(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子を発現させた卵母細胞を保持するセルを複数個有する容器を保持するステージを移動させて，前記複数のセルに保持された卵母細胞のうち第１の卵母細胞の位置決めを行なう工程と、
前記第１の卵母細胞へのガラス電極の挿入を、ガラス電極から発する電気信号に基づいて，前記セル内の溶液面への接触，前記第１の卵母細胞の膜表面への接触，前記第１の卵母細胞の膜内への挿入を検出して行う工程と、
前記第１の卵母細胞の膜内への挿入を検出した後、前記第１の卵母細胞の膜電位を所定の値に固定する工程と、
前記膜電位の固定を検出した後、前記第１の卵母細胞に化学物質を投与する工程と、
前記第１の卵母細胞の前記化学物質に対する応答を、電流値を計測して測定する工程とを有することを特徴とする電気生理自動計測方法。
【請求項２】
請求項１記載の電気生理自動計測方法において、前記第１の卵母細胞の膜表面に圧力をかけた状態でガラス電極を振動させ、前記第１の卵母細胞にガラス電極を挿入することを特徴とする電気生理自動計測方法。
【請求項３】
請求項１記載の電気生理自動計測方法において、前記セル内の溶液面への接触の後、オフセット電位を除去する工程を有することを特徴とする電気生理自動計測方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は，卵母細胞を用いる電気生理自動計測装置及び電気生理自動計測方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
生体の電気的性質に関する科学は「電気生理学」として約２００年の歴史を持ち，生理学の中でも主要な分野の一つとして発展してきた。特に神経・筋肉に於いては活動電位が興奮の最も本質的な現象であり，興奮伝導が電流の媒介によって行われることが明らかにされ，電気生理学はその最も重要な研究分野となっている。
【０００３】
電位固定法（Ｖｏｌｔａｇｅ  ｃｌａｍｐ  ｍｅｔｈｏｄ）は１９４０年代にアメリカのＣｏｌｅによって提案された。この電位固定法は，膜電位が変動する瞬間に膜電位を抑制する方向に電流を流すフィードバック回路を利用することで膜電位を常に一定にする方法である。この電位固定法を用いて膜電位とイオン透過性の関係についての定量的な計測が可能になり，イギリスのＨｏｄｇｉｋｉｎ，ＨｕｘｌｅｙとＫａｔｚらは電位固定法を用いてヤリイカの巨大神経の膜コンダクタンスの性質を解析し，その後の神経生物学研究の基礎になる多くの業績を挙げた。
【０００４】
これらの成果はジャーナル・オブ・フィジオロジー，第１１６号（１９５２年），第４２４頁から第４４８頁（Ｈｏｄｇｉｋｉｎ，Ａ，Ｌ．，Ｈｕｘｌｅｙ，Ａ．Ｆ．  ａｎｄ  Ｋａｔｚ，Ｂ．，Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１１６（１９５２），ｐｐ．４２４−４４８）に報告されている。
【０００５】
その後，この方法はＮｅｈｅｒとＳａｃｋｍａｎによって更に洗練された。彼らは生きた細胞から単一チャネル分子に流れる電流をリアルタイムで計測することに成功した。この技術はパッチクランプ法と呼ばれる。このパッチクランプ法の技術については，サックマンらによって「シングルチャネルレコーディング」（１９９５年）（Ｓａｃｋｍａｎ，Ｂ．，Ｎｅｈｅｒ，Ｅ．（ｅｄｓ．）：Ｓｉｎｇｌｅ−Ｃｈａｎｎｅｌ  Ｒｅｃｏｒｄｉｎｇ（２ｎｄ  ｅｄ．），Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９９５））に於いて詳しく述べられている。
【０００６】
電気的シグナルを記録するための電極として，直径約１ｍｍの硬質ガラス毛細管の中央部をヒーターで熱して軟らかくし，長軸方向に急速に引き伸ばして引き切ったものを用意する。引き伸ばされた先端が開口しており，その直径が１μｍ以下であるものを選んで，この毛細管の内部に３Ｍの塩化カリウム（ＫＣｌ）溶液を注入して満たし，これを電極として手動で細胞に突き刺すことで膜電位を測定することが可能である。
【０００７】
ホルモンや神経伝達物質の多くは，７回膜貫通型受容体あるいはＧ蛋白共役型受容体と呼ばれる受容体を介して細胞に情報を伝えている。近年ヒトゲノム計画が急速に進展し，遺伝子の塩基配列に関する情報が大量に蓄積しており，リガンドが不明のいわゆる「オーファン」の受容体遺伝子も数多く存在しているものと推定されている。
