(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛋白質をコードするcDNAを環状プラスミドに組み込み、この環状プラスミドを10mM Mg+2存在下でDNaseI処理を37度、5分間以内の条件で処理して無作為な位置で切断し、一カ所のみで切断された切断部位に、Asn-X-Ser、Asn-X-Thr、Y-Thr-Pro-Z-Pro及びSer-Glyからなる群（X、Y及びZは任意のアミノ酸）から選ばれる少なくとも１つの糖鎖結合アミノ酸配列をコードするDNA断片を導入する際に、そのDNA断片として、（１）糖鎖結合アミノ酸配列をコードするDNAの5’末端側に3n個のヌクレオチドを、3’末端側に3n個のヌクレオチドを付加したDNA断片、（２）糖鎖結合アミノ酸配列をコードするDNAの5’末端側に3n+1個のヌクレオチドを、3’末端側に3n+2個のヌクレオチドを付加したDNA断片、（３）糖鎖結合アミノ酸配列をコードするDNAの5’末端側に3n+2個のヌクレオチドを、3’末端側に3n+1個のヌクレオチドを付加したDNA断片、の混合物（上記（１）〜（３）においてnは整数）を用いることにより、糖鎖結合部位のフレームがそれを導入される蛋白質のフレームと一致するクローンを取得できるようにすることを特徴とする、蛋白質の一次構造上の無作為な一カ所に糖鎖結合部位が導入された変異体をコードするcDNAのライブラリーを作製する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、蛋白質の一次構造上の無作為な部位に任意のアミノ酸またはペプチドを導入した変異蛋白質の生産方法、当該変異蛋白質のライブラリーを作製する方法、および当該変異蛋白質をコードするcDNAのライブラリーを作製する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
アミノ酸の直鎖状重合体である蛋白質の一次構造の改変には、従来、化学的手法と並んで遺伝子工学的手法が用いられてきた。遺伝子工学的手法を用いての蛋白質構造の改変には、DNA構造上に塩基の置換、欠失、導入を生じせしめ、これを翻訳させることによって、アミノ酸の置換、欠失、導入をもたらすことが一般的に行われてきた。
しかし、このような変異の導入は、意図した特定の部位に、特定の変異をもたらすことしかできず、意図しない無作為な部位に導入することはできなかった。
【０００３】
また、従来の技術では、各種の変異蛋白質を作成するためには、それぞれをコードする cDNA を個別に作成、単離しなければならなかった。
近年、蛋白質構造活性相関の研究によって機能ドメインの解明が進み、任意の蛋白質の一次構造上に様々な機能を有する異種のペプチドを導入する技術が開発されたが、蛋白質の機能改変をもたらす最適な導入位置を決定するためには、試行錯誤によらなければならなかった。
【０００４】
さらに、近年、糖蛋白質の糖鎖が蛋白質部分の機能に与える重要性が理解されるに伴い、既知蛋白質の一次構造上に糖鎖を付加されうる配列を有するペプチドを導入して糖鎖付加を生じせしめる技術が開発されたが、該糖鎖付加配列アミノ酸の導入位置の最適化については試行錯誤によるしかなかった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、機能改変につながる構造活性相関情報の無い蛋白質、もしくは機能改変が予測できない蛋白質の構造改変を行って改変した機能を有する蛋白質を取得するために、一次構造上の無作為な部位に任意のアミノ酸またはペプチドを導入した蛋白質変異体ライブラリーを製造する技術を提供することにある。さらに、この変異体ライブラリーの中から、望ましい機能に変化した蛋白質を選択することにより、意図した機能改変蛋白質を得るためのアミノ酸またはペプチド導入部位の最適化を図る技術を提供することにある。
【０００６】
本発明の別の課題は、機能改変につながる構造活性相関情報の無い蛋白質、もしくは機能改変が予測できない蛋白質に糖鎖修飾を導入して改変した機能を有する蛋白質を取得するために、一次構造上の無作為な部位に糖鎖修飾アミノ酸またはペプチドを導入した糖鎖修飾蛋白質変異体ライブラリーを製造する技術を提供することにある。さらに、この糖鎖修飾変異体ライブラリーの中から、望ましい機能に変化した糖蛋白質を選択することにより、意図した機能改変糖蛋白質を得るための糖鎖修飾アミノ酸またはペプチド導入部位の最適化を図る技術を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、蛋白質をコードするcDNAを含む環状プラスミドを無作為な位置で一カ所切断し、この部位にアミノ酸またはペプチドをコードするDNAを導入することによって、翻訳された蛋白質の一次構造上の任意の位置にアミノ酸またはペプチドを導入する技術を完成した。これによって、蛋白質の一次構造上の様々な部位にアミノ酸またはペプチドが導入された変異体ライブラリーを構築することが可能となった。
【０００８】
本発明者らは、当該技術を分泌型単純蛋白質 secFGF-1 に適用し、各種糖鎖付加配列アミノ酸を導入することによって、secFGF-1を糖鎖修飾された蛋白質として生産することに成功した。本明細書において、「FGF」とは、繊維芽細胞増殖因子（fibroblast growth factor）をいう。
さらに、本発明者らは、当該ライブラリーより、機能改変 secFGF-1 を選択する技術をも同時に完成し、その結果、蛋白質への変異導入による機能改変をシングルステップで完成する手法を完成した。
本発明はこのような知見に基づいて完成されたものである。
【０００９】
すなわち、本発明は、蛋白質をコードするcDNAを環状プラスミドに組み込み、この環状プラスミドを無作為な位置で一カ所切断し、この切断部位に、アミノ酸またはペプチドをコードするDNAを導入することを特徴とする、蛋白質の一次構造上の無作為な部位にアミノ酸またはペプチドが導入された変異体をコードするcDNAのライブラリーを作製する方法を提供する。本明細書において、「蛋白質の一次構造上の無作為な部位にアミノ酸またはペプチドが導入された変異体をコードするcDNAのライブラリー」とは、蛋白質の一次構造上の無作為な部位にアミノ酸またはペプチドが導入された種々の変異体をコードするcDNAの集団をいい、これらのcDNAは、通常、プラスミドやウイルスなどのベクターに組み込まれた状態にある。
【００１０】
