(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）ＲＰＭＩ8866細胞培養上清またはＡＴＬ−２細胞培養上清を得る工程、および（２）ゲル濾過クロマトグラフィーによって分子量１００から６００の画分を分画する工程によって生産され、（３）Ｂ１０４細胞のアポトシス、ＣＴＬＬ−２細胞のアポトシスおよびＪｕｒｋａｔ細胞のアポトシスに対して抑制活性を有し、かつ（４）加熱処理によりアポトシス抑制活性が失活しないという性質を有するアポトシス抑制物質。
【請求項２】
（１）ＲＰＭＩ8866細胞培養上清またはＡＴＬ−２細胞培養上清を得る工程、および（２）ゲル濾過クロマトグラフィーによって分子量１００から６００の画分を分画する工程によって生産され、（３）Ｂ１０４細胞を２−メルカプトエタノール不存在下に培養したときに起こるアポトシス、ＣＴＬＬ−２細胞を２−メルカプトエタノール不存在下、かつインターロイキン−２存在下に培養したときに起こるアポトシスおよびＪｕｒｋａｔ細胞を過酸化水素存在下に培養したときに起こるアポトシスに対して抑制活性を有し、かつ（４）５６℃、３０分間の加熱処理によりアポトシス抑制活性が失活しないという性質を有する請求項１記載の物質。
【請求項３】
ＲＰＭＩ8866細胞またはＡＴＬ−２細胞の培養上清を分子量3000Ｄａカットオフ膜により限外濾過し、素通り画分を集め、ゲル濾過カラムクロマトグラフィー［カラム：SUPERDEX(登録商標) Peptide ＨＲ１０／３０カラム（Pharmacia社製、サイズ 1.0×３０ｃｍ／ｃｍ）、カラム緩衝液：５０ｍＭリン酸バッファー−0.15Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ 7.0）、流速：２５０μｌ／ｍｉｎ］で５００μずつ分画したときに、分画番号３〜５に溶出されることを特徴とするアポトシス抑制物質。
【請求項４】
ＲＰＭＩ8866細胞またはＡＴＬ−２細胞の培養上清を分子量3000Ｄａカットオフ膜により限外濾過し、素通り画分を集め、逆相カラムクロマトグラフィ［カラム：ＴＳＫｇｅｌ（登録商標）（品番：ODS80Ts、4.6 ＭＭＤ×15.0ＣＭＬ、東ソー社製）、使用緩衝液：Ａ液として0.05％トリフルオロ酢酸、Ｂ液として0.05％トリフルオロ酢酸−62.5％アセトニトリル−37.5％Ｈ2Ｏで、試料添加から３ｍｌまでＡ液１００％，以後９ｍｌまでにＢ液１００％とするグラディエント、流速：２００μｌ／ｍｉｎ］で２００μｌずつ分画したときに、分画番号１０に溶出されることを特徴とするアポトシス抑制物質。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、アポトシス抑制物質、および該物質を有効成分として含有する薬剤に関する。
【０００２】
【発明の背景】
アポトシスまたはプログラム細胞死（計画された細胞死）は、KerrおよびWyllieらによって提唱された細胞死の過程または様式のひとつである（Brit. J. Cancer, 26, 239 (1972) 参照）。アポトシスは生理的な個体発生あるいは疾患や薬剤効果の発現の際に見られ、個々の細胞に本来備わったプログラムの活性化に基づいて起こると考えられ、必要な細胞が障害を受けて死ぬ過程であるネクロシス（壊死）とは区別される。アポトシスがネクロシスと異なる点としては、アポトシスの場合にはＲＮＡ合成と蛋白合成を伴うのに対して、ネクロシスの場合にはこれらを伴わない点である。
【０００３】
アポトシスを誘導する刺激には様々なものがあり、そのメカニズムにも多様性があるが、形態学的な特徴は共通である。形態学的変化として最初に観察されるのは、クロマチンの凝集塊の形成であり、ほとんどの場合、これはＤＮＡの断片化反応を伴う（Nature, 284, 555 (1980) 参照）。クロマチンの凝集が見られると、細胞質の凝縮などが起こり、更に細胞自体がアポトシス小体と呼ばれる細胞断片を形成し、この形成されたアポトシス小体が迅速に周囲の細胞やマクロファージなどによって貪食分解されることによってアポトシスが起こるとされている。また、アポトシスに関する機序としては（１）生理活性物質［神経成長因子（ＮＧＦ）やコロニー刺激因子（ＣＳＦ）など］の欠如や（２）アポトシス誘導因子［腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）やリンフォトキシンなどの因子やｃ−ｍｙｃ、ｐ５３遺伝子産物など］によってアポトシスは誘導され（Cell, 69, 119(1192) およびNature, 359, 849 (1993)参照）、アポトシス抑制因子［ｂｃｌ−２など］によってアポトシスは阻害される（Nature, 359, 552 (1992)および同誌、359, 554 (1994)参照）など多くのことが知られている。
