(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロテイン標的に結合する親和力リガンドについて天然材料をスクリーニングする方法であって、
（１）プロテイン標的と天然材料を溶液状態で混合して反応混合物を形成する工程と、
（２）この反応混合物を、サンプル中に存在する標的および標的結合リガンドによる複合体形成を可能にする条件下で培養する工程と、
（３）前記反応混合物を、第１のサイズ排除媒体を通過させ、それぞれが第１のプリセット値より小さい分子量を有した小さい分子量の化合物を前記反応混合物から除去する工程と、
（４）工程（３）からのサイズ排除された反応混合物を、リガンド／標的の複合体を自由リガンドおよび自由標的に解離することを促進する条件下に置く工程と、
（５）工程（４）で得られた反応混合物を、第２のサイズ排除媒体を通過させ、第２のプリセット値より大きい分子を前記反応混合物から除去する工程と、
（６）工程（５）で得られた反応混合物を、少なくとも一つで分析する工程とを備えることを特徴とする方法。
【請求項２】
前記第１のサイズ排除媒体は、約２，０００ダルトン以下の分子量を有する分子を除去する請求項１の方法。
【請求項３】
前記第１のサイズ排除媒体は、約１，０００ダルトン以下の分子量を有する分子を除去する請求項１の方法。
【請求項４】
前記第１のサイズ排除媒体は、ゲル濾過またはサイズ排除ＨＰＬＣカラムを備える請求項１の方法。
【請求項５】
工程（４）は、工程（３）からのサイズ排除混合物に、有機溶媒と有機酸とを含む溶液を添加する請求項１の方法。
【請求項６】
前記第２のサイズ排除媒体は、限界濾過メンブレンを備える請求項１、４または５の方法。
【請求項７】
前記第２のサイズ排除媒体は、約１０，０００ダルトン以上の分子量を有する分子を前記反応混合物から除去する請求項１、４または５の方法。
【請求項８】
前記第２のサイズ排除媒体は、約３，０００ダルトン以上の分子量を有する分子を前記反応混合物から除去する請求項１、４または５の方法。
【請求項９】
前記第２のサイズ排除媒体は、約２，０００ダルトン以上の分子量を有する分子を前記反応混合物から除去する請求項１、４または５の方法。
【請求項１０】
前記限界濾過メンブレンは、約１０，０００ダルトン以下の分子量を有する分子を前記反応混合物から除去する請求項６の方法。
【請求項１１】
前記限界濾過メンブレンは、約３，０００ダルトン以下の分子量を有する分子を前記反応混合物から除去する請求項６の方法。
【請求項１２】
前記限界濾過メンブレンは、約２，０００ダルトン以下の分子量を有する分子を前記反応混合物から除去する請求項６の方法。
【請求項１３】
（７）工程（６）からの分析結果を参照標準と比較する工程を更に備える請求項１、４または５の方法。
【請求項１４】
前記参照標準は、プロテイン標的単体のサンプル、またはプロテイン標的と天然サンプルの混合物いずれかを、工程（２）〜（６）を経させた分析結果である請求項１３の方法。
【請求項１５】
工程（１）において、工程（２）に先行して反応混合物中の前記標的と結合する既知の競合リガンドを含める工程を更に備える請求項１、４または５の方法。
【請求項１６】
前記既知の競合リガンドと前記標的の濃度は、ほぼ等モルである請求項１５の方法。
【請求項１７】
前記既知の競合リガンドの濃度は、前記標的の濃度の約２倍から１０倍の範囲にある請求項１５の方法。
【請求項１８】
前記既知の競合リガンドの濃度は、前記標的の濃度の約５倍である請求項１５の方法。
【請求項１９】
（７）工程（６）からの分析結果を参照標準と比較する工程を更に備える請求項１５の方法。
【請求項２０】
前記参照標準は、前記プロテイン標的と前記既知の競合リガンドの混合物を、他の標的結合リガンドの不存在下で、工程（２）〜（６）を経させた分析結果である請求項１３の方法。
