(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞培養多ウェルプレート中で足場非依存性細胞を培養して増殖させる細胞の培養方法において、上記細胞培養多ウェルプレートとして、少なくともウェル内表面がポリメタクリレートにて構成され且つ２以上のウェルを有するウェルプレートを使用することを特徴とする細胞の培養方法。
【請求項２】
足場非依存性細胞の培養が選択増殖的に行われる請求項１に記載の細胞の培養方法。
【請求項３】
ポリメタクリレートがポリ（ヒドロキシアルキル）メタクリレートである請求項１又は２に記載の細胞の培養方法。
【請求項４】
ポリ（ヒドロキシアルキル）メタクリレートがポリ（２−ヒドロキシメチル）メタクリレートである請求項３に記載の細胞の培養方法。
【請求項５】
請求項１〜４の何れかに記載の細胞の培養方法において、足場非依存性細胞の増殖の度合いを定量する細胞の定量方法。
【請求項６】
定量法として、［３Ｈ］チミジン取込み検定法、テトラゾリウム還元検定法または比色法を採用する請求項５に記載の細胞の定量方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、細胞の培養方法および定量方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
生体から取り出された癌細胞は、培養によって増殖した後、試験、検査などに利用される。ところで、通常、癌細胞には正常細胞が混入しているため、通常の方法で癌細胞を培養した場合、正常細胞も増殖し、その結果、癌細胞の増殖度などの調査を精確に行うことが出来ない。
【０００３】
上記の問題を解決するため、例えば、寒天培養や無血清培養などを利用し正常細胞を自然消滅させて除去する方法が提案されている。また、例えば、ポリ−Ｎ−置換アクリルアミド誘導体などの感温性高分子と細胞増殖因子から成る培養基材表面で癌細胞を選択的に増殖させる方法が提案されている（特開平７−３１４７０号公報）。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、寒天培養や無血清培養などを利用する方法は長時間を要し、特開平７−３１４７０号公報に記載の方法は、かなり簡便化されているが、未だ不十分であり、一層簡便化された経済的な方法が求められている。
【０００５】
また、正常な組織培養細胞系が形質転換した場合、種々の生長パラメータが変化し、好ましくない環境下では細胞分裂を制限するという調整機能が弱まり、特に、形質転換細胞は、足場依存性（ａｎｃｈｏｒａｇｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ）の性質、すなわち、増殖のために基層に付着し、基層上で増殖拡張するという通常の性質を失う。
【０００６】
細胞増殖の足場依存性を調節する分子的事象および形質転換細胞が足場を必要としなくなる機構は、十分には理解されていないが、確固たる付着なしに増殖する能力（足場非依存性）は、腫瘍発生性の最善のインビトロ指針である（Ｃｏｎｎｏｌｌｙ，Ｄ．Ｔ．，Ｋｎｉｇｈｔ，Ｍ．Ｂ．，Ｈａｒａｋａｓ，Ｎ．Ｋ．，Ｗｉｔｔｗｅｒ，Ａ．Ｊ．，ａｎｄ  Ｆｅｄｅｒ，Ｊ．（１９８６）Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１５２，１３６−１４０、Ｂｏｒｅｎｆｒｅｕｎｄ，Ｅ．，ａｎｄ  Ｐｕｅｒｎｅｒ，Ｊ．Ａ（１９８４）Ｊ．Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ９，７−９）。
【０００７】
そして、最近の技術的進歩の結果、接着により提供される細胞外信号の役割に関心が高まって来ており、足場非依存性細胞生長（足場非依存性細胞の生長性）の適当な検定法が重要となっている。従って、斯かる観点からも、足場非依存性細胞の生長性の簡便で経済的な定量方法が求められている。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記実情に鑑み種々検討を行った結果、特定の材料でウェル内表面を構成した多ウェル細胞培養容器中で足場非依存性細胞を培養するならば、足場非依存性細胞が選択的に増殖し、しかも、容易に定量することが出来るとの知見を得た。本発明は、斯かる知見に基づき完成されたものであり、次の（１）〜（６）に関するものである。
