(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式を有する化合物およびその塩：
0003833245.tif 000013
式中、
Ｘ2＝ＧｈｙＣＨ−、ＧｈｙＣＣＨ3−またはＨ−；
Ｘ1、Ｘ’1およびＸ’2＝独立にＧｈｙＣＨ−またはＧｈｙＣＣＨ3−；
Ｚ＝非置換、モノ−またはジ−Ｃ−メチル置換、あるいはそのモノ−またはジ−不飽和誘導体である−ＮＨ（ＣＯ）ＮＨ−、−（Ｃ6Ｈ4）−、−（Ｃ5ＮＨ3）−または−Ａ−（ＣＨ2）n−Ａ−、ｎ＝２−１０；そして
Ａ＝−ＮＨ（ＣＯ）−、−ＮＨ（ＣＯ）ＮＨ−、−ＮＨ−または−Ｏ−。
【請求項２】
Ｘ2がＧｈｙＣＨ−またはＧｈｙＣＣＨ3−であり、Ｘ2がＸ1のメタまたはパラにあり、そしてＸ’2がＸ’1のメタまたはパラにある、請求項１記載の化合物。
【請求項３】
Ｎ，Ｎ’ービス（３，５−ジアセチルフェニル）デカンジアミドテトラキス（アミジノヒドラゾン）四塩酸塩である、請求項２記載の化合物。
【請求項４】
以下の式を有する化合物およびその塩：
0003833245.tif 000014
式中、
Ｘ1、Ｘ2およびＸ3＝独立にＧｈｙＣＨ−またはＧｈｙＣＣＨ3−；
Ｘ’1、Ｘ’２およびＸ’３＝独立にＨ−、ＧｈｙＣＨ−またはＧｈｙＣＣＨ3−；
Ｚ＝（Ｃ6Ｈ3）（ｍ1、ｍ2、ｍ3＝０のとき）またはＺ＝Ｎ（ｍ1、ｍ2、ｍ3＝独立に２−６のとき）；そして
Ａ＝−ＮＨ（ＣＯ）−、−ＮＨ（ＣＯ）ＮＨ−、−ＮＨ−または−Ｏ−。
【請求項５】
Ｘ’1、Ｘ’2およびＸ’3のいずれかがＨ以外のものであるとき、Ｘ1、Ｘ２、およびＸ３からなる群の対応する置換基はそれぞれＸ’1、Ｘ’2およびＸ’3のメタまたはパラにある、請求項４記載の化合物。
【請求項６】
ｍ1、ｍ2、ｍ3＝０であり、そしてＡ＝−ＮＨ（ＣＯ）−である、請求項４記載の化合物。
【請求項７】
ｍ1、ｍ2、ｍ3＝２−６であり、そしてＡ＝−ＮＨ（ＣＯ）ＮＨ−である、請求項４記載の化合物。
【請求項８】
請求項１、３または４記載の化合物及び医薬的に許容しうる担体を含む医薬組成物。
【請求項９】
血漿アルギニンからの尿素の合成の阻害を必要とする患者での前記阻害のための、請求項８記載の化合物を含む医薬組成物。
【請求項１０】
悪液質の改善を必要とする患者での前記改善のための、請求項８記載の化合物を含む医薬組成物。
【請求項１１】
酸化窒素合成の有害な作用を改善することを必要とする患者での前記改善のための、請求項８記載の化合物を含む医薬組成物。
【請求項１２】
サイトカイン分泌の有害な作用を改善することを必要とする患者での前記改善のための、請求項８記載の化合物を含む医薬組成物。
【請求項１３】
患者が主要壊死因子分泌の有害な作用の改善を必要とする、請求項１２記載の医薬組成物。
【請求項１４】
内毒素ショックの治療を必要とする患者での前記治療のための、請求項８記載の化合物を含む医薬組成物。
【請求項１５】
請求項８記載の化合物に応答性の新生物をもつ患者での前記新生物の治療のための、請求項８記載の化合物を含む医薬組成物。
【請求項１６】
血漿アルギニンからの酸化窒素の合成の阻害を必要とする患者での前記阻害のための、請求項８記載の化合物を含む医薬組成物。
【請求項１７】
マクロファージによるアルギニン取り込みをブロックすることにより悪液質の改善を必要とする患者で悪液質を改善するための、請求項８記載の化合物を含む医薬組成物。
【請求項１８】
患者におけるマクロファージのアルギナーゼ活性をブロックすることにより悪液質の改善を必要とする患者で悪液質を改善するための、請求項８記載の化合物を含む医薬組成物。
【請求項１９】
マクロファージによる尿素合成を阻害するのに有効な請求項８記載の化合物を含む、悪液質の改善を必要とする患者での悪液質を改善するための医薬組成物。
【請求項２０】
患者の血液細胞および血管細胞によるアルギニン取り込みをブロックすることにより患者における酸化窒素合成の有害な作用を改善するための、請求項８記載の化合物を含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
１．技術分野
本発明は、炎症性症状の治療、例えば癌およびその他の慢性疾患に関連する貧栄養状態ならびに体のやせ症状の臨床症候群である悪液質（ｃａｃｈｅｘｉａ）の防止および改善に有用な新規方法および組成物に関する。さらに特定すると、本発明は芳香族グアニルヒドラゾン（”Ｇｈｙ”、より適切にはアミジノヒドラゾン、すなわちＮＨ2（ＣＮＨ）−ＮＨ−Ｎ＝）組成物、ならびにマクロファージによるアルギニンの取り込みおよび／またはその尿素への変換を阻害するための使用に関する。これらの組成物および方法はまた、酸化窒素（ＮＯ）の生成、ならびにマクロファージやその他の細胞によるサイトカインの分泌を防止し、それ故ＮＯ媒介性の炎症およびこれを必要とする人のその他の応答を防止するのに有用である。別の態様では、上記組成物はアルギニン依存性腫瘍および感染におけるアルギニンの取り込みを阻害するのに使用できる。
２．背景技術
悪液質は罹患の動物の組織質量が減少することを特徴とし、宿主の体重減少となって現れる。悪液質は多くの種類の慢性疾患に見られる進行性かつしばしば致死的合併症であり、その結果、治療目的は基礎疾患を単に癒すだけでは足りなくなる。悪液質患者のタンパク質貯蔵量の減少、体重の減少および一般に貧栄養状態はそれぞれ独立に罹病や死の原因となりうる。さらに、悪液質と関連する衰弱は、主な病因に対する積極的薬物療法や外科療法に対して患者が耐えうる能力を有意に制限してしまう。
２．１．悪液質の兆候は飢餓の兆候とは異なる
悪液質は、一般に種々の障害：例えば、癌、化学療法、放射線障害、慢性感染症、外傷および外科ストレスに関連する重篤でかつしばしば致死的合併症である。宿主の全エネルギー必要度に対して不十分な食品摂取が悪液質症候群に共通の要因である。悪液質の特徴を定義するこの相対的減食（ｈｙｐｏｐｈａｇｉａ）に加えて、食欲不振もしばしば見られる。
しかしながら、悪液質を示す症候群の研究により、悪液質が単に宿主の必要度以下のタンパク質および炭水化物の食品摂取によるものではないことが示された。部分的または完全飢餓の期間に見られるやせのパターンは、組織タンパク質が比較的保存されるのと同時に初期の体全体の脂質の減少を伴うという点で、悪液質は非ストレス性のカロリー剥奪とは異なる。これとは対照的に、悪液質は組織貯蔵所からの脂質とタンパク質の両方が有意に減少するという特徴をもつ。
２．２．悪液質と飢餓の相違の意味
悪液質について最も普通に受け入れられている一般的説明は、宿主のタンパク質が組織内で分解してアミノ酸の材料になるというものである。これらのアミノ酸はグルコース、アルブミンおよび肝臓中の宿主の防御タンパク質の合成に必要であると考えられている。
この一般に受け入れられている説によると、カロリーとタンパク質の全摂取量を増加する治療が悪液質症候群を実質的に改善するはずである。しかしながら、たとえ非経口全栄養を劇的に与えても、悪液質を効率よく治療することはできない（Brennan,1986 NEJM 305:375,Detsky,et al.,1987,ANN INTERN MED 107:195,McGeer,et al.,1989,ANN INTERN MED 110:734,Koretz,1984,J CLIN ONCOL 2:534）。
治療様相としての栄養補充が失敗したことに加えて、悪液質と飢餓とにおける脂質とタンパク質の減少パターンの基本的相違は、悪液質が単に、基礎疾患による異常な栄養必要性の増加によるものでもなく、また病気のために食欲を生理的に制御できなくなったことによる食欲不振によるものでもないことを示唆する。この相違はむしろ直接または間接に基礎疾患によって宿主の代謝に何らかの基本的な変化が生じたためであることを示唆する。
この結論をさらに支持するものとして、サイトカインとして知られる可溶性の宿主生産の調節タンパクとエフェクタータンパク質が一連の出来事の連鎖の中で、悪液質を導くことを示唆する証拠が多く提出されてきた。正常な動物と悪液質の動物の血液循環を結合させる実験が行われた。“パラビオーゼ”動物と呼ばれるこの実験において、基礎疾患は元の宿主に完全に残っているのに、その他の点では正常な動物がすぐに悪液質を発症することが観察された。これらの結果および別の観察は、循環性のメディエータが悪液質の最も近い原因であることを強く示唆する。すなわち、この異化状態は、侵入性の細胞または生物が成長したために負わされた過剰な代謝要求の受動的結果ではなく、あるいは代謝要求を満たすのに必要な食品摂取が単に少ない結果でもない。
これらの液性因子を同定する可能性としては、悪液質で産生される可溶性メディエータが宿主免疫／炎症関連分子として既に同定されておりリンパ球およびマクロファージによって分泌されるもの（サイトカイン）と同じ分子であることであった。これらのサイトカインが悪液質に関与しているという理論は、外因性の腫瘍壊死因子（カケクチンとしても知られており、本明細書では”ＴＮＦ”という）を試験動物に投与すると悪液質の多くの特徴を擬態したという観察によって確認された（Darling et al.,1990,CANCER RES 50:4008;Beutler & Cerami,1988,ADV IMMUNOL 42:213）。さらに、抗ＴＮＦ抗血清は実験的腫瘍系における悪液質の兆候の多く（ただし全てではない）を改善した（Sherry,et al.,1989,FASEB J 3:1956;Langstein,et al.,1989,SURG FORUM 15:408）。
２．３．治療法探索における悪液質でのサイトカインの役割の影響
悪液質症候群の全ての面が１つのサイトカインによるものであっても、あるいはいくつかのサイトカイン、ホルモンおよびその他の液性因子の組み合わせによるものであっても、このような知識はそれ自体で悪液質の基礎となる代謝変化を説明するための細胞的または生化学的メカニズムを提供するものではなく、また有効な治療に直接結び付くものでもない。究極的には、サイトカインは標的細胞と相互作用して、生理学的および病態生理学的に重要な標的細胞の代謝または表現型の変化を誘導しなければならない。従って、サイトカインの媒介の一般的同定や特定サイトカインの特異的関係の示唆は、悪液質の全体像をもたらすにはどのような細胞および／または全身の代謝変化が起きるのかを正確に決定するための中間的な目的に過ぎない。
種々の悪液質症候群のメディエータとしてサイトカインを示唆する知見を、悪液質の代謝変化に主として寄与する因子として肝臓と筋肉細胞への広範な興味とを組み合わせて、多くの者が既知のサイトカインの肝臓および筋肉細胞への影響を調べ、これらの組織に影響をもつ新規サイトカインを探索した。しかしながら、今日までに、いずれの単独または組み合わによる既知のサイトカインも、in vivoでタンパク質分解をすると推定される部位に典型的な細胞を用いるin vitro系で、貯蔵タンパク質からアミノ酸を直接動員することを示すことはできなかった。
２．４．内毒素ショックの媒介物としての酸化窒素
酸化窒素合成酵素（ＮＯＳ）によってＬ−アルギニンから酵素的に生産される分子である酸化窒素（ｎｉｔｒｉｃ  ｏｘｉｄｅ：ＮＯ）は、生理学的恒常性および炎症細胞毒性の両方のメディエータである（Moncada,S.& Higgs,A.,1993,THE NEW ENGLAND JOURNAL OF MEDICINE 329,2001-2012;Nathan,C.,1992,FASEB J 6,3051-3064）。例えば内皮細胞でのＮＯＳの構成的および誘導的アイソフォームを介するＮＯの生産は、血管拡張をもたらし、血圧と組織灌流を支配する（Kilbourn,R.G.,Jubran,A.,Gross,S.S.et al.,1990,BIOCHEM.BIOPHYS.RES.COMMUN.172,1132-1138）。一方、活性化マクロファージにおける誘導ＮＯＳによるＮＯの生産のないことが細胞毒性を与え、血管透過性を増加し、ＴＮＦαとＩＬ−１の放出を増強する（Ding,A.H.,Nathan,C.F.& Stuehr,D.J.J Immunol.141,2407-2412(1988);Kubes,P.& Granger,D.N.Am.J.Physiol.262,H611-H615(1992);Van Dervort,A.L.,Yan,L.,Nadara,P.J.,et al.J Immunol.152,4102-4109(1994);Bouskela,E.& Rubanyi,G.M.SHOCK 1,347-353(1994);Hibbs.J.B.,Taintor,R.R.& Vavrin,Z.Science 235,473-476(1987);Granger,D.L.,Hibbs,J.B.,Perfect,J.R.& Durack,D.T.J.Clin.Invest.85,264-273(1990)）。ＮＯの種々の生物学的作用の研究は、ＮＯＳを妨害してＮＯの生産を阻害する化合物によって進んだ。しかし、ＮＯＳアイソフォームは高度に保存されているので、構成ＮＯＳと誘導ＮＯＳとの活性を有意に区別することのできるＮＯＳ阻害剤は得られなかった。
従来のＮＯＳ阻害剤は内毒血症からの生存を改善することに関してある程度しか成功しなかった。これは、部分的にはこれらの阻害剤が内皮細胞由来平滑筋弛緩因子（ＥＤＲＦ）を無差別に抑制したためである（Cobb,J.P.,et al.,1992,J EXP.MED.176:1175-1182;Minnard,E.A.,et al.,1994,ARCH SURG.129:142-148;Billiar,T.R.,et al.,1990,J LEUKOCYTE BIOL.48:565-569）。内毒血症においてＥＤＲＦを抑制すると、血管収縮と臨界血管床への血流の減少を引き起こし生存が脅かされるのかも知れない。今までのところ、内皮由来ＮＯを阻害することなくサイトカイン誘導のマクロファージＮＯを阻害する化合物は報告されていない。
