(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤ３４+細胞を末梢化するための組成物であって、ＶＣＡＭ−１に対する、ＣＤ３４+細胞表面のＶＬＡ−４抗原の結合を阻止する因子を含み、該因子は抗ＶＬＡ−４抗体あるいは抗ＶＣＡＭ−１抗体または該抗ＶＬＡ−４抗体あるいは抗ＶＣＡＭ−１抗体の誘導体であって、該誘導体は、キメラ抗体、単鎖抗体、ヒト化抗体、それらのＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、およびＦ（ｖ）フラグメントからなる群より選択される、組成物。
【請求項２】
前記因子が、ヒト抗ＶＬＡ−４抗体あるいは抗ＶＣＡＭ−１抗体である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ＣＤ３４+細胞の少なくとも一部が、造血幹細胞である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記組成物が、ＣＤ３４+細胞増殖の刺激因子とともに投与される、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記組成物が、ＣＤ３４+細胞増殖の刺激因子とともに投与される、請求項２に記載の組成物。
【請求項６】
前記組成物が、造血幹細胞増殖の刺激因子とともに投与される、請求項３に記載の組成物。
【請求項７】
前記刺激が、５−フルオロウラシル、あるいは、Ｇ−ＣＳＦ、幹細胞因子、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、Ｔ−ＳＣＦ、ＳＣＰＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−６、およびＩＬ−１１からなる群より選択されるサイトカインに仲介される、請求項４に記載の組成物。
【請求項８】
前記刺激が、５−フルオロウラシル、あるいは、Ｇ−ＣＳＦ、幹細胞因子、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、Ｔ−ＳＣＦ、ＳＣＰＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−６、およびＩＬ−１１からなる群より選択されるサイトカインに仲介される、請求項５に記載の組成物。
【請求項９】
前記刺激が、５−フルオロウラシル、あるいは、Ｇ−ＣＳＦ、幹細胞因子、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、Ｔ−ＳＣＦ、ＳＣＰＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−６、またはＩＬ−１１からなる群より選択されるサイトカインに仲介される、請求項６に記載の組成物。
【請求項１０】
前記サイトカインがＧ−ＣＳＦである、請求項７に記載の組成物。
【請求項１１】
前記サイトカインがＧ−ＣＳＦである、請求項８に記載の組成物。
【請求項１２】
前記サイトカインがＧ−ＣＳＦである、請求項９に記載の組成物。
【請求項１３】
前記組成物が、前記サイトカインの投与後に投与される、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１４】
前記組成物が、前記サイトカインの投与後に投与される、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１５】
癌を治療するための化学療法および／または放射線療法を受ける前の患者から、ＣＤ３４+細胞を含有する末梢血を得るための組成物であって、該組成物は、ＶＣＡＭ−１に対する、ＣＤ３４+細胞表面のＶＬＡ−４抗原の結合を阻止する因子を含み、ＣＤ３４+細胞を含有する該得られた末梢血は、該療法を受けた患者に戻すための濃縮ＣＤ３４+細胞を得るために使用され、該因子は抗ＶＬＡ−４抗体あるいは抗ＶＣＡＭ−１抗体または該抗ＶＬＡ−４抗体あるいは抗ＶＣＡＭ−１抗体の誘導体であって、該誘導体は、キメラ抗体、単鎖抗体、ヒト化抗体、それらのＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、およびＦ（ｖ）フラグメントからなる群より選択される、組成物。
【請求項１６】
癌を治療するための化学療法および／または放射線療法を受ける前の患者から、白血球搬出によってＣＤ３４+細胞を含有する末梢血を得るための組成物であって、該組成物は、ＶＣＡＭ−１に対する、ＣＤ３４+細胞表面のＶＬＡ−４抗原の結合を阻止する因子を含み、ＣＤ３４+細胞を含有する該得られた末梢血は、該療法を受けた患者に戻すための濃縮ＣＤ３４+細胞を得るために使用され、該因子は抗ＶＬＡ−４抗体あるいは抗ＶＣＡＭ−１抗体または該抗ＶＬＡ−４抗体あるいは抗ＶＣＡＭ−１抗体の誘導体であって、該誘導体は、キメラ抗体、単鎖抗体、ヒト化抗体、それらのＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、およびＦ（ｖ）フラグメントからなる群より選択される、組成物。
【請求項１７】
癌を治療するための化学療法および／または放射線療法を受ける前の患者から、エキソビボにおいて増量されるためのＣＤ３４+細胞を含有する末梢血を得るための組成物であって、該組成物は、ＶＣＡＭ−１に対する、ＣＤ３４+細胞表面のＶＬＡ−４抗原の結合を阻止する因子を含み、ＣＤ３４+細胞を含有する該得られた末梢血は、該療法を受けた患者に戻すための濃縮ＣＤ３４+細胞を得るために使用され、該因子は抗ＶＬＡ−４抗体あるいは抗ＶＣＡＭ−１抗体または該抗ＶＬＡ−４抗体あるいは抗ＶＣＡＭ−１抗体の誘導体であって、該誘導体は、キメラ抗体、単鎖抗体、ヒト化抗体、それらのＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、およびＦ（ｖ）フラグメントからなる群より選択される、組成物。
【請求項１８】
ＣＤ３４+細胞増殖の刺激因子をさらに含有する、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１９】
癌を治療するための化学療法および／または放射線療法を受ける前の患者から、ＣＤ３４+細胞を含有する末梢血を得るためのキットであって、該キットは、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の組成物およびＣＤ３４+細胞増殖の刺激因子を備える、キット。
【請求項２０】
ＡＩＤＳを治療するための化学療法および／または放射線療法を受ける前の患者から、ＣＤ３４+細胞を含有する末梢血を得るための組成物であって、該組成物は、ＶＣＡＭ−１に対する、ＣＤ３４+細胞表面のＶＬＡ−４抗原の結合を阻止する因子を含み、ＣＤ３４+細胞を含有する該得られた末梢血は、該療法を受けた患者に戻すための濃縮ＣＤ３４+細胞を得るために使用され、該因子は抗ＶＬＡ−４抗体あるいは抗ＶＣＡＭ−１抗体または該抗ＶＬＡ−４抗体あるいは抗ＶＣＡＭ−１抗体の誘導体であって、該誘導体は、キメラ抗体、単鎖抗体、ヒト化抗体、それらのＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、およびＦ（ｖ）フラグメントからなる群より選択される、組成物。
【請求項２１】
ＡＩＤＳを治療するための化学療法および／または放射線療法を受ける前の患者から、白血球搬出によってＣＤ３４+細胞を含有する末梢血を得るための組成物であって、該組成物は、ＶＣＡＭ−１に対する、ＣＤ３４+細胞表面のＶＬＡ−４抗原の結合を阻止する因子を含み、ＣＤ３４+細胞を含有する該得られた末梢血は、該療法を受けた患者に戻すための濃縮ＣＤ３４+細胞を得るために使用され、該因子は抗ＶＬＡ−４抗体あるいは抗ＶＣＡＭ−１抗体または該抗ＶＬＡ−４抗体あるいは抗ＶＣＡＭ−１抗体の誘導体であって、該誘導体は、キメラ抗体、単鎖抗体、ヒト化抗体、それらのＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、およびＦ（ｖ）フラグメントからなる群より選択される、組成物。
【請求項２２】
ＡＩＤＳを治療するための化学療法および／または放射線療法を受ける前の患者から、エキソビボにおいて増量されるためのＣＤ３４+細胞を含有する末梢血を得るための組成物であって、該組成物は、ＶＣＡＭ−１に対する、ＣＤ３４+細胞表面のＶＬＡ−４抗原の結合を阻止する因子を含み、ＣＤ３４+細胞を含有する該得られた末梢血は、該療法を受けた患者に戻すための濃縮ＣＤ３４+細胞を得るために使用され、該因子は抗ＶＬＡ−４抗体あるいは抗ＶＣＡＭ−１抗体または該抗ＶＬＡ−４抗体あるいは抗ＶＣＡＭ−１抗体の誘導体であって、該誘導体は、キメラ抗体、単鎖抗体、ヒト化抗体、それらのＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、およびＦ（ｖ）フラグメントからなる群より選択される、組成物。
【請求項２３】
抗ＨＩＶ因子をさらに含有する、請求項２０〜２２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２４】
ＣＤ３４+細胞増殖の刺激因子をさらに含有する、請求項２０〜２２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２５】
