(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
電気泳動槽に緩衝液と試料とを連続的に注入しながら試料の分離・分取を行うフリーフロー電気泳動法において、少なくとも３種の泳動緩衝液を用い、陽電極近域に流す泳動緩衝液と陰電極近域に流す泳動緩衝液と試料流通部域に流す泳動緩衝液とを電気伝導度が異なる泳動緩衝液とし、両電極近域に流す泳動緩衝液に対し試料流通部域に流す泳動緩衝液の電気伝導度を低くするとともに、陽電極近域に流す泳動緩衝液として分離する試料成分よりも移動度の大きな陰イオンを含んだ緩衝液を用い、陰電極近域に流す泳動緩衝液として分離する試料成分よりも移動度の小さな陰イオンを含んだ緩衝液を用いることを特徴とするフリーフロー電気泳動法。
【請求項２】
請求項１記載のフリーフロー電気泳動法において、試料流通部域に流す泳動緩衝液に、陰電極近域に流す泳動緩衝液を希釈した液を用いることを特徴とするフリーフロー電気泳動法。
【請求項３】
請求項１または２に記載のフリーフロー電気泳動法において、陽電極近域に流す泳動緩衝液と陰電極近域に流す泳動緩衝液の電気伝導度が等しいことを特徴とするフリーフロー電気泳動法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、液体試料に電圧を印加することによって該液体に含まれる溶質を分離するフリーフロー電気泳動法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
フリーフロー電気泳動とは、電気泳動層に試料と指示液を連続的に注入しながら電気泳動によって分離及び分取を行なうことができる電気泳動方法であって、２枚の板に挟まれて構成された非常に厚さの薄い液体流路に一定流速で支持液を流して流出口への支持液の層状の流れを作り、該流路への液体注入口近傍に設けた試料注入口から試料を注入し下流に試料液を流すとともに、流路の両端に設けた電極に電圧を印加することによって、試料に含まれる物質が電気泳動の原理によって当該物質によって定まる泳動方向（例えば、正負いずれかの電極方向）及び速度で泳動分離しながら所定の流出口に流出する原理を利用するものである。
【０００３】
例えば、特願第2001-210560号には、複数の緩衝液を自然拡散を抑えつつ流しながら電気泳動を行うことを可能とする構成を有するフリーフロー電気泳動素子が開示されている。この構成によって等速電気泳動や等電点電気泳動等の様々な分離法が実施可能となり、分離効率を向上することが可能であると記載されている。また、同特許出願には高分子を含む泳動緩衝液と高分子を含まない緩衝液を同時に流しながら電気泳動を行うことを特徴とするフリーフロー電気泳動法が開示されている。この方法によって、分子ふるい効果を有する泳動が可能となり、それによってサイズ分離効果を有するフリーフロー電気泳動が可能となると記載されている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
上記先行技術は、上述のような利点を有するものの、複数の緩衝液を用いた具体的なフリーフロー電気泳動方法の具体例としては、高分子を含む緩衝液と高分子を含まない緩衝液の組み合わせの一例のみの記載であり、他に具体例が記載されていない。高分子を含んだ緩衝液の利用はサイズ分離効果の利点を有するものの、粘度の高い緩衝液を薄い液体流路に流すことになり、フリーフロー電気泳動素子に圧力がかかってフリーフロー電気泳動素子の耐久性が落ちたり、フリーフロー電気泳動素子や配管が高分子によって汚染されるため装置メンテナンスを頻繁に行う必要が生じたり、分取液に高分子が混ざって分離した成分の純度が落ちるという問題点を有し、サイズ分離効果を必要とせず電場中における移動度の差で分離できる試料の分離には適していない。
【０００５】
したがって本発明は、上記問題を解決すべくなされたもので、サイズ分離効果を与えない場合にも電場中における移動度の差で分離できる試料を分離する電気泳動分離において、複数の緩衝液を流すことで分離能を向上することが可能なフリーフロー電気泳動法を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段及び作用効果】
本発明のフリーフロー電気泳動方法は、電気泳動槽に緩衝液と試料とを連続的に注入しながら試料の分離・分取を行うフリーフロー電気泳動法において、少なくとも３種の泳動緩衝液を用い、陽電極近域に流す泳動緩衝液と陰電極近域に流す泳動緩衝液と試料流通部域に流す泳動緩衝液とを電気伝導度が異なる泳動緩衝液とし、両電極近域に流す泳動緩衝液に対し試料流通部域に流す泳動緩衝液の電気伝導度を低くするとともに、陽電極近域に流す泳動緩衝液として分離する試料成分よりも移動度の大きな陰イオンを含んだ緩衝液を用い、陰電極近域に流す泳動緩衝液として分離する試料成分よりも移動度の小さな陰イオンを含んだ緩衝液を用いることを特徴とする（請求項１）。
【０００７】
本発明において、フリーフロー電気泳動とは、上述した通り、電気泳動槽に試料と支持液を連続的に注入しながら電気泳動による分離及び分取を行う電気泳動法である。分離操作は予め緩衝液注入口から一定流速で支持液を流して複数の流出口への液の流れを作り、試料注入口から試料を注入する。泳動槽内部は狭い空間特有の物理的現象によって強い層流が実現されているため、異なる液体を連続的に流すと液体が拡散しにくく、ほぼ直線的に流出口に向かって流れ出る。泳動槽の両端に形成した１対の電極間に電圧を印加すると、試料に含まれる物質は電気泳動の原理によって当該物質によって定まる泳動方向（例えば、正負いずれかの電極側）に泳動しながら流出口に流出する。物質によって泳動の方向及び速度が異なるため、試料に含まれる物質は分離しながら流出口に流出する。従って、複数の流出口の中から特定の分取口より液を取り出すことにより試料の分取が行える。
