(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、標的核酸試料中の候補座位（locus）における特定の核酸配列の有無の迅速な検出方法：
i）前記候補座位の事前選択された一つまたはそれ以上の位置（position）へＤＮＡグリコシラーゼに対する基質である修飾塩基を導入し；
ii）非塩基（abasic）部位を生じるように、前記ＤＮＡグリコシラーゼにより修飾塩基を切除（excise）し；そして
iii）工程ii）で生じた非塩基（abasic）部位のリン酸結合を切断し（cleave）;
iv）前記標的核酸配列中の前記候補座位の前記特定の核酸配列の有無を同定するために、工程iii）の切断産物を解析すること。
【請求項２】
正常なＤＮＡ前駆体ヌクレオチドおよび少なくとも一つの被修飾前駆体ヌクレオチドを組み合わせて用いることで候補座位を増幅する、請求項１の方法。
【請求項３】
少なくとも一つの増幅プライマーが候補座位に隣接する、請求項２の方法。
【請求項４】
少なくとも一つのプライマーを標識する、請求項３の方法。
【請求項５】
少なくとも一つの前駆体ヌクレオチドを標識する、請求項２から４のいずれか一項の方法。
【請求項６】
化学修飾によって修飾塩基を候補座位に導入する、請求項１から５のいずれか一項の方法。
【請求項７】
ＤＮＡグリコシラーゼ酵素がウラシルＤＮＡグリコシラーゼである、請求項１から６のいずれか一項の方法。
【請求項８】
ＤＮＡグリコシラーゼ酵素の基質を固定化する、請求項７の方法。
【請求項９】
アルカリで処理することによって非塩基部位のリン酸結合を切断する、請求項１から８のいずれか一項の方法。
【請求項１０】
熱処理によって非塩基部位のリン酸結合を切断する、請求項１から８のいずれか一項の方法。
【請求項１１】
酵素処理によって非塩基部位のリン酸結合を切断する、請求項１から８のいずれか一項の方法。
【請求項１２】
酵素が、非プリンまたは非ピリミジン部位を特異的に切断する酵素である、請求項１１の方法。
【請求項１３】
修飾塩基がウラシルまたはヒポキサンチンである、請求項１から１２のいずれか一項の方法。
【請求項１４】
標的核酸試料がＤＮＡである、請求項１から１３のいずれか一項の方法。
【請求項１５】
ＤＮＡが一本鎖、ホモ二本鎖、またはヘテロ二本鎖ＤＮＡである、請求項１４の方法。
【請求項１６】
標的核酸試料がＲＮＡであり、増幅工程に先だって逆転写によってＲＮＡをｃＤＮＡに変換する、請求項２から１３のいずれか一項の方法。
【請求項１７】
切断産物を特異的核酸プローブによるハイブリダイゼーションによって検出する、請求項１から１６のいずれか一項の方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、標的核酸試料中の候補座位の特定の核酸配列の存在の有無を迅速に検出するための方法に関する。特に、本発明はDNA試料における特定の突然変異を検出するための方法に関する。
背景となる技術
標的核酸試料中の候補座位の特定の核酸配列の検出は、遺伝性障害および感染性疾患の診断に関していくつかの理由で非常に重要である。多くの異なる突然変異を検出することは、特定の遺伝的障害の存在をスクリーニングするために必要である。増幅したDNA試料において特定の配列を検出することにより、注目をする生物そして特に感染性の生物を検出するための近年のDNA診断方法が顕著に改善される。候補座位における配列の検出に関する近年の技術は、扱いにくく、特異性に欠け、最適化および使用が困難であるか、または試料の量が多くなると、適応性が乏しいかのいずれかである。
標的核酸試料中の候補座位の特定の核酸試料を検出するための既知の方法がいくつかある。これらの方法の詳細を以下に述べる。
１）制限酵素解析
制限酵素解析による特定のDNA配列の検出。制限酵素は特定のDNA配列を切断する。例えば、EcoRI酵素は、二本鎖DNAをGAATTCの配列で切断する。従って、特定のDNA試料中の候補座位がEcoRIで切断されるかを確認することによって、候補座位にGAATTC配列が存在するか存在しないかを決定できる。候補座位の制限部位の出現または消失によって、候補座位の配列中で１つまたはそれ以上の塩基配列が変化したことが示唆される。従って、候補座位における制限部位の出現または消失は、各々の制限部位のいずれかの塩基または複数の塩基の変化を含みうる。それゆえ、候補座位における制限部位の出現または消失からは、研究者は厳密な配列変化知り得ない。しかし、候補座位における特定の配列を検出するための制限酵素の使用にともなういくつかの問題点がある。これには以下を含む：
a）候補座位における特定の配列の存在の有無は、一般に制限部位に起こらない；
b）異なる制限酵素は異なる認識配列を持つため、異なる制限酵素が、一般に異なる候補座位における特定の配列の存在の有無を検出するために必要である；そして
c）異なる酵素は異なる候補座位における特定の配列の存在の有無を検出するために必要であるために、量が大量になると、この手法により遂行することは困難になり、かつ自動化は困難である。
２）DNAシーケンス
DNAシーケンスは、いかなる候補座位の特定の配列も検出可能である。DNAシーケンスの主要な方法は、ジデオキシ法またはチェーンターミネーション法としても知られているサンガー法（Sanger, F.およびCoulson, A.R.（1975）J.Mol.Biol. 94,444-448）、および化学法としても知られているマキサム・ギルバート法（Maxam, A.M.およびGilbert, W.（1977）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74,560-564）である。
DNAシーケンスは特定の候補座位に特定の配列が存在するかまたは存在しないかを決定する究極的な手法であるが、以下のようないくつかの好ましくない点がある：
a）異なる候補座位における特定の配列の存在の有無を日常的に検出するにはやっかいで困難な方法である；
b）与えられた候補座位における特定の配列の存在の有無を決定するためにはフルサイズのシーケンスゲルが必要である；
c）解析に使用するDNA試料は、質の高いDNA配列を得るために高品質であることが必要がある；
d）直接増幅したDNA試料のDNAシーケンスは一般に問題点が多い；
e）シーケンスゲルはしばしば解読困難でありうる；
f）高い成功率で大量に読むことは達成困難である；
g）DNA配列の中には他と比較して入手困難であるものもある；そして
h）候補座位における特定の配列の存在の有無を検出するために、多くの異なる大きさのDNA断片を解読することが必要である。
３）ウラシル干渉
増幅したDNA分子中にウラシルをランダムに低レベルでとりこませる方法が示された。これは、通常のDNA前駆体ヌクレオチドおよびdUTPの存在下においてDNAを増幅することによって行われる。dTTPおよびdUTPの比率を選択し、それにより増幅過程においてdTTPがアデニン残基の反対に高頻度で取り込まれるのに対して、dUTPが鋳型鎖のアデニン残基の反対側に時々取り込まれる。この結果、増幅分子の中全体に、低量のウラシル残基がランダムに分布している産物の母集団が得られる。ウラシルグリコシラーゼで増幅産物を処理し、非塩基部位（abasic）を切断することで、結果的にウラシル残基が取り込まれた位置で分子が切断される。ウラシルがアデニン残基の反対側に低レベルでランダムに取り込まれるために、異なる分子はウラシル残基が取り込まれた場所に依存して切断される。従って、増幅過程において使用したプライマーのうちひとつを標識して、DNAシーケンスゲルですべての切断産物を分離すれば、増幅したDNA試料の片側鎖に取り込まれたウラシルの位置の総数を決定することが可能である（Tu, W.T.およびStruhl, K.Nuc. Acids Res.,（1992）20,771-775.Devchand, P.R.ら,Nuc.Acids Res.（1993）21,3437-3443）。
概要を示した手法の主な応用は、DNAフットプリントである（特定のタンパク質が結合するDNAの塩基を同定するために使用する方法）。
ウラシル取込み法は、増幅したDNA試料におけるウラシル残基の総数の位置を決定するのに使用可能である。しかし、
a）特定の候補座位におけるウラシル残基を迅速に検出するのにはやっかいで困難な方法である；
b）特定の候補座位におけるウラシル残基を決定するためには、フルサイズのシーケンスゲルが必要である；
c）シーケンスゲルはしばしば解読/読みとりが困難である；そして
d）特定の候補座位におけるウラシル残基を検出するのに、多くの異なる大きさのDNA断片を解読することが必要である。
４）ミスマッチヌクレオチドグリコシラーゼの使用
ミスマッチヌクレオチドグリコシラーゼを使用した２例は、点突然変異の検出について報告している（Lu, A-LおよびShu, I-C,Genomics（1992）14, 249-255およびHsu, I-Cら、Carcinogenesis（1994）14, 1657-1662）。問題のグリコシラーゼは、一般的なグリコシラーゼ活性およびG/Tミスマッチを切断するヒトチミジンDNAグリコシラーゼにより、A/Gミスマッチのミス対合したアデニンを効率的に解離させ、A/Cミスマッチのミス対合したアデニンを非効率的に解離させるE. coliのMutY遺伝子産物である。これらの酵素は、ミスマッチが存在する増幅したヘテロ二本鎖DNA分子中の変異を検出するのに使用されてきた。増幅反応に使用したプライマーのうちひとつを標識することで、グリコシラーゼ処理、非塩基部位（abasic）での切断、そしてゲル電気泳動で断片を解読した後にミスマッチの位置を検出することが可能である。
この方法には以下に述べるいくつかの問題点がある：
a）この方法は、問題のある場所でミスマッチ塩基対が形成さているヘテロ二本鎖分子が形成されることに依存する。従って、ホモ接合体である試料における変異の検出には、外部のプローブを提供する必要があり、そしてミスマッチを生じるようなハイブリダーゼーションを行った；
b）この方法は、ミスマッチの位置を検出することは可能であるが、ミスマッチ部位の配列は必ずしも検出することができない；そして
c）すべてのミスマッチが等しい効率で認識されるとは限らない。
５）ミスマッチ塩基対の切断に基づく他の方法
ミスマッチ塩基対の切断に基づく他のいくつかの方法が、点突然変異、欠失変異および挿入変異を検出することについて示されている。これらは、ミスマッチ塩基対部位の化学的な切断、ゲル電気泳動でホモ二本鎖分子が迅速に移動するのに対してヘテロ二本鎖はゆっくりと移動することに基づいたヘテロ二本鎖の検出を含む。RNA:DNAハイブリッドにおけるミスマッチのRNAse切断および酵素的手段によるミスマッチの切断。
上述のすべての方法により、ヘテロ二本鎖における変異を検出でき、核酸分子内のおよその変異の位置を決定することが可能である（試料中の突然変異の存在の情報を与えるだけのヘテロ二本鎖電気泳動遅延法の場合を除く）。しかし、これらの方法は、ヘテロ二本鎖の場合にのみ機能し、候補座位に特定の配列が存在することについて推測（演繹）することは不可能である。
６）リガーゼ連鎖反応
リガーゼ連鎖反応（LCR）は、候補座位における特定の標的配列の存在の有無を決定するために使用可能なプローブ増幅方法である。これは、変性した標的DNA鎖上に互いに隣り合ってハイブリダイゼーションする２対のオリゴヌクレオチドを結合させるDNAリガーゼ酵素を使用する。酵素は２つのオリゴヌクレオチド間にホスホジエステル結合を形成させ、それによって結合部位のオリゴヌクレオチドが鋳型に正確にハイブリダイゼーションするようになる。従って、結合部位においてオリゴヌクレオチドと標的配列との間で正確に対合すると、オリゴヌクレオチドがライゲーションして結果として両方のオリゴヌクレオチドを相加した大きさの大きな産物を形成することができる。アニーリング、ライゲーションおよび変性を何回も繰り返すと、結果としてより大きな産物が対数的に増幅する。従って、より大きな産物が存在しない場合には、オリゴヌクレオチド配列および鋳型DNA配列の間に相違があるということを意味する一方、より大きな産物の検出は、候補座位に配列が存在することを示唆する。
この方法は候補座位の特定の配列を検出するための潜在力は高く、大量の試料を処理することも可能であるが、候補座位に特定の配列が存在することについて推測（演繹）することが不可能である。加えて、この方法は過程を最適化するためにかなりの努力が必要である。
７）ARMS法
ポリメラーゼ連鎖反応において使用する適切なプライマーを設計することによって、候補座位の特定の配列の存在の有無を検出することが可能である。増幅耐性法（ARMS）としてして知られているこの方法では、プライマーの3′末端と標的配列が完全に一致する場合にのみ標的配列の増幅が起こるようなプライマーを設計する。従って、プライマーのうちひとつが標的試料の与えられた配列に相補的で、相手となるプライマーの3′末端が候補座位の野生型配列に相補的であるように１対のプライマーを設計した場合に、この１対のプライマーは、候補座位に野生型配列が存在する場合にのみ増幅産物をつくりだしうる。3′末端が候補座位の突然変異配列に相補的であるように第３のプライマーを設計した場合、標的試料の与えられた配列に相補的なプライマーと共に使用した場合には、このプライマーにより候補座位に変異配列が存在する場合には増幅産物が生産される。この方法による問題点は以下のようである：
a）候補座位に野生型または変異配列が存在するかを決定するために３つのプライマーが必要である；
b）この方法により候補座位に特定の配列が存在することを推測（演繹）することは不可能である；および
c）ARMS法のアニーリング条件は厳密でなければならず、したがってこの方法を多くの場合に転用することは困難であり、また調べる各々の変異について、最適化しなければならない。
従って、核酸診断分野において、迅速に大量の試料について候補座位の特定の配列を検出するためのしっかりした方法が必要である。
発明の説明
本発明は、以下の工程を含む標的核酸試料における候補座位の特定の核酸配列の存在の有無を迅速に検出するための方法を提供する：