ＡＩＤＳを治療するための化学療法および／または放射線療法を受ける前の患者から、ＣＤ３４+細胞を含有する末梢血を得るためのキットであって、該キットは、請求項２０〜２２のいずれか１項に記載の組成物、ならびに抗ＨＩＶ因子およびＣＤ３４+細胞増殖の刺激因子から選択される少なくとも１つの因子を備える、キット。
【請求項２６】
遺伝子疾患または後天性疾患を治療するための遺伝子療法を受ける前の患者から、ＣＤ３４+細胞を含有する末梢血を得るための組成物であって、該組成物は、ＶＣＡＭ−１に対する、ＣＤ３４+細胞表面のＶＬＡ−４抗原の結合を阻止する因子を含み、ＣＤ３４+細胞を含有する該得られた末梢血は、濃縮ＣＤ３４+細胞を得るために使用され、該濃縮ＣＤ３４+細胞は、該遺伝子疾患または後天性疾患を改善する遺伝子でトランスフェクトされ、そして該療法を受けた該患者に戻され、該因子は抗ＶＬＡ−４抗体あるいは抗ＶＣＡＭ−１抗体または該抗ＶＬＡ−４抗体あるいは抗ＶＣＡＭ−１抗体の誘導体であって、該誘導体は、キメラ抗体、単鎖抗体、ヒト化抗体、それらのＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、およびＦ（ｖ）フラグメントからなる群より選択される、組成物。
【請求項２７】
遺伝子疾患または後天性疾患を治療するための遺伝子療法を受ける前の患者から、白血球搬出によってＣＤ３４+細胞を含有する末梢血を得るための組成物であって、該組成物は、ＶＣＡＭ−１に対する、ＣＤ３４+細胞表面のＶＬＡ−４抗原の結合を阻止する因子を含み、ＣＤ３４+細胞を含有する該得られた末梢血は、濃縮ＣＤ３４+細胞を得るために使用され、該濃縮ＣＤ３４+細胞は、該遺伝子疾患または後天性疾患を改善する遺伝子でトランスフェクトされ、そして該療法を受けた該患者に戻され、該因子は抗ＶＬＡ−４抗体あるいは抗ＶＣＡＭ−１抗体または該抗ＶＬＡ−４抗体あるいは抗ＶＣＡＭ−１抗体の誘導体であって、該誘導体は、キメラ抗体、単鎖抗体、ヒト化抗体、それらのＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、およびＦ（ｖ）フラグメントからなる群より選択される、組成物。
【請求項２８】
遺伝子疾患または後天性疾患を治療するための遺伝子療法を受ける前の患者から、エキソビボにおいて増量されるためのＣＤ３４+細胞を含有する末梢血を得るための組成物であって、該組成物は、ＶＣＡＭ−１に対する、ＣＤ３４+細胞表面のＶＬＡ−４抗原の結合を阻止する因子を含み、ＣＤ３４+細胞を含有する該得られた末梢血は、濃縮ＣＤ３４+細胞を得るために使用され、該濃縮ＣＤ３４+細胞は、該遺伝子疾患または後天性疾患を改善する遺伝子でトランスフェクトされ、そして該療法を受けた該患者に戻され、該因子は抗ＶＬＡ−４抗体あるいは抗ＶＣＡＭ−１抗体または該抗ＶＬＡ−４抗体あるいは抗ＶＣＡＭ−１抗体の誘導体であって、該誘導体は、キメラ抗体、単鎖抗体、ヒト化抗体、それらのＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、およびＦ（ｖ）フラグメントからなる群より選択される、組成物。
【請求項２９】
ＣＤ３４+細胞増殖の刺激因子をさらに含有する、請求項２６〜２８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３０】
遺伝子疾患または後天性疾患を治療するための遺伝子療法を受ける前の患者から、ＣＤ３４+細胞を含有する末梢血を得るためのキットであって、該キットは、請求項２６〜２８のいずれか１項に記載の組成物およびＣＤ３４+細胞増殖の刺激因子を備える、キット。
【請求項３１】
請求項１に記載の組成物およびＣＤ３４+細胞増殖の刺激因子を備える、キット。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、造血幹細胞の操作に関する。より詳細には、本発明は、末梢血中の造血幹細胞数を増加させるための方法に関する。
発明の背景
造血幹細胞は、血液中で細胞のリンパ球系、骨髄系、および赤血球系の系統を生じる原始的な方向づけられていない前駆細胞(primitive,uncommitted progenitor cells)である。幹細胞群は、骨髄中の全細胞のごくわずかの割合を構成し、末梢血ではさらに少量の割合で存在する。
幹細胞は一般的に、その表面抗原決定基により特徴づけられる。Tsukamotoらの米国特許第5,061,620号(1991)には、幹細胞高濃縮細胞組成は、CD34+、CD10-、CD19-、およびCD33-であることが教示されている。Leonら、Blood 77:1218-1227(1991)には、CD34+細胞の約1%、あるいは全骨髄細胞群の約0.01%は、CD33（骨髄系統）、CD71（赤血球系統）、あるいはCD10およびCD5（BおよびTリンパ球系統）のような分化抗原を発現しないこと、ならびに、成熟中のCD34発現の発現減少は、分化抗原の発現増大に関連することが、教示されている。
抗原特性と機能特性との組合せもまた、幹細胞を特徴づけるために使用された。Sutherlandら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:3584-3588(1990)には、原始幹細胞は、ダイズアグルチニンに結合せず、高レベルのCD34を発現し、高平板効率で芽細胞コロニーを形成し、長期培養初期細胞（LTC-IC）に富むことが、教示されている。Craigら、Blood Reviews 6:59-67(1992)には、CFU-GMアッセイは、骨髄あるいは末梢血の幹細胞採取物の造血前駆細胞生存性について最も広く使用される測定法であり、CD34+パーセントによく相関することが教示されている。Spangrude、Immnology Today 10:344-350(1989)には、幹細胞が、その他の骨髄細胞型に比較して、ローダミン123を低レベルに蓄積することが教示されている。Chaudhauryら、Cell 66:85-94(1991)には、幹細胞が、その他の骨髄細胞型に比較して、高レベルのP-糖タンパク質を発現することが教示されている。
造血幹細胞操作の能力は、癌治療のための有効な化学療法アプローチおよび放射線療法アプローチにますます重要になってきた。化学療法および放射線療法に対する最近のアプローチは、骨髄移植（BMT）を利用する。BMTは、幹細胞、前駆細胞、およびより成熟した血液細胞を含有する生骨盤骨髄を１〜２リットル取り出すこと、癌細胞を殺すために化学療法あるいは放射線療法により患者を治療すること、および、骨髄細胞を静脈に再導入することを包含する。しかし、BTMには多くの不利益がある。BMTのためのBM採取には全身麻酔法が必要であり、このため危険性および経費の両方が増大する。さらに、癌細胞が骨髄中に存在し、厳密に取り除かれない場合には、疾患の再発は明瞭な危険性である。また、癌細胞による骨髄の広範囲におよび侵入（骨髄腫、ワルデンストレームマクログロブリン血症）が存在する場合には、末梢血細胞が、自家移植（ABMT）での使用のために、唯一選択できるものである。結局、骨盤照射を受けた患者は、ABMTの候補者ではない。
これらの困難の結果として、化学療法を受けている患者に幹細胞を自家供給するための、末梢血から幹細胞を得る方法を提供するのに多大の興味が引き出された。末梢血由来の幹細胞の自家供給は、化学療法あるいは放射線療法の多量投与使用をなすが、BMTより危険性が少ない。さらに、末梢血由来の幹細胞の使用は、幹細胞を得るための麻酔を必要としない。また、Lowry、Exp.Hematol.20:937-942(1992)は、骨髄中の癌細胞は末梢化しない傾向があることを教示している。しかし、このような方法の重大な限界は、幹細胞は末梢血中に通常はごく少量にしか存在しないことである。Loboら、Bone Marrow Trasplantation 8:389-392(1991)は、いかなる末梢化方法も行わずに集められた末梢血幹細胞を加えても、骨髄除去(myeloablative)治療後の骨髄回復を早めないことを教示している。これとは逆に、Haasら、Exp.Hematol.18:94-98(1990)では、組換えヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）で動員された末梢血幹細胞の自家移植の成功が実証されている。従って、末梢化法によって末梢血中の幹細胞数を増加させることは、自家幹細胞移植源として末梢血を利用する方法の成功にとって重要である。その他のサイトカインが、これに関して有用であり得る。RoweおよびRapoport,J.Clin.Pharmacol.32:486-501(1992)には、GM-CSFに加えて、マクロファージコロニー刺激因子（M-CSF）、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）、エリトロポエチン、インターロイキン-1、-2、-3、-4および-6、ならびに、種々のインターフェロンおよび腫瘍壊死因子を含む、その他のサイトカインは、多大の可能性を有することが示唆されている。
