(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者において精神分裂病により発現量が変化する遺伝子を規定する核酸の発現量が、統計学的に健常人の発現量の範囲内にあるかどうかを解析する方法であって、
被験者から採取した試料において、蛋白質キナーゼ DYRK4（GenBank No.Y09305 ）の遺伝子を規定する核酸（その断片及びその核酸と相補的な核酸を含む）及び／又は前記遺伝子を規定する核酸がコードするタンパク質（その断片を含む）の発現量を測定して定量値を求める工程、及び前記定量値が正常群の範囲内であるかを統計学的に解析する工程を含む、上記方法。
【請求項２】
請求項１記載の方法であって、更に、前記試料中に含有される下記の精神分裂病により発現量が変化する遺伝子を規定する核酸（その断片及びその核酸と相補的な核酸を含む）及び／又は前記精神分裂病により発現量が変化する遺伝子を規定する核酸がコードするタンパク質（その断片を含む）の発現量を測定して定量値を求める工程、及び前記定量値が正常群の範囲内であるかを統計学的に解析する工程を含み、
前記精神分裂病により発現量が変化する遺伝子を規定する核酸が、以下のタンパク質群：
（１）蛋白質チロシンホスファターゼシグマ（GenBank No.U35234 ）
（２）チロシン蛋白質キナーゼレセプターTIE-2 （GenBank No.L06139 ）
（３）EPH-関連レセプターチロシンキナーゼリガンド５（GenBank No.L38734 ）
（４）１型インターフェロンレセプター（GenBank No.X77722 ）
（５）プロテインキナーゼATR （GenBank No.U49844 ）
（６）STAT2 （GenBank No.U18671 ）
（７）高親和性神経成長因子レセプター前駆体（GenBank No.X03541 ）
（８）OX40L レセプター前駆体（GenBank No.X75962 ）
（９）STAT4 （GenBank No.L78440 ）
（10）KIAA0096（GenBank No.D43636 ）
（11）プリンリッチ一本鎖DNA 結合蛋白質アルファ（GenBank No.M96684 ）
（12）OX2 膜糖蛋白質前駆体（GenBank No.X05323 ）
（13）CDC25B（GenBank No.M81934 ）
（14）グアニンヌクレオチド結合蛋白質 G(I)/G(S)/G(O) ガンマ-10 サブユニット（GenBank No.U31383 ）
（15）PKU-alpha （GenBank No.AB004884 ）
（16）Wnt-8B（GenBank No.X91940 ）
（17）グリシルtRNA合成酵素（GenBank No.D30658 ）
（18）メラノーマ抗原P15 （GenBank No.U19796 ）
（19）転写開始因子eIF-2 アルファサブユニット（GenBank No.U26032 ）
（20）キュリンホモログ２（GenBank No.U83410 ）
（21）膜貫通蛋白質性前駆体（GenBank No.X87852 ）
（22）GTP 結合核蛋白質RAN （GenBank No.M31469 ）
（23）アデニレートキナーゼイソ酵素１（GenBank No.J04809 ）
（24）細胞周期蛋白質 P38-2G4ホモログ（GenBank No.U59435 ）
（25）インターフェロンガンマレセプター（GenBank No.J03143 ）
（26）ニューロフィブリマトーシス２（GenBank No.L27133 ）
（27）カドヘリン６前駆体（CDH6）（GenBank No.D31784 ）
（28）二重特異性蛋白質ホスファターゼ８（GenBank No.U27193 ）
（29）アルギニン／セリンリッチスプライシング因子７（GenBank No.L22253 ）
（30）PIRIN （GenBank No.Y07867 ）
（31）RAD51C切断蛋白質（GenBank No.AF029670 ）
（32）血管内皮成長因子レセプター１（GenBank No.X51602 ）
（33）DNA トポイソメラーゼ１（GenBank No.J03250 ）
（34）ラミニンアルファ４サブユニット前駆体（GenBank No.X70904 ）
（35）ソマトスタチンレセプター２型（GenBank No.M81830 ）
（36）トランスフェリンレセプター（GenBank No.X01060 ）
をコードして上記括弧内にGenBank 受付番号が示された核酸群に含まれる核酸であることを特徴とする、上記方法。
【請求項３】
被験動物が精神分裂病に罹患しているか否かを診断する診断方法であって、
核酸及び／又はタンパク質を含有する試料を前記被験動物から採取する工程と、
前記試料中における、蛋白質キナーゼ DYRK4（GenBank No.Y09305 ）の遺伝子を規定する核酸（その断片及びその核酸と相補的な核酸を含む）、及び／又は前記核酸がコードするタンパク質（その断片を含む）の含量を定量する工程と、
前記蛋白質キナーゼ DYRK4（GenBank No.Y09305 ）の遺伝子を規定する核酸、及び／又は前記蛋白質キナーゼ DYRK4（GenBank No.Y09305 ）の遺伝子を規定する核酸によりコードされるタンパク質の定量値を指標として、前記被験動物が精神分裂病に罹患しているか否かを診断する工程とを具備する、上記方法。
【請求項４】
請求項３記載の方法であって、更に、前記試料中における、精神分裂病により発現量が変化する遺伝子を規定する核酸（その断片及びその核酸と相補的な核酸を含む）である少なくとも１つの核酸、及び／又は前記核酸がコードするタンパク質（その断片を含む）である少なくとも１つのタンパク質の含量を定量する工程と、
前記精神分裂病により発現量が変化する遺伝子を規定する核酸、及び／又は前記精神分裂病により発現量が変化する遺伝子を規定する核酸によりコードされるタンパク質の定量値を指標として、前記被験動物が精神分裂病に罹患しているか否かを診断する工程とを具備し、
