(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
流体カプセルを導管内を流すカプセル化学分析検定法において、流体カプセルが、油をベースにした隔離用流体によって分離される個別の隔離された水性セグメントを有し、前記個別のセグメントの少なくとも一つが化学発光ジオキセタン試薬を、また個別のセグメントの少なくとも他の一つがジオキセタン試薬と反応して光を生じる活性化試剤を、夫々含み、化学発光ジオキセタン試薬として下記式、
0003771642.tif 000043
（式中、Ｒ1は、１ないし２０の炭素原子を有する、置換されたアルキル、ヘテロアルキル、アルケニルまたはアルキニル基であって、カルボキシレート、スルフォネート、サルフェート、ホスフェート、ホスフォネート、ニトレート、トリアルキルアンモニウム、トリアルキルホスフォニウム、ジアルキルスルフォニウムおよびグアニジニウム基からなる群から選択される少なくとも二つの基で置換され、かつ、随意に、酸素、窒素、イオウ、リン、ハロゲンおよびアルカリ金属からなる群から選択される１以上の原子を含む親水性有機基であり、Ｒ3およびＲ4は、各々が、随意にヘテロ原子で置換することができ、またジオキセタン環にスピロ融合した環式または多環式環基を組み合わされて随意に形成し得る非環式、環式または多環式有機基であり、Ｒ2は、付加的な置換基を含むことができるフェニルおよびナフチル基からなる群から選ばれるアリール環基であり、ＯＸ基は、Ｏ-Ｍ+基（ただし、Ｍは水素原子、アルカリ金属イオン、第四級アンモニウムおよび第四級ホスフォニウム・イオンからなる群から選択される基）、ＯＯＣＲ8基（ただし、Ｒ8は２ないし８の炭素原子を有し、かつ随意にヘテロ原子を含むアルキルおよびアリール基からなる群から選択される基）、ＯＰＯ3-2塩、ＯＳＯ3-塩、β-Ｄ-ガラクトシドキシおよびβ-Ｄ-グルクロニジロキシ基からなる群から選択される基である）で表される安定なジオキセタンを使用することを特徴とするカプセル化学分析検定法。
【請求項２】
前記個別のセグメントの少なくとも一つが前記活性化試剤として酵素で標識付けされた免疫試薬を含む請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記流体カプセルが前記導管を通って可逆的に流される請求項１記載の方法。
【請求項４】
Ｒ3およびＲ4が組み合わされて、ジオキセタン環とスピロ融合されて環式または多環式アルキル基を形成し、かつ６ないし３０の炭素原子を含み、さらに随意に付加的置換基を含む請求項１記載の方法。
【請求項５】
ジオキセタン試薬が下記式、
0003771642.tif 000044
で表される請求項１記載の方法。
【請求項６】
Ｒ1が、少なくとも二つのカルボキシレート基で置換されている請求項１記載の方法。
【請求項７】
ジオキセタンが、下記式、
0003771642.tif 000045
で表される請求項１記載の方法。
【請求項８】
前記個別のセグメントの少なくとも一つが、ジオキセタン試薬と活性化試剤との反応によって生ずる光の量を増大させるエンハンサー物質を含む請求項１記載の方法。
【請求項９】
前記エンハンサー物質が非ポリマー系でカチオン系物質である請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記エンハンサー物質が下記式、
0003771642.tif 000046
（式中、各Ａは、ＰおよびＮ原子からなる群から独立に選ばれ、Ｌｉｎｋは、置換および未置換アリール、アルキル、アルケニルおよびアルキニル基からなる群から選ばれる少なくとも二つの炭素原子を含む有機結合基であり、Ｌｉｎｋは場合によりヘテロ原子を含有してもよく、Ｒは１ないし２０の炭素原子を含む低級アルキルおよびアラルキル基からなる群から選ばれ、Ｙはアニオンである）で表されるジカチオン系界面活性剤である請求項８記載の方法。
【請求項１１】
前記エンハンサー物質が下記式、
0003771642.tif 000047
（式中、Ｌｉｎｋはフェニレンである）で表されるジカチオン系界面活性剤である請求項８記載の方法。
【請求項１２】
ジオキセタンが下記式、
0003771642.tif 000048
（式中、Ｒ5はジオキセタン環にスピロ融合され、６ないし３０の炭素原子を含み、また随意に付加的置換基を含み得る環式または多環式アルキル基からなる群から選ばれる）で表される請求項８、９、１０または１１記載の方法。
【請求項１３】
Ｒ5は、アダマンティル基および置換アダマンティル基からなる群から選ばれる請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
ジオキセタンが、下記式、
0003771642.tif 000049
で表される請求項１２記載の方法。
【請求項１５】
ジオキセタンが、下記式、
0003771642.tif 000050
で表され、また、エンハンサー物質が１−トリオクチルホスフォニウムメチル−４−トリブチルホスフォニウムメチルベンゼン・ジクロライドである請求項８記載の方法。
【請求項１６】
Ｒ1がカルボキシレート、スルフォネート、サルフェート、ホスフェート、ホスフォネート、ニトレート、トリアルキルアンモニウム、トリアルキルホスフォニウム、ジアルキルスルフォニウムおよびグアニジニウム基からなる群から選択される少なくとも二つの基で置換され、かつ、随意に酸素、窒素、イオウ、リン、ハロゲンおよびアルカリ金属からなる群から選択される１以上の原子を含む、１ないし２０の炭素原子を有する、直鎖または分岐アルキル基である請求項１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、酵素含有化学試薬によりトリガー(trigger）して、化学発光を生じ得る安定な１，２−ジオキセタンおよび組成物に関する。ジオキセタンは、アルコキシ置換基の一部である一以上のイオン化可能基を含む。本発明を実施するために用いられる組成物は、上に述べた安定なジオキセタン、カチオン界面活性剤、および随意に、生成される化学発光量を高める蛍光物質を含む。本発明のジオキセタンおよび高度化された組成物は、光を発生させる（化学発光の）方法および分析生成物の存在および量を検出するための分析方法に有用である。イオン化可能基は、より水溶性の高いジオキセタンの実現を可能にし、カプセル化学分析システムの予期しない化学的キャリオーバー(carryover）の問題を解決する点で重要である。
【０００２】
【従来の技術】
ａ．酵素によりトリガー可能なジオキセタン
酵素によりトリガー可能なジオキセタンの最初の諸例が、アメリカ合衆国特許出願（Ａ．Ｐ．シャープ、アメリカ合衆国特許出願一連番号第８８７１３９号）および一連の論文（Ａ．Ｐ．シャープ、Ｒ．Ｓ．ハンドリー、Ｂ．Ｐ．ジリ、テトラヘドロン・レター、９３５（１９８７）、Ａ．Ｐ．シャープ、Ｍ．Ｄ．サンディソン、Ｒ．Ｓ．ハンドリー、テトラヘドロン・レター、１１５９（１９８７）、Ａ．Ｐ．シャープ、フォトケミカル・フォトバイオロジー、４７Ｓ、５０Ｓ（１９８８））に記載されている。保護されたアリーロキシド置換基をもつ高度に安定なアダマンティル置換ジオキセタンが酵素と水性緩衝液の両方の作用でトリガーされると、分解して発光し、強く電子を出すアリーロキシド・アニオンを生じ、これがジオキセタンの分解速度を劇的に高める。その結果、保護された形のジオキセタンの遅い熱分解で生じる場合より数桁高い強度の化学発光を生じる。シャープのアメリカ合衆国特許第５０６８３３９号は、酵素によりトリガー可能な共有結合の蛍光基をもつジオキセタンを開示しており、これが分解されると、蛍光物質へのエネルギー移転による高度な化学発光が生じる。ブロンステインのアメリカ合衆国特許第５１１２９６０号および第５２２０００５号ならびにＰＣＴ出願（ＷＯ８８／００６９５）は、トリガー可能な置換されたアダマンティル基をもつジオキセタンを開示している。エドワーズのアメリカ合衆国特許第４９５２７０７号は、リン酸塩置換ジオキセタンを開示している。ブロンステインのＰＣＴ出願（ＷＯ９４／２６７２６）は、非共役位置で酵素活性ＯＸ基およびアリール環上の付加基と置換したフェニルまたはナフチル基をもつアダマンティル・ジオキセタンを開示している。
