(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ジメチルホルムアミド中で、ヘキサン酸と、エチル（ジメチルアミノプロピル）カーボジイミド、又は、１−シクロヘキシル−３−（２−モルフォリノエチル）カルボジイミドと、ハイドロオキシスルフォサクシネート、又は、Ｎ−ハイドロオキシサクシニイミドとを反応させたものを、リン酸緩衝溶液、又は、カーボネート緩衝溶液中で、アルブミン、ミオグロビン、ヘモシアニン、ケイホルリムペットヘモシアニン、リジン残基を有する生体高分子である低密度リポたんぱく質（ＬＤＬ）の中のいずれかと反応させ、この反応生成物から得た、ヘキサノニル化した蛋白質を含有する抗原液または抽出物であって、アミド付加体であるヘキサノニルリジンを選択的に識別できるヘキサノニルリジン抗体の製造に用いる抗原。
【請求項２】
ジメチルホルムアミド中で、ヘキサン酸と、エチル（ジメチルアミノプロピル）カーボジイミド、又は、１−シクロヘキシル−３−（２−モルフォリノエチル）カルボジイミドと、ハイドロオキシスルフォサクシネート、又は、Ｎ−ハイドロオキシサクシニイミドとを反応させたものを、リン酸緩衝溶液、又は、カーボネート緩衝溶液中で、アルブミン、ミオグロビン、ヘモシアニン、ケイホルリムペットヘモシアニン、リジン残基を有する生体高分子である低密度リポたんぱく質（ＬＤＬ）の中のいずれかと反応させ、この反応生成物から得ることを特徴とする、ヘキサノニル化した蛋白質を含有する抗原液または抽出物であって、アミド付加体であるヘキサノニルリジンを選択的に識別できるヘキサノニルリジン抗体の製造に用いる抗原の製造方法。
【請求項３】
請求項２の方法によって製造した抗原のフロンイントアジュバントによるエマルジョンを抗体作成用の動物に注射して免疫とし、当該免疫した抗体作成用の動物の血液の血清から得ることを特徴とした、アミド付加体であるヘキサノニルリジンを選択的に識別できるヘキサノニルリジン抗体。
【請求項４】
請求項２の方法によって製造した抗原のフロンイントアジュバントによるエマルジョンを抗体作成用の動物に注射して免疫とし、当該免疫した抗体作成用の動物の血液の血清から得ることを特徴とした、アミド付加体であるヘキサノニルリジンを選択的に識別できるヘキサノニルリジン抗体の製造方法。
【請求項５】
エマルジョンの抗体作成用の動物への注射は、所定間隔ごとに繰り返して行い、注射の度ごとに、注射後所定期間経過時のヘキサノニルリジン抗体の産出を測定し、ヘキサノニルリジン抗体の産出に変動が生じなくなるまで前記注射を繰り返すことを特徴とした請求項４記載の、アミド付加体であるヘキサノニルリジンを選択的に識別できるヘキサノニルリジン抗体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、アミド付加体であるヘキサノニルリジンを認識する抗体とその製造に用いる抗原を得ることを目的としたヘキサノニルリジン抗体とその製造法並びにそれに用いる抗原とその製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
アミド付加体であるヘキサノニルリジンは、脂質ヒドロペルオキシドとリジン残基の反応で化学的に生成される物質であることが発明者などにより見出されている（平成９年度農芸化学会大会講演要旨集第５４頁  Ｎｏ．２Ｐｐ８「リノール酸ヒドロペルオキシドと生体アミンの付加体を認識する抗体の特異性とその応用」）。これより、ヘキサノニルリジンは、過酸化脂質により生体成分が損傷を受ける際の指標になることが容易に推定される。
【０００３】
従来、過酸化脂質や酸化剤により生成するアミノ酸修飾物を検出、定量する手段としては、酸加水分解法があるが、この方法では、ヘキサノニルリジンのようなアミド付加型の化合物の場合、アミド結合が開裂してしまう。このため酸加水分解法はヘキサノニルリジンの化学的な検出、定量には適用できなかった。
【０００４】
