(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物（但し、ヒトを除く）の発生中の胚において移動増殖期の始原生殖細胞を採取し体外で培養、増殖する方法であって、培地中にＴＮＦ−α及び／又はＴＮＦ−βを添加することを特徴とする、始原生殖細胞の体外培養法。
【請求項２】
哺乳動物（但し、ヒトを除く）の発生中の胚において移動増殖期の始原生殖細胞を採取し体外で培養、増殖する方法であって、培地中にＴＮＦ−α及び／又はＴＮＦ−βを添加し、さらに、ＳＣＦ及び／又はＬＩＦを培地に添加することを特徴とする、始原生殖細胞の体外培養法。
【請求項３】
移動増殖期の始原生殖細胞がマウスの７．５〜８日胚に含まれることを特徴とする、請求項１または２に記載の始原生殖細胞の体外培養法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
一般に、始原生殖細胞は減数分裂を行う以前の生殖細胞で、例えばマウスの始原生殖細胞は７日胚の原条後端の胚体外中胚葉中から約２０〜３０個の細胞塊として分離されるものであるが、ＥＳ細胞（胚幹細胞）よりより高い頻度で外来遺伝子との相同組み換えが起る可能性があるために、将来発生工学に多く利用されるものである。
【０００２】
本発明ではＴＮＦ−αなどの添加によって始原生殖細胞を増殖させることが可能となるので発生工学に広く利用されることが期待されるものである。
【０００３】
【従来の技術】
生物個体への分化能を有する細胞に対して人為的な遺伝子操作を施し、これを個体にまで育成する技術は、真核生物の組織や個体レベルにおける生物現象の解明、或いは有用な動物個体の作出・育種につながる重要な技術として、近年注目を浴びている。
【０００４】
生物個体への分化能を有する細胞としては、受精卵、肺幹細胞（以下ＥＳ細胞という）、始原生殖細胞などがあるが、これらのうち受精卵或いはＥＳ細胞を用いた個体の作出は技術的にほぼ確立されつつある。特にマウス受精卵前核に外来遺伝子を導入することによって作出されたトランスジェニックマウスは、癌や免疫の研究に欠くことの出来ない実験モデルとなっている。
【０００５】
一方、始原生殖細胞は、減数分裂の際に相同遺伝子組み換えが起こることから、ＥＳ細胞（ＥＳ細胞での遺伝子の組み換え率は約１／１０6とかなり低い）より高頻度で外来遺伝子との相同組み換えが起こる可能性があり、また、ＥＳ細胞では遺伝子導入動物を作成するのに一度キメラ動物を経由する必要があるのに対して、始原生殖細胞からは直接遺伝子導入動物を作成することが可能であるという特長がある。後者の特長は、世代交代が長いために育種に長期間を要する家畜などは非常に有利な点である。しかしながら、始原生殖細胞の実験的操作はまだ困難であり、技術が確立していない。
【０００６】
本発明者らは、これまでにマウス胎仔卵巣（１２．５日胚以降のものを使用）の生殖細胞と体細胞を解離した後、再構成卵巣を作成、移植することで生殖細胞由来の仔を作成することに成功している（Hashimoto et al., 1992, Dev. Growth Differ. 34, 233-238）。このことは、始原生殖細胞の発生工学的な利用が潜在的には可能であることを意味しているが、この方法では得られる産仔数が少なく、いまだ実用的ではない。今後、始原生殖細胞の発生工学的な活用を行うためには、始原生殖細胞の性質を保持したままで、長期間培養する手法を確立することが最も重要である。
【０００７】
