(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検物質と、この被検物質に特異的に結合可能な特異結合物質を標識担体に結合した固定化標識担体との凝集反応の程度を測定することにより、前記被検物質の量を分析する乾式分析方法において、
前記固定化標識担体と、その拡散を抑制しつつ保持する非流動性物質との混合物に、前記非流動性物質の流動性を増加させるゾル化剤を接触させ、前記固定化標識担体と前記被検物質との凝集反応を行わせることを特徴とする乾式分析方法。
【請求項２】
前記固定化標識担体と前記非流動性物質とが皮膜を構成し、この被膜に前記ゾル化剤と被検物質を供給して、皮膜内での凝集反応を検出することを特徴とする請求項１の乾式分析方法。
【請求項３】
前記固定化標識担体と前記非流動性物質とが皮膜を構成し、前記ゾル化剤を含有する水浸透性層をこの皮膜の上に重層させ、
前記被検物質を前記水浸透性層に供給して、前記ゾル化剤と共に、前記皮膜に移行させることを特徴とする請求項１の乾式分析方法。
【請求項４】
前記標識担体が金属コロイドであり、凝集反応による金属コロイドの色調の変化によって、凝集反応の程度を検出することを特徴とする請求項１〜３のいずれかの乾式分析方法。
【請求項５】
前記非流動性物質が糖類で、前記ゾル化剤が糖質分解酵素であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかの乾式分析方法。
【請求項６】
被検物質と、この被検物質に特異的に結合可能な特異結合物質を標識担体に結合した固定化標識担体との凝集反応の程度を測定することにより水性検体中の被検物質の量を分析する分析要素において、
被検物質に特異的に結合可能な特異結合物質を標識担体に結合した固定化標識担体を、その拡散を抑制しつつ保持する非流動性物質媒体層と；
前記非流動性物質の流動性を高めて媒体中での凝集反応を可能とするゾル化剤を含有する水浸透性層であって、前記検体を供給したときにゾル化剤を非流動性物質媒体層へ移行させる水浸透性層；
とを備えることを特徴とする分析要素。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、被検物質に対する特異結合物質を標識担体に結合した固定化標識担体と、被検物質との凝集反応により、微量物質の検出、分析を行う分析方法に関するものである。詳しくは、固定化標識担体の拡散を抑制しつつ保持する非流動性物質媒体に、その流動性を増加させるゾル化剤を接触させ、媒体層中での凝集反応を行わせる被検物質の乾式分析方法に関するものである。またこの分析方法を可能にする乾式分析要素に関する。
【０００２】
【発明の背景】
近年、医療分野において、病態の診断や治療効果の判定などのために、検体中の微量物質、特に抗体又は抗原を迅速、簡便にしかも精度よく定量することが非常に重要となっている。このため抗体又は抗原などを不溶性担体粒子に固定化し、これと抗原又は抗体を反応させて体液成分中の抗原又は抗体の存在を検査する免疫血清学的検査が広く利用されている。
【０００３】
広く行われているラテックス粒子イムノアッセイは、抗体を吸着させたラテックス粒子（感作ラテックス）と検体とをガラス板上で混合し、検体中の抗原との半王によりラテックス粒子の凝集を起こさせ、この凝集状態を肉眼で観察する。他の定性的検出法と同様、検体を様々に希釈してアッセイを行うことにより、検体中の抗原を半定量的に測定することができる。
【０００４】
また、抗体を結合したラテックス粒子を使用し、検体中の抗原と反応したラテックス粒子の凝集物の量を比濁法により光学的に測定する方法も提案されている(特公昭58-11575号公報、特公昭62-43138号公報、特公昭62-55103号公報等)。この方法により、最近では、自動分析装置を用いて抗原又は抗体を定量的に測定することも行われるようになってきている。
【０００５】
