(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
均一ホモポリオキシム組成物であって、前記組成物に存在するホモポリオキシム分子が、複数の少なくとも３個のオキシム結合を介して複数の第二有機分子に結合した第一有機ベースプレート分子を含んでなり、前記オキシム結合は各前記第二有機分子上の直交反応基と前記ベースプレート分子上の相補直交反応基と反応させることにより形成され、かつ前記直交反応基及び前記相補直交反応基がアルデヒド基、ケト基及びアミノオキシ基からなる群から選択され、前記第二有機分子において前記ベースプレート分子上の少なくとも３個の相補直交反応基が同一の化学構造を有し、前記ベースプレート分子及び前記第二有機分子がアミノ残基、糖残基、核酸残基及び／又は脂質から形成された均一ホモポリオキシム組成物。
【請求項２】
均一ヘテロポリオキシム組成物であって、複数の少なくとも３個のオキシム結合を介して複数の第二有機分子に結合した第一有機ベースプレート分子を含んでなり、前記オキシム結合は各前記有機第二分子上の直交反応基と前記ベースプレート分子上の相補直交反応基と反応させることにより形成され、かつ前記直交反応基及び前記相補直交反応基がアルデヒド基、ケト基及びアミノオキシ基からなる群から選択され、前記ベースプレートに結合する前記第二有機分子の少なくとも１つが他のベースブレート分子と結合する第２の化学構造を有する他の前記第二有機分子と異なる第１の化学構造を有し、前記ベースプレート分子及び前記第二有機分子がアミノ残基、糖残基、核酸残基及び／又は脂質から形成された均一ヘテロポリオキシム組成物。
【請求項３】
各オキシム結合が、同じ配向にある請求項１に記載の均一ホモポリオキシム組成物。
【請求項４】
前記ベースプレート分子に結合し、且つ金属キレート剤、検出可能マーカー、親油性アンカー及びオキシム形成基とは異なる化学反応性直交基からなる群から選択される第三有機分子をさらに含んでなる請求項１又は２に記載のポリオキシム組成物。
【請求項５】
前記第二有機分子が治療薬又は検出可能マーカーである請求項１又は２に記載のポリオキシム組成物。
【請求項６】
免疫原性である請求項１又は２に記載のポリオキシム組成物。
【請求項７】
細胞をイメージングする方法であって、前記細胞を検出可能量の請求項４又は５に記載のポリオキシム組成物と、イメージング剤又は検出可能マーカーと標的細胞との間の錯体の形成に都合の良い適当な条件下で接触させることを含んでなる細胞をイメージングする方法。
【請求項８】
１）オキシム結合を形成でき、アルデヒド基、ケト基及びアミノオキシ基からなる群から選択される少なくとも３個の同一の直交反応基をその中に有する第一有機ベースプレート分子を得る工程と、
２）前記ベースプレート分子上の前記直交反応基とオキシム結合形成でき、アルデヒド基、ケト基及びアミノオキシ基からなる群から選択される相補直交反応基をその中に有する第二有機分子を得る工程と、
３）前記ベースプレート分子を、前記第二有機分子と前記ベースプレート分子上の前記複数の直交反応基との間の反応をオキシム結合形式が可能な条件下で完了させるのに十分な量の前記第二有機分子と接触させる工程と、
４）ポリオキシム生成物を単離する工程と、
を含んでなる方法により製造した実質的に均一なポリオキシム組成物。
【請求項９】
１）オキシム結合を形成でき、アルデヒド基、ケト基及びアミノオキシ基からなる群から選択される少なくとも３個の同一の直交反応基をその中に有する第一有機ベースプレート分子を得る工程と、
２）前記ベースプレート分子上の前記直交反応基とオキシム結合形成でき、アルデヒド基、ケト基及びアミノオキシ基からなる群から選択される相補直交反応基をその中に有する第二有機分子を得る工程と、
３）前記ベースプレート分子を、前記第二有機分子と前記ベースプレート分子上の前記複数の直交反応基との間の反応をオキシム結合形式が可能な条件下で完了させるのに十分な量の前記第二有機分子と接触させる工程と、
４）ポリオキシム高分子を単離する工程と、
を含んでなる実質的に均一な高分子の製造方法。
【請求項１０】
１）オキシム結合形成のできる少なくとも３個の直交反応基をその中に有する第一有機ベースプレート分子を得る工程と、
２）前記ベースプレート分子上の相補直交反応基とオキシム結合形成でき、アルデヒド基、ケト基及びアミノオキシ基からなる群から選択される直交反応基をその中に有する第二有機分子を得る工程と、
３）前記ベースプレート分子上の前記相補直交反応基とオキシム結合形成でき、アルデヒド基、ケト基及びアミノオキシ基からなる群から選択される直交反応基を中に有する第三有機分子を得る工程と、
４）前記ベースプレート分子と前記第二有機分子とを、オキシム結合形成できる条件下で混合する工程と、
５）前記ベースプレート分子と前記第三有機分子とを、オキシム結合形成できる条件下で、工程４）の前記混合と同時かそれに引き続いて混合する工程と、
６）ヘテロポリオキシム生成物を分離する工程と、
を含んでなる方法により製造されたヘテロポリオキシム組成物。
【請求項１１】
１）オキシム結合を形成でき、アルデヒド基、ケト基及びアミノオキシ基からなる群からそれぞれ独立して選択される少なくとも３個の直交反応基をその中に有する第一有機ベースプレート分子を得る工程と、
２）前記ベースプレート分子上の相補直交反応基とオキシム結合形成でき、アルデヒド基、ケト基及びアミノ−オキシ基からなる群から選択される直交反応基をその中に有する第二有機分子を得る工程と、
３）前記ベースプレート分子上の前記直交反応基とオキシム結合形成でき、アルデヒド基、ケト基及びアミノ−オキシ基からなる群から選択される直交反応基をその中に有し、かつ前記第二有機分子とは異なる化学構造を有する第三有機分子を得る工程と、
４）前記ベースプレート分子と前記第二有機分子とを、オキシム結合形成できる条件下で混合する工程と、
５）前記ベースプレート分子と前記第三有機分子とを、オキシム結合形成できる条件下で、工程４）の前記混合と同時かそれに引き続いて混合する工程と、
６）ヘテロポリオキシム生成物を分離する工程と、
を含んでなる平行アセンブリーによるヘテロポリオキシム組成物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
序  文
技術分野
本発明は、一般的にポリオキシムの均一調製及びヘテロポリオキシムの調製であって、前記ポリオキシムが複数のオキシム結合を含有する規定された構造の高分子であるポリオキシムの調製、並びにこのような分子のアセンブリーに用いられる試薬及び方法に関する。
背景
従来から、ポリペプチド等の複雑なポリマーを製造するのに２つの方法が使用されている。一つの方法は、比較的制御されない重合反応によるものであり、モノマーサブユニットが反応して大きなポリマーが生成する。この方法を用いて、ポリペプチド及びプラスチック（例えば、ポリエチレン又はナイロン）等の多分散高分子が、それぞれアミノ酸又は小さな脂肪族若しくは芳香族有機分子等のモノマー残基から生成できる。このような多分散高分子は比較的容易に製造できるが、重合高分子生成物は、分子レベルでは均一ではなく、長さが異なり且つ組成さえも異なるポリマーの混合物、例えば、ランダムコポリマーである。さらに、このような多分散調製において生成した同族体が類似しているために、単一の高分子量生成物を純粋な形態で得ることは困難又は不可能である。
複雑な高分子を得るのに利用される第二の方法は、可逆的に保護されたモノマーの連続アセンブリー法である。この手法を使用して、規定された典型的には線状の構造体の生成物を得ることができる。残念なことに、この方法は、製造できる分子のサイズ及びより決定的には分子の複雑さが制限される。例えば、約５０〜８０アミノ酸残基よりも大きい規定されたポリペプチド又はタンパク質の合成は、この技術の及ぶところではない。予め精製された保護ペプチド（一度に２種）の縮合は、大きな保護断片が不溶であることから制限される。その結果、例えば、均一線状ポリペプチドの合成は、アミノ酸残基の上限が約１００に制限される。
Ｍｕｔｔｅｒ等（Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９８９）５：１３〜２１）は、分岐鎖ポリペプチドを、固相ペプチド合成中に保護アミノ酸を合成保護樹脂結合ペプチド鋳型に段階的にカップリングすることにより合成した。可溶性鋳型アセンブリー合成タンパク質を得るには、脱保護・開裂を必要とした。また、段階的固相ペプチド合成を用いて、Ｔａｍ及びＺａｖａｌａ（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．（１９８９）１２４：５２〜６１）は、複抗原ペプチドと称されるペプチド分岐を有する分岐鎖「リシンツリー」鋳型を構築し、続いてＨＦ脱保護及び開裂して可溶性粗製形態のものを得ている。
ポリペプチド合成に使用される保護基は一般的に保護可能分子の溶解度を減少させるので、未保護ポリペプチドを縮合する能力により、保護前駆体を用いた場合に直面する溶解性の問題が改善されるだけでなく、最終生成物を得るのに必要とされる過酷な脱保護法の使用が最小限ですむ。しかしながら、未保護前駆体を使用すると、一見克服するのが困難に思える位置特異性の問題が生じる。したがって、化学選択的結さつを介して未保護断片の位置特異的縮合を使用する試みがなされた。
化学選択的結さつでは、接合しようとする前駆体分子上の特異的部位に存在する反応性基の相補対を使用する必要がある。チオール基及びブロモアセチル基等の相補化学反応性を有する反応性基を使用すると、位置特異的方法において結合が形成される。例えば、チオール型化学選択的結さつを使用して、多抗原性ペプチドが調製された。過酷な脱保護法及び段階的固相合成中の近接した成長ペプチド結合手間で生じる可能性のある立体障害により生じる不純な生成物の形成を回避する試みにおいて、Ｄｒｉｊｆｈｏｕｔ及びＢｌｏｅｍｈｏｆｆ（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．（１９９１）３７：２７〜３２）は、チオール型化学選択的結合を使用し、分岐した「オクタアミノリシンツリー」ペプチドを合成し、この脱保護アミノ基を延長して保護スルフヒドリル基（Ｓ−アセチルメルカプトアセチル）を含有させ、続いて適当に変更したスルフヒドリル含有抗原性ペプチドに結合させた。しかしながら、得られた生成物は高速液体クロマトグラフィーにより明らかにされる特性が悪く、十分に特性決定がなされなかった。より最近では、チオールケミストリーを使用して、二断片縮合において、完全合成線状官能ＨＩＶプロテアーゼ類似体が調製された（Ｓｃｈｎｏｌｚｅｒ及びＫｅｎｔ（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：２２１〜２２５）。
残念なことに、チオールケミストリーは、完全には特異的ではない。例えば、チオール基はジスルフィド結合混合に関与することが周知である。さらに、ブロモアセチル及びマレオイル等のアルキル化剤は、チオール基以外の求核アミノ酸基と反応することがある。例えば、ブロモアセチルは、メチオニン残基のチオエーテル側鎖と反応するので、所望の生成物の均一性及び／又は設計の複雑さが制限される。
したがって、安定な結さつ結合を有する容易に合成される規定された構造の構造体の調製、特に均一調製並びに容易、迅速及び温和な合成；実質的に定量的な収量；設計の汎用性；及び多種多様な生化学種の化合物を用いた構成への適用を提供できるこれらの高分子の調製を構成するための方法が必要とされている。さらに、所望の活性、溶解性、コンフォメーション及び他の所望の特性が設定でき；ペプチド又はオリゴヌクレオチド等の成分が非線状多価形態で提供され；より高い結合親和性及び相互作用の特異性が提供され；そして均一高分子の場合には、均一調製が可能である規定された構造の高分子、特に均一な高分子も必要とされている。さらに、本明細書で説明する利点を有するペプチド又はオリゴヌクレオチド等の高分子のライブラリーも必要とされている。本発明によれば、これらのニーズが満足され且つそれらに関連した利点も得られる。
発明の概要
本発明は、容易に合成される均一高分子の均一調製及び容易に合成される不均一高分子であって、規定された構造を有し且つ複数の安定なオキシム結合を含有する高分子、並びにオキシム形成を介する化学選択的結さつによるこのような高分子の迅速且つ特異的アセンブリーのための試薬及び方法に関する。
規定された構造の高分子は、複数の第二有機分子（ＣＯＳＭ）への複数のオキシム結合（好ましくは少なくとも３個）を有する他分子（「ＣＯＳＭ」と称する）が結合する有機分子（「ベースプレート」と称する）を含んでなる。ホモポリオキシム高分子の場合、ＣＯＳＭは互いに同一である。一実施態様では、オキシム結合は、配向が同じである。ヘテロポリオキシム高分子の場合、ベースプレートが複数の第二有機分子に結合しており、ベースプレートに結合したこれら第二有機分子の少なくとも一つが他の結合第二有機分子とは異なる。また、これらの分子を構成するための２種の試薬も提供される：複数のオキシム形成反応性基と、オキシム結合形成においてベースプレート上に存在するオキシム形成直交反応性基と相補の直交反応性基を有する第二有機分子とを有するベースプレート。本発明の目的のための第二有機分子は、相補直交特異的活性分子（「ＣＯＳＭ」）とも称し、以下でさらに定義する。オキシム結合は、オリゴマー又は高分子サブユニットを接合する加水分解的に安定な手段を提供する。これらの種々の反応性基を、本明細書では、反応性において互いに相補であり、且つ形成される高分子の前駆体に存在する他の官能基とは反応しないことを意味する「直交」基と称する。
さらに、本発明によれば、化学選択的にベースプレート上の複数の直交反応性基の各々を複数の第二有機分子のひとつに存在するその相補反応性直交基に対してオキシム結合形成を介して結合させることを含んでなる平行自己アセンブリーによるこれらの分子の調製方法も提供される。ベースプレート及び第二有機分子は、好ましくはアミノ酸残基から形成される。他の実施態様では、ベースプレート及び／又は第二有機分子は、糖残基、核酸残基及び／又は脂質から形成するか、糖残基、核酸残基及び／又は脂質をさらに含んでなる。好ましいベースプレートは、固相ペプチド合成（「ＳＰＰＳ」）又は核酸若しくは炭水化物含有ベースプレートに関してそれと等価の合成等の制御された有機化学的合成により調製される。炭水化物含有ベースプレートは、好ましくは天然若しくは組み換え源から単離するか、又は酵素的に調製することが好ましい。単離ペプチド又はタンパク質（例えば、組み換え手段により調製された）の均一調製は、ベースプレートの実施態様を作製するのにも適当である；しかしながら、このような分子は、複数のオキシム形成性直交反応基を得るための続いての位置特異性変更と適合する残基が含有でき且つさらに位置特異性変更後に規定の構造及び顕著な均質性が維持されるように設計するか選択しなければならない。したがって、続いて糖残基の化学的又は酵素的酸化により変更される不均一抗体糖タンパク質調製は、本発明に適当なベースプレートの実施態様ではない。
さらに、抗原及び免疫抗原としての使用を含むこれらのポリオキシム化合物の使用方法も提供される。また、これらの組成物を含んでなる医薬組成物を含む組成物が提供される。また、本発明のポリオキシムを提供するキット又はそれらの合成用試薬が提供される。
本発明のポリオキシム化合物は、比較的複雑な合成的に調製された高分子である。いままで調製された最も大きな種は、１９５アミノ酸残基を含有する約２０ｋＤ複合体である：ＮＨ２ＯＣＨ２ＣＯ−ＥＬＧＧＧＰＧＡＧＳＬＱＰＬＡＬＥＧＳＬＱＫＲ−ＯＨ（配列番号：１０）とＯ＝ＣＨ−ＣＯ−Ｇｌｙ３−〔Ｌｙｓ（ＣＯＣＨＯ）〕７−Ｇｌｙ−ＯＨ（配列番号：９）との間に形成されたホモポリオキシムオクタオキシム。この開示からみて当業者に明らかなように、本発明により提供されるこれらの化合物を調製する迅速、特異的、高収率、温和且つ汎用性のある方法を用いることにより、より大きく且つより複雑な分子が、均一且つ規定さこれた形態で容易に得ることができる。
【図面の簡単な説明】
第１図は、ヘキサ−ＴＣＴＰ−ポリオキシムの構造を示す。図示されているように、ＴＣＴＰ−ＣＯＳＭがベースプレート構造体におけるリシン残基の５つのε−位置の各々及びベースプレート構造体のＮ末端に結合している。
第２図は、オキシム反応開始３時間後に採取した試料のＲＰ−ＨＰＬＣ中に得られるクロマトグラムを示す。ピーク１は未結合ＴＣＴＰ−ＣＯＳＭを含有する画分を示し、ピーク２はヘキサ−ＴＣＴＰ−ポリオキシム生成物を含有する画分を示す。
第３図は、オキシム反応開始１８時間後の試料のＲＰ−ＨＰＬＣ中に得られたクロマトグラムである。ピーク１は未結合ＴＣＴＰ−ＣＯＳＭを含有する画分を示し、ピーク２はヘキサ−ＴＣＴＰ−ポリオキシム生成物を含有する画分を示す。
第４図は、ヘキサ−ＴＣＴＰ−ポリオキシムの移動を示すポリアクリルアミドゲルの写真である。レーン１はタンパク質標準であり、レーン２はヘキサ−ＴＣＴＰ−ポリオキシムである。
第５図は、ヘキサ−ＴＣＴＰ−ポリオキシムのエレクトロスプレーイオン化質量分光光度法により得られた質量スペクトルである。縦軸は検出器応答（％ＦＳ）のフルスケール％を示し、横軸は質量／電荷比（Ｍ／Ｚ）である。ピーク上の数は、いくつかの正の電荷（プロトン）を有する各高分子量種のＭ／Ｚ値を示す。例えば、Ｍ／Ｚ＝１０３７．６でのピークは、１０プロトン（Ｚ＝１０）を有する。対応種の質量（Ｍ）を計算すると、（１０）Ｘ（１０３７．６）＝１０３７６、−１０（１０プロトンの場合）＝１０３６６ａｍｕとなる。全ての信号から計算した平均質量は、１０３６７．４１±１．２８である。理論値は１０３６５．４９である。Ｔｒｉｏ２／３０００ＥＳＩデータシステムを使用した（測定値１０３６７．４１±１．２８、理論値１０３６５．４９）。
第６図（ＡＯＡ−１２−ｍｅｒを用いて作製した１２−ｍｅｒヘキサオキシムの安定性）は、ｐＨ２．１で４８時間（ａ）、ｐＨ４．６で２４時間（ｂ）又はｐＨ７．０で３０．５時間（ｃ）のインキュベーションに続いて行ったヘキサ−ＴＣＴＰ−ポリオキシムのＲＰ−ＨＰＬＣ中に得られたクロマトグラムである。矢印は、不完全ペンタ−、テトラ−等のＴＣＴＰに関する予測溶出時間を示す；部分生成物は観察されない。
第７図は、ヘキサ−ＰｅｐＣ−ポリオキシムの構造を示す。図示されているように、ＰｅｐＣ−ＣＯＳＭがベースプレート構造体におけるリシン残基の５つのε−位置の各々及びベースプレート構造体のＮ末端に結合している。
第８図は、オキシム反応開始１８時間後に採取した試料のＲＰ−ＨＰＬＣ中に得られるクロマトグラムを示す。ピーク１は未結合ＰｅｐＣ−ＣＯＳＭを含有する画分を示し、ピーク２はヘキサ−ＰｅｐＣ−ポリオキシム生成物を含有する画分を示す。
第９図（ＰｅｐＣ−ヘキサオキシムのＥＳＩ−ＭＳ）は、ヘキサ−ＰｅｐＣ−ポリオキシムのエレクトロスプレーイオン化質量分光光度法により得られた質量スペクトルを示す。
第１０図（ＰｅｐＣ−オクタオキシムのＥＳＩ−ＭＳ）は、オクタ−ＰｅｐＣ−ポリオキシムのエレクトロスプレーイオン化質量分光光度法により得られた質量スペクトルを示す。
第１１図は、ヘキサ−ＴＣＴＰ−ポリオキシムの構造を示す。図示されているように、ＣＯＳＭがベースプレート構造体におけるリシン残基の５つのε−位置の各々及びベースプレート構造体のＮ末端に結合している。第１図に示した構造体と比較した時のオキシム結合の立体化学的な面に注目されたい。
第１２Ａ図、第１２Ｂ図、第１２Ｃ図及び第１２Ｄ図は、４種のオキシム生成物のエレクトロスプレーイオン化質量分光光度法により得られた質量スペクトルと分子量の計算値を示す。第１２Ａ図は、ベースプレートテレフタルアルデヒドとペプチドＮＨ2ＯＣＨ2ＣＯ−Ｎｌｅ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−（Ｄ−Ｐｈｅ）−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−ＯＨとの間で形成されたモノオキシムのスペクトルである（α−メラニン細胞刺激ホルモン（「ＭＳＨ」）の合成類似体）。第１２Ｂ図は、ベースプレートテレフタルアルデヒドとペプチドＮＨ2ＯＣＨ2ＣＯ−Ｎｌｅ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−（Ｄ−Ｐｈｅ）−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−ＯＨとの間で形成されたホモポリオキシムのスペクトルである。第１２Ｃ図は、ベースプレートテレフタルアルデヒドとペプチドＮＨ2ＯＣＨ2ＣＯ−Ｎｌｅ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−（Ｄ−Ｐｈｅ）−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−ＯＨとＮＨ2ＯＣＨ2ＣＯ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−ＯＨ（配列番号：４）との間で形成されたヘテロポリオキシム（ヘテロダイマー）のスペクトルである。第１２Ｄ図は、ベースプレートテレフタルアルデヒドとペプチドＮＨ2ＯＣＨ2ＣＯ−Ｎｌｅ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−（Ｄ−Ｐｈｅ）−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−ＯＨとＮＨ2ＯＣＨ2ＣＯ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−ＯＨ（配列番号：１３）との間で形成されたヘテロポリオキシム（ヘテロダイマー）スペクトルである。
発明の詳細な説明
定義
本発明の目的のために、以下の用語を、次のように定義する。
「相補直交化学的反応性基」とは、一対の化学的反応性基の一つであって、対の相補メンバーと化学選択的に反応するものとして定義される。例えば、アミノ−オキシ−アセチル（「ＡＯＡ」）とグリオキシリル（「ＧＸＬ」）は、反応してオキシム結合を形成する相補直交化学的反応性基である。
用語「化学選択的に結さつされた」とは、相補直交化学反応性基間で生じる特異的な結さつを示す。
「直交」とは、存在する他の基又は適用される他のケミストリーを損なうことなく使用できる条件又は基を意味する。したがって、例えば、本発明の面からは、アミノ−オキシ−アセチル基は直交である。
「相補直交特異的活性分子」（「ＣＯＳＭ」）は、相補直交化学反応性基及び特異的活性分子又はその一部分を含有する分子である。ＣＯＳＭは、部分的には、ベースプレート構造体上に存在する相補直交化学反応性基に対して化学選択的結さつできる相補直交化学反応性基を有することにより定義される。本発明の目的のためには、ＣＯＳＭの相補直交化学反応性基は、オキシム結合形成反応性対の一員でなければならない。用語「特異的活性」とは、ＣＯＳＭも、その相補直交化学反応性とは別に、規定された生物学的、化学的又は物理的活性を有することを示す。ＣＯＳＭに関する規定された固有活性は、ベースプレートと反応して最終高分子生成物を形成する前には、ＣＯＳＭ構造体自体から直ぐには明らかにならないことがあることは勿論明らかなことである。用語「ＣＯＳＭ」は、それ自体第二有機分子の性質を限定することを意味せず、それと相互に置き換え可能に使用されることを意味する。さらに、第二有機分子に関連するいずれの特異的活性も、ベースプレートに結合後に活性化できるか実現できる。
「特異的生物活性」とは、その構造により特定の分子又は基に付与される生物活性を意味する。特異的生物活性は、特定分子又は基に対して唯一であるか、特定分子又は基が属する系のメンバーと関連させることができる。
