(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
呼吸性シンシチウムウイルス（ＲＳＶ）Ｆタンパク質に特異的に結合し、以下よりなる群から選ばれた軽鎖および重鎖可変領域：
ＲＦ−１抗体の軽鎖可変領域および重鎖可変領域であって、配列番号９に示すアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域および配列番号１０に示すアミノ酸配列を有する重鎖可変領域；および
ＲＦ−２抗体の軽鎖可変領域および重鎖可変領域であって、配列番号１１に示すアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域および配列番号１２に示すアミノ酸配列を有する重鎖可変領域
を含むモノクローナル抗体。
【請求項２】
ＲＦ−１抗体の軽鎖および重鎖を含み、該軽鎖が配列番号１３に示すアミノ酸配列を有し、該重鎖が配列番号１４に示すアミノ酸配列を有する、請求項１のモノクローナル抗体。
【請求項３】
ＲＦ−２抗体の軽鎖および重鎖を含み、該軽鎖が配列番号１５に示すアミノ酸配列を有し、該重鎖が配列番号１６に示すアミノ酸配列を有する、請求項１のモノクローナル抗体。
【請求項４】
ヒトのカッパまたはラムダ軽鎖定常領域、およびヒトのガンマ１、ヒトのガンマ４およびヒトのガンマ４（ＰＥ）定常領域よりなる群から選ばれた重鎖定常領域を含む組換え抗体である請求項１のモノクローナル抗体。
【請求項５】
インビトロでＲＳＶを中和する請求項１のモノクローナル抗体。
【請求項６】
ＲＳＶ Ｆタンパク質に対して２×１０-9〜１０-10モルの親和性（Ｋｄ）を有する、請求項１のモノクローナル抗体。
【請求項７】
ヒトＲＳＶ Ｆタンパク質に結合する、請求項１のモノクローナル抗体。
【請求項８】
インビトロでヒトＲＳＶを中和する請求項７のモノクローナル抗体。
【請求項９】
以下よりなる群から選ばれたポリペプチド：
ＲＦ−１抗体の軽鎖可変領域および重鎖可変領域であって、配列番号９に示すアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域および配列番号１０に示すアミノ酸配列を有する重鎖可変領域；
ＲＦ−２抗体の軽鎖可変領域および重鎖可変領域であって、配列番号１１に示すアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域および配列番号１２に示すアミノ酸配列を有する重鎖可変領域；
ＲＦ−１抗体の軽鎖および重鎖であって、配列番号１３に示すアミノ酸配列を有する軽鎖および配列番号１４に示すアミノ酸配列を有する重鎖；および
ＲＦ−２抗体の軽鎖および重鎖であって、配列番号１５に示すアミノ酸配列を有する軽鎖および配列番号１６に示すアミノ酸配列を有する重鎖
をコードするヌクレオチド配列を有するＤＮＡ核酸でトランスフェクションされている真核生物細胞。
【請求項１０】
その真核生物細胞がＣＨＯ細胞である請求項９の細胞。
【請求項１１】
配列番号１、配列番号４、配列番号３、配列番号２、配列番号５、配列番号６、配列番号７、および配列番号８よりなる群から選ばれたヌクレオチド配列を有するＤＮＡ核酸分子でトランスフェクションされている真核生物細胞。
【請求項１２】
ＲＳＶ Ｆタンパク質に特異的に結合し、以下よりなる群から選ばれた軽鎖および重鎖可変領域：
ＲＦ−１抗体の軽鎖可変領域および重鎖可変領域であって、配列番号９に示すアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域および配列番号１０に示すアミノ酸配列を有する重鎖可変領域；および
ＲＦ−２抗体の軽鎖可変領域および重鎖可変領域であって、配列番号１１に示すアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域および配列番号１２に示すアミノ酸配列を有する重鎖可変領域
を含むモノクローナル抗体を分泌するエプスタイン−バー不死化Ｂ細胞株。
【請求項１３】
該モノクローナル抗体が、ＲＦ−１抗体の軽鎖および重鎖を含み、該軽鎖が配列番号１３に示すアミノ酸配列を有し、該重鎖が配列番号１４に示すアミノ酸配列を有する、請求項１２の細胞株。
【請求項１４】
該モノクローナル抗体が、ＲＦ−２抗体の軽鎖および重鎖を含み、該軽鎖が配列番号１５に示すアミノ酸配列を有し、該重鎖が配列番号１６に示すアミノ酸配列を有する、請求項１２の細胞株。
【請求項１５】
該モノクローナル抗体が、ヒトのカッパまたはラムダ軽鎖定常領域、およびヒトのガンマ１、ヒトのガンマ４およびヒトのガンマ４（ＰＥ）定常領域よりなる群から選ばれた重鎖定常領域を含む組換え抗体である、請求項１２の細胞株。
【請求項１６】
該モノクローナル抗体がインビトロでＲＳＶを中和する請求項１２の細胞株。
【請求項１７】
該モノクローナル抗体がＲＳＶ Ｆタンパク質に対して２×１０-９〜１０-10モルの親和性（Ｋｄ）を有する、請求項１２の細胞株。
【請求項１８】
該モノクローナル抗体がヒトＲＳＶ Ｆタンパク質に結合する、請求項１２の細胞株。
【請求項１９】
該モノクローナル抗体がインビトロでヒトＲＳＶを中和する、請求項１８の細胞株。
【請求項２０】
ＲＳＶ Ｆタンパク質に特異的に結合するヒト抗体を非ヒト動物で産生する方法であって、
(i)ＲＳＶ Ｆタンパク質およびＩＬ−２存在下にヒトの脾細胞を培養することによってヒトの脾細胞をインビトロで初回抗原刺激し、
(ii)この初回抗原刺激したヒトの脾細胞を重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）表現型を有する動物に移入して再構成した動物を生成し、
(iii)該再構成した動物をＲＳＶ Ｆタンパク質で免疫することによって該インビトロで初回抗原刺激したヒトの脾細胞をインビトロで追加免疫し、ついで
(iv)該再構成した動物を、該動物中の該移入したヒトの脾細胞がＲＳＶ Ｆタンパク質に特異的に結合するヒト抗体を産生するのに十分な時間、生存して維持すること
を含む方法。
【請求項２１】
インビトロでの初回抗原刺激をＩＬ−２に加えてＩＬ−４、ＩＬ−６およびその組み合わせよりなる群から選ばれた少なくとも１のサイトカインの存在下で行う、請求項２０の方法。
【請求項２２】
インビトロでの初回抗原刺激が、ＲＳＶ Ｆタンパク質に特異的な抗体応答を誘発するのに十分な濃度のＲＳＶ Ｆタンパク質にヒトの脾細胞を１〜１０日間暴露することを含む、請求項２０の方法。
【請求項２３】
該移入する工程が、初回抗原刺激したヒトの脾細胞をＳＣＩＤマウスまたはＳＣＩＤ／Beigeマウスに腹腔内注射することを含む、請求項２０の方法。
【請求項２４】
１０4〜１０8の初回抗原刺激したヒトの脾細胞をＳＣＩＤマウスまたはＳＣＩＤ／Beigeマウスに腹腔内注射する、請求項２３の方法。
【請求項２５】
追加免疫を移入工程の３〜１４日後に行う、請求項２０の方法。
【請求項２６】
追加免疫を移入工程の７日後に行う、請求項２５の方法。
【請求項２７】
追加免疫が、少なくとも１のアジュバントとともにＲＳＶ Ｆタンパク質を投与することをさらに含む、請求項２０の方法。
【請求項２８】
該再構成した動物からヒト抗体産生細胞を単離する工程をさらに含む、請求項２０の方法。
【請求項２９】
該単離したヒト抗体産生細胞が該再構成した動物の腹腔または脾臓から得られる、請求項２８の方法。
【請求項３０】
該単離したヒト細胞をインビトロで不死化する工程をさらに含む、請求項２８の方法。
【請求項３１】
不死化工程が、該単離したヒト細胞にエプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）を感染させることを含む、請求項３０の方法。
【請求項３２】
不死化工程が、該単離したヒト細胞を融合パートナー細胞と融合させることを含む、請求項３０の方法。
【請求項３３】
該単離したヒト細胞が、ＲＳＶ Ｆタンパク質に対するヒトモノクローナル抗体を産生するコンビナトリアルヒト抗体遺伝子ライブラリーを生成するのに用いられる、請求項２８の方法。
【請求項３４】
該ヒト抗体を該再構成した動物から単離した組織から精製する工程をさらに含む、請求項２０の方法。
【請求項３５】
該再構成した動物で腫瘍形成を検出し、ついで該腫瘍からヒト抗体産生細胞を単離する工程をさらに含む、請求項２０の方法。
【請求項３６】
追加免疫をする前に、該再構成した動物に新たな初回抗原刺激していないヒトの脾細胞を導入する工程をさらに含む、請求項２０の方法。
【請求項３７】
ヒトの脾細胞が抗原刺激されていないナイーブな細胞である、請求項２０の方法。
【請求項３８】
以下よりなる群から選ばれたポリペプチド：
配列番号９に示すアミノ酸配列を有するＲＦ−１抗体の軽鎖可変領域；
配列番号１０に示すアミノ酸配列を有するＲＦ−１抗体の重鎖可変領域；
配列番号１１に示すアミノ酸配列を有するＲＦ−２抗体の軽鎖可変領域；
配列番号１２に示すアミノ酸配列を有するＲＦ−２抗体の重鎖可変領域；
配列番号１３に示すアミノ酸配列を有するＲＦ−１抗体の軽鎖；
配列番号１４に示すアミノ酸配列を有するＲＦ−１抗体の重鎖；
配列番号１５に示すアミノ酸配列を有するＲＦ−２抗体の軽鎖；
配列番号１６に示すアミノ酸配列を有するＲＦ−２抗体の重鎖
をコードするヌクレオチド配列を有する核酸。
【請求項３９】
請求項３８の核酸を含む発現ベクター。
【請求項４０】
配列番号１、配列番号４、配列番号３、配列番号２、配列番号５、配列番号６、配列番号７、および配列番号８よりなる群から選ばれたヌクレオチド配列を有する、ＲＦ−１抗体またはＲＦ−２抗体のポリペプチドをコードする核酸。
【請求項４１】
検体中のＲＳＶの存在を検出する方法であって、
該検体をＲＳＶ Ｆタンパク質に特異的に結合するモノクローナル抗体とともにＲＳＶ Ｆタンパク質と抗体との免疫複合体を形成する条件下でインキュベーションし、ついで
該ＲＳＶ Ｆタンパク質と抗体との免疫複合体の存在を検出して、ＲＳＶが検体中に存在するかどうかを決定すること
を含み、その際、該モノクローナル抗体が以下よりなる群から選ばれた軽鎖および重鎖可変領域：
ＲＦ−１抗体の軽鎖可変領域および重鎖可変領域であって、配列番号９に示すアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域および配列番号１０に示すアミノ酸配列を有する重鎖可変領域；および
ＲＦ−２抗体の軽鎖可変領域および重鎖可変領域であって、配列番号１１に示すアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域および配列番号１２に示すアミノ酸配列を有する重鎖可変領域
を含むことを特徴とする方法。
【請求項４２】
該モノクローナル抗体が、ヒトのカッパまたはラムダ軽鎖定常領域、およびヒトのガンマ１、ヒトのガンマ４およびヒトのガンマ４（ＰＥ）定常領域よりなる群から選ばれた重鎖定常領域を含む、請求項４１の方法。
【請求項４３】
該モノクローナル抗体が、ＲＦ−１抗体の軽鎖および重鎖を含み、該軽鎖が配列番号１３に示すアミノ酸配列を有し、該重鎖が配列番号１４に示すアミノ酸配列を有する、請求項４１の方法。
【請求項４４】
該モノクローナル抗体が、ＲＦ−２抗体の軽鎖および重鎖を含み、該軽鎖が配列番号１５に示すアミノ酸配列を有し、該重鎖が配列番号１６に示すアミノ酸配列を有する、請求項４１の方法。
【請求項４５】
該モノクローナル抗体が直接または間接にレポーター分子に結合している請求項４１の方法。
【請求項４６】
該レポーター分子が検出可能な酵素または放射性核種である請求項４５の方法。
【請求項４７】
その検体が呼吸器から得た体液である請求項４１の方法。
【請求項４８】
検体中のＲＳＶの存在を検定するための試験用キットであって、
(i)ＲＳＶ Ｆタンパク質に特異的に結合するモノクローナル抗体；および
(ii)該モノクローナル抗体に直接または間接に結合しているレポーター分子
を含み、その際、該モノクローナル抗体が以下よりなる群から選ばれた軽鎖および重鎖可変領域：
ＲＦ−１抗体の軽鎖可変領域および重鎖可変領域であって、配列番号９に示すアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域および配列番号１０に示すアミノ酸配列を有する重鎖可変領域；および
ＲＦ−２抗体の軽鎖可変領域および重鎖可変領域であって、配列番号１１に示すアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域および配列番号１２に示すアミノ酸配列を有する重鎖可変領域
を含むことを特徴とするキット。
【請求項４９】
該モノクローナル抗体が、ヒトのカッパまたはラムダ軽鎖定常領域、およびヒトのガンマ１、ヒトのガンマ４およびヒトのガンマ４（ＰＥ）定常領域よりなる群から選ばれた重鎖定常領域を含む、請求項４８の試験用キット。
【請求項５０】
該モノクローナル抗体が、ＲＦ−１抗体の軽鎖および重鎖を含み、該軽鎖が配列番号１３に示すアミノ酸配列を有し、該重鎖が配列番号１４に示すアミノ酸配列を有する、請求項４８の試験用キット。
【請求項５１】
該モノクローナル抗体が、ＲＦ−２抗体の軽鎖および重鎖を含み、該軽鎖が配列番号１５に示すアミノ酸配列を有し、該重鎖が配列番号１６に示すアミノ酸配列を有する、請求項４８の試験用キット。
【請求項５２】
該レポーター分子が検出可能な酵素または放射性核種である請求項４８の試験用キット。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
呼吸性シンシチウムウイルス（ＲＳＶ）は、一般的に気管の上部および株に感染するニューモウイルス属のパラミクソウイルスである。これは接触伝染性が強いので、２才までに高いパーセントの子供が感染する。さらに、４才までに、事実上すべてのヒトがＲＳＶの免疫をもっている。
典型的には、ＲＳＶ感染はマイルドであり、気管の上部に局部的にとどまり、特別の治療を必要としない普通の風邪に似た症状を起こさせる。しかしながら、ある種の患者、例えば子供、老人または潜在的な心肺疾患のある、免疫抑制された人では、このウイルスは、下部の気管に広がり入院や呼吸支持が必要になることがある。これらのある場合に、ＲＳＶ感染は永久的な肺損傷を起こさせ、生命を脅かすことさえある。合衆国だけでも、ＲＳＶにより毎年約９０，０００人が入院し、約４５００人が死亡している。
ＲＳＶは、結合糖タンパク質、Ｇ、に関連する血清学的差異に主として基づく２つの主要な菌株の亜群ＡおよびＢであると思われる。主要な表面糖タンパク質、すなわち、９０kＤ Ｇタンパク質、は分離物間のアミノ酸レベルで５０％までが異なり得る（Johnson et al,Proc.Natl.Acad.Sci.(1987),84,5625-5629)。反対に、治療の標的であるかもしれない、７０kＤ融合（Ｆ）タンパク質は、異なるＲＳＶ菌株にわたって非常によく保存されていて、すなわち、アミノ酸レベルで約８９％である（Johnson et al,J.Gen.Virol.(1988),69,2623-2628,Johnson et al,J.Virol.(1987),10,3163-3166,P.L.Collins,Plenum Press,NY(1991),103-162)。さらに、所与の型のＦ−タンパク質から誘導された抗体は他の型と交差反応する。
Ｆ−タンパク質はヘテロ二量体であり、直鎖の前駆体から産生され、それぞれ４８および２３kＤのジスルフィド結合フラグメントからなる（Walsh et al,J.Gen.Virol,(1985),66,401-415）。ポリクローナル抗体によるシンシチウム形成の阻害は２３kＤフラグメントとの重要な反応に関係している。
既述のように、ＲＳＶ感染は通常マイルドであるが、ある種の人には生命の危険があり得る。現在、重いＲＳＶ感染は抗ウイルス剤のリババリンの投与によって処置されている。しかしながら、リババリンはＲＳＶ感染の制御に何等かの効果があるが、その使用はいくつかの理由により好ましくない。例えば、非常に高価であり、病院でのみ投与され得る。他の公知のＲＳＶ治療はＲＳＶ感染の症状を処置するのみであり、気管支炎の患者にはエーロゾル気管支拡張剤の使用および気管支炎およびＲＳＶ肺炎の患者にはコルチコステロイド治療を含む。
今日まで、ＲＳＶワクチンは抗ウイルス防御抗体を増強するためであり、非常に成績が悪い。例えば、ホルマリン不活性化ＲＳＶに基づくワクチンは約２５年前に試験され、事実、融合阻害活性を欠く抗体を誘導し（Murphy et al,Clinical Microbiology(1988),26,1595-1597）、時には病気を悪化させさえする。これは防御抗体を誘導するためのホルマリン不活性化ウイルスが無能力であることで説明され得る。高抗体力価がワクチン被投与者に測定されたが、特定の防御力価は対照群より低かった。これはホルマリン不活性化ＲＳＶが防御抗体を誘導するのに要求される必要なコンホメーションのエピトープを示し得ないからかもしれない。
今日まで有効なＲＳＶワクチンは知られていないが、抗体治療が感染しやすい患者のＲＳＶ感染に対する防衛をもたらし得、存在するＲＳＶ感染そのものを排除さえし得るとのいくつかの臨床的証拠は存在する。例えば、新生児には重い気管支炎の発生率は低く、母親の防衛物質の存在が寄与しているとの仮説が立てられている（Ogilvie et al,J.Med Virol(1981),7,263-271）。また、再感染に免疫を持っている子供は再感染した子供より統計学的に高抗−Ｆ−タンパク質力価を有している。さらに、高力価ＲＳＶ−免疫ドナーから製造された静脈内免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）は鼻のＲＳＶ流出を減少させ、酸素添加（oxygenation）を改善する（Hemming et al,Anti.Viral Agents and Chemotherapy(1987),31,1882-1886）。また、最近の研究では、ＲＳＶ強化免疫グロブリン（ＲＳＶＩＧ）を投与することによってウイルスが退治され肺損傷が防御されることが示唆されている（Groothuis et al,The New England J.Med.(1993),329,1524-1530,K.McIntosh,The New England J.Med.(1993),329,1572-1573,J.R.Groothuis,Antiviral Research,(1994),23,1-10,Siber et al,J.Infectious Diseases(1994),169,1368-1373,Siber et al,J.Infectious Diseases(1992),165:456-463）。
