(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の試験用セルを有するカートリッジからなる、血液試料の血小板機能性評価のための装置であって、試験用セルのそれぞれに凝固剤と所定量の血小板活性化剤とが入れてあり、またそれらセルの少なくもふたつのものの血小板活性化剤の量を異ならせてあることを特徴とする装置。
【請求項２】
前記血小板活性化剤が１−０−アルキル−２−アセチル−ｓｎ−グリセリル−３−ホスホリルコリンである請求の範囲１記載の装置。
【請求項３】
前記血小板活性化剤が１−０−アルキル−２−アセチル−ｓｎ−グリセリル−３−ホスホリルコリン、コラーゲン、エピネフリン、リストセチン及びアラキドン酸からなる群から選ばれる請求の範囲１記載の装置。
【請求項４】
血液試料を複数部分の試料に分割し、選択された量の血小板活性化剤の存在下に夫々の試料部分について凝固試験を行ない、夫々の部分試料当りの血小板活性化剤の選択された量は相互に異なり、夫々の前記試料部分当りの凝固時間の差にもとづいて血小板機能性を決定することからなる血液試料における血小板機能性を決定するための方法。
【請求項５】
前記血小板活性化剤が１−０−アルキル−２−アセチル−ｓｎ−グリセリル−３−ホスホリルコリンである請求の範囲４記載の方法。
【請求項６】
前記血小板活性化剤が１−０−アルキル−２−アセチル−ｓｎ−グリセリル−３−ホスホリルコリン、コラーゲン、エピネフリン、リストセチンからなる群から選ばれる請求の範囲４記載の方法。
【請求項７】
複数の試験用セルを有するカートリッジからなる、血液試料の血小板機能性評価のための装置であって、試験用セルのそれぞれに凝固剤と所定量の凝固影響剤とが入れてあり、またそれらセルの少なくもふたつのものの凝固影響剤の量を異ならせてあることを特徴とする装置。
【請求項８】
血液試料を複数部分の試料に分割し、凝固影響剤の選択された量の存在下に夫々の試料部分の凝固試験を行ない、夫々の部分試料当りの薬剤の選択された量は相互に異なり、夫々の部分試料当りの凝固時間の差にもとづいて凝固特性を決定することからなる血液試料の凝固特性を決定するための方法。
【請求項９】
前記凝固影響剤が血小板活性化剤である請求の範囲７記載の装置。
【請求項１０】
前記凝固影響剤が血小板活性化剤である請求の範囲８記載の方法。
【請求項１１】
複数の試験用セルを備えた、血液試料の血小板機能性試験を行うための装置であって、試験用セルが血液試料の等分された分量を入れられるようになっており、試験用セルのそれぞれに凝固剤と所定量の血小板活性化剤とが入れてあり、またそれらセルの少なくもふたつのものの血小板活性化剤の量を異ならせてあり、この構成により血液試料の各等分分量につき凝固時間が決定され、それら等分分量の相対凝固時間により血液試料の血小板機能性が決定されることを特徴とする装置。
【請求項１２】
血小板活性化剤が１−０−アルキル−２−アセチル−ｓｎ−グリセリル−３−ホスホリルコリン、コラーゲン、エピネフリン、リストセチン及びアラキドン酸からなる群から選択されたものであることを特徴とする請求の範囲１１記載の装置。
【請求項１３】
血小板活性化剤が１−０−アルキル−２−アセチル−ｓｎ−グリセリル−３−ホスホリルコリンである請求の範囲１１記載の装置。
【請求項１４】
試験用セル中の血小板活性化剤の量が約０ないし約２．７６マイクログラムである請求の範囲１１記載の装置。
【請求項１５】
血液試料の等分分量中の血小板活性化剤の濃度が約０と約１５０ｎＭである請求の範囲１１記載の装置。
【請求項１６】
試験用セルの少なくもひとつが血小板活性化剤を全く含まずまた残りのセルがそれぞれ異なる量の血小板活性化剤を含んでいる請求の範囲１１記載の装置。
【請求項１７】
凝固剤がカオリンである請求の範囲１１記載の装置。
【請求項１８】
血小板機能性試験がプランジャー感知装置技術により行われる請求の範囲１１記載の装置。
【請求項１９】
複数の試験用セルを備えた、血液試料の凝固特性評価のための装置であって、試験用セルが血液試料の等分された分量を入れられるようになっており、試験用セルのそれぞれに凝固剤と所定量の凝固影響剤とが入れてあり、それらセルの少なくもふたつのものの凝固影響剤の量が異ならせてあり、この構成により血液試料の各等分分量につき凝固時間が決定され、それら等分分量の相対凝固時間により血液試料の凝固特性が決定されることを特徴とする装置。
