(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物細胞を、(1)支持体上にて細胞分裂中期同期化剤の存在下で培養する工程と、(2)前記支持体を振盪し、支持体から離脱した細胞を回収する工程と、(3)回収された細胞集団から、直径が２０μｍを超え３０μｍ以下の細胞を収集する工程とを含み、さらに、前記工程(1)と前記工程(2)の間に、前記支持体を振盪し、支持体から離脱した細胞を培養上清と共に捨て、支持体上に残る細胞を、支持体上にて細胞分裂中期同期化剤の存在下で培養することから成る工程を１回〜３回行なうことを含むＭ期細胞の収集方法により収集されたＭ期細胞を培養して２分割させ、均一に２分割した細胞を分離して回収することを含む、Ｇ１期細胞の収集方法。
【請求項２】
前記工程(3)は、細胞分裂中期同期化剤を含む培養液中で、前記直径の細胞を収集することにより行われる請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記工程(3)は、内径が２０μｍのピペットで細胞を吸引して収集することにより行われる請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記細胞分裂中期同期化剤が2-メトキシエストラジオールである請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
請求項１ないし４のいずれか１項に記載の方法で収集された細胞（ヒトの細胞を除く）又は少なくともその核を除核卵子（ヒトの卵子を除く）に移植し、得られた細胞を培養して細胞分裂させることを含む、核移植方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、Ｍ期又はＧ１期にある哺乳動物細胞の収集方法及び該細胞を用いた核移植方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
特定細胞周期の細胞集団を得ることは、各々の細胞周期でどのような生化学反応が起きているかや、細胞増殖機構を明らかにする上で大切である。分裂中期細胞の選択的同調法としてTerashimaら1)による振盪法は、細胞周期の中で分裂中期細胞は丸い球形で、培養皿との接着性が低くなり剥がれやすくなることを利用したもので、生理的状態を変えずに分裂中期に同調された細胞を回収できる方法である。この振盪法では、ピペットで培養液を培養細胞表面に軽く吹き付けて回収した細胞の内、分裂中期細胞を76.6〜87.4%回収できているが、完全な分裂中期細胞集団の回収には至っていない。一方、細胞分裂中期への誘導同期化にはコルヒチン2、3)やコルセミド4)、ノコタゾール5)などが一般的に用いられている。Zieveら6)はノコタゾールを細胞に作用させ、振盪法により細胞を回収して25〜34%の分裂中期細胞を得ているが、分裂細胞の回収効率は低い。
【０００３】
また、近年、体細胞を用いる核移植技術では、血清飢餓培養によるG0/G1期へ誘導した細胞を核体として用いてクローン産仔作出に成功7)しており、特定細胞周期の核体を用いた核移植胚の核の動きや、発生の機構解明を知る上でも有用なものである。すなわち、１９９７年、Wilmutらが体細胞を用いた用いた核移植により産仔作出に成功している7)。これはヒツジ乳腺細胞を培養、増殖したところで培地中の血清濃度を5%から0.05%に下げ、細胞を血清飢餓状態にすることで核体として用いる細胞をG0/G1期に同調する方法で、現在核移植時の核体の処理に広く用いられている。しかしながら、この方法で処理した細胞は血清飢餓状態にしなかったときに比べDNAの断片化が多く8,9)、血清飢餓状態にした細胞で核移植した胚を代理母へ移植すると、血清飢餓状態にしなかった場合に比べ妊娠を継続できない個体が多い10)ことから、作業効率が低くなると言う問題がある。
【０００４】
