(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：３に残基１−５３５として示されたアミノ酸配列および配列番号：３に残基７１２−７２２として示されたアミノ酸配列を含み、さらに配列番号：３に残基５３６−７１１として示される１６個のリピート単位のうち０から１５個を前記２つの配列の間に含む、７２２アミノ酸より短いＢＳＳＬ変種であるＢＳＳＬ活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子。
【請求項２】
配列表に配列番号：５、６または９として示されたアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする請求項１に記載の核酸分子。
【請求項３】
請求項１または２に記載の核酸配列によりコードされたポリペプチド。
【請求項４】
９０％以上の純度を有する請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項５】
請求項１または２に記載の核酸分子を含むハイブリッド遺伝子。
【請求項６】
請求項５に記載のハイブリッド遺伝子を含む複製可能な発現ベクター。
【請求項７】
ウシ乳頭腫ウイルスベクターｐＳ２５８、ｐＳ２５９またはｐＳ２９９である請求項６に記載のベクター。
【請求項８】
請求項５に記載のハイブリッド遺伝子を取り込んだ細胞。
【請求項９】
マウス細胞系統Ｃ１２７または大腸菌からのものである請求項８に記載の細胞。
【請求項１０】
（ｉ）請求項１または２に記載の核酸分子を特定の宿主細胞または生物中で複製できるハイブリッド遺伝子に挿入し；（ii）得られた組換えハイブリッド遺伝子を宿主細胞または生物に導入し；（iii）ポリペプチドを発現させるために、得られた細胞を培地中または培地上で確認し増殖し、あるいは生物を確認し生殖させ；そして（iv）そのポリペプチドを回収することより成る、組換えポリペプチドの製造方法。
【請求項１１】
前記ハイブリッド遺伝子がウシ乳頭腫ウイルスベクターｐＳ２５８、ｐＳ２５９またはｐＳ２９９に含まれる請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ハイブリッド遺伝子が発現されると組換えポリペプチドが生産されるようにハイブリッド遺伝子を取り込んだ宿主細胞または生物中で発現可能なハイブリッド遺伝子であって、そして請求項１または２に記載の核酸配列を該ハイブリッド遺伝子の発現を媒介できる遺伝子に挿入することにより生産されるハイブリッド遺伝子を含む発現系。
【請求項１３】
（ａ）請求項１２に記載の発現系を非ヒト哺乳動物の受精卵または胚細胞に導入してその発現系をその哺乳動物の生殖系列に取り込み、そして
（ｂ）得られた導入受精卵または胚を成熟雌性非ヒト哺乳動物に発生させることより成る、ＢＳＳＬ変種を発現できるトランスジェニック非ヒト哺乳動物の作出方法。
【請求項１４】
（ａ）非ヒト哺乳動物のＢＳＳＬ発現能を破壊して実質的に哺乳動物ＢＳＳＬが発現されないようにし、そして請求項１２に記載の発現系を前記哺乳動物の生殖系列に該哺乳動物でＢＳＳＬ変種が発現されるように挿入する；および／または（ｂ）その哺乳動物ＢＳＳＬ遺伝子またはその一部を請求項１２に記載の発現系で置換することより成る、ＢＳＳＬ変種を発現でき、そしてその哺乳動物自体からのＢＳＳＬを実質的に発現できないトランスジェニック非ヒト哺乳動物の作出方法。
【請求項１５】
請求項１または２に記載のＤＮＡ配列をそのゲノム中に取り込んだトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項１６】
前記ＤＮＡ配列が哺乳動物の生殖系列に存在する請求項１５に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項１７】
前記ＤＮＡ配列が哺乳動物の乳タンパク質遺伝子中に存在する請求項１５または１６記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項１８】
マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタおよびウシより成る群より選択される請求項１５〜１７のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項１９】
請求項１５〜１８のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物の子孫。
【請求項２０】
請求項１５〜１９のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物から得られる乳。
【請求項２１】
請求項２０に記載の乳より成る特殊調整粉乳。
【請求項２２】
請求項３または４に記載のポリペプチドより成る特殊調整粉乳。
【請求項２３】
乳児食組成物に請求項３または４に記載のポリペプチドを補うことより成る特殊調整粉乳の製造方法。
【請求項２４】
外分泌膵不全に関する病態、嚢胞性線維症、慢性膵炎、脂肪吸収不全、脂溶性ビタミン吸収不全もしくは生理学的理由による脂肪吸収不全の治療のため、または食物脂質利用もしくは早産新生児の食物脂質利用の改善のための請求項３または４に記載のポリペプチドを含んで成る医薬。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は胆汁酸塩刺激リパーゼ（Bile Salt-Stimulated Lipase）（BSSL；EC 3.1.1.1）の変種である新規ポリペプチドに関する。本発明はまた、それらポリペプチドをコードするDNA分子、そしてそれらDNA分子を含んで成る亜生産物（subproduct）にも関する。本発明は更に、前記BSSL変種の生産方法、およびBSSL変種発現能のあるトランスジェニック非ヒト（すなわちヒト以外の）哺乳動物の生産方法に関する。更に、本発明は、そのようなトランスジェニック動物のほか、かかるトランスジェニック動物からの乳より成る特殊調整粉乳（infant formula）に関する。本発明はまた、前記ポリペプチドより成る薬学的組成物、および前記ポリペプチドおよびDNA分子の医薬製造のための使用にも関する。
発明の背景
食物脂質の加水分解
食物脂質は重要なエネルギー源である。高エネルギートリアシルグリセロールはこれらの脂質の95％以上を構成する。一部の脂質、例えばある種の脂肪酸と脂溶性ビタミンは必須食物成分である。胃腸管吸収の前に、それらトリアシルグリセロールおよびマイナー成分、すなわちエステル化脂溶性ビタミンとコレステロール、およびジアシルホスファチジルグリセロールはエステル結合が加水分解される必要があり、それによってより疎水性の低い、吸収性のよい生成物が得られる。これらの反応はリパーゼと呼ばれる特定の酵素群によって触媒される。
人間の場合に関与する必須リパーゼは、胃リパーゼ、膵コリパーゼ依存性リパーゼ（トリ−およびジアシルグリセロールの加水分解）、膵ホスホリパーゼＡ２（ジアシルホスファチジルグリセロールの加水分解）およびカルボン酸エステルハイドロラーゼ（CEH）（コレステリル−および脂溶性ビタミンエステルのみならず、トリ−、ジ−およびモノアシルグリセロールの加水分解）であると考えられる。母乳保育新生児では、胆汁酸塩刺激リパーゼ（BSSL）が前述の脂質のいくつかについての加水分解に重要な役割を演じている。胆汁酸塩と共に脂質消化生成物は混合ミセルまたは単層ベジクルを形成し（Hernell et al., 1990）それがもとで吸収が生じる。
胆汁酸塩刺激リパーゼ
胆汁酸塩刺激リパーゼ（BSSL）は限られた数の生物種、例えば、ヒト、ゴリラ、ネコおよびイヌなどの乳成分である（Hernell et al., 1989, Hamosh et al., 1986）。上方小腸内容物中で胆汁と混ざりあうと、BSSLは一次胆汁酸塩により特異的に活性化される（Hernell, 1975）。全乳タンパク質の約１％にあたる
0003837444.tif 000002
BSSLは乳と共に胃を通過する間分解されることはなく、また十二指腸内容物中で胆汁酸塩によって、トリプシンやキモトリプシンなどの膵プロテアーゼによる不活性化から保護される。
BSSLを完全に不活性化してしまう
0003837444.tif 000003
人乳熱処理（62.5℃で30分間低温殺菌）によって、早期産児の脂肪吸収係数は約1/3低下する（Williamson et al., 1978, Atkinson et al., 1981）。従って、類似脂肪組成の特殊調整粉乳よりも新鮮な人乳トリアシルグリセロールの利用の方が優れているのはBSSLの故である（Hernell et al., 1991, Chapell et al., 1986）。
BSSLはトリアシルグリセロールだけでなくジ−およびモノアシルグリセロール、コレステリルエステルおよび脂溶性ビタミンエステルも加水分解することから、非特異的リパーゼである（EC 3.1.1.1）。従って、人乳トリアシルグリセロールの最も効率的な利用は胃リパーゼ（EC 3.1.1.3）、コリパーゼ依存性膵リパーゼ（EC 3.1.1.3）およびBSSLの協力作用を必要とするのに
0003837444.tif 000004
活性化後のBSSLはそれだけで大部分の人乳脂質を加水分解する潜在能力を有する。
最近の研究の示唆するところによれば、乳酵素は新生児による長鎖ポリ不飽和脂肪酸の利用に特に重要である（Hernell et al., 1993）。これらの脂肪酸はエイコサノイドの、そして神経発生の重要な前駆体である。新生児、特に早期に生まれた新生児では、これらの脂肪酸をそれらの前駆体から合成する能力に限界がある。それ故、それらは、誕生後、今のところ規定されない期間の間必須と考えられる。
いくつかの研究室による最近の研究で、乳リパーゼおよび膵カルボン酸エステルハイドロラーゼ（CEH）（E.C. 3.1.1.1）の両者のcDNA構造が確認された（Baba et al., 1991；Hui et al., 1991；Nilsson et al., 1990；Reue et al., 1991）ところ、その結論は、乳酵素と膵酵素とは同じ遺伝子の産生物であるというものである。BSSL／CEH遺伝子のcDNA配列および推測されるアミノ酸配列（配列番号：１）は、WO 91/15234（Oklahoma Medical Research Foundation）およびWO 91/18923（Aktiebolaget Astra）にも開示されている。
BSSLは単鎖糖タンパク質である。推測されるタンパク質（配列番号：３）は722アミノ酸残基を有し、また高度にグリコシル化されている（Abouakil et al., 1989）。このタンパク質のＮ−末端側半分はアセチルコリンエステラーゼおよびいくつかの他のエステラーゼに対し、著しい相同性を示す（Nilsson et al., 1990）。
仮の活性部位セリン残基は、セリン−194に位置していて、このセリン周辺の配列はセリンハイドロラーゼのコンセンサス活性部位配列と符号する。単一の仮のＮ−グリコシル化部位は活性部位セリンからわずか７残基Ｎ末端側に位置している（Nilsson et al., 1990）。
