(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ロイコバクター属、ミコバクテリウム属、リゾビウム属及びシュードモナス属より成る群から選ばれた微生物であって、下記一般式（Ｉ）で表されるアミド化合物の加水分解能を有するものの菌体及び／または該菌体処理物の存在下、下記一般式（Ｉ）
0003758333.tif 000029
で表されるアミド化合物を加水分解することにより下記一般式（II）
Ｒ−ＣＯＯＨ                          …（II）
で表される酸を生成させることを特徴とするアミド化合物の加水分解方法。
[上記一般式（Ｉ）及び一般式（II）中、Ｒは置換基を有していてもよい直鎖状もしくは分岐鎖状のＣ1 〜Ｃ18のアルキル基、置換基を有していてもよい直鎖状もしくは分岐鎖状のＣ2 〜Ｃ18のアルケニル基、置換基を有していてもよい直鎖状もしくは分岐鎖状のＣ2 〜Ｃ18のアルキニル基、置換基を有していてもよいＣ3 〜Ｃ10のシクロアルキル基、置換基を有していてもよいＣ3 〜Ｃ10のシクロアルケニル基、置換基を有していてもよいＣ6 〜Ｃ14のアリール基、または置換基を有していてもよい複素環残基を表し、Ｒ1 はメチル基、エチル基またはｔ−ブチル基を表す。但し、Ｒ1 がメチル基またはエチル基を表す場合には、Ｒは
0003758333.tif 000030
｛上記式中、Ｒ2 は置換基を有していてもよい直鎖状もしくは分岐鎖状のＣ1 〜Ｃ10のアルキル基、置換基を有していてもよい直鎖状もしくは分岐鎖状のＣ2 〜Ｃ10のアルケニル基または置換基を有していてもよい直鎖状もしくは分岐鎖状のＣ2 〜Ｃ10のアルキニル基を表し、Ｒ3 はハロゲン原子、置換基を有していてもよい直鎖状もしくは分岐鎖状のＣ1 〜Ｃ5 のアルキル基を有していてもよいアミノ基またはヒドロキシル基を表すか、Ｒ2 とＲ3 とが結合してＲ2 Ｒ3 ＣＨで
0003758333.tif 000031
（上記式中、Ｒ4 はそれぞれ独立してカルボキシル基、ハロゲン原子、ＮＯ2 、ＣＮ、直鎖状もしくは分岐鎖状のＣ1 〜Ｃ4 のアルキル基、直鎖状もしくは分岐鎖状のＣ1 〜Ｃ4 のアルコキシ基または−ＣＯＮＨＲ5 （式中、Ｒ5 は水素原子または直鎖状もしくは分岐鎖状のＣ1 〜Ｃ4 のアルキル基を表す）を表し、Ｘは−ＮＨ−または−Ｏ−を表し、ｐは０〜３の整数を表し、ｍ、ｎ及びｒは０、１または２を表し、ｑは０または１を表す。但し、２≦ｍ＋ｎ＋ｒ＋ｑ≦４である。）を表す。｝で示される基を表す。］
【請求項２】
Ｒが
0003758333.tif 000032
で示される基であることを特徴とする請求項１記載のアミド化合物の加水分解方法。
【請求項３】
Ｒがピペラジニル基であることを特徴とする請求項１記載のアミド化合物の加水分解方法。
【請求項４】
Ｒ1がｔ−ブチル基であることを特徴とする請求項１ないし３のいずれかに記載のアミド化合物の加水分解方法。
【請求項５】
ロイコバクター属、ミコバクテリウム属、リゾビウム属及びシュードモナス属より成る群から選ばれた微生物であって、下記一般式（Ｉ）で表されるアミド化合物の光学異性体の一方を選択的に加水分解する能力を有するものの菌体及び／または該菌体処理物を下記一般式（Ｉ）
0003758333.tif 000033
で表される（ＲＳ）−アミド化合物と反応させ、加水分解により生成した下記一般式（II）
Ｒ−ＣＯＯＨ                …（II）
で表される（Ｓ）−カルボン酸もしくは（Ｒ）−カルボン酸または加水分解されなかった（Ｒ）−アミド化合物もしくは（Ｓ）−アミド化合物の少くともいずれか一つを単離することを特徴とする光学活性化合物の製造方法。
[上記一般式（Ｉ）及び一般式（II）中、Ｒは置換基を有していてもよい直鎖状もしくは分岐鎖状のＣ1 〜Ｃ18のアルキル基、置換基を有していてもよい直鎖状もしくは分岐鎖状のＣ2 〜Ｃ18のアルケニル基、置換基を有していてもよい直鎖状もしくは分岐鎖状のＣ2 〜Ｃ18のアルキニル基、置換基を有していてもよいＣ3 〜Ｃ10のシクロアルキル基、置換基を有していてもよいＣ3 〜Ｃ10のシクロアルケニル基、置換基を有していてもよいＣ6 〜Ｃ14のアリール基、または置換基を有していてもよい複素環残基を表し、Ｒ1 はメチル基、エチル基またはｔ−ブチル基を表す。但し、Ｒ1 がメチル基またはエチル基を表す場合には、Ｒは
0003758333.tif 000034
｛上記式中、Ｒ2 は置換基を有していてもよい直鎖状もしくは分岐鎖状のＣ1 〜Ｃ10のアルキル基、置換基を有していてもよい直鎖状もしくは分岐鎖状のＣ2 〜Ｃ10のアルケニル基または置換基を有していてもよい直鎖状もしくは分岐鎖状のＣ2 〜Ｃ10のアルキニル基を表し、Ｒ3 はハロゲン原子、置換基を有していてもよい直鎖状もしくは分岐鎖状のＣ1 〜Ｃ5 のアルキル基を有していてもよいアミノ基またはヒドロキシル基を表すか、Ｒ2 とＲ3 とが結合してＲ2 Ｒ3 ＣＨで
0003758333.tif 000035
（上記式中、Ｒ4 はそれぞれ独立してカルボキシル基、ハロゲン原子、ＮＯ2 、ＣＮ、直鎖状もしくは分岐鎖状のＣ1 〜Ｃ4 のアルキル基、直鎖状もしくは分岐鎖状のＣ1 〜Ｃ4 のアルコキシ基または−ＣＯＮＨＲ5 （式中、Ｒ5 は水素原子または直鎖状もしくは分岐鎖状のＣ1 〜Ｃ4 のアルキル基を表す）を表し、Ｘは−ＮＨ−または−Ｏ−を表し、ｐは０〜３の整数を表し、ｍ、ｎ及びｒは０、１または２を表し、ｑは０または１を表す。但し、２≦ｍ＋ｎ＋ｒ＋ｑ≦４である。）を表す。｝で示される基を表す。］
【請求項６】
Ｒが
0003758333.tif 000036
で示される基であることを特徴とする請求項５記載の光学活性化合物の製造方法。
【請求項７】
Ｒ1がｔ−ブチル基であることを特徴とする請求項５又は６記載の光学活性化合物の製造方法。
【請求項８】
ロイコバクター属、ミコバクテリウム属、リゾビウム属及びシュードモナス属より成る群から選ばれた微生物であって、下記一般式（III）で表されるアミド化合物の光学異性体の一方を選択的に加水分解する能力を有するものの菌体及び／または該菌体処理物を、下記一般式（III
）
0003758333.tif 000037
（上記一般式（III）中、Ｒ1 はメチル基、エチル基またはｔ−ブチル基を表し、Ｒ4 はそれぞれ独立してカルボキシル基、ハロゲン原子、ＮＯ2 、ＣＮ、直鎖状もしくは分岐鎖状のＣ1 〜Ｃ4 のアルキル基、直鎖状もしくは分岐鎖状のＣ1 〜Ｃ4 のアルコキシ基または−ＣＯＮＨＲ5 （式中、Ｒ5 は水素原子または直鎖状もしくは分岐鎖状のＣ1 〜Ｃ4 のアルキル基を表す）を表し、Ｘは−ＮＨ−または−Ｏ−を表し、ｐは０〜３の整数を表し、ｍ、ｎ及びｒは０、１または２を表し、ｑは０または１を表す。但し、２≦ｍ＋ｎ＋ｒ＋ｑ≦４である。）で表される（Ｒ，Ｓ）−アミド化合物と反応させ、加水分解により生成した下記一般式（IV）
0003758333.tif 000038
（上記一般式（IV）中、Ｒ4 、Ｘ、ｐ、ｍ、ｎ、ｒ及びｑは上記で定義した通り。）で表される（Ｓ）−カルボン酸もしくは下記一般式（Ｖ）