【０００８】
「緩衝液」とは、本発明では電気泳動に用いる「泳動液」のことを指す。
溶液に酸または塩基を加えた場合あるいは希釈した場合のｐＨの変化を緩める作用、すなわち緩衝作用をもつ溶液がそれに当たる。
弱酸と強塩基、弱塩基と強酸、弱酸と弱塩基の混合液が代表的緩衝液であるが、その組成・濃度・ｐＨは特に限定されず、一般的に電気泳動に用いられる組成・濃度・ｐＨを用いることができる。
【０００９】
電極近域とは、液体流路の流れ方向かつ電極に沿った液体流路内の領域をいい、試料流通部域とは試料を流し、電気泳動原理によって試料を電気泳動分離する領域をいう。
本発明で用いる電気泳動素子は、本発明の目的を達成できる限り特に限定されないが、先願である特願第2001-210560号に開示されている電気泳動素子を好適に用いることができる。これについては後述する。
本発明に関する実施の形態は、後記する参考例１および実施例１〜３にて具体的に説明する。
【００１０】
参考例１中では、請求項１における「試料流通部域に流す泳動緩衝液」及び「両電極近域に流す泳動緩衝液」は、それぞれ「緩衝液１」及び「緩衝液２」が該当する。
参考例を含む本発明によれば、以下の作用効果が得られる。
本発明のフリーフロー電気泳動法は、両電極近域に電気伝導度の高い緩衝液が、試料流通部域に電気伝導度の低い緩衝液が流れた状態でフリーフロー電気泳動が行われる。電極間に印加した電圧は、電気伝導度の低い緩衝液に大きな割合でかかる。このため、試料が流れる近域に効果的に高電圧を印加することが可能となり、分離能が向上する。分離速度を速くできるので、使用するフリーフロー電気泳動素子を小型化し、廉価に製造することを可能となり、将来的には使い捨てフリーフロー電気泳動素子を可能とする。また、両電極近域には電圧のかかる割合が低いためジュール熱による発熱も抑えられ、電極における気泡の発生を抑制することができる。
【００１１】
したがって参考例を含む本発明は、両電極近域に流す泳動緩衝液と試料流通部域に流す泳動緩衝液とを電気伝導度が異なる泳動緩衝液とし、両電極近域に流す泳動緩衝液に対し試料流通部域に流す泳動緩衝液の電気伝導度を低くすることで、分離能を向上することが可能なフリーフロー電気泳動法を提供することができる。
以下に本発明の好ましい実施態様について説明する。
（１）第1の好ましい実施の態様（請求項１に対応）
第1の好ましい実施態様は、参考例を含む本発明のフリーフロー電気泳動法（請求項１記載）において、すくなくとも３種の泳動緩衝液を用い、陽電極近域に流す泳動緩衝液と陰電極近域に流す泳動緩衝液と試料流通部域に流す泳動緩衝液とを電気伝導度が異なる泳動緩衝液とし、陽電極近域に流す泳動緩衝液として分離する試料成分よりも移動度の大きな陰イオンを含んだ緩衝液を用い、陰電極近域に流す泳動緩衝液として分離する試料成分よりも移動度の小さな陰イオンを含んだ緩衝液を用いることを特徴とする。
本発明の好ましい第1の実施の態様は、実施例１の実施の態様が対応する。
【００１２】
（対応する実施例）
この発明に関する実施の形態は、第１の実施の形態が対応する。本実施例１中、「試料流通部域に流す泳動緩衝液」は、「緩衝液１」が該当し、「陽電極近域に流す泳動緩衝液」は、「緩衝液２」が該当し、「陰電極近域に流す泳動緩衝液」は、「緩衝液３」が該当する。本実施例中「分離する試料」は、「キシレンシアノールＦＦとブロモフェノールブルーを混合した水溶液」が該当する。
【００１３】
（作用効果）
本発明の第1の好ましい実施の態様によれば、フリーフロー電気泳動法は、陰電極近域に電気伝導度が高く且つ分離する試料成分よりも移動度の小さな陰イオンを含んだ緩衝液が、陽電極近域に電気伝導度が高く且つ分離する試料成分よりも移動度の大きな陰イオンを含んだ緩衝液が、試料流通部域に電気伝導度が低い緩衝液が流れた状態でフリーフロー電気泳動が行われる。従って、電極間に印加した電圧は、電気伝導度の低い緩衝液に大きな割合でかかる。このため、試料が流れる近域に効果的に高電圧を印加することが可能となり、本発明で目的とする分離能の向上が達成できる。さらに、分離速度を速くできるので、使用するフリーフロー電気泳動素子を小型化し、廉価に製造することを可能となり、将来的には使い捨てフリーフロー電気泳動素子を可能とする。
【００１４】
また、陰電極近域に流す泳動緩衝液に含まれる陰イオンは被分離試料成分よりも移動度が小さく、陽電極近域に流す泳動緩衝液に含まれる陰イオンは被分離試料成分よりも移動度が大きい。このため、本発明の第1の好ましい実施の態様における電気泳動では等速電気泳動的な分離が実現され、試料は先行イオンと終末イオンの間に挟まれて分離しながら収束する。このため分離した成分が広がらず高濃度の状態で回収することが可能となる。ここで等速電気泳動とは、移動度の大きなイオンを含む緩衝液と移動度の小さなイオンを含む緩衝液とを用いて、分離されたゾーンの全てが同じ速度で移動するような状態を作って分離させる電気泳動法で、試料は二つの緩衝液に挟まれて分離し収束する挙動を示す。
【００１５】
したがって本発明の第1の好ましい実施の態様は、陽電極近域に流す泳動緩衝液と陰電極近域に流す泳動緩衝液と試料流通部域に流す泳動緩衝液とを電気伝導度が異なる泳動緩衝液とし、両電極近域に流す泳動緩衝液に対し試料流通部域に流す泳動緩衝液の電気伝導度を低くし、且つ陽電極近域に流す泳動緩衝液として分離する試料成分よりも移動度の大きな陰イオンを含んだ緩衝液を用い、陰電極近域に流す泳動緩衝液として分離する試料成分よりも移動度の小さな陰イオンを含んだ緩衝液を用いることで、分離能を向上し、且つ高濃度の分取液を得ることが可能なフリーフロー電気泳動法を提供することができる。
