(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
投与により糖尿病性合併症の発症及び進展を抑制するためのプロポリス組成物において、プロポリスと、ローヤルゼリー及びシリマリンから選ばれる少なくとも１種とよりなることを特徴とするプロポリス組成物。
【請求項２】
前記プロポリスは原料プロポリスから水抽出して得られる水抽出プロポリス又は前記水抽出プロポリスをさらにアルコール抽出して得られる水抽出プロポリスである請求項１に記載のプロポリス組成物。
【請求項３】
前記ローヤルゼリーは総炭素数１０個の不飽和脂肪酸を２０〜４０重量％含有するものである請求項１又は請求項２に記載のプロポリス組成物。
【請求項４】
前記ローヤルゼリー及びシリマリンから選ばれる少なくとも１種の配合量はプロポリスに対して重量基準で０．０１〜１００倍の量に設定されている請求項１〜請求項３のうちいずれか一項に記載のプロポリス組成物。
【請求項５】
少なくとも前記シリマリンを含有する請求項１又は請求項２に記載のプロポリス組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、糖尿病合併症の発症及び進展を抑制するのに有効な成分を含有するプロポリス組成物に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
近年、糖尿病及びそれに関連して起こる糖尿病性合併症を発症する人が増加している。その糖尿病性合併症の発症例の１例について説明すると、まず、体内においては血中のグルコースやガラクトースをポリオール（ソルビトールなど）に変換する酵素であるアルドース還元酵素（アルドースリダクターゼ、以下ＡＲと記載する）が、主に末梢神経や水晶体に存在している。そして、糖尿病のような高血糖の状態、つまり、血中のグルコースの増加に伴い、そのグルコースが前記ＡＲによりソルビトールに変換されて、体内におけるソルビトールの産生量が増加するとともに、体内に蓄積される。その結果、このソルビトールの蓄積により糖尿病性合併症である白内障や神経障害が引き起こされる。
【０００３】
糖尿病性合併症を引き起こすその他の種々の要因としては、ニコチンアミドジヌクレオチドリン酸（以下ＮＡＤＰＨと記載する）、還元型グルタチオン（以下ＧＳＨと記載する）の減少や、水晶体膜の過酸化などが考えられている。従って、これらの糖尿病性合併症の発症、進展を阻止、遅延する目的で、前記ＡＲの活性を阻害するＡＲ阻害剤の開発が進められている。
【０００４】
また、天然物中のＡＲ阻害活性物質としてはプロポリス、ギムネマ、イラクサ、クワ葉、イチョウ葉、エキナセア、チョウセンアザミ、ヨモギ、ローズマリー、メグスリノキ、アブラギク等が報告され、その主な有効成分はカルボン酸やフラボノイドだと考えられている。
【０００５】
前記プロポリスの抗糖尿病作用については、ラットを用いたモデル実験で糖尿病性白内障に有効であったとの報告（Medicine and Biology．133(2)，41-43，1996）がある。またプロポリスに含まれるフラボノイド類の中には、ＡＲ阻害活性を有するものがあり、プロポリスの抗酸化作用による水晶体の過酸化物質の消長による効果も期待できると考えられる。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
ところが、前記プロポリスを糖尿病性合併症の発症、進展の抑制のために使用した場合、in  vitroではＡＲ阻害活性を発揮させることができるが、in  vivoではＡＲ阻害活性が十分に発揮されていない。これは糖尿病性合併症に有効なＡＲ阻害活性が不十分、活性成分の体内吸収、標的となる組織への移行が不十分であることを意味し、十分なＡＲ阻害活性を得るためには多量のＡＲ阻害活性物質の摂取が必要となってくる。しかし、多量のＡＲ阻害活性物質を摂取するためにはプロポリスを多量に必要とし、糖尿病性合併症の発症、進展の抑制のための費用が嵩むという問題があった。
