(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ライスプラスミノーゲン（Lys-Plasminogen;以下、Lys-Plg.と称することがある）のエラスターゼ分解生成物よりなる肺癌転移増殖抑制効果を有するプラスミノーゲン断片。
【請求項２】
Lys-Plg.のエラスターゼ分解生成物であってヘパリン結合性を示す断片よりなる、請求項１記載のプラスミノーゲン断片。
【請求項３】
プラスミノーゲンよりLys-Plg.を調製し、次に該Lys-Plg.をエラスターゼ処理し、得られた断片よりヘパリン結合性を示す断片を回収することを特徴とする、肺癌転移増殖抑制効果を有するプラスミノーゲン断片の調製方法。
【請求項４】
プラスミノーゲンよりLys-Plg.を調製するに際し、プラスミノーゲン含有溶液に直接プラスミンを添加する方法、あるいはトラネキサム酸を用いて間接的自然消化を促す方法を適用する請求項３に記載のプラスミノーゲン断片の調製方法。
【請求項５】
ヘパリン結合性を示す断片を回収するに際し、Lys-Plg.のエラスターゼ分解生成物含有溶液をヘパリンをリガンドとした担体に通液し、吸着・溶出する方法を適用する請求項３または請求項４に記載のプラスミノーゲン断片の調製方法。
【請求項６】
請求項１または請求項２に記載のプラスミノーゲンを主たる成分とする肺癌転移増殖抑制剤。
以上
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本願発明は、生物学的に活性な新規な血漿蛋白質断片および該蛋白質断片の調製方法に関する。詳細には、ライスプラスミノーゲン（Lys-Plasminogen；以下、Ｌｙｓ-Ｐｌｇ.と称することがある）のエラスターゼ分解生成物であってとりわけヘパリン結合性を示す断片を好適な態様とする腫瘍転移増殖抑制効果を有するプラスミノーゲン断片、該プラスミノーゲン断片を主成分とする腫瘍転移増殖抑制剤および該プラスミノーゲン断片の調製方法に関する。従って、本願発明は、Ｌｙｓ-Ｐｌｇ.をエラスターゼで分解した際に生成する断片、とりわけヘパリン結合性を示すＬｙｓ-Ｐｌｇ.の断片に、生化学あるいは医学的意義が存する分野、例えば肺癌、大腸癌に代表される固形癌等の臨床治療の分野において広く利用される。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】
プラスミノーゲンは分子量８０,０００の血漿蛋白であり、血液の凝固線溶系に関与する酵素前駆体である。当該物質は、プラスミン、ウロキナーゼ゛またはプラスミノーゲンアクチベーターによって限定分解を受け、活性型であるプラスミンに変換されフィブリン凝塊物を分解する働きがある。プラスミノーゲンはその分子中に５つのクリングル部分および活性中心を有するセリンプロテアーゼドメインから成り立っている。また、前記クリングル部分の特性のためリジンと結合することができ、リジン結合担体を用いて特異的に調製することが可能である。  プラスミノーゲンは、エラスターゼによって限定分解され、アミノ酸配列の  79Ｔｙｒからクリングル３までの部位、クリングル４部位およびクリングル５を含むセリンプロテアーゼドメインの３つの部位に分けられ、これらは各々リジン結合部位Ｉ（Lysine Binding site I；以下、ＬＢＳ-Ｉと称することがある）、リジン結合部位II（Lysine Binding Site II；以下、ＬＢＳ-IIと称することがある）及びミニプラスミノーゲン（mini-Plasminogen；以下、ｍｉｎｉ Ｐｌｇ.と称することがある）と呼ばれている（Davidson J.F.,et.al:The primary structureof human plasminogen:isolation of two lysine-binding fragments and "mini-"plasminogen（MW,38,000）by elastase-catalyzed-specific limited proteolysis.Raven Press,New York,vol.3,p.191-209,1978.）。
