(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性およびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する組み換えポリペプチドの製造方法であって、以下の工程：
ａ．成熟かつネイティブなモロニーのネズミ白血病ウイルス（Moloney Murine Leukemi a Virus）（ＭＭＬＶ）逆転写酵素と実質的に同じサイズであるＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性およびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードしているＭＭＬＶ由来の核酸配列、少なくとも１つの選択可能マーカー遺伝子、プロモーター配列、およびＲＮａｓｅ活性の発現を欠くエシェリシア・コリ（Escherichia coli）１２００株宿主細胞中でプラスミドを自律的に複製しうる複製開始点からなるプラスミドを構築し（ここに核酸配列はアミノ末端コドンの次の位置１におけるグリシンをコードするコドンならびに該イー・コリ（E.coli）宿主細胞における遺伝子発現にとり好ましい縮重コドンを含み、該縮重コドンは、成熟かつネイティブなＭＭＬＶ逆転写酵素の位置２におけるアミノ酸をコードするＣＴＧ、位置３におけるアミノ酸をコードするＡＡＣ、および位置４におけるアミノ酸をコードするＡＴＣであり）、
ｂ．ＲＮＡｓｅ活性の発現を欠く該イー・コリ宿主細胞中にプラスミドを挿入し、
ｃ．細胞分裂およびポリペプチド遺伝子の発現を促進しうる条件下の液体培地中で該プラスミドを含有している該イー・コリ宿主細胞を増殖させ、
ｄ．該イー・コリ宿主細胞を溶解して細胞溶解物を得て、次いで、
ｅ．該ポリペプチドを細胞溶解物から精製する
からなる方法。
【請求項２】
ポリペプチドが１本の共有結合アミノ酸鎖からなる請求項１の方法。
【請求項３】
該ポリペプチドがアミノ末端にメチオニン残基を有する請求項１の方法。
【請求項４】
該ポリペプチドのアミノ末端における５個のアミノ酸残基をコードしている核酸が、イー・コリのｔＲＮＡが優先的に結合するコドンからなる請求項１の方法。
【請求項５】
該ポリペプチドのアミノ末端における５個のアミノ酸残基をコードしている核酸が配列５’−ＡＴＧＧＧＴＣＴＧＡＡＣＡＴＣ−３’（配列番号：１０）からなる請求項１の方法。
【請求項６】
該プラスミドがさらに、該ポリペプチド遺伝子の開始コドンから７ないし９ヌクレオチド上流のリボゾーム結合部位からなる請求項１の方法。
【請求項７】
該リボゾーム結合部位が、イー・コリのｒＲＮＡの核酸配列に相補的な核酸配列からなる請求項６の方法。
【請求項８】
該リボゾーム結合部位が配列５’−ＴＡＡＧＧＡＧＧＴ−３’からなる請求項７の方法。
【請求項９】
リボゾーム結合部位が、該ポリペプチドの遺伝子をコードしている核酸配列の開始コドンから９ヌクレオチド上流にある請求項６または７の方法。
【請求項１０】
該リボゾーム結合部位と該開始コドンとの間にある約７個ないし約９個の塩素のスペーサー核酸配列が、開始コドンから３ヌクレオチド上流の位置にアデニン残基を有する配列からなる請求項６または８の方法。
【請求項１１】
リボゾーム結合部位およびスペーサー核酸配列が一緒になって、５’−ＲＲＴＴＴＲＲ−３’からなる核酸配列を有し、Ｒがグアニンまたはアデニンであり、該スペーサー核酸配列がリボゾーム結合部位と重複するものである請求項１０の方法。
【請求項１２】
スペーサー核酸配列が５’−ＴＴＡＡＡＡＡＣＣ−３’からなる請求項１０または１１の方法。
【請求項１３】
選択可能マーカー遺伝子が該宿主細胞に少なくとも１つの抗生物質耐性を付与するものである請求項１の方法。
【請求項１４】
該抗生物質がテトラサイクリンを含むものである請求項１３の方法。
【請求項１５】
ポリペプチドがさらに、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド中のＲＮＡ鎖を分解できるのである請求項１の方法。
【請求項１６】
請求項１、１０または１１の方法により製造されるポリペプチドからなる組成物。
【請求項１７】
ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性およびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する組み換えポリペプチドの精製方法であって、
ａ．成熟かつネイティブなモロニーのネズミ白血病ウイルス（Moloney Murine Leukemi a Virus）（ＭＭＬＶ）逆転写酵素と実質的に同じサイズであるＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性およびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する組み換えポリペプチドをコードしているＭＭＬＶ由来の核酸配列からなる組み換えベクターを含有しているＲＮａｓｅ欠損イー・コリ（E.coli）１２００株宿主細胞を得て（ここに核酸配列はアミノ末端コドンの次の位置１におけるグリシンをコードするコドンならびに該イー・コリ（E.coli）宿主細胞における遺伝子発現にとり好ましい縮重コドンを含み、該縮重コドンは、成熟かつネイティブなＭＭＬＶ逆転写酵素の位置２におけるアミノ酸をコードするＣＴＧ、位置３におけるアミノ酸をコードするＡＡＣ、および位置４におけるアミノ酸をコードするＡＴＣであり）、
ｂ．組み換えポリペプチドを含んでいる複数の該宿主細胞を溶解し、そのことにより細胞溶解物を得て、
ｃ．高くても約０．０５Ｍ  ＮａＣｌに相当する伝導率を有する溶液の存在下のカチオン交換媒体に細胞溶解物を適用し、そのことにより該組み換えポリペプチドをカチオン交換媒体に結合させ、
ｄ．約０．２Ｍ  ＮａＣｌに相当する伝導率から始まり約０．７Ｍ  ＮａＣｌに対応する伝導率で終了する塩グラジエントに該組み換えポリペプチドを接触させることにより該結合ポリペプチドをカチオン交換媒体から溶離させ、少なくとも１つのフラクション中の該組み換えポリペプチドを回収し、
ｅ．回収した該組み換えポリペプチドを含有するフラクションをゲル濾過カラムに適用し、少なくとも１つのフラクション中の該組み換えポリペプチドを再度回収する
ことからなる方法。
【請求項１８】
カチオン交換媒体がホスホセルロース誘導体からなる請求項１７の方法。
【請求項１９】
ポリペプチドが約７００００ダルトンの見かけの分子量を有する請求項１７の方法。
【請求項２０】
さらなるヌクレアーゼ活性を本質的に含まない媒体中の、請求項１７の方法に従って精製された、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性およびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性およびＲＮＡｓｅ  Ｈ活性を有するポリペプチドからなる組成物。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
レトロウイルスは、遺伝物質が１本鎖ＲＮＡからなるウイルスの群である。吸着および宿主細胞中へのレトロウイルスＲＮＡの侵入後、ウイルスＲＮＡは相補的ＤＮＡ鎖の合成にための鋳型として役立つ。次いで、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素の作用の間にＤＮＡは２本鎖となる。ウイルスＲＮＡ鋳型からの相補的ＤＮＡの合成に関与しているＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性は、通常には、逆転写酵素と呼ばれる。
多くのレトロウイルスが種々の癌および他の疾病の原因であるので、レトロウイルスは特に興味深い。レトロウイルスであるヒト・免疫不全ウイルスは、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の原因である。さらに、ほとんどすべてのＲＮＡ鋳型から相補的ＤＮＡを作る能力があるため、逆転写酵素自身が、分子生物学において重要な試薬となっている。よって、通常には、逆転写酵素を用いてハイブリダイゼーションプローブ用核酸を作成し、また引き続き行うクローニングおよび発現のために１本鎖ＲＮＡを２本鎖ＤＮＡに変換する。
近年、逆転写酵素が転写に基づく増幅系の成分として用いられている。これらの系はＲＮＡおよびＤＮＡ標的配列を百万兆倍まで増幅する。例えば、バーグ（Burg）ら、ＰＣＴ特許出願ＷＯ８９／０１０５０（１９８８年）；ギンゲラス（Gingeras）ら、ＰＣＴ特許出願ＷＯ８８／１０３１５（１９８８年）；ダベイ（Davey）およびマレク（Malek）、欧州特許出願ＥＰＯ  ０３２９８２２（１９８８年）；ギンゲラス（Gingeras）ら、欧州特許出願ＥＰＯ  ０３７３９６０（１９８９年）；マレク（Malek）およびダベイ（Davey）、ＰＣＴ特許出願ＷＯ９１／０２８１４（１９８９年）；カシアン（Kacian）およびフルツ（Fultz）、欧州特許出願ＥＰＯ  ０４０８２９５Ａ２（１９９０年）参照。参照によりこれらすべての文献を本開示中に記載されているものと見なす。転写に基づく増幅方法のいくつかは、これらの方法による増幅反応が等温的であるので、例外的に便利である。よって、これらの系は、診断試験を行う日常的な臨床研究室に特に適している。感染症を引き起こす病原体および癌または遺伝病に関連した遺伝子配列の検出は、かかる試験のうち最も重要なものである。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いてＲＮＡ標的を増幅する場合に、逆転写酵素はいくつかのプロトコールにおいて最初の工程としても使用されている。マレク（Malek）ら、米国特許第５，１３０，２３８号（１９９２年）；およびモチャーラ（Mocharla）ら、ジーン（Gene）第９９巻：２７１〜２７５頁（１９９０年）参照。かかる「ＲＴ−ＰＣＲ」法において、逆転写酵素を用いてＲＮＡ標的に対する最初の相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）コピーを作成し、次いで、これをＤＮＡ複製の連続ラウンドにより増幅する。