自家移植のためのその他のアプローチは、免疫アフィニティー法による末梢血からの幹細胞の精製である。これらの方法は、化学療法を組み合わせた自家幹細胞移植のみならず、遺伝子治療にもまた有望であり、ここでは、精製幹細胞は、欠陥遺伝子機能を修正するための遺伝子操作に必要であり、次に、失われた機能を供給するために患者に再導入される。しかし、Edgington、Biotechnology 10:1099-1106(1992)には、最近の方法には、末梢化を行わずに、十分な細胞を処置するために３回別々の４時間の期間が必要とされることが教示されている。DePalma、Genetic Engineering News、Vol.12、1992年５月１日には、これが、末梢化のためのG-CSFでの処置によって改良され得ることが教示されている。
これらの研究は、造血幹細胞の末梢化を達成するための新規な方法を開発することの重要性を明白にする。１つの可能性は、骨髄環境から末梢に幹細胞を放出する新規な方法を究明することである。残念なことに、インビボでの骨髄環境中の造血幹細胞を維持する分子相互作用型については知られていない。最近、いくつかのインビトロ研究は、幹細胞と骨髄間質細胞との間の結合におけるインテグリン、フィブロネクチン、およびその他の表面抗原の重要な役割に注目し始めた。
インテグリンは、細胞間の相互作用、細胞と細胞外マトリックスと間の相互作用、および、胚発育およびT-細胞応答の制御に関連する相互作用を仲介する、16を超えるヘテロダイマーメンバーを有する膜内在性糖タンパク質の大きなファミリーである。インテグリン中、VLA-5（α5β1）複合体は広く分布し、フィブロネクチンに対するレセプターとして機能する。VLA-4（α4β1）複合体は、正常末梢血B細胞およびT細胞、胸腺細胞、単球、および、ある種の黒色腫細胞、ならびに、骨髄芽細胞および赤芽球上で相当なレベルで発現される。VLA-4のリガンドは、血管細胞付着分子-1（VCAM-1）およびCS-1、フィブロネクチンのHep II領域内で代替的にスプライシングされたドメインである。インテグリンの別のグループ（CDIIa/CD18、CDIIb/CD18、およびCDIIc/CD18）は、共通β2鎖を共有し、末梢T細胞、単球、および成熟顆粒球上で可変的に発現される。β2-インテグリンのリガンドは、活性化内皮細胞に認められるIgスーパーファミリーのメンバー（ICAM-1およびICAM-2）を含む。
Issekutz,J.Immunol.147:4178-4148(1991)には、ラットVLA-4に対するモノクローナル抗体であるTA-2が、微小腹膜滲出リンパ球および末梢リンパ節由来リンパ球の、血液からの血管内皮を通過する炎症部位へのインビボ移動を阻害することが開示されている。この文献ではまた、TA-2によるラットの全身処置により、全血液リンパ球数の増加を伴うことが観察されている。
Teixidoら、J.Clin.Invest.90:358-367(1992)では、インビトロモデルにおいて、VLA-4/VCAM-1、VLA-5/フィブロネクチン、およびβ2-インテグリン/ICAM-1間の相互作用が全て、骨髄間質細胞と、CD34を高レベルで発現する細胞との付着に重要であることが教示されている。Simmonsら、Blood 80:388-395(1992)には、インビトロモデルにおいて、間質細胞とCD34+細胞との付着は、主にVLA-4/VCAM-1相互作用に依存し、VLA-4あるいはVCAM-1のいずれかに対するモノクローナル抗体でかなり制御されるが、フィブロネクチンは結合にあまり役割をなさないことが教示されている。Williamsら、Nature 352:438-441(1991)には、インビボにおけるマウス研究によって、ネズミ造血幹細胞の間質細胞細胞外マトリックス（ECM）への付着が、IIICSドメインの代替スプライス領域を含むフィブロネクチンのタンパク質分解フラグメントにより、ある程度は促進されることが教示され、その相互作用がVLA-4によって仲介されるようであることを示唆している。これらの全ての研究は、幹細胞とそれらの微小環境との付着を阻むために抗体を利用した。しかし、付着が起こった後に、このような相互作用が可逆的か、あるいは混乱されるかは分析されていない。これらの結果は、骨髄環境と造血幹細胞との間のどのような相互作用がインビボ環境内に幹細胞を維持する原因となるのか、そして、このような相互作用が幹細胞の末梢化の達成を混乱させるかどうかを決定するためにさらなる研究の必要性を示す。
従って、末梢化および帰巣(homing)のプロセスを理解するための科学研究目的と、癌治療あるいは遺伝子治療行程における自家幹細胞移植のための末梢化のより良い方法の開発との両方のために、幹細胞末梢化の新規な方法の必要性が存在する。おそらく、このような方法は、現存する方法よりも、末梢血においてさらに高レベルの幹細胞を産生する。
発明の要旨
第一の局面では、本発明は、末梢血中の造血幹細胞およびCD34+細胞数を増加させる新規な方法を提供し、これはまた造血幹細胞およびCD34+の「末梢化（peripheralization）」あるいは「動員（mobilization）」として公知である。この方法は、造血幹細胞およびCD34+細胞表面上のVLA-4抗原の阻止因子を投与する工程を包含する。抗VLA-4あるいは抗VCAM-1抗体を含む種々の因子が、このような阻止を仲介するために使用され得、それは、必要に応じて、１本鎖、ヒト化あるいはキメラ、それらのFab、Fab'、F(ab')2あるいはF(v)フラグメント、それらの重鎖あるいは軽鎖モノマーあるいはダイマー、あるいはそれらの混合物、可溶性フィブロネクチン、CS-1ペプチドあるいはアミノ酸配列EILDVあるいは同類置換アミノ酸配列を含むフィブロネクチンペプチド、あるいは可溶性VCAM-1、二官能性VCAM-1/Ig融合タンパク質あるいはVCAM-1ペプチドであり得る。
別の局面では、本発明は、サイトカイン治療のみによるよりも、予測されるより多大の効果を有する、造血幹細胞およびCD34+細胞を末梢化するための新規な方法を提供する。本発明のこの局面に従って、この方法は、本発明の第一の局面のように、造血幹細胞およびCD34+細胞の表面のVLA-4抗原の阻止因子を、造形幹細胞増殖刺激因子と組み合わせて投与することを包含する。造血幹細胞増殖刺激因子を投与する工程は、サイトカイン、好ましくはG-CSF、幹細胞因子、全能性幹細胞因子、幹細胞増殖因子、あるいはGM-CSF、しかし代替的にM-CSF、エリトロポエチン、インターロイキン-1、-2、-3、-4、-6、あるいは11を使用して、実施され得る。
その他の局面では、本発明は、癌のための化学療法あるいは放射線療法を受けている患者に、末梢血幹細胞を移植する改良方法を提供する。この方法では、骨髄除去化学療法あるいは放射線療法の実施前に、造血幹細胞およびCD34+細胞の表面のVLA-4抗原の阻止を仲介する因子の投与によって、患者の骨髄から幹細胞が末梢化される。この因子はこれのみで投与され得るか、あるいは、好ましくは幹細胞増殖を刺激する因子と組み合わせて投与され得る。末梢化された幹細胞は、次に白血球搬出(leukapheresis)により末梢血から回収される。次に、幹細胞は、抗CD34抗体による免疫吸着によって回収された末梢化血液から濃縮される。必要に応じて、濃縮幹細胞は次に、幹細胞増殖を刺激する因子の存在下での培養によって、エキソビボで増量される。骨髄除去化学療法あるいは放射線療法の実施後に、濃縮および必要に応じて増量された幹細胞が患者の循環血液に戻され、骨髄中にそれ自身を植え付ける(engraft)。
別の局面では、本発明は、AIDSのために骨髄除去化学療法あるいは放射線療法を受けている患者に、末梢血幹細胞を移植する改良方法を提供する。この方法は、癌のために化学療法あるいは放射線療法を受けている患者に、末梢化幹細胞を移植することに関して記載されているのと同じ工程を包含する。さらに、この方法はまた、必要に応じて、AZT、可溶性CD4、およびAIDSウイルスあるいはアンチセンスあるいは抗原オリゴヌクレオチドのCD4特異的阻止因子のような、抗ウイルス剤のような抗HIV剤を、濃縮および必要に応じて増量された幹細胞を患者の循環血液に戻す前後に、患者に投与することを包含する。この工程は、新たに戻された幹細胞の子孫に残余ウイルスが感染することを阻む「掃討(mopping up)」機能をなす。
別の局面では、本発明は、種々の遺伝子疾患および後天性疾患を有する患者に、遺伝子治療を実施するための改良方法を提供する。この方法では、幹細胞は、造血幹細胞およびCD34+細胞の表面のVLA-4抗原の阻止を仲介する因子を投与することにより、患者の骨髄から末梢化される。本明細書に前述した方法におけるように、この因子は単独で、あるいは幹細胞の増殖を刺激する因子と組み合わせて投与され得る。次に、末梢血は白血球搬出で集められる。そして、幹細胞は、抗CD34抗原を用いた免疫吸着によって、回収末梢血から濃縮される。必要に応じて次に、濃縮幹細胞は、幹細胞の増殖を刺激する因子の存在下での培養によって、エキソビボで増量される。濃縮および必要に応じて増量された幹細胞は次に、両栄養性(amphotrophic)レトロウイルスベクターあるいはその他の適切なベクターで形質導入され、それは遺伝子疾患あるいは後天性疾患を改善する遺伝子を発現する。必要に応じて、ベクターはまた、発現される選択性マーカーを有し得、その場合、うまく形質導入された細胞は、選択性マーカーの存在について選択され得る。形質導入されそして必要に応じて選択された幹細胞は次に、患者の循環血液に戻され、骨髄にそれ自身が植え付けられる。