当業者は、特異的生物活性も、特定の分子又は基として同じ特異的な生物活性を有する構造的に異なるか無関係な分子又は基と関連させることができることが分かるであろう。例えば、抗イディオタイプ抗体は、たとえ抗イディオタイプ抗体と抗原が構造的に異なっているとしても、抗イディオタイプ抗体が育成される抗体を育成するのに使用される抗原と同じ特異的生物活性を有することができる。
「特異的化学的反応」とは、その構造により特定の分子又は基に付与される化学活性を意味する。特異的化学活性は、特定分子又は基に対して唯一であるか、特定分子又は基が属する系のメンバーと関連させることができる。また、特異的化学活性は、特定の分子又は基と同じ特異的化学活性を有する少数の構造的に異なるか関連のない分子又は基と関連させることができる。
「平行アセンブリー」とは、一種類の直交化学反応性基を有する第二有機分子（ＣＯＳＭ）がベースプレート構造体上の相補直交化学反応性基に化学選択的に結さつする時に生じる多部位制御反応を意味する。
抗原性分子は、動物有機体を刺激して抗体を産生することができ且つこのように産生された抗体と特異的に結合することができる物質、しばしばＲＮＡ又はペプチドを包含する。抗体−抗原複合体は、抗原と抗体の特異的相互作用により形成される分子集合体を意味する。
抗体は、抗原の投与に反応して動物有機体に形成され且つ前記抗原と特異的に結合できるグロブリン型の糖タンパク質である。これらも、免疫グロブリンと称される。抗体断片は、それらの抗体又はハプテンと選択的に結合するある種の能力を保持できる。抗原又はハプテンと結合できる能力は、抗原−結合アッセイにより測定される（例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ編集、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ニューヨーク（１９８８）参照；引用することにより本明細書の開示の一部とされる））。このような抗体断片には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’及び（Ｆａｂ’）2などがあるが、これらには限定されない。天然抗体は、動物から単離されるか、又は動物若しくはハイブリッド動物（ハイブリドーマ）細胞系から単離されるものである。
ハプテンは、免疫応答の免疫生成物と反応するが、キャリアに複合して完全抗原を形成しなければそれ自身では免疫応答を誘発することができない抗原の部分を意味する。金属キレートは、ハプテンの一例である。
本明細書で使用される用語「相補決定領域」（ＣＤＲ）とは、抗原又はハプテン結合部位の形成に寄与する三次元ループ構造体を形成する抗体の可変軽鎖及び可変重鎖領域についてのアミノ酸配列を意味する。
治療薬は、動物に投与した時に動物における疾病を予防若しくは軽減するか、疾病状態を抑止するか軽減する分子である。治療薬には、抗腫瘍抗生物質、抗ウイルスタンパク質、放射性同位体、医薬又はトキシンなどがあるが、これらには限定されない。
多価分子は、分子間の相互作用のための複数の結合部位を有する分子である。多価分子の一例は、複数抗原を含有する多価免疫抗原である。
「薬学的に許容されるキャリア」とは、リン酸緩衝食塩水；水；又は油／水エマルジョン等のエマルジョン等の標準的な医薬キャリアのいずれかであって種々の湿潤剤を含むことができるものを意味する。
「投与される」とは、被検者に効果的な量の化合物又は医薬組成物を提供することを意味する。動物への投与方法は当業者において周知であり、経口、静脈内、トランスダーマル及び非経口投与などがあるが、これらには限定されない。投与は、他の治療の過程全体を通して連続的又は断続的に実施することができる。投与の最も効果的な手段及び量を決定する方法は当業者に周知であり、治療用化合物又は組成物、治療目的及び治療される動物又は患者により異なる。
ペプチド又はタンパク質は、天然及び組み換えペプチド又はタンパク質だけでなく、同様な生物又は化学活性を有することができる点で十分に天然ペプチド又はタンパク質に等しい他の非天然型のペプチド又はタンパク質を意味する。当該技術分野において公知のように、ペプチドは、非天然又は非タンパク原性アミノ酸残基から形成できる。さらに、当該技術分野において周知のように、アミノ酸残基は、非アミド結合を介して接合されることができる。また、ペプチド又はタンパク質は、どちらかの末端に生体内でのペプチド又はタンパク質の分解を防止したり最小限に抑える保護基を含有できる。
本発明の「均一ポリオキシム組成物」は、（ランダムコポリマーのように、個々の分子が少なくとも長さ及びしばしば特異的構造が異なる典型的な有機ポリマーとは対照的に）ポリオキシム分子の実質的に全てが同一の化学的構造を有する化学組成物を意味する。また、このような組成物は、ポリオキシムの個々の分子の実質的に全てが互いに同一であるので「自己同一」組成物とも称せられる。ここで、「実質的に全て」とは、総ベースプレート分子の少なくとも８０％がベースプレートに結合した同一ＣＯＳＭを同数有することを意味する。１００％に至るまでの９０％、９５％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％等の純度が高くなるほど、「実質的に全て」の好ましい意味のが強くなる。本発明の説明の残りの部分から明らかなように、単一ベースプレート上のＣＯＳＭのヘテロポリオキシムの全ては同一とは限らないが、それでも組成物は本明細書で定義される均一である。本発明から容易に理解されるように、均一ポリオキシム組成物は、ホモポリオキシム又はヘテロポリオキシムを含んでなることができる。例えば、段階アセンブリーにより、各工程で異なるＣＯＳＭを導入してヘテロポリオキシムの均一組成物を形成できる。ポリオキシムの不均一調製は、例えば、ポリオキシムペプチドライブラリーを形成する際又は同族列の分子を含んでなるＣＯＳＭ混合物を結合する際に、オキシム化工程中に異なるＣＯＳＭの混合物を使用することにより意図的に生じさせることができる。
本明細書で使用される「高分子」とは、分子量少なくとも２０００、好ましくは少なくとも５０００、更に好ましくは少なくとも１０，０００である（生物源の分子だけでなく無機成分を有する有機分子も含む）有機分子を意味する。
説明
本発明によれば、複数の安定なオキシム結合を含んでなる規定された構造の新規な多価分子、これらの分子の均一組成物並びにオキシム形成を介した化学選択的結さつによる迅速且つ特異的アセンブリー用試薬及び方法が提供される。本発明では、これらの分子は、一般的にポリオキシムと称する。ホモポリオキシムとヘテロポリオキシムの両方が提供される。
ホモポリオキシム化合物は、複数の第二有機分子への複数（好ましくは少なくとも３個）のオキシム結合を有する有機ベースプレート分子を含んでなる。
一実施態様では、全てのオキシム結合は、配向が同じである。ヘテロポリオキシム化合物は、複数の第二有機分子への複数のオキシム結合（好ましくは少なくとも３個）を有する有機ベースプレート分子を含んでなる；ここで、ベースプレートに結合した第二有機分子の少なくとも一つは、化学組成がベースプレートに結合した別の第二有機分子とは異なる。ベースプレートは、複数の第二有機分子のいずれか一つに存在する相補直交反応性基と化学選択的に反応できる複数のオキシム形成直交反応性基を有する有機分子である。ポリオキシムの均一組成物は、第二特異的活性分子上の相補直交反応性基に対するベースプレート上の相補直交反応性基のオキシム結合形成を介した反応により形成される。本発明の好ましい実施態様では、ベースプレート構造体は、アミノ酸鎖基から形成される主鎖を有するペプチドである。当該技術分野において公知のように、非天然アミノ酸又はＤ−光学異性体又は置換（例えば、Ｎ−置換）アミノ酸、β−アミノ酸等を含有するペプチドは、化学合成できる；一般的でないアミノ酸を含有するペプチドは、組み換え手段により調製できるが、通常化学合成又は後発現変更により製造される。ペプチドベースプレート主鎖は、ペプチド合成中のオキシム形成性相補直交反応基への変更に適当な側残基を有するアミノ酸残基を含んでなる。ＣＯＳＭ上の相補化学反応性基とオキシム結合を形成できる化学反応性基は、ベースプレートにおける好ましくは少なくとも３個のアミノ酸残基に存在する。アミノ酸残基は、オキシム形成性化学反応性基を含有する変更モノマーとしてペプチド結合生成中に組み込むか、ペプチド結合の形成後に変更してこのような基を含有させることができる。オキシム形成性基を担持するのに好ましい一般的な残基は、特異的に保護された形態で入手でき、常法で容易に変更でき且つ安定な誘導体を形成できるものでよい。好ましくは、極めて容易にアシル化され且つ還元的アルキル化により変更できるリシン及びオルニチン残基並びにアルキル化又はジスルフィド形成により変更できるシステイン残基である。これよりも好ましさが低い残基には、セリン、トレオニン、ヒスチジン、メチオニン（アルキル化できる）、チロシン（アルキル化できるが、そのアシル誘導体があまり安定でない）及びトリプトファン（アルキル化又はアシル化できる）がある。また、残基は、例えば、間隔、電荷、溶解性等の所望の物理的又は生物学的特性を付与するように選択してもよい。また、これらのアミノ酸の同族体（Ｌ異性体よりもむしろＤ異性体）、置換誘導体（例えば、Ｎ−置換）及びβ−アミノ酸も、オキシム形成性基を担持するための好ましい残基である。
ヘテロポリオキシムの場合、ベースプレート上の各化学選択的に結さつされたＣＯＳＭは、互いに独立して同一であっても異なっていてもよい。他の実施態様は、糖残基、核酸残基及び／又は脂質から全体的又は部分的に形成されるベースプレート及び／又はＣＯＳＭを含有する。本発明の開示から明らかなように、ほとんどいずれのオリゴ又は高分子構築ブロック残基も、ＣＯＳＭ又はベースプレートの形成に使用できる。本発明の開示から当業者に明らかなように、これらの化合物の迅速、特異的、高収率、温和及び汎用性のある方法を用いることにより、より大きく且つより複雑な分子を容易に得ることができる。
一実施態様では、ベースプレート又はＣＯＳＭは、組み換え法により設計・調製されるか、天然源から単離され、且つアルデヒド等のオキシム形成性相補直交反応性基は、選択的酵素触媒逆タンパク質分解によるポリペプチドのＣ末端上に位置特異的に形成されるか、温和な酸化によりＮ末端セリンかトレオニンに位置特異に形成される（例えば、Ｇｅｏｇｈｅｇａｎ等（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．（１９９２）３：１３８〜１４６）、Ｇａｅｒｔｎｅｒ等（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．（１９９２）３：２６２〜２６８）、ＥＰ２４３９２９及びＷＯ９０／０２１３５参照；引用することにより本明細書の開示の一部とされる）。多価ベースプレートとして使用する場合、組み換え又は天然ペプチドの均一調製物は、二量体又は四量体に生じるような複数のＣ又はＮ末端を有して、直交反応性基の特異的形成が容易にされることが好ましい。例えば、Ａ鎖をＢ鎖に共有結合して有するインシュリン類似体（各鎖がＮ末端セリン（又はトレオニン）を有する）は、位置選択的酸化により二価アルデヒドベースプレートに転化できる。さらなる実施態様では、Ｃ末端は、酵素触媒逆タンパク質分解により変更してトリ−又はテトラ−アルデヒドベースプレートを形成できる。このようなベースプレートは、固相合成ペプチドベースプレートに対して少なくともサイズ及び複雑さの面で利点を有する。本明細書において教示されているように、大きな柔軟性を持って、当業者は特異的に配置された相補反応性基を有する所望の配列、構造及び作用のベースプレート及びＣＯＳＭを設計し且つ得ることができる。ポリオキシム及びこれらの合成方法は、Ｒｏｓｅ（Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．「Ｆａｃｉｌｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ」（１９９４）１１６：３０〜３３；引用することにより本明細書の開示の一部とされる）に記載されている本発明者等の研究室において開発された。
好ましいベースプレート及びＣＯＳＭ構造体は典型的にはアミノ酸残基から形成されるが、他の実施態様には、糖残基、核酸残基及び／又は脂質から形成されるものなどがある。
ベースプレート又はＣＯＳＭ構造体がペプチドである場合には、端末化学基は、通常アミノ基及びカルボキシル基である。当業者は、これらの末端基を反応性又は非反応性にすることができることが分かるであろう。基は化学的に保護され且つ脱保護か、本明細書で教示されている方法及び当該技術分野において公知の方法で変更することにより反応性とすることができるので、非反応性基は、非反応性であってもよい。また、ベースプレートの末端化学基は、ベースプレート構造体内の残基に共有結合して環状ベースプレート構造体を形成してもよい。
本発明の一実施態様によれば、オキシム結合形成できる一相補反応性基がアミノオキシ基又はアルデヒド基であるベースプレート構造体が提供される。アミノ−オキシ−アセチル（「ＡＯＡ」）又はＯＨＣ−ＣＯ−又はグリオキシリル（「ＧＸＬ」）等のアルデヒド基が好ましい。実際には、アルデヒド基（又はアミノオキシ基）を意図する構造体に接続するさらなる構造体（式中Ｘ）を使用できる：例えば、ＯＣＨ−Ｘ−Ｎｌｅ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−（Ｄ−Ｐｈｅ）−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−ＯＨ（式中、Ｘは単純に−ＣＯ−であっても、より精巧な構造体であってもよい；又はＮＨ2−Ｏ−Ｘ−Ｎｌｅ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−（Ｄ−Ｐｈｅ）−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−ＯＨ（式中、Ｘは単純に−ＣＨ2−ＣＯ−であっても、より精巧な構造体であってもよい）。
アルデヒド基がベースプレート上にある時には、アルデヒド官能に隣接する追加の接続構造体に存在する基は重要ではない；しかしながら、これらの基には、アルデヒドとその相補アミノオキシ基との間のオキシム結合の形成を妨害しないことが要求される。これらの基は、アルデヒドよりも優先してアミノオキシ基と反応しても、反応に対する立体障害を生じても、反応性基を失活してもいけない。接続基は、存在する他の官能と反応しないが、もしそうするように設計するのであれば、望ましくない方法（即ち、生成物の均一性又は活性を減少させる方法）を用いないようにする。
接続基は、好ましくは置換又は非置換脂肪族若しくは芳香族基、例えば、フェニル若しくはＣ1〜Ｃ10アルキレン成分、Ｃ1〜Ｃ10アルキル基又はそれらの組み合わせ、又はアミノ酸鎖（例えば、可撓性ヒンジ又はループ配列（例えば、Ａｒｇｏｓ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９０）２１１：９４３〜９５８参照））、又はヌクレオチド鎖、糖鎖、脂質鎖、又はそれらの組み合わせを含んでなる非反応性基を表し、ヘテロ原子を含んでいてもよい。
アミノオキシ基がベースプレート上にある時には、アミノオキシ官能に隣接する追加の接続構造体に存在する基は重要ではない；しかしながら、これらの結合基には、アミノオキシとその相補アルデヒド基との間のオキシム結合の形成を妨害しないことが要求される。これらの基は、アミノオキシ基よりも優先してアルデヒド基と反応しても、反応に対する立体障害を生じても、反応性基を失活してもいけない。
ベースプレート上に存在するアルデヒド官能又はアミノオキシ官能に隣接した追加の接続構造に存在する官能基についての上記の説明は、ＣＯＳＭ上の接続基にも適用される。
ポリオキシムを抗原性又は免疫原性目的に使用することを意図する場合、強力に免疫原性でない接続基を選択することは当業者には明らかなことである。ポリオキシムを結合目的で使用することを意図する場合には、好ましい接続基は、結合、結合活性、生成物の安定性又は溶解性等の性質を高めるか、少なくともそれらを妨害しないものである。
接続基は、オキシム結合の加水分解安定性を高めるように選択できる。オキシムの加水分解安定性は、それらの構造に影響される；データから、オキシム安定性は次の順序で増加することが明らかである：−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ2−ＣＨ＝Ｎ−Ｏ−ＣＨ2＜−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ＝Ｎ−Ｏ−ＣＨ2−＜−Ｃ6Ｈ4−ＣＨ＝Ｎ−Ｏ−ＣＨ2−。
また、接続基の特徴は、ベースプレートとＣＯＳＭが糖、核酸又は脂質残基から調製される時に適用される。
また、本発明のベースプレートは、任意にＣＯＳＭとオキシム結合を形成できない残基を含んでなる。このような残基は、相補反応性基間に大きなＣＯＳＭを収容するに十分な間隔を提供することができる。さらに、このような残基は、適当に位置させた時には、公知である他の所望の特徴を提供できるか、そのような残基の配列、〔例えば、所望の三次コンフォメーション、コンフォメーション拘束、サイデッドネス（ｓｉｄｅｄｎｅｓｓ）（例えば、両親媒性らせん構造の形成による）、基礎骨格（例えば、エンジニアードポリペプチドミニボディにより提供される）、増加した溶解度、親油性、生物活性又は作用を含むがこれらには限定されない〕に関して決定できる。このような化学的に不活性な残基としては、例えば、アミノ酸、糖及びヌクレオチドがあるが、これらには限定されない。所望の官能性を有する本発明のベースプレートの実施態様の設計に適用できる複合分子の二次及びさらには三次構造体を予測する種々の方法については、当業者が十分認識するところである。
ベースプレート構造体がペプチドを含んでなる場合、ペプチドベースプレート構造体が溶液においてペプチドのアミノ酸配列に部分的に依存するコンフォメーションを有することは、当業者には分かることであろう。このような情報は、特定の課題のためにペプチドベースプレート構造体の最適アミノ酸配列を決定するのに有効である。例えば、α−らせん構造体を形成することが予想されるペプチドベースプレート構造体は、相補直交化学反応性基を含有するアミノ酸残基がα−らせんの同じ面から延びるように合成できる。ＣＯＳＭとの化学選択的結さつに続いて、各ＣＯＳＭの特異的活性領域は、同じ方向に延びるであろう。溶液において特異的ペプチドにより付与される他の種類のコンフォメーションについては当業者の知るところであり、隣接ＣＯＳＭ間の所望の間隔を含む所望の三次構造を有するポリオキシムを合成できる。例えば、好ましい合成ペプチドベースプレート、ペプチド設計法及び他の合成上考慮すべき点については、Ａｌｔｍａｎｎ及びＭｕｔｔｅｒ（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９０）２２：９４７〜９５６）及びそれに引用されている文献に一部分例示されている。
Ｔａｍ及びＺａｖａｌａ（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．（１９８９）１２４：５２〜６１；引用することにより本明細書の開示の一部とされる）により説明されている固相ペプチド合成により形成される「リシンツリー」は、本明細書に記載のように改良してオキシム形成性相補直交反応性基（同じ配向でもよい）を含有するようにするなら、ベースプレート形成に使用するのに適当である。また、ベースプレート構造体は、本明細書に記載のように改良してオキシム形成性相補直交反応性基（同じ配向でもよい）を含有するようにするなら、例えば、Ｆｌｏｅｇｅｌ等（Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ（１９９２）３２：１２８３〜１３１０（引用することにより本明細書の開示の一部とされる）により記載されている「鋳型アセンブリー合成タンパク質」（「ＴＡＳＰ」）に関して使用されるような鋳型から形成できる。アルデヒド又はアミノオキシ末端官能化カルボロドは、二価ベースプレートか、ＣＯＳＭとしての役割りを果たす。別個の長さ及び規定された構造の均一分子として調製されるカルボロドは、特異的末端基官能で変更できる（Ｍｏｏｒｅ、（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ３６１：１１８〜１１９及びそこに引用されている文献参照；引用することにより本明細書の開示の一部とされる）。
ベースプレートをアミノ酸から形成する時には、ベースプレート構造体のペプチド配列は通常の固相ペプチド合成（「ＳＰＰＳ」）により合成でき、ペプチドをまだ固相に結合したままで、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル等の活性形態におけるＢｏｃ−アミノオキシ酸（Ｂｏｃ−ＡＯＡ）を、未完成ペプチド鎖に付加できる。例えば、ベースプレート構造体は、５リシン残基等の５個の反応性基を有するペプチドから構成できる。Ｂｏｃ−ＡＯＡＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルは、リシン残基のε−アミノ基の各々だけでなく、もし左が未保護の状態ならばＮ末端αアミノ基と反応して、この例ではε−ＡＯＡ−ペンタリシン配列及びもしＮ末端αアミノ基を意図的にアシル化したならばＮ末端にＡＯＡ基を含有するであろうベースプレート構造体を形成できる。
また、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル等の活性形態におけるＢｏｃ−Ｓｅｒ（ベンジル）−ＯＨ又はＢｏｃ−Ｓｅｒ（ｔ−ブチル）−ＯＨを使用して、ベースプレート構造体上に相補直交化学反応性基を形成できる。Ｂｏｃ−セリン（ベンジル）Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルは、５リシン残基のε−アミノ基だけでなく、もし所望ならばＮ末端αアミノ基と反応して、ε−Ｓｅｒ−ペンタリシン及びＮ末端α−Ｓｅｒ基を含有する前駆体ベースプレートを形成する。ｐＨ７での過ヨウ素酸塩等の温和な酸化剤による前駆体ベースプレートの処理により、ε−Ｓｅｒ−ペンタリシン及びもし存在するならばα−Ｓｅｒ−Ｎ末端が、それぞれε−ＧＸＬ−ペンタリシン及びα−ＧＸＬ−Ｎ末端に転化され、ヘキサ−ＧＸＬ−ベースプレート構造体が生成する。
酸化反応は、エチレングリコール等の１，２結合を中心として比較的自由に回転できる１，２−ジオール又は１−アミノ−２−オール又は１−オール−２−アミノ化合物を用いて停止できる。別法として、酸化反応は、例えば、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）による過ヨウ素酸塩の迅速除去により停止できる。第一アミノ基を含有するセリン残基についての酸化反応だけが生じるので、ペプチドのε−セリン残基及びＮ末端でのセリン残基のみが、グリオキシリルに転化される。Ｎ末端セリンが酸化しないように化学的に保護（もしそのような保護が望ましいならば）する方法は、当業者の知るところである。
ε−及びα−セリン残基のＧＸＬ基への転化後、オキシム化反応がＧＸＬベースプレート構造体と相補ＡＯＡ−ＣＯＳＭとの間でｐＨ４．６で生じて、ポリオキシムを形成できる。オキシムは、広範囲のｐＨ値で形成し、ｐＨ約５未満では迅速に形成する。ポリオキシム形成の程度はＲＰ−ＨＰＬＣにより監視でき、反応は分取ＲＰ−ＨＰＬＣにより停止できる。得られた化合物の分子量は、エレクトロスプレーイオン化質量分光光度法により測定できる。別法として、ＡＯＡ−ベースプレート構造体を使用でき、この場合、オキシム化反応は、ＡＯＡ−ベースプレート構造体と、アルデヒド基を有する複数のＣＯＳＭとの間で生じることができる。
