(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘビ毒から、アンクロッドおよび強塩基性プロテアーゼからなる群から選択されたトロンビン類似プロテアーゼを精製するための方法において、この方法が、
ａ）前精製工程
−  プロテアーゼを含有する溶液を獲得し、
−  このプロテアーゼ溶液を親和性クロマトグラフィーマトリックスまたはアニオン交換樹脂上に適用して、
−  親和性クロマトグラフィーマトリックスまたはアニオン交換樹脂から溶離液中にプロテアーゼを溶離する工程、
ｂ）主精製工程
−  工程ａ）からの溶離液を、２５〜３５ｎｍの孔径を有し、３０〜６０μｍの粒径を有するガラスビーズのマトリックス上に適用し、その際該溶離液を７.５〜９.０のｐＨ値の塩基性溶液の形でガラスビーズのマトリックスに適用し、その際ヘビ毒からのトロンビン類似プロテアーゼはガラスビーズに吸着され；
−  次いで、該プロテアーゼをガラスビーズのマトリックスから溶離溶液中に溶離する工程
ｃ）精密な精製工程
−  工程ｂ）からの溶離液をゲル濾過用ゲルマトリックス上に、または９０〜１１０ｎｍの孔径を有し、３０〜６０μｍの粒径を有するガラスビーズのマトリックス上に適用し、その際、該溶離液を酸性溶液の形でガラスビーズのマトリックスに適用し；かつ
−  精製したプロテアーゼを溶離し、かつ回収する工程
を包含することを特徴とする、トロンビン類似プロテアーゼの精製法。
【請求項２】
工程ｃ）での精製をゲル濾過用ゲルマトリックスを用いて実施する、請求項１記載の精製法。
【請求項３】
溶離液を工程ｃ）において、ガラスビーズのマトリックス上に適用する、請求項１記載の精製法。
【請求項４】
ヘビ毒がAgkistrodon属のヘビからのものである、請求項１記載の精製法。
【請求項５】
ヘビ毒が毒ヘビ（Agkistrodon rhodostoma）からのものである、請求項４記載の精製法。
【請求項６】
精製された生成物がアンクロッドである請求項１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は、ヘビ毒からトロンビン類似プロテアーゼを精製する方法に関する。
そのようなプロテアーゼの例は、バトロキソビン、クロタラーゼ（crotalase）、及び特に、アンクロッド（ancrod）である。アンクロッドは、毒ヘビ（Agkistrodon rhodostoma）のヘビ毒から単離された抗凝血剤（メルク・インデックス、1989、No 664）である。ヘビ毒からのその製造のためには、すでに多くの方法が記載されている（英国特許第1094301号、同第1177506号、同第1293793号明細書、米国特許第3743722号、同第3879369号明細書、ドイツ特許公開第2428955号、同第2734427号公報）。これらの方法は、主にクロマトグラフィー工程に基づいており、アンクロッドは種々の収量と純度で獲得されている。
ヘビ毒からの高純度アンクロッドの製造は、従来成功していない。それぞれの製法により、多かれ少なかれ異種蛋白質で汚染された、主成分としてアンクロッドを含有する酵素の混合物が常に単離された。
今や、トロンビン類似プロテアーゼをヘビ毒から高純度な形で製造する方法が見いだされた。
本発明の課題は、ヘビ毒からトロンビン類似プロテアーゼを精製するための方法に関し、この方法は
