(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
エチルアルコール耐性及びジオキサン類耐性を有することを特徴とするサッカロミセス・セレビシエに属する酒類酵母変異株Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ９Ｄ２７株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１５４９７）。
【請求項２】
請求項１に記載のサッカロミセス・セレビシエに属する酒類酵母変異株Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ９Ｄ２７株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１５４９７）を用いることを特徴とする酒類の製造方法。
【請求項３】
酵母細胞の母集団から、ジオキサン類に対して耐性を示すサッカロミセス・セレビシエに属する酒類酵母変異株Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ９Ｄ２７株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１５４９７）を選択することを特徴とする請求項１に記載の酒類酵母変異株の取得方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、優れた発酵性能及び生成エチルアルコール存在下で強い発酵力を示し、生成エチルアルコール濃度に対する耐性を有する新規酵母及び該酵母を用いた酒類の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
現在までに、清酒酵母にエチルアルコール耐性を獲得させる方法としては、２０％エチルアルコール溶液中に放置後、生存している酵母を分離する方法（特公昭５７−２９９９０号）、エチルアルコール耐性酵母が、酵母生菌体溶菌酵素によって溶解されにくいという性質を利用する方法（特公昭５５−３０３５５号）、高級アルコール類に対して耐性を獲得した酵母がエチルアルコールに対しても高い耐性を有することを利用する方法（特公平６−５５１３４号）が公開されている。また、焼酎酵母に関しては、ＴＴＣ染色性試験でピンク色を示し、かつＤ．Ｃ．染色性試験で白色を示す株を取得することにより、大麦焼酎醪において増殖速度が高く、エチルアルコール耐性を有する酵母（特開平６−６２８３８号）が公開されている。更に、エチルアルコール耐性酵母に関しては、クロトリマゾールに耐性を有するものの中から選択する方法（特開平６−２０５６６７号）が公開されている。
現在のところ、エチルアルコール耐性の実用酵母の育種例としては、２０％エチルアルコールを含む緩衝液中で生存する酵母を植え継ぐ方法により分離した協会１１号酵母が実用化されているにすぎない（特公昭５７−２９９９０号）。エチルアルコール耐性の協会１１号酵母については、清酒醪中での発酵速度が緩慢であること、香気バランスの面で協会７号酵母に劣るなどの問題がある。
従来のエチルアルコール耐性酵母の取得方法は、２０％エチルアルコール中で生存可能な酵母、低級アルコール中で生存可能な酵母、あるいは溶菌酵素に耐性な酵母を選択する方法であり、醪末期における高濃度のエチルアルコール存在下でも死滅しにくく酒質の劣化も起きにくい。しかし、これらすべての方法は、高エチルアルコール濃度状態でも発酵できる酵母を取得する方法ではない。また、クロトリマゾールに耐性を有する酵母は、親株以上のエチルアルコール耐性を示し優れているが、香りの面で官能的には向上していない。更に、ジオキサンを培地に添加して培養すると、生育が速くなり収量が多くなる方法（特開昭４８−５８１８６号）が公開されているが、ジオキサン耐性株を取得し、発酵能力を高める報告ではない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
現在、一般に使用されている清酒酵母は、清酒醪中において２０〜２２％のエチルアルコールを生成する。しかし、原料米や麹の品質により発酵が遅滞することがあり、このようなとき酵母は自己消化し色度とアミノ酸度が増加する。この場合、酒質を損なうばかりか、製造現場においては、製造計画に変更が生じ、生産性を低下させる要因となっている。このような現況から、自己消化を起こさず、かつ優れた発酵性能及び生成エチルアルコール存在下でエチルアルコール耐性の性格を有する清酒酵母が必要とされていた。また同様に、優れた発酵性能及び生成エチルアルコール存在下でエチルアルコール耐性の性格を有する焼酎酵母も必要とされていた。
