(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Trichoderma属のキシラナーゼ産生微生物を栄養培地内で培養することによるキシラナーゼの豊富な酵素複合体の製造方法であって、培養物中に、予備処理したライムギの希薄アルコール蒸留廃液をキシラナーゼの誘導物質として、および同時に炭素源として用いることを含み、その予備処理にはライムギの希薄アルコール蒸留廃液の固体構成成分の除去、水分および他の揮発性物質の蒸発による非揮発性成分の濃縮、ならびにそれに続く得られたライムギの希薄アルコール蒸留廃液の濃縮物のオートクレーブ処理を含む、製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、予備処理したライムギの希薄アルコール蒸留廃液（stillage）をキシラナーゼ形成の誘導物質として用いてキシラナーゼの豊富な酵素複合体を製造するための発酵方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
公知のように、キシラナーゼとは、ヘミセルラーゼに与えられた酵素の名前で、キシラン(もしくは「木化ゴム」)をキシロースおよび他の糖に加水分解する。この酵素はまたエンド−１，４−β−Ｄ−キシラナーゼもしくは１，４−β−Ｄ−キシランキシラノヒドロラーゼとしても知られ、ＥＣ３．２．１．８酵素分類に属する。キシランは、それ自身、１，４−β−グリコシド結合Ｄ−キシロピラノース由来の多糖類で、異なる組成の短い側鎖を有し、分子内にアラビノース、グルコース、ガラクトースおよび／またはグルクロン酸ならびにアセチル基およびメチル基をも含み、多くの落葉樹および針葉樹の、ならびに穀物、フスマ、ペクチン、トラガカント、植物ゴムなどの成分である。森におけるそれらの存在に注目すると、キシランは、幅広い種々の天然の物質に属している。それらの構造の多様性という観点から、分枝した、部分的にアセチル化されたキシランの完全な分解には、種々のキシラナーゼの作用が必要であり、それによりキシランはキシロースおよび他の糖に加水分解される。キシラナーゼの作用のこの態様は複雑で、常に他の酵素(ある程度、相乗的に作用する)との関係から理解される。
【０００３】
キシラナーゼは、菌類、例えば、Trichoderma、Penicillium、Aspergillus、TalaromycesおよびSporotrichumおよび細菌類、例えば、Clostridium、Cellulomonas、Bacillus、ThermononsporaおよびRuminococcusによって作られる。それらは、セルロース業界で主に漂白剤および向上剤(improving agent)として、最近では動物飼料の製造に用いられている。後者の分野の応用に関して、外来性の酵素、例えばキシラナーゼの、ライムギ、オオムギ、またはライコムギ(triticale)を含有する飼料における使用に関する研究は、それぞれの調製物が、非デンプン性の多糖類の反栄養的作用の低下に与える好ましい影響、および栄養分の動物の腸における改善された消化性および吸収を指摘している。最も重要な酵素群は、今日ではブロイラーの飼育に特に用いられており、オオムギ、コムギおよびライムギのような穀物タイプに存在する非デンプン性の多糖類を加水分解することのできる酵素のみからなる。そのような酵素を含むいくつかの調製物は、既に市場に出ており、例えば、Roxazyme（登録商標）G（Roche）は、セルラーゼ、β−グルカナーゼおよびキシラナーゼを主な酵素として含有する。そのような調製物は、動物の飼育において先に述べた利点があるので動物の飼料に混合される。本発明により製造されるキシラナーゼが豊富な酵素複合体は、これらの調製物の製造に非常に有用な物質として提供される。飼料添加物として家禽栄養物にキシラナーゼを用いることは、重要な応用分野であり、例えば、製造されるブロイラー飼料は、そのような飼料添加物のないエネルギーの少ない穀物タイプ、例えば、オオムギ、オートムギ、ライムギおよびライコムギによって達成されるものと比較して、実質的に増加した栄養価を有する〔Mh. Vet.-Med. 48, 213-217(1993)およびその中で引用された参考文献〕。
【０００４】
