(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体の抗原結合部位ではない、所定の標的物質に特異的に結合する結合ドメインを提示する方法であって、
（ａ）細菌細胞、細菌胞子、またはバクテリオファージに由来する、増幅可能な遺伝子パッケージの多様化された集団であって、各遺伝子パッケージはキメラポテンシャル結合タンパク質をコードする核酸構築体を含有しており、該キメラポテンシャル結合タンパク質がそれぞれ
（ｉ）一本鎖抗体ではない所定の親タンパク質の安定な所定の結合ドメインの変異体であるポテンシャル結合ドメイン、及び
（ｉｉ）遺伝子パッケージの外表面上にポテンシャル結合ドメインを提示させるための外表面タンパク質
を含んでいるものを用意し、
（ｂ）該キメラポテンシャル結合タンパク質を発現させ、該遺伝子パッケージの外表面上にそのポテンシャル結合ドメインを提示し
（ｃ）該ポテンシャル結合ドメインと標的物質が相互作用できるように該遺伝子パッケージを所定の標的物質に接触させ、
（ｄ）該標的物質に結合するのに成功した安定な成功結合ドメインを含む、野生型の上記細菌細胞、細菌胞子、またはバクテリオファージそのものに含まれるタンパク質と同一でない１種のキメラポテンシャル結合タンパク質を、その外表面上に提示している遺伝子パッケージであって、該成功結合ドメインをコードする核酸を含有しているものを少なくとも１つ回収し、
（ｅ）ついで該成功結合ドメインをコードする核酸をインビボまたはインビトロで増幅することを特徴とする方法。
【請求項２】
増幅可能な遺伝子パッケージが細菌細胞に由来することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
増幅可能な遺伝子パッケージが細菌胞子に由来することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
増幅可能な遺伝子パッケージがバクテリオファージに由来することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
外表面タンパク質がＭ１３のコートタンパク質あるいはそのコートタンパク質の一部であって外表面輸送シグナルを体現しているものにより与えられることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
外表面タンパク質がＭ１３のｇＩＩＩタンパク質あるいはその一部であって外表面輸送シグナルを体現しているものにより与えられることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
親タンパク質が、ウシ膵臓トリプシンインヒビター、クラムビン、オボムコイド、Ｔ４リゾチーム、ニワトリ卵白リゾチーム、リボヌクレアーゼ、アズリンからなる群から選択されるものであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
外表面タンパク質がｌａｍＢタンパク質、あるいはその一部であって外表面輸送シグナルを体現しているものにより与えられることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
外表面にキメラポテンシャル結合タンパク質を有するウイルスであって、該キメラポテンシャル結合タンパク質が
（ｉ）一本鎖抗体ではない結合ドメインであって、その融点が５０℃以上であり、抗体の可変領域ではない標的物質に、結合ドメイン:標的複合体の解離定数が１０-6モル/リットル未満であるように十分に強く結合するもの、及び
（ｉｉ）該ウイルスのコートタンパク質の少なくとも機能性部分であって、キメラポテンシャル結合タンパク質が適切な宿主細胞中で産生される際にそのキメラポテンシャル結合タンパク質またはその細胞内修飾体をそのウイルスの外表面に提示する働きをするものを有し、該結合ドメインは標的物質に結合できるが、該コートタンパク質はその標的物質に優先的に結合することなく、該結合ドメインは該ウイルス本来のコートタンパク質にとっては異質のものであることを特徴とするウイルス。
【請求項１０】
増幅可能な遺伝子パッケージ中、多様化されたヌクレオチドによりもたらされるアミノ酸において、酸性アミノ酸または塩基性アミノ酸の出現確率が同等であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
親タンパク質が少なくとも１つの安定な結合ドメインを有し、該結合ドメインは少なくとも６０℃の融点を有し、少なくともｐＨ３．０−８．０の範囲で安定であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
増幅可能な遺伝子パッケージが大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株に由来することを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項１３】
増幅可能な遺伝子パッケージが繊維状ファージに由来することを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項１４】
増幅可能な遺伝子パッケージが大腸菌のＭ１３バクテリオファージまたは緑膿菌（Ｐｓ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の繊維状ファージＰｆ１に由来することを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項１５】
親タンパク質が遺伝子パッケージとは本来関係がないものであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
親タンパク質が遺伝子パッケージの表面タンパク質ではないことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
親タンパク質が細胞やウイルスの表面タンパク質ではないことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
親タンパク質が細胞またはウイルスのタンパク質ではないことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
増幅可能な遺伝子パッケージの多様化された集団が：
a)親タンパク質中多様化するアミノ酸の位置を決定し；
b)それぞれの位置における多様化の範囲を決定し；
c)決定された多様化の範囲を得るのに適当な核酸を合成し；
d)合成された核酸を遺伝子パッケージの集団に挿入すること；
により調製されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
遺伝子パッケージの多様化された集団が、親タンパク質中少なくとも１のアミノ酸の位置に相当するアミノ酸が非等モルのヌクレオチド混合物を用いることによって得られるものであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
成功結合ドメインの標的物質に対する親和性が、親タンパク質の結合ドメインの標的物質に対する親和性よりも大きいことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
遺伝子パッケージの外表面が該キメラポテンシャル結合タンパク質のみならず野生型外表面タンパク質を提示することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
該キメラポテンシャル結合タンパク質と該野生型外表面タンパク質をコードする遺伝子の少なくとも１つは調節可能なプロモーターの制御下にあり、キメラポテンシャル結合タンパク質と野生型外表面タンパク質間の比を調節できることを特徴とする、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
外表面タンパク質が繊維状ファージのｇＩＩＩに由来するコートタンパク質であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
ポテンシャル結合ドメインが成熟野生型コートタンパク質の露出したカルボキシ末端またはアミノ末端に結合されていることを特徴とする、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
ポテンシャル結合ドメインが外表面タンパク質のドメイン境界に位置することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
ポテンシャル結合ドメインが外表面タンパク質の折り返し部位またはループに位置することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
外表面タンパク質がＭ１３のｇＶＩＩＩタンパク質であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
遺伝子パッケージが、ｐＨの低下、非共有結合相互作用を弱める塩や溶質の濃度の増加、温度の上昇、または溶解性標的物質の濃度の増加、またはこれらの組合せによって溶出されて回収されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
該ウイルスがその外表面に更に該ウイルスの対応する野生型コートタンパク質を有することを特徴とする、請求項９に記載のウイルス。
【請求項３１】
結合ドメインが成熟コートタンパク質のアミノ末端に位置していることを特徴とする、請求項９に記載のウイルス。
【請求項３２】
コートタンパク質がｇＶＩＩＩタンパク質であることを特徴とする、請求項９に記載のウイルス。
【請求項３３】
コートタンパク質がｇＩＩＩタンパク質であることを特徴とする、請求項９に記載のウイルス。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
［発明の分野］
この発明は突然変異誘発、発現、クロマトグラフィー的な選択、そして増幅といった工程をくり返すことによる新規な結合タンパク質の開発に関するものである。
［従来の技術］
タンパク質のアミノ酸配列はその三次元（３Ｄ）構造を決定する。このことはまたタンパク質の機能を決定する（EPST63,ANFI73）。SchulzとSchirmer（SCHU79,ch5）のタンパク質の分類系をここで取り入れる。
タンパク質の三次元構造は本質的にはある遺伝子座でアミノ酸が同一であるということには影響を受けない。他の遺伝子座においてはただ1つのタイプ、あるいは２、３のタイプのアミノ酸しか許されないこともある（SHOR8S,EISE8S,REID88）。一般的に、多くの変ったタイプをもつ遺伝子座は溶媒の方へ向かっているアミノ酸側鎖基を持つ。しかし、側鎖基がタンパク質の他の方向へ向かっている一定の変型も存在する（SCHU79,P169〜171;CREI84,P239〜245、314〜315）
タンパク質の２次元構造（ヘリックス、シート、ターン、ループ）は大部分局所の配列により決定される。ある特定のアミノ酸はある特定の２次元構造に関連する傾向にあり、一般に用いられるChou-fasman（CHOU74,CHOU78a,CHOU78b）の規則はこれらの関連性に依存するものである。しかしながら、全てのアミノ酸のタイプがヘリックス中および平行あるいは逆平行シート中に観察される。同一配列のペンタペプチドが様々なタンパク質中にみられるが、場合によってペンタペプチドの立体配座は非常に異なる[KABS84,ARGO87]。
