(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療有効量のインターフェロンを含み、治療有効量が１日あたり５０００ＩＵから２０×１０6ＩＵであって、この有効量が非経口投与にてヒトに投与された場合に病的応答を誘導しない量である、ウイルス性疾患に対する、ヒトの宿主防御機構を刺激するための、口腔粘膜接触投与のためのインターフェロン組成物。
【請求項２】
治療有効量が１日当たり１×１０4ＩＵから１×１０6ＩＵのインターフェロンを含む、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
他のサイトカイン又はインターフェロンインデューサーを含む、請求項１記載の組成物。
【請求項４】
他の治療剤を含む、請求項１記載の組成物。
【請求項５】
他の治療剤が他の抗ウイルス剤である、請求項４記載の組成物。
【請求項６】
宿主防御機構が、関節炎、糖尿病、ループス性、多発性硬化症、脳炎、マラリア、子宮頚癌、生殖器ヘルペス、ヘルペス水痘、Ｂ型およびＣ型肝炎、ＨＩＶ、ＨＰＶ、ＨＳＶ−１および２感染症を攻撃する、請求項１記載の組成物。
【請求項７】
インターフェロンの有効量を一回投与量として投与するためのものである、請求項１−６のいずれかに記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
本発明は宿主哺乳類の疾病症状に対する防御機構をインターフェロンを口腔粘膜を介して投与することによって刺激する方法を提供する。詳細には、本発明は自己免疫疾患、マイコバクテリア性疾患、神経変性疾患、寄生虫性およびウイルス性疾患の治療方法として適用し得る。
背景技術
インターフェロン-α（IFN-α）は、白血病、リンパ腫、エイズ関連カポジ肉腫および肝炎など、広い範囲の疾患の治療に広く使われている（Gutterman, J.U., Proc. Natul. Acad. ScIUSA,1994 91:1198−1205）。インターフェロンβ（IFN-β）は緩解-悪化を繰り返す多発性硬化症およびB型肝炎ウイルスによる感染症の治療について、適応症が認められている。インターフェロン-αおよびインターフェロン-βは共にタイプＩインターフェロンである。静脈内、皮下、筋肉内、局所および病巣内投与など、数多くの投与経路がタイプＩインターフェロンの投与に採用されているが、経口投与は一般には用いられていない。というのは、インターフェロンはタンパク質分解酵素によって不活性化され、またそのままでは消化管から吸収されにくいと考えられているタンパク質であるからである。実際、経口投与した後、血中インターフェロンが検出されないという報告が数多くある（CantellとPyhala, J. Gen. Virol., 1973 20:97-104; Willsら、J.IFN Res., 1984 4:399-409; Gilsonら、J.IFN Res., 1985 5:403-408）。
インターフェロンのインデューサーがマウスのプラスモディウム・ベルグハイ・マラリア(Plasmodium berghei malaria)の実験的感染を保護すること、そしてこの保護作用は、スポロゾイト（sporozoite）誘導感染に対してのほうが,血液寄生によるものに対してより強力なものであった（Jahielら、Science, 1986 16:1802; Nature, 1968 220:710; Amer. J. Trop Med Hyg., 1969 18:823）。マウスへ、ニューカッスル病ウイルス感染マウスのプールした血清内のインターフェロンを腹腔内もしくは静脈内に投与したところ、スポロゾイト誘導プラスモディウム・ベルグハイ・マラリアに対して保護作用が認められた。しかしながら、ウサギ血清からのインターフェロンには効果が無かった。保護作用は、インターフェロンが寄生の進行におけるプレ赤血球相（即ち、スポロゾイト投与の3時間前もしくは投与後約40時間まで）に投与された場合に認められた(Jahielら, Nature 1970 227:1350-1351)。
経鼻スプレーまたは経口液体製剤として低用量インターフェロンを投与する、低用量インターフェロンの様々なウイルス疾患、特にインフルエンザに対する有用性に関する数多くの裏づけのない報告がある。しかしながら、これらの報告のほとんどにおいて、インターフェロン製剤は比較的粗製である。ライノウイルス感染の治療のため、比較的高用量の鼻腔内インターフェロン投与をプラセボ投与と比較した報告があるが、治療は有効であったものの副作用の重大な影響があった(Haydenら、J.Infect.Dis.,1983 148:914-921)。同様に、二つの無作為ダブルブラインド臨床試験を含む数多くの研究がなされているが、鼻腔内投与した高用量組替えインターフェロン-α２では、ライノウイルス感染に暴露された対象を保護するという全身作用は認められなかった(Douglasら、New Engl.J.Med.,1986 314:65-80; Hydenら、New Engl.J.Med.,1986 314:71-75)。
より最近では、一連の特許明細書には異種由来のインターフェロンをウシの感染症鼻気管炎（シッピングフィーバー）の治療、およびネコの白血病の治療のため、他の治療たとえばワクチンの有効性の向上のため、食餌療法の効果の向上のため、そしてウシタイレリア感染症の予防のために経口投与することが開示されている。それぞれ米国特許第4,462,985号、オーストラリア特許第608519号、オーストラリア特許第583332号および米国特許5,215,741号を参照されたい。これらの明細書において、使用されているインターフェロンはキャンテル（Cantell）の方法によって調製されたヒトインターフェロン−αであって、リン酸緩衝生理塩水溶液として体重1ポンドあたり0.01から5Ｚの量が投与されている。これらの明細書はかかる低用量のインターフェロンを口腔粘膜に、好ましくは口腔粘膜との接触時間を延長し得る製剤にて投与することが、広範囲の疾患の治療に有用であり得ることを示唆するが、シッピング熱、ネコ白血病、イヌパルボウイルスおよびタイレリア症以外の症状に対しての試験結果はその大部分が裏付けの無いものであった。