また、たんぱく質を酵素で消化して生じてくるヘキサノニルリジンをマススペクトル法で確認する方法があるが、定量性に欠け、その一方、高価な測定機器が必要であり経済上も問題があった。
【０００５】
一般的に生体成分中で選択的に精度高く検出乃至定量する方法としてイムノアッセイ法（ＥＬＩＳＡ法）があるが、この測定に必要なヘキサノニルリジンを検出できる抗体は存在しないため、ＥＬＩＳＡ法によってヘキサノニルリジンを検出、定量することはできなかった。
【０００６】
従って、従来、生体内でリジン残基を持つ生体成分の過酸化脂質による損傷の程度を知る指標となるヘキサノニルリジンを検出、定量する経済的で精度の高い手段は存在しなかった。
【０００７】
【発明により解決すべき課題】
ヘキサノニルリジンを生体成分中で精度高く検出乃至定量する方法を確立するために、ヘキサノニルリジンを選択的に検出できる抗体を見つけ、その製造法を確立することが課題であった。
【０００８】
【課題を解決する為の手段】
然るにこの発明は、長年にわたる鋭意研究の結果、ヘキサノニルリジンを選択的に識別できる抗体を見つけ、更にこの抗体の製造に用いる抗原とその製造方法を見け出すことにより、前記抗体の製造を可能とし、これによってヘキサノニルリジンを有効かつ適切に検出乃至定量できるようになり、前記従来の要請を満足させることができたのである。
【０００９】
すなわち、この発明は、ヘキサン酸またはその誘導体のカルボン酸残基を活性化させ、該カルボン酸残基が活性化されたヘキサン酸またはその誘導体をたんぱく質と反応させ、この反応生成物から得たことを特徴とするヘキサノニルリジン抗体の製造に用いる抗原とその製造方法を提案するものである。前記反応生成物は、ヘキサノニル化したケイホルリムペットヘモシアニン等のたんぱく質を含有する抗原液または抽出物であって、本発明の抗原は、この抗原液または抽出物から従来公知の透析方法などによって得ることができる。
【００１０】
前記において、ヘキサン酸またはその誘導体のカルボン酸残基を活性化させる方法としては、ジメチルホルムアルデヒド中でヘキサン酸またはその誘導体とカーボジイミドとを反応させることとしたものである。ここで、ヘキサン酸またはその誘導体としては、ヘキサン酸、無水ヘキサン酸、ヘキサン酸エステル等を用いることができる。また、カーボジイミドとしては、エチル（ジメチルアミノプロピル）カーボジイミドあるいは１−シクロヘキシル−３−（２−モルフォリノエチル）カルボジイミドのようなジイミドを用いることがでる。
【００１１】
前記において、ジメチルホルムアミド中でヘキサン酸またはその誘導体とカーボジイミドとを反応させる過程において、ハイドロオキシスルフォサクシネートを反応に参加させることもできる。このハイドロオキシスルフォサクシネートは、ジメチルホルムアミド中におけるヘキサン酸とカーボジイミドとの反応を促進させるために参加させるものであるので、これを用いなくても本発明の抗原は製造可能であり、また、反応促進という観点からいえば、ハイドロオキシスルフォサクシネートでなくて、Ｎ−ハイドロオキシサクシニイミドのような反応促進剤を用いることもできる。
【００１２】
また、前記においてカルボン酸残基が活性化されたヘキサン酸またはその誘導体と反応させるたんぱく質としては、アルブミン、ミオグロビン、ヘモシアニン、ケイホルリムペットヘモシアニン等のたんぱく質や低密度リポたんぱく質（ＬＤＬ）等のリジン残基を有する生体高分子を用いることができる。
【００１３】
更に、本発明においては、前記のようにカルボン酸残基が活性化されたヘキサン酸またはその誘導体をたんぱく質と反応させる工程をリン酸緩衝溶液中で行わせることとしている。リン酸緩衝溶液中でなくても当該反応を行わせることは可能であるが、リン酸緩衝溶液中で行わせたほうが、反応が安定になるので好ましい。また、リン酸緩衝溶液に替えて、カーボネート緩衝溶液中において、この反応を行わせることもできる。
【００１４】
