(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
二つのDNA部分配列を含んでなるポリヌクレオチドによってコードされる組換えタンパク質であって、第１の部分配列がＩＬ−４レセプターの細胞外ドメインのタンパク質をコードし、第２の部分配列がヒト免疫グロブリン重鎖IgGの不変領域の、第１ドメイン以外の全てのドメインをコードし、上記タンパク質のカルボキシ末端が、ヒト免疫グロブリン重鎖の不変領域のアミノ末端に結合されており、組換えタンパク質が二量体を形成する、組換えタンパク質。
【請求項２】
IgGがIgG１である、請求項１に記載の組換えタンパク質。
【請求項３】
第１および第２の融合パートナーからなる可溶性の組換え融合タンパク質であって、第１の融合パートナーがＩＬ−４レセプターの細胞外ドメインのタンパク質であり、第２の融合パートナーがヒト免疫グログリン重鎖IgG１のヒンジ、CH２、およびCH３ドメインであり、上記タンパク質のカルボキシ末端がヒトIgG１のヒンジのアミノ末端に結合されており、組換えタンパク質が二量体を形成する、組換え融合タンパク質。
【請求項４】
二量体がCHO細胞で生成される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組換えタンパク質。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載された組換えタンパク質をコードするDNA分子。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか１項に記載された組換えタンパク質の製造方法であって、該組換えタンパク質をコードするDNAを哺乳類細胞発現系に導入し、該タンパク質を発現させ、発現後に、生成されたタンパク質を精製することを特徴とする方法。
【請求項７】
生成されたタンパク質が、免疫グロブリン部分を介してアフィニティクロマトグラフィーにより精製される、請求項６に記載の組換えタンパク質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、免疫グロブリン族(family)に属さないヒトタンパク質若しくはその一部および免疫グロブリン分子の不変領域の各種の部分から成る、遺伝子操作による可溶性の融合タンパク質に関する。２つの融合パートナーの機能上の特性は、驚くべきことにはこの融合タンパク質において保持されている。
【０００２】
欧州特許公開（ＥＰ−Ａ）第０３２５２６２号公報および欧州特許公開（ＥＰ−Ａ）第０３１４３１７号公報には、ヒトＴ細胞のＣＤ４膜タンパク質の各種のドメインとヒトＩｇＧ１部分からなる対応融合タンパク質が開示されている。これらの融合タンパク質のあるものは、細胞に結合したＣＤ４分子と同じ親和性でヒト免疫不全ウイルスの糖タンパク質ｇｐ１２０に結合する。ＣＤ４分子は免疫グロブリン族に属し、したがって免疫グロブリン分子と極めて類似した三次構造を有する。これはＴ−細胞抗原レセプターのα鎖にも適用され、これについて前記のような融合も報告されている（ガスコイン(Gascoigne) ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, (1987), 2937-2940 ）。したがって、極めて類似したドメイン構造に基づいて、この場合には融合タンパク質における２つの融合パートナーの生物活性の保持が予想されるべきであった。
【０００３】
