(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
IFNγＲ遺伝子の個々の遺伝子座における損傷の導入の結果として主要組織適合複合体（MHC）抗原の発現をアップレギュレートする能力を欠いた遺伝子操作された哺乳動物細胞であって、上記損傷の導入は、IFNγＲタンパク質のトランスメンブラン・コーディング領域に連結され、かつ、当該領域の下流に在る転写的且つ翻訳的に弱められた陽性の選択マーカー遺伝子をコードするDNAを含む少なくとも１つのDNAターゲッティング構造体により哺乳動物細胞をトランスフェクションすることにより、ここで上記DNAターゲッティング構造体の発現生成物が、機能的選択マーカーに融合されたIFNγＲの上記トランスメンブラン領域を含む融合タンパク質であり、そして上記選択マーカーが、上記遺伝子操作された細胞の細胞膜の細胞質側上で発現される、前記哺乳動物細胞。
【請求項２】
INFγＲ遺伝子のトランスメンブラン・コーディング領域に連結され、かつ、当該領域の下流に在る転写的且つ翻訳的に弱められた陽性の選択マーカー遺伝子をコードするDNAを含むDNAターゲッティング構造体。
【請求項３】
前記選択マーカー遺伝子がネオマイシン耐性遺伝子である、請求項２に記載のDNAターゲッティング構造体。
【請求項４】
IFNγＲ遺伝子の不活性化の結果としてMHC抗原の発現をアップレギュレートする能力を欠いた遺伝子操作された哺乳動物細胞を、少なくとも１のDNAターゲッティング構造体による上記宿主哺乳動物細胞のトランスフェクションにより、製造する方法であって、以下のステップ：
DNAターゲッティング構造体で哺乳動物細胞をトランスフェクトする、
を含み、ここで上記DNAターゲッティング構造体が、IFNγＲのトランスメンブラン・コーディング領域に連結され、かつ、当該領域の下流に在る転写的且つ翻訳的に弱められた陽性の選択マーカー遺伝子をコードするDNAを含み、そして上記DNAの発現生成物が、前記遺伝子操作された細胞の細胞膜の細胞質側上で発現される、IFNγＲの上記トランスメンブラン領域に融合された機能的選択マーカーを含む融合タンパク質である前記方法。
【請求項５】
哺乳動物細胞における内在性膜タンパク質をコードする遺伝子を不活性化するための相同組換えの検出の改良方法であって、以下のステップ：
IFNγＲ遺伝子のトランスメンブラン・コーディング領域に連結され、かつ、当該領域の下流に在る転写的及び翻訳的に弱められた陽性の選択マーカー遺伝子をコードするDNAを含む少なくとも１のDNAターゲッティング構造体により上記哺乳動物細胞をトランスフェクトし、ここで、上記DNAターゲッティング構造体が相同組換えにより上記哺乳動物細胞内の染色体中に組込まれ、それにより、IFNγＲをコードする上記遺伝子が不活性化され、そして選択マーカーに融合されたIFNγＲの上記トランスメンブラン領域を含む融合タンパク質が生成され、当該選択マーカーは、上記トランスフェクトされた哺乳動物細胞の細胞膜の細胞質側上で発現され；そして
上記融合タンパク質を生成するトランスフェクトされた細胞を選択する、
を含む前記方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明の分野は、移植を包含する細胞及び器官治療において及びキメラ性非ヒト哺乳類を生成するために普遍的なドナーとして作用できる、主要組織適合性複合体抗原欠乏性細胞及び機能的な主要組織適合性複合体（MHC）抗原の発現を欠いている器官の生成及び使用に関する。
背  景
疾病及び感染から脊椎動物を保護するためには、複雑な保護システムが開発されて来た。哺乳類においては、免疫システムは、宿主を保護するために多くの異なったタイプの細胞及び機構を伴って一次防御として作用する。広範囲の種類の造血細胞が存在し、そして主要な保護系統はリンパ系及び骨髄系である。リンパ系及び骨髄系の細胞に起因する免疫システムは、非自己から自己を認識するためにインビボで成長せしめられる。免疫システムが自己を攻撃するそれらの異常な情況、たとえばリウマチ様関節炎、紅斑性狼瘡及び一定の形の糖尿病は、外来性物質のみが攻撃される宿主にとって重要な証拠である。ウィルス、細菌又は他の病原体の侵入の結果としての疾病から宿主を保護する保護機構はまた、異なった哺乳類宿主、たとえば同種異系宿主からである細胞も認識することができる。
自己一対一非自己認識のためのシステムの部分として、表面膜タンパク質の主要組織適合性複合体（MHC）抗原は重要な役割を示す。個々の宿主は、他の宿主とこの宿主とを区別するように作用する宿主自体の組のクラスＩ及びII MHC抗原を有する。Ｔ−リンパ系システムは、自己のようなMHC抗原の存在の認識に基づいて予測される。他の同種異系宿主からの移植が存在する場合、移植片が宿主と適合せず又は宿主が免疫無防備状態でない場合、その移植片は免疫システムにより攻撃され、そして破壊され得る。リンパ球、単球又はその前駆体、特に骨髄を含む移植片が存在する場合、移植片は外来体として宿主を攻撃し、移植片対宿主疾患をもたらす。
受容体の細胞が欠乏しており、損傷を受けており又は機能不全である受容体宿主に細胞を移植することを所望する多くの情況が存在する。宿主が免疫無防備状態である場合、種々の病気から宿主を保護できる特定の白色細胞、特にＴ−細胞の輸注に興味が存在する。宿主が特定の疾病に対する防御を高める能力を欠いている場合、宿主の無防備状態の免疫システムを補充できる特定のＴ−細胞又はＢ−細胞又はそれらの前駆体の投与にもまた興味が存在する。一定の細胞が欠乏している場合、たとえば糖尿病に関して、ランゲルハンス島を欠く場合、又はパーキンソンス病に関して、ドパミンを分泌する細胞を欠く場合、又は種々の造血疾病における骨髄細胞を欠く場合、又は筋肉消耗病における筋肉細胞を欠く場合、又は視力障害における網膜上皮細胞、又はやけど又は非治癒性創傷のためのケラチノサイトを欠く場合、所望する機能を実現させる細胞を供給できることが所望される。効果的である細胞のためには、細胞は宿主による攻撃から安全であるべきであり、その結果、それらの細胞は、免疫システムにより破壊されることなく機能することができる。従って、移植された細胞の拒絶を引き起こす遺伝子生成物の発現を不活性化するように標的を向けられた遺伝子の使用により、受容体の免疫システムによる攻撃から防御しながら、機能でき、増殖でき、そして分化できる細胞を生成するための効果的な手段を見出すことが興味の対象である。同じ理由が、心臓、肺、肝臓及び腎臓を包含する移植のための器官の使用に適用される。
相同組換えは、内因性遺伝子の座位特異的変性を可能にし、そして従って、遺伝された又は獲得された変異が修正され、そして／又は新規変更がゲノム中に構築され得る。遺伝子療法への相同組換えの適用は、正常な二倍体の体細胞において相同組換えを効果的に実施する能力に依存する。正常な体細胞における相同組換え又は“遺伝子標的化”が遺伝子療法のための潜在的に強力な方法を提供するが、しかしながら、多分化能性マウス胚幹（ES）細胞及び連続細胞系を除いて、相同組換えは、十分に特徴化され、形質転換されていない、すなわち“正常な”哺乳類体細胞に関しては報告されていない。マウスES細胞系と対照的に、正常なヒト体細胞はインビトロで限りある寿命期間を有する(Hayflick and Moorhead,Exptl.Cell.Res.25:585-621(1961))。これは遺伝子標的化によるそれらの変性を挑戦的にし、この方法の低い効率を付与し、すなわち10-5〜10-8の組換え体／入力細胞の効率を与える。さらに、この方法は、哺乳類細胞がトランスフェクトされたDNAを、相同部位でよりもランダム部位で100〜1000倍効果的に組込む傾向がある事実により、さらに複雑化される。
本発明は、網膜上皮細胞、ケラチノサイト及び筋原細胞のような細胞におけるβ2−ミクログロブリン及びIFN−γＲ遺伝子を包含する、MHC抗原発現に関連する遺伝子を不活性化するために形質転換されていない二倍体の体細胞を標的化するための方法を開示する。それらの方法は、機能的なMHCの発現の欠失をもたらす標的遺伝子を不活性化するための新規標的化手段を提供する。膜タンパク質を標的化するための本発明の方法においては、そのようなタンパク質の役割が研究され得、そしてそれらの発現が、たとえば、受容体、たとえばＴ細胞受容体として作用する膜タンパク質を操作した。
動物モデルにおいて種々の生理学的工程をインビボで研究できることにもまた実質的な興味が存在する。それらの情況の多くにおいては、特定部位態様で不活性化され又は導入される特定の遺伝子を有することが所望される。宿主に存在する細胞のすべて又は実質的に大部分が変異誘発される場合、種々の方法が研究され得る。さらに、１つの野生型遺伝子及び１つの変異誘発された遺伝子を有するヘテロ接合性宿主がホモ接合性宿主を得るために変異誘発され、その結果、すべての細胞が適切な変性を有する。そのような遺伝子的に変異誘発された動物は、薬物をスクリーニングし、生理学的工程を研究し、新規生成物を開発し、そして同様のことをするために役立つ。
関連文献
多くの文献が哺乳類細胞、たとえばヒト細胞への相同組換えの使用を記載する。それらの文献は、Kucherlapati et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:3153-3157,1984;Kucherlapati et al.,Mol.Cell.Bio.5:714-720,1985;Smithies et al.,Nature 317:230-234,1984;Wake et al.,Mol.Cell.Bio.8:2800-2809,1985;Ayares et al.,Genetics 111:375-388,1985;Ayares et al.,Mol.Cell Bio.7:1656-1662,1986;Song et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:6820-6824,1987;Thomas et al.,Cell 44:419-428,1986;Thomas and Capecchi,Cell 51:503-512 1987;Nandi et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:3845-3849,1988;及びMansour et al.,Natune 336:348-352,1988を包含する。
Evans and Kaufman,Natune 294:146-154,1981;Doetschman et al.,Nature 330:576-578,1987;Thomas and Capecchi,Cell 51:503-512,1987;Thompson et al.,Cell 56:316-321,1989は、胚幹細胞に特定の遺伝的変異を創造し、そして生殖系にそれらの変異をトランスファーするために相同組換えを用いる種々の観点を個々に記載する。相同組換え出来事をスクリーニングするために使用されるポリメラーゼ鎖反応は、Kim and Smithies,Nucleic Acids Res.16:8887-8903,1988;及びJoyner et al.,Nature 338:153-156,1989に記載される。ネオマイシン遺伝子を誘導するための変異ポリオーマ  エンハンサー及びチミジン  キナーゼ  プロモーターの組合せは、Thomas and Capecchi、前記、1987;Nicholas and Berg(1983),Teratocarcinoma Stem Cell,eds.Siver,Martin and Strikl and(Cold Spring Harbor Lab.,Cold Spring Harbor,NY(pp.469-497);及びLinney and Donerly,Cell 35 693-699,1988により、胚幹細胞及びEC細胞の両者において活性的であることが示された。
ベアーリンパ球が、Schuurman et al.,The Thymocyte in“Bare Lymphocyte”Syndrome,Microenvironments in the Lymphoid System,et.Klaus,G.G.B.,Plenum Press,NY,pp.921-928(1985);Sulliran et al.,J.Clin.Invest.76:75-79(1985);Lisowska-Grospierre et al.,ibid.76:381-385(1985);Arons,et al.,J.Inf.Dis.156:837-841(1987);Clement et al.J.Clin.Inrest.81:669-675(1988);Sugiyama et al.,Chest 89:398-401(1986);及びHume et al.,Human Immunology 25:1-11(1989)に記載されている。
遺伝的な疾病を処理するためへの種々の正常な体細胞の移植は報告されている(Blaese et al.,Human Gene Ther.4:521-527(1993)。最近の移植実験は、能原細胞移植が薬物供給のために潜在的に有用なビークルを表わすことを示唆する(Barr et al.,Science 254:1507-1509(1991)及びDhawan et al.,Science 254:1509-1512(1991))たとえば、Duchennu筋ジストロフィー及び他の筋肉劣化及び筋肉消耗病を処理するためへの正常な筋原細胞の移植は、Partridge,Muscle & Nerve 14:197-212(1991)により提案されている。
インターフェロン−γ（IFN−γ）は、可能性ある抗ウィルス性、抗−増殖性及び免疫変性効果を示す、感染及び炎症の工程の間に生成されるサイトキンである(Trinchieri et al.,Immunol.Today.6:131-136(1985);Pestka et al.,Ann.Rev.Biochem.56:727-777(1987);及びFarrar et al.,Ann Rev.Immunol.11:571-611(1993))。それらの作用の多くは、MHC抗原の誘発の引き金を引く、偏在的に発現された高親和性細胞表面受容体、すなわちIFN−γ受容体(Aguet et al.,Cell 55:273-280(1988))に結合することによって介在されると思われる(Rosa et al.,Immunol.Today 5:261-262(1984))。IFN−γはβ2−マイクログロブリン、及びMHCクラスＩ複合体の発現(Germain et al.,Ann.Rev.Immunol.11:403-450(1993))及びMHCクラスＩ及びII分子の発現(Pestka et al.,Ann.Rev.Biochem.56:727-777(1987);Farrar et al.,Ann.Rev.Immunol.11:571-611(1993);Rosa et al.,Immunol.Today 5:262-263(1984)及びTruwsdale et al.,Nature 348:741-744(1990))に関連する抗原性ペプチドTAP−１及びTAP−２のトランスポーターをコードする遺伝子の生成物の発現を調節するので、相同組換えを用いてのその受容体を不活性化することによるIFN−γの効果のブロッキングは同種異系移植片の細胞性拒絶を低めることができる。培養されたヒト筋原細胞はMHCクラスＩ及びクラスII抗原の両者をひじょうに低いレベルで発現するが、しかしそれらの発現は、IFN−γによる処理の後、有意に高まる(Bao et al.,Immunol.Cell.Biol.68:235-242(1990))。従って、同種異系受容体においては、移植部位を浸透するＴ細胞により放されるIFN−γはMHC発現を調節し、ドナー筋原細胞の拒絶をもたらす。MHCクラスＩの発現はまた、他のサイトキン、たとえばIFN−γ及びIFN−β並びにIL−１により調節され得るので、IFN−γＲの不活性化は、組織適合性バリヤーを通して移植され得る普遍的なドナー筋原細胞を生成するために、MHCクラスＩ発現のために重要な他の遺伝子、たとえばIL−1R，TAP1及び／又はTAP2、及び／又はβ2−ミクログロブリン及び／又はプロテアゾーム遺伝子の不活性化と組合され得る。
