(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
固相担体の表面に、一群のビニルスルホニル基を有する化合物が非共有結合的に固定されている反応性固相担体。
【請求項２】
ビニルスルホニル基が下記の式により表わされるものである請求項１に記載の反応性固相担体：
【化１】
0003808389.tif 000004
［上記の式において、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3は、互いに独立に、水素原子、炭素原子数が１乃至６のアルキル基、炭素原子数が６乃至２０のアリール基、及び炭素原子数が１乃至６のアルキル鎖を有する合計炭素原子数が７乃至２６のアラルキル基からなる群より選ばれる原子もしくは基を表わす］。
【請求項３】
Ｒ1、Ｒ2及びＲ3が共に水素原子である請求項２に記載の反応性固相担体。
【請求項４】
固相担体がシート状の基板である請求項１に記載の反応性固相担体。
【請求項５】
シート状の基板が、ガラス基板もしくは樹脂基板である請求項４に記載の反応性固相担体。
【請求項６】
ビニルスルホニル基を有する化合物が、下記の式により表わせる化合物である請求項１に記載の反応性固相担体：
【化２】
0003808389.tif 000005
［上記の式において、Ｘ1およびＸ2は互いに独立に、−ＣＲ1＝ＣＲ2Ｒ3を表わし、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3は、互いに独立に、水素原子、炭素原子数が１乃至６のアルキル基、炭素原子数が６乃至２０のアリール基、及び炭素原子数が１乃至６のアルキル鎖を有する合計炭素原子数が７乃至２６のアラルキル基からなる群より選ばれる原子もしくは基を表わし、そしてＬは連結基を表わす］。
【請求項７】
ビニルスルホニル基を有する化合物が、１，２−ビス（ビニルスルホニルアセトアミド）エタンもしくは１，２−ビス（ビニルスルホニルアセトアミド）プロパンである請求項６に記載の反応性固相担体。
【請求項８】
固相担体の表面に、一群のビニルスルホニル基を有する化合物を該表面との共有結合を生成させない条件にて接触させることを特徴とする反応性固相担体の製造方法。
【請求項９】
ビニルスルホニル基が下記の式により表わされるものである請求項８に記載の製造方法：
【化３】
0003808389.tif 000006
［上記の式において、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3は、互いに独立に、水素原子、炭素原子数が１乃至６のアルキル基、炭素原子数が６乃至２０のアリール基、及び炭素原子数が１乃至６のアルキル鎖を有する合計炭素原子数が７乃至２６のアラルキル基からなる群より選ばれる原子もしくは基を表わす］。
【請求項１０】
Ｒ1、Ｒ2及びＲ3が共に水素原子である請求項９に記載の製造方法。
【請求項１１】
固相担体がシート状の基板である請求項８に記載の製造方法。
【請求項１２】
シート状の基板が、ガラス基板もしくは樹脂基板である請求項１１に記載の製造方法。
【請求項１３】
ビニルスルホニル基を有する化合物が、下記の式により表わせる化合物である請求項８に記載の製造方法：
【化４】
0003808389.tif 000007
［上記の式において、Ｘ1およびＸ2は互いに独立に、−ＣＲ1＝ＣＲ2Ｒ3を表わし、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3は、互いに独立に、水素原子、炭素原子数が１乃至６のアルキル基、炭素原子数が６乃至２０のアリール基、及び炭素原子数が１乃至６のアルキル鎖を有する合計炭素原子数が７乃至２６のアラルキル基からなる群より選ばれる原子もしくは基を表わし、そしてＬは連結基を表わす］。
【請求項１４】
ビニルスルホニル基を有する化合物が、１，２−ビス（ビニルスルホニルアセトアミド）エタンもしくは１，２−ビス（ビニルスルホニルアセトアミド）プロパンである請求項１３に記載の製造方法。
【請求項１５】
一群のビニルスルホニル基が非共有結合的に固定されてなる反応性固相担体の表面に、該ビニルスルホニル基と反応して共有結合を形成する反応性基を備えたオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、もしくはペプチド核酸を接触させることを特徴とする、オリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチド検出用具の製造方法。
【請求項１６】
ビニルスルホニル基が下記の式により表わされるものである請求項１５に記載の製造方法：
【化５】
0003808389.tif 000008
［上記の式において、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3は、互いに独立に、水素原子、炭素原子数が１乃至６のアルキル基、炭素原子数が６乃至２０のアリール基、及び炭素原子数が１乃至６のアルキル鎖を有する合計炭素原子数が７乃至２６のアラルキル基からなる群より選ばれる原子もしくは基を表わす］。
【請求項１７】
Ｒ1、Ｒ2及びＲ3が共に水素原子である請求項１６に記載の製造方法。
【請求項１８】
固相担体がシート状の基板である請求項１３に記載の製造方法。
【請求項１９】