【０００３】
ワンのＰＣＴ出願（ＷＯ９４／１０２５８）には、他のトリガー可能なジオキセタンが開示されている。ワンが開示したジオキセタンは、アルキル基（これはモノ置換されたものでもよい）および置換フェニル−Ｏ基を含み、トリガー可能なＯＸ基に加えてベンゼン環置換基上に一以上の非水素基が存在するものである。
【０００４】
上記の文献に開示されているジオキセタンは、すべて、芳香族カルボン酸のアルキルエステルを含む発光カルボニル化合物を生成するもので、この芳香族カルボン酸のアルキルエステルは、通常は、ヒドロキシ安息香酸またはヒドロキシナフトエ酸のメチルエステルあるいはヒドロキシアリールケトンである。
【０００５】
ｂ．トリガー可能なジオキセタンの化学発光の界面活性剤による増強
酵素でトリガーされる安定な１，２−ジオキセタンの分解から生じる化学発光のアンモニウム界面活性剤および蛍光物質を含めて水溶性物資の存在下での増強も報告されている（Ａ．Ｐ．シャープ、Ｈ．アカヴァン、およびＬ．Ｊ．ロマノ、クリニカル・ケミストリー、３５（９）、１８６３（１９８９））。臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）および５−（Ｎ−テトラデカノル）アミノ−フルオレセインからなる蛍光ミセルは、中間のヒドロキシ置換ジオキセタンを捕捉し、励起状態のアニオン系エステルからミセルの親水性環境内のフルオレセイン化合物への効率的なエネルギー移転によって化学発光量子収量を４００倍も増大させる。
【０００６】
シャープのアメリカ合衆国特許第４９５９１８２号および５００４５６５号は、化学的にまた酵素でトリガーされて生じる安定なジオキセタンの化学発光の、第四級アンモニウム界面活性剤ＣＴＡＢによって形成されるミセルの存在下での増強の他の例を記載している。蛍光ミセルは、また、塩基でトリガーされるヒドロキシおよびアセトキシ置換ジオキセタンの発光を増強する。
【０００７】
ヴォイタのアメリカ合衆国特許第５１４５７７２号は、酵素で生じる１，２−ジオキセタンの化学発光の、第四級アンモニウム基のペンダントのみまたはフルオレセイン(fluorescein)が付加されたポリマーの存在下での増強を開示している。化学発光を高めるものとして報告されている他の物質には、ウシのアルブミン等の球状タンパク質や第四級アンモニウム界面活性剤などがある。他のカチオン系ポリマー化合物は、化学発光エンハンサー(enhancer)として限界的効果を示す。非イオン系ポリマー化合物は、通常、効果がなく、アニオン系ポリマーは、発光を有意に減少させる。ブロンステインのＰＣＴ出願（ＷＯ９４／２１８２１）は、上に述べたポリマー第四級アンモニウム界面活性剤であるエンハンサーの混合物を増強添加剤と共に使用することを記載している。
【０００８】
トリガー不能なジオキセタンのＣＴＡＢの存在下でのピラニンによる増強および触媒作用も記載されている（マーチン・ジョッソ、Ｐｈ．Ｄ論文、ウェイン州立大学（１９９２）、部内討論要約、５３巻、第１２Ｂ号、ｐ６３０５）。
アカヴァン−タフティのアメリカ合衆国特許第５３９３４６９号は、酵素で生成された１，２−ジオキセタンの化学発光の、ポリマー第四級ホスホニウム塩を随意に蛍光エネルギー・アクセプターで置換したものの存在下での増強を開示している。
【０００９】
ヨーロッパ特許出願一連番号第９４１０８１００．２号は、酵素で生じた１，２−ジオキセタンの化学発光の、ジカチオン・ホスホニウム塩の存在下での増強を開示している。トリガー可能なジオキセタンの化学発光を増強するために、アニオン系蛍光物質とジカチオン系エンハンサーを組み合わせることを開示した資料は存在しない。本発明の種類の置換ジオキセタンの増強例は、報告されていない。
【００１０】
ｃ．水溶性が改良されたトリガー可能なジオキセタン
酵素がトリガー可能なジオキセタンは、現在、多くの用途でマーカー酵素用基質として広く使用されており、用途としては、免疫学的検定、遺伝子発現の研究、ウエスタンブロット法、サザンブロット法、ＤＮＡ配列、感染因子内の核酸セグメントの識別等が含まれる。この種の化合物の使用が増加しているにもかかわらず、検定法によってはその使用が限定されるものもある。より水溶性の高いトリガー可能なジオキセタンがのぞまれている。下の構造式に示されるように、ホスフェートジオキセタンのアルカリ性ホスファターゼによる脱リン酸によって形成されるヒドロキシ・ジオキセタンが、水および緩衝化液内で、また化学発光エンハンサーを含む組成物内で高い溶解性を保つことがとくに望ましい。このようなジオキセタンおよび組成物は、加水分解酵素または加水分解酵素の複合体を検出するためのある種の検定法で重要である。
0003771642.tif 000002
【００１１】
本発明の他の背景として、以下の例の説明からより十分に理解されることになるであろうが、カプセル化学分析の原理にもとづく自動計測で行なわれる検定で、従来の化学発光ジオキセタン試薬を使用すると、一つの流体セグメントから他の流体セグメントへの試薬のキャリオーバーが生じ、不正確な測定が行なわれるおそれがあり、誤った結果が得られ、非再現性にもとづく不明確性が生じることが明らかにされている。カプセル化学分析は、アメリカ合衆国特許第５３９９４９７号に記載されており、参考としてその全文を本出願に添付してある。キャリオーバーの問題を克服するための可能な手段として、とくに、ヒドロキシ・ジオキセタンの水溶性を改良することによって、この発光反応がカプセル化学分析システムの隣接する流体セグメントの中へキャリオーバーされることを排除あるいは最小化できる可能性のあることが明記されている。
【００１２】
コマーシャル・ベースで使用されるジオキセタン化合物には、アルコキシ基に付加される可溶化基が組み込まれていない。したがって、この種のジオキセタンは、キャリオーバー・ゼロを必要とする検定法に使用するのに適していない。ジオキセタンに可溶化基を組み込む提案も行なわれている（アメリカ合衆国特許第５２２０００５号）。アダマンティル置換基の上で置換されたカルボキシル基をもつジオキセタンを主張する資料もあるが、そのようなジオキセタンの調製は記載されていない。重要なことであるが、ジオキセタンの水溶性および他の性質にカルボキシル基を添加するとどのような効果があるのかの開示は存在しない。当該技術においてどれだけ多くの可溶化基が必要かあるいはどのような具体的な効果が得られるかの報告はなにもない。発光を起こさせる保護基の除去を妨げる、あるいは他の方法で発光を妨げるような可溶化基の使用は価値がないであろう。同様に、発光反応中に除去されるような可溶化基も有用でないであろう。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、おどろくことに、ホスフェートジオキセタンの脱リン酸によって生成されるヒドロキシ・ジオキセタンに関連するキャリオーバーの問題をなくすためには、一つの可溶化基を組み込むだけでは不十分であることを示すものである。この問題を解決するために、そのヒドロキシ・ジオキセタン生成物が高い水溶性を保つホスフェートジオキセタンを提供するものである。さらに、そのようなホスフェートジオキセタンを含み、検定においてトリガー試剤と反応させると効率的な化学発光を行なう増強された組成物を提供するものである。
【００１４】
本発明の第一の目的は、酵素の作用によって化学発光を生成するために、酵素でトリガーされ水溶液への可溶性が改良された安定した１，２−ジオキセタンを提供することにある。本発明の第二の目的は、さらにジオキセタン構造上に配置された二以上の可水溶化基で置換された１，２−ジオキセタンを提供することにある。本発明の他の目的は、増強された化学発光を得るために二以上の可水溶化基をもつジオキセタン、非ポリマー・カチオン系エンハンサー、および随意に蛍光物質を含む組成物を提供することにある。本発明のさらに他の目的は、カプセル化学分析システムで行なわれる検定に用いる際に試薬のキャリオーバーの問題を排除するジオキセタンおよび組成物を提供することである。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
