(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
マウス胚性癌腫細胞Ｆ９株を抗原として作製された抗４Ｃ９モノクロナール抗体と反応することを特徴とする、ブタ始原生殖細胞由来であって胚幹細胞様の多能性または全能性分化能を有し、フィーダー細胞上で継代培養可能なブタＥＧ細胞。
【請求項２】
下記の特徴を有する請求項１に記載のＥＧ細胞。
ａ）フィーダー細胞上で培養開始後４日〜１週間頃から小コロニーの形成が認められ、これらの小コロニー内の細胞間の境界は不明瞭で、核内には顕著な核小体が認められ、固定するとコロニー内の細胞間の境界は明瞭となり、細胞同士が密に接着し合い重層したコロニーの形成が認められ、細胞は形態的に未分化な幹細胞の特徴を有し、
ｂ）継代の際コロニーは解離しにくく断片状となり、これらの断片をフィーダー細胞上で培養するとドーム状に盛り上がったコロニーを形成し、更に培養を続けるとコロニーは、次第に大きくなるにつれて細長く突起状に伸展して網目状となり、
ｃ）長期間継代培養しても形態的に未分化な特徴を保持した状態で増殖する。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のＥＧ細胞がブタの正常宿主胚に導入されたキメラ胚。
【請求項４】
請求項３記載のキメラ胚に由来するキメラブタ及びそれらの子孫。
【請求項５】
請求項１又は２に記載の細胞に外来遺伝子が導入されたブタＥＧ細胞。
【請求項６】
導入された外来遺伝子によって内在遺伝子が改変された請求項５記載のＥＧ細胞。
【請求項７】
導入された外来遺伝子によって内在遺伝子が不活化された請求項６に記載のＥＧ細胞。
【請求項８】
請求項５〜７のいずれかに記載のＥＧ細胞がブタの正常宿主胚に導入されたキメラ胚。
【請求項９】
請求項８記載のキメラ胚に由来するキメラブタ。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、有蹄類の始原生殖細胞から誘導される多能性または全能性分化能を有するＥＧ細胞、該ＥＧ細胞を用いて作製されるキメラ胚及び該キメラ胚に由来するキメラ動物に関する。
背景技術
1980年にGordonらによる外来遺伝子を人為的に導入、組込ませたマウス（トランスジェニックマウスと呼ばれる）の作出（J. W. Gordon & F. H. Ruddle: Science, 214, 1244, 1981; J. W. Gordon et al.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 7380, 1980）や、1982年のPalmiterらによるヒト成長ホルモン遺伝子を導入して得られた「スーパーマウス」と呼ばれるトランスジェニックマウスの作出（R. D. Palmiter et al.: Nature, 300, 611, 1982）以降、個体レベルで導入遺伝子の機能や発現を調べる試みが盛んになり、ヒト遺伝病の関連遺伝子や癌遺伝子などを導入した疾患モデル動物の作出が、マウスやラット等の実験動物を使用して行われ、遺伝病や発癌機構の解明に大きく寄与している。
一方、中大型家畜であるウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ等の有蹄類のトランスジェニック動物の作出が、乳汁中に医薬品となりうる生理活性蛋白質を分泌させる所謂バイオリアクターとしての試みでなされ、既に一部では産業化の段階を迎えようとしている。例えば「トレーシー」と名付けられたヒトα-1-アンチトリプシンを高濃度に乳汁中に分泌するトランスジェニックヒツジ（G. Wright et al.: Bio/Technology, 9, 830, 1991; A. S. Carver et al.: Bio/Technology, 11, 1263, 1993）、ヒトtissue-type plasminogen activatorを分泌するトランスジェニックヤギ（K. M. Ebert et al.:Bio/Technology, 9, 835, 1991）等の報告がある。更に、家畜本来の乳や肉の生産性の向上、耐病性の付与、飼料効率の改善といった品種改良へ向けての試みがなされている。
このようなトランスジェニック動物の作出は、通常受精卵の核内に遺伝子を直接導入する方法で行われる。この方法では、導入する遺伝子の染色体への組込み位置、組込みコピー数、組込み方向等を任意に制御することが全く不可能である。更に、導入効率はかなり低いのが一般的である。従って、遺伝子をマイクロインジェクションした莫大な数の受精卵の全てを個体にして、遺伝子が組込まれているか否か、その遺伝子が発現しているか否か、又染色体のどこにどのように組込まれているかなどを、個々の動物について調べる必要が生じる。これらに加え、一般に中大型家畜では、妊娠期間、性成熟に要する期間が長いため、マイクロインジェクション法によるトランスジェニック家畜作出には、莫大な数の家畜の飼育維持に要する経費と、数年を単位とする時間を要することになる。
マイクロインジェクション法以外にも、いくつかトランスジェニック動物を作出する方法がある。そのうちでも、マイクロインジェクション法の欠点と考えられる、遺伝子の染色体への組み込みを任意に制御した動物個体を作出することが不可能であるという点を解決したトランスジェニック動物の作出が、ＥＳ（embryonic stem, ES）細胞を使用することで可能となっている。
ES細胞とは、通常胚盤胞と呼ばれる発生段階の胚に存在する将来動物個体となる未分化な細胞群である内部細胞塊（Inner cell mass, ICM）の細胞を培養することによって得られた細胞株である。ES細胞は1981年にM. J. EvansとM. H. Kaufman（M. J. Evans & M. H. Kaufman: Nature, 292, 154, 1981）に続いて、G. R. Martin（G. R. Martin: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 7634, 1981）によりマウスで多分化能を有する細胞株として樹立された。このES細胞を正常な宿主胚盤胞へ導入し仮親子宮へ戻すことによってキメラ作製を行ったところ、高いキメラ形成能を持つ、生殖系列キメラ（ES細胞由来の機能的生殖細胞を持つキメラマウス）が得られた（A. Bradley et al.: Nature, 309, 255, 1984）。このES細胞株は、培養下で、種々の遺伝子導入法（例えばリン酸カルシウム法、レトロウイルスベクター法、リポゾーム法、エレクトロポレーション法等）の適用が可能である。また、遺伝子が組込まれた細胞を選別する方法を工夫し、相同遺伝子組換え（homologous recombination）を利用し、特定の遺伝子を狙って改変（置換、欠失、挿入）させた細胞のクローンを得ることもできる。