レトロウイルスの逆転写酵素は３種の酵素活性を有する。ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性、およびＲＮＡｓｅ  Ｈ活性である。バーマ（Verma）、ザ・リバース・トランスクリプターゼ（The Reverse Transcriptase）、バイオキミ・バイオフィジ・アクタ（Biochim.Biophys.Acta.）第４７３巻：１〜３８頁（１９７７年）参照。後者の活性は、ＲＮＡ：ＤＮＡ２本鎖に含まれるＲＮＡを特異的に分解する。ＲＮＡｓｅ  ＨによるＲＮＡ：ＤＮＡ中間体のＲＮＡ鎖の分解は、いくつかの転写の基づく増幅系において重要な要素であり、増幅を妨害する混入ヌクレアーゼによる所望でない分解とは区別すべきである。
転写に基づく増幅系の欠点は、痕跡量のヌクレアーゼに対する感受性である。多くの重要な疾病が非常に少量の標的核酸分子を含有する試料を生じうるので、少量の標的核酸の検出は、しばしば、正確で特に合った診断にとり重要である。実際のところ、多くの標識分子が低レベルである場合、標的増幅方法の価値は最も重要である。標的核酸の入力レベルが低い場合、ＲＮＡ標的の所望でない分解またはＲＮＡもしくはＤＮＡ反応中間体により増幅が失敗し、その結果診断を誤る危険性がある。ＲＮＡ標的の損失により増幅が失敗する可能性があるので、リボヌクレアーゼの混入もＲＴ−ＰＣＲにおける問題である。
リボヌクレアーゼは比較的遍在性であり、特に、レトロウイルス標品を包含する種々の生物学的材料中および組み換え蛋白の発現に通常に使用される細胞中に高濃度で見いだされる。リボヌクレアーゼは、頻繁に、種々の源由来の逆転写酵素標品に混入しており、ｃＤＮＡ合成、プローブ調製、および標的の増幅以外の他の使用を妨害することが報告されている。しばしば、この混入の悪影響を最小限にするためにＲＮＡｓｅ阻害剤が反応に用いられる。例えば、マニアティス（Maniatis）ら、モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（Molecular Cloning:A Laboratory Manual）８．１１〜８．１３（第２版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Cold Spring Harbor Laboratory Press）、１９８９年）参照、参照により本明細書に記載されているものと見なす。
しかしながら、ＲＮＡｓｅを阻害または不活性化するために通常用いられる界面活性剤、カオトロープ（chaotrope）、有機物、金属、プロテアーゼおよび金属を包含する多くの物質は、それらは増幅に使用する酵素も同様に阻害するであろうから、標的増幅系における使用に不適当である。ヒト・胎盤ＲＮＡｓｅ阻害剤（ブラックバーン（Blackburn）ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J.Biol.Chem.）第２５２巻：５９０４頁（１９７７年））またはラット・肝阻害剤（グリブノー（Gribnau）ら、アーチ・バイオケミ・バイオフィジ（Arch.Biochem.Biophys.）第１３０巻：４８〜５２頁（１９６９年））のごときＲＮＡｓｅ阻害蛋白は不安定であるかもしれず、高価であり、阻害剤により阻害されない核酸およびＲＮＡｓｅのごときさらなる妨害性物質を生じる可能性がある。
ヌクレアーゼのほかに、痕跡量の他の酵素、核酸、およびある種のバッファー塩類も増幅反応を妨害しうる。増幅反応の性質上、これらの物質は逆転写酵素の多くの用途にとり単に望ましくないばかりでなく、酵素標品がそれらを出来る限り少量含んでいることが重要である。種々の源からの逆転写酵素の単離および精製が報告されている。酵素をウイルス粒子、細胞、または組織から直接単離する場合、広く行われている診断試験における使用には経費がかかりすぎる。例えば、カシアン（Kacian）ら、バイオキミ・バイオフィジ・アクタ（Biochim.Biophys.Acta.）第４６巻：３６５〜３８３頁（１０７１年）；ヤング（Yang）ら、バイオケミ・バイオフィジ・リサ・コミュ（Biochem.Biophys.Res.Comm.）第４７巻：５０５〜５１１頁（１９７５年）；リウ（Liu）ら、アーチ・ウイロロ（Arch.Virol.）第５５巻：１８７〜２００頁（１９７７年）；カトー（Kato）ら、ジャーナル・ウイロロ・メソッズ（J.Virol.Methods）第９巻：３２５〜３３９頁（１９８４年）；リューク（Luke）ら、バイオケミストリー（Biochemistry）第２９巻、１７６４〜１７６９頁（１９９０年）；ル・グリス（Le Grice）ら、ジャーナル・オブ・ウイロロジー（J.Virol.）第６５巻：７００４〜７００７頁（１９９１年）参照。さらに、これらの方法は、標的増幅反応への逆転写酵素の使用を妨害する重大な阻害剤または混入物質である物質の除去を確実に行うものではない。種々の目的への逆転写酵素の使用におけるもう１つの重要な事柄は、酵素に関連したＲＮＡｓｅ  Ｈ活性である。ＲＮＡｓｅ  Ｈ活性の量およびＲＮＡ依存性逆転写酵素活性ならびにＤＮＡ依存性逆転写活性と共働してＲＮＡｓｅ  Ｈが作用する様式は、転写に基づく増幅系を包含する種々の目的への酵素の有用性に影響する重要な特徴である。高すぎるあるいは低すぎる活性、都合の悪い種類の活性（非特異的ＲＮＡｓｅのごとき）、またはＤＮＡ合成とほとんど共働しない活性はすべて、個々の適用例の質を低下させる可能性がある。合成活性および分解活性の適切なバランスが維持されなければならない。このことは、使用する個々の逆転写酵素の機能であるばかりでなく、ＲＮＡおよび／またはＤＮＡ分解活性を除去するための精製プロトコールの能力にも依存する。
細菌宿主における逆転写酵素のクローニングおよび発現はずでに報告されている。トリの骨髄芽球症ウイルス由来の逆転写酵素（ＡＭＶ−ＲＴ）をクローニングし発現する試みは、有意な量の精製酵素の生産には至らなかった。このことは、明らかに、二量体形態を形成し、特異的な翻訳後修飾を受けて十分に活性な酵素を生じる２つのポリペプチド鎖（α鎖およびβ鎖）からＡＭＶ−ＲＴが成っているという事実による。遺伝子がイー・コリ（E.coli）中で発現された場合にはこれらの同じ修飾は起こらない。
トリ・ウイルスＲＴとは対照的に、哺乳動物ウイルス由来の多くの逆転写酵素は１本のポリペプチド鎖からなっている。これらの酵素をクローン化し発現する努力は、より成功している。詳細には、ゴフ（Goff）ら、米国特許第４，９４３，５３１号（１９９０年）およびコテビッツ（Kotewicz）ら、米国特許第５，０１７，４９２号には、モロニーのネズミ白血病ウイルス（Molony Murine Leukemia Virus）由来でイー・コリ中で発現された逆転写酵素（ＭＭＬＶ−ＲＴ）の精製方法が記載されており、該方法は、大部分の市販逆転写酵素標品についての基礎を作った。
多くの市販逆転写酵素標品は、ヌクレアーゼの混入のために、標的の増幅における使用および他の目的には不適であることがわかっている。上記サムブルック（すでに参照により本明細書に記載されているものとしている）；リスコフ（Ryskov）ら、モレ・バイオロ・リポ（Mol.Biol.Rep.）第８巻：２１３〜２１６頁（１９８２年）参照。市販ＭＭＬＶ−ＲＴ標品に関する他の問題は、ＤＮＡ合成と精製酵素のＲＮＡｓｅ  Ｈ活性との間の変化した共働作用、プライマー部位に結合して合成を開始する能力または堅固な２次構造領域を読む能力の低下に関連しており、あるいはまた、ＤＮＡｓｅならびに他の蛋白の混入によるものであるかも知れない。アグロノフスキー，エイ・エイ（Agronovsky,A.A.）、アナリティカル・バイオケミストリー（Anal.Biochem.）第２０３巻：１６３〜１６５頁（１９９２年）参照。さらに、すでに利用可能な精製方法を用いて調製された市販標品は有意なロット間のばらつきを示す。
そのうえ、一部には、用いる精製が長時間の労力を要すること、スケールアップのために使用する試薬および装置が高価なこと、および酵素収率が低いことにより、かかる酵素の価格は標的増幅系の商業的利用が広がることを妨げている。
それゆえ、ＤＮＡ合成およびＲＮＡｓｅ  Ｈの消化的活性の正しいバランスを有し、そのことにより核酸増幅方法における使用に特に適している、改善された形態の逆転写酵素を提供することが本発明の１の目的である。
転写に基づく増幅反応を妨害する望ましくないＲＮＡｓｅのごとき混入物質を低レベルで含有する逆転写酵素の便利な源を、これらの特性を有するＭＭＬＶ−ＲＴ酵素をコードしている遺伝子をイー・コリ宿主中でクローニングし発現させることにより提供することが、本発明のもう１つの目的である。
イー・コリのリボヌクレアーゼ欠損株においてＭＭＬＶ−ＲＴ遺伝子をクローン化し発現させることにより、精製前後に該酵素に付随しているＲＮＡｓｅ活性を低下させることが本発明のさらにもう１つの目的である。
該酵素の単離のための単純な精製スキームを開発することが本発明のもう１つの目的である。
高レベルの純度のＲＴを低コストで得るための精製方法を提供することが本発明のさらなる目的である。
発明の概要
本発明は、クローン化されたバージョンのＭＭＬＶ−ＲＴに関する遺伝子を含む発現ベクターまたはプラスミドに関し、該発現ベクターまたはプラスミドは、イー・コリのごとき適当な宿主細胞を形質転換するのに用いられた場合、該遺伝子の発現およびレトロウイルス逆転写酵素に付随したＤＮＡ依存性ならびにＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性およびＲＮＡｓｅ  Ｈ活性を有する遺伝子産物の生成を誘導する。
さらに本発明は、野生型株と比較して低レベルのリボヌクレアーゼ活性を有する宿主細胞中に挿入されたＭＭＬＶ−ＲＴに関する遺伝子を含んでいるプラスミドに関する。
さらに本発明は、宿主細胞から生じた酵素を精製する方法に関し、該方法は、適当な培地、醗酵条件、細胞の収集ならびに保存、細胞の溶解およびクロマトグラフィーからなる。
さらに本発明は、本発明発現ベクター、宿主細胞、および精製方法により生産された酵素に関する。該酵素は高度に精製されており、核酸増幅および他の遺伝学的操作方法における使用に適する。