本発明によれば、好ましくは免疫グロブリンの不変領域のアミノ末端に結合しているヒトタンパク質は免疫グロブリン族に属さず、かつ下記のクラスに帰属されるものである。すなわち、(i)   細胞外ドメインが全体または部分的に融合体に組み込まれている膜結合タンパク質。これらは、特にトロンボプラスチンおよびサイトカインレセプターおよび成長因子レセプター例えばインターロイキン−４およびインターロイキン−７の細胞レセプター、腫瘍壊死因子、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、エリスロポエチンである。(ii)  全体または部分的に融合体に組み込まれている非膜結合可溶性タンパク質。これらは、特に治療上興味深いタンパク質であり、例えばエリスロポエチンおよび他のサイトカインおよび成長因子である。
【０００４】
融合タンパク質は、既知の原核および真核生物発現系において、好ましくは哺乳類細胞（例えば、ＣＨＯ、ＣＯＳおよびＢＨＫ細胞）中で調製することができる。
【０００５】
本発明による融合タンパク質は、その免疫グロブリン部分のために、アフィニティークロマトグラフィによって容易に精製され、生体中で改良された薬物動態学的特性を有する。
【０００６】
多くの場合に、融合タンパク質中のＦｃ部は治療および診断に使用するのに非常に有利であり、したがって例えば改良された薬物動態学的特性を生じる（欧州特許公開（ＥＰ−Ａ）第０２３２２６２号公報）。一方、幾つかの使用に際しては、融合タンパク質を記載されている有利な方法で発現させ、検出し、精製した後にＦｃ部を欠失させることができることが望ましい。これは、Ｆｃ部分が治療および診断に使用するのに障害となる場合、例えば融合タンパク質を免疫するための抗原として用いようとする場合である。
【０００７】
この目的に使用することが考えられる各種のプロテアーゼが存在する。例えば、パパインとペプシンを用いて免疫グロブリンからＦ（ａｂ）フラグメントを生成させるが（免疫学(Immunology)、ロイト・アイ(Roitt, I.) ら監修、ゴウアー・メディカル・パブリッシング(Gower Medical Publishing)、ロンドン、（1989年））、それらは特に特異的な方法では開裂しない。血液凝固因子Ｘａは対照的にタンパク質において比較的まれなテトラペプチド配列Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇを認識し、アルギニン残基の後でタンパク質の加水分解開裂を行う。記載されたテトラペプチドを含む配列は、最初にナガイ(Nagai) とソジャーセン(Thogersen) によって遺伝子工学的手段によって導入された（ナガイ・ケイ(Nagai, K.) およびソジャーセン・エイチ・シー(Thogersen, H.C.) 、Nature, 309, (1984) 810-812 ）。これらの著者らは、大腸菌中で発現されたタンパク質は実際に因 子Ｘａによって特異的に開裂されることを示すことができた。しかし、このようなタン白質が真核生物においておよび特に動物細胞において発現され、精製後に因子Ｘａによって開裂もされる可能性の発表例はまだない。しかしながら、動物細胞における本発明によるタンパク質の発現は、この種の細胞系においてのみ、例えば融合パートナーとして正常に膜に結合したレセプターがそれらの天然構造を保持し、したがってそれらの生物活性を保持して分泌されることが予想されるので、好ましい。細胞培養上澄液中に分泌されると、融合タンパク質を引き続いて直接精製することが容易になる。
【０００８】
したがって、本発明は、免疫グロブリン族に属さないヒトタンパク質若しくはその一部と各種のサブクラスの免疫グロブリン（ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ）の重鎖または軽鎖の不変領域の各種の部分から成る遺伝子操作による可溶性の融合タンパク質に関する。免疫グロブリンとしては、融合がヒンジ部で起こる、特に好ましくはヒトＩｇＧ１の重鎖の不変部が好ましい。具体的な態様では、Ｆｃ部は、組み込まれてもいて且つ因子Ｘａで開裂することができる開裂配列によって簡単な方法で除くことができる。
