(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
クロマトグラフィー法により第８因子を含むウイルス不活性分画を製造する方法であって、寒冷沈降物又は血漿を原料とし、寒冷沈降物の溶解後に、ウイルス不活性化が前記分画をジ−またはトリ−アルキルリン酸及び非イオン性界面活性剤で処理することによって行われ、続いて、ポリ（グリシジル  メタクリレート）または親水化されたポリスチレンから選択される多孔性親水性ポリマーのメンブレンまたはコンパクトディスク上でのメンブレンクロマトグラフィーを用いた分離工程を少なくとも一回行う方法。
【請求項２】
前記分離工程がメンブレン中又はメンブレン上に配置されているイオン交換材料により行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記イオン交換材料が陰イオン交換材料である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ウイルス不活性化が低温殺菌工程により行われる、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記低温殺菌工程後にメンブレンクロマトグラフィーを用いた追加の分離工程が行われる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記メンブレンクロマトグラフィーが第８因子に対して高いアフィニティを持つ材料により行われる、請求項１ないし５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
第８因子に対して高いアフィニティを持つ材料が高分子量及び／又は低分子量のリガンドにより修飾されている、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
第８因子に対して高いアフィニティを持つ修飾された材料が第８因子に対して高いアフィニティを持つ固定化リガンドを備えている、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
クロマトグラフィー材料が分離すべき第８因子と疎水性相互作用をすることができるか、又は疎水性相互作用を媒介する適当なリガンドを備えている、請求項１ないし８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
精製すべきサンプルを、０ないし150mM塩化ナトリウムに対応する低いイオン強度を持つ水性系によりイオン交換材料を含むメンブレンに適用し、その後、pH値を４ないし９に維持しながら、500ないし1,500mM塩化ナトリウム溶液に対応する高いイオン強度の水性系で溶出する、請求項１ないし９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記溶出前に、200ないし400mM塩化ナトリウム溶液に対応するイオン強度のより高い水性系による洗浄工程が行われる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
精製すべきサンプルを、非常に高いイオン強度を持つ溶液から、表面上に疎水性リガンドを備えたメンブレンに適用し、より低いイオン強度を持つ溶媒系で溶出する、請求項１、４ないし９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
第８因子を含む溶出分画を濃縮し、添加物を加え、及び／又は凍結乾燥する、請求項１ないし12のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記ウイルス不活性化が最大15重量%の洗剤で処理することによって行われる、請求項１ないし13のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記ウイルス不活性化の前に水酸化アルミニウム処理が行われる、請求項１ないし14のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
本発明はクロマトグラフィー法により第８因子を含むウィルス不活性化分画を製造する方法、及び本発明の方法により得ることができる第８因子を含む分画に関する。
第８因子は血液凝固において重要な役割を演じる生命物質である。従って、第８因子の投与によって血液凝固障害を治療することができる。そのため投与可能な第８因子製剤の必要性は大きい。天然の材料から濃縮度の高い形態の第８因子を単離しようと非常に多くの試みがなされてきた。例えば寒冷沈降物から第８因子を精製するクロマトグラフィー法が既に知られている。寒冷沈降物とは低温で血漿を処理することにより得られる分画のことである。EP 367 840 B1は、予備寒冷沈降せずに血漿から第８因子を単離するクロマトグラフィー法に関するものである。イオン交換基で修飾された親水性クロマトグラフィー材料によるクロマトグラフィー分離によって第８因子を含有する分画が分離される。