(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロテアーゼの活性の検出のための蛍光発生組成物であって、下記式（II）：
【化１】
0003771262.tif 000088
〔式中、Ｆ1は蛍光団であり、Ｃ15，Ｃ14，Ｃ13，Ｐ2，Ｐ1，Ｐ1'，Ｐ2'はアミノ酸であり、Ｓ1は１〜約50個の長さのアミノ酸範囲のペプチドスペーサーであり、ｎは０又は１であり；そしてｎが１の場合には、Ｓ1はペプチド結合によりＣ15のαアミノ基を介してＣ15に結合しており；そしてＹは、下記式（III）又は（IV）：
【化２】
0003771262.tif 000089
（式中、Ｃ23及びＣ24はアミノ酸であり、Ｆ2は蛍光団であり、Ｓ2は１〜50個のアミノ酸の長さのペプチドスペーサーであり、ｋは０又は１であり；そしてｋが１の場合は、Ｓ2はペプチド結合によりＣ24又はＣ23のαカルボキシル基を介してＣ24又はＣ23に結合している）であり；Ｐ2−Ｐ1−Ｐ1'−Ｐ2'は、Ｐ1とＰ1'との間で開裂されるプロテアーゼ開裂部位であり；そして
Ｐ2'がプロリンでない場合、Ｙは式（III）（式中、Ｃ23−Ｃ24はPro−Cys，Aib-Cys，Pro-Lys及びAib-Lysから成る群から選択される）であり；
Ｐ2'がプロリンである場合、Ｙは式（IV）（式中、Ｃ23はCys及びLysから成る群から選択される）であり；
Ｐ2がプロリンである場合、Ｃ15−Ｃ14−Ｃ13はAsp-Ｃ14−Ｃ13又はAsp-Ｃ14−Aibであり；そして
Ｐ2がプロリンでない場合、Ｃ15-Ｃ14-Ｃ13は、Asp−Ｃ14−Pro，Asp-Ｃ14-Aib，Asp-Aib-Pro，Asp-Pro-Ｃ13，Asp-Aib-Ｃ13，Asp-Pro-Aib及びAsp-Aib-Aibから成る群から選択され；
Ｃ13がProである場合、Ｃ15−Ｃ14−Ｃ13はAsp−Ｃ14−Pro又はAsp-Aib-Proであり；
Ｃ14がProである場合、Ｃ15−Ｃ14−Ｃ13はAsp-Pro-Ｃ13又はAsp-Pro-Aibであり；そして
Ｐ2及びＣ13がいずれのProでない場合、Ｃ15−Ｃ14−Ｃ13はAsp-Pro-Ｃ1３、Asp-Aib-Ｃ１3、Asp-Ｃ1４−AIB及びAsp-Pro-Aibから成る群から選択され；
ここで、コンホーメーション決定領域Ｃ15−Ｃ14−Ｃ13及びＣ23−Ｃ24がペプチド主鎖に曲げを導入しこれにより前記蛍光団Ｆ1及びＦ2は100Å未満の距離をもって相互に隣接する位置にあり、これによりＦ1とＦ2は基底状態のダイマーを形成し、吸光最大値が短い波長に移行しそして蛍光が消光される〕
で表される化合物を含んでなる組成物。
【請求項２】
Ｐ2がPro，Gly，Phe，Arg，Leu，Gln，Glu，Ile，His及びAlaから成る群から選択され；
Ｐ1がCys，Met，Nle，Arg，Leu，Gly，His，Glu，Ala，Phe，Tyr及びAsnから成る群から選択され；
Ｐ1'がThr，Ser，Met，Nle，Leu，Ala，Ile，Phe，Val，Glu，His及びTyrから成る群から選択され；そして
Ｐ2'がIle，Gly，Met，Nle，Leu，Ala，Gln，Arg，Val，Ser，Tyr及びAsnから成る群から選択される；
請求の範囲第１項記載の組成物。
【請求項３】
Ｃ15がAsp又はLysであり；
Ｃ14がAla，Met，Nle，Aib，Pro，Ile，Gly，Asp Arg，Thr，Phe，Lys，Gln及びSerから成る群から選択され；
Ｃ13がIle，Aib，Pro，Thr，Ser，Ala，Val，Gly，Phe及びGlnから成る群から選択される；
請求の範囲第２項記載の組成物。
【請求項４】
Ｐ2'がProであり；
Ｙが式IVであり；そして
Ｃ23がCys及びLysから成る群から選択される請求の範囲第１項記載の組成物。
【請求項５】
Ｙが式（III）であり；そして
Ｃ23−Ｃ24がPro-Cys及びPro-Lysから成る群から選択される；
請求の範囲第１項記載の組成物。
【請求項６】
ｋが１であり；そして
Ｓ2がGly-Tyrである；
請求の範囲第１項〜第５項のいずれか１項記載の組成物。
【請求項７】
Ｆ1が315nm〜650nmの範囲の励起波長を有する螢光団である、請求の範囲第１項〜第６項のいずれか１項記載の組成物。
【請求項８】
Ｆ2が315nm〜650nmの範囲の励起波長を有する螢光団である、請求の範囲第１項〜第７項のいずれか１項記載の組成物。
【請求項９】
Ｆ1がフルオレッセイン、５−カルボキシテトラメチルローダミン、６−カルボキシテトラメチルローダミン及び７−ヒドロキシ−４−メチルクマリン−３−酢酸から成る群から選択される、請求の範囲第１項〜第８項のいずれか１項記載の組成物。
【請求項１０】
Ｆ2がローダミンＸアセトアミド、５−カルボキシ−Ｘ−ローダミン及び７−ジエチルアミン−３−（（４’−ヨードアセチル）アミノ）フェニル）−４−メチルクマリンから成る群から選択される請求の範囲第１項〜第９項のいずれか１項記載の組成物。
【請求項１１】
Ｆ1及びＦ2が同じである、請求の範囲第１項〜第10項のいずれか１項記載の組成物。
【請求項１２】
Ｆ1及びＦ2がフルオロセインイソチオネート、５−（及び−６）−カルボキシテトラメチルローダミンスクシンイミジルエステル及び５−（及び−６）−カルボキシ−Ｘ−ローダミンスクシンイミジルエステルから成る群から選択される、請求の範囲第１項〜第11項のいずれか１項記載の組成物。
【請求項１３】
ｎ及びｋが０であり；
Ｃ1がAsp-Ala-Ileであり；
ＰがPro-Nle-Ser-Ileであり；
Ｃ2がPro-Cysであり；
Ｆ1が５−カルボキシテトラメチルローダミンであり；そして
Ｆ2がローダミンＸアセトアミドである；
請求の範囲第１項記載の組成物。
【請求項１４】
ｎ及びｋが０であり；
Ｃ1がAsp-Ala-Ileであり；
ＰがPro-Met-Ser-Ileであり；
Ｃ2がPro-Cysであり；
Ｆ1が５−カルボキシテトラメチルローダミンであり；そして
Ｆ2がローダミンＸアセトアミドである；
請求の範囲第１項記載の組成物。
【請求項１５】
ｎが０であり；
ｋが１であり；
Ｃ1がAsp-Ala-Ileであり；
ＰがPro-Nle-Ser-Ileであり；
Ｃ2がPro-Cys及びPro-Lysから成る群から選択され；そして
Ｃ2がGly-Tyrである；
請求の範囲第１項記載の組成物。
【請求項１６】
ｎが１であり；
ｋが１であり；
Ｃ1がAsp-Ala-Ileであり；
ＰがPro-Nle-Ser-Ileであり；
Ｃ2がPro-Cys及びPro-Lysから成る群から選択され；
Ｓ1がLysであり；そして
Ｓ2がGly-Tyrである；
請求の範囲第１項記載の組成物。
【請求項１７】
前記組成物が、下記の群：
【化３】
0003771262.tif 000090
から成る群から選択される請求の範囲第１項記載の組成物。
【請求項１８】
ｎが１であり；
ｋが０であり；
Ｃ1がAsp-Ala-Ileであり；
ＰがPro-Nle-Ser-Ileであり；
Ｃ2がPro-Cysであり；そして
Ｓ1がLys-Lys-Gly-Gly-Glyである；
請求の範囲第１項記載の組成物。
【請求項１９】
Ｓ1が固体支持体に接合される請求の範囲第18項記載の組成物。
【請求項２０】
Ｃ1がAsp-Ala-Ileであり；
ＰがPro-Nle-Ser-Ileであり；
Ｃ2がPro-Cysであり；
ｎが０であり；
ｋが１であり；そして
Ｓ2がAsp-Gly-Gly-Gly-Lys-Lysである；
請求の範囲第１項記載の組成物。
【請求項２１】
Ｓ2が固体支持体に接合される、請求の範囲第20項記載の組成物。
【請求項２２】
生物学的サンプルにおけるプロテアーゼの活性を検出するための方法であって、
生物学的サンプルと、請求の範囲第１項〜第21項のいずれか１項記載の蛍光発生組成物とを接触せしめ、そして
前記蛍光発生組成物の蛍光の変化を検出し、ここで蛍光の増加がプロテアーゼ活性を示す、
段階を含んだ成る方法。
【請求項２３】
前記生物学的サンプルが、組織学的切片、培養された細胞、生物流体及び組織から成る群から選択される、請求の範囲第22項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、螢光レベルを活性プロテアーゼの存在下で高める新規種類の螢光発生組成物に関する。それらの螢光発生プロテアーゼインジケーターは典型的には可視波長で螢光を発し、そしてその故に、生物学的サンプル中のプロテアーゼ活性の検出及び位置決定のためにひじょうに有用である。
発明の背景
プロテアーゼは、ペプチド結合を触媒的に加水分解する多くの種類のタンパク質分解酵素を意味する。プロテアーゼの主なグループは、メタロプロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ及びアスパラギン酸プロテアーゼを包含する。プロテアーゼ、特にセリンプロテアーゼは、多くの生理学的過程、たとえば血液凝固、受精、炎症、ホルモン生成、免疫応答及び繊維素溶解に関連している。
多くの病状は、特定のプロテアーゼ及びそれらのインヒビターの活性の変更により引き起こされ、そしてその変更により特徴づけられ得る。たとえば、気腫、関節炎、血栓症、癌転移及びいくつかの形の血友病は、セリンプロテアーゼ活性の調節の欠陥に起因する（たとえば、Textbook of Biochemistry with Clinical Correlations，John Wiley and Sons，Inc．N．Y．(1993)を参照のこと）。同様に、プロテアーゼは癌転移に関連すると考えられて来た。プロテアーゼウロキナーゼの高められた合成は、多くの癌における転移能力の上昇と関連付けれて来た。ウロキナーゼは、細胞外空間に遍在するプラスミノーゲンからのプラスミンを活性化し、そしてその活性化は転移する腫瘍細胞が侵入する細胞外マトリックスにおけるタンパク質の分解を引き起こすことができる。プラスミンはまた、コラゲナーゼを活性化することができ、従って、毛細管及びリンパ系を取り囲む基礎膜におけるコラーゲンの分解を促進し、それにより、標的組織中への腫瘍細胞の侵入を可能にする（Dano、など、Adv．Cancer．Res.，44：139(1985)）。
特定のプロテアーゼの活性の変化の明確な測定は、根底にある病状の処置及び管理において臨床的に有意義である。しかしながら、プロテアーゼは容易にはアッセイすることができない。典型的なアプローチは、プロテアーゼと結合する抗体を用いるELISA、又は種々のラベルされた基質を用いるRIAを包含する。それらの天然の基質によるアッセイは、実施するのに困難であり、且つ高価である。現在入手できる合成基質によるアッセイは、高価で、低感受であり、且つ非選択性である。さらに、多くの“インジケーター”基質は、プロテアーゼの自己破壊を一部もたらす多量のプロテアーゼを必要とする。
プロテアーゼ検出への最近のアプローチは、Ｐ１’位置（切断できるペプチド結合のカルボキシル側のアミノ酸位置）に位置する離れた色原体又は螢光発生体の切断誘発される分光学的変化に依存する（たとえば、アメリカ特許第4,557,862号及び第4,648,893号を参照のこと）。しかしながら、多くのプロテアーゼは、プロテアーゼの認識のために切断されやすい結合のいづれかの側に２又は３個のアミノ酸残基を必要とし、そして従って、それらのアプローチはプロテアーゼ特異性を欠いている。
しかしながら、最近、螢光発生インジケーター組成物が開発されており、ここでは“ドナー”螢光団は、HIVプロテアーゼのための結合部位であるペプチド（７個のアミノ酸）及びそのペプチドに螢光団及び発色団を連結するリンカーを含む短い橋により“レセプター”発色団に連結されている（Wangなど、Tetra．Lens．45：6493〜6496(1990)）。ドナー螢光団のシグナルは、共鳴エネルギートランスファー(RET)を包含すると思われる工程を通してレセプター螢光団により消光される。ペプチドの切断は、螢光団及び発色団の分離、すなわち前記消光の除去をもたらし、そして続くシグナルがドナー螢光団から測定された。
不運なことには、ドナーとレセプターとの間の橋の設計は、アッセイの感度を制限する比較的無能な消光を導びいた。さらに、発色団は、紫外線範囲において強く光を吸収する分子を典型的には含む生物学的サンプルにおいて検出のための感度を減じる紫外線範囲での光を吸収した。
切断される場合、高いシグナルレベル、及び損なわれていない場合、非常に近いシグナルレベルを示し、高度のプロテアーゼ特異性を示し、そして可視範囲において独占的に作動し、それによりそれらを生物学的サンプルへの使用のために適切に螢光発生プロテアーゼインジケーターが所望される。本発明の組成物は、それらの及び他の利点を提供する。
発明の要約
本発明は、特定のプロテアーゼの存在下で、その螢光を高める新規の試薬を提供する。それらの螢光発生プロテアーゼインジケーターは、それらがプロテアーゼにより消化される場合、可視波長で高い強度の螢光シグナルを供給する。可視波長におけるそれらの高い螢光シグナルのために、それらのプロテアーゼインジケーターは、生物学的サンプル、特に凍結された組織断片におけるプロテアーゼ活性の検出のために特に適切である。
本発明の螢光発生プロテアーゼインジケーターは、プロテアーゼの活性の検出のために適切な組成物である。それらの組成物は、下記一般式：
0003771262.tif 000002
〔式中、Ｐは約２〜約８個、より好ましくは約２〜約６個及び最とも好ましくは、約２〜約４個のアミノ酸からなる、プロテアーゼのためのプロテアーゼ結合部位を含んで成るペプチドであり；Ｆ1及びＦ2は螢光団であり；Ｓ1及びＳ2は長さ１〜約50個の範囲のアミノ酸のペプチドスペーサーであり；ｎ及びｋは独立して０又は１であり；そしてＣ1及びＣ2は長さ約１〜約３個の範囲のアミノ酸のペプチドを含んで成るコンホメーション決定領域である〕を有する。コンホメーション決定領域はそれぞれ、組成物中に曲げを導入し、それにより螢光団が約100Å以下の分離を伴ってお互いと隣接している、組成物の一般的なＵ−形状配置を創造する。スペーサー（Ｓ1及びＳ2）のいづれかが存在する場合、それらは末端アミノ酸のα炭素原子に結合されるペプチドによりプロテアーゼ結合部位に連結される。従って、ｎが１である場合、Ｓ1はＣ1の末端αアミノ基を通して、ペプチド結合によりＣ1に連結され、そしてｋが１である場合、Ｓ2はＣ2の末端αカルボキシル基を通してペプチド結合によりＣ2に連結される。
プロテアーゼ結合部位を含んで成るアミノ酸残基は、従来、特定のプロテアーゼにより加水分解されるペプチド結合に対して番号付けされている。従って、切断されたペプチド結合のアミノ側上の第１のアミノ酸残基はＰ1と命名され、そして切断されるペプチド結合のカルボキシル側上の第１のアミノ酸残基はＰ1'と命名される。残基の番号付けは、加水分解されたペプチド結合からの距離が離れるほど高まって行く。従って、４のアミノ酸プロテアーゼ結合領域は、
Ｐ2−Ｐ1−Ｐ1'−Ｐ2'
と命名されたアミノ酸を含み、そしてプロテアーゼはＰ1とＰ1'との間の結合領域を切断する。
好ましい態様においては、プロテアーゼ結合部位（Ｐ）は、テトラペプチドであり、Ｃ1はトリペプチドであり、そしてＣ2はアミノ酸又はジペプチドである。従って、組成物は、下記式：
0003771262.tif 000003
〔式中、Ｃ15，Ｃ14，Ｃ13，Ｐ2，Ｐ1，Ｐ1'，Ｐ2'はアミノ酸であり、そしてＹは、下記式：
0003771262.tif 000004
（ここでＣ23，Ｃ24はアミノ酸である）で表わされる化合物から成る群から選択された組成物である〕を有する（注：下付き文字は切断部位に対して番号付けされる）。
特に好ましい態様においては、組成物は、Ｐのアミノ酸組成物が特定のプロテアーゼにより切断される切断部位（Ｐ1−Ｐ1'ペプチド結合）に隣接して対称的に配置された４個のアミノ酸に対応する式IIの組成物である。従って、コンホメーション決定領域は、プロテアーゼ結合領域をまず決定し、コンホメーション決定領域に存在する“残りの（left-over）”残基を決定し、そして必要なら、次のガイドラインに従ってそれらの残基を変性することによって企画される：
１．Ｐ2'部位がProでない場合、Ｃ2はジペプチド（式III）Pro−Cys，Aib-Cys，Pro-Lys、又はAib-Lysであり、そして逆に、Ｐ2'部位がProである場合、Ｃ2は単一のアミノ酸残基（式IV）Cys又はLysである。
２．Ｐ2部位がProでない場合、Ｃ1はAsp-C14-Pro，Asp-C14-Aib，Asp-Aib-Pro，Asp-Pro-C13，Asp-Aib-C13，Asp-Pro-Aib又はAsp-Aib-Aibから成るトリペプチドであり、そしてＰ2部位がPro残基である場合、Ｃ1はAsp-C14-C13又はAsp-C14-Aibから成るトリペプチドである。