【０００８】
７回膜貫通型受容体のリガンドはホルモン，情報伝達物質，サイトカイン，酵素など多岐にわたり，分子種としてもアミン，アミノ酸，ペプチド，タンパク質，脂質，核酸，イオンなどが含まれる。更に，光や匂い，味などに対する感覚受容体も７回膜貫通型受容体の一種であり，生体機能の調節に重要な役割を果たしている。このため，７回膜貫通型受容体は，しばしば疾患にも深く関与しているため創薬の重要なターゲットとされてきた。実際，市販されている医薬品には７回膜貫通型受容体に結合することにより薬効を示すものが多い。このようなオーファン受容体のリガンドをスクリーニングし，決定する手段の一つとしても，電気生理法は重要である。
【０００９】
電気生理法は膜タンパク質分子の機能をリアルタイムで計測することのできる数少ない方法の一つであり，受容体タンパク質の中心的研究法である。従って，電気生理法は医薬品開発に於いても欠くことのできない技術であり，将来的にもその重要性は増していくものと考えられる。
【００１０】
なお，特開平１１−０８３７８５号公報に，卵母細胞にヒスタミン受容体を発現させ，卵母細胞のヒスタミンに対する応答を計測し，組織特異的にアレルギー反応を検出する技術が記載されている。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
上記したように，電気生理法はイオンチャネルの研究及び医薬品の開発に欠かせないものである。しかし，電気生理実験を行なうためには多くの煩雑な手作業を必要とするという問題がある。まず，測定者は細いガラス管を熱して引き延ばし，先端の直径が１μｍ以下のガラス微小電極を手作業で作成する必要がある。更に，ガラス電極を細胞に挿入するためには，マイクロマニュピレーターを手動で操作する必要がある。
【００１２】
マイクロマニュピレーターはガラス電極を保持し，ガラス電極の微量変位を手動で調節できる装置であるが，その操作については熟練した技術が要求されるという問題がある。一般にガラス電極を細胞内に挿入するためには手動でマイクロマニュピレーターを用いる。このため，ガラス電極が考案された１９４０年代から現在に至るまで電気生理に関する計測は測定者の職人的な手作業に大きく依存していた。
【００１３】
既存技術を用いてガラス電極の卵母細胞への挿入の自動化を考える時，画像認識の応用が考えられる。上部からＣＣＤカメラにより卵母細胞の膜表面の存在位置を計測し，ガラス電極をモータなどで駆動し移動させ，挿入することが考えられる。しかし，ガラス電極の挿入時には卵母細胞の膜表面は弾性変形を伴うため，上方からの画像認識により，膜内にガラス電極が正確に挿入されたかどうかについて判断を行うことは極めて難しい。また，画像認識によるガラス電極の挿入制御は，極めて高価になるため現実的な制御手段とはいえない。
【００１４】
卵母細胞あるいは培養細胞を用いた電気生理実験に於ける電流変化応答は細胞によるばらつきが大きいため，多数の細胞からの電流応答を平均化することでデータの信頼性を増す必要がある。従って，十分に信頼できるデータを得るためには各計測者が手作業で細胞にガラス電極を挿入する電気生理実験を多数回行う必要がある。そのため，信頼できるデータを得るためには長時間と多大な労力を要するという問題がある。
【００１５】
本発明の目的は，ガラス電極からの電気信号の基づいてガラス電極を卵母細胞膜内に挿入し，膜電位を固定し薬物投与した時の反応を自動計測する卵母細胞を用いる電気生理自動計測装置及び電気生理自動計測方法を提供することにある。
【００１６】
【課題を解決するための手段】
本発明の電気生理自動計測装置では，アース電極が配置又は形成されるセルの複数個（例えば，８×１２＝９６個）が規則正しく配列され成型されている容器の各セルに卵母細胞を保持し，容器を保持し移動させて所定のセル内の卵母細胞の位置決めをＸＹステージの移動により行ない，所定のセル内の卵母細胞に１本又は２本のガラス電極を挿入手段により挿入して，ガラス電極から発する電気信号を検出手段により検出して，卵母細胞の膜電位を固定手段により所定の値に固定して，マイクロシリンジにより卵母細胞に化学物質を投与し，卵母細胞についての電気生理測定を自動で行なう。
【００１７】
