(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１４に示されるアミノ酸配列を有するポリぺプチド、若しくは該ポリペプチドにおける１個のアミノ酸残基が欠失、付加、挿入若しくは置換されたアミノ酸配列を有し、かつキシログルカンオリゴ糖分解活性を有するポリペプチド。
【請求項２】
Ｎ末端にメチオニンが付加された請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
シグナル配列が付加された請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項４】
配列番号１２中に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、若しくは該ポリペプチドにおける１個のアミノ酸が欠失、付加、挿入または置換されたアミノ酸配列を有するポリペプチドであって、キシログルカンオリゴ糖分解活性を有するポリペプチドの前駆体となるポリペプチド。
【請求項５】
配列番号１８に示されるアミノ酸配列を有する請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれかに記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項７】
配列番号１３に示される塩基配列を有するポリヌクレオチド、若しくは該ポリヌクレオチドにおける１個の核酸が欠失、付加、挿入または置換された塩基配列を有するものであって、キシログルカンオリゴ糖分解活性を有するポリペプチドを発現するポリヌクレオチド。
【請求項８】
開始コドンが付加された請求項７に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９】
シグナルペプチド配列に対応する塩基配列が付加された請求項７に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０】
配列番号１１に示される塩基配列を有するポリヌクレオチド、若しくは該ポリヌクレオチドにおける１個の核酸が欠失、付加、挿入または置換された塩基配列を有するポリヌクレオチドであって、キシログルカンオリゴ糖分解活性を有するポリペプチドの前駆体を発現するポリヌクレオチド。
【請求項１１】
請求項７〜９のいずれかに記載のポリヌクレオチドに対し、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつキシログルカンオリゴ糖分解活性を有するポリペプチドを発現するポリヌクレオチドであって、ストリンジェントな条件が、０．５％ＳＤＳ、５×デンハルツ及び１００μg/ｍｌサケ精子ＤＮＡを含む６×ＳＳＣ中で、５０℃〜６５℃で４時間〜一晩保温し、次いで、６×ＳＳＣ中、室温で１０分間、０．１％ ＳＤＳを含む２×ＳＳＣ中、室温で１０分間、０．１％ ＳＤＳを含む０．２×ＳＳＣ中、４５℃で３０分間洗浄する条件である、上記ポリヌクレオチド。
【請求項１２】
請求項１０に記載のポリヌクレオチドに対し、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつキシログルカンオリゴ糖分解活性を有するポリペプチドの前駆体を発現するポリヌクレオチドであって、ストリンジェントな条件が、０．５％ＳＤＳ、５×デンハルツ及び１００μg/ｍｌサケ精子ＤＮＡを含む６×ＳＳＣ中で、５０℃〜６５℃で４時間〜一晩保温し、次いで、６×ＳＳＣ中、室温で１０分間、０．１％ ＳＤＳを含む２×ＳＳＣ中、室温で１０分間、０．１％ ＳＤＳを含む０．２×ＳＳＣ中、４５℃で３０分間洗浄する条件である、上記ポリヌクレオチド。
【請求項１３】
請求項７〜９のいずれかに記載のポリヌクレオチドに対し、９５％以上の相同性を有し、キシログルカンオリゴ糖分解活性を有するポリペプチドを発現するポリヌクレオチド。
【請求項１４】
請求項１０に記載のポリヌクレオチドに対し、９５％以上の相同性を有し、キシログルカンオリゴ糖分解活性を有するポリペプチドの前駆体を発現するポリヌクレオチド。
【請求項１５】
請求項７〜１４のいずれかに記載のポリヌクレオチドに縮重するポリヌクレオチド。
【請求項１６】
請求項６〜１５のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含有することを特徴とする組換えベクター。
【請求項１７】
請求項１６に記載の組換えベクターを含むことを特徴とする形質転換体。
【請求項１８】
請求項１７に記載の形質転換体を培養し、培養物から、組み換えられたポリヌクレオチドに対応するポリペプチドを採取することを特徴とする、ポリペプチドの製造方法。
【請求項１９】
ポリペプチドが、キシログルカンオリゴ糖分解活性を有するものである請求項１８に記載のポリペプチドの製造方法。
【請求項２０】
キシログルカンオリゴ糖分解活性が、キシログルカンオリゴ糖の主鎖を構成するβ-グルコシド結合について、還元末端側から２番目のβ-グルコシド結合を特異的に分解するものである請求項１９に記載のポリペプチドの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規なキシログルカンオリゴ糖分解酵素、キシログルカンオリゴ糖分解活性を有する特定のアミノ酸配列を有するポリペプチド、その遺伝子、該遺伝子を含有する組換えベクター、該組換えベクターにより形質転換された形質転換体、及び該形質転換体を培養して上記ポリペプチドを製造する方法等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
キシログルカンは、グルコース、キシロース、ガラクトース、フコース、アラビノースなどを構成単糖とするヘテロ多糖であるが、グルコースがβ-１，４-グルコシド結合で多数結合した主鎖に対して、キシロースがα-１，６キシロシド結合で高頻度に分岐結合した構造を基本とすることから、キシログルカンと呼称されている。このキシログルカンは、植物の一次細胞壁の構成成分として、またタマリンド豆に代表される熱帯産マメ科植物の種子貯蔵多糖として重要な役割を担っており、その構造や機能が注目されている。特に、植物の一次細胞壁中におけるキシログルカンは、セルロースと密接に関わって存在していると考えられており、セルロースとの相対的な存在形態が、植物細胞の伸長や形態分化に重要な役割を担っているものと考えられている。このようなキシログルカンの役割を解明するために種々の手法が用いられているが、中でもキシログルカンを分解することのできる各種グリコシダーゼは、重要で強力な分析手段を提供する。
【０００３】
