(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料セルと参照セルの屈折率差の変化を検知する示差屈折率検出器において、試料セルからの溶出液を希釈し、参照溶液として利用するために試料セルと参照セルの間に少なくとも試料セル容積の１０倍以上の容積を有する攪拌チャンバーを挿入した液体クロマトグラフ用示差屈折率検出器。
【請求項２】
試料セルと参照セル内の圧力差を同一にするための分岐流路、空気ダンパーを有する請求項１の液体クロマトグラフ用示差屈折率検出器。
【請求項３】
攪拌チャンバー内の温度を溶媒だめまたはカラム恒温槽の温度と一致させるための温度調節機構を有する請求項１の液体クロマトグラフ用示差屈折率検出器。
【請求項４】
攪拌チャンバー内溶液容積が試料セル容積の１００倍以上であることを特徴とする請求項１の液体クロマトグラフ用示差屈折率検出器。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、液体クロマトグラフ用示差屈折率検出器に関し、さらに詳細には単一送液ポンプで試料セルと参照セルに溶媒を送り成分を検出するための液体クロマトグラフ用示差屈折率検出器に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
試料セルと参照セルを有する液体クロマトグラフ用示差屈折率検出器では、試料セルと参照セルに同一溶媒を流すことにより安定したベースラインが得られ、安定した測定を行うことができる。しかし、試料セルと参照セルに同一の溶媒を流すには、それぞれに送液ポンプが必要であるため、クロマトグラフ装置が高価になるばかりでなく、トラブル発生頻度の高いチェック弁等の可動部品数が増えるため、頻繁なメンテナンスが必要になる。
【０００３】
このため、１台の送液ポンプで送液した溶媒を試料セルに至る前で分岐するとともに、参照セルの前の配管に溶媒を満たしておき、分岐された溶媒（測定されるべき成分の一部を含む）を該配管に送ることで満たしておいた溶媒を参照セルに押し流す方式提案されている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、分岐の割合は分岐配管の抵抗に依存しているため、溶媒粘度が変化すれば分流比が変化することになる。特にサイズ排除クロマトグラフィーでは、測定される高分子物質はその重合度によって粘度が異なるため、単に溶媒のみの場合と該成分を含んだ溶媒、さらには含まれている種々成分の重合度によって分流比が微妙に変化する。液体クロマトグラフィーの手法では、クロマトグラムピークの溶出時間により成分を同定し、該ピークの面積や高さに基づき各成分の定量を行うため、分流比変化に起因する流量変化は、測定精度に影響を与える。
【０００５】
例えばサイズ排除クロマトグラフィーでは、カラムからの流量（溶出容量）が１％変化すると、測定結果（前記のようにして同定される、各種成分の平均分子量）に２０％以上の誤差を生むという報告もある（D.D.Bly,H.J.Stoklosa,J.J.kirkland and W.W.Yau,Anal.Chem.47(11),181 0(1975)）。
【０００６】
さらに、溶媒の分岐により、微量とはいえ成分の１部を含む溶媒が参照セル側に流れるため、測定に供した試料のすべてが検出に利用されないという課題もある。
【０００７】
この課題を解決するために、１台の送液ポンプで送液した溶媒を試料セルの後で分岐し、参照セルの前の配管に溶媒で満たしておき、試料セルを通過後の溶媒を分岐させ、該配管内の溶媒を押し流すことも考えられるが、十分に攪拌、希釈されない成分が分岐流路から参照セルまでの配管容量と分流比に応じて参照セルに送り込まれることになり、長時間測定を行うとクロマトグラムのベースラインにドリフトまたは負ピークを生じることになる。