ターンとループは他の２次元構造（ヘリックスやシート）よりも容易に挿入、消去を許す（RICH81,THR88,SUTC87a）、ということはよく似たタンパク質は大抵においループとターンが異なることになる。
Bacillus amyloliquefacieneから得られるズブチリシンの３つの残基を、B.licheniformisから得られるズブチリシンの相当する残基と同じになるように変えると、そのアミノ酸配列中残り８２は差異をそのまま残したままであるが後者の微生物からのズブチリシンとほとんど同じ活性を有するプロテアーゼになった。それらは活性部位が７Å内の相異しかなかったので、この変化した３つの残基が選ばれた[WELL87a]。
SchulzとSchirmerはタンパク質の他の分子との結合についての多くの観察をまとめた（SCHU79,P98〜105）。例えば、ヘモグロビンのアルファ鎖はヘモグロビンのベーター鎖に強く結合し（デルタＧは-11.0 Kcal/molよりもよりマイナス）、抗体は抗原に強く結合し(Kdが10-6から10-14の範囲で、解離定数Kdは[A][B]/[A:B]に等しい）、塩基性ウシ膵臓トリプシンインヒビタ（BPTI）はトリプシンと強く結合し（Kd=6.0×10-14M(TSCH87）、デルタG=-18.0Kcal/mole）、アビジンはビオチンと結合する(Kd=1.3×10-15M(CREI84,P362)）。これらいずれの場合も結合は、接触する表面の相補性に起因する。即ち突起[bumps]は穴[holes]にフィットし、異符号の電荷がくっつき、双極子で整列し、疎水性原子は他の疎水性原子と接触するという具合に。バルクな水は除外されるけれども、個々の水分子がしばしば分子間の境界の充填空間にみられる。これらの水は通常タンパク質の1つかそれ以上の原子や他の結合水と水素結合する。
タンパク質結合に影響を及ぼすファクターはわかっている（CHOT75,CHOT76,SCHU79,P98〜107,CRE187,Ch8）が、新しい相補性表面をデザインすることは困難である。側鎖基を置換するいくつかの法則が開発されている（SUTC87b）がタンパク質の側鎖基は柔軟なので、新しい側鎖基がどのような立体構造をしているか予想することは困難である。さらにタンパク質を他の分子に結合させる力は全て比較的弱いので、これらの力の効果を予想することも困難である。それ故、理論のみに根ざしてすぐれた結合タンパク質をデザインすることも困難である（QUIO87）。
しかしながら、酵素・基質親和性はタンパク質工学により幸運にも増加させられてきた[WILK84]。Bacillus stearothermophilusのチロシントランスファーRNAシンセターゼの点突然変異体はATPに対する親和性が100倍増加したことが示されている。遺伝子座表面において１個のアミノ酸を他のアミノ酸に置換することにより、タンパク質の三次元構造に影響を及ぼすことなく、基質結合の他にタンパク質の結合能力を著しく変えていることになろう。例えば、鎌状赤血球細胞のヘモグロビンにおいて、表面残基Ｅ６をベーター鎖においてＶに変えるとデオキシヘモグロビン−Ｓとなり、自己結合して繊維を形成する（DICK83,P125〜145）。その時、ヘモグロビンの３次あるいは４次元構造は変化しない（PADL85,HISH75,WISH76）。
BPTIの１個のアミノ酸を変えるとそのトリプシンへの結合能力を大きく弱めるが、新しい分子のいくつかはもとの性質を維持し、キモトリプシンと結合し、阻害する。一方他のものはエラスターゼに結合するという新しい性質を示す（TANK77;TSCH87）。ラムダCro受容体の表面の１個のアミノ酸を変えると天然のオペレーター遺伝子Or3に対する親和性が著しく減じるが、突然変異オペレーター遺伝子に対する突然変異タンパク質の結合を著しく増大せしめる（EISE85）。それ故結合タンパク質の表面を変えることは、結合能力をなくすることなくその特異性を変えることになる。
最近開発されてきたいわゆる“逆方向の遺伝学”技術は、適性塩基性遺伝子座対に１個の特定の突然変異を産生するのに使用されている（OLIP86,OLIP87,AUSU87）。突然変異は一般にアミノ酸の配列から、また、ある場合には野性型機能が失われていることにより探知される。これらの操作は研究者をしてタンパク質の各残基の機能（MILL88）あるいは規範的DNA配列における各塩基対の機能を分析させることとなる[CHEN88]。これらの分析で、単一のオールタレーションを持つ突然変異体を得ようとする古典的な目的に達しようと努力することになった（AUSU87）。
逆方向の遺伝学はしばしば、どの残基がタンパク質の構造や機能に最も重要なのか決定するため、コードできる域に適用される。即ち単一の突然変異体をタンパク質の各残基で単離することはどの残基が重要な役割をしているかという最初の評価を与えることになる。
本発明の方法以前に、逆遺伝学を用いて新規な突然変異体を生成するため、２つの一般的方法が開発されてき。１つは、いわゆる“タンパク質手術”（DILL87）と呼ばれ、特定の置換の構造や機能にたいする効果を決定するため、１つのタンパク質残基に特定の置換をほどこすことである（CRAI85）（RAOS87）（BASH87）。しかしながら、多くの望ましいタンパク質オールタレーションが多数のアミノ酸置換を必要とし、それ故１つの塩基の変換をしても、あるいは任意の１つの前記に全ての可能なアミノ酸の置換をしてさえ、アクセッシブルではない。
他の方法は、突然変異性化学物質や放射線を用い、クローン化した遺伝子内の多くの遺伝子座で色々な突然変異体をランムダに生成するものである。この変化の特異な位置や性質はDNA配列で決定する(PAKU86)。この方法は検査されるべきコロニーの数において限界がある。また、この方法はタンパク質の構造や結合能に対するその関係についての知識を利用するものでもない。
アミノ酸(ULME83)の置換を支配する法則に向かっての発展は、上記方法のいずれかを使用し、また検査することができるコロニーの数の実際的な限界を用いることに多大な努力が払われたため大きく遅れてきた(ROBE86)。
合成DNAに関しての“飽和性突然変異”という用語は一般に、a)DNA制限領域の遺伝子のフラグメント内に各々可能な１個の塩基変化が現れていること、b)大抵の突然変異体遺伝子がただ１つの突然変異を有していること、という集団の生成を意味するのに用いられている。それ故DNAの６個の塩基対の長さのための全ての可能な１つの突然変異のセットは１８個の突然変異体の集団となる。Oliphantら(OLIP86)やOliphantとStruhl(OLIP87)は高度に退化したオリゴヌクレオチドの連結反応やクローニングについて述べ、飽和性突然変異をプロモータ配列や機能の研究に適用している。彼らは同様な方法がタンパク質の遺伝子的発現の研究に用いることができようと示唆しているが、a)変化させるタンパク質残基を選択すること、または、b)望ましい性質をもつ突然変異体を選択し、あるいはスクリーニングすることを如何にするか行うかについては述べていない。
Reidhaar-OlsonとSauer(REID88)はラムダバクテリオファージからのcIリプレッサの二量体堺面で全て２０個のアミノ酸を介して２個あるいは３個の残基を同時に変えるために、合成退化オリゴnts(ヌクレオチドのこと、以下同じ)を用いた。しかし彼らはいくつの残基が一遍に変えられるかの限界につき述べていないし、ＤＮＡをコードする異なるアミノ酸の存在率が異なる点については言及していない。彼らは野性型の二量化[dimerization]するか二量化しないか、どちらかの性質をもつタンパク質を探したが、新規な結合特性をもつタンパク質を見つけていないし、報告もしていない。何人かの研究者が新たにタンパク質をデザインし合成した。これらデザインされたタンパク質は小さく、大抵は遺伝子的というよりは試験管内でポリペプチドとして合成された。Gutteとその共同研究者は５５％エタノール中にDDTと結合するポリペプチドを合成した(MOSE83)。最近、Moserら(MOSE87)は、デザインされた２４個の残基のDDT結合タンパク質と、LacZにDDT結合配列が融合したものの両方のE.coli中での遺伝子発現について報告している。彼らは生理学的に活性なタンパク質のデザインは現在までのところ不可能であると述べている。
Erickson1ら(ERIC86)はβシートを持つということを意味するベータベリンと名づけた所の一連のタンパク質をデザインし合成した。彼らは数百種の同族体ベータベリンを合成するのに混合試薬でポリペプチド合成することと、カラムに充填した選ばれたターゲット化合物に対して高いアフィニティをもつ同族体をとり出すのにカラム使用を示唆している。変ったタンパク質の混合合成の継続的段階や特異的結合による精製を心に描くいている彼らは、変化に対して残基がいかに選択されるべきかを述べていない。タンパク質は増幅できないので、研究者はどの置換が結合能を改良したのかを知るために回収されたタンパク質を追跡しないといけない。研究者は、タンパク質の各変化種が配列のために単離したフラクションに充分量存在するように、多様性の程度を制限しなければならない。
種々の物質に対するそのアフィニティを介して細胞を分離する方法が開発されている。動物細胞に対して適用された方法は次のような共通の問題を明らかにする。即ち、a)細胞とアフィニティ支持体間の非特異的相互作用、b)細胞のアフィニティマトリックスへの不可逆的結合(BONN85)である。
Ferenciとその共同研究者は、E.coliのマルトース運搬タンパク質ＬａｍＢの突然変異体のクロマトグラフィ単離に関し一連の論文を発表している(WAND79,FERE80a,FERE80b,FERE80c,FERE82a,FERE82b,FERE83,FERE84,FERE86a,FERE86b,FERE86c,FERE87a,FERE87b,HEIN87;HEIN88)。その論文は、lamB遺伝子座で自然突然変異体と誘発突然変異体とが固定化マルトース、マルトデキストリンあるいはデンプンを支持層としたカラムでクロマトグラフィ的に単離できると報告している。またその報告は他の適用も可能であるが、マルトデキストリンのポアや同様のポアのタンパク質と相互作用する残基についてのみ、その適用は可能であると推測している。突然変異体のタンパク質はキメラではなかったし、新しいターゲットに結合させようという試みはなされていない。
文献FERE86とCLUN84は共に化学物質を代謝できる生きたバクテリアで実験することの困難さを指摘し、クロマトグラフィ実験の間にその生理学的態度を変化している。
異種遺伝子[heterologous gene]のフラグメントはバクテリオファージF1の遺伝子IIIに導入することができる(SMIT85)。もしも遺伝子がもとの読み込みフレームを保持していると、変換された[altered]遺伝子IIIの発現が、その遺伝子IIIタンパク質に、導入されたドメインを現わすことになる。その結果生じたfiウイルス粒子の細胞株は、異種DNAによりコードされたタンパクに対しての抗体により吸着される。そのファージはpH2.2で溶出し、いくらかの感染能力を維持する。しかしながらf1の遺伝子IIIのシングルコピーが、遺伝子IIIタンパク質の全てのコピーが影響を受けるように、異種遺伝子の挿入に用いられた。挿入により生じたファージの感染力は25倍減少した。
Smithは遺伝子生成物に対する抗体を用いてクローン化された遺伝子を単離する方法を紹介した。しかし彼は挿入された遺伝子物質を突然変異させることや、挿入されたタンパク質ドメインに新しい結合能力を導入することについては何も述べていない。
Plasmodium Falciparumからのcircumsporozoiteタンパク質の繰り返し領域のフラグメントが、遺伝子IIIタンパク質内への挿入物としてM13の表面に発現した(CRUZ88)。組み換えファージはウサギにおいて抗原でもあり免疫原でもあった。著者は挿入された物質の突然変異を示唆していない。
