(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含み、カオトロピック試薬の存在なしに行われる、RNAおよびDNA混合液中のRNA濃度を減少させる方法；
（ａ）第１のRNA濃度を有する、RNAおよびDNAを含有する溶液を準備する工程、
（ｂ）前記第１の濃度より小さい第２の濃度でRNAを含有する濾液を得るために、前記溶液を、DNAより前記RNAがより強固に結合するような珪藻土の有効量に通して濾過する工程、および
（ｃ）RNA濃度が減少した前記濾液を回収する工程。
【請求項２】
前記第１のRNA濃度を前記第２のRNA濃度に比較するとき、前記RNA濃度の減少幅が少なくとも10％である請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記第１のRNA濃度を前記第２のRNA濃度に比較するとき、前記RNA濃度の減少幅が少なくとも25％である請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記第１のRNA濃度を前記第２のRNA濃度に比較するとき、前記RNA濃度の減少幅が少なくとも50％である請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記第１のRNA濃度を前記第２のRNA濃度に比較するとき、前記RNA濃度の減少幅が少なくとも85％である請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記混合物が細胞溶解物である請求項１記載の方法。
【請求項７】
前記珪藻土材料が約90％SiO2から構成される請求項１記載の方法。
【請求項８】
前記珪藻土材料が焼成されている請求項１記載の方法。
【請求項９】
前記焼成珪藻土材料が融剤焼成されている請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記融剤焼成珪藻土材料が酸洗浄されている請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記珪藻土材料が約10lbs／cu. ft.（160Kg／ｍ3）の乾燥密度を有する請求項１記載の方法。
【請求項１２】
前記珪藻土材料が中央値で約22.3μｍの粒子サイズを有する請求項１記載の方法。
【請求項１３】
前記珪藻土材料が中央値で約７μｍのケーク孔サイズを有する請求項１記載の方法。
【請求項１４】
前記珪藻土材料が、SiO2約89.6％、Al2O2約4.0％、Fe2O3約1.5％、P2O5約0.2％、TiO2約0.2％、CaO約0.5％、MgO約0.6％、Na2O、K2Oおよびこれらの組合せから選ばれる酸化物約3.3％、から構成される請求項１記載の方法。
【請求項１５】
以下の工程を含み、カオトロピック試薬の存在なしに行われる、RNAおよびDNA混合液中のRNA濃度を減少させる方法；
（ａ）第１のRNA濃度を有する、RNAおよびDNAを含有する溶液を準備する工程、
（ｂ）前記溶液を、DNAより前記RNAがより強固に結合するような珪藻土の有効量に接触させることで、濾過、遠心分離、または沈降により前記珪藻土から分離した後に、前記第１の濃度より小さい第２の濃度でRNAを含有する液状の生成物を生産する工程、および
（ｃ）RNA濃度が減少した前記濾液を回収する工程。
【請求項１６】
以下の工程を含み、カオトロピック試薬の存在なしに行われる、RNAおよびDNA混合物中のRNA成分から組換えプラスミドDNAを精製する方法；
（ａ）第１のRNA濃度を有する、RNAおよび組換えプラスミドDNAを含有する溶液を準備する工程、
（ｂ）組換えプラスミドDNAを含有し、かつ前記第１の濃度より小さい第２の濃度でRNAを含有する濾液を得るために、前記溶液を、DNAより前記RNAがより強固に結合するような珪藻土の有効量に通して濾過する工程、および
（ｃ）RNA成分が減少した前記濾液を回収する工程。
【請求項１７】
前記組換えプラスミドDNAが、医薬品調製物の成分である請求項16記載の方法。
【請求項１８】
以下の工程を含み、カオトロピック試薬の存在なしに行われる、RNA溶液中の異なった種類の可溶性RNAを分離する方法；
（ａ）第１および第２の種類の可溶性RNAを含有するRNA溶液を準備する工程、および
（ｂ）前記溶液を、ある種のRNAがその他の種類のRNAより、より強固に結合するような珪藻土の有効量に通して濾過することで、第１の可溶性RNAを含有する濾液と、前記珪藻土に集積する第２の可溶性RNAを含有する生成物とを得る工程。
【請求項１９】
前記RNAの種類のうちのひとつが、医薬品調製物の成分である請求項18記載の方法。
【請求項２０】
以下の工程を含み、カオトロピック試薬の存在なしに行われる、RNAおよびDNA混合液中のRNA成分から組換えプラスミドDNAを精製する方法；
（ａ）第１のRNA濃度を有する、RNAおよび組換えプラスミドDNAを含有する溶液を準備する工程、
（ｂ）前記溶液に、DNAより前記RNAがより強固に結合するような珪藻土の有効量を添加する工程、
（ｃ）（ｂ）工程で得られた珪藻土添加混合液を混合することで、懸濁液を得る工程、
（ｄ）珪素土で予めプレコートされた濾過膜を通して前記懸濁液を通すことで、珪藻土ケークを前記濾過膜上に収集して、組換えプラスミドDNAを含有し、かつ前記第１の濃度より小さい第２の濃度でRNAを含有する濾液を得る工程、および
（ｅ）RNA成分が減少した前記濾液を回収する工程。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、珪藻土を用いた生物学的物質混合物中のＲＮＡ濃度減少方法に関する。
背景技術
分子生物学では、その重要な事項が精製された組換えＤＮＡプラスミドの存在に依存している（例えば、Thompson, BioChromatography 1:68(1986); Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Assoc. & Wiley, 1987; Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989）。重大な意義を有する実用的な技術の発展は、細胞が染色体外の遺伝物質を組み込み可能であることを発見したことであった。その結果として、プラスミドＤＮＡのような独立複製染色体外ＤＮＡが、この遺伝物質が維持されるであろう適切な宿主細胞中で、多様な生物起源から得られたいかなるＤＮＡセグメントへの挿入とその増幅のために、ベヒクルとして使用可能である。
原核細胞と真核細胞の組換えプラスミドＤＮＡの分析的なスケールの生育と予備的なスケールの生育の両者のために用いられる発酵と組織培養の工程は、進歩してきている。これらのプラスミドＤＮＡの合成生成の生物学的な工程では、脂質、炭水化物、リポタンパク質、タンパク質、多糖、染色体ＤＮＡ、リボソーム、ＲＮＡおよびその他の高分子構成成分等を含む細胞の構成成分の複合混合物が伴に生産される。その後の使用のために純粋なプラスミドＤＮＡを単離する必要がある。