【請求項２１】
少なくとも一つで分析する工程は、（ａ）質量分析法、（ｂ）質量分析法とオンライン結合された液体クロマトグラフィ又は（ｃ）液体クロマトグラフィで分析させる工程、とからなることを特徴とする請求項１の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［関連出願との相互参照］
この出願は、１９９９年２月１２日に出願された米国暫定特許出願第６０／１１９，９６６号の利益を主張し、ここにその全体を参照によって組み入れる。
【０００２】
［連邦補助研究または開発に関する表明］
適用なし
【０００３】
［発明の背景］
本発明は、複合生理学的材料、例えば天然生成物および組み合わせライブラリを、サイズ排除分離、限界濾過、および質量分析法を使用して、親和力配位子についてスクリーニングすることに関する。
【０００４】
新規薬品候補用の複合生理学的サンプルを高処理量のスクリーニングプログラムでテストすることは、医薬産業で使用される成功した戦略である。しかしながら、活性サンプルが同定されると、その活性サンプルを、特に天然生成抽出物から分離することが困難になる。
【０００５】
天然抽出物は、単一の活性化合物の隔離を困難にする化合物の、高度に化学的な種々のコレクションを表す。殆どの成功した薬品化合物は、小さい分子量（２，０００ダルトン以下）であるので、サイズに基づく分離は、活性化合物の隔離を支援する有用なツールになり得る。
【０００６】
組み合わせ化学は、多数の異なった化学薬品を同時に生成する手段を提供する。最近の分析手法は、そのような組み合わせライブラリのスクリーニングが、所望の特性を保有したそれら化合物を選択することを可能にする。しかしながら、これらの方法は、それらの限界を有している。このため、活性配位子を同定するための生理学的標的に対する組み合わせライブラリの高処理量のスクリーニングを提供する成功した分析方法に対する必要性が残る。
【０００７】
ライブラリのスクリーニングは、配位子−レセプターの相互作用の程度を判定するために、一般に結合または機能アッセイを包含する。しばしば、配位子またはレセプターのいずれも固体表面（例えば、ポリマービードまたはプレート）上で不動態化され、そして、結合または機能活性の検出後に、配位子は放出され、異なる手段、例えば質量分析法で同定される。固体相スクリーニングアッセイは、溶液ベースの方法よりも速い、活性アナライトの隔離および同定を提供する。一方で、組み合わせリサーチの可溶性非ペプチドライブラリへのシフトと、異種アッセイに関連した限界は、溶液状態での組み合わせライブラリの迅速で効率的なスクリーニング用の躍進的な技術に対する要請を作りだす。溶液相アッセイは、スクリーニングの特異性を増加することに望ましいものであるが、現在の方法論は、長く骨の折れる反復性のプロセスを包含する。
【０００８】
近年、エレクトロスプレー式イオン化質量分析法（ＥＳＩ−ＭＳ）もまたスクリーニングに、直接または溶液ベースのスクリーニング法と関連して使用されている。ＥＳＩ−ＭＳによる組み合わせライブラリの直接スクリーニングは、配位子と結合したプロテインの非共有錯体を特徴付ける（即ち、プロテイン標的とその配位子を、小さなものであっても、区別する）その能力を頼みにしている。この代わりに、生理学的活性化合物の構造的判定に対する最終次元として、質量分析法が、オンラインまたはオフラインで、溶液ベースのスクリーニング法と結合される。
【０００９】