Ｂ型肝炎ウイルス抗原をコードする遺伝子フラグメントが、lamBのフラグメントに融合された。そしてもしもその融合がLamB露呈のドメインをコードする領域内でおこったとすると、HBV抗原が細胞表面に現れ免疫原となる(CHAR87)。Charbitら(CHAR87)はこれら工学的に作られた細胞株を生きたバクテリアワクチンの開発に用いられることを示唆したが、彼らは融合した異種遺伝子フラグメントの突然変異誘発については示唆していないし、結合能力の開発もしていない。
Ladnerは米国特許No.4,704,692の“２本鎖あるいは多鎖ポリペプチドを１本鎖ポリペプチドへの変換に対して可能な化学構造決定、表示するためのコンピューターを用いたシステムと方法”で本質的に同じ三次元構造を持ったままで２本鎖あるいはそれ以上の鎖から成り立つタンパク質をより少ないポリペプチド鎖に変換するためのデザイン法について述べている。しかし変えられた[variegated]DNAや遺伝子選択については何も述べていない。LadnerとBirdはWO88/01649(公告1988年3月10日）でリンカーペプチドの1本鎖抗体の調製につきコンピュータによってデザインするという特殊な適用法を述べている。
Landner,GlichそしてBridはWO88/06630（公告1988年9月7日）(LGB)で、１本鎖抗体の結合決定領域をコードするDNAを変え、SCAD/gpVキメラがファージの外面に顕示されるようにSCAD遺伝子をラムダファージのgpV遺伝子にサブクローン化し、そしてアフィニティークロマトグラフィーで抗原に結合するファージを選択すること、により、種々の１本鎖抗体ドメインを特定の抗原に結合させるためスクリーンしてもよいことを述べている。そこで述べられている唯一の抗原はウシの成長ホルモンである。他の結合性物質、ターゲット、担体有機物、その他の外面タンパク質については議論していない。また突然変異の程度や方法についても何の言及もない。
LadnerとBirdはWO88/06601(公告1988年9月7日で、1本鎖の“擬二量化”リプレッサー（DNA結合タンパク質）が、推定上のリンカーペプチドを突然変異させ、ひき続いて不斉性リプレッサーのデザイン用の認識要素辞書を作成するのに突然変異と選択を使うことができるかも知れないという、生体内選択により生成できるかも知れないと示唆している。リプレッサは有機体の外面に顕示されない。
どの引用文献も先行技術もしくは関連する技術なのかにつき定見はない。また参考文献表中に記載の日付は引例日であって、実際に公表された日付ではない。
［発明の要約］
本発明は、所望の結合特性を持つ新規なタンパク質を特定する突然変異遺伝子の構造、発現、そして選択、ならびにそれらタンパク質自体に関するものである。これらタンパク質により結合される物質（以下「ターゲット」と呼ぶ）はタンパク質であることが多いが、タンパク質である必要はない。ターゲットは有機分子や無機分子は勿論、他の生物学的あるいは合成的高分子でもよい。
新規な結合タンパク質は、1)既知の結合ドメインをコードするサブ配列内に既知の結合タンパク質をコードする遺伝子を突然変異させるか、または、2)１番目のタンパク質に遺伝子のこのようなサブ配列をとり、それを２番目のタンパク質（それ自身既知のこのような結合タンパク質であってもいいし、なくてもいい）の遺伝子の全部または一部と連結させることにより、3)既知のこのような結合能力をもっていないが、それ自身を結合能力（裂片、溝など）に貸す２次あるいはより高次な構造を有するタンパク質にコードする遺伝子を突然変異させるか、あるいは、4)その結合をひきおこすことが知られているサブ配列にはなくて、既知の結合タンパク質をコードする遺伝子を、その結合を引き起こすことが知られているサブ配列中ではないところで突然変異させることにより、得られる。新規結合タンパク質が得られるタンパク質は、ターゲット物質に対して特異なアフィニティをもっている必要はない。
１つの具体例として、本発明は、
ａ）複数の複製可能な遺伝子パッケージの変えられた集団を用意する。この遺伝子パッケージはそれぞれ、(i)該遺伝子パッケージの外面上にタンパク質を顕示するよう指示する構造シグナル、および(ii)ターゲットに結合するための、ポテンシャル結合ドメインからなる核酸構造体を有しており、この核酸構造体は、外面に顕示されるポテンシャル結合タンパク質の発現をコードするものであり、そしてここでは上記個々の遺伝子パッケージによって、複数の異なるポテンシャル結合ドメインが顕示され、
ｂ）次に上記タンパク質を発現させ、そして上記遺伝子パッケージの外面上で上記タンパク質の顕示を生じさせ、
ｃ）次に、上記タンパク質のポテンシャル結合ドメインと上記ターゲット物質とが相互に反応することができるように、上記遺伝子パッケージをターゲット物質と接触させ、そしてターゲット物質と結合することに成功する結合ドメインを持つ遺伝子パッケージを、ターゲット物質と結合しない結合ドメインを持つ遺伝子パッケージから分離し、次いで、
ｄ）結合成功結合ドメインを有する、少なくとも１つの遺伝子パッケージを採取し、次に複製し、
ｅ）ターゲット物質に結合する遺伝子パッケージの結合成功結合ドメインのアミノ酸配列を決定し、
ｆ）工程(a)に従い、複数の複製可能な遺伝子パッケージの変えられた新規な集団を調製するが、この(f)工程では、この新規パッケージのポテンシャル結合ドメインを生む親のポテンシャル結合ドメインが、工程(e)で決定された配列を有する決定成功結合ドメインであるようにし、そして上記工程(b)〜(e)を、この新規集団を用いて繰り返して行い、そして、
所望の結合特性の結合ドメインを有する遺伝子パッケージが得られたら、
ｇ）その所望の結合ドメインをコードする遺伝子を遺伝子パッケージから抽出し、それを適当な発現系に位置づけること（そうすればその結合ドメインは単位タンパク質[unitary protein]として、即ち、より大きなタンパク質のドメインとして発現される）
に関する。
さらに本発明は、複数の複製可能な遺伝子パッケージの雑種集団の調製方法に関し、タンパク質が遺伝子パッケージの外面に現れるように、ポテンシャル結合タンパク質を発現する遺伝子を各遺伝子パッケージが有しているもので、この方法は、
i)ポテンシャル結合ドメインの発現をコードする基本配列、およびコードされたタンパク質が選択された複製可能な遺伝子パッケージの外面上に顕示されるようにシグナルをコードする第２の配列よりなる、そのそれぞれのＤＮＡ挿入体の変化集団を調製し、次いで
ii)生成するＤＮＡ構築物の集団を、選択された複製可能な遺伝子パッケージ中に組み込むことによって、複製可能な遺伝子パッケージの集団を作る、
ことを含むものである。
好ましい具体例では、ポテンシャル結合タンパク質をコードする挿入体が複製可能な遺伝子パッケージの外面タンパク質をコードする遺伝子に組み込まれる。
本発明は一定の色々な領域で特徴をもつ一連のポテンシャル結合タンパク質のファミリィをコードする多様性のあるDNAをデザインし合成することを含むもので、ここでタンパク質は、予め定められたターゲットと結合するタンパク質を得る目的でデザインされるのである。
本発明の目的上、“ポテンシャル結合タンパク質”という用語は変えられたDNA集団内のDNA分子の一つの種によりコードされたタンパク質を指し、そこでは変化の領域はターゲット物質に結合する結合ドメインとして働く力をもつポリペプチドの一または２以上のセグメントをコードする１または２以上のサブ配列に現れるものを言う。
場合によっては、変えられたDNAの“親の配列”について言及することが助けになろう。みつけた新しい結合ドメインが既知の結合ドメインと同族である場合には、その親配列はその既知の結合ドメインをコードする配列ということになる。変えられたDNAは大抵の遺伝子座でこの親の配列と同一であるだろうが、選んだ遺伝子座では親の配列と同じではない。ポテンシャル結合ドメインが最初の原理でデザインされた時は、親の配列は所望の結合ドメインを形成するように予期されたアミノ酸配列をコードする配列であって、変えられたDNAは高度な配列類似性でもってその親に相関する“娘DNA”の集団となる。
本発明の基本原理は、強制される進化の一つである。強制的進化の効率は、どの残基を変化させるかを注意深く選択することにより大きく高められる。ポテンシャル結合ドメインの三次元構造は、この選択における主たる決定要素となる。最初に、ターゲットの一分子に同時的に接触できる一セットの残基を同定する。それから、これら残基をコードするコドンの全部または一部が、DNAの変化集団を産生するように同時に変換される。DNAの変化集団は、遺伝子パッケージの変化集団が産生されるように、細胞を形質転換するため用いられる。
可能な結合タンパク質をコードする遺伝子を持つ遺伝子パッケージの混合集団は、実際にターゲットに結合するタンパク質を発現する遺伝子を含むパッケージ（“成功結合ドメイン”）を増大させる。このような増大過程を一、二回行った後、選択した遺伝子の一つまたは２以上を試験し、配列する。望むならば、変換のための新しい遺伝子座も選択される。一つの世代の選択された娘遺伝子はそれから、変えられたDNAのための次世代の親配列となり、ひきつづいての次の“変化サイクル”を初めることになる。このようなサイクルは所望のターゲット親和性をもつタンパク質が得られるまで続けられる。
上記事項に続く「請求の範囲」記事の事項は、本明細書中に組み込んで好ましい実施例とする。
【図面の簡単な説明】
図１は種々の結合ドメインのタイプ間の関係を示す概略図である。
図２は予め決めたターゲットに対し親和性を持つ新規なタンパク質を生成するために用いられる主要工程を示す流れ図である。
図３はターゲット物質の分子に接触したＰＢＤ（ポテンシャル結合ドメイン）を図式的に表わしたものである。
図４はＭ１３mp18とpBR322からのpLG3の構造の概略図である。
図５はpLG3と合成DNAからのpLG7の構造の概略図である。
［発明の詳細な説明］
Sec.0.1：概説
本発明は望ましい結合特性をもつ新規なタンパク質を、結合タンパク質を持たない、あるいは望ましくない結合タンパク質を持つ、よく似た遺伝子から特定の突然変異遺伝子を分離するもので、次の方法による。すなわち、1)突然変異遺伝子各々の生成物が、遺伝子を含む複製遺伝子パッケージの外面に顕示されるように、アレンジし、2)所望のターゲット物質に改良された結合性をもってタンパク質特定化遺伝子を含むパッケージに対して、これらパッケージの集団を増大させるために、その所望のターゲット物質を組み込むアフィニティ分離を行うことである。
ＫD(ｘ,ｙ)を解離定数とすると、
0003771253.tif 000002
となる。
次に上記「請求の範囲」として記載の実施例の目的のために、もし
（1）一つの分子、イオンあるいは原子種Ａにつき
解離定数ＫD(Ｐ,Ａ)＜１０-6moles/liter，
（2）異なる分子、イオンあるいは原子種Ｂにつき
解離定数ＫD(Ｐ,Ｂ)＞１０-1moles/liter
なら，タンパク質Ｐは結合タンパク質である。
これら二つの条件の結果として、タンパク質ＰはＢよりもＡに特異性を示し、Ａに対して最小限の親和性（あるいは結合活性）を示す。