本発明の目的は、造血、幹細胞の骨髄への帰巣、および幹細胞のサイトカイン誘導末梢化を研究するための実験モデルとして、造血幹細胞およびCD34+細胞を末梢化する方法を提供することである。本発明のさらなる目的は、化学療法あるいは放射線療法後の自家移植用の幹細胞富化末梢血を提供するための、造血幹細胞およびCD34+細胞の末梢化を最適化する方法を提供する。本発明のさらなる目的は、化学療法あるいは放射線療法後の幹細胞の自家移植、あるいは遺伝子治療での使用のため、末梢血からの精製造血幹細胞および前駆細胞の収量を最大にするためのCD34+細胞の末梢化方法を提供することである。本発明のさらなる目的は、正常幹細胞のサイトカイン誘導細胞分化あるいは夾雑白血病細胞の増殖を起こす危険をともなわない、幹細胞およびCD34+細胞を末梢化する方法の提供である。本発明のさらなる目的は、白血球搬出を計画するための、末梢血中の前駆細胞含量ピークに対する予測タイミングを有する末梢化方法の提供である。
本発明は、造血幹細胞表面のVLA-4抗原の阻止因子を投与することにより、幹細胞およびCD34+細胞を末梢化する方法を提供することによって、これらの各目的を満たす。この効果は、このような阻止因子の使用により増大され得、幹細胞を増幅するアプローチと結び付いて相乗効果がもたらされる。
【図面の簡単な説明】
図１は、赤毛ザル（パネルＡおよびＣ）あるいはヒヒ（パネルＢ）の抗VLA-4抗体（ネズミモノクローナル抗体HP1/2）による処置前後の、末梢血中の全白血球およびCFUのプロフィールを示す。破線は、右側の縦軸に表示されているように、全白血球数を示す。斜線の四角は、左側の縦軸に記録されているように、CFU-GMを示す。黒白角は、左側の縦軸に表示されているように、BFUeを示す。下向きの矢印は、抗体の投与点を示す。横軸は、抗VLA-4抗体の最初の投与前後の日数を示す。
図２は、抗CD18モノクローナル抗体60.3での動物処置前後の、末梢血中の全白血球およびCFUのプロフィールを示す。全ての記号は、図１の通りである。
図３は、G-CSFおよび抗VLA-4モノクローナル抗体HP1/2による組合せ処置の結果を示す。パネルＡでは、細い下向きの矢印がG-CSF投与点を示し、太い下向きの矢印が抗体投与点を示し、（三角を伴った）点線が全リンパ球数を示す以外は、全ての記号は、図１の通りである。パネルＢでは、同じ記号が、GCSFのみで処置されたコントロール動物の結果を示す。
図４は、GCSFおよびHP1/2抗体での組合せ処置（パネルＡ）、あるいはGCSFのみでの処置（パネルＢ）の結果である、高増殖可能（HPP）前駆細胞（密集増殖の直径が0.5mmを超えるコロニー）を示す。記号は図３の通りである。
図５は、抗VLA-4ネズミモノクローナル抗体HP1/2の重鎖および軽鎖の可変領域をコードするヌクレオチド配列を示す。パネルＡは、最初のコドンの開始を示す最初のヌクレオチドを伴った、重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列である。パネルＢは、最初のコドンの開始を示す最初のヌクレオチドを伴った、軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列である。
図６は、5-フルオロウラシルおよび抗VLA-4ネズミモノクローナル抗体HP1/2による組合せ処置の結果を示す。記号は、図３に記載の通りである。パネルAは、組合せの結果を示し、対してパネルＢは、5-フルオロウラシル処置のみの結果を示す。
図７は、そこに移植されたネズミHP1/2からのCDR-コーディング配列を有する、VH-コーディング領域およびVK-コーディング領域のヌクレオチド配列を示す。パネルＡは、移植VH配列を示す。パネルＢは、移植VK配列を示す。
図８は、ヒト化抗VLA-4抗体hHP1/2の重鎖および軽鎖の可変領域をコードするヌクレオチド配列を示す。パネルＡは、VH領域をコードするヌクレオチド配列である。パネルＢは、VK領域をコードするヌクレオチド配列である。
図９は、ヒト化抗VLA-4抗体hHP1/2による処置結果を示す。記号は、図３に記載の通りである。
図１０は、抗VLA-4抗体HP1/2のネズミFabフラグメントによる処置結果を示す。記号は、図３に記載の通りである。
好ましい実施態様の詳細な説明
本発明は、造血幹細胞の操作に関する。より詳細には、本発明は、造血幹細胞およびその他のCD34+細胞の末梢化に関する。
第一の局面では、本発明は、造血幹細胞およびCD34+細胞を末梢化する方法を提供し、この方法は、造血幹細胞およびCD34+細胞表面のVLA-4抗原の阻止因子を投与する工程を包含する。本発明の目的のために、用語「VLA-4抗原の阻止因子」は、間質細胞表面上または細胞外マトリックス（ECM）中でVLA-4抗原とVCAM-1あるいはフィブロネクチンとの相互作用を妨害し得る因子を意味することを意図する。本明細書に実証されているように、このようなVLA-4抗原の阻止は、幹細胞およびCD34+細胞の末梢化を引き起こす。この実証では、阻止因子としてVLA-4に対するモノクローナル抗体が利用された。当業者は、この実証を得て、VLA-4抗原を阻止し得る任意の因子が、本発明の方法にうまく使用され得ることを認識する。従って、本発明の目的のために、造血幹細胞表面上のVLA-4抗原を阻止し得る任意の因子は、本明細書の実施例に使用されているモノクローナル抗体の等価物であると考えられる。例えば、本発明は、少なくともペプチド、ペプチド疑似体、炭水化物、およびCD34+細胞あるいは造血幹細胞の表面のVLA-4抗原を阻止し得る小さな分子を、等価物として意図する。
好ましい実施態様では、造血幹細胞およびCD34+細胞表面のVLA-4抗原を阻止するために、本発明の方法に使用される阻止因子は、モノクローナル抗体あるいは抗体誘導体である。好ましい抗体誘導体には、ヒト化抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、Fab、Fab'、F(ab')2およびF(v)抗体フラグメント、および抗体重鎖あるいは軽鎖のモノマーあるいはダイマー、あるいはそれらの混合物が、包含される。同種移植拒絶を制御するためのモノクローナル抗体OKT3の成功した使用は、ヒト化抗体が好ましいが、ネズミモノクローナル抗体が治療適用に有効であり得る。VLA-4に対するモノクローナル抗体は、本発明に従う方法での好ましい阻止因子である。VLA-4に対するヒトモノクローナル抗体は、本発明に従う方法での別の好ましい阻止因子である。これらは、Boernerら、J.Immunol.147:86-95(1991)に記載のように、インビトロ感作ヒト脾細胞を用いて調製され得る。あるいは、それらは、Perssonら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:2432-2436(1991)に記載のような、あるいは、HuangおよびStollar,J.of Immunol.Methods 141:227-236(1991)に記載のような、レパートリークローニングにより調製され得る。本発明の方法における別の好ましい阻止因子は、抗VLA-4特異性を有するキメラ抗体、およびヒト抗体定常領域である。これらの好ましい阻止因子は、米国特許第4,816,397号、およびMorrisonら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-6855(1984)に例証されているような、人工認識法によって調製され得る。本発明の方法でのさらに別の好ましい阻止因子は、抗VLA-4特異性を有するヒト化抗体である。ヒト化抗体は、Jonesら、Nature 321:522(1986);Riechmann,Nature 332:323(1988);Queenら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:10029(1989);およびOrlandiら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:3833(1989)に記載のような、人工認識法に従って調製され得る。当業者は、図５に示されているような、HP1/2の重鎖および軽鎖可変領域（配列番号1および2）をコードするヌクレオチド配列に基づき、単に、クローニング、変異誘発、および発現（抗体の発現については、例えば、Bossらの米国特許第4,923,805号を参照のこと）の周知の方法によって、これらの好ましい阻止因子を産生し得る。その他２つの好ましい阻止因子は、本明細書に参考として援用されている米国特許第4,946,778号に記載されているように調製され得る一本鎖抗体；および、その教示が本明細書に参考として援用されている米国特許第5,091,513号に記載されているように調製され得る生合成抗体結合部位である。当業者は、任意の上記の抗体あるいは抗体誘導体阻止因子が、本発明の目的のためのこの用語の意味の中で、VLA-4のレセプターに結合し、そして造血幹細胞表面のVLA-4抗原を阻止するための因子として作用することにより、本発明の方法において作用し得ることを認識する。従って、本発明の抗体および抗体誘導体阻止因子は、上記のように、VCAM-1あるいはフィブロネクチンに対して結合特異性を有する実施態様を包含する。なぜなら、これらの分子は、幹細胞と間質細胞あるいは細胞外マトリックスと間の付着に重要であるか、あるいはその他の組織および血液を介する幹細胞の輸送を妨害すると思われるからである。