BSSL配列は、そのＣ−末端部に各々11アミノ酸残基の16個の高プロリンリピートを含んでいる。リピート数の変動が様々な生物種由来の対応酵素間の分子サイズおよびアミノ酸組成の相違の主たる説明になると思われる（Han et al., 1987, Fontaine et al., 1991, Kuger et al., 1989）。これらのリピートはタンパク質の15〜20％炭水化物のほとんどを担持している（Baba et al., 1991, Abouakil et al., 1989）。
BSSLおよび典型的エステラーゼの間の独特な構造的相違は、ポリペプチド鎖のＣ−末端部、すなわち11アミノ酸残基の16個の高プロリンリピートにある。雌ウシおよびラット由来の対応膵酵素はそれぞれ３個および４個のリピートしか持たない（Han et al., 1987, Kyger et al., 1989）。従って、見込みある一つの仮説は、Ｃ−末端または少なくともその一部がリパーゼ活性、すなわち乳化長鎖トリアシルグリセロールに対する活性に不可欠であるというものである。
脂質吸収不全
脂質吸収不全の、従って栄養不良の、共通的原因は膵コリパーゼ依存性リパーゼおよび／または胆汁酸塩の管腔内レベルの低下である。このようなリパーゼ欠乏の典型例は、患者の80％において生涯欠乏をもたらす一般的遺伝病である嚢胞性線維症患者、およびしばしば慢性アルコール中毒症によるところの慢性膵炎患者である。
膵リパーゼ欠乏症患者の現行治療は、極めて多い用量のブタ膵酵素の粗製調製物を経口投与する方法である。しかしながら、コリパーゼ依存性膵リパーゼは胃内に広がる低pHにより失活する。この作用は大量の酵素を用いても完全には克服し得ない。従って大量投与は大抵の患者にとって不十分である上に、それら調製物は純粋でなくまた口あたりが悪い。
胃の酸性域は通過して空腸の比較的アルカリ性の環境においてのみ酵素を放出するある種の錠剤が組成されている。しかしながら、多くの膵疾患患者は、異常酸性空腸を有し、そしてそのような場合には、錠剤が酵素を放出し得なくなることがある。
さらに、現在上市されている調製物は人間以外の給源のものであるため、患者に有害な作用を生じかねない、あるいは治療効率低下を招きかねない免疫反応のリスクがある。現在の調製物についてのもう一つの短所は、コリパーゼ依存性リパーゼ以外の脂肪分解活性含量について述べられていない点である。実際、それらの大抵のものは極めて低いレベルのBSSL／CEH活性を含んでいる。補給療法にも拘わらず嚢胞性線維症を罹う多くの患者が脂溶性ビタミンおよび必須脂肪酸の欠乏症を罹うのは、このことが一つの理由であり得る。
従って、ヒトリパーゼに由来する性質および構造を有すると共に広い基質特異性を有し、また、一種または数種の膵脂肪分解酵素の欠乏症を罹う患者に経口投与できる製品が大いに必要とされている。本発明を用いることにより導くことのできる製品は、それ自体で、あるいは他のリパーゼを含有する調製物との組み合わせでこのニーズを充足する。
本発明の技術思想の簡単な説明
本発明による組換えBSSL変種は触媒活性は維持するが、全長BSSLよりも少ないグリコシル化部位を含み、従って潜在的に低下した炭水化物不均質度をもって生産される。このように複雑さが少なくなるため精製および組換えタンパク質の確認が容易となり、その結果、BSSL活性を有するポリペプチドの生産の費用効果が向上する。
一つの観点において、グリコシル化度が低下することから、宿主に対する苛酷さが低下し、またいくつかの宿主細胞においてより高い生産が可能となる。もう一つの観点において、BSSL変種ではグリコシル化部位の数が減少するために、下等真核生物での効率的生産が可能となり、また免疫反応を起こす可能性のある異常グリコシル化の潜在的危険が抑えられる。グリコシル化のサイズが減少しまた複雑さがなくなるということは、極めて複雑で重い炭水化物部位を有するタンパク質の場合よりも宿主範囲が広くなるということも示唆している。
治療的に用いるBSSL変種がサイズはより小さいが等しく活性であるということは、補充に必要な物質の重量が軽くなることを意味する。Ｏ−グリコシル化リピートの大部分または全部を欠く組換えBSSL変種のもう一つの可能な長所は、受容個体における免疫応答の危険が低下する点である。これは、Ｏ−連結糖がそれが産生される細胞によっては極めて異種であり得るためである。
天然BSSLは腸粘膜に結合しそしてその腸粘膜によって取り込まれるとの指摘が科学文献にある。取り込みが少なくなるように選択されたBSSL変種はより長時間にわたって食物脂質基質に対して作用することになり、その結果、管腔内消化が一段と効率化する。このような変種の例がグリコシル化度の低い分子である。
前述のとおり、BSSLは、新生児の神経発生に大変重要である長鎖ポリ不飽和脂肪酸の利用（Hernell et al., 1993）、またビタミンＡの利用に特に重要であることが示唆されている。これらの点で一段と有効な本発明のBSSL変種は既知の方法により選択することができる。端を切り取った、あるいは短縮された酵素は、異なる脂質基質に対する特異性に影響し得る高次構造に関し異なりがちである。
本発明の開示
一つの観点において、本発明は、配列番号：３に残基536-722として示されたアミノ酸配列の一部を含む722アミノ酸より短いBSSL変種であるポリペプチドをコードする核酸分子に関する。
「アミノ酸配列の一部」という用語は、単一のアミノ酸、およびいくつかのアミノ酸の配列またはいくつかのそのような配列を組み合わせたものより成るものとして理解されるべきである。
「BSSL変種」という用語は、配列表に配列番号：３として示されるヒトBSSLのアミノ酸配列の一部より成るBSSL活性を有するポリペプチドとして理解されるべきである。
「BSSL活性を有するポリペプチド」という用語は、少くとも、
（a）経口投与に適している；
（b）特異的胆汁酸塩により活性化される；
（c）小腸内容物中で非特異的リパーゼとして働く、すなわち、脂質をそれらの化学構造および物理的状態（乳化、ミセル、可溶状態）とは相対的に無関係に加水分解できる
という性質を有し、そして所望により
（d）異なる長鎖および異なる不飽和度の脂肪酸を含むトリアシルグリセロールを加水分解できる；
（e）更に、ジアシルグリセロール、モノアシルグリセロール、コレステリルエステル、リソホスファチジルアシルグリセロールおよびレチニルおよびその他の脂溶性ビタミン−エステルをも加水分解できる；
（f）トリアシルグリセロールのsn-1（3）エステル結合だけでなくsn-2エステル結合も加水分解できる；
（g）一次だけでなく二次胆汁酸塩とも相互作用することができる；
（h）至適活性は胆汁酸塩に依存する；
（i）胃内容物が触媒効率に実質的に全く影響しないという意味において安定である；
（j）胆汁酸塩が存在すれば、膵プロテアーゼ、例えばトリプシンによる不活性化に対して安定である；
（k）ヘパリンおよびヘパリン誘導体、例えばヘパリンサルフェートに結合することができる；
（l）脂質−水中間相（interphase）に結合することができる；
（m）凍結乾燥を可能とするに十分安定である；
（n）人乳または処方乳（milk formula）などで食物成分と混合した場合に安定である
という性質のうちの一以上を有するポリペプチドとして理解されるべきである。
別の観点において、本発明は、前記BSSL変種がそのＣ−末端位にフェニルアラニン残基を有するか、またはそのＣ−末端部にGln-Met-Pro配列を含んで成るか、あるいはまたそのＣ−末端部に配列番号：３に残基712-722として示されたアミノ酸配列を含んで成る前記核酸分子に関する。
本明細書の文脈において、「Ｃ−末端位」という用語は、最後のＣ−末端残基の位置を示し、一方、「Ｃ−末端部」という用語はBSSL変種のＣ−末端を構成する約50アミノ酸残基であるとして理解されるべきである。
更に本発明は、前記BSSL変種が16より少ないリピート単位を含んで成る前記核酸分子に関する。本明細書の文脈において、「リピート単位」という用語は、配列表の配列番号：１に示された各々33ヌクレオチドの反復単位の一つを示す。
別の観点において、本発明は、そのアミノ酸配列が配列表に配列番号：５、６または９として示されたアミノ酸配列と少なくとも90％相同であるポリペプチドをコードする核酸分子、およびそのアミノ酸配列が配列表に配列番号：７として示されたアミノ酸配列と少なくとも90％相同であるポリペプチドをコードする核酸分子（ただし187位にアスパラギン残基を有するポリペプチドをコードする核酸分子を除く）に関する。
更に、本発明は、配列表に配列番号：５、６、７または９として示されるポリペプチド、および前記核酸配列によりコードされたポリペプチドにも関する。
更に、本発明は、前記核酸分子を含んで成るハイブリッド遺伝子、かかるハイブリッド遺伝子を含んで成る複製可能な発現ベクター、およびかかるハイブリッド遺伝子を取り込んだ細胞に関する。この細胞は原核細胞、単細胞真核生物または多細胞生物、例えば哺乳動物に由来する細胞であってよい。
本明細書の文脈において、「ハイブリッド遺伝子」とは一方において前述のBSSL変種をコードする核酸配列、そして他方においてハイブリッド遺伝子生産物の発現を媒介できる遺伝子の核酸配列を含んで成る核酸配列を示す。「遺伝子」という用語は、遺伝子全体ならびにハイブリッド遺伝子の意図した組織での発現を媒介しそしてターゲティングできるその亜配列を表わす。通常、前記亜配列は、少なくとも、プロモーター領域、転写開始部位、3′および5′非コーティング領域および構造配列のうちの一つ以上を取り込んだものである。
ハイブリッド遺伝子は、好ましくは、試験管内で、BSSL変種をコードする核酸配列を当該技術分野において知られる方法を用いて発現を媒介できる遺伝子中に挿入することにより形成される。あるいはまた、BSSL変種をコードする核酸配列は、生体内で相同組換えにより挿入することができる。
本明細書の文脈において、「複製可能な」という用語は、そのベクターが導入されている所与の宿主細胞中で複製できることを意味する。核酸配列のすぐ上流にシグナルペプチドをコードする配列を存在させてもよく、その存在によりそのベクターを取り込んだ宿主細胞により発現されるBSSL変種の分泌が確実となる。そのシグナル配列は、その核酸配列と天然的に関連するものであっても、あるいは別の起源のものであってもよい。
前記ベクターは、組換えDNA手順に都合よく付すことのできるいずれのベクターであってもよく、またベクターの選択は該ベクターを導入しようとする宿主細胞に依存することが多い。従って、ベクターは、自己複製ベクター、すなわちその複製が染色体複製から独立している染色体外物質として存在するベクターであってもよい。そのようなベクターとしては例えばプラスミド、ファージ、コスミド、ミニ、クロモゾームまたはウイルスが挙げられる。あるいはまた、ベクターは、宿主細胞に導入されると宿主細胞ゲノムに一体化されそしてその中に一体化された一つまたは複数のクロモゾームと共に複製されるものであってよい。適切なベクターの例は細菌発現ベクターおよび酵母発現ベクターである。本発明のベクターは前記定義した本発明の核酸配列のどれでも担持することができる。
