(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
海水の塩分濃度で生育して細胞内に澱粉を蓄積し、暗くかつ嫌気性雰囲気に保つことにより細胞内の澱粉よりエタノールを生産するクラミドモナス属に属する微細藻  Chlamydomonas sp. MT-JE-SH-1。
【請求項２】
クラミドモナス属に属する微細藻  Chlamydomonas sp. MT-JE-SH-1を海水の塩分濃度で培養して細胞内に澱粉を蓄積させた後、培養した藻体を含むスラリーを、ｐＨを６．０〜９．０の範囲に保ちながら暗黒かつ嫌気性雰囲気に保持してエタノールを生成させることを特徴とするエタノール製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は燃料や化学原料等として有用なエタノールの製造のために用いる新規な微細藻及び該微細藻によるエタノール製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、エタノールは石炭、石油等の化石資源を原料としてエチレンを経由して化学合成する方法、あるいはサトウキビの糖やトウモロコシの澱粉等のバイオマスを原料として発酵生産する方法により製造されている。原料が澱粉の場合は、酸加水分解やカビ等の作用により澱粉を単糖まで糖化し、更に酵母等のアルコール発酵微生物を作用させ、エタノールに変換するものである。
【０００３】
バイオマス原料の中で、クロレラ，ドナリエラ，クラミドモナスなどで代表される微細藻は光合成生物の中でも極めて生産性が高いことが知られているが、これらの中には澱粉を多量に（乾燥重量の約２０〜５０重量％）含有するものが知られており、これらの微細藻澱粉を原料として前記の方法によりエタノールを製造する方法がある。（文献：特公昭５４−１１３９７、特公昭５５−１１３１６各号公報）
【０００４】
また、本発明者らは澱粉含有微細藻の中に細胞内澱粉をエタノールに変換する反応を行なうものがいることに着目し、このような澱粉含有微細藻を培養し、この微細藻を濃縮したスラリーのｐＨを中性付近に保ちながら暗くかつ嫌気性雰囲気に保持してエタノールを生成させることによりエタノールを製造できることを見いだし、特願平５−２３９８４５号として特許出願した。
【０００５】
従来の微細藻澱粉を原料にエタノール発酵微生物を用いてエタノールを製造する方法では、原料となる微生物細胞内の澱粉を一旦抽出し、分離回収する必要があるが、微細藻の細胞壁は強固なものが多く、機械的な破砕に多くの動力を消費したり、高価な細胞壁分解酵素を必要とした。また、澱粉の抽出・精製では多量の有機溶剤や遠心分離の動力が必要であることが問題であった。
【０００６】
更に、抽出した澱粉は生の状態にあるため、糖化酵素により糖化する前に、加熱処理し澱粉を糊化する必要があり、この工程で多量の加熱のためのエネルギが必要であることも問題であった。通常この加熱エネルギはエタノール製造工程全体のエネルギの２〜３割を占めるとされる。
【０００７】
これに対して、澱粉含有微細藻を培養した後、この微細藻を濃縮したスラリーのｐＨを中性付近に保ちながら、暗くかつ嫌気性雰囲気に保持してエタノールを生成させる本発明者らが特願平５−２３９８４５号で提案した方法は、微細藻細胞内の澱粉を抽出分離する必要はなく、また生澱粉糊化のための加熱、更に糖化も不要であり、エタノール発酵も微細藻自身が行うため、従来の方法に比べて工程が大幅に簡略化され、製造のためのエネルギの低減が可能となった。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
前記の、本発明者らの提案した方法においても、なお次のような課題がある。微細藻の培養規模が大きくなるほど、培養のために大量の水が必要となるが、特に、微細藻の培養に有利な日照量が大きな地域では、降雨量が少なく淡水の確保がネックとなることが多い。従って、このような地域でも大量の淡水を必要とせず培養できる微細藻が望まれている。