前記精神分裂病により発現量が変化する遺伝子を規定する核酸が、以下のタンパク質群：
（１）蛋白質チロシンホスファターゼシグマ（GenBank No.U35234 ）
（２）チロシン蛋白質キナーゼレセプターTIE-2 （GenBank No.L06139 ）
（３）EPH-関連レセプターチロシンキナーゼリガンド５（GenBank No.L38734 ）
（４）１型インターフェロンレセプター（GenBank No.X77722 ）
（５）プロテインキナーゼATR （GenBank No.U49844 ）
（６）STAT2 （GenBank No.U18671 ）
（７）高親和性神経成長因子レセプター前駆体（GenBank No.X03541 ）
（８）OX40L レセプター前駆体（GenBank No.X75962 ）
（９）STAT4 （GenBank No.L78440 ）
（10）KIAA0096（GenBank No.D43636 ）
（11）プリンリッチ一本鎖DNA 結合蛋白質アルファ（GenBank No.M96684 ）
（12）OX2 膜糖蛋白質前駆体（GenBank No.X05323 ）
（13）CDC25B（GenBank No.M81934 ）
（14）グアニンヌクレオチド結合蛋白質 G(I)/G(S)/G(O) ガンマ-10 サブユニット（GenBank No.U31383 ）
（15）PKU-alpha （GenBank No.AB004884 ）
（16）Wnt-8B（GenBank No.X91940 ）
（17）グリシルtRNA合成酵素（GenBank No.D30658 ）
（18）メラノーマ抗原P15 （GenBank No.U19796 ）
（19）転写開始因子eIF-2 アルファサブユニット（GenBank No.U26032 ）
（20）キュリンホモログ２（GenBank No.U83410 ）
（21）膜貫通蛋白質性前駆体（GenBank No.X87852 ）
（22）GTP 結合核蛋白質RAN （GenBank No.M31469 ）
（23）アデニレートキナーゼイソ酵素１（GenBank No.J04809 ）
（24）細胞周期蛋白質 P38-2G4ホモログ（GenBank No.U59435 ）
（25）インターフェロンガンマレセプター（GenBank No.J03143 ）
（26）ニューロフィブリマトーシス２（GenBank No.L27133 ）
（27）カドヘリン６前駆体（CDH6）（GenBank No.D31784 ）
（28）二重特異性蛋白質ホスファターゼ８（GenBank No.U27193 ）
（29）アルギニン／セリンリッチスプライシング因子７（GenBank No.L22253 ）
（30）PIRIN （GenBank No.Y07867 ）
（31）RAD51C切断蛋白質（GenBank No.AF029670 ）
（32）血管内皮成長因子レセプター１（GenBank No.X51602 ）
（33）DNA トポイソメラーゼ１（GenBank No.J03250 ）
（34）ラミニンアルファ４サブユニット前駆体（GenBank No.X70904 ）
（35）ソマトスタチンレセプター２型（GenBank No.M81830 ）
（36）トランスフェリンレセプター（GenBank No.X01060 ）
をコードして上記括弧内にGenBank 受付番号が示された核酸群に含まれる核酸であることを特徴とする方法。
【請求項５】
被験動物が精神分裂病のモデル動物として有用であるか否かを判定する方法であって、
請求項３または請求項４に記載の方法により、前記被験動物が精神分裂病に罹患しているか否かを診断する過程と、
前記被験動物が精神分裂病に罹患していれば、前記被験動物が精神分裂病のモデル動物として有用であると判定する過程を備えることを特徴とする方法。
【請求項６】
抗精神分裂病薬の候補物質をスクリーニングを行う方法であって、
精神分裂病のモデル動物に前記被験物質を与える過程と、
請求項３または請求項４に記載の方法により、前記モデル動物の精神分裂病が治癒又は改善されたか否かを診断する過程と
前記モデル動物の精神分裂病が治癒又は改善していれば、前記被検物質が抗精神分裂病薬の候補物質であると判定する過程を備えることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、精神分裂病により発現量が変化する遺伝子を規定する核酸の発現量が、統計学的に健常人の発現量の範囲内にあるかを解析する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
精神分裂病は、人口の約0.8%が青年期に発症する精神疾患であり、病歴も長期にわたるために、精神分裂病による社会的損失は計り知れないものとなっている。
このため、これまでに、世界中の多くの研究室で、精神分裂病の治療法及び診断法が盛んに研究されており、治療については、クロルプロマジン等のドーパミン受容体拮抗薬が開発されて以来、長足の進歩を遂げている。
これに対して、精神分裂病の診断法は、最新のアメリカでの診断基準であるDSMIV においても、妄想型、解体型、緊張型、鑑別不能型といった心理症候学でのみ規定されているので、最終的な診断は担当医の主観に依存せざるを得ず、診断の精度は十全ではない。
このような現状の下、現在、精神分裂病の原因遺伝子の染色体マッピング、及びその同定が盛んに繰り広げられているが、確定的な報告はない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記課題を解決するためになされたものであり、核酸を測定することにより、遺伝子発現を指標とした精神分裂病の客観的診断に資することを目的とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
前記課題を解決するために、本発明は被験者において精神分裂病により発現量が変化する遺伝子を規定する核酸の発現量が、統計学的に健常人の発現量の範囲内にあるかを解析する方法を提供する。本方法は、被験者から採取した試料において、精神分裂病により発現量が変化する遺伝子を規定する核酸及び／又は前記精神分裂病により発現量が変化する遺伝子を規定する核酸がコードするタンパク質の発現量を定量する工程を含む。