【０００４】
このようなアポトシスという現象が最近注目されている理由としては、
（１）アポトシスが個体形成において重要な役割を演じていることが示されたこと、
（２）生体内での内的、外的要因による細胞死が多くの場合アポトシスによること、
（３）エイズそのほかの疾病において、その病因となる体細胞（リンパ系細胞）の現象にアポトシスが深く関わっていること、
（４）各種の抗癌剤がアポトシスでのガン細胞破壊を行なうこと、さらに
（５）最近の遺伝子研究の進展によりアポトシスそのものがどのような遺伝子で制御されていて、アポトシスに至る情報はどのようにして伝達されるかについての知見が蓄積され、細胞生物学上の基本的興味が持たれていることなどが挙げられる。
【０００５】
さらに詳しくアポトシスと病気の関係について述べると、例えば、ＨＩＶウイルスに感染すると、リンパ球の死滅により免疫系が破壊されて、感染に対する抵抗力がなくなるが、このリンパ球の死滅はほとんどがアポトシスによるとされている（Science, 257, 217 (1992)参照）。自己免疫疾患などにおいても、そのリンパ系細胞の減少はアポトシスによることが知られている。また、神経系の自己免疫疾患である脳脊髄炎の発症は脊髄細胞がアポトシスで死滅することがひとつの原因であることが示されている。
【０００６】
さらに、アルツハイマー病など、ニューロン死を伴う疾患および学習・記憶とアポトシスの関連も重要とされている。癌との関連では、癌抑制遺伝子ｐ５３がＤＮＡ損傷を受けた細胞のアポトシスに関わっていることも明らかになり、癌抑制遺伝子のアポトシスへの関与も注目されている。さらに、発癌との関係では前癌組織としての過形成結節を形成する細胞の多くがアポトシスで死滅し、残った細胞がやがて癌細胞へと変化することも知られている。
【０００７】
【発明の構成】
本発明者らは、新たなアポトシス抑制物質を見出すべく鋭意検討を重ねた結果、偶然にもある種の癌化された細胞の培養上清中にアポトシスを抑制する物質を見出し、本発明を完成した。本発明のアポトシス抑制物質の特徴をまとめると以下のようになる。
（１）ＲＰＭＩ8866細胞培養上清またはＡＴＬ−２細胞培養上清中に存在する。
（２）分子量が１００から６００である。
（３）Ｂ１０４細胞のアポトシス、ＣＴＬＬ−２細胞のアポトシスおよびＪｕｒｋａｔ細胞のアポトシスに対して抑制活性を有する。
（４）加熱処理によりアポトシス抑制活性が失活しない。
【０００８】
その特徴をさらに詳しく述べると以下のようになる。
（１）ＲＰＭＩ8866細胞培養上清またはＡＴＬ−２細胞培養上清中に存在する。
（２）分子量が１００から６００である。
（３）Ｂ１０４細胞を２−メルカプトエタノール不存在下に培養したときに起こるアポトシス、ＣＴＬＬ−２細胞を２−メルカプトエタノール不存在下、かつインターロイキン−２（ＩＬ−２）存在下に培養したときに起こるアポトシスおよびＪｕｒｋａｔ細胞を過酸化水素存在下に培養したときに起こるアポトシスに対して抑制活性を有する。
（４）５６℃、３０分間の加熱処理によりアポトシス抑制活性が失活しない。
（５）塩、２−メルカプトエタノール、システアミン、システィン、グルタチオンおよびサイトカイン様物質のいずれでもない物質である。
【０００９】
本発明のアポトシス抑制物質は、ＲＰＭＩ8866細胞またはＡＴＬ−２細胞の培養上清を分子量3000Ｄａカットオフ膜により限外濾過し、素通り画分を集め、ゲル濾過カラムクロマトグラフィー［カラム：SUPERDEX(登録商標) Peptide  ＨＲ１０／３０カラム（Pharmacia社製、サイズ 1.0×３０ｃｍ／ｃｍ）、カラム緩衝液：５０ｍＭリン酸バッファー−0.15Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ7.0）、流速：２５０μｌ／ｍｉｎ］で５００μｌずつ分画したときに、分画番号３〜５に溶出される。×
【００１０】