【０００３】
ところで、プラスミノーゲンにはＮ末端にグルタミン酸残基を有するグルプラスミノーゲン（Glu-Plasminogen；以下、Ｇｌｕ-Ｐｌｇ.と称することがある）とリジン残基を有するライスプラスミノーゲン（Lys-Plasminogen；Ｌｙｓ-Ｐｌｇ.）が知られている。前者がインタクトタイプのプラスミノーゲンで、後者はプラスミノーゲンの活性化の際にプラスミンによってＧｌｕ-Ｐｌｇ.のＮ末端領域にあるＬｙｓ76−Ｌｙｓ77結合が切断されて生成するものである。なお、Ｌｙｓ-Ｐｌｇ.にはＬｙｓの他にＶａｌ、ＭｅｔのＮ末端アミノ酸残基が検出されている。Ｌｙｓ-Ｐｌｇ.のウロキナーゼ゛による活性化速度は、Ｇｌｕ-Ｐｌｇ.に比べて非常に速く、また、Ｌｙｓ-Ｐｌｇ.はＧｌｕ-Ｐｌｇ.より強くフィブリンに結合する等のいくつかの異なる性質を有している。これらは、両プラスミノーゲン分子の高次構造の違いによるものと考えられ、特にその分子中のクリングル１の空間配置の変化によるものと考えられている（Lerch P.G., et al. Localization of individual lysine-binding regions in human plasminogen and investigations on their complex-forming properties.Eur J Biochem,107,7-13,1980）。
【０００４】
最近、O'Reilly等は、ヒトのＧｌｕ-Ｐｌｇ.の分解物中のＬＢＳ-Ｉに血管新生阻害活性を見いだし、この物質が癌の転移後の増殖を抑えることを報告した（O'Reilly M.S.,et al. Angiostatin:a navel angiogenesis inhibitor that mediates the suppression of metastases by a lewis lung carcinoma.Cell,79,315-328,1994.）。本願発明者等は、Ｇｌｕ-Ｐｌｇ.をエラスターゼ処理して得られるプラスミノーゲンリジン結合部位Ｉ（以下、区別のためＧｌｕ-ＬＢＳ-Ｉと称することがある）を用い、彼らの実験に準じて再現実験を行なったが、血管新生阻害効果及び転移抑制効果で抑制する傾向はある程度認められるものの、対照群に比べ有意差を認めるには至らなかった。
【０００５】
【問題を解決するための手段、発明の構成】
上述の問題点に鑑み、本願発明者はＧｌｕ-ＬＢＳ-Ｉがエラスターゼで処理される前に、ある種の物質（酵素）によって処理された場合に初めてその活性を発現するという仮説をたて、それに基づき、プラスミノーゲンをプラスミンによって消化し、Ｎ末端残基がリジン残基で始まる分子すなわちＬｙｓ-Ｐｌｇ.を調製し、これをエラスターゼによって分解することによって、ライスタイプリジン結合部位 Ｉ（以下、Ｌｙｓ-ＬＢＳ-Ｉと称することがある）を調製し、この分子の癌転移増殖に与える影響について検討した。
【０００６】
本願発明者等は、鋭意研究の結果、驚くべきことに、プラスミノーゲンをプラスミンで分解したものを原料とした際に得られるＬｙｓ-ＬＢＳ-Ｉが強い腫瘍増殖抑制効果を有することを見出した。さらに本差を導く原因について検討した結果、Ｌｙｓ-ＬＢＳ-Ｉ中にＧｌｕ-ＬＢＳ-Ｉには認められない低イオン強度でヘパリン担体に結合し得る断片があることを発見し、Ｇｌｕ-Ｐｌｇ.が、いったんライス形態（Lys Form）に変換された後に本作用を発揮するとの知見を見出した。さらに、この性質を利用することで血管新生阻害効果のある断片をヘパリンを結合した担体で効率よく調製できることを見出した。
これら知見に基づいて、Ｌｙｓ-Ｐｌｇ.のエラスターゼ分解生成物であってとりわけヘパリン結合性を示す断片を好適な態様とする腫瘍転移増殖抑制効果を有するプラスミノーゲン断片、該プラスミノーゲン断片を主成分とする腫瘍転移増殖抑制剤および該プラスミノーゲン断片の調製方法を提供する本願発明を完成させるに至った。
