(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（Ｉ）：
【化１】
0003731618.tif 000008
〔式中、Ｘは−Ｎ（Ｒ3 ）−、メチレン基、酸素原子、又は硫黄原子であり、Ｒ1 及びＲ2 は、同じか又は異なり、それぞれ水素原子、炭素数１〜４のアルキル基、非置換アミノ基、置換されたアミノ基、カルボキシル基、アルコキシ基、シアノ基、ニトロ基又はハロゲン原子であり、Ｒ3 は炭素数１〜４のアルキル基、非置換フェニル基、置換されたフェニル基、ベンジル基、アルコキシカルボニルメチル基、又はアリールオキシカルボニルメチル基である〕で表される化合物又はその塩。
【請求項２】
置換されたフェニル基が、一般式（II）：
【化２】
0003731618.tif 000009
（式中、Ｒ4 、Ｒ5 及びＲ6 は、同じか又は異なり、それぞれ水素原子、炭素数１〜４のアルキル基、非置換アミノ基、置換されたアミノ基、カルボキシル基、アルコキシ基、シアノ基、ニトロ基、ハロゲン原子又はスクシンイミノ基である）で表される基である請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
アリールオキシカルボニルメチル基が、一般式（III)：
【化３】
0003731618.tif 000010
（式中、Ｒ7 、Ｒ8 及びＲ9 は、同じか又は異なり、それぞれ水素原子、炭素数１〜４のアルキル基、非置換アミノ基、置換されたアミノ基、カルボキシル基、アルコキシ基、シアノ基、ニトロ基、ハロゲン原子又はスクシンイミノ基である）で表される基である請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
請求項１に記載の一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩を標識物質として用いることを特徴とする、被検試料中の検査対象物質の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規エポキシ誘導体に関する。本発明による前記エポキシ誘導体は化学発光性物質であるので、そのエポキシ誘導体を標識物質あるいは発光性基質として用いて、例えば被検物質の検出を行うことができる。
【０００２】
【従来の技術】
近年、蛍や海蛍などの生物発光が研究され、酵素ルシフェラーゼがルシフェリンとＡＴＰ（アデノシン三リン酸）の反応を触媒して発光することや、エクオリンという物質がカルシウムイオンと特異的に結合して、発光することが解明された。また、ペルオキシダーゼがルミノール過酸化水素の発光反応を触媒することもよく知られており、最近では合成によって安定化ジオキセタンに燐酸基を導入した基質が作られ、アルカリフォスファターゼの作用によって発光反応が起こることが報告されている。
【０００３】
一方、生物や酵素の働きによらず、化学物質が活性化剤により励起されて発光する反応も研究されており、一般に化学発光と称されている。この中にはアクリジニウムエステルのアルカリ性過酸化水素による発光や、蛍光物質を過シュウ酸によって励起して発光させる反応が知られている。
【０００４】
発光反応の検出は、吸光度測定や蛍光測定に比べ非常に微量な反応でも検出することが可能であり、酵素や発光物質自体をラジオアイソトープの代わりにラベル物質として用い、検体中に含まれる測定対象物質（例えば、抗原、抗体、ＤＮＡなどの生理活性物質等）を高感度に測定しようという試みが従来よりなされてきた。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
測定対象物質を、高感度かつ迅速に測定しようとする場合、ターンオーバーにある程度の時間を必要とする酵素をラベルとして用いて発光性基質の発光を検出する方法よりも、発光性物質それ自体をラベルとして使用し、励起剤によって発光させて検出する方法の方が有利であると思われる。
化学発光を起こす物質としては、例えば、安定化ジオキセタンが知られている。この物質は酸素分子を含み、不安定で高エネルギーをもつ四員環構造のジオキセタンを励起エネルギーとし、同じ化合物内に含まれる蛍光物質を励起して発光させることができる。ジオキセタンは非常に不安定で試薬として用いることはできないと思われていたが、アダマンタンとの複合体である安定化ジオキセタン、すなわちアダマンチリデンアダマンタン−１，２−ジオキセタンが、２５℃において半減期２０年以上の安定物質であることが判明して以来、この物質を標識物質として利用する方法が検討されてきた。しかしながら、この物質を発光させるためには１５０〜２５０℃の加熱が必要であり、更に、この物質のアダマンタン部分は非常に蛍光強度の弱い物質であったため、水性溶媒中の測定対象物質を検出するラベルとしては不適当であった。
【０００６】
前記の改良として、シャープ等は４−（ヒドロキシ−２−ナフチル）−４−メトキシスピロ（１，２−ジオキセタン−３，２’−アダマンタノン）を合成し、更に、アダマンタノンとジオキセタンにキサンテンやフルオレイン等が結合した化合物も合成して、安定性及び発光強度の検討を行った（特公平３−５０５７３９号公報）。これらの化合物では、安定性が保たれ、酵素による脱リン酸化を引き金とした発光反応も認められたものの、発光強度が弱いために、酵素をラベルとした測定系で基質として使用する方法にのみ用途が限定されていた。