もう一つの観点において、本発明は（ｉ）前述の核酸分子を特定の宿主細胞または生物中で複製できるハイブリッド遺伝子に挿入し；（ii）得られた組換えハイブリッド遺伝子を宿主細胞または生物に導入し；（iii）組換えポリペプチドを発現させるために、得られた細胞を培地中または培地上で増殖させ、あるいは生物を確認しそして生殖させ；そして（iv）そのポリペプチドを回収することより成る組換えポリペプチドの製造方法に関する。
細胞の増殖に用いられる培地は目的に適した任意の慣用培地であってよい。適当なベクターは前述のベクターのいずれであってもよく、また適当な宿主細胞は前掲の細胞タイプのいずれであってもよい。ベクターを構築しそしてそれを宿主細胞に導入するのに用いられる方法は、組換えDNA分野においてこのような目的に知られた任意の方法であってもよい。細胞により発現された組換えヒトBSSL変種は細胞のタイプおよびベクターの組成に依存して、分泌される、すなわち細胞膜を通して輸送される。
BSSL変種が組換え宿主により細胞内に生産される、すなわち細胞により分泌されない場合には、それは機械的手段、例えば音波処理またはホモジナイゼーションによる細胞破砕より成る標準的手順によって、あるいは酵素的または化学的手段を施した後精製することによって回収することができる。
BSSL変種をコードするDNA配列は、分泌されるためには、シグナルペプチドをコードする配列によって先行されるべきであり、その配列の存在により細胞からのBSSL変種の分泌が確実となるため、少なくとも有意割合の発現BSSL変種が培地に分泌されそして回収される。
更に、本発明は、ハイブリッド遺伝子が発現されると組換えポリペプチドが生産されるように該ハイブリッド遺伝子を取り込んだ宿主細胞または生物中で発現可能なハイブリッド遺伝子を含み、そして該ハイブリッド遺伝子は前記の核酸配列を該ハイブリッド遺伝子の発現を媒介できる遺伝子に挿入することにより生産される発現系に関する。
本発明の組換えBSSL変種を生産するための一つの可能な方法はBSSL変種を乳中に排泄できるトランスジェニック非ヒト哺乳動物の使用である。トランスジェニック非ヒト哺乳動物の使用には、高収量の組換えBSSL変種が妥当なコストで得られ、またとくに非ヒト哺乳動物が雌牛である場合には、例えば特殊調整粉乳の通常成分である乳中に組換えBSSL変種が生産されるため組換えBSSL変種を乳ベース製品中の補充栄養分として用いる場合に大がかりな精製を必要としないという利点がある。
更にまた、非ヒト哺乳動物などの高等生物中に生産すると通常、例えば前述の如き翻訳後プロセシングや適切な折りたたみに関し、哺乳動物タンパク質のプロセシングが正しく行われるようになる。更にまた大量の実質的に純粋なBSSL変種を得ることができる。
従って、前述の発現系は、BSSL変種をコードするDNA配列を非ヒト哺乳動物の乳タンパク質をコードする遺伝子に挿入して、そのハイブリッド遺伝子を取り込んだ哺乳動物の成熟雌の乳腺で発現できるハイブリッド遺伝子を形成して成る哺乳動物発現系であってよい。
発現組織としての乳腺および乳タンパク質をコードする遺伝子は、乳タンパク質が乳腺で高発現レベルで天然に生産されることから、一般に、トランスジェニック非ヒト哺乳動物での異種タンパク質生産に用いるのに特に適していると考えられる。更に、乳は集め易く、また大量に入手できる。これに関連して、組換えBSSL変種の生産での乳タンパク質遺伝子の使用には、それが発現および産生場所（乳腺）の調節の点でその天然の産生条件に似た条件下で生産されるという、もう一つの長所がある。
トランスジェニック哺乳動物に用いる場合、前述のハイブリッド遺伝子は好ましくは、ハイブリッド遺伝子産生物が乳腺中に正しく分泌しうるように、シグナルペプチドをコードする配列を含む。シグナルペプチドは、典型的には、当該乳タンパク質遺伝子に通常存在するものかあるいはBSSL変種をコードするDNA配列に関連のものである。しかしながら、ハイブリッド遺伝子産生物の乳腺への分泌を媒介できるその他のシグナル配列も適している。もちろん、ハイブリッド遺伝子の様々な要素は、遺伝子産生物の正しい発現とプロセシングが可能となるような仕方で融合されるべきである。従って、通常、選択したシグナルペプチドをコードするDNA配列は、BSSL変種をコードするDNA配列のＮ−末端部に正確に融合されるべきである。ハイブリッド遺伝子において、BSSL変種をコードするDNA配列は、通常、その停止コドンを含むが、それ自体のメッセージクリーバンス（message cleavance）およびポリアデニル化部位は含まない。BSSL変種をコードするDNA配列の下流には、通常、乳タンパク質遺伝子のmRNAプロセシング配列が保持される。
多くの要因が特定のハイブリッド遺伝子の実際の発現レベルを担っていると考えられる。プロモーターのおよび前述の如き他の調節配列の能力、哺乳動物のゲノムにおける発現系の一体化部位、乳タンパク質をコードする遺伝子におけるBSSL変種をコードするDNA配列の一体化部位、転写後調節を担う要素およびその他の同様の要因が得られる発現レベルに極めて重要であり得る。当業者であれば、ハイブリッド遺伝子の発現レベルに影響する各種要因に関する知識に基づいて、本発明の目的に有用な発現系の設計の仕方はわかるであろう。
使用すべき乳タンパク質遺伝子は発現系を挿入しようとしているものと同じ生物種に由来するものであってよく、あるいはそれは別の生物種に由来するものであってよい。これに関連して、遺伝子発現の標的を乳腺に定めて調節要素は生物種の境界を越えて機能を発揮する（これは考えられる共通の祖先によるものであるかもしれない）ことが示されている（Henninghausen et al., 1990）。
本発明の発現系の構築に使用すべき乳タンパク質をコードする適切な遺伝子またはそれらの有効亜配列の例は、通常、様々な哺乳動物由来の乳清タンパク質の中にみられ、例えば（好ましくはマウス由来の）乳清酸性タンパク質（whey acidic protein（WAP））遺伝子、および（好ましくはヒツジ由来の）β−ラクトグロブリン遺伝子などである。また、様々な起源のカゼイン遺伝子もBSSL変種のトランスジェニック生産に適していると認め得る可能性があり、例えばウシαS1−カゼインおよびウサギβ−カゼインなどが例示される。現在好ましいとされる遺伝子はマウスWAP遺伝子であるが、それは該遺伝子が様々なトランスジェニック動物の乳において多くの外来ヒトタンパク質について高レベルの発現を与えることができることが見出されているからである（Henninghausen et al, 1990）。
本発明の発現系と好適に関係付けられるもう一つの配列は高レベル発現を媒介できるいわゆる発現安定化配列である。かかる安定化配列が乳タンパク質遺伝子の近傍および上流に存在するとの強い示唆が存在する。
本発明には、（a）前述の発現系を非ヒト哺乳動物の受精卵または胚細胞に導入してその発現系をその哺乳動物の生殖系列に取り込み、そして（b）得られた導入受精卵または胚を成熟雌性非ヒト哺乳動物に発生させることより成るBSSL変種を発現できるトランスジェニック非ヒト哺乳動物の作出方法も包含される。
哺乳動物の生殖系列への発現系取り込みは任意の適切な方法、例えば“Manipulating the Mouse Embryo”；A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1986に記載されているような方法を用いて行うことができる。例えば数百分子の発現系を選択した哺乳動物の受精卵、例えば受精した一細胞卵またはその前核、または胚に直接注入でき、次いでその微注入卵を引き続き偽妊娠養母（foster mother）の卵管に移しそして発生させることができる。
BSSL変種を発現できるトランスジェニック非ヒト哺乳動物の作出方法はまた、その哺乳動物がその哺乳動物自体からのBSSLを実質的に発現できない方法も包含する。そのような方法は（a）非ヒト哺乳動物のBSSL発現能を破壊して実質的に哺乳動物BSSLが発現されないようにし、そして前述の発現系を前記哺乳動物の生殖系列に該哺乳動物中でBSSL変種が発現されるように挿入する、および／または（b）前記哺乳動物BSSL遺伝子またはその一部を前述の発現系で置換することより成る。
前述の哺乳動物のBSSL発現能はBSSLの発現を担うDNA配列に突然変異を導入することにより都合よく破壊することができる。そのような突然変異はDNA配列の解読枠をはずす変異、停止コドンの導入、またはDNA配列の一つ以上のヌクレオチドの欠失を包含しうる。
哺乳動物BSSL遺伝子またはその一部を、周知の相同組換え原理を用いることにより、前述の発現系、またはBSSL変種をコードするDNA配列で置換することができる。
もう一つの重要な観点において本発明は、前述のDNA配列をそのゲノム中に取り込んだトランスジェニック非ヒト哺乳動物に関する。前記DNA配列は、好ましくは、哺乳動物の生殖系列に、また哺乳動物の乳タンパク質遺伝子中に存在することができる。トランスジェニック非ヒト哺乳動物は、好ましくは、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタおよびウシより成る群より選択することができる。
更に、前述のトランスジェニック非ヒト哺乳動物の子孫ならびにかかるトランスジェニック非ヒト哺乳動物から得られた乳も本発明に包含される。
本発明は更に、前述の乳より成る特殊調整粉乳、および前述のBSSL変種より成る特殊調整粉乳に関する。特殊調整粉乳は常法を用いて調製することができ、また任意の必要な添加物、例えば無機質、ビタミンなどを含むことができる。
別の観点において、本発明は前述のBSSL変種を含んで成る医薬組成物および治療に用いるためのかかるBSSL変種に関する。
更に別の観点において、本発明は、外分泌膵不全、嚢胞性線維症、慢性膵炎、脂肪吸収不全、脂溶性ビタミン吸収不全、生理学的理由による脂肪吸収不全に関係した病態の治療のための医薬を製造するための前記のBSSL変種の使用に関する。また本発明は、特に早産新生児における食物脂質の利用を改善するための医薬を製造するためのBSSL変種の使用にも関する。
実施例
1.  真核および原核細胞での組換えBSSLの発現
1.1.  実験手順
1.1.1  組換えプラスミド
pUC19中にクローン化された2.3kbヒトBSSL cDNA（Nilsson et al., 1990）を含むプラスミドpS146をHindIIIおよびSalＩで消化しそしてそのBSSL cDNAをウシ乳頭腫ウイルス（BPV）発現ベクター、pS147に導入した（Fig.１）。このベクターはヒトBSSL cDNAをマウスメタロチオネイン１（mMT-1）エンハンサーおよびプロモーター要素（Pavlakis & Hamer, 1983）を含有している。mRNAプロセシングシグナルはウサギβ−グロビン遺伝子のエキソンIIの一部、イントロンII、エキソンIIIおよび下流要素を含むゲノム断片により提供される。転写単位を全BPVゲノムを含むベクター中のクローン化した。転写はBPVおよびBSSL転写単位に対して一方向性であった。大腸菌（E. coli）中でベクターを伝播させるために、そのベクターは、pBR322誘導体であるpML2d（Sarver et al., 1982）をも含有する。
