(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＥＳＲ装置のキャビティーでのＥＳＲ計測に用いる生物試料の測定セルにおいて、
キャビティー内で生物試料の測定対象部位以外をマイクロ波を反射する材料で覆い、前記キャビティーの鉛直方向の中心軸に対して軸対象に、かつ前記キャビティーの中心を通る水平面に対して面対称に配置されるマイクロ波の反射・遮蔽部を有するとともに、前記生物試料周りの空気を前記キャビティー内雰囲気と隔離し、かつ流動させるための通気路を具備することを特徴とする生物試料の測定セル。
【請求項２】
請求項１記載の生物試料の測定セルを用いて、植物の諸器官の測定対象部位以外を覆うとともに、通気を行い、植物の諸器官のＥＳＲ信号を実時間観察可能にすることを特徴とする生物試料の測定方法。
【請求項３】
請求項２記載の生物試料の測定方法において、前記植物の諸器官の部分を前記マイクロ波の反射・遮蔽部で覆い、前記植物の諸器官の切り口から吸水しながら測定することを特徴とする生物試料の測定方法。
【請求項４】
請求項２記載の生物試料の測定方法において、前記マイクロ波の反射・遮蔽部中に水または水溶液を保持し、前記植物の諸器官の切り口をこれに挿入し、前記切り口から吸水しながら測定することを特徴とする生物試料の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
汎用型ＥＳＲ（電子スピン共鳴）装置で使用することのできるマイクロ波の反射部を有する測定セルの材質と形状、及びこれを用いて植物の葉などの諸器官のラジカルを水分供給しながらリアルタイム計測する方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
近年、生物の生命活動において活性酸素を中心とするラジカルの役割が注目されている。動物において、白血球による活性酸素の生成が感染等に対する生体防御機構の根幹をなすことは、古くから知られていたが、加えて、ガンの発生、老化等にもラジカルの生成・反応が密接に関わっていることが判明しつつある。植物とラジカルとの関わりについても、光合成反応の不調和によって引き起こされる光障害が活性酸素の生成を初発の反応とすることが解明されて以来、精力的に研究されてきた。最近の研究から、外部からのストレスに対する植物の防御機構に活性酸素・ラジカルが関与していることが判明してきた。
【０００３】
これらの研究において、様々なラジカルの検出・計測方法が提案され実施されてきた。中でも、ＥＳＲ計測は、その原理からラジカルの直接測定が可能なことから、多くの有効な知見を生み出してきた。
【０００４】
ＥＳＲ計測は、分子軌道中に不対電子を有する対象物（ラジカル・多くの金属イオン）が磁場の中に置かれた時に、マイクロ波を吸収することを利用してこれを定性・定量する計測法である。対象試料の形状の制約をあまり受けることなく遷移金属・ラジカル分子を計測することが可能であり、古くは材料科学の分野で主に用いられたが、先に述べたような背景から、近年は生体試料中のラジカル計測に用いられることが多くなった。
【０００５】
しかしながら、通常ＥＳＲ計測に用いられる周波数１０ＧＨｚ前後（Ｘ−ｂａｎｄ帯）のマイクロ波は、水に強く吸収されるために、水分を多く含む生体試料（組織片、懸濁溶液、水溶液）を対象としたＥＳＲ計測では、次のような工夫がなされている。
【０００６】
（１）標準的なＥＳＲ装置（Ｘ−ｂａｎｄ帯のマイクロ波を使用）においては、水分を含んだ試料は、出来るだけ少量が効率よくマイクロ波照射を受けるように測定室（キャビティー）の中央に位置させる。例えば、内径０．２〜０．５ｍｍ前後の石英キャピラリーセルや、内部が５０ｍｍ（長さ）×１０ｍｍ（幅）×０．３〜１ｍｍ（厚さ）程度の石英フラットセルを用いる。
【０００７】
