(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１、２、３、２７、２８および２９に示したアミノ酸配列から選ばれるアミノ酸配列を含むヒト顆粒球コロニー刺激因子活性およびトロンボポエチン活性を有するポリペプチド。
【請求項２】
以下の［１］〜［３］のいずれかに記載のヒト顆粒球コロニー刺激因子活性およびトロンボポエチン活性を有するポリペプチド。
［１］配列番号１に示したアミノ酸配列において、アミノ酸番号１５５〜３２８番目のアミノ酸配列が、以下の配列（ａ）〜（ｌ）のいずれかに示すアミノ酸配列と置換したアミノ酸配列を含むポリペプチド
［２］配列番号２に示したアミノ酸配列において、アミノ酸番号１６７〜３４０番目のアミノ酸配列が、以下の配列（ａ）〜（ｌ）のいずれかに示すアミノ酸配列と置換したアミノ酸配列を含むポリペプチド
［３］配列番号３に示したアミノ酸配列において、アミノ酸番号１７１〜３４４番目のアミノ酸配列が、以下の配列（ａ）〜（ｌ）のいずれかに示すアミノ酸配列と置換したアミノ酸配列を含むポリペプチド
配列（ａ）
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配列（ｂ）
0003763846.tif 000053
配列（ｃ）
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配列（ｄ）
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配列（ｅ）
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配列（ｆ）
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配列（ｇ）
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配列（ｈ）
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配列（ｉ）
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配列（ｊ）
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配列（ｋ）
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配列（ｌ）
0003763846.tif 000063
【請求項３】
配列番号４に示した塩基配列中の塩基番号５２６〜１０４７番目の塩基配列で示されるＤＮＡと１．０Ｍ塩化ナトリウム存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１倍濃度のＳＳＣ溶液中、６５℃で洗浄する条件下でハイブリダイズし、かつヒト顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、および配列番号４に示した塩基配列中の塩基番号６４〜５２５番目の塩基配列で示されるＤＮＡと１．０Ｍ塩化ナトリウム存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１倍濃度のＳＳＣ溶液中、６５℃で洗浄する条件下でハイブリダイズし、かつトロンボポエチン活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを連結して得られるＤＮＡにコードされるヒト顆粒球コロニー刺激因子活性およびトロンボポエチン活性を有する融合ポリペプチド。
【請求項４】
請求項１、２または３記載の融合ポリペプチドの少なくとも１個のアミノ基がポリアルキレングリコール誘導体で化学修飾されたヒト顆粒球コロニー刺激因子活性およびトロンボポエチン活性を有する融合ポリペプチド。
【請求項５】
ポリアルキレングリコール誘導体が、ポリエチレングリコール誘導体、ポリプロピレングリコール誘導体およびポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体の誘導体からなる群より選ばれるポリアルキレングリコール誘導体である、請求項４記載の融合ポリペプチド。
【請求項６】
請求項１、２または３記載の融合ポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項７】
ＤＮＡが、配列番号４、５および６に示したＤＮＡ配列から選ばれる配列を含むＤＮＡである、請求項６記載のＤＮＡ。
【請求項８】
請求項１、２または３記載の融合ポリペプチドを有効成分として含有してなる貧血治療剤。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、顆粒球コロニー刺激因子（以下、Ｇ−ＣＳＦと略記する）活性を有するポリペプチドと血小板増幅因子（トロンボポエチン；以下、ＴＰＯと略記する）活性を有するポリペプチドとからなる融合ポリペプチドおよび該融合ポリペプチドをコードするＤＮＡに関する。本発明の融合ポリペプチドは、血小板と好中球とを同時に生成・増幅させることができ、貧血の治療等に有用である。
背景技術
血液は赤血球、白血球、血小板といった造血細胞から構成される。これらの造血細胞はただ一種類の多分化能性血液幹細胞から種々の分化段階を経て、成熟する。その過程は、サイトカインと総称される一群の蛋白質因子により複雑な制御を受けている。ある一つのサイトカインは、種々の造血細胞の分化・増殖に関与する。一方、ある一つの造血細胞は、種々のサイトカインにより分化・増殖の制御を受ける。これをサイトカイン作用の重複と呼ぶ。これらのサイトカインのなかで、ＴＰＯとＧ−ＣＳＦは作用の重複が少ないと考えられている。
ＴＰＯは、主として血小板の形成に関与する。血小板は、主として骨髄中に存在する巨核球という大きな核を有する造血細胞の断片化により生成される。血小板は血管内の損傷部位において、血餅を生じさせるのに必須である。さらに、血小板は損傷部位において他の機能を持つ蛋白質を放出することで、血液凝固のみならず、損傷治癒において重要な働きを担う。血小板が減少すると出血し易い状態となり、致命的である。
Ｇ−ＣＳＦは、白血球の一種である好中球の活性化ならびに好中球の前駆細胞からの分化を促進するサイトカインである。好中球は、外敵たとえば細菌やウイルスが侵入した際に、最初に防御反応をつかさどる。好中球が減少すると、感染に対して無防備となり、この場合もしばしば致命的である。
現在の癌治療において、化学療法剤の投与やＸ線照射あるいは白血病治療における骨髄移植療法により、多分化能性血液幹細胞が損傷を受け、その結果、造血細胞が全て減少するという副作用が問題になっている。明らかに、血小板ならびに白血球減少の患者に対して、サイトカインを投与してそれらの細胞数を増幅させることは、出血傾向の改善や感染症の予防といった面で、非常に有益である。
血小板と好中球とを同時に増幅させるサイトカインは、現在までに見いだされておらず、そのような薬効をもった医薬品はない。
血小板の増幅または巨核球の分化増殖促進作用を有する物質としては、白血球阻害因子、幹細胞因子、マクロファージコロニー刺激因子、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子、エリスロポエチン、インターロイキン（ＩＬ）−３、ＩＬ−６、ＩＬ−１１、巨核球コロニー刺激因子等が知られている〔メトカフ(Metcalf)ら、ブラッド(Blood) 80, 50-56 (1990)；ハント(Hunt)ら，ブラッド(Blood) 80, 904-911 (1992)；特公平6-11705；ホフマン(Hoffman)ら，ブラッド・セル(Blood Cells) 13, 75-86 (1987)；マヅア(Mazur)ら，エクスペリメンタル・ヘマトロジー(Exp.Hematol.) 15, 1123-1133 (1987)；マクニース(McNiece)ら，エクスペリメンタル・ヘマトロジー(Exp.Hematol.) 16, 807-810 (1988)；ル(Lu)ら，ブリティッシュ・ジャーナル・オブ・ヘマトロジー(Brit.J.Hematol.) 70, 149-156 (1988)；イシバシ(Ishibashi)ら，プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス(Proc.Natl.Acad.Sci.USA) 86, 5953-5957 (1989)、WO95/21919、WO95/18858〕。これら多くのサイトカインは、作用の重複によって、血小板を増幅させるものであると理解される。最近になって、c-mplという受容体のリガンドが血小板増幅因子の中で、最も活性が強く、また直接作用するサイトカインであることが明らかにされた〔デサベイジ(de Sauvage)ら，ネイチャー(Nature) 369, 533 (1994)〕。
顆粒球を増殖させる物質としては、前述のＩＬ−３、マクロファージコロニー刺激因子、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子等が知られているが、好中球を特異的に増殖させるという点でＧ−ＣＳＦが最も高い活性を有する〔ニコラ(Nicola)ら，ジャーナル・オブ・バイオロジカルケミストリー(J.Biol.Chem.) 258, 9017 (1983) 〕。異なる二つのサイトカインを融合したポリペプチドとしては、特表平6-500116、米国特許第5359035号、エクスペリメンタル・ヘマトロジー(Exp. Hematol.) 21, 647-655 (1993)、同18, 615 (1990)等に報告がある。しかしながら、ＴＰＯが一方のサイトカインとして用いられた融合ポリペプチドは知られていない。
本発明の目的は、血小板と好中球とを同時に生成・増幅させることができる融合ポリペプチドを提供することにある。当該融合ポリペプチドが得られれば、巨核球コロニー形成ならびに好中球コロニー形成、巨核球前駆体および好中球前駆体の分化または成熟を制御することができる。
発明の開示
本発明は、Ｇ−ＣＳＦ活性を有するポリペプチドとＴＰＯ活性を有するポリペプチドとからなる融合ポリペプチドおよび該融合ポリペプチドをコードするＤＮＡ、スペーサーペプチドを介して、Ｇ−ＣＳＦ活性を有するポリペプチドとＴＰＯ活性を有するポリペプチドとが融合した融合ポリペプチドおよび該融合ポリペプチドをコードするＤＮＡ、および、該Ｇ−ＣＳＦ活性を有するポリペプチドとＴＰＯ活性を有するポリペプチドとからなる融合ポリペプチドがポリエチレングリコール誘導体で化学修飾されたポリペプチドに関する。更に、該融合ポリペプチドを有効成分として含有してなる貧血治療剤に関する。
本発明で用いられるＧ−ＣＳＦ活性を有するポリペプチドとしては、Ｇ−ＣＳＦ活性を有する蛋白質であればいずれでもよく、例えば、第１表に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド〔ネイチャー(Nature) 319, 415 (1986)〕をあげることができる。
更に、第１表に示されたアミノ酸配列とは１個以上のアミノ酸が置換、欠失または付加したアミノ酸配列を有し、かつＧ−ＣＳＦ活性を有する蛋白質をあげることができ、例えば、第２表、特開昭63-267299、特開昭63-299、特表昭63-500636等に記載のｈＧ−ＣＳＦをあげることができる。