【０００９】
（１）細胞培養多ウェルプレート中で足場非依存性細胞を培養して増殖させる細胞の培養方法において、上記細胞培養多ウェルプレートとして、少なくともウェル内表面がポリメタクリレートにて構成され且つ２以上のウェルを有するウェルプレートを使用することを特徴とする細胞の培養方法。
【００１０】
（２）足場非依存性細胞の培養が選択増殖的に行われる上記（１）に記載の細胞の培養方法。
【００１１】
（３）ポリメタクリレートがポリ（ヒドロキシアルキル）メタクリレートである上記（１）又は（２）に記載の細胞の培養方法。
【００１２】
（４）ポリ（ヒドロキシアルキル）メタクリレートがポリ（２−ヒドロキシメチル）メタクリレートである上記（３）に記載の細胞の培養方法。
【００１３】
（５）上記（１）〜（４）の何れかに記載の細胞の培養方法において、足場非依存性細胞の増殖の度合いを定量する細胞の定量方法。
【００１４】
（６）定量法として、［３Ｈ］チミジン取込み検定法、テトラゾリウム還元検定法または比色法を採用する上記（５）に記載の細胞の定量方法。
【００１６】
以下、本発明を詳細に説明する。本発明で使用する細胞培養多ウェルプレートは、ウェル内表面がポリメタクリレートにて構成されている点を除き、２以上のウェルを有する通常の細胞培養多ウェルプレートと同じである。本発明で使用する細胞培養多ウェルプレートは、公知の細胞培養多ウェルプレートの少なくともウェル内表面または当該表面を含む一面側をポリメタクリレート被膜でコートすることにより容易に得られるが、細胞培養多ウェルプレート自体をポリメタクリレートで形成することも可能である。なお、公知の細胞培養多ウェルプレートはポリスチレン製である。
【００１７】
本発明で使用される細胞培養多ウェルプレートは、通常１０〜２００、好ましくは４０〜１５０のウェルを有するが、２以上のウェルを有する限り、その種類は制限されず、正常細胞の増殖定量用に現在使用されている細胞培養多ウェルプレートの何れをも使用することが出来、９６ウェルマイクロプレートが最も一般的に使用される。
【００１８】
ポリメタクリレートとしては、ポリメタクリル酸の置換または非置換のアルキルエステルが挙げられる。非置換アルキルエステルとしては、例えば、炭素数１〜２０のアルキルエステルが挙げられる。置換アルキルエステルとしては、例えば、炭素数１〜２０であって１又は２以上の置換基を有するアルキルエステルが挙げられる。置換基としては、例えば、ヒドロキシ基、アミノ基、（モノ、ジ又はトリ）低級アルキルアミノ基または置換ヒドロキシ基（例えば、コハク酸、フタル酸、リン酸などの酸とのエステルルを形成したヒドロキシ基）、エポキシ基などが挙げられる。置換アルキルエステルとしては、置換低級アルキルエステルが好ましい。そして、低級アルキルとしては、炭素数１〜６のアルキル基、具体的には、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル等が挙げられる。また、置換基としてはヒドロキシ基が好ましい。
【００１９】
好ましいポリメタクリル酸エステルとしては、ポリ（ヒドロキシ低級メタクリレート）、例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリ（２−ヒドロキシプロピルメタクリレート）、ポリ（２−ヒドロキシブチルメタクリレート）等が挙げられ、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）としては、シグマ社製の製品Ｎｏ．Ｐ３９３２等を利用することが出来る。ポリメタクリレートの重合度は、被膜を形成し得る程度であれば特に制限はないが、通常５０〜１０5 程度、好ましくは１００〜１０4 程度である。
【００２０】