低容量インターフェロンの経口または口腔咽頭粘膜投与の効果についてのさらに最近の研究の総説が出されている(Bocci、Clin.Pharmacokinet.,1991 21:411-417;Critic.Rev.Therap.Drug Carrier Systems, 1992 9:91-133; CumminsとGeorgiades, Archivum Immun. Therap. Exp., 1993 41:169-172)。このような療法は特に、HIV感染の治療に有用であると提案されており、そしてAIDS患者に対して、少なくともその生活の質(quality of life)を向上させることができる(Kaiserら、AIDS, 1992 6:563-569; Koechら、Mol. Biol. Ther., 1990 2:91-95)と報告されている。しかしながら、他の報告では、かかる治療は何ら臨床上の効果を示さないことを指摘している。低容量のインターフェロンを含有する経口トローチをB型肝炎の治療に用いるための第Ｉ相試験の報告がある(Zielinskaら、Archiv. Immunol. Therap.Exp., 1993 41:241-252)。
これに対して、ブリハムとウイメンズホスピタルによる国際特許公開第WO95/27499は、抗原を誘導する前にインターフェロン-βを消化管に挿管することによって投与すれば、I型糖尿病、多発性硬化症、自己免疫性関節炎のごとき自己免疫疾患の進行を最低でも一部押さえることができることを、よく知られた動物モデルを用いて報告している。インターフェロン-βをこの経路または腹腔内に、消化管内の「傍観(bystander)」抗原と共に投与することは、耐容性を誘導するのに、かなり効果的である。このことは、インターフェロン-βが外因性の抗原に対する液性及び細胞性応答を誘導するよりむしろ、経口投与の耐性の誘導を向上させるのに有用であることを示唆する。
発明の開示
本発明は、インターフェロンを口腔粘膜を介して投与することによる,哺乳類の宿主防御系を刺激する方法を提供する。本発明の一の態様においては、本発明は哺乳類に免疫刺激量のインターフェロンを口腔粘膜を介して投与することによって、当該哺乳類の免疫応答を刺激する方法である。
本発明は自己免疫疾患、マイコバクテリウムによる疾患、神経変性疾患、寄生虫性疾患およびウイルス感染症を、インターフェロンの有効量を口腔粘膜を介して哺乳類に投与することによって治療する方法を提供する。ここで該有効量は同じインターフェロンを非経口投与した場合に病的応答を誘導する量より少ない量である。特に、本発明は、関節炎、糖尿病、ループス性および多発性硬化症、癩病及び結核などのマイコバクテリアによる疾患、海綿状脳炎およびクロイツフェルド-ヤーコブ病などの神経変性不全症、マラリアのごとき寄生虫による疾患および子宮頸癌、生殖器ヘルペス、Ｂ型およびＣ型肝炎、ＨＩＶ、ＨＰＶ、ＨＳＶ−１および２のごときウイルス性疾患の治療方法を提供する。
口腔粘膜投与としては、有効用量のインターフェロンを一回量として投与しても、一回量投与による免疫刺激と等価な刺激を生じさせるのに十分なよう、小用量のものを複数回に分けて投与してもよい。同様に、インターフェロンの有効量をある一定期間持続的に投与して、一回量投与で得られるのと等価な効果を得るようにしてもよい。
本発明の方法は1日につき約1500IU、好ましくは5000IUから約20×106IUのインターフェロン、より好ましくは1日につき約1×104IUから約20×106IUのインターフェロン、もっとも好ましくは1日につき約1×104IUから約1×106IUのインターフェロンであって、選択された用量が本明細書で規定する非経口投与による病的応答を誘導しない量、もしくは非経口投与した場合に病的応答を誘導する量より少ない用量を投与することによって実施し得る。この用量の範囲は一般にはヒトインターフェロン−αをヒトに投与する場合のものである。特定の種類のインターフェロンを用いて患者を治療している医師が、本発明に基づき治療対象患者についての適当な用量を決定するのは容易である。
他の態様において、本発明は少なくとも１種のインターフェロンの治療有効量を含有する口腔粘膜投与のための医薬組成物を提供する。この組成物は溶液、錠剤、トローチ剤、ゲル、シロップ、ペーストまたは口腔粘膜分配系徐放性製剤であり得る。組成物は任意に緩衝剤、安定化剤、濃厚化剤、吸収および粘性増強剤などを含んでいてもよい。
一の態様において、本発明の医薬組成物は約1500IU、好ましくは5000IUから約20×106IUのインターフェロン、より好ましくは約１×104IUから約20×106IUのインターフェロン、もっとも好ましくは約１×104IUから約１×106IUのインターフェロンを含有する１用量単位として提供される。
本発明の方法は、単独の治療手段として、または化学療法もしくは放射線療法との併用療法として、あるいはインターロイキン２，１２または１５などの他のサイトカイン類、もしくはIFN−インデューサーと共に投与してもよい。
本発明の方法は、インターフェロン−α、β、γ、ωおよびコンセンサスインターフェロンから選択されるタイプＩまたはタイプＩＩのインターフェロンを用いて行えばよいが、最も好ましいのはインターフェロン−αである。
発明の詳細な説明
以下の定義および実施例は本発明の説明のため、参考にのみ用いられる。本明細書において言及した特許および文献は、本明細書に明示的に含まれる。
定義
本明細書において、「インターフェロン」はタイプＩまたはタイプＩＩのインターフェロンであり、一般にはインターフェロン−α、β、γ、ωと名づけられるもの、およびその混合物を含み、さらにコンセンサス配列も含む。インターフェロンは、広く市販のものが入手可能であり、数多くの適応症が承認されている。インターフェロンは天然由来のものであってもよいが、遺伝子組替えによる製品がより好ましい。本明細書において、「インターフェロン」の語にはさらにインターフェロン活性を有するポリペプチドフラグメント、および例えば安定性向上等を目的として配列の改変が導入されたキメラあるいは変異体であって、本来の性質を維持しているもの（例えば米国特許第5,582,824号、第5,593,667号、および第5,594,107号参照）も含まれる。
本発明は宿主防御機構または免疫機構の刺激が有利に働く、いかなる疾患症状に対しても適応できることが理解されなくてはならないが、好ましい疾患症状は自己免疫疾患またはウイルスもしくは寄生虫の感染である。本発明の目的のため、インターフェロンは単独で用いても、もしくは他の剤または処置と併用して用いてもよいことが理解されなくてはならない。