上述のようにキシログルカンはグルコース、キシロース、ガラクトース、フコース、アラビノースなどを構成単糖とし、かつ主鎖の構造がセルロースと同様なものであることから、これを分解できるグリコシダーゼとして、エンド-１，４-β-D-グルカナーゼ、β-ガラクトシダーゼ、イソプリメベロース生成オリゴキシログルカン分解酵素、α-キシロシダーゼ、β-グルコシダーゼおよびα-フコシダーゼが知られており、キシログルカンの構造や機能の解明に、各種起源のこれら酵素が用いられてきた。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、キシログルカンの複雑な構造から察せられるように、既知のグリコシダーゼでは切断できない結合が数多く残っており、既知酵素とは異なる分解様式をもつ新しいグリコシダーゼの開発が嘱望されていた。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、キシログルカンには既知のグリコシダーゼでは直接切断できないグリコシド結合のほうが多いこと、また酵素は一般的に高い基質特異性を有していることに着目し、自然界よりキシログルカンを炭素源として生育できる微生物のスクリーニングを行い、さらに分離微生物の生産するキシログルカン分解酵素系を、種々の構造をもつキシログルカンオリゴ糖を分解基質として精査することにより、これまで知られていない分解様式でキシログルカンを分解する酵素の存在の可能性について鋭意検討した。その結果、酵母菌の一種であり、高純度キシログルカンオリゴ９糖の大量調製に有効な菌株として知られているゲオトリカム属の一菌株（ゲオトリカム（Geotrichum）属菌M128株）が  新規なキシログルカンオリゴ糖分解酵素を生産することを見出すとともに、該酵素のアミノ酸配列及びその遺伝子の塩基配列を解明し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち、本発明の要旨は以下の（１）〜（２０）に係るものである。
（１）配列番号１４に示されるアミノ酸配列を有するポリぺプチド、若しくは該ポリペプチドにおける１個のアミノ酸残基が欠失、付加、挿入若しくは置換されたアミノ酸配列を有し、かつキシログルカンオリゴ糖分解活性を有するポリペプチド。
（２）Ｎ末端にメチオニンが付加された上記（１）に記載のポリペプチド。
（３）シグナル配列が付加された上記（１）に記載のポリペプチド。
（４）配列番号１２中に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、若しくは該ポリペプチドにおける１個のアミノ酸が欠失、付加、挿入または置換されたアミノ酸配列を有するポリペプチドであって、キシログルカンオリゴ糖分解活性を有するポリペプチドの前駆体となるポリペプチド。
（５）配列番号１８に示されるアミノ酸配列を有する上記（２）に記載のポリペプチド。
（６）上記（１）〜（４）のいずれかに記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
（７）配列番号１３に示される塩基配列を有するポリヌクレオチド、若しくは該ポリヌクレオチドにおける１個の核酸が欠失、付加、挿入または置換された塩基配列を有するものであって、キシログルカンオリゴ糖分解活性を有するポリペプチドを発現するポリヌクレオチド。
（８）開始コドンが付加された上記（７）に記載のポリヌクレオチド。
（９）シグナルペプチド配列に対応する塩基配列が付加された上記（７）に記載のポリヌクレオチド。
（１０）配列番号１１に示される塩基配列を有するポリヌクレオチド、若しくは該ポリヌクレオチドにおける１個の核酸が欠失、付加、挿入または置換された塩基配列を有するポリヌクレオチドであって、キシログルカンオリゴ糖分解活性を有するポリペプチドの前駆体を発現するポリヌクレオチド。
（１１）上記（７）〜（９）のいずれかに記載のポリヌクレオチドに対し、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつキシログルカンオリゴ糖分解活性を有するポリペプチドを発現するポリヌクレオチドであって、ストリンジェントな条件が、０．５％ＳＤＳ、５×デンハルツ及び１００μg/ｍｌサケ精子ＤＮＡを含む６×ＳＳＣ中で、５０℃〜６５℃で４時間〜一晩保温し、次いで、６×ＳＳＣ中、室温で１０分間、０．１％ ＳＤＳを含む２×ＳＳＣ中、室温で１０分間、０．１％ ＳＤＳを含む０．２×ＳＳＣ中、４５℃で３０分間洗浄する条件である、上記ポリヌクレオチド。
（１２）  上記（１０）に記載のポリヌクレオチドに対し、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつキシログルカンオリゴ糖分解活性を有するポリペプチドの前駆体を発現するポリヌクレオチドであって、ストリンジェントな条件が、０．５％ＳＤＳ、５×デンハルツ及び１００μg/ｍｌサケ精子ＤＮＡを含む６×ＳＳＣ中で、５０℃〜６５℃で４時間〜一晩保温し、次いで、６×ＳＳＣ中、室温で１０分間、０．１％ ＳＤＳを含む２×ＳＳＣ中、室温で１０分間、０．１％ ＳＤＳを含む０．２×ＳＳＣ中、４５℃で３０分間洗浄する条件である、上記ポリヌクレオチド。
（１３）  上記（７）〜（９）のいずれかに記載のポリヌクレオチドに対し、９５％以上の相同性を有し、キシログルカンオリゴ糖分解活性を有するポリペプチドを発現するポリヌクレオチド。
（１４）上記（１０）に記載のポリヌクレオチドに対し、９５％以上の相同性を有し、キシログルカンオリゴ糖分解活性を有するポリペプチドの前駆体を発現するポリヌクレオチド。
（１５）上記（７）〜（１４）のいずれかに記載のポリヌクレオチドに縮重するポリヌクレオチド。
（１６） 上記（６）〜（１５）のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含有することを特徴とする組換えベクター。
（１７）上記（１６）に記載の組換えベクターを含むことを特徴とする形質転換体。
（１８）上記（１７）に記載の形質転換体を培養し、培養物から、組み換えられたポリヌクレオチドに対応するポリペプチドを採取することを特徴とする、ポリペプチドの製造方法。
（１９）ポリペプチドが、キシログルカンオリゴ糖分解活性を有するものである上記（１８）に記載のポリペプチドの製造方法。
（２０）キシログルカンオリゴ糖分解活性が、キシログルカンオリゴ糖の主鎖を構成するβ-グルコシド結合について、還元末端側から２番目のβ-グルコシド結合を特異的に分解するものである上記（１９）に記載のポリペプチドの製造方法。
【０００７】
なお、本発明においては、「アミノ酸配列を有するポリペプチド」あるいは「塩基配列を有するポリヌクレオチド」というとき、該記載において指摘するアミノ酸配列または塩基配列のみではなく、これら配列をその部分として含有するポリペプチド、ポリヌクレオチドも包含する。
【０００８】