【０００５】
【発明の実施の形態】
本発明は、精神分裂病患者において、下記の表１に記載された14種のタンパク質の遺伝子、つまりメッセンジャーRNA の発現量が、統計学的に有意に変化しているという本発明者らの発見に基いてなされたものである。下記実験例で詳述されているように、本発明者らは、精神分裂病患者と正常者の剖検脳における約3000種の遺伝子の発現量を比較することによって、これらの遺伝子を見出した。尚、本願明細書において、「精神分裂病により発現量が変化する遺伝子を規定する核酸」とは、表１に示す遺伝子を規定する核酸を意味する。
【０００６】
【表１】
核酸がコードする蛋白質                                GenBank No
（１）蛋白質チロシンホスファターゼシグマ                      U35234
（protein tyrosine phosphatase sigma）
（２）インターロイキン１０前駆体                              M57627
（interleukin-10 precursor (IL-10)）
（３）チロシン蛋白質キナーゼレセプターTIE-2                   L06139
（tyrosine-protein kinase receptor TIE-2）
（４）EPH-関連レセプターチロシンキナーゼリガンド５            L38734
（EPH-related receptor tyrosine kinase ligand 5 ）
（５）１型インターフェロンレセプター                          X77722
（type I interferon receptor (IFN-R)）
（６）プロテインキナーゼATR                                   U49844
（protein kinase ATR）
（７）STAT2                                                   U18671
（signal transducer and activator of transcription 2）
（８）高親和性神経成長因子レセプター前駆体                    X03541
（high-affinity nerve growth factor receptor precursor）
（９）OX40L レセプター前駆体                                  X75962
（OX40L receptor precursor）
（10）STAT4                                                   L78440
（signal transducer and activator of transcription 4）
（11）KIAA0096                                                D43636
（12）プリンリッチ一本鎖DNA 結合蛋白質アルファ                M96684
（purine-rich single-stranded DNA-binding protein alpha ）
（13）OX2 膜糖蛋白質前駆体                                    X05323
（OX2 membrane glycoprotein precursor ）
（14）CDC25B                                                  M81934
（15）グアニンヌクレオチド結合蛋白質 G(I)/G(S)/G(O)           U31383
ガンマ-10 サブユニット
（guanine nucleotide-binding protein G(I)/G(S)/G(O)     gamma-10 subunit）
（16）PKU-alpha                                               AB004884
（17）上皮成長因子レセプター                                  M34309
（epidermal growth factor receptor）
（18）Wnt-8B                                                  X91940
（19）グリシルtRNA合成酵素                                    D30658
（glycyl tRNA synthetase）
（20）メラノーマ抗原P15                                       U19796
（melanoma antigen P15）
（21）転写開始因子eIF-2 アルファサブユニット                  U26032
（translation initiation factor eIF-2 alpha subunit ）
（22）キュリンホモログ２                                      U83410
（cullin homolog 2 (CUL2) ）
（23）膜貫通蛋白質性前駆体                                    X87852
（transmembrane protein sex precursor ）
（24）GTP 結合核蛋白質RAN                                     M31469
（GTP-binding nuclear protein RAN (TC4) ）
（25）アデニレートキナーゼイソ酵素１                          J04809