３．発明の要約
本発明は尿素の生産、より詳細にはマクロファージによる尿素の生産を阻害すること、そして特にマクロファージによるアルギニンの取り込みを媒介する輸送プロセスを阻害することによる悪液質を治療する方法および化合物に関する。本発明の方法は、発作、ショック、炎症およびその他のＮＯ関連症状に付随するＮＯ媒介性応答によって誘導される損傷を制限または防止するためにも用いることができる。本発明の別の目的は、腫瘍または感染症の治療におけるアルギニン取り込みの阻害に関し、ここで腫瘍細胞、感染細胞または感染因子はアルギニンを必要とする。本発明のさらに別の目的は、活性化マクロファージによる腫瘍壊死因子のようなサイトカインの心身に有害な分泌を阻害することにある。
本発明の目的に使用しうる化合物のクラスは複数のグアニルヒドラゾン（Ｇｈｙ）部分、より的確にいうとアミジノヒドラゾンで置換された芳香族化合物を含むが、これに限定されない。このような化合物の合成と用途を記載する。本発明はさらに別の化合物を上記の活性について試験するためのスクリーニングアッセイ、ならびにこの治療法に使用しうる医薬組成物を含む。
尿素生産と酸化窒素の生理学的合成との間には密接な関係があるので、本発明の化合物は、細胞によるＮＯ生産、特にマクロファージによる生産を制限するのにも有効である。
本明細書で記載し請求する治療がどのようにしてまた何故作用するのかという理論に制限される訳ではないが、本発明は以下の悪液質モデルを本出願人が樹立したことに部分的に基づく：悪液質においては、活性化マクロファージが循環アルギニンを窒素の最終産物に変換し、これが体内から除去され、失われた血清アルギニンに取って変わるために筋肉および／または肝臓およびその他の器官によるタンパク質の異化作用を必要とすることにより宿主の窒素プールが枯渇する。従って、活性化マクロファージは全身プールから窒素を絶えず排出する”窒素シンク（nitrogen sink）”を作り出し、組織タンパク質の異化作用により新しい窒素源としてアミノ酸を放出して補うことを体に強要する。このモデルは、その他の組織に尿素を作らせる活性化マクロファージによって放出される因子を同定しようと本出願人が試みるなかにおいて、活性化マクロファージ自体がアルギニンを分解することにより尿素を直接合成することを見いだした実験に基づいている。
活性化マクロファージはアルギニンを以下の２つの方法で分解する：（ａ）尿素とオルニチンへ；あるいは（ｂ）シトルリンと酸化窒素へ（図１）。このようにして生じた尿素と酸化窒素は全体の体内窒素プールから窒素を除去する。なぜなら、これらの代謝物は有効に再利用するためにリサイクルされないからである。従って、悪液質では活性化マクロファージが血漿のアルギニンを枯渇させる。すると、血漿中のアルギニンの恒常性を維持するための体のメカニズムが、窒素とアルギニン源を放出するために筋肉、肝臓およびその他の器官からのタンパク質の異化を必要とする。活性化マクロファージにおけるアルギニンの分解が組織タンパク質貯蔵の不適切な動員の主な原因であるという発見によって、本明細書に記載する治療を開発することが可能になった。すなわち、活性化マクロファージによるアルギニン取り込み、および／または代謝の”窒素シンク”から容赦のない尿素の喪失を生じるアルギニンからの尿素の生産を妨害し、これによって組織からタンパク質がさらに異化されるのを阻害する治療である。
本発明の目的はさらに、酸化窒素合成酵素のマクロファージ特異的阻害剤が存在しないことによる限界を克服するために、マクロファージによる酸化窒素の生産を阻害するために使用する化合物および方法を提供することにある。理論に拘束される訳ではないが、本発明者らは、ＮＯを生産するために誘導された内皮細胞ではなくマクロファージによるアルギニン取り込みの要求に対しては利点が得られるであろうと理論付けた。本発明の化合物はマクロファージによるＮＯ生産を阻害するが、血管活性な（内皮細胞由来の）ＮＯ生産を阻害しないことが見いだされた。従って、本発明の化合物は、例えば内毒素ショックや敗血症ショックに付随するマクロファージ誘導のＮＯ媒介効果を妨げるのに有利である。
上述した記載は説明のために示されたものであって、本発明を限定するものではない。本発明は悪液質の生理学的モデルに関する背景技術を用いて開発されたが、本発明自体はマクロファージによる尿素生産を阻害するために、非代謝性グアニルヒドラゾン基をもつアルギニン類似体、アルギノ擬似体（ａｒｇｉｎｏｍｉｍｅｔｉｃｓ）、およびその他の化合物の使用を包含する。このような化合物の一般的クラスはグアニルヒドラゾンを含む芳香族である。これらの化合物は、アセチルベンゼンおよびベンズアルデヒドとをアミノグアニジンおよび酸と、水性エタノール中、高温で反応させることにより合成できる（Ulrich et al.,1982,DRUG DEVELOPMENT RESEARCH 2:219;Ulrich & Cerami,1984,MEDICAL CHEMISTRY 27:35:これらの文献を参照としてここに包含する）。
本発明は、本発明で使用する化合物の合成（下記第６節）；尿素生産を阻害する化合物を同定するための全細胞アッセイ（下記第７節）；アルギニン取り込みを阻害する化合物を同定するための全細胞アッセイ（下記第８節）；アルギナーゼ阻害アッセイ（下記第９節）；悪液質の動物モデル系を用いる本発明の効果の証明（下記第１０節）；カラゲナン誘導足腫脹を用いる動物モデルにおける炎症を減少するための本発明の効果の証明（下記第１１節）；内皮細胞由来平滑筋弛緩因子の効果を阻害することなく（下記第１２節）リポ多糖誘導死を防止するための本発明のin vivo効果の証明（下記第１３節）；およびＬＰＳおよびγ−インターフェロンで刺激されたＲＡＷ２６４．７細胞による腫瘍壊死因子分泌を阻害するための本発明のin vitro効果（下記第１４節）を記載する実施例によって示される。第１２〜１４節の結果は、毒性ショックまたは全身性炎症応答症候群に付随する病気や死を防止するうえでの効果を示している。別の実施例では、ラット中央大脳動脈の閉塞により誘導した梗塞の重篤度を減少させるうえでの（下記第１５節）、およびヌードマウスモデルにおける実験新生物の成長を減少させるうえでの（下記第１６節）化合物番号１４の効果を示す。
【図面の簡単な説明】
図１は、炎症性細胞によるアルギニン分解の生化学および器官間の基質循環を示す。
図２は、常在性マクロファージによる尿素生産を示す。
図３は、マクロファージによる尿素生産はＬＰＳおよびγ−インターフェロンによって刺激されることを示す。対照−○−；ＩＦＮγ（２５Ｕ／ｍｌ）−●−；ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）−◇−；ＩＦＮγ（２５Ｕ／ｍｌ）＋ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）−◆−。
図４は、補足薬剤の存在下または不在下におけるＲＡＷ２６４．７細胞の尿素生産に対するγ−インターフェロンおよびＬＰＳの効果の用量と応答との関係を示す。図４Ａ：１００ｎｇ／ｍｌＬＰＳの存在下および不在下でのγ−インターフェロンの各種用量；図４Ｂ：２５Ｕ／ｍｌγ−インターフェロンの存在下および不在下でのＬＰＳの各種用量。
図５は、細胞外アルギニンに対するＲＡＷ２６４．７の尿素生産の依存性を示す。対照−●−；ＩＦＮγ（２５Ｕ／ｍｌ）＋ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）−▲−。
図６は、アルギニン輸送を示す。刺激後の種々の時間におけるＲＡＷ２６４．７細胞によるテトラ−3Ｈ−アルギニンの取り込み。
図７は、本発明の例示化合物の化学構造を示す。図７Ａ：番号１〜７；図７Ｂ：番号８〜１３；図７Ｃ：番号１４〜２０；図７Ｄ：番号２１〜２４；図７Ｅ：番号２５〜２７；図７Ｆ：番号２８〜３０；図７Ｇ：番号３１〜３３；図７Ｈ：番号３４〜３６；図７Ｉ：番号３７〜４０；図７Ｊ：番号４１〜４３。
図８は、γ−カラゲナン誘導のマウス足腫脹に対する化合物番号１４の保護効果の用量依存性を示す。
図９は、化合物番号１４および公知の酸化窒素合成酵素阻害剤であるＬ−ＮG−メチル−アルギニンの、アセチルコリン誘導低血圧に及ぼす効果を比較したものである。
図１０は、化合物番号１４のＬＰＳ誘導死亡率に及ぼす効果を示す。
図１１は、ＬＰＳ／γ−インターフェロン刺激したＲＡＷ２６４．７細胞によるＴＮＦ分泌に及ぼす化合物番号１４の効果を示す。
図１２は、０、１、５および２５μＭの化合物番号１４で処理した細胞によるＴＮＦ生産を示す、ＬＰＳ／γ−ＩＦＮ刺激したＲＡＷ２６４．７細胞由来の培養液のウエスタンブロットである。
図１３は、ＬＰＳ／γ−ＩＦＮ刺激したＲＡＷ２６４．７細胞によるＮＯおよびＴＮＦ生産に及ぼす化合物番号１４と細胞外アルギニンの組み合わせ効果を比較したものである。図１３ＡはＮＯ生産：対照−●−；１μＭ化合物番号１４−▽−；５μＭ化合物番号１４−▼−；２５μＭ化合物番号１４−□−。図１３ＢはＴＮＦ生産：対照−●−；５μＭ化合物番号１４−▼−；２５μＭ化合物番号１４−▽−。
図１４は、ＬＰＳ／γ−ＩＦＮ刺激したＰＢＭＣによるサイトカイン生産に及ぼす化合物番号１４の効果を示す。図１４Ａ：腫瘍壊死因子；図１４Ｂ：ＩＬ−６；図１４Ｃ：マクロファージ炎症性タンパク質−１α；図１４Ｄ：マクロファージ炎症性タンパク質−１β。
図１５は、化合物番号１４の、休止細胞におけるアルギニン輸送に及ぼす効果−●−、ならびに刺激したＲＡＷ２６４．７細胞に及ぼす効果−▽−を示す。
図１６は、γ−ＩＦＮ／ＬＰＳで８時間刺激し、化合物番号１４にさらに４時間さらしたＲＡＷ２６４．７細胞のＮＯ生産に及ぼす化合物番号１４の効果を示す。
５．発明の詳細な説明
本発明は尿素の生産、特にマクロファージによる尿素の生産を阻害することによる悪液質を治療する方法および化合物に関する。本発明の方法は、発作、ショック、炎症およびその他のＮＯ関連症状に付随するＮＯ媒介性応答によって誘導される損傷を制限または防止するためにも用いることができる。この目的のために、本発明は尿素およびＮＯのマクロファージによる生産を阻害すること、より特定すると、誘導された尿素の過剰生産を阻害し、かつマクロファージによるアルギニン取り込みを媒介する輸送プロセスを阻害することに関する。本発明はさらに、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）のようなサイトカインの心身に有害な分泌を阻害することを含む。本発明の別の態様は、腫瘍または感染症の治療におけるアルギニン取り込みの阻害に関し、ここで腫瘍細胞または感染因子はアルギニンを必要とする。
本発明に使用しうる化合物のクラスは複数のグアニルヒドラゾン部分、より的確にいうとアミジノヒドラゾンで置換された芳香族化合物を含む。このような化合物の合成と用途を記載する。本発明はさらに試験化合物から上記の活性をもつものを試験するためのスクリーニングアッセイ、ならびにこの治療法に使用しうる医薬組成物を含む。
歴史的にいえば、本発明者らの初期の研究は、培養肝細胞により多くの尿素を生産させるマクロファージによって生産される仮説的な可溶性メディエータを見いだすことを目的としていた。より特定すると、本発明者らは悪液質に付随する多くの慢性疾患症状に見られるような刺激または活性化されたマクロファージによって生産されるメディエータを見いだすことを意図した。in vitroで肝細胞性尿素の生産を増加させるサイトカインを単離するための初期の試みにおいて行った対照試験によって、活性化マクロファージ自身が尿素を有意な量で生産することを偶然発見した。移植した腫瘍により悪液質にしたマウスから単離したマクロファージによって尿素生産が増強されたことを示す実験から、これがin vivo状態にも関連することを確認した（図２）。これらの研究は、ネズミマクロファージ細胞株ＲＡＷ２６４．７がマクロファージ活性化剤であるＬＰＳおよびγＩＦＮに応答して、細胞外アルギニンの利用度に依存して尿素生産を増加させることを示すことによってさらに確認された（図３〜５）。これらの研究により以下に詳述する薬理活性アッセイを開発できた。本発明で使用する化合物はこのアッセイに基づいて同定され、本発明の効果を示す動物モデル系で使用された（下記第１０、１１、１２、１３、１５および１６節）。
前記の結果は活性化マクロファージによるサイトカインの分泌が悪液質プロセスの一面に過ぎないことを示唆する。本発明者らは以下のモデルと仮説を開発したが、これは説明のためにのみ提出するものであり、特定のメカニズムや科学モデルに本発明を限定するものではない。このモデルで同じく重要なことは、活性化マクロファージの直接代謝プロセスである。データによると、悪液質では活性化マクロファージが尿素を大量に分泌させる。マクロファージの直接の寄与による窒素喪失の大きさは、実験的培養データから推定できる。このような研究により、単一の活性化マクロファージが１日当たり約５０ｐｇの尿素を生産することが示された。活性化マクロファージの割合がヒトの全体的な免疫細胞集団の約１０％であると推定するならば、全部で約１０11個の活性化マクロファージが存在する。この集団数は１日当たり約５ｇの窒素喪失に相当し、大ざっぱに見て１日当たり３０ｇのタンパク質への翻訳に相当する。この喪失の程度は慢性悪液質の臨床で見られる体重減少のかなりの部分を占める。