同様に、動物実験では、ウイルス中和抗体での抗体治療がＲＳＶ感染に対する防衛をもたらし得、存在するＲＳＶ感染そのものを排除さえし得ることが示唆されている。例えば、インビトロの中和マウスモノクローナル抗体はマウスを感染から守り、確立したＲＳＶ感染を取り除くと報告されている（Taylor et al,J.Immunology,(1984),52,137-142,Stott et al,"Immune Responses,Virus Infections and Disease,I.R.L.Press,London(1989),85-104"）。
また、ＲＳＶのＦ−タンパク質のモノクローナル抗体はインビボおよびインビトロの両方のＲＳＶモデルで高い効果を示している（Tempest et al,Bio/Technology,(1991),9,266-271,Crowe et al,Proc.Natl.Acad.Sci.(1994),91,1386-1390,Walsh et al,Infection and Immunity,(1984),43,756-758,Barb as III,et al,Proc.Natl.Acad.Sci.(1992),89,10164-10168,Walsh,et al,J.Gen.Virol.(1986),67,505-513）。動物実験では、５２０−２０００μg/kg体重の低い抗体濃度で殆ど元の状態に回復すると報告されている(Crowe et al,Proc.Natl.Acad.Sci.(1994),91,1386-1390)。さらに、これらの抗体は実験室株および野生株を含むＡおよびＢ株の両方を中和すると記載されている。これらの抗体は注射（Groothuis et al,The New England J.Med.(1993),329,1524-1530,Siber et al,J.Infectious Diseases(1994),169,1368-1373）またはエーロゾル（Crowe et al,Proc.Natl.Acad.Sci.(1994),91,1386-1390）のいずれかにより投与される。
ＲＳＶ Ｆ−タンパク質に対する潜在的な治療モノクローナル抗体の異なる２つの型がかって文献に記載され、ヒト化ネズミ抗体（Tempest et al,Bio/Technology,(1991),9,266-271）または真性なヒト抗体（Ｆabフラグメント）（Barbas III,et al,Proc.Natl.Acad.Sci(1992),89,10164-10168）である。ヒト化ネズミ抗体は一般的なヒトＦｃ上に可変部の構造領域とともに交差株中和ネズミ抗−Ｆ−タンパク質抗体をＣＤＲグラウトすることによって産生される。ヒトＦabフラグメントはＨＩＶ陽性ドナー（免疫易感染）から得られたヒト骨髄細胞を用いたコンビナトリアルライブラリー技術によって産生された。ヒト化およびヒトＲＳＶ抗体のインビボの治療的力価は、それぞれ５および２mg/kg体重である。しかしながら、ヒト化抗体はシンシチウム阻害活性で試験されたが、ヒト抗−ＲＳＶ Ｆabフラグメントはそのウイルス中和活性の測定で評価されていることに注意すべきである。従って、ヒト化およびヒト抗−ＲＳＶ抗体について報告された結果は直接比較できない。
コンビナトリアルライブラリー技術によって生産されたＦabフラグメントはエーロゾルにおいて有効であると報告されている。これは恐らく分子の大きさが比較的小さいためである。ＲＳＶワクチンの主な投与群は幼児であるから、これらの結果は非常に勇気づけられるものである。従って、エーロジルは特に望ましい投与法である。
しかながら、ＲＳＶに特異的なヒト化およびＦabフラグメントの以前の公開報告にもかかわらず、いまだ、改善された治療的能力を有する改良された抗−ＲＳＶ抗体、特に、ＲＳＶ感染を効果的に中和し妨害するＲＳＶ Ｆ−タンパク質に高い親和性と特異性を有する抗−ＲＳＶ抗体の必要性は高い。
抗体治療は主に２種類の異なる作用：(i)完全な非標識抗体または標識抗体を用いる受動的免疫治療、および(ii)自己免疫におけるネットワークバランスの再確立の抗−イデオタイプを用いる能動的免疫治療に再区分される。
能動的免疫治療において、はだかの抗体は、抗原を中和するために、または標的膜関連抗原にエフェクター機能を目的として投与される。中和はリンホカイン、ホルモンまたはアナフィラトキシン、すなわち、Ｃ５ａによるものである。エフェクター機能は補体結合、マクロファージ活性化および補充、および抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を含む。はだかの抗体は白血病の治療に用いられ（Ritz et al,S.F.Blood,(1981),58,141-152）、ＧＤ２に対する抗体は神経芽細胞腫（Schulz et al,Cancer Res.(1984),44,5914）および黒色腫（Irie et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,(1986),83:8694）の治療に用いられてきた。また、高抗−ＲＳＶ力価をもつ静脈免疫ガンマグロブリン（ＩＶＩＧ）抗体は最近ＲＳＶ感染により生じる呼吸困難の治療に実験的に用いられている（Hemming et al,Anti.Viral Agents and Chemotherapy(1987),31,1882-1886,Groothuis et al.,The New England J.Med.(1993),329,1524-1530,K.McIntosh,The New England J.Med.(1993),329,1572-1573,J.R.Groothuis,Antiviral Research,(1994),23,1-10,Siber et al,J.Infectious Diseases(1994),169,1368-1373）。
モノクローナル抗体の治療効果は例えば、抗原に結合する抗体の量、反応性、特異性および種類などを含む要因によって変化する。また、抗体のインビトロの半減期は重要な治療要因である。
さらに、抗体の治療能力に著しく影響を与える別の要因はそれらが由来する種である。現在、免疫治療に用いられるモノクローナル抗体はほとんど例外なくげっ歯類起源のものであるが（Schulz et al,Cancer Res.(1984),44,5914,Miller et al,Blood(1981),58,78-86,Lanzavecchia et al,J.Edp.Med.(1988),167,345-352,Sikora et al,Br.Med.Bull.(1984),40:240,Tsujisaki et al,Cancer Research(1991),51:2599）、それはげっ歯類モノクローナル抗体の生産には十分解明され効率の高い技術を使用するからである
0003771267.tif 000002
しかしながら、げっ歯類モノクローナル抗体は治療効果はあるが、ヒト抗体に関しては制限と欠点が存在し得る。例えば、それらはしばしば宿主のエフェクター機能（ＣＤＣＣ、ＡＤＣＣなど）の最適状態に及ばない刺激を誘発する。また、ネズミ抗体はヒト抗−ネズミ抗体（ＨＡＭＡ）応答を誘発し得る（Schroff et al,Can.Res.(1985),45:879-885,Shawler et al,J.Immunol.(1985),135:1530-1535）。これは短命な抗体半減期をもたらし得（Dillman et al,Mod.(1986),5,73-84,Miller et al,Blood(1981),62:988-995）、またある場合には、血清病およびアナフィラキシーなどの有毒副作用を生じさせ得る。
ある種の患者には、例えば、重い免疫制御患者（例えば、強い化学的または放射性伝達癌治療を受けた患者）（Irie et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.(1986),83:8694,Dillman et al,Mod.(1986),5,73-84,Koprowski et al,Proc.Natl.Acad.Sci.(1984),81:216-219））の場合、ネズミモノクローナル抗体の使用は特別の負の副作用を生じさせる。反対に、正常または高活性免疫系の患者ではネズミ抗体は少なくともある種の疾病症状に対して特別の効果を示し得る。
ネズミモノクローナル抗体の限界を越えるために、組換技術が、キメラ抗体（Morrison et al,Proc.Natl.Acad.Sci.(1984),81:216-219,Boulianne et al,Nature,(1984),312,644-646）、「ＣＤＲ接合」によるヒト化抗体（Riechmann et al,Nature(1984),332-327）および、抗原性を軽減または除去するために他のアミノ酸で特定の表面残基を置換による「張り合わせ（veneered）」抗体の産生に適用されてきた。
しかしながら、このような抗体は臨床的に成功裡に用いられてきたが（Gillis et al,J.Immunol.Meth(1989),25:191）、それらは製造が面倒であることが判明した。これは、最適抗体認識および親和性に対する必要条件の知識が十分に解明されていなかったことによる。また、ヒトのフレームワークとマウスＣＤＲ領域はしばしば、抗体活性に負に作用して立体的に相互作用する。さらに、このような抗体は時にまた患者の強いＨＡＭＡ応答を誘発する。
ヒト抗体はそれらのネズミの対応物に対して大きな利点；ヒト抗体は最適のエフェクター機能を誘発し、それらはＨＡＭＡ応答を誘発せず、宿主抗原特異的抗体は、余りに微小であるため外因性免疫系では認識できない治療的に価値のあるエピトープの確認を可能にし得る（ennox et al,"Monoclonal Antibodies in Clinical Medicine,"London:Academic Press(1982)）を示す。
ヒト抗体は非常に望ましいが、それらの製造は、倫理的配慮およびヒト抗体の従来の産生方法がしばしば効率が悪いという事実を含む種々の要因によって厄介である。例えば、ヒトの患者は一般に、倫理的および安全性への配慮から、殆どの抗原で十分に免疫され得ない。従って、特定の抗原に対して、１０8モル以上の有用な親和性をもつヒトモノクローナル抗体分離の報告はほとんどない（McCabe et al,Cancer Research,(1988),48,4348-4353）。また、ドナー初回抗原刺激細胞からの抗−ウイルス性ヒトモノクローナル抗体の分離は厄介であることが判明した。例えば、ゴルニーは、ＨＩＶ陽性ドナーからの末梢血液単核細胞（ＰＭＢＣ'ｓ）のＥＢＶ形質転換培養物の１４，３２９のうちのたった７つが、安定で抗−ＨＩＶ抗体産生細胞株に特異的であったと報告している（Gorny et al,Proc.Natl.Acad.Sci.(1989),86:1624-1628）。
今日まで、多くのヒト抗−腫瘍抗体が、癌患者からの末梢血リンパ球（ＰＢＬｓ）（Irie et al,Br.J.Cancer,(1981),44:262）または腫瘍放出リンパ節リンパ球（Schlom et al,Proc.Natl.Acad.Sci.(1980),77:6841-6845,Cote et al,Proc.Natl.Acad.Sci.(1983),80:2026-2030）から生産された。しかしながら、このような抗体はしばしば細胞間で反応し、従って治療的には効果のない抗原（Ho et al,In Hybridoma Technology,Amsterdam(1988),37-57）、またはＩgＭの種類（McCabe et al,Cancer Research,(1988),48,4348-4353）、ＩgＧ類より固形癌に浸透する能力の低い抗体の種類であった。これらのうちヒト抗体が臨床試験まで移行したのがほとんどない（Drobyski et al,R.C.Transplantation(1991),51,1190-1196）ことは、取り出された抗体が最適状態に及ばない品質をもっていたことを示唆している。さらに、これらの方法は試験用ドナー初回抗原刺激Ｂ細胞を開発したから、これらの細胞が有用なモノクローナル抗体の取得の最適資源ではないことは明らかである。
最近、初回抗原刺激されたドナーからのヒト抗体の生産は、ヒトＢ細胞の増加をもたらすＣＤ４０での刺激により（Banchereau et al,F.Science(1991),251:70,Zhang et al,J.Immunol.(1990),144,2955-2960,Tohma et al,J.Immunol.(1991),146:2544-2552）または不死化への余分のインビトロの追加免疫段階のプライマーにより（Chaudhuri et al,Cancer Supplement(1994),73,1098-1104）、改善されてきた。この原理は、初回抗原刺激されたドナー（４２−４４）からの細胞を用いてサイトメガロウイルス、エプスタイン−バールウイルスおよびヘモフィラス・インフルエンザに対するヒトモノクローナル抗体の生産に利用され、他の方法（３２）で得られたものより著しく高い収率を示した。
さらに、ドナー初回抗原刺激のために、健康なドナーからのリンパ球の免疫およびエクスビボ培養が報告された。初回抗原刺激されたドナーからのＰＢＬ細胞のエクスホマイン追加免疫を用いたヒトモノクローナル抗体の生産のいくつかの成功が報告された（Maeda et al,Hybridoma(1986),5:33-41,Kozbor et al,J.Immunol.(1984),14:23,Duchosal et al,Nature(1992),355:258-262）。インビトロの免疫の実現可能性は、最初ネズミリンパ球を用いて１９６７年にミシェルおよびダットンによって示された（Mishell et al,J.Exp.Med(1967),126:423-442）。１９７３年に、ホフマンはヒトリンパ球を成功裡に免疫化した（Hoffman et al,Nature(1973),243:408-410）。また、初回抗原刺激の成功は、末梢血液から（Luzzati et al,J.Exp.Med.(1975),144:573-585,Misiti et al,J.Exp.Med.(1981),154:1069-1084,Komatsu et al,Int.Archs.Allergy Appl.Immunol.(1986),80:431-434,Ohlin et al,C.A.K.Immunology(1989),68:325(1989)）、扁桃腺（Strike et al,J.Immunol.(1978),132:1789-1803）、および脾臓、この脾臓は外傷から得られた脾臓（Ho et al,In Hybridoma Technology,Amsterdam(1988),37-57,Boerner et al,J.Immunol.(1991),147:86-95,Ho et al,J.Immunol.(1985),135:3831-3838,Wasserman et al,J.Immunol.Meth.(1986),93:275-283,Wasserman et al,J.Immunol.Meth.(1986),93:275-283,Brams et al,Hum.Antibod.Hybridomas(1993),4,47-56,Brams et al,Hum.Antibod.Hybridomas(1993),4,57-65）および原発性血小板減少症（ＩＴＰ）患者からの脾臓（Boerner et al,J.Immunol.(1991),147:86-95,Brams et al,Hum.Antibod.Hybridomas(1993),4,47-56,Brams et al,Hum.Antibod.Hybridomas(1993),4,57-65,McRoberts et al,"In Vitro Immunization in Hybridoma Technology",Elsevier,Amsterdam(1988),267-275,Lu et al,P.Hybridoma(1993),12,381-389）からのリンパ球を用いて報告された。
インビトロ免疫はかなりの利点、例えば、容易に再現可能な免疫、適当な培養および手技によって、それ自体抗体分類の手技を容易にする（Chaudhuri et al,Cancer Supplement(1994),73,1098-1104）。また、自己抗原に対するインビボ耐性がＩＶＩ間に広がらない（Boerner et al,J.Immunol.(1991),147:86-95,Brams et al,J.Immunol.Methods(1987),98:11）との証拠がある。従って、この技術は自己抗原、例えば、癌マーカーおよび自己免疫に関与する受容体に対する抗体の生産に適用し得る。
インビトロの、例えば、癌関連抗原（ＴＡＡｓ）（Boerner et al,J.Immunol.(1991),147:86-95,Borrebaeck et al,Proc.Natl.Acad.Sci.(1988),85:3995）のみで免疫刺激した種々の抗体に対する応答の発生が報告されている。しかしながら、得られた抗体は残念ながら、典型的なＩgＭであり、ＩgＧサブクラスではなく（McCabe et al,Cancer Research,(1988),48,4348-4353,Koda et al,Hum.Antibod.Hybridomas,(1990)）、１：１５、２次（ＩgＧ）応答は免疫ドナーからのリンパ球を用いたプロトコルでのみ報告された。従って、これらのプロトコルは１次免疫応答の誘発には成功するが、再応答の発生にはドナー免疫細胞を必要とすると思われる。