細胞のプラスミドＤＮＡの精製に関して多数の方法が単独的に開発されている。しかしながら、これらの方法の全てにおいて３つの基本的な主要点、すなわち(1)細胞成長、(2)細胞溶解、(3)細胞ＲＮＡ、細胞ＤＮＡからのプラスミドＤＮＡの分離、が共通している。様々な抽出が、精密で再現性のあるプラスミドＤＮＡ精製のために重要なキーとなっている。これらの抽出は、不純物分子（例えば、タンパク質、細胞ＤＮＡ、ＲＮＡ等）の大部分を除去するために、特に複合生体システムに適用されるときに行われる。適正な抽出は、プラスミド精製におけるクロマトグラフィー工程およびクロマトグラフィーを用いない工程の両者にとって重要である。
１Ｌ（１〜２ｇ湿重量）のエシェリヒア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞からプラスミドＤＮＡを精製する従来法を段階を追って表１に示す。
表１：１Ｌ（１〜２ｇ）のＥ．ｃｏｌｉ細胞からのプラスミドＤＮＡの精製
細胞溶解
１．緩衝液Ａを用いて細胞を最終容量が７ｍｌとなるように再懸濁させる。緩衝液Ａの組成は、２５ｍＭ  トリス−塩酸（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ  Ｎａ2ＥＤＴＡ、１％（ｗ／ｖ）グルコースである。
２．緩衝液Ｂを１４．０ｍｌ加え、反転によって穏やかに混合し、氷上で１０分間インキュベートする。緩衝液Ｂの組成は、０．２Ｎ  ＮａＯＨ、１％  ＳＤＳである。
３．冷却（４℃）した緩衝液Ｃを１０．５ｍｌ加え、白色沈殿が生成するまで反転によって穏やかに混合し、氷上で５分間インキュベートする。緩衝液Ｃの組成は、３．０Ｍ  酢酸カリウム、２．０Ｍ  酢酸（ｐＨ４．８）である。
４．２５Ｋ×ｇで２０分間、遠心分離を行い、新しい試験管に上清を移す。
５．冷却（−２０℃）した９５％エタノールを正確に２倍容量加え、渦攪拌（ボルテックス）し、氷上で２０分間インキュベートする。
６．１２Ｋ×ｇで２０分間、遠心分離を行い、上清を取り除く。
核酸抽出
７．ペレット（沈殿）を１．２ｍｌの緩衝液Ｄに再懸濁させる。緩衝液Ｄの組成は、２０ｍＭ  トリス−塩酸（ｐＨ７．２）、１ｍＭ  Ｎａ2ＥＤＴＡである。
８．緩衝液Ｅを０．６ｍｌ加え、渦攪拌（ボルテックス）し、氷上で２０分間（または４℃で１６時間）インキュベートする。緩衝液Ｅの組成は、７．５Ｍ酢酸アンモニウムである。
９．１２Ｋ×ｇで２０分間、遠心分離を行い、上清を新しい試験管に移すことで取り出し、ペレットを取り除く。
１０．冷却（−２０℃）した９５％エタノール４．０ｍｌを加え、渦攪拌（ボルテックス）し、氷上で２０分間インキュベートする。
１１．１２Ｋ×ｇで２０分間、遠心分離を行い、上清を廃棄し、ペレットを（転倒させて）５分間風乾する。
１２．ペレットを０．４ｍｌの緩衝液Ｆに再懸濁させる。緩衝液Ｆの組成は、２０ｍＭ  トリス−塩酸（ｐＨ７．２）、１ｍＭ  Ｎａ2ＥＤＴＡ、５０ｍＭ  ＮａＣｌである。
１３．１０００単位のＲＮアーゼ（RNase）を加え、３７℃で３０分間インキュベートする。
１４．０．４ｍｌのフェノール（緩衝液Ｆと飽和させる）を加え、よく渦攪拌（ボルテックス）する。
１５．１２Ｋ×ｇで１０分間、遠心分離を行い、上層の水溶液を新しい試験管に移す。
１６．２．０Ｍ  ＮａＣｌを０．１ｍｌ加え、渦攪拌（ボルテックス）する。
１７．冷却（−２０℃）した９５％エタノール１．０ｍｌを加え、よく渦攪拌（ボルテックス）し、−２０℃で３０分間（または１６時間）インキュベートする。
１８．１２Ｋ×ｇで２０分間、遠心分離を行い、上清を廃棄し、ペレットを冷却（−２０℃）した８０％エタノールで注意深く洗浄し、（転倒させて）５分間風乾する。
１９．ペレットを１．６ｍｌの水に再懸濁させる。
この従来法の一般的な要点は、細胞を溶菌し、染色体ＤＮＡを変性させ、共有結合的な閉環状プラスミドＤＮＡをそのまま完全に残すための、ｐＨ１２．５での細胞の穏やかな処理（工程２）にある。高濃度の塩やＳＤＳの存在中、中和状態で、染色体ＤＮＡ、タンパク質および細胞破片は沈殿し、遠心分離により取り除かれる（工程３、４）。可溶画分に残った核酸（ＲＮＡ、プラスミドＤＮＡ）は、不純物であるいずれのタンパク質あるいは染色体ＤＮＡの沈殿を抑えた短時間のエタノール沈殿によって回収される（工程５、６）。回収された核酸は、２．５Ｍの酢酸アンモニウムとともにインキュベートされて、遠心分離により取り除かれる高分子量ＲＮＡ、タンパク質、リポ多糖を析出させる（工程７〜９）。高濃度プラスミドＤＮＡ調製物はエタノール沈殿によって濃縮され、ＲＮＡを消化するためにＲＮアーゼ（RNase）で処理され、ＲＮアーゼ（RNase）およびいずれの残存タンパク質をも除去するためにフェノール抽出され、そしてエタノール沈殿により回収される。２６０ｎｍの吸光度とそれに続く精製ストラテジーによれば、この最終試料は、約５０％のプラスミドＤＮＡ、５０％の低分子ＲＮＡオリゴヌクレオチドと通常１％未満の染色体ＤＮＡを含有する。
この様な方法は、例えば、遺伝子治療を目的とするような医薬品用ＤＮＡの製産には適当でないかもしれない。これについては、粗溶解物中の核酸の多くの部分を占める宿主由来のＲＮＡを再現性をもって減少させる方法であって、病原菌による汚染の疑いのあるＲＮアーゼ（RNase）のような外来の動物由来の酵素の使用に頼らず、また、ＲＮアーゼ（RNase）を調製物から取り除くためのフェノールのような有害な有機抽出溶媒の使用によらない、および、食品医薬品局（ＦＤＡ）のような薬物規制組織に安全であると一般的に認められた試薬のみを使用した方法が必要とされる。
発明の要約
本発明は、（ａ）第１の濃度でＲＮＡを含有する生物学的物質混合物を準備する工程、（ｂ）第２の濃度でＲＮＡを含有する濾液を得るために、前記混合物を珪藻土材料に通して濾過する工程（ここで、第２濃度は第１の濃度より小さい）、および（ｃ）ＲＮＡ濃度が減少した前記濾液を回収する工程、を含む生物学的物質混合物中のＲＮＡ濃度を減少させる方法を提供する。
本発明によれば、ＲＮＡ濃度の少なくとも凡そ１０％までを、あるいは有利には少なくとも凡そ２５％までを、また好ましくは少なくとも凡そ５０％までを、さらにより好ましくは少なくとも凡そ８５％までを減少させることができる。
また、本発明によれば、前記生物学的物質混合物を細胞溶解物とすることができる。
本発明の一実施態様では、珪藻土材料はＳｉＯ2を約９０％含有する。これは焼成されてもよい。また、融剤焼成（直接焼成に対するものとして）されてもよい。珪藻土材料は、（分析用グレードの品質のために）酸洗浄されてもよい。
別の実施態様では、珪藻土材料は乾燥密度が約１０ｌｂｓ／ｃｕ．ｆｔ．（１６０ｋｇ／ｍ3）である。この珪藻土材料においては粒子の大きさは中央値でおよび２２．３μｍとすることができる。ケークの孔の大きさは中央値で７μｍとすることができる。
また本発明の好ましい実施態様では、珪藻土材料はＳｉＯ2を約８９．６％、Ａｌ2Ｏ2を約４．０％、Ｆｅ2Ｏ3を約１．５％、Ｐ2Ｏ5を約０．２％、ＴｉＯ2を約０．２％、ＣａＯを約０．５％、ＭｇＯを約０．６％、Ｎａ2Ｏ＋Ｋ2Ｏを約３．３％含有する。