【０００９】
更に、本発明は、遺伝子工学によるこれらの融合タンパク質の調製法およびそれらの診断および治療のための使用に関する。
【００１０】
【実施例】
最後に、本発明を更に例によって説明する。
例１：  トロンボプラスチン融合タンパク質
血液凝固は人体における中心的な重要な過程である。凝固カスケードの適度に微妙な調整がなされ、ここでは多数の細胞因子および血漿タンパク質が協同している。これらのタンパク質（およびその共同因子）は全体として凝固因子と呼ばれている。凝固カスケードの最終生成物はトロンビンであり、これは血小板の凝集を引き起こし、フィブリンが血小板の血栓を安定化するのである。トロンビンはフィブリノーゲンからフィブリンの形成を触媒し、それ自体プロトロンビンの限定されたタンパク分解によって形成される。活性化された因子Ｘ（因子Ｘａ）はこの段階に関与しており、因子Ｖａおよびカルシウムイオンの存在下で血小板膜に結合して、プロトロンビンを開裂させる。
因子Ｘを活性化するには、外因性および内因性経路の２つの方法がある。内因性経路では、一連の因子は、タンパク質分解によって活性化されて、それらのそれぞれについて順に活性なプロテアーゼを形成する。外因性経路では、損傷した細胞によってトロンボプラスチン（組織因子）の合成が増加し、因子ＶＩＩａおよびカルシウムイオンと共に因子Ｘを活性化する。以前は、トロンボプラスチンの活性はこの反応に限定されると考えられていた。しかしながら、トロンボプラスチン／ＶＩＩａ複合体も、因子ＩＸの水準で内因性経路を活性化するのをなかだちする。したがって、トロンボプラスチン／ＶＩＩａ錯体は、血液凝固の最も重要な生理学的活性化因子の一つである。
それ故、トロンボプラスチンは、診断助剤（下記参照）としての使用は別にして、先天性または後天性血液凝固不全症の治療薬の成分としても用いることができると考えられる。この例には、因子ＶＩＩＩ、ＩＸまたはＸＩの欠損によって引き起こされる慢性血友病、またはたとえば肝臓または腎臓病等の結果としての血液凝固の急性障害がある。外科的処置後にこの様な治療薬を使用することも考えられる。  トロンボプラスチンは免疫グロブリン族には属さない必須の膜タンパク質である。トロンボプラスチンのｃＤＮＡ配列は、全部で４つのグループによって報告されている（フィッシャー(Fisher)ら、Thromb, Res., 48 (1987), 89-99；モリセイ(Morrisey)ら、Cell, 50 (1987), 129-135；スカルパティー(Scarpati)ら、Biochemistry, 26 (1987), 5234-5238；スパイサー(Spicer)ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84 (1987), 5148-5152）。トロンボプラスチンｃＤＮＡは２９５個のアミノ酸残基のポリペプチドであってその内の３２個のＮ−末端アミノ酸がシグナルペプチドとして働くものをコードするオープン・リーディング・フレームを含む。成熟したトロンボプラスチンは２６３個のアミノ酸残基を含み、３つのドメイン構造、すなわち、i)  アミノ末端細胞外ドメイン（２１９個のアミノ酸残基）；ii)   トランスメンブラン領域（２３個のアミノ酸残基）；iii)  細胞質ドメイン（カルボキシル末端：２１個のアミノ酸残基）を有する。細胞外ドメインでは、Ｎ−グリコシル化に対して３つの潜在的部位がある（Ａｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ）。トロンボプラスチンは通常はグリコシル化されるが、グリコシル化はタンパク質の活性にとって本質的なものではないと思われる（パボースキイ(Paborsky)ら、Biochemistry, 29 (1989), 8072-8077）。