また、インビトロにおけるヒトモノクローナル抗体を効果的に誘導するために一般的なプロトコルを開発するため、培養および免疫の変数を系統的に分析する研究が行われた（Boerner,J.Immunol.(1991),147:86-95,Brams et al,Hum.Antibod.Hybridoms(1993),4,47-56,Lu et al,Hybridoma(1993),12,381-389）。これにより、被験歴のないヒト脾臓細胞のＩＶＩによって誘導されたフェリチンに特異的なヒトモノクローナル抗体の分離が得られた（Boerner et al,J.Immunol.(1991),147:86-95）。本研究によりまた、あらたな二次（ＩgＧ）応答が完全にインビトロで誘導され得るプロトコルが得られた（Brams et al,Hum.Antibod.Hybridomas(1993),4,57-65）。
しかしながら、ＩＶＩの非常に有利な利点にもかかわらず、このような方法の効果は、免疫細胞が培養容器の単層で成長するという事実のため厳しく制限される。反対に、三次元構造を有するインビボの胚中心は免疫応答の活性相中脾臓に観察される。これらの三次元構造には、多くの免疫学者によりＢ細胞の抗原−特異的活性化の部位を比較すると信じられている抗原提示細胞によって取り囲まれている活性化Ｔ−およびＢ−細胞が含まれる。
天然の脾臓環境に代替するものは、「重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）」マウスなどの免疫易感染性動物宿主中の脾臓条件の「再現」または模倣である。ヒトリンパ球は、ＳＣＩＤのマウス（hu−ＳＣＩＤ）により容易に養子免疫され、高濃度の免疫グロブリンを産生する（Mosier et al,Nature(1988),335:256,McCune et al,L.Science(1988),241,1632-1639）。さらに、再構築のために用いられたドナー患者が特定の抗原に暴露されたならば、同じ抗原に対する強い二次応答がこのようなマウス中に誘導され得る。例えば、Duchosal et al,Nature(1992),355:258-262は、１７年前に破傷風トキソイドで予防接種されたドナー患者のヒト末梢血Ｂ−細胞がＳＣＩＤ環境中に再刺激され、高濃度、すなわち約１０4が産生され得たと報告した。さらに彼らは、ヒトの細胞から抽出されたラムダおよびＭ１３ファージのコンビナトリアルライブラリー法（Huse et al,R.A.Science(1989),246:1275）を用いて、２種のヒト抗−ＴＴ抗体遺伝子のクローニングおよび発現を報告している。報告された抗体の抗原親和性は１０8−１０9／Ｍの範囲であった。しかしながら、このプロトコルはドナー患者の初回抗原刺激細胞が必要であり、収率が非常に低く、３７０,０００クローンのライブラリーから２クローンのみが得られた。
従って、かってはhu−ＳＰＬ−ＳＣＩＤのマウスは、抗原に対するひとモノクローナル抗体を産生するためだけに利用され、ドナー患者は天然に効率よく初回抗原刺激されるかまたは予防接種
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されるかのいずれかであり、それは多くの場合、ウイルス性または細菌性抗原の暴露を伴う。また、hu−ＳＣＩＤ動物モデルを用いて報告された血清力価のレベルは、正常なマウスの免疫処置により典型的に行われたものより著しく低い。
さらに、一次抗体応答の誘導の後にナイーブなヒトリンパ球を用いたhu−ＳＣＩＤのマウスに二次抗体応答の誘導が起こり得る２種のプロトコルが開示された。しかしながら、これらのプロトコルの両方の使用は実質的に制限される。第１のプロトコルでは、一次応答は、肝臓、胸腺およびリンパ節が外科的に移植されたヒト胎児性hu−ＳＣＩＤのマウス中に誘導される。しかしながら、この方法は、入手が非常に制限される胎児組織、並びにプロトコルの複雑な外科的方法（McCune et al,L.Science(1988),241,1632-1639）により厳しく制限される。第２のプロトコルでは、致死量の放射線照射した正常なマウスが、Ｔ−およびＢ−細胞摘出ヒト骨髄細胞およびＳＣＩＤのマウス骨髄細胞を用いて再構築される（Lubin et al,Science,(1991),252-427）。しかしながら、この方法は、４カ月のインキュベート期間が必要なので不利である。さらに、両方のプロトコルは、非常に低い抗体力価レベル、すなわち１０4以下という結果である。
また、Carlsson et al,J.Immunol.(1992),148:1065-1071は、抗原（破傷風トキソイド）初回抗原刺激ドナーからのＰＢＭＣｓを用いた方法を１９９２年に報告している。その細胞は短時間のインビトロ培養およびＳＣＩＤマウスへの移入前の初回抗原刺激期間にマクロファージおよびＮＫ細胞をまず激減させた。ついで、hu−ＳＰＬ−ＳＣＩＤのマウスを抗原で追加免疫した。この方法では、ＳＰＬ−ＳＣＩＤ血清中、５×１０5まで、平均ＴＴ特異ひとＩgＧ力価＝１０4という結果が報告された。
ヒトモノクローナル抗体を不断に、理想的には永久的に分泌する細胞を得るために、不死化Ｂ細胞の産生を必要とする。Ｂ細胞の不死化は、一般に、次の４つの方法のうちの１つにより行われ得る：(i)ＥＢＶでの形質転換、(ii)マウス−ヒトのヘテロ融合、(iii)ＥＢＶ形質転換後のヘテロ融合、および(iv)コンビナトリアル免疫グロブリン遺伝子ライブラリー技術。
ＥＢＶ形質転換は、多数の報告において、主に、抗ＨＩＶ抗体の産生に上手く使用されている（Gorny,et al,Proc.Natl.Acad.Sci.(1989),86:1624-1628,Posner,et al.J.Immunol.(1991),146:4325-32）。主な利点は、Ｂ細胞２００個あたり約１個が形質転換されるようになることである。しかし、ＥＢＶ形質転換細胞は、一般的には、不安定であり、主に、少量のＩgＭ抗体を産生し、十分にクローン化せず、また培養してから数カ月後には抗体を製造しなくなる。ヘテロ融合（Carrol,et al,J.Immunol.Meth.(1986),89:61-72）は、一般的には、高レベルのＩgＧ抗体を分泌するハイブリドーマを産生するのに有利である。ハイブリドーマはまた、希釈を制限することにより、容易にクローン化もする。しかし、不利な点は、収率が低いこと、すなわち、２０,０００個のリンパ球あたり１個以下のハイブリドーマにしかならないことである（Boerner et al,J.Immunol.(1991),147:86-95,Ohlin,et al,C.A.K.Immunology(1989),68:325,Xiu-mei et al,Hum.Antibod.Hybridomas(1990),1:42,Borrebaeck C.A.K.Abstract at the "Second International Conference" on "Human Antibodies and Hybridomas,"April 26-28,1992,Cambridge,England）。ＥＢＶ形質転換後、ヘテロ融合を組み合わせると、次の２つの利点が得られる：(i)ＥＢＶ形質転換後、ヒトＢ細胞がより容易に融合パートナーと融合する、および(ii)より安定かつより多くハイブリドーマを産生する（Ohlin,et al,Immunology(1989),68:325,Xiu-mei et al,Hum.Antibod.Hybridomas(1990),1:42,Borrebaeck C.A.K.Abstract at the "Secomd International Conference" on "Human Antibodies and Hybridomas,"April 26-28,1992,Cambridge,England）。最後の技術、すなわち、コンビナトリアル疫グロブリン遺伝子ライブラリー技術の利点は、非常に大きなライブラリーがＭ１３ Ｆab発現技術によってスクリーニングされ得（Huse,et al,Science(1989),246:1275,William Huse,Antibody Engineeromg:A Practical Guide,Borrebaeck C.A.K.,ed.5:103-120）、またその遺伝子が容易に産生細胞系へ伝達され得るという事実である。しかし、その収率は、一般的には、３７０，０００クローンあたり約１個と極めて低いオーダーである（Duchosal,et al,Nature(1992),355:258-262）。
すなわち、上記によれば、より効果的なヒトモノクローナル抗体、特にＲＳＶに特異的な抗体、の生産方法は非常に利益があることは明らかである。さらに、現在入手し得るものより、優れた結合活性、特異性およびエフェクター機能を有するＲＳＶ−Ｆタンパク質に特異的なヒト抗体もまた強く待望されていることもまた明らかである。
本発明の目的
本発明の目的は所望の抗原に特異的な高力価のヒト抗体の改良された産生方法を提供することである。
本発明のより具体的な目的は、(i)ナイーブなインビトロヒト脾臓細胞の初回抗原刺激、(ii)初回抗原刺激された脾臓細胞の免疫易感染性ドナー、例えばＳＣＩＤマウス、への伝達、および(iii)抗原での追加免疫を含む、高力価ヒト抗体の新規産生方法を提供することである。
本発明の別の具体的な目的は、呼吸性シンシチウムウイルス（ＲＳＶ）、および特にＲＳＶ融合（Ｆ）タンパク質に特異的なヒトモノクローナル抗体の改良された産生方法を提供することである。
本発明の別の目的は、主としてＩgＧを分泌するＥＢＶ不死化Ｂ−細胞の形成に好都合であるＥＢＶ不死化Ｂ−細胞の改良された産生方法を提供することである。
本発明のより具体的な目的は、
(i)ナイーブなインビトロヒト脾臓細胞の初回抗原刺激；
(ii)そのようなインビトロ初回抗原刺激された脾臓細胞を免疫易感染性ドナー、例えばＳＣＩＤマウス、への伝達；
(iii)抗原での免疫易感染性ドナーの追加免疫；
(iv)抗原を追加免疫された免疫易感染性ドナー、例えばＳＣＩＤマウス、からヒト抗体産生Ｂ細胞の分離；
(v)上記分離されたヒト抗体産生Ｂ細胞のＥＢＶ形質転換
を含む主としてＩgＧ類を分泌するＥＢＶ不死化Ｂ−細胞の改良された産生方法を提供することである。
本発明の別の目的は、主としてヒトＩgＧ類を分泌する、ＳＣＩＤマウスから得られるＥＢＶ形質転換ヒトＢ細胞を含む新規組成物を提供することである。
本発明のより具体的な目的は、
(i)ナイーブなインビトロヒト脾臓細胞の初回抗原刺激；
(ii)得られたインビトロ初回抗原刺激されたナイーブな脾臓細胞を免疫易感染性ドナー、例えばＳＣＩＤマウス、への伝達；
(iii)抗原での免疫易感染性ドナー、例えばＳＣＩＤマウスの追加免疫；
(iv)抗原を追加免疫された免疫易感染性ドナー、例えばＳＣＩＤマウス、からヒト抗体産生Ｂ細胞の分離；
(v)上記分離されたヒト抗体産生Ｂ細胞のＥＢＶ形質転換
を含む方法によって産生される、主としてヒトＩgＧ類を分泌する、ＥＢＶ形質転換ヒトＢ−細胞を含む新規組成物を提供することである。
本発明の別の具体的な目的は、２×１０-9モル以下のＲＳＶ Ｆ−タンパク質に対して親和性を有するＲＳＶ中和ヒトモノクローナル抗体を産生することである。
さらに、本発明の別の目的は、２×１０-9モル以下のＲＳＶ Ｆ−抗原に対して親和性を有する、ＲＳＶ中和ヒトＩgＧモノクローナル抗体を分泌するＥＢＶ不死化細胞株を提供することである。
本発明のより具体的な目的は、それぞれ、ＲＦ−２およびＲＦ−１と称され、インビボでＲＳＶを中和し、各々２×１０-9以下のＲＳＶ Ｆ−タンパク質に対して親和性を有する、ヒトモノクローナル抗体を分泌する、２種のＥＢＶ不死化細胞株、ＲＦ−２およびＲＦ−１を提供することである。
本発明の別の目的は、ＲＦ−１またはＲＦ−２の重鎖および軽鎖可変領域をコードするＤＮＡ配列で真核細胞をトランスフェクションしてＲＦ−１またはＲＦ−２の可変領域を含むヒト抗体を分泌するトランスフェクタントを産生することである。
本発明のより具体的な目的は、ＲＦ−１またはＲＦ−２重鎖および軽鎖可変領域を発現するトランスフェクションされたＣＨＯ細胞を提供することである。
本発明の別の目的は、ＲＳＶ Ｆ−タンパク質に特異的であり、ＲＳＶ Ｆ−タンパク質に対して２×１０-9モル以下のＫｄを示す、ＲＳＶ中和ヒトモノクローナル抗体の治療的または予防的有効量を投与してヒトのＲＳＶ感染を治療または予防することである。
本発明のより具体的な目的は、ＲＦ−１またはＲＦ−２の可変重鎖および軽鎖領域を含み発現するトランスフェクションされた真核細胞中に発現されるＲＦ−１またはＲＦ−２またはヒトモノクローナル抗体の治療的または予防的有効量を投与してヒトのＲＳＶ感染を治療または予防することである。
本発明の別の目的は、薬学的に許容され得る担体または賦形剤と組み合わせて、インビトロでＲＳＶを中和し、２×１０-9モル以下のＲＳＶ Ｆ−タンパク質に対してＫｄを有するＲＳＶ Ｆ−タンパク質に特異的なヒトモノクローナル抗体の治療的または予防的有効量を含む、ＲＳＶ感染を治療または予防するワクチンを提供することである。
本発明のより具体的な目的は、薬学的に許容され得る担体または賦形剤と組み合わせて、ＲＦ−１またはＲＦ−２の可変重鎖および軽鎖領域をコードするＤＮＡ配列を含み発現するトランスフェクションされた真核細胞から誘導される、ＲＦ−１またはＲＦ−２またはヒトモノクローナル抗体の治療的または予防的有効量を含む、ヒトのＲＳＶ感染を治療または予防するワクチンを提供することである。
本発明の別の目的は、ＲＳＶ融合（Ｆ）−タンパク質に対して２×１０-9モル以下の親和性を有するヒトモノクローナル抗体を用いて、試料、例えばたん、中のＲＳＶの存在を検査することによりＲＳＶ感染の診断方法を提供することである。
さらに、本発明の別の目的は、ＲＳＶ融合（Ｆ）−タンパク質に対して２×１０-9モル以下の親和性を有する、ＲＳＶ Ｆ−タンパク質に特異的なヒトモノクローナル抗体を含み、その抗体が直接または間接的に適当なレポーター分子、例えば酵素または放射性核種に結合している、ＲＳＶ感染の検出のための新規免疫プローブおよび検査キットを提供することである。好ましい実施態様において、これらのヒトモノクローナル抗体は、ＲＦ−１またはＲＦ−２の可変重鎖および軽鎖領域でトランスフェクションされている真核性細胞、例えばＣＨＯ細胞、中に産生されたＲＦ−１またはＲＦ−２または組換ヒトモノクローナル抗体を含む。
発明の簡単な説明
本発明は、その最も広い態様において、所望の抗原、好ましくはヒト疾患状態の予防、治療または検出に関与する抗原に対するヒト抗体の新規製造方法に関する。これら方法は、ナイーブな（naive）ヒト脾臓細胞をインビトロで初回抗原刺激し、得られたインビトロで初回抗原刺激した脾臓細胞を免疫無防備状態にあるドナー、たとえばＳＣＩＤマウスに移し、ついで該免疫無防備状態にあるドナーに抗原をブースター投与することを含む。
本発明はまた、ＩgＧを分泌する細胞の産生に有利なエプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）不死化Ｂ細胞の製造方法であって、ナイーブなヒト秘蔵細胞をインビトロで初回抗原刺激し、得られた初回抗原刺激した脾臓細胞を免疫無防備状態にあるドナー、たとえばＳＣＩＤマウスに移し、該免疫無防備状態にあるドナーに抗原をブースター投与し、ヒト抗体を分泌する、好ましくはＩgＧを分泌するＢ細胞を該抗原ブースター投与したドナー、たとえばＳＣＩＤマウスから単離し、ついで該単離したヒト抗体分泌細胞をＥＢＶでトランスフォーメーションすることを含む方法にも関する。
本発明はさらに詳しくは、ＲＳＶ融合（Ｆ）タンパク質に対して高親和性を示し、ＲＳＶ感染を中和もする、ＲＳＶ、とりわけＲＳＶ Ｆタンパク質に対するヒト抗体の製造の改良法、並びにこれら方法の結果得られるヒトモノクローナル抗体に関する。このことは、好ましくは、ナイーブなヒト脾臓細胞をインビトロでＩ１−２および任意にＲＳＶ Ｆタンパク質で初回抗原刺激し、得られたインビトロで初回抗原刺激した脾臓細胞を免疫無防備状態にあるドナー、たとえばＳＣＩＤマウスに移し、ついでＲＳＶ Ｆタンパク質をブースター投与して、ＲＳＶ Ｆタンパク質に対する高親和性、すなわち≦２×１０-9モルを有する中和抗ＲＳＶ Ｆタンパク質ヒト抗体を分泌するヒトＢ細胞を産生させることにより行う。
得られたＢ細胞は、ヒト抗ＲＳＶ Ｆタンパク質モノクローナル抗体を定常的かつ安定に提供できるように不死化するのが好ましい。好ましい態様において、Ｂ細胞を抗原ブースター投与したＳＣＩＤマウスから単離し、ついでＥＢＶウイルスでトランスフォームして、ヒトＩgＧを優勢的に分泌するＥＢＶトランスフォームしたヒトＢ細胞を産生させる。
ついで、これら細胞をクローニングして、ＲＳＶ Ｆタンパク質に対する高親和性、すなわち≦１０-7、好ましくは≦２×１０-9モルを有するヒトモノクローナル抗体を分泌するＥＢＶトランスフォームした細胞株を選択する。
本発明はまた、かかる抗ＲＳＶ Ｆタンパク質ヒトモノクローナル抗体の治療剤および／または予防剤並びに診断剤としての使用にも関する。上記のように、本発明の方法の結果、ＲＳＶ Ｆタンパク質に対する高親和性を示す、すなわちＲＳＶ Ｆタンパク質に対する≦２×１０-9モルのＫｄを有し、インビトロでＲＳＶを中和もするヒトモノクローナル抗体が産生される。それゆえ、これら抗体は、ＲＳＶ Ｆタンパク質が種々のＲＳＶ単離物において高度に保存されている表面タンパク質であることが事実であるとしたなら、ＲＳＶ感染の予防または治療のための予防剤および治療剤として理想的に適している。また、本発明のＲＳＶ Ｆタンパク質に対するヒトモノクローナル抗体の親和性および特異性が高いのであるなら、これら抗体はまたＲＳＶ感染を診断するのに用いることもできる。