【０００７】
安定なジオキセタン化合物は、それを励起させて発光させるのに大きなエネルギーを必要とするため、常温、わずかな加温下又は冷却下での測定などの通常の使用には不向きである。一方、小さなエネルギーで発光する化合物は安定性に欠ける。
こうした問題点の一つの解決策として、ウッドヘッド等はＮ−メチルアクリジニウム−９−カルボキシレートのフェニルエステルにアルカリ性過酸化水素を加えると、ジオキセタンを経由して発光反応が起こることを示し、更に、フェニルエステル部分にタンパク質結合性架橋剤を組み込みラベルとして用いることができることも示した（ＧＢ２１１２７７９号明細書）。しかし、この化合物も、発光収率は１％程度であった。従って、標識物質としては、より安定で、発光時には強い発光を示す物質が望まれていた。
【０００８】
一方、マックカップラ等はＤＮＡを検出する際に、ピレン等の色素を標識物質とし、この物質に紫外線照射することによって溶存酸素から生じる一重項酸素を利用して、９−（アダマンチリデン）−Ｎ−メチルアクリダンにジオキセタンを生じさせ、その熱分解時に発する発光を検出する方法を開発した（ＥＰ公開０３４５７７６号公報）。この方法は、９−（アダマンチリデン）−Ｎ−メチルアクリダンのメチルアクリダン部分は蛍光強度が強いため、発光物質の出発材料として用いるのには適しているが、実際に９−（アダマンチリデン）−Ｎ−メチルアクリダンにジオキセタン部分を導入すると、安定性に欠け、単離物として取り出すことができなかったため、反応溶液中で中間体として生成させ、不安定なまま利用した方法である。
【０００９】
このように、ジオキセタンをアダマンタン等のバルキーな物質で安定化してエネルギー源として利用する方法、エステル結合部分をアルカリ性過酸化水素で励起し、このエネルギーで発光反応を起こす方法、紫外線で励起状態を作り出し、そのエネルギーで発光反応を起こす方法などが報告されてきたが、通常は安定で、発光反応時に全てのエネルギーが発光反応に利用され、強い光を生む系が望まれている。
従って、本発明の目的は、安定性に優れ、且つ容易に発光反応を起こすことができる新規な発光性物質を提供することにある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
前記の目的は、本発明による新親エポキシ誘導体によって達成することができる。即ち、本発明は、一般式（Ｉ）：
【化４】
0003731618.tif 000002
〔式中、Ｘは−Ｎ（Ｒ3 ）−、メチレン基（−ＣＨ2 −）、酸素原子（−Ｏ−）、又は硫黄原子（−Ｓ−）であり、Ｒ1 及びＲ2 は、同じか又は異なり、それぞれ水素原子、炭素数１〜４のアルキル基、非置換アミノ基、置換されたアミノ基、カルボキシル基、アルコキシ基、シアノ基、ニトロ基又はハロゲン原子であり、Ｒ3 は炭素数１〜４のアルキル基、非置換フェニル基、置換されたフェニル基、ベンジル基、アルコキシカルボニルメチル基、又はアリールオキシカルボニルメチル基である〕で表される化合物又はその塩に関する。
【００１１】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本明細書において「炭素数１〜４のアルキル基」は、直鎖状若しくは分枝状のアルキル基であり、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｉ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｉ−ブチル基、ｓ−ブチル基、又はｔ−ブチル基である。本明細書において「非置換アミノ基」は、−ＮＨ2 基である。「置換されたアミノ基」は、例えば、低級アルキル基、特には炭素数１〜４のアルキル基でモノ−若しくはジ−置換されたアミノ基であり、例えば、モノ若しくはジメチルアミノ基、モノ若しくはジエチルアミノ基、メチルエチルアミノ基、又はモノ若しくはジベンジルアミノ基を挙げることができる。
「アルコキシ基」は、例えば、炭素数１〜４のアルコシキ基、例えば、メトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロポキシ基、ｉ−プロポキシ基、ｎ−ブトキシ基、ｉ−ブトキシ基、ｓ−ブトキシ基、又はｔ−ブトキシ基である。「ハロゲン原子」は、例えば、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、又はフッ素原子である。
【００１２】
「置換フェニル基」は特に限定されないが、炭素数１〜４のアルキル基、非置換アミノ基、置換されたアミノ基、カルボキシル基、アルコキシ基、シアノ基、ニトロ基、ハロゲン原子及びスクシンイミノ基からなる群から選んだ同一若しくは異なる置換基１〜５個、好ましくは１〜３個を担持していることができる。従って、置換フェニル基は、例えば、一般式（II）：
【化５】
0003731618.tif 000003
（式中、Ｒ4 、Ｒ5 及びＲ6 は、同じか又は異なり、それぞれ水素原子、炭素数１〜４のアルキル基、非置換アミノ基、置換されたアミノ基、カルボキシル基、アルコキシ基、シアノ基、ニトロ基、ハロゲン原子又はスクシンイミノ基である）で表される基であることができる。
