(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
澱粉、蛋白質および脂質の少なくとも一種の成分を含有する食品を、少なくとも一種の蛍光色素で染色した後、使用した蛍光色素の最大吸収波長の−４０nmより低波長領域内におけるそれぞれ異なる少なくとも２つの波長でそれぞれの画像を得、得られた画像を合成することを特徴とする、多成分分散系食品の組織構造を解析する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、澱粉、蛋白質および脂質の少なくとも一種の成分を含有する多成分分散系食品の組織構造を立体的に解析する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
澱粉、蛋白質および脂質は食品の三大栄養素といわれている。パン類、麺類、米飯、菓子類、天ぷらなどの二次加工食品は小麦粉、米を主原料としており、これらに含まれる三大栄養素成分が食品中にどのような形態で存在しているかによって味覚、食感が大きく変わるものと考えられている。従来これらの味覚、食感の評価はもっぱら官能検査によって行われていたが、近年機器類を用いて食品の組織構造を解明し、その組織構造から食感等を判別することが試みられている。しかしながら、これらの機器類によって組織構造を観察しても各構成成分の境界部が不鮮明であったり、得られる画像が平面的であるため満足し得る評価が行えないのが現状である。
【０００３】
例えば電子顕微鏡による場合は、標本に電子を飛ばして反射してきた電子を検出して標本の形を観察したり（走査型電子顕微鏡）あるいは標本を透過した電子と未透過の電子の差を検出して標本の形を観察したり（透過型電子顕微鏡）するが、これらの方法はいずれも非常に高い分解能で標本を観察することができる反面、染色ができないため特定成分の判別が困難であり、その境界部分の構造解析をすることができない。
光学顕微鏡による場合は、標本の特定成分の染色を行い観察するが、やはり境界部分が不鮮明であり、さらに多重染色によりある程度の色分けはできるが、染色による特異性が小さく、かつ染色剤のオーバーラップによって組織構造の判別が実質的にできなかった。
レーザー共焦点顕微鏡は、レーザー光を採用することで、直進性に優れた強い光を一点に集中させることができる。そのレーザー光を利用し、合焦点のみの像を表示でき、また、焦点深度の深い断面像が得られるため、コントラストの高い画像が得られる。その反面、染色ができないため得られた画像から特定成分の判別が難しく、その境界部分の構造解析をすることは困難である。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者等は、澱粉、蛋白質および脂質を含有する多成分分散系食品の複雑な組織構造を鮮明に判別することが可能な画像解析方法について種々研究を重ねた結果本発明を完成するに至った。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
すなわち、本発明は、澱粉、蛋白質および脂質の少なくとも一種の成分を含有する食品を蛍光性の蛋白質染色色素、蛍光性の脂質染色色素、蛍光性の澱粉染色色素、または蛍光性の非特性色素の中から少なくとも一種類以上の染色剤で染色した後、少なくとも一種類の蛍光色素の最大吸収波長の−４０nmより低波長領域のそれぞれ異なる少なくとも２つの波長で観察し、取得した少なくとも２つ以上の画像を合成する多成分分散系食品の組織構造を解析する方法である。
【０００６】
【発明の実施の形態】
次に本発明方法について説明する。
