(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号１または３に記載のヌクレオチド配列、
（ｂ）配列番号２または４に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
（ｃ）配列番号１のヌクレオチド位置番号１８１〜７９５または配列番号３のヌクレオチド位置番号１５〜６２９に相当するヌクレオチド配列、
（ｄ）（ｃ）のヌクレオチド配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一のヌクレオチド配列であって、ＪＮＫ（ｃ−Ｊｕｎアミノ末端キナーゼ）活性化を調節するかまたはＪＮＫ媒介シグナル伝達をモジュレートする活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
（ｅ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）のアレリック変異体またはスプライス変異体、
（ｆ）少なくとも約２５、５０、７５、１００または１００を超えるアミノ酸残基を有し、ＪＮＫ活性化を調節するかまたはＪＮＫ媒介シグナル伝達をモジュレートする活性を有するポリペプチド断片をコードする（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）または（ｅ）のヌクレオチド配列、
（ｇ）少なくとも約１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００または１００を超えるヌクレオチドの断片を含む（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）のヌクレオチド配列、
（ｈ）配列番号２または４に記載の１〜１００アミノ酸残基の置換及び／または欠失を有し、ＪＮＫ活性化を調節するかまたはＪＮＫ媒介シグナル伝達をモジュレートする活性を有するか、または抗体を作製するための抗原として働くポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
（ｉ）ストリンジェントな条件下で（ａ）〜（ｈ）のいずれかにハイブリダイズし、ＪＮＫ活性化を調節するかまたはＪＮＫ媒介シグナル伝達をモジュレートする活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
（ｊ）（ａ）〜（ｈ）のいずれかに対して相補的なヌクレオチド配列
からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む単離核酸分子。
【請求項２】
請求項１に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
【請求項３】
請求項２に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項４】
真核細胞である請求項３に記載の宿主細胞。
【請求項５】
原核細胞である請求項３に記載の宿主細胞。
【請求項６】
請求項３に記載の宿主細胞の培養物を適当な培地で増殖させ、前記培養物からタンパク質を単離することからなるタンパク質の産生方法。
【請求項７】
請求項６に記載の方法により産生したポリペプチド。
【請求項８】
（ａ）配列番号２または４に記載のアミノ酸配列、
（ｂ）ＪＮＫ活性化を調節するかまたはＪＮＫ媒介シグナル伝達をモジュレートする活性を有するか、または抗体を作製するための抗原として働く少なくとも約２５、５０、７５、１００または１００を超えるアミノ酸残基を含む配列番号２または４に記載のアミノ酸配列の断片、
（ｃ）配列番号２または４のオーソログ、及び
（ｄ）（ａ）または（ｃ）のアレリック変異体またはスプライス変異体、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド。
【請求項９】
請求項１に記載の核酸分子によりコードされる単離ポリペプチド。
【請求項１０】
請求項８に記載のポリペプチドに特異的に結合する抗体またはその断片。
【請求項１１】
モノクローナル抗体である請求項１０に記載の抗体。
【請求項１２】
異種アミノ酸配列に融合された請求項８に記載のポリペプチドを含む融合ポリペプチド。
【請求項１３】
異種アミノ酸配列がＩｇＧ定常ドメインまたはその断片である請求項１２に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１４】
ＪＮＫ媒介疾患またはＪＮＫ媒介疾患に対する感受性の指標としてサンプル中の請求項８に記載のポリペプチドまたは請求項１に記載の核酸分子によりコードされるポリペプチドの発現の存在または量を測定する方法であって、サンプルを請求項１０に記載の抗体と接触させることを特徴とする前記方法。
【請求項１５】
（ａ）請求項８に記載のポリペプチドを化合物と接触させ、
（ｂ）前記化合物に対する前記ポリペプチドの結合度を測定することを含む、
ポリペプチドに結合する化合物の同定方法。
【請求項１６】
配列番号２６のアミノ酸配列を含むペプチドで非ヒト動物を免疫することによって作製される抗体の、動物においてポリペプチドのレベルを調節するための医薬の製造における使用。
【請求項１７】
配列番号２６のアミノ酸配列を含むペプチドで非ヒト動物を免疫することによって作製される抗体の、ＪＮＫ媒介疾患またはＪＮＫ媒介疾患に対する感受性を診断するための医薬の製造における使用。
【請求項１８】
化合物がＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチド活性を阻害するかどうかを調べる方法であって、請求項３に記載の細胞を前記化合物に接触させ、前記細胞におけるＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチド活性を測定することを含む、前記方法。
【請求項１９】
配列番号２または４に記載のアミノ酸配列を含むＪＮＫ活性化ホスファターゼの産生方法であって、
（ａ）請求項３に記載の宿主細胞をＪＮＫ活性化ホスファターゼの発現に適した条件下で培養し、
（ｂ）ＪＮＫ活性化ホスファターゼを回収することを含む、
前記方法。
【請求項２０】
宿主細胞においてＪＮＫ活性化ホスファターゼ活性を増加させる能力について化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）化合物を請求項３に記載の宿主細胞と接触させ、
（ｂ）宿主細胞のＪＮＫ活性化ホスファターゼ活性をモジュレートする前記化合物の能力を測定することを含み、
前記化合物の存在下での前記活性の差が当該化合物によるモジュレート活性を示す前記方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、新規なＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチド及び該ポリペプチドをコードする核酸分子を提供する。本発明はまた、ベクター、宿主細胞、抗体及びＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドの産生方法に関する。ＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドに関連する疾患の診断及び治療方法をも提供する。
【０００２】
（発明の背景）
核酸分子の同定、クローニング、発現及び操作の技術的進歩に伴ってヒトゲノムの解読に基づいて新規治療薬の発見がかなり加速された。現在、迅速な核酸配列決定技術により今までにないスピードで配列情報を得ることができ、コンピュータ分析と合わせて重複配列を全ゲノムに集合させることができ、ポリペプチドコード領域を同定することができる。予想されるアミノ酸配列を公知のアミノ酸配列のデーターベース編集と比較すると、既に同定されている配列及び／または構造的ランドマークとの相同度を調べることができる。核酸分子のポリペプチドコード領域をクローニングし、発現させると、構造及び機能分析のためのポリペプチド産物が提供される。変異体及び誘導体を与えるために核酸分子及びコードされているポリペプチドを操作すると、好ましい特性を治療として有用な産物に対して付与することができる。
【０００３】
過去１０年間にわたりゲノム研究がかなり技術的に進歩しているにも関わらず、ヒトゲノムに基づく新規な治療薬の開発の可能性は未だ十分に実現されていない。潜在的に有利なタンパク質治療薬をコードする遺伝子または治療分子に対する「標的」として作用し得るポリペプチドをコードする遺伝子は未だ同定されていない。更に、多くのヒト遺伝子由来のポリペプチド産物の構造及び機能分析はまだ実施されていない。
【０００４】
従って、本発明の目的は、診断または治療効果を有する新規なポリペプチド及び前記ポリペプチドをコードする核酸分子を同定することである。
【０００５】
（発明の要旨）
本発明は、新規なＪＮＫ活性化ホスファターゼ核酸分子及びコード化ポリペフチドに関する。
【０００６】
本発明は、
（ａ）配列番号１または３に記載のヌクレオチド配列、
（ｂ）配列番号２または４に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
（ｃ）配列番号１のヌクレオチド位置番号１８１〜７９５または配列番号３のヌクレオチド位置番号１５〜６２９に相当するヌクレオチド配列、
（ｄ）（ｃ）のヌクレオチド配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
（ｅ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）のアレリック変異体またはスプライス変異体、
（ｆ）少なくとも約２５、５０、７５、１００または１００を超えるアミノ酸残基を有し、ＪＮＫ活性化を調節するかまたはＪＮＫ媒介シグナル伝達をモジュレートする活性を有するポリペプチド断片をコードする（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）または（ｅ）のヌクレオチド配列、
（ｇ）少なくとも約１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００または１００を超えるヌクレオチドの断片を含む（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）のヌクレオチド配列、
（ｈ）配列番号２または４に記載の１〜１００アミノ酸残基の置換及び／または欠失を有し、ＪＮＫ活性化を調節するかまたはＪＮＫ媒介シグナル伝達をモジュレートする活性を有する、または抗体を作成するための抗原として働くポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
（ｉ）ストリンジェントな条件下で（ａ）〜（ｈ）のいずれかにハイブリダイズするヌクレオチド配列、
（ｊ）（ａ）〜（ｈ）のいずれかに対して相補的なヌクレオチド配列
からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む単離核酸分子を提供する。
【０００７】
本発明はまた、
（ａ）配列番号２または４に記載のアミノ酸配列、
（ｂ）ＪＮＫ活性化を調節するかまたはＪＮＫ媒介シグナル伝達をモジュレートする活性を有する、または抗体を作成するための抗原として働く少なくとも約２５、５０、７５、１００または１００を超えるアミノ酸残基を含む配列番号２または４に記載のアミノ酸配列の断片、
（ｃ）配列番号２または４のオーソログ、及び
（ｄ）（ａ）または（ｃ）のアレリック変異体またはスプライス変異体
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドを提供する。
【０００８】
本発明はまた、上記した核酸分子を含む発現ベクター、本発明の発現ベクターを含む宿主細胞、及び前記宿主細胞を培養し、場合により産生したポリペプチドを単離することを含むＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドの産生方法をも提供する。
【０００９】
ＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドをコードする核酸分子を含むトランスジェニック非ヒト動物も本発明に包含される。前記ＪＮＫ活性化ホスファターゼ核酸分子を、高い循環レベルをも含み得るＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドを発現させ、高いレベルとし得るように動物に導入する。或いは、ＪＮＫ活性化ホスファターゼ核酸分子を内在性ＪＮＫ活性化ホスファターゼの発現を防止する（すなわち、ＪＮＫ活性化ホスファターゼ遺伝子ノックアウトを有するトランスジェニック動物を作成する）ように動物に導入する。トランスジェニック非ヒト動物は好ましくは哺乳動物、より好ましくはラットやマウスのようなげっ歯動物である。
【００１０】
また、本発明のＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドの誘導体、本発明のＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドを含む融合ポリペプチド、及び本発明のＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドに特異的に結合する抗体をも提供する。
【００１１】
本発明のタクレオチドまたはポリペフチド、及び担体、アジュバント、溶解補助剤、安定化剤、酸化防止剤または他の医薬的に許容され得る物質を含む組成物も本発明に包含される。本発明の組成物には、本発明のヌクレオチドまたはポリペプチドを治療有効量含む医薬組成物及びポリペプチド及び核酸分子を用いる方法も含まれ得る。
【００１２】
驚くことに、ＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドは造血細胞において他とは異なる発現をし、よって他の二元活性ホスファターゼとは区別される。従って、本発明のポリペプチド及びその有用な核酸中間体は造血細胞をバックグラウンドから区別するのにも有用であり得る。
【００１３】
本発明のＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチド及び核酸分子は、ＪＮＫ媒介疾患に関連する状態を治療、予防及び／または検出するための治療薬をスクリーニングするために使用され得る。本発明は、ＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドを動物に投与することを含むＪＮＫ媒介疾患を治療、予防または改善する方法を提供する。本発明はまた、ＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドの発現の存在または量を測定し、ＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドの発現の存在または量に基づいてＪＮＫ媒介疾患またはＪＮＫ媒介疾患に対する感受性を診断することを含む動物におけるＪＮＫ媒介疾患またはＪＮＫ媒介疾患に対する感受性の診断方法をも提供する。動物は好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトである。本発明は、ＪＮＫ媒介疾患の治療用医薬品の製造方法にも関する。
【００１４】
哺乳動物細胞において、特定のタンパク質キナーゼ経路が例えば炎症性サイトカイン、化学療法剤及びＵＶもしくは電離放射線のためのストレスに応答して活性化される。用語「ＪＮＫ媒介疾患」は、少なくとも部分的に前記ストレスに応答したｃ−Ｊｕｎアミノ末端キナーゼ（ＪＮＫ）シグナル伝達経路の過剰発現により生ずる病的状態を指すために使用される。ＪＮＫ媒介疾患には、例えば虚血性心疾患、心肥大、熱または放射線（ＵＶ、Ｘ線、γ線、β線等）による火傷、腎不全、酸化ストレスまたはアルコールによる肝障害、呼吸窮迫症候群、敗血症性ショック、関節リウマチ、自己免疫障害及び他の炎症性疾患が含まれ得る。ＪＮＫ媒介疾患には更に増殖性疾患が含まれる。ストレス関連ＪＮＫ媒介増殖性疾患の例には、乾癬及び身体の各種組織の悪性腫瘍（例えば、皮膚、骨髄、肺、肝、乳、胃腸系及び尿生殖路の悪性腫瘍）が含まれる。
【００１５】
本発明は、ＪＮＫシグナル伝達経路に関与するポリペプチド（ホスファターゼ）を提供する。このポリペプチドはｃ−Ｊｕｎアミノ末端キナーゼのサイトカインまたは他の刺激に対する応答をモジュレートし、よってＪＮＫ活性化を調節し、ＪＮＫ媒介シグナル伝達をモジュレートする。ＪＮＫ活性のモジュレーションは抑制または刺激効果を含む。場合により、ＪＮＫ活性の上昇、例えばアポトーシスの誘導が望ましい。
【００１６】
ＪＮＫ活性を阻害する治療薬はＪＮＫ媒介シグナル伝達経路を妨害する。例えば、治療薬はＪＮＫのタンパク質キナーゼ活性を変更し、ＪＮＫ転写または翻訳のレベルを低下させ（例えば、アンチセンスポリヌクレオチドはＪＮＫ  ｍＲＮＡを結合できる）、またはＪＮＫリン酸化を変更し得、よってＪＮＫ媒介シグナル伝達経路を混乱させる。前記治療薬の例には、ＪＮＫ活性化ポリペプチドに特異的に結合する抗体及びＪＮＫ活性を競合的に阻害するＪＮＫ活性化ポリペプチドの断片が含まれる。
【００１７】
ＪＮＫ活性を促進または増強する治療薬はＪＮＫ媒介シグナル伝達経路を補う。例えば、促進剤は、ＪＮＫ媒介疾患がＪＮＫ活性化ポリペプチドの過小発現により引き起こされる場合に投与され得る。更に、ＪＮＫ活性化ポリペプチドをコードするＤＮＡの一部をＪＮＫ活性化ポリペプチドを過小発現する細胞に導入し得る。
【００１８】
本発明のポリペプチドは、動物におけるサイトカイン産生を含む疾患を治療する治療薬をスクリーニングするために使用され得る。前記治療薬はあるストレス因子（stressor）に曝された結果として生じたプロ炎症性（proinflammatory）サイトカインに対する細胞応答をモジュレートし得る。前記疾患には、疾患の病因及び／または疾患の生理学的影響がプロ炎症性サイトカインに対する応答をモジュレートすることにより改善され得る医学的障害及び疾患が含まれる。前記疾患には、アレルギー疾患、アナフィラキシー、炎症、マスト細胞障害、敗血症及び癌が含まれるが、これらに限定されない。
【００１９】
本発明のポリペプチド及びポリヌクレオチドは、ＪＮＫシグナル伝達経路をモジュレートする薬剤を同定するのに有用である。ＪＮＫシグナル伝達経路を阻害する物質は上記ＪＮＫ媒介疾患の治療に使用され得る。ＪＮＫシグナル伝達経路を刺激する物質は組織におけるプログラム化細胞死（アポトーシス）の誘導を含めた各種方法で使用され得る。例えば、ＵＶダメージを受けた細胞の除去は癌を予防するために使用され得る。
【００２０】
本発明は更に、ストレス関連の炎症性疾患の緊急及び予防的治療手段を提供する。例えば、虚血性心疾患は再潅流後の虚血及び酸化ストレスのエピソードの間に治療され得る。更に、虚血の危険のある患者は虚血エピソードの前に治療され得る。別の例では、ＪＮＫ活性を阻害する治療薬は、ＴＮＦ及びＩＬ−１を含めた炎症性サイトカインに対する応答を抑制することにより炎症性応答を抑えるために投与され得る。ストレス関連増殖性疾患もＪＮＫ活性を阻害する治療薬を投与することにより治療され得る。前記治療薬は悪性腫瘍の治療において単独で、または他の治療薬（例えば、化学療法剤）と組合せて使用され得る。
【００２１】
ＪＮＫ活性をモジュレートするために使用される物質には、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、及びアンチセンスオリゴヌクレオチドやリボザイムのような他の分子が含まれる。従って、本発明は、治療を要する患者に対してＪＮＫ活性をモジュレート（所要により、阻害または増強）する治療薬を有効量投与することによるＪＮＫ媒介疾患の治療手段を提供する。本明細書中、用語「治療薬」は治療を要する患者に投与したときにＪＮＫ媒介疾患に対して所望の効果を達成する化合物または分子を意味する。前記治療薬の治療用途には、急性膵炎、ＡＬＳ、アルツハイマー病、悪液質／食欲不振、喘息、アテローム性動脈硬化症、慢性疲労症候群、発熱、糖尿病（例えば、インシュリン糖尿病）、糸球体腎炎、移植片宿主拒絶、出血性ショック、痛覚過敏、炎症性腸疾患、変形性関節症，乾癬性関節炎や関節リウマチを含めた関節の炎症状態、脳虚血（例えば、いずれも神経変性につながる恐れがある外傷、てんかん、出血または卒中の結果としての脳損傷）を含めた虚血性損傷、肺疾患（例えば、ＡＲＤＳ）、多発性骨髄腫、多発性硬化症、骨髄性（例えば、ＡＭＬ及びＣＭＬ）及び他の白血病、筋疾患（例えば、筋タンパク質代謝、特に敗血症における筋タンパク質代謝）、骨粗鬆症、パーキンソン病、疼痛、早産、乾癬、再潅流損傷、敗血症性ショック、放射線療法による副作用、側頭下顎関節病、腫瘍転移、または緊張、捻挫、軟骨損傷、外傷、整形外科手術、感染または他の疾患から生ずる炎症状態が含まれるが、これらに限定されない。
【００２２】
ＪＮＫまたはＪＮＫ様活性は心肥大に関与すると見られる。例えば、Ｓｉｌｂｅｒｂａｃｈら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４（５５）：２４８５８−２４８６４（１９９９）、Ｙａｎｏら，Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．，８３（７）：７５２−７６０（１９９８）、Ａｄａｍｓら，Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．，８３（２）：１６７−１７８（１９９８）、Ｎｅｍｏｔｏら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１８（６）：３５１８−３５２６（１９９８）、Ｗａｎｇら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３（１０）：５４２３−５４２６（１９９８）及びＲａｍｉｒｅｚら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２（２２）：１４０５７−１４０６１（１９９７）を参照されたい。ＪＮＫ活性の阻害剤は前記症状を改善し得る。
【００２３】
本発明は、ＪＮＫ活性の阻害または低下により腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）媒介及びインターロイキン−１（ＩＬ−１）媒介疾患及び他の疾患（例えば、炎症、疼痛及び糖尿病を含む疾患）の予防及び治療において有用な物質の製造手段を提供する。ＪＮＫはＴＮＦ−α及びＩＬ−１により活性化され得、そのシグナル化経路に関与するようである。ＪＮＫ活性の阻害または低下はＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６及び／またはＩＬ−８の影響、特にＴＮＦ−α及びＩＬ−１の高レベルを緩和することができる。従って、ＪＫＡＰ活性が阻害または低下するとＪＮＫ活性が阻害または低下し、これにより前記シグナル化経路の影響が緩和される。
【００２４】
ＩＬ−１及びＴＮＦ−αは、多くの炎症性刺激（例えば、リポポリサッカライド（ＬＰＳ））または外部からの細胞ストレス（例えば、浸透圧ショック及び過酸化物）に応答して単核細胞やマクロファージを含めた各種細胞から分泌されるプロ炎症性サイトカインである。基礎レベルよりも高いＴＮＦ−α及び／またはＩＬ−１は、関節リウマチ、パジェット病、骨粗鬆症、多発性筋炎、ブドウ膜炎、急性及び慢性骨髄性白血病、膵臓β細胞破壊、骨関節症、リウマチ様脊椎炎、痛風性関節炎、炎症性腸疾患、成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、感染、クローン病、アレルギー性鼻炎、潰瘍性大腸炎、アナファラキシー、接触皮膚炎、喘息、筋変性、悪液質、ライター症候群、Ｉ型及びＩＩ型糖尿病、骨吸収病、移植片宿主反応、虚血性再潅流障害、アフローム性動脈硬化症、脳外傷、多発性硬化症、大脳性マラリア、敗血症、敗血症性ショック、毒性ショック症候群、発熱、及び感染による筋肉痛を含めた各種病状の媒介または悪化に関与している。ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＨＩＶ−３、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、インフルエンザ、アデノウイルス、肝炎ウイルス（ＨＳＶ−１及びＨＳＶ−２を含む）及び帯状疱疹もＴＮＦ−αにより悪化する。
【００２５】
また、ＴＮＦ−αは頭部外傷、卒中及び虚血において役割を発揮すると報告されている（Ｓｈｏｈａｍｉら，Ｊ．Ｃｅｒｅｂ．Ｂｌｏｏｄ  Ｆｌｏｗ  Ｍｅｔａｂ．，１４：６１５（１９９４）及びＦｅｕｒｓｔｅｒｉｎら，Ｎｅｕｒｐｓｃｏ．Ｌｅｔｔ．，１６４：１２５（１９９３））。ＴＮＦ−αをラット皮質に投与すると、毛細管中に好中球が多く蓄積し、小血管中に接着すると報告されている。ＴＮＦ−αは他のサイトカイン（ＩＬ−１β、ＩＬ−６）及びケモキニンの浸潤を促進し、好中球の梗塞域への浸潤が促進される（Ｆｅｕｒｓｔｅｉｎ，Ｓｔｒｏｋｅ，２５：１４８１（１９９４））。また、ＴＮＦ−αはＩＩ型糖尿病において役割を果たすと示唆されている（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ，１３０：４３−５２（１９９４）及びＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌ，１３６：１４７４−１４８１（１９９５））。ＴＮＦ−αは特定のウイルスライフサイクル及び該サイクルに関連する病状を促進する際に役割を果たすようである（Ｃｌｏｕｓｅら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４２：４３１（１９８９）、Ｌａｈｄｅｖｉｒｔａら，Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．，８５：２８９（１９８８））。
【００２６】
ＴＮＦ−αは炎症のサイトカインカスケードの上流において調節する。その結果、高レベルのＴＮＦ−αは他の炎症性及びプロ炎症性サイトカイン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−６及びＩＬ−８）のレベルを上昇させ得る。基礎レベルに比して高いレベルのＩＬ−１が関節リウマチ、骨関節症、リウマチ脊椎炎、痛風性関節炎、炎症性腸疾患、成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、乾癬、クローン病、潰瘍性大腸炎、アナファラキシー、筋変性、悪液質、ロイター症候群、Ｉ型及びＩＩ型糖尿病、骨吸収疾患、虚血性再潅流障害、アテローム性動脈硬化症。頭部外傷、多発性硬化症、敗血症、敗血症性ショック及び毒性ショック症候群を含めた多数の病気を媒介または悪化することが示唆されている。ＴＮＦ−α抑制に対して感受性のウイルス、例えばＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＨＩＶ−３もＩＬ−１により影響される。ＩＬ−１は特定のウイルスライフサイクルを促進する際に役割を果たすようである（Ｆｏｌｋｓら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３６：４０（１９８６））。Ｂｅｕｌｅｒら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３５：３９６９（１９８５））は悪液質におけるＩＬ−１の役割を検討している。Ｂａｒａｃｏｓら（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３０８：５５３（１９８３））は筋変性におけるＩＬ−１の役割を検討している。
【００２７】
ＴＮＦ−α及びＩＬ−１は膵臓β細胞破壊及び糖尿病で役割を果たすようである。膵臓β細胞は、血中グルコースホメオスタシスの媒介を助けるインシュリンを産生する。膵臓β細胞の破壊はしばしばＩ型糖尿病を伴う。膵臓β細胞機能異常はＩＩ型糖尿病患者で起こり得る。ＩＩ型糖尿病はインシュリンに対する機能性耐性により特徴付けられる。更に、ＩＩ型糖尿病はしばしば高レベルの血漿グルカゴン及び速い肝臓グルコース産生を伴う。グルカゴンは、インシュリンによる肝臓糖新生抑制を弱める調節ホルモンである。グルカゴン受容体は肝臓、腎臓または脂肪組織に存在している。従って、グルカゴンアンタゴニストは血漿グルコースレベルを低下させるのに有用である（援用により本明細書に含まれるとする国際特許出願公開第９７／１６４４２号パンフレット）。グルカゴン受容体を拮抗させることにより、肝臓におけるインシュリン応答性が改善され、よって糖生成が低減し、肝グルコース生成率が低下すると考えられる。
【００２８】