さらに、本発明のアポトシス抑制物質は、ＲＰＭＩ8866細胞またはＡＴＬ−２細胞の培養上清を分子量3000Ｄａカットオフ膜により限外濾過し、素通り画分を集め、逆相カラムクロマトグラフィ［カラム：ＴＳＫｇｅｌ（登録商標）（品番：ODS80Ts、4.6ＭＭＤ×15.0ＣＭＬ、東ソー社製）、使用緩衝液：Ａ液として0.05％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、Ｂ液として0.05％ＴＦＡ−62.5％アセトニトリル−37.5％Ｈ2Ｏで、試料添加から３ｍｌまでＡ液１００％，以後９ｍｌまでにＢ液１００％とするグラディエント、流速：２００μｌ／ｍｉｎ］で２００μｌずつ分画したときに、分画番号１０に溶出される。
【００１１】
上記した、本発明のアポトシス抑制物質の起源、精製方法、生物活性および諸性質は後記の実施例で詳細に説明される。
本発明物質はアポトシスが関与する疾患、例えば、感染症、免疫機能および脳機能の低下または亢進あるいは腫瘍等の予防および／または治療剤として用いることが期待される。
【００１２】
アポトシスが関与する疾患としては、ＡＩＤＳ、ＡＲＣ（ＡＩＤＳ関連疾患）、成人Ｔ細胞白血病、毛様細胞白血病、脊髄症、呼吸器障害、関節症、ブドウ膜炎等のＨＩＶまたはＨＴＬＶ−１関連疾患やＣ型肝炎等のウイルス関連疾患、癌、全身性エリテマトーデスや慢性関節リウマチ等の膠原病、潰瘍性大腸炎、シェーグレン症候群、原発性胆汁性肝硬変、突発性血小板減少性紫斑病、自己免疫性溶血性貧血、重症筋無力症、インスリン依存型（Ｉ型）糖尿病等の自己免疫疾患、骨髄異形成症候群、周期性血小板減少症、再生不良性貧血、突発性血小板減少症、汎発性血管内凝固症等の血小板減少を伴う各種疾患、Ｃ型、Ａ型、Ｂ型、Ｆ型等のウイルス性や薬剤性の肝炎および肝硬変等の肝疾患、アルツハイマー病、アルツハイマー型老年痴呆症等の痴呆症、脳血管障害、神経変性疾患、成人呼吸急迫症候群、感染症、前立腺肥大症、子宮筋腫、気管支喘息、動脈硬化症、各種先天性奇形症、腎炎、老人性白内障、慢性疲労症候群、筋ジストロフィーおよび抹消神経障害等が挙げられる。
【００１３】
上記の目的のために、本発明のアポトシス抑制物質は、通常全身的または局所的に、一般的には経口または非経口の形で投与される。好ましくは、経口投与、静脈内投与または脳室内投与である。
投与量は、年齢、体重、症状、治療効果、投与方法、処理時間等により異なるが、通常、成人一人あたり、１回につき、１００μｇから１００ｍｇの範囲で、１日１回から数回経口投与されるか、または成人一人あたり、１回につき、１０μｇから１００ｍｇの範囲で、１日１回から数回非経口投与される。もちろん前記したように、投与量は、種々の条件により変動するので、上記投与量より少ない量で十分な場合もあるし、また範囲を超えて必要な場合もある。
本発明のアポトシス抑制物質を投与する際には、経口投与のための個体組成物、液体組成物およびその他の組成物、非経口投与のための注射剤、外用剤、坐剤およびその他の組成物として用いられる。いずれの組成物も公知の方法により処方される。
【００１４】
【実施例】
以下、実施例により本発明を詳述するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１：細胞培養
使用した各種細胞株の培養は、以下の方法に従って行なった。
ＲＰＭＩ8866細胞（ＥＢウイルス感染ヒトＢリンパ芽球様細胞株、J. Immunol., 123, 2004-2010 (1979)およびProc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 84, 819-823(1987)）およびＡＴＬ−２細胞（ＨＴＬＶ−１感染ヒトＴ細胞株、J. Exp.Med., 162, 2169-2174 (1985)）は、５×１０4cells／ｍｌ細胞密度で播種し、１０％牛胎児血清（以下、「ＦＣＳ」または単に「血清」という。）を含むＲＰＭＩ1640培地（GIBCO社製）で２４〜４８時間培養した。この時、先の細胞密度になるように１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ1640培地にて細胞を継代し、培養を繰り返した。
Ｊｕｒｋａｔ細胞（ヒトＴ細胞白血病由来細胞、Nature, 311, 631-635 (1984)およびOncogene, 8, 3133-3139 (1993)）は１０×１０4cells／ｍｌ細胞密度で播種し、１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ1640培地で２４〜４８時間培養した。継代は播種密度を１０×１０4cells／ｍｌとし、それ以外はＲＰＭＩ8866細胞の場合と同様にして行なった。