また、別法では、オキシム化をｐＨ４．６未満で行う。ｐＨが低いほど、ある種のペプチドの溶解度にとっては有利なことがある。ある種のペプチド、例えば、アミノ−オキシ−アセチル−ＹＲＥＤＧＶＴＰＹＭＩＦＦＫＤＧＬＥＭＥＫ−ＯＨ（配列番号：１２）の溶解度を増加させるには、ｐＨ２．１が好ましい。さらに、オキシム化は、ｐＨ４．６よりもｐＨ２．１ではるかに迅速に生じる。当業者は、ポリオキシム形成に関するＣＯＳＭ及びベースプレートのｐＨ対溶解度プロフィールを決定し、オキシム化反応中の分子のｐＨ安定性を考慮して特異的オキシム化反応について適当なｐＨを選択できる。
ベースプレート構造体上に存在する相補直交化学反応性基は、ＣＯＳＭをベースプレート構造体に化学選択的に結さつしてポリオキシムを調製するのに有用である。例えば、ベースプレート構造体がＡＯＡ基を含有し、ＣＯＳＭがグリオキシリル（ＧＸＬ）等のアルデヒド基を含有するならば、相補直交化学基の化学選択的結さつによるオキシム化が、規定された構造のポリオキシムの均一調製の形成において、迅速且つ実質的に定量的に生じる。
ベースプレートがアルデヒドとアミノオキシ化学反応性基の両方（例えば、ＡＯＡ及びＧＸＬ基の両方）を含有する可能性のあるヘテロポリオキシムの実施態様では、これらの基の一方は、ベースプレート上の未保護化オキシム形成性基に相補の直交化学反応性基を有する第一ＣＯＳＭの化学選択的結さつ中に保護することができる。保護基を、以下の実施例に示す。ベースプレート構造体上の保護基の脱保護に続いて、第二化学選択的結さつを実施する。最も容易には、第一オキシム連鎖（又は結合対）を、ＳｅｒのＧＸＬへの転化前に形成し、その後第二オキシム連鎖（又は結合対）を、新たに形成されたＧＸＬ基を介して形成できる。オキシム結合は、ＳｅｒのＧＸＬへの過ヨウ素酸塩酸化中安定であることが知られている。この態様では、極めて複雑なヘテロポリオキシムを形成できる。好ましい実施態様では、ベースプレートは、ε−ＡＯＡを有するリシン一つ以上とε−Ｓｅｒを有する第二リシン一つ以上を含有する。この場合、ポリオキシム合成は、ＡＯＡ基を介した第一オキシム化後、ＳｅｒのＧＸＬへの酸化及びそれに続く第二オキシム化により行われる。別法として、ベースプレートを配座的に設計して分子内オキシム形成を防止するようにでき、さらに、ベースプレート濃度及びベースプレート：ＣＯＳＭ比をベースプレートの重合が最小限となるように設定できる。
また、ヘテロポリオキシムは、均一反応性基を有するベースプレートをＣＯＳＭの混合物（「ＣＯＳＭ集団」と称する）に対して反応させることによっても得ることができる。
さらなる実施態様においては、ベースプレートは、リポーター基又はリンカー基に、典型的には非オキシム結合を介して結合した少なくとも一種のベースプレート末端残基を有することができる。リンカー又はリポーター基は、化学選択的にベースプレート末端に結さつしてもよいし、ベースプレート合成中に添加してもよい。直交リンカー基を含有するポリオキシムを、相補直交結合基を含有する第二ポリオキシムに結合してポリオキシムダイマーを得てもよい。結合基の相補性を除いて、ポリオキシムは、同一でも異なっていてもよい。
個々のＣＯＳＭは、ペプチド、ポリペプチド、脂質、オリゴ糖、核酸配列、又はこれらの分子構造体の組み合わせ等の有機分子（無機成分を含有できる）である。適当に末端変更したカルボロドは、適当なＣＯＳＭである。本発明の一実施態様では、アルデヒド基末端を介して還元糖に対して行うか、温和な化学的又は酵素的酸化により糖について調製することができる。別の実施態様では、オキシム形成は、ＲＮＡに関してＲｅｉｎｅｓ及びＣａｎｔｏｒ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９７４）１：７６７〜７８６；引用することにより本明細書の開示の一部とされる）により例示されているような核酸の熱酸化により生じるか、２核酸配列の化学的又は酵素的合成中に行うことができる。このようなアルデヒドは、オキシムを形成するのに適当な相補反応性基である。
本発明のホモポリオキシムの一実施態様では、ＣＯＳＭはペプチドである。別の実施態様では、ＣＯＳＭ及びしたがってポリオキシム自体は、抗原性であり、好ましくは免疫原性である。本発明のヘテロポリオキシムの一実施態様では、少なくとも一つのＣＯＳＭはペプチドである。別のヘテロポリオキシムの実施態様では、ポリオキシムの少なくとも一つのＣＯＳＭ及びしたがってポリオキシム自体は、抗原性、好ましくは免疫原性である。抗原性ポリオキシムは、生体外及び生体内において有用である。生体外では、抗原性ポリオキシムは、例えば、イムノアッセイ用試薬として有用である。生体内では、抗原性ポリオキシムは、例えば、ワクチンとして有用な免疫原としての役割を果たす。本発明の別の実施態様では、ハプテン性又は抗原性ペプチドＣＯＳＭにより、ペプチド単独と比較して増加した原子価、及び増加した免疫原性を有する抗原性分子が得られる。多価原子価では、接触が多くなるので、一般的に結合力が高くなり且つ相互作用の特異性が高くなる。レセプターに対するリガンドの多コピーを含んでなるポリオキシムの場合、もしベースプレートにより提供されるＣＯＳＭ間隔と配向が適当であるならば、近位のレセプターを架橋できる。
本発明の開示に鑑みて、当業者は、適当な相補化学反応性基を有するＣＯＳＭを得ることができる。例えば、精製ペプチドＣＯＳＭ等の特異的活性分子は、ＳＰＰＳにより合成できる。ペプチドの合成中又はそれに続いて、一対のオキシム形成性相補直交化学反応性基の一方を、ベースプレート構造体の合成に関して記載した方法を用いてペプチドに結合できる。また、他の周知の方法を用いてペプチドＣ末端アルデヒドの自動化合成等のポリペプチドアルデヒドを調製することもできる（例えば、Ｍｕｒｐｈｙ等、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９９２）１１４：３１５６〜３１５７参照；引用することにより本明細書の開示の一部とされる）。オキシム形成性相補直交化学反応性基は、保護された形態で結合しても、未保護の形態で結合してもよい。オキシム形成性相補直交化学反応性基をＣＯＳＭに結合する方法には、化学反応性側鎖基を介しての結合などがある。例えば、オキシム形成性相補直交化学反応性基は、Ｓ原子を介してシステイン含有ＣＯＳＭに、アルキル化又はジスルフィド形成により結合できる。次に、ベースプレートに対するオキシム化後、ＣＯＳＭを、そのＣｙｓ残基を介してベースプレートにチオエーテル結合（又はジスルフィド結合）及びオキシム結合により結合する。好ましいアルキル化合物は、結合ＡＯＡ基を有するハロゲン化アルキルである。好ましくは、Ｂｒ−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２−Ｏ−ＮＨ−Ｂｏｃ（ＡＯＡ基は保護されており、オキシム化工程前に除去できる）及びＢｒ−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２−Ｏ−ＮＨ２である。別のアルキル化剤は、Ｂｒ−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＮＨ−ＣＯＣＨ2ＯＮＨ−Ｂｏｃである。ブロモアセチル基は、例えば、Ｃｙｓ残基のチオール基のアルキル化に関してはるかに反応性が高い。これよりも好ましさが低いのが、ヨードアセチル基であり、反応性が高すぎて光分解により損失することがある。ブロモアセチル基の他のアルキル化基には、マレオイル基などがある。本明細書において教示されているように、この基を用いたタンパク質変更用リンカーとしては、ＡＯＡ−Ｌｙｓ（マレオイル−β−アラニル）−ＯＨ及びマレオイル−β−アラニル−ＮＨＣＨ2ＣＨ2ＮＨ−ＣＯＣＨ2ＯＮＨ2が例示される。マレオイル基は高分子複合体を調製するのに有用であるけれども、重大な安定性の問題（環の加水分解的開裂）があり、均一なポリオキシム調製についての適性が低い。さらに、マレオイル基を含むアルキル化では、ブロモアセチル基でのアルキル化により形成される結合よりも剛性があり且つ嵩張ったリンカーが得られ、したがって、免疫系にとってはより識別しやすい。生体内用途に好ましいリンカーは、免疫反応が指向しないものである。オキシム形成性相補直交化学反応性基のジスルフィド結合を介したシステインの側鎖への結合用化合物としては、例えば、２−ピリジル−Ｓ−Ｓ−ラジカルを含有するものである。好ましい例は、２−ピリジル−Ｓ−Ｓ−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２−Ｏ−ＮＨ−Ｂｏｃ及び２−ピリジル−Ｓ−Ｓ−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２−Ｏ−ＮＨ２である。得られたＣｙｓ含有誘導体は、ジスルフィド結合を介して結合したアミノオキシアセチル（又は保護されたアミノオキシアセチル）基を有する。本明細書で開示されている変更は、ＣＯＳＭをポリアルデヒドベースプレートに、Ｃｙｓ側鎖を介して、ジスルフィド及びオキシム結合により接続するのに有用である。この態様の結合の場合、ＣＯＳＭ、例えば、ペプチドを、ベースプレートからジスルフィド還元（体内で生じることが知られているプロセス）により遊離させることができる。未変更ペプチドのこのような遊離は、天然病原体についての対応エピトープの後での刺激に対する免疫反応を高めることができる。小分子は典型的には免疫系の細胞により容易には吸収されず、キャリアへの結合なしに異物、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン等のタンパク質として認識されるので、ポリオキシムにより、小ペプチド（又は非ペプチド）免疫抗原に対しての利点が提供される。ポリオキシムベースプレート又はポリオキシム自体により、小分子が効率的に均一に提供され、且つ免疫系を刺激する「ヘルパーエピトープ」の源が提供される。ベースプレート上に小ペプチドのいくつかのコピーを一緒に連鎖することにより、免疫系によって「識別」され、分解によることを含む処理がなされて免疫系による刺激及び認識がされる高分子が形成される。
本発明のさらなる実施態様では、ヘテロポリオキシムが、標的用結合ペプチド（例えば、腫瘍過発現ソマトスタチンレセプターに結合するソマトスタチン類似体）と、標的細胞による内在化後ポリオキシム構築物から放出されるリシンＡ鎖等の細胞障害性ペプチドの両方を含有する。これにより、リシンＢ鎖が細胞を結合する天然トキシンのプロセスをまね、リシンの内在化及びＳ−Ｓ結合の還元に続いて、リシンＡ鎖が細胞質に放出されて、細胞死を生じる。Ａ鎖とＢ鎖を非破壊性リンクにより連鎖すると毒性（有効性）が何桁も減少する。
さらなる実施態様では、ポリオキシムを、放出要素を必要とする非ウイルス性遺伝子療法デリバリーシステムに使用できる。
Ｓ−Ｓ結合は、破壊可能連鎖を提供する。他の破壊可能結合には、生体外又は生体内において、作用又はデリバリーの部位で特異的加水分解酵素により認識できるものなどがある。当該技術分野において公知であるような加水分解酵素感受性結合は、本明細書において教示されているようなポリオキシムに取り込まれることができ、制限酵素ヌクレオチド配列、リパーゼにより認識される脂質結合、グリコシダーゼにより認識される炭水化物結合、及びペプチダーゼ又はプロテアーゼにより認識されるペプチド結合などがあるが、これらには限定されない。Ｓ−Ｓ連鎖の他に破壊可能連鎖を、生体外又は生体内において生じる特定の化学的又は物理的環境（例えば、ｐＨ、温度、触媒の存在、光分解）に対する優先的化学感受性（所望であれば経時的）、例えば、Ａｓｐ−Ｇｌｙペプチド結合の酸加水分解に関して選択できる。このように、活性ＣＯＳＭの放出は、細胞の内在化の必要なく局在化部位で発生できる。放出可能ＣＯＳＭを有する本発明の実施態様は、例えば、環境の変化（又は酸化等の化学変化）に反応して性質を変化する外被膜物又は材料、例えば、菌性タンパク質又は酵素の存在に反応して抗真菌性成分を放出するカビ防止剤を使用することができる。非放出性ＣＯＳＭを用いた実施態様は、例えば、経時的放出を必要としない材料又は被覆に使用できる。例えば、防水日焼けローションは、ＵＶブロックＣＯＳＭを活性型で結合した疎水性鋳型を含有することができる。
本発明のポリオキシム実施態様は、診断目的又はイムノアッセイ等の結合アッセイにおけるアッセイ用の向上した試薬と向上したキットに使用できる。例えば、抗原ペプチドを担持する均一ポリオキシム組成物により固相イムノアッセイにおける検出感度が増加する。多価ポリオキシムが大きいほど、イムノアッセイに使用されるマルチウエルプレート等の表面により容易に付着できる。
また、ポリオキシムを含有する向上した診断キットも、本発明の実施態様として意図される。
また、アミノオキシアセチル基及びジチオピリジル基は、例えばＮＨ2ＯＣＨ2ＣＯ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ（Ｓ−２−ピリジル）−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−ＮＨ2（配列番号：２３）のように同じペプチドＣＯＳＭに存在できる。本明細書において実証されているように、２−チオピリジル保護基がＣｙｓ側鎖上に存在しても、オキシム形成は阻害されない。このような変更ポリオキシムは、標準的なチオールケミストリー（チオールによる攻撃によりピリジン−チオンが失われてジスルフィドを得るか、チオールを還元した後アルキル化する）の適用を介して２−チオピリジル基が本明細書で教示されるさらなる種（ＣＯＳＭ）を結合するのに有用であるさらなる利点がある。本発明のさらなる実施態様では、チオールに関して２，２’−ジチオジピリジン（２，２’ジピリジルジスフレフィドとしても知られている）との適用できる反応は、Ｂｒｏｃｋｌｅｈｕｒｓｔ及びＬｉｔｔｌｅ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．（１９７２）１２８：４７１〜４７４に見られる。また、これらの反応は、４，４’−ジピリジルジスルフィドに適用される。本発明のさらなる実施態様では、タンパク化学における２−ピリジルチオ誘導チオールとの反応は、例えばＣａｒｌｓｓｏｎ、Ｊ．、Ｄｒｅｖｉｎ、Ｈ．及びＡｘｅｎ，Ｒ．（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．（１９７８）１７３：７２３〜７３７）により提供される。他の実施態様は、上記した化合物と類似の化学反応特性を有するイオウ保護基を含有することができる。さらなる実施態様には、２−チオ−５−ニトロ安息香酸及び２−チオ−５−ニトロピリジンなどがある。好ましい試薬は、所望の生物活性が得られるのに加えて、合成及び生成物単離の面で都合のよいものである。好ましい試薬は、所望の誘導体生成物と試薬と副生成物との間の分離を容易にするものである。勿論、試薬の選択は用いる分離手段にも依存し、したがって、正確な試薬の決定は、特定の不安定性及び使用する高分子ＣＯＳＭに精通する高分子化学者にゆだねるのが最もよい。例えば、ＤＴＮＢは、イオン交換分離に利用できる負の電荷を導入する。逆相ＨＰＬＣによる分離に関しては、試薬ブランク及びシステインとの対照反応を含む反応を小規模で実施する。このような試料の自動注入後一晩で得られた結果を調べるために、分取スケール用途の場合、最も都合のよい分離が得られる試薬を選択する。汎用及び初期研究用に好ましい試薬は、例えばＦｌｕｋａから市販されている２，２’−ジチオジピリジンである。
オキシム形成性相補直交化学反応性基と、別の非ベースプレート高分子と特異的に反応できる２−チオピリジル等の追加の反応性基を有するここで教示されているＣＯＳＭは、自体リンカーとして使用できる。例えば、ＡＯＡと２−チオピリジル官能の両方を有するＣＯＳＭは、第二高分子を用いたジスルフィド結合形成を介した別の高分子又はＣＯＳＭ結合用リンカーとしての役割を果たすことができる。
ＣＯＳＭは、さらに、部分的に特異的活性分子又はその一部分を構成するものとして定義される。本明細書で使用される用語「特異的活性」とは、ＣＯＳＭは、相補直交化学反応性とは別に定義された生物的、化学的又は物理的活性を有することを示す。例えば、ＣＯＳＭは、抗原、エピトープ又はハプテンとして特異的に活性であることがある。また、ＣＯＳＭは、抗体の相補的決定領域等のレセプター又は細胞表面レセプターへのリガンドとして特異的に活性であることがある。
上記したＣＯＳＭアルキル化により、ベースプレートへの抗体断片等の高分子の別の結合方法が提供される。Ｆ（ａｂ’）２断片の重鎖を連鎖するジスルフィド結合の還元により生成したＩｇＧ抗体のＦ（ａｂ’）断片をアルキル化して、オキシム形成性相補反応基を含有するようにできる。生体内において、ポリオキシムは腎臓における局在が減少して排泄率を減少させる。多価異種特異性を有する化合物の合成は、今般可能となった。例えば、同じＩｇＧ断片の異なる領域又は異なる特異性を有するＩｇＧから得た領域を用いたヘテロポリオキシムを調製できる。さらに、抗体結合領域をレセプター結合、細胞結合又は他のリガンド結合分子に結合して、多価抗体を形成できる。例えば、ＩｇＧ（食細胞のＦｃレセプターを結合するため）の軽鎖又は重鎖定常領域（Ｆｃ）に連鎖したＣＤ４ドメイン（ＨＩＶのｇｐ１２０タンパク質を結合するため）を有する二重特異性ハイブリッド分子である「イムノアドヘシン」を例示するＰＣＴ／ＵＳ８８／０３４１４及びＣａｐｏｎ等（Ｎａｔｕｒｅ（１９８９）３３７：５２５〜５３０；引用することにより本明細書の開示の一部とされる）は、本発明のポリオキシムに結合できる異なる特異性について一部分を提供している。
ペプチドベースプレート構造体に関してここに記載されているように、酵素触媒逆タンパク質分解を介したＣ末端、又はＮ末端セリン又はトレオニン残基（天然に存在又はＣＯＳＭに設計）の位置特異性結合又は変更は、ＣＯＳＭ調製に適用できる。部位特異的に配置したアルデヒド又はアミノオキシ基を担持する天然又は合成ポリペプチドも、例えば、Ｏｆｆｏｒｄ、Ｒ．Ｅ．ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、第２３５〜第２５１頁、編集者Ｒｅｅｓ等（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｐｒｅｓｓ、１９９２）（引用することにより本明細書の開示の一部とされる）に記載のようにして使用できる。アルデヒド等の反応性基は、組み換え的に誘導されるポリペプチドのＮ末端に部位特異的に配置できる（例えば、Ｇｅｏｇｈｅｇａｎ等（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．（１９９２）３：１３８〜１４６）；Ｇａｅｒｔｎｅｒ等（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．（１９９２）３：２６２〜２６８参照）。組み換え法後に部位特異的変更を行ってオキシム連鎖を形成できるＣＯＳＭを形成するタンパク工学の併用は、所望の規定された構造及び活性を有するポリオキシムの均一調製を設計し行うための強力な手段である。反応性基が本例におけるよりもさらに離して配置してより大きなポリペプチドＣＯＳＭを収容するようにしたベースプレートさえ調製すれば、ＣＯＳＭのサイズについては制限がない。ベースプレートの構造設計に関して当該技術分野において公知である方法及び本明細書で説明されている方法は、ＣＯＳＭ設計にも適用できる。
また、ＣＯＳＭは、金属イオンの特異的活性キレーター又は検出可能なマーカーを結合するために有用な分子であってもよい。このような検出可能なマーカーには、放射性核種、ビオチン、ルシフェリン又はアルカリホスファターゼの基質である５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート／ニトロブルーテトラゾリウムなどの検出の酵素的方法に用いられる基質などがある（Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  第２版（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  １９８９）；引用することにより本明細書の開示の一部とされる）。適当な金属キレート化分子には、米国特許第４，６７８，６６７号（引用することにより本明細書の開示の一部とされる）ＥＤＴＡのキレート（エチレンジアミン四酢酸）及びＥＤＴＡの類似体などがあるが、これらには限定されない。このような類似体は、米国特許第４，６２２，４２０号（引用することにより本明細書の開示の一部とされる）に記載されているような放射性金属などの金属イオンと錯形成できる。また、ＣＯＳＭは、例えば、ガリウム−６７及びガリウム−６８をキレート化するＡＯＡ−デスフェリオキサミン、又は可溶形態でビオチンを含有するＡＯＡ−ビオチン等の他のキレーターから構成されてもよい。
金属イオンが放射性である場合には、このようなポリオキシムは、悪性組織又は腫瘍のイメージング又は処理のために生体内において特に有用である。ここでの開示及び有効な周知の知識を用いれば、当業者は、生体外診断及び生体内診断並びに治療のためのこれらのＣＯＳＭを含有するベースプレートを構築する方法が分かるであろう。一般的な方法の記載については、例えば、米国特許第５，１８５，１４３号、第５，０１１，６７６号、第５，０８７，６１６号、第４，７０７，３５２号、第５，０８４，２６６号、第４，９１８，１６４号、第４，８６５，８３５号、第４，８６１，５８１号、第４，６５９，８３９号、第４，６５２，４４０号及び第４，４４４，７４４号（引用することにより本明細書の開示の一部とされる）を参照できる。
上記したように、化学選択的結さつによるポリオキシムの平行アセンブリーは、例えば、ベースプレート構造体上のＧＸＬ基とＣＯＳＭ上のＡＯＡ基とが相補直交化学反応して規定の高分子構造を有するポリオキシムの均一生成物を形成する結果得られる。ポリオキシムの他の実施態様は、上記したものから得た逆相補構造、即ち、アミノオキシベースプレート及びアルデヒド系第二有機分子、を有する。これらは、特に一連のアルデヒド含有分子が有効である時に意図される（例えば、糖）。しかしながら、一般的に好ましい実施態様は、アルデヒドベースプレートを含有する。
また、本発明によれば、ポリオキシム（ホモ−又はヘテロ−ポリオキシム）を形成するための平行アセンブリー法も提供される。上記したように、化学選択的結さつにより、規定された構造及び特性を有するポリオキシム分子が形成される。実施例３は、原子価が２を超えるベースプレートを用いた平行アセンブリーによるポリオキシム形成の以下の特徴などの予期せぬ驚くべき特徴を示している：合成の容易性、迅速性及び温和性；実質的に定量的な収率；及び立体障害の明らかな不存在。実施例１４は、ヘテロポリオキシムの形成を示している。
生体物質などの他の官能基、例えば、リポーター基（ビチオン又はラジオメタル用キレーター等）、親油性アンカー（トリパルミトイル−Ｓ−グリコール−Ｃｙｓ等）又は直交反応性連鎖基（ブロモアセチル又はＳ−アセチルチオアセチル若しくはＳ−Ｓ−２−ピリジル等のマスクドチオール等）を、オキシム化の前にベースプレートに添加できるが、これらには限定されない。ビオチン又はＮ−アセチル−システイン含有ベースプレートを、実施例でとりあげて説明する。変更ベースプレートにより、ワクチンやバイオセンサー等にポリオキシムを使用する際に、より柔軟性をもって使用できる。本発明のポリオキシムのレポーター標識実施態様は、レポーター基を介して監視される。親油性アンカーと規定された分子構造の両方を有する安定なポリオキシムは、例えば、ポリオキシムを膜に挿入してワクチンの生産性を高めたり、他の親油性環境に挿入するのに有効である。ポリオキシムの他の高分子への結合又はポリオキシム同士の結合又は表面への結合は、所望の連鎖を形成するのに使用するための異なる非オキシム直交反応性連結基を有する実施態様により保進される。
