(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
シアノアクリレート系接着剤、フィブリン接着剤又はゼラチン系接着剤から選択される生体組織用接着剤に下記式〔Ｉ〕
【化１】
0003806241.tif 000006
で示されるペプチドが含有されていることを特徴とするペプチド含有生体組織用接着剤。
【請求項２】
更に、アスコルビン酸が含有されていることを特徴とする請求項１記載のペプチド含有生体組織用接着剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は生体組織用接着剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
外科手術などにおいて、皮膚、臓器、血管などの創部の閉鎖・接合は、最も基本的な手技のひとつであり、現在では、糸による縫合が一般的になっている。しかし、創部の閉鎖・接合を縫合糸を用いずに、迅速に、適度な張力に耐えうる生物学的適合性のよい接着剤にて行うことが考えられ、いくつかの生体組織用接着剤が臨床的に用いられている。従来より、臨床的に使用され、または開発されている生体組織用接着剤としては、シアノアクリレート系接着剤、ポリウレタン系接着剤、ゼラチン系接着剤、フィブリン接着剤などがある。
【０００３】
上記シアノアクリレート系接着剤は、瞬間接着剤として工業的にも広く使用されているが、接着剤の適用方法としては、接合しようとする組織間に直接塗布して接着する直接法と、組織同士を密着させた上から布片をおいて被覆し接着する間接法とがある。しかしながら、シアノアクリレート系接着剤は、接着強度が大きい点では優れているが、硬化物が硬すぎるため創面の止血が不完全になり易いこと、硬化したポリマーの加水分解生成物であるホルムアルデヒドが毒性を有し組織の修復を阻害することなどの欠点があると言われている（木村  肇：日本接着学会誌、２２（２）、７７頁（１９８６年））。このため、中枢神経や血管に直接触れる部位には使用できず、適応箇所に制限がある。また、分解速度が遅いため異物となって創傷治癒を妨げ易いという問題もある。
【０００４】
上記ポリウレタン系接着剤としては、硬化後の接合部の柔軟性が維持されるよな弾性接着剤として開発された反応性ウレタンプレポリマー接着剤がある。反応性ウレタンプレポリマー接着剤は、その合成原料である芳香族ジイソシアネートが生体毒性を有するという問題がある。そのため、硬化速度の多少の遅延にもかかわらず、無毒性のフッ素化脂肪族ジイソシアネートを用いることが試みられている（松田  武久：生体材料、７（１）、３２頁（１９８９年））。
【０００５】
上記ゼラチン系接着剤に用いられるゼラチンは、コラーゲンを加水分解して得られる蛋白質であり、単独でも接着作用があるが、重合剤としてホルムアルデヒドやグルタルアルデヒドを加えると速やかにゲル化して収縮する。また、レゾシノールをゼラチンに添加すると接着層を疎水化し接着強度が高まる。このゼラチン系接着剤は、組織に対して有害であるホルムアルデヒドを重合剤として用いるため、術野に直接、該接着剤を塗布する場合に組織にホルムアルデヒドが触れ、生体毒性を示すという問題がある。
【０００６】
上記フィブリン接着剤は、高濃度のヒトフィブリノーゲンを基材とし、フィブリノーゲンをフィブリンに転換する酵素であるトロンビン、フィブリンを安定化させる因子である血液凝固第XIII因子、これらの反応に必要なカルシウムイオンおよび生成したフィブリン塊をプラスミンやトリプシンなどの線溶系酵素による分解から保護して接着力を持続させるための線維素溶解活性阻害物質であるアプロチニンが配合されている。フィブリン接着剤は、使用時に、これらの物質を混合し、使用局所でフィブリン塊を生成させるようになっている。このフィブリン接着剤は、異物となり難く、毒性もなく、創面の創傷治癒過程を阻害せず、むしろ促進的に働くなどの利点も多いが、しかしながら、柔軟であるため固定力および接着力が弱いという問題がある。また、副作用としてフィブリン糊が細菌の培地となりうるため感染の危険がある。また、調製時間が長いため手術時間が長くなるという問題もある。