【００１３】
「アルコキシカルボニルメチル基」は、例えば、炭素数１〜４のアルコキシ部分を有するカルボニルメチル基であり、例えば、メトキシカルボニルメチル基、又はエトキシカルボニルメチル基を挙げることができる。また、「アリールオキシカルボニルメチル基」は、例えば、場合により１又はそれ以上の置換基を担持することのある炭素数６〜１８のアリール部分を有するアリールオキシカルボニルメチル基である。好ましいアリールオキシカルボニルメチル基は、例えば、一般式（III)：
【化６】
0003731618.tif 000004
（式中、Ｒ7 、Ｒ8 及びＲ9 は、同じか又は異なり、それぞれ水素原子、炭素数１〜４のアルキル基、非置換アミノ基、置換されたアミノ基、カルボキシル基、アルコキシ基、シアノ基、ニトロ基、ハロゲン原子又はスクシンイミノ基である）で表される基である。
【００１４】
前記一般式（Ｉ）で表される新規エポキシ誘導体において、Ｘが−Ｎ（Ｒ3 ）−、メチレン基、酸素原子、又は硫黄原子であり、Ｒ1 及びＲ2 が、同じか又は異なり、それぞれ水素原子又は炭素数１〜４のアルキル基であり、Ｒ3 が炭素数１〜４のアルキル基、非置換フェニル基、置換されたフェニル基、ベンジル基、アルコキシ部分の炭素数が１〜４のアルコキシカルボニルメチル基、又はフェニルオキシカルボニルメチル基である前記一般式（Ｉ）で表されるエポキシ誘導体又はその塩が好ましい。
【００１５】
前記一般式（Ｉ）で表される新規エポキシ誘導体において、Ｘが−Ｎ（Ｒ3 ）−、メチレン基、酸素原子、又は硫黄原子であり、Ｒ1 及びＲ2 が水素原子であり、Ｒ3 がメチル基、非置換フェニル基、ベンジル基、又はエトキシカルボニルメチル基である前記一般式（Ｉ）で表されるエポキシ誘導体又はその塩が特に好ましい。
【００１６】
前記一般式（Ｉ）で表わされるエポキシ誘導体がカルボキシル基又はアミノ基を有する場合には、前記エポキシ誘導体は塩を形成することができ、それらの塩も本発明の化合物に含まれる。カルボン酸塩としては、例えば、アルカリ金属（例えば、ナトリウム又はカリウム）の塩を挙げることができ、アミノ基の塩としては、例えば、酸付加塩、例えば、塩酸塩、硫酸塩、各種スルホン酸塩、シュウ酸塩、又は過塩素酸塩を挙げることができる
【００１７】
本発明による前記一般式（Ｉ）で表わされるエポキシ誘導体は、それ自体公知の方法によって調製することができる。
調製方法の１例を、工程図によって図１に示す。すなわち、ケトン類（１）とアダマンタノンとを、例えば、無水三塩化チタンアルミニウム還元型と水素化アルミニウムリチウムによる還元的縮合反応によりオレフィン体（２）へ誘導する。続いて、得られたオレフィン体（２）を、例えば、塩化メチレン中でｍ−クロロ過安息香酸を用い、常温で短時間反応させると、目的のエポキシ誘導体（Ｉ）を得ることができる。
【００１８】
前記の工程において原料として用いるケトン類（１）は、公知化合物であり、それ自体公知の方法により調製することができる。例えば、Ｒ1 及びＲ2 が水素原子であり、Ｘが−Ｎ−ＣＨ3 であるケトン化合物（１ａ）〔すなわち、１０−メチル−９（１０Ｈ）−アクリドン〕、並びにＲ1 及びＲ2 が水素原子であり、Ｘが−Ｎ−ＣＨ2 Ｃ6 Ｈ5 であるケトン化合物（１ｂ）〔すなわち、１０−フェニルメチル−９（１０Ｈ）−アクリドン〕は、西らの文献（Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊｐｎ．，５４，１８９８，１９８１年）とＪ．Ｊ．Ｃｈａｒｂｉｔらの文献（Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｅｎｇ．Ｄａｔａ，３４，１３６，１９８９年）に従って合成することができる。また、Ｒ1 及びＲ2 が水素原子であり、Ｘが−Ｎ−ＣＨ2 ＣＯ2 Ｃ2 Ｈ5 であるケトン化合物（１ｃ）〔すなわち、９−オキン−１０（９Ｈ）−アクリジン酢酸エチル〕は、Ｎ．Ｍｉｏｓｇａらの文献（Ｐｈａｍａｚｉｅ，４０，８００，１９８５年）と、Ｉ．Ｄ．Ｐｏｓｔｅｓｃｕらの文献（Ｊ．Ｐｒａｋｔ．Ｃｈｅｍｉｅ．，３１９，３４７，１９７７年）に従って合成することができる。更に、Ｒ1 及びＲ2 が水素原子であり、Ｘが−Ｎ−ＣＨ2 Ｃ6 Ｈ5 であるケトン化合物（１ｄ）〔すなわち、１０−フェニル−９（１０Ｈ）−アクリドン〕は、Ｍｉｔｔｅｉｌｕｎｇらの文献（Ｂｅｒ，３９，１６９１，１９０６年）に従って合成することができる。
【００１９】
前記一般式（Ｉ）で表される本発明のエポキシ誘導体は、発光性物質であり、しかも従来のアクリジン誘導体等と比較して、中性付近の水溶液中での保存安定性が格段に優れている。例えば、従来技術の代表的発光アクリジン誘導体である９−フェノキシカルボニル−１０−メチルアクリジニウムフルオロスルホネート（ＰＭＡ）の中性水溶液中での保存安定性は、１ヶ月で約８０％発光量が低下するのに対し、本発明のエポキシ誘導体、例えば、１０−メチルジスピロ〔アクリジン−９（１０Ｈ），２’−オキシラン−３’，２”−トリシクロ（３．３．１．１３，７）デカン〕（Ｉａ）は、中性水溶液中に１ヶ月保存しても、ほとんど発光量の低下はみられなかった。
【００２０】