シート状の基板が、ガラス基板もしくは樹脂基板である請求項１８に記載の製造方法。
【請求項２０】
ビニルスルホニル基を有する化合物が、下記の式により表わせる化合物である請求項１５に記載の製造方法：
【化６】
0003808389.tif 000009
［上記の式において、Ｘ1およびＸ2は互いに独立に、−ＣＲ1＝ＣＲ2Ｒ3を表わし、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3は、互いに独立に、水素原子、炭素原子数が１乃至６のアルキル基、炭素原子数が６乃至２０のアリール基、及び炭素原子数が１乃至６のアルキル鎖を有する合計炭素原子数が７乃至２６のアラルキル基からなる群より選ばれる原子もしくは基を表わし、そしてＬは連結基を表わす］。
【請求項２１】
ビニルスルホニル基を有する化合物が、１，２−ビス（ビニルスルホニルアセトアミド）エタンもしくは１，２−ビス（ビニルスルホニルアセトアミド）プロパンである請求項２０に記載の製造方法。
【請求項２２】
固相担体の表面に一群のビニルスルホニル基を有する化合物が非共有結合的に固定されている反応性固相担体のビニルスルホニル基に、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、もしくはペプチド核酸が共有結合的に結合固定されてなるオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチド検出用具。
【請求項２３】
ビニルスルホニル基が下記の式により表わされるものである請求項２２に記載の検出用具：
【化７】
0003808389.tif 000010
［上記の式において、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3は、互いに独立に、水素原子、炭素原子数が１乃至６のアルキル基、炭素原子数が６乃至２０のアリール基、及び炭素原子数が１乃至６のアルキル鎖を有する合計炭素原子数が７乃至２６のアラルキル基からなる群より選ばれる原子もしくは基を表わす］。
【請求項２４】
Ｒ1、Ｒ2及びＲ3が共に水素原子である請求項２３に記載の検出用具。
【請求項２５】
ビニルスルホニル基を有する化合物が、下記の式により表わせる化合物である請求項２３に記載の検出用具：
【化８】
0003808389.tif 000011
［上記の式において、Ｘ1およびＸ2は互いに独立に、−ＣＲ1＝ＣＲ2Ｒ3を表わし、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3は、互いに独立に、水素原子、炭素原子数が１乃至６のアルキル基、炭素原子数が６乃至２０のアリール基、及び炭素原子数が１乃至６のアルキル鎖を有する合計炭素原子数が７乃至２６のアラルキル基からなる群より選ばれる原子もしくは基を表わし、そしてＬは連結基を表わす］。
【請求項２６】
ビニルスルホニル基を有する化合物が、１，２−ビス（ビニルスルホニルアセトアミド）エタンもしくは１，２−ビス（ビニルスルホニルアセトアミド）プロパンである請求項２２に記載の検出用具。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、生体高分子物質の構造の解析に有用な検出用具に関し、特に遺伝子の発現、変異、多型等の効率的な解析に有用な、多数の生物起源の高分子物質もしくはその類縁体を固相担体表面に整列固定させた検出用具に関する。本発明は特に、ＤＮＡ断片試料の塩基配列の解析に有用な、多数のヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体を固相担体表面に高密度に整列固定させた高密度アレイ型検出用具（ＤＮＡ検出チップ）、そしてその高密度アレイ型検出用具の作製に有利に用いることのできる反応性固相担体に関する。
【０００２】
【従来の技術】
多彩な生物の遺伝子機能を効率的に解析するための技術開発が急速に進んでおり、それらのＤＮＡもしくはＤＮＡ断片の塩基配列の解析のために、ＤＮＡチップとよばれる、多数のＤＮＡ断片あるいは合成オリゴヌクレオチドなどのヌクレオチド誘導体を固相基板の表面に固定した検出用具が用いられている。このような固相基板の表面に結合固定されたヌクレオチド誘導体などの、ＤＮＡもしくはその断片あるいは合成オリゴヌクレオチドのような検出用分子はプローブ分子とも呼ばれる。代表的なＤＮＡチップは、スライドガラス等の固相担体に多数のプローブ分子を整列固定させたマイクロアレイである。このＤＮＡチップの製造、そしてその使用に関するＤＮＡチップ関連技術は、ＤＮＡ以外の生体分子の検出にも利用可能であると考えられ、従って、創薬研究、疾病の診断や予防法の開発等に新しい手段を提供するものとして期待されている。
【０００３】
ＤＮＡチップ関連技術が具体化してきたのは、ＤＮＡの塩基配列をオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションによって決定する方法が考案されたことに始まる。この方法は、ゲル電気泳動を用いる塩基配列決定法の限界を克服できる方法ではあったが、当初は実用化には至らなかった。
【０００４】