本発明の目的は、前記従来技術の問題点を解決すべく、醪末期において自己消化を起こしにくく、香りの面で官能的にも向上し、かつ発酵性能に優れたエチルアルコール耐性酵母を分離、育種する方法を提供すること、及び該酵母を用いて淡麗ですっきりした酒質の清酒及び焼酎等の酒類を製造する方法を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明を概説すれば、本発明の第１の発明は、エチルアルコール耐性及びジオキサン類耐性を有することを特徴とするサッカロミセス・セレビシエに属する酒類酵母変異株Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ９Ｄ２７株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１５４９７）に関する。
また、本発明の第２の発明は、本発明の第１の発明に記載のサッカロミセス・セレビシエに属する酒類酵母変異株Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ９Ｄ２７株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１５４９７）を用いることを特徴とする酒類の製造方法に関し、第３の発明は、酵母細胞の母集団から、ジオキサン類に対して耐性を示すサッカロミセス・セレビシエに属する酒類酵母変異株Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ９Ｄ２７株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１５４９７）を選択することを特徴とする本発明の第１の発明に記載の酒類酵母変異株の取得方法に関する。
【０００５】
本発明者らは、酵母の自己消化の際に働くカルボキシペプチダーゼＹをジオキサンが最終濃度３０％で活性化すること、また構造的にエチルアルコールが２分子連なった化学構造式をしていることからエチルアルコールと性質が似ている点に着目し、清酒酵母からジオキサン類耐性株を分離し、この中から親株以上のエチルアルコール耐性を示し、発酵性能に優れ、かつ香気豊かな株が存在することを見出し、本発明を完成した。
【０００６】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を具体的に説明する。
本発明で用いるジオキサン類は、１，４−ジオキサン、１，３−ジオキサン、１，２−ジオキサン、１，４−ジオキセン等、ヘテロ原子として酸素２個を含む６員環を基本骨格としてもつ類縁又は類似化合物をいう。
【０００７】
ここでいうジオキサン類耐性株とは、親株が生育しないジオキサン類濃度条件下でも生育可能な酵母菌株であって遺伝的にあるいは形質的に性質の変化した酵母菌株をいう。
【０００８】
本発明において優れた発酵性能とは、醪末期における生成エチルアルコール濃度が高くなることや、例えば清酒を例にとると日本酒度の切れがよくなるといった残存エキス分が少なくなること、すわなち発酵力が強くなることをいい、またエチルアルコール耐性とは、醪末期における高濃度のエチルアルコール存在下でも死滅しにくいことに加えて、発酵性能が低下せずにエチルアルコールを生成することができることをいう。
【０００９】
本発明においてジオキサン類耐性株を取得するときに選択される酵母細胞の母集団は、野性株、馴養株、人工的な変異誘発（物理的手段、化学的手段）を行った変異処理株、交雑株、細胞融合株及びプラスミド等による形質転換株のいずれでもよい。
変異処理としては、酵母に公知の変異誘導法、例えば、変異誘発の物理的手段としては、紫外線照射、放射線照射等があり、化学的手段としては、エチルメタンスルホネート（ＥＭＳ）、Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン等の変異例を接触させる方法を適宜用いることにより行えばよい。
清酒醸造に使用される酵母では例えば日本醸造協会で純粋培養して頒布されている協会６号酵母、協会７号酵母、協会９号酵母、協会１０号酵母、協会１１号酵母、協会１２号酵母、協会１３号酵母、協会１４号酵母、協会６０１号酵母、協会７０１号酵母、協会９０１号酵母、協会１００１号酵母等が挙げられ、焼酎酵母では例えば協会焼酎２号酵母、鹿児島工試酵母、宮崎工試酵母、泡盛１号酵母等が挙げられるが、ワイン酵母、シェリー酵母、ビール酵母、ウイスキー酵母、及びアルコール酵母でも本発明の方法により同様の結果が得られる。
【００１０】
ここに得られるジオキサン類耐性株は、清酒酵母、焼酎酵母、ワイン酵母、シェリー酵母、ビール酵母、ウイスキー酵母、及びアルコール酵母等のいずれでも、エチルアルコール耐性を有するので、これらの酵母を用いて清酒、焼酎、ワイン、ビール、ウイスキー等の酒類を製造すれば、淡麗ですっきりした酒質の製品を製造することができる。更に、これらの酵母を用いて香気液を製造することも可能である。