（２）本発明の好ましい第2の実施の態様（請求項２に対応）
第２の好ましい実施態様は、本発明のフリーフロー電気泳動法の第1の好ましい実施の態様（請求項１）において、試料流通部域に流す泳動緩衝液に、陰電極近域に流す泳動緩衝液を希釈した液を用いることを特徴とする。
【００１６】
（対応する実施例）
本発明の第2の好ましい実施の態様は、実施例２の実施の態様が対応する。本実施例２中、「試料流通部域に流す泳動緩衝液」は、「緩衝液１」が該当し、「陰電極近域に流す泳動緩衝液」は、「緩衝液３」が該当する。
（作用効果）
本発明のフリーフロー電気泳動法は、陰電極近域に電気伝導度が高く且つ分離する試料成分よりも移動度の小さな陰イオンを含んだ緩衝液が、陽電極近域に電気伝導度が高く且つ分離する試料成分よりも移動度の大きな陰イオンを含んだ緩衝液が、試料流通部域に電気伝導度が低い緩衝液が流れた状態でフリーフロー電気泳動が行われる。電極間に印加した電圧は、電気伝導度の低い緩衝液に大きな割合でかかる。このため、試料が流れる近域に効果的に高電圧を印加することが可能となり、本発明の目的である分離能の向上が達成できる。さらに、分離速度を速くできるので、使用するフリーフロー電気泳動素子を小型化し、廉価に製造することを可能となり、将来的には使い捨てフリーフロー電気泳動素子を可能とする。
【００１７】
また、陰電極近域に流す泳動緩衝液に含まれる陰イオンは試料よりも移動度が小さく、陽電極近域に流す泳動緩衝液に含まれる陰イオンは試料よりも移動度が大きい。このため、本発明の第2の好ましい実施の態様では電気泳動は等速電気泳動的な分離が実現され、第1の好ましい実施の態様と同様に試料は先行イオンと終末イオンの間に挟まれて分離しながら収束する。このため分離した成分が広がらず高濃度の状態で回収することが可能となる。
【００１８】
また、試料流通部域に流す泳動緩衝液は陰電極近域に流す泳動緩衝液を希釈した組成であり、含まれる陰イオンが等しいため、収束に要する時間を短縮することが可能となる。また、試料流通部域に流す泳動緩衝液は陰電極近域に流す泳動緩衝液を希釈して調製でき、緩衝液の準備が簡便となる。
【００１９】
したがって本発明の第2の好ましい実施の態様は、陽電極近域に流す泳動緩衝液と陰電極近域に流す泳動緩衝液と試料流通部域に流す泳動緩衝液とを電気伝導度が異なる泳動緩衝液とし、両電極近域に流す泳動緩衝液に対し試料流通部域に流す泳動緩衝液の電気伝導度を低くし、陽電極近域に流す泳動緩衝液として分離する試料成分よりも移動度の大きな陰イオンを含んだ緩衝液を用い、陰電極近域に流す泳動緩衝液として分離する試料成分よりも移動度の小さな陰イオンを含んだ緩衝液を用い、試料流通部域に流す泳動緩衝液に陰電極近域に流す泳動緩衝液を希釈した液を用いることで、分離能を向上し、且つ効率的に高濃度の分取液を得ることが可能なフリーフロー電気泳動法を提供することができる。
【００２０】
（３）本発明の第3の好ましい実施の態様（請求項３に対応）
本発明の第3の好ましい実施の態様は、本発明の第１の好ましい実施の態様のフリーフロー電気泳動法に加えて、陽電極近域に流す泳動緩衝液と陰電極側に流す泳動緩衝液の電気伝導度が等しいことを特徴とする。
【００２１】
（対応する実施例）
本発明の第３の好ましい実施の態様は、実施例３の実施の態様が対応する。本実施例３中、「陽電極近域に流す泳動緩衝液」は、「緩衝液２」が該当し、「陰電極近域に流す泳動緩衝液」は、「緩衝液３」が該当する。
（作用効果）
本発明の第3の好ましい実施の態様のフリーフロー電気泳動法は、陰電極近域に電気伝導度が高く且つ分離する試料成分よりも移動度の小さな陰イオンを含んだ緩衝液が、陽電極近域に電気伝導度が高く且つ分離する試料成分よりも移動度の大きな陰イオンを含んだ緩衝液が、試料流通部域に電気伝導度が低い緩衝液が流れた状態でフリーフロー電気泳動が行われる。電極間に印加した電圧は、電気伝導度の低い緩衝液に大きな割合でかかる。このため、試料が流れる近域に効果的に高電圧を印加することが可能となり、本発明の目的とする分離能の向上が達成できる。分離速度を速くできるので、使用するフリーフロー電気泳動素子を小型化し、廉価に製造することを可能となり、将来的には使い捨てフリーフロー電気泳動素子を可能とする。
【００２２】
また、陰電極近域に流す泳動緩衝液に含まれる陰イオンは試料よりも移動度が小さく、陽電極近域に流す泳動緩衝液に含まれる陰イオンは分離する試料成分よりも移動度が大きい。このため、本発明の第3の好ましい実施の態様における電気泳動は等速電気泳動的な分離が実現され、本発明の第１の好ましい実施の態様と同様に被分離試料成分は先行イオンと終末イオンの間に挟まれて分離しながら収束する。このため分離した成分が広がらず高濃度の状態で回収することが可能となる。
また、陽電極近域に流す泳動緩衝液と陰電極近域に流す泳動緩衝液は電気伝導度が等しいため両電極で生じるジュール熱による発熱が等しく、両電極で生じる気泡の出方が偏らずに安定するため、長時間の安定な分離が可能となる。
【００２３】
したがって本発明の第3の好ましい実施の態様では、陽電極近域に流す泳動緩衝液と陰電極近域に流す泳動緩衝液と試料流通部域に流す泳動緩衝液とを電気伝導度が異なる泳動緩衝液とし、両電極近域に流す泳動緩衝液に対し試料流通部域に流す泳動緩衝液の電気伝導度を低くし、陽電極近域に流す泳動緩衝液として分離する試料成分よりも移動度の大きな陰イオンを含んだ緩衝液を用い、陰電極近域に流す泳動緩衝液として分離する試料成分よりも移動度の小さな陰イオンを含んだ緩衝液を用い、陽電極近域に流す泳動緩衝液と陰電極側に流す泳動緩衝液との電気伝導度を等しくすることで、分離能を向上し、高濃度の分取液が得られ、且つ長時間の安定した使用が可能なフリーフロー電気泳動法を提供することができる。