結局は、本発明は、種々の目的のための、明確には、転写に基づく増幅ならびにＲＴ−ＰＣＲ反応における相補的ＤＮＡの合成のための、本明細書記載の方法により生産された酵素の使用に関する。
【図面の簡単な説明】
図１：プラスミドｐＵＣ１８Ｎの構築
図２：プラスミドｐＵＣ１８Ｎの構築に使用したオリゴヌクレオチド
図３：リボゾーム結合部位の配列比較
図４：リボゾーム結合部位およびスペーサー領域を修飾するために使用したオリゴヌクレオチド
図５：プラスミドｐＵＣ１８  ＭＭＬＶ  Ｓｓｔ−Ｈｉｎｄの構築
図６：プラスミドｐＵＣ１８  ＭＭＬＶ  III  Ｔａｉｌｅｄの構築
図７：プラスミドｐＵＣ１８  Ｔａｉｌｅｄの構築に使用したオリゴヌクレオチド
図８：プラスミドｐＵＣ１８Ｎ  ＭＭＬＶ  ＧｌｙおよびｐＵＣ１８Ｎ  ＭＭＬＶ  Ｇｌｙ  Ｔｅｔ（−）の構築
図９：プラスミドｐＵＣ１８Ｎ  ＳＤ９Ｄ  ＭＭＬＶ  ＧｌｙおよびｐＵＣ１８Ｎ  ＳＤ９Ｄ  ＭＭＬＶ  Ｇｌｙ  Ｔｅｔ（−）の構築
図１０：精製ＭＭＬＶ−ＲＴのＰ−１１およびセファクリルＳ−２００フラクションのドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）のゲルの写真
発明の詳細な説明
定義
特記しないかぎり、本明細書に用いられる下記用語は次のように表される意味を持つ。
「選択可能マーカー遺伝子」とは、選択可能マーカー遺伝子を含まない細胞と比較して、いずれも一定の組成の培地で増殖させられた場合に、宿主細胞によって担持され発現されると増殖上の利点を当該宿主細胞に付与しうる遺伝子をコードしているＤＮＡフラグメントを意味する。例えば、β−ラクタマーゼをコードしている遺伝子は、この遺伝子を含んでいる宿主細胞にアンピシリン耐性を付与し、一方、該遺伝子を含まない細胞はアンピシリンに感受性があるだろう。よって、β−ラクタマーゼに関する遺伝子を発現する細胞のみがアンピシリン含有培地で増殖するであろう。同様に、必須アミノ酸を合成できない細胞は当該アミノ酸を含まない培地では増殖しないであろうが、細胞に必須アミノ酸を作ることを可能にさせる遺伝子を含む細胞はその培地において増殖するであろう。
慣用的には、選択可能遺伝子および「沈黙の」遺伝子および／または遺伝学的エレメントの双方を含んでいる細胞を同定する手段として、選択可能マーカー遺伝子を、例えばプラスミドもしくは発現ベクター、１もしくはそれ以上の他の遺伝子または遺伝学的エレメントに結合させることができる。
「精製」核酸または蛋白とは、炭水化物、所望でない核酸、または所望でない蛋白のごとき細胞成分を当該核酸または蛋白から除去する少なくとも１の工程に供された核酸または蛋白を意味する。
「上流」とは、核酸鎖上の特定の遺伝子座の５'側、あるいは２本鎖核酸分子の場合には核酸分子の当該領域における遺伝子転写方向に関する特定の遺伝子座の５'側を意味する。
「下流」とは、核酸鎖上の特定の遺伝子座の３'側、あるいは２本鎖核酸分子の場合には核酸分子の当該領域における遺伝子転写方向に関する特定の遺伝子座の３'側を意味する。
「Ｔm」は、２本鎖核酸分子、または２本鎖領域を有する核酸分子の集団のうち５０％が１本鎖になるかまたは熱変性する温度を意味する。
「組み換え体」とは、核酸分子または蛋白が少なくとも一部にはインビトロ生化学的方法の結果物であることを意味する。よって、「組み換えＤＮＡ分子」は天然に存在しない分子である。かかる組み換え分子は、制限エンドヌクレアーゼフラグメントからなる分子、インビトロ核酸ライゲーション生成物、インビトロエキソヌクレアーゼフラグメント、およびプロモーター、リプレッサー遺伝子、選択可能マーカー遺伝子、温度感受性ＤＮＡ複製エレメント、構造遺伝子等のうちの１つまたはそれ以上のごとき異種の遺伝学的エレメントからなる発現ベクターを包含するが、これらに限らない。
「組み換え」蛋白または酵素は天然には見いだされないものである。これらのものは、精製蛋白標品および組み換えＤＮＡ分子から精製された蛋白を包含する。通常には、後者の蛋白は異種宿主細胞、すなわち、対象とする蛋白または酵素については本来のものではない細胞において発現される。しかしながら、対象蛋白が由来した生物と同一種の宿主細胞中に含まれている発現ベクター上に組み換え蛋白をコードしている遺伝子が存在していてもよい。
「切断された」とは、より小型のバージョンの対象遺伝子または蛋白を意味する。はじめの核酸またはアミノ酸配列に関して、リファレンスとなる核酸または蛋白の切断バージョンは、リファレンスとなる分子と比較すると、１もしくはそれ以上のヌクレオチドまたはアミノ酸を欠くものである。
「実質的な配列相同性」とは、第１の核酸または蛋白分子が、第２のリファレンスとなる核酸または蛋白に対して、認識可能なほどのランダムでない類似性（その核酸またはアミノ酸配列のそれぞれ少なくとも約８９％以上について）を有することを意味する。
核酸または蛋白の「ドメイン」とは、連続した核酸またはアミノ酸残基からなる少なくとも１の一定の領域を意味する。
「複製開始点」とは、プライマー生成およびＤＮＡポリマラーゼ活性の開始が起こるＤＮＡの特定の領域を意味する。本明細書においては、宿主中で発現ベクターのコピー数を増加させる、ＤＮＡ発現ベクター上に存在する核酸エレメントを意味するために該用語を用いる。
「プロモーター」とは、ＲＮＡポリメラーゼ酵素が結合でき、ＤＮＡ鋳型の転写を開始できるＤＮＡの特定の領域からなる遺伝学的エレメントを意味する。かくして、核酸配列に含まれる遺伝学的情報の、当該核酸配列に対応するアミノ酸配列からなる蛋白生成物への翻訳の第１段階が提供される。
「遺伝子発現」または「蛋白発現」とは、宿主生物による、遺伝子中に含まれる情報からの蛋白生成物の生産を意味する。
「形質転換」とは、宿主細胞に核酸分子を含ませるように誘導する生化学的方法を意味する。通常には、かかる核酸分子は、少なくとも１つの複製開始点、選択可能マーカー遺伝子、および宿主細胞内での選択可能マーカー遺伝子の発現のためのプロモーターからなる遺伝学的エレメントである。
「異種」とは同じ種でないことを意味する。よって、異種宿主細胞において発現される酵素は、その酵素がもともと由来する種とは異なる種の宿主細胞において生産されることとなる。
「遺伝子」とは発現蛋白またはポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する核酸領域を意味する。遺伝子は、発現蛋白のアミノ酸残基に対応するコドンを含む１またはそれ以上の「コーディング配列」からなっており、さらに遺伝子は、発現蛋白のアミノ酸残基に対応するコドンを含まない１またはそれ以上の「非コーディング」ヌクレオチド配列からなっていてもよいが、必ずしもその必要はない。
ＭＭＬＶ−ＲＴ発現ベクターの構築および評価に使用するすべての生化学的方法は、制限消化プロトコール、ゲル電気泳動、サザンブロット、およびＤＮＡ修飾反応を包含し（これらに限らず）、当業者に知られたものであり、すでに参照により本明細書に記載されていると見なした上記サムブルックらの文献に記載されている。さらに、これらの方法の多くは、バチルス・ステアロサーモフィルス由来の精製ＤＮＡポリメラーゼというタイトルの、共通の所有者のものであり本願と同日に出願されたリッグス（Riggs）らの同時係属出願（参照により本明細書に記載されているものとみなす）に記載されている。
Ｉ．クローニングベクターの構築
ａ．プラスミドｐＵＣ１８Ｎ
プラスミドｐＵＣ１８（ライフ・テクノロジーズ・インコーポレイテッド（Life Technologies,Inc.）メリーランド州ベセスダ）を親プラスミドとして用いた。アガロースゲル上の制限マッピング法によりクローンをスクリーニングした。図１に示すように、２個のヌクレオチド塩基の置換を行うことにより、ＮｃｏI制限部位を、ｐＵＣ１８のｌａｃＺリボゾーム結合部位とＥｃｏＲI制限部位との間に導入した。図２に示す２個の合成オリゴヌクレオチド１および２（配列番号：１および２）を用いて該変異を導入した。示したように、該オリゴヌクレオチドはそれらの３'末端における３０塩基対が重複している。該オリゴヌクレオチドはハイブリダイゼーション可能であり、イー・コリのＤＮＡポリメラーゼIのクレノウフラグメントを用いてフィル−インされ、ＰｖｕIIおよびＥｃｏＲIで消化された。プラスミドｐＵＣ１８をＥｃｏＲIで消化し、ＰｖｕIIで部分消化して２個のＤＮＡフラグメントを得た。大きい方のフラグメントは、インタクトなアンピシリン耐性遺伝子（Ａｍｐ）、複製開始点（Ｏｒｉ）、およびｌａｃＺ遺伝子の一部を含んでいた。小さい方のＥｃｏＲI−ＰｖｕIIフラグメントはｐＵＣ１８のマップの４５０〜６２８の位置に相当するｌａｃＺ遺伝子の一部分からなる。合成ＥｃｏＲI−ＰｖｕIIフラグメントを大きい方のベクターフラグメント中に挿入し、ライゲーションし、イー・コリＪＭ１０９株の形質転換に使用した。正しく構築されたベクターを含むクローンは、基質としてＸ−ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド）を用いて青色を生じ、ｌａｃＺ遺伝子が正しく再構築されたことを示した。制限マッピングによりこれらの結果をさらに証明した。このベクターをｐＵＣ１８Ｎと命名した（図１参照）。
ｂ．逆転写酵素遺伝子を含むプラスミドの構築
ミラー（Miller）およびバーマ（Verma）、ジャーナル・オブ・ウイロロジー（J.Virol.）第４９巻：２１４〜２２２頁（１９８４年）に記載されたｐＭＭＬＶ−Ｌクローンから、インタクトなＭＭＬＶ遺伝子をＳｓｔI−ＨｉｎｄIIIフラグメントとして単離した。このフラグメントは、ＭＭＬＶ位置２５５８（ＳｓｔI部位）から位置４８９４（ＨｉｎｄIII部位）までの領域に対応するヌクレオチド配列を含み、さらに余分に４０塩基上流と余分に８４塩基下流との間の全ＲＴ遺伝子を含んでいた。プラスミドベクターｐＵＣ１８をＳｓｔIおよびＨｉｎｄIIIで消化し、該ベクターとＲＴ遺伝子とをライゲーションし、コンピテントなイー・コリＤＨ５αｆ'細胞の形質転換に使用した。得られたプラスミドをｐＵＣ１８  ＭＭＬＶ  Ｓｓｔ−Ｈｉｎｄと命名した（図５）。次いで、このプラスミドをＥｃｏＲIおよびＢｇｌIで消化し、ＲＴ遺伝子の末端の３'配列を欠く２０１３ｂｐのＭＭＬＶ−ＲＴフラグメントを得た。該ＲＴ遺伝子フラグメントを、そのＢｇｌI部位において、２個のオリゴヌクレオチド８および９（それぞれ配列番号：１１および１２）由来のＢｇｌI−ＨｉｎｄIIIオーバーハング（図７）を有するように設計された２本鎖リンカーにライゲーションした。該合成リンカーは、ＭＭＬＶ逆転写酵素のカルボキシル末端に関するコーディング配列および停止コドンを含んでいた。プラスミドｐＵＣ１８をＥｃｏＲIおよびＨｉｎｄIIIで消化し、大きいベクターフラグメントをゲル精製し、再構築したＲＴ遺伝子とライゲーションした。得られたプラスミドをｐＵＣ１８  ＭＭＬＶ  III  Ｔａｉｌｅｄと命名し、それは余分な３'配列が除去されたＭＭＬＶ遺伝子を含んでいた。