トロンボプラスチンは、凝固の診断試験における血漿試料に対する添加剤として必要である。被験者の凝固状態は、一段階プロトロンビン凝固時間測定（例えば、クイック試験）によって見出だすことができる。診断試験に要するトロンボプラスチンは現在はヒト組織から得られ、調製法は標準化することが難しく、収率は低く、かなりの量のヒト出発材料（胎盤）を供給しなければならない。一方、遺伝子工学による天然の膜結合トロンボプラスチンの調製も精製過程が複雑であるため困難であることが予想される。これらの困難は、本発明による免疫グロブリン部分への融合によって回避することができる。本発明によるトロンボプラスチン融合タンパク質は、哺乳類細胞（例えば、ＣＨＯ、ＢＨＫ、ＣＯＳ細胞）によって培地中に分泌され、プロテインＡ−セファロース上でアフィニティークロマトグラフィによって精製され、一段階プロトロンビン凝固時間測定では驚くべきほどの高い活性を有する。
トロンボプラスチンｃＤＮＡのクローニング
スカルパティー(Scarpati)ら、Biochemistry, 26 (1987), 5234-5238によって報告された配列をトロンボプラスチンｃＤＮＡのクローニングに用いた。これから２つのオリゴヌクレオチドプローブ分子（図１参照）が誘導された。これらの２つのプローブ分子を用いて、ヒト胎盤からのｃＤＮＡバンクをスクリーニングした（グルンドマン(Grundmann) ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83  (1986), 8024-8028 ）。
各種の長さのｃＤＮＡクローンを得た。一つのクローンである２ｂ−Ａｐｒ５は次の手順に用いられるものであり、スカルパティー(Scarpati)らの報告に記載されているｃＤＮＡと同じアミノ酸配列をコードする。図２〜５に、クローン２ｂ−Ａｐｒ５の全体配列をそれから誘導されるトロンボプラスチンのアミノ酸配列と共に示す。
トロンボプラスチン融合タンパク質をコードするハイブリッドプラスミドｐＴＦ１Ｆｃの構築
プラスミドｐＣＤ４Ｅガンマー１（欧州特許第０３２５２６２Ａ２号公報、寄託番号第６７６１０号でＡＴＣＣへ寄託）をヒトＣＤ４レセプターおよびヒトＩｇＧ１からなる融合タンパク質の発現に用いる。ＣＤ４の細胞外ドメインをコードするＤＮＡ配列を、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩを用いてこのプラスミドから欠失させる。この場合には酵素ＨｉｎｄＩＩＩで部分開裂のみを行い、ｐＣＤ４Ｅガンマー１（位置２１９８）に含まれる２つのＨｉｎｄＩＩＩ部位の一方だけを切断するようにしなければならない。その結果真核生物転写調節配列（プロモーター）の後に開放したＨｉｎｄＩＩＩ部位が続く開環ベクターとなる。開放ＢａｍＨＩ部位はペンタペプチドリンカーに対するコード領域の開始部位に位置し、この後にヒトＩｇＧ１のヒンジおよびＣＨ２およびＣＨ３ドメインが続く。ＢａｍＨＩ認識配列ＧＧＡＴＣＣにおけるリーディング・フレームは、ＧＡＴがアスパラギン酸として翻訳されるようになっている。熱安定性を有するＤＮＡポリメラーゼでＤＮＡを増幅すると、任意の所望な配列が一方のまたは両方の末端に結合するような仕方で所定の配列を修飾することができる。トロンボプラスチンの５′−非翻訳領域における配列（Ａ：  ５′ＧＡＴＣＧＡＴＴＡＡＧＣＴＴＣＧＧＡＡＣＣＣＧＣＴＣＧＡＴＣＴＣＧＣＣＧＣＣ３′）またはコード領域における配列（Ｂ：  ５′ＧＣＡＴＡＴＣＴＧＧＡＴＣＣＣＣＧＴＡＧＡＡＴＡＴＴＴＣＴＣＴＧＡＡＴＴＣＣＣＣ３′）とハイブリダイズすることができる２個のオリゴヌクレオチドを合成した。これらのうち、オリゴヌクレオチドＡはコード鎖の配列と部分的にホモロジーであり、オリゴヌクレオチドＢは非コード鎖と部分的にホモロジーである（図６を参照されたい）。