別の態様において、本発明は、（ａ）第１の濃度でＲＮＡを含有する生物学的物質混合物を準備する工程、（ｂ）前記混合物を珪藻土材料にさらすことで、濾過、遠心分離、または沈降により珪藻土材料から分離した後に、第２の濃度でＲＮＡを含有する生成物を生産する工程（ここで、第２の濃度は第１の濃度より小さい）、および（ｃ）ＲＮＡ濃度が減少した前記生成物を回収する工程、を含む生物学的物質混合物中のＲＮＡ濃度を減少させる方法を提供する。
さらに別の態様において、本発明は、（ａ）組換えプラスミドＤＮＡを含有し、かつ第１の濃度でＲＮＡを含有する生物学的物質混合物を準備する工程、（ｂ）組換えプラスミドＤＮＡを含有し、かつ第２の濃度でＲＮＡを含有する濾液を得るために、前記混合物を珪藻土材料に通して濾過する工程（ここで、第２の濃度は第１の濃度より小さい）、および（ｃ）ＲＮＡ成分が減少した前記濾液を回収する工程、を含む生物学的物質混合物中のＲＮＡ成分から組換えプラスミドＤＮＡを精製する方法を提供する。
この組換えプラスミドＤＮＡは、核酸に基づく薬剤となることが可能である。
さらにまた別の態様において、本発明は、（ａ）第１および第２の種類の可溶性ＲＮＡを含有する生物学的物質混合物を準備する工程、（ｂ）前記混合物を珪藻土材料に通して濾過することで、第１の可溶性ＲＮＡを含有する濾液と、前記珪藻土材料に集積する第２の可溶性ＲＮＡを含有する生成物とを得る工程、および（ｃ）前記濾液を回収、または、前記珪藻土材料から第２のＲＮＡを溶離する工程、を含む生物学的物質混合物中の異なった種類の可溶性ＲＮＡを分離する方法を提供する。
前記ＲＮＡの種類のうちのあるものは、核酸に基づく薬剤となることが可能である。
また別の態様において、本発明は、（ａ）組換えプラスミドＤＮＡを含有し、かつ第１の濃度でＲＮＡを含有する生物学的物質混合物を準備する工程、（ｂ）前記混合物に珪藻土材料を添加する工程、（ｃ）（ｂ）工程で得られた珪藻土材料添加混合物を混合することで、懸濁液を得る工程、（ｄ）珪藻土で予め被覆（プレコート）された濾過膜を通して前記懸濁液を流すことで、珪藻土ケークを前記濾過膜上に収集し、組換えプラスミドＤＮＡを含有しかつ第２の濃度でＲＮＡを含有する濾液を得る工程（ここで、第２の濃度は第１の濃度より小さい）、および（ｅ）ＲＮＡ成分が減少した前記濾液を回収する工程、を含む生物学的物質混合物中のＲＮＡ成分から組換えプラスミドＤＮＡを精製する方法を提供する。
発明の詳細な説明
我々は、珪藻土材料を用いた生物学的物質混合物中にＲＮＡ濃度減少方法を見出した。理論的に確固としていない、あるいは限定されていないが、珪藻土材料はＲＮＡを吸着すると考えられている。従って、第１の濃度でＲＮＡを含有する生物学的物質混合物を準備し、それから、第２の濃度でＲＮＡを含有する濾液を得るために、前記混合物を珪藻土材料に通して濾過する。ここで、第２の濃度は第１の濃度より小さい。そして最後に、ＲＮＡ濃度が減少した前記濾液を回収する。
後述する半定量的な分析に基づいて、我々は、いかなる工程においてもＲＮＡ濃度の少なくとも凡そ１０％までを、あるいは有利には少なくとも凡そ２５％までを、また好ましくは少なくとも凡そ５０％までを、さらにより好ましくは少なくとも凡そ８５％までを減少させることができると算定している。
いずれの珪藻土材料も考慮されている。例えば、セライト社（Celite Corp., Lompoc, CA）の製品カタログに説明されているセライト（Celite；商標）珪藻土材料を、ここで引用して具体例とした。珪藻土材料は、化石化した微小な先史時代の水生生物の骨格を起源とする材料である。珪藻土材料は、液体からの固体の分離を助けるために濾過助剤として用いられる。珪藻土材料は典型的には、広範囲な工業的濾過の要求を満たす多様な粒子サイズの粉体に加工される。
濾過は、この過程により透過性材料を液体が通過することによって液体から粒子を分離する過程である。前記透過性材料は、濾材あるいは濾膜と呼ばれている。濾膜は、濾過隔膜と呼ばれる他の透過性材料に支持されている。濾過隔膜は典型的にはスクリーン膜である。理論的には、液体は通過し、固体は濾膜上の透過性ケークを造りながら残る。大きく、かつ圧縮できない粒子については、この理論に近づくことができる。しかしながら、実際には、大きな固体だけが濾膜上に残り、微細な固体はしばしば通り抜ける。もし、保有する固体が少しも圧縮できないとしたら、その液体の流速は不経済的なレベルにまで減少する。組換えプラスミドＤＮＡを製造する場合には、流速の減少は、（特に細胞溶解物中では）その安定性が限界となったプラスミドＤＮＡの損失へと変わる。珪藻土材料は、理想的な濾過条件に近くなるように作用する。
珪藻土材料の原料は採掘され、それから濾過助剤として供給されるために加工される。加工は通常、粉砕、焼成、空気分級によって行われ、二酸化珪素を主成分とする実質的に不活性な仕上がり品の濾過助剤が得られる。濾膜上に沈積すると、前記珪藻土材料は堅固であるが多孔質の濾過ケークであって、液体はこのフィルターを通過するが該液体中の粒子物質は篩い分ける濾過ケークを形成する。
珪藻土材料を用いた濾過は、一般に２工程の操作でなっている。最初は、プレコートと呼ばれる濾過助剤の薄い保護層が、濾過助剤のスラリーを繰り返し流し通すことによって、濾材の上から造られる。プレコート後、濾過助剤が濾過されるべき液体中に添加される。濾過が進行するにつれて、未濾過液体中の懸濁固体と混合した濾過助剤は、プレコート上に沈積する。これによって、新しい濾過表面が連続的に形成される。微細な濾過助剤粒子は、懸濁不純物を捕捉するが清澄な液体を詰まることなく通過させる、無数の極微な水路を供給する。
効果的で、経済的な濾過助剤は、堅固で、複雑に形造られた、多孔質の、単一粒子であり、高い透過性、安定性、非圧縮性を有する濾過ケークを形成し、高流速で極微細な固体をも除去し、濾過される液体に化学的に不活性であって本質的に不溶性であるだろう。珪藻土材料は、多種多様の複雑に形作られた粒子でかつ不活性組成物であることから、これらの要求を満たしている。
濾過助剤のグレードは、工業的濾過の要求を満たす広範囲の粒子サイズを供給することが可能である。最も微細な珪藻土材料は、通常、最も高い清澄性と最も低い流速をもたらすだろう。このグレードを造り出すためには、珪藻土は選択的に採石、乾燥、粉砕、空気分級されてもよい。より粒が粗くより速い流速の濾過助剤を造るためには、珪藻土は焼成され空気分級される。これらは、直接焼成グレードと呼ばれる。より大きな粒子を得るためには、焼成の前に融剤を添加して、融剤焼成された濾過助剤を得る。これらは、最も粒の粗いグレードである。
これらの珪藻土材料における標準グレードに加えて、多種多様な濾過の応用のために特殊製品が製造可能である。酸洗浄された濾過助剤は、例外的な精製が必要とされる使用のために、鉄とカルシウムの含有量を減少させる目的の酸洗浄によって得られる。分析グレードの濾過助剤は、分析作業における助剤としての使用、あるいは特別な例外的な精製が要求される使用のために最大限に酸洗浄することによって得られる。