本発明によると、尿素生産の阻害、特にマクロファージで誘導される尿素生産の阻害は上述のプロセスを逆行させるであろう。いわゆる”尿素サイクル”を完了するために用いる酵素に関して、マクロファージの細胞代謝は肝臓の代謝と異なる。いずれの組織においても、尿素生産の最終段階はアルギニンのアミジノ部分を酵素であるアルギナーゼが加水分解してオルニチンと尿素とが生じる（図１）。マクロファージと肝臓の尿素生産における顕著な相違は、マクロファージには酵素オルニチントランスカルバミラーゼの実質的量が不足しており、従ってアルギナーゼによって生産されるオルニチンを有効に再利用することができず、また尿素生産のためにアンモニウム（ＮＨ4）を直接用いることもできず、外部から供給されるアルギニンに依存しなければならない点である。第２に、尿素の加水分解的放出を触媒するアルギナーゼ酵素が２種類あるようであり、１つはマクロファージに特に見いだされ、２つ目は肝臓の肝細胞で典型的に見いだされる。
マクロファージと肝臓の尿素生産におけるこれらの相違は２つの示唆を含む：第１に、マクロファージは血漿からアルギニンを選択的に枯渇させる。この循環性アルギニンはその他の組織におけるタンパク質分解によって究極的には補われなければならない。なぜなら、窒素の尿素への変換は実質的に不可逆的であり、すなわち尿素は再利用のためにさらに代謝されることがない。アルギニン自体は、グルタメート合成酵素、グルタミン合成酵素およびカルバモイルホスファターゼ合成酵素によって、α−ケトグルタレートとアンモニウムとから合成される。第２に、もしもマクロファージの尿素生産がアルギニン取り込みに依存し、肝臓の尿素合成がこれに依存しないとすると、悪液質に付随する窒素喪失を選択的にブロックし、一方対応する肝機能は比較的損傷せずに残すことができるであろう。
さらに、アルギナーゼ酵素のマクロファージ型を選択的にブロックし、肝臓型をブロックしないことは有利である。本明細書のin vitroアッセイでは、どの試験化合物がこれらの代謝プロセスのそれぞれを特異的に阻害するかの検出について記載する。これらのアッセイではマクロファージ細胞株ＲＡＷ２６４．７を用いる。ＲＡＷ２６４．７細胞株アッセイで、新規な１５の化合物を含む２０の化合物を用いてマクロファージの尿素生産阻害を試験した。６つの化合物が約１０μＭまたはそれ以下のＩＣ50を示し、さらに別の５つの化合物が１０μＭ以上であるが、１００μＭ以下のＩＣ50を示した（第７．２節参照）。
本発明の別の態様はマクロファージの尿素生産を阻害するための全ての公知の方法を含む。このような方法は組換えＤＮＡ法を含むが、これに限定されない。例えば、マクロファージ型アルギナーゼのｍＲＮＡと相補的なアンチセンスメッセージを発現するベクターを悪液質宿主のマクロファージに導入する。あるいは、マクロファージ型アルギナーゼのｍＲＮＡに特異的なリボザイムを用いる。いずれかに適したベクターのマクロファージへの特異的導入をリポソーム担体を用いることにより実施できる。
本発明の別の態様は酸化窒素（ＮＯ）生産の阻害、特に酵素ＮＯシンターゼの阻害を含む。ＮＯは活性化マクロファージおよびその他の細胞由来のうちの血管内皮細胞によって生産される。ＮＯは各種炎症疾患：特にショック、心筋層の虚血性壊死（梗塞形成）、および中枢神経系の場合の病因として示唆されてきた。ＮＯシンターゼはアルギニンのシトルリンへの酸化を触媒し、ＮＯの放出を伴う。従って、アルギニン取り込みを阻害する化合物は細胞レベルでのＮＯシンターゼ活性の有効な抑制剤である。さらに、上述したクラスの化合物は分子レベルでのＮＯシンターゼの特異的阻害剤である。本明細書に示すデータは本発明の化合物がＥＤＲＦ活性を阻害することなくＮＯ生産を阻害することを示す。
さらに別の態様では、本発明は全身性炎症応答症候群（ＳＩＲＳ）としても知られる毒性ショックの治療に使用できる。本明細書に記載のデータは、本発明の化合物がＳＩＲＳに関連する疾病や死を防止するために以下の２つの独立した経路で作用することを示す：（ａ）アルギニン取り込みを防止し、これによって活性化マクロファージによるＮＯ合成をブロックする；そして（ｂ）腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）のようなサイトカインの分泌をブロックする。
本発明のさらに別の態様では、アルギニン取り込みの阻害を腫瘍または感染症の治療に用いることができ、このとき腫瘍細胞または感染因子はアルギニンを必要とする。例えば、アルギニンを必要とする腫瘍は乳房、肝臓、肺および脳の腫瘍を含むが、これらに限定されない。またアルギニンを必要とする感染性病原体はニューモシスティス・カリニ（Pneumocystis carinii）、トリパノゾーマ・ブルセイ（Trypanosoma brucei）、Ｔ．コンゴレンス（T.congolense）およびＴ．エヴァンシ（T.evansi）を含むが、これらに限定されない。
本発明で使用できる阻害剤の例としては、アルギニン類似体；さらに特定すると［（アミノイミノメチル）ヒドラゾノ］メチル部分および［２−（アミノイミノメチル）ヒドラゾノ］エチル部分（以後において”グアニルヒドラゾン”と総称する）で置換されたアリーレン化合物を含むが、これに限定されず；最も好ましくは２、３または４つのグアニルヒドラゾン部分をもつジフェニル化合物である。これらの阻害化合物は、アルギニンのグアニジノ基の非加水分解性類似体を１またはそれ以上もつ。
本発明の活性を試験したグアニルヒドラゾン化合物のうち、１つのグアニルヒドラゾン部分のみをもつ化合物は不活性であるか、あるいは尿素生産の５０％減少を達成するのにｍＭオーダーの濃度を必要とした。２、３または４つのグアニルヒドラゾン部分をもつベンジルおよびジフェニル化合物はある場合には１０μＭ以下で活性であった。試験した全ての場合において、高活性化合物は尿素生産を阻害したのみでなく、アルギニンの細胞への輸送をも阻害した。本発明の好ましい態様は、アルカンジイミドで結合した２つのフェニル核またはアルカンで結合した２つのフェノキシ核をもつフェニル化合物で置換されたジ−、トリ−およびテトラ−グアニルヒドラゾンである。第２の好ましい態様は、トリアセチルフェニルまたはトリホルミルフェニルトリス（グアニルヒドラゾン）である。公知であるこれらの有用な化合物の例としては、モノアリーレンビスグアニルヒドラゾン、例えば１，３−ジアセチルピリジンビス（グアニルヒドラゾン）（２）、Ulrich,1982、モノアリーレントリス（グアニルヒドラゾン）、例えば１，３，５−トリアセチルベンゼントリス（グアニルヒドラゾン）（１）、Ulrich,1984、およびビスアリーレンビス（グアニルヒドラゾン）、例えば４，４’−ジアセチルジフェニルウレアビス（グアニルヒドラゾン）（８）、Korytnyk,W.et al.,J.MEDICAL CHEMISTRY 21:507-13,1978を含む。これらの化合物は約１０μＭから約５０μＭの濃度でin vitroでマクロファージの尿素生産を阻害する。さらに本発明の新規化合物は、５倍低い濃度で阻害活性をもつ。このような化合物は、ビスアリーレントリス（グアニルヒドラゾン）、例えば３，５，４’−トリアセチルジフェニルウレアトリス（グアニルヒドラゾン）（図１７．９）、ビスアリーレンテトラキス（グアニルヒドラゾン）、例えばＮ，Ｎ’−ビス（３，５−ジアセチルフェニル）デカンジアミドテトラキス（グアニルヒドラゾン）（図１７．１４）および３，３’−（エチレンジオキシ）ジベンズアルデヒドビス（グアニルヒドラゾン）（図１７．１６）を含む。
本発明の範囲にさらに含まれるのは、各アリーレン基が１または２つのグアニルヒドラゾノアルキル置換基をもつトリスアリーレングアニルヒドラゾノ化合物である。このような化合物は本明細書に記載の方法を用いて合成できる。
５．１．活性化合物を同定するためのアッセイ
本発明で用いる化合物の同定に以下のアッセイを使用できる。さらに、このアッセイは各試験化合物のＩＣ50（すなわち、アッセイするパラメーターを５０％阻害する濃度）を決定するのに用いうる。in vivoで用いるときには、各化合物の用量はin vitroで測定したＩＣ50を含む循環濃度の範囲を達成するように調製すべきである。
このアッセイは本発明の方法の範囲を限定するものと解してはならない。当業者には、同じ結果が得られる均等なアッセイを開発するためのアッセイ系を作り出すための修飾をなしうることが理解できよう。本明細書で記載する実施例では、ＲＡＷ２６４．７細胞株を用いた。しかしながら、本発明はＲＡＷ２６４．７細胞株に限定されず、いかなるマクロファージ細胞株または初代培養で活性化された非形質転換マクロファージでも用いうる。
５．１．１．尿素および酸化窒素生産のための全細胞アッセイ
一般に、尿素生産のための全細胞アッセイは以下のようにして実施できる：マクロファージまたは内皮細胞を試験阻害剤の存在下に活性化する（例えば、下記実施例で記載するγＩＦＮおよびＬＰＳを含むが、これらに限定されない因子を用いて）。適当な培養時間、例えばおよそ一晩から２日までの後、培養上清を分析して尿素および酸化窒素の存在を試験する。細胞株による尿素および酸化窒素の生産は、これら化合物の血清濃度測定に臨床試験室で用いられているのと同じ比色アッセイによって測定できる。各種濃度の阻害剤の効果は、試験阻害剤で処理しなかった対照培養物の上清と比較することにより決定できる。いかなる阻害用量における毒性も同定できる別の対照も含めてよい。以下に記載する実施例で用いた細胞内酵素乳酸デヒドロゲナーゼまたは同等の対照の放出アッセイは、このような目的に使用できる。
５．１．２．アルギニン取り込みの全細胞アッセイ
本発明の化合物によるアルギニン膜貫通濃縮活性の阻害は、担体を含まない（ｃａｒｒｉｅｒ−ｆｒｅｅ）放射性標識アルギニンを用いて測定される。この目的のために、細胞を培養して試験阻害剤の存在下に、付着（例えば２時間から一晩）および活性化（例えば下記実施例で記載するγＩＦＮおよびＬＰＳを含むがこれらに限定されない因子を用いて）させる。適当なインキュベーション時間の後、担体を含まない標識アルギニンを培養物に加える。短時間（例えば５分間）の後、培養物中の細胞と非特異的に結合した放射性標識アルギニンと置き換えるために、非標識アルギニンを含む溶液で細胞を洗浄する。次いで細胞を溶解し、細胞溶解物中の放射性標識アルギニンの存在を分析する。試験化合物の効果は、処理細胞への放射性標識の取り込みと、強力な阻害剤で処理しなかった対照細胞培養物への放射性標識の取り込みとを比較することによって決定する。
本明細書の実施例で記載する態様において、細胞の試験集団がしっかり付着するように約３時間培養した。次いで可能性のある阻害剤を種々の濃度で複数の培養物に加えた。１時間後に例えばＬＰＳおよびγＩＦＮ（ただしこれに限定されない）を含むマクロファージ刺激剤を加えた。１８時間後に細胞をグルコースを添加した平衡塩類溶液で洗浄した。担体を含まない放射性標識アルギニンを加えて、５分後に、外部に結合した標識と置換するための非標識アルギニン１０ｍＭを含む０℃に冷却した緩衝液で３回細胞を洗浄してアルギニンの活性取り込みを停止した。洗浄細胞の内容物をギ酸１００μｌ中に可溶化し、標準法でカウントした。
５．１．３．アルギナーゼ活性の細胞溶解物アッセイ
アルギナーゼ活性を測定する細胞溶解物アッセイは、試験化合物の存在下にアルギナーゼ活性化緩衝液に細胞溶解物をさらすことを含む。適当なインキュベーション時間の後、アルギニンを加えて、例えばサンプル中の尿素濃度を測定することによってアルギナーゼの酵素活性を決定する。試験化合物の阻害活性は、得られた結果を試験化合物にさらさなかった対照サンプルと比較することによって決定する。下記の実施例で示すように、０．５から４ｍｇ／ｍｌの間のタンパク質濃度で細胞溶解物の低速上清をまず調製することによりアルギナーゼの直接阻害を決定する。上清をＭｎＣｌ2とアルブミンとを含む活性化緩衝液と１：４の比率で混合し、アリコートを種々の濃度の可能性のある阻害化合物とともにインキュベートする。５５℃で２０分熱活性化した後、溶液を０．２５Ｍアルギニンとし、次いで３７℃で２０分インキュベートする。遠心によってタンパク質を除去するためにＴＣＡを加え、上清の尿素濃度をジアセチルモノキシムに基づく比色アッセイによって測定する。
５．２．活性化合物
上述のin vitroバイオアッセイを用いることにより、どの化合物が尿素および酸化窒素の生産ならびにアルギニン取り込みの阻害剤であるかを同定した。これらの実験結果は第７．２節にまとめてある。試験した２０の化合物のうち、化合物番号１、９、１３、１４、１５および１６の６つの化合物は１〜１０μＭ濃度で有効な阻害剤であった。化合物番号２、８、１１、１８および１９のさらに６つの化合物は１０〜１００μＭ濃度で有効であった。最も活性であると同定された化合物（化合物番号１４）を悪液質、ＮＯ媒介性炎症、内毒素誘導ショック、大脳梗塞形成および新生物の動物モデルでin vivoで用いた。これらの各モデルにおいて、化合物番号１４は有効であることが証明された（下記第１０、１１、１３、１５および１６節）。
５．２．１．化合物およびその合成
以下の記載において、ＧｈｙＣＨ−＝ＮＨ2（ＣＮＨ）−ＮＨ−Ｎ＝ＣＨ−であり、ＧｈｙＣＣＨ3−＝ＮＨ2（ＣＮＨ）−ＮＨ−Ｎ＝ＣＣＨ3−である。本発明の化合物は以下の２つの大きな属を含む。第１の属は以下の式をもつ化合物およびその塩からなる：
0003833245.tif 000002
式中、
Ｘ2＝ＧｈｙＣＨ−、ＧｈｙＣＣＨ3−またはＨ−；
Ｘ1、Ｘ’1およびＸ’2＝独立にＧｈｙＣＨ−またはＧｈｙＣＣＨ3−；
Ｚ＝非置換、モノ−またはジ−Ｃ−メチル置換、あるいはそのモノ−またはジ−不飽和誘導体である−ＮＨ（ＣＯ）ＮＨ−、−（Ｃ6Ｈ4）−、−（Ｃ5ＮＨ3）−または−Ａ−（ＣＨ2）n−Ａ−、ｎ＝２−１０；そして
Ａ＝独立に−ＮＨ（ＣＯ）−、−ＮＨ（ＣＯ）ＮＨ−、−ＮＨ−または−Ｏ−およびその塩。