３．Ｐ3（C13）残基がProである場合、Ｃ1はAsp-C14-Pro又はAsp-Aib-Proから成るトリペプチドである。
４．Ｐ4（C14）残基がProである場合、Ｃ1はAsp-Pro-C13又はAsp-Pro-Aibから成るトリペプチドである。
５．Ｐ2及びC13が両者ともプロリンでない場合、Ｃ1はAsp-Pro-C13，Asp-Aib-C13，Asp-C14-Pro，Asp-C14-Aib，Asp-Pro-Aib又はAsp-Aib-Proから成るトリペプチドである。
表２は特に好ましいプロテアーゼ結合部位（Ｐ）及び適切なコンホメーション決定領域（Ｃ1及びＣ2）を示す。従って、本発明はまた、式IIの組成物も包含し、式中、Ｐ2は、Pro，Gly，Phe，Arg，Leu，Gln，Glu，His，Ile、又はAlaであり；Ｐ1はCys，Met，Nle，Arg，Leu，Gly，His，Glu，Ala，Phe，Tyr、又はAsnであり；Ｐ1はThr，Ser，Met，Nle，Leu，Ala，Ile，Phe，Val，Glu，His、又はTyrであり；そしてＰ2はIle，Gly，Met，Nle，Leu，Ala，Gln，Arg，Val，Ser，Tyr，Gln、又はAsnである。特に好ましいものは、式IIの組成物であり、式中、Ｐドメイン（Ｐ2−Ｐ1−Ｐ1'−Ｐ2'）は、Pro-Met-Ser-Ile，Pro-Nle-Ser-Ile，Gly-Arg-Thr-Gly，Arg-Met-Ser-Leu，Arg-Nle-Ser-Leu，Gly-Arg-Ser-Leu，Leu-Leu-Ala-Leu，Leu-Gly-Ile-Ala，Gln-Gly-Ile-Leu，Gln-Gly-Leu-Leu，Gln-Gly-Ile-Ala，Gln-Ala-Ile-Ala，Gln Gly-Ile-Ala，Glu-Gly-Leu-Arg，Gly-His-Phe-Arg，Leu-Glu-Val-Met，Leu-Glu-Val-Nle，Ile-His-Ile-Gln，Ala-Asn-Tyr-Asn，Ala-Gly-Glu-Arg，Ala-Gly-Phe-Ala，Gln-Gly-Leu-Ala，Ala-Gln-Phe-Val，Ala-Gly-Val-Glu，Phe-Cys-Met-Leu，Phe-Cys-Nle-Leu，His-Phe-Leu-Arg，Glu-Leu-Phe-Ser，Leu-Ala-Phe-Leu，His-Phe-Val-Arg，Leu-Leu-His-Asn，Gln-Tyr-Thr-Tyr，Gln-Tyr-Ser-Asn、又はIle-Tyr-Ser-Glnである。
本発明はまた、式IIの組成物も包含し、式中、C15はAsp又はLysであり；C14はAla，Met，Nle，Aib，Pro，Ile，Gly，Asp Arg，Thr，Lys，Phe，Gln、又はSerであり；そしてC13はIle，Aib，Pro，Thr，Ser，Ala，Val，Gly，Phe、又はGlnである。特に好ましいものはＣ1コンホメーション決定領域（C15-C14-C13）がAsp-Ala-Ile，Asp-Ile-Pro，Asp-Aib-Pro，Asp-Gly-Pro，Asp-Asp-Pro，Asp-Arg-Pro，Asp-Ile-Aib，Asp-Aib-Aib，Asp-Gly-Aib，Asp-Asp-Aib又はAsp-Arg-Aibである組成物である。
好ましいプロテアーゼインジケーターは、Ｐ2'がProであり、Ｃ2が単一のアミノ酸である式IIの組成物を包含する。従って、Ｙは式IV（式中、C23は好ましくはCys又はLysである）である。もう１つの態様において、Ｙは式IIIであり、そしてC23はProであり、そしてC24はCys又はLysである。さらにもう１つの好ましい態様において、Ｓ1はLysであり、そして／又はＳ2はGly-Tyrである。
特に好ましい態様において、Ｆ1は315nm〜約650nmの範囲の励起波長を有する螢光団である。Ｆ2は315nm〜約650nmの範囲の励起波長を有する螢光団であり、あるいはＦ1及びＦ2は315nm〜約650nmの範囲の励起及び吸収波長を有する螢光団である。Ｆ1はドナー螢光団であり、そしてＦ2はレセプター螢光団であり得、又は逆に、Ｆ2がドナー螢光団であり、そしてＦ1がレセプター螢光団でもあり得る。Ｆ1は５−及び／又は６−カルボキシテトラメチルローダミン又は７−ヒドロキシ−４−メチルクマリン−３−酢酸であり得、そしてＦ2はローダミンＸアセトアミド、５−及び／又は６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン又は７−ジエチルアミノ−３−（（４’−ヨードアセチル）アミノ）フェニル）−４−メチルクマリンであり得る。プロテアーゼインジケーターにおける２種の螢光団Ｆ1及びＦ2は同じであっても又は異なっていても良い。
特に好ましい態様において、ｎ及びｋは０であり；Ｃ1はAsp-Ala-Ileであり；ＰはPro-Nle-Ser-Ileであり；Ｃ2はPro-Cysであり；Ｆ1は５−及び／又は６−カルボキシテトラメチルローダミンであり；そしてＦ2は５−及び／又は６−カルボキシ−Ｘ−ローダミンである。さらに特に好ましい態様においては、ｎ及びｋは０であり；Ｃ1はAsp-Ala-Ileであり；ＰはPro-Met-Ser-Ileであり；Ｃ2はPro-Cysであり；Ｆ1は５−カルボキシテトラメチルローダミンであり；そしてＦ2はローダミン−Ｘ−アセトアミドである。
本発明はまた、Ｃ1がAsp-Ala-Ileであり；ＰがPro-Met-Ser-Ile又はPro-Nle-Ser-Ileであり；Ｃ2がPro-Cysであり；そしてｎ又はｋのいづれかが１であり、そしてＳ1又はＳ2のいづれかが配列Asp-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Glu-Asp-Glu-Lys，Lys-Glu-Asp-Gly-Gly-Asp-Lys，Asp-Gly-Ser-Gly-Glu-Asp-Glu-Lys，Asp-Gly-Gly-Gly-Lys-Lys、又はLys-Glu-Asp-Glu-Gly-Ser-Gly-Asp-Lysを有するスペーサーである組成物も包含する。それらの組成物において、Ｆ1は５−及び／又は６−カルボキシテトラメチルローダミンであり；そしてＦ2はローダミン−Ｘ−アセトアミドである。それらの組成物は、固体支持体、又は膜脂質又はリポソームを包含する脂質に接合され得る。
もう１つの態様においては、上記組成物のいづれかが、サンプル中のプロテアーゼ活性を検出するための方法に使用され得る。サンプルは、たとえば研究又は産業において使用される“貯蔵(stock)”プロテアーゼのサンプルであり得、又はそれは生物学的サンプルでもあり得る。従って、本発明は、サンプルと上記組成物のいづれかとを接触せしめ、そして次に、螢光の上昇がプロテアーゼ活性を示す螢光発生組成物の螢光の変化を検出することによってサンプル中のプロテアーゼ活性を検出するための方法を提供する。前記サンプルは好ましくは、生物学的流体、たとえば唾液又は血液を包含する生物学的サンプル、組織サンプル、たとえば生検又は断片、及び生検としての又は培養物における細胞サンプルである。特に好ましいものは、組織断片、培養された細胞、培養された組織及び同様のものである。
【図面の簡単な説明】
図１はエラスターゼの添加の前及び後でのD-Nor FES-Aプロテアーゼインジケーター（F1-Asp-Ala-Ile-Pro-Nle-Ser-Ile-Pro-Cys-F2）のHPLC分析を示し、ここでＦ1はドナー（Ｄ）螢光団（５’−カルボキシテトラメチルローダミン（Ｃ2211））であり、そしてＦ2はレセプター（Ａ）螢光団（ローダミンＸアセトアミド（R492））である。（Ａ）エラスターゼの添加の前のHPLCは、損なわれていないインジケーター分子を表わす遅い溶出ピークを示す。（Ｂ）エラスターゼの添加の後のHPLCは、両螢光団が吸収する550nmでの検出を示す。（Ｃ）エラスターゼの添加の後のHPLCは、Ｆ2が最大に吸収する580nmでの検出を示す。
図２は、エラスターゼの添加の前（ａ）及び後（ｂ）でのD-Nor FES-A螢光発生プロテアーゼインジケーターの発光スペクトルを示す。
図３は、エラスターゼ１単位の添加の後、時間の関数としての図１の螢光発生プロテアーゼインジケーターの時間−依存性上昇を示す。
図４は、エラスターゼ１単位の添加の後、時間の関数としてのドナー螢光団の螢光強度を示す。（ａ）図１の螢光発生プロテアーゼインジケーター、（ｂ）２種の螢光団の個々により単独でラベルされた、図１の螢光発生プロテアーゼのペプチド主鎖。D-Nor FES-AはF1-Asp-Ala-Ile-Pro-Nle-Ser-Ile-Pro-Cys-F2プロテアーゼインジケーターであり、ここでＦ1はドナー螢光団（５’−カルボキシテトラメチルローダミン（Ｃ2211））であり、そしてＦ2はレセプター螢光団（ローダミンＸアセトアミド（R492））である。D-Nor FES及びA-Nor FESはそれぞれ、同じペプチド主鎖を有するが、しかし前記２種の螢光団の１つのみを担持する分子を示す。
好ましい態様の記載
定義
特にことわらない限り、本明細書に使用されるすべての技術的及び科学的用語は、本発明が属する当業者により通常理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載される方法及び材料に類似するか又はそれらと同等のいづれかの方法及び材料が本発明の試験の実施において使用され得るが、好ましい方法及び材料が記載される。本発明のために、次の用語が下記に定義される。
用語“プロテアーゼ結合部位”とは、特異的に認識され、そしてプロテアーゼにより切断されるアミノ酸配列を意味する。プロテアーゼ結合部位は、プロテアーゼにより加水分解されるペプチド結合を含み、そしてこのペプチド結合により連結されるアミノ酸残基は、その切断部位を形成すると言われる。それらのアミノ酸は、それぞれ、加水分解された結合のアミノ及びカルボキシル側上の残基のためにＰ1及びＰ1'を示す。
螢光団は、特徴的な波長で光を吸収し、そして次に最とも典型的には、特徴的な異なった波長で光を再発光する分子である。螢光団は、当業者に良く知られており、そしてローダミン及びローダミン誘導体、フルオレセイン及びフルオレセイン誘導体、クマリン、及びランタニドイオンシリーズとのキレート化剤を包含するが、但しこれらだけには限定されない。螢光団は、光を吸収するが、しかし特徴的には、光を再発光しない発色団とは区別される。
“ペプチド”及び“ポリペプチド”は、α炭素原子が、１つのアミノ酸のα炭素カルボニル基と他のアミノ酸のアミノ基との間での縮合反応により形成されるペプチド結合を通して連結されるアミノ酸の鎖である。従って、鎖の一端での末端アミノ酸（アミノ末端）は、遊離アミノ基を有し、そして鎖の他端での末端アミノ酸（カルボキシル末端）は、遊離カルボキシル基を有する。本明細書で用いられる場合、用語“アミノ末端”（Ｎ−末端として略語化される）は、ペプチドの末端でのアミノ酸上の遊離α−アミノ基、又はペプチド内のいづれか他の位置でのアミノ酸のα−アミノ基（ペプチド結合に関与する場合、イミノ基）を意味する。同様に、用語“カルボキシ末端”は、ペプチドのカルボキシ末端上の遊離カルボキシル基又はペプチド内のいづれか他の位置でのアミノ酸のカルボキシル基を意味する。ペプチドはまた、ペプチド擬似体、たとえばアミド結合に対してエーテル結合により連結されるアミノ酸をも包含する。
本明細書に記載されるポリペプチドは、左側でアミノ末端及び右側でカルボキシル末端により書かれる。本発明のペプチド成分を含んで成るアミノ酸は、プロテアーゼ切断部位に対して番号付けされ、そして番号はその切断部位からカルボキシル及びアミノ方向に距離と共に連続的に多くなる。カルボキシル部位上の残基は、Ｐ1'におけるような“'”により、又はそれらが位置する領域を示す文字及び下付き文字により示される。その“'”は、残基が切断部位のカルボキシル側上に位置することを示す。
用語“残基”又は“アミノ酸”とは、本明細書で使用される場合、ペプチド中に組込まれたアミノ酸を意味する。アミノ酸は天然に存在するアミノ酸であり、そして特にことわらない限り、天然に存在するアミノ酸と類似する態様で機能することができる、天然のアミノ酸の既知の類似体を包含することができる。
用語“ドメイン”又は“領域”とは、ポリペプチドの特徴的な領域を意味する。ドメインは、特定の構造特徴、たとえばβ回転、αヘリックス、又はβプリーツシートにより、特徴的な構成アミノ酸（たとえば優先的な疎水性又は親水性アミノ酸、又は反復アミノ酸配列）により、又は折りたたまれた立体ポリペプチドの特定領域におけるその局在化により特徴づけられ得る。本明細書で使用される場合、領域又はドメインは、一連の連続したアミノ酸から成る。
用語“プロテアーゼ活性”又は“プロテアーゼの活性”とは、プロテアーゼによりペプチドの切断を意味する。プロテアーゼ活性は、多くの小さなペプチドフラグメントへの１又は複数のペプチドの“消化”を包含する。特定のプロテアーゼのプロテアーゼ活性は、特定のプロテアーゼにより特異的に認識される特定のペプチド結合部位での加水分解をもたらすことができる。その特定のプロテアーゼは、特定の末端アミノ酸残基を担持するペプチドフラグメントの生成により特徴づけられ得る。
本明細書において言及されるアミノ酸は、次のような短縮表示により記載される：
0003771262.tif 000005
プロテアーゼ活性の螢光発生インジケーター
本発明は、サンプル中のプロテアーゼ活性を検出するために有用な新規螢光発生分子を提供する。本発明の螢光発生プロテアーゼインジケーターは一般的に、特定のプロテアーゼにより認識され、そして切断されるアミノ酸配列を有するペプチドにより“レセプター”分子に連結される螢光団（ドナー）を包含する。ドナー螢光団は典型的には、異なった（より長い）波長で再発光する特定の波長での入射放射線により励起される。ドナー螢光団がレセプター分子に接近して維持される場合、レセプターは螢光団により再発光される光を吸収し、それにより、ドナー分子の螢光シグナルを消光せしめる。従って、例１に示されるような２種の異なった螢光団による二重ラベルされたペプチドの他に、同じ螢光団により二重ラベルされたペプチドもまた、プロテアーゼインジケーターとしても使用され得る（たとえば例６を参照のこと）。ドナー螢光団及びレセプターを連結する十分に設計されたペプチド（すなわち、本発明のペプチド）の切断は、２つの分子の分離、消光効果の開放及び螢光の上昇をもたらす。
１つの基本的な用途において、本発明の螢光発生分子は、実験又は産業使用のための試薬（たとえば緩衝溶液中で）として製造される精製されたプロテアーゼの活性をアッセイするために使用され得る。多くの他の酵素のように、プロテアーゼは、特にそれらがそれらの活性形として貯蔵される場合、時間の経過と共に活性を失なう。さらに、多くのプロテアーゼは、使用する前、酵素の活性形を生成するために、特定のペプチド結合の加水分解によりそれ自体活性化されるべき不活性前駆体形（たとえばチモーゲン）で天然において存在する。活性化の程度は多種であり、そしてプロテアーゼは時間の経過と共に活性を失なうので、プロテアーゼが活性であることを認識し、そしてしばしば、特定の用途においては、特定のプロテアーゼを用いる前、その活性を定量化することがしばしば所望される。
プロテアーゼ活性を認識し、そして定量化するためのこれまでのアプローチは、プロテアーゼのアリコートとその基質とを混合し、一定の期間、消化せしめ、そして次に、その消化されたタンパク質の量を、最とも典型的にはHPLCにより測定することを包含する。このアプローチは、時間の浪費であり、高価な試薬を用い、多くの段階を必要とし、そして相当量の労力を必要とする。対照的に、本発明の螢光発生試薬は、単一段階工程における数分でのプロテアーゼ活性の急速な決定を可能にする。試験されるべきプロテアーゼのアリコートは単純に、本発明の螢光発生試薬に添加され、又はその試薬と接触せしめられ、そして続く螢光の変化がモニターされる（たとえば、螢光計を用いて）。
“試薬”溶液におけるプロテアーゼ活性を決定する他に、本発明の螢光発生組成物は生物学的サンプルにおけるプロテアーゼ活性を検出するためにも使用され得る。用語“生物学的サンプル”とは、本明細書で使用される場合、生物から又は生物の成分（たとえば細胞）から得られたサンプルを意味する。サンプルはいづれかの生物学的組織又は流体のものであり得る。ときおり、サンプルは、患者に由来するサンプルである“臨床学的サンプル”であり得る。そのようなサンプルは、唾液、血液、血液細胞（たとえば白血球細胞）、組織又は細い針の生検サンプル、尿、腹水、及び胸水、又はそれらからの細胞を包含するが、但しそれらだけには限定されない。生物学的サンプルはまた、組織の断片、たとえば組織学的な目的のために採取される凍結断片も包含する。