別の好ましい実施態様では、本発明に従う方法に使用される阻止因子は、抗体あるいは抗体誘導体ではなく、VLA-4に対する可溶性型の天然結合タンパク質である。これらの阻止因子には、可溶性VCAM-1、二官能性VCAM-1/Ig融合タンパク質、あるいはVCAM-1ペプチド、ならびにフィブロネクチン、代替スプライス非III型接続セグメントを有するフィブロネクチン、およびアミノ酸配列EILDVあるいは同様の同類置換アミノ酸配列を含むフィブロネクチンペプチドが包含される。これらの阻止因子は、幹細胞表面上のVLA-4に対する、間質細胞あるいはECM結合の結合タンパク質との競合により作用する。
本発明の第一の局面に従うこの方法では、阻止因子は、好ましくは非経口的に投与される。阻止因子は、好ましくは薬学的に受容可能なキャリアを含有する滅菌薬学的組成物として投与され、このキャリアは、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、あるいはそれらの組合せのような、多くの周知のキャリアであり得る。好ましくは、阻止因子は、抗体あるいは抗体誘導体のときには、約0.1mg/kg体重／日と約10mg/kg体重／日との間の用量で投与される。抗体あるいは抗体誘導阻止因子でないときには、用量範囲は、好ましくは、これらの抗体量に対するモル当量の間であるべきである。投与量の最適化は、阻止因子の投与後の末梢血のCFU-GMアッセイあるいは末梢血中のCD34+細胞アッセイによって決定され得る。好ましい投与量は、末梢血中のCFU-GM含有量を少なくとも10倍増加させる。
第二の局面では、本発明は、サイトカインのみでの治療よりかなり有効である、造血幹細胞の末梢化方法を提供する。本発明のこの局面に従って、この方法は、インビボにおける造血幹細胞の増殖刺激因子を投与する工程と組み合わせて、造血幹細胞表面のVLA-4抗原の阻止因子を投与する工程を包含する。造血幹細胞表面のVLA-4抗原の阻止因子を投与する工程は、本発明の第一局面について記載されている様式と厳密に同じ様式で実施される。インビボにおける造血幹細胞増殖の刺激因子の投与工程は、好ましくは、サイトカイン投与を介して実施される。
造血幹細胞の増殖を刺激するための好ましいサイトカインには、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）、幹細胞因子、全能性幹細胞因子（TSCF）、幹細胞増殖因子（SCPF）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、マクロファージコロニー刺激因子（M-CSF）、エリトロポエチン、インターロイキン-1、-2、-3、-4、-6、および-11が包含される。最も好ましいのは、G-CSF、幹細胞因子、およびGM-CSFであり、なぜなら、これら３つは全て、幹細胞増殖を引き起こすことが公知であるからである。G-CSFおよびGM-CSFが前駆細胞の増殖を刺激する能力は、それらが造血幹細胞の末梢化を引き起こす能力（例えば、Haasら、Exp.Hematol.18:94-98(1990)およびBlood 72:2074(1988)を参照のこと）としてよく立証されている（例えば、Metcalf,Nature 339:27-30(1989)を参照のこと）。この能力はまた、幹細胞因子についても立証されている（Andrewら、Blood 80:920-927(1992)）。さらに、本明細書に示されているこれらのその他のサイトカインの多大の可能性が認識されている（RoweおよびRapoport,J.Clin.Pharmacl.32:486-501(1992)）。本発明の目的のために、造血幹細胞の増殖刺激は、インビボにおけるこのような増殖を仲介し得る任意のサイトカインによって実施され得る。従って、本発明の目的のために、造血幹細胞のインビボにおける増殖を刺激し得る任意のサイトカインは、G-CSF、幹細胞因子、およびGM-CSFと等価であると考えられ、これらもまた互いに等価であると考えられる。さらに、化学療法剤のみの使用で、前駆細胞の増殖が導かれ得る。このような薬剤もまた、本発明に従った方法に、VLA-4阻止因子と組合せられ得る。
本発明の第二の局面に従うこの方法では、サイトカインは、好ましくは、非経口投与される。サイトカインは、好ましくは薬学的に受容可能なキャリアを含有する滅菌薬学的組成物として投与され、このキャリアは、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、あるいはそれらの組合せのような、多くの周知のキャリアであり得る。好ましくは、サイトカインは、G-CSFのときには、約1μg/kg体重／日と約50μg/kg体重／日との間の用量で投与され、最も好ましくは、約10-15μg/kg体重／日で投与される。最も好ましくは、サイトカインは、約4日から約10日にわたる行程で投与される。投与量の最適化あるいはサイトカインの組合せ（例えば、G-CSFおよびキットリガンド）は、サイトカインの投与および阻止因子の投与後の末梢血のCFU-GMアッセイによって決定され得る。好ましい投与量は、サイトカインのみと比較して、末梢血１ミリリットル当りのCFU-GM数を少なくとも５倍増加させるべきである。
本発明のこの局面に従って、造血幹細胞あるいはCD34+細胞表面のVLA-4抗原の阻止因子を投与する工程およびこれらの細胞の増殖に対する刺激因子を投与する工程は、共存的あるいは連続的に実施され得る。好ましい実施態様では、この工程は、連続的に、好ましくは、第一工程で、CD34+あるいは造血幹細胞増殖の刺激因子の投与が実施される。
第三の局面では、本発明は、癌に対する化学療法あるいは放射線療法を受けている患者に、末梢血幹細胞を移植する改良方法を提供する。この方法では、化学療法あるいは放射線療法の実施の前に、幹細胞は、造血幹細胞およびCD34+細胞の表面のVLA-4抗原の阻止を仲介する因子を投与することにより、患者の骨髄から末梢化される。この方法に使用される阻止因子は、好ましくは、本発明の第一の局面の考察に記載されたこれらの阻止因子から選択される。この因子は、単独あるいは幹細胞の増殖を刺激する因子と組み合わせて投与され得る。必要に応じてこの方法に使用される増殖刺激因子は、好ましくは、本発明の第二の局面の考察に記載されたそれらの増殖刺激因子から選択される。次に、末梢化された幹細胞は、白血球搬出により末梢血から集められる。次に、幹細胞は、抗CD34抗体を用いる免疫吸着のようなCD34アフィニティークロマトグラフィーにより、集められた末梢化血液から濃縮される。このような幹細胞濃縮は、当該分野に周知であり、例えば、Berenson,Transplantation Proceedings 24:3032-3034(1992)により記載され、これは本明細書に参考として援用されている。次に、必要に応じて、濃縮幹細胞は、幹細胞増殖を刺激する因子の存在下でそれらを培養して、エキソビボにおいて増量される。このエキソビボ増量は、本発明の第二の局面の考察に記載されている任意の増殖刺激因子を単独あるいは組合せで用いて、実施され得る。末梢血由来のCD34+細胞のこのようなエキソビボ増量は、当該分野で周知であり、例えば、Bruggarら、Blood 81:2579-2584(1993)に記載されている。化学療法あるいは放射線療法の実施後に、濃縮および必要に応じて増量された幹細胞は、次に患者の循環血液に戻され、骨髄中にそれ自身が植え付けられる。
癌に対する化学療法あるいは放射線療法後の、移植用の末梢化幹細胞の使用の価値は、当該分野で認められ、Bensingerら、Blood 81:3158-3163(1993);Chaoら、81:2031-2035(1993);KessingerおよびArmitage,Blood 77:211-213(1991);Galeら、Bone Marrow Transplantation 9:151-155(1992);およびSienaら、Blood 74:1904-1914(1989)を含む、多くの参考文献に記載されている。本発明に従うこの方法は、末梢血中にこのような幹細胞の濃度を増加させることにより、移植の成功の可能性を大いに改良し、末梢血由来の幹細胞の移植に改良を提供する。
第四の局面では、本発明は、精製末梢血幹細胞を、AIDSのために骨髄除去化学療法あるいは放射線療法を受けた患者に移植する改良方法を提供する。この方法は、癌のために化学療法あるいは放射線療法を受けた患者に末梢化幹細胞を移植することについての記載と同じ工程を包含する。さらに、この方法はさらに、必要に応じて、AZT、可溶性CD4、および、AIDSウイルスあるいはアンチセンスあるいは抗原オリゴヌクレオチドのCD4特異的阻止因子のような、抗ウイルス剤のような抗HIV剤を、濃縮および必要に応じて増量された幹細胞を患者の循環血液に戻す前後に、患者に投与することを包含する。この工程は、新たに戻された幹細胞の子孫に残余ウイルスが感染することを阻む「掃討」機能をなす。