Schwartzberg et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:3210-3214(1990)は、選択可能な融合タンパク質をコードするDNAによる相同組換えにより内因性ｃ−ab1遺伝子座の標的化された遺伝子破壊を記載する。他の興味ある文献は、エピトープ付加によるヒトCD４遺伝子座での遺伝子標的化を記載するJasin et al.,Genes & Deuelopment 4:157-166(1990)及びプロモーターのないneo遺伝子を含む標的化DNAフラグメントを用いてのマウス胚幹細胞におけるHprt遺伝子の標的化された変異誘発を記載するDoetschman et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:8583-8587(1998)を包含する。Neo遺伝子の種々の使用を記載する他の文献は、Sedivy and Sharp,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:227-231(1989);Riele et al.,Letters to Nature 348:649-651(1990);Jeannotte et al.,Molec.and Cell.Biol.11(11):5578-5585(1991);Charron et al.,Molec.Cell.Biol.10(4):1799-1804(1990);Stanton et al.,Molec.Cell.Biol.10(12):6755-6758(1990)を包含する。
体細胞遺伝子療法への遺伝子標的化の好都合な適用は、標的細胞における遺伝子型異常をもたらす他の遺伝的変更を誘発することなく、標的遺伝子座中に外因性DNAの正確な組込みを必要とする。ランダム組換えの頻度に比較して、体細胞に存在する低い頻度の組換え出来事を富化する方法のための必要性が存在する。
発明の要約
移植のために使用される場合、特に普遍的なドナー細胞、たとえば形質転換されていない二倍体ヒト体細胞として、又は突然変異を担持するキメラ性哺乳類を生成するために使用され得る胚幹細胞として、免疫攻撃を減じるように作用できる、少なくとも１つの機能的な主要組織適合性複合体（MHC）抗原を欠いている哺乳類細胞が供給される。細胞は相同組換えの結果として得られる。特に、少なくとも１つのMHC抗原鎖、たとえばMHCα鎖又はβ2−ミクログロブリンの少なくとも１つの対立遺伝子を不活性化することによって、機能的なMHC抗原の発現のための減じられた能力を有する細胞が生成され得る。機能的MHC抗原を欠くその得られる細胞は、宿主（受容体）の免疫攻撃のためのマーカーを欠く移植のためのドナーとして使用され得る。その細胞は、移植のための組織を生成するために使用され得る。細胞はまた、他の細胞とインビトロで相互作用せしめるためにも使用され得る。この形質を担持するトランスジェニック哺乳類は免疫欠損の研究において使用され得、そして移植のための組織及び細胞源として使用され得る。
他方、MHC抗原の発現と関連する不活性化された遺伝子、たとえばIFN−γＲ遺伝子を含む細胞は、MHC抗原の発現を調節する能力を欠いているドナー細胞の生成をもたらす、IFN−γに応答してMHC抗原発現の調節を妨げるために、本発明の方法を用いて得られる。
形質転換されていない体細胞における低い頻度の相同組換えが急速に検出され得る方法及び標的構造体が提供される。本発明の方法においては、強いプロモーター及び検出のためにリガンドに結合するエピトープ、並びに選択可能マーカー遺伝子を含むDNA構造体は、相同組換えのための標的の遺伝子座をコードする細胞の染色体における配列に標的を向けられる。このDNA構造体が細胞にトランスフェクトされる場合、融合タンパク質が発現され、そして細胞外に分泌される。さらに、リーダー配列及びトランスメンブラン配列をコードする配列から下流のタンパク質コード領域中に選択マーカーを挿入することによって統合した膜タンパク質の不活性化のための新規方法及び標的構造体が提供される。標的構造体は、上流の配列と読み取り枠を整合し、そして機能的膜の細胞質側上にマーカーを有する融合タンパク質をコードするように、完全な膜タンパク質をコードする遺伝子中に選択可能マーカー遺伝子を挿入する。細胞は、本発明の方法を用いてこの構造体により形質転換され、そして選択マーカーにより選択され、そして次に、組換え体の存在についてスクリーンされる。
本発明のもう１つの方法は、機能的MHC抗原の発現を欠いている組織又は細胞が移植されている哺乳類に治療剤、たとえばシクロスポリンを投与し、そして時間にわたって移植された組織又は細胞の拒絶の存在又は不在について観察することによって、哺乳類における移植片拒絶を妨げるための治療剤の有効性を決定するための方法である。
【図面の簡単な説明】
図1A−Ｃは、＃137標的ベクター（図3A）、ヒトβ2−Ｍ遺伝子座（図3B）及び正しく標的化された組換え遺伝子座（図3C）の例Ｖに記載される図である。
図２は、例Ｖに記載される、＃148β2−Ｍ標的ベクターの図である。
図３は、例VIに記載される、＃159 Neo置換標的ベクターの図である。
図4A−Ｃは、例VIIIに記載されるようなマウスIFN−γＲ遺伝子を標的化するための手段を示し；図4AはIFNγＲ標的ベクターpB−IT１及びpB−IT２を示し（pB−IT１における点画ボックスはMC１−NeoポリＡのプロモーター−エンハンサー配列を示す）；図4Bは野生型IFNγＲ遺伝子の一部の制限地図を示し（実線＝BamHＩフラグメント；黒ぬりのボックス＝エキソン；点線＝BamHＩフラグメント以外の配列）；図4Cは相同組換え続く標的遺伝子座の予測される構造体を示す（斜称のボックス＝プローブＢとハイブリダイズするIFNγＲ配列；Ｂ＝BamHＩ；Ｈ＝HindIII；Ｅ＝EcoRＩ及びＸ＝XbaＩ）。
図5A−Ｂは、例VIIIに記載されるようなマウス筋原細胞における抗原の発現を示す螢光プロフィールである。図5Aは、親筋原細胞系（IFNγＲ，＋／＋）、標的の筋原細胞4C17（IFNγＲ，＋／−）及びホモ接合性変異体マウスから単離された筋原細胞（IFNγＲ，−／−）におけるMHCクラスＩ抗原及びIFNγＲ結合ドメインの発現を示し；図5Bはマウス筋原細胞におけるGR−20抗原の発現を示す（点線は螢光抗体のバックグラウンド結合を示す）。
特定の態様の記載
機能的MHC抗原を欠く遺伝子的に構築された哺乳類細胞が、移植のための普遍的ドナー細胞として種々の目的のために提供される。その細胞は相同組換えの結果として得られる。細胞はさらに、対象の遺伝子の導入又は不活性化により変性され得る。
変性された細胞は、すべての組織及び器官においてMHC抗原の減じられた発現を有するトランスジェニック動物を生成するために使用され得る。そのような動物、特にマウス及び他の小哺乳類は、剤の効果を測定するために、特に薬物をスクリーンするために実験的に使用され得る。それらは、皮膚、腎臓、肝臓、等の移植片を包含する種々の移植治療のためのモデルシステムとして使用され得る。
相同組換えは、特定部位態様での遺伝子、特にMHC抗原に関連する遺伝子の不活性化又は変更のために使用され得る。細胞の性質に依存して、少なくとも１つの機能的MHC抗原を欠く細胞は、同種異系宿主へのドナーとして使用され、又は胚幹細胞が存在するなら、移植のための器官又は細胞又は組織の源としてそれ自体使用され得るトランスジェニック哺乳類宿主の生成に使用され得る。
クラスＩ及びクラスIIMHC抗原は、それぞれα及びβサブユニットから成るヘテロダイマーである。クラスＩMHC抗原においては、βサブユニットはβ2−ミクログロブリンである。MHC抗原の少なくとも１つの、好ましくは両サブユニット、より特定にはβ2−ミクログロブリンのコピーの不活性化が特に興味の対象である。胚幹細胞のβ2−ミクログロブリン遺伝子における変異が生成される場合、その胚幹細胞に由来する哺乳類宿主は、免疫システム及びそのシステムにおけるクラスＩMHC抗原の役割の研究のために使用され得る。実施可能な宿主において種々の機能を提供できる、少なくとも１つの機能的MHC抗原、クラスＩ又はクラスII、好ましくはクラスＩを欠いている細胞を供給する方法が特に興味の対象である。この方法は、β2−ミクログロブリン遺伝子、クラスＩ又はIIMHC抗原のα−サブユニット又はクラスIIMHC抗原のβ−サブユニットに関連する遺伝子座の１つに関連するDNAによる、予定された種の哺乳類細胞、特に正常な細胞のトランスフェクションを包含する。ヒトクラスIIMHC抗原はHLA−DR，DP及びDQ（ここでDRは特に興味あるものである）である。
DNAは、機能的MHC抗原分子の発現を妨げるために、生来の遺伝子の少なくとも１つの、通常両コピー中への損傷の導入を伴って特定遺伝子座で遺伝子の少なくとも一部を含むであろう。その損傷は、挿入、欠失、置換又はそれらの組合せであり得る。損傷が不活性化される遺伝子の１つのコピーのみに導入される場合、標的遺伝子の単一の変異誘発されていないコピーを有する細胞が増幅され、そして損傷が第１の損傷と同じか又は異なっている第２の標的化段階にゆだねられ、そして欠失又は置換が関与する場合、始めに導入された損傷の少なくとも一部をオーバーラップできる。この第２の標的化段階においては、相同性ではあるが、しかし異なった哺乳類の選択マーカー、たとえば耐ヒドロマイシン（hygr）を含む同じアームを有する標的ベクターが、ホモ接合的に標的化されたクローンを生成するために使用される（約10-5〜10-8の効率）。得られた形質転換体は機能的な標的抗原の不在についてスクリーンされ、そしてその細胞のDNAが野生型の標的遺伝子の不在を確かめるためにさらにスクリーンされ得る。他方、表現型に関するホモ接合性は、変異誘発のためのためにヘテロ接合性の宿主を繁殖することによって達成され得る。
他方、自発的にホモ接合性になっている細胞についてはだれでも選択できる。従って、細胞は、ヘテロ接合性細胞における非−分離により非標的化染色体上の遺伝子座の野生型の変更されていないコピーを失なう。これは、正常な二倍体の体細胞又はES細胞における４組の染色体の誤った分類に細胞分裂の間、起因する。通常、細胞は、細胞分裂の間、２つの娘細胞の個々に個々の染色体の１つのコピーを分類する。時々（約10-5の頻度）、細胞は、娘細胞の１つに同じ染色体の２つのコピーを、及び他の娘細胞に他の染色体を両コピーを分類する。ほとんどの時間、この機構は変更された遺伝子の２つのコピーを含む正常な生存細胞を生成するであろう。細胞分裂の間、自発的にホモ接合性細胞を生成する異なった機構は遺伝子変換である。低い頻度（10-6以下）で、細胞は編集する鋳型としてその相同体を用いて、遺伝子を編集するであろう。これは、２種の類似する遺伝子間の差異が除去される（編集削除される）組換え出来事である。この編集は短い領域（１〜1000bp）にわたって存在し、そしてホモ接合性を生成するであろう。本発明においては、ホモ接合性クローンは、それがもはや、標的化された遺伝子生成物のいづれも発現しないので、機能的なMHC抗原をもはや発現しないであろう。たとえば、細胞は、それが不活性化されたβ2−ミクログロブリン遺伝子のためにホモ接合性である場合、機能的なクラスＩMHCをもはや発現しないであろう。次に、ヘテロ接合性細胞は、抗−HMCクラスＩ抗体及び補体の組合せを用いて又は前記抗体及び磁気ビーズ(Vaccaro,Am.Biotech.Lab.30-35(1990)又はFACSソーティングの組合せを用いて選択され得る。さらに、ヘテロ接合性細胞においては、耐性遺伝子、たとえばneorの単一のコピーのみが存在するので（但し、ホモ接合性クローンの場合、この遺伝子の２つのコピーが存在する）、たとえばNeo配列又はプロモーターの突然変異を通しての耐性遺伝子の効率の低下は、２つのコピーを含むホモ接合性細胞の増殖を好む、選択剤、たとえばG418の濃度の選択を可能にする(Mortensen et al.,Mol.Cell.Biol.12(5):2391-2395(1992))。さらに、非分離は相反出来事であり、そして、ホモ接合性野性型細胞は抗生物質選択に対してひじょうに敏感であるので、低レベルの抗生物質の選択が細胞集団の連続した拡張の間、ホモ接合性に向かっての集団の流れを可能にするであろう。
形質転換にゆだねられ得る細胞は、細胞治療、研究、他の細胞とのインビトロでの相互作用又は同様の出来事に使用され得る、対象のいづれかの哺乳類細胞であり得る。特定の興味ある細胞は、他の系統の中で、ランゲルハンス島、ドパミンを分泌できる副腎髄質、骨芽細胞、破骨細胞、上皮細胞、内皮細胞、Ｔ−リンパ球、ニューロン、グリア細胞、ガングリオン細胞、腎細胞、胚幹細胞、肝細胞、骨髄細胞及び筋原細胞を包含する。これらの細胞は、哺乳類宿主、たとえばネズミ及び他のゲッ歯動物、ウサギ類、ブタ、ネコ、ウシ、イヌ、ヒト等から得られる。
機能的MHC発現を欠く細胞が、特定の機能を達成し、そして哺乳類宿主中に導入され、又は研究又は他の目的のために使用されるために選択されるであろう。また、特定の系統にすでにゆだねられている元の前駆体又は前駆体細胞であり得る、上記細胞のいづれかのための前駆体として作用する幹細胞が興味の対象であろう。特に興味ある物として、次の細胞、すなわち形質転換されていない二倍体の哺乳類体細胞、特にヒト細胞、たとえば上皮細胞、たとえばケラチノサイト、腎上皮細胞、及び間葉細胞、たとえば筋原細胞、造血細胞、リンパ球、たとえばＴ細胞、及びインビトロで容易に操作され得、培養に長期間維持され得、そして細胞が長期間、生存しそして機能的のまま存続するであろう宿主中に導入され得る他の細胞を挙げることができる。
胚幹細胞に関しては、胚幹細胞系が使用され得、又は胚幹細胞は宿主、たとえばネズミ動物、たとえばマウス、ラット、テンジクネズミ、チャイニーズハムスター又は他の実験用小動物から新しく得られる。細胞は適切な線維芽細胞−支持細胞層上で増殖され、又は白血病阻害因子（LIF）の存在下で増殖され、そして次に、変異誘発のために使用され得る。
機能的MHC抗原の発現を欠く細胞を生成するために特定のHMC抗原に関連する遺伝子の１つの又は両コピーを不活性化するために使用される方法は、配列の選択、使用される選択可能マーカー及びMHC抗原の不在を同定するために使用される方法において、主に類似しており又は異なっており、但し類似する方法は特定抗原の発現の不在を確かめるために使用され得る。前記方法は類似するので、β2−ミクログロブリン遺伝子及びIFN−γＲ遺伝子の不活性化が例として使用される。実質的に同じ方法であるが、しかし他の遺伝子配列を包含する方法は、クラスIIMHC抗原のα−及びβ−サブユニットのために及び機能的MHC抗原発現に関連する他の遺伝子のために十分であることが理解されるべきである。
細胞中への損傷の所望する導入を提供するDNA構造体が使用され得る。この構造体は、構造体の調製、宿主細胞のトランスフェクション及び宿主細胞中への構造体の組込みに使用され得る変異誘発された配列以外の機能的物体を含むように変性され得る。使用され得る技法は、リン酸カルシウム／DNA同時沈殿物、核中へのDNAのマイクロインジェクション、エレクトロポレーション、損なわれていない細胞との細菌性プロトプラスト融合、トランスフェクション又は同様の手段を包含する。DNAは一本又は二本鎖、線状又は環状、緩和又は超らせんDNAであり得る。哺乳類細胞をトランスフェクトするための種々の技法に関しては、Keown et al.,Methodes in Enzymology(1990)Vol.185,527-537ページを参照のこと。