電気生理測定を自動で行なうために，ＸＹステージ，挿入手段，固定手段，及びマイクロシリンジは，制御手段により制御される。制御手段は，ガラス電極から発する電気信号に基づいて，ガラス電極のセル内の溶液面への接触，卵母細胞の膜表面への接触，卵母細胞の膜内への挿入を検出識別して，ガラス電極の卵母細胞への挿入の制御，マイクロシリンジによる卵母細胞への化学物質の投与の制御を行ない，電気生理自動計測装置の自動化を可能とする。即ち，ガラス電極の抵抗の測定，ガラス電極の零点電位の調整，ガラス電極のバイブレーション，膜電位の固定及び化学物質の投与の制御により自動計測を行う。
【００１８】
各セルの形状は，円錐の先端に半球を持つ形状を有し，各セルに卵母細胞を効率よく保持する。
【００１９】
より好ましくは，電気生理自動計測装置を，遮蔽手段により電磁波から遮蔽する。また，肉眼でセルに保持された卵母細胞を光学的にモニタする光学顕微鏡を配置しても良い。
【００２０】
アース電極は，導電性を持つ金属により成形され，表面が塩化銀により被覆され，セルに個別にアース線を付加する。容器を寒天により成型して，寒天の一部にアース電極を接触させて複数のセルを一様に接地できる。また，アース電極を１軸上でセルに保持された溶液内で移動させて，セル毎に独立して接地する構成としても良い。
【００２１】
より具体的には，８×１２＝９６個の卵母細胞が各セル内に規則的に配置された卵母細胞保持用プレートは，ＸＹステージ上に搭載される。１つの卵母細胞が保持されているセルにはそれぞれ独立にアース電極が付加されている。実体顕微鏡の視野中央にＸＹステージにより位置決めされた１つの卵母細胞に，２本のガラス電極をモーター駆動による移動により自動挿入する。ＸＹステージ，ガラス電極を駆動するモーター，リガンド投与用マイクロシリンジを駆動するモーター及び電気生理計測装置を，ガラス電極からの電気信号に基づいて外部より一括して制御用コンピューターで制御し，複数の卵母細胞についての電気生理測定を自動で行なうことができる。計測された卵母細胞の電流応答は計測記録用コンピューターで記録する。
【００２２】
本発明の電気生理自動計測方法では，卵母細胞を保持し，アース電極が配置又は形成されるセルの複数個を有する容器をＸＹステージに保持して，ＸＹステージを移動させて，所定のセル内の卵母細胞の位置決めを行ない，所定のセル内の卵母細胞に１本又は２本のガラス電極を挿入して，ガラス電極から発する電気信号を検出して，卵母細胞の膜電位を所定の値に固定して，マイクロシリンジにより卵母細胞に化学物質を投与し，卵母細胞についての電気生理測定を自動で行なう。電気生理測定を自動で行なうために，ＸＹステージの移動の制御，卵母細胞へのガラス電極を挿入の制御，卵母細胞の膜電位の固定の制御，卵母細胞への化学物質の投与の制御の，各制御を，ガラス電極から発する電気信号に基づいて行なう。上記の各制御は，ガラス電極のセル内の溶液面への接触，卵母細胞の膜表面への接触，卵母細胞の膜内への挿入を検出識別することにより行ない，電気生理自動計測の自動化を可能とする。
【００２３】
本発明では，ガラス電極を卵母細胞膜に自動挿入し膜電位を保持し，薬物投与した時の反応を自動計測する電気生理自動計測装置を提供する。図５を参照して，以下に本発明の原理を説明する。まず，空中にあるガラス電極１０３をセル内に保持された卵母細胞６０１に向けて移動する。ガラス電極１０３が溶液面６０３に着水し，アース電極６０４と通電すると，ガラス電極の電位は０ｍＶ付近を示す。ガラス電極１０３を移動させ卵母細胞６０１の膜表面にガラス電極１０３が接触する時に，−５ｍＶ程度の電位を示す。更に，ガラス電極１０２を移動させ膜内にガラス電極１０２が挿入された時，−２０ｍＶ程度の電位を示す。以上のガラス電極の電位状態を制御用コンピューターにより取り込み，ガラス電極１０２と卵母細胞６０１の相対位置を識別し，ガラス電極１０２を卵母細胞６０１に挿入し膜電位を保持し薬物を投与する，一連の電気生理計測を自動化する。
【００２４】
本発明の卵母細胞を用いる電気生理自動計測装置では，電気生理計測を自動化し計測者の負担を軽減し，計測の回数を増すことによりデータの信頼性を向上させることが可能となる。また，自動化により多数の試料の計測を高速化し，多数の電気生理計測を短時間に処理することが可能となる。更に，塩基配列が既知であるが機能が未知である遺伝子の機能をスクリーニングすることも可能となる。
【００２５】
【発明の実施の形態】
図１は，本発明の実施例の電気生理自動計測装置の構成例を示す図である。本発明の実施例の電気生理自動計測装置では，複数の細胞を電気生理法を用いて連続かつ自動に計測する。