i）前記候補座位の中の１つまたはそれ以上のあらかじめ選択した位置へ、DNAグリコシラーゼの基質である修飾塩基を導入し；
ii）非塩基部位（abasic）を作成するために前記DNAグリコシラーゼにより修飾塩基を切断し；
iii）工程ii）において生じた非塩基部位（abasic）のリン酸結合を切断し；および
iv）前記標的核酸配列中の前記候補座位における前記特定の核酸配列の存在の有無を特定するための工程iii）の切断産物を解析すること。
本発明による方法は、単一の酵素および単一の工程がDNAにおける多くの既知の変異を検出するために使用可能である現在知られている方法よりも、顕著な利点を提供する。従って、大量の試料も、本明細書の以下に例示するように迅速に容易に処理可能である。
本発明にしたがった方法により、遺伝子変異のような特定の配列が本明細書中において”候補座位”として既知の特定の位置に存在するか否かを決定するために標的核酸を調べることが可能である。
好ましくは、候補座位は正常なDNA前駆体ヌクレオチドおよび少なくとも１つの修飾前駆体ヌクレオチドを使用して増幅する。
本明細書中において使用した”増幅”という用語は、単一のまたは複数種のヌクレオチド配列のコピー数を増幅させるin vitroにおける過程のことである。標的試料の増幅により、結果として増幅されるDNAへ前駆体ヌクレオチドが取り込まれる。一般的には、標的試料の増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）にて適切なプライマーを使用して行う。標的試料の増幅は、リガーゼ連鎖反応（LCR）および短いPCR工程を使用した変形LCR（PLCR）を使用しても、行うことができる。DNA増幅過程の場合における前駆体ヌクレオチドは、本明細書中で”正常な”DNA前駆体ヌクレオチドとして述べたデオキシリボヌクレオチドであるdATP,dCTP,dGTPおよびdTTPとして述べる。本明細書中で使用した修飾前駆体ヌクレオチドは、核酸中に取り込まれた後DNAグリコシラーゼ酵素によって認識される基質の単一または複数の塩基（グリコシラーゼ基質塩基）を形成することができる修飾された単一または複数のヌクレオチドである。
増幅は一般的には、正常なDNA前駆体ヌクレオチドおよび１つまたはそれ以上の修飾前駆体ヌクレオチドを使用して、結果として修飾前駆体ヌクレオチドが正常な前駆体ヌクレオチドの一つに置換されるような標的核酸試料を増幅することに関する。増幅産物中への修飾前駆体ヌクレオチドの取込みにより、１つまたはそれ以上の位置に増幅産物中でDNAグリコシラーゼ酵素によって認識される１つまたはそれ以上のグリコシラーゼ基質塩基を生成する。標的核酸試料のすべてまたは一部の候補座位に特定の配列が存在するかもしれないし、または標的核酸試料には存在しないかもしれない。
さらに好ましくは、すくなくともひとつの増幅用プライマーは候補座位に隣接して位置している。
従って、増幅の目的に適したプライマーは、プライマーのうちひとつが候補座位に隣接した位置に（本明細書中においては”隣接プライマー”と呼ぶ）存在し、増幅過程のあいだ、伸長する隣接プライマーへの最初の修飾前駆体ヌクレオチドの取込みの位置が、候補座位に存在する特定の配列に従って候補座位または候補座位から離れている場所になるように設計する。本明細書中において使用した１対のプライマーのうちもうひとつのプライマーは、本明細書中にて後に定義するように”末端プライマー”と呼ぶ。
修飾前駆体ヌクレオチドが候補座位にのみ取り込まれるか、またはまったく取り込まれないように隣接および末端プライマーを設計すると、増幅した標的核酸試料中に特定の配列が存在するかまたはしない場合にも、グリコシラーゼの標的塩基を持つ標的鎖が切断されて２つの断片になる。
標的試料の標的鎖の増幅は、標的核酸試料の相補的な標的鎖の相補領域にアニーリングする隣接したオリゴヌクレオチドプライマーを使用して行うことが可能である。増幅過程において隣接プライマーのプライマー伸長を行うと、5′から3′方向に前駆体ヌクレオチドおよび修飾前駆体ヌクレオチドが取り込まれる結果となる。増幅過程において隣接プライマーの伸長によって生成される増幅DNA鎖は、本明細書中において”標的鎖”と呼ぶ。増幅過程においてもうひとつのプライマー（本明細書中で”末端プライマー”と呼ばれている）の伸長によって生成される増幅DNA鎖は、本明細書中において”相補的な標的鎖”と呼ぶ。標的試料の相補的な標的鎖の増幅は、標的核酸試料の標的鎖の相補領域にアニーリングする末端オリゴヌクレオチドプライマーを使用して行うことが可能である。増幅過程における末端プライマーのプライマー伸長を行うと、5′から3′方向に前駆体ヌクレオチドおよび修飾前駆体ヌクレオチドが取り込まれる結果となる。標的配列の両方の鎖の増幅は、隣接および末端プライマーを両方用いて行うことが可能である。PCR過程において、繰返し増幅サイクルを行う。この場合の増幅断片の大きさは、標的核酸試料の鎖に隣接および末端プライマーがアニーリングする位置によって決まる。
標的試料における候補座位の突然変異のような特定の配列の検出のためには、隣接プライマーが候補座位に近接した場所にあり、それにより増幅過程のあいだ、伸長する隣接プライマーへの最初の修飾前駆体ヌクレオチド取込みの位置が、候補座位に特定の配列が存在するかいないかに従って候補座位または候補座位の末端の場所になるように、増殖用プライマーを設計する。候補座位の修飾前駆体ヌクレオチドの取込み位置が望ましい場所であった場所に、プライマー内の塩基すべてが、プライマー配列に相補的な新規に合成されたDNA中へのかぎとなる修飾前駆体ヌクレオチドではなくむしろヌクレオチドの優先的な取込みが促進されるようにプライマーを設計する（鍵となる修飾前駆体ヌクレオチドとは、特定の配列の存在の有無により、候補座位に取り込まれるべき修飾前駆体ヌクレオチドをいう。）。例えば、dUTPが修飾塩基ヌクレオチドである場合には、シトシン、グアニン、チミン、イノシンまたはプライマー配列に相補的な新規に合成されたDNA中へのウラシル残基の取込みを妨げる修飾塩基（ウラシル以外）によってアデニンを置換するようにプライマーを合成する。dITPが修飾塩基ヌクレオチドである場合には、グアニン、チミン、アデニン、ウラシルまたはプライマー配列に相補的な新規に合成されたDNA中へのイノシン残基の取込みを妨げる修飾塩基（イノシン以外）によってシトシンを置換するようなプライマーを合成する。標的差の候補座位での切断に加えて、プライマー内の特定の点での切断が望ましいものである場合には、１つまたはそれ以上のグリコシラーゼ基質塩基がプライマー内の決まった単一または複数の位置に存在するようにプライマーを合成する。増幅過程の後に適切なグリコシラーゼでプライマーを処理すると、単一または複数の特定の位置でプライマーが切断される結果となる。このようにプライマーを設計すると、候補座位の特定の配列の存在の有無を示唆する標的鎖の特定の断片の検出が促進され、望む場合には検出過程で妨害しないような大きさにプライマーを小さくできる。
適切には、本発明にしたがって増幅方法を使用する場合には少なくともひとつのプライマーを標識する。増幅過程に先立ってプライマーのうちひとつを標識しておくと、増幅した標的鎖または相補鎖のみを検出することが可能である。プライマーの標識は、プライマーを合成するあいだまたは合成した後にプライマーに放射性物質、蛍光、または検出可能なリガンドを添加することを含むさまざまな方法で行うことが可能である。増幅過程において、標識した前駆体ヌクレオチド（すなわち、放射性標識した前駆体ヌクレオチド、または蛍光または検出可能なリガンド基に結合した前駆体ヌクレオチド）を使用すると、取り込まれた標識を持つ標的鎖および相補的な標的鎖およびグリコシラーゼによる切断過程によって得られたDNA断片の検出が促進される。銀染色または臭化エチジウム染色のようなDNA染色方法により、断片を分離した後に増幅した標的核酸試料のグリコシラーゼによる切断の結果生じたすべての断片の検出が促進される。あるいは、標的鎖および相補的な鎖およびグリコシラーゼによる切断の結果として得られた断片の検出は、適切な核酸ハイブリダイゼーションプローブを使用して行うことが可能である。
修飾塩基は候補座位に存在する塩基を化学的に修飾することによって導入することが可能である。
特定のDNAグリコシラーゼ酵素によって認識されるように特定の化学物質でDNAを処理することで、存在する塩基を修飾するいくつかの方法が存在する。例えば、メチルニトロソウレアのようなアルキル化試薬でDNAを処理すると、アルキルプリンDNAグリコシラーゼで認識され切除されるN3-メチルアデニンおよびN3-メチルグアニンを含むいくつかのアルキル化塩基が生じる。二硫化ナトリウムでDNAを処理すると、DNAのシトシン残基の脱アミノ化が起こりDNA内にウラシルDNAグリコシラーゼにより切断することができるウラシル残基を形成する。
従って、先行技術の知識では、増幅した標的核試料の候補座位に存在する塩基は、化学的手法によりグリコシラーゼで認識可能な基質に変換可能である。例えば、候補座位に存在するシトシンは、容易にウラシルに変換できるので、増幅した試料は候補座位でのウラシルDNAグリコシラーゼ切断を受けやすくなる。シトシンではなくて5-メチルシトシンを含むような隣接プライマーを合成した場合、5-メチルシトシンが脱アミノ化されるとウラシル残基ではなくてチミン残基を生じるので、プライマーはウラシルDNAグリコシラーゼによる切断に耐性となりうる。
好ましくは、修飾塩基はDNAグリコシラーゼ酵素により切除（または切断）される。
従って、適切には増幅過程の後に、増幅標的試料中に存在するグリコシラーゼの基質塩基を認識して放出させる適切なDNAグリコシラーゼ酵素で増幅産物を処理し、結果として増幅した標的核酸試料にプリンやピリミジンがない部位が生じる。
修飾前駆体抜くレオ利度がdUTPである場合、グリコシラーゼの基質塩基であるウラシルが増幅した標的核酸試料に生じうる。試料にウラシルDNAグリコシラーゼを添加すると、試料からウラシルが放出する。修飾前駆体ヌクレオチドがdITPである場合、グリコシラーゼの基質塩基であるヒポキサンチンが増幅した標的核酸試料に生じる。試料にアルキルプリンDNAグリコシラーゼを添加すると、試料からヒポキサンチンが放出する。増幅した標的核酸試料からグリコシラーゼの基質塩基が放出されると、ウラシルの場合にはピリミジンではない部位およびヒポキサンチンの場合にはプリンではない部位が生じる。
増幅した標的核酸中の候補座位の特定の配列の有無の結果、増幅標的核酸試料の標的鎖をグリコシラーゼを介して切断することによって、固定化法による検出もまた可能となる。この場合、通常隣り合ったプライマーであるプライマーの一つが、固体マトリックスへの標的鎖の固定を可能にする結合した「捕獲」試薬を用いて合成される。プライマーは、修飾された前駆体ヌクレオチドが増幅された核酸試料中の候補座位のみに取り込まれるように設計される。この増幅過程は標識前駆体ヌクレオチドの存在下で実施され、候補座位の末端（3′）に位置する伸長した隣接プライマー中に標識が取り込まれる。増幅した標的鎖の固定化は、増幅した標的鎖を、捕獲試薬と特異的に結合する分子を持つ固体マトリックスと共にインキュベートすることによって達成される。次に、変性剤で洗浄し、固定化されない全ての物質を切除することによって、相補的標的鎖の切除が行われる。グリコシラーゼの基質塩基が候補座位に存在する場合、グリコシラーゼ媒介性切断反応によって、標的鎖の標識された部分の遊離が起きる。遊離した断片の切除および遊離したまたは固定化されたままである標識のレベルの測定によって、候補座位における特定の配列の存在の有無が示される。または、標的鎖の標識化が望ましくない場合、特定の核酸ハイブリダイゼーションプローブを用いて検出が行われ得る。このようなプローブは、完全な固定化された標的鎖、グリコシラーゼ媒介性切断反応の後で遊離した標的鎖の部分、または切断反応後に残存する標的鎖の部分を検出するように、容易に設計することができる。
このグリコシラーゼ媒介性切断反応によって、変異部位の周辺のDNA配列が知られている限り、いかなる標的試料中の候補座位のいかなる特定の配列の検出も可能である。増幅反応に適したプライマーを設計するためには、候補座位の両側の少なくとも15から20ヌクレオチドの配列情報が必要である。
現在まで、修飾塩基を認識するDNAグリコシラーゼ酵素の使用は、増幅された標的核酸試料中の候補座位における特定の配列の検出に直接的に用いられてはいない。
グリコシラーゼ媒介性切断反応の主な適用は、前述の固定化法によって、候補座位における特定の配列の有無を検出することがそれによって可能になることである。
適した「捕獲」試薬の一つはビオチンである。即ち、標的鎖の固定化を引き起こすように、固体マトリックスに被覆または結合したストレプトアビジンへの標的鎖の固定化を可能にする、ビオチンが結合したプライマーの一つが適切に合成される。特定の配列が候補座位に存在する、または存在しない場合に修飾前駆体ヌクレオチドが候補座位の標的鎖にのみ取り込まれるようにプライマーを設計する。
適当には、前駆体ヌクレオチドの一つも標識される。上記で示したように、増幅過程は好ましくは標識前駆体ヌクレオチド（例えばα-P32dNTP、蛍光dNTP、またはジゴキシゲニンdNTP）の存在下で実施され、その結果伸長した隣接プライマーに標識が取り込まれる。また、標識前駆体ヌクレオチドを目標のプライマーおよび候補座位の末端（3′）にのみ取り込むことができるように、即ち標識前駆体ヌクレオチドが候補座位と隣接プライマーとの間に取り込まれ得ないように、捕獲基を有するプライマーも設計する。
好ましくは、非塩基部位のリン酸結合がアルカリ処理または他の化学処理、熱処理および酵素による処理から選択される処理によって切断される。