本発明は、水溶性が改良されたトリガー可能なジオキセタンに関する。この種のトリガー可能なジオキセタンは、カプセル化学分析システムにおける隣接するセグメントへの発光ヒドロキシ・ジオキセタンのキャリオーバーを排除しまたは最小化するものである。キャリオーバーは、水溶性の低い発光材料が、カプセル化学分析システムにおいて分離用流体として用いられるフルオロカーボンオイルの中で溶化、堆積、または沈殿するときに生じ得る。試薬のキャリオーバーは、不正確な測定、誤った結果、および非再現性にもとづく不明確性につながる。
【００１６】
本発明は、かかる課題を解決するために、夫々下記の構成よりなる。
（１）流体カプセルを導管内を流すカプセル化学分析検定法において、流体カプセルが、油をベースにした隔離用流体によって分離される個別の隔離された水性セグメントを有し、前記個別のセグメントの少なくとも一つが化学発光ジオキセタン試薬を、また個別のセグメントの少なくとも他の一つがジオキセタン試薬と反応して光を生じる活性化試剤を、夫々含み、化学発光ジオキセタン試薬として下記式、
0003771642.tif 000003
（式中、Ｒ1は、１ないし２０の炭素原子を有する、置換されたアルキル、ヘテロアルキル、アルケニルまたはアルキニル基であって、カルボキシレート、スルフォネート、サルフェート、ホスフェート、ホスフォネート、ニトレート、トリアルキルアンモニウム、トリアルキルホスフォニウム、ジアルキルスルフォニウムおよびグアニジニウム基からなる群から選択される少なくとも二つの基で置換され、かつ、随意に、酸素、窒素、イオウ、リン、ハロゲンおよびアルカリ金属からなる群から選択される１以上の原子を含む親水性有機基であり、Ｒ3およびＲ4は、各々が、随意にヘテロ原子で置換することができ、またジオキセタン環にスピロ融合した環式または多環式環基を組み合わされて随意に形成し得る非環式、環式または多環式有機基であり、Ｒ2は、付加的な置換基を含むことができるフェニルおよびナフチル基からなる群から選ばれるアリール環基であり、ＯＸ基は、Ｏ-Ｍ+基（ただし、Ｍは水素原子、アルカリ金属イオン、第四級アンモニウムおよび第四級ホスフォニウム・イオンからなる群から選択される基）、ＯＯＣＲ8基（ただし、Ｒ8は２ないし８の炭素原子を有し、かつ随意にヘテロ原子を含むアルキルおよびアリール基からなる群から選択される基）、ＯＰＯ3-2塩、ＯＳＯ3-塩、β-Ｄ-ガラクトシドキシおよびβ-Ｄ-グルクロニジロキシ基からなる群から選択される基である）で表される安定なジオキセタンを使用することを特徴とするカプセル化学分析検定法である。
【００１７】
（２）前記（１）記載の方法において、前記個別のセグメントの少なくとも一つが前記活性化試剤として酵素で標識付けされた免疫試薬を含む方法である。
【００１８】
（３）前記（１）記載の方法において、前記流体カプセルが前記導管を通って可逆的に流される方法である。
【００１９】
（４）前記（１）記載の方法において、Ｒ３およびＲ４が組み合わされて、ジオキセタン環とスピロ融合されて環式または多環式アルキル基を形成し、かつ６ないし３０の炭素原子を含み、さらに随意に付加的置換基を含む方法である。
【００２０】
（５）前記（１）記載の方法において、ジオキセタン試薬が下記式、
0003771642.tif 000004
で表される方法である。
【００２２】
（６）前記（１）記載の方法において、Ｒ1が、少なくとも二つのカルボキシレート基で置換されている方法である。
【００２４】
（７）前記（１）記載の方法において、ジオキセタンが、下記式、
0003771642.tif 000005
で表される方法である。
【００２５】
（８）前記（１）記載の方法において、前記個別のセグメントの少なくとも一つが、ジオキセタン試薬と活性化試剤との反応によって生ずる光の量を増大させるエンハンサー物質を含む方法である。
【００２６】
（９）前記（８）記載の方法において、前記エンハンサー物質が非ポリマー系でカチオン系物質である方法である。
【００２７】
（１０）前記（８）記載の方法において、前記エンハンサー物質が下記式、
0003771642.tif 000006
（式中、各Ａは、ＰおよびＮ原子からなる群から独立に選ばれ、Ｌｉｎｋは、置換および未置換アリール、アルキル、アルケニルおよびアルキニル基からなる群から選ばれる少なくとも二つの炭素原子を含む有機結合基であり、Ｌｉｎｋは場合によりヘテロ原子を含有してもよく、Ｒは１ないし２０の炭素原子を含む低級アルキルおよびアラルキル基からなる群から選ばれ、Ｙはアニオンである）で表されるジカチオン系界面活性剤である方法である。
【００２８】
（１１）前記（８）記載の方法において、前記エンハンサー物質が下記式、
0003771642.tif 000007
（式中、Ｌｉｎｋはフェニレンである）で表されるジカチオン系界面活性剤である方法である。
【００２９】
（１２）前記（８）、（９）、（１１）または（１２）記載の方法において、ジオキセタンが下記式、
0003771642.tif 000008
（式中、Ｒ5はジオキセタン環にスピロ融合され、６ないし３０の炭素原子を含み、また随意に付加的置換基を含み得る環式または多環式アルキル基からなる群から選ばれる）で表される方法である。
【００３０】
（１３）前記（１２）記載の方法において、Ｒ5は、アダマンティル基および置換アダマンティル基からなる群から選ばれる方法である。
【００３１】
（１４）前記（１２）記載の方法において、ジオキセタンが、下記式、
0003771642.tif 000009
で表される方法である。
【００３２】
（１５）前記（８）記載の方法において、ジオキセタンが、下記式、
0003771642.tif 000010
で表され、また、エンハンサー物質が１−トリオクチルホスフォニウムメチル−４−トリブチルホスフォニウムメチルベンゼン・ジクロライドである方法である。
（１６）前記（１）記載の方法において、Ｒ1がカルボキシレート、スルフォネート、サルフェート、ホスフェート、ホスフォネート、ニトレート、トリアルキルアンモニウム、トリアルキルホスフォニウム、ジアルキルスルフォニウムおよびグアニジニウム基からなる群から選択される少なくとも二つの基で置換され、かつ、随意に酸素、窒素、イオウ、リン、ハロゲンおよびアルカリ金属からなる群から選択される１以上の原子を含む、１ないし２０の炭素原子を有する、直鎖または分岐アルキル基である方法である。
【００３３】
【発明の実施の形態】
本発明は、酵素含有試薬によってトリガーし、化学発光を起こさせることのできる、１，２−ジオキセタンに関する。本発明を実施するにあたって有用な安定したジオキセタンは、下記式で表わすことができる。
0003771642.tif 000011
ただし、Ｒ１は、１ないし２０の炭素原子を有する一つの置換アルキル、ヘテロアルキル、アルケニルまたはアルキニル基、少なくとも二つの水溶液への可溶性を高める基、および随意に酸素、窒素、イオウ、リン、ハロゲンおよびアルカリ金属からなる群から選ばれる１以上の原子を含む親水性有機基であり、Ｒ３およびＲ４は、各々が、随意にヘテロ原子で置換することができ、またジオキセタンに安定性を与える非環式、環式、多環式有機基であり、Ｒ２は、付加的な置換基を含むことができるフェニルおよびナフチル基からなる群から選ばれるアリール環基であり、Ｘは、活性化試剤によって除去できる保護基であり、不安定な酸化中間ジオキセタン化合物を形成し、それが分解して電子エネルギーを放出して光と二つのカルボニル含有化合物を生成し、該化合物の一つは、反応に応じて可溶性増大基を含むオキシアニオン置換エステルである。
【００３４】
0003771642.tif 000012
【００３５】
一つの実施形態にあっては、基Ｒ１は、水溶液への可溶性を高める少なくとも二つの基で置換されたＣ１ないしＣ２０の直鎖または分岐アルキル基である。好ましい可溶化基は、使用条件下で実質的にイオン化される基からなり、カルボキシレート、スルフォネート、サルフェート、ホスフェート、ホスフォネート、ニトレート、トリアルキルアンモニウム、トリアルキルホスフォニウム、ジアルキルスルフォニウム、およびグアニジニウム基を含むがこれらに限定されるものではない。