この発明は上記のような従来の問題点に着目してなされたものである。その目的とするところは、糖尿病性合併症の発症、進展を抑制する作用を少量の使用量で効果的に発揮することができるプロポリス組成物を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するための手段として、請求項１に記載のプロポリス組成物は、投与により糖尿病性合併症の発症及び進展を抑制するためのプロポリス組成物において、プロポリスと、ローヤルゼリー及びシリマリンから選ばれる少なくとも１種とよりなることを特徴とするものである。
請求項２に記載のプロポリス組成物は、請求項１に記載の発明において、前記プロポリスは原料プロポリスから水抽出して得られる水抽出プロポリス又は前記水抽出プロポリスをさらにアルコール抽出して得られる水抽出プロポリスであるものである。
請求項３に記載のプロポリス組成物は、請求項１又は請求項２に記載の発明において、前記ローヤルゼリーは総炭素数１０個の不飽和脂肪酸を２０〜４０重量％含有するものである。
請求項４に記載のプロポリス組成物は、請求項１〜請求項３のうちいずれか一項に記載の発明において、前記ローヤルゼリー及びシリマリンから選ばれる少なくとも１種の配合量はプロポリスに対して重量基準で０．０１〜１００倍の量に設定されているものである。
請求項５に記載のプロポリス組成物は、請求項１又は請求項２記載の発明において、少なくとも前記シリマリンを含有する。
【０００８】
【発明の実施の形態】
以下、この発明を具体化した実施形態について詳細に説明する。
プロポリス組成物はプロポリスと、ローヤルゼリー及びシリマリンから選ばれる少なくとも１種とよりなり、糖尿病性合併症の発症及び進展を抑制する作用を有するものである。
【０００９】
前記プロポリスについて説明すると、プロポリスはミツバチが種々の植物から採取した樹脂状物質を素材として、花粉やミツバチ自身の腺物質が混ざって構成されたものである。そして、プロポリスは蜂の生活において、巣内の隙間に塗り付けられ、外敵、すなわち有害なウイルス、バクテリア等の微生物、他の昆虫等が蜂の巣に侵入するのを防ぐために使用されるものである。
【００１０】
プロポリスに含まれる糖尿病性合併症の発症及び進展を抑制する作用であるＡＲ阻害活性物質としては、具体的には、クマル酸、桂皮酸、クロロゲン酸、カフェ酸、フェルラ酸等のフェノール性有機酸類等が挙げられる。
【００１１】
プロポリス組成物に使用されるプロポリスとしては原料プロポリス、その原料プロポリスを溶媒によって抽出したプロポリス抽出物（水抽出プロポリス又はアルコール抽出プロポリス）、前記プロポリス抽出物をさらに溶媒によって抽出したプロポリス抽出物が使用される。
【００１２】
前記原料プロポリスの産地は中国、ブラジル、ヨーロッパ諸国、オセアニア諸国、アメリカがあるがそのいずれであってもよい。原料プロポリスはそのまま用いてもよいが、ごみやワックス等の夾雑物もあり、また、そのままでは処理が困難な場合があるので、溶媒によって抽出したプロポリス抽出物を用いるのが好ましい。
【００１３】
前記水抽出プロポリスは体内に速やかにかつ効率的に吸収される。一方、アルコール抽出プロポリスは体内に吸収されにくく、体内における有効成分の利用が阻害されるため、内用剤として用いるときは水抽出プロポリスを利用するのが好ましい。
【００１４】
水抽出プロポリスの原料としてはプロポリス原塊及びアルコール洗浄したプロポリス原塊のうちの少なくとも一方を使用する。そして、前記原料に水を加えて攪拌してプロポリス水分散液とする。次いで、そのプロポリス水分散液をロート等を使用して濾過し、残渣を除去することにより水抽出プロポリスの水溶液が得られる。
【００１５】
水抽出プロポリスのプロポリス組成物への利用形態は特に限定されるものでなく、例えば上記水抽出プロポリスの水溶液等の液状のものを利用してもよく、また、その水抽出プロポリスの水溶液を適当な濃度に濃縮した後に、凍結乾燥、噴霧乾燥等の方法により乾燥させ、それを粉砕して粉末状としたものを利用してもよい。さらに、上記方法により粉末状に形態変更された水抽出プロポリスを水に溶解して再度液状とした水抽出プロポリスの水溶液を利用してもよい。液状又は粉末状の水抽出プロポリスはさらにアルコール抽出してフェノール性有機酸類の濃度を高めてからプロポリス組成物に利用するのが好ましい。
【００１６】