関節リウマチでは、ＩＬ−１及びＴＮＦ−αは関節炎を患っている関節内の組織破壊につながるコラゲナーゼ及び中性プロテアーゼを産生するように滑膜細胞及び軟骨細胞を誘導する。動物の関節リウマチモデルでは、ＴＮＦ−αまたはＩＬ−１を複数回関節内に注入すると、急性及び破壊形態の関節炎が生じた（Ｂｒａｈｎら，Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｓ．，１１：２５３（１９９２）、Ｃｏｏｐｅｒ，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，８９８：２４４（１９９２）及びＣｈａｎｄｒａｓｅｌｋａｒら，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．，５５：３８２（１９９０））。培養リウマチ滑膜細胞を用いる研究では、ＩＬ−１はＴＮＦ−αよりも非常に強いストロメリシン誘導剤である（Ｆｉｒｅｓｔｅｉｎ，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，１４０：１３０９（１９９２））。局所注入の部位では、ケモキニン（例えば、ＩＬ−８）の誘導及び接着分子の上向き調節のために好中球、リンパ球及び単球の遊走が観察される（Ｄｉｎａｒｅｌｌｏ，Ｅｕｒ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｎｅｔｗ．，５：５１７−５３１（１９９４））。
【００２９】
本発明は、ＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドを被験分子と接触させ、この被験分子のポリペプチドへの結合度を測定することを含むＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドに結合する被験分子の同定方法をも提供する。前記方法は更に、被験分子がＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストであるかどうかを調べることを含む。
【００３０】
本発明は、ＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドの発現またはＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドの活性に対する分子の影響を試験する方法をも提供する。
【００３１】
ＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドの発現を調節し、そのレベルをモジュレート（すなわち、増加または低下）させる方法も本発明に包含される。１つの方法は、ＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドをコードする核酸分子を動物に投与することを含む。別の方法では、ＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドの発現を調節する要素を含む核酸分子を投与し得る。これらの方法の例には遺伝子療法及びアンチセンス療法が含まれる。
【００３２】
（図面の説明）
本発明の上記及び他の態様及び作用効果は以下の詳細説明及び添付図面から明白であろう。
【００３３】
図１は、ヒトＪＮＫ活性化ホスファターゼ遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号１）及びヒトＪＮＫ活性化ホスファターゼタンパク質の推定アミノ酸配列（配列番号２）を示す。
【００３４】
図２は、マウスＪＮＫ活性化ホスファターゼ遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号３）及びマウスＪＮＫ活性化ホスファターゼタンパク質の推定アミノ酸配列（配列番号４）を示す。
【００３５】
図３は、ＪＫＡＰアミノ酸配列分析及び発現パターンを示す。
（Ａ）  特定ＭＡＰＫホスファターゼの触媒ドメインに対応するアミノ酸配列を逐次分枝クラスタリング(sequential branching clustering)を用いてＰＩＭＡ  １．４でアラインさせた。生じたアラインメントをＢＯＸＳＨＡＤＥで処理した。配列同一性を黒色で、類似性を灰色で強調して示す。ギャップをドットで示す。アラインさせた配列はｍＪＫＡＰ（配列番号５）、パッカード（配列番号６）、ｒＭＫＰ−３（配列番号７）、ｒＭＡＫＰ−Ｘ（配列番号８）、ｈＭＫＰ−４（配列番号９）、ｒＭＫＰ−２（配列番号１０）、ｍＭＫＰ−１（配列番号１１）、ｍＨ３／６（配列番号１２）、ｍＰＡＣ−１（配列番号１３）、ｈＶＨ３（配列番号１４）、ｈＶＨＲ（配列番号１５）及び生じた共通配列（配列番号１６〜２０）を含む。
（Ｂ）  系統発生分析を１０００レプリケートのブーツトラッピングを伴うＰＲＯＴＰＡＲＳを用いるＰＨＹＬＩＰＯでの節減によりアライン配列に対して実施した。数は共通樹における分枝の発生に相当する。
（Ｃ）  成体マウス由来のポリアデニル化ｍＲＮＡをＪＫＡＰ  ｃＤＮＡプローブとハイブリダイズした。ｍＲＮＡ完全性及び量をβ−アクチンとのハイブリダイゼーションにより確認した。塩基対で表示する分子量を左に示す。
【００３６】
図４は、ＪＫＡＰのｉｎ  ｓｉｔｕ発現分析を示す。
（Ａ及びＢ）  ＦＡＣＳにより成体マウス骨髄から得たＬｉｎ−Ｓｃａ−１＋細胞（Ａ）及びＬｉｎ−Ｓｃａ−１−細胞（Ｂ）をＪＫＡＰ  ｃＤＮＡ断片とハイブリダイズした。
（Ｃ〜Ｅ）  Ｅ１０．５マウス胚をＪＫＡＰアンチセンスリボプローブ（２０×）（Ｃ）及びＪＫＡＰセンスリボプローブ（２０×）（Ｄ）とハイブリダイズした。尾方領域を５０×（Ｅ）で示す。
（Ｆ）  （Ｃ）の胚の尾方領域から１０μｍの横断面を取った（２００×）（ＪＷＢ）。
【００３７】
図５は、トランスフェクトした２９３Ｔ細胞におけるＪＫＡＰによるｐ３８またはＥＰＫではなく、ＪＮＫの活性化を示す。
（Ａ）  ２９３Ｔ細胞（１．５×１０５細胞／３５ｍｍウェル）に０．１μｇのＨＡ−ＪＮＫ単独、またはＨＡ−ＪＮＫ＋２μｇのＪＫＡＰまたはＪＫＡＰ−Ｃ８８Ｓをトランスフェクトした。
（Ｂ）  ２９３Ｔ細胞（１．５×１０５細胞／３５ｍｍウェル）に２μｇのＨＡ−ｐ３８及び異なる量のＪＫＡＰを同時トランスフェクトした。対照として、ＨＡ−ｐ３８及び２μｇのＭＫＫ６の同時トランスフェクトを含めた。
（Ｃ）  ２９３Ｔ細胞（１．５×１０５細胞／３５ｍｍウェル）に２μｇのＨＡ−ＥＲＫ２及び異なる量のＪＫＡＰを同時トランスフェクトした。対照として、ＨＡ−ＥＲＫ２及び０．５μｇのＰＫＣ−ξの同時トランスフェクトを含めた。トランスフェクトしたＤＮＡの量を正規化するために空ベクターを使用した。トランスフェクトしてから４４時間目に、細胞を収集し、細胞ライゼートを作成した。ＨＡ−ＪＮＫ１、ＨＡ−ｐ３８及びＨＡ−ＥＲＫ−２を抗−ＨＡ抗体（１２ＣＡ５）で免疫沈降させ、免疫複合体キナーゼアッセイを基質としてそれぞれＧＳＴ−ｃＪｕｎ（１−７９）、ＧＳＴ−ＡＴＦ−２及びＭＢＰを用いて実施した。ＨＡ−ＪＮＫ１、ＨＡ−ｐ３８及びＨＡ−ＥＲＫ−２発現の当量レベルを抗−ＨＡ（１２ＣＡ５）を用いるイムノブロット分析により確認した。
（Ｄ）  ＴＮＦ−α誘導ＪＮＫ活性の突然変異体ＪＫＡＰによるブロッキング。０．１μｇのＨＡ−ＪＵＫ１単独、またはＨＡ−ＪＵＫ１＋２μｇのＪＫＡＰ−Ｃ８８Ｓをトランスフェクトした２９３Ｔ細胞をＴＮＦ−α（１０ｎｇ／ｍｌ）で処理した。３０分後、細胞を招集し、細胞ライゼートを作成した。ＨＡ−ＪＵＫ１を抗−ＨＡ抗体（１２ＣＡ５）で免疫沈降させ、免疫複合体キナーゼアッセイを基質としてＧＳＴ−ｃＪＵＮ（１−７９）を用いて実施した。ＨＡ−ＪＵＫ１発現の当量レベルを抗−ＨＡ（１２ＣＡ５）を用いるイムノブロット（ＩＢ）分析により確認した。
【００３８】
図６は、ＪＫＡＰ−／−ＥＳ細胞の作成を示す。
（Ａ）  ＪＫＡＰゲノム座、標的ベクター及び突然変異座を概略的に示す。標的事象を検出するために使用した制限酵素サイト（Ｂ＝ＢａｍＨＩ、Ｘ＝ＸｂａＩ、Ｓ＝ＳａｌＩ）及びプローブを示す。
（Ｂ）  ゲノムＤＮＡを、２ｍｇ／ｍｌ  Ｇ４１８でのＪＫＡＰ＋／−ＥＳ細胞系の選択により誘導したＪＫＡＰ＋／＋、ＪＫＡＰ−／−及びＪＫＡＰ−／−ＥＳ細胞から単離した。ＤＮＡをＢａｍＨＩで消化し、サザン分析のために移し、標的ベクターの５’挿入サイトに隣接するプローブとハイブリダイズした。塩基対で表示する分子量を左に示す。
（Ｃ）  ＪＫＡＰ＋／＋、ＪＫＡＰ＋／−及びＪＫＡＰ−／−ＥＳ細胞由来の全ＲＮＡを単離し、ＪＫＡＰ  ｃＤＮＡプローブとハイブリダイズした。ノーザン転移後、ＲＮＡ完全性及び量をメチレンブルー染色により調べた。塩基対で表示する分子量を左側に示す。
【００３９】
図７は、ＪＮＫ活性化に関して（Ｅ）ＵＶ−Ｃを除き、（Ａ）ＴＮＦ−α、（Ｂ）ＴＦＧ−β、（Ｃ）ＩＬｌ及び（Ｄ）ソルビトール、に対するＪＫＡＰ−／−ＥＳ細胞の低い応答を示す。ＪＫＡＰ＋／＋及びＪＫＡＰ−／−ＥＳ細胞の〜８０％密度をＴＮＦ−α（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＴＧＦ−β（１０ｎｇ／ｍｌ）及びＩＬ−１（１０ｎｇ／ｍｌ）で１０分間処理し、ソルビトール（４００ｍＭ）及びＵＶ−Ｃ（３００Ｊ／ｍ２）で３７℃で３０分間処理した。次いで、細胞を収集し、細胞ライゼートを作成した。内在性ＪＮＫ１を抗−ＪＮＫ１抗体（Ａｂ１０１）で免疫沈降させ、免疫複合体キナーゼアッセイを基質としてＧＳＴ−ｃＪｕｎ（１−７９）を用いて実施した。
（Ｆ）  ＪＵＫ１  ＪＫＡＰ＋／＋、ＪＫＡＰ＋／−及びＪＫＡＰ−／−ＥＳ細胞の発現レベルを抗−ＪＮＫ１抗体（Ａｂ１０１）を用いるイムノブロット分析によりモニターした。
（Ｇ）  ＪＫＡＰ＋／＋及びＪＫＡＰ−／−胚由来の線維芽細胞の培養物を１００ｎｇ／ｍｌの４−α−ホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）で刺激した。異なる時間経過後に、細胞ライゼートを作成し、抗−ＥＲＫ２で免疫沈降させた。ＥＲＫ２キナーゼ活性をＭＢＰのリン酸化により測定した。ＭＢＰをＰＡＧＥゲル上で分離し、リン酸化産物をホスホルイメージャー分析により調べた。
（Ｈ）  ＪＫＡＰ＋／＋及びＪＫＡＰ−／−胚由来の線維芽細胞の培養物をＵＶ−Ｃ（３００Ｊ／ｍ２）で刺激し、異なる時間経過後Ｐ３８活性に関する免疫複合体アッセイを実施した。内在性Ｐ３８を免疫沈降させた後、そのキナーゼ活性を同様の結果を有するＭＢＰまたはＧＳＴ−ＡＦＴ２で測定した。
【００４０】
図８は、２９３Ｔ細胞におけるｍｙｃタグ付ＪＫＡＰのＨＰＫ−１での同時発現を示す。
（Ａ）  ライゼートを作成し、ＨＰＫ−１を抗−ＨＰＫ−１抗体（４８４）で免疫沈降させた。同時免疫沈降させたＪＫＡＰを市販されている抗−ｍｙｃ抗体を用いて検出した。ＨＰＫ−１発現の当量レベルを市販の抗−ＨＰＫ−１抗体（４８４）を用いるイムノブロット分析により確認した。
（Ｂ）  ２９３Ｔ細胞に０．１μｇのＨＡ−ＪＮＫ１単独、ＨＡ−ＪＮＫ１＋２μｇのＪＫＡＰまたはＨＰＫ−１、またはＨＡ−ＪＮＫ１＋２μｇずつのＪＫＡＰ及びＨＰＫ−１を同時トランスフェクトした。図８（ｂ）参照。トランスフェクトしたＤＮＡの量を正規化するために空ベクターを使用した。細胞ライゼートを作成し、ＨＡ−ＪＵＫ１を抗−ＨＡ抗体（１２ＣＡ５）で免疫沈降させた。免疫複合体キナーゼアッセイを基質としてＧＳＴ−ｃＪｕｎｅ（１−７９）を用いて実施した（ＷＥＳＴＥＲＮ）。
（Ｃ）  ２９２Ｔ細胞に２μｇの空ベクター対照、ｍｙｃ−ＪＫＡＰまたはｍｙｃ−ＪＫＡＰ−Ｃ８８Ｓをトランスフェクトした。細胞ライゼートを作成し、市販の抗−ｍｙｃ抗体で免疫沈降させた。ホスファターゼ活性について生じた沈殿をｐ−ニトロフェニルホスフェート（ｐＮＰＰ）によりアッセイした。３０分後、３Ｎ  ＮａＯＨを添加して酵素反応を停止し、生成物を４１０ｎｍで分光光度分析により測定した。
【００４１】
（発明の詳細説明）
本セクションは本発明を系統的に説明するためのものにすぎず、本明細書に記載の要旨を限定するものと解釈すべきでない。本明細書で引用したすべての文献は援用により本明細書に包含されるものとする。
【００４２】
新規な二元特異的ホスファターゼ（dual-specificity phosphatase）、すなわちＪＮＫ経路を選択的に上向きに調節するＪＮＫ活性化ホスファターゼ（ＪＮＫＰ）をクローン化し、特性化した。このタンパク質は、ＪＮＫの最大活性化のために必要であると見られる。ＪＮＫ活性化ホスファターゼが過剰発現すると、ＪＮＫカスケードが特異的に活性化された。培養胚幹細胞における標的化遺伝子破壊から、紫外線（ＵＶ）照射ではなく、プロ炎症性サイトカイン及び浸透圧ストレスによるＪＮＫ活性の誘導のためにＪＮＫ活性化ホスファターゼが必要であったことが立証された。これらのデータから、ＭＡＰキナーゼによるシグナル化の調節におけるホスファターゼの新しい役割が示唆される。
【００４３】
キナーゼが「ターン・オン」したものをホスファターゼがターン・オフするように作用するという概念からホスファターゼにかなり興味が持たれている。確かに、以前に同定された二元特異的ホスファターゼは、キナーゼの触媒ドメインのＴＸＹモチーフ中のトレオニン及びチロシン残基の脱リン酸化によって、もともと不活化されたＭＡＰＫを有している（Ｍ．Ｈ．Ｃｏｂｂ及びＥ．Ｊ．Ｇｏｌｄｓｍｉｔｈ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０：１４８４３（１９９５））。ＪＮＫ活性化ホスファターゼはＪＮＫ経路を独自に活性化するが、まだメカニズムは解明されていない。抑制性タンパク質の不活性化のように、ＪＮＫ上の抑制性残基の直接脱リン酸化が１つの可能性である。ＪＮＫ活性化ホスファターゼはＪＮＫを直接ではなく、むしろＪＮＫの上流のキナーゼ成分を活性化し得る。
【００４４】
ＪＮＫ活性化ホスファターゼがＥＲＫ及びｐ３８よりもＪＮＫに対して経路特異性を示すメカニズムはまだ不明である。他のＭＡＰキナーゼホスファターゼは、基質結合に関与する非触媒Ｎ−末端ドメインにより経路特異性を決定すると予測される（Ｍ．Ｃａｍｐｓら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８０：１２６２（１９９８）；Ｍ．Ｍｕｄａら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３：９３２３（１９９８））。ＪＮＫ活性化ホスファターゼは、Ｎ−末端ドメインを欠くにも関わらずＪＮＫに対して高い特異性を維持している。ＪＮＫ活性化ホスファターゼの特異性は、触媒ポケットに固有であり得るか、または多分相互作用タンパク質が基質特異性を与える。
【００４５】
刺激誘導ＪＮＫ活性化においてＪＮＫ活性化ホスファターゼが必要であることは、ＭＡＰキナーゼホスファターゼの中での新規な知見である。このこととＪＮＫ活性化ホスファターゼの他の独自の特性とから、単純な「オフ・スイッチ」としてよりもＭＡＰキナーゼシグナル化におけるホスファターゼのより複雑な役割が裏付けられる。
【００４６】
定義
用語「ＪＮＫ活性化ホスファターゼ核酸分子」は、配列番号１または３に記載のヌクレオチド配列を含むかまたは本質的に該ヌクレオチド配列からなる核酸、または配列番号１または３に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むかまたは本質的に該ヌクレオチド配列からなる核酸を指す。
【００４７】
関連核酸分子は、配列番号１または３に示すヌクレオチド配列と約７０％同一のヌクレオチド配列を含むかまたは本質的に該ヌクレオチド配列からなり、または配列番号２または４に記載のポリペプチドと約７０％同一のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むかまたは本質的に該ヌクレオチド配列からなる。好ましい実施態様では、ヌクレオチド配列は配列番号１または３に対応するヌクレオチド配列と約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、または約９５，９６，９７，９８もしくは９９％同一であり、または配列番号２または４に記載のポリペプチド配列と約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、または約９５，９６，９７，９８もしくは９９％同一であるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列である。関連核酸分子も、少なくとも約１０個、約１５個、約２０個、約２５個、約５０個、約７５個、約１００個、または約１００個を超える隣接ヌクレオチドである上記ＪＮＫ活性化ホスファターゼ核酸分子の断片を含む。関連核酸分子は、少なくとも約２５個、約５０個、約７５個、約１００個、または約１００個を超えるアミノ酸残基のポリペプチドをコードする上記ＪＮＫ活性化ホスファターゼ核酸分子の断片を含む。関連核酸分子は、配列番号２または４のポリペプチドと比較して１〜５０アミノ酸残基の置換、修飾及び／または欠失を含むかまたは本質的に当該残基の置換、修飾及び／または欠失からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。関連ＪＮＫ活性化ホスファターゼ核酸分子は、本明細書に記載の中程度又は高度にストリンジェントな条件下で上記核酸分子またはその相補体とハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む。好ましい実施態様では、関連核酸分子は、中程度又は高度にストリンジェントな条件下で配列番号１または３に記載の配列、もしくは配列番号２または４に記載の配列を含むポリペプチドをコードする分子、上記核酸断片、上記ポリペプチドをコードする核酸断片とハイブリダイズする配列を含む。関連核酸分子は上記核酸のアレリックまたはスプライス変異体を含み、上記ヌクレオチド配列と相補性である配列を含むと理解されたい。
【００４８】
用語「単離核酸分子」は、元々存在している少なくとも１つの汚染核酸分子を含まない、好ましくはタンパク質の産生、治療または診断の際の使用を邪魔する他の汚染哺乳動物核酸分子を実質的に含まない本発明の核酸分子を指す。
【００４９】
用語「アリレック変異体」は、生物または生物集団の染色体上の所与の座を占める遺伝子の幾つかの考えられる天然に存在する代替型の１つを指す。
【００５０】
用語「スプライス変異体」は、ＲＮＡ転写物中のイントロン配列のオールタナティブプロセッシングにより作成される核酸分子、通常ＲＮＡを指す。
【００５１】
用語「発現ベクター」は、宿主細胞における増殖に適しており、挿入した異種核酸配列の発現を指向及び／または制御する核酸配列を含むベクターを指す。その例には、転写、翻訳、及びイントロンが存在するならばＲＮＡスプライシングが含まれるが、これらに限定されない。
【００５２】
用語「高度にストリンジェントな条件」は、（１）洗浄のために低いイオン強度試薬及び高い温度［例えば、５０℃で０．０１５Ｍ  ＮａＣｌ／０．００１５Ｍ  クエン酸ナトリウム／０．１％  ＮａＤｏｄＳＯ４（ＳＤＳ）］を用いるまたは（２）ハイブリダイゼーション中ホルムアルデヒドのような変性剤を用いる［例えば、５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド＋０．１％  ウシ血清アルブミン］条件を指す。Ｙ．Ｔ．Ｉｐ及びＲ．Ｊ．Ｄａｖｉｓ，Ｃｕｒｒ，Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１０：２０５（１９９８）、Ｄ．Ｇ．Ｉ．Ｇｏｂｅｒｄｈａｎ及びＣ．Ｗｉｌｓｏｎ，Ｂｉｏａｓｓａｙｓ，２０：１００９（１９９８）参照。或いは、４２℃でのＦｉｃｏｌｌ、０．１％  ポリビニルピロリドン、５０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）、７５０ｍＭ  ＮａＣｌ及び７５ｍＭ  クエン酸ナトリウムの使用も例示される。他の例は、４２℃での５０％  ホルムアルデヒド、５×ＳＳＣ（０．７５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０７５Ｍ  クエン酸ナトリウム）、５０ｍＭ  リン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％  ピロリン酸ナトリウム、５×デンハート溶液、音波処理したサケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％  ＳＤＳ及び１０％  硫酸デキストラン、及び４２℃での０．２×ＳＳＣ及び０．１％  ＳＤＳ中での洗浄である。
【００５３】
用語「中度にストリンジェントな条件」は、上記のストリンジェントな条件よりも弱い洗浄溶液及びハイブリダイゼーション条件（例えば、温度、イオン強度、ＳＤＳの％）の使用を含む条件を指す。中緊縮条件の例は、２０％  ホルムアルデヒド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１５ｍＭ  クエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭ  リン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート溶液、１０％  硫酸デキストラン及び２０μｌ／ｍｌ  変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中３７℃で一晩インキュベート後１×ＳＳＣ中約３７〜５０℃で洗浄というような条件である。当業者はプローブの長さ等の要因に適応させるために所要により温度、イオン強度等をどのような調節するかを認識している。
【００５４】
オリゴヌクレオチドプローブをｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーをスクリーニングするために使用する或る好ましい実施態様では、高緊縮条件は配列を標的するためのオリゴヌクレオチドプローブの融点（Ｔｍ）に依存して使用される。Ｔｍは以下の式（Ｂｏｌｔｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，４５：１３９０（１６６２））を用いて推定され得る。
Ｔｍ＝８１．５−１６．６（ｌｏｇ［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−（６００／Ｎ）
ここで、［Ｎａ＋］はハイブリダイゼーション（または、洗浄）溶液中のナトリウムイオン濃度であり、％Ｇ＋Ｃはオリゴヌクレオチド中のグアニン及びシトシン含量であり、Ｎはヌクレオチドで表示するプローブ長である。
【００５５】
高ストリンジェント溶液の例は、オリゴヌクレオチドプローブの長さに応じて３５〜６３℃の温度での６×ＳＳＣ及び０．０５％  ピロリン酸ナトリウムである。例えば、或る実施態様によれば、１４塩基対プローブは３５〜４０℃で、１７塩基対プローブは４５〜５０℃で、２０塩基対プローブは５２〜５７℃で、２３塩基対プローブは５７〜６３℃で洗浄する。温度はバックグラウンド非特異的結合が高く現れているときには２〜３℃高くし得る。第２の高ストリンジェント溶液はオリゴヌクレオチドプローブを洗浄するために塩化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＣ）を使用する。１つのストリンジェント洗浄溶液は３Ｍ  ＴＭＡＣ、５０ｍＭ  トリスＨＣｌ（ｐＨ８．０）及び０．２％ＳＤＳである。この溶液を用いる洗浄温度はプローブの長さに依存する。例えば、１４塩基対プローブは３５〜４０℃で、１７塩基対プローブは約４５〜５０℃で、２０塩基対プローブは５２〜５７℃で、２３塩基対プローブは５７〜６３℃で洗浄する。
【００５６】
用語「ＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチド」は、配列番号１または２のアミノ酸配列を含むポリペプチド及び本明細書に記載の関連ポリペプチドを指す。関連ポリペプチドには、アレリック変異体、スプライス変異体、断片、誘導体、置換変異体、欠失変異体、挿入変異体、融合ポリペプチド及びオーソログが含まれる。ＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドは本明細書に定義されている成熟ポリペプチドであってもよく、製造方法に応じてアミノ末端メチオニン残基を有していてもいなくてもよい。
【００５７】
用語「ＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチド断片」は、配列番号２または４に記載のＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドの完全長よりも短いアミノ酸配列を含むペプチドまたはポリペプチドを指す、前記断片は、例えばアミノ末端での切断、カルボキシル末端での切断及び／またはアミノ酸配列からの残基の内部欠失により生じ得る。ＪＮＫ活性化ホスファターゼ断片は代替ＲＮＡスプライシングまたはインビボプロテアーゼ活性の結果であり得る。
【００５８】
用語「ＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチド変異体」は、配列番号２または４に記載のＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドアミノ酸配列に比して１つ以上のアミノ酸配列の置換、欠失及び／または付加を含むＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドを指す。変異体は天然に存在しているものであっても人工的に構築してもよい。前記ＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチド変異体は前記変異体をコードする対応の核酸分子から作成され得、配列番号２または４に記載の野生型ＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドのＤＮＡ配列とは異なるＤＮＡ配列を有する。
【００５９】
用語「ＪＮＫ活性化ホスファターゼ融合ポリペプチド」は、ＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチド、その断片、変異体または誘導体と異種ペプチドまたはポリペプチドとの融合体を指す。
【００６０】
用語「ＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチド誘導体」は、例えば１つ以上のポリマーを共有結合させることにより化学的に修飾させたＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチド、その変異体または断片を指し、前記ポリマーには非限定的に水溶性ポリマー、Ｎ−結合またはＯ−結合炭水化物、糖、ホスフェート及び／または他の分子が含まれる。誘導体は、ポリペプチドに結合している分子の種類または位置の点で天然に存在するＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドとは異なるように修飾されている。誘導体には更にＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドに元々結合している化学基を１つ以上欠失させたものが含まれる。
【００６１】
用語「生物学的に活性なＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチド」、「生物学的に活性なＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチド断片」、「生物学的に活性なＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチド変異体」及び「生物学的に活性なＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチド誘導体」は、ＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドの少なくとも１つの作用特性（例えば、ＪＮＫ活性化の調節またはＪＮＫ媒介シグナル伝達のモジュレート）を有するＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドを指す。通常、ＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチド並びにその変異体、断片及び誘導体はＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドの少なくとも１つの作用特性（例えば、ＪＮＫ活性化の調節またはＪＮＫ媒介シグナル伝達のモジュレート）を有する。更に、ＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドは免疫原として活性であり得る（すなわち、ポリペプチドは少なくとも１つのエピトープを含み、該エピトープに対して抗体が作成され得る）。
【００６２】
核酸分子、ポリペプチド、宿主細胞等のような生物学的材料に関連して使用するとき、用語「天然に存在する」は天然に存在し、ヒトにより操作されていないものを指す。