また、金コロイド凝集法を利用して、抗原物質の検出を吸光度の変化に基づき行っている方法が提案されている（特開平2−141665、特開平5−209879）。
【０００６】
これらの免疫分析方法はＢ／Ｆ分離を必要としない点で有用な方法であるが、ラッテクス試薬の場合、液状試薬である為に保存安定性が悪い。また金コロイド凝集法においては、金コロイド溶液が試薬としての保存安定性に劣る。このため、凍結乾燥品の金コロイド試薬を、測定時に専用の溶解液と混合する必要があり、操作が煩雑であった。また、少量検体の測定には向いていないなどの欠点があった。
【０００７】
このような保存安定性や、操作の簡便性などの点で優れる分析方法として、いわゆる乾式分析方法がある。いわゆる湿式法（又は溶液法）とは、使用する試薬をまず水性溶媒に溶解して試薬溶液を作り、この試薬溶液を分析試料に加えて生じた呈色反応生成物を比色計で測定するものである。これに対して乾式法は、試薬組成物を乾燥状態で含有させた試験片、分析スライド、分析テープなどの乾式分析要素に、水性試料を直接点着して、要素内で生じた呈色又は変色をそのまま比色測定するものであり、試薬溶液を用いる湿式法に較べ、操作の簡便性、分析の迅速性に優れている。
【０００８】
しかしながら、乾式分析要素の層構成の中で凝集反応を行わせ、その凝集物の存在自体を直接検出するものは未だ提案されていない。寒天ゲル中で免疫沈降反応を行うOuchterlony法のように、ゲル中で凝集反応を生じさせることも考えられるが、短時間に凝集反応を生じさせるためには、反応の場となるゲルには標識担体が凝集可能な程度の流動性が要求される。この流動性を確保するための十分な湿度が要求されると、乾燥状態（又は半乾燥状態）で保存される分析要素とすることはできない。また流動性の高いゲルでは、その包装・保管に注意を要することになり簡便な乾式法には適さなくなる。
【０００９】
【発明の目的】
本発明は、このような事情に鑑みなされたものであり、被検物質に対する特異結合物質を標識担体に結合した固定化標識担体と、被検物質との凝集反応を乾式分析法により行い、試薬の保存安定性に優れ、簡便に高感度の検出・分析ができる被検物質の乾式分析方法を提供することを第１の目的とする。
また、本発明は、被検物質との反応による固定化標識担体の凝集を検出して、被検物質を簡便かつ高感度に分析することができる乾式分析要素を提供することを第２の目的とする。
【００１０】
【発明の構成】
本発明の第１の目的は、被検物質と、この被検物質に特異的に結合可能な特異結合物質を標識担体に結合した固定化標識担体との凝集反応の程度を測定することにより、被検物質の量を分析する乾式分析方法において、
固定化標識担体とその拡散を抑制しつつ保持する非流動性物質との混合物に、前記非流動性物質の流動性を増加させるゾル化剤を接触させ、固定化標識担体と被検物質との凝集反応を行わせることを特徴とする乾式分析方法、により達成される。
【００１１】
すなわち、本発明は、固定化標識担体の凝集反応の場となる媒体として、分析時にゾル化剤によりこの媒体の流動性（すなわち固定化標識担体の拡散性）を高め、固定化標識担体の拡散・凝集を促進するようにした非流動性物質を使用するものである。この非流動性物質を媒体として固定化標識担体と混合することにより、保存時には、使用する試薬組成物の安定性を損なわない程度の乾燥状態の媒体とすることができ、分析時にはゾル化剤によりゾル化、液化され固定化標識担体の凝集反応を十分生起できる程度の流動性を確保できる。
【００１２】
好ましい態様では、被検物質を含有する水性検体にゾル化剤を添加し、これを固定化標識担体を含有する非流動性媒体に接触させる。この媒体を皮膜状に形成すれば、媒体中で生じた凝集物を、皮膜状媒体の透過光又は反射光の光学的変化として検出することが容易である。凝集物の有無、その量は、皮膜状媒体中の濁度変化として検出してもよく、また凝集による標識担体の色調変化で検出してもよい。
【００１３】
