(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効量の水不溶性カロチノイド０．１〜１０重量％および非毒性キャリアーを含有する、正常皮膚細胞の黒色腫への変換抑制用薬剤。
【請求項２】
下記の成分（１）および（２）を含有する請求項１記載の薬剤：
（１）水不溶性カロチノイド０．１〜１０重量％、並びに
（２）脂肪酸、トリグリセリド脂質、非鹸化性脂質製剤およびこれらの任意の混合物から成る群から選択される沈殿防止剤、
ソルビタンの脂肪酸エステルとポリオキシエチレンとの反応生成物、グリセロール脂肪酸エステルおよび脂肪酸のアセチル化エステルから成る群から選択される乳化剤、並びに
糖およびポリオールから成る群から選択される水溶性分散剤
を含有する非毒性キャリアー９０〜９９．９重量％。
【請求項３】
正常皮膚細胞が哺乳類の正常皮膚細胞である請求項１または２記載の薬剤。
【請求項４】
正常皮膚細胞がヒトの正常皮膚細胞である請求項１または２記載の薬剤。
【請求項５】
正常皮膚細胞がメラニン細胞である請求項１から４いずれかに記載の薬剤。
【請求項６】
水不溶性カロチノイドがβ−カロチンを含有する請求項１から５いずれかに記載の薬剤。
【請求項７】
水不溶性カロチノイドがβ−カロチンを２〜５０重量％含有する請求項６記載の薬剤。
【請求項８】
水不溶性カロチノイドがβ−カロチンを２０〜４０重量％含有する請求項６記載の薬剤。
【請求項９】
メラニン細胞の黒色腫への変換が、ＤＮＡ転写因子の活性の調節によって抑制される請求項１から８いずれかに記載の薬剤。
【請求項１０】
転写因子の活性が、ＤＮＡの発現の抑制によって調節される請求項９記載の薬剤。
【請求項１１】
トリグリセリド脂質が、植物脂肪、植物油、動物脂肪および動物油から成る群から選択される請求項２記載の薬剤。
【請求項１２】
乳化剤がグリセロールモノオレエートである請求項２または１１記載の薬剤。
【請求項１３】
水溶性分散剤が、ソルビトールおよびグリセロールから成る群から選択される請求項２または１１記載の薬剤。
【請求項１４】
薬剤が０．１〜１０．０μｇ／ｍｌの濃度で水不溶性カロチノイドを含有する請求項１から１３いずれかに記載の薬剤。
【請求項１５】
薬剤が０．３〜３．０μｇ／ｍｌの濃度で水不溶性カロチノイドを含有する請求項１４記載の薬剤。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
この発明は上皮細胞の腫瘍化抑制用カロチノイド剤(carotenoid  agent)および該カロチノイド剤を用いる処置法に関する。特にこの発明はメラニン細胞の黒色腫化抑制用カロチノイド剤および該カロチノイド剤を用いる処置法に関する。
発明の背景
以下の説明は特にメラニン細胞と黒色腫に関するものであるが、その他の上皮細胞に関しても類似の議論が適用できることは当業者には明らかである。
黒色腫は、タンニンとして認識されている褐色のメラニンを生成する皮膚細胞(メラニン細胞)の変性に起因する。あざやそばかすはメラニン細胞が多く含まれる部分に発生する。
黒色腫は一般に皮膚を日光にさらすことによって発生する。色白の人々、特にあざのある人は黒色腫になりやすい。
メラニン細胞の増殖分裂様式が光の影響により変化を受けて黒色腫が発生すると考えられる。黒色腫は身体の他の部位へ広がる悪性の場合がある。広がらない黒色腫は良性黒色腫と呼ばれている。
黒色腫は通常は露出した皮膚に形成されるが、口腔内のような部位で発生することもある。
黒色腫は増殖して大きくなるので、身体の他の部位まで広がる前に外科的に除去しなければならない。黒色腫が内部臓器まで広がると、その除去または治療はより困難となり、化学療法または放射線療法が必要となる。従って、メラニン細胞の黒色腫化を抑制することができるならば、黒色腫の処置に関連する問題も少なくすることが可能となる。