合成を容易にするため、好ましい態様にはＡが単一の官能基である化合物を含む。本発明にはまた、上記の式と同じ化合物であって、Ｘ1およびＸ2＝Ｈ；Ｘ’1およびＸ’2＝独立にＧｈｙＣＨ−またはＧｈｙＣＣＨ3−；Ｚ＝−Ａ−（ＣＨ2）n−Ａ−、ｎ＝３−８；そしてＡ＝−ＮＨ（ＣＯ）−または−ＮＨ（ＣＯ）ＮＨ−およびそれらの塩である化合物を含む。さらに、Ｘ1およびＸ2＝Ｈ；Ｘ’1およびＸ’2＝独立にＧｈｙＣＨ−またはＧｈｙＣＣＨ3−；そしてＺ＝−Ｏ−（ＣＨ2）2−Ｏ−である化合物を含む。
本発明の属のさらなる例としては以下のものを含む：Ｘ2＝ＧｈｙＣＨ−、ＧｈｙＣＣＨ3−またはＨ−；Ｘ1、Ｘ’1およびＸ’2＝ＧｈｙＣＨ−またはＧｈｙＣＣＨ3−；そしてＺ＝−Ｏ−（ＣＨ2）n−Ｏ−、ｎ＝２−１０およびその塩である属；ならびにＸ2がＨ以外のものであり、Ｘ2がＸ1に対してメタまたはパラにあり、そしてＸ’2がＸ’1に対してメタまたはパラにある関連の属。Ｘ2＝ＧｈｙＣＨ−、ＧｈｙＣＣＨ3−またはＨ−；Ｘ1、Ｘ’1およびＸ’2＝ＧｈｙＣＨ−またはＧｈｙＣＣＨ3−；そしてＺ＝−ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−およびその塩である上記式の化合物；ならびにＸ2がＨ以外のものであり、Ｘ2がＸ1に対してメタまたはパラにあり、そしてＸ’2がＸ’1に対してメタまたはパラにある関連の属。
以下の式をもつ化合物も含まれる：
0003833245.tif 000003
式中、ｎ＝３−８；Ｘ2およびＸ’2＝ＧｈｙＣＨ−、ＧｈｙＣＣＨ3−またはＨ−；Ｘ1およびＸ’1＝ＧｈｙＣＨ−またはＧｈｙＣＣＨ3−；およびその塩；ならびにＸ2またはＸ’2またはその両方がＨ以外のものであり、Ｘ2またはＸ’2がそれぞれＸ1またはＸ’1に対してメタまたはパラにある関連の属。さらに以下の式をもつ化合物も含まれる：
0003833245.tif 000004
式中、Ｘ2およびＸ’2＝ＧｈｙＣＨ−、ＧｈｙＣＣＨ3−またはＨ−；Ｘ1およびＸ’1＝ＧｈｙＣＨ−またはＧｈｙＣＣＨ3−；そしてｎ＝２−１０およびその塩；ならびにＸ2またはＸ’2またはその両方がＨ以外のものであり、Ｘ2またはＸ’2がそれぞれＸ1またはＸ’1に対してメタまたはパラにある関連の属。
第２の主な属は以下の式をもつ化合物およびその塩からなる：
0003833245.tif 000005
式中、
Ｘ1、Ｘ2およびＸ3＝独立にＧｈｙＣＨ−またはＧｈｙＣＣＨ3−；
Ｘ’1、Ｘ’2およびＸ’3＝独立にＨ−、ＧｈｙＣＨ−またはＧｈｙＣＣＨ3−；Ｚ＝（Ｃ6Ｈ3）（ｍ1、ｍ2、ｍ3＝０のとき）またはＺ＝Ｎ（ｍ1、ｍ2、ｍ3＝独立に２−６のとき）；そしてＡ＝−ＮＨ（ＣＯ）−、−ＮＨ（ＣＯ）ＮＨ−、−ＮＨ−または−Ｏ−およびそれらの塩。
本発明の属のさらなる例としては、Ｘ’1、Ｘ’2およびＸ’3のいずれかがＨ以外のものであり、Ｘ1、Ｘ2およびＸ3からなる群の対応する置換基がそれぞれＸ’1、Ｘ’2およびＸ’3に対してメタまたはパラにある属；ｍ1、ｍ2、ｍ3＝０でＡ＝−ＮＨ（ＣＯ）ＮＨ−である属、ならびにｍ1、ｍ2、ｍ3＝２−６でＡ＝−ＮＨ（ＣＯ）ＮＨ−である属を含む。
本発明の化合物は２つの基本的反応により合成できる。当業者であればこれらの反応を用いて多数の変異体が合成できること、ならびにこれらの変異体がここに開示する化合物と共通の性質を有することを理解するであろう。
反応１は第１級または第２級アミンをもつ置換芳香族化合物、例えば３，５−ジアセチルアニリンを、ジオールジクロリド、例えばグルタリルジクロリドと反応させて対応するＮ，Ｎ’−ジフェニルアルカンジアミドを生成することからなる。”逆行（ｒｅｖｅｒｓｅｄ）”ジアミドも製造できる。アセチルおよびジアセチル安息香酸は、対応する置換トルエンとＫＭｎＯ4との反応により製造できる。次いで酸を標準法で活性化し、適当なα、ω−アルカンジアミンと反応させて逆行”ジアミド”を生成する。順行および逆行が混じったジアミドはペプチド合成の分野で公知の方法により合成できる。このようにして、Ｎ−ｔ−ブチルオキシカルボニルアミノ酸を置換アニリンと反応させ、次いで脱保護し、アミノ基を活性化置換安息香酸と反応させる。本明細書では特に記載しない限り、”−ＮＨ（ＣＯ）−”の記載は−（ＣＯ）ＮＨ−異性体を含むものとする。
この方法はジオールジクロリドに限定されない。トリオール化合物のトリクロリド誘導体もトリフェニルアルカントリアミドの合成に同様に使用できる。適当な三酸は環状の酸、例えば１，３，５−シクロヘキサントリカルボン酸（Aldrich Chem.Co.）、１，３，５−トリメチル，１，３，５−シクロヘキサントリカルボン酸（Kemp's triacid,Kemp and Petrakis,1981,J.Org.Chem.46:5140）、１，３，５−ベンジントリカルボン酸（Aldrich Chem.Co.）、および１，２，３−プロパントリカルボン酸（Sigma Chem.Co.）のような線状トリカルボン酸を含む。ジオールクロリドの代わりにトリクロロメチルクロロホルメートを用いて同様の反応を行い、ジフェニル尿素縮合生成物を得る。反応１に代わる反応として、１，２−ジブロモエタンなどの１，ｎ−ジブロモアルカンと、３−ヒドロキシアセトフェノンなどのモノヒドロキシアリーレンとを反応させて１，ｎ−（ｎ−アルカンジオキシ）ジアリーレンを生成することができる。
本発明の別の態様には、式：Ｈ2Ｎ−（ＣＨ2）n−ＮＨ−（ＣＨ2）q−ＮＨ2（式中、ｎ，ｑ＝２−６）および式：Ｙ−（（ＣＨ2）n−ＮＨ2）3［式中、ＹはＮ（ｎ＝２−６）、Ｃ（ＮＯ2）（ｎ＝３）、Ｃ−アルカン（ｎ＝１）、１，３，５−アダマンタントリイル（ｎ＝３）または１，３，５−ベンジントリイル（ｎ＝１−３）のいずれかである］のトリアミンの使用を含む。
本発明のさらに２つの態様では、アセチル−またはジアセチルアリールイソシアネートをアルカンジアミンと反応させるか、あるいはアセチル−またはジアセチルアリールアミンをアルカンジイルジイソシアネートと反応させてビス−ウレイド中間体を生成させ、これをアミノグアニジンと反応させてグアニルヒドラゾン最終生成物を製造する。必要なイソシアネートは市販されているか、あるいはトルエンまたはキシレン中、対応アミンをホスゲン、トリクロロメチルクロロホルメートまたはビス（トリクロロメチル）カーボネートと高温で反応させることにより合成できる。
反応２はアセトフェノンまたはベンズアルデヒド型部分をアミノグアニジンと反応させて縮合生成物を製造し、ここでイミノ結合（Ｎ＝Ｃ）したアミノグアニジンがアリーレンのケトンまたはカルボニル部分と置き換わってグアニルヒドラゾンを生成し、水分子の放出を伴う。
５．２．２．医薬製剤
その薬理的性質のために、本発明の化合物は悪液質、有害なＮＯ仲介性応答、梗塞、アルギニンを必要とする腫瘍または感染症に悩む患者の治療に使用できる。このような化合物はそれ自体で、または適当な担体または賦形剤と混合した医薬組成物で患者に投与できる。
全身投与に適した剤型に本発明を実施するためにここで開示された化合物を製剤化するために医薬的に許容しうる担体を使用することは、本発明の範囲に含まれる。適切に担体と製造法を選択することにより、本発明の組成物、特に溶液剤組成物は静脈内注射などにより非経口投与できる。当業界で公知の医薬的に許容しうる担体を用いて化合物は経口投与に適した剤型に容易に製剤化される。このような担体は本発明の化合物を治療すべき患者が経口摂取できるように錠剤、丸剤、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー、懸濁液などに調剤できる。
本発明の使用に適した医薬組成物は、活性成分が所望の目的を達成するための有効量で含まれている組成物を含む。有効量の決定は当業者には容易であり、特に本明細書の詳細な開示に照らせば容易である。
活性成分に加えて、医薬組成物には賦形剤および助剤を含む適当な医薬的に許容しうる担体を含み、これらは医薬的に使用される製剤への活性成分の加工を容易にする。経口投与用に調剤された製剤は錠剤、糖衣錠、カプセル、または液剤でありうる。
本発明の医薬組成物はそれ自体は公知の方法、例えば通常の場合、溶解、顆粒化、糖衣工程、浮遊化、エマルジョン化、カプセル化、封入または凍結乾燥などにより製造できる。
非経口投与用医薬製剤は水可溶性形態の活性化合物の水溶液を含む。さらに、活性化合物の懸濁液は適当な油性注射懸濁液として調剤される。適当な親油性溶媒またはビヒクルはゴマ油などの脂肪油、またはオレイン酸エチルやトリグリセリドなどの脂肪酸エステル、またはリポソームを含む。水性注射懸濁液はカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールまたはデキストランなどの懸濁液の粘性を増す物質を含んでよい。あるいは、懸濁液は、安定化剤または高濃度溶液の製剤を可能にするために化合物の溶解度を増す物質を含んでよい。
経口用医薬製剤は、活性化合物を固形賦形剤と混合し、得られる混合物を場合により粉末にし、所望の場合には適当な助剤を加えた後顆粒混合物を処理して錠剤または糖衣錠コアを得る。適当な賦形剤は、ラクトース、スクロース、マンニトールまたはソルビトールなどを含む糖類；例えばトウモロコシ澱粉、小麦澱粉、米澱粉、ジャガイモ澱粉、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムなどのセルロース調製物、および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などの充填剤である。所望するならば、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸またはアルギン酸ナトリウムのような塩を含む崩壊剤を添加してもよい。
糖衣錠コアには適当なコーティングを施してもよい。この目的のためには、場合によりアラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポル（ｃａｒｂｏｐｏｌ）ゲル、ポリエチレングリコール、および／または二酸化チタン、ラッカー溶液、および適当な有機溶媒または溶媒混合物を含む濃縮糖溶液を使用できる。識別のためにまたは活性化合物用量の異なる組み合わせを特徴付けるために染料または色素を錠剤や糖衣錠に添加してもよい。
経口投与に用いる医薬製剤はゼラチン製のプッシュフィット（push-fit）カプセル、ならびにゼラチンとグリセロールまたはソルビトールなどの可塑剤から製造される軟質の密封カプセルを含む。プッシュフィットカプセルは、ラクトースなどの充填剤、澱粉などの結合剤、および／またはタルクまたはステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤および場合により安定化剤と混合した活性成分を含む。軟質カプセルでは、活性化合物を脂肪油、液体パラフィンまたは液体ポリエチレングリコールなどの適当な液体に溶解または懸濁することができる。
５．３．化合物の用途
本発明の方法に用いる全ての化合物にとって、適当な用量とは、表Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩで報告するような該化合物について有効であると決定されたか、あるいは本明細書に記載の方法で決定されたＩＣ50を包含する循環濃度範囲を達成するような用量である。例えば、化合物番号１、９、１３または１５を悪液質、炎症、内毒素ショックまたは敗血症ショック、梗塞または新生物の治療に用いる場合には、選択した製剤が何であれ、投与量は約５μＭから１００μＭの間の血清濃度または循環血漿濃度を達成するのに十分なものであるべきである。化合物番号１４を悪液質、炎症、内毒素ショックまたは敗血症ショック、梗塞または新生物の治療に用いる場合には、選択した製剤が何であれ、投与量は約０．５μＭから１０μＭの間の血清濃度または循環血漿濃度を達成するのに十分なものであるべきである。実施例に示すように、悪液質治療に用いる化合物番号１４の１日の非経口投与量は約０．４ｍｇ／Ｋｇ、ＬＰＳ誘導毒性の治療に用いるには１．０ｍｇ／Ｋｇの１回の非経口用量がネズミモデルでは有効である。当業者であれば一定の投与経路に適した用量は当業者に公知の薬理学的方法を用いて決定できることを理解するであろう。
本発明の化合物を慢性炎症の治療に用いる場合には、上述の用量範囲を出発点として用いて標準的な薬理学的手法により用量を決定すべきである。急性炎症症状の治療には、別の態様では１回の大用量を投与してもよい。実施例に示すように、化合物番号１４では５．０ｍｇ／Ｋｇの１回の非経口投与量が急性症状を治療するのに有効であることが見いだされた。
６．実施例：活性化合物の合成
この節では本発明で有用な中間体および例示化合物の合成と精製を詳細に記載する。
６．１．中間体生成物の合成
以下の記載においてはアミジノヒドラゾンおよびグアニルヒドラゾンおよび（アミノイミノメチル）ヒドラゾノは同義語と理解されたい。
種々の長さのアルカン鎖によって置換アリーレン化合物を結合するために以下の反応を用いる。結合はアミド、フェノキシアルカンまたは尿素である。
６．１．１．Ｎ，Ｎ’−ビス（３，５−ジアセチルフェニル）ペンタンジアミド
ピリジン（０．４ｍＬ）を含むジクロロメタン（７ｍＬ）中の３，５−ジアセチルアニリン（５３１ｍｇ）をグルタリルジクロリド（０．１４１ｍＬ）で処理した。１時間後、濾過して水で洗浄してＮ，Ｎ’−ビス（３，５−ジアセチルフェニル）ペンタンジアミド、融点２４６−７℃を得た。
同様に、３，５−ジアセチルアニリンと対応のジオールジクロリドから以下の化合物を製造した：
Ｎ，Ｎ’−ビス（３，５−ジアセチルフェニル）ブタンジアミド、融点２９３−６℃；
Ｎ，Ｎ’−ビス（３，５−ジアセチルフェニル）ヘキサンジアミド、融点２６９−７０℃；
Ｎ，Ｎ’−ビス（３，５−ジアセチルフェニル）ヘプタンジアミド、融点２００−３℃；
Ｎ，Ｎ’−ビス（３，５−ジアセチルフェニル）オクタンジアミド、融点１８３−４℃；