一つのタンパク質のドメインが選ばれたターゲットに特異的に結合するタンパク質の能力に第１次的に関与するとき、これを以下“結合ドメイン”(BD)と呼ぶ。我々は、安定タンパク質ドメイン、すなわち“最初のポテンシャル結合ドメイン”(IPBD)、を遺伝子パッケージの外面上に出現させることを遺伝子工学的に作り出す。本発明は既知の結合タンパク質の結合ドメインのような“親のポテンシャル結合ドメイン”(PPBD)に関する全ての数多くの色々な異なった“ポテンシャル結合ドメイン”(PBD)の発現に関するものであり、最も成功的な突然変異PBDをコードする遺伝子の選択と増幅に関するものである。IPBDは変化の第１回目にPPBDとして選ばれる。選択から結合への工程は一つあるいはそれ以上の“成功結合ドメイン”(SBD)を単離する。１回の変化と選択から結合への工程から得られたSBDは、次回の工程にとってのPPBDとされる。しかしながら、本発明は、この方法が系時的にもまた同時的にも、タンパク質の任意のあるいは全てのBDに適用できることから、単一のBDをもつタンパク質に限るものではない。種々のBDの関係を図１に示す。
“変えられたＤＮＡ”[varigated DNA]とは、ほぼ全体の鎖を通じて同じ塩基配列をもつが、特定の遺伝子座の一定数、好ましくは５〜１０個のコドン、で変化する分子の集団である。変えられたDNAの分子は、それが遺伝子の一部を構築するようにプラスミド中に導入される。変えられたDNAを含むプラスミドがバクテリアの形質転換に用いられると、各細胞はもとのタンパク質の異形[version]を作る。バクテリアの各コロニーは他のいかなるコロニーとも異なる異形を産生する。もしもDNAの変化[varigations]がタンパク質の表面上あるいはループ内に存在することが知られた遺伝子座に集中すると、タンパク質の集団が生成され、その集団の多くのメンバーは親タンパク質とほぼ同じ三次元構造の中に包み込まれる。しかしながら各メンバーの特異的結合性はそれぞれ異なるだろう。所望の結合特性をもつタンパク質の遺伝子を含むコロニーを、望ましい親和性を示さない遺伝子から選り分けることが残されている。
“１本鎖抗体”は、少なくとも200のアミノ酸から成る１本鎖ポリペプチドであり、そのアミノ酸は抗原に結合するため２領域を一緒にさせるペプチドリンカーにより連結された２つの抗原結合領域を形成する。この２つの抗原結合領域のどちらか一方は、既知の抗体の変異ドメインであるか、または、それらの(1)それぞれが既知の抗体の変異軽重ドメインの９本のストランドと同様な方法で空間的に関係付けられた９本のストランドのベータ管内に畳み込まれるにちがいないし、(2)上述の既知抗体の可変ドメインがするのと同じように、それぞれが１つにフィットするにちがいない。一般的に言えば、このことは超可変部に相当するアミノ酸は除外して、既知の抗体の可変ドメインのアミノ酸には少なくとも８８％の相同性が有ることが要求されるということになる。
“アフィニティ分離手段”とは、a)アフィニティカラムクロマトグラフィー、b)アフィニティマトリックス物質からのバッチ溶離、c)プレートにくっついたアフィニティ物質からのバッチ溶離d)蛍光で活性化した細胞選別、e)ターゲット物質の存在下での電気泳動等を含むものであるが、これらに限定されるものではない。“親和性物質”とは“被分析体”[analyte]と呼ばれる精製されるべき物質のための親和性をもつ物質を意味するのに用いられる。大抵の場合、親和性物質と被分析体のアソーシエーションは、一旦不純物が洗浄されれば被分析体を親和性物質から遊離させることができるように可逆的である。
アフィニティーカラムクロマトグラフィーであれ、容器内につめたアフィニティマトリックス物質からのバッチ溶離であれ、プレートからのバッチ溶離であれ、非常によく似ているので、以後“アフィニティクロマトグラフィー”と呼ぶ。
蛍光活性の細胞選別は、それ自身蛍光性のものであるか、蛍光分子で標識された親和性物質を用いる。現在市販されている細胞選別剤は、例えばテキサスレッドのように、各細胞に結合する蛍光色素800〜1000分子を必要とする。FACSは一秒間に103個の細胞あるいはウイルスを選別する。
電気泳動的アフィニティ分離はターゲット物質の存在下でのウイルスや細胞の電気泳動を含むもので、ここでは上述のターゲット物質の結合により、ウイルスのパーティクルや細胞の正味の電荷が変わる。これはバクテリオファージを電荷に基づいて分離するのに用いられる(SERW87)。
本発明は、所望の結合特性を有するタンパク質をコードする遺伝子を持つ細胞とかウイルスの集団を増大させるため、バクテア細胞あるいはバクテリアウイルス（あるいは他の遺伝子パッケージ）のアフィニティ分離を利用するものである。
本発明において”選択”[select]、[selection]とは、純粋に遺伝子的意味、すなわちバイオロジカルプロセスで用いられるもので、表現型特性が望ましい表現型を顕示する有機体の集団を増大するため用いられる。
本発明の工程は主として次の３部分より成る。
１．遺伝子パッケージ(GP)の表面上に最初のポテンシャル結合ドメイン(IPBD)を顕示する複製可能なGP−−GP(IPBD)と呼ぶ−−のデザインと生産
２．既知の親和性分子を結合するGP(IPBD)を、既知の親和性分子とはいずれも結合しない所の、野性型GP、あるいはGP(IPBD-)、から分離するアフィニティ分離のデザインと具体策、
３．異なるGP(PBD)の106またはそれ以上の集団−−GP(vgPBD)と呼ぶ−−が産生されるところの構造指向性突然変異と呼ぶこととする遺伝子変化(または多様化)法のデザインと具体策
一つのアフィニティ分離を“分離サイクル”と呼ぶ。そして１個のSBDを単離するのに必要な回数の分離サイクルに先立つ変化(または多様化)段階を“変化(または多様化)サイクル”と呼ぶ。一つのラウンドからの１個のSBDのアミノ酸配列は、次の多様化サイクルでPPBDとなる。我々はSBDと選ばれたターゲット間を結ぶ望ましい親和性と特異性が得られるまで多様化サークルを繰り返し実行した。
第１部は、単一のIPBD配列を扱う菌株の構築である。IPBD（最初のポテンシャル結合ドメイン）が、GP（遺伝子パッケージ）の表面に表れるように、ipbd配列に隣接するＤＮＡ配列中のosp-ipbd遺伝子内に、可変性[variability]が導入されてもよい。抗体のような正確に折りたたまれたIPBDに高い親和性をもつ分子が、a)GP表面上のIPBDを探知し、b)GP表面上にIPBDを顕示するコロニーをスクリーニングし、c)１集団からIPBDを顕示するGPを選択するのであるが、その集団のあるメンバーはGP表面にIPBDを顕示するであろう、以上のために用いられる。一つの好ましい具体例として、この第１部は次のことを含む。
1)バクテリア細胞(Sec.1.1.1)、バクテリア胞子(Sec.1.2.1)、バクテリア胞子(Sec.1.2.1)あるいはファージ(Sec.1.3.1)のような適当な外面タンパク質(Sec.1.1.3,1.2.3,1.1.3)を持つGPを選択すること、
2)安定なIPBD(Sec.2)を選択すること、
3)a)サブ配列としてIPBDを含み、b)GP面上にIPBDが表れるようにする、アミノ酸配列をデザインすること(Sec.1.12,1.2.2、1.32.4)、
4)a)デザインしたアミノ酸配列をコードし、b)必要な遺伝子的制御を供給し、c)遺伝子操作に対する便利な部位を導入する、という遺伝子−−osp-ipbdと呼ぶ−−を工学すること(Sec.4.1,4.2,4.3,5.1,5.2)、
5)osp-ipbd遺伝子をGP内にクローニングすること(Sec.6.1)
そして
6)形質転換されたGP(Sec.7)を採集し、これをGP面上でIPBDの存在につきGPで試験する(Sep.8)。このテストはAfM(IPBD)で示す、IPBDに対し高い親和性のアフィニティ分子で行われる。
他の具体例として上記第１部は次のことを含む。すなわち、上述の1)と2)と、
3)a)一つのサブ配列としてIPBDをコードし、b)ランダムDNAがipbd遺伝子フラグメントに操作可能に結合するように適当な制限部位を含み、そしてc)必要な遺伝子操作を施す、所のＤＮＡ配列をデザインし、−−このＤＮＡ配列は“顕示プローブ”と呼ばれる(Sec.1.1.3,1.2.3,1.3.3)
4)その顕示プローブを構築し、
5)顕示プローブをOCV内にクローニングし、OCVの適当なホストでそれを増幅し、
6)ランダムDNAあるいは擬ランダムDNAを顕示プローブ中の制限部位の１つにクローニングし(Sec.6,2)，それによってランダムまたは擬ランダムDNAをポテンシャルospとして機能させ、
7)GP表面上のIPBDの存在に対して形質転換されたGPのコロニーをスクリーニングするGP(Sec.7)を採取し、（このスクリーニングはPBDに対して高い親和性をもつアフィニティ分子−−AfM(IPBD)と呼ぶ−−）(Sec.8)、またはその代わりに、
8)AfM(IPBD)を用いるアフィニティ分離法でもってIPBDを顕示するGPを選択すること(Sec.8)。
一旦、GP(IPBD)が産出されたら、種々の異なるターゲットに結合する色々な新規タンパク質を開発する出発物質としてそのGPを何回でも用いることができる。GP面上に１つのIPBDを出現させる工学的知識は、異なるIPBDを顕示する他のGP(IPBD)をデザインし産生するのに使うことができる。
第１部は単に単一のIPBDについて扱っているが、多くの調製法が第３部でなされている。そこでは我々は数多くの突然変異をポテンシャル結合ドメインに導いている。第１部でPBDやpbdについて言及したことは準備的な意図を示すものである。
第２部では、我々はAfM(IPBD)に対するIPBDの親和性に根ざして、野性型GP−−wtGPで示す−−からGP(IPBD)を分離することを最適化し、アフィニティ分離工程の感度を確立した。好ましい具体例として、本発明の第２部は次のことを含む。
1)礎質容量に対するAfM(IPBD)の色々な濃度でのAfM(IPBD)を持つアフィニティーカラムを調製する。(Sec.10.1)
2)GPに対し色々な量のIPBDを持つGP(IPBD)を調製する。
3)カラムの溶離には溶媒組成を段階的に変えるグラジエント法を採用する。
4)a)GPに対するIPBD、b)担体容量に対するAfM(IPBD)の濃度（密度）、c)最初のイオン強度、d)溶離速度、e)担体容量に対するGP量、以上のどの組合せがwtGPからGP(IPBD)を分離するのに最もよい結果を与えるかを決定する。(Sec.10.1)
5)最適化条件を用いてwtGPのずっと多量のものから単離できるGP(IPBD)の最小量を決定する。(Sec.10.2)
6)アフィニティ分離操作の効率を決定する(Sec.10.3)
第２部は、１個の別のGPが多量に過剰であることから単一型のGP(IPBD)を分離することを最適化した。この最適化条件はターゲットに結合するGP(PBD)をターゲットを、ターゲットと結合しないGP(PBD)から分離するのに第３部で用いられる。この最適化操作は一つの、または２以上の特定温度で行われ、また一つまたは２以上の特定ｐＨにおいて行われる。第３部では使用者は選択したSBDがターゲットと結合するべき条件を指定しなければならない。もし指定した使用条件がアフィニティ分離の最適化条件と著しく異なれば、使用者は第２部に戻り、選択したSBDの使用意図条件に近い条件でアフィニティ分離を最適化しなければならない。
第３部では、ターゲット物質と第１部で得たターゲット物質に適したGP(IPBD)とを選ぶ。IPBDを多様化の最初のサイクルへのPPBDとして用い、様々な種類のPBDをコードする様々な種類のosp-pbd遺伝子を調製する。PPBDの結合特性より優れた結合特性のターゲットに関する結合特性をもったPBDを顕示するGPのためにGP(vgPBD)集団を増量するため、第２部で得たアフィニティ分離を用いる。一つの多様化サイクルから選んだSBDは、次の多様化サイクルではPPBDとなる。好ましい具体例として、本発明による処理の第３部は次のことを含む。
1)ターゲット分子を選択し(Sec.11)、
2)GP(IPBD)を選択(Sec.12)し、