これまで記載されて来た螢光発生プロテアーゼインジケーターは典型的には、紫外線範囲での光を吸収する（たとえば、Wang、など．、前記）。従って、それらは、紫外線範囲において吸収する構成成分（たとえばタンパク質）を典型的には含む生物学的サンプルにおけるプロテアーゼ活性の敏感な検出のためには不適切である。対照的に、本発明の螢光インジケーターは、可視範囲（400nm〜約700nm）において吸収し、そして発光する。従って、それらのシグナルは、螢光団の活性化、すなわち光の吸収により容易に消光されないし、又はバックグラウンド分子により妨害もされず；従って、それらは生物学的サンプルにおいて容易に検出される。
さらに、しばしば螢光団及び消光発色団を用いるこれまでの螢光発生プロテアーゼインジケーターとは異なって、本発明のインジケーターは、２種の螢光団（すなわち、ドナー及びレセプターとしての螢光団）、又は本発明のペプチド主鎖の１つにより連結される場合、基底状態のダイマーを効果的に形成する同じ２つの螢光団を使用することができる。これまで記載された発色団／螢光団の組合せよりも一層高い消出の程度を示す螢光団の対が選択され得る。事実、これまでの組成物は、対合する発色団により得られる消出の低い程度のために、比較的低い効能の螢光団に制限されて来た（Wangなど、前記）。対照的に、本発明の螢光発生プロテアーゼインジケーターは、高い効能の螢光団を用い、そして消光がペプチド基質の切断により開放される場合、強いシグナルを提供しながら、高い程度の消光を達成することができる。高いシグナルは、ひじょうに低いレベルのプロテアーゼ活性の検出を可能にする。従って、本発明の螢光発生プロテアーゼインジケーターは、プロテアーゼ活性の現場検出のために特に適切である。
本発明の螢光発生プロテアーゼインジケーターは、下記一般式：
0003771262.tif 000006
〔式中、Ｐはプロテアーゼ結合部位を含むペプチドであり、Ｆ1及びＦ2は蛍光団であり、Ｃ1及びＣ2はコンホメーション決定領域であり、そしてＳ1及びＳ2は任意のペプチドスペーサーであり、Ｆ1はドナー螢光団であり、そしてＦ2はレセプター螢光団であり、又は逆に、Ｆ2はドナー螢光団であり、そしてＦ1はレセプター螢光団であり、あるいはＦ1及びＦ2は同一であり得る〕を有する。プロテアーゼ結合部位は、そのプロテアーゼ活性をインジケーターが示すように企画されているプロテアーゼにより認識され、そして切断されるアミノ酸配列（ペプチド）を提供する。プロテアーゼ結合部位は、典型的には、約２〜約８個、より好ましくは約２〜約６個及び最とも好ましくは２〜約４個のアミノ酸の長さの範囲のペプチドである。
コンホメーション決定領域は、分子中に曲げを導入するアミノ酸配列である。２つのコンホメーション決定領域の組合された効果は、実質的にＵ−形状のコンホメーションを達成するよう組成物のペプチド主鎖中に２つの曲げを付与することである。このＵ−形状のコンホメーションは、それぞれＣ1及びＣ2のアミノ及びカルボキシル末端に結合される螢光団をお互い接近せしめる。従って、螢光団は好ましくは、約100Å以下の距離でお互いに隣接して位置する。螢光団（Ｆ1及びＦ2）は典型的には、それらはリンカーに結合され得るけれども、コンホメーション決定領域に直接的に接合される。存在する場合、任意のスペーサー（Ｓ1及びＳ2）が、固体支持体に組成物を、又は生物学的サンプルの成分（たとえば細胞膜）に組成物を連結するために使用される。
実質的にＵ−形状化されたコンホメーションは、組成物のプロテアーゼ特異性を高める。コンホメーション決定領域（前記Ｕ形状のアーム）を含んで成るアミノ酸配列は、お互いとの及び結合された螢光団との立体的妨害により、酵素にほとんど近づくことができない。プロテアーゼ結合部位（Ｕ形状の底部上に存在する）は、螢光団又はコンホメーション決定領域のいづれかにより比較的妨げられず、そしてそのため、プロテアーゼに容易に接近することができる。
プロテアーゼ結合部位及びコンホメーション決定領域
プロテアーゼ結合部位及びコンホメーション決定領域は、連続したアミノ酸配列（ペプチド）を形成する。プロテアーゼ結合部位は、特定のプロテアーゼにより認識され、そして切断されるアミノ酸配列である。種々のプロテアーゼが特定のアミノ酸に隣接するペプチド結合を切断することは良く知られている。従って、たとえば、トリプシンは、塩基性アミノ酸、たとえばアルギニン及びリジンに続くペプチド結合を切断し、そしてキモトリプシンは、大きな疎水性アミノ酸残基、たとえばトリプトファン、フェニルアラニン、チロシン及びロイシンに続くペプチド結合を切断する。セリンプロテアーゼは、小さな疎水性残基、たとえばアラニンに続くペプチド結合を切断する。
しかしながら、特定のプロテアーゼは、正しい隣接したアミノ酸を有するタンパク質におけるあらゆる結合を切断しないであろう。むしろ、プロテアーゼは、個々の特定のプロテアーゼのための認識ドメインとして作用する特定のアミノ酸配列に対して特異的である。
認識ドメインを含み、そしてそれ故に、プロテアーゼにより認識され、そして切断され得るいづれかのアミノ酸配列が、本発明の螢光発生プロテアーゼインジケーター組成物の“プロテアーゼ結合部位”のために適切である。既知のプロテアーゼ基質配列及びプロテアーゼのペプチドインヒビターは、それらが切断され、又はそれらが阻害する特定のプロテアーゼにより認識されるアミノ酸配列を有する。従って、既知の基質及びインヒビター配列は、プロテアーゼ認識領域への使用のために適切な基本的配列を提供する。本発明の組成物におけるプロテアーゼ結合ドメインとして使用するために適切な多くのプロテアーゼ基質及びインヒビター配列は表２に示されている。当業者は、これが完全な列挙ではなく、そして他のプロテアーゼ基質又はインヒビター配列が使用され得ることを認識するであろう。
プロテアーゼ結合部位を含むアミノ酸残基は、従来、特定のプロテアーゼにより加水分解されるペプチド結合に対して番号付けされている。従って、切断されたペプチド結合のアミノ側上の第１のアミノ酸残基は、Ｐ1として命名され、そして切断されたペプチド結合のカルボキシル側上の第１のアミノ酸残基はＰ1'として命名される。残基の番号は、加水分解されたペプチド結合から離れた距離ほど多くなる。従って、４つのアミノ酸プロテアーゼ結合領域は、Ｐ2−Ｐ1−Ｐ1'−Ｐ2'と称するアミノ酸を含み、そしてプロテアーゼは、Ｐ1とＰ1'との間の結合領域を切断する。
好ましい態様において、本発明の螢光発生プロテアーゼインジケーターのプロテアーゼ結合領域は、切断部位に対して対称であるように選択される。従って、たとえば、結合領域がIle-Pro-Met-Ser-Ile（たとえばα−１抗−トリプシン）であり、そして切断がMetとSerとの間で生じる場合、この配列に基づく４つのアミノ酸残基結合領域は、
0003771262.tif 000007
である。より長い配列から選択される結合ドメインの他の例は、表２に提供されている。プロテアーゼ結合ドメイン内に存在しない残るアミノ又はカルボキシル残基は、下記に説明されるように一定の制限を受けやすいコンホメーション決定領域の一部として残存することができる。従って、本発明の例においては、アミノ末端Ileは、Ｃ1コンホメーション決定領域中に組込まれ得る。
種々のアミノ酸置換が、結合特異性を高め、反応性側鎖を排除し、又は分子のコンホメーションエントロピーを減じる（自由度を低める）ために、プロテアーゼ結合ドメインを含んで成るアミノ酸に行なわれ得る。従って、たとえば、酸化できる硫黄を担持するメチオニン(Met)残基をノルロイシンにより置換することが時々所望される。従って、与えられる例においては、好ましいプロテアーゼ結合領域は、次の配列：
0003771262.tif 000008
を有するであろう。
コンホメーション決定領域
コンホメーション決定領域（Ｃ1及びＣ2）は、本発明の螢光発生プロテアーゼインジケーター分子のペプチド主鎖を固定し、そしてその中に曲げを導入する、プロテアーゼ切断領域のいづれかの端でのペプチド領域である。２種のコンホメーション決定領域及び比較的直線状のプロテアーゼ切断領域の組合せは、“Ｕ”形状の基部（中央）で切断部位を有する、おおよそＵ−形状の分子を生成する。用語Ｕ−形状とは、もちろん、おおよそであり、すなわち螢光団が近接した並置（たとえば約100Å以下）下で比較的固定して保持されることを意味する。
アミノ酸、たとえばプロリン(Pro)及びα−アミノ酪酸(Aib)の両者が、ペプチド分子中に曲げを導入し、そしてペプチド主鎖の固定性を高めるために選択される。Ｃ1及びＣ2ドメインは、Ｕ形状の“アーム”が固定され、そして結合された螢光団が約100Å以下の距離、分離してお互い隣接して位置するように選択される。ペプチド主鎖の必要な合成及び螢光団の配置を維持するためには、コンホメーション決定領域は、好ましくは４個の長さ又はそれ以下の長さのアミノ酸であり、又は他方では、約18個以上の長さのアミノ酸であり、そして安定したαヘリックスコンホメーション又はβ−プリーツシートを形成する。
好ましい態様において、本発明の螢光発生プロテアーゼインジケーターのペプチド主鎖は、トリペプチドＣ1領域、テトラペプチドＰ領域及び単一アミノ酸又はジペプチドＣ2領域を含むであろう。それらの化合物は、下記式：
0003771262.tif 000009
〔式中、Ｙは、
0003771262.tif 000010
又は
0003771262.tif 000011
のいづれかである〕により表わされ得る。それらの式において、ペプチド結合領域は−Ｐ2−Ｐ1−Ｐ1'−Ｐ2'−として示され、そしてコンホメーション決定領域Ｃ1及びＣ2のアミノ酸残基はそれぞれ−Ｃ15−Ｃ14−Ｃ13−及び−Ｃ23−Ｃ24−として示される。Ｃ2領域は、アミノ酸か又はジペプチドのいづれかであり得る。Ｃ2領域がジペプチドであろうと又はアミノ酸であろうと、Ｆ2螢光団及びＳ2スペーサーは、存在する場合、Ｃ2のカルボキシル末端残基に常に結合される。スペーサーがＣ2領域に存在する場合、それはαカルボキシル基にペプチド結合によりＣ2のカルボキシル末端残基を結合される。
上記で示されたように、コンホメーション決定領域は典型的には、分子中に曲げを導入し、そしてその剛性を高めるアミノ酸残基、たとえばプロリン(Pro)を含む。しかしながら、プロテアーゼ結合領域（Ｐ）の末端残基がそれら自体、曲げを創造する残基、たとえばプロリンである場合、その末端に結合されるＣ領域においてＰに接近した位置で曲げを創造する残基を配置することは必要でないことを当業者は理解するであろう。従って、コンホメーション決定領域は、上記のようにプロテアーゼ結合領域をまず決定し、コンホメーション決定領域に存在する“残りの”残基を決定し、そして必要なら、次のガイドラインに従ってそれらの残基を変性することによって企画される：
１．Ｐ2'部位がProでない場合、Ｃ2はジペプチド（式III）Pro−Cys，Aib-Cys，Pro-Lys、又はAib-Lysであり、そして逆に、Ｐ2'部位がProである場合、Ｃ2は単一のアミノ酸残基（式IV）Cys又はLysである。
２．Ｐ2部位がProでない場合、Ｃ1はAsp-C14-Pro，Asp-C14-Aib，Asp-Aib-Pro，Asp-Pro-C13，Asp-Aib-C13，Asp-Pro-Aib又はAsp-Aib-Aibから成るトリペプチドであり、そしてＰ2部位がPro残基である場合、Ｃ1はAsp-C14-C13又はAsp-C14-Aibから成るトリペプチドである。
３．Ｐ3（C13）残基がProである場合、Ｃ1はAsp-C14-Pro又はAsp-Aib-Proから成るトリペプチドである。
４．Ｐ4（C14）残基がProである場合、Ｃ1Asp-Pro-C13又はAsp-Pro-Aibから成るトリペプチドである。
５．Ｐ2及びC13が両者ともプロリンでない場合、Ｃ1はAsp-Pro-C13，Asp-Aib-C13，Asp-C14-Pro，Asp-C14-Aib，Asp-Pro-Aib又はAsp-Aib-Proから成るトリペプチドである。
上記のように、いづれかのメチオニン(Met)がノルロイシン(Nle)により置換され得る。Ｃ1、及びＣ2から成る多くの適切なペプチド主鎖が表２に提供される。
0003771262.tif 000012
0003771262.tif 000013
0003771262.tif 000014
１．好ましい態様において、配列の後に、Gly-TyrのＳ2スペーサーが続く。従って、たとえば、Ｃ24がLysである場合、Ｃ24−Ｓ2はLys-Gly-Tyrである。
“ドナー”及び“レセプター”螢光団
入射光線により励起された螢光団は光を吸収し、そして次に、異なった（長い）波長で光を再発光する。しかしながら、“レセプター”として知られる第２種類の分子の存在下で、いわゆるドナー螢光団により発光された光は、レセプターにより吸収され、それにより、ドナーの螢光シグナルを消光する。従って、螢光団／発光団に対立するものとして、２種の螢光団の使用は、ドナーの発光スペクトルとレセプターの励起スペクトルとの間でのオーバーラップの明確な評価を可能にする。これは、消光の最適化を可能にするペプチド主鎖の設計を促進する。これは、低濃度のプロテアーゼ活性の検出を促進する高い効率のドナー／レセプター対をもたらす。従って、螢光団／発色団の組合せが適切であるけれども、好ましい態様においては、本発明の螢光発生プロテアーゼインヒビターは２種の螢光団を含むであろう。
“ドナー”及び“レセプター”分子は典型的には、レセプター分子の吸収スペクトルが、ドナー分子の発光スペクトルと、できるだけ広くオーバーラップするように、調和した対として選択される。さらに、ドナー及びレセプター螢光団は好ましくは、ドナー分子の吸収及び発光スペクトルが可視範囲（400nm〜約700nm）に存在するように選択される。それにより、螢光団は、生物学的サンプルにおいて検出できるシグナルを提供し、従って、生物学的流体、組織ホモジネート、組織断片及び同様のものにおけるプロテアーゼ活性の検出を促進する。多くの螢光団の発光スペクトル、吸収スペクトル及び化学組成は、当業者に良く知られている（たとえば、Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals，R．P．Hauglond，ed.を参照のこと、これは引用により本明細書に組込まれる）。
好ましい螢光団対は、ローダミン誘導体を包含する。従って、たとえば５−カルボキシテトラメチルローダミン又は５−及び／又は６−カルボキシテトラメチルローダミンのスクシンイミジルエステル（Molecular Probes，Eugene，Oregon，USAから入手できるC211及びＣ1171）（式Ｖ）は、特に好ましいドナー分子であり：
0003771262.tif 000015
そしてローダミンＸアセトアミド（Molecular ProbesからのR492）（式VI）又は５−及び／又は６−カルボキシ−Ｘ−ローダミンのスクシンイミジルエステル（Molecular ProbesからのＣ1309）は特に好ましいレセプター分子である：
0003771262.tif 000016
それらの螢光団は、このドナー／レセプター対の両メンバーの励起及び発光が可視波長に存在し、分子が高い励起係数を有し、そして分子が溶液において高い螢光収率を有するので、特に好ましい。励起係数は発光団による特定波長での光吸収の測定であり、そして従って、シグナルを消光するその能力に関連し、ところが螢光収率は再発光された光に対する吸収された光の割合であり、そして螢光団の効率の測定値であり、そして従って、プロテアーゼインジケーターの感度に影響を及ぼす。
もちろん、最とも好ましいものではないが、紫外線範囲下で吸収し、そして発光する螢光団もまた、本発明のプロテアーゼインジケーターに使用され得る。螢光団の１つの特に好ましい紫外線吸収対は、ドナー分子として下記７−ヒドロキシ−４−メチルクマリン−３−酢酸（式VII）：
0003771262.tif 000017
及びレセプター分子として下記７−ジエチルアミノ−３−（（４’−ヨードアセチル）アミノ）フェニル）−４−メチルクマリン（式VIII）：
0003771262.tif 000018
である。それらの及び他の螢光団は、多くの製造業者、たとえばMolecular Probes(Eugene，Oregon，USA)から市販されている。
調和された吸収及び発光スペクトルを有する螢光団が本発明の実施下で必要とされないことは驚くべき発見である。事実、単一種の螢光団は、Ｆ1及びＦ2により支配される位置における本発明のポリペプチド主鎖に連結される場合、それ自体、消光することができる。さらに、この消光は、ペプチド主鎖が切断される場合、十分に開放される。