小さい分子のプロテインに対する結合研究用に最近使用された１つの方法であるフンメル−ドライヤー法は、レセプタープロテインとその配位子の、ゲル濾過による、サイズ分離に基づいたものである。レセプター（即ち、標的プロテイン）とレセプター−配位子の錯体を、サイズ差に基づいて他の小さな未結合の分子から分離する方法は、先ずペプチドライブラリの残りからの抗体−ペプチドの錯体に適用され、逆相高性能液体クロマトグラフィ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）上での配位子の分析が後続する。(R. N. Zuckerman et al., Proc. Nat. Acad. Sci., USA 89:4505-4509 (1992), J. M. Kerr et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 3:463-468 (1993)。
【００１０】
サイズ排除分離はまた、小さい分子の組み合わせライブラリにも適用されている。サイズ排除錯体隔離処理および質量分析法を使用して、生理学的標的に対し高親和力を有する配位子を選択および同定するための方法を開発することが研究されている。例えば、Y. Dunayevskiy et al., Rapid Comm. Mass Spec. 11:1178-84 (1997); M. M. Siegel et al., J. Mass Spec. 33:264-273 (1998)。組み合わせライブラリと他の化合物の錯体混合物とを、サイズ排除分離に基づいて、スクリーニングするこれらの試みは、実際の応用、特に高処理量スクリーニングの励行下では限られた成功しかない。１つの主要な問題は、高処理量のサイズ排除錯体分離スクリーニングプロトコルに使用される移送ラインと他の導管、特に逆相ＨＰＬＣカラムへの移送ラインの、１〜２時間の動作後に目詰まりして通過できなくなる傾向である。このような目詰まりは、ＨＰＬＣカラムの固定相上のプロテインの不可逆性回収に起因して起こり、移送ラインの頻繁な交換を必要とする。それはまた、そのようなスクリーニングプロトコルの全体の有効性とオンライン自動化を制限する要因でもある。この効果は、大きなＭＷの生体分子を含有する天然サンプルのような複合生理学的混合物を扱うときに更に言われる。それ故、高処理量の条件に耐え得るサイズ排除スクリーニング法に対する要求が残る。
【００１１】
［発明の簡単な要約］
本方法は、親和力相互作用とサイズ排除法を組み合わせて、小さな分子の化合物を、高度な複合混合物、例えば天然サンプルから迅速に隔離して特徴付けすることを可能にする。
【００１２】
また、本方法の技術の組み合わせの利点は、化合物のプールを、一時に一化合物ではなく、同時にスクリーニングすることを可能にすることである。本発明は、サイズ排除分離（例えば、ゲル濾過による）工程と限界濾過工程双方の独特な組み合わせを、質量分析法と共に使用して、親和力配位子用に迅速にスクリーニングする改良された方法を提供する。本方法の１つの利点は、維持された高処理量のスクリーニングを、ＨＰＬＣカラムを少なくとも７日間交換することなしに、可能にする点である。
【００１３】
一般に、この発明の迅速なスクリーニング方法は、
（ｉ）プロテイン標的（ＴＧ）と、小さい分子量を有する生理学的サンプル親和力配位子（Ｌ）とを混合および培養して、溶液状態で配位子／標的（Ｌ／ＴＧ）の錯体形成に導く条件下で、反応混合物を形成する工程と、
（ｉｉ）分子量差に基づいて、小さい分子の化合物は分離して保持するが、プロテインや配位子／プロテイン標的（Ｌ／ＴＧ）錯体は通過させるサイズ排除媒体を使用して、前記反応混合物から生理学的サンプル中に存在する未結合の小さい分子量の材料を除去する工程と、
（iii）未結合のプロテインや結合したＬ／ＴＧ錯体のような大きな分子量の材料だけを今は含有するサイズ排除された反応混合物を、自由で小さい分子量の配位子（Ｌ）と標的（ＴＧ）を溶液状態で生じさせるために、Ｌ／ＴＧ錯体解離に導く条件下に置き、そして第２のサイズ排除媒体、例えば限界濾過メンブレンを使用して、工程（ｉｉ）からのサイズ排除された反応混合物に残存するプロテイン標的および他の大きな分子から、自由配位子を分離する工程と、そして