そのような降雨の少ない地域でも、沿海部では海水がほぼ無尽蔵に利用できるため、本発明者等は海水で旺盛に増殖し、澱粉を多く含有し、且つ細胞内澱粉のエタノール変換性能に優れた微細藻であれば、上記課題を解決できると考えついたが、これまでにこのような微細藻についての報告はなかった。
本発明の目的は、このような微細藻の提供及びこの微細藻を用いたエタノールの製造方法の提供にある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決する手段として本発明は、
（１）海水の塩分濃度で生育して細胞内に澱粉を蓄積し、暗くかつ嫌気性雰囲気に保つことにより、細胞内の澱粉よりエタノールを生産するクラミドモナス属に属する微細藻 Chlamydomonas sp. MT-JE-SH-1 、及び
（２）クラミドモナス属に属する微細藻  Chlamydomonas sp. MT-JE-SH-1を海水の塩分濃度で培養して細胞内に澱粉を蓄積させた後、培養した藻体を含むスラリーを、ｐＨを６．０〜９．０の範囲に保ちながら暗黒かつ嫌気性雰囲気に保持してエタノールを生成させることを特徴とするエタノール製造方法、
を提供するものである。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明者らは、多数の海水を採取し、海水でも旺盛に増殖し、澱粉を多く含有し、且つ細胞内澱粉のエタノール変換性能に優れた微細藻を探索、分離、検討の結果、紅海海水より上記課題を解決できる優れた性能の微細藻を分離することに成功し、本発明に至った。
本株は細胞内澱粉をエタノールに変換し、このエタノールを細胞外に放出するので、従来のように細胞を破壊して澱粉を抽出分離するする必要はなく、生澱粉糊化のための加熱や糖化も不要であるので、簡単な工程で製造エネルギを低減できる。
【００１１】
本発明の微細藻は、下記に示す光合成色素成分及び形態学的特徴より、クラミドモナス属と同定され、本発明者らはこの藻株を Chlamydomonas sp. MT-JE-SH-1 株と命名した。
また、本株を工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託申請したが、「緑藻であるため」との理由により受託拒否に該当した。
なお、クラミドモナス属に分類される微細藻は淡水性で多くの種類が知られ、また、海水性でも数種が報告されている。
【００１２】
本発明のChlamydomonas sp. MT-JE-SH-1株の海水からの分離は以下の操作により行った。
入手した紅海海水（約５０００ｍｌ）を遠心分離（３０００ｘｇ，１０ｍｉｎ）し、その大部分の上清を捨て、残った沈殿物と僅かな海水を懸濁し、その懸濁物１ｍｌをゲンランガムを支持体とする表１に示す組成の改変ＥＳ培地に塗布した。次にこのゲランガム培地を１５００Ｌｕｘ、２５℃の環境下で約１ケ月静置培養し、緑黄色の広がったコロニー状の微細藻を得ることができた。しかし、この微細藻のコロニー状のものは、顕微鏡観察により、複数種の微細藻が混在しているものと判断されたため、次に、この混在する微細藻から、顕微鏡下でキャピラリーピペットにより楕円形の微細藻を１個ずつつり上げ、前記改変ＥＳ培地１００μｌを入れたマイクロタイタープレートに移植し、これらの微細藻１２個を約２ケ月間、１５００Ｌｕｘ、２５℃の環境下で静置培養すると、そのうち５株が単一種の微細藻として数万個レベルに増殖した。
【００１３】
【表１】
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【００１４】
次に、これらを１０ｍｌの改変ＥＳ培地入りのＬ字管に移し、約３週間、３５００Ｌｕｘ，２５℃，６０ｒｐｍにて振盪培養したところ、そのうち３株がＬ字管に付着することなく浮遊状態で、細胞濃度を簡易的に濁度で示すＯＤ750 が３以上になるまで増殖した。この１０ｍｌをさらに６０ｍｌの改変ＥＳ培地の入った１００ｍｌの三角フラスコに移し、２５℃，６０ｒｐｍで２週間振盪培養することにより、微細藻の大量培養に用いる種株を得ることができた。
