(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
円二色性データから、蛋白質の二次構造成分比の計算に用いる計算波長範囲を選択する方法であって、
前記計算波長範囲の長波長端を所定の波長に固定する長波長端固定工程と、
前記計算波長範囲の短波長端を順次変更し、それぞれの二次構造成分比が零または正の値をもつという拘束条件で二次構造成分比を最適化法によって算出する仮成分比算出工程と、
前記仮成分比算出工程で算出されたそれぞれの二次構造成分比の合計値をそれぞれの計算波長範囲について算出する合計値算出工程と、
前記合計値算出工程で算出された合計値の誤差がそれぞれ所定の許容値以下であると、その中から短波長端が最も大きい計算波長範囲を探索し、また、合計値の誤差がそれぞれ所定の許容値より大であると、その中から合計値が１００％と最も近似する計算波長範囲を探索する探索工程と、
前記探索工程で探索された計算波長範囲を蛋白質の二次構造成分比の計算に用いる計算波長範囲として選択する選択工程と、
を備えたことを特徴とする蛋白質の二次構造解析に用いる計算波長範囲選択方法。
【請求項２】
請求項１記載の方法において、前記探索工程は前記二次構造成分比の合計値の誤差が許容値以下の計算波長範囲を優先して探索することを特徴とする蛋白質の二次構造解析に用いる計算波長範囲選択方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は蛋白質の二次構造解析に用いる計算波長範囲選択方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
蛋白質の円二色性（ＣＤ）がその二次構造を鋭敏に反映することは良く知られている事実である。
図１には二次構造成分比が異なるミオグロビン（Myoglobin）、リゾチーム（Lysozyme）およびパパイン（Papain）のＣＤスペクトル測定例が示されている。
なお、同図において、Ｍはミオグロビン（Myoglobin）、Ｌはリゾチーム（Lysozyme）、Ｐはパパイン（Papain）の遠紫外ＣＤ測定例である。
これら円二色性スペクトルの特徴的形状と強度から二次構造成分比を評価しようとする種々の試みがなされ、その解析原理として例えばYang教授らのリファレンスＣＤスペクトル法が採用されている。
【０００３】
すなわち、蛋白質のＣＤを４つの基本二次構造のリファレンスＣＤを用いて（１）式で表す。
Ｐ（λ）＝ｆH・Ｈ（λ）＋ｆB・Ｂ（λ）＋ｆT・Ｔ（λ）＋ｆR・Ｒ（λ）  …  （１）
ただし、Ｐ（λ）、Ｈ（λ）、Ｂ（λ）、Ｔ（λ）およびＲ（λ）は、それぞれタンパク質、ヘリックス、ベータ、ターン及びランダムの波長λにおけるＣＤ値（平均残基分子楕円率）を表す。ｆi（ｉ＝Ｈ，Ｂ，Ｔ，Ｒ）は、蛋白質のそれぞれの二次構造成分比を表す。
そして、未知構造蛋白質の二次構造成分比ｆi（ｉ＝Ｈ，Ｂ，Ｔ，Ｒ）を（１）式のカーブフィッティングによって求めるものである。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
ところで、リファレンスＣＤスペクトル法に代表される蛋白質二次構造解析では、二次構造成分比の計算に用いる計算波長範囲の選択の仕方が悪いと、得られた二次構造成分比とそれらのＸ線解析データとの相関係数が低くなってしてしまう。特にベータ構造の評価精度を維持するためには真空紫外域までのＣＤデータ（たとえば１８０ｎｍ以下）を用いなければならなかった。
【０００５】
しかしながら、このような短波長まで測定領域を延長することによって、溶媒の選択や、空気中の酸素の吸収をさけるために行う円二色性分散計内の窒素置換の問題などの困難が増えてくるため、数多くのプログラムの使用者にとって１９０ｎｍまでの測定が限界であり、１８０ｎｍ以下の測定は事実上不可能であった。
そのため、二次構造成分比の評価精度を維持するためには計算波長範囲の選択は重要であるが、プログラムの使用者の要求に十分に応えることができていなかった。
【０００６】
その理由は、二次構造成分比の計算に用いる計算波長範囲の設定には数多くの場合が考えられ、さらには選択された計算波長範囲が最適なものであるかどうかを判断するための適切な規範が存在しないため、プログラムの使用者は満足のゆく評価精度が得られるまで、計算波長範囲を選択してから二次構造成分比を算出するまでの一連の操作を繰り返さなければならず、非常に煩わしいものであった。