本発明におけるキシログルカンオリゴ糖分解酵素は、キシログルカンオリゴ糖の主鎖を構成するβ-グルコシド結合について、還元末端側から２番目のβ-グルコシド結合を特異的に分解する機能を有する。
この酵素は、ゲオトリカム（Geotrichum）属菌M128株により生産され、ゲオトリカム（Geotrichum）属菌M128株は、ゲオトリカム・エスピー  （Geotrichum sp.）M128株、FERM P-16454として産業技術総合研究所、特許微生物寄託センターに寄託されている。
【０００９】
上記ゲオトリカム（Geotrichum ）属菌M128株より、本発明の酵素を生産するためには、通常、タマリンド種子キシログルカンを炭素源とし、これに窒素源として、硝酸塩、アンモニウム塩或いはペプトン、酵母エキスのような無機または有機の窒素源と少量の金属塩を含む液体または固体培地を用い、２０〜３０℃で、４〜１０日程度、好気的に培養される。本発明の酵素は、菌体外に生産される酵素であるため、液体培地の場合は培養後、濾過或いは遠心分離した上澄液を、そして固体培養の場合は培養後、水または適当な無機塩類で抽出した液を、粗酵素液とすることができる。粗酵素液中には、本発明の酵素以外にキシログルカンを分解する種々の酵素活性が含まれるため、これを除去する必要があるが、公知のクロマトグラフィーにより、本発明の酵素以外の共存するグリコシダーゼ活性を除去することができる。
【００１０】
上記のようにして得られた本発明の酵素（精製物）は、以下のような性質を有している。
【００１１】
（１）分子量及び等電点；精製された本発明の酵素は、分子量が約９６,０００で、等電点ｐＨは約６．０である。
【００１２】
（２）作用；本発明の酵素は、各種起源のキシログルカンのエンド-β-１，４-グルカナーゼによる部分分解で生ずるキシログルカン由来オリゴ糖のうち、主鎖の重合度が３以上のキシログルカンオリゴ糖に作用し、そのオリゴ糖の主鎖を構成するβ-グルコシド結合について、還元末端側から２番目のβ-グルコシド結合を特異的に分解する。このとき、還元末端に位置するグルコース残基の結合にあずかる４位の水酸基以外が修飾されていると、本発明の酵素は当該のβ-グルコシド結合を分解できない。
【００１３】
また、キシログルカンオリゴ糖について、主鎖の還元末端グルコースから数えて３番目のグルコース残基に結合している、側鎖キシロースの水酸基のうち２位水酸基が修飾されていると、本発明の酵素は還元末端側から２番目のβ-グルコシド結合を分解できない。さらに、キシロース側鎖を持たない重合度４以上のセロオリゴ糖について、本酵素は還元末端側から２番目のβ-グルコシド結合を分解しセロビオースを生成するが、キシログルカンオリゴ糖の分解速度にくらべて非常に遅く、その比は２００分の１以下である。
【００１４】
重合度４以上のセロオリゴ糖について、これを分解しセロビオースを生成する酵素として、１，４-β-D-グルカン-セロビオヒドロラーゼ（EC ３．２．１．９１）が知られているが、該酵素はキシロース側鎖をもつキシログルカンオリゴ糖の、主鎖を構成するβ-グルコシド結合を分解することはできない。このように、既知のグリコシダーゼには、キシログルカンオリゴ糖の主鎖を構成するβ-グルコシド結合について、還元末端側から２番目のβ-グルコシド結合に特異的に作用する酵素は知られておらず、したがって本発明の酵素は、新規な分解様式をもつ新しいキシログルカンオリゴ糖分解酵素である。
【００１５】
（３）作用ｐＨ及び最適作用ｐＨ；キシログルカンオリゴ７糖を分解基質としたとき、本発明の酵素の作用ｐＨ範囲は、４５℃で１０分間作用させた場合、ｐＨ３〜５であり、最適作用ｐＨは約４．０付近に認められた。
【００１６】
（４）安定ｐＨ範囲；本発明の酵素をクエン酸-リン酸塩緩衝液中で、４５℃，３時間放置してその残存活性からみた安定ｐＨ範囲は約ｐＨ３．５〜８．０であった。
【００１７】
（５）作用温度範囲及び最適作用温度；キシログルカンオリゴ７糖を分解基質としたとき、本発明の酵素の作用温度範囲は、ｐＨ４．０で１０分間作用させた場合、約５５℃まで作用が認められたが、最適作用温度は５０℃であった。
【００１８】
（６）熱安定性；本発明の酵素を５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）のもとで、各温度で１０分間加熱処理した残存活性は５０℃までは殆ど失活せず、５５℃で約１０％、６０℃で約８５％が活性を失った。
【００１９】
（７）阻害剤；各種金属イオンのうちで、１ｍＭ以上の水銀イオンにより、本発明の酵素は強く阻害された。
【００２０】
（８）精製法；本発明の酵素は、培養上清を限外濾過により濃縮・脱塩した後、陰イオン交換体ＰＢＥ９４のカラムを用いたイオン交換及び吸着クロマトグラフィーを繰り返し行い、活性を保持している画分を濃縮して、さらにトヨパールＨＷ５５Ｆカラムによるゲル濾過を行うことで、ＳＤＳ電気泳動的に均一なまで分離精製することができた。
【００２１】
（９）活性測定法；本発明の酵素は、キシログルカンオリゴ糖を特異的に分解することから、タマリンドガムより調製したキシログルカンオリゴ７糖の３０ミリモル水溶液０．５ミリリットル（ｐＨ４．０）に対して、適量の酵素を添加して全量を１ミリリットルとし、４５℃で１０分間反応させ、生成する還元糖をネルソン-ソモギー法により測定し、活性を求めた。この条件で、１分間に１マイクロモルのグルコースに相当する還元力を生成する酵素量を１単位とした。
【００２２】
本発明の新規なキシログルカンオリゴ糖分解酵素は、分泌蛋白であり、配列番号１２に示されるアミノ酸配列を有し、該配列中、残基１〜２３はシグナル配列である。本酵素の成熟体蛋白は、この残基１〜２３の配列が除かれたものであり、このアミノ酸配列を配列番号１４に示す。
【００２３】
したがって、本発明のポリペプチドとして好適なものは、少なくともこの配列番号１４のアミノ酸配列を有するものであるが、また、このポリペプチドと１個又は複数個のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入若しくは置換によりアミノ酸配列が異なるものであっても、キシログルカンオリゴ糖分解活性を有する限り本発明に含まれる。
【００２４】
また、本発明のポリペプチドとしては、配列番号１２で示されるような、上記シグナル配列を有する前駆体ポリペプチド、あるいは、該ポリペプチドと１個又は複数個のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入若しくは置換によりアミノ酸配列が異なるものであっても、スプライシングによりキシログルカンオリゴ糖分解活性を有するポリペプチドを産生可能なものも挙げることができる。
【００２５】