ｃ．ｐＵＣ１８Ｎ  ＭＭＬＶ  ＧｌｙおよびｐＵＣ１８Ｎ  ＭＭＬＶ  Ｇｌｙ  Ｔｅｔ（−）の構築
クローン化されたＲＴ遺伝子の余分な５'配列を以下のように除去した。１９９７ｂｐのＭａｍI−ＨｉｎｄIIIフラグメントをｐＵＣ１８Ｎ  ＭＭＬＶ  III  Ｔａｉｌｅｄから単離した（図８）。この核酸フラグメントは、ＭＭＬＶ−ＲＴ遺伝子配列の５'側の２３個のヌクレオチドを伴わないＲＴ遺伝子を含んでいた。相補的ヌクレオチドを合成し、ハイブリダイゼーションを行ってＲＴ遺伝子の５'部分を作り直した（しかし、下に示すように、２番目のアミノ酸位置のグリシンをコードするヌクレオチドおよび開始コドンを含んでいるＮｃｏI  ５'オーバーハングを伴っていた）。
0003808501.tif 000002
プラスミドｐＵＣ１８ＮをＮｃｏIおよびＨｉｎｄIIIで消化し、生じた２個のフラグメントの小さい方を除去した。配列番号：したオリゴヌクレオチド（配列番号：３および４）を、ＮｃｏI部位において大きい方のｐＵＣ１８Ｎフラグメントにライゲーションし、次いで、１９９２ｂｐのＭＭＬＶ−ＲＴ  ＭａｍI−ＨｉｎｄIII遺伝子も挿入し、発現ベクターｐＵＣ１８Ｎ  ＭＭＬＶ  Ｇｌｙ（図８）を得た。下記のように構築したｐＵＣ１８  Ｔｅｔ（＋）由来のＴｅｔ遺伝子をＡａｔII部位において挿入し、得られたプラスミドをｐＵＣ１８Ｎ  ＭＭＬＶ  Ｇｌｙ  Ｔｅｔ（−）と命名した。マイナスの印は、ベクター中のＴｅｔ遺伝子の方向を示す。
本発明のクローン化されたＭＭＬＶ−ＲＴは２つの点でネイティブな酵素とは異なる。第１に、ネイティブな酵素の位置１を示すスレオニン残基をコードしているコドン（ＲＴ遺伝子の２番目のコドン）が、本発明のクローン化されたＲＴにおいてはグリシンコドンに置換されていること、第２に、成熟ネイティブ蛋白配列のアミノ酸位置２、３および４を占めるロイシン、アスパラギンおよびイソロイシン残基がイー・コリにとってより好ましいコドンに置換されたことである。ロイシンをコードするＣＴＡコドンが縮重コドンＣＴＧに置換され；アスパラギンをコードするＡＡＴコドンが縮重コドンＡＡＣに置換され；イソロイシンをコードするＡＴＡコドンが縮重コドンＡＴＣに置換された（ワダ，ケイ（Wada,K.）、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Nucl.Acids Res.）第１９巻（補）：１９８１〜１９８６頁（１９９１年）参照）。
ｄ．プラスミドｐＵＣ１８Ｎ  ＳＤ９Ｄの構築
クローン化されたＭＭＬＶ−ＲＴの発現を最適化するために、ｐＵＣ１８ＮのｌａｃＺリボゾーム結合部位（ＲＢＳ）を修飾して、イー・コリの１６Ｓ  ｒＲＮＡに相補的な９個の塩基をｐＵＣ１８親ベクターに存在する４個の塩基のかわりに含むようにした。同時に、図３において一方の鎖についてＳＤ７、ＳＤ８およびＳＤ９として示すように、７、８、または９塩基対のいずれかによってＲＢＳとＡＴＧ開始コドンを分離するスペーサー領域を有するように、プラスミドを構築した。これらのスペーサー配列の設計に共通するエレメントは、１）ＡＴＧ開始コドンに対して５'側の３番目の位置のアデノシン（Ａ）、２）ＮｃｏI部位中を除き、スペーサー領域中のグアニン（Ｇ）またはシトシン（Ｃ）の不存在、および３）ＲＢＳとスペーサーにまたがる５'−ＲＲＴＴＴＲＲ−３'配列（ここに、Ｔはチミジンであり、Ｒはプリンヌクレオチド（アデニンまたはグアニン））であった。異種遺伝子発現のためのこれらの共通エレメントは、ジェイ（Jay）ら、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユーエスエイ（Proc,Natl.Acad.Sci.USA）第７８巻：５５４３〜５５４８頁（１９８１年）およびジェスパース（Jespers）ら、プロテイン・エンジニアリング（Protein Engineering）第４巻：４８５〜４９２頁（１９９１年）に示唆されていた。
これらの修飾を導入するために使用されたオリゴヌクレオチドを図４に示す。オリゴヌクレオチド５、６および７（配列番号：５、６および７）を、図２に示すオリゴヌクレオチド１と組み合わせて使用した。オリゴヌクレオチド６のＡＴＧスタートコドンの５'側のヌクレオチドの４個の塩基およびオリゴヌクレオチド７のＡＴＧスタートコドンの５'側の４個もしくは５個の塩基をＡおよびＴの混合物を用いて合成した。なぜなら、理論的には、いずれもが好ましくないからであった。ジェスパースら、上記文献参照。ｐＵＣ１８Ｎの構築におけるように、相補的な３０塩基対の領域がオリゴヌクレオチド１とオリゴヌクレオチド３、４および５との間に存在していた。上記のごとく、オリゴヌクレオチドの各ペアーをハイブリダイゼーションさせ、イー・コリのＤＮＡポリメラーゼIのクレノウフラグメントを用いてフィル−インし、ＰｖｕIIおよびＥｃｏＲIで消化し、次いで、ｐＵＣ１８Ｎの構築の際に使用したのと同じ大型のｐＵＣ１８  ＰｖｕII−ＥｃｏＲIフラグメント中に挿入した。次いで、ＭＭＬＶ−ＲＴ遺伝子を、下記のごとくＮｃｏI−ＨｉｎｄIIIフラグメントとしてこのベクター中にクローン化した。
ＭＭＬＶ−ＲＴ発現レベルを測定することによりこれらの構築物を評価した。９塩基のスペーサー（ＳＤ９；オリゴヌクレオチド７）を有するプラスミドを含んでいる細胞は最高レベルの逆転写酵素の発現を示した。そのプラスミドを単離し、配列決定した。ＡＴＧスタートコドンの５'側の縮重ヌクレオチドの４個および５個の塩基はともにアデノシン（Ａ）残基であることがわかった。該発現ベクターをｐＵＣ１８Ｎ  ＳＤ９Ｄと命名した。
ｅ．テトラサイクリン耐性遺伝子の挿入
ｐＵＣ１８のアンピシリン耐性（β−ラクタマーゼ）遺伝子を、初期のベクター構築物における遺伝学的選択マーカーとして用いた。しかしながら、β−ラクタマーゼは抗生物質を比較的迅速に破壊するように作用するという事実により、アンピシリンが唯一の選択基準であるかなりの大きさのプラスミド欠損復帰集団が培養物中に存在することとなりうる。
培養物中の細胞集団を強固に調節するために、テトラサイクリン耐性遺伝子を含むようにベクターを修飾した。テトラサイクリンは、抗生物質を不活性化するというよりはむしろ抗生物質の細胞への取り込みをブロックするように作用するため、アンピシリン存在下よりもテトラサイクリン存在下のほうが培養物は安定なはずである。
テトラサイクリン耐性遺伝子を、ｐＢＲ３２２から、１４２７ｐｂのＥｃｏＲI−ＡｖａIフラグメントとして単離した。イー・コリのＤＮＡポリメラーゼIのクレノウフラグメントを用いて１本鎖オーバーハングをフィル−インし、平滑末端フラグメントを得た。ＡａｔIIリンカーをテトラサイクリン耐性遺伝子フラグメントにライゲーションし、ＡａｔIIで消化した。プラスミドｐＵＣ１８をＡａｔIIで消化し、直鎖状になったベクターを、テトラサイクリン耐性遺伝子を含むＡａｔIIフラグメントにライゲーションさせた。ライゲーション混合物を用いてコンピテントなイー・コリＪＭ１０９細胞を形質転換し、テトラサイクリン耐性により形質転換体を選択した。制限マッピングにより該プラスミドの構造を証明した。テトラサイクリン耐性遺伝子が両方向に挿入されているクローンを選択した。プラスミドをｐＵＣ  Ｔｅｔ（＋）およびｐＵＣ  Ｔｅｔ（−）と命名した。
クローン化されたＭＭＬＶ逆転写酵素を含むプラスミド中への挿入用に、該２種のプラスミドをテトラサイクリン耐性遺伝子（Ｔｅｔ）供給源として用いた。Ｔｅｔ遺伝子は、逆転写酵素のクローニングに使用される酵素に対する制限部位を有するが、ＲＴ遺伝子はＡａｔII部位を含まないので、このアプローチは、すでにＴｅｔ遺伝子を含んでいるベクター中への逆転写酵素遺伝子（ＲＴ）の挿入を試みるのに好ましいものであった。
ｆ．ｐＵＣ１８Ｎ  ＳＤ９Ｄ  ＭＭＬＶ  ＧｌｙおよびｐＵＣ１８Ｎ  ＳＤ９Ｄ  ＭＭＬＶ  Ｇｌｙ  Ｔｅｔ（−）の構築
インタクト、ならびに修飾逆転写酵素遺伝子をｐＵＣ１８Ｎ  ＭＭＬＶ  Ｇｌｙ  Ｔｅｔ（−）から２０１８ｂｐのＮｃｏI−ＨｉｎｄIIIフラグメントとして単離し、ＮｃｏI−ＨｉｎｄIIIポリリンカー領域が除去されているベクターｐＵＣ１８Ｎ  ＳＤ９Ｄとライゲーションさせた。ｐＵＣ１８Ｎ  ＳＤ９Ｄ  ＭＭＬＶ  Ｇｌｙと呼ばれる得られたプラスミドは、上記のごとく改良されたリボゾーム結合部位およびスペーサー領域を有するほかに、上記のごとく３つの方法で修飾されたＭＭＬＶ−ＲＴ遺伝子を含んでいた。このプラスミドをその唯一のＡａｔII部位において開裂し、ｐＵＣ１８  Ｔｅｔ（＋）由来のＡａｔII  Ｔｅｔ遺伝子フラグメントを該ベクター中に挿入しライゲーションした。２つの可能な方向のＴｅｔ遺伝子を含むプラスミドを単離し、各プラスミドを含むクローンについてＲＴ発現レベルを試験した。（−）方向（ＭＭＬＶ−ＲＴと同じ方向のコーディング鎖を伴う）のｔｅｔ遺伝子有するクローンは、それとは反対の方向のｔｅｔ遺伝子を有するクローンよりも高レベルのＲＴを生産することがわかり、それゆえ、好ましいクローンとして選択した。
ＩＩ．宿主細胞株の選択
