(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
バチルス・サーキュランス由来のβ-ガラクトシダーゼを４５℃以上の温度で加熱処理することを特徴とするガラクトオリゴ糖の生成能を高めるためのβ−ガラクトシダーゼの改質方法。
【請求項２】
加熱処理の温度が４５℃以上〜６０℃以下である請求項１記載のガラクトオリゴ糖の生成能を高めるためのβ−ガラクトシダーゼの改質方法。
【請求項３】
該バチルス・サーキュランス由来のβ-ガラクトシダーゼがβ-ガラクトシダーゼＩであることを特徴とする請求項１または２記載のガラクトオリゴ糖の生成能を高めるためのβ−ガラクトシダーゼの改質方法。
【請求項４】
請求項１ないし請求項３のいずれかの請求項記載の改質方法により得られたβ−ガラクトシダーゼを乳糖に作用させることを特徴とするガラクトオリゴ糖の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、β−ガラクトシダーゼの改質方法に関し、更に詳細にはバチルス・サーキュランス由来β−ガラクトシダーゼ中に含まれるβ−ガラクトシダーゼＩのガラクトオリゴ糖の生成能を高めるための改質方法およびこの改質されたβ−ガラクトシダーゼによるガラクトオリゴ糖の製造方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
β−ガラクトシダーゼ（β−galactosidase）は、β−Ｄ−ガラクシド結合の加水分解とともにガラクトシル基転移反応を触媒する酵素として知られており、近年、乳糖からのガラクトオリゴ糖の製造に有用であることが数多く報告されている。
【０００３】
β−ガラクトシダーゼは、微生物、動物、植物に広く分布しているが、ガラクトオリゴ糖の製造には糖転移率の高い微生物起源の酵素が選択される。このような微生物由来のβ−ガラクトシダーゼとしては、例えば、バチルス・サーキュランス（Bacillus circulans）、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）、クリプトコッカス・ローレンティー（Cryptococcus laurentii）のほか、ブレラ・シンギュラリス（Bullera singularis）、リポマイセス（Lypomyces）属酵母、ステリグマトマイセス（Sterigmatomyces）属酵母などが知られている。
【０００４】
これらのうち、バチルス・サーキュランスは、２種のβ−ガラクトシダーゼ（β−ガラクトシダーゼＩ、β−ガラクトシダーゼＩＩ）を生産することが知られており、その酵素学的性質も報告されている（Agric.Biol.Chem., 48 (12), 3053-3061 (1984)）。 この２種のβ−ガラクトシダーゼはオリゴ糖の生成能において大きく相違し、β−ガラクトシダーゼＩはガラクトオリゴ糖の生成能が低く、β−ガラクトシダーゼＩＩは、ガラクトオリゴ糖の生成能が高いことが確認されている。
【０００５】
このため、市販のバチルス・サーキュランス由来のβ−ガラクトシダーゼ製剤より、ガラクトオリゴ糖の製造に有利なβ−ガラクトシダーゼＩＩを分離する方法が提案されている（特開昭６２−１１８８８６号）。 しかしながら、この方法はカラムを用いた分離方法であり、カラムに充填した樹脂（ハイドロキシアパタイト）量あたりに処理できる酵素蛋白質の量が少ない、カラム分離に時間がかかる、経費が極めて高い等の点で工業的実施には実用的ではなかった。
【０００６】
また、両タイプの酵素を含むバチルス・サーキュランス由来のβ−ガラクトシダーゼで、乳糖濃度３０重量％以上の高濃度下で転移反応を起こさせると、ガラクトオリゴ糖を収率よく製造することができることが報告されている（特公平３−５４５５９号）。 しかしながら、この方法で示された高濃度乳糖での反応では、β−ガラクトシダーゼＩＩに比べてＩの方がガラクトオリゴ糖の生成率が低いことが認められる。また、高乳糖濃度での反応は乳糖の結晶が析出しない高温で反応しなければならないことから、耐熱性の低いβ−ガラクトシダーゼＩは反応中に失活が起こり、反応が遅延する難点があった。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