本発明のエポキシ誘導体は、検体中の特定物質を検出する従来公知のあらゆる分析手段において、発光標識物質として用いることができる。特に、生体試料中に含まれる微量の生理活性物質を免疫学的に、あるいは核酸の親和性を利用し、又はクロマトグラフィーを利用して測定する方法、酵素免疫学的、分子生物学的に測定する方法や装置、あるいはキット等に利用するのが好ましい。例えば、サンドイッチ法と呼ばれる免疫学的測定に利用する場合には、まず、ポリエチレンなどの不溶性担体に固定化した特定物質に対する抗体に、試料を接触させることで試料中に含まれる特定物質は、抗体との親和力により上記不溶性担体上に結合する。次に、特定物質に対する抗体（モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体）に本発明新規発光物質を従来公知の手段（例えば、物理吸着法あるいは化学的結合）で担持した標識抗体を、前記の不溶性担体に接触させる。この操作により標識抗体は、不溶性担体上に結合している特定物質の量に相関した分だけ不溶性担体上に結合する。次に、不溶性担体上に結合していない過剰の標識抗体を洗浄操作等により分離してから化学発光測定を行う。
【００２１】
本発明のエポキシ誘導体は、アルカリ性過酸化水素の添加により強く発光することができる。従って、化学発光を誘発する試薬としては、通常、水酸化ナトリウムや水酸化カリウム等のアルカリ水溶液に、過酸化水素等の過酸化物を混合した物を使用することができる。このような化学発光を誘発する試薬を、先の不溶性担体上に結合している標識抗体に接触させ、本発明の新規発光物質を化学反応により発光させることができる。この時の発光強度は、試料中の特定物質濃度に相関しているので、発光強度をフォトンカウンター等により測定することで、試料中の特定物質濃度を求めることができる。
更に本発明によれば、前記抗体を用いた免疫学的検出法だけではなく、核酸に対しても、その核酸と相補的な核酸との親和性を利用し、目的の核酸を検出することができる。
【００２２】
また、本発明者が見出したところによれば、本発明のエポキシ誘導体の発光強度を増加することのできる特定の化合物が存在し、反応の要素であるアルカリ性過酸化水素に、トリフルオロ酢酸やトリエチルアミン等を加えると発光量が増加する現象がみられる。
【００２３】
特定物質が含まれる被検試料としては、血液、血清、血漿、尿、唾液、髄液等の生体液や、細胞及び組織抽出物を挙げることができ、特定物質としては、各種タンパク質、多糖類、脂質、核酸等が挙げられ、より具体的には、フィブリノーゲン、アルブミン、ＣＲＰ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ等の蛋白、ＡＦＰ、ＣＥＡ等の腫瘍関連蛋白、Ｂ型肝炎ウイルス関連蛋白やその抗体、Ｃ型肝炎ウイルス関連蛋白やその抗体、ＨＩＶ抗原や抗体、ＨＴＬＶ抗体等の感染症関連マーカー、Ｄダイマー、ＰＰＩ、ＴＡＴ等の凝固関連マーカー、インシュリン、ＨＣＧ、サイロキシン等のホルモンや、抗てんかん薬及びジゴキシン等の薬剤を挙げることができる。
また、特定物質が核酸であれば特定の塩基配列を有するＤＮＡ断片などが挙げられる。
【００２４】
【実施例】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。また、以下の実施例において、融点は、柳本微量融点測定装置を用いて測定し、全て未補正である。赤外線吸収（ＩＲ）スペクトルは、日本分光ＦＴ／ＩＲ−２００型赤外線光度系を用いて測定した。また、 1Ｈ−ＮＭＲスペクトルは、バリアンＶＸＲ−２００型（２００ＭＨｚ）を用い、内部標準にテトラメチルシランを用いて測定した。シリカゲルクロマトグラフィーは、Ｅ．Ｍｅｒｃ  Ｋｉｅｓｅｌ  ６０（７０〜２３０メッシュ）を用いた。
【００２５】
更に、以下の実施例及び参考例などにおいて、出発材料であるケトン化合物〔図１の化合物（１）〕、中間体であるオレフィン誘導体〔図１の化合物（２）〕及び最終生成物〔図１の化合物（Ｉ）〕における置換基Ｒ1 、Ｒ2 、及びＸが共通の化合物群を、説明の便宜のために以下の（ａ）〜（ｇ）に分けて表記する。従って、例えば、以下の（ａ）に属する出発材料（１）はケトン化合物（１ａ）、中間体（２）はオレフィン誘導体（２ａ）、そして最終生成物は、エポキシ誘導体（Ｉａ）となる。
（ａ）：Ｒ1 ＝Ｒ2 ＝Ｈ，Ｘ＝Ｎ−ＣＨ3
（ｂ）：Ｒ1 ＝Ｒ2 ＝Ｈ，Ｘ＝Ｎ−ＣＨ2 Ｃ6 Ｈ5
（ｃ）：Ｒ1 ＝Ｒ2 ＝Ｈ，Ｘ＝Ｎ−ＣＨ2 ＣＯ2 Ｃ2 Ｈ5
（ｄ）：Ｒ1 ＝Ｒ2 ＝Ｈ，Ｘ＝Ｎ−Ｃ6 Ｈ5
（ｅ）：Ｒ1 ＝Ｒ2 ＝Ｈ，Ｘ＝ＣＨ2
（ｆ）：Ｒ1 ＝Ｒ2 ＝Ｈ，Ｘ＝Ｓ
（ｇ）：Ｒ1 ＝Ｒ2 ＝Ｈ，Ｘ＝Ｏ
【００２６】
参考例１：出発材料（２ａ）〜（２ｇ）の調製
〔１〕９，１０−ジヒドロ−１０−メチル−９−（トリシクロ〔３．３．１．１3,7 〕デシリデン）アクリジン（２ａ）の合成