0003763846.tif 000002
0003763846.tif 000003
本発明で用いられるＴＰＯ活性を有するポリペプチドとしては、ＴＰＯ活性を有する蛋白質であればいずれでもよく、例えば、第３表に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドであるｃ−ｍｐｌリガンド〔ネイチャー(Nature) 369, 533 (1994)〕の他、白血病阻害因子、幹細胞因子、マクロファージコロニー刺激因子、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子、エリスロポエチン、インターロイキン（ＩＬ）−３、ＩＬ−６、ＩＬ−１１、巨核球コロニー刺激因子等をあげることができる。
0003763846.tif 000004
本発明のポリペプチドを構成するＧ−ＣＳＦ活性を有するポリペプチドおよびＴＰＯ活性を有するポリペプチドは、それぞれ、活性に関与する部分が含まれるポリペプチドであればよい。例えば、ＴＰＯ活性を有するポリペプチドとしてｃ−ｍｐｌリガンドを用いる場合、Ｎ末端アミノ酸から１５３〜１５４番目のアミノ酸配列が含まれていればよい。
また、本発明のポリペプチドは、スペーサーペプチドを介してＧ−ＣＳＦ活性を有するポリペプチドとＴＰＯ活性を有するポリペプチドとを融合させたポリペプチドを含む。当該スペーサーペプチドとしては、Ｇ−ＣＳＦ活性およびＴＰＯ活性を妨げないものなら、いかなる配列でも用いることができる。例えば、第４表に挙げられたペプチド等をスペーサーペプチドとして用いることができる。
0003763846.tif 000005
本発明の融合ポリペプチドの具体例としては、配列番号１、２または３に示したアミノ酸配列を有するポリペプチド等および該融合ポリペプチドのアミノ酸配列において、Ｇ−ＣＳＦ活性およびＴＰＯ活性を失わない範囲で、１個以上のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたポリペプチドで、該ポリペプチドのアミノ酸配列と４０％以上の相同性を有するものをあげることができる。相同性は、６０％以上が好ましく、更に好ましくは８０％以上である。
ここで、アミノ酸の置換、欠失または付加は、ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Nucleic Acid Research), 10, 6487 (1982)、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proc. Natl. Acad. Sci., USA), 79, 6409 (1982)、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proc. Natl. Acad. Sci., USA), 81, 5662 (1984)、サイエンス（Science), 224, 1431 (1984)、PCT WO85／00817、ネイチャー（Nature), 316, 601 (1985)、ジーン（Gene), 34, 315 (1985)、ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Nucleic Acids Research), 13, 4431 (1985)、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Current Protocols in Molecular Biology）,８章Mutagenesis of Cloned DNA, John Wiley & Sons,Inc.(1989)等に記載の方法に準じて実施することができる。
また、上記ポリペプチドのＮ末端アミノ酸に分泌シグナルペプチドの付加したアミノ酸配列を有するペプチドも本発明の融合ポリペプチドに含まれ、例えば、配列番号４、５または６に示したアミノ酸配列を有するポリペプチド等をあげることができる。
更に、上記ポリペプチドの少なくとも１個のアミノ基がポリアルキレングリコール誘導体で化学修飾されたＧ−ＣＳＦ活性およびＴＰＯ活性を有する融合ポリペプチドも本発明の融合ポリペプチドに含まれる。
ポリアルキレン誘導体としては、ポリエチレングリコール誘導体、ポリプロピレングリコール誘導体、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体等の誘導体をあげることができ、例えば、ポリエチレングリコール−サクシンイミジルプロピオネイトをあげることができる。
該ポリエチレングリコール誘導体で化学修飾された融合ポリペプチドは、特公平7-96558に記載された方法により作製することができる。
本発明の融合ポリペプチド（以下、ＴＰＯ−ＣＳＦと略す）をコードするＤＮＡは、公知のＴＰＯ活性を有するポリペプチドの塩基配列およびＧ−ＣＳＦ活性を有するポリペプチドの塩基配列をもとにして、ポリメラーゼ・チェーン・リアクション（ＰＣＲ）法等により得ることができる。また、化学合成により取得することもできる。
ＴＰＯ−ＣＳＦをコードするＤＮＡとしては、配列番号１、２または３に示したアミノ酸配列を有するポリペプチド、あるいは、配列番号１、２または３に示したアミノ酸配列とは１個以上のアミノ酸が置換、欠失または付加したアミノ酸配列を有し、かつＧ−ＣＳＦ活性およびＴＰＯ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列を含むＤＮＡをあげることができ、例えば、配列番号４、５または６に示した塩基配列を含むＤＮＡをあげることができる。
更に、上記ＤＮＡに対して、Ｇ−ＣＳＦ活性およびＴＰＯ活性を失わない範囲内で置換変異、欠失変異、挿入変異などの変異が導入されたＤＮＡをあげることができ、例えば、配列番号４、５または６に示した塩基配列を含むＤＮＡをプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション法またはプラークハイブリダイゼーション法を用いることにより得られるＤＮＡをあげることができる。
具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したメンブランフィルターを用いて、０．７〜１．０Ｍ塩化ナトリウム存在下、６５℃で、配列番号４、５または６に示した塩基配列を含むＤＮＡをプローブとして、ハイブリダイゼーションを行った後、０．１倍濃度から２倍濃度までの間の濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸３ナトリウムである。）中、６５℃でフィルターを洗浄することにより同定されるＤＮＡをあげることができる。
なお、ハイブリダイゼーションの実験法は、モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（Molecular Cloning, A laboratory manual）、第２版〔サンブルック（Sambrook）、フリッチ（Fritsch）、マニアチス（Maniatis）編集、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Cold Spring Harbor Laboratory Press）、１９８９年刊〕に記載されている。
ＴＰＯ−ＣＳＦは上記で定義されるＤＮＡによってコードされる全てのポリペプチドを包含する。
ＴＰＯ−ＣＳＦをコードするＤＮＡを含むプラスミドとしては、例えば、pBS-T153LND28、pBS-T154ND28、pBS-153ND28LN1が挙げられる。pBS-T153LND28を含む大腸菌であるEscherichia coli TLN-1、pBS-T154ND28を含む大腸菌であるEscherichia coli TN-1は、平成７年２月１６日付で工業技術院生命工学工業技術研究所、日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号３０５）にそれぞれＦＥＲＭ  ＢＰ−５００１、ＦＥＲＭ  ＢＰ−５００２として寄託されている。
上記のようにして得られるＴＰＯ−ＣＳＦをコードする遺伝子（以下、ＴＰＯ−ＣＳＦ遺伝子と略す）を宿主中で発現させるためには、まず、ＴＰＯ−ＣＳＦ遺伝子を含むＤＮＡ断片を、制限酵素類あるいはＤＮＡ分解酵素類で、ＴＰＯ−ＣＳＦ遺伝子を含む適当な長さのＤＮＡ断片とした後に、発現ベクター中プロモーターの下流に挿入し、次いで上記ＤＮＡを挿入した発現ベクターを、発現ベクターに適合した宿主中に導入する。
宿主としては、目的とする遺伝子を発現できるものは全て用いることができる。例えば、エッシェリヒア属、セラチア属、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、シュードモナス属、バチルス属、等に属する微生物菌株の他、酵母菌株や動物細胞宿主等をあげることができる。
発現ベクターとしては、上記宿主において自立複製可能ないしは染色体中への組込みが可能で、ＴＰＯ−ＣＳＦ遺伝子を転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。
大腸菌等の微生物を宿主として用いる場合は、ＴＰＯ−ＣＳＦ発現ベクターは微生物中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、ＴＰＯ−ＣＳＦ遺伝子、転写終結配列、より構成されていることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
発現ベクターとしては、例えば、ｐＢＴｒｐ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２（いずれもベーリンガーマンハイム社より市販）、ｐＫＹＰ１０（特開昭58-110600）、ｐＫＹＰ２００〔アグリカルチャラル・バイオロジカル・ケミストリー(Agric. Biol. Chem.), 48, 669 (1984)〕、ｐＬＳＡ１〔アグリカルチャラル・バイオロジカル・ケミストリー(Agric. Biol. Chem.), 53, 277 (1989)〕、ｐＧＥＬ１〔プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス(Proc. Natl. Acad. Sci., USA), 82, 4306 (1985)〕、pBluescript（STRATAGENE社）、ｐＴｒｓ３０〔エシェリヒア・コリJM109/pTrS30（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０７）より調製〕、ｐＴｒｓ３２〔エシェリヒア・コリJM109/pTrS32（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０８）より調製〕、ｐＡＧＥ１０７〔特開平3-22979;Miyajiら，サイトテクノロジー(Cytotechnology), 3, 133(1990)〕、ｐＡＳ３−３（特開平2-227075)およびｐＡＭｏＥＲＣ３Ｓｃ ＣＤＭ８〔ブライアン・シード(Brian Seed)ら，ネイチャー(Nature), 329, 840(1987)〕等を例示することができる。
