(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号３で記載されるアミノ酸配列からなるハンセヌラポリモルパ由来のγ-グルタミルシステイン合成酵素。
【請求項２】
請求項１の合成酵素をコーディングする遺伝子。
【請求項３】
配列番号１の４５１番から２４０３番までの塩基配列からなる請求項２に記載の遺伝子。
【請求項４】
請求項２または３の遺伝子を含む発現ベクター。
【請求項５】
前記発現ベクターはpG24である請求項４に記載の発現ベクター。
【請求項６】
請求項４または５の発現ベクターを宿主細胞に形質導入した形質転換体。
【請求項７】
pG24発現ベクターを大腸菌DH5aに形質導入した形質転換体(寄託番号  KCTC10370BP)である請求項６に記載の形質転換体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、グルタチオン生合成遺伝子に関するものである。より具体的には、グルタチオン生合成機能欠損変異株に導入する時、グルタチオン生合成機能と共に重金属耐性及び細胞増殖機能を回復させるγ-グルタミルシステイン合成酵素に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
グルタチオン(glutathione, GSH)は、好気性原核細胞と真核細胞内に最も多いチオール(thiol)系化合物であり、酸化ストレス反応及び重金属のような生体異物質の毒性に対する防禦反応に関与する重要な生理的機能を持ったトリペプチドである。γ-グルタミル-L-システイングリシン(γ-glutamyl-L-cysteineglycin)を構成成分とするグルタチオンは細胞内で、L-グルタミン酸、L-システイン及びグリシンを利用してγ-グルタミルシステイン合成酵素(γ-glutamylcysteine synthetase, 以下「γ-GCS」と略称する)及びグルタチオン合成酵素(glutathione synthetase, 以下「GS」と略称する)の連鎖作用によって生成される。グルタチオン生合成関連酵素のγ-GCSとGSをコーディングする二遺伝子は、大腸菌、植物、ネズミ及び人体(Griffith and Mulcahy, Advances in Enzymology and Related Areas of Molecular Biology, 1999, 73, 209-267)だけではなく、酵母のサッカロマイセスセレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)及びスキゾサッカロマイセスポンベ(Schizosaccharomyces pombe)から分離された(Ohtake and Yabuuchi, Yeast, 1991, 7, 953; Al-Lahham等, Yeast, 1999, 15, 385)。
【０００３】
サッカロマイセスセレビシエの場合、グルタチオン生合成経路の一番目段階であり律速段階(rate-determining step)に関与する酵素のγ-GCSをコーディングするGSH1 遺伝子の発現が反応性酸素族(H2O2)、過酸素陰イオン発生系及び重金属カドミウム等によって調節される。これは、転写因子のYap1、Skn7、Met-4、Met-31、Met-32及びCbf1によって調節されたと報告されている(Wu等, Mol. Cell. Biol., 1994, 14, 5832; Lee等, J. Biol. Chem., 1999, 274, 16040; Dormer等, J. Biol. Chem., 2000, 275, 32611)。
グルタチオンは、メタノール代謝過程に必須的な役割を担当している。メタノール代謝過程を見ると、メタノールはペロキシゾームでホルムアルデヒドと過酸化水素に転換され(Sahm H., Adv. Biochem. Eng., 1977, 6, 103)、転換されたホルムアルデヒドは、細胞質に行ってギ酸に酸化され脱水素酵素(dehydrogenase)反応によって最終的に二酸化炭素になる。ホルムアルデヒドが酸化されるためには、補助因子にグルタチオンを利用したNAD+-依存脱水素酵素にとって反応が進行される。また、メタノールで培養されたキャンディダボイディニ(Candida boidinii)の場合、ペロキシゾームの膜表面で生成されるアルキルハイドロペロキサイド(alkyl hydroperoxides)に対する反応に関与するグルタチオンペロキシダーゼのCbPmp20蛋白質と共に相当な濃度の還元型グルタチオンがペロキシゾーム部位で観察された(Sakai等, Microbiology, 2002, 148, 2697)。
