(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホスホリパーゼＢ活性及びリパーゼ活性を共に有し、配列番号：１に示すアミノ酸配列中少なくとも第３６７位のアミノ酸Ｌｙｓから第７１２位のアミノ酸Ａｓｎまでのアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列に対して１個又は数個のアミノ酸の置換、欠失又は付加により修飾されているアミノ酸配列を有する蛋白質。
【請求項２】
配列番号：１の第３６７位のアミノ酸Ｌｙｓから第７１２位のアミノ酸Ａｓｎまでのアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列に対して１又は数個のアミノ酸の置換、欠失又は付加により修飾されているアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の蛋白質。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の蛋白質をコードするＤＮＡ。
【請求項４】
配列番号：１に記載の塩基配列を有するＤＮＡと高ストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つホスホリパーゼＢ活性及びリパーゼ活性の両方を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
【請求項５】
請求項４に記載のＤＮＡによりコードされている蛋白質。
【請求項６】
請求項３又は４に記載のＤＮＡを含んで成るベクター。
【請求項７】
請求項６に記載のベクターにより形質転換された宿主。
【請求項８】
請求項７に記載の宿主を培養し、そして培養物から、ホスホリパーゼＢ活性及びリパーゼ活性を有する蛋白質を採取することを特徴とする、ホスホリパーゼ蛋白質の製造方法。
【請求項９】
同程度の高いホスホリパーゼＡ２とリパーゼ比活性を示し、小腸、精巣（精子）、食道に特異的に発現する請求項１又は２に記載の蛋白質。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は新規なホスホリパーゼ、該ホスホリパーゼをコードする遺伝子系、及び該ホスホリパーゼの製造方法に関する。本発明のホスホリパーゼはホスホリパーゼ活性及びリパーゼ活性を併せ持ち、膵臓ホスホリパーゼ補充療法剤、ホスホリパーゼＢ／リパーゼ測定用試薬等として有用である。
【０００２】
【従来の技術】
ホスホリパーゼはリン脂質を加水分解する酵素の総称であり、リン脂質（グリセロールリン脂質）は、グリセロールの末端及び中央のヒドロキシル基に脂肪酸がエステル結合しており、他方の末端のヒドロキシル基にリン酸基を介してコリン、エタノールアミン等が結合している化合物である。グリセロールリン脂質中のグリセロール基のｓｎ−１位の脂肪酸エステル結合を加水分解するホスホリパーゼをホスホリパーゼＡ1 と称し、グリセロール基のｓｎ−２位の脂肪酸エステル基を加水分解するホスホリパーゼをホスホリパーゼＡ2 と称し、また、ホスホリパーゼＡ1 活性及びホスホリパーゼＡ2 活性を併有するホスホリパーゼをホスホリパーゼＢと称する。
【０００３】
また、リン脂質中の末端又は中央の脂肪酸アシル基の内一方が除去されたリン脂質をリゾリン脂質と称し、リゾリン脂質に作用して残っている脂肪酸エステル結合を加水分解する酵素も、分解生成物が前記ホスホリパーゼＢの場合と同じであるため、ホスホリパーゼＢに含められる。他方、リン脂質のグリセロール基とリン酸基との間のエステル結合を加水分解するホスホリパーゼをホスホリパーゼＣと称し、リン酸基とコリンやエタノールアミン等との間の結合を加水分解するホスホリパーゼをホスホリパーゼＤと称する。
他方、脂肪酸のグリセリンエステルのアシル基を加水分解する酵素をリパーゼと称する。従来、ホスホリパーゼＢ活性とリパーゼ活性とを併有する酵素は知られていない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明は、ホスホリパーゼＢ活性とリパーゼ活性とを併有する新規な酵素を提供しようとするものである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