DNAグリコシラーゼの働きによるグリコシラーゼ基質塩基の遊離に続く非塩基部位切断による鎖切断反応は、本明細書ではグリコシラーゼ媒介性切断と呼称する。候補座位における特定の配列の有無によって、増幅された標的核酸試料中の候補座位への修飾前駆体ヌクレオチドの取り込みが起きるかどうかが決定する。即ち、修飾前駆体ヌクレオチドが候補座位に取り込まれる場合、グリコシラーゼ媒介性切断反応によって候補座位において標的鎖の切断が起き、この切断部位は伸長した隣接プライマーの3′末端に最も近い切断部位でありうる。修飾前駆体ヌクレオチドが候補座位に取り込まれない場合、修飾前駆体ヌクレオチドが取り込まれる候補座位の末端の最初の部位において、伸長した隣接プライマーの3′末端に最も近い切断部位での切断が起きうる。即ち、グリコシラーゼ媒介性切断の後で伸長した隣接プライマーの観察される長さから、候補座位における特定の配列の有無が診断可能であると考えられる。
好ましい処理は高温アルカリ、または非プリンまたは非ピリミジン部位を特異的に切断する酵素（例えば大腸菌エンドヌクレアーゼIV）による。これらの処理のいずれも、非プリンまたは非ピリミジン部位を5′側で完全に切断する。グリコシラーゼ基質塩基が増幅された標的鎖中の候補座位に一つだけ存在する場合、グリコシラーゼ媒介性切断反応によって標的鎖は一つの部位でのみ切断され、二つの断片鎖を生じる。用いられるプライマー配列の設計操作によって、標的鎖上の候補座位に加えて、標的および/または相補鎖のいかなる望まれる部位にグリコシラーゼ基質塩基を有する産物を増幅することも可能となり、グリコシラーゼによって切断された増幅標的核酸試料のその後の解析が容易となる。
候補座位における特定の配列の有無によって、グリコシラーゼ基質塩基が標的鎖の候補座位に取り込まれるかどうかが決定される。即ち、これは候補座位に特定の配列が存在するか否かによる増幅された標的鎖のグリコシラーゼ媒介性切断反応によって異なる診断用切断パターンを産生する。また、プライマーは、特定の配列が候補座位に存在する場合にグリコシラーゼ基質塩基が標的鎖に存在しないようにも設計し得る。このような場合、標的鎖はグリコシラーゼ媒介性切断に対して耐性である。
増幅標的核酸試料のグリコシラーゼ媒介性切断による産物/切断パターンは、現行のDNA長決定法（例えばポリアクリルアミドゲル電気泳動、アガロースゲル電気泳動、または高性能液体クロマトグラフィー（HPLC））によって決定され得る。
即ち、本発明に従って増幅法が用いられた場合の伸長した隣接プライマーの大きさは、変性後に現行のDNA長決定法（例えば変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動）によって決定され得る。増幅過程における標識された前駆体ヌクレオチドまたはDNA染色法の利用が、増幅された標的核酸試料のグリコシラーゼ媒介性切断によって生じる全ての断片の検出を容易にしたのに対して、増幅過程に先立つ隣接プライマーの標識化は、切断された伸長した隣接プライマーのみの検出を容易にする。
用いられる修飾塩基は好ましくはラウシルまたはヒポキサンチンである。
即ち、好ましい修飾前駆体ヌクレオチドはdUTPおよびdITPであり、これらはDNAに取り込まれた場合にそれぞれグリコシラーゼ基質塩基のウラシルおよびヒポキサンチンを生じる。修飾された前駆体ヌクレオチドのdUTPは、塩基ウラシルとリン酸化糖分子からなるリン酸化糖塩基である。修飾された前駆体ヌクレオチドdITPは、塩基ヒポキサンチンとリン酸化糖分子からなるリン酸化糖塩基である。DNA中のウラシルは、ウラシルDNAグリコシラーゼ（UDG）によって特異的に認識され、DNAから遊離される。また、ウラシルDNAグリコシラーゼはDNA中に存在するある種の他のウラシル関連塩基を認識する。ヒポキサンチンは、アルキルプリンDNAグリコシラーゼ（ADG）によって特異的に認識され、DNAから遊離される。この酵素はまた、DNA中のN3メチルアデニン、N3メチルグアニン、O2メチルシトシンおよびO2メチルチミンを認識し遊離させる。前駆体ヌクレオチドdATP、dCTPおよびdGTP、および前駆体ヌクレオチドdUTPを用いた標的DNA配列の増幅は、チミンがウラシルに置換された増幅DNAを生じる。増幅過程において、ウラシルは新しく合成されるDNA鎖の鋳型DNA鎖のアデニン残基に相補的な部位に取り込まれる。前駆体ヌクレオチドdATP、dCTP、およびdTTP、および修飾前駆体ヌクレオチドdITPの存在下での標的DNA配列の増幅は、グアニンが優先的にヒポキサンチンに置換された増幅DNAを生じる。他の前駆体ヌクレオチドが限定されていない場合、増幅過程において、ヒポキサンチンは鋳型DNA鎖の反対側シトシンに対して取り込まれる。
いかなる源からのいかなるDNAまたはRNAも標的試料として用い得る。
好ましくは、標的核酸試料はDNAである。増幅反応のためには、RNAは先ず逆転写によってcDNAに変換される。特定の配列は全てのまたは一部の標的核酸試料の候補座位に存在し得るか、または標的核酸中に存在しないこともあり得る。標的核酸試料は候補座位における特定の配列の有無に関してホモ接合体またはヘテロ接合体であり得、これは前述の先行技術のいくつかを超える本発明の方法の長所の一つである。
本発明の方法に従って使用することができるDNAは一本鎖、ホモ二本鎖またはヘテロ二本鎖であり得る。
特定の先行技術の方法と比較して本発明の有する長所のいくつかは以下の通りである。
候補座位における点、挿入または欠失型変異による起こり得る全ての配列変異を同定するために最少二つのグリコシラーゼが必要とされ、一つのグリコシラーゼが12すべての起こり得る変異のうち10個を検出するために用いられ得るという点で、本発明は制限酵素解析法を超える利点を有する。
切断産物の長さを測定するために大型DNAシークエンシング型ゲルを必要とせず、標的核酸中の特定の配列の有無を検出するために必要な切断産物の数が少ないという点で、本発明による方法は、DNAシークエンシングよりも著しく迅速である。通常、野生型のDNA断片に加えてもう一つの別のDNA断片が出現するか否かが、標的核酸中の特定のDNA配列の有無を診断するのに十分でありうる。候補座位における特定の配列の有無を検出するために、DNAシークエンシングに比べ、異なる長さの複数のDNA断片の解読が必要である。本発明による方法によって、固定化された標的核酸からDNA断片が遊離するか否かを決定することによって、候補座位における特定の配列の有無の検出が可能となる。これはDNAシークエンシングによっては可能ではない。
本発明による方法にはまた、ウラシル競合法に対して顕著な改善点も見られる。標的核酸試料に導入された修飾ヌクレオチドが事前選択された全ての部位に導入されるという点で、本発明による方法はウラシル競合法とは異なる（ウラシル競合法においては、ウラシルは増幅される分子中にランダムに、低いレベルで取り込まれる）。また、本発明による方法では、導入された修飾ヌクレオチドは特定のDNA前駆体を置換する（ウラシル競合法においては、正常なヌクレオチドに対してある割合の修飾ヌクレオチドが用いられる）。ウラシル競合法に対する本発明による方法の他の利点は、本発明による方法は有意に迅速であり、切断産物の長さを測定するために大型DNAシークエンシング型ゲルを必要とせず、検出される必要のある切断産物の数が少ないちうことである。通常、野生型のDNA断片に加えてもう一つのDNA断片が出現するか否かが、標的核酸中の特定のDNA配列の有無を診断するのに十分でありうる。ウラシル競合法に対して、特定の候補座位におけるウラシル残基を検出するために、異なる長さの複数のDNA断片の解読が必要である。本発明による方法によって、固定化された標的核酸からDNA断片が遊離するか否かを決定することによって、候補座位における特定の配列の有無の検出が可能となる。これはウラシル競合法によっては可能ではない。
ミスマッチヌクレオチドグリコシラーゼの利用に対する本発明の方法の利点は、ホモ接合体またはヘテロ接合体な状態での特定の配列（変異またはその他）の有無を検出するために外部プローブが必要でないことである。本発明の方法では、ウラシルDNAグリコシラーゼのような特定のグリコシラーゼが一本鎖DNAに作用し、一本鎖DNAについて調査することができる。さらに、本発明に従って用いられる修飾塩基はそれらを認識するグリコシラーゼ酵素によって効率的に認識され切除される。即ち、外部プローブの提供が不要であり、ハイブリダイゼーション過程が不要であり、一本鎖DNAを用いることができ、大量の試料の処理を迅速・簡便に達成し得るという点で、本発明は概説されたミスマッチ切断法に対して著しい利点を有する。
最後に候補座位において野生型または変異型配列のどちらが存在するかを決定するために一つの増幅反応のみが必要であるという点において、本発明の方法はARMS法に対して著しい利点を有する。ARMS法の対合条件は厳密でなくてはならず、したがって多くの場合に転用が困難であり、調査される各変異ごとに最適化されなければならない。それに対して、本発明の方法は確立されており、容易に最適化され、大量の試料の処理が可能である。
【図面の簡単な説明】
図1は、実施例1に記載される過程A）の模式図である。
図2は、実施例1に記載される過程B）の模式図である。
図3は、実施例2に記載される過程の模式図である。
図4は、実施例3に記載される過程の模式図である。
図5は、実施例4に記載される過程の模式図である。
図6は、実施例5に記載される過程の模式図である。
図7は、実施例6に記載される過程の模式図である。
図8は、実施例7に記載される過程の模式図である。
図9は、実施例8に記載される過程の模式図である。
本発明の実施態様
本発明は以下の実施例によってさらに例示される。
実施例1
悪性過温症を引き起こす、ヒト骨格リアノジン受容体遺伝子（RYR1）の位置1021におけるGからAの塩基置換変異の、変異についてヘテロ接合体である患者での存在を検査するために、本発明による方法が用いられた。工程の流れを図1に示した。この場合、標的核酸は悪性過温症の患者から抽出されたDNAであり、候補座位はヒトRYR1遺伝子のヌクレオチド1021であり、目的は患者のRYR1対立遺伝子のいずれかの候補座位にG：CまたはA：Tの特定の配列が存在するかどうかを決定することであった。図1に示す下部鎖は標的鎖であり、候補座位におけるT（U）ヌクレオチドの有無が決定された。上部鎖は相補標識的鎖である。
実施例においては、正常対立遺伝子は正常な配列を有するRYR1対立遺伝子を指し、変異対立遺伝子は位置1021に変異配列を有するRYR1対立遺伝子を指す。変異部位の周囲のDNA配列は図1に示し、変異部位は太字の大文字で示す。
A）候補座位領域の標的核酸配列および隣接および末端プライマーの配列（プライマーは標準ヌクレオチド（dG、dA、dTおよびdC）を含む）は図1に示す。6ピコモルの隣接プライマーは1ユニットのポリヌクレオチドキナーゼ、適当な緩衝液および1uCiγ32P ATP（3000Ci/mmol）と共に37℃30分にインキュベートすることによって末端標識された。標的核酸試料は以下のようにPCRで増幅された：PCRの反応混合液は罹患者から得た200ngのゲノムDNA、0.2mM dATP、dCTP、dGTPおよびdUTP、1.5mM MgCl2、50mM KCl、10mM Tris-HCl（pH9.0）、0.1％TritonX-100、6ピコモルの各プライマーを総体積19μl中に含む。反応液は次に等量のミネラルオイルを重層され、ホットスタートPCR（反応液は1ユニットのTaqポリメラーゼ（総体積20μl）の添加に先だって5分94℃で熱された）が行われた。94℃60秒、59℃60秒、72℃60秒の30サイクルをサーモサイクラー中で行い、続いて水溶性反応液を別のチューブに回収した。増幅された標的核酸を含む反応混合液は次に、増幅工程で伸長しなかったプライマーを消化するためにエキソヌクレアーゼIで処理された。これは、0.5ユニットのエキソヌクレアーゼIとともに2μlのPCR反応液を37℃30分でインキュベートすることによって達成された。エキソヌクレアーゼは次に反応液を80℃15分インキュベートすることによって熱処理失活された。
次にウラシルDNAグリコシラーゼ（0.05ユニット）を添加し、室温で30分インキュベートした。ウラシルDNAグリコシラーゼ処理に続いて、増幅産物中に生じた非プリンまたは非ピリミジン（AP）部位を、NaOHを最終濃度0.25Mに加え、混合物を95℃15分熱することによって完全に切断した。次に反応液はTris塩基を最終濃度30mMに加えることによって中性化された。
等量のホルムアミドロード用色素（90％ホルムアミド、0.025％ブロモフェノールブルー、0.025％キシレンシアノール）を試料に加え、ついで85℃5分熱された。試料全量は次に20％変性（7Ｍ尿素）ポリアクリルアミドゲルにロードし、試料中の切断産物の長さ解析のために400ボルト3から4時間、電気泳動を行った。電気泳動後、-70℃で12時間、ゲルを直接Ｘ線写真フィルムに感光させることによってオートラジオグラフィーを行った。標識されたオリゴヌクレオチドのセット（20mer、22mer、24mer）をマーカーとして用いた。オートラジオグラフィーによる産物の解析によって、二つの切断産物がほぼ等量存在することが示された。本明細書で以下に記載されるように、正常な遺伝子に対応する一つの産物は22ヌクレオチド（n）の長さであり、二つ目の産物は変異型遺伝子に対応し、20nの長さであった。
20n産物はウラシル残基が標的鎖の位置1021に取り込まれた場合にのみ生じるものであった。即ち、20n断片を検出することは位置1021にT残基が存在することを示す。正常な対立遺伝子においては、最初に取り込まれるウラシルは位置1019になるはずであり、その結果22nの産物を生じるはずである。即ち、22n断片の検出は位置1021にT残基が存在しないことを示し、位置1019にT残基が存在することを示す。20nおよび22n産物の両者ともほぼ等量検出され、標的核酸がG1021A変異に関してヘテロ接合体である個人由来であることが示唆された。患者が正常なホモ遺伝子型であれば、22n産物のみが検出されるはずである。患者が疾病のホモ接合体であれば、20n産物のみが検出されるはずである。20n産物に対する22n産物の相対的強度から、標的核酸試料中の正常および変異対立遺伝子の相対的レベルを決定することができる。これは、特定の正常および変異対立遺伝子間のレベルに大きな差異があり得る複合した試料を解析するためにとくに有用である。