【００１５】
Ｂ１０４細胞（ヒトＢ細胞株、J. Immunol., 146, 819-825 (1991)）は１０×１０4cells／ｍｌ細胞密度で播種し、１０％ＦＣＳ、５０μＭ ２−メルカプトエタノール（以下、２−ＭＥと略記する。）を含むＲＰＭＩ1640培地で２４〜４８時間培養した。継代は培地組成以外は、Ｊｕｒｋａｔ細胞の場合と同様にして行なった。
ＣＴＬＬ−２細胞（マウスＴ細胞株、ＡＴＣＣ番号：ＴＩＢ２１４）は５×１０4cells／ｍｌ細胞密度で播種し、１０％ＦＣＳ、５０μＭ ２−ＭＥおよび１ Kendall unit／ｍｌ ＩＬ−２を含むＲＰＭＩ1640培地で２４〜４８時間培養した。継代は培地組成以外は、Ｊｕｒｋａｔ細胞の場合と同様にして行なった。
【００１６】
実施例２：アポトシス阻害物質を含有する細胞培養上清の調製
ＲＰＭＩ8866細胞、ＡＴＬ−２細胞およびＪｕｒｋａｔ細胞を実施例１記載の方法に従って培養し、約５０×１０4cells／ｍｌ細胞密度にまで増殖させた。この時点で血清を含まないＲＰＭＩ1640培地で細胞を１回洗浄後、２０〜６０×１０4cells／ｍｌ細胞密度になるよう１％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ1640培地２０ｍｌで細胞を懸濁し、３７℃、５％ＣＯ2条件下で４８時間培養した（このときの細胞密度は８０〜１００×１０4cells／ｍｌ）。培養後、1500ｒｐｍ、５分間の遠心操作により細胞を集め、その培養上清をディスミック（ＤＩＳＭＩＣ）0.2μｍフィルター（アドバンテック東洋社製）に通して上清中から細胞の混入を除いた。
【００１７】
次に、セントリコン−３（分子量3000Ｄａカットオフ用、以下、ＹＭ３膜という、Amicon社製）上部に上清を添加し、3000ｒｐｍ、４℃で連続遠心した。適宜、上部に上清を追加する一方、下部容器に集められた素通り画分を４℃で保存した。素通り画分に後述する活性（実施例３に記載する。）が認められたため、これを活性サンプルとして１０〜２０ｍｌごとに取りだし、２８０ｎｍ紫外吸収で大部分の蛋白の消失を確認後、分注して−８０℃で保存した。
【００１８】
実施例３：活性の測定（バイオアッセイ）
（ａ）Ｂ１０４細胞のＤＮＡ合成に対する作用
Ｂ１０４細胞はその増殖に２−ＭＥの存在が必須であり、２−ＭＥの除去によりＢ１０４細胞のＤＮＡ合成は抑制された。図１に、２−ＭＥ共存下および非共存下におけるＢ１０４細胞の増殖曲線を示す。すなわち、Ｂ１０４細胞を培養し、継時的に細胞数を計測したところ、２−ＭＥ非共存下、Ｂ１０４細胞は増殖しないばかりでなく死滅した。
【００１９】
次に、この死滅が典型的なアポトーシスかどうかを検討するため、プロピジウムヨージド（Propidium Iodide、以下、「ＰＩ」という。）染色した細胞をフローサイトメーター（商品名：FACScan、ベクトンディッキンソン社製）で解析した。まず、経時的に細胞を採取し、軽くピペッティングして細胞塊をほぐした。次いで、1500ｒｐｍ、５分間の遠心により細胞沈査を得、５０μｇ／ｍｌ ＰＩ−0.1％ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００−0.1％クエン酸ナトリウム（Sodium citrate）に懸濁し、遮光下、４℃で保存した。各サンプルを順にフローサイトメーターにてＤＮＡ解析し、アポトーシスで典型的に増加してくる通常より少ないＤＮＡ含量の細胞（ハイポ−ジプロイド（hypo-diploid）細胞という。）の割合を算出した（以下、この方法を「表１の方法」という。）。結果を表１に示す。
【００２０】
【表１】
0003832673.tif 000002
【００２１】
表１から明らかなように、２−ＭＥが共存し、細胞が増殖する時はハイポ−ジプロイド細胞はほぼ２０％であるが、２−ＭＥ非共存下では培養後３６時間で最大42.2％に達し、典型的なアポトシスを起こすことが判明した。