従って本発明は、ホスホリパーゼＢ活性及びリパーゼ活性を共に有し、配列番号：１に示すアミノ酸配列中の少なくとも第３６７位のアミノ酸Ｌｙｓから第７１２位のアミノ酸Ａｓｎまでのアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列に対して１個又は数個のアミノ酸の置換、欠失又は付加により修飾されているアミノ酸配列を有する蛋白質、並びに配列番号：１に示す塩基配列とハイブリダイズすることができるＤＮＡによりコードされており、且つホスホリパーゼＢ活性及びリパーゼ活性を併有する蛋白質を提供する。
【０００６】
本発明はさらに、上記の蛋白質をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含んで成る組換えベクター、特に発現ベクター、及び該ベクターにより形質転換された宿主に関する。
本発明はまた、上記の宿主を培養し、該培養物から、ホスホリパーゼＢ活性及びリパーゼ活性を併有する酵素を採取することを特徴とする該酵素の製造方法に関する。
【０００７】
【発明の実施の形態】
酵素蛋白質
本発明の酵素は、単一の酵素としてホスホリパーゼ活性（リゾホスホリパーゼ活性を含めて）及びリパーゼ活性を有する多機能酵素である。例えば、ラットの小腸から精製した酵素は、ラット小腸膜分画から自己消化によって可溶化され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定した分子量は非還元条件下で約３５kDa であり、還元条件下では１４kDa 及び２１kDa の２本のバンドとして示される。ラットの近位回腸からのｃＤＮＡによりコードされている蛋白質は配列番号：１に示す１位のアミノ酸Ｍｅｔから１４４３位のアミノ酸Ｇｌｎまでのアミノ酸配列を有する。
【０００８】
この蛋白質は、図１に示すように、そのＮ−末端に、１位のＭｅｔから第３０位のＧｌｙまでのアミノ酸配列を有するシグナルペプチドを有し、Ｃ−末端に１４２１位のＬｅｕから第１４４３位のＴｒｐまでのアミノ酸配列を有する膜結合ドメインを有し、これらの間に４個の反復配列、すなわち第４３位のＬｅｕから第３５２位のＡｓｎまでの第一反復配列、第３６７位のＬｙｓから第７１２位のＡｓｎまでの第二反復配列、第７１４位のＧｌｙから第１０５９位のＡｓｎまでの第三反復配列、及び第１０７０位のＡｓｎから第１４０８位のＧｌｎまでの第四反復配列が存在し、この内図４に示すごとく、第二反復配列にホスホリパーゼＢ活性、リゾホスホリパーゼ活性及びリパーゼ活性が存在する。
【０００９】
従って本発明の酵素蛋白質は、配列番号：１に示すアミノ酸配列の内、少なくとも第二反復配列に相当する第３６７位のＬｙｓから７１２位のＡｓｎまでのアミノ酸配列を有し、このアミノ酸配列のＮ−末端及び／又はＣ−末端に更なるアミノ酸又はアミノ酸配列が付加されていてもよい。一般に、天然型酵素のアミノ酸配列中で少数のアミノ酸を変更しても本来の酵素活性が維持されることが知られている。
【００１０】
従って、本発明の酵素は、上記のアミノ酸配列において１個〜数個、例えば１０個以下のアミノ酸が付加、欠失及び／又は他のアミノ酸による置換によって修飾されたアミノ酸配列を有していてもよい。本発明はさらに、配列番号：１に示す塩基配列を有するＤＮＡと所定のストリンジェンシー条件下、例えば６５℃、１６時間（５×ＳＳＰＥ、０．５％ＳＤＳ、１×Ｄｅｎｄａｒｄｔ溶液、２０μｇ／mlサケ精子ＤＮＡ）においてハイブリダイズするＤＮＡによりコードされており、且つホスホリパーゼＢ活性（リゾホスホリパーゼ活性を含む）とリパーゼ活性とを併有する酵素をも包含する。
【００１１】
遺伝子系