プロモーターとしては、大腸菌等の宿主中で発現できるものであればいかなるものでもよい。例えば、trpプロモーター(Ｐtrp)、lacプロモーター（Ｐlac）、PLプロモーター、PRプロモーターなどの、大腸菌やファージ等に由来するプロモーターをあげることができる。またＰtrpを２つ直列させたプロモーター（Ｐtrpx２）、tacプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。
リボソーム結合配列としては、大腸菌等の宿主中で発現できるものであればいかなるものでもよいが、リボソーム結合配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６〜１８塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。
ＴＰＯ−ＣＳＦ遺伝子はＴＰＯ−ＣＳＦをコードする遺伝子であればいずれも用いることができるが、該遺伝子のＤＮＡ配列を宿主微生物での発現に最適なコドンとなるように、塩基を置換して用いることが好ましい。
本遺伝子の発現には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、好適には構造遺伝子直下に転写終結配列を配置することが望ましい。
宿主としては、Escherichia coliXL1-Blue、Escherichia coli XL2-Blue、Escherichia coli DH1、Escherichia coli DH5α、Escherichia coli MC1000、Escherichia coli KY3276、Escherichia coli W1485、Escherichia coli JM109、Escherichia coli HB101、Escherichia coli No.49、Escherichia coli W3110、Escherichia coli NY49、Bacillus subtilis、Bacillus amyloliquefacines、Brevibacterium immariophilum ATCC14068、Brevibacterium saccharolyticum ATCC14066、Brevibacterium flavum ATCC14067、Brevibacterium lactofermentum ATCC13869、Corynebacterium glutamicum ATCC13032、Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870、Microbacterium ammoniaphilum ATCC15354等をあげることができる。
酵母菌株を宿主として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ＹＥｐ１３（ATCC37115）、ＹＥｐ２４（ATCC37051）、ＹＣｐ５０（ATCC37419）等を例示することができる。
プロモーターとしては、酵母菌株の宿主中で発現できるものであればいかなるものでもよい。例えば、ヘキソースキナーゼ等の解糖系の遺伝子のプロモーター、gal 1プロモーター、gal 10プロモーター、ヒートショック蛋白質プロモーター、MFα1プロモーター、CUP 1プロモーター等のプロモーターをあげることができる。
宿主としては、Saccharomyces cerevisae、Schizosaccharomyces pombe、Kluyveromyces lactis、Trichosporon pullulans、Schwanniomyces alluvius等をあげることができる。
動物細胞を宿主として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ｐｃＤＮＡ Ｉ／Ａｍｐ、ｐｃＤＮＡ Ｉ、ｐｃＤＭ８（いずれもフナコシ社より市販）ｐｃＤＮＡ ３（インヴィトロージェン社製）、ｐＡＧＥ２４８、ｐＡＧＥ２１０等を例示することができる。
プロモーターとしては、動物細胞の宿主中で発現できるものであればいかなるものでもよい。例えば、ヒトＣＭＶのＩＥ(immediate  early)遺伝子のプロモーター等のプロモーターをあげることができる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
ＴＰＯ−ＣＳＦ遺伝子はＴＰＯ−ＣＳＦをコードする遺伝子であればいずれも用いることができる。
通常、該遺伝子から発現されたＴＰＯ−ＣＳＦは、発現された一部しか細胞外に分泌されないため、積極的にＴＰＯ−ＣＳＦを宿主細胞外に分泌させるには、ポールソンらの方法〔C. Paulsonら，ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J. Biol. Chem.), 264, 17619 (1989)〕およびロウらの方法〔John. B. Loweら，プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proc. Natl. Acad. Sci.), USA, 86, 8227 (1989)、John. B. Loweら：ジーンズ・アンド・ディベラプメント（Genes Develop.), 4, 1288 (1990)〕に準じて、該遺伝子にシグナルペプチドをコードする塩基配列を付加した配列を有する遺伝子を作製し、該遺伝子を用いるとよい。
宿主としては、ナマルバ細胞、ＨＢＴ５６３７（特開昭63-299)、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞等をあげることができる。
動物細胞へのＴＰＯ−ＣＳＦ遺伝子を含むＤＮＡの導入法としては、動物細胞にＤＮＡを導入することができればいかなる方法も用いることができる。例えば、エレクトロポーレーション法〔Miyajiら：サイトテクノロジー(Cytotechnology), 3, 133(1990)〕、リン酸カルシウム法（特開平2-227075）、リポフェクション法〔フィリップ・エル・フェルグナー（Philip L. Felgner)ら：プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proc. Natl. Acad. Sci., USA), 84, 7413 (1987）〕等を用いることができる。形質転換株の取得および培養は、特開平2-227075あるいは特開平2-257891に記載されている方法に準じて行なうことができる。
上記のようにして得られた形質転換体を通常の培養方法に従って培養することにより、ＴＰＯ−ＣＳＦを生産させることができる。
大腸菌や酵母菌等の微生物を宿主として用いた形質転換体を培養する培地は、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれでもよい。
炭素源としては、それぞれの微生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノールなどのアルコール類が用いられる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、りん酸アンモニウム、等の各種無機酸や有機酸のアンモニウム塩、その他含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体およびその消化物等が用いられる。
無機物としては、りん酸第一カリウム、りん酸第二カリウム、りん酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が用いられる。
培養は、振盪培養または深部通気攪拌培養などの好気的条件下で行う。培養温度は１５〜４０℃がよく、培養時間は、通常１６〜９６時間である。培養中ｐＨは、３.０〜９.０に保持する。ｐＨの調整は、無機あるいは有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニアなどを用いて行う。
また培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、lacプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）等を、trpプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸（ＩＡＡ）等を培地に添加してもよい。
動物細胞を宿主として用いた形質転換体を培養する培地は、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地、ＭＥＭ培地〔イーグル(Eagle)社製、ギブコ・ビー・アール・エル(GibcoBRL)社製〕、Ｄ−ＭＥＭ培地〔ギブコ・ビー・アール・エル(GibcoBRL)社製〕またはこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等が用いられる。
培養は、５％ＣＯ2存在下等の条件下で行う。培養温度は３５〜３７℃がよく、培養時間は、通常３〜７日間である。
また培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
特開平2-227075に記載されている方法に準じて、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子等を用いた遺伝子増幅系を利用して生産量を上昇させることもできる。
このようにして生産された本発明のＴＰＯ−ＣＳＦは、通常の蛋白質の精製方法により精製することができる。
例えば、ＴＰＯ−ＣＳＦが宿主細胞外へ分泌されない場合には、該形質転換体の培養液を遠心分離することにより、培養液中の細胞を集め、該細胞を洗浄した後に、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠沈分離することにより得られた上清から、硫安等による塩析、ジエチルアミノエチル(DEAE)-セファロースなどの陰イオン交換クロマトグラフィー、ブチルセファロース、フェニルセファロースなどの疎水性クロマトグラフィー、分子篩を用いたゲル濾過法、等電点電気泳動等の電機泳動法等の手法を用い、ＴＰＯ−ＣＳＦを精製することができる。
ＴＰＯ−ＣＳＦが分泌される場合には、該形質転換体の培養上清を用いて、上述の該無細胞抽出液の上清の場合と同様の処理を行うことにより、精製されたＴＰＯ−ＣＳＦを取得することができる。
大腸菌内に生産させる場合は、上記の方法と特開昭63-267292に記載された方法を組み合わせることにより効率的に精製することができる。
また、本発明のＴＰＯ−ＣＳＦを、さらに他の蛋白質との融合蛋白質として生産し、融合した蛋白質に親和性をもつ物質を用いたアフィニティークロマトグラフィーを利用して精製することもできる。例えば、ロウらの方法〔John. B. Loweら,プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proc. Natl. Acad. Sci.), USA, 86, 8227 (1989)、John. B. Loweら，ジーンズ・アンド・ディベラプメント（Genes Develop.), 4, 1288 (1990）〕に準じて、本発明のＴＰＯ−ＣＳＦをプロテインＡとの融合タンパク質として生産し、イムノグロブリンＧを用いるアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる。