本発明のcDNAライブラリー作製法は、以下の工程：
（ａ）蛋白質をコードするcDNAを環状プラスミドに組み込む工程、
（ｂ）前記環状プラスミドを無作為な位置で一カ所切断する工程、
（ｃ）アミノ酸またはペプチドをコードするDNAを前記プラスミドの切断部位に導入するが、ここで、アミノ酸またはペプチドをコードするDNAの５'末端側および／または３'末端側に、追加のヌクレオチドを付加することにより、アミノ酸またはペプチドのフレームがそれを導入される蛋白質のフレームと一致するクローンを取得できるようにする工程、
（ｄ）前記アミノ酸またはペプチドをコードするDNAを導入されたプラスミドを宿主細胞に導入して、形質転換体を得る工程、
（ｅ）前記形質転換体から、プラスミドを回収する工程、
（ｆ）回収されたプラスミドから、アミノ酸またはペプチドをコードするDNAと蛋白質をコードするcDNAとを含む領域のDNAを切り出す工程、
（ｇ）切り出したDNAを発現ベクターに組み込む工程、
（ｈ）前記発現ベクターを宿主細胞に導入する工程、および
（ｉ）前記宿主細胞において、蛋白質変異体を発現させる工程
を含んでもよい。また、（ｃ）の工程で、アミノ酸またはペプチドをコードするDNAを、選択マーカー遺伝子と連結した状態で、プラスミドの切断部位に導入し、（ｄ）の工程で、選択マーカー遺伝子の発現に基づいて形質転換体を選別し、（ｆ）の工程で、選択マーカー遺伝子を除去するとよい。
【００１１】
また、本発明は、蛋白質の一次構造上の無作為な部位にアミノ酸またはペプチドが導入された変異体をコードするcDNAのライブラリーを作製し、このライブラリー中のcDNAがコードしている蛋白質変異体を発現させることを特徴とする、蛋白質変異体のライブラリーを作製する方法を提供する。本明細書において、「蛋白質変異体のライブラリー」とは、種々の蛋白質変異体の集団をいう。
【００１２】
さらに、本発明は、蛋白質の一次構造上の無作為な部位にアミノ酸またはペプチドが導入された変異体をコードするcDNAのライブラリーを作製し、このライブラリー中のcDNAがコードしている蛋白質変異体を発現させ、目的の蛋白質変異体を発現している細胞を選択し、この細胞に蛋白質変異体を産生させることを特徴とする、蛋白質変異体を生産する方法を提供する。本発明の蛋白質変異体生産法は、以下の工程：
（ａ）蛋白質に特異的な応答を示す細胞株を用意する工程、
（ｂ）蛋白質の一次構造上の無作為な部位にアミノ酸またはペプチドが導入された変異体をコードするcDNAを組み込んだ発現ベクターを前記細胞株に導入することにより、cDNAライブラリーを作製する工程、
（ｃ）前記応答を検出して、応答を示す細胞を選択する工程、および
（ｄ）選択した細胞を培養して、培養液および／または培養細胞から目的の蛋白質変異体を回収する工程
を含んでもよい。
【００１３】
変異を受ける蛋白質としては、いかなる蛋白質であってもよい。一例として、FGF ファミリーに属する因子およびその近縁の因子、ヘパリン結合性増殖因子ファミリーに属する因子およびその近縁の因子を挙げることができ、より具体的には、以下の（ａ）〜（ｆ）の蛋白質を挙げることができる。
（ａ）配列番号２(FGF-1a)のアミノ酸配列からなる蛋白質。
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは修飾されたアミノ酸配列からなり、FGF-1活性を有する蛋白質。
【００１４】
（ｃ）配列番号４(FGF-6/1a)のアミノ酸配列からなる蛋白質。
（ｄ）配列番号４のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは修飾されたアミノ酸配列からなり、FGF-6/1a活性を有する蛋白質。
（ｅ）配列番号６(secFGF-1)のアミノ酸配列からなる蛋白質。
（ｆ）配列番号６のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは修飾されたアミノ酸配列からなり、secFGF-1活性を有する蛋白質。
【００１５】
導入されるアミノ酸またはペプチドとしては、いかなるアミノ酸またはアミノ酸２個以上よりなるいかなるペプチドであってもよいが、特に、機能性ペプチドが、蛋白質機能の改変を期待できるので、好適である。
例えば、糖鎖の付加を受けることができるアミノ酸またはペプチドを導入することによって、糖鎖付加型変異体を作成することができる。
糖鎖の付加を受けることができるペプチドとしては、Asn-X-Ser, Asn-X-Thr, Y-Thr-Pro-Z-Pro, Ser-Gly (X, Y, Z は任意のアミノ酸）などが挙げられ、これらを含む多種多様なペプチドが含まれる。
【００１６】
糖鎖が硫酸化多糖またはグリコサミノグリカンである場合には、糖鎖の付加を受けることができるペプチドはプロテオグリカンコアタンパク質またはその一部分であるとよい。糖鎖がN-型糖鎖（アスパラギン結合型糖鎖）である場合には、糖鎖の付加を受けることができるペプチドがN-型糖鎖付加アミノ酸配列を含むペプチドであるとよい。糖鎖がO-型糖鎖（セリン・スレオニン結合型糖鎖）である場合には、糖鎖の付加を受けることができるペプチドがO-型糖鎖付加アミノ酸配列を含むペプチドであるとよい。
【００１７】
さらにまた、本発明は、上記の蛋白質変異体生産法により生産することができる新規な蛋白質変異体を提供する。蛋白質変異体としては、FGFファミリーに属する因子またはその近縁の因子の変異体、ヘパリン結合性増殖因子ファミリーに属する因子またはその近縁の因子の変異体などを挙げることができる。例えば、上記(a)〜(f)の蛋白質の変異体、具体的には、配列番号２５、２７、２９、３１、３３または３５のアミノ酸配列を含むFGF-1変異体を挙げることができる。
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１８】
【発明の実施の形態】
本発明において、アミノ酸またはペプチドを導入する蛋白質としてはいかなる蛋白質であってもよい。また、導入するアミノ酸またはペプチドとしてはいかなるアミノ酸またはペプチドであってもよい。
以下、具体例として、ヘパリン結合性増殖因子 FGF-1に糖鎖結合配列を含むペプチドを導入する例を示すが、本発明はこれに限定されるものではない。
ペプチドを導入する蛋白質としては、例えば、以下の（ａ）〜（ｆ）のいずれかの蛋白質であるとよい。
【００１９】
（ａ）配列番号２(FGF-1a)のアミノ酸配列からなる蛋白質。