ａ．プロテアーゼ粗生成物に、親和性クロマトグラフィーか、又は塩基性イオン交換体でのクロマトグラフィーによる前精製を実施し、
ｂ．このようにして得られたトロンビン類似酵素を含有するフラクションを弱カチオン交換体上でのクロマトグラフィーにかけるか、又はそのフラクションを塩基性範囲中でのガラスへの吸着により分離し、かつ
ｃ．工程２からの主成分をゲルクロマトグラフィーにかけるか、又はこの成分を酸性範囲中でガラスでのクロマトグラフィーにより精製する、
ことからなり、しかしこの際工程２及び３の少なくとも一方がガラスへの吸着又はガラスでのクロマトグラフィーによる分離を包含する。
更に、本発明の課題はヘビ毒からの９５〜１００％の純度のトロンビン類似プロテアーゼに関する。
段階ｂにおいて、ガラスへの吸着による精製を実施すること、及びゲルクロマトグラフィーを用いて段階ｃを実施することは推奨される。
発明の特に有利な実施態様においては、段階ｂ及び段階ｃの両段階において、ガラスへの吸着又はガラスでのクロマトグラフィーにより精製される。
アグマチン（Agmatine）−セファロース、アルギニン−セファロース又はヘパリン−セファロースは、特に親和性クロマトグラフィーによる前精製のために好適である。
前精製のために適当な塩基性イオン交換体は、特にＤＥＡＥ−セルロース及びＤＥＡＥ−セファロースである。
イオン交換体クロマトグラフィーのために挙げることのできる緩衝剤は、特に、トリス−燐酸塩とリン酸ナトリウム緩衝液である。
イオン交換体クロマトグラフィーは、ｐＨ５〜９、有利には６〜８.５で実施される。
前精製の際に、異種蛋白質と他の構成分の約７０〜８０％が粗酵素から除去される。
精製の第２工程をカチオン交換体を使用して実施するのであれば、好適なものは以下の弱酸性交換体である：ＣＭ−セファロース、ｐＨ５〜９、及びアンバーライトＣＧ５０、ｐＨ５〜９。
ガラスでのクロマトグラフィーとは、アンクロッド及び関連するトロンビン類似酵素、並びに強塩基性プロテアーゼがｐＨ７.５〜９.０、有利には８.０〜８.５でガラスマトリックスに結合されることを意味する。特に酸性の異種蛋白質の約６０％は、非結合の形でカラムから平衡緩衝液（有利にトリス−燐酸塩緩衝液またはリン酸ナトリウム緩衝液）で洗浄される。塩化ナトリウムの追加によって緩衝液のイオン強度を０.３〜１.０Ｍに増加させることにより、アンクロッドを９０％を越す純度でガラスから分別的に溶離する。
第２精製工程において、この酵素は約９０％までに濃縮される。
精製工程ｃとしてのゲルクロマトグラフィーのために好適であるのは、特に次のものである：セファクリルＳ−１００ＨＲ、スーパーデックス（SUPERDEX）、セファデックス、ウルトラゲル（ULTROGEL）及びスーパーローズ（SUPEROSE）。
この精製工程ｃの際にガラスでのクロマトグラフィーを選ぶのであれば、４〜６の酸性ｐＨ範囲で、塩基性異種蛋白質がアンクロッド溶液からガラス表面上に吸着され、一方アンクロッドはカラムから平衡緩衝液中に９５％を大きく越える純度で直接溶離されることができる。緩衝液の所望のイオン強度は、塩化ナトリウムのような塩の添加によって制御することができる。
新規方法は、特に純粋な形でのアンクロッドの製造のために著しく好適であり、そしてこの精製法によりアンクロッドは明らかに９５％を越える純度で得られる。