さらに詳しくは、本発明は、ＲＳＶ Ｆタンパク質に対する２つの特別のヒトモノクローナル抗体、すなわち、ＲＦ−１およびＲＦ−２、並びにそれから得られる組換えヒト抗体（該抗体は、好ましくはＣＨＯ細胞（該細胞はＲＦ−１またはＲＦ−２の可変重鎖および軽鎖ドメインをコードするＤＮＡ配列でトランスフェクションされている）中で産生される）を提供する。これら抗体は、ＲＳＶ感染の治療または予防のための予防剤および／または治療剤として特に有用である。さらに、これら抗体は診断剤として有用である。なぜなら、これら抗体はＲＳＶ Ｆタンパク質に高親和性で結合する、すなわちＲＳＶ Ｆタンパク質に対する≦２×１０-9の親和性を有するからである。これら抗体は治療剤として特に有用である。なぜなら、これら抗体はＲＳＶ Ｆタンパク質に対して高親和性および特異性を有し、ＲＳＶ感染をインビトロで有効に中和する能力を有するからである。
【図面の簡単な説明】
図１は、抗Ｆタンパク質ｈｕ−ＳＰＬ−ＳＣＩＤ血清を用いたＦタンパク質のイムノブロットを示す：（Ａ）および変性（Ｂ）Ｆタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、ウエスタンブロッティングによりニトロセルロースに移したことに注意。ニトロセルロースストリップを、陽性の対照であるマウス抗Ｆタンパク質ＭＡｂ（レーン１Ａおよび１Ｂ）、陰性の対照であるｈｕ−ＳＰＬ−ＳＣＩＤ血清抗ＴＴ（レーン２Ａおよび２Ｂ）およびマウス＃６（レーン３Ａおよび３Ｂ）、マウス＃３（レーン４Ａおよび４Ｂ）およびマウス＃４（レーン５Ａおよび５Ｂ）からのｈｕ−ＳＰＬ−ＳＣＩＤ抗Ｆタンパク質血清と反応させた。
図２は、ｈｕ−ＳＰＬ−ＳＣＩＤ血清抗Ｆタンパク質を用いたＨＥＰ−２細胞の免疫蛍光を示す。非感染（左）およびＲＳＶ感染したＨＥｐ−２細胞を、ブースター投与の１５日後に採取した１：５０希釈ｈｕ−ＳＰＬ−ＳＣＩＤマウス＃６からの血清と反応させた。
図３は、プラスチック結合したアフィニティー精製ＲＳＶ Ｆタンパク質への精製ＲＦ−１およびＲＦ−２の反応性を示す。参照ヒト抗ＲＳＶ血清、ＬＮの反応性をも記録してある。ＥＬＩＳＡプレートを５０ｎｇのＲＳＶ Ｆタンパク質でコーティングした。
図４は、腫瘍細胞上澄み液から精製したＲＦ−１（レーン２）およびＲＦ−２（レーン３）ヒトＭＡｂのＩＥＦを示す。ＩＥＦは３−１０のｐＨ勾配で行った。レーン１はｐｉ標準を示す。
図５は、種々の量のＲＦ−１ついでＦＩＴＣ−標識ＧＡＨ ＩgＧとともにインキュベートしたＨＥｐ−２細胞およびＲＳＶ感染ＨＥｐ−２細胞、１×１０6の間接免疫蛍光フローサイトメトリーアッセイを示す。全集団の相対平均強度を記録してある。
図６は、ヒト抗体の発現に使用するＮＥＯＳＰＬＡベクターを示す。ＣＭＶ＝サイトメガロウイルスプロモーター。ＢＥＴＡ＝マウスβグロビン主要プロモーター。ＢＧＨ＝ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル。ＳＶＯ＝ＳＶ４０複製起点。Ｎ１＝ネオマイシンホスホトランフェラーゼエクソン１。Ｎ２＝ネオマイシンホスホトランフェラーゼエクシン２。ＬＩＧＨＴ＝ヒト免疫グロブリンκ定常領域。Heavy＝ヒト免疫グロブリンγ１またはγ４ＰＥ定常領域。Ｌ＝リーダー。ＳＶ＝ＳＶ４０ポリアデニル化領域。
図７ａは、ＲＦ−１の可変軽鎖ドメインのアミノ酸配列および核酸配列を示す。
図７ｂは、ＲＦ−２の可変重鎖ドメインのアミノ酸配列および核酸配列を示す。
図８ａは、ＲＦ−２の可変重鎖ドメインのアミノ酸配列および核酸配列を示す。
図８ｂは、ＲＦ−１の可変軽鎖ドメインのアミノ酸配列および核酸配列を示す。
図９ａは、ＲＦ−１軽鎖、リーダー配列、およびヒトκ定常ドメイン配列のアミノ酸配列および核酸配列を示す。
図９ｂは、ＲＦ−１重鎖、リーダー配列、およびヒトγ／定常ドメイン配列のアミノ酸配列および核酸配列を示す。
図１０は、図９ａ〜９ｃに示すＲＦ−１核酸配列およびヒトγ／定常ドメインを含む、ＮＳＫＥ１と称するＮＥＯＳＰＬＡベクターの模式図を示す。
図１１ａは、ＲＦ−２軽鎖、リーダー配列、およびヒトκ定常ドメイン配列のアミノ酸配列および核酸配列を示す。
図１１ｂは、ＲＦ−２重鎖、リーダー配列、およびヒトγ／定常ドメイン配列のアミノ酸配列および核酸配列を示す。
図１１ｃは、ヒトγ／定常ドメインのアミノ酸配列および核酸配列を示す。
図１２は、図１１ａ〜１１ｃに示すＲＦ−２核酸配列およびヒトγ／定常ドメイン配列を含む、ＮＳＫＧ１と称するＮＥＯＳＰＬＡベクターの模式図を示す。
発明の詳細な説明
上記のように、本発明は、所望の抗原、好ましくはヒト疾患状態に関与する抗体に対するヒトモノクローナル抗体の新規な非常に効率的な製造方法を提供する。ヒト疾患状態に関与する抗原は、一般に抗体の適当な治療標的を含む表面抗原であろう。たとえば、これにはウイルスの表面タンパク質およびヒト癌細胞の表面上で発現される抗原が含まれる。好ましい態様において、表面抗原はＲＳＶの融合タンパク質（Ｆタンパク質）を含むであろう。
ヒト疾患状態には、例示として、ウイルス感染、たとえば、ＲＳＶ、パピローマウイルス、肝炎、ＡＩＤＳなど、癌、細菌感染、酵母感染、寄生体感染、たとえばマラリアなどが含まれる。本質的に、ヒト疾患状態は、特定の抗原に特異的なヒトモノクローナル抗体の投与によって潜在的に防御または治療が可能なあらゆるヒト疾患状態を包含することを意図している。
本発明のヒトモノクローナル抗体の製造方法は、本質的に、ナイーブヒト脾臓細胞のインビトロでの初回抗原刺激、これら脾臓細胞の免疫無防備状態のドナーへ、すなわちＳＣＩＤマウスの移行、ついで該脾臓細胞を投与したＳＣＩＤマウスへの抗原ブースター投与の組み合わせを含む。驚くべきことに、ヒト抗体を製造するためのこれら２つの公知方法の組み合わせが相乗的結果を生み出すことがわかった。とりわけ、免疫した抗原に対する非常に高められた抗原特異的応答、およびＩgＧイソ型のヒトモノクローナル抗体の非常に高い力価が得られる。さらに詳しくは、この組み合わせにより、これまでにない高い二次応答が得られることがわかった：すなわち、ｈｕ−ＳＰＬ−ＳＣＩＤ血清でのヒトＩgＧ応答はＳＣＩＤでのナイーブ細胞の移行から得られる結果に比べて１０倍高く、特異的抗体応答は１０００倍増加した。また、得られる抗体は活動昴進（hyperactive）免疫動物で実験的に産生される抗体に匹敵する高い親和性および特異性を有することがわかっている。また、かかる予期しない結果を得るためにナイーブな脾臓細胞を用いる場合には、インビトロと得られたｈｕ−ＳＰＬ−ＳＣＩＤマウス中に導入した後との両場合に抗原で攻撃する必要があることもわかった。また、抗原のブースター投与の直前に、別の新たな初回抗原刺激していない脾臓細胞をｈｕ−ＳＰＬ−ＳＣＩＤドナーに導入することも必須ではないが好ましい。このことにより、抗体応答が一層さらに促進されることがわかった。
本発明は、ナイーブなヒト細胞から二次応答を生成するための最適のインビトロ一次およびブースタープロトコールが以前に開示された［ブラムズ（Brams）ら、Hum.Antibod.Hybridomas（１９９３）、４、５７−６５］後に開発された。ブラムズら、Hum.Antibod.Hybridomas（１９９３）、４、５７−６５のプロトコールは、一つの抗原攻撃に供した培養液から得られるものに比べて約２倍から１０倍高い抗原特異的なＩgＧ応答を与えることがわかった。このインビトロ免疫（ＩＶＩ）プロトコールは、非常に異なる抗原、すなわち、ウマフェリチン（ＨｏＦ）、カルモデュリン、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、マウスＩgＧ、トランスフェリン、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、Ｔ細胞依存性タンパク質担体に結合したジニトロフェニル（ＤＮＰ）およびＲＳＶ融合（Ｆ）タンパク質を用いて発展され、最適化された。
本質的に、このプロトコールは、培養を開始した後の１日目に脾臓細胞培養液を１：１の比率の自己脾臓細胞とともに抗原で再刺激することを含む。このプロトコールを用いて測定されたＩgＧ応答は、繰り返し抗原暴露の結果であったが、二次応答と等価なものであることが示された。
これら実験はさらに、外傷性脾臓およびＩＴＰ脾臓を含む完全な脾臓がリンパ球の最適の採取源であることを示した。対照的に、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）および扁桃またはリンパ節からの細胞は抗原特異的な応答を誘発するうえで劣っていることがわかった。さらに、細胞成分の枯渇または中和はより悪い応答となった［ベーナー（Boerner）ら、J.Immunol.（１９９１）、１４７：８６−９５］。また、これら実験は、所定の脾臓細胞調製物および抗原に対して独特の最適抗原濃度が存在することを示した。
それゆえ、ナイーブなヒト脾臓細胞から二次応答を生成するための最適なインビトロ一次およびブースタープロトコールが確立されたら、このプロトコールをヒトモノクローナル抗体を産生するための以前のインビボ法、すなわちＳＣＩＤマウスと組み合わせることが考えられた。試験を行うまでは、初回抗原刺激した脾臓細胞の投与がＳＣＩＤマウスによる所定抗原に対するヒトモノクローナル抗体の産生に対して、または維持されるべきヒトリンパ球の能力に対して、いかなる影響を及ぼすか（もし、あるなら）については知られていなかった。しかしながら、このことが抗原ブースト（boost）の促進およびインビトロ初回抗原刺激したナイーブな脾臓細胞の発現の促進をもたらすと思われた。
この点に関し、リンパ球はＳＣＩＤ中でそれ自体を確立し数カ月生存しうることが以前に報告されている［マッキューン（McCune）ら、Science（１９８８）、２４１、１６３２−１６３９、ルビン（Lubin）ら、Science（１９９１）、２５２：４２７］。しかしながら、上記に記載したように、ＳＣＩＤまたは抗原に対するヒトモノクローナル抗体を用いた従来法は、生まれつきまたはワクチン接種により以前に抗原に暴露されたドナーからの細胞を用いており、一般に高ヒト抗体力価とはならなかった。
実に驚くべきことに、ｈｕ−ＳＣＩＤモデルにおいてヒトナイーブ脾臓細胞からの二次応答を産生させるためのインビトロ一次およびブースタープロトコール［ブラムズら、Hum.Antibod.Hybridomas（１９９３）、４、５７−６５］の組み合わせが、免疫した抗原に対する非常に有意な抗原特異的ＩgＧ応答によって示されるように、相乗的な結果となった。
さらに、これら方法の組み合わせから（ウマフェリチン（ＨｏＦ）をモデル抗原として使用）以下のことがわかった：
(i)ＳＣＩＤに移す前にインビトロ免疫段階を導入することが、有意の抗原特異的応答を信頼性をもって誘発するのに必須である；
(ii)ＳＣＩＤマウス中でヒト脾臓細胞の最適の維持を達成するためにヒト細胞を腹腔内に移さなければならない；
(iii)最適のインビトロ培養は約３日である；
(iv)ＩＬ−２および任意にＩＬ−４またはＩＬ−６をインビトロで使用すると、ｈｕ−ＳＰＬ−ＳＣＩＤマウスにおいて抗原特異的応答の最高の抗体力価が得られる；
(v)マウスでのｈｕ−ＳＰＬ−ＳＣＩＤは、アジュバント、たとえば、完全フロイントアジュバント（ＦＣＡ）および／またはミョウバン中に懸濁した抗原をブースター投与するのが好ましい；
(vi)マウス由来であろうとヒト由来であろうとＮＫ細胞の死滅または中和は、驚くべきことに抗体産生に対して何ら利益をもたらさない。しかしながら、低ＮＫ株であるＳＣＩＤ−ベージュ（beige）マウスをインビトロ初回抗原刺激細胞の宿主として用いると、アジュバントの組み合わせ、すなわちＦＣＡおよびミョウバンを用いてブースター投与を行ったときに優れた応答が得られることがわかった；
(vii)ｈｕ−ＳＰＬ−ＳＣＩＤマウスの〜１／３の脾臓（リンパ節ではなく）を通常のＳＣＩＤに比べて２５倍まで拡張した。さらに、これらのうち、かかる脾臓中の細胞の２／３までが通常のヒトリンパ球膜マーカーに対して陽性であると試験された。
さらに詳しくは、本発明の方法は、ナイーブなヒト脾臓細胞をインビトロにて抗原で約１〜１０日間、好ましくは約３日間、初回抗原刺激し、該初回抗原刺激した細胞をＳＣＩＤマウスに移し、ついで該マウスを約３〜１４日後、好ましくは約７日後に抗原をブースター投与することを含む。このことにより、約２４日以降に、得られたｈｕ−ＳＰＬ−ＳＣＩＤマウスの血清中に高抗原特異的ＩgＧ応答が得られることが示された。一般に、血清の最終希釈力価は、ナイーブな抗原としてウマフェリチンを用いて約１０6（約５０ｍｇ ＩgＧ／ｍｌにおいて半最大応答）およびウイルス抗原、すなわちＲＳＶの融合タンパク質で想起（recall）応答が誘発される場合には１０7（約５ｍｇ ＩgＧ／ｍｌにおいて半最大応答）である。これら結果に基づき、他の抗原を用いた場合にも同様の応答が得られるであろうことが予想される。
上記のように、所望の抗体応答の最適な誘発にはｈｕ−ＳＰＬ−ＳＣＩＤマウスにおいてインビトロとインビボの両方でのヒト細胞の抗原攻撃が必要である。インビトロ初回抗原刺激の際にＩＬ−２が必要であること、およびＩＬ−２とともにＩＬ−４およびＩＬ−６を同時投与するとｈｕ−ＳＰＬ−ＳＣＩＤマウスにおける応答がさらに促進されることもわかった。さらに、ＳＣＩＤ再構成は容易になるが、放射線照射した（irradiated）同種リンパ球の同時腹腔内投与には依存しなかった。
さらに、抗体応答は脾臓ごとに有意の変異が存在することがわかった。たとえば、ある種の脾臓では抗原特異的な抗体応答を生成するために１０日目に抗原と自己の脾臓細胞とを同時に投与する必要があった。また、抗体応答レベルは、異なるｈｕ−ＳＰＬ−ＳＣＩＤマウスにおいて若干異なることがわかった。しかしながら、当業者であれば本明細書中の教示に基づいて、所定の抗原に対する最適の抗原特異的抗体応答を生成するのに適した条件を容易に選択することができる。
たとえば、幾つかの異なる脾臓調製物について、たとえばインビトロ免疫の１０日後に培養液中に特異的な抗体を産生する能力を試験することにより、最高の応答を同定することができる。さらに、各脾臓から多数の細胞が調製され解凍されるので、選択した脾臓から３日間の新たなインビトロ免疫を行い、ついでこれをＳＣＩＤマウスに移すことが可能である。対照的に、末梢血細胞は、かなり限られた量のＰＢＬしか１回の移行で１ドナーから回復できないことから、かかる最適化はできない。
上記で記載したように、従来の報告とは対照的に、本発明の方法では末梢血細胞を用いたときにヒトＮＫ活性の中和は脾臓に対して何ら影響を及ぼさないことがわかった。さらに、補体結合抗アシアロＧＭＩ抗体でＳＣＩＤ ＮＫ細胞を中和すると抗原特異的なＩgＧ応答な減少した。対照的に、ＮＫ細胞レベルの減少した株であるＳＣＩＤ／ベージュマウスを用いると、通常のＳＣＩＤに比べて抗原特異的なＩgＧ応答が有意に増加した。
さらに、２つの免疫経路、静脈内（ＩＶ）および腹腔内（ＩＰ）を、ＳＣＩＤマウスの再構成、すなわち該マウス中での脾臓細胞の維持およびヒト抗体の産生をもたらす能力について比較した。腹腔が細胞移行および免疫の最適の部位であることがわかった。さらに、現在までのところ、細胞の静脈内移行は０．０１μｇ／ｍｌを越えるヒトＩgＧがマウス血清中に検出されたときに決して再集団（repopulation）となることは認められていない。
また、得られたＩgＧ濃度は移行したヒト細胞の数と直接的な相関関係を有することもわかった。たとえば、ＳＣＩＤの再集団は、５×１０6のインビトロ初回抗原刺激脾臓細胞を腹腔内注射した場合には９２％であり、５×１０7のインビトロ初回抗原刺激脾臓細胞を腹腔内注射した場合には実質的に１００％であった。当業者であれば本明細書中の教示に基づいて、注射したインビトロ初回抗原刺激脾臓細胞の最適数を選択することができる。一般に、これは約１０4〜約１０8細胞、さらに好ましくは約１０6〜１０8細胞、最も好ましくは少なくとも約１０7〜１０8細胞の範囲であろう。
抗体応答は特定のアジュバントの存在下で行えることもわかった。さらに詳しくは、最大ヒト抗体応答は、ｈｕ−ＳＰＬ−ＳＣＩＤマウスを完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）中に懸濁した抗原またはＣＦＡとミョウバンとをいっしょに用いてブースター投与したときに達成されることが観察された。フェリチンをブースター投与したｈｕ−ＳＰＬ−ＳＣＩＤにおける試験は、ＣＦＡの方がミョウバンよりも優れたアジュバントであり、それぞれ３３ｍｇ／ｍｌおよび１３ｍｇ／ｍｌヒトＩgＧを誘起することを示した。ＣＦＡとミョウバンとの組み合わせはＳＣＩＤにおける応答を改善しなかった。しかしながら、これらアジュバントをＳＣＩＤ／ベージュ−ｈｕ（このマウスは減少したＮＫ細胞活性となる変異を有している）に用いるとＣＦＡ単独の場合に比べてＩgＧ産生が８〜１０倍増加する。しかしながら、他のアジュバントまたはそれらの組み合わせもまた同様のまたはより増大した結果をもたらすことが期待される。完全フロイントアジュバントとミョウバンとをいっしょに用いた場合の全ヒトＩgＧの最高濃度は約１０ｍｇ／ｍｌであり、特定のＩgＧの最高濃度は約５００μｇ／ｍｌモノクローナル抗体当量であった。
この方法をフェリチンとともに使用すると、特異性、反応性、およびＩg鎖イソ型の点で高度免疫したヤギ、ウサギおよびブタで得られるものに匹敵するポリクローナル抗体応答が得られた。ｈｕ−ＳＰＬ−ＳＣＩＤ血清抗体は、ほとんどＩgＧであり、高フェリチンの組織からの細胞にのみ結合し、低フェリチンまたはフェリチン陰性の組織からの細胞には結合せず、天然のフェリチンおよびウエスタンブロッティングにおける変性したフェリチンの両者を認識した。これら結果は、得られたヒト抗体の抗体濃度という点でも抗原特異性という点でも極めて予期しないものである。さらに、異なる抗原を用いて同様の結果が得られる。
注射後、ヒト細胞は２つの部位、すなわち腹腔およびマウス脾臓に蓄積する傾向があることがわかった。血液中には約７％未満のヒト細胞が認められたが、リンパ節および肝臓はヒト抗原のものであり、肥大した脾臓および場合によりある種の動物での腫瘍中では２５％〜３３％の細胞がヒト由来であった。これらヒト細胞は肥大した脾臓ではほとんどＢ細胞とＴ細胞ばかりであり、あとは少量のＣＤ１４+細胞（ほとんど単球）であった。