特定の理論に基づくものではないが、消光は、２種の螢光団の電子軌道が相互作用し、可逆的消光をもたらす、基底状態ダイマーの形成により達成されると思われる。それは、基底状態ダイマーを効果的に形成するために螢光団を十分に接近せしめる、本発明のペプチド主鎖の限定されたコンホメーションエントロピーである。
従って、好ましい態様において、本発明のプロテアーゼインジケーターは、単一種の螢光団のみを包含する。この態様においては、単一種の螢光団のみが使用されるので、発光又は吸収スペクトルを調和する必要性は存在しない。従って、広範囲の種類の螢光団が効果的に使用され得る。さらに、単一の螢光団の使用は、合成化学をひじょうに簡単にする。
螢光発生プロテアーゼインジケーターの調製
本発明の螢光発生プロテアーゼインジケーターは、まず、ペプチド主鎖、すなわちプロテアーゼ切断部位（Ｐ）、２種のコンホメーション決定領域（Ｃ1及びＣ2）、及び存在するなら、スペーサー（Ｓ1及びＳ2）を合成することによって好ましくは調製される。次に、螢光団がペプチドに化学的に接合される。螢光団は好ましくは、ペプチドに直接的に接合されるが、しかしながら、それらはまた、リンカーを通してもペプチドに結合される。最後に、螢光発生プロテアーゼインジケーターが固体支持体に結合される場合、次に、それは直接的に又はリンカーを通して、スペーサー（Ｓ1又はＳ2）を経て固体支持体に化学的に接合される。
ａ）ペプチド主鎖の調製
配列のＣ−末端アミノ酸が不溶性支持体に結合され、続いて配列における残るアミノ酸を連続的に付加する固相ペプチド合成は、本発明の化合物のペプチド主鎖を調製するための好ましい方法である。固相合成のための技法は、次の文献に記載されており：Barany and Merrifield，Solid−Phase Peptide Synthesis：pp．３〜284，The Peptides：Analysis，Synthesis，Biology，Vol．２：Special Methods in Peptide Synthesis，Part A.，Merrifield，et al，J．Am．Chem．Soc．85，2149〜2156(1963)、及びGross and Meienhofer，eds．Academic Press，N．Y.，1980及びStewart et al.，Solid Phase Peptide Synthesis，２nd ed．Pierce Chem．Co.，Rockford，III.(1984)；これらは引用により本明細書に組込まれる。固相合成は、FMOCまたはTBOC化学を用いて市販のペプチド合成機により最とも容易に達成される。螢光助剤プロテアーゼインジケーターのペプチド成分の化学合成は、例１及び２に詳細に記載されている。
特に好ましい態様においては、ペプチド合成は、Fmoc合成化学を用いて実施される。Asp，Ser，Thr及びTyrの側鎖が好ましくは、Ｓ−トリチル及びＳ−ｔ−ブチルチオを用いて保護され、そしてLys残基が好ましくは、リシン残基のためのｔ−Boc，Fmoc及び４−メチルトリチルを用いて保護される。適切に保護されたアミノ酸試薬は市販されている。複数の保護基の使用は、選択的なブロック解除及びいづれか特定の所望する側鎖への螢光団の結合を可能にする。従って、たとえば、ｔ−Boc保護解除は、ジクロロメタン中、TFAを用いて達成され、Fmoc保護解除はDMF又はＮ−メチルピロリドン中、20％（ｖ／ｖ）ピペリジンを用いて達成され、そして４−メチルトリチル保護解除は水中、１〜５％（ｖ／ｖ）TFA、又はDCM中、１％TFA又は５％トリイソプロピルシランを用いて達成される。Ｓ−ｔ−ブチルチオ保護解除は水性メルカプトエタノール（10％）を用いて達成され、ｔ−ブチル及びｔ−boc、及びＳ−トリチル補助解除は、TFA：フェノール：水：チオアニソール：エタンジチオール（85：５：５：2.5：2.5）を用いて達成され、そしてｔ−ブチル及びｔ−Boc保護解除はTFA：フェノール：水（95：５：５）を用いて達成される。詳細な合成、保護解除、及び螢光団結合法は、例１及び２に提供される。
他方、本発明の螢光発生プロテアーゼインジケーターのペプチド成分は、組換えDNA技法を用いても合成され得る。手短に言及すれば、所望するアミノ酸配列をコードするDNA分子が、Beaucage and Carruthers，Tetra．Letts．22：1859〜1862(1981)により記載される固相ホスホラミジット法、Matleucci、など．、J．Am．Chem．Soc.，103：3185(1981)（両者は引用により本明細書中に組込まれる）を包含する当業者に知られている種々の方法、又は当業者に知られている他の方法により化学的に合成される。好ましくは、DNAは、標準方法を用いての市販のDNA合成機に基づいて標準のβ−シアノエチルホスホラミジットを用いて合成され得る。
オリゴヌクレオチドは、必要なら、当業者に良く知られている技法により精製され得る。典型的な精製法は、ゲル電気泳動、アニオン交換クロマトグラフィー（たとえばMono−Ｑカラム、Pharmacia−LKB，Piscataway，New Jersey，USA）又は逆相高性能液体クロマトグラフィー（HPLC）を包含するが、但しこれらだけには限定されない。タンパク質及びペプチド精製の方法は、当業者に良く知られている。標準方法のレビューのためには、Methods in Enzymology，Volume 182：Guide to Protein Purification，M．Deutscher，ed．(1990)，619〜626ページ（これは、引用により本明細書に組込まれる）を参照のこと。
オリゴヌクレオチドは、相補的オリゴヌクレオチドによるアニーリング、又はDNAポリメラーゼによる重合により二本鎖DNAに転換され得る。次に、DNAがプロモーターの制御下でベクター中に挿入され、そして宿主細胞を形質転換するために使用され、その結果、細胞がコードされたペプチド配列を発現する。ペプチドのクローニング及び発現の方法は当業者に良く知られている。たとえば、Sambrook，et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(２nd Ed.，Vols．１−３，Cold Spring Harbor Laboratory(1989))，Methods in Enzymology，Vol．152：Guids to Molecular Cloning Technigues（Berger and Kimmel(eds.)，San Diego：Academic Press，Inc．(1987)）、又はCurrent Protocols in Molecular Biology，（Ausubel，et al．(eds.)，Greens Publishing and Wiley−Interscience，New York(1987)（これらは、引用により本明細書に組込まれる）を参照のこと。
ｂ）ペプチド主鎖への螢光団の連鎖
螢光団は、当業者に良く知られている多くの手段のいづれかによりペプチド主鎖に連結される。好ましい態様においては、螢光団は、螢光団上の反応部位からペプチド上の反応基、たとえば末端アミノ又はカルボキシル基に、又はアミノ酸側鎖上の反応性基、たとえばアミノ、ヒドロキシル、又はカルボキシル成分に直接的に連結される。多くの螢光団は通常、適切な反応部位を含む。他方、螢光団は、他の分子への連鎖のために反応性部位を付与するよう誘導体化され得る。第２分子への結合のために官能基により誘導体化された螢光団は、種々の製造業者から入手できる。誘導体化は、螢光団自体上の基の単純な置換によることができ、又はリンカーへの接合によることができる。種々のリンカーが当業者に良く知られており、そして下記に論ぜられる。
上記のように、好ましい態様においては、螢光団は、プロテアーゼインジケーターのペプチド主鎖に直接連結される。従って、たとえば、５’−カルボキシテトラメチルローダミン（Ｃ2211）螢光団は、式Ｖに示されるようにアミノ酸のαアミノ基を通してアルパラギン酸に連結され得る。ローダミンＸアセトアミド（R492）のヨードアセトアミド基は、式VIに示されるように、システインのスルフヒドリル基との反応により連結され得る。そのような連結を実施する手段は、当業者に良く知られており、そして１つのそのような連結の詳細が例１に提供される。
当業者は、ペプチドスペーサー（Ｓ1又はＳ2）が存在する場合（下記で論ぜられるように）、螢光団は好ましくは、スペーサー自体がそれぞれＣ1又はＣ2の末端アミノ及びカルボキシル基とペプチド連鎖を形成するにつれて、Ｃ1又はＣ2の末端アミノ酸の側鎖上の反応性基を通してコンホメーション決定領域に連結されることを理解するであろう。
ｃ）スペーサーペプチドの選択及び固体支持体への連鎖
本発明の螢光発生プロテアーゼインジケーターは、溶液で得られ、又は固体支持体に連結され得る。“固体支持体”とは、本発明の螢光発生プロテアーゼインジケーターを用いてのプロテアーゼ活性についてのアッセイのために使用される溶液に存在するいづれの成分にも溶解せず又はその成分と反応せず、そして螢光発生分子の結合のための官能基を提供するいづれかの固体材料を意味する。固体支持材料は当業者に良く知られており、そしてシリカ、調節された多孔性ガラス(CPG)、ポリスチレン、ポリスチレン／ラテックス、カルボキシル変性テフロン、デキストラン、誘導体化された多糖類、たとえばアミノ、カルボキシル又はスルフヒドリル基を担持する寒天、種々のプラスチック、たとえばポリエチレン、アクリル樹脂、及び同様のものを包含するが、但しこれらだけには限定されない。“半固体”支持体、たとえば細胞及びリポソームに見出されるような脂質膜もまた使用される。当業者は、固体支持体が、リンカーの結合又はペプチドの直接的な結合のための反応性部位を供給するために官能基（たとえばヒドロキシル、アミン、カルボキシル、エステル、及びスルフヒドリル）により誘導体化され得ることを理解するであろう。
螢光助剤プロテアーゼインジケーターは、螢光団を通して、又はインジケーターを含むペプチド結合を通して、直接的に固体支持体に連結され得る。ペプチド主鎖を通しての連鎖が、最とも好ましい。
ペプチド主鎖を通して固体支持体に連結することが所望される場合、そのペプチド主鎖は、追加のペプチドスペーサー（式ＩにおいてＳ1又はＳ2と命名されている）を含むことができる。そのスペーサーは、ペプチド主鎖のアミノ又はカルボキシル末端で存在し、そして約１〜約50個のアミノ酸、より好ましくは１〜約20個及び最とも好ましくは１〜約10個のアミノ酸の長さのものであり得る。特に好ましいスペーサーは、Asp-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Glu-Asp-Glu-Lys，Lys-Glu-Asp-Gly-Gly-Asp-Lys，Asp-Gly-Ser-Gly-Glu-Asp-Glu-Lys、及びLys-Glu-Asp-Glu-Gly-Ser-Gly-Asp-Lysを包含する。
ペプチドスペーサーのアミノ酸組成は、スペーサーが支持体から分子の活性成分を分離するように作用し、それにより所望しない相互作用を妨げる場合、臨界ではない。しかしながら、スペーサーのアミノ酸組成は、リンカー又は固体支持体自体が容易に結合される側鎖を有するアミノ酸（たとえばシステイン又はリシン）を供給するよう選択され得る。他方、リンカー又は固体支持体自体は、Ｓ1のアミノ末端又はＳ2のカルボキシル末端に結合され得る。
好ましい態様においては、ペプチドスペーサーは実際、リンカーにより固体支持体に連結される。用語“リンカー”とは、本明細書で用いられる場合、他の分子にペプチドを連結するために使用され得る分子（たとえば、固体支持体、螢光団、等）を意味する。リンカーは、ペプチドと共有結合を形成することができる第１反応部位及び固体支持体上の反応性基と共有結合を形成することができる第２反応部位を供給するホモ二官能性分子である。ペプチド（スペーサー）との共有結合は、末端カルボキシル又はアミノ基のいづれかを通してであり、又はアミノ酸側鎖上の反応性基による（たとえばシステインへのジスルフィド結合を通して）。
適切なリンカーは、当業者に良く知られており、そして直鎖又は枝分れ鎖の炭素リンカー、複素環式炭素リンカー又はペプチドリンカーを包含するが、但しこれらだけには限定されない。上記のように、リンカーは、それらの末端カルボキシル又はアミノ基を通して、又はそれらの反応性側鎖基を通してカルボキシル及びアミノ末端アミノ酸に連結され得る。
特に好ましいリンカーは、アミノ基、カルボキシル基、又はスルフヒドリルに対して共有結合を形成することができる。アミノ結合リンカーは、反応性基、たとえばカルボキシル基、イソシアネート、イソチオシアネート、エステル、ハロアルキル、及び同様のものを包含する。カルボキシル−結合リンカーは、反応性基、たとえば種々のアミン、ヒドロキシル及び同様のものを形成することができる。最後に、スルフヒドリル−／結合リンカーは、反応性基、たとえばスルフヒドリル基、アクリレート、イソチアシネート、イソシアネート及び同様のものを包含する。特に好ましいリンカーは、固体支持体上に見出されるスルフヒドリル基によりアミノ基（たとえばペプチドにおけるリシン残基上に見出されるアミノ基）を連結するために、又は固体支持体上に見出されるアミノ基によりスルフヒドリル基（たとえば、ペプチドのシステイン残基上に見出される）を連結するためにスルホMBO（ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル）を包含する。他の特に好ましいリンカーは、EDC（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド）及びビス−（スルホスクシンイミジルスベレート）を包含する。他の適切なリンカーは、当業者に良く知られている。
本発明の螢光発生化合物は、ドナー螢光団が、分子の切断の後、固体支持体上に保持されるように、又はドナー蛍光団が、切断の後、溶液中に入るように、Ｓ1又はＳ2スペーサーのいづれかを通して固体支持体に連結され得る。前者の場合、次に支持体がプロテアーゼ活性を検出するために螢光についてアッセイされ、そして後者の場合、液体がプロテアーゼ活性を検出するために螢光についてアッセイされる。
プロテアーゼ活性の検出
本発明はまた、種々の情況においてプロテアーゼ活性を検出するために螢光発生プロテアーゼインジケーターを用いるための方法も提供する。従って、１つの態様においては、本発明は、実験又は産業目的のために使用されるプロテアーゼの原液のプロテアーゼ活性を確証し、又は定量化するために螢光発生インジケーターを用いる方法を提供する。使用する前、プロテアーゼ原液のプロテアーゼ活性の確証は一般的に、プロテアーゼはしばしば、時間の経過と共に活性を失ない（たとえば、自己加水分解を通して）又はチモーゲン前駆体から活性化される場合、種々の程度の活性化を示すので推薦される。
原液のプロテアーゼ活性についてのアッセイは、本発明の螢光発生プロテアーゼインジケーターに一定量の原液を添加し、そして螢光の続く上昇を測定することを単に必要とする。原液及び螢光発生インジケーターはまた結合され得、そしてプロテアーゼの活性を最適化する“消化緩衝液”においてアッセイされ得る。プロテアーゼ活性をアッセイするのに適切な緩衝液は当業者に良く知られている。一般的に、そのpHが特定のプロテアーゼの最適pHに対応する緩衝液が選択されるであろう。たとえば、エラスターゼ活性をアッセイするのに特に適切な緩衝液は、50mMのリン酸ナトリウム、１mMのEDTA（pH8.9）から成る。その測定は、螢光計、及び螢光団のための“励起”光源を提供し、そして次に、特定の波長で発光される光を測定する装置により最とも容易に行なわれる。プロテアーゼを欠く対照のインジケーター溶液との比較は、プロテアーゼ活性の測定を提供する。その活性レベルは、既知の活性のプロテアーゼ溶液により生成される螢光の変化速度が決定される、プロテアーゼ／インジケーターの組合せのための標準曲線を生成することによって正確に定量化され得る。
螢光発生化合物の検出は好ましくは、螢光計を用いて達成されるけれども、検出は当業者に良く知られている種々の他の方法により達成され得る。従って、たとえば、本発明の螢光団は可視波長を発光するので、検出は光源による励起に応答しての螢光の可視検査により単純に行なわれ得る。検出はまた、ディジタイザー又は他の像獲得システムに連結されたビデオカメラを用いて、像分析システムにより行なわれ得る。検出はまた、螢光顕微鏡下でフィルターを通しての可視化により行なわれ得る。その顕微鏡は、オペレーターにより可視化されるシグナルを提供する。しかしながら、シグナルは写真フィルム上に又はビデオ分析システムを用いて記録され得る。シグナルはまた、像分析システム又は単なる光度計のいづれかを用いて即時に単純に定量化され得る。