従って、本発明の目的は、回収した細胞集団中の、細胞周期がＧ１期にある細胞の割合が従来方法よりも高い、Ｇ１期細胞の収集方法を提供することである。また、本発明の目的は、除核卵子（ヒトの卵子を除く。以下同じ）に核移植した後の細胞のうち、分裂、増殖して小型化桑実胚以降にまで発達するものの割合が従来の方法よりも高い、核移植方法を提供することである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本願発明者らは、鋭意研究の結果、哺乳動物細胞を、(1)支持体上にて細胞分裂中期同期化剤の存在下で培養し、(2)前記支持体を振盪し、支持体から離脱した細胞を回収し、(3)回収された細胞集団から、直径が２０μｍを超え３０μｍ以下の細胞を収集する方法であって、さらに、前記工程(1)と前記工程(2)の間に、前記支持体を振盪し、支持体から離脱した細胞を培養上清と共に捨て、支持体上に残る細胞を、支持体上にて細胞分裂中期同期化剤の存在下で培養することから成る工程を１回〜３回行なうことを含むＭ期細胞の収集方法により、収集された細胞集団中のＭ期細胞の割合を従来の方法よりも大幅に高めることが可能なことを見出した。さらに、このようにして得られたＭ期細胞を培養して２分割させ、均一に２分割した細胞を分離して回収することにより、収集された細胞集団中のＧ１期細胞の割合を従来の方法よりも大幅に高めることが可能なことを見出した。さらに、本願発明者らは、鋭意研究の結果、上記本発明の方法により収集されたＧ１期細胞（ヒトの細胞を除く）を、核移植の核ドナーとして用いることにより、除核卵子に核移植した細胞のうち、小型化桑実胚にまで分裂、増殖するものの割合が有意に高くなることを見出した。
【０００６】
すなわち、本発明は、哺乳動物細胞を、(1)支持体上にて細胞分裂中期同期化剤の存在下で培養する工程と、(2)前記支持体を振盪し、支持体から離脱した細胞を回収する工程と、(3)回収された細胞集団から、直径が２０μｍを超え３０μｍ以下の細胞を収集する工程とを含み、さらに、前記工程(1)と前記工程(2)の間に、前記支持体を振盪し、支持体から離脱した細胞を培養上清と共に捨て、支持体上に残る細胞を、支持体上にて細胞分裂中期同期化剤の存在下で培養することから成る工程を１回〜３回行なうことを含むＭ期細胞の収集方法により収集されたＭ期細胞を培養して２分割させ、均一に２分割した細胞を分離して回収することを含む、Ｇ１期細胞の収集方法を提供する。
【０００８】
さらに、本発明は、上記本発明の方法で収集された細胞（ヒトの細胞を除く）又は少なくともその核を除核卵子に移植し、得られた細胞を培養して細胞分裂させることを含む、核移植方法を提供する。
【０００９】
【発明の実施の形態】
先ず、本発明におけるＭ期細胞の収集方法について説明する。
【００１０】
この方法に供せられる細胞は、哺乳動物細胞である。哺乳動物の種は、何ら限定されるものではなく、例えばウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマのような大型家畜、マウス、ラットのような齧歯動物、サル等の霊長動物を例示することができるがこれらに限定されるものではない。また、細胞が由来する組織や器官も何ら限定されるものではなく、いずれの組織や器官由来の細胞でもよく、体細胞でも生殖細胞でもよい。もっとも、血球細胞のように、支持体上に付着させて培養することができないものは不適である。また、外来遺伝子が導入された細胞や、特定の遺伝子がノックアウトされた細胞であってもよい。外来遺伝子を導入したクローン動物（ヒトを除く）を作出することを目的とする場合等には、外来遺伝子の導入の容易さの観点から線維芽細胞を好ましく用いることができる。
【００１１】