上で述べたように、本発明は、該酵素複合体の製造方法、すなわちTrichoderma属のキシラナーゼ産生微生物を栄養培地内で（その栄養培地は基本的に炭素源、窒素源および特定の塩を含有している）培養し、そして形成されたキシラナーゼが豊富な（かつ同時にセルラーゼならびにβ−グルカナーゼが減少している）酵素複合体をその栄養培地から単離することによる製造方法に関する。特に、Trichoderma属の微生物は、セルロース分解を明らかに優先する多糖類分解活性（すなわち、この活性はセルロースの分解を選択的に行う）を生じるものとして効果的である。この活性の範囲を変えようとする多くの試み、とりわけ、キシラン分解活性を選択的に増加させようとする目的を持つ試みがなされてきた。この目的のため、キシラン含有物質は、キシラナーゼ形成の誘導を達成するために栄養培地(発酵培地)に加えられてきた。精製したキシラン、コムギフスマ、オオムギ包頴、粉砕したトウモロコシの穂軸（トウモロコシの軸の粉末：maize spindle flour）、ワラ、およびライムギの希薄アルコール蒸留廃液がこれらの例である。この手段により、より高いキシラナーゼ活性の方へ活性のスペクトルを転置することが可能である（技術的背景としてドイツ特許明細書ＤＤ２７８３５９号およびＤＤ２９１６７３号；欧州特許公開（ＥＰ）第０４５５９２８Ａ１号；Appl. Microbiol. Biotechnol. 40, 224-229(1993)；ならびにEnzyme & Microb. Technol. 18, 495-501(1996)を参照されたい）。特に、この誘導物質効果は、ライムギの希薄アルコール蒸留廃液を用いる費用効率のよい方法で達成することができる；しかしながら、ライムギの希薄アルコール蒸留廃液は、濃度の上昇と共にそれぞれの微生物の成長と酵素形成に阻害的影響を示す。
【０００５】
驚くべきことに、誘導物質として用いるライムギの希薄アルコール蒸留廃液の水とその他の揮発性物質の蒸発による特別な予備処理が、天然のライムギの希薄アルコール蒸留廃液の上記の不都合な阻害活性を打ち消すと共に、誘導物質としての活性を増加させ、その結果、そのように処理した濃縮型のライムギの希薄アルコール蒸留廃液が使用に好都合であるということが見出された。その処理の結果として誘導され、微生物の培養の間に（発酵槽内で）実現した酵素の形成は、酵素のスペクトルに顕著な変化をひきおこす：キシラン分解活性は他の酵素の活性、すなわち、セルロース分解およびグルカノース分解活性より数百％優れている：セルラーゼに対するキシラナーゼの比は、キシラナーゼの方に驚くべきシフトを実現した。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、キシラナーゼの豊富な（かつ同時に、セルラーゼおよびβ−グルカナーゼの低下した）酵素複合体を、Trichoderma属のキシラナーゼ産生微生物を特別な栄養培地中で培養することにより製造することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
この目的は、本発明により、予備処理したライムギの希薄アルコール蒸留廃液をキシラナーゼ形成の誘導物質として（以後、「キシラナーゼ誘導物質」という）、および同時に炭素源として培養中で用いることにより達成され、その予備処理にはライムギの希薄アルコール蒸留廃液の固体構成成分の除去、水分および他の揮発性物質の蒸発による非揮発性成分の濃縮、ならびにそれに続く得られたライムギ濃縮物の希薄アルコール蒸留廃液のオートクレーブ処理を含む。
【０００８】
キシラナーゼの豊富な酵素複合体の製造のための本発明による方法に用いられ得るTrichoderma属のキシラナーゼ産生微生物としては、特に、野生型のＱＭ６ａ株、例えば、ＱＭ９１２３、ＱＭ９４１４、Ｍ１８．２、Ｍ１８．２−ｙ、Ｒｕｔ Ｍ−７、およびＲｕｔ ＮＧ−１４から誘導されるTricoderma(T.)reesei変異体（Bland S. Montenecourt, “Torichoderma reesei cellulases”, Trend in Biotechnology, Vol. 1 No. 5, 156-160頁、1983およびその中で引用されている参考文献を参照されたい）が考慮される。
【０００９】
前記の微生物の株のいくつかは寄託されており、すなわち、
ＱＭ６ａ：          ATCC 13631，CCM F-560，CMI 45548，DSM 768；
ＱＭ９１２３：      ATCC 24449
ＱＭ９４１４：      ATCC 26921，CCM F-522，DSM 769；
Ｍ１８．２：        DSM 10683；および
Ｍ１８．２−y：       DSM 7537
である。
【００１０】