（adenylate kinase isoenzyme 1 (AK1)）
（26）細胞周期蛋白質 P38-2G4ホモログ                          U59435
（cell cycle protein P38-2G4 homolog）
（27）インターフェロンガンマレセプター                        J03143
（interferon-gamma receptor (IFNR-gamma; IFNGR1)）
（28）ニューロフィブリマトーシス２                            L27133
（neurofibromatosis 2 (NF2) ）
（29）カドヘリン６前駆体（CDH6）                              D31784
（cadherin 6 precursor (CDH6) ）
（30）二重特異性蛋白質ホスファターゼ８                        U27193
（dual-specificity protein phosphatase 8）
（31）アルギニン／セリンリッチスプライシング因子７            L22253
（arginine/serine-rich splicing factor 7）
（32）PIRIN                                                   Y07867
（33）RAD51C切断蛋白質                                        AF029670
（RAD51C truncated protein）
（34）血管内皮成長因子レセプター１                            X51602
（vascular endothelial growth factor receptor 1 ）
（35）DNA トポイソメラーゼ１                                  J03250
（DNA topoisomerase I (TOP1)）
（36）塩基性繊維芽細胞成長因子前駆体                          M34186
（basic fibroblast growth factor receptor precursor ）
（37）ラミニンアルファ４サブユニット前駆体                    X70904
（laminin alpha 4 subunit precursor ）
（38）蛋白質キナーゼ DYRK4                                    Y09305
（protein kinase DYRK4）
（39）ソマトスタチンレセプター２型                            M81830
（somatostatin receptor type 2 (SS2R) ）
（40）トランスフェリンレセプター                              X01060
（transferrin receptor (TFRC) ）
【０００７】
表１に記載の遺伝子は、 (１) シグナル強度、（２）遺伝子発現変化率（「患者群の平均発現量／正常群の平均発現量」と「正常群の平均発現量／患者群の平均発現量」のうち何れか大きい方、実験例参照）、及び（３）患者群と正常群における遺伝子の平均発現量の差の検定で得られたp 値を全て参酌することによって、精神分裂病の診断指標として特に有用であると判断された遺伝子である。なお、「p 値」とは、帰無仮説の下で、ある統計量が計測される確率のことをいう。
しかしながら、診断の精度によっては、かかる厳密な基準（詳細については、実験例を参照）以外の基準を用いて指標遺伝子を選定してもよい。
具体的には、p 値のみ、又は遺伝子発現変化率のみを基準にして、指標とすべき核酸を選定してもよい。
【０００８】
p 値のみを基準にする場合、p 値が0.5 以下、好ましくは0.4 以下、より好ましくは0.3 以下、より好ましくは0.25以下、より好ましくは0.2 以下、より好ましくは0.15以下、より好ましくは0.10以下、より好ましくは0.05以下である遺伝子を指標として選定し得る。さらに好ましくは、p 値が0.02以下、0.01以下、0.005 以下、0.025 以下、0.002 以下、又は0.001 以下の遺伝子を指標として選定してもよい。
遺伝子発現変化率のみを基準にする場合、遺伝子発現変化率が1.1 以上、好ましくは1.2 以上、より好ましくは1.25以上、より好ましくは1.3 以上、より好ましくは1.4 以上、より好ましくは1.5 以上、より好ましくは1.6 以上、より好ましくは1.7 以上、より好ましくは1.75以上、より好ましくは1.8 以上、より好ましくは1.9 以上、より好ましくは2.0 以上の遺伝子を指標として選択し得る。さらに、好ましくは、遺伝子発現変化率が2.1 以上、2.2 以上、2.25以上、2.5 以上、3 以上、4 以上、5 以上、6 以上、7 以上、7.5 以上、8 以上、9 以上、10以上、15以上、20以上、25以上、30以上、40以上、50以上、60以上、70以上、75以上の遺伝子を指標として選択し得る。
例えば、診断精度によっては、表１に記載の遺伝子に代えて、又はこれらの遺伝子と共に、下表２の遺伝子の発現量も指標とし得る。
【０００９】
【表２】
核酸がコードする蛋白質                                GenBank No
（１）蛋白質ホスファターゼ2A B56ベータ(PP2A)                  L42374
（protein phosphatase 2A B56-beta (PP2A)  ）
（２）蛋白質ホスファターゼ2A B56アルファ                      L42373
（protein phosphatase 2A B56-alpha）
（３）ジャヌスキナーゼ２ (JAK2)                               AF005216