更に、Ｇ−ＣＳＦ活性を有するポリペプチドに対する抗体、例えば、Ｇ−ＣＳＦに対する抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーで精製することもできる。
本発明のＴＰＯ−ＣＳＦは、そのままあるいは各種の製剤形態を取る医薬組成物として使用することができる。
本発明の医薬組成物は活性成分として、有効な量のＴＰＯ−ＣＳＦを薬理学的に許容される担体と均一に混合して製造できる。
これらの医薬組成物は、注射に対して適する単位服用形態にあることが望ましい。
注射による投与に用いる注射剤は、蒸留水、塩化ナトリウムもしくは塩化ナトリウムと無機塩との混合物等の塩溶液、マンニトール、ラクトース、デキストラン、グルコース等の糖溶液、グリシン、アルギニン等のアミノ酸溶液、有機酸溶液、有機塩基溶液、または塩溶液と糖溶液の混合溶液からなる担体を用いて調製するすることができる。この際、常法に従い、浸透圧調整剤、ゴマ油、ダイズ油等の植物油、レシチンもしくは非イオン界面活性剤等の界面活性剤等の助剤を用いて、溶液、懸濁剤、分散剤として調製することができる。これらの溶液を粉末化、凍結乾燥等の操作により用時溶解製剤として調製することもできる。
本発明のＴＰＯ−ＣＳＦを有効成分として含む上記医薬組成物は、貧血を伴う疾病を有する患者、疾病の治療の結果として貧血状態になるような患者等の治療に適している。
【図面の簡単な説明】
第１図はＴＰＯ−ＮＤ２８（１）をコードするＤＮＡを含むプラスミドの造成を示した図である。
第２図はＴＰＯ−ＮＤ２８（２）をコードするＤＮＡを含むプラスミドの造成を示した図である。
第３図はＴＰＯ−ＮＤ２８（３）をコードするＤＮＡを含むプラスミドの造成を示した図である。
発明を実施するための最良の形態
実施例１  ＴＰＯ−ＣＳＦをコードするＤＮＡの作製
Ｇ−ＣＳＦ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡとして、ヒトＧ−ＣＳＦのアミノ酸配列のうち、第１番目のアミノ酸残基がアラニン（Ａｌａ）に、第３番目のアミノ酸がスレオニン（Ｔｈｒ）に、第４番目のアミノ酸がチロシン（Ｔｙｒ）に、第５番目のアミノ酸がアルギニン（Ａｒｇ）に、および第１７番目のアミノ酸がセリン（Ｓｅｒ）に全て置換されたポリペプチドであるＮＤ２８をコードするＤＮＡ（特開昭63-267292）を用い、ＴＰＯ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、第３表のアミノ酸配列を有するポリペプチド〔デサベイジ(de Sauvage)ら，ネイチャー(Nature), 369 533 (1994) ;以下、ＴＰＯと略記する〕をコードするＤＮＡを用いて以下のようにしてＴＰＯ−ＣＳＦをコードするＤＮＡを作製した。ＴＰＯとＮＤ２８との融合ポリペプチドを以下、ＴＰＯ−ＮＤ２８と略す。
１．  ＴＰＯ遺伝子の取得
ＴＰＯ−ＮＤ２８を作製するために用いるＴＰＯをコードする遺伝子（以下、ＴＰＯ遺伝子と略す）は、デサベイジ(de Sauvage)らが報告した塩基配列〔ネイチャー(Nature), 369, 533 (1994）〕をもとに、ＰＣＲ法により以下のようにして取得した。
ＴＰＯ遺伝子の５’端塩基配列を含む配列番号７に示されたＤＮＡ（以下、プライマー１と略記する）およびＴＰＯ遺伝子の３’端塩基配列を含む配列番号８に示されたＤＮＡ（以下、プライマー２と略記する）を、アプライド・バイオシステムズ社３８０Ａ・ＤＮＡ合成機を用いて合成した。各々のプライマーにはクローニングが容易になるように末端に制限酵素認識配列を付加した。
該プライマー１、２、ヒト肝臓ポリＡ+ｍＲＮＡ〔クローンテク(Clontech)社製、商品番号CL6510-1〕ｍＲＮＡおよびスーパースクリプト・プレアンプリフィケーション・システム・フォア・ファースト・ストランド・ｃＤＮＡ・合成キット〔SuperScript Preamplification System for First Strand cＤＮＡ Synthes is Kit、ギブコ・ビー・アール・エル(GibcoBRL)社製〕を用いて、逆転写ＰＣＲ法によりＴＰＯ遺伝子翻訳領域配列の増幅およびクローニングを行った。
ヒト肝臓ポリＡ+ｍＲＮＡ１，０００ｎｇおよびオリゴ（ｄＴ）１２−１８  ５００ｎｇ（キットに含有）を含む０．０１３ｍｌの水溶液を７０℃、１０分間処理した後、氷中に１分間放置した。
該放置液に、１０倍濃度の合成緩衝液（synthesis buffer）０．００２ｍｌ、１０ｍＭ ｄＮＴＰｍｉｘ  ０．００１ｍｌ、０．１Ｍ ＤＴＴ  ０．００２ｍｌ、SuperScript II RT（２００ｋＵ／ｍｌ）０．００１ｍｌ（いずれもキットに含有）を添加し、室温で１０分間放置した後、４２℃で５０分間インキュベートした。インキュベート後、９０℃で５分間加熱し、逆転写反応を終了させた。
該反応液にE. coli RNaseH（２，０００Ｕ／ｍｌ；キットに含有）０．００１ｍｌを加え、３７℃で２０分間インキュベートした。
該反応液０．００５ｍｌ、４００ｎＭ プライマー１、４００ｎＭ プライマー２、２０ｍＭ トリス−塩酸（ｐＨ８．２）、１０ｍＭ 塩化カリウム、０．０１ｍｇ／ｍｌ ウシ血清アルブミン（以下、ＢＳＡと略記する）、２ｍＭ 塩化マグネシウム、６ｍＭ 硫酸アンモニウム、０．１％ トリトンＸ−１００、１０％ ジメチルスルフォキシド（以下、ＤＭＳＯと略記する）、０．０５ｍＭ デオキシアデノシン３リン酸（以下、ｄＡＴＰと略記する）、０．０５ｍＭ デオキシシチジン３リン酸（以下、ｄＣＴＰと略記する）、０．０５ｍＭ デオキシグアノシン３リン酸（以下、ｄＧＴＰと略記する）、０．０５ｍＭ デオキシチミジン３リン酸（以下、ｄＴＴＰと略記する）を含む反応液０．１ｍｌにＰｆｕポリメラーゼ〔ストラタジーン(Stratagene)社製〕２．５単位を加え、パーキンエルマ・シータス・ＤＮＡ・サーマル・サイクラー（PERKIN ELMER CETUS DNA Thermal Cycler、宝酒造社製）を用いて、９４℃／４５秒、５０℃／１分、７２℃／２分間のインキュベーション行程を３５回繰り返すことによりＰＣＲを行った。
該反応液を用いて、フェノール／クロロホルム抽出およびエタノール沈殿を行い、得られた沈殿をＴＥ緩衝液〔１０ｍＭ トリス−塩酸（ｐＨ８．０）、１ｍＭ エチレンジアミン四酢酸（以下、ＥＤＴＡと略記する）〕０．０１５ｍｌに溶解した。
該溶液に制限酵素ＨｉｎｄIIIおよびＫｐｎＩを添加し、ＰＣＲで増幅されたＤＮＡを消化した。
該溶液をアガロースゲル電気泳動にかけ、該アガロースゲルより約１．１ｋｂのＨｉｎｄIII−ＫｐｎＩ処理ＤＮＡ断片を単離した。
該ＤＮＡ断片（５０ｎｇ）とマルチクローニング部位を持つプラスミドベクターpBluescript II SK(-)〔ストラタジーン(Stratagene)社製〕のＨｉｎｄIII−ＫｐｎＩ切断２．９ｋｂ断片（３０ｎｇ）をＤＮＡライゲーションキットＶｅｒ．ｌ（宝酒造社製）を用いて連結した（反応液量０．０１８ｍｌ）。
該反応液を用い、大腸菌ＤＨ５α株〔ギブコ・ビー・アール・エル(GibcoBRL)社製ライブラリー・エフィシェンシーＤＨ５αコンピテントセル〕を定法に従って形質転換し、該形質転換株を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布後、３７℃で一晩培養した。
生育してきた形質転換株数株から公知の方法〔バーンボイム(Birnboim)ら；ヌクレイック・アシッヅ・リサーチ(Nucleic Acids Res.), 7, 1513 (1979)〕に従ってプラスミドを単離した。
該プラスミド中の挿入断片の塩基配列を、タック・ダイデオキシ・ターミネータ・サイクル・シークエンス・キット〔Taq DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing Kit、アプライド・バイオシステムズ社製、商品番号401113〕およびABI373A ＤＮＡシーケンサー〔アプライト・バイオシステムズ社製〕を用いて決定した。塩基配列の決定に際して、ＴＰＯ遺伝子の塩基配列〔デサベイジ(de Sauvage)ら，ネイチャー(Nature), 369, 533 (1994)〕をもとに配列番号９〜１３または１４で示される塩基配列を有する６つのＤＮＡおよびベクター中の塩基配列を含む配列番号１５または１６で示される塩基配列を有する２つのプライマーを合成し、塩基配列決定に用いるプライマーとして用いた。
塩基配列決定方法はキットおよび装置の説明書に従った。
該プラスミドのうち、挿入断片の塩基配列が報告されているＴＰＯ遺伝子の塩基配列と一致したプラスミド、ｐＢＳ−ＴＰＯ３３２を以後の操作に用いた。
２．  ＴＰＯ−ＮＤ２８をコードするＤＮＡの造成とその発現
実施例１−１．で得られたＴＰＯをコードするＤＮＡ、および特開昭63-267292に記載された方法により得られたＮＤ２８をコードするＤＮＡを用いて、ＴＰＯとＮＤ２８の融合ポリペプチド（Ｎ末側にＴＰＯ、Ｃ末側にＮＤ２８）ＴＰＯ−ＮＤ２８を以下のようにして作製した。
１）ＴＰＯ−ＮＤ２８（１）〔配列番号２；リンカー(GlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlySerArg;配列番号１７）を介するタイプ〕をコードするＤＮＡ（配列番号５）の造成
成熟型ＴＰＯは３３２アミノ酸よりなるが、このうちＮ末側１５３アミノ酸からなる短縮型蛋白質でも完全長ＴＰＯと変わらない活性を示すことが報告されている〔デサベイジ(de Sauvage)ら,ネイチャー(Nature), 369, 533 (1994)〕ことより、Ｎ末側にＴＰＯのＮ末から１５３番目までのアミノ酸、Ｃ末側に完全長ＮＤ２８（１７４アミノ酸）がリンカー(GlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlySerArg)を介して結合したＴＰＯ−ＮＤ２８（１）をコードするＤＮＡを、以下のようにして作製した（第１図参照）。
▲１▼  ＴＰＯ−ＮＤ２８（１）のＴＰＯ部分をコードするＤＮＡの作製
ＴＰＯ−ＮＤ２８（１）のＴＰＯ部分をコードするＤＮＡをＰＣＲ法を用いて作製するために、３’末側のプライマーとして、リンカーのアミノ酸配列に対応する塩基配列（配列番号１８）を有するＤＮＡプライマー（以下、プライマー３と略記する）を合成した。
このプライマー３とプライマー１およびｐＢＳ−ＴＰＯ３３２とを用いて、以下のようにＰＣＲを行った。
ｐＢＳ−ＴＰＯ３３２ １０ｎｇ、４００ｎＭ プライマー３、４００ｎＭ プライマー１、２０ｍＭ トリス−塩酸（ｐＨ８．２）、１０ｍＭ 塩化カリウム、０．０１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、２ｍＭ 塩化マグネシウム、６ｍＭ 硫酸アンモニウム、０．１％ トリトンＸ−１００、１０％ ＤＭＳＯ、０．０５ｍＭ ｄＡＴＰ、０．０５ｍＭ ｄＣＴＰ、０．０５ｍＭ ｄＧＴＰ、０．０５ｍＭ ｄＴＴＰを含む反応液０．１ｍｌにＰｆｕポリメラーゼ ２．５単位を加え、パーキンエルマ・シータス・ＤＮＡ・サーマル・サイクラー（PERKIN ELMER CETUS DNA Thermal Cycler、宝酒造社製）を用いて、９４℃／４５秒、５０℃／１分、７２℃／１分間のインキュベーション工程を１８回繰り返すことによりＰＣＲを行った。