カロチノイド、特にβ−カロチンが乳癌、肺癌、結腸癌、前立腺癌、頸部癌、心臓病および脳卒中の発生率を低減させ、また、しみやあざの変性を抑制するということが仮定されている。これに関連して、哺乳類の体内においてはβ−カロチンがビタミンＡ、ビタミンＡ類似体またはレチノイドに変換されるという仮定がなされている［ムーン(Moon  R. C.)、「癌の化学的予防剤としてのカロチノイドとレチノイドの比較検討」、J. Nutr.、第１１９巻、第１２７頁〜第１３４頁(１９８９年)］。カロチノイド、特にβ−カロチンが化学的予防剤の研究において重要な化合物となっているのは、このプロビタミンＡ活性および酸化的損傷抑制能に起因する。例えば、特に細胞内での正常な代謝の副生物であるフリーラジカルを失活させるために抗酸化剤が用いられている。
β−カロチンは赤血球生成性プロトポルフィリン症(erythropoietic  protoporphyria;ＥＰＰ)の治療に用いられている。ＥＰＰはポルフィリン化合物の代謝阻害をもたらす遺伝病である。この病気をもつ患者の皮膚を日光にさらすと、直ちに水泡が形成される。
先に例示した特定の癌の発生率を低減させるのにカロチノイドが有効であろうということが仮定されているが、カロチノイドがメラニン細胞の黒色腫化を抑制するのに有効であるという可能性を実証した研究は全くなされていない。
このような理由から、カロチノイドがメラニン細胞の黒色腫化の抑制または低減に有効であるかどうかを決定するための研究をおこなった。この研究に際しては、カロチノイドの性状や化学的特性に起因して該化合物をヒトに適用するのは困難であるという問題を解決することが必要であった。
カロチノイドは親油性であるために、水に有効量溶解させることができない。カロチノイドは低密度リポタンパク質と共に血流中へ輸送されると考えられる。
これまでのところ、正常な細胞と変換細胞に対するβ−カロチンの効果を調べるために、β−カロチンを溶剤(例えば、テトラヒドロフラン、ブタノール、クロロホルム、ヘキサン、ジメチルスルホキシド、エタノール)を用いて溶解させるかまたはリポソームミセルとする生体外での試験がいくつかおこなわれている。従来のリポソーム製剤は細胞系の培養において毒性を示すので、その用途は限定される。これらの点に関しては下記の文献を参照されたい:
(ｉ)ベンラム(Benram  J. S.)、パング(Pung. A.)およびチャーリー(Churley  M.)ら、「化学的に誘発される腫瘍変換に対する種々のカロチノイドによる予防」、Carcinogenesis、第１２巻、第６７１頁〜第６７８頁(１９９１年)、
(ii)ハズカ(Hazuka M. B.)、プラサド−エドワーズ(Prasad−Edweards  J.)およびニューマン(Newman F.)ら、「β−カロチンは形態学的分化を誘発し、培養中のメラニン細胞のアデニルサイクラーゼ活性を低下させる」、J. Am. Coll. Nutr.、第９巻、第１４３頁〜第１４９頁(１９９０年)、
(iii)シュルツ(Schulz  T. D.)、チュー(Chew  B. P.)およびシーマン(Seaman  W. R.)ら、「ヒトの癌細胞の生体外増殖に対するリノール酸の共役ジェン誘導体およびβ−カロチンの抑制効果」、Canc. Letters、第６３巻、第１２５頁〜第１３３頁(１９９２年)、
(iv)シュヴァルツ(Schwartz  J. L.)およびシュクラール(Shklar  G.)、「生体外のヒトの癌細胞系に対するカロチノイドとα−トコフェロールの選択的細胞毒効果」、J. Oral  Maxillofac  Surg.、第５０巻、第３６７頁〜第３７３頁(１９９２年)、
(v)シュヴァルツ、タナカ(Tanaka  J.)およびカンデカール(Khandekar  V.)ら、「ヒトのＳＣＣ−２５扁平上皮癌細胞内のアルキル化剤の活性調節因子としてのβ−カロチンおよび／またはビタミンＥ」、Canc. Chemother. Pharmacol.、第２９巻、第２０７頁〜第２１３頁(１９９２年)、
(vi)チャン(Zhang  L-X.)、クーニー(Cooney  R. V.)およびバートラム(Bertram  J. S.)、「カロチノイドはＣ３Ｈ／１０Ｔ１／２細胞内においてギャップ結合能を高めて脂質の過酸化を抑制する;該化合物のこれらの特性と癌に対する化学的予防作用との関係」、Carcinogenesis、第１２巻、第２１０９頁〜第２１１４頁(１９９１年)、
(vii)チャン、クーニーおよびバートラム、「カロチノイドはそれらのプロビタミンＡまたは抗酸化剤としての特性とは無関係にコネキシン４３遺伝子発現の調節能を高める」、Canc. Res.、第５２巻、第５７０７頁〜第５７１２頁(１９９２年)。