前記アルコール抽出について説明すると、まず、液状の水抽出プロポリス又は粉末状の水抽出プロポリスを水に溶解して水溶液を調製する。このとき、水抽出プロポリスの水溶液の水抽出プロポリスの濃度は０．１〜１０重量％に設定されるのが好ましく、１〜３重量％に設定されるのがより好ましい。水抽出プロポリスの濃度が０．１重量％未満の場合、ＡＲ阻害活性を充分に発揮することができない。一方、水抽出プロポリスの濃度を１０重量％より大きくしても、ＡＲ阻害活性は向上せず、かえって水抽出プロポリスの使用量が多くなる。
【００１７】
次いで、その水溶液に対し適当量のエタノールを添加する。エタノールの添加量は、水抽出プロポリスとエタノールとの溶液におけるエタノールの終濃度が３０〜８０vol/vol％となるように設定されるのが好ましく、水抽出プロポリスの収率とそのＡＲ阻害活性を考慮して６０〜８０vol/vol％となるように設定されるのがより好ましい。
【００１８】
エタノール添加後、この水溶液中に析出物が生成するので、この析出物を静置又は遠心して沈殿除去する。すると、フェノール性有機酸類の濃度が高められた上清画分が得られる。さらに、その上清画分を物質の極性を利用した溶媒抽出法によって分画し、その酸性物質画分を分取することによって、フェノール性有機酸類の濃度がより高められた水抽出プロポリスが得られる。なお、セファデックスのようなゲル濾過担体をカラムに充填したゲル濾過カラムを使用して分画しても、同様にフェノール性有機酸類の濃度がより高められた水抽出プロポリスが得られる。
【００１９】
上記アルコール抽出後の水抽出プロポリスに含まれるフェノール性有機酸類の濃度は、抽出前の水抽出プロポリスに含まれるフェノール性有機酸類の濃度の１．５〜２倍となる。従って、得られる水抽出プロポリスのＡＲ阻害活性は、抽出前の水抽出プロポリスによるＡＲ阻害活性の１．５倍強くなる。なお、得られる水抽出プロポリスは、得られた酸性物質画分の液状の形態のまま、酸性物質画分を蒸留してエタノールを留去した水溶液の形態、又はそれらを乾燥して得られる粉末の形態とされて利用される。
【００２０】
さらに、上記溶媒抽出法によって得られた酸性物質画分をさらに溶媒抽出法によって分画する。この際、酸性物質画分が液状の形態のときは、そのまま又は希釈、濃縮により適当な濃度に調整して使用し、粉末状のときは溶媒、例えば水や含水エタノール等に溶解した溶解液を使用する。このときの酸性物質画分の濃度は０．１〜１０重量％に設定されるのが好ましく、１〜３重量％に設定されるのがより好ましい。また、上記溶解液のｐＨ（水素イオン濃度）を調整するときは、塩酸や水酸化ナトリウムを使用し、その他の溶媒としてはエチルエーテル、クロロホルム、酢酸エチル等の有機溶媒のほか、酸性物質を抽出する場合には水相として飽和炭酸水素ナトリウム溶液（重曹水）やｐＨ８〜９の高濃度のリン酸緩衝液等が用いられる。
【００２１】
従って、２回目の溶媒抽出法により得られる酸性物質画分の水抽出プロポリスに含まれるフェノール性有機酸類の濃度は、１回目の溶媒抽出後の２〜４倍となり、アルコール抽出前の水抽出プロポリスに含まれるフェノール性有機酸類濃度の３〜８倍となる。さらに、ＡＲ阻害活性は、アルコール抽出前の水抽出プロポリスによるＡＲ阻害活性の２〜３倍強くなる。
【００２２】
次に、ローヤルゼリーについて説明すると、ローヤルゼリーは女王蜂の特別食であって、働き蜂の下咽頭腺から分泌される乳白色の半流動体の性状のものである。その成分は水分約６５〜６７重量％、蛋白質約１１〜１３重量％、脂質５〜１０重量％、その他ミネラル、ビタミンを含む。ローヤルゼリーは古来より広く民間で用いられてきており、その薬理作用としては、動物実験において成長促進効果、生殖機能向上があり、また臨床では栄養改善、食欲増進、血圧調節、女性機能改善、肝機能正常化等と多岐にわたっている。
【００２３】
ローヤルゼリー中には総炭素数１０個の不飽和脂肪酸が含有され、その不飽和脂肪酸は生ローヤルゼリー中に約１．４〜２重量％、凍結乾燥ローヤルゼリー中に約５〜７重量％程度含有されている。前記不飽和脂肪酸としては、１０−ヒドロキシデセン酸、１０−ヒドロキシデカン酸及び３，１０−ジヒドロキシデカン酸が挙げられ、それらはＡＲ阻害活性を発揮することが報告されている。
【００２４】