本発明はさらに、本発明の酵素をコードしており、該酵素の製造のために有用な遺伝子系すなわち、前記の種々のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含んで成る組換えベクター、特に発現ベクター、及び該ベクターにより形質転換された宿主に関する。本発明のＤＮＡの塩基配列は、前記の種々のアミノ酸配列をコードするものであればよいが、一例として、配列番号：１に示すコード領域の塩基配列又はその一部分から成るものが挙げられる。
【００１２】
このＤＮＡは、適当なｃＤＮＡライブラリーから選択されたｃＤＮＡ、またはゲノミックＤＮＡライブラリーから選択されたＤＮＡであってもよい。ｃＤＮＡやゲノミックＤＮＡの選択は、例えば、本発明の酵素の部分アミノ酸配列に基いて設計されたＤＮＡプローブを用いて行うことができ、あるいはそのようにして設計されたＤＮＡをプライマーとして用いてＰＣＲ法により増幅してもよい。
【００１３】
また、修飾されたアミノ酸配列を有する酵素をコードするＤＮＡは、前記のＤＮＡライブラリーのスクリーニング又はＰＣＲ法により得た、生来の塩基配列を有するＤＮＡを基礎にして、常用の部位特定変異誘発やＰＣＲ法を用いて合成することができる。例えば、修飾を導入したい部位を含むＤＮＡ断片を、上記により得られたｃＤＮＡ又はゲノミックＤＮＡの制限酵素消化により得、これを鋳型にして、所望の変異を導入したプライマーを用いて部位特定変異誘発又はＰＣＲ法を実施し、所望の修飾を導入したＤＮＡ断片を得、これを、目的とする酵素の他の部分をコードするＤＮＡに連結すればよい。
【００１４】
あるいはまた、短縮されたアミノ酸配列を有する酵素をコードするＤＮＡを得るには、例えば目的とするアミノ酸配列より長いアミノ酸配列、例えば全長アミノ酸配列をコードするＤＮＡを、所望の制限酵素により切断し、得られたＤＮＡ断片が目的とするアミノ酸配列の全体をコードしていない場合には、不足部分を合成ＤＮＡを連結することにより補えばよい。
【００１５】
本発明はまた、前記のＤＮＡを含んで成る組換えベクター、特に発現ベクター、及び該ベクターにより形質転換された宿主に関する。宿主としては、原核生物又は真核生物を用いることができる。原核生物としては、細菌、例えばエシェリヒア（Escherichia ）属に属する細菌、例えば大腸菌（Escherichia  coli）、バシルス（Bacillus）属微生物、例えばバシルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）、等常用の宿主を用いることができる。
【００１６】
真核性宿主としては、下等真核生物、例えば真核性微生物、例えば真菌である酵母又は糸状菌が使用できる。酵母としては、例えばサッカロミセス（Saccharomyces ）属微生物、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces  cerevisiae）等が挙げられ、また糸状菌としてはアスペルギルス（Aspergillus ）属微生物、例えばアスペルギルス・オリゼ（Aspergillus  oryzae）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus  niger ）、ペニシリウム（Penicillium ）属微生物等が挙げられる。さらに、動物細胞又は植物細胞が使用でき、動物細胞としては、マウス、ハムスター、サル、ヒト等の細胞系が使用される。さらに、昆虫細胞、例えばカイコの細胞、又はカイコの成虫それ自体も宿主として使用される。
【００１７】
本発明の発現ベクターは、それらを導入すべき宿主の種類に依存して発現制御領域、例えばプロモーター及びターミネーター、複製起点等を含有する。細菌用発現ベクターのプロモーターとしては、常用のプロモーター、例えばｌａｃ，Ｔ７，ｔｒｐ等が使用され、酵母用プロモーターとしては、例えばＡＤＨ１，ＰＨＯ５等が使用され、糸状菌用プロモーターとしては例えば、グルコアミラーゼ遺伝子、α−アミラーゼ遺伝子等のプロモーターが使用される。また、動物細胞宿主用プロモーターとしてはウイルス性プロモーター、例えばＳＶ４０、単純ヘルペス、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、プロモーター等が使用される。