本発明は前記従来技術の事情に鑑みなされたものであり、その目的は蛋白質の二次構造成分比、特にベータ構造の評価精度の改善が容易になし得る蛋白質の二次構造解析に用いる計算波長範囲選択方法を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
前記目的を達成するために本発明にかかる蛋白質の二次構造解析方法に用いる計算波長範囲選択方法は、円二色性データから、蛋白質の二次構造成分比の計算に用いる計算波長範囲を選択する方法であって、長波長端固定工程と、仮成分比算出工程と、合計値算出工程と、探索工程と、選択工程と、を備えたことを特徴とする。
前記長波長端固定工程は、前記計算波長範囲の長波長端を所定の波長に固定する。
【０００８】
前記仮成分比算出工程は、前記計算波長範囲の短波長端を順次変更し、それぞれの二次構造成分比が零または正の値をもつという拘束条件で二次構造成分比を最適化法によって算出する。
前記合計値算出工程は、前記仮成分比算出工程で算出されたそれぞれの二次構造成分比の合計値をそれぞれの計算波長範囲について算出する。
前記探索工程は、前記合計値算出工程で算出された合計値の誤差がそれぞれ所定の許容値以下であると、その中から短波長端が最も大きい計算波長範囲を探索し、また、合計値の誤差がそれぞれ所定の許容値より大であると、その中から合計値が１００％と最も近似する計算波長範囲を探索する。
【０００９】
前記選択工程は、前記探索工程で探索された計算波長範囲を蛋白質の二次構造解析に用いる計算波長範囲として選択する。
なお、前記探索工程は、前記二次構造成分比の合計値の誤差が許容値以下の計算波長範囲を優先して探索することが好適である。
【００１０】
【発明の実施形態】
以下、図面に基づき本発明の一実施態様について説明する。
図２には本発明の一実施態様にかかる蛋白質二次構造解析用の装置のブロック図が示されている。
なお、本実施態様ではリファレンスＣＤとして図４に示すヤン教授らのリファレンスＣＤを想定し、未知構造蛋白質の二次構造成分比を（１）式のカーブフィッティングによって求める場合について説明する。
図２において、装置１０は、長波長短固定手段、仮成分比算出手段、合計値算出手段、探索手段、及び選択手段としてのＣＰＵ１２と、ＲＯＭ１４と、ＨＤＤ１６とを含む。
【００１１】
ＲＯＭ１４にはカーブフィッティングプログラムをはじめ、例えば（１）式に示す解析関数やリファレンスＣＤデータなどが記憶されている。
ＨＤＤ１６には円二色性分散計（図示省略）で測定された被解析蛋白質のＣＤデータが記憶されている。
そして、二次構造解析の開始を指示する解析開始信号がＣＰＵ１２に入力されると、ＣＰＵ１２は、ＲＯＭ１４に記憶されている解析プログラムを起動する。
このとき、ＣＰＵ１２は、リファレンスＣＤデータやＨＤＤ１６に記憶されている被解析蛋白質のＣＤデータも同時に読み出して、この未知構造蛋白質の二次構造成分比を（１）式のカーブフィッティングによって求めることができる。
【００１２】
すなわち、ＣＰＵ１２は、波長λにおける蛋白質のＣＤ値Ｐ（λ）を、たとえば４つの基本二次構造のリファレンスＣＤを用いて近似的に（１）式で表す。
ただし（１）式において蛋白質ＣＤ値Ｐ（λ）は、それぞれ測定された波長範囲のｎ個の波長点λｉ（ｉ＝１，２，…，ｎ）においてそれぞれ独立した値をもっている。Ｈ（λｉ）、Ｂ（λｉ）、Ｔ（λｉ）およびＲ（λｉ）の４つの二次構造のリファレンスＣＤ値を用いて、被解析蛋白質のそれぞれの二次構造成分比ｆH、ｆB、ｆT、ｆRを最小二乗法により求める。
【００１３】
ここで、前記（１）式は厳密に成り立つのではなく、波長λｉ（ｉ＝１，２，…，ｎ）において誤差（εｉ）が含まれており、これは（２）式で表せられる。
すなわち、誤差（εｉ）＝Ｐｉ−（ｆH・Ｈｉ＋ｆB・Ｂｉ＋ｆT・Ｔｉ＋ｆR・Ｒｉ）（ｉ＝１，２，…，ｎ）                                …    （２）
ただし、前記（２）式において、Ｐｉ＝Ｐ（λｉ），Ｈｉ＝Ｈ（λｉ），Ｂｉ＝Ｂ（λｉ），Ｔｉ＝Ｔ（λｉ），Ｒｉ＝Ｒ（λｉ）である。