ポリメタクリレート被膜によるウェル内表面または当該表面を含む一面側のコートは、可能な限り均一に行うのが好ましい。ポリメタクリレートは、通常、有機溶媒の溶液として使用される。ポリメタクリレートの濃度は、コート方法や目的とする被膜の厚さ等により種々異なるために一概には決定し得ないが、通常、０．５〜５０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１〜２０ｍｇ／ｍｌ、更に好ましくは２〜１０ｍｇ／ｍｌ程度である。
【００２１】
コート方法は、特に制限されず、従来公知の手段を適宜採用することが出来る。そして、ポリメタクリレート被膜の厚さは、培養しようとする細胞の種類などにより種々異なるために一概には決定し得ないが、通常０．００２〜５０μｍ、好ましくは０．０１〜４０μｍ程度である。また、場合により、０．００２μｍよりも薄くてもよいし、５０μｍよりも厚くてもよい。
【００２２】
本発明における足場非依存性細胞としては、正常細胞以外のものであれば特に制限はなく、人または温血動物における癌細胞もしくは遺伝子組み替えにより癌遺伝子などを組み込んだ形質転換細胞などが使用出来る。
【００２３】
本発明の細胞の培養方法は、上記の細胞培養多ウェルプレート中で足場非依存性細胞を培養して増殖させることより成る。すなわち、細胞培養多ウェルプレート中に足場非依存性細胞を含む培地を適量入れ、常法、例えば、高湿度雰囲気中で通常２０〜４５℃、好ましくは３５〜４０℃程度で培養して増殖させる。
【００２４】
培地としては、細胞培養に使用される従来公知の何れの培地も使用することが出来、例えば、ダルベッコ変法イーグル培地の他、「ＢＭＥ（ｂａｓａｌ  ｍｅｄｉｕｍ  Ｅａｇｌｅ）」、「ＭＥＭ（ｍｉｎｉｍｕｍ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ
ｍｅｄｉｕｍ）」、「ＨａｍＦ１０  ｍｅｄｉｕｍ（ハム培地）」、「ＭｃＣｏｙ  ５Ａ  ｍｅｄｉｕｍ」、「１９９  ｍｅｄｉｕｍ」、「ＲＰＭＩ１６４０
ｍｅｄｉｕｍ」などが挙げられる。
【００２５】
本発明の細胞の定量方法は、上記の細胞培養多ウェルプレート中で足場非依存性細胞を培養して増殖させ、その増殖の度合いを定量することより成る。増殖の度合いの定量法としては、通常の足場依存性細胞の増殖を定量するために開発されている種々のマイクロプレート比色法やその他の定量方法が利用可能と考えられる。例えば、比色検定法としては、酸性ホスファターゼ、ニュートラルレッド、クリスタルバイオレット、ＭＴＴ及びスルホローダミンＢを使用する各種の検定法などが挙げられる。これらについては、次の▲１▼〜▲６▼の公知文献を参考にすることが出来る。
【００２６】
▲１▼Ｃｏｎｎｏｉｉｙ，Ｄ．Ｔ．，Ｋｎｉｇｈｔ，Ｍ．Ｂ．，Ｈａｒａｋａｓ，Ｎ．Ｋ．，Ｗｉｔｔｗｅｒ，Ａ．Ｊ．，ａｎｄ  Ｆｅｄｅｒ，Ｊ．（１９８６）Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１５２，１３６−１４０
▲２▼Ｂｏｒｅｎｆｒｅｕｎｄ，Ｅ．，ａｎｄ  Ｐｅｅｒｎｅｒ，Ｊ．Ａ（１９８４）Ｊ．Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ９，７−９
▲３▼Ｋｕｅｎｇ，Ｗ．，Ｓｉｌｂｅｒ，Ｅ．，ａｎｄ  Ｅｐｐｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｕ．（１９８９）Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８２，１６−１９
▲４▼Ｍｏｓｓｍａｎ，Ｔ．（１９８３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ
６５，５５−６３
▲５▼Ｖｉｓｔｉｃａ，Ｄ．Ｔ．，Ｓｋｅｈａｎ，Ｏ．，Ｓｃｕｄｉｅｒｏ，Ｄ．，Ｍｏｎｋｓ，Ａ．，Ｐｉｔｔｍａｎ，Ａ．，ａｎｄ  Ｂｏｙｄ，  Ｍ．Ｒ．（１９９１）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５１，２５１５−２５２０
▲６▼Ｓｋｅｈａｎ，Ｐ．，Ｓｔｏｒｅｎｇ，Ｒ．，Ｓｃｕｄｉｅｒｏ，Ｄ．，Ｍｏｎｋｓ，Ａ．，ＭｃＭａｈｏｎ，Ｊ．Ｂ．，Ｖｉｓｔｉｃａ，Ｄ．Ｔ．，Ｗａｒｒｅｎ，Ｊ．Ｔ．，Ｂｏｋｅｓｃｈ，Ｈ．，Ｋｅｎｎｙ，Ｓ．ａｎｄ  Ｂｏｙｄ，Ｎ．Ｒ．（１９９０）Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．８２，１１０７−１１１２
