(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の水溶液（Ａ）および（Ｂ）の２つの水溶液を、容量比（Ａ）：（Ｂ）＝１００：１〜５０：１で分けた動物胚培養用培地
（Ａ）乳酸若しくはその塩、
塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム並びに炭酸水素ナトリウムからなる群より選択される少なくとも１の無機塩、
および、ｐＨ指示薬
を含み、ｐＨ７．０〜７．５に調整された中性水溶液、
（Ｂ）ピルビン酸、
ホスホマイシン、
および、セフェム系抗生物質
を含み、ｐＨ４．０〜５．５に調整された酸性水溶液。
【請求項２】
セフェム系抗生物質が、セファロチンである請求項１記載の動物胚培養用培地。
【請求項３】
酸性水溶液が、さらに、動物胚による乳酸の代謝を促進する物質を含む請求項１記載の動物胚培養用培地。
【請求項４】
動物胚による乳酸の代謝を促進する物質が、ＮＡＤである請求項３記載の動物胚培養用培地。
【請求項５】
酸性水溶液が、さらに、複合型抗酸化剤を含む請求項１記載の動物胚培養用培地。
【請求項６】
複合型抗酸化剤が、グルタチオン、システインおよびビタミンＣからなる群から選択された２種以上の化合物である請求項５記載の動物胚培養用培地。
【請求項７】
動物胚が受精卵である請求項１記載の動物胚培養用培地。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、動物胚培養用培地に関し、さらに詳細には、体外で受精された受精卵を子宮腔内に移植可能な状態まで培養させる動物胚培養用培地に関する。
【０００２】
【従来の技術】
細胞培養用培地とは、生体等から取り出した細胞の生存、機能維持あるいは増殖に必要な栄養源の供給、老廃物等の拡散除去を行う培地である。該培地は、通常、アミノ酸、ビタミン、ブドウ糖、微量金属等を含む培地に、血清などの添加物を加えて使用する。しかし、動物胚はその発生の初期においてはブドウ糖の利用率は低く、むしろピルビン酸および乳酸を必要とする。このため、動物胚の培養には、緩衝液であるアール（Earle）液をベースにピルビン酸および乳酸を添加した体外受精用培地（ＨＴＦ培地）またはアール液をベースにした最小必須栄養培地（α−ＭＥＭ培地）に、ペニシリンG、硫酸ストレプトマイシンなどの抗生物質および血清を添加して使用に供されている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、ピルビン酸、乳酸および抗生物質を添加した上記培地を使用して、動物胚、特に受精卵を培養するには、下記問題がしばしば生じる。
精液は、遠心分離、スイムアップ（swim up）などの方法により媒精されるが、精子は射精時に外尿道付近の常在菌で汚染されており無菌ではない。従って、従来の培地にはペニシリンG、硫酸ストレプトマイシンなどの抗生物質が添加されているが、これらの抗生物質は水溶液中で容易に加水分解され、抗菌力を維持できない。
ピルビン酸は中性水溶液中で不安定であるため、ｐＨが7.2〜7.3である市販培地においては初期添加濃度が保持されていない。
酸素抵抗性に寄与するスーパーオキサイドジスムターゼ（ＳＯＤ）等の抗酸化酵素が未誘導であるため、未分化である初期胚は酸素により影響を受ける。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題を解決するため、種々鋭意検討した結果、動物胚培養用培地を２つに分け、一方は中性水溶液、他方を酸性水溶液とし、さらに乳酸、発育環境を色調で示すインジケーターを中性水溶液に、ピルビン酸および抗生物質を酸性水溶液中に溶解させて、動物胚が培養されるに従い、培地のｐＨの変化に応じて変化する該インジケーターの色調の変化を観察することにより、動物胚の発育状態の判定を容易に行うことができる動物胚培養用培地を完成するに至った。
【０００５】
すなわち、本発明は使用時に混合される下記の水溶液（Ａ）および（Ｂ）を含んでなる動物胚培養用培地である。
（Ａ）中性付近で安定な栄養素および発育環境を色調の変化で示すインジケーターを含む中性水溶液、