Ｎ，Ｎ’−ビス（３，５−ジアセチルフェニル）ノナンジアミド、融点１７９−８０℃；
Ｎ，Ｎ’−ビス（３，５−ジアセチルフェニル）デカンジアミド、融点１９６−９℃；
Ｎ，Ｎ’−ビス（３，５−ジアセチルフェニル）ドデカンジアミド、融点１７８−９℃；
Ｎ，Ｎ’−ビス（３，５−ジアセチルフェニル）（イソフタル酸ジアミド）、融点２８３−４℃。同様にして、３−アミノアセトフェノンとグルタリルジクロリドからＮ，Ｎ’−ビス（３−アセチルフェニル）ペンタンジアミド、融点１７４−５℃を製造した。
６．１．２．Ｎ−（４−アセチルフェニル）−Ｎ’−（３，５−ジアセチルフェニル）尿素
トルエン（２０ｍＬ）中の４−アミノアセトフェノン（１．３５ｇ）をトリクロロメチルクロロホルメート（１．２ｍＬ）で処理した。混合物を２時間加熱還流した。３，５−ジアセチルアニリン（１．７７ｇ）を加えて混合物を１時間加熱還流し、次いで室温で１６時間放置した。生成物を濾取しエタノールで洗浄し、乾燥することによりＮ−（４−アセチルフェニル）−Ｎ’−（３，５−ジアセチルフェニル）尿素、融点２５１−２℃、０．９３ｇを得た。
６．１．３．１，２−ビス（３−アセチルフェノキシ）エタン
３−ヒドロキシアセトフェノン（８．４ｇ）と１，２−ジブロモエタン（５．０７ｇ）を水酸化カリウム（３．８３ｇ）で処理し、窒素下で２日間加熱還流した。混合物を冷却し水（２００ｍＬ）を加えて混合物を１時間撹拌した。沈殿を濾過し、イソプロパノールから再結晶して１，２−ビス（３−アセチルフェノキシ）エタン、融点１２０−１℃、１．２１ｇを得た。
６．１．４．１，５−ビス［（［（３，５−ジアセチルフェニル）−アミノ］カルボニル）アミノ］−２−メチルペンタン
１，５−ジイソシアネート−２−メチルペンタン（０．１８ｍＬ）を、触媒４−ジメチルアミノピリジン（１０ｍｇ）を含むジクロロメタン（７ｍＬ）中の３，５−ジアセチルアニリン（０．５３１ｇ）の懸濁液に加えた。混合物を２時間還流し、一晩放置した。濾過により白色結晶、融点１２４−１３０℃、０．３０ｇを得た。
６．１．５．トリス［２−（［（３ーアセチルフェニル）アミノ］カルボニルアミノ）エチル］アミン
ジクロロメタン（１０ｍＬ）中の３−アセチルフェニルイソシアネート（０．６０ｇ）をトリス（２−アミノエチル）アミン（０．１４６ｇ）と反応させた。激しい反応が起こり多量の白色にごり状物が得られた。メタノールを加えて混合物を再濃縮すると結晶性物質を生じ、これを濾過した。収量０．６１ｇ、融点１９３℃。
６．１．６．３，５−ジアセチルフェニルイソシアネートおよびＮ，Ｎ’−ビス（３，５−ジアセチルフェニル）尿素
氷浴中、撹拌しながら３，５−ジアセチルアニリン（３．０ｇ、１６．９ｍｍｏｌ）をトルエン（５０ｍＬ）中に懸濁した。トルエン（１０ｍＬ）中のビス（トリクロロメチル）カーボネート（１．６７ｇ、５．９ｍｍｏｌ）溶液を加えた。懸濁液を室温に戻し、室温で一晩撹拌した。次に混合物を４時間加熱還流し、冷却し、濾過してＮ，Ｎ’−ビス（３，５−ジアセチルフェニル）尿素、融点（分解）１３７−８℃（ガス発生）を１．１ｇ得た。濾液を蒸発させると３，５−ジアセチルフェニルイソシアネート、融点７１℃、２．２ｇが白色粉末として得られた。
６．２．中間体の最終生成物への変換
以下の反応は一般的縮合反応を説明する例示であり、ここではアミノグアニジンの第１アミンがアセトフェノンまたはベンズアルデヒドまたはケトンの酸素と置き換わりＨ2Ｏを生成し、グアニルヒドラゾンを形成する。一般に、全ての反応は水性アルコール中で酸触媒とともに高温で実施する。生成物は冷却時の、場合によっては石油エーテルまたはイソプロパノールの添加による再結晶で回収する。再結晶により精製を行った。
化合物４、図７Ａ．４：４−（［（アミノイミノメチル）ヒドラゾノ］メチル）桂皮酸塩酸塩：
８３％エタノール（２４ｍＬ）中、４−ホルミル桂皮酸（１．７６ｇ）とアミノグアニジン塩酸塩（１．２２ｇ）を２時間加熱した。冷却、濾過により４−（［（アミノイミノメチル）ヒドラゾノ］メチル）桂皮酸塩酸塩、融点２８５−８℃、２．５６ｇを得た。
化合物６、図７Ａ．６：２−（［（１Ｈ−イミダゾール−１−イル）−１，４−フェニレン］エチリジン）ヒドラジンカルボキシイミダミド塩酸塩：
８３％エタノール（１２ｍＬ）中、４−（１Ｈ−イミダゾール−１−イル）アセトフェノン（１．８６ｇ）とアミノグアニジン塩酸塩（１．２２ｇ）を４８時間加熱した。冷却、濾過により２−（［（１Ｈ−イミダゾール−１−イル）−１，４−フェニレン］エチリジン）ヒドラジンカルボキシイミダミド塩酸塩、融点２７５−６℃、２．６ｇを得た。
化合物７、図７Ａ．７：２−［（３，４−ジヒドロキシフェニル）エチリジン］ヒドラジンカルボキシイミダミド塩酸塩：
７５％エタノール（１６ｍＬ）中、３，４−ジヒドロキシアセトフェノン（３．０４ｇ）とアミノグアニジン塩酸塩（２．４４ｇ）を窒素下に４時間加熱した。冷却、濾過により２−［（３，４−ジヒドロキシフェニル）エチリジン］ヒドラジンカルボキシイミダミド塩酸塩、融点２４２−５℃、２．７ｇを得た。
化合物９、図７Ｂ．９：Ｎ−（４−アセチルフェニル）−Ｎ’−（３，５−ジアセチルフェニル）ウレアトリス（アミジノヒドラゾン）三塩酸塩：
８３％メタノール（１２ｍＬ）中、Ｎ−（４−アセチルフェニル）−Ｎ’−（３，５−ジアセチルフェニル）尿素（０．６７６ｇ）、アミノグアニジン塩酸塩（０．８３ｇ）およびアミノグアニジン二塩酸塩（０．０１ｇ）を１８時間加熱した。冷却、濾過によりＮ−（４−アセチルフェニル）−Ｎ’−（３，５−ジアセチルフェニル）ウレアトリス（アミジノヒドラゾン）三塩酸塩、融点２４７−２５３℃（分解）、０．８５ｇを得た。
化合物１０、図７Ｂ．１０：５−（１−［２−（アミノイミノメチル）ヒドラゾノ］エチル）サリチル酸塩酸塩：
８０％エタノール（２５ｍＬ）中、５−アセチルサリチル酸（３．６ｇ）とアミノグアニジン塩酸塩（２．４ｇ）を２時間加熱した。冷却、濾過により粗５−（１−［２−（アミノイミノメチル）ヒドラゾノ］エチル）サリチル酸塩酸塩、５．２ｇを得た。このうちの０．５８ｇをＮａＯＨ水溶液（ｐＨ１２．５）に溶解しＨＣｌ水溶液（ｐＨ２まで）で再沈殿させて精製し、５−（１−［２−（アミノイミノメチル）ヒドラゾノ］エチル）サリチル酸塩酸塩、融点３１２−３℃（分解）、０．４５ｇを得た。
化合物１２、図７Ｂ．１２：Ｎ，Ｎ’−ビス（３−アセチルフェニル）ペンタンジアミドビス（アミジノヒドラゾン）二塩酸塩：
メタノール（３５ｍＬ）中、Ｎ，Ｎ’−ビス（３−アセチルフェニル）ペンタンジアミド（３．６６ｇ）、アミノグアニジン塩酸塩（２．７５ｇ）およびアミノグアニジン二塩酸塩（０．０５ｇ）を１８時間加熱した。冷却、濾過によりＮ，Ｎ’−ビス（３−アセチルフェニル）ペンタンジアミドビス（アミジノヒドラゾン）二塩酸塩、融点１８７−１９１℃、５．４１２ｇを得た。
化合物１３、図７Ｂ．１３：Ｎ，Ｎ’−ビス（３，５−ジアセチルフェニル）ペンタンジアミドテトラキス（アミジノヒドラゾン）四塩酸塩：
９１％エタノール（４．４ｍＬ）中、Ｎ，Ｎ’−ビス（３，５−ジアセチルフェニル）ペンタンジアミド（０．４５ｇ）、アミノグアニジン塩酸塩（０．５５ｇ）およびアミノグアニジン二塩酸塩（０．０１ｇ）を１８時間加熱した。冷却、濾過によりＮ，Ｎ’−ビス（３，５−ジアセチルフェニル）ペンタンジアミドテトラキス（アミジノヒドラゾン）四塩酸塩、融点２９９−３０１℃、０．７９４ｇを得た。
化合物１４、図７Ｃ．１４：Ｎ，Ｎ’−ビス（３，５−ジアセチルフェニル）デカンジアミドテトラキス（アミジノヒドラゾン）四塩酸塩：
９１％エタノール（５．５ｍＬ）中、Ｎ，Ｎ’−ビス（３，５−ジアセチルフェニル）デカンジアミド（０．６５ｇ）、アミノグアニジン塩酸塩（０．６９１ｇ）およびアミノグアニジン二塩酸塩（０．０１ｇ）を１８時間加熱した。冷却、濾過によりＮ，Ｎ’−ビス（３，５−ジアセチルフェニル）デカンジアミドテトラキス（アミジノヒドラゾン）四塩酸塩、融点３２３−４℃（分解）、０．８７ｇを得た。
化合物１５、図７Ｃ．１５：２，２’−［１，２−エタンジイルビス（オキシ−３，１−フェニレンエチリジン）］ビスヒドラジンカルボキシイミダミド二塩酸塩：
９６％メタノール水溶液（６．２５ｍＬ）中、１，２−ビス（３−アセチルフェノキシ）エタン（０．８９４ｇ）、アミノグアニジン塩酸塩（０．８３ｇ）およびアミノグアニジン二塩酸塩（０．０１ｇ）を１８時間加熱した。冷却、濾過により２，２’−［１，２−エタンジイルビス（オキシ−３，１−フェニレンエチリジン）］ビス（ヒドラジンカルボキシイミダミド）二塩酸塩、融点３０３−７℃、１．３７８ｇを得た。
化合物１６、図７Ｃ．１６：３，３’−（エチレンジオキシ）ジベンズアルデヒドビス（アミジノヒドラゾン）二塩酸塩：
９６％エタノール（６．２５ｍＬ）中、３，３’−（エチレンジオキシ）ジベンズアルデヒド（１．０８ｇ）、アミノグアニジン塩酸塩（１．１０５ｇ）およびアミノグアニジン二塩酸塩（０．００５ｇ）を窒素下に１８時間加熱した。冷却、濾過により３，３’−（エチレンジオキシ）ジベンズアルデヒドビス（アミジノヒドラゾン）二塩酸塩、融点２６４−６℃、１．４２８ｇを得た。
化合物１７、図７Ｃ．１７：４，４’−（エチレンジオキシ）ジ−ｍ−アニスアルデヒドビス（アミノヒドラゾン）二塩酸塩：
９５％メタノール（１０．５ｍＬ）中、４，４’−（エチレンジオキシ）ジ−ｍ−アニスアルデヒド（０．９９ｇ）、アミノグアニジン塩酸塩（０．８２９ｇ）およびアミノグアニジン二塩酸塩（０．０１ｇ）を窒素下に１６時間加熱した。冷却、濾過により４，４’−（エチレンジオキシ）ジ−ｍ−アニスアルデヒドビス（アミノヒドラゾン）二塩酸塩、融点３２２−３℃（分解）、１．５２ｇを得た。
化合物１８、図７Ｃ．１８：３，３’−（トリメチレンジオキシ）ジ−ｐ−アニスアルデヒドビス（アミジノヒドラゾン）二塩酸塩：
９５％メタノール（１０．５ｍＬ）中、３，３’−（トリメチレンジオキシ）ジ−ｐ−アニスアルデヒド（１．０３２ｇ）、アミノグアニジン塩酸塩（０．８２９ｇ）およびアミノグアニジン二塩酸塩（０．０２ｇ）を１６時間加熱した。冷却、濾過により３，３’−（トリメチレンジオキシ）ジ−ｐ−アニスアルデヒドビス（アミジノヒドラゾン）二塩酸塩、融点２３３−５℃、１．３７２ｇを得た。
化合物１９、図７Ｃ．１９：１，４−ビス［２−（アミノイミノメチル）ヒドラゾノ］シクロヘキサン二塩酸塩：
水（５０ｍＬ）中、１，４−シクロヘキサンジオン（２．２４ｇ）、アミノグアニジン二炭酸塩（６．０ｇ）および濃塩酸（３．６７ｍＬ）を５分加熱した。溶液を冷却しイソプロパノール（５０ｍＬ）で処理した。結晶化が完了した後、濾過により１，４−ビス［２−（アミノイミノメチル）ヒドラゾノ］シクロヘキサン二塩酸塩、融点２６０℃（分解）、２．９１ｇを得た。
化合物２０、図７Ｃ．２０：２，２’−（１，４−ジフェニル−１，４−ブタンジイリデン）ビスヒドラジンカルボキシイミダミド二塩酸塩：
５０％エタノール（６０ｍＬ）中、１，２−ジベンゾイルエタン（４．７６ｇ）、アミノグアニジン二炭酸塩（５．４５ｇ）および濃塩酸（３．３３ｍＬ）を２４時間加熱した。冷却、濃縮、濾過により２，２’−（１，４−ジフェニル−１，４−ブタンジイリデン）ビス（ヒドラジンカルボキシイミダミド）二塩酸塩、融点２８５−６℃、４．３ｇを得た。
６．３．追加の例示化合物
化合物２１、図７Ｄ．２１：Ｎ，Ｎ’−ビス（３，５−ジアセチルフェニル）ブタンジアミドテトラキス（アミジノヒドラゾン）四塩酸塩：
９１％エタノール（５．５ｍＬ）中、Ｎ，Ｎ’−ビス（３，５−ジアセチルフェニル）ブタンジアミド（０．５４５ｇ）、アミノグアニジン塩酸塩（０．６９ｇ）およびアミノグアニジン二塩酸塩（０．０１ｇ）を１８時間加熱した。冷却、濾過によりＮ，Ｎ’−ビス（３，５−ジアセチルフェニル）ブタンジアミドテトラキス（アミジノヒドラゾン）四塩酸塩、融点３１４℃、０．９７ｇを得た。
化合物２２、図７Ｄ．２２：Ｎ，Ｎ’−ビス（３，５−ジアセチルフェニル）ヘキサンジアミドテトラキス（アミジノヒドラゾン）四塩酸塩：
９１％２−メトキシエタノール（５．５ｍＬ）中、Ｎ，Ｎ’−ビス（３，５−ジアセチルフェニル）ヘキサンジアミド（０．５８ｇ）、アミノグアニジン塩酸塩（０．６９ｇ）およびアミノグアニジン二塩酸塩（０．０１ｇ）を１８時間加熱した。熱いうちに濾過することによりＮ，Ｎ’−ビス（３，５−ジアセチルフェニル）ヘキサンジアミドテトラキス（アミジノヒドラゾン）四塩酸塩、融点（炭化）３２０−３３０℃、０．９３６ｇを得た。
化合物２３、図７Ｄ．２３：Ｎ，Ｎ’−ビス（３，５−ジアセチルフェニル）ヘプタンジアミドテトラキス（アミジノヒドラゾン）四塩酸塩：
９１％エタノール（４．４ｍＬ）中、Ｎ，Ｎ’−ビス（３，５−ジアセチルフェニル）ヘプタンジアミド（０．４７８ｇ）、アミノグアニジン塩酸塩（０．５５３ｇ）およびアミノグアニジン二塩酸塩（０．０１ｇ）を１８時間加熱した。冷却、濾過によりＮ，Ｎ’−ビス（３，５−ジアセチルフェニル）ヘプタンジアミドテトラキス（アミジノヒドラゾン）四塩酸塩、融点２７３−７℃、０．７３９ｇを得た。
化合物２４、図７Ｄ．２４：Ｎ，Ｎ’−ビス（３，５−ジアセチルフェニル）（イソフタル酸ジアミド）テトラキス（アミジノヒドラゾン）四塩酸塩：
２−メトキシエタノール／水の７：１混合物（１１．５ｍＬ）中、Ｎ，Ｎ’−ビス（３，５−ジアセチルフェニル）（イソフタル酸ジアミド）（０．７２６ｇ）とアミノグアニジン塩酸塩（０．８２９ｇ）を１８時間加熱した。冷却、濾過によりＮ，Ｎ’−ビス（３，５−ジアセチルフェニル）（イソフタル酸ジアミド）テトラキス（アミジノヒドラゾン）四塩酸塩、融点（炭化）３２２−３３０℃、０．５４ｇを得た。