B）プライマーの3′末端が位置1023、1024または1025に位置し、プライマーが適切な最適長を維持する（5′末端を適切に調整することによる）ような、隣接プライマーの再設計が可能である。例えば、隣接プライマーが5′方向に3ヌクレオチド移動した場合、プライマー配列は5′-CTG CAC GAA GCA CAG TGA CT-3′となる。即ち、変異対立遺伝子からは23n産物が生じ、正常対立遺伝子からは25n産物が生じる。隣接プライマーの長さは20nであるため、利用されなかったプライマーを切除する必要はない。この変更は図2に示す。
実施例2
いくつかの場合、候補座位における特定の配列の有無を示すグリコシラーゼ切断産物間に大きいおよび/または明らかな長さの差異が存在するように本発明による増幅プライマーを設計するのが有利である。これは、隣接プライマーおよび候補座位の末端の、グリコシラーゼが認識する基質塩基の取り込み部位が変更するように、プライマーの一方または両方を変更することによって達成され得る。これは、新しく合成されるDNA中のグリコシラーゼ基質塩基の取り込みを促進する残基のいくつかまたは全てが、グリコシラーゼ基質塩基の取り込みを促進しないヌクレオチドによって置換されるように、プライマーを合成することによって達成され得る。
本実施例で利用される方法は、末端プライマーが後ろから2番目の3′位置（位置1019）にイノシン残基を持つように合成され、利用されなかったプライマーを切除するためのエキソヌクレアーゼ処理が行われない（この場合には不用であるため）こと以外は、実施例1に記載されたものと全く同様である。即ち、標的鎖の増幅の間にウラシルではなくシトシン残基が新しく合成されるDNAの反対側の位置1019に取り込まれる。その結果、増幅産物のグリコシラーゼ媒介性切断の結果、変異対立遺伝子由来の23n断片および正常対立遺伝子由来の28n断片が生じる（図3に示す）。
候補座位の末端のウラシル残基を取り込むと考えられる部位における余分なまたは全てのウラシル残基の取り込みを、ウラシル残基が候補座位に存在する場合に標的鎖の切断が候補座位でのみ起きる程度まで阻害することによって、大きい差異が達成され得る。相補標的鎖上の隣接プライマーの反対側のウラシル残基を取り込むと考えられる部位における余分なまたは全てのウラシル残基の取り込みを阻害するために、同じ方法もまた用いることができる。
実施例3
塩基とDNA骨格間のN-グリコシド結合の切断によって、DNAから塩基が遊離し、その結果非プリンまたは非ピリミジン部位（AP部位）が生じる。AP部位の3′側のホスホジエステル結合はアルカリに対して不安定であり、中性pHでもβ-脱離による切断も受けやすい。即ち、AP部位を有するDNA試料のアルカリまたは熱処理によって、DNA骨格のホスホジエステル結合が切断され、その結果5′リン酸基を有するDNA末端および3′リン酸化デオキシリボースを有する末端が生じる。続く3′末端リン酸化デオキシリボースの切除は、酵素エキソヌクレアーゼIIIまたはエンドヌクレアーゼIVによる処理を含む様々な方法によって達成し得る。一つまたはそれ以上のAP部位を有する増幅されたDNA断片を、ウラシルDNAグリコシラーゼ切断の後に、95℃15分熱することによって、AP部位を切断し、3′末端リン酸化デオキシリボースを有するまたは有さない産物がほぼ同じ割合で生じることを観察した。この選択的な切断は、グリコシラーゼ媒介性切断反応産物の正確な検出を促進するために用いられ得る。
実施例2の方法が繰り返されたが、増幅された標的核酸のウラシルDNAグリコシラーゼ処理に続いて、反応液を95℃15分熱することによって増幅産物中に生じたAP部位を切断し、NaoHが添加されないために反応液を中性化する必要がないことが異なる。実施例1に記載した手順の完了に続いて、オートラジオグラフィーの解析によって、4つの切断産物（28n産物および、28n産物＋3′末端リン酸化デオキシリボースである、約1ヌクレオチド長い産物（28n＋）、および23n産物および、23n産物＋3′末端リン酸化デオキシリボースである、約1ヌクレオチド長い産物（23n＋））がほぼ等量、および利用されなかった標識プライマーが見られた。この変更は図4に示す。
23nおよび23n＋産物は、ウラシル残基が標的鎖の位置1021に取り込まれた場合にのみ生じるものであった。即ち、23nおよび23n＋断片の検出は、位置1021におけるT残基の存在を示す。正常対立遺伝子においては、最初に取り込まれるウラシルは位置1016であり、28n産物を生じるはずである。即ち、28nおよび28n＋産物の検出は、位置1021におけるT残基の不在および位置1019におけるT残基の存在を示す。本実施例においては、23n、23n＋、28nおよび28n＋産物はほぼ等量で検出され、標的核酸がG1021A変異に関してヘテロ接合体である個人由来であることが示唆された。利用されないプライマーよりも3′末端リン酸化デオキシリボース一つ長い断片の出現が候補座位における特定配列の有無を示す場合に、条件が容易に設計され得るため、この方法は多重式の方法にとって特に有用である。
実施例4
標的核酸試料の標的鎖中の候補座位の特定配列のグリコシラーゼ媒介性切断によって、固相あるいは固定化技術を用いた切断産物の検出も可能となる。本発明のこの特徴によって、大量の試料の処理が可能となり、時間のかかるゲル電気泳動解析の利用が回避される。いかなる候補座位も、本技術によって特定の配列の有無に関して調査され得る。この適当な主な分野は、標的試料中の遺伝子変異の検出および特定の生物の同定にある。
本実施例および実施例5および6は、以下の分野の両者における適用を説明する。
標的核酸が悪性過温症患者から抽出したDNAであり、候補座位がヒトRYR1遺伝子のヌクレオチド1021であり、目的が患者のRYR1対立遺伝子の一方または両方の候補座位にA:T塩基対が存在するか決定することであるという点で、実施例1で用いられたものと同様の方法が用いられた。手順は図５に示す。この場合、下部鎖は「標的鎖」であり、上部鎖は「相補鎖」である。標的鎖上の候補座位におけるT（U）ヌクレオチドの有無が決定された。
隣接プライマーが5′末端をビオチニル化され、末端プライマーにおいて全てのA残基がイノシンに置換された点以外は、用いた隣接および末端プライマーは実施例1で用いたものと同様である。A残基の置換の結果、候補座位にA：T塩基対が存在した場合、増幅された標的鎖は一つのウラシル残基を含むのみであった。即ち、ウラシルDNAグリコシラーゼ媒介性切断による標的鎖の切断は、ウラシル残基が存在した場合には一つの位置（1021）でのみ起こりえた。そのため、この場合における増幅された標的鎖の切断は、標的核酸試料の位置1021におけるA：T塩基対の存在を示す。
隣接プライマーは合成中は5′末端をビオチニル化された。標的核酸試料は以下のようにPCRによって増幅した：PCRの反応混合液は罹患者の200ngのゲノムDNA、0.2mM dCTP、dGTP、dATPおよびdUTP、1uCi α32P dCTP（3000Ci/mmol)、1.5mM MgCl2、50mM KCl、10mM Tris-HCl（pH9.0）、0.1％TritonX-100、6ピコモルの各プライマーを総体積9μl中に含む。反応混合液は次に等量のミネラルオイルを重層され、ホットスタートPCR（反応液は1ユニットのTaqポリメラーゼ（総体積25μl）の添加に先だって5分80℃で熱された）が行われた。94℃60秒、59℃60秒、72℃60秒の30サイクルをサーモサイクラー中で行った。
1μlの水溶性PCR反応液を、20μlのストレプトアビジン被覆磁性ビーズ（Dynal（登録商標）beads）および19μlの滅菌水を含むチューブAとラベルしたチューブに加え、室温で10分インキュベートすることによって産物の固定化を行った。次にチューブは磁石スタンド中に置かれ、ビオチン標識PCR産物の結合したビーズはチューブの片側に蓄積される。取り込まれない標識および利用されない末端プライマーおよびヌクレオチド三リン酸を含む上清を切除し、PCR増幅DNAを捕捉したビーズは10mM Tris-HCl（pH7.5）、1mM EDTAおよび1M NaClを含む緩衝液で数回洗浄した。増幅DNAは次に40μlの0.1M NaOHを加えることによって変性した。上清中の相補鎖を切除し、標的鎖はストレプトアビジン被覆磁性ビーズに結合したままであった。ビーズは40μlの0.1M NaOHで再度洗浄し、次に前述の緩衝液で洗浄した。固定化された標的鎖は次に0.05ユニットのウラシルDNAグリコシラーゼで処理し、アルカリを最終濃度0.25MのNaOHになるように加えることによってAP部位で切断した。遊離物質は次にチューブBとラベルした別のチューブに移され、シンチレーション測定によって32Pの存在をモニターした。切断された固定化PCR産物を含むチューブも、32Pの存在に関してモニターした。
シンチレーション測定による32Pの存在をモニターすることによって、ウラシルDNAグリコシラーゼ切断後に約半数の放射性物質がチューブBに遊離することを示した。これは、固定化されたPCR産物の約半数が、候補座位にU残基が存在するために切断されたことを示した。即ち、標的試料はRYR1遺伝子の位置1021のA:T塩基対に関してヘテロ接合体であることが結論づけることができた。
実施例5
固定化を伴うグリコシラーゼ媒介性切断が、Mycobacterium tuberculosis複合体の病原生物の存在を検出するために用いられた。
MPB70遺伝子はMycobacterium tuberculosis複合体生物中に特異的に見られ、複合体の存在を検出するためにPCRまたは他の方法によるMPB70遺伝子の検出が首尾良く用いることができるいくつかの報告が公開された。本実施例においては、PCR産物中に一つのUおよび標識が取り込まれるように、MPB70遺伝子の一部の特異的増幅が実施された。即ち、産物の固定化の後にウラシルDNAグリコシラーゼによる切断を行うことによって、容易に検出され得る標識産物が遊離するはずである。
図6に示すように、プライマーが囲む標的鎖の被増幅部位がいくつかのグアニン、シトシン、あるいはアデニン、および一つのウラシルを含むように、MPB70遺伝子の一部を増幅するように特異的プライマーを設計した。これを達成するために、反対側の標的鎖にウラシルが取り込まれないように末端プライマーを設計した。捕獲試薬を有する隣接プライマーおよび標識ヌクレオチド前駆体を用いた増幅の後、増幅された標的鎖を固定化し、ウラシルDNAグリコシラーゼによって切断した。即ち、標的鎖の標識断片がこの過程によって遊離し、容易に検出できた。
より特定的には、本実施例の目的は、隣接プライマーの伸長の間に取り込まれた位置496のウラシル残基の切断をモニターすることによってMPB70の増幅断片（ヌクレオチド472-540）の存在を検出することであった。MPB70遺伝子中のGCAに富む配列（標的鎖）をdGTP、dCTP、dUTPおよびdATPを用いて増幅するようにプライマーを設計した。イノシン（あるいはミスマッチ）がアデニンに置換し、増幅産物の標的鎖中に存在する唯一のウラシルが位置496であるように、末端プライマーを設計した。隣接プライマーは5′末端をビオチニル化した。候補座位領域の標的核酸配列および隣接プライマーと末端プライマーの配列を図6に示す。
標的核酸試料は以下のようにPCRによって増幅した：PCRの反応混合液は罹患者の200ngのゲノムDNA（またはMPB70遺伝子のPCRによって増幅された領域を200倍希釈したもの1μl）、0.2mM dATP、dCTP、dGTPおよびdUTP、1μCiα32P dCTP（3000Ci/mmol）、1.5mM MgCl2、50mM KCl、10mM Tris-HCl（pH9.0）、0.1％TritonX-100、6ピコモルの各プライマーを総体積9μl中に含む。反応混合液は次に20μlのミネラルオイルを重層され、ホットスタートPCR（反応混合液は1ユニットのTaqポリメラーゼ（総体積10μl）の添加に先だって5分94℃で熱された）を行った。94℃60秒、58℃60秒、72℃60秒の30サイクルをサーモサイクラー中で行い、続いて水溶性反応混合液が別のミクロチューブに回収された。
1μlの水溶性PCR反応液を、20μlのストレプトアビジン被覆磁性ビーズ（Dynal beads）および19μlの滅菌水を含むチューブAとラベルしたチューブに加え、室温で10分インキュベートすることによって産物の固定化を行った。次にチューブは磁石スタンド中に置かれ、ビオチン標識PCR産物の結合したビーズはチューブの片側に蓄積される。取り込まれない標識および利用されない末端プライマーおよびヌクレオチド三リン酸を含む上清を切除し、PCR増幅DNAを捕捉したビーズは10mM Tris-HCl（pH7.5）、1mM EDTAおよび1M NaClを含む緩衝液で数回洗浄した。増幅されたDNAは次に40μlの0.1M NaOHを加えることによって変性された。上清中の相補鎖を切除し、標的鎖はストレプトアビジン被覆磁性ビーズに結合したままであった。ビーズは40μlの0.1M NaOHで再度洗浄し、次に前述の緩衝液で洗浄した。固定化された標的鎖は次に0.05ユニットのウラシルDNAグリコシラーゼで処理し、アルカリを最終濃度0.25MのNaOHになるように加えることによってAP部位で切断した。遊離物質は次にチューブBとラベルした別のチューブに移し、シンチレーション測定によって32Pの存在をモニターした。切断した固定化PCR産物を含むチューブも、32Pの存在に関してモニターした。
シンチレーション測定による32Pの存在をモニターすることによって、ウラシルDNAグリコシラーゼ切断後に放射性物質がチューブBに遊離することを示した。これは、固定化したPCR産物が、候補座位にU残基が存在するために切断されたことを示した。即ち、標的試料はMycobacterium tuberculosis複合体に由来すると結論づけることができた。
実施例6