したがって、ＣＰＵ１２は、（２）式に示すこれらの誤差（εｉ）の平方和（Ｓ）を最小にする蛋白質のそれぞれの二次構造成分比ｆH、ｆB、ｆT、ｆRを求めるのである。
【００１４】
平方和（Ｓ）＝ε１2＋ε２2＋…＋εｎ１2＝Σεｉ2＝Σ｛Ｐｉ−（ｆH・Ｈｉ＋ｆB・Ｂｉ＋ｆT・Ｔｉ＋ｆR・Ｒｉ）｝2                       …    （３）
すなわち、前記（３）式を蛋白質のそれぞれの二次構造成分比ｆH、ｆB、ｆT、ｆRでそれぞれ偏微分したそれぞれの式を零とおく。
つまり、∂Ｓ／∂ｆH＝２Σ｛Ｈｉ（ｆH・Ｈｉ＋ｆB・Ｂｉ＋ｆT・Ｔｉ＋ｆR・Ｒｉ）−Ｐｉ・Ｈｉ｝＝０より、ｆH・ΣＨｉ2＋ｆB・ΣＨｉ・Ｂｉ＋ｆT・Σ・Ｈｉ・Ｔｉ＋ｆR・ΣＨｉ・Ｒｉ−ΣＰｉ・Ｈｉ＝０        …    （４−１）
を得る。
【００１５】
同様にして、∂Ｓ／∂ｆBより、ｆH・ΣＨｉ・Ｂｉ＋ｆB・ΣＢｉ2＋ｆT・ΣＢｉ・Ｔｉ＋ｆR・ΣＢｉ・Ｒｉ−ΣＰｉ・Ｂｉ＝０            …    （４−２）
を得る。
また、∂Ｓ／∂ｆTより、ｆH・ΣＨｉ・Ｔｉ＋ｆB・ΣＢｉ・Ｔｉ＋ｆT・ΣＴｉ2＋ｆR・ΣＴｉ・Ｒｉ−ΣＰｉ・Ｔｉ＝０               …    （４−３）
を得る。
【００１６】
∂Ｓ／∂ｆRより、ｆH・ΣＨｉ・Ｒｉ＋ｆB・ΣＢｉ・Ｒｉ＋ｆT・ΣＴｉ・Ｒｉ＋ｆR・ΣＲｉ2−ΣＰｉ・Ｒｉ＝０                       …    （４−４）
を得る。
このようにして、ＣＰＵ１２は、前記（４）式の４元連立１次方程式の解として、被解析蛋白質のそれぞれの二次構造成分比ｆH、ｆB、ｆT、ｆRを求めることができる。
【００１７】
本発明において特徴的なことは蛋白質の二次構造成分比の計算に用いる計算波長範囲を容易に選択可能としたことであり、このために本実施態様においてはＣＰＵ１２が、長波長端固定手段と、仮成分比算出手段と、合計値算出手段と、探索手段と、選択手段とを備えることとした。
すなわち、図３に示すように長波長端固定手段（ｓ１００）は、計算波長範囲の長波長端を所定の波長に固定する。本実施態様においては、例えばリファレンスＣＤの長波長端、または被解析蛋白質のＣＤデータの長波長端のうち、短い方の波長に設定している。
【００１８】
仮成分比算出手段（ｓ１０２）は、前記計算波長範囲の短波長端を順次変更し、それぞれの二次構造成分比が零または正の値をもつという拘束条件で二次構造成分比を種々の最適化法で算出する。
すなわち、蛋白質のそれぞれの二次構造成分比ｆH、ｆB、ｆT、ｆRが零または正の値をもつという拘束条件を与えている。
このために本実施態様においては、ＣＰＵ１２が、前述のようにして求めた蛋白質の二次構造成分比ｆH、ｆB、ｆT、ｆRの中で負の値をもつものがあると、これを零とおいて前記（４）式を解く。この場合、３元連立１次方程式を解くこととなる。
【００１９】
合計値算出手段（ｓ１０４）は、前記仮成分比算出手段（ｓ１０２）で算出された二次構造成分比の合計値をそれぞれの計算波長範囲について算出する。
すなわち、波長λｉにおける蛋白質のそれぞれの二次構造成分比ｆH、ｆB、ｆT、ｆRが求まると、その合計値を算出する。
【００２０】
探索手段（ｓ１０６）は、前記合計値算出手段（ｓ１０４）で算出された合計値の誤差がそれぞれ所定の許容値以下であると、その中から短波長端が最も大きい計算波長範囲を探索し（ｓ１０８）、また、合計値の誤差がそれぞれ所定の許容値より大であると、その中から合計値が１００％と最も近似する計算波長範囲を探索する（ｓ１１０）。
【００２１】
すなわち、リファレンスＣＤのもつｎ個の波長点数のうち、大きい番号が短波長側であるとする。ＣＰＵ１２は長波長端（ｎ＝１）を固定して短波長端を１ステップずつ順次ずらして上記の最適化計算を行うのである。
この場合、ｎ個の波長点λｉ（ｉ＝１，２，３，…，ｎ）から、ｎ−ｋ個の波長点λｉ（ｉ＝１，２，３，…，ｎ−ｋ）までの、短波長端が順次ずれた波長範囲での二次構造成分比ｆH，ｆB，ｆT，ｆRの合計値が（ｋ＋１）個求まる。
【００２２】
合計値に対して所定の許容値内の値が複数個得られた場合、短波長端を最も長波長側のλｉ（ｉ＝ｎ−ｋ）に設定し、その許容値より大の場合には、１００％に最も近い波長範囲のものを選ぶ。探索された波長範囲はｎ−ｋ個の波長点数をもつことになる。