（Ｂ）酸性で安定な栄養素および細菌の発育を抑制する抗菌性薬剤を含む酸性水溶液。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明の水溶液（Ａ）において、動物胚を発育せしめる中性付近で安定な栄養素としては、乳酸またはその塩およびその他の無機塩などの基本成分を含む。
水溶液（Ａ）は、乳酸塩、例えば乳酸ナトリウムなどの水溶液が例示される。乳酸ナトリウムの含有量は、水溶液（Ａ）中、1.0〜2.0ml／l、好ましくは1.5〜2.0ml／lである。
また、乳酸塩以外の無機塩としては、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、塩素などの基本成分を含む無機塩、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、炭酸水素ナトリウムなどが例示される。この無機塩の含有量は、水溶液（Ａ）中、6.0〜11.0g／l、好ましくは8.0〜9.5g／lである。
その他、微量の無機成分、例えば鉄、セレンなどを含んでいてもよい。
生物体の代謝能力に応じたグルコースなどの炭素源、アミノ酸などの窒素源、エストロゲンまたはアンドロゲンなどのホルモンあるいはインシュリン、インシュリン様成長因子などの成長因子類などを含んでいてもよい。
【０００７】
また、本発明の水溶液（Ａ）において、発育環境を外観的に感知可能とするインジケーターとは、動物胚の培養によって生ずるｐＨの変化を色調にて示すｐＨ指示薬、例えばフェノールレッド（ｐＫａ＝7.9）、ブロモチモールブルー（ｐＫａ＝7.1）、ｏ−クレゾールブルー（ｐＫａ＝8.2）などがある。ｐＨ指示薬は水溶液（Ａ）が中性付近から酸性付近へ変化する際に色調の変化するものであれば、いずれのものでもよい。インジケーターの含有量は、水溶液（Ａ）中、1.0〜3.0mg／l、好ましくは1.0〜2.0mg／lである。
発育環境が動物胚の生育に適しない状態になったときには、培地の交換を行う。
【０００８】
さらに、本発明の水溶液（Ｂ）において細菌の発育を抑制する抗菌性薬剤としては、ホスホマイシン、セフェム系抗生物質（セファロチンなど）、β−ラクタム系抗生物質、アミノグリコシド系抗生物質、テトラサイクリン系抗生物質、マクロライド系抗生物質、ペプチド系抗生物質、ヌクレオシド系抗生物質、ポリエン系抗生物質などが例示される。これらの抗生物質の少なくとも１種を使用する。これらの抗生物質中、細菌細胞壁ペプチドグリカンの生合成を阻害するホスホマイシン、セフェム系抗生物質（セファロチンなど）などが特に好ましい。抗菌性薬剤の含有量は、水溶液（Ｂ）中、0.5〜3.0g／l、好ましくは1.0〜2.0g／lである。
【０００９】
また、本発明の水溶液（Ｂ）において、酸性で安定な栄養素としては、ピルビン酸、および動物胚による乳酸からピルビン酸への代謝を促進する物質、例えばニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）などの補酵素が挙げられる。ピルビン酸の含有量は1.0〜3.0ml／l、好ましくは1.5〜3.0ml／lである。これらの代謝促進物質の含有量は、最終濃度中、0.03〜0.07g／l、好ましくは0.04〜0.06g／lである。
さらに、本発明の水溶液（Ｂ）において、複合型抗酸化剤としては、初期胚の酸素抵抗性に寄与する、例えば、グルタチオン、Ｎ−アセチルシステイン、システイン、アスコルビン酸（ビタミンＣ）、α−トコフェロール、尿酸、ピルビン酸、グルコース、アルブミン、フェリチンなどが挙げられる。複合型抗酸化剤はこれらの抗酸化剤のうち、少なくとも２種の抗酸化剤を組み合わせて用いる。抗酸化剤は１種であると、初期胚の酵素抵抗性に寄与する抗酸化剤の酸化により有効性が低下する。
特に、初期胚の酸素抵抗性に寄与する抗酸化剤としては、グルタチオンが好ましく、システイン、アスコルビン酸（ビタミンＣ）は酸化還元電位の違いによりグルタチオンの酸化を阻止する。複合型抗酸化剤の含有量は、水溶液（Ｂ）中、7.0〜15.0g／l、好ましくは10.0〜12.0g／lである。
【００１０】
本発明の培地は、動物胚を培養するに当り、上記水溶液（Ａ）および水溶液（Ｂ）を混合して使用する。水溶液（Ａ）のｐＨは7.0〜7.5である。該水溶液には、緩衝剤、例えば、ＨＥＰＥＳなどを添加する。ｐＨが7.0未満であると、混合時のｐＨが培養に適さなくなる。ｐＨが7.5を超えると同じく培養に適さない。
