(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体または固体対象上の、あるいは液体または固体対象中の、ランダム数Ｘｎ（ｎ＝１，２，３．．．Ｎ）の分子クラス、分子群および分子部分を決定しまたは同定しおよび測定する自動装置であって、
該装置はピペッティング系、３Ｄハンドリング系および光学測定系の組合せを具備し；該ピペッティング系、該３Ｄハンドリング系および該光学測定系はコンピューターによって制御およびモニターされ；該ピペッティング系は液体を採取し分注する自動ピペッティング、自動ピペット交換を提供し；かつピペットの反復位置決定において、少なくとも±０.１ｍｍの精度を示し、
更に、前記装置はイメージングデバイスを装備し、
該イメージングデバイスは検査下に一つの同一の対象のランダム数の個々の標識パターンのイメージを記録し、コンピューターの助けを借りた画像重ね合わせによってそれらを高度に複雑な分子組合せパターンに変換し；少なくとも２つの分子クラス、分子群または分子部分が一つの同一の対象において決定され及び同定される自動装置。
【請求項２】
前記３Ｄハンドリング系が、ピペットの反復位置決定の所定の精度をもって前記ピペッティング系を往復させることができる請求項１記載の自動装置。
【請求項３】
前記光学測定系が倒立または直立顕微鏡載物台を具備した請求項１または２記載の自動装置。
【請求項４】
前記顕微鏡載物台が天候ボックス（climatic box）を含む請求項３記載の自動装置。
【請求項５】
請求項１〜４何れか１項に記載の自動装置であって、前記３Ｄハンドリング系がロボットまたは直線状ガイド系を具備した自動装置。
【請求項６】
固体または液体対象における分子クラス、分子群または分子部分を決定しまたは同定する自動化された方法であって、
ランダム数の試薬溶液Ｙｎ（ｎ＝１，２，３．．．．Ｎ）の同時または順次の適用により、一つの同一の対象において少なくとも２つの分子クラス、分子群または分子部分を検査し測定し、
前記方法は更に、ランダム数の回数を反復できるインキュベーションならびにイメージングおよび脱色のサイクルを具備し、
各サイクルに続き、検査すべき対象のシグナル分布パターンを記録し、
更に、各サイクルで得られたシグナル分布パターンが、コンピューターの助けを借りた画像重ね合わせによって、検査すべき対象の複雑な分子組み合わせパターンに変換される自動化方法。
【請求項７】
請求項６記載の自動化方法であって、以下の自動的工程、即ち、
Ｉ．第１の溶液Ｙ１を、該溶液を含有する容器から採取し、
ＩＩ．対象担体手段上に設置した該対象に該溶液を適用する工程と、
ＩＩＩ．自動的に調整された時間の間、該溶液を対象に作用させる工程と、
ＩＶ．第１の溶液Ｙ１で予め処理した対象のイメージまたは測定値を記録し、または工程ＩＶに先立って工程Ｖを行う工程と、
Ｖ．溶液Ｙ１を除去する工程と、
ＶＩ．第１の溶液Ｙ１または第２の溶液Ｙ２あるいは第１および第２溶液の混合液を対象に反復して適用することによって工程Ｉ−Ｖを反復する工程と、
ＶＩＩＩ．ランダム数の溶液Ｙｎ（ｎ＝１，２，３．．．Ｎ）またはその混合液で工程ＩないしＶＩを反復する工程とを具備する方法。
【請求項８】
請求項６または７記載の自動化方法であって、請求項７記載の工程Ｖにおける第１もしくは第２溶液または溶液Ｙｎあるいはその混合液の除去に続いて、所定の時間の直後またはその後に（これは変更可能）、洗浄溶液Ｚ１またはＺ２またはＺｎ（ｎ＝１，２，３．．．．Ｎ）を対象に適用する自動化方法。
【請求項９】
請求項６〜８の何れか１項記載の自動化方法であって、前記溶液が着色剤、錯化剤、抗体またはリガンド、特に蛍光色素−結合抗体またはリガンドを具備した自動化方法。
【請求項１０】
請求項６〜９の何れか１項記載の自動化方法であって、前記対象が試料、組織検体、または１もしくは複数の細胞である自動化方法。
【請求項１１】
請求項６〜１０の何れか１項記載の自動化方法であって、以下の自動工程、即ち、
Ｉ．第１試薬溶液Ｙ１、特に蛍光色素−含有溶液を容器から採取し、該溶液を試料、組織検体、または１もしくは複数の細胞にピペッティングする工程と、
ＩＩ．該試料、該組織検体、または該１または複数の細胞をある時間にわたってインキュベートする工程と、
ＩＩＩ．該試薬溶液Ｙ１を除去し、洗浄溶液Ｚ１ないしＺｎを対象に１回または数回ピペッティングする工程と、
ＩＶ．標識の分布パターンを記録する工程と、
Ｖ．蛍光が検出されなくなるまで対象を脱色する工程と、
ＶＩ．第２の試薬溶液を採取する工程と、