【００２４】
（実施例）
本発明のフリーフロー電気泳動方法で好適に用いることができるフリーフロー電気泳動素子について説明する。本フリーフロー電気泳動素子としては特願第２０００-210560号の図1乃至図4にに示すものと実質的に同じものを用いることができる。但し、本発明のフリーフロー電気泳動方法に用いることができるフリーフロー電気泳動素子はこのものに限定されない。
【００２５】
図１はこの発明で用いるフリーフロー電気泳動素子１の上面図である。フリーフロー電気泳動素子１は、泳動槽構成基板２と注入口構成基板３との組み合わせで構成される。図１の線Ａの部分の断面図を図２に、泳動槽構成基板２の上面図を図３に、注入口構成基板３の裏面図を図４に示す。このフリーフロー電気泳動素子１は、幅広の溝からなる泳動槽８と細長い溝からなる２つの電極室９と、泳動槽８と電極室９とを区切る隔壁１０を構成した泳動槽構成基板２と、複数の緩衝液注入口４ａ〜４ｕと複数の試料注入口５ａ〜５ｅと複数の流出口６ａ〜５ｕと１対の電極７ａ，７ｂを構成した注入口構成基板３とを張り合わせて構成される。電極７は注入口構成基板３の泳動槽構成基板２と対向する面上に薄膜で構成される。隔壁１０は対向する注入口構成基板３との間に空隙を有して構成される。複数の緩衝液注入口４ａ〜４ｕと複数の流出口６ａ〜６ｕは同数で互いにそれぞれ対応し且つ流れに対して垂直方向に見て同間隔で構成される。
【００２６】
泳動槽構成基板２及び注入口構成基板３の素材はホウケイ酸ガラス、電極７は白金薄膜からなる。泳動槽８と電極室９は公知のウェットエッチング法にて深さ３０マイクロメートルに加工した。隔壁１０は対向する注入口構成基板３との間に５マイクロメートルの空隙ができるように加工した。緩衝液注入口４と試料注入口５と流出口６は超音波加工によって加工した。電極７はスパッタリング法によって成膜した。泳動槽構成基板２及び注入口構成基板３の接合は、図示しないアモルファスシリコン薄膜を介して陽極接合法によって接合した。
【００２７】
本フリーフロー電気泳動素子では、緩衝液注入口と流出口とが同数互いにそれぞれ対応し且つ流れに対して垂直方向に見て同間隔で構成されているので、狭い空間である泳動槽に緩衝液を連続的に流した場合、流れが強い層流となるため液体同志が拡散しにくい状態が生じ、それぞれの緩衝液注入口から異なる緩衝液を流した場合、それと対応する流出口に拡散することなく流れ出る。なお、等速泳動及び等電点電気泳動においては、緩衝液注入口は間隔を小さくして密に設けることが好ましい。
次に、該フリーフロー電気泳動素子１を用いたフリーフロー電気泳動法を示す。
【００２８】
まず、本発明のフリーフロー電気泳動素子１の機能について説明する。フリーフロー電気泳動とは、電気泳動槽に試料と支持液を連続的に注入しながら電気泳動による分離及び分取を行う電気泳動法である。該電気泳動槽は、本発明の電気泳動槽８がそれに当たる。分離操作は予め複数の緩衝液注入口４から一定流速で支持液を流して複数の流出口６への液の流れを作り、複数ある試料注入口５の少なくとも一つから試料を注入する。泳動槽内部は狭い空間特有の物理的現象によって強い層流が実現されているため、異なる液体を連続的に流すと液体が拡散しにくく、ほぼ直線的に流出口に向かって流れ出る。１対の電極７間に電圧を印加すると試料に含まれる物質は、電気泳動の原理によって正負いずれかの電極側に泳動しながら流出口６に流出する。物質によって泳動の方向及び速度が異なるため、試料に含まれる物質は分離しながら流出口６に流出する。従って、複数の流出口６の中から特定の分取口より液を取り出すことにより試料の分取が行える。電圧の印加に伴い電極７から発生した気泡は隔壁１０によって泳動槽８側に入ることなく電極室を流れ流出口６に向かう。
【００２９】
（参考例１）（請求項１に該当）
緩衝液１として３ｍＭトリスヒドロキシメチルアミノメタン−３ｍＭ塩酸緩衝液を、緩衝液２として１０ｍＭトリスヒドロキシメチルアミノメタン−１０ｍＭ塩酸緩衝液を、試料としてキシレンシアノールＦＦとブロモフェノールブルーを混合した水溶液を用い、図1と図2で説明したフリーフロー電気泳動素子１にてフリーフロー電気泳動を行った。フリーフロー電気泳動素子としては、図１乃至図２に示すものを用いた。フリーフロー電気泳動素子１は電極７ａを電圧印加電源の陰極に、電極７ｂを電圧印加電源の陽極に接続した。緩衝液は、陰極近域の緩衝液注入口４ａ〜４ｅと陽極近域の緩衝液注入口４ｑ〜４ｕに緩衝液２を、試料流通部域の緩衝液注入口４ｆ〜４ｐに緩衝液１をポンプで流した。試料は試料注入口５ｂからポンプで注入した。フリーフロー電気泳動は、緩衝液１と２及び試料を注入しながら電極７に電圧を印加して行った。分取液は流出口６ａ〜５ｕからの流出液を回収して得た。数ｋＶの電圧を印加しフリーフロー電気泳動を行うと、試料中のキシレンシアノールＦＦは陰極よりの流出口に、ブロモフェノールブルーは陽極よりの流出口に分離して流出した。
【００３０】
数ｋＶの電圧を印加しフリーフロー電気泳動を行うと、試料中のキシレンシアノールＦＦは陰極よりの流出ロに、プロモフェノールブルーは陽極よりの流出口に分離して流出した。
単一の緩衝液を用いた場合、キシレンシアノールＦＦとブロモフェノールブルーの流出する流出口の間隔は、流出ロの数にして一つ分あけて流出するのに対し、本実施例では流出口にして4つ分あけた分離が得られた。このように、分離率は単一の緩衝液を用いた場合よりも優れており、分離能の高い分離が可能となった。