（２）水の吸収の少ない周波数帯（１ＧＨｚ付近、Ｌ−ｂａｎｄ帯）のマイクロ波を用いるＥＳＲ装置を使用する。このＬ−ｂａｎｄ  ＥＳＲ装置を用いれば、大きな組織片・ラット程度の大きさの動物を計測対象とする事が可能であるが、装置自体が一般的でなく、かつ汎用ＥＳＲ装置（Ｘ−ｂａｎｄ  ＥＳＲ装置）と比べて測定感度が低く、特殊な計測（大量の安定なラジカルを外から与えた上で計測するなど）にしか適用できない。
【０００８】
今後、Ｌ−ｂａｎｄ  ＥＳＲ装置の開発が進めば、動物・植物共に生理的条件下（実際に生物が生活している状態）でのラジカル計測が可能になり、
（Ｉ）動物（人間を含む）の体内のラジカル分布計測による診断
（ＩＩ）植物のラジカルをリアルタイムで計測することによる、環境（ストレス）のモニタリング
などが、実現されると予想される。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
植物の葉などの諸器官を対象としたＥＳＲ計測は、破砕して懸濁溶液とするか、試料の切片・小さな葉などをフラットセル内に保持することで行われている。
【００１０】
しかし、葉を用いた場合でも給水をすることが出来ないため、これらの方法では生理的条件に近い状態でのラジカルの観察は不可能である。
【００１１】
汎用されているＸ−ｂａｎｄ  ＥＳＲ装置を用いて、植物のラジカルを生理的条件下でリアルタイム観察することは、先に述べたように植物の環境ストレス応答のメカニズムを解明する上で必須の条件である。
【００１２】
キャビティー内に保持した試料に水を供給する方法としては、葉を対象とした場合を例にとれば、（Ｉ）枝のついた葉を測定対象とし、枝の切り口をキャビティー外に出して水に浸ける、（II）キャビティー内に水を置き葉柄を浸ける、という方法が考えられる。
【００１３】
しかしながら、（Ｉ）の方法は、キャビティー内に存在する測定対象以外の部分の水分によるマイクロ波の吸収を最小限に抑える必要があり、結果として測定試料のサイズを小さくしなければならないので、通常の測定対象（葉の中のラジカル）は測定できない。また、（II）の方法は、キャビティー内の水がマイクロ波を吸収するため測定は不可能である。
【００１４】
本発明は、ＥＳＲ装置の一般的な測定室（ユニバーサルキャビティー）において、これらの問題を解決し、生物試料にラジカルを給水しながら測定するための生物試料の測定セル及びそれを用いた測定方法を提供することを目的とする。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
本発明は、上記目的を達成するために、
〔１〕ＥＳＲ装置のキャビティーでのＥＳＲ計測に用いる生物試料の測定セルにおいて、キャビティー内で生物試料の測定対象部位以外をマイクロ波を反射する材料で覆い、前記キャビティーの鉛直方向の中心軸に対して軸対象に、かつ前記キャビティーの中心を通る水平面に対して面対称に配置されるマイクロ波の反射・遮蔽部を有するとともに、前記生物試料周りの空気を前記キャビティー内雰囲気と隔離し、かつ流動させるための通気路を具備することを特徴とする。
【００１６】
〔２〕生物試料の測定方法において、上記〔１〕記載の生物試料の測定セルを用いて、植物の諸器官の測定対象部位以外を覆うとともに、通気を行い、植物の諸器官のＥＳＲ信号を実時間観察可能にすることを特徴とする。
【００１７】
〔３〕上記〔２〕記載の生物試料の測定方法において、前記植物の諸器官の部分を前記マイクロ波の反射・遮蔽部で覆い、前記植物の諸器官の切り口から吸水しながら測定することを特徴とする。
【００１８】
〔４〕上記〔２〕記載の生物試料の測定方法において、前記マイクロ波の反射・遮蔽部中に水または水溶液を保持し、前記植物の諸器官の切り口をこれに挿入し、前記切り口から吸水しながら測定することを特徴とする。
【００１９】
本発明は、キャビティー内で生物試料の測定対象部位以外をマイクロ波を反射する材料で覆うようにする。これに用いる材料は、ＥＳＲ信号を与えずマイクロ波を反射することが必要である。例えば、金・銅などが最適であり、アルミニウムも使用可能である。ただし、マイクロ波の反射材をキャビティー内に入れることは、マイクロ波の照射パターンを変えることになるため、ユニバーサルキャビティーでは測定が困難となる。