このように、バチルス・サーキュランス由来のβ−ガラクトシダーゼを用いてガラクトオリゴ糖の効率的な製造を行う技術開発が行われているものの、いまだ工業的実施においてβ−ガラクトシダーゼＩの混在に由来する問題点を改善するという点で満足のゆく技術は提案されておらず、さらに効率の良いガラクトオリゴ糖の製造方法が望まれていた。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記現状に鑑み、バチルス・サーキュランス由来のβ−ガラクトシダーゼについて研究を重ねたところ、ガラクトオリゴ糖の生成能が低いβ−ガラクトシダーゼＩを加熱処理することにより、ガラクトオリゴ糖の生成能が高まり、β−ガラクトシダーゼＩＩに類似した酵素に改質されるというという極めて特異的な現象を見い出した。
また、これはβ−ガラクトシダーゼの粗酵素から分離したβ−ガラクトシダーゼＩに対してだけでなく、分離前のβ−ガラクトシダーゼの粗酵素に対して加熱処理を行っても同様の効果が得られることを見い出し本発明を完成した。
【０００９】
即ち、本発明の第１の発明は、バチルス・サーキュランス由来のβ−ガラクトシダーゼを加熱処理することを特徴とするガラクトオリゴ糖の生成能を高めるためのβ−ガラクトシダーゼの改質方法である。
また、本発明の第２の発明は、上記改質方法においてバチルス・サーキュランス由来のβ−ガラクトシダーゼがβ−ガラクトシダーゼＩであるガラクトオリゴ糖の生成能を高めるためのβ−ガラクトシダーゼの改質方法である。
更に本発明の第３の発明は、上記両改質方法において加熱処理を４０〜６０℃で行うガラクトオリゴ糖の生成能を高めるためのβ−ガラクトシダーゼの改質方法である。
更にまた、本発明の第４の発明は、上記各改質方法により得られたβ−ガラクトシダーゼを乳糖に作用させるガラクトオリゴ糖の製造方法である。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明の改質方法の対象となるβ−ガラクトシダーゼは、バチルス・サーキュランス由来のものである。 バチルス・サーキュランスに属する微生物の産生するβ−ガラクトシダーゼであれば、いずれも利用することができるが、好ましいものの例としては、バチルス・サーキュランス（ＡＴＣＣ−３１３８２）の培養により得られたβ−ガラクトシダーゼ等を挙げることができる。
【００１１】
上記のβ−ガラクトシダーゼは、乳糖に作用させた場合のガラクトオリゴ糖の生成能が低いβ−ガラクトシダーゼＩおよび乳糖に作用させた場合のガラクトオリゴ糖の生成能が高いβ−ガラクトシダーゼＩＩを含有するものであるが、本発明の改質方法は、β−ガラクトシダーゼの粗酵素からβ−ガラクトシダーゼＩのみを分離した後に実施しても、また両酵素を分離せずβ−ガラクトシダーゼＩＩを含有する状態で実施しても良い。
【００１２】
また、バチルス・サーキュランス由来のβ−ガラクトシダーゼとして、市販の酵素製剤を用いることもできるが、このものが賦形剤として糖を含有している場合は糖含量ができるだけ少ないものか、あるいは糖を除いて用いることが望ましい。 糖が存在すると本発明の改質が十分に行われない場合がある。 なお、市販されている酵素製剤の例としては、ビオラクタＮ５（大和化成（株）製）などが挙げられる。
【００１３】
本発明のβ−ガラクトシダーゼの改質方法を実施するには、上記のβ−ガラクトシダーゼ（ＩまたはＩとＩＩの混合）を単に加熱処理すれば良い。 加熱は、４０℃以上の温度で、適宜時間、酵素が失活しない範囲で行えば良く、例えば、４０〜６０℃程度の温度で１０分〜１６時間程度、望ましくは、４５〜５５℃程度の温度で１時間〜１６時間程度行うのがよい。 なお、４０℃未満の加熱では十分な改質が行われず、また、６０℃を越える加熱では酵素が失活してしまう場合がある。 これらの加熱条件はタンクなどでのバッチ式加熱での条件であって、例えばプレートヒーターなど連続的に加熱可能な装置を用いれば高温で短時間の加熱も実施可能となる。 以上の加熱処理により、β−ガラクトシダーゼ中のβ−ガラクトシダーゼＩがβ−ガラクトシダーゼＩＩに類似した特徴を有する酵素に改質され、ガラクトオリゴ糖の生成能が高められる。
【００１４】
上記方法により改質されたβ−ガラクトシダーゼを用いてガラクトオリゴ糖を製造するには、このβ−ガラクトシダーゼを単に乳糖に作用させれば良い。