マウス始原生殖細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏ（特に１２．５日胚以前）では活発に増殖しているにもかかわらず、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの培養はほとんど不可能であった。１９９１年にＳＣＦ（stem cell factor）とＬＩＦ（leukemia inhibitory factor）が、始原生殖細胞の増殖／生存を促進することが報告された（Godin et al.,1991,Nature 352, 807-809；Dolici et al., 1991 Nature 352,809-811；Matsui et al., 1991, Nature 353,750-752；De Felici et al., 1991, Dev. Biol. 147, 281-284）。また、ＳＣＦ、ＬＩＦ及びｂＦＧＦ（bovine fibroblast growth factor）を組み合わせて培養すると始原生殖細胞自体の性質が変化し、ＥＳ細胞に似た細胞（embryonic germ cell）になることが知られている（Matsui et al., 1992, Cell 70, 841-847；Resnick et al., 1992, Nature 359, 550-551）。しかしながら、これらの成長因子を加えても始原生殖細胞のｉｎ  ｖｉｖｏにおける増殖速度はｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける増殖速度に比べてはるかに高く、まだ未知の増殖因子が存在している可能性が高いと考えられている。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は発生工学にとって重要な始原生殖細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏでより効率よく増殖させ、またより長期間その性質を保持したままで増殖生存させることを目的としている。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、始原生殖細胞の増殖因子を鋭意探索してきたが、ＴＮＦ−α（Tumor necrosis factor α、腫瘍壊死因子）及びＴＮＦ−βが、始原生殖細胞の増殖／生存を促進する新たな因子であることを見い出した。
【００１０】
本発明は始原生殖細胞の培養に際し、ＴＮＦ−α及び／又はＴＮＦ−βを添加した培地を使用することを特徴とする始原生殖細胞の培養法に関するものである。
また本発明は、ＴＮＦ−α及び／又はＴＮＦ−βに加え、ＳＣＦ及び／又はＬＩＦを添加した培地を使用することを特徴とする始原生殖細胞の培養法に関するものである。
【００１１】
本発明に使用するＴＮＦ−αは、CarswellらがＢＣＧ感作後にエンドトキシン処理したマウス血清中から見い出した抗腫瘍活性蛋白質であって、従来はＴＮＦと呼ばれてきたものである(Carswell, E. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72:3666-3670, 1975）。ところが、ＴＮＦとは別途に見い出されていた生理活性物質であるリンホトキシンが、ＴＮＦとアミノ酸配列の相同性が約３０％しかないにも拘らず、ＴＮＦと極めて類似した生理活性を有し、しかもレセプターをＴＮＦと共有していることからＴＮＦ−βとも呼ばれるようになった。このため、従来のＴＮＦをＴＮＦ−αと呼ぶようになった（Vassalli, P., Anhu. Rev. Immunol. 10 : 411-452, 1992)。従って、本発明に使用するＴＮＦ−αとはＴＮＦと言い慣わされているものと同じ物質なのである。
【００１２】
ＴＮＦ−αは、抗腫瘍活性の他に、破骨作用、細胞への脂質の取込み阻害活性、血管内皮細胞の阻害作用等の極めて多彩な生理活性を有していることが知られているが、始原生殖細胞を増殖する作用を有しているということは今まで報告がなく、全く新しい知見である。
【００１３】