【０００８】
従って、前記２つの方式では、一定時間毎に分岐配管以降の参照セル側の流路の溶媒を置換する必要があるため、溶媒置換後のベ−スラインに乱れを生じ、多数の試料を測定する場合、測定以外に安定化のための時間を要していた。
【０００９】
かかる課題を解決するために、単に試料セルと参照セルを直列に接続することも試みられているが、試料セル側に参照セル及び接続配管、更には出口配管等による背圧がかかり、ベースラインを安定化することは困難である。また、試料セルと参照セルとでは検出信号が逆転するため、通常試料セルで検知されるピークと、両セルを接続する配管容量分遅れて参照セルで検知される負ピークの２本の相反するピークが得られるため、測定結果の解析作業が複雑になる。このため、溶出に要する時間が、溶媒が試料セル容量、両セルの接続配管容量そして参照セル容量を通過するのに必要な時間以上である成分では、測定に適するピーク形状として検出することができない。
【００１０】
本発明は、かかる従来技術の課題に鑑み、単一送液ポンプで試料セル、参照セルに溶媒を送液することを可能とし、注入した試料をロスすることなく検知でき、さらに安定した連続測定が行える液体クロマトグラフ用示差屈折率検出器を提供することにある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記のごとき従来課題を解決すべく検討を行った結果、本発明を完成するに至った。即ち本発明は、試料セルからの溶出液を希釈し、参照溶液として利用するために試料セルと参照セルの間に少なくとも試料セル容積の１０倍以上の容積を有する攪拌チャンバーを挿入した液体クロマトグラフ用示差屈折率検出器である。
【００１２】
本発明の示差屈折率検出器では、試料セルの後に設けられた分岐流路の一方は廃液槽に接続されているため、試料セル内の圧力は、接続配管による背圧と廃液槽内の大気圧で決まり、ほぼ一定に保たれる。また、該分岐流路の他方は参照セル側へ流れる試料成分を減ずるための希釈効果も担っている。例えば、廃液槽側と参照セル側とで９９：１の分岐を行えば、参照セル側へは試料セルで検知した成分の１／１００の濃度しか流れないことになる。
【００１３】
分岐流路で参照セル側に分岐された溶媒中の成分は、適当容積を有する攪拌チャンバーに送られ、該攪拌チャンバーで更に希釈及び均一化される。攪拌チャンバーは、瞬時にしかも均一に攪拌できることが好ましいため、動的に撹拌（希釈）を行うダイナミックミキサーが特に好ましい。
【００１４】
ここで、攪拌チャンバーより参照セルに送られる溶媒中の成分濃度について考えると、瞬時にチャンバー内成分濃度が均一に攪拌される場合、参照セルに送られる成分濃度と攪拌チャンバー内の濃度は等しくなり、その濃度変化は以下の式により計算できる。
【００１５】
【数１】
0003785469.tif 000002
【００１６】
ここで、ｘ（ｔ）は時間ｔにおける攪拌チャンバー内の成分濃度でありかつ攪拌チャンバーから流出する成分濃度、ｘ０は攪拌チャンバー内の初期成分濃度  （従って測定開始時は０となる）である。Ｖ０は攪拌チャンバーの容積、ｖは流入溶媒量、ａは流入溶媒中の成分濃度を示し、「exp 」はエクスポネンシャルである。例えば、攪拌チャンバーの容積を１ｍｌとし、水で満たし、送液ポンプから有機溶媒を１ｍｌ／分で流し、廃液側と参照セル側の分岐比を９９：１つまり攪拌チャンバーには毎分１０μｌの有機溶媒が流れ込んでくると仮定した場合、６０分後の攪拌チャンバー内の有機溶媒濃度は、以下のように計算できる。
【００１７】
【数２】
0003785469.tif 000003
【００１８】
即ち、６０分で攪拌チャンバー内の溶媒（水）が45.12 ％（451.2 μｌ）置換されることになる。
【００１９】