【００６３】
用語「単離ポリペプチド」は、自然環境に存在する少なくとも１つの汚染ポリペプチドを含まない、好ましくは治療または診断を邪魔する恐れがある他の汚染哺乳動物ポリペプチドを実質的に含まない本発明のポリペプチドを指す。
【００６４】
用語「オーソログ」は、異なる種から同定されたポリペプチドに相当するポリペプチドを指す。例えば、マウスとヒトＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドはオーソログと見做される。
【００６５】
用語「成熟ＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチド」は、リーダー配列を欠くポリペプチドを指し、アミノ末端（場合によりリーダー配列を有する）及び／またはカルボキシル末端の原核プロセッシング、大きな前駆体からの小さなポリペプチドの切断、Ｎ−結合及び／またはＯ−結合グリコシル化等のようなポリペプチドの他の修飾を含み得る。
【００６６】
用語「有効量」及び「治療有効量」は、観察可能レベルの前記したＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドの１つ以上の生物学的活性を支持するのに有用または必要なＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドの量を指す。
【００６７】
核酸分子及び／またはポリペプチドの関連性
当業界で公知のように、用語「同一性」は配列を比較して決定した２つ以上のポリペプチド分子または２つ以上の核酸分子の配列間の関係を指す。当業界において、「同一性」は、場合に応じてヌクレオチドまたはアミノ酸配列の鎖間のマッチにより決定したポリペプチドまたは核酸分子配列の間の配列関連度を意味する。「同一性」はコンピュータープログラムの特定の数学モデル（すなわち、アルゴリズム）によりアドレスされるギャップアラインメントを有する２つ以上の配列間の同一マッチのパーセントを指す。
【００６８】
用語「類似性」は関連する概念であるが、「同一性」とは異なり、同一マッチ及び保存的置換マッチの両方を含む類似性の尺度を指す。保存的置換はポリペプチドに適用され、核酸分子に適用されないので、類似性はポリペプチド配列の比較のみを扱う。２つのポリペプチド配列が例えば１０／２０同一アミノ酸を有し、残りがすべて非保存的置換であるならば、同一性及び類似性は共に５０％である。同一例において５個以上の位置が保存的置換されている場合には同一性は５０％であるが、類似性は７５％（１５／２０）である。従って、保存的置換が存在する場合、２つのポリペプチド間の類似度はこれら２つの配列間の同一度よりも高い。
【００６９】
用語「保存的アミノ酸置換」は、その位置のアミノ酸残基の極性または電荷に殆ど乃至全く影響がないような天然アミノ酸残基の非天然残基による置換を指す。例えば、ポリペプチド中の非極性残基を他の非極性残基で置換すると保存的置換が生ずる。更に、アラニン走査型突然変異について上記したようにポリペプチド中の天然残基をアラニンで置換してもよい。保存的アミノ酸置換についての一般的規則を表１に示す。
【００７０】
【表１】
0003842130.tif 000002
【００７１】
保存的アミノ酸置換には、典型的には生物学的システムでの合成よりむしろ化学ペプチド合成により取り込まれる非天然アミノ酸残基が含まれる。これには擬ペプチド、及びアミノ酸部分の他の逆または反転形態が含まれる。
【００７２】
アミノ酸配列に対する保存的修飾（及びコーディングヌクレオチドに対する対応修飾）により、天然に存在するＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドに類似の機能的及び化学的特性を有するＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドが産生されると期待される。対照的に、ＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドの機能的及び／または化学的特性の実質的な修飾は、（ａ）例えばシートまたは螺旋コンホメーションとしての置換領域の分子骨格の構造、（ｂ）標的サイトでの分子の電荷及び疎水性、または（ｃ）側鎖のバルクの維持に対する影響の点で有意に異なる置換を選択することにより達成され得る。天然に存在する残基は共通の側鎖の性質に基づいて、
１）疎水性（ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ）、
２）中性親水性（Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ）、
３）酸性（Ａｓｐ、Ｇｌｕ）、
４）塩基性（Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ）、
５）鎖配向に影響を与える残基（Ｇｌｙ、Ｐｒｏ）及び
６）芳香族（Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ）に分類され得る。
【００７３】
非保存的置換には、前記クラスの内の１つのメンバーの他のクラスのメンバーでの交換が含まれる。置換された残基は、非ヒトＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドと相同性のヒトＪＮＫ活性化ホスファターゼ分子の領域または分子の非相同領域に導入され得る。
【００７４】
関連する核酸分子及びポリペプチドの同一性及び類似性は、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａ．Ｍ．Ｌｅｓｋ編，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８８年）発行、Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｃｅｔｓ，Ｄ．Ｗ．Ｓｍｉｔｈ編，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９３年）発行、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，第１部，Ａ．Ｍ．Ｇｒｉｆｆｉｎ及びＨ．Ｇ．Ｇｒｉｆｆｉｎ編，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ（１９９４年）発行、Ｇ．ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｌｅ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９８７年）発行、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ，Ｍ．Ｇｒｉｂｓｋｏｖ及びＪ．Ｄｅｖｅｒｅｉｓ編，Ｍ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ（１９９１年）発行、Ｃａｒｉｌｌｏら，ＳＩＡＭ  Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．，４８：１０７３（１９８８）等に記載されているような公知の方法により容易に計算することができる。
【００７５】
同一性及び／または類似性を決定するための好ましい方法は、検査する配列間の最大マッチを与えるように設計されている。同一性及び類似性の決定方法は公開されているコンピュータープログラムで体系づけられている。２つの配列間の同一性及び類似性を決定するための好ましいコンピュータープログラム法には、ＧＡＰ（Ｄｅｖｅｒｅｕｓら，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１２：３８７（１９８４）；ウィスコンシン州マジソンに所在のウィスコンシン大学のＧｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ及びＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−１０（１９９０））を含めたＧＣＧプログラムパッケージが含まれるが、これらに限定されない。ＢＬＡＳＴ  ＸプログラムはＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）及び他のソース（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，ＢＬＡＳＴ  Ｍａｎｕａｌ（メリーランド州ベセスダに所在のＮＣＢ  ＮＬＭ  ＮＩＨ；上掲のＡｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０））から公開されている。同一性を決定するために公知のＳｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用することできる。
【００７６】
例えば、コンピュータアルゴリズムＧＡＰ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ）を用いて、配列同一％を測定しようとする２つのポリペプチドを各アミノ酸の最適マッチングのためにアラインする（「マッチドスパン(matched span)」はアルゴリズムにより決まる）。ギャップ開放ペナルティー(gap opening penalty)（３×平均項として計算される；「平均項」は使用した比較マトリックスの項の平均である；「項」は特定の比較マトリックスにより各完全アミノ酸マッチに割り当てられるスコアまたは数である）、ギャップオープニングペナルテイー(gap extension penalty)（通常ギャップ開放ペナルティーの１／１０倍である）及び比較マトリックス（例えば、ＰＡＭ  ２５０またはＢＬＯＳＵＭ  ６２）がアルゴリズムと一緒に使用される。標準比較マトリックス（ＰＡＭ２５０比較マトリックスについてはＤａｙｈｏｆｆら，５  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｓｕｐｐ，３，１９７８））参照、ＢＬＯＳＵＭ  ６２比較マトリックスについてはＨｅｎｉｋｏｆｆら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：１０９１５−１９（１９９２）参照）もアルゴリズムにより使用される。
【００７７】
ポリペプチド配列比較のための好ましいパラメーターには、
アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４３−５３（１９７０）、
比較マトリックス：Ｈｅｎｉｋｏｆｆら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：１０９１５−１９（１９９２）のＢＬＯＳＵＭ  ６２、
ギャップペナルテイー：１２、
ギャップ長ペナルテイー：４、
類似性の閾値：０
が含まれる。
【００７８】
ＧＡＰプログラムが上記パラメータと使用される。上記パラメータはＧＡＰアルゴリズムを用いるポリペプチド比較（末端ギャップに対するペナルティーなしで）のためのデフォールトパラメータである。
【００７９】
核酸分子配列比較のための好ましいパラメータには、
アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４３−５３（１９７０）、
比較マトリックス：マッチ＝＋１０、ミスマッチ＝０、
ギャップペナルテイー：５０、
ギャップ長ペナルテイー：３
が含まれる。
【００８０】
ＧＡＰプログラムが上記パラメータと使用される。上記パラメータは核酸分子比較のためのデフォールトパラメータである。
【００８１】
Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｍａｎｕａｌ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ，バージョン９（１９９７年９月）に記載されているものを含めた他のアルゴリズム、ギャップ開放ペナルティー、ギャップ拡張ペナルティー、比較マトリックス、類似性の閾値等を当業者が使用してもよい。実施しようとする特定の比較、例えばＤＮＡ対ＤＮＡ、タンパク質対タンパク質、タンパク質対ＤＮＡに応じて、また所与の対の配列間（この場合にはＧＡＰ及びＢｅｓｔＦｉｔが通常好ましい）または１つの配列と大きなデータベースの配列間（この場合にはＦＡＳＴＡまたはＢＬＡＳＴが好ましい）を比較するかに応じて特に選択される。
【００８２】
単離したマウスｃＤＮＡの配列分析（マウスＪＮＫ活性化ホスファターゼ様タンパク質：配列番号２）は、タンパク質のＦＧＦファミリーの新規メンバーをコードしたことを示した。マウスＪＮＫ活性化ホスファターゼ様遺伝子は２０５アミノ酸のタンパク質（配列番号４）をコードする６１５ｂｐオープンリーディングフレーム（配列番号３）を含む（図２）。前記マウス配列を使用してヒトＪＮＫ活性化ホスファターゼ様オーソログを同定した。ヒトＪＮＫ活性化ホスファターゼ様ポリペプチドｃＤＮＡクローンの配列分析は、ヒトＪＮＫ活性化ホスファターゼ様遺伝子が２０５アミノ酸のタンパク質（図１）（配列番号２）をコードする６１５ｂｐオープンリーディングフレーム（配列番号１）を含むことを示した。
【００８３】
図３（Ａ）はヒトＪＮＫ活性化ホスファターゼ、マウスＪＮＫ活性化ホスファターゼ及び特定のＭＡＰＫホスファターゼのアミノ酸配列アラインメントを示している。Ｉｎｓｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（ＵＲＬ  Ｄｏｔ．ｉｍｇｅｎ．ｂｃｍ．ｔｍｃ．ｅｄｕ：９３３１／ｍｕｌｔｉ−ａｌｉｇｎ／ｍｕｌｔｉ−ａｌｉｇｎ．ｈｔｍｌ  Ｂａｙｌｏｒ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｌａｕｎｃｈｅｒ）データベースのＰＩＭＡ  １．４プログラムを用いて予想されるマウスＪＮＫ活性化ホスファターゼ様ポリペプチドをコンピュータ分析したところ、前記タンパク質がＨＶＨＲに最も近かったことが示された。ＧＡＰプログラムを用いて、マウスＪＮＫ活性化ホスファターゼ様ポリペプチドはＨＶＨＲと３２％同一であることが分かった。マウスＪＮＫ活性化ホスファターゼ様ポリペプチドはヒトＪＮＫ活性化ホスファターゼ様タンパク質と８９％同一である。
【００８４】
核酸分子
本発明で使用される組換えＤＮＡ方法は、包括的にＳａｍｂｒｏｏｋら，「分子クローニング：実験マニュアル(Molecular Cloning: A Laboratory Manual)」，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９年）発行及び／または「分子生物学の現在のプロトコル(Current Protocols in Molecular Biology)」，Ａｕｓｕｂｅｌら編，Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｌｉｓｈｅｒｓ  Ｉｎｃ．ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（１９９４年）発行に記載されているものである。
【００８５】
本発明は本明細書に記載の核酸分子及び前記分子の入手方法を提供する。ＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドまたはその断片をコードする遺伝子またはｃＤＮＡはゲノムまたはｃＤＮＡライブラリーのハイブリダイゼーションスクリーニングまたはＰＣＲ増幅により得ることができる。ハイブリダイゼーションによりライブラリーをスクリーニングするために使用されるプローブまたはプライマーは、同一または関連するファミリーの遺伝子（例えば、保存モチーフ）由来の他の公知の遺伝子または遺伝子断片についての配列情報に基づいて作成され得る。加えて、ＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドをコードする遺伝子が他の種から同定されている場合にはその遺伝子の全部または一部を他の種（オーソログ）由来の対応遺伝子または同一種（ホモログ）由来の関連遺伝子を同定するためのプローブとして使用され得る。前記プローブまたはプライマーは、ＪＮＫ活性化ホスファターゼ遺伝子を発現すると考えられる各種組織ソース由来のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために使用され得る。また、ＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドをコードする遺伝子を同定し、単離するためにゲノムライブラリーをスクリーニングするために配列番号１または２に記載の配列を有する核酸分子の一部または全部を使用することができる。典型的には、前記スクリーニングから得られる疑陽性の数を最小限とするために中〜高度のストリンジェントな条件をスクリーニングのために使用する。
【００８６】
ＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドをコードする核酸分子を、発現タンパク質の性質に基づいてポジティブなクローンの検出を使用する発現クローニングにより同定することもできる。典型的には、宿主細胞表面上で発現し、現れるクローン化タンパク質に対する抗体または他の結合パートナー（例えば、受容体またはリガンド）を結合させることにより核酸ライブラリーをスクリーニングする。前記抗体または結合パートナーは所望のクローンを発現する細胞を同定するために検出可能な標識を用いて修飾される。
【００８７】
ＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドまたはその断片をコードする核酸分子を作成するための別の方法は、Ｅａｇｅｌｓら，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．，２８：７１６−３４（１９８９）に記載されているような当業者に公知の方法を用いる化学合成である。前記方法には特に核酸合成のためのホスホトリエステル、ホスホルアミダイト及びＨ−ホスホネート方法が含まれる。前記化学合成の好ましい方法は一般的なホスホルアミダイト化学を用いるポリマー支持合成である。典型的には、ＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドをコードするＤＮＡは数百のヌクレオチド長を有する。約１００ヌクレオチドよりも長い核酸は前記方法を用いて数個の断片として合成され得る。次いで、前記断片を連結すると完全長のＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドが形成され得る。通常、ポリペフチドのアミノ末端をコードするＤＮＡ断片はＡＴＧを有し、このＡＴＧはメチオニン残基をコードする。このメチオニンは、宿主細胞で産生されるポリペプチドが該細胞から分泌されるように設計されているかに応じてＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドの成熟形態で存在していたりいなかったりする。
【００８８】
場合により、ＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチド変異体をコードする核酸分子を作成することが望ましいことがある。前記変異体をコードする核酸分子は部位特異的突然変異、ＰＣＲ増幅または他の適当な方法により製造され得、ここでプライマーは所望の点突然変異を有する（突然変異方法の説明については、上掲のＳａｍｂｒｏｏｋら及び上掲のＡｕｓｕｂｅｌら参照）。上掲のＥａｇｅｌｓらの方法を用いる化学合成も前記変異体を作成するために使用することができる。当業者に公知の他の方法も使用可能である。
【００８９】
或る実施態様では、核酸変異体は所与の宿主細胞におけるＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドの最適発現のために変更したコドンを含む。特定のコドンの変更は発現のために選択したＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチド及び宿主細胞に依存する。前記した「コドン最適化」は各種方法、例えば所要の宿主細胞において高度に発現させた遺伝子で使用するのに好ましい選択コドンを用いて実施され得る。高度に発現させた細菌遺伝子のコドン選択についての“Ｅｃｏｈｉｇｈ．Ｃｏｄ”のようなコドン頻度表(codon frequency tables)を組み入れたコンピューターアルゴリズムを使用し得、こうしたアルゴリズムはウィスコンシン州マジソンに所在のＧｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  ＧｒｏｕｐのＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎパーッケージバージョン９．０により提供されれる。他の有用なコドン頻度表には“Ｃｅｌｅｇａｎｓ ｈｉｇｈ．ｃｏｄ”、“Ｃｅｌｅｇａｎｓ ｌｏｗ．ｃｏｄ”、“Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｈｉｇｈ．ｃｏｄ”、“Ｈｕｍａｎ ｈｉｇｈ．ｃｏｄ”、“Ｍａｉｚｅ ｈｉｇｈ．ｃｏｄ”及び“Ｙｅａｓｔ ｈｉｇｈ．ｃｏｄ．”が含まれる。
【００９０】
他の実施態様では、核酸分子は、上に定義した保存的アミノ酸置換を含むＪＮＫ活性化ホスファターゼ変異体、１つ以上のＮ−結合またはＯ−結合グリコシル化サイトの付加及び／または欠失を含むＪＮＫ活性化ホスファターゼ変異体、１つ以上のシステイン残基の欠失及び／または置換を有するＪＮＫ活性化ホスファターゼ変異体、または上記したＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチド断片をコードする。更に、核酸分子は本明細書に記載のＪＮＫ活性化ホスファターゼ変異体、断片及び融合ポリペプチドの組合せをコードし得る。
【００９１】
ベクター及び宿主細胞
ＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドをコードする核酸分子は一般的な連結手段を用いて適切な発現ベクターに挿入される。前記ベクターは典型的には使用する特定の宿主細胞において機能性であるように選択される（すなわち、ベクターは遺伝子の増幅及び／または遺伝子の発現が起こり得るように宿主細胞組織と適合性である）。ＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドをコードする核酸分子は原核、酵母、昆虫（バキュロウイルス系）及び／または真核宿主細胞中で増幅／発現され得る。宿主細胞の選択は一部、ＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドが翻訳後に修飾（例えば、グリコシル化及び／またはリン酸化）されるかに依存する。そうならば、酵母、昆虫または哺乳動物宿主細胞が好ましい。発現ベクターについては、１８５  Ｍｅｈ．Ｅｎｚ．，Ｄ．Ｖ．Ｇｏｅｄｄｅｌ編，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９０年）発行を参照されたい。
【００９２】
典型的には、宿主細胞で使用される発現ベクターはプラスミド維持のため及び外来性ヌクレオチド配列のクローニング・発現のための配列を含む。前記配列は或る実施態様ではまとめて「フランキング（flanking）配列」と称されるが、この配列は以下のヌクレオチドの１つ以上を含む：プロモーター、１つ以上のエンハンサー配列、複製起源、転写停止配列、供与体及び受容体スプライスサイトを含む完全イントロン配列、分泌のためのリーダー配列、リボソーム結合サイト、ポリアデニル化配列、発現させるポリヌクレオチドをコードする核酸を挿入するためのポリリンカー領域及び選択マーカー要素。以下、前記した各配列を説明する。
【００９３】
場合により、ベクターは「タグ」配列、すなわちＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドコーディング配列の５’または３’に位置するオリゴヌクレオチド分子（このオリゴヌクレオチド分子はＰｏｌｙＨｉｓ（例えば、ｈｅｘａＨｉｓ）をコートする）、または他の「タグ」、例えばＦＬＡＧ、ＨＡ（赤血球凝集素インフルエンザウイルス）またはｍｙｃを含み得る。後者に対する抗体は市販されている。前記タグは典型的にはポリペプチドの発現時にポリペプチドに融合し、宿主細胞からＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドをアフィニティー精製するための手段として使用し得る。アフィニティー精製は、例えばアフィニティーマトリックスとしてタグに対する抗体を用いるカラムクロマトグラフィーにより達成され得る。任意に、タグはその後精製ＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドから各種手段により、例えば開裂のために特定のペプチダーゼを用いて除去され得る。
【００９４】
フランキング配列は、通常ＪＮＫ活性化ホスファターゼ発現を調節するように機能する同種（すなわち、宿主細胞と同一の種及び／または株に由来する）、異種（すなわち、宿主細胞の種または株とは異なる種に由来する）、ハイブリッド（すなわち、２つ以上のソース由来のフランキング配列の組合せ）、合成または天然配列である。フランキング配列が宿主細胞組織中で機能し且つ活性化され得るならば、フランキング配列のソースは原核または真核生物、脊椎または非脊椎生物、または植物であり得る。
【００９５】
本発明のベクターにおいて有用なフランキング配列は当業界で公知の幾つかの方法により得ることができる。典型的には、ＪＮＫ活性化ホスファターゼ遺伝子フランキング配列以外で本発明において有用なフランキング配列はマッピング及び／または制限エンドヌクレアーゼ消化により予め同定されており、よって適当な制限エンドヌクレアーゼを用いて適切な組織ソースから単離され得る。場合により、１つ以上のフランキング配列の完全ヌクレオチド配列が公知であり得る。フランキング配列は核酸合成またはクローニングに関して上記した方法を用いて合成され得る。
【００９６】
フランキング配列の全部またはその一部のみが公知である場合、ＰＣＲを用いて及び／またはゲノムライブラリーを同一または異なる種由来の適当なオリゴヌクレオチド及び／またはフランキング配列を用いてスクリーニングすることにより得ることができる。
【００９７】
フランキング配列が公知でない場合、フランキング配列を含むＤＮＡの断片は例えばコーディング配列または別の遺伝子を含み得る大ピースのＤＮＡから単離され得る。単離は、制限エンドヌクレアーゼで消化して適切なＤＮＡ断片を生成し、その後アガロースゲル精製、Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）カラムクロマトグラフィーまたは当業者に公知の他の方法を用いて単離することにより達成され得る。この目的を達成するための適当な酵素の選択は当業者には自明である。
【００９８】
複製の起源は典型的には市販されている原核発現ベクターの一部であり、宿主細胞におけるベクターの増幅を助ける。場合によってはベクターを特定コピー数まで増幅させることがＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドを最適に発現させるために重要であり得る。選択したベクターが複製サイトの起源を含んでいないときには、公知の配列に基づいて化学的に合成し、ベクターに連結され得る。
【００９９】
プラスミドｐＢＲ３２２（マサチューセッツ州ビバリーに所在のＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏｌａｂｓのＰｒｏｄｄｕｃｔ  Ｎｏ．３０３−３ｓ）からの複製の起源が多くのグラム陰性菌に適しており、各種起源（例えば、ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、水泡性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、またはＨＰＶやＢＰＶのようなパピローマウイルス）が哺乳動物細胞におけるベクターのクローニングのために使用される。通常、複製成分の起源は哺乳動物発現ベクターのためには必要でない（例えば、ＳＶ４０起源は初期プロモーターを含んでいるのでしばしば単独で使用される）。
【０１００】
転写停止配列は、典型的にはポリペプチドコーディング領域の末端の３’に位置し、転写を停止するために働く。通常、原核細胞中の転写停止配列はＧ−Ｃリッチ断片及びその後のポリ−Ｔ配列である。配列はライブラリーから容易にクローン化されるかまたはベクターの一部として市販されているが、配列は上記したような核酸合成のための方法を用いて容易に合成され得る。
【０１０１】