さらに、本発明のポリペプチドは、遺伝子組換え手段を用いて製造することができる。この場合、例えば、上記配列番号１４に示されるアミノ酸配列のＮ末端に開始コドン由来のメチオニンが付加したもの、あるいはそのＣ末端に発現ベクター由来のアミノ酸残基及び得られるポリペプチドの精製のためのヒスチジンタグ等が付加したものであってもよく、例えば、配列番号１８に示されるポリペプチドについて、キシログルカンオリゴ糖分解活性を有することが確認されている。
【００２６】
本発明のキシログルカンオリゴ糖分解活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子としては、該酵素を産生する微生物から該遺伝子のクローニングによって取得することができる遺伝子や該遺伝子に相同性を有する遺伝子があげられる。相同性としては、少なくとも６０％以上の相同性を有する遺伝子、好ましくは８０％以上の相同性を有する遺伝子、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有する遺伝子が挙げられる。
本発明のキシログルカンオリゴ糖分解活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子としては、例えば以下のようなポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）が好ましい。
【００２７】
（１）配列番号１３に示す塩基配列を有するポリヌクレオチド、あるいは該ポリペプチドの１個又は複数個の核酸が欠失、付加、挿入または置換された塩基配列を有するポリヌクレオチドであって、キシログルカンオリゴ糖分解活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
（２）上記（１）のポリヌクレオチドに開始コドンが付加されているポリヌクレオチド。
（３）上記（１）に示されるポリヌクレオチドにシグナル配列に対応する塩基配列が付加されたポリヌクレオチド、あるいは該ポリヌクレオチドにおける１個又は複数個の核酸が欠失、付加、挿入または置換された塩基配列を有し、かつスプライシングにより成熟体を発現可能なポリヌクレオチドであって、具体的には配列番号１１に示される塩基配列を有するポリヌクレオチド。
【００２８】
さらに、このほか上記（１）〜（３）のポリヌクレオチドに対しストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子、該ポリヌクレオチドに相同性を有するポリヌクレオチド、及び該ポリヌクレオチドに縮重するポリヌクレオチドもそれらがコードするポリペプチドがキシログルカンオリゴ糖分解活性を有する限り本発明に含まれる。
なお、ここでいう「ストリンジェントな条件下」とは、例えば以下の条件をいう。すなわち０．５％ＳＤＳ、５×デンハルツ（Denhartz's、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％フィコール４００）及び１００μg/ｍｌサケ精子ＤＮＡを含む６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは、０．１５ ｍｏｌ/ｌ、０．０１５ｍｏｌ/ｌクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０ ）中で、５０℃〜６５℃で４時間〜一晩保温する条件をいう。
【００２９】
本発明のキシログルカンオリゴ糖分解活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、上述したキシログルカンオリゴ糖分解酵素を産生する微生物から、例えば以下に記載するような方法で該遺伝子のクローニングを行うことによって取得することができる。まず、新規なキシログルカンオリゴ糖分解酵素を産生する微生物から上述の方法によって本発明の新規なキシログルカンオリゴ糖分解酵素を単離、精製し、その部分アミノ酸配列に関する情報を得る。
【００３０】
部分アミノ酸配列決定方法としては、例えば、精製された本酵素蛋白質を直接エドマン分解法〔Journal of Biological Chemistry, 256, 7990-7997 （1981）〕によりアミノ酸配列分析〔プロテイン−シーケンサ４７６Ａ、アプライド バイオシステムズ（Applied Biosystems）社製等〕に供してもよいし、あるいはタンパク質加水分解酵素を作用させて限定加水分解を行い、得られたペプチド断片を分離精製し、得られた精製ペプチド断片についてアミノ酸配列分析を行うのが効果的である。
【００３１】
こうして得られる部分アミノ酸配列の情報を基に、新規なキシログルカンオリゴ糖分解酵素遺伝子をクローニングする。一般的に、 ＰＣＲを用いる方法あるいはハイブリダイゼーション法を利用してクローニングを行うことができる。
【００３２】
ＰＣＲ法やハイブリダイゼーション法を利用する場合、例えば、Sambrook and Russell，Molecular Cloning: A Laboratory Manual，Third edition, Cold Spring Habor Laboratory Press（2001）に記載の方法を用いることができる。
【００３３】
ＰＣＲ法を利用する場合、以下のような方法を用いることができる。まず、新規なキシログルカンオリゴ糖分解酵素を産生する微生物のｃＤＮＡを鋳型とし、部分アミノ酸配列の情報を基にデザインした合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いてＰＣＲ反応を行い、目的の遺伝子断片を得る。
【００３４】
この増幅ＤＮＡ断片について通常用いられる方法、例えば、ジデオキシチェーンターミネーター法で塩基配列を決定すると、決定された配列中に合成オリゴヌクレオチドプライマーの配列以外に新規なキシログルカンオリゴ糖分解酵素の部分アミノ酸配列に対応する配列が見出され、目的の酵素遺伝子の一部を取得することができる。さらに、得られた遺伝子断片をプローブとして用いるハイブリダイゼーション法や、５′−ＲＡＣＥ(Rapid Amplification of cDNA ends)及び ３′−ＲＡＣＥ法等を行うことによって、新規なキシログルカンオリゴ糖分解酵素全長をコードする遺伝子をクローニングすることができる。
【００３５】
本発明においては、ゲオトリカム・エスピー（Geotrichum sp.）M128株を用い、ＰＣＲ法を利用して、キシログルカンオリゴ糖分解酵素をコードする遺伝子の全塩基配列を決定した。この塩基配列は配列番号１１に示される。
これによってコードされるアミノ酸配列を配列番号１２に記載した。  このアミノ酸配列のうち、Ｎ末端１〜２３のアミノ酸残基はシグナル配列を示し、成熟体のポリペプチドは、２４番目のリジンから始まるアミノ酸配列を有し（配列番号１４）、該成熟体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列は配列番号１３に示すとおりである。