0003758333.tif 000039
（上記一般式（Ｖ）中、Ｒ4 、Ｘ、ｐ、ｍ、ｎ、ｒ及びｑは上記で定義した通り。）で表される（Ｒ）−カルボン酸または加水分解されなかった（Ｒ）−アミド化合物もしくは（Ｓ）−アミド化合物の少なくともいずれか一つを単離することを特徴とする光学活性化合物の製造方法。
【請求項９】
微生物が工業技術院生命工学技術研究所にＦＥＲＭ  Ｐ−１５８８５、ＦＥＲＭ  Ｐ−１５８８６、ＦＥＲＭ  Ｐ−１５９３０及びＦＥＲＭ  Ｐ−１５９７０として寄託されているＭＣＩ３３３１株、ＭＣＩ３３３２株、ＭＣＩ３３４６株及びＭＣＩ３３６０株から選択される微生物あるいはシュードモナス  アゾトフォルマンス  ＩＡＭ１６０３（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｚｏｔｏｆｏｒｍａｎｓ  ＩＡＭ１６０３）であることを特徴する請求項５ないし８のいずれかに記載の光学活性化合物の製造方法。
【請求項１０】
ロイコバクター属、ミコバクテリウム属及びリゾビウム属より成る群から選ばれた微生物であって、下記一般式（III）で表されるアミド化合物の光学異性体のうちのＳ体を選択的に加水分解する能力を有するものの菌体及び／又は該菌体処理物を下記一般式（III）
0003758333.tif 000040
（上記一般式（III）中、Ｒ1 はメチル基、エチル基またはｔ−ブチル基を表し、Ｒ4 はそれぞれ独立してカルボキシル基、ハロゲン原子、ＮＯ2 、ＣＮ、直鎖状もしくは分岐鎖状のＣ1 〜Ｃ4 のアルキル基、直鎖状もしくは分岐鎖状のＣ1 〜Ｃ4 のアルコキシ基または−ＣＯＮＨＲ5 （式中、Ｒ5 は水素原子または直鎖状もしくは分岐鎖状のＣ1 〜Ｃ4 のアルキル基を表す）を表し、Ｘは−ＮＨ−または−Ｏ−を表し、ｐは０〜３の整数を表し、ｍ、ｎ及びｒは０、１または２を表し、ｑは０または１を表す。但し、２≦ｍ＋ｎ＋ｒ＋ｑ≦４である。）で表される（Ｒ，Ｓ）−アミド化合物と反応させ、加水分解により生成した下記一般式（IV）
0003758333.tif 000041
（上記一般式（IV）中、Ｒ4 、Ｘ、ｐ、ｍ、ｎ、ｒ及びｑは上記で定義した通り。）で表される（Ｓ）−カルボン酸または加水分解されなかった（Ｒ）−アミド化合物の少なくともいずれか一つを単離することを特徴とする光学活性化合物の製造方法。
【請求項１１】
微生物が工業技術院生命工学技術研究所にＦＥＲＭ  Ｐ−１５８８５、ＦＥＲＭ  Ｐ−１５８８６、ＦＥＲＭ  Ｐ−１５９３０及びＦＥＲＭ  Ｐ−１５９７０として寄託されているＭＣＩ３３３１株、ＭＣＩ３３３２株、ＭＣＩ３３４６株及びＭＣＩ３３６０株から選択される微生物であることを特徴する請求項１０記載の光学活性化合物の製造方法。
【請求項１２】
シュードモナス属より成る群から選ばれた微生物であって、下記一般式（III）で表されるアミド化合物の光学異性体のうちＲ体を選択的に加水分解するものの菌体及び／または該菌体処理物を下記一般式（III）
0003758333.tif 000042
（上記一般式（III）中、Ｒ1 はメチル基、エチル基またはｔ−ブチル基を表し、Ｒ4 はそれぞれ独立してカルボキシル基、ハロゲン原子、ＮＯ2 、ＣＮ、直鎖状もしくは分岐鎖状のＣ1 〜Ｃ4 のアルキル基、直鎖状もしくは分岐鎖状のＣ1 〜Ｃ4 のアルコキシ基または−ＣＯＮＨＲ5 （式中、Ｒ5 は水素原子または直鎖状もしくは分岐鎖状のＣ1 〜Ｃ4 のアルキル基を表す）を表し、Ｘは−ＮＨ−または−Ｏ−を表し、ｐは０〜３の整数を表し、ｍ、ｎ及びｒは０、１または２を表し、ｑは０または１を表す。但し、２≦ｍ＋ｎ＋ｒ＋ｑ≦４である。）で表される（Ｒ，Ｓ）−アミド化合物と反応させ、加水分解により生成した下記一般式（Ｖ）
0003758333.tif 000043
（上記一般式（Ｖ）中、Ｒ4 、Ｘ、ｐ、ｍ、ｎ、ｒ及びｑは上記で定義した通り。）で表される（Ｒ）−カルボン酸または加水分解されなかった（Ｓ）−アミド化合物の少くともいずれか一つを単離することを特徴とする光学活性化合物の製造方法。
【請求項１３】
微生物がシュードモナス  アゾトフォルマンス  ＩＡＭ１６０３（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｚｏｔｏｆｏｒｍａｎｓ  ＩＡＭ１６０３）であることを特徴する請求項１２記載の光学活性化合物の製造方法。
【請求項１４】
Ｒ1 がｔ−ブチル基であることを特徴とする請求項５ないし１３のいずれかに記載の光学活性化合物の製造方法。
【請求項１５】
0003758333.tif 000044
がピペラジニル基であることを特徴とする請求項５ないし１４のいずれかに記載の光学活性化合物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、生物学的加水分解による有機酸の製造方法及び生物学的加水分解による光学分割方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
有機酸類あるいはアミド化合物類は医薬及び農薬の中間原料として有用な化合物である。従来、有機アミド化合物のアミド結合を加水分解して有機酸を合成する方法はアルカリを用いる方法等多数知られている。また有機化学的手法によるラセミ体のＮ−ｔ−ブチルアミド化合物の光学分割としてはＮ−ｔ−ブチル−２−ピペラジンカルボキサミドに光学活性乳酸等の分割剤を用いる方法（特開平８−３１４５号公報）が知られている。一方、ラセミ体のアミド化合物を生物学的に光学分割し、かつ光学活性な有機酸を得る方法としては、環状α−アミノカルボキサミドから環状Ｓ−α−アミノカルボン酸と環状Ｒ−α−アミノカルボキサミドを製造する方法（特開平８−５６６５２号公報）が報告されている。しかしながら、Ｎ−ｔ−ブチルアミド化合物のアミド結合を酵素的に加水分解し有機カルボン酸をつくる方法は、これまで全く見い出されていなかった。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
従来の化学合成による有機酸類の製造方法は過酷な反応条件を必要とするためその適用範囲には制限があった。さらに、得られた有機酸類が不斉炭素を有する場合は、医薬または農薬の中間体として用いるためにはラセミ体を適当な分割剤を用いて工業的に光学分割する必要があるが、分割率あるいはコストの面からも有効な方法が見い出されていなかった。そこでこれらの問題を生じず、さらには、工業的に効率よくラセミ体を光学分割する方法及び有機酸の合成方法の開発が求められていた。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上述の問題を解決すべく鋭意検討した結果、アミド結合を加水分解する能力を有する微生物を見い出し本発明を完成するに至った。またさらに鋭意検討した結果、選択的に光学異性体の一方を加水分解する能力を有する微生物を見い出し、この微生物の菌体及び／または該菌体処理物を用いてアミド結合を加水分解すれば光学活性な有機カルボン酸を製造できることを見い出し、ひいてはこの方法により、アミド化合物を光学分割できることを見い出し、本発明に到達した。