ＴＮＦ−αは、始原生殖細胞が活発に増殖している早い胎齢時期で効果があり、始原生殖細胞の生存因子よりむしろ分裂因子として働いている。ＴＮＦ−αの増殖効果はＳＣＦあるいはＬＩＦを加えることで相乗的に働く。特にＴＮＦ−α＋ＳＣＦ＋ＬＩＦを組み合わせると最も効果がある。一方、始原生殖細胞の性質を変える性質があるｂＦＧＦとの組合せでは効果がむしろ失われる。ＴＮＦ−αは始原生殖細胞が活発に増殖しているマウスの８．５−９．５日胚で発現していることは既に報告されており（Ohsawa and Natori 1989, Dev. Biol. 135, 459-461）、ｉｎ  ｖｉｖｏで実際に働いている可能性が高い。このように、ＴＮＦ−αは始原生殖細胞の性質を保持したまま培養するのに効果があり、その発生工学的利用に大きな進歩をもたらす可能性が期待できる。
【００１４】
以下に実施例を示す。
【００１５】
【実施例】
始原生殖細胞の培養を行うためにはマイトマイシン処理したフィーダー細胞が必要である。以下フィーダー細胞の準備、始原生殖細胞の単離とその培養、始原生殖細胞の検出方法等について順に記す。
【００１６】
１）フィーダー細胞
フィーダー細胞としては、胎仔繊維芽細胞株であるＳＴＯ細胞を用いた。ＳＴＯ細胞は株細胞であるが、継代を繰り返すうちにＳＴＯ細胞の形態や増殖速度が変化してくるので、１〜２ケ月程度培養したものは廃棄し、凍結保存しておいたストックから新たに培養を始めた。
【００１７】
ａ．試薬
培地ＤＭＥＭ（Dulbecco's modified Eagle's medium）（Gibco）＋１０％ＦＣＳ
ＰＢＳ（−）（Dulbecco、Ca、Mg不含、pH7.2）
トリプシン：０．０５％トリプシン（Difco）−１ｍＭ  ＥＤＴＡ  ＰＢＳ（−）溶液
０．１％ゼラチン溶液：ゼラチン（Swine skin、Type Ａ：Sigma）を０．１％になるように水を加え、オートクレーブして溶解滅菌。
マイトマイシンＣ：マイトマイシンＣ（Sigma）を２ｍｇ／ｍｌになるように水を加えて溶かし、ろ過滅菌する。１００μｌずつに小分けし−８０℃で保存。
【００１８】
ｂ．ＳＴＯ細胞の維持
ＳＴＯ細胞の培養は細胞がほぼコンフレント（１００ｍｍの培養皿に細胞数が５×１０6）になったら継代することで行う。継代は、細胞をＰＢＳ（−）で２回洗浄してから数分トリプシン処理して、１００ｍｍの培養皿に約１／１０（５〜６×１０6）の細胞をまくと、２日後にはほぼコンフレントにまで達する。
【００１９】
ｃ．フィーダー細胞の作成
手順
▲１▼フィーダー細胞を作る培養皿を予めゼラチンでコートしておく（３７℃で最低１時間）。
▲２▼ほぼコンフレントに近いＳＴＯ細胞に、最終濃度１０μｇ／ｍｌになるようにマイトマイシンＣを加え、２〜２．５時間培養する。
▲３▼培地を除きＰＢＳ（−）で３回洗浄し、トリプシン処理して細胞を剥し、遠心する（1000rpm，５分）。
▲４▼細胞を２．５×１０6／ｍｌの濃度に懸濁する。
▲５▼培養皿のゼラチンを取り除き、細胞懸濁液を加える。２４穴プレートに０．５ｍｌの懸濁液を加えて一様なフィーダー細胞を作成する。
作成後２４±８時間に作成したものを始原生殖細胞のフィーダーとして使用した。
【００２０】
２）始原生殖細胞の単離とその培養
始原生殖細胞は、胎仔より始原生殖細胞を含む組織断片として切り出し、トリプシンで解離して単離しフィーダー細胞上で培養を行った。
ＰＢ−１培地中で７．５日胚では尿膜基部、８日胚（５．６体節期）では尿膜から後腸部分、１０．５日胚では腸間膜部分、１１．５日胚では生殖隆起（中腎を含む）、１２．５日胚では生殖隆起（中腎を含まず）を、始原生殖細胞を含む組織断片として切り出した。培養液は下記のＥＳＭに２０％の血清を加えたものを使用した。成長因子等何も加えていないものを以下Controlと記す。
培養皿は２４穴を用い、１穴あたり７．５日胚の場合には１個分、８日胚と１０．５日胚の場合には０．５個分、１１．５日胚と１２．５日胚の場合は０．２５個分で培養を行った。培地は毎日交換した。