次に、この３株を１３００ｍｌ規模の偏平大型培養ビンにて１５０００Ｌｕｘ，２５℃，０．５％ＣＯ2 含有（空気）雰囲気下で培養し、増殖速度、澱粉含有率及びエタノール生産性能を比較評価した。その結果、この中で、これらの性能が最も優れた１株を獲得し、この株を Chlamydomonas sp. MT-JE-SH-1 株と命名した。
【００１５】
Chlamydomonas sp. MT-JE-SH-1株の菌学的特徴を以下に示す。なお、本藻株の栄養細胞（好適生育環境、豊富な栄養条件下で旺盛に増殖する状態での細胞）及び不動細胞（生育環境悪化、栄養枯渇条件下での細胞）の顕微鏡写真を図１に、また栄養細胞の薄層切片の透過型電子顕微鏡写真を図２に示す。図３は図２の顕微鏡写真を模式的に示した説明図である。
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【００１６】
本発明の微細藻を使用したエタノール製造は、本発明者らが先に提案した特願平５−２３９８４５号明細書で示したプロセスに準じて実施できる。このプロセスの一例を図４に示し、これに基づき具体的な製造方法を説明する。
図４において、微細藻培養手段１は、本発明の Chlamydomonas sp. MT-JE-SH-1 株を光独立的に培養する手段である。これには、水深約１０〜３０ｃｍ程度の上面が開放された流水路型の培養槽等を用いることができ、海水をベースに窒素、リンなどの無機栄養を与えながら太陽光を受光して培養することができる。ここで海水は、その中に含む微細藻の補食生物等の異物をろ過等により除去された後、培養槽に供給される。培養は常温付近、例えば２５〜３５℃で行なう。
【００１７】
次に、培養液中の微細藻の濃度が培養液１０００ｍｌ当たり０．１〜３．０ｇ（乾燥固形分として）程度になった時点で培養を止め、微細藻濃縮手段２により濃縮する。具体的には、微細藻濃縮手段２において、沈殿性の高い微細藻の場合には、一旦自然沈殿により固形分１〜５重量／容積％（１０００ｍｌ当たり１０〜５０ｇ）前後に濃縮した後、遠心分離、ベルトフィルタなどにより更に固形分１０〜２０重量／容積％（１０００ｍｌ当たり１００〜２００ｇ）に濃縮する。本プロセスにおいては、流動性を有する範囲で可能な限り高固形分に濃縮すると、スラリーとしての取り扱いや後段での緩速撹拌が可能で、且つエタノール濃度を高くでき、後段でのエタノール濃縮が有利になる。
【００１８】
このようにして得られた微細藻のスラリーを暗く且つ嫌気性雰囲気に保持できる保持手段３に導いて、エタノールの生産を行わせる。保持手段３はスラリーポンプあるいは攪拌機などの緩速撹拌手段を備えたｐＨモニター付き半密閉型容器からなる。ここで、暗い雰囲気とは、光合成が行われない程度に光を遮断した状態をいう。また、嫌気性雰囲気とは空気雰囲気において微細藻の呼吸によりＯ2 が消費され、Ｏ2 濃度がゼロになった状態をいう。
【００１９】
この保持手段３にスラリーを導入し、緩くかき混ぜながら暗く且つ嫌気性雰囲気に保持することにより、微細藻自身が行なう細胞内澱粉の発酵作用によりエタノールを生成させる。この間、ｐＨモニターによりスラリーのｐＨを監視しておき、ＮａＯＨ等のアルカリ溶液とＨＣｌ等の酸溶液の供給手段を備えたｐＨ調整手段４より、アルカリ溶液又は酸溶液を添加して、スラリーのｐＨを６．０〜９．０、好ましくは６．５〜８．０の範囲に保つようにする。ｐＨ調整手段４は、保持手段３のｐＨモニターに連動して作用し、連続的に槽内のｐＨを調整できるようにすることもできる。
保持手段３内での微細藻の滞留時間は、微細藻の種類、保持条件などにより異なるが、５〜５０時間の範囲が一般的である。
この工程の温度は、常温付近、例えば２５〜３５℃で行なう。
【００２０】
スラリー中のエタノール濃度が５〜５０ｇ／１０００ｍｌ程度になった時点で、エタノール分離濃縮手段５に導き、エタノールの分離濃縮を行なう。エタノール分離濃縮手段５は、蒸留の他、エタノール又は水分離膜による濃縮方法、あるいはプロパン等の溶媒を用いた超臨界抽出法などを用いることにより、最高は無水エタノールまでの所望の濃度に濃縮することができる。
エタノールを分離した後の残渣は、乾燥後、焼却等により処分したり、発酵させ堆肥などとして利用することもできる。