その後、上記のような構成のＤＮＡチップと、その作製技術が開発され、遺伝子の発現、変異、多型等を短時間で効率よく調べることが可能となった。すなわち、作製されたＤＮＡチップ上のＤＮＡ断片もしくはオリゴヌクレオチドに相補性を示すＤＮＡ断片試料（標的ＤＮＡ断片ともいわれる）は、一般的には、ＤＮＡチップ上のＤＮＡ断片もしくはオリゴヌクレオチドと、標識したＤＮＡ断片試料とのハイブリダイゼーションを利用して検出される。
【０００５】
ＤＮＡチップ作製技術を実用化するためには、多数のＤＮＡ断片やオリゴヌクレオチドを固相担体表面に高密度に、かつ安定に整列させるための技術が必要とされる。
【０００６】
ＤＮＡチップの作製方法としては、固相担体表面で直接オリゴヌクレオチドを合成する方法（オン・チップ法）と、予め調製用意したＤＮＡ断片あるいはオリゴヌクレオチドを固相担体表面に結合固定する方法とが知られている。オン・チップ法としては、光照射で選択的に除去される保護基の使用と、半導体製造に利用されるフォトリソグラフィー技術および固相合成技術とを組み合わせ、所定の微少なマトリックス領域でのオリゴヌクレオチドの選択的な合成を行なう方法（マスキング技術）が代表的である。
【０００７】
予め調製用意したＤＮＡ断片やオリゴヌクレオチドを固相担体表面に結合固定する方法としては、ＤＮＡ断片の種類や固相担体の種類に応じて下記の方法が知られている。
（１）固定するＤＮＡ断片がｃＤＮＡ（ｍＲＮＡを鋳型にして合成した相補的ＤＮＡ）やＰＣＲ産物（ｃＤＮＡをＰＣＲ法によって増幅させたＤＮＡ断片）である場合には、ｃＤＮＡあるいはＰＣＲ産物を、ＤＮＡチップ作製装置に備えられたスポッタ装置により、ポリ陽イオン化合物（ポリリシン、ポリエチレンイミン等）で表面処理した固相担体の表面に点着し、ＤＮＡ断片の持つ電荷を利用して固相担体に静電結合させるのが一般的である。なお、固相担体表面の処理方法としては、アミノ基、アルデヒド基、エポキシ基等を有するシランカップリング剤を用いる方法も利用されている。このシランカップリング剤を用いた表面処理では、アミノ基、アルデヒド基等は、共有結合により固相担体表面に固定されるため、ポリ陽イオン化合物による表面処理の場合と比較して、安定に固相担体表面に固定される。
【０００８】
上記のＤＮＡ断片の電荷を利用する方法の変法として、アミノ基で修飾したＰＣＲ産物をＳＳＣ（標準食塩−クエン酸緩衝液）に懸濁させ、これをシリル化したスライドガラス表面に点着し、インキュベートした後、水素化ホウ素ナトリウムによる処理および加熱処理を順に行なう方法が報告されている。しかし、この固定方法では必ずしも充分なＤＮＡ断片の固定安定度が得られ難いという問題がある。ＤＮＡチップ技術では、検出限界が重要となる。そのため、固相担体表面に充分な量で（すなわち、高密度に）、かつ安定にＤＮＡ断片が結合固定することは、ＤＮＡ断片プローブと標識した試料核酸断片とのハイブリダイゼーションの検出限界の向上に直接影響する。
【０００９】
（２）固定するオリゴヌクレオチド（プローブ分子）が合成オリゴヌクレオチドである場合には、まず反応活性基を導入したオリゴヌクレオチドを合成し、予め反応性基を形成させるように表面処理した固相担体表面に該オリゴヌクレオチドを点着して、該オリゴヌクレオチドを固相担体表面に共有結合により結合固定させる方法も知られている。例えば、表面にアミノ基を導入したスライドガラスに、ＰＤＣ（ｐ−フェニレンジイソチオシアネート）の存在下、アミノ基導入オリゴヌクレオチドを反応させる方法、および該スライドガラスに、アルデヒド基導入オリゴヌクレオチドを反応させる方法が知られている。これらの二つの方法は、前記（１）のＤＮＡ断片の電荷を利用して静電結合により固定する方法と比べると、オリゴヌクレオチドが固相担体表面に安定に結合固定されるという利点がある。しかし、ＰＤＣを存在させる方法は、ＰＤＣとアミノ基導入オリゴヌクレオチドとの反応が遅く、またアルデヒド基導入オリゴヌクレオチドを用いる方法では、反応生成物であるシッフ塩基の安定性が低い（従って、加水分解が起こり易い）という問題点がある。
【００１０】
なお、近年、ＤＮＡチップのプローブ分子として、オリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチド（合成されたオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチド及びＤＮＡ分子やＤＮＡ断片、そしてＲＮＡ分子やＲＮＡ断片をも包含する）の代りに、ＰＮＡ（ペプチド核酸）と呼ばれるオリゴヌクレオチド類縁体を用いる技術も提唱されている。このＰＮＡの固相基板へ共有結合により固定するための方法として、アビジンとビオチンとを組合わせて用いる方法も知られている（特開平１１−３３２５９５号公報）。この公開公報には、固相基板として、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）バイオセンサを利用することの技術も記載されている。表面プラズモン共鳴バイオセンサ上にプローブ分子が固定されたＤＮＡチップを用いて、その表面にハイブリダイゼーションを介して結合固定されたＤＮＡ断片は、表面プラズモン共鳴現象を利用して検出することができる。
【００１１】
また、ＤＮＡチップの基板として、電荷結合素子（ＣＣＤ）を用いることも知られている（Nucleic Acids Research, 1994, Vol.22, No.11, 2124-2125）。
【００１２】