以下、本願発明の概略を説明する。
【０００７】
本願発明は、プラスミノーゲンにプラスミン等を作用させて得られるＬｙｓ-Ｐｌｇ.のエラスターゼ分解生成物であって、とりわけヘパリン結合性を示す断片を好適な態様とする腫瘍転移増殖抑制効果を有するプラスミノーゲン断片を提供する。また、前記腫瘍転移増殖抑制効果を有するプラスミノーゲン断片を有効成分とする新規な腫瘍転移増殖抑制剤を提供する。さらに、前記プラスミノーゲン断片を効率よく調製し得る次の工程からなる調製方法をも提供する。▲１▼プラスミノーゲンにプラスミン等を作用させてＬｙｓ-Ｐｌｇ.を生成させる。▲２▼Ｌｙｓ-Ｐｌｇ.含有溶液をエラスターゼ処理し、クリングル１からクリングル３を含む画分に分解する。▲３▼得られる画分のうち、ヘパリンに対して強い結合性がある部分を選択し、所望の腫瘍転移増殖抑制効果を有するプラスミノーゲン断片を得る。
【０００８】
本願発明の腫瘍転移増殖抑制効果を有するプラスミノーゲン断片の本態は、Ｌｙｓ-Ｐｌｇ.のエラスターゼ分解生成物である。そのうち、より強力な腫瘍転移増殖抑制効果を有する部分はヘパリン結合性を示す断片よりなるプラスミノーゲン断片である。該プラスミノーゲン断片は、Ｎ末端アミノ酸が７７Ｌｙｓから始まるクリングル１〜３より構成され、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で分子量３８Ｋｄａを示す糖鎖を含まない蛋白質である。これは、他の糖鎖を含むアイソフォームに比べより強いヘパリン結合性を示す。当該断片は中性域での生理イオン濃度（生理条件）ではヘパリンに結合することができないが、環境が酸性に傾いた場合に生理イオン濃度でヘパリンに結合し得る特徴を有する。
【０００９】
理解を容易にするために、本願発明のプラスミノーゲン断片の構造に深く関与するプラスミノーゲンのエラスターゼによる分解の工程を図１および図２に示した。図１に示すようにプラスミノーゲンをエラスターゼによって分解した場合、７９残基アミノ酸の部分で限定分解され、Ｎ末端がＴｙｒであるクリングル１〜３を含む断片（ＬＢＳ-Ｉ）が遊離する。一方、プラスミノーゲンをプラスミンによって限定分解した場合、Ｎ末端がＬｙｓで始まるプラスミノーゲン（Ｌｙｓ-Ｐｌｇ.）が調製され、これを同様にエラスターゼで切断するとＮ末端残基がＬｙｓのクリングル１〜３を含む断片（Ｌｙｓ-ＬＢＳ-Ｉ）が遊離する（図２）。当該物質のＮ末端のアミノ酸配列がＬｙｓで始まる原因は、エラスターゼによる分解に関与するアミノ酸の立体的配列が成立しないため、79Ｔｙｒの部分で切断されなかったものと考えられるが、Ｎ末端残基のわずか１、２分子の違いによって、以下に示すヘパリンへの結合性を大きく変えてしまうことは興味深いものである。
【００１０】
ところで、ヘパリンは、血漿成分であるアンチトロンビンIIIと結合し血液凝固を抑制する作用を有している。ヘパリンあるいはヘパリン様物質は血管内腔に敷き占められている血管内皮細胞上に広く分布し血管内の余分な凝固を抑制している。本願発明のプラスミノーゲン断片の持つヘパリン結合性は、従来考えられているプラスミノーゲン（プラスミン）がフィブリン等に結合する際に必要となる例えばリジンとの結合で例示される結合様式の他に、前記血管内皮細胞へ直接結合して何等かの作用を及ぼす可能性を有している。
腫瘍の遠隔転移巣が増殖するためには、腫瘍細胞への栄養分と老廃物を運搬する血管が必要であり、腫瘍の増殖の過程で「新しい血管を形成し、腫瘍へと引き込む（血管新生）」という現象が観察される。新生血管は、腫瘍細胞からのシグナルを受けた既存血管の内皮細胞が既存血管を破壊し、腫瘍細胞へ向かって「増殖」、「伸長」、「管腔の形成」という段階を経て形成される。