無水三塩化チタンアルミニウム還元型３ｇ（１５ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）１２０ｍｌ中に懸濁し、氷冷下で水素化アルミニウムリチウム０．２０ｇ（７．６ｍｍｏｌ）を加えて１０分間撹拌した後、トリエチルアミン１．１ｍｌ（７．６ｍｍｏｌ）を加えた。この反応液を９０分間加熱還流した後、Ｎ−メチル体（１ａ）０．５ｇ（２．４ｍｍｏｌ）と２−アダマンタノン０．３６ｇ（２．４ｍｍｏｌ）とを含む３０ｍｌの無水ＴＨＦ溶液を滴下し、更に還流を３９時間行った。反応混合物を室温にもどし、氷冷下で、氷水６０ｍｌを少量ずつ加えた後、酢酸エチルにより抽出を３回行った。有機層を水及び飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を留去した後、酢酸エチル／へキサン〔１：１０（ｖ／ｖ）〕の混合溶媒を用いたシリカゲルクロマトグラフィーで残渣を精製し、オレフィン体（２ａ）０．４９ｇ（１．５ｍｍｏｌ、収率６３％）を無色結晶として得た。物性値は以下のとおりであった。
融点：２５６〜２５７℃（酢酸エチル）
ＩＲ  γ（ＫＢｒ）：２９０８，２８４７，２３５８，１５８９，１４６１，１３３９，１２６９，１１２９，１０９８，１０４２ｃｍ-1
ＵＶ  λmax CH3 CNｎｍ（ｌｏｇ  ε）：３４０（３．７８），２８７（４．０１），２６１（４．１６），２２６（４．４６）
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3 ）δ：１．５３−２．２２（１２Ｈ，ｍ），３．４１（３Ｈ，ｓ），６．９８（４Ｈ，ｔｄ，Ｊ＝８，２Ｈｚ），７．１５−７．２６（４Ｈ，ｍ）
元素分析：Ｃ24Ｈ25Ｎ（分子量＝３２７．４７）に対して：
計算値：Ｃ＝８８．０３；Ｈ＝７．６９；Ｎ＝４．２８
実測値：Ｃ＝８７．９３；Ｈ＝７．６５；Ｎ＝４．２８
【００２７】
〔２〕９，１０−ジヒドロ−１０−ペンジル−９−（トリシクロ〔３．３．１．１3,7 〕デシリデン）アクリジン（２ｂ）の合成
上記〔１〕で得た生成物の１０−メチル基の代わりに、１０位にベンジル基を有する９，１０−ジヒドロ−１０−ベンジル−９−（トリシクロ〔３．３．１．１3,7 〕デシリデン）アクリジン（２ｂ）は、対応するケトン体（１ｂ）を出発材料として用い、上記〔１〕と同様な操作を実施し、以下の物性値をもつ無色結晶として収率３５％で得ることができた。
融点：２１８〜２１９．５℃（酢酸エチル）
ＩＲ  γ（ＫＢｒ）：３０２６，２９０５，２８４６，１７１８，１５８９，１４９１，１４５８，１３７１，１２６６，１２２５，１０９８，１０６３ｃｍ-1ＵＶ  λmax CH3 CNｎｍ（ｌｏｇ  ε）：３４１（３．９３），２９３（４．０１），２５８（４．２３），２２６（４．６１）
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3 ）δ：１．５３−２．２２（１２Ｈ，ｍ），３．４３−３．４９（２Ｈ，ｍ），５．２３（２Ｈ，ｍ），６．８３（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８，２Ｈｚ），７．０３（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８，２Ｈｚ），７．１５−７．２７（９Ｈ，ｍ）
元素分析：Ｃ30Ｈ29Ｎ（分子量＝４０３．５７）に対して：
計算値：Ｃ＝８９．２９；Ｈ＝７．２４；Ｎ＝３．４７
実測値：Ｃ＝８９．３１；Ｈ＝７．３２；Ｎ＝３．４６
【００２８】
〔３〕９，１０−ジヒドロ−９−（トリシクロ〔３．３．１．１3,7 〕デシリデン）−１０−アクリジン酢酸エチル（２ｃ）の合成
同様に、９，１０−ジヒドロ−９−（トリシクロ〔３．３．１．１3,7 〕デシリデン）−１０−アクリジン酢酸エチル（２ｃ）も、対応するケトン体（１ｃ）を原料として用い、上記〔１〕と同様な操作を実施し、以下の物性値をもつ無色結晶として６３％の収率で得ることができた。
融点：２１６〜２１７℃（酢酸エチル）
ＩＲ  γ（ＫＢｒ）：２９０７，２８４７，１７５１，１５９１，１４５８，１３６８，１１８８，１０９８，１０２４ｃｍ-1
ＵＶ  λmax CH3 CNｎｍ（ｌｏｇ  ε）：３３４（３．９０），２８６（３．９９），２５８（４．２０），２２５（４．５５）
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3 ）δ：１．２７−２．２２（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ），１．５５−２．２１（１２Ｈ，ｍ），３．４１−３．４４（２Ｈ，ｍ），４．６４（２Ｈ，ｓ），６．７７（２Ｈ，ｔｄ，Ｊ＝８，１Ｈｚ），６．９８（２Ｈ，ｔｄ，Ｊ＝１０，１Ｈｚ），７．１１−７．２７（４Ｈ，ｍ），
元素分析：Ｃ25Ｈ29ＮＯ2 （分子量＝３９９．５３）に対して：
計算値：Ｃ＝８１．１７；Ｈ＝７．３２；Ｎ＝３．５１
実測値：Ｃ＝８０．８２；Ｈ＝７．３６；Ｎ＝３．４７
【００２９】
〔４〕９，１０−ジヒドロ−９−フェニル−９−（トリシクロ〔３．３．１．１3,7 〕デシリデン）アクリジン（２ｄ）の合成
同様に、１０位にフェニル基を有する９，１０−ジヒドロ−９−フェニル−９−（トリシクロ〔３．３．１．１3,7 〕デシリデン）アクリジン（２ｄ）も、対応するケトン体（１ｄ）を原料として用い、上記〔１〕と同様な操作を実施し、以下の物性値をもつ無色結晶として５１％の収率で得ることができた。
融点：２４５〜２５５．５℃（酢酸エチル）
ＩＲ  γ（ＫＢｒ）：２９０６，２８４５，１５８８，１５５９，１５４０，１５０７，１４９０，１４６６，１４５１，１２７８，１０９８ｃｍ-1