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは修飾されたアミノ酸配列からなり、FGF-1活性を有する蛋白質。
（ｃ）配列番号４(FGF-6/1a)のアミノ酸配列からなる蛋白質。
（ｄ）配列番号４のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは修飾されたアミノ酸配列からなり、FGF-6/1a活性を有する蛋白質。
（ｅ）配列番号６(secFGF-1)のアミノ酸配列からなる蛋白質。
（ｆ）配列番号６のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは修飾されたアミノ酸配列からなり、secFGF-1活性を有する蛋白質。
【００２０】
配列番号２、４、および６のアミノ酸配列を有する蛋白質は、例えば、配列番号１、３、および５のDNA配列によりそれぞれコードされる。
これらの蛋白質は、FGFファミリーに属する因子のペプチド配列の他、糖鎖の付加を受けることができるペプチド配列やシグナルペプチドの配列を含んでいるものもある。
本明細書でいうヘパリン結合性蛋白質及びFGFは、配列表に記載されたcDNAが一次的に規定する蛋白質に加え、細胞から分泌される際にそのアミノ末端に存するシグナルペプチドと呼ばれる分泌の為のペプチド配列が切断された形の蛋白質を含む。
【００２１】
以下、具体例として、糖鎖結合配列を含むペプチドを導入する例を示すが、本発明はこれに限定されるものではない。
蛋白質に共有結合した糖鎖としてはヘパラン硫酸やコンドロイチン硫酸などの硫酸化多糖、グリコサミノグリカン、N-型糖鎖、およびO-型糖鎖を例示することができるが、これらに限定されることはない。
本明細書でいう硫酸化多糖とは、蛋白質の一次構造に存するセリン残基に結合したキシロースを起点として伸長する、もしくは後述のN-型糖鎖やO-型糖鎖の非還元末端側に伸長する、あるいは遊離状態で存在する多様な糖鎖構造を総称するものであり、その多くはアミノ糖とウロン酸（またはガラクトース）の二糖単位の繰り返し構造をもち、いくつかの水酸基あるいはアミノ基が硫酸基で置換されているものをいう。
【００２２】
また、グリコサミノグリカンとは、同様の構造を有するものであるが、硫酸基での置換がないものも含む。本明細書では、これらを総称して、硫酸化多糖等と記す。具体的な構造は、「糖鎖の細胞における運命」（永井・箱守・木幡編、講談社サイエンティフィック）などに記載されており、代表的な糖鎖配列を図１に示す。
本明細書でいうN-型糖鎖とは、蛋白質の一次構造に存するアスパラギン残基に結合したN-アセチルグルコサミンを起点として伸長する多様な糖鎖構造を総称するものである。具体的な構造は、「糖鎖の細胞における運命」（永井・箱守・木幡編、講談社サイエンティフィック）などに記載されており、代表的な糖鎖配列を図２に示す。
【００２３】
本明細書でいうO-型糖鎖とは、蛋白質の一次構造に存するセリン残基またはスレオニン残基に結合したN-アセチルガラクトサミンを起点として伸長する多様な糖鎖構造を総称するものである。具体的な構造は、「糖鎖の細胞における運命」（永井・箱守・木幡編、講談社サイエンティフィック）などに記載されており、代表的な糖鎖配列を図３に示す。
これらの硫酸化多糖等、N-型糖鎖およびO-型糖鎖は、その機能を発揮する限りにおいて、その糖鎖配列の一部に、付加、欠失、置換または修飾があってもよい。
【００２４】
本明細書において、「機能改変」とは、対象の蛋白質の活性が変化することを意味する。機能改変の例として、生理活性（増殖促進活性、分化促進活性等）の単純な改変のみならず、活性発現に要求される補因子の必要性の変化や、熱、酸またはアルカリに対する抵抗性の変化といった物理的安定性の変化、血中半減期の変化等によって示される生物学的安定性の変化などが挙げられる。
糖鎖付加配列を含むペプチドを分泌型FGF-1に導入し、糖鎖付加型FGF-1を製造する方法の一例を以下に説明する。
【００２５】
ペプチドを導入する蛋白質のcDNAは、DDBJ (日本DNAデータバンク）など遺伝子バンクに登録された配列から適当なプライマーを設計し、当該動物の当該組織の mRNA より RT-PCR （逆転写 PCR )を行うことによって、取得できる。
得られたcDNAを適当なプラスミドに結合することによって、蛋白質をコードする遺伝子の構築が完成する。cDNAを組み込むプラスミドとしては、宿主内で複製保持されるものであれば、いずれも使用することができるが、例えば大腸菌由来の pBR322、pUC18 、及びこれらを基に構築されたpET-3cなどを挙げることができる。
【００２６】
また、該蛋白質が、分泌シグナルを持たない非分泌型蛋白質である場合には、適当な分泌シグナルをその 5'-末端に付加することにより、分泌型蛋白質とすることができ、糖鎖付加経路にのせることができるとともに、精製、活性確認を容易にすることができる。適当な分泌シグナルとしては、例えば、典型的な分泌型糖蛋白質のアミノ末端を利用することができ、具体的には、マウス FGF-6のN-末端より40残基のアミノ酸などが挙げられる。
【００２７】
得られたプラスミドに、適当な処理を施すことにより、当該ベクターを任意の部位で一カ所切断することができる。この処理としては、 10 mM Mg2+存在下での DNase I処理や超音波処理などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。10 mM Mg2+存在下での DNase I処理を３７度、５分間以内とすると、プラスミド内での２カ所以上の切断の頻度を押さえることができる。
切断されたベクターは、例えばアガロース電気泳動等に供することにより、未切断ベクターと分離することができる。
【００２８】
導入するペプチドをコードするDNAは、アミノ酸翻訳コドン表に基づき、任意に合成することによって取得できる。あるいは、天然に存在する機能性ペプチドをコードする cDNA を前述の方法によって取得することによっても可能である。
例えば、N-型糖鎖付加を受けるアミノ酸配列としては、Asn-X-Thr、Asn-X-Ser（配列中、X は任意のアミノ酸である。) が挙げられ、これをコードするDNAとしては、例えば、配列番号７に示すDNA配列を含むDNAが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２９】