また本発明の第２の目的は、被検物質と、この被検物質に特異的に結合可能な特異結合物質を標識担体に結合した固定化標識担体との凝集反応の程度を測定することにより水性検体中の被検物質の量を分析する乾式分析要素において、
前記固定化標識担体をその拡散を抑制しつつ保持する非流動性物質媒体層と；前記非流動性物質の流動性を高めて媒体中での凝集反応を可能とするゾル化剤を含有する水浸透性層であって、前記検体を供給したときにゾル化剤を非流動性物質媒体層へ移行させる水浸透性層；
とを備えることを特徴とする乾式分析要素、により達成される。
【００１４】
固定化標識担体の凝集反応の場となる媒体を層構成とし、分析時に、ゾル化剤によりこの媒体の流動性を高め、固定化標識担体の拡散・凝集を促進するようにしたものである。これにより、保存時には、使用する試薬組成物の安定性を損なわない程度の乾燥状態とすることができ、分析時にはゾル化剤によりゾル化、液化され固定化標識担体の凝集反応を十分生起できる程度の流動性を確保できる。
【００１５】
【発明の構成の詳細な説明】
被検物質と特異結合物質
本発明で分析できる被検物質は、これに特異的に結合する特異結合物質が天然界に存在するもの、あるいは化学的手段によりこれを用意できるものであればよい。特異結合物質は、被検物質に対し特異的に結合することが可能であり、かつ標識担体に結合させることのできる物質である。
【００１６】
被検物質と特異結合物質との組み合わせは、例えば、抗原と抗体、ある種の糖類とレクチン、ビオチンとアビジン、プロテインＡとIgＧ、ホルモンとそのレセブター、酵素と基質、核酸と相補的な核酸、などが例として挙げられる。この組合せは、逆でもよい。
【００１７】
最も一般的な例は、抗原を被検物質とし、抗体を特異結合物質とするものである。特異結合物質としての抗体は、ポリクローナル抗体でもよく、モノクローナル抗体であってもよい。また、複数の種類の抗体を使用してもよい。また、抗体のクラスは特に限定されず、ＩｇＧであってもＩｇＭであっても使用可能であるし、また例えばＦabやＦab'やＦ(ab')2等の抗体のフラグメントであってもよい。なお、モノクローナル抗体を特異結合物質として使用する場合には、抗体を固定化した標識担体の凝集を生じさせるためには、被検物である抗原が２以上のエピトープを有するか、２種類以上のモノクローナル抗体が必要となる。ただし、被検物がヘモグロビンのようにサブユニットの多量体である場合には、１種類のモノクロナール抗体を固定化した標識担体の凝集を生じさせることができる。
【００１８】
標識担体
特異結合物質を結合して標識する標識用担体は、特異結合物質を結合した固定化標識担体が被検物との反応により凝集し、その凝集の程度が検出可能なものであればよい。免疫凝集反応に用いられている担体を使用することができる。例えば、ポリスチレン、スチレン−ブタジエン共重合体のような有機高分子のラテックス粒子、金属コロイドのような金属等を用いることができる。担体粒子（又はコロイド）の平均粒径は、0.02〜10μmの範囲が好ましい。担体の粒径が大きすぎると免疫学的反応前の担体自体による光学的反射又は散乱による光学的強度が高すぎて測定が困難となりやすい。また粒径が小さすぎると担体凝集物の検出感度が低くなる傾向にある。
【００１９】
従来公知の金属コロイドはいずれも標識担体として使用することができる。例えば、金コロイド、銀コロイド、白金コロイド、鉄コロイド、水酸化アルミニウムコロイド、などが挙げられる。特に、金コロイドと銀コロイドが適当な粒径において、金コロイドは赤色、銀コロイドは黄色を示す点で好ましい。
【００２０】
金属コロイドの粒径としては、約１〜500nmが好ましく、特に強い色調が得られる５〜100nmがさらに好ましい。金属コロイドと特異結合物質との結合は、従来公知の方法（例えばThe Journal of Histochemistry and Cytochemistry, Vol.30,No.7,pp691-696,(1982)）に従い、行うことができる。
【００２１】