該反応液を用いて、フェノール／クロロホルム抽出およびエタノール沈殿を行い、得られた沈殿をＴＥ緩衝液０．０１５ｍｌに溶解した。
該溶液に制限酵素ＨｉｎｄIIIおよびＸｂａＩを添加し、ＰＣＲで増幅されたＤＮＡを消化した。
該溶液をアガロースゲル電気泳動にかけ、該アガロースゲルより約０．６ｋｂのＨｉｎｄIII−ＸｂａＩ処理ＤＮＡ断片を単離した。
該ＤＮＡ断片（１００ｎｇ）とpBluescript II SK(-)のＨｉｎｄIII−ＸｂａＩ切断２．９ｋｂ断片（５０ｎｇ）をＤＮＡライゲーションキットＶｅｒ．１〔宝酒造社製〕を用いて連結した（反応液量０．０１８ｍｌ）。
該反応液を用い、大腸菌ＤＨ５α株を定法に従って形質転換し、該形質転換株を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布後、３７℃で一晩培養した。
生育してきた形質転換株数株から公知の方法に従ってプラスミドを単離した。
該プラスミド中の挿入断片の塩基配列を、タック・ダイデオキシ・ターミネータ・サイクル・シークエンス・キットおよびABI373A ＤＮＡシーケンサー〔アプライド・バイオシステムズ社製〕を用いて決定した。塩基配列の決定に際して、配列番号９〜１２、１５および１６に示した塩基配列を有するプライマーを塩基配列決定に用いるプライマーとして用いた。
塩基配列決定方法はキットおよび装置の説明書に従った。
該プラスミドのうち、挿入断片の塩基配列が報告されているＴＰＯ遺伝子の塩基配列と一致した、プラスミドｐＢＳ−Ｔ１５３ＬＮＤを以後の操作に用いた。
▲２▼  ＴＰＯ−ＮＤ２８（１）のＮＤ２８部分をコードするＤＮＡの作製
ＴＰＯ−ＮＤ２８（１）のＮＤ２８部分をコードするＤＮＡをＰＣＲ法を用いて作製するために、５’末端のプライマーとして、リンカーおよびＮＤ２８のアミノ酸配列に対応する塩基配列（配列番号１９）を有するプライマー（以下、プライマー４と略記する）を、３’末端のプライマーとしてＮＤ２８のＣ末端側のアミノ酸配列に対応する塩基配列を含む塩基配列（配列番号２０）を有するプライマー（以下、プライマー５と略記する）を合成した。
これらのプライマーおよびＮＤ２８をコードするＤＮＡを含むプラスミドｐＣｆＢＤ２８（特開昭63-267292）を用いて、以下のＰＣＲ反応を行った。
ｐＣｆＢＤ２８ １０ｎｇ、４００ｎＭ プライマー４、４００ｎＭ プライマー５、２０ｍＭ トリス−塩酸（ｐＨ８．２）、１０ｍＭ 塩化カリウム、０．０１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、２ｍＭ 塩化マグネシウム、６ｍＭ 硫酸アンモニウム、０．１％ トリトンＸ−１００、１０％ ＤＭＳＯ、０．０５ｍＭ ｄＡＴＰ、０．０５ｍＭ ｄＣＴＰ、０．０５ｍＭ ｄＧＴＰ、０．０５ｍＭ ｄＴＴＰを含む反応液０．１ｍｌにＰｆｕポリメラーゼ２．５単位を加え、パーキンエルマ・シータス・ＤＮＡ・サーマル・サイクラー（PERKIN ELMER CETUS DNA Thermal Cycler、宝酒造社製）を用いて、９４℃／４５秒、５０℃／１分、７２℃／１分間のインキュベーション行程を１８回繰り返すことによりＰＣＲを行った。
該反応液を用いて、フェノール／クロロホルム抽出およびエタノール沈殿を行い、得られた沈殿をＴＥ緩衝液０．０１５ｍｌに溶解した。
該溶液に制限酵素ＳａｃIIおよびＸｂａＩを添加し、ＰＣＲで増幅されたＤＮＡを消化した。
該溶液をアガロースゲル電気泳動にかけ、該アガロースより約０．５ｋｂのＳａｃII−ＸｂａＩ処理ＤＮＡ断片を単離した。
該ＤＮＡ断片（１００ｎｇ）とpBluescript II SK(-)のＳａｃII−ＸｂａＩ切断２．９ｋｂ断片（５０ｎｇ）をＤＮＡライゲーションキットVer.1（宝酒造社製）を用いて連結した（反応液量０．０１８ｍｌ）。
該反応液を用い、大腸菌ＤＨ５α株を定法に従って形質転換し、該形質転換株を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布後、３７℃で一晩培養した。
生育してきた形質転換株数株から公知の方法に従ってプラスミドを単離した。
該プラスミド中の挿入断片の塩基配列を、タック・ダイデオキシ・ターミネータ・サイクル・シークエンス・キットおよびABI373A ＤＮＡシーケンサーを用いて決定した。塩基配列の決定に際して、ＮＤ２８をコードするＤＮＡの塩基配列を含む配列番号２１または２２に示す塩基配列を有する２種類のＤＮＡ、およびベクターに存在する配列を含む配列番号１５または１６に示す塩基配列を有する２種類のＤＮＡを、塩基配列決定に用いるプライマーとして用いた。
塩基配列決定方法はキットおよび装置の説明書に従った。
該プラスミドのうち、挿入断片の塩基配列がＮＤ２８遺伝子およびプライマーの塩基配列と一致したプラスミド、ｐＢＳ−ＬＮＤ２８を以後の操作に用いた。
▲３▼  ＴＰＯ−ＮＤ２８（１）をコードするＤＮＡの作製
実施例1-2-1)-▲１▼および▲２▼で作製したＴＰＯ部分およびＮＤ２８部分を各々コードするＤＮＡを以下のように連結した。
ｐＢＳ−Ｔ１５３ＬＮＤ ２，０００ｎｇを制限酵素ＳａｃIIおよびＸｂａＩで消化後、アガロースゲル電気泳動にかけ、約３．５ｋｂのＤＮＡ断片を単離した。
また、５００ｎｇのｐＢＳ−ＬＮＤ２８を制限酵素ＳａｃIIおよびＸｂａＩで消化後、アガロースゲル電気泳動にかけ、約０．５ｋｂのＤＮＡ断片を単離した。
該３．５ｋｂのＤＮＡ断片（１００ｎｇ）と約０．５ｋｂのＤＮＡ断片（１００ｎｇ）とをＤＮＡライゲーションキットVer.1〔宝酒造社製〕を用いて連結させた（反応液量０．０１８ｍｌ）。
該反応液を用い、大腸菌ＤＨ５α株を定法に従って形質転換し、該形質転換株を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布後、３７℃で一晩培養した。
生育してきた形質転換株数株から公知の方法に従ってプラスミドを単離した。
制限酵素ＳａｃIIおよびＸｂａＩを用いてプラスミドの構造を調べ、両ＤＮＡ断片が結合した構造を有するプラスミド、ｐＢＳ−Ｔ１５３ＬＮＤ２８を以後の操作に用いた。
２）ＴＰＯ−ＮＤ２８（２）〔配列番号１；リンカーを介さないタイプ〕をコードするＤＮＡ（配列番号４）の造成
ＮＤ２８（１７４アミノ酸）のＮ末にリンカーを介さずにＴＰＯのＮ末から１５４番目までのアミノ酸が結合したＴＰＯ−ＮＤ２８（２）をコードするＤＮＡを、以下のようにして作製した（第２図参照）。
▲１▼  ＴＰＯ−ＮＤ２８（２）のＴＰＯ部分をコードするＤＮＡの作製
ＴＰＯ−ＮＤ２８（２）のＴＰＯ部分をコードするＤＮＡをＰＣＲ法を用いて作製するために、３’側のプライマーとして、ＴＰＯおよびＮＤ２８のアミノ酸配列に対応する塩基配列を有する配列番号２３に示される塩基配列を有するプライマー（以下、プライマー６と略記する）を合成した。
このプライマー６と、プライマー１およびｐＢＳ−ＴＰＯ３３２を用いて、以下のＰＣＲを行った。
ｐＢＳ−ＴＰＯ３３２  １０ｎｇ、４００ｎＭ プライマー１、４００ｎＭ プライマー６、２０ｍＭ トリス−塩酸（ｐＨ８．２）、１０ｍＭ 塩化カリウム、０．０１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、２ｍＭ 塩化マグネシウム、６ｍＭ 硫酸アンモニウム、０．１％ トリトンＸ−１００、１０％ ＤＭＳＯ、０．０５ｍＭ ｄＡＴＰ、０．０５ｍＭ ｄＣＴＰ、０．０５ｍＭ ｄＧＴＰ、０．０５ｍＭ ｄＴＴＰを含む反応液０．１ｍｌにＰｆｕポリメラーゼ２．５単位を加え、パーキンエルマ・シータス・ＤＮＡ・サーマル・サイクラーを用いて、９４℃／４５秒、５０℃／１分、７２℃／１分間のインキュベーション工程を１８回繰り返すことによりＰＣＲを行った。
該反応液を用いて、フェノール／クロロホルム抽出およびエタノール沈殿を行い、得られた沈殿をＴＥ緩衝液０．０１５ｍｌに溶解した。
該溶液に制限酵素ＨｉｎｄIIIおよびＸｈｏＩを添加し、ＰＣＲで増幅されたＤＮＡを消化した。
該溶液をアガロースゲル電気泳動にかけ、該アガロースゲルより約０．５ｋｂのＨｉｎｄIII−ＸｈｏＩ処理ＤＮＡ断片を単離した。
該ＤＮＡ断片（１００ｎｇ）とpBluescript II SK(-)のＨｉｎｄIII−ＸｈｏＩ切断２．９ｋｂ断片（５０ｎｇ）をＤＮＡライゲーションキットＶｅｒ．１（宝酒造社製）を用いて連結した（反応液量０．１８ｍｌ）。
該反応液を用い、大腸菌ＤＨ５α株を定法に従って形質転換し、該形質転換株を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布後、３７℃で一晩培養した。
生育してきた形質転換株数株から公知の方法に従ってプラスミドを単離した。
該プラスミド中の挿入断片の塩基配列を、タック・ダイデオキシ・ターミネータ・サイクル・シークエンス・キットおよびABI373AＤＮＡシーケンサー〔アプライド・バイオシステムズ社製〕を用いて決定した。塩基配列の決定に際して、配列番号９〜１２、１５および１６に示した塩基配列を有するプライマーを塩基配列決定に用いるプライマーとして用いた。
塩基配列決定方法はキットおよび装置の説明書に従った。
該プラスミドのうち、挿入断片の塩基配列がＴＰＯ遺伝子およびプライマーの塩基配列と一致した、プラスミドｐＢＳ−Ｔ１５４ＮＤを以後の操作に用いた。
▲２▼  ＴＰＯ−ＮＤ２８（２）をコードするＤＮＡの作製
実施例1-2-2)-▲１▼で作製したＴＰＯ部分をコードするＤＮＡと実施例1-2-1)-▲２▼で作製したＮＤ２８部分をコードするＤＮＡとを以下のようにして連結した。
ｐＢＳ−Ｔ１５４ＮＤ２００ｎｇを制限酵素ＫｐｎＩおよびＸｈｏＩで消化後、アガロースゲル電気泳動にかけ、約３．５ｋｂのＤＮＡ断片を単離した。
また、ｐＢＳ−ＬＮＤ２８の５００ｎｇを制限酵素ＫｐｎＩおよびＸｈｏＩで消化後、アガロースゲル電気泳動にかけ、約０．５ｋｂのＤＮＡ断片を単離した。
該３．５ｋｂのＤＮＡ断片（１００ｎｇ）と約０．５ｋｂのＤＮＡ断片（１００ｎｇ）とをＤＮＡライゲーションキットVer.1〔宝酒造社製〕を用いて連結させた（反応液量０．０１８ｍｌ）。
該反応液を用い、大腸菌ＤＨ５α株を定法に従って形質転換し、該形質転換株を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布後、３７℃で一晩培養した。
生育してきた形質転換株数株から公知の方法に従ってプラスミドを単離した。
制限酵素ＫｐｎIIおよびＸｈｏＩを用いてプラスミドの構造を調べ、両ＤＮＡ断片が結合した構造を有するプラスミド、ｐＢＳ−Ｔ１５４ＮＤ２８を以後の操作に用いた。
３）ＴＰＯ−ＮＤ２８（３）〔配列番号３；リンカー(SerGlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlyArg；配列番号２４）を介するタイプ〕をコードするＤＮＡ（配列番号６）の造成
Ｎ末側にＴＰＯのＮ末から１５３番目までのアミノ酸、Ｃ末側に完全長ＮＤ２８（１７４アミノ酸）がリンカー(SerGlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlyArg）を介して結合したＴＰＯ−ＮＤ２８（３）をコードするＤＮＡを、以下のようにして作製した（第３図参照）。