異なる方法で設計された隣接プライマーを用いて反応を行った点以外は、実施例5の方法が繰り返した。この場合、増幅の間に標的鎖にウラシルが取り込まれないように隣接プライマーを設計した（図7に示す）。即ち、この場合、増幅産物はウラシルDNAグリコシラーゼによる切断に対して耐性であるはずであり、標識はチューブBに遊離しないはずである。この場合、シンチレーション測定による32Pの存在をモニターすることによって、チューブB中の標識はウラシルDNAグリコシラーゼによりインキュベートした後も固定化されたままであることを示した。チューブBには標識は放出されなかった。産生した疑似PCR産物にウラシル残基が取り込まれ、そのために標識がチューブBに遊離すると考えられるため、この方法は正しいDNAが固定化されていることを証明するために特に有効である。実施例5と6を組み合わせて用いることによって、調査者がMycobacterium tuberculosis複合体の有無を高い信頼性で診断することが可能になる。
実施例7
事前選択されたプライマーを用いた、特定の長さの特定のDNA断片の増幅は、DNA診断分野では診断目的のために一般的に用いられる。このような診断法の一つの欠点は、目的の診断用産物と同じ長さの人為的な増幅産物が生じ、誤診が起こり得るということである。即ち、信用限界値を上げる、または診断用増幅断片が正しいことを証明する方法は、診断の正確性を改善し、増幅のみによる診断よりも優れているため、診断分野では重要な価値を有する。
特異的なプライマーを用いた、Mycobacterium tuberculosis複合体生物中に見られるMOB70遺伝子の特定の断片の増幅は、試料中のこれらの生物の有無を診断するために用いられた。本実施例においては、Mycobacterium tuberculosis複合体から特異的なプライマーを用いて増幅したMPB70遺伝子の116bpおよび130bp断片が正しいことを検査するために、本発明の方法が用いられた。先ず、MPB70遺伝子から116bpおよび130bp産物を増幅する用に、特異的プライマーおよびMycobacterium tuberculosis複合体DNA試料を用いてPCRを行った。116bpおよび130bpの増幅産物をウラシルDNAグリコシラーゼによって切断する場合には、特定の大きさの断片を生じ、最初の増幅産物が正しいことを証明するようにプライマーおよび増幅条件を設計した。
増幅方法は図8に示す。図の通り、ヌクレオチド320から436に渡るMPB70遺伝子の116bp領域を増幅するために、プライマーA（5′-ggcctcggtgcagggaatgtc-3′）およびプライマーB（5′-ccaggtttacttgcggattga-3′）を選択した。また、最初に取り込まれるウラシルがプライマーAの3′末端の11ヌクレオチド下流であり、プライマーBの2ヌクレオチド下流であるようにプライマーを選択した。同様に、ヌクレオチド551から681に渡るMPB70遺伝子の130bp領域を増幅するためにプライマーCおよびDを選択した。この場合、最初に取り込まれるウラシルはプライマーCの3′末端の26ヌクレオチド下流であり、プライマーDの2ヌクレオチド下流である。標識プライマーを用いてMPB70遺伝子の116bpおよび130bpを増幅し、続いてウラシルDNAグリコシラーゼで切断することによって、116bp PCR産物由来の32nおよび23n断片、および130bp PCR産物由来の47nおよび23n断片が生じる。
116bp産物はMycobacterium tuberculosis複合体DNA試料から、以下のようにPCRにより増幅した。PCRの反応混合液は200ngのMycobacterium tuberculosis複合体DNA、0.2mM dATP、dCTP、dGTPおよびdUTP、1.5mM MgCl2、50mM KCl、10mM Tris-HCl（pH9.0）、0.1％TritonX-100、6ピコモルの各プライマーAおよびBを総体積19μl中に含む。最初の増幅反応混合液中で、γ32ATPおよびポリヌクレオチドキナーゼを用いてプライマーAを末端標識し、第二の増幅においてプライマーBを標識した。反応混合液に次いで等量のミネラルオイルを重層し、ホットスタートPCR（反応混合液は1ユニットのTaqポリメラーゼ（総体積20μl）の添加に先だって5分94℃で熱された）を行った。94℃60秒、57℃60秒、72℃60秒の30サイクルをサーモサイクラー中で行い、続いて水溶性反応混合液を別のチューブに回収した。増幅された標的核酸を含む反応混合液は次に、増幅工程で伸長しなかったプライマーを消化するためにエキソヌクレアーゼIで処理した。これは0.5ユニットのエキソヌクレアーゼIとともに3μlのPCR反応混合液を37℃30分でインキュベートすることによって達成した。エキソヌクレアーゼは次に反応液を80℃15分インキュベートすることによって熱処理失活された。
次にウラシルDNAグリコシラーゼ（0.05ユニット）を上記の3μlの反応混合液に加え、37℃で30分インキュベートした。ウラシルDNAグリコシラーゼ処理に続いて、増幅産物中に生じた非ピリミジン部位を、NaOHを最終濃度0.05Mになるように加え、反応混合液を95℃15分熱することによって完全に切断した。次に反応混合液はTris塩基を最終濃度30mMになるように加えることによって中性化した。等量のホルムアミドロード用色素（90％ホルムアミド、0.025％ブロモフェノールブルー、0.025％キシレンシアノール）を混合液に加え、85℃5分加熱した。各混合液の5μlは次に20％変性（7M尿素）ポリアクリルアミドゲルにロードし、試料中の切断産物の長さ解析のために400ボルト3時間、電気泳動を行った。電気泳動後、-70℃で12時間、ゲルを直接X線写真フィルムに感光することによってオートラジオグラフィーを行った。
オートラジオグラフィーによる産物の解析によって、以下の切断パターンが示された。プライマーAが末端標識された最初の反応では32n産物が観察された。32n産物はウラシル残基がプライマーAの3′末端の12ヌクレオチド下流に取り込まれた場合にのみ生じた。プライマーBが末端標識された第二の反応では23n産物が観察された。23n産物はウラシル残基がプライマーBの3′末端の3ヌクレオチド下流に取り込まれた場合にのみ生じた。
Mycobacterium tuberculosis複合体DNA試料から、プライマーAおよびBの代わりに、プライマーC（5′-catcctgacctaccacgtagt-3′）およびプライマーD（5′-gtcggcgttaccgaccttgag-3′）を用いる以外は、上に概説したのと全く同じようにPCRによって130bp産物を増幅した。オートラジオグラフィーによる産物の解析によって、以下の切断パターンが示された。プライマーCが末端標識された反応では47n産物が観察された。47n産物はウラシル残基がプライマーCの3′末端の27ヌクレオチド下流に取り込まれた場合にのみ生じた。プライマーDが末端標識された反応では23n産物が観察された。23n産物はウラシル残基がプライマーDの3′末端の3ヌクレオチド下流に取り込まれた場合にのみ生じた。
ここで、記載された増幅過程は、別個に標識されたプライマーを用いて記載されたように独立に、または一回の増幅反応に4つの標識プライマーを含む多重反応として、行うことができる。後者の場合、ウラシルDNAグリコシラーゼによる切断、電気泳動、オートラジオグラフィーの後、47n、32nおよび23nの標識産物が一つのレーンに検出される。
DNA断片の特定の部位にウラシルが存在する確率は1/4即ち0.25である。その部位にウラシルが存在しない確率は3/4即ち0.75である。プライマーAの場合、切断される前にプライマーAは11ヌクレオチド伸長する。このような伸長がランダムに起きる確率は、0.7511=0.042である。伸長したプライマーは取り込まれた12ヌクレオチドの部位で切断され、この部位にウラシルが存在することが示される。その特定の部位にウラシルが存在する可能性は0.25である。即ち、11塩基対伸長産物がランダムに生じる確率は、0.042×0.25=0.0105である。同様に、プライマーBが2塩基伸長する確率は0.752×0.25=0.14である。即ち、ランダムな116bp産物が切断されて32n（21nプライマーAの11ヌクレオチド伸長産物）および23n（21nプライマーBの2ヌクレオチド伸長産物）産物を生じる確率は、0.0105×0.14=0.0014である。プライマーCおよびDがそれぞれ26nおよび2n伸長する場合の130bp産物に関する同様の計算によって、そのような伸長産物がランダムに生じる確率は0.000019であることが示される。両方のPCR産物を併せて考えると、観察される産物がランダムに生じる可能性は0.000000027である。即ち、本実施例によって、Mycobacterium tuberculosis由来のPCR産物の確認における本発明の方法の適用性が示される。即ち、本発明の方法のこのような適用は、診断または他の目的の増幅核酸の確認のための迅速で正確な方法を提供する。
実施例8
ウラシルDNAグリコシラーゼが一本鎖DNAと二本鎖DNAの両者に対して作用するという事実によって、ウラシル残基を有する線型増幅産物の解析におけるこの酵素の利用が可能となる。
一本鎖DNAの線型増幅によって、対数的DNA増幅を超える著しい利点を提供することができる場合がある。しかし、線型増幅法によって生じる一本鎖DNAは二本鎖DNAと比較して一般的に迅速な解析には向かないため、線型増殖にはいくつかの困難が存在する。例えば、一本鎖DNAは一般的に制限酵素で切断されない。さらに、特異的プライマー対を用いたゲノムDNAのPCRによる対数増幅は特定の長さの二本鎖DNA産物を産生し、長さ測定技術によって解析されやすい。断片の5′および3′末端は順向きおよび逆向きプライマーによって定められる。一方、ゲノムDNAの線型増幅によって、定まった5′末端と不定の3′末端を有する断片が生じる。本実施例においては、線型増幅の後に特定の長さの一本鎖断片を生成するための、本発明の方法の利用を示す。候補座位における特定の配列の存在んお有無を決定するために、候補座位を有する核酸断片を増幅することが通常必要である。多くの場合、増幅されたDNAの複数の候補座位について、特定の配列の存在を調査することが必要または望ましい。これは、ヒト疾患を引き起こす遺伝子変異の検出に特に望ましい。即ち、複数の候補座位の同時増幅とその後の候補座位の同時解析を可能にするいかなる方法も、一つの座位の解析法に比べて有利である。複数の候補座位を有する核酸断片の増幅は、線型増幅法または対数増幅法によって達成することができる。しかし、いくつかの独立の方法または全長DNAシークエンシングを必要とする複数の座位の解析は、多くの場合迅速性に制限がある。本実施例においてはまた、二つの特定の候補座位における特定の変異の有無を同時に決定するための本方法の適用性を示す。
本発明の方法は、悪性過温症を引き起こす、ヒト骨格リアノジン受容体遺伝子（RYR1）の候補座位7301および7370におけるGからAの塩基置換変異をどちらかの変異についてヘテロ接合体として有する二人の患者における、これらの変異の有無を同時に検出するために用いられた。各工程の流れを図9に示す。この場合、標的核酸は悪性過温症の二人の患者（AおよびB）由来の骨格筋cDNAからPCRで増幅されたDNA断片である。図9に示す下部鎖が標的鎖である。標的DNAの線型増幅において伸長したプライマーに最初に取り込まれるウラシルの位置が変異対立遺伝子の場合には取り込まれる6番目のヌクレオチドの位置であり、正常対立遺伝子の場合は8番目であるように、プライマーA（26n、5′-ggcttggattagatgcatctctggtg-3′）を設計した。最初に取り込まれるウラシルの位置が変異対立遺伝子の場合には取り込まれる5番目のヌクレオチドの位置であり、正常対立遺伝子の場合は12番目であるように、プライマーB（28n、5′-gaattccaaggtcctccaagggcacaag-3′）を設計した。どちらのプライマーも、線型増幅によって同じ方向に伸長する。候補座位におけるT（U）の有無は、ウラシルDNAグリコシラーゼによる切断、ゲル電気泳動、オートラジオグラフィーによって決定した。標的核酸はゲノムDNAまたは増幅されたいかなるDNA部分でもあり得る。本実施例においては、標的核酸はcDNAからPCRによってRYR1遺伝子の6995から7402領域を増幅することによって生成した。
プライマーAおよびBは、実施例1に記載されたようにγ32Pで末端標識した。患者AおよびB由来の標的核酸は等量のエキソヌクレアーゼI（0.5U/μl）で37℃30分処理され、PCRに利用されなかったプライマーを分解した。次に80℃15分インキュベートすることによって、エキソヌクレアーゼを不活性化した。この処理は、以降の工程で全ての対数増幅を防ぐために必要であった。ゲノムDNAが標的核酸である場合、この工程は不要である。標的核酸試料1μlは独立に、6ピコモルの被標識プライマーAおよびB、0.2mM dATP、dCTP、dGTPおよびdUTP、2mM MgSO4、10mM KCl、20mM Tris-HCl（pH8.8）、10mM（NH4）2SO4、0.1％TritonX-100（総体積19μl）と共にインキュベートした。反応混合液は次に等量のミネラルオイルを重層し、線型増幅のためにホットスタート（反応混合液は0.5ユニットのVent DNAポリメラーゼ（エキソ）（総体積20μl）の添加に先だって5分94℃で加熱した）を行った。94℃60秒、55℃60秒、72℃60秒の30サイクルをサーモサイクラー中で行い、続いて水溶性反応混合液を別のチューブに回収した。
次にウラシルDNAグリコシラーゼ（0.05ユニット）を上の反応液5μlに加え、37℃で30分インキュベートした。ウラシルDNAグリコシラーゼ処理に続いて、増幅産物中に生じた非ピリミジン（AP）部位を、NaOHを最終濃度0.05Mになるように加え、混合液を95℃15分熱することによって完全に切断した。次に反応液はTris塩基を最終濃度30mMになるように加えることによって中性化した。等量のホルムアミドロード用色素（90％ホルムアミド、0.025％ブロモフェノールブルー、0.025％キシレンシアノール）を試料に加え、85℃5分加熱した。試料5μlは次に20％変性（7M尿素）ポリアクリルアミドゲルにロードし、試料中の切断産物の長さ解析のために400ボルト3時間、電気泳動を行った。電気泳動後、-70℃で12時間、ゲルを直接X線写真フィルムに感光させることによってオートラジオグラフィーをが行った。