【０００７】
このように、シアノアクリレート系接着剤、ポリウレタン系接着剤、ゼラチン系接着剤などの生体組織用接着剤は、生体組織に対し生体毒性を有し、組織の創傷治癒を妨げるという問題点がある。また、フィブリン接着剤は、創面の創傷治癒過程を阻害せず、むしろ促進的に働くが、固定力および接着力が弱いという問題がある。現状ではより積極的に創傷治癒を促進する作用を有する生体組織用接着剤はなく、創傷治癒を促進させ、より接着力の高い生体組織用接着剤が望まれている。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は上記問題点を解決するものであり、その目的は、より高い創傷治癒促進作用を有すると共に、より高い組織接合効果をもつ生体組織用接着剤を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明の請求項１記載のペプチド含有生体組織用接着剤は、生体組織用接着剤に下記式〔Ｉ〕
【化２】
0003806241.tif 000002
で示されるペプチドが含有されていることを特徴とする。
【００１０】
本発明の請求項２記載のペプチド含有生体組織用接着剤は、更に、創傷治癒効果を有する栄養成分が含有されていることを特徴とする請求項１記載のペプチド含有生体組織用接着剤である。
【００１１】
本発明の請求項３記載のペプチド含有生体組織用接着剤は、式〔Ｉ〕で示されるペプチドの含有量が０．０００１〜１０重量％、並びに創傷治癒効果を有する栄養成分としてアスコルビン酸、薬理学的に許容されるアスコルビン酸のエステルおよび薬理学的に許容されるアスコルビン酸の塩からなる群より選ばれる少なくとも一種の含有量が０．００１〜９９重量％であることを特徴とする請求項２記載のペプチド含有生体組織用接着剤である。
【００１２】
本発明の請求項４記載のペプチド含有生体組織用接着剤は、式〔Ｉ〕で示されるペプチドの含有量が０．０００１〜１０重量％、並びに創傷治癒効果を有する栄養成分としてアルギニン、グルタミンおよびビタミンＡからなる群より選ばれる少なくとも一種の含有量が０．００１〜９９重量％であることを特徴とする請求項２記載のペプチド含有生体組織用接着剤である。
【００１３】
本発明の請求項５記載のペプチド含有生体組織用接着剤は、生体組織用接着剤がシアノアクリレート系接着剤、フィブリン接着剤またはゼラチン系接着剤であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載のペプチド含有生体組織用接着剤である。
【００１４】
本発明で用いられる上記ペプチドは、ストレプトマイセス属に属する該ペプチド生産菌株、例えば、放線菌ストレプトマイセス・ノビリス（Streptomyces nobilis、以下「Ｓ．ノビリス」と略記する）を培養し、得られた培養液または同液の乾固物もしくは培養菌体から有機溶剤によって抽出された抽出物を、各種カラムクロマトグラフィーに付し、目的物を含むカラムクロマトグラフィー画分を再結晶処理することにより得られる。
【００１５】
上記ペプチドを生産する放線菌Ｓ．ノビリスは、公的保存機関から入手可能であり、たとえば理化学研究所の保存菌（ＪＣＭ４２７４）（これは米国においてＡＴＣＣ１９２５２およびオランダにおいてＣＢＳ１９８．６５としても保存）などの菌が使用できる。
