(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイクロキュベットを用いて構造化基板上にインサイツ合成により分子Ｍ１、Ｍ２、．．．．．．Ｍｎの異なる鎖で形成される化学又は生体分子の配列の鋳型を製造する方法であって、
次の工程：
１）分子Ｍ１、Ｍ２、．．．．．．Ｍｎと共有結合を形成可能な官能基によって基板のマイクロキュベットを官能化する工程；
２）保護ポリマーの液滴のマイクロデポジッションにより少なくとも１つのマイクロキュベットに保護ポリマーを付着させて、選択されたマイクロキュベットに固体ポリマーのキャップを形成する工程；
３）１又は複数の化学反応を液相で実施して、保護ポリマーで被覆されていないマイクロキュベットの官能基上に第１分子Ｍ１をカップリングさせる工程；
４）工程３）において実施された第１の反応又はその後の反応の１つの後に、保護ポリマーで被覆されているマイクロキュベット上の該保護ポリマーを除去する工程；
５）官能化された各マイクロキュベット上に所望の鎖形成配列が得られるまで工程２）、別の分子Ｍ２、．．．．．．Ｍｎでの工程３）及び工程４）を繰り返し実施する工程；
を具備し、
工程１）が、
ａ）官能基でマイクロキュベットと基板の全表面を官能化し、その後官能基を不安定な保護基により保護し；
ｂ）保護ポリマーの液滴のマイクロデポジッションにより全てのマイクロキュベットに保護ポリマーを付着させて、全てのマイクロキュベットに固体ポリマーのキャップを形成し；
ｃ）マイクロキュベットの周りの基板上に存在する官能基を脱保護し、その後それらを化学カップリング反応と保護ポリマーの除去に用いられる条件下で非不安定性の阻害基と反応させ；
ｄ）全てのマイクロキュベットから保護ポリマーを除去する；
ことからなり、
溶媒中の溶液からポリマーが付着する際に、溶媒を取り除き、形成されたポリマー膜を工程３）又は工程ｃ）を実施する前に５０から１００℃の温度まで基板を加熱することによりアニールする方法。
【請求項２】
マイクロキュベットの官能基が不安定な保護基で保護され、工程３）が最初の反応として官能基の脱保護反応を含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
保護基がトリチル又はトリチル誘導基である請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
分子の配列がオリゴヌクレオチドである請求項１ないし３の何れか１項に記載の方法。
【請求項５】
工程３）が、トリチル基の除去、ヌクレオチドとのカップリング、ヌクレオチド、阻害基とカップリングしなかった官能基の反応、及びヌクレオチドのホスホアミダイト基のホスフェートへの酸化からなるオリゴヌクレオチドのホスホアミダイトによる合成サイクルである請求項３又は４に記載の方法。
【請求項６】
工程４）が、ヌクレオチドのカップリングの後に保護ポリマーを除去することで実施される請求項５に記載の方法。
【請求項７】
保護ポリマーが、ポリビニルアルコール類、ポリスチレン類、ポリビニルカルバゾール類及びポリイミド類のポリマーとその誘導体からなる群から選択される請求項６に記載の方法。
【請求項８】
工程４）がトリチル基の除去の工程３）の後に、保護ポリマーを除去するために実施される請求項５に記載の方法。
【請求項９】
保護ポリマーがポリヒドロキシスチレンであり、脱トリチル化をジクロロメタン中で実施する請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
保護ポリマーが、ポリスチレン又はポリビニルカルバゾールであり、脱トリチル化がアセトニトリル中で実施される請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
保護ポリマーが、ポリエチレンオキシドであり、脱トリチル化がトルエン中で実施される請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
保護ポリマーが、ポリビニルアルコールであり、脱トリチル化がジクロロメタン中で実施される請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
保護ポリマーの除去の工程４）が、ポリマーの溶媒による洗浄によって実施され、該洗浄工程をオリゴヌクレオチドの自動シンセサイザーのサイクルに加える請求項８ないし１２の何れか１項に記載の方法。
【請求項１４】
保護ポリマーが、キャリブレートされたマイクロドロップのディスペンサー又はインクジェットプリンティング法によりマイクロデポジッションロボットにより、付着せしめられる請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明の目的は、化学的又は生物学的分析装置のために化学又は生体子の配列の鋳型を並列して製造する方法にある。
化学又は生体分子とは、特にアミノ酸又はヌクレオチドであり得、その場合、配列とはペプチド又はオリゴヌクレオチドである。