このガラクトオリゴ糖の製造方法は、改質されたβ−ガラクトシダーゼを用いることを除いては、通常の酵素作用条件で実施することができ、例えば、ｐＨ５.０〜８.０程度、温度２０〜７０℃程度の条件で実施すれば良い。 また、改質されたβ−ガラクトシダーゼの添加量も特に限定されないが、通常約１〜２０ＬＵ（乳糖力価）／ｇ基質程度から選択されるのが良い。
【００１５】
本発明方法により改質されたβ−ガラクトシダーゼは、β−ガラクトシダーゼＩのガラクトオリゴ糖の生成能が高められており、ガラクトオリゴ糖の製造におけるβ−ガラクトシダーゼＩの不都合が解消されているため、基質として用いられる乳糖の濃度は特に限定されず、任意の基質濃度でガラクトオリゴ糖の製造を行うことができる。 また、ガラクトオリゴ糖生成反応は乳糖のみの溶液においてだけでなく、牛乳や脱脂粉乳溶液など乳糖を含有する溶液においても高いガラクトオリゴ糖生成率が達成できる。
【００１６】
【実施例】
以下、実施例および試験例を挙げ、本発明を更に詳しく説明する。 なお、本明細書中においては、β−ガラクトシダーゼの活性を以下の方法により評価した。
また、試験例および実施例のβ−ガラクトシダーゼＩとβ−ガラクトシダーゼＩＩは、従来技術であるハイドロキシアパタイトを用いて分離精製をしたものを用いた。
【００１７】
［ β−ガラクトシダーゼの活性評価法 ］
（１） ＯＮＰＧ法（ＯＮＰＧ力価：ＬＳＵ）
酵素溶液１ｍｌを試験管に量りとり、４０ｍＭのＯＮＰＧ（ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド；ｏ−Nitrophenyl−β−D-galactopyranoside）溶液を１ｍｌ加え、ｐＨ６.０、４０℃で１０分間反応させる。 ２％炭酸ナトリウム溶液を５ｍｌ加えて反応を停止させ、４２０ｎｍの吸光度を測定する。 この方法で１分間に１μｍｏｌのＯＮＰ（ｏ−ニトロフェノール；o-Nitrophenol）を遊離する酵素量を１ＬＳＵとした。
【００１８】
（２） 乳糖分解力法（乳糖力価：ＬＵ）
１２％乳糖溶液５ｍｌを試験管に量りとり、酵素溶液を１ｍｌ加えてｐＨ６.０、４０℃で１０分間反応させる。 反応を中止したのち生成したグルコース量をグルコースオキシダーゼ法で測定する。 この方法で１分間に１μｍｏｌのグルコースを生成する酵素量を１ＬＵとした。
【００１９】
（３）活性比（ＬＳＵ／ＬＵ）
β−ガラクトシダーゼＩとβ−ガラクトシダーゼＩＩは、ＯＮＰＧと乳糖に対する分解力が異なることから、これらの活性比（ＬＳＵ／ＬＵ）を両酵素の指標とした。
【００２０】
試 験 例  １
ビオラクタＮ５より調製したβ−ガラクトシダーゼＩを試験管に分注し、密栓したのち各温度条件下で加熱保持した。 所定の時間保持した酵素をＯＮＰＧ法と乳糖分解法にて活性を測定し、活性比（ＬＳＵ／ＬＵ）を算出した。 なお、残存活性％は非加熱の各酵素活性に対する割合で算出した。 この結果を表１に示す。
【００２１】
【表１】
0003831075.tif 000002
【００２２】
試 験 例  ２
ビオラクタＮ５に含まれる賦形剤の糖をセファデックス（Sephadex） G−１０（ファルマシア製）で除いた酵素を調製し、試験例１と同様に各温度条件下で加熱保持した。 所定の時間保持した酵素をＯＮＰＧ法と乳糖分解法にて活性を測定し、活性比（ＬＳＵ／ＬＵ）を算出した。 なお、残存活性％は非加熱の各酵素活性に対する割合で算出した。 この結果を表２に示す。
【００２３】
【表２】
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【００２４】
試 験 例  ３
β−ガラクトシダーゼＩを３０℃から５５℃の各温度で６０分加熱して改質させた。 改質後のβ−ガラクトシダーゼＩを乳糖濃度１０％の基質に４０℃で作用させ、三糖以上のオリゴ糖の含有量を経時的にＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）で測定した。 なお、酵素添加量は５.０ＬＵ／ｇ乳糖とした。 また、コントロールとして非加熱のβ−ガラクトシダーゼＩおよびＩＩについても測定した。 この結果を図１に示す。
【００２５】
試 験 例  ４