なお、配列番号１２あるいは１４に記載したアミノ酸配列に対応する塩基配列は配列番号１１あるいは１３に記載したもの以外に無数に存在するが、これらはすべて本発明の範囲に含まれる。
【００３６】
また、配列番号１２あるいは１４に記載のアミノ酸配列や配列番号１１あるいは１３に記載の塩基配列の情報を元にして、化学合成によって目的とする遺伝子ポリヌクレオチドを得ることもできる(Gene,60(1), 115-127 (1987))。
【００３７】
さらに、ゲオトリカム・エスピーM128株を用いて全塩基配列が明らかにされた新規なキシログルカンオリゴ糖分解酵素遺伝子の全体あるいは一部分をハイブリダイゼーション用のプローブとして用いて、他のキシログルカンオリゴ糖分解酵素を産生する微生物のゲノムＤＮＡライブラリーあるいはｃＤＮＡライブラリーから、配列番号１１の新規なキシログルカンオリゴ糖分解酵素遺伝子と相同性の高いＤＮＡを選別することができる。
【００３８】
ハイブリダイゼーションは、上記に示したストリンジェントな条件下で行うことができる。例えば、新規なキシログルカンオリゴ糖分解酵素を産生する微生物から得たゲノムＤＮＡライブラリーあるいはｃＤＮＡライブラリーを固定化したナイロン膜を作成し、６×ＳＳＣ 、 ０．５％ＳＤＳ 、５×デンハルツ、１００μg/ｍｌサケ精子ＤＮＡを含むプレハイブリダイゼーション溶液中、６５℃でナイロン膜をブロッキングする。その後、32Ｐでラベルした各プローブを加えて、６５℃で一晩保温する。このナイロン膜を６×ＳＳＣ中、室温で１０分間、０．１％ ＳＤＳを含む２×ＳＳＣ中、室温で１０分間、０．１％ ＳＤＳを含む０．２×ＳＳＣ中、４５℃で３０分間洗浄した後、オートラジオグラフィーをとり、プローブと特異的にハイブリダイズするＤＮＡを検出することができる。また、洗いなどの条件を変えることによって様々な相同性を示す遺伝子を得ることができる。
【００３９】
一方、本発明の遺伝子の塩基配列からＰＣＲ反応用のプライマーをデザインすることができる。このプライマーを用いてＰＣＲ反応を行うことによって、本発明の遺伝子と相同性の高い遺伝子断片を検出したり、更にはその遺伝子全体を得ることもできる。
【００４０】
得られた遺伝子が目的のキシログルカンオリゴ糖分解酵素活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子であるかどうかを確認するには、決定された塩基配列を本発明の新規なキシログルカンオリゴ糖分解酵素の塩基配列又はアミノ酸配列と比較し、その遺伝子構造及び相同性から推定することもできる。また、得られた遺伝子のポリペプチドを製造し、キシログルカンオリゴ糖分解酵素活性を測定することにより、目的の酵素活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子であるかどうか確認することができる。
【００４１】
本発明のキシログルカンオリゴ糖分解酵素遺伝子を用いて、キシログルカンオリゴ糖分解酵素活性を有するポリペプチドを生産するには以下の方法が便宜である。まず、目的の酵素遺伝子により発現ベクターを組み換え、該遺伝子を含む組換えベクターを用いて宿主の形質転換を行い、次いで該形質転換体の培養を通常用いられる条件で行うことによって、新規なキシログルカンオリゴ糖分解酵素活性を有するポリペプチドを生産させる。この際、キシログルカンオリゴ糖分解活性を有する成熟体ポリペプチドを得るには、該ポリペプチドのＮ末端にメチオニン残基が付いていないため、該成熟体ポリペプチドに対応する塩基配列において開始コドン（atg）を付加し、さらに、必要に応じ終止コドンを付加する(taa/tag/tga)。
【００４２】
また、宿主としては微生物、動物細胞、植物細胞等を用いることができる。微生物としては、大腸菌、Bacillus属、Streptomyces属、Lactococcus属等の細菌、Saccharomyces属、Pichia属、Kluyveromyces属等の酵母、Aspergillus属、Penicillium属、Trichoderma属等の糸状菌が挙げられる.動物細胞としては、バキュロウイルスの系統が挙げられる。
このうち、真核細胞を用いる場合においては、例えば、遺伝子として、配列番号１１に示すような、シグナル配列に対応する塩基配列を有する前駆体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを用いても、スプライスィングにより成熟体ポリペプチドが生産される。
【００４３】
発現の確認や発現産物の確認は、新規なキシログルカンオリゴ糖分解酵素に対する抗体を用いて行うことが簡便であるが、酵素活性を測定することにより発現の確認を行うこともできる。
【００４４】
形質転換体の培養物から新規なキシログルカンオリゴ糖分解活性を有するポリペプチドを精製するには上述のように、遠心分離、UF濃縮、塩析、イオン交換樹脂等の各種クロマトグラフィーを適宜組み合わせて行うことができる。また、ポリペプチドの精製を有利に行うためには、例えば、使用する遺伝子として、生成するポリペプチドのＣ末端にヒスチジンタグが付加されるように、cay cay cay cay cay cay配列を設けてもよく、また、使用する発現ベクターとしてヒスチジンタグ配列および終止コドンを有するベクターを用い、該ヒスチヂンタグの５’末端上流側に当該遺伝子を挿入してもよい。
【００４５】
一方、本発明によりキシログルカンオリゴ糖分解酵素の一次構造及び遺伝子構造が明らかとなったことにより、本発明の遺伝子を用いて、ランダム変異あるいは部位特異的変異を導入し、天然のキシログルカンオリゴ糖分解酵素のアミノ酸配列中に、１個又は複数個のアミノ酸残基が欠失、付加、挿入若しくは置換の少なくとも１つがなされている遺伝子を得ることが可能である。これにより、キシログルカンオリゴ糖分解酵素活性を有するが、至適温度、安定温度、至適ｐＨ、安定ｐＨ、基質特異性等の性質が少しずつ異なったキシログルカンオリゴ糖分解酵素をコードする遺伝子を得ることが可能であり、遺伝子工学的にこれら酵素活性を有するポリペプチドを製造することが可能となる。
【００４６】
ランダム変異を導入する方法としては、例えば、 DNAを化学的に処理する方法として、亜硫酸水素ナトリウムを作用させシトシン塩基をウラシル塩基に変換するトランジション変異を起こさせる方法〔Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 79, 1408−1412（1982）〕、生化学的方法として、〔α-S〕ｄＮＴＰ存在下、二本鎖を合成する過程で塩基置換を生じさせる方法〔Gene, 64, 313-319（1988）〕、 ＰＣＲを用いる方法として、反応系にマンガンを加えてPCRを行い、ヌクレオチドの取込みの正確さを低くする方法〔Analytical Biochemistry, 224, 347-353（1995）〕等を用いることができる。