即ち、本発明の要旨は、微生物の菌体及び／または該菌体処理物の存在下、下記一般式（Ｉ）
【０００５】
【化１４】
0003758333.tif 000002
【０００６】
で表されるアミド化合物を加水分解することにより下記一般式（II）
【０００７】
【化１５】
0003758333.tif 000003
【０００８】
［上記一般式（Ｉ）及び一般式（II）中、Ｒは置換基を有していてもよい直鎖状もしくは分岐鎖状のＣ1 〜Ｃ18のアルキル基、置換基を有していてもよい直鎖状もしくは分岐鎖状のＣ2 〜Ｃ18のアルケニル基、置換基を有していてもよい直鎖状もしくは分岐鎖状のＣ2 〜Ｃ18のアルキニル基、置換基を有していてもよいＣ3 〜Ｃ10のシクロアルキル基、置換基を有していてもよいＣ3 〜Ｃ10のシクロアルケニル基、置換基を有していてもよいＣ6 〜Ｃ14のアリール基、または置換基を有していてもよい複素環残基を表し、Ｒ1 はメチル基、エチル基またはｔ−ブチル基を表す。但し、Ｒ1 がメチル基またはエチル基を表す場合には、Ｒは
【０００９】
【化１６】
0003758333.tif 000004
【００１０】
｛上記式中、Ｒ2 は置換基を有していてもよい直鎖状もしくは分岐鎖状のＣ1 〜Ｃ10のアルキル基、置換基を有していてもよい直鎖状もしくは分岐鎖状のＣ2 〜Ｃ10のアルケニル基または置換基を有していてもよい直鎖状もしくは分岐鎖状のＣ2 〜Ｃ10のアルキニル基を表し、Ｒ3 はハロゲン原子、置換基を有していてもよい直鎖状もしくは分岐鎖状のＣ1 〜Ｃ5 のアルキル基を有していてもよいアミノ基またはヒドロキシル基を表すか、Ｒ2 とＲ3 とが結合してＲ2 Ｒ3 ＣＨで
【００１１】
【化１７】
0003758333.tif 000005
【００１２】
（上記式中、Ｒ4 ははそれぞれ独立してカルボキシル基、ハロゲン原子、ＮＯ2 、ＣＮ、直鎖状もしくは分岐鎖状のＣ1 〜Ｃ4 のアルキル基、直鎖状もしくは分岐鎖状のＣ1 〜Ｃ4 のアルコキシ基または−ＣＯＮＨＲ5 （式中、Ｒ5 は水素原子または直鎖状もしくは分岐鎖状のＣ1 〜Ｃ4 のアルキル基を表す）を表し、Ｘは−ＮＨ−または−Ｏ−を表し、ｐは０〜３の整数を表し、ｍ、ｎ及びｒは０、１または２を表し、ｑは０または１を表す。但し、２≦ｍ＋ｎ＋ｒ＋ｑ≦４である。）を表す。｝で示される基を表す。］で表される酸を製造する方法に存する。本発明は、詳しくは選択的に光学異性体の一方を加水分解する能力を有する微生物の菌体及び／または該菌体処理物を（ＲＳ）−アミド化合物と反応させ、加水分解により生成した（Ｓ）−カルボン酸もしくは（Ｒ）−カルボン酸または加水分解されなかった（Ｒ）−アミド化合物もしくは（Ｓ）−アミド化合物を単離することにより、光学活性なカルボン酸または光学活性なアミド化合物を製造する方法に存し、さらには、選択的に光学異性体の一方を加水分解する能力を有する微生物の菌体及び／または該菌体処理物を、下記一般式（III ）
【００１３】
【化１８】
0003758333.tif 000006
【００１４】
（上記一般式（III ）中、Ｒ1 はメチル基、エチル基またはｔ−ブチル基を表し、Ｒ4 はそれぞれ独立してカルボキシル基、ハロゲン原子、ＮＯ2 、ＣＮ、直鎖状もしくは分岐鎖状のＣ1 〜Ｃ4 のアルキル基、直鎖状もしくは分岐鎖状のＣ1 〜Ｃ4 のアルコキシ基または−ＣＯＮＨＲ5 （式中、Ｒ5 は水素原子または直鎖状もしくは分岐鎖状のＣ1 〜Ｃ4 のアルキル基を表す）を表し、Ｘは−ＮＨ−または−Ｏ−を表し、ｐは０〜３の整数を表し、ｍ、ｎ及びｒは０、１または２を表し、ｑは０または１を表す。但し、２≦ｍ＋ｎ＋ｒ＋ｑ≦４である。）で表される（ＲＳ）−アミド化合物と反応させ、加水分解により生成した下記一般式（IV）
【００１５】
【化１９】
0003758333.tif 000007
【００１６】
（上記一般式（IV）中、Ｒ4 、Ｘ、ｐ、ｍ、ｎ、ｒ及びｑは既に定義した通り。）で表される（Ｓ）−カルボン酸もしくは下記一般式（Ｖ）
【００１７】
【化２０】
0003758333.tif 000008
【００１８】
（上記一般式（Ｖ）中、Ｒ4 、Ｘ、ｐ、ｍ、ｎ、ｒ及びｑは既に定義した通り。）で表される（Ｒ）−カルボン酸または加水分解されなかった（Ｒ）−アミド化合物もしくは（Ｓ）−アミド化合物を単離することにより、光学活性なカルボン酸または光学活性なアミド化合物を製造する方法に存する。
上記一般式（Ｉ）及び（II）におけるＲで定義される直鎖状もしくは分岐鎖状のＣ1 〜Ｃ18のアルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｉ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｓ−ブチル基、ｉ−ブチル基、ｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ｉ−ペンチル基、ｔ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基、ｉ−ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ウンデシル基、ドデシル基、トリデシル基、テトラデシル基、ペンタデシル基、オクタデシル基等が挙げられ、好ましくは直鎖状もしくは分岐鎖状のＣ1 〜Ｃ5 のアルキル基であり、直鎖状もしくは分岐鎖状のＣ2 〜Ｃ18のアルケニル基としては、ビニル基、１−プロペニル基、２−プロペニル基、１−ブテニル基、２−ブテニル基、３−ブテニル基、ペンテニル基、ヘキセニル基等が挙げられ、好ましくは直鎖状もしくは分岐鎖状のＣ2 〜Ｃ5 のアルケニル基であり、直鎖状もしくは分岐鎖状のＣ2 〜Ｃ18のアルキニル基としては、エチニル基、１−プロピニル基、２−プロピニル基、１−ブチニル基、２−ブチニル基、３−ブチニル基、ペンチニル基、ヘキシニル基等が挙げられ、好ましくは直鎖状もしくは分岐鎖状のＣ2 〜Ｃ5 のアルキニル基であり、Ｃ3 〜Ｃ10のシクロアルキル基としては、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘプチル基、シクロオクチル基、シクロノニル基、シクロデシル基等が挙げられ、Ｃ3 〜Ｃ10のシクロアルケニル基としては、シクロプロペニル基、シクロブテニル基、シクロペンテニル基、シクロヘキセニル基、シクロヘプテニル基、シクロオクテニル基、シクロノネニル基、シクロデセニル基等が挙げられ、Ｃ6 〜14のアリール基としてはフェニル基、ナフチル基、アントリル基等が挙げられ、複素環残基としては、フラン環、ジヒドロフラン環、テトラヒドロフラン環、ピラン環、ジヒドロピラン環、テトラヒドロピラン環、ベンゾフラン環、イソベンゾフラン環、クロメン環、クラマン環、イソクロマン環、チオフェン環、ベンゾチオフェン環、ピロール環、ピロリン環、ピロリジン環、イミダゾール環、イミダゾリン環、イミダゾリジン環、ピラゾール環、ピラゾリン環、ピラゾリジン環、トリアゾール環、テトラゾール環、ピリジン環、ピリジンオキシド環、ピペリジン環、ピラジン環、ピペラジン環、ピリミジン環、ピリダジン環、インドリジン環、インドール環、インドリン環、イソインドール環、イソインドリン環、インダゾール環、ベンゾイミダゾール環、プリン環、キノリジン環、キノリン環、フタラジン環、ナフチリジン環、キノキサリン環、キナゾリン環、シンノリン環、プテリジン環、オキサゾール環、オキサゾリジン環、イソキサゾール環、イシキサゾリジン環、チアゾール環、チアジリジン環、イソチアゾール環、イソチアゾリジン環、ジオキサン環、ジチアン環、モルホリン環、チオモルホリン環等の酸素原子、硫黄原子、窒素原子から選ばれるヘテロ原子を１〜４個有し、環を形成する総原子数が５〜１０の複素環の残基が挙げられる。