本発明は、遺伝学(突然変異、多型性、トランスクリプトーム)における分析又は診断又は研究のための異なった配列を有するオリゴヌクレオチドプローブの鋳型の産生に特に利用される。
【０００２】
(先行技術の水準）
新規な化学的又は生物学的分析システム又は装置は、配列決定及び遺伝子発現研究に使用される。それらはバイオチップ又はＤＮＡチップを製造するために小型化された基板表面に付着せしめられた一群の分子プローブ(オリゴヌクレオチド)を有する。
試料の分析中、抽出された標的核酸を標識し、プローブの鋳型上に付着させる。プローブと標識された標的の間でハイブリダイゼーション(ＤＮＡ二重螺旋の相補鎖間の対形成)を行わしめることによって、ＤＮＡ試料の配列を探して同定できる。
【０００３】
多くの製造方法が開示され、開発されて、小型化とチップ上の分析部位の密度容量が改善されてきた。
異なった基板(シリコン、ガラス、ポリマー、金電極．．．)上にプローブを移植（グラフト）して固定するための様々な技術が、工業上の研究と開発の対象となっていた。
次いで、
−合成前オリゴヌクレオチドを、官能化された基板又は導電性ポリマー上にそれらを移植することにより、固定化するか、
−又は、基板上にインサイツでオリゴヌクレオチドプローブを合成することによって、
プローブの鋳型が製造される。
これまで使用されてきたインサイツ合成法は、部位のアドレッシングに対して二種の異なった方法、すなわち、米国特許第５４７４７９６号[1]に記載されたようなマイクロロボットによるマニュアルアドレッシングと、国際公開９７／３９１５１[2]に記載されたような光化学的アドレッシングを必要としている。
【０００４】
米国特許第５４７４１５１号[1]なる文献では、基板の様々な部位を定めるためにフォトレジスト又はマスクを使用して、基板上に官能化部位が先ず形成され、次いで官能化部位上にオリゴヌクレオチドの配列が、圧電ポンプによって所望の部位に試薬を注入することにより形成されている。
国際公開９７／３９１５１[2]なる文献では、先ず基板に、感光性の保護基で保護された官能基をそれに付与するための処理を施し、次いで基板の特定の官能基をマスクを通しての選択的な照射により脱保護して部位を形成し、もってヌクレオチドをこれらの部位に反応させて所望の配列を構築する。
双方の場合とも、インサイツ合成は、適切に保護されたヌクレオチドの連続的縮合のために、ホスホアミダイト、亜リン酸塩類又はホスホン酸塩類を経由する通常のカップリング反応を含む。合成サイクルは、脱保護、カップリング、遮断及び酸化工程を含んでなり、オリゴヌクレオチドを各部位の表面から成長させる。
【０００５】
光化学アドレッシングでは、ヌクレオチドの脱保護工程は、光によって実施される。部位のアドレッシングは、リソグラフィー工程(マスクを通しての露光)によってなされる。感光性保護基は光により除去され、よってカップリングが、触媒、例えばテトラゾールの存在下で活性化ヌクレオチド(例えば、ホスホアミダイトを持つ)の溶液中に基板を浸漬することにより後に行われうる。
この光制御組み合わせ合成法は、オリゴヌクレオチドを構成するヌクレオチドの数と等しい多くのマスクの製作を必要とし、費用がかかり、面倒な作業である。この方法が非常に高密度のチップ(フォトリソグラフィー法の解像度)となるという利点を有する場合、他方では光化学反応の収率(感光基の除去)は決して１００％にならず、チップ上に形成されたオリゴヌクレオチド配列の純度を確保できない。
【０００６】
米国特許第５４７４７９６号[1]なる文献の場合には、チップの異なる部位上にＤＮＡの４の活性化塩基ヌクレオチド並びにカップリング試薬を分布させるためにジェットプリンティング法(圧電ヘッド)を使用するが、ナノリットルの程度の試薬の量でのおよそ１００μｍ２の部位での固相合成には、マイクロディスペンサーとその関連装置の環境ではつくり出すことが難しい制御雰囲気条件(湿度と酸素に対する感度)を必要とする。更に、高沸点の溶媒とあまり揮発性ではない試薬を必要とする。
連続的な合成サイクルを施すことが必要である基板領域を形成するためにマスクを使用するオリゴヌクレオチド合成のインサイツ法も更に知られている。
しかして、欧州特許出願公開第０７２８５２０号[3]なる文献には、ヌクレオチドを保持するために設計された、その全表面に保護官能基を含む基板と、修飾される基板の領域を画成するためのバリアー材を用いるオリゴヌクレオチドプローブの鋳型製造方法が記載されている。この材料は、ラッカー、液体油類、ポリエステル類、ポリウレタン類及びエポキシ樹脂で通常は液体プレポリマーであるものから選択されうる。それは、異なるプリンティング法によって付着させられる。バリアーを付着させた後、気相での脱保護がバリアー材で被覆されていない官能基について行われる。気相の使用は、使用されるバリアー材が可溶であるか、脱保護溶媒に混入するために必要である。
【０００７】