【００４７】
部位特異的変異を導入する方法としては、例えば、アンバー変異を利用する方法〔ギャップド デュプレックス（gapped duplex ）法、Nucleic Acids Research, 12(24), 9441-9456（1984）〕、制限酵素の認識部位を利用する方法〔Analytical Biochemistry, 200, 81-88（1992）、Gene, 102, 67-70（1991）〕、dut （dUTPase ）とung （ウラシルDNAグリコシラーゼ）変異を利用する方法〔クンケル（Kunkel）法、Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 82, 488-492（1985）〕、ＤＮＡポリメラーゼ及びＤＮＡリガーゼを用いたアンバー変異を利用する方法〔オリゴヌクレオチド  ダイレクティッド デュアル アンバー（Oligonucleotide-directed Dual Amber ：ODA）法、Gene, 152, 271-275（1995）、特開平7-289262号公報〕、ＤＮＡの修復系を誘導させた宿主を利用する方法（特開平8-70874号公報）、ＤＮＡ鎖交換反応を触媒するタンパク質を利用する方法（特開平8-140685号公報）、制限酵素の認識部位を付加した２種類の変異導入用プライマーを用いたＰＣＲによる方法（USP5,512,463）、不活化薬剤耐性遺伝子を有する二本鎖ＤＮＡベクターと２種類のプライマーを用いたＰＣＲによる方法〔Gene, 103, 73-77（1991）〕、アンバー変異を利用したＰＣＲによる方法〔国際公開WO98/02535号公報〕等を用いることができる。
【００４８】
また、市販されているキットを使用することにより、部位特異的変異を容易に導入することができる。市販のキットとしては、例えば、ギャップドデュプレックス法を用いたMutan（登録商標）-G（宝酒造社製）、クンケル法を用いたMutan（登録商標）-K（宝酒造社製）、ODA法を用いたMutan （登録商標）-Express Km（宝酒造社製）、変異導入用プライマーとピロコッカス フリオサス（Pyrococcus furiosus）由来DNAポリメラーゼを用いたQuikChangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit〔ストラタジーン（STRATAGENE）社製〕等を用いることができ、また、 PCR法を利用するキットとして、TaKaRa LA PCR in vitro Mutagenesis Kit（宝酒造社製）、Mutan （登録商標）-Super Express Km （宝酒造社製）等を用いることができる。
【００４９】
このように、本発明により、キシログルカンオリゴ糖分解酵素の一次構造及び遺伝子構造が提供されたことにより、キシログルカンオリゴ糖分解酵素活性を有するポリペプチドの安価で高純度な遺伝子工学的な製造が可能となる。なお、本明細書では種々の文献等を引用したが、これらはすべて参考として本明細書に組み込まれるものである。以下、本発明を実施例を用いて詳述するが本発明はこれらに限定されるものではない。以下、特に明記しない限り、本明細書において％はW/V％で示した。
【００５０】
【実施例】
【実施例１】
タマリンド種子キシログルカン１％とペプトン０．８％と硫酸マグネシウム０．０５％とリン酸一カリウム０．２％と酵母エキス０．０５％とを含む培地（ｐＨ６．０）２０ｍｌを２００ｍｌ容の三角フラスコに入れ、常法により殺菌した後、ゲオトリカム・エスピー（Geotrichum sp.）M128株（FERM P-16454）を接種し、３０℃で６日間通気培養した。その後、遠心分離により除菌し、得られた上澄液について前記活性測定法により活性を測定した結果、培養液１ｍｌ当り０．０５単位であった。
【００５１】
【実施例２】
前記実施例１と同様な組成の培養液４０００ｍｌを調製し、ゲオトリカム・エスピー（Geotrichum sp.）M128株を接種して同様に培養し、培養上清を得た。培養液中の全酵素活性は２１６単位であった。培養上清を限外濾過により濃縮・脱塩した後、陰イオン交換体ＰＢＥ９４のカラムを用いたイオン交換及び吸着クロマトグラフィーを行い、さらにトヨパールＨＷ５５Ｆカラムによるゲル濾過により精製した。精製酵素はＳＤＳ−電気泳動的に均一であり、活性の収率は培養濾液に対して９．２％であった。また、精製酵素タンパク質１ｍｇ当たりの活性は、１１．８単位であった。
【００５２】
【実施例３】
前記実施例２で得られた本精製酵素０．０８単位を、８０ミリグラムのキシログルカンオリゴ７糖を含む反応液１ミリリットルに加え、ｐＨ４．０，４５℃で３時間作用させた。反応終了後、生成物をバイオ・ゲルＰ-２〔バイオラッド（Bio-Rad）社製〕を用いたゲル濾過法により分離・精製し構造を解析した。生成物は、重合度3（オリゴ糖A）と重合度４（オリゴ糖B）の２種類のオリゴ糖からなり、オリゴ糖Aは、イソプリメベロース生成オリゴキシログルカン分解酵素により、等モルのイソプリメベロースとグルコースに分解された。また、オリゴ糖Bは、イソプリメベロース生成オリゴキシログルカン分解酵素により分解され、イソプリメベロースのみを生成した。以上の結果から、本酵素は基質としてあたえたキシログルカンオリゴ７糖の主鎖を構成するβ-グルコシド結合について、該オリゴ糖の還元末端から数えて２番目のβ-グルコシド結合を切断し、分岐４糖と分岐３糖を生成することが明らかになった。
【００５３】
【実施例４】
前記実施例２で得られた本精製酵素０．０１単位を、表１に示す各種のキシログルカンオリゴ糖5ミリグラムに１８時間作用させた後、高速液体クロマトグラフィーにより生成オリゴ糖を分析した。その結果、本酵素は、主鎖の重合度が３以上のキシログルカンオリゴ糖に作用し、そのオリゴ糖の主鎖を構成するβ-グルコシド結合について、還元末端側から２番目のβ-グルコシド結合を特異的に分解することが示された。また、このとき、還元末端に位置するグルコース残基が修飾されていると、当該の結合を分解できないこと、さらに主鎖の還元末端グルコースから数えて３番目のグルコース残基に結合している側鎖キシロース残基が重要であり、このキシロース残基が修飾されていると、本酵素は当該結合を分解できないことが示された。
【００５４】
【表１】
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【００５５】