（ｉｖ）隔離された配位子を、その構造を同定するために、質量分析法（ＭＳ）にかける工程と、
を含む主工程を所定の順序で備える。
【００１４】
［発明の詳細な説明］
この発明は、サイズ排除分離、限界濾過、および質量分析法を使用して、複合生理学的材料をスクリーニングする改良された高処理量のサイズ排除法を提供する。この方法は、いくつかのプールの化合物を、錯体混合物や非常に異なったＭＷサイズの分子を含有する天然サンプルと同様に、一度にスクリーニングすることを可能にする。
【００１５】
この発明は、小さい分子量の親和力配位子（Ｌ）をプロテイン標的（ＴＧ）に溶液状態で結合させる工程と、未結合の標的−不活性材料から配位子／プロテイン（Ｌ／ＴＧ）錯体をサイズ排除分離する工程と、後続するＬ／ＴＧ錯体の解離、および大きい分子（即ち、標的および他のプロテイン）から小さい分子を分離するもう１つのサイズベースの分離（限界濾過）による標的結合配位子の隔離工程と、そして質量分析法（ＭＳ）を単独でまたは液体クロマトグラフィと関連させて（ＬＣ−ＭＳ）使用して配位子を同定する工程、の独特な組み合わせを使用する。
【００１６】
「小さい分子」または「小さい分子量」は、およそ２，０００ダルトン以下の分子量を有する化合物を指すものと従来から理解されている。この方法が、選別された複合生理学的サンプルから、およそ２，０００ダルトン以下、好ましくは１，０００ダルトン以下の標的結合配位子を検出して隔離できると都合がよい。本方法によって同定される小さい分子量の配位子の例は、限定されるものではないが、複合生理学的材料の範囲内の化合物、例えば組み合わせライブラリ（例えば、ペプチド等の）；天然の生成物、サンプルまたは抽出物；および純粋な化合物の混合物を含む。
【００１７】
大きな分子量の化合物は、一般におよそ８，０００、より典型的には１０，０００ダルトン以上の分子量を有する化合物である。例としては、プロテインや、小さな分子の配位子に非共有的に結合したプロテインの錯体が挙げられる。
【００１８】
この発明の一般的な方法の概略が、図１のフローチャートに示されている。
【００１９】
この発明の１つの形態は、プロテイン標的に結合する親和力配位子について複合生理学的材料をスクリーニングする方法を提供する。この方法は、
（１）プロテイン標的と複合生理学的材料を溶液状態で混合して反応混合物を形成する工程と、
（２）この反応混合物を、サンプル中に存在する標的および標的結合配位子による錯形成を可能にする条件下で培養する工程と、
（３）前記反応混合物を、第１のサイズ排除媒体を通過させ、それぞれが第１のプリセット値より小さい分子量を有した小さい分子量の化合物を前記反応混合物から除去する工程と（例えば、前記第１のプリセット値は、５０００ダルトン以下の範囲にあり、３０００Ｄａでカットオフされる）、
（４）工程（３）からのサイズ排除された反応混合物を、配位子／標的の錯体を自由配位子および自由標的に解離することを促進する条件下に置く工程と、
（５）工程（４）で得られた反応混合物を、第２のサイズ排除媒体を通過させ、第２のプリセット値より大きい分子を前記反応混合物から除去する工程と、
（６）工程（５）で得られた反応混合物を、（ａ）質量分析法、または（ｂ）質量分析法とオンライン結合された配位子クロマトグラフィ法で分析させ、これにより工程（５）から生じた反応混合物中に残存する小さい分子量の配位子を特徴付ける工程と
を与えられた順序で備える。
【００２０】
もう１つの形態では、この発明の方法は、工程（６）からの分析結果を参照標準と比較する工程を更に備える。この参照標準は、好ましくは、プロテイン標的単体のサンプル、またはプロテイン標的と非標的結合複合生理学的材料サンプルの混合物いずれかを、工程（２）〜（６）を経させた分析結果（ＭＳまたはＬＣ−ＭＳ結果）である。