米国特許第５６５８７３４号[4]なる文献は、全体が官能化された基板と、緩衝材として作用するポリマーを基板とフォトレジストの間に挿入することにより変更された基板領域を画成するためにフォトレジストを用いたリソグラフィー法を使用している。しかして、この方法は、基板に付着されたポリマー層に、スピンコーターで析出されなければならないフォトレジストを使用し、各サイクルにおいてヌクレオチドを加えるが、それには各サイクルでリソグラフィー工程を必要とする(スピンコーターでの２回の付着、熱アニーリング、マスクを通しての光への露出、感光性樹脂の現像、そして緩衝ポリマーの現像)。基板の官能基を脱保護しポリマーに形成された透孔を通してヌクレオチドを添加する工程の後に、両方の層を溶媒中で除去する。この方法では、ポリマーにより、フォトレジストをヌクレオチド生体層から隔離することが可能になる。従って、このシステムは、リソグラフィー工程とスピンコーターでのコーティング工程に加えて、非常に多くのマスクの製造を必要とする。
この方法の他の欠点は、保護ポリマーの現像中に保護層が「離昇する」危険性にある。実際、フォトレジスト層の下で溶媒が拡散して、ポリマーの離脱が保護部位に生じうる。
特に、本発明の目的は、化学又は生体分子の配列、例えばオリゴヌクレオチドの配列の鋳型を製造する方法にあって、上述の方法の欠点を解消するものである。
【０００８】
（発明の開示）
本発明の方法は、官能化したマイクロキュベットを用いて構造化された基板上に保護ポリマーを選択的に局在化させて付着させるものである。しばらくの間、保護ポリマーは、次の鎖の分子とのカップリングに至る化学反応の間、選択されたマイクロキュベットを保護可能である。選択されたマイクロキュベット上へのマイクロデポジッションによる機械的なアドレッシングは、例えばオリゴヌクレオチドプローブを製造するために、他の組み合わせ合成法において使用される光化学又は電気アドレッシング及びリソグラフィー又はプリンティング法に取って代わる。
本発明によれば、マイクロキュベットを用いて構造化基板上にインサイツ合成により化学分子又はＭ１、Ｍ２、．．．．．．Ｍｎの異なる鎖から形成された化学又は生体分子の配列の鋳型を製造する方法は、次の工程を具備する：
１）分子Ｍ１、Ｍ２、．．．．．．Ｍｎと共有結合を形成可能な官能基によって基板のマイクロキュベットを官能化する工程；
２）保護ポリマーの液滴をマイクロデポジッションして少なくとも１つのマイクロキュベット上へ保護ポリマーを付着して、選択されたマイクロキュベットに固体ポリマーのキャップを形成する工程；
３）１又は複数の化学反応の実施して、保護ポリマーで被覆されていないマイクロキュベットの官能基上に第１分子Ｍ１をカップリングさせる工程；
４）工程３）において実施された第１の反応又は次の反応の１つの後に、保護ポリマーで被覆されたマイクロキュベット上の該保護ポリマーを除去する工程；
５）工程２）、３）及び４）を再び実施して官能化された各マイクロキュベット上に所望の鎖形成配列を得る工程。
【０００９】
本発明の方法では、自動シンセサイザーによる手段と適合性のある、保護ポリマーと該ポリマーを溶解するための溶媒を適切に選択することにより、オリゴヌクレオチド鋳型の合成は、基板にエッチングされたマイクロキュベット又はマイクロリアクター中で実施されうる。このためには、オリゴヌクレオチドの自動シンセサイザーを、保護ポリマーの機械的アドレッシング装置(マイクロデポジッションロボット又はインクジェットプリンティング)と組み合わせる。
機械的アドレッシングは、選択されたマイクロキュベット上へのポリマーの付着を選択的に実施して、次の鎖のモノマー単位を付加するのに使用する試薬に対して活性な領域を決定し選択するために、マイクロキュベット上に嵌合された固体のシールカバーを形成することからなる。
本発明の方法は、不溶性、シール及び被覆特性(形状と厚みの制御)が、合成サイクルの１又は複数の工程に適合し、適切であるような、保護ポリマー保護の選択の可能性を提供する。
【００１０】
本発明の方法は、カップリングサイクルの最初の化学反応の後、又は全てのカップリングサイクルの後の何れかで保護ポリマーの除去を可能にする。
本発明の方法により、オリゴヌクレオチドの自動シンセサイザーにおいて常套的に使用されているもの(アセトニトリル、ジクロロメタン、テトラヒドロフラン)と適合性がある溶媒中での洗浄工程の１つか、又は更なる洗浄工程の何れかにおいて、このポリマーキャップの除去をオリゴヌクレオチドの一般的な自動合成サイクルに含ませることが可能になる。
本発明の方法では、マイクロキュベットの官能化工程１）は、次の工程を適用することにより実施されうる：
ａ）官能基を有するマイクロキュベットと基板の全表面を官能化し；
ｂ）保護ポリマーの液滴をマイクロデポジッションして全てのマイクロキュベット上へ保護ポリマーを付着させ、全てのマイクロキュベットに固体ポリマーのキャップを形成し；
ｃ）化学カップリング反応と保護ポリマーの除去に用いられる条件下で非不安定（non-labile）の阻害基とマイクロキュベットの周りの基板上に存在する官能基を反応させ；