本発明におけるＭ期細胞の収集方法の第１工程では、哺乳動物細胞を、支持体上にて細胞分裂中期同期化剤の存在下で培養する。ここで、「支持体上にて培養する」とは、細胞が支持体に付着した状態で培養することを意味する。血球細胞のように支持体上に付着して増殖する性質を有さない一部の種類の細胞を除けば、哺乳動物細胞は、支持体上で普通に培養すれば、細胞が支持体に付着した状態で増殖する。支持体としては、例えば、プラスチック製やガラス製のシャーレ等を用いることができるが、これらに限定されるものではない。
【００１２】
第１工程の培養に用いられる培養液は、細胞分裂中期同期化剤を含む。細胞分裂中期同期化剤としては、特に限定されるものではなく、公知の細胞分裂中期同期化剤のいずれをも用いることができる。細胞分裂中期同期化剤の好ましい例として、2-メトキシエストラジオール11,12)、コルヒチン2、3)やコルセミド4)、ノコタゾール5)などを挙げることができ、これらのうち2-メトキシエストラジオールが特に好ましいが、これらに限定されるものではない。培養液中の細胞分裂中期同期化剤の濃度は、特に限定されるものではなく、用いる細胞分裂中期同期化剤の種類に応じて適宜選択され、例えば、2-メトキシエストラジオールの場合、0.5μＭ〜1.5μＭ程度、特には0.8μＭ〜1.2μＭ程度が適当である。なお、細胞分裂中期同期化剤の適切な濃度は、複数の濃度の細胞分裂中期同期化剤を用いるルーチンな実験により容易に設定できる（比較例２参照）。
【００１３】
第１工程の培養に用いられる培養液は、細胞分裂中期同期化剤を含むこと以外は、通常の哺乳動物細胞の培養に用いられている培養液を用いることができる。例えば、最少必須培地(MEM)、ダルベッコ変法最少必須培地(D-MEM)、10%ウシ胎児血清(FBS)含有最少必須培地(S-MEM)等を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。これらの哺乳動物細胞培養用の培養液は市販されており、市販品を好ましく用いることができる。
【００１４】
第１工程の培養時間は特に限定されないが、１５分間〜１時間程度が好ましく、２０〜４０分間程度がさらに好ましい。また、培養温度は、その哺乳動物の体温又はその近傍（好ましくは±３℃程度）が好ましい。なお、本明細書において、いずれの工程における培養においても、特に断りがない限り、培養温度はその哺乳動物の体温又はその近傍が好ましい。
【００１５】
なお、上記第１工程は、予め支持体上にて培養している哺乳動物細胞の培養液を、細胞分裂中期同期化剤を含む培養液に交換することにより行うことが好ましい。この場合、細胞分裂中期同期化剤を含む培養液に交換する前の細胞集団は、対数増殖期の細胞を含むことが好ましい。培養液の交換により第１工程を行う場合、上記した第１工程の説明は、培養液を交換した後の培養についてのものである。培養液の交換以前の培養は、常法により行うことができる。
【００１６】
続く第２工程では、第１工程の培養により細胞が付着した支持体を振盪することにより、一部の細胞を支持体から離脱させる。Ｍ期の細胞は球形に近い形をしており、支持体との接着力が弱いので、振盪処理により支持体から離脱しやすく、従って、離脱する細胞集団中のＭ期細胞の割合は、支持体上の細胞集団中のＭ期細胞の割合よりもかなり高くなる。ここで、「振盪処理」とは、支持体を移動させることにより、支持体上の細胞に、支持体の方向と平行な方向（すなわち、支持体を水平に維持する場合には水平方向）に加速度を与える処理を意味し、支持体を直線往復運動させたり、円運動させたり、これら以外の任意の運動をさせることにより行うことができる。振盪処理の条件としては、Ｍ期の細胞が離脱する条件であれば特に限定されないが、例えば、好ましい振盪処理の条件として、細胞に加わる、支持体と平行な方向の加速度が好ましくは0.001 〜30 g(gは重力加速度）、さらに好ましくは0.2〜30 g、さらに好ましくは3〜30g、さらに好ましくは10g〜20g程度であり、処理時間が、１０秒〜２分間、さらに好ましくは３０秒〜１分３０秒程度となる処理を挙げることができる。