in vitroでこのような処理をしたES細胞株は生殖系列への分化能を保持することから、ある特定の遺伝子の機能を個体レベルで調べる研究が現在盛んに行われている（M. R. Capecchi: Science, 244, 1288, 1989）。ES細胞を利用したトランスジェニックマウス作出法は、ある特定の遺伝子のみを任意に改変させた個体を得ることを可能にした点でマイクロインジェクション法によるトランスジェニック動物作出法にはない多くの利点が考えられる。特に、特定の遺伝子を不活化させたノックアウト動物を作出できるようになり、該遺伝子の機能を解明したり、外来性の遺伝子のみを発現させることが可能になったことは注目すべきである。ここでもし、中大型家畜のES細胞が樹立され培養下で遺伝子の導入が可能になれば、乳汁中の蛋白質をヒト蛋白質に置き換えることや、臓器をヒトのドナーとして使用できるように表面抗原を改変することなどが可能となり、その有用性は産業上計り知れないと考えられる。
しかしながら、現在のところ、中大型家畜のみならず他種のES細胞株樹立については成功した報告は殆どなされていない（M. Evans: Embryonic stem cells as a route to an experimental mammalian genetics, in "Gene Expression and its Control", Vol. 2 Genome Analysis (K. E. Daries & S. M. Tilghman, eds.), pp.1-12, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1991）。この理由は不明であるが、一つには妊娠期間の短いマウスでは胚盤胞のICMの増殖は急激であるのに対して、中大型家畜の場合、休止期が存在したりしてかなりICMの増殖が遅いため、ICMを培養下に移してもなかなか増殖しないことが考えられる。しかし、マウスとほぼ同じ妊娠期間を持つラットにおいてもES細胞株の樹立が成功していない点を考えると、未知の重要な因子、例えば増殖因子等が関与していることも考えられる。
最近、松居らは、マウス始原生殖細胞（primordial germ cell:PGC）の体外培養を試み、増殖因子としてSCF（stem cell factor、他にsteel factor、kit ligand、mast cell growth factor等の名称がある）に加えLIF（leukemia inhibitory factor）とbFGF（basic fibroblast growth factor）の存在下でPGCを培養したところ、ES細胞のコロニーと類似したコロニーの形成を観察し、更にフィーダー細胞をマウス胎仔線繊芽細胞由来の細胞株であるSTO細胞［川瀬ら、実験医学，Vol.10,No.13（増刊），1575-1580,1992］に代えたところ、ES細胞コロニーと形態的に類似したコロニーとして増殖維持に成功した。この細胞をマウスの胚盤胞へ導入したところキメラ形成能を有していた（Matsui, Y., Zsebo, K. & Hogan, B. L. M.: Cell, 70: 841-847, 1992）。このようなPGC由来のES細胞様細胞をEG（embryonic germ, EG）細胞と呼ぶことが提唱されている（J. L. Resmick et al.: Nature, 359, 550-551, 1992）。更に、このEG細胞株は、XX、XYの核形に拘わらず樹立でき、かつ生殖系列に入ることが確認された（C. L. Stewart et al.: Develop. Biol. 161, 626-628, 1994）。これらの結果から、EG細胞からＥＳ細胞と同様、多能性または全能性分化能をもつことがわかる。EG細胞はマウスの系統によらず樹立できるので、この方法を改良することにより、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ等の有蹄類のEG細胞を得る道がひらける可能性がある。
本発明は、有蹄類、とりわけブタPGC由来であって多能性または全能性分化能を有し、かつ未分化状態で長期間in vitroで継代培養可能なEG細胞を提供することを目的とする。また本発明は、該EG細胞を用いて作製されるキメラ胚及び該キメラ胚に由来するキメラ動物を作出することを目的とする。また、本発明は、該EG細胞に外来遺伝子を導入したEG細胞株及びそれを用いて作製されるキメラ胚及びそのキメラ胚に由来するキメラ動物を作出することを目的とする。更に本発明は、これらのEG細胞の核をブタの除核卵細胞質に移植して作製した核移植胚及び該核移植胚由来の動物を提供することを目的とする。
発明の開示
本発明は、前記の目的を達成するために特許請求の範囲の各請求項に記載の発明を完成した。以下、本発明についてブタを例として詳述する。
哺乳類のPGCは、極めて類似した移動ルートや細胞の性質を有していることが知られている（P.D.Nieuwkoop & L.A.Sutasurya,1979, “Primordial germs cells in the chordates,Embryogenesis and phylogenesis”,Cambridge University Press,London）。哺乳類として通常マウスを実験動物として使用しているが、その発生機構は哺乳類の中では特殊な「背腹裏返し胚」の様式をとっている。
より一般的な発生様式をとる動物として、また、家畜として一般的に飼育されている動物の多くは、比較発生学等の知見に基づいた分類学上、有蹄類に属している。我々は、有蹄類の家畜の中で繁殖季節がなく妊娠可能で、妊娠期間が比較的短く、かつ多産で胎児を多数得られること、さらに比較的容易に入手可能である点から、ブタを選択した。
またブタは、皮膚等のヒトへの移植に使用されたりして、発生様式もヒトに類似しているため、医学方面によく使用されていることは公知のことである。このことから、ブタはマウスよりもむしろ広く哺乳類に基本的な性質を有していることも考えられる。
ここで、以下本明細書における“多能性分化能”とは、生殖細胞を含めて、外、中、内胚葉由来のいずれの胚葉由来の細胞にも分化することのできることを意味し、“全能性分化能”とは、将来固体全ての細胞種に分化する能力、すなわち完全な固体を形成する能力をいう。
ブタPGC由来のEG細胞株を樹立するためには、各発生段階におけるPGCの存在領域、数及びPGCを同定するための特異的マーカーと、長期間継代培養可能な培養条件の確立とが必要である。
１．PGCの移動経路及び同定
通常哺乳動物のPGCは、アルカリ性ホスファターゼ活性（ALP活性）の高い細胞として、胚体外の尿嚢基部の中胚葉細胞層や内胚葉細胞層内に出現し、発生の進行に従って胚のダイナミックな形態形成による受動的な移動と同時に、細胞自身の能動的な細胞運動とにより、その後、後腸上皮から腸間膜の間充織を経て将来の生殖巣となる生殖原基（生殖巣、生殖隆起）へと移動して行く。