【００２１】
この発明の迅速なスクリーニング法は、オンラインまたはオフライン形式で行うことができる。加えて、この方法は、競合結合の実施形態を、この方法によって検出された配位子が特異的に（既知の競合配位子と同じ部位で）、または非特異的に（例えば、疎水性相互作用により、他の部位で）選択されたプロテイン標的と結合するか否かを判定する対照として、更に含むことができる。
【００２２】
［オフライン実施形態］
標的プロテインは、最初に、溶液状態の生理学的混合物によって、ＬＣ／ＭＳまたは標的に対する配位子の平衡または近平衡結合に到達するに十分な時間（例えば、約５〜６０分、好ましくは５〜１０分）培養される。それから、未結合の小さい分子の化合物からのＬ／ＴＧ錯体の物理的分離が、サイズ排除媒体、例えば小さい分子量の化合物から大きな分子（例えば、サンプル中の標的プロテイン（ＴＧ）と他のプロテイン）と大きな錯体（即ち、Ｌ／ＴＧ錯体）を分離するゲル濾過カラム（例えば、Pharmacia社のＨＲ１０／１０カラム）上で行われる。標的／サンプルの混合物中の小さい非結合分子は、ゲル濾過カラム上に保持される。大きな分子は、空きカラム体積内に溶離する。それ故、この分離工程後に、サイズ排除反応混合物は、生理学的サンプル中に最初から存在していた他の大きい分子と同様に、未結合のＴＧおよびＬ／ＴＧ錯体を含み、それらは全て空きカラム体積中に溶離する。
【００２３】
その後、少なくとも１つの有機溶媒と少なくとも１つの有機酸とを含む溶液（例えば、０．１％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含有するアセトニトリルＡＣＮ溶液１００μＬが、ゲル濾過カラムからのサイズ排除反応混合物に添加される。この工程は、プロテイン変性に対する条件と、続く結合配位子の標的からの放出、即ち結合Ｌ／ＴＧ錯体の解離に対する条件を作成する。結果として得られる混合物全体は、それから第２のサイズ分離媒体、例えば小さい分子量のカットオフ、例えば１，０００〜５０００ダルトン（Ｄａ）、好ましくは２，０００〜４，０００の範囲内、最も好ましくは約３，０００Ｄａの限界濾過メンブレン上に装填される。限界濾過メンブレンのカットオフより小さい分子だけが通過できる。このようにして、この第２のサイズ分離工程は、スクリーニングされた生理学的サンプル中の全ての大きい分子から、解離された配位子の分子を隔離する。第１のサイズ分離工程後に混合物中に残存する小さい分子（即ち、プロテイン標的に対して所望の親和力を有する親和力配位子）は、限界濾過メンブレンを通過し、そのメンブレン表面は、全ての大きい分子（即ち、このサンプルに由来する標的および他の大きなＭＷの分子）を保持する。
【００２４】
残りの、限界濾過された反応混合物または材料は、ＭＳ単体に向けられるか、またはオンラインでＭＳと結合した液体クロマトグラフィ（ＬＣ−ＭＳ）により、限界濾過工程によって隔離された標的結合配位子を分析する。
【００２５】
［オンライン実施形態］
オンライン形式では、サイズ排除カラム（ＳＥＣ）、限界濾過メンブレン、および液体クロマトグラフィ−質量分析法（ＬＣ−ＭＳ）システムがオンラインで一緒に組立られる。この発明の方法を遂行する可能性のある機器的構成の１つは、図２Ａ、２Ｂおよび２Ｃに示されている。これらの図は、異なる時点の方法と装置を図示している。図２Ａは、ループ内の大きい分子量の生体分子の隔離と捕獲を示している。図２Ａは、隔離された大きい分子量の生体分子の、限界濾過メンブレン上への移送を、配位子／標的の錯体解離へ導く条件の適用と共に示し、更に解離された配位子の標的からの分離と、隔離された配位子の逆相ＬＣカラム上への配置とを示している。図２Ｃは、ＬＣ−ＭＳ分析による、限界濾過後の、配位子の特徴付けを示している。