ｄ）全てのマイクロキュベットから保護ポリマーを除去する。
好ましくは、工程ａ）の後に官能基を不安定な保護基により保護し、官能基の脱保護を工程ｂ）の後、及び工程ｃ）を実施する前に行なう。
同様に、本発明の方法を実施する際には、好ましくはマイクロキュベットの官能基の保護を実施する。この場合に、マイクロキュベットの官能基は不安定な保護基によって保護され、工程３）は官能基の第１の脱保護反応を含む。
本発明によると、分子Ｍ１、Ｍ２、．．．．．．Ｍｎは異なるタイプであり得る。例としては、それらは合成又は天然の、Ｌ-又はＤ-アミノ酸、ヌクレオチド(ＲＮＡ又はＤＮＡ)、ペントース又はヘキソースでありうる。アミノ酸である場合、分子Ｍ１、Ｍ２、．．．．．．Ｍｎの数は、多くてもよい。ヌクレオチドの場合には、分子の数は、それがＡ、Ｔ(又はＵ)、Ｇ及びＣを含むので、より制限される。
この場合、ヌクレオチドは、使用されるヌクレオチド合成のタイプに応じて、ホスホアミダイト類、ホスホトリエステル類又はＨ-ホスホネート類の形態であってもよい。これらの分子は、２つの反応性官能基(ヒドロキシル及びリンを有する官能基)を含み、その１つはヒドロキシル官能基で、好ましくは官能化部位の保護基と同一である、保護基により保護される。
【００１１】
適した保護基は、特にトリチル又はトリチル誘導基、例えばジメトキシトリチル基であり得る。
本発明の方法を、ホスホアミダイト合成によりオリゴヌクレオチド配列を産生するために使用する場合、工程３）は合成サイクルに相当し、トリチル保護基の除去、ヌクレオチドとのカップリング、ヌクレオチド、阻害基とカップリングしなかった官能基の反応、及びヌクレオチドのホスホアミダイト基のホスフェートへの酸化からなる。
本発明の方法では、脱保護(脱トリチル化)、カップリング、遮断、酸化及び保護ポリマー除去工程は、様々な大きさの物質を処理するために、反応チャンバーの変更を導入した後、オリゴヌクレオチドの自動シンセサイザーにおいて実施される。
遮断の工程で使用される阻害基は、マイクロキュベットの官能基から保護基を除去する条件下で不安定ではない基である。
例としては、この遮断反応のためにジメチルアミノピリジン(ＤＭＡＰ)のテトラヒドロフラン溶液が使用されうる。
【００１２】
本発明の方法では、脱保護、カップリング、保護物質除去及びおそらくは酸化の工程を、シンセサイザーの反応チャンバー中か又は適当な試薬浴中の何れかに基板を浸漬することにより実施される。保護ポリマーによる選択されたマイクロキュベットの選択的な保護に相当するマイクロキュベットのアドレッシング工程のみが、マイクロデポジッション法により実施される。
有利には、保護ポリマーは、圧電アクチュエーター型、「ピン及びリング」、インクジェットプリンティング、アルキメデス螺旋スクリュー及びマイクロピペッティングの選択的マイクロデポジッション法を用いて機械的アドレッシングにより、液体状態で所望のマイクロキュベット上に付着される。
このポリマーは、溶媒中に溶解状態であり得るが、この場合、形成されたポリマーフィルムは、工程３）又は工程Ｃ）を実施する前に、５０から１００℃の温度まで基板を加熱することによりアニールされる。
マイクロデポジッションによるポリマーのアドレッシングにより、マイクロキュベットは、ヌクレオチド単位のカップリングに相当する４の合成反応の１又は複数の間、選択的に保護されうる。溶液中のポリマーのキャリブレーションされた液滴は、それにより、選択されたマイクロキュベット上に局所的に分散されうる。溶媒の蒸発後、それらはマイクロキュベットに嵌合したシールキャップを形成する。このアドレッシングは、好ましくはオリゴヌクレオチド合成サイクル中の脱トリチル化工程の前に又はカップリング工程の前になされる。
【００１３】
該方法の独創性は、ポリマーの選択とその保護の役割をオリゴヌクレオチド合成における異なった工程に適合させる際の非常に多くの可能性にある。
本発明の方法では、保護ポリマーの選択は非常に重要であり、ある程度の基準を満たさなければならない。
第１に、このポリマーは、マイクロキュベットに嵌合するキャリブレーションされた液滴を形成するように、溶媒中でポリマーを溶解することにより、先に述べたマイクロデポジッション技術によって付着させることができる。溶媒を除去し、基板への付着性を改善するために５０から８０℃の温度でアニールすることが一般に必要である。
ポリマーが合成サイクルの４つの工程の間、保護される理想的な場合には、それは不活性で、好ましくは合成分子及び試薬とカップリングする可能性のある反応性官能基が無い。それはサイクルの工程で使用される溶媒に可溶性であってはならず、これらの溶媒に対して不透過性を示さなければならない。
実際には、ポリマーは、脱トリチル化工程又はカップリング工程で本質的に保護キャップとして作用するのに十分である。次いで、保存工程でポリマー-溶媒の組み合わせを適合させ、最適化することができる。