したがって、増幅を行うと、（コード鎖を基として）コード配列の開始部位の前の５′末端にＨｉｎｄＩＩＩ部位と、トランスメンブラン領域の最初の３個のアミノ酸残基に対するコドンの後の３′末端にＢａｍＨＩ部位を含むＤＮＡフラグメント（８２７ｂｐ）を生じる。ＢａｍＨＩ開裂部位におけるリーディング・フレームは、ｐＣＤ４Ｅガンマー１におけるＢａｍＨＩ部位との連結によってトロンボプラスチンｃＤＮＡの開始コドンからＩｇＧ１の重鎖の停止コドンへと連続するリーディング・フレームを有する遺伝子融合を生じる。所望なフラグメントを得て、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで処理した後、前記のようにして、ＨｉｎｄＩＩＩ（部分的）およびＢａｍＨＩで切断したベクターｐＣＤ４Ｅガンマー１に連結した。生成したプラスミドをｐＴＦ１Ｆｃと命名した（図７）。
哺乳類細胞中へのｐＴＦ１Ｆｃのトランスフェクション
プラスミドｐＴＦ１Ｆｃによってコードされた融合タンパク質を、これ以後はｐＴＦ１Ｆｃと呼ぶことにする。ｐＴＦ１ＦｃはＣＯＳ細胞中において一時的に発現された。このために、ｐＴＦ１Ｆｃを用いてＣＯＳ細胞をＤＥＡＥ−デキストランの助けによってトランスフェクションした（欧州特許公開（ＥＰ−Ａ）第０３２５２６２号公報）。間接免疫螢光を検討したところ、トランスフェクションされた細胞の比率はトランスフェクションから２４時間後には約２５％となり、細胞を血清不含培地中に移した。この細胞上澄液を、更に３日後に回収した。
細胞培養上澄液からのｐＴＦ１Ｆｃ融合タンパク質の生成
一時的にトランスフェクションしたＣＯＳ細胞からの上澄液１７０ｍｌを、プロテインＡ−セファロース０．８ｍｌを含むカラム中４℃でバッチ法で一晩集め、１０容量の洗浄用緩衝液（５０ｍＭトリス緩衝液，ｐＨ８．６、１５０ｍｌＮａＣｌ）で洗浄し、溶出緩衝液（９３：７  １００ｍＭクエン酸：１００ｍＭクエン酸ナトリウム）を用いて０．５ｍｌずつの画分で溶出した。最初の９画分を直ちにそれぞれ２Ｍトリス緩衝液ｐＨ８．６、０．１ｍｌで中和した後纏めて、生成するタンパク質をアミコン(Amicon)マイクロコンセントレーター（セントリコン(Centricon) ３０）中で３サイクルの濃縮／希釈によって、ＴＮＥ緩衝液（５０ｍＭトリス緩衝液ｐＨ７．４、５０ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ）中に移した。この方法で得られるｐＴＦ１Ｆｃは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動によれば純粋である（ユー・ケイ・レムリ(U.K. Laemmli)、Nature 227(1970) 680-685）。還元剤の不在では、それはＳＤＳ−ＰＡＧＥ中では二量体のような挙動を示す（約１６５ＫＤａ）。
プロトロンビン凝固時間測定における精製ＴＦ１Ｆｃの生物活性
ＴＦ１Ｆｃ融合タンパク質は、一段階プロトロンビン凝固時間測定では、低濃度（＞５０ｎｇ／ｍｌ）で活性である（ビナツァー・エイチ(Vinazzer, H.)、Gerinnungsphysiologie und Methoden im Blutgerinnungslabor (1979)、フィッシャー出版(Fisher Verlag) 、シュトゥットガルト）。得られた凝固時間は、ヒト胎盤から単離されたトロンボプラスチンで得られた凝固時間に匹敵するものである。
【００１１】
例２：  インターロイキン−４レセプター融合タンパク質