【００１６】
上記ペプチドを得る方法は、例えば、本発明者らが先に国際出願したＷＯ９６／１２７３２号公報に記載の方法によって得られる。
【００１７】
本発明で用いられる創傷治癒効果を有する栄養成分としては、例えば、アスコルビン酸、薬理学的に許容されるアスコルビン酸のエステル、薬理学的に許容されるアスコルビン酸の塩、アルギニン、グルタミンおよびビタミンＡなどが挙げられ、これらは医薬品として使用可能なものが挙げられる。
【００１８】
上記薬理学的に許容されるアスコルビン酸のエステルとしては、例えば、アスコルビン酸リン酸エステル、アスコルビン酸硫酸エステル、アスコルビン酸パルミチン酸エステル、アスコルビン酸ステアリン酸エステルなどを挙げることができるが、これらに限定されるわけではない。
【００１９】
上記薬理学的に許容されるアスコルビン酸の塩としては、例えば、アスコルビン酸と各種塩基との塩を挙げることができる。例えば、アルカリ金属塩（例えば、ナトリウム塩）、アルカリ土類金属塩（例えば、カルシウム塩、マグネシウム塩など）などを挙げることができるが、これらに限定されるわけではない。
【００２０】
本発明で用いられる生体組織用接着剤としては、従来から生体組織用接着剤として使用されてきたもののいずれも使用可能であり、特に限定されないが、従来技術の項で詳細に説明したシアノアクリレート系接着剤、フィブリン接着剤またはゼラチン系接着剤が好ましい。
【００２１】
本発明のペプチド含有生体組織用接着剤中に含有すべき上記ペプチドの量は、特に限定されず広範囲に適宜選択されるが、ペプチド含有生体組織用接着剤中に、好ましくは、１０-7〜１０重量％の範囲である。
【００２２】
【作用】
本発明で用いられるペプチドは、肉芽形成作用があり、創傷治癒作用を有すると共に、強い抗菌作用も有することが知られている。このペプチドを生体組織用接着剤に含有させることにより、より高い創傷治癒促進作用を有すると共に、より高い組織接合効果をもつ生体組織用接着剤が得られた。
【００２３】
また、上記ペプチドに既に報告されているアスコルビン酸、アルギニン、グルタミンおよびビタミンＡなどの創傷治癒効果を有する栄養成分（医学のあゆみ、６月号別冊、３９〜４４頁、１９９６年）を組み合わせることにより、より一層高い創傷治癒促進作用を有すると共に、より一層高い組織接合効果をもつ生体組織用接着剤が得られた。
【００２４】
【発明の実施の形態】
参考例１
理化学研究所から入手した放線菌Ｓ．ノビリス（ＪＣＭ４２７４）を、酵母エキス０．２％（ｗ／ｖ）添加澱粉・アンモニウム培地５０ｍｌを含む５００ｍｌ容坂口スラスコ５本で、２６℃、１５０ｒｐｍ、１２０時間振盪培養（前々培養）した。続いて同培地１２リットルを含む２０リットル容ジャーファメンターに前々培養菌液２４０ｍｌを接種し、２６℃、４１０ｒｐｍ、通気量４リットル／分で２４時間培養（前培養）した。さらに澱粉・アンモニウム培地（蒸留水１００ｍｌ中に可溶性澱粉を１ｇ、リン酸水素二カリウムを０．０５ｇ、塩化アンモニウムを０．０５ｇ含む）１４０リットルを含む２００リットル容ジャーファメンターに、前培養菌液１２リットルを接種し、２６℃、２４時間種培養した。
【００２５】
さらに澱粉・アンモニウム培地１４００リットルを含む２０００リットル容タンクに、種培養菌液１４０リットルを接種し、２６℃、１４０ｒｐｍ、通気量７００リットル／分、ｐＨ７．５で７日間培養した。
【００２６】
培養終了後、濾過により菌体を濾別した。このようにして得られた菌体６．３４ｋｇ（湿重量）のうち、菌体１ｋｇ（湿重量）にジクロロメタン３リットルを加え、室温で１５時間攪拌後、菌体を濾別し、菌体抽出液を得た。菌体については、同操作を３回繰り返した。得られた菌体抽出液を濃縮後、シリカゲル担体１２０ｇに吸着させた。本吸着シリカゲル担体をシリカゲルカラムにより精製した。