【０００４】
上記の研究報告を通してグルタチオンは、メタノールの酸化に随伴する多様な代謝産物を無毒化(detoxification)することに関与するため、メタノール代謝に必須的であることが分かった。実際に、メタノールは細胞内にグルタチオン含量を増加させることが報告されていて、特にホルムアルデヒド脱水素化酵素欠損変異株で、その現象がさらに明確に現れた(Sibirny等, Arch. Microbiol., 1990, 154, 566)。したがって、メタノールを唯一な炭素源に使用するメタノール資化性酵母は、グルタチオンのよい供給源になると期待されている。
グルタチオンは、酵母のような微生物の外にも動物の肝臓等にも広く分布していて、生体内の呼吸系、酸化還元反応、解毒作用、酵素復活作用、補助酵素としての作用等、重要な生理作用を持っている。また、有毒化合物、反応性酵素誘導体及び放射線による酸化損傷に対する細胞保護物として、そして、一般的に細胞に損傷を与える物質を不活性化させるにおいて重要な役割をしている。
【０００５】
上記で明らかにしたように、多様な機能を持ったグルタチオンは、肝機能強化や脱毒性のための治療剤に有用であるだけではなく、スポーツ飲料等の健康補助のための食品添加剤に活用でき、グルタチオンの大量生産に対する需要が漸次増加している(Yin等, Chinese J. Biotech., 1998, 14, 85)。従来には、グルタチオンを生産するためには、醗酵工業的製造方法で酵母を培養してその培養された酵母からグルタチオンを抽出する方法が広く利用されてきた。例えば、酵母培養にあたり、グルタチオンを構成する3種のアミノ酸であるL-システイン、L-グルタミン酸及びグリシンを単独または混合添加する方法(日本特許 第48092579号及び第53094089号)、L-システインを添加する方法、メチオニン及びその誘導体を添加する方法があった。または、培養する酵母において、突然変異菌株であるメチオニンアナログ耐性菌株を利用する方法、メチオニンまたはメチオニン・リジン要求菌株を利用する方法、LまたはD,L-エチオニン感受性菌株を利用する方法等があり、報告された(米国特許 第4596775号及び第4582801号)。
【０００６】
近来では、遺伝子組換え技術の発達によってグルタチオン生合成に関与する酵素の遺伝子を大腸菌または酵母に多重導入することによってグルタチオンの生産性を高める研究が行なわれている。その例として、大腸菌由来のグルタチオン生合成関連遺伝子のgshI及びgshIIを多重コピープラスミドに挿入して大腸菌に導入する場合、細胞内でグルタチオン合成系の非酵素活性が40倍上昇した(Watanabe等, Appl. Microbiol. Biotech., 1986, 24, 375; 日本特許 第20316900号)。また、gshI及びgshIIを多重コピープラスミドに挿入してサッカロマイセスセレビシエに導入した場合、細胞内で30%程度のグルタチオン生産が増加した(日本特許 第61052299号及び欧州特許 第0300168号)。
【０００７】
一方、グルタチオンの高い重金属吸着能を活用して重金属に対する耐性及び蓄積能が向上した組換え菌株を開発する目的で、グルタチオン生合成遺伝子が有用に活用されている。一例として、γ-GCSとGSをコーディングする大腸菌由来の遺伝子であるgshI及びgshIIを過発現させたインド芥子(Brassica juncea)苗木は、野生苗木に比べてカドミウム(Cd)に対する耐性が増加され、ピトチェラチン(pytochelatin)、γ-グルタミルシステイン、グルタチオン及び総非たんぱく質形チオールの濃度が増加した(Zhu等. Plant Physiology, 1999, 121, 1169; Zhu等, Plant Physiology, 1999, 119, 73)。さらにグルタチオン合成関連遺伝子の発現は、重金属のような毒性物質の存在可否によって敏感に調節及び誘導される(Dormer等 J. Biol. Chem., 2000, 275, 32611)。したがって、γ-GCS及びGSをコーディングする遺伝子由来のプロモータを発光蛋白質、または蛍光たんぱく質等のようなリポーターたんぱく質発現のためのプロモータに使用すれば、毒性物質探知用バイオセンサー開発に必要な組換え菌株開発に有用に活用できる(国際公開番号W09008826号)。
【０００８】