【００１８】
発現ベクターの作製は、制限酵素、リガーゼ等を用いて常法に従って行うことができる。また、発現ベクターによる宿主の形質転換も、常法に従って行うことができる。
本発明はまた、ホスホリパーゼＢ活性及びリパーゼ活性を併有する前記蛋白質の製造方法に関する。前記の発現ベクターにより形質転換された宿主を培養又は飼育し、培養物等から常法に従って、例えば、濾過、遠心分離、細胞の破砕、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー等により目的とする蛋白質を回収、精製することができる。本発明の酵素はまた、それを含有する組織又は器官、例えばラット小腸から上記のようにして回収、精製することもできる。
本発明の酵素は、例えば膵臓リパーゼ補充療法剤、小腸疾患の診断薬としてのホスホリパーゼ／リパーゼ測定系の試薬等として有用である。
【００１９】
【実施例】
次に、本願発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
実施例１．ホスホリパーゼＢ／リパーゼの精製
ラット小腸刷子縁膜からのホスホリパーゼＢ／リパーゼの精製を以下のように行なった。ペントバルビタール麻酔下に切除したラット小腸を−３５℃で約２カ月間保存すると、その間にホスホリパーゼＢ／リパーゼは限定分解により刷子縁膜から可溶化された。
【００２０】
可溶化酵素をＱＡＥ−トヨパール、フェニルセファロース、ＱＡＥ−トヨパール、ヒドロキシアパタイト、ＣｏｎＡ−セファロース及びコスモゲルＱＡの各クロマトグラフィーを用いて、約８２００倍に精製した。精製標品は非還元条件のＳＤＳ−電気泳動において３５kDa の位置に単一バンドとして泳動され、このバンドに一致してホスホリパーゼＡ2 活性、リゾホスホリパーゼ活性及びリパーゼ活性が認められた。
【００２１】
一方、還元条件のＳＤＳ−電気泳動では３５kDa のバンドは消失し、代りに２１kDa と１４kDa の二本のバンドが見られたが酵素活性は検出できなかった。本酵素の至適pHは、ホスホリパーゼＡ2 活性、リゾホスホリパーゼ活性及びリパーゼ活性ともに９付近であった。１−アルキル−ホスファチジルコリン、ジアシル−ホスファチジルコリン及びジアシル−ホスファチジルエタノールアミンに対する反応性は、デオキシコール酸との混合ミセルを基質とした場合、大差はなかった。ジラジルリン脂質リポソームに対する反応性は低いが、胆汁酸／ジラジルリン脂質混合ミセル及びリゾアルキルミセルに対する反応性は高い。したがってホスホリパーゼＡ2 ／リゾホスホリパーゼ活性比は、基質の存在様式により異なる。
【００２２】
実施例２．ホスホリパーゼＢ／リパーゼの部分アミノ酸配列の決定
精製された酵素を還元カルボキシメチル化し、逆相ＨＰＬＣで分離して１４kDa と２１kDa の二種類のポリペプチド鎖を得た。それぞれのＮ末端からのアミノ酸配列をシークエンサーで決定した。その結果、１４kDa のポリペプチド及び２１kDa のポリペプチドからそれぞれ次のアミノ酸配列が得られた。
0003785602.tif 000002
【００２３】
上記のアミノ酸配列中９個又は１０個のアミノ酸に基いて下記のプライマーＫＦ及びＱＴを設計し、常法に従って合成した。なお、プライマーＫＦの５′−末端の８塩基は人為的に付加したＢａｍＨＩ認識配列である。
0003785602.tif 000003
【００２４】
実施例３．ｃＤＮＡのクローニング
実施例２において合成したプライマーを用いてラットｃＤＮＡライブラリーを用いて、ＤＮＡ断片をクローニングした。ラットｃＤＮＡライブラリーは次のようにして作製した。常法により回腸から抽出した１μｇのＲＮＡを鋳型として、２００Ｕの逆転写酵素（Ｓｕｐｅｒ  Ｓｃｒｉｐｔ  ＲＴ）によりｃＤＮＡを合成した。１／２量の合成ｃＤＮＡと上記プライマーＫＦとプライマーＱＴ（各１００pmol）を用いＰＣＲ法によりホスホリパーゼＢ／リパーゼｃＤＮＡ断片を増巾した。ＰＣＲ１サイクルの条件は、９４℃、４０秒；５４℃、１分；７２℃、１分であり、これを３０サイクル行なった。