【００２７】
本発明においては、後記する＜細胞の増殖度合いの定量＞の項に記載のＭＴＴ還元検定法に準じて「固定」および「すすぎ」の工程を省略するのがよい。また、本発明においては、細胞の増殖の度合いの定量法としては、［3 Ｈ］チミジン取込み検定法、ＭＴＴ還元検定法などを使用することが出来る。
【００２８】
【実施例】
以下、本発明を実施例に基づいて更に詳細に説明するが、本発明は、その要旨を超えない限り、以下の実施例に限定されるものではない。
【００２９】
実施例１
（１）＜使用材料＞
ポリ（２−ヒドロキシメチルメタクリレート）：ポリ（ＨＥＭＡ）、３−［４，５−ジメチルチアゾール−２イル］−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド：ＭＴＴ、デキサメタゾン（シグマ（Ｓｉｇｍａ）社製）、［メチル−3 Ｈ］チミジン（ＮＥＮ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｔｓ社製）を使用した。
【００３０】
（２）＜ポリ（ＨＥＭＡ）被膜コート細胞培養多ウェルプレートの作成＞
９５％エタノール中に５ｍｇ／ｍｌの濃度となる様にポリ（ＨＥＭＡ）を加えて３７℃に保持して完全に溶解させた。多チャンネルデスペンサー（井上プロジェクト社製）を載置した９６ウェルマイクロプレート（ポリスチレン製）のウェル中に上記の溶液の５０μｌをピペットで採取した後に蓋を被せ、３７℃で最低２日間乾燥してポリ（ＨＥＭＡ）被膜コート細胞培養多ウェルプレートを作成した。
【００３１】
上記の培養プレートは、ポリ（ＨＥＭＡ）被膜による影響はなく、数週間貯蔵することが出来、使用前に紫外線で滅菌することが出来る。なお、上記の培養プレートは、ポリ（ＨＥＭＡ）被膜の効果の確認のため、９６ウェルマイクロプレート中の半分のウェル（８列中４列）のみにポリ（ＨＥＭＡ）被膜のコートを行い、残りのウェルはノンコートとした。
【００３２】
（３）＜使用細胞＞
ＮＩＨ３Ｔ３並びにそのｖ−ｓｒｃ（ｓｒｃ１）、ｖ−ａｂｌ（ａｂｌ１）、ｖ−Ｈａ−ｒａｓ（ｒａｓ１）及び活性化ｃ−ｒａｆ形質転換細胞（ｒａｆ１）；ＮＲＫ並びにそのｖ−Ｋｉ−ｒａｓ（ｒａｓ２）及び温度感受性ｖ−ｓｒｃ形質転換細胞（ｓｒｃts２）；３Ｙ１並びにそのｖ−ｆｐｓ（ｆｐｓ３）、ｖ−Ｋｉ−ｒａｓ（ｒａｓ−Ｋ３）、ｖ−ｓｒｃ（ｓｒｃ３）、活性化ｃ−Ｈａ−ｒａｓ（ｒａｓ−Ｈ３）及び活性化ｃ−ｍｙｃ形質転換細胞（ｍｙｃ３）（Ｕｅｈａｒａ，Ｙ．，Ｍｕｒａｋａｍｉ，Ｙ．，Ｍｉｚｕｎｏ，Ｓ．，ａｎｄ  Ｋａｗａｉ，Ｓ．（１９８８）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １６４，２９４−２９８）；ｐＭＡＭｎｅｏ−ｖ−Ｋｉ−ｒａｓを使用して形質転換したＣＲＥＦ（Ｆｉｓｈｅｒ，Ｐ．Ｂ．，Ｂａｂｉｓｓ，Ｌ．Ｅ．，Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ，Ｉ．Ｂ．，ａｎｄ  Ｇｉｎｓｂｅｒｇ，Ｈ．Ｓ．（１９８２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７９，３５２７−３５３１）、ｖ−Ｋｉ−ｒａｓがデキサメタゾン誘導性のＭＭＴＶ−ＬＴＲプロモータに連結しているプラスミド（京都大学  Ｍ．野田博士より入手）を使用した。
【００３３】
細胞は、１０％仔牛血清（ＮＩＨ３Ｔ３−及びＮＲＫ誘導細胞）又は１０％牛胎児血清（３Ｙ１及びＣＲＥＦ−誘導細胞）を補充したダルベッコ変法イーグル培地で５％ＣＯ2 を含む加湿雰囲気中３７℃（ＮＩＨ３Ｔ３−、３Ｙ１−及びＣＲＥＦ誘導細胞）または３３℃及び３９℃（ＮＲＫ細胞）で培養した。ｐ−ＭＡＭｎｅｏ−ｖ−Ｋｉ−ｒａｓ形質転換ＣＲＥＦ中のｒａｓの発現は１０-6Ｍデキサメタゾン添加により誘導した。
【００３４】
（４）＜細胞の増殖の度合いの定量＞（ＭＴＴ還元検定法および［3 Ｈ］チミジン取込み検定法）