尚、これらの基はカルボキシル基、ハロゲン、ＮＯ2 、ＣＮ、直鎖状もしくは分岐鎖状のＣ1 〜Ｃ4 のアルキル基、直鎖状もしくは分岐鎖状のＣ1 〜Ｃ4 のアルコキシ基及び−ＣＯＮＨＲ6 （式中、Ｒ6 は水素原子また��直鎖状もしくは分岐鎖状Ｃ1 〜Ｃ4 のアルキル基を表す）からなる群より選ばれる１以上の置換基を有していてもよい。Ｒとしては、好ましくは複素環残基、更に好ましくはピペラジニル基が挙げられる。
【００１９】
上記一般式（Ｉ）及び（III ）のＲ1 はメチル基、エチル基またはｔ−ブチル基を表すが、好ましくはｔ−ブチル基を表す。
また、Ｒ2 で定義される直鎖状もしくは分岐鎖状のＣ1 〜Ｃ10のアルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｉ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｓ−ブチル基、ｉ−ブチル基、ｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ｉ−ペンチル基、ｔ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基、ｉ−ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基等が挙げられ、好ましくは直鎖状もしくは分岐鎖状のＣ1 〜Ｃ5 のアルキル基であり、直鎖状もしくは分岐鎖状のＣ2 〜Ｃ10のアルケニル基としては、ビニル基、１−プロペニル基、２−プロペニル基、１−ブテニル基、２−ブテニル基、３−ブテニル基、ペンテニル基、ヘキセニル基等が挙げられ、好ましくは直鎖状もしくは分岐鎖状のＣ2 〜Ｃ5 のアルケニル基であり、直鎖状もしくは分岐鎖状のＣ2 〜Ｃ10のアルキニル基としては、エチニル基、１−プロピニル基、２−プロピニル基、１−ブチニル基、２−ブチニル基、３−ブチニル基、ペンチニル基、ヘキシニル基等が挙げられ、好ましくは直鎖状もしくは分岐鎖状のＣ2 〜Ｃ5 のアルキニル基が挙げられる。尚、これらの基はカルボキシル基、ハロゲン、ＮＯ2 、ＣＮ、直鎖状もしくは分岐鎖状のＣ1 〜Ｃ4 のアルキル基、直鎖状もしくは分岐鎖状のＣ1 〜Ｃ4 のアルコキシ基及び−ＣＯＮＨＲ6 （式中、Ｒ6 は水素原子または直鎖状もしくは分岐鎖状Ｃ1 〜Ｃ4 のアルキル基を表す）からなる群より選ばれる１以上の置換基を有していてもよい。
【００２０】
Ｒ3 で定義される直鎖状もしくは分岐鎖状のＣ1 〜Ｃ5 のアルキル基を有していてもよいアミノ基としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｉ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｓ−ブチル基、ｉ−ブチル基、ｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ｉ−ペンチル基、ｔ−ペンチル基等を有していてもよいアミノ基が挙げられ、アミノ基に置換している直鎖状もしくは分岐鎖状のＣ1 〜Ｃ5 のアルキル基には更にカルボキシル基、ハロゲン、ＮＯ2 、ＣＮ、直鎖状もしくは分岐鎖状のＣ1 〜Ｃ4 のアルキル基、直鎖状もしくは分岐鎖状のＣ1 〜Ｃ4 のアルコキシ基及び−ＣＯＮＨＲ6 （式中、Ｒ6 は水素原子または直鎖状もしくは分岐鎖状Ｃ1 〜Ｃ4 のアルキル基を表す）からなる群より選ばれる１以上の置換基を有していてもよい。
また、上記一般式（III ）、（IV）及び（Ｖ）並びにＲ2 とＲ3 が結合したＲ2 Ｒ3 ＣＨである
【００２１】
【化２１】
0003758333.tif 000009
【００２２】
としては置換基を有していてもよいアジリジニル基、ピロリジニル基、イミダゾリジニル基、ピラゾリジニル基、モルホリニル基、ピペリジニル基、ピペラジニル基等が挙げられ、好ましくはピペラジニル基である。これらの置換基としては、カルボキシル基、ハロゲン、ＮＯ2 、ＣＮ、直鎖状もしくは分岐鎖状のＣ1 〜Ｃ4 のアルキル基、直鎖状もしくは分岐鎖状のＣ1 〜Ｃ4 のアルコキシ基及び−ＣＯＮＨＲ5 （式中、Ｒ5 は水素原子または直鎖状もしくは分岐鎖状Ｃ1 〜Ｃ4 のアルキル基を表す）が挙げられる。
本発明の好ましい実施の形態としては、選択的に光学異性体のＳ体を加水分解する能力を有する微生物の菌体及び／または該菌体処理物を、下記一般式（III ）
【００２３】
【化２２】
0003758333.tif 000010
【００２４】
（上記一般式（III ）中、Ｒ1 、Ｒ4 、Ｘ、ｐ、ｍ、ｎ、ｒ及びｑは既に定義した通り。）で表される（ＲＳ）−アミド化合物と反応させ、加水分解により生成した下記一般式（IV）
【化２３】
0003758333.tif 000011
（上記一般式（IV）中、Ｒ4 、Ｘ、ｐ、ｍ、ｎ、ｒ及びｑは既に定義した通り。）で表される（Ｓ）−カルボン酸または下記一般式（VI）
【化２４】
0003758333.tif 000012
（上記一般式（VI）中、Ｒ1 、Ｒ4 、Ｘ、ｐ、ｍ、ｎ、ｒ及びｑは既に定義した通り。）で表される加水分解されなかった（Ｒ）−アミド化合物を単離することにより（Ｓ）−カルボン酸または（Ｒ）−アミド化合物を製造する方法が挙げられる。
また、本発明の別の好ましい実施形態としては、選択的に光学異性体のＲ体を加水分解する能力を有する微生物の菌体及び／または該菌体処理物を、下記一般式（III ）
【００２５】
【化２５】
0003758333.tif 000013
【００２６】
（上記一般式（III ）中、Ｒ1 、Ｒ4 、Ｘ、ｐ、ｍ、ｎ、ｒ及びｑは既に定義した通り。）で表される（ＲＳ）−アミド化合物と反応させ、加水分解により生成した下記一般式（Ｖ）
【００２７】
【化２６】
0003758333.tif 000014
【００２８】
（上記一般式（Ｖ）中、Ｒ4 、Ｘ、ｐ、ｍ、ｎ、ｒ及びｑは既に定義した通り。）で表される（Ｒ）−カルボン酸または下記一般式（VII ）
【００２９】
【化２７】
0003758333.tif 000015
【００３０】
（上記一般式（III ）中、Ｒ1 、Ｒ4 、Ｘ、ｐ、ｍ、ｎ、ｒ及びｑは既に定義した通り。）で表される加水分解されなかった（Ｓ）−アミド化合物を単離することにより（Ｒ）−カルボン酸または（Ｓ）−アミド化合物を製造する方法が挙げられる。