【００２５】
増幅産物は、５％ポリアクリルアミドゲル上単一バンド（５４０bp）であったため、ｐＣＲIIプラスミドベクターに直接挿入した。こうして、５４０bpのＤＮＡ断片を得た。この断片は、ホスホリパーゼＢ／リパーゼの一部分をコードしており、全長をコードしていないので、このｃＤＮＡ断片をプローブとして、ラット近位回腸から、λＭＯＳＥｌｏｘクローニングベクター（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて、ｃＤＮＡライブラリーを作製した。このｃＤＮＡライブラリーは、次の様にして作製した。
【００２６】
ラット回腸から精製したポリ（Ａ）+ ＲＮＡ６μｇを用いて、常法により２本鎖ｃＤＮＡを合成した。ｃＤＮＡの両端を平滑化後ＥCOＲＩアダプターを付加し、５００bpより長いｃＤＮＡをスパンカラムにより集めた。このｃＤＮＡをλＭＯＳＥｌｏｘのＥCOＲＩ部位に挿入した。このベクターを用い常法によりｉｎ  ｖｉｔｒｏパッケージング反応を行なってライブラリーを完成させた。
【００２７】
スクリーニングのためのハイブリダイゼーションは次の様にして行った。上記の５４０bpｃＤＮＡを32Ｐでラベルした。ラベル化プローブ（５×１０7 cpm ）を１００mlの５×ＳＳＰＥ、０．５％ＳＤＳ、１×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、２０μｇ／ml変性サケ精子ＤＮＡを含む緩衝液中で６５℃１６時間ナイロンフィルター上のレプリカと反応させた。未反応のプローブは、６５℃０．２×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ中で洗浄した。
【００２８】
こうして、１９個の陽性クローンを得、その１つをｐＭＯＳ−ＲＩＰＬＢと称し、その全塩基配列をサンガー法により決定した。その結果を配列番号：１に示す。このＤＮＡは、全長４６１３bpのｃＤＮＡであり、１４５０個のアミノ酸から成るアミノ酸配列をコードする１個のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含有し、そのＮ−末端には約３０残基のシグナル配列を含んでいた。このアミノ酸配列において、成熟蛋白質部分は４回の相同な繰り返し配列と、Ｃ−末端側の疎水性の膜結合部位とから構成されていた。この構成を図１に模式的に示す。
なお、配列番号：１において、プライマーＫＦは第３７１位から第３７９位までのアミノ酸に対応し、プライマーＱＴは第５３２位のアミノ酸から第５４１位のアミノ酸までに対応した。
【００２９】
実施例４．酵素活性部位の決定
図１に示す全長蛋白質のどの部分に酵素活性があるかを明らかにするため図２に示すように、全長蛋白質の発現プラスミドｐＳＶＬ−ＲＩＰＬＢに加えて、膜結合ドメインのみを除去した蛋白質（配列番号：１中、第１位のＭｅｔから第１４０８位のＧｌｎまでのアミノ酸配列を有する）をコードする発現プラスミドｐＳＶＬ−ΔＣ、シグナルペプチドと第一反復配列とで構成される蛋白質（配列番号：１中、第１位のＭｅｔから第３５７位のＧｌｎまでのアミノ酸配列を有する）をコードする発現プラスミドｐＳＶＬ−＃１、
【００３０】
シグナルペプチドと第二反復配列とから構成される蛋白質（配列番号：１中、第１位のＭｅｔから第４０位のＰｈｅまでのアミノ酸配列と、第３６６位のＭｅｔから第７１２位のＡｓｎまでのアミノ酸配列を有する）をコードする発現プラスミドｐＳＶＬ−＃２、シグナルペプチドと第三反復配列とから構成される蛋白質（配列番号：１中、第１位のＭｅｔから第４０位のＰｈｅまでのアミノ酸配列と、第７１２位のＡｓｎから第１０５９位のＡｓｎまでのアミノ酸配列を有する）をコードする発現プラスミドｐＳＶＬ−＃３、及びシグナルペプチドと第四反復配列とから構成される蛋白質（第１位のＭｅｔから第４０位のＰｈｅまでのアミノ酸配列と、第１０６８位のＩｌｅから第１４０８位のＧｌｎまでのアミノ酸配列とを有する）をコードする発現プラスミドｐＳＶＬ−＃４を、次の様にして作製した。なお、この作製過程を図３及び４に示す。