非流動性物質(媒体）
特異結合物質を結合した標識担体を保持する媒体は、それ自体は非流動性物質であって、後述のゾル化剤によりその流動性が高まって、標識担体の凝集反応を生じさせる物質である。但しゾル化剤がない場合に、標識担体の拡散を完全に抑制し、凝集反応を全く起こさせない程度の非流動性物質である必要はない。ゾル化剤を作用させた場合に、その中に分散・保持されている標識担体が分散媒である液体中により拡散しやすくなり、凝集反応がより生じやすくなるものであればよい。すなわち、本明細書における非流動性物質の媒体とは、ゾル化剤を作用させない場合に、ゾル化剤を作用させた場合に較べて標識担体をその拡散を抑制しつつ保持する媒体であるという意味である。
【００２２】
例えば、非流動性物質(媒体）として、ゲルも使用することができる。ゲルは、一般に線形分子コロイドが架橋により絡み合い網目構造を形成し、ゼリー状に固化したものである。その含水率が高いと、分散媒と間隙を埋める水の間を標識担体粒子が拡散しやすくなり、ある程度の凝集反応は生じるものと考えられる。しかしこの場合でも、ゲル媒体をゾル化させることにより、標識担体の拡散、凝集反応を促進することができる。但し含水率が高く柔らかいゲルは、その保存安定性が劣ること、取り扱いに注意が必要になることなどから簡便性、安定性が要求される乾式分析方法には適さない。
【００２３】
ゾル化剤としてα-アミラーゼを使用する場合には、カルボキシメチル化澱粉などの不溶性澱粉誘導体を非流動性物質（媒体）と使用するのが好ましい態様である。澱粉誘導体は、標識担体を均一に分散、保持でき、またその皮膜を作り易い点で優れている。
【００２４】
ゾル化剤（流動化剤）
特異結合物質を結合した標識担体を保持する媒体としての非流動性物質はゾル化剤により、その流動性が高まり、標識担体の凝集反応を生じさせる。標識担体の凝集反応が、ゾル化剤を添加しない場合よりも高く生じるのであれば、非流動性物質を完全にゾル化、液化するものでなくてもよい。むしろ乾式分析を行うためには、ゾル化剤を作用させた非流動性媒体は、自己の形状を保持することができる程度の非流動性、固さを維持する方が便宜である。この意味で、本発明で言うゾル化剤とは、媒体中に分散保持された標識担体の拡散性が高められ、その凝集反応が生起しやすくなる、また促進される環境を非流動性物質（媒体）に与えるものを意味する。
【００２５】
このように非流動性媒体をゾル化させるものとして、酵素による加水分解、ｐＨ変化による物質の分解、レーザー等による光分解等が挙げられる。
好ましい例として、酵素による加水分解によりゾル化を行うのが、緩和な条件下で加水分解が進行する点で、特に優れている。例えば、オリゴ糖、デンプン誘導体、デンプン分解産物などの多糖類を非流動性物質(媒体）とする場合には、これらを加水分解して架橋構造を壊すアミラーゼなどの糖分解酵素をゲル化剤として使用することができる。
【００２６】
非流動性物質（媒体）とゾル化剤との組合せは、その他の例として、セルロース誘導体とセルラーゼ、プルランとプルナーゼ、ゼラチンとペプシンなどのペプチド分解酵素、核酸と核酸分解酵素とが、それぞれ挙げられる。この中では特に、カルポキシメチル化澱粉などの不溶性澱粉誘導体とα-アミラーゼの組み合わせが優れている。
【００２７】
分析方法
被検物に含む水性検体を、被検物に対する特異結合物質を結合させた標識担体を分散・保持する非流動性物質媒体の皮膜に、接触させる。これと同時、又はその前にゾル化剤をこの皮膜に接触させ、非流動性物質媒体の流動性を高め凝集反応の場を生成する。ゾル化剤を予め水性検体に混合してから、被検物と共に、非流動性媒体被膜に接触させてもよい。あるいは、非流動性媒体被膜の上に水浸透性層を重層しておき、この水浸透性層にゾル化剤を含有させておいてもよい。この場合は、水性検体を水浸透性層に点着することにより、ゾル化剤を被検物と共に非流動性媒体被膜に移行させることができる。
【００２８】