伝統的酵母のサッカロマイセスセレビシエ及び分裂酵母のスキゾサッカロマイセスポンベの場合、グルタチオン生合成の始めの段階に作用するγ-GCSをコーディングする遺伝子のGSH1またはGCS1が欠損したgsh変異株等は、グルタチオンが添加されていない合成培地で生育できず、MNNG(N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine)に対する抵抗性が顕著に強化され、カドミウムイオンに対する敏感性が増加される特徴を示した(Kistler等, Mutat. Res., 1986, 173, 117; Glaeser等, Curr. Genet., 1991, 19, 207)。
また、本発明者達は、メタノール資化性酵母のハンセヌラポリモルパ(Hansenula polymorpha,一名Pichia angusta)でMNNGに対する耐性を持つ反面、カドミウムイオン及びメタノールに敏感に反応して、メタノールまたは複数炭素源を基質にするグルタチオン欠乏培地では成長できない変異株を分離したことがある(Ubiyvovk等, Microbiology, 1999, 68, 26)。「gsh1-2 leu1-1」及び「gsh2-1 leu1-1」と命名されたハンセヌラポリモルパのgsh1及びgsh2 変異株は、野生型菌株に比べて細胞内総グルタチオン含量が極端に少なく、γ-GCS活性はないがGS活性は野生型菌株と似ていた。また、gsh2変異株は、カドミウムにとても敏感である反面、gsh1変異株はクロムに非常に敏感だった。
【０００９】
それで、本発明者達は、生体内で重要な生理作用をし、重金属吸着機能を持ったグルタチオンを大量生産するために本発明者達が分離した変異株(Ubiyvovk等, Microbiology, 1999, 68, 26)からグルタチオン生合成に関与する重要な遺伝子をクローニングし、これをグルタチオン欠乏変異株に導入することによってグルタチオンの生合成が増加して重金属に対する耐性が回復されることを確認して本発明を完成した。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、γ-グルタミルシステイン合成酵素、上記酵素をコーディングする遺伝子、上記遺伝子を含む発現ベクター、上記ベクターを形質導入した形質転換体、上記形質転換体を利用してグルタチオンを大量生産する方法を提供することである。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するために、本発明は、ハンセヌラポリモルパ由来のγ-グルタミルシステイン合成酵素のプロモータ及び遺伝子を含むゲノミックDNAを提供する。
また、本発明は、ハンセヌラポリモルパ由来のγ-グルタミルシステイン合成酵素のプロモータを提供する。
また、本発明は、ハンセヌラポリモルパ由来のγ-グルタミルシステイン合成酵素を提供する。
【００１２】
また、本発明は、上記γ-グルタミルシステイン合成酵素をコーディングする遺伝子を提供する。
また、本発明は、上記遺伝子を含む発現ベクターを提供する。
また、本発明は、上記ベクターを宿主細胞に導入した形質転換体を提供する。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、ハンセヌラポリモルパ由来のγ-グルタミルシステイン合成酵素のプロモータ及び遺伝子を含むゲノミックDNAを提供する。
本発明の配列番号1で記載される遺伝子は、γ-グルタミルシステイン合成酵素(γ-glutamylcysteine synthetase)活性が欠乏したハンセヌラポリモルパ変異菌株(gsh2)のグルタチオン生合成能を回復させる機能がある。上記DNAは、γ-グルタミルシステイン合成酵素のプロモータ及びγ-グルタミルシステイン合成酵素をコーディングする遺伝子を含んでいる(GenBank, 寄託番号AF435121)。上記遺伝子全体4195個の塩基配列中で1番から450番までは、γ-グルタミルシステイン合成酵素のプロモータ部位であり、451番から2403番までは、γ-グルタミルシステイン合成酵素をコーディングする遺伝子部位(open reading frame, ORF)であり、残りの2436番から3140番及び2691番から3146番までは、報告されていないたんぱく質コーディング遺伝子部位(ORF)である。
【００１３】
また、本発明は、 ハンセヌラポリモルパ由来のγ-グルタミルシステイン合成酵素のプロモータを提供する。