構造体を標的化するための相同配列は１又は複数の欠失、挿入、置換又はそれらの組合せを有する、たとえば、β2−ミクログロブリンは１つの部位で欠失を及び選択のために使用され得る遺伝子を含むもう１つの部位で挿入を含み、そして前記挿入された遺伝子の存在が不完全な不活性タンパク質生成物をもたらすであろう。好ましくは、置換が用いられる。挿入された遺伝子に関しては、マーカー、たとえば耐抗生物質、たとえば耐ネオマイシン性、たとえば耐G418性を提供する遺伝子が特に興味の対象である。
欠失は少なくとも約50bp、より通常には少なくとも約100bp及び一般的には約52kbよりも多くないであろうし、そしてここで欠失は通常、エキソンの一部又は１又は複数のエキソン、イントロンの一部又は１又は複数のイントロンを含むコード領域の少なくとも一部を含み、そしてフランキング非コード領域の一部、特に５′−非コード領域（転写調節領域）を含んでも良く又は含まなくても良い。従って、相同領域はコード領域を越えて５′−非コード領域又は他方３′−非コード領域中に延長することができる。挿入は一般的に、10kbpを越えず、通常５kbpを越えず、一般的には少なくとも50bp、より通常には少なくとも200bpである。
相同配列は、少なくとも約100bp、好ましくは少なくとも約150bp、より好ましくは少なくとも約300bpの標的配列及び一般的には20kbpを越えず、通常10kbpを越えず、好ましくは合計的５kbp以下であり、通常、少なくとも約50bpの標的配列を、二重交差組換えを提供するために挿入及び／又は欠失の反対側に含むべきである。
標的遺伝子の上流及び／又は下流に、二重交差が生じるか否かの同定を提供する遺伝子が存在できる。このためには、単純ヘルペスウィルスのチミジンキナーゼ遺伝子が使用され得る。なぜならばチミジンキナーゼ遺伝子の存在は、機能的HSV−tk遺伝子を含む細胞に対するそれらの細胞毒性効果のためにヌクレオシド類似体、たとえばAcyclovior又はGancyclovirの使用により検出され得るからである。それらのヌクレオシド類似体に対する感受性の不在は、チミジンキナーゼ遺伝子の不在を示し、そして従って、相同組換えが生じる場合、二重交差出来事がまた生じたことを示唆する。
β2−ミクログロブリン遺伝子中に挿入される選択マーカー遺伝子の存在は、宿主ゲノム中への標的構造体の組込みを確立する。しかしながら、DNA分析は、相同又は非相同組換えが生じたかどうかを確立するために必要とされよう。これは、挿入体のためのプローブを用い、そして次に、構造体のフランキング領域を越えて延長するβ2−ミクログロブリンの存在のための挿入体を両端に有する５′及び３′領域を配列決定し又はそのような欠失が導入される場合、欠失の存在を同定することによって決定され得る。
ポリメラーゼ鎖反応は、相同組換えの存在の検出において都合良く使用され得る。構造体内の配列に相補的であり、そしてその構造体外の配列に相補的であり、そして標的遺伝子座で存在するプライマーが使用され得る。この場合、相同組換えが生じる場合、相補的鎖に存在する両プライマーを有するDNA重複体を単に得ることができる。プライマー配列又は予測されるサイズの配列の存在を示すことによって、相同組換えの発生が支持される。
構造体はさらに、哺乳類宿主細胞において機能的である複製システムを含む。ほとんどの場合、それらの複製システムはウィルス複製システム、たとえばSimian Viras 40,Epstein-Barrウィルス、乳頭腫ウィルス、アデノウィルス及び同様のものを含むであろう。
マーカー遺伝子が、その遺伝子の性質に依存して、挿入体及び／又はフランキング遺伝子として含まれる場合、それは野生型転写調節領域、特に転写開始調節領域又は異なった転写開始領域を有することができる。遺伝子がその転写開始領域が哺乳類宿主細胞の転写機械装置により認識されない宿主からである場合いつでも、異なった転写開始領域が必要とされるであろう。この領域は構成的であり又は誘発性であり、好ましくは誘発性であり得る。広範囲の種類の転写開始領域が単離され、そして異なった遺伝子と共に使用されている。プロモーターとして特に興味あるものは、哺乳類宿主からのメタロチオネイン−Ｉ及びIIのプロモーター、チミジンキナーゼ、β−アクチン、免疫グロブリンプロモーター、ヒトサイトメガロウィルスプロモーター、SV40プロモーター及びポリオーマウィルスプロモーターである。プロモーターの他は、野生型エンハンサーが存在し、又は異なった遺伝子からのエンハンサーがプロモーター領域に連結され得る。
構造体はさらに、構造体を調製し、個々の操作の後のクローニング、分析、たとえば制限地図又は配列決定を可能にし、続いてクローンの拡張及び追加の操作のためのプラスミドの単離への使用のために原核生物、特にＥ．コリのための複製システムを含むことができる。必要な場合、異なったマーカーが、細菌形質転換体を検出するために使用され得る。
ベクターが調製された後すぐに、それは細菌配列の欠失及び線状化によりさらに操作され、ここで短い欠失、一般的には約500bpを越えない、通常約50〜300bpの欠失が相同配列に供給され得る。その短い欠失は一般的に、標的構造遺伝子の一端又は他端に近いであろう。
構造体が調製され、そして操作され、そして所望しない配列、たとえば所望しない細菌配列がベクターから除去された後すぐに、DNA構造体は標的細胞中に容易に導入される。すでに示したように、標的細胞中にDNAを導入するためのいづれかの便利な技法が使用され得る。標的細胞の形質転換の後、多くの標的細胞が陽性及び／又は陰性マーカー、たとえば耐ネオマイシン性及び耐Acyclovir又はGancyclovir法により選択される。次に、所望する表現型を示すそれらの細胞は、制限分析、電気泳動、サザン分析、ポリメラーゼ鎖反応又は同様の方法によりさらに分析され得る。標的遺伝子部位で損傷の存在を示すフラグメントを同定することによって、相同組換えが標的遺伝子の２つのコピーの１つを不活性化するために生じている細胞を同定できる。
第２構造体は、細胞の表面上での標的MHC抗原の不在がマーカーとして使用され得るので、選択のためのマーカーを必ずしも必要としないことにおいて第１構造体と異なるであろう。従って、標的遺伝子を変性し、そして不活性化するための損傷として、挿入欠失又は置換を再び使用することができる。同様に、特定のクラスIIMHC抗原の発現の不在の証拠として表面上でのクラスIIMHC抗原の不在を検出することができる。
形質転換されていないヒト体細胞における機能的MHC抗原の発現に関連する遺伝子を不活性化するための本発明の方法においては、標的遺伝子が正しく標的決定されている細胞が新規の標的ベクター及びELISAに基づく検出システムを用いて同定され、多くの独立して標的決定されたクローンの急速な欠失を可能にする。この方法においては、相同組換えのための部位は、たとえば抗体を結合するリガンドにより検出され得る、エピトープ、たとえばCD４を含むタンパク質のドメインに融合される強いエンハンサー／プロモーター、たとえばCMVエンハンサーにより動かされる組換え融合タンパク質を創造するように企画され、ここで前記組換え融合タンパク質は正しく標的化された細胞により分泌され、そして次にその分泌された融合タンパク質を認識する抗体を用いるELISA−基礎のシステムを用いて検出される。この方法においては、組換え遺伝子座の５′端は標的ベクターに由来し、そしてその遺伝子座の３′端は標的遺伝子に由来する。完全な５′端は実験的に制御されるので、組換え融合タンパク質の発現レベル及び究極的な輸送運命の両者が指図され得る。下記例においては、ヒト網膜色素上皮（RPE）細胞及びヒトケサチノサイトが、組換え体の検出を促進するためにCD４−β2−ミクログロブリン融合タンパク質を発現するよう遺伝子的に構築された。培養物は、β2−ミクログロブリンエピトープを含むタンパク質をトラップし、そしてCD４エピトープを含むタンパク質を検出するELISAにより融合タンパク質を検出するためにスクリーンされる。そのアッセイはCD４−β2−ミクログロブリン融合タンパク質に対して特異的であることを示し、1000個ほどの発現細胞の検出を可能にする。この方法はES細胞を包含する他の哺乳類細胞型のために使用され得る。CD４エピトープの他に、リガンドにより認識されるエピトープを含む他のペプチド、たとえばエピトープに結合する抗体が融合タンパク質に使用され得る。
本発明のもう１つの方法においては、体細胞が機能的MHC抗原発現に関連する遺伝子を不活性化するために構築される。この方法においては、プロモーターを含まない選択可能マーカー遺伝子が、融合タンパク質において生成する完全な膜タンパク質のトランスメンブランドメインに標的遺伝子の上流の配列と読み取り枠を整合して融合される。その融合タンパク質は膜に輸送され、そしてトランスメンブラン配列、通常の外部膜タンパク質及び前記膜の細胞質側上に位置する選択可能マーカーを供給するために処理される。DNA構造体が導入されており、そして相同組換えが融合タンパク質を供給するために存在している細胞が、マーカーを含み、そして標的遺伝子の１つが不活性化されている細胞集団を得るために選択条件下で増殖される。これは高頻度の遺伝子標的化出来事の検出をもたらす（その生来のプロモーターを有するNeo遺伝子を用いて得られる標的化の頻度に比較してNeo耐性コロニー当りの高い頻度）。
組込みの後、細胞は、転写の５′から３′方向に、野生型転写開始領域、開始コドン、細胞外領域をコードする配列及び完全な膜タンパク質のトランスメンブラン領域、存在するいづれかのイントロン、イントロンによりトランスメンブラン領域をコードする配列から分離され得る選択可能マーカー遺伝子（停止コドンを含む）（ここで適切なドナー及び受容体スプライス部位がトランスメンブランドメインコード配列に選択可能マーカー遺伝子を連結するために存在する）、及び／又は完全な膜タンパク質の細胞内（細胞質）ドメインをコードする配列の一部、すべて又は前記配列を欠く配列、及び選択マーカー遺伝子に連結されている転写終結領域又は標的遺伝子の野生型転写終結領域を含んで成る融合タンパク質のための遺伝子を含むであろう。
いづれかの完全な膜タンパク質、たとえばクラスター又は分化“CD”抗原が標的化され得る。MHC抗原、Ｔ細胞受容体及びサブユニット、たとえばα，β，π，δ、及び種々の受容体タンパク質、たとえばインターフェロン受容体、神経伝達物質受容体、増殖因子受容体、コロニー刺激因子受容体、等が特に興味の対象である。
下記例においては、マウスES細胞及びマウス筋原細胞が、MHC発現の調節を妨げるために、IFN−γＲ遺伝子を不活性化するよう構築された。使用される標的ベクターは、IFN−γＲコード領域中に挿入される、転写的に及び翻訳的に弱められた選択可能マーカー遺伝子（ネオマイシン）を含んだ。相同組換えに基づいて、選択可能マーカーNeoは、IFN−γＲのトランスメンブランドメインに融合されるNeoが細胞質膜の内面に位置するIFN−γＲ−Neoハイブリッドタンパク質として発現され、抗生物質（G418）殺害から組換え体を保護する。他の選択可能マーカー遺伝子、たとえば耐ヒグロマイシン性遺伝子（hygr）が使用され得、そしていづれかの活性膜タンパク質が標的化され得る。
MHC遺伝子の１つのコピーが不活性化されている細胞の形質転換が、次に、不活性化されたMHC遺伝子のためにホモ接合性の細胞を生成するために形質転換の前の方法と同じ手段又はそれとは異なった手段で実施され得る。次に、その得られる形成転換された細胞が、細胞の表面上での標的MHC抗原の不在により選択され得る。これは種々の手段で達成され得る。たとえば、抗原を有するいづれかの細胞を殺害するために補体と一緒に標的MHC抗原のいづれかのエピトープに対する抗体を用いることができる。他方、トキシン、たとえばリシン、アブリン、ジフテリアトキシン又は同様のもののＡ鎖と適切な抗体、たとえばモノクローナル抗体との接合体を使用することができる。抗体が標的抗原を発現する細胞を除去するために使用され得る親和性クロマトグラフィーが用いられ得る。生存するその得られる細胞はそれらの表面上に少なくとも１つのMHC抗原も有するべきでなく、そして野生型細胞としてインビボで導入される場合、移植拒絶にゆだねられない。
次に、得られた細胞はスクリーンtd、クラスＩMHC抗原が表面上に実質的に存在しなことを確める。これは、クラスＩMHC抗原を欠く細胞について選択することによって上記のようにして達成され得る。次に、細胞は、発現のための適切な栄養培地で増殖され、そして種々の手段に使用され得る。細胞は、存在する組織の一部になるよう、移植のために使用され得、又は非同系宿主中への移植のための組織を形成するために増殖され得る。たとえば、ケラチノサイトに関しては、細胞は熱傷の場合、皮膚の置換のために使用され得、ここでケラチノサイドが適用の前、連続層を形成するために増殖される。同様に、ケラチノサイトは、他の部位での使用のために宿主から除去される皮膚を置換するために形成手術の場合に使用され得る。ケラチノサイトのための他の使用は、とこずれ、及び他の非治癒性潰瘍における移植を包含する。
ランゲルハンス島の場合、それらは増殖され、そしてインシュリンの生成のために宿主中への挿入のためにカプセル又は他に導入される。腎上皮細胞の場合、それらは視覚疾患、たとえば斑状変性を処理するために眼の網膜下空間中に注入され又は移植される。免疫細胞の場合、それらは免疫欠損を処理するために血液又は他の部分中に注入され得る。筋原細胞の場合、それらは筋肉消耗病、たとえばDuchonne筋ジストロフィーを処理するために種々の部位で注入され得る。器官移植に関しては、非同系組織、たとえば心臓又は肝臓の外因性移植が関連する種間で実施され得る。
導入される遺伝子はまた、タンパク質生成のために作動し、ここでタンパク質は細胞内に保持され又は分泌される。タンパク質の生成は、増殖因子、たとえばＧ，Ｍ、及びGM−CSF、上皮増殖因子、血小板由来の増殖因子、形質転換増殖因子、等；リンホカイン、たとえばインターロイキン；ホルモン、たとえばACTH、ソマトメジン、インシュリン、アンギオテンシン、等；凝集因子、たとえば第VIIIＣ因子；遺伝子疾患に関連するタンパク質、たとえばアデノシンデアミナーゼ又はノウ胞性線維症に関連するタンパク質の正常なバージョン；保護剤、たとえばα１−抗トリプシン；アミノ酸フリー生成物の生成に関連する調節タンパク質又は酵素、たとえばＬ−ドパミンの生成のためにチロシンヒドロキシラーゼの発現、及び同様のものを包含する。遺伝子は、構成プロモーター又は誘発性プロモーター（エンハンサー配列を含む）の転写制御下に存在する。後者の情況においては、調節は、天然に存在するシグナルによる誘発により生じ、又は外因性シグナルの宿主中への導入の結果として生じる。
細胞の性質、関与する治療及び疾患に依存して、細胞は特定部位での維持のために容器に導入されるフィルムとして、又は不活性マトリックス又はマトリックスに無関係に含浸される固体マスとして、又はリンパ球、白血球又は血液細胞の場合、細胞懸濁液として使用され得る。投与される細胞の数は、特定の用途及び細胞が投与される態様に依存して広く異なるであろう。投与は、適切な位置においての注射、局部適用、切開及び配置による。