ＵＶ  λmax CH3 CNｎｍ（ｌｏｇ  ε）：３４０（４．００），２８６（４．１８），２５６（４．３２），２２８（４．６７）
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3 ）δ：１．８３−２．０７（１２Ｈ，ｍ），３．４８−３．５１（２Ｈ，ｍ），６．４５（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８，２Ｈｚ），６．９７（４Ｈ，ｍ），７．２６（２Ｈ，ｍ），７．３８（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝７，２Ｈｚ），７．４９−７．６２（３Ｈ，ｍ）
元素分折：Ｃ29Ｈ27Ｎ（分子量＝３８９．５４）に対して：
計算値：Ｃ＝８９．４２；Ｈ＝６．９９；Ｎ＝３．６０
実測値：Ｃ＝８９．３１；Ｈ＝７．２４；Ｎ＝３．６２
【００３０】
〔５〕９−トリシクロ〔３．３．１．１3,7 〕デシリデン−９，１０−ジヒドロアントラセン（２ｅ）の合成
また、基本骨格の異なる９−トリシクロ〔３．３．１．１3,7 〕デシリデン−９，１０−ジヒドロアントラセン（２ｅ）についても、対応するケトン体（１ｅ）から上記〔１〕と同様な操作を実施し、４４％の収率で無色結晶として得ることができた。その物性値を以下に示す。
融点：２３２〜２３３．５℃（酢酸エチル）
ＩＲ  γ（ＫＢｒ）：３０６０，３０１２，２９７６，２８４５，１６３２，１４６６，１４５１，１４１９，１２２４，１１０７，１０３５ｃｍ-1
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3 ）δ：１．５７−２．２３（１２Ｈ，ｍ），３．４３（２Ｈ，ｓ），３．７６（２Ｈ，ｅａｃｈ，Ｊ＝１８Ｈｚ），７．０９−７．１９（４Ｈ，ｍ），７．２６（４Ｈ，ｍ）
元素分析：Ｃ24Ｈ24（分子量＝３１２．４５）に対して：
計算値：Ｃ＝９２．２６；Ｈ＝７．７４
実測値：Ｃ＝９２．２２；Ｈ＝７．７８
【００３１】
〔６〕９−トリシクロ〔３．３．１．１3,7 〕デシリデン−９Ｈ−チオキサンテン（２ｆ）の合成
更に、９−トリシクロ〔３．３．１．１3,7 〕デシリデン−９Ｈ−チオキサンテン（２ｆ）についても、対応するケトン体（１ｆ）から上記〔１〕と同様な操作を実施し、収率３２％で無色結晶として得ることができた。その物性値を以下に示す。
融点：２２０〜２２２．５℃（酢酸エチル）
ＩＲ  γ（ＫＢｒ）：３０５６，２９７０，２９１１，２８４５，１６３６，１４５５，１４３６，１３２６，１０６１，１０２９ｃｍ-1
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3 ）δ：１．５０−２．２０（１２Ｈ，ｍ），３．４３（２Ｈ，ｓ），３．２０−３．３６（２Ｈ，ｍ），７．４７（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝７，ＩＨｚ）
〔７〕９−トリシクロ〔３．３．１．１3,7 〕デシリデン−９Ｈ−キサンテン（２ｇ）の合成
また、９−トリシクロ〔３．３．１．１3,7 〕デシリデン−９Ｈ−キサンテン（２ｇ）についても、対応するケトン体（１ｇ）から同様な操作を実施し、収率７８％で無色結晶として得ることができた。その物性値を以下に示す。
融点：２２０〜２２１．５℃（酢酸エチル）
ＩＲ  γ（ＫＢｒ）：２９８１，２９１１，２８４４，１５８０，１５６６，１４７１，１４４５，１３４２，１３０３，１２５２，１２０２，１１５０ｃｍ-1 1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3 ）δ：１．８８−２．０５（１２Ｈ，ｍ），３．４７−３．５３（２Ｈ，ｍ），７．０５−７．２９（２Ｈ，ｍ）
元素分析：Ｃ23Ｈ22Ｏ（分子量＝３１４．４３）に対して：
計算値：Ｃ＝８７．８６；Ｈ＝７．０５
実測値：Ｃ＝８７．７６；Ｈ＝７．０９
【００３２】
実施例１：１０−メチルジスピロ〔アクリジン−９（１０Ｈ），２’−オキシラン−３’，２”−トリシクロ〔３．３．１．１3,7 〕デカン〕（Ｉａ）の合成
前記参考例１〔１〕で得たオレフィン体（２ａ）（５００ｍｇ，１．５ｍｏｌ）の塩化メチレン（２．０ｍｏｌ）溶液に、３−クロロ過安息香酸（６５０ｍｇ，１６８ｍｍｏｌ）を室温で加え、約１０分間撹拌した。薄層クロマトグラフィーにより原料の消失を確認した後、飽和重曹水を加え、過剰の３−クロロ安息香酸を分解した。続いて、ジクロロメタンにより３回抽出を行った。有機層を水及び飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。
溶媒を蒸留した後、残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（酢酸エチル：へキサン＝１：１０）で精製し、エポキシ体（Ｉａ）（４７０ｍｇ，１．４ｍｍｏｌ，８９％）を無色結晶として得た。物性値は以下のとおりであった。
融点：２４１〜２４２℃（酢酸エチル）
ＩＲ  γ（ＫＢｒ）：２９０５，２８５０，１５９５，１４７０，１２６７ｃｍ-1