プロポリス組成物の原料として、ローヤルゼリーは生をそのまま使用してもよく、凍結乾燥して粉末状としたローヤルゼリーを使用してもよい。なお、ローヤルゼリーは通常濁りが発生するため、ローヤルゼリー中の濁りの一因となる不活性蛋白質を除去した、いわゆる脱蛋白ローヤルゼリーを使用してもよい。この脱蛋白ローヤルゼリーは、必要によりアルコールで不溶性蛋白質を沈殿させた後、遠心分離し、珪藻土を用いて濾過することによって得られる。
【００２５】
なお、ローヤルゼリーにより発揮されるＡＲ阻害活性は、主に前記不飽和脂肪酸により発揮されると考えられている。そのため、それら不飽和脂肪酸を高含有するローヤルゼリーエキスをプロポリス組成物に使用するのが好ましく、そのローヤルゼリーエキスは不飽和脂肪酸を２０〜４０重量％含有しているものである。
【００２６】
ローヤルゼリーエキスは少なくとも生ローヤルゼリー及び凍結乾燥ローヤルゼリーから選ばれる少なくとも１種から抽出される。また、不飽和脂肪酸等を高濃度に抽出するには、アルコール等の有機溶媒、具体的にはエタノールが用いられる。その際、エタノール濃度は５〜９９重量％であればよく、色、香りの抽出まで考慮するならば、５〜５０重量％が好ましい。なお、その他の溶媒としては水を使用するのが好ましい。また、有機溶媒の使用量はローヤルゼリーに対して等倍以上、さらに不飽和脂肪酸等の抽出効率の点からは８倍以上であることが好ましい。そして、ローヤルゼリーエキスは、ローヤルゼリーにエタノール水溶液を添加し、十分攪拌した後、濾過又は遠心分離により上清を分取し、その上清を滅圧濃縮することにより得られる。
【００２７】
次いで、シリマリンについて説明すると、シリマリンはオオアザミの種子から抽出されるものである。シリマリンの作用としては、脂質過酸化を抑制し、活性酸素を消去することが報告され、最近の論文では肝硬変に糖尿病を併発した患者血液のマロンジアルデハイド（ＭＤＡ）の濃度を低下させることが報告されている。また、肝細胞再生作用があり、核酸、蛋白合成を促進させる作用を有し、加えて、胆汁の排出を促進させる作用を有することも知られている。シリマリンの抗糖尿病作用としては、抗酸化作用による水晶体の過酸化物質の消長による効果が期待できるものと考えられる。
【００２８】
シリマリン中には多くのフラボノイド類が含まれ、特にフラボノリグナンという化合物群が前記各作用の有効成分と考えられ、その有効成分としての化合物はシリビン、シリジアニン、シリクリスチンである。この３種の化合物の化学式はいずれもＣ26Ｈ22Ｏ10の異性体である。
【００２９】
そして、上記シリマリンの抽出方法としては、まず、オオアザミの種子を細かく挽き、エタノールで抽出する。次いで、抽出液を濃縮してエタノールを除去した後、その濃縮液の油分を遠心分離で除去し、さらに得られる液体を乾燥させて粉砕することによりシリマリンが得られる。
【００３０】
従って、上記水抽出プロポリス又は水抽出後にさらにアルコール抽出を行って得られた水抽出プロポリスとローヤルゼリーエキス、水抽出プロポリス又は水抽出後にさらにアルコール抽出を行って得られた水抽出プロポリスとシリマリン、若しくは水抽出プロポリス又は水抽出後にさらにアルコール抽出を行って得られた水抽出プロポリスとローヤルゼリーエキスとシリマリンをそれぞれ混合することによりプロポリス組成物が調製される。
【００３１】
プロポリス組成物の形態は医薬品及び食品の利用目的に応じて適宜選択され、食用、飲料用として液状、ゼリー状にすることができる上、内服用として粉末状とすることができる。また、カプセル剤、顆粒剤、丸剤、散剤及び錠剤等としても利用される。
【００３２】
プロポリス組成物中におけるローヤルゼリーエキス及びシリマリンの配合量は、水抽出プロポリスに対してローヤルゼリーエキス及びシリマリンの少なくとも１種が重量基準で０．０１〜１００倍に設定されるのが好ましく、０．１〜１０倍に設定されるのがより好ましい。この配合量が０．０１倍未満又は１００倍を超える場合には、相乗的なＡＲ阻害活性の増大が引き起こされにくく、糖尿病性合併症に対する強い効果を発揮させにくくなる。
【００３３】
さらに、プロポリス組成物による相乗的なＡＲ阻害活性の増大を効果的に発揮させるために、水抽出プロポリスに対してローヤルゼリーエキスは重量基準で２〜１０倍、シリマリンが重量基準で１〜３倍に設定されるのが特に好ましい。また、水抽出プロポリスに対してローヤルゼリーエキスとシリマリンの両方を混合する際も、ローヤルゼリーエキスは重量基準で２〜１０倍、シリマリンが重量基準で１〜３倍に設定されるのが特に好ましい。