化合物２５、図７Ｅ．２５：メタノール（５ｍＬ）中、３，３’−（ペンタメチレンジオキシ）ジ−ｐ−アニスアルデヒド（０．７４８ｇ）、アミノグアニジン塩酸塩（０．５５３ｇ）およびアミノグアニジン二塩酸塩（０．０１ｇ）を１８時間加熱した。冷却、濾過により３，３’−（ペンタメチレンジオキシ）ジ−ｐ−アニスアルデヒドビス（アミジノヒドラゾン）二塩酸塩、融点１９５−８℃、０．０８０ｇを得た。
化合物２６、図７Ｅ．２６：ピリジン（０．４５ｍＬ）を含むテトラヒドロフラン（１０ｍＬ）中の３，５−ジアセチルアニリン（０．８８５ｇ）溶液を塩化ベンゾイル（０．６５ｍＬ）で処理した。混合物を１時間撹拌し、次いで水１ｍＬで処理し、１５分撹拌した。次に混合物を水４０ｍＬで希釈し３０分撹拌した。濾過し、水とイソプロパノールで洗浄することによりＮ−ベンゾイル−３，５−ジアセチルアニリンの無色針状晶、融点１８８−１８９℃、１．３６ｇを得た。アミノグアニジン塩酸塩（０．７３ｇ）と少量のＨＣｌを含む８７．５％エタノール水溶液（８ｍＬ）中のＮ−ベンゾイル−３，５−ジアセチルアニリン（０．８４４ｇ）の懸濁液を１８時間加熱還流した。冷却、濾過によりＮ−ベンゾイル−３，５−ジアセチルアニリンビス（アミノヒドラゾン）二塩酸塩（化合物２６）、融点２６８−７２℃、１．３５７ｇを得た。
化合物２７、図７Ｅ．２７：水（８ｍＬ）中の３，５−ジアセチルアニリン（０．５３１ｇ）の懸濁液をシアナミド（０．１４３ｇ）と濃ＨＣｌ（０．２５ｍＬ）で処理し加熱還流した。２時間および４時間後にシアナミドをさらに０．０８０ｇずつ加えた。６時間後に混合物を減圧で濃縮し結晶性物質を分離し、濾過により灰色がかった白色固体、融点１２０−２℃、０．１１０ｇを得た。このうち、０．１０４ｇをアミノグアニジン二塩酸塩（０．０１ｇ）を含む８０％エタノール水溶液（２．５ｍＬ）中で、アミノグアニジン塩酸塩（０．１１２ｇ）で処理した。１８時間還流した後、冷却、濾過によりやや灰色がかった白色固体として（３，５−ジアセチルフェニル）グアニジンビス（アミジノヒドラゾン）三塩酸塩（化合物２７）、融点２７０−３℃、１３３ｍｇを得た。
化合物２８、図７Ｆ．２８：水（８ｍＬ）中の３，５−ジアセチルアニリン（０．５３１ｇ）の懸濁液をシアノグアニジン（０．２８５ｇ）と濃ＨＣｌ（０．２５ｍＬ）で処理し加熱還流した。６時間後に混合物を冷却、濃縮し、濾過により灰色がかった白色固体、融点２６０−７０℃（分解）、０．２４８ｇを得た。このうち、０．２３８ｇを９１％メタノール水溶液（５．５ｍＬ）中で、アミノグアニジン塩酸塩（０．２２１ｇ）と２４時間還流した。濾過により白色針状晶としてＮ−（３，５−ジアセチルフェニル）ビグアニドビス（アミジノヒドラゾン）三塩酸塩（化合物２８）、融点２９４−７℃、０．２９０ｇを得た。
化合物３１、図７Ｇ．３１：塩化メチレン（１０ｍＬ）中の４−アセチルフェニルイソシアネート（１．２ｇ）とトリス（２−アミノエチル）アミン（０．３００ｍＬ）を室温で３０分撹拌した。濾過によりトリス（２−［（［４−アセチルフェニル）アミノ］カルボニル）アミノ］エチル）アミン、融点１８９−９０℃、１．３５ｇを得た。このトリケトン（１．０ｇ）とアミノグアニジン二塩酸塩（０．７７ｇ）をメタノール（５ｍＬ）中４時間加熱した。エタノール（５ｍＬ）を加えて濾過により２水和物としてトリス（２−［（［４−アセチルフェニル）アミノ］カルボニル）アミノ］エチル）アミントリス（アミジノヒドラゾン）三塩酸塩（化合物３１）、融点２２４−５℃（分解）、１．０８ｇを得た。
化合物３２、図７Ｇ．３２：テトラヒドロフラン（５ｍＬ）中の３’−アミノアセトフェノン（０．４６６ｇ）と１，３，５−ベンゼントリカルボニルトリクロリド（０．２６６ｇ）を室温で３０分撹拌した。濾過によりＮ，Ｎ’，Ｎ”−トリス（３−アセチルフェニル）−１，３，５−ベンゼントリカルボキサミド、融点２７０℃、０．５００ｇを得た。このトリケトン（１．０ｇ）とアミノグアニジン二塩酸塩（０．８７ｇ）を２−メトキシエタノール（５ｍＬ）中４時間加熱した。冷却、濾過により２−メトキシエタノール１分子との溶媒和物としてＮ，Ｎ’，Ｎ”−トリス（３−アセチルフェニル）−１，３，５−ベンゼントリカルボキサミドトリス（アミジノヒドラゾン）三塩酸塩（化合物３２）、融点２７０−５℃（分解）、１．４ｇを得た。
化合物３３、図７Ｇ．３３：４’−アミノアセトフェノンからトリケトンＮ，Ｎ’，Ｎ”−トリス（４−アセチルフェニル）−１，３，５−ベンゼントリカルボキサミド、融点３１０℃を介して同様にして合成し、２−メトキシエタノール３分子との溶媒和物としてＮ，Ｎ’，Ｎ”−トリス（４−アセチルフェニル）−１，３，５−ベンゼントリカルボキサミドトリス（アミジノヒドラゾン）三塩酸塩（化合物３３）、融点２９５−３００℃（分解）（徐々に加熱）を得た。
化合物３４、図７Ｈ．３４：塩化メチレン（５ｍＬ）中の３，５−ジアセチルフェニルイソシアネート（０．６ｇ）とトリス（２−アミノエチル）アミン（０．１３ｇ）を室温で３０分撹拌した。濾過によりトリス（２−［（［（３，５−ジアセチルフェニル）アミノ］カルボニル）アミノ］エチル）アミン、融点１９７−８℃、０．６ｇを得た。このヘキサケトン（０．４７ｇ）とアミノグアニジン二塩酸塩（０．６１ｇ）をメタノール（５ｍＬ）中で４時間加熱した。冷却、濾過により２水和、半エタノール和物としてトリス（２−［（［（３，５−ジアセチルフェニル）アミノ］カルボニル）アミノ］エチル）アミンヘキサキス（アミジノヒドラゾン）七塩酸塩（化合物３４）、融点２４５−６℃（分解）、０．８６ｇを得た。
化合物３５、図７Ｈ．３５：テトラヒドロフラン（５０ｍＬ）中の４−アセチルフェニルイソシアネート（３ｇ）とトリス（３−アミノプロピル）アミン（１．０６ｇ）を３０分撹拌した。エタノール（１００ｍＬ）を加えて混合物を室温で一晩放置した。濾過によりトリス（３−［（［（４−アセチルフェニル）アミノ］カルボニル）アミノ］プロピル）アミン、融点１８４−５℃、２．８ｇを得た。このジケトン（０．４ｇ）とアミノグアニジン二塩酸塩（０．２９ｇ）をメタノール（３ｍＬ）中で４時間加熱した。エタノール（３ｍＬ）を加えて濾過により２水和、エタノール和物としてトリス（３−［（［（４−アセチルフェニル）アミノ］カルボニル）アミノ］プロピル）アミントリス（アミジノヒドラゾン）三塩酸塩（化合物３５）、融点２０９−１０℃（分解）、０．５ｇを得た。
化合物３６、図７Ｈ．３６：テトラヒドロフラン（５ｍＬ）中の３，５−ジアセチルフェニルイソシアネート（０．４ｇ）とトリス（３−アミノプロピル）アミン（０．１２ｇ）を室温で３０分撹拌した。濾過によりトリス（３−［（［（３，５−ジアセチルフェニル）アミノ］カルボニル）アミノ］プロピル）アミン、融点１４７−８℃、０．３２ｇを得た。このヘキサケトン（０．４ｇ）とアミノグアニジン二塩酸塩（０．４９ｇ）をメタノール（３ｍＬ）中で４時間加熱した。エタノールを加え、濾過により２水和、半エタノール和物としてトリス（３−［（［（３，５−ジアセチルフェニル）アミノ］カルボニル）アミノ］プロピル）アミンヘキサキス（アミジノヒドラゾン）七塩酸塩（化合物３６）、融点２５０−１℃（分解）、０．５８ｇを得た。
化合物３７、図７Ｉ．３７：塩化メチレン（５ｍＬ）中の３−アセチルフェニルイソシアネート（１ｇ）と４’−アミノアセトフェノン（０．８４ｇ）を室温で３０分撹拌した。濾過により３，４’−ジアセチル−Ｎ，Ｎ’−ジフェニル尿素、融点２５２−３℃（分解）、２．０ｇを得た。このジケトン（０．６ｇ）とアミノグアニジン二塩酸塩（０．６５ｇ）をエタノール（５ｍＬ）中で加熱した。冷却、濾過により半水和物として３，４’−ジアセチル−Ｎ，Ｎ’−ジフェニルウレアビス（アミジノヒドラゾン）二塩酸塩（化合物３７）、融点２４３−４℃（分解）、０．８ｇを得た。
化合物３８、図７Ｉ．３８：塩化メチレン（５ｍＬ）中の３−アセチルフェニルイソシアネート（０．２７ｇ）と３，５−ジアセチルアニリン（０．３ｇ）を室温で３０分撹拌した。濾過により３，３’，５’−トリアセチル−Ｎ，Ｎ’−ジフェニル尿素、融点２２３−４℃、０．５ｇを得た。このトリケトン（０．３４ｇ）とアミノグアニジン二塩酸塩（０．４９ｇ）をエタノール（５ｍＬ）中で４時間加熱した。冷却、濾過により水和物として３，３’，５’−トリアセチル−Ｎ，Ｎ’−ジフェニルウレアトリス（アミジノヒドラゾン）三塩酸塩（化合物３８）、融点２４５℃（分解）、０．６ｇを得た。
化合物３９、図７Ｉ．３９：Ｎ，Ｎ’−ビス（３，５−ジアセチルフェニル）尿素（０．３８ｇ）、アミノグアニジン塩酸塩（０．４４ｇ）およびアミノグアニジン二塩酸塩（５９ｍｇ）を２−メトキシエタノール（５ｍＬ）中、９０−１００℃で６時間加熱した。冷却、濾過により２．５水和、半メタノール和物としてＮ，Ｎ’−ビス（３，５−ジアセチルフェニル）ウレアテトラキス（アミジノヒドラゾン）四塩酸塩（化合物３９）、融点２６３−４℃（分解）、０．６６ｇを得た。
化合物４０、図７Ｉ．４０：９５％エタノール（２．５ｍＬ）中、Ｎ，Ｎ’−ビス（３，５−ジアセチルフェニル）ノナンジアミド（０．１００ｇ）、アミノグアニジン塩酸塩（０．１１５ｇ）およびアミノグアニジン二塩酸塩（３ｍｇ）を５時間加熱還流した。冷却、濾過により２水和物としてＮ，Ｎ’−ビス（３，５−ジアセチルフェニル）ノナンジアミドテトラキス（アミジノヒドラゾン）四塩酸塩（化合物４０）、融点２９５−６℃、０．１８ｇを得た。
化合物４１、図７Ｊ．４１：９５％エタノール（２．５ｍＬ）中、Ｎ，Ｎ’−ビス（３，５−ジアセチルフェニル）ドデカンジアミド（０．１００ｇ）、アミノグアニジン塩酸塩（０．１１５ｇ）およびアミノグアニジン二塩酸塩（３ｍｇ）を時間加熱した。冷却、濾過により４水和物としてＮ，Ｎ’−ビス（３，５−ジアセチルフェニル）ドデカンジアミドテトラキス（アミジノヒドラゾン）四塩酸塩（化合物４１）、融点２６８−９℃、０．０７０ｇを得た。
化合物４２、図７Ｊ．４２：４−ジメチルアミノピリジン（５ｍｇ）を含む塩化メチレン（７ｍＬ）中の３，５−ジアセチルアニリン（０．３５４ｇ）の懸濁液を、２−メチル−１，５−ペンタンジイルジイソシアネート（０．１８ｍＬ）で処理した。２時間加熱還流した後、混合物を冷却した。少量をｔ−ブチルメチルエーテルで処理して種晶を作り、これを反応混合物に加えた。数時間撹拌した後、濾過により１，５−ビス［（［（３，５−ジアセチルフェニル）アミノ］カルボニル）アミノ］−２−メチルペンタン、融点１２８℃、０．１２０ｇを得た。このテトラケトン（０．１００ｇ）、アミノグアニジン塩酸塩（０．１１５ｇ）およびアミノグアニジン二塩酸塩（３ｍｇ）を９５％エタノール（２．５ｍＬ）中で１８時間加熱した。冷却、濾過により４水和物として１，５−ビス［（［（３，５−ジアセチルフェニル）アミノ］カルボニル）アミノ］−２−メチルペンタンテトラキス（アミジノヒドラゾン）四塩酸塩（化合物４２）、融点２５８−９℃、０．１６ｇを得た。
化合物４３、図７Ｊ．４３：９５％エタノール（２．５ｍＬ）中、Ｎ，Ｎ’−ビス（３，５−ジアセチルフェニル）オクタンジアミド（０．１００ｇ）、アミノグアニジン塩酸塩（０．１１５ｇ）およびアミノグアニジン二塩酸塩（１０ｍｇ）を２０時間加熱した。冷却、濾過により２．５水和物としてＮ，Ｎ’−ビス（３，５−ジアセチルフェニル）オクタンジアミドテトラキス（アミジノヒドラゾン）四塩酸塩（化合物４３）、融点３０８−９℃、０．１７ｇを得た。
７．実施例：尿素およびNO OUT PUTに対する全細胞阻害検定
本節は本発明の化合物が活性化されたマクロファージ中の尿素合成を阻害する能力を測定するための組織培養検定の方法および結果を詳細に述べる。
７．１．材料と方法
RAW264.7細胞を10％のＦＢＳを含むRPMI 1640中、他の点では標準の培養条件のもとで、微小培養ウェルに１×106/mlの濃度でまき、５時間付着させる。次いで、これら細胞を、試験対象の阻害剤の存在下で25U/mlのγＩＦＮおよび0.1μg/mlのＬＰＳを用いて活性化した。18時間培養後、培養液上清中に存在する尿素濃度は、分取した培養上清について、血中尿素の窒素ジアセチルモノキシム比色検定法（Sigma Chem.Co.St.Louis,MO）を実施することによって決定し、阻害は、添加した阻害物の濃度がゼロであることを除いて同一の処理を行った対照培養中の尿素に対する尿素の百分比として表した。
亜硝酸塩の産生は同一の培養上清の比色検定によって定量した。簡単には、１％（W/V）スルファニルアミド、0.1％ナフチルエチレンジアミンジ−HCl（Griess Reagent）、2.5％H3PO4を含む試験溶液および培地の一部を４：１に混合し、10分間インキュベート後、560nmにおける吸収を測定した。この亜硝酸塩の濃度はNaNO3を用いて調製標準曲線を補間して得た。
種々の濃度の試験用化合物を、刺激したRAW264.7細胞の培養培地中に含ませた。活性化培養18時間後の尿素および／または亜硝酸塩の濃度は、少なくとも一つの対照培養から得られた非阻害対照値と比較して決定した。阻害剤の各濃度について減少率（fractional reduction）を計算し、ＩＣ50（50％減少を与える濃度）を補間して得た。化学部は温和に加熱（60℃）して培地に溶解させた。溶解性の乏しい化合物は塩基に溶かした。完全に可溶性ではないこれらの化合物のストック溶液の濃度はＯＤ280によって決定した。
試験化合物が細胞死をもたらすことがある場合、その程度を決定するために、培養上清を細胞内酵素である乳酸脱水酵素（ＬＤＨ）の存在について検定を行った。これよりここに報告する実施例中、試験化合物によるそのような細胞毒性は観察されなかった。
７．２．結果
グアニルヒドラゾン化合物が尿素生成を阻害する能力を測定する試験結果を表Ｉ、IIおよびIIIに示した。表Ｉに示した最も強力な化合物は、ＩＣ50が10μM以下であった。最も活性な化合物はテトラグアニルヒドラゾンデガンジアミド（化合物番号14）であった。同じく、きわめて活性な化合物は上記化合物のペンタンジアミド（化合物番号13）、エタンジオキシビス（グアニルヒドラゾン）、（化合物番号16）；混合尿素ビス（グアニルヒドラゾン）（化合物番号９）；およびトリアセチルベンジントリス（グアニルヒドラゾン）（化合物番号１）である。