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3 ）δ：１．０２−２．１３（１４Ｈ，ｍ），３．４６（３Ｈ，ｓ），６．９５−７．０５（４Ｈ，ｍ），７．２３−７．３６（４Ｈ，ｍ）
元素分析：Ｃ24Ｈ24ＮＯ（分子量＝３４３．４７）に対して：
計算値：Ｃ＝８３．９３；Ｈ＝７．３４；Ｎ＝４．０８
実測値：Ｃ：８３．９８；Ｈ＝７．３１；Ｎ＝４．０３
【００３３】
実施例２：１０−ベンジルジスピロ〔アクリジン−９（１０Ｈ），２’−オキシラン−３’，２”−トリシクロ〔３．３．１．１3,7 〕デカン〕（Ｉｂ）の合成
出発材料として前記参考例１〔２〕で得たオレフィン体（２ｂ）を用いること以外は実施例１と同様の方法で、標記化合物を無色柱状結晶として、９７％の収率で得た。物性値は以下のとおりであった。
融点：２２７〜２２９℃（酢酸エチル）
ＩＲ  γ（ＫＢｒ）：２９１３，２８４９，１５９６，１４６４，１３７１，１２６７ｃｍ-1
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3 ）δ：１．０５−２．１７（１４Ｈ，ｍ），５．２７（２Ｈ，ｓ），６．８５（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ），６．９７（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ），７．０９−７．４２（９Ｈ，ｍ）
元素分析：Ｃ31Ｈ29ＮＯ（分子量＝４１９．５７）に対して：
計算値：Ｃ＝８５．８８；Ｈ＝６．９７；Ｎ＝３．３４
実測値：Ｃ＝８５．８５；Ｈ＝６．９８；Ｎ＝３．３０
【００３４】
実施例３：ジスピロ〔アクリジン−９（１０Ｈ），２’−オキシラン−３’，２”−トリシクロ〔３．３．１．１3,7 〕デカン〕−１０−酢酸エチル（Ｉｃ）の合成
出発材料として前記参考例１〔３〕で得たオレフィン体（２ｃ）を用いること以外は実施例１と同様の方法で、標記化合物を無色柱状結晶として、８５％の収率で得た。物性値は以下のとおりであった。
融点：１７７〜１７８℃（酢酸エチル）
ＩＲ  γ（ＫＢｒ）：２９１２，２８４９，１７５３，１５９８，１４９９，１４６４，１３６６ｃｍ-1
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3 ）δ：１．０５−２．２０（１４Ｈ，ｍ），１．２６（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ），４．２６（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝７Ｈｚ），４．６７（２Ｈ，ｓ），６．７２（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ），７．０２（２Ｈ，ｔｄ，Ｊ＝１，８Ｈｚ），７．１９−７．３４（２Ｈ，ｍ），７．３７（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ），７．０９−７．４２（９Ｈ，ｍ）
元素分析：Ｃ31Ｈ29ＮＯ（分子量＝４１９．５７）に対して：
計算値：Ｃ＝７８．０４；Ｈ：７．０３；Ｎ＝３．３７
実測値：Ｃ＝７７．７９；Ｈ＝７．０３；Ｎ＝３．３７
【００３５】
実施例４：１０−フェニルジスピロ〔アクリジン−９（１０Ｈ），２’−オキシラン−３’，２”−トリシクロ〔３．３．１．１3,7 〕デカン〕（Ｉｄ）の合成
出発材料として前記参考例１〔４〕で得たオレフィン体（２ｄ）を用いること以外は実施例１と同様の方法で、標記化合物を無色柱状結晶として、８８％の収率で得た。物性値は以下のとおりであった。
ＩＲ  γ（ＫＢｒ）：２９１７，２８５１，１５９７，１４９７，１４５７，１３１９ｃｍ-1
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3 ）δ：１．１６−２．１５（１４Ｈ，ｍ），６．４４（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ），６．９３−７．１２（３Ｈ，ｍ），７．３７（４Ｈ，ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ），７．５０−７．６８（４Ｈ，ｍ）
【００３６】
実施例５：９−１０−ジヒドロジスピロ〔アントラセン−９，２’−オキシラン−３’，２”−トリシクロ〔３．３．１．１3,7 〕デカン〕（Ｉｅ）の合成
出発材料として前記参考例１〔５〕で得たオレフィン体（２ｅ）を用いること以外は実施例１と同様の方法で、標記化合物を無色柱状結晶として、１００％の収率で得た。物性値は以下のとおりであった。
ＩＲ  γ（ＫＢｒ）；３０２０，２９６４，２９５０，２８４９，１４７０，１４５５，１４１８，１３５０ｃｍ-1
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3 ）δ：１．１０−２．２０（１４Ｈ，ｍ），３．９９（２Ｈ，ｅａｃｈ  ｄ，Ｊ＝１８Ｈｚ），７．１８−７．３７（６Ｈ，ｍ），７．４０（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝３，６Ｈｚ）
元素分折：Ｃ24Ｈ24Ｏ（分子量＝３２８．４５）に対して：