【００２０】
これを解決するために、キャビティー内の反射材の形状を、キャビティーの鉛直方向の中心軸に対して軸対象に、かつキャビティーの中心を通る水平面に対して面対称にすることで、マイクロ波の照射パターンの歪みを押さえるようにする。このマイクロ波反射部は、先に例をあげたような金属素材で作製するだけでなく、石英などの表面への金属蒸着・条件を満たさない素材（スチールなど）の金属メッキで作製してもよい。
【００２１】
先に述べた葉を例にとった給水方法の問題点は、（Ｉ）葉以外の部分をマイクロ波反射材で覆うことで、（II）マイクロ波反射材の中に水を保持し葉柄をこれに挿入することで解決される。
【００２２】
加えて、通気が生理的条件下での測定に必要であるため、石英などのマイクロ波を反射しない材料を用いて、生物試料とマイクロ波遮蔽部の周りに通気路を設置するようにする。
【００２３】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態を図面を参照しながら説明する。
【００２４】
図１は本発明の実施例を示すユニバーサルキャビティーの斜視図、図２は本発明の実施例を示すユニバーサルキャビティーのマイクロ波の反射・遮蔽部の説明図である。
【００２５】
これらの図に示すように、ユニバーサルキャビティー（単にキャビティーという）１は矩形を成しており、その中心に鉛直方向の中心軸１Ａを有する筒状の空洞部からなる測定セル挿入部６を有する。また、キャビティー１の中心を通る水平面１Ｂが示されている。
【００２６】
このように、ＥＳＲ装置のキャビティーでのＥＳＲ計測に用いる生物試料の測定セルにおいて、キャビティー１内で生物試料の測定対象部位以外をマイクロ波を反射する材料で覆い、前記キャビティー１の鉛直方向の中心軸１Ａに対して軸対象に、かつ前記キャビティーの中心を通る水平面１Ｂに対して面対称に配置されるマイクロ波の反射・遮蔽部を有するとともに、前記生物試料とマイクロ波の反射・遮蔽部の周りに通気路を具備する。
【００２７】
図３は本発明の実施例を示す連続型測定セルの模式図、図４はその連続型測定セルを用いた測定例を示す模式図である。
【００２８】
ここではマイクロ波反射材としてアルミニウムを用い、前述の条件を満たすように同型のアルミ管が鉛直方向の中心線上に中心に対して上下対称に位置する形になっている。これらを用いた測定の実施例を図４に示した。
【００２９】
まず、図３において、１はキャビティー、２は測定セルであり、この測定セル２はアルミ管３、石英管４、接合部５からなり、測定セル挿入部６に挿入される。
【００３０】
図３に示すように、上下のアルミ管３を石英管４で繋いだ連続型測定セル２の接合部５はマイクロ波を反射・吸収することが少なく、かつＥＳＲ信号を与えない方法・材質を用いることが必要である。例えば、アルミ管３と石英管４のねじ込み・差し込みによる接合や、テフロンなどを用いた外部保持が有効である。この測定セル２は、アルミニウムと石英からなる管がキャビティーを上下に貫き、その管自体が通気路となる。
【００３１】
計測では、図４に示すように、枝付きの葉などの諸器官（花、芽、実など）を測定セル２にセットして行う。つまり、接合部５をはずして葉１１を石英管４部に挿入し、枝部１２をアルミ管３に挿入する。測定セル２をキャビティー１内に固定し、葉１１につながった枝部１２の切り口１３を水または水溶液１４に浸ける。
【００３２】
図５は本発明の実施例を示す分離型測定セルの模式図、図６はその分離型測定セルを用いた測定例を示す模式図（その１）、図７はその分離型測定セルを用いた測定例を示す模式図（その２）である。
【００３３】
図５において、２１はキャビティー、２２は測定セルであり、この測定セル２２はアルミ管２３、石英管２４からなり、測定セル挿入部６に挿入される。
【００３４】