例１
ａ．前精製
マライ半島のマムシ亜科の毒ヘビ（Malayan pit viper）の乾燥毒３ｇを
トリス−（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ）−リン酸塩緩衝液ｐＨ８.５、５０ｍｌ中に溶かし、このヘビ毒の不溶性細胞成分を遠心分離し、かつ透明で、黄色の溶液を、直径１.６ｃｍで、かつ３０ｃｍの高さまでＤＥＡＥ-セファロース-ＦＦ（Pharmacia社）で充填されたクロマトグラフィーカラムに適用した。このヘビ毒のトロンビン類似酵素及び酸性特性を有するタンパク質はマトリックスに結合した。クロマトグラフィーを１５０〜２００ｍｌ／ｈの流速で実施した。溶出液のＡ280nmの値が０.５以下に下がるまで平衡緩衝液（ＴＲＩＳ−リン酸塩緩衝液、ｐＨ８.５）約３００ｍｌで室温でカラムを洗浄し、かつ更に３５ｍＭのＴＲＩＳ−リン酸塩緩衝液、ｐＨ６.０、４００ｍｌで溶出液のＡ280nmの値が＜０.４になるまで洗浄することにより、異種蛋白質の約７０〜８０％（２８０nm）での開始溶液の光学密度を基礎として）が溶離された。アンクロッドを含有する主フラクションは１５０ｍＭのＴＲＩＳ−リン酸塩緩衝液、ｐＨ６.０、１５０〜２００ｍｌ中に、収率８５％で溶離された。
ｂ．主な精製
アンクロッドを含有する溶出液を、呼称分離限界１００００ダルトンを有する膜での限外濾過によって２０ｍｌに濃縮し、１００ｍＭ ＴＲＩＳ−リン酸塩緩衝液、ｐＨ８.０を用いて再緩衝した。この溶液を、直径１.６ｃｍを有し、かつビオラン（BIORAN）−ＣＰＧガラス（Schott社、孔径：２５〜３５ｎｍ、粒径３０〜６０μｍ）で１５ｃｍの高さまで充填されたカラムに適用した。室温で、１００ｍＭのＴＲＩＳ−リン酸塩緩衝液、ｐＨ８.０ ３００ｍｌで、流速２５０ｍｌ／ｈでカラムを洗浄することにより、異種蛋白質の約６０％（２８０nmでの適用物質の光学密度を基礎として）がカラムから溶出された。
溶離のために、１００ｍＭ ＴＲＩＳ−リン酸塩を用いてｐＨ８.０に緩衝した０.５Ｍ塩化ナトリウム溶液を使用した。溶出液を自動的に約１０ｍｌのフラクションで集めた。トロンビン類似酵素は、１つのピークとそれに続く尾部領域を伴って溶離された。最高でもトロンビン類似副成分を５％含有する形で、主成分（アンクロッドに相当する）を得るためには、主ピークから尾部領域への移行部において、個々のフラクションをそれらのフィブリノゲナーゼ活性およびそれらの組成の両方に関して、逆相ＨＰＬＣを用いて、調査した。１７００Ｕ／ＯＤ280nmを超える比活性を有し、かつＨＰＬＣにおいて副成分を１０％未満で含有するフラクションのみを主ピークと混合した（約８０ｍｌ）。主成分は、純度９６％及び収率７２％でビオラン−カラムから得られた。
ｃ．精密な精製
主成分アンクロッドを含有する溶出液をＹＭ１０膜（Amicon社）での限外濾過により２ｍｌまで濃縮し、得られた濃縮物を直径１.６ｃｍ及びセファリル（SEPHARYL）Ｓ−１００ＨＲで８５ｃｍの高さまで充填したカラムに適用した。このカラムは前もってｐＨ６.９を有する１００ｍＭ塩化ナトリウム及び１００ｍＭリン酸ナトリウムの緩衝液を用いることにより平衡にした。残留プロテアーゼとＴＲＩＳは、このゲルクロマトグラフィーによってアンクロッドから分離された。この工程中の収率は約９０％であった。
例２
ａ．前精製