細胞は、ウェル当たり１，０００個（ｖ−Ｋｉ−ｒａｓ形質転換ＮＲＫ）又は２，５００個（その他の全ての細胞）の細胞密度で前記９６ウェルプレートの各ウェル中に１５０μｌの容積で播種した。種々の成長期の後、１５μｌＭＴＴ（リン酸塩緩衝食塩水中５ｍｇ／ｍｌ）を添加し、更に、４時間インキュベーションを行った。そして、１００μｌのＳＤＳ溶液（１０ｍＭ塩酸中２０％）の添加により得られるＭＴＴホルマザンを可溶化し、２４時間後に、マイクロプレート読取装置を使用して５７０ｎｍの測定波長と６９０ｎｍの基準波長で光学密度（ＯＤ）を測定した。
【００３５】
ＤＮＡ中への［3 Ｈ］チミジンの取込みの測定は、次の様にして行った。先ず、各ウェルに［3 Ｈ］チミジンを添加し（０．３μＣｉ／ウェル、１０-6Ｍ）、２４時間インキュベーションした。細胞は、セルハーベスターを使用し、ベックマン  レディー  フィルター（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｒｅａｄｙ  Ｆｉｌｔｅｒ）上で捕集した。そして、放射能を計数した。
【００３６】
（５）＜コロニー形成＞
細胞を含む５ｍｌの培地（ダルベッコ変法イーグル培地）６０ｍｍ組織培養ディッシュ上に平らに延ばし、７日後、０．４ｍｌの２５％グルタルアルデヒドを使用して細胞を固定し、２０％エタノール中に０．１％のクリスタルバイオレットを含む溶液によって染色した。軟寒天中のコロニーは、６０ｍｍ組織培養ディッシュ中で０．５％の寒天を使用して凝固した５ｍｌ基部層上で０．３％の寒天を含有する培地１．５ｍｌ中の細胞を平板培養して形成した。そして、１４日後、０．４ｍｌＭＴＴ（リン酸塩緩衝食塩水中５ｍｇ／ｍｌ）を使用してコロニーを染色した。
【００３７】
（６）＜ポリ（ＨＥＭＡ）被膜コート細胞培養多ウェルプレート中の種々の癌遺伝子形質転換細胞の生長試験＞
本生長試験においては、９６ウェルマイクロプレート中の半分のウェル（８列中４列）のみにポリ（ＨＥＭＡ）被膜のコートを行い、残りのウェルはノンコートとした前記の９６ウェルマイクロプレートを使用した。
【００３８】
（ａ）５個のＮＩＨ３Ｔ３細胞系（ＮＩＨ３Ｔ３、ａｂｌ１、ｒａｆ１、ｒａｓ１、ｓｒｃ１）又は６個の３Ｙ１細胞系（３Ｙ１、ｆｐｓ３、Ｈ−ｒａｓ３、Ｋ−ｒａｓ３、ｍｙｃ３、ｓｒｃ３）を単一の培養プレートに播種した（ウェル当たり培地１５０μｌ中で２，５００細胞）。そして、各細胞系について２つの縦行を使用した。１０〜１２個の同価培養プレートを調製し、０〜８日または９日まで毎日ＭＴＴ還元のために処理した。３日、５日および７日には、各ウェルの培地の７５μｌを除去して新鮮な培地を補充した。細胞生長はＭＴＴ還元検定により測定した。
【００３９】
図１は、ＮＩＨ３Ｔ３細胞系についてのポリ（ＨＥＭＡ）被膜ノンコートウェル中の生長曲線、図２は、ＮＩＨ３Ｔ３細胞系についてのポリ（ＨＥＭＡ）被膜コートウェル中の生長曲線、図３は、３Ｙ１細胞系についてのポリ（ＨＥＭＡ）被膜ノンコートウェル中の生長曲線、図４は、３Ｙ１細胞系についてのポリ（ＨＥＭＡ）被膜コートウェル中の生長曲線である。これらの図において、横軸は培養日数、縦軸は波長５７０ｎｍにおける光学密度（ＯＤ）を表す。また、親細胞３Ｙ１については６ウェルの平均であり、他の全部の細胞については８ウェルの平均である。
【００４０】
図１及び図３から明らかな様に、正常線維芽細胞（ＮＩＨ３Ｔ３及び３Ｙ１）と癌遺伝子形質転換線維芽細胞の生長速度は、足場依存条件（ポリ（ＨＥＭＡ）被膜ノンコート組織培養ウェル）下では同等であった。しかしながら、図２及び図４から明らかな様に、細胞付着がポリ（ＨＥＭＡ）により妨げられた場合（ポリ（ＨＥＭＡ）被膜コートウェルの場合）、正常細胞と形質転換細胞の生長の間には著しい相違が認められた。また、親の正常線維芽細胞（図２中のＮＩＨ３Ｔ３及び図４中の３Ｙ１）は増加しなかったのに対し、癌遺伝子形質変換体（図２中のａｂｌ１、ｒａｆ１、ｒａｓ１及び図４中のｆｐｓ３、Ｈ−ｒａｓ３、Ｋ−ｒａｓ３、ｍｙｃ３、ｓｒｃ３）は、ポリ（ＨＥＭＡ）被膜ノンコート組織培養ウェル上での生長に比し、幾らか生長速度が遅くなるが、全てがポリ（ＨＥＭＡ）被膜コート表面上で増殖した。
【００４１】