患者A由来の試料の解析によって、利用されなかった26nおよび28nプライマーに加えて、39n、33n、31nの切断産物が見られた。この切断産物のパターンは、患者AがRYR1遺伝子の候補座位7370の正常対立遺伝子に関してはホモ接合体であり、かつG7301A変異に関してヘテロ接合体である場合にのみ生じうるものであった。患者B由来の試料の解析によって、利用されなかった26nおよび28nプライマーに加えて、39n、33n、32nの切断産物が見られた。この切断産物のパターンは、患者BがRYR1遺伝子の候補座位7301の正常遺伝子に関してはホモ接合体であり、かつG7370A変異に関してヘテロ接合体である場合にのみ生じるものであった。即ち、本発明の方法の適用によって、特定の変異の有無を二つの座位について同時に解析することが可能であった。本実施例では、二つの候補座位を調査した。本方法は、選択されるプライマーが線型増幅に働くが対数増幅は行えない限りにおいて、ゲノムDNAまたは増幅された標的DNA中の複数の候補座位に容易に適用され得る。
特定の長さの増幅された核酸断片の生成は、感染性因子の診断または増幅された核酸分子の確認に通常用いられる。本実施例においては、本発明の方法を使用することによって、線型増幅によって特定の長さの一本鎖断片が生成した。特定の長さの増幅断片を生成するための対数増幅ではなく線型増幅の利用が可能になるため、これは本方法の有用な適用である。
配列表
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（ix）特徴:
（A）NAME/KEY:misc_feature
（B）存在位置:33
（D）その他の情報:Nは非プリンまたは非ピリミジンである。
（ix）特徴:
（A）NAME/KEY:misc_feature
（B）存在位置:36..37
（D）その他の情報:Nは非プリンまたは非ピリミジンである。
（ix）特徴:
（A）NAME/KEY:misc_feature
（B）存在位置:40
（D）その他の情報:Nは非プリンまたは非ピリミジンである。
（xi）配列:SEQ ID NO:20:
0003790797.tif 000021
（2）配列情報SEQ ID NO:21:
（i）配列の特性:
（A）長さ:41塩基対
（B）型:核酸
（C）鎖の数:二本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（iii）ハイポセティカル:NO
（iii）アンチセンス:YES
（vi）起源:
（A）生物名:ヒト
（ix）特徴：
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（B）存在位置:21
（D）その他の情報:Nは非プリンまたは非ピリミジンである。
（ix）特徴:
（A）NAME/KEY:misc_feature
（B）存在位置:23
（D）その他の情報:Nは非プリンまたは非ピリミジンである。
（ix）特徴:
（A）NAME/KEY:misc_feature
（B）存在位置:26..27
（D）その他の情報:Nは非プリンまたは非ピリミジンである。
（ix）特徴:
（A）NAME/KEY:misc_feature
（B）存在位置:30
（D）その他の情報:Nは非プリンまたは非ピリミジンである。
（ix）特徴:
（A）NAME/KEY:misc_feature
（B）存在位置:32
（D）その他の情報:Nは非プリンまたは非ピリミジンである。
（xi）配列:SEQ ID NO:21:
0003790797.tif 000022
（2）配列情報SEQ ID NO:22:
（i）配列の特性:
（A）長さ:26塩基対
（B）型:核酸
（C）鎖の数:二本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（iii）ハイポセティカル:NO
（iii）アンチセンス:NO
（vi）起源:
（A）生物名:ヒト
（xi）配列:SEQ ID NO22:
0003790797.tif 000023
（2）配列情報SEQ ID NO:23:
（i）配列の特性:
（A）長さ:20塩基対
（B）型:核酸
（C）鎖の数:二本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（iii）ハイポセティカル:NO
（iii）アンチセンス:YES
（vi）起源:
（A）生物名:ヒト
（xi）配列:SEQ ID NO:23:
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（2）配列情報SEQ ID NO:24:
（i）配列の特性:
（A）長さ:44塩基対
（B）型:核酸
（C）鎖の数:二本鎖
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（ii）配列の種類:DNA（genomic）
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（vi）起源:
（A）生物名:ヒト
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（2）配列情報SEQ ID NO:25:
（i）配列の特性:
（A）長さ:44塩基対
（B）型:核酸
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（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（iii）ハイポセティカル:NO
（iii）アンチセンス:NO
（vi）起源:
（A）生物名:ヒト
（xi）配列:SEQ ID NO:25:
0003790797.tif 000026
（2）配列情報SEQ ID NO:26:
（i）配列の特性:
（A）長さ:44塩基対
（B）型:核酸
（C）鎖の数:二本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（iii）ハイポセティカル:NO
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（vi）起源:
（A）生物名:ヒト
（xi）配列:SEQ ID NO:26:
0003790797.tif 000027
（2）配列情報SEQ ID NO:27:
（i）配列の特性:
（A）長さ:44塩基対
（B）型:核酸
（C）鎖の数:二本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（iii）ハイポセティカル:NO
（iii）アンチセンス:NO
（vi）起源:
（A）生物名:ヒト
（ix）特徴：
（A）NAME/KEY:misc_feature
（B）存在位置:27
（D）その他の情報:Nは非プリンまたは非ピリミジンである。
（ix）特徴:
（A）NAME/KEY:misc_feature
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（D）その他の情報:Nは非プリンまたは非ピリミジンである。
（ix）特徴:
（A）NAME/KEY:misc_feature
（B）存在位置:33
（D）その他の情報:Nは非プリンまたは非ピリミジンである。
（ix）特徴:
（A）NAME/KEY:misc_feature
（B）存在位置:36..37
（D）その他の情報:Nは非プリンまたは非ピリミジンである。
（ix）特徴:
（A）NAME/KEY:misc_feature
（B）存在位置:40
（D）その他の情報:Nは非プリンまたは非ピリミジンである。
（xi）配列:SEQ ID NO:27:
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（2）配列情報SEQ ID NO:28:
（i）配列の特性:
（A）長さ:44塩基対
（B）型:核酸
（C）鎖の数:二本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（iii）ハイポセティカル:NO
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（vi）起源:
（A）生物名:ヒト
（ix）特徴：
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（D）その他の情報:Nは非プリンまたは非ピリミジンである。
（ix）特徴:
（A）NAME/KEY:misc_feature
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（D）その他の情報:Nは非プリンまたは非ピリミジンである。
（ix）特徴:
（A）NAME/KEY:misc_feature
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（D）その他の情報:Nは非プリンまたは非ピリミジンである。
（ix）特徴:
（A）NAME/KEY:misc_feature
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（D）その他の情報:Nは非プリンまたは非ピリミジンである。
（xi）配列:SEQ ID NO:28:
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（2）配列情報SEQ ID NO:29:
（i）配列の特性:
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（C）鎖の数:二本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
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（A）生物名:ヒト
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（2）配列情報SEQ ID NO:30:
（i）配列の特性:
（A）長さ:44塩基対
（B）型:核酸
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（ii）配列の種類:DNA（genomic）
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（vi）起源:
（A）生物名:ヒト
（xi）配列:SEQ ID NO:30:
0003790797.tif 000031
（2）配列情報SEQ ID NO:31:
（i）配列の特性:
（A）長さ:44塩基対
（B）型:核酸
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（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（iii）ハイポセティカル:NO
（iii）アンチセンス:NO
（vi）起源:
（A）生物名:ヒト
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0003790797.tif 000032
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（i）配列の特性:
（A）長さ:44塩基対
（B）型:核酸
（C）鎖の数:二本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（iii）ハイポセティカル:NO
（iii）アンチセンス:YES
（vi）起源:
（A）生物名:ヒト
（xi）配列:SEQ ID NO:32:
0003790797.tif 000033
（2）配列情報SEQ ID NO:33:
（i）配列の特性:
（A）長さ:44塩基対
（B）型:核酸
（C）鎖の数:二本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（iii）ハイポセティカル:NO
（iii）アンチセンス:NO
（vi）起源:
（A）生物名:ヒト
（ix）特徴：
（A）NAME/KEY:misc_feature
（B）存在位置:27
（D）その他の情報:Nは非プリンまたは非ピリミジンである。
（ix）特徴:
（A）NAME/KEY:misc_feature
（B）存在位置:31
（D）その他の情報:Nは非プリンまたは非ピリミジンである。
（ix）特徴:
（A）NAME/KEY:misc_feature
（B）存在位置:33
（D）その他の情報:Nは非プリンまたは非ピリミジンである。
（ix）特徴:
（A）NAME/KEY:misc_feature
（B）存在位置:36..37
（D）その他の情報:Nは非プリンまたは非ピリミジンである。
（ix）特徴:
（A）NAME/KEY:misc_feature
（B）存在位置:40
（D）その他の情報:Nは非プリンまたは非ピリミジンである。
（xi）配列:SEQ ID NO:33:
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（i）配列の特性:
（A）長さ:44塩基対
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（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（iii）ハイポセティカル:NO
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（vi）起源:
（A）生物名:ヒト
（ix）特徴：
（A）NAME/KEY:misc_feature
（B）存在位置:24
（D）その他の情報:Nは非プリンまたは非ピリミジンである。
（ix）特徴:
（A）NAME/KEY:misc_feature
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（D）その他の情報:Nは非プリンまたは非ピリミジンである。