（Janus kinase 2 (JAK2) ）
（４）シグナルトランスデューシングアダプター分子              U43899
（signal transducing adaptor molecule (STAM)）
（５）CDC37 ホモログ                                          U63131
（CDC37 homolog ）
（６）MAP キナーゼ活性化デスドメイン蛋白質                    U77352
（MAP kinase-activating death domain protein）
（７）セリン／スレオニン蛋白質ホスファターゼ2B                S46622
触媒サブユニットガンマ
（serine/threonin protein phosphatase 2B
catalytic subunit gamma）
（８）蛋白質キナーゼＡアンカーイング蛋白質                    AF037439
（protein kinase A anchoring protein）
（９）エフリンA3前駆体(EFNA3)                                 U14187
（ephrin A3 precursor (EFNA3) ）
（10）ナトリウム依存性プロリントランスポーター                S80071
（sodium-dependent proline transporter）
（11）CD45抗原                                                Y00638
（CD45 antigen）
（12）リソソーマルアルファグルコシダーゼ前駆体                Y00839
（lysosomal alpha-glucosidase precursor ）
（13）ヘルペスウイルスエントリーメディエーター                U70321
（Herpes virus entry mediator (HVEM)）
（14）セリン／スレオニン蛋白質キナーゼレセプターR4前駆体      L11695
（serine/threonine-protein kinase receptor R4     precursor (SKR4)）
（15）ARG2（アルギナーゼII）                                  U82256
（ARG2 (Arginase II)）
（16）細胞障害性T-リンパ球プロテイナーゼ                      M36118
（cytotoxic T-lymphocyte proteinase ）
（17）アクチビン受容体Ｉ型前駆体                              Z22534
（ACTIVIN RECEPTOR TYPE I PRECURSOR (EC 2.7.1.-)
(ACTR-1) ）
（18）フェニルエタノールアミンN-メチルトランスフェラーゼ      J03727
（phenylethanolamine N-methyltransferase (PNMTase)）
【００１０】
本発明の方法は、かかる基準に合致する遺伝子若しくはその断片、及び／又はこれらの遺伝子がコードするタンパク質若しくはその断片の発現量を指標とすることにより、被験者が精神分裂病に罹患しているか否かを客観的に診断する目的にも使用する事ができる。
本発明の方法を実施するためには、まず、精神分裂病に罹患しているか否かを診断すべき被験者から核酸又はタンパク質を含有する試料を採取する。
本明細書において、「精神分裂病」なる語には、妄想型精神分裂病、解体型精神分裂病、緊張型精神分裂病、及び鑑別不能型精神分裂病を含む任意の型の精神分裂病が含まれる。
本明細書において、「被験者」とはヒトであり、特に本発明の方法の診断対象である患者を意味する。
本明細書において、「被験動物」とはヒト以外の動物であり、特に実験動物として好適なマウス、ラット、モルモット、イヌ、ウサギ、サル、チンパンジー等を意味する。
【００１１】
本発明の方法では、上記表１及び表２に記載のタンパク質、最も好ましくは上表１に記載のタンパク質若しくはその断片、及び／又はこれらのタンパク質若しくはその断片をコードする核酸若しくは該核酸の断片から選択される少なくとも１つのタンパク質及び／又は核酸を定量する。
「表１に記載のタンパク質をコードする遺伝子を規定する核酸及び該核酸と相補的な核酸」とは、典型的には、これらのタンパク質のメッセンジャーRNA 及びcDNAを意味する。また、これらのメッセンジャーRNA 又はcDNAの翻訳領域の末端及び／又は内部に調節配列やポリアデニル配列等の任意のポリヌクレオチドが含まれていてもよい。表１に記載のタンパク質が複数の対立遺伝子によってコードされ得る場合には、全ての対立遺伝子、それらの転写産物及びcDNAが「表１に記載のタンパク質をコードする遺伝子を規定する核酸及び該核酸と相補的な核酸」に含まれる。
核酸の「断片」とは、タンパク質をコードする遺伝子を規定する核酸又は該核酸の一部を含むポリヌクレオチドを意味し、典型的には、表１に記載のタンパク質のメッセンジャーRNA 又はcDNAの制限断片であり得る。
指標とすべき遺伝子の発現量を定量するためには、まず、被験者から、「核酸又はタンパク質を含有する試料」を採取する。核酸及びタンパク質は体内に広く含まれており、また、同一遺伝子である限り、同じ制御を受けていることが多いので、脳以外にも、被験者から採取した組織、細胞、体液を含む任意の試料が「核酸又はタンパク質を含有する試料」になり得る。好ましい試料は、生検脳、剖検脳、脳脊髄液、血液が含まれる。
【００１２】
本発明の方法において使用するのに好ましい試料は、辺縁系の脳部位から採取した生検試料であり、好ましくは帯状回の生検試料である。ただし、上記の遺伝子はその他の脳部位や、血液等の末梢組織にも発現しているため、これらの組織もまた生検試料として本発明の方法で使用することが可能であり、帯状回の生検試料のみならず、これら種々の組織を用いる方法もまた、本発明の範囲内であると解されるべきである。