例えば、O-型糖鎖付加を受けるアミノ酸配列としては、X-Thr-Pro-X-Pro（配列中、X は任意のアミノ酸である。）が挙げられ、これをコードするDNAとしては、例えば、配列番号８に示すDNA配列を含むDNAが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
例えば、グリコサミノグリカン付加を受けるアミノ酸配列としては、 Ser-Glyの繰り返し配列が挙げられ、これをコードするDNAとしては、例えば、配列番号９に示すDNA配列を含むDNAが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００３０】
例えば、グリコサミノグリカン付加を受ける別のアミノ酸配列としては、プロテオグリカンのコアタンパク質の部分配列が挙げられ、これをコードするDNAとしては、例えば、配列番号１０に示すDNA配列を含むDNAが挙げられるが、これらに限定されるものではない。配列番号１０に示すDNA配列がコードするアミノ酸配列を配列番号１１に示す。
当該ペプチドをコードするDNAの両端、あるいは一端、あるいは内部に選択マーカー遺伝子（例えば、薬剤耐性遺伝子）を融合することにより、導入変異体の選別を容易にすることができる。このとき適当なアダプター配列を用いることができる。内部に選択マーカー遺伝子を融合する場合には、それを除去したのちセルフライゲーションを施すことにより、当該ペプチドをコードするDNA配列になるように設計することができる。
【００３１】
さらに、当該ペプチドをコードするDNAと選択マーカー遺伝子との融合遺伝子の両端、あるいは一端にその塩基数の和が３ｎ（ｎは整数）となる個数のヌクレオチドを付加したものの混合物を用いることにより、当該蛋白質の遺伝子の読み枠をそろえることも可能となる。
当該ペプチドをコードするDNAと選択マーカー遺伝子との融合遺伝子の断片を、一カ所で切断されたベクターと結合することにより、蛋白質遺伝子中へのペプチドをコードするcDNAの導入が完成する。この結合方法としては、例えばT. Maniatisら、Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, p. 239 (1982)に記載の方法などが挙げられ、具体的には、DNA リガーゼを用いる方法等、分子生物学で一般的に用いられる方法を適用することができる。
【００３２】
得られたベクターを適当な宿主に導入した後、選択薬剤存在下で培養することにより、当該遺伝子と結合したベクターを含む大腸菌のみが生菌として得られる。
宿主としては、大腸菌 DH5α株などを例示することができる。選択マーカー遺伝子としては、アンピシリン耐性遺伝子(Amp)、クロラムフェニコール耐性遺伝子(Cm)、テトラサイクリン耐性遺伝子(Tc)、カナマイシン耐性遺伝子(Km)等を例示することができる。
【００３３】
得られた形質転換体の混合物からプラスミドを回収し、制限酵素処理によって薬剤耐性マーカー遺伝子を除去した後、セルフライゲーションを生じせしめることにより、ペプチド導入蛋白質遺伝子ライブラリーの構築が完成する。
上記のようにして作製したプラスミドライブラリーから、分泌シグナル、導入ペプチドおよび被導入蛋白質をコードする塩基配列を含む領域（以下、「導入変異型蛋白質をコードする塩基配列を含む領域」と記す。) を切り出し、これを発現に適したベクター中のプロモーターの下流に連結することにより、発現型ベクターライブラリーを得ることができる。
【００３４】
上記の導入変異型蛋白質をコードする塩基配列を含む領域はその 5'-末端に翻訳開始コドンとしてのATG を有し、また3'-末端には翻訳終始コドンとしてのTAA
、TGA またはTAG を有してもよい。
さらに該コーディング領域にコードされている蛋白質を発現させるにはその上流にプロモーターを接続する。
本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。形質転換する宿主が枯草菌である場合には、SP01プロモーター、SP02プロモーター、penPプロモーターなど、宿主が酵母である場合には、PHO5プロモーター、PGK プロモーター、GAP プロモーター、ADH プロモーターなどが挙げられる。また、宿主が動物細胞である場合には、SV40由来のプロモーター、レトロウイルスのプロモーターが挙げられる。
【００３５】
上記の組み換えDNAを含むベクターを宿主細胞に導入することにより、該ベクターを保持する形質転換体を製造する。
宿主細胞としては、目的に適切なものならば、いかなるものであってもよい。例えば、糖鎖付加配列ペプチドの導入による糖鎖付加変異蛋白質の発現を目的とする際には、蛋白質への糖鎖付加経路を有するもの、例えば、酵母 (例えばPichia pasto ris, Saccharomyces cerevisiae) 、動物細胞（例えばCOS cell, CHO cell, BHK cell, NIH3T3 cell, BALB/c3T3 cell, HUVE cell, LEII cell)、昆虫細胞（例えば、Sf-9 cell 、Tn cell ）などを例示することができる。しかし、これらに限定されることはない。
【００３６】
上記の形質転換は、それぞれの宿主について一般的に行われている方法で行う。また、一般的でなくとも適用可能な方法ならばよい。例としては、宿主が酵母であればリチウム法その他の方法により作成したコンピータント細胞に組み換え DNAを含むベクターを温度ショック法あるいはエレクトロポレーション法により導入する。宿主が動物細胞であれば、増殖期等の細胞に組み換え DNAを含むベクターをリン酸カルシウム法、リポフェクション法あるいはエレクトロポレーション法により導入する。
【００３７】
このようにして得られた形質転換体を培地にて培養することにより、変異体蛋白質を産生させる。
形質転換体を培養する場合、培養に使用される培地としては、それぞれの宿主について一般的に用いられているものを用いる。または一般的でなくとも適用可能な培地ならば良い。例としては、宿主が酵母であればＹＰＤ培地などを用いる。宿主が動物細胞であれば、Dulbecco's MEMに動物血清を加えたものなどを用いる。
【００３８】