本発明のプロモータは、上記配列番号1で記載される塩基配列の1番から450番までの配列からなり、グルタチオン生合成に関係するγ-グルタミルシステイン合成酵素の発現を誘導してグルタチオンの生合成を増加させる役割をするプロモータであり、配列番号2で記載される塩基配列またはその一部塩基配列であり得る。また、グルタチオン合成関連遺伝子の発現が重金属のような毒性物質の存在可否によって敏感に調節され誘導されることによって、本発明のプロモータと一緒に発光たんぱく質または蛍光蛋白質のようなリポーター蛋白質をコーディングする遺伝子を含む発現ベクターを製造して形質導入させた組換え菌株を利用すれば、毒性物質を探知するのに有用にたやすく使用できる。
【００１４】
また、本発明は、ハンセヌラポリモルパ由来のγ-グルタミルシステイン合成酵素を提供する。
本発明者達は、γ-グルタミルシステイン合成酵素活性の欠乏によってグルタチオン生合成能が欠損したハンセヌラポリモルパ変異菌株のグルタチオン生合成能を回復させる機能を持った配列番号1で記載される塩基配列に3個のたんぱく質コーディング遺伝子部位(451番から2403番、2436番から3140番及び2691番から3146番)が存在することを確認した後、これらの各々の遺伝子が含まれた発現ベクターを製造して、これを形質導入した形質転換体を利用してグルタチオン生合成能力を調査した。その結果、451番から2403番のたんぱく質コーディング遺伝子部位を含む遺伝子で製造された形質転換体だけがグルタチオン生合成能力が増加したことが分かった(表2 参照)。
【００１５】
それで、上記451番から2403番のたんぱく質コーディング遺伝子部位がどのような蛋白質をコーディングするのかを分析するために配列の相同性分析を行なった結果、上記配列はキャンディダアルビカン(C. albicans)のGcs1p(GenBank 寄託番号AAG43412)遺伝子と53%の同一性と69%類似性を示し、サッカロマイセスセレビシエのScGsh1p遺伝子と47%の同一性と61%の類似性を示した。また、スキゾサッカロマイセスポンベのSpGcs1p遺伝子と46%の同一性と63%の類似性を示し、ヒト(Homo sapiens)のHsGCSh遺伝子と45%の同一性と63%の類似性を示した。他のγ-グルタミルシステイン合成酵素とも相当に高い類似性を示すことが分かった(図2 参照)。それで、本発明者達は、上記蛋白質がγ-グルタミルシステイン合成酵素であることを確認した。本発明のγ-グルタミルシステイン合成酵素は、上記配列番号1で記載される塩基配列の451番から2403番のたんぱく質コーディング遺伝子配列からコーディングされる配列番号3で記載されるアミノ酸配列を持っている。
【００１６】
また、本発明は、上記γ-グルタミルシステイン合成酵素をコーディングする遺伝子を提供する。
本発明の遺伝子は、上記でハンセヌラポリモルパのγ-グルタミルシステイン 合成酵素であることを確認した配列番号3で記載される酵素をコーディングする遺伝子であり、配列番号4で記載される塩基配列を持つことが好ましい。配列番号4で記載される本発明の遺伝子配列は、450bp程度の5' 隣接領域配列と1792bp程度の3' 隣接配列を持っていて、典型的なTATA ボックス、CAATボックス及びポリアデニレイション(polyadenylation)配列は、観察されなかった。しかし、たんぱく質翻訳開始コドンから上流416bp地点においてサッカロマイセスセレビシエのGSH1遺伝子発現を調節する蛋白質のCbf1が結合する部位と知られているCDEI-結合地域(GCACG)（「地域」は「領域」ともいう。以下、同様。）と推定される配列は観察された(図2 参照)。したがって、本発明の遺伝子は、反応性酸素族や重金属カドミウム存在可否により、Cbf1相同蛋白質によって発現が調節されることが分かった。
【００１７】
また、他の生物体由来のγ-グルタミルシステイン合成酵素のように本発明の遺伝子は、グルタチオン-結合蛋白質で一般的に観察されるグルタチオンとの特異的相互作用に関連する配列番号5で記載されるGWRVEFRPME モチーフ、保存されたリジン及びアルギニン残基を持っていて、酵素の活性中心部と推定される配列番号6で記載されるMGFGMGXXCLQ領域でよく保存されたシステイン残基を持っている(図2 参照)。
上記結果から、本発明の遺伝子はグルタチオン要求性補完機能と共にグルタチオン生合成経路で最も重要な第一段階の反応に作用するγ-GCSをコーディングすることが分かる。
【００１８】
また、本発明は、上記遺伝子を含む発現ベクターを提供する。
本発明の発現ベクターは、γ-グルタミルシステイン合成酵素を生産できるように製造した発現ベクターであり、グルタチオンの生合成を増加させられる発現ベクターである。本発明の好ましい実施例では、配列番号4で記載される遺伝子をpYT3 ベクターに挿入して製造したベクターを「pYT3-pG24」と命名した。