保護ポリマーは、ついで保護ポリマーで除去される試薬を不必要に消費するのを避けるために、カップリング工程の間に分子Ｍ１、Ｍ２、．．．．．．Ｍｎ、例えばヌクレオチドとカップリング可能なＯＨ、ＮＨ２又はＣＯＯＨタイプの遊離水素を持つ官能基を含まないことが好ましい。
【００１４】
ポリマーは、ヌクレオチドに対して不活性な溶媒によって除去することができなければならず、更に、それは溶解状態で、例えば選択されたマイクロデポジッション法によってマイクロキュベット上に付着するのを可能にする粘度及び表面張力のような物理化学特性を示さなければならない。
本発明の方法では、保護ポリマーの選択は、マイクロキュベットを保護しなければならない工程に従って、オリゴヌクレオチド合成に使用される可能性のある溶媒中でのその溶解性を考慮してなされる。
官能基から保護基を除去する工程の間、又は脱トリチル化工程の間だけ、ポリマーによる保護を付与するのは望ましい場合は、一般にはジクロロ酢酸(ＤＣＡ)、トリクロロ酢酸(ＴＣＡ)又はＺｎＢｒ２タイプのルイス酸をおよそ２−５％でジクロロメタン、アセトニトリル又はトルエンのような溶媒中に含有する脱トリチル化試薬に不溶性のポリマーを選択することで十分である。
そのようなポリマーの例としては、次のものが挙げられる：ジクロロメタン、アセトニトリル及びトルエンに不溶性のポリビニルアルコール類；ジクロロメタンに不溶性のポリヒドロキシスチレン類；アセトニトリルに不溶性のポリスチレン類、ポリビニルカルバゾール類及びポリイミド類；及びトルエンに不溶性のポリエチレンオキシド類である。
【００１５】
カップリング工程の間だけポリマーによるマイクロキュベットの保護をもたらすことが望ましい場合は、使用される溶媒で、一般にはアセトニトリルに不溶であるポリマーがカップリングに選択されるべきである。
この目的のために、この溶媒に不溶性のポリビニルアルコール、ポリスチレン、ポリビニルカルバゾール及びポリアミドタイプのポリマー及び誘導体からなる群から選択されるポリマーが使用されうる。
また保護ポリマーは、溶解によりその除去をすることができる溶媒に応じて、選択される。好ましくは、ポリマーは、オリゴヌクレオチドの自動シンセサイザーに一般的に使用されているものと相容性のある、通常は(脱トリチル化のための)ジクロロメタン、(カップリングのための適した)アセトニトリル、及び(遮断及び酸化のための)テトラヒドロフランである、溶媒に溶解するものが選択される。しかしながら、アセトニトリル及びトルエンのような他の溶媒を、収率をロスすることなく、脱トリチル化のためのジクロロメタンの代わりに使用することもできる。
使用されうるポリマー、様々な溶媒中でのそれらの溶解性、本発明の方法の１又は複数の工程でのそれらの使用可能性、及びそれらの除去方法を次の表１に示す。
【００１６】
0003808313.tif 000002
【００１７】
表１のポリマーの中で、ポリビニルアルコールが、オリゴヌクレオチド合成の全工程の間、マイクロキュベットの保護をもたらしうるので興味深い。更に、それは、マイクロデポジッションロボットで簡単に使用されうる。他方、その除去は、水又はＤＭＳＯが合成溶媒の一部とならず、よって更なる工程と乾燥を必要とするので、容易ではない。
従って、(キャピラリー、圧電性、又は「ピン及びスピン」タイプの)マイクロディスペンサーロボットに連結された自動シンセサイザー(適合するサンプル支持体)を使用することによるプローブの産生の場合、水に可溶性であり、同時に水性媒体での付着及び除去工程を必要とする保護ポリマーを使用しないことが好ましい；これは、無水媒体で実施される合成の連続化において面倒でありうる。
任意の更なる乾燥処理を避けるために、マイクロキュベットの選択的保護には、無水溶媒で除去され、自動シンセサイザーで使用される溶媒のサイクルと互換性があるポリマーを選択することが、より適切である。
【００１８】
例えば、ポリスチレンは、それが不溶であるアセトニトリル(２％ＴＣＡ)中で実施される脱トリチル化工程の選択的保護ポリマーとして作用しうる；次のカップリング工程はアセトニトリル(テトラゾール)中で実施される；次いでポリマーは、非常に溶解性のあるジクロロメタン中での洗浄サイクルにより除去されうる。更に、ポリスチレンは、不活性で、活性なヌクレオチドを固定可能なＯＨ基を全く持たず、また(アセトニトリル中での)カップリング工程での保護役割を持つ。
また、ポリヒドロキシスチレン自体は、ポリスチレンよりも付着が容易であるので興味深く、シンセサイザーの一般的な溶媒で容易に取り除かれる。他方、ジクロロメタン中での脱トリチル化工程の間のみ保護をもたらすが、この溶媒中でのカップリング工程の前のアセトニトリルでの洗浄工程により取り除かれうる。
また、ポリ(エチレンオキシド)は、脱トリチル化がトルエン中でなされるという条件下だけでは脱トリチル化に適しているが、ＣＨ３ＣＮ又はＣＨ２Ｃｌ２で容易に取り除かれる。
ポリビニルカルバゾールとポリイミドは、ＣＨ３ＣＮでの脱トリチル化及びカップリング工程の間に保護を提供し、次いでシンセサイザーで使用される溶媒の一部であるＣＨ２Ｃｌ２によって除去される。しかしながら、これらのポリマーの付着は、さらに難しい。