3)a)IPBDの三次元構造、b)相同タンパク質の配列、c)基本的な構造を損なわずに異なったアミノ酸に耐性のあるのはどの残基かを示すコンピューターあるいは理論的なモデリングをし(Sec.13.1)、
4)様々な変異体の数に基づき同時に変化させるべき残基のサブセットを選択し、かつ、どの変異体がアフィニティ分離の探知能力内にあるかを選択(Sec.13.2)し、
5)次の通りにして多様化を実施し、すなわち、
a)多様化の候補になる残基をコードする塩基の幾つか、または全部のヌクレオチド基質の特定混合物を用いて変化させられる残基をコードするosp-pbd遺伝子の一部分を合成し、それによってＤＮＡ分子の集団−−vgDNA−−を生成し、
b)通常法によりこのvgDNAを操作クローニングベクター(OCV)(例えばプラスミドとか、バクテリオファージ)中に連結[ligate]し(Sec.14.1)、
c)細胞を形質転換するため、この連結DNAを使用し、それにより形質転換細胞の集団を産生し(Sec.14.2)、
d)形質転換細胞の集団を培養（即ち数をふやす）し、GP(PBD)の集団−−GP(bgPBD)−−を採集し(Sec.14.3)、
e)選ばれたターゲット分子をアフィニティ分子として第３部で得たアフィニティ分離を用いてターゲットに結合するGPの集団を増加させ(Sec.15)、
f)ターゲットに対する改良された結合能力をもつGP(SBD)が単離されるようになるまで工程３,5.dと工程３,5.eをくり返し(Sec.15)、そして
g)単離された単数または複数のSBDの選ばれたターゲットに対する親和性や特異性をテストし(Sec.15.8)、
6)望ましい程度の結合力が得られるまで工程３.3，工程３.4、工程３.5をくり返す。
第３部が各新しいターゲット物質に対してくり返される。第１部は、もし選ばれたターゲットに適当なGP(IPBD)がないときだけくり返す必要がある。第２部は、もし新規結合タンパク質の意図した使用条件が以前の最適化条件と著しく異なるときには、新しく得たGP(IPBD)と前に得たGP(IPBD)に対して繰り返す必要がある。
Sec.0.2  略号解説
次のような略号が本を通して使用される。
0003771253.tif 000003
0003771253.tif 000004
Sec.0.3  標準配列決定法
本発明はDNAサブ配列中のヌクレオチド(nts)の配列を決定する方法であるが、単一の方法に限るものではない。配列決定反応、アガロースゲル電気泳動法、ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)が標準的操作で実行される(AUSU87)。
本発明はタンパク質を決定する単一の方法に限ったものではない。ドメインのアミノ酸配列の決定法として請求の範囲に記載の事項は、直接的、間接的を問わず、どんな実際的方法、それら方法の組合せ、を含む。大抵の場合、好ましい方法は、タンパク質をコードするDNA配列を決定し、そしてアミノ酸配列を推論することである。ある場合には、タンパク質配列決定の標準法は翻訳後プロセスを探る必要があるかもしれない。
選択したターゲット物質に対し親和性を持つ新規な結合タンパク質の作成と単離の過程における主要工程を、図２に示す。
Sec.1：遺伝子パッケージの特性化と外面上に異種結合ドメインを顕示する方法
Sec.0.1：遺伝子パッケージの一般的要件
どの選択〜結合工程でＧＰが実行されるかの問題は、選択後に、ある適当な環境化での成長か、試験管内でカプセルにされた遺伝子情報の増幅と再生かのどちらか、が可能でなければならないことを強調しておく。成長の最小段階で、数の増加は時間的に大略、指数関数的でなければならない。望ましい結合特性を示す集団成分は、例えば106個中に1個か、それ以下しかないくらい非常に小さい。しかし一旦、この集団成分が非結合成分から分離されると、それ自身を増強することは可能であるにちがいない。生きた細胞を培養することは既知の遺伝子物質の最も有力な増幅法であり、また好ましいことでもある。遺伝子情報は試験管内で増幅することもできるが、これは推められない。
GPは普通、増殖性バクテリア細胞か、バクテリア胞子かバクテリアDNAウイルスである。どんな生物細胞、あるいはウイルスの菌株でも、その菌株が次のようなものであれば、可能性として有用である。
1)培養液中に維持できる。
2)アフィニティ分離でき、その生存率を保持できる。
3)現実的な容易さで遺伝的に変化[alter]できる。そして
4)アフィニティ分離の間にターゲット物質と相互作用できるポテンシャル結合タンパク質ドメインを顕示するために操作できる。
IPBD配列をコードするDNAは、IPBDがGPの外面に顕示されるように、GPに本来備わっている外面タンパク質(OSP)の少なくとも外面輸送シグナルをコードするDNAに操作的にリンクされる。もし融合がドメイン境界の近くにあるなら、GPの生存率、あるいはIPBDまたはPBDの結合特性に悪影響を及ぼすことなく、遺伝子パッケージをして、その外面にIPBDあるいはPBDを顕示させることが可能となる。
細胞に認識され、タンパク質をして、細胞質から輸送させられ、そして細胞の表面に顕示させられるタンパク質の特性は、“外面輸送シグナル”と命名されよう。
選択〜結合工程経由で(osp-ipbd遺伝子から誘導される)osp-pdb遺伝子をもつ複製可能な遺伝子体(ファージあるいはプラスミド)−−Sec.14をみよ−−は、以下、オペラティブ クローニング ベクター(OCV)と呼ぶ。OSVがファージのとき、それは遺伝子パッケージとしても機能する。１つのGPの選択は、適当なOCVとして適当なOSPの入手可能性によって一部的に決定される。
GPは例えば冷凍により容易に貯蔵ができるのが好ましい。もしもGPが細胞ならば、20〜40分のような短い世代時間のものでなければならない。GPがウイルスであれば、それは例えば感染細胞に対して少なくとも100個の平均放出数を持つような多分裂性なものでなければならない。培養するのに手がかかり、高くつくGPは好ましくない。GPは好ましくは遠心分離により容易に採取されるものがよい。GPは、好ましくは−70〜40℃の温度範囲内で安定な(数日間または数週間、4℃で安定)ものがよく、HLPCで見られるように、剪断力耐性があり、紫外線にセンシティブでなく、乾燥に強く、ｐＨ2.0〜10.0に耐性で、SDSやトリトンのような表面活性剤、4M尿素や2Mグアニジン塩酸塩のようなカオトロープにも耐性で、カリウムイオン,ナトリウムイオン、硫酸イオンのような通常のイオンにも耐性で、エーテルやアセトンのような通常の有機溶媒にも耐性、分解酵素にも耐性なものがよい。最後に適当なOCVがなければならない(Sec.3をみよ)
OSPの三次元構造と、OSP遺伝子の配列(P.47)は知られていることが好ましい。もしその三次元構造が知られていなければ、どの残基が細胞表面に露呈しているかとか、OSP内のドメインの境界の位置、および／または、OSPと外部からの挿入物との成功した融合、等に関する知識があることが好ましい。OSPは好ましくはGPの外面に多くのコピーとして表れ、好ましくは非必須機能を働く。OSPは翻訳後処理されないか、少なくともこの処理が理解されていることが好ましい。
好条件なCP,OCVそしてOSPは、一つの規準で最高得点をするようなものよりも、致命的障害が最小なものがよい。
次に、a)増殖的[vegitatively]に成長したバクテリア細胞(Sec.1.1)、b)バクテリア胞子(Sec.1.2)およびc)(Sec.1.3)の場合に、この工程に投げかけられた疑問に一般的な答を考えよう。
いくつかのGPにとって好ましいOSPを表２に挙げる。
Sec.1.1：遺伝子パッケージとしてのバクテリア細胞
培養液で成長した特性のよくわかているバクテリア菌株を選ぶことができる。この場合の重要な問題は、a)細胞の外層にタンパク質を局在化[localize]する機構について我々は充分に知っているか、b)IPBDが外層膜の環境下に折り畳まれるか、そして、c)アフィニティ分離で、osp-ipbdから導かれたosp-pbdの発現を細胞は変化させるか、である。あるIPBDは、媒体中にはなくて、細胞中に存在する、Fe4S4クラスターのような大きな不溶性な補欠分子族を必要とするかも知れない。ある鉄毒素中にみられるFe4S4クラスターの生成は、細胞内にみられる酵素により触媒される(BONO85)。このような補欠分子族を必要とするIPBDは、もしバクテリア細胞上に顕示されれば、折り畳み、すなわち機能しなくなるだろう。
Sec.1.1.1：GPとして好都合なバクテリア細胞
E.coliについての広範な知識に立脚すると、組み換えに欠陥のあるE.Coliの菌株は、バクテリアGPとして最も強力な候補である。他の好ましい候補は、Salmonella typhimurium,Bacillus subtilis,Pseudomonas aeruginosaである。
Sec.1.1.2：バクテリア細胞にIPBDを顕示するのに好ましい外面タンパク質
グラム陰性バクテリアは、OSPのサブセットを生成する外層膜タンパク質(OMP)をもつ。OMPが外層膜に局在化する原因となるシグナルは成熟タンパク質のアミノ酸配列にコードされている。omp遺伝子のフラグメントとｘ遺伝子のフラグメントの融合はＸをその外層膜上に現出させる(BENS84,CLEM81)。もし融合のデータが得られないときは、ipbdフラグメントをosp遺伝子の色々なフラグメントに融合させ、IPBD顕示の表現型を選択またはスクリーニングすることにより、細胞の外面上にosp-ipbdの融合を顕示するGPを得る。
Oliverはバクテリアにおけるタンパク質の分泌機構につき概説している(OLIV85,OLIV87)。二階堂とVaara(NIKA87)は、グラム陰性バクテリアの外層膜にどのタンパク質が局在化されるかについての機構を概説している。例えば、E.ColiのLamBタンパク質は、後で取り除かれる典型的なシグナル配列で合成される。Bensonら(BENS84)は、成熟LamBタンパク質の1〜49の残基がその融合中に存在するなら、そしてその残基1〜43が不十分であるなら、LamB-LacZ融合のタンパク質が、E.Coliの外層膜中に沈着することを示した。
E.ColiのLamBはマルトース、マルトデキストリン輸送のポーリンで、ラムダバクテリオファージやKIOを吸着する受容体として働く。このタンパク質はホモジェニティに精製され(ENDE78)、三量体としての機能を示した(PALV79)。ファージ耐性の突然変異は各ファージを吸着するLamBタンパク質部分を決定するために用いられた(ROAM80,CLEM81,CLEM83,GEHR87)。
ファージ受容体やマルトデキストリン輸送の機構を示す位相的なモデルが開発された。そのモデルはこれらのドメインや外層膜の表面に関するそれらの位置を示している（CLEM81,CLEM83,CHAR84,HEIN88）。
LamBは、もしも機構化したＮ末端配列が存在するなら、外層膜に輸送される。さらに、成熟配列の最初の49のアミノ酸が輸送の成功に必要である(BENS84)。LamBタンパク質部分と他の外層膜タンパク質であるOmpC,OmpF及びPhoE間の相同が検知され(NIKA84)、そこにはLanBアミノ酸39〜49と他のタンパク質の配列間の相同もあった。これらのサブ配列は、外層膜へ輸送のタンパク質を標識することになる。さらに、精製したLamBで免疫感作したマウスから得たモノクロナール抗体は、はっきりしたトポロジカルな、また機能的な、４つの領域を識別するのに用いられ、その２つはマルトース輸送に関係している(GABA82)。