【００２６】
オンライン法では、標的−配位子結合を可能にするに十分な時間（例えば、５〜６０分）の反応混合物の培養後に、その混合物は、ＳＥＣに注入され、そしてＳＥＣのＳＥＣ固定相によって保持されない、大きい分子が先ず取り出される。小さい分子は、ＳＥＣ固定相の孔内に保持される。大きい分子に対応するクロマトグラフのピークは、サンプルループに転送され（図２ａ）、そしてＳＥＣからの残りの流れは、廃棄へと迂回される。それから、Ｌ／ＴＧ錯体解離用の条件を提供するために、有機溶媒（例えば、アセトニトリル（ＡＣＮ）酸（ＴＦＡ））と有機酸（例えば、酢酸またはトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ））とを含有した溶液が、ループ中でサンプルに添加される。同時に、サンプルは、限界濾過メンブレンのチャンバ内に移送される（図２ｂ）。その後、サンプルは、更に放出された配位子のＬＣ−ＭＳ分析をするために、限界濾過メンブレンを通してＭＳ内へ、あるいはＬＣカラム内へ直接ポンプ輸送される（図２ｃ）。放出された小さい分子の配位子だけがメンブレンを通過することができ、そして後にＭＳまたはＬＣ−ＭＳによって同定される。
【００２７】
［競合結合実施形態］
この発明の他の１つの実施形態は、競合結合の使用と、既述されたスクリーニングアッセイとを組み合わせるものである。選択された標的に結合する既知の競合配位子（ＣＬ）の利用は、生理学的混合物から抽出された活性配位子が標的プロテインの特異的結合部位または既知の部位に結合するか否かを判定可能にする。この場合、既知のＳ．Ｈ．に結合するＣＬが標的と生理学的サンプルとの反応混合物に添加される。この生理学的サンプルは、最初の混合および培養段階で、小さい分子量の親和力配位子を含有している。そして質量分析中に、ＬおよびＣＬ信号がモニタされる。抽出された配位子ＬのＭＳ信号が、結合混合物中のＣＬの存在による影響を受けていない場合は、同定された配位子Ｌが、ＴＧのＣＬ結合部位とは異なる部位に結合しているものと結論づけることができる。この競合結合手法は、このようにして、標的の異なる部位に結合している配位子を同定できるようにする。例えば、このことは、このスクリーニング法の間に検出された非特異的バインダーを、標的プロテインの活性を調節するための候補化合物として、迅速に評価することに使用することができる。代わりに、スクリーニング、テストおよび／または特徴付けの努力を、配位子分子の標的への結合が反応混合物中の既知の競合配位子の包含を減少させるような、配位子分子（Ｌ）に集中することもできる。そのような結果は、スクリーニングされたサンプルからの候補配位子が、このようにして、既知の競合配位子がするように、プロテイン標的上の同じ部位に結合することを示唆している。
【００２８】
この方法の競合結合実施形態では、スクリーニングされたサンプルが特定的標的結合配位子を含んでいるか否かを判定するための参照標準は、プロテイン標的と既知の競合結合配位子の混合物を、他の標的結合配位子の不存在下で、工程（２）〜（６）を経させた、ＭＳまたはＬＣ−ＭＳの結果である。
【００２９】
（例示的プロトコルおよび材料）
［例示的ゲル濾過隔離プロトコル］
プロテイン標的（例えば、ヒトのカルボニックアンヒドラーゼＩＩ（ＣＡＩＩ）への結合を検定することに使用される候補化合物のストック溶液は、それらをアセトニトリル (HPLC Grade; Fisher Scientific, Springfield, NJ, USA) （ＡＣＮ）と緩衝液Ａの１：１（ｖ／ｖ）混合物中に溶解し、さらに結合アッセイで所望とされる濃度より１０倍高い濃度まで希釈することによって調製することができる。この標的プロテインストック溶液は、緩衝液Ａ中で標的を溶解して希釈することで調製することができる。