発現ベクターpS147を、Harvey Sarcomaウイルス5′−ロングターミナルリピートおよびSimianウイルス40ポリアデニル化シグナルによって駆動されるネオマイシン抵抗性遺伝子をコードするベクターと共に同時移入した（Lusky & Botchan, 1984）。
BSSLを大腸菌で発現させるために、BSSL cDNAをプラスミドpT7-7（Ausubel et al., 1992）からのNdeＩ-BamHＩ断片としてプラスミドpGEMEX-1（Promega, Madison，ウィスコンシン州，米国）中にサブクローン化した（Studier & Moffat, 1986）。このクローン化手順によって、Ｔ７遺伝子10をコードする配列は開始コドンによって先行された成熟タンパク質をコードするBSSL遺伝子によって置換された。最終の発現ベクター、pGEMEX／BSSLは特異的BSSL内部プライマーを用いたDNA配列決定により実証された。
1.1.2.  変異誘発
開始コドンAGTのＡにヌクレオチド番号１を付与した。アミノ酸のナンバリングのために、シグナルペプチドの最初のメチオニンを−23とし、成熟タンパク質の最初のアミノ酸残基であるアラニンの番号を１とする。
欠失変種Ａ（配列番号：４）を構築するために、二つのPCRプライマー、PCR-1およびPCR-2を合成した（表１）。様々なプラスミドにクローン化するためにHindIII、SalＩおよびBamHＩ部位を創出した。BSSL配列中にアミノ酸配列を変えることなくBclＩ部位を作った。これは他の変種を得るための合成DNAの付加を容易にするために行われた。プライマーPCR-2は二つの合成停止コドンを含有している。得られたPCR断片をBamHＩおよびHindIIIで消化しそして配列分析のためにpUC18中にクローン化した。このプラスミドをpS157と指称した。正しいPCR断片を、BSSL配列にユニークAsp700部位（BSSL cDNAの1405位）およびβ−グロビン遺伝子断片の前のSalＩ部位のところで融合することによりBPV発現に挿入してpS257を得た。
オリゴヌクレオチド番号３、４、７および８（表１）を用いてB変種構築（配列番号：５）を行った。アニーリングされたオリゴヌクレオチドは全長タンパク質のリジン712からフェニルアラニン722を表わすＣ−末端アミノ酸配列そのものをコードしている。この断片をグルタミン535に融合した。最後のフェニルアラニンの直後に翻訳停止を挿入した。この断片は5′−末端にBclＩ部位を、そして3′−末端にSalＩ部位を含み、pS157への導入が可能である。得られたプラスミドをAsp700およびSalＩで消化しそして313bp断片を前述の発現ベクターを導入した。得られたプラスミドをpS258と名付けた。
0003837444.tif 000005
Ｃ変種（配列番号：６）をコードする遺伝子を構築するためにオリゴヌクレオチド１〜６（表１）を用いた。アニーリングされたDNA断片はグルタミン535とリジン712−フェニルアラニン722配列との間に挿入された、コンセンサス（Nilsson et al., 1990）に一致する11アミノ酸をコードする二つの反復を含んでいる。この断片も5′−末端にBclＩ部位を、そして3′−末端にSalＩ部位を含み、前述と同じクローン化手法が可能である。得られたプラスミドをpS259とした。
変種Ｎ（非Ｎ−グリコシル化変種、配列番号：７）を構築するために、二つのPCRプライマー（表１のPCR-3およびPCR-4）を合成した。配列分析目的に360bp PCR生成物をpUC19中にクローン化するために、EcoRＩおよびBamHＩ部位を創出した。アスパラギン187のところの潜在的Ｎ−連結グリコシル化部位をグルタミンに変えた。その修飾された配列をBalＩ-HindIII断片として単離し、そしてmMT-1プロモーターおよびBSSL cDNAの5′−末端を含むSacＩおよびBalＩ断片と共にSacＩおよびHindIII消化pUC19中にクローン化した。約1.2kb SacＩ-DraIII断片をこのプラスミドから単離し、そして発現ベクター内のmMT-1要素およびBSSL cDNA配列のそれぞれに挿入した。得られたプラスミドをpS299と名付けた。
1.1.3.  哺乳動物細胞培養および移入
前記ベクターを、燐酸カルシウム沈殿法（Graham & Van der Eb, 1973）に従って、マウス細胞系統C127（ATCC CRL 1616）に同時移入した。
C127細胞を10％牛胎児血清を補給したHamのF12−ダルベッコ修飾イーグル培地（DMEM）（１：１）で培養した。ネオマイシン抵抗性細胞クローンを1.5mg×ml-1のG418を用いて選択し、そして10〜15日後に抵抗性細胞クローンをマスタープレートから単離しそして分析用に継代培養した。
1.1.4.  細菌株および培養条件
発現実験のために、ベクターpGEMEX／BSSLを大腸菌株、JM109（DE3）およびBL21(DE3）pLysSに形質転換した。発現実験はStudier et al.（1986）の記載に従って行った。細菌を集菌後、細胞を遠心分離（5,000×ｇ，４℃で10分間）によりペレット化した。細胞周辺および細胞質画分を調製するために、そのペレットをペレット１ｇあたり、４mlの20mM Tris-Cl／20％スクロース、pH8.0、200μlの0.1M EDTAおよび40μlのリゾチーム（水１mlあたり15mg）中に再懸濁した。その懸濁液を氷上で40分間インキュベートした。ペレット１ｇあたり160μlの0.5Ｍ MgCl2を添加し、次いでその懸濁液を12,000×ｇで20分間遠心分離した。得られた上清は細胞周辺タンパク質を含有し、またペレットは細胞質画分を表わす。あるいはまた、可溶性タンパク質の調製のために細胞を40mM Tris-Cl、0.1mM EDTA、0.5mMフェニルメチルスルホニルフルオライド、pH8.2に懸濁し、凍結融解および音波処理して（数回）、溶菌した。その溶菌液を遠心分離した（30,000×ｇ，25℃で30分間）。
1.1.5.  核酸分析
RNAおよびDNAを単離された哺乳動物細胞系統または大腸菌細胞から調製した（Ausubel et al., 1992）。RNAまたはDNAをアガロースゲル上で分画し、そしてGeneScreen Plus（New England Nuclear）上にブロットし、そして供給元の指示に従ってハイブリダイズさせた。
1.1.6.  天然酵素の調製
胆汁酸塩−刺激リパーゼを既述のとおり
0003837444.tif 000006
人乳から精製した。精製された調製物はSDS-PAGEによる判定によれば均質であり、また長鎖トリアシルグリセロールを基質として用いてアッセイしたところ、１分および１mgあたり、100μmol脂肪酸遊離という比活性を有した。
1.1.7.  酵素アッセイ
アラビアゴムで乳化されたトリオレインを基質として用いて、既述のとおり
0003837444.tif 000007
酵素アッセイを行った。10mMコール酸ナトリウムを活性胆汁酸塩として用いてインキュベーションを行った。胆汁酸塩依存性を試験した際、図３に示された濃縮物に胆汁酸塩（コール酸ナトリウムまたはデオキシコール酸ナトリウム、Sigma Chem. Co.）を添加した。
1.1.8.  ウエスターンブロッティング
ブロッティング実験で有意な反応を得るために、馴化培地をBlue Sepharose（Pharmacia LKB Biotechnology）でのクロマトグラフィーにより濃縮した。各培地をBlue Sepharose（ゲル１mlあたり約10mlの培地）と混合した。そのゲルを（ゲル１mlあたり10mlの）0.1Ｍ KCl含有0.5Ｍ Tris-Cl緩衝液、pH7.4で洗浄した。同一緩衝液中の1.5Ｍ KClを用いて酵素活性を溶出した。この手順により、25〜30倍濃縮と共に３〜５倍精製が得られた。本質的にLaemmli（1970）に従って、SDS-PAGEを10％ポリアクリルアミドゲル上で行った。ニトロセルロース膜に移し、そして精製BSSLに対するポリクローナルウサギ抗血清と共にインキュベーションした後、アルカリ性ホスファターゼと接合したヤギ抗−ウサギIgGおよびBio-Radの現像キットを用いて検出を行った。
1.1.9.  Ｎ−グリコシダーゼＦ処理
１分あたり2.5μmol脂肪酸遊離のBSSL活性を含む10μlの変種Ｂに１μlの１Ｍ β−メルカプトエタノールおよび0.5μlの10％（w/v）SDSを添加した。５分間煮沸後、10μlの0.1Ｍ燐酸ナトリウム緩衝液、pH8.0、6.0μlの0.1Ｍ EDTA、４μlの7.5％（w/v）Nonidet P40および５μl（１Ｕ）のＮ−グリコシダーゼＦ（Boehringer Mannheim）を添加した。対照として、同量の変種Ｂを、グリコシダーゼを添加しないほかは同様に処理した。37℃で一夜インキュベーションした後、サンプルをSDS-PAGEにかけそしてポリクローナルウサギBSSL抗血清を用いてプロットした。
1.2.  結果
1.2.1.  BSSL変種の構築
BSSL変種の修飾を全長BSSLと関係づけて表２および図１にまとめる。これらの変種の作出に用いた手法はセクション1.1に記載されている。変種Ａ（配列番号：４）に対しては、535位のグルタミンの後に停止コドンを導入しそれによって全長タンパク質の最後の187アミノ酸を除去した。変種Ｂ（配列番号：５）に対しては、11個のＣ−末端アミノ酸そのものともともとの翻訳停止をコードする領域をグルタミン-535に融合した。従って、この変種はすべてのリピートを欠いている。変種Ｃ（配列番号：６）に対しては、コンセンサス（Nilsson et al., 1990）に一致する配列を有する二つのリピートを含む断片をグルタミン−535とリジン−712−フェニルアラニン−722配列との間に挿入した。
活性部位セリン−194近傍に位置する一時的にすぎないＮ−連結炭水化物構造の重要性を分析するために、変種を構築した。変種Ｎ（配列番号：７）は、アスパラギン−187の潜在的Ｎ−グリコシル化部位をグルタミンに変えることにより得られた。
0003837444.tif 000008
1.2.2.  哺乳動物細胞系統中の組換えDNAの特性評価
様々なBSSL変種をコードする発現ベクターを移入した細胞系統からDNAサンプルを調製した。調製されたDNAをBamHＩで消化し、アガロースゲルで分画しそしてハイブリッド形成のために膜に移した。使用したプローブは32P−標識BSSL cDNAであった。このハイブリッド形成結果により、組換え遺伝子の存在が確認されると共に、ベクターコピー数が様々な細胞系統でほぼ等しいことも確認された（図２）。ハイブリッド形成断片の位置は様々な鎖長の様々なBSSL配列を反映し、また予期されたサイズと一致した。それらの位置はまた、移入実験に用いた細菌由来DNAに類似したがこのことは、細胞系統中でベクターDNAの大きな再配列が起きなかったことを示している（図２）。変種Ａを表わすDNAサンプルにおける上方のハイブリッド形成シグナルは多分部分消化によるものである。
1.2.3.  哺乳動物細胞におけるmRNAの全長および変異BSSL発現