現在マウスを始めとして数種の哺乳動物のPGCの同定がALP活性を指標として行われ、その移動経路も明らかにされている（マウス：Clark,J.M. & Eddy,E.M., Dev. biol., 47, 136-155, 1975;ラット：C.H.Kemper & P.W.J. Peters, Teratology, 36, 117-124,1987;ウサギ：C.E. Chretien, Annales d'Embryologic et de Morphgenese,1(4)361-372,1968;ウシ：A. Jost & J. Prepin, Arch. Anat. Anat. microse., 55(2), 161-186, 1966）。しかしブタPGCに関しては、各発生段階における胎仔の胎齢と相関するPGCの数や存在領域（移動経路）についてはほとんど知見がない。生殖隆起は、胎齢23〜24日から認められ、胎齢26日頃から性判別が可能となり、PGCは胎齢17日頃に中腎近傍に初めて観察される（J.L.Black&B.H.Erikson,Anat.Rec.,161,45-46,1968）との知見があるのみである。
最近マウスPGCの同定には、stage-specific embryonic antigen-1（SSEA-1）、EMA-1或いはForssman抗原に代表されるような細胞表面糖鎖抗原に対するモノクローナル抗体を用いた免疫組織化学的同定方法が用いられている（Solter, D. & Knowles,B. B.: Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 45, 5565-5569, 1978; Hahnel, A. C. & Eddy, E.M.: J. Reprod. lmmunol., 10, 89-110, 1987; Kanai, Y. et al.: Histochemistry,94, 561-568,1994）。これらのモノクローナル抗体はマウスの胚性癌腫細胞（embryonal carcinoma cells：EC細胞）を抗原として作製されるが、これらの抗原の中で、SSEA-1類似の糖鎖抗原［LEX抗原］を認識するモノクローナル抗体のひとつである4C9は、マウスＥＣ細胞Ｆ９株を抗原として作製されたもので（Nomoto, S, et al., Exp. Cell Res., 164, 49-62, 1980）、この抗体を用いた免疫染色法がPGC特異性の高いものとして注目されている（Yoshinaga, K., et al.: Differentiation, 48, 75-82, 1991）。さらに抗ＳＳＥＡ−１モノクローナル抗体は、マウスＥＧ細胞と反応する（Y. Matsui, et al., Cell, 70, 841-847, 1992）。これらのことから本発明者らはモノクローナル抗体4C9（三井製薬から商品名ＬＥＸ−２として市販されている）を用いて、免疫組織化学によるブタ胎仔におけるPGCの存在領域、数およびPGC由来のＥＧ細胞株の同定を行い、該方法が、ブタEG細胞株の同定に適していることを見い出した。
２．PGCの採取
家畜としてのブタの品種は主要なものだけでも80品種に上るが、本発明はこれらの品種に限定されない。以下、ブタ胎仔からPGCを採取する方法を述べる。
通常、胎齢18〜39日のブタ胎仔からPGCを採取する。通常、胎齢26日以降の胎仔の場合は中腎から分離した生殖巣のみを使用する。これ以前の胎仔の場合は、中腎の一部、後腸、腸間膜を含む領域を使用する。この場合、可能な限り余分な組織（例えば神経管、表皮、肝臓、中腎の大部分）を取り除くことが好ましい。余分な組織を取り除けなかった場合は、解離した細胞を一旦ゼラチンでコートした培養皿で60分間培養した培養上清中の細胞を使用すると好適な結果が得られることがある。
切り出した組織をCa++、Mg++を含まないPBS(-)で1回洗浄した後、0.25%トリプシン−0.5mM EDTA溶液で室温5〜10分間処理し、血清入り培地を加えてほぼ単一の細胞になるまでピペッティングすることによって細胞懸濁液を得ることができる。この懸濁液を1,000rpmで5分間遠沈して細胞を回収することができる。
３．EG細胞株の樹立
ブタEG細胞株は、解離した細胞を、マイトマイシンＣ或いはγ線照射処理により不活化した胎仔線維芽細胞を支持細胞層（フィーダー細胞）として、細胞増殖因子を添加した培地で継代培養することにより樹立することができる。
3・1  フィーダー細胞
フィーダー細胞の調製は川瀬らの方法［川瀬ら、実験医学,Vol.10,No.13（増刊）, 1575-1580, 1992］に準じて実施できる。
フィーダー細胞としては、ブタ初代線維芽細胞の他に通常のマウスES細胞用のフィーダー細胞であるマウス胎仔線維芽細胞あるいはそれ由来の細胞株STOが使用できるが、STO細胞株を更にサブクローニングして得られた細胞株SL-10がゼラチンへの接着性の良さから適している。ＳＬ−１０は、ＳＴＯ細胞株にネオマイシン耐性遺伝子を導入した細胞をＣＣＥマウス由来のＥＳ細胞株のフィーダー細胞として用い、その中から未分化な状態で該ＥＳ細胞を最も良好に維持する細胞を選択したものである。
EG細胞を未分化状態で継代維持するには、フィーダー細胞がよい状態であることが好ましい。そのためには、フィーダー細胞がサブコンフルエント（コンフルエントになる直前）になったら直ちに継代することが好ましい。これを怠ると細胞は互いに重層し合い、また増殖速度が速くなる傾向が現れる。このような状態のものは、一般にフィーダー細胞には適さない。フィーダー細胞は継代を繰り返している間に、細胞の形態や増殖速度が変化してくるので、2〜3カ月程度培養したものは廃棄し、凍結保存しておいたストックから新たに培養を始めることが好ましい。
培地としては通常マウスES細胞のフィーダー細胞培養用培地を用いることができる。例えば、Dulbecco's modified Eagle's medium（DMEM）、或いはハイグルコースDMEMにウシ胎仔血清（FCS）を10%添加した培地などである。
3・2  培養方法
ブタEG細胞株を樹立、維持、増殖させるための培地としては、基本的には通常マウスのES細胞株培養用培地に種々の細胞増殖因子を添加したものが使用できる。例えば、ハイグルコースDMEMに、20%ウシ胎仔血清、0.1mM 2-メルカプトエタノール、30μM核酸混合液及び1,000u/ml LIFを添加したものを基本培地として、更にこれにBuffalo Rat liver cellの培養上清（BRL-conditioned medium; BRL-CM）（Smith, A. G. & Hooper, M. L., Dev. Biol., 121:1-9, 1987）を1:1又は2:3になるように混合したもの、あるいは前記基本培地に、1〜50ng/ml bFGFを添加したものなどが使用できる。この際水及びFCSの品質はEG細胞株の樹立や維持に大きく影響する。使用する水はMilliQ（Milli-pore社製）で採取し、石英式蒸留装置で蒸留したものが好ましい。FCSに対してはロットチェックを行うことが好ましい。ロットチェックはマウスES細胞又はマウスEG細胞のコロニーの形態が良好で形成率の高いものを選べばよい。さらにこれに加えて、マウスPGCの増殖、生存率でもチェックするとよい。胎仔１個体から採取した細胞をその胎齢に応じて１〜４枚の35mm培養皿のフィーダー細胞上にまき、通常の培養条件、好ましくは37℃、5% CO2の条件下で培養する。フィーダー細胞上で培養開始後４日〜１週間頃から小コロニーの形成が認められる。これらのコロニー内の細胞間の境界は、顕微鏡による観察によっても困難なほど不明瞭で、核内には顕著な核小体が認められる。コロニー内に観察される核から、コロニーを形成する個々の細胞は、細胞質に比べて大きな核を持ち、未分化な幹細胞に特有な形態的特徴を示すと推定される。