【請求項２０】
凝固影響剤が血小板活性化剤である請求の範囲１９記載の装置。
【請求項２１】
血小板活性化剤が１−０−アルキル−２−アセチル−ｓｎ−グリセリル−３−ホスホリルコリン、コラーゲン、エピネフリン、リストセチン及びアラキドン酸からなる群から選ばれたものである請求の範囲２０記載の装置。
【請求項２２】
血小板活性化剤が１−０−アルキル−２−アセチル−ｓｎ−グリセリル−３−ホスホリルコリンである請求の範囲２０記載の装置。
【請求項２３】
凝固剤がカオリンである請求の範囲１９記載の装置。
【請求項２４】
複数の試験用セルを有するカートリッジからなる、血液試料の血小板機能性を指摘するための装置であって、各試験用セルが血液試料の等分された分量を入れられるようになっており、試験用セルのそれぞれに凝固を促進するのに十分な量の凝固剤と所定量の血小板活性化剤とが入れてあり、また一方のセルと他方のセルの血小板活性化剤の量を異ならせてあり、この構成によりセル中の血液試料の等分分量の凝固時間が該等分分量の粘度変化によって測定され、それら等分分量の相対凝固時間により血液試料の血小板機能性が指摘されることを特徴とする装置。
【請求項２５】
血小板活性化剤が１−０−アルキル−２−アセチル−ｓｎ−グリセリル−３−ホスホリルコリンである請求の範囲２４記載の装置。
【請求項２６】
血小板活性化剤が１−０−アルキル−２−アセチル−ｓｎ−グリセリル−３−ホスホリルコリン、コラーゲン、エピネフリン、リストセチンおよびアラキドン酸からなる群から選択されたものである請求の範囲２４記載の装置。
【請求項２７】
粘度変化がプランジャー感知装置技術により測定される請求の範囲２４記載の装置。
【請求項２８】
複数の試験用セルを有するカートリッジからなる、血液試料の血小板機能性を指摘するための装置であって、各試験用セルが血液試料の等分された分量を入れられるようになっており、試験用セルのそれぞれに凝固を促進するのに十分な量の凝固影響剤と所定量の血小板活性化剤が入れてあり、一方のセルと他方のセルの凝固影響剤の量を異ならせてあり、この構成によりセル中の血液試料の等分分量の凝固時間が該等分分量の粘度変化によって測定され、それら等分分量の相対凝固時間により血液試料の血小板機能性が指摘されることを特徴とする装置。
【請求項２９】
前記凝固影響剤が血小板活性化剤である請求の範囲２８記載の装置。
【請求項３０】
粘度変化がプランジャー感知装置技術により測定される請求の範囲２８記載の装置。
【請求項３１】
複数の試験用セルからなる、血液試料の血小板機能性試験を行うための装置であって、各セルのそれぞれに凝固を促進するのに十分な量の凝固剤と所定量の血小板活性化剤とが入れてあり、またそれらセルの少なくもふたつのものの血小板活性化剤の量を異ならせてあり、この構成により血小板機能性が血液試料の粘度変化により決定されることを特徴とする装置。
【請求項３２】
血小板活性化剤が１−０−アルキル−２−アセチル−ｓｎ−グリセリル−３−ホスホリルコリン、コラーゲン、エピネフリン、リストセチンおよびアラキドン酸からなる群から選択されたものであることを特徴とする請求の範囲３１記載の装置。
【請求項３３】
血小板活性化剤が１−０−アルキル−２−アセチル−ｓｎ−グリセリル−３−ホスホリルコリンである請求の範囲３１記載の装置。
【請求項３４】
試験用セル中の血小板活性化剤の量が約０ないし約２．７６マイクログラムである請求の範囲３１記載の装置。
【請求項３５】
血液試料の等分分量中の血小板活性化剤の濃度が約０と約１５０ｎＭである請求の範囲３１記載の装置。
【請求項３６】
試験用セルの少なくもひとつが血小板活性化剤を全く含まずまた残りのセルがそれぞれ異なる量の血小板活性化剤を含んでいる請求の範囲３１記載の装置。
【請求項３７】
凝固剤がカオリンである請求の範囲３１記載の装置。
【請求項３８】
血小板機能性試験がプランジャー感知装置技術により行なわれる請求の範囲３１記載の装置。
【請求項３９】
複数の試験用セルを備えた、血液試料の凝固特性指摘のための装置であって、試験用セルのそれぞれに凝固を促進するのに十分な量の凝固剤と所定量の凝固影響剤とが入れてあり、それらセルの少なくもふたつのものの凝固影響剤の量が異ならせてあり、この構成により血液試料の相対凝固時間が該血液試料の粘度変化により測定され、該相対凝固時間により血液試料の凝固特性が指摘されることを特徴とする装置。