適当な濾過助剤のグレードを選択することは、高い清澄性と低い流速との間の妥協である。最良の濾過助剤は、濾過助剤の使用者によって決定され特定化されるべき許容可能な清澄性の度合いを維持しながらも、最も速い流速が得られるようなグレードである。選択は経験的であり、また当業者の技術の範囲内である。
所定の濾過において、濾液の清澄性は主に、濾過のための濾過助剤のグレードと量、プレコートのための濾過助剤のグレードと量、流通過程の長さ、および濾過速度によって制御される。
何れのグレードの濾過助剤によっても得られ得る清澄性の度合いの決定は、適当な技術、例えば、ブフナー漏斗を使った濾過稼働試験によって為され得るが、またこれはまた当該技術のレベル内である。
濾過システムの通常操作において、フィルターは最初、濾過助剤と液体の混合物を前記フィルターに流し通すことによって、プレコートされる。プレコートは、不純物によって目詰まりを起こすことから濾膜を保護するために作用する。プレコートの量、プレコートスラリーの濃度、およびプレコートの速度は、濾過理論と濾過稼働試験に基づいて選択される。
プレコートの後、濾過が開始される。プレコートを崩壊させないことに注意を払うべきである。用いられる濾過助剤の量は、適当な濾過理論と従来法による研究室試験を基に決定される。添加量が少なすぎると、不利である。これは、目詰まりを招く。濾過助剤にとってこの量は、適度に作用するのに単に十分でないだけである。また、添加量が多すぎても有益ではない。これもまた、目詰まりを招く。濾過助剤にとってこの量は、予定の結果をもたらすには過剰なものである。
珪藻土材料は、多様な物理的性質を基に区別可能である。粒子の大きさは中央値で約１０〜約６０μｍと多様にすることができる。ケークの孔の大きさは中央値で約１〜約２５μｍの間を変動させることができる。乾燥密度は、約５〜約２０ｌｂｓ／ｃｕ．ｆｔ．（約８０〜約３２０ｋｇ／ｍ3）に多様化できる。典型的な化学分析に基づくと、二酸化珪素の含有量は約８５〜約９０％に多様化できる。珪藻土材料のその他の成分には、Ａｌ2Ｏ2、Ｆｅ2Ｏ3、Ｐ2Ｏ5、ＴｉＯ2、ＣａＯ、ＭｇＯ、およびＮａ2Ｏ＋Ｋ2Ｏが含まれ得る。これらの成分は様々な量で、例えば、Ａｌ2Ｏ2は約３．３〜約４．５％で、Ｆｅ2Ｏ3は約１．１〜約１．５％で、Ｐ2Ｏ5は約０．２〜約０．３％で、ＴｉＯ2は約０．２％で、ＣａＯは約０．５〜約０．８％で、ＭｇＯは約０．６〜約０．７％で、Ｎａ2Ｏ＋Ｋ2Ｏは約１．０〜約４．２％で、含有されることができる。
好ましい実施態様において珪藻土材料は焼成濾過助剤である。この焼成濾過助剤は、融剤焼成（直接焼成に対するものとして）されたものであり、また、（分析グレードの品質までに）酸洗浄されたものである。粒子の大きさの中央値は２２．３μｍである。ケークの孔の大きさの中央値は７μｍである。乾燥密度は約１０ｌｂｓ／ｃｕ．ｆｔ．（１６０ｋｇ／ｍ3）である。この焼成濾過助剤は、ＳｉＯ2を約８９．６％、Ａｌ2Ｏ2を約４．０％、Ｆｅ2Ｏ3を約１．５％、Ｐ2Ｏ5を約０．２％、ＴｉＯ2を約０．２％、ＣａＯを約０．５％、ＭｇＯを約０．６％、Ｎａ2Ｏ＋Ｋ2Ｏを約３．３％含有している。
我々は、セライト社（Celite Corp., Lompoc, CA）より入手可能な、コースグレードのセライト（Celite；商標）ハイフロ・スーパー・セル（Hyflo Super Cel；商標）濾過助剤を、好ましく採用する。
珪藻土材料とその他の材料とを組み合わせてなる濾過助剤は、本発明の範囲内に含まれると考えられる。例えば、セライト（Celite；商標）フィブラ−セル（Fibra-Cel）濾過助剤やクノ社（Cuno, Meriden, CT）から得られるクノ・ゼータ・プラス（Cuno Zeta Plus）濾過助剤に例示されるように、珪藻土はセルロースファイバーと組み合わせることができる。セルロースファイバーと同等物が考えられるし、またその他の混合物も意図される。
生物学的物質混合物中のＲＮＡ濃度を減少させるための本発明の別の実施態様においては、第１の濃度でＲＮＡを含有する生物学的物質混合物が準備される。前記混合物は珪藻土材料にさらされ、濾過、遠心分離、または沈降により珪藻土材料から分離した後に、第２の濃度でＲＮＡを含有する生成物を得る（ここで、第２の濃度は第１の濃度より小さい）。最後に、ＲＮＡ濃度が減少した前記生成物が回収される。
本発明は、生物学的物質混合物中のＲＮＡ成分から組換えプラスミドＤＮＡを精製するのに有用である。この実施態様においては、組換えプラスミドＤＮＡを含有し、かつ第１の濃度でＲＮＡを含有する生物学的物質混合物を準備する。それから、組換えプラスミドＤＮＡを含有し、かつ第２の濃度でＲＮＡを含有する濾液を得るために、前記混合物を珪藻土材料に通して濾過する（ここで、第２の濃度は第１の濃度より小さい）。最後に、ＲＮＡ成分が減少した前記濾液を回収する。
この方法は、核酸に基づく薬剤の精製のために有用である。
本発明の方法は、環状、スーパーコイルプラスミド（スーパーコイルモノマー、ダイマー、コンカテマー）に制限されずに、通常は、葉緑体、ミトコンドリア等を含むその他のスーパーコイルＤＮＡ分子や、異なった形態（例えば、異なった複製形態）の環状ＤＮＡ分子、さらに線状ＤＮＡ分子、例えば、染色体ＤＮＡやオリゴヌクレオチドＤＮＡにも適応する。
また、本発明は特定の大きさや構造を有するプラスミドに制限されるものではない。本発明は、大きさや構造に関係なくあらゆる種類のプラスミドに亘って一般的な適用可能性を有する。実施例を参照のこと。我々は、例えば、ｐＢＲ３２２およびｐＵＣを基本とする、ビシストロン（bi-cistronic）およびモノシストロン（mono-cistronic）の、ヒトおよびヒト以外に由来する、プラスミドの精製に同様に本発明を用いた。
さらに、この方法は生物学的物質混合物中の異なった種類のＲＮＡを分離するのに適用可能であろう。いくつかの研究所において、ＤＮＡによるよりもＲＮＡによる遺伝子治療を実行しようとする試みがある。宿主の不純物ＲＮＡを選択的に除去する精製方法は、特定の形態のＲＮＡの回収が分離の目的である場合には、非常に価値がある。
この実施態様においては、第１および第２の種類の可溶性ＲＮＡを含有する生物学的物質混合物を準備する。それから、前記混合物を珪藻土材料に通して濾過することで、第１の可溶性ＲＮＡを含有する濾液と、前記珪藻土材料に集積する第２の可溶性ＲＮＡを含有する生成物とを得る。最後に、前記濾液を回収する。また、それが好ましい種類のＲＮＡであれば、第２のＲＮＡを前記珪藻土材料から溶離可能である。
生物学的物質混合物中のＲＮＡ成分から組換えプラスミドＤＮＡを精製するための好ましい手順を表２に示す。ここで上記混合物は細胞溶解物である。また、これは、プラスミドＤＮＡを、核酸に基づく薬剤として使用するための標準薬剤グレードに精製する、開始から終了までの手順でもある。
表２：医薬品グレードプラスミドＤＮＡの精製方法
１．細胞ペースト。
２．緩衝液に細胞を再懸濁する。
３．細胞を希薄な塩基と界面活性剤中で溶解させる。
４．宿主ＤＮＡとＥ．ｃｏｌｉタンパク質を沈殿させるために溶解物を酸性にする。
５．細胞砕片およびその他の不純物を遠心分離、濾過、沈降によって除去する。
６．珪藻土材料を用いた濾過により上清を清澄化する。
