(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１対のフォトダイオードと、前記１対のフォトダイオードでそれぞれ光電変換された電荷を入力とする信号検出トランジスタ回路と、前記１対のフォトダイオードおよび前記信号検出トランジスタ回路を駆動する入力端子と、前記信号検出トランジスタ回路からの検出電圧を出力する出力端子とが形成された半導体集積回路基板と、前記半導体集積回路基板の上部に、前記１対のフォトダイオードの一方に対向して蛍光材を含む溶液が導入される液槽が形成された、透明材料からなる容器とを有する蛍光検出装置であって、
前記１対のフォトダイオードの他方および前記信号検出トランジスタ回路に対向して遮光層を具備したことを特徴とする蛍光検出装置。
【請求項２】
前記一方のフォトダイオードによる検出信号から、前記他方のフォトダイオードによる検出信号を減算することにより、前記液槽に入射する励起光により励起された蛍光の強度が計測されることを特徴とする請求項１記載の蛍光検出装置。
【請求項３】
前記遮光層は、光吸収材料の表面が低反射処理されて成ることを特徴とする請求項１記載の蛍光検出装置。
【請求項４】
前記液槽の底部に病因遺伝子の一本鎖ＤＮＡが固定化され、前記液槽に蛍光材で蛍光修飾したサンプル遺伝子の一本鎖ＤＮＡを含む溶液が導入され、その後前記溶液が除去され、前記励起光を照射して蛍光の強度が計測されることを特徴とする請求項２記載の蛍光検出装置。
【請求項５】
前記液槽の底部に特定の蛋白質を捕らえる抗体が固定化され、前記液槽に蛍光材で蛍光修飾した蛋白質の溶液が導入され、その後前記溶液が除去され、前記励起光を照射して蛍光の強度が計測されることを特徴とする請求項２記載の蛍光検出装置。
【請求項６】
前記液槽に、サンプル遺伝子の一本鎖ＤＮＡ溶液と、ポリメラーゼ・チェーン反応（ＰＣＲ）により前記一本鎖ＤＮＡ溶液と蛍光反応を起こす試薬とが導入され、蛍光の強度が計測されることを特徴とする請求項２記載の蛍光検出装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、蛍光発光を測定することで、試料中に存在する特定の遺伝子の検出に応用可能な蛍光検出装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、国際ヒトゲノムプロジェクトの進展により、ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）の塩基配列が判明しつつあり、今後、その情報を基にして個人の最適な投薬や遺伝病の早期発見・治療などの実現が進められている。その中で、特定の遺伝子情報を簡易的に解析する遺伝子解析チップの早期開発が特に望まれている。
【０００３】
各個人固有の遺伝子情報は、ＤＮＡの塩基配列に基づいたｍ−ＲＮＡ（メッセンジャー・リボ核酸）を介して生成されるタンパク質や酵素の発現によって決定される。このタンパク質や酵素により生体機能が司られる。例えば、病因情報（遺伝子病など）や薬品代謝機能なども、遺伝子情報により生体にインプリントされている。このようなことから、予め遺伝子を調べることにより発症前に病気・治療の診断予測が可能となり、より健康な生活が維持できるようになる。
【０００４】
こうしたことから、疾病や投薬に関係する遺伝子の特定が盛んに進められおり、現在数百以上の相関が明らかにされている。
【０００５】
ＤＮＡチップの蛍光発光検出を例にして、従来の方法について以下に説明する。
【０００６】
判明している病因遺伝子と相補的な塩基配列の核酸プローブを数センチメートル角のガラスチップやシリコンチップに固定化する。このチップは、一般的にＤＮＡチップと呼ばれる。
【０００７】
次に、調べたいサンプル遺伝子を細胞（例えば、血液など）から抽出し、サンプル遺伝子から同じ塩基配列を持つ蛍光色素で標識した核酸鎖をポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）技術を用いて生成および増幅する。このＰＣＲにより、サンプル遺伝子の数十万倍以上に増幅され蛍光標識された核酸鎖が生成される。この蛍光色素で標識した核酸鎖を含む溶液中にＤＮＡチップを入れて、ハイブリダイゼーション反応をさせる。その後、ＤＮＡチップから蛍光色素で標識した核酸鎖を含む溶液を洗い流す。
【０００８】