インターフェロンを投与する際、任意にインターフェロン合成及び放出のインデューサーを投与してもよい。インデューサーはインターフェロンと同時に投与しても別に投与してもよい。インターフェロンのインデューサーは数多く知られており例えばポリＩ：Ｃなどのポリヌクレオチドが含まれるが、低分子量の経口投与し得るインターフェロンインデューサーが好ましく用いられる。好ましいインデューサーは当業者に知られており、例えばティロロン(Tilorone)（米国特許第3,592,819号；Albrechtら、J.Med.Chem.1974 17:1150−1156）およびキノロン誘導体イミキモド(Imiquimod)（Savageら、Brit.J.Cancer., 1996 74：1482−1486）が挙げられる。
本発明の方法および組成物は、特定の症状の治療のための任意に１または複数の他の治療法と併用してもよく、治療に関与する医師もしくは獣医師はかかる他の治療法を状況によって適当に選択すればよい。
ウイルス性疾患は急性または劇症性のものであってよくライノウイルス、インフルエンザ、ヘルペス性水痘、ヘルペス性帯状疱疹、デング熱または、麻疹ウイルス脳炎、マリーバレー脳炎、日本脳炎B型、ダニ脳炎、及びヘルペス性脳炎を含むがこれらに限定されない。また、エボラウイルス、マールブルグ病ウイルス、ラッサ熱、ハンタウイルス及びウマ麻疹ウイルスのごとき他の動物からヒトへと感染すると考えられているウイルスの感染などもまた含まれる。これらの症状の多くは、治療法および／またはワクチンが現在無いものであり、考えられている治療では不適当である疾患である。または、ウイルス性疾患は例えばB型肝炎、C型肝炎、D型肝炎または他のウイルス性肝炎、およびCMV、HIV、HPV、HSV IおよびIIに依る感染症のごときウイルスによって生じた慢性感染症であってもよい。Ｂ型肝炎およびＣ型肝炎は現在、インターフェロンの腹腔内投与にて治療されている。エイズへ推移するＨＩＶ感染に対する、長期インターフェロン治療に付いては、臨床試験中である。
本発明の第2の態様で治療され得る疾患はマラリアであり、再びタイプIまたはIIインターフェロンを上記と同様にして投与する。マラリアの原因となる生物体は、プラスモディウム・マラリア(PlasmodIUm malariae)、プラスモディウム・ヴィヴァックス（PlasmodIUm vivax）、プラスモディウム・ファルシパルム（PlasmodIUm falciparum）またはプラスモディウム・オバール(PlasmodIUm ovale)であり得る。本発明の方法は特に、マラリアが大脳へ進行するのを防止する方法を意図している。
本発明の第3の態様ではHIV、リューマチ性関節炎および多発性硬化症のごとき自己免疫不全であって、悪化と緩解を繰り返すか、また慢性に進行する、あるいはエイズのごとき免疫不全に対する治療方法を提供する。
さらに、本発明の方法および投与処方は他の治療とともに用いてもよい。例えば、ヘルペスウイルス感染には、アシクロビルまたはガンシクロビルを用い得る。HIV感染に対しては、アジドチンミジン（ジドブジン）または1または複数の他のHIV逆転写酵素阻害剤、および／またはHIVプロテアーゼ阻害剤を用い得る。
本発明の医薬組成物を調製する際には、当業者には明らかであるIFNのための広範囲の媒体および賦形剤を用いることができる。代表的な製剤の方法は、レミントン「ザサイエンスアンドプラクティスオブファーマシー(The Science and Practice of Pharmacy)第１９版、マックパブリッシング社、アメリカ合衆国ペンシルバニア州イーストン1995年およびこの前の版に開示されている。本発明のIFN製剤には米国特許第4,496,357号に記載のグリシンまたはアラニンのごとき安定化増強剤を添加してもよく、及び/または1または複数の担体、例えば担体タンパク質を添加してもよい。例えば、ヒトの治療のためには、医薬グレードのヒト血清アルブミンが、任意に希釈剤としてのリン酸緩液と共に通常用いられる。ヒトIFNのための賦形剤をヒト血清アルブミンとする場合には、ヒト血清アルブミンはヒトの血清由来のものであっても、組替により得られるものであってもよい。通常、血清アルブミンを用いる場合には、同種由来のものが用いられる。
IFNはIFNが投与対象の口腔粘膜洞と接触するようないずれかの方法で投与すればよい。すなわち本発明はいかなる特定の製剤にも限定されるものでないことが理解されなくてはならない。本明細書においてIFNを深部口腔粘膜洞内に投与する方法を説明する。これは、液状、固形状、エアロゾル状製剤によっても、また点鼻剤またはスプレーによっても、達成し得る。従って、本発明は液状、固形状、シロップ剤、トロ−ーチ剤、頬錠剤、およびネブライザーの処方を含むが、これらに限定はされない。エアロゾルまたはネブライザー処方の場合には、製剤の粒子サイズが重要であり、当業者は粒子サイズを調節する適当な方法を見出し得る。
ひとつの態様において、インターフェロンは一回投与量を投与する。他の態様においては、インターフェロンはより低い容量のものを複数回投与して、あるいは一定時間の間持続的に分配させて、一回量投与と均等な効果を得るようにしてもよい。この持続分配の一例としては、放出遅延あるいは放出調節装置を咽頭腔内に付着させ、もしくは埋め込み、インターフェロンの高濃度一回量に匹敵する量を一定期間放出させるようにする方法がある。
インターフェロンの口腔粘膜投与のための代表的な製剤は以下の処方である（％はｗ/ｗを示す）：
錠剤：デキストロースＢＰ  ４５％；ゼラチンＢＰ  ３０％；小麦デンプンＢＰ  １１％；ナトリウムカーメロース(carmellose sodium)ＢＰ  ５％；卵アルブミンＢＰＣ  ４％；ロイシンＵＳＰ  ３％；プロピレングリコールＢＰ  ２％；およびIFN-α２  106IU。この錠剤はそのまま用いて口内でゆっくり溶解させても、水中に溶解させたものを必要に応じて口中に保持して口腔粘膜と接触させてもよい。
インターフェロンペーストの製剤例は米国特許第4,675,184号に開示されている。グリセリン  ４５％、ナトリウムＣＭＣ  ２％、クエン酸緩衝液（pH４．５）  ２５％，蒸留水  全体を10０％とする量、およびIFN-α２  106IU。インターフェロンペーストは、頬粘膜に貼り付ければよい。