以下の実施例で記載する二価及び三価のベースプレートは対称を保持する。しかしながら、位置異性体を有するポリオキシムは、例えば、ベースプレートとして、Ｈ−Ｇｌｙ3−Ｌｙｓ（ＣＯＣＨＯ）−Ｌｙｓ（ＣＯＣＨＯ）−Ｇｌｙ−ＯＨ（配列番号：１１）を使用することにより形成できる；このような場合、第一リシンの環境は、第二リシンの環境と同一ではない。より一般的には、ベースプレートは、標的構造との相互作用に有利であるように計画的に合成でき、且つ対称ではない。
本発明の追加のヘテロポリオキシム実施態様は、反応基４個を有するベースプレートを用いたヘテロポリオキシム形成により調製される。この際、一配向の反応性基３個をアンブロックしてペプチドＣＯＳＭと反応させ、次に第四ベースプレート反応性基の脱保護及び異なるＣＯＳＭとの反応を行う。
本発明のさらなるヘテロポリオキシム実施態様は、ＣＯＳＭライブラリーである。好ましいライブラリーは、ペプチドＣＯＳＭから調製する。ポリオキシムペプチドライブラリーは、ベースプレートとペプチドＣＯＳＭ混合物（ＣＯＳＭ集団）から形成される。各ＣＯＳＭのペプチド部は、標準的な線状ペプチドライブラリーを設計するための公知の方法に準じて設計できる。例えば、Ｊｕｎｇ等（Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｒ．Ｅｐｔｏｎ編集、１９９２、Ｉｎｔｅｒｃｅｐｔｏｒ、Ａｎｄｏｖｅｒ、英国、第２２２〜２３５頁）は、標準的な合成線状ペプチドライブラリーの設計、合成及び方法を簡単に記載している。ポリオキシムペプチドライブラリーで表されるペプチド配列は、ベースプレート上に少なくとも一個のオキシム形成性化学反応性基に相補な反応性化学基を含有するように合成する。ペプチド配列は、個々又は混合物で合成できる。ペプチドＣＯＳＭ又は混合物は、個々に反応させてもよいし、ベースプレートと組み合わせて反応させてポリオキシムライブラリーを形成できる。また、ペプチドＣＯＳＭは、逐次的にベースプレートと反応させて規定のヘテロポリオキシム化合物を形成できる。ポリオキシム形成中に形成された中間体ポリオキシムは、単離できる。中間体ポリオキシムは、未反応オキシム形成基を含有する。中間体ポリオキシムを、次に別の個々のペプチドＣＯＳＭ又はペプチドＣＯＳＭ混合物と反応させて、より複雑なヘテロポリオキシムライブラリーを調製する。もし必要又は所望ならば、過剰のアミノオキシ化合物（又はアルデヒド）を、例えば、スクリーニング（下記に記載）又は他の使用前に、アルデヒド（又はアミノオキシアセチル）ゲルカラムを通過させることにより除去してもよい。ポリオキシムライブラリーは、標準ポリペプチドライブラリーに関するのと同様の方法で反復スクリーニングプロセスに使用できる。
適当に選択されたベースプレートは、ペプチド「指（フィンガー）」が目的構造体に近接するか相互作用する準備ができた状態で、「手の平（パーム・オブ・ハンド）」として役割を果たす。種々の実施態様において、「パーム」ベースプレートを変化させて、間隔、親水性、電荷等を最適化する。
もし２０の一般的なＬ−アミノ酸から形成されるたった４００ジペプチドアミドのライブラリーであって、全てがアミノオキシアセチル基を担持し、ポリアルデヒドベースプレートの原子価が３であることを考え、次に対称については無視すると、混合について得られる可能性のあるトリオキシムは、４００3＝６．４ｘ１０7である。
合成ペプチドライブラリーのスクリーニングについては、おびただしい数の手法が開発された。ポリオキシムペプチドライブラリーを使用する際の最適化の手法は、実質的にＨｏｕｇｈｔｅｎ等（Ｎａｔｕｒｅ（１９９１）３５４：８４）及びＧｅｙｓｅｎ及びＭａｓｏｎ（Ｂｉｏ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔ．（１９９３）３：３９７〜４０４）に記載されているとおりであるが、ここでの著者は線状ペプチドのみを使用していることが異なる。例えば、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ（配列番号：１４）から出発し、次にＧｌｙ−Ａｌａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ（配列番号：１５）等から出発して２０コードアミノ酸全てが位置１及び全てが位置２にあるようにして４００組のペプチドを調製できる。Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａは、全てのアミノ酸残基が全ての位置に存在する４つの続いた位置を意味する。適当なアッセイで４００試料をスクリーニングすることにより、最も活性なものを少なくとも一つを同定できる。例えば、もしＡｒｇ−Ｔｙｒ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ（配列番号：１６）配列が最も活性であることが判明したならば、次のスクリーニングにおいて、次の４００試料についてＡｒｇ−Ｔｙｒを固定してＡｒｇ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｘａａ（配列番号：１７）、Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｘａａ−Ｘａａ（配列番号：１８）等を得る。もしスクリーニング後にＡｒｇ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｘａａ−Ｘａａ（配列番号：１９）が最も活性であると判明したならば、全てがＡｒｇ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕから出発しＣ末端にＧｌｙ−Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ａｌａ等のいずれかを有するさらに４００試料についての最終スクリーニングを実施する。アッセイに線状ヘキサペプチドを用いる代わりに、これらのペプチドをベースプレート上に、平行アセンブリー及びオキシム結合形成を介して取りつける。
ポリオキシムライブラリーを使用する利点には、１）ベースプレートがアッセイで活性な構造を含有し、したがって、アッセイにおいてより低濃度のポリオキシムを使用でき、溶解性の問題を最小限に抑えることができること（このライブラリーを使用しないとこの問題が非常に顕著である）；及び２）多価であるので、一般的に接触が多くなるので、結合力が高くなり且つ相互作用の特異性が高くなるなどがある。
ベースプレートは、好ましくはアルデヒド化学反応性基を含有する；しかしながら、一連のアルデヒド含有分子（例えば、糖）が有効である時には、逆相補構造体、即ち、アミノオキシベースプレートを有するポリオキシムペプチドライブラリーの他の実施態様が特に意図される。
あるポリオキシムライブラリー実施態様では、ポリオキシム構造の一部分を通常の方法により合成でき、オキシム化を使用してライブラリーにおいて意図する配列を表すさらなる要素を付加する。
以下、例を挙げて非同一ペプチドＣＯＳＭのベースプレートへの結合を示すこととする。
アミノオキシアセチル−（又はアルデヒド変更）モノメトキシ−ポリエチレングリコール又は他の同族列のポリマーをＣＯＳＭ混合物として使用することにより、ポリオキシムが分子自体内で不均一性を有することができる。このようなポリオキシムは、ＮＨ2ＯＣＨ2ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ2ＣＨ2Ｏ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）nＣＨ2ＣＨ2ＯＣＨ3又はＯ−ＣＨＣＨ2Ｏ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）nＣＨ2ＣＨ2ＯＣＨ3又はＯ＝ＣＨＣＯＮＨＣＨ2ＣＨ2Ｏ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）nＣＨ2ＣＨ2ＯＣＨ3（式中、ｎは整数である）等の同族列のメンバーの混合物の平行アセンブリーにより形成される。同族列のアルデヒド系及びＡＯＡ変更分子を、平行アセンブリーポリオキシム形成に使用できる。タンパク質変更の点において、本発明のＣＯＳＭ実施態様により、安定性、溶解性及び半減基を増加できるタンパク質ＰＥＧ化が可能となる。また、数個の鎖を、自体タンパク質に結合しているベースプレートに結合できる。そのとき整数ｎが一連の値をとるので生成物はわずかに均一ではないが、ポリオキシムは、例えば小タンパク質の生物学的半減期を延長したり、治療的タンパク質の抗原性を減少するのに有用である。
別個の実施態様では、ポリオキシムは、さらに動物中で免疫反応を誘発する能力を有するとして特徴付けられる。免疫原性を有する複数のＣＯＳＭに共有結合したベースプレート構造体から形成される免疫原性ポリオキシムは、動物において免疫反応を誘発する能力を有する。例示の目的のみに限れば、ＣＯＳＭは、ハプテン、細胞表面レセプター若しくはその断片、金属キレート剤又はウイルス抗原のエピトープに対応するペプチド又はポリペプチドであることができる。数多くの異なる免疫調節ペプチドＣＯＳＭ、例えば、Ｈｏｂｂｓ等（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３８：２５８１〜２５８６（１９８７））、Ａｎｔｏｎｉ等（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７：３２０１〜３２０４（１９８６））及びＮｅｎｃｉｏｎｉ等（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：８００〜８０４（１９８７））（引用することにより本明細書の開示の一部とされる）に記載されているペプチド等が存在する。また、キレート剤に結合した種々のペプチドも周知であり、例えば、メラミン細胞刺激ホルモンペプチド誘導体などがある（ヨーロッパ特許出願第０  ４９８  ７７１  Ａ２号（１９９２年３月２日出願；引用することにより本明細書の開示の一部とされる）。これらのポリオキシムは、ワクチン及びイメージング剤として生体内において有用である。
別の実施態様において、ＣＯＳＭは、ベースプレートに化学選択的に結さつできる核酸配列であることができる。また、核塩基は、ペプチド又はポリペプチド配列に結合してポリペプチド−核酸（ＰＮＡ）を形成でき、これをＣＯＳＭとして使用し、ベースプレートに結さつできる。
32Ｐ、ビオチン、放射標識キレーター、又はアルカリホスファターゼ等の酵素（又はその基質）等の検出性ポリマーと連結して使用する時、得られたポリオキシムは、種々の診断法、例えば、ノーザン及びサザンハイブリダイゼーションアッセイに有用である非常に特異的且つ反応性のある核酸プローブを提供する（Ｓａｍｂｒｏｏｋ等（１９８９）参照）。
別個の実施態様では、ポリオキシムは、抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）の配列に同一の配列を有するポリペプチドである複数のＣＯＳＭを有する。当業者に公知のように、ＣＤＲを金属キレート剤に結合して二官能ＣＯＳＭを形成してもよく、又は別法では、キレート剤又はレポーター剤を本明細書に記載のようなベースプレートに結合する。ＣＤＲポリオキシムは、生体外及び生体内において有用である。生体外では、ＣＤＲポリオキシムは、種々のイムノアッセイにおいてポリクローナル及びモノクローナル抗体の代わりに使用できる。生体内では、受動的に動物を免疫化したり、疾病を診断及び治療するのに有用である。
また、本発明のポリオキシムは、ポリオキシムに結合できる意図する生物学的活性分子を精製するのに有用である（一般的な方法については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等（１９８９）及びＨａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ（１９８８）参照）。
ポリオキシムは、シリコンチップ、組織培養プレート又は合成若しくは天然樹脂等の固相に結合できる。ポリオキシムを、例えば、チオピリジル又はアセチル基で一時的に保護したチオール基を使用して固相に化学選択的に結さつして、チオエーテル又はチオエステル結合を形成できる。別法では、ポリオキシムを、ポリオキシムのベースプレート部に共有結合した脂質アンカー基を介して、脂質層又は細胞膜等の固相に結合できる。固体表面に付着又は結合したポリオキシムのＣＯＳＭは、ＣＯＳＭリガンドを結合する標的分子の精製又は標的分子の存在の検出用リガンドとして使用できる。もしＣＯＳＭを、本明細書で教示されているようなＳ−Ｓ結合を含有するもの等の破壊可能リンクを介してベースプレートに結合するならば、ＣＯＳＭ標的対をベースプレート／表面から放出して精製・分析を容易にできる。
生物活性分子を細胞にターゲッティングするための可溶複合体も、本発明により提供される。可溶複合体は、複数の生物活性分子に結さつし且つ細胞特異的結合剤に連鎖したベースプレート構造体を含んでなる。別法では、ベースプレートを、複数の細胞特異的結合剤に結さつでき且つ生物活性分子に連鎖できる。このような可溶複合体は、適当なレセプターを発現する細胞に対して細胞又は組織特異的デリバリーシステムを提供する。生物活性分子には、均一抗体ＣＤＲ、抗体断片、エピトープ、パラトープ、核酸、細胞レセプターと特異的に反応するリガンド並びに標的分子を特異的に結合する能力を保持する細胞レセプター又はそれらの断片などがあるが、これらには限定されない。また、生物活性分子は、治療薬、例えば、トキシン、化学療法薬又は放射性同位体を結合して有するペプチドであることもできる。本発明の目的のための細胞特異的結合剤は、特異的生体分子を認識且つ結合する分子である。このような薬剤には、抗体、抗体断片及び細胞表面レセプター（又はそれらの生物活性断片）などがあるが、これらには限定されない。例えば、細胞特異的結合剤は、腫瘍細胞特異的レセプター、細胞表面レセプター又は細胞表面レセプター用リガンドであることができる。
ポリオキシムのみを含有する組成物の他に、本発明のポリオキシム及び少なくとも一種の他成分を含有する組成物も本発明の範囲内である。また、本発明の治療用ポリオキシム実施態様と薬学的に許容されるキャリアとを含有する医薬組成物も具体化される。
また、本発明によれば、動物に対して、薬学的に許容されるキャリアに添加した上記で定義した免疫学的に効果的な量の抗原性ポリオキシムを投与することを含んでなる動物において免疫反応を誘発する方法も提供される。本発明の目的のための動物は、好ましくは哺乳類等の脊椎動物、とりわけマウス、サル又はヒトである。一実施態様では、動物はヒト患者である。抗原性ポリオキシムによって、誘発される免疫反応は、体液性か、細胞免疫性か、それらの両方である。
本発明のポリオキシムには、いくつかの新規な特徴がある。本発明の合成ホモポリオキシム分子に関する一つの新規な特徴は、ポリオキシムが均一なことである。ポリオキシムは、多価であり、水溶液又は半水溶液中で安定であり、−３〜５０℃の温度で調製できるが、最も有利なのが室温での調製である。本発明のポリオキシムは、個々の成分の特異的生物反応性並びに特異的化学的及び物理的反応性に関連して利用できる。
本明細書において明らかにされるように、相互作用してベースプレートとＣＯＳＭとの間にオキシム連鎖を形成する相補反応性基は非常に特異的である。本明細書において教示されているオキシム化反応により、反応生成物が完全又は実質的に定量的な収率で得られた。このような複合体分子形成は、極めて温和な条件下で生じる。希薄条件下での迅速性には驚くべきものがあり、しばしば分子内凝集又は反応を最小限とするのに有用である。オキシム化反応が伴わず、ポリオキシムの自己アセンブリーが生じることがある。ポリオキシムは、収量が実質的に定量的であり且つ微量の中間体と最終生成物とが典型的に実質的に異なる（即ち、少なくともＣＯＳＭ一単位の有無により）ので、それらの分離方法が容易に選択且つ適用されるため精製が容易である。オキシム結合は、ヒドラゾン等に比較して、一連の生理的条件で優れた加水分解安定性を有する。オキシム結合は、一般的に酵素的加水分解を受けない。したがって、ポリオキシムは、複合体が完全且つ安定であることが望ましい場合の用途に特に適当である利点がある。実施例において明らかにされるように、ポリオキシム化反応は極めて温和であり、したがって生物活性又は機能を保持する生物高分子を調製するのに有利である。ポリオキシムの化学的性質により、サブユニットの可逆的化学的保護を有する必要がない。大きな柔軟性を持って、ベースプレートとＣＯＳＭを部位特異的に変更してオキシム結合を形成できる反応性基を形成することができる。この柔軟性があることと可逆性保護の必要性がないことのために、ベースプレートとＣＯＳＭの設計は、人工及び天然分子並びにそれらの誘導体におよぶ。ここで明らかにされた驚くべきことに立体障害がないこと（例えば、７連続リシン残基の側鎖の各々に結合した２３−ｍｅｒペプチド）は、複合分子を設計できることを示している。このような複合分子では、サブユニットの個々の能力が高まり且つ結合され、全体が各部の合計よりも大きい。例えば、ベースプレートは、ペプチドの溶解性を向上するように設計できるだけでなく、ペプチドを多価及び／又は拘束された形態においてレセプター若しくは抗体又は動物の免疫性に提供するように設定できる。合成ベースプレートとＣＯＳＭから形成したポリオキシムは、ウイルスフリーである更なる利点がある。
以下の実施例は、説明のために提供されるものであり、本発明の態様を限定するものではない。
実施例
実施例１．化学反応性アルデヒド又はアミノ−オキシアセチル基を有するペプチドベースプレート構造体の合成
ＧＸＬ−ベースプレート構造体の合成
ペプチドベースプレート構造体を固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）を用いて構成した。簡単に述べると、自動化ＳＰＰＳを、４３０Ａ型ペプチドシンセサイザー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）を用いて行った。所望のアミノ酸配列をシンセサイザーにプログラミングし、合成を標準Ｆｍｏｃプロトコールを用いてすすめた。出発樹脂は、Ｇｌｙ−ＰＡＭポリスチレン（１合成当たり０．５ｍｍｏｌ）であった。２種の異なるペプチド配列を合成した：Ｈ−Ｇｌｙ3−〔Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）〕5−Ｇｌｙ−ＰＡＭ樹脂及びＨ−Ｇｌｙ3−〔Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）〕7−Ｇｌｙ−ＰＡＭ樹脂。
Ｂｏｃ基を、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を用いて除去した。簡単に述べれば、ＴＦＡ約１５ｍｌを、樹脂１ｇとともに室温で１時間インキュベーションした。次に、試料を濾過し、ジクロロメタンで洗浄し、乾燥した。遊離α−及びε−アミノ基を、各アミノ基に対して２当量の活性Ｂｏｃ−Ｓｅｒ（ベンジル）Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（乾燥ＤＭＳＯ中０．１６Ｍ）を用いてアシル化した。見掛けｐＨを水で湿らせたｐＨ試験紙を用いて測定し、Ｎ−メチルモルホリンによりｐＨ８〜９に調整した。次に、樹脂を２時間攪拌した。
この反応に続いて行った標準ニンヒドリン試験により、アシル化が不完全であることが分かった。したがって、樹脂を濾過し、アシル化反応を、Ｎ−メチルモルホリンによりｐＨ８〜９に維持しながら反復した。この反応に続いて行ったニンヒドリン試験により、アシル化が実質的に完了したことが分かった。樹脂を濾過し、ＤＭＳＯで洗浄した後、ジクロロメタンで洗浄し、真空乾燥した。反応により、Ｈ−Ｇｌｙ3−〔Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）〕5−Ｇｌｙ−ＰＡＭ樹脂１．３ｇから樹脂１．７ｇが得られた。
開裂脱保護を、試料を１７ｍｌＴＦＡに溶解することにより行った。混合物を３０分間攪拌した後、トリフルオロメタンスルホン酸（ＴＦＭＳＡ）１．７ｍｌを添加した。この溶液を１時間攪拌し、ペプチドを乾燥エーテルを用いて析出させた。ペプチドを、乾燥エーテルで３回洗浄し、真空乾燥した。
得られたペプチドと開裂樹脂との混合物を、水６０ｍｌに再懸濁した。水溶性であるペプチドを溶解し、溶液を濾過した。凍結乾燥後、濾液を水５０ｍｌに溶解し、その５ｍｌを、２５０Ｘ２１ｍｍ内径Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ  ３００Ａ  ５μｍ  Ｃ８カラムを用いたＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ）を１０ｍｌ／分で実施することにより精製した。溶媒Ａは０．１％ＴＦＡであり、溶媒Ｂは９０％アセトニトリルの０．１％ＴＦＡ溶液であった。
ペプチドを、１００％Ａで定組成精製し、前部が出てまもなく溶出した。次に、カラムを５０％Ｂで洗浄し、１００％Ａで平衡化してから次の注入を行った。生成物であるＨ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ3−〔Ｌｙｓ（Ｈ−Ｓｅｒ）〕5−Ｇｌｙ−ＯＨ（配列番号：７）（収率＝１００ｍｇ）は、分析的ＲＰ−ＨＰＬＣ（２５０Ｘ４ｍｍ内径カラム；充填物及び溶媒は上記の通り）により、０．６ｍｌ／分定組成１００％Ａで５分間、次に１分当たり２％Ｂの割合で１００％Ｂまで直線勾配をつけて単一ピークとして溶出した。ペプチドの保持時間は、２０分であった。
精製したペプチドを、エレクトロスプレーイオン化質量分光光度法（ＥＳＩ−ＭＳ）により特性決定した。３０００ａｍｕ  ｒｆジェネレーターを備えたＴｒｉｏ２０００分光光度計を使用した（Ｆｉｓｏｎｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ；英国アルトリンシャム）。試料を、水／メタノール／酢酸（容積比：４９．５／４９．５／１）に２μｌ／分で注入した。試料の測定分子量は、計算予測値が１４０９．５６ダルトンであるのに対して、１４１０．１２＋／−０．６６ダルトンであった。
Ｈ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ3−〔Ｌｙｓ（Ｈ−Ｓｅｒ）〕5−Ｇｌｙ−ＯＨ（配列番号：７）（水中１０ｍＭ）０．２ｍｌをイミダゾール−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ６．９５）７．８ｍｌと混合し、ＮａＩＯ4（水中０．１Ｍ）０．２４ｍｌを添加することにより、前駆体ベースプレート構造体上のセリン基を化学反応性グリオキシリル（ＧＸＬ）基に転化した。混合物を高速攪拌した後、室温で５分間インキュベーションした。酸化反応を、エチレングリコール（水中０．１Ｍ）を０．４８ｍｌ添加し溶液を高速攪拌することにより停止させた。試料を、酢酸でｐＨ４．０に調整し、ＲＰ−ＨＰＬＣ２５０ｘ１０ｍｍ内径Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ  ３００Ａ  ７μｍ  Ｃ８カラムに注入した。溶離は、定組成１００％Ａを用いて４ｍｌ／分で５分間、続いて１分当たり２％Ｂの割合で最終濃度１００％Ｂまで直線勾配をつけて行った。ヘキサ−ＧＸＬ−ベースプレート（配列番号：６）は、保持時間１６分で溶出した。
溶媒は、加熱することなく、真空遠心分離（Ｓｐｅｅｄ−Ｖａｃ；Ｓａｖａｎｔ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）により除去した。反応により精製ヘキサ−ＧＸＬ−ベースプレート約１ｍｇが得られ、これを粉末として−２０℃で保存したところ、少なくとも数週間は安定であった。同様の方法を使用して、オクタ−ＧＸＬ−ベースプレート（配列番号：９）を調製した。