培養は、それぞれの宿主について一般的に用いられている条件で行う。また一般的でなくとも適用可能な条件ならばよい。例としては、宿主が酵母であれば約25〜37℃で、約12時間〜２週間行い、必要により通気や撹拌を加えることができる。宿主が動物細胞であれば約32〜37℃で、5% CO2、100%湿度の条件で約24時間〜２週間行い、必要により気相の条件を変えたり撹拌を加えることができる。
【００３９】
当該発現型ベクターライブラリーの中から、機能改変変異体を選択する際には、該蛋白質の性質に基づき、適当な方法を選択する。
例えば、FGF-1蛋白質にペプチドを導入し、増殖因子活性の変化した変異体を選択する際には、次に示す一連の手法を適用するが、これに限定されるものではない。
まず、FGF-1特異的な増殖を示す浮遊細胞株を取得し、これを宿主として発現型ベクターライブラリーを遺伝子導入し、これを以下の機能改変変異型 FGF-1選択系に供する。
【００４０】
FGF-1特異的な増殖を示す細胞株としては、FGFレセプターを遺伝子導入したマウス（pro B 細胞株） Ba/F3などが挙げられるが、これに限定されるわけではない。
上記の発現型ベクターライブラリーを遺伝子導入した細胞株を限界希釈し、ヘパリンおよびウシ胎児血清を含む液体培地中で培養すると、機能改変変異型 FGF-1分泌クローンはオートクラインもしくはパラクラインによって、コロニーを形成する。
当該クローンを選択後、RT-PCR等によって、発現 FGFの遺伝子配列を解析することによって、機能改変 FGF-1の構造すなわち導入ペプチドの至適部位を決定することができる。
【００４１】
得られた機能改変変異型 FGF-1分泌株から機能改変変異型 FGF-1を得るには、培養液中に放出されたものを、遠心分離後の上澄み液から直接回収できる。また、培養菌体あるいは細胞から抽出する場合には、培養後、ホモジェナイザー、フレンチプレス、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解によって菌体あるいは細胞を破壊することにより菌体外に目的のタンパク質を溶出させ、可溶性の画分から該タンパク質を得ることができる。また目的のタンパク質が不溶性画分に含まれる場合は菌体あるいは細胞を破壊後、遠心分離により不溶性画分を回収し、塩酸グアニジンなどを含む緩衝液などによって可溶性にして回収する方法も用いうる。このほか塩酸グアニジンなどのタンパク質変性剤を含む緩衝液によって直接菌体あるいは細胞を破壊し、菌体外に目的のタンパク質を溶出させる方法もある。
【００４２】
上記上澄み液から機能改変変異型 FGF-1を精製するには、公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行うことができる。これらの公知の分離、精製法としては、塩析、溶媒沈殿、透析、限外濾過、ゲル濾過、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー、等電点電気泳動などが使用されうる。さらに、多くのヘパリン結合性タンパク質については、ヘパリンセファロースを担体としたアフィニティークロマトグラフィー法が適用できる。
【００４３】
このようにして得られた標品は機能改変変異型 FGF-1の活性が損なわれない限りにおいて透析、凍結乾燥を行い、乾燥粉末とすることもできる。さらに、担体として血清アルブミンなどを添加して保存することは、標品の容器への吸着を防ぐのに有効である。
また、精製過程、あるいは保存過程での微量の還元剤の共存は、該標品の酸化を防ぐのに好適である。還元剤としては、βメルカプトエタノール、ジチオスレイトール、グルタチンなどが挙げられる。
本発明の機能改変変異型FGF-1は、化学的な方法でペプチドを蛋白質に導入することにより、製造することもできる。
以上、機能改変変異型FGF-1を例にとり本発明を説明したが、ヘパリン結合性タンパク質以外の蛋白質についても無作為な部位にアミノ酸またはペプチドを導入することができる。
【００４４】
【微生物の寄託】
本発明の機能改変変異型FGF-1をコードする遺伝子（配列番号２４、２６、２８、３０、３２および３４のDNA配列をそれぞれ有する。）を組み込んだプラスミドpMEXneoを含む大腸菌DH5α株は、工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託番号FERM P-17181、FERM P-17182、FERM P-17183、FERM P-17184、FERM P-17185およびFERM P-17186にて、平成１１年１月２８日に寄託された。
【００４５】
【実施例】
以下、実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に制限されるものではない。
〔実施例〕
[１]実施例の概要
以下、実施例として、N-型糖鎖付加を受ける配列を、繊維芽細胞増殖因子 FGF-1の一次構造上の無作為な位置に導入する方法を示し、本発明を具体的に説明する。
【００４６】
［２］ペプチド挿入変異体 secFGF-1 cDNAの構築
１）secFGF-1プラスミドの構築
1. FGF-1a/pBluescript II (KS+)プラスミドの作成
ヒト FGF-1 cDNAを、J. Exp. Med. (1992), 175 (4), 1073-1080に従い、ヒトcDNAライブラリーより単離した。単離されたヒト FGF-1 cDNAを鋳型とし、# 967 (5'-GCG TCG ACA GCG CTA ATT ACA AGA AGC CCA AAC TC-3')（配列番号１２）および # 630 (5'-CCG AAT TCG AAT TCT TTA ATC AGA AGA GAC TGG-3')（配列番号１３）をプライマーとして PCR反応を行った。特異的に増幅された 434塩基対のバンドを電気泳動により分離し、これを抽出後、 EcoR I および Sal Iで二重切断した。得られた、422 塩基対のバンドを分離抽出し、これを、EcoR I, Sal I で二重切断した pBluescript II (KS+) クローニングベクター (2934塩基対、Stratageneより購入) に挿入して、FGF-1a/pBluescript II (KS+) を得た。
FGF-1a/pBluescript II (KS+) を Aor51H I および Sal Iで順次消化し、得られた2626塩基対のバンドを分離抽出し、以下に示す連結反応に用いた。
【００４７】
2.マウス FGF-6<NQ> cDNA 断片の作成