同様に、含嗽剤またはシロップの場合には所望の量のインターフェロンを市販のマウスウオッシュもしくは咳止めシロップの処方に加えて調製すればよい。
上記特定の用量の範囲内において、個々の症例における最適な治療は症状、疾患の段階、先に行った治療、他の継続している治療、対象哺乳類の総合的な健康状態とインターフェロンに対する感受性などに依存するものである。従って、医師もしくは獣医師がこれらの状況すべてを考慮して、その裁量により決定する。治療期間は当然のことながら治療すべき症状によって異なり、例えばエボラウイルス感染によるような、急性の感染症は、肝炎のような慢性症状の場合と異なる治療法が採用されるであろう。
本明細書に開示した有効用量は、哺乳類に非経口投与した場合に病的応答を生じさせないものである。病的応答は、急性、慢性もしくは累積的なものであり得、白血球減少などの血液化学的な変化、骨髄の減少、または他の病理パラメーターによって見出される。本明細書において、病的応答の語には熱、倦怠あるいは流感様症状、静脈炎のごとき血管の反応および注射部位の局所炎症反応などの好ましくない副作用を含むものとする。かかる応答は患者個々のインターフェロンに対する感受性の相違からしても、患者間でかなり異なるものである。インターフェロンの口腔粘膜投与による治療のための許容される低用量を決定するための簡単な試験は、患者の年齢、体重、適応症、進行度などから推定される許容量を注射し、この注射が上記に規定する病的応答を導くかどうかを確認することである。この際、注射部位の局所的な炎症の有無がもっとも容易な確認方法となる。副作用が認められない場合は、その同じ用量を口腔粘膜に投与し得る。望ましくない応答が認められる場合には、より低用量でこのプロセスの繰り返しを、病的応答を惹起しない用量を特定するまで行う。
多くの患者にとっての、口腔粘膜投与のための用量は現在承認されている非経口投与において耐容性があり、有効であると知られている用量とほぼ同じであると予測される。従って、特異性の目的のため、許容される低用量のインターフェロンの用量は、一日あたり約1500IU、好ましくは5000IUから約20×106IUのインターフェロンである。より好ましい一日用量は約１×104IUから約20×106IUのインターフェロン、もっとも好ましくは約１×104IUから約１×106IUのインターフェロンであって、非経口投与による病的応答を誘導しない用量である。ある態様においては、総用量を低用量を時間をかけて複数回投与することによって投与してもよく、または持続的に分配されるようあるいは脈動的に放出されるよう、口腔粘膜内に接着もしくは埋め込んだ調節放出装置によって投与してもよい。
インターフェロンおよびインターフェロン処方
マウスインターフェロン−α/β
マウスIFN-α/β（Mu IFN-α/β）は、公知の方法にてニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）で誘導した培養Ｃ２４３−３より調製し、精製した（Toveyら，Proc. Soc. Exp. Biol. and Med. 1974 146:809-815）。ここで調製した標品は水泡性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）でチャレンジしたマウス９２９細胞を用いて、以前に開示されたごとく(Toveyら，Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1974 146:809-815)アッセイしたところ４×106国際単位（IU）/mlの力価を有しており、５×107IU/mgタンパク質の特異活性を示した。標品は国立衛生局（ＮＩＨ）のマウスIFN-α/βの国際基準試料(G−002−9004−5411)に基づき標準化した。
ヒトIFN-α 1-8
組替えヒトIFN-α 1-8（Hu IFN-α 1-8；ＢＤＢＢロット番号ＣＧＰ３５２６９−１、チバガイギー、スイス国バーゼル）は先に開示されているごとくMeisterら、J.Gen.Virol.1986 67:1633−1643)調製及び精製したものである。この研究に用いられた標品をＶＳＶでチャレンジした同種ヒトＷＩＳＨ細胞上で既知の方法（Toveyら、Nature 1977 267:455-457）)によりアッセイしたところ７０×106IU/mlの力価を、そして異種マウスL929細胞でアッセイしたところ１×106IU/mlの力価を有していた。試料はＮＩＨヒトIFN-α国際基準試料（Ｇ-023-901-527）およびマウスIFN-α/β基準試料（Ｇ-002-9004-5411）に対して標準化した。このIFN試料の特異活性は2×108IU/ｍｇタンパク質であった。
組替えマウスインターフェロン-α
組替えマウスインターフェロン−αはライフ・テクノロジーズ・インコーポレイテッドより購入した。この試験に用いた試料（ロット番号ＨＫＫ４０４）はＶＳＶでチャレンジしたマウスのＬ９２９細胞で調べた場合(Toveyら，Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1974 146:406-415)６×106IU/mlの力価、特異活性は６×108IU/ｍｇタンパク質を有していた。
組替えマウスインターフェロンβ
組換えマウスインターフェロンβはＲ＆Ｄシステムズ・インコーポレイテッドより購入した。この実験に使用した試料（ロット番号1976-01S）は既知の方法でＶＳＶにてチャレンジしたマウスL929細胞にて測定した場合(Toveyら，Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1974 146:406-415)、3.2×104IU/mlの力価で、特異活性は８×106IU/ｍｇタンパク質であった。
組替えマウスインターフェロンγ
組替えマウスインターフェロンγはＲ＆Ｄシステムズ・インコーポレイテッドより購入した。この実験に使用した試料（ロット番号2580-03SA）は既知の方法でＶＳＶにてチャレンジしたマウスL929細胞にて測定した場合(Toveyら，Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1974 146:406-415)、2×105IU/mlの力価で、特異活性は1×107IU/ｍｇタンパク質であった。