【００３４】
また、プロポリス組成物には、前記各成分に加えて、ゲル化剤、香料、防腐剤、酸化防止剤、着色剤、清涼剤、殺菌剤、ｐＨ調整剤等の添加剤を適宜添加することも可能である。
【００３５】
次に、上記実施形態によって発揮される効果について説明する。
（１）  プロポリス組成物は水抽出プロポリス又は水抽出後にさらにアルコール抽出を行って得られた水抽出プロポリスと、ローヤルゼリーエキス及びシリマリンから選ばれる少なくとも一種とを混合して調製されている。そのため、ＡＲ阻害活性を有する各成分を同時に含有することによって、抗糖尿病作用を相乗的に増大させ、プロポリス組成物の使用量を少量で糖尿病性合併症の発症、進展を抑制する作用を効果的に発揮することができる。また、糖尿病そのものの発症、進展を抑制する作用も効果的に発揮することができる。さらに、取り扱い性がよい上、恒久的な体質改善につながり得る長期間の連続投与を可能にすることができる。
【００３６】
（２）  水抽出プロポリス又は水抽出後にさらにアルコール抽出を行って得られた水抽出プロポリス、ローヤルゼリーエキス及びシリマリンはいずれも安価に入手することができるため、プロポリス組成物を安価に製造することができる。
【００３７】
（３）  水抽出プロポリス又は水抽出後にさらにアルコール抽出を行って得られた水抽出プロポリス、ローヤルゼリーエキス及びシリマリンはそれぞれ公知の抽出方法によって抽出した抽出物を利用できることから、プロポリス組成物を液状、ゼリー状、粉末状、液剤、カプセル剤、顆粒剤、丸剤、散剤及び錠剤等の多様な形態での投与を行うことができる。
【００３８】
（４）  プロポリスのなかでも水抽出プロポリス又は水抽出後にさらにアルコール抽出を行って得られた水抽出プロポリスを使用するため、プロポリス原塊を使用する場合と比較してプロポリス組成物中にＡＲ阻害活性を発揮するフェノール性有機酸類を多量に含有させることができる。従って、プロポリス組成物に対する水抽出プロポリスの使用量を少量にすることができるとともに、糖尿病そのもの及び糖尿病性合併症の発症、進展を抑制する作用をより効果的に発揮することができる。
【００３９】
（５）  ローヤルゼリーはＡＲ阻害活性を発揮する１０−ヒドロキシデセン酸、１０−ヒドロキシデカン酸及び３，１０−ジヒドロキシデカン酸を２０〜４０重量％含有しているローヤルゼリーエキスを使用した。そのため、ローヤルゼリーを使用する場合と比較してプロポリス組成物に対するローヤルゼリーの使用量を少量にすることができるとともに、糖尿病そのもの及び糖尿病性合併症の発症、進展を抑制する作用をより効果的に発揮することができる。
【００４０】
（６）  ローヤルゼリーエキス及びシリマリンの配合量は水抽出プロポリスに対してそれぞれ重量基準で０．０１〜１００倍に設定した。そのため、糖尿病そのもの及び糖尿病性合併症に対する効果の相乗的増大効果を確実に発揮させることができる。
【００４１】
【実施例】
以下、前記実施形態を実施例及び比較例を用いて具体的に説明する。
（比較例１）
ブラジル産プロポリス原塊２００ｋｇを粉砕機で粉砕し、これに９５vol/vol％エタノールを４０００リットル加えて、時々攪拌しながら室温で４日間放置した。その後、その上澄み液を濾過により分離除去してエタノール洗浄済みのプロポリス原塊を得た。次に、得られたエタノール洗浄済みのプロポリス原塊５０ｋｇに温水３００リットルを加え、常時攪拌しながら４５℃で５時間抽出を行った後、バケット型遠心分離機で固液分離して分離液を得た。この分離液に珪藻土３５ｋｇを加えて攪拌した後、濾過をして濾過液を得た。この濾過液を濃縮した後、凍結真空乾燥にて乾燥して、水抽出プロポリスの乾燥粉末２２００ｇを得た。
【００４２】
（比較例２）
上記比較例１で得られた水抽出プロポリスの乾燥粉末１８０ｇに６０℃の温水９リットルを加えて１時間攪拌した後、エタノール２１リットルを加えてさらに２時間攪拌した。そして、この水−エタノール溶液を室温で一晩放置して析出物を沈殿させ、上清画分を分取した。この上清画分を濃縮し、減圧乾燥して水抽出プロポリスをさらにアルコール抽出した水抽出プロポリスの乾燥粉末９５ｇを得た。
【００４３】
（比較例３）