ＶＩＩ．ランダム数の試薬溶液Ｙｎまたはその混合液で工程ＩないしＶＩを反復する（反復する標識−イメージング−脱色のサイクル）工程と、
を具備した自動化方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、液体または固体対象における分子クラス、分子部分または分子群のランダム数Ｘｎ（ｎ＝１，２，３，．．．．Ｎ）を決定または同定し、および測定する自動装置に関する。本発明は、さらに、液体または固体対象におけるランダム数Ｘｎ（ｎ＝１，２，３．．．．Ｎ）の分子クラス、分子部分または分子群を決定しまたは同定しおよびマッピングする方法に関し、そこでは、ランダム数の試薬を同時または順次に対象に自動的に適用し測定する。
【０００２】
例えば、蛋白質分子またはポリマーの異なる分子クラスまたは分子群の相関的分布および／または組合せおよび配置、あるいは、要すれば対象の着色挙動を検査しおよび決定しまたは同定するために、自然科学、特に生物学、化学、生化学および医学において、種々の技術および方法が使用されている。これらの異なる方法および技術は、各液体または固体対象における分子群の配置、分布および構造についての知識を得ることを目的とする。この目的では、検査すべき対象を特異的溶液で処理して、例えば、形成された複合体（例えば、ＥＤＴＡ金属錯体または抗原／抗体複合体等）に基づいて、特異的な分子クラスまたは分子群を検査しおよび決定しまたは同定する。かかる方法は、問題の対象におけるかかる分子種の配置および分布に基づいてある種の疾患の徴候についての診断的測定データを得るために、または細胞または細胞系の分子組織についての知見を得るために、主として、医学および生物学の分野で使用されている。
【０００３】
先行技術の手動方法は一定のスキームに従っている。例えば、生物学および医学においては、検査すべき対象を特異的試薬を含有する溶液で処理する。かかる試薬は、ある種の分子群と反応して特に特異的複合体を形成する着色剤、抗体等であってよい。これは、特異的試薬が検査すべき対象における特異的な基または部位を標識することを意味する。ある暴露時間の後、特異的に標識された対象を、次いで、例えばフルオレセイン−イソチオシアナートまたはフィコエリトリンを用いた異なる蛍光シグナルによる細胞の鏡検において、通常はシグナル分布パターンによって検査する。
【０００４】
先行技術によると、単純な有色溶液を用いる組織切片の染色のごとき手動方法のいくつかは、特別の自動染色デバイスによって行うこともできる；細胞中の単純な分子マーキングについては、自動標識デバイスが存在する。
【０００５】
いずれの場合も、すなわち、対象、特に細胞または組織切片の試薬での手動および自動処理においても、対象を手でかかるデバイス（例えば顕微鏡）に入れた後に、この目的に供される特別に設計された異なった別々のデバイスにより、結果を目視的にコントロールし評価する必要がある。
【０００６】
先行技術によると、試薬で対象を処理する更に複雑な方法（これはプロセスの間にある時点で評価され記録される必要がある）、例えば、種々の溶液の細胞への順次の適用は、手動方法に完全に限定されていて非常に誤差が出易い。すなわち、該方法は量に関して評価できず、また統計学では使用できない。かかる方法が長時間（例えば３４時間）にわたって、例えば各々正確に２０分間の間隔で個々の中間工程の非常に正確な時間チェックを要する場合、検査者が実行可能であるために課せられる限界は今日まで過剰なものであった。
【０００７】
多数の分子クラスの相互の相関分布を決定しまたは同定するために、生物医学は、しばしば、突き止めるべき分子クラスに（直接的にまたは間接的に）各々カップリングする種々の異なる蛍光色素を使用する。この場合、これらの異なる蛍光色素から発せられる蛍光シグナルは別々に検出される。これらのシグナルを相互に関連付けると、結局、種々の分子クラスの相関的分布についての情報が得られる。
【０００８】
しかしながら、組み合わせ分子分別プロセスを調べるのにとりわけ重要なこれらの方法は、所与の試料における最大４ないし５の異なる蛍光シグナルの検査に限られる。というのは、非常に多数の異なる蛍光シグナルを相互に分離するのは不可能だからである。従って、これまでに存在する方法は、一つの同一試料に存在する分子クラスを決定しまたは同定しおよび突き止めるということになると、非常に限定的である。かくして、従来、高次の組み合わせ形態を検出するのは不可能であった。
【０００９】