次に、この発明は、前記のようにして生成された抗原を用い、当該抗原のフロンイントアジュバントによるエマルジョンを用いて免疫した抗体作成用の動物の血液の血清から得ることを特徴とするヘキサノニルリジン抗体とその製造方法を提案するものである。
【００１５】
ここで、前記エマルジョンを用いて抗体作成用の動物を免疫するにあたっては、前記エマルジョンを、抗体作成用の動物に所定間隔ごとに繰り返して注射し、注射の度ごとに、注射後所定期間経過時のヘキサノニルリジン抗体の産出を測定し、ヘキサノニルリジン抗体の産出に変動が生じなくなるまで前記注射を繰り返すこととしたものである。
【００１６】
このようにして製造した本発明のヘキサノニルリジン抗体は、血清中に抗体を生成させたまま用いることができ、また当該血清から抽出して用いることもできる。
【００１７】
前記において用いた抗体作成用の動物としては、例えば、ＮＺＷウサギ（Ｎｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ  Ｗｈｉｔｅ  Ｒａｂｂｉｔ）を用いることができ、この他にも、抗体作成に通常用いられているウサギなど種々の動物を用いることが可能である。
【００１８】
前記における抗体作成用の動物の免疫は、初回免疫として前記抗原のフロイント完全アジュバントによるエマルジョンを用いて行い、２回目以降の免疫は、前記抗原のフロイント不完全アジュバントによるエマルジョンを用いて行うものである。これは、初回免疫では、免疫反応を誘発させるためフロイント完全アジュバントを用いるのに対して、２回目以降の追加免疫は、新たに抗体を作るのではなく、初回免疫の時に既に発現している抗体を増やすことを目的としているのでフロイント不完全アジュバントを用いるからである。
【００１９】
【実施例１】
本発明の抗原を生成する実施例について説明する。
【００２０】
ヘキサン酸（５．５ｍｇ）、エチル（ジメチルアミノプロピル）カーボジイミド（９．１ｍｇ）、ハイドロオキシスルフォサクシネート（１０．３ｍｇ）を８００μｌのジメチルホルムアミドに溶かし、室温で２４時間、撹拌しつつ、反応させる。これに、たんぱく質として２０ｍｇのケイホルリムペットヘモシアニン（ＫＬＨ）を、３．７８ｍｌの０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）とともに加え、室温下で、撹拌しつつ４時間反応させる。ついでＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ）に対して４℃で透析し、３日間透析外液を数回交換して、ヘキサノニル化したケイホルリムペットヘモシアニン（ヘキサノニル化ＫＬＨ）を含有する抗原液としてのこの発明の抗原を得た。
【００２１】
この実施例においては、エチル（ジメチルアミノプロピル）カーボジイミドを用いたが、これに替えて１−シクロヘキシル−３−（２−モルフォリノエチル）カルボジイミドを用いても本発明の抗原を製造することができる。また、前記において用いたハイドロオキシスルフォサクシネートは反応促進剤として反応に参加させたものであるので、これを用いなくても、本発明の抗原を製造することは可能である。更に、この実施例においては、たんぱく質としてケイホルリムペットヘモシアニンを用いたが、これに替えてアルブミン等のたんぱく質や低密度リポたんぱく質（ＬＤＬ）等のリジン残基を有する生体高分子を用いることができるのは、前述したとおりである。
【００２２】
ヘキサノニルリジンが上記反応で生成されていることは、前記抗原を消化酵素プロテイナーゼＫで消化した後、ＬＣ−ＭＳ分析により確認した。
【００２３】
