(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト由来アンチトロンビン−IIIを有効成分とする脊髄障害予防治療剤。
【請求項２】
ヒト由来アンチトロンビン−IIIを有効成分とする脊髄障害に由来する病態の予防治療剤であって、該脊髄障害に由来する病態が運動機能障害または組織障害のいずれかであることを特徴とする予防治療剤。
【請求項３】
脊髄障害が脊髄損傷または脊髄虚血のいずれかであることを特徴とする請求項１または２記載の予防治療剤。
【請求項４】
運動機能障害が運動麻痺、完全麻痺、半側麻痺、対麻痺、完全対麻痺である、請求項２記載の予防治療剤。
【請求項５】
ヒト由来アンチトロンビン−IIIを有効成分とする脊髄虚血予防治療剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、ヒト由来アンチトロンビン−III （以下、単にＡＴ−III という）の新規作用を利用した新規薬剤に関する。すなわち、ＡＴ−III を有効成分とする運動機能障害予防治療剤、ＡＴ−III を有効成分とする組織障害予防治療剤、ＡＴ−III を有効成分とする脊髄障害予防治療剤、ＡＴ−III を有効成分とする脊髄障害に由来する病態の予防治療剤およびＡＴ−III を有効成分とする脊髄虚血予防治療剤に関する。
【０００２】
【従来技術・発明が解決しようとする課題】
ＡＴ−III は血漿中に存在するα2 グロブリンに属する糖蛋白質の一種で、その分子量は６５，０００〜６８，０００であり、プロテアーゼ阻害活性を有し、トロンビンの凝固活性を強く阻害する。
また、トロンビンに対する阻害作用のみならず、その他の凝固因子、例えば活性化Ｘ因子、活性化IX因子などに対する阻害作用をも有している。その他、プラスミンやトリプシンに対する阻害作用があることも報告されている。
これらの阻害作用は、一般にヘパリンの共存下でより速やかに進行することが知られている。
このような薬理作用を有するＡＴ−III は、凝固異常亢進の補正、具体的には汎発性血管異常症（ＤＩＣ）の治療を目的として用いられるものである。
【０００３】
ところで、胸部大動脈瘤手術において脊髄虚血によって引き起こされる対麻痺は、その発生頻度が２．２〜２４％と報告されており、重篤な合併症として注目されている。その対策として一時的バイパスなどの手術手技の工夫やインスリン、ステロイドなどによる薬理的脊髄保護による方法が報告されているが、その効果は十分とはいえない。
【０００４】
本発明は、ＡＴ−III の従来知られていなかった作用を利用した新規な薬剤を提供することを目的とする。つまり、ＡＴ−III の新規な医薬用途を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、ＡＴ−III に運動機能障害、組織障害等の改善効果があることを見出し、本発明を完成した。
【０００６】
即ち、本発明はＡＴ−III を有効成分とする運動機能障害予防治療剤、組織障害予防治療剤、および脊髄障害予防治療剤に関する。
【０００７】
本発明で使用されるＡＴ−III は、ヒト由来のもので、医薬として使用できる程度に精製されたものであれば特に制限されるものではなく、例えばヒトの全血、血漿、血清または凝固した血液から圧搾された血清等から精製することができる。使用される血液としては、特にＨＢｓ抗原、抗ＨＩＶ抗体に陰性であり、ＧＴＰが正常値の２倍以下であるものが好ましい。
【０００８】
ＡＴ−III を調製するための出発原料としては、例えば血漿のコーン分画法における画分IV−１，画分IV，上清Ｉまたは上清II＋III （ＥＰ公開５５１０８４）等が使用される。
ＡＴ−III の精製法としては、例えば特開昭４８−３５０１７号明細書、特公昭５９−７６９３号明細書に開示の方法、疎水性クロマト（特開平１−２７５６００号）、陰イオン交換体処理（特開平２−４７１７号）等が例示される。
また、ＡＴ−III は細胞培養法（例えば、特表昭５７−５００７６８号公報参照）、遺伝子工学法（例えば、特開昭５８−１６２５２９号公報参照）などにより調製されるものであってもよい。また、市販のＡＴ−III 製剤（例えば商品名：ノイアート、（株）ミドリ十字製等）を用いることもできる。