【００３１】
本参考例では両電極近域に緩衝液２が、試料流通部域に緩衝液１が流れた状態でフリーフロー電気泳動が行われる。緩衝液２は緩衝液１に対して濃度が高いため電気伝導度が高い。電極７に印加した電圧は、電気伝導度の低い緩衝液１に大きな割合でかかる。このため、試料が流れる近域に効果的に高電圧を印加することが可能となり、分離能が向上する。また、両電極近域には電圧のかかる割合が低いためジュール熱による発熱も抑えられ、電極における気泡の発生を抑制することができる。
【００３２】
したがって参考例１を含む本発明は、両電極近域に流す泳動緩衝液と試料流通部域に流す泳動緩衝液とを電気伝導度が異なる泳動緩衝液とし、両電極近域に流す泳動緩衝液に対し試料流通部域に流す泳動緩衝液の電気伝導度を低くすることで、分離能を向上することが可能なフリーフロー電気泳動法を提供することができる。なお、この発明の実施例は、当然、各種変更が可能である。
例えば、緩衝液の種類は限定されず通常電気泳動に用いられる緩衝液に変更できる。緩衝液の濃度は、緩衝液１に対して緩衝液２の伝導度が高い組み合わせであれば限定されない。また、緩衝液１と緩衝液２とを同一組成の緩衝液とする必要はなく、異なる組成の緩衝液とすることも可能である。緩衝液２の注入口は限定されず、両電極から適当な幅を持って流すことができる。また、試料注入口の場所は緩衝液１が流れている場所であれば限定されない。
【００３３】
また、この発明の参考例に用いたフリーフロー電気泳動素子１は、複数の緩衝液注入口を有するものであって、安定な層流状態でフリーフロー電気泳動を行うことが可能なフリーフロー電気泳動素子であれば、その構成は特に限定されない
（実施例１）（請求項１に該当）
緩衝液１として５ｍＭトリスヒドロキシメチルアミノメタン−５ｍＭ６−アミノ−ｎ−カプロン酸緩衝液を、緩衝液２として２０ｍＭトリスヒドロキシメチルアミノメタン−２０ｍＭ塩酸緩衝液を、緩衝液３として５０ｍＭトリスヒドロキシメチルアミノメタン−５００ｍＭＣＡＰＳ緩衝液を、試料としてキシレンシアノールＦＦとブロモフェノールブルーを混合した水溶液を用い、参考例１で用いたフリーフロー電気泳動素子１にてフリーフロー電気泳動を行った。フリーフロー電気泳動素子１は電極７ａを電圧印加電源の陰極に、電極７ｂを電圧印加電源の陽極に接続した。緩衝液は、陰極近域の緩衝液注入口４ａ〜４ｅに緩衝液３を、陽極側の緩衝液注入口４ｑ〜４ｕに緩衝液２を、試料流通部域の緩衝液注入口４ｆ〜４ｐに緩衝液１をポンプで流した。試料は試料注入口５ｂからポンプで注入した。フリーフロー電気泳動は、緩衝液１と２及び試料を注入しながら電極７に電圧を印加して行った。分取液は流出口６ａ〜６ｕからの流出液を回収して得た。数ｋＶの電圧を印加しフリーフロー電気泳動を行うと、試料中のキシレンシアノールＦＦとブロモフェノールブルーは分離後に収束し、キシレンシアノールＦＦは陰極よりの流出口に、ブロモフェノールブルーは陽極よりの流出口に分離して流出した。
【００３４】
数ｋＶの電圧を印加しフリーフロー電気泳動を行うと、試料中のキシレンシアノールＦＦとブロモフェノールブルーは分離後に収束し、キシレンシアノールＦＦは陰極よりの流出口に、ブロモフェノールブルーは陽極よりの流出口に分離して流出した。
単一の緩衝液を用いた場合、キシレンシアノールＦＦとブロモフェノールブルーの流出する流出口の間隔は、流出口の数にして一つ分あけて流出するのに対し、本実施例では流出口にして４つ分あけた分離が得られた。また、参考例１の条件ではキシレンシアノールＦＦとブロモフェノールブルーはそれぞれ２つの流出口にまたがって流出したが、本条件では分離後収束してそれぞれ１つの流出口のみに流出した。このように、分離率は単一の緩衝液を用いた場合よりも優れており、分離能の高い分離が可能となった。また、分離後に収束しているため、濃度の高い状態での分離が可能となった。
【００３５】
（作用・効果）
次に、この発明の実施例の作用及び効果を説明する。
本実施例では陰電極側近域に緩衝液３が、陽電極側近域に緩衝液２が、試料流通部域に緩衝液１が流れた状態でフリーフロー電気泳動が行われる。緩衝液３及び２は緩衝液１に対して濃度が高いため電気伝導度が高い。電極７に印加した電圧は、電気伝導度の低い緩衝液１に大きな割合でかかる。このため、試料が流れる近域に効果的に高電圧を印加することが可能となり、本発明で目的とする分離能が向上する。
また、緩衝液３に含まれるＣＡＰＳは試料のキシレンシアノールＦＦ及びブロモフェノールブルーよりも移動度が小さく、緩衝液２に含まれるクロルイオンは試料のキシレンシアノールＦＦ及びブロモフェノールブルーよりも移動度が大きい。このため、本実施例における電気泳動は等速電気泳動的な分離が実現され、試料は先行イオンであるクロルイオンと終末イオンであるＣＡＰＳの間に挟まれて分離しながら収束する。このため分離した成分が広がらず高濃度の状態で回収することが可能となる。ここで等速電気泳動とは、移動度の大きなイオンを含む緩衝液と移動度の小さなイオンを含む緩衝液とを用いて、分離されたゾーンの全てが同じ速度で移動するような状態を作って分離させる電気泳動法で、試料は二つの緩衝液に挟まれて分離し収束する挙動を示す。
【００３６】
したがって本発明の第1の好ましい実施の態様では、陽電極近域に流す泳動緩衝液と陰電極近域に流す泳動緩衝液と試料流通部域に流す泳動緩衝液とを電気伝導度が異なる泳動緩衝液とし、両電極近域に流す泳動緩衝液に対し試料流通部域に流す泳動緩衝液の電気伝導度を低くし、陽電極近域に流す泳動緩衝液として分離する試料成分よりも移動度の大きな陰イオンを含んだ緩衝液を用い、陰電極近域に流す泳動緩衝液として分離する試料成分よりも移動度の小さな陰イオンを含んだ緩衝液を用いることで、分離能を向上し、且つ高濃度の分取液を得ることが可能なフリーフロー電気泳動法を提供することができる。