上記の溶剤は、投与量によって左右される毒性効果を示すことが知られている。これらの溶剤は静脈内投与製剤または注射用製剤の成分としてはヒトの血液またはリンパ液と適合しない。
従って、カロチノイドを投与する場合には適当なキャリアーを使用しなければならない。このような理由から本発明者は、上皮細胞の腫瘍化、特にメラニン細胞の黒色腫化に対するカロチノイドの抑制効果を調べるための生体外試験をおこなった。
発明の概要
本発明によれば、適切な非毒性キャリアー媒体に水不溶性カロチノイド成分を有効量含有する上皮細胞の腫瘍化抑制用カロチノイド剤が提供される。
本発明はまた、適切な非毒性キャリアー媒体中に配合した水不溶性カロチノイド剤を上皮細胞に有効量投与することを含む上皮細胞の腫瘍化抑制方法を提供する。
上皮細胞は哺乳類の上皮細胞であってもよく、好ましくは皮膚細胞であり、特に好ましくはメラニン細胞である。本発明のより好ましい態様においては、上皮細胞はヒトの上皮細胞、特に好ましくはヒトのメラニン細胞である。
好ましくは、水不溶性カロチノイド成分にはβ−カロチンが含まれる。本発明のさらに好ましい態様においては、水不溶性カロチノイド成分にはβ−カロチンが２〜５０重量％含まれる。さらに好ましくは、水不溶性カロチノイド成分にはβ−カロチンが２０〜４０重量％含まれる。より好ましくは、水不溶性カロチノイド成分にはβ−カロチンが３０重量％含まれる。
好ましくは、キャリアー媒体には次の群から選択される沈澱防止剤が含まれる:脂肪酸、トリグリセリド脂質、非鹸化性脂質製剤、可溶性炭化水素およびこれらの任意の混合物。
トリグリセリド脂質は植物から得られる脂肪および／または油(特に好ましくは種子油、例えば綿実油、ひまわり油またはこれらの任意の混合物)から選択するのが好ましいが、動物源、例えば獣肉および魚肉から得られる脂肪および／または油から選択してもよい。キャリアー媒体に配合するには種子油が特に好ましく、就中、大豆油が特に好ましい。
本発明によるカロチノイド剤には水不溶性カロチノイド成分を０．１〜１０重量％、就中、１〜５重量％配合するのが特に好ましい。
非毒性キャリアー媒体には乳化剤も配合するのが好ましい。乳化剤はツイーン(Tween)ソルビタンの脂肪酸エステルとポリオキシエチレンとの反応生成物、グリセロール脂肪酸エステルおよび脂肪酸のアセチル化エステルから選択するのが好ましい。グリセロールモノオレエートは特に好ましい乳化剤である。
非毒性キャリアー媒体には水溶性分散剤も配合するのが好ましい。水溶性分散剤として特に好ましいものは糖またはポリオール、就中、ソルビトールおよびグリセロールである。
本発明のいずれの態様においても、メラニン細胞と接触させるカロチノイド剤の有効量は、好ましくは０．１〜１０．０μg／ml、就中、,０．３〜３．０μg／mlである。このような濃度は適当な希釈剤を用いて調整すればよい。希釈剤は細胞増殖に適した培地、水性緩衝液、通常の静脈用製剤(等張塩水および５％デキストロース溶液を含む)、血漿およびこれらの任意の混合物から選択するのが好ましい。
この明細書で用いる「混合物」には、エマルション、溶液および結晶懸濁液を含む種々の物理的形態のものが含まれる。
実施例
以下の実施例はカロチノイド組成物のメラニン細胞の処置における効能と該組成物の相対的非毒性(relative  non−toxicity)を例証するものである。
以下の実施例を添付図に基づいて説明する。
図１は正常はヒトのメラニン細胞内でのＤＮＡ合成に対するβ−カロチンの効果を示すグラフである。要するに、ＤＮＡ合成はβ−カロチンの使用量を最大にすることによって著しく抑制されるが、使用量が少ない場合にはほとんどまたは全く抑制されない。ＵＶ試験のための前処理量としては１．０μg／mlを選択した。これは該使用量が、ＤＮＡ合成に対して最小の効果をもたらすβ−カロチンの最大濃度だからである。β−カロチンと共にメラニン細胞を２４時間培養した。各々のデータポイントは対照に対する標準誤差が６ウェル＋／−％の平均値である。