また、本発明は、上記ベクターを宿主細胞に導入した形質転換体を提供する。上記で宿主細胞は、バクテリア、酵母、真菌類、植物細胞及び動物細胞で構成された群から選ぶことが好ましい。本発明の好ましい実施例では、上記pYT3-pG24発現ベクターをグルタチオン生合成酵素が欠乏したハンセヌラポリモルパ変異菌株に導入した形質転換体を製造し、これを「Gsh+Leu+(pG24)」と命名した。また、形質転換体のグルタチオン生合成能力及び重金属耐性に対する反応を調査した結果、グルタチオン生合成能力が増加され重金属耐性が増加したことを確認した(表2 参照)。本発明者達は、pG24発現ベクターを大腸菌DH5aに形質導入した形質転換体を製造し、それを2002年11月8日付けで、韓国生命工学研究院遺伝子銀行に寄託した(寄託番号  KCTC10370BP)。
【００１９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を実施例によって詳細に説明する。
但し、下記の実施例は、本発明を例示するだけのものであって、本発明の内容が下記の実施例によって限定されるものではない。
<実施例 1> ハンセヌラポリモルパからグルタチオン生合成遺伝子のクローニング
本発明者達は、メタノール資化性酵母のハンセヌラポリモルパ(Hansenula polymorpha)菌株からMNNG(N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine)に対する耐性を持つ反面、カドミウムイオンとメタノールに敏感に反応し、グルタチオン欠乏培地では成長できない変異株のgsh1(gsh1-2 leu1-1)及びgsh2(gsh2-1 leu1-1)を分離したことがある(Ubiyvovk等, Microbiology, 1999, 68, 26)。上記gsh1及びgsh2 変異株は、野生型菌株に比べて総グルタチオン含量が非常に少なく、γ-グルタミルシステイン合成酵素活性が無いが、二番目グルタチオン生合成酵素の活性は、野生型菌株と類似であり、gsh2 変異株は、カドミウムにとても敏感である反面、gsh1 変異株はクロムにとても敏感だった。それで、本発明者達は、上記gsh変異菌株からグルタチオン生合成に関与する遺伝子をクローニングしようとした。
<1-1> グルタチオン要求性を回復する形質転換体の選別
本発明者達は、ハンセヌラポリモルパ-大腸菌シャトルプラスミドのpYT3(Genbank accession No. AF347016)にハンセヌラポリモルパCBS4732 leu2菌株(Centraalbureau voor Schimmelcultures, Delft, Netherland)のゲノムDNAライブラリー(Tan等, J. Cell Biol., 1995, 128, 307)がクローニングされたベクターを使用してハンセヌラポリモルパ変異株のgsh1-2 leu2(495-145L)とgsh2-1 leu2(495-40L)に既存の電気的方法(Faber等, Curr Genet, 1994, 25, 305)で形質転換させた。上記形質導入されたハンセヌラポリモルパ菌株をグルコースが含まれたグルタチオン無添加合成培地(10g/lグルコース、1μg/l ビオチン、0.2mg/lチアミンハイドロクロライド、微量元素、20mg/mlロイシン)(Sibirny et al.,Arch.Microbiol,1990,154,566)で培養した後、グルタチオンなしでも成長できる形質転換体を選別した。
【００２０】
その結果、gsh変異株のグルタチオン要求性を補完する機能を持つようになったことによってグルタチオン無しでも成長する形質転換体を選別した。上記形質転換体からプラスミドを分離してBamHIで切断して電気泳動で確認した結果、約7.5kb及び9.6kbのDNA切片があることを確認して、上記DNA切片各々が挿入されたベクターを「pG1」及び「pG2」と命名して、グルタチオン無添加培地で成長する上記ベクターが形質導入された形質転換体を各々「Gsh+Leu+(pG1)」及び「Gsh+Leu+(pG2)」と命名した。
<1-2> 形質転換体のグルタチオン生合成及び重金属に対する耐性の分析
