(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
血清試料中のジェノタイプ１ｂに属するＣ型肝炎ウイルスの第２２０９番目から第２２４８番目のアミノ酸から成るＩＳＤ領域のアミノ酸配列が、配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列と同一か否かを調べることから成る、ジェノタイプ１ｂのＣ型肝炎ウイルスに対するインターフェロン投与による治療の有効性の判定方法であって、前記ＩＳＤ領域又はその一部であってＣ型肝炎ウイルスの第２２１７番目から第２２２０番目のアミノ酸から成るＩＳＤコア領域を含むポリペプチド若しくは配列表の配列番号２８、２９又は３０で表されるアミノ酸配列から成るポリペプチドを抗原として用い、前記血清試料中の該抗原に対する抗体との抗原抗体反応を利用した免疫測定法により行う判定方法。
【請求項２】
血清試料中のジェノタイプ１ｂに属するＣ型肝炎ウイルスの第２２０９番目から第２２４８番目のアミノ酸から成るＩＳＤ領域のアミノ酸配列が、配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列と同一か否かを調べることから成る、ジェノタイプ１ｂのＣ型肝炎ウイルスに対するインターフェロン投与による治療の有効性の判定方法であって、前記ＩＳＤ領域に反応する抗体を用い、前記血清試料中の前記ＩＳＤ領域を抗原とする抗原抗体反応を利用した免疫測定法により行う判定方法。
【発明の詳細な説明】
【産業上の利用分野】
【０００１】
本発明は、ジェノタイプ１ｂに属するＣ型肝炎ウイルス（以下、「ＨＣＶ−１ｂ」ということがある）に対する治療の有効性の判定方法及びそれに用いられるペプチドに関する。
【０００２】
【従来の技術】
インターフェロンはＣ型慢性肝炎に対する１つの根治療法である。しかしながら、同じジェノタイプ１ｂに属するＨＣＶであっても、インターフェロン投与により根治される著効例と全く効かない無効例が存在し、また、その中間型も存在する。従来、同一のジェノタイプの属するＨＣＶのインターフェロンに対する感受性を規定している因子としては、血中ＨＣＶ量、組織学的進行度、ＨＣＶ遺伝子の多様性が示唆されているが、これらの背後にある根本的な原因は解明されていない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
もし、ＨＣＶ−１ｂのインターフェロン投与等の治療に対する感受性を診断することができれば、インターフェロンを投与すべきか否かを知ることができ、インターフェロンが効かないにもかかわらずインターフェロンを投与するという無駄な治療を避けることができ有利である。
【０００４】
従って、本発明の目的は、ＨＣＶ−１ｂに対する治療の有効性を判定する方法を提供することである。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本願発明者らは、鋭意研究の結果、ＨＣＶ−１ｂの第２２０９番目から第２２４８番目のアミノ酸の配列、特に第２２１７番目から第２２２０番目のアミノ酸の配列がインターフェロンに対する感受性に深く関係していることを見出し、かつ、これに基づき、免疫学的方法によりインターフェロンに対する感受性を判定する方法を開発し本発明を完成した。
【０００６】
すなわち、本発明は、血清試料中のジェノタイプ１ｂに属するＣ型肝炎ウイルスの第２２０９番目から第２２４８番目のアミノ酸から成るＩＳＤ領域のアミノ酸配列が、配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列と同一か否かを調べることから成る、ジェノタイプ１ｂのＣ型肝炎ウイルスに対するインターフェロン投与による治療の有効性の判定方法であって、前記ＩＳＤ領域又はその一部であってＣ型肝炎ウイルスの第２２１７番目から第２２２０番目のアミノ酸から成るＩＳＤコア領域を含むポリペプチド若しくは配列表の配列番号２８、２９又は３０で表されるアミノ酸配列から成るポリペプチドを抗原として用い、前記血清試料中の該抗原に対する抗体との抗原抗体反応を利用した免疫測定法により行う判定方法を提供する。また、本発明は、血清試料中のジェノタイプ１ｂに属するＣ型肝炎ウイルスの第２２０９番目から第２２４８番目のアミノ酸から成るＩＳＤ領域のアミノ酸配列が、配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列と同一か否かを調べることから成る、ジェノタイプ１ｂのＣ型肝炎ウイルスに対するインターフェロン投与による治療の有効性の判定方法であって、前記ＩＳＤ領域に反応する抗体を用い、前記血清試料中の前記ＩＳＤ領域を抗原とする抗原抗体反応を利用した免疫測定法により行う判定方法を提供する。