図２はβ−カロチンの存在下または不存在下でのＵＶＢ照射処理に付した後の正常なヒトのメラニン細胞の生存率を示すグラフである。要するに、ＵＶＢ(５００mJ／cm2)の照射から０．０５時間後の細胞の生存率は、β−カロチンを存在させる場合はβ−カロチンを存在させない場合に比べて、ほぼ２０％高くなる。この効果は経時的に維持された。各々のデータポイントは対照に対する標準誤差が３ウェル＋／−％の平均値である。
図３はβ−カロチンの存在下または不存在下でのＵＶＢ照射処置に付したメラニン細胞のノーザン分析を示すグラフである。要するに、５００mJ／cm2の照射から２４時間後に発生するＵＶＢによるc−junの誘導は最も高くなる(基礎レベルの３６．２倍に相当する)。c−fosの誘導は照射から２時間後に最大となる(発現度は基礎レベルの５７倍に相当する)。ＵＶＢによる誘導はβ−カロチンによって実質的に阻害される。c−jun発現は照射誘導は４時間後、β−カロチンによって１１．１倍増大するが、ＵＶＢによる誘導は２４時間後には完全に阻害される。β−カロチンを存在させない場合またはＵＶＢを照射させない場合のこれらの遺伝子の基礎発現度は図示する全てのＲＮＡレベルから差し引いた。ブロットは１８Ｓによるローディングに対して補正した。
図４はβ−カロチンの存在下または不存在下での正常なヒトのメラニン細胞内でのＤＮＡ合成を示すグラフである。要するに、β−カロチンで前処理することによって、ＵＶＢ照射(４００mJ／cm2)から２４時間後のＤＮＡ合成量は増大する。この効果は照射から４時間後には認められない。各々のデータポイントは、対照に対する標準誤差が６ウェル＋／−％の平均値である。
図５は、実施例で使用したストラタリンカー・クロスリンカー(Stratalinker  Crosslinker)装置に用いたＵＶＰ灯のスペクトル分布を示すグラフである。
図６は、ＵＶＢ照射処理に付したメラニン細胞に対するβ−カロチンの処理効果を比較する実験結果を示す４種のヒストグラムである。要するに、メラニン細胞を１μg／mlのβ−カロチンの存在下または不存在下で２４時間処理した結果と適当な対照を用いた結果を比較したものである。培地を除去した後、細胞に１００mJ／cm2または５００mJ／cm2のＵＶＢを照射した。次いで、新鮮な培地を加えて細胞をさらに、１．４〜２４時間培養し、全てのＲＮＡを単離した。これらのヒストグラムは４種の正常なコーカソイドのメラニン細胞系に関する４種の独立したノーザン分析の結果(ローディングに対して補正した結果)を示す。
図７は、ＵＶＢ照射処理(１００mJ／cm2)に付した細胞のＤＮＡ結合活性に対するβ−カロチンの処理効果を示す。
図８は、ＵＶＢ照射処理(５００mJ／cm2)に付した細胞のＤＮＡ結合活性に対するβ−カロチンの処理効果を示す。要するに、４種の正常なコーカソイドのメラニン細胞(ＮＣＭ)系からの核抽出物のＤＮＡ結合活性を測定するために、ＮＦカッパＢ共通配列を用いるゲル移動度シフトアッセイ(gel mobility shift assay)をおこなった。ＮＣＭはβ−カロチン１．０μg／mlを用いて２４時間前処理した後、ＵＶＢ照射処理(５００mJ／cm2)に付し、次いで照射処理から１．４〜２４時間後にアッセイをおこなった。
図９はヒトのメラニン細胞をＯ−テトラデカノイルフォルボール１３−アセテート(ＴＰＡ)、３−イソブチル１−メチルキサンチン(ＩＢＭＸ)またはＴＰＡとＩＢＭＸとの混合物で処理した後、ＵＶＢ照射をおこなったときまたは該照射をおこなわなかったときのＲＮＡの全合成量を示す。要するに、メラニン細胞をＴＰＡ(１０ng／ml)もしくはＩＢＭＸ(０．１mM)または適当な対照を用いて２４時間処理した効果を示す。培地を除去した後、細胞にＵＶＢを照射し(１００mJ／cm2)、次いでＴＰＡもしくはＩＢＭＸを含有するか、または含有しない新鮮な培地を添加して１時間培養し、さらに照射処理をおこなった後、ＲＮＡを単離した。これらのヒストグラムは、２種の正常なコーカソイドの新生児のメラニン細胞系についての２種の独立したノーザン分析の結果(ローディングに対して補正した結果)を示す。
図１０はＵＶ照射に対するヒトのメラニン細胞の反応の原因と考えられる細胞内機構の概要を示す。
図１および図５は、ＤＮＡ合成活性の尺度である三重水素化されたチミジンの取り込み率(％)」に関する。
本発明に関しておこなった実験の詳細を以下に説明する。
実験に関する資料
(a)細胞培養