【００３６】
好ましい一実施形態にあっては、Ｒ１は、少なくとも二つのカルボン酸またはカルボン酸塩の基で置換されたＣ１ないしＣ２０の直鎖または分岐アルキル基であり、これらの置換基には、例えば次式で表わされる構造の基が含まれる。
【００３７】
0003771642.tif 000013
【００３８】
ただし、Ｍは、水素原子、アルカリ金属イオン、または第四級アンモニウム若しくはホスフォニウム・イオンから選ばれる。ＭがＨである場合には、それぞれのジオキセタン化合物が、カルボン酸の官能がイオン化されるｐＨ、すなわちｐＨ≧約７の条件下でのみ使用されることが好ましいことが明かとなっている。
【００３９】
他の一実施形態にあっては、Ｒ１は、例えば下に示す構造の少なくとも二つのカルボン酸またはカルボン酸塩の基で置換された直鎖または分岐ヘテロアルキル基であり、
0003771642.tif 000014
ただし、Ｍは上に定義した通りである。
【００４０】
他の実施形態にあっては、基Ｒ３およびＲ４は、環式または多環式アルキル基Ｒ５の中で共に組み合わされており、該基Ｒ５は、６ないし３０の炭素原子を含み、ジオキセタン環にスピロ融合され、それが熱安定性を与え、また、他の非水素置換基を含むことができる。
0003771642.tif 000015
【００４１】
基Ｒ５は、より好ましくは、多環基、好ましくはアダマンティル基または置換アダマンティル基であって、それに共有結合されたハロゲン、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、カルボニル、カルボキシ、フェニル、置換フェニル、アミノ、およびアルキルアミノ基から選ばれる一以上の置換基Ｒ６を有するものである。
0003771642.tif 000016
【００４２】
他の好ましい実施形態にあっては、Ｒ２は、フェニルまたはナフチル基である。とくに好ましくは、Ｒ２は、その中のＯＸ基が下に示すようにジオキセタン環基に対しメタ位にあるフェニル基である。フェニル環は、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、カルボニル、カルボキシ、アミノ、およびアルキルアミノ基から独立して選ばれる他の環置換基Ｒ７を含んでもよい。若干の構造例を以下に示す。
【００４３】
0003771642.tif 000017
【００４４】
ＯＸ基は、水酸基、Ｏ−Ｍ＋基（ただし、Ｍは水素原子、アルカリ金属イオン、第四級アンモニウムおよび第四級ホスフォニウム・イオンからなる群から選ばれる）、ＯＯＣＲ８基（ただし、Ｒ８は、２ないし８の炭素原子を有し、かつ随意にヘテロ原子を含有するアルキルおよびアリール基からなる群から選ばれる）、ＯＰＯ３−２塩、ＯＳＯ３−塩、β−Ｄ−ガラクトシドキシ、およびβ−Ｄ−グルクロニジロキシ基からなる群から選ばれる。ＯＸ基がＯＰＯ3ー2塩またはＯＳＯ3ー塩のようなイオン系の基である場合には、Ｒ１における水溶性増加基もこの基であってはならない。水溶液中のアルカリ性ホスファターゼの化学発光検出用として特に有効なジオキセタン化合物は、下に示すジオキセタン１である。ジオキセタン１の脱リン酸によって、下に示すヒドロキシ・ジオキセタン２が得られる。
0003771642.tif 000018
【００４５】
比較のために、イオン化可能な基を一つだけ組み込んだ下式のジオキセタン３を調製した。このジオキセタンは、上に述べたキャリオーバーの問題を解決できなかった。
0003771642.tif 000019
【００４６】
本発明の他面にあっては、増強された化学発光が得られる組成物を提供する。増強された組成物は、最高の分析感度が求められる検定にあって効果を発揮する。自然のジオキセタン分解による外因性の発光を維持または減少させながら、このジオキセタン組成物反応の化学発光効率を高めることが、感度を高めあるいは改善し得る一つの方法である。
【００４７】
本発明は、また、トリガーされて化学発光を生じ得る安定した１，２−ジオキセタンおよびエンハンサーを含む組成物に関する。高度化された化学発光を得るための組成物は、水溶液中に上で述べたジオキセタンを含み、また、エンハンサーの不在の場合に生成される量に比較してジオキセタンを活性化試剤と反応させて生成される光の量を増大させる非ポリマー・カチオン系エンハンサー物質を含むものである。該エンハンサー物質は、下の式のジカチオン系界面活性剤であることが好ましい。
0003771642.tif 000020
ただし、各Ａは、ＰおよびＮ原子から独立に選ばれ、Ｌｉｎｋは、置換および未置換アリール、アルキル、アルケニル、アルキニル基から成る群から選ばれる少なくとも二つの炭素原子を含む有機結合基で、ヘテロ原子を含むことができ、Ｒは、１ないし２０の炭素原子を含むアラルキルまたは低級アルキルから選ばれ、Ｙは、アニオンである。とくに好ましくは、該エンハンサー物質は、下の式をもつジカチオン系界面活性剤である。
0003771642.tif 000021
ただし、Ｌｉｎｋは、フェニレンである。
【００４８】
増強された化学発光を得るための本発明の組成物は、随意に少なくとも一つの蛍光物質を補足的エンハンサーとして含むことができる。有用な蛍光物質は、エネルギー移転によって生成される光の量を増大させることのできる化合物である。アニオン系蛍光物質は、カチオン系エンハンサーとの好ましい静電相互作用のためにとくに有効であると考えられる。とくに好ましい蛍光物質としては、ピラニンおよびフルオレセインが挙げられるが、これらに限られるものではない。
【００４９】
【実施例】
以下、本発明を実施例に基づき説明する。
例１． ジオキセタン１の調製
このジオキセタンは、以下で説明する一連の反応によって調製された。中間のアルケン［（３−ヒドロキシフェニル）−（２−ヨードエトキシ）メチレン］トリシクロ［３，３，１，１3,7 ］デカンまでの合成は、基本的に、アメリカ合衆国特許第５０１３８２７号および第５０６８３３９号に記載のとおりに行なった。
【００５０】
0003771642.tif 000022
（ａ）２−クロロエチル３−ヒドロキシベンゾエートの合成
３−ヒドロキシ安息香酸（０．４７モル）６５ｇを５００ｍＬの２−クロロエタノールと３ｍＬのＨ２ＳＯ４に溶かした溶液を４時間還流させた。冷却した溶液を５００ｍＬの水で希釈し、酢酸エチル（３×２５０ｍＬ）で抽出した。酢酸エチルは、ＮａＨＣＯ３で二度抽出した後水で抽出した。酢酸エチル溶液を低圧下で乾燥させ蒸発させ、濃厚な油としての生成物８５ｇを得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ３．８１４（ｔ、２Ｈ、Ｊ＝６Ｈｚ）、４．５６９（ｔ、２Ｈ、Ｊ＝６Ｈｚ）、５．３６（ｂｒ  ｓ、１Ｈ）、７．０６〜７．６７（ｍ、４Ｈ）。
【００５１】
0003771642.tif 000023
（ｂ）２−クロロエチル３−ｔ−ブチルジメチルシリロキシベンゾエートの合成工程（ａ）で得たエステル１０ｇ（５０ｍモル）、塩化ｔ−ブチルジメチルシリル（８．２５ｇ、５５ｍモル）およびイミダゾル（４．７６ｇ、７０ｍモル）を１００ｍＬのＤＭＦに溶かした溶液をアルゴン雰囲気下で１時間攪拌した。溶液を１００ｍＬの水に注ぎ、エーテル（３×５０ｍＬ）で抽出した。複合エーテル溶液を２０ｍＬの水で抽出した。有機層を乾燥させ蒸発させて１８ｇの油を得、この油を、ヘキサン中０−２％の酢酸エチルを用いたカラム・クロマトグラフィーで精製し、無色の油としての生成物１４．４ｇを得た。
1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）  δ０．２１８（ｓ、６Ｈ）、０．９９５（ｓ、９Ｈ）、３．８１（ｔ、２Ｈ）、４．５６（ｔ、２Ｈ）、７．０５〜７．６５（ｍ、４Ｈ）。
【００５２】
0003771642.tif 000024
（ｃ）［（２−クロロエトキシ）−（３−ｔ−ブチルジメチルシリロキシフェニル）メチレン］トリシクロ［３，３，１，１3,7 ］デカンの合成