実施例1-2-2)-▲１▼で作製したＴＰＯ部分をコードするＤＮＡと実施例1-2-1)-▲２▼で作製したＮＤ２８部分をコードするＤＮＡとをリンカー(SerGlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlyArg）を介して結合させるために、リンカーのアミノ酸配列に対応し、両端がＳｐｌＩ−ＢｂｅＩ相補的な末端を生じる塩基配列を有する、配列番号２５および２６に示す２種類のＤＮＡを合成した。
配列番号２５で示されたＤＮＡを０．０１ｍＭ、５ｍＭ ＡＴＰ、５０ｍＭ トリス−塩酸（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ 塩化マグネシウムおよび５ｍＭ ジチオスレイトールを含む溶液０．０２ｍｌにＴ４・ポリヌクレオチド・キナーゼ（Ｔ４ Polynucleotide Kinase、宝酒造社製）１０単位を加え、３７℃で３０分間放置後、７０℃で３分間加熱し、処理液１を得た。
配列番号２６で示されたＤＮＡについても同様の操作を行い、処理液（２）を得た。
処理液（１）および処理液（２）を混合して、９０℃で５分間保温後、３時間かけて２２℃に冷却し、二本鎖ＤＮＡを作製した。
該二本鎖ＤＮＡを実施例1-2-2)-▲２▼で取得したｐＢＳ−Ｔ１５４ＮＤ２８のＴＰＯをコードする遺伝子とＮＤ２８をコードする遺伝子の連結部位に以下のように挿入した。
ｐＢＳ−Ｔ１５４ＮＤ２８  ２，０００ｎｇを制限酵素ＢｂｅＩおよびＳｐｌＩで消化後アガロースゲル電気泳動にかけ、約４．０ｋｂのＤＮＡ断片を単離した。
該約４．０ｋｂのＤＮＡ断片（１００ｎｇ）と上記二本鎖ＤＮＡ（１２．５ｐｍｏｌｅ）とをＤＮＡライゲーションキットVer.1〔宝酒造社製〕を用いて連結させた（反応液量０．０１８ｍｌ）。
該反応液を用い、大腸菌ＤＨ５α株を定法に従って形質転換し、該形質転換株を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布後、３７℃で一晩培養した。
生育してきた形質転換株数株から公知の方法に従ってプラスミドを単離した。
該プラスミド中の挿入断片の塩基配列を、タック・ダイデオキシ・ターミネータ・サイクル・シークエンス・キットおよびABI373A ＤＮＡシーケンサーを用いて決定した。塩基配列を決定する際に、配列番号１２および配列番号２２に示される２種類のＤＮＡをプライマーとして用いた。塩基配列決定法はキットおよび装置の説明書に従った。
該プラスミドのうち、挿入断片の塩基配列がリンカーＤＮＡの塩基配列と一致したプラスミド、ｐＢＳ−１５３ＮＤ２８ＬＮ１を以後の操作に用いた。
実施例２  ＴＰＯ−ＣＳＦの生産
ＴＰＯ−ＣＳＦをコードするＤＮＡを動物細胞で以下のようにして発現させ、ＴＰＯ−ＣＳＦを生産した。
１）ＴＰＯ−ＮＤ２８（１）およびＴＰＯ−ＮＤ２８（２）の生産
プラスミドｐｃＤＮＡ３〔インヴィトロージェン(Invitrogen)社製〕をＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩで消化後アガロースゲル電気泳動にかけ、約５．４ｋｂのＤＮＡ断片（ベクター側）を単離した。
また、実施例1-2-1)-▲３▼および実施例1-2-2)-▲２▼で取得したｐＢＳ−Ｔ１５３ＬＮＤ２８およびｐＢＳ−Ｔ１５４ＮＤ２８をそれぞれＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩで消化後、アガロースゲル電気泳動にかけ、各々より約１．１ｋｂのＤＮＡ断片（インサート側）を単離した。
ベクター側約５．４ｋｂのＤＮＡ断片（１００ｎｇ）と各インサート側ＤＮＡ断片（１００ｎｇ）を、ＤＮＡライゲーションキットVer.1を用いて連結させた（反応液量各０．０１８ｍｌ）。
該反応液を用い、大腸菌ＤＨ５α株を定法に従って形質転換し、該形質転換株を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布後、３７℃で一晩培養した。
生育してきた形質転換株数株から公知の方法に従ってプラスミドを単離した。
制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩを用いてプラスミドの構造を調べ、ベクター側およびインサート側ＤＮＡ断片が結合した構造を有するプラスミドを各々のインサートにつき選択し、ＴＰＯ−ＮＤ２８（１）をコードする遺伝子を含有するプラスミドｐＣＤ−１５３ＬＮＤ２８およびＴＰＯ−ＮＤ２８（２）をコードする遺伝子を含有するプラスミド、ｐＣＤ−１５４ＮＤ２８を以後の操作に用いた。
ｐＣＤ−１５３ＬＮＤ２８またはｐＣＤ−１５４ＮＤ２８をエレクトロポレーション法〔ポッター(Potter)ら、プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス(Proc. Natl. Acad. Sci.) USA., 81, 7161 (1984)〕により動物細胞に導入し、以下のようにして発現を行った。
ＣＯＳ７細胞を１０％ ウシ胎仔血清を添加したＤ−ＭＥＭ培地〔ギブコ・ビー・アール・エル(GibcoBRL)社製、商品番号11885-50〕中で培養した。
該培養により得られたＣＯＳ７細胞をＫ−ＰＢＳ緩衝液〔１３７ｍＭ 塩化カリウム、２．７ｍＭ 塩化ナトリウム、８．１ｍＭ リン酸一水素二ナトリウム、１．５ｍＭ リン酸二水素一ナトリウム、４ｍＭ 塩化マグネシウム〕に懸濁し、８×１０8細胞／ｍｌの細胞懸濁液を調製した。
該懸濁液０．２ｍｌを溝幅０．２ｃｍのパルサーキュベット〔Pulser Cuvette、バイオラッド(BIO-RAD）社製〕に注入した。
該キュベットにｐＣＤ−１５３ＬＮＤ２８またはｐＣＤ−１５４ＮＤ２８を４μｇ加え、よく混合した後、エレクトロポレーション装置ジーンパルサー〔Gene Pulser、バイオラッド(BIO-RAD）社製〕を用い、２００Ω、０．３ｋｖ／ｃｍ、０．１２５ｍＦの条件でパルス印加を行った。
該パルス処理液を氷中に５分間静置後、１０％ ウシ胎仔血清を添加したＤ−ＭＥＭ培地１０ｍｌに懸濁し、ＣＯ2インキュベーター中、３７℃で７２時間培養した。
該培養液を遠心分離し、得られた培養上清を孔径２２０ｎｍのフィルターを用いて濾過することにより、ＴＰＯ−ＮＤ２８（１）またはＴＰＯ−ＮＤ２８（２）溶液を得た。
２）ＴＰＯ−ＮＤ２８（３）の生産
ＴＰＯ−ＮＤ２８（３）を発現させるためのベクターとしてｐＡＧＥ２１０を用いた。ｐＡＧＥ２１０は、ｐＡＧＥ２４８〔佐々木(Sasaki)ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(J.Biol.Chem.), 269, 14730 (1994)〕の誘導体であり、ｐＡＧＥ２４８のモロニー・ムリン・リューケミア・バイラス・プロモーター（Moloney murine leukemia virus promoter、ＸｈｏＩ−ＨｉｎｄIII断片）をｐＡＧＥ１０３〔水上(Mizukami)ら、ジャーナル・オブ・バイオケミストリー(J.Biochem.), 101, 1307 (1987)〕のＳＶ４０ アーリー・プロモーター（SV40 early promoter、ＸｈｏＩ−ＨｉｎｄIII断片）で置き換えられたベクターである。
ｐＡＧＥ２１０をＫｐｎＩおよびＨｉｎｄIIIで消化後、アガロースゲル電気泳動にかけ、約９．０ｋｂのＤＮＡ断片（ベクター側）を単離した。
別に、実施例1-1で取得したｐＢＳ−ＴＰＯ３３２をＫｐｎＩおよびＨｉｎｄIII消化したもの、および、実施例1-2-3)で取得したｐＢＳ−１５３ＮＤ２８ＬＮ１をＫｐｎＩで消化後ＨｉｎｄIIIで部分消化したものをそれぞれアガロースゲル電気泳動にかけ、各々約１．１ｋｂのＤＮＡ断片（インサート側）を単離した。
ベクター側約９．０ｋｂＤＮＡ断片（１００ｎｇ）と各インサート側約１．１ｋｂＤＮＡ断片（１００ｎｇ）を、ＤＮＡライゲーションキットＶｅｒ．１を用いて連結した（反応液量０．０１２ｍｌ）。
該反応液を用い、大腸菌ＤＨ５α株を定法に従って形質転換し、該形質転換株を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布後、３７℃で一晩培養した。
生育してきた形質転換株数株から公知の方法に従ってプラスミドを単離した。
制限酵素ＫｐｎＩを用いてプラスミドの構造を調べ、ベクター側およびインサート側ＤＮＡ断片が結合した構造を有するプラスミドを各々のインサートにつき選択し、ＴＰＯをコードする遺伝子を含有するプラスミドｐＡＧＥ２１０−Ｔ３３２およびＴＰＯ−ＮＤ２８（３）をコードする遺伝子を含有するプラスミドｐＡＧＥ２１０−ＬＮ１を以後の操作に用いた。
ｐＡＧＥ２１０−Ｔ３３２またはｐＡＧＥ２１０−ＬＮ１をエレクトロポレーション法により動物細胞に導入した。
ＣＨＯ細胞を１０％ウシ胎仔血清を添加したＭＥＭ培地(1)〔ギブコ・ビー・アール・エル(GibcoBRL)社製、コード番号19000-024〕中で培養した。
該培養により得られたＣＨＯ細胞をＫ−ＰＢＳ緩衝液に懸濁し、８×１０6細胞／ｍｌの細胞懸濁液を調製した。
該懸濁液０．２ｍｌを溝幅０．２ｃｍのパルサーキュベットに注入した。
該キュベットにｐＡＧＥ２１０−Ｔ３３２またはｐＡＧＥ２１０−ＬＮ１を４μｇ加え、充分混合した後、エレクトロポレーション装置ジーンパルサーを用いて、０．３５ｋＶ／ｃｍ、０．２５ｍＦの条件でパルス印加を行った。
該パルス処理液を氷中５分間静置した後、１０％ ウシ胎仔血清を添加したＭＥＭ培地１０ｍｌに懸濁し、ＣＯ2インキュベーターにて３７℃で２４時間培養した。
該培養細胞を１０％ ウシ胎仔血清およびハイグロマイシンを０．３ｍｇ／ｍｌ添加したＭＥＭ培地(1)で２週間培養した。
該培養細胞を１０％ ウシ胎仔血清およびメトトレキセート（以下、ＭＴＸと略す）を５０ｎＭ添加したＭＥＭ培地(2)〔ギブコ・ビー・アール・エル社製、コード番号12000-022〕で２週間培養した。
同様に、１００ｎＭ、５００ｎＭ、１０００ｎＭとＭＴＸ濃度を順次増加させた培地で培養し、１０００ｎＭ ＭＴＸ耐性株を取得した。
該１０００ｎＭ ＭＴＸ耐性各株を１０％ウシ胎仔血清を添加したＭＥＭ培地(2)で生育させ、ＣＨＯ細胞用無血清培地CHO-S-SFMII〔ギブコ・ビー・アール・エル社製、コード番号12052-015〕に交換し、９６から１４４時間培養した。
該培養液を遠心分離することにより、ＴＰＯまたはＴＰＯ−ＮＤ２８（３）を含有する培養上清を得た。
実施例３  ＴＰＯ−ＮＤ２８（３）およびＴＰＯの精製
実施例2-2)で取得したＴＰＯ−ＮＤ２８（３）またはＴＰＯ１０００ｍｌをセントリプレップ（centriprep、アミコン社製）を用いて５０ｍｌまで濃縮し濃縮液を作製した。
ＸＫ５０カラム（ファルマシア社製）にセファクリルＳ−２００（Sephacryl S-200樹脂、ファルマシア社製）１０００ｍｌを充填しリン酸緩衝液〔９．４ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ〕を満たしておいたカラムに、該濃縮液５０ｍｌを通塔した。
リン酸緩衝液を３ｍｌ／分の速さでカラムに流し、ＴＰＯ−ＮＤ２８（３）またはＴＰＯを溶出した。