【００２７】
シリカゲル担体８００ｇを充填した径８．０ｃｍのカラムに上記抽出物吸着担体約１２０ｇをチャージし、シリカゲルカラムを作成した。このシリカゲルカラムを下記の条件を用いて精製を行なった。溶出溶剤として、ａ）ヘキサン：酢酸エチル＝４：６を４リットル、ｂ）酢酸エチルを３．５リットル、ｃ）メタノールを２リットルを、この順に流速５００ｍｌ／時間で流した。分画は、溶剤組成を変更する毎に行い、特に酢酸エチルの溶出画分は５００ｍｌずつ分画した（従って、酢酸エチルについては、溶出画分数は合計７画分となる）。
【００２８】
上記の各溶出画分について、それぞれ、ＯＤＳ−８０ＴＭ、内径４．６ｍｍ×長さ２５．０ｃｍの東ソー社製のカラムを用いたＨＰＬＣ（日立社製、ポンプＬ−６０００、Ｌ−６２００、検出器Ｌ−３０００、カラムオーブン６５５Ａ−５２）によって、検出波長２１０ｎｍ、カラム温度４０℃、流速１ｍｌ／分の条件で、溶離液として水：アセトニトリル＝３：７を用いて、純度を確認した。
【００２９】
上記のＨＰＬＣによる純度確認において、リテンションタイムが１２〜１５分で溶出されるピーク面積が、全溶出ピーク面積の８０％以上を占めることが確認されたシリカゲルカラム溶出画分を合わせ、同一画分とした。本画分を濃縮乾固後、メタノール−ジクロロメタン系を用いて繰り返し再結晶を行い、柱状結晶３．５ｇを得た。
【００３０】
この物質の構造は、種々の機器分析データよりＷＯ９６／１２７３２号公報に記載された物質と同一であり、式〔Ｉ〕であると決定した。
【００３１】
構造分析データ
上記で得られた物質の機器分析データを以下に示す。
【００３２】
0003806241.tif 000003
【００３３】
0003806241.tif 000004
【００３４】
３．アミノ酸分析
加水分解物としてＤ−セリン、Ｌ−アラニンおよびＤ−Ｎ−メチル−フェニルアラニンが認められた。
【００３５】
（実施例１）
フィブリノーゲン末および血液凝固第XIII因子をアプロチニン溶液に溶解したＡ液と、トロンビン末を塩化カルシウム溶液に溶解したＢ液から構成されるフィブリン糊（ヘキスト社製、商品名  ベリプラストＰ）のＢ液に、参考例１で得られたペプチドをＡ液とＢ液との混合後の最終濃度が０．０１重量％となるように混合した。このようにして得られたＢ液とＡ液を混合し、本発明のペプチド含有生体組織用接着剤とした。後述の性能評価においては、このペプチド含有生体組織用接着剤を調製直後に切創に０．１ｇ塗布する方法により切創に投与した。
【００３６】
（実施例２）
参考例１で得られたペプチドを、ゼラチン糊（Ｅ．Ｈ．Ｓ．社（フランス）製、商品名  ＧＲＦグルー）の中のゼラチン・レゾルシン混合液と混合し、上記ペプチドの最終濃度が０．０１重量％となるようにされた液を得た。後述の性能評価においては、この液を０．１ｇ切創に塗布し、その上にホルムアルデヒド添加液を数滴滴下する方法により切創に投与した。
【００３７】
（実施例３）
参考例１で得られたペプチドを、シアノアクリレート系生体組織用接着剤（三共社製、商品名  Ａｒｏｎ  Ａｌｐｈａ  Ａ）と混合し、上記ペプチドの最終濃度が０．０１重量％となるようにして、本発明のペプチド含有生体組織用接着剤とした。後述の性能評価においては、このペプチド含有生体組織用接着剤を調製直後に切創に０．１ｇ塗布する方法により切創に投与した。
【００３８】
（実施例４）