すべてのインターフェロン試料は、同時に同じアッセイにて力価測定を行い、米国国立衛生局のマウスインターフェロン−α/βの基準試料(G-002-9004-5411)に対して標準化した。
マウスインターフェロン−α/βおよび組替えマウスインターフェロンは投与に先立ち賦形剤フェリミュン（商標；FerimmuneTM）に溶解して用いた。
賦形剤
インターフェロン試料はウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有する、リン酸緩衝生理塩水(PBS)にて希釈した。ウシ血清アルブミンフラクションＶ（ＲＩＡグレード；イムノグロブリン含まず;カタログ番号Ａ７８８８（米国シグマ社）を最終濃度が10０μｇ/mlとなるよう、ＰＢＳ(pH7.4)にて希釈し、フィルターを通して（0.2μ、ミリレックスＧＶ，米国ミリポア社）滅菌した。
明細書に記載した試験において、インターフェロン試料は適当な賦形剤で希釈して用いた。使用した賦形剤は以下の通り、錠剤（ファルマパシフィック社フェリミュン（商標））として提供されるものである。
0003806444.tif 000002
錠剤1個を1.5mlのリン酸緩衝生理塩水に溶解させ、16,000gにて15分間遠心分離し、次いでろ過滅菌(0.2ミクロン、ミレックス-GV、ミリポア)した後に４℃にて使用する前まで保存した。賦形剤は使用前に毎日調製した。
インターフェロン分配系
予備試験において、５μlのクリスタルバイオレットを正常成体マウスの両鼻腔へＰ20エッペンドルフマイクロピペットを用いて投与すれば、ほとんどその直後に染料が口腔咽頭洞表面の全体に広がることが示された。口腔咽頭洞の染色は、染料投与約30分後においても依然明白であった。本質的に同じ結果が、125I-標識化組換えヒトIFN-α 1-8を同じ方法で投与した場合にも得られた。従って、以下の実施例ではこの投与方法を用いた。
本明細書の動物実験の記載において、IFN投与形路に関しての「口腔粘膜」、「口腔咽頭」または「鼻腔内/経口」または「鼻腔内プラス経口」または「in/or」の用語は、IFN試料の深部鼻腔洞へ口腔粘膜洞内に迅速に分配されるよう投与することを意味する。すなわち投与対象哺乳類のの口および喉に投与して、その洞内の粘膜層と接触させるのである。
ＥＭＣＶ（脳心筋炎ウイルス）
バッチ：ロット番号095001
有効期限：1997年12月
調製：EMCVのJH株は、マウスL929細胞上で、既知の方法にて増殖させた（Gresser I., Bourali C, Thomas MT, Falcoff E.，脳心筋炎ウイルス感染マウスにおける、インターフェロン製剤の繰り返し投与の効果：Proc Soc Exp Biol Med 1968 Feb;127:491-6）
分析：本試験に用いたウイルスの保存液の力価はマウスL929細胞上で、5×108.62TCID50であった。
保存：保存EMCVは−70℃で保存した。ウイルスタイトレーションの1日目に電源を切断するのでほぼ同じ温度での保存のバックアップが必要になる。残りの物質は常に凍結したままとした。ウイルスタイトレーションの＋８日に、−70℃のフリーザー温度を−60℃にまで上昇させた。希釈したEMCVは使用直前に調製し、氷上あるいは動物室の冷蔵庫内で保存した。
動物
本研究で用いたマウスは特別無菌コロニーで生育されたマウスである（IFFA ＣＲＥＤＯ、フランス）。使用マウスは、ヴィレジュー（Villejuif）にあるインスティテュートフェデラティフＣＮＲＳ内の、EEC基準に基づく特別な無菌状態の部屋で飼育して用いた。
インターフェロンバイオアッセイ
インターフェロンのアッセイは常套の方法に基づいて行った。簡単に説明すると、試料（20μl）を、２％熱非動化ウシ胎児血清(FCS)（フランス、ギブコ社）含有イーグル最小限必要培地（MEM）（フランス、ギブコ社）80μlに希釈して、多チャンネルマイクロピペット（フィンピペット、ラブシステム社  50-300μl）を用い、マイクロタイタープレート（ファルコン社、カタログ番号3072）の各ウエルへ添加した。WISHまたはＬ929細胞（２×104細胞/ウエル）を２％FCS含有MEM100μlに希釈し、各ウエルへ添加し、37℃、空気中のCO25％という環境下にて（フォーミュラ3029 CO2インキュベーター）一晩インキュベートした。細胞をその後10倍の対物レンズを装着したオリンパスIM ＧＬＤＷ倒立顕微鏡にて観察し、毒性を示す兆候がないかどうかを調べた。検出可能な毒性を示さなかった試料につき連続的二倍希釈物を調製した。最初の全量200μlの２％FCS含有イーグルMEM培地で１：10希釈しているものから出発し、その100μlを多チャンネルマイクロピペットで取り、これを新しい２％FCS含有イーグルMEM培地を各ウエルにつき100μl入れておいたマイクロプレートに移した。ＮＩＨヒトIFN-α基準試料(G-023-901-527)およびNIH Mu IFN-α/β基準試料(G-002-9004-5411)をそれぞれ連続二倍希釈して基準試料も調製した。100μlの2％FCS含有イーグルMEMにWISHもしくはL929細胞（2×104細胞/ウエル）を分散したものを、各基準試料プレートに添加して、３７℃で一晩、空気中5％CO2という条件下でインキュベートした。細胞単層を観察して、明らかな毒性が認められるかどうかをチェックし、その後明らかな毒性の認められなかったものは培養液を吸い取り、100TCID50のVSVを含む（WISH細胞に対しては２×10-4VSV23、L929細胞に対しては10-5VSV23）FCS含有イーグルMEMに培地を置き換えた。プレートを37℃、5％CO2空気という条件下でさらに一晩インキュベートした。ウイルス特異的細胞病理学的影響を細胞単層をオリンパスIM ULWD倒立顕微鏡を用いて観察して調べた。インターフェロンの力価は、ウイルス特異的細胞病理学的影響から50％保護する希釈濃度の逆数から決定し、国際基準単位/mlとして示した(IU/ml)。
実施例１
ウイルス感染に対する,インターフェロン口腔粘膜投与の効果