該溶出液を１２．５分ごとに分画し、後述のＭＴＴアッセイ法によりＴＰＯおよびＧ−ＣＳＦ活性を測定することによりＴＰＯ−ＮＤ２８（３）またはＴＰＯの精製物を取得した。
実施例４  ＴＰＯ−ＮＤ２８（３）のポリエチレングリコールによる修飾
２０ｋｄ ポリエチレングリコール−サクシンイミジル プロピオネイト（20kd PEG-Succinimidyl Propionate、シェアーウオターポリマーズ社製）を４００ｍｇ／ｍｌになるよう氷冷水に加えた。
該水溶液５０μｌ、実施例３で取得したＴＰＯ−ＮＤ２８（３）溶液２００μｌおよび蒸留水１５０μｌを混合し、４℃で１２時間反応させ、ＴＰＯ−ＮＤ２８（３）のポリエチレングリコールによる修飾を行った。
ポリエチレングリコールにより修飾したＴＰＯ−ＮＤ２８（３）〔以下、ＰＥＧ−ＴＰＯ−ＮＤ２８（３）と略す〕を、予めリン酸緩衝液（９．４ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ  ７．２）、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ）で満たしておいたスーパーローズ６１０／３０（ファルマシア社製）に通塔した。
リン酸緩衝液を０．５ｍｌ／分の速さでカラムに流し、溶出を行った。
該溶出液を１分おきに分画し、後述のＭＴＴアッセイ法によりＧ−ＣＳＦ活性およびＴＰＯ活性を調べた。
結果を第５表に示した。
溶出時間３４から４０分に未修飾のＴＰＯ−ＮＤ２８（３）に由来するＧ−ＣＳＦ活性およびＴＰＯ活性が検出され、１６から２８分にＰＥＧ−ＴＰＯ−ＮＤ２８（３）に由来するＧ−ＣＳＦ活性およびＴＰＯ活性が検出された。
該結果よりＧ−ＣＳＦ活性およびＴＰＯ活性の両活性を有する、ポリエチレングリコールにより修飾されたＴＰＯ−ＣＳＦを取得可能であることがわかった。
0003763846.tif 000006
試験例１  ＴＰＯ−ＮＤ２８の分子量の測定
実施例2-1)で取得したＴＰＯ−ＮＤ２８（１）溶液を用い、ゲル濾過クロマトグラフィーにより、以下のようにして分子量を測定した。
予めリン酸緩衝液〔９．４ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ〕で調製しておいたスーパーローズ６ １０／３０（ファルマシア社製）にＴＰＯ−ＮＤ２８（１）溶液０．２ｍｌを通塔し、リン酸緩衝液を０．５ｍｌ／分の速さでカラムに流しＴＰＯ−ＮＤ２８（１）を溶出した。
溶出液を０．５分おきに分画してＴＰＯ活性ならびにＧ−ＣＳＦ活性を後述のＭＴＴアッセイにより測定した。
第６表にスーパーローズからの溶出時間とＴＰＯおよびＧ−ＣＳＦ活性の測定値を示した。
ＴＰＯおよびＧ−ＣＳＦ活性は溶出時間３３．５分で最大であった。
別に、分子量の標準となる蛋白質であるチログロブリン（分子量６７万）、アルドラーゼ（分子量１６万）、ウシ血清アルブミン（分子量６．９万）、Ｇ−ＣＳＦ（分子量２万）をスーパーローズに流して、溶出時間と分子量との相関を求めた。
溶出時間３３．５分から推定されるＴＰＯ−ＮＤ２８（１）の分子量は約４万であった。
0003763846.tif 000007
試験例２ ＴＰＯ−ＣＳＦの生物学的活性
被検定細胞における、被検定液（ＴＰＯ−ＮＤ２８溶液）による細胞増殖刺激活性を測定するための基本的な構成は以下の通りである。
被検定液（ＴＰＯ−ＮＤ２８溶液）、ＴＰＯ標準溶液およびＮＤ２８標準溶液について、各々１０倍連続希釈溶液を調製し、それぞれを微量検定皿の各ウェルに０．０１ｍｌずつ添加する。
活発に増殖している被検定細胞を培養物から遠心分離により収穫、洗浄後、各検定用に最適な細胞濃度となるように検定用の培地に再懸濁する。
被検定希釈液、ＴＰＯ標準希釈液またはＮＤ２８標準希釈液を０．０１ｍｌずつ添加しておいた、上記微量検定皿の各ウェルに、該細胞懸濁液を０．０９ｍｌずつ添加する。
該微量検定皿を３７℃、５％ ＣＯ２で完全に湿ったインキュベーター中にインキュベートした後、以下の検定を行う。
各ウェルに０．５ｍｇ／ｍｌのＭＴＴ〔3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide〕０．０１ｍｌを添加し４時間インキュベート後、０．１Ｎ 塩酸／イソプロピルアルコール液を０．１５ｍｌ添加し、攪拌して細胞より色素抽出した後、該色素量を５４０ｎｍの吸光度で測定することにより細胞増殖を判定した。
以後、細胞増殖刺激活性を測定するための上記測定法をＭＴＴアッセイとよぶ。
（１）Ｂａ／Ｆ３細胞に対する細胞増殖刺激活性の測定
マウスＩＬ−３の存在に依存して増殖するＢａ／Ｆ３細胞を、イスコーブ改変ダルベッコ培地（以下、ＩＭＤＭと略記する）に１０％ 加熱不活性胎児血清（以下、ＦＣＳと略記する）およびマウスＩＬ−３（ＷＥＨＩ−３Ｂの培養上清）を添加した培地で培養した。
該培養Ｂａ／Ｆ３細胞を用い、マウスＩＬ−３の存在しない上記と同じ組成の培地を用いＭＴＴアッセイによる細胞増殖刺激活性の測定を行った。
細胞の播種密度は１ウェル当たり１０，０００細胞で、プレートを５％ ＣＯ２中で４８時間インキュベートする条件でＭＴＴアッセイを行った。
ＭＴＴアッセイの結果、ＴＰＯ、ＮＤ２８、ＴＰＯ−ＮＤ２８（１）、（２）および（３）いずれもＢａ／Ｆ３細胞の細胞増殖刺激活性を有しなかった。
（２）Ｂａ／Ｆ３−ｃｍｐｌに対する細胞増殖刺激活性の測定
マウスＩＬ−３またはＴＰＯの存在に依存して増殖するＢａ／Ｆ３−ｃｍｐｌ細胞を、ＩＭＤＭに１０％ 加熱不活化ＦＣＳ、０．５ｍｇ／ｍｌ Ｇ４１８およびマウスＩＬ−３（ＷＥＨＩ−３Ｂの培養上清）を添加した培地で培養した。
該培養Ｂａ／Ｆ３−ｃｍｐｌ細胞を用い、マウスＩＬ−３の存在しない上記と同じ組成の培地を用いＭＴＴアッセイによる細胞増殖刺激活性の測定を行った。
細胞の播種密度は１ウェル当たり１０，０００細胞で、プレートを５％ ＣＯ２中で４８時間インキュベートする条件でＭＴＴアッセイを行った。
ＭＴＴアッセイの結果、ＴＰＯ、ＴＰＯ−ＮＤ２８（１）、（２）および（３）はＢａ／Ｆ３−ｃｍｐｌ細胞の細胞増殖刺激活性を有していた。
（３）ＮＦＳ−６０細胞に対する細胞増殖刺激活性の測定
ヒトＧ−ＣＳＦまたはマウスＩＬ−３の存在に依存して増殖するＮＦＳ−６０細胞を、ＲＰＭＩ培地に１０％ 加熱不活化ＦＣＳ、２ｍＭ グルタミン、Ｐ／Ｓ（１００Ｕ／ｍｌ ペニシリン、１００ｍｇ／ｍｌ ストレプトマイシン）および１．０ｎｇ／ｍｌの組換え型ヒトＧ−ＣＳＦを添加した培地で培養した。
該培養ＮＦＳ−６０細胞を用い、Ｇ−ＣＳＦの存在しない上記と同じ組成の培地を用いＭＴＴアッセイによる細胞増殖刺激活性の測定を行った。
細胞の播種密度は１ウェル当たり１０，０００細胞で、プレートを５％ ＣＯ２中で４８時間インキュベートする条件でＭＴＴアッセイを行った。
ＭＴＴアッセイの結果、ＮＤ２８、ＴＰＯ−ＮＤ２８（１）、（２）および（３）はＮＦＳ−６０細胞の細胞増殖刺激活性を有していた。
試験例３  ＴＰＯ−ＮＤ２８のマウス骨髄細胞に及ぼす影響
８週令ＢＡＬＢ／ｃマウスを屠殺後、大腿骨、脛骨を取りだし両端を鋏で切断した。該大腿骨、脛骨の切断片に１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ溶液を入れた注射器の針を挿入し骨髄細胞を小試験官に吹きだし、５分間静置した。
該試験管より、パスツールピペットで沈殿物を取らないように上清を吸い上げ、該上清をニコプレップ1.077アニマル〔Nycoprep 1.077 Animal；ニコメッド（NYCOMED）社製、商品番号1002380〕の上に重層し、６００ｇで１５分間遠心分離することによりマウス単核細胞（Mono Nuclear cells：以下、ＭＮＣと略す）を単離した。
被検定液、ＦＣＳ １０％、ＢＳＡ １％およびトランスフェリン〔Transferrin、ベーリンガー・マンハイム（Boehringer manheim）社製〕０．６ｍｇ／ｍｌを含有する溶融で、該ＭＮＣを５ｘ１０5細胞／ｍｌとなるように調製し、ＣＯ2インキュベータ（ＣＯ2 incubator BNA-120D、タバイ（TABAI）社製）中で３７℃、５％  ＣＯ2、９５％以上の湿度の条件のもと５日間培養した。
このときの被検定液としては、最終濃度１．０、１０、１００ｎｇ／ｍｌのＴｐｏ、ＮＤ２８またはＴＰＯ−ＮＤ２８溶液、あるいは該濃度のＴｐｏとＮＤ−２８を等量混合した溶液（ＴＰＯ／ＮＤ２８）を用いた。ＴｐｏおよびＮＤ−２８は実施例３で取得したものを用いた。
該培養後、ＭＮＣの分化の状態を、巨核球系への分化の指標であるＣＤ６１〔ジャーナル オブ メディスン（J. Med.） 311, 1084 (1984)〕の発現量、顆粒球系への分化の指標であるＧｒ−１〔ジャーナル オブ イムノロジー（J. Immunol.） 144, 22 (1991)〕  の発現量を測定することにより調べた。
抗マウスＣＤ６１−ＦＩＴＣ抗体〔anti mouse CD61-FITC Monoclonal Antibody、ファーミンジェン（PHARMINGEN）社製、商品番号01864D〕および抗マウスＧｒ−１−ＰＥ抗体〔anti mouse Gr-1-PE Monoclonal Antibody、ファーミンジェン（PHARMINGEN）社製、商品番号01215A〕で染色した後、エリート フロー サイトメーター〔ELITE flow cytometer、コールター（Coulter）社製〕を用いてＣＤ６１、Ｇｒ−１の発現量を測定した。
結果を第７表に示した。
0003763846.tif 000008
ＴＰＯとＮＤ２８を等量混合した被検液（ＴＰＯ／ＮＤ２８）を添加した場合には、ＮＤ２８単独の被検液を添加したときと同程度に、Ｇｒ−１発現細胞が出現し、ＭＮＣが顆粒球系へ分化していたが、ＣＤ６１発現細胞の出現率は、ＴＰＯ単独の被検液を添加したときよりも低くなり、巨核球系への分化が減少していた。このことは等量のＴＰＯとＮＤ２８が存在する場合、ＭＮＣはよりＮＤ２８に反応して顆粒球系への分化が進むことを示唆している。
しかしながら、ＴＰＯとＮＤ２８の融合ポリペプチドであるＴＰＯ−ＮＤ２８を被検液として添加した場合には、ＣＤ６１発現細胞の出現率は、ＴＰＯ単独の被検液を添加したときと同等以上であり、ＴＰＯ／ＮＤ２８添加の場合の２倍以上であった。しかも、Ｇｒ−１発現細胞の出現率も、ＮＤ２８単独の被検液を添加したときと同等であった。
試験例４  マウスにおける血小板および白血球産生促進作用
ＢＡＬＢ／ｃマウス（雄、７週齢）に実施例３で取得したＴＰＯ １０μｇ／ｍｌまたはＴＰＯ−ＮＤ２８（３） １０μｇ／ｍｌ溶液をマウスの体重２０ｇあたり０．２ｍｌの投与容量で試験の１日目より１日１回連続４日間皮下投与した（処理群、１群４匹）。試験の５日目に個体毎に眼底静脈より採決しミクロセルカウンター（東亜医用電子社製、Sysmex F800）により血小板および白血球数を計測した。
実施例2-2)に記載した方法により、ＴＰＯまたはＴＰＯ−ＮＤ２８（３）遺伝子を発現させるために用いたプラスミドｐＡＧＥ２１０をＣＨＯ細胞に導入後、培養し、該培養上清を用いて、実施例３に記載したＴＰＯ−ＮＤ２８（３）の精製と同じ操作を行い、ＴＰＯ−ＮＤ２８（３）の溶出画分に相応する溶出画分をブランク溶液として用い、上記と同様の操作を行い、血小板および白血球数を計測した。
ＴＰＯおよびＴＰＯ−ＮＤ２８（３）の効果を比較検討するために、ブランク溶液投与群に対する両物質投与群の血小板および白血球数の増加率（％）を次式から算出した。