ＡＯＡ−ベースプレート構造体の合成
別法として、ベースプレートペプチドにおけるアミノ基をＡＯＡ基に転化してポリ−ＡＯＡ−ベースプレート構造体を作製した。簡単に述べれば、Ｈ−Ｇｌｙ3−Ｌｙｓ5−Ｇｌｙ−ＰＡＭ樹脂を、Ｂｏｃ−ＡＯＡ  Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（乾燥ＤＭＳＯ中０．１Ｍ；各アミノ基に対して２．５当量；樹脂０．６９ｇ当たり５０ｍｌ、見掛けｐＨをＮ−メチルモルホリンにてｐＨ８〜９）とともにインキュベーションした。アシル化反応は、室温で２時間インキュベーションしたら完了したことが、標準ニンヒドリン試験により分かった。
樹脂を濾過し、ＤＭＳＯで洗浄後、ジクロロメタンで洗浄し真空乾燥した。開裂脱保護を、ＴＦＡ７ｍｌとＴＦＭＳＡ０．７ｍｌとを含有する溶液を用いて行った。試料を、上記のようにしてエーテルで析出させた後、水に溶解し、濾過し、そして凍結乾燥した。
凍結乾燥粗生成物を水４ｍｌに溶解し、そのうちの０．５ｍｌを、上記した２１ｍｍカラムを用いたＲＰ−ＨＰＬＣを１０ｍｌ／分で実施することにより精製した。１００％Ａで５分間溶離後、１％Ｂ／分勾配で最終濃度５％Ｂまで増加させ、この濃度で２０分間維持した。このカラムを５０％Ｂで洗浄し、各抽出前に１００％Ａで平衡化した。
ヘキサ−ＡＯＡ−ベースプレート生成物（配列番号：５）は、５％Ｂでの定組成溶離中に溶出した。この生成物は、分析的ＲＰ−ＨＰＬＣにより単一ピークとして溶出した。質量をＥＳＩ−ＭＳにより測定したところ、理論質量が１３２５．４ダルトンであるのに対して、１３２５．４９＋／−０．３８ダルトンであった。溶媒除去後、ヘキサ−ＡＯＡ−ベースプレートを粉末として−２０℃で保存したところ、少なくとも数週間は安定であった。保存バイアルを、密封し、揮発性アルデヒドを排除した。
実施例２．ペプチド相補直交特異的活性分子（ＣＯＳＭ）の合成
ＣＯＳＭのペプチド成分を、上記したＳＰＰＳ法を用いて合成した。追加Ｃ末端グリシンを含むヒトトランスレーション的制御腫瘍タンパク質（ＴＣＴＰ）のアミノ酸残基１０２〜１１２に相当する配列Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ（配列番号：１）を有する１２アミノ酸ペプチドを合成した。自動化ペプチド合成を、Ｓａｓｒｉｎ樹脂（Ｂａｃｈｅｍ）を使用し且つＰｍｃをアルギニン残基の側鎖保護として使用した以外は、実施例１に記載したのと同様の４３０Ａ型ペプチドシンセサイザー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）を用いて行った。
ＴＣＴＰペプチドのＮ末端のリシン残基のα−アミノ基を、ＴＣＴＰ樹脂０．３３ｍｍｏｌをＢｏｃ−ＡＯＡ  Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルとともに、実施例１に記載のようにしてインキュベーションすることにより、α−ＡＯＡ基に転化した。開裂脱保護を、フェノール／エタンジチオール／チオアニソール／水／ＴＦＡ（０．７５ｇ／０．２５ｍｌ／０．５ｍｌ／０．５ｍｌ／１０ｍｌ）混合物１．５ｍｌを用いて行った。３時間攪拌後、混合物を濾過し、ペプチドを冷メチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテル４ｍｌで析出させた。析出物を同じエーテルで３回洗浄し、乾燥した。
乾燥析出物を水１５ｍｌに溶解し、その１．５ｍｌを、実施例１に記載の内径２１ｍｍカラムを用いたＲＰ−ＨＰＬＣにより精製した。このカラムを、１００％Ａで１０ｍｌ／分、５分間溶離後、一分当たり１％Ｂの割合で最終濃度９％Ｂまで勾配をつけて溶離し、この濃度を、生成物が溶出するまで維持した（保持時間約４５分）。カラムを５０％Ｂで洗浄し、１００％Ａで平衡化してから各注入を行った。
真空遠心分離により溶媒を除去した後、ＡＯＡ−ＴＣＴＰ試料（配列番号：４）を、ＥＳＩ−ＭＳにより特性決定した。試料の分子量を測定したところ、予測値が１５４１．７３ダルトンであるのに対して、１５４２．５７＋／−１．１４ダルトンであった。反応により、ＡＯＡ−ポリペプチジル樹脂１．３ｇからＡＯＡ−ＴＣＴＰ１２０ｍｇが得られた。ＡＯＡ−ＴＣＴＰＣＯＳＭを、粉末として−２０℃で保存したところ、少なくとも数ヶ月は安定であった。
別法として、Ｎ末端セリン残基を、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ４３０Ａペプチドシンセサイザーにより、ＴＣＴＰ−Ｓａｓｒｉｎ樹脂７０７ｍｇ（０．１７ｍｍｏｌ）に付加させた。Ｆｍｏｃ基を除去後、開裂脱保護を、ＡＯＡ−ＴＣＴＰ  ＣＯＳＭに関して記載したようにして行った。Ｓｅｒ−ＴＣＴＰ前駆体ＣＯＳＭ（配列番号：２）をＲＰ−ＨＰＬＣにより精製し（収率＝９０ｍｇ）、ＥＳＩ−ＭＳにより特性決定した。Ｓｅｒ−ＴＣＴＰ前駆体ＣＯＳＭの分子量を測定したところ、予測値が１５５５．７５ダルトンであるのに対して、１５５６．５３＋／−１．０７ダルトンであった。Ｓｅｒ−ＴＣＴＰ前駆体ＣＯＳＭを粉末として−２０℃で保存したところ、無期限に安定である。
前駆体Ｓｅｒ−ＴＣＴＰ  ＣＯＳＭ（水中１０ｍＭ）１．２ｍｌをイミダゾール−ＨＣｌ緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ６．９５）６．８ｍｌとＮａｌＯ4（水中０．１Ｍ）０．２４ｍｌとを含有する溶液に添加し、試料を高速混合することにより前駆体を化学反応性ＧＸＬ−ＴＣＴＰ（配列番号：３）に転化した。室温で５分後、酸化反応を、エチレングリコール（水中０．１Ｍ）０．４８ｍｌ添加により停止させた。溶液を酢酸によりｐＨ４．０に調整し、ＧＸＬ−ＴＣＴＰを内径１０ｍｍカラムＲＰ−ＨＰＬＣにより単離した。溶離を、４ｍｌ／分１００％Ａで５分間、次に一分当たり２％Ｂの割合で１００％Ｂまで勾配をつけて行った。保持時間は、１９分であった。
溶媒除去後、ＧＸＬ−ＴＣＴＰを、ＥＳＩ−ＭＳにより特性決定した。試料の分子量を測定したところ、予測値が１５２４．７０であるのに対して、１５２４．６３＋／−０．１６であった。ＧＸＬ−ＴＣＴＰ  ＣＯＳＭを粉末として−２０℃で保存したところ、少なくとも数週間は安定であった。
ヒトプロインシュリンＣペプチド配列（ＰｅｐＣ）の残基４３〜６５に相当する２３アミノ酸ペプチドも、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ４３０Ａペプチドシンセサイザーにより標準Ｆｍｏｃプロトコールを用いて合成した。Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｓａｓｒｉｎ樹脂（Ｂａｃｈｅｍ）を、０．５ｍｍｏｌスケールで使用した。樹脂結合ペプチドとしてまだ保護したままで、上記したようにして樹脂（Ｎ末端α−アミノ基約２０μｍｏｌ）１００ｍｇを、Ｂｏｃ−ＡＯＡ  Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを用いてアシル化した。
上記したフェノール混合物３．５ｍｌを用いて開裂及び脱保護した後、ＡＯＡ−ＰｅｐＣ  ＣＯＳＭ（配列番号：１０）を、ＲＰ−ＨＰＬＣ（収量＝８ｍｇ）により精製した。ＡＯＡ−ＰｅｐＣ  ＣＯＳＭの分子質量をＥＳＩ−ＭＳにより測定したところ、理論値が２３０８．５７６ダルトンであるのに対して、２３０８．５７６＋／−０．１１ダルトンであった。ＡＯＡ−ＰｅｐＣ  ＣＯＳＭを上記したようにして保存したところ、少なくとも数ヶ月は安定であった。
実施例３．ヘキサ−ＧＸＬ−ベースプレートとＡＯＡ−ＴＣＴＰ  ＣＯＳＭとの化学選択的結さつによるヘキサ−ＴＣＴＰ−ポリオキシムの平行アセンブリー
ヘキサ−ＴＣＴＰ−ポリオキシムの平行アセンブリーを、ＡＯＡ−ＴＣＴＰ（配列番号：４）（０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液中１０ｍＭ、ｐＨ４．６）２００μｌをヘキサ−ＧＸＬ−ベースプレート構造体（配列番号：６）（水中１０ｍＭ）６．７μｌに添加することにより開始した。混合後、オキシム化反応を、室温で進行させた。ＡＯＡ−ＴＣＴＰ（２μｍｏｌ）は、ベースプレート（６７ｎｍｏｌ；ＧＸＬ基約４００ｎｍｏｌ）に対して、約５倍モル過剰に存在していた。予測ヘキサ−ＴＣＴＰ−ポリオキシム生成物の構造を、第１図に示す。
化学選択的結さつの程度を、ヘキサ−ＴＣＴＰ−ポリオキシムの形成を内径４ｍｍカラムを用いたＲＰ−ＨＰＬＣにより測定することにより監視した。溶離は、１００％Ａで０．６ｍｌ／分、５分間、続いて一分当たり２％Ｂの割合で０から１００％Ｂまで直線勾配をつけて行った。試料の溶離は、２１４ｎｍでの吸収により監視した。インキュベーション３時間後（第２図）及び１８時間後（第３図）に得られたクロマトグラムを示す。インキュベーション３．５時間後、低勾配により分析した時のポリオキシムピークは、トリ−、テトラ−、ペンタ−及びヘキサ−オキシム形態の混合物（データは示してない）であった。ヘキサ−ＴＣＴＰ−ポリオキシムの形成は、インキュベーション１８時間後に実質的に完了した。
反応を停止し、ヘキサ−ＴＣＴＰ−ポリオキシム生成物を、分取ＲＰ−ＨＰＬＣにより精製した。分取スケール反応混合物の０．５ｍｌを、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ  ３００Ａ  ５μｍ  Ｃ８を充填した２５０Ｘ２０ｍｍ（内径）カラムにより精製した。溶離は、１００％Ａで４ｍｌ／分、５分間、続いて一分当たり１％Ｂの割合で最終濃度１００％Ｂまで直線勾配をつけて行った。
過剰ＡＯＡ−ＴＣＴＰが保持時間４４分で溶出し、ヘキサ−ＴＣＴＰ−ポリオキシム生成物が５０分で溶出した。ヘキサ−ＴＣＴＰ−ポリオキシム生成物と、ＡＯＡ−ＴＣＴＰの過剰分の両方を、精製中に回収した。真空乾燥後、収量を計算したところ、ＡＯＡ−ＴＣＴＰ４５ｍｇ及びヘキサ−ＧＸＬ−ベースプレート１．４ｍｇからヘキサ−ＴＣＴＰ−ポリオキシム１１ｍｇが得られたことが分かった。
ヘキサ−ＴＣＴＰ−ポリオキシムを、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）の存在下でＰｈａｓｔシステム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて特性決定した。タンパク質試料を２０％ゲルに附し、電気泳動を１５℃で９０ボルト・時間行い、銀染色により可視化した。タンパク質分子量標準（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を平行レーンで流した。第４図に示すように、ホスホリラーゼ−Ｂ（９４ｋＤａ）、ウシ血清アルブミン（６７ｋＤａ）、オバルブミン（４３ｋＤａ）、炭酸脱水酵素（３０ｋＤａ）、大豆トリプシンインヒビタ（２０．１ｋＤａ）及びα−ラクトアルブミン（１４．４ｋＤａ）を含めた。
第４図に示すように、ヘキサ−ＴＣＴＰ−ポリオキシム生成物は、見掛け分子量約１４ｋＤａを有する主要バンドとして移動した。この分子量は、予想分子量約１０キロダルトン（ｋＤａ）より大きい。分子量が大きいほど、ヘキサ−ＴＣＴＰ−ポリオキシムの予測構造が延びている傾向がある。試料レーンにおいて易動度が大きいぼやけたバンドが存在するのは、ゲルローディング前に試料が沸騰して部分的に分解したことによるものと思われる。ヘキサ−ＴＣＴＰ−ポリオキシムの安定性について、以下説明する。
分子量を、エレクトロスプレーイオン化質量分光光度法により、より正確に測定した。生成物の分子質量を測定したところ、１０，３６７．４１＋／−１．２８ダルトン（第５図）であり、６ＴＣＴＰ  ＣＯＳＭ（配列番号：４）のヘキサ−ＧＸＬ−ベースプレート構造体（配列番号：６）への化学選択的結さつについて予測される予測分子量１０，３６５．４９ダルトンとよく一致している。
ヘキサ−ＴＣＴＰ−ポリオキシム生成物の安定性を、ヘキサオキシム（０．１ｍｇ／ｍｌ）を０．１％ＴＦＡ（ｐＨ２．１）中室温で４８時間、０．１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．６）中２４時間又はリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．０）中３０．５時間インキュベーションすることにより測定した。インキュベーションに続いて、試料を、ＲＰ−ＨＰＬＣにより分析した。第６図に示すように、ヘキサ−ＴＣＴＰ−ポリオキシムは、種々のｐＨ値でインキュベーションした時に安定であった。
実施例４．ヘキサ−ＧＸＬ−ベースプレートとＡＯＡ−ＰｅｐＣ  ＣＯＳＭＳの化学選択的結さつによるヘキサ−ＰｅｐＣ−ポリオキシムの平行アセンブリー
ヘキサ−ＰｅｐＣ−ポリオキシムの平行アセンブリーを、ＡＯＡ−ＰｅｐＣ（０１．Ｍ酢酸ナトリウム中１０ｍＭ、ｐＨ４．６）３０μｌをヘキサ−ＧＸＬ−ベースプレート構造体（水中１０ｍＭ）１μｌに添加し、混合物を室温でインキュベーションすることにより開始した。ＡＯＡ−ＰｅｐＣ（配列番号：１０）は、ベースプレート構造体（配列番号：６）上の各ＧＸＬに対してＡＯＡ基において５倍モル過剰に存在していた。予測ヘキサ−ＰｅｐＣポリオキシムの構造を、第７図に示す。
化学選択的結さつの程度を、ヘキサ−ＰｅｐＣ−ポリオキシムの形成を内径４ｍｍカラムを用いたＲＰ−ＨＰＬＣにより測定することにより監視した。溶離は、１００％Ａで０．６ｍｌ／分、５分間、続いて一分当たり２％Ｂの割合で最終濃度１００％Ｂまで勾配をつけて行った。第８図は、インキュベーション１８時間後に得られたクロマトグラムを示す。ヘキサ−ＴＣＴＰ−ポリオキシム形成に関して観察されるように、ヘキサ−ＰｅｐＣ−ポリオキシム形成は、インキュベーション１８時間後に実質的に完了した。反応は、上記実施例３に記載したような分取ＲＰ−ＨＰＬＣを実施することにより停止させた。
上記したようなエレクトロスプレーイオン化質量分光光度法を用いて、ヘキサ−ＰｅｐＣ−ポリオキシムの分子量を測定したところ、６ＡＯＡ−ＰｅｐＣ  ＣＯＳＭのベースプレート構造体への結さつ体に関する予測値１４，９６６．５８ダルトンに対して、１４，９６５．９６＋／−１．４４ダルトンであった（配列番号：６）（第９図）。比較例として、実験から得たエレクトロスプレーイオン化質量スペクトラムを示す。ここでＡＯＡ−ＰｅｐＣ  ＣＯＳＭ（配列番号：１０）をオクターＧＸＬ−ベースプレート構造体に化学選択的結さつした（配列番号：９）（第１０図）。ここでも、測定値１９９１６．６１＋／−３．０５ダルトンは、８Ｐｅｐ  Ｃ  ＣＯＳＭ含有ポリオキシムに関する予測値１９９１６．０９７ダルトンとよく一致していた。
実施例５．ヘキサ−ＡＯＡ−ベースプレートとＧＸＬ−ＴＣＴＰ  ＣＯＳＭＳの化学選択的結さつによるヘキサ−ＴＣＴＰ−ポリオキシムの平行アセンブリー
ヘキサ−ＴＣＴＰ−ポリオキシムの平行アセンブリーは、ヘキサ−ＡＯＡ−ベースプレート構造体（水中１０ｍＭ）１μｌを０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液１８０μｌ、ｐＨ４．６及びＧＸＬ−ＴＣＴＰ  ＣＯＳＭ（配列番号：３）（水中１０ｍＭ）３０μｌを添加することにより開始した。試料を混合し、室温でインキュベーションした。ＧＸＬ−ＴＣＴＰは、ベースプレート（配列番号：５）上の各ＡＯＡ基に対して５倍モル過剰に存在していた。予測ヘキサ−ＴＣＴＰ−ポリオキシムの構造を、第１１図に示す。この構造は、オキシム結合の立体化学を除いて第１図の構造と類似である。
化学選択的結さつの程度は、上記したようにしてＲＰ−ＨＰＬＣにより監視したところ、ヘキサ−ＴＣＴＰ−ポリオキシムの形成は、インキュベーション５６時間後に完了した。７５時間の監視時間中に、さらなる変化は生じなかった。反応を停止し、ヘキサ−ＴＣＴＰ−ポリオキシム生成物を分取ＲＰ−ＨＰＬＣにより精製した。
分子量をエレクトロスプレーイオン化質量分光光度法により測定したところ、６ＴＣＴＰ  ＣＯＳＭのベースプレート構造体への結さつ体について予測される予測分子量１０，３６５．４９ダルトンに対して、１０，３６５．７２ダルトンであった。また、測定分子量は、第１図に示される生成物の分子量に極めて類似しており、１０，３６７．４１ダルトン（第５図参照）であった。
実施例６．Ｃ末端アルデヒドを有するＣＯＳＭを用いたポリオキシムの調製
Ｃ末端アルデヒド基を含有するプロテアーゼインヒビタであるＬｅｕｐｅｐｔｉｎ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍ．Ｃｏ）を、ヘキサ−ＡＯＡ−ベースプレート構造体に化学選択的に結さつした（配列番号：５）。Ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ（水中１０ｍＭ）３０μｌ及び酢酸ナトリウム緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ４．６）１８０μｌを、ヘキサ−ＡＯＡ−ベースプレート（水中１０ｍＭ）１μｌに添加した。室温で１５時間インキュベーションして反応させた後、反応混合物２０μｌを取り出し、実施例１に記載したようにして、一分当たり２％Ｂの割合で０％から１００％Ｂまで標準勾配をつけたＲＰ−ＨＰＬＣにより分析した。ヘキサ−ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ−オキシムは、保持時間４３分で溶出した。ヘキサ−ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ−オキシムの質量をエレクトロスプレー質量分光光度法により測定したところ、３７７６．４５±０．７０ダルトンであり、予測値３７７５．６６ダルトンとよく一致した。
実施例７．ヘキサ−ＣＯＳＭ−ポリオキシムを用いた免疫化
完全フロイントアジュバントに添加した第１図に示したヘキサ−ＣＯＳＭ−ポリオキシム、ヘキサ−ＴＣＴＰ−ポリオキシム生成物約１００μｇを、１群のウサギの各々の約１０部位に皮下注射した。約４〜６週間の間隔で、ウサギに、不完全フロイントアジュバントにヘキサ−ＣＯＳＭ−ポリオキシム５０μｇを含有するブースター注射した。ブースター注射約１０〜１４日後、ウサギを放血し、血清を分離した。血清は、抗原として使用されるヘキサ−ＴＣＴＰ−ポリオキシムに対して交差反応性を有していた。当業者は、抗原の使用量、アジュバントの種類、注射部位及び方法並びに注射のタイミングを変化できることが分かるであろう（例えばＨａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ（１９８８）、第５章参照）。ヘキサ−ＴＣＴＰ−ポリオキシ免疫した動物から得た抗血清は、ヘキサ−ＴＣＴＰ−ポリオキシムと反応した。抗血清は、ＴＣＴＰタンパク質を二次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥににより分離し、抗血清でプロービング後標識ヤギ抗ウサギ血清でプロービングしたイムノブロットアッセイにおいてＴＣＴＰタンパク質と交差反応しなかった。同様に、オクタ−ＴＣＴＰ−ＭＡＰ構造体が、ＴＣＴＰタンパク質と交差反応しなかったオクタ−ＴＣＴＰ−ＭＡＰ（ＭＡＰは、Ｔａｍ及びＺａｖａｌａにより開示されているような「Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅ」（１９８９））に対する抗体の産生が生じた。これに対して、ヘキサ−ＴＣＴＰ−ポリオキシムは、イムノブロットアッセイにおいてヘプトグロビンのβ鎖と交差反応により人為構造を生成した。抗体は、例えば、イムノドットブロットアッセイを用いて検出し、当業者に周知の方法を用いて精製できる（例えば、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ（１９８８）、第１７８〜第１７９頁及び第８章参照）。
実施例８．シグナル発生基を有するポリオキシムの調製
シグナル発生基を、オキシム化反応前又は後にＣＯＳＭ又はベースプレート構造体に結合する。ビオチンのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル又はＢｏｃ−ビオチン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを、上記したペプチド合成に関する標準条件を用いてＨ−Ｇｌｙ3〔Ｌｙｓ（Ｂｏｃ−Ｓｅｒ（ｂｅｎｚｙｌ）〕5−Ｇｌｙ−ＰＡＭ樹脂のα−アミノ基に結合する。別法として、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（ＥＤＴＡペンタ−ｔ−ブチルエステル）−ＯＨ等のキレーター基を、当該技術分野において周知の方法を用いて、ベースプレートのα−アミノ基に結合する（例えば、Ｒａｎａ等、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．３３：４５２１−４５２４（１９９２）参照；引用することにより本明細書の開示の一部とされる）。ビオチンもＥＤＴＡも、開裂脱保護反応、ＧＸＬ−ベースプレートに対する酸化反応又は標識ベースプレート構造体のＡＯＡ−ＣＯＳＭとのオキシム反応によっては損傷しない。得られたポリ−ＣＯＳＭ−オキシムは、アミノ末端ビオチン又はＥＤＴＡ基を含有する。
実施例９．ポリオキシムの固体表面への結合
ポリオキシムを固体表面に結合するために化学選択的結さつを使用できる。例えば、ポリオキシムを、チオール化学を用いて表面に結合できる。ブロモアセチル−Ｇｌｙ3〔Ｌｙｓ（Ｓｅｒ）〕5Ｇｌｙ−ＯＨを、上記したようにして標準固相ペプチド合成により製造し、ペンタ−ＧＸＬ−ベースプレート（配列番号：８）に酸化し、ＡＯＡ−ＣＯＳＭでオキシム化し、ＲＰ−ＨＰＬＣにより精製した。
チオール基を、当該技術分野において公知の方法を用いて表面に結合する。表面にアミノプロピル基を含有する固体物質を、まずＳ−アセチルチオ酢酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルで処理することによりアシル化する。次に、アシル化表面を、ヒドロキシルアミン希薄水溶液で処理して反応性チオール基を脱アシル化し露出させる。ブロモアセチル−ポリオキシムを、穏やかな水性条件下ｐＨ４〜９でチオエーテル結合を形成することにより、固体表面上のチオール基に結合する。好ましくは、チオエーテル形成を、ｐＨ６．５〜７．５で実施する（例えば、Ｂｒｉｎｋｌｅｙ，Ｍ．，Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．３：２〜１３（１９９２）参照。ここに開示されている内容は、引用するこにとより本明細書の開示の一部とされる）。未結合物質を、表面洗浄により除去する。
実施例１０．結合ポリオキシム介在細胞−細胞結合
２種類の異なるポリオキシムを、上記した方法を用いて合成する。一種類のポリオキシムは、主要抗原を認識し且つそれに結合するＣＯＳＭを含有する。他種類のポリオキシムは、例えばマクロファージ、Ｔ細胞又はキラー細胞に存在する細胞表面レセプターを認識し且つそれに結合するＣＯＳＭを含有する。これら二種類のポリオキシムを、スルフヒドリル基及びブロモアセチル基等のベースプレート構造体のＣ末端又はＮ末端が相補直交化学的反応性基を有するように構成する。
次に、２種類のポリオキシムを、穏やかな水性条件下でｐＨ４〜９でチオエーテル形成することにより共有結合できる。好ましくは、チオエーテル形成を、ｐＨ６．５〜７．５で実施する。反応の完了後、ビ−ポリオキシムをゲル濾過又はＲＰ−ＨＰＬＣ等の標準法により精製し、マクロファージ、Ｔ細胞又はキラー細胞等の適当なレセプター又は標的分子を含有する細胞と主要細胞との間の細胞結合に介在するのに使用される。このようなビ−ポリオキシムは、上記に記載したようなもの等のエフェクター細胞を腫瘍細胞等の意図する標的細胞に局在化するのに使用される。