ここで、二次構造成分比の合計値の誤差が、それぞれ所定の許容値以下である場合、その許容値以下の波長範囲であれば、任意の波長範囲を選択しても、得られる結果は殆どかわりがない。
【００２３】
一方、測定技術から言えば、より短波長まで測定領域を延長するためには、溶媒の選択や、空気中の酸素の吸収をさけるために行う円二色性分散計内の窒素置換の問題などの困難が増えてくる。
このために本実施態様においては、ＣＰＵ１２が探索手段（ｓ１０６）として、前記合計値算出手段で算出された合計値の誤差がそれぞれ所定の許容値以下であると、その中から短波長端が最も大きい計算波長範囲を探索し（ｓ１０８）、また、合計値の誤差がそれぞれ所定の許容値より大であると、その中から合計値が１００％と最も近似する計算波長範囲を探索しているのである（ｓ１１０）。
【００２４】
前記探索手段（ｓ１０６），（ｓ１０８），あるいは（ｓ１１０）で探索された計算波長範囲が各成分比の算出手段（ｓ１１２）で計算に用いる計算波長範囲として選択される。
そして、探索手段で探索された計算波長範囲でカーブフィッティングを行って二次構造成分比を計算する。
すなわち、ＣＰＵ１２は、各二次構造の成分比が零または正の値をもち、かつ、各二次構造の成分比の合計値が１００％をもつという拘束条件を与えて各二次構造の成分比を最小二乗法により算出する。
【００２５】
このために本実施態様においては、選択手段で選択された計算波長範囲における蛋白質のそれぞれの二次構造成分比ｆH、ｆB、ｆT、ｆRに、ｆH＋ｆB＋ｆT＋ｆR＝１（１００％）という拘束条件を与えるため、前記（３）式に、ランダムの成分比ｆR＝１−ヘリックスの成分比（ｆH）−ベータの成分比（ｆB）−ターンの成分比（ｆT）を代入している。
すなわち、平方和（Ｓ）＝Σｉ｛（Ｐｉ−Ｒｉ）−ｆH（Ｈｉ−Ｒｉ）−ｆB（Ｂｉ−Ｒｉ）＋ｆT（Ｔｉ−Ｒｉ）｝2＝Σ｛ｐｉ−（ｆHｈｉ＋ｆBｂｉ＋ｆT・ｔｉ）｝2                                                    …    （５）
【００２６】
ただし、前記（５）式において、ｐｉ＝Ｐｉ−Ｒｉ，ｈｉ＝Ｈｉ−Ｒｉ，ｂｉ＝Ｂｉ−Ｒｉ，ｔｉ＝Ｔｉ−Ｒｉ。
そして、前記（５）式を二次構造成分比ｆH、ｆB、ｆTで偏微分すると、３元連立１次方程式を（４）式と類似の型で得る。これらの解としてヘリックス（Ｈ）、ベータ（Ｂ）およびターン（Ｔ）の成分比ｆH、ｆB、ｆTを求めることができるから、拘束条件（ランダムの成分比ｆR＝１−ヘリックスの成分比（ｆH）−ベータの成分比（ｆB）−ターンの成分比（ｆT））よりランダム（Ｒ）の成分比ｆRも求めることができる。
【００２７】
図５には本実施態様にかかる蛋白質の二次構造解析用の装置１０によるミオグロビン（Myoglobin）の二次構造評価例が示されている。
表１には本実施態様にかかる装置１０を用いた場合と、従来の装置を用いた場合との評価精度の比較結果が示されている。
本分析系では二次構造成分比の評価精度を検証する目的で、計算波長範囲の長波長端として２４０ｎｍが択一される条件とした。また、本実施態様では短波長端として１９０ｎｍ〜２００ｎｍの中から最適な計算波長範囲が探索され、従来例では１９０ｎｍが択一される条件とした。
【００２８】
【表１】
────────────────────────────────────
方法            本実施態様        従来例
────────────────────────────────────
長波長短        ２４０ｎｍ固定    ２４０ｎｍ固定
────────────────────────────────────
短波長端        探索工程          １９０ｎｍ固定
────────────────────────────────────
ヘリックス      ０．８９          ０．８８
────────────────────────────────────
ベータ          ０．８４          ０．７３
────────────────────────────────────
ターン          ０．４４          ０．１３
────────────────────────────────────