Sec.1.1.3：バクテリア細胞OSP中へのIPBD挿入部位の選択膜内在性タンパク質につきコードする配列にphoAを融合するために、PhoAドメインが、膜内在性タンパク質のどこにphoA遺伝子が挿入されたかに従って、局在化される(BECK83,MANO86)。即ち、もしもphoAが、サイトプラズム内に通常みられるアミノ酸の後に挿入されるのであれば、PhoAはそのサイトプラズム中に出現する。しかし、もしphoAがペリプラズムに通常見られるアミノ酸の後に挿入されるのであれば、PhaAドメインは膜のペリプラズム側に位置され、そこでアンカーとなる。Beckwithと共同研究者は(BECK88)、膜内在性タンパク質に対する遺伝子に挿入できるlacZ遺伝子にこの知見を拡張し、lacZ遺伝子がどこに挿入されるかによりサイトプラズマがペリプラズマかどちらか一方のLacZドメインを発現出来るようになった。
OSP-IPBD融合タンパク質は、外層膜の一部はよく整列されていないので、グラム陰性バクテリアの外層膜で構造的役割を満足させる必要はない。大きなOSPには、融合を発現する細胞が細胞表面上にIPBDを顕示するように、ospが先端を切られipbdに融合される1つあるいはそれ以上の部位がありそうである。もしも細胞上にXを表示するためospフラグメントとｘフラグメント間の融合がなされたら、我々はDNA配列中のｘをipbdで置き換えることによりipbd遺伝子をデザインすることができる。そうでなければ、成功OMP-IPBD融合は、最良のompフラグメントをipbdに融合し、融合された遺伝子を発現させ、そして生じたGPをIPBD顕示の表現型としてテストすることによりみつけられる。我々はIPBDが顕示されるだろうという可能性を最大にするompとipbd間の融合のポイントを調べるため、OMPについて得られたデータを用いる。他の方法として我々は、ospを数々の部位で切断し、あるいは色々な長さのospフラグメントを産出するように切断し、そのospフラグメントをipbdに融合させる。そして細胞表面にIPBDを顕示している所の、上記融合を発現している細胞をスクリーニングし選択する。更に別法として、ompフラグメントのipbdへの融合中のランダムDNAの短いセグメントを作り、IPBD顕示の表現型を示すメンバーの生じた多様性[varigated]集団をスクリーニングし選択する。
osp-ipbd遺伝子のプロモータは、例えばイソプロピルチオガラクトシド(IPTG)(lac UV5プロモータ)のような小さな化学誘発物質により制御されるのか好ましい。それは天然のosp遺伝子由来である必要はない。いかなる制限バクテリアプロモータも用いることができる(MANI82)。
一旦増殖性バクテリア細胞を用いて遺伝子パッケージ系がデザインされたら、次はIPBDを選択する(Sec.2)。
Sec.1.1.4：バクテリア細胞に挿入されたランダムDNAから凝osp遺伝子をin vivo選択
天然のOSPとOSP中の挿入部位を選ぶ変法として、我々は次の要素から成る遺伝子を構築することができる。すなわち、a)制限プロモータ(例えばlacUV5)、b)Shine-Dalgarno配列、c)ペリプラズム輸送シグナル配列、d)ランダムDNAのセグメントとipbd遺伝子の融合(Kaiserらが行ったように(KAIS87))、e)ストップコドン、そして、f)転写ターミネータ、以上。90〜300の塩基よりなるランダムDNAは多くのポテンシャルOSTSをコードする。（EF.KAIS87）ipbdとランダムDNAの融合は、どちらが優位となってもよいが、ipbd優位の方が幾分好ましい。この方法で生成した集団からの単離体は、IPBD顕示のためにスクリーニングすることができる。結合を介しての選択の方法が、GP面上にIPDBを顕示するGPを選択するのに用いられ、したがってこの方法は、機能OSTSをコードするDNA挿入体を含むものである。あるいは、GPのクローン単離体がIPBD顕示の表現型のためにスクリーニングされてもよい。
ランダムDNAのipdn優位への指向は、成功GP(IPBD)を用いる方法を考慮することから生じる。第３部で、我々はosp-pbd遺伝子のpbd領域に多くの突然変異を導入するが、そのあるものは無償性ストップコドンを含んでいる。もしもpbdがランダムDNAに優先するなら、pbdの無償性ストップコドンは、細胞表面にOSP-PBDタンパク質を何ら発現させることになる。もしもpbdがランダムDNAの後に続くのなら、pbdの無償性ストップコドンは細胞表面上に不完全ながらOSP-PBDタンパク質を出現させることになる。不完全タンパク質は、しばしば非特異的にスティッキイなので、不完全PBDを顕示するGPは容易に集団からとり除くことができる。
Sec.1.2：バクテリア胞子にIPBDを顕示
バクテリア胞子はGP候補として好ましい性質をもっている。Bacillus胞子はその表面でタンパク質を活動的に代謝もしないし変化もさせない。しかしながら胞子には化学的試剤、物理的試剤に対して、増殖性バクテリア細胞あるいはファージよりもずっと抵抗性である。胞子は、胞子形成をひきおこす分子機構がM13の形成やE.Coliの外層膜へのタンパク質輸出よりも、うまく作用しないという欠点をもっている。
Sec.1.2.1：GPとして使用するに好都合なバクテリア胞子
Bacillus属のバクテリアは、熱、放射線、乾燥そして毒性化学物質によるダメージに対して著しく抵抗性のある内生胞子を生成する(Losickらにより概説(LOSI86))。これらの胞子は、種特異性で部分的にしか明らかにされていない複雑な構造と形態形成をもっている。下記の観察は遺伝子パッケージとしてBacillus胞子の使用を妥当であるとする。
プラDNAは一般的に胞子に含まれる。タンパク質をコードしたプラスミドはBacillus胞子の表面に観察される(DEBR86)。胞子形成は、ある程度分かっている複雑な時間統制を含んでいる(LOSI86)。いくつかの胞子形成プロモータの配列が知られており、このようなプロモータに操作的にリンクしたコード配列は、胞子形成の間にだけ発現する(RAYC87)。
Donovanらは、B.subtilis胞子コートのいくつかのポリペプチド組成を同定した(DONO87)。即ち、２つの完全なコートタンパク質の配列と他の２つのアミノ末端フラグメントの配列が決定されている。この胞子のいくつかの組成は、例えば小さな酸可溶胞子タンパク質(ERRI88)といった前胞子内で合成され、一方、他の組成は母細胞内で合成され、胞子（例えばコートタンパク質）内に現出する。合成の空間的機構は転写レベルで制御される。
胞子は自己集合するが、胞子の異なった部分に種々のタンパク質を局在させるシグナルについてはよく理解されていない。多分、胞子コート上に母細胞のサイトプラスミドズムからコートタンパク質の貯蔵[deposition]を制御するシグナルがポリペプチド配列内に埋め込まれるのであろう。コートタンパク質の全てではないが、いくつかは前駆体として合成され、胞子コートに貯蔵される前に特異的ポテアーゼにより処理される(DONO87)。野性型とはほんの少し異なる生育胞子は、４つのコートタンパク質のどれか１つがたとえ欠けていてもB.subtilis内で産出される(DONO87)。ジスルフィド結合が胞子内に生成される(チオール還元剤がコートのタンパク質のいくつかを可溶化するのに必要である)。１２kdのコートタンパク質、CotD、は５個のシステインを含む。CotDはまた以上に多くのヒスチジン(16)とプロリン(7)を含む。１１kdコートタンパク質、CotC、はたった1個のシステインと１個のメチオニンを含むのみである。CotCは9コのK-Kジペプチドと1個の孤立したKとして表れる19コのリジンを(K)をもつ非常に異常なアミノ酸配列を持っている。その中の10コは5コのY-Yジペプチドとして表れる20コのチロシン(Y)がある。YとKに多く存在するペプチドは酸化的環境において交差結合することが知られている。CotCは19個のKに極めて近い16DとEのアミノ酸を有する。CorCは、A,F,R,I,L,N,P,Q,SあるいはWのアミノ酸はない。CotCもCotDのどちらも翻訳後に開裂しない。タンパク質CotA、CotBは、翻訳後開裂する。
Bacillus属からの内性胞子はStreptomycesからの外生胞子よりもより安定である。Bacillus Subtilisは4〜6時間で胞子を生成するが、Streptomycesの種は胞子形成するのに数日から数週間を要するだろう。さらに遺伝子の知識や操作法は胞子生成する他のバクテリアよりもB.subtilieにつき、より開発されている。それ故Bacillus胞子はStreptomyces胞子よりもより好ましい。Clostridium属のバクテリアもまた非常に耐性のある内生胞子を生成するが、非常に嫌気性生物であるクロストリディアは培養には不適である。Bacillus種の選択はクローニング系の知識を利用により支配され、又いかに容易に胞子形成が制御されるにも支配される。１菌株がSec.1.10に挙げた選択基準で選んである。多くの増殖生化学的方法は胞子形成が初まるときに閉ざされるので、補欠分子族が得られなくなる。
Sec.1.2.2：バクテリア胞子上にIPBDを顕示するに好都合な外面タンパク質
もしもGPとして胞子が選択されたら、胞子タンパク質のプロモータは胞子コートタンパク質が胞子上で合成され貯蔵されるとき、そして胞子コートタンパク質が作られた特殊な場所で最も活性なので、プロモータはosp遺伝子の最も重要な部分となる。B.sublilisにおいていくらかの胞子コートタンパク質は特定のプロテアーゼにより翻訳後処理される。OSP-IPBD融合の構築に、特定のプロテアーゼを認識する配列が混合することを避けるために、前駆体と成熟コートタンパク質の配列を知ることは価値あることである。成熟胞子コートタンパク質の配列は胞子コート内にそのタンパク質を貯蔵させるシグナルをもっている。それ故成熟コートタンパク質の配列のいくらかあるいは全てを含む遺伝子融合はIPBDを顕示する表現型をスクリーニングし、選択するのに都合がよい。
cotCあるいはcotDのフラグメントにipbdフラグメントを融合することは、IPBDを胞子コート上に出現させる傾向にある。遺伝子cotCとcotDは、CotCやCotDが翻訳後開裂しないので、好ましいosp遺伝子である。cotAあるいはcotBからのサブ配列はIPBDがB.subtilis胞子の表面に表れるのをひきおこすためにも用いられるが、これらのタンパク質では翻訳後開裂がおこることを考慮しなければならない。DNAをコードしたIPBDはコード化領域の末端かコード化領域の隠れた部位のどちらかにcotAあるいはcotBのフラグメントを融合できる。胞子はそれからIPBD顕示表現型に対してスクリーニングされ、選択される。
現在までのところ、E.Coliのlacプロモータとして外因性化学誘導物質により誘導されたBacillus胞子形成は示されていない。それにもかかわらず、胞子形成プロモータにより産出されたタンパク質の量はShine-Dalgarno配列のDNA配列あるいはコドン使用のような外的因子により制御される。
Sec.1.2.3：バクテリア胞子のOSPへのIPBDの挿入部位の選択
胞子OSPへの挿入部位を支配する条件は、Section1.1.3で述べたことと同様である。
Sec.1.2.4：バクテリア胞子に挿入されたランダムDNAからosp遺伝子のin vivo選択
胞子に関する条件は増殖性バクテリア細胞(Sec.1.1)について考慮したのと同じであるが、タンパク質が胞子上に表れる原因となる機構に関する情報は不足している。それでランダムDNAの使用はより魅力的である。
我々はa)胞子形成プロモータを使用、そして、b)ペリプラズムシグナル配列を存在すべきでないということ、を除いてはE.Coli細胞にIPBDを結合させるのに上述の1.1.4の実験法を用いることができる。
Sec.1.3：ファージの外面にIPBDを顕示