上記比較例１で得られた濾過液の上清画分１７．５リットルを３．５リットルまで濃縮した後、その濃縮液を塩酸でｐＨ３に調整した。この調整液に酢酸エチル３．６リットルを加えて分液ロートを用いて水相と酢酸エチル相に分離し、得られた水相に酢酸エチル３．６リットルを再度加え、前記と同様の分離操作をさらに２回行った。そして、酢酸エチル相を一つにまとめ、これを１．２リットルまで濃縮した後、その濃縮液を水酸化ナトリウムでｐＨ９に調整した。
【００４４】
この調整液に飽和炭酸水素ナトリウム溶液１．２５リットルを加え、その溶液を分液ロートを用いて炭酸水素ナトリウム溶液相と酢酸エチル相に分け、得られた酢酸エチル相に飽和炭酸水素ナトリウム溶液１．２５リットルを再度加え、前記と同様の分離操作をさらに２回行った。飽和炭酸水素ナトリウム溶液相を一つにまとめて、これを塩酸でｐＨ２．８に調整した。
【００４５】
この調整液に酢酸エチル３．８リットルを加え、その溶液を分液ロートを用いて炭酸水素ナトリウム溶液相と酢酸エチル相に分け、得られた炭酸水素ナトリウム溶液相に酢酸エチル３．８リットルを再度加え、前記と同様の分離操作をさらに１回行った。酢酸エチル相を一つにまとめて濃縮し、減圧乾燥して水抽出した後、水抽出プロポリスをさらにアルコール抽出した水抽出プロポリスの乾燥粉末１７０ｇを得た。
【００４６】
（比較例４）
凍結乾燥ローヤルゼリー１０ｋｇに９５vol/vol％エタノール５０リットルを加えて、室温で攪拌した。その上清を濾過により分離除去し、減圧濃縮した後、固形物９５０ｇのローヤルゼリーエキスを得た。
【００４７】
（比較例５）
ブルガリア産オオアザミの種子３ｋｇを粉砕機で粉砕後、９９vol/vol％エタノール３０リットルを加えて、室温で攪拌した。その上清を濾過により分離除去した後、残渣を再度エタノールで抽出して、その抽出液を濾過してその上清を分取した。上清を一つにまとめて減圧濃縮した後、さらに、遠心分離により油脂分と固形分を分け、固形分３７５ｇのシリマリンエキスを得た。
【００４８】
（実施例１）
比較例１で得られた水抽出プロポリス乾燥粉末と、比較例４で得られたローヤルゼリーエキスとを１対５の重量比で混合したものを実施例１のプロポリス組成物とした。
【００４９】
（実施例２）
比較例１で得られた水抽出プロポリス乾燥粉末と、比較例５で得られたシリマリンエキスとを１対２の重量比で混合したものを実施例２のプロポリス組成物とした。
【００５０】
（実施例３）
比較例１で得られた水抽出プロポリス乾燥粉末と、比較例４で得られたローヤルゼリーエキスと、比較例５で得られたシリマリンエキスとを１対５対２の重量比で混合したものを実施例３のプロポリス組成物とした。
【００５１】
（実施例４）
比較例２で得られた水抽出プロポリス乾燥粉末と、比較例４で得られたローヤルゼリーエキスとを１対５の重量比で混合したものを実施例４のプロポリス組成物とした。
【００５２】
（実施例５）
比較例２で得られた水抽出プロポリス乾燥粉末と、比較例５で得られたシリマリンとを１対２の重量比で混合したものを実施例５のプロポリス組成物とした。
【００５３】
（実施例６）
比較例２で得られた水抽出プロポリス乾燥粉末と、比較例４で得られたローヤルゼリーエキスと、比較例５で得られたシリマリンとを１対５対２の重量比で混合したものを実施例６のプロポリス組成物とした。
【００５４】
（実施例７）
比較例３で得られた水抽出プロポリス乾燥粉末と、比較例４で得られたローヤルゼリーエキスとを１対５の重量比で混合したものを実施例７のプロポリス組成物とした。
【００５５】
（実施例８）
比較例３で得られた水抽出プロポリス乾燥粉末と、比較例５で得られたシリマリンとを１対２の重量比で混合したものを実施例８のプロポリス組成物とした。
【００５６】
（実施例９）
比較例３で得られた水抽出プロポリス乾燥粉末と、比較例４で得られたローヤルゼリーエキスと、比較例５で得られたシリマリンとを１対５対２の重量比で混合したものを実施例９のプロポリス組成物とした。
【００５７】
（試験例１）
（ＡＲ阻害活性試験）
比較例１〜５で得られた各水抽出プロポリス乾燥粉末について、ＡＲ阻害活性を測定した。
【００５８】