非流動性媒体被膜内の凝集反応の有無、凝集の程度は、皮膜の透過光又は反射光の光学的変化として検出する。皮膜状媒体中の濁度変化として検出してもよく、また凝集による標識担体の色調変化で検出してもよい。
【００２９】
分析要素の層構成
図１は、本発明の乾式分析要素の一実施態様を示す。図１において、符号１０は支持体であり、その上には非流動性物質媒体層（皮膜層）１２、ゾル化剤を含有する水浸透性層１４が積層されている。
【００３０】
支持体１０としては光不透過性（不透明）、光半透過性（半透明）、光透過性（透明）のいずれのものも用いることができるが、一般的には光透過性で水不透過性の支持体が好ましい。光透過性水不透過性支持体の材料として好ましいのものはポリエチレンテレフタレート、ポリスチレンである。
【００３１】
非流動性物質媒体層１２は、前述したように、被検物質に対する特異結合物質を結合した標識担体を、ゾル化された場合よりもその拡散を抑制しつつ保持する非流動性物質媒体からなる層である。
【００３２】
この非流動性物質媒体層には、担体標識特異結合物質と被検物質との特異的結合反応の際に至適なｐＨを与えるため、緩衝剤を含有させてもよい。例えば結合反応が抗原抗体反応であれば、通常の抗原抗体反応に使用できるｐＨ緩衝剤、例えばトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Tris）を含む緩衝剤；燐酸塩を含む緩衝剤；硼酸塩を含む緩衝剤；クエン酸又はクエン酸塩を含む緩衝剤；グリシンを含む緩衝剤；ビシン(Bicine)を含む緩衝剤；HEPESを含む緩衝剤；MES（2-モルホリノエタンスルホン酸）を含む緩衝剤などのグッド緩衝剤などを用いることができる。ｐＨは通常の抗原抗体反応が行われるｐＨの範囲内であれば問題ない。
【００３３】
また非流動性物質媒体層（皮膜）中には、凝集反応を促進させる為にポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）等の高分子ポリマーを含有してもよい。
【００３４】
水浸透性層１４は、ゾル化剤を含有する。水浸透性を確保するためには、多孔性媒体からなる多孔性層とするか、親水性ポリマーバインダーからなる層とするのが好ましい。
【００３５】
多孔性層は繊維質であってもよいし、非繊維質であってもよい。繊維質材料としては、例えば濾紙、不織布、織物布地（例えば平織布地）、編物布地（例えばトリコット編物布地）、ガラス繊維濾紙等を用いることができる。非繊維質材料としては、特開昭49-53888等に記載の酢酸セルロース等からなるメンブランフィルター；特開昭49-53888、特開昭55-90859（対応米国特許 4,258,001）、特開昭58-70163（対応米国特許 4,486,537）等に記載の無機物又は有機物微粒子からなる連続空隙含有粒状構造物層；等のいずれでもよい。特開昭61-4959(対応欧州公開 EP 0166365A）、特開昭62-116258 、特開昭62-138756(対応欧州公開 EP 0226465A）、特開昭62-138757(対応欧州公開 EP 0226465A）、特開昭62-138758(対応欧州公開 EP 0226465A）等に記載の部分接着された複数の多孔性層の積層物も好適である。
【００３６】
多孔性層は供給される液体の量にほぼ比例した面積に液体を展開する、いわゆる計量作用を有する展開層であってもよい。展開層としては、これらのうち織物布地、編物布地などが好ましい。織物布地などは特開昭57-66359号に記載されたようなグロー放電処理をしてもよい。展開層には、展開面積、展開速度等を調節するため、特開昭60-222770（対応: EP 0162301A）、特開昭63-219397（対応ドイツ特許公開 DE 37 17 913A）、特開昭63-112999（対応: DE 37 17 913A）、特開昭62-182652（対応: DE 37 17 913A）に記載したような親水性高分子あるいは界面活性剤を含有させてもよい。