EP 0 238 701は超高純度の感染性抗血友病因子の製造方法に関するもので、この方法では、前処理済分画は、エタノール沈殿によってフィブリノーゲン、グロブリン、アルブミン類及び他の干渉成分から遊離された寒冷沈降物である。欧州特許出願88 108 458.6は寒冷沈降物分画をウィルス不活性化した後のイオン交換剤によるクロマトグラフィー分離を記載している。EP 0 173 242Aは、炭水化物のみをベースとする（但し、この炭水化物マトリックスはDEAE基により修飾されている）陰イオン交換材料によるクロマトグラフィーによって第８因子調製品を得る方法を記載している。特に、DEAEセファロース及びDEAEセルロースが有用であると記載されている。GB-A-1,178,958に、ECTEOLAセルロースカラムを用いた第８因子の精製が記載されている。この修飾セルロースはエピクロロヒドリン及びトリエタノールアミンの反応によって導入された塩基性置換基を含む。上述の先行技術はバッチ式プロセスの形態のクロマトグラフィー分離又はカラムクロマトグラフィーのいずれかを利用している。これらの方法ではかなり良好な結果が得られるものの、生物学的に貴重な第８因子の収率を高めることが経済的及び論理的理由からさらに求められている。
このため本発明の基礎にある技術的課題は、先行技術から派生した、収率及び生物活性が改善された第８因子調製品が得られる方法を提供することにある。
驚くべきことにこの課題は、寒冷沈降物又は血漿を原料とし、続いて任意で水酸化アルミニウム処理を行い、かつ寒冷沈降物の溶解後にメンブレンクロマトグラフィーを用いた分離工程を使用する方法によって解決される。
本発明の方法は市販の寒冷沈降物又は血漿を用いて行うことができる。好ましくは解凍した寒冷沈降物を、第８因子を予め濃縮する目的でサンプルをさらに予備精製するように水酸化アルミニウムで処理する。
メンブレン中又はメンブレン上に配置されている材料による実際のクロマトグラフィー精製に先立って、ウィルス不活性化を行う。このウィルス不活性化はEP 131 740 A1に記載された方法に従って、生体適合性有機溶媒（洗剤）、Triton▲Ｒ▼ X-100/TNBP、好ましくはTween▲Ｒ▼/TNBP（トリ-n-ブチルホスフェート）で処理することにより行われる。コラン酸ナトリウム/TNBPでも良好な結果が得られる。好ましくは、洗剤は最大15重量%までの量で使用する。
サンプル中の第８因子を精製するためのクロマトグラフィー分離工程は、イオン交換基により修飾されたベース材料、特に陰イオン交換剤、又は免疫アフィニティリガンドにより修飾された材料のいずれかによって行ってもよい。上記の材料はメンブレン中に配置されていることが重要である。好ましくは、これらのメンブレンは修飾セルロース又はプラスチックファイバーのようなベース材料でできている。多孔性ポリ（グリシジル  メタクリレート）及び／又は同様の構造を持つ他の多孔性親水性ポリマー並びに親水化されたポリスチレンでできたメンブレン及びコンパクトディスクが特に有用である。
第一の例では、分離に適したメンブレンはセルロース製の積層薄膜又はプラスチックファイバーのいずれかからなるものであり、或いは第二の例では、シリカゲル又はポリマー担体でできたコンパクトディスクからなる。これらのメンブレン又はディスクのベース材料には対応する陰イオン交換基又は免疫アフィニティリガイドが備えられている。特に第四アミン又はジエチルアミノエチル基のような陰イオン交換基がイオン交換基として考えられる。適当な陽イオン交換剤は原則的に、スルホン酸又はリン酸基で修飾された材料のような弱酸性又は強酸性の陽イオン交換剤である。
イオン交換基はいわゆるスペーサーを用いて又は用いずにベース材料ファイバーに結合させることができる。スペーサーを備えた材料はテンタクル（触手）材料とも呼ばれる。対応するスペーサー及びリガンドがDE 42 04 694に述べられている。例えば、グルコサミン残基もスペーサーとして作用しうる。DEAE又は第四アミンのような陰イオン交換基が、多孔性ポリ（グリシジル  メタクリレート）又は上記の他の材料でできたメンブレンに結合していてもよい。陰イオン交換基の結合は、メンブレンを形成する材料に直接なされるか、又はグルコサミン残基等のスペーサーを介してなされることもある。
本発明の方法の別の態様では、第８因子に対して高いアフィニティを持つ固定化された物質によるアフィニティメンブレンクロマトグラフィーを使用する。特に、モノクローナル及び／若しくはポリクローナル抗体、又は第８因子結合性抗体フラグメントが適している（免疫アフィニティメンブレンクロマトグラフィー）。好ましくはこれらの抗体はヒト又はマウスに由来するものである。
第８因子に対してアフィニティを持つ物質は化学反応性基によって担体に固定化される。好ましくはこの反応性基は担体材料に直接作用するよりもむしろスペーサーの末端に作用する。第８因子に対する物質の固定化は、トシル、トレシル、ヒドラジド等のような反応性基における結合を介して行われる。類似の方法は、フィリップス（T.M.Philips）の「アフィニティクロマトグラフィー」（「クロマトグラフィー」（E. Heftmann, ed）, 5th ed. Elsevier, Amsterdam 1992）により知られている。