【０００７】
以下、本発明を詳細に説明する。
【０００８】
本発明の判定方法によりＨＣＶ−１ｂに対する治療の有効性が判定されるインターフェロンは、特に限定されず、例としてインターフェロンα２ａ、インターフェロンα２ｂ、インターフェロンベータ及び天然型インターフェロンαを挙げることができる。
【０００９】
本願発明者らは、多数のＨＣＶ−１ｂによるＣ型慢性肝炎患者の血清試料中のＨＣＶ−１ｂのアミノ酸配列を決定し、これらとインターフェロン投与の有効性との関係を綿密に比較検討した結果、ＨＣＶ−１ｂの第２２０９番目から第２２４８番目のアミノ酸（本明細書において、この領域を「ＩＳＤＲ」（Interferon Sensitivity Determining Region)又は「ＩＳＤ領域」と言う）の配列、特に第２２１７番目から第２２２０番目のアミノ酸（本明細書において、この領域を「ＩＳＤコア領域」という）の配列がインターフェロン感受性に深く関係しており、この領域を調べることによりインターフェロン投与の有効性が判定可能であることを見出した。なお、ＨＣＶ−１ｂのアミノ酸配列及びそのナンバリングはKato, N, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 1990;87 9524-8 ）に記載されている。
【００１０】
すなわち、野生型のＨＣＶ−１ｂでは、上記ＩＳＤＲのアミノ酸配列が配列表の配列番号１に示す配列であり、この場合にはインターフェロン投与が無効である（著効率０％）ことを見出した。また、ＩＳＤＲのアミノ酸配列が、配列番号１で示す配列からはずれるほどインターフェロン投与が著効となる確率が大きく、４個以上のアミノ酸残基が相違する場合には、７０症例を調査した下記実施例では、インターフェロン治療の著効率が１００％に達した。相違するアミノ酸残基の数が１〜２個の場合（３個の場合はなかった）はこれらの中間であり、下記実施例では著効率は１３％であった。また、２０症例について調べた別の実施例では、相違するアミノ酸残基数が３以上で著効率１００％、１〜２で著効率約１３％、野生型で無効率１００％（著効率０％）となった。なお、ここで言う、アミノ酸残基の相違の態様としては、置換のみならず、挿入、欠失及び終止コドンとなったものも含まれる。
【００１１】
従って、試料中のＨＣＶ−１ｂのＩＳＤＲのアミノ酸配列が配列番号１に示す配列と同一か否かを調べることにより、インターフェロン治療が有効となる可能性があるか否かを知ることができる。
【００１２】
さらに、インターフェロン治療が著効となる場合のＩＳＤＲの部分配列の例が明らかになった。これらの配列を配列表の配列番号２〜１４に示す。従って、試料中のＨＣＶ−１ｂのＩＳＤＲのアミノ酸配列が、配列番号２〜１４の配列のいずれかと同じであれば、インターフェロン治療が著効となる可能性が高いと判定される。
【００１３】
上記ＩＳＤＲの中でも、第２２１７番目から第２２２０番目までの４個のアミノ酸（本明細書において、この領域を便宜的に「ＩＳＤコア領域」という）の配列が特に重要であることが見出された。ＩＳＤコア領域が野生型の場合、すなわち、Thr His His Asp （配列番号１５）の場合には、インターフェロン治療が無効であり、ＩＳＤコア領域のアミノ酸配列がこの配列と相違しているとインターフェロン治療が著効になる可能性がある。そして、ＩＳＤコア領域のアミノ酸配列が野生型の配列と異なるアミノ酸残基の数が増えるほどインターフェロン治療が著効になる可能性が高くなる。合計５６症例を調べた下記参考例では、ＩＳＤコア領域の４個のアミノ酸のうち、３個以上が異なる場合にはインターフェロン治療の無効率は０％（著効率１００％）、２個の場合は１６．７％、１個の場合には６２．５％、野生型の場合には１００％であった。
【００１４】
従って、試料中のＨＣＶ−１ｂのＩＳＤコア領域のアミノ酸配列が配列番号１５に示される野生型の配列と同一か否かを調べることにより、インターフェロン治療が有効となる可能性があるか否かを知ることができる。
【００１５】