インターロイキン−４（ＩＬ−４）はＴ細胞によって合成され、Ｂ−細胞の増殖を刺激することができるので最初のうちはＢ−細胞成長因子と呼ばれていた。それはこれらの細胞に多数の効果を及ぼす。特にその一つは、活性化されたＢ細胞における免疫グロブリンのサブクラスＩｇＧ１およびＩｇＥの分子の合成の刺激である（コフマン(Coffmann)ら、Immunol. Rev., 102 (1988) 5 ）。更に、ＩＬ−４もＴ細胞および他の造血細胞の増殖および分化を調節する。したがって、これはアレルギーおよび他の免疫学的反応の調節に寄与する。ＩＬ−４は、特異的レセプターに高い親和性で結合する。ヒトＩＬ−４レセプターをコードするｃＤＮＡは単離されている（イドゼルダ(Idzerda) ら、J. Exp. Med., 171 (1990) 861-873）。ｃＤＮＡ配列から導かれるアミノ酸配列を分析することにより、ＩＬ−４レセプターは全部で８２５個のアミノ酸からなり、２５個のＮ−末端アミノ酸がシグナルペプチドとして働くことは明らかである。成熟したヒトＩＬ−４レセプターは８００個のアミノ酸からなり、トロンボプラスチンと同様に、３つのドメイン構造、すなわちi)  アミノ末端細胞外ドメイン（２０７個のアミノ酸）；ii)   トランスメンブラン領域（２４個のアミノ酸）およびiii)  細胞質ドメイン（５６９個のアミノ酸）を有する。細胞外ドメインではＮ−グリコシル化のための６つの潜在部位がある（Ａｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ／Ｓｅｒ）。ＩＬ−４レセプターは、ヒトＩＬ−６レセプター、ヒトＩＬ−２レセプターのβ−サブユニット、マウスエリスロポエチンレセプターおよびラットプロラクチンレセプターと類似点を有する（イドゼルダ(Idzerda) ら、上記）。したがって、トロンボプラスチンと同様に、それは免疫グロブリン族の一員ではなく、記載された相同タンパク質と共にヘマトポエチンレセプターの新規な族に入れられる。この族の構成員は、トランスメンブラン領域近くに配置された細胞外ドメインに共通して４つのシステイン残基と保存配列（Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｘ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ）を有する。
ＩＬ−４／ＩＬ−４レセプター系の記載された機能に基づいて、ＩＬ−４によって媒介される免疫反応（例えば、移植拒絶反応、自己免疫症、アレルギー反応）を抑制するためのＩＬ−４レセプターの組換え型を治療に用いることができる。  治療に要する物質の量から、これらの分子を遺伝子工学によって調製することが必要になる。アフィニティークロマトグラフィによって直接精製され且つ薬物動態学的特性が改良されているので、本発明によれば、免疫グロブリン融合タンパク質としてのＩＬ−４レセプターの可溶性型の合成は特に有利である。
ＩＬ−４レセプター融合タンパク質は哺乳類細胞（例えば、ＣＨＯ、ＢＨＫ、ＣＯＳ細胞）によって培地中に分泌され、アフィニティークロマトグラフィによってプロテインＡ−セファロース上で精製され、驚くべきことには未処理の膜結合ＩＬ−４レセプター分子の細胞外ドメインと同じ機能上の特性を有する。
ＩＬ−４レセプター融合タンパク質をコードするハイブリッドプラスミドｐＩＬ−４ＲＦｃの構築
プラスミドｐＣＤ４Ｅガンマー１をＸｈｏＩおよびＢａｍＨＩで切断すると、開放したＸｈｏＩ部位がプロモーター配列の下流に配置している開環ベクターを生じる。開放ＢａｍＨＩ部位はペンタペプチドリンカーのコード領域の開始部位に配置しており、この後にヒトＩｇＧ１のヒンジおよびＣＨ２およびＣＨ３ドメインが続く。ＢａｍＨＩ認識配列ＧＧＡＴＣＣにおけるリーディング・フレームは、ＧＡＴがアスパラギン酸として翻訳されるようになっている。ＤＮＡを熱安定性を有するＤＮＡポリメラーゼで増幅すると、任意の所望な配列が一方のまたは両方の末端に結合することができるような仕方で所定の配列を修飾することができる。