実施例１において、Ｂ液に参考例１で得られたペプチドを混合する代わりに、参考例１で得られたペプチドとアスコルビン酸（和光純薬社製）を混合し、混合後の最終濃度が共に０．０１重量％となるようにした他は、実施例１と同様に操作して、本発明のペプチド含有生体組織用接着剤とした。後述の性能評価においては、このペプチド含有生体組織用接着剤を調製直後に切創に０．１ｇ塗布する方法により切創に投与した。
【００３９】
（比較例１）
フィブリン糊（ヘキスト社製、商品名  ベリプラストＰ）のＡ液とＢ液を混合し、生体組織用接着剤とした。後述の性能評価においては、この生体組織用接着剤を調製直後に切創に０．１ｇ塗布する方法により切創に投与した。
【００４０】
（比較例２）
生体組織用接着剤としてゼラチン糊（Ｅ．Ｈ．Ｓ．社（フランス）製、商品名ＧＲＦグルー）を用いた。後述の性能評価においては、この生体組織用接着剤液を切創に０．１ｇ塗布し、その上にホルムアルデヒド添加液を数滴滴下する方法により切創に投与した。
【００４１】
（比較例３）
生体組織用接着剤としてシアノアクリレート系生体組織用接着剤（三共社製、商品名  Ａｒｏｎ  Ａｌｐｈａ  Ａ）を用いた。後述の性能評価においては、この生体組織用接着剤を切創に０．１ｇ塗布する方法により切創に投与した。
【００４２】
性能評価
実施例１〜４のペプチド含有生体組織用接着剤および比較例１〜３の生体組織用接着剤について、以下の方法により性能評価した。
【００４３】
１０週齢のウイスター系ラットの背部を毛刈りし、背部正中線に垂直な方向にメスで２ｃｍの切創を作成した。この切創部を等間隔で３ケ所で縫合した後、実施例１〜４および比較例１〜３の接着剤を前記のようにして投与処置した。処置の３日後にラットを犠牲死させ、抜糸後、切創中央部から左右に１ｃｍ幅の短冊状の皮膚切片を切り取った。レオメーターを用いて切創部の耐抗張力（ｇ／ｃｍ）を測定した。それぞれの実施例および比較例について５匹のラットを用いて行い、耐抗張力（ｇ／ｃｍ）はこれらラットについて得られた値の平均値を取った。結果を表１に示した。
【００４４】
【表１】
0003806241.tif 000005
【００４５】
表１より、実施例１のペプチド含有生体組織用接着剤を投与した群では、比較例１の生体組織用接着剤を投与した群よりも、耐抗張力が大きく上昇したことが分かる。実施例２と比較例２、および実施例３と比較例３の関係においても同じことが言える。また、実施例４より、更にアスコルビン酸を含有するペプチド含有生体組織用接着剤においては、更に効果が上がることがわかる。
【００４６】
【発明の効果】
本発明の請求項１記載の発明の構成は、上記の通りであり、本発明によれば、より高い創傷治癒促進作用を有すると共に、より高い組織接合効果をもつ生体組織用接着剤が提供される。
【００４７】
本発明の請求項２記載の発明の構成は、上記の通りであり、本発明によれば、より一層高い創傷治癒促進作用を有すると共に、より一層高い組織接合効果をもつ生体組織用接着剤が提供される。
【００４８】
本発明の請求項３記載の発明の構成は、上記の通りであり、本発明によれば、より一層高い創傷治癒促進作用を有すると共に、より一層高い組織接合効果をもつ生体組織用接着剤が提供される。
【００４９】
本発明の請求項４記載の発明の構成は、上記の通りであり、本発明によれば、より一層高い創傷治癒促進作用を有すると共に、より一層高い組織接合効果をもつ生体組織用接着剤が提供される。
【００５０】
本発明の請求項５記載の発明の構成は、上記の通りであり、本発明によれば、より一層高い創傷治癒促進作用を有すると共に、より一層高い組織接合効果をもつ生体組織用接着剤が提供される。
【００５１】
また、請求項１〜５記載の発明は、その高い創傷治癒促進効果からみて、従来の生体組織用接着剤に見られた毒性も緩和しているものと推定される。