まず、ＡＲ阻害活性試験方法について説明する。新鮮な牛の水晶体１０個をはさみで細かく切断し、冷却した５倍量の１ｍＭ−２−メルカプトエタノールを含むＰＢＳ（phosphate-buffered saline）を加えて、冷却しながらホモジネートした。このホモジネート液を４℃、１８０００ｇで３０分間遠心し、その上清を分取してＡＲ粗抽出液を得た。
【００５９】
次に、吸光度測定用のセルに、ＡＲ粗抽出液０．４ｍｌと、１００ｍＭの硫酸リチウムを含むＰＢＳ２．０ｍｌと、１．５ｍＭのＮＡＤＰＨ０．２ｍｌと、比較例１〜５で得られた各水抽出プロポリス乾燥粉末を水に溶解した溶解液０．２ｍｌとを入れて、転倒混和する。続いて、このセルを２５℃で１０分間プレインキュベートした後、７５ｍＭのＤＬ−グリセルアルデヒド溶液０．２ｍｌを加えて転倒混和する。そして、このサンプル溶液（計３．０ｍｌ）について、３４０ｎｍの吸光度変化を２５℃で５分間記録した。この測定記録から１分間当たりの吸光度変化を算出し、以下の式に従ってＡＲ阻害率（％）を算出した。
【００６０】
ＡＲ阻害率＝｛１−（ΔＡｓ−ΔＡｂ）／（ΔＡｃ−ΔＡｂ）｝×１００
ΔＡｂ：溶解液とＤＬ−グリセルアルデヒド溶液の代わりに１００ｍＭの硫酸リチウムを含むＰＢＳを使用したときの１分間当りの吸光度変化
ΔＡｃ：溶解液の代わりに１００ｍＭの硫酸リチウムを含むＰＢＳを使用したときの１分間当りの吸光度変化
ΔＡｓ：サンプル溶液の１分間当りの吸光度変化
さらに、サンプル溶液中の水抽出プロポリス乾燥粉末の濃度とＡＲ阻害率との関係から最小二乗法によって、ＡＲ活性を５０％阻害する濃度（ＩＣ50）を求めた。その結果を表１に示す。
【００６１】
これらの酵素調製法及び活性測定法は周知の方法である（Archives of Biochemistry and Biophysics,216(1),337-344,1982、The journal of Antibiotics,48(11),1345-1346,1995）。
【００６２】
【表１】
0003783999.tif 000002
表１に示すように、比較例１〜５のいずれにもＡＲ阻害活性が認められた。水抽出プロポリスについては、精製してフェノール性有機酸類を多く含むにつれてＩＣ50が小さくなるため、少量の水抽出プロポリスでＡＲ阻害活性を発揮することができることが示された。
【００６３】
（試験例２）
（ラット糖尿病性白内障試験）
糖尿病性合併症に対する水抽出プロポリス、ローヤルゼリーエキス及びシリマリンの効果を調べるため、その発症、進展にＡＲが関与する糖尿病性白内障について、ラットを用いたモデル実験を実施した。
【００６４】
まず、市販の粉末飼料（オリエンタル酵母株式会社製  ＣＲＦ−１）とＤ−ガラクトースとを含有する飼料を調製し、さらに、各比較例及び実施例においては、前記飼料に対して表２に示す配合割合で水抽出プロポリス、ローヤルゼリーエキス及びシリマリンをそれぞれ配合した。なお、比較例１〜５及び実施例１〜９においては、Ｄ−ガラクトースを水抽出プロポリスに対して重量基準で２５倍となるように配合した。なお、対照例１は市販の粉末飼料にＤ−ガラクトースのみを配合した飼料を与えたものであり、対照例２は市販の粉末飼料のみを飼料として与えたものである。
【００６５】
次に、比較例１〜５及び実施例１〜９、対照例１，２において、それぞれ雄性Sprague-Dawley系ラット（体重９０ｇ前後、１群６匹）に対して、上記飼料を１４日間自由摂取させた後、ガラクトース誘発糖尿病性白内障ラットを作製して、それらを解剖に供した。
【００６６】
【表２】
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次いで、前記ガラクトース誘発糖尿病性白内障ラットの眼に０．５％トロピカミド点眼液（わかもと製薬）を点眼し、眼を十分に散瞳させた後、水晶体の混濁度を肉眼で観察した。白内障の判定は、水晶体の混濁度をSippelの方法（Invest．Ophthalmol．，5,568-578,1966）に従って評価した（Score０、１、２、３、４）。さらに、得られたスコアより白内障抑制率（％）を、以下に示す計算式に従って計算した。
【００６７】
白内障抑制率（％）＝｛（対照例１のスコア平均値−比較例又は実施例のスコア平均値）／（対照例１のスコア平均値）｝×１００