側鎖を有するキシログルカンオリゴ糖について、その主鎖を構成する１，４-β-D-グルコシド結合を直接分解する酵素としては、イソプリメベロース生成オリゴキシログルカン分解酵素が従来より知られていた。しかし、該酵素はキシログルカンオリゴ糖を、その非還元末端よりエキソ型の分解様式でイソプリメベロース単位に分解する酵素であるのにた対して、本酵素はキシログルカンオリゴ糖の主鎖を構成するβ-グルコシド結合について、還元末端側から２番目のβ-グルコシド結合を直接分解できる点で、既知酵素とは全く異なる基質特異性と分解様式を持つ酵素であった。
【００５６】
【実施例５】
〈ゲオトリカム・エスピー（Geotrichum sp.）M128株由来の新規なキシログルカンオリゴ糖分解酵素をコードする遺伝子の単離〉
【００５７】
本明細書においては、遺伝子操作手法は特に記載しない限り成書（例えばSambrook and Russell，Molecular Cloning: A Laboratory Manual，Third edition, Cold Spring Habor Laboratory Press, 2001）に従って行った。
【００５８】
〔部分アミノ酸配列の決定〕
実施例２で得られたキシログルカンオリゴ糖分解酵素の精製標品を、プロテイン・シークエンサー〔アプライド バイオシステムズ（Applied Biosystems）社製〕に供し、配列番号１に示す２２残基のＮ末端アミノ酸配列を決定した。次に、実施例２で得られたキシログルカンオリゴ糖分解酵素の精製標品をリシルエンドペプチダーゼ（和光純薬工業社製）による分解を行った。得られた分解物を逆相液体クロマトグラフィーに供し、分離されたペプチド画分のうち三つをプロテイン・シークエンサーに供し、配列番号２，３，４に示す９〜１２残基の内部アミノ酸配列を決定した。
【００５９】
配列番号１：
Lys-Glu-His-Tyr-Glu-Phe-Lys-Asn-Val-Ala-Ile-Gly-Gly-Gly-Gly-Tyr-Ile-Thr-Gly-Ile-Val-Ala
配列番号２：
Asp-Leu-Leu-Tyr-Ala-Arg-Thr-Asp-Ile-Gly-Gly-Ala
配列番号３：
Ala-Ser-Ala-Pro-Ser-Ala-Val-Phe-Ile-Trp-Gly-Thr
配列番号４：
Val-Tyr-Gly-Arg-Val-Tyr-Leu-Gly-Thr
【００６０】
全ＲＮＡの調製  実施例1と同様に培養を行い、常法によりＲＮＡ単離キット（FastRNA Kit-RED、BIO 101社製）を用いて、添付の説明書に従って全ＲＮＡを調整し、ｍＲＮＡ調製キット〔QuickPrep mRNA Purification Kit、アマシャムファルマシア  バイオテク（Amersham Pharmacia Biotech）社製〕を用いてｍＲＮＡを精製した。得られたｍＲＮＡから、ｃＤＮＡ合成キット〔TimeSaver cDNA Synthesis kit、アマシャム  ファルマシア  バイオテク（Amersham Pharmacia Biotech）社製〕を用いて、オリゴｄＴプライマーと逆転写酵素によるｃＤＮＡ合成を行った。
【００６１】
ＰＣＲによる増幅  配列番号１のN末端領域アミノ酸配列および配列番号３の内部アミノ酸配列をもとに、配列番号５に示すセンス・プライマーと配列番号６に示すアンチセンス・プライマーの２種の混合オリゴヌクレオチドをＤＮＡ合成機〔アプライド バイオシステムズ（Applied Biosystems）社製〕により合成し、ＰＣＲプライマーとした。
【００６２】
配列番号５  センス・プライマー：
5'-GARCAYTAYGARTTYAARAAYGT -3'
配列番号６  アンチセンス・プライマー：
5'-GTNCCCCADATRAANACNGC-3'
【００６３】
これらのプライマーとゲオトリカム・エスピー（Geotrichum sp.）M128株のｃＤＮＡを鋳型として、以下の条件下、ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ  ９７００〔アプライド バイオシステムズ（Applied Biosystems）社製〕を用いてＰＣＲ反応を行なった。
【００６４】
＜ＰＣＲ反応液＞ １０×ＰＣＲ反応緩衝液 (宝酒造社製)１０μl 、ｄＮＴＰ混合液 (それぞれ２．５ｍｍｏｌ/ｌ、宝酒造社製) 8 μ、 １００μｍｏｌ/ｌセンス・プライマー５μl 、１００μｍｏｌ/ｌアンチセンス・プライマー５μl 、蒸留水７１μl、ｃＤＮＡ溶液（１００μg/ｍｌ）０．５μl 、ＥＸ−ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ (宝酒造社製)０．５μl
【００６５】
＜ＰＣＲ反応条件＞ ステージ１： 変性（９４℃、５分） １サイクル
ステージ２： 変性（９４℃、１分）アニール（４５℃、１分）伸長（７２℃、２分）３５サイクル
ステージ３： 伸長（７２℃、１０分）１サイクル
【００６６】
得られた約２ｋｂｐのＤＮＡ断片をpGEM-T Easy〔プロメガ（Promega）社製〕にクローニング後、塩基配列を確認したところ、センス・プライマーの直後とアンチセンス・プライマーの直前に、上記の部分アミノ酸配列をコードする塩基配列が見出された。また、配列番号２の内部アミノ酸配列をコードする塩基配列も見いだされた。
【００６７】
〔５′末端及び３′末端の決定〕
前記ＤＮＡの塩基配列をもとにして、５′−ＲＡＣＥ(Rapid Amplification of cDNA ends)用のアンチセンス・プライマーとして配列番号７及び配列番号８で示される２種のプライマーを作製し、ｃＤＮＡを鋳型として、５′−ＲＡＣＥ法により５′末端のＤＮＡ断片を得て、その塩基配列を決定した。また、同様に、３′−ＲＡＣＥ用のセンス・プライマーとして配列番号９及び配列番号１０で示される２種のプライマーを作製し、３′−ＲＡＣＥ法により３′末端のＤＮＡ断片を得て、その塩基配列を決定した。
【００６８】
配列番号７：
5'-CGTACAGCAGGTCCTTGGTCTTTGG-3'
配列番号８：
5'-TAATGTACCCGCCGCCGCCGAT-3'
配列番号９：
5'-GGCAAGTTCTTCGTCTCGACCGAC-3'
配列番号１０：
5'- CCAAGTCGGACGGCAAGAAGGCTA -3'
【００６９】
決定されたキシログルカンオリゴ糖分解酵素をコードするｃＤＮＡの塩基配列を配列番号１１に示す。得られたｃＤＮＡは全長２６４６塩基対からなり、１２０〜１２２番目の開始コドン（atg）から２５５６〜２５５８番目の終止コドン（taa）で終了する、配列番号１２に示す８１２アミノ酸からなる蛋白質をコードすると予想されるオープンリーディングフレームを有する。開始コドンの周辺は、翻訳開始部位に重要な−３位及び＋４位のgの要求を満たしている。このアミノ酸配列中には、Ｎ末端領域アミノ酸配列（配列番号１）および内部アミノ酸配列（配列番号２〜４）が見出された。