これら結果は、脾臓、リンパ節、肝臓および腹腔を調べるフローサイトメトリーにより決定した。ヒトの脾臓細胞が脾臓を再集団化（repopulated）した場合には、それはしばしば天然のＳＣＩＤ脾臓に比べて２５倍までサイズが大きくなっていることがわかった。摘出後すぐに測定したとき、ヒト細胞は脾臓中の全細胞数の約３０％までを構成し、残りは未知の起源のものであった。しかしながら、３日間培養した後には生存細胞の大部分はヒト由来であることがわかった。というのは、これら細胞は抗体に結合し、マウスリンパ球とは交差反応を示さなかったからである。
さらに、再構成したマウスは脾臓のサイズが通常のマウスと肥大した脾臓を有するマウスとの２つのグループに分けることができることが観察された。肥大した脾臓、すなわち通常より２５倍大きな脾臓を有するｈｕ−ＳＰＬ−ＳＣＩＤマウスは、通常の脾臓を有するマウスに比べて約１５０倍高いレベルのヒトＩgＧを有し、同様に処理した通常のサイズの脾臓を有するマウスより約１０，０００倍高いレベルの抗原特異的ヒトＩgＧを有していた。抗原特異的な応答の相対的な親和性が応答全体を通して増大したことがわかったが、これは全免疫グロブリンプールのうちのより高いパーセントのものが、より良好な結合特性を有する抗体からなることを示していた。これら結果は、このシステムが抗原駆動されたものであることを示している。
これら結果は非常に有意であり、ｈｕ−ＳＰＬ−ＳＣＩＤからヒト細胞を回収し、該細胞を組み合わせヒト抗体遺伝子ライブラリーを生成するために用いることによって臨床的および／または診断的に使用可能な高親和性および特異性を有するヒトモノクローナル抗体を得ることが可能であることを示している。
さらに詳しくは、本発明は、ＲＳＶ Ｆタンパク質に対して高い親和性、すなわち≦２×１０-9モルタンパク質を示す新規なヒトモノクローナル抗体を提供するものであり、該ヒトモノクローナル抗体はＲＳＶをインビトロで中和することができる。本発明はさらに、かかるＲＳＶ Ｆタンパク質に対するヒトモノクローナル抗体の製造方法を提供する。
一般に、かかるヒト抗体は、ナイーブなヒト脾臓細胞をＲＳＶ Ｆタンパク質でインビトロ免疫し、該インビトロ免疫したヒト脾臓細胞を免疫無防備状態にある動物ドナー、すなわちＳＣＩＤマウスに移し、該動物にＲＳＶ Ｆタンパク質をブースター投与し、ついで該動物から、ＲＳＶ Ｆタンパク質に対するヒトモノクローナル抗体を分泌するヒトＢ細胞を単離し、該ヒトＢ細胞を免疫し、ついで該免疫したＢ細胞をクローニングしてＲＳＶ Ｆタンパク質に対する高親和性、好ましくは少なくとも１０-７モル、さらに好ましくは≦２×１０-9モルを有するヒトモノクローナル抗体を分泌する細胞を選択する。
上記のように、とりわけヒト脾臓細胞、すなわち以前にＲＳＶ Ｆ抗原に暴露されたかまたは暴露されておらず免疫無防備状態にある動物ドナー、すなわちＳＣＩＤマウスに移されるヒト脾臓細胞のインビトロ免疫と該動物ドナーをついでＲＳＶ Ｆタンパク質抗原でブースター投与することの組み合わせは、ＳＣＩＤマウスにおいてヒト抗体を製造する従来法に比べて有意な利点をもたらすことがわかった。すなわち、本発明の方法は、非常に高い抗体力価、すなわち最高の抗Ｆタンパク質力価が約１０-7である抗体力価、および高いＩgＧ濃度、すなわち最も高い応答で約３ｍｇ／ｍｌの濃度をもたらす。さらに、この方法は、非常に有利な特性の組み合わせ、すなわちＲＳＶ Ｆタンパク質に対する高い親和性を示すことと実質的なインビトロ中和活性を示すこととの両者を有するヒト抗体の製造を可能とする。
実施例において一層詳細に記載するように、本発明者らは２つのヒトモノクローナル抗体、すなわちプラモン共鳴（plasmon resonance）により決定したときにＦタンパク質に対する親和性定数Ｋａ＝１０10Ｍを示すＲＦ−１、および滴定微小熱量測定法（titration microcalorimetry）により決定したときにＫａ＝１０８Ｍの親和性定数を示すＲＦ−２を単離した。また、ＲＦ−２の計算したＫｄは２×１０-9Ｍであった。さらに、これら両抗体とも８〜１２０ｎｇ／ｍｌの濃度でインビトロウイルス中和特性を示すとともに、以前にＲＳＶが感染した細胞の融合を抑制する能力をも示す。重要なことに、このインビトロ中和活性は、Ａ型およびＢ型の両ウイルス型の広範な範囲の種々の野生型および実験室ＲＳＶ株に対して適用できる。
これら結果、すなわちＲＳＶ Ｆタンパク質（ＲＳＶ感染細胞の表面上に発現される表面タンパク質を含む）に対する本発明の抗体の高親和性並びに該ウイルスを有効に中和する能力およびウイルス感染した細胞の融合を抑制する能力から、本発明のヒトモノクローナル抗体は治療剤および予防剤として、すなわちＲＳＶに罹りやすいかまたはＲＳＶに感染した患者においてＲＳＶを治療または予防するのに適しているに違いない。上記のように、ＲＳＶ感染は幼児において特に広範にみられ、免疫無防備状態のヒトにおいてもみられる。それゆえ、本発明のモノクローナル抗体は、かかる対象者においてＲＳＶを予防または治療するのに特に望ましいであろう。
さらに、本発明のモノクローナル抗体がヒト由来であることから、受動免疫療法に特に適している。これは、本発明の抗体がマウスモノクローナル抗体の潜在的な制約、すなわちＨＡＭＡ応答および正常なヒトエフェクター機能の不在、を受けないであろうことによる。実際、本発明のヒトモノクローナル抗体の特徴付け（以下の実施例に記載）に基づき、ＲＦ−１およびＲＦ−２の両者が、以前に開示されたマウスまたはキメラ抗Ｆタンパク質抗体および組換えライブラリー由来のヒトＦａｂフラグメントに比べて実質的に一層高いインビトロ中和活性および以前に感染したＲＳＶ細胞の融合を抑制する能力を示すことが明らかである。また、本発明の抗体がヒト由来であることにより、かかる中和活性がインビボ投与後も維持されるであろうことが基体される。
本発明のヒトモノクローナル抗体の他の利点は、正常組織との反応性を実質的に有しないことである。以下に示すように、本発明のヒトモノクローナル抗体はＲＳＶ感染細胞にのみ結合し、リンパ組織、肝臓、前立腺または咽頭表皮などの細胞株には結合しない。それゆえ、これら抗体はインビボ投与したときにＲＳＶ感染細胞には有効に結合するが正常組織には結合せず、かくしてＲＳＶ感染の中和をもたらすことができる。さらに、開示した特性に基づき、ＲＳＶ Ｆタンパク質に対する本発明のヒトモノクローナル抗体はＲＳＶ感染に感受性に宿主を保護するのに用いることが期待される。
さらに詳しくは、ＲＳＶ Ｆタンパク質に対する本発明のヒトモノクローナル抗体は、たとえば外傷性かまたはＩＴＰ源からヒト脾臓細胞を入手し、ついでこれをインビトロで初回抗原刺激することにより製造する。このことには、本質的に、該ナイーブなヒト脾臓細胞を充分な量のＩ１−２および任意にＲＳＶ Ｆタンパク質の存在下でインビトロにて培養して免疫（初回抗原刺激ともいう）を誘発させることが含まれる。一般に、使用するＲＳＶ Ｆタンパク質の量は約１〜２０ｎｇ／ｍｌ ＲＳＶタンパク質、より好ましくは１０〜１００ｎｇ／ｍｌ、最も好ましくは約４０ｎｇ／ｍｌのＲＳＶタンパク質である。
インビトロ培養の培地には、リンホカイン、とりわけＩＬ−２および任意にＩＬ−４およびＩＬ−６も含まれるであろう。その量は、免疫および抗体産生細胞の所望の産生をもたらす量であろう。たとえば、ＩＬ−２の場合、約５〜２００ＩＵ／ｍｌ、より好ましくは約１０〜５０ＩＵ／ｍｌ、最も好ましくは２５ＩＵ／ｍｌの量が適している。
この培地にはまた、培養中のヒト脾臓細胞の生存力を維持するのに必要な他の成分、たとえばアミノ酸や血清も含まれるであろう。実施例では２ｍＭグルタミン、２ｍＭピルビン酸ナトリウム、非必須アミノ酸、２５ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２および２０％ウシ胎仔血清を補充したＩＭＤＭを含有する培地を用いた。しかしながら、当業者であれば本明細書中の教示に基づき、日常的な最適化を用いて培地を変えることができる。
インビトロ免疫段階は免疫を誘発するのに充分な時間行われるであろう。一般に、細胞をＲＳＶ Ｆタンパク質の存在下、約１〜１０日間、好ましくは約３日間培養するであろう。しかしながら、これは、たとえば特定の脾臓細胞試料に依存して変わるであろう。同様に、当業者であれば本明細書中の教示に基づき、また公知の方法を用いて、インビトロ免疫段階の適当な時間を決定できる。
インビトロ免疫に用いる抗原は、脾臓細胞がＦタンパク質に対して免疫され、他の無用な（非表面）抗原に対して免疫されることのないことを確実にするため、精製したＲＳＶ Ｆタンパク質が好ましいであろう。精製したＲＳＶ Ｆタンパク質を得る方法は当該技術分野で知られている。本発明では、とりわけウェルシュ（Walsh）らの方法（ウォルシュら、J.Gen.Virol.、７０、２９５３−２９６１、１９８９）を利用した。しかしながら、ＲＳＶ Ｆタンパク質に対する特異性を有するヒトモノクローナル抗体を得るに充分な純度のＲＳＶ Ｆタンパク質が得られる限り、特定の方法は重要ではない。別法として、ＲＳＶ Ｆタンパク質は米国特許第５２８８６３０号（１９９４年２月２２日発行）に記載した組換え法により製造することができる。
インビトロ免疫した後、ついでＲＳＶ Ｆタンパク質を免疫したまたは初回抗原刺激したナイーブなヒト脾臓細胞を免疫無防備状態にあるドナー、すなわちＳＣＩＤマウスに導入する。このことは、ＲＳＶ Ｆタンパク質で初回抗原刺激したヒト脾臓細胞をＳＣＩＤマウスに腹腔内投与することにより行うのが好ましい。投与する該脾臓細胞の数は、一般に約１０4〜１０8脾臓細胞の範囲であり、約１０7〜１０8脾臓細胞が好ましいであろう。かかる細胞の数は、所望の再構成、すなわちＲＳＶ Ｆタンパク質に特異的なヒト抗体の回収可能な濃度を産生するＳＣＩＤマウスとなるものである。好ましくは、かかる脾臓細胞は投与する前に約８×１０8細胞／ｍｌの濃度にてＨＢＳＳ中に懸濁されるであろう。
脾臓細胞を腹腔内に移した後、ついでＳＣＩＤマウスにＲＳＶ Ｆタンパク質をブースター投与する。このことは、ヒト抗ＲＳＶ Ｆタンパク質抗体の所望の産生が実現されるように脾臓細胞の移行から充分近い時点にて行う。一般に、このことは、移行から３〜１４日後、最適には移行後約７日で行う。投与するＲＳＶ Ｆタンパク質の量は、約１〜５０μｇ、好ましくは約１〜１０μｇの範囲であろう。実施例では５μｇのタンパク質を投与した。しかしながら、投与の量および時点は特定のマウス、脾臓試料、およびＲＳＶ Ｆタンパク質の純度に依存して変わってよい。
抗原のブースター投与は、好ましくはアジュバント、たとえば完全フロイントアジュバント、ミョウバン、サポニンなどの存在下で行い、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）およびミョウバンが好ましいであろう。しかしながら、実質的に等価または一層高い結果を得るために他の公知のアジュバントを代用することができる。
ブースター投与後、ついでＳＣＩＤマウスをたとえば尾から採血し、そのヒトＩgＧ濃度および抗Ｆタンパク質抗体力価を試験する。ついで、最高の抗体力価および濃度を示す動物を用いてヒトＩgＧ分泌細胞を回収する。
最高の抗Ｆヒト抗体力価を有するＳＣＩＤマウスは、ヒト抗体分泌細胞の良好な採取源となる大きな腹部腫瘍を生成することがわかった。好ましくは、これら腫瘍を滅菌条件下で切り出すことにより回収し、単一細胞の懸濁液を調製し、ついで細胞を洗浄および培養する。実施例では細胞を２％ウシ胎仔血清を含有するＩＭＤＭで洗浄し、１０％ＦＣＳ含有ＩＭＤＭを入れたＴ−２５フラスコ中、１０6細胞／ｍｌの懸濁中で細胞を培養する。しかしながら、かかる培養条件は当業者により変えることができる。
ついで、これら細胞を好ましくはＥＢＶを用いて不死化する。ついで、抗Ｆタンパク質抗体を分泌する不死化細胞を公知の方法、たとえばＥＬＩＳＡにより同定する。上記のように、この方法は、ＲＳＶ Ｆタンパク質に特異的に結合する２つの別個のヒトモノクローナル抗体、すなわちＲＦ−１およびＲＦ−２が同定される結果となることを示した。しかしながら、本明細書の教示、とりわけ実施例に基づき、同様の特性を有するＲＳＶ Ｆタンパク質に対する他のヒトモノクローナル抗体が不当な実験を行うことなく当業者により得ることができる。たいていは２つの異なる実験において異なるＳＣＩＤマウスを用いて生成されたという事実から、これら２つの抗体は別個のものである。ＲＦ−１およびＲＦ−２を発現する細胞株は、長期間、すなわち、それぞれ約１８カ月および１６カ月、培養を維持でき、およそ約３６〜４８時間の倍加時間で分裂した。特定の抗体濃度は、０．５×１０6細胞／ｍｌで播種し３日間増殖させた培養で平均約０．８〜１μｇ／ｍｌである。
以下に一層詳細に記載するように、ＲＦ−１およびＲＦ−２はともにＩgＧ（ｌ、ｋ）であり、ＥＬＩＳＡにおいてＦタンパク質への半最大結合がそれぞれ０．６ｎｇ／ｍｌおよび１ｎｇ／ｍｌで示され、それぞれ約８．８および８．９の等電点を示す。
さらに、これら抗体はＲＳＶ Ｆタンパク質に対する高い親和性を示す。詳しくは、ＲＦ−１の場合、ＩＡＳＹＳ機械上でのプラスモン共鳴により決定されるＲＦ−１の解離定数は約１０-10Ｍである。ＲＦ−２のＫａ定数もまた、ワイズマン（Wiseman）ら（１９８９）およびロバート（Robert）ら（１９８９）による滴定微小熱量測定法による決定したとき、同様に高い。
さらに、これら抗体はＲＳＶ感染細胞には有効に結合するが、試験した正常なヒト細胞、たとえば呼吸器内層（ＨＥｐ−２、咽喉表皮癌腫、ＣＣＬ２３）、肝臓（ＨｅｐＧ２、ヒト脾臓細胞株、ＨＢ８０６８）、リンパ組織、ＳＢ、ヒトＢリンパ芽球細胞株、カタログ番号ＣＣＬ１２０およびＨＳＢ、Ｔリンパ芽球細胞株、カタログ番号ＣＣＬ１２０．１、および前立腺（ＬＮＣａＰ．ＦＧＣ、ヒト前立腺癌株、カタログ番号ＣＲＬ１７４０）には結合しないことが示された。
重要なことに、ＲＦ−１およびＲＦ−２はともに実質的なインビトロＲＳＶウイルス中和を示すことが示された。このことは、２つの異なるアッセイ（以下に一層詳細に記載する）、すなわち、ウイルスを細胞に加える前に精製モノクローナル抗体と前以て反応させて行う感染中和アッセイ（抗体がウイルス感染性を抑制する能力を測定する）およびウイルスの細胞内への侵入後にモノクローナル抗体がウイルスの増殖および拡張を抑制する能力を測定する融合抑制アッセイにおいて示された。
さらに、以下に一層詳細に記載するように、ＲＦ−１およびＲＦ−２はともに、それぞれ約３０ｎｇ／ｍｌから１０００ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度にて１２の異なる単離物のウイルス感染を抑制した。それゆえ、ＲＦ−２はＲＦ−１よりも明らかに優れており、ＲＦ−１に比べて約１．２５〜１０倍低い濃度で５０％ウイルス抑制（ＥＤ５０）をもたらす。
対照的に、前以て感染した細胞での融合およびウイルス抗原発現を抑制するには一層高濃度のモノクローナル抗体が必要であり、ＲＦ−１はＲＦ−２よりも約５〜１０倍強力である。さらに、ＲＦ−１およびＲＦ−２はともにＢ型ＲＳＶ、Ｂ型ＲＳ６５５６、およびＡ型ＲＳＶ、Ａ型プロトタイプＲＳロング（Long）に対しても有効であった。それゆえ、インビトロでの結果は、本発明のモノクローナル抗体がＡ型およびＢ型の両プロトタイプの異なるＲＳＶ株により引き起こされたＲＳＶ感染を治療または予防するのに用いることができることを示している。上記でも記載したように、ＲＳＶ Ｆタンパク質は異なるＲＳＶ単離物においてかなりよく保存されている。それゆえ、ＲＳＶ Ｆタンパク質に対する本発明のモノクローナル抗体はＲＳＶ Ｆタンパク質の保存されたエピトープに結合すると思われる。
上記のように、本発明のヒトモノクローナル抗体またはそれから得られる（調製法は以下に記載する）可変重鎖および軽鎖配列を含む組換えヒト抗体は、受動抗体療法によりＲＳＶ感染を治療または予防するための治療剤または予防剤として用いられるであろう。とりわけ、これらＤＮＡ可変ドメインをコードするＤＮＡ配列は、図２に示すアイデック（ＩＤＥＣ）の特許に係る発現ベクター中に組み込むことができる。このバージョンは実質的に本願と同じ出願人に係る米国特許第０８／３７９，０７２号（１９９５年１月２５日出願）（参照のため本明細書中に引用する）に記載されている。このベクターは、ヒト定常ドメイン、たとえば、ヒトガンマ１、ヒトガンマ４またはガンマ４ＰＥと称するその変異体を含む（米国特許第０８／３７９，０７２号（参照のため本明細書中に引用する）を参照）。一般に、このことには治療または予防に有効な量の本発明のヒトモノクローナル抗体を感受性の患者またはＲＳＶ感染を示す患者に投与することを含むであろう。有効投与量は、好ましくは約５０〜２０，０００μｇ／Ｋｇ、さらに好ましくは約１００〜５０００μｇ／Ｋｇの範囲であろう。しかしながら、適当な投与量は、処置する宿主の状態、体重などの因子に依存して変わるであろう。適当な有効投与量は当業者により決定することができる。
本発明のヒトモノクローナル抗体は、抗体を投与するのに適したあらゆる投与法により投与することができる。典型的には、本発明の抗体は、注射、たとえば静脈内、筋肉内もしくは腹腔内注射、またはさらに好ましくはエアロゾルにより投与されるであろう。上記に記載したように、エアロゾル投与は処置する患者が新生児である場合に特に好ましい。
薬理学的に許容しうる形態への抗体の製剤化は、公知の薬理学的担体および賦形剤を用いて公知の方法により行うことができる。適当な担体および賦形剤の例としては、緩衝食塩水、ウシ血清アルブミンなどが挙げられる。
さらに、本発明の抗体はＲＳＶ感染細胞への高い特異性および親和性を示すことから、ＲＳＶ感染の診断のための免疫プローブとしての有用性を有する。このことは、一般に、ＲＳＶ感染していると思われる患者の試料、たとえば呼吸液（respiratory fluid）を採取し、該試料を本発明のヒトモノクローナル抗体とともにインキュベートしてＲＳＶ感染細胞の存在を検出することを含むであろう。
このことには、ヒトモノクローナル抗体−ＲＳＶ免疫複合体を検出するリポーター分子で本発明のヒト抗体を直接または間接に標識することが含まれるであろう。公知の標識の例としては、酵素、たとえば、β−ラクタマーゼ、ルシフェラーゼなど、および放射性標識が挙げられる。
モノクローナル抗体を用いて抗原の免疫検出を行う方法は当該技術分野でよく知られている。また、本発明の抗ＲＳＶ Ｆタンパク質抗体を診断に有効な量の適当なリポーター分子と組み合わせてＲＳＶ感染の検出のための試験キットとすることができる。
材料および方法