本発明者達は、上記実施例<1-1>で選別した形質転換体がグルタチオンを生合成するかどうかを分析するために野生型菌株NCYC495 leu1-1(National Collection of Yeast Clustures, Food Reaearch Institute, Norwich, UK)、gsh変異菌株gsh1-2 leu1-1、gsh2-1 leu1-1及びグルタチオン遺伝子が導入された形質転換体Gsh+Leu+(pG1)及びGsh+Leu+(pG2)を1%が添加されたセミ合成培地(1%グリセロール、0.05%酵母エキス、20mg/lロイシン)で培養後グリセロール1%が添加された合成培地(グリセロール1%、ビオチン1μg/l、チアミンハイドロクロライド0.2mg/l、微量元素、ロイシン20mg/ml)(Sibirny et al.,Arch.Microbiol,1990,154,566)で14時間培養した。上記培養後、ブレッヘ及びバッシの方法(Brehe and Burch, Anal. Biochem., 1976, 74, 189)によって細胞破砕液から蛋白質(mg)に含まれた総グルタチオンの含量(nmol)を測定した。また、グルタチオンの生合成に関係した酵素のγ-グルタミルシステイン合成酵素(γ-glutamylcystein syntase, 以下「γ-GCS」と略称する)及びグルタチオン合成酵素(glutathion syntase, 以下「GS」と略称する)の活性を分析するためにセミ合成培地で培養された対数期中盤の細胞からウビボグの方法(Ubiyvovk等, Microbiology, 1999, 68, 26)にしたがって30分間、蛋白質(mg)に含まれたγ-GCS及びGSの含量(nmol)を測定した。また、重金属に対する耐性を分析するために1%グルコース重金属のカドミウム(0.05mM)またはクロム(0.4mM)を含む固体合成培地で酵母細胞を3日間培養後、酵母成長を観察及び分析した。
【００２１】
その結果、形質転換体Gsh+Leu+(pG1)及びGsh+Leu+(pG2)は、グルタチオン生合成が増加し、メタノールまたは複数炭素源(グルコース及びメタノール)を基質にした合成培地での成長能力が野生型水準に回復しただけではなく、カドミウム(Cd)及びクロム(Cr)イオンに対する抵抗性が野生型菌株と同じくらいに現れ、形質転換されていない gsh1とgsh2 変異株自体よりMNNGにさらに敏感に反応した(表 1)。
【００２２】
【表１】
0003783023.tif 000002
【００２３】
それで、Gsh+Leu+(pG1)及びGsh+Leu+(pG2)形質転換体に導入されたpG1及びpG2ベクターのインサートDNAを分析してみた(Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd edn. Cold Spring harbor laboratory press, Cold spring harbor, NY, 1989)。
その結果、pG1ベクターのBamHIで切断される7.5kb DNA切片は、四つのたんぱく質コーディング部位を含んでいるが、グルタチオン合成遺伝子とは関連しない遺伝子だった。次に、pG2ベクターのBamHIで切断される9.6kb DNA切片を再びBamHIまたはXbaIで切断した結果、3.9kb(BamHI)、4.0kb(BamHI)、3.3kb(XbaI)と4.2 kb(XbaI)の小さなDNA断片に切断されたことが分かった。それで、上記DNA切片各々をpYT3ベクターに挿入して製造したベクターを各々pG21、pG22、pG23及びpG24と命名した(図 1)。
【００２４】
上記ベクターをgsh2 変異株に再び形質転換させ、形質転換された各々の形質転換体を「Gsh+Leu+(pG21)」、「Gsh+Leu+(pG22)」、「Gsh+Leu+(pG23)」及び「Gsh+Leu+(pG24)」と命名した。 形質転換体を上記と同一な方法でグルタチオン生合成及び重金属耐性に対する分析した結果、Gsh+Leu+(pG24)形質転換体だけが野生型と同一にグルタチオンを生合成したことを確認した(表 2)。
【００２５】
【表２】
0003783023.tif 000003
【００２６】
<実施例 2> グルタチオン生合成遺伝子の分析
本発明者達は、上記実施例1でグルタチオン生合成能力が野生型に復帰したことが確認されたGsh+Leu+(pG24)形質転換体から標準酵母遺伝子方法を利用してpG24プラスミドDNAを分離し、アガロースゲル電気泳動によって分離されたDNAの大きさを確認した(Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd edn. Cold Spring harbor laboratory press, Cold spring harbor, NY, 1989)。上記確認されたDNAの塩基配列分析は、GPS-1ゲノムプライミングシステム(New England Biolabs, Beverly, MA, USA)及び塩基配列自動分析機(BigDye terminator cycle sequencing ready reaction kit)(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)を使用して行なった。