７．清澄化された濾液からＰＥＧ−８０００を用いてＤＮＡを沈殿させる。
８．濾過によりＤＮＡを回収する。
９．緩衝液にＤＮＡを溶解させ、酢酸アンモニウムを用いてＲＮＡ、タンパク質、リポ多糖不純物を沈殿させる。
１０．濾過により不純物からＤＮＡを分離する。
１１．イソプロパノールを用いてＤＮＡを沈殿させる。
１２．緩衝液中のプラスミドＤＮＡペレットを回収する。
１３．ファルマシア（Pharmacia）Ｓ−１０００によるゲル濾過クロマトグラフィーで残存する不純物（より高分子量の種類のＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、およびエンドトキシン）を除去する。
１４．得られた画分、プール、およびエタノール沈殿物を分析する。
１５．注射剤用ベヒクルと無菌フィルターを用いて濃度を調整する。
１６．標準バルクプラスミドＤＮＡの調製。
１７．最後に、製剤（formulation）、無菌充填を行い終了する。
医薬品グレードプラスミドＤＮＡの精製のためのこの方法を以下に詳細に述べる。
細胞溶解；細胞ペーストは、湿菌重量１ｇあたり６ｍｌの冷溶液Ｉ（６１ｍＭ  グルコース、２５ｍＭ  トリス緩衝液  ｐＨ８．０、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ：５℃）中に、室温で撹拌によって完全に再懸濁される。この溶液に、湿菌重量１ｇあたり１２ｍｌの溶液II（０．２Ｎ  ＮａＣｌ、１％  ＳＤＳ）を加え、均質になるまで反転して混合する。これを湿った氷上で、約１０分間インキュベートする。前記溶解細胞溶液に、湿菌重量１ｇあたり９ｍｌの冷溶液III（３．０Ｍ  酢酸カリウム：ｐＨ５．０：５℃）を加え、白色、綿状の沈殿が現れるまで反転して混合し、湿った氷上で約５分間インキュベートする。
濾過；濾過、遠心分離、または沈降によって、上記溶解物から細胞砕片を除去する。上清を収集して、およそ２５ｇ／Ｌの珪藻土材料を添加し、テーブルトップブフナー漏斗に配置した（好ましくはプレコートされた）濾過膜（ワットマン（Whatman）＃１、＃１１３またはそれと同等品）を通して濾過することによってこれを清澄化する。または、細胞砕片は上記溶解物から、直接珪藻土材料を助剤とする濾過によって除去される。この場合、およそ９０ｇ／Ｌの珪藻土材料を直接上記溶解溶液に添加し、均質になるまで渦混合する。それから、テーブルトップブフナー漏斗に配置した（好ましくはプレコートされた）濾過膜（ワットマン（Whatman）＃１、＃１１３またはそれと同等品）を通して、前記溶解物を濾過する。
我々は、プレコートは必須でないことを見出した。プレコートは、好ましいものである。我々は、脱イオン水で珪藻土スラリーを作製しテーブルトップブフナー漏斗に配置した濾過膜を通してこれを濾過することによって、プレコートを行う。
細胞溶解物に添加する珪藻土材料の量は、上述のように経験的に決定される。より低い限度では、１０、１５、または２０ｇ／Ｌで添加可能である。２５ｇ／Ｌが好ましい。より高い限度では、２５〜３０、４０、１００または１５０ｇ／Ｌで添加可能である。９０ｇ／Ｌが好ましい。これらの指標は、許容される清澄性の度合いを維持しながら、最も速い流速（または、濾過助剤１ドルの価値当たりの最大流量）を提供するために、最適化することができる。
珪藻土材料の濾過工程は、珪藻土がＲＮＡに結合するように作用する付加機能にこれらの要素が釣り合うことによって最適化されるだろう。さらに、流速、清澄性、濾過のための濾過助剤のグレードと量、プレコートのための濾過助剤のグレードと量、流通過程の長さ、濾過速度、流量、および浸透性等の様な指標は、達成されるべきＲＮＡ濃度の減少度に非常に大きく依存するだろう。減少度合いの近似的な値は、従来法による濾過稼働試験により得られる。濾液中のＲＮＡ量は、数々の方法、例えば、定型的な生化学分析によって測定可能である。実施例４を参照のこと。
ＤＮＡ沈殿；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ、例えば、ＰＥＧ−８０００）が濾液に５〜１５％（ｗ／ｖ）、さらにＮａＣｌが０．３〜１．５Ｍ添加される。ＰＥＧ懸濁液は、好ましくは２〜８℃で一晩、撹拌される。ＤＮＡ沈殿は、ＰＥＧ懸濁液に約２５ｇ／Ｌの珪藻土材料を添加し、テーブルトップブフナー漏斗に配置した（好ましくはプレコートされた）濾過膜を通してこれを濾過することによって、収集される。ＤＮＡ沈殿はケークに捕捉されて、そのケークをＴＥ緩衝液（０．０１Ｍ  トリス−塩基  ｐＨ８．０、０．００１Ｍ  ＥＤＴＡ）に懸濁させることによって回収される。
ＲＮＡ、タンパク質、およびリポ多糖の除去；酢酸アンモニウムを上記ＴＥ緩衝液に２．５Ｍまで加えて、２〜８℃でおよそ３０分間撹拌する。この珪藻土材料をまだ含有する懸濁液を、テーブルトップブフナー漏斗に配置した（好ましくはプレコートされた）濾過膜に通して濾過する。それからＤＮＡ濾液は、任意にサブミクロン濾過によって清澄化される。
最終的なＤＮＡ沈殿；最終的なＤＮＡ沈殿は、０．６倍容量の冷イソプロパノールを用いて−２０℃で最低２時間、行われる。ＤＮＡ沈殿は、ソーバル（Sorvall）テーブルトップ遠心分離機で、２０００×ｇ、３０分間あるいはこれと同等にして、遠心分離にかけられる。ＤＮＡペレットは、ゲル濾過クロマトグラフィーの前にカラム緩衝液に再懸濁される。
ゲル濾過クロマトグラフィー；ＤＮＡ排除限界が２００００ｂｐのファルマシアＳ−１０００縦剤ゲル濾過カラム（Pharmacia, Piscataway, NJ）を注入する。Ｓ−１０００のマトリックスは、アリルデキストランとＮ,Ｎ'−メチレンビスアクリルアミドが共有結合的に架橋することにより調製された、不活性で安定性の高いマトリックスである。このカラムは、最終の床高が８０〜８５ｃｍ（２．６×８０ｃｍ）で、ファルマシアＸＫ２６／１００カラム（Pharmacia, Piscataway, NJ）２つに注入され、結果として合計カラム容量がおよそ９００ｍｌ、および合計の長さがおよそ１６０ｃｍとなる。カラムは、それぞれ独立して一方向に加圧充填され、逆にされ、平衡保持と操作のために直列に連結される。カラムは、カラム緩衝液により平衡化され、適切な流速で運転される。清澄化された溶解物プラスミドＤＮＡは、０．２μｍのシリンジフィルターを通して濾過され、カラムにかけられる。カラム操作と分画は、ファルマシアＦＰＬＣ（Pharmacia, Piscataway, NJ）により、自動的に行われる。各画分（カラム容量のおよそ０．５〜５％）は、生成物溶出領域を越えて収集され、０．８％アガロースゲル電気泳動により分析される。生成物溶出の厳密な範囲は、ゲル分析によって決定される。妥当な画分は貯溜され、２倍容量の冷エタノールによる沈殿が行われる。このカラム精製されたＤＮＡは、標準バルクプラスミドＤＮＡの精製が必要になるまで、−２０℃で保存される。クロマトグラフィーの後、カラムとＦＰＬＣは少なくとも１カラム容量の０．２Ｍ  ＮａＯＨで消毒される。