なお、この発明の実施例は、当然、各種変更が可能である。
【００３７】
例えば、緩衝液２は被分離試料成分よりも移動度の大きい陰イオンを含むものであれば特に限定されない。陰イオン種としては、クロルイオンの他に酢酸などを用いることができる。また、緩衝液３は被分離試料成分よりも移動度の小さい陰イオンを含むものであれば特に限定されない。陰イオン種としてはＣＡＰＳの他に、カプロン酸、グルタミン酸、β−アラニン、フェノールなどを用いることができる。緩衝液１は、含まれる陰イオンの移動度が緩衝液２中の陰イオンの移動度よりも遅いもので、緩衝液３中に含まれる陰イオンの移動度と同じもしくは速いものを用いれば、その種類は限定されない。緩衝液１，２，３共に、陰イオンの対イオンの種類は特に限定されない。トリスヒドロキシメチルアミノメタンの他に例えば、ヒスチジン、β−アラニン、アメジオール、２−アミノ−２−メチルプロパノール、バリウムイオン、カリウムイオン等を用いることができる。また、緩衝液１の濃度は緩衝液２及び３よりも電気伝導度が低い状態とすれば特に限定されない。緩衝液２，３の注入口は限定されず、電極から適当な幅を持って流すことができる。また、試料注入口の場所は緩衝液１が流れている場所であれば限定されない。
【００３８】
なお、本実施例は陰イオンを分離対象試料成分とした場合における条件である。陽イオンを分離対象とする場合、陽電極近域に流す泳動緩衝液に分離する試料成分よりも移動度の小さな陽イオンを含んだ緩衝液を用い、陰電極近域に流す泳動緩衝液に分離する試料成分よりも移動度の大きな陽イオンを含んだ緩衝液を用いることで、同様の効果を有するフリーフロー電気泳動法を提供することができる。
【００３９】
（実施例２）（請求項２に該当）
緩衝液１として１０ｍＭトリスヒドロキシメチルアミノメタン−１００ｍＭＣＡＰＳ緩衝液を、緩衝液２として５ｍＭトリスヒドロキシメチルアミノメタン−１０ｍＭ酢酸緩衝液を、緩衝液３として５０ｍＭトリスヒドロキシメチルアミノメタン−５００ｍＭＣＡＰＳ緩衝液を、試料としてキシレンシアノールＦＦとブロモフェノールブルーを混合した水溶液を用い、参考例１で説明したフリーフロー電気泳動素子１にてフリーフロー電気泳動を行った。フリーフロー電気泳動素子１は電極７ａを電圧印加電源の陰極に、電極７ｂを電圧印加電源の陽極に接続した。緩衝液は、陰極近域の緩衝液注入口４ａ〜４ｅに緩衝液３を、陽極近域の緩衝液注入口４ｑ〜４ｕに緩衝液２を、試料流通部域の緩衝液注入口４ｆ〜４ｐに緩衝液１をポンプで流した。試料は試料注入口５ｂからポンプで注入した。フリーフロー電気泳動は、緩衝液１と２及び試料を注入しながら電極７に電圧を印加して行った。分取液は流出口６ａ〜６ｕからの流出液を回収して得た。数ｋＶの電圧を印加しフリーフロー電気泳動を行うと、試料中のキシレンシアノールＦＦとブロモフェノールブルーは分離後に収束し、キシレンシアノールＦＦは陰極よりの流出口に、ブロモフェノールブルーは陽極よりの流出口に分離して流出した。
【００４０】
数ｋＶの電圧を印加しフリーフロー電気泳動を行うと、試料中のキシレンシアノールＦＦとブロモフェノールブルーは分離後に収束し、キシレンシアノールＦＦは陰極よりの流出口に、ブロモフェノールブルーは陽極よりの流出口に分離して流出した。参考例１同様、分離率は単一の緩衝液を用いた場合よりも優れており、分離能の高い分離が可能となった。また実施例１同様、分離後に収束しているため、濃度の高い状態での分離が可能となった。また、実施例１の条件では収束に要する時間が試料注入後から３秒であったのに対し、本実施例では１秒で収束した。このように分離後の収束が短時間生じ、効率的な分離が可能となった。
【００４１】
（作用・効果）
次に、この発明の実施例の作用及び効果を説明する。
本実施例では陰電極近域に緩衝液３が、陽電極近域に緩衝液２が、試料流通部域に緩衝液１が流れた状態でフリーフロー電気泳動が行われる。緩衝液３及び２は緩衝液１に対して濃度が高いため電気伝導度が高い。電極７に印加した電圧は、電気伝導度の低い緩衝液１に大きな割合でかかる。このため、試料が流れる近域に効果的に高電圧を印加することが可能となり、本発明で目的とする分離能の向上が達成できる。
【００４２】
また、緩衝液３に含まれるＣＡＰＳは試料のキシレンシアノールＦＦ及びブロモフェノールブルーよりも移動度が小さく、緩衝液２に含まれるクロルイオンは試料のキシレンシアノールＦＦ及びブロモフェノールブルーよりも移動度が大きい。このため、本実施例における電気泳動は実施例１と同様に等速電気泳動的な分離が実現され、試料は先行イオンであるクロルイオンと終末イオンであるＣＡＰＳの間に挟まれて分離しながら収束する。このため分離した成分が広がらず高濃度の状態で回収することが可能となる。
また、緩衝液１は緩衝液３を５倍希釈した組成であり、含まれる陰イオンが等しいため、収束に要する時間を短縮することが可能となる。また、緩衝液１は緩衝液３を希釈して調製でき、緩衝液の準備が簡便となった。
【００４３】
したがって本発明は、陽電極近域に流す泳動緩衝液と陰電極近域に流す泳動緩衝液と試料流通部域に流す泳動緩衝液とを電気伝導度が異なる泳動緩衝液とし、両電極近域に流す泳動緩衝液に対し試料流通部域に流す泳動緩衝液の電気伝導度を低くし、陽電極近域に流す泳動緩衝液に分離する試料よりも移動度の大きな陰イオンを含んだ緩衝液を用い、陰電極近域に流す泳動緩衝液に分離する試料よりも移動度の小さな陰イオンを含んだ緩衝液を用い、試料流通部域に流す泳動緩衝液に陰電極近域に流す泳動緩衝液を希釈した液を用いることで、分離能を向上し、且つ効率的に高濃度の分取液を得ることが可能なフリーフロー電気泳動法を提供することができる。