様々な組換えBSSL遺伝子の発現を分析するために、単離された細胞系統からRNAを調製した。ノーザーンブロット実験および32P−標識BSSL cDNAとのハイブリッド形成から、組換えmRNAはBSSLベクターを取り込んだすべての細胞系統中で検出できることが示された（図３）。BSSL cDNAを除いて同じベクターを含む細胞系統に由来する対照サンプルではハイブリッド形成は認められなかった。
様々な鎖長のハイブリッド形成mRNAはcDNAの修飾と符合した。様々なサンプル中の組換えBSSL mRNA変種の定常状態レベルは変種Ａを除いて大体同じであった（図３）。変種Ａ mRNAの蓄積低下の理由は分っていないが、それは二つの細胞系統集団のほか単離クローンについて認められた。様々なサンプル中に等量のRNAが存在することは、マウスβ−アクチンプローブへのハイブリッド形成により確認された（図３、下側パネル）。
1.2.4.  哺乳動物細胞における全長BSSLおよびBSSL変種の生産
全長BSSLおよび様々な変異体を移入したC127−細胞の個々のクローンからの培地を集めてそのBSSL活性をアッセイした（図４）。全長分子および変種Ｎ、ＢおよびＣについては、最高の発現を示すクローンの活性範囲は、培地１mlおよび１分間あたり0.7〜2.3μmol脂肪酸遊離であった。天然乳BSSLのそれに匹敵する比活性を用いるならば、これは培地１mlあたり７〜23μgの発現レベルに相当しよう。変種Ａについては、分析したすべてのクローンの活性は、１分間および培地１mlあたり0.05μmolを下回る脂肪酸遊離であつた。最大活性を示すクローンをBlue-Sepharose上で濃縮しそして凍結乾燥したところ、極めて低いレベルではあるが活性酵素が実際発現されたことが判明した。変種Ａを用いた場合に得られる活性が低いことは比活性が相当に低いことにより一部説明し得るという可能性を排除し得なかった。
様々な移入実験のクローンからのウエスターンブロットを図５Ａに示す。BSSL変種の見掛けMrは予測どおりであった。しかしながら、全長BSSLのほか変種ＢおよびＣについては二重バンドが得られている点に留意すべきである。三つとも単一のＮ−グリコシル化部位を無傷なまま有しているのに対し、二重バンドを示さなかった変種Ｎはその部位を欠いていることから、その二重バンドはＮ−グリコシル化の差異にするものとするのが一つの妥当な説明である。そこで、変種ＢをＮ−グリコシダーゼＦによる消化に付した。図５Ｂに示されるとおり、上方バンドはほんの微量しか残らないのに下方のバンドは強度を増したが、このことは発現した変種のほんの一部しかＮ−グリコシル化されなかったことを示している。
BSSLの特性の一つは、その一次胆汁酸塩、例えばコール酸塩による特異的活性化である（Hernell, 1975）。BSSLの様々な組換体はすべて、コール酸塩活性化について同じ濃度依存性を示した（図６）。使用したアッセイ系では約10mMで最大活性が得られた。コール酸塩をデオキシコール酸塩（二次胆汁酸塩）と交換するとこのような活性化は起こらなかった。このように、組換え全長体および様々な変種は胆汁酸塩活性化に関し同じ特異性を示した。
1.2.5.  大腸菌における全長BSSLの発現および生化学的特性評価
二つの大腸菌株JM109（DE3）およびBL21（DE3）pLysS（Studier et al., 1986）をＴ７プロモーターのコントロール下にヒトBSSL cDNAを含む発現ベクターpGEMEX／BSSLで形質転換した。両菌株からの形質転換体を確認し、培養しそしてIPTGで約90分間誘導した（Studier et al., 1986）。BSSL cDNAを32P−標識プローブとして用いたノーザーンブロットによる全mRNAの分析から、いずれの菌株においても発現が効率的に誘導されたこと、および転写がきちんと調節されたことが実証された（図７Ａ）。約2.4kbという組換えBSSL mRNAの見掛けサイズは予測鎖長と符合する。タンパク質サンプルをSDS-PAGE分離しそして抗−BSSL抗体で免疫検出することによって、大腸菌において全長BSSLが効率的に生産されることが示された（図７Ｂ）。BL21（DE3）pLysS株における方がJM109（DE3）におけるよりも細胞周辺に分泌されたタンパク質が多かった（図７Ｂ）。
IPTG−誘導大腸菌培養液は培養液１mlあたり0.5〜４μgのBSSLタンパク質に相当する活性可溶性BSSLを含有した。ウエスターンブロッティングから、反応性物質の20〜60％が不溶性ペレット中にあることが示された。非誘導細菌は有意なBSSL活性を全く含んでいなかった。
培養細菌からのリパーゼ活性は天然乳BSSLと同じ胆汁酸塩依存性を示した。
2.  組換え全長型および変異型の胆汁酸塩−刺激リパーゼの精製および特性評価
2.1.  実験手順
2.1.1.  酵素および酵素変種
組換え全長BSSLおよびBSSL変種Ｂ、ＣおよびＮを既述の如く構築しそして発現させた。天然酵素に比べ変種Ｂ（配列番号：５）は16個すべてのユニークはＯ−グリコシル化された、高プロリンＣ−末端リピート（aa 536-711）を欠いているが最もＣ−末端の断片（aa 712-722）がグルタミン−535に融合している。変種Ｃ（配列番号：６）は同じＣ−末端断片および11残基のリピート２個をグルタミン−535とリジン−712の間に含んでいる。変種Ｎ（非−Ｎ−グリコシル化変種、配列番号：７）においては、唯一のＮ−連結糖を引き受けるアスパラギン−187をグルタミン残基と交換した。天然BSSLは人乳から既述のとおりに精製した
0003837444.tif 000009
2.1.2.  酵素アッセイ
アラビアゴムに乳化したトリオレインを基質として用いてリパーゼ活性を既述のとおり
0003837444.tif 000010
アッセイした。
活性化胆汁酸塩としてコール酸ナトリウム（10mM）を用いた。様々なアッセイ改変は図の説明に示されている。
2.1.3.  免疫吸着剤の調製
精製乳BSSL（５mg）をSepharoseにCNBrを用いて製造元の記述に従って結合させた。精製乳BSSLに対しウサギ中に生成させた40mlのポリクローナル抗血清をカラムに通した。特異抗体を0.1Ｍグリシン−HCl、pH2.5で溶出した。そのpHを直ちに固体Trisで約８に調節した。脱塩および凍結乾燥後、６mgのアフィニティー精製抗体を前述の如くSepharoseに結合した。
2.1.4.  精製手順
５〜25μgの組換え発現BSSLまたはBSSL変種を含む馴化培地をBlue Sepharose（Pharmacia社、スエーデン）と、沈降ゲル１mlあたり培地10mlとして混合した。端−端（end-to-end）混合を30分間行った後、そのゲルを0.05Ｍ Tris-Cl、pH7.0、0.05Ｍ KClで洗浄し、そしてリパーゼ活性を0.05Ｍ Tris-Cl、pH7.0、1.5Ｍ KClで溶出した。活性ピークをプールし、そして５mMナトリウムベロナール、pH7.4、0.05Ｍ NaClに対して透析した。その透析液をヘパリン−Sepharoseカラムにかけた。そのカラムを５mMナトリウムベロナール緩衝液、pH7.4、中、0.05→1.0Ｍ NaCl濃度勾配を用いて溶出した。リパーゼ活性を含む画分をプールしそして免疫吸着剤カラムにかけた。0.05Ｍ Tris-Cl、pH7.5、0.15Ｍ NaClで洗浄後、結合リパーゼを0.1Ｍグリシン−HCl、pH2.5で溶出した。それら画分のpHを直ちに固体Trisで約８に調節した。
2.1.5.  電気泳動
ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）を本質的にLaemmli（1970）に従って行った。タンパク質をCommassie Brilliant Blueで染色した。
2.1.6.  Ｎ−末端配列分析
アミノ酸配列分析は、Applied Biosystems Inc. 477Aパルス液相シーケンサーおよびオンラインフェニルチオヒダントイン120Ａアナライザーで製造元からのレギュラーサイクルプログラムおよび薬品を用いて行った。配列決定された標準タンパク質（β−ラクトグロブリン）から算出した当初および反復収率はそれぞれ47％および97％であった。
2.2.  結果
2.2.1.  組換えBSSLおよびBSSL変種の精製
馴化培地のBlue Sepharoseでのクロマトグラフィーは主として濃縮段階として用いた。引き続きヘパリン−Sepharoseでのクロマトグラフィーでは、主として培地中に存在する大部分のアルブミンを除去することにより、最初の精製が行われた。この段階はまた、組換えBSSL分子がすべてヘパリン結合を保持していることを示した。免疫吸着剤処理の後、すべてのBSSL変種はSDS-PAGEによる判定では90％以上の純度を示した（図８）。全長酵素および変種ＢおよびＣはダブレットとして移動した。それら様々な変種の見掛けMrを表３に示す。Ｎ−末端配列分析は８サイクルに対しすべての変種について単一の配列：Ala-Lys-Leu-Gly-Ala-Val-Tyr-Thr-を示した。
2.2.2.  リパーゼ活性
表３に様々な調製物の見掛け分子量を示す。それら調製物の比活性の範囲は、１分間およびタンパク質１mgあたり75〜120μmol脂肪酸遊離であった。従って、全長BSSLとBSSL変種の間に活性の有意差は認められなかった。
前記調製物はすべて、乳化長鎖トリアシルグリセロールに対する活性のために、一次胆汁酸塩（コール酸ナトリウム）を絶対的に必要とした（図９Ａ）。デオキシコール酸ナトリウム塩は、いずれの変換をも活性にした（データは示さず）。しかしながら、それら異なる胆汁酸塩を組み合わせると、デオキシコール酸塩は二つの作用を有した（図９ＢおよびＣ）。第一に、それにより活性に必要なコール酸塩濃度が低くなり、そして第二に、それはより高い胆汁酸塩濃度で酵素活性を阻害した。
0003837444.tif 000011
2.2.3.  組換えBSSLおよびBSSL変種の安定性
組換えBSSLおよびBSSL変種は天然乳BSSLと同じpH安定性を示した（図10）。2.5〜３付近のpHではすべての場合に不活性化が生じた。pH３を越えるとタンパク質濃度が十分高ければすべての変種は完全に安定であった。これは、牛血清アルブミンまたはオボアルブミンを添加することにより行われた（データは示さず）。希釈サンプルは試験されたすべてのpHにおいて安定性が劣ったが閾値は同じままであった（データは示さず）。図11は、組換え酵素の熱安定性が天然乳酵素に匹敵することを示している。37〜40℃の温度で活性は低下し始める。変種（Ｂ、Ｃ、Ｎ）は全長組換え酵素および乳酵素よりも安定性が幾分低いように思われる。しかしながら、タンパク質濃度を牛血清アルブミンの添加により高めると、すべての変種は40℃でも安定であった（図11）。
天然乳BSSLおよびすべての組換え変種はいずれもトリプシンに感受性を示した。時間依存性不活性化が得られた（図12）。しかしながら、胆汁酸塩、すなわちコール酸塩を緩衝液に含めると、リパーゼ変種が保護され、そしてリパーゼ活性が保持された（図12）。
このように、多くの試験管内特性、すなわち胆汁酸塩活性化、ヘパリン結合、pHおよび濃度安定性およびプロテアーゼによる不活性化に対する胆汁酸塩保護に関しては、様々なBSSL変種を天然乳BSSLと比較した場合に有意差は認められなかった。