標準バルクプラスミドＤＮＡの調製；エタノール沈殿されたカラム精製ＤＮＡは、ソーバル（Sorvall）テーブルトップ遠心分離機で、４〜１０℃、最高速度で３０分間あるいはこれと同等にして、遠心される。ペレットは風乾され、そして貯蔵される。貯蔵されたペレットは、注射剤用ベヒクル中に再懸濁される。ＤＮＡは、それから、０．２μｍのフィルターを通して、パイロジェンフリー容器に濾過流入される。無菌試験、品質コントロール、および貯留のために、製品のロット番号、パート番号、容量、濃度、日付の説明がラベリングされたサンプルが取り出され、隔離されて凍結保存される。この情報は、後の最終的な製剤（formulation）、無菌充填、終了のために目録に記入される。
効果
この方法では、珪藻土材料は、前記方法の流れからいって、宿主細胞ＲＮＡ不純物の十分量を吸着することによるプラスミドＤＮＡの精製を促進する。実施例４を参照のこと。プラスミドＤＮＡ精製のためには、ＲＮＡの抽出は極めて重要である。というのは、ＲＮＡが粗溶解物中の核酸の多くの部分を占めるからである。ＲＮＡ不純物の負荷を減少させるいかなる操作工程も、得られる精製プラスミドＤＮＡにとっては重要なものである。
上記手順において、珪藻土材料はさらに細胞溶解物の高速直接濾過を可能にすることによりプラスミドＤＮＡの精製を促進する。この点は、プラスミドＤＮＡが細胞溶解物中でのみ限定された安定性を有することから、重要である。珪藻土材料ケークに捕獲された細胞砕片やその他の不純物からのプラスミドＤＮＡの分離は、高収率調製物の生産のために極めて重要である。
珪藻土材料を用いるＲＮＡの抽出は、特に、遺伝子、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アンチセンスまたは三重螺旋分子が、病気の処置において治療的に機能するような、核酸に基づく薬剤の分野に適する。珪藻土材料は、ＦＤＡのような薬物規制組織に安全であると一般的に認められた試薬である。加えてこれは、動物由来の酵素として病原菌による汚染の疑いのあるＲＮアーゼ（RNase）の、ＲＮＡ排除のための使用に替わるものである。表１と表２を比較のこと。さらにこれは、ＲＮアーゼ（RNase）調製物を取り除くための有害な有機溶剤、例えば、フェノール、の使用の必要性を排除するものである。表１と表２を比較のこと。珪藻土材料の使用は、大規模生産への移行がし易い測定可能な単位操作である。これは、標準的な手順に比べて、かなり著しく製造時間を短縮するものである。これらの特徴が、珪藻土材料による方法を技術手順の現状から区別しており、特に医薬品グレードＤＮＡの生産によく適するものとしている。
本発明の個々の態様は、例示された特定の実施態様にその範囲を制限することなく、本発明を例示しようとする以下の実施例を参照することによって、より容易に理解されるであろう。
実施例１  ｐＨＬＡ−Ｂ７プラスミドの精製
遺伝子治療薬としての使用が予定されるｐＨＬＡ−Ｂ７プラスミドを精製した。モデルは、ＨＬＡ−Ｂ７抗原をコードする遺伝子を使用した悪性の免疫療法のために表されたものであった。この遺伝子が、抗原のイン・サイチュー（in situ）生産のためにＤＮＡ／リポソーム・トランスフェクションによって、腫瘍にインビボで導入された。Rubin等，Human Gene Therapy 5:1385(1994); Hersh等，Human Gene Therapy 5:1371(1994); Vogelzang等，Human Gene Therapy 5:1357(1994)。
ｐＨＬＡ−Ｂ７プラスミドのサイズは、約４９００ｂｐであった。これは、細菌の複製起点を含むｐＢＲ３２２を基礎とするプラスミドであった。これは、ＨＬＡ−Ｂ７と命名されたクラス１ＭＨＣ抗原の、重鎖（ヒト ＨＬＡ−Ｂ７ ｃＤＮＡ）および、軽鎖（チンパンジー β−２ ミクログロブリン ｃＤＮＡ）をコードした。これらの２つのタンパク質は、ビシストロニック(bi-cistronic)なｍＲＮＡ上に発現した。このｍＲＮＡの真核細胞での発現は、３’末端の長い繰返し配列(long terminal repeat)に由来するラウス肉腫ウイルスプロモーター配列に依存した。発現はまた、ウシ成長ホルモン遺伝子由来の転写終結／ポリアデニル化の信号配列に依存した。重鎖の発現は、５’キャップ依存性タンパク質翻訳開始部位により調節された。軽鎖の発現は、脳心筋炎ウイルス由来のキャップ非依存性翻訳エンハンサー（ＣＩＴＥ）配列により調節された。プラスミドはまた、Ｔｎ９０３由来のカナマイシン抵抗性遺伝子をコードした。
この精製では、５００ｇの湿細胞ペーストを処理して、２９．１ｍｇの精製プラスミドＤＮＡが回収された。
細胞溶解；約５００ｇの細胞ペーストを、３Ｌの冷溶液Ｉ（６１ｍＭ  グルコース、２５ｍＭ  トリス緩衝液  ｐＨ８．０、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ：５℃）中に、室温で撹拌しながら再懸濁させた。次いで、６Ｌの溶液II（０．２Ｎ  ＮａＣｌ、１％  ＳＤＳ）を加え、均質になるまで反転して混合した。これを湿った氷中で、１０分間インキュベートした。それから４．５Ｌの冷溶液III（３．０Ｍ  酢酸カリウム：ｐＨ５．０：５℃）を加え、白色、綿状の沈殿が生じるまで反転して混合し、湿った氷中で１０分間インキュベートした。
濾過；およそ１２００ｇのセライト（Celite；商標）珪藻土を上記溶解物に加え、均質になるまで渦攪拌によって混合した。テーブルトップブフナー漏斗をワットマン（Whatman）＃１１３濾紙を用いて組み立てた。この濾紙を脱イオン水中でセライト（Celite；商標）珪藻土によりプレコートした。それから、上記溶解物を濾過装置中の濾紙に注いで、セライト（Celite；商標）ケークを濾紙上に構築させた。１３．５Ｌを濾過するための合計時間は１５分であった。回収された濾液の合計は１２Ｌであった。
ＤＮＡ沈殿；上記濾液にＰＥＧ−８０００を１０％（ｗ／ｖ）、さらにＮａＣｌを元の細胞量１ｇ当たり０．５８ｇとなるように添加した。このＰＥＧ懸濁液を、およそ４℃で一晩撹拌した。ＤＮＡ沈殿は、次のようにして収集された。約３２５ｇのセライト（Celite；商標）珪藻土をＰＥＧ懸濁液に添加し、均質になるまで渦攪拌によって混合した。テーブルトップブフナー漏斗をワットマン（Whatman）＃１１３濾紙を用いて組み立てた。この濾紙を脱イオン水中でセライト（Celite；商標）珪藻土によりプレコートした。それから、上記ＰＥＧ懸濁液を濾過装置中の濾紙に注いで、セライト（Celite；商標）ケークを濾紙上に構築させた。ケークは吸引乾燥された。ＤＮＡ沈殿は前記セライト（Celite；商標）ケークに捕捉され、そのケーク１ＬのＴＥ緩衝液（０．０１Ｍ  トリス−塩基  ｐＨ８．０、０．００１Ｍ  ＥＤＴＡ）に懸濁させることによって回収された。合計量は１７００ｍｌとなった。
ＲＮＡ、タンパク質、およびリポ多糖の除去；酢酸アンモニウムを上記ＴＥ緩衝液に２．５Ｍまで加えて１８００ｍｌとし、およそ４℃で約１時間撹拌した。テーブルトップブフナー漏斗をワットマン（Whatman）＃１１３濾紙を用いて組み立てた。この濾紙を脱イオン水中でセライト（Celite；商標）珪藻土によりプレコートした。それから、珪藻土をまだ含有する上記酢酸アンモニウム懸濁液を濾過装置中の濾紙に注いで、セライト（Celite；商標）ケークを濾紙上に構築させた。ケークは吸引乾燥された。１５００ｍｌになったＤＮＡ濾液は、それから、０．８μｍのボトルトップフィルターを通したサブミクロン濾過により清澄化された。