即ち、前記抗原を、たんぱく質量として１ｍｇ／ｍｌとなるようにリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解し、２３ｍｇのビーズに固相化したプロテイナーゼＫを添加し、５５℃で８時間反応させた。２０００ｒｐｍで３分で遠心してプロテイナーゼＫ固相化ビーズを取り除き、その上清をＬＣ−ＭＳで分析した。ＬＣとしてカラムDevelosil ODS-HG-5(4.6φ×250mm)を用い、溶媒を０．１％酢酸／アセトニトリル（１：１）とし、流速０．８ｍｌ／ｍｉｎとした。ヘキサノニルリジンの分子量が２４４であることから、エレクトロスプレーのプラスモードで２４５のｍａｓｓでスキャンした。その結果、同様に処理したヘキサノニル化反応前のたんぱく質はピークが検出されなかったものの、前記ヘキサノニル化したたんぱく質処理物（ヘキサノニル化ＫＬＨ）からは、ヘキサノニルリジン標品と同一位置にピークが検出された。このことから、本実施例の抗原液のたんぱく質中にはヘキサノニルリジンが生成していることが明らかになった。
【００２４】
【実施例２】
次に本発明の抗体を生成する実施例について説明する。
【００２５】
前記実施例１で生成した抗原を測定してたんぱく質量１ｍｇ／ｍｌとなるようにＰＢＳ（ｐＨ７．４）に溶解し、この５００μｌを注射器にとり、フロイント完全アジュバント７５０μｌを取った別の注射器と連結させ、これらを交互に動かすことにより最終たんぱく質濃度０．５ｍｇ／ｍｌのエマルジョンを作成した。
【００２６】
抗体作成用の動物としてＮＺＷウサギを用い、当該ＮＺＷウサギの大腿部に数カ所、前記エマルジョンを全量注射した（初回免疫）。
【００２７】
１ヶ月後、前記実施例１で生成した抗原を測定してたんぱく質量１ｍｇ／ｍｌとなるようにＰＢＳ（ｐＨ７．４）に溶解し、この５００μｌを注射器にとり、フロイント不完全アジュバント７５０μｌを取った別の注射器と連結させ、これらを交互に動かすことによってエマルジョンを作成し、これを注射し、追加免疫とした。この追加免疫を２週間ごとに繰り返し、注射１週間後に少量採血し、抗体の産出を前記実施例１のヘキサノニル化ＫＬＨの調製法と同様にして作成したヘキサノニル化ＢＳＡ（ヘキサノニル化した牛血清アルブミン（Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ））に対して抗体が反応するかをＥＬＩＳＡ法によって確認した。
【００２８】
抗体の産出が最大になったところで（２週間前と比較してヘキサノニルリジン抗体の産出に変動が生じなくなったところ、すなわち、ある追加免疫の１週間後に確認された抗体の産出と、当該追加免疫の２週間後に行われた次の追加免疫の１週間後に確認された抗体の産出とが同一になったところで）、ＮＺＷウサギから採血し、この血液より血清を得た後、当該血清より本発明のヘキサノニルリジン抗体を得た。
【００２９】
このように、本発明のヘキサノニルリジン抗体は、前記のように免疫したＮＺＷウサギの血液から得た血清中に生成されているので、使用に際しては、そのまま用いることもできるが、前記血清から抗体のみを抽出して用いることもできる。
【００３０】
この実施例においては前記のように、初回免疫から追加免疫との間の間隔、追加免疫と次の追加免疫との間の間隔を、それぞれ１カ月、２週間としたが、このような間隔で追加免疫を行うことに限定されるものではない。ただし、初回免疫は抗体を産出させるためのものであり、通常、最初に抗原を注射してから４日乃至５日で抗体が血中に表れ、次第に量が増大して１０日前後にピークとなることから、初回免疫から最初の追加免疫までは２週間以上おくことが好ましい。また、追加免疫は、前記抗体をたくさん作らせるために行うものであるが、追加免疫後すぐには抗体は増加しないので、追加免疫後１週間おいてから採血し、採血後１週間おいてから次回の追加免疫を行うこととしたものである。
【００３１】
前記のように免疫したＮＺＷウサギの血液から本発明のヘキサノニルリジン抗体を得る工程は、以下のように行った。すなわち、まずウサギの耳動脈より大量採血を行い、３７℃で１時間保温した後、４℃で一晩静置する。これを３０００回転で１０分間遠心し、得られた上清（抗血清）を滅菌フィルターに通して得たものである。本実施例では、これを分注し、−８０℃にて保存した。
【００３２】