５５℃で１時間加熱して改質させたβ−ガラクトシダーゼ（Ｉ,ＩＩ混合）を、３０または５０重量％の乳糖濃度の基質にそれぞれ５０および６０℃で作用させ、三糖以上のオリゴ糖の含有量を経時的に測定した。 なお、酵素添加量はそれぞれ６.０または８.０ＬＵ／ｇ乳糖とした。 また、コントロールとして非加熱のものについても測定した。 この結果を図２に示す。
【００２６】
この結果、基質濃度に関係なく改質β−ガラクトシダーゼ（Ｉ,ＩＩ混合）がオリゴ糖製造に有効であることが明らかになった。
【００２７】
実 施 例  １
β−ガラクトシダーゼＩの加熱処理とガラクトオリゴ糖の製造：
ビオラクタＮ５（５５００ＬＵ／ｇ）を５０ｇ秤量して１Ｌの０.０２Mリン酸緩衝液（ｐＨ６.０）に溶解し、限外濾過モジュール（ＳＩＰ−１０１３、旭化成製）を用い、酵素の濃縮と賦形剤の糖を除いた。 得られた３７０ｍｌをハイドロキシアパタイト（ＢＩＯ−ＧＥＬ ＨＴ, ＢＩＯ−ＲＡＤ製）を充填した２Ｌのカラムに通し、０.０２Mのリン酸緩衝液（ｐＨ６.０）の４Ｌを流したのち、同緩衝液の濃度をステップワイズで上昇させ、０.１５Mを１０Ｌ流してβ−ガラクトシダーゼＩＩを溶出させた。
【００２８】
次いで、０.２０Ｍの同緩衝液を１０Ｌ流したのち０.２５Mの緩衝液１５Ｌでβ−ガラクトシダーゼＩを回収し、限外濾過装置を用いて濃縮して１２５,０００ＬＵの酵素液を調製した。 このβ−ガラクトシダーゼＩ溶液（６０ｍｌ）をビーカーにとり、攪拌しながら５５℃で１時間加熱した。 加熱処理した酵素液の活性を測定したところ１１１,０００ＬＵでＬＳＵ／ＬＵは０.６であった。
【００２９】
２５ｋｇの食品用乳糖を２５Ｌの水に加えて加熱溶解し、次いで反応タンクのジャケットに水を流して６０℃まで冷却した。 ６Ｎ−NａＯＨを加えてｐＨを６.０に調製したのち、１００,０００ＬＵの上記β−ガラクトシダーゼＩを加え、６０℃で１０時間反応させた。 反応後、三糖以上のガラクトオリゴ糖３９.９％、二糖４１.５％、グルコース１８.０％、ガラクトース０.６％の糖組成の溶液を得た。
【００３０】
実 施 例  ２
β−ガラクトシダーゼＩ＋ＩＩの加熱処理とガラクトオリゴ糖の製造：
ビオラクタＮ５（５５００ ＬＵ／ｇ）を２５ｇ秤量して５００ｍｌの０.０２Mリン酸緩衝液（ｐＨ６.０）に溶解し、攪拌しながら５５℃で１時間加熱した。加熱処理した酵素液（１３２,０００ ＬＵ、ＬＳＵ／ＬＵ：０.６）を限外濾過装置で濃縮した。
【００３１】
２５ｋｇの食品用乳糖を２５Ｌの水に加えて加熱溶解し、次いで反応タンクのジャケットに水を流して６０℃まで冷却した。 ６Ｎ−NａＯＨを加えてｐＨを６.０に調製したのち、１００,０００ＬＵの上記酵素液を加えて６０℃で１２時間反応させ、三糖以上のガラクトオリゴ糖４０.０％、二糖４０.９％、グルコース１８.５％、ガラクトース０.６％の糖組成の溶液を得た。
【００３２】
【発明の効果】
本発明の改質方法によれば、加熱という極めて簡易な方法により、バチルス・サーキュランス由来のβ−ガラクトシダーゼのうち、ガラクトオリゴ糖の生成能が低いβ−ガラクトシダーゼＩを、ガラクトオリゴ糖の生成能が高いβ−ガラクトシダーゼＩＩに類似した特徴に改質させることができ、これによりガラクトオリゴ糖の生成能を高めることができる。
【００３３】
また、本発明改質方法では、分離されたβ−ガラクトシダーゼＩ単独のみならず、分離前のβ−ガラクトシダーゼを利用することができるため、分離工程を設けることなくガラクトオリゴ糖の製造に非常に有利なβ−ガラクトシダーゼを得ることができる。
【００３４】
さらに、本発明の改質方法により得られたβ−ガラクトシダーゼは、基質濃度にかかわらず優れたガラクトオリゴ糖の生成能を有するものであり、ガラクトオリゴ糖の製造に極めて有効なものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】β−ガラクトシダーゼＩの改質条件と反応でのオリゴ糖の含有率の経時的変化の関係を示す図面。
【図２】高い基質濃度における加熱または非加熱β−ガラクトシダーゼを用いた場合のオリゴ糖生成率の比較を示す図面。以  上
【図１】
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【図２】
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