三ネックのフラスコをアルゴンで清浄し、無水ＴＨＦ４００ｍＬを入れた。攪拌しながら三塩化チタニウム（４８ｇ、０．３モル）を加え、フラスコを氷浴で冷やした。水素化リチウム・アルミニウム（６．０ｇ、０．１６モル）を少量加えて短時間発熱反応を起こさせた。ＬＡＨを全部加えた後、冷却浴を外し、混合物を室温まで暖めた。トリエチルアミン（３０ｍＬ）を添加し、黒色の混合物をアルゴン雰囲気下で１．５時間還流させた。還流を続けながら、５０ｍＬの乾燥ＴＨＦの中のアダマンタノン（１４ｇ、９３ｍモル）および２−クロロエチル３−ｔ−ブチルジメチルシリロキシベンゾエート（１０ｇ、３１ｍモル）を滴下した。さらに１０分後、ＴＬＣ（ヘキサン中の５％酢酸エチル）によって、エステルが新しい物質に変化したことが示されたので、混合物を冷却し、ヘキサン３Ｌで希釈した。ヘキサンの上澄みをとり、濾紙で濾過し、蒸発させたところ、油が残ったので、これをシリカ・ゲル上のカラム・クロマトグラフィーで精製し、ヘキサン中０−３％の酢酸エチルで溶出し、アルケン８．６８ｇ（エステル・ベースで６５％）を得た。
1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）  δ０．１９５（ｓ、６Ｈ）、０．９８３（ｓ、９Ｈ）、１．７８〜１．９８（ｍ、１２Ｈ）、２．６５（ｂｒ  ｓ、１Ｈ）、３．３３４（ｂｒ  ｓ、１Ｈ）、３．５５（ｔ、２Ｈ）、３．６６（ｔ、２Ｈ）、６．８５〜７．２９（ｍ、４Ｈ）。
【００５３】
0003771642.tif 000025
（ｄ）［（２−クロロエトキシ）−（３−ヒドロキシフェニル）メチレン］トリシクロ［３，３，１，１3,7］デカンの合成
シリル保護アルケン（８．０ｇ、１９ｍモル）を乾燥ＴＨＦ１００ｍＬの中に溶解させ、フッ化テトラブチルアンモニウム５．２ｇと反応させた。１５分間攪拌した後、溶液を蒸発させ、残留物をエーテル１００ｍＬと水１００ｍＬに分けて溶解させた。水溶液は、三つのエーテル１００ｍＬ部分で抽出した。複合有機溶液は、三つの水１００ｍＬ部分で洗い、乾燥させ、蒸発させた。残留物を、ヘキサン中５−２０％の酢酸エチルを用いてクロマトグラフにかけた。これによって油性の生成物４．７８ｇを得た。
1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）  δ１．７８〜１．９８（ｍ、１２Ｈ）、２．６７（ｂｒ  ｓ、１Ｈ）、３．３４（ｂｒ  ｓ、１Ｈ）、３．５５（ｔ、２Ｈ）、３．６９（ｔ、２Ｈ）、４．９１（ｂｒ  ｓ、１Ｈ）、６．７７〜７．１９（ｍ、４Ｈ）。
【００５４】
0003771642.tif 000026
（ｅ）［（３−ヒドロキシフェニル）−（２−ヨードエトキシ）メチレン］トリシクロ［３，３，１，１3,7］デカンの合成
クロロエトキシアルケン（２ｇ）を無水アセトン３０ｍＬ中に溶解した。ヨウ化ナトリウム（９．３ｇ）を加えて溶液を４日間還流させた。冷却後、沈殿物を濾過し、わずかなＣＨ2Ｃｌ2で洗浄した。洗浄液とアセトンを組み合わせて蒸発させた。残留物をＣＨ2Ｃｌ2中に再溶解し、水で洗浄し、乾燥させた。粗物質を、ヘキサン中２５％の酢酸エチルを用いてクロマトグラフにかけた。わずかに黄色い油の収量は９３％であった。
1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）  δ１．７８〜１．９８（ｍ、１２Ｈ）、２．６５（ｂｒ  ｓ、１Ｈ）、３．１９（ｔ、２Ｈ）、３．３５（ｂｒ  ｓ、１Ｈ）、３．６９（ｔ、２Ｈ）、４．９０（ｂｒ  ｓ、１Ｈ）、６．７５〜７．２４（ｍ、４Ｈ）。
【００５５】
0003771642.tif 000027
（ｅ）［（３，３−ビスカルボエトキシ）プロポキシ）−（３−ヒドロキシ−フェニル）メチレン］トリシクロ［３，３，１，１3,7］デカンの合成
マロン酸ジエチル（３．１２ｇ）をナトリウム・エトキシド２１％のエタノール溶液１１．６５ｍＬを含む無水エタノール２５ｍＬに溶解した。溶液を氷浴中で冷却して反応混合物にヨードエトキシ・アルケン（３．２ｇ）をエタノール溶液として滴下した。反応系を一夜還流させた。冷却後、混合物を蒸発させ、酢酸エチルに再溶解した。酢酸エチル溶液を水で抽出し、乾燥させ、蒸発させた。粗物質を、ヘキサン中１５−２５％の酢酸エチルを用いてクロマトグラフにかけた。生成物の収量はほぼ４２−４８％であった。
1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ１．２４（ｔ、６Ｈ）、１．７８〜１．９７（ｍ、１２Ｈ）、２．１１〜２．１７（ｑ、２Ｈ）、２．６６（ｂｒ  ｓ、１Ｈ）、３．２１（ｂｒ  ｓ、１Ｈ）、３．４２（ｔ、２Ｈ）、３．６３（ｔ、１Ｈ）、４．１３〜４．２２（ｍ、４Ｈ）、５．００（ｂｒ  ｓ、１Ｈ）、６．７５〜７．２１（ｍ、４Ｈ）。
【００５６】
0003771642.tif 000028
（ｆ）［（３，３−ビスカルボエトキシ）プロポキシ）−（３−ビス−（２−シアノエチル）ホスフォリロキシ）フェニル）メチレン］トリシクロ［３，３，１，１3,7］デカンの合成
アルゴン層の下にＣＨ2Ｃｌ2３０ｍＬを入れたフラスコを氷浴中で冷却した。ピリジン（６．９５ｍＬ）を加え、さらにＰＯＣｌ3（２．４７ｍＬ）をゆっくり加え、１５分間連続して攪拌した。１０ｍＬのＣＨ2Ｃｌ2と５ｍＬのピリジン中に工程（ｅ）で得たアルケンを加えた溶液を滴下した。氷浴を外し、溶液を２時間攪拌した。この溶液にピリジン６．９５ｍＬおよび２−シアノエタノール６．１ｇを加えた。反応混合物を一夜攪拌して黄色い沈殿物を得た。この混合物を２００ｍＬのＣＨ2Ｃｌ2に加え、３×７５ｍＬの水で洗浄した。ＣＨ2Ｃｌ2抽出物を乾燥させ蒸発させた。粗物質を、ヘキサン中７０％の酢酸エチルを用いてクロマトグラフィーで精製した。
1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）  δ１．２５（ｔ、６Ｈ）、１．７４〜１．９８（ｍ、１２Ｈ）、２．１０〜２．１７（ｑ、２Ｈ）、２．６１（ｂｒ  ｓ、１Ｈ）、２．８１（ｔ、４Ｈ）、３．２１（ｂｒ  ｓ、１Ｈ）、３．４２（ｔ、２Ｈ）、３．５９（ｔ、１Ｈ）、４．１１〜４．２２（ｍ、４Ｈ）、４．３９〜４．４６（ｍ、４Ｈ）、７．１４〜７．３６（ｍ、４Ｈ）。
【００５７】
0003771642.tif 000029
（ｇ）［（３，３−ビスカルボキシプロポキシ）−（３−ホスフォリロキシフェニル）メチレン］トリシクロ［３，３，１，１3,7］デカン  ４ナトリウム塩の合成
工程（ｆ）で得られたアルケン（３．９ｇ）をアセトン１２ｍＬ中に溶解した。水３ｍＬ中水酸化ナトリウム１．０４ｇの溶液を加えた。溶液を１９時間攪拌し、その間にアセトン３ｍＬをフラスコに加えた。液体の上澄みをとり、他のアセトンでよく洗浄した。真空中で乾燥させたところ、白色の固体が得られた。
1Ｈ  ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ）  δ１．７２〜２．０７（ｍ、１４Ｈ）、２．５９（ｂｒ  ｓ、１Ｈ）、３．１４〜３．１８（ｍ、２Ｈ）、３．４０（ｔ、２Ｈ）、７．０１〜７．３４（ｍ、４Ｈ）。
【００５８】
0003771642.tif 000030
（ｈ）［４−（３，３−ビスカルボキシ）プロポキシ）−４−（３−ホスフォリルオキシフェニル）スピロ［１，２−ジオキセタン−３，２’−トリシクロ［３，３，１，１3,7］デカン］  ４ナトリウム塩の合成
工程（ｇ）で得られたアルケン（２．５ｇ）をＤ2Ｏ ５０ｍＬ中に溶解した。ｐ−ジオキサン５０ｍＬ中にポリマー結合ローズ・ベンガル（５００ｍｇ）を懸濁させ、上の水溶液に加えた。反応混合物を５−７℃に冷却し、酸素の沸騰を起こさせ、混合物にカプトン（ＫＡＰＴＯＮ）（デュポン）の５ｍｉｌのシートを介してナトリウム・ランプを照射した。合計１８時間後、濾過してポリマーのビーズ（ｂｅａｄｓ）を除き、容器をメタノールで洗浄し、混ぜ合せた溶液を２５ｍＬまで濃縮させた。残留溶媒は、凍結乾燥で除去した。
【００５９】
例２． ジオキセタン３の調製
このジオキセタンは、以下で説明する一連の反応によって調製された。中間のアルケン［（３−カルボキシポロポキシ）−（３−ヒドロキシフェニル）メチレン］トリシクロ［３，３，１，１3,7］デカンまでの合成は、基本的に、ヨーロッパ公開特許出願第９１１１３６０１．８号に記載のとおりに行なった。