【００３７】
乾式分析要素の製造方法
本発明の乾式分析要素は諸特許明細書に記載の公知の方法により調製することができる。本発明の分析要素は一辺約15mmから約30mmの正方形またはほぼ同サイズの円形等の小片に裁断し、特公昭57-28331（対応米国特許 4,169,751)、実開昭56-142454（対応米国特許 4,387,990)、特開昭57-63452、実開昭58-32350、特表昭58-501144（対応国際公開: WO 83/00391)等に記載のスライド枠に収めて化学分析スライドとして用いることが、製造，包装，輸送，保存，測定操作等の観点で好ましい。使用目的によっては、長いテープ状でカセットまたはマガジンに収めて用いたり、または小片を開口のあるカードに貼付または収めて用いることなどもできる。
【００３８】
乾式分析要素による分析方法
本発明の分析要素は前述の諸特許明細書等に記載の操作と同様の操作により液体試料中の被検物質の定量分析ができる。被検物質が抗原又は抗体である場合は、例えば約５μL〜約30μL、好ましくは８〜15μLの範囲の血漿、血清、尿などの水性液体試料液を水浸透性層１４に点着する。点着した分析要素を約20℃〜約45℃の範囲の一定温度で、好ましくは約30℃〜約40℃の範囲内の一定温度で１〜10分間インキュベーションする。要素内の発色又は変色を光透過性支持体側から反射測光し、予め作成した検量線を用いて比色測定法の原理により検体中の被検物質の量を求めることができる。点着する液体試料の量、インキュベーション時間及び温度を一定にすることにより定量分析を高精度に実施できる。
【００３９】
測定操作は特開昭60-125543、同60-220862、同61-294367、同58-161867(対応米国特許 4,424,191）などに記載の化学分析装置により極めて容易な操作で高精度の定量分析を実施できる。なお、目的や必要精度によっては、目視により発色の度合いを判定して、半定量的な測定を行なってもよい。
【００４０】
分析要素が水浸透性層１４を有さない場合、すなわち、分析要素内にゾル化剤を含有させていない場合には、分析要素外の適当な反応溶液中で必要な免疫反応を行わせた後、その反応液を要素に点着すれば標識酵素活性の変化として被検物を分析することができる。例えば、抗原を分析する場合には、要素に点着する前に、水性試料液を抗体及び酵素標識リガンドを含む溶液と混和して、結合反応を十分行なわせてから、基質層に点着すればよい。
【００４１】
例えば、被検物質が抗原、特異結合物質が抗体、標識担体が金属コロイド、非流動性媒体がカルボキシルメチル化澱粉、ゾル化剤がアミラーゼである場合には、以下のように乾式分析要素を作製し、分析を行うことができる。
【００４２】
金属コロイドで標識した抗体をカルボキシルメチル化澱粉溶液中に分散し、この分散物を透光性支持体１０上に塗布し乾燥して、皮膜１２を形成する。この上に、アミラーゼが含浸してある布１４を接着することにより、凝集反応用乾式分析要素を作製する。
【００４３】
この分析要素に被検物質（抗原）を含む水性検体を点着する。被検物質は布１４中のアミラーゼと共にカルボキシルメチル化澱粉層１２に移行して、この層１２内で抗原抗体反応とカルボキシルメチル化澱粉の酵素分解が起こり、その結果金属コロイドが凝集する。
【００４４】
金属コロイドは凝集により色調が変化することから、ゲルの色調変化を測定することにより被検物質の検出、定量が可能となる。例えば金コロイドの場合は、凝集前には540nm付近を主吸収波長とする赤紫色を呈する。凝集によりコロイド粒子のサイズが大きくなると吸収は長波長側にシフトして、薄い赤紫色又は灰色を呈する。従って、540ｎｍにおける反射光学濃度の減少、凝集により出現する約630ｎｍにおける反射光学濃度の増加、あるいは540ｎｍと630ｎｍの２波長で反射光学濃度を測定し、その差から被検物質（抗原）の量を定量することができる。
【００４５】
【実施例１】
抗へモグロビン抗体結合金コロイドの調製：