容量の減縮；次にミリポア（Millipore）ＰＴＧＣ（標準分子量限界１００００）予備／スケール・タンジェンシャルフローフィルター（Millipore, Bedford, MA）を用いて上記濾液を濃縮した。１５００ｍｌの初期容量がおよそ９０分で６２０ｍｌに減少した。この操作中濾液は氷上で管理された。
最終的なＤＮＡ沈殿；最終的なＤＮＡ沈殿は、０．６倍容量（３７５ｍｌ）の冷２−プロパノールを用いて−２０℃で最低２時間行われた。ＤＮＡ沈殿は、ソーバル（Sorvall）テーブルトップ遠心分離機により、２０００×ｇで３０分間遠心処理された。ＤＮＡペレットは、ゲル濾過クロマトグラフィーの前に２４ｍｌの生理食塩水に再懸濁された。
ゲル濾過クロマトグラフィー；ＤＮＡ排除限界が２００００ｂｐのファルマシアＳ−１０００縦列ゲル濾過カラム（Pharmacia, Piscataway, NJ）を、最終の床高８０〜８５ｃｍ（２．６×８０ｃｍ）で、ファルマシアＸＫ２６／１００カラム（Pharmacia, Piscataway, NJ）２つに注入し、結果として合計カラム容量がおよそ９００ｍｌ、および合計の長さがおよそ１６０ｃｍとなった。このカラムは、それぞれ独立して一方向に加圧充填され、逆にされ、均衡保持と操作のために直列に連結された。カラムは生理食塩水により平衡化され、およそ０．６ｍｌ／分の流速で運転された。清澄化された溶解物プラスミドＤＮＡは、０．２μｍのシリンジフィルターを通して濾過されて、カラムにかけられた。カラム操作と分画は、ファルマシアＦＰＬＣ（Pharmacia, Piscataway, NJ）により、自動的に行われた。各画分（カラム容量のおよそ０．５〜５％）は、生成物溶出領域を越えて収集され、０．８％アガロースゲル電気泳動により分析された。生成物溶出の厳密な範囲は、ゲル分析によって決定された。妥当な画分は貯溜され、２倍容量の冷エタノールによって沈殿が行われた。このカラム精製されたＤＮＡは、必要とされるまで−２０℃で保存された。クロマトグラフィーの後、カラムとＦＰＬＣを、少なくとも１カラム容量の０．２Ｍ  ＮａＯＨで滅菌した。
実施例２  医薬品グレードの精製ｐＨＬＡ−Ｂ７プラスミド
実施例１のプラスミドＤＮＡは、以下の表３で与えられる規準により決定されるような医薬品グレード標準にまで精製された。
0003808506.tif 000002
実施例３  精製ｐＨＬＡ−Ｂ７プラスミドの有効性
実施例１によって精製されたｐＨＬＡ−Ｂ７プラスミドの有効性を、ＤＭＲＩＥ／ＤＯＰＥを用いた脂質媒介インビトロ・トランスフェクションに続くＨＡＬＬ細胞（ヒトメラノーマ細胞系）でのＨＬＡ−Ｂ７遺伝子発現により測定した。
トランスフェクションの前日、２００００〜４０００００のＨＡＬＬ細胞が、６ウェルプレートの各ウェルに播種された。細胞はトランスフェクションの前にはコンフルエントの７５％以上の単層であった。細胞は５μｇのプラスミドＤＮＡによって、５μｇのＤＭＲＩＥ（ウマにより合成）と５μｇのＤＯＰＥ（アバンチ・ポーラー・リピッズ社（Avanti Polar Lipids, Inc., Alabaster, AL）により合成）の存在下、トランスフェクションされた。細胞は、５％ＣＯ2通気をしながら、３７℃でインキュベートされた。血清を減少させた培地、例えばＯｐｔｉ−ＭＥＭ（ギブコ・バル・ライフ・テクノロジーズ（GIBCO BRL Life Technologies, Baltimore, MD））にウシ胎児血清を補填したものが、トランスフェクションから１〜４時間後と２４時間後に細胞に添加された。細胞は、トランスフェクションから４８時間後に回収された。
細胞表面におけるＨＬＡ−Ｂ７の発現は、抗ＨＬＡ−Ｂ７マウス抗体、続いて蛍光二次抗体（抗マウスＩｇＧモノクローナル抗体Ｒ−フィコエリスリン（紅藻素(phycoerythrin)）複合体）により標識することによって測定された。細胞の免疫螢光染色は、フロー・サイトメトリー（流動細胞測定法）により分析された。トランスフェクションされた細胞では、負対照（トランスフェクションされていない細胞または無関係な遺伝子によりトランスフェクションされた細胞）と比べて、平均の蛍光強度における２倍量の増加が認められた。有効性は、参照ロットに対して５０〜２００％であった。
実施例４  セライト（Celite；商標）珪藻土を用いたＲＮＡ濃度の減少化
実施例１のプラスミド精製工程をアガロースゲル電気泳動により評価した。細胞溶解とセライト（Celite；商標）補助による濾過の後、およびＰＥＧによるＤＮＡ沈殿とセライト（Celite；商標）を用いた清澄化の後、我々は以下の分析を行った。ケークはＴＥ緩衝液に再懸濁されて、テーブルトップブフナー漏斗に配置されセライト（Celite；商標）でプレコートされたワットマン（Whatman）＃１１３フィルターを通して濾過された。濾液の一部を０．８％アガロースゲル上で電気泳動にかけた。さらに、セライト（Celite；商標）ケークの洗浄緩衝液の一部を同じゲル上で同様に電気泳動にかけた。
臭化エチジウム染色ゲルが分析された。プラスミドＤＮＡ生成物は、セライト（Celite；商標）濾液中に、スーパーコイルモノマー、ダイマーおよびコンカテマーとして存在した。セライト（Celite；商標）ケークの洗浄緩衝液には、不純物である宿主ＲＮＡの含有が認められた。これは、驚くべき結果であった。なぜならば、ＲＮＡがセライト（Celite；商標）ケーク中に収集されることは予期されなかったからである。
半定量的な分析によって、これに代表される様ないかなる工程においてもＲＮＡ濃度が約８５％程度まで減少されることが明らかとなった。
実施例５  ｐＣＭＶＩＬ２ＢＧＨプラスミドの精製
遺伝子治療薬としての使用が予定されるｐＣＭＶＩＬ２ＢＧＨプラスミドを精製した。アプローチは、インビボでの樹立された腫瘍への組換え遺伝子の病変内局所直接投与によって開発されている。この遺伝子は、腫瘍がイン・サイチュー（in situ）で生育し、局所量のインターロイキン−２（ＩＬ−２）を生産し分泌するように、遺伝学的に改変する。インターロイキン−２は腫瘍を破壊することが予想されている。
ｐＣＭＶＩＬ２ＢＧＨプラスミドのサイズは、約４９００ｂｐであった。これは、細菌の複製起点を含むｐＵＣを基礎とするプラスミドであった。これは、ＩＬ−２融合タンパク質をコードした。このタンパク質は、ラットインシュリンII遺伝子の５’非翻訳領域の短いセグメント及びリーダーペプチドの最初の６個のアミノ酸と、ヒトＩＬ−２コード化配列の５’からそのリーダーペプチドの最初の２個のアミノ酸を除いたものをコードする部分をクローニングすることによって構築された。この融合タンパク質は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の極早期１プロモーター／エンハンサー配列による真核細胞の転写制御のもとに置かれた。この配列は、８００＋ｂｐイントロンを含むＣＭＶの極早期の１遺伝子からの５’非翻訳配列と、ＩＬ−２融合タンパク質コード化配列と、転写終結／ポリアデニル化の信号配列を有するウシ成長ホルモン遺伝子由来の３’非翻訳配列とを含む複合ｍＲＮＡの発現を促進した。プラスミドはまた、Ｔｎ９０３由来のカナマイシン抵抗性遺伝子をコードした。