なお、本願発明者らは、ＨＣＶ−１ｂのアミノ酸配列のうち、上記ＩＳＤＲ（ＮＳ５Ａ領域中に存在）の他に、超可変領域（ＨＶＲ）にも各症例毎にアミノ酸の変異が見られることを観察した。ＨＶＲはＨＣＶ−１ｂの株により配列が高頻度で異なっていることが知られている領域である。しかしながら、ＨＶＲにsilent mutation しかなくても（すなわちコードされるアミノ酸配列は同じでも）インターフェロン感受性が異なるＨＣＶ−１ｂが存在し、また、配列とインターフェロン感受性との関連が見られないことから、ＨＶＲがインターフェロン感受性を直接決定している可能性はないと判断した。従って、インターフェロン感受性は、上記ＩＳＤＲにより決定されることが明らかになった。
【００１６】
本発明の判定方法では、免疫測定の手法を利用する。すなわち、例えば、配列番号１に示される野生型のＩＳＤＲのアミノ酸配列又はその一部を有するポリペプチドを合成する。このポリペプチドは市販のペプチド合成機を用いて、又は周知の遺伝子工学的手法により容易に行うことができる。このポリペプチドを抗原として用いて免疫測定を行うことにより、試料中に該ポリペプチドと特異的に反応する抗体が存在するか否かを知ることができる。このような抗体が存在すれば、その患者中には野生型のＨＣＶ−１ｂが存在することがわかり、ひいてはインターフェロン治療が無効であることがわかる。免疫測定法自体は周知であり、周知の免疫測定法のいずれをも適用することが可能である。すなわち、測定形式で分類すれば、例えばサンドイッチ法、競合法、凝集法等が適用可能であり、また、標識で分類すれば例えば酵素免疫分析法、放射免疫分析法、蛍光免疫分析法、ビオチン免疫分析法等が適用可能である。免疫分析法の詳細は周知であり、下記実施例にも具体的に記載されている。
【００１７】
あるいは、野生型のＩＳＤＲのアミノ酸配列又はその一部を有するポリペプチドを動物に免疫して、これに対する抗体を回収し、これを用いて免疫分析法により試料中に野生型のＩＳＤＲが存在するか否かを知ることができる。抗体はポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよいが、モノクローナル抗体が好ましい。モノクローナル抗体は周知のケーラーとミルシュタインの方法に基づき容易に得ることができる。免疫測定法は上記の通り周知であり、いかなる公知の免疫測定法も適用可能である。この方法によれば、試料中に野生型のＩＳＤＲが存在するか否かを知ることができる。
【００１８】
なお、上記方法は、配列番号１に示すアミノ酸配列との異同を調べるものであるが、上記のように、配列番号２〜１４の配列と同じであれば、インターフェロン治療が著効となる可能性が高いので、上記の免疫測定法において、配列番号１の配列に代えて配列番号２〜１４の配列を用いることも可能である。
【００１９】
【実施例】
以下、本発明を実施例に基づきさらに具体的に説明する。もっとも、本発明は、下記実施例に限定されるものではない。
【００２０】
参考例１
(1) ＲＮＡの精製
７０例のＨＣＶ−１ｂによるＣ型慢性肝炎患者血清各１００μｌにＲＮＡｚｏｌＢ（商品名、BIOTEX LAB社製）９００μｌ、クロロホルム１５０μｌを加え、２ｍｌのエッペンドルフチューブ中１５秒間攪拌後、４℃で５分間放置した。１２０００ｒｐｍ、４℃で１５分間遠心し、上清を１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに移し、これにイソプロパノールを６５０μｌ加え攪拌後１５分放置後、１２０００ｒｐｍ、４℃、２０分間遠心し、沈殿を得た。さらに１ｍｌの７５％エタノールを加え攪拌後１２０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心し上清を捨てた。この操作をさらに２回繰り返した後、得られた沈殿を乾燥した。
【００２１】
(2) ｃＤＮＡ合成
精製したＲＮＡに５ｘＲＴバッファー２μｌ、０．１Ｍ  ＤＴＴ  １μｌ、１０ｍＭ  ｄＮＴＰ  １μｌ、ランダムプライマー（２６０ｎｍにおける吸光度５、以下、このような場合「５  Ｏ．Ｄ．２６０ｎｍ」と記載）１μｌ、ＤＥＰＣ処理水２μｌを加え、攪拌後、３７℃で４５分間加温しｃＤＮＡ合成を行った。
【００２２】
(3) １回目のＰＣＲ