これは、例えば、支持体を振盪幅（振盪の端から端までの距離、円運動の場合は直径）1〜10mmの範囲で1000〜5000rpmで、好ましくは、振盪幅（振盪の端から端までの距離、円運動の場合は直径）2〜4mmで2500〜3500rpmで、かつ、上記好ましい加速度の範囲に入る条件で、直線的あるいは曲線的に振盪させることにより好ましく行うことができる。振盪処理は、素手で支持体を振ることによっても行うことができるが（特に加速度が0.1 g以下の場合）、回収できるＭ期細胞の数をより多くするために、上記したさらに好ましい加速度である0.2 g以上で振盪処理を行う場合には、市販のミキサー等の振盪用機械に支持体（シャーレ等）を取付けて振盪処理を行うことができる。もっとも、0.2 g未満の加速度で素手で振る場合でも、単に振盪の加速度によって細胞が支持体と平行な方向に受ける力のみではなく、培養液の流動に起因して培養液による水圧を細胞が受けるので、支持体の大きさ（シャーレの場合には直径）と培養液の量を適宜設定することにより、小さな加速度でも比較的効率よくＭ期細胞を回収することができる。支持体の大きさと培養液の量はルーチンな実験により適宜設定できるが、例えば直径１０cmのシャーレの場合、培養液の量が４〜６ｍｌ程度が適当である。もっとも、Ｍ期細胞の回収数は、ミキサー等の振盪用機械を用いてより大きな加速度を与える方が多くなる。支持体から離脱した細胞の回収は、培養上清を遠心処理すること等により容易に行うことができる。
【００１７】
続く第３工程では、第２工程で回収された細胞集団から、直径が２０μｍを超え、３０μｍ以下の細胞を収集する。ここで収集する細胞は、細胞膜の輪郭が明瞭な、ほぼ球形の細胞が好ましい。なお、細胞が球形ではない場合、「直径」は短径を意味する。この収集操作は、顕微鏡下で、ピペットを用いて細胞を１つずつ吸引することにより行うことができる。ピペットは、内径が２０μｍ程度のものが好ましく、少し変形しながらピペット内を通過する細胞を収集することにより、上記好ましい直径を有する細胞を収集することができる。この操作は、細胞分裂中期同期化剤を含む培養液中に第２工程で回収した細胞を入れ、この培養液に細胞を入れた状態で上記選抜操作を行うことが好ましい。なお、選抜操作は１時間以内、さらに好ましくは４５分以内に行うことが好ましい。また、選抜操作を行っている間の培養液の温度は、10〜25℃の室温、好ましくは15〜20℃の室温でよい。
【００１８】
なお、上記第１工程と第２工程の間に、前記支持体を振盪し、支持体から離脱した細胞を培養上清と共に捨て、支持体上に残る細胞を、支持体上にて細胞分裂中期同期化剤の存在下で培養することから成る工程を１回〜３回行うと、回収される細胞集団中の、正常なＭ期細胞の割合をさらに高くすることができる。ここでの振盪処理の好ましい条件は、上記した第２工程における振盪処理の好ましい条件と同様であり、また、支持体上での細胞分裂中期同期化剤の存在下での培養の好ましい条件は、上記した第１工程における培養の好ましい条件と同様である。なお、この工程を行う場合、第１工程の培養終了時にＭ期にあった細胞のほとんどは最初の振盪処理で支持体から離脱し、培養上清と共に捨てられてしまうが、支持体上に残った細胞は、Ｇ１期〜Ｇ２期付近の細胞であり、分裂中期を経たＧ１期の細胞がほとんど存在しないことから、培養後の回収時におけるＭ期細胞の割合が一層高くなるものと考えられる。
【００１９】
上記方法により、回収した細胞集団中のＭ期細胞の割合を極めて高くすることができる。下記実施例では、回収された細胞集団中、Ｍ期細胞の割合が99.1%と極めて高かった。
【００２４】
Ｇ１期細胞集団は、上記方法により収集されたＭ期細胞集団を培養して２分割させ、均一に２分割した細胞を分離して回収することによって得ることができる。この場合、培養は、細胞分裂中期同期化剤を含まない、通常の培養液を用いて常法により行うことができる。培養時間は、通常、１５分〜１時間程度であり、２０分〜４０分程度が好ましい。
【００２５】