この制限は、ある種の分子クラスまたは分子群を前記したごとくに標識した後の第１工程において、紫外線照射による脱色によってこの標識部位に結合した蛍光色素を破壊することによって克服できる。
【００１０】
引き続いて、さらなる分子クラスを標識するための１の最大５種までの異なる蛍光色素を含有する対象に第２のまたはさらなる溶液を適用する。所要の暴露時間の後、今度は、新しい特異的シグナル分布パターンが特異的に標識された分子から得られる。蛍光色素を脱色した後、このプロセスを多数回反復する。かくして、シグナル分布パターンの数は使用する試薬溶液の数に従って増加する。これらの異なるシグナル分布パターンは、対象における分子群の配置および分布についての知見を与え得る。
【００１１】
しかしながら、分子クラスまたは分子群を決定しまたは同定するこれらの公知の方法はかなりの欠点を示す。というのは、個々の方法工程は手で行われるからである。これらの工程を手で行うのは非常に時間を消費し、これは、量に関して正確な評価としなければならない現代的方法に対し、誤差を生じやすくし、また標準化が十分でなくする。１つの例は、試薬溶液を手で対象にピペッティングし、次いで、該対象を手で顕微鏡載物に載せて適切に位置決めすることである。次いで、全てのさらなるピペッティング操作は、対象を顕微鏡載物台上で変化させることなく手で対象に対して行われる。手動ピペッティング操作において、試薬溶液の正確な量が常に正確に付着する訳ではない。反復ピペッティング動作の場合には、ピペットを対象の同一スポット上に常に正確に位置させるのは不可能のようである。さらに、検査すべき対象にピペットが接触することが容易に起こる可能性があり、従って、対象の各スポットが変化し得る。この結果、評価結果が歪められてしまう。
【００１２】
各々３０分内に手動で使い果たされる、２０を超える異なるマーカーを具備したテストシリーズは完了するのに数日間を要する。シグナルまたはイメージの引き続いての評価、すなわち、相関的分子分布パターンの決定または同定は、数週間を要しかねない。というのは、異なるシグナル分布パターンを組み合わせて全体としてのイメージが得られる前にまず該パターンを個々に評価しなければならないからである。この評価方法も非常に時間を消費する。従って、評価結果が最終的に得られるまでに数週間を要しかねない。
【００１３】
これらの理由で、公知の方法を用いると、対象において、せいぜい４〜５と少ない分子のクラスしか突き止め、決定または同定できない。すなわち、検査しおよび決定しまたは同定できる分子クラスまたは分子群の数はこれまで非常に制限されてきた。
【００１４】
上記の理由で、個々の試料のより複雑な分子的組合せパターンの正確な定量的鏡検を行うことは現在不可能である。
【００１５】
本発明の目的は、異なる対象における分子クラス、分子群または分子部分（例えば、エピトープ、ドメイン）を決定しまたは同定する従来の方法の欠点または制限を克服することにある。
【００１６】
かくして、本発明は、液体または固体対象におけるランダム数Ｘｎ（ｎ＝１，２，３．．．．．ｎ）の分子クラス、分子群および分子部分を決定しまたは同定しおよび測定するための自動装置に関する。この装置を用いると、一つの同一の対象のランダム数の個々の標識パターンを記録し、コンピューターの助けを借りた画像重ね合わせにより高度に複雑な分子組合せパターンに変換することができる。
【００１７】
本発明のさらなる主題は、液体または固体対象におけるランダム数Ｘ（Ｘ＝１，２，３．．．Ｎ）の異なる分子クラスまたは分子群を自動的に決定しまたは同定できる自動化方法である。
【００１８】
この自動化方法においては、反復的蛍光脱色操作に基づいて、かつランダム数の蛍光標識および蛍光脱色操作を順次行うことによって、一つの同一の（好ましくは生物学的）構造における異なる分子種および分子クラスのランダムで複雑な組合せを決定しまたは同定できる。このように、系における、好ましくは生物学的系におけるより高次の組み合わせ形態を決定しまたは同定できる。
【００１９】
本発明による装置は、ピペッティング系、３Ｄハンドリング系ならびに光学測定系を具備する。特に好ましいのは、倒立または直立の顕微鏡載物台の使用である。３Ｄハンドリング系はロボットまたは直線状ガイド系を具備する。直線状ガイド系、およびかくして試薬ラックの全直線状アレイは、技術的見地より非常に複雑ではなく、よって非常に経済的である。さらに、イメージングデバイスが該装置に連結され、特に顕微鏡ユニットに連結されている。該装置は自動である。すなわち、その構成要素の機能的操作は、個々におよび組み合わせて、コンピューターで制御されモニターされる。
【００２０】