ＰＣＲはホットスタート法により行った。すなわち、０．６ｍｌのＰＣＲチューブにlower mix （プライマーＨＣＶ−９（配列番号１６）とプライマーＨＣＶ−１０（配列番号１７）各２．５  Ｏ．Ｄ．２６０ｎｍを０．５μｌずつ、１０ｍＭｄＮＴＰ  １μｌ、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ2   ３μｌ、滅菌ＭＱ水  ５μｌ）を１０μｌとり、ａｍｐｌｉｗａｘ１００（商品名：パーキンエルマー社製）を１粒加え、９０℃、１分加温した後、２５℃で３分間放置し膜を作った。この膜の上にupper mix （１０ｘＰＣＲバッファー（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５００ｍＭ  ＫＣｌ（ｐＨ８．３）５μｌ、滅菌ＭＱ水３５μｌ、Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（商品名、プロメガ社製）０．２μｌ）と先のｃＤＮＡを１μｌ加え、以下のプログラムでＰＣＲを行った。
サーマルサーキュラーＰＪ９６００（商品名、パーキンエルマー社製）を用いた場合：
９４℃  ２０秒（変性）
５５℃  ２０秒（アニーリング）
７７℃  ２０秒（伸長）
３５サイクル
サーマルサーキュラーＰＪ２０００又は４８０（商品名、パーキンエルマー社製）を用いた場合：
９４℃  ６０秒（変性）
５５℃  ６０秒（アニーリング）
７７℃  ６０秒（伸長）
３５サイクル
【００２３】
(4) ２回目のＰＣＲ
ＰＣＲはホットスタート法により行った。すなわち、０．６ｍｌのＰＣＲチューブにlower mix （プライマーＨＣＶ−Ｅ−Ｓ（配列番号１８）とプライマーＨＣＶ−Ｅ−ＡＳ（配列番号１９）各２．５  Ｏ．Ｄ．２６０ｎｍを０．５μｌずつ、１０ｍＭｄＮＴＰ  １μｌ、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ2   ３μｌ、滅菌ＭＱ水５μｌ）を１０μｌとり、ａｍｐｌｉｗａｘ１００（商品名：パーキンエルマー社製）を１粒加え、９０℃、１分加温した後、２５℃で３分間放置し膜を作った。この膜の上にupper mix （１０ｘＰＣＲバッファー５μｌ、滅菌ＭＱ水３５μｌ、Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（商品名、プロメガ社製）０．２μｌ）と先の１回目のＰＣＲ産物を１μｌ加え、１回目のＰＣＲと同じプログラムでＰＣＲを行った。
【００２４】
(5) ＰＣＲ産物の精製
クイックスピンカラムＧ５０（ＴＥ）（商品名、ベーリンガーマンハイム社製）を用いて２回目のＰＣＲ産物を精製した。
【００２５】
(6) 塩基配列決定
dye terminator法を用い、３７３Ａオートシークエンサー（商品名、パーキンエルマー社製）で塩基配列を決定した。反応はＰＲＩＳＭキット（商品名、パーキンエルマー社製）を用い、反応混合物９．５μｌ、配列番号３１で示される塩基配列を有する塩基配列決定用プライマーＳ  ３．２ｐｍｏｌ、精製した２回目のＰＣＲ産物を５．０μｌ、ＭＱ水４．５μｌを０．２ｍｌＰＣＲチューブ中で、以下のプログラムでＰＣＲを行った。すなわち、サーマルサーキュラーＰＪ９６００（商品名、パーキンエルマー社製）を用いて９６℃  １５秒、５０℃  １秒、６０℃  ４分間で２５サイクル行った後、４℃で次の操作まで放置した。上記反応液２０μｌをクイックスピンカラムＧ５０（ＴＥ）で精製後、乾燥し、３７３Ａオートシークエンサー（パーキンエルマー社製）で６％アクリルアミド（１９：１）を用い電気泳動を行い、ＩＳＤＲを含む断片の塩基配列決定を行った。得られた塩基配列をアミノ酸に変換後、ＩＳＤＲの４０アミノ酸について、配列番号１に示す野生型のＩＳＤＲと比較した。
【００２６】
一方、各患者にはインターフェロンαを６カ月間にわたり総投与量５１６〜８８０ＭＵで投与した。治療後６カ月間にわたり、血中ＨＣＶ−ＲＮＡの存否及びＧＰＴ値（ＵＶ法）を測定した。血中ＨＣＶ−ＲＮＡ濃度はbranched DNA probe assay（Lancet, 1993, 341:1501-1504)により測定した。また、ＧＰＴ値は、ＪＳＣＣ準拠処方試薬を使用し、測定温度３７℃で測定した。治療後６カ月間にわたり、血中ＨＣＶ−ＲＮＡ陰性、ＧＰＴ正常となったものを著効、それ以外を無効とした。
【００２７】