以下の材料および方法を実施例１〜６において用いた。
Ｆタンパク質調製物および精製：
Ｆタンパク質の調製は、本質的にウォルシュらの方法［ウォルシュら、J.Gen.Virol.、７０、２９５３−２９６１（１９８９）］に従って行った。簡単に説明すると、７０％コンフルエンシーのＨＥｐ−２細胞にＲＳＶのロング株、Ａ型のｌａｂ適合型を感染させた。Ｔ−１５０培養フラスコ中、５％ウシ胎仔血清、２ｍＭグルタミンおよび２ｍＭピルビン酸ナトリウムを補充したＩＭＤＭ中にて４８時間培養した後、１％トリトンＸ−１００および１％デオキシコール酸を含有するＰＢＳの溶解緩衝液で細胞を溶解した。Ｆタンパク質の精製を、マウスモノクローナル抗Ｆ抗体、Ｂ４（ヒロユキ・ツツミ（Hiroyki Tsutsumi）からの好意による）（ツツミら、１９８７）を結合させたセファデックスのアフィニティーカラム上にて粗製の細胞溶解液から行った。カラムを溶解緩衝液で充分に洗浄し、精製Ｆタンパク質を０．１％デオキシコール酸を含有するｐＨ２．５の０．１Ｍグリシン中で溶出した。溶出液を１Ｍトリス、ｐＨ８．５で直ちに中和し、ＰＢＳに対して透析した。エクストラクティ（Extracti）−Ｄゲルカラム（ピアス、ロックフォード、イリノイ、カタログ番号２０３４６）上で界面活性剤を除去した後、ＥＩＡによりＦタンパク質の濃度を測定し、ガンマ放射線を照射して溶液を滅菌した。
リンパ球細胞調製物：
脾臓を、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）患者の臨床的に適用された脾摘の後に得た。金属メッシュで篩にかけることにより単一細胞懸濁液を調製し、２％ウシ胎仔血清を補充したＩＭＤＭ培地中で洗浄した。塩化アンモニウム溶解緩衝液で３７℃にて９０秒間処理することにより赤血球を取り除いた。ついで、この白血球に富む懸濁液を血清含有培地で２回洗浄し、氷冷凍結培地（９５％ＦＣＳと５％ＤＭＳＯ）中に１０8細胞／ｍｌにて再懸濁し、使用するまで液体窒素中で凍結した。
インビトロ免疫（ＩＶＩ）：
２ｍＭグルタミン、２ｍＭピルビン酸ナトリウム、非必須アミノ酸、２５μｇ／ｍｌのＩＬ−２および１０％ウシ胎仔血清を補充したＩＭＤＭ中で培養を行った。２.５μｇ／ｍｌのアンホテリシン、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン、１００μｇ／ｍｌのカナマイシン、５μｇ／ｍｌのクロルテトラサイクリン、５０μｇ／ｍｌのネオマイシンおよび５０μｇ／ｍｌのゲンタマイシンを含む抗体混合物を加えた。上記細胞を４０ｎｇ／ｍｌのＦタンパク質とともに３×１０6細胞／ｍｌにて６ウエルクラスター中で培養した。３日後、細胞を回収し、洗浄し、ＳＣＩＤ再構成のためにＨＢＳＳ中に８×１０8細胞／ｍｌにて再懸濁した。
ＳＣＩＤマウスの再構成：
５〜８週齢の雌ＣＢ１７／ＳＣＩＤマウスを、ＩＶＩに供した４×１０7のヒト脾臓細胞を含む２００μｌのＨＢＳＳを腹腔内注射することにより再構成した。１週間後、ＣＦＡ中の５μｇのＦタンパク質を腹腔内にてブースター投与し、さらに１５日後に尾から採血した。その血清をヒトＩgＧ濃度および抗Ｆタンパク質抗体力価について試験した。
ｈｕ／ＳＣＩＤマウスからのヒト細胞の回収：
高い抗Ｆタンパク質抗体力価を有する２匹のｈｕ−ＳＰＬ−ＳＣＩＤマウスは大きな腹部腫瘍を生じた。屠殺したマウスから滅菌条件下で切り出すことにより腫瘍を回収し、単一細胞の懸濁液を調製し、これら細胞を２％ウシ胎仔血清を含むＩＭＤＭで洗浄し、Ｔ−２５フラスコ中、１０％ＦＣＳを含有するＩＭＤＭ中で１０6細胞／ｍｌにて培養した。
ヒトＩgＧおよび抗Ｆタンパク質抗体の試験：
ヒトＩgＧおよび抗Ｆタンパク質抗体の試験をＥＬＩＳＡにより行った。この目的のため、プレートをそれぞれ０.１Ｍ重炭酸緩衝液、ｐＨ９.５中のＧＡＨ−Ｉｇ（０.０５μｇ／ウエル）かまたはＦタンパク質（０.０５μｇ／ウエル）で一夜コーティングし、１％ウシ胎仔血清を含有するＰＢＳでブロックした。マウス血清、培養上澄み液または精製抗体の系列希釈をプレートと反応させた。結合したヒトＩgＧは、その後にＧＡＨ−ＩgＧ−ＨＲＰおよびＯＰＤ基質（シグマ）を加えることにより明らかにされた。選択した高力価のヒト血清を両アッセイにおいて陽性の対照として用い、精製ポリクローナルヒトＩgＧまたは（γ、κ）ミエローマタンパク質をそれぞれヒトＩgＧおよびモノクローナル抗体の評価に際しての標準として用いた。
ヒト抗体のイソタイプ決定：
イソタイプの決定を上記のようにＦタンパク質をコーティングしたプレート上でＥＬＩＳＡにより行った。結合したヒトＩgＧを、ヒトγ１、γ２、γ３、γ４、μ、κおよびλ鎖に特異的なＨＲＰコンジュゲートマウスモノクローナル抗体をその後に加えることにより明らかにした。陽性の対照は、（γ１、κ）、（γ２、κ）、（γ３、κ）、（γ４、κ）または（λ、λ）イソタイプおよび遊離のκ鎖およびλ鎖のミエローマタンパク質を用いて行った。
プロテインＡ精製：
タンパク質の精製をプロテインＡ−セファロース４Ｂカラム上の培養上澄み液から行った。簡単に説明すると、上澄み液を回収し、０．２ｍｍのフィルターで濾過し、０．０２％のアジ化ナトリウムを補充した。カラム（ゲル容量約０．５ｍｌ）を０．０２％アジ化ナトリウムを含有するＰＢＳ中で平衡化し、ついで上澄み液を低速で負荷した。充分に洗浄した後、結合したヒトモノクローナルＩgＧを０．１Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ３．５中で溶出し、セントリコン（Centricon）１０を濾紙（アミコン）を用いてＰＢＳ−アジドに対して透析し、さらに使用するまでガンマ放射線を照射することにより滅菌した。カラムをクエン酸、ｐＨ２．５で再生し、その後の使用のために０．０２％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳで再平衡した。
等電点電気泳動：
ヒト抗体の等電点電気泳動（ＩＥＦ）をポリアクリルアミド前形成ゲル（ファルマシア、ウプサラ、スウェーデン、カタログ番号８０−１１２４−８０）中、ｐＨ３〜ｐＨ１０で行った。簡単に説明すると、２０μｌの試料を負荷し、１５００ボルトで９０分間行った。ｐｉ５．８〜１０．２５の標準をｐｉ標準のために用いた。ゲルをクマシーブルー染色により染色し、２５％メタノール、６８％水および８％酢酸を含有する脱染色緩衝液中で脱染色した。
ウエスタンブロッティング：
天然および沸騰により変性させた両Ｆタンパク質を１０％ポリアクリルアミドゲル中で移動させた。ゲルを３０ボルトで２時間および６０ボルトで一夜、ニトロセルロースシート上にブロッティングした。移動後、ニトロセルロースをＰＢＳ中の１％ＢＳＡおよび０.１％トゥイーン２０で室温にて１時間ブロックした。種々のストリップをＰＢＳ中で洗浄し、一次抗体、ｈｕ−ＳＰＬ−ＳＣＩＤ抗Ｆタンパク質血清、またはｈｕ−ＳＰＬ−ＳＣＩＤ抗破傷風毒素陰性対照、またはマウス抗Ｆタンパク質陽性対照を１時間かけて加えた。血清はすべて１：５００に希釈した。ＰＢＳで充分に洗浄した後、二次抗体、試料および陰性対照にはＧＡＨＩgＧ−ＨＲＰ、または陽性対照にはＧＡＭ ＩgＧを１時間かけて加えた。ブロットを４−クロロ−１−ナフトールで明示させた。
免疫蛍光：
ＲＳＶ感染したＨＥｐ−２細胞（４×１０4）を氷冷アセトンを用いてガラススライド上に固定し、２０μlの血清（１：１０に希釈）または精製ＭＡｂ（２μｇ／ｍｌ）を３７℃にて１時間反応させた。スライドを洗浄し、結合した抗体をＧＡＨＩgＧ−ＦＩＴＣで３７℃にて３０分間明示させ、蛍光顕微鏡下で観察した。
ＦＡＣＳｃａｎ分析：
ＲＳＶ感染したＨＥｐ−２細胞（１０6細胞／試料）を洗浄緩衝液（アジ化ナトリウム０.１％を含有するＰＢＳ）で洗浄した。細胞ペレットを、２μｇ／ｍｌのＲＦ−１またはＲＦ−２を含有する５０μｌのインキュベーション緩衝液（ＢＳＡ ０.１％を補充したアジ化ナトリウム０.１％含有ＰＢＳ）中に再懸濁した。氷上で１５分間インキュベートした後、細胞を洗浄し、ＧＡＨ ＩgＧ−ＦＩＴＣを含有するインキュベーション緩衝液中に氷上にてさらに１５分間再懸濁した。３回洗浄した後、細胞を１％ホルムアルデヒドを含有するＰＢＳ（１ｍｌ）中に固定し、ベクトン−ディキンソンＦＡＣＳｃａｎ装置で分析した。
親和性の決定：
可溶性のＦタンパク質に対するヒトＭＡｂの親和性を決定するために２つの方法を用いた：
プラスモン共鳴では、ＩＡＳＹＳ機械を用い、抗体を装置の湿潤側に共有結合させ、これから該装置の乾燥側に照射した光の屈折の変化に基づいて質量の変化を決定することができる。種々の濃度のＦタンパク質を加え、ついでＰＢＳの定常流で溶出させた。該抗体からのＦタンパク質の遊離の結果としての質量の変化を測定し、それから動力学Ｋoffを決定した。Ｋａの計算は、種々の初期飽和レベルからの遊離速度を試験することにより行った。
別法として、親和定数の決定をワイズマンらおよびロバートらによる微小熱量測定法により以下のようにして行った：ＲＦ−２とＦタンパク質とを既知濃度で熱チャンバ中、４２℃にて同時にインキュベートし、溶液中の免疫複合体の生成に伴うエンタルピー変化を測定した。この反応を５０℃で繰り返した。結合解離定数Ｋをロバートらに従って温度およびエンタルピー変化の関数として下記式にて計算した：
0003771267.tif 000004
式中、ＫｏｂｓおよびΔＨobsは、所定の絶対温度（Ｔｏｂｓ）で実験的に観察された結合平衡定数およびエンタルピー変化であり、Ｒは普遍的な気体定数（１.９８７）であり、ΔＣは実験的に決定された結合熱容量変化である。
補体促進（Complement-enhanced）ウイルス中和アッセイ：
２つの実験室株（ロング、Ａ型、および１８５３７、Ｂ型）および１０の野生型ＲＳウイルス単離物（入院中の幼児から単離したもの）を用い、抗Ｆタンパク質ヒトＭＡｂの中和能を評価した。系列希釈したヒトＭＡｂを、補体の存在下、１００μｌ ＩＭＤＭ／マイクロタイタープレートウエル中、室温にて３０分間、ウイルス（５０〜１００ｐｆｕ）とともにプレインキュベートした。ＨＥｐ−２細胞（５×１０4／ウエル）を１００μｌ ＭＥＭ中にて加え、３７℃、５％ＣＯ2にて３日間インキュベートした。プレートを洗浄し、アセトンで固定し、空気乾燥し、ＲＳＶ抗原をマウスＭＡｂを用いたＥＬＩＳＡにより検出した。中和の終点を、抗体を加えない対照のウエルに比べて抗原産生を５０％減少させる希釈として任意に決定した。
ウイルス融合抑制アッセイ：
融合抑制力価の決定を、１００ＴＣＩＤ50のＲＳＶロング（プロトタイプＡウイルス）またはＲＳ６５５６（Ｂ型臨床単離物）をＶＥＲＯ細胞（５×１０4／ウエル）とともにマイクロタイタープレート中、３７℃、５％ＣＯ2にて４時間プレインキュベートすることにより行った。種々の濃度のヒトモノクローナル抗体または対照を各ウエルに加え、各４の培養液を３７℃、５％ＣＯ2にて６日間インキュベートした。対照の培養液はウエル非感染細胞（陰性）かまたは抗体の不在下の感染細胞（陽性）を含んでいた。ウイルス増殖の検出を、ウサギポリクローナル抗Ｆタンパク質抗血清およびＨＲＰ−標識抗ウサギＩgＧを用いたＥＬＩＳＡにより行った。反応液をＴＭBlue基質（ＫＰＩ、ゲイサーズバーグ、メリーランド）で発色させた。力価（ＥＤ５０）は、ＭＡｂの用量応答の回帰分析に基づき、ウイルス増殖を５０％抑制する抗体濃度として定義した。
実施例１
ＨＵ−ＳＰＬ−ＳＣＩＤ力価：
１５匹のＳＣＩＤマウスに、ＩＴＰ状態の単一のドナーからのヒト脾臓細胞を投与した。これら細胞は、ＩＬ−２および種々の濃度の可溶性Ｆタンパク質の存在下で３日間、前以て培養した。すべての動物は首尾よく再構成し、Ｆタンパク質をブースター投与した後に全ヒトＩgＧ濃度は血清中で１２μｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌ、抗Ｆタンパク質力価は３×１０2〜１０6で様々であった（表Ｉ）。インビトロでのＦタンパク質の暴露とインビボでの抗Ｆタンパク質力価との間に何ら相関関係は観察されなかった。ウマフェリチン抗原系での本発明の方法において、その後のインビボでの特異的な抗体力価を確実にするために脾臓細胞のインビトロ培養の際に抗原暴露が必要であることが以前に観察された。これら２つの系での不一致は、関与する抗原の違いによるのかもしれない。なぜなら、ヒトは生まれつきウマフェリチンには暴露されておらず、ＩＶＩ段階は脾臓細胞の初回抗原刺激を含み、インビトロで一次応答を誘発するのに対して、一方、実質的にすべてのヒトは生まれてから早い時期に天然感染によりＲＳＶに免疫になっており、これがＦタンパク質に対する永久的な記憶となり、それゆえインビトロでＩＬ−２単独で刺激した後にインビボでブースター投与しても二次応答を誘発するに充分であるからである。
抗血清は、等電点電気泳動から判断されるように（データは示していない）ポリクローナルであった。抗血清をＦタンパク質への反応性についてウエスタンブロッティングにより試験した。本発明者らの結果は、ポリクローナルヒトＡｂが可溶性の天然のＦタンパク質をその二量体の形態（１４０ＫＤ）でも単量体の形態（７０ＫＤ）でも認識することを示した。抗血清はまた変性したＦタンパク質とも強く反応し、４８ＫＤと２３ＫＤとの２つのサブユニットに特異的に結合した（代表的データを図１に示す）。このことは、Ｆタンパク質に対する体液性の応答の少なくとも一部は該分子の直線状で非立体的なエピトープに対して向けられたものであることを示唆している。免疫蛍光試験はさらに、ｈｕ−ＳＰＬ−ＳＣＩＤ血清の特異性を示していた。なぜなら、天然のＳＣＩＤマウス血清ではなく免疫血清がＲＳＶ感染ＨＥｐ−２細胞と強く反応したからである（図２）。陰性対照として用いた非感染ＨＥｐ−２細胞に対しては反応性は観察されなかった。それゆえ、可溶性のＦタンパク質が、天然に感染した細胞上に発現される膜ウイルス抗原に特異的な抗体を産生するのに適した抗原であると結論された。
実施例２
腫瘍細胞培養における抗体の同定：
高い抗Ｆタンパク質力価を有するすべてのマウスを屠殺し、腹膜灌流および脾臓からヒト細胞を回収した。２匹のマウス（ｈｕ−ＳＰＬ−ＳＣＩＤ＃６およびｈｕ−ＳＰＬ−ＳＣＩＤ＃１５）が腹部に固形の腫瘍を自然に生じ、これを回収し、単一細胞の懸濁液にして試験した。これら腫瘍細胞は、ＥＬＩＳＡにより決定されるように特異的な抗Ｆタンパク質抗体を分泌した。これら腫瘍および抗体をＲＦ−１（ＲＳＶ Ｆタンパク質）およびＲＦ−２と称する。ＲＦ−１およびＲＦ−２は、約２カ月離れて行った２つの実験において生成され、個々のｈｕ−ＳＰＬ−ＳＣＩＤマウスから単離されたので別個の抗体である。これら抗体は、培養においてそれぞれ１８カ月および１６カ月以上確立され、約３６〜４８時間の倍加時間で分裂した。特定の抗体濃度は、０.５×１０6細胞／ｍｌにて播種して３日間増殖させた培養においては典型的に０.５〜１μｇ／ｍｌであった。
さらに特徴付けるため、プロテインＡセファロースカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーにより両ヒトＭＡｂを培養上澄み液から精製した。ＲＦ−１およびＲＦ−２の両抗体は、ＥＬＩＳＡにおいてＦタンパク質に対する半最大結合をそれぞれ０.６ｎｇ／ｍｌおよび１ｎｇ／ｍｌにて示すＩgＧ（1.k）である（図３）。ＩＦＥにおける移動パターンからＲＦ−１およびＲＦ−２の等電点はそれぞれ８.８および８.９と決定された（図４）。ＲＦ−１およびＲＦ−２はフローサイトメトリーにおいてＲＳＶ感染ＨＥｐ−２細胞を特異的に認識した（図５）。ＲＦ−１の解離定数Ｋｄは、ＩＡＳＹＳ機械上でのプラスモン共鳴により１０-10Ｍ範囲であると決定された。ＲＦ−２のＫｄ定数は、ワイズマンら（１９８９）およびロバートら（１９８９）による滴定微小熱量測定により２×１０-9Ｍと決定された。
実施例３
抗Ｆタンパク質の組織特異性：
ＡＴＣＣで入手可能な一連のヒト細胞株に対する反応性について、精製した抗体をフローサイトメトリーにより測定する間接免疫蛍光アッセイによりスクリーニングした（表II）。その結果は、これら抗体が呼吸器内層（ＨＥｐ−２、喉頭表皮癌腫、ＣＣＬ２３）、肝臓（ＨｅｐＧ２、ヒト肝臓細胞株、ＨＢ８０６５）、リンパ組織（ＳＢ、ヒトＢリンパ芽球細胞株、カタログ番号ＣＣＬ１２０およびＨＳＢ、Ｔリンパ芽球細胞株、カタログ番号ＣＣＬ１２０.１）および前立腺（ＬＮＣａＰ.ＦＧＣ、ヒト前立腺癌株、カタログ番号ＣＲＬ１７４０）などの細胞株には結合しないことを示した。
実施例４
インビトロ機能的活性：
これら抗体がインビトロでウイルス中和作用を有するかどうかを決定するため、これら抗体を２つのタイプの機能的アッセイに供した。感染中和アッセイは、ウイルスを細胞に加える前に精製モノクローナル抗体と前以て反応させることによって行い、それゆえＭＡｂがウイルス感染性を抑制する能力を反映する。融合抑制は、ウイルスの細胞内への侵入後にＡｂがウイルスの増殖および拡張を抑制する能力を反映する。両アッセイの結果は、ＥＩＡにおけるウイルス抗原滴定により決定されるように、所定のインキュベーション時間後に放出される培養液中のウイルスの量として測定した。
両Ａｂは、試験した１２の単離物のすべてについて、ＲＦ−１およびＲＦ−２それぞれ３０ｎｇ／ｍｌ〜１０００ｎｇ／ｍｌおよび８ｎｇ／ｍｌ〜１６５ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度にてウイルス感染を抑制することができた。ＲＦ−２はＲＦ−１よりもつねに優れており、ＲＦ−１に比べて１.２５〜１０倍低い濃度で５０％ウイルス抑制（ＥＤ５０）をもたらした。代表的なデータを表IIIに示す。
予想されるように、前以て感染した細胞での融合およびウイルス抗原発現を抑制するには一層高濃度のＭＡｂが必要であった。このアッセイにおいてＲＦ−１はＲＦ−２よりも５〜１０倍強力であった。両ＭＡｂは、Ａ型プロトタイプＲＳロングよりもＢ型プロトタイプＲＳ６５５６に対して一層有効であった。
0003771267.tif 000005
表Ｉ：単一のドナーからの脾臓細胞をＦタンパク質とともにまたはＦタンパク質なしでＩＬ−２の存在下で３日間培養した。ＳＣＩＤマウスを４×１０7細胞で再構成し、ＣＦＡ中の１０μｇのＦタンパク質をブースター投与した。マウス＃１、２、３、４および５では新鮮な同種細胞（２０×１０6）をブースターとともに注射した。ヒトＩgＧ濃度はポリクローナルＩgＧの標準曲線との比較により決定し、抗Ｆタンパク質力価はＥＩＡにおける終点希釈により決定した。