胚幹細胞、特にネズミ宿主からのES細胞が形質転換される場合、トランスジェニック動物を成長せしめるような細胞を使用することが所望される。そのような方法に関しては、変異誘発の後、細胞は適切な培地、たとえばウシ胎児血清増強DMEMにおける支持細胞層上に配置され得る。構造体を含む細胞は、選択培地を用いることによって検出され得、そしてコロニーが増殖するのに十分な時間の後、コロニーは採取され、そして相同組換えの発生について分析され得る。前で記載したように、ポリメラーゼ鎖反応が、構造体配列内及びそれ以外で、但し標的の遺伝子座でプライマーと共に使用され得る、次に、相同組換えを示すそれらのコロニーが、胚の操作及び胚盤胞注入のために使用され得る。胚盤胞は、排卵の3.5日後、子宮をフラッシュすることによって４〜６週目の過剰排卵された雌から得られる。次に、胚幹細胞がトリプシン処理され、そしてその変性された細胞が胚盤胞を含む液滴に添加される。少なくとも１つ、通常少なくとも約10、及び約30までの変性された胚幹細胞が胚盤胞の胞胚腔中に注入される。注入の後、少なくとも１〜約15個の胚盤胞が擬似妊娠の雌の個々の子宮角に戻される。次に、それは出産予定日までそのままにされ、そして得られる同産子が構造体を有する変異細胞についてスクリーンされる。胚盤胞が形質転換されたES細胞から異なった親子関係についてスクリーンされる。異なった表現型の胚盤胞及びES細胞を供給することによって、キメラ性子孫は容易に検出され得る。特に有用な表現型は、髪の色であるが、但しいづれの表現型でも使用され得、又は所望により、変性されたゲノムDNAの存在についてプローブする遺伝子型を調べることもできる。
子犬は通常、養子母中への胚盤胞の導入の後16〜18日で生まれるであろう。キメラ性動物は、形質転換されたゲノムの存在についてスクリーンされ、そして形質転換されたゲノムを含んで成る雄及び雌が個々の配偶者になる。ホモ接合性子孫は機能的クラスＩMHC細胞を欠いており、そして減じられた数の成熟CD8+Ｔ−細胞（TCRαβ）を有する。
トランスジェニック哺乳類は、いづれかの非ヒト哺乳類、たとえば実験用動物、家畜、等であり得る。そのような哺乳類はネズミ及び他のゲッ歯動物、ウサギ類、ブタ、ネコ、ウシ、犬、ヒト、等であり得る。クラスＩMHCを欠いている哺乳類は、移植のための器官、細胞又は組織の源、たとえば心臓、肺、皮膚、肝臓及び腎臓として使用され得る。動物はまた、薬物をスクリーンするために、たとえば治療剤、たとえば免疫抑制剤、たとえばシクロスポリンの存在下で動物における移植片の拒絶をモニターするために、実験的にも使用され得、又は皮膚、腎臓、肝臓、等の移植片を包含する移植療法のためのモデルシステムとしても使用され得る。
下記実験セクションにおいては、相同組換えを用いてMHC抗原発現に関連する種々の遺伝子の不活性化の結果として機能的MHC抗原の発現を欠いている細胞の生成を示す態様が開示されている。従って、第１の態様においては、本発明の方法を用いてマウス及びヒトケラチノサイトにおけるβ2−ミクログロブリン遺伝子を不活性化するための方法が記載されている。
追加の態様においては、不活性化されたβ2−ミクログロブリンを含むマウス胚幹細胞及びそれらの細胞から生成されたマウスが記載される。MHC−欠失マウス皮膚細胞の移植が、もう１つの態様として開示されている。
さらに追加の態様においては、ヒト網膜上皮細胞（RPE）におけるHPRT遺伝子の標的化が記載される。
もう１つの態様においては、融合タンパク質組換え体を生成する標的ベクターを用いてのヒトRPE細胞におけるβ2−ミクログロブリン遺伝子の標的化が開示される。追加の態様においては、β2−ミクログロブリンを不活性化するためへの単純なNeo置換標的ベクターの使用が記載される。
さらにもう１つの態様においては、プロモーターを含まない選択可能マーカー遺伝子を含む標的ベクターを用いてのマウス胚幹細胞及びマウス筋原細胞におけるIFN−γＲ遺伝子の標的化が記載される。
次の例は例示的であって、本発明を限定するものではない。
実  験
Ｉ．β2ミクログロブリン遺伝子発現の不活性化によるHMC抗原を欠いている上皮ケラチノサイトの増殖
細  胞
マウス上皮ケラチノサイトを、新生マウスの皮膚から得る。その皮膚サンプルを血清フリー媒体ですすぎ、そして小さな断片に切りきざむ。断片をトリプシンにより処理し、そして得られる単一細胞懸濁液を洗浄し、そして3T3線維芽細胞支持細胞層上にプレートする。EGF（５ng／ml）を５日目の最後で添加する。細胞を、ヒドロコルチゾン（10-6Ｍ）、コレラトキシン（10-7Ｍ）、インシュリン（５ng／ml）、トランスフェリン（５ng／ml）、T3（２×10-8Ｍ）及び20％ウシ胎児血清により補充された培地に維持する。
ヒト上皮ケラチノサイトを、ケラチノサイトの源として環状切除された皮膚からの新鮮な皮膚サンプルを用いて単離する。次に、そのサンプルを実質的に上記のようにして処理する。
DNAベクター
それぞれ、Parnes and Seidman,Cell,29:661-669,(1982)及びGusow et al.,J.Immunol.139:3132-3138(1987)により単離され、そして特徴づけられたようなマウス及びヒトβ2−ミクログロブリン遺伝子を、相同性のために使用する。
不活性ベクター１の構成
不活性化ベクターを、β2−ミクログロブリン遺伝子の第２、第３及び第４エクソンを包含するゲノムDNAの４kbのHindIIIフラグメントから構成する。pBR322中にサブクローン化された前記４kb HindIIIフラグメントを、EcoRＩにより消化し、そして選択可能なネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（neoR）遺伝子を挿入する。neoR遺伝子は、pSV2neo(Southern and Berg,Mol.Appl.Genet.,1:332,(1982))から得られる。得られるベクターはB2KO1と呼ばれる。
不活性化ベクター２の構成
第２ベクターの構成のための出発プラスミドは、B2KO1である。この場合、単純ヘルペスウィルスタイプ１のチミジンキナーゼ遺伝子を、B2KO1のHindIII部位で挿入する。
β2−ミクログロブリンの１つのコピーの不活性化
第１又は第２段階における形質転換のために使用されるDNAは、クローニングプラスミドB2KO1からのフランキング相同配列及び細菌性プラスミドDNAを有さないtk遺伝子を一端で有する同じ配列を有する、挿入された配列を含んで成る。得られるDNAフラグメントをエタノール沈殿法により精製し、そして0.22ミクロンのフィルターを通すことにより清浄する。DNAを従来の手段により単離し、そしてマイクロインジェクションによりケラチノサイト細胞中に導入する(Capecchi,Cell,22:479-488(1980))。DNA構造体の約５〜50のコピーを個々の核に注入する。次に、細胞を、200μｇ／mlのG418(Geneticin,Cibco Labs)を含んで成る選択培地において増殖する。第２構造体に関しては、細胞をまた、Gancyclovir(Syntex Corp,Palo Alto,CA)又はAyclovir(Burrows Wellcome,Research Triangle Park,NC)にプレートする。コロニーからの細胞を単離し、そしてポリメラーゼ鎖反応及びサザンブロットバイブリダイゼーションにより分析する。不活性化されるβ2−ミクログロブリンの１つのコピーを示す細胞を、第２コピーを負かすために使用する。
β2−ミクログロブリン遺伝子の第２コピーの不活性化遺伝子
単一の不活性化されたβ2−ミクログロブリン遺伝子を有する上記から得られた細胞を、変性されたB2KO1プラスミドに上記のようにしてマイクロインジェクトし、そしてGancyclovir又はAcyclovirに対して耐性の細胞を単離する。クラスＩ遺伝子の発現を欠いている細胞も、Parish et al.,(1974),Eur.J.Immunol.,4:808により記載されるようにして、β2−ミクログロブリン及び補体に対して特異的なモノクローナル抗体と前記細胞とを組合すことによって単離する。得られる生存細胞を、選択培地において増殖し、そして同じモノクローナル抗体の親和性カラムに通す。カラムはHarlow and Lane,(1988),Antibodies:A Laboratory Manual,CSH Pressにより記載されるようにして調製される。細胞のサザンブロット分析を行ない、組込みの正しい遺伝子座を確立する。次に、細胞を拡張し、そして追加の使用のために貯蔵する。
ケラチノサイトの単層の生成
クラスＩMHCを欠く得られた細胞を用いて、Rheinwald and Green,Cell 6:331-343,(1975)により記載されているようにして、ケラチノサイトの単層を増殖する。この層を同種異系マウスに、Rheinwald and Green,(1975)、前記により記載されているようにして移植する。細胞はその表面に付着し、そして増殖し、保護皮膚層を供給する。
β2−ミクログロブリンについての上記と同じ方法に続いて、HLA−DR遺伝子を、宿主細胞のHLA−DR遺伝子のα又はβ−サブユニットを両端に有する相同配列を用いることによって不活性化する。この場合、クラスIIMHC抗原を有するか又はそのような誘発された抗原を発現する能力を有する細胞が、細胞性免疫応答に関連する一次クラスII抗原を発現することから阻止される。
次の研究においては、胚幹細胞を、β2−ミクログロブリン遺伝子の１つとの相同組換えにより変性した。
II．β2−ミクログロブリンの不活性化、標的プラスミドの構成
プラスミドpKCβ2Ｂは、8.4kbpのXhoＩフラグメント内に完全なβ2−Ｍ遺伝子を含む(Ozato and Orrison,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82:2427-2431,(1985);Warner et al.,Bio.Reprod.,36:611-616,(1987))。この遺伝子の５′XhoＩ〜BamHＩフラグメントを、pUC19中にサブクローン化した。２種のKpnＩ制限酵素部位（１つは５′フラグメントDNAにおいて、及び他の１つは第１イントロン内に存在する）を、KpnＩによる消化により除去し、続いてT4ポリメラーゼによる処理及び再連結を伴う。ユニークClaＩ部位を、EcoRＩによる部分消化によりエキソン２に創造し、続いてクレノウポリメラーゼにより処理し、そしてClaＩリンカーにより連結する。単純ヘルペスウィルスのチミジンキナーゼ遺伝子（HSV−tk）プロモーター及びポリオーマエンハンサーにより駆動されるネオマイシン遺伝子を含む、プラスミドpMC1 Neo(Kim and Smithies,Nucloic Acid Res.,16:8887-8903,(1988))の1150bpのXhoＩ〜HIフラグメントを、このClaＩ部位中にリンカーを通して挿入した。２つのプラスミド、C65.2.3及びC65.5.9を得、ここでそれらはβ2−ミクログロブリン遺伝子の転写の配向に対して挿入されたフラグメントの転写の配向において異なっている。それらの個々の５′XhoＩ〜XpnＩフラグメントを、この実験で使用される標的ベクターを得るためにpUC19中にクローン化した。プラスミドC84.4Bにおいては、ネオマイシン及びβ2Ｍプロモーターの３′配向が同定される。反対の形態がプラスミドC84.2Dにおいて生じる。
培養、エレクトロポレーション、及びES細胞の選択
ES細胞系E14TG2a(Sawicki et al.,Nature,294:450-451,(1981))を、実質的に記載されているようにして、マイトマイシン処理された一次胚線維芽細胞支持層上で培養した(Ostrand Rosenberg et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.86:5084-5088,(1989))。胚線維芽細胞は、ネオマイシントランス遺伝子のためにホモ接合性である雄により14〜17日早く交配されたC57BL/6雌からの胚から調製され(Evans and Kaufman,Nature,292:154-156,(1981));それらの細胞はG418を含む培地において増殖することができる。エレクトロポレーション条件は、前記記載した条件に類似した(Doetschman et al.,Nature,330:576-578,(1987))。ES細胞をトリプシン処理し、４×107/mlの濃度で培養培地に再懸濁し、そして第１の実験においてｎの濃度で及び第２の実験において５nMの濃度での標的DNAの存在下でエレクトロポレート処理した。150−250μＦのキャパシタンスを伴っての300Ｖの電圧が５mmの長さ及び100mm2の断面のエレクトロポレート細胞には最適であることが見出された。５×106個のエレクトロポレーション処理された細胞を、15％ウシ胎児血清（FBS）及び0.1mMの２−メルカプトエタノールにより補充されたダルベッコ変性イーグル培地（DMEM）の存在下で100mmの皿におけるマイトマイシン処理された線維芽細胞上にプレートした。培地は、２００μｇ／mlのg418を含む培地により、エレクトロポレーションの24時間後に交換された。
G418耐性ES細胞コロニーの分析
エレクトロポレーションの10〜14日後に目に見えるESコロニーを、ポリメラーゼ鎖反応（PCR）を用いての分析のために毛管ピペットにより採取した。採取されたコロニーの半分を、マイトマイシン処理された支持細胞層によりすでに接種されている24−ウェルのプレートに貯蔵した。３〜４のプールに組合される他の半分を、約0.5mlのPBSを含むEppendorf管に移し、そして相同組換えについてPCRにより分析した。PCRのための条件は実質的に記載されている通りであった(Linney and Donerly,Cell,35:693-699,(1983))。ES細胞をペレット化し、５μｌのリン酸緩衝溶液（PBS）に再懸濁し、そして個々の管への55μｌのＨ20の添加により溶解した。DNaseを、個々の管を95℃で10分間加熱することによって不活性化した。55℃で30分間のプロティナーゼＫによる処理の後、個の溶解物30μｌを、PCR緩衝液、1.5μｇの個々のプライマー、３ＵのTaqポリメラーゼ、10％ DMSO及びdATP，dCTP，dGTP及びdTTP（それぞれ0.2mM）を含む反応混合物20μｇを含む管に移した。PCRを、92℃で65秒の溶解及び65℃での10分間のアニーリング及び拡張を伴って、前に記載されるようにして(Kim and Smithies、前記、(1988))設計されたサーモサイクラーを用いて55サイクルを行なった。２種のプライム用オリゴヌクレオチド：
TGGCGGACCGCTATAGGAC(配列番号01)及び
GATGCTGATCACATGTCTCG（配列番号02）は、それぞれ、ネオマイシン遺伝子の出発コドンの３′側に位置する650個の塩基の配列及びβ2−Ｍ遺伝子のエキソン３に位置する配列に対応する。反応混合物20μｌをアガロースゲル上で電気泳動し、そしてナイロン膜（Zeta Bind）に移した。フィルターを、β2−Ｍ遺伝子の32Ｐ−ラベルされた450bpのEcoRＩ−KpnＩフラグメントによりプローブした。
ゲノムDNAの調製及び制限酵素分析
ゲノムDNAを、ES細胞、完全な新生マウス及びマウスの尾から従来の方法により調製した。DNAを製造業者により指図されるようにして制限酵素により消化し、そしてフラグメントを0.7％アガロースゲル上で分離した。DNAをナイロン膜に移し、そして上記の32Ｐラベルされたフラグメントによりプローブした。
胚の操作及び胚盤胞の注入
マウスを、Jackson Laboratories(Bar Harbor,ME)又はCharles River(Raleigh,NC)から入手した。C57BL16胚盤胞を生後３〜４週目の過剰排卵された雌から得た。子宮をM2媒体(Joyner et al.,Nature,338:153-156,(1989))によりフラッシュし、排卵の3.5日後、胚盤胞を集め、新鮮なM2媒体により数回、洗浄し、そしてパラフィン油下で100μｌ液滴のM2に配置した。ES細胞をトリプシン処理し、新鮮なDMEM媒体により１度洗浄し、そして約２×106個の細胞／mlに希釈した。細胞５mlを、胚盤胞を含む液滴に添加した。10〜15個のES細胞を個々の胚盤胞の胞胚腔中に注入した。注入の後、６〜９個の胚盤胞を、精管切除された雄により前もって2.5日前、交配された擬似妊娠された雌の個々の子宮角に戻した。C57BL/6×DBA F1及びC57BL/6×CBA F1の両マウスは、卓越した育成親であることがわかっており、100％近くの妊娠率を達成し、そして小同産児を生ぜしめることができる。