なお、本発明のヘキサノニルリジン抗体は、前記のように免疫したＮＺＷウサギの血清中に生成されているので、この血清の中から本発明の抗体を得る工程は、前述した方法に限られず、通常採用されている種々の方法で行うことができる。
【００３３】
前記実施例１、実施例２で説明した本発明の抗原の製造及び本発明の抗体の製造は、好ましい一実施例に過ぎず、反応に供させる物質の分量、反応時間、反応温度、等々のパラメーターは種々に変更可能である。
【００３４】
【試験例１】
ヘキサノニルリジンに対する抗体が生成していることの証明として以下の試験を行い、図１の結果を得た。
【００３５】
即ち、初回免疫から１ヶ月後に得られた血清（ｉｍｍｕｎｅ  ｓｅｒｕｍ）及び免疫前の血清（ｃｏｎｔｒｏｌ  ｓｅｒｕｍ）を用いて、抗体の産出を確認した。ＥＬＩＳＡプレートにヘキサノニル化ＢＳＡ（０．０１ｍｇ／ｍｌ）を５０μｌまき、何段階か希釈した血清を更に作用させることで、ヘキサノニル化ＢＳＡに対する抗体の結合性を見た。なお、この試験で用いたヘキサノニル化ＢＳＡは、前記実施例１のヘキサノニル化ＫＬＨの調製法と同様にして作成したものである。
【００３６】
その結果、図１図示のように、ヘキサノニル化ＫＬＨを免疫する前の血清（ｃｏｎｔｒｏｌ  ｓｅｒｕｍ）では全くヘキサノニル化ＢＳＡとは反応しないものの、免疫後の血清（ｉｍｍｕｎｅ  ｓｅｒｕｍ）では強力な結合活性が認められた。このことから、ヘキサノニル化ＫＬＨを免疫した血清中にヘキサノニルリジンを認識する抗体が産出されていることが確認できた。
【００３７】
この試験において、ＥＬＩＳＡは以下のようにして行った。ＥＬＩＳＡのプレートにヘキサノニル化ＢＳＡを５０μｌ添加し、４℃で一晩静置した。翌日、０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０入りのＰＢＳ（ＴＰＢＳ）で３回、水で３回洗った後、４％のＢｌｏｃｋ  Ａｃｅ（２００μｌ）で３７℃１時間ブロッキングした。上記したと同じように洗った後、１００μｌの血清（１％ＢＳＡ入りＰＢＳで希釈、いくつかの濃度段階の血清を作成）を添加し、３７℃で２時間反応させた。洗った後、２次抗体として、ペルオキシダーゼ標識抗体を１／５０００（ＴＰＢＳ当たり）となるように１００μｌ添加し、３７℃１時間反応させた。洗った後、ｏ−フェニレンジアミン５ｍｇ、３０％過酸化水素１０μｌを１０ｍｌのクエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ５．５）に溶解させた発色液を１００μｌずつ添加し、発色を行い、４９２ｎｍの吸光度を測定した。
【００３８】
【試験例２】
抗体の認識するアルキル側鎖の長さについて交差性を検討すべく以下の試験を行い、図２の結果を得た。
【００３９】
ヘキサノニル化ＢＳＡは前記実施例１のヘキサノニル化ＫＬＨの調製法と同様にして作成したものであり、ヘキサン酸から調製したが、その側差が長いもの或いは短いものに対する交差性がどの程度認められるか競争的ＥＬＩＳＡ法により検討した。
【００４０】
炭素数２（Ｃ２）から炭素数１１（Ｃ１１）の脂肪酸を競争物質として検討した。ＥＬＩＳＡプレートにコーテイングにはヘキサノニル化ＢＳＡを用いた。
【００４１】
この結果、図２に示すように、Ｃ６が最もよく認識されるが、Ｃ５、Ｃ７も認識することがわかった。
【００４２】
また、本発明の抗体は、炭素数３（Ｃ３）の修飾ＢＳＡを認識しないことから、α−オレイン酸等のオメガ３系の脂肪酸の酸化物に由来する酸化的付加化合物は認識せず、オメガ６系の付加化合物を選択的に認識できることがわかった。
【００４３】