【請求項４０】
凝固剤がカオリンである請求の範囲３９記載の装置。
【請求項４１】
粘度変化がプランジャー感知装置技術により測定される請求の範囲３９記載の装置。
【請求項４２】
前記凝固影響剤が血小板活性化剤である請求の範囲３９記載の装置。
【請求項４３】
血小板活性化剤が１−０−アルキル−２−アセチル−ｓｎ−グリセリル−３−ホスホリルコリン、コラーゲン、エピネフリン、リストセチンおよびアラキドン酸からなる群から選択されたものである請求の範囲３９記載の装置。
【請求項４４】
血小板活性化剤が１−０−アルキル−２−アセチル−ｓｎ−グリセリル−３−ホスホリルコリンである請求の範囲３９記載の装置。
【請求項４５】
複数の試験用セルを備えた、血液試料の血小板機能性試験を行うための装置であって、試験用セルが血液試料の等分された分量を入れられるようになっており、試験用セルのそれぞれに凝固を促進するのに十分な量の凝固剤と所定量の血小板活性化剤とが入れてあり、またそれらセルの少なくもふたつのものの血小板活性化剤の量を異ならせてあり、この構成により血液試料の各等分分量につき凝固時間が決定され、凝固時間が等分分量の粘度変化に基づいており、セル中のそれら等分分量の相対凝固時間により血液試料の血小板機能性が決定されることを特徴とする装置。
【請求項４６】
血小板活性化剤が１−０−アルキル−２−アセチル−ｓｎ−グリセリル−３−ホスホリルコリン、コラーゲン、エピネフリン、リストセチンおよびアラキドン酸からなる群から選択されたものである請求の範囲４５記載の装置。
【請求項４７】
血小板活性化剤が１−０−アルキル−２−アセチル−ｓｎ−グリセリル−３−ホスホリルコリンである請求の範囲４５記載の装置。
【請求項４８】
粘度変化がプランジャー感知装置技術により測定される請求の範囲４５記載の装置。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は血小板機能性評価のための装置に関する。より詳細には、本発明は血小板の機能性評価に使用するための改善された多槽カートリッジおよびそれを使用する方法に関する。
技術的背景
全血の凝血または凝固において、血小板が重要な役割を演ずることが観察されている。血小板が活性化されると、血液の凝固時間を短縮する。この短縮化は血小板のはじめの状態に関係し、血小板機能不全は心肺バイパス手術後の術後出血の主要な原因と考えられる。
血小板の機能性は血液および緩衝液中のカオリン（kaolin）のような凝血促進剤を混合することによって便宜的に決定される。これは試験用カートリッジ中に組み込まれた一連の試験用のセル中で行なわれる。凝血剤を加えた後に、各セル中の血液／カオリン溶液は烈しくかきまぜられて凝血促進のために血小板が活性化される。各セル中の血液試料のかきまぜの程度は夫々異なる。米国特許第５，３１４，８２６号に述べたように、凝固時間は、かきまぜ程度に比例する。かきまぜ程度の函数としての血液の一部分の凝固時間の比較によって、血小板の機能性を決定することができる。それを実施するための方法と装置は米国特許第４，５９９，２１９号および第５，３１４，８２６号に詳細に開示されている。本発明の更なる理解のための必要性から、これら二つの米国特許における開示を参考として、ここに組み入れた。
血小板の化学的活性化剤または薬剤は従来から良く知られている。かかる活性化剤の一つである１−Ｏ−アルキル−２−アセチル−ｓｎ−グリセリル−３−ホスホリルコリン、すなわち生物学的活性リン脂質がデモプーロス(Demopoulos)らによってJ.Biol. Chem.,(1979), 245, 9355〜8に開示されている。この血小板活性化剤または活性化薬剤は、しばしば血小板活性化因子と呼ばれ、活性血小板の能力を高めて効果的に血液凝固反応に関与し、その結果、血液の凝固時間を短縮する。もしも血小板が不活性であるか、または正常に機能しないと、活性化剤は凝固時間に僅かに影響するか、または影響を与えないであろう。
本発明の主要な目的は、血液試料中の機能性血小板の評価を容易にする、改善された血小板機能性試験用カートリッジを提供することにある。