【００６０】
0003771642.tif 000031
（ａ）３−クロロプロピル３−ヒドロキシベンゾエートの合成
３−クロロ−１−プロパノール（１６１．６ｇ、１．７１モル）を３−ヒドロキシ安息香酸（４０．０ｇ、０．２９モル）および触媒量の硫酸と合計９時間還流させた。過剰なアルコールは、真空蒸留で除去した。得られたオレンジ色の油を４００ｍＬの水で希釈し、ｐＨ７に中和した。溶液は、酢酸エチルで（３×２５０ｍＬ）で抽出した。有機層を１００ｍＬのブラインで洗浄し、無水硫酸ナトリウムの上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮させた。生成物をカラム・クロマトグラフィーで精製し、６７．５ｇの生成物を得たが、これは、出発材料のアルコールを少量含んだものであった。
1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）  δ２．２４（ｑｕｉｎｔ、２Ｈ）、３．７０（ｔ、２Ｈ）、４．４８（ｔ、２Ｈ、Ｊ＝６Ｈｚ）、５．５５（ｓ、１Ｈ）、７．０５〜７．６３（ｍ、４Ｈ）。
【００６１】
0003771642.tif 000032
（ｂ）３−クロロプロピル  ３−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリロキシ）ベンゾエートの合成
３−クロロプロピル  ３−ヒドロキシベンゾエート（６７．５ｇ）を無水ＤＭＦ（１００ｍＬ）中に、つづいて塩化ｔ−ブチル−ジメチルシリル（５２．１１ｇ）中に溶解した。反応混合物をＡｒのもとで出発材料がなくなるまで攪拌した。反応混合物を水（５００ｍＬ）で希釈し、ヘキサン（４×７５０ｍＬ）およびさらに２×２５０ｍＬの酢酸エチルで抽出した。合体した有機溶液を硫酸ナトリウムの上で乾燥し、減圧下で濃縮させ、再び５００ｍＬの水およびヘキサンの間に分割した。有機溶液を乾燥、蒸発させて、白色結晶状のシリル化エステルを得た（８９．６４ｇ、９４％）。
1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）  δ０．２１９（ｓ、６Ｈ）、０．９９８（ｓ、９Ｈ）、２．２４（ｑｕｉｎｔ、２Ｈ）、３．７０（ｔ、２Ｈ）、４．４７０（ｔ、２Ｈ）、７．０３〜７．６４（ｍ、４Ｈ）。
【００６２】
0003771642.tif 000033
（ｃ）［（３−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリロキシフェニル）−（３−クロロプロポキシ）メチレン］トリシクロ［３，３，１，１3,7］デカンの合成
乾燥させた３Ｌの三ネックのフラスコの中に入れた乾燥したＴＨＦ（５００ｍＬ）に、０℃、アルゴンの雰囲気下で三塩化チタニウム（２５．８ｇ、０．１６７モル）を加えた。水素化リチウム・アルミニウム（３．０１ｇ、０．０８４モル）を少量加えて激しく攪拌した。反応混合物を室温まで暖め、トリエチルアミン２３．３ｍＬを滴下した。添加終了後、反応混合物を２時間還流させた。加熱を止め、還流混合物に、１００ｍＬの乾燥ＴＨＦに３−クロロプロピル−３−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリロキシ）ベンゾエート（５．２８ｇ、０．０１６モル）およびアダマンタノン（７．２３ｇ、０．０４８モル）を溶解した溶液を４５分かけて滴下した。反応混合物を、室温で一夜攪拌した。黒色の混合物を水で希釈し、３×３００ｍＬのヘキサンで抽出した。合体した有機溶液を濾過し、硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で濃縮させた。残留物をフラッシュ・クロマトグラフィー（２％酢酸エチル／ヘキサン）で一部精製し、生成物として粘着性の油を得た。これは、次の工程に使用した。
1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）  δ０．２００（ｓ、６Ｈ）、０．９８８（ｓ、９Ｈ）、１．６６〜２．０１（ｍ、１４Ｈ）、２．６３（ｂｒ  ｓ、１Ｈ）、３．２３（ｂｒ  ｓ、１Ｈ）、３．５３８（ｔ、２Ｈ、Ｊ＝５．７Ｈｚ）、３．６４０（ｔ、２Ｈ、Ｊ＝６．６Ｈｚ）、６．７５〜７．２２（ｍ、４Ｈ）。
【００６３】
0003771642.tif 000034
（ｄ）［（３−クロロプロポキシ）−（３−ヒドロキシフェニル）メチレン］トリシクロ［３，３，１，１3,7］デカンの合成
シリル保護アルケン（５．３６ｇ、わずかに不純）を乾燥ＴＨＦ７５ｍＬの中に溶解させ、Ａｒの雰囲気下においた。ＴＢＡＦ（４．１６ｇ、１３．２ｍモル）を添加し、反応混合物を室温で３０分間攪拌した。溶媒を蒸発させ、残留物を水１００ｍＬに溶解した。溶液を３×１２５ｍＬのエーテルで抽出し、有機層をブラインで洗浄して硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を減圧下で除去し、ヘキサン中１０％の酢酸エチルを用いてカラム・クロマトグラフィーにかけた結果、保護を外したアルケン２．０５ｇを得た。
1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）  δ１．７８〜２．０１（ｍ、１４Ｈ）、２．６５（ｂｒ  ｓ、１Ｈ）、３．２２（ｂｒ  ｓ、１Ｈ）、３．５４１（ｔ、２Ｈ、Ｊ＝６Ｈｚ）、３．６４４（ｔ、２Ｈ、Ｊ＝６Ｈｚ）、５．３０（ｓ、１Ｈ）、６．７５〜７．２４（ｍ、４Ｈ）。
【００６４】
0003771642.tif 000035
（ｅ）［（３−シアノプロポキシ）−（３−ヒドロキシフェニル）メチレン］トリシクロ［３，３，１，１3,7］デカンの合成
無水ＤＭＳＯ（４ｍＬ）中にクロロアルケン（８１５ｍｇ、２．４ｍモル）を加えた溶液にシアン化ナトリウム（３００ｍｇ、６．１ｍモル）を加えて紫色の溶液を生成し、これを１２０℃で１時間加熱した。冷やした溶液をエーテル（５０ｍＬ）で希釈し、水（３×２５ｍＬ）で洗浄した。エーテル層を減圧下で乾燥、濃縮させた。油状の生成物の収量は、８５％であった。
1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）  δ１．７７〜１．９７（ｍ、１４Ｈ）、２．４９（ｔ、２Ｈ）、２．６５（ｂｒ  ｓ、１Ｈ）、３．１９（ｂｒ  ｓ、１Ｈ）、３．４９（ｔ、２Ｈ）、５．０４（ｓ、１Ｈ）、６．７５〜７．２４（ｍ、４Ｈ）。
【００６５】
0003771642.tif 000036
（ｆ）［（３−カルボキシプロポキシ）−（３−ヒドロキシフェニル）メチレン］トリシクロ［３，３，１，１3,7］デカンの合成
ニトリル（０．６７ｇ、２ｍモル）に水酸化ナトリウム（２Ｎ溶液７ｍＬ）を加え、反応混合物を３６時間還流させた。溶液を室温に冷やし、酢酸（１ｅｑ．）で中和した。混合物を酢酸エチルで抽出した。有機層を、水で３回、次にブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。生成物を減圧下で濃縮させて油状とし、酸（０．６４ｇ、９１％）を得た。
1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）  δ１．７８〜１．９７（ｍ、１４Ｈ）、２．４７（ｔ、２Ｈ）、２．６５（ｂｒ  ｓ、１Ｈ）、３．２２（ｂｒ  ｓ、１Ｈ）、３．４５（ｔ、２Ｈ）、５．８３（ｓ、１Ｈ）、６．７４〜７．２２（ｍ、４Ｈ）。
【００６６】
0003771642.tif 000037
（ｇ）［（３−カルボメトキシプロポキシ）−（３−ヒドロキシ−フェニル）メチレン］トリシクロ［３，３，１，１3,7］デカンの合成
前の工程のカルボン酸（６６０ｍｇ、１．９ｍモル）を１０ｍＬのＣＨ2Ｃｌ2に溶解した。ＤＣＣ（５９７ｍｇ、２．８ｍモル）、ＤＭＡＰ（２３ｍｇ）、およびメタノール（１ｍＬ）を加え、３０ｍＬを入れたフラスコを氷浴中で冷却した。ピリジン（６．９５ｍＬ）を加え、溶液を１８時間攪拌した。混合物を濾過して固体の物質を除去し、蒸発させた。固体の残留物をエーテルに懸濁させて濾過した。生成物をヘキサン中３０％の酢酸エチルを用いてカラム・クロマトグラフィーで精製した。