また、水溶液（Ｂ）のｐＨは4.0〜5.5である。該水溶液にはｐＨを調整するために、ＮａＯＨなどを添加する。ｐＨが4.0未満、あるいは5.5を超えた場合、成分の分解が起こる。
これらの水溶液（Ａ）および水溶液（Ｂ）の混合比は、（Ａ）：（Ｂ）＝100：1〜50：1（容量比）である。
【００１１】
本発明の培地における各成分組成について、その一例を下記に示す。
水溶液（Ａ）：下記成分の全てを含むｐＨ7.0〜7.5に調整された水溶液。
乳酸ナトリウム           1.0〜2.0ml
塩化ナトリウム           5.0〜7.0g
塩化カリウム             0.3〜0.5g
塩化カルシウム・2H2O     0.1〜0.4g
硫酸マグネシウム・7H2O   0.03〜0.1g
フェノールレッド         1.0〜3.0ｍg
炭酸水素ナトリウム       1.5〜3.0g
ＨＥＰＥＳ               2.0〜5.0g
グルコース               0.1〜0.8g
純水 
合計                     1,000 ml
水溶液（Ｂ）：下記成分の全てまたは一部を含むｐＨ4.0〜5.5に調整された水溶液。
ピルビン酸            1.0〜3.0ml
グルタチオン          0.3〜0.8g
Ｌ−システイン塩酸塩  4.0〜7.0g
アスコルビン酸        3.0〜7.0g
ＮＡＤ                0.03〜0.07g
セファロチン          0.3〜0.7g
ホスホマイシン        0.5〜1.5g
純水                   
合計                    1,000 ml
【００１２】
【実施例】
次に本発明を実施例により詳細に説明する。
実施例１
下記水溶液（Ａ）25ml、水溶液（Ｂ）0.3ml、および血清5mlを使用時に混合した培地を培養容器に入れ、該容器中の培地に、ヒト初期胚5〜8個（37例）を播種した。次いで、37℃、O2  5％、CO2  5％、N2  90％の雰囲気下で、40〜70時間、静置培養を行った。培養後、顕微鏡で確認し、4〜8分割に入ったヒト初期胚３個を患者に移植し、１ヶ月後に妊娠診断薬および超音波画像を用いて妊娠の診断を行った。その結果を表１に示す。
比較のために、市販ＨＴＦ培地（GIBCO社製）を使用して、同様にヒト初期胚の培養を行い、妊娠しているか否かを判断した。
【００１３】
水溶液（Ａ）：下記成分を含むｐＨ7.4に調整された水溶液。
乳酸ナトリウム      1.73ml
塩化ナトリウム      6.02g
塩化カリウム        0.35g
塩化カルシウム      0.295g
硫酸マグネシウム    0.075g
フェノールレッド    1.5mg
炭酸水素ナトリウム  2.10g
ＨＥＰＥＳ          3.34g
グルコース          0.1g
純水                                      
合計                1,000 ml
水溶液（Ｂ）：下記成分を含むｐＨ4.5に調整された水溶液。
ピルビン酸            2.03ml
グルタチオン          0.50g
Ｌ−システイン塩酸塩  5.40g
アスコルビン酸        5.00g
ＮＡＤ                0.05g
セファロチン          0.50g
ホスホマイシン        1.00g
純水                   
合計                  1,000 ml
【００１４】
【表１】
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【００１５】
表１から明らかなように、本発明の動物胚培養用培地は、市販のＨＴＦ培地に比べて、良好なヒト初期胚の発育により高い妊娠率を示した。
【００１６】
【発明の効果】
本発明の動物胚培養用培地は、抗菌性薬剤により細菌汚染による腐敗を防ぎ、含有栄養素により動物胚の良好な発育を可能とした。