マウス FGF-6 cDNAを、Oncogene (1990), 5(6), 823-31に従い、マウスcDNAライブラリーより単離した。単離したマウス FGF-6 cDNAを鋳型とし、# 105 (5'-GCG TCG ACC CAC CAT GTC-3')（配列番号１４）および # 124 (5'-GCG ATA TCC AGT AGC GTG CCT TGG GCG CG-3') （配列番号１５）をプライマーとして PCR反応を行った。特異的に増幅された 138塩基対のバンドを電気泳動により分離し、これを抽出後、EcoR Vおよび Sal Iで二重切断した。得られた、130 塩基対のバンドを分離抽出し、以下に示す連結反応に用いた。
【００４８】
3. secFGF-1 遺伝子の作成
マウス FGF-6の PCR産物の EcoR V/Sal I 断片、及び FGF-1a/pBluescript II (KS+)の Aor51H I/Sal I 断片を DNA連結反応に供し、secFGF-1/pBluescript II (KS+)ベクターを得た。さらにこれを、EcoR Iおよび Sal Iで二重切断し、得られた、540 塩基対のバンドを分離抽出した。これを、EcoR I, Sal I で二重切断した pMEXneo発現ベクター (5916塩基対、Dr. M. Barbacid, Mol. Cell. Biol. (1989) 9(1), 24-33)に挿入して、この工程の最終産物である secFGF-1 遺伝子を得た。この発現型ベクターは、配列番号５の塩基配列を含む。
【００４９】
２）DNase I による一カ所切断
上記により得られた sec FGF-1/pBluescript II (KS+) プラスミド 10 ugを 10 mM MgCl2を含む溶液中で、DNase I (400 pg)で 37 度 5分間処理した。反応生成物を 1.4 %アガロースゲル電気泳動により分離し、3474塩基対の位置に泳動される DNA断片を回収、精製し、以下に示す連結反応に用いた。
【００５０】
３）NLS-Cm断片の作成
NLS-Cm断片はフレーム１、２、３の３通りを作成した。これは、導入ペプチドのフレームがそれを導入される蛋白質のフレームと一致するクローンを多数取得するためである。
【００５１】
1.  NLS-Cmフレーム１の作成
クロラムフェニコール耐性遺伝子を含むプラスミド pCmを鋳型として、# 3n+1F (5'-gcgcgcgtttaaacttaagcatcggcacgtaagaggttccaactt-3')（配列番号１６）、および# 3n+1R (5'-atatatatcccgggcttaagttacgccccgccctgccactca-3')（配列番号１７）をプライマーとして PCR反応を行った。特異的に増幅された741塩基対のバンドを電気泳動により分離し、これを抽出後、Pme I および  Sma I で二重切断した。得られた、720塩基対のバンドを分離抽出し、NLS-Cmフレーム１を得て、以下に示す連結反応に用いた。
【００５２】
2.  NLS-Cmフレーム２の作成
pCm を鋳型として、# 3n+2F (5'-atatatcgcgaacttaagcatcggcacgtaagaggttccaac-3')（配列番号１８）、および# 3n+2R (5'-atatatatgccggcttaagttacgccccgccctgccactca-3')（配列番号１９）をプライマーとして PCR反応を行った。特異的に増幅された739塩基対のバンドを電気泳動により分離し、これを抽出後、Nae I および Nru Iで二重切断した。得られた、720塩基対のバンドを分離抽出し、NLS-Cmフレーム２を得て、以下に示す連結反応に用いた。
【００５３】
3.  NLS-Cmフレーム３の作成
pCm を鋳型として、# 3nF (5'-gcgcgcgttaacttaagcatcggcacgtaagaggttccaactt-3')（配列番号２０）、および# 3nR (5'-atataagcgcttaagttacgccccgccctgccactca-3')（配列番号２１）をプライマーとして PCR反応を行った。特異的に増幅された734塩基対のバンドを電気泳動により分離し、これを抽出後、Hinc II および Aor51H I で二重切断した。得られた、717塩基対のバンドを分離抽出し、NLS-Cmフレーム３を得て、以下に示す連結反応に用いた。
【００５４】
４）ライゲーション
DNase I処理した secFGF-1/pBluescript II (KS+)プラスミド、及び、NLS-Cmフレーム１あるいはNLS-Cmフレーム２あるいはNLS-Cmフレーム３を DNAリガーゼを用いた DNA連結反応に供した。
反応生成物を用いて、大腸菌 DH5αを形質転換し、これを 30 ug/ml のクロラムフェニコール、 50 ug/ml のアンピシリンを含む LB 培地中で18時間、培養した。
【００５５】
増殖した大腸菌からプラスミドを回収、精製し、制限酵素 Afl II で切断した。反応生成物を 1.4 %アガロースゲル電気泳動により分離し、4194あるいは4191塩基対の位置に泳動される DNA断片を回収、精製し、DNA リガーゼを用いた DNA連結反応を行うことによりセルフライゲーション（自己結合）させた。これを用いて、再び大腸菌 DH5αを形質転換し、 50 ug/ml のアンピシリンを含む LB 培地中で18時間、培養した。
【００５６】
増殖した大腸菌のうち６種を選択し、その大腸菌からプラスミド DNA (A, B, C, D, E及びF)を回収、精製し、そのヌクレオチド配列をサイクルシークエンス法によって解読した。その結果、N-型糖鎖付加を受ける配列をコードする DNAが導入された secFGF-1 の構造（配列番号２４、２６、２８、３０、３２および３４の DNA配列をそれぞれ有する。）が明らかになった。これらプラスミドに含まれる糖鎖付加配列導入 secFGF-1 cDNAを以下に示すように発現ベクターへの組み込みに用いた。なお、配列番号２４、２６、２８、３０、３２および３４の DNA配列配列がコードするアミノ酸配列を配列番号２５、２７、２９、３１、３３および３５にそれぞれ示す。
以上の操作の概略を図４に示す。
【００５７】
５）発現ベクターへの組み込み