従って、たとえば、サンプルのプロテアーゼ活性についての基本的アッセイは、緩衝液にサンプルを懸濁し、又は溶解し（アッセイされる特定のプロテアーゼの最適pHで）、本発明の螢光発生プロテアーゼインジケーターの１つを緩衝液に添加し、そして分光光度計を用いて螢光の得られる変化をモニターすることを包含するであろう。分光光度計は、ドナー螢光団の励起波長でドナー螢光団を励起し、そしてドナー螢光団の発光波長でその得られる螢光を検出するよう設定されるであろう。
もう１つの態様において、本発明のプロテアーゼ活性インジケーターは、生物学的サンプルにおけるプロテアーゼ活性の検出のために使用され得る。従って、好ましい態様においては、本発明は、単離された生物学的サンプル、たとえば唾液、血液、血液細胞、腫瘍生検及び同様のもの、又は培養物中の細胞又は組織、又はその断片が包埋されておらず、そして固定されていない断片におけるプロテアーゼ活性を検出するための方法を提供する。
ａ）単離された生物学的サンプルのエキソビボアッセイ
１の態様において、本発明は単離された生物学的サンプルにおけるプロテアーゼ活性の検出方法を提供する。これは、本発明の螢光助剤プロテアーゼインジケーターとサンプルとを単純に接触せしめ、そしてインジケーターの螢光の変化を時間と共にモニターすることによって決定され得る。サンプルは、上記のように“消化緩衝液”に懸濁され得る。サンプルはまた、分析の前、たとえば遠心分離により細胞残骸を除去され得る。
螢光助剤プロテアーゼインジケーターが固体支持体に結合される場合、アッセイは、サンプル溶液にインジケーターを担持する固体支持体を接触せしめることを包含する。インジケーターがドナー螢光団を担持する分子側により固体支持体に連結される場合、そのインジケーターの消化に起因する支持体の螢光が上記手段のいづれかにより時間の経過と共にモニターされるであろう。逆に言えば、レセプター分子螢光団が固体支持体に結合される場合、試験溶液が固体支持体上に通され、そして次に、試験溶液のその得られる発光（切断された螢光団による）が測定される。この後者のアプローチは、高い処理量の自動アッセイのために特に適切である。
ｂ）組織学的断片の現場アッセイ
もう１つの態様においては、本発明は組織学的断片における現場プロテアーゼ活性を検出するための方法を提供する。組織におけるプロテアーゼ活性を検出するこの方法は従来技術の方法（たとえば、特異的染色、抗体ラベル、等）よりも実質的な利点を提供する。なぜならば、単純なラベリングアプローチとは異なって、プロテアーゼインジケーターを用いての現場アッセイは、プロテアーゼの単純な存在又は不在よりもむしろ実際の活性を示すからである。プロテアーゼは、しばしば、プロテアーゼラベルを結合することができるそれらの不活性前駆体（チモーゲン）形で組織に存在する。従って、従来のラベリングアプローチは、組織のプロテアーゼ活性と共に生理学的状態に関しての情報を提供しない。
現場アッセイ法は一般的に、組織断片（好ましくは凍結された断片）を供給し、その断片と本発明の螢光発生プロテアーゼインジケーターの１つとを接触せしめ、そして得られる螢光を可視化することを含んで成る。可視化は好ましくは、螢光顕微鏡を用いて行なわれる。その螢光顕微鏡は“ドナー”螢光団の螢光を誘発するために“励起”光源を供給する。顕微鏡は典型的には、得られる螢光の検出を最適化するためにフィルターを備え付けられている。従って、たとえば、例１に記載される螢光助剤プロテアーゼインジケーターに関して、Nikon顕微鏡のための典型的なフィルターキューブは、励起フィルター（λ＝550±12nm）、二色ミラー（λ＝580nm）及び干渉−発光フィルター（λ＝580±10nm）を含むであろう。上記のように、顕微鏡は、カメラ、光測計又は像獲得システムを備え付けられ得る。
断片は好ましくは、固定化又は包埋がサンプル中のプロテアーゼ活性を破壊するので凍結断片として切断される。
螢光発生インジケーターは、多くの手段で断片に導入され得る。たとえば、螢光助剤プロテアーゼインジケーターは、組織断片に適用される、上記のような緩衝溶液に供給され得る。他方、螢光発生プロテアーゼインジケーターは、半固体媒体、たとえば組織サンプル上に広げられるゲル又は寒天として供給され得る。ゲルは、プロテアーゼ活性に応答してシグナルを提供しながら、サンプル中の湿気の保持を助ける。螢光発生プロテアーゼインジケーターはまた、ウェスターンブロットの開発に類似する方法に使用され得るポリマー、たとえばプラスチックフィルムに接合されて供給され得る。プラスチックフィルムはスライド上の組織サンプル上に配置され、そして切断されたインジケーター分子に起因する螢光が顕微鏡下でサンプル組織に見られる。
典型的には、組織サンプルは、内因性プロテアーゼが螢光発生プロテアーゼインジケーターを切断する時間インキュベートされるべきである。インキュベーション時間は、37℃までの温度（37℃も含む）で約10〜60分の範囲であろう。
ｃ）培養物における細胞の現場アッセイ
さらにもう１つの態様において、本発明は培養物における細胞の現場プロテアーゼ活性を検出する方法を提供する。培養された細胞は、チャンバースライド上で又は懸濁液中で増殖され、そして次に、細胞遠心分離により組織学的スライドに移される。スライドはリン酸緩衝溶液により洗浄され、そして螢光発生プロテアーゼインジケーターを含む溶液又は半固体ポリマーにより被覆される。スライドが、内因性プロテアーゼがプロテアーゼインジケーターを切断するのに必要な時間、37℃でインキュベートされる。次に、スライドは、上記のような適切なフィルターを備え付けられた螢光顕微鏡下で試験される。
プロテアーゼ活性検出キット
本発明はまた、サンプル中のプロテアーゼ活性の検出のためのキットを提供する。キットは本発明の螢光発生プロテアーゼインジケーターを含む１又は複数の容器を含んで成る。インジケーターは、溶液に供給され、又は固体支持体に結合され得る。従って、キットは、インジケーター溶液又はインジケーター“計量棒”、吸取紙、培養培地及び同様のものを含むことができる。キットはまた、自動プロテアーゼ活性検出器への使用のためのインジケーターカートリッジ（ここでは、螢光発生インジケーターが“レセプター”螢光団側により固体支持体に結合されている）も含むことができる。
キットはさらに、方法を教授し、そしてキットの成分の使用を記載する取扱説明書を含むことができる。さらに、キットはまた、他の試薬、緩衝液、種々の濃度のプロテアーゼインヒビター、原液プロテアーゼ（標準曲線、等の生成のための）、培養培地、使い捨てキュベット及び同様のものを、本発明の螢光発生プロテアーゼインジケーターを用いてのプロテアーゼ活性の検出を助けるために包含する。
例
本発明は次の例により例示される。それらの例は例示目的のためであって、本発明を制限するものではない。
例１
プロテアーゼ活性の検出のための螢光発生分子の合成
ａ）ペプチド主鎖の合成
アミノ酸配列Asp-Ala-Ile-Pro-Nle-Ser-Ile-Pro-Cys（ここでＣ1はAsp-Ala-Ileであり、ＰはPro-Nle-Ser-Ileであり、そしてＣ2はPro-Cysである）及びAsp-Ala-Ile-Pro-Met-Ser-Ile-Pro-Cys（ここでＣ1はAsp-Ala-Ileであり、ＰはPro-Met-Ser-Ileであり、そしてＣ1はPro-Cysである）を、下記表３に与えられるカップリングサイクルのための手段を用い、ｔ−Boc  Cys-Pam樹脂及びｔ−Boc化学を用いて手動的に合成した。合成されたペプチドを、４℃の温度で無水条件下で60分間、塩酸による処理により保護解除した。
0003771262.tif 000019
粗製のHF保護解除され、そして分解された後のペプチドを、分離用Ｃ18カラム（YMC．Inc.，Charlestown，North Carolina，USA）を用いて逆相HPLCにより精製した。使用された溶媒システムは、水、及びアセトニトリル含有0.1％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸(TFA)であった。HPLCを、10ml／分の流速で次のグラジエントを用いて実施した。
0003771262.tif 000020
メチオニン含有ペプチドの精製は、メチオニンオキシドをメチオニンに還元するためにペプチドを還元条件、たとえばジチオトレイトール(DTT)及び加熱にゆだねることを必要とした。この還元処理は、１mMのDTT（pH7.5）を含む150mMのリン酸ナトリウム緩衝液にペプチドを60〜80℃で30分間、溶解することによって実施された。還元はまた、0.03ＮのHClによる弱酸性pH下で実施されたが、しかしより長い加熱時間を必要とした。続くHPLC精製されたメチオニン含有ペプチドは、水溶液又は凍結形での存在に基づいて酸化することが見出された。酸化されたペプチドは、上記還元条件をくり返すことにより還元性になることが見出された。
ｂ）螢光団分子によるペプチド主鎖の誘導体化
ペプチドを、ドナー及びレセプター螢光団により連続的に誘導体化した。特に、Molecular Probes，Inc．Eugene，Oregon，USAから入手できるドナー螢光団（５’−カルボキシテトラメチルローダミン（Ｃ2211））をまず、ペプチドのアミノ末端に共有結合した。３：１のモル比でのペプチド：プローブを、最少量、通常20〜60μｌの溶媒NMP（Ｎ−メチルピロリドン）に溶解した。１モル当量のDIEA（ジイソプロピルエチルアミン）をまた、反応混合物に添加した。次に、その反応物を37℃で、12時間〜３日間インキュベートした。２日後、追加の１モル当量の色素分子を時々、添加した。誘導体化は、３日までにほぼ最大収率に達成した。単一のＣ2211螢光団を担持するペプチドを、下記のようにしてHPLC精製した。
第２（レセプター）螢光団（ローダミンＸアセトアミド（R492））を、螢光団のヨードアセトアミド基と末端システインのスルフヒドリル基との間の連鎖によりペプチドのカルボキシルシステインに結合した。この結合は、最初の螢光団について記載されているようにして達成された。
次に、完全な螢光発生プロテアーゼインジケーターを、１ml／分で表４に示されるグラジエントを用いて、Waters Associates Inc．（Milford，Massachusetts，USA）からの分析用逆相Ｃ3カラム（２mlの空隙率）を用いてのHPLCにより精製した。
0003771262.tif 000021
螢光団の結合においてのアミノ及びスルフヒドリル基の両者の遅い反応性は、ペプチドの反応基への接近を立体的に妨げたペプチド主鎖の折たたまれた構造の機能であると思われた。不適切な線状ペプチドを用いての対照実験は、相当に早い結合を示した。折たたまれた構造体はまた、例２及び３に報告される結果により支持される。ペプチドのコンピューターエネルギー最少化モデルはまた、開放された延長構造体よりもむしろ折たたまれた構造体を想定するためのペプチドについての可能な選択を示した。これは、２種のプロリン残基を含むコンホメーション決定領域の存在のためである。
例２
プロテアーゼ活性インジケーターの他の合成
ａ．Fmoc−保護されたペプチド主鎖の合成
表６に列挙されるアミノ酸配列を、表７に与えられるカップリングサイクルについての手段を用いて、Fmoc化学及び２−クロロトリチルクロリド樹脂を利用して手動的に合成した。
0003771262.tif 000022
合成されたペプチドを、室温で30分間、緩酸処理（２：７：１のｖ／ｖ比での酢酸：ジクロロメタン：トリフルオロエタノール）により２−クロロトリチルクロリド樹脂から切断した。このペプチド樹脂切断溶液10mlアリコートを、乾燥されたペプチド樹脂0.1ｇに添加した。次の側鎖保護基を合成に使用した：Asp，Ser，Thr、及びTyr残基のためのｔ−ブチル、Cys残基のためのＳ−トリチル及びＳ−ｔ−ブチルチオ、及びリシン残基のためのｔ−Boc，Fmoc及び４−メチルトリチル。
側鎖保護基、及び合成されたペプチドのαアミノ基上のFmoc基を、この緩酸ペプチド樹脂切断試薬により切断されなかった。保護されたペプチド含有溶液を凍結乾燥せしめた。その凍結乾燥された保護ペプチドを、ｔ−Boc保護解除のためにジクロロメタン中、30％（ｖ／ｖ）TFA，Fmoc保護解除のためにDMF又はＮ−メチルピロリドン中、20％（ｖ／ｖ）ピリジン、４−メチルトリチル保護解除のために水中、１〜５％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸又はDCM中、１％TFA／５％トリイソプロピルシラン、Ｓ−ｔ−ブチルチオ保護解除のために水性メルカプトエタノール（10％）、ｔ−ブチル、ｔ−Boc及びＳ−トリチル保護基解除のためにTFA：フェノール：水：チアニゾール：エタンジチオール＝85：５：５：2.5：2.5溶液、及びｔ−ブチル及びｔ−Boc及びＳ−トリチルのためにTFA：フェノール：水＝90：５：５溶液によりさらに処理した。
完全に又は部分的に側鎖保護解除されたペプチドを、個々の溶媒に0.075％（ｖ／ｖ）TFAを含む水／アセトニトリルグラジエントによりＣ18カラムを用いて逆相HPLCにより精製した。
ｂ．螢光団による、保護されたペプチド主鎖の誘導体化
十分に精製された保護ペプチドを、Cys又はLys残基の側鎖の選択的保護解除のために適切な試薬によりさらに処理した。リシンのエプシロン（ε）アミノ基保護のために、３種の異なった保護基、すなわちｔ−Boc，Fmoc、及び４−メチルトリチル基の使用は、選択的保護解除、及び従って、特定のリシン残基の選択的誘導体化を可能にした。
たとえば、保護されたペプチド約１mgを、最少量のＮ−メチルピロリドンに溶解した。スクシンイミジルエステル反応性官能基により誘導体化された適切な螢光団を、ペプチド上の反応性螢光団の1.2〜２倍モル過剰でのペプチド溶液に添加した。10倍モル過剰のジイソプロピルエチルアミン（DIEA）をその反応混合物に添加した。その反応を、室温で２〜４時間、進行せしめた。誘導体化されたペプチドを、Ｃ18又はＣ４カラム及び0.075％（ｖ／ｖ）TFA−含有水／アセトニトリル溶媒システムを用いて逆相HPLCにより精製した。
最初の螢光団によるペプチドの誘導体化は、少なくとも１つのひじょうに疎水性の基、たとえばFmocの存在により促進された。螢光団汚染物、及び誘導体化反応として蓄積する反応副生成物及び分解生成物からの誘導体化されたペプチドの溶離（たとえば分割）を可能されるペプチド上のそのような疎水性基の存在が、進行を可能にされる。
次に、Fmoc基の保護解除は、１つのアミノ基又はスルフヒドリル基が所望する螢光団により誘導体化された後に実施された。アミノ基接合のために使用される螢光団は、Ｃ1171，５−（及び６−）カルボキシテトラメチルローダミンスクシンイミジルエステル、Ｃ1309，５−（及び６−）カルボキシ−Ｘ−ローダミンスクシンイミジルエステル及びフルオロセインイソチアシアネートであった。保護解除の後、第２蛍光団を、最初の付加法と同じ態様で添加した。
0003771262.tif 000023
ｃ．誘導体化されたペプチドの分子量特徴付け
保護されたペプチドの誘導体化の間又はその後、強酸保護解除段階が時々、種々のアミノ酸側鎖から残るｔ−ブチル基を除去するために使用されるので、芳香族アミノ酸又は螢光団が化学的に変性されている可能性が存在した。従って、誘導体化され、そして精製されたペプチドの分子量を決定した。
分子量は、フライト質量分光計、すなわちKratos AnalyticalからのKompact MADLＩのマトリックス助力のレーザー脱着時間を用いて測定された。その質量分光計を、Leucine−Enkaphelin（556.6amu），Bradykinin（1061.2amu）及びMellitin（2847.5amu）により検量した。使用されるサンプルマトリックスは、α−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸であった。サンプルを標的に適用し、そしてエタノール溶液中、0.1％TFA  １mlをその標的上に添加し、そして次に、乾燥せしめた。50回のレーザーショットからの累積質量スペクトルデータを収集し、そして個々のサンプルについての、親質量ピーク＋１に対応するピークを決定した。その結果は表８に要約されている。
計算された及び実験的に決定された質量値間の良好な一致は、最終精製された螢光団−接合のペプチドにおけるいづれの副反応生成物の不在を示す。
0003771262.tif 000024
例３
螢光発生プロテアーゼインジケーターは、消化される場合、強いシグナルを供給する