【００２７】
その結果、pG24プラスミドDNAは、全体4195bp大きさの配列番号1で記載される塩基配列であることを確認した。上記全体DNAには、593bp、456bp及び1953bp大きさをした3つのたんぱく質コーディング地域(open reading frame, ORF)が存在した。上記3つのたんぱく質コーディング地域中、593bp及び456bp 大きさの小さなたんぱく質コーディング地域を含むpg22ベクターは、gsh2変異株のグルタチオン欠乏能力を復帰させられず、今まで報告された蛋白質との類似性もとても低かった(表２参照)。それに反して、1953bp大きさで650個のアミノ酸をコーディングする最も大きなたんぱく質コーディング地域を含むpg24ベクターは、gsh2変異株をグルタチオン合成能力を持った形質に変換させる機能を持っていて、上記のたんぱく質コーディングする遺伝子は、キャンディダアルビカン(C. albicans)のGcs1p(GenBank 寄託番号AAG43412)遺伝子と53%の同一性と69%類似性を示した。また、サッカロマイセスセレビシエ(S. cerevisiae)のScGsh1p遺伝子と47%の同一性と61%の類似性を示し、スキゾサッカロマイセスポンベ(Sch. pombe)のSpGcs1p遺伝子と46%の同一性と63%の類似性を示し、ヒト(Homo sapiens)のHsGCSh遺伝子と45%の同一性と63%の類似性を示し、他のγ-GCSとも相当に高い類似性を示した(図 2)。それで、本発明者達は、上記4195bp大きさのpG24プラスミドDNAがハンセヌラポリモルパγ-GCSをコーディングする遺伝子であると推定して「HpGSH2」と命名し、2002年9月24日付けでGenBankに寄託した(寄託番号AF435121)。
<実施例 3> HpGSH2 遺伝子の構成成分特性分析
本発明者達は、上記実施例2で分離したHpGSH2 遺伝子の塩基配列に存在する細部構成要素を分析するために配列番号1で記載される塩基配列を利用してたんぱく質コーディング地域、たんぱく質配列相同性分析及び配列分析をした。具体的に、たんぱく質コーディング地域(open reading frame; ORF)は、NCBI(National Center for Biotechnology Information, Bethesda, MD, USA)のグラフ分析プログラムのORF Finderを使用して分析した。たんぱく質配列相同性分析は、BLASTサーバーを使用し、配列分析は、MultAlinプログラムを使用した(Corpet, F. Nucleic Acids Res., 1988, 16, 10881)。
【００２８】
その結果、配列番号1で記載されるHpGSH2遺伝子は、450bp程度の5'隣接領域配列(1番から450番まで)と1792bp程度の3'隣接配列(2401番から4195番まで)を持っていて、典型的なTATAボックス、CAATボックス及びポリアデニレイション(polyadenylation)配列は、観察されなかった。しかし、たんぱく質翻訳開示コドンから上流416bp 地点でサッカロマイセスセレビシエのGSH1遺伝子発現を調節する蛋白質のCbf1が結合する部位と知られたCDEI-結合地域(GCACG)と推定される配列(31番から35番まで)が観察された(図 2)。これを通してハンセヌラポリモルパ遺伝子HpGSH2が反応性酸素族や重金属カドミウム存在可否によってCbf1相同蛋白質によって発現が調節されることが分かった。
【００２９】
また、他の生物体由来のγ-グルタミルシステイン合成酵素のように、ハンセヌラポリモルパHpGsh2pは、グルタチオン-結合蛋白質で一般的に観察されるグルタチオンとの特異的相互作用に関連する配列番号5で記載されるGWRVEFRPMEモチーフ(配列番号3で記載されるアミノ酸配列の457番から466番まで)と保存されたリジンまたはアルギニン残基(配列番号3で記載されるアミノ酸配列の459番と503番アミノ酸残基)を持っていて(Coblenz and Wolf, Yeast, 1995, 11, 1171)、酵素の活性中心部と推定される配列番号6で記載されるMGFGMGXXCLQ領域でよく保存されシステイン残基(配列番号3で記載されるアミノ酸配列の251番目ないし261番目)を持っていた(図 2)。したがって、gsh2変異株のグルタチオン要求性補完機能と共に上記の色々な構造的な特徴は、HpGSH2遺伝子がグルタチオン生合成経路で最も重要な第一段階反応に作用するγ-GCSをコーディングすることが分かった。