本発明で使用する微生物としてはアミド化合物のアミド結合を加水分解する能力を有する微生物であれば特に限定されないが、好ましくはロイコバクター属、ミコバクテリウム属、リゾビウム属あるいはシュードモナス属に属する微生物が挙げられ、より詳細には工業技術院生命工学技術研究所にＦＥＲＭ  Ｐ−１５８８５、ＦＥＲＭ  Ｐ−１５８８６、ＦＥＲＭ  Ｐ−１５９３０及びＦＥＲＭ  Ｐ−１５９７０として寄託されているＭＣＩ３３３１株、ＭＣＩ３３３２株、ＭＣＩ３３４６株及びＭＣＩ３３６０株から選択される微生物あるいはシュードモナス  アゾトフォルマンス  ＩＡＭ１６０３（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｚｏｔｏｆｏｒｍａｎｓ  ＩＡＭ１６０３）が挙げられる。選択的に光学異性体のＳ体を加水分解する微生物としては、好ましくはロイコバクター属、ミコバクテリウム属またはリゾビウム属に属する微生物が挙げられ、好ましい菌株としては、工業技術院生命工学技術研究所にＦＥＲＭ  Ｐ−１５８８５、ＦＥＲＭ  Ｐ−１５８８６、ＦＥＲＭ  Ｐ−１５９３０及びＦＥＲＭ  Ｐ−１５９７０として寄託されているＭＣＩ３３３１株、ＭＣＩ３３３２株、ＭＣＩ３３４６株及びＭＣＩ３３６０株から選択される微生物が挙げられる。選択的に光学異性体のＲ体を加水分解する微生物としてはシュードモナス属に属する微生物が挙げられ、好ましい菌株としてはシュードモナス  アゾトフォルマンス  ＩＡＭ１６０３（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｚｏｔｏｆｏｒｍａｎｓ  ＩＡＭ１６０３）が挙げられる。尚、微生物を使用する際には、菌体のままでもよいし、該菌体の処理物でもよいし、菌体と該菌体処理物を併せて使用してもよい。
【００３１】
選択的に光学異性体の一方を加水分解する能力を有する微生物を用いた場合、反応液または培養液中の加水分解により生成した有機カルボン酸または加水分解されなかったＮ−ｔ−ブチルアミド化合物を溶媒抽出、クロマトグラフィー等の常法により単離することにより光学分割を行うことができる。
【００３２】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明で使用する微生物のうち光学異性体のＳ体を選択的に加水分解する微生物としては、例えばＭＣＩ３３３１株、ＭＣＩ３３３２株、ＭＣＩ３３４６株、ＭＣＩ３３６０株等が挙げられる。ＭＣＩ３３３１株、ＭＣＩ３３３２株、ＭＣＩ３３４６株及びＭＣＩ３３６０株は本発明者らにより天然土壌から分離された細菌であり、それぞれ工業技術院生命工学技術研究所にＦＥＲＭ  Ｐ−１５８８５、ＦＥＲＭ  Ｐ−１５８８６、ＦＥＲＭ  Ｐ−１５９３０、ＦＥＲＭ  Ｐ−１５９７０として寄託されている。ＭＣＩ３３３１株及びＭＣＩ３３３２株の菌学的性状は以下の通りである。
【００３３】
【表１】
0003758333.tif 000016
0003758333.tif 000017
0003758333.tif 000018
【００３４】
６．分類学的考察
（１）高次の同定
ＭＣＩ３３３１及び３３３２株は１）グラム陽性、２）細胞は短桿〜桿状を示すが、顕著な多形性は示さない、３）芽胞を形成しない、４）運動性を持たない、５）細胞壁中にジアミノ酪酸を持つ、６）メナキノンＭＫ１１を有する、７）ＤＮＡ中のＧ＋Ｃ含量は６８〜７０％を示す、などの特徴を持っている。これらの特徴から、両菌株はバージェイズマニュアル・システマティック・バクテリオロジー［Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ］第２巻、１２６１〜１４３４頁（１９８６）及び、プロカリオート［Ｔｈｅ  Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ］第２版（１９９２）、第２巻、１３５５〜１３６８頁に記載されているＩｒｒｅｇｕｌａｒ，Ｎｏｎｓｐｏｒｉｎｇ，Ｇｒａｍ−Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｒｏｄｓに近縁であることが示唆された。これらの菌群は細胞壁のアミノ酸組成など化学分類学的特徴によって属の定義が明確に行われている。そこで細胞壁にジアミノ酪酸を持つ属及びその周辺菌と両菌株について比較を行ったところ、下記表２に示すように、ＭＣＩ３３３１及び３３３２株は化学分類学的性状においてロイコバクター属（Ｌｅｕｃｏｂａｃｔｅｒ）の特徴とほぼ一致した。
【００３５】
【表２】
0003758333.tif 000019
【００３６】
（２）属の同定
ロイコバクター属はインターナショナル・ジャーナル・オブ・システマティック・バクテリオロジー［Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆＳｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ］第４６巻、Ｎｏ．４、９６７〜９７１頁（１９９６）に新属として記載されており、ロイコバクター  コマガタエ（Ｌｅｕｃｏｂａｃｔｅｒ  ｋｏｍａｇａｔａｅ）ＩＦＯ１５２４５、１種を含んでいる。そこで本菌株ＭＣＩ３３３１及び３３３２株と、ロイコバクター属との系統学的関係を明らかにするため、両菌株及びロイコバクター  コマガタエ（Ｌｅｕｃｏｂａｃｔｅｒ  ｋｏｍａｇａｔａｅ）ＩＦＯ１５２４５株の１６Ｓ  ｒＲＮＡの塩基配列（約１５００ｂｐ）を決定した。得られた塩基配列に基づき、Ｇｅｎｂａｎｋ、ＥＭＢＬ及びＤＤＢＪのデータベースにおいて検索を行い系統樹を作成した。その結果、図１に示すように、ＭＣＩ３３３１、３３３２株及びロイコバクター  コマガタエ（Ｌｅｕｃｏｂａｃｔｅｒ  ｋｏｍａｇａｔａｅ）は、独立した１つのグループとして系統枝を形成し、両菌株はロイコバクター属に帰属することが判明した。しかし、ロイコバクター  コマガタエ（Ｌｅｕｃｏｂａｃｔｅｒ  ｋｏｍａｇａｔａｅ）とはＤＮＡ中のＧ＋Ｃ含量が異なっており、１６Ｓ  ｒＲＮＡの塩基配列に基づく系統樹からも、種レベルで異なっている可能性が示された。また、本菌株ＭＣＩ３３３１株と３３３２株は、生育温度やクエン酸の利用などの点で異なっており、明らかに区別された。
以上のことから、本菌株をそれぞれ、ロイコバクター  エスピー（Ｌｅｕｃｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）ＭＣＩ３３３１株及びＭＣＩ３３３２株と同定した。
次に、ＭＣＩ３３４６株の菌学的性質は以下の通りである。
【００３７】
１．形態的性質
プレインハートインフュージョン寒天培地上、３０℃、培養２４時間後及び３日後に顕微鏡観察を行った。ＭＣＩ３３４６株は短桿状〜桿状を示し、培養初期においても菌糸状にはならない。細胞は運動性を有しない。気菌糸、胞子及び胞子嚢は観察されなかった。
２．培養的性質