ヒトの新生児の包皮を０．２５％トリプシン(４℃)中に一夜放置した。この培養をおこなった後、組織をこすりおとし、メラニン細胞を回復させた。このメラニン細胞を次の成分を含有するＭＣＤＢ１５１培地［シグマ社(Sigma)製］中で培養した:２％牛胎児血清、０．３％牛下垂体エキス［クロネチックス社(Clonetics Corp.)製］、１０ng／mlＴＰＡ、２mMCaCl2、５μg／mlインスリンおよび０．１mM  ＩＢＭＸ(シグマ社製)。
(b)化学薬品
β−カロチンは藻類ドゥナリエラ・サリナ(Dunaliella  salina)から単離した。β−カロチンは全カロチノイド中に８５〜９０％含まれ、残りの半分はオキシカロチノイド(ルテインおよびゼアキサンチン)であり、半分はα−カロチンであった。γ−カロチンは通常は高圧液体クロマトグラフィーによっては検出されない。大豆油は大豆から単離した。β−カロチンと大豆油との結晶懸濁液を調製した。この懸濁液を乳化して下記の組成物を調製した。該組成物は加熱または濾過による滅菌処理に付した。細胞系についての試験をおこなう前に、各々の小瓶中の該組成物は各試験に使用する新鮮な小瓶を用いて低温小瓶［コスター社(Costar)製］に小分けした。実験の全操作を通じて、β−カロチンが直接光にさらされるのを避けた。β−カロチンの乳化組成物の配合組成は次の通りである:
成  分 配合量(重量％)
β−カロチン                                    ２．４
大豆油                                          ６．８
グリセリルモノオレエート                        ７．２
グリセロール                                  ６６．７
水                                            １６．９
この組成物は次の様にして調製した。β−カロチンと大豆油との結晶懸濁液を加熱し、グリセリルモノオレエートを添加した。この油性相を高剪断混合によってグリセロールの水性相中に分散させた後、６０〜７０℃での均質化処理に付した。均質化圧は通常は８，０００〜１０，０００ＰＳＩであるが、使用するホモジナイザーに応じて変化させてもよい。得られた組成物は加熱による滅菌処理に付した。一般的には、加熱は分散用容器(３mlのガラス製小瓶)中において１２１℃で１５分間の圧熱処理によっておこなう。所望により、抗酸化剤としてトコフェロールを０．３％添加することによって、毒性物の経時的生成を防止してもよい。
(c)実験条件
紫外線(ＵＶ)照射は細胞に対して重大な損傷、例えば、遺伝的突然変異、発癌の促進およびその他の有害な変化等をもたらす。ヒトに対するＵＶ照射の潜在的に有害な効果は主としてＵＶＢスペクトル(即ち、波長が２９０〜３２０nmの放射線)に起因する。この点に関しては次の文献を参照されたい:ギルヒレスト(Gilchrest  B. A.)、ソーラー(Soler  N. A.)、スタッフ(Staff  J. S.)およびミーム(Mihm  M. C. Jr.)「ヒトの日焼け反応:組織学的および生化学的研究」、J. Am. Acad. Dermatol.、第５巻、第４１１頁〜第４２２頁(１９８１年)。ＵＶ照射の別の形態はＵＶＣ照射である。日光に含まれるＵＶＣ放射線は２５４nmのオーダーの波長を有する放射線であるが、生物学的にはＵＶＢ放射線のような問題はもたらさない。これは、日光に含まれるＵＶＣ放射線が地球のオゾン層によって強く吸収されるからである。従って、この実験においてはメラニン細胞に対するＵＶＢ照射の効果およびメラニン細胞をカロチノイドで処理することによる該効果の変化を検討した。細胞はプラスチック製容器内で培養したのでＵＶＣ放射線は実験系から遮断された。
メラニン細胞のＵＶＢ照射はストラタリンカー・クロスリンカー装置［ストラタジーン社(Stratagene)製］を用いておこなった。、該装置は、ＵＶＸ−３１ラジオメーター［ユー・ブイ・ピー社(ＵＶＰ  Inc.)製］で測定したときに放射極大中心を３０２nmに示すＵＶＰ灯を５個具有する。波長が２８０nmよりも短い放射線は組織培養皿に蓋を装着させることによって遮断した。図５は該ＵＶＰ灯のスペクトル分布を示す。
