, N., Hiji    kata, M., Ootsuyama, Y., et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 8    7, 9524-9528）による）を含む。YO-271と３〜１３番目が相補的である。
【００３０】
（標的RNA ）
TEMP271-RNA ：5'-GUGCCCCCGCGAG-3'
（反応液組成）
×１ SSC
1mM EDTA
50nM YO-271
50nM TEMP271あるいはTEMP271-RNA
2)反応液にミネラルオイル１５０μｌを添加した。
【００３１】
3)蛍光測定用セル内の反応液温度をモニターしながら、約８４℃から約２６℃まで序冷した。同時に励起波長４９０nm, 蛍光波長５１０nmで蛍光強度を測定した。
【００３２】
(1)(2)(3) のそれぞれの場合において、８０℃における蛍光強度を１としたときの相対蛍光強度の変化を図１に示した。特定の温度における相対蛍光強度からYO-271のみの相対蛍光強度を差し引いた結果を図２に示した。図２からTm値を読みとった結果( 蛍光によるTm測定結果) を表１に示した。
【００３３】
【表１】
0003785517.tif 000002
【００３４】
以上の通り、DNA-DNA ２本鎖よりDNA-RNA ２本鎖の方がTm値が高くなるという報告と一致する結果が得られた。５０nMという低濃度（２６０nmにおける吸光度測定の場合の１／３０程度）のプローブ・標的核酸を用いて、Tm値を測定することが可能となった。
【００３５】
以上から、本発明によって特定核酸を配列特異的に高感度に検出できることが確認できた。
【００３６】
実施例２
本発明の分析法により、インターカレーター性蛍光色素標識プローブを用いた蛍光測定により、点変異の存在する標的RNA のＴｍ値を調べた。
【００３７】
1)(1) プローブ（YO-271）のみ、(2)YO-271 及び標的核酸RNA （TypeII-RNA）、(3)YO-271 および標的核酸RNA （ Type III -RNA）を含む反応液１４０μｌを蛍光測定用セルに分注した。ここで、用いた物質及び試薬組成は以下の通りである。  （標的核酸DNA ）
TypeII-RNA：5'-GUGCCCCCGCGAG-3' 、HCV 塩基配列番号２２１〜２３３（加藤ら）を含む。YO-271と３〜１３番目が相補的
（標的核酸RNA ）
TypeIII -RNA：5'-GUGCCCCCGCAAG-3' 、 Type II-RNAの配列の１１番目のG が  A に変異
（反応液組成）
40mM Tris ・HCl,pH8.0
25mM KCl
4mM MgCl2
50nM YO-271
50nM Type II-RNAあるいはTypeIII -RNA
2)蛍光測定用セルにミネラルオイル１５０μｌを添加した。
【００３８】
3)蛍光測定用セル内の反応液温度をモニターしながら、約８５℃から約２６℃まで徐冷した。同時に励起波長４９０nm, 蛍光波長５１０nmで蛍光強度を測定した。
【００３９】
(1)(2)(3) のそれぞれの場合において、８０℃における蛍光強度を差し引いた蛍光強度の変化を図３に示した。特定の温度における蛍光強度からYO-271のみの蛍光強度を差し引いた結果を図４に示した。図４からTm値を読みとった結果( 蛍光によるTm測定結果) を表２に示した。
【００４０】
【表２】
0003785517.tif 000003
【００４１】
以上の通り、TypeII-RNAとTypeIII -RNAでTm値に１０℃の差が認められた。以上から、本発明によって、特定核酸配列の一塩基の変異をホモジニアス系で高感度に検出できることが確認できた。
【００４２】
実施例３
本発明のの分析法により、一塩基の変異の有無の判定を行った。
【００４３】
1)(1) プローブ（YO-271）のみ(2) YO-271と標的DNA （TEMP271 及び標的DNA ３〜１３のそれぞれ）を含む反応液１４０μｌを蛍光測定用キュベットに分注した。ここで、用いた物質及び試薬組成は以下の通りである。
【００４４】
（標的DNA ）
HCV cDNA塩基配列番号２２１〜２３３（加藤ら）を含み、YO-271と３〜１３番目が相補的である。
TEMP271 ：5'-GTGCCCCCGCGAG-3'
DNA ３：5'-GTACCCCCGCGAG-3'
DNA ４：5'-GTGACCCCGCGAG-3'
DNA ５：5'-GTGCACCCGCGAG-3'
DNA ６：5'-GTGCCACCGCGAG-3'
DNA ７：5'-GTGCCCACGCGAG-3'
DNA ８：5'-GTGCCCCAGCGAG-3'