2〜4%パラホルムアルデヒドあるいは95%冷エタノールなどで固定したコロニーでは、コロニー内の細胞間の境界は明瞭となり、細胞同士が密に接着し合い重層したコロニーを形成しており、細胞は形態的に未分化な幹細胞の特徴を示していることが確認される。
フィーダー細胞上でサブコンフルエントになった細胞は継代を行う。継代は、例えば以下の方法で行う。細胞をPBS(-)で洗浄した後、トリプシン−EDTAで処理する。この時細胞は多数の断片を含む細胞懸濁液となる。この細胞懸濁液の1/4〜1/2量を新たな35mm培養皿のフィーダー細胞上にまく。これらの断片を培養するとドーム状に盛り上がったコロニーを形成する。これらのコロニーは通常の組織化学分析により強いアルカリ性ホスファターゼ活性を示すことが多い。更に培養を続けると、これらのコロニーは次第に大きく成長すると共に細長く突起状に伸展して網目状となる。このように大きく成長したコロニーは、アルカリ性ホスファターゼ活性の弱い部域或いは検知できない部域が観察されるようになることが多い。
またこれらのコロニーは、前述のマウス胚性癌腫細胞F9株を抗原として作製されたモノクローナル抗体4C9と免疫組織化学的に反応する。
このようにして樹立されたブタＥＧ細胞は、工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−４６９４で寄託されている。［なお、実際に寄託されているものは（Large White X Duroc）F1雌にDuroc雄を交配して得られた胎仔由来のＥＧ細胞株で４代継代したものである。］
４．ブタEG細胞の凍結保存
EG細胞は長期間培養し続けていくと細胞が分化してしまったり、キメラ形成能が低下するなど性質が変化するので、できるだけ早いうちに凍結保存することが好ましい。
EG細胞を、同細胞の継代方法に概ね準じて、例えば以下のようにして解離し凍結保存する。まず、フィーダー細胞上で増殖した細胞をPBS(-)で2回洗浄した後、0.25%トリプシン-0.05mM EDTA溶液1mlを加え、35〜39℃下で5〜10分間処理する。ピペッティングにより細胞を解離した後、10%FCS添加DMEM 1mlを加え、再度ピペッティングにより細胞を懸濁する。次に細胞懸濁液を15ml遠沈管に回収し、1,000r.p.m.で5分間遠沈する。上澄除去後、35mmディッシュ1枚当たり凍結用溶液1mlで懸濁し、1mlずつ凍結保存用チューブ（Cryotube、Nunc社製）に分注する。凍結チューブはそのまま-80℃のディープフリーザー中に静置し、凍結完了後液体窒素中に移し保存する。（または、凍結チューブは直接液体窒素中に投入し凍結保存する。）
凍結保存した細胞の融解及び培養は、例えば以下のようにして行う。凍結チューブを37℃のウォーターバス中にて融解し、15ml遠沈管に回収する。10%FCS添加DMEM数mlを加え、再度ピペッティングにより細胞を懸濁し、1,000r.p.m.で5分間遠沈する。上澄除去後、凍結チューブ1枚分当たり培地2mlで懸濁し、SL10をフィーダー細胞とした35mmディッシュにまき、EG細胞の培養条件下にて培養する。
５．ブタEG細胞の遺伝子改変
EG細胞は培養細胞であるので、他の培養細胞と全く同様に種々の遺伝子導入法（例えばリン酸カルシウム法、リポゾーム法、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法等）が利用できる。また、導入できる遺伝子も何ら制限されるものではなく、細菌、動物またはヒトの染色体に由来する遺伝子を包含する。同様に、マウスES細胞株を利用するジーンターゲッティングの方法として使用されるターゲッティングベクターを用いた内在遺伝子の相同遺伝子組換えによる改変も可能である。以下に相同遺伝子組換えの方法を述べる。
5・1  ターゲティングベクターの構築方法及び相同組換えを起こした細胞を選別する方法
ターゲティングベクターの相同部分に用いる染色体DNAは、EG細胞と同じ遺伝的背景のものが好ましい。相同組換えの頻度は、ベクターに含まれる相同領域が長いほど高くなる（Capecchi, M. R.: Science 244: 1288-1292, 1989）ので、相同領域が5kb以上は存在することが好ましい。ベクターの構築方法及び相同組換えを起こした細胞を選別する方法は、
5・1・1  選択マーカーを含まずPCR法のプライマーに使う部分の塩基配列のみが内在の遺伝子と異なったベクターを用い、PCR法で多数のクローンから選び出す方法（Zimmer, A. & Gruss, P.: Nature 388: 150, 1989）
5・1・2  「promoterless neo法」と呼ばれる方法で、プロモーターを有しないネオマイシン耐性遺伝子を含むベクターを作製し、標的遺伝子のエクソンにフレームを合わせて挿入し、相同組換えを起こした細胞をG418耐性で選別する方法（Schwartzberg, P. L. et al.: Science 246: 799, 1989）
5・1・3  プロモーター付きのネオマイシン耐性遺伝子を含むベクターを導入し、まずランダム及び相同組換えによってベクターを組込んだ細胞をG418耐性で選別し、その後PCR法などによって目的クローンを選ぶ方法（Joyner, A. L. et al.: Nature 338: 153, 1989）、
5・1・4  「二重選別法（positive-negative selection）」と呼ばれるもので、ポジティブマーカーとしてネオマイシン耐性遺伝子を、ネガティブマーカーとしてヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼ遺伝子（HSV-tk遺伝子）またはジフテリア毒素遺伝子を用いてベクターを作製し、G418及びGancylovir（GANC）で相同組換え体を選別する方法（Capecchi, M. R.: Science 244: 1288, 1989, Yagi, T. et al.: Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.,87: 9918-9922, 1990）などが用いられる。
5・2ターゲティングベクターのEG細胞への導入
ターゲティングベクターのEG細胞への導入は、通常マイクロインジェクション法（前記5・1・1の方法の場合等）或いはエレクトロポレーション（前記5・1・2〜5・1・4の方法の場合等）を用いる。
染色体への導入遺伝子の組み込みが確認されたEG細胞株を正常胚に注入する等の方法によって、EG細胞及び正常細胞胚由来の細胞から構成されるキメラブタを作製することができる。この時EG細胞が生殖系列に入ると導入遺伝子は子孫に伝わることになる。