本発明の他の目的は、血液試料部分をその中に受け入れて、血小板活性に予言的な凝固結果を与える試験カートリッジを提供することにある。
発明の開示
上述した目的に従い、本発明は複数の試験セルを有するカートリッジによって具現化される。夫々のセルは血液試料の一部分を収容できるようになっている。凝固剤の計測された量が夫々のセルの反応室に乾燥した充填物として塗られる。夫々のセルにおける凝固剤の量は夫々の他のセルにおいて凝固剤の量と異なり、少なくとも一つのセルが血小板活性化剤を含まない。加えて、ヘパリンまたはプロタミンの量が夫々のセルに液体または乾燥物で加えられる。セルはまた、カオリンのような凝固剤を含み、この剤はカートリッジ使用の際に反応室中に挿入されて血液および血小板活性化剤と混合される。各セル内の試料の相対凝固時間が測定され、標準とおよび相互に比較したときに血液試料の血小板機能性が決定される。
カートリッジおよび血小板機能性決定の方法は患者の血液条件が厳密にモニターされねばならない心臓切開や心肺手術に関連して有用である。
【図面の簡単な説明】
図１は本発明を具体化した多槽カートリッジの前正面図である。
図２は実質的に図１の線２−２の面における断面図である。
図３は血小板活性化因子濃度と凝固時間の関係を示すグラフである。
本発明実施のための最上の方法
本発明は前部下垂スカートまたは下垂板１４を有するカートリッジ板１２からたれ下がり、かつ一体化した複数の試験セル１１、好ましくはかかるセルの６箇を有する試験カートリッジ１０において具体化される。カートリッジは、米国特許第４，５９９，２１９号に詳述したように、夫々のセル１１中に挿入された血液試料の一部分の凝固時間の決定のために上記特許に詳細に述べたような試験装置中に挿入できるようになっている。各セル１１は下方向に先細の管１５によって形成され、この先細管１５には、その端部からの中程に内側に突出する環状座１６が画定され、また上部密封面１８および下部密封面１９も画定される。管１５の下端に弾性可撓性滑動プラグ２０が位置し、プランジャー・シャフト２２によって画定されたプランジャー２１および密封ワッシャーまたは円板２４が管の上方部分に位置する。密封ワッシャー２４は環状座１６の上部密封面１８に当接し、プラグ２０と共に下部凝固剤室２５を画定する。管１５はワッシャー２４の上方にプラグ２８を画定し、試験機（示されていない）と連動されている。
緩衝、静菌溶液中のカオリンのような凝固剤２９がプラグ２０上、かつ密封ワッシャー２４下の凝固剤室２５中に含まれる。カートリッジが使用されるとき、各セルのプランジャー２１は引き上げられ、プラグ２０は上方に押され、この結果、上部セル反応室２６中に含まれた血液試料中に凝固剤が押しやられて凝固が始まる。
本発明によれば、化学的血小板活性化因子または薬剤３０の計測された量が頂部または上部反応室２６中に乾燥充填物として供給される。この血小板活性化因子組成物は、血液試料が凝固室２６中に導入され、凝固剤２９が添加され混合されたときに、血液試料中に溶解する。加えて用いられるべき化学的操作に応じて、ヘパリンまたはプロタミンの選択された量が反応室２６における乾燥充填物として用いられる。
一連の異なる凝固時間を与えるために、各セルにおける血小板活性化因子の量が各他のセルにおける量と異なる。最初の二つの小槽１１Ａおよび１１Ｂ（図１参照）においては血小板活性化因子が用いられていない。連続する夫々のセル１１Ｃ、１１Ｄ、１１Ｅおよび１１Ｆにおいては、次第に増加する量の血小板活性化因子または血小板活性化薬剤が用いられた。
好ましい血小板活性化因子は化合物１−Ｏ−アルキル−２−アセチル−ｓｎ−グリセリン−３−ホスホリルコリン、すなわち生物学的活性リン脂質である。使用されうる他の因子または化合物は、コラーゲン、エピネフリン、リストセチンおよびアラキドン酸である。好ましい血小板活性化因子、１−０−アルキル−２−アセチル−ｓｎ−グリセリル−３−ホスホリルコリンの充填物は、この因子を０．２５％のウシ血清アルブミンを含む食塩（ＮａＣｌ）と混合し、脱イオン水で望ましい因子濃度にうすめることにより合成される。望ましい因子濃度の夫々の溶液の量がセル中に入れられ蒸発されると、血小板活性化因子の望ましい量の固体または乾燥充填残漬が残される。望ましい量のヘパリンおよびプロタミンを添加し、充填物として乾燥することもできる。