ベクターｐＤＣ３０２／Ｔ２２−８（イドゼルダ(Idzerda) ら、上記）においてクローニングされたＩＬ−４レセプターｃＤＮＡの５′−非翻訳領域における配列（Ａ：  ５′ＧＡＴＣＣＡＧＴＡＣＴＣＧＡＧＡＧＡＧＡＡＧＣＣＧＧＧＣＧＴＧＧＴＧＧＣＴＣＡＴＧＣ３′）またはコード領域における配列（Ｂ：  ５′ＣＴＡＴＧＡＣＡＴＧＧＡＴＣＣＴＧＣＴＣＧＡＡＧＧＧＣＴＣＣＣＴＧＴＡＧＧＡＧＴＴＧＴＧ３′）とハイブリダイズすることができる２個のオリゴヌクレオチドを合成した。これらのうち、オリゴヌクレオチドＡはコード鎖の配列と部分的にホモロジーであり、オリゴヌクレオチドＢは非コード鎖と部分的にホモロジーである（図８を参照されたい）。熱安定性を有するＤＮＡポリメラーゼを用いて増幅を行うと、コード鎖を基としてコード配列の開始部位の前の５′末端にＸｈｏＩ部位と、細胞外ドメインの最後のコドンの前の３′末端にＢａｍＨＩ部位を含むＤＮＡフラグメント（８３６ｂｐ）を生じる。ＢａｍＨＩ開裂部位におけるリーディング・フレームは、ｐＣＤ４Ｅガンマー１におけるＢａｍＨＩ部位との連結によってＩＬ−４レセプターｃＤＮＡの開始コドンからＩｇＧ１の重鎖の停止コドンへと連続するリーディング・フレームを有する遺伝子融合を生じる。所望なフラグメントを得て、ＸｈｏＩおよびＢａｍＨＩで処理した後、前記のようにして、ＸｈｏＩ／ＢａｍＨＩで切断したベクターｐＣＤ４Ｅガンマー１に連結した。生成したプラスミドをｐＩＬ４ＲＦｃと命名した（図９）。
哺乳類細胞へのｐＩＬ４ＲＦｃのトランスフェクション
プラスミドｐＩＬ４ＲＦｃによってコードされた融合タンパク質を、これ以後はｐＩＬ４ＲＦｃと呼ぶ。ｐＩＬ４ＲＦｃを、ＣＯＳ細胞中で一時的に発現させた。このために、ＣＯＳ細胞をｐＩＬ４ＲＦｃを用いてＤＥＡＥ−デキストランの助けによってトランスフェクションした（欧州特許公開第０３２５２６２号公報）。間接免疫螢光を検討したところ、トランスフェクションされた細胞の比率はトランスフェクションから２４時間後には約２５％となり、細胞を血清不含培地中に移した。この細胞上澄液を、更に３日後に回収した。
細胞培養上澄液からのＩＬ４ＲＦｃ融合タンパク質の生成
一時的にトランスフェクションされたＣＯＳ細胞からの上澄液５００ｍｌを、プロテインＡ−セファロース１．６ｍｌを含むカラム中４℃でバッチ法で一晩集め、１０容量の洗浄用緩衝液（５０ｍＭトリス緩衝液，ｐＨ８．６、１５０ｍｌＮａＣｌ）で洗浄し、溶出緩衝液（９３：７  １００ｍＭクエン酸：１００ｍＭクエン酸ナトリウム）を用いて０．５ｍｌずつの画分で溶出した。最初の９画分を直ちにそれぞれ２Ｍトリス緩衝液ｐＨ８．６、０．１ｍｌで中和した後纏めて生成するタンパク質をアミコン(Amicon)マイクロコンセントレーター（セントリコン(Centricon) ３０）中で３サイクルの濃縮／希釈によって、ＴＮＥ緩衝液  （５０ｍＭトリス緩衝液ｐＨ７．４、５０ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ）中に移した。この方法で得られるＩＬ４ＲＦｃは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動によれば純粋である（ユー・ケイ・レムリ(U.K. Laemmli)、Nature 227(1970) 680-685）。還元剤の不在では、それはＳＤＳ−ＰＡＧＥ中では二量体のような挙動を示す（約１５０ＫＤａ）。
精製したＩＬ４ＲＦｃの生物活性
ＩＬ４ＲＦｃタンパク質は、膜結合した未処理のＩＬ−４レセプターと同じ親和性で（ＫD ＝０．５ｎＭ） 125Ｉ−放射能標識したＩＬ−４と結合する。これは、１０〜１０００ｎｇ／ｍｌの濃度で、ＩＬ−４−依存性細胞系ＣＴＬＬＨｕＩＬ−４ＲＩクローンＤ（イドゼルダ(Idzerda) ら、上記）の増殖を阻害する。更に、、これは例えばウサギ抗ヒトＩｇＧをコーティングしておいたマイクロタイタープレートにそのＦｃ部を介して結合することができ、且つこの形態で同様に高い親和性でそのリガンドに結合する。