1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）  δ１．７７〜１．９６（ｍ、１４Ｈ）、２．４２（ｔ、４Ｈ）、２．６５（ｂｒ  ｓ、１Ｈ）、３．２２（ｂｒ  ｓ、１Ｈ）、３．４１（ｔ、２Ｈ）、３．６５（ｓ、３Ｈ）、５．１５（ｂｒ  ｓ、１Ｈ）、６．７４〜７．２２（ｍ、４Ｈ）。
【００６７】
0003771642.tif 000038
（ｈ）［（３−カルボメトキシプロポキシ）−（３−ビス−（２−シアノエチル）ホスフォリルオキシ）フェニル）メチレン］トリシクロ［３，３，１，１3,7]デカンの合成
アルゴン層の下にＣＨ2Ｃｌ2５ｍＬを入れたフラスコを氷浴中で冷却した。ピリジン（０．５ｍＬ）を加え、さらにＰＯＣｌ3 （４６５ｍｇ）をゆっくり加え、１５分間連続して攪拌した。１：１のＣＨ2Ｃｌ2／ピリジン０．５ｍｇの中に工程（ｇ）で得たアルケン（３６０ｍｇ）の溶液を滴下した。氷浴を外し、溶液を１３５分間攪拌した。この溶液にピリジン１．０ｍＬおよび２−シアノエタノール０．６９ｍＬを加えた。反応混合物を４時間攪拌して白色の沈殿物を得た。ＴＬＣによって二つの物質の生成が示された。さらにシアノエタノール２００μＬを加えて生じた沈殿物を溶解させようとしたが、一夜攪拌しても効果がなかった。溶液を蒸発させて乾燥させ、粗物質を、クロマトグラフィーで精製した。
1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）  δ１．７９〜１．９８（ｍ、１４Ｈ）、２．４１（ｔ、２Ｈ）、２．６１（ｂｒ  ｓ、１Ｈ）、２．８０（ｍ、４Ｈ）、３．２３（ｂｒ  ｓ、１Ｈ）、３．４１（ｔ、２Ｈ）、３．６５（ｓ、３Ｈ）、４．３２〜４．４８（ｍ、４Ｈ）、７．１５〜７．３７（ｍ、４Ｈ）。
【００６８】
0003771642.tif 000039
（ｉ）［（３−カルボキシプロポキシ）−（３−ホスフォリルオキシフェニル）メチレン］トリシクロ［３，３，１，１3,7］デカン３ナトリウム塩の合成
工程（ｈ）で得られたアルケン（１４２ｍｇ）をアセトン４ｍＬ中に溶解した。＜１ｍＬの水に水酸化ナトリウム３６．４ｍｇを溶かした溶液を加えた。溶液を２０時間攪拌し、沈殿物を生成させた。液体の上澄みをとり、固体を他のアセトンでまた次にメタノールで洗浄した。真空中で乾燥させたところ、白色の固体１０ｍｇが得られた。
1Ｈ  ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ）  δ１．７１〜１．９５（ｍ、１４Ｈ）、２．２３（ｔ、２Ｈ）、２．６２（ｂｒ  ｓ、１Ｈ）、３．１８（ｂｒ  ｓ、１Ｈ）、３．５３（ｔ、２Ｈ）、７．０４〜７．３６（ｍ、４Ｈ）。
【００６９】
0003771642.tif 000040
（ｊ）［４−（３−カルボキシプロポキシ）−４−（３−ホスフォリルオキシフェニル）スピロ［１，２−ジオキセタン−３，２’−トリシクロ［３，３，１，１3,7］デカン］の合成
工程（ｉ）で得られたアルケン（２６．８ｍｇ）をＤ2Ｏ  １．５ｍＬ中に溶解した。ｐ−ジオキサン−ｄ８１．５ｍＬ中にポリマー結合ローズ・ベンガル（７５ｍｇ）を懸濁させ、上の水溶液に加えた。反応混合物を５−７℃に冷却し、酸素の沸騰を起こさせ、混合物にカプトン（ＫＡＰＴＯＮ）の０．００５”のシートを介してナトリウム・ランプを照射した。合計３０分後、1Ｈ  ＮＭＲによって反応が完了したことが示された（δ２．６でのピークの消滅）ので、ポリマーのビードを濾過して取り除いた。
【００７０】
例３． カプセル化学分析システムでの試薬のキャリオーバーの問題の発見
以下に説明する実験は、本質的にはクマーがアメリカ合衆国特許第５３９９４９７号に記載しているようなプロトタイプのカプセル化学分析システムに対し、発光（ルミネセンス）を測定するために構成された検出システムで行った。方法および装置は、テフロン管を介して流体セグメントの流れを供給するもので、管は、内表面にフルオロカーボンオイルの絶縁層を有する。試料および試薬は、この管の中に吸引させ、得られた液体セグメントを管を通して移動させる。ヘテロジニアスイムノアッセイ法で必要な分離工程と洗浄工程は、磁石を用いて一つの水性セグメントから他のセグメントへ磁気粒子を移すことによって容易となった。検出システムは、フォトン・カウンターと光ファイバー読み取りヘッドからなり、このうち、ファイバーは、光の収集効率をできるだけ高めるためにテフロン管の周囲に径方向に配置した。
【００７１】
発光試薬の試験には代表的なイムノアッセイ法としてテクニコン・イムノ(TECHNICON IMMUNO)１（登録商標）ＴＳＨ法（ベイヤー・コーポレーション、米国ニューヨーク州タリータウン）を用いた。この方法の原理は、抗原ＴＳＨを含む試料をフルオレセイン−標識抗体を含む第一試薬（Ｒ１）および抗体−アルカリ性ホスファターゼ（ＡＬＰ）複合体(conjugate)を含む第二試薬（Ｒ２）と共に同時に培養するものである。各抗体は、ＴＳＨ抗原上の異なるエピトープに特異的であり、そのためこれら二つの抗体とＴＳＨ抗原の間で「サンドイッチ」の形成が促進された。結合されたアンチ−フルオレセイン(bound anti-fluorescein)を含む磁気粒子をこのサンドイッチを捕捉するために使用し、次いで捕捉された粒子を洗浄し、未結合試薬を除去した。次に、粒子にＡＬＰ用基質を含む発光試薬を加え、発光を測定した。
【００７２】
発光Ｒ３試薬は、０．２ｍＭのＣＳＰＤ（ジナトリウム３−（４−メトキシスピロ（１，２−ジオキセタン−３，２’−（５’−クロロ）トリシクロ［３，３，１，１3,7］デカン）−４−イル）フェニルホスフェート（トロピックスＩｎｃ．、米国マサチューセッツ州ベドフォード）、３ｍＭのピラニン（ヒドロキシピレンスルフォン酸）、１ｍＭのＭｇＣｌ2 、１Ｍのジエタノールアミン緩衝剤（ｐＨ１０．０）、０．１％のトリトンＸ−１００、および０．１％のＮａＮ3からなるものであった。カプセル化学分析システムにおける事象の順序を図１に示す。流体カプセル、すなわち試験パッケージは、六つの液体セグメントからなり、その各々の容積は２８μｌであった。磁気粒子（テクニコン・イムノ１システムに用いた磁気粒子試薬１．４μｌ）を第一のセグメント（ＭＰ）の中に吸引させた。流体の残りは、粒子洗浄緩衝液（２５ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）、ｐＨ７．５、０．２ＭのＮａＣｌと、０．１％のトリトンＸ−１００と保存剤を含む）である。Ｒ１（ＴＳＨに対するフルオレセイン−標識抗体を含む血清がベースの溶液１０．４μｌ）、Ｒ２（ＡＬＰで複合体化(conjugated)したＴＳＨに対する抗体を含む血清がベースの溶液１０．４μｌ）、およびＳ（血清の試料７．２μｌ）を第二のセグメントの中に吸引させた。次の二つのセグメント（Ｗ１およびＷ２）は、上の磁気粒子（ＭＰ）セグメントで用いたと同じ洗浄緩衝液とした。第五のセグメントは、上述の組成物Ｒ３で、重要な要素は、発光基質と発光エンハンサーである。第六のセグメントは、インター・テスト緩衝液（上に述べた粒子緩衝液と同じ）で、隣接する試験を隔離するために用いた。磁気の移転は、図１の矢印で示してある。これらの移転は、二つの磁気移転アセンブリー（Ｍ１またはＭ２）の一つを用いることによって容易に行なえた。１３分間培養し、その間にサンドイッチの形成が行なわれたが、その後に、Ｍ１が磁気粒子をＲ１＋Ｒ２＋Ｓセグメントの中に移転させ、捕捉を開始した。さらに６分間経過後、Ｍ２が粒子を第一の洗浄セグメントの中に移転させた。さらに１２秒間経過後、Ｍ２が粒子を第二の洗浄セグメントの中に移転させた。さらに１２秒間経過後、Ｍ２が粒子をＲ３セグメントの中へ移転させ、水性セグメントの流れがルミノメーター読み取りヘッドを前後に通過するのに応じてこのセグメントからの発光が検出された。
【００７３】