澱粉、蛋白質および脂質の少なくとも一種の成分を含有する食品（以下多成分分散系食品という）の組織標本を作成する。この組織標本の作成方法としては凍結固定法、浸漬固定法、マイクロウェーブ処理固定法等が採用できる。
【０００７】
次に凍結固定法について説明する。
多成分分散系食品をミクロトームの冷却ステージ上に凍結固定する。次いで凍結固定した試料を一定の厚みに切り出す。切り出した切片をプレパラート上に載せてヒーターで乾燥固定させ固定化する。別に蛍光色素溶液を調製し、この蛍光色素溶液と試料切片を一定時間（例えば１〜３０分間、長い場合で１〜３時間）反応させた後乾燥する。乾燥した試料切片を軟質のカナダバルサムで封入することによって組織標本を得ることができる。
前記組織標本の作成にあたって試料切片を複数の蛍光色素で染色する場合は、蛍光色素と反応させて乾燥した後別の蛍光色素と反応させて乾燥する操作を繰り返すことによって複数の蛍光色素を用いて染色することができる。
【０００８】
また、浸漬固定法は、多成分分散系食品をホルマリン溶液またはグルタルアルデヒド溶液に１２〜２４時間浸漬させる。次いでこの多成分分散系食品を流水中で数時間（例えば１〜１２時間）洗浄する。洗浄した多成分分散系食品は、脱水した後８０％、９５％、９９．５％および１００％濃度のエタノール溶液で順次各々２〜４時間浸漬処理する。次に多成分分散系食品をキシレン−軟質パラフィン液に１２時間浸漬し包埋する。包埋したパラフィンを台木の上に固定する。固定した多成分分散系食品はミクロトームを使用し、一定の厚みに切り出す。切り出した切片は湯浴（３５〜４０℃）上に浮かせて、しわをのばした後、スライドグラス上に切片をすくいあげ乾燥させる。別に蛍光色素溶液を調製し、この蛍光色素溶液と切片を一定時間（例えば１〜３０分間、長い場合で１〜３時間）反応させた後乾燥する。乾燥した切片を軟質のカナダバルサムで封入することによって組織標本を得ることができる。
なお複数の蛍光色素を用いて染色する場合は、凍結固定法と同様に蛍光色素で染色した後乾燥した後再度別の蛍光色素を用いて染色した後乾燥し、この操作を繰り返すことにより多重染色を行うことができる。
さらにマイクロウェーブ処理固定法は多成分分散系食品を例えばグルタルアルデヒド溶液に１２〜２４時間浸漬させ、マイクロウェーブを１０〜６０秒間照射し固定する。以後浸漬固定法と同様に処理することによって組織標本を得ることができる。
【０００９】
本発明方法の染色剤として使用する蛍光色素としては、フルオレセイン−イソチオシアネート、エオキシン−イソチオシアネート、ルシファーイエローＣＨ、レゾルフィン、テトラメチルローダミン−イソチオシアネート、クマリンマレイン酸イミド、７−アミノ−４−メチルクマリン−３−酢酸、フルオレスカミン、塩化ダンシル、ダンシルヒドラジン、アシッドグリーン、アクリジンオレンジ、アクリジンイエロー、コンゴレッド、酸性フクシン、ナイルブルー、ファーストグリーン、カルセイン、カルセインブルー、アクリフラビン、エバンスブルー、ローダミン１２３、ズダンブラックＢ、過ヨウ素酸シッフ、塩基性パラローズアニリン、パラローズアニリンアセテート、ベーシックルビン、マゼンダIII、アニリンブルー、アルファズリンＡ、アルファズリンＦＧ、パテントブルーＶＦ、トリ−（ｐ−アミノフェニル）アミン、トリ−（ｐ−イソチオシアネートフェニル）アミン等が挙げられる。
【００１０】
これらの蛍光色素のうち澱粉を特異的に染色する蛍光色素としては、コンゴレッド、過ヨウ素酸シッフ等が挙げられ、また蛋白質を特異的に染色する蛍光色素としてはフルオレスカミン、酸性フクシン、塩基性パラローズアニリン、パラローズアニリンアセテート、ベーシックルビン、マゼンダIII、アニリンブルー、アルファズリンＡ、アルファズリンＦＧ、パテントブルーＶＦ、トリ−（ｐ−アミノフェニル）アミン、トリ−（ｐ−イソチオシアネートフェニル）アミン等が挙げられ、さらに脂質を特異的に染色する蛍光色素としてはナイルブルー、ズダンブラックＢ等が挙げられる。