故に、前述の血管内皮細胞の働きを抑制することによって、遠隔転移巣の増殖を抑制することが可能であり、本願発明のプラスミノーゲン断片の持つヘパリン結合性は血管内皮細胞の働きに対し作用を及ぼす最低条件を備えているものである。
【００１１】
しかしながら、前述したように血管は血管内皮細胞で敷き占められているため、
腫瘍細胞の遠隔転移巣の増殖を抑制するために作用物質を腫瘍細胞の新生血管のみに結合させるには何等かの特異性が必要である。本願発明のプラスミノーゲン断片の特徴は、生理条件（等張状態）下ではヘパリンまたはヘパリン様物質に結合することができないが環境のｐＨが低下した非生理的な条件ではヘパリン結合性を獲得することである。ところで、Jainらは腫瘍内の血管は極度に分極化し血流が鬱滞した状態であり、低酸素状態によりその環境は酸性に傾いていることを報告している（Jain R.K., et al. Barriers to drug delivery in solid tumors. Sci. Am. vol.271(1),p.58-65, 1994）。本願発明のプラスミノーゲン断片が腫瘍に対して特異的に作用する原因は、他の血流中では認められない腫瘍部内に特有のこの非生理的な環境に起因するためであると本願発明者等は考察している。
本願発明のプラスミノーゲン断片が腫瘍細胞の増殖を抑制する作用機作については不明であるが、その構造を考慮するとプラスミン作用の競合的な阻害によるものではないかと考えられる。
【００１２】
前記したごとく、O'Reilly等はプラスミノーゲン断片が、直接、血管内皮細胞の増殖を抑制することを報告している。彼らはルイス肺癌を移植した担癌動物が、強力な血管新生阻害物質をその血中および尿中に産生していることを発見し、この物質を精製してこれをアンジオスタチンと命名した。該アンジオスタチンはプラスミノーゲンの内部断片と極めて高い相同性を示し、ヒトＬＢＳ-Ｉ（Ｇｌｕ-ＬＢＳ-Ｉ）を精製したものにも同様の活性を示すことを報告した。前記ヒトＬＢＳ-Ｉは分子量３８Ｋｄａ〜４２.５Ｋｄａを有する３つのアイソフォームを持つ物質であり、本願発明のプラスミノーゲン断片と高い相同性を示す点で注目される。
【００１３】
現段階では、本願発明のプラスミノーゲン断片とアンジオスタチンが作用機作および物質として同一であるか否かについては明確には断定できない。しかしながら、本願発明のプラスミノーゲン断片とアンジオスタチンには、▲１▼本願発明のプラスミノーゲン断片には糖鎖が含まれておらず、糖鎖を含む他のアイソフォームに比べ有意に遠隔転移腫瘍細胞の増殖を阻害すること、▲２▼本願発明のプラスミノーゲン断片はアンジオスタチンほどの血管内皮細胞の増殖抑制効果を奏しないこと等のような物性並びに生物活性において明らかな差異が存在することも事実である。
本願発明によってもたらされるプラスミノーゲン断片が有する高度な腫瘍転移増殖抑制効果は、前述のアンジオスタチンとの差異に起因する可能性は否定できない。
【００１４】
本願発明のプラスミノーゲン断片を製造する方法は特に限定されていないが、例えば、以下の方法が例示される。
先ず血液よりプラスミノーゲンを分離し、得られたプラスミノーゲンよりＬｙｓ-Ｐｌｇ.を調製する。血液由来のプラスミノーゲンの製法としては以下の方法が挙げられる。例えば、代表的な製法としてはリジン担体を用いるアフィニティークロマトグラフィーで精製するDeutsch等の方法（Deutsch D.G., et al., Science vol.170,p.1095,1970）およびその改変法がある（Brockway W.J.,et al., Arch.Bochem.Biophys., vol.151,p.194,1972）。即ち、新鮮血漿にアプロチニン（２０Ｕ／ｍｌ）、ＥＤＴＡ（２.５ｍＭ）を加えて混和させた後、リジン担体に結合させ、０.１ＭＮａＣｌ／２.５ｍＭＥＤＴＡ／２０Ｕアプロチニン／ｍｌを含有する緩衝液、さらに界面活性剤を含有する同緩衝液で洗浄した後、６-アミノヘキサン酸で溶出することによって高純度のプラスミノーゲンを調製することが可能である。最終的に精製濃縮を限外濾過膜（例えば、ａｍｉｃｏｎ社ＹＭ１０）で行なう。