標的化されたES細胞の単離及び特徴化
２種の独立した標的実験を行なった。個々においては、２×107個の細胞を入って来るDNAの存在下でエレクトロポレートし、そして次に、G418を含む培地において培養した。約２週間後、G418耐性コロニーが容易にわかった。次に、個々のコロニーの一部を24−ウェルのプレートの個々のウェルに移し、そして残る部分を、PCR分析のために２〜４の他のコロニーからの部分と共にプールした。第１の実験においては、合計100のG418耐性コロニーを含む32のプールのうち１つのプールが陽性のPCRシグナルを与えた。この陽性のプールに分配された３種の個々のコロニーをPCRにより個々に分析し、そして陽性クローン、すなわちES39Bを同定した。第２の実験において得られる134個のG418耐性コロニーの類似する分析はまた、クローンES22Aを同定し、これはPCRにゆだねられる場合、好結果を生む標的化を示す910bpのDNAフラグメントを生成した。
β2−Ｍ遺伝子（その遺伝子は常染色体であり、そして２つのコピーで存在する）の１つのコピーの標的化された分裂を確かめるために、２種のPCR陽性クローン、ES39B及びES22Aを拡張し、そしてそれらのDNAを単離し、そして次に、β2−Ｍ遺伝子の第２エキソン及び第１イントロンの部分からの配列を検出するプローブを用いて、サザンブロットにより分析した。制限酵素XhaＩ，BamHＩ及びKpnＩにより得られるパターンは、β2−Ｍ遺伝子の２つのコピーの１つがPCR−陽性クローンにおいて計画された態様で分裂したかいづれかを予測するパターンに一致する。すなわち、処理されていない細胞に存在するDNAにサイズ的に同一の１つのDNAフラグメントが、すべての３種の酵素により存在した。相同組換え出来事について予測されるサイズの追加のフラグメントがPCR−陽性クローンにのみ存在した。組換えによる第２エキソン中へのネオマイシン遺伝子の挿入は、生来の遺伝子座において同等のフラグメントよりも約１kb長いβ2−Ｍ特異的プローブにより検出できるXhaＩフラグメントをもたらす。新しいBamHＩ部位を標的DNAによりその遺伝子座中に導入し、10.6kbpから900にβ2−ｍプローブにより検出されるBamHＩフラグメントのサイズを減じた。新規フラグメントはまた、KpnＩ消化の後にも見られる。ES39Bにおいては、KpnＩフラグメントは、標的プラスミドの５′端と生来の遺伝子座との間での交差により予測されるように、７kbの長さである。ES22Aにおいては、この新規のKpnＩフラグメントは4.0kbの長さであり、これは欠失されたKpnＩ部位がその遺伝子座中に組込まれなかったことを示唆する。この観察は、細胞系ES22Aにおける交差の１つが、たぶん交差中間体の分枝点移動の後、生来の遺伝子座の第３ KpnＩ部位と入って来るDNAの挿入されるネオマイシン遺伝子との間で決定したことを示唆する。５′側の交差部位は異なるけれども、両変性された細胞系は、エキソン２におけるネオマイシン遺伝子の挿入により計画された手段で分裂されたβ2−Ｍ遺伝子を含む。ネオマイシン遺伝子のためのプローブによるオートラジオグラフィーのために使用されるフィルターの再ハイブリダイゼーションは、ハイブリダイズするバンドのみが構造体の構造により予測されるバンドであることを示す。
標的化されたES細胞のキメラ性子孫
不活性化されたβ2−Ｍ遺伝子を担持する２種のES細胞系は、マウス生殖系中へのこの変異誘発の導入を可能にすることが予測される。最後に、本発明者は10〜15個の細胞をC57BL/6胚盤胞中に注入した。胚を擬似妊娠の雌中に再移植した。ES細胞系E14TG2aは129/O1a胚から単離されるので、それは及びそれに由来するすべての細胞系は、このマウス系の毛色マーカーの特徴を担持することが予測される。それらは、アグーチ遺伝子座で優性ＡW対立遺伝子、ｃ−遺伝子座で劣性チンチラ対立遺伝子及びｐ−遺伝子座で劣性ｐ−対立遺伝子（ピンクの目）を含む(Quinn et al.,J.Reprod.Fertil.,66:161-168,(1981))。毛包の中胚葉由来の部分へのES細胞の寄与がアグーチの毛をもたらす。ES細胞起源のメラノサイト（及び従って、ｐ及びcch突然変異を担持する）が移動した毛包はクリーム色の毛を生成する。それらの毛色は、非アグーチC57BL/6宿主胚盤胞に由来する子犬に見られる一様な黒色の毛とは容易に区別される。
生存する子犬の70％以上がキメラ体である。標的化されたβ2−Ｍに特徴的な6.1 XhaＩバンドの強さは、変性されたES細胞がこの動物の組織に広範に寄与したことを示す。
キメラ性マウスの生成
生後３〜４週目のC573B/6雌マウスを、PMS及びhCGの連続的な注入により過剰排卵せしめ、そして類似する種の生殖力のある雄と交配した。交配の４日後、雌マウスを殺し、そして胚盤胞をM9媒体により子宮をフラッシュすることによって得た。集められた胚盤胞をパラフィン油に含浸されそしてまた、いくらかのES22a細胞を含む同じ媒体の液滴に移した。それらの細胞を、トリプシン処理し、続いてM2媒体により洗浄しそしてそれに再懸濁することにより注入用に調製した。10〜15個のES22a細胞を通常の微小操作技法を用いて個々の胚盤胞の胚胞腔中に導入した。次に、胚盤胞を含むES細胞を、擬似妊娠育成母の子宮に移した。育成母は、精管切除された雄マウスとB6／D2雌との交配により得られた。膣栓の存在により評価されるように、前記移行の日の2.5日前に交配した雌が、胚盤胞を含むES細胞のための育成母として使用された。胚盤胞の成長はインビボで進行し、そして子犬は一般的に16〜18日後に生まれた。ES細胞のその子孫に対する寄与は、子犬の毛色の試験により目により判断される。胚盤胞は、一様な黒毛のC57BL/6マウスから得られた。ES細胞系E14TG2a、すなわちES22aが由来される両親系を、129/O1aマウスから単離した。このマウス系は、クリーム色をしており、３種の毛色遺伝子、すなわちアグーチ遺伝子座で優性ＡW対立遺伝子、ｐ遺伝子座でピンクの目の対立遺伝子及びＣ遺伝子座で劣性cch対立遺伝子の組合された効果の結果である。ES22aがこの動物の形成に関与した子孫はカッ色及びクリーム色の毛を有した。ES22a細胞を含む胚盤胞からの子犬の約80％がある程度の毛色キメラ性を示した。
変異誘発されたβ2−Ｍ遺伝子のためにヘテロ接合性の動物の生成
E22a細胞が生殖線に寄与する場合、動物はES22aゲノムを含み、そしてそれをその子孫に伝達する精子を生成することが予測される。ES22aゲノムは優性毛色マーカーＡWに対してホモ接合性である。キメラ体が非−アグーチ、たとえばC57BL/6又はB6／D2である動物と交配される場合、精子又はES細胞起源から生じる子孫は、それらの毛色により精子又は胚盤胞起源に由来する子孫とは区別され得る。アグーチ動物の50％は、変異誘発されたβ2−Ｍ遺伝子を受け継ぐことが予測される。それらは、それらの尾から単離されたDNAの分析により同定され得る。従って、尾の１cmをアグーチ動物から切除し、そして標準技法によりDNAを調製した。DNAを制限酵素XhaＩ又はHindIIIのいづれかにより消化し、そしてサザンブロットにより及びβ2−Ｍ遺伝子の放射性ラベルされたフラグメントによりプローブすることにより分析した。対照のマウスに見出されるフラグメントよりも１kb大きなXhaＩ又はHindIIIフラグメントの存在は、動物における変異誘発されたβ2−Ｍ遺伝子の存在の徴候である。
変異誘発されたβ2−Ｍ遺伝子のためにホモ接合性の動物の生成
それらのDNAが変異誘発されたβ2−Ｍ遺伝子の１つのコピーを担持することを示す雄及び雌動物を交配した。それらの交配に起因する子孫を再び、XhaＩ又はHindIII大フラグメントの存在について分析した。そのような交配からの子孫の１／４が、予測されるように欠損性遺伝子のためにホモ接合性であった。それらの動物は、ES細胞E14TG2a中に、相同組換えによる始めに導入された変異誘発を担持する新生マウス株を示す。
β2−Ｍ−／−マウスの表現型の決定
予測されるように、β2−Ｍタンパク質の変異誘発がクラスＩ発現の損失をもたらしたかどうかを決定するために、β2−Ｍ変異誘発のためにホモ接合性である２匹の動物を殺し、そして細胞表面クラスＩ発現の存在について試験した。リンパ節、脾臓及び胸腺から単離された細胞を、クラスＩ抗原Ｈ−2Rb及びＨ−2Dbに対して向けられたモノクローナル抗体により試験した。ES細胞系が由来するマウス系129/O1a及びそれらの動物を生ぜしめるキメラ体が交配されているC57BL/6の両者は、Ｈ−2bハプロタイプを発現する。バックグラウンド以上の染色は、試験された組織のいづれにおいてもホモ接合性β2−Ｍ−／−マウスから得られた細胞に関して見出されなかった。従って、予測されるように、β2−Ｍ遺伝子の不活性化は、細胞表面でクラスＩ抗原を発現しない動物をもたらした。動物は健康そうに見え、そしてそれらの同産児とは視覚的に区別され得なかった。
Ｔ−細胞の変異誘発に対するクラスＩ抗原の欠失の効果を、Ｔ−細胞分化の種々の段階を支配する抗体により胸腺細胞を単離し、そして染色することによって試験した。そのデータは、正常なβ2−Ｍ−／−及びヘテロ接合性動物の胸腺におけるCD４-８-，CD４+８+及びCD４+８-細胞集団が同一であることを示した。対照的に、CD４-８+集団は、異なった遺伝子型の動物間では異なっている。CD４-８+細胞は正常な胸腺の細胞の10％を表わすが、しかしβ2−Ｍマウスの胸腺における細胞の１％以下である。興味あることには、ヘテロ接合体におけるそれらの細胞の数もまた、いく分、減じられている。
クラスＩ遺伝子の不在が、Ｔ細胞受容体遺伝子の発現により示されるように、Ｔ−細胞の成熟に影響を及ぼすかどうかを決定するために、胸腺細胞を、TCRαβ又はTCRγδ受容体のいづれかに対して向けられた抗体により染色した。αβ細胞受容体陽性細胞のプロフィールにおける有意な差異は、正常なものに比較して、β2−Ｍ−／−動物に見られず、これはクラスＩ抗原がCD４+８+又はCD４+８-細胞を担持するTCRへの胸腺細胞の成熟のために必要とされないことを示唆する。
次に、末梢Ｔ−細胞を、αβTCR及びCD４並びにCD８の発現について試験した。β2−Ｍを欠いている動物の脾臓及びリンパ節からのαβTCR担持Ｔ−細胞の収率は、正常な同産児対照の収率とは有意に異ならなかった。αβTCRを担持するすべてのＴ−細胞の20％〜32％がまた、β2−Ｍ＋／＋及び＋／−動物においてCD８を生ぜしめる。CD４-，CD８+胸腺細胞はβ2−Ｍヘテロ接合性動物において、いく分、消耗されるが、それらのマウスにおける末梢CD８+Ｔ−細胞のレベルは、正常な同産児のレベルに匹敵した。対照的に、αβTCR−担持のＴ−細胞は、β2−Ｍ突然変異のためにホモ接合性の動物においてCD８を実質的に発現しなかった。予備実験が、変異マウスにおいてCD８+を出現せしめる少数のαβＴ−細胞は染色方法においてノイズによるものであったかどうかを見出すために行なわれた。従って、それらの動物からのＴ−細胞を、抗−CD３抗体及びインターロイキン−２により被覆されたプラスチック上で数日間、増殖せしめ、ここでこの方法はしばしば、CD８+Ｔ−細胞の増殖を選択的に刺激する。CD８担持のαβ＋Ｔ−細胞は、そのような処理の後、多数には出現しなかったが、但しγδ担持のＴ−細胞は増殖した。結論は、CD８+，αβ細胞がクラスＩMHC発現を欠いている動物に実質的に不在であることである。
胸腺細胞、及び脾臓及びリンパ節からのＴ−細胞をまた、γδTCRの発現について試験した。それらの細胞の数はβ2−Ｍ−／−マウス及び対照においては類似した。生成物実験（上記）は、β2−Ｍからのγδ−担持細胞が増殖することを示し、そしてそらに、それらの細胞の予備試験は、それらの約１／４がCD８を担持したことを示した。従って、それらの研究は、γδＴ−細胞が、それらがまたCD８を担持していても、それらの存在のためにクラスＩ発現を必要としないことを示唆する。
III．MHC−欠損皮膚細胞の移植
マウスの生成
機能的β2−ミクログロブリン遺伝子を欠くマウスは、マウスの129株を用いて、ES細胞におけるこの遺伝子を特異的に破壊するために相同組換えを用いて、上記のようにして誘導された。それらの変性された細胞を用いて、C57BL/6マウスに育成されるキメラマウスを生成した。β2−ミクログロブリン遺伝子の破壊されたコピーを担持する子犬を異種交配し、Ｈ−２bβ2−ミクログロブリン欠損性ホモ接合体を生成した。この方法は、C57BL/6及び129株の両者からの少々の組織適合性抗原を有するが、しかし機能的β2−ミクログロブリン遺伝子座を欠いている、混合された遺伝子バックグラウンドのマウスを発生せしめた。表１は、それらの実験に使用された種々のマウス株のMHCハプロタイプを示す。
0003734831.tif 000002
同系受容体上への皮膚移植
皮膚移植を、Billingham and Medawar(1951)J.Exp.Bio.28:385の方法の適用に従って実施した。生後６〜10週目のドナーマウスの躯幹に由来する十分な厚さの皮膚を、生後８〜12週の受容体マウスの側腹部上に移植層上に固定した。この部位を石油ガーゼパッチにより被覆し、そして硬膏剤包帯により受容体の中間部の回りを巻いた。包帯を７日目に取り除き、そして移植された組織を、その後毎日、日により観察した。この実験は、盲検法を用いて行なわれた。
β2−ミクログロブリン欠損性マウスからの皮膚移植片は同系受容体により容易に受け入れられたが、しかしそれらの同じ受容体上への対照の同種異系移植片は通常の時間で拒絶された。対照的に、それらの同じ動物からの骨髄移植片は、NK−細胞介在工程により同系受容体により拒絶された。皮膚実験からのデータは表２に示される。
0003734831.tif 000003
MHCクラスＩ抗原の欠失は、（C57BL/6×129）Ｆ1受容体からのデータにより示されるように、同系ドナーからの皮膚移植片の拒絶に影響を与えないことが上記データから見出され得る。Ｈ−２bβ2−細胞は129親からのマイナーな組織適合性抗原を発現し、そしてその結果、その移植片はC57BL/6ホモ接合性マウスにより拒絶された。移植片が拒絶される前の長さは、クラスＩミスマッチを越えての移植片に関して（11.3−11.9日）よりも少々の組織適合性抗原ミスマッチに関して（13，９日）が長かった。
Ｈ−２クラスＩミスマッチ受容体上への皮膚移植
クラスＩMHC抗原不適合の存在下でβ2−ミクログロブリン欠損組織の移植可能性を試験するために、いくつかの新しいマウス株の育成を必要とした。
F1受容体動物を生成するために、Ｂ10コンジェニック株を129株により交配した。Ｂ10及びC57BL/6のマイナーな抗原のプロフィールは、実質的に同一であり、そしてその結果、（Ｂ10×129）Ｆ1マウスは、Ｈ−２bβ2−ミクログロブリン欠損マウスに存在する前記マイナーな抗原に対して耐性である。
クラスIMHCミスマッチを担持するドナー株を創造するために、β2−ミクログロブリン欠損性を、Ｈ−２kハプロタイプを有するＢ10株、すなわちB10.BR中に生ぜしめた。MHC表現型Ｈ−２k/k、すなわちβ2−ミクログロブリン-/-を有するマウスを誘導した。それらのマウスは、Ｂ10及び129株の両者からのマイナーな組織適合性抗原を担持していた。