(d)ＲＮＡ分析
全てのＲＮＡは、界面活性剤を用いる溶解処理に付した後、フェノール−クロロホルム抽出とエタノール沈澱処理をおこなうことによって単離した。ＲＮＡ(１５μg)を変性ホルムアルデヒド／アガロースゲル上でのサイズ分画処理に付した後、毛細管ブロッティング法によってナイロン製フィルター上に移した。ブロットを32Ｐで標識化したcDNAプローブにさらした後、次の成分を含有する媒体(４２℃)中でのハイブリッド形式処理に２４時間付した:５０％ホルムアミド［２Ｘ  ＳＳＣ、５Ｘデンハルツ(Denhardts)］、０．１％  ＳＤＳ、１０％デキストランスルフェートおよび１００μg／ml鮭精子ＤＮＡ。次いで、フィルターを６０℃で０．５−０．１Ｘ  ＳＳＣのストリンジェンシー(stringency)まで洗浄した後、フィルム(フジフィルム社製)を用いてオートラジオグラムを−８０℃で３〜１０日間撮影した。オートラジオグラムはＧＳ−３６５ソフトウェア［ヘーファー・サイエンティフィック社(Hoefer Scientific)製］を用いるデンシトメトリーによって定量した。
(e)遺伝子プローブ
c−junプローブはプラスミドｐＨＪからの１．２kb  Sal １／Hpa  Ｉフラグメントである［ボーマン(Bohmann)、１９８７年］。c−fosプローブはプラスミドＢＫ２８からの１．８kb  Xho  Ｉ／Eco ＲＩフラグメントである［ヴェルマ(Verma)、１９８８年］。１８Ｓプローブは、プラスミドpBからのEco ＲＩ消化と５．６kbフラグメントの分離によって単離した［ゴンザレス(Gonzalez)、１９８８年］。
(f)細胞の計数とＤＮＡ合成の測定
細胞は０．２５％トリプシンを用いて収集し、クールターカウンター［クールター・インストゥルメント社(Coulter  Instruments)製］を用いて計数した。生存度はトリパンブルー排除(trypan  blue  exclusion)によって決定した。ＤＮＡ合成は、培地に添加した(メチル−3Ｈ)−チミジン２．５mCi／ml(２０Ci／mmol)［デュポン−ニューイングランド・ヌクレア社(Dupont−New  England  Nuclear)製］を用いて培養終了前４時間にわたって標識化することによって測定した。メラニン細胞はPh. D.細胞ハーベスター［ケンブリッジ・リサーチ社(Cambridge  Research  Inc.)製］を用いて収集した。取り込まれた放射能量は液体シンチレーションカウンターＬＳ５０００ＴＤ［ベックマン・インストゥルメンツ社(Beckman  Instruments)製］を用いて測定した。
(g)核タンパク質抽出物
細胞は全面の約５０〜６０％まで増殖させた後、以下のセクション(ｉ)に記載の実験プロトコルに従って処理した。細胞は次の成分を含有する氷上の低張緩衝液中において１５分間膨潤させた:１０mM  ＨＥＰＥＳ(ｐＨ７．８)、０．１mM  ＥＤＴＡ、１０mM  ＫＣＣ、１mM  ＤＴＴ、ＰＭＳＦ。細胞質ゾルのタンパク質フラクションは、ノニデット(Nonidet)Ｐ−４０を０．５％まで添加した後、遠心分離(５００g、５分間)によって核から分離させることによって入手した。核タンパク質は残存するペレットを高張緩衝液［２０μＭ  ＨＥＰＥＳ(ｐＨ７．９）、３５０mM  NaCl、１mM  ＤＴＴ、１mM  ＰＭＳＦ］を用いる透析処理(１０℃、２時間)に付すことによって単離した。単離した核タンパク質は−８０℃で凍結保存した。定量は波長２３０nm、２６０nmおよび３２０nmにおける光学濃度からの計算によっておこなった。
(h)ゲル移動度シフトアッセイ
各々の抽出物試料５μgを、32pで標識化したＮＦカッパＢの共通オリゴヌクレオチド１０，０００cpmと共にインキュベートした。１時間インキュベートした後、試料を低イオン強度のポリアクリルアミドゲル中での電気泳動処理に付した。タンパク質:ＤＮＡ複合体の定量はデンシトメトリーによっておこなった。
(i)実験プロトコル
実験は下記のタイムテーブルに従っておこなった。
0003795075.tif 000002