【００２１】
【実施例】
以下実施例により本発明の内容を更に具体的に説明する。
〔実施例１〕
Chlamydomonas sp. MT-JE-SH-1株を表２に示す組成の栄養をろ過海水に混合したものを培地として用い、培養した。この培地１０リットルと、該 Chlamydomonas sp. MT-JE-SH-1 株の培養種４ｇ（乾燥固形分として）を偏平透明容器に入れ、白色蛍光灯で約１５０００Ｌｕｘの連続照射を行い、空気（０．５％ＣＯ2 添加）を通気しながら、２５℃で５日間培養し、１０リットル中に２４ｇ（乾燥固形分として）の藻体を含む培養液を得た。なお、この培養終了後の微細藻は乾燥重量当たり２５重量％の澱粉含量を示した。
【００２２】
【表２】
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【００２３】
次に、この培養液１０リットルを遠心沈殿法により濃縮し、１００ｍｌの液中に Chlamydomonas sp. MT-JE-SH-1 株の藻体２４ｇ（乾燥固形分として）を含む藻体スラリー液とし、これを容積２００ｍｌの半密閉容器に移し、窒素ガスを短時間スラリー液に注入して容器内の酸素を除去した後、暗い条件下、３０℃で振盪（６５往復／ｍｉｎ）し、エタノールの生成を行わせた。この間、０．１Ｎ  ＮａＯＨ又は０．１Ｎ  ＨＣｌを適宜添加して、スラリー液のｐＨを６．５〜８．０の範囲に保持した。生産されたエタノールの分析をガスクロマトグラフィーによって行い、エタノール濃度の経時変化を調べた結果、図５のグラフに示すように約２日後に最大１８ｇ／１０００ｍｌのエタノールが得られた。図５のグラフにおいて横軸は嫌気性暗条件下での保持時間（ｈｒ）、縦軸はエタノール濃度（ｇ／１０００ｍｌ）を表す。
【００２４】
【発明の効果】
本発明の微細藻 Chlamydomonas sp. MT-JE-SH-1 株を用いることにより、ほぼ無尽蔵に得られる海水を利用して培養を行い、培養液を濃縮して得られる藻体スラリーをｐＨを中性付近に保ちながら暗く且つ嫌気性雰囲気に保持してエタノールを製造することが可能となる。これにより、エタノール生産微細藻の培養における淡水確保のネックが解消されるため、日照量が豊富で光合成生産に有利であるにもかかわらず、水の確保が困難なために、従来は生産立地にできなかった地域においてもエタノール生産が可能となり、微細藻によるエタノール生産プロセスを大規模に利用することが可能になる。
また、本発明は海水を利用して生産できるため、農業による食糧生産との間で、肥沃な土地と淡水を競合することがなく、これまで未利用の砂漠等の荒廃地と海水を用いてエネルギーや化学原料となるエタノールを大量に製造することができる。しかも、本発明は太陽光による光合成により炭酸ガスを固定し有効利用するため、地球規模での大気中炭酸ガス減少対策としても有効である点で、一石二鳥の効果を奏するものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の微細藻 Clamydomonas sp. MT-JE-SH-1株の栄養細胞、及び不動細胞の形状を示す図面に代る顕微鏡写真（倍率２，５００倍）である。
【図２】本発明の微細藻 Clamydomonas sp. MT-JE-SH-1株の栄養細胞の細胞内構造を示す図面に代る透過型電子顕微鏡写真（倍率１４，０００倍）である。
【図３】図２の電子顕微鏡写真を模式的に示した説明図である。
【図４】本発明の微細藻 Clamydomonas sp. MT-JE-SH-1株によるエタノール製造プロセスの概要を示すフロー図である。
【図５】本発明の微細藻 Clamydomonas sp. MT-JE-SH-1株を用いたエタノール生産の実施例において、微細藻スラリー中に生成したエタノール濃度の経時変化を示すグラフ図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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