特開平４−２２８０７６号公報（米国特許第５３８７５０５号明細書に対応）には、ビオチン分子を付けた標的ＤＮＡを、アビジン分子を表面に固定した基体に結合させて、標的ＤＮＡを分離する技術が記載されている。
【００１３】
特公平７−４３３８０号公報（米国特許第５０９４９６２号明細書に対応）には、リガンド−受容体アッセイに用いる検出用具であって、表面に反応活性基を有する微孔質ポリマー粒子の表面に受容体分子を結合させた分析用具が記載されている。
【００１４】
特開２００１−２２８１５２号公報には、固相担体の表面に、一群のビニルスルホニル基もしくはその反応性前駆体基がそれぞれ連結基を介して共有結合により固定されてなる反応性固相担体、そしてこの反応性固相担体を用いた、本発明者の発明になる、オリゴヌクレオチドあるいはポリヌクレオチドの検出用具（いわゆるＤＮＡチップ）が記載されている。
【００１５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、固相担体表面に、予め調製した、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ペプチド核酸などのヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体を迅速かつ安定に結合固定させるために特に有利に用いることができる反応性固相担体、そして、その反応性固相担体に、ヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体が結合固定されてなる、特定の塩基配列部分を有するＤＮＡ、ＲＮＡ、あるいはそれらの断片の検出用具を提供することを、その課題とする。
【００１６】
【課題を解決するための手段】
本発明の発明者は、上記の特開２００１−２２８１５２号公報に記載の、ビニルスルホニル基もしくはその反応性前駆体基がそれぞれ連結基を介して共有結合により固定された反応性固相担体に関する研究を続けた結果、ビニルスルホニル基を有する化合物は、ガラス基板あるいは樹脂シートなどの固相担体に単に接触させることによって、容易に固相担体に非共有結合的に固定され、このようにして作成した反応性固相担体に、ビニルスルホニル基と共有結合する基を有するヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体（プローブ化合物）を接触させて共有結合により固定すると、上記公報に記載の検出用具と同等の感度の、特定の塩基配列部分を有するＤＮＡ、ＲＮＡ、あるいはそれらの断片の検出用具が得られることを見出した。
【００１７】
また、この知見を利用して、ポリエステルフィルムなどのような疎水性の高い樹脂フィルムの表面にビニルスルホニル基を有する化合物を非共有結合的に固定した反応性固相担体に、プローブ化合物（オリゴヌクレオチドなど）を点着すると小さな径の点着スポットが形成されることから、従来にも増して高密度のＤＮＡチップの作製が可能になることも判明した。
【００１８】
従って、本発明は、固相担体の表面に、一群のビニルスルホニル基（別に、ビニルスルホン基あるいはスルホニルビニル基と呼ぶこともある）が非共有結合的（すなわち、固相担体表面と共有結合を形成することなく）に固定されてなる反応性固相担体にある。
【００１９】
上記のビニルスルホニル基は下記の式（１）により表わされるものであることが望ましい。
【００２０】
【化９】
−ＳＯ2−ＣＲ1＝ＣＲ2Ｒ3    −−−  （１）
【００２１】
［上記の式（１）において、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3は、互いに独立に、水素原子、炭素原子数が１乃至６のアルキル基、炭素原子数が６乃至２０のアリール基、及び炭素原子数が１乃至６のアルキル鎖を有する合計炭素原子数が７乃至２６のアラルキル基からなる群より選ばれる原子もしくは基を表わす］。
上記の式（１）において、−ＣＲ1＝ＣＲ2Ｒ3は、Ｒ1、Ｒ2、そしてＲ3のいずれもが水素原子である、−ＣＨ＝ＣＨ2で表わされるビニル基であることが望ましい。
【００２２】
本発明の反応性固相担体は、好ましくは固相担体に、下記式（２）：
【００２３】
【化１０】
Ｘ1−ＳＯ2−Ｌ−ＳＯ2−Ｘ2       −−−  （２）
【００２４】
［上記式において、Ｘ1及びＸ2は互いに独立に、−ＣＲ1＝ＣＲ2Ｒ3を表わし；Ｒ1、Ｒ2及びＲ3は、互いに独立に、水素原子、炭素原子数が１乃至６のアルキル基、炭素原子数が６乃至２０のアリール基、及び炭素原子数が１乃至６のアルキル鎖を有する合計炭素原子数が７乃至２６のアラルキル基からなる群より選ばれる原子もしくは基を表わし、Ｌは連結基を表わす］
で表わされるジスルホン化合物を、共有結合が生成しない条件にて接触させることによって容易に製造することができる。
【００２５】
上記の式（２）で表わされるジスルホン化合物の代表的な例としては、１，２−ビス（ビニルスルホニルアセトアミド）エタンおよび１，２−ビス（ビニルスルホニルアセトアミド）プロパンを挙げることができる。
【００２６】