本発明の螢光発生プロテアーゼインジケーターがプロテアーゼにより容易に消化されることを示すために、切断の程度を、プロテアーゼの存在下でインジケーター切断生成物の出現についてアッセイすることによって決定した。式F1-Asp-Ala-Ile-Pro-Nle-Ser-Ile-Pro-Cys-F2（ここでＦ1はαアミノ基を通してアスパラギン酸に連結されるドナー螢光団（５’−カルボキシテトラメチルローダミン（Ｃ2211））であり、そしてＦ2はシステインのスルフヒドリル基を通して連結されるレセプター螢光団（ローダミンＸアセトアミド（R492））である）を有するプロテアーゼインジケーター約１μｇを、50mMのリン酸ナトリウム、１mMのEDTA（pH8.9）から成る緩衝液に溶解した。この溶液に、１単位のエラスターゼを添加した。その溶液を、エラスターゼの添加の前及び添加の約30分後にHPLCにより分析した。消化は37℃で行なわれた。HPLCにより分離された成分を、Ｃ2211螢光団及びR492螢光団の両者の検出を可能にする550nmの波長で及びR492螢光団の検出を可能にする580nmの波長でモニターした。
結果は、プロテアーゼエラスターゼの添加の前及び添加の後の螢光発生プロテアーゼインジケーター溶液のHPLCプロフィールを示す図１に示される。図１（ａ）は、損なわれていない螢光発生プロテアーゼインヒビターを表わす単一のピークを示す、エラスターゼの添加の前のHPLCを示す。エラスターゼの添加後（図１（ｂ）及び１（ｃ））、螢光発生プロテアーゼインジケーターの完全な消化を示す後期溶離の単一のピーク（図１（ａ））の痕跡は存在しなかった。さらに、図１（ｂ）及び１（ｃ）における２つの優先的なピークは、消化が単一の部位で主に生じたことを示唆する。ペプチド配列内の他の部位での低い程の消化を示すいくつかの小さなピークが存在するが、しかしながら、わずか２つの消化ピークの著しい優先は、それらの第２部位がエラスターゼに容易に接近できなかったことを示す。
エラスターゼプロテアーゼの添加後の螢光発生プロテアーゼインジケーターの発光スペクトルの変化を、励起及び発光側の両者上で4nmで設定されたスリット幅を伴ってSLMスペクトロ螢光計モデル48000を用いてモニターした。すべての測定は、37℃で実施された。
図２におけるスペクトルは、エラスターゼの添加の前（ａ）及び添加の後（ｂ）での螢光発生プロテアーゼインジケーターの発光を示し、そしてエラスターゼの添加の後、インジケータードナー螢光団の発光強度の時間依存性上昇を図３にプロットする。螢光発生プロテアーゼインヒビターは、エラスターゼプロテアーゼによる処理の後、589nmでの螢光の10倍以上の上昇を示し（図２（ａ）が図２（ｂ）に比較された）、そして螢光の５倍以上の上昇がプロテアーゼへの暴露の始めの1000秒以内で生じた。処理されたインジケーターと処理されていないインジケーターとの間の強さの変化は、それらが特定のスリット幅を通して統合されるシグナルを表わすので、ある程度、使用されるスリット幅の機能である。従って、より広いスリット幅（たとえば８又は16nmのスリット）が使用される場合、さらに高いシグナルが消化に応答して提供されるであろう。
例４
螢光シグナルは、分子内エネルギーの消光解除によるものであった
プロテアーゼ処理の後に観察される螢光の上昇が分子内エネルギーの消光解除によるものであることを示すために、螢光発生プロテアーゼインジケーターのエラスターゼ消化により生成されるシグナルを、Ｆ1(Ｃ2211)又はＦ2(R492)のいづれかに結合される同じペプチド主鎖のエラスターゼ処理により生成されるシグナルに比較した。等濃度の二重螢光団分子及び２種の単一螢光団分子への１単位のエラスターゼの添加の後のドナー螢光団の螢光強度の変化を調べた。
その結果は図４に示される。二重螢光団分子は、初期において、ほぼ完全な消光を示し、続いて、エラスターゼの添加の約30分後、一定値に達する、エラスターゼの添加の後での螢光の劇的な上昇を示した（図４（ａ））。対照的に、２種の単一螢光団分子は、実質的に初期消光を示さず、そしてエラスターゼの添加後、螢光の有意な変化も示さなかった。実際、その螢光レベルは、十分に消化された二重螢光団インジケーター分子の螢光レベルに相当した（図４（ｂ））。
それらの結果は、螢光発生プロテアーゼインジケーターの螢光強度の上昇が、ドナー螢光団からレセプター螢光団に分子内で移行される共鳴エネルギーの中断によるものであり、そして螢光団とペプチド主鎖との間の相互作用ではないことを示唆する。これは、大きなペプチド又は疎水性ペプチドへの結合に基づいて、多くの疎水性螢光団の螢光が消光されるので、有意である。
例５
特定の理論に基づくものではないが、本発明の螢光発生プロテアーゼインジケーターは、それらの折りたたまれた構造により、より特定にはそれらの比較的剛性のＵ−形状コンホメーションにより、高い程度のプロテアーゼ特異性を達成すると思われる。その分子から得られる螢光は、２種の螢光団の平均隔離距離に影響を及ぼす。従って、プロテアーゼインジケーターが比較的折たたまれていないか又は柔軟な状態で存在する場合、折たたまれていない状態（変性）を引き起こす傾向がある条件は、プロテアーゼの不在下で分子の螢光に対する効果をほとんど又はまったく有さないことが予測された。逆に言えば、分子が比較的剛性である場合、螢光団の平均隔離距離の上昇が予測され、それにより消光効果が低められることが予測されるので、変性条件は、螢光シグナルを高めることを予測されるであろう。
従って、プロテアーゼの不在下での螢光発生プロテアーゼインジケーターの螢光に対する変性条件の効果を決定した。最初に、温度の関数としての、例１のインジケーターの螢光の変化を測定した。相対的な螢光強度（ドナー螢光団の）は、25℃での約0.6の値（相対的螢光単位（RU））から50〜55℃での約1.2RU値にほぼ直線的に上昇し、そしてその後、プラトーに達した。
同様に、カオトロピック試薬（２Ｍ又は８Ｍのウレア）により変性される場合、螢光強度は、分子が変性されるにつれて、時間の経過と共にプラトーに上昇する。
それらのデータは、螢光発生プロテアーゼインジケーターが通常、エネルギー最少化問題解決法に基づくモデルにより予測されるように、コンホメーション決定領域により創造される安定した折たたまれたコンホメーションで存在することを示す。プラトーの螢光レベルは、十分に変性されたペプチド主鎖によりまだ連結されている螢光団の残る消光を示す。延長された（変性された）ペプチドの消化は、螢光団がお互いさらに遠くの方に移動することができるので、螢光の２倍以上の上昇をもたらす。
例６
１つの螢光団により二重ラベルされたペプチドの消光及び開放
１つの螢光団により二重ラベルされた本発明のペプチド主鎖が、螢光消光をまだ達成し、従って共鳴エネルギー移行の他に、他の機構を通しての消光を示すことは、本発明の驚くべき発見である。
基底状態の二量体化及び衝突性(collisional)消光が全体の観察される消光に寄与することを評価するために、表９に列挙される一連の二重ラベルされたペプチドを合成した。
個々の色素により単独でラベルされたNorFesペプチドと共に色素の吸収スペクトルを比較する他に、切断の前及び後で取られた発光スペクトルが、共鳴エネルギー移行(RET)以外の手段により、消光の％及び螢光シグナル消光の存在を決定するために比較された。
螢光団は、アスパラギン酸残基（Ｄ）のα−アミノ基を通してアミノ末端に及びリシン（Ｋ）のε−アミノ基に連結された。ラベリングは、Ｃ1171又はＣ1309に連結されるスクシンイミジル基の置換により行なわれた。NorFES−KGYと称するペプチドの構造は次の通りである：
0003771262.tif 000025
吸光分光計から決定されるように、フルオレセイン−NorFES−フルオレセインを除く、すべての二重ラベルされたペプチドは、いわゆる基底状態のダイマーの存在を示した。これは、より短い波長への吸光最大値の移行、及び酵素消化された、二重ラベルされたサンプルについてのスペクトルに比較される場合、吸収スペクトルの形状の変化により示された。エラスターゼによる切断に基づいて、基底状態のダイマーを破壊し、そしてその得られるスペクトルは同濃度のそれぞれの単独でラベルされたペプチドを含む溶液と同じであった。
特定の理論に基づくものではないが、本発明に従って企画され、そして合成された化合物に観察される基底状態のダイマー形成は、ペプチド主鎖のＵ形状コンホメーションが螢光団をきわめて接近した状態にし、従って、基底状態二量体化を通して逆消光をもたらす２種の螢光団の電子軌道のオーバーラップを可能にすることを示すと思われる。本発明のポリペプチドが、これまで観察されるよりも有意に低い色素濃度で基底状態のダイマーの形成を可能にしたことは驚くべき発見であった。たとえば、溶液における遊離フルオロセイン色素の基底状態二量体化は、0.74Ｍ以上の高い濃度でのみ観察され、溶液における遊離エオシン色素の基底状態二量体化は、2.8×10-2Ｍ以上の高い濃度でのみ観察され（Forster and Konig，Zeitschrift fur Electrochemie，61：344（1957）を参照のこと）、そして溶液におけるローダミンＢ色素の基底状態二量体化は、６×10-4Ｍ以上の濃度でのみ観察された（Arbeloa and Ojeda，Chemical Physics Letters，87：556(1982)を参照のこと）。対照的に、本発明においては、その効果は、4.0×10-7Ｍで又は報告された値よりも約100倍近い濃度で観察された。
本発明に従って合成された化合物についての基底状態ダイマーの観察は、表９に列挙されるそれらの化合物と同じ螢光団を有する二重ラベルされたペプチドについての有意なレベルの螢光消光を予測した。実際、この予測は確証された。すなわち、Ｃ1171−NorFES−KGY−Ｃ1171、すなわちホモ二重ラベルされたペプチドとＣ1171−NorFES−KGY−Ｃ1309との比較は、消光の程度がヘテロ−対ホモ−においてわずかに高いことを示す（94％対90％）。しかしながら、フルオロセイン誘導体はわずか55％の消光を示した。％螢光消光（％Ｑ）についての記号Ｉo及びＩcは、損なわれていないラベルされたペプチド及び酵素消化されたラベルされたペプチド溶液についての螢光強度を言及する。
0003771262.tif 000026
基質配列は１つのアミノ酸残基により拡張され、そして螢光団は、観察される消光の量の主な心配を伴わないでリシン残基の側鎖上にエピシロンアミノ基を通して結合され得た。特に、この付加（Ｋ−NorFES−KGYと称するペプチド）は、ヘテロ−及びホモ−二重ラベルされたペプチドの両者について、切断率のわずかな上昇及び％消光のひじょうにわずかな上昇をもたらした（Ｋ−NorFES−KGYペプチドにおいては、Ｎ−末端ラベリングは、α−アミノ末端よりもむしろリシンのエプシロンアミノ基を通してであった）。
エラスターゼによるそれらの基質の切断率をまた、シグナルが最大値の１／２である、プロテアーゼの添加後の時間を記録することによって測定した（表９を参照のこと）。３種のホモ−二重ラベルされたペプチド、すなわちＣ1171；Ｃ1309の２種の分子及びフルオレセイン（F1）によりラベルされたNorFES−KGYの比較は、次のような切断率の順序を示す：F1−NorFES−KGY−F1＞Ｃ1171−NorFES−KGY−Ｃ1171＞Ｃ1309−NorFES−KGY−Ｃ1309。
例７
ホモ−二重ラベルされたプロテアーゼインジケーターの使用
本発明のプロテアーゼインジケーターのインビトロ効能を示すために、表皮癌細胞系A431の細胞を、５％ウシ胎児血清(FCS)を含むダルベッコ最少必須培地(DME)を含むPermanox細胞培養チャンバースライド(Nunc，Inc.，Naperville，Illinois，USA)において不完全集密性まで増殖した。培地の除去の後、70％エタノールを含む溶液200μｌを、個々のチャンバーに添加し、そしてインキュベーションを２分間実施した。次に、エタノール性媒体を除去し、そして単層培養物をDME（FCSを含まない）により２度洗浄した。
次に、１×10-7Ｍの濃度でＣ1171−NorFES−Ｃ1171を含むDME溶液を、前記単層培養物と共に10分間インキュベートした。次に細胞を、ローダミンフィルターキューブを用いてNikon螢光顕微鏡により螢光について試験した。（２種の異なった螢光団によりラベルされたペプチド〔ヘテロ−二重ラベルされた〕に比較して単一の螢光団によりホモ−二重ラベルされたペプチドを用いての利点は、ホモ−二重ラベルされたペプチドを用いての螢光顕微鏡は、二色鏡の発光側上にカットオフフィルター〔すなわち、定義された波長以上のすべての光を伝達するフィルター〕を単に必要として、ところが、ヘテロ−二重ラベルされたペプチドを用いての螢光顕微鏡は好ましくは、干渉フィルター〔すなわち、定義された波長範囲（Ｘ±Ｙnm）における光を伝達するフィルター〕を用いることである）。
個々の細胞を、その全細胞を満たす拡散レッド螢光（エラスターゼにより切断されるプロテアーゼインジケーターにより生成される）により明確に定義した。集密性集団の縁での細胞に関して、その集団の黒い境界部は、細胞の細胞質におけるレッド螢光とは明確に異なっており、これは、その螢光がバックグラウンド螢光又は媒体によるプロテアーゼインジケーターの切断によらなかったことを示唆する。
上記例は、例示的であって、本発明を限定するものではない。本発明の他の変法は当業者に容易に明らかになるであろう。本明細書に引用されるすべての出版物、特許及び特許出願は、引用により本明細書に組込まれる。
配列の列挙
（１）一般情報：
（ｉ）出願人：Komoriya，Akira
Packard Beverly S．
（ii）発明の名称：生物学的サンプル中のプロテアーゼの検出のための組成物及びその使用方法
（iii）配列の数：54
（２）配列番号１についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：４個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：配列番号１：
0003771262.tif 000027
（２）配列番号２についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：４個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：領域
（Ｂ）位置：one−of（２）
（Ｄ）他の情報：注＝“Ｘaaはノルロイシンである”
（xi）配列：配列番号２：
0003771262.tif 000028
（２）配列番号３についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：４個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：配列番号３：
0003771262.tif 000029
（２）配列番号４についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：４個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：配列番号４：
0003771262.tif 000030
（２）配列番号５についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：４個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：領域
（Ｂ）位置：one−of（２）
（Ｄ）他の情報：注＝“Ｘaaはノルロイシンである”
（xi）配列：配列番号５：
0003771262.tif 000031
（２）配列番号６についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：４個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：配列番号６：
0003771262.tif 000032
（２）配列番号７についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：４個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：配列番号７：
0003771262.tif 000033
（２）配列番号８についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：４個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：配列番号８：
0003771262.tif 000034