この試験において、競争的ＥＬＩＳＡは以下のようにして行った。予め、ＥＬＩＳＡのプレートに０．０１ｍｇ／ｍｌのヘキサノニル化ＢＳＡを５０μｌ添加し、４℃で一晩静置した。同時に血清（実施例１で得た本発明の抗原で免疫したＮＺＷウサギの血液から得た血清）を１／２５００となるように１％ＢＳＡ入りＰＢＳに溶かしたものを５０μｌとり、様々な濃度でＰＢＳにより希釈した競争物質５０μｌと混ぜ、４℃で一晩反応させた（抗体最終濃度１／５０００）。翌日、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０入りのＰＢＳ（ＴＰＢＳ）で３回、水で３回洗った後、４％のＢｌｏｃｋ  Ａｃｅ（２００μｌ）で３７℃１時間ブロッキングした。上記したと同じように洗った後、前夜より反応させたサンプルを９０μｌ添加し、３７℃で２時間反応させた。洗った後、２次抗体として、ペルオキシダーゼ標識抗体を１／５０００（ＴＰＢＳ当たり）となるように１００μｌ添加し、３７℃１時間反応させた。洗った後、ｏ−フェニレンジアミン５ｍｇ、３０％過酸化水素１０μｌ入りの１０ｍｌのクエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ５．５）を１００μｌ添加し、発色を行い、４９２ｎｍ吸光度を測定した。競争的ＥＬＩＳＡの場合は、結果をＢ／Ｂ０として図２に表示した。但し、
Ｂ  ＝( 当該試料区の４９２ｎｍの吸光度) −( 抗体無添加区の４９２ｎｍの吸光度)
Ｂ０＝( 試料無添加区の４９２ｎｍの吸光度) −( 抗体無添加区の４９２ｎｍの吸光度) を示す。
【００４４】
【試験例３】
低分子ヘキサノニルリジン誘導体に対する交差性について検討すべく以下の試験を行い、図３の結果を得た。
【００４５】
構造の同定されているヘキサノニルリジンを含むペプタイドを競争物として、これが本発明の抗体に認識されるか競争的ＥＬＩＳＡ法により検討した。その結果、ヘキサノニル化したＡＧＬＭＥ（アセチル−グリシル−リジン  メチルエステル）や、ヘキサノニル化したＢｚ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（ベンゾイル−グリシルリジン）に対して本発明の抗体が結合することが明らかになった。また、このことから、本発明の抗体のエピトープは、ヘキサノニルリジンであることがわかった。
【００４６】
【試験例４】
酸化ＬＤＬや過酸化脂質で修飾されたたんぱく質等に対する発明の抗体の結合性について、ＥＬＩＳＡ法で検討し、図４の結果を得た。
【００４７】
即ち、銅イオンで２４時間酸化したＬＤＬが発明の抗体と反応し、またアラキドン酸、リノール酸、カルジオリピン等をアスコルビン酸−鉄系で酸化したもので処理したたんぱく質においても本発明の抗体との結合性が認められた。１３−ハイドロパーオキシオクタデカジエノ酸（１３−ＨＰＯＤＥ）や、１５−ハイドロパーオキシエイコサテトラエノ酸（１５−ＨＰＥＴＥ）の様なヒドロペルオキシドと反応したたんぱく質とも本発明の抗体との結合があった。一方、脂質過酸化とは関係のない過酸化水素−鉄系で酸化したたんぱく質（ｏｘｉｄｉｚｅｄ  ＢＳＡ）は、全く結合せず認識されなかった。
【００４８】
以上から、この発明の抗体はオメガ６系の不飽和脂肪酸の過酸化物に由来する付加化合物を認識し、その付加化合物はカルジオリピン等のリン脂質からも生成することが明らかになった。
【００４９】
１３−ＨＰＯＤＥや、１５−ＨＰＥＴＥの様なヒドロペルオキシドで修飾したたんぱく質も交差性を示したことから、本発明の抗体が生体内の酸化修飾の良いマーカーとなることが確認できた。
【００５０】
この試験におけるＥＬＩＳＡ法は、抗体希釈率を１／５０００に固定し、試料をプレートへ撒く濃度を０．０１ｍｇ／ｍｌにし、その他は前記試験例１に準じて実施した。
【００５１】
【試験例５】
脂質過酸化の終期段階でアルデヒド類が生成されてくることが知られているが、このアルデヒド類により修飾されたアルデヒド修飾たんぱく質との交差性についてＥＬＩＳＡ法で検討し、図５の結果を得た。
【００５２】