【００１５】
血中内には完全分子型のプラスミノーゲンがほとんど全てであり、そのＮ末端残基がリジンであるＬｙｓ-Ｐｌｇ.は僅かに存在するにすぎない。そのため、プラスミノーゲンをＬｙｓ-Ｐｌｇ.に変換する工程が必要となる。そのための、プラスミノーゲンにウロキナーゼ゛を直接作用させる方法（Ljungberg J., et al.,Throromb.Res.,vol.53,p.569-576,1989）や、プラスミンを直接作用させる方法（Castellino F.S., et al.,Methods in Enzymology, Academic press,New York, vol.80,p.365,1981）、あるいは長時間孵置することによる方法（Markus G.,et al.,J. Biol. Chem.,vol.254,p.1211-1216,1979）が存在する。本願発明においては、好適な方法として、予めトラネキサム酸存在下でプラスミノーゲンを孵置し自己消化させＬｙｓ-Ｐｌｇ.を調製する方法が推奨される。
【００１６】
その後、得られたＬｙｓ-Ｐｌｇ.をエラスターゼで分解し、生成する断片よりＬｙｓ-Ｐｌｇ.のクリングル１〜３までを含む分子（Ｌｙｓ-ＬＢＳ-Ｉ）を回収する。その際、例えばセファデックスＧ-７５を用いるゲル濾過法およびこれに引き続いて行なわれるリジン（Ｌysine）−アフィニティークロマトグラフィーによって、良好なＬｙｓ-ＬＢＳ-Ｉの調製が達成される。引続き、得られるＬｙｓ-ＬＢＳ-Ｉを、ヘパリンをリガンドとしたレジンに接触させ結合画分を得ることによって、ヘパリンに強く結合する画分を特異的に調製することができる。
【００１７】
本願発明者の知る限りでは、本願発明のプラスミノーゲン断片すなわちＬｙｓ-ＬＢＳ-Ｉを、遺伝子組換え技術に基づき直接産生させた例は知り得ない。しかしながら、遺伝子組換え技術によりＬｙｓ-プラスミノーゲン産生細胞を構築し、これより調製されるＬｙｓ-プラスミノーゲンをエラスターゼによって断片化する方法、あるいは本願発明のプラスミノーゲン断片をコードする遺伝子を好適なベクター等を用いて真核細胞、哺乳動物細胞または昆虫細胞等適当な宿主細胞に導入して恒常的に所望のプラスミノーゲン断片を産生させ、これより調製する方法も現実的な調製手段として充分考慮され得る。
【００１８】
上述の方法で調製されたプラスミノーゲン断片の活性を最大限に維持するために、本発明のプラスミノーゲン断片は新鮮であるか、４℃で保存する場合には保存後約５日以内のものが好ましい。あるいは、本発明のプラスミノーゲン断片は、ヒトアルブミン、ゼラチン、塩、糖またはアミノ酸などの好適な安定化剤と共に凍結乾燥もしくは液体の状態で保存することができるし、さらには、プラスミノーゲン断片溶液を凍結し保存することも可能である。また、感染性夾雑ウイルスの不活性化を目的として、凍結乾燥もしくは液状の状態において所定の条件下、例えば凍結乾燥状態では６５℃９６時間、液状では６０℃１０時間の加熱処理を施すことは、薬剤の安全性の観点から極めて好ましい態様である。
本願発明では、かかる有効成分としてのプラスミノーゲン断片と公知の適当な賦形剤を組み合わせ、公知の方法で本願発明の腫瘍転移増殖抑制剤とすることができる。
【００１９】
本願発明のプラスミノーゲン断片を本態とする腫瘍転移増殖抑制剤の有効投与量は、例えば投与対象者の年齢、症状及び重症度などにより変動し、最終的には医師の意図により変動するものであるが、例えば一般に成人一日当り５０〜５００ｍｇであり、望ましくは１００〜３００ｍｇを１〜２回に分けて投与するのがよい。投与方法は単回大量(ボラス)あるいは点滴の静脈内投与が最適である。また、場合により他の抗腫瘍剤と併用することも可能であり、本願発明で提供される腫瘍転移増殖抑制剤中に前記の抗腫瘍剤を併存させることも好ましい一つの態様である。
【００２０】