ＥＳＭの組成
１００ｍｌ  ＤＭＥＭ
０．４５ｇグルコース
０．５ｍｌ  ＮＥＡＡ（non-essential amino acid：Gibco）
１ｍｌヌクレオシド溶液（Sigama）
下記の成長因子の１種以上
ＳＣＦ  ３２．５ｎｇ／ｍｌ（mouse recombinant, GENZYME）
ＬＩＦ  １０００ｕｎｉｔ／ｍｌ（mouse recombinant, AMRAD）
ｂＦＧＦ  ２０ｎｇ／ｍｌ（human recombinant, GENZYME）
ｈＴＮＦ  ４０００ｕｎｉｔ／ｍｌ（human recombinant RSD）
ｍＴＮＦ（mouse recombinant, GENZYME）
ｈＬＴ（ＴＮＦ−β）（human recombinant RSD）
ヌクレオシド溶液：アデノシン、グアノシン、シチジン、ウリジンそれぞれ３ｍＭ、チミジン１ｍＭの水溶液３７℃に加温して溶かし、ろ過滅菌し、−２０℃で保存。
抗生物質はペニシリンかストレプトマイシンを用いた。
【００２１】
３）始原生殖細胞の検出方法等
始原生殖細胞はアルカリ性フォスファターゼ活性により検出し（図１）、計数をおこなった。また細胞分裂速度の検定にはＡｍｅｒｓｈａｍ  ＰＲＮ−２０を用い検出した。また始原生殖細胞細胞数に有為な差があるか否かについては、ｔ−検定により調べた。
【００２２】
始原生殖細胞におけるＴＮＦ−αの効果
まず８日胚から始原生殖細胞を取り出し、培地中にＴＮＦ−αを加え培養を行った。結果を図２に示す。ControlやＳＣＦ＋ＬＩＦに比べたところＴＮＦ−αの始原生殖細胞の増殖効果が確認された。またＴＮＦ−αの濃度効果を解析したところ、１，０００ｕｎｉｔ／ｍｌ以上で最大に達した（図３）。図２及び図４以後の実験では４，０００ｕｎｉｔ／ｍｌの濃度で培地中に加えた。始原生殖細胞の発生時期でこのＴＮＦ−αの効果が差があるか否かを、７．５日胚（図４）、１０．５日胚（図５）、１１．５日胚（図６）と１２．５日胚（図７）で始原生殖細胞を含む組織を取り出し、細胞を解離し同様に培養を行った。その結果、７．５日胚の始原生殖細胞で８日胚より大きな増殖効果が観察されたが、一方１０．５日以降の胎仔の始原生殖細胞ではほとんどその効果が見られなかった。このようにＴＮＦ−αは始原生殖細胞が活発に移動増殖している７．５−８日胚で始原生殖細胞の増殖を促進することが判明した。
【００２３】
この増殖効果が始原生殖細胞の分裂因子によるものか、それとも生存因子によるものかを調べるため、始原生殖細胞でのＢｒｄＵの取り込み率を調べた。その結果を図８に示す。培養４日までＴＮＦ−αによって始原生殖細胞でのＢｒｄＵ取り込み率すなわちＤＮＡ合成が上昇しており、ＴＮＦ−αが始原生殖細胞の分裂因子であることが明らかになった。
【００２４】
始原生殖細胞の増殖因子／生存因子として今までにＳＣＦ、ＬＩＦおよびｂＦＧＦが報告されており、これらとＴＮＦ−αと組み合わせることで始原生殖細胞の増殖効果が増加するか否かを検討した。その結果を図９に示す。ＴＮＦ−α＋ＳＣＦあるいはＴＮＦ−α＋ＬＩＦで増殖効果がより増加した。とくにＴＮＦ−α＋ＳＣＦ＋ＬＩＦでは始原生殖細胞は培養１日から培養４日までの間に約７．６倍増加した。ところが、ＴＮＦ−α＋ｂＦＧＦのときはこの効果がなくなり、Ｃｏｎｔｒｏｌと同じぐらいまでしか増殖しなかった。
【００２５】
ＴＮＦ−αのレセプターはほとんどの細胞に存在し、Ｒ１とＲ２の種類があってＲ２には種特異性があることが今までに報告されている。以上の実験ではマウスの始原生殖細胞に対しヒト・組換えＴＮＦ−αで効果があったので、ＴＮＦ−Ｒ１のレセプターを介しての増殖である可能性が高い。図３と同様にしてマウス・組換えＴＮＦ−αで効果を調べた。培養３日ではマウスＴＮＦ−αとヒトＴＮＦ−αに差は見られなかったが、培養５日ではマウスの方が効果があった(図１０、図１１）。またＴＮＦ−β（ＬＴ）について同様に調べたところ同様な効果が観察された（図１２）ことからＴＮＦ−βもＴＮＦ−αと同様の始原生殖細胞の増殖因子である可能性が高い。