選択マーカー遺伝子要素は特定培地で成長させた宿主細胞の生存及び成長に必要なタンパク質をコードする。典型的な選択マーカー遺伝子は、（ａ）原核宿主細胞に対して抗生物質または他の毒素（例えば、アンピシリン、テトラサイクリンまたはカナマイシン）耐性を付与する、（ｂ）宿主細胞の栄養要求不足を補充する、または（ｃ）複合培地から得ることができない必要な栄養素を補給するタンパク質をコードする。好ましい選択マーカーはカナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子及びテトラサイクリン耐性遺伝子である。ネオマイシン耐性遺伝子も原核及び真核宿主細胞における選択のために使用され得る。
【０１０２】
他の選択遺伝子は発現されるであろう遺伝子を増幅するために使用され得る。増幅は、成長に必要なタンパク質の産生のためにかなり必要とされる遺伝子を組組換え細胞の連続世代の染色体内に縦列で反復させるプロセスである。哺乳動物細胞のための適当な選択マーカーの例にはジヒドロホレートレダクターゼ（ＤＨＦＲ）及びチミジンキナーゼが含まれる。哺乳動物細胞形質転換体を、ベクター中に存在するマーカーにより形質転換体のみが生存するように独自に適合させる選択圧力下に置く。培地中の選択剤の濃度が連続的に変化し、よって選択遺伝子とＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドをコードするＤＮＡの両方が増殖される条件下で形質転換細胞を培養することにより選択圧力を加える。その結果として、大量のＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドが増幅ＤＮＡから合成される。
【０１０３】
リボソーム結合サイトは通常ｍｒｎａの翻訳開始のために必要であり、Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列（原核細胞）またはＫｏｚａｋ配列（真核細胞）により特徴付けられる。前記要素は典型的にはプロモーターに対して３’の位置及び発現させるＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドのコーディング配列に対して５’の位置にある。各種Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列があるが、典型的にはポリプリン（すなわち、高いａ−ｇ含量を有する）である。多くのＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列が同定されており、その各々は上記した方法を用いて容易に合成され、原核ベクターにおいて使用され得る。
【０１０４】
多くの場合、ベクター中に１つ以上のイントロンを存在させることにより核酸分子の転写が増加する。これは、ポリペプチドを真核宿主細胞、特に哺乳動物宿主細胞において産生させるときに特に当てはまる。使用するイントロンは、特に使用する遺伝子が完全長ゲノム配列またはその断片である場合にはＪＮＫ活性化ホスファターゼ遺伝子内に元々存在し得る。イントロンが（多くのｃＤＮＡの場合のように）遺伝子内に元々存在していないときには、イントロンは他のソースから入手可能である。フランキング配列及びＪＮＫ活性化ホスファターゼ遺伝子に対するイントロンの位置は通常重要である。なぜならば、イントロンは効率的に転写されなければならないからである。従って、ＪＮＫ活性化ホスファターゼｃＤＮＡ分子を発現させるときのイントロンの好ましい位置は転写開始サイトに対して３’及びポリ−Ａ転写停止配列に対して５’である。好ましくは、イントロンはコーディング配列を邪魔しないようにｃＤＮＡの一方または他方（すなわち、５’または３’）に位置している。イントロンがそれを挿入する宿主細胞と適合性であるならば、ウイルス、原核及び真核（植物または動物）生物を含めた任意のソース由来のイントロンを本発明の実施のために使用可能である。また、合成イントロンも使用可能である。場合により、２つ以上のイントロンをベクター中に使用してもよい。
【０１０５】
本発明の発現及びクローニングベクターは典型的には、宿主細胞により認識され且つＪＮＫ活性化ホスファターゼタンパク質をコードする分子に作動的に連結されるプロモーターを含む。プロモーターは、構造遺伝子の転写及び翻訳を制御する構造遺伝子（通常約１００〜１０００ｂｐ）の開始コドンの上流（すなわち、５’）に位置する非翻訳配列である。プロモーターは便宜的に誘導プロモーター及び構成的プロモーターの２つに大別される。誘導プロモーターは、栄養素の存在／不在や温度変化のような培養条件の若干の変化に応じて制御下でＤＮＡから高い転写レベルを開始する。各種の宿主細胞により認識されるプロモーターは多数公知である。前記プロモーターは、ソースＤＮＡ由来のプロモーターを制限酵素消化により除去し、所望のプロモーター配列をベクターに挿入することによりＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドをコードするＤＮＡに作動的に連結される。天然のＪＮＫ活性化ホスファターゼプロモーター配列はＪＮＫ活性化ホスファターゼＤＮＡの増幅及び／または発現を指向するために使用され得る。しかしながら、天然プロモーターに比して高い転写及び発現産物の高い収率が可能であり、使用するために選択した宿主細胞系と適合性であるならば、異種プロモーターが好ましい。
【０１０６】
原核宿主細胞と共に使用するのに適したプロモーターには、β−ラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、及びｔａｃプロモーターのようなハイブリッドプロモーターが含まれる。他の公知の細菌プロモーターも適当である。これらの配列は公開されており、当業者は必要な制限サイトを与えるために必要によりリンカーまたはアダプターを用いて所望のＤＮＡ配列に連結させることができる。
【０１０７】
酵母宿主細胞と共に使用するのに適した適当なプロモーターも当業界で公知である。酵母エンハンサーを酵母プロモーターと共に使用することが有利である。哺乳動物宿主細胞と共に使用するのに適したプロモーターは公知であり、ポリオ−マウィルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（例えば、Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ２）、ウシパピローマウイルス、鳥類サルコーマウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、及び最も好ましくはＳｉｍｉａｎ  Ｖｉｒｕｓ  ４０（ＳＶ４０）のゲノムから得たものが含まれる。他の好適な哺乳動物プロモーターには異種哺乳動物プロモーター、例えば熱ショックプロモーター及びアクチンプロモーターが含まれる。
【０１０８】
ＪＮＫ活性化ホスファターゼ遺伝子発現を制御する際に興味深い別のプロモーターには、ＳＶ４０初期プロモーター領域（Ｂｅｒｎｏｉｓｔ及びＣｈａｍｂｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２９０：３０４−１０（１９８１））、ＣＭＶプロモーター、ラウス肉腫ウイルスの３’長末端リピート中に含まれるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏら，Ｃｅｌｌ，２２：７８７−９７（１９８０））、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７８：１４４４−４５（１９８１））、メタロチオニン遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ，２９６：３９−４２（１９８２））、β−ラクタマーゼプロモーターのような原核発現ベクター（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５：３７２７−３１（１９７８））、ｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８０：２１−２５（１９８３））が含まれるが、これらに限定されない。組織特異性を示し、トランスジェニック動物において利用されている以下の動物転写制御領域も興味深い：膵臓胞状細胞において活性なエラスターゼＩ遺伝子制御領域（Ｓｗｉｆｔら，Ｃｅｌｌ，３８：６３９−４６（１９８４）、Ｏｒｎｉｔｚら，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５０：３９９−４０９（１９８６）、ＭａｃＤｏｎａｌｄ，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，７：４２５−５１５（１９８７））、膵臓β細胞において活性なインシュリン遺伝子制御領域（Ｈａｎａｈａｎ，Ｎａｔｕｒｅ，３１５：１１５−２２（１９８５））、リンパ球細胞において活性な免疫グロブリン遺伝子制御領域（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌら，Ｃｅｌｌ，３８：６４７−５８（１９８４）、Ａｄａｍｓら，Ｎａｔｕｒｅ，３１８：５３３−３８（１９８５）、Ａｌｅｘａｎｄｅｒら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，７：１４３６−４４（１９８７））、精巣、乳房、リンパ球及びマスト細胞において活性なマウス乳癌ウイルス制御領域（Ｌｅｄｅｒら，Ｃｅｌｌ，４５：４８４−９５（１９８６））、肝臓において活性なアルブミン遺伝子制御領域（Ｐｉｎｋｅｒｔら，Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌ．，１：２６８−７６（１９８７））、肝臓において活性なα−フェト−タンパク質遺伝子制御領域（Ｋｒｕｍｌａｕｆら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，５：１６３９−４８（１９８５）、Ｈａｍｍｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３５：５３−５８（１９８７））、肝臓において活性なα１−アンチトリプシン遺伝子制御領域（Ｋｅｌｓｅｙら，Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌ．，１：１６１−７１（１９８７））、骨髄細胞において活性なβ−グロビン遺伝子制御領域（Ｍｏｇｒａｍら，Ｎａｔｕｒｅ，３１５：３３８−４０（１９８５）、Ｋｏｌｌｉａｓら，Ｃｅｌｌ，４６：８９−９４（１９８６））、脳中の希突起神経膠細胞において活性なミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域（Ｒｅａｄｈｅａｄら，Ｃｅｌｌ，４８：７０３−１２（１９８７））、骨格筋において活性なミオシン軽鎖−２遺伝子制御領域（Ｓａｎｉ，Ｎａｔｕｒｅ，３１４：２８３−３６（１９８５））、及び視床下部において活性なゴナドトロピン放出ホルモン遺伝子制御領域（Ｍａｓｏｎら，Ｓｃｉｎｅｃｅ，２３４：１３７２−７８（１９８６））。
【０１０９】
本発明のＪＮＫ活性化ホスファターゼタンパク質をコードするＤＮＡの高級真核細胞による転写を高めるためにエンハンサー配列をベクターに挿入してもよい。エンハンサーは、転写を高めるためにプロモーターに作用する、通常約１０〜３００ｂｐの長さを有するＤＮＡのシス作用要素である。エンハンサーは比較的に方向及び位置非依存性である。エンハンサーは転写単位に対して５’及び３’に存在している。哺乳動物遺伝子から入手可能な幾つかのエンハンサー配列が公知である（例えば、グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェト−タンパク質及びインシュリン）。しかしながら、典型的にはウイルス由来のエンサーを使用する。ＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、ポリマーエンハンサー及びアデノウイルスエンハンサーが真核プロモーターの活性化のためのエンハンシング要素の例である。エンハンサーをＪＮＫ活性化ホスファターゼＤＮＡに対して５’または３’の位置でベクターにスプライスさせる場合、エンハンサーは典型的にはプロモーターから５’のサイトに位置する。
【０１１０】
本発明の発現ベクターは、市販されているベクターのような出発ベクターから構築され得る。前記ベクターは場合により所望のフランキング配列をすべて含む。１つ以上の上記フランキング配列が使用するベクター中に既に存在していないときには、別個に入手し、ベクターに連結され得る。各フランキング配列を得るために使用する方法は当業者に公知である。
【０１１１】
本発明を実施するために好ましいベクターは細菌、昆虫及び哺乳動物宿主細胞と適合性であるものである。前記ベクターには、特にｐＣＲＩＩ、ｐＣＲ３及びｐｃＤＮＡ３．１（カリフォルニア州サンディェゴに所在のＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＢＳＩＩ（カリフォルニア州ラ・ホーヤに所在のＳｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＥＴ１５（ウィスコンシン州マジソンに所在のＮｏｖａｇｅｎ）、ｐＧＥＸ（ニュージャージー州ピスカタウェイに所在のＰｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ｐＥＧＦＰ−Ｎ２（カリフォルニア州パロアルトに所在のＣｌｏｎｔｅｃｈ）、ｐＥＴＬ（ＢｌｕｅＢａｃＩＩ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＤＳＲ−アルファ（国際特許出願公開第９０／１４３６３号パンフレット）及びｐＦａｓｔＢａｃＤｕａｌ（ニューヨーク州グランドアイランドに所在のＧｉｂｃｏ−ＢＲＬ）が含まれる。
【０１１２】
他の考えられるベクターには、コスミド、プラスミド及び修飾ウイルスが含まれるが、これらに限定されない。ベクター系は選択した宿主細胞と適合性でなければならない。前記ベクターには、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（登録商標）プラスミド誘導体（高コピー数ＣｏｌＥ１ベースのファジミド、カリフォルニア州ラ・ホーヤに所在のＳｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）のようなプラスミド、Ｔａｑ増幅ＰＣＲ産物をクローニングするために設計されているＰＣＲクローニングプラスミド（例えば、ＴＯＰＯ（商標）ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（登録商標）Ｋｉｔ、ＰＣＲ２．１（登録商標）プラスミド誘導体、カリフォルニア州カールズバッドに所在のＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、及びバキュロウイルス発現系のような哺乳動物、酵母またはウイルスベクター（ｐＢａｃＰＡＫプラスミド誘導体、カリフォルニア州ラ・ホーヤに所在のＣｌｏｎｔｅｃｈ）が含まれるが、これらに限定されない。組換え体分子は形質転換、トランスフェクション、感染、エレクトロポレーションまたは他の公知の方法を介して宿主細胞に導入され得る。
【０１１３】
ベクターを構築し、ＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドをコードする分子をベクターの適正なサイトに挿入したら、完成したベクターを増幅及び／またはポリペプチド発現のために適当な宿主細胞に挿入され得る。
【０１１４】
宿主細胞は原核宿主細胞（例えば、大腸菌）または真核宿主細胞（例えば、酵母細胞、昆虫細胞または脊椎動物細胞）であり得る。適当な条件下で培養したとき、宿主細胞はＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドを合成し、その後このポリペプチドは（宿主細胞が培地中にポリペプチドを分泌するときには）培地から収集されるかまたは（分泌しないときには）宿主細胞から直接収集され得る。適当な宿主細胞の選択は、所望の発現レベル、活性のために望ましいまたは必要なポリペプチド修飾（例えば、グリコシル化またはリン酸化）及び生物学的活性分子への再生容易性のような複数要因に基づく。
【０１１５】
多数の好適な宿主細胞が当業界で公知であり、多くはバージニア州マナッサスに所在のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）から入手可能である。その例には哺乳動物細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ６１）ＣＨＯ  ＤＨＦＲ−細胞（Ｕｒｌａｕｂら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７：４２１６−２０（１９８０））、ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）２９３または２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１５７３）または３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ９２）が含まれる。好適な哺乳動物宿主細胞及び形質転換、培養、増幅、スクリーニング、誠意生物産生及び精製のための方法の選択は当業界で公知である。他の好適な哺乳動物細胞系はサルＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１６５０）及びＣＯＳ−７細胞系（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１６５１）、及びＣＶ−１細胞系（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ７０）である。更なる例の哺乳動物宿主細胞には、形質転換細胞系を含めた霊長類細胞系及びげっ歯動物細胞系が含まれる。正常な二倍体細胞、一次組織のインビトロ培養から誘導される細胞菌株及び一次外植片も適当である。候補細胞は遺伝子型からみて選択遺伝子を欠いていてもよく、優性的に作用する選択遺伝子を含み得る。他の好適な哺乳動物細胞系には、マウス神経芽細胞腫Ｎ２Ａ細胞、ＨｅＬａ、マウスＬ−９２９細胞、Ｓｗｉｓｓ，Ｂａｌｂ−ｃまたはＮＩＨマウス由来の３Ｔ３細胞系、ＢＨＫまたはＨａＫハムスター細胞系（ＡＴＣＣ）が含まれるが、これらに限定されない。前記細胞系のそれぞれはタンパク質発現の当業者には公知であり、入手可能である。
【０１１６】
本発明のために適当な宿主細胞として細菌細胞も好適である。例えば、大腸菌の各種菌株（例えば、ＨＢ１０１（ＡＴＣＣ番号３３６９４）、ＤＨ５、ＤＨ１０及びＭＣ１０６１（ＡＴＣＣ番号５３３３８））もバイオテクノロジーの分野で宿主細胞として公知である。枯草菌、シュードモナス属、他のバチラス属、ストレプトマイセス属の各種菌株も本発明の方法で使用され得る。
【０１１７】
当業界で公知の酵母細胞の多くの菌株も本発明のポリペプチドの発現用宿主細胞として利用可能である。好ましい酵母細胞には、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｉｖｉｓａｅ）が含まれる。
【０１１８】
更に、所望ならば、昆虫細胞系が本発明の方法で利用され得る。前記系は、例えばＫｉｔｔｓら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１４：８１０−１７（１９９３）、Ｌｕｃｋｌｏｗ，ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，４：５６４−７２（１９９３）及びＬｕｃｋｌｏｗら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６７：４５６６−７９（１９９３）に記載されている。好ましい昆虫細胞はＳｆ−９及びＨｉ５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）である。
【０１１９】
ＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチド用発現ベクターの特定宿主細胞への形質転換またはトランスフェクションは、塩化カルシウムを用いる方法、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクションまたはＤＥＡＥ−デキストラン法を含めた公知の方法を用いて達成され得る。方法は使用する宿主細胞の種類に応じて選択される。前記方法及び他の好適方法は当業者に公知であり、例えば上掲のＳａｍｂｒｏｏｋらに記載されている。
【０１２０】
ポリペプチド産生
ＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチド発現ベクターを含む宿主細胞（即ち形質転換またはトランスフェクトしたもの）は当業者に公知の一般的な培地を用いて培養され得る。前記培地は通常細胞の成長及び生存に必要なすべての栄養素を含む。大腸菌の培養に適した培地は、例えばルリアブロス（ＬＢ）及び／またはテリフィックブロス（ＴＢ）培地である。真核細胞の培養に適した培地はＲＰＭＩ  １６４０、ＭＥＭ、ＤＭＥＭであり、これらには培養する特定細胞系が必要とするならば血清及び／または成長因子を補充し得る。昆虫の培養に適した培地は必要に応じてイーストオレート、ラクトアルブミン、水解物及び／またはウシ胎仔血清を補充したグレース培地である。
【０１２１】
典型的には、トランスフェクトまたは形質転換した細胞の選択的増殖のために有用な抗生物質または他の化合物を培地への補充物として添加される。使用される化合物は宿主細胞を形質転換するために使用したプラスミド上に存在する選択マーカー要素により決定され得る。例えば、選択マーカー要素がカナマイシン耐性であるときに培地に添加される化合物はカナマイシンである。選択的増殖のための他の化合物にはアンピシリン、テトラサイクリン及びネオマシインが含まれる。
【０１２２】
宿主細胞が産生するＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドの量は当業者に公知の一般的方法を用いて評価され得る。前記方法には、ウェスタンブロット分析、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、非変性ゲル電気泳動、ＨＰＬＣ分離、免疫沈降及び／または活性アッセイ（例えば、ＤＮＡ結合ゲルシフトアッセイ）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１２３】
ＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドが宿主細胞から分泌されるように設計されているならば、該ポリペプチドの大部分は細胞培地中に存在し得る。しかしながら、ＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドが宿主細胞から分泌されないならば、該ポリペプチドは細胞質及び／または核（真核宿主細胞の場合）、または細胞質ゾル（グラム陰性宿主細胞の場合）中に存在する。
【０１２４】
ＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドが宿主細胞細胞質及び／または核中に存在するときには、典型的には宿主細胞を機械的にまたは洗剤を用いて破壊して細胞内内容物を緩衝溶液に放出させる。その後、ＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドは前記溶液から単離され得る。
【０１２５】
溶液からのＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドの精製は各種方法を用いて達成され得る。カルボキシルまたはアミノ末端にヘキサヒスチジン（ＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチド／ｈｅｘａＨｉｓ）のようなタグ、またはＦＬＡＧ（コネチカット州ニューヘーブンに所在のＥａｓｔｍａｎ  Ｋｏｄａｋ  Ｃｏ．）またはｍｙｃ（Ｉｎｖｉｔｏｇｅｎ）のような他の小ペプチドを含むようにポリペプチドを合成したときには、前記ポリペプチドは本質的にカラムマトリックスが直接タグまたはポリペプチドに対して高い親和性を有しているアフィニティーカラム中に溶液を通すことにより１ステップ方法で精製され得る（すなわち、モノクローナル抗体はＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドを特異的に認識する）。例えば、ポリヒスチジンは高い親和性及び特異性でニッケルに結合し、よってニッケルのアフィニティーカラム（例えば、Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）ニッケルカラム）をＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチド／ポリＨｉｓを精製するために使用することができる。例えば、「分子生物学の現在のプロトコル(Current Protocols in Molecular Biology)」，セクション１０．１１．８（Ａｕｓｕｂｅｌら編，Ｊｏｈｎ  ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９９３年）発行）を参照されたい。
【０１２６】
ＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドをタグを結合させずに、抗生物質を使用せずに作成するときには、他の公知の精製方法を使用することができる。前記方法には、イオン交換クロマトグラフィー、モレキュラーシーブクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、天然ゲル電気泳動とゲル溶離の組合せ、及び分取等電点電気泳動（“Ｉｓｏｐｒｉｍｅ”ｍａｃｈｉｎｅ／ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，Ｈｏｅｆｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）が含まれるが、これらに限定されない。場合により、純度を高めるために前記方法の２つ以上を組み合わせてもよい。
【０１２７】
ＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドを細胞内で産生させるときには、（グラム陰性菌に対する封入体を含めた）細胞内材料は当業者に公知の一般的方法を用いて宿主細胞から抽出され得る。例えば、宿主細胞を溶菌させ、Ｆｒｅｎｃｈプレス、均質化及び／または音波処理後遠心することにより周辺細胞質／細胞質の内容物を放出させることができる。
【０１２８】
ＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドが細胞質ゾル中に形成された封入体を有しているときには、前記封入体はしばしば内部及び／または外部細胞膜に結合し得、よって遠心後に主にペレット材料中に存在する。その後、前記ペレット材料は封入体を放出、分断及び溶解させるようにｐＨ極値で、またはアルカリｐＨでは還元剤（例えば、ジチオトレイトール）の存在下でカオトロピック剤（例えば、洗剤、グアニジン、グアニジン誘導体、尿素または尿素誘導体）を用いて、酸性ｐＨではトリスカルボキシエチルホスフィンを用いて処理され得る。ここで可溶性形態のＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドはその後ゲル電気泳動、免疫沈降等を用いて分析され得る。ＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドを単離させたいときには、Ｍａｒｓｔｏｎら，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．，１８２：２６４−７５（１９９０）に記載されているような一般的方法を用いて単離され得る。
【０１２９】
場合により、ＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドは単離したときには生物学的に活性でないときがある。ポリペプチドをその３元構造に再生または変換し、ジスルフィド結合を形成するための各種方法を使用して生物学的活性を回復させることができる。前記方法には、可溶化ポリペプチドを特定濃度のカオトロープの存在下で通常７以上のｐＨに曝すことが含まれる。カオトロープの選択は封入体溶解のために使用する選択に非常に類似しているが、通常カオトロープは低濃度で使用し、可溶化のために使用したカオトロープと同一である必要はない。多くの場合、再生／酸化溶液は還元剤、またはタンパク質のシステイン架橋を形成する際にジスルフィドシャッフリングを起こし得る特定のレドックス電位を生じさせるための特定比で還元剤とその酸化形態を含む。通常使用されている幾つかのレドックス対には、システイン／シスタミン、グルタチオン（ＧＳＨ）／ジチオビスＧＳＨ、塩化銅、ジチントレイトール（ＤＴＴ）／ジチアンＤＴＴ、及び２−メルカプトエタノール（ｂＭＥ）／ジチオ−ｂ（ＭＥ）が含まれる。多くの場合、再生効率を高めるために共溶媒が作用され得、また必要であり得る。この目的で使用されるより一般的な試薬にはグリセロール、各種分子量のポリエチレングリコール、アルギニン等が含まれる。