今回の実施例に使用した血液由来のプラスミノーゲン断片は、マウスでの単回静脈内投与毒性試験、反復静脈内投与毒性試験、一般薬理試験(ビーグル犬を用いた呼吸循環器系に及ぼす影響)、ウイルス不活化試験などによりその安全性が確認されている。
以下、本願発明の理解を深めるために実施例に沿って説明するが、本願発明はこれらの実施例になんら限定されるものではない。
【００２１】
【実施例】
実施例 １
（プラスミノーゲンの調製）
新鮮凍結プール血漿１０リッターに、２０ｍＭベンツアミジン、１ｍＭ ＰＭＳＦ、１００Ｕ／ｍｌアプロチニン（トラジオール  バイエル社製）を加え、室温で冷融解した。その後、浮遊物を高速遠心機（ＲＳ-２０ＩＶ；トミー精工社製）で８,０００ｒｐｍ、４℃、の条件下２０分間遠心を行ない上清を得た。上清を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／０.５Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ ７.５）で平衡化したリジン-セファロース４Ｂ（ファルマシア社製）カラム（内径５.０×３０ｃｍ）に流速１.０ｍｌ／ｍｉｎで通液し、さらに、５倍容の同緩衝液で洗浄した。その後、緩衝液を１０ｍＭアミノヘキサン酸を含む同緩衝液に置換し溶出を行なった。溶出液は０.１Ｍ炭酸アンモニウム緩衝液に対して４℃で一晩透析した。
【００２２】
実施例 ２
（Ｌｙｓ-Ｐｌｇ.の調製）
実施例１のクロマトグラフィーの操作で得られる溶出液を濃縮した後、５０ｍＭＴｒｉｓ／２０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６.５）で一晩透析し、濃縮液に１ｍＭトラネキサム酸を加え、さらに一晩３０℃で孵置した。
【００２３】
実施例 ３
（エラスターゼ-Sepharose）の調製
エラスターゼ（シグマ社製 Tyep IV:From Porcine Pancreas）５０ｍｇを０.５ＭＮａＣｌを含む０.１Ｍ炭酸水素ナトリウム溶液で溶解後、さらに一晩４℃で同緩衝液に対して透析した。エラスターゼを固定化するゲルは、ＣＮＢｒ-活性化セファロース４ Fast Flow（ファルマシア社製）を用い、その結合は添付の使用説明書に従って、エラスターゼとゲルの割合を５ｍｇ エラスターゼ／ｍｌゲルにて行なった。
【００２４】
実施例 ４
（プラスミノーゲン及びＬｙｓ-Ｐｌｇ.のエラスターゼ分解物の調製）
実施例１及び実施例２で調製したＧｌｕ-及びＬｙｓ-Ｐｌｇ.をＷｉｍａｎ等の方法に従い、実施例３で調製したエラスターゼで分解し、両プラスミノーゲンのエラスターゼ分解物を分離した。つまり、精製したＧｌｕ-Ｐｌｇ.あるいはＬｙｓ-Ｐｌｇ.に１０ｍｇ／ｍｌに、アプロチニン１００Ｕ／ｍｌ（トラジオール；バイエル社製）を加え、０.１Ｍ炭酸アンモニウム溶液に溶解した。これに、エラスターゼ-Sepharoseを酵素基質比が１：１００になるように加え、２５℃で一晩攪拌させながら反応させた。反応終了後、ガラスフィルターで反応液を濾過し、濾液を０.１Ｍで平衡化させたリジン-Sepharose（Pharmacia社製）に通液後、同緩衝液で洗浄した。リジン-Sepharose結合画分は、２０ｍＭアミノヘキサン酸を含む同緩衝液で溶出した。溶出液は、限外濾過膜（ＹＭ-１０ ａｍｉｃｏｎ社製）で濃縮し、０.１Ｍ炭酸アンモニウム緩衝液で平衡化したセファデックスＧ-７５（ファルマシア社製）カラム（内径５.０×４０ｃｍ）に通液し、Ｇｌｕ-リジン結合部位Ｉ（Ｇｌｕ-ＬＢＳ-Ｉ）、Ｌｙｓ-リジン結合部位Ｉ（Ｌｙｓ-ＬＢＳ-Ｉ）を各々調製した。なお、両ＬＢＳ-Ｉは凍結乾燥し、使用するまで４℃で保存した。
【００２５】
実施例 ５
（ヘパリンとの結合性）
実施例４に示した方法で得られたＧｌｕ-ＬＢＳ-Ｉ及びＬｙｓ-ＬＢＳ-Ｉを、ヘパリンをリガンドとしたイムノアフィニティークロマトグラフィー（Hi trap Heparin（商品名）;ファルマシア社製）に通液し、塩濃度による濃度勾配溶出を行なうことによって得られるヘパリン結合画分の蛋白を、吸光度でモニターしヘパリンアフィニティー及び量比を比較した。