【００２６】
図１に示すように，本発明の電気生理自動計測装置は，卵母細胞を観察する実体顕微鏡１１６；卵母細胞に挿入するガラス電極１０２，１０３；微小電気信号を増幅する微小電気信号増幅回路部１２２，１２３；リガンドを卵母細胞に投与するリガンド投与用マイクロシリンジ１２６；実体顕微鏡１１６及びガラス電極１０２，１０３を保持するＸＹステージ１０１；卵母細胞を保持する９６個の（セル）穴を持つ９６穴卵母細胞保持用プレート１１１；９６穴プレート用アース電極１２４；ガラス電極１０２，１０３の電位状態及び抵抗状態を示す電気信号を測定する電気生理測定回路部１０９；ＸＹステージ１０１，及びガラス電極１０２，１０３の移動を行なうためのモーターの駆動を制御するモーター駆動用コントローラー１０７；計測結果を記録する計測記録用コンピューター１２１；電気生理測定回路部１０９，モーター駆動用コントローラー１０７，及び計測記録用コンピューター１２１を制御する制御用コンピューター１０８から構成される。
【００２７】
実体顕微鏡１１６はその光軸が垂直になるようにＸＹステージ１０１に配置される。モーター１０４，１０５によりそれぞれ駆動されるガラス電極１０２，１０３は，実体顕微鏡１１６を配置した垂直軸から３０度傾けた位置に対称に配置される。また，ノイズを低減させ，効率よく電気生理実験を行うためにシールドにより装置全体を覆い，空気中の電磁波を遮蔽する。
【００２８】
本実施例では，ヒトヒスタミン受容体遺伝子をインジェクションした後に数日間の培養を経た卵母細胞を使用する。これらの卵母細胞は，９６穴卵母細胞保持用プレート１１１に保持される。ヒトヒスタミン受容体を発現している９６個の卵母細胞は，８×１２＝９６のマトリックス上に規則正しく配置される。
【００２９】
ガラス電極１０２，１０３の位置は，実体顕微鏡１１６の視野中央に位置決めされたセル内の１つの卵母細胞に挿入が可能な位置に調整されている。
【００３０】
制御用コンピューター１０８による制御により，ガラス電極駆動用モーター１０４，１０５を一軸（図１に示す矢印で示す）上に駆動させ，実体顕微鏡１１６の視野中央に位置決めされた卵母細胞に，ガラス電極１０２，１０３を挿入できる。
【００３１】
ガラス電極１０２，１０３の細胞膜内への挿入の過程を実体顕微鏡１１６により肉眼で観察できる。また，実体顕微鏡１１６にＣＣＤカメラを付加し，ガラス電極１０２，１０３の卵母細胞への挿入状況をモニターし，画像処理からガラス電極１０２，１０３の移動を制御することも可能である。
【００３２】
なお，実体顕微鏡１１６は必ずしもガラス電極１０２，１０３を卵母細胞へ挿入するために必須な構成ではなく，ガラス電極１０２，１０３の動作を目視により確認するためだけのものである。従って，ガラス電極１０２，１０３の移動機構の精度を高めて，目視による確認なしにガラス電極１０２，１０３を卵母細胞へ挿入可能な構成とすることにより，実体顕微鏡１１６は装置から除去することが可能である。
【００３３】
リガンド投与用マイクロシリンジ１２６は，支持体１２７を通して微小電気信号増幅回路部１２２に保持されているため，ガラス電極駆動用モーター１０５によりガラス電極１０２と共に移動できる。ガラス電極１０２が卵母細胞膜内に挿入された時に，リガンド投与用マイクロシリンジ１２６の先端は，卵母細胞の膜表面付近に十分に接近する位置に調整されており，ヒスタミンを効率よく投与できる。
【００３４】
電気生理測定回路部１０９ではガラス電極１０２，１０３の電位状態及び抵抗状態を示す電気信号を測定する。細胞膜にガラス電極１０２，１０３が挿入されたことを示す電気信号が電気生理測定回路部１０９により取り込まれ，これを識別した制御用コンピューター１０８は電気生理測定回路部１０９に膜電位を−６０ｍＶに固定する信号を送り返し，卵母細胞の膜電位が固定される。
【００３５】
細胞の膜電位の固定を確認した後に，制御用コンピューター１０８は，マイクロシリンジ駆動用モーター１２５を駆動させて，卵母細胞の膜表面に発現しているヒスタミン受容体にリガンドであるヒスタミンをマイクロシリンジ１２６により投与する。
【００３６】
なお，卵母細胞の膜表面に発現可能な受容体はヒスタミン受容体に限定されるものではなく，種種の受容体を発現させることが可能である。卵母細胞の膜表面に存在するヒスタミン受容体は，ヒスタミンの結合により活性化され，一連のシグナル伝達が進行し，最終的に卵母細胞のクロライドチャネルよりクロライドイオンが細胞外に流れ出す。