結果を図１及び図２に示す。図１及び図２から明らかなように、ＩＳＤＲが野生型のものは著効率が０％であり、野生型とアミノ酸が１個又は２個異なっているものは著効率が１３％であり、４個以上異なっているものは著効率が１００％であった。なお、年令、性別、組織型インターフェロンの総投与量、治療前のＧＰＴ値には有意の差は認められなかった。従って、ＩＳＤＲの配列が野生型と同じか否かを調べることにより、インターフェロン治療が無効か否かを知ることができる。また、野生型と異なるアミノ酸残基の数を調べることにより、インターフェロン治療が著効を示す確率を見積もることができる。
【００２８】
また、上記検査により判明した著効例のＩＳＤＲのアミノ酸配列のＮ末端から２９アミノ酸残基のアミノ酸配列を配列番号２〜１４に示す。試料中のＨＣＶ−１ｂのＩＳＤＲのアミノ酸配列がこれらの配列のいずれかと同じ場合には、インターフェロン治療が高い確率で著効を示すものと考えられる。
【００２９】
参考例２
７７例のＨＣＶ−１ｂによるＣ型慢性肝炎患者について、参考例１と同様な検査を行った（なお、インターフェロンの総投与量は３２４ＭＵ以上）。決定されたアミノ酸配列のうち、上記ＩＳＤコア領域のアミノ酸配列を配列番号１５に示される配列、すなわち、Thr His His Asp と比較し、変異しているアミノ酸残基の数を調べた。結果を表２及び表３に示す。なお、表２中、「変異型」とは、ＩＳＤコア領域の配列が野生型のものとはアミノ酸１つでも異なっているものを意味する。
【００３０】
【表２】
0003756974.tif 000002
【００３１】
【表３】
0003756974.tif 000003
【００３２】
表２及び表３から、ＩＳＤコア領域のアミノ酸配列が野生型の場合、インターフェロン治療が無効であることがわかる。また、野生型と相違するアミノ酸数が増えるほどインターフェロン治療の無効率が減少し、３個以上相違する場合には無効率が０％となることがわかる。
【００３３】
参考例３
２回目のＰＣＲに用いるプライマーを変更することを除き、参考例１と同様な検査を行った。２回目のＰＣＲには、ＨＣＶ−ＩＳＤＲ−Ｓ（配列番号２０）及びＨＣＶ−ＩＳＤＲ−ＡＳ（配列番号２１）を用いた。参考例１と同様、ＩＳＤＲを含む断片が増幅され、その塩基配列が決定された。
【００３４】
参考例４
２回目のＰＣＲ及び塩基配列決定に用いるプライマーを変更することを除き、参考例１と同様な検査を行った。２回目のＰＣＲには、ＨＣＶ−ＩＳＤＲ−Ｔ７（配列番号２２）及びＨＣＶ−ＩＳＤＲ−Ｒ２２（配列番号２３）を用いた。塩基配列決定には、Ｔ７２０（配列番号３２）及びＲ２２（配列番号３３）を用いた。参考例１と同様、ＩＳＤＲを含む断片が増幅され、その塩基配列が決定された。
【００３５】
実施例１
配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するペプチドＭ０並びに配列番号２４及び２５に示されるアミノ酸配列をそれぞれ有するペプチドＭ１及びＭ２をＡＢＩ社４３０Ａ型ペプチド合成機を用いて合成し、０．２〜０．４ｍｌを０．４５μｍフィルターで濾過し、ＨＰＬＣ精製を行った後凍結乾燥した。
【００３６】
合成したペプチドＭ０、Ｍ１、Ｍ２をそれぞれ１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解して１μｌ／ｍｌに調製した。それぞれ９６ウェルのＥＬＩＳＡプレート（ＭａｘＳｏｒｂ、商品名、ｎｕｎｃ社製）に５０μｌ／ウェルずつ入れた。室温で２時間放置した。１００μｌのＰＢＳでウェルを２回洗った。５％ＢＳＡ又は０．０５％ゼラチンを含むＰＢＳを各ウェルに２５０μｌ加え、１６時間放置した。
【００３７】
次に、前処理を行った試料血清を１ウェル当たり１００μｌ加え、１時間放置した。ＰＢＳで２回洗った。５％ＢＳＡ又は０．０５％ゼラチンを含むＰＢＳで希釈したペルオキシダーゼ標識ウサギ抗ヒト免疫グロブリン抗体を１ウェル当たり５０μｌ加え、室温で３０〜６０分反応させた。１ウェル当たり１００μｌのＰＢＳで３回洗った。オルソフェニレンジアミン（ＯＤＥ）溶液（クエン酸−リン酸緩衝液（クエン酸、０．５ｇ、リン酸水素２ナトリウム  １．８４ｇ、蒸留水１００ｍｌ、ｐＨ５．０）１００ｍｌにＯＤＥ  ４０ｍｇを溶解し、さらに３０％過酸化水素水を３０μｌ加える）を各ウェルあたり１００μｌ加えた。１０〜３０分間反応させ、２Ｍ硫酸を５０μｌ／ウェル加え反応を停止させた。ＥＬＩＳＡリーダー（Ｏ．Ｄ．４９２ｎｍ）で吸光度を測定した。ｃｕｔ  ｏｆｆをＯ．Ｄ．４９２ｎｍ＝０．５とし、Ｍ０、Ｍ１、Ｍ２ともに、ＨＣＶ抗体陰性患者５例では陰性であった。ＨＣＶ−１ｂタイプ（インターフェロンα無効例）５例では陽性、ＨＣＶ−１ｂタイプ（インターフェロン著効例）５例では陰性と判定された。