0003771267.tif 000006
表II：ＲＦ−２と種々の細胞株との反応性。種々の細胞株をＲＦ−２、２００ｎｇ／１０6細胞との間接免疫蛍光標識に供した。Ｆａｂヤギ抗ヒトＩgＧ−ＦＩＴＣを第二段階に用いた。（−）はＲＦ−２の存在が平均蛍光のチャネルの変化とならないことを示す。（＋）は平均標識の０.５ｌｏｇの増加を示す。
0003771267.tif 000007
表III：ＥＤ50は、モノクローナル抗体用量−応答の回帰分析に基づいてウイルス増殖を５０％抑制する抗体の濃度として定義される。
実施例５（比較例）
Ｆタンパク質に対するＩgＧ想起応答のインビトロでの誘発：
人口の９５％以上が年齢の２歳以上にわたってＲＳＶに暴露されており、ＲＳＶに首尾よく応答している［ヘンダーソン（Henderson）ら、J.Med.（１９７９）、３００、５３０−５３４］。それゆえ、脾臓細胞をインビトロにてＲＳＶ Ｆタンパク質で攻撃すると想起応答となるに違いなく、実際、主にＩgＧの応答がインビトロにて脾臓細胞で誘発された（図５）。最適抗原濃度である４０ｎｇ／ｍｌは、一次応答を誘発する抗原で観察されるもの、すなわちフェリチン、Ｉｌｉｇ／ｍｌ［ベーナー（Boener）ら、J.Immunol.、１９９１、１４７、８６−９５；ブラムス（Brams）ら、Hum.Antibod.Hybridomas、１９９３、４、４７−５６］に比べて少なくとも１次数低い大きさであった。それゆえ、Ｆタンパク質でインビトロにて初回抗原刺激すると二次様の応答が誘発されると考えなければならない。ＲＳＶ Ｆタンパク質に対して有意のインビトロ応答を誘発する幾つかの試みは、ＰＢＭＣおよび扁桃由来細胞で失敗に終わっている。
インビトロで初回抗原刺激した脾臓細胞からモノクローナル抗体を生成する限られた努力からＲＳＶ Ｆタンパク質に対する幾つかのモノクローナルＩgＧとして得られている。しかしながら、これらの殆どは幾つかの対照抗原の一つとＥＬＩＳＡにおいて交差反応した（結果は示していない）。
実施例６
ＲＦ−２をコードする遺伝子のクローニング：
ＲＦ−１およびＲＦ−２クローンはいずれも有意な量の抗体を産生しない。また、これら細胞系はいずれも２０％ＦＣＳを含有する培地中で最もよく増殖したが、これは、精製抗体にウシＩgＧが夾雑するので不都合である。したがって、意味のある動物モデル試験を行うのに必要な量の抗体（これには、通常選択した抗体につき１ｇが必要である）を製造および精製するのを可能にするには、ＲＦ−１およびＲＦ−２をコードする遺伝子を生産ベクターおよび細胞系に組み込むことが好都合である。本願譲受人であるIDEC Pharmaceuticals,Inc.,はＣＨＯ細胞中でヒトモノクローナル抗体を産生する非常に効率的な真核性生産系を開発した。このベクター系は共願の米国特許第08/379,072号（1995年１月25日出願）、および共願の米国特許第08/149,099号（1993年11月３日出願）に記載されている（この内容は本明細書の一部を構成する）。この系を常套的に使用することにより、抗体遺伝子をトランスフェクションしたＣＨＯ細胞は、スピナー培養中で無血清培地１Ｌにつき抗体約２００ｍｇを、またメトトレキセート中で増幅後に発酵器中で５００ｍｇ／Ｌ以上を産生する。
約５ｘ１０6個のＲＦ−２細胞をクローンした細胞培養から（下記参照）ｍＲＮＡ単離キット、Fast Tract（In VitroGen,San Diego,California）を用いてＲＮＡを抽出し、一本鎖ｃＤＮＡをオリゴ−ｄＴプライマーおよび逆転写酵素を用いて製造した。ｃＤＮＡの部分標本を出発物質に用い、可変領域遺伝子のポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）による増幅を行った。ＰＣＲは２組のプライマーを用いて行った（表ＩＶ参照）。
0003771267.tif 000008
第１組のプライマーは、重鎖可変領域を増幅するために設計された。この組は、Ｊ領域に結合する１つの３プライマーと、後期リーダーおよびフレームワーク１領域に結合する５つのファミリー特異的５’プライマーからなる。第２組のプライマーはKapp可変領域を増幅させるために設計された。この組は、後期リーダーおよびフレームワーク１領域に結合する４つの５’プライマーおよび１つの３’プライマーからなる。ＰＣＲ反応物をアガロースゲルで電気泳動し、正しいサイズの３５０塩基対のバンドを切り取った。ＤＮＡを電気溶出し、適切な制限酵素で切断し、ＩＤＥＣのＮＥＯＳＰＬＡ発現ベクター中にクローンした（図６参照）。ヒト抗体を発現させるのに用いたＮＥＯＳＰＬＡベクターには以下のものが含まれる：ＣＭＶ＝サイトメガロウイルスプロモーター、ＢＥＴＡ＝マウスβグロビン主要プロモーター、ＢＧＨ＝ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル、ＳＶＯ＝ＳＶ４０複製起点。Ｎ１＝ネオマイシンホスホアムスフェラーゼエクソン１、Ｎ２＝ネオマイシンホスホトランスフェラーゼエクソン２。ＬＩＧＨＴ＝ヒト免疫グロブリンκ鎖定常領域。Ｈｅａｖｙ＝ヒト免疫グロブリンγ１またはγ４ ＰＥ定常領域。Ｌ＝リーダー。ＳＶ＝ＳＶ４０ポリアデニル化領域。
ＩＤＥＣのＮＥＯＳＰＬＡ発現ベクターは、免疫グロブリン遺伝子の大規模生産用に設計された（Reffら、Blood,(1994),83,435-445参照、この内容は本明細書の一部を構成する）。これらベクターを用いて、マウス／ヒトキメラ、霊長類動物／ヒトキメラおよびヒト抗体を高レベルで発現させることに成功した。ＮＥＯＳＰＬＡは、プラスミドベクターＤＮＡが安定的に組み込まれたＣＨＯ細胞を選択するためのネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子を含む。さらに、ＮＥＯＳＰＬＡは、メトトレキセート中で増幅させるためのジヒドロホーレート還元酵素遺伝子、ヒト定常軽鎖（κまたはγ）およびヒト定常重鎖領域（γ１またはγ４（ＰＥ））を含む。γ４（ＰＥ）は、２つの突然変異（残るＦｃＲの結合を排除するために導入されたＣＨ２領域中のグルタミン酸、および重鎖ジスルフィド結合の相互作用の安定性を増すための、ヒンジ領域中のプロリン置換）を含むヒトγ４定常領域である（Algreら、J.Immunol.,148,3461-3468,(1992);Angalら、Mol.Immunol.,30,105-108(1993)、これらの内容は本明細書の一部を構成する）。所望の軽鎖可変領域の挿入を促進するため、ベクター中に独特な制限部位が組み込まれた（Reffら、Blood,(1994),83,435-445）。
ＲＦ−２の軽鎖は、デュプリケートでＮＥＯＳＰＬＡ中にクローンされ、Sangerらの方法にしたがって配列決定された（Sangerら、Proc.Natl.Acad.Sci.(1997),74,5463-5467）。κ鎖はκ２サブグループのメンバーである。同様に、ＲＦ−２のヒト重鎖可変領域が単離され、ヒトγ１定常ドメインの前方にクローンされた。
共通のＴａｃ逆転写酵素を用いることによりＲＦ−１およびＲＦ−２の軽鎖をコードする遺伝子は容易にクローンされたが、重鎖をコードする遺伝子のｃＤＮＡを得ることはできなかった。しかし、この問題は、高温（７０℃）に耐える逆転写酵素に置き換えることにより未然に防がれた。これにより、ＶH２ファミリーの遺伝子から最初に誘導されたプライマーを用いて完全なＰＣＲ生成物を得ることができた。
ＲＦ−１軽および重可変ドメインのアミノ酸配列および核酸配列をそれぞれ図７ａおよび８ｂに示す。ＲＦ−２軽および重可変ドメインのアミノ酸配列および核酸配列をそれぞれ図７ｂおよび８ａに示す。図９ａ−９ｃは、標記ＮＥＯＳＰＬＡベクター中に発現したＲＦ−１の核酸およびアミノ酸配列を示す。図９ａおよび９ｂは、リーダー、可変軽および重、ならびにヒト定常ドメイン配列、すなわちヒトκドメインおよびヒトγ／定常ドメインを示す。図９ｃは、ヒトγ／定常ドメインのアミノ酸および核酸配列を示す。図１０には、ＣＨＯ細胞中で図９ａ−９ｃに示す配列を発現させることにより組換えＲＦ−１を得るための発現ベクターを図解している。
同様に、図１１ａ−１１ａは、リーダー配列、ＲＦ−１可変軽、ヒトκ定常領域、ＲＦ−２可変重、およびヒトγ／定常ドメインを示す。図１２は、ＣＨＯ細胞中で組換えＲＦ−２を発現させるための発現ベクターを図解している。
実施例７
ＥＢＶ形質転換細胞をクローニングするためのプロトコールの開発：
ＥＢＶ形質転換細胞からの抗体産生は連続的に低下し、最終的に停止する（Kozborら、J.Immunol.(1981),127,1275-1280）。したがって、抗体産生を停止させずに続けさせる（immortalize）には、停止する前に細胞から免疫グロブリンをコードする遺伝子を抽出し、適切な発現系に組み込むことが不可欠である。
しかし、ＥＢＶ形質転換細胞は限界希釈や半固形寒天でクローンすることが非常に難しい。我々の２つの抗−Ｆタンパク質抗体、ＲＦ−１およびＲＦ−２のプロテインＡ精製調製物の等電点フォーカシングゲル電気泳動により、ＲＦ−２調製物に抗体の少なくとも２つのポピュレーションと、ＲＦ−１調製物中にオリゴクローナリティ（oligoclonality）の可能性が示された。
マウスサイオーマ（thyoma）系ＥＬ−４ Ｂ５（Zhangら、J.Immunol.(1990),144,2955-2960）をフィーダー層として用いることにより、限界希釈による１個の細胞から細胞を増殖させた（expand）。ヒトサイオーマ細胞系ＥＬ−４ Ｂ５は、Ｂ細胞への成長を誘導するように膜レセプター中にｇｐ３９を発現する。ＥＬ−４ Ｂ５細胞を、１μＬプレートに５ｘ１０4個／ウェル接種し、該培養由来の細胞を種々の濃度（０.３８個／ウェルおよびそれ以上）でＥＬ−４ Ｂ５層上に接種した。適当な時間後に、接種濃度ごとに増殖がみられたウェル数が算定した。
上清中にヒトＩgＧおよび抗原特異的ＩgＧが存在するかを試験した。このプロトコールを用いて、元のオリゴクローナル調製物からそれぞれＲＦ−１（表Ｖ参照）およびＲＦ−２（表VI参照）を産生する細胞を単離およびクローンした。クローニング中に認められた非特異抗体についてはアイソタイプのみを分析し、特異抗体のＩgＧ１ｋと同じであることがわかった。特異抗体は、ＲＦ−１培養中の種々の時点で作成した凍結物由来のＦ−タンパク質特異的クローンの収量および産生されたＩgＧ量に基づいて、培養開始直後に総抗体量の約１／２０が生じ、約８カ月培養後に消失すると見積もられた。ＲＦ−２は、あらゆる示した時間で総ＩgＧのかなりの大きな部分（約１０％も）を産生した。オリゴクローナル調整物からの抗体を用いてＥＤ５０価の過大評価をもたらすin vitro中和データを得た。しかし、我々のプラスモン（plasmon）共鳴を用いるアフィニティ試験では純粋な抗体の使用を要しなかった。滴定微小熱量測定法（titration micro calorimetry）を用いる該アフィニティ試験はクローン化物質を用いて実施された。
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in vitro中和活性による２つのヒトモノクローナル抗体の臨床応用性を確認するため、２つの異なる動物モデルにおいて、これら抗体のＳＲＶ感染を除去する効果によりさらにこれらの抗体を特徴づけた。これらの前臨床成績評価は、適切な発現ベクター中に挿入された該抗体をコードするクローン化遺伝子でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞によって産生された物質を用いて行われる（図６参照）。２つの抗体モデル（１つは完全な相補およびＦｃレセプター結合ドメイン、を含み（γ１）、もう１つはこれらのドメインを欠く（γ））（ＰＥ突然変異体）（Alegreら、J.Immunol.,(1992),148,3461-3468;Angalら、Molecular Immunology, (1993),30,105-108）が試験されるであろう。γ４変種の試験原理は、２つの考えに基づいている：(i)抗−Ｆタンパク質Ｆａｂはin vitro（Barbasら、Proc.Natl.Acad.Sci.(1992),89,10164-10168）およびin vivo（Croweら、Proc.Natl.Acad.Sci.(1994),91,1386-1390、肺内に直接投与したにも関わらず）で有意なウイルス中和効果を示していること、ならびに(ii)ウイルス感染によってすでにストレスを受けている感受性組織においてエフェクター機能の活性化をもたらす肺損傷を避けることは有利であろうこと。コントロールの非特異抗体、１つはγ１で１つはγ４（ＰＥ）は、１つの集団内部の非特異ハイブリドーマＩgＧ1抗体から生じるであろう。
最初の動物モデルはマウスモデルである（Taylorら、J.Immunology(1984),52,137-142;Walsh,E.E.,J.Infectious Diseases (1994),170,345-350）。このモデルは、１週間インキュベーション後の肺組織中の感染（load）ウイルスが２ｌｏｇ減少する最小用量で規定される有効用量を測定するのに使用する。このモデルは、どの抗体モデルを用いて進めるかを決めるのに用いられる。第２の動物モデルはアフリカミドリザルを用いる霊長類動物モデルである（Kakukら、J.Infectious Diseases(1993),167,553-561）。ＲＳＶはアフリカミドリザルに肺損傷を引き起こすが、このモデルの主目的は、抗体の、その損傷を抑制する特性を評価することである。このモデルを用いる試験の数は１抗体を異なる５用量で試験するものに限られよう。抗体、用量および感染日に対する注入日は、マウスモデルにおける知見に基づいて決定されよう。肺切片では、プラークアッセイを行ったウイルスについて、ＲＳＶによって生じた病変を検出するための光学顕微鏡検査を行った。
２種類の抗体を産生する細胞を刺激し、増殖させる過程で生じたあらゆるアミノ酸配列の変化が観察されよう。これは、ＲＦ−１およびＲＦ−２の重鎖のＣＤＲ３領域に基づくＰＣＲプライマーのセットを用い、ＲＦ−１およびＲＦ−２をコードする遺伝子配列が２つの細胞系が生じた元の凍結細胞物質中に存在しているかを試験することにより行われる。陽性コントロールはＲＦ−１およびＲＦ−２が加わった（spiked）供給源細胞である。該分析はLevyら、1989、Levyら、J.Exp.Med.(1989),169:2007およびAlegreら、J.Immunol.(1992),148,3461-3468;Angalら、Molecular Immunology(1993),30,105-108;Footeら、Nature(1991),352,530-532;Radaら、Proc.Natl.Acad.Sci.(1991),88,5508-5512;Kocksら、Rev.Immunol.(1989),7,537-559;Wysockiら、Proc.Natl.Acad.Sci.(1986),83,1847-1851;Kippsら、J.Exp.Med.(1990),171,189-196;Uekiら、Exp.Med.(1990),171,19-34によって確立された原理に従う。
実施例８
大量（＞１００ｍｇ／Ｌ）のＲＦ−１およびＲＦ−２を生じるＣＨＯ細胞系の作製：
ａ．発現プラスミドのトランスフェクション、最高レベルのＲＦ−１およびＲＦ−２を発現するＧ４１８耐性ＣＨＯクローンの単離および増殖。
ＲＦ−１およびＲＦ−２可変領域遺伝子をＮＥＯＳＰＬＡ中にクローンしたら、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（ＤＧ４４）（Urlaubら、J.Somat.Cell Mol.Genet.,(1986),16,,555)をプラスミドＤＮＡで形質転換する。ＣＨＯ細胞をヒポキサンチンおよびチミジン不含ＳＳＦＭ Ｈ（ＧＩＢＣＯ）中で増殖させる。ＢＴＸ ６００エレクトロポーレーション装置（ＢＴＸ、San Diego,CA）を用い、細胞４ｘ１０6個を０．４ｍＬディスポーザブルキュベット中でプラスミドＤＮＡ２５μｇを用いてエレクトロポーレーションした。エレクトロポーレーション前に、哺乳動物細胞中で発現した遺伝子を細菌中で増殖させるために使用したプラスミドの部分から分離するため、プラスミドＤＮＡをＰａｃＩで制限する。エレクトロポーレーションの条件は、２３０Ｖ、４００マイクロファラデー、１３ ｏｈｍｓである。エレクトロポーレーションしたものをそれぞれ９６ウェルプレート（約４０，０００細胞／ウェル）に接種した。プレートに、エレクトロポーレーション後３日間およびその後定期的にコロニーが生じるまで、４００μg/mLのＧ４１８を含有する培地（Genetin,GIBCO）を加える。コロニーから得られる上清においてヒトＩgＧの存在と抗−Ｆタンパク質活性をＥＬＩＳＡでアッセイする。
ｂ．メトトレキセート中での抗体発現の増幅
次に、最高量の免疫グロブリンを産生するＧ４１８耐性コロニーを大容器に移し、増殖させる。最高量を分泌するＧ４１８クローンの発現は、９６ウェルプレート中、５ｎＭメトトレキセート（ＭＩＸ）中で選択することによる遺伝子増幅により増加する。次に、最高量の抗体を産生する５ｎＭコロニーを増殖させ、次いで９６ウェルプレート中で、再度５０ｎＭ ＭＩＸ中で選択することにより発現を増幅させる。このプロトコールにより、我々は以前に７日間のスピナー培養中で２００ｍｇ／Ｌ以上（発酵器中、６日間で０．５ｇ／Ｌ以上）を分泌するＣＨＯ細胞を誘導することができた。次に、ヒト抗体をプロテインＡアフィニティクロマトグラフィーを用いて上清から精製する。
ｃ．抗体の産生と精製