【０１３０】
ＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドの発現時に封入体が十分に形成されないときには、ポリペプチドは主に細胞ホモジネートを遠心後の上清中に存在し、更に下記するような方法を用いて上清から単離される。
【０１３１】
ＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドが部分的にまたは実質的に不純物を含まないように該ポリペプチドを部分的にまたは完全に精製することが好ましい場合には、当業者に公知の一般的方法を使用し得る。前記方法には、電気泳動による分離とその後の電気溶離、各種タイプのクロマトグラフィー（アフィニティー、イムノアフィニティー、モレキュラーシーブ及び／またはイオン交換）及び／または高速液体クロマトグラフィーが含まれるが、これらに限定されない。場合により、完全に精製するために前記方法を２つ以上使用することが好ましいこがある。
【０１３２】
ＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチド、その断片及び／または誘導体は、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８５：２１４９（１９６３）、Ｈｏｕｇｈｔｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：５１３２（１９８５）、及びＳｔｅｗａｒｔ及びＹｏｕｎｇ，Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，１９８４）に記載されているような当業界で公知の方法を用いる化学合成方法、例えば固相ペプチド合成によっても製造され得る。前記ポリペプチドは場合によりアミノ末端上にメチオニンを有して合成され得る。化学合成したＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドまたは断片を前記文献に記載されている方法を用いて酸化して、ジスルフィド結合を形成してもよい。ＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチド、断片または誘導体は、天然ソースから組換えにより産生したかまたは天然ソースを精製した対応のＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチド、断片または誘導体に匹敵する生物学的活性を有していると予想され、よって組換えまたは天然ＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドと互換可能に使用され得る。
【０１３３】
ＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドを得るための別の手段は、ＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドが元々存在しているソース組織及び／または流体のような生物学的サンプルからの精製である。前記精製は上記したタンパク質の精製方法を用いて実施され得る。精製中ＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドの存在は、例えば組換え産生したＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドまたはそのペプチド断片に対して作成した抗体を用いてモニターされ得る。
【０１３４】
ポリペプチド
本発明のポリペプチドには、単離ＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチド及び該ペプチドに関連するペプチド、例えば上に定義した断片、変異体、融合ポリペプチド及び誘導体が含まれる。
【０１３５】
本発明のＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチド断片はアミノ末端（任意にリーダー配列を含む）での切断、カルボキシル末端での切断及び／またはポリペプチドの内部欠失の結果生じ得る。好ましい実施態様では、切断及び／または欠失は約１０個、約２０個、約５０個、約７５個、約１００個または約１００個を超えるアミノ酸を含む。こうして作成したポリペプチド断片は約２５個、約５０個、約７５個、約１００個、約１５０個または約２００個の隣接アミノ酸を含む。ＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチド断片は場合によりアミノ末端メチオニン残基を含み得る。
【０１３６】
本発明のＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチド変異体は、配列番号２または４に比して１個以上のアミノ酸置換、付加及び／または欠失を含む。好ましい実施態様において、前記変異体は１〜３個、１〜５個、１〜１０個、１〜１５個、１〜２０個、１〜２５個、１〜５０個、１〜７５個、１〜１００個または１００個を超えるアミノ酸置換、挿入、付加及び／または欠失を有し、前記置換は上に定義した保存的であっても、非保存的であっても、その組合せであってもよい。変異体はカルボキシル末端またはアミノ末端（任意にリーダー配列を有する）でのアミノ酸残基の付加を有し得る。
【０１３７】
好ましいＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチド変異体には、１個以上のシステイン残基が欠失されていたり他のアミノ酸（例えば、セリン）で置換されているシステイン変異体が含まれる。システイン変異体は、ＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドを例えば不溶性封入体の単離後のように生物学的に活性なコンホメーションに再生しなければならないときに有用である。システイン変異体は通常天然タンパク質よりも数個多いシステイン残基を有し、典型的には不対システインから生ずる相互作用を最小限とするために偶数を有する。
【０１３８】
当業者は公知の方法を用いて天然ＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドの適当な変異体を決定することができる。例えば、生物学的活性を損なうことなく変化させ得る分子の適当な区域を予測することができる。また、当業者は生物学的活性または構造にとって重要であり得る区域に対して生物学的活性を損ねたりポリペプチド構造に悪影響を与えることなく保存的アミノ酸置換を施すことができる。
【０１３９】
活性を損なうことなく変化させ得る分子の適当な区域を予測するために、当業者は活性の点で重要であると考えられない区域を標的することができる。例えば、同一種または他の種由来の同様の活性を有する類似ポリペプチドが公知のとき、ＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドのアミノ酸配列を類似ポリペプチドと比較することができる。前記比較をした後、当業者は類似ポリペプチドの中で保存される分子の残基及び部分を決定することができる。当業者は保存されないＪＮＫ活性化ホスファターゼ分子の区域の変化が生物学的活性及び／または構造に悪影響を及ぼす可能性が少ないことを承知している。当業者は、比較的に保存される領域であっても、活性を維持しながら天然に存在する残基の代わりに化学的に類似のアミノ酸で置換されることを承知している（保存的アミノ酸置換）。
【０１４０】
また、当業者は活性または構造の点で重要である類似ポリペプチド中の残基を同定する構造−機能研究を検討し得る。前記比較にてらして、当業者は類似アミノ酸中の活性及び構造の点で重要なアミノ酸残基に相当するＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチド中のアミノ酸残基の重要性を予測することができる。当業者はＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドの予測した重要なアミノ酸残基に代わる化学的に類似のアミノ酸置換を選択することができる。
【０１４１】
利用できるならば、当業者は類似ポリペプチド中の構造に関連する３次元構造及びアミノ酸配列を分析することもできる。この情報にてらして、当業者はその３次元構造に関してＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドのアミノ酸残基のアラインメントを予測することができる。当業者はタンパク質の表面上の予測されるアミノ酸残基をラジカル変化させないように選択することができる。なぜならば、前記残基は他の分子との重要な相互作用に関わり得るからである。
【０１４２】
更に、当業者は各アミノ酸残基に１つのアミノ酸置換を含む試験変異体を作成することができる。前記変異体は本明細書に記載の活性アッセイを用いてスクリーニングすることができる。前記変異体は適当な変異体についての情報を集めるために使用され得る。例えば、特定アミノ酸残基への変化により活性が破壊されることを見つけたなら、前記変化を有する変異体が避けられる。換言すると、前記実験で集めた情報に基づいて、別の許容可能な変異体を見つけようと試みるときに当業者は更なる置換が単独でまたは他の突然変異との組合せで避けなければならないアミノ酸がわかる。
【０１４３】
本発明のＪＮＫ活性化ホスファターゼ融合ポリペプチドは異種ペプチドまたはタンパク質に融合したＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチド、断片、変異体または誘導体を含む。異種ペプチド及びタンパク質には、ＪＮＫ活性化ホスファターゼ融合ポリペプチドを検出及び／または単離することができるエピトープ、貫膜受容体タンパク質またはその一部（例えば、細胞外ドメインまたは貫膜及び細胞内ドメイン）、貫膜受容体タンパク質に結合するリガンドまたはその一部、触媒活性な酵素またはその一部、オリゴマー化を促進するタンパク質またはペプチド（例えば、ロイシンジッパードメイン）及び安定性を向上させるタンパク質またはペプチド（例えば、免疫グロブリン定常部）が含まれるが、これらに限定されない。ＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドはそれ自体またはその断片、変異体または誘導体に融合され得る。融合はＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドのアミノ末端またはカルボキシル末端で実施され、リンカーまたはアダプター分子を用いて指向され得るか、またはリンカーまたはアダプター分子（例えば、１個以上、最高約２０個または最高約５０個のアミノ酸残基）を介し得る。リンカーまたはアダプター分子はＤＮＡ制限エンドヌクレアーゼに対するまたは融合部分を分離させ得るプロテアーゼに対する開裂サイトを有して設計され得る。
【０１４４】
本発明の更なる実施態様では、ＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチド、断片、変異体及び／または誘導体はヒトＩｇＧのＦｃ領域に融合している。１例では、ヒトＩｇＧヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３領域が当業者に公知の方法を用いてＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドのＮ−末端またはＣ−末端のいずれかで融合され得る。別の例では、ヒンジ領域及びＣＨ２及びＣＨ３領域の一部が融合され得る。こうして作成したＪＮＫ活性化ホスファターゼＦｃ−融合ポリペプチドはＰｒｏｔｅｉｎ  Ａアフィニテイーカラムを用いて精製され得る。更に、Ｆｃ領域に融合したペプチド及びタンパク質は非融合同等物よりもインビボで実質的に長い半減期を示すことが判明した。また、Ｆｃ領域に融合すると、融合ポリペプチドのダイマー化／マルチマー化が起こる。Ｆｃ領域は天然に存在するＦｃ領域であるかまたは治療品質、循環時間、低い凝集等のような特定品質が改善されるように改変され得る。
【０１４５】
ＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチド誘導体も本発明の範囲に含まれる。前記誘導体は、ＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドがポリマーに結合している化学的修飾ＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチド組成物である。選択されるポリマーは典型的には、結合させるタンパク質が水性環境（例えば、生理学的環境）中に沈殿しないように水溶性である。前記ポリマーは任意の分子量を有し、直鎖であっても分枝鎖であってもよい。ＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドポリマーにはポリマーの混合物も含まれる。好ましくは、最終製品の治療用途のためにはポリマーは医薬的に許容され得るものである。
【０１４６】
水溶性ポリマーまたはその混合物は、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、モノメトキシポリエチレングリコール、デキストラン（例えば、約６ｋＤのような低分子量を有するデキストラン）、セルロース、他の炭水化物を主成分とするポリマー、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）及びポリビニルアルコールからなる群から選択され得る。本発明には、共有結合したＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドマルチマーを製造するために使用され得る二官能性ＰＥＧ架橋分子も含まれる。
【０１４７】
アシル化反応のために、選択されるポリマーは単一の反応性エステル基を有するべきである。還元アルキル化のためには、選択されるポリマーは単一の反応性アルデヒド基を有するべきである。反応性アルデヒドは、例えば水溶性であるポリエチレングリコールプロピオアルデヒド、またはそのモノＣ１−１０アルコキシまたはアリールオキシ誘導体である（米国特許第５，２５２，７１４号明細書参照）。
【０１４８】
ＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドのペジル化は、例えばＦｒａｎｃｉｓら，Ｆｏｃｕｓ  ｏｎ  Ｇｏｒｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ，３：４−１０（１９９２）、欧州特許出願公開第０  １５４  ３１６号明細書、同第０  ４０１  ３８４号明細書及び米国特許第４，１７９，３３７号明細書に記載されているように当業界で公知のペジル反応により実施され得る。ペジル化は下記する反応性ポリエチレングリコール分子（または類似の反応性水溶性ポリマー）とのアシル化反応またはアルキル化反応を介して実施され得る。
【０１４９】
本発明で使用される１つの水溶性ポリマーはポリエチレングリコール（ＰＥＧと略記される）である。本明細書中、ポリエチレングリコールは、モノ−（Ｃ１−１０）アルコキシ−またはアリールオキシ−ポリエチレングリコールのような他のタンパク質を誘導化するために使用されてきた任意の形態のＰＥＧを包含することを意味する。
【０１５０】
一般的に、化学誘導化は生物学的活性の物質を活性化ポリマー分子と反応させるために使用される適当な条件下で実施され得る。ペジル化ＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドの製造方法は、通常（ａ）ＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドが１つ以上のＰＥＧ基に結合するようになる条件下でポリペプチドをポリエチレングリコール（例えば、ＰＥＧの反応性エステルまたはアルデヒド誘導体）と反応させるステップ、及び（ｂ）反応生成物を得るステップを含む。通常、アシル化反応の最適反応条件は公知のパラメーター及び所望の結果に基づいて決定される。例えば、ＰＥＧ：タンパク質の比率が高くなるとポリペジル化産物の割合が高くなる。
【０１５１】
好ましい実施態様では、ＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチド誘導体はアミノ末端に１つのＰＥＧ部分を有する。援用により本明細書に含まれるとする米国特許第５，２３４，７８４号明細書を参照されたい。
【０１５２】
通常、本発明のＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチド誘導体の投与により活性化またはモジュレートされ得る条件には、ＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドについて本明細書に記載されているものが含まれる。しかしながら、本明細書に記載のＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチド誘導体は非誘導化分子に比して追加の活性、高いもしくは低い生物学的活性、または他の特性（例えば、長いもしくは短い半減期）を有し得る。
【０１５３】
抗体
ＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチド、断片、変異体及び誘導体は当業界で公知の方法を用いて抗体を作成するために使用され得る。従って、ＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドに結合する抗体及び抗体断片が本発明の範囲内である。抗体はポリクローナル、単一特異性ポリクローナル、モノクローナル、組換え、キメラ、ヒト化、完全ヒト、単鎖及び／または二重特異性であり得る。
【０１５４】
ＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドに対するポリクローナル抗体は、通常動物（例えば、家兎またはマウス）においてＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチド及びアジュバントを複数回皮下または腹腔内に注入することにより作成される。免疫化する種において免疫原性である担体タンパク質、例えばキーホールインペットヘモシアニン、血清、アルブミン、ウシチログロブリンまたは大豆トリプシン阻害剤にＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチド、その変異体、断片または誘導体にコンジュゲートすることが有用であり得る。また、ミョウバンのような凝集剤を免疫応答を高めるために使用する。免疫化後、動物を出血させ、血清を抗−ＪＮＫ活性化ホスファターゼ抗体力価についてアッセイする。
【０１５５】
ＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドに対するモノクローナル抗体は、細胞系の連続培養により抗体分子を産生するべく提供されている任意の方法により作成される。モノクローナル抗体を作成するための好適な方法の例には、ハイブリドーマ方法（Ｋｏｈｌｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−９７（１９９５））及びヒトＢ−細胞ハイブリドーマ方法（Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）、Ｂｒｏｄｅｕｒら，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｉｎｉｑｕｅ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，５１−６３（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，１９８７））が含まれる。
【０１５６】
本発明はＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドと反応性のモノクローナル抗体を作成するハイブリドーマ細胞系も提供する。
【０１５７】
本発明のモノクローナル抗体は治療薬として使用するために修飾され得る。１つの実施態様は、所望の生物学的活性を発揮する限り、重鎖及び／または軽鎖の一部が特定種に由来するかまたは特定の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体中の対応配列と同一であるかまたは相同であり、残りの鎖は他の種に由来するかまたは別の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体中の対応配列と同一であるかまたは相同である「キメラ」抗体及び前記抗体の断片である（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号明細書、Ｍｏｒｒｉｓｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１−５５（１９８５））。
【０１５８】
別の実施態様では、本発明のモノクローナル抗体は「ヒト化」抗体である。非ヒト抗体をヒト化する方法は当業界で公知である。通常、ヒト化抗体は非ヒトであるソースから導入した１つ以上のアミノ酸残基を有する。ヒト化は当業界で公知の方法に従って（Ｊｏｎｅｓら，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−２５（１９８６）、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−２７（１９８８）、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−３６（１９８８））げっ歯動物の相補性決定部位（ＣＤＲ）をヒト抗体の対応部位の代わりに置換することにより実施され得る。
【０１５９】
ＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチド、断片、変異体及び／または誘導体を結合する完全ヒト抗体も本発明に包含される。前記抗体は、内在性免疫グロブリン産生の非存在下でヒト抗体のレパトアを産生し得るトランスジェニック動物（例えば、マウス）の（場合により担体にコンジュゲートさせた）ＪＮＫ活性化ホスファターゼ抗原で免疫化することにより作成される。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：２５５１−５５（１９９３）、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら，Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５５−５８（１９９３）、Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎら，Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏ．，７：３３（１９９３）を参照されたい。ヒト抗体はまたファージディスプレーライブラリーにおいて作成され得る（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１（１９９１）、Ｍａｒｋｓら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１（１９９１））。
【０１６０】
本発明の抗−ＪＮＫ活性化ホスファターゼ抗体は、ＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドの検出及び定量のために公知のアッセイ方法、例えば競合結合アッセイ、直接及び間接サンドイッチアッセイ及び免疫沈降アッセイ（Ｓｏｌａ，「モノクローナル抗体：技術マニュアル(Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques)」，１４７−５８，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ（１９８７年）発行）において使用され得る。前記抗体は使用するアッセイ方法に適した親和性でＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドを結合する。
【０１６１】
競合結合アッセイは、限定量の抗−ＪＮＫ活性化ホスファターゼ抗体と結合させるために標識標準（例えば、ＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドまたはその免疫学的反応性部分）の試験サンプルアナライト（ＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチド）と競合する能力に依存している。試験サンプル中のＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドの量は抗体に結合するようになる標準の量と反比例する。結合するようになる標準の量の測定を容易とするために、競合またはその後に抗体は通常不溶性になり、抗体に結合する標準及びアナライトは有利には未結合のままの標準及びアナライトから分離され得る。
【０１６２】
サンドイッチアッセイは、それぞれが検出及び／または定量すべきタンパク質の別の免疫原性部分、すなわちエピトープに結合し得る２つの抗体の使用を含む。サンドイッチアッセイでは、試験サンプルアナライトを典型的には固体支持体上に固定化させた第１抗体に結合し、その後第２抗体をアナライトに結合し、よって不溶性の３部分複合体を形成する。例えば、米国特許第４，３７６，１１０号明細書参照。第２抗体それ自体は検出可能な部分により標識され得（直接サンドイッチアッセイ）、または検出可能な部分で標識した抗−免疫グロブリン抗体を用いて測定され得る（間接サンドイッチアッセイ）。例えば、１つのタイプのサンドイッチアッセイは、検出可能部分が酵素であるＥＬＩＳＡアッセイである。
【０１６３】
本発明はまた、ＪＮＫ活性化ホスファターゼ抗体及び生体サンプル中のＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドレベルを検出するのに有用な他の試薬を含むキットに関する。前記試薬には、第２活性、検出可能標識、ブロッキング血清、ポジティブ及びネガティブな対照サンプル及び検出試薬が含まれ得る。
【０１６４】
遺伝子工学処理した非ヒト動物
更に、ＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチド発現レベルが有意に低下しているかまたは完全に消失するように天然ＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドをコードする遺伝子が破壊（すなわち、ノックアウト）されている非ヒト動物、例えばマウス、ラット、及び他のげっ歯動物、家兎、山羊、羊または他の飼育動物も本発明の範囲内である。前記動物は米国特許第５，５５７，０３２号明細書に記載されているような技術及び方法を用いて作成され得る。
【０１６５】
本発明は更に、非ヒト動物（例えば、マウス、ラット、及び他のげっ歯動物、家兎、山羊、羊または他の飼育動物）の天然形態のＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドをコードする遺伝子または異種ＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチド遺伝子を前記動物により過剰発現させて「トランスジェニック」動物となっている前記動物も含む。前記トランスジェニック動物は米国特許第５，４８９，７４３号明細書及び国際特許出願公開第９４／２８１２２号パンフレットに記載されているような公知の方法により作成され得る。
【０１６６】
本発明は更に、１つ以上の天然ＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドの発現レベルを変更するように１つ以上の本発明のＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチド用プロモーターが（例えば、下記する相同的組換えにより）活性化または不活化されている非ヒト動物を含む。
【０１６７】