図面は本発明の操作の具体例の模式的構造を示す。
【００２１】
自動ピペッティング装置は先行技術で十分に知られている。しかしながら、これらは、本発明の装置には適しない。異なる分子クラスを正確に検出しマッピングするには、ピペットチップを液体または固体対象の正確に同一個所に反復して置くことが可能でなければならない。さらに、チップが先に使用した微量の溶液を決して含有しないように保護するために、新しい溶液を採取する前にピペットチップを自動的に交換するのが必要でありまたは望ましい。ピペッティング系は溶液用の容器、使用した溶液およびピペットチップ用の収集容器、洗浄溶液用の容器、使用可能なピペットチップ用の容器、使用し捨てたピペットチップ用の容器および暴露時間後の洗浄溶液用の容器を具備する。加えて、ピペッティングユニットには、そこに貯蔵された試薬用の温度制御手段を設けることができる。
【００２２】
本発明によるピペッティング系は、ピペットを対象の一定のスポットまでランダム数の回数だけ移動させることができるように、対象試料におけるピペット反復位置決定において適切な精度を示す。好ましくは、ピペットの反復位置決定における精度は少なくとも±０. １ｍｍであるべきである。さらに、ピペッティング系は、使用する各溶液の採取および分注が自動的に起こるように制御される。ピペッティング系は高度な移動性および融通性を有する。
【００２３】
３Ｄハンドリング系は今日ほとんど全ての産業分野で使用される。ピペットを溶液に導入し、充填されたピペットを対象まで移動させ、溶液を分注した後に出発位置に戻る本発明における３Ｄハンドリング系は、対象に適合するピペットの反復位置決定において正確性を有しなければならない。特異的分子クラスを検査するために、特にテストシリーズの間に異なる溶液で処理される対象における一定のスポットまたは個所を特定するために、ピペットの反復位置決定における３Ｄハンドリング系の正確性が必要とされる。偏りは歪められた評価結果となるので、３Ｄハンドリング系は、この全体の方法のために、ランダム数の回数だけ予め特定された対象のスポットにアプローチするような位置になければならない。この理由で、それは、同様に好ましくは少なくとも±０. １ｍｍであるピペットの反復位置決定における正確性を示す。３Ｄハンドリング系は３Ｄワーキング領域内を移動し、ピペッティングデバイスを正確に位置決定するための回転軸を有する。ピペッティング系および３Ｄハンドリング系の個々の機能ならびに両系の技術的共働はコンピューター制御される。
【００２４】
本発明の自動装置のさらなる必須構成要素は、光学測定系、特に顕微鏡である。特に好ましいのは、倒立または直立の顕微鏡載物台の使用である。要すれば、特に長期間実験において、生細胞のために正確な生理学的条件を維持する気候ボックスを顕微鏡に装備することができる。顕微鏡載物台は自動フィルターおよびレンズ変更手段を有する。
【００２５】
顕微鏡載物台はイメージングデバイスに連結される。このイメージングデバイスは、各実行の後に顕微鏡を介して光学的に伝達される各シグナル分布パターンのイメージを採取するので、コンピューター制御イメージ評価を可能とする。
【００２６】
本発明の全体の自動装置は以下の技術的パラーメーターを有する。
【００２７】
１．それは中央コンピューターを介して制御できる。
【００２８】
２．ピペットチップは自動的に交換される。
【００２９】
３．３Ｄハンドリング系およびピペッティング系は、好ましくは少なくとも±０. １ｍｍであるピペット反復位置決定における正確性を示す。
【００３０】
４．個々の系は振動、発光、場によって損傷されず、使用者はノイズによって乱されない。
【００３１】
５．要すれば、サーモスタットを備えることができる。
【００３２】
６．ピペッティングデバイスを正確に位置決定するための３Ｄワーキング領域および回転軸を備えなければならない。
【００３３】
本発明の自動装置は、自然科学、特に生物学および医学における種々の適用分野で使用できる。適用の特に重要な分野は癌および免疫系の研究および診断である。
【００３４】
固体または液体対象における分子クラスまたは分子群を決定または同定するための本発明の方法は、液体または固体対象において、ランダム数Ｘｎ（ｎ＝１，２，３．．．．Ｎ）の異なる分子クラスまたは分子群を、特異的試薬溶液Ｙｎ（ｎ＝１，２，３，．．．Ｎ）によって、ランダムな回数だけ、自動的に決定しまたは同定しおよびマッピングできることを特徴とする。
【００３５】
この方法は以下の自動工程を具備している：