相同遺伝子組み換え等により特定の遺伝子を改変したES細胞株では、通常この改変遺伝子をヘテロに持っている。このヘテロのES細胞株に対して更に同様の遺伝子ターゲッティングを行いホモのES細胞株を得ることもできるが、改変遺伝子をヘテロに持つ雌雄を得た後、これらの交配によりホモ個体を得ることが一般的である。しかし最近、マウスにおいて任意の遺伝子の改変したヘテロのES細胞クローンをG418にて選別する場合、培養下でホモのクローンにする方法も報告されており、（R. M. Mortensen et al.: Mol. Cell. Biol. 12, 2391-2395, 1992）ブタEG細胞株においてもこの方法が適用可能である。
細胞の性については、germ line transmissionを調べる上で、通常は細胞がXYならば雄のキメラで、XXならば雌のキメラで調べる必要があることから、通常性染色体の形態で判断している。また、PCRにより、Y染色体に特異的な配列を検知する方法なども使用できる。Tgマウスを得るためには、産仔が多数得られる雄のキメラを使用する方が有利であること、また、精子を凍結保存することができることなどから、XYの細胞株一般に使用する。
６．キメラブタの作出
EG細胞株を初期胚（宿主）に注入すると正常発生に組み込まれ様々な細胞に分化するのでキメラブタを作出できる。更にそれが生殖系列キメラならばEG細胞由来のブタを作出できる。
EG細胞株を用いたキメラブタの作出は、例えば柏崎らの方法（Veterinary Record, 130, 186-187, 1992）に準じて実施できる。以下、具体的に作出方法の一例を説明する。
6・1キメラブタ胚の作製と移植
ホスト受精卵回収用に成熟及び未成熟雌ブタを用いる。ホルモン刺激若しくは自然性周期での発情発現時に、人工授精若しくは自然交配を行ったブタの子宮より受精卵を回収する。なお、集合キメラを作製する場合の受精卵の発生段階は、緻密化（Compaction）前（４〜８細胞期）のものを、注入キメラを作製する場合は胚盤胞〜拡大胚盤胞のものを用いる。
EG細胞はトリプシン処理をし、培地を加えてよくピペッティングをし単一細胞にまで解離する。細胞は予めゼラチンコートした培養皿にまき数十分間インキュベートする。フィーダー細胞はEG細胞より接着性が高いので、この処理によりフィーダー細胞は培養皿に接着し、浮遊状態にあるEG細胞を回収できる。
顕微鏡下でマイクロ・マニピュレーターを用いてキメラ胚を作製する。マイクロ・マニピュレーターにはホールディング・ピペットとインジェクション・ピペットをセットし、まず透明帯をホールディング・ピペットで保定する。次に集合キメラの場合は、緻密化前のホスト受精卵の囲卵腔内に、注入キメラの場合は胚盤胞〜拡大胚盤胞の胞胚腔内に、EG細胞を十数個、インジェクション・ピペットを用いて注入する。
細胞注入後キメラ胚は直ちに若しくは数時間培養後、受卵ブタ子宮に移植する。この移植用受卵ブタの発情周期は受精卵の発生段階の前後１日程度のものを用いる。移植は両側若しくは片方の子宮角に行う。
6・2キメラブタの判定
移植されたキメラ胚が受胎−分娩した場合、キメラブタの判定を行う。ホスト受精卵が保有すべき酵素、DNAもしくは毛色パターンとEG細胞が保有すべき同パターンが混在する場合、EG細胞が少なくとも体細胞には寄与しているとみなす。例えば、ホスト受精卵の遺伝子型が「Duroc×Duroc」であれば、毛色パターンは茶色となるはずである。また、EG細胞の遺伝子型が「LW×LW」（LW：ラージ・ホワイト）であれば、毛色パターンは白色となるはずである。ここで、「Duroc×Duroc」の遺伝子型を有するホスト受精卵に、「LW×LW」の遺伝子型を有するEG細胞を導入して得られた産子に一部白色の毛があれば、その産子はキメラブタと判定される。
得られたキメラブタが生殖系列キメラか否かは交配試験またはDNA解析試験によって行う。交配試験は以下のように行うことができる。得られたキメラブタを性成熟させ、そのキメラブタを交配する。その結果得られた産子の遺伝的マーカーを調べ、EG細胞がキメラブタの生殖細胞に分化して、EG細胞由来の精子／卵子を産生するようになった産子か否かの判定を行う。例えば、キメラブタ（例えばメス）の毛色パターンが茶と白の混在であったとする。ここで、茶色の細胞はホスト受精卵由来であり、白色の細胞はEG細胞由来とする。このキメラブタに「Duroc×Duroc」の遺伝子型を有し毛色パターンが茶色であるオスを交配させる。得られた複数の産子のうち1頭でも白い毛を保持しているものがあれば前記のキメラは生殖系列キメラと判定される。また、DNA解析試験は、得られたキメラブタの精子、卵子若しくは生殖細胞を回収し、解析することによって行うことができる。
７．核移植ブタの作出
再現性のある核移植技術は1983年McGrathとSolterによって初めて報告された（MaGrath, J. & Solter, D.: Science, 220, 1300-1302, 1983）。この技術を用いればキメラ作出の過程を経ずして直接EG細胞由来の子孫を得ることができる。以下EG細胞の核をブタの除核未受精卵に移植する方法の一例を示す。
7・1除核卵細胞質の準備
レシピエント細胞質には除核卵細胞質を用いる。除核卵細胞質としては、体外あるいは体内成熟卵、前核期卵等を用いる。
7・1・1  成熟卵子の準備
成熟卵子は体外成熟卵子、或いは体内成熟卵子を用いる。体外成熟卵子の場合、採取したブタ卵巣の卵胞より卵胞卵を採取する。卵細胞質が均一で緊密な卵丘細胞層に包まれた卵子を選択回収し体外成熟培養する。また、体内成熟卵子を用いる場合には、発情後排卵時期前後に回収する。
7・1・2  前核期卵の準備
レシピエント細胞質として前核期卵を用いる場合には、体外或いは体内成熟卵子を体外受精したものか、体内成熟−体内受精したものを回収して用いる。
7・1・3  除核卵細胞質の準備
体外成熟培養した卵子或いは体内成熟卵子は卵丘細胞を除去した後、第１極体の放出された卵子を成熟卵子として選択する。成熟卵子は細胞骨格阻害剤を含む培地中で処理した後、マイクロマニピュレーターに装着したマイクロピペットを用いて第１極帯と共にその周辺の細胞質を一部吸引除去する。最終的には、DNA結合性で核を生体染色する螢光色素であるヘキスト33342等を用いて核染色を行い、螢光顕微鏡下で除核の成否を確認する。前核期卵細胞質を用いる場合には、前核を螢光色素等で生体染色するか、遠沈により脂肪顆粒を遍在させた後、マイクロマニピュレーターを用いて除核する。
7・2ドナー細胞の準備
核移植に用いるEG細胞は、同細胞の継代方法に概ね準じて解離することにより準備する。即ち、フィーダー細胞上で増殖した細胞はトリプシン溶液にて処理した後、ピペッティングにより解離する。解離後EG細胞とフィーダー細胞の細胞混合浮遊液をゼラチンコートディッシュにて処理し上澄を回収する。この処理により接着性の高いフィーダー細胞がかなり除去され、EG細胞の収率が上がる。上澄は遠沈洗浄後少量の培地で再懸濁し、注入操作まで保存する。
7・3核移植胚の作製
核移植胚の作製には、電気融合による方法とセンダイウイルス（HVJ）による方法がある。電気融合法の場合、ドナー細胞をマイクロマニピュレーターに装着したマイクロピペットで吸引する。ホールディングピペットで保定した除核卵細胞質の透明帯の切開部よりマイクロピペットを挿入し、囲卵腔内にドナー細胞を注入する（注入胚）。注入胚は細胞融合用溶液中にて電気融合させる。HVJを用いて融合する場合には、ドナー細胞をマイクロピペットに吸引した後、続けて少量のHVJ溶液を吸引する。ドナー細胞を除核卵細胞質に押し付けるようにして注入し、細胞間にHVJを挟み込むことにより融合させる。処理した胚はしばらく培養して融合を確認後、融合した胚は、核移植の時期まで更に培養する。