脳心筋炎ウイルス（EMCV）をマウスの腹腔内に投与して感染させると、CNSの不全および脳炎に特徴付けられる、急速に進行する致死疾患が生じる（Rueckart, R.R., Virology,Fields ed., 705-738,1985, Raven Press, New York）。IFN-αは致死EMCV感染に対して予防的に投与しても、あるいは例えウイルスの複製が標的臓器において発生した後に投与してもいずれも保護作用を示すことが示されている(Finter, N/B/; Front. of Biol., 1973 2 135-147)。本試験において我々は、口腔粘膜投与された低用量の天然および組替IFNの、致死量のEMCVを投与されたマウスの生存率に対する効果を調べたが,これは非常に厳しい抗ウイルス活性の試験である。
脳心筋炎ウイルスのＪＨ株を公知の方法にてマウスL929細胞上で増殖させた(Gresser Proc. Soc.Exp.Biol.and Med., 1968 127:491-496)。本試験で使用した保存用ウイルス（EMC-α）の力価はマウスL929細胞に対して5×108.62TCID50であった。
致死量のEMCV(300LD50)にて感染させたマウスへ200または2000IUのMu IFN-α/βまたはHu IFN-α 1-8をin/or経路で投与したところ、平均生存期間を増加させた。表1及び2に示した6回すべての試験において、Hu IFN-α 1-8はMu IFN-α/βと同程度の有効性を示した。
IFNをin/or経路で投与したところ、行った9試験のうちの6試験において、統計的に有意な生存期間の延長が認められた。さらに、すべての試験において、有効であるという傾向が認められた。
ip経路による投与(1投与あたり200μl)では、平均生存期間の有意な延長が8試験中7試験において認められた(表1及び2)。
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表1及び2のデータから、ipおよびin/or投与は直接比較が可能であり、ip経路の投与はわずかに有効（7/16件）なだけであるか、有意な差が無い（9/16件）ことが明らかである。
我々の予備試験のデータでは、いずれかの経路でインターフェロンを1日2回投与しても（表3）、マウスを感染から保護する作用の有意性を、1日1回投与(表1,2)と比して増加させることはなかった。
実施例２
EMVCの経口感染に対する予防的および治療的比有効性
200または2000IUのHu IFN-α 1-8をin/orまたはipにて投与したところ、EMCVの感染の日からIFN投与を開始し、感染後4日間投与しつづけた場合と、ウイルス感染の4日前からIFN投与をはじめ、感染の日に投与を止めた場合では、処置マウスの平均生存日数には有意な差が無かった(表3)。
この結果は、致死量のEMCVを感染させたマウスへ低用量のIFNを口腔粘膜を介して投与したところ、その生存期間は対数ランクのＸ二乗検定より判断すれば（Mantel,1966）、統計的に有意に増加したことを示す。
実施例３
水泡性口内炎ウイルスの口腔粘膜投与による効果
特別無菌飼育コロニーから得た1群10匹の6週令のマウスへ、100LD50の水泡性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）(Toveyら、Proc.Soc.Exp.Biol.Med., 1974 146:406-415)を10μlの体積として経鼻感染させた。ウイルス感染7時間後に感染マウスに対して、無処置、一定量のマウスインターフェロンα/βをフェリミュン賦形剤で10μl量としたものを口腔粘膜経路で1日1回、4日間投与、同じスケジュールでの10μlの賦形剤単独投与（コントロール）のいずれかの処置を行った。
成体マウスをマウスインターフェロンα/βにて処置することによって、VSVの致死量で感染させた動物の生存率に顕著な増加が認められた。即ち、致死量のSVSウイルスの感染後10日目に無処置およびコントロールのマウスがすべて死亡したという系において、10,000IUのインターフェロンα/βを投与されたうちの３０％の動物が、ウイルス感染後21日目でも生存していた。臨床所見からは、21日目に生存していたほとんどの動物は、なお生存しつづけることが示唆された。
実施例４
細胞タンパク質の発現における口腔粘膜インターフェロンの効果
IFN-αは細胞受容体に結合した後、数多くの細胞タンパク質の発現を誘導することが知られている。これらのタンパク質は、インターフェロン作用のマーカーとして有用であると考えられている。
われわれは、in/or経路でIFN-αを投与した場合の3種類のIFN誘導タンパク質、MHCクラスI抗原、Ly6 A/E抗原および2'5'-オリゴアデニル酸合成酵素の発現を調べた。
ip投与した場合にはたった20IUのMu IFN-αによって末梢血単球および顆粒球のＨ−２Ｋd抗原の発現が顕著に増加する系において、DBA-2マウス（H-2Kd）に対し、20,000IUまでのMu IFN-αをin/or経路にて投与したが、末梢血リンパ球、単球もしくは顆粒球上のH-2Kdの発現の有意な増加は認められなかった。実際には、単球上への発現は少し減少した。
同様に、Ｉ型IFNの腹腔内投与によって、各種リンパ球細胞上のLy6 A/E抗原の発現は顕著に増強されている（Dumontら、J.Immunol, 1986 137:201-210）のであるが、20,000IUまでのMu IFN-αのin/or経路による投与は、Ly6 A/E抗原の発現に対して、有意な効果を及ぼさなかった。同様の結果がMu IFN-αもしくはHu IFN-α 1-8の200および20,000 IUをin/or経路で投与した場合にも得られた。
スイスまたはDBA/2マウスのいずれにおいても20IUという少量のMu IFN-αを腹腔内に投与すると、末梢血単核球および脾細胞の両方に顕著な2'5'-オリゴアデニル酸成酵素活性の上昇が認められた。これに対して、同じ試験において、20,000 IUまでのMu IFN-αをin/or経路に投与しても、2'5'-オリゴアデニル酸合成酵素発現の有意な増加は認められなかった。さらに、Mu IFN-αもしくはHu IFN-α 1-8の200および20,000 IUをin/or経路で投与した場合、IFNの投与開始後10日間にわたるいずれの時点においても、2'5'-オリゴアデニル酸合成酵素発現の有意な変化は認められなかった。
実施例５
インターフェロンの口腔粘膜投与後の生体利用度
IFNの生体利用度および薬物動態を調べるため、かかる研究に最も適した薬物-血液量比を有するマウスを用いた。マウスに、一回量の高用量の組替えIFN-αを投与したが、この際に、可能な限り高い比放射能の125Ｉで標識したものを用いた。