【００３７】
計測記録用コンピューター１２１は，このクロライドイオン流を電流変化として捉え記録する。１つの細胞についての測定が終了した後，制御用コンピューター１０８は，電気生理測定回路部１０９を通じ，膜電位の固定を解除し，ガラス電極駆動用モーター１０４，１０５を初期位置にまで移動させ，２本のガラス電極１０２，１０３を卵母細胞より引き抜く。次に，ＸＹステージ１０１を隣り合ったセルの間隔分だけ移動させ，実体顕微鏡１１６の視野中央に，次の計測を行なう卵母細胞の位置決めを行なう。以上の操作を繰り返すことにより，複数の卵母細胞について効率的に連続して電気生理実験を自動化することが可能である。一般に，卵母細胞を用いた電気生理的測定方法では，ガラス電極１０２，１０３を２本用いる２電極膜電位固定法が広く用いられている。一方，卵母細胞より小さな神経細胞では，１本のガラス電極のみを使用する１電極膜電位固定法が広く用いられている。これは神経細胞では，ピコアンペアレベルのイオン電流量を測定するのに対し，卵母細胞の場合は細胞体が大きいために，マイクロアンペアの電流量が発生するために，従来の１電極膜電位固定法をそのまま使用することが困難なためである。しかし，原理的には，イオン電流レベルを卵母細胞で予想される数マイクロアンペアの電流が測定可能な電気回路を設計することにより，卵母細胞の計測においても１電極膜電位固定法を適用することが可能である。これにより，２電極膜電位固定法に於ける複数のガラス電極の挿入が単純化され，ガラス電極の挿入に伴うエラーの発生を減少させることが可能である。また，計測の手続きも同様に簡素化するために，２電極膜電位固定法と比較して１電極膜電位固定法は単位時間当たりに計測できる卵母細胞の個数を増すことが可能であるため，スループットが向上する。また，装置の製造コストも低くできるという利点もある。
【００３８】
また，ガラス微小管を用いて目的となる遺伝子を手作業で細胞に注入するマイクロインジェクション法が，従来，細胞への遺伝子導入の主流な方法の一つであるが，本実施例のガラス微小管の細胞への挿入方法を応用し，一定量の遺伝子を細胞に注入する機構を付加することにより，複数の細胞の各細胞にガラス微小管を自動挿入した後に，目的となる遺伝子を一定量注入する装置を製作することが可能である。
【００３９】
図２は，本発明の実施例のアレルギー診断を行なう電気生理自動計測装置の構成例を示す図である。複数の９６穴卵母細胞保持用プレート１１１がベルトコンベア８０９により搬送され，プレートスタッカー８０３に装着される。プレートスタッカー８０３を使用することにより，ベルトコンベアに８０９により搬送されてきた複数の９６穴卵母細胞保持用プレート１１１を効率よく整理し，円滑にＸＹステージ１０１に９６穴卵母細胞保持用プレート１１１を順次送り込むことが可能となる。各プレート上の卵母細胞にはヒスタミン受容体が既に発現している。
【００４０】
アレルギー診断の具体的な検査項目として挙げられるのが，杉花粉，ハウスダスト，イエダニなどである。予め検体から採取された血液にアレルゲンを添加し，３０〜９０分程インキュベートしたものを遠心分離し，血漿成分を回収する。この前処理を事前に行っておく。これらの各検体からの血漿成分を反応ディスク８０６内の反応容器８０５に設置する。
【００４１】
リガンド投与用マイクロシリンジ１２６に反応容器８０５内の血漿成分を採取し，モーター８１０によりマイクロシリンジ１２６を回転させて，９６穴卵母細胞保持用セル１１１に保持された卵母細胞に血漿成分を投与する。これにより，多数の検体から採取された血液について多項目について検査を行うことが可能である。以上の動作を，制御用コンピューター１０８’により統合して行う。制御用コンピューター１０８’は，図２に図示しない，図１に示すモーター駆動用コントローラー１０７，及び電気生理測定回路部１０９を制御すると共に，図１に示す計測記録用コンピューター１２１を兼ねており，計測データの取得，管理も一括して行う。
【００４２】
図３は，本発明の実施例で使用する９６穴卵母細胞保持用プレートの構成例を示す平面図であり，図４は，図３に示す９６穴卵母細胞保持用プレートの断面図である。卵母細胞保持用プレート１１１は，８×１２＝９６個の独立したセル２０２をもつ。セル２０２は，上方に９０度の角度で開いており，セルの下方部に半球部２０３をもつ。なお，プレート上のセル数は９６個に限定する必要はなく，電気生理実験に使用する細胞の大きさに応じて３８４，８６４，１５３６個のセル数に拡張することが可能である。