【００３８】
実施例２
Ｃ型慢性肝炎患者血清から参考例１と同様にしてＨＣＶ−ＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡ合成、１回目のＰＣＲを行った。次に、それぞれ１００ｎｇ以下のプライマーＭＭＦ１（配列番号２６）及びＭＭＦ２（配列番号２７）を用い、１．２５単位のＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭＫＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2 、０．０１％ゼラチンの組成の１００μｌの溶液に１回目のＰＣＲ産物を１μｌ加え、９５℃  １分、５５℃  ２０秒、７２℃  ２０秒で２５サイクルＰＣＲを行った。増幅産物を制限酵素ＥｃｏＲＩ  ５単位を用い、制限酵素処理し、ＥｃｏＲＩ末端を作製した。これを５μｌと発現ベクターｐＧＥＸ−１ラムダＴ  ＥｃｏＲＩ／ＢＡＰグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＴＳ）融合ベクター（ファルマシアバイオテク社製のｐＧＥＸにラムダＴファージとＧＴＳの融合タンパク質を組み込んだベクター）１００ｎｇを、６６ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、ＡＴＰ  １ｍＭ、スペルミジン１ｍＭ、ＭｇＣｌ2   １０ｍＭ、ＤＤＴ  １５ｍＭ、Ｔ４リガーゼ３００単位の溶液（合計１０μｌ）で、２２℃、３時間反応させた。大腸菌ＪＭ１０９にトランスフォームし、培養寒天培地で培養し、コロニーハイブリダイゼーションでインサートを確認した。さらに塩基配列を決定し、発現ベクターにＩＳＤＲ配列をコードする遺伝子が組み込まれていることを確認した。さらに、Ｅ．ｃｏｌｉに得られた発現ベクターをトランスフォームし、ＩＳＤＲ配列発現ベクター株を作製した。発現されたＩＳＤＲとＧＴＳの融合タンパク質は、Glutathion Sepharose 4B （商品名、ファルマシアバイオテク株式会社）によるアフィニティクロマトグラフィーにより精製し、クローニング部位のすぐ上流に位置する部位特異的プロテアーゼ（トロンビン）の認識部位を利用し、切り離し、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に１μｇ／ｍｌになるように調製した。９６ウェルのＥＬＩＳＡプレート（ＭａｘＳｏｒｂ、商品名ｎｕｎｃ社製）に５０μｌ／ウェルずつ入れた。室温で２時間放置した。１００μｌのＰＢＳでウェルを２回洗った。５％ＢＳＡ、又は０．０５％ゼラチンを含むＰＢＳを各ウェルに２５０μｌ加え、１６時間放置した。以下、実施例６と同様にＥＬＩＳＡを行った。その結果、ＨＣＶ抗体陰性患者５例では陰性であった。ＨＣＶ−１ｂタイプ（インターフェロンα無効例）５例では陽性、ＨＣＶ−１ｂタイプ（インターフェロン著効例）５例では陰性と判定された。
【００３９】
実施例３
１６ｍｇのキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）を１ｍｌのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）に溶解し、スターラーで攪拌しながら９．３μｌのｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロスクシンイミドエステル（ＭＢ）溶液（０．３ｍｇ／μｌになるようにッジメチルフォルムアミドにＭＢを溶解した溶液）を加え、室温で３０分間攪拌した。１．５ｍｌエッペンドルフチューブに移し、４℃、１６０００ｒｐｍで５分間遠心した。上清を内径１ｃｍ、長さ３０ｃｍのガラス製カラムを使用し、セファデックスＧ−２５（商品名、ファルマシア社製）にかけ（５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．０使用）１ｍｌずつ分取し、そのうち、クマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色法を用いＫＬＨとＭＢの結合体を含む画分を見つけ、まとめて−８０℃に保存した。なお、ＣＢＢ染色は次のようにして行った。ＰＶＤＶ膜をメタノールで湿らせ、次に蒸留水で置換した。各フラクションを１μｌスポットし、脱色液（５０％メタノール、５％酢酸）にしたした。さらに０．１％ＣＢＢを含むメタノールに１０秒漬け、脱色液に移した。ＫＬＨ−ＭＢ画分は青く染まった。