7・4核移植胚の移植
作製した核移植胚は体外培養後、分割した胚をレシピエント（受卵ブタ）に卵管或いは子宮移植する。受精ブタの発情周期は核移植卵の発生段階の前後１日程度のものがよい。
7・5核移植胚による産仔の検定
核移植胚の場合、除核操作の際に核の螢光染色等により除核が確認されていれば、ミトコンドリア等のDNAを除けば、得られた産仔は全て核移植胚由来、即ちドナー細胞（EG細胞）由来の遺伝子を持つはずである。たとえレシピエント卵子の除核操作にミスが生じ、電気融合によりドナー細胞とは融合せずに単為発生が誘起されたとしても、個体にまで発育することは現在のところ確認されておらず、妊娠途上で退行死滅する。ドナー細胞と融合したとしても3倍体または4倍体となり同様に産仔は得られない。少なくとも除核未受精卵とドナー細胞との間で毛色、酵素、DNA等のマーカーが何か一つあれば、キメラの判定のような手間はかからず、100%どちらかであることは即座に判明する。
7・6交配能力の検定
核移植による産仔は、当然生殖細胞に至るまで100%ドナー細胞（EG細胞）に由来するものであり、性成熟させた後交配能力さえ確認すればよい。
【図面の簡単な説明】
図１は、ブタ胎仔PGCからの培養薬１週間後の小コロニーを示す写真である。コロニー内の細胞の境界は不明瞭である。（位相差、対物レンズｘ４０）
図２は、培養２週間目のコロニーを示す写真である。（位相差、対物レンズｘ２０）
図３は、継代後２日目のコロニーを示す写真である。３−１は明視野、対物レンズｘ１０、３−２は位相差、対物レンズｘ２０で観察したものである。
図４は、網目状に成長したコロニーを示す写真である。（位相差、対物レンズｘ１０）
図５は、モノクローナル抗体4C9による免疫組織化学染色を示す写真である。EG細胞コロニーは4C9に陽性である。ペルオキシダーゼの発色により観察した。（位相差、対物レンズｘ２０）
図６は、ブタEG cell line３００７−５及び３００５−５の染色体例を示す。
発明を実施するための最良の形態
以下に、本発明の実施例を示すが、本発明はこれらの実施例によって何ら制限を受けるものではない。
１．PGCの採取
1・1ブタ胎仔の採取
ブタ胎仔は（Large White×Duroc）F1雌にDuroc雄を交配或いは人工授精させて得た。一部の胎仔は（Large White×Duroc）F1雌にDuroc×France hybrid雄を交配或いは人工授精させて得た。更にDuroc同士或いは梅山豚同士を交配させて得られた胎仔も使用した。交配及び人工授精は、午前と午後、或いは午後と翌日の午前と、2回を行った。胎齢は交配或いは人工授精を行った日を胎齢0日とした。ブタ胎仔は、胎齢18〜39日（18、19、20、21、22、23、24、25、26、29、30、31、32、33、39日）のものを使用した。
屠畜後のブタ妊娠子宮を直ちに回収し、子宮頚部を縛った後、CETAB（cetyltrimethylammonium bromide）液にて殺菌消毒した。生理食塩水で洗浄後、生理食塩水の入ったビニール袋の中に浸した状態にして室温（12月〜4月）にて3時間以内に持ち帰った。子宮を再びCETAB液にて洗浄後、生理食塩水中に胎仔の卵黄膜・尿膜をなるべく破損しないようにして子宮から胎仔を取り出した後、卵黄膜、尿膜等を除去した。
1・2ブタ胎仔内のPGCの数と分布域−PGCの同定
モノクローナル抗体4C9を用いて、ブタ胎仔のパラフィン切片に対する免疫組織化学的同定を行った。
1・2・1方法
胎齢20日、21.5日及び25日の胎仔を使用した。
Yoshinagaら（Yoshinaga, K. et al.: Differentiation, 48, 75-82, 1991）の方法に基本的に従い以下のようにして行った。2%燐酸緩衝パラホルムアルデヒド（pH 7.4）で12時間固定した後、アルコール脱水、パラフィンで包埋し、7μmの連続切片を作製した。標本を脱パラフィンし、内在性ペルオキシダーゼ活性を阻害するため0.3%過酸化水素水を含むメタノール溶液に20分間浸漬した。その後70%及び90%アルコールにそれぞれ5分間浸漬し、更に流水にて5分間洗浄した。PBSで5分間ずつ3回洗浄した後、400倍に希釈したモノクローナル抗体LEX-2（三井製薬）と4℃24時間反応させ、PBSで5分間ずつ3回洗浄した。200倍希釈したビオチン標識−ヒツジ抗ラットIgM抗体（Amersham）で室温45分間反応、PBSで5分間ずつ3回洗浄、100倍希釈したペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン−ビオチン複合体（Amersham）で室温30分間反応させた。PBSで5分間ずつ3回洗浄した後、0.02% DAB（3,3'-diaminobenzidine、和光純薬）、0.005%過酸化水素水及び50mMアジ化ナトリウム（和光純薬）を加えた、50mMトリス緩衝液（pH 7.5）を添加した発色反応液に、10分間沈漬し、ヘマトキシリンで後染色した後、光学顕微鏡下でLEX-2陽性細胞の検出を行った。対照実験として、一次抗体の代わりにラットの免疫グロブリン標準血清（Bethyl）を用いた。
1・2・2結果
胎齢20日胎仔では後腸上皮内に最も陽性細胞が観察された。他に、背側腸間膜間葉内、及び中腎の生殖隆起予定領域にも既に到達した陽性細胞を観察した。陽性細胞の総数は約70個ほどであった。21.5日胎仔では、陽性細胞の大部分は、背側腸間膜間葉及び生殖隆起予定領域に観察され、総数としては約250個ほどであった。25日胎仔では、ほぼ大部分の陽性細胞は、生殖隆起予定領域で観察された。しかしながら、その反応は低下する傾向にあり、陽性細胞数の計測は困難であった。これらの結果は、胎仔外部形態でブタとマウス胎齢とを対応させてマウスの胎齢でのPGCの分布域をそれに対応するブタ胎仔に適用したPGCの分布推定域と一致した結果となった。従って、モノクローナル抗体4C9を用いた免疫組織化学的分析によって、ブタPGCの同定が可能であることが判明した。
1・3ブタPGCの採取
卵黄膜、尿膜等を除去した前記ブタ胎仔を室温のPB1液（Wood, M. J., Whittingham, D. G. & Rall, W. F.: Mammalian Development, A Practical Approach, Monk, M. ed., pp. 255-280, IRL Press, 1987）中に置き、以下の手順で速やかに細胞の採取が行われた。
胎齢26日以降の胎仔の場合、中腎から分離した生殖巣のみ使用し、これ以前の胎仔の場合は、中腎の一部、後腸、腸間膜を含む領域を使用した。その場合に余分な組織、例えば、神経管、表皮、肝臓、中腎などをピンセット、ハサミ、タングステン針、微小メスなど用いて可能な限り取り除いた。余分の組織を取り除けなかった場合は、解離した細胞を一旦ゼラチンでコートした培養皿で60分間培養した上清中の細胞を使用した。