プロテインＡ又はプロテインＧリガンドを持つメンブレン上に抗体を予め吸着させておいてもよい。その後共有結合架橋を行うことによって、抗体の溶出（カラムの浸出）を防ぐことができる。プロテインＡ又はプロテインＧメンブレン上に抗体を架橋させるには遊離の担体の場合と同様の操作を用いることができる。プロテインＡ又はプロテインＧに固定化させる利点は、抗体が分子の不変セグメント（Fc）においてのみ固定化されることにある。従って、抗原結合部分（Fab)は遊離のまま維持され、第８因子との相互作用は妨げられない。
別の態様では、疎水性相互作用を確実にさせる材料を第８因子の分離に使用する。使用される疎水性材料は非環状及び／又は環状アルキル鎖、例えばC1ないしC18アルキル鎖、及び芳香族物質である。疎水性相互作用を行う適当な材料としては好ましくは疎水性勾配をもつものが挙げられる。疎水性は、例えばヒドロキシ基、アミノ基、シアノ基等のプロトン性極性又は非プロトン性極性基のような極性基を導入することによって勾配をつけることができる。好ましくは、それぞれの分離条件に応じて適合させる。
ウィルス不活性化は熱処理により行ってもよい。好ましくは、第８因子を含む溶出サンプルを一回目のメンブレンクロマトグラフィー工程に続いて低温殺菌工程に付す。対応する操作はP 43 18 435.9に提唱されている。そこでは第８因子が濃縮された分画を安定化剤の存在下でジ−又はトリ−アルキルリン酸及び任意で湿潤剤と接触させて、さらに、同時に又は続いて55℃から67℃の範囲の昇温下で５ないし30時間処理する。ウィルス不活性化の２つの方法、洗剤による処理及び加熱処理を組み合わせると有利にできる。
低温殺菌工程に使用した化学物質を除去するために、二回目のメンブレンクロマトグラフィーを続いて行ってもよい。好ましくは、添加した安定化剤の分離を、スペーサーを介してクロマトグラフィー担体材料の表面に配置されているDEAE又は第四アンモニア化合物で修飾されたメンブレンによって行う。加えて、対応するリガンドをスペーサーを用いずに担体材料の表面上に配置することも可能である。選択された条件下では安定化剤がこの陰イオン交換材料によって抑制されることはないが、第８因子はクロマトグラフィー材料上に吸着される。
その後、徐々に高い塩濃度を示す水性溶媒系で第８因子を溶出する。
こうして得られた第８因子を含む分画を通常の方法により濃縮し、添加物を加え（filled）、任意で凍結乾燥する。
好ましくは、一回目のメンブレンクロマトグラフィー分離工程において、低イオン強度の溶液からの第８因子を使用する。好ましくは、この水性系は０ないし150mM塩化ナトリウム溶液に対応するイオン強度を持つ。このようなイオン強度では、第８因子は依然としてクロマトグラフィー材料に吸着されているが、結合力のより弱い不純物は同じイオン強度の水性系で洗い出すことができる。
本発明の方法の他の態様では、吸着された物質の精製を200ないし400mM塩化ナトリウム溶液に対応するイオン強度の水性系で行うことができる。その後、第８因子の脱着及びこの分画の溶出を500ないし1500mM塩化ナトリウム溶液に対応するイオン強度の水性系で、pH値を４ないし９の範囲に維持しながら行う。陽イオン交換クロマトグラフィーを行う場合は、好ましくはpH＜６で行うが、陰イオン交換クロマトグラフィーは逆に約６よりも高いpH値で行う。
第８因子の精製を免疫アフィニティメンブレンクロマトグラフィーで行う場合は、陰イオン交換材料を用いる上記の方法とは異なり、カオトロピック試薬又は高濃度の塩溶液で溶出を行う。好ましくは、第８因子に高いアフィニティを持つ物質と第８因子自身の間の結合を分裂させるのに十分な濃度のカオトロピック試薬又は塩で溶出を行う。それぞれの溶出系における上記材料の濃度は第８因子と対応する結合成分の間のアフィニティの強さに依存する。好ましくは、あまり高くないアフィニティを持つ抗体を免疫アフィニティリガンドとして使用する。その結果として、変性能の低い水性溶液で溶出を行うことができる。好ましくは、上記免疫アフィニティメンブレンからの第８因子の溶出に、１から６、とりわけ２から４Mの尿素濃度を持つ水性溶液又は対応する高濃度の塩溶液を使用する。
疎水性相互作用クロマトグラフィーの場合、例えば高濃度の硫酸アンモニウム（最高濃度４M）又は塩化ナトリウム（最高濃度５M)のようなイオン強度の非常に高い水性溶液としてサンプルを使用する。特に、イオン強度のより低い塩溶液で漸次又は連続的に溶出を行う。有機溶媒を含む水性溶液、とりわけ希アルコール溶液を疎水性相互作用メンブレンクロマトグラフィーにおいてサンプルを溶出するための低イオン強度の溶液として使用してもよい。
驚くべきことに本発明の操作により第８因子の迅速且つ混入のない精製が確実になされ、同時に第８因子は高純度及び高収率で得られる。さらに、この方法で得られる第８因子の特異的活性は非常に高く、それは本発明の方法における活性因子の変性が低いことによるものと考えられる。よって、本発明の方法を介して得ることができる第８因子含有分画も本発明の対象である。