本発明はまた、 一群のビニルスルホニル基が非共有結合的に固定されてなる反応性固相担体の表面に、該ビニルスルホニル基と反応して共有結合を形成する反応性基を備えたオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、もしくはペプチド核酸などのヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体を接触させることを特徴とする、オリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチド検出用具の製造方法にもある。
【００２７】
【発明の実施の形態】
本発明の反応性固相担体は、固相担体の表面に、一群のビニルスルホニル基を含む化合物が非共有結合的に固定された構成を有している。本発明の反応性固相担体は、固相担体とビニルスルホニル基を有する化合物とを、共有結合が生成しない条件にて単に接触させることにより容易に製造することができる。
【００２８】
固相担体は、特に疎水性、あるいは親水性の低い、表面が平滑な基板であることが好ましい。また、その表面が凹凸を有する平面性の低い基板も用いることができる。固相担体の材質としては、ガラス、セメント、陶磁器等のセラミックスもしくはニューセラミックス、ポリエチレンテレフタレート、ポリエチレンナフタレート、金属、酢酸セルロース、ビスフェノールＡのポリカーボネート、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート等のポリマー、シリコン、活性炭、多孔質ガラス、多孔質セラミックス、多孔質シリコン、多孔質活性炭、織編物、不織布、濾紙、短繊維、メンブレンフィルターなどの各種の多孔質物質を挙げることができる。固相担体の材質は、ガラス、またはポリエチレンテレフタレートもしくはポリエチレンナフタレートなどであることが特に好ましい。固相担体の厚さは、１００乃至２０００μｍの範囲にあることが好ましい。
【００２９】
すなわち、たとえば、上記の式（２）で表わされるジスルホン化合物を、前記の固相担体と、例えば水性雰囲気にて、接触させることによって、本発明の反応性固相担体を容易に製造することができる。
【００３０】
本発明で好ましく用いるジスルホン化合物の代表例については、前記の特開２００１−２２８１５２号公報を参照することができる。
【００３１】
上記のようにして得られた反応性固相担体を利用して、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ断片、あるいはＲＮＡ断片などの天然起源のポリヌクレオチドあるいはオリゴヌクレオチドの検出固定のための検出具（一般にＤＮＡチップと呼ばれているもの）を作製するためには、上記の反応性固相担体を、その担体表面上のビニルスルホニル基と反応して共有結合を形成するアミノ基などの反応性基を備えたヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体と接触させる方法が利用される。すなわち、このようにして所望のヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体からなるプローブ分子を備えた検出具（いわゆるＤＮＡチップ）を作製することができる。
【００３２】
本発明の固相基板表面に非共有結合的に固定されたビニルスルホニル基は、加水分解に対して高い抵抗性を有しており、容易に安定に保存することができ、また、アミノ基を予め備えているか、あるいはアミノ基などの反応性基が導入されているかヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体の反応性基と迅速に反応して、安定な共有結合を形成することができる。
【００３３】
プローブ化合物（分子）として用いるヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体の代表例としては、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、そしてペプチド核酸を挙げることができる。これらのヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体としては、天然起源のもの（ＤＮＡ、ＤＮＡ断片、ＲＮＡあるいはＲＮＡ断片など）であってもよく、あるいは合成化合物であってもよい。また、ヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体としては、その糖単位部分に架橋基を有するＬＮＡと呼ばれる化合物などの各種の類縁化合物が含まれる。
【００３４】
プローブ分子としてＤＮＡ断片を用いる場合は、目的によって二通りに分けることができる。遺伝子の発現を調べるためには、ｃＤＮＡ、ｃＤＮＡの一部、ＥＳＴ等のポリヌクレオチドを使用することが好ましい。これらのポリヌクレオチドは、その機能が未知であってもよいが、一般的にはデータベースに登録された配列を基にしてｃＤＮＡのライブラリー、ゲノムのライブラリーあるいは全ゲノムをテンプレートとしてＰＣＲ法によって増幅して調製する（以下、「ＰＣＲ産物」という）。ＰＣＲ法によって増幅しないものも、好ましく使用することができる。また、遺伝子の変異や多型を調べるには、標準となる既知の配列をもとにして、変異や多型に対応する種々のオリゴヌクレオチドを合成し、これを使用することが好ましい。さらに、塩基配列の分析を目的とする場合、４n（ｎは、塩基の長さ）種のオリゴヌクレオチドを合成して、それらを使用することが好ましい。ＤＮＡ断片の塩基配列は、一般的な塩基配列決定法によって予めその配列が決定されていることが好ましい。ＤＮＡ断片は、２乃至５０量体であることが好ましく、１０乃至２５量体であることが特に好ましい。