一つまたは二つのフェニル核をもつ化合物は強い効果をもつ。二つの核が存在する場合、これが尿素、ジアミドまたはアルカンジオキシ官能基によって連結されていると効果がある。単一のグアニルヒドラゾン官能基をもつ化合物は効果がより小さい。
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８．実施例：アルギニンとり込みの全細胞阻害検定
本節は、本発明の化合物が活性化されたマクロファージによるアルギニンのとりこみを阻害する能力を測定するための組織培養検定の方法および結果を詳細に述べる。
８．１．材料と方法
RAW264.7細胞を96ウェルの標準の微小培養プレートに106/ウェルの濃度でまき、２時間から一夜接着させる。次いで培地を試験対象の化合物を含む培地で置換する。一時間後、培地に25U/mlのγＩＦＮおよび0.1μg/mlのＬＰＳとなるように添加し、さらに培養を続ける。次いで0.1％グルコースを含むHEPES−緩衝クレブス（Krebs）塩溶液で細胞を２回洗浄する。担体不含のテトラ−3Ｈ−アルギニンを各ウェルに加え（2.5μCi/ウェルで69m Ci/mmolの比活性）、５分間アルギニンの能動的とり込みを行わせ、その後外部に付着した放射性標識を除去するために10mMの非標識アルギニンを含む氷冷した生理食塩水で洗浄することによって細胞を０℃に急冷する。洗浄した細胞の内容物を100μlの蟻酸で溶解し、標準方法によって測定した。インキュベーション時間の関数で表わしたテトラ−3Ｈ−アルギニンのとり込み量を図６に示した。阻害物の活性を決定するための以下の実験ではインキュベーションは８時間にわたって行った。
８．２．結果
活性化マクロファージにおける尿素産生を抑制する最も活性の強い本発明の化合物のテストを行い、アルギニンのとり込みに対するその効果を決定した。7.2.節の表Ｉに示した結果は、活性のある化合物の夫々は、尿素産生を有効に阻害するのと同様の投与量でとり込みを有効に阻害することを示している。これらのデータは、アルギニン輸送タンパク質がこれら化合物の作用の標的となっていることを示唆している。
９．実施例：アルギナーゼ阻害アッセイ
本節は、本発明の化合物がマクロファージより得たアルギナーゼの活性を阻害する能力を測定するための無細胞アッセイの方法および結果を詳細に述べる。
９．１．材料と方法
50mM HEPES、１％NP-40、0.1mg/mlフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）および１μg/mlのアプロチニンを含む溶解バッファーを添加することにより作製した洗浄RAW264.7の細胞溶解液から、1200ｇ×２分の遠心上清を得た。上清の容量を、タンパク質濃度が２〜４mg/mlとなるように調整した。上清と試験に供する各種濃度の阻害剤を含む活性化バッファー（30mM MnCl2、0.3Mグリシン、１％ＢＳＡ、pH9.8）中における上清の１：４の混合物を55℃で20分間インキュベーションした。アルギナーゼ活性は、上記溶液と0.375Mアルギニン（pH9.8）との１：２の混合物を37℃で10分間混合して測定した。
９．２．結果
細胞性尿素産生の抑制に対して最も活性な６つの化合物をテストに用い、どれが上記細胞溶解液アッセイにおけるアルギナーゼの活性を阻害しうるか否かを検討した。結果は、用いた濃度と条件のもとでは、アルギナーゼは本発明の化合物の阻害作用に感受性をもたないことを示す。
10．実施例：in vivoでの悪液質の治療
化合物番号14の全身的窒素の逸失を減少させる効果を直接に試験するために、腫瘍関連のタンパク質異化疾病（悪液質）の動物モデルを採用した。15×166のAtT-20細胞を筋肉内に接種することによって適当なグループに対して腫瘍を導入した。このモデルは正常な摂食を行うが14日以内に全身のタンパク質に正味20％の減量を生ずることにより特徴づけられるタンパク質異化病を惹き起こすものとして知られている。化合物14の一日の投与量0.4mg/kgを、“処置”グループに対し腹腔に投与した。14日間にわたって尿試料を採取する便を図るために、ヌードマウス（nu/nu）を代謝ケージ（metabolic cages）で餌育した（４匹／ケージ）。食物の摂取は毎日計量した。動物を４グループに分けた。それらは１）腫瘍をもたない無処置の対照グループ、２）腫瘍をもつ、無処置のグループ、３）腫瘍をもつ、処置グループ、４）腫瘍をもたない処置グループである。尿を採取し、尿中の尿素の損失を定量した。
結果は表IVにまとめた（mg尿素／グループとして表わした）：
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本実験の期間中、すべてのグループの食物摂取量は同程度（16±２g/日）であった。
データは、化合物14が通常悪液質と結びついている尿への過剰な尿素の排出を防ぐことを示している。
尿素の損失は全身の窒素損失の80％を占め、また、すべてのグループにおける窒素の摂取量が同様であるので、これらのデータはさらに、化合物14が全身の窒素保持を増強させることを示唆する。
これらの観察のもつ意義は、この窒素の損失が筋肉総量に対してもつ影響を測定することによって明らかにされる。化合物14は14日間にわたり約200mg/マウスの尿素の損失を防いだ。これは化合物14による処置によって保持された、約100mgの窒素、625mgのタンパク質、または2.7gの筋肉湿重と等価である。
11．実施例：in vivoにおける炎症の治療
化合物番号14の抗炎症剤としての効果を直接に試験するために、炎症の標準動物モデルを用いた。刺激性カラギーナンをマウスの足裏に注射することによって誘起される足の腫れは、1960年代初期より臨床的に有用な抗炎症剤の検出のために用いられてきた。
足の浮腫は、C3H/HeNマウスの左後足の足裏表面に、HEPES 25mM、pH7.4中の１％ラムダ−カラギーナンを50μl注射することによって誘起させた。右足には50μlのHEPESのみを注射した。マウスは二つのグループに分けられた。対照（ｎ＝３）グループは足への注射1.5時間前に、ビヒクルのみを腹腔内投与された。実験グループ（ｎ＝４）は、足への注射1.5時間前に、化合物番号14の５mg/kgを腹腔内に投与した。足への注射３時間後、ノギスを用いて足の厚さを計測した。データはHEPES注射の足の厚さに対するカラギーナン注射の足の厚さの変化として表わした。
結果は表Ｖにまとめた。当表は３匹の対照および３匹の化合物番号14処理のマウスの足の厚さをmmで表わしたカラギーナン誘導の増大を含んでいる。阻害は、標準の数式によって定義される肥大の％阻害としても報告することができる。即ち、
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化合物番号14が腫脹を抑制した処理マウスについてこのパラメーターを計算すると、70％阻害という値を得る。
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図８は、同一のアッセイにおけるさまざまな投与量の化合物番号14の効果を示すものである。kg体重あたり１から10mgの間の投与量が足の腫脹の阻害に有効であることをデータは示している。
これらのデータは、化合物番号14が炎症を防ぐことを示している。これは炎症細胞におけるアルギニン輸送依存の酸化窒素産生の阻害によって媒介されると考えられている。
12．実施例：化合物番号14は内皮由来の弛緩因子によって媒介される血管拡張反応には効果がない
マクロファージの酸化窒素の産生によって惹き起こされる血管の損壊および低血圧を制御するために用いる薬剤の重要な必要条件は、これがin vivoにおいてＥＤＲＦの活性を妨害しないということである。そのような妨害は制御することのできない高血圧の原因となり得、またＮＯシンターゼの阻害剤の有効な臨床的利用を妨げる。我々は動物モデルにおける化合物番号14のＥＤＲＦ活性に対する効果を測定し、化合物番号14が酸化窒素産生を阻害するがＥＤＲＦ活性は阻害しないことを見出した。
メスのSprague-Dawleyラット（225〜250g体重）をネンブタール（50mg/kg,i.p.）で麻酔し、気管チューブを挿入し、ポリエチレンチューブ（PE 50）を用い、標準の方法によって頸動脈および頸静脈にカニューレを挿入する（Tracey,K.J.,et al.,1986,SCIENCE 234,470-474）。血圧は、圧力トランスデューサーおよびレコーダー（モデルRS-3200,Gould Inc.）によって連続的に記録した。ここに示した実験に於いては、ラットは、滅菌したＮG−メチル−Ｌ−アルギニン（NMA:Sigma;10mg/kg）、化合物番号14（50mg/kg）、またはビヒクル（0.4ml）のいずれか１つの動脈内への一回投与を受けた。ＬＰＳを含まない滅菌水で希釈したアセチルコリン（ACh）を、指示した投与量で頸静脈カニューレを通して投与した。この溶液は１ml/kg体重という一定の注入可能な容量になるよう希釈した。
低血圧症（ＥＤＲＦ）の反応は、ACh投与の30秒後に記録された平均の動脈血圧の減少として測定された。アセチルコリンの各投与量について試験されたラットの数は、各実験条件につき４〜６匹である。データは平均±s.e.m.として表わした。
ＥＤＲＦ活性はＮＭＡによって阻害された。これはビヒクル処理の対照に比較して血圧が減衰することによって証明される（図９；またKilbourn,R.G.,et al.,1990,Proc.Natl.Acad.Sci.87,3629-3632参照）。これと対照的に、化合物番号14は、in vivoにおいてアセチルコリン誘導のＥＤＲＦ活性を抑制せず、化合物番号14処理のラットは、内皮由来のＮＯ活性のための機能的能力を維持していたことを示す。
13．実施例：化合物番号14は致命的なエンドトキシンショックを防ぐ
リポ多糖体（ＬＰＳ）の致死的な毒性を防御する化合物番号14の効果を評価するための実験を行った。BALB/cマウスに対し72時間以内に50％の致死率をもたらすようにＬＰＳを投与した（図10）。BALB/cマウス（19〜21g）に対し13.75mg/kgのＬＰＳ（E.coli 0111:B4;Sigma）を腹腔内に注射した（0.2ml/マウス）。ＬＰＳストック溶液（10mg/ml）を先ず20分間超音波処理し、ＬＰＳを含まない水に希釈し（1.375mg/ml）、次いで注射直前に10分間再び超音波処理を行った。化合物番号14（１mg/kg,i.p.）の投与はＬＰＳの1.5時間前に行った。化合物番号14の注射液は、定量的な発色性のリムルス・アメボサイト・ライゼートテスト（BioWhittaker,Walkersville,MD）による測定ではＬＰＳを含まなかった。データのポイントはグループあたり10匹のマウスよりなる二グループから得たものである。
ＬＰＳ投与の1.5時間前に投与した化合物番号14は致死性を減少させた。データは、独立比についてのＺテストを用いて統計的分析にかけた。対照と化合物番号14との間の差異は有意であった（１-テイルP値＜0.05；Ｚ＝1.95）。
化合物番号14のみの投与を受けたマウスについて全身的な毒性を示す顕著な兆候はみられなかった。ＬＰＳ投与後、対照マウスは活気がなく、運動性を失い、背を丸めて身を寄せ合った。このようなＬＰＳ毒性の目に見える兆候は、化合物番号14によって著しく抑制された。すべてのマウスについて下痢が見られたが、これは化合物番号14によって抑制されなかった。
これまでに入手可能なＮＯＳ阻害剤は、エンドトキシン中毒に対する生存率を高めるうえでは見るべき成果は得られなかった。それは、これら阻害剤がＥＤＲＦをも区別せずに抑制してしまうことが原因の一つとなっている。Cobb,J.P.,1992,J.Exp.Med.176:1175-1182;Minnard,E.A.,1994,ARCH.SURG.129:142-148;Billiar,T.R.,1990,J.Leukocyte.Biol.48:565-569.エンドトキシン中毒期間中のＥＤＲＦの抑制は、血管収縮および臨界血管床（critical vascular beds）への血流の減少を惹き起こす。本データは、内皮由来のＮＯ反応を保持させる物質を用いてサイトカイン誘導性のマクロファージＮＯを阻害することは、敗血症ショック期間中の生存率を高めることができる利点をもつことを示す。
14．実施例：化合物番号14はサイトカインおよびＮＯの産生を防ぐ
本節は、本発明の化合物が活性化されたマクロファージによるＴＮＦの産生を阻害する能力を測定するための組織培養アッセイの方法および結果を詳細に述べるとともに、これに限定するものではなく、説明の目的のために化合物番号14が、アルギニンとり込みの阻害とは独立の機構によるＴＮＦの分泌の阻害に有効であることを示す。
RAW264.7細胞を、標準の６ウェルの培養プレートに106/ウェルの濃度でまき、２時間から一夜の間で付着させた。次いで、この培地をテストすべき化合物を含む培地で置換した。一時間後、培地に25U/mlのγＩＦＮおよび0.1μg/mlのＬＰＳを含むように加え、培養をさらに18時間続行した。次いで培地を採取し、細胞破片を遠心分離によって除去した。この馴らし上清について、標準の方法を用いてＴＮＦの存在を検定した。それらはL929細胞の細胞毒性バイオアッセイ、ラジオイムノアッセイまたはＥＬＩＳＡ、およびマウスＴＮＦに対する抗体を用いたウエスタンブロットなどである。