同様の条件で、１％の試料濃度を５０μｌ、その成分が１０分の広がりをもってカラムから溶出すると仮定し、１０分毎に６回注入した後、つまり６０分後の攪拌チャンバー内の成分濃度を計算する。まず、カラムから溶出した時点での成分濃度は、１％、５０μｌの成分が１０分、つまり１０ｍｌに広がるので、０．０５ｍｇ／ｍｌと計算できる。さらにその後１／１００に分岐されるので０．５μｇ／ｍｌとなる。上記計算式により攪拌チャンバーの置換率は４５．１２％なので０．２２５６μｇ／ｍｌと計算できる。つまり６０分後の攪拌チャンバー内の成分濃度は、０．００００２２５６％と計算される。これをＧＰＣで多用されている標準ポリスチレンの屈折率濃度係数ｄｎ／ｄｃ＝０．１９５ｍｌ／ｇより、ＲＩ信号に換算すると４．４×１０-8ＲＩＵとなる。実際のクロマトグラフィーでは成分が含まれている領域と含まれていない領域があるため、ベースラインへの影響はこの計算値よりもさらに小さくなる。ベースラインへの影響がこの程度に抑えられるため十分参照溶液としても使用できることがわかる。
【００２０】
なお、上記計算は分流比を９９：１、攪拌チャンバー容積を１ｍｌつまり試料セル（通常は１０μｌ）の１００倍として計算したが、攪拌チャンバー容積を１００μｌつまり試料セルの１０倍とするとベースライン信号への影響は４．４×１０-7ＲＩＵと計算できる。この様に、攪拌チャンバーの溶液容積を試料セルの１０倍以上とすることが好ましく、特に１００倍以上とすることが好ましい。
【００２１】
攪拌チャンバーからの溶媒は参照セルに送られた後、廃液槽に送られるため、参照セル内の圧力は廃液槽への接続配管による背圧と廃液槽内の大気圧でほぼ一定に保たれる。なお、試料セルと廃液槽、参照セルと廃液槽への接続に同一サイズ（管径）の配管を用いれば、試料セルと参照セルの背圧を等しくするすることができる。
【００２２】
分岐流路における分流比及び攪拌チャンバーの溶液容積を変えることにより、希釈及び均一化の度合いを自由にコントロールすることができる。
【００２３】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を、図面に示した実施の形態に基づき詳細に説明する。
【００２４】
図１は、本発明の液体クロマトグラフ用示差屈折率検出器を有する液体クロマトグラフ装置の概略図を示すものである。溶媒だめ１中の溶媒２は配管３を経て送液ポンプ４に吸引され、配管５、試料注入口（六方バルブ）６、配管７を経て分離カラム８に供される。カラム８からの溶出液は配管９を経て示差屈折率検出器の試料セル１０に入り、配管１１を経て流路分岐部１２で２流路に分岐される。  流路分岐部１２で分岐された溶媒の一方は、配管１３、電磁弁１４、配管１５を経て廃液槽２３に廃液される。他方の流路に分岐された溶媒は、配管１６、ニードルバルブ１７、配管１８、攪拌チャンバー１９、配管２０を経て示差屈折率検出器の参照セル２１に入る。電磁弁１４は測定時には開放の状態になっており、流路分岐部１２での分岐の割合はニードルバルブ１７の絞り具合に依存する。参照セル２１からの溶媒は配管２２を経て廃液槽２３に廃液される。
【００２５】
試料注入口６から注入された試料は分離カラム８で各成分に分離され、示差屈折率検出器の試料セル１０に導入され検出される。試料セル１０から出た成分は配管１１を経て流路分岐部１２で一定の割合に分岐される。例えば、９９：１の割合で分岐された場合、一方の流路での成分濃度は試料セルで検出された時の１／１００に希釈されることになる。この希釈された成分は攪拌チャンバー１９にてさらに希釈、均一化され、配管２０を経て、参照セル２１に送られる。
【００２６】