これらの株のいくつかは、ｌａｃ  Iqリプレッサーを含み、イソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）での誘導を必要とする。生じた蛋白をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で可視化することにより、そしてたいていの場合、粗細胞溶解物についての酵素活性アッセイにより、ＲＴ遺伝子を含んでいる宿主細胞のＲＴ発現レベルを評価した。ＲＮＡｓｅ  I欠損株のうち、イー・コリ１２００（エール大学イー・コリ・ジェネティック・ストック・センター（Yale University E.coli Genetic Stock Center）の４４４９株）は、これらのアッセイを用いた場合に、構成的に高レベルの酵素発現を示した。特記しないかぎり、本明細書記載のすべての実験はこの株を用いて行った。
ＩＩＩ．ｐＵＣ１８Ｎ  ＳＤ９Ｄ  ＭＭＬＶ  Ｇｌｙ  Ｔｅｔ（−）を含むイー・コリ１２００の増殖
醗酵培地（Ａ−Ｚ  アミン培地）は、体積２００リットル中、以下の成分を含有していた。：
Ｎ−ＺアミンＡ（シェフィールド・プロダクツ（Sheffield Products）、ノーウィッチ（Norwich）、Ｎ.Ｙ.）                                 ２ｋｇ
酵母エキス（ディフコ（Difco））                       １ｋｇ
ＮａＣｌ                                              １ｋｇ
ＮａＯＨ                                              ８ｇ
テトラサイクリン（７０％エタノール中１２ｍｇ／ｍｌ）  ２００ｍｌ
混合物を醗酵容器中に入れて１２１℃で２０分オートルレーブし、次いで、放冷した。温度が３７℃に達した時、テトラサイクリンを添加した。
ｐＵＣ１８Ｎ  ＳＤ９Ｄ  ＭＭＬＶ  Ｇｌｙ  Ｔｅｔ（−）を含むイー・コリ１２００の種培養を、２ｍｌのＮ−Ｚアミンならびに１２μｇ／ｍｌのテトラサイクリン（ＬＢ＋Ｔｅｔ）に該ベクターを含有する株の凍結ストック培養物を接種し、３７℃で一晩振盪しながらインキュベーションすることにより調製した。次いで、得られた２ｍｌの培養物を用いて２０個の１リットル培養に接種し、それらを再び３７℃で振盪しながらインキュベーションした。
次いで、２００リットルのファーメンターに２０リットルの種培養を接種し、波長６６０ｎｍにおける光の減衰を測定することにより決定した最大減衰に達してから３０分経過するまで細胞を増殖させた。通常、このことは培養約７．５時間後に起こる。インキュベーション中、最初の３時間は１５０ＲＰＭで、次いで、１８０ＲＰＭで連続的に培養物を撹拌した。４５リットル／分で空気を容器に入れた。醗酵している間、培地のｐＨを調節せず、醗酵期間中、約８．２まで上昇した。
培養物を２０℃に冷却し、シャープルズ（Sharples）遠心機で細胞を収集した。細胞を洗浄しなかった。細胞ペーストを２００ｇずつに分け、液体窒素中で凍結した。凍結中、細胞傀を小片に砕いて急速かつ完全な凍結を確実にした。次いで、凍結細胞ペーストを−７０℃で保存した。
ＩＶ．イー・コリ１２００／ｐＵＣ１８Ｎ  ＳＤ９Ｄ  ＭＭＬＶ  Ｇｌｙ  Ｔｅｔ（−）からＭＭＬＶ逆転写酵素の精製
１．逆転写酵素活性および蛋白濃度のアッセイ
逆転写酵素活性のアッセイ方法は当該分野において知られている。本明細書記載の研究については、カシアン（Kacian）により記載されたｄＴ：ｒＡアッセイを用いた（カシアン、メソッズ・イン・ウイロロジー（Methods in Virology）中、メソッズ・フォー・アッセイング・リバース・トランスクリプターゼ（Methods for Assaying Reverse Transcriptase）（アカデミック・プレス（Academic Press）、１９７７年、この開示部分を参照により本明細書に記載されているものと見なす）。逆転写酵素活性１ユニットは、該文献に記載の条件下で１０分間に１ｎｍｏｌのｄＴＴＰを酸沈殿形態に変換する。
２．細胞の溶解
１１００グラムの凍結細胞ペーストを小片に砕き、３．３リットルの溶解バッファー（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ  エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール、５ｍＭ  ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、１％（ｖ／ｖ）トリトンＸ−１００、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ））中に、４℃で撹拌により懸濁した。次いで、８０００ｐｓｉの連続圧においてＡＰＶ  Ｇａｕｌｉｎ  １５ＭＲホモジナイザーに２回通すことにより細胞を溶解させた。受け容器をアイスバス中に保ち、最初のホモジナイズ物を２回目に通す３０分前に凍らせた。次いで、４℃で１時間、４５００ｘｇで遠心分離することにより溶解物を清澄化させ、ペレットを捨てた。清澄化溶解物を即座に使用するか、または−７０℃で凍結し、使用前に４℃にするかのいずれかとした。
３．ホスホセルロースカラムクロマトグラフィー
製造者が推奨するように、ホスホセルロース（ワットマン（Whatman）Ｐ１１、１００ｇ）を２．５リットルの０．５Ｎ  ＮａＯＨ、次いで、２．５リットルの０．５Ｎ  ＨＣｌで処理した。最後の水洗後、ホスホセルロースを１．０リットルの１．０Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）に懸濁し、５〜１０分放置し、ブフナー漏斗に移した。減圧濾過によりバッファーを除去し、溶出液のｐＨが洗浄液のｐＨと一致するまでホスホセルロースを１．０Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で洗浄した。ホスホセルロースをビーカーに移し、０．０５Ｍ  ＮａＣｌを含有する１．０リットルのカラムバッファー（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０％（ｖ／ｖ）  グリセロール、１ｍＭ  ＤＴＴ、０．１％（ｖ／ｖ）トリトンＸ−１００および１ｍＭ  ＰＭＳＦ）に懸濁した。５〜１０分後、上記のごとくバッファーを減圧除去した。次いで、０．０５Ｍ  ＮａＣｌを含有するカラムバッファーにホスホセルロースを懸濁し、４℃に冷却した。
引きつづき行うすべての工程を４℃で行った。ファルマシア（Pharmacia）ＦＰＬＣ装置を用いてクロマトグラフィーを行った。ファルマシア  ＸＫ５０／３０（５．０ｃｍｘ２６．０ｃｍ）に洗浄され平衡化されたホスホセルロースを充填して５００ｍｌのベッドを形成した。次いで、６０ｍｌ／時の流速の０．０５Ｍ  ＮａＣｌを含有する１リットルのカラムバッファーでカラムを洗浄した。カラムアダプター（ファルマシア  ＡＫ５０）を用いてカラム末端のデッドボリュームを最小とした。６００ｍｌの清澄化細胞溶解物を、３０ｍｌ／時の流速でカラムに適用した。次いで、同じ流速の０．２Ｍ  ＮａＣｌを含有する６５０ｍｌのカラムバッファーでカラムを洗浄した。カラムベッドの収縮のため、過剰のバッファーをカラム上部の空間から除去し、最上部のフローアダプターを調節してベッド表面との接触を維持するようにした。
カラムバッファー中０．２Ｍ  ＮａＣｌから０．７Ｍ  ＮａＣｌの直線的な塩のグラジエント１５００ｍｌ（３０ｍｌ／時）でカラムを溶離した。溶離液を、その２８０ｎｍにおける吸光度によって蛋白の存在についてモニターした。蛋白ピークの溶離の間（１５ｍｌのフラクションを集めた）以外は、２５ｍｌのフラクションを集めた。
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）後、クマシブルー染色を用いてカラムフラクションを分析した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは当該分野においてよく知られており、レムリ，ユー・ケイ（Laemmli,U.K.）、ネイチャー（Nature）第２２７巻：６８０頁（１９７０年）に記載されており、参照により本明細書に記載されているものと見なす。各フラクションからの１０μｌを各ゲルレーンにて分析した。対照レーンには既知量の精製ＭＭＬＶ−ＲＴを入れた。ＭＭＬＶ−ＲＴ対照と同様の見かけの分子量を示して移動する有意な量の蛋白を含有し、わずかの目に見える蛋白バンドを含んでいるフラクションをプールした。主蛋白ピーク中に溶離した蛋白のうち約９５％をプールすることができ、有意な量の混入蛋白を含んでいなかった。さらに活性のアッセイを用いてピークのＭＭＬＶ−ＲＴ酵素フラクションの位置を知り、プールした。かかる方法は当業者に知られている。
４．セファクリルＳ２００ゲル濾過
体積８０〜１００ｍｌのプールしたホスホセルロースフラクションを、２０ｐｓｉの窒素圧でアミコン（Amicon）Ｐ３０膜を用いるアミコン限界濾過セル中の限界濾過により、２５ｍｌ未満に濃縮した。製造者の指示に従って、２本の２．６ｃｍｘ９４ｃｍのファルマシア  ＸＫ  ２６／１００カラムにセファクリルＳ２００（ファルマシア）を充填した。カラムアダプターを用いてデッドボリュームを最小にした。両カラムを直列に接続した。流速９０ｍｌ／時の０．２Ｍ  ＮａＣｌを含有する２リットルのカラムバッファーでカラムを洗浄した。濃縮したホスホセルロースプール（約２５ｍｌ）をカラム上流に負荷し、９０ｍｌ／時のの同じバッファーでカラムを展開した。再度、溶離液を、その２８０ｎｍにおける吸光度についてモニターし、最初の２００ｍｌの溶離液を単一プールとして集め、蛋白ピークの溶離中は４ｍｌのフラクションを集めた。約２９０〜３００ｍｌのバッファーをカラムに適用した時にＭＭＬＶ−ＲＴが溶離した。
再度、上記のごとくＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いてフラクションを分析した。ピーク領域の各フラクションからの３μｌを上記のごとく各ゲルレーン中で泳動した。対照レーンには既知量の精製ＭＭＬＶ−ＲＴを入れた。精製ＭＭＬＶ−ＲＴと一緒に移動する有意な量の蛋白を含有し、わずかの目に見える蛋白バンドを含んでいるフラクションをプールした。好ましくは、ＭＭＬＶ−ＲＴよりも高い見かけの分子量の目立ったピークを含むフラクションをプールに入れない。主Ｓ２００ピーク中の蛋白の９５〜９８％の間の蛋白がプール中に含まれていた。逆転写酵素活性に関するアッセイを用いてフラクションにおけるＭＭＬＶ−ＲＴの位置を決定し同定を行ってもよいが、好ましくは、プール中に高分子量の混入物が含まれるのを避けるために、分析にＳＤＳ−ＰＡＧＥを含める。