すなわち、５０ｍＭＮａＣｌを含むＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７.２）で平衡化したイムノアフィニティーレジン１ｍｌに、同緩衝液で溶解したＧｌｕ-ＬＢＳ-Ｉ（１ｍｇ／ｍｌ）及びＬｙｓ-ＬＢＳ-Ｉ（１ｍｇ／ｍｌ）を１００μｌ接触させ、流速０.５ｍｌ／ｍｉｎの条件で同緩衝液１０ｍｌで洗浄した後、５０ｍＭＮａＣｌ／Ｔｒｉｓ緩衝液１０ｍｌ、１ＭＮａＣｌ／ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７.２）１０ｍｌでグラジエント溶出した。
ヘパリンアフィニティーの結果を図３および図４に示した。図３に示すようにＬｙｓ-ＬＢＳ-Ｉはヘパリン非結合画分、中程度結合画分、高結合画分に分かれるのに対して、Ｇｌｕ-ＬＢＳ-Ｉは高結合画分に相当する部分が認められなかった（図４）。また、ヘパリンの高結合画分を１２.５％のＳＤＳ-ＰＡＧＥを行なった結果、その分子量は３８ｋｄａ付近であり、糖鎖を含まないＬＢＳ-Ｉの分子量に一致した（図５）。なお、原料となるプラスミノーゲンは平衡化緩衝液組成で溶解せず、同操作は実施できなかった。
【００２６】
実施例 ６
（ヘパリンとの結合性  ｐＨとの関係）
実施例４に示した方法で得られたＬｙｓ-ＬＢＳ-Ｉを、ｐＨ５.０〜７.２の範囲における生理食塩濃度でのヘパリンをリガンドしたイムノアフィニティークロマトグラフィー（Hi trapTM Heparin; ファルマシア社製）を行なうことによって、Ｌｙｓ-ＬＢＳ-Ｉのヘパリンへの結合性を調べた。
すなわち、１５０ｍＭＮａＣｌを含むクエン酸緩衝液（ｐＨ５.０〜７.２）で平衡化した前記クロマトレジン１ｍｌに同緩衝液で溶解したＬｙｓ-ＬＢＳ-Ｉ（１ｍｇ／ｍｌ）を１００μｌ接触させ、流速０.５ｍｌ／ｍｉｎの条件で同緩衝液１０ｍｌで洗浄した後、１ＭＮａＣｌ／クエン酸緩衝液（ｐＨ５.０〜７.２）１０ｍｌで溶出した。
Ｌｙｓ-ＬＢＳ-Ｉのヘパリン結合性とｐＨとの関係を図６に示した。図のように、等張条件下で中性付近ではＬｙｓ-ＬＢＳ-Ｉはヘパリンに結合できないが、ｐＨの低下にともない、ヘパリンの結合性は上昇し、ｐＨ５.０の条件下で全ての画分がヘパリンに結合した。
【００２７】
実施例 ７
（ヒトプラスミノーゲンヘパリン結合断片の調製）
実施例４で得られるＧｌｕ-ＬＢＳ-Ｉ及びＬｙｓ-ＬＢＳ-Ｉを５０ｍＭＮａＣｌを含むＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７.２）で一晩透析後、実施例５のヘパリンアフィニティークロマトグラフィーの操作を行ない、１０ｍｇ／ｍｌの濃度のヘパリン結合画分を調製した。また、Hi trap TM Heparin ５ｍｌに上述のエラスターゼ断片１０ｍｇ／ｍｌを３ｍｌ接触させ、２.５ｍｌ／ｍｉｎの流速で４０分間洗浄後、１Ｍ ＮａＣｌ／ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７.２）２５ｍｌでグラジエント溶出し、溶出画分をフラクションコレクター（レディラック、ファルマシア社製）で分取した。ヘパリン結合画分はプールした後、０.１Ｍ炭酸アンモニウム緩衝液で透析し、無菌濾過を行なった後、凍結乾燥して動物実験に供した。
【００２８】
実施例 ８
（肺転移増殖抑制試験）
癌細胞はルイス肺癌ＬＬ２（Bertram J.S., et al.:Establishment of a cloned line of Lewis Lung Carcinoma cells adapted to cell culture.: Cancerlett vol.11,p.63-73,1980）を大日本製薬より購入し、高濃度グルコース-ＤＭＥＭ培地／１０％ＦＣＳで培養、継代を続けたものを用いた。