次に、図４に示す蛍光検出装置を用いて、ＤＮＡチップの蛍光発光を測定する。レーザなどの光源２０５からの励起光２０９は、ビームスプリッター２０４で反射されて、対物レンズ２０６に入る。励起光２０９は、対物レンズ２０６で集光されて、ＤＮＡチップ２０８の核酸プローブの固定部２０７に当たる。
【０００９】
ハイブリダイゼーション反応でハイブリダイゼーションした場合、病因遺伝子に基づいた核酸プローブと蛍光色素を標識した核酸鎖が二本鎖を形成し、溶液を洗い流した後も、蛍光物質がＤＮＡチップ２０８上に残ることになり、励起光２０９により蛍光標識が球状放射の蛍光２１０を発生する。ハイブリダイゼーションしていない場合は、蛍光しない。蛍光２１０と励起光２０９には、数十ナノメートル程度の波長の差がある。
【００１０】
蛍光の一部２１１と励起光２０９の反射光が対物レンズ２０６に戻り、ビームスプリッター２０４に入射する。励起光２０９の反射光は、ほとんどがビームスプリッター２０４で反射されて、光源側に向かい、蛍光の一部２１１は、ビームスプリッター２０４を透過して、受光器２０１側に向かう。ビームスプリッター２０４を透過した蛍光の一部２１１は、波長を限定するフィルター２０３で励起光２０９の反射光は除去される。蛍光の一部２１１は、受光器レンズ２０２を通って、蛍光強度を測定する受光器２０１に入射する。ハイブリダイゼーション反応でハイブリダイゼーションしていない場合は、蛍光しないために、受光器２０１に光は入射しない。
【００１１】
図４に示すように、従来の蛍光検出装置では、遺伝子検知のために大掛かりな光学系による測定系を用いて、蛍光発光強度を検知している。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上記従来の遺伝子検知のための蛍光検出装置では、フィルター、光学レンズを必要とし、また長い光路長のために蛍光部から受光部までの間でのロスが大きく、蛍光が十分に受光器に入射できないことで、検出感度が低いことが問題となっている。
【００１３】
本発明は、上記従来の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、蛍光発光強度を高感度で検出可能な小型の蛍光検出装置を提供することにある。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
前記の目的を達成するため、本発明に係る蛍光検出装置は、少なくとも１対のフォトダイオードと、１対のフォトダイオードでそれぞれ光電変換された電荷を入力とする信号検出トランジスタ回路と、１対のフォトダイオードおよび信号検出トランジスタ回路を駆動する入力端子と、信号検出トランジスタ回路からの検出電圧を出力する出力端子とが形成された半導体集積回路基板と、半導体集積回路基板の上部に、１対のフォトダイオードの一方に対向して蛍光材を含む溶液が導入される液槽が形成された、透明材料からなる容器とを有する蛍光検出装置であって、１対のフォトダイオードの他方および信号検出トランジスタ回路に対向して遮光層を具備したことを特徴とする。
【００１５】
この構成によれば、１対のフォトダイオードの他方および信号検出トランジスタ回路に対向して遮光層を設けることで、蛍光ではない熱に起因して、他方のフォトダイオードで生じた信号を検出することができる。特に、蛍光を光電変換する一方のフォトダイオードと隣接して他方のフォトダイオード形成することにより、両方のフォトダイオードにおける温度が同じになり、熱によるフォトダイオードでの電荷生成が同じになる。
【００１６】
本発明に係る蛍光検出装置において、一方のフォトダイオードによる検出信号から、他方のフォトダイオードによる検出信号を減算することにより、液槽に入射する励起光により励起された蛍光の強度が計測されることを特徴とする。
【００１７】
この構成によれば、熱により生成した電荷分を除外でき、熱、温度要因による信号精度の低下が抑制できる。
【００１８】
また、本発明に係る蛍光検出装置において、遮光層は、光吸収材料の表面が低反射処理されて成ることが好ましい。
【００１９】
この構成によれば、多重反射による遮光された他方のフォトダイオードへの光の入射を抑制でき、蛍光による信号を高精度に検出できる。
【００２０】
また、本発明に係る蛍光検出装置において、液槽の底部に病因遺伝子の一本鎖ＤＮＡが固定化され、液槽に蛍光材で蛍光修飾したサンプル遺伝子の一本鎖ＤＮＡを含む溶液が導入され、その後溶液が除去され、励起光を照射して蛍光の強度が計測されることが好ましい。