DNA ９：5'-GTGCCCCCACGAG-3'
DNA １０：5'-GTGCCCCCGAGAG-3'
DNA １１：5'-GTGCCCCCGCAAG-3'
DNA １２：5'-GTGCCCCCGCGTG-3'
DNA １３：5'-GTGCCCCCGCGAA-3'
（反応液組成）
10mM Tris ・HCl ，pH8.3
50mM KCl
50nM YO-271
50nM TEMP271あるいは標的核酸DNA ３〜１３
2)セル温度３７℃および５１℃において、励起波長４９０nm, 蛍光波長５１０nmの蛍光強度を測定した。
【００４５】
３７℃および５１℃で(1)(2)のそれぞれの場合について蛍光強度を測定し、YO-271のみの蛍光強度を差し引いた値を図５に示した。３７℃での蛍光強度は、変異の位置によって差がみられ、DNA １１では最も低い値を示した。一方、５１℃では、相補的なTEMP271 の場合を除き、蛍光の増加は認められなかった。
【００４６】
本発明によって、位置特異的に一塩基の変異の有無のみならずその位置に関する情報も得られることが確認された。
【００４７】
実施例４
試料中の核酸のその注目する核酸配列に相補的な配列からなるインターカレーター標識プローブを用いて試料中の標的核酸との複合体の融解温度を測定すれば、その値を変異のない核酸との複合体の融解温度と比較することによって標的核酸配列中の変異の有無を判定することが可能となる。また、このようにして融解温度が得られれば、これとは逆に、インターカレーター標識プローブを含む試料溶液の蛍光を融解温度近傍で測定しその値を変異のない核酸試料の測定値と比較することによる変異の検出を目的とする簡便な一段階の分析方法も提供される。
【００４８】
そこで、本願請求項７の分析法を用いて、慢性C 型肝炎患者血清でTypeIII   （岡本ら）血清5 検体、TypeII・TypeIII 重感染血清３検体およびTypeII血清３検体について、 Type IIに相補的な配列を含むプローブを用いて融解温度近傍での蛍光強度の測定からHCV RNA の点変異のホモジニアス検出が可能か調べた。
【００４９】
1)有機溶媒及び蛋白質変性剤を用いる市販の核酸抽出キット（東ソー（株）製）を用いて、血清検体のそれぞれ２００μl より核酸抽出を行った。
【００５０】
2)抽出したRNA 沈殿をサンプル希釈液４０μl に溶解し、このうち１０μl をサンプルとして測定に用いた。
【００５１】
（サンプル希釈液の組成）
10mM Tris ・HCl(pH8.0)
0.1mM EDTA
100 μg/ml酵母RNA
1mM DTT
2U/ μl RNase Inhibitor
3)RTカクテル、5 μl をPCR 用チューブに分注し、調製したサンプルおよび陰性コントロールとして注射用蒸留水10μl を添加した。
【００５２】
（RTカクテルの組成）
30mM Tris ・HCl(pH8.3)
150mM KCl
13.6mM MgCl2
4.3mM dNTPs
3mM DTT
3U/ μl RNase inhibitor
6U/ μl MMLV逆転写酵素
3.6 μM プライマーＲ： 5'-GCACTCGCAAGCACCCTATCA-3'
4)サーマルサイクラーにて逆転写反応を行った。
【００５３】
（逆転写反応条件）
42℃、10分間
99℃、6 分間
5)PCR カクテル、60μl を添加した。
【００５４】
（PCR カクテルの組成）
10mM Tris ・HCl(pH8.3)
50mM KCl
1.6mM MgCl2
0.025 ％ノニデットP-40
37.5U/mlホット・スタート専用Taq DNA ポリメラーゼ
0.3 μM プロモーター・プライマー：
5'-ATTTAGGTGACACTATAGAATACAACACTCCACCATAGATCACTCCCCTG-3'
6)サーマルサイクラーにてPCR を行った。
【００５５】
（PCR 条件）
1) 95 ℃、9 分間
引き続き、以下の2)〜4)より成るサイクルを40サイクル行った。
2) 95 ℃、30秒間
3) 67 ℃、30秒間
4) 72 ℃、1 分間
7)PCR 反応液70μl と転写反応液65.3μl を混合した。
【００５６】
（転写反応液の組成）
75.3mM Tris ・HCl(pH8.0)
15.1mM MgCl2
10.7mM DTT
0.86mM NTPs
4.3mM スペルミジン
2.2U/ μl RNase Inhibitor
53.6nM YO-271
8)３０U ／μｌのSP6 RNA ポリメラーゼを４．７μｌ添加する。
【００５７】
9)37℃にて、30分間反応させた。
【００５８】
10) 転写反応液に２．８μｌの０．５M EDTAを添加した。