ＩＳＰ［インターナショナル・ストレプトマイセス・プロジェクト（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  Ｐｒｏｊｅｃｔ）］規定の培地上、３０℃、７日間培養後のＭＣＩ３３４６株の性状を以下の表３に示した。
【００３８】
【表３】
0003758333.tif 000020
【００３９】
（５）炭素源の利用( プリドハム・ゴトリーブ寒天培地上で３０℃、７日間培養)
ＭＣＩ３３４６株は炭素源無添加の対照培地でも若干の生育が見られたため、対照を−とする資化性を表４に示した。
【００４０】
【表４】
0003758333.tif 000021
【００４１】
４．化学分類学的性質
ＭＣＩ３３４６株の化学分類学的性質を表５に示した。
【００４２】
【表５】
0003758333.tif 000022
【００４３】
５．分類学的考察
（１）高次の同定
ＭＣＩ３３４６株は１）細胞壁ペプチドグリカンにｍｅｓｏ−ジアミノピメリン酸を有する、２）全菌体加水分解物中にアラビノース及びガラクトースを含む、３）細胞壁ペプチドグリカンのＮ−アシル型はグリコリル型である、などの化学分類学的特徴を持っている。これらの特徴から、本菌株はプロカリオート［Ｔｈｅ  Ｐｒｏｋａｒｙｏ−ｔｅｓ］第２版（１９９２）、第２巻、１１８０〜１２７０頁に記載されているノカルディア科（Ｎｏｃａｒｄｉａｃｅａｅ）、あるいはミコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）に属することが示唆された。
【００４４】
（２）属の同定
これらの菌群はメナキノンの分子種及び、この菌群に特徴的な菌体成分であるミコール酸の分子種で属の識別が可能である。本菌株ＭＣＩ３３４６は４）メナキノンとしてＭＫ９（Ｈ2 ）を持つことから、ノカルディア科（Ｎｏｃａｒｄｉａｃｅａｅ）に含まれるゴルドナ属（Ｇｏｒｄｏｎａ）、もしくはミコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）であることが分かった。
しかし、本菌株はゴルドナ属のような培養時間による多形性、ロッド−コッカスサイクル（Ｒｏｄ−ｃｏｃｃｕｓ  ｃｙｃｌｅ）を示さず、また、薄相クロマトグラフィを用いて、本菌株と各属とのミコール酸を分析、比較したところ、本菌株はミコバクテリウム属と同様のＲｆ値を示し、明らかにゴルドナ属及びその他の属とは区別された。
従って、以上の結果から本菌株ＭＣＩ３３４６株をミコバクテリウム  エスピー（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．）と同定した。
次に、ＭＣＩ３３６０株の菌学的性状は以下の通りである。
【００４５】
【表６】
0003758333.tif 000023
0003758333.tif 000024
0003758333.tif 000025
【００４６】
６．分類学的考察
（１）高次の同定
ＭＣＩ３３６０株は１）グラム陰性桿菌、２）好気性、３）芽胞を形成しない、４）周鞭毛による運動性を有する、５）３−ケトラクトースを生成しない、６）ユビキノンＱ１０を有する、７）ＤＮＡ中のＧ＋Ｃ含量は６５モル％、７）菌体脂肪酸としてＣ18:1を多く含有するなどの特徴を持っている。これらの特徴から、両菌株はバージェイズマニュアル・システマティック・バクテリオロジー［Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ］第１巻、２３４〜２５６頁（１９８４）に記載されているリゾビアシーエ科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）に帰属することが示唆された。
【００４７】
（２）属の同定
リゾビアシーエ科にはリゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）及びフィロバクテリウム属（Ｐｈｙｌｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）が含まれている。本菌株は周鞭毛を有することから、リゾビウム属もしくはアグロバクテリウム属に近縁であることが示唆された。
【００４８】
次にグラム陰性菌の分類、同定に有効な指標とされている、ハイドロキシ脂肪酸について比較を行った。ＩＦＯ  リサーチ・コミュニケーション［Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ，Ｏｓａｋａ  ＲｅｓｅａｒｃｈＣｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ］第１５巻、５７〜７５頁（１９９１）では、ハイドロキシ脂肪酸の組成により、リゾビアシーエ科に属する菌群を種または種以下のレベルで分類している。本菌株ＭＣＩ３３６０は共通する３−ＯＨ−Ｃ14:0以外に、少量の３−ＯＨ−Ｃ16:0及び３−ＯＨ−Ｃ18:0を含み、２−ハイドロキシ脂肪酸を持たない。この脂肪酸パターンはリゾビウム  メリロティ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｌｏｔｉ）、リゾビウム  フレディ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍｆｒｅｄｉｉ）及びリゾビウム  ガレガ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｇａｌｅｇａｅ）に類似していた。またアグロバクテリウム属の菌群とはいずれも一致しなかったことから、本菌株はリゾビウム属に帰属するのが妥当と思われた。
以上のことから、本菌株ＭＣＩ３３６０をリゾビウム  エスピー（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｓｐ．）と同定した。
【００４９】
本発明で使用する微生物のうち光学異性体のＲ体を選択的に加水分解する微生物としては、例えばシュードモナス  アゾトフォルマンス  ＩＡＭ１６０３（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｚｏｔｏｆｏｒｍａｎｓ  ＩＡＭ１６０３）が挙げられる。この菌株は公知の菌株であり、東京大学分子細胞生物学研究所（ＩＡＭ）より容易に入手できる。
また、上記微生物は、ＵＶ照射、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）処理、エチルメタンスルホネート（ＥＭＳ）処理、亜硝酸処理、アクリジン処理等による変異株、あるいは細胞融合もしくは遺伝子組換え法などの遺伝学的手法により誘導される組換え株んどのいずれの株であってもよい。