【００２１】
この構成によれば、二本鎖ＤＮＡが形成されていた部分が蛍光を発するので、サンプル遺伝子が病因遺伝子と相補な塩基配列であることが分かり、特定の遺伝子を検知することができる。
【００２２】
また、本発明に係る蛍光検出装置において、液槽の底部に特定の蛋白質を捕らえる抗体が固定化され、液槽に蛍光材で蛍光修飾した蛋白質の溶液が導入され、その後溶液が除去され、励起光を照射して蛍光の強度が計測されることが好ましい。
【００２３】
この構成によれば、蛍光修飾された蛋白質が、抗体が捕らえる特定の蛋白質であれば、蛍光修飾された蛋白質と抗体が液槽の底部に生成され、それが蛍光を発するので、特定の蛋白質を検知することができる。
【００２４】
また、本発明に係る蛍光検出装置において、液槽に、サンプル遺伝子の一本鎖ＤＮＡ溶液と、ポリメラーゼ・チェーン反応（ＰＣＲ）により一本鎖ＤＮＡ溶液と蛍光反応を起こす試薬とが導入され、蛍光の強度が計測されることが好ましい。
【００２５】
この構成によれば、ＰＣＲ法などの遺伝子増幅法を実施することができる。
【００２６】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の好適な実施の形態について、図１から図３を参照しながら説明する。
【００２７】
図１は、本発明の一実施形態に係る蛍光検出装置における光検出部分の構造を示す断面図であり、図２は、図１の蛍光検出装置における蛍光検出回路の詳細構成を示す図（ａ）およびその駆動タイミングチャート（ｂ）であり、図３は、図１の蛍光検出装置における光検出部分の外観構造を示す斜視図である。なお、図１から図３を通じて、同じ構成および機能を有する部分については、同一の符号を付している。
【００２８】
図１において、ｐ型シリコン基板７には、ｎ型不純物層８、８−１および対応する最表面にｐ＋層２１、２１−１がそれぞれ設けられたフォトダイオード８０、８０−１と、フォトダイオード８０、８０−１でそれぞれ光電変換された電荷信号を増幅する増幅用トランジスタ６、６−１と、電荷信号を読み出した後にフォトダイオード８０の電荷をリセットするリセットトランジスタ９と、電荷信号を読み出した後にフォトダイオード８０−１の電荷をリセットするリセットトランジスタ９−１とが形成される。
【００２９】
また、ｐ型半導体基板７の上部には、層間絶縁膜４が形成され、その上に形成された、透明材料、例えば石英からなる容器１４中に、蛍光材を含む溶液１７を入れる液槽１３が、フォトダイオード８０の上部に対向して形成される。１６は、液槽１３内の溶液に入射する励起光を示している。
【００３０】
フォトダイオード８０、８０−１でそれぞれ光電変換された電圧が、金属配線１、１−１により、増幅用トランジスタ６、６−１の制御ゲート３、３−１にそれぞれ入力される。２、５は、それぞれ、増幅トランジスタ６のソース金属配線、ドレイン金属配線である。２−１、５−１は、それぞれ、増幅トランジスタ６−１のソース金属配線、ドレイン金属配線である。１１、１１−１は、それぞれ、リセットトランジスタ９、９−１の制御ゲートであり、１０はリセット電源線である。
【００３１】
また、１２は、フォトダイオード以外のリセットトランジスタなどの能動素子を遮光する金属層である。１２−１、１２−２は、フォトダイオード８０−１のみを遮光する金属層であり、表裏面を低反射化している。材料としては、例えば、アルミニウム膜の表裏面に窒化チタン（ＴｉＮ）などの光吸収膜で低反射化したものをスパッタなどにより形成する。
【００３２】
図２（ａ）の蛍光検出回路において、８０、８０−１はフォトダイオード、２３はリセットトランジスタ、２４は増幅用トランジスタ、２５は負荷トランジスタ、２６および２６−１は選択用トランジスタである。負荷トランジスタ２５のゲートとソースは接地されている。３２は増幅用トランジスタ２４の電源、３３はリセットトランジスタ２３のリセット電源、３４はリセットトランジスタのタイミング制御入力端子である。３６および３６−１は、それぞれ選択用トランジスタ２６、２６−１のタイミング制御端子である。３５は、増幅用トランジスタ２４と負荷トランジスタ２５とで構成されるソースホロワ回路の信号出力端子である。なお、図２（ａ）では、図１の２つの増幅用トランジスタ６、６−１を１つの増幅用トランジスタ２４で表し、２つのリセットトランジスタ９、９−１を１つのリセットトランジスタ２３で表している。また、図２（ａ）の選択用トランジスタ２６、２６−１、および負荷トランジスタ２５は、図１では例示の便宜上省略している。