【０００９】
本発明の有効成分であるＡＴ−III は、ヒト、イヌ、ウシ、ウマ、マウス、ラット等の哺乳動物における運動機能障害の予防治療、組織障害の予防治療の作用・効果を有する。
ここに運動機能障害とは、中枢神経や末梢神経等の障害により運動機能に異常をきたす病態をいい、例えば脊髄障害（例えば脊髄損傷，脊髄虚血，脊髄の手術）に起因するものが例示され、具体的には、例えば運動麻痺，完全麻痺，半側麻痺，対麻痺等が挙げられる。
また、ここに組織障害とは、各種臓器の傷害および機能障害を含むあらゆる障害を意味し、例えば脊髄組織の障害等が挙げられる。
特に、胸部大動脈瘤手術における合併症として生じる、脊髄虚血により発生する組織障害または運動機能障害（例えば、対麻痺）等に対して、ＡＴ−III は治療、予防効果を有する。
【００１０】
従って、ＡＴ−III は運動機能障害予防治療剤、組織障害予防治療剤、脊髄障害予防治療剤および脊髄虚血予防治療剤として有用であり、特に脊髄障害（例えば、脊椎傷害、脊髄虚血）に起因する病態（例えば、運動機能障害または組織障害の少なくとも一つを含む病態）の予防および／または治療剤として有用である。
【００１１】
本発明の予防治療剤においては、有効成分としてＡＴ−III 単独の態様で用いられることが好ましい。
【００１２】
本発明の予防治療剤は、本発明の目的に反しない限り通常医薬品に用いられる薬理的に許容される添加剤（例えば、担体、賦形剤、希釈剤等）、安定化剤または製薬上必要な成分を配合していてもよい。
添加剤・安定化剤としては、糖類，例えばブドウ糖，果糖等の単糖類、ショ糖，乳糖，麦芽糖等の二糖類、マンニトール，ソルビトール等の糖アルコール；クエン酸，リンゴ酸，酒石酸等の有機酸またはその塩（例えば、ナトリウム塩，カリウム塩，カルシウム塩等）；グリシン，アスパラギン酸，グルタミン酸等のアミノ酸またはその塩（例えば、ナトリウム塩等）；ポリエチレングリコール，ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体，ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル等の界面活性剤；ヘパリン，アルブミンなどが挙げられる。
【００１３】
本発明製剤は、ＡＴ−III と上記成分とを適宜混合し、粉末剤，液剤，顆粒剤，錠剤，カプセル剤，シロップ剤，注射剤等の態様に調製され、経口的または非経口的に投与される。好ましくは、静脈投与の態様である。
本製剤は、特にＡＴ−III を薬理的に許容される添加剤とともに凍結乾燥品としておき用時溶解して使用する態様の製剤とするか、もしくは液状製剤とすることが好ましい。かかる製剤は、要すれば使用時に注射用蒸留水や滅菌精製水等によって約１〜１００ＡＴ−III 単位／ｍｌ溶液として、より好ましくは生理的に等張な塩濃度および生理的に好ましいｐＨ値（ｐＨ６〜８）に調整される。
【００１４】
本発明製剤の投与量は症状，体重，性別，動物種等によって適宜選択すればよく、一般的にヒトの成人に対しては、ＡＴ−III として運動機能障害、組織障害、脊髄障害、脊髄虚血の各予防、治療のいずれにおいても、通常１〜１０００単位／ｋｇ体重／日、好ましくは１０〜５００単位／ｋｇ体重／日を１日１〜数回に分けて投与する。例えば、静脈内投与の場合１０〜１００単位／ｋｇ体重／日の投与量で投与することが好ましい。
本明細書において、ＡＴ−III の力価は、１単位が正常人血漿１ｍｌ中に含まれるＡＴ−III 量に相当する。
【００１５】
【実験例・実施例】
以下、本発明を詳細に説明するため実験例および実施例を挙げるが、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない。
【００１６】
実験例１
（１）実験方法