この時に、活性サンプルがＢ１０４細胞のＤＮＡ合成を回復させるか否かを検定した。具体的には、９６穴平底プレート（９６ well flat bottom plate）(商品名：NUNCLON、NUNC社製)に、血清を含まないＲＰＭＩ1640培地で希釈した活性サンプルを５０μｌ／well添加した。次に対数増殖期にあるＢ１０４細胞（細胞密度１１０6cells／ｍｌ）を1500ｒｐｍで５分間遠心し、細胞沈査に１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ1640培地を１０ｍｌ加えた。この遠心操作を２回繰り返し、最終細胞密度２０×１０4cells／ｍｌに懸濁後、活性サンプル添加済みのプレートに５０μｌ／well添加した（最終、１×１０4cells／１００μｌ／well，５％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ1640培地）。３７℃、５％ＣＯ2で２０時間培養後、２０μＣｉ／ｍｌの［3Ｈ］−チミジンを１０μｌ／well添加した。４時間培養後、細胞をハーベストし、液体シンチレーションカウンターで取り込まれた［3Ｈ］−チミジン量を定量した（以下、この方法を「表２の方法」という。）。結果を表２に示す。
【００２２】
【表２】
0003832673.tif 000003
【００２３】
表２から判るように、用量依存的にＲＰＭＩ8866培養上清（活性サンプル）は、２−ＭＥ非共存下のＢ１０４細胞のＤＮＡ合成を上昇させた。この活性は、ＹＭ３膜素通り画分（すなわち、分子量3000Ｄａ以下の画分）にも認められた。ＲＰＭＩ8866培養上清の活性は２−ＭＥの作用を代替するばかりでなく、２−ＭＥの作用に相加的であることが判明した。
【００２４】
他の細胞培養上清（活性サンプル）中にも同じような活性（すなわち、２−ＭＥ除去したＢ１０４細胞のＤＮＡ合成活性を回復させる活性）が認められないか、ＡＴＬ−２細胞培養上清およびＪｕｒｋａｔ細胞培養上清について検討した。コントロール培地（１％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ1640培地）でのＤＮＡ合成活性を１００として各培養上清を１０（ｖ／ｖ）％容量添加した時の相対値を表３に示す。
【００２５】
【表３】
0003832673.tif 000004
【００２６】
ＲＰＭＩ8866細胞のみならず、ＡＴＬ−２細胞の培養上清にも２−ＭＥを除去したＢ１０４細胞のＤＮＡ合成を回復させる活性が認められた。しかし、Ｊｕｒｋａｔ細胞培養上清にはその活性はほとんどないものと考えられる。
【００２７】
（ｂ）Ｂ１０４細胞のアポトシスに対する作用
前記（ａ）に示したＢ１０４細胞がアポトシスを生ずる系において、ＲＰＭＩ8866細胞培養上清がこれを抑制するか否かを検討した。方法は、ＲＰＭＩ8866培養上清を２−ＭＥ非共存下でのＢ１０４細胞培養系に加え、経時的に表１の方法に準じて解析した。結果を通常増殖時のハイポ−ジプロイド細胞の割合を１００とした相対値として示した。結果を表４に示す。
【００２８】
【表４】
0003832673.tif 000005
【００２９】
２−ＭＥ除去時に培養４８時間で３０２％まで増加するハイポ−ジプロイドＤＮＡを持つ細胞の増加を、３０（ｖ／ｖ）％容量のＲＰＭＩ8866培養上清の添加は通常増殖レベルにまで抑制した。
【００３０】
（ｃ）ＣＴＬＬ−２細胞のＤＮＡ合成に対する作用
ＤＮＡ合成活性を回復させる活性サンプル中の活性は、Ｂ１０４細胞に特異的なのか、あるいは他の細胞に対しても同じ活性を示すのか調べるため、２−ＭＥおよびＩＬ−２に依存的な増殖を示すＣＴＬＬ−２細胞を用いて検討した。
前記（ａ）と同様、９６穴プレートにＲＰＭＩ8866細胞培養上清を６０％含むように希釈し、５０μｌ／well添加した。対数増殖期にあるＣＴＬＬ−２細胞最（細胞密度５０×１０4cells／ｍｌ）を（ａ）と同様に、遠心と洗浄を２回繰り返し、終細胞密度２０×１０4cells／ｍｌに懸濁後、最終濃度４ Kendall unit／ｍｌとなるようにＩＬ−２を添加して、あるいは最終濃度１００μＭとなるように２−ＭＥを添加して、５０μｌ／well添加した（最終１×１０4cells／１００μｌ／well、３０％活性サンプルの存在もしくは非存在下、２ Kendall unit／ｍｌ ＩＬ−２もしくは５０μＭ ２−ＭＥを含む５％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ1640培地）。以下、（ａ）と同様にＤＮＡ合成量を測定した（以下、この方法を「表５の方法」という）。結果を表５に示す。
【００３１】
【表５】
0003832673.tif 000006
【００３２】