上記方法により収集されたＭ期細胞集団及びＧ１期細胞集団は、細胞集団中の細胞の細胞周期がほとんど揃っているので、特定の細胞周期でどのような生化学反応が起きているかや細胞増殖機構の研究に非常に適している。
【００２６】
また、上記本発明の方法により収集された細胞（ヒトの細胞を除く。以下この段において同じ）を核ドナーとして核移植を行うことにより、核移植後の細胞が小型化桑実胚にまで分裂、増殖する確率が有意に高くなるという新たな知見が見出された。従って、本発明は、上記本発明の方法により収集された細胞又は少なくともその核を除核卵子に移植し、得られた細胞を培養して細胞分裂させることを含む、核移植方法をも提供する。この核移植方法は、核ドナーとして上記本発明の方法により収集された細胞を用いることを除き、常法により行うことができ、下記実施例にも好ましい一例が詳細に記載されている。なお、核移植は、下記実施例に記載したような、核ドナーとなる本発明の細胞全体を移植することのみならず、少なくとも細胞の核を移植することによっても行うことができ、この場合、核と細胞質を共に移植してもよい。
【００２７】
【実施例】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。各例の説明に先立ち、各例で用いた細胞の調製方法、Ｍ期への同期化方法、細胞周期を調べるための標本作製と観察方法、及び統計解析方法等の各例に共通な手法について説明する。
【００２８】
(1)  胎仔線維芽細胞
線維芽細胞（黒毛和牛）は，妊娠54日目の胎仔由来の細胞を用いた。回収した胎仔は無菌的に細断・トリプシン消化して細胞懸濁液を回収し，10%ウシ胎仔血清(FBS)を含むダルベッコ変法MEM(D-MEM, Gibco BRL, Cat No. 11885-084, MD, USA)培地で培養を行った後，細胞を凍結保存した(継代1回)。実験には凍結保存してある細胞を10cmプラスチックシャーレ(Falcon,353003)に播種，1度継代して再び対数増殖期に増殖した細胞を実験に用いた。
【００２９】
(2)  分裂期への同期化
分裂中期への同期化には10%FBSを含む最少必須培地(S-MEM,Cat. No.11385-036,Gibco BRL, MD, USA)に0.5μMあるいは1μMとなるように2-メトキシエストラジオール(2-MeOE2, Cat No.M6383, Sigma chemical Co., MO, USA)を添加して使用した。
【００３０】
(3)  胎仔線維芽細胞の標本作製と観察
胎仔線維芽細胞は，細胞を含む培地を15ml試験管に集め，遠心分離（1000rpm,5分間）することで回収した。遠心後，細胞沈渣を少量の培地で再浮遊し，細胞懸濁液をスライドガラス上に均一に塗抹した。その後，室温で風乾・固定（99.9%エタノール,5分間）して標本を作製した。
【００３１】
標本は，Hoechst33342（Sigma Chemical Co, MO, USA）で染色し，蛍光顕微鏡下で観察を行った。判定に用いた細胞は，細胞膜の輪郭が明瞭なもののみとし，比較例1および比較例2では，核が細胞分裂前期(prophase)，中期(metaphase)，後期(anaphase)および終期(telophase)までの細胞を細胞分裂期(M期)細胞とした。また，核膜の形成されている核が細胞質中に1つだけ存在するものを正常間期細胞と判定した。さらに，細胞質中の核が断片化している細胞，細胞質中に核が認められない細胞(無核細胞)あるいは細胞質中に複数の核を有するもの（多核細胞）は異常細胞と判定した。実施例1、２ではM期細胞を，さらに正常分裂中期細胞(分裂中期の核が細胞質中の1カ所に存在している細胞)と異常分裂中期細胞(分裂中期の核が細胞質中の2カ所以上に存在する細胞)に分類して判定した。また，間期細胞も正常間期細胞(核膜の存在する核が細胞質中に1つ存在する細胞)および異常間期細胞(核膜の存在する核が細胞質中に2つ以上存在する細胞あるいは細胞質中の核が断片化している細胞)に分類して判定した。
【００３２】