（２）配列番号９についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：４個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：配列番号９：
0003771262.tif 000035
（２）配列番号10についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：４個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：配列番号10：
0003771262.tif 000036
（２）配列番号11についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：４個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：配列番号11：
0003771262.tif 000037
（２）配列番号12についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：４個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：配列番号12：
0003771262.tif 000038
（２）配列番号13についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：４個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：配列番号13：
0003771262.tif 000039
（２）配列番号14についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：４個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：配列番号14：
0003771262.tif 000040
（２）配列番号15についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：４個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：配列番号15：
0003771262.tif 000041
（２）配列番号16についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：４個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：領域
（Ｂ）位置：one−of（４）
（Ｄ）他の情報：注＝“Ｘaaはノルロイシンである”
（xi）配列：配列番号16：
0003771262.tif 000042
（２）配列番号17についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：４個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：配列番号17：
0003771262.tif 000043
（２）配列番号18についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：４個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：配列番号18：
0003771262.tif 000044
（２）配列番号19についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：４個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：配列番号19：
0003771262.tif 000045
（２）配列番号20についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：４個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：配列番号20：
0003771262.tif 000046
（２）配列番号21についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：４個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：配列番号21：
0003771262.tif 000047
（２）配列番号22についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：４個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：配列番号22：
0003771262.tif 000048
（２）配列番号23についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：４個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：配列番号23：
0003771262.tif 000049
（２）配列番号24についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：４個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：配列番号24：
0003771262.tif 000050
（２）配列番号25についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：４個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：領域
（Ｂ）位置：one−of（３）
（Ｄ）他の情報：注＝“Ｘaaはノルロイシンである”
（xi）配列：配列番号25：
0003771262.tif 000051
（２）配列番号26についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：10個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：配列番号26：
0003771262.tif 000052
（２）配列番号27についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：７個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：配列番号27：
0003771262.tif 000053
（２）配列番号28についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：８個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：配列番号28：
0003771262.tif 000054
（２）配列番号29についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：６個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：配列番号29：
0003771262.tif 000055
（２）配列番号30についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：９個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：配列番号30：
0003771262.tif 000056
（２）配列番号31についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：９個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：領域
（Ｂ）位置：one−of（５）
（Ｄ）他の情報：注＝“Ｘaaはノルロイシンである”
（xi）配列：配列番号31：
0003771262.tif 000057
（２）配列番号32についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：５個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：配列番号32：
0003771262.tif 000058
（２）配列番号33についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：９個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：配列番号33：
0003771262.tif 000059
（２）配列番号34についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：５個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：配列番号34：
0003771262.tif 000060
（２）配列番号35についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：９個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：領域
（Ｂ）位置：one−of（５）
（Ｄ）他の情報：注＝“ＸaaはMet又はノルロイシンである”
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：領域
（Ｂ）位置：one−of（８）
（Ｄ）他の情報：注＝“ＸaaはPro又はアミノイソ酪酸である”
（xi）配列：配列番号35：
0003771262.tif 000061
（２）配列番号36についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：９個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：領域
（Ｂ）位置：one−of（２）
（Ｄ）他の情報：注＝“ＸaaはMet、アミノイソ酪酸又はProである”
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：領域
（Ｂ）位置：one−of（８）
（Ｄ）他の情報：注＝“ＸaaはThr、アミノイソ酪酸又はProである”
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：領域
（Ｂ）位置：one−of（８）
（Ｄ）他の情報：注＝“ＸaaはPro又はアミノイソ酪酸である”
（xi）配列：配列番号36：
0003771262.tif 000062
（２）配列番号37についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：９個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：領域
（Ｂ）位置：one−of（２）
（Ｄ）他の情報：注＝“ＸaaはAla又はアミノイソ酪酸である”
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：領域
（Ｂ）位置：one−of（３）
（Ｄ）他の情報：注＝“ＸaaはThr、アミノイソ酪酸又はProである”
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：領域
（Ｂ）位置：one−of（６）
（Ｄ）他の情報：注＝“ＸaaはMet又はノルロイシンである”
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：領域
（Ｂ）位置：one−of（６）
（Ｄ）他の情報：注＝“ＸaaはPro又はアミノイソ酪酸である”
（xi）配列：配列番号37：
0003771262.tif 000063
（２）配列番号38についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：９個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：領域
（Ｂ）位置：one−of（２）
（Ｄ）他の情報：注＝“Ｘaaはアミノイソ酪酸である”
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：領域
（Ｂ）位置：one−of（３）
（Ｄ）他の情報：注＝“ＸaaはSer、アミノイソ酪酸又はProである”
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：領域
（Ｂ）位置：one−of（５）
（Ｄ）他の情報：注＝“ＸaaはMet又はノルロイシンである”
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：領域
（Ｂ）位置：one−of（８）
（Ｄ）他の情報：注＝“ＸaaはPro又はアミノイソ酪酸である”
（xi）配列：配列番号38：
0003771262.tif 000064
（２）配列番号39についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：９個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：領域
（Ｂ）位置：one−of（２）
（Ｄ）他の情報：注＝“Ｘaaはアミノイソ酪酸である”
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：領域
（Ｂ）位置：one−of（３）
（Ｄ）他の情報：注＝“ＸaaはAla、アミノイソ酪酸又はProである”
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：領域
（Ｂ）位置：one−of（８）
（Ｄ）他の情報：注＝“ＸaaはPro又はアミノイソ酪酸である”
（xi）配列：配列番号39：
0003771262.tif 000065
（２）配列番号40についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：９個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：領域
（Ｂ）位置：one−of（２）
（Ｄ）他の情報：注＝“Ｘaaはアミノイソ酪酸である”
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：領域
（Ｂ）位置：one−of（３）
（Ｄ）他の情報：注＝“ＸaaはThr、アミノイソ酪酸又はProである”
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：領域
（Ｂ）位置：one−of（８）
（Ｄ）他の情報：注＝“ＸaaはPro又はアミノイソ酪酸である”
（xi）配列：配列番号40：
0003771262.tif 000066
（２）配列番号41についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：９個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：領域
（Ｂ）位置：one−of（２）
（Ｄ）他の情報：注＝“ＸaaはGly又はアミノイソ酪酸である”
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：領域
（Ｂ）位置：one−of（３）
（Ｄ）他の情報：注＝“ＸaaはPro又はアミノイソ酪酸である”
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：領域
（Ｂ）位置：one−of（８）
（Ｄ）他の情報：注＝“ＸaaはPro又はアミノイソ酪酸である”
（xi）配列：配列番号41：
0003771262.tif 000067
（２）配列番号42についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：９個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：領域
（Ｂ）位置：one−of（２）
（Ｄ）他の情報：注＝“ＸaaはGly、アミノイソ酪酸又はProである”
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：領域
（Ｂ）位置：one−of（３）