２−ＭＥとＩＬ−２の両方に依存的な増殖を示すＣＴＬＬ−２細胞は、両方を除去した場合のみならず、一方のみ除去した条件においてもＤＮＡ合成が抑えられた。しかし、３０（ｖ／ｖ）％濃度のＲＰＭＩ8866細胞培養上清の存在により、ＩＬ−２除去時のＤＮＡ合成は回復できないが、ＩＬ−２存在時（２−ＭＥ除去時）のＤＮＡ合成を部分的に回復できた。また両者存在時におけるＲＰＭＩ8866細胞培養上清の存在はＤＮＡ合成促進活性を妨害しなかった。
【００３３】
（ｄ）Ｊｕｒｋａｔ細胞のアポトシスに対する作用
Ｊｕｒｋａｔ細胞は、過酸化水素（Ｈ2Ｏ2）やダイアマイド処理により、およそ培養１２時間後にハイポ−ジプロイドＤＮＡ増加およびＤＮＡラダー形成（ladder formation）が観察され、典型的なアポトシス像を呈して死滅する（J.Immunol., 154, 3194-3203 (1995)参照のこと）。そこで、過酸化水素によるＪｕｒｋａｔ細胞のアポトシスを活性サンプルが抑制するか否かを検討した。
【００３４】
３０（ｖ／ｖ）％濃度のＲＰＭＩ8866細胞培養上清を含むか、あるいは含まないＲＰＭＩ1640−１０％ＦＣＳ培地に、対数増殖期にある（細胞密度１×１０6cells／ｍｌ）Ｊｕｒｋａｔ細胞を最終細胞密度２０×１０4cells／ｍｌになるよう懸濁し、９６穴平底プレートに５０μｌ／well添加した。ここに血清を含まないＲＰＭＩ1640培地で希釈した過酸化水素（三徳化学工業（株）社製）を終濃度２０μＭとなるよう５０μｌ／well添加した（最終１×１０4cells／１００μｌ／well、２０μＭ過酸化水素を含む５％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ1640培地）。３７℃、５％ＣＯ2で２０時間培養し、２０μＣｉ／ｍｌの［3Ｈ］−チミジンを１０μｌ／well添加した。４時間培養後、細胞をハーベストし、取り込まれた［3Ｈ］−チミジン量を定量した（以下、この方法を「表６の方法」という。）。結果を表６に示す。
【００３５】
【表６】
0003832673.tif 000007
【００３６】
表６から判るように、ＲＰＭＩ8866細胞培養上清は過酸化水素によるＪｕｒｋａｔ細胞の増殖抑制を回復させた。この作用はＪｕｒｋａｔ細胞数をカウントすることによっても確認できた。
更に、２０μＭ過酸化水素存在下で２４時間培養したＪｕｒｋａｔ細胞を、表１の方法と同様にＰＩ染色し、ハイポ−ジプロイドＤＮＡを持つ細胞の割合を算出した。結果を表７に示す。
【００３７】
【表７】
0003832673.tif 000008
【００３８】
ＲＰＭＩ8866細胞培養上清は、２０μＭ過酸化水素存在下で６８％にまで上昇するアポトシス細胞の出現を顕著に抑制することが判明した。
次に、予め１５μＭ過酸化水素を、血清を含まないＲＰＭＩ1640培地で種々希釈したＲＰＭＩ8866細胞培養上清、もしくは２−ＭＥと３７℃、３０分間プレインキュベーションし、９６穴プレートに５０μｌ／well添加しておいた。ここに、１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ1640培地に懸濁したＪｕｒｋａｔ細胞を加え（最終１×１０4cells／１００μｌ／well、前処理した過酸化水素を含む５％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ1640培地）、先と同様に［3Ｈ］−チミジンの取り込み量を測定した。５０μＭ ２−ＭＥでプレインキュベーションした場合の取り込み量を１００として各前処理サンプルを添加した場合の取り込み量相対値を求めた。結果を表８に示す。
【００３９】
【表８】
0003832673.tif 000009
【００４０】
プロトンドナーである２−ＭＥには過酸化水素を弱毒化する作用があるが、これには過酸化水素との前処理を必要とする。ＲＰＭＩ8866細胞培養上清にも１５μＭ過酸化水素との３７℃、３０分間の前処理を行うことによって、過酸化水素処理によるＪｕｒｋａｔ細胞の［3Ｈ]-チミジン取り込み抑制作用が抑制された。従って、ＲＰＭＩ8866細胞培養上清中には過酸化水素の細胞毒性を消去するラジカルスカベンジャー様の活性の存在が示唆された。同様の知見は、ＡＴＬ−２細胞培養上清でも認められた。
【００４１】
実施例４：活性サンプルの熱安定性