(4)  統計解析
比較例1，2および実施例４で得られた数値は，ANOVAによる解析を実施し，有意水準5%以下を有意差有りと判断した。
【００３３】
(5)  細胞の培養
特に断りがない限り、細胞の培養は、35〜40℃で行った。また、ピペットを用いた細胞の選別は、10〜25℃で行った。
【００３４】
比較例１    振盪処理のみ
対数増殖期の細胞が入ったプラスチックシャーレ（直径10 cm)のD-MEM培地をS-MEM(2-MeOE2不含)培地5mlと入れ替え培養を継続し，30分後，プラスチックシャーレを振盪処理しないで，あるいは振盪処理して培養上清を全量回収した。振盪処理は，ミキサー(池田理化，D-10)にプラスチックシャーレ底面を密着させ，1分間振動（円運動）させて行った（１分間当たりの回転数：3000回、直径：0.3ｃｍ）。回収した培養上清の一部で細胞数を算定し，残りの培養上清は遠心分離(1000rpm,5分間)して，沈渣を少量の培地中に再懸濁後，スライドグラスに塗抹した。
【００３５】
また，同様に振盪処理の有無がプラスチックシャーレ底面に付着している接着細胞の数およびその細胞周期に及ぼす影響を検討した。培養上清除去後のプラスチックシャーレをリン酸緩衝液(-)（以下PBS(-)）で洗浄し，0.25%トリプシン溶液を加え，プラスチックシャーレ底面に付着している細胞を剥離した。剥離後，細胞懸濁液の一部で細胞数を算定し，残りの細胞は遠心分離し，培養上清と同様に沈渣を塗抹した。塗抹標本は風乾後，固定・染色して観察した。
【００３６】
その結果、振盪処理を行わずに培養上清中から細胞を回収すると，0.03×106個の細胞が回収され，そのうち13.7%がM期細胞，66.5%が間期細胞および19.8%が異常細胞だった。一方，振盪処理を行って培養上清中から細胞回収すると，振盪処理しなかった時の約6倍の0.19×106個の細胞が回収できた。回収された細胞のうち26.1%がM期細胞，66.7%が間期細胞および7.3%が異常細胞だった。培養上清中のM期細胞の割合は振盪処理することで有意(P<0.05)に増加した。また，振盪処理により正常な間期細胞の割合は変化しなかったものの，異常細胞は振盪処理することで有意(P<0.05)に減少した(表1)。
【００３７】
培養上清の回収と同時に，プラスチックシャーレ底面に接着している細胞をトリプシン消化して回収したところ，振盪処理を行わなかった場合，4.87×106個の細胞が回収でき，98.1%が間期細胞だった。また，振盪処理した場合，3.60×106個の細胞が回収でき，98.5%が間期細胞だった。プラスチックシャーレ底面に接着している細胞の細胞数および各細胞周期の割合は，振盪処理による影響は認められなかった(P>0.05)(表2)。
【００３８】
【表１】
0003842597.tif 000002
【００３９】
【表２】
0003842597.tif 000003
【００４０】
比較例２    細胞周期同期化剤と振盪処理の組み合わせ
細胞周期同期化のために細胞分裂中期同期化剤(2-MeOE2)と振盪処理を併用することで，培養上清中から回収される細胞の細胞周期がどのように変化するか，振盪処理して細胞を回収する操作を3回連続して行い検討した。すなわち対数増殖期の細胞の入ったシャーレ中のD-MEM培地から，S-MEM(0.5μMあるいは1.0μM 2-MeOE2含)培地5mlに入れ替え培養を継続した。30分後，振盪処理，培養上清を遠心分離(1000rpm,5分間)して細胞を回収した(1回目回収細胞)。残ったプラスチックシャーレには新しいS-MEM(0.5μＭ又は1.0 μＭ  2-MeOE2含)培地5mlを加え，更に30分間培養を継続した。30分後，1回目と同様に振盪処理，培養上清を遠心分離して細胞を回収した(2回目回収細胞)。残ったプラスチックシャーレには新しいS-MEM(0.5μＭ又は1.0 μＭ  2-MeOE2含)培地5mlを加え，更に30分間培養を継続した。30分後，1回目及び2回目と同様に振盪処理，培養上清を遠心分離して細胞を回収した(3回目回収細胞)。各濃度および各回数で得られた細胞は，少量の培地中に再懸濁後，塗抹標本を作製した。標本は風乾後，固定・染色して観察した。