（ix）特徴:
（A）NAME/KEY:misc_feature
（B）存在位置:29..30
（D）その他の情報:Nは非プリンまたは非ピリミジンである。
（ix）特徴:
（A）NAME/KEY:misc_feature
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（D）その他の情報:Nは非プリンまたは非ピリミジンである。
（ix）特徴:
（A）NAME/KEY:misc_feature
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（D）その他の情報:Nは非プリンまたは非ピリミジンである。
（xi）配列:SEQ ID NO:34:
0003790797.tif 000035
（2）配列情報SEQ ID NO:35:
（i）配列の特性:
（A）長さ:23塩基対
（B）型:核酸
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（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（iii）ハイポセティカル:NO
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（vi）起源:
（A）生物名:ヒト
（xi）配列:SEQ ID NO:35:
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（2）配列情報SEQ ID NO:36:
（i）配列の特性:
（A）長さ:20塩基対
（B）型:核酸
（C）鎖の数:二本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（iii）ハイポセティカル:NO
（iii）アンチセンス:NO
（vi）起源:
（A）生物名:ヒト
（ix）特徴:
（A）NAME/KEY:修飾_base
（B）存在位置:19
（D）その他の情報:/mod_base=i
（xi）配列:SEQ ID NO:36:
0003790797.tif 000037
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（i）配列の特性:
（A）長さ:44塩基対
（B）型:核酸
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（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（iii）ハイポセティカル:NO
（iii）アンチセンス:NO
（vi）起源:
（A）生物名:ヒト
（ix）特徴:
（A）NAME/KEY:修飾_base
（B）存在位置:19
（D）その他の情報:/mod_base=i
（xi）配列:SEQ ID NO:37:
0003790797.tif 000038
（2）配列情報SEQ ID NO:38:
（i）配列の特性:
（A）長さ:44塩基対
（B）型:核酸
（C）鎖の数:二本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（iii）ハイポセティカル:NO
（iii）アンチセンス:YES
（vi）起源:
（A）生物名:ヒト
（xi）配列:SEQ ID NO:38:
0003790797.tif 000039
（2）配列情報SEQ ID NO:39:
（i）配列の特性:
（A）長さ:44塩基対
（B）型:核酸
（C）鎖の数:二本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（iii）ハイポセティカル:NO
（iii）アンチセンス:NO
（vi）起源:
（A）生物名:ヒト
（ix）特徴:
（A）NAME/KEY:修飾_base
（B）存在位置:19
（D）その他の情報:/mod_base=i
（ix）（A）NAME/KEY:misc_feature
（B）存在位置:27
（D）その他の情報:Nは非プリンまたは非ピリミジンである。
（ix）特徴:
（A）NAME/KEY:misc_feature
（B）存在位置:31
（D）その他の情報:Nは非プリンまたは非ピリミジンである。
（ix）特徴:
（A）NAME/KEY:misc_feature
（B）存在位置:33
（D）その他の情報:Nは非プリンまたは非ピリミジンである。
（ix）特徴:
（A）NAME/KEY:misc_feature
（B）存在位置:36..37
（D）その他の情報:Nは非プリンまたは非ピリミジンである。
（ix）特徴:
（A）NAME/KEY:misc_feature
（B）存在位置:40
（D）その他の情報:Nは非プリンまたは非ピリミジンである。
（xi）配列:SEQ ID NO:39:
0003790797.tif 000040
（2）配列情報SEQ ID NO:40:
（i）配列の特性:
（A）長さ:44塩基対
（B）型:核酸
（C）鎖の数:二本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（iii）ハイポセティカル:NO
（iii）アンチセンス:YES
（vi）起源:
（A）生物名:ヒト
（ix）特徴：
（A）NAME/KEY:misc_feature
（B）現在位置:29..30
（D）その他の情報:Nは非プリンまたは非ピリミジンである。
（ix）特徴:
（A）NAME/KEY:misc_feature
（B）現在位置:33
（D）その他の情報:Nは非プリンまたは非ピリミジンである。
（ix）特徴:
（A）NAME/KEY:misc_feature
（B）現在位置:35
（D）その他の情報:Nは非プリンまたは非ピリミジンである。
（xi）配列:SEQ ID NO:40:
0003790797.tif 000041
（2）配列情報SEQ ID NO:41:
（i）配列の特性:
（A）長さ:26塩基対
（B）型:核酸
（C）鎖の数:二本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（iii）ハイポセティカル:NO
（iii）アンチセンス:NO
（vi）起源:
（A）生物名:ヒト
（ix）特徴:
（A）NAME/KEY:修飾_base
（B）存在位置:19
（D）その他の情報:/mod_base=i
（xi）配列:SEQ ID NO:41:
0003790797.tif 000042
（2）配列情報SEQ ID NO:42:
（i）配列の特性:
（A）長さ:28塩基対
（B）型:核酸
（C）鎖の数:二本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（iii）ハイポセティカル:NO
（iii）アンチセンス:YES
（vi）起源:
（A）生物名:ヒト
（xi）配列:SEQ ID NO:42:
0003790797.tif 000043
（2）配列情報SEQ ID NO:43:
（i）配列の特性:
（A）長さ:44塩基対
（B）型:核酸
（C）鎖の数:二本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（iii）ハイポセティカル:NO
（iii）アンチセンス:NO
（vi）起源:
（A）生物名:ヒト
（ix）特徴:
（A）NAME/KEY:修飾_base
（B）存在位置:19
（D）その他の情報:/mod_base=i
（xi）配列:SEQ ID NO:43:
0003790797.tif 000044
（2）配列情報SEQ ID NO:44:
（i）配列の特性:
（A）長さ:44塩基対
（B）型:核酸
（C）鎖の数:二本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（iii）ハイポセティカル:NO
（iii）アンチセンス:YES
（vi）起源:
（A）生物名:ヒト
（xi）配列:SEQ ID NO:44:
0003790797.tif 000045
（2）配列情報SEQ ID NO:45:
（i）配列の特性:
（A）長さ:44塩基対
（B）型:核酸
（C）鎖の数:二本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（iii）ハイポセティカル:NO
（iii）アンチセンス:NO
（vi）起源:
（A）生物名:ヒト
（ix）特徴:
（A）NAME/KEY:修飾_base
（B）存在位置:19
（D）その他の情報:/mod_base=i
（ix）特徴：
（A）NAME/KEY:misc_feature
（B）現在位置:27
（D）その他の情報:Nは非プリンまたは非ピリミジンである。
（ix）特徴:
（A）NAME/KEY:misc_feature
（B）現在位置:31
（D）その他の情報:Nは非プリンまたは非ピリミジンである。
（ix）特徴:
（A）NAME/KEY:misc_feature
（B）現在位置:33
（D）その他の情報:Nは非プリンまたは非ピリミジンである。
（ix）特徴:
（A）NAME/KEY:misc_feature
（B）現在位置:36..37
（D）その他の情報:Nは非プリンまたは非ピリミジンである。
（ix）特徴:
（A）NAME/KEY:misc_feature
（B）現在位置:40
（D）その他の情報:Nは非プリンまたは非ピリミジンである。
（xi）配列:SEQ ID NO:45:
0003790797.tif 000046
（2）配列情報SEQ ID NO:46:
（i）配列の特性:
（A）長さ:44塩基対
（B）型:核酸
（C）鎖の数:二本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（iii）ハイポセティカル:NO
（iii）アンチセンス:YES
（vi）起源:
（A）生物名:ヒト
（ix）特徴：
（A）NAME/KEY:misc_feature
（B）現在位置:24
（D）その他の情報:Nは非プリンまたは非ピリミジンである。
（ix）特徴:
（A）NAME/KEY:misc_feature
（B）現在位置:29..30
（D）その他の情報:Nは非プリンまたは非ピリミジンである。
（ix）特徴:
（A）NAME/KEY:misc_feature
（B）現在位置:33
（D）その他の情報:Nは非プリンまたは非ピリミジンである。
（ix）特徴:
（A）NAME/KEY:misc_feature
（B）現在位置:35
（D）その他の情報:Nは非プリンまたは非ピリミジンである。
（xi）配列:SEQ ID NO:46:
0003790797.tif 000047
（2）配列情報SEQ ID NO:47:
（i）配列の特性:
（A）長さ:26塩基対
（B）型:核酸
（C）鎖の数:二本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（iii）ハイポセティカル:NO
（iii）アンチセンス:NO
（vi）起源:
（A）生物名:ヒト
（ix）特徴:
（A）NAME/KEY:修飾_base
（B）存在位置:19
（D）その他の情報:/mod_base=i
（ix）特徴:
（A）NAME/KEY:misc_feature
（B）存在位置:26
（D）その他の情報:配列は、３’末端リン酸デオキシリボースと共にまたはそれらなしで示す。
（xi）配列:SEQ ID NO:47:
0003790797.tif 000048
（2）配列情報SEQ ID NO:48:
（i）配列の特性:
（A）長さ:26塩基対
（B）型:核酸
（C）鎖の数:二本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（iii）ハイポセティカル:NO
（iii）アンチセンス:NO
（vi）起源:
（A）生物名:ヒト
（ix）特徴:
（A）NAME/KEY:修飾_base
（B）存在位置:19
（D）その他の情報:/mod_base=i
（ix）特徴:
（A）NAME/KEY:misc_feature
（B）存在位置:26
（D）その他の情報:配列は、３’末端リン酸デオキシリボースと共に、またはそれなしで示す。
（xi）配列:SEQ ID NO:48:
0003790797.tif 000049
（2）配列情報SEQ ID NO:49:
（i）配列の特性:
（A）長さ:28塩基対
（B）型:核酸
（C）鎖の数:二本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（iii）ハイポセティカル:NO
（iii）アンチセンス:YES
（vi）起源:
（A）生物名:ヒト
（ix）特徴：
（A）NAME/KEY:misc_feature
（B）現在位置:28
（D）その他の情報:配列は、３’末端リン酸デオキシリボースと共にまたは、それなしで示す。
（xi）配列:SEQ ID NO:49:
0003790797.tif 000050
（2）配列情報SEQ ID NO:50:
（i）配列の特性:
（A）長さ:26塩基対
（B）型:核酸
（C）鎖の数:二本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（iii）ハイポセティカル:NO
（iii）アンチセンス:NO
（vi）起源:
（A）生物名:ヒト
（ix）特徴:
（A）NAME/KEY:修飾_base
（B）存在位置:19
（D）その他の情報:/mod_base=i
（ix）特徴:
（A）NAME/KEY:misc_feature
（B）存在位置:26
（D）その他の情報:配列は、３’末端リン酸デオキシリボースと共にまたはそれなしで示す。
（xi）配列:SEQ ID NO:506:
0003790797.tif 000051
（2）配列情報SEQ ID NO:51:
（i）配列の特性:
（A）長さ:23塩基対
（B）型:核酸
（C）鎖の数:二本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（iii）ハイポセティカル:NO
（iii）アンチセンス:YES
（vi）起源:
（A）生物名:ヒト