なお、この発明の実施例は、実施例１と同様に当然、各種変更が可能である。
【００４４】
例えば、緩衝液２は試料よりも移動度の大きい陰イオンを含むものであれば特に限定されない。陰イオン種としては、クロルイオンの他に酢酸などを用いることができる。また、緩衝液３は試料よりも移動度の小さい陰イオンを含むものであれば特に限定されない。陰イオン種としてはＣＡＰＳの他に、カプロン酸、グルタミン酸、β−アラニン、フェノールなどを用いることができる。緩衝液１，２，３共に、陰イオンの対イオンの種類は特に限定されない。トリスヒドロキシメチルアミノメタンの他に例えば、ヒスチジン、β−アラニン、アメジオール、２−アミノ−２−メチルプロパノール、バリウムイオン、カリウムイオン等を用いることができる。また、緩衝液１は緩衝液３を希釈したものであればその濃度は特に限定されない。緩衝液２，３の注入口は限定されず、電極から適当な幅を持って流すことができる。また、試料注入口の場所は緩衝液１が流れている場所であれば限定されない。
【００４５】
（実施例３）（請求項３に該当）
緩衝液１として５ｍＭトリスヒドロキシメチルアミノメタン−５ｍＭ６−アミノ−ｎ−カプロン酸緩衝液を、緩衝液２として５ｍＭトリスヒドロキシメチルアミノメタン−５ｍＭ塩酸緩衝液を、緩衝液３として５０ｍＭトリスヒドロキシメチルアミノメタン−５００ｍＭ６−アミノ−ｎ−カプロン酸緩衝液を、試料としてキシレンシアノールＦＦとブロモフェノールブルーを混合した水溶液を用い、図1及び図2で説明したフリーフロー電気泳動素子１にてフリーフロー電気泳動を行った。緩衝液の調製において、緩衝液２と緩衝液３は電気伝導度が等しくなるように調製した。電気電伝導度は２５℃の条件にで伝導率測定率で測定し、調整した。本実施例における緩衝液２及び３の電気伝導度は０．２５ｍＳ／ｃｍであった。フリーフロー電気泳動素子１は電極７ａを電圧印加電源の陰極に、電極７ｂを電圧印加電源の陽極に接続した。緩衝液は、陰極近域の緩衝液注入口４ａ〜ｅに緩衝液３を、陽極側の緩衝液注入口４ｑ〜ｕに緩衝液２を、試料流通部域の緩衝液注入口４ｆ〜ｐに緩衝液１をポンプで流した。試料は試料注入口５ｂからポンプで注入した。フリーフロー電気泳動は、緩衝液１と２及び試料を注入しながら電極７に電圧を印加して行った。分取液は流出口６ａ〜ｕからの流出液を回収して得た。数ｋＶの電圧を印加しフリーフロー電気泳動を行うと、試料中のキシレンシアノールＦＦとブロモフェノールブルーは分離後に収束し、キシレンシアノールＦＦは陰極よりの流出口に、ブロモフェノールブルーは陽極よりの流出口に分離して流出した。分離率は単一の緩衝液を用いた場合よりも優れており、分離能の高い分離が可能となった。また、分離後に収束しているため、濃度の高い状態での分離が可能となった。また、収束も短時間で生じ、効率的な分離が可能となった。また、電極７における気泡の発生が安定し、長時間の安定な分離が可能となった。
【００４６】
数ｋＶの電圧を印加しフリーフロー電気泳動を行うと、試料中のキシレンシアノールＦＦとブロモフェノールブルーは分離後に収束し、キシレンシアノールＦＦは陰極よりの流出口に、ブロモフェノールブルーは陽極よりの流出口に分離して流出した。参考例１同様、分離率は単一の緩衝液を用いた場合よりも優れており、分離能の高い分離が可能となった。また実施例１同様、分離後に収束しているため、濃度の高い状態での分離が可能となった。また、実施例２同様、収束も短時間で生じ効率的な分離が可能となった。また実施例２では、緩衝液２と３の電気伝導度が等しくないため電気伝導度の低い緩衝液３側に緩衝液２側よりも高いジュール熱が発生して、緩衝液３側から生じる気泡発生量が多くなり、長時間の安定した流れが得られなかったのに対し、本実施例では緩衝液２と３の電気伝導度が等しいため、両電極側の発熱量が均一となって気泡の発生量が安定した。このため、長時間の安定な分離が可能となった。
【００４７】
（作用・効果）
次に、この発明の実施例の作用及び効果を説明する。
本実施例では陰電極近域に緩衝液３が、陽電極近域に緩衝液２が、試料流通部域に緩衝液１が流れた状態でフリーフロー電気泳動が行われる。緩衝液３及び２は緩衝液１に対して濃度が高いため電気伝導度が高い。電極７に印加した電圧は、電気伝導度の低い緩衝液１に大きな割合でかかる。このため、試料が流れる近域に効果的に高電圧を印加することが可能となり、本発明で目的とする分離能の向上が達成される。
また、緩衝液３に含まれるＣＡＰＳは試料のキシレンシアノールＦＦ及びブロモフェノールブルーよりも移動度が小さく、緩衝液２に含まれるクロルイオンは試料のキシレンシアノールＦＦ及びブロモフェノールブルーよりも移動度が大きい。このため、本実施例における電気泳動は実施例２と同様に等速電気泳動的な分離が実現され、試料は先行イオンであるクロルイオンと終末イオンであるＣＡＰＳの間に挟まれて分離しながら収束する。従って、分離した成分が広がらず高濃度の状態で回収することが可能となる。また、緩衝液１と緩衝液３は含まれる陰イオンが等しいため、収束に要する時間が短縮される。また、緩衝液２と緩衝液３は電気伝導度が等しいため両電極で生じるジュール熱による発熱が等しく、両電極で生じる気泡の出方が偏らずに安定するため、長時間の安定な分離が可能となる。
【００４８】