ＲＰＭＩ8866細胞培養上清サンプルおよびそのＹＭ３膜を用いた限外濾過の素通り画分を５６℃、３０分間加熱処理し、表２の方法であるＢ１０４細胞を用いたバイオアッセイと表６の方法であるＪｕｒｋａｔ細胞を用いたバイオアッセイに供した。熱処理していない上清サンプル同様、５６℃、３０分間加熱処理した上清サンプルおよびＹＭ３膜素通り画分は、２−ＭＥ除去によるＢ１０４細胞の増殖抑制効果、並びに過酸化水素によるＪｕｒｋａｔ細胞の増殖抑制効果を共に抑制し、５６℃、３０分間の熱処理に対し安定であることが判明した。
【００４２】
実施例５：活性サンプル中のアポトシス抑制物質の精製
（ａ）ゲル濾過カラムクロマトグラフィー
これまでの実験から、２−ＭＥ非共存下でＢ１０４細胞はアポトシスを起こし、ＣＴＬＬ−２細胞はＩＬ−２や２−ＭＥが存在しないと死滅するが、２−ＭＥが存在しない時のこれらの細胞死を抑制する活性がＲＰＭＩ8866細胞やＡＴＬ−２細胞の培養上清中に存在することが判った。しかも、この活性は過酸化水素によるＪｕｒｋａｔ細胞死をも抑制した。そこで次に、ＲＰＭＩ8866細胞培養上清からこの細胞死抑制物質（本発明物質）の精製を行なった。
【００４３】
ＲＰＭＩ8866細胞1.6〜2.0×１０7cellsの培養上清を実施例２と同様にして２０ｍｌ調製した。直ちに、混入してくる細胞をフィルターを通して除いた後、ＹＭ３膜（Amicon社製）で限外濾過を行い、素通り画分を集めて−８０℃保存すると共に、細胞死抑制活性を確認した。エバポレーターにて１０倍濃縮した試料１００μｌをSUPERDEX(登録商標) Peptide HR 10/30カラム（Pharmacia社製、サイズ1.0×30ｃｍ／ｃｍ）を用いたSMARTシステム（Pharmacia社製、検出器はμ-peakモニターを使用）にチャージした。このゲル濾過カラムクロマトグラフィーのカラム緩衝液には、５０ｍＭリン酸バッファー−0.15Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ7.0）を用い、２５０μｌ／ｍｉｎの流速にて５００μｌずつμ−セパレーション・ユニット（μ-separation unit）（Pharmacia社製）で分画した。
【００４４】
次に、各分画をSpin-X（Costar社製）にて滅菌処理し、バイオアッセイに用いた。各分画の活性をＣＴＬＬ−２細胞の２−ＭＥ非存在下でのＤＮＡ合成活性（表５の方法）で調べたところ、塩の溶出を示すコンダクティビティーのピーク（分画番号６〜９）とは異なる分画番号３〜５に活性ピークが出現した（図２−１および２−２参照のこと）。同じ分画をＢ１０４細胞の２−ＭＥ非存在下でのＤＮＡ合成活性（表２の方法）で調べても、同一の分画番号３〜５に活性ピークを認めた。更に２度の繰り返し実験を行い、再現性良く分画３〜５に活性を回収できた。しかし、両測定でコントロール培地を同カラムで分画した各分画には全く活性が認められなかった。以上のことから、抗アポトシス活性は塩濃度の変化による非特異的現象でないことが明らかとなった。
更に、ＡＴＬ−２細胞培養上清中の抗アポトシス活性も、ＲＰＭＩ8866細胞培養上清中の抗アポトシス活性と同様に、同条件ではやはり分画番号３〜５に溶出された。
【００４５】
（ｂ）分子量の推定
これまでの知見で、ＹＭ３膜での限外濾過で素通り分画に活性を認めたことから、活性を担う分子（本発明のアポトシス抑制物質）の分子量は３ｋＤａ以下であろうと予想された。そこで、ゲル濾過カラムクロマトグラフィーと同条件で種々の標準タンパクを分画し、そのリテンションボリュームからアポトシス抑制物質の分子量推定を行った。本カラムクロマトグラフィー（使用カラム：SUPERDEX(登録商標) Peptide HR 10/30）は、カラム全用量（アセトンの溶出容積、以下「Ｖｔ」とする。）が18.93ｍｌ、ボイド溶（ブルーデキストラン溶出容積、以下、「Ｖｏ」とする。）が8.08ｍｌであった。同一条件で標準ペプチドとしてグリシン（分子量75.07）、システアミン（同113.61）、Ｌ−システイン（同１２１）、グルタチオン（還元型、同307.3）、(Ｇｌｙ)6（同360.3)、グルタチオン（酸化型、同６１２）、サブスタンスＰ（同1347）、ガストリンＩ（Gastrin Ｉ）（同2098）およびアプロチニン（同6500）を用いて、ゲル分配定数（Ｋａｖ）＝（Ｖｅ−Ｖｏ）／（Ｖｔ−Ｖｏ）を算出した（「Ｖｅ」は各標準品の溶出容積とする）。Ｋａｖと分子量の対数との間には直線関係が成立する。アポトシス抑制物質の溶出容積16.5〜18.5ｍｌ（分画番号３〜５）は、Ｋａｖ値0.77〜0.96を示し、この直線を用いて相当する分子量を算出したところ、推定分子量は１００〜６００Ｄａと求められた。