各抗体１００ｍｇを得る。マウスモデル試験で決定した量の分泌抗体を産生する。５０nMメトトレキセート含有ＣＨＯ−Ｓ ＳＦＭ II無血清培地（GIBCO Cat.No.91-0456DK）中で選択したＣＨＯトランスフェクトーマ（transfectoma）を含むスピナーフラスコを用い、必要量の抗体を生産する。上清を回収し、フィルターのセット（最終０．２nmフィルター）で濾過して特定の物質を除去する。上清を、抗体の全量に基づいて予め決定したサイズのプロテインＡカラムにかける。洗浄後、０．１Ｍグリシン／ＨＣｌ（ｐＨ２．８）を用いてカラムから中性緩衝液の１Ｍトリス／ＨＣｌ（ｐＨ７．４）中に溶出する。溶出／中性緩衝液を、Amicon CentriprepまたはCentricon30(Cat.no.4306および4209）を用いる限外濾過により１０００回以上滅菌ＰＢＳと交換する。抗体濃度を２ｍｇ／ｍＬに調整し、０．２ｎｍフィルターで濾過して滅菌する。抗体を精製し、動物に使用するまで２ｍＬクライオチューブ中で氷冷貯蔵する。
実施例９
ＲＳＶ動物モデルでのパフォーマンスに関するＲＦ−１とＲＦ−２の特性
ＲＦ−１およびＲＦ−２のパフォーマンスを適当な動物モデルを使用して判定する。この評価法は２段階に分かれ、第一は（ａ）抗体の力価を測定し、ならびにその抗体がウイルス感染を排除するために必須な支持（効果器）機能の型を決定をするためのBalb／cモデル［Taylorほか、J.Imuunology（１９８４年）、５２巻：１３７〜１４２頁；Croweほか、Proc.Natl.Acad.Sci.（１９９４年）、９１巻：１３９６〜１３９０頁；Connorsほか、J.Virology（１９９２年）、６６巻：７４４４〜７４５１頁］。マウスモデルで得たデータから霊長類モデルにおいてさらに研究するために候補１種を選択する。霊長類モデルはアフリカミドリザルモデルである［Kakukほか、J.Infectious・Diseases（１９９３年）、１６７巻：５５３〜５６１頁］。対象モノクローナル抗体が肺障害に関連するウイルスの予防に使用できることを確認するためには霊長類モデルは特に適当である。
ａ．マウスモデルにおけるテストパフォーマンス
われわれが選択するゲッ歯類モデルはＢａｌｂ／ｃマウスである。このモデルは受動的療法の研究についてはよく研究されている［Croweほか、Proc. Natl.Acad.Sci.（１９９４年）、９１巻：１３８６〜１３９０頁；Connorsほか、J.Virology（１９９２年）、６６巻：７４４４〜７４５１頁］。Balb／cマウスは上部気道および下部気道におけるＲＳＶ増殖には全段階で高度に寛容である［Taylorほか、J.Immunology（１９８４年），５２巻：１３７〜１４２頁］。動物を５の群に分け、標準的マウスチャウおよび水を自由摂取させ、ロチェスターゼネラル病院動物施設指針に沿って飼育する。これらの指針はニューヨーク州保健局、連邦動物福祉法およびＤＨＨＳ法令に適合している。注射、ウイルス感染、眼窩採血、および頚部脱臼による屠殺を含めて全操作法はペントレン麻酔下に排気フード下に行った。
ｉ    抗体有効量の決定およびＲＦ−１とＲＦ−２およびγ１とγ４（ＰＥ型）のパフォーマンスの比較。
第０日に１群５匹のマウスを１００μＬ容量中のＲＳＶの１０６ロング（サブグループＡ）または１０5個の１８５３７（サブグループＢ）プラーク形成単位（ＰＦＵ）の点鼻によって感染させる。ウイルス力価のピークである第４日目に動物に４種の各Ｆ蛋白質特異的モノクローナル抗体標本または対照抗体を腹腔内に注射すればよい。検査する用量は最初は試験管内研究から血清中和力価を与えるように算出した約１：３００またはそれ以上の参考用量の周辺に集中させる。この力価は小動物でＲＳＶ感染に対する保護レベルに関連している。用量反応関係は参考用量の２５、５、１、１／５、および１／２５倍での処理によって評価する。さらに高用量または低用量を用いる実験も必要なら行う。対照マウスには前記の通りにアイソタイプ適合モノクローナル抗体の対応する用量を注射する。２４時間後の第５日はウイルス放出の最盛期であるが、この日にマウスを屠殺する。心臓穿孔によって血清を採取し、鼻甲介および肺臓を摘出し、秤量し、各々１ｍＬおよび２ｍＬのＮＭＭ中でホモジナイズする。ＨＥｐ−２細胞でウイルスの力価についてホモジネートを検定し、ウイルス力価をＴＣＩＤ50／ｇ組織で表す。群間の平均力価を対照群とスチューデントのｔ−検定によって比較する。血清は感染時と屠殺時に採取してヒトのモノクローナル抗体について酵素免疫検定および中和検定によって定量する。上部呼吸樹ではＩｇＧアイソタイプは能動的には分泌されない（ＩgＡに比較して）ので、ウイルス力価の最大低下値は肺臓ウイルス増殖にあると予測される。感染第４日の治療が肺ウイルスの減少に無効であることが証明されたら、第２日および／または第３日の治療を評価する。
原液中および注射した動物から得られる血清中の各モノクローナル抗体力価は前記の通りにＥＬＩＳＡを使用して測定する。確定している方法（８２）に従って親和性クロマトグラフィーによって精製したＲＳＶ融合蛋白質を固相で使用する。実験的ＲＳＶ感染症に対するマウスＩgＧの応答を評価するためにＲＳＶ・Ｇ蛋白質に対する別の検定も案出するのがよい。ヒトのＩgＧおよびマウスＩgＧに対して特異的なウサギ抗体（Virion・Systems社、ベセスダ、ＭＤから入手できる）を用い、ヒトのモノクローナル抗体またはマウスの抗体をＥＬＩＳＡによって検出する。
これらのモノクローナル抗体の用量応答関係をウイルス力価を２log10倍以上または＞９９％低下させる最低抗体力価として各抗体について測定する。保護の程度は屠殺時に到達していた血清抗体レベルに関連する。これに加えて、ヒトのモノクローナル抗体の様々な組合せの相乗効果の可能性も検討する。前記に略述した初期試験管内研究の結果を使用して生体内実験を誘導する。例えばＲＦ−１およびＲＦ−２がＲＳＶ・Ｆ蛋白質上にある別個の抗原結合部位を有するなら、同じアイソタイプ（γ１またはγ４）の組合せが相乗効果を示すこともある。
ｉｉ    肺組織の組織学的評価
肺炎の受動療法の効果を標準的な組織病理学的および組織免疫化学的な技術によって評価する。細気管支周囲の浸潤および肺胞浸潤の双方が一次または二次感染後のマウスについて記載されている［Connersほか、J.Virology（１９９２年）、６６巻：７４４４〜７４５１頁］。実験動物をモノクローナル抗体で前記の通り処理する。無感染無処置対照マウスを組織学的効果を評価するための比較対照として使用する。感染後第５日および第８日に、肺臓を摘出し、定常的な充填圧（３０cmＨ2Ｏ）下に３０分間ホルマリンで膨張させる。切片にしてヘマトキシリン−エオシンで染色した後、炎症性浸潤の程度を細気管支周囲および肺胞部分について（ＰＭＮおよびリンパ球を別個に）標準的評点法を用いて測定する。γ１およびγ４モノクローナル抗体が補体を別々に固定し、活性化することも予測されるので、肺切片の炎症領域を購入可能なウサギの抗マウスＣ３抗体（Virion・Systems社、ベセスダ、ＭＤ）およびペルオキシダーゼ結合ヤギおよびウサギＩｇＧを用いてマウスＣ３沈着で染色する。
固定肺臓組織に見られる組織学的変化の評価に加え、肺臓の炎症を肺胞細胞学も評価して査定する。前記の通り処置したマウス群を屠殺し、下部気道にＰＢＳ３ｍＬを反復潅流することによって気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）を行う。ＢＡＬの細胞を計数し、細胞遠心分離標本の染色によって細胞型を確認する。
ｉｉｉ    感染症への自然免疫応答に及ぼす抗体療法の効果
コトンラットおよびヨザルのモデルでは、ＲＳＶ感染のポリクローナルＩgＧ製品を用いる受動的療法は動物を攻撃から十分に保護するが、後続するウイルスに対する抗体の自然応答が減少する［Ｈｅｍｍｉｎｇほか、J.Infectious・Diseases（１９８５年）、１５２巻：１０８３〜１０８６頁；Princeほか、Virus・Research（１９８５年）、３巻：１９３〜２０６頁］。これと対照的に、Grahamは処置したマウスが抗体への鈍感な応答およびウイルスの攻撃への罹患性の双方を示すことを見出した［Grahamほか、Ped.Research（１９９３年）、３４巻：１６７〜１７２頁］。ヒトのモノクローナル抗体を用いてこの可能性を評価するため、マウスをＲＳＶのロング株に感染させ、前記略述の通り第４日に保護用量の抗体で処置する。対照には感染無処置動物および無感染処置動物を含める。抗体測定のため８週間は１週間置きに、続く８週間は４週間置きにマウスから採血する。ＲＳＶ・ＦおよびＧ蛋白質に対するヒトのモノクローナル抗体およびマウスの抗体の双方をＥＬＩＳＡで測定する。これに加え、血清の中和力価を各時点で測定する。残留するヒトのモノクローナル抗体および能動的に産生されたマウス抗体による中和への寄与をＥＬＩＳＡの結果および無感染抗体処理対照の中和活性の結果によって推定する。ヒトのモノクローナル抗体がＥＬＩＳＡによって検出されなければ、ＲＳＶの同一株を動物に再投与する。第４日に動物を屠殺し、肺および鼻組織をウイルスについて力価検定して対照群と比較する。
細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）誘導に及ぼすモノクローナル抗体療法の影響を評価するために同様な実験を行うが、注射の６週間後にマウスを屠殺し、脾細胞培養物を活性ＲＳＶで５日間刺激する［Walsh,E．E．、J.Infectious・Diseases（１９９４年）、１７０巻：３４５〜３５０頁］。ＣＴＬ活性を標準的クロム５１放出検定法によって持続的感染Balb／c線維芽細胞細胞系統（ＢＣＨ４細胞）を用い、無感染Ｂａｌｂ／ｃ線維芽細胞細胞系統と比較して評価する。
主に樹立されたＲＳＶ感染症の受動的療法の有効用量に関する研究に基づき、次にＲＳＶ感染症を予防し、または処置するためにはＲＦ−１またはＲＦ−２のどちらの抗体が最も有効であるかを決定する。γ１またはγ４（ＰＥ）態様間の選択には肺組織学的研究、特に補体の補給がＣ１ｑ結合抗体で明確に強化されると思われるかどうか、を考慮する必要がある。後続する強化された脈管化ウイルス−抗体の対立を増加するかも知れないが、補体の多量な活性化は有害な効果を示す可能性がある。
ｃ．サルモデルにおけるテストパフォーマンス
選択する抗体に付いての決断的試験は霊長類で行う。われわれはＲＳＶに高度な寛容性を示し、感染が肺臓病理を強化し、また検出可能な病巣を導く［Kakukほか、J.Infectious・Diseases（１９９３年）、１６７巻：５５３〜５６１頁］アフリカミドリザル（Cercopithecus・aethiops）を選択する。アフリカミドリザルは容易に購入でき、危険がない。このサルの体重は５ｋｇおよび１０ｋｇの間である。抗体の予測的用量最大値は２０ｍｇ／ｋｇである。各１０ｋｇの動物３匹を２０ｍｇ／ｋｇ、すなわち６００ｍｇの抗体で処置する。野生のアフリカミドリザルはＲＳＶに対する自然の免疫を持っており、われわれの研究に導入する要件は血清がＲＳＶについて陰性であることである。
マウスモデルで確立したベースライン、有効用量／ｋｇおよび療法開始前の感染時点、に基づいて、ウイルスを減少させる有効用量を確立するため、ならびにこれが肺臓病理の予防に関連するかどうかついて、特に実質組織の炎症への関与について、確認するため、限定された一連の試験を行う。ウイルス株は１種、すなわちロング株（サブタイプＡ）を検査する。最初に参照用量の２５、５、１および１／２５倍を検査する。対照群２種、一方はウイルスに感染し、抗体処置しないもの、他方はウイルスに感染し、アイソタイプ適合対照抗体の最大用量で処置したものを分析する。本質的に実験は前記の通りに行う。１群３匹のサルを点鼻法により１０6ＰＦＵのウイルスで感染させる。ウイルス感染の後、６日から７日目にサルを屠殺し、肺臓および咽頭サンプルを採取し、前記の通りウイルス検定および組織学的検査を行う。
組織学的検査は実質的に前記の通りに行う。略述すれば、肺を１０％中性緩衝ホルマリンで定常充填圧下に潅流する。肺を少なくとも１週間ホルマリン中に保持するのがよい。切片にしてヘマトキシリン−エオシンで染色後、スライドをKakukほか、J.Infectious・Diseases（１９９３年）、１６７巻：５５３〜５６１頁に従って組織病理学的に評価する。血清サンプルも採取し、ＲＳＶに対するヒトの抗体の力価をＥＬＩＳＡおよび感染中和検定で測定する。
実施例１０
１．ヒトの組織切片での試験管内検査による組織特異性の確認
次に抗体を二人の別人から得た異なる正常組織切片について免疫組織学的研究によって正常な組織への潜在的な交差反応性についてさらに試験する。略述すれば、凍結組織のCryostatミクロトーム切片に次の試験３種を行う：固定化分析、ニトロ化分析および特異性／分布分析。精製ビオチン標識抗ＲＳＶ・Ｆ蛋白質抗体を１％ＢＳＡ添加ＰＢＳに添加し、スライドを３０分間湿潤チャンバー中、２００Ｃでインキュベーションする。次にスライドを１％ＢＳＡ添加ＰＢＳで洗浄する。続いてこのスライドをアビジン−ＨＲＰとともに１％ＢＳＡ添加ＰＢＳ中で３０分間インキュベーションする。ＨＲＰを３，３−ジアミノベンジジン四塩酸塩と反応させると、ＨＲＰでの酸化が介在する不溶性沈殿染色物を形成する。これが対象ヒトモノクローナル抗体の潜在的な交差反応性を確認する。この試験はImpath研究所、ＮＹ、ＮＹで行い、ＦＤＡによるヒトの治療を最終目的とする製品のＩＮＤ提出用として承認を受ける。この組織学的な手法は既存の組織を使用し、放射能標識抗体でのＲＳＶ感染サルを標的とする別の研究より安価である。
配列表
配列番号１：
配列の長さ：３２１
配列の型：核酸
起源：Homo sapiens
配列の特徴：CDS、(1)..(321)
配列：
0003771267.tif 000011
配列番号２：
配列の長さ：３７８
配列の型：核酸
起源：Homo sapiens
配列の特徴：CDS、(1)..(378)
配列：
0003771267.tif 000012
配列番号３：
配列の長さ：３１８
配列の型：核酸
起源：Homo sapiens
配列の特徴：CDS、(1)..(318)
配列：
0003771267.tif 000013
配列番号４：
配列の長さ：３７８
配列の型：核酸
起源：Homo sapiens
配列の特徴：CDS、(1)..(378)
配列：
0003771267.tif 000014
配列番号５：
配列の長さ：７０５
配列の型：核酸
起源：Homo sapiens
配列の特徴：CDS、(1)..(702)
配列：
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配列番号６：
配列の長さ：１４２８
配列の型：核酸
起源：Homo sapiens
配列の特徴：CDS、(1)..(1425)
配列：
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配列番号７：
配列の長さ：７０８
配列の型：核酸
起源：Homo sapiens
配列の特徴：CDS、(1)..(702)
配列：
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配列番号８：
配列の長さ：１４２８
配列の型：核酸
起源：Homo sapiens
配列の特徴：CDS、(1)..(1425)
配列：
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配列番号９：
配列の長さ：１０７
配列の型：アミノ酸
起源：Homo sapiens
配列：
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配列番号１０：
配列の長さ：１２６
配列の型：アミノ酸
起源：Homo sapiens
配列：
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配列番号１１：
配列の長さ：１０６
配列の型：アミノ酸
起源：Homo sapiens
配列：
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配列番号１２：
配列の長さ：１２６
配列の型：アミノ酸
起源：Homo sapiens
配列：
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配列番号１３：
配列の長さ：２３４
配列の型：アミノ酸
起源：Homo sapiens
配列：
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配列番号１４：
配列の長さ：４７５
配列の型：アミノ酸
起源：Homo sapiens
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配列番号１５：
配列の長さ：２３４
配列の型：アミノ酸
起源：Homo sapiens
配列：
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配列番号１６：
配列の長さ：４７５
配列の型：アミノ酸
起源：Homo sapiens
配列：
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図４】
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【図６】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図９ａ】
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【図９ｂ】
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【図９ｃ】
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【図１０】
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【図１１ａ】
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【図１１ｂ】
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【図１１ｃ】
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【図１２】
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