Ｉ．ピペッティング系によって、試薬溶液Ｙ１が、溶液Ｙ１を含有する容器から自動的に採取される。
【００３６】
ＩＩ．ステージまたは対象保持体上に載置した対象（固体または液体）に溶液Ｙ１を自動的に適用する。
【００３７】
ＩＩＩ．自動的に特定された時間だけ、溶液Ｙ１を対象と反応させる。
【００３８】
ＩＶ．かかる暴露の直後または、要すれば実際の暴露の間も、溶液Ｙ１で処理された対象の画像を、顕微鏡のイメージング系を自動的に作動させることによって採取してもよい。別法として、工程ＶＩに先行して工程Ｖを行ってもよい。
【００３９】
Ｖ．溶液Ｙ１を自動的に特定したある時間だけ対象と反応させた後に、溶液Ｙ１をピペッティング系によって除去する（吸引除去する）。
【００４０】
対象および行うべき特別の決定または同定に応じて、工程ＶＩにおいて異なる別法が可能である。
【００４１】
ＶＩａ．ピペッティング系によって、第２の溶液Ｙ１または溶液Ｙ２あるいはＹ１およびＹ２の混合液を適用する。
【００４２】
ＶＩｂ．溶液Ｙ１、溶液Ｙ２、または溶液Ｙ１およびＹ２の混合液を除去した後、洗浄溶液Ｚ１を自動的に対象に適用し、特定できる間だけ対象と反応させる。
【００４３】
ＶＩｃ．溶液Ｙ１の除去後直ちに、洗浄溶液Ｚ２またはＺ３またはＺｎ（ｎ＝１，２，３．．．Ｎ）をピペッティング系を介して自動的に適用する。
【００４４】
ＶＩｄ．溶液Ｙ１の除去の直後、洗浄溶液Ｚ１ないしＺｎを、変更し得る特定の順序で対象に適用する。
【００４５】
ＶＩｅ．溶液Ｙ１への暴露およびその除去に続いて可変な自動的に特定された時間の後、洗浄溶液を対象に適用する。
【００４６】
ＶＩｆ．変更し得る一定の特定された時間が経過した後にのみ、洗浄溶液Ｚ１ないしＺｎをある順序である暴露時間の間、対象に対して自動的に適用する。
【００４７】
ＶＩＩ．一つの溶液Ｙ３、あるいはランダムな数の異なった溶液Ｙｎまたは該異なる溶液Ｙｎの混合液を用いて、工程Ｉ−ＶＩｆをランダムな回数だけ反復してもよい。
【００４８】
少なくとも検査すべき対象に関して可能な限り、工程Ｉ−ＶＩＩをいずれかの時点で且つ工程のランダムな段階で中断してもよく、またランダム数の回数だけ反復してもよい。個々のサイクルは非常に速く、好ましくは各々５分ないし３０分内に行うことができる。
【００４９】
本発明のこの方法は、すべてコンピューターによって自動的に制御される、３Ｄハンドリング系、ピペッティング系、光学測定系、特に顕微鏡載物台、およびイメージングデバイスを具備した本発明の自動装置で行うことができる。
【００５０】
本発明の方法は、ある時間内に、量および質に関する評価結果を正確とするであろう。さらに、対象におけるランダム数の分子クラス、分子種または分子部分を検査、決定および同定することができる。該方法を手で行う場合に生じる誤差源は大いに排除された。その結果、本発明の自動化方法は、異なる分子群を検査および決定し、または同定することに関して、先行技術方法よりもかなり優れた利点を示す。
【００５１】
本発明の好ましい態様において、該方法は、種々の疾患およびそれらの治療に対する知見を得るために、分子群の配置および相関的分布についての知識を得ることを目的として、細胞もしくは組織検体におけるランダム数の分子種またはエピトープを自動的に検出しマップするために行う。この目的では、細胞または組織検体を、例えば、蛍光抗体またはリガンドを含有する第１の試薬溶液Ｙ１で処理する。あるインキュベーションの後、特異的に標識された組織検体または細胞の標識の特別の分布パターンを写真に取り、記録する。
【００５２】
標識の分布パターンを記録するには、例えば、自動コンピューター制御下に、蛍光色素を自動的に励起させ、ビデオカメラのシャッターを所定の時間開口させる。かくして、蛍光シグナルを、好ましくはデジタルシグナル、すなわちデジタル化イメージの形態で記録する。自動蛍光励起用のシャッターと同様に、シャッターの所定の開口時間の後、シャッターを自動的に再度閉じる。適当な蛍光フィルターおよびシャッターの作動を用い、試料中に同時に存在する、すなわち試料に結合した異なる蛍光色素について同一操作を自動的に反復する。
【００５３】
引き続いて、特異的に標識された試料を脱色し、洗浄し、次いで、第２の試薬溶液Ｙ２またはランダム数の試薬溶液Ｙｎまたはその混合液で処理する。ランダム数のかかる標識−イメージング−脱色サイクルによって行うことができる自動化方法は医学および生物学における用途に特に適している。検査すべき固体または液体対象について可能な限り、個々の工程をランダムな回数だけ反復することができる。第１工程および／または引き続いての工程またはこれらの反復サイクルは、透過光顕微鏡と組み合わされた蛍光顕微鏡のごとき光学的方法によって行う。該方法の第１の試行は、透過光技術によって、標識した組織検体または細胞のイメージ、すなわち、相コントラストイメージまたは微分干渉コントラストイメージを記録することによって終了する。各サイクルは、特異的に標識された組織検体または特異的に標識された細胞のイメージのこの記録で終了する。