前記した非ヒト動物は薬物候補をスクリーニングするために使用され得る。薬物候補の動物に対するインパクトを測定し得る。例えば、薬物候補はＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチド遺伝子の発現を上昇または低下させ得る。或る実施態様では、ＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドまたはＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチド断片の産生量は動物を薬物候補に接触させた後測定し得る。或る実施態様では、薬物候補の動物に対する実際のインパクトを検出し得る。例えば、特定遺伝子が過剰発現すると、病気または病状が発生するかまたはそれらに関連し得る。そのような場合、薬物候補の遺伝子の発現を低下させる能力または薬物候補の病状を予防または抑制する能力を調べることができる。他の例では、特定代謝産物、例えばポリペプチドの断片が産生されると、病気または病状が発生するかまたはそれらに関連し得る。そのような場合、薬物候補の代謝産物の産生を低下させる能力または薬物候補の病状を予防または抑制する能力を調べることができる。
【０１６８】
ＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチド活性のモジュレーター
幾つかの状況では、ＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドの活性のモジュレーター、すなわちアゴニストまたはアンタゴニストである分子を同定することが望ましい。
【０１６９】
ＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドをモジュレートする天然もしくは合成分子は以下に記載するようなスクリーニングアッセイの１つ以上を用いて同定され得る。前記分子は、局所または静脈注射により、経口デリバリー、移植デバイス等により生体内または生体外に投与され得る。
【０１７０】
本明細書では、アッセイの記載に関して以下の定義を使用する。
【０１７１】
「被験分子」は、ＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドの活性をモジュレート（すなわち、上昇または低下）し得る能力についての評価対象の分子を指す。最も一般的には、被験分子はＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドと直接相互作用する。しかしながら、被験分子が間接的に、例えばＪＮＫ活性化ホスファターゼ遺伝子発現に影響を与えるかまたはＪＮＫ活性化ホスファターゼ結合パートナー（例えば、受容体またはリガンド）に結合することによりＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドの活性をモジュレートする場合も考えられる。１実施態様では、被験分子は少なくとも約１０−６Ｍ、好ましくは約１０−８Ｍ、より好ましくは約１０−９Ｍ、更に好ましくは約１０−１０Ｍの親和定数でＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドと結合する。
【０１７２】
ＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドと相互作用する化合物を同定するための方法も本発明に包含される。或る実施態様では、被験分子がＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドと相互作用し得る条件下でＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドを被験分子とインキュベートし、相互作用の程度を測定する。被験分子は実質的に精製された形態または粗な混合物としてスクリーニングされ得る。被験分子は核酸分子、タンパク質、ペプチド、炭水化物、脂質または低分子量の有機または無機化合物であり得る。１組の被験分子をＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドと相互作用するものとして同定したら、その分子を更にＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチド活性を上昇または低下させる能力について評価する。
【０１７３】
被験分子とＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドの相互作用の測定は細胞ベースの結合アッセイ、膜結合アッセイ、液相アッセイ及びイムノアッセイを含めた幾つかのフォーマットで実施され得る。通常、被験分子をＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドと特定時間インキュベートし、ＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチド活性を本明細書に記載の生物学的活性を測定するための１つ以上のアッセイにより測定する。
【０１７４】
被験分子とＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドの相互作用は、イムノアッセイにおいてポリクローナルまたはモノクローナル抗体を用いて直接アッセイされ得る。或いは、上記したエピトープタグを含むＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドの修飾形態を液体及びイムノアッセイで使用することができる。
【０１７５】
或る実施態様では、ＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドアゴニストまたはアンタゴニストはタンパク質、ペプチド、炭水化物、脂質、またはＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドと相互作用してその活性を調節する低分子量分子であり得る。ＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドの考えられるタンパク質アンタゴニストには、前記ポリペプチドの活性領域と相互作用し、ＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドの少なくとも１つの活性を阻害または排除する抗体が含まれる。ＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチド発現を調節する分子には、ＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドをコードする核酸に対して相補性であるかまたはＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドの発現を指向または制御する核酸配列に対して相補性であり且つ発現のアンチセンスレギュレーターとして作用する核酸が含まれ得る。
【０１７６】
ＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドが結合パートナー（例えば、受容体またはリガンド）との相互作用を介して生物学的活性を示す事例では、ＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドの対応結合パートナーへの結合を測定するために各種のインビトロアッセイを使用し得る。これらのアッセイは、ＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドのその結合パートナーへの結合の速度及び／または程度を上昇または低下させる能力について被験分子をスクリーニングするために使用され得る。１つのアッセイでは、ＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドを微量測定プレートのウェルの底に結合することにより固定化する。次いで、放射線標識したＪＮＫ活性化ホスファターゼ結合パートナー（例えば、ヨード化ＪＮＫ活性化ホスファターゼ結合パートナー）及び被験分子をそのウェルに任意の順序で逐次または同時に添加し得る。インキュベート後、ウェルを洗浄し、ＪＮＫ活性化ホスファターゼタンパク質へのその結合パートナーによる結合の程度を測定するために放射能のシンチレーションカウンターを用いてカウントし得る。典型的には、分子を広範囲の濃度で試験し、試験アッセイの１つ以上の要素を欠く一連の対照ウェルを結果の評価の精度のために使用し得る。この方法の代替方法は、タンパク質の位置を逆転することを含み、すなわちＪＮＫ活性化ホスファターゼ結合パートナーを微量測定プレートウェルに固定し、被験分子及び放射線標識したＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドとインキュベートし、ＪＮＫ活性化ホスファターゼ結合の程度を測定する（例えば、「分子生物学の現在のプロトコル(Current Protocols in Molecular Biology)」，１８章，Ａｕｓｕｂｅｌら編，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９９５年）発行参照）。
【０１７７】
放射性標識の代替として、ＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドまたはその結合パートナーをビオチンにコンジュゲートし、その後ビオチニル化タンパク質の存在は比色的またはストレプトアビジンの蛍光タグ付けにより検出され得る酵素（例えば、ホースラディシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）またはアルカリホスファターゼ（ＡＰ））に結合したストレプトアビジンを用いて検出され得る。ビオチンにコンジュゲートしたＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドまたはＪＮＫ活性化ホスファターゼ結合パートナーに対する抗体も使用され得、ＡＰまたはＨＲＰに結合した酵素結合ストレプトアビジンとインキュベートした後検出され得る。
【０１７８】
ＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチド及びＪＮＫ活性化ホスファターゼ結合パートナーは、アガロースビーズ、アクリルビーズまたは他の種類の不活性基質に結合することにより固定化され得る。基質−タンパク質複合体は相補性タンパク質及び被験化合物を含む溶液中に配置され得る。インキュベート後、前記ビーズを遠心により沈降させ、ＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドとその結合パートナー間の結合の量を上記した方法を用いて評価し得る。或いは、基質−タンパク質複合体をカラム中に固定化し、被験分子及び相補性タンパク質をそのカラムに通すことができる。その後、ＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドとその結合パートナー間の複合体の形成を上記した技術、すなわち放射性標識、抗体結合等を用いて評価し得る。
【０１７９】
ＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドとＪＮＫ活性化ホスファターゼ結合パートナー間の複合体の形成を増加または低下させる被験分子を同定するために使用される別のインビトロアッセイはＢｉａｃｏｒｅアッセイシステム（ニュージャージー州ピスカタウェイに所在のＰｈａｒｍａｃｉａ）のような表面プラスモン共鳴検出器システムである。Ｂｉａｃｏｒｅシステムは製造業者のプロトコルを用いて実施され得る。このアッセイは本質的に、検出器中に位置するデキストラン被覆センサーチップへのＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドまたはＪＮＫ活性化ホスファターゼ結合パートナーの共有結合を含む。その後、被験化合物及び他の相補性タンパク質をセンサーチップを収容しているチャンバに同時にまたは逐次注入し、結合した相補性タンパク質の量をセンサーチップのデキストラン被覆側に物理的に結合している分子量の変化に基づいて評価され得る。分子量の変化は検出システムにより測定可能である。
【０１８０】
ある場合には、ＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドとＪＮＫ活性化ホスファターゼ結合パートナー間の複合体の形成を上昇または低下させる能力について２つ以上の被験化合物を評価することが望ましいことがある。こうした場合には、第１の被験化合物に追加の被験化合物を同時にまたは逐次添加することにより上記したアッセイを簡単に改変し得る。アッセイの残りのステップは上記した通りである。
【０１８１】
上記したようなインビトロアッセイは、有利にはＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチド及びＪＮＫ活性化ホスファターゼ結合パートナーによる複合体形成に対する影響について多数の化合物を容易にスクリーニングするために使用され得る。前記アッセイはファージディスプレー、合成ペプチド及び化学合成ライブラリーで作成した化合物をスクリーニングするために自動化され得る。
【０１８２】
ＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドとＪＮＫ活性化ホスファターゼ結合パートナー間の複合体の形成を増加または低下させる化合物は、ＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドまたはＪＮＫ活性化ホスファターゼ結合パートナーを発現する細胞及び細胞系を用いて細胞培養物中でスクリーニングされ得る。細胞及び細胞系は哺乳動物から入手可能であるが、好ましくはヒトまたは他の霊長類、イヌまたはげっ歯動物ソースから入手する。
【０１８３】
細胞培養物を薬物候補の効果をスクリーニングするために使用され得る。例えば、薬物候補はＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチド遺伝子の発現を上昇または低下させ得る。或る実施態様では、細胞培養物を薬物候補に接触させた後にＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドまたはＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチド断片の産生量を測定し得る。或る実施態様では、細胞培養物への薬物候補の実際のインパクトを検出し得る。例えば、特定遺伝子の過剰発現は細胞培養物に対する特定のインパクトを有し得る。こうした場合、遺伝子の発現を上昇または低下させる薬物候補の能力または細胞培養物に対する特定のインパクトを防止または抑制する薬物候補の能力を調べることができる。他の例では、ポリペプチド断片のような特定の代謝産物が産生すると、疾患または病状になるかまたはそれに関連し得る。こうした場合、細胞培養物における代謝産物の産生を低下させる薬物候補の能力を調べることができる。
【０１８４】
酵母２ハイブリッド系（Ｃｈｉｅｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ，８８：９５７８−８３（１９９１））をＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドに結合するかまたは相互作用する新規ポリペプチドを同定するために使用することができる。その例として、酵母ＧＡＬ４−ＤＮＡ結合ドメインに融合したＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドの細胞質ドメインをコードするＤＮＡを含むハイブリッド構築物を２ハイブリッドバイトプラスミドとして使用し得る。スクリーニングから生じたポジテイブクローンを相互作用タンパク質を同定するために更に特性化し得る。
【０１８５】
本発明の別の目的は治療タンパク質の相同的組換えによるインビトロ産生及び治療タンパク質の遺伝子治療による産生及びデリバリーのための方法に関する。
【０１８６】
ＪＮＫ活性化ホスファターゼタンパク質は相同的組換えにより産生され得るかまたはＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドをコードするＤＮＡを既に含む細胞に導入した制御要素を用いる組換え産生方法により産生され得る。例えば、相同的組換え方法は、通常の転写的にサイレントなＪＮＫ活性化ホスファターゼ遺伝子または過小発現遺伝子を含み、よって治療有効量のＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドを発現する細胞を産生する細胞を修飾するために使用され得る。相同的組換えは、転写活性遺伝子における突然変異を誘導または訂正するために遺伝子をターゲットするために元々開発された技術である（Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｒｉ，Ｐｒｏｇ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．ａｎｄ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３６：３０１（１９８９））。基本的技術は特異的突然変異を哺乳動物ゲノムの特定領域に導入するため（Ｔｈｏｍａｓら，Ｃｅｌｌ，４４：４１９−２８（１９８６）、Ｔｈｏｍａｓ及びＣａｐｅｃｃｈｉ，Ｃｅｌｌ，５１：５０３−１２（１９８７）、Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，８５：８５８３−８７（１９８８））、または欠陥遺伝子内の特定突然変異を訂正するため（Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎら，Ｎａｔｕｒｅ，３３０：５７６−７８（１９８７））の方法として開発された。相同的組換え方法の例は米国特許第５，２７２，０７１号明細書（欧州特許第９１  ９０  ３０５１号明細書、欧州特許出願公開第５０５  ５００号明細書、国際特許出願ＵＳ９０／０７６４２号明細書、国際特許出願公開第９１／０９９５５号パンフレット）に記載されている。
【０１８７】
相同的組換えにより、ゲノムに挿入すべきＤＮＡ配列は標的ＤＮＡに結合することにより当該遺伝子の特定領域に向けられ得る。標的ＤＮＡはゲノムＤＮＡの領域に対して相補性（相同的）なヌクレオチド配列である。ゲノムの特定領域に対して相補的な標的ＤＮＡの小ピースをＤＮＡ複製過程中親鎖と接触させる。細胞に挿入されれたＤＮＡの一般的性質は共有相同領域を介して内在性ＤＮＡの他のピースとハイブリダイズさせ、よって組換えることである。この相補鎖を突然変異、異なる配列または追加のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドに結合させるならば、組換えの結果として新たに合成された鎖に組み込まれる。校正可能の結果として、ＤＮＡの新規配列を鋳型として使用することが可能である。従って、転移されたＤＮＡがゲノムに組み込まれる。
【０１８８】
前記した標的ＤＮＡのピースに対してＪＮＫ活性化ホスファターゼタンパク質の発現と相互作用し得るＤＮＡの領域を結合させる。例えば、プロモーター／エンハンサー要素、サプレッサー及び外来性転写モジュレート要素を所期の宿主細胞のゲノムに所望のＪＮＫ活性化ホスファターゼタンパク質をコードするＤＮＡの転写に影響を与えるのに十分な近接及び配向で挿入する。制御要素は宿主細胞ゲノム中に存在するＤＮＡの一部を制御する。従って、ＪＮＫ活性化ホスファターゼタンパク質の発現は、ＪＮＫ活性化ホスファターゼ遺伝子それ自体をコードするＤＮＡのトランスフェクションによってではなく、ＪＮＫ活性化ホスファターゼタンパク質の転写のための認識可能信号と共に内在性遺伝子配列を与えるＤＮＡ調節セグメントと結合させた標的ＤＮＡ（当該内在性遺伝子と相同性の領域を含む）を使用することにより達成され得る。
【０１８９】
例示的方法では、細胞中の所望の標的遺伝子（すなわち、所望の内在性細胞遺伝子）の発現は、少なくとも調節配列、エキソン及びスプライスドナーサイトを含むＤＮＡを所定サイトでの細胞ゲノムへの相同的組換えにより導入することにより変更される。前記成分は、実際新しい転写単位（ＤＮＡ構築物中に存在する調節配列、エキソン及びスプライスドナーサイトが内在性遺伝子に作動的に結合している）が産生されるように染色体（ゲノム）ＤＮＡに導入される。前記成分゛染色体ＤＮＡに導入されると、所望の内在性遺伝子の発現が変更される。
【０１９０】
本明細書中、変更遺伝子発現は得られた細胞中で通常サイレント（非発現）な遺伝子の活性化（または発現の誘起）、得られた細胞において生理学的に有意なレベルで発現しない遺伝子の発現を含み得る遺伝子の発現の増加、得られた細胞中で起こるものとは異なるように調節または誘導パターンの変化、及び得られた細胞中で発現する遺伝子の発現の低下（排除も含む）を含む。
【０１９１】
更に、本発明は標的遺伝子の発現を変更する方法において有用なＤＮＡ構築物に関する。或る実施態様では、例示のＤＮＡ構築物は（ａ）標的配列、（ｂ）調節配列、（ｃ）エキソン及び（ｄ）不対スプライス−ドナーサイトを含む。ＤＮＡ構築物中の標的配列は、要素（ｂ）〜（ｄ）が内在性標的遺伝子の配列に作動的に結合するように細胞中の標的遺伝子へ要素（ａ）〜（ｄ）を統合させる。別の実施態様では、ＤＮＡ構築物は（ａ）標的配列、（ｂ）調節配列、（ｃ）エキソン、（ｄ）スプライス−ドナーサイト、（ｅ）イントロン及び（ｆ）スプライス−アクセプターサイトを含み、標的配列は要素（ｂ）〜（ｆ）が内在性標的遺伝子に作動的に結合するように要素（ａ）〜（ｆ）を統合させる。標的配列は染色体ゾルＤＮＡ中の特定サイトと相同性であり、前記標的配列は前記細胞質ＤＮＡと相同的組換えが起こる。構築物中、エキソンは通常調節配列の３’にあり、スプライス−ドナーサイトはエキソンの３’にある。
【０１９２】
本明細書に記載のＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドの核酸配列のように特定遺伝子の配列が公知の場合、その遺伝子の特定領域と相補性のＤＮＡのピースは合成されるかまたは他の方法、例えば当該領域と境界を接する特定認識サイトで天然ＤＮＡを適当に制限することにより入手できる。前記ピースは細胞への挿入時に標的配列として機能し、ゲノム内でその相同性領域にハイブリダイズする。このハイブリダイゼーションがＤＮＡ複製中に起こると、前記したＤＮＡピース及び該ピースに結合している追加の配列はオカザキ断片として作用し、ＤＮＡの新たに合成した娘鎖に返される。従って、本発明はＪＮＫ活性化ホスファターゼ分子をコードするヌクレオチドを含み、前記ヌクレオチドは標的配列として使用され得る。
【０１９３】
ＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドのインビボ及びインビトロ遺伝子治療デリバリーも考えられる。インビトロの遺伝子治療は、ＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドをコードする遺伝子をポリヌクレオチド分子または他の適当なデリバリーベクター（Ｈｅｆｔｉ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２５：１４１８−３５（１９９４））を局所注入して細胞に導入することにより達成され得る。例えば、ＪＮＫ活性化ホスファターゼタンパク質をコードするポリヌクレオチド分子は標的細胞へのデリバリーのためのアデノ関連ウイルスベクターに含まれ得る（例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎの国際特許出願公開第９５／３４６７０号パンフレット、国際特許出願第ＵＳ９５／０７１７８号明細書参照）。組換え体アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ゲノムは通常、機能的プロモーター及びポリアデニル化配列に作動的に結合するＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に隣接するＡＡＶ逆方向末端リピートを含む。
【０１９４】
別のウイルスベクターには、レトロウイルス、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス及びパピローマウイルスが含まれるが、これらに限定されない。米国特許第５，６７２，３４４号明細書は、組換え神経親和性ＨＳＶ−１ベクターを含むインビボウイルス媒介遺伝子転移系を記載している。米国特許第５，３９９，３４６号明細書は、治療タンパク質をコードするＤＮＡセグメントを挿入するようにインビトロで処理したヒト細胞をデリバリーすることにより患者に治療タンパク質を与える方法を例示している。遺伝子治療技術を実施するための他の方法及び材料は米国特許第５，６３１，２３６号明細書（アデノウイルスベクターを含む）、米国特許第５，６７２，５１０号明細書（レトロウイルスベクターを含む）及び米国特許第５，６３５，３９９号明細書（サイトカインを発現するレトロウイルスベクターを含む）に記載されている。
【０１９５】
非ウイルスデリバリー方法には、リポソーム媒介転移、裸のＤＮＡデリバリー（直接注入）、受容体媒介転移（リガンド−ＤＮＡ複合体）、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈降及び微粒子衝撃（例えば、遺伝子ガン）が含まれる。遺伝子治療材料及び方法には、誘導プロモーター、組織特異的エンハンサー−プロモーター、部位特異的組み込みように設計されたＤＮＡ配列、親細胞に比して選択的効果を与え得るＤＮＡ配列、形質転換細胞を同定するための標識、負の選択システム及び発現制御システム（安全測定）、（細胞標的用の）細胞特異的結合剤、細胞特異的インターナリゼーション因子、ベクターにより発現を高めるための転写因子、及びベクター製造方法が含まれる。遺伝子治療技術を実施するための別の方法及び材料は米国特許第４，９７０，１５４号明細書（エレクトロポレーション方法）、国際特許出願公開第９６／４０９５８号パンフレット（核リガンド）、米国特許第５，６７９，５５９号明細書（遺伝子デリバリーのためのリポタンパク質含有システムに関する）、米国特許第５，６７６，９５４号明細書（リポソーム担体を含む）、米国特許第５，５９３，８７５号明細書（リン酸カルシウムトランスフェクション方法に関する）及び米国特許第４，９４５，５００号明細書（生物学的に活性な粒子を細胞の表面に浸透させ、細胞の内部に挿入させるような速度で前記粒子を細胞で推進させる）に記載されている。発現制御技術には化学誘導調節（例えば、国際特許出願公開第９６／４１８６５号パンフレット及び同第９７／３１８９９号パンフレット参照）、修飾ステロイドホルモン受容体系でのプロゲステロンアンタゴニストの使用（例えば、米国特許第５，３６４，７９１号明細書参照）、エクジソン制御系（例えば、国際特許出願公開第９６／３７０６９号パンフレット参照）及びポジテイブなテトラサイクリン制御可能なトランスアクチベーター（例えば、米国特許第５，５８９，３６２号明細書、同５，６５０，２９８号明細書及び同５，６５４，１６８号明細書参照）が含まれる。
【０１９６】
遺伝子治療を適用され得る１つの方法は、「遺伝子治療ＤＮＡ構築物」を形成するように構成的または誘導プロモーターに作動的に結合し得るＪＮＫ活性化ホスファターゼ遺伝子（ＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチド、その断片、変異体または誘導体をコードするゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ及び／または合成ＤＮＡ）を使用することである。前記プロモーターは、構築物を挿入する細胞または組織のタイプで活性であるならば内在性ＪＮＫ活性化ホスファターゼ遺伝子と同種または異種のいずれであってもよい。遺伝子治療ＤＮＡ構築物の他の成分は任意に、部位特異的統合のために設計されたＤＮＡ分子（例えば、相同的組換えのために有用な内在性フランキング配列）、組織特異的プロモータ、エンハンサー、サイレンサー、親細胞に比して選択的効果を与え得るＤＮＡ分子、形質転換細胞に対する標識として有用なＤＮＡ分子、負の選択系、細胞特異的結合剤（例えば、細胞標的のために）、細胞特異的インターナイゼーション因子、及びベクターを製造し得るベクター及び因子により発現を高めるための転写因子を含み得る。
【０１９７】
その後、前記遺伝子治療ＤＮＡ構築物は患者の細胞（生体内または生体外）に導入され得る。遺伝子治療ＤＮＡ構築物を導入するための１つの手段ではウイルスベクターを使用する。遺伝子治療ＤＮＡ構築物をデリバリーするための遺伝子治療に通常使用される適当なウイルスベクターには、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、単純ヘルペスウイルス、レンチウイルス、パピローマウイルス及びレトロウイルスベクターが含まれるが、これらに限定されない。前記ベクターの幾つか、例えばレトロウイルスベクターは遺伝子治療ＤＮＡ構築物を患者細胞のクロモゾルＤＮＡにデリバリーし、遺伝子治療ＤＮＡ構築物はクロモゾルＤＮＡに統合し得る。他のベクターはエピソームとして機能し、遺伝子治療ＤＮＡ構築物は細胞質中に留まる。