【００４０】
ＫＬＨ−ＭＢ  １．０ｍｌと０．５ｍｌの蒸留水に溶かしたＩＳＤＲ配列ペプチド（Ｍ０）、０．２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液０．５ｍｌを混ぜた。反応液にアルゴンガスを吹きつけ、ロータリーシェーカーで室温３時間振盪した。これを２００μｌずつ分注し、−２０℃に保温した。
【００４１】
フロイント完全アジュバント１．５ｍｌに２００μｌのＭＯ−Ｋを混ぜ、ウサギ（ニュージーランドホワイト、雌、２．５ｋｇ前後、５匹）にそれぞれ皮下約２０ケ所に注入した。３週間後に２回目の注入を５０μｌ行い、以後１０日毎に３カ月注入を繰り返した。抗ＩＳＤＲ抗体のチェックは実施例６に記載した抗体検出系を使用した。得られた抗ＩＳＤＲ配列抗体をＰＢＳ（０．０５％ゼラチン含む）で希釈し、９６ウェルのＥＬＩＳＡプレート（ＭａｘＳｏｒｂ、商品名、ｎｕｎｃ社製）に５０μｌ／ウェルずつ入れた。室温で２時間放置した。１００μｌのＰＢＳでウェルを２回洗った。５％ＢＳＡ又は０．０５％ゼラチンを含むＰＢＳを各ウェルに２５０μｌ加え、１６時間放置した。以下、実施例６と同様にＥＬＩＳＡを行った。その結果、ＨＣＶ抗体陰性患者２例では陰性であった。ＨＣＶ−１ｂタイプ（インターフェロンα無効例）２例では陽性、ＨＣＶ−１ｂタイプ（インターフェロン著効例）３例では陰性と判定された。
【００４２】
実施例４
上記ペプチドＭ０、Ｍ１及びＭ２並びに配列番号２８、２９及び３０でそれぞれ示される配列を有するペプチドＭ３、Ｍ４及びＭ５をＡＢＩ社４３０Ａ型ペプチド合成機を用いて合成し、０．２〜０．４ｍｌを０．４５μｍフィルターでろ過し、ＨＰＬＣ精製を行った後凍結乾燥した。
【００４３】
合成したペプチドＭ０、Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ４、Ｍ５をそれぞれ１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解して１μｇ／ｍｌに調整した。それぞれ、９６ｗｅｌｌのＥＬＩＳＡプレート（マキソープ；商品名、ｎｕｎｃ社製）に５０μｌ／ｗｅｌｌずつ入れた。室温で２時間放置した。ペプチド溶液を取り除いた。１００μｌのＰＢＳでｗｅｌｌを２回洗った。５％ＢＳＡ又は０．０５％ゼラチンを含むＰＢＳを各ｗｅｌｌに２５０μｌ加え、１６時間放置した。
【００４４】
次に、試料血清を１ｗｅｌｌあたり１００μｌ加え１時間放置した。ＰＢＳで２回洗った。５％ＢＳＡ（商品名；牛血清アルブミン、ベーリンガーマンハイム）又は０．０５％ゼラチンを含むＰＢＳで希釈したペルオキシダーゼ標識ウサギ（又はヤギ）抗マウス免疫グロブリン抗体を１ｗｅｌｌあたり５０μｌ加え室温で３０〜６０分反応した。１ｗｅｌｌあたり１００μｌのＰＢＳで３回洗った。オルソフェニレンジアミン（ＯＤＥ）溶液（クエン酸−リン酸緩衝液（クエン酸、０．５ｇ、リン酸水素２ナトリウム１．８４ｇ、蒸留水１００ｍｌ、ｐＨ５．０）１００ｍｌにＯＤＥ  ４０ｍｇを溶解しさらに、３０％過酸化水素水を３０μｌ加えた）を各ｗｅｌｌあたり１００μｌ加えた。１０〜３０分反応させ、２Ｍ硫酸を５０μｌ／ｗｅｌｌ加え反応を停止させた。ＥＬＩＳＡリーダー（Ｏ．Ｄ．４９２ｎｍ）で吸光度を測定した。ｃｕｔ  ｏｆｆを、Ｏ．Ｄ．４９２ｎｍ＝０．５とし、Ｍ０、Ｍ１、Ｍ２、Ｍ４、Ｍ５共に、ＨＣＶ抗体陰性患者５例では陰性、ＨＣＶ−１ｂタイプ（ＩＦＮアルファ無効例）５例では陽性、ＨＣＶ−１ｂタイプ（ＩＦＮ著効例）５例では陰性と判定された。
【００４５】
【発明の効果】
本発明により、ＨＣＶ−１ｂに対するインターフェロン治療が有効か否かの判定が可能になった。本発明により、インターフェロン治療が無効な患者に対してインターフェロン治療を行うという無駄がなくなる。従って、本発明はＨＣＶ−１ｂによるＣ型慢性肝炎の治療に貢献するものと期待される。
【００４６】
【配列表】
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【００４７】
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【００４８】
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【００４９】
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【００５０】
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【００５１】
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【００５２】
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【００５３】
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【００５４】
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【００５５】
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【００５６】
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【００５７】
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【００５８】
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【００５９】
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【００６０】
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【００６１】
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【００６２】
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【００６３】
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【００６４】
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【００６５】
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【００６６】
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【００６７】
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【００６８】
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【００６９】
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【００７０】
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【００７１】
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【００７２】
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【００７３】
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【００７４】
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【００７５】
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【００７６】
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【００７７】
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【００７８】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ＩＳＤＲの配列とインターフェロン投与の効果を示す図である。
【図２】ＩＳＤＲの配列とインターフェロン投与の効果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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