【００５４】
このように、反復する標識−イメージング−脱色のサイクルを経る検査下で各試料、細胞または組織検体におけるランダム数の個々の標識パターンのイメージを得たり、個々のまたは多数な分子分布の得られた複雑な組合せパターンを決定したり、あたかも（例えば、細胞の）生物学的構造に対する順列的パターンであるかのごとくそれらをランダムに投影することが可能である。画像重ね合わせおよびイメージ解析は特別のコンピューターによって自動的に行うことができる。単一または多数の細胞のイメージのコンピューターの助けを借りた画像重ね合わせは、原理的には構造−結合パターンとして可視的には決して検出できない細胞におけるかかる複雑な分子組織形態の、合理的方法にての、例えば一晩にわたる、検出または同定および評価を容易とする。これは、個々のイメージの冗長な評価プロセス、例えばパターンの手動コピーを排除する。さらに、相関的分子濃度およびトポロジー学的関係に関する必須の定量的結論は特別のアルゴリズムによってのみ得ることができる。さらに、これまで目視的に行われてきた評価のため、個々のイメージを組み合わせてトータルなイメージを得たり、あるいは全細胞系における高度に複雑な順列的挙動を解析するのは同様にほとんど不可能であった。
【００５５】
本発明の方法によって、今や、ランダム数の異なる試薬溶液を用いて、ランダムな回数だけ、試料、細胞または組織検体を特異的に標識するのが可能となった。かくして、各ランダム試料における試薬の順序を変更することによって示すこができるように、本質的立体的障害は排除される。というのは、各標識結果は実質的に一定のままだからである。本発明のこの態様で使用する試薬は、抗体、レクチン、核酸、バイオトキシン、（蛋白質のごとき）免疫グロブリン結合性分子、蛍光色素または酵素のごとき他の特異的リガンドを具備する。特に好ましいものは蛍光抗体もしくはリガンド、特に蛍光色素−結合抗体もしくはリガンドである。この態様で使用する対象は、ある種のステージまたは担体上に置かれた、あるいは（ゲルのごとき）ある種の媒体に含有された単一細胞、複数細胞、組織切片または分子であり得る。
【００５６】
以下に示すのは、細胞または組織検体中の分子クラスを標識し測定する個々の自動工程の一般的記載である。しかしながら、本発明による方法は断じてこれらの工程に限定する意図のものではない。個々の工程は必要であれば相互に交換しまたは省くことができる。
【００５７】
細胞（例えば、固定した細胞、例えばアセトン固定細胞、アジ化ナトリウム処理細胞または生細胞）のごとき対象を顕微鏡載物台に載せる。試料を手で調製し、装置のステージに載せた後、以下の自動工程を行う：
１．第１のインキュベーション溶液Ｙ１（１または数種の蛍光色素が結合した試薬）を採取する。
【００５８】
２．該溶液Ｙ１を対象にピペッティングする。
【００５９】
３．ある温度、例えば室温で、該溶液Ｙ１と共に対象をインキュベートする。
【００６０】
４．該インキュベーション溶液Ｙ１を除去する。
【００６１】
５．洗浄溶液Ｚ１、例えば緩衝液を対象上に１回または数回落とす。
【００６２】
６．該洗浄溶液Ｚ１を除去する。
【００６３】
７．蛍光分布パターンを記録する（イメージング）（数種の蛍光色素の場合、選択的蛍光記録フィルターをイメージング操作で使用する）。
【００６４】
８．洗浄溶液Ｚ２を対象にピペッティングする。
【００６５】
９．蛍光励起によって試料を励起させる。
【００６６】
１０．蛍光が存在しなければ、脱色プロセスを終了する。この時点は、従前のテストに基づいて特定され、イメージング系によって確認または決定される。
【００６７】
１１．該洗浄溶液Ｚ２を除去する。
【００６８】
１２．（１種または数種の蛍光色素−結合試薬を含有する）第２のインキュベーション溶液Ｙ２を採取する。
【００６９】
１３．（前記したごとく、それに触れることなく、またはその位置をシフトさせることなく）該溶液を同一細胞試料上に落とす。
【００７０】
１４．前記第４−１１項を継続する。引き続いて、第３、第４、第５、．．．第Ｎインキュベーション溶液を用いて同方法を反復する。
【００７１】