ランダム        ０．３８          ０．３９
────────────────────────────────────
【００２９】
この結果、従来例に比較して本実施態様にかかる装置１０によれば、特にベータ構造の評価精度が改善され、その他の二次構造についても評価精度が維持されていることが理解される。
以上のように、本実施態様にかかる蛋白質の二次構造解析用の装置１０によれば、蛋白質の二次構造成分比を計算するのに用いる計算波長範囲を適切にしかも容易に選択することができるので、二次構造成分比の評価精度の改善が容易に行える。
【００３０】
しかも、このような評価精度の改善が測定の困難な１８０ｎｍ以下のＣＤデータを用いることなく成し得るため、数多くのプログラムの使用者にとって非常に有効である。
また、アミノ酸配列からの二次構造予測精度も年々向上してきており、本実施態様にかかる蛋白質の二次構造解析用の装置は、これらの結果を確かめる簡便な手法として有効である。
【００３１】
なお、本発明の蛋白質の二次構造解析に用いる計算波長範囲選択方法としては、前記各構成に限定されるものではなく、発明の要旨の範囲内で種々の変形が可能である。
すなわち、前記各構成ではリファレンスＣＤとしてヤン教授らのリファレンスＣＤを用いる場合について説明したが、本発明はこれに限定されるものではない。
すなわち、その他、使用者が測定した構造既知の蛋白質ＣＤデータから計算によって作られたもの、ポリペプチドや変性蛋白質のＣＤデータから作られたものを用いることができる。
【００３２】
これらの機能は、ある蛋白質の改変や変性などに伴う二次構造成分比のモニタにも有効である。その応用例として、図６，７には、温度コントロールシステムによって測定された蛋白質の熱変性ＣＤスペクトル及びそれらの二次構造成分比の解析結果がそれぞれ示されている。
【００３３】
また、前記構成では、最適化法のアルゴリズムとして重回帰形の最小二乗法を用いた場合について説明したが、種々の最適化法を用いることができる。
また、前記構成では、ＣＤデータがＨＤＤ（ハードディスク）に記憶されている場合について説明したが、たとえばＦＤ（フロッピーディスク）などの他の記憶手段を用いることができる。
さらに、前記構成では、探索工程において、合計値の誤差が所定の許容値以下または大の場合について説明したが、これらの合計値が、所定の許容値以下と大の両者に存在する場合、二次構造成分比の合計値の誤差が所定の許容値以下の計算波長範囲を優先して探索することが好適である。
【００３４】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明にかかる蛋白質の二次構造解析に用いる計算波長範囲選択方法によれば、蛋白質の二次構造成分比を計算するのに用いる計算波長範囲を適切にしかも容易に選択することができるので、蛋白質の二次構造成分比の評価精度の改善を容易になし得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】蛋白質の遠紫外ＣＤ測定例
【図２】本発明の実施態様にかかる蛋白質二次構造解析用の装置の概略構成を示すブロック図
【図３】本発明の実施態様にかかる装置の処理内容を示すフローチャート
【図４】本発明の実施態様にかかる装置で採用されているヤン教授らのリファレンスＣＤスペクトル
【図５】本発明の実施態様にかかる装置によるミオグロビン（Myoglobin）の二次構造評価例
【図６】リボヌクレアーゼＡ（Ribonuclease A）の０．００１規定硫酸（0.001N H2SO4）溶液中における熱変性ＣＤスペクトル
【図７】リボヌクレアーゼＡ（Ribonuclease A）の０．００１規定硫酸（0.001N H2SO4）溶液中の熱変性に伴う二次構造変化の解析例
【符号の説明】
１０  …  蛋白質二次構造解析用の装置
１２  …  ＣＰＵ（長波長端固定手段、仮成分比算出手段、合計値算出手段、探索手段および各成分比算出手段）
１４  …  ＲＯＭ
１６  …  ＨＤＤ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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