プールしたＳ２００フラクションを、ほとんどすべての使用のために十分に濃縮する。酵素を５０％グリセロール中−２０℃で保存することができる。
実施例１：ｐＵＣ１８Ｎ  ＭＭＬＶ  Ｇｌｙ  ｔｅｔ（−）または修飾されたリボゾーム結合部位ならびに異なる長さのスペーサー配列を伴ったｐＵＣ１８Ｎ  ＭＭＬＶ  Ｇｌｙ  Ｔｅｔ（−）を含んでいるイー・コリによるＭＭＬＶ−ＲＴの発現
１番目の位置におけるグリシンアミノ酸置換を含んでいるＭＭＬＶ−ＲＴ遺伝子を、ｐＵＣ１８Ｎおよび上記スペーサーおよび修飾リボゾーム結合部位を伴うｐＵＣ１８Ｎ中において評価した。すべてのベクターはｔｅｔ遺伝子を含んでおり、イー・コリ１２００株において評価された。
これら２種の構築物のいずれかを含むイー・コリ１２００の培養５０ｍｌを、３７℃で振盪しながら１６．５時間増殖させた。０．５ｍｌの部分試料を取り、微量遠心機で２分間遠心分離し、上清を捨てた。細胞ペレットを０．５ｍｌの洗浄バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡおよび０．２５Ｍ  スクロース）に懸濁し、次いで、上記のごとく遠心分離した。細胞ペレットを−８０℃で凍結し、次いで、２００μｌの溶解バッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％  グリセロール）に再懸濁し、氷上に２０分放置した。１００μｌの０．７５％（ｖ／ｖ）トリトンＸ−１００を各試料に添加し、混合物を２回凍結融解した。遠心分離により溶解物を清澄化し、リード（Read）およびノースコウト（Northcote）の方法（アナリティカル・バイオケミストリー（Anal.Biochem.）第１１６巻：５３〜６４頁（１９８１年）、その開示を参照により本明細書に記載されているものと見なす）により全蛋白をアッセイした。
溶解物の一部を逆転写酵素活性に関してアッセイした。溶解物中の全蛋白１マイクログラムあたりのユニットならびに細胞培養物１ミリリットルあたりのユニットとして各クローン中の逆転写酵素のレベルを計算した。表１に示す結果は、修飾リボゾーム結合部位（ＲＢＳ）および９塩基のスペーサー配列を含むベクターが最も高レベルの酵素を発現したことを示す。
0003808501.tif 000003
実施例２：イー・コリ１２００およびＪＭ１０９宿主株における修飾ＭＭＬＶ−ＲＴの比較
プラスミドｐＵＣ１８Ｎを用いて、１番目のネイティブなアミノ酸位置におけるグリシン、アラニン、またはバリン置換を伴うＭＭＬＶ−ＲＴをコードしているプラスミドを作成した。オリゴヌ３および４に類似であるがＲＴ遺伝子の２番目の位置において配列５'−ＧＴＴ−３'または５'−ＧＣＴ−３'（それぞれバリンまたはアラニンをコード）で示されるコドンを開始コドンの後に伴っているオリゴヌクレオチドを用いてこれらの置換を行った。ｐＵＣ１８  Ｔｅｔ（＋）由来のＴｅｔ遺伝子を、比較のために得られたプラスミド中に各方向に挿入した。これらのプラスミドを用いて、ｌａｃリプレッサーｌａｃ  Iq遺伝子のエピゾームコピーを含むイー・コリＪＭ１０９宿主細胞を形質転換した。細胞が対数増殖期に達した場合に、０．５ｍＭ（ＩＰＴＧ）を約２２時間添加することによりｌａｃプロモーターを誘導したこと以外は、実施例１のごとく形質転換細胞を増殖させた。部分試料を取り、実施例１のように逆転写酵素活性についてアッセイした。結果を下表２に示す。わかるように、Ｇｌｙ  Ｔｅｔ（−）構築物は最も高レベルの酵素発現を示した。
0003808501.tif 000004
別々の実験において、Ｇｌｙ  Ｔｅｔ（−）およびＶａｌ  Ｔｅｔ（−）構築物をイー・コリ宿主１２００およびＪＭ１０９において評価した。ＪＭ１０９培養物を上記のごとく誘導したが、１２００の培養物は誘導しなかった。下表３に示す結果は、両株における発現レベルはＧｌｙ置換ＭＭＬＶ−ＲＴに匹敵し、Ｖａｌ置換プラスミドに関しては１２００株において発現レベルがより高いことを示す。
0003808501.tif 000005
実施例３：イー・コリ１２００／ｐＵＣ１８Ｎ  ＳＤ９Ｄ  ＭＭＬＶ  Ｇｌｙ  Ｔｅｔ（−）の増殖およびＭＭＬＶ−ＲＴの発現
１リットルの増殖培地は１０ｇのＮ−Ｚアミン  Ａ、５ｇの酵母エキス、５ｇのＮａＣｌ、および０．１ｍｌの１０Ｎ  ＮａＯＨを含有していた。７０％エタノール中の１２ｍｇ／ｍｌテトサイクリン１ｍｌを、オートクレーブし冷却した培地に添加した。
イー・コリ形質転換体の凍結ストック培養物を２ｍｌの培地に接種した。これを３７℃で一晩振盪して増殖させた。該２ｍｌの細菌培養物を用いて５００ｍｌの培地に接種し、この培養物を上記のごとく一晩増殖させた。今度は、該５００ｍｌの培養物を用いて、ニュー・ブランズウィック（New Brunswick）Ｂｉｏ  Ｆｌｏ  IIIファーメンター中の５リットルの培地に接種した。３５０ＲＰＭで撹拌しながら培養物を増殖させた。醗酵中、４リットル／分で空気を培養物に通した。ｐＨ、光学密度、蛋白濃度および逆転写酵素活性の測定用に５〜１０ｍｌの試料を１時間ごとに取った。これらの結果を下表４に示す。
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実施例４：クローン化ＭＭＬＶ−ＲＴの大規模精製
上記実施例１のように酵素を調製した。試薬の体積を、工程開始時のペレット化細胞重量に比例して調節した。表５に示すように、高度に精製された酵素が回収率４８％で得られた。
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実施例５：１２００／ｐＵＣ１８Ｎ  ＳＤ９Ｄ  ＭＭＬＶ  Ｇｌｙ  Ｔｅｔ（−）クローンからの精製ＭＭＬＶ−ＲＴのＳＤＳ−ＰＡＧＥ
上記実施例４のＰ−１１プールおよびセファクリルプール中の蛋白のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により精製の進行をモニターした。本質的には上記レムリの文献に記載されたようにして１０％還元性ゲル中でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。試料を以下のように調製した。Ｐ−１１プールの一部をゲル試料バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール、５％  β−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）、２％（ｗ／ｖ）ＳＤＳおよび０．０５％（ｗ／ｖ）ブロモフェノールブルー）中に５０倍希釈し、９５℃で５分間加熱した。セファクリルカラムプールの一部をゲル試料バッファーで１０倍希釈し、同様に加熱した。市販ＭＭＬＶ−ＲＴ試料（オハイオ州クリーブランドのＵＳＢ製）を同様に調製した。後者の試料については、比活性１８７０００Ｕ（ユニット）／ｍｇであり、初期濃度１５００Ｕ／μｌで提供されたことが供給者により報告されていた。前以て染色された分子量マーカー（カリフォルニア州サン・ラファエルのバイオラッド・ラボラトリーズ製）を用いて試料プール中に含まれる蛋白の分子量を評価した。マーカー蛋白の見かけの分子量は、１８５００Ｄａ（卵白リゾチーム）、２７５００Ｄａ（大豆トリプシンインヒビター）、２３５００Ｄａ（ウシ・カルボニックアンヒドラーゼ）、４９５００Ｄａ（ニワトリ・オボアルブミン、８００００Ｄａ（ウシ・血清アルブミン）、および１０６０００Ｄａ（ウサギ・筋肉由来のホスホリラーゼＢ）であった。表５に示すようにゲルに負荷し、ゲルを図１０に示す。
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実施例６：ＭＭＬＶ−ＲＴ市販標品中に混入しているリボヌクレアーゼ活性
セファデックスＧ７５の２４ｃｍｘ０．４ｃｍカラムを下記バッファー（１Ｘカラムバッファー）で平衡化した：２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、０．０１％（ｖ／ｖ）ノニデットＰ−４０および１０％（ｖ／ｖ）グリセロール。
酵素とともにインキュベーションされたＲＮＡの消失を測定するための核酸ハイブリダイゼーションを用いることによりＲＮＡｓｅアッセイを行った。該方法の詳細は、アーノルド（Arnold）ら、米国特許第５，２８３，１７４号およびネルソン（Nelson）ら、米国特許出願第０８／０９４，５７７号に見いだされる。各酵素試料の５ｍｌを試験管に移した。１０ｍｌのインビトロ合成された水中のＲＮＡ転写物（約１〜４ｆｍｏｌ）を添加し、反応物を３７℃で１時間インキュベーションした。０．１Ｍ  コハク酸リチウム（ｐＨ４．７）、１．１Ｍ  塩化リチウム、２％（ｗ／ｖ）ラウリル硫酸リチウム、２０ｍＭ、ＥＤＴＡ、２０ｍＭ  エチレングリコールビス（ベータ−アミノエチルエステル）Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'四酢酸（ＥＧＴＡ）、１５ｍＭ  アルドリチオール（ウィスコンシン州ミルウォーキーのアルドリッチ・ケミカル（Aldrich Chemical）社製）中に、ＲＮＡ転写物の領域に相補的な５０ｍｌのアクリジニウムエステル標識ＤＮＡプローブを添加し、反応混合物を６０℃で２０分インキュベーションした。０．６Ｍ  ホウ酸ナトリウム（ｐＨ８．５）、１％（ｖ／ｖ）トリトンＸ−１００からなる溶液３００ｍｌを添加し、反応混合物を６０℃で７分間インキュベーションして未標識プローブ上に存在するアクリジニウムエステルを破壊した。残存標識量をルミノメーターで測定した。
放射性標識プローブを用いるＲＮＡｓｅ活性測定法、または酸沈殿形態から酸可溶性形態への変換をモニターすることにより放射性標識ＲＮＡの分解を直接測定するＲＮＡｓｅ活性測定法が当業者に知られており、本発明の実施に使用してもよい。科学文献に記載の低レベルのＲＮＡｓｅ活性をアッセイする他の方法が利用可能であり、本発明の実施へのそれらの適用は当業者により容易に理解される。