精製した70×106IUのHu IFN-α 1-8を1.4mlのＰＢＳに溶解させ、Mogensenら（Int.J.Cancer,1981 28:575-582）による、HunterとGreenwood(Nature, 1962 194:495-496)のクロラミン-T法の改良法を用いてヨウ素化した。
ヒトWISH細胞をVSVに暴露したものでは、125Ｉ標識Hu IFN-α 1-8(ロット番号CGP35269-1)は2×107IU/mlの生物活性を示し、L929細胞をVSVに暴露したものでは1×106IU/mlの活性を示した。
６−７週令のメスのスイスマウスにiv、ipもしくはin/or経路にて2×107IU、即ち１×106マウスIUの125I Hu IFN-α 1-8（1.0369×107cpm/マウス）と等価なものをを処置した。示した時間において、各群3匹をマウスを殺し、血液を集め、その量を測定した。腎臓、肝臓、肺、脾臓、および胃/食道を取り、水分を吸い取った後に±10μｇの精度にて重量を測定した。各試料の放射活性をγカウンターを用いてそれぞれ測定した。次いで全血を遠心分離（800g×10分、4℃）で分離して、血清を分取し、計測した後に-80℃にて凍結した。血清は上記のごとくヒトWISH細胞およびマウスL929細胞の両方による標準バイオアッセイによってIFN濃度を調べた。血清試料中の放射活性物質を次いでアフィニティー免疫沈降によって単離させ、SDS-PAGEにて分析した。
1.0369×107cpm/マウスの125I標識Hu IFN-α 1-8のiv一括投与5分後に、非常に高レベルの放射活性(＞2×106cpm/ml)が動物の末梢血から検出された。全血の放射活性は15分及び30分の時点では連続的に低下した。1.0369×107cpm/マウスの125I標識Hu IFN-α 1-8のip一括投与5分後に動物の末梢血から検出された放射活性は、iv一括投与の5分後に検出されたものの約20倍低かった。この場合放射活性のレベルは注射後15分及び30分において、累進的に増加した。125I標識Hu IFN-α 1-8のin/or投与後、5、10または15分後に動物の血中に検出される放射活性レベルは、同じ量の放射線標識IFNをip投与した後同じ時間に認められた量より、有意に低かった。これら3つの経路による投与において、125I標識Hu IFN-α 1-8のin/or投与後、全血より血清により高いレベルの放射活性が検出された。全血1ミリリットルあたりの放射活性が、同じ量の血清よりも低いということは、全血の細胞成分を除けば測定される血清の量が有意に多くなることによる。
すべてのマウスからの血清サンプルにつき、生理活性IFNの存在の有無を、上記に記載した標準的なバイオアッセイ法を用いて調べた。その結果、ivまたはipの経路で125I標識Hu IFN-α 1-8を投与したすべてのマウスにおいて、計測したいずれの時間においても容易に検出し得るレベルのIFNが認められた。これに対して、125I標識Hu IFN-α 1-8をip/or投与した群では、血清中に比較的高いレベルの放射活性が認められたのにもかかわらず、試験を行ったいずれの動物、いずれの時間においても生物活性を有するIFNは検出されなかった。
125I標識Hu IFN-α 1-8投与動物の血清から検出された放射活性物質が実際に本来のIFNの存在を示すものであるかどうかを調べるため、試料をタンパク質Ａ−Ｇアガロースを用いて免疫沈降させ、試料中にある免疫グロブリンを沈降させるため、アフィニティ-精製ずみポリクローナル抗IFN-α抗体で処理し、さらに免疫沈降を行った。試料を次いで上記のごとくＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）にかけた。
125I標識Hu IFN-α 1-8のivまたはip投与の後の血清内の放射活性物質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって、非投与125I標識Hu IFN-α 1-8と同一の電気泳動パターンを示して移動する、単一の均一なバンドが認められた。この物質の見かけ上の分子量はおよそ20000ダルトンであると測定されたが、これはそのままのHu IFN-α 1-8の分子量に対応する。一方、in/or経路により125I標識Hu IFN-α 1-8を投与したマウスの血清サンプルにおいては、各ゲルに等量の放射活性物質が検出されたが、いずれもがIFNと類似の見かけの分子量を有する物質を含有していなかった。
放射線標識した物質の臓器分布を調べたところ、125I標識Hu IFN-α 1-8のiv投与5分後に、非常に高いレベルの活性が腎臓に、高レベル活性が肝臓、肺および脾臓に認められた。これら４つの臓器の放射活性のレベルはそれぞれ、その後15分及び30分後には迅速に減少していくのが認められた。これに対して胃の放射活性レベルは15分及び30分において迅速に増加し、iv一括投与後30分の血清内と同じレベルにまで達することが認められた。
125I標識Hu IFN-α 1-8のip投与では、調べたすべての臓器において15分以内に活性がピークに達し、30分では減少した。同様に、125I標識Hu IFN-α 1-8のin/or投与の場合でも調べたすべての臓器における放射活性のピークレベルは15分後に達成され、30分後の測定では放射活性はいくらか減少していた。125I標識Hu IFN-α 1-8をin/or投与した場合の胃/食道における放射活性のレベルは、非経口投与で臓器にて検出された量より1オーダー多く、同量の放射線標識Hu IFN-α 1-8をivまたはipのいずれかの経路で投与した場合よりもかなり高いものであった。
実施例６
経鼻/経口で投与したインターフェロンの薬動態学
Hu IFN-α 1-8の精密な動態を調べるため、1.0369×107cpm/マウスの125I標識Hu IFN-α 1-8をiv、ipまたはin/orにてマウスに投与し、全血および血清の放射活性のレベルを24時間にわたり、一定時間毎に調べた。