（ｂ）図５〜図１０は、３Ｙ１細胞系についてのポリ（ＨＥＭＡ）被膜ノンコートウェル中の第４日目の生育状態を示す図面代用写真、図１１〜図１６は、３Ｙ１細胞系についてのポリ（ＨＥＭＡ）被膜コートウェル中の第４日目の生育状態を示す図面代用写真である。これらの図面代用写真は、ＭＴＴの添加前に１０倍の対物レンズを使用して撮影した。
【００４２】
図５〜図１０から明らかな様に、ポリ（ＨＥＭＡ）被膜ノンコート組織培養ウェルでは細胞接着と展延を示した生長をするが、図１１〜図１６から明らかな様に、ポリ（ＨＥＭＡ）被膜コート面上では細胞接着と展延が阻止されて細胞は丸い形状を留めている。
【００４３】
ポリ（ＨＥＭＡ）被膜コート面上の癌遺伝子形質転換細胞は、軟寒天中のコロニーに似た球状集合体を形成した。親細胞３Ｙ１は、顕微鏡下の観察によれば、それらがＭＴＴを還元する能力を保持しているため、実験の終わり（８日または９日）まで生存している様に見えたが、ポリ（ＨＥＭＡ）被膜コートウェルでは増殖しなかった。この様にポリ（ＨＥＭＡ）被膜コート面上の細胞の生長能力は、形質転換細胞の足場非依存性の特徴を反映している様に思われる。そして、この特徴は、従来の軟寒天培地で観察されていたのと同じものである。本発明者らは、本発明で使用した形質転換細胞が軟寒天中でコロニーを形成するのに対し、正常な３Ｙ１はコロニーを形成しないことを確認した。
【００４４】
（ｃ）親細胞３Ｙ１とその形質転換細胞の増殖は、上記と同様、［3 Ｈ］チミジン取込み検定法により定量した。すなわち、前記のＭＴＴ実験と並行して第４日目に実施した。図１７は、３Ｙ１細胞系についての培養第４日目に［3 Ｈ］チミジン取込み検定法により定量した［3 Ｈ］チミジンの取り込み量を示すグラフである。図１７に示すグラフにおいて、親細胞３Ｙ１は培養プレート上の６ウェル、他の細胞は８ウェルの平均値である。なお、誤差棒線は標準偏差を示す。
【００４５】
予期した通り、ポリ（ＨＥＭＡ）被膜コートウェルに播種した親細胞３Ｙ１による［3 Ｈ］チミジンの取込みは、ポリ（ＨＥＭＡ）被膜ノンコートウェルに播種した場合（２０６６±２２３ｃｐｍ）に比較して非常に低かった（７１±８ｃｐｍ）。一方、ポリ（ＨＥＭＡ）被膜コート面上の癌遺伝子形質転換細胞（ｆｐｓ３、Ｈ−ｒａｓ３、Ｋ−ｒａｓ３、ｍｙｃ３、ｓｒｃ３）は、新しく合成されたＤＮＡの中に［3 Ｈ］チミジンを取り込んだ。取込みの水準は、標準的ポリ（ＨＥＭＡ）被膜ノンコートウェル上で平板培養した細胞よりも低いが、ＭＴＴ還元検定法（図３及び図４）と一致した。
【００４６】
（ｄ）温度感受性ｓｒｃ（ｓｒｃts）を使用して形質転換した細胞、すなわち、ラウス肉腫ウイルスの温度感受性突然変異株を感染させたラット腎細胞（ＮＲＫ：ｓｒｃts／ＮＲＫ）について、足場依存性（ポリ（ＨＥＭＡ）被膜ノンコート）及び足場非依存性（ポリ（ＨＥＭＡ）被膜コート）の条件下の生長試験を行った。また、親細胞ＮＲＫ及びＮＲＫのｖ−Ｋｉ−ｒａｓ形質転換細胞（Ｋｉ−ｒａｓ／ＮＲＫ）についても同様の生長試験を行った。
【００４７】
上記の細胞系は、許容温度（３３℃）では形質転換表現型を示し、非許容温度（３９℃）では正常表現型を示す（Ｍｕｒａｋａｍｉ，Ｙ．，Ｍｉｚｕｎｏ，Ｓ．，ａｎｄ  Ｕｅｈａｒａ，Ｙ．（１９８８）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４８，１５８７−１５９０）。
【００４８】
図１８は、親細胞ＮＲＫについてのポリ（ＨＥＭＡ）被膜コート又はノンコートウェル中における３３℃及び３９℃での生長曲線、図１９は、ＮＲＫのｖ−Ｋｉ−ｒａｓ形質転換細胞（Ｋｉ−ｒａｓ／ＮＲＫ）についてのポリ（ＨＥＭＡ）被膜コート又はノンコートウェル中における３３℃及び３９℃での生長曲線、図２０は、ラウス肉腫ウイルスの温度感受性突然変異体を感染させたＮＲＫ（ｓｒｃts／ＮＲＫ）についてのポリ（ＨＥＭＡ）被膜コート又はノンコートウェル中における３３℃及び３９℃での生長曲線である。これらの図において、横軸は培養日数、縦軸は波長５７０ｎｍにおける光学密度（ＯＤ）を表す。何れの生長曲線もＭＴＴ還元検定法で測定した結果である。親細胞ＮＲＫは１２ウェルの平均、他の細胞は１６ウェルの平均である。
【００４９】