各サイクルは、対応する相コントラストイメージまたは微分干渉コントラストイメージの記録で終了する。工程１−１４は全て自動で行う。コンピューターの助けを借りた画像重ね合わせによって、個々のイメージを組み合わせて全体イメージが得られ、次いで、評価する。個々の細胞または組織検体のこの全体分子イメージは、２18の異なる組合せの結果、前記した例のようになるので、もしそれらの数が高い、例えば１８の異なる登録分子クラスであれば、基本的には目視的には決定または同定または評価できない細胞における組織の複雑な分子形態についての知見を与えるであろう。この分別解像はさらに容易に増強させることができる。系、特に細胞系の順列的解析についての公知の方法は、せいぜい２3 および２5 の間のそれらの順列的分別能力に鑑みると、厳格に制限される。組合せから得られる分子組織の高次の構造は、公知方法によっては検出できない。
【００７２】
系、特に細胞系の順列的解析についての全ての公知の方法とは対照的に、本発明の方法は組み合わせた分子を分別するかなり改良された能力（解像能力）を示す。
【００７３】
本発明の方法は、単一血液検体単独からの免疫系において、特異的順列的分別スペクトルの検出を可能とする。
【００７４】
その結果、本発明の方法は、特に生物学および医学において、個々の分子群の分子配置または分子分布に対する知見ならびに特異的疾患の徴候およびそれらの可能な治療に対する知見を得るのを可能とする。
【００７５】
順列的分子分別（すなわち、分別解像）についての実質的に限定されない「解像」のため、異常な分子組合せが免疫系の細胞の細胞表面に存在するという、当該方法の現実的使用は既に示されている。これらは、例えば、ある種の神経変性疾患の場合に、細胞侵入についての異常表面暗号に対する完全に新しい知見、およびかくして診断および療法の新しい方法についての知見も与える。
【００７６】
本発明の方法についてのさらなる適用分野は、例えば遺伝子チップについての複雑な遺伝パターンのマッピングであり得るが、これは、多重薬物テストまたは複雑な突然変異パターンの検出で将来大いに有意義であろう。
【００７７】
しかしながら、本発明のプロセスは、細胞または組織試料における分子組織形態を決定しまたは同定しおよび検査するのに特に適するが、それらに限定されるものではない。
【００７８】
一般に、液体または固体形態のいずれの対象も、その分子構造または配置あるいはその中の分子部分の存在につき検査できる。その例は、半導体、合金またはプラスチックにおける分子の配置および組合せの検査および決定または同定である。
【００７９】
以下の実施例は、本発明をさらに詳細に説明することを意図するが、本発明を限定するものではない。
【００８０】
＜実施例＞
個々の細胞の蓄積（単離した単核血液白血球、対物スライドに適用）、すなわち一つの同一試料中の１８の異なる分子クラスは、自動的に制御された反復するインキュベーション−イメージング−脱色サイクル（ＲＩＩＢＣ）によって標識される。
【００８１】
調製：
１．カバーグラスを単離した細胞で被覆する。
【００８２】
２．室温（ＲＴ）で約１０分間細胞を風乾する。
【００８３】
３．（ＲＴにて）アセトン中で１０秒間、それを短時間固定する。
【００８４】
４．それを短時間風乾する。
【００８５】
５．液体窒素中で予め冷却したイソペンタン上でカバーガラスを瞬時ショック凍結する。
【００８６】
６．（マイナス８０度で長時間貯蔵する）あるいは
７．マイナス２０度で２０分間アセトン中で脱水する。
【００８７】
８．ＲＴで風乾する。
【００８８】
９．ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７. ４）中で再水和させる。
【００８９】
１０．１：３０正常ヤギ血清でプレインキュベートする。
【００９０】
１１．ＰＢＳ中で洗浄する。
【００９１】
１２．倒立顕微鏡の載物台上の特別の担体上にカバーガラスを瞬時に載せる。
【００９２】
１３．相コントラストレンズを用いて所望の細胞に焦点を合わせ、同時に、接眼レンズを介して細胞を目視的にモニターする。
【００９３】
１４．顕微鏡載物台の湿潤チャンバーを閉じる。
【００９４】
１５．ピペッティングロボットにスイッチを入れる。
【００９５】
１６．ピペッティング−イメージング−脱色工程についての順序および時間間隔をコンピューターに入力する。
【００９６】
１７．自動機械のラック中の所与の容器（例えば、エッペンドルフ反応容器）に試薬（抗体溶液、緩衝液）を充填する。
【００９７】
自動機械によってＲＩＩＢＣを行う：