故に、本発明は、陽電極近域に流す泳動緩衝液と陰電極近域に流す泳動緩衝液と試料流通部域に流す泳動緩衝液とを電気伝導度が異なる泳動緩衝液とし、両電極近域に流す泳動緩衝液に対し試料流通部域に流す泳動緩衝液の電気伝導度を低くし、陽電極近域に流す泳動緩衝液として分離する試料成分よりも移動度の大きな陰イオンを含んだ緩衝液を用い、陰電極近域に流す泳動緩衝液として分離する試料よりも移動度の小さな陰イオンを含んだ緩衝液を用い、陽電極近域に流す泳動緩衝液と陰電極近域に流す泳動緩衝液との電気伝導度を等しくすることで、分離能を向上し、高濃度の分取液が得られ、且つ長時間の安定した使用が可能なフリーフロー電気泳動法を提供することができる。
なお、この発明の実施例は、実施例１と同様に当然、各種変更が可能である。
【００４９】
例えば、緩衝液２は試料よりも移動度の大きい陰イオンを含むもので、緩衝液３と同じ電気伝導度であれば組成や濃度は特に限定されない。陰イオン種としては、クロルイオンの他に酢酸などを用いることができる。また、緩衝液３は試料よりも移動度の小さい陰イオンを含むもので、緩衝液２と同じ電気伝導度であれば組成や濃度は特に限定されない。陰イオン種としてはＣＡＰＳの他に、カプロン酸、グルタミン酸、β−アラニン、フェノールなどを用いることができる。緩衝液１は、含まれる陰イオンの移動度が緩衝液２中の陰イオンの移動度と同じもしくは遅いもので、緩衝液３中に含まれる陰イオンの移動度と同じもしくは速いものを用いれば、その種類は限定されない。緩衝液１，２，３共に、陰イオンの対イオンの種類は特に限定されない。トリスヒドロキシメチルアミノメタンの他に例えば、ヒスチジン、β−アラニン、アメジオール、２−アミノ−２−メチルプロパノール、バリウムイオン、カリウムイオン等を用いることができる。また、緩衝液１の濃度は緩衝液２及び３よりも電気伝導度が低い状態とすれば特に限定されない。緩衝液２，３の注入口は限定されず、電極から適当な幅を持って流すことができる。また、試料注入口の場所は緩衝液１が流れている場所であれば限定されない。
【００５０】
【発明の効果】
参考例を含む本願請求項１によれば、電気泳動槽に緩衝液と試料とを連続的に注入しながら試料の分離・分取を行うフリーフロー電気泳動法において、少なくとも２種以上の泳動緩衝液を用い、両電極近域に流す泳動緩衝液と試料流通部域に流す泳動緩衝液とを電気伝導度が異なる泳動緩衝液とし、両電極近域に流す泳動緩衝液に対し試料流通部域に流す泳動緩衝液の電気伝導度を低くしているので、電極間に印加した電圧は、電気伝導度の低い緩衝液に大きな割合でかかる。このため、試料が流れる近域に効果的に高電圧を印加することが可能となり、分離能が向上する。分離速度を速くできるので、使用するフリーフロー電気泳動素子を小型化し、廉価に製造することが可能となり、将来的には使い捨てフリーフロー電気泳動素子を可能とする。また、両電極近域には電圧のかかる割合が低いためジュール熱による発熱も抑えられ、電極における気泡の発生を抑制することができる。
【００５１】
また、本願請求項１によれば、少なくとも３種の泳動緩衝液を用い、陽電極近域に流す泳動緩衝液と陰電極近域に流す泳動緩衝液と試料流通部域に流す泳動緩衝液とを電気伝導度が異なる泳動緩衝液とし、陽電極近域に流す泳動緩衝液として分離する試料成分よりも移動度の大きな陰イオンを含んだ緩衝液を用い、陰電極近域に流す泳動緩衝液として分離する試料成分よりも移動度の小さな陰イオンを含んだ緩衝液を用いる。このため、請求項１に含まれる参考例で得られる効果に加えて、請求項１におけるフリーフロー電気泳動法では等速電気泳動的な分離が実現され、試料は先行イオンと終末イオンの間に挟まれて分離しながら収束する。このため分離した成分が広がらず高濃度の状態で回収することが可能となる。
【００５２】
本願請求項２によれば、請求項２記載のフリーフロー電気泳動法において、試料流通部域に流す泳動緩衝液に、陰電極近域に流す泳動緩衝液を希釈した液を用いる。このため、本願請求項２におけるフリーフロー電気泳動法では、参考例１およびそれを含む請求項１で得られる効果に加えて、試料流通部域に流す泳動緩衝液は陰電極近域に流す泳動緩衝液を希釈した組成であり、含まれる陰イオンが等しいため、収束に要する時間を短縮することが可能となる。また、試料流通部域に流す泳動緩衝液は陰電極近域に流す泳動緩衝液を希釈して調製でき、緩衝液の準備が簡便となる。
【００５３】
請求項３によれば、参考例１およびそれを含む請求項１記載のフリーフロー電気泳動法において、陽電極近域に流す泳動緩衝液と陰電極近域に流す泳動緩衝液の電気伝導度が等しい。参考例１を含む請求項１で得られる効果に加えて、請求項３におけるフリーフロー電気泳動法では陽電極近域に流す泳動緩衝液と陰電極近域に流す泳動緩衝液は電気伝導度が等しいため両電極で生じるジュール熱による発熱が等しく、両電極で生じる気泡の出方が偏らずに安定するため、長時間の安定な分離が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  本発明のフリーフロー電気泳動法で用いることができるフリーフロー電泳動素子の平面図である。
【図２】  図1に示すフリーフロー電泳動素子のA−A線での断面図である。
【図３】図１のフリーフロー電気泳動素子の泳動槽構成基板の上面図である。
【図４】図１のフリーフロー電気泳動素子の注入口構成基板３の裏面図である。
【符号の説明】
１  フリーフロー電気泳動素子
２  泳動槽構成基板
３  注入口構成基板
４（４ａ〜４ｕ）  緩衝液注入口
５（５ａ〜５ｅ）  試料注入口
６（６ａ〜６ｕ）  流出口
７（７ａ〜７ｂ）  電極
８  泳動槽（電気泳動槽）
９  電極室
１０  隔壁
【図１】
0003833110.tif 000002
【図２】
0003833110.tif 000003
【図３】
0003833110.tif 000004
【図４】
0003833110.tif 000005