3.  トランスジェニック動物における発現
3.1.  発現ベクターの構築
トランスジェニック動物からの乳中に組換えヒトBSSLを生産するための発現ベクターを構築するために、次の方策を用いた（図13）。
Lidberg et al.（1992）に記載の方法を用いてヒトBSSL遺伝子の異なる部分を含む三つのプラスミド（pS309，pS310およびpS311）を得た。プラスミドpS309は、BSSL遺伝子を5′非転写領域から第４イントロンの一部までカバーするSphＩ断片を含有する。プラスミドpS310は、BSSL変種遺伝子配列を第１イントロンの一部から第６イントロンの一部までカバーするSacＩ断片を含有する。最後に、プラスミドpS311は、BSSL遺伝子を第５イントロンの主要部分から残りのイントロン／エキソン構造をカバーしそしてエキソン11に欠失を有するBamHＩ断片を含む。それら欠失配列は231bpであり、それ故に全長BSSLよりも丁度77アミノ酸または７リピートだけ少ないBSSL変種をコードする配列が得られる。得られるBSSL変種（“変種Ｔ”）のヌクレオチド配列は配列表に配列番号：８として示されている。変種Ｔのアミノ酸配列は配列表に配列番号：９として示されている。
ヒトBSSL遺伝子のエキソン11には高反復配列があるため、この配列をプラスミドにクローン化しそして細菌に伝播させると比較的高頻度の再配列を予測することができる。この仮定に基づき、端を切り取ったエキソン11を含有する所望の一つのBSSL変種を確認し、単離しそして配列分析に付した。
プラスミドpUC19のHindIIIおよびSacＩ部位にクローン化されたヒトBSSL cDNAの一部を含むもう一つのプラスミド、pS283をゲノム配列の融合に用いた。プラスミドpS283はまた適切な制限酵素部位、KpnＩをBSSLの5′非翻訳リーダー配列に位置させるのにも用いられた。
プラスミドpS283をNcoＩおよびSacＩで消化し、そして約2.7kbの断片を電気泳動により単離した。プラスミドpS309はNcoＩおよびBspEＩで消化し、そしてBSSL遺伝子の5′−部分を含む約2.3kbの断片を単離した。プラスミドpS310はBspEＩおよびSacＩで消化し、そしてBSSL遺伝子の中間領域の一部を含む約2.7kbの断片を単離した。これら三つの断片を結合し、そしてコンピテント大腸菌TG２株に形質転換しそして形質転換体をアンピシリン選抜によって単離した。
多くの形質転換体からプラスミドを調製し、そして所望の構築物を含むpS312（図14）と呼ばれる一つのプラスミドを以後の実験に用いた。
停止コドンの下流に位置するBamHＩ部位が以後のクローン化を容易にするためSalＩ部分に変えられたpS311の変性体を得るために、次の方法を用いた。すなわち、プラスミドpS311を部分的BamHＩ消化により直線化した。直線化した断片を単離し、そしてBamHＩをSalＩ部位（5′-GATCGTCGAC-3′）に変えることによってBamHＩ部位を破壊する合成DNAリンカーを挿入した。この合成リンカーの一体化には二つの可能な位置があったので得られたプラスミドを制限酵素断片により分析した。エキソン11の下流の所望位置にリンカーが挿入されたプラスミドを単離しそしてpS313と称した。
ヒトBSSL変種ゲノム配列を取り込んだ最終発現ベクター構築物を得るために、泌乳期にある乳腺細胞中での段階および組織特異的発現を媒介するように設計された既存の発現ベクターpS314を用いた。プラスミドpS314はNotＩ断片としてクローン化されたマウス乳清酸性タンパク質（WAP）遺伝子（Campbell et al., 1984）からのゲノム断片を含有する。このゲノム断片は、約4.5kbの上流調節配列（upstream regulatory sequences; URS）、四つ全部のマウスWAPエキソンおよび全てのイントロン配列および最終エキソンの下流の約３kbの配列を有している。天然WAP翻訳開始コドンの24bp上流の第１エキソン中にユニークkpnＩ部位が在る。もう一つのユニーク制限酵素部位はエキソン３に位置するSalＩ部位である。
ヒトBSSL変種ゲノム配列をこれらの部位、KpnＩおよびSalIの間に次の手法により挿入した。すなわち、第一にpS314をKpnＩおよびSalＩで消化しそして切断プラスミドを表わす断片を電気泳動により単離した。第二にpS312をKpnＩおよびBamHＩで消化しそしてヒトBSSL遺伝子の5′−部分を表わす約4.7kbの断片を単離した。第三に、pS313をBamHＩおよびSalＩで消化しそしてヒトBSSL遺伝子の3′−部分を単離した。これらの三つの断片を結合し、コンピテント大腸菌細菌に形質転換し、そして形質転換体をアンピシリン選抜後に単離した。
てくつかの形質転換体からプラスミドを調製し、そして制限酵素地図作成と配列分析により入念に分析した。所望の発現ベクターを表わす一つのプラスミドを規定しそしてpS317と名付けた（図15）。
原核プラスミド配列を除くために、pS317をNotＩで消化した。次にヒトBSSL変種ゲノム断片に隣接するWAP配列より成る組換えベクター要素をアガロース電気泳動により単離した。単離された断片を電気溶出（electroelution）を用いて更に精製してからそれをマウス胚に注入した。
トランスジェニックマウスの乳中にヒトBSSL変種を発現させるための組換え遺伝子を図16に示す。
3.2.  トランスジェニック動物の生産
セクション3.1.に従ってNotＩ断片をプラスミドpS317から単離した。このDNA断片はヒトBSSL変種をコードするゲノム配列に結合したマウスWAPプロモーターを含有した。単離された断片を３ng／μlの濃度で過排卵を起こすために、５IU妊馬血清ゴナドトロピンでプライムされたドナーマウスから得られた350個のC57B1／6J×CBA／2J-f2胚の前核に注入した。C57B1／6J×CBA／2J-f1動物は
0003837444.tif 000012
Breeding and Research Center LTD, Ry,デンマークから入手した。卵管から胚を集めた後、それらをＭ２培地（Hogan et al., 1986）中ヒアルロニダーゼ処理により卵丘細胞から分離した。それら胚を洗浄後、Ｍ16培地（Hogan et al, 1986）に移しそして５％CO2雰囲気のインキュベーターに保った。それら注入は、NarishigiハイドローリックマイクロマニピュレーターおよびNomarsKi光学装置を備えたNikon倒立顕微鏡を用い、軽パラフィン油で覆ったＭ２の微滴中で行った。注射後に健常と思われる267個の胚を0.37mlの2.5％Avertinを腹腔内投与した12匹の偽妊娠C57B1／6J×CBA／2J-f1受容固体に移植した。動物誕生の３週間後に得られた尾部生検標本からのDNAのPCR分析により、トランスジーンを組み込んだマウスを確認した。陽性結果をサザンブロット分析により確認した。
乳の収集のために、雌性泌乳動物に２IUのオキシトシン腹腔内注射しそして10分後に0.40mlの2.5％Avertinで腹腔内経路で麻酔した。シリコーン処理チューブを介して集乳装置を乳頭に取り付け、そして乳を乳腺をゆっくりマッサージすることにより1.5mlエッペンドルフ管に集めた。乳量は泌乳日に応じて、マウス１匹および集乳１回あたり0.1〜0.5mlの幅で変動した。
3.3.  トランスジェニックマウスにおけるBSSL変種の発現
切除尾部サンプルから調製したDNAの分析によりトランスジェニックマウスを確認した。されら組織サンプルをプロティナーゼＫとインキュベートしそしてフェノール／クロロホルムで抽出した。発現ベクター断片を表わす異種導入DNAが存在する場合に特定の断片を増幅するプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応にその単離されたDNAを用いた。またそれら動物をDNAハイブリッド形成実験により分析することによって、PCRデータを確認し、あり得る再配列、組み込まれたベクター要素の構造をテストしそして組み込まれたベクター要素のコピー数についての情報を得た。
一組の実験において、それら二つの方法で31匹のマウスを分析した結果、１匹のマウスがpS317に由来する異種DNAベクター要素を有していることが実証された。PCR分析およびハイブリッド形成実験の結果は同じであった（図17）。全部で供試動物65匹中10匹がpS317で形質転換されていた。
ベクターDNA要素を有していることが確認されたマウス（始祖動物）を次いで交配させ、そしてF1一腹産仔を同じ方法によりトランスジーンについて分析した。
泌乳中にpS317トランスジェニック雌体の様々な組織から単離されたRNAをアガロースホルムアルデヒトゲル電気泳動により分離し、膜にブロットしそしてプローブとしての32P−標識BSSL cDNAとハイブリッド形成させた。得られた結果は泌乳中の発現は乳腺に限定されることを示している（図18）。
乳サンプルをオキシトシン処理して泌乳を誘導した麻酔始祖動物から集め、そして組換えヒトBSSL変種の有無を分析した。これはSDS-PAGE、ニトロセルロース膜への転移および天然ヒトBSSLに対して生じさせたポリクローナル抗体とのインキュベーションによって行った。得られた結果から、トランスジェニックマウスからの乳中に組換えヒトBSSL変種が発現したことが実証された。図19は、トランスジェニックマウスからの乳中の組換えヒトBSSL変種が存在していることを実証している。様々なpS317トランスジェニックマウス由来の乳サンプルをSDS-PAGE分離しそして免疫ブロッティングを行うと、pS314で形質転換したマウスの乳に由来する全長組換えBSSLに比べ見掛け分子量が低下した組換えBSSL変種が効率的に生産されることが示される。プラスミドpS314はpS317に類似しているが、ただし、pS314はゲノム変種に変えて全長ヒトBSSL cDNAを含有している。すべてのマウス乳サンプル中に見られるダブレットバンドはマウスBSSLを表わし、従って抗血清の交叉活性を示す。この結論は、このダブレットバンドが精製マウスBSSLを含有する図19のレーン９に見られるという所見によって更に支持される。
トランスジェニック動物の安定系統が作られた。
同様の方法により、ヒトBSSL変種を発現できるウサギ、ウシまたはヒツジなど他のトランスジェニック動物を作ることができる。
寄託
次のプラスミドはブダペスト条約に従ってDSM（Deutsche Sammlung von Mikrooganismen und Zellkulturen）に寄託されている：
0003837444.tif 000013
【図面の簡単な説明】
図１
Ａ．様々なBSSL変種の発現に用いられるBPVベースベクターの地図。
Ｂ．分析された様々なBSSL変種の概略図。FLは全長BSSLを示す。活性部位は丸印によって示され、また潜在的Ｎ−凍結炭水化物に対する部位は三角印によって示される。リピートを含む領域は縞模様の区域として示され、そして保存されたＣ−末端は中実区域として示される。
図２