この結果、参照セル２１を流れる成分濃度は流路分岐部での希釈と攪拌チャンバーでの希釈により、通常測定される試料濃度における参照溶媒として使用するに際して悪影響を与えない濃度にすることができる。また、測定対象成分濃度に較べて非測定対象成分濃度が高い場合には、当然参照セル側で非対象成分に起因する濃度勾配が発生し、クロマトグラム上においてドリフトとして観測される恐れがあるが、ニードルバルブ１７を絞り込み、流路分岐部１２から攪拌チャンバー側に分流する溶媒量を減ずることによりドリフトを低減させることが可能となる。
【００２７】
電磁バルブ１４は、溶媒交換用に設けたもので、電磁バルブ１４を閉じ、ニードルバルブ１７を開放することにより、送液ポンプ４からの溶媒すべてが攪拌チャンバー１９、参照セル２１に流れ込むため、溶媒交換を容易に行うことができる。
【００２８】
図２及び図３は、ＴＨＦ溶媒を１．０ml／分の流速で流した時の示差屈折率検出器の出力を記録したものであり、図２は試料セルと参照セルを直接接続した場合の出録記録を、図３は本発明の示差屈折率検出器による出力記録である。図２及び図３から、本発明の流路により安定したベースラインが得られていることがわかる。
【００２９】
図４及び５は、液体クロマトグラフ装置に示差屈折率検出器を組み込み測定した標準ポリスチレンのクロマトグラムを示すものであり、図４は試料セルと参照セルを直接接続した場合のクロマトグラムを、図５は本発明の示差屈折率検出器によるクロマトグラムである。図４及び５から、試料セルと参照セルを直接接続しただけでは測定に適したクロマトグラムが得られないことがわかる。
【００３０】
本発明において、０．００１％濃度の標準ポリスチレン５０μｌを繰り返し注入した際の測定結果は重量平均分子量の再現性でＣＶ値で０．５％前後、ベースラインドリフトで５×１０-7ＲＩＵ／ｈ程度が得られ、２台の送液ポンプを用いた構成と同等の測定安定性が得られた。
【００３１】
【発明の効果】
本発明によれば、試料セルでは測定に供した試料のすべてがカラムで分離された分離能を保ちながら通過するが、参照セルでは検出に影響を及ぼさない、同一液性の溶媒により希釈された試料成分が通過することになる。従来方法のように別のカラムもしくは分岐を通過した液性を参照セルに導く場合、カラムまたは分岐等の問題で同一の液性にならないことが経験的に認識されているが、本発明では、この問題が回避できるばかりでなく、試料セルと参照セルを直列に接続した構成でも、２台のポンプで試料セル、参照セルにそれぞれ溶媒を送液するのと同等の安定性が得られるため、安価な装置構成が可能となる。また、参照セルに別途溶媒を送液する必要がないので溶媒消費量が抑えられる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明による液体クロマトグラフ用示差屈折率検出器を示す図である
。
【図２】図２は、試料セルと参照セルを直列に接続しただけの時のベースライン信号の様子を示す図である。
【図３】図３は、図１に示した示差屈折率検出器でのベースライン信号の様子を示す図である。
【図４】図４は、試料セルと参照セルを直列に接続して測定した標準ポリスチレンのクロマトグラムを示す図である。
【図５】図５は、図１に示した示差屈折率検出器により測定した標準ポリスチレンのクロマトグラムを示す図である。
【符号の説明】
１溶媒だめ
２溶媒
３配管
４送液ポンプ
５配管
６試料注入口
７配管
８分離カラム
９配管
１０試料セル
１１配管
１２流路分岐部
１３配管
１４電磁弁
１５配管
１６配管
１７ニードルバルブ
１８配管
１９攪拌チャンバー
２０配管
２１参照セル
２２配管
２３廃液槽
【図１】
0003785469.tif 000004
【図２】
0003785469.tif 000005
【図３】
0003785469.tif 000006
【図４】
0003785469.tif 000007
【図５】
0003785469.tif 000008