骨髄除去化学療法あるいは放射線療法は、HIVにより感染された血液中の任意の細胞を破壊することが一般的に予測される。従って、「掃討」工程は、このような治療後の患者に移植された幹細胞の子孫に他の場合では感染し得る任意の残余ウイルスを除去する作用をなす。数種の因子が、このような「掃討」工程での使用に有用であり得る。例えば、CD4特異的抗HIV因子およびアナログが、非感染CD34+細胞のHIVによる感染を予防的に阻むことが示された。同様に、抗HIVオリゴヌクレオチドが、非感染細胞のHIV感染を阻むことが、例えば、米国特許第4,806,463号（その教示は本明細書に参考として援用されている）に示されている。このようなオリゴヌクレオチドは、テスト期間100日までウイルス逸脱を阻むことが示された。Lisziewiczら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:3860-3864(1993)を参照のこと。従って、本発明に従うこの方法は、AIDSに対する新たな治療アプローチを提供する。
第五の局面では、本発明は、種々の任意の遺伝子疾患および後天性疾患を有する患者に、遺伝子治療を実施するための改良方法を提供する。この方法では、幹細胞は、造血幹細胞およびCD34+細胞表面のVLA-4抗原の阻止を仲介する因子の投与により、患者の骨髄から末梢化される。この方法に使用される阻止因子は、好ましくは、本発明の第一の局面の考察に記載されている阻止因子から選択される。本明細書に前述した方法におけるように、この因子は、単独あるいは幹細胞増殖を刺激する因子と組み合わせて投与され得る。必要に応じてこの方法に使用される増殖刺激因子は、好ましくは、本発明の第二の局面の考察に記載されている増殖刺激因子から選択される。次に、末梢血は、白血球搬出により集められる。幹細胞は次に、抗CD34抗体を用いる免疫吸着により、集められた末梢血から濃縮される。このような幹細胞濃縮は、当該分野で周知であり、例えば、Berenson,Transplantation Proceedings 24:3032-3034(1992)に記載されており、この参考文献は本明細書に掲載されている。必要に応じて、濃縮幹細胞は次に、幹細胞の増殖を刺激する因子の存在下で、エキソビボにて増量される。このエキソビボ増量は、本発明の第二の局面の考察に記載されている任意の増殖刺激因子を単独あるいは組み合わせて用いて、実施され得る。末梢血からのCD34+細胞のこのようなエキソビボ増量は当該分野で周知であり、例えば、Bruggarら、Blood 81:2579-2584(1993)に記載されている。濃縮および必要に応じて増量された幹細胞は、次に両栄養性レトロウイルスベクター、あるいはその他の適切なベクターで感染させられ、遺伝子疾患あるいは後天性疾患を改善する遺伝子を発現する。必要に応じて、ベクターはまた、発現される選択性マーカーを有し得、うまく形質導入された細胞は、選択性マーカーの存在について選択され得る。形質導入および必要に応じて選択された幹細胞は、次に患者の循環血液に戻され、骨髄中にそれ自身が植え付けられる。レトロウイルス仲介遺伝子転移および次の患者への移植のための末梢血由来の幹細胞の使用に対するアプローチの有用性は、当該分野で認識され、例えば、Bragniら、Blood 80:1418-1422(1992)に記載されている。本発明に従うこの方法は、このような末梢血中の幹細胞濃度を増加させることによる、末梢血由来の幹細胞の移植に改良を提供し、これによりレトロウイルストランスフェクションおよび次の移植の成功の可能性を大いに改良し、そして部分的に除去レジメ(ablative regimens)を受けている患者への遺伝子工学的に処理した細胞の繰り返し投与および形質導入細胞の増殖促進因子の受容を可能にする。このような幹細胞濃縮は、当該分野で周知であり、例えば、Berenson,Transplantation Proceedings 24:3032-3034(1992)に記載されており、この参考文献は本明細書に掲載されている。
本発明は、多くの目的に有用である。造血幹細胞あるいはCD34+細胞の末梢化方法は、これらの細胞の骨髄への帰巣、およびそれらのある種の感染症および外傷での往来に関連する、分子相互作用および分子シグナルの理解のために向けられた科学研究において価値がある。本発明はまた、CD34+および造血幹細胞に富む末梢血源を提供し、従って、本発明の方法を、化学療法または放射線療法後の、あるいは遺伝子治療の行程における、これらの細胞型の自家移植を含む治療適用に有用にする。本発明は、もっぱら現在のサイトカインに基づく方法に多くの利点を提供する。例えば、末梢化は、正常細胞のサイトカイン誘導細胞分化あるいは夾雑白血病細胞の増殖の危険性を伴わずに得られ得、細胞障害性因子と組み合わされ得る。さらに、本発明の方法では、末梢血中の前駆細胞のピークのタイミングは、一貫して最初の抗体注入から約24時間と約72時間との間にあり、従って、白血球搬出のための最も有益なタイミングをさらに予測し得るようにする。
本発明の両局面に従う方法の特定の実施態様の有効性は、実施例において実証されている。本発明の第一の局面に従って、VLA-4に対するモノクローナル抗体は、赤毛ザルおよびヒトに投与された。マウスモノクローナルHP1/2であるこれらの抗体は、以前にPulidoら、J.Biol.Chem.266:10241(1991)に記載され、そして、種々の細胞表面のVLA-4抗原を阻止することが知られている。この場合に、これらの抗体の投与は、末梢血中に存在するCFU-GMの80倍もの（平均40倍）増加をもたらした。公知のCFU-GMアッセイは、PBSC採取物の造血前駆細胞の生存性についてもっとも広く使用されている測定法であり、末梢血中に存在するCD34+細胞のパーセントとよく相関する（Craigら、Blood Reviews 6:59-67(1992)を参照のこと）。従って、これらの結果は、造血幹細胞およびCD34+細胞表面のVLA-4抗原の阻止因子の投与により、造血幹細胞およびCD34+細胞の末梢化が生じることを実証する。その上、この結果はヒトにも適用される。
本発明の第二の局面に従って、VLA-4に対するモノクローナル抗体が、G-CSFでの処置の５日後に赤毛ザルに投与された。G-CSFがインビボにおいて造血幹細胞およびCD34+細胞を刺激し得ることは、公知である（Metcalf.Nature 339:27-30(1989)を参照のこと）。G-CSF単独で、4および5日の処置によって、末梢血中に存在するCFU-GMの増加をもたらした。G-CSF処置の停止および抗VLA-4抗体での処置の開始後に、末梢血中のCFU-GM数は、さらに劇的に増加した。G-CSF単独によるコントロール実験で確証されたように、G-CSF単独では、この場合に認められた型のCFU-GMの処置後増加を引き起こさないことが、当業者により認識される。従って、これらの結果は、霊長類動物において、造血幹細胞およびCD34+細胞表面のVLA-4抗原の阻止因子の投与は、これらの細胞の増殖の刺激因子の投与と組み合わせて、相乗効果を有する。これらの結果がヒトに対して等しく適用しないことを考える理由は存在しない。
理論に捕らわれることは望まないが、出願人は、造血幹細胞およびCD34+細胞の表面のVLA-4抗原阻止因子の投与が、間質細胞上あるいはECM中で、VLA-4と、フィブロネクチンおよび／またはVCAM-1のようなその微細環境リガンドとの間の相互作用の途絶を介して、骨髄環境からの細胞放出を仲介することにより、これらの細胞の末梢化を引き起こすと考える。造血幹細胞およびCD34+細胞の増殖刺激因子の投与は、少なくともある程度の、これらの細胞数の絶対的な増加により末梢化を引き起こすと考えられる。従って、幹細胞増殖刺激因子との組合せで、VLA-4抗原の阻止因子投与は、相補的な機構によって末梢化を達成すると考えられる。抗VLA-4抗体とG-CSFと間の観察された相乗効果は、この解釈を支持する。さらに、抗VLA-4抗体と5-フルオロウラシルと間の観察された相乗効果は、さらにこの解釈を確証する。これらの機構は相補的であると思われるので、VLA-4抗原の阻止因子の投与および増殖刺激が共存的あるいは引き続いて実施されるにもかかわらず、観察された相乗効果は注目されるべきである。
以下の実施例は、本発明の特定の好ましい実施態様をさらに例証し、全くどこにも限定することを意図していない。
実施例１
抗VLA-4抗体を用いる幹細胞の末梢化
３匹の赤毛ザルおよび１匹のヒヒに、抗VLA-4マウスモノクローナル抗体HP1/2（1mg/kg体重／日）を、４日間連続して静脈内に注射した。処置の間の種々の時点および終了後に、末梢血を集めて、従来のフィコール-ハイパック（Ficoll-Hypaque）分離法によって、単球を集めた。全白血球を、血液１ミリリットルあたり回収された単球数から算出した。CFU-GMおよびBFUeを、従来のアッセイにより決定した（例えば、Papayannopoulouら、Science 224:617(1984)を参照のこと）。これらの研究の結果を、２匹の赤毛ザル（パネルＡおよびC）および１匹のヒヒ（パネルＢ）について図１に示す。これらの結果は、抗VLA-4モノクローナル抗体によるこれらの霊長類動物の処置により、処置開始後の約２〜４日をピークに、全白血球数に少量の増加（２倍まで）が生じたことを実証する。さらに重要なことに、血液１ミリリットルあたりの全CFU-GMは、処置開始後の約２〜４日をピークに、さらに劇的に増加した（約40倍）。もう１匹の赤毛ザルでは、１回の抗体注射後、約８倍のCFU-GM増加が認められた（データは示していない）。造血前駆細胞の潜在的な再滞在、およびCFU-GMとCD34+の割合との間の相関性を測定するための十分に確立されたCFU-GMアッセイを使用すると、これらの結果は、抗VLA-4抗体が幹細胞の末梢化を引き起こすことを確証する。