さらに、水晶体の混濁度を観察後、眼球を摘出し、さらに、水晶体を分離してＧＳＨ含量（μｇ／ｌｅｎｓ）の測定試料とした。ＧＳＨ含量はＯ−フタルアルデヒドによる蛍光法（Analytical biochemistry,74,214-226,1976）に準じて測定した。さらに、得られた水晶体のＧＳＨ含量より、ＧＳＨ含量の減少作用を抑制する抑制率（％）を、以下に示す計算式に従って計算した。
【００６８】
抑制率（％）＝｛（比較例又は実施例のＧＳＨ含量平均値−対照例１のＧＳＨ含量平均値）／（対照例２のＧＳＨ含量平均値−対照例１のＧＳＨ含量平均値）｝×１００
統計学的処理はStudent t-test を用い、表中の＊は対照例１に対する有意差が５％以下の危険率であることを示し、＊＊は対照例１に対する有意差が１％以下の危険率であることを示す。
【００６９】
それらの結果を表３〜６に示す。
【００７０】
【表３】
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表３に示すように、比較例１〜５はいずれも白内障の観察において、水晶体の混濁を抑制したが、比較例３を除いてその抑制効果は軽度なものであった。また、比較例１〜３の比較においては、フェノール性有機酸類が最も高含有な比較例３に強い効果が認められた。水晶体中のＧＳＨ含量は、比較例１〜５のいずれも対照例より有意に多かった。
【００７１】
【表４】
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表４に示すように、実施例１〜３は各比較例と比べて白内障の程度を著しく抑制し、水晶体ＧＳＨ含量も同様に各比較例と比べて著しく回復していた。この効果は水抽出プロポリスにローヤルゼリーエキス及びシリマリンのうちの少なくとも一種を同時に含有する場合、ＡＲ阻害活性が相乗的に発揮されることを意味している。
【００７２】
【表５】
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【００７３】
【表６】
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表５及び表６に示すように、実施例４〜６及び表７〜９のいずれも、表４の結果と同様に、水抽出プロポリスにローヤルゼリーエキス及びシリマリンのうちの少なくとも一種を同時に含有する場合、ＡＲ阻害活性が相乗的に発揮されることを意味している。また、水抽出プロポリスのフェノール性有機酸類が高含有の場合、ＡＲ阻害活性がさらに増大することが認められた。
【００７４】
なお、前記実施形態より把握される技術的思想につき、以下に説明する。
・  前記請求項１〜請求項４のうちいずれか一項に記載のプロポリス組成物を所定の形状に加工し、糖尿病性合併症の発症及び進展を抑制する作用を有することを特徴とするプロポリス含有食品。このように構成した場合、食品として服用しながら糖尿病性合併症の発症、進展を抑制する作用を効果的に発揮することができる。
【００７５】
・  前記ローヤルゼリーは、生ローヤルゼリー及び凍結乾燥ローヤルゼリーから選ばれる少なくとも１種をアルコールで抽出したローヤルゼリーエキスである請求項１〜請求項４のうちいずれか一項に記載のプロポリス組成物。このように構成した場合、ローヤルゼリーエキスは不飽和脂肪酸を高含有するため、プロポリス組成物に対するローヤルゼリーの使用量を少量にすることができるとともに、糖尿病性合併症の発症、進展を抑制する作用をより効果的に発揮することができる。
【００７６】
・  プロポリスに対してローヤルゼリー及びシリマリンから選ばれる少なくとも１種を混合して調製されるプロポリス組成物の製造方法。このように構成した場合、糖尿病性合併症の発症、進展を抑制する作用を少量の使用量で効果的に発揮することができるプロポリス組成物を容易に製造することができる。
【００７７】
【発明の効果】
以上詳述したように、この発明によれば次のような効果が発揮される。
請求項１〜請求項５のうちいずれか一項に記載の発明によれば、糖尿病性合併症の発症、進展を抑制する作用を少量の使用量で効果的に発揮することができる。
【００７８】
請求項４に記載の発明によれば、糖尿病の合併症に対する効果の相乗的増大効果を確実に引き起こすことができる。さらに、様々な形態に容易に加工することができ、多様な形態での投与を行うことができる。