Sec.1.3.1.：GPとして用いるのに好都合なファージ
バクテリア細胞や胞子とは異なり、ファージの選択はOSPの三次元構造とキャプシド内の他のタンパク質とそれぞれがどのように相互作用するかという知識に大きく依存する。ファージゲノムの大きなパッケージ機構はファージゲノムそれ自身クローニングベクターなのでまた重要である。osp-ipbd遺伝子はファージゲノムに挿入できるにちがいない。
それ故、
1)ウイルス粒子は遺伝物質の挿入や置き換えを受けることができるに違いない。そして
2)ファージのゲノムは扱いやすい操作にとって充分小さいに違いない。
ファージを選択する時ほかに考慮すべきことは、
1)ファージの形態形成過程はIPBDが折り畳まれる機会があるような環境を決定すること。
2)IPBDを含む必須ジスルフィドは細胞内には折り畳まれないこと。
3)IPBDを必要とする大きなあるいは不溶性補欠分子族は、補欠分子族が欠けているので、分泌されても折り畳まないこと。
そして
4)多様化(または変化)[variegation]が第３部に導入されると、多重感染がハイブリッドGPを生成することができ、このGPは１つのPBDに対する遺伝子をもつが、少なくとも異なったPBDのいくつかのコピーをその表面に持つ。この確率は最小限にするのが好ましい。
バクテリオファージは完全な親ファージと結びつく酵素的能力が小さいか全くないので、またその遺伝子はバクテリアホストの外部では不活性で、その結果成熟ファージフラグメントを代謝的に不活性にするので、GPとしてすぐれた候補である。線状ファージM13とバクテオファージPhiX174は、ことの外興味がある。
［線状ファージ］
通常のクローニングそして配列ベクターである線状ファージM13の全体のライフサイクルはよく理解されている。M13とf1は密接に関係しているので、それぞれに関することを両方の性質として考慮する(RASC86)。いくらか違いがあるのは歴史的な正確性による。M13の遺伝子的構造（完全な配列(SCHA78)、10コの遺伝子の同定と機能、そしてプロモータの転写と位置のオーダーは、ウイルス粒子の物理的構造同様よく知られている。コートタンパク質の構造と機能については最近の解説RASC86をみよ。M13に関連することがらは例１に示してある。
［バクテリオファージPhiX174］
バクテリオファージPhiX174は遺伝学的には、生化学的にも電子顕微鏡的にも充分研究された非常に小さな二十面体のウイルスである(The Single-Stranded DNA Phages(DENH78)をみよ)。今日まで、PhiX174からのタンパク質はＸ線回折では研究されていない。PhiX174は殆どどんな追加的DNAも受け入れないことからクローニングベクターとして用いられない。このウイルスはいくつかの遺伝子がオーバーラップする程ギッシリと閉じ込められている。Chambersら(CHAM82)は遺伝子Ｇでの突然変異体はホストがこのタンパク質を供給するようにプラスミド上に存在する野性型Ｇ遺伝子により救助される。
PhiX174の３つの遺伝子生成物は成熟ウイルス粒子の外部に存在する。F(キャプシド)、G(ウイルス粒子1個につき60コのコピーの大スパイクタンパク質)そしてH(ウイルス粒子につき12コのコピーの小スパイクタンパク質)である。Gタンパク質は175のアミノ酸から成るが、Hは328のアミノ酸より成っている。Fタンパク質はウイルスの1本鎖DNAと相互作用する。タンパク質F,GそしてHはウイルス感染細胞の単一のメッセンジャーRNAから翻訳される。
［大きなDNAファージ］
ラムダあるいはT4のようなファージはM13あるいはPhiX174よりも大きなゲノムをもつ。大きなゲノムは小さなゲノムよりも便利には取り扱えない。しかしながら大きなゲノムをもつファージはもしも遺伝的操作が便利に行えるのなら用いることができる。ラムダやT4のファージは、選択できるより多くのSOPを持つM13やPhiX174よりも複雑な三次元キャプシド構造をもつ。ラムダファージウイルス粒子やT4ファージウイルス粒子は、IPBD要求性の大きな、あるいは不溶性の補欠分子族がこれらファージの表面に折り畳まれるように、細胞内的に生成する。しかしながら、ラムダファージやT4ファージは好ましいものではないが、これらファージの誘導体はこうした欠点を克服するように構築することができる。
RNAファージ
QベータのようなRNAファージは、RNAの操作がDNAの操作程簡単ではないので、好ましくない。コンピテントRNAバクテリオファージは好ましくないが、有用な遺伝子的に変化させたRNA含有のパーティクルは、例えばMS2のように、RNAファージから得ることができる。
MS2をGPとして使うため、osp-ipbd遺伝子がタンパク質キャプシドに適合することができるように、大抵の天然のウイルス性ゲノムをとり除く必要がある。もしもコートタンパク質が存在すれば、Aタンパク質はRNA含有パーティクルの生成をひきおこす+RNAの鎖の5'末端の部位に配列特異的に結合することが知られている。もしもAタンパク質結合部位を有するメッセージ、およびコートタンパク質やPBDのキメラに属する遺伝子が、Ａタンパク質や野性型のコートタンパク質（両方ともプラスミドの調節遺伝子から産出されるが）をも含む細胞内で産出されたなら、キメラタンパク質をコードするRNAがパッケージされることになる。そのRNAによりコードされたタンパク質によりカプセル中にとじこめられたRNAのパッケージは、そのパッケージ内の遺伝メッセージが外部のあるものを特定化する主たる判断基準を満足する。パーティクルそのものは生きてない。SBDをもつパッケージを単離した後、次のことをする必要がある。
1)RNAをタンパク質キャプシドより分離する
2)AMVあるいはMMTVの逆転写酵素を用いてDNA内にRNAを逆転写する
3)採取した遺伝メッセージを配列その他の操作のためにプラスミド内にサブクローン化するのに充分となるまで、ポリメラーゼ鎖反応(PCR)を数サイクル行ってDNAを増幅する。
それともなれば、助人ファージが単離したファージを助けるため用いてもよい。
Sec.1.3.2：ファージにIPBDを顕示するのに好都合な外面タンパク質
所与のバクテリオファージに好ましいOSPは、ファージ表面に、通常、最多数でコピーが存在するものがよい。というのはOSP-IPBDの野性型OPSに対する比率を変えるのに最も融通性があり、また、満足できるアフィニティ分離が得られる可能性が最大だからである。しかも、１または数個のコピーに存在するタンパク質は、通常、形態形成あるいは感染の本質的な機能を果たすからである。付加あるいは挿入で、このようなタンパク質を突然変異させることは、GPの生存率を減じる結果となる傾向にある。
野性型のosp遺伝子が保存されるのは好ましい。ipbd遺伝子フラグメントは受容性osp遺伝子の２番目のコピーか、新しく工学的に作り出されたosp遺伝子に挿入することができる。GPがM13のとき使用されるのに好ましいOSPは、遺伝子IIIタンパク質である（例１をみよ）。
Sec.1.3.3：OSPへのIPBDの挿入部位の選択
使用者はipbd遺伝子フラグメントを挿入するのに候補OSP遺伝子中の部位を選択しなければならない。多くのバクテリオファージのコートは高度にオーダーされている。それ故バクテリアや胞子の場合とは異なり、バクテリアファージにおいては工学的に作成されたOSP-IPBD融合タンパク質中の親のOSPの残基の全部あるいは大部分を保持することが重要である。ファージosp遺伝子のipbd遺伝子を挿入するのに好ましい部位は、a)IPBDがそのもとの形の中に折り畳まれている、b)OSPドメインがもとの形の中に折り畳まれている、そして、c)これら２ドメイン間に障害がない、ものであることである。
もしもOSPのアミノ末端あるいはカルボキシ末端のどちらかが溶媒中に露呈しているファージの三次元モデルがあるなら、その成熟OSPの露出した末端は、ipbd遺伝子の挿入の第一の候補となる。三次元モデルの低い解像で充分である。
三次元構造が欠除しているときは、成熟OSPのアミノ末端とカルボキシ末端がipbd遺伝子の挿入に最もよい候補となる。機能的な融合は、ドメイン間の好ましくない相互作用を避けるため、IPBDとOSPドメイン間に付加的残基が必要となろう。IPBDあるいはOSPに相同なタンパク質の特異的配列をコードするランダム配列のDNAやRNAは、もし必要なら、ospフラグメントとipbdフラグメント間に挿入できる。
OSP内のドメイン境界での融合も、機能性融合を得るよい方法である。Smithは、異種DNAをf1の遺伝子IIIにサブクローニングしたとき、そのような境界をみつけた(SMIT85)。
ドメインを同定するにはいくつかの方法がある。原子コオディネートよる方法はJaninとChothia(JANI85)により解説されている(JAN85)。ROSE85、RASH84,VITA84,PABO79,POTE83,そしてSCOT87も参照せよ。
得られる構造情報が候補OSPアミノ配列だけならば、我々はターンとループの予想にこの配列を用いることができる。いくつかのループとターンは正確に予想できる高い可能性がある（.Shou,Fasiman(CHOU72)）。これらの位置[locations]はまたipbd遺伝子フラグメントの挿入候補となりえる。
Sec.1.3.4：バクテリア胞子にランダムDNA挿入体からの凝-OPS遺伝子の生体内選択
別法として、機能挿入部位は、多くの組換構築物を生成し、また表現型特徴確認により機能菌株を選択することによって決定できるだろう。OSP-IPBDはファージコートにおいて構造的役割を充足するにちがいないので、ipbd遺伝子にカップリングされるどのような特定のランダムDNA配列も、機能的にコート内に適合する融合タンパク質を生成するとは思えない。それにもかかわらず、コートタンパク遺伝子の大きなフラグメントとipbd遺伝子間に挿入されたランダムDNAは、生きているファージの外部にIPBDを顕示する１つあるいはそれ以上のメンバーを含む傾向にある集団を産出するだろう。1.1.4で定義したのと同様、顕示プローブが構築されてランダムDNA配列が適当な部位にクローン化される。
Sec.2：IPBDの選択
IPBDは天然から得られるタンパク質か、天然にえられるタンパク質のドメインから選択される。あるいは第一の原理からデザインされる。デザインされたタンパク質は、次の点を有するなら、天然のタンパク質より有利である、即ち、a)デザインされたタンパク質がより安定、b)デザインされたタンパク質がより小さい、そして、c)デザインされたタンパク質の電荷分布がもっと自由に特性化できる。
候補IPBDは次のような規準を充足しなければならない。即ち、
1)使用しようとする条件下で安定(ドメインは、たとえばBPTIのように、挿入されるタンパク質全体を成す)、2)アミノ酸配列の知識が得られる、3)外面上の残基と、その空間的相互関係とを同定、そして、4)IPBDに高い特異的親和性を持つAfM(IPBD)分子が利用できること、である。
IPBDは必要以上に大きくないのが好ましい。というのはその方が、相対的に小さなアミノ酸配列中に制限部位をアレンジすることが容易だからである。これら要件全てを満足する候補IPBDの有用性は、以下に述べる情報が入手可能かどうかにかかっている。