【００３３】
次に、このように構成された蛍光検出回路の動作原理について、図１および図２（ａ）を用いて説明する。
【００３４】
まず、フォトダイオード８０、８０−１のカソード側を、リセットトランジスタ２３と選択用トランジスタ２６、２６−１により、リセット電源３３の正電圧に充電する。増幅用トランジスタ２４と負荷トランジスタ２５とで構成されるソースホロワ回路の信号出力Ｖ３５は、フォトダイオード８０、８０−１の検出電圧を読み出していない時には、リセットトランジスタ２３により充電された電圧と同じになる。
【００３５】
その後、フォトダイオード８０に蛍光１６’が入射すると、フォトダイオード８０では光電変換により発生した電子、および熱により生成された電子が、ｎ型不純物層８に蓄積され、フォトダイオード８０のカソード側の電圧が低下する。しかし、フォトダイオード８０−１では、遮光層１２−１、１２−２により遮光されているために、光電変換が起きず、熱による電荷生成による電子だけがｎ型不純物層８−１に蓄積され、その分、フォトダイオード８０−１のカソード側の電圧が若干低下することになる。
【００３６】
次に、蛍光１６’を光電変換した信号の読み出しについて、図２（ｂ）のタイミングチャートを用いて説明する。
【００３７】
まず、フォトダイオード８０、８０−１のカソードを上記のように充電後、蛍光計測する一定の時間後に、フォトダイオード８０のカソード電圧を読み出す。そのために、図２（ｂ）に示すように、選択用トランジスタ２６をオンにする制御パルスＶ３６をタイミング制御入力端子３６に入力し、続いてリセットトランジスタ２３をオンにする制御パルスＶ２３をタイミング制御入力端子３４に入力する。その結果、選択用トランジスタ２６がオンになってから、リセットトランジスタ２３がオンになるまでの間の信号出力端子３５の電圧Ｖ３５が、フォトダイオード８０のカソード電圧の信号となる。
【００３８】
続いて、フォトダイオード８０−１のカソード電圧を読み出す。そのために、図２（ｂ）に示すように、選択用トランジスタ２６−１をオンにする制御パルスＶ３６−１をタイミング制御入力端子３６−１に入力し、続いてリセットトランジスタ２３をオンにする制御パルスＶ３４をタイミング制御入力端子３４に入力する。その結果、選択トランジスタ２６−１がオンになってから、リセットトランジスタ２３がオンになるまでの間の信号出力端子３５の電圧Ｖ３５が、フォトダイオード８０−１のカソード電圧の信号となる。
【００３９】
信号出力端子３５の電圧Ｖ３５には、光電変換および熱による信号と光電変換を含まない熱のみによる信号が出現する。これらの信号の差分を測定することにより、蛍光１６’を光電変換した信号が検出される。
【００４０】
実際には、図３に示すように、蛍光材を含む溶液１７を入れた液槽１３に対して、蛍光を励起する励起光１６が入射される。図３において、１５は、図１および図２に示した半導体集積回路を具備した半導体集積回路基板である。蛍光材を含む溶液１７に励起光１６が入射すると、球状に放射する蛍光１６’が発生し、蛍光１６’は、半導体集積回路基板１５のｎ型不純物層８に入射して光電変換される。
【００４１】
次に、このような蛍光検出装置の応用について説明する。
【００４２】
例えば、液槽１３の底部に病因遺伝子の一本鎖ＤＮＡを固定化し、Ｃｙ3などの蛍光材で蛍光修飾したサンプル遺伝子の一本鎖ＤＮＡを含む溶液を液槽１３に導入する。固定化した病因遺伝子と蛍光修飾したサンプル遺伝子が、相補的な塩基配列である場合には、ハイブリダイゼーションが起り、蛍光材がついた二本鎖ＤＮＡとなる。その後、蛍光修飾したサンプル遺伝子の一本鎖ＤＮＡを含む溶液を除去する。そして、蛍光発光の励起光１６を照射すると、二本鎖ＤＮＡが形成されているところが蛍光１６’を発する。もし、蛍光発光がフォトダイオード８０、８０−１により検出された場合、二本鎖ＤＮＡが形成されていたことになり、サンプル遺伝子が病因遺伝子と相補な塩基配列であったことが分かる。ここで、フォトダイオードが多数形成されている場合には、複数の病因遺伝子の一本鎖ＤＮＡを固定化していれば、同時に複数の病因遺伝子について検査できる。
【００４３】