【００３１】
ｐＭＯＳ−ＲＩＰＬＢをＢａｍＨＩで切断して、ｃＤＮＡをアガロース電気泳動で回収し、発現用ベクターｐＳＶＬのＢａｍＨＩ部位に挿入した。このベクターをｐＳＶＬ−ＲＩＰＬＢと名づけた。シグナル配列部分をそれぞれの反復配列ｃＤＮＡに連結するため、まず、第１位Ｍｅｔから第４０位ＰｈｅまでをコードするｃＤＮＡとその３′末端にＮｈｅＩ，ＤｒａＩ、ストップコドン、ＢａｍＨＩの順序のクローニングサイトを連結したＤＮＡ断片をＰＣＲ法により合成した。この際、プライマーとしてＵ１８とＮｒｅｖを用い、鋳型としてｐＳＶＬ−ＲＩＰＬＢを用いた。
【００３２】
このｃＤＮＡ断片をｐＭＯＳｂｌｕｅに挿入し、ｐＭＯＳ−ｈｅａｄと名付けた。次にｐＭＯＳ−ｈｅａｄをＡｐａＩとＢａｍＨＩで切断したｃＤＮＡ断片と、ｐＳＶＬ−ＲＩＰＬＢを同様に切断したプラスミッド側断片を回収し、お互いにつなぎ合わせてｐＳＶＬ−ｈｅａｄを作成した。ｐＳＶＬ−ｈｅａｄには、ＮｈｅＩ，ＤｒａＩ，ＭｌｕＩ，ＢａｍＨＩのクローニングサイトが存在するので、これを利用してｐＳＶＬ−＃１，ｐＳＶＬ−＃２，ｐＳＶＬ−＃３，ｐＳＶＬ−＃４，ｐＳＶＬ−ΔＣを作成した。
【００３３】
（１）ｐＳＶＬ−＃１の作成：ｐＳＶＬ−ＲＩＰＬＢからＡｐａＩとＰｕｖIIで切り出したｃＤＮＡ断片と、ｐＳＶＬ−ｈｅａｄからＡｐａＩとＤｒａＩで切断したプラスミッド側断片を連結して、ｐＳＶＬ−＃１を作成した。
（２）ｐＳＶＬ−＃２，−＃３，−＃４の作成：５′末端にＮｈｅＩ配列のあるセンス方向のプライマー（Ｆ２，Ｆ３，Ｆ４）と５′末端にＭｌｕＩとストップコドンのあるアンチセンス方向のプライマー（Ｒ２，Ｒ３，Ｒ４）、鋳型としてｐＳＶＬ−ＲＩＰＬＢを用いてＰＣＲ法により第２、第３および第４反復配列部分ｃＤＮＡを合成した。これらのＰＣＲ産物を、ｐＳＶＬ−ｈｅａｄをＮｈｅＩとＭｌｕＩで切断したプラスミッド側断片にクローニングして、ｐＳＶＬ−＃２，−＃３および−＃４を作成した。
（３）ｐＳＶＬ−ΔＣの作成：ｐＳＶＬ−ＲＩＰＬＢをＢａｍＨＩで切断して作成したプラスミッド側断片にｐＳＶＬ−＃４のＢａｍＨＩ断片を挿入してｐＳＶＬ−ΔＣを作成した。
【００３４】
実施例５．蛋白質の発現
実施例４に記載した各プラスミドを用いて常法に従ってＣＯＳ細胞を形質転換した後、形質転換されたＣＯＳ細胞をダルベコ・改変イーグル培地中で３７℃にて７２時間培養し培養上清を採取後、細胞を剥離し、６００μｌのＨＥＰＥＳ緩衝生食水に浮遊させた。細胞浮遊液を３０秒２回超音波破砕し、１０００ｇ１０分間４℃で遠心して上清を回収した。さらに上清を４℃で１００，０００ｇ、４５分間遠心し上清と沈殿に分離した。沈殿画分はＨＥＰＥＳ生食２００μｌに分散させた。
【００３５】
以上のようにサンプルを調製し、酵素活性（ホスホリパーゼＡ2 活性、リゾホスホリパーゼ活性、及びリパーゼ活性）を次のようにして測定した。
酵素活性は、基質（１mM）としてホスホリパーゼＡ2 反応には、１−パルミトイル−２−オレオイル−ホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、リパーゼ反応にはトリオレオイルグリセロール（ＴＯＧ）、リゾホスホリパーゼ反応には、１−パルミトイル−グリセロホスホコリン（ＬＰＣ）を用い、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH８．５）、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、胆汁酸（ホスホリパーゼＡ2 反応では６mMコール酸、リパーゼ反応では、６mMデオキシコール酸、リゾホスホリパーゼ反応では無添加）、１０mMＥＤＴＡを含む溶液５０μｌ中３７℃で測定した。
反応はＤｏｌｅ試薬（ｎ−ヘプタン／２−プロパノール／２ＮＨ2 ＳＯ4 、１０：４０：１ｖ／ｖ）２００μｌを加え停止し、さらにｎ−ヘプタン１２０μｌ、水７０μｌ、内部標準物質マルガリン酸５nmolを加え、反応産物の脂肪酸をｎ−ヘプタン層に抽出した。抽出した脂肪酸を９−アントリルジアゾメタンで誘導体化後、逆相ＨＰＬＣ（９８％アセトニトリル／２％Ｈ2 Ｏ、アイソクラティツク溶出）で分離、定量した。検出は、２５４nmのＵＶ吸収を用いて行った。