【００１１】
清酒、焼酎、ワイン、ビール、ウイスキー、香気液等の製造方法は特に限定するものではなく、一般的な方法に従って製造することができる。
【００１２】
本発明において分離したジオキサン類耐性株からエチルアルコール耐性株を分離するには、例えば清酒酵母を例にとると、まず初めに一次スクリーニングとして耐エチルアルコール性試験を行い、親株よりもメチレンブルー染色率の低い株を選択し、その中で比較的メチレンブルー染色率の低い株に対して小仕込試験を行い、総炭酸ガス減量が親株より多く、エチルアルコール生成量、日本酒度の切れが親株よりよく、かつ上槽直前の酵母のメチレンブルー染色率の低い株を選択すればよい。
馴養株、変異処理株あるいは交雑株の中からジオキサン類耐性株を選択すると、かなりの高頻度でエチルアルコール耐性株が得られる。
この理由として自己消化の際働くプロテアーゼが抑制（発現量低下あるいは活性低下）されたか、あるいはジオキサン類により酵母の細胞膜の構造を変化してエチルアルコールに耐性な構造になったのではないかと推定される。
【００１３】
後述する本発明の方法により分離された９Ｄ２７株のジオキサン類に対する最小生育阻害濃度（以下、ＭＩＣと略称する）は８．８％であり、イミダゾール系阻害剤（ミコナゾール、エコナゾール、クロトリマゾール等）に対しては耐性を示さないことから、クロトリマゾール耐性酵母とジオキサン類耐性酵母とではエチルアルコール耐性機構が異なるものと推定される。
本発明により得られるエチルアルコール耐性酵母は、純米酒などの日本酒度目標値の高い清酒製造においては、親株と比較して、日本酒度の切れに優れ、アミノ酸度の増加も少なく、従来にない淡麗辛口の清酒製造が可能となる。清酒以外の酒類の製造においても同様に従来にない淡麗ですっきりした酒質の製品の製造が可能となる。
【００１４】
以下にその分離方法の１例を示す。
（酵母の処理方法並びに耐エチルアルコール性試験）
清酒用泡なし酵母、日本醸造協会９０１号（以下、Ｋ−９０１と略述する）株を、ＳＤ培地〔イーストニトロゲンベース（アミノ酸不含）０．６７ｗ／ｖ％、グルコース２ｗ／ｖ％〕５ｍｌで１日培養後、その５０μｌを１，４−ジオキサン（６．１％、６．３％、以下０．２％刻み９．０％まで）含有ＳＤ培地５ｍｌに加えて、２５℃で１０日間静置培養した。その結果、Ｋ−９０１株は７．２％で生育が阻害されたので、ＭＩＣは７．２％と判定した。なお、Ｋ−７０１株についても同様にＭＩＣを測定した結果、７．０％であった。
次に、Ｋ−９０１株を１，４−ジオキサン含有ＳＤ培地を用いて馴養し、ジオキサン類耐性株を取得した。
７．２％の１，４−ジオキサン含有ＳＤ培地で生育した株を０．２％増（７．４％）の１，４−ジオキサン含有ＳＤ培地に植え継ぎ、ＯＤ６１０ｎｍの吸光度が２．０になるまで２５℃で静置培養した。この操作を順次繰り返し、８．２％の１，４−ジオキサン含有ＳＤ培地、８．８％の１，４−ジオキサン含有ＳＤ培地で生育する変異株を平板寒天培地にてコロニーを分離した。
上記で得られた株に対して耐エチルアルコール性試験を行った。
ＹＰＤ液体培地（酵母エキス１ｗ／ｖ％、ポリペプトン２ｗ／ｖ％、グルコース２ｗ／ｖ％）５ｍｌで３０℃にて前培養後、水で洗浄し０．３ｍｌの滅菌水に懸濁した。麹汁培地（ブリックス度１．８、ｐＨ４．４）８．２ｍｌにエチルアルコール１．８ｍｌ、培養した酵母菌体を加え、１０℃で１０日間静置後、メチレンブルー染色率を測定した。
【００１５】
（エチルアルコール耐性の高い菌株の分離方法）
ジオキサン類耐性の馴養株のうち、耐エチルアルコール性試験でメチレンブルー染色率の低い菌株（９Ｄ９、９Ｄ１８、９Ｄ２７、９Ｄ３０）について表１に示す仕込配合で総米２００ｇの清酒の小仕込試験を行った。
【００１６】
【表１】
0003835564.tif 000002
【００１７】
掛米は精米歩合７７％（ｗ／ｗ）のα米〔セブンライス工業（株）製〕を使用した。麹は、精米歩合７２％（ｗ／ｗ）の白米を用いて製造した。酵母は５ｍｌ中に１×１０9 個含むものを添加した。発酵温度は１５℃一定で行った。留後１８日目で上槽し、国税庁所定分析法に従って分析を行った。低沸点香気成分はヘッドスペースガスクロマトグラフィーにて測定した。一般分析の結果、いずれの変異株も親株（Ｋ−９０１株）より生成エチルアルコール濃度は高く、日本酒度の切れはよく、炭酸ガス減量は大きかった。以上の形質は、当該変異株がＫ−９０１株とは異なる新規酵母菌であることを示すものである。
【００１８】
上記のように、本発明による菌株｛馴養株：９Ｄ９、９Ｄ１８、９Ｄ２７、９Ｄ３０｝は、Ｋ−９０１株の変異株であるが、その菌学的性質を以下に示す。