それらの動物からの完全な皮膚を、（B10.A(2R)×129）Ｆ1受容体上に、上記の方法により移植した。その受容体マウスはＨ−2Db/bであり、そしてドナーマウスは、上記で示されたように、Ｈ−2Dk/kである。従って、MHCクラスＩ対立遺伝子はＤ遺伝子座でミスマッチされる。しかしながら、ドナーマウスはβ2−ミクログロブリンを欠いているので、MHCクラスＩ抗原はその細胞表面上では発現されず、そしてその結果、移植片はミスマッチされた受容体により拒絶されなかった。表３はそれらの動物を用いての皮膚移植片の生存時間を示す。
0003734831.tif 000004
それらの結果は、β2−ミクログロブリン遺伝子座でのホモ接合性変異誘発が主要な移植バリヤーとして作用するＤkクラスＩMHC抗原の能力を効果的に排除することを示す。受容体マウスは、皮膚移植片を拒絶するB10.BR受容体の能力により示されるように、マイナーな組織適合性遺伝子座で十分なミスマッチが存在する場合、β2−ミクログロブリン欠損細胞をまだ拒絶することができる。
インビボで、クラスＩMHC分子は、CD８+Ｔ細胞により認識のために外来性ペプチド抗原を提供する役割を演じる。結果として、CD８+Ｔ細胞は、外来性MHCクラスＩ抗原の発現に基づいて、移植された組織のみを認識し、そして拒絶することができる。MHCクラスＩミスマッチβ2−ミクログロブリン欠損皮膚移植片の延長された生存率は、CD８+Ｔ細胞が外来物としてこの組織を認識することができず、その結果、それらの細胞が受容体の免疫応答の全分枝を回避することを可能にすることを示唆する。
IV．ヒト体細胞RPE細胞の標的化
ヒト網膜色素沈着上皮（RPE）細胞におけるHPRT遺伝子が、MHC抗原発現に関連する遺伝子を標的化する前、形質転換されていない二倍体ヒト体細胞における正確な変更を達成する能力を示すために、相同組換えを用いて標的化された。
λクローンHuλ３(ATCC)(Patel et al.,Molec.and Cell.Biol.6(2):393-403(1986))からサブクローン化されたヒトHPRT遺伝子配列のフラグメント(Edwards et al.,Genomics 6:593-608(1990))(“Ｒ”11777-17810)を、標準方法を用いてpUCクローニングベクター中にサブクローン化した。ベクターpMC1neo(Thomas and Capecchi,Cell 51:503-512(1987))からのneor遺伝子を、hHPRT遺伝子のエキソン３に位置するユニークXhoＩ部位中に挿入した。HPRT.MC1neo.roと称するこのベクターは、hHPRT遺伝子座の６kbの相同体を含み、そしてそれぞれ挿入ベクター及び置換ベクター支持体を創造するためにBglII又はHindIIIのいづれかにより切断した。ベクター支持体を標準方法により精製し、そしてDNA濃度を１mg／mlに調節した。１μｇの線状ベクターDNAを、Mayerson et al.(Invest.Opthalmo.& Visnal Sci.26:1599-1609(1985))の方法を用いて、ヒト死体からの眼組織から単離された正常な雄の一次性ヒトRPE細胞の個々のサンプル（４×106個の細胞／サンプル）中にエレクトロポレート処理した。次に、その細胞を３個の150mm組織培養皿上の非感受性増殖培地に配置し、そして37℃で２日間インキュベートした。３日目、その増殖培地を変え、そして150μｇ／mlのG418を含む培地を添加した。その増殖培地を５日目に再び変え、そして150μｇ／mlのG418（neo）及び400μｇ／mlの６−チオグアニンを含む培地を添加した。この培地をその後、３日ごとに変えた。トランスフェクション後、約２週間で、標的ベクターが細胞の単独のHRPT遺伝子と相同組換えしているその細胞に由来する増殖するコロニーが、10個のプレートの約１つのプレート上で明確になった。ベクターDNAが含まれなければ、いづれのプレート上ででもコロニーは明確でなかった。個々のコロニーを、150mmの皿上で多量の培養物に増殖せしめた。個々のコロニーのサンプルを界面活性剤含有緩衝液により溶解し、そして高分子量（HMW）DNAを標準方法により単離した。それらのサンプルをBamHＩにより消化し、そして10μｇのアリコートを、hHPRT遺伝子（HPRT R1ベクター配列の３′側）からのPCRによりクローン化されたプローブを用いてサザンブロット上で分析した。
プローブは次のプライマーを用いて調製された：
PC 5 : 5' GACTCAGAATTCGCATGCTTAATTAAGATTGATTGATTGA-TGGTTTACAGTAGGAC 3'(配列番号03)
PC 31 : 5' GATTACGAATTCAAGCTTGTCAAAGCATTTTCTACCACTGA-GAATTGATC 3'(配列番号04)
それらのブロットは、野生型の親DNAの場合、20kbのバンド；BglII−切断ベクターによりトランスフェクトされ、そしてG418及び６−チオグアニンにより選択されたクローンにおいては15kbのバンド；及びHindII−切断ベクターによりトランスフェクトされ、そしてG418及び６−チオグアニンにより選択された細胞においては６kbのバンドを示した。少なくとも３種の追加消化物を用いて、それらの個々のクローンを分析した。すべては、個々の選択された（G418＋６−チオグアニン）クローンが正確な置換（HindIII）又は挿入（BglII）組換え反応を受けたことを示唆した。挿入及び置換の両組換え出来事は、約10-7組換え体／投入細胞の頻度で生じた。それらのデータは表４に要約される。わずか１つのクローンが、個々の組換えクローンの独立性を確保するためにトランスフェクション当たりに計数された。分子内組換えを、いくつかの挿入変異体の復帰頻度を試験することによってこのシステムにおいて研究した。それらの変異体のすべては、同等の割合で、HPRT＋，neos表現型に復帰した。それらの復帰体は、投入細胞当たり10-5の頻度で検出された。それらのコロニーの多くは、サザンブロットにより真の組換え体であることが示された。それらの結果は、HPRT遺伝子を不活性化するためにヒト一次RPE細胞における遺伝子標的化を示す。
0003734831.tif 000005
Ｖ．ヒト細胞におけるβ2−ミクログロブリン遺伝子座の標的化
これらの実験は、正常な二倍体ヒトRPE細胞におけるβ2−ミクログロブリン（β2−Ｍ）を不活性化することによって、正常な二倍体ヒト細胞におけるクラスＩMHC抗原の細胞−表面発現を低めるための遺伝子座の標的化を示す。
２つのアプローチが、クラスＩMHC抗原の発現を低めるためにβ2−Ｍ遺伝子座を不活性化するために開発された。第１のアプローチにおいては、５′から３′末端の方に次の記載される要素を有する、＃137と称する標的化ベクターを構成した：ゲノムDNA相同体の7.6kbのフラグメント（β2−Ｍ遺伝子のエキソン１の上流の領域からのNotＩ−MluＩフラグメント）；ベクターを安定して組込む細胞を選択するための十分に機能的なネオマイシン（Neo）耐性遺伝子（pMC1 Neoに由来する）、下流の相同又はDSHフラグメント（β2−Ｍ遺伝子のエキソン４の下流からの1.4kbのXhaＩ−SmaＩフラグメント）；ヘルペスチミジンキナーゼ遺伝子（2.0kb）；強いCMV初期プロモーター及びエンハンサーを包含する組換え遺伝子座の５′端；５′未翻訳領域の一部、シグナル配列（アミノ酸番号１〜23）及びβ2−Ｍ遺伝子のエキソン１からの最後の10個の塩基対（アラニン、次に成熟β2−Ｍ遺伝子生成物の最初の２つのコドンをコードする）に読み取り枠を整合して融合される成熟ヒトCD４遺伝子生成物（アミノ酸番号24-222）の最初の２つの免疫グロブリン様ドメインを含んで成る、ヒトCD４（T４）（Maddon et al.,Cell 42:93-104(1985);GENBANK:HUMATCT4)のための部分cDNA配列（603bp）；及びβ2−Ｍ遺伝子の最初のイントロンからの3.5kbフラグメント（ClaＩ部位まで）（図1A）。ヒトβ2−Ｍ遺伝子座は図1Bに示され；そして正しく標的化された組換え遺伝子座は図1Cに示される。
＃148（図２）と称する追加の標的化ベクターを、4.0kbの相同体を残して、β2−Ｍプロモーターの上流の５′領域の3.5kbを除去することによって構成した。
マイクロタイターウェルの表面にβ2−Ｍコードエピトープを含むタンパク質を結合し、そしてCD４−コードエピトープを有する結合されたタンパク質を検出することによって相同標的化出来事により生成されるキメラ性CD４−β2−Ｍ遺伝子生成物を検出するために、ELISAを行なった。マイクロタイタープレートを、ウサギ抗−ヒトβ2−Ｍ IgG調製物(DAKO Corp.,Carpinteria,CA)により被覆した。非特異的結合部位をオボアルブミンにより飽和した。サンプルを適用し、そしてインキュベートした。洗浄の後、不活性化構造体のために使用されるCD４の一部に含まれるエピトープを結合することが知られているネズミモノクローナル抗−ヒトCD４抗体(Ortho Diognostic Systems,Raritan,NJ)をウェルに添加し、そしてインキュベートした。次の段階においては、アルカリホスファターゼ−接合ウサギ抗−マウスIgG2a(Cappel,Organon Teknika,Corp.,Durham,NC)を、ウェルにおいてインキュベートした。続いて、ウェルをホスファターゼ色素形成性基質ｐ−ニトロフェニルホスフェートと共にインキュベートし、そしてその結果をプレートリーダー上で読み取った。ELISAアッセイの調製を可能にするために、RPR細胞を継代６培養物から収穫し、そして次の対照のベクター、すなわちCMV即時−初期プロモーター、イントロン、CD４シグナル配列及び十分な長さのCD４ cDNAコード領域及びSV40ポリアデニル化シグナルを含む十分な長さのCD４発現ベクター、又はCMVプロモーター、及びCD４シグナル配列及びβ2−Ｍの十分な長さの成熟コード領域に融合されるCD４の初めの２つの免疫グロブリン様エピトープから成るキメラ性cDNA、並びにSV40ポリアデニル化シグナルを含む、β2−Ｍ融合タンパク質発現ベクターにより、エレクトロポレーション(0.5mlの細胞；270ボルト、960μＦ、血清を含まないDME／Ｆ12培地１ml当たり８×106個の細胞、室温で１〜５μｇの線状DNA)を用いてトランスフェクトした。トランスフェクション後１日で、ならし培地をトランスフェクトされた細胞から収穫し、そしてβ2−Ｍコードエピトープを含むタンパク質を取り込み、そしてCD４コードエピトープを有する結合されたタンパク質を検出するELISAにより試験した。得られたアッセイは、細胞計数及びサンプル希釈により試験されるように、1000個ほどの発現細胞の検出を可能にするCD４−β2Ｍ融合タンパク質に対して特異的であることを示した。
＃137及び＃138標的化ベクターを、制限酵素により線状化し（表５に示されるように）、そして４×106個の細胞当たり2.0〜7.5μｇのベクターを用いて、エレクトロポレーションによりRPE細胞（継代７〜18）中にトランスフェクトした。次に、細胞をローウェル又は24−ウェルプレートにプレートした。トランスフェクションの次の日、G418を400μｇ／mlの濃度で培地に添加し、そして細胞を、G418耐性コロニーが現われるまで約２週間、G418中で選択した。１〜10のコロニーを含むならし培地をELISAを用いてスクリーンし、正しく標的化されたクローンから発現されるキメラ性CD４−β2Ｍ遺伝子融合タンパク質を検出した。個々の陽性プールに由来する個々のクローンから得られたならし培地を再スクリーンし、そして組換えクローンを同定した。９回の個々の標的化実験からのデータは表５に要約される。いくつかのELISA陽性クローンを追加の分析のためにランダムに選択した。それらのクローンを拡張し、そしてサザンブロット及び放射性免疫沈殿法によりアッセイした。
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分泌された融合タンパク質を検出するために、放射性免疫沈殿（RIP）アッセイを次の通りに行なった。個々の選択されたクローン（クローン：24．１．３．２及び28．１．６．２）のトランスフェクトされていない及びELISA陽性細胞の小継代培養物を、Ｓ35−メチオニン及びＳ35−システインにより４時間、放射性ラベルした。このラベル化期間の後、細胞及びそれらの上清液を収穫した。細胞を溶解し、そして溶解物及び上清液をウサギ抗−ヒトβ2−ミクログロブリンIgG調製物(DAKO,Carpinteria,CA)又はウサギ抗−CD４ IgG調製物(American BioTechnologies,Inc.,Cambridgo,MA)のいづれかと共にインキュベートした。続いて、サンプルを、それらの表面上でプロテインＡを通してウサギIgGを結合する固定されたスタフィロコーカスアウレウス（Staphylococcas aureus）細胞と共にインキュベートした。得られる免疫複合体を遠心分離により集め、そしてSDSポリアクリルアミドグラジエントゲル上で電気泳動した。ゲルをサリチル酸ナトリウム、すなわち35Ｓにより放される弱いβ粒子の検出の感度を高めるシンチラントにより処理した。次に、ゲルをＸ−線Kodak XAR−５フィルムに露光し、そしてフルオログラフィー像を得た。
親RPE細胞は、β2Ｍ IPに関して12kbのバンドを示し、そしてCD４ IPに関しては、明確なバンドは存在しなかった。対照的に、２種のELISA陽性形質転換体（レーン２，３及び５，６）は、それらがCD４−特異的抗体により免疫沈殿される場合にまた存在した追加の31kbバンドを示す。これはCD４−β2Ｍ融合タンパク質の予測される分子量である。ELISA陽性クローンの個々はまた、変性されていないβ2Ｍタンパク質の発現を示した。これは、二倍体遺伝子座の１つのコピーで変性されたクローンの予測される表現型である。
追加のELISA−陽性クローン（クローン28．２．６．１及び33．１．４．６）を拡張し、そしてゲノムDNAをサザン分析により抽出した。ゲノムDNAをHpaＩ又はEcoRＶのいづれかにより消化し、１％アガロースゲル上で分別し、固体支持体にブロットし、そして相同体の３′領域を両端に有するプローブによりハイブリダイズせしめた。親RPE細胞は個々の消化物に関して単一バンドを示し（HpaＩ消化物においては約6.4kb及びEcoRＶ消化物においては約20kb）、そしてELISA陽性クローンは野生型制限フラグメント及び正確な標的化出来事のために予測されるサイズの新しい組換え体バンド（HpaＩ消化物においては約12.5kb及びEcoRＶ消化物においては約17kb）を示した。これは、それらの細胞の組換え性質を示し、そしてこの方法論が相同組換え出来事の頻度の決定を可能にし、そして形質転換されていない二倍体ヒト細胞におけるMHC発現に直接的に関連する遺伝子座を標的化する能力を示したことを例示する。
ある場合、融合遺伝子のCD４コード部分を排除することが所望される。なぜならば、それが導入される宿主生物において融合ペプチドの潜在的な免疫原性が存在するためである。そのような場合、融合タンパク質のCD４部分を排除する、相同性のDSH領域（図１）間のDNA配列の欠失を含む生存細胞について選択するために標的化した後、ガンミクロビルを適用する。他方、細胞からの融合タンパク質の分泌を排除するためには、CD４のためのシグナル配列は、標的化ベクター及び組換え体のためにスクリーンされる細胞溶解物からELISAを用いて欠失され得る。
VI．Neo置換ベクターによる標的化
第２のアプローチにおいては、＃137及び＃148標的化ベクターを、＃159（図３を参照のこと）と称する標的ベクターにより置換した。このベクターは、Neo置換ベクターである。ベクター＃159は、p148と同じ上流の相同領域、すなわちβ2−Ｍ遺伝子のエキソンＩの上流の領域からの4.0kbのScaＩ−MluＩフラグメント、ｐMC1 Neo−変異体からの変異Neo発現単位（野生型Neo DNA配列においてbp 1286でXhoII制限部位を欠失する）、及びエキソン１の３′端からの14bpの構築されたNheＩ部位からβ2−Ｍ遺伝子の最初のイントロンにおけるClaＩ部位までの3.5kbの下流の相同領域を含む。このベクターを用いての好都合な標的化は、β2−Ｍ遺伝子座でのヌル突然変異の導入をもたらす。