（ix）特徴：
（A）NAME/KEY:misc_feature
（B）現在位置:23
（D）その他の情報:配列は、３’リン酸デオキシリボースと共にまたはそれなしで示す。
（xi）配列:SEQ ID NO:51:
0003790797.tif 000052
（2）配列情報SEQ ID NO:52:
（i）配列の特性:
（A）長さ:20塩基対
（B）型:核酸
（C）鎖の数:二本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（iii）ハイポセティカル:NO
（iii）アンチセンス:NO
（vi）起源:
（A）生物名:ヒト
（ix）特徴:
（A）NAME/KEY:修飾_base
（B）存在位置:10
（D）その他の情報:/mod_base=i
（ix）特徴:
（A）NAME/KEY:修飾_base
（B）存在位置:12
（D）その他の情報:/mod_base=i
（ix）特徴:
（A）NAME/KEY:修飾_base
（B）存在位置:15..16
（C）同定方法:experimental
（D）その他の情報:/mod_base=i
（ix）特徴:
（A）NAME/KEY:修飾_base
（B）存在位置:19
（D）その他の情報:/mod_base=i
（xi）配列:SEQ ID NO:52:
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（i）配列の特性:
（A）長さ:41塩基対
（B）型:核酸
（C）鎖の数:二本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（iii）ハイポセティカル:NO
（iii）アンチセンス:NO
（vi）起源:
（A）生物名:ヒト
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（A）NAME/KEY:修飾_base
（B）存在位置:10
（D）その他の情報:/mod_base=i
（ix）特徴:
（A）NAME/KEY:修飾_base
（B）存在位置:12
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（ix）特徴:
（A）NAME/KEY:修飾_base
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（ix）特徴:
（A）NAME/KEY:修飾_base
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（i）配列の特性:
（A）長さ:41塩基対
（B）型:核酸
（C）鎖の数:二本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（iii）ハイポセティカル:NO
（iii）アンチセンス:YES
（vi）起源:
（A）生物名:ヒト
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（2）配列情報SEQ ID NO:55:
（i）配列の特性:
（A）長さ:41塩基対
（B）型:核酸
（C）鎖の数:二本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（iii）ハイポセティカル:NO
（iii）アンチセンス:NO
（vi）起源:
（A）生物名:ヒト
（ix）特徴:
（A）NAME/KEY:修飾_base
（B）存在位置:10
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（ix）特徴:
（A）NAME/KEY:修飾_base
（B）存在位置:12
（D）その他の情報:/mod_base=i
（ix）特徴:
（A）NAME/KEY:修飾_base
（B）存在位置:15..16
（D）その他の情報:/mod_base=i
（ix）特徴:
（A）NAME/KEY:修飾_base
（B）存在位置:19
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（2）配列情報SEQ ID NO:56:
（i）配列の特性:
（A）長さ:41塩基対
（B）型:核酸
（C）鎖の数:二本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（iii）ハイポセティカル:NO
（iii）アンチセンス:YES
（vi）起源:
（A）生物名:ヒト
（xi）配列:SEQ ID NO:56:
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（2）配列情報SEQ ID NO:57:
（i）配列の特性:
（A）長さ:20塩基対
（B）型:核酸
（C）鎖の数:二本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（iii）ハイポセティカル:NO
（iii）アンチセンス:YES
（vi）起源:
（A）生物名:ヒト
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（2）配列情報SEQ ID NO:58:
（i）配列の特性:
（A）長さ:24塩基対
（B）型:核酸
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（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（iii）ハイポセティカル:NO
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（A）生物名:Mycobacterium tuberculosis
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（i）配列の特性:
（A）長さ:68塩基対
（B）型:核酸
（C）鎖の数:二本鎖
（D）トポロジー:環状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（iii）ハイポセティカル:NO
（iii）アンチセンス:NO
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（A）生物名:Mycobacterium tuberculosis
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（2）配列情報SEQ ID NO:60:
（i）配列の特性:
（A）長さ:20塩基対
（B）型:核酸
（C）鎖の数:二本鎖
（D）トポロジー:環状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（iii）ハイポセティカル:NO
（iii）アンチセンス:YES
（vi）起源:
（A）生物名:Mycobacterium tuberculosis
（ix）特徴:
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（ix）特徴:
（A）NAME/KEY:修飾_base
（B）存在位置:14
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（ix）特徴:
（A）NAME/KEY:修飾_base
（B）存在位置:17
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（2）配列情報SEQ ID NO:61:
（i）配列の特性:
（A）長さ:76塩基対
（B）型:核酸
（C）鎖の数:二本鎖
（D）トポロジー:環状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（iii）ハイポセティカル:NO
（iii）アンチセンス:NO
（vi）起源:
（A）生物名:Mycobacterium tuberculosis
（xi）配列:SEQ ID NO:61:
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（2）配列情報SEQ ID NO:62:
（i）配列の特性:
（A）長さ:76塩基対
（B）型:核酸
（C）鎖の数:二本鎖
（D）トポロジー:環状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（iii）ハイポセティカル:NO
（iii）アンチセンス:YES
（vi）起源:
（A）生物名:Mycobacterium tuberculosis
（ix）特徴:
（A）NAME/KEY:修飾_base
（B）存在位置:12
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（ix）特徴:
（A）NAME/KEY:修飾_base
（B）存在位置:22
（D）その他の情報:/mod_base=i
（ix）特徴：
（A）NAME/KEY:修飾_base
（B）存在位置:25
（D）その他の情報:/mod_base=i
（xi）配列:SEQ ID NO:62:
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（2）配列情報SEQ ID NO:63:
（i）配列の特性:
（A）長さ:51塩基対
（B）型:核酸
（C）鎖の数:二本鎖
（D）トポロジー:環状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（iii）ハイポセティカル:NO
（iii）アンチセンス:NO
（vi）起源:
（A）生物名:Mycobacterium tuberculosis
（xi）配列:SEQ ID NO:63:
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（2）配列情報SEQ ID NO:64:
（i）配列の特性:
（A）長さ:25塩基対
（B）型:核酸
（C）鎖の数:二本鎖
（D）トポロジー:環状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（iii）ハイポセティカル:NO
（iii）アンチセンス:NO
（vi）起源:
（A）生物名:Mycobacterium tuberculosis
（xi）配列:SEQ ID NO:64:
0003790797.tif 000065
（2）配列情報SEQ ID NO:65:
（i）配列の特性:
（A）長さ:76塩基対
（B）型:核酸
（C）鎖の数:二本鎖
（D）トポロジー:環状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（iii）ハイポセティカル:NO
（iii）アンチセンス:NO
（vi）起源:
（A）生物名:Mycobacterium tuberculosis
（xi）配列:SEQ ID NO:65:
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（2）配列情報SEQ ID NO:66:
（i）配列の特性:
（A）長さ:76塩基対
（B）型:核酸
（C）鎖の数:二本鎖
（D）トポロジー:環状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（iii）ハイポセティカル:NO
（iii）アンチセンス:YES
（vi）起源:
（A）生物名:Mycobacterium tuberculosis
（ix）特徴:
（A）NAME/KEY:修飾_base
（B）存在位置:12
（D）その他の情報:/mod_base=i
（ix）特徴:
（A）NAME/KEY:修飾_base
（B）存在位置:22
（D）その他の情報:/mod_base=i
（ix）特徴:
（A）NAME/KEY:修飾_base
（B）存在位置:25
（D）その他の情報:/mod_base=i
（xi）配列:SEQ ID NO:66:
0003790797.tif 000067
（2）配列情報SEQ ID NO:67:
（i）配列の特性:
（A）長さ:116塩基対
（B）型:核酸
（C）鎖の数:二本鎖
（D）トポロジー:環状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（iii）ハイポセティカル:NO
（iii）アンチセンス:NO
（vi）起源:
（A）生物名:Mycobacterium tuberculosis
（xi）配列:SEQ ID NO:67:
0003790797.tif 000068
（2）配列情報SEQ ID NO:68:
（i）配列の特性:
（A）長さ:130塩基対
（B）型:核酸
（C）鎖の数:二本鎖
（D）トポロジー:環状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（iii）ハイポセティカル:NO
（iii）アンチセンス:NO
（vi）起源:
（A）生物名:Mycobacterium tuberculosis
（xi）配列:SEQ ID NO:68:
0003790797.tif 000069
（2）配列情報SEQ ID NO:69:
（i）配列の特性:
（A）長さ:408塩基対
（B）型:核酸
（C）鎖の数:二本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（iii）ハイポセティカル:NO
（iii）アンチセンス:NO
（vi）起源:
（A）生物名:ヒト
（xi）配列:SEQ ID NO:69:
0003790797.tif 000070
【図１】
0003790797.tif 000071
【図２】
0003790797.tif 000072
【図３】
0003790797.tif 000073
【図４】
0003790797.tif 000074
【図５】
0003790797.tif 000075
【図６】
0003790797.tif 000076
【図７】
0003790797.tif 000077
【図８】
0003790797.tif 000078
【図９】
0003790797.tif 000079