本発明の製造方法においては、上記微生物の１種あるいは２種以上が菌体及び／または菌体処理物として用いられる。具体的には、上記微生物を培養して得られた菌体をそのまま、あるいは培養して得られた菌体を公知の手法で処理したもの、即ち、アセトン処理したもの、凍結乾燥処理したもの、菌体を物理的または酵素的に破砕したもの等の菌体処理物を用いることができる。また、これらの菌体または菌体処理物から、上記一般式（Ｉ）で表されるアミド化合物のアミド結合に作用しこれを一般式（II）で表される有機カルボン酸へ変換する能力を有する酵素画分を粗製物あるいは精製物として取り出して用いることも可能である。さらには、このようにして得られた菌体、菌体処理物、酵素画分等をポリアクリルアミドゲル、カラギーナンゲル等の担体に固定化したもの等を用いることも可能である。そこで本明細書において、「菌体及び／または該菌体処理物」の用語は、上述の菌体、菌体処理物、酵素画分、及びそれらの固定化物全てを含有する概念として用いられる。
【００５０】
次に、本発明の製造方法について具体的に説明する。
本発明の製造方法において微生物は、通常、培養して用いられるが、この培養については常法通り行うことができる。本微生物の培養のために用いられる培地には本微生物が資化しうる炭素源、窒素源、及び無機イオン等が含まれる。炭素源としては、グルコース等の炭水化物、グリセロール等のアルコール類、有機酸その他が適宜使用される。窒素源としては、ＮＺアミン、トリプトース、酵母エキス、ポリペプトンその他が適宜使用される。無機イオンとしては、リン酸イオン、マグネシウムイオン、鉄イオン、マンガンイオン、モリブデンイオンその他が必要に応じ適宜使用される。更に、イノシトール、パントテン酸、ニコチン酸アミドその他のビタミン類を必要に応じ添加することは有効である。以上の成分以外にも、ピペラジンカルボン酸やピラジンアミド、ピペラジンアミド、ｎ−ブチロニトリル、ｎ−ブチルアミド、ｉｓｏ−ブチロニトリル、ｉｓｏ−ブチルアミド、クロトンニトリル、クロトンアミド、メタクリロニトリル、メタクリルアミド等のニトリル化合物やアミド化合物、好ましくはピラジンアミドやピペラジンアミドを加えることにより、高活性が得られることもある。また、炭素源、窒素源として上記のニトリル化合物やアミド化合物を用いることもできる。培養は、好気的条件下に、ｐＨ約６〜８、温度約１５〜３５℃の適当な範囲に制御しつつ１０〜１００時間行う。
【００５１】
上記一般式（Ｉ）で表されるアミド化合物に上記微生物を作用させて有機カルボン酸を製造する方法として、本微生物を培養し、得られた菌体懸濁液に上記一般式（Ｉ）で表されるアミド化合物を添加し反応させ有機カルボン酸を得る方法、培地に上記一般式（Ｉ）で表されるアミド化合物を添加し培養と反応を同時に行う方法、あるいは培養終了後、上記一般式（Ｉ）で表されるアミド化合物を添加して更に培養を行う方法等を用いることができる。反応温度は１５〜４０℃が好ましく、ｐＨ５〜１２の範囲が好ましい。上記一般式（Ｉ）で表されるアミド化合物濃度は０．１〜１０％の範囲が望ましく、必要ならば上記一般式（Ｉ）で表されるアミド化合物は反応の間、追補添加される。また、必要に応じて金属イオンを添加することにより反応が促進される場合がある。
培養及び反応で得られた有機カルボン酸または未反応のアミド化合物の採取方法としては溶媒抽出、クロマトグラフィー等、通常の分離・精製方法により行うことができる。例えば、アミド化合物はクロロホルムや酢酸エチル等を用いた溶媒抽出により抽出できる。また逆相カラムを用いれば、水とメタノールやアセトニトリル等の溶媒との混合液で、有機カルボン酸と未反応のアミド化合物を各々単独で溶出させることも可能である。
【００５２】
【実施例】
以下に実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、その要旨を越えない限り本発明の技術分野における通常の変更をすることができる。
実施例１
ピラジンアミド  ５．０ｇ／Ｌ、イーストエキス  ３．０ｇ／Ｌ、肉エキス
１．５ｇ／Ｌ、ペプトン  ２．５ｇ／Ｌ、リン酸２カリウム  ３．０ｇ／Ｌ、リン酸１カリウム  １．０ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  １ｇ／Ｌ、ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ０．０１ｇ／Ｌ、微量金属混合液（組成を表９に示す）５ｍＬ／Ｌ（ｐＨ７．０）の組成からなる液体培地２０ｍＬに、ＭＣＩ３３３１株を接種し、３０℃で２４時間好気的に培養した。得られた培養液を遠心分離し、菌体を集め５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄した。これに（ＲＳ）−Ｎ−ｔ−ブチルアミドピペラジン２．５ｇ／Ｌを含む５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を加え、全量を２ｍＬとし３０℃で好気条件下で２４時間反応させた。反応終了後、反応液を塩化ナトリウムで飽和した後クロロホルムにて抽出を行った。得られた（Ｒ）−Ｎ−ｔ−ブチルアミドピペラジンは２．２５ｍｇであり、光学純度は９８％ｅ．ｅ．であった。尚、水層中の（Ｓ）−２−カルボキシピペラジン蓄積量は０．８５ｇ／Ｌであり、光学純度は１００％ｅ．ｅ．であった。上記の光学純度は高速液体クロマトグラフィーにより下記の条件で測定した。Ｎ−ｔ−ブチルアミドピペラジンのＳ体の保持時間は下記分析条件１において８．９分であり、Ｒ体の保持時間は１１．５分であった。２−カルボキシピペラジンについては下記分析条件１においてはＳ体が２．２分、Ｒ体が３．６分であり、分析条件２においてはＳ体が５．３分、Ｒ体が３．７分であった。得られたＮ−ｔ−ブチルアミドピペラジンと２−カルボキシピペラジン各々について1 Ｈ−ＮＭＲにて構造確認を行った。Ｎ−ｔ−ブチルアミドピペラジンは（ＣＤＣｌ3 ，４００ＭＨｚ）条件下で、δ（ppm ）＝１．３３（９Ｈ，ｓ），２．６７〜２．７９（３Ｈ，ｍ），２．８２〜２．９３（２Ｈ，ｍ），３．１３〜３．２０（２Ｈ，ｍ），６．７５（１Ｈ，ｂｒ）であり、２ーカルボキシピペラジン２塩酸塩は（Ｄ2 Ｏ，４００ＭＨｚ）条件下で、δ（ppm ）＝３．２２〜３．３８（３Ｈ，ｍ），３．５４〜３．６６（２Ｈ，ｍ），３．８０（１ｈ，ＤＤ，ｊ＝１４．０ｈＺ，３．６ｈＺ），４．１１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１１．２Ｈｚ，３．６Ｈｚ）であった。
【００５３】
【表７】
0003758333.tif 000026
【００５４】
実施例２
グリセロール  １０．０ｇ／Ｌ、ピラジンアミド２．０ｇ／Ｌ、イーストエキス  ２．０ｇ／Ｌ、ポリペプトン  ２．０ｇ／Ｌ、リン酸２カリウム  ３．０ｇ／Ｌ、リン酸１カリウム  １．０ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  １ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム７水和物  ０．０２ｇ／Ｌ、（ｐＨ７．０）の組成からなる液体培地２０ｍＬに、ＭＣＩ３３３２株を接種し、３０℃で２４時間好気的に培養した。得られた培養液を遠心分離し、菌体を集め５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄した。これに（ＲＳ）−Ｎ−ｔ−ブチルメタクリルアミド１０ｇ／Ｌを含む５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を加え、全量を２ｍＬとし３０℃で好気条件下で２４時間反応させた。反応終了後のメタクリル酸蓄積量は３ｇ／Ｌであった。尚、メタクリル酸は高速液体クロマトグラフィーにより、下記条件３にて測定した。