【００１９】
保護ポリマーの除去は、自動シンセサイザーサイクルのプロトコルに導入された洗浄工程において、シンセサイザーで直接なされうる。
例えば、脱トリチル化工程で使用される一般的な溶媒であるジクロロメタンは、通常使用される酸試薬(ＴＣＡ又はＤＣＡ)による脱トリチル化反応の効果を全くロスすることなく、アセトニトリル、トルエン、キシレン、又は更にハロゲン化芳香族溶媒のような溶媒に置き換えられる。
本発明の方法は、従来技術の方法に比べ、数多くの利点を有する。
実際に、インサイツ合成のための光化学アドレッシングを用いた文献[2]の方法、又はリソグラフィー法を使用した文献[4]のものに比較して、本発明の方法は、配列を形成する分子Ｍ１、Ｍ２、．．．．．．Ｍｎの数と等しい数のマスクを製造するという事実から時間がかかり費用が嵩む作業であるマスクの製造を回避する。更に、光化学アドレッシングの場合に、脱保護は完全ではなく、配列が長くなればなるほど、所望の配列を得る確率が低くなる。従って、不必要な配列が基板上に形成されるが、これは脱保護が完全である本発明ではあり得ない。
【００２０】
文献[1]の方法と比較すると、本発明の方法は、カップリング反応が過剰な試薬で実施されうるので実行が容易である一方、文献[1]では、カップリング反応は特別な条件下、つまり窒素又はアルゴンの雰囲気中で修飾される部位に直接いくらかのｎＬの試薬で実施される。
文献[3]と比較すると、本発明の方法は、マイクロキュベット、又は合成部位が前もって定められ、保護が固体ポリマーのキャップを使用することによってより強固であり、脱保護反応が自動シンセサイザーで直接液相中で実施され、気相ではないので、実施がより容易である。
本発明の方法では、マイクロデポジッションによる選択されたマイクロキュベット上への保護ポリマーの付着は、特別な注意を必要とせず、唯一の条件は、ポリマーの液滴が保護されるべきマイクロキュベットを覆うことである。
本発明の他の特徴及び利点は、添付図面を参照しながら、もちろん例示のためで限定するものではない以下の説明を読むことでより明らかになるであろう。
【００２１】
（実施態様の詳細な開示）
本発明の方法を実施するために、１５０μｍから数ｍｍ、しかし好ましくは数百μｍ離して、及び約１０μｍの程度の深さのマイクロキュベットで構造化されたガラス又は好ましくはシリコン基板を用いて開始する。これらのキャリブレーションされたマイクロキュベットは、一般的なフォトリソグラフィー及びエッチング方法によって製造される。
マイクロキュベット３を備えた基板１は図１Ａに示される。マイクロキュベット３は、保護基７により保護された、ヒドロキシル基のような親水性官能基５によって官能化される。これらの保護基は、オリゴヌクレオチド合成において一般的に使用されているジメトキシトリチル基であり得る。
【００２２】
基板がシリコンウェーハである場合、部位の官能化は次のような方法で実施できる。
シリコン板の表面を、最初に例えば５０００Åの厚みまで、熱的にＳｉＯ２へ酸化し、次いでアルカリ性又は酸性媒体中でＳｉ-ＯＨへ酸化することで洗浄することにより活性化する。次に、基板の全表面の官能化を、グリコール型のリンカー分子又はスぺーサーアームを持つアミノシラン又はエポキシシラン型の官能化されたシラン処理剤、例えばＮ(ビス-ヒドロキシメチル)基と例えばポリエチレングリコール型のスぺーサーアームを含むシランでの処理によって行う。基板のシランと後に合成されるオリゴヌクレオチドの間にそのようなスぺーサーを導入することは、使用の間にハイブリダイゼーション収率が増加するので興味深い。反応性官能基はジメトキシトリチル(ＤＭＴ)のような基によって保護する。
【００２３】
次いで、全てのマイクロキュベットの保護を、ジェットによってマイクロデポジッションロボットでキャリブレーションされた液滴の形で付着するポリマーキャップにより実施する。
液滴の乾燥後、ポリマーにより保護されない基板の表面のＯＤＭＴ官能基を、酸性媒体(ＴＣＡ)中での脱トリチル化により脱保護する。マイクロキュベットの外側表面のこれらの反応性官能基を、専らマイクロキュベット中でのオリゴヌクレオチドのインサイツ合成を制限するために遮断(キャップ)し、次いで、ポリマーを、溶媒中で洗浄することにより基板全体から除去する。
次に、工程２）を、図１Ａに示されているように、ディスペンサーロボットのようなマイクロピペット１１を用いて、又はジェットプリンティングによって、ウェーハの少なくとも１つの官能化されたマイクロキュベット上に保護ポリマー９を付着させることにより実施する。
図１Ｂは、保護ポリマー９で覆われていないウェーハのマイクロキュベット３上の官能基５から保護基７を除去することからなる次の工程が示している。しかして、保護ポリマー９によって保護されないマイクロキュベット３が脱保護されたヒドロキシル官能基５を含むウェーハが得られる。この工程は、酸溶液、例えばトリチル基を除去するために、トリクロロ酢酸のジクロロメタンＣＨ２Ｃｌ２の溶液中に、ウェーハを浸漬することにより実施することができる。