上下のアルミ管２３が連結されていない分離型セルの場合も、マイクロ波の遮蔽部であるアルミ管２３の形と位置は、連続型セルと同じく前述の条件を満たさなければならない。この分離型セルでは、連続型セルとは異なり連結部・接合部を必要としないが、上下のアルミ管２３をそれぞれキャビティー２１に固定する必要がある。通気のために、全体を石英管２４で覆う。
【００３５】
計測は、図６に示すように、基本的には連続型セルと同じ様式で行う。ただし、連続型よりも葉の大きさの制約が少ない。
【００３６】
図７に示した実施例は、キャビティー２１内の水または水溶液３１に葉柄を浸けて計測する場合の様式である。下方に位置するアルミ管２３に水（水溶液）３１を入れても、マイクロ波の吸収はほとんどアルミ管２３で遮蔽されているため、測定が可能である。なお、３２はアルミ管２３の底部シールである。
【００３７】
図８は、図３の連続型セルを用いて、図４に示す方法で計測した葉のラジカルの経時変化を示す図であり、縦軸は信号の強度、横軸は時間（分）を示している。
【００３８】
図中の白矢印の示すところで、枝を浸けている水溶液を交換した。水溶性で植物に取り込まれやすいラジカル分子（スピンプローブ）を吸わせるとシグナル強度は増大し、水に切り替えると減少した。このように、本発明によって、植物の吸水に伴うスピンプローブの導入による葉の部分でのラジカル量の変化を、汎用型Ｘ−ｂａｎｄ  ＥＳＲ装置（のユニバーサルキャビティー）で初めて測定することが可能となった。
【００３９】
なお、本発明は上記実施例に限定されるものではなく、本発明の趣旨に基づいて種々の変形が可能であり、これらを本発明の範囲から排除するものではない。
【００４０】
【発明の効果】
以上、詳細に説明したように、本発明によれば、以下のような効果を奏することができる。
【００４１】
（Ａ）市販の標準型Ｘ−ｂａｎｄ  ＥＳＲ装置を用いて、マイクロ波の照射パターンを変えることなく、植物の葉などの諸器官のラジカルを生理的条件に近い状態で長時間観察することが可能となる。つまり、葉のラジカルを観察しながら、吸わせる水溶液・通気させる気相を変えるといった実験が可能となり、植物の環境ストレス応答のメカニズムの解明に寄与するところが大である。
【００４２】
（Ｂ）植物の環境ストレス応答のメカニズムの解明が進めば、より栽培が容易な作物、冷害などを受け難い作物の作出につながる。また、先に述べたように、環境ストレス検出器として植物を利用する道を開くことができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  本発明の実施例を示すユニバーサルキャビティーの斜視図である。
【図２】  本発明の実施例を示すユニバーサルキャビティーのマイクロ波の反射・遮蔽部の説明図である。
【図３】  本発明の実施例を示す連続型測定セルの模式図である。
【図４】  本発明の実施例を示す連続型測定セルを用いた測定例を示す模式図である。
【図５】  本発明の実施例を示す分離型測定セルの模式図である。
【図６】  本発明の実施例を示す分離型測定セルを用いた測定例を示す模式図（その１）である。
【図７】  本発明の実施例を示す分離型測定セルを用いた測定例を示す模式図（その２）である。
【図８】  本発明の実施例を示す連続型セルを用いて計測した葉のラジカルの経時変化を示す図である。
【符号の説明】
１，２１    ユニバーサルキャビティー
１Ａ    鉛直方向の中心軸
１Ｂ    キャビティーの中心を通る水平面
２，２２    測定セル
３，２３    アルミ管
４，２４    石英管
５    接合部
６    測定セル挿入部
１１    葉
１２    枝部
１３    切り口
１４，３１    水または水溶液
３２    底部シール
【図１】
0003739624.tif 000002
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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