この精製では、４９０ｇの湿細胞ペーストを処理して、１０．２ｍｇの精製プラスミドＤＮＡが回収された。
細胞溶解；細胞ペーストは、湿菌重量１ｇあたり６ｍｌの冷溶液Ｉ（６１ｍＭ  グルコース、２５ｍＭ  トリス緩衝液  ｐＨ８．０、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ：５℃）中に、室温で撹拌によって再懸濁された。次いで、湿菌重量１ｇあたり１２ｍｌの溶液II（０．２Ｎ  ＮａＣｌ、１％  ＳＤＳ）を加え、均質になるまで反転して混合した。これを湿った氷中で、１０分間インキュベートした。それから、湿菌重量１ｇあたり９ｍｌの冷溶液III（３．０Ｍ  酢酸カリウム：ｐＨ５．０：５℃）を加え、白色、綿状の沈殿が生じるまで反転して混合し、湿った氷中で５分間インキュベートした。
濾過；遠心分離によって上記溶解物から細胞砕片を除去した。上清を収集して、およそ２５ｇ／Ｌのセライト（Celite；商標）珪藻土を添加しテーブルトップブフナー漏斗を通して濾過することによってこれを清澄化した。あるいは、およそ９０ｇ／Ｌのセライト（Celite；商標）珪藻土を直接上記溶解溶液に添加し、均質になるまで渦混合することも可能である。それから、テーブルトップブフナー漏斗を通して前記溶解物を濾過すればよい。
ＤＮＡ沈殿；上記濾液にＰＥＧ−８０００を１０％（ｗ／ｖ）、さらにＮａＣｌを元の細胞量１ｇ当たり０．５８ｇとなるように添加した。このＰＥＧ懸濁液を、およそ４℃で一晩撹拌した。ＤＮＡ沈殿は、ＰＥＧ懸濁液に約２５ｇ／Ｌのセライト（Celite；商標）珪藻土を添加し、テーブルトップブフナー漏斗を通してこれを濾過することによって、収集された。ＤＮＡ沈殿は、セライト（Celite；商標）ケーク中に捕捉され、そのケークをＴＥ緩衝液（０．０１Ｍ  トリス−塩基  ｐＨ８．０、０．００１Ｍ  ＥＤＴＡ）に懸濁させることによって回収された。
ＲＮＡ、タンパク質、およびリポ多糖の除去；酢酸アンモニウムを上記ＴＥ緩衝液に２．５Ｍまで加えて、およそ４℃で約３０分間撹拌した。このセライト（Celite；商標）珪藻土をまだ含有する懸濁液を、テーブルトップブフナー漏斗を通して濾過した。それから、ＤＮＡ濾液をサブミクロン濾過によって清澄化した。
最終的なＤＮＡ沈殿；最終的なＤＮＡ沈殿を、０．６倍容量の冷２−プロパノールを用いて、−２０℃で最低２時間行った。ＤＮＡ沈殿は、ソーバル（Sorvall）テーブルトップ遠心分離機により、２０００×ｇで３０分間遠心処理された。ＤＮＡペレットは、ゲル濾過クロマトグラフィーの前に生理食塩水に再懸濁された。
ゲル濾過クロマトグラフィー；ＤＮＡ排除限界が２００００ｂｐのファルマシアＳ−１０００縦列ゲル濾過カラム（Pharmacia, Piscataway, NJ）を、最終の床高８０〜８５ｃｍ（２．６×８０ｃｍ）で、ファルマシアＸＫ２６／１００カラム（Pharmacia, Piscataway, NJ）２つに注入し、結果として合計カラム容量がおよそ９００ｍｌ、および合計の長さがおよそ１６０ｃｍとなった。このカラムは、それぞれ独立して一方向に加圧充填され、逆にされ、平衡保持と操作のために直列に連結された。カラムは生理食塩水により平衡化され、およそ０．７５ｍｌ／分の流速で運転された。清澄化された溶解物プラスミドＤＮＡは、０．２μｍのシリンジフィルターを通して濾過されて、カラムにかけられた。カラム操作と分画は、ファルマシアＦＰＬＣ（Pharmacia, Piscataway, NJ）により、自動的に行われた。各画分（カラム容量のおよそ０．５〜５％）は、生成物溶出領域を越えて収集され、０．８％アガロースゲル電気泳動により分析された。生成物溶出の厳密な範囲は、ゲル分析によって決定された。妥当な画分は貯溜され、２倍容量の冷エタノールによって沈殿が行われた。このカラム精製されたＤＮＡは、必要とされるまで−２０℃で保存された。クロマトグラフィーの後、カラムとＦＰＬＣを、少なくとも１カラム容量の０．２Ｍ  ＮａＯＨで滅菌した。
実施例６  医薬品グレードの精製ｐＣＭＶＩＬ２ＢＧＨプラスミド
実施例６のプラスミドＤＮＡは、以下の表４で与えられる規準により決定されるような医薬品グレード標準にまで精製された。
0003808506.tif 000003
実施例７  精製ｐＣＭＶＩＬ２ＢＧＨプラスミドの有効性
実施例５によって精製されたｐＣＭＶＩＬ２ＢＧＨプラスミドの有効性を、ＤＭＲＩＥ／ＤＯＰＥを用いた脂質媒介インビトロ・トランスフェクションに続くＢ１６ＦＯ細胞（マウスメラノーマ細胞系）でのＩＬ−２遺伝子発現により測定した。
トランスフェクションの前日、２００００〜４０００００のＢ１６ＦＯ細胞が、６ウェルプレートの各ウェルに播種された。細胞はトランスフェクションの前にはコンフルエントの７５％を越える単層であった。細胞は２．５μｇのプラスミドＤＮＡによって、０．５μｇのＤＭＲＩＥ（ウマにより合成）と０．５μｇのＤＯＰＥ（アバンチ・ポーラー・リピッズ社（Avanti Polar Lipids, Inc., Alabaster, AL）により合成）の存在下、トランスフェクションされた。細胞は、５％ＣＯ2通気をしながら、３７℃でインキュベートされた。血清を減少させた培地、例えばＯｐｔｉ−ＭＥＭ（ギブコ・バル・ライフ・テクノロジーズ（GIBCO BRL Life Technologies, Baltimore, MD））にウシ胎児血清を補填したものが、トランスフェクションから１〜４時間後と２４時間後に細胞に添加された。細胞上清が、トランスフェクションから８０時間後に回収された。
細胞上清におけるＩＬ−２の発現は、酵素増幅感度免疫測定法（メドジェニックス（Medgenix）ＥＬＩＳＡ、メドジェニックス（Medgenix）診断用薬（Fleurus, Belgium））によって測定された。有効性は、参照ロットに対して５０〜２００％であった。
実施例８  ｐＣＭＶＢＧＨプラスミドの精製
ｐＣＭＶＢＧＨプラスミドを精製した。このプラスミドのサイズは約４３００ｂｐであった。これは、ヒトＩＬ−２コード化配列を除いて、ｐＣＭＶＩＬ２ＢＧＨプラスミドにおいて認められたすべての要素を含有していた。
実施例６に記載の精製工程を用いて、５０３ｇの湿細胞ペーストが処理され、１４．１ｍｇの精製プラスミドＤＮＡが回収された。
我々は、珪藻土を用いた生物学的物質混合物中のＲＮＡ濃度減少方法を提供する。これは、珪藻土材料にとって、新しい用途である。我々は、珪藻土材料は有効なＲＮＡの約８５％程度を留めると評価している。
本発明の個々の実施態様が詳細に述べられてきたが、これらの実施態様が制限的であるよりむしろ模範的であることは、当業者にとって明白であろうし、本発明の本来の範囲は、添付のクレームにおいて定義づけられた範囲である。