【００５５】
【表８】
0003758333.tif 000027
【００５６】
実施例３
ピラジンアミド  ５．０ｇ／Ｌ、イーストエキス  ３．０ｇ／Ｌ、肉エキス１．５ｇ／Ｌ、ペプトン  ２．５ｇ／Ｌ、リン酸２カリウム  ３．０ｇ／Ｌ、リン酸１カリウム  １．０ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  １ｇ／Ｌ、ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ
０．０１ｇ／Ｌ、微量金属混合液（表９）５ｍｌ／Ｌ（ｐＨ７．０）の組成からなる液体培地２０ｍＬに、ＭＣＩ３３４６株を接種し、２７℃で２４時間好気的に培養した。得られた培養液を遠心分離し、菌体を集め５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄した。これに（ＲＳ）−Ｎ−ｔ−ブチルアミドピペラジン２．５ｇ／Ｌを含む５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を加え、全量を２ｍＬとし３０℃で好気条件下で２４時間反応させた。反応終了後、反応液を塩化ナトリウムで飽和した後クロロホルムにて抽出を行った。得られた（Ｒ）−Ｎ−ｔ−ブチルアミドピペラジンは２．３７ｍｇであり、光学純度は９９％ｅ．ｅ．であった。尚、水層中の（Ｓ）−２−カルボキシピペラジン蓄積量は０．８５ｇ／Ｌであり、光学純度は１００％ｅ．ｅ．であった。上記の光学純度及び生産物の同定は実施例１と同様の方法を用いて決定した。
【００５７】
実施例４
実施例３と同様の培地、つまりピラジンアミド  ５．０ｇ／Ｌ、イーストエキス  ３．０ｇ／Ｌ、肉エキス  １．５ｇ／Ｌ、ペプトン  ２．５ｇ／Ｌ、リン酸２カリウム  ３．０ｇ／Ｌ、リン酸１カリウム  １．０ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  １ｇ／Ｌ、ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ  ０．０１ｇ／Ｌ、微量金属混合液（表９）５ｍｌ／Ｌ（ｐＨ７．０）の組成からなる液体培地１００ｍＬに、ＭＣＩ３３６０株を接種し、３０℃で１４時間好気的に培養した。得られた培養液を遠心分離し、菌体を集め５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄した。これに（ＲＳ）−Ｎ−ｔ−ブチルアミドピペラジン２．５ｇ／Ｌを含む５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を加え、全量を２ｍＬとし３０℃で好気条件下で４８時間反応させた。反応終了後、実施例３と同様の処理にて得られた（Ｒ）−Ｎ−ｔ−ブチルアミドピペラジンは２．６１ｍｇであり、光学純度は７７％ｅ．ｅ．であった。尚、水層中の（Ｓ）−２−カルボキシピペラジン蓄積量は０．７８ｇ／Ｌであり、光学純度は８０％ｅ．ｅ．であった。上記の光学純度及び生産物の同定は実施例１と同様の方法を用いて決定した。
【００５８】
実施例５
ニュートリエントブロス  １０．０ｇ／Ｌ、ＤＬ−リンゴ酸ナトリウム  １０．０ｇ／Ｌ、リン酸２カリウム  ３．０ｇ／Ｌ、リン酸１カリウム  １．０ｇ／Ｌ、硫酸鉄・７水塩  ０．０１ｇ／Ｌ、微量金属混合液（表９）５ｍＬ／Ｌ（ｐＨ７．０）の組成からなる液体培地１００ｍＬに、シュードモナス  アゾトフォルマンス  ＩＡＭ１６０３（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｚｏｔｏｆｏｒｍａｎｓ  ＩＡＭ１６０３）株を接種し、３０℃で１２時間好気的に培養した。
得られた培養液を遠心分離し、菌体を集め２５ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄した。これに（ＲＳ）−Ｎ−ｔ−ブチルピペラジン−２−カルボキサミド５．０ｇ／Ｌを含む２５ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）を加え、全量を１０ｍＬとし３０℃で好気条件下で４８時間反応させた。反応終了後、反応液を塩化ナトリウムで飽和した後クロロホルムにて抽出を行った。得られた（Ｓ）−Ｎ−ｔ−ブチルピペラジン−２−カルボキサミドは１５．２ｍｇであり、光学純度は９８％であった。尚、水層中の（Ｒ）−ピペラジン−２−カルボン酸の蓄積量は１．２８ｇ／Ｌであり光学純度は７０％であった。上記の光学純度及び生産物の同定は実施例１と同様の方法を用いて決定した。
【００５９】
実施例６
実施例５と同様に培養して得られた、シュードモナス  アゾトフォルマンス
ＩＡＭ１６０３（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｚｏｔｏｆｏｒｍａｎｓ  ＩＡＭ１６０３）の菌体を超音波処理により破砕し、超遠心分離によって無細胞抽出液を得た。本抽出液より、硫安分画、陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー及びゲルろ過の操作により、Ｎ−ｔ−ブチルピペラジン−２−カルボキサミドをＲ体選択的にそのアミド結合を加水分解する酵素蛋白質を高度に精製した。この蛋白質溶液（０．２ｇ蛋白質／Ｌ）１００μＬを、Ｎ−ｔ−ブチルピペラジン−２−カルボキサミドを５．０ｇ／Ｌ含む２５ｍＭリン酸カリウム緩衝液１．０ｍＬに添加して、３０℃でかく拌し反応させた。２４時間後、本反応液を上記高速液体クロマトグラフィー分析条件２により分析したところ、１．７２ｇ／Ｌの（Ｒ）−ピペラジン−２−カルボン酸を検出し、生成したピペラジン−２−カルボン酸の光学純度は９９．８％ｅ．ｅ．であった。また、同液を高速液体クロマトグラフィー分析条件１において分析したところ、残存したＮ−ｔ−ブチルピペラジン−２−カルボキサミドの光学純度は９９．６ｅ．ｅ．であった。上記の光学純度及び生産物の同定は実施例１と同様の方法を用いて決定した。
【００６０】
【表９】
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【００６１】
【本発明の効果】
本発明によって、微生物を利用して、Ｎ−ｔ−ブチルアミド化合物から有機酸を簡便に製造することが可能になったのみならず、加水分解により光学活性な有機カルボン酸の製造及びラセミ体のＮ−ｔ−ブチルアミド化合物の光学分割を容易に行うことが可能となった。
【図面の簡単な説明】
【図１】１６Ｓ  ｒＲＮＡの塩基配列による、本発明の菌株とその周辺菌との系統関係を示す図である。
【図１】
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