【００２４】
図１Ｃは、保護ポリマー９で保護されていないマイクロキュベット３上のヒドロキシル官能基との反応よる、分子Ｍ１の次のカップリング工程３）を示す。オリゴヌクレオチドプローブの鋳型を製造することが望まれる場合には、分子Ｍ１を、プローブを製造するための合成方法に従って、ホスホアミダイト類、ホスホネート類又はホスフェートのようなヌクレオチドによって形成する。この工程では、ヒドロキシル基５との第１のヌクレオチドＭ１(ホスホアミダイト)のカップリングが、テトラゾールの存在下でアセトニトリル中の活性化ヌクレオチドＭ１の溶液中にウェーハを浸漬することにより実施される。このようにして図１Ｃに示される構造が得られる。
図１Ｄは、分子Ｍ１と反応しなかった残余のフリーのヒドロキシル基が阻害される次の工程を示し、その結果、異なった次に続くカップリングに使用される他のヌクレオチドと引き続いて反応できない。この反応は、例えばテトラヒドロフラン(ＴＨＦ)中のジメチルアミノピリジン(ＤＭＡＰ)溶液中にウェーハを浸漬することにより阻害基１１を設けるこにより実施されうる。
ホスホアミダイトを用いた方法によるオリゴヌクレオチド配列を製造する場合には、続いて、前の工程(図１Ｃ)のカップリング中に導入された３価のリン原子について酸化を実施して、より安定な５価のリン原子にする。これは、水、ピリジン及びテトラヒドロフラン(ＴＨＦ)の混合物にヨウ素を入れた酸化溶液にウェーハを浸漬することにより実施されうる。
【００２５】
この酸化工程の後に、未修飾マイクロキュベットから保護ポリマー９を除去することで次の工程４）を実施する。しかして、図１Ｅに示された構造が得られる。保護ポリマー９のこの除去は、適当な溶媒に該溶媒にウェーハを浸漬して溶解させることにより実施されうる。
しかして、保護ポリマー付着工程とは別に、本発明の方法の工程は、適切な試薬と溶媒中にウェーハを浸漬し、続いて必要ならば異なった溶媒で洗浄することにより実施される。これらの作業は制御された雰囲気を持つ容器中でなされうる。適切な試薬浴に浸漬することによるこれらの異なった工程は、オリゴヌクレオチドの自動シンセサイザーに連結された反応セルにおいて好適には実施されうる。
更に、使用される試薬は固体基板上の分子と比較して大きく過剰であり、これが実際に１００％の転換レベルを持つ反応を得ることができるという利点をもたらすが、これは選択部位に試薬をマイクロピペッティングすることにより反応を実施する参照方法[１]の場合ではなかったものである。
【００２６】
分子Ｍ１で選択されたマイクロキュベットを修飾するこの最初の工程の後に、他のマイクロキュベットを分子Ｍ２．．．．．．又はＭｎで修飾しうる。この場合、既に修飾されたマイクロキュベットの保護を先ず保護ポリマー９により実施する。しかして、図１Ｆに示された構造が得られる。もちろん、基板の他のマイクロキュベットもまた、それらがたとえ分子Ｍ１により前の工程で修飾されていなかったとしても、保護ポリマー９で被覆されうる。この操作の後に、保護ポリマー９で被覆されていないマイクロキュベットの親水性官能基５から保護基７をついで除去し、他のヌクレオチドＭ２を、先と同じ方法で操作することにより（図１Ｂ及び１Ｃ）官能基５上にカップリングさせる。図１Ｇは得られた構造を示している。この操作の後に、反応しなかったヒドロキシル基の阻害を実施し、ついで３価のリンの５価のリンへの酸化と、分子Ｍ２により修飾されなかったマイクロキュベットからの保護ポリマー９の除去を実施する。
ついで、これらの異なった操作を選択されたマイクロキュベットについて再び実施し、分子の所望の鎖Ｍ１、Ｍ２、．．．．．．．Ｍｎ、すなわち、基板１の異なったマイクロキュベット上に異なった鎖配列を持つオリゴヌクレオチドを得る。
例を挙げると、シリコンにエッチングされた１００ｘ１００ｘ３０μｍのマイクロキュベットを含むシリコン基板上にオリゴヌクレオチドプローブの鋳型が製造された。マイクロキュベットの官能化は、ＯＨ基がジメトキシ又はモノメトキシトリチル基により保護されているＮ,Ｎ-(ビスヒドロキシエチル)アミノプロピルトリメトキシシランによりなるシラン処理剤で実施される。
【００２７】
二つのオリゴヌクレオチド配列の鋳型の例示的な実施態様を以下に記載する。
一般的なマイクロエレクトロニクス法、すなわち、デポジッション、フォトリソグラフィー及びエッチングを使用してマイクロキュベットで構造化された基板で開始する。マイクロキュベットの外形を図２に示す。
シリコン基板を２ｘ２ｃｍ２のチップ切断した後、洗浄（１）、シラン処理（２）及びヘキサエチレングリコールアームブランチング（３）手順を次のようにして実施する：
１）ＮａＯＨ溶液（１ｇのＮａＯＨ、３ｍＬの脱イオン化（ＤＩ）水、４ｍＬの９５％ＥｔＯＨ）中で雰囲気温度で２時間の間、基板をインキュベートし、次いでＤＩ水で洗浄し、ブロワーで乾燥させる。