２５μｌのＭＭＬＶ−ＲＴ市販標品（オハイオ州クリーブランドのＵ．Ｓ．バイオケミカルズ製）を、１２．５μｌのグリセロール不含１０Ｘカラムバッファー、１０μｌの１０ｍｇ／ｍｌブルーデキストラン溶液、および７７．５μｌの水と混合した。上記サムブルックの文献に記載されているように、使用前に水をジエチルピロカルボネートで処理して混入しているＲＮＡｓｅを破壊した。酵素をカラムに適用し、流速１．８ｍｌ／時のカラムバッファーで溶離した。２３０μｌのフラクションを集め、上記のごとく逆転写酵素およびＲＮＡｓｅ活性についてアッセイした。
２本の同じカラムにより得られた結果を下表に示す。
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この表に示すように、市販酵素標品は有意な内在性ＲＮＡｓｅ活性を有している。このＲＮＡｓｅ活性は、１本鎖ＲＮＡを分解するので、ＭＭＬＶ−ＲＴ酵素に付随するＲＮＡｓｅ  Ｈ活性以外のものである。ゲル濾過クロマトグラフィーにより分析する場合、ＲＮＡｓｅ  Ｈでない活性の少なくとも４本のピークが得られる。これらのピークは４種の異なる酵素を表すのかもしれない。あるいはまた、それらは１種またはそれ以上の酵素の凝集、かかる蛋白のサブユニットへの解離、または他のクロマトグラフィー上の人為的なものであるかもしれない。ＲＮＡｓｅ  ＨでないＲＮＡｓｅ活性のこれらのピークのうち少なくとも１つがＭＭＬＶ−ＲＴと同時に溶離する。
実施例７：イー・コリ宿主細胞ＪＭ１０９および１２００から部分精製された組み換えＭＭＬＶ−ＲＴにおける混入リボヌクレアーゼの比較
プラスミドｐＵＣ１８Ｎ  ＳＤ９Ｄ  ＭＭＬＶ  Ｇｌｙ  Ｔｅｔ（−）で形質転換された宿主細胞ＪＭ１０９および１２００における、Ｐ１１カラム精製後のＭＭＬＶ−ＲＴ含有細胞溶解物中に存在する混入リボヌクレアーゼ活性量を比較するために、各カラムからのフラクションを、上記カシアン（Kacian）、メソ・ウイロロ（Meth.Virol.）に記載のｄＴ：ｒＡアッセイを用いて逆転写酵素活性について、さらに上記実施例に記載のアッセイを用いてＲＮＡｓｅ  ＨでないＲＮＡｓｅ活性に関してアッセイした。
各細胞タイプに関して得られた結果を下表に示す。
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データは、ＪＭ１０９細胞から調製された酵素は、Ｐ１１カラムプロフィール全体にわたって有意な量のＲＮＡｓｅ  ＨでないＲＮＡｓｅ活性を含むことを示す。有意な量のＲＮＡｓｅ活性が逆転写酵素活性とともに溶離した。対照的に、イー・コリ１２００細胞から精製された逆転写酵素は、粗抽出液をホスホセルロースカラムクロマトグラフィーにより精製した後は、検出可能な混入ＲＮＡｓｅ活性を含まなかった。
実施例８：イー・コリ１２００／ｐＵＣ１８Ｎ  ＳＤ９Ｄ  ＭＭＬＶ  Ｇｌｙ  Ｔｅｔ（−）から精製された組み換えＭＭＬＶ逆転写酵素を用いるミコバクテリウム・ツベルクローシス（Mycobacterium tuberculosis）のリボゾームＲＮＡの増幅
カシアンおよびフルツ、ＥＰＯ０４０８２９５Ａ２（参照により本明細書に記載されているものとみなす。該出願の所有者は本願と共通である）に記載された方法を用いて核酸増幅を行った。試薬混合物を以下のように作成した。７６８μｌの水に、４４μｌのＫＣｌ、５００μｌの４０ｍＭ  ｒＮＴＰｓ、５００μｌの１０ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、９μｌのＴ７プロモーター−プライマー（８４ｐｍｏｌｅｓ／μｌ）、および５μｌの非Ｔ７プライマー（１５０ｐｍｏｌｅ／μｌ）を添加し、混合した。この混合物（溶液Ａ）の体積を計算したところ５０回のアッセイに適していた。５０μｌの溶液Ａを各反応試験管に添加した。１０マイクロリットルの精製標的ｒＲＮＡ（鋳型希釈バッファー（１５０ｍＭ  ＫＣｌ中０．２％（ｗ／ｖ）ウシ・血清アルブミン）で希釈して０．０５〜２５ｆｇ／μｌとした）を各試験管に添加した。標的ｒＲＮＡはプライマーに対して十分に相補的な核酸配列を有し、プロモーター−プライマーは厳密な条件下でハイブリダイゼーションできるものであった。ｒＲＮＡの調製は当業者に知られている。２００マイクロリットルのシリコンオイルを各反応混合物の表面に重層し、反応試験管をヒーティングブロック中９５℃で１５分加熱した。次いで、反応試験管を４２℃のウォーターバス中に移し、５分間放冷した。
４６．８μｌの希釈バッファーを試験管に移し、１．１μｌ（９００Ｕ）のＭＭＬＶ−ＲＴおよび２μｌ（４００Ｕ）のＵ７  ＲＮＡポリメラーゼを添加することにより酵素混合物を調製した。次いで、この混合物を各試験管に添加した。次いで、反応物を４２℃で２時間インキュベーションした。次いで、アーノルド（Arnold）ら、ＰＣＴ  ＷＯ８９／０２４７６およびアーノルドら、クリニカル・ケミストリー（Clin.Chem.）第３５巻：１５８８〜１５９４頁（１９８９年）（前者は本願と所有者が共通であり、両者を参照により本明細書に記載されているものとみなす）に記載されたように、標的配列に指向されるアクリジニウムエステル標識ＤＮＡプローブを用いて増幅されたＲＮＡ量を測定した。２系で行った負の対照以外はすべての反応を４系で行った。下表９に示す結果は、増幅された標的配列の飽和レベルが、実験開始時の２．５ｆｇ程度の少量の投入鋳型ＲＮＡで得られることを示す。
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実施例９：イー・コリ１２００／ｐＵＣ１８Ｎ  ＳＤ９Ｄ  ＭＭＬＶ  Ｇｌｙ  Ｔｅｔ（−）から精製された組み換えＭＭＬＶ−ＲＴを用いるｃＤＮＡ合成
ＲＮＡ配列決定反応において、組み換え精製ＭＭＬＶ−ＲＴがｃＤＮＡを合成する能力を市販逆転写酵素標品（Ｕ．Ｓ．バイオケミカルズ）の能力と比較した。
２０ｍｌの１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．４ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）および２８１．７μｌのトリエチルアミンを混合することによりＴＴＥバッファーを調製した。プライマーは下記配列を有していた：
配列番号：８
配列番号：９
ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、プライマーをその５'末端において32Ｐで標識した。末端標識核酸の製法は一般的に当該分野において知られている。末端標識後、製造者の説明書に従ってＮｅｎｓｏｒｂTMカラム（ニュー・イングランド・ヌクレアー（New England Nuclear）により精製し、次いで、エタノール沈殿した。
イー・コリ１２００／ｐＵＣ１８Ｎ  ＳＤ９Ｄ  ＭＭＬＶ  Ｇｌｙ  Ｔｅｔ（−）から精製した組み換えＭＭＬＶ−ＲＴまたは市販業者から購入した逆転写酵素のいずれかを用いて反応を行った。
反応混合物は１００μｌの最終体積中に下記試薬を含有していた：１０μｌのＧＰＥバッファー（５００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１７５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、２５０ｍＭ  ＫＣｌ、２０ｍＭ  スペルミジン）、４μｌノストックｄＸＴＰｓ（１０ｍＭ）、０．５μｌ  １Ｍ  ＤＴＴ、２０ピコモルの32Ｐ標識プライマー、２０ピコモルの未標識プライマー、２０ピコモルの精製イー・コリｒＲＮＡ、６００ユニットの逆転写酵素、逆転写酵素以外のすべての成分を混合し、次いで、混合物を９５℃で５分間加熱して鋳型ＲＮＡの２次構造を変性させた。次いで、反応物を６０℃に３０分置いてプライマーをｒＲＮＡ標的にアニーリングさせた。反応混合物を室温まで冷却し、逆転写酵素を添加した。ＤＮＡ合成を４２℃で６０分行った。本質的にはウィリアムズ（Williams）ら、バイオテクニックス（BioTechniques）第４巻：１３８〜１４７頁（１９８６年）に記載されているように、反応物を７％ポリアクリルアミドゲルで分析した。
ゲル電気泳動から判断すると、両方の酵素は同じ効率でＲＮＡ鋳型からｃＤＮＡを合成することがわかった。
実施例１０：イー・コリ１２００／ｐＵＣ１８Ｎ  ＳＤ９Ｄ  ＭＭＬＶ  Ｇｌｙ  Ｔｅｔ（−）由来の組み換えＭＭＬＶ−ＲＴを用いての逆転写酵素により媒介されるＰＣＲ
すべてのＰＣＲ反応を、パーキン・エルマー−シタス（Perkin Elmer-Cetus）９６００型ＤＮＡサーマルサイクラー中で行った。サーマルサイクラーをプログラミングして下記様式および順序で反応物をインキュベーションした：
９４℃３分；
５１℃３０秒、７２℃２分、次いで、９４℃１分を３５サイクル；
７２℃５分；
４℃一晩。
２つの別々のＭＭＬＶ−ＲＴ標品ならびに上記と同じ市販業者から得たロットをこの実験に使用した。異なる量のＲＴを試験したが、使用したすべての酵素標品について５０ユニットの酵素が最適であることがわかった。実験に用いた試薬は下記のとおり：５Ｘ  ＲＴバッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、７５ｍＭ、３ｍＭ  ＭｇＣｌ2、５ｍＭＤＴＴ）；１０Ｘ  ＰＣＲバッファー（パーキン・エルマー）（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５００ｍＭ  ＫＣｌ、１５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、０．１％ゼラチン）；ＲＴプレミックス（各反応について）（４μｌの５Ｘ  ＲＴバッファー、１００ピコモルの（−）センスプライマー、水（全体積２０μｌ））；ＰＣＲプレミックス（各反応について）（８μｌの１０Ｘ  ＰＣＲバッファー、１００ピコモルの（＋）センスプライマー、２．５ユニットのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、および水（全体積８０μｌ））。プローブを１０ｍＭコハク酸リチウムバッファー（ｐＨ５．０）、０．１％ラウリル硫酸リチウム（ＬＬＳ）中に保存しておいた。