【００４３】
セル２０２のそれぞれは１つの卵母細胞を保持し，保持することが可能である。卵母細胞保持用プレート１１１は，市販の９６穴タイタープレートと同様の大きさ及び穴（セル）の位置をもつ。卵母細胞保持用プレート１１１の大きさは縦８５ｍｍ，横１２７ｍｍ，厚さ１０ｍｍである。セル２０２の直径は９ｍｍであり，セル２０２の間隔は９．５ｍｍである。
【００４４】
セル２０２は卵母細胞をセル下方部の半球部２０３に保持できる。この半球部２０３の径が大きすぎるとガラス電極１０２，１０３の挿入時に，卵母細胞がセル２０２内に安定して保持されず，移動するため，安定してガラス電極１０２，１０３を卵母細胞に挿入できない。一方，半球部２０３の径が小さすぎると，卵母細胞が半球部２０３内に入りきらないために，卵母細胞の安定した保持ができない。２本のガラス電極１０２，１０３を卵母細胞に挿入する時に，卵母細胞を半球部２０３内で安定して保持するために最適な径は，１．２ｍｍ±０．１ｍｍである。
【００４５】
また，実体顕微鏡１１６を用いてガラス電極１０２，１０３の卵母細胞への挿入を目視により観察する場合は，ガラス電極１０２，１０３を卵母細胞保持用プレート１１１の垂直方向から卵母細胞に挿入きない。この場合は，ガラス電極１０２，１０３は卵母細胞保持用プレート１１１から垂直方向の軸に対して一定の角度を保持する必要がある。
【００４６】
図５は，本発明の実施例に於けるガラス電極の卵母細胞への挿入制御を示す図である。本発明では，ガラス電極の電位信号に基づいて，ガラス電極の卵母細胞への挿入のための制御を行なう。
【００４７】
卵母細胞保持用プレートの１つのセルに卵母細胞６０１が保持されている。ガラス電極１０２，１０３が移動する軸上に卵母細胞６０１は位置している。リガンド投与用シリンジ１２６は，ガラス電極１０３より微小量後退した位置に調整され，設置されている（従って，図５には図示せず）。図５に示すグラフは，時間と共に変化するガラス電極１０２，１０３の電位の変遷を示し，（ａ）から（ｅ）に示すガラス電極の異なる位置に対応する異なる電位状態を示す。
【００４８】
（ａ）に示すように，ガラス電極１０２は溶液面６０３より上方に位置し，アース電極６０４とは通電しておらず，従って，電位は無限大となる。制御用コンピューターは，電位が無限大であることから，ガラス電極１０２が空中にあることを認識する。
【００４９】
（ｂ）に示すように，卵母細胞６０１に向かって移動を開始したガラス電極１０２が溶液面６０３に到達すると，ガラス電極１０２とアース電極６０４とが溶液６０３を通して接触し通電するため，電位は０±３ｍＶ付近となる。ガラス電極１０２の溶液面６０３への到達を認識した制御用コンピューターは，ガラス電極１０２の抵抗が０．８ＭΩ〜２．４ＭΩの許容値の範囲に収まるかどうかを計測し，判定する。ガラス電極１０２の抵抗が許容値内に入らない場合は，モーターによりガラス電極１０２は引き上げられ，ガラス電極１０２の交換を行なう。更に，制御用コンピューターは±３ｍＶ程度のオフセット電位を自動で除去し，０ｍＶに電位を調整する。
【００５０】
（ｃ）に示すように，制御用コンピューターは，モーター駆動によりガラス電極１０２を卵母細胞６０１に向かって移動させる。ガラス電極１０２が卵母細胞６０１に接触すると，卵母細胞は弾性変形する。この時，ガラス電極の電位は更に，約５ｍＶ程度降下する。制御用コンピューターは，この電位降下を検出し，ガラス電極１０２が卵母細胞６０１の膜表面に接触したことを認識する。
【００５１】
（ｄ）に示すように，制御用コンピューターは，卵母細胞１０２の膜表面に圧力をかけた状態でガラス電極１０２をモーターの駆動軸上で振動させる。これにより，卵母細胞６０１に大きな損傷を与えることなく円滑にガラス電極１０２を膜内に挿入することが可能である。通常の卵母細胞１０２の膜電位は−２０ｍＶ程度なので，制御用コンピューターは，−２０ｍＶ程度の電位を検出することにより，ガラス電極１０２が卵母細胞６０１内に挿入されたことを認識する。
【００５２】
（ｅ）に示すように，ガラス電極１０３も，（ａ）〜（ｄ）の操作を繰り返すことで，卵母細胞６０１膜内に挿入する。２本のガラス電極１０２，１０３が卵母細胞６０１に挿入された後に，制御用コンピューターは電気生理測定回路部１０９に膜電位を−６０ｍＶに固定する信号を送ることにより，膜電位を−６０ｍＶに固定する。