【００４１】
このように2-MeOE2による細胞周期の同期化と振盪処理の併用により細胞回収を行ったところ，2-MeOE2処理せずに振盪処理のみで培養上清を回収した場合(比較例１，26.1%)に比べ，M期細胞の割合が増加(28.8〜81.2%)した(表3)。1,2および3回目に回収したM期細胞の割合は，各回数とも2-MeOE2濃度が0.5μMより1.0μMで有意に高かった(P<0.05)。0.5μMの2-MeOE2で30分間処理すると，回収回数が1回目に比べて2回および3回目に回収した細胞集団でM期細胞の割合が有意(P<0.05)に高くなった(表3)。一方，1.0μMの2-MeOE2で30分間処理すると，回収回数が多くなるほどM期細胞の割合は有意(P<0.05)に増加した。一方，正常間期細胞および異常細胞の割合は，0.5μMおよび1.0μM 2-MeOE2処理でともに1回目に比べて2回目および3回目に回収した細胞集団で有意に減少した(P<0.05)。
【００４２】
【表３】
0003842597.tif 000004
【００４３】
実施例１    Ｍ期細胞の収集
対数増殖期の細胞が入ったプラスチックシャーレ中のD-MEM培地から，S-MEM(１μＭ  2-MeOE2含)培地5mlに入れ替え培養を継続した。30分後，比較例１と同様にして振盪処理を行い，培養上清を廃棄した。残ったシャーレには新しいS-MEM培地(2-MeOE2含)を加え，更に30分間培養を継続した。30分後，上記と同様に振盪処理，培養上清を遠心分離(1000rpm,5分間)して細胞を回収した(2回目回収細胞)。集めた細胞の一部をD-MEM(2-MeOE2含)培地に移し，30分以内に内径が20μmのガラスピペット(COOK社,Cat.No.PBBP-2000)を用いて，直径が20μmより若干大きめの細胞で，細胞膜の輪郭が明瞭なほぼ球形の細胞を選別した。選別した細胞は直ちにHoechst33342および1μM 2-MeOE2を含むリン酸緩衝液(D-PBS)中に移し，倒立蛍光顕微鏡下で細胞周期を検討した。
【００４４】
このように1μMの2-MeOE2で細胞をM期へ同期化し，振盪処理により2回目の培養上清を回収した。その中で直径が約20μm以上の細胞を選抜して観察したところ，集めた細胞の99.1%はM期細胞だった(表4)。また，回収できたM期細胞のほとんど(98.8%,243/246)は正常な分裂中期細胞だった。
【００４５】
【表４】
0003842597.tif 000005
【００４９】
実施例２    Ｇ１期細胞の収集
対数増殖期の細胞が入っているシャーレ中のD-MEM培地を，S-MEM(１μＭ  2-MeOE2含)培地に入れ替え30分間培養を継続し，振盪処理して上清を廃棄した。次に残ったプラスチックシャーレへ新しいS-MEM培地(１μＭ  2-MeOE2含)を加え，更に30分間培養を継続し，振盪処理，培養上清を遠心分離(1000rpm,5分間)して細胞を回収した(2回目回収細胞)。回収した細胞は，5%ウシ胎仔血清(FBS)を含むTCM199(Gibco BRL, Cat No.12340-030, MD, USA, 2-MeOE2含)培地に移し，60分以内に内径が20μmのガラスピペット(COOK社,Cat.No.PBBP-2000)を用いて，直径が20μmより若干大きめの細胞で，細胞膜の輪郭が明瞭なほぼ球形の細胞を選抜した(M期細胞)。選抜した細胞は38℃の炭酸ガスインキュベーターに移し，30分間培養した(5%CO2,95%空気)。培養終了後，30分以内に，均一に2分割している細胞のみを選び，ガラス針を用いて2個の細胞に分離し(G1期細胞)、回収した。
【００５０】
実施例３、比較例３