正常なヒトのメラニン細胞を適当な容器(６ウェルプレート、９６ウェルプレート、７５cmもしくは１７５cmフラスコ)内に接種し、全面の５０〜６０％まで増殖させた。「処理」グループの場合には、次いで新鮮な培地とβ−カロチン(１．０μg／ml)を添加し、細胞をβ−カロチンと共に２４時間インキュベートした。インキュベーションをおこなった後、細胞をＰＢＳを用いて２回洗浄し、次いでＵＶＢを照射した(５００mJ／cm2)。照射後、β−カロチンを含有しない新鮮な培地を添加し、さらに１時間、２時間、４時間および２４時間インキュベートした。「０．０５時間」は、ＵＶＢ照射後、細胞を３分以内に収集した時点を意味する。「対照」グループにおいては、β−カロチン処理以外は「処理」グループと全く同様の処理をおこなった。
結果の検討
図１によれば、β−カロチンの添加量が最大の場合には、ＤＮＡ合成は著しく抑制されるが、添加量が少ない場合にはこのような抑制効果はほとんどまたは全くみられない。ＵＶ照射実験のためのβ−カロチンの前処理量としては１．０μg／mlを選択したが、これはＤＮＡ合成に対する最小の効果を得るためのβ−カロチンの最大濃度が１．０μg／mlだからである。β−カロチンはメラニン細胞と共に２４時間インキュベートした。各々のデータポイントは、対照に対する標準誤差が６ウェル＋／−％の平均値である。
図２は、ＵＶＢの照射(５００mJ／cm2)から０．０５時間後の細胞の生存率はＵＶＢ照射のみの場合に比べてβ−カロチンを存在させる場合の方が約２０％高くなることを示す。この効果は経時的に維持された。各々のデータポイントは、対照に対する標準誤差が３ウェル＋／−％の平均値である。
図３は、５００mJ／cm2の照射から２４時間後に発生するＵＶＢによるc−jumの誘導が最も大きくなることを示す(基礎レベルの３６．２倍に相当する)。c−fosの誘導は照射から２時間後に最大となる(発現度は基礎レベルの５７倍に相当する)。ＵＶＢによるc−fosの誘導はβ−カロチンによって実質的に阻害される。c−jun発現は照射から４時間後にβ−カロチンによって１１．１倍増大するが、２４時間後にはＵＶＢによる誘導は完全に阻害される。β−カロチンを存在させない場合またはＵＶＢを照射させない場合のこれらの遺伝子の基礎発現度は図示する全てのＲＮＡレベルから差し引いた。ブロットは１８Ｓによるローディングに対して補正した。
図４は、β−カロチンで処理したメラニン細胞における三重水素化チミジンの取り込み量は照射後２４時間で増大することを示す。
特定の理論に限定されるものではないが、例示した混合物は非常に微細なエマルションであると考えられる。
図６のヒストグラムは４種の別々のノーザン分析の結果を示す。左側にはＵＶＢを１００mJ／cm2照射した結果を示し、右側にはＵＶＢを５００mJ／cm2照射した結果を示す。図６のヒストグラムに示すように、c−fosとc−junのＲＮＡレベルは急激に増大し、照射後１時間で最大の発現度に達する。しかしながら、この誘導は一過性のものであり、発現度は照射後４時間で基礎レベルまで低下する。５００mJ／cm2の照射後１時間のc−jun発現度は１００mJ／cm2の照射の場合に比べてほぼ２倍になる。c−fosの発現度も５００mJ／cm2の照射後の場合が高くなる。β−カロチンはＵＶＢ照射で誘発されるc−fosの発現を変化させず、また、c−junに対してもわずかな効果を及ぼすだけである。
図７は、照射処理に付したメラニン細胞から単離した核タンパク質のＤＮＡ結合活性に関する。転写因子ＮＦカッパＢに対する活性は経時的に実質的な影響を受けなかった。細胞質中での核因子カッパＢ(ＮＦカッパＢ)の活性は核因子カッパＢ複合体の不活性なＮＦカッパＢ−インヒビターの解離に起因することが知られている。これに関しては次の文献を参照されたい:シモン(Simon  M. M.)ら、「ＵＶＢ照射による細胞不含細胞質ゾル抽出物中の染色体ＤＮＡ損傷によって核因子カッパＢ(ＮＦカッパＢ)活性は独立して誘発される」、The  Joural  of  Investigative  Dermatology、第１０２巻(第４号)、第４２２頁(１９９４年)。しかしながら、β−カロチンはＮＦカッパＢ結合活性を幾分低下させる。１００mJ／cm2の照射によっては基礎レベル以上の結合活性は誘発されないが、β−カロチンはＮＦカッパＢ活性に変化をもたらす。