【００４６】
２−ＭＥ様のプロトンドナーとして、システアミン、Ｌ−システインが考えられるが、明らかにリテンションボリュームが異なっていた。推定分子量レンジ内の既知分子として、Ｌ−システインの会合分子であるL-シスチンには抗アポトシス活性は認められなかった。また、還元型グルタチオンには５０μＭ以上の濃度で用量依存的な抗アポトシス活性を認め、分子量的にも適合するが、以下の理由により本発明のアポトシス抑制物質は還元型グルタチオンではないと考えられる。
【００４７】
（ｉ）ＲＰＭＩ8866細胞培養上清中の総グルタチオン量（還元型＋酸化型）をMethod s in Enzymology, 113, 548-553記載の方法に従い、酵素法にて測定したが測定限界（５μＭ）以下であった。
（ii）還元型グルタチオンを中性（ｐＨ７）に調製し、速やかにバイオアッセイ系に加えた場合、抗アポトシス活性は完全に失われた。還元型グルタチオンは中性条件下、非常に速やかに酸化されるものと考えられた。
（iii）後述する逆相クロマトグラフィーにおいて、抗アポトシス活性分画と還元型グルタチオン（カタログ番号：G-4251、シグマ（SIGMA）社製）の溶出分画が異なっていた。
従って、本発明のアポトシス抑制物質は、２−ＭＥ、システアミン、Ｌ−システインおよび還元型グルタチオンとは異なる物質であると考えられる。
【００４８】
（ｃ）逆相カラムクロマトグラフィー
実施例５（ａ）と同じ濃縮サンプル１００μｌをＴＳＫｇｅｌ（登録商標）（品番：ODS80Ts、4.6ＭＭＤ×15.0ＣＭＬ、東ソー社製）を用いたSMARTシステム（Pharmacia製、検出器はμ-peakモニター使用）にチャージした。この逆相カラムクロマトグラフィーの使用緩衝液はＡ液として0.05％ＴＦＡ、Ｂ液として0.05％ＴＦＡ−62.5％アセトニトリル−37.5％Ｈ2Ｏで、試料添加から３ｍｌまでＡ液１００％，以後９ｍｌまでにＢ液１００％とするグラディエントを用い、２００μｌ／ｍｉｎの流速にて試料添加時から２００μｌずつμ-separation unit（Pharmacia社製）にて分画した（図３参照のこと）。次に各分画を完全に乾固させた後、水に溶解した。Spin-X（Costar社製）で滅菌処理し、バイオアッセイに用いた。試料中の活性をＢ１０４細胞、またはＣＴＬＬ−２細胞の２−ＭＥ非存在下でのＤＮＡ合成活性（表２または表５の方法）で調べたところ、両アッセイにおいて共に、分画番号１０に活性ピークが認められた（図４参照のこと）。また、実施例５（ａ）における抗アポトシス活性画分（分画番号３〜５）を上記と同じ条件で逆相カラムクロマトグラフィーで分画したとき、やはり活性画分は分画番号１０に溶出された。抗アポトシス活性はこのクロマトグラフィー条件で素通り画分に存在するものの塩の溶出を示すコンダクティビティーのピーク（分画番号９）とは異なることから、塩による非特異的な現象を見ているわけではない。一方、還元型グルタチオンはこの条件下では分画番号２７−２８に溶出されたことから、抗アポトシス活性がグルタチオンであることは否定された。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は２−ＭＥ共存下および非共存下におけるＢ１０４細胞の増殖曲線を示す。
【図２】  図２−１は、実施例５（ａ）で行なったゲル濾過カラムクロマトグラフィーのＯＤ値（２８０ｎｍ）（図中、（ａ）で示される。）とコンダクティビティー曲線（図中、（ｂ）で示される。）およびＣＴＬＬ−２細胞を用いたＤＮＡ合成活性を示すグラフ（図中、（ｃ）で示される。また、グラフ中の数字は分画番号を示す。）である。
【図３】  図２−２は、実施例５（ａ）で行なったゲル濾過カラムクロマトグラフィーの各分画のＣＴＬＬ−２細胞を用いたＤＮＡ合成活性を示すグラフである。
【図４】  図３は、実施例５（ｃ）で行なった逆相カラムクロマトグラフィーのＯＤ値（２１５ｎｍ）（図中、（ａ）で示される。）とＢ液濃度（図中、  （ｂ）で示される。）を示したグラフである。
【図５】  図４は、実施例５（ｃ）で行なった逆相カラムクロマトグラフィーの各分画のＣＴＬＬ−２細胞を用いたＤＮＡ合成活性を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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