図11は、化合物番号14の増加した量の存在下では、RAW264.7細胞によるL929細胞バイオアッセイで定量した生物活性のあるＴＮＦの産生が抑えられることを示す。10μMの化合物番号14では、培養液中におけるＴＮＦの蓄積が99％以上減少したことをデータは示している。図12は、５および25μMの濃度の化合物番号14を用いて培養した細胞の培地にＴＮＦが存在しないことを示すウエスタンブロットである。化合物番号14で処理した細胞がＴＮＦ分泌能を失うことは、化合物番号14によるＮＯ合成の阻害のみに帰することはできない。ＮＯＳ阻害剤である、Ｎ−メチル−アルギニン（ＮＭＡ）は、10μMという濃度でも、この系におけるＴＮＦの産生を阻害しない。ＴＮＦ産生の阻害はまた、アルギニン輸送の遮断によってもたらされるアルギニンの減少による効果に帰することもできない。図13Ａは、化合物番号14が５μMの濃度でＮＯ合成の阻害剤として機能するが、この阻害は培地中に存在する50〜100μMのアルギニンによって部分的に回復することができた。これとは対照的に、図13Ｂのデータは、５μMの化合物番号14のＴＮＦ分泌に対する効果は、１mMの細胞外アルギニンと同量にしても低下しないことを明らかに示している。これらの結果は、アルギニンには決定的に依存しないある機構によって活性化されたマクロファージからのＴＮＦの産生を化合物番号14が特異的に阻害することを示している。
ＬＰＳの非経口的な投与によってＴＮＦを産生するよう刺激されたラットにおける血清ＴＮＦレベルの測定によって、質的に同様なデータが得られている。ＬＰＳ刺激の二時間前に、化合物番号14をラットに腹腔投与した。ＬＰＳ刺激後２〜３時間の間にＴＮＦの血清中のレベルを測定した。化合物番号14で処理したラットの血清ＴＮＦレベルは、非処理の対照ラットにおけるものの約半分のみであった。
ヒト末梢血を単球の起源として用い、ＴＮＦの他に、たとえばＩL-６およびマクロファージの炎症タンパク質-１αおよび-１β（ＭＩＰ-１αおよびＭＩＰ-１β）などのさまざまなサイトカインについて同様な結果が得られた。ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、“FICOLL▲Ｒ▼”に基づいた方法を用いて単離し、これを標準の６ウェルの培養プレートに106/ウェルでまき、２時間から一夜付着させ、非付着細胞は洗い流し、培地をテストすべき化合物を含んだ培地で置換した。１時間後、培地に25U/mlのγＩＦＮおよび0.1μg/mlのＬＰＳを含むように加え、さらに18時間培地をインキュベートした。次いで培地を採取し、細胞破片を遠心分離によって除去した。この馴らし上清について、L929細胞の細胞毒性バイオアッセイおよびイムノアッセイ（ELISA）の標準方法を用いてサイトカインの存在をアッセイした。結果は、この系でテストすると、化合物番号14は約10−20μMの濃度で、ヒトＰＢＭＣ細胞によるＴＮＦ，ＩＬ-６，ＭＩＰ-１α、およびＭＩＰ-１βの産生を有効に阻害した。図14Ａ-Ｄは、１〜20μMの化合物番号14の増加した量の存在下では、ヒトＰＢＭＣ細胞培養によるこれらサイトカインの産生が妨げられたことを示している。
15．実施例：化合物番号14は巣状脳梗塞に対する防護作用をもつ
本節は化合物番号14が脳梗塞（「脳卒中」としても知られる）を治療する能力を測定するための動物モデルの方法および結果を詳細に述べる。
Lewisラット（オス、270−300g）に、手術前後に任意に水と餌を与えた。ラットにケタミン（120mg/kg i.m.）を与えて麻酔し、自然呼吸を行わせ、加温毛布で体温を35.5−36.5℃に保った。前頸部および右眼と右耳の間の領域を剃毛した。前頸部正中切開を行い左総頸動脈（ＣＡＡ）を露出させ、これを迷走神経を保存しつつ周囲の組織が混入しないよう分離した。以後の操作に備えて、４−０絹糸でこの動脈の周囲をとりまいた。次いで右総頸動脈を露出させ、これを二重の４−０絹糸結紮によって恒久的に閉塞させた。
開頭術を施すために、外耳道および右眼角を結ぶ線に直交する１cmの切開を行った。解剖顕微鏡を用いて、頬骨と側頭骨の融合部の頭側ほぼ２cmの部位に穿孔した１mmの穴から右中大脳動脈を露出させた。穿孔は常用の生理食塩水を連続的に滴下させ、直下の皮質部への熱の伝達を回避した。骨はドリルによって薄い殻を残すまで薄くし、これをマイクロ用鉤およびマイクロ用鉗子によって除去した。次いで硬膜を切開し、30ゲージの注射針によって反転させ、鼻腔裂よりほぼ１mmの部位に右中大脳動脈（ＭＣＡ）を露出させた。
ミクロマニピュレーターおよび20ミクロンのタングステン糸の鉤を用い、右中大脳動脈を皮質表面上0.5mm持ち上げ、血管上のタングステン鉤に対し、電気焼灼の先端を接触させて分断した。熱の適用によって動脈は速やかに焼灼切断され、皮質への損傷をもたらすことなく、皮質上に落着する。再現し得る卒中を引き起こすために、左ＣＣＡを30−60分間一時的に閉塞させねばならない。従って、本モデルに於いては左ＣＣＡを30分間閉塞した。開頭部を外科用ゼラチン泡でおおい、皮膚切開部をバイクリル（vicryl）縫合によって閉鎖した。その後ラットをケージに戻し、24時間にわたって食餌と水を自由に摂取できるようにさせた。手術後ラットの行動はやや円滑さを欠くが、間もなく走行、飲食を含む活動をとり戻した。
ＭＣＡ切断の24時間後、ラットを麻酔し、断頭し、潅流を行わずに速やかに脳を摘出し、これを分析のため脳スライサーにかけ、１mm間隔で冠状断面を作製した。調製した新鮮な薄片を２，３，５−トリフェニルテトラゾリウム（ＴＴＣ）（NaCl中２％、154mM）中に浸潤し、暗所で37℃、30分間インキュベートし、ミトコンドリアのデヒドロゲナーゼ活性について染色した。脳梗塞は非染色（白色）組織の領域として、赤色に染色される生きた組織と対照的に容易に可視化される。次いで薄片を10％ホルマリンを含む緩衝液に浸し、写真撮影を行った脳薄片の投影像について面積計を用いて梗塞部位を決定した。個々のラットの梗塞のサイズは、それぞれの脳薄片に存在する梗塞領域を合計し、これを当該ラットのすべての薄片の半球部位の合計で割ることによって計算した（各薄片の半球領域の百分比として表わした）。ラットは10のグループについて研究し、データはグループごとの平均の卒中容積として表現した。
対照（化合物番号14によって処理しなかったもの）の平均の梗塞サイズは3.1％±0.5％であった。動脈切断１時間前に化合物番号14の投与をうけたラット（１mg/kg,i.v.）に生じた梗塞のサイズはより小さかった（1.7％±0.2％）。これらの差異は非対（unpaired）のデータに対するStudentのｔ−テストによれば、統計的に有意（ｐ＜0.05）である。これらの実験は、化合物番号14が巣状脳梗塞のサイズを有効に減少させることを示している。
16．実施例：化合物番号14の抗腫瘍活性
本節は、本発明の化合物が腫瘍の増殖を阻害し、腫瘍の退行を生じさせる能力を測定するための、腫瘍増殖の動物モデルの方法および結果を詳細に述べる。細胞を、標準の組織培養フラスコ中、ウシ胎児血清（10％）を補ったＤＭＥＭ中に播いた。哺乳動物の発現ベクターで安定にトランスフェクトしたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞は、ヒトＴＮＦ（ＣＨＯ−ＴＮＦ）を構成的に分泌する。ＣＨＯ−ＴＮＦ腫瘍を用いた実験は以下のように行った。ヌードマウスに注射する当日、細胞を採取し、nu/nuヌードマウス（体重20ｇ）の後肢に筋注した（マウスあたり10−15×106細胞）。次いでマウスをケージに収容し、食餌と水を随意に与えた。腫瘍の成長をモニターし、確立した腫瘍が現れた時点で（第６週目）試験化合物を毎日投与した（0.4mg/kg、腹腔内、一日一回）。２週間後、マウスを安楽死させ、腫瘍の重さを計り、ノギスで大きさを計測した。ＣＨＯ−ＴＮＦ腫瘍はこれらマウスの皮膚にも転移する。転移の数を記録する。
化合物番号14の非経口投与は、５匹のマウス中４匹の腫瘍のサイズの減少をもたらした。これらマウスの腫瘍の重量を計量し、大きさを計測した。マウスの皮膚への転移の検査によれば、５匹の対照中４匹に平均2.5±１の皮膚転移が生じた。処置をうけたマウスのいずれにも皮膚転移は認められなかった。これらのデータは化合物番号14が抗腫瘍活性をもつことを示している。
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17．それまで静止状態の細胞対活性化状態の細胞のアルギニンのとり込みおよびＮＯ産生に対する化合物番号14の阻害効果
本節は、アルギニンのとりこみとＮＯ産生の阻害に必要な化合物番号14の濃度を測定するための実験を述べる。用いられる技術は上記7.1.節に述べた。
図13Ａは、γ−ＩＦＮ／ＬＰＳ刺激の１時間前から検定の完了する刺激後18時間まで化合物番号14に連続的にさらされたRAW264.7細胞によるＮＯの産生に対する、化合物番号14の効果を示す。データは化合物番号14が細胞外のアルギニンによって競合的に拮抗作用をうけるＮＯ産生の阻害剤であることを示す。これらのデータは、生理的なアルギニンの濃度（100μM）でのこのアッセイにおいて化合物番号14のI.C.50は３から５μMの間であることを示している。
図６に示されるように、RAW264.7細胞によるアルギニン取り込みのピークレベルは、γＩＦＮ／ＣＰＳ刺激後約８時間である。RAW264.7細胞を図13Ｂのように刺激前に化合物番号14にさらし、８時間目のアルギニン取り込みを測定すると、化合物番号14のアルギニン取り込みに対するI.C.50は、ＮＯ産生に対して観察されたものにきわめて近く、7.5μM（データ示さず）であった。
しかしながら、マクロファージのＮＯ産生に対する化合物番号14のすべての効果は、アルギニン取り込みの急激な阻害だけでは完全に説明できない。図15は、RAW264.7細胞が一切の阻害剤なしにγ−ＩＦＮ／ＬＰＳ刺激をうけ、次いでその８時間後、細胞を化合物番号14に10分さらし、その時点でアルギニンのとりこみを測定したときに観察されたデータを示す。γ−ＩＦＮ／ＬＰＳに８時間刺激されたのちに、アルギニンとり込みをアッセイする10分前にアルギニンを含まないバッファー中で化合物番号14にさらされたRAW264.7細胞について測定したI.C.50は60±15μM（平均±標準誤差n=3）であった。これら急激な被爆実験の結果は、これまでに述べた連続的な被爆実験と二つの点で異なっている。第一に、全アルギニンのとり込みの３分の１が、化合物番号14非依存の機構を通じて生じ、これはRAW264.7の刺激された細胞でも刺激されなかった細胞でも存在するようである。第二に、γ−ＩＦＮ／ＬＰＳ誘導性のアルギニン輸送が確立した数時間の間のアルギニンとり込みを50％阻害するのに必要な化合物番号14の濃度は、刺激前に化合物番号14を導入した場合の増大したアルギニンのとり込みまたはＮＯ産生を50％阻害するのに必要な濃度よりも高かった。
γ−ＩＦＮ／ＬＰＳ刺激をうけたRAW264.7細胞が最初の刺激後８時間目から実験完了まで阻害剤にさらされた場合には、化合物番号14に対する中間的なレベルの感受性が観察された。これらの実験ではＮＯ産生は12時間−24時間の間で測定された。そのような実験条件下では、図16は、I.C.50として20±２μM（平均±標準誤差n=3）が観察されたことを示している。
これらのデータは全体として、RAW264.7細胞がγ−ＩＦＮ／ＬＰＳによる活性化に先立って化合物番号14にさらされると、ＮＯ産生および誘導できるアルギニンのとり込みが低濃度の化合物番号14に対して等しく感受性をもつ一方、刺激をうけなかったRAW264.7細胞のアルギニンとり込みは化合物番号14に対して感受性をもたないことを示している。これとは対照的に、γ−ＩＦＮ／ＬＰＳによって刺激され、ある遅れをもって化合物番号14に簡単にさらされたRAW264.7細胞のアルギニンとり込みは、刺激前に化合物番号14が与えられた場合よりも、化合物番号14に対してより感受性が低かった。同様に、刺激後何時間も経過した後に化合物番号14の処理をうけた細胞によるＮＯ産生は、それまで休止状態にあった細胞のＮＯ産生の誘導よりも化合物番号14にによる阻害に対して感受性が低いことが示された。
これらのデータは、in vivoでは、活性化されたマクロファージによる進行中のＮＯ産生を阻止するためには、活性化されていないマクロファージによるＮＯ産生の開始を妨害するのに必要なレベルよりも高レベルの化合物番号14が必要とされるであろうこと、また、化合物番号14は細胞に急激に与えた場合よりも継続的に与えた場合の方がより有効であることを示している。
本発明は、本発明の個々の性格をただ例示することを意図して述べた特定の具体化例にその範囲を限定するものではなく、機能的に等価の方法および成分は本発明の範囲に入るものである。実際、ここに述べられ示されたものに加え、本発明のさまざまな改良は、これまでの記述および付図から、本技術の専門家には明らかとなるであろう。そのような改良は、付記の請求の範囲に含まれることを意図している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図７Ｇ】
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【図７Ｈ】
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【図７Ｉ】
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【図７Ｊ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１５】
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【図１６】
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