【００２６】
始原生殖細胞とＥＳ細胞はともにアルカリ性フォスファターゼ陽性であるが、始原生殖細胞では移動形態を示すものが見られるのに対し、ＥＳ細胞ではそのようなことはなく、コロニーを形成している。そのため増殖因子を加えることによってアルカリ性フォスファターゼ陽性細胞の割合が増加していなければ、始原生殖細胞の性質を保持している可能性が高い。図１３にその結果を示す通り、ＴＮＦ−αを培地中に加えてもコロニーの細胞の割合はほとんど変化せず、アルカリ性フォスファターゼ陽性細胞は始原生殖細胞の性質を保持している可能性が高い。一方、ｂＦＧＦを加えると全体の細胞数はほとんど増加しないのにコロニー形成率が大きく上昇しており、性質が変化していることがわかる。
【図面の簡単な説明】
【図１】アルカリ性フォスファターゼ活性によって検出された始原生殖細胞の顕微鏡写真
（ａ）マウス胎齢８日胚より単離した始原生殖細胞をヒト組換えＴＮＦ−αを加え５日間培養したもの。
（ｂ）マウス胎齢８日胚より単離した始原生殖細胞をヒト組換えＴＮＦ−α＋ＳＣＦ＋ＬＩＦを加え４日間培養したもの。細胞膜が赤い呈色（本図面では黒い線）をしているのが始原生殖細胞である。ＥＳ細胞と異なり細胞の中には移動形態を示すものがみられる。
【図２】マウス胎齢８日胚より単離した始原生殖細胞の培養に対するヒト組換えＴＮＦ−αとＳＣＦ＋ＬＩＦ等の効果（以下全てのグラフでのバーは標準誤差を示す）。
【図３】マウス胎齢８日胚より単離した始原生殖細胞の３日間培養におけるヒト組換えＴＮＦ−αの濃度効果。
【図４】マウス胎齢７．５日胚より単離した始原生殖細胞の培養におけるヒト組換えＴＮＦ−αの効果。
【図５】マウス胎齢１０．５日胚より単離した始原生殖細胞の培養におけるヒト組換えＴＮＦ−αの効果。
【図６】マウス胎齢１１．５日胚より単離した始原生殖細胞の培養におけるヒト組換えＴＮＦ−αの効果。
【図７】マウス胎齢１２．５日胚より単離した始原生殖細胞の雄と雌それぞれの培養におけるヒト組換えＴＮＦ−αの効果。
【図８】マウス胎齢８日胚より単離した始原生殖細胞のＢｒｄＵ取り込みにおけるヒト組換えＴＮＦ−αの効果。
【図９】マウス胎齢８日胚より単離した始原生殖細胞の培養におけるヒト組換えＴＮＦ−αとその他の成長因子の効果。
【図１０】マウス胎齢８日胚より単離した始原生殖細胞の３日間と５日間培養におけるヒト組換えＴＮＦ−αの濃度効果。
【図１１】マウス胎齢８日胚より単離した始原生殖細胞の３日間培養と５日間培養におけるマウス組換えＴＮＦ−αの濃度効果。
【図１２】マウス胎齢８日胚より単離した始原生殖細胞の３日間培養と５日間培養におけるヒト組換えリンホトキシン（ＬＴ＝ＴＮＦ−β）の濃度効果。
【図１３】マウス胎齢８日胚より単離した始原生殖細胞培養下でのコロニー形成率に対するヒト組換えＴＮＦ−αとｂＦＧＦの効果。
【図１】
0003763854.tif 000002
【図２】
0003763854.tif 000003
【図３】
0003763854.tif 000004
【図４】
0003763854.tif 000005
【図５】
0003763854.tif 000006
【図６】
0003763854.tif 000007
【図７】
0003763854.tif 000008
【図８】
0003763854.tif 000009
【図９】
0003763854.tif 000010
【図１０】
0003763854.tif 000011
【図１１】
0003763854.tif 000012
【図１２】
0003763854.tif 000013
【図１３】
0003763854.tif 000014