細胞周期を同期化しなかった細胞（比較例３），あるいは実施例２で回収された、G1期へ同期化した細胞（実施例３）を核体として核移植を行い，核体と除核成熟卵子細胞質との膜融合，2細胞期胚以降あるいは8細胞期胚以降への卵割および小型化桑実胚以降への発育について比較検討した。細胞周期を同期化しなかった細胞は，胎仔線維芽細胞が96穴プレート(Nunc，167008)の底面積の約80%を占めるまで増殖した状態（80%コンフルエント細胞）で，トリプシン処理により回収した。
【００５１】
除核成熟卵子は，ウシ卵胞卵子をTCM199培地(5%FBS含)中で体外成熟(19〜20時間,5%CO2,95%空気)し，0.1%ヒアルロニダーゼ添加のPBS(-)中で卵丘細胞を除去後，第1極体を有し，かつ卵細胞質の均一な卵子を選抜し，マイクロマニピュレーターを用いて除核操作13)により作製した。除核の確認は，除去した卵細胞質をHoechist 33342を含む培地で20〜30分間（39℃）培養後，倒立蛍光顕微鏡下にて核の有無を判定し，除去した細胞質中に核が存在する除核卵子を実験に供した。核移植では，除核成熟卵子の囲卵腔に核体（細胞全体）を挿入し，成熟培養開始から23〜25時間目に0.05mM CaCl2，0.1mM MgSO4を含む0.3Mマンニトール溶液14)中で直流電圧負荷(30V/150μm,10μ秒,1回)を行い，引き続きCaイオノフォアおよびサイクロヘキシミド(Sigma chemical Co., MO, USA)を用いた複合活性化処理15)およびウシ卵管上皮細胞との共培養による発生培養を行った。作製した核体と除核成熟卵子の組み合わせ(核移植胚)の一部は，直流電圧負荷後約19時間目にHoechist 33342で30分間染色し，倒立蛍光顕微鏡下にて観察し，細胞質中に核が認められたものを融合胚と判定した。融合率は作製した核移植胚に占める融合胚数で算出した。また，残りの核移植胚は，核移植後3日目に2細胞期胚あるいは8細胞期胚以降への卵割，6日目に小型化桑実胚以降への発育について判定した。核移植胚の2細胞期胚以降あるいは8細胞期胚以降への卵割率および小型化桑実期胚以降への発育率は，作製した核移植胚に融合率を掛けた数を推定融合胚数として，推定融合胚に占める卵割および発育胚数で算出した。
【００５２】
その結果，核体と除核成熟卵子との融合率は80.3%(80コンフルエント細胞)および64.7%(G1期細胞)となり，80%コンフルエント細胞を用いたほうが高い傾向を示したものの，有意な差は認められなかった(P>0.05)(表6)。また，細胞周期同期化の有無は推定融合胚数における2細胞期胚および8細胞期胚以降への卵割率に影響を及ぼさなかった。しかし，6日目の小型化桑実胚以降への発育は，同期化した細胞を核体とした場合で有意(P<0.05)な増加を認めた(表6)。
【００５３】
【表６】
0003842597.tif 000006
【００５４】
【発明の効果】
本発明により、回収した細胞集団中の、細胞周期がＧ１期にある細胞の割合が従来方法よりも高い、Ｇ１期細胞の収集方法が提供された。また、本発明により、除核卵子に核移植した後の細胞のうち、分裂、増殖して小型化桑実胚以降にまで発達するものの割合が従来の方法よりも高い、細胞を飢餓状態にさらすことがない核移植方法が提供された。本発明の方法によれば、細胞周期がＧ１期にほとんど揃った細胞集団を得ることができるので、特定の細胞周期でどのような生化学反応が起きているかや細胞増殖機構の研究に非常に有用である。特に、本発明の方法によれば、細胞を飢餓状態にさらす必要がないため、飢餓状態により、細胞が悪影響を受ける懸念がない。また、本発明の方法により収集された細胞を核ドナーとして核移植を行うことにより、核移植後の細胞が小型化桑実胚にまで分裂、増殖する確率が有意に高くなるので、本発明の方法は、体細胞クローンの作出に大いに貢献するものと期待される。
【００５５】
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