当業者は、異なる細胞表面レセプター及び標的分子は、種々の細胞により同定されることが分かるであろう。したがって、ビ−ポリオキシムは、特定の意図する細胞の結合に介在するように構成される。
また、当業者は、ビ−ポリオキシムは特定の細胞を認識し且つそれに結合できる一つの種類のＣＯＳＭと例えばリポーター分子を結合するのに有用である第二種類のＣＯＳＭとを含有できることも分かるであろう。このようなビ−ポリオキシムは、不均一集団の細胞又は動物における特定細胞の存在及び位置を検出するのに有用である。別法として、第二種類のＣＯＳＭは、リシン等のエフェクター分子を結合することにより、エフェクター分子を意図する特定細胞指向とすることができる。
実施例１１．種々のメラニン細胞刺激ホルモン類似体−ポリオキシムの平行アセンブリー
Ｎ末端アミノオキシアセチル基を担持する合成ポリペプチドＮＨ2ＯＣＨ2ＣＯ−Ｎｌｅ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−（Ｄ−Ｐｈｅ）−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−ＯＨ及びＮＨ２ＯＣＨ２ＣＯ−Ｎｌｅ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−（Ｄ−Ｐｈｅ）−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−アミド（両方ともα−メラニン細胞刺激ホルモン（「ＭＳＨ」）類似体）を調製し、別個にポリ（アルデヒド）ベースプレート分子、例えば、テレフタルアルデヒド又はＯＣＨ−ＣＯ−ＧＬｙ3−〔Ｌｙｓ（ＣＯＣＨＯ）〕5−Ｇｌｙ−ＯＨ（配列番号：６）とともに、酢酸緩衝水溶液、ｐＨ４．６、室温でインキュベーションした。オキシム化反応後に、上記した逆相ＨＰＬＣを行った。二価及び三価アルデヒドベースプレートとの反応は迅速（１時間）であり、一方、六価又は八価アルデヒドベースプレートとの反応はより長い時間（約１６時間）を要したが、それでも完了近くまで進行した。最終生成物は、各場合において、質量分光光度法により特性決定した。全ての実験的に測定した質量は、理論値とよく一致していた。ＮＨ２ＯＣＨ２ＣＯ−Ｎｌｅ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ（Ｄ−Ｐｈｅ）−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−ＯＨ及びＮＨ２ＯＣＨ２ＣＯ−Ｎｌｅ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ（Ｄ−Ｐｈｅ）−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−アミドはテレフタルアルデヒドと円滑に反応してホモダイマーｐ−Ｃ６Ｈ４〔ＣＨ＝ＮＯＣＨ２ＣＯ−Ｎｌｅ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−（Ｄ−Ｐｈｅ）−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−ＯＨ〕２及びｐ−Ｃ６Ｈ４〔ＣＨ＝ＮＯＣＨ２ＣＯ−Ｎｌｅ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−（Ｄ−Ｐｈｅ）−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−アミド〕２を生成した。−ＯＨ形態のＥＳＩ−ＭＳを、第１２Ｂ図に示す。生成物は、一般的に高度に水溶性であった。但し、この性質は、使用される成分の親水性によることが明らかである。オキシム結合の極性を逆にすることにより、異性体種が生成した。
ＨＰＬＣ分析により、ポリオキシムが室温、ｐＨ２．１、４．６及び７．０で、少なくとも２４時間加水分解安定性であることが分かった。構造により影響を受けることが判明したオキシム結合加水分解安定性は、以下の順序で増加することが観察された：−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ＝Ｎ−Ｏ−ＣＨ２＜−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ＝Ｎ−Ｏ−ＣＨ２−＜−Ｃ６Ｈ４−ＣＨ＝Ｎ−Ｏ−ＣＨ２−。したがって、生体外オキシム結合の安定性により、免疫接合体の生体分布の研究を、数日間かかるマウス及び臨床で行うことができる。勿論、これらの人工タンパク質は、天然ポリペプチド及びタンパク質のように、脱アミド化、酸化、微生物分解等することが予測される。
実施例１２．二価及び三価アルデヒドベースプレートの合成
ニトリロ酢酸（Ｆｌｕｋａ、１ｍｍｏｌカルボキシル基６４ｍｇ）を、音波処理及びわずかに温めて、ＤＭＦ１５ｍｌに溶解した。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド固形物（Ｆｌｕｋａ）１ｍｍｏｌを添加し溶解した後、１Ｍジシクロヘキシルカルボジイミド（Ｆｌｕｋａ）１ｍｌを添加した。室温で一晩反応した後、ＤＣＣが存在せず、反応混合物を濾過して、ＤＣＣ尿素析出物の一部分を除去した。濾液に、アミノアセトアルデヒドジエチルアセタール（Ｆｌｕｋａ）１．２ｍｍｏｌを添加した。一晩反応した後、０．１％トリフルオロ酢酸３０ｍｌを添加し、その後、９０％アセトニトリルの０．１％ＴＦＡ溶液１ｍｌを添加後、酢酸０．６ｍｌを添加した。完全に混合した後、ＤＣＣ尿素を再び、Ｔｅｆｌｏｎ膜フィルターにより濾去した。生成物のうちの１０ｍｌを、上記した２５０ｘ２０ｍｍカラムを用いた分取ＨＰＬＣにより、２１４ｎｍで監視し、ＴＦＡ系を用いて６ｍｌ／分で実施することにより精製した。溶媒Ａ（０．１％ＴＦＡ）により５分間溶離した後、２％Ｂ／分の直線勾配を適用した（Ｂ＝アセトニトリル９０％中ＴＦＡ０．１％）。三価アセタールＮ〔ＣＨ２−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ（ＯＥｔ）２〕3の保持時間は４２分であり、二価アセタールＮ〔ＣＨ２−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ（ＯＥｔ）２〕2ＣＨ２−ＣＯ２Ｈの保持時間は３５分であった。生成物を、ＦＡＢ−ＭＳにより同定した：三価アセタールのＭ＋Ｈ+についてはｍ／ｚ５３７及び二価アセタールのＭ＋Ｈ+についてはｍ／ｚ４２２。
ロータリーエバポレータ及び凍結乾燥により溶媒を除去した後、脱アセタール化を、５％ＴＦＡ、３７℃、２時間の条件で行った。もし５％ＴＦＡ溶液を直接蒸発させるとトリアルデヒドが分解するので、生成物Ｎ〔ＣＨ２−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨＯ〕3を、少量（３０μｌ）、溶媒Ａにより定組成で６ｍｌ／分で操作している分取カラムに注入し、カラムを注入の間に１００％Ｂで洗浄することにより単離した。脱保護からの過剰ＴＦＡは保持時間１１分で溶出し、生成物トリアルデヒドベースプレートは１３分で溶出した。トリアルデヒド溶液を、１Ｍ  ＮａＯＨでｐＨ約３に調整し、−２０℃で保存した。二価アルデヒドベースプレートを、同様に単離した。
実施例１３．非対称二価及び対称三価ポリオキシムの調製
三価対称ベースプレートＮ〔ＣＨ２−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨＯ〕3と実施例１１のアミノ−オキシ−アセチル−α−ＭＳＨ遊離酸類似体との間のオキシム化を、上記したようにして実施した。モノ−、ジ−及びトリオキシムが調製された。これらは、分析的ＨＰＬＣ（２５０ｘ４ｍｍ内径カラム、０．６ｍｌ／分、２％Ｂ／分勾配）で、それぞれ保持時間３２分、３５分及び３６分で溶出した。
実施例１４．アセチル−システインベースプレートの合成
乾燥ＤＭＳＯ２０ｍｌに添加したＦｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＳｕ０．２ｍｍｏｌを、Ｈ−Ｇｌｙ３−Ｌｙｓ〔Ｂｏｃ−Ｓｅｒ（ＢｚＩ）−〕５−Ｇｌｙ−ＯＣＨ２−ＰＡＭ−樹脂０．１ｍｍｏｌに添加した。「ＯＳｕ」は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル体を示す。見掛けｐＨ８（Ｎ−メチルモルホリンで調整）で数時間混合後、アシル化が完了したことがニンヒドリン試験により確認された。ＦｍｏｃをＤＭＦ／ピペリジンを用いて除去し、得られた遊離アミノ基を、Ｎ−メチルモルホリンを塩基として用いてＤＭＦ中無水酢酸５当量でアセチル化した。開裂／脱保護は、以下のようにして行った：樹脂１００ｍｇに、チオアニソール／エタンジチオール（容積比＝２：１）１５０μｌを添加し；室温で１０分間攪拌後、ＴＦＡ１ｍｌを添加し、攪拌を１０分間継続し；次に、ＴＦＭＳＡ（トリフルオロメタン硫酸）１００μｌを、激しく攪拌しながらゆっくりと添加し、反応を攪拌しながら２５分間進行させ；次に、冷ジエチルエーテル（１０ｍｌ）を添加してペプチドを析出させ；１分間攪拌後、析出物をここで開裂された樹脂と一緒に遠心分離により回収し；粗ペプチドをＴＦＡ０．５ｍｌに溶解し、Ｔｅｆｌｏｎフィルターにより樹脂を濾去した後、再び冷エーテルで析出させた。生成物を、２５０ｘ４ｍｍ内径カラムを用いたＨＰＬＣを、０．６ｍｌ／分で、最初の５分間１００％Ａ後、ＴＦＡ系を用いて１％Ｂ／分で実施することにより精製した。生成物は、保持時間２５分間で主要ピークとして溶出し、ＥＳＩ−ＭＳにより特性決定した（１４６７．９２＋／−０．７９；理論値１４６６．６２）。
実施例１５．ヘテロポリオキシムの調製
多価ベースプレートに付加した変更ペプチドの量を制限することにより、部分反応生成物が迅速に生成し、容易に単離された。例えば、ＮＨ2ＯＣＨ2ＣＯ−Ｎｌｅ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−（Ｄ−Ｐｈｅ）−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−ＯＨは、５倍過剰のテレフタルアルデヒド（１０倍過剰のアルデヒド基）と円滑に反応して、ＯＣＨ−Ｃ6Ｈ4−ｐ−ＣＨ＝ＮＯＣＨ2ＣＯ−Ｎｌｅ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−（Ｄ−Ｐｈｅ）−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−ＯＨが得られ、これをＨＰＬＣにより単離し、ＥＳＩ−ＭＳにより特性決定した（第１２Ａ図）。このモノオキシムとわずかに過剰のＮＨ2ＯＣＨ2ＣＯ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−ＯＨ（配列番号：４）との反応により、意図したヘテロダイマーオキシムｐ−Ｃ6Ｈ4〔ＣＨ＝ＮＯＣＨ2ＣＯ−Ｎｌｅ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−（Ｄ−Ｐｈｅ）−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−ＯＨ〕〔ＣＨ＝ＮＯＣＨ2ＣＯ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−ＯＨ〕が迅速に得られ、これをＥＳＩ−ＭＳにより特性決定した（第１２Ｃ図）。類似のヘテロダイマーを、ＮＨ2ＯＣＨ2ＣＯ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−ＯＨ〕（配列番号：４）の代わりにＮＨ2ＯＣＨ2ＣＯ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−ＯＨ〕（配列番号：１３）を用いて調製し、これもＥＳＩ−ＭＳにより特性決定した（第１２Ｄ図）。
実施例１６．アルキル化による相補反応性基のペプチドシステイン側鎖への結合及びそれに続くポリオキシム形成
化合物（ｉ）Ｂｒ−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２−Ｏ−ＮＨ−Ｂｏｃ及び（ｉｉ）Ｂｒ−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２−Ｏ−ＮＨ２を、以下のようにして合成した：酢酸エチル８５ｍｌに溶解したＢｏｃ−ＮＨＯＣＨ２ＣＯ−ＯＳｕ１０ｍｍｏｌに、混合しながらエチレンジアミン１．３５ｍｌ（２０ｍｍｏｌ）を添加した。室温で１時間後、析出物を遠心分離により除去し、その後加熱することなくロータリーエバポレータにより溶媒除去を行った。得られた粘着性残留物を、１％酢酸２０ｍｌに入れた。少量の不溶性ダイマー物質を、この段階で遠心分離により除去した。水溶液を氷冷した後、予め水で平衡化し、１０ｍｌ使い捨てポリプロピレンシリンジに充填し、氷冷したＤｏｗｅｘ−５０Ｗｘ８  ２００−４００メッシュカラム（Ｈ＋型）に附した。氷を使用して、試料結合中に樹脂によるプロトンの遊離によりＢｏｃ保護基が損失するのを減少させた。Ｄｏｗｅｘカラムの溶離を、ｐＨ３．５緩衝液（ピリジン／酢酸／水容積比＝１０：１００：８９０）４０ｍｌチャンバーをｐＨ６．５緩衝液（ピリジン／酢酸／水容積比＝２５０：１０：２２５０）４０ｍｌチャンバーとを接続し且つｐＨ３．５チャンバーから抜き出すことによるピリジン酢酸緩衝液勾配を用いて、流量約０．５ｍｌ／分で行った。カラム流出液を、ブタン−１−オール／酢酸／水／アセトン（容積比＝７：２：４：７）系を用いたシリカプレートによるＴＬＣで監視した後、ニンヒドリンで染色した。中間体化合物（ｉｉｉ）ＮＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２−Ｏ−ＮＨ−Ｂｏｃは、出てきた最初のニンヒドリン陽性物質であり（Ｒｆは、上記系で約０．７であり；ｄｅ−Ｂｏｃ物質のＲｆは約０．４であり；エチレンジアミンのＲｆは約０．０７であった）。加熱することなくロータリーエバポレータで溶媒除去した後、残留物を水で希釈し、凍結乾燥して無色油状物とした。最終精製を、直径２０ｍｍのカラムを用いたＨＰＬＣにより、ＴＦＡ系、５ｍｌ／分、定組成１００％Ａ１０分後、溶媒Ｂを１５分間かけて１００％Ｂとする直線勾配により行った。この際、２２９ｎｍで監視した。標的物質は、溶媒前部が出た後の唯一の主要ピークであり、保持時間が約３３分であった。中間体は、エレクトロスプレーイオン化質量分光光度法により（ｉｉｉ）として同定された。
ＢｒＣＨ２ＣＯ−ＯＳｕ２５０ｍｇをＤＭＳＯ２ｍｌに溶解した溶液に、混合しながら化合物（ｉｉｉ）をＤＭＳＯ１ｍｌに溶解した溶液１１０ｍｇを添加した。見掛けｐＨ（予め水で湿したＭｅｒｃｋ  ｐＨ指示薬ストリップで測定）を、Ｎ−メチルモルホリン５０μｌを添加して約８とした。２０分後（ｐＨが約４に低下）、水２５ｍｌを添加した。わずかな析出物を濾過により除去し、上記したようにしてＲＰ−ＨＰＬＣにより単離した。この場合、試料を、約８ｍｌづつ適用した。１００％Ａ定組成５分後、２％Ｂ／分の直線勾配を、２２９ｎｍで監視しながら適用した。生成物は、溶媒前部の出現後唯一の主要ピークであり、保持時間は、約４１分間であった。生成物をロータリーエバポレータで単離後、凍結乾燥した。収量は、約１００ｍｇであった。エレクトロスプレーイオン化質量分光光度法により化合物（ｉ）として確認された物質は、ほぼＭ＋Ｈ３５５の予測された臭素同位体パターンを示した。
化合物（ｉ）をトリフルオロ酢酸に室温で３０分間５０ｍｇ／ｍｌ溶解することにより化合物（ｉ）のＢｏｃ基を除去した後、高真空下で乾燥することにより、化合物（ｉｉ）を調製した。
化合物（ｉ）及び（ｉｉ）を、水にそれぞれ４０及び５０ｍｇ／ｍｌに入れ、アルキル化した。ペプチドアセチル−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−アミド（配列番号：２０；インフルエンザウイルスのＴ細胞エピトープ；Ｂｒｏｗｎ等、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９３）６７：２８８７〜２８９３参照）を、ＡＢＩ４３０Ａシンセサイザーを用いた標準Ｆｍｏｃ法により製造し、逆相ＨＰＬＣにより精製し、エレクトロスプレーイオン化質量分光光度法により同定した；質量の測定値及び理論値は１４２３．６であった。このペプチドを、水／アセトニトリル（２：１ｖ／ｖ）に１．５ｍＭで溶解した。０．１％トリフルオロ酢酸１００μｌに、ペプチド溶液２０μｌ、試薬溶液（化合物（ｉ）又は（ｉｉ））２０μｌ及び１Ｍリン酸緩衝液（対イオンナトリウム、ｐＨ７．０）２０μｌを添加した。反応を、室温で実施した。ＴＦＡ系を用いた分析的逆相ＨＰＬＣにより、３０分以内に、化合物（ｉ）及び（ｉｉ）との定量的反応が示され；未反応ペプチド（保持時間３９分間）がなく、代わりに、保持時間３７分（化合物（ｉｉ）との反応の場合）又は４１分（化合物（ｉ）との反応の場合）に新しいピークが出現した。続く３時間はさらなる反応が生じなかった。試薬（ｉ）又は（ｉｉ）の不存在下では、ペプチドはゆっくりと酸化してジスルフィドダイマーとなった（６時間で約３０％）。アルキル化反応の生成物を、エレクトロスプレーイオン化質量分光光度法により同定し；試薬（ｉ）の場合の生成物に関しては、質量の測定値１６９７．０であり、理論値１６９６．９であり；試薬（ｉｉ）の場合の生成物に関しては、質量の測定値１５９６．６であり、理論値１５９６．８であった。
化合物（ｉ）でアルキル化されたポリペプチドの場合、Ｂｏｃ基を、オキシム化の前に標準ＴＦＡ処理により除去した。化合物（ｉｉ）でアルキル化したポリペプチドは、この処理の必要がなかった。アルキル化ペプチドを長期間貯蔵しなければならない場合には試薬（ｉ）が推奨され、一方、Ｂｏｃ基を除去するための無傷処理で容易には生き残れない大きいか脆弱なポリペプチド（抗体断片等）とともに使用するには、試薬（ｉｉ）が推奨される。
別のアルキル化試薬Ｂｒ−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＮＨ−ＣＯＣＨ2ＯＮＨ−Ｂｏｃを、Ｂｒ−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＮＨ2（ウイスコンシン州ミルウオーキーにあるＡｌｄｒｉｃｈ社から臭水素化物として入手できる）のＢｏｃ−ＡＯＡ−ＯＳｕによるアシル化を行い調製した。このハロゲン化アルキルを使用して、上記したＣｙｓ含有インフルエンザウイルスをアルキル化した。反応が、ミリモル濃度でさえ室温で極めてゆっくりと生じた。
実施例１７．チオエーテル結合アミノオキシアセチル相補反応基を有するペプチドの平行アセンブリー
チオエーテル結合を介してＣｙｓ側鎖に結合した遊離アミノオキシアセチル基を担持したポリペプチドを、Ｎ−又はＣ−末端上にアミノオキシアセチル基を担持するポリペプチドに関して上記したようなオキシム反応に使用した。これにより、チオエーテルとオキシム結合を介するＣｙｓ側鎖を介してベースプレートに接続したＣＯＳＭを有するポリオキシムの製造方法が提供される。実施例１６のポリペプチド誘導体を、ここに記載するベースプレートとともに使用して種々のポリオキシムを形成した。例えば、アセチル−Ａｓｐ−Ｃｙｓ（ＣＨ２ＣＯＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−ＣＯＣＨ２ＯＮＨ２）−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−アミド（配列番号：２１）とベースプレートＧＸＬ−Ｌｙｓ（ＧＸＬ）−Ｌｙｓ（ＧＸＬ−Ｌｙｓ（ＧＸＬ））−Ｔｙｒ−ＯＨ（配列番号：３１）との間のテトラオキシムを形成できる。ベースプレートを、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）をＴｙｒ（ｔＢｕ）−Ｓａｓｒｉｎ樹脂に結合させる工程、脱Ｆｍｏｃ工程、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）の再結合工程、脱Ｆｍｏｃ工程、Ｂｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）の結合工程、開裂／脱保護工程及びＳｅｒをＧＸＬに酸化する工程により形成した。また、ＡＯＡ−Ｌｙｓ（ＡＯＡ）−Ｌｙｓ（ＡＯＡ−Ｌｙｓ（ＡＯＡ））−Ｔｙｒ−ＯＨも製造した。
実施例１８．ジスルフィド結合を介する反応基のシステインの側鎖への結合
化合物（ｉｖ）２−ピリジル−Ｓ−Ｓ−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２−Ｏ−ＮＨ−Ｂｏｃ及び（ｖ）２−ピリジル−Ｓ−Ｓ−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２−Ｏ−ＮＨ２を、以下のようにして合成した。シスタミンジヒドロクロリドを、ＤＭＦ中Ｂｏｃ−ＮＨＯＣＨ２ＣＯ−ＯＳｕで、塩基としてのＮ−メチル−モルホリンとアミノ基に対して２０％過剰の活性エステルを用いてアシル化した。３容の水で希釈後、アシル化生成物を酢酸エチルに抽出し、ジクロロメタン／メタノール（２４０：１０）を溶媒として用いたシリカゲルカラムにより精製した。生成物ビス（Ｂｏｃ−アミノオキシアセチル）シスタミンは、分析的ＨＰＬＣでは単一ピークであり、予測された質量スペクトルを示した。ジスルフィド結合を、１％重炭酸アンモニウム溶液に添加した５倍過剰のジチオトレイトールで還元し、得られたＢｏｃ−アミノオキシアセチル−システアミンを分取ＨＰＬＣにより単離した。チオール基を２，２’−ジチオジピリジン（０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ４．６に５倍量添加した溶液）と反応させて化合物（ｉｖ）を得て、ジエチルエーテルでの抽出により単離した（過剰試薬とともに）。小割合の石油エーテルを添加すると、過剰試薬のほとんどが析出し、溶液に化合物（ｉｖ）が残った。ロータリー蒸発後、化合物（ｉｖ）を、ＨＰＬＣで精製し、エレクトロスプレーイオン化質量分光光度法により特性決定した（Ｍ＋Ｈ３６０．５）。化合物（ｉｖ）の化合物（ｖ）への転換は、ＴＦＡでの標準処理（１時間、室温）により達成された。化合物（ｉｖ）及び（ｖ）は、穏やかな水性条件下で、２−チオピリジル基を介してＣｙｓ含有ペプチドと完全に反応した（例えば、酢酸緩衝液ｐＨ４．６又はリン酸緩衝液ｐＨ７、試薬低ミリモル濃度２２℃；反応は１０分後に完了した）。
例えば、化合物（ｉｖ）及び（ｖ）を、ペプチドアセチル−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−アミド及びＡＯＡ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−アミド（配列番号：２２）と反応させた。アセチル−Ａｓｐ−Ｃｙｓ（Ｓ−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣＯＣＨ２ＯＮＨ−Ｂｏｃ）−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−アミド（配列番号：３０）を、ＲＰ−ＨＰＬＣにより精製し、エレクトロスプレーイオン化質量分光光度法により特性決定した；質量測定値１６７１．７、質量理論値１６７１．９。Ｃｙｓは、慣例のようにＳ原子を含み、例えば、上記構造におけるＣｙｓ（Ｓ−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣＯＣＨ２ＯＮＨ−Ｂｏｃ）は、ＣｙｓのＳ原子とＳ−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣＯＣＨ２ＯＮＨ−ＢｏｃのＳ原子との間に形成された側鎖を含有するジスルフィドを示す。これは、全体を通して当てはまる。得られたペプチド誘導体は、ジスルフィド結合を介して結合したアミノオキシアセチル（又は保護されたアミノオキシアセチル）基を有していた。