【００５９】
11) 転写反応液を蛍光分光光度計内で６５℃に保温した蛍光測定用セルにうつし、励起波長490nm 、蛍光波長510nm において蛍光強度を測定した。
【００６０】
65℃で測定した蛍光強度から陰性コントロールの蛍光強度を差し引いた結果を図６に示した。 Type III に比べ、TypeIIは有意に高い蛍光強度を示した。 Type II・TypeIII 重感染についても、血清中のTypeIIHCV RNA 量が微量であると考えられる１検体を除き高い蛍光強度を示した。
【００６１】
以上の通り、TypeIIに相補的な配列からなる発蛍光プローブによって、TypeIIのHCV RNA のみをホモジニアスに検出することが可能であると結論できた。
【００６２】
インターカレーター標識プローブを含む試料溶液の蛍光を融解温度近傍で測定し、その値を変異のない核酸試料の測定値と比較することによって変異の検出が可能であることが確認できた。
【００６３】
【発明の効果】
以上の説明から明らかなように、本発明によれば、プローブが標的核酸と相補結合を形成するとプローブに標識されているインターカレーター性蛍光色素の蛍光強度が増加することから、相補結合に寄与しなかった余剰プローブを分離する工程を必要とせずに、その相補結合の形成の有無の検出及び形成された相補結合体の定量が可能となり、反応液の温度を変えながらその蛍光強度を測定することによって特定の核酸の融解温度を決定することを可能とする均一系での簡便な一段階の分析方法が提供される。
【００６４】
従って、本発明によれば、インターカレーター標識プローブが標的核酸を配列特異的に識別し標的核酸と複合体を形成することによってその蛍光強度が変化することから、試料中に標的核酸以外の２本鎖核酸や、２次構造を内部に持つ１本鎖の標的核酸が共存する場合においても、これらに由来するバックグラウウンド蛍光に妨害されることなく標的核酸とプローブとの複合体の融解温度の測定が可能となる。
【００６５】
また、試料中の核酸のその注目する核酸配列に相補的な配列からなるインターカレーター標識プローブを用いて試料中の標的核酸との複合体の融解温度を測定すれば、その値を変異のない核酸との複合体の測定結果と比較することによって標的核酸配列中の変異の有無の判定が可能となる。このようにして融解温度が得られれば、これとは逆に、インターカレーター標識プローブを含む試料溶液の蛍光を融解温度近傍で測定しその値を変異のない核酸試料の測定値と比較することによる変異の検出を目的とする簡便な一段階の分析方法も提供される。例えば、Ｃ型肝炎ウイルスにはそのＲＮＡの配列によって複数のタイプがあり、インターフェロンの治療効果がそれらのタイプに依存していることが知られている。このような場合には、特に、その治療計画を立案する上で臨床的に有効な手段を提供することとなる。
【００６６】
また、本発明によれば、複合体の存在を蛍光で検出することから、一般的に、吸光度の測定からＴｍを求める方法に比べて、試料中の比較的微量の核酸に対しても有効な手段を提供することになり、特にＰＣＲ法によっても数ng程度の増幅産物しか期待できない微量の標的核酸しか含まない臨床試料も分析対象とすることが可能である。
【００６７】
一方、本発明によれば、均一系での分析が可能で相補結合に寄与しなかった余剰プローブを分離する工程を必要としないことから、操作がより簡便で労力も軽減され、特に短時間に多数の検体の処理が要求される臨床検査の現場での適応も可能で、さらに自動化も容易である。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、プローブのみ及びプローブと標的核酸の混合液の温度変化に対する蛍光の変化を示す図である。
【図２】図２は、図１に示したプローブと標的核酸の複合体の融解曲線からプローブのみの結果を差し引いた複合体の融解曲線を示す図である。
【図３】図３は、プローブのみ及びプローブと標的核酸の混合液の温度変化に対する蛍光の変化を示す図である。
【図４】図４は、図３に示したプローブと標的核酸の複合体の融解曲線からプローブのみの結果を差し引いた複合体の融解曲線を示す図である。
【図５】図５は、３７℃及び５１℃に蛍光強度と変異の位置との関係を示す図である。
【図６】図６は、臨床サンプルでの６５℃での蛍光強度の測定結果を示す図である。
【図７】図７は、ＮＡＳＢＡ法による核酸増幅を行う場合についてその概略を示すものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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