ヒト包皮から単離され、そしてマウス胚線維芽細胞の支持細胞層の存在下で増殖された正常なヒトケラチノサイトを、４×106個の細胞当たり２μｇのDNAを用いて制限酵素NotＩ及び／又はClaＩにより消化されたp159を用いて上記のようにしてエレクトロポレーションによりトランスフェクトした。次に、細胞を、マウス胚線維芽細胞から成る支持細胞層を含む100mm又は150mmの組織培養皿にプレートした。トランスフェクションの次の日、G418を400μｇ／mlの濃度で培地に添加し、そして細胞を約２週間にわたって選択した。次に、個々のクローンを、支持細胞を含む24−ウェルプレートから採取し、そして２つの150mm皿に拡張した。ゲノムDNAを１つの皿から調製し、そして細胞を凍結せしめた。クローンからのDNAをEcoRＶにより消化し、アガロースゲル上で電気泳動し、そしてサザンブロットのためにナイロン膜に移した。β2−Ｍ遺伝子からの2kbのEcoRＩフラグメント（ベクターの構成のために使用される相同の下流）を、プローブとして使用する（図１）。そのベクターに関しては、そのプローブとハイブリダイズする約17kbのEcoRＶフラグメントが、相同組換え出来事が生じた場合、予測される。組換えされていない遺伝子座は、約20kbのサイズのハイブリダイズするフラグメントを含むべきである。初期の組換え体クローンは、１つの組換えられた遺伝子座及び１つの組換えされていない遺伝子座を含むであろう。
MHC遺伝子座の両コピーにNeo標的ベクターを含む組換え細胞（すなわち標的の出来事のためにホモ接合性の細胞）を得るために、細胞を高レベルのG418で選択する。他方、ヘテロ接合性細胞を、抗−β2Ｍ又は抗−dMHCクラスＩ分子及び補体の組合せを用いて、又は磁気ビーズに結合される抗−dMHCクラスＩ抗体(Vaccaro,Am.Biotech.Lab.30-35(1990))を用いて選択する。変異体Neo遺伝子を含むベクターを用いて、選択剤G418の濃度を試験し、Mortensen et al.,Molec.and Cell.Biol.12(5):2391-2395(1992)により記載される方法を用いて、ホモ接合性細胞の増殖を好む濃度を得る。さらに、非分離は相反的出来事であり、そしてホモ接合性の野生型細胞はG418選択に対してひじょうに敏感であるので、低レベルのG418選択が、細胞集団の連続した拡張の間、細胞集団のホモ接合性への流れを引き起こすであろう。
自発的に相同接合性になる細胞の選択の他に、不活性化されたβ2−Ｍ遺伝子のためにホモ接合性の細胞は、上記のようなNeoベクターを用いて相同標的化をくり返すことによって得られる。同じ相同性のアームを含み、但し異なった選択可能マーカー、たとえばヒグロマイシンr（hygr及びNeor）を有する標的ベクターを用いて、ホモ接合的に標的化されたクローンを、初期標的化効率（hygrクローン当たり10-6〜10-7、好ましくは10-2で、ヘテロ接合体から生成する。
VII．正常なヒトケラチノサイトにおけるβ2−Ｍ遺伝子座の標的化
ヒト包皮から単離され、そしてマウス胚線維芽細胞支持細胞の存在下で増殖された正常なヒトケラチノサイトを、上記例Ｖに記載される＃137標的ベクターの線状化された調製物を用いてトランスフェクトした。ヒトケラチノサイトのG418rコロニーを、上記のようにしてCD４−β2Ｍ融合タンパク質の発現のために選択し、そしてスクリーンした。３種の独立した実験からの結果は表６に示される。
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それらの実験は、相同組換えが上記のようにヒトRPE細胞のために観察される頻度にひじょうに類似する頻度で体細胞に達成したことを示した。標的化の絶対的頻度に観察される差異は、２種の細胞型の異なるコロニー形成率によるものであり、すなわちhRPE細胞に関しては約90％及びヒトケラチノサイトに関しては５％である。
それらの結果は、相同組換えがインビトロで増幅される異なったヒト細胞型の指図された変性のために使用され得ることを示す。その結果はまた、それらの方法を用いて生成される組換え体を検出する標的構造体及び変性されたELISAの能力も示す。本発明の方法は、アッセイされる細胞の生存率を害しないで、低頻度で生じ、そして検出するのが困難である所望する相同組換えの急速且つ正確な検出を可能にする。従って、それは、都合良く標的化されたタンパク質の、検出のために細胞外の分泌輸送を引き起こすことによって、単純に機能的変異タンパク質の生成を可能にするために細胞内タンパク質標的物に適用され得る。
VIII．胚幹細胞におけるIFN−γＲ遺伝子座の標的化
この例は、マウス胚幹細胞におけるIFN−γ遺伝子座の標的化を記載する。正常な体細胞における遺伝子標的化の効率は低いと予測されるので、相同組換えを容易に受けるマウス胚幹（ES）細胞における標的化出来事を強化する方法が開発された。
標的化プラスミドの構成。IFN−γＲ遺伝子のエキソン中に挿入される転写的に活性的なネオマイシン（Neo）選択マーカーを含む置換ベクターpB−IT１を次のようにして構成した（図４）。プラスミドpB−17.2Bを、標的化配列の源として使用した。このプラスミドは、プラスミドBluescript(Stratagene,San Diego,CA)中に挿入された129個のマウスPCC4細胞から調製されたλファージライブラリーから単離された7.2kbのBamHＩフラグメントを含む。オリゴヌクレオチドを、公開されたIFN−γＲ cDNA配列(Hemmi et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:9901-9905(1989))に基づいて合成し、そしてラベルし、そしてプローブとして使用した。次に、IFN−γＲエキソンIV〜VI（図4B）を含むpB−17.2Bの5.2kb BamHＩ−HindIIIフラグメントを、pBluescript SK(Stratagene)中にサブクローン化した。得られるプラスミド（pB−5.2BH）は、タンパク質のトランスメンブラン領域をコードするエキソンVI内に、選択可能マーカー遺伝子の挿入のために選択されたユニークEcoRＩ部位を有する。ベクターpB−IT１（図4A）を、XhoＩ−EcoRＩアダプターを用いて、pB−5.2BHのEcoRＩ部位中に完全なNeoカセット、すなわちpMC1−NeoポリＡの1.1kbのXhoＩ−SalＩフラグメントをサブクローン化することによって製造した。次に、受容体遺伝子として同じ転写方向にNeo遺伝子を有するサブクローンを選択した。G418耐性に関しての選択の後、コロニーを相同組換えのためにスクリーンした。分析される432 ES細胞のいづれも標的化されず、この事は相同組換えが数少い出来事であることを示唆する（表７）。非正統的DNA組込みに起因する耐性コロニーの数を減じるために、プロモーター−エンハンサー配列、並びにpB−IT１におけるMC1−Neoの翻訳開始（ATG）コドンを、オリゴヌクレオチド−指図変異誘発により欠失せしめた。その得られる、プロモーター無しのNeoベクター（pB−IT２）（図4A）は、Hemmi et al.前記によれば、Lys25から下流に、受容体遺伝子のコード領域中に整合して融合される選択可能マーカーの第２コドン（GGA）を有する。このベクターにおけるIFN−γＲ配列は、pB−IT１におけるのと同じである。従って、トランスフェクションの後、pB−IT２と標的遺伝子座との間での相同組換えが生じる場合、Neo遺伝子がIFN−γＲ−Neo融合タンパク質として発現されるであろう。選択可能な遺伝子がトランスメンブランコード領域から９bp下流に挿入されたので（Hemmi et al.、前記）、融合タンパク質におけるNeo配列はG418に耐性を付与する細胞質に保持されるべきである。エレクトロポレーションの前、プラスミドを、Bluescriptプラスミド内を切断するPvaＩにより線状化した。
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エレクトロポレート処理された細胞のコロニー形成率は、ES細胞においては20〜30％であり、そして筋原細胞においては30〜55％の範囲であった。IFN−γＲ-は標的化されたG418rクローンである。クローンは、Neoに由来する５′プライマー（5' ACGGTATCGCCGCTCCCGAT 3'）（配列番号05）及び標的ベクターの外部のIFN−γＲゲノム配列に由来する３′プライマー（5' GACCTATTTGTGCATTGGAAGC 3'）（配列番号06）を用いてＰＣＲによりスクリーンした。それらのクローンのうち132個をサザンブロットにより再スクリーンした。
細胞培養、エレクトロポレーション及び選択。強化手段を試験するために、ES細胞をベクターpB−ITI又はpB−IT２によりエレクトロポレート処理し、そしてG418により選択した。Dr.Oliver Smithies,University of North Carolina,Chapel Hill,NCにより供給されるES細胞系E14TG2a(Hooper et al.,Nature 326:292-295(1987))を、Robertson,Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells:a Pratical Approach,ed.Robertson(TRL Oxford),71-112ページ（１９８７）により記載されようにして、G418（NSTO）に対して耐性の有系分裂的に不活性なSTO線維芽細胞上で培養した。ES細胞系Ｅ14−１(Kuhn et al.Science 254:707-710(1991))胚一次線維芽細胞を支持細胞層として使用し、そして組換えネズミ白血病阻害因子（104Ｕ／ml）を前記培地に添加した。
さらに、マウス筋原細胞が相同組換えを行なう能力が、マウスES細胞におけるIFN−γＲ遺伝子を不活性化するために高い効果的な相同組換えのための上記手段を用いて調査された。筋原細胞を、0.5％コラゲナーゼを用いて生後14日目のマウス（C57BL/6×129）の骨格筋から単離し、線維芽細胞汚染を減じるために２時間、予備プレートし、そして次に、Ｆ10補充された培地（10％ウシ胎児血清、５％馬血清、２mMのグルタミン、0.5％鶏のひなの胚抽出物、20ng／mlの線維芽細胞増殖因子及びマウス筋肉線維芽細胞からのならし培地を含む新鮮な培地、１：１）に105個の細胞／cm2で接種した。筋原細胞形態を有する細胞をクローン化し、そして線維芽細胞ならし培地を含む、Ｆ−10補充された培地において100倍になるまで培養した。それらの培養条件下で、細胞は一次単離の筋原細胞と同じ表現型及び増殖調節を発現し、そして収縮する筋管の分化及び形成するそれらの能力を保持する(Austin et al.,In vitro 29A:105A(1993))。クローンを採取し、そして拡張した。増殖及び形態におけるひじょうに小さな変動が観察された。
ES細胞（２×107）又は筋原細胞（１×107）を、0.8mlのCa2+及びMg2+フリーリン酸緩衝培地（ES細胞）又は線状化されたプラスミドDNA 10μｇを含む、0.5mlのＦ10培地（筋原細胞）において、600Ｖ／cm及び500μＦ（ES細胞）又は875Ｖ／cm及び960μＦ（筋原細胞）でBio−Rad遺伝子パルサーを用いてエレクトロポレート処理した。エレクトロポレートされた細胞をプレートし、そして培地を、24時間後（ES細胞）又は48時間後（筋原細胞）、100μｇ／mlのG418（活性形）を含む培地により置換した。個々のG418耐性コロニーを、10〜18日後（ES細胞）及び10〜12日後（筋原細胞）、採取し、そして拡張せしめた。
pB−IT２によりエレクトロポレート処理されたES細胞は、IFN−γＲ−Neo構造体における選択可能遺伝子が機能的であることを示すG418耐性コロニーを形成した。転写的に休止した標的ベクターpB−IT２により得られるコロニーの数は、十分な機能の標的ベクターにより得られた数よりも相当に低かった（120倍）（表７）。
ベクターpB−IT２によりエレクトロポレート処理された筋原細胞はまた、G418耐性コロニーを形成した。合計のエレクトロポレート処理された細胞当たりのG418体コロニーの頻度は、ES細胞よりも筋原細胞に関してが120倍高かった（表７）。
スクリーン。ベクターpB−IT２により生ぜしめられた耐性ES細胞を次の通りに相同組換えのためにスクリーンした。DNA（６〜10μｇ）を、0.8％アガロースゲル上での電気泳動により分離し、ナイロン膜(Zeta bind,Cuno Laboratory Products,Meriden,CONN)に移し、そして標準条件下で、標準ベクター配列（図4C）の３′側で溶解するIFN−γＲプローブ（プローブＡ）によりハイブリダイズせしめた。標的遺伝子座中へのNeo遺伝子の挿入は、7.2kbの野生型BamHＩフラグメントの他に、このプローブとハイブリダイズする新規の2.5kbのBamHＩフラグメントを付与する。２種の異なった実験で生成された合計206個のG418耐性コロニーのうち、32のコロニーは標的化された遺伝子座のために予測される2.5kbのBamHＩフラグメントを示した（表７）。この方法により陽性である５個の組換えクローンからのDNAをさらに拡張し、そして分析した。ゲノムDNAをEcoRＩ又はXhaＩにより消化し、そしてプローブＡ又は標的ベクター（図4C）の外部の５′側IFN−γＲ外部プローブ（Ｂ）のいづれかによりハイブリダイズせしめた。プローブは、DNA鋳型としてcDNAクローン（プローブＢ）又はpB−17.2B（プローブＡ）を用いて、ポリメラーゼ鎖反応（PCR）により生成された。それらのプローブはヌクレオチド103〜486（プローブＢ）及び1000〜1666（プローブＡ）に相当する（Hemmi et al.、前記）。IFN−γＲ cDNAを、マウスEL−４細胞から単離された全RNAの逆転写及びPCRによるその生成物の増幅により生成したエキソンVIにおけるEcoRＩ部位が標的ベクターにおいて除去されるので、正しく標的化されたクローンからのEcoRＩ消化DNAは、両プローブによりハイブリダイズされた22.5kbのフラグメントを与えた。この新規のEcoRＩフラグメントは、プローブＡとハイブリダイズする9.5kbのEcoRＩフラグメント、プローブＢとハイブリダイズする12kbのEcoRＩフラグメント及び挿入されたNeo遺伝子により満たされる領域から成る。約22kbの新規フラグメントがすべての５個のクローンにおいて検出され、これは前記ベクターと標的遺伝子座との間での相同組換えを示唆する。従って、XhaＩにより消化され、そしてプローブＡによりハイブリダイズされた同じクローンからのDNAは内因性の6.5kbのXhaＩフラグメント中へのNeoの挿入に起因する新規の7.5kbフラグメントを与えた。ベクターpB−IT２により得られた組換え出来事の頻度（１／６）は、選択可能マーカーの転写及び翻訳のために必要な標的ベクターにおける配列の不在が相対的な遺伝子標的化頻度を少なくとも70倍低めたことを示した。
合計400のG418耐性筋原細胞コロニーを取り、拡張し、そしてサザンブロット分析によりスクリーンした。それらのクローンのうち４個は、IFN−γＲ遺伝子座で正しく標的化されていることが見出された。相同組換えの頻度は、G418耐性筋原細胞100当たり約１であることが見出された。筋原細胞における遺伝子標的化の相対的頻度はES細胞のために観察される頻度よりも低いが、合計のG418耐性コロニー当たりの相同組換え（１／６）は筋原細胞よりもES細胞においてが約15倍高く、筋原細胞における絶対的な遺伝子標的化頻度は約８倍高いことが見出された（筋原細胞に関しては1.6×10-6及びES細胞に関しては2.1×10-7）（表７）。