３０匹の６週令の雄マウス（C57BL6／J）に、ルイス肺癌１０7cells／ｍｌの１００μｌを背部皮下に移植し、１５〜１８日間飼育した。その後、形成された原発巣を術的な操作によって取り除き、皮膚を縫合した。体重及び原発巣の重量を考慮し、マウスを３群に分け、１４日間飼育した後、実施例４で調製したＬｙｓ-ＬＢＳ-Ｉを０.５ｍｇ／ｋｇ、Ｇｌｕ-ＬＢＳ-Ｉ ０.５ｍｇ／ｋｇ、対照群として生理食塩液１００μｌを毎日１０日間、腹腔内投与した。投与終了後、マウスの肺を摘出し、その重量を比較した。なお、統計処理はノンパラメトリック解析を用いた。腫瘍の転移増殖に対するＬｙｓ-ＬＢＳ-Ｉ、Ｇｌｕ-ＬＢＳ-Ｉ の効果の結果を図７に示した。対照群（生理食塩液）投与群の肺重量は０.７０５±０.４１１ｇであるのに対して、Ｌｙｓ-ＬＢＳ-Ｉ投与群の重量は０.２４７±０.０５ｇと、Ｌｙｓ-ＬＢＳ-Ｉは有意に癌の転移増殖を抑制していた。一方、Ｇｌｕ-ＬＢＳ-Ｉ投与群は０.４０６±０.１８６ｇであり、有意差は認められなかった。
【００２９】
実施例 ９
（免疫不全動物を用いた肺転移抑制試験）
実施例８の試験について、マウスを免疫不全動物スキッドマウス（Scid mouse）に換え、同様に肺転移増殖を評価した。
異種蛋白の連続投与による免疫の影響を考慮した本実施例のモデルで行なった結果を図８に示した。対照群であるＬｙｓ-ＬＢＳ-Ｉ投与群及びＧｌｕ-ＬＢＳ-Ｉ投与群の肺重量はそれぞれ、０.５２２±０.２３２ｇ、０.２１７±０.０１９ｇ、０.３２４±０.１５２ｇであり、同様の結果が得られた。
【００３０】
実施例 １０
（ヘパリンの結合画分の腫瘍転移増殖抑制効果）
実施例７の方法で調製した、ヘパリン結合画分、ヘパリン非結合画分の腫瘍増殖抑制効果を実施例８と同様の方法で評価した結果を図９に示した。対照群（生理食塩液）投与群の肺重量は０.６８９±０.２５０ｇであるのに対して、ヘパリン結合画分投与群の重量は０.２４８±０.０５ｇと、ヘパリン結合画分は有意に癌の転移増殖を抑制していた。一方、ヘパリン非結合画分投与群は０.５１５±０.２０８ｇであり、有意差は認められなかった。
【００３１】
実施例 １１
（ヘパリン結合画分のＮ末端アミノ酸配列の決定）
実施例７の方法で調製したヘパリン結合画分で１２.５％ＳＤＳ-ＰＡＧＥを行なった後、定法に従いメンブランにトランスブロットし、得られるバンドの部分を切り出し、Ｎ末端アミノ酸配列分析装置（Bio Applied社製）を用いて、そのＮ末端アミノ酸残基を調べた。その結果、当該物質はＮ末端にＬｙｓとＶａｌを有する２種類の蛋白質の複合体であり、その比率は１.５６〜２.３：１の割合であることが判明した。
【図面の簡単な説明】
【図１】  プラスミノーゲンのエラスターゼによる分解の工程を示す図である。
【図２】  プラスミノーゲンをプラスミンによって限定分解し、これをエラスターゼで処理した場合の分解の工程を示す図である。
【図３】  Ｇｌｕ-ＬＢＳ-Ｉの、ヘパリンをリガンドとしたイムノアフィニティークロマトグラフィーでの溶出パターンを示す図である。
【図４】  Ｌｙｓ-ＬＢＳ-Ｉの、ヘパリンをリガンドとしたイムノアフィニティークロマトグラフィーでの溶出パターンを示す図である。
【図５】  Ｌｙｓ-ＬＢＳ-Ｉのヘパリン高結合画分をＳＤＳ-ＰＡＧＥ（ゲル電気泳動）で解析した結果を示す図である。
【図６】  Ｌｙｓ-ＬＢＳ-Ｉのヘパリン結合性とｐＨとの関係を示す図である。
【図７】  Ｃ５７ＢＬ６／Ｊマウスを用いたルイス肺癌の肺転移増殖抑制試験に対するＬｙｓ-ＬＢＳ-Ｉの効果を示す図である。
【図８】  スキッド（ＳＣＩＤ）マウスを用いたルイス肺癌の肺転移増殖抑制試験に対するＬｙｓ-ＬＢＳ-Ｉの効果を示す図である。
【図９】  Ｌｙｓ-ＬＢＳ-Ｉヘパリン結合画分の腫瘍転移増殖抑制効果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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