計算値：Ｃ＝８７．７６；Ｈ＝７．３６
実測値：Ｃ＝８７．４８；Ｈ＝７．３５
【００３７】
実施例６：ジスピロ〔９Ｈ−チオキサンテン−９，２’−オキシラン−３’，２”−トリシクロ〔３．３．１．１3,7 〕デカン〕−１０−オキサイド（Ｉｆ）の合成
出発材料として前記参考例１〔６〕で得たオレフィン体（２ｆ）を用いること以外は実施例１と同様の方法で、標記化合物を無色柱状結晶として、５８％の収率で得た。物性値は以下のとおりであった。
融点：２６７〜２６８．５℃（酢酸エチル）
ＩＲ  γ（ＫＢｒ）：３０７６，２９１２，２８５４，２５９４，１５８０，１４５０，１４１３，１３５３，１３０２，１２２７，１１７１，１１３８，１１２７ｃｍ-1
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3 ）δ：１．４０−２．２５（１４Ｈ，ｍ），７．４７−７．６３（６Ｈ，ｍ），８．１０（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１，６Ｈｚ）
【００３８】
実施例７：ジスピロ〔トリシクロ〔３．３．１．１3,7 〕デカン２，２’−オキシラン−３’，９”−９Ｈ−キサンテン〕（Ｉｇ）の合成
出発材料として前記参考例１〔７〕で得たオレフィン体（２ｇ）を用いること以外は実施例１と同様の方法で、標記化合物を無色柱状結晶として、９８％の収率で得た。物性値は以下のとおりであった。
融点：１３１〜１３２．５℃（酢酸エチル）
ＩＲ  γ（ＫＢｒ）：２９１４，２８５０，１６０３，１５７３，１４５０，１３１７，１２００，１１４７，１１００，１０７５，１０３２ｃｍ-1
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3 ）δ：１．０９−２．２０（１４Ｈ，ｍ），７．０７−７．４５（８Ｈ，ｍ）
元素分折：Ｃ23Ｈ22Ｏ2 （分子量＝３３０．４３）に対して：
計算値：Ｃ＝８３．６０；Ｈ＝６．７１
実測値：Ｃ＝８３．５６；Ｈ＝６．７４
【００３９】
実施例８：発光量の測定−１
以下の発光量測定にはベルトールド社のＬｕｍａｔ  ＬＢ９５０１を用いた。実施例１〜４で得た１０位置換ジスピロ〔アクリジン−９（１０Ｈ），２’−オキシラン−３’，２”−トリシクロ〔３．３．１．１3,7 〕デカン〕（Ｉａ〜Ｉｄ）の１×１０-6Ｍ溶液をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、あるいはＤＭＳＯと蒸留水の等量混合液で調整し、得られた溶液それぞれ１００μｌをガラスチューブに採り、測定装置のホルダーにセットし、発光開始液として水酸化ナトリウムと過酸化水素水を各０．１Ｎ含む溶液を１００μｌ注入し、１２０秒間の発光カウントを積算して発光量とし、ＲＬＵ（Ｒｅｌａｔｉｖｅ  Ｌｉｇｈｔ  Ｕｎｉｔ：相対発光単位）で示した。
【００４０】
【表１】
（Ａ）ｌ００％ＤＭＳＯ溶液中
0003731618.tif 000005
（Ｂ）５０％ＤＭＳＯ＋５０％蒸留水溶液中
0003731618.tif 000006
【００４１】
実施例９：発光量の測定−２
実施例２で得た１０−ベンジルジスピロ〔アクリジン−９（１０Ｈ），２’−オキシラン−３’，２”−トリシクロ〔３．３．１．１3,7 〕デカン〕（Ｉｂ）を、ジクロロメタン（ＣＨ2 Ｃｌ2 ）、ＤＭＳＯあるいはＤＭＳＯ−Ｈ2 Ｏ（蒸留水）（１：１）に溶かし、１×１０-6Ｍに調整し、発光強度を増すのに効果があったトリフルオロ酢酸、メタクロロ過安息香酸、又はトリエチルアミンをそれぞれ添加剤として加えてからの１２０秒間のカウントを積算して発光量とした。結果を表２に示す。なお、表２において、ｍＣＰＢＡはメタクロロ過安息香酸、ＴＥＡはトリエチルアミンであり、ＴＦＡはトリフルオロ酢酸である。また、２５秒後とは、水酸化ナトリウムと過酸化水素を加えてから２５秒後、更にその下に記載の試薬を加えたときの発光量を示す。
【００４２】
【表２】
0003731618.tif 000007
表１と表２の結果から明らかなように、本発明によるエポキシ誘導体（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）、及び（Ｉｄ）は、シャープらの文献（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  Ｖｏｌ．２８，Ｎｏ．１１，ｐ１１５５，１９８７）のアダマンタン誘導体と比較しても、より高い発光力を示した。また、表２の結果から、本発明によるエポキシ誘導体は、添加物によって発光強度が変化し、トリエチルアミン（ＴＥＡ）やトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を添加したときに発光強度が増すことがわかった。
【００４３】
【発明の効果】
本発明によるエポキシ誘導体は、従来の発光性アクリジン誘導体などと比較して、特に中性付近での保存安定性が格別に優れており、血液などの生物学的検体中の特定物質を検出する際のラベルとして有効に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明によるエポキシ誘導体の合成工程を示す説明図である。
【図１】
0003731618.tif 000011