粒径50ｎｍの金コロイド溶液（BRITISH BIOCELL社）600μLに、0.2Ｍ炭酸カリウム溶液11μLを添加してｐＨ9.0とした。この金コロイド溶液611μLに、抗ヘモグロビン抗体溶液（2.5mg/mL、MEDlX BlOCHEM社製、0.02Ｍリン酸緩衝液(pH6.4)、0.02％アジ化ナトリウム含有）を蒸留水で0.1 mg/mLに調製したものを60μL添加した。この混合物を振盪撹拌後、安定化剤として10 mMリン酸緩衝液（ｐＨ6.4、１％ＢＳＡ(牛血清アルブミン）、0.05％アジ化ナトリウム含有）600μLを添加した。高速遠心機にて145,000rpmで60分間遠心し、上澄みを除去した。沈澱物を10mMリン酸緩衝液（pH 6.4、１％ＢＳＡ、0.05％アジ化ナトリウム含有）100μLに再懸濁し、抗ヘモグロビン抗体結合金コロイド懸濁液を得た。
【００４６】
【実施例２】
抗ヘモグロビン抗体結合金コロイド皮膜スライド（１）の作成
実施例１で得られた抗ヘモグロビン抗体結合金コロイド700μgを含有する溶液2.5mLに、カルボキシメチル化澱粉50mgを加え撹拌し、この分散物をポリエチレンテレフタレート(PET)フィルム上に塗布し、減圧乾燥して、抗ヘモグロビン抗体結合金コロイド皮膜（層）を設けた。
【００４７】
一方、布（5×5cm：50デニール相当のPET紡績糸36ゲージ編みした厚さ約250μｍのトリコット編物布地）に、α-アミラーゼ（１mg/mL、10mMグリセロりん酸緩衝液、pH 7.0）３mLを含浸し30分間静止した。その後、この布をホットメルト剤で抗ヘモグロビン抗体結合金コロイド皮膜の上に接着し、抗ヘモグロビン抗体結合金コロイド皮膜スライド(1)を作成した。また比較対照として布にα-アミラーゼが含浸させない他は同様にして作成したスライド(2)も作成した。
【００４８】
【実施例３】
ヘモグロビン（Exocell社）を0.05％ポリエチレングリコールを含むＰＢＳ溶液で希釈して所定濃度のヘモグロビン液を作成し、抗ヘモグロビン抗体結合金コロイド皮膜スライド(1)、(2)に10μLを点着し、37℃で６分間インキュベートした後、ＰＥＴ支持体側から中心波長550nmと630nmの反射光学濃度を測定した。550nmにおける反射光学濃度ＯＤ550と630nmにおける反射光学濃度ＯＤ630の差を求めた。結果を図２に示す。
【００４９】
図２に示すように、布（水浸透性層）にα−アミラーゼを含有する実施例スライド(1)（図中、○）は、比較対照スライド(2)（図中、□）と比較して、検体中のヘモグロビン濃度変化に対して大きな反射光学濃度差（ＯＤ550−ＯＤ630）を示し，Ｓ／Ｎ比に優れていた。また比較例スライドではヘモグロビン濃度200ng/mL以下の領域における反射光学濃度差（ＯＤ550−ＯＤ630）は、極めて僅かであるのに対し、実施例スライドでは大きな値を示し、低濃度領域において特に感度よく分析できることが示された。
【００５０】
【発明の効果】
以上のように、本発明の分析方法は、固定化標識担体の凝集反応の場となる媒体として、分析時にゾル化剤によりこの媒体の流動性（すなわち固定化標識担体の拡散性）を高め、固定化標識担体の拡散・凝集を促進するようにした非流動性物質を使用するものである。この非流動性物質を媒体として固定化標識担体と混合することにより、保存時には試薬組成物の安定性を損なわない程度の乾燥状態の媒体とすることができ、分析時にはゾル化剤によりゾル化、液化され固定化標識担体の凝集反応を十分生起できる程度の流動性を確保できる。この結果、乾式分析法による被検物の分析が行うことができる。
【００５１】
また、本発明の乾式分析要素は、被検物に対する特異結合物質を結合した標識担体を保持する非流動性物質媒体層と、その上に積層されるゾル化剤を含有する水浸透性層とを備えるように構成した。従って、被検物質を含有する検体を水浸透性層に点着、供給するだけで、媒体層中での凝集反応を起こさせ、被検物の高感度かつ簡便な乾式分析が可能となる。