【００３６】
その結果、図５に示すように、いずれの酵素活性も、全長蛋白質（プラスミドｐＳＶＬ−ＲＩＰＬＢから発現）及び第二反復配列（及びシグナル配列）から成る蛋白質（プラスミドｐＳＶ−＃２から発現）において認められ、酵素活性部位が第二反復配列中に存在することが確認された。
さらに、前記の試料をイムノブロッティング法により分析し、また前記培養細胞中のＲＮＡについてノーザンブロッティング法による分析を行った。
【００３７】
イムノブロッティング：試料として、ｐＳＶＬ−ＲＩＰＬＢで形質転換された細胞の場合は膜画分、それ以外のベクターを導入した細胞の場合には、培養上清を用いた。１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル各レーンに２０μｇの蛋白質量をのせた。泳動後ＰＶＤＦ膜にブロットした。１次抗体として、ホスホリパーゼＢ／リパーゼの第４５０〜１４５０番目のアミノ酸配列に対応する蛋白質に対するウサギポリクローナル抗体を用い、２次抗体としてペルオキシダーゼラベル化抗ウサギＩｇＧ抗体を用いた。コニカイムノステインＨＲＰキットにより発色させた。
【００３８】
ノーザンブロッティング：培養細胞から酸グアニジニウム−チオシアネート−フェノール−クロロホルム抽出法により全ＲＮＡ画分を調製＜各レーンに３０μｇの全ＤＮＡをのせた。＞した。32Ｐラベル化全長ＲＩＰＬＢｃＤＮＡをプローブとして５×ＳＳＰＥ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、０．５％ＳＤＳ、２０μｇ／ml精子ＤＮＡ溶液中、４２℃、１６時間ハイブリダイズさせた。洗浄は６５℃で行なった。その結果を図６に示す。
【００３９】
発現ベクターｐＳＶＬ−ΔＣ，ｐＳＶＬ−＃１，ｐＳＶＬ−＃２，ｐＳＶＬ−＃３，ｐＳＶＬ−＃４を導入したＣＯＳ細胞では、それぞれのｃＤＮＡに対応する大きさのｍＲＮＡが発現していたが、ｃＤＮＡを含まないｐＳＶＬのみを導入した細胞では本酵素のｍＲＮＡの発現は見られなかった。ｐＳＶＬ−ＲＩＰＬＢ導入細胞では膜分画に２００kDa の酵素が検出されたが（Ｃ−末端疎水領域を欠くｐＳＶＬ−ΔＣ導入細胞では培養上清に酵素が検出された。この結果、Ｃ−末端疎水性ドメインが膜結合に関与することが明らかとなった。また、第２、第４反復配列に対応する酵素は、培養上清に検出されたが第１、第３反復配列に対応する酵素は検出できなかった。本実験に用いた抗体の反応性が各々の反復配列部分で異なっていることが示唆される。
【００４０】
実施例６．ホスホリパーゼＢ／リパーゼの生体内分布
ホスホリパーゼＢ／リパーゼ酵素の生体内分布を調べるため、ラットの小腸、脳、肺、食道、胃、十二指腸、回腸、盲腸、結腸、心臓、肝臓、腎臓、膵臓、脾臓、胸腺、精巣及び卵巣からＲＮＡを抽出し、前記のｃＤＮＡをプローブとして用いて、ノーザンブロット法により、ホスホリパーゼＢ／リパーゼ酵素をコードする遺伝子の分布を観察した。その結果、図７に示すように、小腸のほかに、食道及び精巣にも、小腸からのｍＲＮＡと同じ長さであり、且つプローブｃＤＮＡとハイブリダイズするｍＲＮＡが存在することが明らかとなり、本酵素が消化以外の役割を担っている可能性が示された。
また、十二指腸、空腸、回腸（上部）及び回腸（下部）の粘膜、並びに食道の粘膜及び筋肉からの抽出したＲＮＡの結果を図８に示す。
【００４１】
ホスホリパーゼＢ／リパーゼは、小腸口側よりも肛門側の回腸とりわけ上部回腸粘膜に豊富に存在していた。したがって、食物中の脂質は、まず、小腸上部の管腔内で膵臓から分泌されたリパーゼやホスホリパーゼＡ2 の作用で分解され、その後、回腸の本酵素により経末消化を受けることが示唆された。食道上皮は、小腸上皮と異なり刷子縁を持たない偏平上皮細胞から成るので本酵素の分布を上皮と固有筋層に分けて検討した。食道においても本酵素は上皮細胞に存在していた。
【００４２】
【配列表】
配列番号：１