また、ここで、液槽１３の底部に、病因遺伝子の一本鎖ＤＮＡに代えて、特定の蛋白質を捕らえる抗体を固定化しても構わない。その場合、後で蛍光修飾した蛋白質の溶液を入れる。その後、蛍光修飾した蛋白質の溶液を除去し、蛍光の励起光１６を照射する。ここで、蛍光修飾された蛋白質が、抗体が捕らえる特定の蛋白質であれば、蛍光修飾された蛋白質と抗体が液槽１３の底部に生成され、それが蛍光１６’を発し、フォトダイオード８０、８０−１で検出できる。これにより、特定の蛋白質の検知ができる。ここで、フォトダイオードが多数形成されている場合には、複数の抗体を固定化していれば、同時に複数の蛋白質について検知できる。
【００４４】
さらに、この装置において、ＰＣＲ法などの遺伝子増幅法を実施してもよい。この場合、ターゲットＤＮＡを含むサンプル溶液と、ターゲットＤＮＡの両端にハイブリタイズ可能な一対のプライマー、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ等）、ｄＮＴＰｓおよび蛍光インターカーレータ等を含むバッファー液とを液槽１３に入れる。そして、ターゲットＤＮＡの熱変性、プライマーのアニーリングおよびＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応の一連のステップを繰り返すことにより、ターゲットＤＮＡの増幅を行う。このようにして得られた増幅産物に蛍光インターカーレータが結合するので、これに励起光１６を照射し、生じる蛍光１６’をフォトダイオード８０、８０−１で検出すればよい。なお、蛍光反応は、上記に限らず、例えば、インベーダーアッセイ法や、ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ法による蛍光反応を液槽１３で起こさせ、その蛍光の強度を計測してもよい。
【００４５】
半導体集積回路基板１５は、シリコン基板からＩＣ（集積回路）を製造するＭＯＳ（金属−酸化膜−半導体）プロセスにより作製される。本実施形態において、半導体集積回路基板１５の材料をシリコン単結晶基板としたが、これに限らず、フォトダイオードとトランジスタが形成可能な基板材料ならよく、ガラス基板上に形成した多結晶シリコン集積回路基板、アモルファスシリコン集積回路基板、ＧａＡｓ集積回路基板などでも良い。
【００４６】
また、透明材料にからなる容器１４は、石英に限るものでなく、光透過率が高く、蛍光が極力少ない材料であれば良い。
【００４７】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明によれば、蛍光材を含む溶液を入れる液槽の下の蛍光測定用のフォトダイオードに隣接して、遮光層を設けたフォトダイオードを設け、同じ増幅回路を介して信号を読み出して、差分を比較評価することで、熱による外乱要因を排除でき、高感度に蛍光を検出できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  本発明の一実施形態に係る蛍光検出装置における光検出部分の構造を示す構造図
【図２】  図１の蛍光検出装置における蛍光検出回路の詳細構成を示す回路図（ａ）およびその駆動タイミングチャート（ｂ）
【図３】  図１の蛍光検出装置における光検出部分の外観構造を示す斜視図
【図４】  従来の蛍光検出装置の構成図
【符号の説明】
１、１−１…金属配線
２、２−１…ソース金属線
３、３−１…制御ゲート
４…層間絶縁膜
５、５−１…ドレイン金属配線
６、６−１…増幅用トランジスタ
７…ｐ型半導体基板
８、８−１…ｎ型不純物層
９、９−１…リセットトランジスタ
１０…リセット電源線
１１、１１−１…制御ゲート
１２、１２−１、１２−２…遮光用の金属層
１３…液槽
１４…容器
１５…半導体集積回路基板
１６…励起光
１６’…蛍光
１７…蛍光材を含む溶液
２１、２１−１…ｐ＋不純物層
２３…リセットトランジスタ
２４…増幅用トランジスタ
２５…負荷トランジスタ
２６、２６−１…選択用トランジスタ
３２…電源
３３…リセット電源
３４…タイミング制御入力端子
３５…信号出力端子
３６、３６−１…タイミング制御入力端子
８０、８０−１…フォトダイオード
【図１】
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【図２】
0003811393.tif 000003
【図３】
0003811393.tif 000004
【図４】
0003811393.tif 000005