テフロン管が光を透過させるため、光のパイピング(piping)（すなわち「光学的キャリオーバー」の問題が予想された。具体的には、隣接の試験のＲ３セグメントが発するフォトンの若干がテフロン材の中に入り、管の長手方向に伝搬し、散乱して問題の試験の信号測定中に検出器の中に入る可能性があった。しかし、隣接の試験で信号が検出されている間、この現象は予想したようには起こらなかった。試験Ｎからの距離にともなって急速に減衰するのではなく、図２に示すように、隣接のテスト・パッケージのＲ３セグメントのあたりに光の出力のピークがあることが観察された。図２で、試験Ｎは、約毎秒７５０万カウント（ｃｐｓ）の高いレベルの発光を示した。試験Ｎ−１およびＮ−２は、試験Ｎの前に管の中に吸引され、この試験の前にルミノメーターを通過した。また、試験Ｎ＋１およびＮ＋２は、試験Ｎの後に行なわれた。分析システムは、流れの中の個々の気体および液体のセグメントでカウントされたフォトンを記録した。図２のグラフは、５つの試験の１０の反復パネルの平均を示すが、試験は、各々、ＡＬＰのない場合に生じたバックグランドの発光信号についての補正を行なった。各データ・ポイントから試薬なしの値を引いたものが、５つの試験の各々の１０の反復パネルから得られた平均である。キャリオーバー信号の大きさは、各隣接の試験におけるピークｃｐｓを試験Ｎにおけるピークｃｐｓで割って計算した。これらの値は、ｐｐｍで表わした。
【００７４】
このような現象の原因としては、他に、意図しないかたちで試験Ｎから隣接の試験の中にＡＬＰの物理的キャリオーバーが生じたことが考えられる。このようなことは、例えば、管が壁に堆積した粒子状物質を含み、それが管を通る液体セグメントの滑らかな流れを妨げる場合に起こり得る。しかし、隣接の試験のＲ３セグメントの中に１０ｍＭの無機リン酸塩を入れても、隣接の試験の信号の大きさに影響はなかった。この量のリン酸塩は、これらの試験条件の下では、ＡＬＰを少なくとも９０％抑制するはずなので、物理的キャリオーバーの可能性は排除された。
【００７５】
さらに光学的キャリオーバーの可能性も排除するために、蛍光エンハンサー  ピラニンを試験Ｎだけから除外し、隣接の試験には入れるようにした。その結果、試験Ｎの信号の大きさは約１０分の一に低下した。しかし、図３に示すように、隣接の試験のピークの高さの有意な変化はなかった。隣接の試験でキャリオーバー信号が比例的に変化しなかったことで、キャリオーバーが光学的なものでないことが明確に示された。
【００７６】
キャリオーバーの問題の原因は、さらに他の予想しない種類のキャリオーバーにあった。ヒドロキシ・ジオキセタンの中間物がテフロン管の内壁を被覆するために用いたフルオロカーボンオイルに十分に溶解し、キャリオーバーが、このオイルを介して溶解したヒドロキシ・ジオキセタン中間物が隣接の試験のＲ３セグメント内に移転したことによるものであることがわかった。このプロセスを、隣接の試験のＲ３セグメントの緩衝液をｐＨ１０での１ＭのＤＥＡからｐＨ７での１Ｍのトリス（Tris）へ変更して試験した。ｐＨ７では、これらＲ３セグメントにおいて溶解したヒドロキシ・ジオキセタン中間物は、安定しており、光を発しない。図４に示すように、このｐＨの変更の結果、発光の側波帯が完全に除去された。Ｎ＋１およびＮ−１の試験の残りのわずかなキャリオーバーは、予期した程度の光学的キャリオーバーによるものであった。これらの結果から、隣接の試験でのピークの発光源が、ＣＳＰＤから生じたヒドロキシ・ジオキセタンの隣接の試験のＲ３セグメント内への「化学的キャリオーバー」であったことが確認された。
【００７７】
例４． ジカルボン酸置換ジオキセタン１による観察された化学的キャリオーバーの排除
下記の表１は、反応中間物の化学的キャリオーバーに対して他の三つのジオキセタンを使用した場合の効果を示す。ルミゲン(LUMIGEN)ＰＰＤ［４−（メトキシ）−４−（３−ホスフォリル−オキシフェニル）スピロ［１、２−ジオキセタン−３、２’−トリシクロ［３、３、１、１３、７］デカン］（ルミゲンＩｎｃ．、米国ミシガン州サウスフィールド）、モノカルボン酸誘導体であるジオキセタン３、およびジカルボン酸誘導体であるジオキセタン１を、各々、試験の中で同じ濃度で使用した。ｐｐｍの欄は、Ｎ−１の試験の信号で、最も悪いケースの挙動を示すものである。変質されてない親化合物ＰＰＤのキャリオーバーも、ＣＳＰＤで観察されたと同じ高さで２度以上見いだされた。おどろくことに、モノカルボン酸誘導体であるジオキセタン３は、化学的キャリオーバーの大きさを８４％しか低減させなかった。このことは、帯電(charged)基が一つだけでは、反応中間物のフルオロカーボンオイルへの可溶化を完全に防ぐのに不十分であることを示している。しかし、ジカルボン酸誘導体では、１００％の効果が得られ、所望の効果を得るためには帯電基が二つあれば十分であることが示された。
【００７８】
表1  化学的キャリオーバーの低減
化合物 ｐｐｍ 低減％
ルミゲン  ＰＰＤ         １６４０
ジオキセタン３            ２６０        ８４
ジオキセタン１                ０      １００
【００７９】
例５． エンハンサーの役割
ジオキセタン１をベースにした試薬を最適化するための一部として、多数のエンハンサー物質を調べた。ｐＨ９．６では、エンハンサーＡ（１−トリオクチルホスフォニウムメチル−４−トリブチルホスフォニウムメチルベンゼン・ジクロライド）は、発光信号を６．２倍に高め、エンハンサーＢ（ポリ（ビニルベンジルトリブチルホスフォニウム・クロライド））は、信号を１９．７倍に高めた。ｐＨ１０．０では、エンハンサーＡは、信号を４．８倍に高め、エンハンサーＢは、信号を１８．９倍に高めた。
【００８０】
エンハンサーＢのほうがより高い光の強度が得られたにもかかわらず、エンハンサーＡのほうが低分子量のモノマー化合物であるので分析システムには好ましいとされた。ポリマー化合物は、とくにポリカチオン系である場合、血清成分と作用し合って沈殿を生じ、それが分析システムの操作に有意な問題をあた得る。
【００８１】
フルオレセインおよびピラニンは、ともに、エンハンサーＡと組み合わせて補足的蛍光物質として用いると有効であることが分かった。これらの蛍光物質は、単独では、約１０倍の増強を達成するためには比較的高い濃度（３ｍＭ）で使用する必要がある。しかし、エンハンサーＡと組み合わせて使用すると、共働効果が得られ、エンハンサーがない場合に必要な蛍光物質の濃度より１００分の一の濃度で、ほぼ同程度の増強が達成される。下記の表２および表３は、１ｍｇ／ｍｌのエンハンサーＡの存在の下でのピラニンとフルオレセインによる増強の程度を示す。
【００８２】
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【００８３】
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【００８４】
例６． カプセル化学分析システムの最適の組成
上に説明した観察結果から、カプセル化学分析システムの最適の組成が開発された。この組成は、ジオキセタン１が０．１〜１ｍＭ、ピラニンが１．０〜０．０５ｍＭ、エンハンサーＡが０．１〜５ｍｇ／ｍＬ、Ｍｇ+2が０〜１ｍＭ、２−アミノ−２−メチル−１−１プロパノール（ｐＨ１０．０）が０．１〜１Ｍ、およびトリトンＸ−１００が０．０１〜１％からなるものである。この組成を使用すると、化学的キャリオーバーの問題を完全に除去することができ、効果が高められる。
【図面の簡単な説明】
【図１】問題とすべきキャリオーバーを測定するカプセル化学分析システムの説明図である。
【図２】カプセル化学分析システムにおける隣接するセグメントの、例の中で詳述するキャリオーバーによる発光観察を示す線図である。
【図３】例の中で詳述する実験で観察された隣接するセグメントを示す図で、キャリオーバーが光学的な性質のものでないことを示す線図である。
【図４】例の中で詳述する実験で観察された隣接するセグメントを示す図で、キャリオーバーが実際には化学的な性質のものであることを示す線図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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