【０１９８】
遺伝子治療により細胞における内在性ＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチド発現を増加させるための別の手段では、１つ以上のエンハンサー要素をＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドプロモーターに挿入し、前記エンハンサー要素はＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチド遺伝子の転写活性を高めるように働き得る。使用されるエンハンサー要素は遺伝子を活性化したい組織に基づいて選択され、前記組織におけるプロモーター活性化を付与することが公知のエンハンサー要素が選択される。例えば、ＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドをコードする遺伝子がＴ細胞において変化する場合にはｌａｃプロモーターエンハンサー要素が使用され得る。ここでは、添加される転写要素の機能性部分は標準のクローニング技術を用いてＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドプロモーターを含むＤＮＡの断片に挿入され、場合によりベクター及び／または５’及び／または３’フランクキング配列等に挿入され得る。その後、「相同的組換え構築物」として公知の前記構築物は生体外または生体内の所望細胞に導入され得る。
【０１９９】
遺伝子治療は、内在性プロモーターのヌクレオチド配列を変更することによりＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチド発現を低下するために使用され得る。前記変更は通常相同的組換え法により達成され得る。例えば、不活化のために選択したＪＮＫ活性化ホスファターゼ遺伝子のプロモーターの全部または一部を含むＤＮＡ分子は、転写を調節するプロモーターのピースを除去及び／または置換するべく工学処理され得る。例えば、ＴＡＴＡボックス及び／またはプロモーターの転写アクチベーターの結合サイトは標準的生物学的技術を用いて欠失され得る。前記欠失は対応するＪＮＫ活性化ホスファターゼ遺伝子の転写を表すプロモーター活性治療を抑制し得る。プロモーター中のＴＡＴＡボックスまたは転写アクチベーター結合サイトの欠失は、（調節しようとするＪＮＫ活性化ホスファターゼ遺伝子と同じまたは関連する種から）ＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドプロモーターの全部または関連部分を含むＤＮＡ構築物を作成することにより達成され得る。前記ＤＮＡ構築物では、ＴＡＴＡボックス及び／または転写アクチベーター結合サイトの活性が低下するかまたは完全に不活性となるようにＴＡＴＡボックス及び／または転写アクチベーター結合サイトヌクレオチドの１つ以上が１つ以上のヌクレオチドの置換、欠失及び／または挿入により突然変異されている。通常変更されたプロモーターセグメントに隣接する天然（内在性）５’及び３’ＤＮＡ配列に相当するＤＮＡの少なくとも約５００塩基を含む前記構築物は、直接または上記したウイルスベクターを用いて適当な細胞（生体外または生体内）に導入され得る。通常、構築物は相同的組換えを介して細胞のゲノムＤＮＡへ統合され、プロモーター構築物中の５’及び３’ＤＮＡ配列は内在性クロモゾルＤＮＡへのハイブリダイゼーションを介して変更プロモーターの統合を助けるように役立ち得る。
【０２００】
他の遺伝子治療方法は、１つ以上のＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドの活性を阻害したい場合に使用され得る。例えば、特定のＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチド遺伝子の少なくとも一部に相補性である配列を有するアンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡ分子が細胞に導入され得る。通常、各アンチセンス分子はそれぞれの特定ＪＮＫ活性化ホスファターゼ遺伝子の開始サイト（５’末端）に対して相補性である。その後アンチセンス分子が対応するＪＮＫ活性化ホスファターゼｍＲＮＡにハイブリダイズすると、このｍＲＮＡの翻訳が防止される。
【０２０１】
或いは、遺伝子治療は１つ以上のＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドの優性ネガティブ抑制剤を作成するために使用される。この場合、それぞれの特定ＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドの突然変異完全長または切断ポリペプチドをコードするＤＮＡを作成し、上記したウイルスまたは非ウイルス方法を用いて患者の細胞に導入し得る。各突然変異体は通常生物学的役割の点で内在性ポリペプチドと競合するように設計されている。
【０２０２】
ＪＮＫ活性化ホスファターゼ核酸及びポリペプチドの使用
本発明の核酸分子は、染色体上にＪＮＫ活性化ホスファターゼ遺伝子及び関連遺伝子の位置をマッピングするために使用し得る。マッピングは当業界で公知の技術、例えばＰＣＲ増幅及びｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより実施し得る。
【０２０３】
核酸分子はまた、ＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチド発現のアンチセンス抑制剤として使用される。前記抑制は、発現制御配列（三重らせん形成）またはＪＮＫ活性化ホスファターゼｍＲＮＡに対して相補性であり且つハイブリダイズする核酸分子により生起され得る。アンチセンスプローブは、本明細書に記載のＪＮＫ活性化ホスファターゼ遺伝子の配列を用いる公知の技術により設計され得る。アンチセンス抑制剤により、細胞または生物中にＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドの低下または不在に関する情報が与えられる。
【０２０４】
ハイブリダイゼーションプローブは、関連配列についてｃＤＮＡ、ゲノムまたは合成ＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために本発明で提供されるＪＮＫ活性化ホスファターゼ遺伝子配列を用いて作成され得る。公知の配列に対して高い同一性を示すＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドのＤＮＡ及び／またはアミノ酸配列の領域は上記した配列アラインメントアルゴリズムを用いて容易に決定され、その領域はスクリーニング用プローブを設計するために使用し得る。
【０２０５】
本発明の核酸分子は遺伝子治療に使用され得る。インビボでＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドを発現する核酸分子により、細胞または生物におけるポリペプチドの影響に関する情報が与えられる。
【０２０６】
それ自体生物学的に活性なポリペプチドをコードしないＪＮＫ活性化ホスファターゼ核酸分子、断片、変異体及び／または誘導体は哺乳動物組織または体液サンプル中のＪＮＫ活性化ホスファターゼＤＮＡまたは対応ＲＮＡの存在を定性的または定量的に調べるための診断アッセイにおいてハイブリダイゼーションプローブとして使用され得る。
【０２０７】
ＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチド、断片、変異体及び／または誘導体はＪＮＫ媒介疾患を予防、治療または診断するための物質をスクリーニングするために使用され得る。
【０２０８】
生物学的に活性であるかまたはないかに関係なく、ＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチド、断片、変異体及び／または誘導体はＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドに結合する抗体を作成するために有用である。前記抗体はインビボ及びインビトロの診断目的で使用され、例えば体液または細胞サンプル中のＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドの存在を検出するために標識形態で使用されるが、これに限定されない。前記抗体はＪＮＫ媒介疾患を予防または治療するためにも使用され得る。前記抗体はＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドの少なくとも１つの活性特性を低下またはブロックするためにＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドに結合し得、または活性を増加させるためにポリペプチドに結合し得る。
【０２０９】
下記実施例は単に例示のためにすぎず、決して本発明の範囲を限定するものと解釈してはならない。
【０２１０】
実施例１：マウスＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチド遺伝子のクローニング
ｃＤＮＡクローニング及び分析のための材料及び方法は上掲したＳａｍｂｒｏｏｋらに記載されている。
【０２１１】
“ＬＳ２０−１”及び“ＬＳ２０−２”として同定したオリジナルの配列タグは７００の異なるディスプレーＰＣＲ（ＤＤ−ＰＣＲ）クローンを配列調査して得た。ＤＤ−ＰＣＲインサートをプラスミドベンターｐＧＥＭ−Ｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）にサブクローニングした。タグＬＳ２０−１及びＬＳ２０−２中の共通インサートはＧｅｎＢａｎｋの同時期研究において他の公知の遺伝子、発現配列タグ（ＥＳＴ）または配列タグ付サイト（ＳＴＳ）と配列相同性を示さなかった。ＬＳ２０−１中のインサートはｐＧＥＭベクター中のＴ７ポリメラーゼ転写開始サイトに関してセンス方向にあった。ＬＳ２０−２中のインサートは同一のプロモーターに関してアンチセンス方向にあった（方向は両方向にプローブを標識し、ノーザンブロットにハイブリダイズすることにより推定した）。制限エンドヌクレアーゼＰｓｔＩで消化すると、クローンＬＳ２０−２はＴ７転写開始サイトを用いる放射線標識リボプローブの合成のための良い鋳型が生じる。前記リボプローブ鋳型をその後完全長ＬＳ２０  ｃＤＮＡに対するλファージライブラリーをスクリーニングするために使用した。
【０２１２】
マウスにおけるＬＳ２０発現のノーザン分析から、他の組織の中で骨格筋においてｍＲＮＡの良好なレベルが示された。本発明者らは幾つかの優れたマウス及びヒト骨格筋ｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ及びＳｔｒａｔａｇｅｎｅ）を持っていたので、骨格筋をターゲットソースとして選択した。
【０２１３】
マウス骨格筋ｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）の力価を測定した。１００万プラークを平板培養し、ニトロセルロースフィルター（ニューハンプシャー州Ｋｅｅｎｓに所在のＳｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｅｌｌ）上に２回リフトした。ＬＳ２０リボプローブとのハイブリダイゼーションをＳｔａｒｋ緩衝液（５０％  ホルムアルデヒド，５０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ６．５），５×ＳＳＣ，１％  ＳＤＳ，５×デンハート溶液，０．０５％  サルコシルナトリウム及び３００μｇ／ｍｌ  サケ精子ＤＮＡ）において４２℃で一晩実施した。フィルターを１×ＳＳＣ，０．１％  ＳＤＳ，４２℃の最終緊縮度まで洗浄し、−７０℃で強調スクリーンを用いてＸ線フィルム（ニューヨーク州ロチェスターに所在のＥａｓｔｍａｎ  ＫｏｄａｋのＸ−ＯＭＴ  ＡＲ）に一晩露出させた。フイルムを現像し、両対の二重リフトでハイブリダイズする（プレート２、７、８、９、１０（２ｅａ）、１５、１６、１７、１８（２ｅａ）、１９及び２０からの）１３プラークプールを同定し、単離した。
【０２１４】
公知のＬＳ２０を延長する新規配列の迅速単離を容易とするために、上記１３一次プラークプールに対してアンカーＰＣＲを使用した。３つの合成オリゴヌクレオチドを作成した。第１のオリゴヌクレオチド１０６５−３０（配列番号２１）は左λファージベクター腕の３２ヌクレオチド領域と同一の配列を有し、１サイドでベクター内のインサートクローニングサイトに隣接している：
（５’−ＣＣＴＴＴＴＴＧＡＧＣＡＡＧＴＴＣＡＧＣＣＴＧＧＴＴＡＡＧＴＣＣ−３’）（配列番号２１）、
第２のオリゴヌクレオチド１３８６−５８（配列番号２２）はＬＳ２０−２インサートの５’−末端近くの３３ヌクレオチドストリングと同一の配列を有する：
（５’−ＧＧＡＧＧＣＣＴＣＴＣＴＣＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＧＡＧＣＣＣＴＣＡＧＧ−３’）（配列番号２２）、
第３のオリゴヌクレオチド１３８６−５９（配列番号２３）はＬＳ２０−２インサートの３’−末端近くの３１ヌクレオチドストリングに相補性（アンチセンス）である：
（５’−ＧＧＣＡＧＣＡＣＣＡＧＣＣＴＧＡＡＣＴＴＴＧＣＡＡＴＡＴＴＴＣ−３’）（配列番号２３）。
【０２１５】
λファージ特異的プライマーを２つのＬＳ２０−特異的プライマーのいずれかと組合せ、ＰＣＲを実施した。４つのオリジナルのプラークプール（プール７、１７、１８及び２０）はＬＳ２０−特異的プライマーの片方とＰＣＲ増幅したが、他方とはしなかった。こうして増幅したＰＣＲ産物をゲル精製し、それぞれ＃３、１８、１９及び２６と名付けた（ゲルレーンに対応してナンバリングした）。ゲル精製断片をプラスミドベクターｐＣＲ２．１（カリフォルニア州サンジェゴに所在のＩｎＶｉｔｓｏｇｅｎ）にサブクローン化し、各クローンを単離した（クローン３−２、１９−２７及び２６−３１）。
【０２１６】
上記した３つのプラスミドクローンからのインサートを両方の鎖上で配列決定し、オリジナルのＬＳ０配列と比較した。オリジナルのＬＳ２０配列の最長５拡張はクローン２６−３１中に含まれていたが、ＬＳ２０コーディング領域には拡張しなかった。１．１Ｋｂｐプローブ鋳型を、クローン２６−３１を制限酵素ＮｃｏＩで消化することにより作成した。このプローブ鋳型を使用して、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅマウス骨格筋ライブラリーを更にスクリーニングするためのランダムヘキサマープライムドブローブを合成した。
【０２１７】
第２のマウス骨格筋ライブラリー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を上記したように平板培養し、リフトし、上記の１．１Ｋｂｐ  ＬＳ２０鋳型から作成したランダムヘキサマープライムドプローブを用いてプローブした。フィルターを第１ライブラリーの場合のようにハイブリダイズした後、２×ＳＳＣ，０．１％  ＳＤＳ，４２℃，５分の最終緊縮度まで洗浄した。フイルムを露出させると、２０個の一次ポジティブプラークプールを単離した（プール２−１、２−２、２−３、３−１、６−１、６−２、６−３、７−１、１２−１、１２−２、１２−３、１６−１、１６−２、１６−３、１６−４、１６−５、１６−６、１８−１、１８−２、１８−３）。アンカーＰＣＲを上記したように同一プライマーを用いて実施した。一次プラークプール２−３、１６−２、１６−４及び１８−４はすべてＬＳ２０−特異的プライマー１３８６−５８とＰＣＲ産物を生じたが、１３８６−５９とは生じなかった。２−３を除くすべてのプールは複数のバンドを増幅させ、よってプール２−３からの単一増幅バンドをゲル精製し、サブクローン化し（ｐＣＲ２．１）、配列決定した。（一次プール２−３のＰＣＲ増幅を介する）サブクローン２−３ｂの配列を得、二元特異的ホスファターゼとして公知のタンパク質類と相同性を有する推定タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含むことが分かった。このｃＤＮＡ（下記する）のヒトオーソログをその後クローニングして、マウスＬＳ２０  ｃＤＮＡは完全長であり、ＪＫＡＰまたはＪＮＫ活性化ホスファターゼとして公知のタンパク質に対するボナファイディ開始メチオニンをコードした。
【０２１８】
実施例２：ヒトＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチド遺伝子のクローニング
新規なマウスＬＳ２０  ｃＤＮＡ配列を用いるＧｅｎｂａｎｋ  ＥＳＴ配列のＦＡＳＴＡ研究から、クローン２４９００２と称されるヒトＥＳＴと高い相同性ヒットを示した。クローン２４９００２はＩＭＡＧＥコンソーシウム供給業者（メリーランド州セントルイスに所在のＧｅｎｏｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）から購入し、全体を配列決定した。インサートは短く、６１４ｂｐであった。クローン２４９００２のインサートを制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩを用いて消化することにより単離し、ゲル精製し、その後のヒト胎児肝ｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のスクリーニングで使用するランダムヘキサマープライムドプローブを合成するための鋳型として使用した。更に、ヒトＬＳ２０配列に基づいて２つの新規なオリゴヌクレオチドプライマーを合成した。ヒトＬＳ２０配列の１４３ｂｐ内部断片を増幅するためまたは上記したマウスＬＳ２０  ｃＤＮＡのクローニングに使用したと類似のアンカーＰＣＲスキームに使用するために、センス（１４７０−２５）（配列番号２４）及びアンチセンス（１４７０−２３）（配列番号２５）プライマーを設計した。
（５’−ＣＡＧＣＡＧＣＧＧＡＴＴＣＡＣＣＡＴＣ−３’）（配列番号２４）
（５’−ＧＣＧＡＴＣＡＣＣＡＧＴＧＴＣＡＣＧＣ−３’）（配列番号２５）
【０２１９】
ヒト胎仔肝ｃＤＮＡライブラリーを上記したように平板培養し、２回リフトした。約６００ｂｐ  ２４９００２鋳型からのランダムヘキサマープライムドプローブを前記フィルターと４２℃で一晩ハイブリダイズした。フィルターを０．２×ＳＳＣ，０．１％  ＳＤＳ，４２℃の最終緊縮度まで洗浄し、フィルムに露出した。８個の一次ポジティブプールを同定し、単離した（プール５−１、５−２、１０−１、１６−１、１６−２、１６−３、１６−４、１６−５）。これらのプールに対してベクター特異的プライマー１０６５−３０及び２つのｈＬＳ２０−特異的プライマー１４７０−２５または−２６のいずれかを用いてアンカーＰＣＲを実施した。前記一次プールの１つ（１６−１Ａ）からのＰＣＲ産物をゲル精製した、サブクローン化し、配列決定した。
【０２２０】
１６−１Ａ由来サブクローンからの配列を得た。前記配列は予想される開始メチオニン、完全ｏｒｆ及び終止コドンとインフレームの上流ストップコドンを有して完璧な完全長ヒトＬＳ２０  ｃＤＮＡをコードした。ＤＮＡ配列決定を、製造業者の推奨に従って各鋳型の両鎖でＴａｑ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇキット（カリフォルニア州フォスターシティーに所在のＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）及び自動化ＤＮＡシーケンサー（型番３７７、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）でのクローニングベクターに適当なプライマーを用いて実施した。
【０２２１】
実施例３：ＪＫＡＰアミノ酸配列分析及び発現パターン
ＪＫＡＰをまず、成体マウス骨髄造血細胞、すなわちＣ５７８１６株マウス由来の全マウス骨髄細胞のＦＡＣＳ−選別Ｌｉｎ−Ｓｃａ−１＋サブセットにおいて差別的に上向き調節される転写物を単離するように設計したスクリーニングにおいて同定した。ディファレンシャルディスプレーＰＣＲ（ＤＤＰＣＲ）（ＤＤＰＣＲはＲ．Ｊｕｒｅｃｉｃ，Ｔ．Ｎｇｕｙｅｎ，Ｊ．Ｗ，Ｂｅｌｍｏｎｔ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．，１２：５０２（１９９６）、Ｒ．Ｊｕｒｅｃｉｃ，Ｒ．．Ｇ．Ｎａｃｈｔｍａｎ，Ｓ．Ｍ．Ｃｏｌｉｃｏｓ．Ｊ．Ｗ．Ｂｅｌｍｏｎｔ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２５９：２３５（１９９８）に記載されているように実施した）を使用して、ＪＫＡＰ転写物を特に幹細胞活性が不足しているＬｉｎ−Ｓｃａ−１＋集団に比してＦＡＣＳから得たマウス骨髄細胞の幹細胞に富むＬｉｎ−Ｓｃａ−１＋集団において優先的に発現するものとして同定した。ＪＫＡＰを戻し交雑パネルによりマウス近位染色体１３にマッピングした（マーカー順序を加えた）。完全長ＪＫＡＰ  ｃＤＮＡは、（ｃＤＮＡクローニング−ＪＫＡＰの完全長ｃＤＮＡを予備発現データに基づいて骨格筋ライブラリーから単離した）から構成され、ＭＡＰＫ経路において活性を有するタンパク質チロシンホスファターゼのサブグループ、二元特異的ホスファターゼに非常に類似の７００ｂｐオープンリーディングフレームを含んでいた（図３Ａ）。予想されるＪＫＡＰタンパク質は二元特異的ホスファターゼの触媒Ｃ−末端ドメインを含んでいるが、Ｎ−末端非触媒ドメインを欠き、その結果多くの他のＭＡＰＫホスファターゼよりも〜１００ａａ短い。二元特異的ホスファターゼのサインモチーフＩ／ＶＨＣｘｘＧｘＳＲＳのすべての残基（Ｊ．Ｍ．Ｄｅｎｕ，Ｊ．Ａ．Ｓｔｕｃｋｅｙ，Ｍ．Ａ．Ｓａｐｅｒ，Ｊ．Ｅ．Ｄｉｘｏｎ，Ｃｅｌｌ，８７：３６１（１９９６）、Ｎ．Ｋ．Ｔｏｎｋｓ及びＢ．Ｇ．Ｎｅｅｌ，同上、ｐ．３６５）はＪＫＡＰホスファターゼ中に保存されている。触媒ドメインに制限される最大節減分析から、ＪＫＡＰが公知のＭＡＰＬホスファターゼのオーソログではないことを示す（図３Ｂ）。ノーザンブロット分析により、ＪＫＡＰは試験した多くの成体マウス組織で発現する（図３Ｃ）。主に完全長ＪＫＡＰ  ｃＤＮＡに相当する２つの転写物の検出から、組織特異的スプライシングまたはプロセッシングが示唆される。３．０ｋｂ転写物及び１．３ｋｂ転写物が脳、精巣、心臓、肝臓及び腎臓中に存在し、骨格筋中には低レベルで存在していた。
【０２２２】
実施例４：マウス骨髄細胞のｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション
マウス組織におけるＪＫＡＰの発現パターンを更に特徴づけるために、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション分析を実施した。成体マウス骨髄からのＬｉｎ  Ｓｃａ−１＋及びＬｉｎ  Ｓｃａ−１−細胞のハイブリダイゼーションから、ＪＫＡＰのディファレンシャル発現が確認され（図４Ａ及びＢ）、これからこの造血性前駆体集団内での細胞に対して独自のＪＫＡＰに対する役割が示唆される。マウス骨髄からＦＡＣＳを経て得たＬｉｎ  Ｓｃａ−１＋及びＬｉｎ  Ｓｃａ−１−細胞を再懸濁し、ＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒドに固定した後、ＲＮａｓｅを含まないＴＥＳＰＡ（Ｓｉｇｍａ）処理ガラススライド上に載せた。ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを、細胞に対して修正を加えてＵ．Ａｌｂｒｅｃｈｔ，Ｇ．Ｅｉｃｈｅｌｅ，Ｊ．Ａ．Ｈｅｌｍｓ，Ｈ．Ｃ．Ｌｕ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ，Ｇ．Ｐ．Ｄａｓｔｏｎ編（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，１９９７），ｐ．２３−４８に記載されているように実施した。ＪＫＡＰ  ｃＤＮＡのヌクレオチド位置２２５１−２５６６に相当するジゴキシゲニン標識ＪＫＡＰリボプローブ０．５〜１μｇ／ｍｌをＷ．Ｎｕｍｂｅｒｇ，Ｂ．Ｍ．Ｃｚａｒｎｅｔｚｋｉ，Ｄ．Ｓｃｈａｄｅｎｄｏｒｆ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１８：４０６（１９９５）に記載されているようにカバースリッピングなしに細胞にハイブリダイズした。
【０２２３】
フローサイトメトリーを経て得たＬｉｎ  Ｓｃａ−１＋及びＬｉｎ  Ｓｃａ−１−マウス細胞を再懸濁し、ＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒドに固定した後、ＲＮａｓｅを含まないＴＥＳＰＡ（Ｓｉｇｍａ）処理ガラススライド上に載せた。細胞を室温で２０〜３０分間風乾し、ＰＢＳで５分間濯ぎ、０．７２％  無水酢酸（Ｆｉｓｃｈｅｒ）を含む０．１Ｍ  トリエタノールアミンＨＣｌ（ｐＨ８．０；Ｆｉｓｃｈｅｒ）において１０分間アセチル化し、ＰＢＳで５分間濯いだ。次いで、細胞を０．９％  ＮａＣｌにおいて５分間平衡化し、３０％、５０％、７０％、８０％、９５％及び１００％  ＥｔＯＨの脱水シリーズを実施し、最後に室温で２０分間風乾した。細胞を疎水性ペン（Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｓｃｉｎｅｃｅｓ）を用いて包囲し、湿潤チャンバーにおいて５０μｌのプレハイブリダイゼーション溶液（５０％  ホルムアミド，２０ｍＭ  トリスＨＣｌ（ｐＨ８．０），０．３ｍＭ  ＮａＣｌ，１０％  硫酸デキストラン，１×デンハート溶液，０．５ｍｇ／ｍｌ  酵母ｔＲＮＡ，１０ｍＭ  ＤＴＴ）と５０〜５５℃で１時間インキュベートした。９５℃で５分間加熱した５０μｌのハイブリダイゼーション溶液中のジゴキシゲニン標識リボプローブを総ハイブリダイゼーション容量１００μｌあたり５０〜１００ｎｇの最終濃度に添加し、５０〜５５℃で１４〜１８時間インキュベートした。ハイブリダイゼーション後、スライドを常に撹拌しながら２×ＳＳＣ，０．１％  ツイーン２０を用いて５５〜６０℃で１時間、０．５×ＳＳＣ，０．１％  ツイーン２０を用いて３７℃で３０分間、０．５×ＳＳＣ，０．１％  ツイーン２０を用いて室温で３０分間洗浄した。ＤＩＧ標識リボプローブの抗体検出のために、細胞をＰＢＳで濯ぎ、ブロッキング緩衝液（ＰＢＳ  ０．１％  ツイーン２０中１０％  λ血清）中３７℃で３０分間インキュベートした後、ブロッキング緩衝液で１：５００希釈したヒツジ抗−ＤＩＧ−ＡＰ−コンジュゲート抗体（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）と３７℃で１時間インキュベートした。抗体インキュベート後、スライドをＰＢＳ，０．１％  ツイーン２０で濯ぎ、常に撹拌しながらＰＢＳ，０．１％  ツイーン２０を用いて室温で１０分間洗浄した後、常に撹拌しながら検出緩衝液（１００ｍＭ  トリスＨＣｌ（ｐＨ９．５），１００ｍＭ  ＮａＣｌ，５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２）を用いて室温で１０分間洗浄した。抗体を比色検出するために、スライドを暗い湿ったチャンバーにおいて基質溶液（検出緩衝液中４５０μｇ／ｍｌのニトロブルーテトラゾリウムクロリド（ＮＢＴ），１７５μ／ｍｌの５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート４−トルイジン塩（ＢＣＩＰ），２４０μｇ／ｍｌのレバミソール）と室温で３０〜６０分間インキュベヘートした。最後に、スライドを水で十分に洗浄して反応を停止し、カバースリップを水性載置培地を用いて載せた。
【０２２４】
実施例５：Ｅ１０．５マウス胚のｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション
胚性日（Ｅ）１０．５マウス胚のホールマウントｉｎ  ｓｉｔｕｅ  ハイブリダイゼーションで、体節及び分枝アーチに高レベルのＪＡＫＰ転写物が検出された（図４のＣ〜Ｅ）。Ｅ１０．５マウス胚のホールマウントｉｎ  ｓｉｔｕｅ  ハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーションを固定チューブで実施した以外はＤ．Ｇ．Ｗｉｋｉｎｓｏｎ，「ｉｎ  ｓｉｔｕキイブリダイゼーション：実際的アプローチ(In situ Hypridization: A Practical Approach)」），Ｄ．Ｇ．Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ編，オックスフォードに所在のＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９２年）発行，ｐ．７５−８３に記載されているようにＪＫＡＰ  ｃＤＮＡのヌクレオチド位置１７〜１５２２に相当するジゴキシゲニン標識リボプローブ２００ｎｇ／ｍｌを用いて実施した。１日目に（ＰＢＴ（ＰＢＳ＋０．１％  ツイーン２０）中４％  パラホルムアルデヒドに一晩固定し、ＰＢＴで３回洗浄し、ハイブリダイゼーション日まで１００％  メタノール中に保存した）胚を７５％−５０％−２５％−０％  メタノールシリーズを用いて再水和し、ＰＢＴで２回洗浄し、ＰＢＴ中１０μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ溶液中で１５分間インキュベートした。ＰＢＴ中２ｍｇ／ｍｌのグリシンで洗浄した後ＰＢＴ中４％  パラホルムアルデヒド／０．２％  グルタルアルデヒド中に再固定することによりプロテイナーゼＫ反応を停止した。胚をＰＢＴで３回洗浄し、ハイブリダイゼーション溶液（５×ＳＳＣ，５０％  ホルムアミド，１％  ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌずつのヘパリン及び酵母ｔＲＮＡ）を用いて６５℃で１時間プレハイブリダイズし、１００ｎｇ／ｍｌのジゴキシゲニン標識リボプローブを添加した新しいハイブリダイゼーション溶液を用いて一晩ハイブリダイズした。２日目に以下の洗浄を実施した：（１）６５℃において洗浄溶液Ｉ（５×ＳＳＣ，５０％  ホルムアルデヒド，１％  ＳＤＳ）を用いて３０分間で２回、（２）６５℃において１：１の洗浄溶液Ｉ：洗浄溶液ＩＩ（０．５Ｍ  ＮａＣｌ，１０ｍＭ  トリスＨＣｌ（ｐＨ７．５），０．１％  ツイーン２０）を用いて１０分間で１回、（３）室温において洗浄溶液ＩＩを用いて５分間で３回、（４）３７℃において洗浄溶液ＩＩ＋１００μｇ／ｍｌ  ＲＮａｓｅ  Ａを用いて３０分間で１回、（５）洗浄溶液ＩＩを用いて５分間で１回、（６）６５℃において洗浄溶液ＩＩＩ（２×ＳＳＣ，５０％  ホルムアルデヒド，０．１％  ツイーン２０）を用いて３０分間で２回、（６）ＴＢＳＴ（１４０ｍＭ  ＮａＣｌ，２．７ｍＭ  ＫＣｌ，２５ｍＭ  トリスＨＣｌ（ｐＨ７．５），０．１％  ツイーン２０）を用いて５分間で３回、（７）ＴＢＳＴ＋１０％  正常ラム血清を用いて９０分間で１回、（８）４℃においてＴＢＳＴ＋ヒツジ及びジゴキシゲニンＦａｂ断片（ＴＢＳＴ＋１％  正常ラム血清中の熱不活化Ｅ１４．５マウス胚粉末に６０分間予め吸収させたＦａｂ断片）の１：２０００希釈物で一晩。３日目に、胚を室温においてＴＢＳＴを用いて６０分間で５回洗浄した後、４℃で一晩で６回目洗浄を行った。４日目に、胚をＣＴ溶液（１００ｍＭ  トリスＨＣｌ（ｐＨ９．５），１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２，２ｍＭ  レバミソール，０．１％  ツイーン２０）を用いて１０分間で２回洗浄した��、暗所室温でＣＴ溶液＋３３７．５μｇ／ｍｌ  ニトロブルーテトラゾリウム塩＋１７５μｇ／ｍｌ  ５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート＋１０％  ポリビニルアルコール中でインキュベートした（Ｂａｒｔｈ及びＩｖａｒｉｅ，１９９４）。約５〜６時間発色させた後、胚をＰＢＴで３回洗浄し、ＰＢＴ中５０％  グリコールで清澄化し、４℃においてＰＢＴ中５０％  グリセロール中で貯蔵した。胚をパラフィンに包埋し、Ａｌｂｒｅｃｈｔら（１９９  ）に従って切片を作成した。切片を核ファストレッドを用いて逆染色した。
【０２２５】
Ｊ．Ｂａｒｔｈ及びＲ．Ｉｖａｒｉｅ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１７：３２４（１９９４）に記載されているようにポリビニルアルコールを添加して発色を強化した。同様の発達段階でトリ及びヒト胚の限定的な造血サイトとして同定された領域の胚性背面大動脈で発現は見られなかった（Ｔ．Ｊａｆｆｒｅｄｏ，Ｒ．Ｇａｕｔｉｅｒ，Ａ．Ｅｉｃｈｍａｎｎ，Ｆ．Ｄｉｅｔｅｒｌｅｎ−Ｌｉｅｖｒｅ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１２５：４５７５（１９９８）、Ｍ．Ｌａｂａｓｔｉｅ，Ｆ．Ｃｏｒｔｅｓ，Ｐ．Ｒｏｍｅｏ，Ｃ．Ｄｕｌａｃ，Ｂ．Ｐｅａｕｌｔ，Ｂｌｏｏｄ，９５：３６２４（１９９８））。このことから、初期の胚内造血細胞はＪＫＡＰを発現しないことが示される（図４Ｆ）。
【０２２６】
実施例６：２９３Ｔ細胞のトランスフェクション
ＪＫＡＰホスファターゼがＭＡＰＫホスファターゼとかなり配列類似性を有していると仮定して、ＭＡＰＫカスケードにおけるＪＫＡＰホスファターゼの活性を試験した。免疫複合体キナーゼアッセイを用いて、ＪＫＡＰホスファターゼ及びＪＮＫ１、ＥＲＫ２またはｐ３８を同時トランスフェクトした２９３Ｔ細胞でＭＡＰＫ活性をアッセイした。溶菌緩衝液（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４），２ｍＭ  ＥＧＴＡ，５０ｍＭ  グリセロホスフェート，１％  トリトンＸ−１００，１０％  グリセロール，１ｍＭ  ジチオトレイトール，２μｇ／ｍｌ  アプロチニン，１ｍＭ  フェニルメチルスルホニルフロリド，１ｍＭ  ＮａＣｌ，１ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４）中で家兎抗−ＪＮＫ１ポリクローナル抗体（Ａｂ１０１）またはマウス抗−ＨＡモノクローナル抗体（１２ＣＡＳ）＋タンパク質Ａ−アガロースビーズ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）とインキュベートすることにより、内在性ＪＮＫ１及び過剰発現したＨＡ−ＪＮＫ１を免疫沈降させた。沈降物を溶菌緩衝液で２回、ＬｉＣｌ緩衝液（５００ｎＭ  ＬｉＣｌ，１００ｍＭ  トリスＨＣｌ（ｐＨ７．６），０．１％  トリトンＸ−１００）で２回、キナーゼ緩衝液（５００ｍＭ  ＬｉＣｌ，１００ｍＭ  トリスＨＣｌ（ｐＨ７．６），０．１％  トリトンＸ−１００）で２回及びキナーゼ緩衝液（２０ｍＭ  ＭＯＰＳ（ｐＨ７．２），２ｍＭ  ＥＧＴＡ，１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１ｍＭ  ジチオトレイトール，０．１％  トリトンＸ−１００，１ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４）で２回洗浄した。次いで、ペレットをキナーゼ緩衝液３０μｌ中１μｇ  ＧＳＴ−ｃｌｕｎ（１−７９）、１５μＭ  ＡＴＰ及び１０μｇＣｉ［ｙ−３２Ｐ］ＡＴＰと混合した。キナーゼ反応を３０℃で３０分間実施し、等容量のＳＤＳサンプリング緩衝液で停止した。反応混合物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びオートラジオグラフィーにより分析した。ペプチドで免疫化した家兎からポリクローナルＡｂ１０１を誘導した。
Ｎ’―ＣＫＮＧＶＩＲＧＱＰＳＰＬＡＱＶＱＱ―Ｃ’（配列番号２７）
使用した担体はＫＬＨであった。上記抗体は、２回注入及びバースト注入から３週間後の停止を用いて標準的方法により作成した。Ａｂ１０１（力価＞１：１０Ｋ）を作成するための１つの好適なソースはＧｅｎｅｍｅｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｉｎｃ．である。Ｃｈｅｎ，Ｙ．Ｒ．，Ｍｅｙｅｅｒ，Ｃ．Ｆ．及びＴａｎ，Ｔ．Ｈ．（１９９６）も参照されたい。γ線誘導アポトーシスにおけるｃ−Ｊｕｎ  Ｎ−末端キナーゼ（ＪＮＫ１）の持続活性化：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１：６３１−６３４、Ｈｕ，Ｍ．Ｃ．Ｔ．，Ｑｉｕ，Ｗ．Ｒ．，Ｗａｎｇ，Ｘ．，Ｍｅｙｅｒ，Ｃ．Ｆ．及びＴａｎ，Ｔ．Ｈ．（１９９６）。ＪＮＫ−ＳＡＰＫキナーゼカスケードを活性化する新規なヒト造血性祖先キナーゼのヒトＨＰＫ１：Ｇｅｎｅ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１０：２２５１−２２６４、Ｗａｎｇ，Ｗ．，Ｚｈｏｕ，Ｇ．，Ｈｕ，Ｍ．Ｃ．Ｔ．，Ｙａｏ，Ｚ．及びＴａｎ，Ｔ．Ｈ．（１９９９）。ＴＧＦ−βシグナル伝達のキナーゼメディエーターである形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−β）−活性化キナーゼ（ＴＡＫ１）による造血性祖先キナーゼ１（ＨＰＬ）依存のストレス活性化ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ−末端キナーゼ（ＪＮＫ）経路の活性化：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２：２２７７１−２２７７６、Ｅｎｓｅｎａｔ，Ｄ．，Ｙａｏ，Ｚ．，Ｗａｎｇ，Ｘ．Ｓ．，Ｋｏｒｉ，Ｒ．，Ｚｈｏｕ，Ｇ．，Ｌｅｅ，Ｓ．Ｃ．及びＴａｎ，Ｔ．Ｈ．（１９９９）。造血性祖先キナーゼと相互作用する新規なＳｒｃ相同性３ドメイン含有アダプタータンパク質ＨＩＰ５５：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４：３３９４５−３３９５０、Ｚｈｏｕ，Ｇ．，Ｌｅｅ，Ｓ．Ｃ．，Ｙａｏ，Ｚ．及びＴａｎ，Ｔ．Ｈ．（１９９９）。造血性祖先キナーゼ１は形質転換成長因子β−誘導ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ−末端キナーゼシグナル化の成分である（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４：１３１３３−１３１３８）。
【０２２７】
予期せぬことに、ＪＫＡＰはＪＮＫ１を活性化したが、ＥＲＫ２もｐ３８も活性化させなかった（図５）。一時的なトランスフェクションを２９３Ｔ細胞においてニュージャージー州Ｌａｖｅｌｅｔｔｅに所在のＳｐｅｃｉａｌｔｙ  Ｍｅｄｉａ，Ｉｎｃ．から提供されたリン酸カルシウム沈降プロトコルを用いて実施した。簡単に説明すると、２９３Ｔ細胞を１．５×１０５細胞／３５ｍｍプレートウェルの密度で平板培養し、翌日指定量の各種ＤＮＡプラスミドをトランスフェクトした。トランスフェクトしたＤＮＡの量を正規化するために空ベクターを使用した。トランスフェクション効率をモニターするための内部コントロールとしてβ−ガラクトシダーゼをコードするプラスミドを細胞に同時トラクスフェクトした。
【０２２８】
ＪＫＡＰの突然変異体不活性形態（ＪＫＡＰ−Ｃ８８Ｓ）をトランスフェクトするとＪＮＫが活性化した。このことから、この応答が無傷のＪＫＡＰホスファターゼ活性に依存することを示す。これらのデータは、ＪＮＫ経路におけるＪＫＡＰに対する特定の役割を示唆している。突然変異体ＪＫＡＰ−Ｃ８８Ｓは、８８位のシステインがセリンで置換されている点で野生型ＪＫＡＰと異なる。分子の他の領域は変更されていない。８８位のシステインは基質に対するホスファターゼの求核攻撃において中央の触媒活性残基である。従って、この位置をセリン置換すると、ＪＫＡＰ分子は生化学的に不活性となる。
【０２２９】
ＴＮＦ−α誘導のＪＮＫ活性を突然変異体ＪＫＡＰでブロックした。０．１ｕｇのＨＡ−ＪＮＫ１単独、またはＨＡ−ＪＮＫ１＋２ｕｇのＪＫＡＰ−Ｃ８８Ｓをトランスフェクトした２９３Ｔ細胞をＴＮＦ−α（１０ｎｇ／ｍｌ）で処理した。３０分後、細胞を収集し、細胞ライゼートを作成した。ＨＡ−ＪＮＫ１を抗−ＨＡ抗体（１２ＣＡ５）で免疫沈降させ、免疫複合体キナーゼアッセイを基質としてＧＳＴ−ｃＪｕｎ（１−７９）を用いて実施した。当量レベルのＨＡ−ＪＮＫ１発現が抗−ＨＡ（１２ＣＡ５）を用いるイムノブロット（ＩＢ）分析により確認された。
【０２３０】
実施例７：ＪＫＡＰのＪＵＫ活性化の調節に対する影響
ＪＫＡＰがＪＮＫ活性化のために必要であるかを調べるために、ＪＮＫホスファターゼが不足している細胞の各種刺激に対する応答を試験した。相同的組換えによるＪＫＡＰの欠失に対して異型接合性のマウス胚性幹（ＥＳ）細胞を作成し、二次選択により同型接合クローンを誘導した（図６）。ＪＫＡＰ＋／＋及びＪＫＡＰ−／−細胞を数個のサイトカインまたは環境ストレスの１つに曝した（図７）。ＪＮＫ標的ＥＳクローンを本質的にＡ．Ｂｒａｄｌｅｙ，奇形がん腫及び胚性幹細胞：実際的アプローチ(Teratocarinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach)，Ｅ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ編，オックスフォードに所在のＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９８７年）発行，ｐ．１１３−１５２に記載されているように作成した。簡単に説明すると、ホスファターゼの触媒ドメインをコードするＪＫＡＰの２つのコーディングエキソンを欠失させたターゲッティングベクターを設計した。前記ベクターはマウス１２９／ＳＶ／ＥＶ全ゲノムＤＮＡライブラリー由来のＤＮＡを用いて構築した。このベクターを１２９／ＳＶ／ＥＶマウスライブラリー由来のＡＢ２．２ＥＳ細胞ライブラリーにエレクトロポレートした。ＡＢ２．２ＥＳ細胞系はＢｌａｃｋ  Ａｇｏｕｔｉ  １２９マウスから誘導した。この細胞系は、ＳＮＬ７６／７支持細胞上で増殖させたときに主として正常であるＸＵ細胞系である。Ｌ１Ｆ発現カセット及びＲＶ４．０（ネオ発現カセット）をトランスフェクトしたＳＴＯ細胞のクローン単離物であるＳＮＬ７６／７を正常状態でＥＳ細胞を維持する能力に関して選択した。得られたクローンを、相同的組換えを立証するためにサザンブロット分析によりスクリーニングした。２つの標的クローンを、約２０ＥＳ細胞／胚盤胞でＥ３．５  Ｃ５７ＢＬ／６１胚盤胞にマイクロインジェクトした。
【０２３１】
６０ｍｍ皿において〜８０％密集ＪＫＡＰ＋＋及びＪＫＡＰ＋ＥＳ細胞をＴＮＦ−α（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＴＧＦ−β（１０ｎｇ／ｍｌ）及びＩＬ−１（１０ｎｇ／ｍｌ）で１０分間、ソルビト−ル（４００ｎＭ）及びＵＶ−Ｃ（３０Ｊ／ｍ２）で３０分間処理した。次いで、細胞を収集し、細胞ライゼートを作成した。内在性ＪＮＫ１を抗−ＪＮＫ１（Ａｂ１０１）で免疫沈降させ、免疫複合体キナーゼアッセイを基質としてＧＳＴ−ｃＪｕｎ（１−７９）を用いて実施した。ＪＫＡＰ＋＋及びＪＫＡＰ＋ＥＳ細胞におけるＪＮＫ１の発現レベルを抗ＪＮＫ１抗体（Ａｂ１０１）を用いるイムノブロット分析によりモニターした。特異的にＪＮＫ経路に関わる（Ａ．Ｊ．Ｆｌｉｎｔ，Ｔ．Ｔｉｇａｎｉｓ，Ｄ．Ｂａｒｆｏｒｄ，Ｎ．Ｋ．Ｔｏｎｋｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９４：１６８０（１９９７））、Ａ．Ｊ．Ｇａｒｔｏｎ，Ａ．Ｊ．Ｆｌｉｎｔ，Ｎ．Ｋ．Ｔｏｎｋｓ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１６：６４０８（１９９６））プロ炎症性サイトカイン腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−α及び形質転換成長因子（ＴＧＦ）−βで刺激すると、ＪＫＡＰ−／−細胞におけるＪＮＫ活性化がかなり低下した。インターロイキン（ＩＬ）−１または高オスモル(hyperosmolar)ショックで刺激してもＪＮＫ活性化が低下したが、ＵＶ線で刺激したときにはＪＫＡＰ−／−細胞におけるＪＮＫ活性化が軽度にしか低下しなかった。これらのデータから、刺激誘導下でＪＮＫ活性を完全に誘導するためにＪＫＡＰが必要であることが示される。
【０２３２】
ＪＫＡＰ＋／＋及びＪＫＡＰ−／−胚由来の線維芽細胞の培養物を１００ｎｇ／ｍｌの４−α−ホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）で刺激した。異なる時間経過後に細胞ライゼートを作成し、抗−ＥＲＫ２で免疫沈降させた。ＥＲＫ２キナーゼ活性をＭＢＰのリン酸化により測定した。ＭＢＰをＰＡＧＥゲル上で分離し、リン酸化産物をホスホルイメージャー分析により測定した。図７（ｇ）参照。ＪＫＡＰ＋／＋及びＪＫＡＰ−／−胚由来の線維芽細胞の培養物をＵＶ−Ｃ（１００Ｊ／ｍ２）で刺激し、異なる時間経過後にｐ３８活性についての免疫複合体アッセイを実施した。内在性ｐ３８を免疫沈降させた後、そのキナーゼ活性を同様の結果を示すＭＢＰまたはＧＳＴ−ＡＴＦ−２を用いて測定した。図７（ｈ）参照。野生型細胞と比較して、ＪＫＡＰ−／−胚性線維芽細胞はＥＲＫ２経路の活性化を伴ってＰＭＡに応答し、ｐ３８ストレス応答経路の活性化を伴ってＵＶ−Ｃ刺激に応答した。これらの結果は、前記細胞におけるＪＫＡＰの主要活性がＪＮＫ経路であることを示す。経路特異性は、特異的にＪＫＡＰ活性を高めるかまたは該活性と干渉する化合物にとって有利であり得るが、ＪＫＡＰ有用性の必要要件ではない。
【０２３３】
実施例８：哺乳動物細胞におけるＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドの産生
インビトロでヒトＪＮＫ活性化ホスファターゼを発現させるために、ヒトＬＳ２０をコードするｃＤＮＡをレトロウイルス構築物ＭＳＣＶ２．１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）にサブクローン化した。ＬＳ２０インサートの配列を確認した後、この発現ベクターをＧＰ＋Ｅ８６パッケージング細胞系（マサチューセッツ州ケンブリッジに所在のＧｅｎｅｔｉｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）にトランスフェクトし、組換えウイルスを含む上清を得た。次いで、この上清を使用してマウスＮＩＨ−３Ｔ３細胞（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション）を感染させ、感染細胞をＧ４１８（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を用いて選択した。対照細胞またはＬＳ２０  ｃＤＮＡ含有組換えレトロウイルスを感染させた細胞からの抽出物を溶菌緩衝液（ＰＢＳ＋０．５％  Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ２０（ミズーリ州セントルイスに所在のＳｉｇｍａ））を用いて生成した。抽出物３０μｌを１０％  トリス−グリシンゲル（カリフォルニア州サンジェゴに所在のＮｏｖｅｘ）に流した。次いで、タンパク質をニトロセルロースペーパー（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｅｌｌ）に移し、ＴＢＳ緩衝液（２０ｍＭ  トリス（ｐＨ７．５），１３８ｍＭ  ＮａＣｌ，０．１％  ツイーン２０（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）中で５％  ドライミルクを用いてブロックした。動物＃１４３６からの抗−ＬＳ２０抗血清を、ＴＢＳ緩衝液中１：１０００の比率でＬＳ２０を検出するためのウェスタンブロット分析において使用した。ホースラディシュペルオキシダーゼをコンジュゲートした抗−家兎Ｉｇ抗体＃ＮＡ  ９３４（ニュージャージー州Ｒａｈｗａｙに所在のＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を１：２０００の比率で二次検出のために使用した。ＬＳ２０ポジティブバンドの検出は強化化学ルミネッセンス（ＥＣＬ）キット（ニュージャージー州Ｐｉｓｃａｔａｗａｙに所在のＡｍｅｒｓｈａｍ）を用い、製造業者の推奨プロトコルに従って実施した。ＬＳ２０組換えレトロウィルス感染細胞からの抽出物では２６キロダルトン（ｋＤ）及び２０ｋＤの２つのバンドが検出されたが、対照抽出物では検出されなかった。２つのバンドの原因の種類は未知である。
【０２３４】
実施例９：抗−ＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチド抗体の作成
ＪＮＫ活性化ホスファターゼポリペプチドに対する抗体は、生物学的または化学的合成により作成した精製タンパク質またはＪＮＫ活性化ホスファターゼペプチドで免疫化することにより得ることができる。抗体の作成方法はＬｅｓｌｉｅ  Ｈｕｄｒｏｎ及びＦｒａｎｋ  Ｃ．Ｂａｙ，Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第２版，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｎｅｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ（１９８０年）発行に記載されている方法であり得る。
【０２３５】
動物（典型的には、マウスまたは家兎）にＪＮＫ活性化ホスファターゼ抗原を注射し、酵素結合イムノソルベントアッッセイ（ＥＩＡ）で測定して十分な血清力価レベルを有する動物をハイブリドーマ産生のために選択する。免疫化動物の脾臓を集め、単細胞懸濁液として調製し、そこから脾細胞を回収する。脾細胞をマウスミエローマ細胞（例えば、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４細胞）に融合し、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）において２００Ｕ／ｍｌペニシリン、２００ｕｇ／ｍｌ  ストレプトマイシンスルフェート及び４ｍＭ  グルタミンとインキュベートし、次いでＨＡＴ選択培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジン）においてインキュベートした。選択後、組織培養物上清を各融合ウェルから取り出し、ＪＮＫ活性化ホスファターゼ抗体産生についてＥＩＡにより試験した。
【０２３６】
抗−ＪＮＫ活性化ホスファターゼ抗体を入手するための別の方法、例えば完全ヒト抗体を作成するためにヒトＩｇ座を有するトランスジェニックマウスの免疫化及び抗体可変ドメインの突然変異誘発により作成したような合成抗体ライブラリーのスクリーニングを使用することもできる。
【０２３７】
本実験では、ヒトＪＮＫ活性化ホスファターゼの５’末端の配列を含むペプチド（配列番号２６）を作成し、抗体誘導のために使用した。このペプチドを担体タンパク質キーホールリンペットヘマシアニンと結合させ、２週間毎に１回のブーストスケジュールで家兎に注入した。ペプチドに対する抗体の力価を、ペプチドを固定化したプレートを用いるＥＬＩＳＡアッセイにより測定した。１つの動物（＃４３６）がペプチドに対して最高の力価を有していることが判明した。
Ｈ２Ｎ−ＣＧＮＦＫＤＡＲＤＡＥＱＬＳ−ＣＯＯＨ（配列番号２６）
実施例１０：ＪＫＡＰとＨＰＫ−１の相互作用
ｍｙｃタグ付ＪＫＡＰを２９３Ｔ細胞においてＨＰＫと同時発現した。図８（ａ）参照。ライゼートを作成し、ＨＰＫ−１を市販されている抗−ＨＰＫ−１抗体（４８４）で免疫沈降させた。同時免疫沈降したＪＫＡＰを市販の抗−ｍｙｃ抗体を用いて検出した。当量レベルのＨＰＫ−１発現を市販の抗−ＨＰＫ−１抗体（４８４）を用いるイムノブロット分析により確認した。２９３Ｔ細胞に０．１ｕｇのＨＡ−ＪＮＫ１単独、ＨＡ−ＪＮＫ１＋２ｕｇのＪＫＡＰまたはＨＰＫ−１、またはＨＡ−ＪＮＫ１＋２ｕｇずつのＪＫＡＰ及びＨＰＫ−１をトランスフェクトした。図８（ｂ）参照。トランスフェクトしたＤＮＡの量を正規化するために空ベクターを使用した。細胞ライゼートを作成し、ＨＡ−ＪＮＫ１を抗−ＨＡ抗体（１２ＣＡ５）で免疫沈降させた。免疫複合体キナーゼアッセイを基質としてＧＳＴ−ｃＪｕｎｅ（１−７９）を用いて実施した（ＷＥＳＴＥＲＮ）。２９２Ｔ細胞に２ｕｇの空ベクター対照、ｍｙｃ−ＪＫＡＰ、ｍｙｃ−ＪＫＡＰ−Ｃ８８Ｓをトランスフェクトした。細胞ライゼートを作成し、市販の抗−ｍｙｃ抗体で免疫沈降させた。生じた沈降物をホスファターゼ活性についてｐ−ニトロフェニルホスフェート（ｐＮＰＰ）の加水分解によりアッセイした。３０分後、３Ｎ  ＮａＯＨを添加して酵素反応を停止し、生成物を４１０ｎｍで分光光度法で測定した。図８（ｃ）参照。
【０２３８】
ＪＫＡＰは比較の対照に比べて固有ホスファターゼ活性を有していることが判明した。すべての公知の二元特異的ホスファターゼに保存されるアミノ酸残基内でＪＫＡＰを部位特異的突然変異させると、観測されるホスファターゼ活性が完全に阻害された。ＪＫＡＰはＪＮＫ経路のＪＮＫの上流で作用するセリン−トリオニンキナーゼであるＨＰＫ−１と相互作用することが特に認められ得た。加えて、ＪＫＡＰはＪＮＫの活性化においてＨＰＫ−１と特異的に相乗作用を示す。この結果から、ＪＫＡＰがＨＰＫ−１を活性化することが示唆される。ＨＰＫ−１はＪＫＡＰの天然基質の１つであり得るが、脱リン酸化のための標的であり得る正確な残基は本実験で見つかっていない。
【０２３９】
本発明を好ましい実施態様に基づいて説明してきたが、当業者は変更及び修飾をなし得ると理解されたい。従って、添付の請求の範囲は本発明の範囲内のすべての均等な変更を包含すると意図される。
【図面の簡単な説明】
【図１】  ヒトＪＮＫ活性化ホスファターゼ遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号１）及びヒトＪＮＫ活性化ホスファターゼタンパク質の推定アミノ酸配列（配列番号２）を示す。
【図２】  マウスＪＮＫ活性化ホスファターゼ遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号３）及びマウスＪＮＫ活性化ホスファターゼタンパク質の推定アミノ酸配列（配列番号４）を示す。
【図３（ａ）】  ＪＫＡＰアミノ酸配列分析及び発現パターンを示す。
【図３（ｂ）】  ＪＫＡＰアミノ酸配列分析及び発現パターンを示す。
【図３（ｃ）】  ＪＫＡＰアミノ酸配列分析及び発現パターンを示す。
【図４】  ＪＫＡＰのｉｎ  ｓｉｔｕ発現分析を示す。
【図５（ａ）】  トランスフェクトした２９３Ｔ細胞におけるＪＫＡＰによるｐ３８またはＥＰＫではなく、ＪＮＫの活性化を示す。
【図５（ｂ）】  トランスフェクトした２９３Ｔ細胞におけるＪＫＡＰによるｐ３８またはＥＰＫではなく、ＪＮＫの活性化を示す。
【図５（ｃ）】  トランスフェクトした２９３Ｔ細胞におけるＪＫＡＰによるｐ３８またはＥＰＫではなく、ＪＮＫの活性化を示す。
【図５（ｄ）】  トランスフェクトした２９３Ｔ細胞におけるＪＫＡＰによるｐ３８またはＥＰＫではなく、ＪＮＫの活性化を示す。
【図６（Ａ）】  ＪＫＡＰ−／−ＥＳ細胞の作成を示す。
【図６（ｂ）】  ＪＫＡＰ−／−ＥＳ細胞の作成を示す。
【図６（Ｃ）】  ＪＫＡＰ−／−ＥＳ細胞の作成を示す。
【図７】  ＪＮＫ活性化に関して刺激に対するＪＫＡＰ−／−ＥＳ細胞の応答を示す。
【図７（Ｇ）】  ＪＮＫ活性化に関して刺激に対するＪＫＡＰ−／−ＥＳ細胞の応答を示す。
【図７（ｈ）】  ＪＮＫ活性化に関して刺激に対するＪＫＡＰ−／−ＥＳ細胞の応答を示す。
【図８ａ】  ２９３Ｔ細胞におけるｍｙｃタグ付ＪＫＡＰのＨＰＫ−１での同時発現を示す。
【図８（ｂ）】  ２９３Ｔ細胞におけるｍｙｃタグ付ＪＫＡＰのＨＰＫ−１での同時発現を示す。
【図８（ｃ）】  ２９３Ｔ細胞におけるｍｙｃタグ付ＪＫＡＰのＨＰＫ−１での同時発現を示す。
【配列表】
0003842130.tif 000003
0003842130.tif 000004
0003842130.tif 000005
0003842130.tif 000006
0003842130.tif 000007
0003842130.tif 000008
0003842130.tif 000009
0003842130.tif 000010
0003842130.tif 000011
【図１】
0003842130.tif 000012
【図２】
0003842130.tif 000013
【図３（ａ）】
0003842130.tif 000014
【図３（ｂ）】
0003842130.tif 000015
【図３（ｃ）】
0003842130.tif 000016
【図４】
0003842130.tif 000017
【図５（ａ）】
0003842130.tif 000018
【図５（ｂ）】
0003842130.tif 000019
【図５（ｃ）】
0003842130.tif 000020
【図５（ｄ）】
0003842130.tif 000021
【図６（Ａ）】
0003842130.tif 000022
【図６（ｂ）】
0003842130.tif 000023
【図６（Ｃ）】
0003842130.tif 000024
【図７】
0003842130.tif 000025
【図７（Ｇ）】
0003842130.tif 000026
【図７（ｈ）】
0003842130.tif 000027
【図８ａ】
0003842130.tif 000028
【図８（ｂ）】
0003842130.tif 000029
【図８（ｃ）】
0003842130.tif 000030