サイクル１：
１．溶液Ａ（８０ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７. ４、＋１０ｍｌのフルオレセイン−イソチオシアナート（ＦＩＴＣ）が結合したモノクローナル抗体−１、＋１０ｍｌのフィコエリトリン（ＰＥ）が結合したモノクローナル抗体−２を具備した溶液１００ｍｌ）を、ピペッティングロボットによって、該溶液Ａを含有する容器から採取する。該容器はプラスチック反応容器である。
【００９８】
２．ピペッティングロボットが、顕微鏡の対象載置台上にある対象（カバーガラス上の細胞）に溶液Ａを適用する。
【００９９】
３．溶液Ａをある時間（例えば、室温で２０分間）対象に作用させる。
【０１００】
４．工程３の直後、ピペッティングロボットはこのインキュベーション溶液を吸い上げ、それを捨てるか、あるいは所望によりそれを自動機械のラック中の特別の排液容器（反応容器）にピペットで入れてもよい。
【０１０１】
５．これに続き、緩衝液での１０回連続の洗浄工程を行い、緩衝液は、ラック中の反応容器からピペッティングロボットによって順次に採取され、細胞試料に適用され、引き続いて再度吸い上げられ、捨てられる。個々の洗浄工程の持続：ほぼ２分
６．１０回の洗浄工程が終了すると、緩衝液を再度試料に適用する。
【０１０２】
７．工程６の直後、ある時間にわたって、イメージングデバイス（例えば、ＣＣＤカメラ）によってある時間相コントラスト様式でイメージを自動的に採取し、保存する。調製の間を通じてイメージングがいくつかのＺ面で起こって、アルゴリズムによって最適焦点面を決定される。
【０１０３】
８．工程７の直後、蛍光シャッターを開け、蛍光色素フィコエリトリンから発せられる蛍光シグナルを記録する。顕微鏡における適当な蛍光フィルターデータは、ＰＥおよびＦＩＴＣの実質的全分離が可能なように選択される必要がある（例えば、ＰＥ用（ＤＥＰＩＬ  ５７５±７ｎｍ）およびＦＩＴＣ用（ＢＰ  ５１５−５４５ｎｍ）発光フィルター）。イメージングは、（細胞試料に応じて）ランダムにプログラム可能な時間で２の蛍光シグナルの各々につき別々に、あるいは所望により二色性フィルターによって同時に起こる。規定したイメージ記録時間の後、蛍光シャッターを再度閉じる。
【０１０４】
９．工程８の後、蛍光シャッターを開けたままにし、励起波長によって試料を励起することによって試料を脱色する（この種の温和な脱色は結合した蛍光色素を破壊するが、免疫原性ドメインの特性は保存するであろう）。
【０１０５】
１０．いったん脱色時間が経過すると、蛍光シャッターを再度自動的に開け、前記したのと同時点で各個々の蛍光色素につきイメージングデバイスによってシグナルを記録する（このシグナル記録により、脱色時間が発光シグナルを完全に排除するのに十分であったか否かに関しての指標が供される：これは、自動機械のソフトウェアによって決定されるか、あるいは各固定時点はこの方法のために予めプログラムされる）。
【０１０６】
サイクル２：
１１．工程１０の後、ピペッティングロボットによって緩衝液を吸い上げ、（８０ｍｌの緩衝液＋１０ｍｌのＦＩＴＣ−結合モノクローナル抗体−３＋１０ｍｌのＰＥ−結合抗体−４を具備した）溶液Ｂを対象に適用する。
【０１０７】
１２．工程１１に続いて、前記したのと同一の工程（２ないし１０：サイクル２）を行う。
【０１０８】
サイクル３：
１３．理論的には、サイクル２の終了に続き、新しい溶液Ｃ（各々ＦＩＴＣおよびＰＥに結合した、特異性５および６のさらなる２種の抗体用）でサイクル３を行う。
【０１０９】
サイクル３に続き、標識の特異性を損なうことなく、実質的にランダムな数の異なる抗体用のさらなるＮサイクルを自動的に行うことができる。
【０１１０】
この原理は、対応する特異的結合部位にて新しい蛍光色素−結合抗体を何度も細胞に負荷しつつ、結合した蛍光色素は脱色によって破壊され、抗体を細胞に結合したままにするであろう。これらの結合では立体障害は起こらない：これは、各ランダムアプローチにおいて抗体反応の順序を変更することによって示すことができる。
【０１１１】
かくして、実質的にランダムな大きな数の分子クラスをこのようにして個々の細胞において検出することができる。これにより、細胞における分子組合せを系統的に検査する方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明の操作の具体例の模式的構造を示す。
【図１】
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