【００１１】
次に蛍光染色された食品は使用した蛍光色素の最大吸収波長の−４０nmのより低波長領域内において、２つ以上の波長で観察する。この観察を蛍光色素の最大吸収波長の−４０nmより、高波長領域で観察すると蛍光強度が強くなること等、反対に判別がしずらくなり本発明の目的は達成されない。
【００１２】
本発明における「観察」手段としては使用する蛍光色素の種類によって可視光による観察方法、赤外波長または紫外波長の領域で観察する方法によって行われる。赤外または紫外波長の領域で観察する場合は特定の観測機器を用い、観測データーを電気信号に変換し、コンピューター処理することによって観測することが可能である。
【００１３】
本発明の蛍光観察に使用する光源としては、水銀ランプ（１００Ｖ）、水銀ランプ（２００Ｖ）、キセノンランプ（７５Ｖ）、キセノンランプ（１５０Ｖ）、ハロゲンランプ（１２Ｖ１００Ｗ）、タングステンランプ（６Ｖ３０Ｗ）。これ以外にも、キセノンランプ［２５０〜１，０００nm］、タングステンランプ［２５０〜１，０００nm］、Ｃｒ：ＬｉＳＡＦランプ［４３０nm］、ヘリウム−カドミニウムレーザー［３２５、４４２nm］、アルゴンイオンレーザー［４８８、５１４nm］、Ｎｄ：ＹＡＧレーザー［５３２nm］、ヘリウムネオンレーザー［５４３、５９４、６３３nm］、クリプトンイオンレーザー［５６８、６４７nm］などの励起光源が用いられる。
【００１４】
本発明において多成分分散系食品の組織構造を解析する場合通常蛍光観察により行われるが、位相差と併用することによって、より立体的な組織構造として観察できる。この位相差手段としては明視野観察、位相差観察、微分干渉観察等が挙げられるが特に位相差観察あるいは微分干渉観察との併用が好ましい。
【００１５】
前記の蛍光観察に用いられるフィルターとしては励起フィルター、ダイクロイックフィルター、吸収フィルターあるいはこれらがセットになったミラーユニットが用いられる。これらのミラーユニットとしてはＵ−ＭＷＵ［励起フィルター（３３０〜３８５nm）、吸収フィルター（４２０nm）、吸収フィルター（４００nm）］、Ｕ−ＭＷＩＢ［励起フィルター（４６０〜４９０nm）、吸収フィルター（５１５nm）、吸収フィルター（５０５nm）］、Ｕ−ＭＷＩＧ［励起フィルター（５２０〜５５０nm）、吸収フィルター（５８０nm）、吸収フィルター（５６５nm）］、Ｕ−ＭＷＩＹ［励起フィルター（５４５〜５８０nm）、吸収フィルター（６１０nm）、吸収フィルター（６００nm）］（オリンパス光学工業株式会社製品名）等が挙げられる。
【００１６】
前記の蛍光観察と明視野観察を併用する場合は照明ランプの明るさの透過率を全体の６％以下に抑えることが好ましい。この観察に用いられるＮＤフィルターとしてはＬＢＤフィルター（オリンパス光学工業株式会社製品名）、ＮＤ２５フィルター（オリンパス光学工業株式会社製品名）、ＮＤ６フィルター（オリンパス光学工業株式会社製品名）等が挙げられる。
【００１７】
本発明は、前記の蛍光観察を行うにあたり、使用した蛍光色素の最大吸収波長の−４０nmより低波長領域内において２箇所以上の波長点によって観察することが必要である。
【００１８】
次に本発明の蛍光観察について説明する。
多成分分散系食品の組織標本をＡ蛍光色素（λmaxａ）を用いて染色した場合は、例えば「ａ−４５nm」および「ａ−６０nm」の波長で観察する。