一回のiv一括投与後のマウス血中125I標識Hu IFN-α 1-8の薬動態は、ほぼ対数カーブに沿ったものであった。これは非常によく似た分子である組換えヒトαA/D(Bgl)を用いてマウスで行われた先の試験の結果(Bohoslawedら、J.IFN Res 1986 6:207-213)と合致する。生物学的利用可能物質の量、即ち濃度対時間のカーブの下領域から計算される量もまた、ヒトαA/Dと同様であった。２相性時間消費クリアランスカーブが125I標識Hu IFN-α 1-8のiv一括投与後に認められたが、これは腎臓で排除されるもののカーブの特徴であり、この結果は実施例4の結果と合致する。125I標識Hu IFN-α 1-8をip投与した場合の薬物動態は、先に報告されているIFNをim投与した場合のものと非常によく似ていた。
容易に検出し得るレベルの生物活性IFNが、125I標識Hu IFN-α 1-8のiv一括投与あるいはip投与後のいずれにおいても、すべての動物の血清に認められた。125I標識IFN-α 1-8のin/or投与後の血清には抗ウイルス活性は認められなかったが、同じ動物においてEMCVの致死量の感染に対する統計的に有意な保護作用が認められてた（表4）。
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考察
急性ウイルス感染の確立された基本的なモデルにおいて我々の得たこれらの結果は、低用量IFN口腔粘膜投与を全身性ヒト急性ウイルス感染症の治療に用いるための「原理の立証」を支持する疑う余地のない証拠を提供するものであり、このモデルにおいて、天然の複合IFN-αサブタイプ混合物および単一リコンビナントIFN-αアイソタイプ(例えばMu IFN-α)の両方が、統計的に有意な抗ウイルス活性を生ずることを示すものである。天然Mu IFN-α/βおよびHu IFN-α 1-8は口腔粘膜経路で投与した場合に等しく有効であった。組替えMu IFN-βおよびMu IFN-γもまた、同等の抗ウイルス活性を示した。
一定の型および用量のIFNを口腔粘膜経路で投与した場合に得られる保護の程度を、全身投与（ip注射）により得られるものと比較したところ、いくつかのケースにおいてはIFNの非経口投与のほうがほんの少し有効度が高いが、他のケースでは、有効性が口腔粘膜経路を越すということはなかった。
バイオマーカーのパイロット試験において（実施例４）は、試験した3つのバイオマーカー（MHCクラスI抗原、Ly6 A/E抗原および2'5'-オリゴアデニル酸合成酵素活性）のいずれもが、このIFN-α/βをin/or投与した際に得られる非常に顕著な抗ウイルス活性を反映していないことは、明らかである。
腹腔内投与した場合には、20IUという非常に少ない量のIFN-αでも、上記３つのバイオマーカーすべてを非常に顕著に発現する一方、口腔粘膜険路ではIFN-αを20,000IUまで投与しても何ら検出可能な変化が出ないというこの両者の間の差異は非常に大きなものである。
生物マーカーのうちのいずれかに対する効果が、より早い時期、もしくは中間時において認められるかもしれない可能性を除くことはできないが、これはありそうにない。というのは、IFNがこれらのタンパク質をコードする遺伝子の転写に影響を及ぼすよう働き、そのためにIFN処置後数時間まではいずれかの生物マーカーの変化が認められるということは通常は考えられないからである。
また、他の多数のIFN誘導性タンパク質のうちのいずれかがIFN-αの口腔粘膜経路投与の後に何らかの全身性作用を及ぼす可能性も除くことはできないが、特定のIFN-誘導遺伝子の発現の分化制御を含むことになり、この可能性も低い。しかしながら、IFNバイオマーカーへの影響が局所で、例えば口腔粘膜経路でIFN-αを投与した後、鼻リンパ球上で観察されることはあり得る。
試験した生物マーカーの検出可能な影響が認められなかったことと対応して、IFNの口腔粘膜投与療法中にモニターした血液学的または血液化学的パラメーターには、20000IUまでのIFN-αを投与された動物でさえ、対応する変化はなかった。
薬動態-生理活性試験の結果は、放射標識Hu IFN-α 1-8を口腔粘膜経路で一回投与したが、末梢血には先に使用されたものよりも1オーダー感受性の高い系で試験しても循環IFNが認められない条件下で、統計的に有意な全身性の抗ウイルス効果が得られるというものである。この結果と調和して、IFNの口腔粘膜投与によって惹起される抗ウイルス性活性の度合いは、古典的な用量-効果関係をとる。
容易に検出し得るレベルの放射性標識物質が125I標識IFN-α 1-8の口腔粘膜投与後の全血および血清に認められた。この結果は大量の非標識IFNの経口投与後の動物の血清にIFNを検出することができなかったとする先の結果と反する。しかしながら、口腔粘膜投与の後に全血および血清の両方に検出された放射活性物質は、生物的には不活性であった。さらに、SDS-PAGE分析の結果から、この物質は低分子量のものであり、胃及び小腸におけるIFNの消化後の分解生成物であるとの可能性が最も高い。口腔粘膜投与後の放射標識物質の組織移行分析では、他のいずれの臓器よりも顕著に高いレベルの放射活性が胃に認められた。これらの結果は、生物的に活性なIFNは口腔粘膜投与の後には吸収されないにもかかわらず、この投与によって統計的に有意な抗腫瘍活性がインビボで示されるということをはっきりと示す。
見出された有用な効果をいかなる既に提案されている機構と結びつけるつもりはない。われわれの結果は、口腔粘膜経路で投与されたIFNは現在、また見出されていない新規な機構によってウイルスに影響を及ぼしていることを示唆するものである。この新規な機構は、外部から投与されたIFNの直接作用を含まず、また体内のIFNの誘導も含まないものである。これは、検出し得るレベルの循環IFNが認められなかったこと、または３つの生物マーカー試験で支持される。この機構は少なくともその一部分は、鼻腔及び口腔をとりまく大量のリンパ組を刺激することによるものであると考えられる。われわれは、口腔粘膜IFNが全身投与したインターフェロンと少なくとも同等の効力を有することを示したが、この結果は本発明のIFNをウイルス性疾患の治療においてインターフェロンを口腔粘膜経路で投与することを強力に支持するものである。これは、IFNの臨床使用に、重要なかかわりを持ち得る。
発明の明確性および理解のために発明をかなり詳しく説明したが、本技術分野においての知識を有する者にとっては、開示した態様および方法の様々な改良および改変は本明細書に開示した発明のコンセプトの範囲からはずれることなく、実施され得ることは明らかである。