微生物T.reeseiの株、QM6a、QM9123およびQM9414は、国際寄託機関、例えば、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSM)および／またはAmerican Type Culture Collection(ATCC)のカタログに載っており、そしてこれらおよび他のソースから市販されている。微生物Ｍ１８．２株は、ＤＳＭに１９９６年５月１４日に、Biopract GmbH, Rudower Chaussee 5, D-12489 Berlinにより、長期保存のため寄託され、寄託番号ＤＳＭ １０６８３を割り当てられた。１９９８年６月１２日、ＤＳＭはBiopract GmbHから寄託をブダペスト条約下のものに移行するよう要請された。最後に、微生物Ｍ１８．２−ｙ株は、元々１９８９年８月３１日にJenaのZentralinstitut fur mikrobielle und experimentelle Therapie(ZIMET)にブダペスト条約に基づいて寄託され、寄託番号ＩＭＥＴ４３９１５を与えられた。１９９３年３月４日この株はBraunschweigのＤＳＭに移され、新しい寄託番号ＤＳＭ７５３７を与えられた。所有権の変更により、微生物T.reesei Ｍ１８．２−ｙ株は、最終的に、F.Hoffmann-La Roche AGの所有物となった。
【００１１】
本発明による方法においてキシラナーゼ誘導物質としてかつ同時に炭素源として用いられる予備処理したライムギの希薄アルコール蒸留廃液は、穀物蒸留所から得られ、通常は廃棄物と考えられている希薄蒸留廃液（ビナス(vinasse)または蒸留所の“蒸留廃液”(distillery “slop”)）に由来する。(処理されていない)ライムギの希薄アルコール蒸留廃液は、以下の公知の方法でライムギから酒精(spirit)生成物となる：ライムギ、水および酵素（エキソ−およびエンド−グルカナーゼ）を基に、ライムギ澱粉のアルコールへの発酵を、酵母により３０℃で３日にわたって行う。アルコールの蒸留後、ライムギ澱粉がほとんどない混合物が、ライムギの希薄アルコール蒸留廃液として残る。
【００１２】
異なるバッチからのライムギの希薄アルコール蒸留廃液の成分は、天然の生成物にはつきものの変化を受けやすく、主に炭水化物（セルロース、ヘミセルロース、ペントサン類）、少量のアルブミン、無機物および脂肪ならびに酵母発酵の残りの量のエタノールおよび他の産物を含む。
【００１３】
ライムギの希薄アルコール蒸留廃液の予備処理は、実質的に、固体の除去、非揮発性成分の濃縮および得られた濃縮物のオートクレーブ処理を含む。これらの予備処理の工程は、以下の好ましい特徴を有する：
−ライムギの希薄アルコール蒸留廃液の固体構成成分の、デカンテーションおよびプレート分離機（例えば、SA1型Westfalia Separator AG, Oelde, Germany）を用いる分離による除去。廃棄されるべき固体含有画分の容量は、ライムギの希薄アルコール蒸留廃液の容量の約３０％〜約５０％の量である。
−バキュームロータリーエバポレーター(例えば、VUV20-I型、Schott & Gen, Jena, Germany)を、約４０℃〜約５０℃の沸騰温度で、固体を含まないライムギの希薄アルコール蒸留廃液の温度に対応した蒸気圧で用いる、固体を含まないライムギの希薄アルコール蒸留廃液の非揮発性成分の濃縮。これらの条件下で、固体を含まないライムギの希薄アルコール蒸留廃液の約８０％〜約９０％という所望の容量の減少が約１時間で達成される。非揮発性成分の濃度は、したがって、約１：５〜約１：１０になる（約５〜約１０倍）
−濃縮した固体を含まないライムギの希薄アルコール蒸留廃液の少なくとも約３０分間の約１２１℃（便利には、１２１±１℃）でのオートクレーブ処理。
【００１４】
予備処理したライムギの希薄アルコール蒸留廃液だけでなく、他の炭素源も、本発明による方法の栄養培地のために考慮される、すなわち、とりわけ、ラクトース、セルロース、キシラン、コムギフスマ、グルコースシロップおよび噴霧乾燥したコーンスティープリカー（corn steep liquor）である。
【００１５】
特に好ましいさらなる炭素源は、ラクトース、セルロース、オートムギの包頴のキシランである。
【００１６】
栄養培地のための窒素源としては、とりわけ、硫酸アンモニウム〔（ＮＨ4)2ＳＯ4〕、アンモニア水〔ＮＨ3−Ｈ2Ｏ〕および脱脂した大豆粗びき粉（有機窒素源として）が考慮される。窒素含有量は、便利には、炭素源を基にして、少なくとも２０％の量である。
【００１７】