【００５３】
以上，詳述したように，本実施例ではガラス電極１０２，１０３から得られる電気信号のみを用いて，卵母細胞６０１に２本のガラス電極１０２，１０３の挿入を実行でき，更に，ヒスタミン投与に応答する電流変化を検出することが可能である。
【００５４】
次に，９６穴卵母細胞保持用プレート１１１を使用して電気生理計測を行う際のアースの３種類の取り方について以下に説明する。
【００５５】
図６は，本発明の実施例で使用する９６穴プレート用アース電極の形状を示す平面図であり，図７は，図６に示す９６穴卵母細胞プレート用アース電極の部分斜視図である。図６は，９６穴卵母細胞保持用プレート１１１に組み合わせる９６穴プレート用アース電極３０１を示す。９６穴プレート用アース電極３０１の材質は，銅又はアルミニウムであり，形成された後に銀メッキを施す。更に，銀メッキを施した９６穴プレート用アース電極３０１を１５０ｍＭの塩化ナトリウム溶液中に浸し，１．５Ｖ程度の直流電流を流した状態で２４時間以上放置することにより，銀と塩素イオンとを反応させ，９６穴プレート用アース電極３０１の表面に塩化銀の皮膜を作る。生体中の細胞外液の主成分はＮａＣｌであり，銀電極とＮａＣｌ溶液との間に両方に共通したイオンをもつ化学物質（ここでは，塩化銀）があれば分極電圧の発生を防ぎ，計測上の電気雑音を低減できる。
【００５６】
図７は，９６穴プレート用アース電極３０１を斜め上方よりみた図である。９６穴プレート用アース電極３０１は，各セル２０２に対してそれぞれ独立に伸びるアース部３０２をもち，アース部３０２はセル２０２の側面に沿って４５度の角度で折り込まれている。このため，９６穴プレート用アース電極３０１を１箇所で接地することにより，９６個のセル２０２全てのアースをとることが可能である。また，上記の方法以外に，９６穴卵母細胞保持用プレート１１１に直接アース電極をパターニングし，アースを取ることもできる。
【００５７】
図８は，本発明の実施例で使用する寒天からなる９６穴卵母細胞保持用プレートを作成し，アースをとる方法を示す図である。次に説明する方法では，寒天からなる卵母細胞保持用プレート４０５を作成しアースをとる。容器４０３に，予め加熱してゾル化した寒天４０２を流し込む。次に，９６穴卵母細胞保持用セルの型４０１をゾル化した寒天４０２中に浸し，固定する。一定時間放置した後，ゾル化した寒天４０２は室温まで冷却され，ゲル化する。型４０１をゲル化した寒天４０４より取り外すと，ゲル化した寒天４０４は卵母細胞を保持可能な形状に成型されており，寒天からなる９６穴卵母細胞保持用セル４０５を作成できる。ゲル化した寒天４０４は通電に十分な水溶液をゲル内に含むため，寒天上の任意の箇所にアース電極４０６を配置することにより，９６の個々のセルについて一括してアースをとることが可能である。従って，寒天からなる９６穴卵母細胞保持用セル４０５を用いることにより，煩雑なアース電極を付加することなく簡便に電気生理測定を連続で行なうことが可能となる。使い捨て可能な寒天製の容器は，プラスチックで作成する容器に比較して，非常に安価である。
【００５８】
図９は，本発明の実施例に於いてアース電極を移動させて各セルについてアースをとる構成例を示す図である。図９に示すように，アース電極をガラス電極に付随させて移動することにより，各セル内の電気生理計測でアースをとる。アース電極５０３をガラス電極１０３の先端付近に支持体５０２を通して固定する。リガンド投与用マイクロシリンジ１２６は，ガラス電極１０２にオフセットを保った形で固定されている。
【００５９】
ガラス電極１０３を卵母細胞６０１に向かって移動させていくと，アース電極５０３が溶液面６０３に接触する。アース電極５０３が溶液６０３に接触したことでガラス電極１０３は通電し，オフセット電位を除去する。ガラス電極１０２についても同様にアースを取ることが可能である。ガラス電極１０３にアース電極５０３を付随させることにより，複雑なアース電極を付加することなく，複数のセルについて安定したアースをとることが可能である。また，アース電極５０３をガラス電極１０３に付随させるのではなく，新たに一軸上にアース電極５０３を独立に移動させるアース電極駆動用モーターを用意する。これにより，ヒスタミン投与時に於ける卵母細胞の膜表面上での２本のガラス電極，アース電極，リガンド投与用シリンジが非常に接近するため，計測上のエラーが発生しやすいという問題を解決し，安定した状態でアースをとることも可能である。