本明細書において、「核酸」なる語には、任意の単純ヌクレオチド及び／又は修飾ヌクレオチドからなるポリヌクレオチド、例えばcDNA、メッセンジャーRNA、全RNA 、hnRNA 、等が含まれる。「修飾ヌクレオチド」には、イノシン、アセチルシチジン、メチルシチジン、メチルアデノシン、メチルグアノシンを含むリン酸エステルの他、紫外線や化学物質の作用で後天的に発生し得るヌクレオチドも含まれる。
核酸を定量する場合、被験者から試料を採取した後、通常は、該試料から核酸を抽出する操作を行う。生体成分から核酸を抽出する方法としては、例えばフェノール抽出、エタノール沈殿の他、任意の抽出方法を使用し得る。メッセンジャーRNA を抽出する場合には、オリゴdTカラムにかけてもよい。
核酸の量が少ないときには、必要に応じて、核酸を増幅する操作を行ってもよい。増幅操作は、例えば、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)等のポリメラーゼ連鎖反応( 以下PCR と略記する) によって行い得る。また、以下に記載するように、増幅操作は、定量操作として、又は定量操作を兼ねて行ってもよい。
【００１３】
必要に応じて、抽出操作及び／又は増幅操作を行った後には、表１又は表２に記載のタンパク質をコードする遺伝子を規定する核酸からなる群から選択される少なくとも１つの核酸又はその断片を定量する。
核酸を定量するためには、定量的PCR 、サザンブロット法、ノーザンブロット法、RNA 消化酵素保護マッピング法及びそれらの組み合わせを含む本分野で周知の任意の方法を使用し得る。
定量的PCR としては、典型的には、放射性物質、例えば32P でラベルされたヌクレオチドを用いて増幅産物を内部標識する方法を使用し得る。また、放射性物質でラベルされたプライマーを用いて増幅産物をエンドラベルする方法も使用し得る。標識された増幅産物は、ゲル濾過、アルコール沈澱、トリクロロ酢酸沈澱、グラスフィルター等への物理的吸着を含む周知の方法を用いて、遊離の放射性ヌクレオチド又はプライマーと分離することができる。続いて、電気泳動やハイブリダイゼーションを行って、又は行わずに、液体シンチレーション、オートラジオグラフィー、イメージングプレート（バイオイメージングアナライザー(BAS; 富士写真フィルム) 等）等の操作によって、増幅産物を定量する。放射性物質の代わりに、蛍光物質や発光物質を標識物質として使用し、分光蛍光光度計、蛍光用マイクロプレートリーダー、CCD カメラを用いて増幅産物を定量してもよい。また、PCR 操作中に標識物質を取り込ませない場合には、エチジウムブロマイド、SYBR Green ITM、PicoGreenTM （Molecular Probes社）等のインターカレート蛍光色素を用いて増幅産物を検出することもできる。
【００１４】
定量的PCR を行わない場合、最も一般的には、核酸を含む試料を電気泳動にかけ、サザンブロットやノーザンブロットを行った後、検出可能な標識物質でラベルされたプローブを用いて定量する。
また、多種類の核酸を同時に定量する場合には、これらの手法と共に、又はこれらの手法に代えて、DNA チップやDNA マイクロアレイを用いてもよい。
核酸の定量に代えて、又は核酸の定量と共に、メッセンジャーRNA （遺伝子）から産生されるタンパク質を定量することにより、遺伝子の発現量を間接的に推定してもよい。本発明の方法によって、精神分裂病を診断するには、核酸よりも、核酸がコードするタンパク質を定量することが有用であることも多いであろう。
【００１５】
タンパク質を組織から抽出する方法、及びタンパク質を定量する方法としては、本分野において周知である任意の方法を使用し得る。タンパク質を定量する場合には、ウエスタンブロット法、固相酵素免疫検定法を含む酵素免疫検定法、免疫細胞化学法、免疫組織化学法を使用し得る。
なお、本明細書では、最も一般的な操作の概略を例示したにすぎないので、上記方法の様々な変法や全く異なる方法も使用できる。
現在、電気泳動装置やPCR 装置等を組み合わせて、核酸の抽出、増幅、分離、定量を全自動で行う装置が市販されているので、このような装置を用いることも好ましい。このような装置を用いれば、通常の臨床検査と同じように、精神分裂病の診断を行うことが可能となる。
所定の核酸の定量及び／又はタンパク質の定量に続いて、その定量値を指標として、被験者が精神分裂病に罹患しているか否かを判定する。
単一の核酸及び／又はタンパク質の定量値を指標として診断する場合、正常値を参考にして適切な閾値を設定し、該閾値を上回っているか、又は下回っていれば、精神分裂病である可能性が高い。例えば、精神分裂病患者内で量が増加する場合には、設定した閾値を上回っていれば、精神分裂病である可能性が高いと判定し得る。
【００１６】
以下のように、閾値は、所望の診断精度に応じて選定すればよい。
非精神分裂病健常者群（以下、正常群と称する）と精神分裂病患者群（以下、単に患者群と称する）における遺伝子発現量の分布が何れも明らかになっているときには、例えば、定量すべき核酸又はタンパク質を採取した個体が正常群に属する確率が10% 、5%、又は1%であるように閾値を設定する。
正常群の遺伝子発現量の分布のみが明らかになっているときには、定量すべき核酸又はタンパク質を採取した個体が正常群に属するという仮定の下で、該核酸又はタンパク質についてそのような定量値が得られる確率（以下p 値という、典型的には両側確率であるが、片側確率でもよい）が、10% 、又は5%、又は1%であるような核酸又はタンパク質の量又は濃度を閾値として設定し得る。
患者群の遺伝子発現量の分布のみが明らかなときにも、同様の統計手法によって解析し得る。
p 値の計算は、例えば、t 検定やノンパラメトリック検定等の検定手法によって算出することができる。
正常群及び／又は患者群における遺伝子の発現量の統計学的分布を明らかにするには、典型的には、少なくとも5 個体、好ましくは10個体、より好ましくは20個体、さらに好ましくは50個体、最も好ましくは100 個体の発現量を測定すべきである。