BSSL変種をBSSLを発現する細胞系統からのDNAのサザーンブロット分析。全長BSSL（FL）、変種Ａ（Ａ）、変種Ｂ（Ｂ）、変種Ｃ（Ｃ）および変種Ｎ（Ｎ）を発現する細胞系統から調製されたDNAを分析した。５μgの調製された各細胞由来DNA（左側）および１ngの精製細胞由来ベクターDNA（右側）をBamHＩで消化した。DNAサンプルをアガロースゲル上で分離し、GeneScreen Plus膜に移しそして32P−標識ヒトBSSL cDNAとハイブリッド形成させた。
図３
組換えBSSL変種を発現する単離細胞系統からのRNAのノーザーンブロット分析。全長BSSL（FL）、変種Ａ（Ａ）、変種Ｂ（Ｂ）、変種Ｃ（Ｃ）、変種Ｎ（Ｎ）を生産する細胞系統から調製された10μgの全RNAを分析した。BSSLに関係しないタンパク質をコードするほかは図１のベクターと同じBPV−ベクターを取り込んだC127細胞系統からのRNAを負のコントロール（−）（上側パネル）として用いた。フィルターを32P−標識BSSL cDNAとハイブリッド形成させた。そのフィルターを次にマウスβ−アクチンcDNAプローブと再ハイブリッド形成した。β−アクチンmRNAシグナル（下側パネル）は各レーンに負荷されるRNA量の内部コントロールとして用いた。
図４
ヒトBSSLの全長体および変異体を移入したC127細胞におけるBSSL活性の発現。C127細胞に様々なBSSL−構築物、すなわち全長BSSL（FL）、変種Ｎ（Ｎ）、変種Ｃ（Ｃ）、変種Ｂ（Ｂ）、変種Ａ（Ａ）を移入した。最初の増殖期経過後、個々のクローンを選抜しそして集密になるまで増殖させた。選抜されたクローン数を図中に示す。リパーゼ活性は馴化培地で測定した。数値は馴化培地１mlおよび１分間あたりに遊離される遊離脂肪酸のμmol数で表わされている。
図５
Ａ．全長および変異組換えBSSLのウエスターンブロッティング。ゲルにかけられた１分間あたりに遊離される脂肪酸のμmol数として表わされるリパーゼ活性量は次のとおりであった：全長0.2（レーン１）、変種Ｎ 0.16（レーン２）、変種Ｃ 0.6（レーン３）、変種Ｂ 0.8（レーン４）および天然BSSL 0.1（レーン５）。使用した抗血清は人乳から精製されたBSSLに対しウサギ内に生成させた。サイズマーカー（Prestained SDS-PAGE Standards, Low Range, BioRad）の位置を左に示す。
Ｂ．Ｎ−グリコシダーゼＦ処理変種Ｂのウエスターンブロット。変種Ｂを実験手順に記載のとおりＮ−グリコシダーゼＦで消化した。レーン１は未処理の、そしてレーン２は処理されて変種Ｂを示す。
図６
全長および異変BSSLの胆汁酸塩依存性。全長組換えBSSL（★）、変種Ａ（□）、変種Ｂ（▲）、変種Ｃ（■）、変種Ｎ（●）および精製人乳BSSL（○）からの馴化培地で、様々な濃度のコール酸ナトリウム（実線）またはデオキシコール酸ナトリウム（破線）の存在下にリパーゼ活性を測定した。Ａ変種については、馴化培地を実験手順に記載したとおりにBlue Sepharoseで濃縮した。他のもののわずか1/10の最大活性しか有しない変種Ａを除いて、各酵素共給源の量は同レベルの最大活性が得られるように選択された。対照実験から増殖培地は天然BSSLの活性レベルまたは胆汁酸塩依存性に影響を与えないことがわかった（データは示さず）。
図７
Ａ．pGEMEXを用いた様々な大腸菌株により生産されるBSSLのノーザーンブロット。細菌の誘導は実験手順に記載されたとおりにIPTGにより行われた。
実験条件は図２の説明文に記載したとおりであった。レーン１、BL21（DE3）pLysS株、誘導されず；レーン２、BL21（DE3）pLysS株、誘導された；レーン３、JM109（DE3）株、誘導されず；レーン４、JM109（DE3）株、誘導された。
Ｂ．pGEMEXを用いた様々な大腸菌株での組換えBSSLの発現を示す、８〜18％SDS-PAGEの精製乳BSSLに対する抗体を用いたウエスターンブロット。実験手順に記載されたとおりに細菌をIPTGで誘導しそして細胞質および細胞周辺タンパク質を溶菌液から調製した。レーン２〜５（細胞周辺調製物）および７〜10（細胞質調製物）における細菌タンパク質負荷量は染色を生産レベルに比例させるために同じ培養量を表わす。レーン１、Pharmacia社分子サイズマーカー；レーン２および８、JM109（DE3）株、誘導された；レーン３および７、JM109（DE3）株、誘導されず；レーン４および10、BL21（DE3）pLysS株、誘導された；レーン５および９、BL21（DE3）pLysS株、誘導されず；レーン６、25mgの精製天然乳BSSL。
図８
精製組換えBSSLおよびBSSL変種のSDS-PAGE。全長組換えBSSL（FL）およびBSSL変種Ｎ、ＢおよびＣは既述したとおりに精製された。各々３μgをかけたが、変種Ｂについては例外で1.5μgを用いた。５μgの精製天然乳BSSL（NAT）をかけた。サイズマーカーの位置は左に示されている。
図９
組換えBSSLおよびBSSL変種のコール酸ナトリウムによる活性化に及ぼすデオキシコール酸ナトリウムの効果。組換え全長BSSL（●）、組換えBSSL変種Ｂ（○）、Ｃ（■）およびＮ（▲）および精製天然乳BSSL（□）の精製調製物のリパーゼ活性を、５mM（中央パネル）または10mM（右側パネル）のデオキシコール酸の存在下に、およびその非存在下に（左側パネル）、様々な濃度のコール酸ナトリウムを用いてアッセイした。
図10
様々なpHにおける組換えBSSLおよびBSSL変種の安定性。天然BSSL、組換え全長BSSLおよびBSSL変種をpH２〜８の様々な緩衝液中、37℃でインキュベートした。すべての緩衝液は１mg／mlの牛血清アルブミンを含有した。30分後にアリコートをとってリパーゼ活性をアッセイした。記号の説明は図９の説明文を参照。
図11
組換えBSSLおよびBSSL変種の熱安定性。精製組換え全長BSSL、BSSL変種および天然乳BSSLを50mM Tris-Cl緩衝液、pH7.5中、示された温度でインキュベートした。一セットのサンプルに牛血清アルブミン（BSA）を１mg／mlとなるように添加した。30分後にサンプルをとり出してリパーゼ活性をアッセイした。活性は０分における各サンプルについての活性に対する百分率として表わされる。記号の説明は図９の説明文を参照。
図12
組換えBSSLおよびBSSL変種のトリプシンによる不活性化に及ぼす胆汁酸塩の効果。精製組換え全長BSSL、BSSL変種および天然乳BSSL（１〜４μgを含有する15μl）を、10mMコール酸ナトリウムの非存在下に（破線）および存在下に（実線）、10μgのトリプシン（TPCK−トリプシン、Boehringer-Mannheim）を含む60μlの1.0Ｍ Tris-Cl、pH7.4に25℃で添加した。示された時点でアリコートをとり出してリパーゼ活性をアッセイした。数値はトリプシンの非存在下の対照インキュベーション中で得られる数値に対する百分率として表わされる。記号の説明は図９の説明文を参照。
図13
プラスミドpS317の生産方法。更に詳細にはセクション3.1.を参照。
図14
プラスミドpS312の概略構造。
図15
プラスミドpS317の概略構造。
図16
セクション3.1.に記載されているような、WAP遺伝子の第１エキソンへのヒトBSSL変種ゲノム構造の物理的導入を示す物理的地図。
図17
Ａ．トランスジェニック動物の確認に用いられるPCR−プライマーの局在化を概略的に示したもの。5′−プライマーは、WAPとBSSL変種間の融合部の上流−148bp位に始まるWAP配列内に位置する。3′−プライマーは、融合点の400bp下流に終る第１BSSL変種イントロン内に局在する。
Ｂ．使用プライマーの配列。
Ｃ．潜在的始祖動物のPCR分析の典型的分析を示すアガロースゲル。Ｍ：分子量マーカー。レーン１：プラスミドpS317から生じたコントロールPCR−生成物。レーン２〜13：潜在的始祖動物からのDNA調製物を用いたPCR反応。
図18
pS317を遺伝子導入した雌マウスから単離された様々な組織から調製されたRNAのノーザーンブロット分析。それら組織を泌乳４日目に単離した。各組織からの全RNA 10μgをアガロース−ホルムアルデヒド分離により分析し、膜に移しそして32P−標識ヒトBSSL cDNAとハイブリッド形成させた。レーンは、Mg：乳腺；Li：肝臓；Ki：腎臓；Sp：脾臓；He：心臓；Lu：肺臓；Sg：唾液腺；Br：脳を含んでいる。ヌクレオチドのRNAサイズは右側に示されている。
図19
pS317トランスジェニックマウスおよび全長cDNAベクターpS314を遺伝子導入したマウスおよび対照動物から得られた乳のウエスターンブロッティング。サンプルをSDS-PAGEにより分離し、Immobilonフィルターに移し、そして天然ヒトBSSLに対し生成させた抗血清で免疫ブロットした。レーン１：分子量マーカー；レーン２、３および４：pS317始祖動物F0＃91の三匹のF1娘動物（F130、31および33）からの２μlの乳；レーン５：pS314始祖動物＃90からの２μlの乳。レーン６、７および８：三匹の非−BSSLトランスジェニック動物からの２μlの乳；レーン９：精製マウスBSSL；レーン10：精製ヒト天然BSSL。
0003837444.tif 000014
0003837444.tif 000015
0003837444.tif 000016
配  列  表
（1）一般情報：
（ｉ）出願人：
（A）名称：AB ASTRA
（B）通り名：Kvarnbergagatan 16
（C）市名：Sodertalje
（E）国名：Sweden
（F）郵便コード（ZIP）：S-151 85
（G）電話：＋46-8-553 260 00
（H）ファックス：＋46-8-553 288 20
（I）テレックス：19237 astra s
（ii）発明の名称：新規ポリペプチド
（iii）配列の数：９
（iv）コンピューター読み取り可能形態
（A）媒体タイプ：フロッピーディスク
（B）コンピューター：IBM PCコンパチブル
（C）オペレーティングシステム：PC-DOS/MS-DOS
（D）ソフトウエア：PatentIn Release #1.0, Version #1.25（EPO）
（vi）優先権基礎出願データ：
（A）出願番号：SE 9300686-4
（B）出願日：1993年３月１日
（vi）優先権基礎出願データ：
（A）出願番号：SE 9300722-7
（B）出願日：1993年３月４日
（2）配列番号：１の情報：
（ｉ）配列の特性：
（A）配列の長さ：2428塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：二本鎖
（D）トポロジー：直線状
（ii）配列の種類：cDNA to mRNA
（iii）ハイポセティカル配列：NO
（iii）アンチセンス：NO
（vi）起源：
（A）生物名：ホモサピエンス（Homo sapiens）
（F）組織の種類：乳腺
（ix）配列の特徴：
（A）名称／記号：CDS
（B）存在位置：82..2319
（D）他の情報：／産物＝“胆汁酸塩−刺激リパーゼ”
（ix）配列の特徴：
（A）名称／記号：exon
（B）存在位置：985..1173
（ix）配列の特徴：
（A）名称／記号：exon
（B）存在位置：1174..1377
（ix）配列の特徴：
（A）名称／記号：exon
（B）存在位置：1378..1575