リン酸二水素カリウム（ＫＨ2ＰＯ4）は、例えば、栄養培地のためのリン源として考慮に入れる。リン含有量は、便利には、炭素源を元にすると少なくとも２．５％である。
【００１８】
栄養培地は、便利には、さらなる塩を含有し、そのため、とりわけ硫酸マグネシウム、硫酸鉄、硫酸マンガンおよび硫酸亜鉛ならびに塩化カルシウムおよび塩化コバルトが考慮される。栄養培地は、リン源、好ましくはリン酸二水素カリウムおよび／または塩、好ましくは硫酸マグネシウム、硫酸鉄、硫酸マンガンおよび硫酸亜鉛、ならびに塩化カルシウムおよび塩化コバルトもまた有することができる。
【００１９】
栄養分の更なる成分として、例えば、消泡剤、例えばＭ−３０(Serva Feinbiochemica, Heidelberg, Germany)、Glanapon DG102(Bussetti, Vienna, Austria)またはMAZU 8005(Quest International, Cork, Ireland)を用いることができる。
【００２０】
本発明の方法において、約３５〜約４５g/l、好ましくは約４０g/lの、培養培地の全容量を元にすると１０倍に濃縮された予備処理したライムギの希薄アルコール蒸留廃液が用いられる。Trichoderma reeseiの接種の容量は、便利には、培養培地の全容量の約１０％の量である。
【００２１】
培養のためのpH値は、便利には、約５．５〜約６．５の範囲にあり、好ましくは約６．０である。培養培地中でのpH値の調整は、便利には、（ＮＨ3をもとにして）約１２．５％〜約２５％の濃度のアンモニア水により行われる。
【００２２】
培養温度に関しては、便利には約２８℃〜約３４℃、好ましくは３１℃である。
【００２３】
用いる発酵装置は、完全に従来の培養容器（発酵槽）であってよく、外からの感染を排除するため、予防措置が採られている。そのような培養容器は、通常、とりわけ、空気供給のための撹拌装置(arrangement)およびガス化装置があるが、それは、本発明により行われる培養が微生物の通気液体培養だからである。撹拌速度および空気供給は、便利には、培養培地中の酸素含有量が酸素飽和値の約１０％よりも下がらないように調節される。
【００２４】
本発明による方法を行うのに特に適しているのは、最初の工程（バッチ相）にバッチ発酵、それに続く基質誘導工程（流加相）を含むいわゆる「流加培養技術」である。このバッチ相は、栄養培地中での菌糸体の培養のために供され、それにより発酵槽の注入（接種）が便利に３つの工程(ｉ)〜(iii)で行われる。
【００２５】
（ｉ)微生物の保存株から傾斜培養した寒天培養物の分生子を、滅菌水道水ですすぐ。この水には便利には乳化剤、例えばTween（登録商標）80（好ましくはこの場合、約１g/lの濃度）を含有する。分生子懸濁物は、少なくとも５×１０8分生子/l、特に５×１０8〜１×１０9/lに適切に調整される。
【００２６】
(ii)Ｃ−源としてグルコースまたはセルロース、リン酸、硝酸、尿素、ペプトンおよび微量元素を基にしたTrichoderma reesei属の微生物用の公知の栄養培地を適切に有する振盪フラスコ〔例えば、R.Haapala, E.Parkkinen, P.Suominen and S. Linko, “Production of extracellular enzymes by immobilized Trichoderma reesei in shake flask cultures”, Appl. Microbiol. Biotechnol. 43, 815-821(1995)を参照〕に工程（ｉ）で製造された分生子懸濁物を注入する。栄養培地に対する分生子懸濁物の容量比は、便利には約１：２５〜約１：５０である。これらの振盪フラスコ内で、分生子を約３１℃±１℃（３０℃〜３２℃）で、便利には約３１℃で、振盪振動数を約２００〜約３００rpmで、好ましくは約２５０rpmで、良く分枝した分生子を有する培養培地が形成されるようになるまで培養する。胞子の形成は認められるべきではない。
【００２７】
(iii)発酵槽には、工程(ii)で生成された培養培地が注入され、その結果、発酵槽内の栄養培地に対する培養培地の容量比は、便利には、約１：５〜約１：１０、好ましくは約１：５である。
【００２８】
酵素の形成は、主に続く流加培養相で起きる。誘導物質として基質溶液、好ましくは予備処理したライムギの希薄アルコール蒸留廃液、有機窒素源として脱脂した大豆粗びき粉または大豆粗びき粉の浸漬液(soya meal liquor)、ならびに炭素源としてラクトースの添加(基質誘導)は、分生子の特異的な二酸化炭素の放出の制御装置または分析的に補助された工程制御という手段により適切に調整される。基質誘導は、例えば、発酵により排出されたガスの二酸化炭素濃度という手段により測定することもできるし、あるいは経験に基づいて決定された時間管理により行うこともできる。