【００１７】
また、必要に応じて、任意の様々な統計手法を用いて、被験者が精神分裂病に罹患しているか否かをさらに正確に判定することも可能であるが、そのような手法を用いた診断方法も、当然、本発明の方法の範囲に属する。本願明細書において、「定量値が正常群の範囲内であるかを統計学的に解析する工程」とは、以下に具体的に記載する様な統計学的な工程を意味する。
単一の核酸及び／又はタンパク質の定量値を指標として判定する場合には、以下の実験例で詳述されているように、患者群の発現量が多く（シグナルが10以上；実験例参照）、両者の絶対遺伝子発現変化率（実施例参照）が1.5 倍以上で、且つ平均の差の検定におけるp 値が5%以下である核酸及び／又はタンパク質を指標とすることが好ましい。
複数の核酸及び／又はタンパク質の定量値を指標として判定する場合には、それぞれの核酸及び／又はタンパク質について適切な閾値を設定し、単一の核酸及び／又はタンパク質を指標とする場合と同様に、各遺伝子の発現量が閾値を上回っているか、又は下回っているかを調べる。
所望の判定精度に応じて、１つの核酸及び／又はタンパク質の定量値が閾値を上回っているか、又は下回っていれば、精神分裂病の可能性があると判定し得る。２以上の核酸及び／又はタンパク質の定量値が閾値を上回っているか、又は下回っていれば、精神分裂病の可能性がさらに高いと判定し得る。確定的な判定を下したい場合には、より多くの核酸及び／又はタンパク質の定量値が閾値を上回っているか、下回っているときに、精神分裂病であると判定する。
さらに、本発明の判定方法は、従来の主観的診断方法と併用することもできる。
【００１８】
また、何らかの方法によって、確定的に精神分裂病であることが明らかな患者から、本発明の診断方法において指標として使用し得る核酸及び／又はタンパク質の定量値についてのデータを収集することができれば、本発明の診断方法のみによって確定的な判定を下すことも可能となる。
本発明の主題は、精神分裂病の客観的診断方法を提供することに存するのであって、本明細書に具体的に記載した個々の抽出操作、増幅操作、及び解析操作に存するのではない。従って、上記各操作以外の操作を用いた診断方法も本発明の範囲に属することに留意しなければならない。
以上のごとく、本発明の方法を用いれば、核酸（遺伝子）の発現量及び核酸(遺伝子) に由来する生物学的産物( タンパク質) を指標とすることにより、被験者が精神分裂病に罹患しているか否かを客観的に診断することができる。
それ故、本発明の方法は、ヒトを除く精神分裂病のモデル動物の有用性を判定する方法、及びこのようなモデル動物を用いた薬物スクリーニングにおいて、薬物の有効性を判定する方法に応用し得る。
精神分裂病のモデル動物の有用性を判定するには、前記診断方法と同様に、所定の遺伝子の発現に基いて、被験動物が精神分裂病を発症しているか否かを診断し、該動物が精神分裂病を発症していれば、精神分裂病のモデル動物として有用であると判定する。
【００１９】
「被験動物」には、マウス、ラット、及びサルが含まれるが、ヒト以外の動物であれば、任意の動物が「被験動物」になり得る。
ヒト以外の動物では、精神分裂病の診断は、さらに困難であったので、該方法は極めて有用である。
さらに、このようなモデル動物に、抗精神分裂病薬の候補物質を投与した後、上記のごとく所定の核酸及び／又はタンパク質を定量し、精神分裂病が治癒又は改善されていれば、前記候補物質は抗精神分裂病作用を有していると判断し得る。すなわち、本発明の診断方法を応用すれば、抗精神分裂病薬の候補物質を容易且つ正確にスクリーニングすることができる。
「抗精神分裂病薬の候補物質」は、試験者が所望する任意の物質であり得る。
【００２０】
また、本発明の診断方法は、法的責任能力の有無を調べる目的で、又はその他の目的で行われる精神鑑定に適用することも可能である。
以下、実験例及び実施例により、本発明をさらに詳細に説明するが、いかなる意味においても本発明の範囲を限定するものではない。
【００２１】
【実施例】
本発明者らによって同定された、診断指標となり得る遺伝子について説明する。
本研究では、精神分裂病患者の死後の帯状回の剖検脳（サンプル群Ｓ）と精神疾患を持たない人の帯状回の剖検脳（サンプル群Ｃ）を用いて、組織からRNA を抽出し、まずその品質を検定した。
【００２２】
高品質と判定されたRNA を各群6 サンプル選定し、個々のRNA より( 計12例)逆転写反応で放射化リンのラベルを入れ、これをプローブとして用いて、クローンテック社のDNA マイクロアレイ、3 種類と反応させることで、複数の遺伝子の発現量の一括測定とパターン化（分子発現プロファイリング）を行った。用いた3 種類のDNA マイクロアレイは、アトラスヒト1.2 アレイ、アトラスヒト1.2 アレイII、及びアトラスヒト癌1.2 アレイで（各アレイ共、1176遺伝子を含有）ある。これら３種類のアレイを用いることで、合計約３０００にも及び遺伝子の発現変化が評価、検定される。
【００２３】
高温摂氏65度で低温濃度(0.3xSSC) 下、１時間以上に及ぶ洗浄により、非特異的なハイブリダイゼーションシグナルを用いたDNA アレイより除去した。その後、各遺伝子スポットに対応する放射能シグナルは、富士写真フィルム社のBAS5000 イメージアナライザーで測定、定量した。各サンプルに対応するDNA マイクロアレイのシート間に生ずる実験手技によるシグナル強度のばらつきを補正するために、アレイ上の全ての遺伝子発現シグナルの総和を計算し、その総和がアレイ、サンプルRNA によらず一定（総計３００００）と仮定することで、シグナルの標準化を行った（通称、グローバルノーマライゼーションと呼ばれる）。
【００２４】
各遺伝子スポットに対応するシグナルは、富士写真フィルム社のBAS5000 イメージアナライザーで測定、定量した。各RNA サンプルに対応するDNA マイクロアレイのシート間のシグナル強度のばらつきを補正するために、シート上の全ての遺伝子発現シグナルの総和を計算し、その総和がシート、サンプルRNA によらず一定と仮定することで、シグナル強度の標準化を行った。