【００１２】
例３：  エリスロポエチン融合タンパク質
成熟エリスロポエチン（ＥＰＯ）は１６６のアミノ酸からなる糖タンパク質であり、赤血球の成長に必須である。これは、赤血球前駆体細胞の成熟と最終的分化を刺激する。ヒトＥＰＯのｃＤＮＡをクローニングし（欧州特許公開第０２６７６７８号公報）、成熟ＥＰＯおよび分泌に本質的な２２個のアミノ酸のシグナルペプチドをコードする。ｃＤＮＡを用いて、遺伝子操作による哺乳類細胞中での組換えの機能性ＥＰＯを調製することができ、各種の病因（例えば、急性腎不全に関連したもの）の貧血の発生の治療のために臨床的に用いることができる。直接精製および薬物動態学的特性が改良されているので、本発明によれば、免疫グロブリン融合タンパク質としてＥＰＯの合成は特に有利である。
エリスロポエチン融合タンパク質をコードするハイブリッドプラスミドｐＥＰＯＦｃの構築
この構築は例２に記載したのと同様の方法で行った（節：「ＩＬ−４レセプター融合タンパク質をコードするハイブリッドプラスミドｐＩＬ−４ＲＦｃの構築」）。ベクターｐＣＥＳ（欧州特許公開第０２６７６７８号公報）でクローニングしたＥＰＯｃＤＮＡの開始コドンに近接した配列（Ａ：  ５′ＧＡＴＣＧＡＴＣＴＣＧＡＧＡＴＧＧＧＧＧＴＧＣＡＣＧＡＡＴＧＴＣＣＴＧＣＣＴＧＧＣＴＧＴＧＧ３′）および停止コドンに近接した配列（Ｂ：  ５′ＣＴＧＧＡＡＴＣＧＧＡＴＣＣＣＣＴＧＴＣＣＴＧＣＡＧＧＣＣＴＣＣＣＣＴＧＴＧＴＡＣＡＧＣ３′）とハイブリダイズすることができる２つのオリゴヌクレオチドを合成した。これらのうち、オリゴヌクレオチドＡはコード鎖の配列と部分的にホモロジーであり、オリゴヌクレオチドＢは非コード鎖と部分的にホモロジーである（図１０を参照されたい）。熱安定性を有するＤＮＡポリメラーゼで増幅すると、コード鎖を基として開始コドンの前の５′末端にＸｈｏＩ部位を含むＤＮＡフラグメント（５９８ｂｐ）であって、３′末端にＥＰＯ（Ａｓｐ）の最後から２番目のＣ−末端アミノ酸残基がＢａｍＨＩ認識配列中に存在するものが生じる。ＢａｍＨＩ開裂部位におけるリーディング・フレームは、ｐＣＤ４Ｅガンマー１におけるＢａｍＨＩ部位との連結によってＥＰＯｃＤＮＡの開始コドンからＩｇＧ１の重鎖の停止コドンへと連続するリーディング・フレームを有する遺伝子融合を生じる。所望なフラグメントを得てＸｈｏＩおよびＢａｍＨＩで処理した後、前記のようにして、ＸｈｏＩ／ＢａｍＨＩで切断したベクターｐＣＤ４Ｅガンマー１に連結した。生成したプラスミドをｐＥＰＯＦｃと命名した（図１１）。
【図面の簡単な説明】
【図１】例１における２種類のオリゴヌクレオチドプローブ分子を表わす。
【図２】クローン２ｂ−Ａｐｒ５の全配列およびそれから誘導されるトロンボプラスチンのアミノ酸配列における始めの配列を表わす。
【図３】図２に続く配列を表わす。
【図４】図３に続く配列を表わす。
【図５】図４に続く配列でクローン２ｂ−Ａｐｒ５の全配列の終りの配列を表わす。
【図６】例１のオリゴヌクレオチドＡおよびオリゴヌクレオチドＢの配列を表わす。
【図７】プラスミドｐＴＦ１Ｆｃを表わす。
【図８】例２のオリゴヌクレオチドＡおよびオリゴヌクレオチドＢの配列を表わす。
【図９】プラスミドｐＩＬ４ＲＦｃを表わす。
【図１０】例３のオリゴヌクレオチドＡおよびオリゴヌクレオチドＢの配列を表わす。
【図１１】プラスミドｐＥＰＯＦｃを表わす。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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