結合混合物は、５０μＬの標的ストックと５μＬの候補化合物ストックからなる。反応混合物は、ピペットによって静かに混合した後に、室温で１時間培養される。ゲル濾過カラム（例えば、この発明のオフライン形式の、Sephadex社のＧ２５高速脱遠スピンカラムか、Pharmacia社のＨＲ１０／１０カラム）は、製造者の指示に従って扱われた。例えば、Ｇ２５カラムは最初に１００μＬの水で洗浄され、そして４℃で５分間、３０００ｒｐｍ（−９００ｇ）で遠心分離された。反応混合物は、それからカラム上に装填され、前と同様に遠心分離された。未結合の化合物は、カラム上に維持されるべきであるが、低分子量の候補化合物に結合したプロテインまたは未結合のプロテインは、カラムを通して流れるべきである。スピンカラムの流中のプロテイン錯体は、回収される。溶出したフラクション中のプロテイン−配位子の錯体は、それからトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）(Sigam Chemical CO.)を０．１％含有するＡＣＮ溶液１００μＬを加え、室温で５分間培養し、そして１５秒間渦巻き運動させることによって変性される。変性されたプロテインは、１００００ｇの遠心分離を３０秒行うことによって取り除かれる。
【００３０】
［例示的限界濾過プロトコル］
ゲル濾過プロトコルの結果生じた上澄み液は、それから第２のサイズ排除分離媒体、好ましくは限界濾過メンブレンに投入される。例としては、マイクロコン−３(Microcon-3, Amicon社, Beverly, MA, USA) として販売されている２０，０００、１０，０００または３０，０００ダルトンのカットオフを有した限界濾過メンブレンがある。約１０，０００Ｄａ以下のカットオフを有したメンブレン（それは３０，０００Ｄａ以上の分子の約１％を通過させる）が好ましい。３，０００Ｄａのカットオフのメンブレンは、３０，０００Ｄａ以上の分子の約０．１％だけを通過させる。最も好ましい限界濾過メンブレンは、有機溶媒（例えば、ＡＣＮ）と有機酸（例えば、ＴＦＡまたは酢酸）に１００％耐えることができるものである。
【００３１】
小さい分子量、例えば約１０００〜５０００Ｄａ、好ましくは２０００〜４０００Ｄａの範囲内の他のカットオフを有する限界濾過メンブレンもまた市販されている（例えば、All Filtron社, Northborough, MAの５０００Ｄａカットオフ）。
【００３２】
［例示的ＭＳまたはＬＣ−ＭＳプロトコル］
限界濾過された液体（標的に結合した候補配位子を含んでいる）は、小さい体積内での凍結乾燥および再懸濁後に、質量分析法単独によって、または質量分析法と結合された液体クロマトグラフィによって、放出された小さい分子量の化合物の存在について分析される。
【００３３】
質量分析法：分析は、例えばイオントラップ３重４極質量分析計ＬＣＱ(Thermo-Quert Corporation, San Jose, CA, USA)またはＡＰＣＩ上で行われる。エレクトロスプレー電圧は、約＋４．５〜４．７５ｋＶの範囲内に概ね維持される。イオン光学系の設定値は、イオンの最大効率を検出器に与えるために、分析の日に最適化される。効果的な質量範囲は、約１秒／スキャンのレートで概ねｍ／ｚ１５０からｍ／ｚ７００である。
【００３４】
液体クロマトグラフィ：例えば、サンプルは、流率１ｍｌ／分の勾配モードで動作するＨＰ１１００(Hewlett Packard Paulo Alto,CA, USA)クロマトグラフィを通して導入される。メタケムテクノロジー社(MetaChem Technologies, Torrance, CA, USA)のＩｎｅｒｔｓｉｌＣ１８ベースの不活性化されたマイクロボアカラム（４．６ｍｍ×１０ｃｍ）がサンプル分離用に使用された。移動相勾配は、１５分間で、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ  Ｈ２Ｏ＋ＡＣＮ  ９０／１０（ｖ／ｖ）からＨ２Ｏ＋ＡＣＮ  ０／１００（ｖ／ｖ）へ変化するものである。サンプルは、１０μＬの外部ループを有するＲｈｅｏｄｙｎｅモデル７１２５インジェクタ(Rheodyne Model 7125 injector, Cotati, CA, USA)を通して導入された。サンプル注入体積は、概ね１〜１９μＬであった。