【００１９】
また複数の蛍光色素を用いて多成分分散系食品の組織標本を染色した場合、例えばＢ蛍光色素（λmaxｂ）およびＣ蛍光色素（λmaxｃ）を用いて蛍光観察を行う場合には「ｂ−５０nm」および「ｂ−８０nm」での観察、「ｃ−６０nm」および「ｃ−７０nm」での観察、「ｂ−５０nm」および「ｃ−６０nm」での観察、「ｂ−８０nm」および「ｃ−６０nm」での観察、「ｂ−５０nm」、「ｂ−８０nm」および「ｃ−６０nm」での観察、「ｂ−５０nm」、「ｂ−８０nm」、「ｃ−６０nm」および「ｃ−７０nm」での観察等の種々の観察方法が採用できる。
【００２０】
【実施例】
次に本発明方法をさらに具体的に説明するために実施例を掲げるが、本発明は以下の実施例のみに限定されるものではない。
【００２１】
実施例１，比較例１〜３
パン生地を冷却ステージ上で急速凍結させる。凍結切片をミクロトームで一定の厚さに薄切し、顕微鏡用プレパラート上に乾燥固定し切片を作製する。次に蛋白質染色色素であるアニリンブルー（λmax＝６０５nm）を用いて切片を染色し、十分乾燥させる。次に得られた組織標本を蛍光顕微鏡（オリンパス光学工業社製ＢＸ５１）で下記表１に示す蛍光観察用フィルターを用いて蛍光観察を行った。また、蛍光観察と、位相差観察あるいは微分干渉観察を併用して行った。
評価は観察によって撮影した組織構造の画像を重ね合わせた写真を１０名のパネラーにより表２に示す評価基準に従って評価を行った。その試験結果を示せば表１のとおりである。
【００２２】
【表１】
0003771861.tif 000002
【００２３】
【表２】
0003771861.tif 000003
【００２４】
実施例２〜４，比較例４〜６
うどんの麺線を浸漬固定する。浸漬固定した麺線を冷却ステージ上で凍結固定した後、ミクロトームで一定の厚さに薄切し、顕微鏡用プレパラート上に乾燥固定し切片を作製する。次に蛋白質染色色素であるパラローズアニリンアセテート（λmax＝５４５nm）を用いて切片を染色し、乾燥する。次に、非選択性蛍光色素であるファーストグリーンＦＣＦ（λmax＝６２２nm）を用いて切片を染色し、乾燥する。
次に得られた組織標本を蛍光顕微鏡（オリンパス光学工業社製ＢＸ５１）で下記表３に示す蛍光観察用フィルターを用いた蛍光観察を行った。また、蛍光観察と、位相差観察あるいは微分干渉観察を併用して行った。
評価は観察によって撮影した組織構造を重ね合わせた写真を実施例１と同様に評価を行った。その試験結果を示せば表３のとおりである。
【００２５】
【表３】
0003771861.tif 000004
【００２６】
実施例５，比較例７〜９
天ぷらの衣を冷却ステージ上でコンパウンド（三共コパウドＣＴＣ）と共に急速凍結させる。凍結切片をミクロトームで一定の厚さに薄切し、顕微鏡用プレパラート上に乾燥固定し切片を作製する。次に脂質染色色素でズダンブラックＢ（λmax＝５９８nm）を用いて切片を染色し、乾燥する。次に、蛋白質染色色素である酸性フクシン（λmax＝５４５nm）を用いて切片を染色し、乾燥する。
次に得られた組織標本を蛍光顕微鏡（オリンパス光学工業社製ＢＸ５１）で下記表４に示す蛍光観察用フィルターを用いた蛍光観察を行った。また、蛍光観察と、位相差観察あるいは微分干渉観察を併用して行った。
評価は観察によって撮影した組織構造を重ね合わせた写真を実施例１と同様に評価を行った。その試験結果を示せば表４のとおりである。
【００２７】
【表４】
0003771861.tif 000005
【００２８】
【発明の効果】
本発明方法によれば、澱粉、蛋白質、脂質等を含有する多成分分散系食品の組織構造を立体的画像として解析することができる。