マライ半島のマムシ亜科の毒ヘビの乾燥毒２.１ｇを３５ｍＭ ＴＲＩＳ−リン酸塩緩衝液、ｐＨ８.５、５０ｍｌ中に溶かし、このヘビ毒の不溶性細胞成分を遠心分離し、かつ透明で、黄色の溶液を、直径１.６ｃｍで、かつ３０ｃｍの高さまでＤＥＡＥ-セファロース-ＦＦ（Pharmacia社）で充填され、かつ前記緩衝液で平衡にされたクロマトグラフィーカラムに適用した。溶出液のＡ280nmの値が＜０.２に下がるまで平衡緩衝液６００ｍｌで室温でカラムを洗浄することにより、異種蛋白質の約７０％（２８０nmでの開始溶液の光学密度を基礎として）が溶離された。主フラクションは１５０ｍＭのＴＲＩＳ−リン酸塩緩衝液、ｐＨ６.０、２００〜２５０ｍｌを用いて、収率９０〜１００％で溶離された。
ｂ．主な精製
例１と同様にして、２０ｍｌに濃縮し、かつ５０ｍＭ Ｎａ−リン酸塩緩衝液、ｐＨ８.５を用いて再緩衝した。この溶液をビオラン（BIORAN）−ＣＰＧガラスカラム（直径１.６ｃｍ、高さ：１５ｃｍ、孔径：２５〜３５ｎｍ、粒径３０〜６０μｍ）に適用した。室温で、５０ｍＭのＮａリン酸塩緩衝液、ｐＨ８.５ ３００ｍｌで、流速２５０ｍｌ／ｈでカラムを洗浄することにより、異種蛋白質の約６０％（２８０nmでの適用物質の光学密度を基礎として）がカラムから溶離された。
トロンビン類似酵素の溶離のために、５０ｍＭ Ｎａ−リン酸塩を用いてｐＨ８.０に緩衝した１Ｍ塩化ナトリウム溶液を使用した。緩衝液１５０ｍｌを使用し、適用した酵素の単位の約８０％が溶出された。
ｃ．精密な精製
溶出液を前記のように２０ｍｌまで濃縮し、ｐＨ値５.０を有する５０ｍＭ Ｎａ−リン酸塩緩衝液を用いて再緩衝した。この溶液を直径１.６ｃｍを有し、かつビオラン（BIORAN）−ＣＰＧガラス（但し、孔径：９０〜１１０ｎｍ、粒径３０〜６０μｍ）で１５ｃｍの高さまで充填された、カラムに適用した。ｐＨ５.０で、塩基性蛋白質及び副成分のみがビオランガラスに結合し、一方主成分アンクロッドは平衡緩衝液を用いてカラムからほぼ１００％の純度でかつ収率約８０〜９０％で（適用した単位に基づき）溶出した。
例３
ａ、ｂ．前精製及び主な精製
マライ半島のマムシ亜科の毒ヘビの乾燥毒２.１ｇを例２と同様にして、ＤＥＡＥ-セファロース上で前精製し、かつこの溶出液を実施例１と同様にして２０ｍｌに濃縮し、かつ更にｐＨ６.２の４０ｍＭ ＴＲＩＳ−リン酸塩緩衝液を用いて再緩衝した。この溶液を直径１.６ｃｍを有し、かつＣＭ−セファロース−ＦＦ（Pharmacia社）で２０ｃｍの高さまで充填され、かつ前記緩衝液で平衡にされたクロマトグラフィーカラムに適用した。室温で、平衡緩衝液３００ｍｌで、流速２５０ｍｌ／ｈでカラムを洗浄することにより、異種蛋白質の約６０％（２８０nmでの適用物質の光学密度を基礎として）がカラムから溶出された。
トロンビン類似酵素の溶離のために、例２と同様にして、５０ｍＭ Ｎａ−リン酸塩を用いてｐＨ８.０に緩衝した１Ｍ塩化ナトリウム溶液を使用した。緩衝液１５０ｍｌを使用し、適用したトロンビン類似酵素の単位の約８０％が溶出された。
ｃ．精密な精製
アンクロッドの精密な精製を、例２と同様にして５０ｍＭリン酸塩緩衝液、ｐＨ５.０を用いて、ビオラン−ＣＰＧガラス（孔径約１００ｎｍ；粒径３０〜６０μｍ）で実施した。アンクロッドはカラムから９５％を越える純度及び収率約８５％（適用した単位を基礎として）で溶出された。