即ち、図５図示のように、アルデヒド修飾ＢＳＡは、いずれも本発明の抗体との結合性を示さず、本発明の抗体との交差性は無いことがわかった。特に、１−ヘキサナール修飾たんぱく質は、ヘキサノニルリジンにきわめて類似した構造ができるが、本発明の抗体との交差性を全く示さなかったことから、本発明の抗体がアミド型のヘキサノニルリジンを特異的に認識することが判断でき、本発明の抗体が、脂質過酸化の終期段階でなく、初期段階における生体傷害を特異的に検出できる手段となることが考えられた。
【００５３】
【試験例６】
ＬＤＬをラジカル発生剤ＡＡＰＨ（２，２´−ａｚｏｂｉｓ（２−ａｍｉｄｉｎｏｐｒｏｐａｎｅ）ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）により酸化する際に、ＬＤＬ中にヘキサノニルリジンが生成するか検討し、図６の結果を得た。
【００５４】
すなわち、ＡＡＰＨの濃度が高くなるほどヘキサノニルリジンの生成が多くなっていくことがわかった。
【００５５】
【試験例７】
ＬＤＬを酸化促進剤硫酸銅（ＣｕＳＯ4 ）により酸化する際に、ＬＤＬ中にヘキサノニルリジンが生成するか検討し、図７の結果を得た。
【００５６】
すなわち、ＣｕＳＯ4 を加えない対照（Ｃｏｔｒｏｌ）では、ヘキサノニルリジンは、まったく生成されないのに対し、ＣｕＳＯ4 添加区では、反応時間の経過と共にヘキサノニルリジンの生成が多くなることが認められた。
【００５７】
ＬＤＬの酸化は、動脈硬化を引き起こすことが報告されており、本発明の抗体は生体内での酸化ＬＤＬを検出し、動脈硬化の予防、治療に役立つことが示された。
【００５８】
【発明の効果】
この発明によれば、ヘキサノニルリジンを選択的に識別できる抗体を提供することができる。これによって、ヘキサノニルリジンを有効、適切かつ高精度で検出あるいは定量することが可能になる。また、この発明によれば、当該抗体の生成に用いる抗原を提供することができる。
【００５９】
本発明の抗体を用いることにより、従来は使用することができなかった、生体成分中で選択的に精度高く検出乃至定量する方法としてのＥＬＩＳＡ法を、生体成分中のヘキサノニルリジンの検出、定量に使用することができるようになる。本発明の抗体は、アミド型のヘキサノニルリジンを特異的に認識することができるので、脂質過酸化の終期段階でなく、初期段階における生体傷害を特異的に検出するための有用な手段とすることができる。また、本発明の抗体は、生体内脂質過酸化反応の初期段階で発生するヒドロペルオキシドによる生体たんぱく質の修飾を、生体成分中で容易に検出することができ、更に、ＬＤＬがラジカルや酸化促進剤で酸化されることをも容易に検出できるので、生体内での酸化ＬＤＬを検出し、動脈硬化の予防、治療に役立たせることができるという有用性がある。
【００６０】
ここで、本発明の抗体の生成に用いる抗原は、ジメチルホルムアミド中でヘキサン酸とカーボジイミドとを反応させたものを、リン酸緩衝液中で、ケイホルリムペットヘモシアニン等のたんぱく質と反応させ、その反応生成物から得るものであるので、容易に製造することが可能である。
【００６１】
更に、本発明の抗体は、この抗原を用いて免疫した抗体生成用の動物（ＮＺＷウサギなど）の免疫後の血清から高収量で製造できるので、比較的安価に、大量に提供することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１】ヘキサノニルリジンを認識する抗体が生成していることを示す図。
【図２】抗体の認識するアルキル側鎖の長さに対する交差性を示す図。
【図３】低分子ヘキサノニルリジン誘導体に対する交差性を示す図。
【図４】異なる方法で酸化修飾された各種たんぱく質に対する結合性を示す図。
【図５】アルデヒド類により修飾されたたんぱく質との交差性を示す図。
【図６】ラジカル発生剤ＡＡＰＨによるＬＤＬ酸化でのヘキサノニルリジンの生成図。
【図７】酸化促進剤（ＣｕＳＯ4 ）によるＬＤＬ酸化でのヘキサノニルリジン生成図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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