得られたプラスミドA、B、C、D、E及びFを、EcoR Iおよび Sal Iで二重切断し、アガロースゲル電気泳動上、552あるいは549塩基対のバンドを分離抽出した。これを、EcoR I、 Sal Iで二重切断した pMEXneo発現ベクター (5916塩基対) に挿入して、G、H、I、J、K及びLを得た。
【００５８】
[３]挿入配列の機能性の確認
secFGF-1の一次構造上の無作為な位置に導入されたN-型糖鎖付加を受ける配列が機能していることを以下の方法により確認した。N-型糖鎖付加を受ける配列をコードする DNAが導入された secFGF-1 発現ベクターG、H、I、J、K及びLを、マウスpro B 細胞株Ba/F3 に遺伝子導入し、ジェネテイシン存在下で培養することによって遺伝子導入細胞を選択し、単一クローンを得た。これらの細胞抽出液を調製し、発現された蛋白質を含むこの抽出液の一部をN-型糖鎖を特異的に切断する酵素であるN-グリカナーゼで消化した。未処理のものと消化物をそれぞれSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動、イムノブロットにより解析した。図５に示すように、６種のベクターの発現産物であるそれぞれの蛋白質が全て N-グリカナーゼにより低分子量化したことから、N-型糖鎖による修飾を受けたことが確認された。図５中、(-)は未処理、(+)は酵素処理後の各機能改変変異型 FGF-1のイムノブロットを示す。白三角は secFGF-1 の蛋白質骨格のサイズを示す。１はFERM P-17185、２はFERM P-17182、３はFERM P-17181、４はFERM P-17183、５はFERM P-17186、６はFERM P-17184のcDNA配列の発現産物である。N-グリカナーゼ処理によりsecFGF-1の蛋白質骨格のサイズに低分子量化したことから、すべての機能改変変異型 FGF-1が N-型糖鎖修飾を受けたことが確認された。
【００５９】
［４］機能改変変異型 FGF-1の選択
１）FGF 特異的標的細胞株の作成
FGFレセプター（サブタイプ R1c）の発現ベクター (Dr. D.M. Ornitzより供与、J. Biol. Chem. (1996) 271(25), 15292-15297) を、マウスpro B 細胞株Ba/F3 (理化学研究所  細胞開発銀行 RCB No. 0805)に遺伝子導入し、ジェネテイシン存在下で培養することによって遺伝子導入細胞(FGF-R1c/BaF3細胞) を選択した。IL-3非存在下、10 ng/ml FGF-1、10 ug/mlヘパリン、10 %牛胎児血清を含む RPMI 1640培地中で増殖する単一クローンを用いて以下の実験に用いる。
【００６０】
２）発現ベクターへの組み込み
得られたプラスミドを、EcoRIおよびSalIで２重切断し、アガロースゲル電気泳動上、552あるいは549塩基対のバンドを分離抽出した。これを、EcoRI、SalIで２重切断したpMEXneo発現ベクター(5916塩基対)に挿入して、NLS secFGF-1/pMEXneoを得た。
【００６１】
３）当該標的細胞株への遺伝子導入
得られた NLS sec FGF-1/pMEXneoベクターをエレクトロポレーション法によって FGF-R1c/BaF3細胞に遺伝子導入し、100 ug/ml ヘパリン、10 %牛胎児血清を含む RPMI 1640培地中で培養する。14日後、コロニーを形成したクローンを選択し、このクローンが生産、分泌する機能改変変異体 secFGF-1 を、以下の解析に用いる。
【００６２】
４）機能改変変異型 secFGF-1 の遺伝子の取得
当該クローンを通常培地（IL-3源として 10 % WEHI培養上清、10 %牛胎児血清を含む RPMI 1640培地）中で培養し、グアニジンイソチアネート法によって、その total RNAを回収する。これをランダムヘキサマーをプライマーとする逆転写反応に供し、得られた cDNA を鋳型として #956 (5'-TCTTCCgATAgACTgCgTCg-3')（配列番号２２）及び #957 (5'-CATTCTAgTTgTggTTTgTCC-3') （配列番号２３）をプライマーとして PCR反応を行う。この反応生成物を EcoR I、 Sal Iで二重切断し、EcoR I、 Sal Iで二重切断した pMEXneoベクター (5916塩基対) に挿入して、NLS-secFGF-1/pMEXneoを得た。その DNA配列をサイクルシークエンス法によって解読し、機能改変変異型 FGF-1の構造が得られた。そのDNA配列は配列番号３０および３２に示すものであった。
【００６３】
［３］機能改変変異型 FGF-1の生産
１）遺伝子導入と大量生産
配列番号３０および３２に示すDNA配列を含む発現ベクターをリポフェクション法によってCHO-K1細胞（チャイニーズハムスター卵巣細胞 K1 亜株、理化学研究所  細胞開発銀行 RCB 0285)に遺伝子導入し、ジェネテイシン存在下で培養することによって遺伝子導入細胞を選択した。得られる細胞を培養皿ほぼいっぱいになるまで増やし、培地を無血清培地に交換することによって物質生産量を増大させた。２日毎に培地を交換し、得られた馴化培地は低速遠心分離した後、その上清を４℃で保存した。
【００６４】
２）機能改変変異型 FGF-1の精製
機能改変変異型 FGF-1分泌細胞の馴化培地にヘパリンセファロースビーズを加え、４℃で２時間以上攪拌した。低速遠心によって沈降するビーズを回収し、生理的リン酸緩衝液（ PBS : phosphate buffered saline, pH 7.4）で十分に洗浄後、2.5 M NaClを含む PBSによってヘパリン固定化ビーズに結合した蛋白質を溶出した。さらにこの溶出液に蒸留水を加え塩濃度を低下させた後、再び、ヘパリン親和性アフィニテイービーズを充填した高速液体クロマトグラフィーに供し、NaClの濃度勾配によって機能改変変異型 FGF-1を溶出した。
【００６５】
〔試験例１〕
FGFレセプター発現細胞株FGF-R1c/BaF3に対するDNA合成促進活性
FGF-R1c/BaF3の培養液から、IL-3を除去後、直ちに機能改変変異型 FGF-1および10 ug/mlヘパリン、10 %ウシ胎児血清を含む培地を加える。３６時間培養後、放射標識されたチミジンを４時間取り込ませ、この間に DNA中に取り込まれた放射能によって新たに合成された DNA量とする。
【００６６】
〔試験例２〕
ヒト血管内皮細胞の増殖促進におけるヘパリン依存性