（Ｄ）他の情報：注＝“ＸaaはPro又はアミノイソ酪酸である”
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：領域
（Ｂ）位置：one−of（８）
（Ｄ）他の情報：注＝“ＸaaはPro又はアミノイソ酪酸である”
（xi）配列：配列番号42：
0003771262.tif 000068
（２）配列番号43についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：９個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：領域
（Ｂ）位置：one−of（２）
（Ｄ）他の情報：注＝“ＸaaはGly、アミノイソ酪酸又はProである”
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：領域
（Ｂ）位置：one−of（３）
（Ｄ）他の情報：注＝“ＸaaはPro又はアミノイソ酪酸である”
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：領域
（Ｂ）位置：one−of（８）
（Ｄ）他の情報：注＝“ＸaaはPro又はアミノイソ酪酸である”
（xi）配列：配列番号43：
0003771262.tif 000069
（２）配列番号44についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：９個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：領域
（Ｂ）位置：one−of（２）
（Ｄ）他の情報：注＝“ＸaaはGly、アミノイソ酪酸又はProである”
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：領域
（Ｂ）位置：one−of（３）
（Ｄ）他の情報：注＝“ＸaaはPro又はアミノイソ酪酸である”
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：領域
（Ｂ）位置：one−of（８）
（Ｄ）他の情報：注＝“ＸaaはPro又はアミノイソ酪酸である”
（xi）配列：配列番号44：
0003771262.tif 000070
（２）配列番号45についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：９個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：領域
（Ｂ）位置：one−of（２）
（Ｄ）他の情報：注＝“ＸaaはGly、アミノイソ酪酸又はProである”
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：領域
（Ｂ）位置：one−of（３）
（Ｄ）他の情報：注＝“ＸaaはPro又はアミノイソ酪酸である”
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：領域
（Ｂ）位置：one−of（８）
（Ｄ）他の情報：注＝“ＸaaはPro又はアミノイソ酪酸である”
（xi）配列：配列番号45：
0003771262.tif 000071
（２）配列番号46についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：９個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：領域
（Ｂ）位置：one−of（２）
（Ｄ）他の情報：注＝“ＸaaはGly、アミノイソ酪酸又はProである”
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：領域
（Ｂ）位置：one−of（３）
（Ｄ）他の情報：注＝“ＸaaはPro又はアミノイソ酪酸である”
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：領域
（Ｂ）位置：one−of（８）
（Ｄ）他の情報：注＝“ＸaaはPro又はアミノイソ酪酸である”
（xi）配列：配列番号46：
0003771262.tif 000072
（２）配列番号47についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：９個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：領域
（Ｂ）位置：one−of（２）
（Ｄ）他の情報：注＝“ＸaaはAsp、アミノイソ酪酸又はProである”
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：領域
（Ｂ）位置：one−of（３）
（Ｄ）他の情報：注＝“ＸaaはVal、アミノイソ酪酸又はProである”
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：領域
（Ｂ）位置：one−of（８）
（Ｄ）他の情報：注＝“ＸaaはPro又はアミノイソ酪酸である”
（xi）配列：配列番号47：
0003771262.tif 000073
（２）配列番号48についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：９個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：領域
（Ｂ）位置：one−of（２）
（Ｄ）他の情報：注＝“ＸaaはAsp、アミノイソ酪酸又はProである”
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：領域
（Ｂ）位置：one−of（３）
（Ｄ）他の情報：注＝“ＸaaはThr、アミノイソ酪酸又はProである”
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：領域
（Ｂ）位置：one−of（７）
（Ｄ）他の情報：注＝“ＸaaはMet又はノルロイシンである”
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：領域
（Ｂ）位置：one−of（８）
（Ｄ）他の情報：注＝“ＸaaはPro又はアミノイソ酪酸である”
（xi）配列：配列番号48：
0003771262.tif 000074
（２）配列番号49についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：９個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：領域
（Ｂ）位置：one−of（２）
（Ｄ）他の情報：注＝“ＸaaはArg、アミノイソ酪酸又はProである”
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：領域
（Ｂ）位置：one−of（３）
（Ｄ）他の情報：注＝“ＸaaはAla、アミノイソ酪酸又はProである”
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：領域
（Ｂ）位置：one−of（８）
（Ｄ）他の情報：注＝“ＸaaはPro又はアミノイソ酪酸である”
（xi）配列：配列番号49：
0003771262.tif 000075
（２）配列番号50についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：９個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：領域
（Ｂ）位置：one−of（２）
（Ｄ）他の情報：注＝“ＸaaはGly、アミノイソ酪酸又はProである”
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：領域
（Ｂ）位置：one−of（３）
（Ｄ）他の情報：注＝“ＸaaはPro又はアミノイソ酪酸である”
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：領域
（Ｂ）位置：one−of（８）
（Ｄ）他の情報：注＝“ＸaaはPro又はアミノイソ酪酸である”
（xi）配列：配列番号50：
0003771262.tif 000076
（２）配列番号51についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：９個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：領域
（Ｂ）位置：one−of（２）
（Ｄ）他の情報：注＝“ＸaaはGly、アミノイソ酪酸又はProである”
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：領域
（Ｂ）位置：one−of（３）
（Ｄ）他の情報：注＝“ＸaaはPro又はアミノイソ酪酸である”
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：領域
（Ｂ）位置：one−of（８）
（Ｄ）他の情報：注＝“ＸaaはPro又はアミノイソ酪酸である”
（xi）配列：配列番号51：
0003771262.tif 000077
（２）配列番号52についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：９個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：領域
（Ｂ）位置：one−of（２）
（Ｄ）他の情報：注＝“ＸaaはGly、アミノイソ酪酸又はProである”
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：領域
（Ｂ）位置：one−of（３）
（Ｄ）他の情報：注＝“ＸaaはPro又はアミノイソ酪酸である”
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：領域
（Ｂ）位置：one−of（８）
（Ｄ）他の情報：注＝“ＸaaはPro又はアミノイソ酪酸である”
（xi）配列：配列番号52：
0003771262.tif 000078
（２）配列番号53についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：９個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：領域
（Ｂ）位置：one−of（２）
（Ｄ）他の情報：注＝“ＸaaはAsp、アミノイソ酪酸又はProである”
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：領域
（Ｂ）位置：one−of（３）
（Ｄ）他の情報：注＝“ＸaaはVal、アミノイソ酪酸又はProである”
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：領域
（Ｂ）位置：one−of（８）
（Ｄ）他の情報：注＝“ＸaaはPro又はアミノイソ酪酸である”
（xi）配列：配列番号53：
0003771262.tif 000079
（２）配列番号54についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：９個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：領域
（Ｂ）位置：one−of（２）
（Ｄ）他の情報：注＝“ＸaaはGly、アミノイソ酪酸又はProである”
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：領域
（Ｂ）位置：one−of（３）
（Ｄ）他の情報：注＝“ＸaaはAsp又はアミノイソ酪酸である”
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：領域
（Ｂ）位置：one−of（８）
（Ｄ）他の情報：注＝“ＸaaはPro又はアミノイソ酪酸である”
（xi）配列：配列番号54：
0003771262.tif 000080
（２）配列番号55についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：９個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：領域
（Ｂ）位置：one−of（２）
（Ｄ）他の情報：注＝“ＸaaはGly、アミノイソ酪酸又はProである”
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：領域
（Ｂ）位置：one−of（３）
（Ｄ）他の情報：注＝“ＸaaはPro又はアミノイソ酪酸である”
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：領域
（Ｂ）位置：one−of（８）
（Ｄ）他の情報：注＝“ＸaaはPro又はアミノイソ酪酸である”
（xi）配列：配列番号55：
0003771262.tif 000081
（２）配列番号56についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：９個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：領域
（Ｂ）位置：one−of（２）
（Ｄ）他の情報：注＝“ＸaaはAsp、アミノイソ酪酸又はProである”
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：領域
（Ｂ）位置：one−of（３）
（Ｄ）他の情報：注＝“ＸaaはVal、アミノイソ酪酸又はProである”
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：領域
（Ｂ）位置：one−of（８）
（Ｄ）他の情報：注＝“ＸaaはPro又はアミノイソ酪酸である”
（xi）配列：配列番号56：
0003771262.tif 000082
（２）配列番号57についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：11個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：領域
（Ｂ）位置：one−of（２）
（Ｄ）他の情報：注＝“Ｘaaはノルロイシンである”
（xi）配列：配列番号57：
0003771262.tif 000083
（２）配列番号58についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：11個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：領域
（Ｂ）位置：one−of（２）
（Ｄ）他の情報：注＝“Ｘaaはノルロイシンである”
（xi）配列：配列番号58：
0003771262.tif 000084
（２）配列番号59についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：12個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：領域
（Ｂ）位置：one−of（２）
（Ｄ）他の情報：注＝“Ｘaaはノルロイシンである”
（xi）配列：配列番号59：
0003771262.tif 000085
（２）配列番号60についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：11個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：配列番号60：
0003771262.tif 000086
（２）配列番号61についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：12個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：配列番号61：
0003771262.tif 000087
【図１Ａ】
0003771262.tif 000091
【図１Ｂ】
0003771262.tif 000092
【図１Ｃ】
0003771262.tif 000093
【図２Ａ】
0003771262.tif 000094
【図２Ｂ】
0003771262.tif 000095
【図３】
0003771262.tif 000096
【図４Ａ】
0003771262.tif 000097
【図４Ｂ】
0003771262.tif 000098