アミノオキシアセチル基とジチオピリジル基は、同じペプチドＣＯＳＭに存在できる。例えば、ＮＨ2ＯＣＨ2ＣＯ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ（Ｓ−２−ピリジル）−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−ＮＨ2（配列番号：２３）を、ＡＯＡ−ペプチドの−ＳＨ体と２，２’−ジチオジピリジンとの反応（上記した条件下でｐＨ４．６）により生成した。変更ペプチドを、ＨＰＬＣにより単離した。この変更ペプチドは、予測されたエレクトロスプレーイオン化質量スペクトルを示した。このペプチドＣＯＳＭを、０．１Ｍ酢酸緩衝液（対イオンナトリウム）とアセトニトリルとの混合物（容積比２：１）中において、以下のように製造したテトラアルキルベースプレートと反応させた。ベースプレートを、Ｍｕｔｔｅｒ（Ｔｕｃｈｓｃｈｅｒｅｒ等、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  １９９２、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ、Ｃ．Ｈ．及びＥｂｅｒｌｅ、Ａ．Ｎ．編集、ＥＳＣＯＭ、Ｌｅｉｄｅｎ、（１９９３）第８４８〜８４９頁）に記載された２Ｃｙｓ（Ｃ）残基：Ａｃ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−ＮＨ２（配列番号：２４）間にジスルフィド結合を有する環状構造に基づいて構成した。この鋳型前駆体の４Ｌｙｓ（Ｋ）側鎖を、標準条件下Ｂｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＳｕでアシル化した。アシル化生成物をＨＰＬＣにより単離し、Ｂｏｃ及びブチル保護を、室温で１時間のＴＦＡ処理により除去した。ＴＦＡを、加熱することなく真空下で除去した。得られたベースプレート前駆体（分析的ＨＰＬＣで単一ピークを示し且つ予測されたエレクトロスプレーイオン化質量スペクトルを示す）を、前記ベースプレートについて説明したような過ヨウ素酸塩で酸化し、ＨＰＬＣにより再単離した。室温で１６時間オキシム化後、予測されたテトラオキシムをＨＰＬＣにより単離し、エレクトロスプレーイオン化質量分光光度法により特性決定した：質量測定値７４７９．３１、理論値７４７９．４３。ポリオキシムは、０から１００％Ｂまで２％Ｂ／分の勾配で溶離した時に４５分後に分析カラムから溶出した。
ここで明らかにされるように、Ｃｙｓ側鎖上の２−チオピリジル保護基の存在によってはオキシム形成は防止されなかった。
実施例１９．リンカーとしてのＣＯＳＭ
ここで調製されたＣＯＳＭは、自体リンカーとして使用できる。例えば、ＡＯＡ及び２−チオピリジル官能基の両方を有するＡＯＡ−ＣＯＳＭ  ＮＨ2ＯＣＨ2ＣＯ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ（Ｓ−２−ピリジル）−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−ＮＨ2（配列番号・２３）を、リンカーとして使用して、２Ｃｙｓ残基間にジスルフィド結合を有する以下のＣＯＳＭを形成した：
0003734828.tif 000002
実施例２０．芳香族アルデヒド基を有する三価ベースプレートの合成
ベースプレート
0003734828.tif 000003
を、以下のようにして合成した。トリス（２−アミノエチル）アミン（約１／３ｍｍｏｌ；Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）５０μｌをＤＭＳＯ５ｍｌに溶解し、４−カルボキシベンズアルデヒドヒドロキシスクシンイミドエステル（２４７ｍｇ、１ｍｍｏｌ、ＤＭＳＯ５ｍｌに溶解）に添加した。室温で２時間後、水２０ｍｌを添加した。さらに２時間後、生成物を、クロロホルム２ｘ１０ｍｌで抽出した。集めた有機相を水１０ｍｌで洗浄後、ロータリーエバポレータにより乾固した。淡黄色固体を水５０ｍｌ中で音波処理し、濾過し、高真空で乾燥して、わずかに黄色がかった白色粉末９４ｍｇを得た。生成物は、逆相ＨＰＬＣにより単一主要成分として溶出し、エレクトロスプレーイオン化質量分光光度法により（ｖｉ）として同定された：質量測定値及び理論値５４２（５４３Ｍ＋Ｈ）。ＨＰＬＣにより極微量であることが確認された少量（１０％未満）の不純物は、４−カルボキシベンズアルデヒド基（Ｍ＋Ｈ４１１）１個を欠く（ｖｉ）、即ち、ベースプレート：
0003734828.tif 000004
として同定された。
ある用途の場合、この不純物を、分取ＨＰＬＣにより除去した。上記アシル化反応においてより多くのトリス（２−アミノエチル）アミン（及び同量の活性エステル）を用いることにより、（ｖｉｉ）の予測通りであり、ＴＦＡ系を用いた分取ＨＰＬＣにより容易に単離された。
化合物（ｖｉ）及び（ｖｉｉ）の場合、用いたパラ置換は、アシル化反応及び続いてのオキシム形成に関して立体障害が最小となることが予想される。これらの構造体の中央窒素原子により、水溶性が確保され、トリアルデヒドであっても、用いるミリモル濃度で可溶である。
好ましいリンカーは、ここで教示される相補反応末端基を有し、反応生成物の均一性を提供し（以下で説明するような同族列を使用する時を除く）、且つ他の機能性（例えば、溶解性又は所望の三次元コンフォメーション）を提供するが、所望の反応を妨害しない（アルキル化、ジスルフィド形成又はオキシム形成）ものである。
実施例２１．芳香族アルデヒド鋳型を用いて調製したポリオキシム
上記したアミノオキシアセチル化ペプチドを有する（例えば、α−ＭＳＨ：ＡＯＡ−Ｎｌｅ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−（Ｄ）Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−アミドの類似体を有する）オキシムを含むポリオキシムを、芳香族トリ−及びジ−アルデヒド鋳型（ｖｉ）及び（ｖｉｉ）を用いて調製した。反応後、ＲＰ−ＨＰＬＣ及びエレクトロスプレーイオン化質量分光光度法を実施した。得られたポリオキシムを、ＨＰＬＣで精製し、エレクトロスプレーイオン化質量分光光度法で特性決定した：全ては、予測された質量を有していた。化合物（ｖｉ）及び（ｖｉｉ）は、特に加水分解及びさらには酢酸（０．３３Ｍ）中でのソジウムシアノボロヒドリド（０．３Ｍ）による還元に対しても耐性があるオキシムを形成することが分かった。
α−ＭＳＨ類似体Ｎｌｅ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−（Ｄ−ＰＨｅ）−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓは、α−アミノ基部が変更された時及びこの基を介してホモダイマーとして結合された時でも、メラノーマ細胞に結合することが公知である（Ｂａｇｕｔｔｉ等：Ｐｒｏｇ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．（１９９２）２６：１１０〜１１８）。ＭＳＨの生物活性は、例えば、ペプチドをＢ１６−Ｆ１メラノーマ細胞の刺激に関して試験するインサイチュメラニンアッセイを用いて測定できる（Ｂａｇｕｔｔｉ  １９９２）。
あるα−メラニン細胞刺激ホルモン類似体ポリオキシムの結合及び効力を測定した。マウスメラノーマ細胞を用いた結合アッセイにおける相対結合（Ｂａｇｕｔｔｉ（１９９２））は、全長天然ホルモンに関する平均解離定数（Ｋｄ）を本発明によるオキシム類似体に関するＫｄで割って得られた値を意味する。メラニンアッセイにおける相対効力（Ｂａｇｕｔｔｉ（１９９２））は、全長ホルモンと類似体濃度（最大作用の５０％が得られる濃度）の比を意味する。α−ＭＳＨの類似体、Ｎｌｅ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−（Ｄ）Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−アミドに関する結果が得られる。この類似体の対照モノオキシム（アセトアルデヒドでオキシム化したアミノオキシアセチルペプチド）は、相対結合が０．８２であり、相対効力が１．７８であった。アミノオキシアセチルペプチドと化合物（ｖｉ）との間で形成されたトリオキシムは、相対結合４．９及び相対効力０．２４であった。アミノオキシアセチルペプチドとグリオキサール（Ｏ＝ＣＨ−ＣＨ＝Ｏ）との間で形成されたジオキシムは、相対結合３．３３及び相対効力３．１５であった。
実施例２２．抗体断片のアルキル化及びそれに続くポリオキシム形成
また、化合物（ｉｉ）を用いて、Ｆ（ａｂ’）２断片の重鎖を結合するジスルフィド結合の還元により生成したＩｇＧ抗体のＦ（ａｂ’）断片を含むはるかに大きいポリペプチドをアルキル化した。モノクローナル抗体Ｍａｂ３５のＦ（ａｂ’）断片を、標準的な手段により調製した。ペプチドＦ（ａｂ’）2を、システアミンで還元してＦ（ａｂ’）ＳＨとし、次にこれを試薬（ｉｉ）でアルキル化し且つ以下のベースプレート（ｖｉ）か（ｖｉｉ）でオキシム化した。反応後、（分析前に１０ｍＭジチオトレイトールで完全還元するかせずに）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ゲル濾過クロマトグラフィー及びエレクトロスプレーイオン化質量分光光度法を実施した。意図したジオキシムが良好な収量で得られ、トリオキシムは低収量であった（恐らく、立体障害のため；このような障害は通常使用するリンカーが長いほど少ない）。生体内では、Ｆ（ａｂ’）2ポリオキシムは、腎臓における局在化を減少させて、排泄を減少させるであろう。
実施２３．オキシム結合の還元
還元されたオキシム結合は、非共役脂肪族オキシムよりも中性及び酸性ｐＨでの加水分解に対しての感受性が低い。オキシム結合の還元を、Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、編集長Ｂａｒｒｙ  Ｍ．Ｔｒｏｓｔ、第８巻、Ｉａｎ  Ｆｌｅｍｉｎｇ編集、第６０〜７８頁、Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、１９９１に記載の方法に準じて実施した。非共役脂肪族基、例えば、−ＣＨ２−ＣＨ＝ＮＯ−ＣＨ２−の間で形成されたオキシムは、０．３３Ｍ酢酸にソジウムシアノボロヒドリド０．３Ｍを添加した溶液により、室温で数分〜数時間で容易に還元された。長時間処理（例えば、一晩）では、分解した。還元生成物は、逆相ＨＰＬＣにより、未還元出発物質よりも早く溶出し、これをエレクトロスプレーイオン化質量分光光度法により同定したところ、予測された還元オキシム結合一個当たり２質量単位の増加が確認された。還元オキシム（ここでは、Ｎ，Ｏ−ジアルキルヒドロキシアミン）は、中性及び酸性ｐＨで、非共役脂肪族オキシムよりも加水分解に対する感受性が低かった。
共役脂肪族オキシム、例えば、−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＨ＝ＮＯ−ＣＨ２−は、還元剤での長時間処理により部分的にのみ還元された。芳香族オキシム、例えば、−Ｃ６Ｈ４−ＣＨ＝ＮＯ−ＣＨ２−は、これらの条件下では還元できなかった。このようなオキシムを還元し且つある状況下で有用であるより強力な条件は公知である（例えば、Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、編集長Ｂａｒｒｙ  Ｍ．Ｔｒｏｓｔ、第８巻、Ｉａｎ  Ｆｌｅｍｉｎｇ編集、第６０〜７８頁、Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、１９９１参照）。但し、この場合、トリプトファンのインドール側鎖等の存在する他の感受性のある基を還元しないように注意しなければならない。
実施例２４．免疫原性ポリオキシム
インフルエンザウイルスペプチドのＴ細胞エピトープ〔Ｈ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−ＮＨ２（Ｂｒｏｗｎ等、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９３）６７：２８８７−２８９３）〕及びＣ末端ペプチド含有Ｂ−及びＴ−エピトープ〔Ｈ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−ＯＨ（配列番号：２５；例えば＜Ｊａｃｋｓｏｎ、Ｄ．Ｃ．及びＢｒｏｗｎ、Ｌ．Ｅ．、Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９１）４：１１４−１２４）〕を用いて、ポリオキシム免疫抗原の調製を例証した。
ペプチドＡＯＡ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−ＯＨ（配列番号：２６）を、標準Ｆｍｏｃプロトコール及び市販のＦｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｓａｓｒｉｎ樹脂（スイス国ＡＧ、１４４  Ｈａｕｐｔｓｔｒａｓｓｅ、４４１６ＢｕｂｅｎｄｏｒｆにあるＢａｃｈｅｍ製）を用いたＡＢＩ  ４３０Ａでの自動化固相合成により調製した。開裂脱保護の前に、ペプチドを、樹脂上でＢｏｃ−ＮＨＯＣＨ２ＣＯ−ＯＳｕによりアシル化し、上記したようにして構成した。分取ＨＰＬＣによる精製後、ペプチドを、エレクトロスプレーイオン化質量分光光度法により、遊離アミノオキシアセチルペプチドと、一部をｐＨ４．６で小過剰のアセトアルデヒドとともにインキュベーションし、生成物をＨＰＬＣにより単離して形成されるオキシムの両方として特性決定した。アルデヒドオキシムの質量は、測定値２７４４．４６、理論値２７４４．１８であった。
Ａｃ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−ＮＨ２に基づく上記した環状ベースプレートを、ポリオキシム形成に使用した。これを、上記したようにして過ヨウ素酸塩で酸化し、ＨＰＬＣで単離した。次に、平行アセンブリーオキシム化を、上記した条件下でグリオキシリル基（Ｌｙｓ（Ｋ）側鎖上のＳｅｒ基の酸化により形成）とペプチドＡＯＡ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−ＯＨのアミノオキシアセチル基との間で実施した（酢酸緩衝液ｐＨ４．６、各グリオキシリル基に対して５倍過剰のペプチド、１６時間、室温）。得られたテトラオキシムを、ＨＰＬＣにより単離し、エレクトロスプレーイオン化質量分光光度法により特性決定した（測定値１２０９７．０８、理論値１２０９７．０４）。
ポリオキシム（この場合テトラオキシム）を、Ｔ細胞増殖アッセイで試験し、さらにはウイルスの攻撃に対する保護に関するマウスでの生体内試験を行った。
ここに記載の方法を用いて、免疫原性に有用な以下のＣＯＳＭも調製した：ＡＯＡ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−ＮＨ２（配列番号：２２）、Ａｃ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−ＡＯＡ）−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−ＮＨ２（配列番号：２７）、Ａｃ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ（ＣＨ２ＣＯＮＨＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−ＡＯＡ）−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−ＮＨ２（配列番号：２１）及び
0003734828.tif 000005
他の有用なＣＯＳＭは、以下のものである：Ａｃ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ*−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−ＡＯＡ（配列番号：２８）（式中、Ｃｙｓ*はＣｙｓのＳ−カルボキシアミドメチル誘導体である）、Ａｃ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−ＡＯＡ（配列番号：２９）及び
0003734828.tif 000006
ヘテロテトラオキシム免疫原性ポリオキシムは、典型的には、ＡＯＡ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ*−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−ＮＨ２とＡＯＡ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−ＯＨ（式中、Ｃｙｓ*はＣｙｓのＳ−カルボキシアミドメチル誘導体である）の両方の２コピーを有する。
実施例２５．ポリオキシム同族列
アミノオキシアセチル−（又はアルデヒド変更−）モノメトキシ−ポリエチレングリコール又はＣＯＳＭ混合物としての他の同族列ポリマーを使用することにより、ポリオキシムを分子自体内で均一とすることができる。このようなポリオキシムは、ＮＨ2ＯＣＨ2ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ2ＣＨ2Ｏ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）nＣＨ2ＣＨ2ＯＣＨ3又はＯ−ＣＨＣＨ2Ｏ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）nＣＨ2ＣＨ2ＯＣＨ3又はＯ＝ＣＨＣＯＮＨＣＨ2ＣＨ2Ｏ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）nＣＨ2ＣＨ2ＯＣＨ3（式中、ｎは整数である）等の同族列から選ばれたものの混合物の平行アセンブリーにより形成される。同族列のアルデヒド系及びＡＯＡ変更分子を、平行アセンブリーポリオキシム形成に使用できる。
上記したように、本発明によれば、異なる間隔、電荷、親油性、原子価、コンフォメーションの拘束、溶解性並びに他の所望の物理的及び生物学的（例えば、免疫学的）特性を有するＭＳＨ等のスクリーニング用生物学的化合物のポリオキシム多量体を迅速に合成する手段が提供される。
本発明は、上記実施態様により説明したが、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく種々の変更が可能であることが理解されなければならない。したがって、本発明は、以下の特許請求の範囲によってのみ限定される。
配列表
（１）一般情報
（ｉ）出願人：Ｒｏｓｅ，Ｋｅｉｔｈ
Ｏｆｆｏｒｄ，Ｒｏｂｉｎ
（ｉｉ）発明の名称：ポリオキシム及びそれらの製造
（ｉｉｉ）配列数：３１
（ｉｖ）郵便住所
（Ａ）住所：Ｃｏｏｌｅｙ  Ｇｏｄｗａｒｄ  Ｃａｓｔｒｏ
Ｈｕｄｄｌｅｓｏｎ  ＆  Ｔａｔｕｍ
（Ｂ）ストリート：５  Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ  Ｓｑｕａｒｅ
（Ｃ）市：Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ
（Ｄ）州：カルフォルニア
（Ｅ）国：米国
（Ｆ）郵便番号：９４０３６
（ｖ）コンピューター読み取り可能形態：
（Ａ）メディアタイプ：フロッピーディスク
（Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ  ＰＣ互換
（Ｃ）オペレーティングシステム：ＰＣ−ＤＯＳ／
ＭＳ−ＤＯＳ
（Ｄ）ソフトウエア：ＰａｔｅｎｔＩｎ  Ｒｅｌｅａｓｅ
＃１．０、バージョン＃１．２５
（ｖｉ）現出願データ：
（Ａ）出願番号：ＰＣＴ出願番号は現時点では未定
（Ｂ）出願日：同時出願
（Ｃ）種類：
（ｖｉｉｉ）代理人／エージェント：
（Ａ）名前：Ｔｏｒｃｈｉａ，Ｔｉｍｏｔｈｙ  Ｅ．
（Ｂ）登録番号：３６，７００
（Ｃ）参照／ドケット番号：ＡＢＩＣ−００１／０３ＷＯ
（ｉｘ）通信：
（Ａ）電話：（４１５）８４３  ５４８１
（Ｂ）ファックス：（４１５）８５７−０６６３
（Ｃ）テレックス：３８０８１６  ＣｏｏｌｅｙＰＡ
（２）配列番号：１：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１２アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｘｉ）配列：配列番号：１：
0003734828.tif 000007
（２）配列番号：２：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１２アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｘｉ）配列：配列番号：２：
0003734828.tif 000008
（２）配列番号：３：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１２アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）名前／キー：変更部位
（Ｂ）存在位置：１
（Ｄ）他情報：アミノオキシアセチル−Ｌｙｓ
（ｘｉ）配列：配列番号：３：
0003734828.tif 000009
（２）配列番号：４：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１２アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）名前／キー：変更部位
（Ｂ）存在位置：１
（Ｄ）他情報：ＧＸＬ−Ｌｙｓ
（ｘｉ）配列：配列番号：４：
0003734828.tif 000010
（２）配列番号：５：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：９アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）名前／キー：変更部位
（Ｂ）存在位置：１
（Ｄ）他情報：ＡＯＡ−Ｇｌｙ
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）名前／キー：変更部位
（Ｂ）存在位置：４
（Ｄ）他情報：ＡＯＡ−Ｌｙｓ
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）名前／キー：変更部位
（Ｂ）存在位置：５
（Ｄ）他情報：ＡＯＡ−Ｌｙｓ
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）名前／キー：変更部位
（Ｂ）存在位置：６
（Ｄ）他情報：ＡＯＡ−Ｌｙｓ
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）名前／キー：変更部位
（Ｂ）存在位置：７
（Ｄ）他情報：ＡＯＡ−Ｌｙｓ
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）名前／キー：変更部位
（Ｂ）存在位置：８
（Ｄ）他情報：ＡＯＡ−Ｌｙｓ
（ｘｉ）配列：配列番号：５：
0003734828.tif 000011