切り出した組織（生殖巣或いは中腎の一部、後腸、腸間膜を含む領域）はPBS（-）で1回洗浄後、0.25%トリプシン−0.5mM EDTA溶液で室温5〜10分間処理し、血清入り培地を加えてピペッティングを行い、ほぼ単一細胞になるまで解離した。次いで1000rpmで5分間遠沈して細胞を回収した。
２．EG細胞株の樹立
2・1フィーダー細胞
STO細胞のサブクローンSL10を使用した。SL10の場合、2週間がフィーダー細胞としての利用限度であり、7〜10日で継代を行った。培地としてはDMEM+10%FCSを使用した。
フィーダー細胞の調製手順は以下の通りである。
2・1・1  コンフルエントになったフィーダー細胞を、マイトマイシンCを10μg/mlになるように加えた培地（ハイグルコースDMEM＋10%ウシ胎仔血清）で2.5〜3時間CO2インキュベーターで培養し、フィーダー細胞を不活化する。
2・1・2  培地を除き、PBS(-)で3回洗い、0.5%トリプシン−1mM EDTA処理により細胞を剥がし、培地を加え、細胞を良く懸濁した後、遠心（1,000rpm、5分）して上清を除く。
2・1・3  細胞を適当な濃度（STO細胞の場合は2.5×105/ml、胎仔線維芽細胞の初代培養細胞なら5.0×105/mlの濃度）に懸濁する。
2・1・4  フィーダーをつくる培養皿は予めゼラチンコートしておく。0.1%ゼラチン溶液（swine skin、Type A:Sigma社製）で覆い、37℃で1時間以上インキュベートする。
2・1・5  培養皿のゼラチン溶液を除き、細胞の懸濁液を加える。数時間経てばフィーダー細胞として使用可能である。
2・2EG細胞株の樹立と固定
2・2・1  培養
表１に示す通常のマウスES細胞株培養用培地（ESM）に1,000U/mlリコンビナント・マウスLIF或いはヒトLIFを添加したものを基本培地（以後培地▲１▼と称する）として、更に▲１▼にBRL-CMを1:1或いは2:3となるように加えたもの（E/B）（以後培地▲２▼と称する）や、bFGFを▲１▼に1〜50ng/ml添加したもの（以後培地▲３▼と称する）を使用した。回収した細胞の培養は全てフィーダー細胞上で37℃、5%CO2の条件下で行った。培地交換は培地の色で判断した。通常、35mm培地皿当たり胎仔1個体から採取した細胞数相当から培養を開始した。
継代は、マウスES細胞の継代方法にほぼ準じて行った。0.25%トリプシン−0.5mM EDTA溶液で3〜5分間処理し、培地を添加して軽くピペッティングすることにより培養皿から剥がし、更にピペッティングした後ゼラチンコート培養皿に移し、15〜30分間培養した上清中の細胞を回収した。
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2・2・2増殖形態
胎齢18〜26日頃の胎仔の細胞の培養から、開始後4日〜1週間ほどで、細胞同士の境界が不明瞭な、フィーダー細胞の上に盛り上がったコロニーが観察され、細長く伸展して行った（図1,2）。1〜2週間後継代を行った。このコロニーは通常の処理では解離しにくく、多数の断片となった。これらの断片は、フィーダー上でドーム状に盛り上がったコロニーとなった（図3-1,図3-2）。更に培養を続けると、この球形のコロニーは細長く伸展して行き、各コロニーはお互いに連結して網目状のコロニーを形成した（図４）。固定すると細胞間の境界が明瞭となった。
前記▲１▼〜▲３▼の培地を用いて培養したものを比較すると、培地▲２▼において細胞の増殖が他のものよりも遅く、コロニーは培地▲１▼、培地▲３▼の場合のものよりも盛り上がった形態となった。培地▲２▼、培地▲３▼においては、フィーダー細胞への形態に変化が生じ、特に培地▲３▼においてはフィーダー細胞の寿命は若干短かった。マウスとヒトのLIFに有意な差は認められなかった。LIFの濃度を10,000U/mlにしても違いは認められなかった。
（Large White×Duroc）F1雌×Duroc雄と、Duroc同士、梅山豚同士の交配して得た胎仔からのコロニーの間に差は認められなかった。
6カ月間継代培養を続けたところ、中には分化していく傾向にあるコロニーも存在したが、大半は上述の形態を保ちつつ未分化な状態で継代維持された。
2・2・3アルカリホスファターゼ（ALP）の組織化学的染色
ブタEG細胞株の培養ディッシュをダルベッコのPBS(-)で2回洗浄した後、4℃の95%冷エタノールで30分以上固定し、次いで4℃の無水エタノールで30分以上脱水した。固定液を除き、ディッシュを室温で0.1M Tris-HCl（pH9.0〜9.5）にて5分間3回洗浄した後、1.5〜2mlの染色液（下記染色液作製方法参照）を各ディッシュに加え、遮光下で室温にてALPを15〜30分間染色した。PBS(-)で2回洗浄した後グリセロールを加え位相差立体顕微鏡で赤褐色に染まったEG細胞コロニーを検鏡した。結果を表２のALP欄に示す。
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・染色体作製方法
ナフトールAS-BIホスフェート（シグマ社、カタログ番号N-2125）2.5mgと、ファースト赤TR塩（シグマ社）15mg［又はファースト紫B塩6mg（シグマ社）、ファースト青BB塩12.5mg（シグマ社）］とを0.1M Tris-HCl緩衝液25mlに加え、遮光下で3〜5分間撹拌して溶解し、次いで濾過する。
2・2・4培養細胞に対する免疫組織化学的同定
a.  抗４Ｃ９抗体との反応
35mm培養皿で培養したEG細胞株を2%燐酸緩衝パラホルムアルデヒド（pH7.4）で12時間4℃で固定した後、PBSで洗浄した。内在性ペルオキシダーゼ活性を阻害するため、0.3％過酸化水素水を含むメタノール溶液に室温で20分間浸した。次いで、70%及び90%アルコールにそれぞれ5分間浸漬し、更に流水にて5分間洗浄した。PBSで5分間ずつ3回洗浄した後、50〜100倍に希釈したモノクローナル抗体LEX-2と4℃、24時間反応させた。PBSで3回室温にて洗浄した後、100倍希釈したビオチン標識ヒツジ抗ラットIg抗体（Amersham）で室温にて45分間旋回させながら反応させた。PBSで5分間ずつ3回洗浄した後、100倍希釈したペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン−ビオチン複合体とで30分間室温で旋回させながら反応させた。PBSで5分間ずつ3回洗浄した後、0.02% DAB（3,3'-diaminobenzidine、和光純薬）・0.05%過酸化水素水及び50mMアジ化ナトリウム（和光純薬）を含む50mMトリス緩衝液（pH7.5）からなる発色反応液に室温で10分間浸し発色させた。水道水にて洗浄し検鏡した。対照実験として、一次抗体4C9の代わりにラットの免疫グロブリン標準血清（Benthyl）を用いた。結果を図５に示す。処理されたブタEG細胞に発色がみられ、ブタEG細胞は、モノクローナル抗体LEX-2と結合することが確認された。
b.  抗4C9抗体の螢光抗体染色