図８は、ＵＶＢを５００mJ／cm2照射した後の正常なコーカソイドのメラニン細胞のＤＮＡ結合活性の測定結果を示す。ＮＦカッパＢの典型的なオートラジオグラムを図の左側に示し、測定結果を図の右側に示す。最も低い活性は照射から２４時間後にみられる。
図７に示すように、照射量が１００mJ／cm2のときにはβ−カロチンはＮＦカッパＢに対して適度な効果をもたらすが、照射量が５００mJ／cm2になると、β−カロチンは照射から１時間後にＮＦカッパＢ活性を５０％以上抑制する。これらのデータは、ＵＶＢの照射量が高いときにはＮＦカッパＢ結合活性が低レベルに調節されることを示す。
図９は、ＴＰＡおよびＩＢＭＸ中で培養した正常なコーカソイドの新生児のメラニン細胞のノーザン分析の結果を示す。ＵＶＢを１００mJ／cm2照射した後のc−junの誘導はこれらの培地条件の影響を受けることが判明した。ＴＰＡまたはＩＢＭＸを用いて２４時間処理するか、またはこのような処理をおこなわないメラニン細胞を照射処理に付した後、問題となる因子の存在下または不存在下でさらに１時間インキュベートした。完全培地(即ち、ＴＰＡとＩＢＭＸの両方を含有する培地)中で照射したメラニン細胞に比べて、c−junの誘導は約５０％低下した。さらに、ＴＰＡおよびＩＢＭＸで処理しない照射メラニン細胞はc−jun発現を、非照射条件下の試料の場合のレベルまで低減させる。ＲＮＡレベルは、ＵＶＢ照射を受けるメラニン細胞内においてＴＰＡ、ＩＢＭＸまたはこれらの混合物の不存在によって影響を受けない。照射量が１００mJ／cm2の場合、c−junを完全に誘導させるためには、メラニン細胞はＴＰＡとＩＢＭＸの両方を必要とする。
結論
紫外線照射によるＤＮＡ損傷によって多くの転写因子が影響を受けやすいことが文献に報告されている。このような因子にはc−fos遺伝子、c−jun遺伝子、ＮＦカッパＢ複合体およびＡＰ−１複合体が含まれる。正常なメラニン細胞のＤＮＡに対する紫外線照射損傷に関する応答の仲介に含まれる幾分複雑な推定機構の概略を図１０に示す。培養した正常なメラニン細胞に関して一連の実験をおこなった(ＵＶＢ照射後の該細胞のc−fosとc−junの発現に対するノーザン分析によって検討した)。c−fos遺伝子とc−jun遺伝子に対する効果を調べた実験から得られたデータは幾分矛盾する結果をもたらした。観察された矛盾は多数の影響因子、例えば、使用した紫外線の照射量が上皮細胞中のc−fos遺伝子およびc−jun遺伝子に対する照射効果または誘発応答に対するカロチノイドの効果を調べるのに不適当であった可能性等に起因するかもしれない。従って、異なった実験条件下において、これらの遺伝子に対する照射とカロチノイド処理の効果を調べる必要がある。さらに、junとfosの遺伝子ファミリーの他のメンバー(例えば、jun−Ｂ、jun−Ｄ、fos−Ｂ、fraＩ、fraII等)が、正常な上皮細胞への紫外線照射に対する応答および該応答に対するβ−カロチンの効果に関連してより重要な役割を果たしている可能性もある。これらの問題を解決するためにはさらに別の実験が必要である。
一方、本願の発明者は、ＮＦカッパＢ複合体の比較的最近発見された特性に関する研究を最近おこなった。この研究によれば、該複合体によって仲介されるＵＶ損傷応答をβ−カロチンが防ぐということを示す統計的に有意な結果が得られた。本明細書ではこのような結果を説明するために特定の明確な理論を開示するものではないが、ＮＦカッパＢ複合体は、正常なヒトのメラニン細胞への紫外線照射によって誘発される核酸損傷に対して比較的減弱性で高感度のインジケーターであると考えられる。該メラニン細胞をβ−カロチンを用いて前処理することによって統計的に有意な防止効果が得られるが、この効果はＵＶＢを５００mJ／cm2照射してから１時間後に特に高くなる。この防止効果は、スチューデントのt−テストによるp値が０．０５よりも小さいときに統計的に有意である。従って、メラニン細胞の黒色腫化およびβ−カロチンによる該黒色腫化の抑制を研究するモデルとして現在知られているもののなかで、ＮＦカッパＢ複合体は最も適当なモデルと考えられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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