（２）配列番号：６：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：９アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）名前／キー：変更部位
（Ｂ）存在位置：１
（Ｄ）他情報：ＧＸＬ−Ｇｌｙ
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）名前／キー：変更部位
（Ｂ）存在位置：４
（Ｄ）他情報：ＧＸＬ−Ｌｙｓ
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）名前／キー：変更部位
（Ｂ）存在位置：５
（Ｄ）他情報：ＧＸＬ−Ｌｙｓ
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）名前／キー：変更部位
（Ｂ）存在位置：６
（Ｄ）他情報：ＧＸＬ−Ｌｙｓ
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）名前／キー：変更部位
（Ｂ）存在位置：７
（Ｄ）他情報：ＧＸＬ−Ｌｙｓ
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）名前／キー：変更部位
（Ｂ）存在位置：８
（Ｄ）他情報：ＧＸＬ−Ｌｙｓ
（ｘｉ）配列：配列番号：６：
0003734828.tif 000012
（２）配列番号：７：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１０アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）名前／キー：変更部位
（Ｂ）存在位置：５
（Ｄ）他情報：セリン−Ｌｙｓ
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）名前／キー：変更部位
（Ｂ）存在位置：６
（Ｄ）他情報：セリン−Ｌｙｓ
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）名前／キー：変更部位
（Ｂ）存在位置：７
（Ｄ）他情報：セリン−Ｌｙｓ
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）名前／キー：変更部位
（Ｂ）存在位置：８
（Ｄ）他情報：セリン−Ｌｙｓ
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）名前／キー：変更部位
（Ｂ）存在位置：９
（Ｄ）他情報：セリン−Ｌｙｓ
（ｘｉ）配列：配列番号：７：
0003734828.tif 000013
（２）配列番号：８：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：９アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）名前／キー：変更部位
（Ｂ）存在位置：１
（Ｄ）他情報：ブロモアセチル−Ｇｌｙ
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）名前／キー：変更部位
（Ｂ）存在位置：４
（Ｄ）他情報：ＧＸＬ−Ｌｙｓ
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）名前／キー：変更部位
（Ｂ）存在位置：５
（Ｄ）他情報：ＧＸＬ−Ｌｙｓ
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）名前／キー：変更部位
（Ｂ）存在位置：６
（Ｄ）他情報：ＧＸＬ−Ｌｙｓ
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）名前／キー：変更部位
（Ｂ）存在位置：７
（Ｄ）他情報：ＧＸＬ−Ｌｙｓ
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）名前／キー：変更部位
（Ｂ）存在位置：８
（Ｄ）他情報：ＧＸＬ−Ｌｙｓ
（ｘｉ）配列：配列番号：８：
0003734828.tif 000014
（２）配列番号：９：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１１アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）名前／キー：変更部位
（Ｂ）存在位置：１
（Ｄ）他情報：ＧＸＬ−Ｇｌｙ
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）名前／キー：変更部位
（Ｂ）存在位置：４
（Ｄ）他情報：ＧＸＬ−Ｌｙｓ
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）名前／キー：変更部位
（Ｂ）存在位置：５
（Ｄ）他情報：ＧＸＬ−Ｌｙｓ
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）名前／キー：変更部位
（Ｂ）存在位置：６
（Ｄ）他情報：ＧＸＬ−Ｌｙｓ
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）名前／キー：変更部位
（Ｂ）存在位置：７
（Ｄ）他情報：ＧＸＬ−Ｌｙｓ
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）名前／キー：変更部位
（Ｂ）存在位置：８
（Ｄ）他情報：ＧＸＬ−Ｌｙｓ
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）名前／キー：変更部位
（Ｂ）存在位置：９
（Ｄ）他情報：ＧＸＬ−Ｌｙｓ
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）名前／キー：変更部位
（Ｂ）存在位置：１０
（Ｄ）他情報：ＧＸＬ−Ｌｙｓ
（ｘｉ）配列：配列番号：９：
0003734828.tif 000015
（２）配列番号：１０：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２３アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）名前／キー：変更部位
（Ｂ）存在位置：１
（Ｄ）他情報：ＡＯＡ−Ｇｌｕ
（ｘｉ）配列：配列番号：１０：
0003734828.tif 000016
（２）配列番号：１１：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：６アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）名前／キー：変更部位
（Ｂ）存在位置：４
（Ｄ）他情報：ＧＸＬ−Ｌｙｓ
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）名前／キー：変更部位
（Ｂ）存在位置：５
（Ｄ）他情報：ＧＸＬ−Ｌｙｓ
（ｘｉ）配列：配列番号：１１：
0003734828.tif 000017
（２）配列番号：１２：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２１アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）名前／キー：変更部位
（Ｂ）存在位置：１
（Ｄ）他情報：ＡＯＡ−Ｔｙｒ
（ｘｉ）配列：配列番号：１２：
0003734828.tif 000018
（２）配列番号：１３：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１１アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）名前／キー：変更部位
（Ｂ）存在位置：１
（Ｄ）他情報：ＡＯＡ−Ｌｙｓ
（ｘｉ）配列：配列番号：１３：
0003734828.tif 000019
（２）配列番号：１４：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：６アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＹＥＳ
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）名前／キー：変更部位
（Ｂ）存在位置：３
（Ｄ）他情報：いずれかのアミノ酸
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）名前／キー：変更部位
（Ｂ）存在位置：４
（Ｄ）他情報：いずれかのアミノ酸
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）名前／キー：変更部位
（Ｂ）存在位置：５
（Ｄ）他情報：いずれかのアミノ酸
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）名前／キー：変更部位
（Ｂ）存在位置：６
（Ｄ）他情報：いずれかのアミノ酸
（ｘｉ）配列：配列番号：１４：
0003734828.tif 000020
（２）配列番号：１５：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：６アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＹＥＳ
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）名前／キー：変更部位
（Ｂ）存在位置：３
（Ｄ）他情報：いずれかのアミノ酸
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）名前／キー：変更部位
（Ｂ）存在位置：４
（Ｄ）他情報：いずれかのアミノ酸
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）名前／キー：変更部位
（Ｂ）存在位置：５
（Ｄ）他情報：いずれかのアミノ酸
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）名前／キー：変更部位
（Ｂ）存在位置：６
（Ｄ）他情報：いずれかのアミノ酸
（ｘｉ）配列：配列番号：１５：
0003734828.tif 000021
（２）配列番号：１６：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：６アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＹＥＳ
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）名前／キー：変更部位
（Ｂ）存在位置：３
（Ｄ）他情報：いずれかのアミノ酸
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）名前／キー：変更部位
（Ｂ）存在位置：４
（Ｄ）他情報：いずれかのアミノ酸
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）名前／キー：変更部位
（Ｂ）存在位置：５
（Ｄ）他情報：いずれかのアミノ酸
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）名前／キー：変更部位
（Ｂ）存在位置：６
（Ｄ）他情報：いずれかのアミノ酸
（ｘｉ）配列：配列番号：１６：
0003734828.tif 000022
（２）配列番号：１７：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：６アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＹＥＳ
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）名前／キー：変更部位
（Ｂ）存在位置：５
（Ｄ）他情報：いずれかのアミノ酸
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）名前／キー：変更部位
（Ｂ）存在位置：６
（Ｄ）他情報：いずれかのアミノ酸
（ｘｉ）配列：配列番号：１７：
0003734828.tif 000023
（２）配列番号：１８：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：６アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＹＥＳ
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）名前／キー：変更部位
（Ｂ）存在位置：５
（Ｄ）他情報：いずれかのアミノ酸
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）名前／キー：変更部位
（Ｂ）存在位置：６
（Ｄ）他情報：いずれかのアミノ酸
（ｘｉ）配列：配列番号：１８：
0003734828.tif 000024
（２）配列番号：１９：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：６アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＹＥＳ
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）名前／キー：変更部位
（Ｂ）存在位置：５
（Ｄ）他情報：いずれかのアミノ酸
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）名前／キー：変更部位
（Ｂ）存在位置：６
（Ｄ）他情報：いずれかのアミノ酸
（ｘｉ）配列：配列番号：１９：
0003734828.tif 000025
（２）配列番号：２０：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１３アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）名前／キー：変更部位
（Ｂ）存在位置：１
（Ｄ）他情報：アセチル−Ａｓｐ
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）名前／キー：変更部位
（Ｂ）存在位置：１３
（Ｄ）他情報：Ｈｉｓ−アミド
（ｘｉ）配列：配列番号：２０：
0003734828.tif 000026
（２）配列番号：２１：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１３アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）名前／キー：変更部位
（Ｂ）存在位置：１
（Ｄ）他情報：アセチル−Ａｓｐ
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）名前／キー：変更部位
（Ｂ）存在位置：２
（Ｄ）他情報：Cys（CH2CONH-CH2CH2NH-COCH2ONH2）-
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）名前／キー：変更部位
（Ｂ）存在位置：１３
（Ｄ）他情報：Ｈｉｓ−アミド
（ｘｉ）配列：配列番号：２１：
0003734828.tif 000027
（２）配列番号：２２：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１３アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）名前／キー：変更部位
（Ｂ）存在位置：１
（Ｄ）他情報：ＡＯＡ−Ａｓｐ
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）名前／キー：変更部位
（Ｂ）存在位置：１３
（Ｄ）他情報：Ｈｉｓ−アミド
（ｘｉ）配列：配列番号：２２：
0003734828.tif 000028
（２）配列番号：２３：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１３アミノ酸
（Ｂ）形：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）名前／キー：変更部位
（Ｂ）存在位置：１
（Ｄ）他情報：ＡＯＡ−Ａｓｐ
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）名前／キー：変更部位
（Ｂ）存在位置：２
（Ｄ）他情報：Ｃｙｓ（Ｓ−２−ピリジル）
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）名前／キー：変更部位
（Ｂ）存在位置：１３
（Ｄ）他情報：Ｈｉｓ−アミド
（ｘｉ）配列：配列番号：２３：
0003734828.tif 000029
（２）配列番号：２４：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１０アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：環状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）名前／キー：変更部位
（Ｂ）存在位置：１
（Ｄ）他情報：アセチル−Ｃｙｓ
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）名前／キー：変更部位
（Ｂ）存在位置：１０
（Ｄ）他情報：Ｃｙｓ−アミド
（ｘｉ）配列：配列番号：２４：
0003734828.tif 000030
（２）配列番号：２５：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２３アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：配列番号：２５：
0003734828.tif 000031
（２）配列番号：２６：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２３アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）名前／キー：変更部位
（Ｂ）存在位置：１
（Ｄ）他情報：ＡＯＡ−Ｐｒｏ
（ｘｉ）配列：配列番号：２６：
0003734828.tif 000032
（２）配列番号：２７：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１３アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）名前／キー：変更部位
（Ｂ）存在位置：１
（Ｄ）他情報：アセチル−Ａｓｐ
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）名前／キー：変更部位
（Ｂ）存在位置：２
（Ｄ）他情報：Cys（CH2CH2CH2NH-AOA）
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）名前／キー：変更部位
（Ｂ）存在位置：１３
（Ｄ）他情報：Ｈｉｓ−アミド
（ｘｉ）配列：配列番号：２７：
0003734828.tif 000033
（２）配列番号：２８：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１３アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）名前／キー：変更部位
（Ｂ）存在位置：１
（Ｄ）他情報：アセチル−Ａｓｐ
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）名前／キー：変更部位
（Ｂ）存在位置：２
（Ｄ）他情報：Cys（カルボキシアミドメチル）
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）名前／キー：変更部位
（Ｂ）存在位置：１３
（Ｄ）他情報：His-NHCH2CH2NH-AOA
（ｘｉ）配列：配列番号：２８：
0003734828.tif 000034
（２）配列番号：２９：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１３アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）名前／キー：変更部位
（Ｂ）存在位置：１
（Ｄ）他情報：アセチル−Ａｓｐ
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）名前／キー：変更部位
（Ｂ）存在位置：１３
（Ｄ）他情報：His-NHCH2CH2NH-AOA
（ｘｉ）配列：配列番号：２９：
0003734828.tif 000035
（２）配列番号：３０：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１３アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）名前／キー：変更部位
（Ｂ）存在位置：１
（Ｄ）他情報：アセチル−Ａｓｐ
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）名前／キー：変更部位
（Ｂ）存在位置：２
（Ｄ）他情報：Cys（S-CH2CH2NHCOCH2ONH-Boc）
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）名前／キー：変更部位
（Ｂ）存在位置：１３
（Ｄ）他情報：Ｈｉｓ−アミド
（ｘｉ）配列：配列番号：３０：
0003734828.tif 000036
（２）配列番号：３１：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：４アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）名前／キー：変更部位
（Ｂ）存在位置：１
（Ｄ）他情報：ＧＸＬ−Ｌｙｓ（ＧＸＬ）
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）名前／キー：変更部位
（Ｂ）存在位置：２
（Ｄ）他情報：Ｌｙｓ（ＧＸＬ−Ｌｙｓ（ＧＸＬ））
（ｉｘ）配列の特徴：
（Ａ）名前／キー：
（Ｂ）存在位置：
（Ｄ）他情報：
（ｘｉ）配列：配列番号：３１：
0003734828.tif 000037
【図１】
0003734828.tif 000038
【図２】
0003734828.tif 000039
【図３】
0003734828.tif 000040
【図４】
0003734828.tif 000041
【図５】
0003734828.tif 000042
【図６ａ】
0003734828.tif 000043
【図６ｂ】
0003734828.tif 000044
【図６ｃ】
0003734828.tif 000045
【図７】
0003734828.tif 000046
【図８】
0003734828.tif 000047
【図９】
0003734828.tif 000048
【図１０】
0003734828.tif 000049
【図１１】
0003734828.tif 000050
【図１２Ａ】
0003734828.tif 000051
【図１２Ｂ】
0003734828.tif 000052
【図１２Ｃ】
0003734828.tif 000053
【図１２Ｄ】
0003734828.tif 000054