【００２９】
本発明の別の面によると、さらなる脱脂した大豆の粗びき粉または大豆の粗びき粉の浸漬液は、（さらなる）窒素源として用いられる。さらなるキシラナーゼ産生の増加は、脱脂した大豆の粗びき粉または大豆の粗びき粉の浸漬液の予備処理したライムギの希薄アルコール蒸留廃液への添加により達成されることが確立された。したがって、脱脂した大豆の粗びき粉または大豆の粗びき粉の浸漬液は、キシラナーゼ誘導物質の作用を有すると考えられる。したがって、脱脂した大豆の粗びき粉または大豆の粗びき粉の浸漬液をさらなるキシラナーゼ誘導物質かつ窒素源として用いることができる。
【００３０】
脱脂した大豆粗びき粉は、大豆を挽いた便利な市販の製品である。培養培地中の脱脂した大豆の粗びき粉の濃度は、便利には、バッチ相で栄養培地に対して約２０〜３０g/l、流加培養相で基質溶液に対して約１５〜２５g/l、好ましくはそれぞれ、約２５g/lおよび２０g/lである。
【００３１】
代わりに用いられる大豆粗びき粉の浸漬液は、脱脂した大豆粗びき粉の成分の水溶液である。大豆粗びき粉の浸漬液は、脱脂した大豆粗びき粉を水に懸濁することにより製造される（約３５g/l）。この懸濁物を、約１０分間沸騰させ、室温にまで冷却した後、固体構成成分を濾過して除く。固体を含まない濾液（大豆粗びき粉の浸漬液）の容量は、濾過前の大豆粗びき粉懸濁物の容量の約８０％である。大豆粗びき粉の浸漬液は、好ましくは流加培養相で、脱脂した大豆粗びき粉の重量に相当する大豆粗びき粉の浸漬液の容量で、脱脂した大豆粗びき粉の代替物として用いられる。
【００３２】
本発明により製造された酵素複合体の懸濁物の分離およびその精製と濃縮は、それ自身公知の方法により行うことができる。これの基本的な要件は、低い培地温度(約５℃〜約１５℃)、低いpH値(約４〜４．５)、ならびに無菌条件である。その手順は便利には：
−発酵培地からバイオマスを遠心分離または濾過ならびに精密濾過(microfiltration)により分離すること；
−限外濾過により酵素複合体を濃縮すること；
−固体酵素調製物の製造のため、酵素複合体の濃縮の次に噴霧乾燥を行うことができること、
を含む。
【００３３】
本発明により得られた酵素複合体の主な適用分野は、動物飼料製造における食品添加物としての利用である。この酵素複合体は、未処理発酵培地として、培養の濾液として、酵素濃縮物として、または固体調製物として用いられる。
【００３４】
本発明は以下の実施例により例示される。
【００３５】
【実施例】
キシラナーゼが豊富な酵素複合体を、Trichoderma reesei Ｍ１８．２−ｙ（ＤＳＭ７５３７）を用いて流加培養で製造した。
【００３６】
ライムギの希薄アルコール蒸留廃液の製造については、ライムギの希薄アルコール蒸留廃液の固体を含まない画分を減圧下で約５０℃で７．５倍に濃縮し、１２１℃で３０分間オートクレーブにかけた。
【００３７】
バッチ相のための栄養培地の製造については、ラクトース２０．８g/l、微結晶セルロース８．３g/l、脱脂した大豆粗びき粉２５g/l、ライムギの希薄アルコール蒸留廃液濃縮物３３．３ml/l、ＫＨ2ＰＯ4 ３．７５g/l、（ＮＨ4）2ＳＯ4６．０g/l、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．５g/l、ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ ０．５g/l、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ６．２５mg/l、ＭｎＳＯ4・Ｈ2Ｏ ２．０mg/l、ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １．７５mg/lおよびＣｏＣｌ2・６Ｈ2Ｏ ２．５mg/lからなる１８００mlの栄養培地を１２１℃で５lの発酵槽内で２０分間オートクレーブ処理し、１２．５％のアンモニア水でpHを６．０に調整した。
【００３８】
流加培養用の基質溶液の製造については、ラクトース３００g/l、セルロース１０g/l、大豆粗びき粉の浸漬液５００ml/l、およびライムギの希薄アルコール蒸留廃液の濃縮物１０７ml/lからなる基質および誘導物質の溶液１０００mlを１２１℃で２０分間オートクレーブ処理した。（大豆粗びき粉の浸漬液５００mlの製造は、大豆粗びき粉２０ｇを６００mlの水に懸濁し、懸濁物を１０分間沸騰させ、固体含有物を濾過した。）