被験薬としてアンチトロンビン−III （以下ＡＴ−III ）、ヘパリン、ＡＴ−III ＋ヘパリン、Ｄａｎｓｙｌ−ＧｌｙＧｌｙＡｒｇ−Ｃｈｌｏｒｍｅｔｈｙｌｋｅｔｏｎｅ処理ＦＸａ（以下ＤＥＧＲ−Ｘａという）等をそれぞれ３ｍｇ／ｋｇ体重の割合でラットに経静脈投与し、その３０分後、各ラットの第１２胸椎を２０ｇの重錘で圧迫して脊髄損傷を与えた。
各種被験薬を投与した各脊髄損傷ラットについて、後肢運動機能、脊髄組織中の出血量、脊髄組織中の血管透過性などを比較検討して、ＡＴ−III の脊髄損傷保護効果を調べた。なお、運動障害の判定は脊髄圧迫した２４時間後に行い、障害程度は以下のＴａｒｌｏｖの評価法用いて客観的に評価した。
−評価−
０：随意運動なし（いわゆる完全対麻痺）、１：関節の動きを認めうる、
２：良好な関節の動きを認めるが起立不能、３：起立と歩行可能、
４：跳躍および疾走可能。
【００１７】
（２）結果および考察
後肢運動機能および完全対麻痺の割合は表１に示す通りであった。この結果から、ＡＴ−III 単独を前投与しておくことにより、脊髄損傷に対して保護効果があり、運動機能障害が著明に軽減することが判明した。
【００１８】
【表１】
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【００１９】
また、脊髄組織中の出血量もＡＴ−III 単独前投与により約４０％軽減した。かかるＡＴ−III の脊髄保護作用はヘパリンの併用で相殺され、またヘパリンやＤＥＧＲ−Ｘａでは効果がなかったことから血液抗凝固作用以外の作用機序によることが考えられる。
【００２０】
実験例２
（１）実験方法
脊髄損傷後にＡＴ−III を投与した場合の効果、すなわち、ＡＴ−III 投与による治療効果を検討した。まず、実験例１の方法に準じて脊髄損傷ラットを作成した。実験は以下の４群で行い、その効果を比較した。▲１▼被験薬無投与群、▲２▼ＡＴ−III 前投与群（脊髄損傷を与える３０分前に、ＡＴ−III を投与量２５０単位／ｋｇ体重の割合で静脈内投与したもの）、▲３▼ＡＴ−III 低投与群（脊髄損傷を与えた３０分後に、ＡＴ−III を投与量２５０単位／ｋｇ体重の割合で静脈内投与したもの）、▲４▼ＡＴ−III 高投与群（脊髄損傷を与えた３０分後に、ＡＴ−III を投与量５００単位／ｋｇ体重の割合で静脈内投与したもの）。尚、効果の確認および評価は実験例１の方法に準じて行った。
【００２１】
（２）結果および考察
後肢運動機能および完全対麻痺の割合は表２に示す通りであり、運動機能障害はＡＴ−III 単独を後投与することにより著明に減少した。
【００２２】
【表２】
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【００２３】
実験例３
脊髄損傷後にＡＴ−III を投与した場合におけるミエロペルオキシダーゼ（以下、ＭＰＯという）の障害局所での挙動を確認した。ＭＰＯは局所の障害度の指標となるものである。まず、実験例１の方法に準じて脊髄損傷ラットを作成した。実験は以下の３群で行い、その効果を比較した。▲１▼正常ラット群、▲２▼ＡＴ−III 無投与群（脊髄損傷群）、▲３▼ＡＴ−III 後投与群（脊髄損傷を与えた３０分後に、ＡＴ−III を投与量２５０単位／ｋｇ体重の割合で静脈内投与したもの）。各群のラットについて、脊髄損傷２４時間後に損傷した脊髄組織中のＭＰＯ量を吸光度測定法（波長４６０ｎｍ）により測定した。結果を表３に示す。ＡＴ−III 投与により、ＭＰＯは約１／２に減少し、脊髄組織の障害度が軽減していることが判明した。
【００２４】
【表３】
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【００２５】
実験例４
（１）実験方法
脊髄虚血は、ラット（体重３００〜４００ｇ）の左胸部を開胸し、胸部大動脈（第５胸椎レベル）を３０分間結紮することにより行った。ＡＴ−III を、脊髄虚血処置の３０分前（２５０単位／ｋｇ体重）または脊髄虚血処置の１５分後（５００単位／ｋｇ体重）に、各ラットに経静脈投与し、後肢運動機能，脊髄組織中の好中球集積量（虚血１２時間後にＭＰＯ活性として測定）を指標として、ＡＴ−III の運動機能障害に対する保護効果および組織障害に対する予防治療効果を調べた。なお、運動障害の判定および評価は脊髄虚血２４時間後に、実験例１に準じてＴａｒｌｏｖの評価法により行った。また、ＭＰＯ活性は吸光度測定法（波長４６０ｎｍ）により測定した。