翻訳開始部位から、成熟体のＮ末端領域アミノ酸（配列番号１）の直前までの配列（残基１〜２３）は、シグナル配列であり、本発明の酵素が分泌蛋白であることを示唆している。
成熟体蛋白質のアミノ酸配列を配列番号１４に、該成熟体蛋白質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列を配列番号１３に示す。
【００７０】
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0003837497.tif 000004
0003837497.tif 000005
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0003837497.tif 000012
【００７１】
0003837497.tif 000013
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【００７２】
本発明はキシログルカンオリゴ糖分解活性を有する前記の配列のポリペプチドやそれをコードするヌクレオチドに特に限定されるものではなく、キシログルカンオリゴ糖分解活性を有するポリペプチドからなる更に長いポリペプチドやそれをコードするヌクレオチドを含むものである。
【００７３】
実施例６
〈新規なキシログルカンオリゴ糖分解酵素の大腸菌での発現プラスミドの構築〉成熟体のＮ末端領域アミノ酸配列およびＣ末端領域アミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列をもとに、配列番号１５に示すセンス・プライマーと配列番号１６に示すアンチセンス・プライマーを作製した。この際、Ｎ末端領域側のセンス・プライマーの５’側には、制限酵素Nde I認識配列（catatg）を、Ｃ末端領域側のアンチセンス・プライマーの５’側には制限酵素Bgl II認識配列（agatct）を付加した。制限酵素認識配列のさらに５’側に付加されている複数の塩基は、制限酵素の切断効率を増加させるためのものである。
【００７４】
配列番号１５  成熟体発現用センスプライマー：
5'-TCGCTCGCGCATATGAAGGAGCACTACGAGTTCAAGAATG-3'
配列番号１６  成熟体発現用アンチセンスプライマー
5'-TGGAAGATCTCCTTTTTCACATAGCAGTGCGTGCCCTT-3'
【００７５】
これらのプライマーとゲオトリカム・エスピー（Geotrichum sp.）M128株のｃＤＮＡを鋳型として、以下の条件下、ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ  ９７００〔アプライド バイオシステムズ（Applied Biosystems）社製〕を用いてＰＣＲ反応を行なった。
【００７６】
＜ＰＣＲ反応液＞１０×ＰＣＲ反応緩衝液 (宝酒造社製)１０μl 、ｄＮＴＰ混合液 (それぞれ２．５ｍｍｏｌ/ｌ、宝酒造社製) 8 μ、１０μｍｏｌ/ｌセンス・プライマー５μl 、１０μｍｏｌ/ｌアンチセンス・プライマー５μl 、蒸留水７１μl、ｃＤＮＡ溶液（１００μg/ｍｌ）０．５μl 、ＥＸ−Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ (宝酒造社製)０．５μl
【００７７】
＜ＰＣＲ反応条件＞ ステージ１： 変性（９６℃、１分） １サイクル
ステージ２： 変性（９６℃、１０秒）アニール及び伸長（６８℃、４分）30サイクル
【００７８】
得られた約２．４ｋｂｐのＤＮＡ断片を制限酵素Nde I及びBgl IIで切断し、制限酵素Nde I及びBgl IIで切断したpET29a(+)〔ノバジェン（Novagen）社製〕にクローニングした。塩基配列が正しいことを確認した後、大腸菌BL21-CodonPlus (DE3)-RP〔ストラタジーン（STRATAGENE）社製〕に導入した。得られた形質転換体を３０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むLB培地で３７℃で振盪培養した。培地にイソプロピル-β-Ｄ-チオガラクトピラノシドを添加して生産誘導すると、目的の遺伝子産物は、蛋白質封入体として菌体内に蓄積した。
【００７９】
【実施例７】
〈タンパク質封入体の単離・可溶化・巻き戻し〉
上述のようにして培養した菌体を集菌後、蛋白質抽出キット〔バグバスター（BugBuster）、ノバジェン（Novagen）社製〕を用いて細胞の破砕および蛋白質封入体の精製を行った。精製された蛋白質封入体を、８Ｍ尿素−１ｍＭジチオトレイトール−５０ｍＭトリス・塩酸−１ｍＭエチレンジアミン四酢酸溶液（ｐＨ８．０）に、タンパク質濃度が約１ｍｇ／ｍｌになるよう溶解した。
【００８０】
可溶化上清を２５ｍＭイミダゾール・塩酸（ｐＨ７．４）に透析し、尿素、ジチオトレイトールを除去することによって巻き戻しを行った。
【００８１】
得られたポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号１８に示し、また、該アミノ酸配列に対応する塩基配列を配列番号１７に示す。該ポリペプチドは、配列番号１４に記載の成熟体ポリペプチドのアミノ酸配列のＣ末端（７８９番目のＬｙｓ）に、発現ベクターpET29a(+)由来の３０アミノ酸残基及び６個のヒスチジンからなるヒスチジンタグが付加されているものである。該ポリペプチドのキシログルカンオリゴ糖分解活性について、表１に示した各種キシログルカンオリゴ糖を基質として検討した結果、ゲオトリカム・エスピー（Geotrichum sp.）M128株から得られた酵素とまったく同様な結果を得た。すなわち、この組み換え酵素は、キシログルカンオリゴ糖の主鎖を構成するβ-グルコシド結合について、還元末端側から２番目のβ-グルコシド結合を特異的に分解する酵素活性を有していた。
【００８２】
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【００８３】
これらの結果より、本発明で得られた新規なキシログルカンオリゴ糖分解酵素遺伝子を用いて、組換え酵素を大腸菌を用いて製造出来ることが確認された。
【００８４】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明は、キシログルカンオリゴ糖の主鎖を構成するβ-グルコシド結合について、還元末端側から２番目のβ-グルコシド結合を特異的に分解する新規な酵素を提供するとともにそのアミノ酸配列、その遺伝子の構造を明らかにしたものであり、本発明によれば、植物細胞の伸長や形態分化に重要な役割を担っているものと考えられているキシログルカンの構造や機能を解明するための新しい分析手段が提供できる。
【００８５】
【配列表】
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