（ix）配列の特徴：
（A）名称／記号：exon
（B）存在位置：1576..2415
（ix）配列の特徴：
（A）名称／記号：mat peptide
（B）存在位置：151..2316
（ix）配列の特徴：
（A）名称／記号：polyA signal
（B）存在位置：2397..2402
（ix）配列の特徴：
（A）名称／記号：repeat region
（B）存在位置：1756..2283
（ix）配列の特徴：
（A）名称／記号：5′UTR
（B）存在位置：1..81
（ix）配列の特徴：
（A）名称／記号：repeat unit
（B）存在位置：1756..1788
（ix）配列の特徴：
（A）名称／記号：repeat unit
（B）存在位置：1789..1821
（ix）配列の特徴：
（A）名称／記号：repeat unit
（B）存在位置：1822..1854
（ix）配列の特徴：
（A）名称／記号：repeat unit
（B）存在位置：1855..1887
（ix）配列の特徴：
（A）名称／記号：repeat unit
（B）存在位置：1888..1920
（ix）配列の特徴：
（A）名称／記号：repeat unit
（B）存在位置：1921..1953
（ix）配列の特徴：
（A）名称／記号：repeat unit
（B）存在位置：1954..1986
（ix）配列の特徴：
（A）名称／記号：repeat unit
（B）存在位置：1987..2019
（ix）配列の特徴：
（A）名称／記号：repeat unit
（B）存在位置：2020..2052
（ix）配列の特徴：
（A）名称／記号：repeat unit
（B）存在位置：2053..2085
（ix）配列の特徴：
（A）名称／記号：repeat unit
（B）存在位置：2086..2118
（ix）配列の特徴：
（A）名称／記号：repeat unit
（B）存在位置：2119..2151
（ix）配列の特徴：
（A）名称／記号：repeat unit
（B）存在位置：2152..2184
（ix）配列の特徴：
（A）名称／記号：repeat unit
（B）存在位置：2185..2217
（ix）配列の特徴：
（A）名称／記号：repeat unit
（B）存在位置：2218..2250
（ix）配列の特徴：
（A）名称／記号：repeat unit
（B）存在位置：2251..2283
（xi）配列：配列番号：１：
0003837444.tif 000017
0003837444.tif 000018
0003837444.tif 000019
0003837444.tif 000020
0003837444.tif 000021
（2）配列番号：２の情報：
（ｉ）配列の特性：
（A）配列の長さ：745アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直線状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：配列番号：２：
0003837444.tif 000022
0003837444.tif 000023
0003837444.tif 000024
0003837444.tif 000025
（2）配列番号：３の情報：
（ｉ）配列の特性：
（A）配列の長さ：722アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（C）トポロジー：直線状
（ii）配列の種類：タンパク質
（iii）ハイポセティカル配列：NO
（vi）起源
（A）生物名：ホモサピエンス（Homo sapiens）
（F）組織の種類：乳腺
（xi）配列：配列番号：３：
0003837444.tif 000026
0003837444.tif 000027
0003837444.tif 000028
0003837444.tif 000029
（2）配列番号：４の情報：
（ｉ）配列の特性：
（A）配列の長さ：535アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直線状
（ii）配列の種類：タンパク質
（iii）ハイポセティカル配列：NO
（vi）起源：
（A）生物名：ホモサピエンス（Homo sapiens）
（F）組織の種類：乳腺
（ix）配列の特徴：
（A）名称／記号：ペプチド
（B）存在位置：1..535
（D）他の情報：／label=Variant A
（xi）配列：配列番号：４：
0003837444.tif 000030
0003837444.tif 000031
0003837444.tif 000032
（2）配列番号：５の情報：
（ｉ）配列の特性：
（A）配列の長さ：546アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直線状
（ii）配列の種類：タンパク質
（iii）ハイポセティカル配列：NO
（vi）起源：
（A）生物名：ホモサピエンス（Homo sapiens）
（F）組織の種類：乳腺
（ix）配列の特徴：
（A）名称／記号：ペプチド
（B）存在位置：1..546
（D）他の情報：／label=Variant B
（xi）配列：配列番号：５：
0003837444.tif 000033
0003837444.tif 000034
0003837444.tif 000035
0003837444.tif 000036
0003837444.tif 000037
（2）配列番号：６の情報：
（ｉ）配列の特性：
（A）配列の長さ：568アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直線状
（ii）配列の種類：タンパク質
（iii）ハイポセティカル配列：NO
（vi）起源：
（A）生物名：ホモサピエンス（Homo sapiens）
（F）組織の種類：乳腺
（ix）配列の特徴：
（A）名称／記号：ペプチド
（B）存在位置：1..568
（D）他の情報：／label=Variant C
（xi）配列：配列番号：６：
0003837444.tif 000038
0003837444.tif 000039
0003837444.tif 000040
（2）配列番号：７の情報：
（ｉ）配列の特性：
（A）配列の長さ：722アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直線状
（ii）配列の型：タンパク質
（iii）ハイポセティカル配列：NO
（vi）起源：
（A）生物名：ホモサピエンス（Homo sapiens）
（F）組織の種類：乳腺
（ix）配列の特徴：
（A）名称／記号：ペプチド
（B）存在位置：1..722
（D）他の情報：／label=Variant N
（xi）配列：配列番号：７：
0003837444.tif 000041
0003837444.tif 000042
0003837444.tif 000043
0003837444.tif 000044
（2）配列番号：８の情報：
（ｉ）配列の特性：
（A）配列の長さ：2184塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：二本鎖
（D）トポロジー：直線状
（ii）配列の種類：DNA（genomic）
（iii）ハイポセティカル配列：NO
（iii）アンチセンス：NO
（vi）起源：
（A）生物名：ホモサピエンス（Homo sapiens）
（F）組織の種類：乳腺
（ix）配列の特徴：
（A）名称／記号：CDS
（B）存在位置：82..2088
（D）他の情報：／label=Variant T
（ix）配列の特徴：
（A）名称／記号：mat peptide
（B）存在位置：151..2085
（ix）配列の特徴：
（A）名称／記号：repeat region.
（B）存在位置：1756..2052
（ix）配列の特徴：
（A）名称／記号：repeat unit
（B）存在位置：1756..1788
（ix）配列の特徴：
（A）名称／記号：repeat unit
（B）存在位置：1789..1821
（ix）配列の特徴：
（A）名称／記号：repeat unit
（B）存在位置：1822..1854
（ix）配列の特徴：
（A）名称／記号：repeat unit
（B）存在位置：1855..1887
（ix）配列の特徴：
（A）名称／記号：repeat unit
（B）存在位置：1888..1920
（ix）配列の特徴：
（A）名称／記号：repeat unit
（B）存在位置：1921..1953
（ix）配列の特徴：
（A）名称／記号：repeat unit
（B）存在位置：1954..1986
（ix）配列の特徴：
（A）名称／記号：repeat unit
（B）存在位置：1987..2019
（ix）配列の特徴：
（A）名称／記号：repeat unit
（B）存在位置：2020..2052
（xi）配列：配列番号：８：
0003837444.tif 000045
0003837444.tif 000046
0003837444.tif 000047
0003837444.tif 000048
0003837444.tif 000049
（2）配列番号：９の情報：
（ｉ）配列の特性：
（A）配列の長さ：688アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直線状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：配列番号：９：
0003837444.tif 000050
0003837444.tif 000051
0003837444.tif 000052
0003837444.tif 000053
0003837444.tif 000054
【図１Ａ】
0003837444.tif 000055
【図１Ｂ】
0003837444.tif 000056
【図２】
0003837444.tif 000057
【図３】
0003837444.tif 000058
【図４】
0003837444.tif 000059
【図５】
0003837444.tif 000060
【図６】
0003837444.tif 000061
【図９】
0003837444.tif 000062
【図７】
0003837444.tif 000063
【図８】
0003837444.tif 000064
【図１０】
0003837444.tif 000065
【図１１】
0003837444.tif 000066
【図１２】
0003837444.tif 000067
【図１３】
0003837444.tif 000068
【図１４】
0003837444.tif 000069
【図１５】
0003837444.tif 000070
【図１６】
0003837444.tif 000071
【図１７Ａ】
0003837444.tif 000072
【図１７Ｂ】
0003837444.tif 000073
【図１７Ｃ】
0003837444.tif 000074
【図１８】
0003837444.tif 000075
【図１９】
0003837444.tif 000076