【００５２】
最後の本発明の好ましい態様をまとめると以下の通りである。
(1) 被検物質と、この被検物質に特異的に結合可能な特異結合物質を標識担体に結合した固定化標識担体との凝集反応の程度を測定することにより、前記被検物質の量を分析する乾式分析方法において、
前記固定化標識担体と、その拡散を抑制しつつ保持する非流動性物質との混合物に、前記非流動性物質の流動性を増加させるゾル化剤を接触させ、前記固定化標識担体と前記被検物質との凝集反応を行わせることを特徴とする乾式分析方法。
(2) 前記ゾル化剤は、被検物質と共に前記混合物に供給されることを特徴とする(1)の分析方法。
(3) 前記固定化標識担体と前記非流動性物質とが皮膜を構成し、この被膜に前記ゾル化剤と被検物質を供給して、皮膜内での凝集反応を検出することを特徴とする(1)又は(2)の分析方法。
(4) 前記固定化標識担体と前記非流動性物質とが皮膜を構成し、前記ゾル化剤を含有する水浸透性層を前記皮膜の上に重層させ、
前記被検物質を前記水浸透性層に供給して、前記ゾル化剤と共に、前記皮膜に移行させることを特徴とする(3)の分析方法。
(5) 前記標識担体がラテックス粒子である(1)〜(4)の分析方法。
(6) 前記標識担体が金属コロイドであり、凝集反応による金属コロイドの色調の変化によって、凝集反応の程度を検出することを特徴とする(1)〜(4)の分析方法。
(7) 前記金属コロイドが金コロイド又は銀コロイドである(6)の分析方法。
(8) 前記非流動性物質が糖類で、前記ゾル化剤が糖質分解酵素であることを特徴とする(1)〜(7)の分析方法。
(9) 前記非流動性物質が多糖類で、前記ゾル化剤が糖質分解酵素である事を特徴とする(1)〜(7)の分析方法。
(10) 前記多糖類が、デンプン誘導体である(9)の分析方法。
(11) 前記被検物が抗原であり、前記特異結合物質が抗体である(1)〜(9)の分析方法。
(12) (4)における皮膜と水浸透性層を備えることを特徴とする被検物質の乾式分析要素。
(13) 被検物質と、この被検物質に特異的に結合可能な特異結合物質を標識担体に結合した固定化標識担体との凝集反応の程度を測定することにより水性検体中の被検物質の量を分析する乾式分析要素において、
被検物質に特異的に結合可能な特異結合物質を標識担体に結合した固定化標識担体を、その拡散を抑制しつつ保持する非流動性物質媒体層と；
前記非流動性物質の流動性を高めて媒体中での凝集反応を可能とするゾル化剤を含有する水浸透性層であって、前記検体を供給したときにゾル化剤を非流動性物質媒体層へ移行させる水浸透性層；
とを備えることを特徴とする乾式分析要素。
(14) 前記標識担体がラテックス粒子である(13)の分析要素。
(15) 前記標識担体が金属コロイドであり、凝集反応による金属コロイドの色調の変化によって、凝集反応の程度を検出することができる(13)の分析要素。
(16) 前記金属コロイドが金コロイド又は銀コロイドである(15)の分析方法。
(17) 前記非流動性物質が糖類で、前記ゾル化剤が糖質分解酵素であることを特徴とする(13)〜(16)の分析要素。
(18) 前記非流動性物質が多糖類で、前記ゾル化剤が糖質分解酵素である事を特徴とする(13)〜(16)の分析要素。
(19) 前記多糖類が、デンプン誘導体である(18)の分析要素。
(20) 前記水浸透性層が、多孔性媒体からなる(13)の分析要素。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の乾式分析要素の一実施態様例の構成図である。
【図２】実施例３の結果を示す図であり、実施例スライド(1)及び比較例スライド(2)の乾式分析要素の検量線を示す図である。
【符号の説明】
１０  透光性支持体
１２  非流動性物質媒体層（皮膜層）
１４  ゾル化剤を含有する水浸透性層
【図１】
0003756007.tif 000002
【図２】
0003756007.tif 000003