【００２５】
複数の精神分裂病患者に共通性をもって量的変化を示す遺伝子を確定するために、精神分裂病患者（サンプル群Ｓ；N=6 ）と非精神患者（サンプル群Ｃ；N=6）から得られた発現シグナルのデータを解析した。また、スチューデントのt 検定による有意差検定を用いて、シグナル強度のデータの統計解析を行った。
【００２６】
本実験例では、精神分裂病群のシグナル強度の平均値が10を超える遺伝子については、遺伝子発現変化率（「Ｓ群の平均発現量／Ｃ群の平均発現量」と「Ｃ群の平均発現量／Ｓ群の平均発現量」のうち何れか大きい方）が1.5 倍以上で、且つp 値が0.05以下のもの、10以下の中程度シグナルについては、遺伝子発現変化率が2.0 倍以上で、p 値が0.01以下の値をもって、該当遺伝子の発現量が、精神分裂病で有意に変化していると判定した。上記の表１は前者の遺伝子を記載したリストであり、上記の表２は後者の遺伝子を記載したリストである。この基準で選定された表１に記載の遺伝子は、精神分裂病の診断指標として特に有用であり、表２に記載の遺伝子もまた、精神分裂病の診断指標として有用である。表１の遺伝子について、遺伝子発現変化率やp 値等の詳細な統計学的データを示したものが表３である。また、表２の遺伝子について、遺伝子発現変化率やp 値等の詳細な統計学的データを示したものが表４である。
【００２７】
【表３】
0003771502.tif 000002
【００２８】
【表４】
0003771502.tif 000003
【００２９】
例えば、ここではアトラスヒト癌1.2 アレイの位置E-14-fに存在して、以下の解析で有意に精神分裂病に伴って遺伝子発現が変化していた、インターロイキン１０前駆体（Interleukin-10 precursor : GenBank No.M57627）mRNAの定量とその処理、診断可能性について解説する。
【００３０】
（１）複数の精神分裂病患者に共通性をもって量的変化を示す遺伝子を確定するために、精神分裂病患者（サンプル群Ｓ；N=6 ）と非精神患者（サンプル群Ｃ；N=6 ）から得られた発現シグナルのデータを以下の例に従い解析した。この遺伝子シグナルを含む本DNA アレイ上のすべての遺伝子RNA シグナルをBAS5000 イメージアナライザーで測定、定量した。ハイブリダイゼーションによって得た、発現シグナルのデータを図１に示す。結果、インターロイキン１０前駆体（Interleukin-10 precursor : GenBank No.M57627）mRNAの測定シグナル強度は各サンプルで；
精神分裂病患者（サンプル群Ｓ；N=6 ）；S1=9.0, S2=8.3, S3=13.0, S4=14.4,S5=17.6, S6=23.4
非精神病者（サンプル群Ｃ；N=6 ）；C1=0.0, C2=1.7, C3=0.8, C4=5.6, C5=7.0, C6=15.8
となった。
【００３１】
（２）グローバルノーマライゼーションにより、遺伝子発現シグナルの総和がアレイ、サンプルによらず一定（総計３００００）と仮定することで、アレイ間のシグナル強度の標準化を行うと、インターロイキン１０前駆体mRNAの補正シグナル強度は各サンプルで；
精神分裂病患者（サンプル群Ｓ）；S1=27.7, S2=36.9, S3=23.2, S4=37.9, S5=36.0, S6=57.4
非精神病者（サンプル群Ｃ）；C1=0.0, C2=4.2, C3=4.6, C4=18.3, C5=9.0, C6=19.9
となった。
【００３２】
（３）スチューデントのt 検定による有意差検定を用いて、シグナルデータ強度に関する解析を精神分裂病患者（群Ｓ１からＳ６）６例と非精神病患者（群Ｃ１からＣ６）６例に対して行うと平均値と標準偏差は；
精神分裂病患者（サンプル群Ｓ）；36.4±12.0
非精神病患者（サンプル群Ｃ）； 8.8±8.6
でスチューデントｔ検定によるとこれら２群の平均値が異なることが判明する（Ｐ＜0.001 ）。実際、本実施例では、シグナル強度20.0以下のものは全て精神分裂病のもので、20.0以下のものは非精神分裂病となり、この基準で判定してよいことがわかる。マン−ホイットニーの検討によっても、これらの群に順位関係にかたよりがあることが判明した（ｐは0.05以下）。
【００３３】
（４）実際に、未知の検体から上記DNA アレイ解析によって得られたインターロイキン１０前駆体（Interleukin-10 precursor : GenBank No.M57627）mRNAの標準化シグナル強度が36.4-12.0x1.64=16.72以下である場合、正規分布を仮定した精神分裂病患者（サンプル群Ｓ）の分布と対照して９５％以上の統計学的有意性をもって、精神分裂病患者群に属すると見做せず、結果「正常」と判定される。また、標準シグナル強度が8.8+8.6x1.64=22.904 以上である場合、正規分布を仮定した非精神分裂病患者（サンプル群Ｃ）の分布と対照して９５％以上の統計学的有意性をもって正常群に属さない、つまり「精神分裂病」と判定される。22.904未満、16.72 以上のシグナルが得られた場合は、擬陽性と判定される。
【００３４】
同様の基準で選定された表１に記載の遺伝子は、上記のように精神分裂病の診断指標として特に有用であり、ここに得られた複数の遺伝子発現量を検定することで、精神分裂病に対する診断の信頼性は更に向上する。
【００３５】
【発明の効果】
本発明の方法によれば、被験者が精神分裂病に罹患しているか否かを客観的に診断することができる。該方法は、従来の主観的な診断方法に比べて、極めて精度が高い。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、インターロイキン１０前駆体の発現パターンを、精神分裂病患者と非精神病者において比較を行った結果を示す、BAS5000 により検出したハイブリダイゼーション後のシグナルの写真である。
【図１】
0003771502.tif 000004