IX．IFN−γＲ標的化された筋原細胞におけるMHC抗原の発現
上記のようにして相同組換により生成されるIFN−γＲ−Neoハイブリッドタンパク質は、生来の受容体の細胞外及びトランスメンブランドメインを含むが、しかし細胞質ドメインは含んでおらず、これはIFN−γ処理の後、細胞性シグナルトランスダクションのために不可欠であることを示された(Farrar et al.,J.Biol.Chem.266:19626-19635(1991))。この突然変異がIFN−γＲ機能を排除できるかどうかを決定するために、IFN−γＲにより介在される、MHCクラスＩ抗原の発現の誘発を、破壊されたIFN−γＲ対立遺伝子の１つ又は２つのコピーを担持する筋原細胞において評価した。突然変異の２つのコピーを担持する筋原細胞を、突然変異のためにホモ接合性のトランスジェニックマウスの筋肉から単離した。トランスジェニックマウスは、正しく破壊されたIFN−γＲ対立遺伝子を担持するＥ14−１ES細胞を次の通りに胚盤胞中に注入することにより生成された。
キメラ性マウスの生成。胚盤胞操作は、Koller et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:8932-8935(1989)により記載されるようにして行なわれた。手短に言及すれば、変性されたES細胞を、過剰排卵されたC57BL/6雌から得られた胚盤胞中に注入し、そして擬似妊娠受容体の子宮中に再移植した。毛色によるキメラ性マウスをC57BL/6マウスに交配し、そしてホモ接合性変異動物を、ヘテロ接合性子孫を育てることによって得た。アグーチ子孫における変性されたIFN−γＲ対立遺伝子の伝達を、尾の生検から得られたDNAのサザンブロットにより試験した。
細胞螢光定量分析。MHCクラスＩ抗原の発現を誘発するために、親筋原細胞系（IFN−γＲ，＋／＋）、インビトロ標的化された筋原細胞系4C17（IFN−γＲ，＋／−）及び、IFN−γＲホモ接合性変異マウス（−／−）から単離された筋原細胞を、24時間、培養培地のみ（処理されていない細胞）と、又はIFN−γ（1,000Ｕ／ml）の存在又は不在下で、又はマウスIFN−γ及びβ（1200Ｕ／ml，１：９）の混合物と共に培養した。MHCクラスＩ抗原の発現を、特異的免疫螢光染色を用いて決定した。筋原細胞を、0.05％ EDTA溶液により培養皿から除去し、洗浄し、そして28−14−8S（ATCC,Rockville,MD)モノクローナル抗−Ｈ−2Db抗体と共に30分間インキュベートした（106個の細胞）。２回の洗浄の後、細胞を、FITC−接合のヤギ抗−マウスIgG2a抗体(Boehringer Mannheim,Indianapolis,IN)と共にさらに30分間インキュベートした。IFN−γＲ−Neoハイブリッドタンパク質が細胞表面上で発現されたか否かを決定するために、細胞を、IFN−γ(Basu et al.,J.Interferon.Res.9:551-562(1989)及びヤギ抗−ラットIgG−FITC(Caltag Laboratories,S.San Francisco,CA)のための結合部位を認識するラットモノクローナル抗体GR20により染色した。細胞を洗浄し、そして細胞の螢光をBecton Dickinson FACScon流動細胞計測法により測定した。
処理されていない筋原細胞におけるクラスＩ抗原は、すべての３種の細胞型においては検出できなかった。IFN−γは、（＋／＋）及び（＋／−）筋原細胞においてはクラスＩ発現を誘発したが、しかし（−／−）筋原細胞においてはそれを誘発しなかった（図5A）。（＋／−）筋原細胞に誘発される応答は（＋／＋）筋原細胞においてよりも38〜60％低く、これは１つのIFN−γＲ対立遺伝子の破壊がIFN−γＲ機能の低下を引き起こすことを示唆する。対照的に、異なった受容体に結合する、IFN−γ及びβの混合物により誘発されるクラスＩの発現はすべての３種の細胞型のために類似していた（図5A）。IFN−γＲ（−／−）マウスからの筋原細胞は、野生型（＋／＋）及び4C17（＋／−）筋原細胞（図5B）に見出されるレベルに匹敵するレベルでGR−20エピトープを発現した。従って、不活性化されたIFN−γＲ遺伝子のためにホモ接合性か又はヘテロ接合性である筋原細胞は、それらの細胞表面上でのIFN−γＲ細胞外ドメインの発現にもかかわらず、IFN−γに対する有意に低められた応答を有する。
遺伝子標的化筋原細胞の特徴化
標的された筋原細胞を、それらが正常な親筋原細胞の性質を保持するかどうかを決定するために特徴づけた。標的されたクローン4H14，4C8，4C17及び5114を、染色体分析及び基質独立性増殖アッセイにより下記のようにして特徴づけた。形態又は培養必要条件における差異は、それらの細胞と一次筋原細胞（すなわち、動物から直接的に取られ、そして培養されているが、しかし決して継代されたいない細胞）との間に観察されなかった。筋原細胞分化を妨げる条件下で、標的化された筋原細胞は小さく、そして一次筋原細胞と同じ円形状及び基本的な偽足を示した。標的化された細胞は、分化培地（DMEMにおける５％馬血清）において培養される場合、分化し、そして収縮性筋管を形成するそれらの能力を保持した。細胞は始めに、長くなり、双極形態を示し、そして多核化された筋管を形成するために融合する。
筋原細胞が形質転換されていないことを確かめるために、染色体分析を行ない、そして標的細胞がヌードマウスにおいて腫瘍を形成し、そして軟寒天において増殖する能力を研究した。染色体分析は、個々の標的化されたクローンから中期広がりを調製することによって次のようにして実施した。
染色体分析。筋原細胞の中期広がりを、まず対数増殖期の細胞を0.4μｇ／mlのデマコルシンにより７時間処理することによって製造した。次に、細胞を収穫し、そして0.075ＭのKClにより10分間処理し、３：１のMeOH：HAcにより３度10分間、固定し、そして冷たく湿潤した前もって静浄されたスライド上に滴下した(Worton et al.,Methods Enzymol.58:322-344(1979))。Ｇ−バンド法を、0.1％のトリプシンを20〜30秒、続いてGurr's緩衝液（pH6.8）における４％Giemsa（Harleco）染色を用いてスライド上で行なった(Verma & Babu,Humon chromosomes:Manual of basic techniques(Pergamon Press,NY)45-113ページ(1989))。100個の十分に定義された中期広がりを、染色体様式について分析した。Ｇ−バンド広がりを、Kodak Technical Panフィルムに写真を取り、プリントし、そして分析した。
40（2n＝40）のモデル染色体数が、すべてのクローンに観察され、そして４個のうち３個が79％以上であった。筋原細胞系4C17（＋／−）の19個の中期広がりからのＧ−バンド染色体を、核型に分類し、指図し、そして分析した(Nesbitt and Francke,Chrumosuma(Berl.)41:145-158(1973))。すべての広がりは、安定した染色体数を示し、そしてすべての対が表現した。明らかな構造的染色体異常性は観察されなかった。
追加の特徴化のために、標的化された筋原細胞クローンの基質独立性細胞増殖を次の通りに試験した。
基質独立増殖。15％血清中、0.5％寒天７mlを含む培地を、６cmの皿に配置し、そして0.3％軟寒天培地1.5mlに懸濁された104個の細胞により被覆した。培養物を37℃で15日間インキュベートし、この時点で、コロニー増殖について分析した(Macpherson et al.,Virology 23:291-294(1964))。陽性コロニーを、それが0.1mmよりも大きな直径を有したかどうかを評価した。形質転換された対照系NMU2は増殖し、そして軟寒天においてコロニーを形成したが、４個の標的化された筋原細胞クローンのいづれかによってもコロニーは形成されなかった（表８）。
0003734831.tif 000009
対照細胞は、C2C12親筋原細胞系に由来する形質転換された筋原細胞系（NMU2）である。クローン4H14，4C8，4C17及び5I14はIFN−γＲ標的化された筋原細胞クローンである。
さらに、腫瘍形成能力を次の通りに測定した。
腫瘍形成性。106個の細胞を50μｌのPBSに懸濁し、そして生後４〜６週目のヌードマウスに２つの部位で皮下注射した（CD−１BR,Charles River Lab,Wilmingiton,MASS)。正の対照として、正常な筋原細胞を、形質転換された筋原細胞変異体と比較した（NMU2,Rastinejad et al.,Cell 72:903-917(1993))。動物を７〜10週間、腫瘍形成について分析した。
４種の標的化された筋原細胞クローンのいづれも腫瘍を形成しなかった。対照的にNMU2対照細胞は腫瘍を容易に形成した（表８）。それらの結果は、標的化された筋原細胞が選択及び続く培養の間、形質転換されなかったことを強く示唆する。
従って、その形態、細胞増殖及び分化し、そして筋管を形成する能力により示されるように、標的化されたクローンは一次筋原細胞の正常な性質を示す。細胞形質転換又は異常核型の徴候は標的化されたマウス筋原細胞に関しては観察されなかった。筋原細胞において標的化されたIFN−γＲ遺伝子座の制限地図は、いづれの予測されないDNA転位も示さなかった。それらの結果は、正常な哺乳類体細胞、たとえば本発明の方法を用いての遺伝子標的化により遺伝子的に変性された筋原細胞が一次細胞の性質を保持し、そしてヒトにおける遺伝子治療のために有用であることを示す。
筋原細胞における遺伝子を標的化するために使用される本明細書に例示される方法は、予測される低い発生頻度のためにそれらの正常な体細胞に検出するのが困難である相同組換え出来事についての有意な強化を提供する。転写的に及び翻訳的に弱められた選択可能遺伝子、たとえば完全な膜タンパク質をコードする標的遺伝子IFN−γＲのコード領域中に挿入されるNeoを用いる新規の標的化ベクターの使用は、標的遺伝子のトランスメンブランドメインに融合される選択可能マーカーを有するハイブリッドタンパク質の生成をもたらし、その結果、その選択可能マーカーは膜の細胞質側上に発現される。この標的化ベクターは、ES細胞及び筋原細胞における組換え出来事のために実質的な強化を可能にし、これは膜結合されたNeoポリペプチドが耐葉物性の付与において効果的であることを示唆する。上記実験は、少なくとも70倍のES細胞における相対的遺伝子標的化頻度の上昇を生成した。
上記結果によれば、機能的クラスＩMHC抗原の存在の結果として免疫破壊を受けない細胞が供給される。この細胞は、それらが、同種異系宿主中に導入される場合、免疫攻撃を受けず、そしてそれらはそれらの生来の態様で機能することができるので、広く使用され得る。この場合、細胞の数及び／又は機能の損失に起因する広範囲の疾病を処理することができ、ここで導入される細胞は生存し、増殖し、そして機能する。従って、熱傷、擦過傷、病原体又は同様のものの結果としての疾病が処理され得るのみならず、また遺伝子欠損の結果としての疾病も処理され得る。
また、胚幹細胞は、キメラ性哺乳類宿主を供給するために相同組換えにより変性され得る。次に、そのキメラ性哺乳類宿主が選択され、そして不活性化された遺伝子を欠くホモ接合性宿主を生成するために育成され、そして次に、移植のための組織及び細胞の源として、移植治療のためのモデルとして、及び薬物効能を実験的に試験するために使用され得る。
本明細書に引用されるすべての出版物及び特許出願は、それぞれ個々の出版物又は特許出願が特別且つ個々に引例により組込まれることを指摘されているかのように、引例により本明細書に組込まれる。
前述の発明は明確に理解するためにいくらか詳細に例示的且つ例的に記載して来たけれども、一定の変更及び修飾が本発明の範囲内で行なわれ得ることは当業者に明らかであろう。
配列の列挙
（１）一般情報：
（ｉ）出願人：Cell Genesys,Inc.
（ii）発明の名称：普遍的なドナー細胞及びキメラ性哺乳類宿主のための相同組換え
（iii）配列の数：６
（iv）通信先：
（Ａ）受信人：Flehr,Hohback,Test,Albritton & Herbert
（Ｂ）通り：Four Embarcadero Center,Suite 3400
（Ｃ）町：San Froncisco
（Ｄ）州：CA
（Ｅ）国：USA
（Ｆ）郵便番号：94111-4187
（ｖ）コンピューター読取りフォーム：
（Ａ）媒体タイプ：フロッピーディスク
（Ｂ）コンピューター：IBM PC compatible
（Ｃ）操作システム：PC-DOS/MS-DOS
（Ｄ）ソフトウェアー：PatentIn Relcase #1.0,Version #1.25
（vi）現出願データ：
（Ａ）出願番号：PCT/US94/
（Ｂ）出願日：
（Ｃ）分類：
（viii）アトニー／エージェント情報：
（Ａ）名称：Rowland,Bertram I
（Ｂ）登録番号：20015
（Ｃ）参照／ドケット番号：FP-55190-4/BIR
（ix）通信情報
（Ａ）電話：415-781-1989
（Ｂ）テレファクシミリ：415-398-3249
（２）配列番号１についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：19個の塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：cDNA
（xi）配列：配列番号１：
0003734831.tif 000010
（２）配列番号２についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：20個の塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：cDNA
（xi）配列：配列番号２：
0003734831.tif 000011
（２）配列番号３についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：56個の塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：cDNA
（xi）配列：配列番号３：
0003734831.tif 000012
（２）配列番号４についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：50個の塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：cDNA
（xi）配列：配列番号４：
0003734831.tif 000013
（２）配列番号５についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：20個の塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：cDNA
（xi）配列：配列番号５：
0003734831.tif 000014
（２）配列番号６についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：22個の塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：cDNA
（xi）配列：配列番号６：
0003734831.tif 000015
【図１】
0003734831.tif 000016
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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