（菌学的性質）
１．形態学的性質
ＹＰＤ培地で３０℃、２日間培養した後、顕微鏡で観察した。
ａ）形：卵円形
ｂ）大きさ：長さ４．７〜７．９μｍ、幅３．８〜５．５μｍ
２．胞子形成：有り
胞子形成用培地（酢酸カリウム２ｗ／ｖ％、グルコース０．０５ｗ／ｖ％、寒天２ｗ／ｖ％）で３０℃、５日間培養し、顕微鏡で観察した。
３．増殖の形態：出芽
４．生化学的観察
ａ）糖の発酵性
ウイッカーハムの炭素化合物同化試験用培地（ディフコ社製）をダーラム管入り試験管に分注して、当該４菌株を接種し、３０℃で７日間培養して、その炭酸ガス発生の有無を観察した。
グルコース  （＋）              ガラクトース  （＋）
スクロース  （＋）              マルトース    （＋）
ラクトース  （−）              メリビオース  （−）
ラフィノース（＋）
ｂ）糖の資化性
ウイッカーハムの炭素化合物同化試験用培地（ディフコ社製）を用いて、オキザノグラフ法により、３０℃、１４日後の生育を観察した。
グルコース  （＋）              ガラクトース  （＋）
スクロース  （＋）              マルトース    （＋）
ラクトース  （−）
ｃ）硝酸塩の同化性：（−）
硝酸塩は硝酸カリウムとし、ウイッカーハムの炭素化合物同化試験用培地（ディフコ社製）を用いて、オキザノグラフ法により生育を観察した。
ｄ）ＴＴＣ染色：赤
ｅ）β−アラニン培地、３５℃での生育：（＋）
５．高泡の形成
清酒の小仕込を行った結果、高泡の形成は観察されなかった。
以上、形態学的、生化学的結果は、本発明酵母４菌株がサッカロミセス・セレビシエに属する酵母菌であることを示すものである。また、清酒の小仕込試験において高泡の形成も認められないことから、当該４菌株はＫ−９０１株の変異株であることを示すものである。
６．薬剤に対する耐性
それぞれの薬剤を含むＳＤ培地を用いて、３０℃で３日間培養した。その結果を表２に示す。
【００１９】
【表２】
0003835564.tif 000003
【００２０】
ａ）クロトリマゾール耐性
ｂ）ミコナゾール耐性
ｃ）エコナゾール耐性
【００２１】
かくして、本発明により、Ｋ−９０１株を馴養させた後、ジオキサン類を含む培地で選択することによって、優れた発酵性能及び生成エチルアルコール存在下で強い発酵力を示し生成エチルアルコール濃度に対する耐性を有する酵母が提供された。
【００２２】
代表的な菌株である９Ｄ２７株は、Saccharomyces cerevisiae  ９Ｄ２７と表示し、工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ  Ｐ−１５４９７として寄託してある。
【００２３】
本発明の清酒、焼酎及びその他の酒類の製造方法は、これらの酵母菌株を用いることを特徴とし、醸造方法は特に限定するものではない。
【００２４】
【実施例】
次に、本発明の菌株を用いた酒類製造の具体例を挙げて、本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。
【００２５】
実施例１
ジオキサン類耐性変異株４株について、表１に示す仕込配合で清酒の製造を行った。掛米は、精米歩合７７％（ｗ／ｗ）のα米〔セブンライス工業（株）製〕を使用した。麹は、精米歩合７２％（ｗ／ｗ）の白米を用いて製造した。酵母は５ｍｌ中に１×１０9 個含むものを添加した。発酵温度は１５℃一定で行い、留後１８日目で上槽した。対照株として親株のＫ−９０１株を用いた。上槽液の分析結果を表３に示す。
【００２６】
【表３】
0003835564.tif 000004
【００２７】
官能検査は３点法（１：良、２：普通、３：悪）で行い、パネラー１０名の平均値で表した。
【００２８】
この結果、ジオキサン類耐性株９Ｄ９株、９Ｄ１８株、９Ｄ２７株、及び９Ｄ３０株は、親株よりも多量のエチルアルコールを生成し、醪の日本酒度の切れがよく、上槽清酒のアミノ酸度、グルコース、酵母の染色率は低かった。また、上槽清酒は、親株と比較して、官能的にも味と香りのバランスに優れていた。
【００２９】
【発明の効果】
ジオキサン類に耐性を有する酵母の変異株から、発酵性能に優れ、エチルアルコールを高生成し、高濃度のエチルアルコール存在下でも死滅しにくいエチルアルコール耐性の新菌株を取得することができた。本発明による新規酵母菌を用いることにより、清酒製造においては、日本酒度の切れがよく、かつアミノ酸度の低い酒質劣化の少ない清酒を製造することができ、淡麗ですっきりした酒質の清酒の製造を行うことが可能となる。また、清酒以外の酒類の製造においても同様に淡麗ですっきりした酒質の製品の製造を行うことが可能となる。