【００３５】
オリゴヌクレオチドやＤＮＡ断片などのヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体の一方の末端には、前記のビニルスルホニル基と反応して共有結合を形成する反応性基を導入する。このような反応性基は、アミノ基、イミノ基、ヒドラジノ基、カルバモイル基、ヒドラジノカルボニル基、もしくはカルボキシイミド基であることが好ましく、アミノ基であることが特に好ましい。オリゴヌクレオチドやＤＮＡ断片には、通常、クロスリンカーを介してこれらの反応性基が結合される。クロスリンカーとしては、たとえば、アルキレン基あるいはＮ−アルキルアミノ−アルキレン基が利用されるが、ヘキシレン基あるいはＮ−メチルアミノ−ヘキシレン基であることが好ましく、ヘキシレン基であることが特に好ましい。なお、ペプチド核酸（ＰＮＡ）はアミノ基を有しているため、通常は、改めて別に反応性基を導入する必要はない。
【００３６】
固相担体に固定するヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体の代表的な例としては、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、およびペプチド核酸を挙げることができる。これらのヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体としては、その分子の一方の端部もしくは端部附近に、アミノ基、イミノ基、ヒドラジノ基、カルバモイル基、ヒドラジノカルボニル基、もしくはカルボキシイミド基などの、ビニルスルホニル基と反応して共有結合を形成する反応性基を持つものが利用される。
【００３７】
上記のヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体が固定された固相担体は、水性媒体の存在下、該固定ヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体に対して相補性を示すオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチド（ＤＮＡもしくはその断片、あるいはＲＮＡもしくはその断片）を接触させて、ハイブリダイゼーションを発生させることにより、その相補性オリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドを固定することができる。固定すべき相補性のオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドは、その固定を外部から検知することが可能なように、検知可能な標識（例、蛍光標識）が結合していることが望ましい。
【００３８】
反応性基を備えたヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体と本発明の反応性固相担体との接触は、通常、該ヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体の水溶液を反応性固相担体の表面に点着して、常温で一定時間、その状態で維持することにより実施される。具体的には、反応性基を備えたヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体を水性媒体に溶解あるいは分散して水性液としたのち、その水性液を、９６穴もしくは３８４穴プラスチックプレートに分注し、分注した水性液をスポッター装置等を用いて固相担体表面上に滴下する。
【００３９】
点着後のヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体の乾燥を防ぐために、ヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体が溶解あるいは分散してなる水性液中に、高沸点の物質を添加してもよい。高沸点の物質としては、点着後のヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体が溶解あるいは分散してなる水性液に溶解し得るものであって、検出対象の核酸断片試料（標的核酸断片）などの試料とのハイブリダイゼーションを妨げることがなく、かつ粘性があまり大きくない物質であることが好ましい。このような物質としては、グリセリン、エチレングリコール、ジメチルスルホキシドおよび低分子の親水性ポリマーを挙げることができる。親水性ポリマーとしては、ポリアクリルアミド、ポリエチレングリコール、そしてポリアクリル酸ナトリウム等を挙げることができる。このポリマーの分子量は、１０3乃至１０6の範囲にあることが好ましい。高沸点の物質としては、グリセリンあるいはエチレングリコールを用いることがさらに好ましく、グリセリンを用いることが特に好ましい。高沸点の物質の濃度は、ヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体の水性液中、０．１乃至２容量％の範囲にあることが好ましく、０．５乃至１容量％の範囲にあることが特に好ましい。
【００４０】