【００３５】
［実施例Ｉ（オフライン形式）］
この発明のオフライン式スクリーニング手順は、ヒトのカルボニックアンヒドラーゼＩＩ（ＣＡＩＩ）を標的として使用し、またＣＡＩＩの活性部位に特異的に結合する既知の小さい分子の配位子アセタゾラミド（ＡＺ）でスパイクされているＣＡＩＩに対し不活性な天然サンプル（ＮＳ）（例えば不活性カビ抽出物）を使用して実証される。リン酸塩で緩衝されたｐＨ７．０の１％ＤＭＳＯ塩水のような緩衝液中で、約２０μＭのＣＡＩＩと、約１０μＭのＡＺを含有する約１μｇの不活性天然サンプルとが、ＣＡＩＩおよびＡＺの最終濃度を約１マイクロモルとするように混合され、培養された。サイズ排除クロマトログラフィは、ｐＨ７．０の酢酸アンモニウ２００ｍＭの移動相を使用するPharmacia社のＨＲ１０／１０カラムを４ｍｌ／分で使用して行われた。典型的に、結合した配位子（ＡＺ）を有する標的プロテイン（ＣＡＩＩ）を含有して排除された体積は、そのような条件下で、０．６〜０．７分でカラムから溶出する。
【００３６】
図３Ａは、約２０μＭのＣＡＩＩだけが、この発明の方法全体を通過したブランク実験のＬＣ−ＭＳクロマトグラムを示している。図３Ｂは、不活性天然サンプル（ＮＳ）だけで培養されたＣＡＩＩの量と同じことを行ったＬＣ−ＭＳクロマトグラムを図示している。ブランク実験と比較した付加的なピークは図示されていない。このことは、不活性天然サンプルからの標的結合配位子の不存在を示している。図３Ｃ[Orig. Fig. 1c]は、約１０μＭのＣＡＩＩ結合配位子アセタゾラミド（ＡＺ）を今は含有する天然（ＮＳ）サンプルに同じスクリーニングプロセスを行ったＬＣ−ＭＳ結果を示している。活性配位子は、本発明のスクリーニング法の結果、不活性生理学的マトリクスから成功裏に抽出された。図３Ａ〜３Ｃに示されるように、標的ＣＡＩＩ（ＴＧ）ピークは、１０．５分以上の持続時間を有する一連のクロマトグラフィのピークである。配位子ＡＺのピークは、５．９分の持続時間を有する。
【００３７】
当業者は、ここに説明された方法に対し、請求の範囲に規定された本発明の精神および範囲から逸脱することなく、小さな変形を与えることが可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１】  この方法の一般的工程のフローチャートである。
【図２Ａ，２Ｂおよび２Ｃ】  本発明のスクリーニング法のオンライン実施形態を実施するためにセットアップされた装置の、本方法の異なる時点での、模式的説明図である。
【図３Ａ〜Ｂ】  ヒトのカルボニックアンヒドラーゼＩＩに結合する配位子アセタゾラミドをスクリーニングするために、この方法のオフライン実施形態を使用した配位子クロマトグラフィ−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）クロマトグラムを示す。
【図１】
0003788909.tif 000002
【図２Ａ】
0003788909.tif 000003
【図２Ｂ】
0003788909.tif 000004
【図２Ｃ】
0003788909.tif 000005
【図３Ａ】
0003788909.tif 000006
【図３Ｂ】
0003788909.tif 000007
【図３Ｃ】
0003788909.tif 000008