0003763846.tif 000009
結果を第８表に示した。
0003763846.tif 000010
産業上の利用可能性
本発明により、Ｇ−ＣＳＦ活性を有するポリペプチドとＴＰＯ活性を有するポリペプチドとからなる融合ポリペプチドが提供される。本発明の融合ポリペプチドは、血小板と好中球とを同時に生成・増幅させることができ、巨核球コロニー形成ならびに好中球コロニー形成、巨核球前駆体および好中球前駆体の分化または成熟を制御することができる。
配列表
配列番号：1
配列の長さ：328
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源
生物名：ヒト(Homo sapiens)
配列の特徴：
特徴を表す記号:
存在位置：1..154
特徴を表す記号:
存在位置：154..328
配列
0003763846.tif 000011
0003763846.tif 000012
配列番号：2
配列の長さ：340
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源
生物名：ヒト(Homo sapiens)
配列の特徴：
特徴を表す記号：
存在位置：1..153
特徴を表す記号:
存在位置：167..340
配列
0003763846.tif 000013
0003763846.tif 000014
配列番号：3
配列の長さ：344
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源
生物名：ヒト(Homo sapiens)
配列の特徴：
特徴を表す記号:
存在位置：1..153
特徴を表す記号:
存在位置：171..344
配列
0003763846.tif 000015
0003763846.tif 000016
配列番号：4
配列の長さ：1047
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成DNA
起源
生物名：ヒト(Homo sapiens)
配列の特徴：
特徴を表す記号: sig peptide
存在位置：1..63
特徴を表す記号: CDS
存在位置：64..1047
配列
0003763846.tif 000017
0003763846.tif 000018
0003763846.tif 000019
配列番号：5
配列の長さ：1083
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成DNA
起源
生物名：ヒト(Homo sapiens)
配列の特徴：
特徴を表す記号: sig peptide
存在位置：1..63
特徴を表す記号: CDS
存在位置：64..1083
配列
0003763846.tif 000020
0003763846.tif 000021
0003763846.tif 000022
配列番号：6
配列の長さ：1095
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成DNA
起源
生物名：ヒト(Homo sapiens)
配列の特徴：
特徴を表す記号: sig peptide
存在位置：1..63
特徴を表す記号: CDS
存在位置：64..1095
配列
0003763846.tif 000023
0003763846.tif 000024
0003763846.tif 000025
配列番号：7
配列の長さ：44
配列の型：  核酸
鎖の数：  一本鎖
トポロジー：  直鎖状
配列の種類：  他の核酸  合成ＤＮＡ
配列の特徴：
特徴を示す記号：sig peptide
存在位置：  27..44
配列
0003763846.tif 000026
配列番号：8
配列の長さ：  47
配列の型：  核酸
鎖の数：  一本鎖
トポロジー：  直鎖状
配列の種類：  他の核酸  合成ＤＮＡ
配列の特徴：
特徴を示す記号：CDS
存在位置：  23..47
配列
0003763846.tif 000027
配列番号：9
配列の長さ：  24
配列の型：  核酸
鎖の数：  一本鎖
トポロジー：  直鎖状
配列の種類：  他の核酸  合成ＤＮＡ
配列の特徴：
特徴を示す記号：CDS
存在位置：  1..24
配列
0003763846.tif 000028
配列番号：10
配列の長さ：  24
配列の型：  核酸
鎖の数：  一本鎖
トポロジー：  直鎖状
配列の種類：  他の核酸  合成ＤＮＡ
配列の特徴：
特徴を示す記号：CDS
存在位置：  1..24
配列
0003763846.tif 000029
配列番号：11
配列の長さ：  24
配列の型：  核酸
鎖の数：  一本鎖
トポロジー：  直鎖状
配列の種類：  他の核酸  合成ＤＮＡ
配列の特徴：
特徴を示す記号：CDS
存在位置：  1..24
配列
0003763846.tif 000030
配列番号：12
配列の長さ：  24
配列の型：  核酸
鎖の数：  一本鎖
トポロジー：  直鎖状
配列の種類：  他の核酸  合成ＤＮＡ
配列の特徴：
特徴を示す記号：CDS
存在位置：  1..24
配列
0003763846.tif 000031
配列番号：13
配列の長さ：  24
配列の型：  核酸
鎖の数：  一本鎖
トポロジー：  直鎖状
配列の種類：  他の核酸  合成ＤＮＡ
配列の特徴：
特徴を示す記号：CDS
存在位置：  1..24
配列
0003763846.tif 000032
配列番号：14
配列の長さ：  24
配列の型：  核酸
鎖の数：  一本鎖
トポロジー：  直鎖状
配列の種類：  他の核酸  合成ＤＮＡ
配列の特徴：
特徴を示す記号：CDS
存在位置：  1..24
配列
0003763846.tif 000033
配列番号：15
配列の長さ：  17
配列の型：  核酸
鎖の数：  一本鎖
トポロジー：  直鎖状
配列の種類：  他の核酸  合成ＤＮＡ
配列
0003763846.tif 000034
配列番号：16
配列の長さ：  17
配列の型：  核酸
鎖の数：  一本鎖
トポロジー：  直鎖状
配列の種類：  他の核酸  合成ＤＮＡ
配列
0003763846.tif 000035
配列番号：17
配列の長さ：  13
配列の型：  アミノ酸
鎖の数：  一本鎖
トポロジー：  直鎖状
配列の種類：  ペプチド
配列
0003763846.tif 000036
配列番号：18
配列の長さ：  66
配列の型：  核酸
鎖の数：  一本鎖
トポロジー：  直鎖状
配列の種類：  他の核酸  合成ＤＮＡ
配列の特徴：
特徴を示す記号：CDS
存在位置：1..3
特徴を示す記号：CDS
存在位置：43..66
配列
0003763846.tif 000037
配列番号：19
配列の長さ：  45
配列の型：  核酸
鎖の数：  一本鎖
トポロジー：  直鎖状
配列の種類：  他の核酸  合成ＤＮＡ
配列の特徴：
特徴を示す記号：CDS
存在位置：22..45
配列
0003763846.tif 000038
配列番号：20
配列の長さ：  48
配列の型：  核酸
鎖の数：  一本鎖
トポロジー：  直鎖状
配列の種類：  他の核酸  合成ＤＮＡ
配列の特徴：
特徴を示す記号：CDS
存在位置：28..48
配列
0003763846.tif 000039
配列番号：21
配列の長さ：  24
配列の型：  核酸
鎖の数：  一本鎖
トポロジー：  直鎖状
配列の種類：  他の核酸  合成ＤＮＡ
配列の特徴：
特徴を示す記号：CDS
存在位置：1..24
配列
0003763846.tif 000040
配列番号：22
配列の長さ：  24
配列の型：  核酸
鎖の数：  一本鎖
トポロジー：  直鎖状
配列の種類：  他の核酸  合成ＤＮＡ
配列の特徴：
特徴を示す記号：CDS
存在位置：1..24
配列
0003763846.tif 000041
配列番号：23
配列の長さ：  57
配列の型：  核酸
鎖の数：  一本鎖
トポロジー：  直鎖状
配列の種類：  他の核酸  合成ＤＮＡ
配列の特徴：
特徴を示す記号：CDS
存在位置：1..27
特徴を示す記号：CDS
存在位置：28..57
特徴を示す記号：mutation
存在位置：25
特徴を示す記号：mutation
存在位置：33..34
配列
0003763846.tif 000042
配列番号：24
配列の長さ：  17
配列の型：  アミノ酸
鎖の数：  一本鎖
トポロジー：  直鎖状
配列の種類：  ペプチド
配列
0003763846.tif 000043
配列番号：25
配列の長さ：  61
配列の型：  核酸
鎖の数：  一本鎖
トポロジー：  直鎖状
配列の種類：  他の核酸  合成DNA
配列の特徴：
特徴を示す記号：CDS of TPO
存在位置：1..6
特徴を示す記号：linker peptide
存在位置：7..57
特徴を示す記号：CDS of ND28
存在位置：58..61
特徴を示す記号：SplI
存在位置：1..5
特徴を示す記号：MroI
存在位置：7..12
特徴を示す記号：MroI
存在位置：43..48
特徴を示す記号：BbeI
存在位置：58..61
特徴を示す記号：mutation
存在位置：4..5
配列
0003763846.tif 000044
配列番号：26
配列の長さ：  53
配列の型：  核酸
鎖の数：  一本鎖
トポロジー：  直鎖状
配列の種類：  他の核酸  合成DNA
配列の特徴：
特徴を示す記号：CDS of TPO
存在位置：52..53
特徴を示す記号：linker peptide
存在位置：1..51
特徴を示す記号：splI
存在位置：53
特徴を示す記号：MroI
存在位置：10..15
特徴を示す記号：MroI
存在位置：46..51
配列
0003763846.tif 000045
配列番号：27
配列の長さ：349
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源
生物名：ヒト(Homo sapiens)
配列の特徴：
特徴を表す記号： sig peptide
存在位置：-21..-1
配列
0003763846.tif 000046
0003763846.tif 000047
配列番号：28
配列の長さ：361
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源
生物名：ヒト(Homo sapiens)
配列の特徴：
特徴を表す記号： sig peptide
存在位置：-21..-1
配列
0003763846.tif 000048
0003763846.tif 000049
配列番号：29
配列の長さ：365
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源
生物名：ヒト(Homo sapiens
配列の特徴：
特徴を表す記号： sig peptide
存在位置：-21..-1
配列
0003763846.tif 000050
0003763846.tif 000051
【図１】
0003763846.tif 000064
【図２】
0003763846.tif 000065
【図３】
0003763846.tif 000066