<実施例 4> HpGSH2 遺伝子のコピー数及び構造分析
ハンセヌラポリモルパ野生型菌株(CBS4732 leu2)、gsh2変異株(gsh2-1 leu1-1)及びプラスミドpG24が導入されたgsh2形質転換体(Gsh+Leu+(pG24))からHpGSH2 遺伝子のコピー数と構造に対する情報を得るためにサザンブロットを行なった。具体的に、DNAプローブを製造するためにHpGSH2遺伝子をBamHIで切断して収得された2.0kb HpGSH2断片(図 3のA)を準備した。上記各々細胞から染色体を分離して制限酵素PstIで切断後、上記で製造したDNAプローブを利用して一般的な方法でサザンブロット分析を行なった(Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd edn. Cold Spring harbor laboratory press, Cold spring harbor, NY, 1989)。
【００３０】
その結果、野生型菌株では、HpGSH2遺伝子の単一染色体コピーに該当する4.0 kb PstI断片でハイブリダイゼーション・シグナル(hybridization signal)が現れ、形質転換されないgsh2菌株では、4.0kb PstI断片の代わりに6.5kb PstI断片でハイブリダイゼーション・シグナルが現れた。また、プラスミドpG24が導入されたgsh2形質転換体(Gsh+Leu+(pG24))は、導入されたpG24からのPstI断片(4.0kb)と染色体DNAからのPstI断片(6.5kb)による二個のハイブリダイゼーション・シグナルが現れた。4.0kb断片が6.5kb断片よりさらに濃いシグナルを示した(図 3のB)。上記結果を通してgsh2変異がHpGSH2 ORFを取り巻いている二つのPstI位置中の一カ所に位置するであろうことが分かり、野生型HpGSH2遺伝子の導入によってgsh2変異株の欠損表現型が野生型に補完されたことが分かり、gsh2形質転換体にHpGSH2遺伝子が多重に導入されたことが分かった。したがって、γ-GCS欠損表現型に対するHpGSH2遺伝子の補完 能力は、本発明で確保されたHpGSH2遺伝子がハンセヌラポリモルパのγ-GCSをコーディングしていて、gsh2形質転換体の重金属に対する耐性が増加(表 1及び表 2)した理由は、HpGSH2遺伝子の多重導入によって誘導されたことが分かった。
【００３１】
本発明者達は、pG24発現ベクターを大腸菌DH5aに形質導入した形質転換体を製造し、これをを2002年11月8日付けで韓国生命工学研究院遺伝子銀行に寄託した(寄託番号  KCTC10370BP)。
【００３２】
【発明の効果】
上記で詳しく見たように、本発明のハンセヌラポリモルパ 菌株から分離されたグルタチオン生合成遺伝子をグルタチオン生合成欠損変異株に導入させるとグルタチオン生合成機能と共に重金属耐性及び細胞増殖機能を回復または増加させられ、グルタチオンを利用した重金属吸着、補助酵素の生産、肝機能強化剤及び脱毒性化剤として有用に使用できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】pG2プラスミドに挿入された9.6 kb DNA切片の制限酵素による切断部位を示した図である。
【図２】ハンセヌラポリモルパ HpGSH2 遺伝子の塩基配列を他種のグルタチオン生合成酵素遺伝子と相同比較分析したもので、
ScGsh1p: サッカロマイセスセレビシエ
CaGcs1p: キャンディダアルビカン
SpGcs1p: スキゾサッカロマイセスポンベ及び
HsGCSh: ヒト
【図３】 HpGSH2 遺伝子のコピー数分析によるサザンブロット分析によって製造したプローブ DNA(A)及び上記プローブを利用して野生菌株または形質転換体の遺伝子を サザンブロット分析した電気泳動写真(B)である。
ライン1: DNA サイズマーカー。
ライン2: gsh2-1 leu1-1 変異株。
ライン3ないしライン7: Gsh+Leu+(pG24) 菌株。
ライン8: NCYC495 leu1-1 野生型菌株。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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