抗4C9抗体陽性を螢光抗体法で調べる試料は、全て抗4C9抗体とALPとの二重組織化学的染色を行って調べた。ブタEG細胞株の培養ディッシュをウシ胎児血清（FBS）2%及びNaN3 0.1%を含む冷PBSで3回洗浄した後、2%パラホルムアルデヒドを含む0.1Mリン酸緩衝液を用いて室温で20〜30分間EG細胞株を固定した。PBSで3回洗浄後、PBSをブロッキング溶液［正常ヤギ血清（TAGO社、コードNr.5000）5%を含むPBS］と入れ替え、20〜30分間室温で保持した。次いで、BSA5%、250倍希釈ヤギ抗ラットIgM抗体（μ鎖）及びNaN3 0.1%を含むM199ハンクス液と入れ替え、20〜30分間室温で保持した。PBSで3回洗浄後、10倍希釈抗Lex2モノクローナル抗体（フナコシ社、コードLE-01）40〜80μlと約14〜26時間反応させた。PBSで3回洗浄後、25倍希釈FITC結合ヤギ抗ラットIgM抗体［ORGANON TEKNIKA社、コード55759(1613-0201)］40〜50μlと30分間反応させた。PBSで洗浄後、マウスES細胞を染色する場合と同様の方法で、アルカリ性ホスファターゼを室温で5〜18分間染色した。PBSで2回洗浄次いで及びDDWで洗浄後、Vectashieldマウンティング液（螢光用、Vector Lavoratories社、コードH-1000）でwhole mountし、マニキュア液で縁取し検鏡した。結果を表１の4C9の欄に示す。
2・2・5核型分析
樹立された細胞株は、通常核型分析を行い、正常な染色体数の占める割合を分析する。染色体数が正常な細胞の占める割合が大きいほど、生殖系列キメラ形成能を有する株である可能性が高くなる。また、継代を経た場合の染色体数の変化も通常分析される。
a.  被験細胞
よりよい結果を得るために、植え継ぎしてから3〜7日経過した対数分裂期のブタEG細胞を用いた。植え継ぎの3〜5時間前に培地を新しいものと交換した。
b.  標本作製
・コルセミド処理
35mm培養プレート中の対数増殖期にある細胞を、コルセミドの最終濃度が0.04mg/mlを含む培養液を用いて37℃、5% CO2インキュベーター中で2時間培養した（コルセミドの処理濃度・時間は、細胞の種類、増殖度によって適当に加減する）。
・低張処理
培養終了後、培養上清及び0.05%トリプシン処理で回収した細胞を各細胞ごとに同一の遠心管に移し、遠心分離（800〜1,000rpm、5分間）を行った。遠心後上清を除き、細胞ペレットに低張液（0.56% KCl溶液）3mlを加え、細胞を分散させ、37℃で13分間保持した。
・固定
低張処理後、固定液（メタノール：氷酢酸＝3:1）9mlを加え混和し、氷上で20分間あるいは4℃で一晩静置した。遠心分離により細胞を回収し固定液を4ml加え混和した。この操作を2回繰り返した後、細胞ペレットを100〜300μlの固定液中に懸濁した。この細胞懸濁液をパスツールピペットで1〜2滴滴下し、スライドボックス中室温で一晩放置した。
・染色
50mMリン酸緩衝液（pH 6.8）中で新しく調製した5%ギムザ溶液で5分間染色した。次いでDWで1〜2分洗浄し、室温で保持した。
c.  染色体の分析
各々のcell lineの、よく拡がった分裂中期像の染色体標本をミニコピーフィルム（富士、ASA 25-32）で写真撮影した。結果を表１の核型欄及び2つのセルラインの染色体の形態的特徴を図６に示す。図６−１はブタEGセルライン3007-5の5継代目、図６−２は2継代目の染色体図である。
2・2・6性別判断
ブタEG細胞株の性別判断の方法は、Fajfarらの報告［Fajfar,C. J., A. L. Rayburn III, L. B. Schook and M. B. Wheeler (1993) Animal Biotech. 4, 183-193］を修正して用いた。本修正方法によれば、たとえ、フィーダー細胞のコンタミがあっても性別の判断が可能である。
ゲノムDNAの標準的な抽出法［Sambrook, J., E. F. Fritsch and T. Maniatis (1989) Molecular Cloning A Laboratory Manual 2nd ed., CSH Press］を用いてブタEG細胞ゲノムDNAを調製し、DNA量を測定し、10ng/μl溶液を作製した。
MiliQ水37.5μl、PCR緩衝液5μl、dNTP混合液4μl、プライマーYH-1；5'-GCCCTATCTTACCATGGTCAGCCC-3' 1μl、YH-2;5'-CCTCACCAGCAACCTCACAGACC-3' 1μl、Taqポリメラーゼ0.5μl、合計49μlを0.5mlエッペンドルフチューブ内で混合した。
ピペッティングによりゆっくりと混合し、上記ブタEGゲノムDNA1μl（10ng/μl）を反応直前に加え、短時間混合し、60μl以上の鉱油を加えた。94℃1分間、60℃1分間、72℃2分間の30サイクルのPCR cycling反応を行う。
ゲル電気泳動で分析したところ、192bpのバンドが形成された。フィーダー細胞DNAにはバンドがなく、精子DNAには同じ長さのはっきりしたバンドがあることを確認した。
EG細胞のセルライン3005、3006、3007及び3008を確認に供した。3007及び3008のDNAの増幅産物はbore精子DNAと同じ長さのものであったが、3005及び3006からはその長さのものは得られず、SL10のDNAも同様に得られなかった。これらの試料では非特異的な増幅はほとんど行われていないため、3007及び3008はXY核型を有し、3005及び3007はXX核型を有していると結論した。
2・2・7分化誘導
35mmディッシュのブタEG細胞に1mlのトリプシン−EDTAを加え、3〜10分間インキュベートした後、培養液0.2mlを加え、ピペッティングして細胞塊をほぐした。培養液を10mlになるように加え細胞数をカウントして800rpm5分間遠心した。
0.1〜0.3Mのレチノイン酸（all trans、typeXX、シグマR-2625）を含む培養液で細胞を、5×105細胞／mlとなるように再懸濁した後、0.1%ゼラチン溶液でコートした組織培養ディッシュ（Falcon#3002）に5mlまいた。
2日後、アスピレーションにより培地を取り除き、レチノイン酸を含む新鮮な培地と交換した。
細胞が分化を始めると生育は次第に遅くなる。もしも細胞を生育し続ける場合、コンフルエントに達する前にトリプシン−EDTAで細胞を処理し、レチノイン酸を含む新鮮な培地を入れたゼラチン溶液でコートしたディッシュに3×105細胞／mlまく。
産業上の利用の可能性
本発明のブタEG細胞株はES細胞に形態的に類似し多能性または全能性分化能を持ち、かつこのような性質を保持したまま長期間継代培養が可能なので、他の培養細胞と同様に培養下での遺伝子操作、例えば遺伝子ターゲッティング等が可能である。従って生殖系列に分化するEG細胞株が得られれば、この細胞株に産業上有用な遺伝子を導入し、正常胚と組み合わせてキメラを作出し、そのキメラからEG細胞株由来のトランスジェニック子孫を得ることが出来る。また、EG細胞の核を核移植技術により除核卵細胞質に移植してEG細胞由来の子孫を得ることもできる。
【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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