【００２６】
（２）結果
後肢運動機能障害の程度（点数）および完全対麻痺の割合を表４に示す。ＡＴ−III 単独投与群（前および後投与でも）において、運動機能障害および対麻痺が著明に改善した。
【００２７】
【表４】
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【００２８】
脊髄組織中のＭＰＯ活性（腰髄部での脊髄）は、開胸のみの模擬手術群（結紮処置なし、ＡＴ−III 無投与群、ｎ＝４）で１３．８±１１．８単位／ｇ組織、ＡＴ−III 無投与群（結紮処置、ｎ＝４）で９２．４±１３．１単位／ｇ組織、ＡＴ−III 後投与群（ｎ＝４）で４１．６±１１．２単位／ｇ組織であった。
ＭＰＯは局所の障害度の指標となるものであり、ＡＴ−III 投与によりＭＰＯは１／２以下に減少し、障害度が軽減していることが判明した。
【００２９】
実験例５
急性毒性（ＬＤ50）はマウス、ラットの雌雄による差はなく、静脈内投与、経口投与ともＡＴ−III １５０００単位／ｋｇ体重以上、皮下投与ではＡＴ−III ２００００単位／ｋｇ体重以上であった。また、サル（雄）では静脈内投与でＡＴ−III ６０００単位／ｋｇ体重以上であった。
【００３０】
実施例１
コーンの冷アルコール分画法で得られた画分IV−１のペースト１０ｋｇを生理食塩水１００リットルに懸濁し、硫酸バリウムを５（ｗ／ｖ）％になるように加え、室温で３０分間撹拌し、微量に存在するプロトロンビンを硫酸バリウムに吸着させて除去した。この上清液をｐＨ６．５に調整し、ポリエチレングリコール＃４０００を１３（ｗ／ｖ）％になるように加え、生じた沈澱を遠心分離して除き、さらにポリエチレングリコール＃４０００を３０（ｗ／ｖ）％になるように加え、さらに生じた沈澱を遠心分離して回収した。この沈澱を冷生理食塩水約２０リットルに溶解し、予め生理食塩水で調製されたヘパリンセファロースを充填したカラムへ注入し、ＡＴ−III をカラムに吸着させた。このカラムを０．４Ｍの塩化ナトリウム溶液で洗浄して不純蛋白を除いたのち、２．０Ｍの塩化ナトリウム溶液をカラムに流して溶出してくる部分を回収した。
このＡＴ−III の水溶液にクエン酸ナトリウムを０．６Ｍの濃度に加え、ｐＨ７．８に調整した後６０℃で１０時間の加熱処理を施し、続いて０．９％塩化ナトリウム溶液に対し１夜透析を行いつつ濃縮してＡＴ−III の１（ｗ／ｖ）％水溶液を得、必要に応じて濾過または遠心分離を行って透明な液とした。
このＡＴ−III の１（ｗ／ｖ）％水溶液にマンニトール２（ｗ／ｖ）％とクエン酸ナトリウム０．２（ｗ／ｖ）％を加え、塩化ナトリウムが０．５％になるように少量の冷蒸留水で希釈し、１Ｎの水酸化ナトリウムでｐＨ７．６に調整した後、滅菌したミリポアフィルターで除菌濾過し、５００単位づつ分注し、凍結乾燥を行って乾燥製剤とした。
【００３１】
実施例２
１バイアル中、
ＡＴ−III                 ５００単位
マンニトール              ２００ｍｇ
塩化ナトリウム              ５０ｍｇ
クエン酸ナトリウム          ５２ｍｇ
よりなる凍結乾燥品を用時２０ｍｌの注射用蒸留水に溶解して、静注用製剤とした。
【００３２】
【発明の効果】
ＡＴ−III は哺乳動物に対して、運動機能障害および組織障害の改善作用を有し、特に脊髄損傷や脊髄虚血に起因する組織障害または運動機能障害、例えば対麻痺等に改善作用を有する。従って、ＡＴ−III は運動機能障害予防治療剤、組織障害予防治療剤、脊髄損傷予防治療剤および脊髄虚血予防治療剤として有用である。
また、ＡＴ−III は脊髄保護作用および脊髄障害（例えば、脊髄損傷，脊髄虚血等）に由来する運動機能障害あるいは対麻痺等の改善効果を有する。従って、ＡＴ−III は脊髄障害予防治療剤および脊髄障害に由来する病態（運動機能障害，組織障害など）の予防治療剤として有用である。