実施例２
幹細胞の末梢化を生じるためのCD18阻止因子の機能不全
抗原CD18は幹細胞上に存在し、幹細胞に関連する相互作用に重要であると広く考えられている。CD18に対する阻止因子が幹細胞の末梢化を引き起こし得るかどうかを試験するために、もう１匹の赤毛ザルを、CD18に対するモノクローナル抗体で処置した。抗体を、2mg/kg体重／日の投与量で３日間、静脈内注射して投与した。このコントロール実験の結果を図２に示す。全白血球数は、この処置で増加し、これはウサギを用いた以前の実験と一致する。しかし、全GFU-GMは、抗CD18モノクローナル抗体での処置後に増加を示さなかった。従って、CD18が、幹細胞に関連する相互作用に重要であると広く考えられているが、CD18阻止因子は、幹細胞あるいは前駆細胞の末梢化を導かない。これらの結果は、抗VLA-4モノクローナル抗体での処置で観察される幹細胞の末梢化が、実際にVLA-4の特異的阻止によるものであることを確証する。
実施例３
G-CSFと組合せた両方の抗VLA-4抗体での処置から得られた幹細胞の相乗的末梢化
ヒヒを、組換えヒトG-CSFで、１日に２回、５日間連続で処置した。各G-CSF処置は、体重１キログラムあたり15μgのG-CSFの静脈内注射からなった。G-CSF投与の５日後に、ヒヒに、隔日に２回、抗VLA-4モノクローナル抗体（HP1/2）を注射した。各注射は、体重１キログラムあたり１ミリグラムの抗体を含有した。全白血球およびCFU-GMを、実施例１に記載されているように決定した。結果を図３に示す。図のパネルＡに示すように、G-CSFは、４および５日処置により、全白血球の著しい増加とともに、CFU-GMの予測された増加をもたらした。驚くべきことに、５日間のG-CSF処置の最終日の後の、抗VLA-4抗体投与開始後に、さらにCFU-GMの著しい増加が認められ、この場合は、全白血球は全く増加しなかった。この第二の増加により、G-CSF単独に比較して、CFU-GM数で約６倍の向上が得られた。同じプロトコールに従ってG-CSFのみで処置されたコントロール動物は、処置の停止後に、末梢血CFUの連続的な減少を示した（図３、パネルＢを参照のこと）。これらの結果は、抗VLA-4抗体での処置がCFU-GMのこの第二の増加に起因したことを示す。従って、抗VLA-4抗体とG-CSFとの組み合せ処置は相乗効果をもたらし、G-CSFあるいは抗VLA-4抗体のみのいずれかでの処置よりも、はるかにCFU-GMの増加をもたらした。
実施例４
G-CSFと抗VLA-4抗体との組合せ処置後の、末梢血中の高増殖可能細胞の分析
実施例３に記載の実験では、高増殖可能（HPP）細胞もまた計数した。HPP細胞は、分析格子上に濃い密集増殖の、直径0.5mmを超える、肉眼で見えるコロニーを生じる細胞である。これらの細胞の存在は、より多い再滞在容量に関連し、このような細胞は初期前駆細胞と考えられる。結果を図４に示す。G-CSF処置のみと、抗VLA-4抗体との組合せたG-CSF処置との間の末梢血HPP細胞で観察された不均衡は、CFU-GMについて観察された不均衡よりもさらに大きい。これらの結果は、組合せ処置が、さらに前駆細胞を産生するばかりか、潜在的により大きな再滞在容量を有する初期前駆細胞もまた産生することを、示唆している。
実施例５
5-フルオロウラシルとの組合せによる、抗VLA-4抗体での処置から得られる幹細胞の相乗的末梢化
ヒヒを、体重１キログラムあたり100mgの投与量の、化学療法剤5-フルオロウラシルで処置した。開始の５日後に、ヒヒに、抗VLA-4モノクローナル抗体（HP1/2）を隔日に４回注射した。各注射は、体重１キログラムあたり１ミリグラムの抗体を含有した。全白血球およびCFU-GMを、実施例１に記載のように決定した。結果を図６に示す。図のパネルＢに示すように、5-フルオロウラシルのみで、11日および12日に、CFU-GMのおだやかな増加が生じた。しかし、5-フルオロウラシル後の抗VLA-4抗体の投与は、CFU-GMのさらに劇的な増加を生じ、この増加は5-フルオロウラシルのみで産生される10倍よりも大きかった。これらの結果は、抗VLA-4抗体と5-フルオロウラシルとの組合せ処置が相乗効果を生じ、どちらかの因子のみでの処置によるよりも、CFU-GMの多大の増加を引き起こした。さらに、G-CSF／抗VLA-4抗体でともになされたときには、結果は、観察された相乗性が、１つの因子による前駆細胞増殖の刺激、およびその他の因子による骨髄からの前駆細胞の放出に起因するという理論を、強く支持する。従って、これらの結果は、このような相乗効果が、骨髄からの放出をもたらし得る任意の因子と共に、増殖を刺激し得る任意の因子によって産生され得ることを、強く支持する。
実施例６
ヒト化抗VLA-4抗体の調製
抗VLA-4モノクローナル抗体HP1/2の軽鎖および重鎖の相補性決定領域（CDR）を、Kabatら、1991,第5版、第4巻、Sequences of Proteins of Immunological Interest,U.S.Department of Health and Human Services,NIH,USAの配列研究に従って、決定した。ネズミHP1/2 VHのCDRは、アミノ酸31-35（CDR1）、50-66（CDR2）および99-110（CDR3）（それぞれ、Kabat配列のアミノ酸31-35、50-65および95-102に対応する）として本明細書で開示されているヒト化VH配列中に示されている残基に対応する。ネズミHP1/2 VKのCDRは、アミノ酸24-34（CDR1）、50-56（CDR2）および89-97（CDR3）として本明細書で開示されているヒト化VK配列中に示されている残基、およびKabat配列中の同じ残基に対応する。Kabat NEWMフレームワークを、重鎖CDRを受け入れるように選択し、Kabat REIフレームワークを、κ鎖CDRを受け入れるように選択した。CDRのヒトフレームワーク中への移植を、M13変異誘発ベクター、およびフレームワーク由来の短い配列に隣接したHP1/2 CDRコーディング配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用いて、完了した。VH変異誘発ベクターM13VHPCR1は、NEWMフレームワークを有し、そしてOrlandiら、Proc.Natl.Acad.Sci USA 86:3833-3837(1989)に記載されている。VK変異誘発ベクターM13VKPCR2は、本質的にREIフレームワークを含有し、フレームワーク４で、ValからGluへの１つのアミノ酸の変化がある以外は、Orlandiらに記載されたM13VKPCR1と同じである。移植された産物を、PCRで回収し、配列決定のためにM13mp19にクローニングした。移植されたVH配列[配列番号3]を図７のパネルＡに示す。CDR移植に加えて、この産物は、ネズミアミノ酸の27-30位、および94位のArgからAspへの変化をコードする。移植したVK配列[配列番号4]を、図７のパネルＢに示す。
さらなる改変を、Hoら、Gene 77:51-59(1989)の２工程PCR特異変異誘発法により導入した。VH配列については、24位（Kabat番号）をValからAlaに、75位（Kabat番号）をLysからSerに変化し、次に、アミノ酸27-30位および94位を、NEWM配列に変異により戻した。最終のヒト化VH配列[配列番号5]を図８のパネルＡに示す。VK配列については、同じ２工程のPCR特異変異誘発法を使用してさらなる改変を導入した。最終のヒト化VK配列[配列番号6]を図８のパネルＢに示す。
ヒト化HP1/2の完全なVHおよびVK領域を、適切な発現ベクターにクローニングした。次に、適切なヒトIgG1、IgG4あるいはκ定常領域を、ネズミ可変領域に関して適切なリーディングフレーム中でベクターに加えた。次に、ベクターをYB2/Oray骨髄腫細胞（ATCCから入手可能）に共形質導入し、次に両ベクターの存在について選択した。細胞上清のELISA分析は、これらの細胞で産生されたヒト化抗体が、少なくともネズミHP1/2と等しい効力であることを証明した。このヒト化抗体を発現する細胞株を、1992年11月3日にATCCに寄託し、受託番号CRL 11175が与えられた。
実施例７
ヒト化抗VLA-4抗体による処置から得られた幹細胞の末梢化
実施例６に従って調製したヒト化抗VLA-4抗体を、幹細胞の末梢化について試験した。ヒヒモデルを、３日毎日の抗体注射に、再度使用した。この結果を図９に示す。ネズミ抗体について以前に示したように、ヒト化抗VLA-4抗体は、末梢化CFUの多大の増加を生じた。従って、ヒト化VLA-4抗体は、ネズミモノクローナル抗体HP1/2と同じ様式で、幹細胞および前駆細胞の末梢化を起こし得る。この結果は、ヒト化抗体もまた、モノクローナル抗体のように、幹細胞の末梢化に対して、G-CSFとの組合せによって相乗的に作用し得ることを示唆する。