２）基板を１ｍＬの３-グリシドオキシプロピルトリメトキシシラン、３．５ｍＬのトルエン及び０．３ｍＬのトリエチルアミンを含む溶液に８０℃で終夜インキュベートする。それをアセトンで洗浄し、ブロワーで乾燥させ、ついで１１０℃に３時間置く。
３）基板を１５ｍＬのヘキサエチレングリコールと９μＬの硫酸を含む溶液中で８０℃で終夜インキュベートし、ついでアセトンで洗浄し、ブロワーで乾燥させる。
【００２８】
ついで、基板をオリゴヌクレオチドＥＸＰＥＤＩＴＥ８９０９の自動シンセサイザーに連結した特定の部分に位置させる。合成手順は、ホスホアミダイト化学を利用し、４つの工程：脱トリチル化、カップリング、キャッピング及び酸化からなる。使用される手順は１μモルのスケールである。
最初の７つの親が３'ＡＴＣ ＴＣＡ Ｃ５'自動シンセサイザーで作成される。基板をシンセサイザーから取り出し、ポリマー（Cam/alot）をデポジットするロボットに取り付けるか、ポリマーを半分のキュベットに分配する。マイクロキュベット３にポリマー９を充填する概要を図２に示す。光学顕微鏡でのマイクロキュベットの上面図を、３００μｍから６００μｍ離れたサイズについては図３に、２００μｍから４００μｍ離れたサイズについては図４に示す。幾つかのマイクロキュベットは空である。
【００２９】
加熱段階では基板を８５℃で１分３０秒の間ベーキングする。基板をシンセサイザーに戻して、ポリマーで被覆されていないキュベットの半分に対する塩基Ｃのカップリングを実施する。ポリマーは８５℃の水にて除去される。ポリマーの新しいデポジッションをこれら後者のキュベットについて実施する。ベーキング後、基板をシンセサイザーに入れて、他のキュベットへの塩基Ｔのカップリングを実施する。このカップリング後に、ポリマーを除去し、基板をシンセサイザーに入れ、そこで、全てのキュベットが次のカップリングを受ける：Ｃ ＡＡＡ ＴＡＧ。この工程の終わりでは、マイクロキュベットの半分は、配列番号１：-３'ＡＴＣ ＴＣＡ ＣＴＣ ＡＡＡ ＴＡＧ５'-及び他の半分の配列番号２：-３'ＡＴＣ ＴＣＡ ＣＣＣ ＡＡＡ ＴＡＧ５'-を含む。
これらの二つの配列は一つの塩基だけが異なっている。基板をシンセサイザーから取り出し、ヌクレオチド塩基から保護基を除去するためにＮＨ４ＯＨ溶液中６０℃で４５分間インキュベートし、ついでＤＩ水で洗浄し、ボロワーで乾燥させる。
【００３０】
５'にビオチン基を含む第２プローブ-３'ＣＡ ＴＡＧ ＡＧＴ ＧＧＧ ＴＴＴ ＡＴＣ ＣＡ５'-の相補鎖標的でハイブリダイゼーションを実施する。基板を、６９０μＬのシグマ社のＨ-７１４０ハイブリダイゼーションバッファーと１０μＬの標的を１ＯＤ（水に溶解すると１ｃｍに等しい光路を持つタンク中で２６０ｎｍにて測定して１の吸光度になるオリゴヌクレオチドの量）で含む溶液中に入れ、軽く攪拌しながら１時間の間、４０℃でインキュベートし、ついで２回の洗浄をＳＳＣ２Ｘのバッファー浴中で１分間、ＳＣＣ０．２Ｘバッファー浴中で１分間、実施して、ハイブリダイズしていない標的を除去する。ついで基板をブロワーで乾燥させる。Ｃｙ３フルオロフォ(fluorophor)基を含むストレプトアビジン基とのビオチンのカップリングを、５μＬのＣｙ３ストレプトアビジンバッファー及び７００μＬのＰＢＳ、ＴＷ、０．５ＭのＮａＣｌバッファーを含む溶液中で暗所にて雰囲気温度で１０から１５分間なす。ついで基板をＰＢＳ、ＴＷ０．５ＭのＮａＣｌバッファー浴中で１分間洗浄し、ついでＰＢＳバッファー浴で洗浄し、ブロワーで乾燥させる。
【００３１】
蛍光共焦点顕微鏡ＧＳ３０００でのハイブリダイゼーション後に得られた蛍光イメージは、相補鎖プローブとのハイブリダイゼーションのみが生じることを示している。
引用文献
[１]：米国特許第５４７４７９６号
[２]：国際公開９７／３９１５１号
[３]：欧州特許出願公開第０７２８５２０号
[４]：米国特許第５６５８７３４号
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１Ａ−１Ｇは、オリゴヌクレオチドプローブの鋳型を製造するための、本発明の方法の異なる工程を示す。
【図２】  ポリマーで満たされた(６５０×６５０×２５μｍ３) のマイクロキュベットの概略を示す。
【図３】  ポリマーで満たされた又は満たされていないマイクロキュベットの平面図である。
【図４】  ポリマーで満たされた又は満たされていないマイクロキュベットの平面図である。
【図１Ａ】
0003808313.tif 000003
【図１Ｂ】
0003808313.tif 000004
【図１Ｃ】
0003808313.tif 000005
【図１Ｄ】
0003808313.tif 000006
【図１Ｅ】
0003808313.tif 000007
【図１Ｆ】
0003808313.tif 000008
【図１Ｇ】
0003808313.tif 000009
【図２】
0003808313.tif 000010
【図３】
0003808313.tif 000011
【図４】
0003808313.tif 000012