カオリンのような凝固剤は、０．５ｍの塩化カルシウムおよび静菌剤としてのナトリウムアシドのヒドロキシエチルピペラジン・エタンスルホン酸の緩衝液への４％ｗ／ｖ懸濁として合成される。この凝固剤の０．０８８mlの量をカートリッジ１０の各小槽１１の薬剤室２５中に仕込む。
使用にあたっては、血液試料のセル当り０．３５mlの量が各セル中に分配される。この結果、下記の表１に異例として示した血小板活性因子（ＰＡＦ）血中濃度が得られる。
0003806884.tif 000002
各セルの反応室へ血液試料を導入した後に、凝固剤を各反応室へ挿入し、各セルにおける血液の凝固時間を決定した。各セルの凝固時間から、凝固比を計算した。凝固比は、セル１１Ａおよび１１Ｂのコントロール凝固時間の平均値と比較したセルＣ、Ｄ、ＥおよびＦの凝固時間の比である。血小板機能は正常な母集団において観察された最高凝固比反応の％として表わされる。正常母集団反応のこの値は知られており、一方では血小板の機能性も示す凝固比％の計算のために使用することができる。各セルにおける相対凝固時間から、いずれかの適切な望ましい計算をすることができる。血小板機能は、また手術中における血液損失および血液輸血の必要の決定にも用いることができる。血小板機能性は更に心臓手術中のヘパリン治療管理を助ける。
実施例１
血小板活性化因子溶液およびセルの製造
１．ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）〔シグマ・プロダクト(Sigma Product)社＃Ａ−３８０８〕の６２．５mgを計量する。
２．ＮａＣｌの２１９mgを計量する。
３．脱イオン水で２５mlに調合する。これにより、０．２５％ＢＳＡ／０．１５Ｍ  ＮａＣｌが与えられる。ＢＳＡが完全に溶解するまで放置する。
４．ハミルトン(Hamilton)シリンジを用いて血小板活性化因子１−Ｏ−アルキル−２−アセチル−ｓｎ−グリセリン−３−ホスホリルコリンの５０μlを清潔な栓つきガラス瓶中に採取し、蒸発フード中で蒸発させる。２mlのＢＳＡ／ＮａＣｌ溶液を加え、少なくとも１時間放置する。この作業用蓄積物質は１００μＭである。
５．作業用蓄積血小板活性化因子（ＰＡＦ）を脱イオン水で連続的に１／１０に０．１μＭまでうすめる。これら溶液の各５μlは、０．４ml血液中に１．２５μＭ、１２．５μＭ、１２５μＭおよび１２５０μＭを夫々与える。
６．下記の量をセルに加え、指示された血液中濃度が得られる。
0003806884.tif 000003
７．水を蒸発させて各セルに乾燥充填物を残す。
８．自発的提供者からの正常血液の試料を用い、実施例１に従って製造したカートリッジに血液の０．４ml部分を各セルに加え、各セルにおける血液の凝固時間を測定し、図３のようにプロットした。
上述したように、凝固時間を比に変換することによって滴定曲線が標準化された。
血小板活性化因子が存在しない、セルＡの凝固時間は、これに対して全ての他のセル凝固時間が比較されたセル凝固時間である。秒で表わした夫々の他のセル凝固時間により秒で表わしたセルＡの凝固時間を割ることによって比を計算した。次いで１引くセルＡの凝固時間対他のセルの凝固時間の比により凝固比を計算した（１−小槽Ａの時間／小槽Ｘの時間）。正常値の百分率としての血小板機能によってデータを表わすこともできる。これは凝固比を１００倍し、次いで２２の正常なドナーにおける最高血小板活性化因子応答を測定することによって決定されたファクター１．９７を乗ずることによって凝固比から計算される。これらのドナーは血小板の機能不全を知っておらず、薬剤摂取についても知っていない。
以上述べた試験用カートリッジと方法は、単純にして迅速な、血小板機能試験管理の応答点の提供に有用である。この検定は更なる血液治療と管理から利益を受けることができる、心肺バイパス後の過剰な血液損失の患者を確認することができる。
本発明のいくつかの説明のための態様を図示し、上記に詳述したが、開示された特定の形状に本発明を限定する意図は存在しないことが理解されるべきである。これに反して、本発明は、付記する請求の範囲で表わした本発明の精神と範囲内の全ての修正、二者択一的構造および組成、同等物および用途を包含する。
【図１】
0003806884.tif 000004
【図２】
0003806884.tif 000005
【図３】
0003806884.tif 000006