【００６０】
図１０は，本発明の実施例の電気生理自動計測装置を用いて卵母細胞にヒスタミンを投与した時の反応を示す実験データである。図１０は，ヒスタミン受容体を発現させた卵母細胞に対して膜電位の固定を全自動で行い，ヒスタミンを投与し自動計測を行なった結果の一例を示す。図５で説明した，ガラス電極の異なる位置（ａ）〜（ｅ）の状態を経て，矢印（ｅ）で示した時刻で細胞の膜電位を固定し，矢印（ｆ）で示した時刻で１μＭのヒスタミンを５μＬ（リットル）投与を行い，卵母細胞から発する電流応答を自動計測した結果である。
【００６１】
図１０に示す計測では，１個の卵母細胞の計測に約１８０秒必要である。しかし，計測時間については，ガラス電極及びステージの移動の高速化，２本のガラス電極を同時に卵母細胞へ挿入するなどの工夫により，大幅に短縮することが可能である。また，図１０に示す例では，２０秒間で膜電位の固定の確認を行っているが，これは省略できる。更に，ヒスタミン濃度のみを測定するのであれば発生した内向き電流のピーク値（図１０に示す例では，約１３０秒の点での電流ピーク）のみを検出すれば良く，ヒスタミン投与後の履歴計測は省くことができる。従って，６０秒以内での１個の卵母細胞の計測は容易に達成できる。
【００６２】
本発明の電気生理自動計測装置によれば，遺伝子導入によりにある受容体を発現させた複数の卵母細胞のそれぞれに，全自動でガラス電極を挿入し，電位を固定し，対応するリガンドを投与した時の電流応答を計測できる。この結果，例えば，アレルギー関連の診断を高速化でき，大量の検体について短時間に診断を行える。更に，機能が未知である７回膜貫通型受容体の遺伝子を卵母細胞に導入し，未知の受容体を発現した卵母細胞に対して対応するリガンドをスクリーニングする作業を自動化することにより，大規模な遺伝子の機能解析探索を効率良く行なえる。
【００６３】
【発明の効果】
本発明の電気生理自動計測装置によれば，ルーチンワーク的な仕事の自動化により計測者の負担を軽減でき，計測を高速化でき，多数の計測を短時間にできるため，ばらつきの少ない信頼性の高いデーターを取得できるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施例の電気生理自動計測装置の構成例を示す図。
【図２】本発明の実施例のアレルギー診断を行なう電気生理自動計測装置の構成例を示す。
【図３】本発明の実施例で使用する９６穴卵母細胞保持用プレートの構成例を示す平面図。
【図４】図３に示す９６穴卵母細胞保持用プレートの断面図。
【図５】本発明の実施例に於けるガラス電極の卵母細胞への挿入制御法を示す図。
【図６】本発明の実施例で使用する９６穴プレート用アース電極の形状を示す平面図。
【図７】図６に示す９６穴卵母細胞プレート用アース電極の部分斜視図。
【図８】本発明の実施例で使用する寒天からなる９６穴卵母細胞保持用プレートを作成し，アースをとる方法を示す図。
【図９】本発明の実施例に於いてアース電極を移動させて各セルについてアースをとる構成例を示す図。
【図１０】本発明の実施例の電気生理自動計測装置を用いて卵母細胞にヒスタミンを投与した時の反応を示す実験データ。
【符号の説明】
１０１…ＸＹステージ，１０２，１０３…ガラス電極，１０４，１０５…ガラス電極駆動用モーター，１０７…モーター駆動用コントローラー，１０８，１０８’…制御用コンピューター，１０９…電気生理測定回路部，１１１…９６穴卵母細胞保持用プレート，１１６…実体顕微鏡，１２１…計測記録用コンピューター，１２５…マイクロシリンジ駆動用モーター，１２６…リガンド投与用マイクロシリンジ，２０２…セル，２０３…半球部，３０１…９６穴プレート用アース電極，３０２…アース部，４０１…型，４０２…ゾル化した寒天，４０４…ゲル化した寒天，４０５…寒天からなる卵母細胞保持用プレート，１２７，５０２…支持体，４０６…寒天に挿入するアース電極，５０３…支持体に固定されたアース電極，６０４…アース電極，６０３…溶液面，６０１…卵母細胞，８０３…プレートスタッカー，８０５…反応容器，８０６…反応ディスク，８０９…ベルトコンベア，８１０…モーター。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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