この実験に使用するプローブおよびプライマーを、ヒト・乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）ゲノムの配列に相補的であるように設計した。アーノルドおよびネルソン、ＰＣＴ特許出願ＷＯ８９／０２４７６（参照により本明細書に記載されているものと見なす）に開示されているようにアクリジニウムエステルでプローブを標識した。
１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ中にＳｉＨａ細胞（そのゲノム中の組み込まれたＨＰＶ核酸配列を含む）を１．６ｘ１０7個／ｍｌの濃度で懸濁することにより、スプライシングされていない鋳型ＲＮＡの粗標品を作成した。細胞を９５℃で１５分加熱し、室温まで冷却し、次いで、水中に希釈して所望濃度とした。ＨＰＶ１６  Ｅ６遺伝子を含むプラスミドからのＤＮＡのインビトロ転写により、Ｅ６遺伝子からのＲＮＡ転写物を調製した。マツクラ（Matsukura）ら、ジャーナル・オブ・ウイロロジー（J.Virol.）第５８巻：９７９〜９８２頁（１９８６年）により記載されているＨＰＶクローン由来のＤＮＡフラグメントをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔTM II  ＳＫ（＋）および（−）センスクローニングベクター（カリフォルニア州サン・ディエゴのストラタジーン（Stratagene）社製）中にクローン化することにより、このプラスミドを構築した。これらの文献を参照により本明細書に記載されているものと見なす。
ＲＮＡ転写物を製造者により指示されたようにして調製した。
増幅反応を以下のように行った。標的核酸をＭＭＬＶ−ＲＴプレミックスに添加した。この混合物を９５℃で２分間加熱した。プライマーを添加し、６０℃で１０分間標的核酸とアニーリングさせた。次いで、反応混合物を氷上で冷却した。逆転写酵素を添加し、反応物を３７℃で３０分インキュベーションした。次いで、反応物を９５℃で１０分間加熱して逆転写酵素を不活性化させた。混合物を氷中で冷却し、２滴のミネラルオイルを各試験管表面上に重層した。
Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを、ＰＣＲプレミックス中に希釈して上に示した濃度とした。次いで、８０μｌのＰＣＲプレミックスを各試料に添加した。９５℃のサーマルサイクラー中に試料を置き、サイクリングを上記のごとく行った。
アーノルドおよびネルソンの上記文献に記載されたようにしてハイブリダイゼーションおよび検出を行った。各ハイブリダイゼーションアッセイについて、３０μｌの水に、１０μｌのＰＣＲ反応混合物を添加した。ＤＮＡを９５℃で５分間変性させた。１０μｌの希釈プローブを添加し、混合した。次いで、試験管を６０℃で１５分間インキュベーションした。３００μｌの選択試薬を添加し、試験管内容物を混合し、６０℃で５分間インキュベーションした。次いで、試験管を氷中で冷却し、残存するアクリジニウムエステル標識をＬＥＡＤＥＲTMルミノメーター（カリフォルニア州サン・ディエゴのジェン−プローブ・インコーポレイテッド製）にて測定した。
結果を表１０に示す。
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配列表
（１）一般的情報：
（i）出願人：ジェン−プローブ・インコーポレイテッド
（ii）発明の名称：高度に精製された組み換え逆転写酵素
（iii）配列の数：１８
（iv）連絡先：
（Ａ）宛て名：ジェン−プローブ・インコーポレイテッド
（Ｂ）通り名：９８８０キャンパス・ポイント・ドライブ
（Ｃ）都市名：サン・ディエゴ
（Ｄ）州名：カリフォルニア
（Ｅ）国名：アメリカ合衆国
（Ｆ）ＺＩＰ：９２１２１
（v）コンピューター・リーダブル・フォーム：
（Ａ）メディウム・タイプ：３．５インチ・ディスケット、容量１．４４Ｍｂ
（Ｂ）コンピューター：ＣＯＭＰＡＱ  Ｐｒｏｌｉｎｅａ  ４／３３
（Ｃ）オペレイティング・システム：Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  ＭＳ−ＤＯＳ（バージョン６．０）
（Ｄ）ソフトウェア：ワードパーフェクト（バージョン５．１）
（vi）現在の出願データ：
（Ａ）出願番号：
（Ｂ）出願日：
（Ｃ）分類：
（vii）先の出願データ：
下記出願を含む先の全出願：
（Ａ）出願番号：
（Ｂ）出願日：
（viii）代理人等の情報：
（Ａ）氏名：ヘーバー，シェルドン・オー
（Ｂ）登録番号：３８１７９
（Ｃ）代理人等における処理番号：２０７／１４２
（ｉｘ）テレコミュニケーションの情報：
（Ａ）電話番号：（２１３）４８９−１６００
（Ｂ）ファックス番号：（２１３）９５５−０４４０
（２）配列番号：１に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：１１４
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：１本
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の記載：配列番号：１：
0003808501.tif 000017
（３）配列番号：２に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：１１２
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：１本
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の記載：配列番号：２：
0003808501.tif 000018
（４）配列番号：３に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：２４
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：１本
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の記載：配列番号：３：
0003808501.tif 000019
（５）配列番号：４に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：２０
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：１本
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の記載：配列番号：４：
0003808501.tif 000020
（６）配列番号：５に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：１１５
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：１本
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の記載：配列番号：５
0003808501.tif 000021
（７）配列番号：６に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：１１６
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：１本
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の記載：配列番号：６
0003808501.tif 000022
（８）配列番号：７に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：１１７
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：１本
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の記載：配列番号：７：
0003808501.tif 000023
（９）配列番号：１０に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：１５
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：１本
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の記載：配列番号：１０：
0003808501.tif 000024
（１０）配列番号：１１に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：４６
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：１本
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の記載：配列番号：１１：
0003808501.tif 000025
（１１）配列番号：１２に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：５３
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：１本
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の記載：配列番号：１２：
0003808501.tif 000026
（１２）配列番号：１３に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：１９
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：１本
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の記載：配列番号：１３：
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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