図１８から明らかな様に、親細胞ＮＲＫは、親細胞ＮＩＨ３Ｔ３及び親細胞３Ｙ１と同様、ポリ（ＨＥＭＡ）被膜コート面上では生長しなかった。図１９から明らかな様に、Ｋｉ−ｒａｓ／ＮＲＫは、ポリ（ＨＥＭＡ）被膜コート面上で被膜ノンコートウェルとほぼ同じ速度で急速に増殖した。図２０から明らかな様に、ｓｒｃts／ＮＲＫは、ポリ（ＨＥＭＡ）被膜ノンコート面上で３３℃（形質転換表現型）と３９℃（正常表現型）においてほぼ同等の速度で増加したが、被膜コート面上では３３℃に限り増殖した。
【００５０】
本発明者らは、以前、ｓｒｃts／ＮＲＫがポリ（ＨＥＭＡ）被膜ノンコート面（プラスチック面）上で生長する速度は、上記２つの温度で同一であるが、軟寒天培地中の場合、３３℃ではコロニーを形成するが、３９℃では形成しないことを明らかにした（Ｍｕｒａｋａｍｉ，Ｙ．，Ｍｉｚｕｎｏ，Ｓ．，ａｎｄ  Ｕｅｈａｒａ，Ｙ．（１９８８）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４８，１５８７−１５９０）。
【００５１】
（ｅ）誘導性ｒａｓを使用して形質転換した細胞、すなわち、ｐ−ＭＡＭｎｅｏ−ｖ−Ｋｉ−ｒａｓを使用して形質転換したクーロン化フィッシャーラット胎児線維芽細胞（ＣＲＥＦ）であって、そのｖ−Ｋｉ−ｒａｓがデキサメタゾン誘導性ＭＭＴＶ−ＬＴＲプロモーターに連結しているプラスミド（ｐ−ＭＡＭ−ｒａｓ−４）についての生長試験を行った。この試験においては、固体表面上および軟寒天培地中でのこの細胞系のコロニー形成能力をデキサメタゾンの存在または非存在下で検討した。
【００５２】
図２１は、ｐ−ＭＡＭ−ｒａｓ４についてのコロニー形成状態を示す図面代用写真であり、直径６０ｍｍの組織培養ディッシュ上（ダルベッコ変法イーグル培地使用）及び軟寒天培地中で各々デキサメタゾンの存在（＋Ｄｅｘ）又は非存在（−Ｄｅｘ）の条件下に測定した結果である。図２１に示す結果は、２，５００個の細胞を播種し、培養開始から７日後（組織培養ディッシュの場合）又は１４日後（軟寒天培地の場合）に染色して得た。
【００５３】
図２２は、ｐ−ＭＡＭ−ｒａｓ４についての培養７日後の生長状態を示す図面代用写真であり、ポリ（ＨＥＭＡ）被膜コートウェル又はノンコートウェル中で各々デキサメタゾンの存在（＋Ｄｅｘ）又は非存在（−Ｄｅｘ）の条件下に測定した結果である。
【００５４】
図２２に示す結果は、９６ウェルの標準的組織培養プレートでのＭＴＴ還元検定によって得た。すなわち、先ず、前述の通り、培養プレートの下半分（Ｅ〜Ｈ列）にポリ（ＨＥＭＡ）被膜をコートした。そして、培養プレートの右半分にはデキサメタゾン１μＭを含浸させた。ウェル当たり２，５００細胞密度で内側の６０ウェルに細胞を播種し、７日後にＭＴＴ還元のために処理した。３日と５日目に７５μｌの培地を除去して新鮮な培地を補充した。細胞を含まない外側の３６ウェルはブランクとして利用した。実際の光学密度は、組織培養プレートウェル中では、デキサメタゾンなしで１．１７８±０．０１２、デキサメタゾンを使用して０．９９９±０．００６：ポリ（ＨＥＭＡ）塗布ウェル中では、デキサメタゾンなしで０．０３９±０．００１、デキサメタゾンを使用して０．３３６±０．００７（１５ウェルの平均値±標準偏差）であった。
【００５５】
図２１及び図２２に示す様に、ｐ−ＭＡＭ−ｒａｓ−４は、固体（組織培養ディッシュ）表面上での誘導に関係なくコロニーを効率的に形成した。これと対照的に、軟寒天培地中のコロニーの形成は、デキサメタゾンの存在に大きく依存していた。誘導がない（−Ｄｅｘ）場合、軟寒天培地中のｐ−ＭＡＭ−ｒａｓ−４のコロニー形成は殆ど無視できた。
【００５６】
また、ポリ（ＨＥＭＡ）被膜コートプレートを使用することにより、上記と対応する結果が得られた（図２２参照）。すなわち、標準的組織培養プレートウェル中においては、ｐ−ＭＡＭ−ｒａｓ−４は、誘導に関係なく増加しているのに対し、ポリ（ＨＥＭＡ）被膜コートウェル中においては、デキサメタゾンの存在下（＋Ｄｅｘ）に限り増殖した。図２２に示す結果は第７日目に撮影したが、ポリ（ＨＥＭＡ）被膜コートウェル中の相違は、第５日目までには明確であった。なお、インキュベーション時間は、初期の細胞数を増加することによって更に短縮することが出来る。