また、同じ目的のために、ヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体を点着した後の固相担体を、９０％以上の湿度および２５〜５０℃の環境に置くことも好ましい。
【００４１】
ヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体の固定量（数）は、固相担体表面に対して、１０2乃至１０5種類／ｃｍ2の範囲にあることが好ましい。ヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体の量は、１乃至１０-15モルの範囲にあり、重量としては数ｎｇ以下であることが好ましい。点着によって、ヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体の水性液は、固相担体表面にドットの形状で固定される。ドットの形状は、ほとんど円形である。形状に変動がないことは、遺伝子発現の定量的解析や一塩基変異を解析するために重要である。それぞれのドット間の距離は、０乃至１．５ｍｍの範囲にあることが好ましく、１００乃至３００μｍの範囲にあることが特に好ましい。１つのドットの大きさは、直径が５０乃至３００μｍの範囲にあることが好ましい。固相担体表面に点着するヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体の量は、１００ｐＬ乃至１μＬの範囲にあることが好ましく、１乃至１００ｎＬの範囲にあることが特に好ましい。
【００４２】
なお、本発明の反応性固相担体にプローブオリゴヌクレオチドを点着すると、検出用具の表面に小さな径にて点着できるため、プローブオリゴヌクレオチドが高密度にて固定された検出具が容易に実現する。このような効果は、反応性固相担体上での点着液の速すぎる乾燥を防ぐ目的で、プローブオリゴヌクレオチドの点着液の媒体として高沸点の有機溶媒を含む水溶液を用いる場合に、特に有利であり、また固相担体として、ポリエステルフィルムなどのような疎水性の高い樹脂フィルムを簡単に利用できる利点がある。従って、点着スポットを小さな径にすることができるため、従来にも増して高密度のＤＮＡチップの作製が可能になる。
【００４３】
本発明の方法によって製造されたヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体が固定された固相担体の寿命は、ｃＤＮＡが固定されてなるｃＤＮＡ固定固相担体では通常、数週間であり、合成オリゴヌクレオチドが固定されてなる固相担体ではさらに長期間である。本発明のヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体が固定された固相担体は、遺伝子発現のモニタリング、塩基配列の決定、変異解析、多型解析等に利用される。検出原理は、後述する標識した試料核酸断片とのハイブリダイゼーションである。
【００４４】
標識方法としては、ＲＩ法と非ＲＩ法（蛍光法、ビオチン法、化学発光法等）とが知られているが、本発明では蛍光法を用いることが好ましい。蛍光標識に利用される蛍光物質としては、核酸の塩基部分と結合できるものであれば何れも用いることができるが、シアニン色素（例えば、市販のＣｙ  ＤｙｅTMシリーズのＣｙ３、Ｃｙ５等）、ローダミン６Ｇ試薬、Ｎ−アセトキシ−Ｎ2−アセチルアミノフルオレン（ＡＡＦ）あるいはＡＡＩＦ（ＡＡＦのヨウ素誘導体）を使用することができる。
【００４５】
試料核酸断片（標的オリゴヌクレオチド）としては、通常、その配列や機能が未知であるＤＮＡ断片試料あるいはＲＮＡ断片試料などの核酸断片試料が用いられる。
【００４６】
核酸断片試料は、遺伝子の変異や多型を調べる目的では、標識プライマーもしくは標識ｄＮＴＰを含む反応系において標的領域のＰＣＲを行なって得ることが好ましい。
【００４７】
ハイブリダイゼーションは、９６穴もしくは３８４穴プラスチックプレートに分注しておいた、標識した核酸断片試料が溶解あるいは分散してなる水性液を、本発明のヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体を固定した固相担体上に点着することによって実施することが好ましい。点着の量は、１乃至１００ｎＬの範囲にあることが好ましい。ハイブリダイゼーションは、室温乃至７０℃の温度範囲で、そして６乃至２０時間の範囲で実施することが好ましい。ハイブリダイゼーションの終了後、界面活性剤と緩衝液との混合溶液を用いて洗浄を行い、未反応の核酸断片試料を除去することが好ましい。界面活性剤としては、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を用いることが好ましい。緩衝液としては、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液等を用いることができるが、クエン酸緩衝液を用いることが特に好ましい。
【００４８】
ヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体を固定した固相担体を用いるハイブリダイゼーションの特徴は、標識した核酸断片試料の使用量を非常に少なくできることである。そのため、固相担体に固定するヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体の鎖長や標識した核酸断片試料の種類により、ハイブリダイゼーションの最適条件を設定する必要がある。遺伝子発現の解析には、低発現の遺伝子も十分に検出できるように、長時間のハイブリダイゼーションを行うことが好ましい。一塩基変異の検出には、短時間のハイブリダイゼーションを行うことが好ましい。また、互いに異なる蛍光物質によって標識した核酸断片試料を二種類用意し、これらを同時にハイブリダイゼーションに用いることにより、同一のＤＮＡ断片固定固相担体上で発現量の比較や定量ができる特徴もある。
【００４９】
【実施例】
［実施例１］オリゴヌクレオチド検出具の作製と標的オリゴヌクレオチドの検出能の検定
（１）ビニルスルホニル基が非共有結合的に固定されたフィルムの作製
ポリエチレンテレフタレートフィルム（ＰＥＴフィルム、サイズ２５ｍｍ×７６ｍｍ、厚み１８８μｍ）を、１，２−ビス（ビニルスルホニルアセトアミド）プロパンを３重量％含有するホウ酸バッファー液に、２５℃で１２０分間浸漬したのち水洗し、次に、３０℃に設定した、乾燥器にて３０分間乾燥させた。
【００５０】
（２）オリゴヌクレオチド検出具の作製
３’−末端がアミノ基で修飾された４０ｍｅｒのオリゴヌクレオチド（３’−ＴＣＣＴＣＣＡＴＧＴＣＣＧＧＧＧＡＧＧＡＴＣＴＧＡＣＡＣＴＴＣＡＡＧＧＴＣＴＡＧ−５’）を０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．３）に分散した水性液（１×１０-6Ｍ、１μＬ）を、上記（１）で処理した得たＰＥＴフィルムの表面に点着した。直ちに、点着後のフィルムを２５℃、湿度９０％にて１時間放置した後、このフィルムを０．１重量％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）と２×ＳＳＣ（ＳＳＣの原液を２倍に希釈した溶液、ＳＳＣ：標準食塩−クエン酸緩衝液）との混合溶液で２回、０．２×ＳＳＣ水溶液で１回順次洗浄した。次いで、上記の洗浄後のフィルムを０．１Ｍグリシン水溶液（ｐＨ１０）中に１時間３０分浸積した後、蒸留水で洗浄し、室温で乾燥させて、上記オリゴヌウレオチドを固定したオリゴヌクレオチド検出具（ＤＮＡチップ）を得た。
【００５１】
（３）相補的な標的オリゴヌクレオチド試料の検出
５’末端にＣｙ５（蛍光標識）が結合した２２ｍｅｒの標的オリゴヌクレオチド試料（ＣＴＡＧＴＣＴＧＴＧＡＡＧＴＴＣＣＡＧＡＴＣ−５’）をハイブリダイゼーション用溶液（４×ＳＳＣおよび１０重量％のＳＤＳの混合溶液、２０μＬ）に分散させたものを、上記（２）で得た検出具の表面に点着し、表面を顕微鏡用カバーガラスで保護した後、モイスチャーチャンバー内にて６０℃で２０時間インキュベートした。次いで、このものを０．１重量％ＳＤＳと２×ＳＳＣとの混合溶液、０．１重量％ＳＤＳと０．２×ＳＳＣとの混合溶液、及び０．２×ＳＳＣ水溶液で順次洗浄した後、６００ｒｐｍで２０秒間遠心処理し、室温で乾燥した。
検出具の標的オリゴヌクレオチド試料の点着面を蛍光強度を、蛍光スキャニング装置（ＦＬＡ８０００：富士写真フィルム株式会社製）で測定した。その結果を表１に示す。
【００５２】
［比較例１］オリゴヌクレオチド検出具の作製と標的オリゴヌクレオチドの検出能の検定
１，２−ビス（ビニルスルホニルアセトアミド）プロパンを、表面にアミノ基を有するガラススライド（松浪ガラス株式会社製）と、前記特開２００１−２２８１５２号公報に記載の方法に従って接触させ、ガラススライド表面に１，２−ビス（ビニルスルホニルアセトアミド）プロパンが共有結合により固定された反応性ガラススライドを作製し、このガラススライドを用い、実施例１の（２）に記載の操作を行なってオリゴヌクレオチド検出具を作製し、ついで（３）に記載の処理を行なって、標的オリゴヌクレオチドの検出能を検定した。その結果を表１に示す。
【００５３】
【表１】
0003808389.tif 000002
【００５４】
［実施例２］  点着スポット径の比較
実施例１と比較例１で作製したオリゴヌクレオチド検出具の各々に、別に用意したＣｙ５標識オリゴヌクレオチド（濃度１０ｎｇ／μＬ）の三種の溶液（バッファ溶液、５０％グリセリンバッファ溶液、あるいは５０％ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）水溶液）を、それぞれ、市販のスポッタ（スリットピン仕様）を用いて点着し、乾燥したのち、蛍光スキャニング装置（ＦＬＡ８０００）で測定し、点着スポット径を測定した。また、各検出具に対する接触角（バッファ溶液を仕様）を測定した。その結果を表２に示す。
【００５５】
【表２】
0003808389.tif 000003
【００５６】
【発明の効果】
本発明を利用することによって、固相担体の表面に、ヌクレオチド誘導体あるいはその類縁体ヌクレオチドのプローブを、安定かつ迅速に固定することができる。従って、本発明の固定方法によって作製されたヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体が固定された固相担体は、加水分解によるプローブの離脱が起こりにくい非常に安定な固相担体となる。本発明の検出用具を用いると、プローブオリゴヌクレオチドが検出用具の表面に小さな径にて点着できるため、プローブオリゴヌクレオチドが高密度にて固定された検出具が容易に実現する。