【００３９】
バッチ相では、発酵槽は、３００mlの振盪フラスコ前培養物により接種された。適当な接種物を調整するため、１g/lのTWEEN（登録商標）80（ポリエトキシソルビタンオレエート）を含有する滅菌水道水約３mlずつを、保存株からの２つの斜面培養寒天チューブに入れ、両方の寒天の表面からの分生子を振り落とした。次の工程では、それぞれ１００mlの栄養培地の入った３つの振盪フラスコに、等量の分生子懸濁物を注入した。栄養培地は、グルコース２０g/l、ＫＨ2ＰＯ4１５．０g/l、（ＮＨ4）2ＳＯ4 ４．８g/l、ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ ０．３g/l、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．３g/l、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ５．０mg/l、ＭｎＳＯ4・Ｈ2Ｏ １．６mg/l、ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １．４mg/lおよびＣｏＣｌ2・６Ｈ2Ｏ ２．０mg/lからなる。次いで、振盪フラスコ前培養物を３１℃で、振盪の振動数が約２５０rpmで培養した。培地のpH値は、調整も調節もしなかった。培養の開始時にはpH値は約５で、最後には約３．５であった。約２８時間の培養時間の後、発酵槽にこれらの振盪フラスコ前培養物を注入した。次いで、pH値を１２％アンモニア水で６．０に調整した。酸素含有量は、スターラーカスケード調節を用いて、３１℃での酸素飽和値の約１０％に保持した。２１時間培養した後、発酵槽排出ガス中で最初にＣＯ2最大が上回り、したがってバッチ相の終了に達した。
【００４０】
流加培養相については、基質の不連続な添加を、排出ガス中のＣＯ2含有量が最初の最大の８０％まで下がった後に行った。それぞれの添加によりさらなるＣＯ2最大に至った。この添加は、排出ガス中のＣＯ2含有量が以前の最大の８０％まで下がった後に、自動的に一部分ずつ行った。基質溶液の添加容量は、培養培地１lあたりラクトース１．５ｇ、および５０時間発酵の培養培地１lあたりラクトース２．０ｇの添加に相当した。
【００４１】
発酵は、７２時間後に、１０℃まで冷却しpH値を４．５に調整することにより終了させた。胞子を濾過により除き、残りの発酵溶液を分析した。発酵培地中の酵素活性は：
キシラナーゼ：                            ２６２５U/ml
β−グルカナーゼ：                          ５５５U/ml
カルボキシメチルセルラーゼ(CMCase)          ３３０U/ml
であった。発酵培地中に溶解したタンパク質の濃度は、１７．０g/lであった。
【００４２】
酵素およびタンパク質の測定
キシラナーゼ（エンド−１，４−β−キシラナーゼ）の活性は、４０mM酢酸ナトリウム緩衝液中（pH６．０）０．５％キシラン懸濁物（オートムギの包頴由来のキシラン、Roth）と５０℃で２０分間インキュベーションすることにより測定した。１単位のキシラナーゼは、１分あたり１モルのキシロースを放出した。
【００４３】
β−グルカナーゼ（エンド−１，３−１，４−β−グルカナーゼ）の活性は、４０mM酢酸ナトリウム緩衝液中（pH６．０）０．５％リケニン懸濁物(lichenin、Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany)と５０℃で２０分間インキュベーションすることにより測定した。
【００４４】
ＣＭＣase（エンド−１，４−β−グルカナーゼ）の活性は、４０mM酢酸ナトリウム緩衝液中（pH６．０）２．０％カルボキシメチルセルロースナトリウム塩溶液（Carl Roth GmbH）と５０℃で２０分間インキュベーションすることにより測定した。１単位（Ｕ）のβ−グルカナーゼまたはＣＭＣaseは、１分あたり１モルのグルコースを放出した。
【００４５】
タンパク質の測定は、bicinchonic acidに基づくLowryによる変法を用いてタンパク質沈殿（トリクロロ酢酸の添加）に続いて行った。Sigma Proceduer No. TRPO-562(Sigma Chemical Co. St.Leuis, USA)。