配列の長さ：4613bp
配列の型：核酸
鎖の型：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：cDNA
起原
生物名：ラット
直接の起原：プラスミドpSVL-RIPLB
特徴
アミノ酸配列    1...30    シグナル
アミノ酸配列   43...352   第一反復配列
アミノ酸配列  367...712   第二反復配列
アミノ酸配列  714...1059  第三反復配列
アミノ酸配列 1070...1408  第四反復配列
アミノ酸配列 1421...1443  膜結合ドメイン
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【００４３】
0003785602.tif 000005
【００４４】
0003785602.tif 000006
【００４５】
0003785602.tif 000007
【００４６】
0003785602.tif 000008
【００４７】
0003785602.tif 000009
【００４８】
0003785602.tif 000010
【００４９】
0003785602.tif 000011
【００５０】
0003785602.tif 000012
【００５１】
0003785602.tif 000013
【００５２】
0003785602.tif 000014
【００５３】
配列番号：２
配列の長さ：１７
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク
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Pro
【００５４】
配列番号：３
配列の長さ：３０
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク
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【００５５】
配列番号：４
配列の長さ：34
配列の型：核酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成オリゴヌクレオチド
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【００５６】
配列番号：５
配列の長さ：29
配列の型：核酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成オリゴヌクレオチド
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明のホスホリパーゼＢ／リパーゼ酵素の全長構造を示す模式図である。
【図２】図２は、実施例４において作製した各種発現プラスミドの挿入部の構造を示す模式図である。
【図３】図３は、実施例４における各種発現プラスミドの作製の工程を示す図である。
【図４】図４は、実施例４における各種発現プラスミドの作製の工程を示す図である。
【図５】図５は、各種発現プラスミドにより発現されたタンパク質の酵素活性を示すグラフである。
【図６】図６は、各種発現プラスミドにより発現された蛋白質のイムノブロット図、及び各種発現プラスミドにより形質転換された動物細胞宿主において転写されたｍＲＮＡのノーザンブロット図であり、電気泳動の結果を表わす図面代用写真である。
【図７】ラットの種々の組織又は器官から抽出されたＲＮＡを、ホスホリパーゼＢ／リパーゼをコードするｃＤＮＡをプローブとして検出した結果を示すノーザンブロット図であり、電気泳動の結果を示す図面代用写真である。
【図８】図８は、種々の腸粘膜及び食道の組織から抽出したＲＮＡを図６と同様にして検出した結果を示すノーザンブロット図であり、電気泳動の結果を示す図面代用写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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