実施例８
抗VLA-4ネズミFabフラグメントによる処置から得た幹細胞の末梢化
ネズミ抗体HP1/2由来のFabフラグメントを、幹細胞および前駆細胞を末梢化する能力について試験した。実験を、1mg/kgのFabフラグメントを、３日間、１日２回投与して実施した。この場合には、程度の低い効果（ヒト化抗体あるいはモノクローナル抗体に比較して）が認められ、これはFabフラグメントの迅速なクリアランスに起因する。程度は低いが、観察された特徴的なBFU-eの増加により、この結果を確認する。この結果は、抗VLA-4抗体フラグメントが、幹細胞および前駆細胞の末梢化を引き起こし得ることを実証する。このことは、抗VLA-4 Fabフラグメントが、幹細胞の末梢化に対してG-CSFとの組合せによって相乗的に作用し得ることを示唆する。さらに、Fabフラグメントが、抗原結合以外になんらかのエフェクター機能を有することは知られていないので、この結果は、VLA-4に結合し、そのことによりVCAM-1との相互作用を阻止し得る任意の阻止因子が、幹細胞を末梢化し、そして、そうすることにおいて幹細胞増殖を促進する因子と相乗的に作用し得ることを示唆する。
配列表
(1)一般的情報：
(i)出願人：パパイアンノポウロウ，タリア（米国のみ）
ボード  オブ  リージェンツ  オブ  ユニバーシティ  オブ  ワシントン（米国を除く）
(ii)発明の名称：造血幹細胞の末梢化
(iii)配列の数：１０
(iv)関連住所：
(A)住所人：フィッシュ  アンド  ニーブ  気付
(B)番地：アベニュー  オブ  ジ  アメリカ  １２５１
(C)市：ニューヨーク
(D)州：ニューヨーク
(E)国：アメリカ合衆国
(F)郵便番号：10020
(v)コンピューター読み出し形態：
(A)媒体型：フロッピーディスク
(B)コンピューター：IBM PC互換用
(C)操作システム：PC-DOS/MS-DOS
(D)ソフトウェア：パテントインリリース#1.0、バージョン＃1.25
(vi)現在の出願データ：
(A)出願番号：
(B)出願日：
(C)分類：
(vi)先行の出願データ：
(A)出願番号：US 07/977,702
(B)出願日：1992年11月13日
(viii)代理人／事務所情報：
(A)氏名：ハーレー  ジュニア．，  ジェームズ  エフ．
(B)登録番号：27,794
(C)照会／記録番号：B173CIP
(ix)電話回線情報：
(A)電話：(212)596-9000
(B)テレファックス：(212)596-9090
(2)配列番号１の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：360塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列：配列番号１：
0003731892.tif 000002
(2)配列番号２の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：318塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列：配列番号２：
0003731892.tif 000003
(2)配列番号３の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：429塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ix)配列の特徴：
(A)特徴を表す記号：sig_peptide
(B)存在位置：1..57
(ix)配列の特徴：
(A)特徴を表す記号：mat_peptide
(B)存在位置：58..429
(ix)配列の特徴：
(A)特徴を表す記号：CDS
(B)存在位置：1..429
(ix)配列の特徴：
(A)特徴を表す記号：misc_feature
(B)存在位置：1
(D)他の情報：／注記＝「pMDR1019挿入物：ステージ１重鎖可変領域」
(xi)配列：配列番号３：
0003731892.tif 000004
(2)配列番号４の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：143アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列：配列番号４：
0003731892.tif 000005
(2)配列番号５の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：386塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ix)配列の特徴：
(A)特徴を表す記号：sig_peptide
(B)存在位置：1..57
(ix)配列の特徴：
(A)特徴を表す記号：mat_peptide
(B)存在位置：58..384
(ix)配列の特徴：
(A)特徴を表す記号：CDS
(B)存在位置：1..384
(ix)配列の特徴：
(A)特徴を表す記号：misc_feature
(B)存在位置：1
(D)他の情報：／注記＝「pBag190挿入物：VK1(DQL)軽鎖可変領域」
(xi)配列：配列番号５：
0003731892.tif 000006
(2)配列番号６の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：128アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列：配列番号６：
0003731892.tif 000007
(2)配列番号７の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：429塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ix)配列の特徴：
(A)特徴を表す記号：sig_peptide
(B)存在位置：1..57
(ix)配列の特徴：
(A)特徴を表す記号：mat_peptide
(B)存在位置：58..429
(ix)配列の特徴：
(A)特徴を表す記号：CDS
(B)存在位置：1..429
(ix)配列の特徴：
(A)特徴を表す記号：misc_feature
(B)存在位置：1
(D)他の情報：／注記＝「pBAG195挿入物：AS重鎖可変領域」
(xi)配列：配列番号７：
0003731892.tif 000008
(2)配列番号８の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：143アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列：配列番号８：
0003731892.tif 000009
(2)配列番号９の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：386塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ix)配列の特徴：
(A)特徴を表す記号：sig_peptide
(B)存在位置：1..57
(ix)配列の特徴：
(A)特徴を表す記号：mat_peptide
(B)存在位置：58..384
(ix)配列の特徴：
(A)特徴を表す記号：CDS
(B)存在位置：1..384
(ix)配列の特徴：
(A)特徴を表す記号：misc_feature
(B)存在位置：1
(D)他の情報：／注記＝「pBAG190挿入物：VK2(SVMDY)軽鎖可変領域」
(xi)配列：配列番号９：
0003731892.tif 000010
(2)配列番号１０の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：128アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列：配列番号１０：
0003731892.tif 000011
【図１Ａ】
0003731892.tif 000012
【図１Ｂ】
0003731892.tif 000013
【図１Ｃ】
0003731892.tif 000014
【図２】
0003731892.tif 000015
【図３Ａ】
0003731892.tif 000016
【図３Ｂ】
0003731892.tif 000017
【図４Ａ】
0003731892.tif 000018
【図４Ｂ】
0003731892.tif 000019
【図５Ａ】
0003731892.tif 000020
【図５Ｂ】
0003731892.tif 000021
【図６Ａ】
0003731892.tif 000022
【図６Ｂ】
0003731892.tif 000023
【図７Ａ】
0003731892.tif 000024
【図７Ｂ】
0003731892.tif 000025
【図８Ａ】
0003731892.tif 000026
【図８Ｂ】
0003731892.tif 000027
【図９】
0003731892.tif 000028
【図１０】
0003731892.tif 000029