HUVEC（ヒト臍帯由来血管内皮細胞）は 15 % 血清存在下でもＦＧＦなどの増殖因子が欠乏すると細胞周期が停止する。このような状態においたHUVEC(Exp. Cell Res. (1987) 172, 92-100に従って調製した。) に機能改変変異型 FGF-1を添加し、18時間後、放射標識されたチミジンを６時間取り込ませて、この間にDNA 中に取り込まれた放射能によって新たに合成された DNA量とする。
【００６７】
[試験例３]
細胞表面レクチン結合活性
糖鎖を認識する細胞表面膜タンパク質に対する結合活性を評価した。非還元末端ガラクトースを認識するマクロファージレクチン (ML) の cDNA の発現ベクター（J. Biochem., (1992) 111, 331-336に従い、マウス腹腔マクロファージ cDNA ライブラリーより単離し、pMEXneoベクターに組み込んだ。）をFGFレセプターを持たない Ba/F3細胞に遺伝子導入し、ジェネテイシン存在下で培養することによって遺伝子導入細胞を選択した (ML/BaF3 細胞)。この ML/BaF3細胞を標識された機能改変変異型 FGF-1と混合し、インキュベーション後、遠心により細胞を回収し、培地で洗浄し、細胞に結合している機能改変変異型 FGF-1の量を測定した。特異的に結合している量は、ラクトースを含む培地によって解離する量として評価した。その結果、機能改変変異型FGF-1 は、糖鎖の効果として細胞表面に結合する量が有為に多いことが示された。
【００６８】
[試験例４]
肝細胞に対する結合活性、細胞内移行活性と細胞増殖促進活性
糖鎖を認識する性質のある膜タンパク質を細胞表面に有する細胞に対する結合活性、細胞内移行活性および増殖促進活性を評価した。肝細胞は、その細胞表面に FGFレセプターと、非還元末端ガラクトースを認識するアシアロ糖蛋白質レセプターをもつ。肝細胞及びその類縁細胞に機能改変変異型 FGF-1を添加し、試験例３と同様に結合量を測定した。その結果、機能改変変異型 FGF-1は、糖鎖の効果として細胞表面に結合する量が有為に多いことが示された。また細胞内に取り込まれた量を測定した。その結果、機能改変変異型 FGF-1は、糖鎖の効果として細胞内に取り込まれる量が有為に多いことが示された。また細胞を標識されていない機能改変変異型 FGF-1と混合し、18時間後、細胞増殖をあらわすDNA合成量を放射標識されたチミジンの取り込みによって評価した。その結果、機能改変変異型 FGF-1は、糖鎖の効果として細胞増殖促進活性が有為に変化していることが示された。
【００６９】
【発明の効果】
本発明により、蛋白質一次配列上の無作為な位置にペプチドを挿入する技術が提供された。この技術は、蛋白質に人為的に変異を導入する際の、導入部位の至適化に有効な手段となる。これによって、試行錯誤的な変異導入を行わずとも、系統的な変異体の作成が可能となる。
【００７０】
【配列表】
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【００７１】
【配列表フリーテキスト】
配列番号７は、アミノ酸配列Asn-leu-Serをコードするヌクレオチド配列を示す。
配列番号８は、アミノ酸配列Ala-Thr-Pro-Ala-Proをコードするヌクレオチド配列を示す。
配列番号９は、アミノ酸配列Ser-Gly-Ser-Glyをコードするヌクレオチド配列を示す。
配列番号１０は、プロテオグリカンのコアタンパク質の部分配列をコードするヌクレオチド配列を示す。
【００７２】
配列番号１２は、#967プライマーのヌクレオチド配列を示す。
配列番号１３は、#630プライマーのヌクレオチド配列を示す。
配列番号１４は、#105プライマーのヌクレオチド配列を示す。
配列番号１５は、#124プライマーのヌクレオチド配列を示す。
配列番号１６は、#3n+1Fプライマーのヌクレオチド配列を示す。
配列番号１７は、#3n+1Rプライマーのヌクレオチド配列を示す。
【００７３】
配列番号１８は、#3n+2Fプライマーのヌクレオチド配列を示す。
配列番号１９は、#3n+2Rプライマーのヌクレオチド配列を示す。
配列番号２０は、#3nFプライマーのヌクレオチド配列を示す。
配列番号２１は、#3nRプライマーのヌクレオチド配列を示す。
配列番号２２は、#956プライマーのヌクレオチド配列を示す。
配列番号２３は、#957プライマーのヌクレオチド配列を示す。
【００７４】
配列番号２４は、FERM P-17181に導入されている変異型FGF-1遺伝子のヌクレオチド配列を示す。
配列番号２６は、FERM P-17182に導入されている変異型FGF-1遺伝子のヌクレオチド配列を示す。
配列番号２８は、FERM P-17183に導入されている変異型FGF-1遺伝子のヌクレオチド配列を示す。
配列番号３０は、FERM P-17184に導入されている変異型FGF-1遺伝子のヌクレオチド配列を示す。
配列番号３２は、FERM P-17185に導入されている変異型FGF-1遺伝子のヌクレオチド配列を示す。
配列番号３４は、FERM P-17186に導入されている変異型FGF-1遺伝子のヌクレオチド配列を示す。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、代表的硫酸化多糖・グリコサミノグリカン糖鎖の構造を示す。
【図２】図２は、代表的N-型糖鎖の構造を示す。G はガラクトース、GNはN-アセチルグルコサミン、M はマンノース、F はフコース、Sia はシアル酸を示す。
【図３】図３は、代表的O-型糖鎖構造を示す。G はガラクトース、GalNAcはN-アセチルガラクトサミンを示す。
【図４】図４は、ペプチド挿入変異体secFGF-1 cDNAの構築を示す。
【図５】図５は、FERM P-17185、FERM P-17182、FERM P-17181、FERM P-17183、FERM P-17186およびFERM P-17184に導入された変異型FGF-1のcDNAの発現産物の未処理（−）、N-グリカナーゼによる処理後（＋）のイムノブロットを示す。
【図１】
0003790810.tif 000043
【図２】
0003790810.tif 000044
【図３】
0003790810.tif 000045
【図４】
0003790810.tif 000046
【図５】
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