【００５７】
【発明の効果】
以上説明した通り、本発明の細胞の培養方法および定量方法によれば、足場非依存性細胞のみを選択的に増殖させることが出来ると共に足場非依存性細胞の生長性（増殖の度合い）も容易に定量することが出来る。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＮＩＨ３Ｔ３細胞系についてのポリ（ＨＥＭＡ）被膜ノンコートウェル中の生長曲線（ＭＴＴ還元検定法で測定した）である。
【図２】ＮＩＨ３Ｔ３細胞系についてのポリ（ＨＥＭＡ）被膜コートウェル中の生長曲線（ＭＴＴ還元検定法で測定した）である。
【図３】３Ｙ１細胞系についてのポリ（ＨＥＭＡ）被膜ノンコートウェル中の生長曲線（ＭＴＴ還元検定法で測定した）である。
【図４】３Ｙ１細胞系についてのポリ（ＨＥＭＡ）被膜コートウェル中の生長曲線（ＭＴＴ還元検定法で測定した）である。
【図５】３Ｙ１細胞系についてのポリ（ＨＥＭＡ）被膜ノンコートウェル中の第４日目の生育状態を示す図面代用写真である。
【図６】３Ｙ１細胞系についてのポリ（ＨＥＭＡ）被膜ノンコートウェル中の第４日目の生育状態を示す図面代用写真である。
【図７】３Ｙ１細胞系についてのポリ（ＨＥＭＡ）被膜ノンコートウェル中の第４日目の生育状態を示す図面代用写真である。
【図８】３Ｙ１細胞系についてのポリ（ＨＥＭＡ）被膜ノンコートウェル中の第４日目の生育状態を示す図面代用写真である。
【図９】３Ｙ１細胞系についてのポリ（ＨＥＭＡ）被膜ノンコートウェル中の第４日目の生育状態を示す図面代用写真である。
【図１０】３Ｙ１細胞系についてのポリ（ＨＥＭＡ）被膜ノンコートウェル中の第４日目の生育状態を示す図面代用写真である。
【図１１】３Ｙ１細胞系についてのポリ（ＨＥＭＡ）被膜コートウェル中の第４日目の生育状態を示す図面代用写真である。
【図１２】３Ｙ１細胞系についてのポリ（ＨＥＭＡ）被膜コートウェル中の第４日目の生育状態を示す図面代用写真である。
【図１３】３Ｙ１細胞系についてのポリ（ＨＥＭＡ）被膜コートウェル中の第４日目の生育状態を示す図面代用写真である。
【図１４】３Ｙ１細胞系についてのポリ（ＨＥＭＡ）被膜コートウェル中の第４日目の生育状態を示す図面代用写真である。
【図１５】３Ｙ１細胞系についてのポリ（ＨＥＭＡ）被膜コートウェル中の第４日目の生育状態を示す図面代用写真である。
【図１６】３Ｙ１細胞系についてのポリ（ＨＥＭＡ）被膜コートウェル中の第４日目の生育状態を示す図面代用写真である。
【図１７】３Ｙ１細胞系についての培養第４日目に［3 Ｈ］チミジン取込み検定法により定量した［3 Ｈ］チミジンの取り込み量を示すグラフである。
【図１８】親細胞ＮＲＫについてのポリ（ＨＥＭＡ）被膜コート又はノンコートウェル中における３３℃及び３９℃での生長曲線（ＭＴＴ還元検定法で測定した）である。
【図１９】親細胞ＮＲＫのｖ−Ｋｉ−ｒａｓ形質転換細胞（Ｋｉ−ｒａｓ／ＮＲＫ）についてのポリ（ＨＥＭＡ）被膜コート又はノンコートウェル中における３３℃及び３９℃での生長曲線（ＭＴＴ還元検定法で測定した）である。
【図２０】ラウス肉腫ウイルスの温度感受性突然変異体を感染させたＮＲＫ（ｓｒｃts／ＮＲＫ）についてのポリ（ＨＥＭＡ）被膜コート又はノンコートウェル中における３３℃及び３９℃での生長曲線（ＭＴＴ還元検定法で測定した）である。
【図２１】ｐ−ＭＡＭ−ｒａｓ４についてのコロニー形成状態を示す図面代用写真であり、直径６０ｍｍの組織培養ディッシュ上（ダルベッコ変法イーグル培地使用）及び軟寒天培地中で各々デキサメタゾンの存在（＋Ｄｅｘ）又は非存在（−Ｄｅｘ）の条件下に測定した結果である。
【図２２】ｐ−ＭＡＭ−ｒａｓ４についての培養７日後の生長状態を示す図面代用写真であり、ポリ（ＨＥＭＡ）被膜コートウェル又はノンコートウェル中で各々デキサメタゾンの存在（＋Ｄｅｘ）又は非存在（−Ｄｅｘ）の条件下に測定した結果である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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