上記IPBD適合性を判断するのに用いられる情報は、1)三次元構造(強く好まれる知識)、2)IPBDに相同の１または２以上の配列(相同配列が知られていればいる程よい）、3)IPBDのpI(ある場合には必要な知識)、4)温度、ｐＨおよびイオン強度の関数としての安定性と溶解性(広範囲に安定で、使用しようとする条件で可溶性であるのが望ましい）、カルシウムイオンやマグネシウムイオンのような金属イオンに対する結合能（それ自身の結合能を知っている方が好ましいが、知らなくてもよい）、6)もしあるなら酵素活性(知っている方がよいが、それ自身の活性が用いられ、問題となるかも知れない）、7)もしあるなら結合特性（知っている方がよい、特異的結合もまた知っている方が好ましい）、8)IPBDに対する特異的で強い親和性(Ｋd＜１０-11Ｍ)をもつ分子が入手可能であること（好ましい）、9)特異的で中くらいの親和性(１０-8Ｍ＜Ｋd＜１０-6Ｍ)をもつ分子が入手可能(好ましい)、10)アフィニティ分子に結合しないIPBDの突然変異体の配列(好ましい)、そして、11)可視のUV,NMR等の吸収スペクトル(特性吸収を知ることは好ましい)といったことである。
もしもIPBDに対するアフィニティをもつ分子(AfM(IPBD))の一スピーシーズだけが入手可能なら、そのスピーシーズは次のことをするのに用いられる。即ち、a)GP表面にIPBDを検知する、b)礎質上のアフィニティ分子の発現レベルと密度を最適化する(Sec.10.1)、そして、c)アフィニティ分離の感度と効果を決定する(Sec.10.2と10.3)、以上である。しかしながら、上に見られるように、IPBDに対して1つは高くもう1つは中くらいのアフィニティをもつAfM(IPBD)の２スピーシーズが得られることが好ましい。高いアフィニティをもつスピーシーズは、最初の検知において用いられ、感度と効果とを決定するのに用いられる(Sec.10.2と10.3)。そして中くらいのアフィニティをもつスピーシーズは最適化に用いる(10.1)。
少なくとも20コの候補IPBDについては上の情報が得られている、あるいは実際上得られている。例えば、ウシの膵臓トリプシン阻害物質(BPTI,58コの残基)、クラムビン(46コの残基)、オボムコイドの第三のドメイン(56コの残基)、T4リゾチーム(164コの残基）、そしてアズリン(128コの残基)である。
本発明の処理によりPPBDから得られるPBDの多数は、溶媒の方に向いた側鎖基をもつ残基に影響する。露呈した残基は広範囲のアミノ酸を受け入れるが、埋もれた残基はこの点に関しては、より制限されている(REID88)。表面突然変異は典型的にはPBDの融点に小さな影響を持つだけであるが、PBDの安定性を低下させるだろう。それ故選択されたIPBDは高い融点をもつべきである(60℃なら許容されるが、高ければ高い程よい)。そして広い範囲のｐＨ域(8.0〜3.0は許容される、11.0〜2.0なら好ましい)で安定であるべきで、そうすれば突然変異や選択〜結合工程による選択IPBDから得られるSBDは、充分な安定性を保つだろう。種々のPBDを産出するIPBDでの置換は50℃以下にドメインの融点を低めないのが好ましい。
ターゲット分子の2つ一般的特性、即ち大きさと電荷は、ターゲットに特異的に結合する誘導体を生成するのに他のクラスよりもIPBDの一定のクラスの方がより有効である。これは極めて一般的特性であるので、全てのターゲットを６クラスに分けることができる。即ち、a)大きな陽性、b)大きな中性、c)大きな陰性、d)小さな陽性、e)小さな中性、そして、f)小さな陰性である。IPBDの小さな集合は、その1つあるいはいくつかは、ターゲットの上記各クラスに該当するものであるが、選択されたターゲットのいずれにとっても好都合な候補IPBDを含むだろう。
それともなければ使用者は、特定のターゲットに対するGP(IPBD)を工学することを選ぶことができる。Sec.2.1はIPBDの選択におけるターゲットの大きさと電荷に関する基準を示している。
Sec.2.1：IPBDの選択におけるターゲットの大きさの効果
もしもターゲットがタンパク質や他の高分子であるならば、IPBDの好ましい具体例としてはBos taurusからのBPTI(58個の残基)、ブドウの種子からのクラムビン(46コの残基)、あるいはCoturnix coturnix Japonica(日本のウズラ)からのオボムコイドの3番目のドメイン(56コの残基)(PAPA82)のような小さなタンパク質である。なぜならこのクラスからのターゲットは高い特異性で小さなタンパク質を収容できるクレフト[clefts]やグルーブ[grooves]を持っているからである。もしもターゲットが例えばデンプンのような簡潔構造を持たない高分子ならば、あたかも分子として取り扱うべきである。たとえばコラーゲンのような明確な三次元構造をもつ広がった高分子は、大きな分子として扱われるべきである。
もしもターゲットがステロイドのような小さな分子ならば、IPBDの好ましい具体例は、Bos taurusからのリボヌクレアーゼ(124コの残基)、Aspergillus oryzaeからのリボヌクレアーゼ(104コの残基)、Gallus gallusからのニワトリ卵の白いリゾチーム(129コの残基)、Pseudomonas aeruginosaからのアズリン(128コの残基)、あるいはT4リゾチーム(164コの残基)、以上の大きさのタンパク質である。というのは、これらタンパク質は小さなターゲット分子に適合するクレフトやグルーブをもっているからである。Brookhaven Protein Data Bankは、これらタンパク質の三次構造をもっている。T4リゾチーム程大きいタンパク質をコードする遺伝子は、この発明の目的のため通常の技術で操作することができる。
もしもターゲットが鉱物であって水に不溶だと、その鉱物の分子表面の性質を考慮しなければならない。(結晶シリコンのように)なめらかな表面は、充分な接触領域と特異性とを持つように、IPBDとして(リボヌクレアーゼのような)大きなタンパク質に対する媒体を必要とする。(ゼオタイトのような)粗いグルーブがある表面は、小さなタンパク質(BPTI)か、あるいは大きなタンパク質(T4リゾチーム)のどちらでも結合できる。
Sec.2：IPBDの選択に及ぼすターゲット電荷の効果
同符号の電荷をもつ分子間の静電気的反発は、高度に相補的表面を持つ分子が結合するのを防げる。それ故、用いようと思う条件下では、IPBDとターゲット分子とは異符号の電荷をもつかどちらか一方は中性であるか、のどちらかであることが好ましい。異符号のイオンの含有は、熱電気反発を軽減するか、あるいは取り除く。
Sec.2.3：IPBDの選択に関するその他の見解
もしも選択されたIPBDが酵素なら、活性部位の1つあるいはそれ以上の残基を、不活性な酵素機能に変える必要がある。例えば、もしもIPBDがT4リゾチームで、GPがE.Coli細胞あるいはM13ならば、リゾチームが細胞を溶解させないようにリゾチームを不活性化する。一方、もしもGPがPhiX174であるなら、Ｔ４リゾチームは悪影響なしにE.Coli細胞内で過剰生産でき、また、PhiX174が細胞内で生成されるので、リゾチームを不活性化する必要がない。GPまたはそのホストに有害な酵素IPBDを、突然変異体アミノ酸で、その活性部位の1個または２以上の残基で置き換えることにより、不活性化することが好ましい。IPBDののもとの酵素活性を欠活させるため変換された残基の1個または２以上を変化させることは許される。活性酵素をコードするosp-pbd遺伝子を受けるGPは死ぬかもしれないが、大部分の配列は消失しないだろう。
Sec.3：OCVの選択
OCVは例えば10KBよりも小さい方がよい。カセット式変異誘発がOCVで実行されるのが望ましい。好ましくは、OCVをカットしない制限酵素が、少なくとも25個得ることができるのがよい。一本鎖変異誘発が実行可能なことも同様に望ましい。最後にOCVは選択マーカーをもつのが好ましい。適当なOCVは入手可能であり、あるいは入手可能なベクターを操作することによって、工学的に作ることもできる。プラスミド上の遺伝子は、クロモソーム遺伝子よりもずっと容易に構築できるか変異させられるので、プラスミドの方がバクテリアのクロモソームよりよい。バクテリアファージが用いられるときは、osp-ipbd遺伝子がファージゲノムに挿入されなければならない。
M13のようなファージについては、抗生物質耐性遺伝子がゲノム内に工学的に操作される（HINE80）。PhiX174のようなビルレントファージ（毒性ファージ、溶菌ファージ）は、選別できる識別可能プラークを作る。この場合は耐性遺伝子は必須でない。さらにPhiX174のウイルス粒子にはいかなる新しい遺伝子的物質を加える余地もない。抗生物質耐性遺伝子を含有させることができないということは、スクリーニングできるGPの数を制限するので、不利である。
GP(IPBD)は、wtGPにキャリィされていない選択マーカーを持つことが望ましい。wtGPがGP(IPBD)にキャリィされていない選択マーカーを持つこともまた望ましい。
Sec.4：osp-ipbd遺伝子挿入のデザイン
我々はIPBDが発現するとき、IPBDをGP面上に現出させるアミノ酸配列をデザインする。このアミノ酸配列はosp-ipbd遺伝子のコード領域全体を決定するかも知れないし、あるいは、それはランダムDNAがクローン化される制限部位に隣接したipbd配列のみを含むものかも知れない(Sec.6.2)。
実際の遺伝子はどのような方法でも生産できよう。ipbdセグメントから誘導したpbdセグメントは、第３部で述べる方法で容易に遺伝子的に操作できるにちがいない。合成ipbdセグメントの方が、耐性部位の置換[placement]を最大限制御できるので、より好ましい。
Sec.4.1：osp-ipbd遺伝子の遺伝子的制御
osp-ipbd遺伝子の制御に関しての２つの重要な問題は、a)各GPに必要とするOSP-IPBDはどれくらいの量か、そして、b)どれだけ正確にその量を制御しなければならないか、ということである。
アフィニティ分離の本質的機能は、ターゲットに対して高いアフィイティのPBD(IPBDから誘導した)をもつGPを、ターゲットに対して低いアフィイティのPBDをもつGPから分離することである。もしも塩濃度を高めていくというような溶出液のグラジエントが条件を変化させるものであるなら、全ての弱結合性PBDは、強結合性PBDのいずれかが結合を止める前に、結合しなくなるだろう。osp-pbd遺伝子の制御は、全てのパッケージがSec.15で記載した良好な分離をもたらすのに十分なPBDを顕示するようなものでなければならない。もしもPBD/GPの量がアフィイティマトリックスからGPの溶離量に影響があるなら、GBD/GT量を正確に制御する必要がある。次の分析は、溶離量とIPBD/GPの強い直線関係はないことを示し、ただ、a)全てのGPは同じ大きさであること、b)PBDとアフィイティマトリックス間の相互作用は、GPの異なった溶離を支配すること、c)その系は平衡であること、そして、d)いかなる１GP上にあるPBDも全て同じであるということを推測させる。
もしもNpがGP上のPBDと同じなら、各Npはターゲット分子にアクセスを持ち、各PBDはデルタＧbターゲットに結合する自由エネルギーをもち，そのときの結合の全自由エネルギーは、
デルタGbtot＝Np＊デルタGb    である。
デルタGbは、1)イオン濃度、2)ｐＨ、3)温度、4)ショ糖、ブドウ糖、エタノールのような中性溶質濃度、5)カルシウム、酢酸塩、安息香酸塩、ニコチン酸塩のような特殊なイオン、以上のような溶媒のパラメータの関数である。もしも条件がアフィニティ分離の間に変えられたら、デルタＧbはゼロに近付き、デルタＧbtotはNp倍速くゼロに近づく。デルタＧbtotが０に近付き、またはそれ以上になるにつれて、パッケージは固定化ターゲット分子から解離し、溶離する。
より多くのPBDをもつGPは、同じPBDをより少なくもつパッケージよりも、結合・非結合間を速く遷移する。平衡条件では、遷移の中点は個々の相互作用をゼロの自由エネルギーにもたらす溶液条件だけで決定される。PBD/GPの数は遷移のシャープさを決定する。
PBD/GPの数は、遺伝子的に同一のGP(PBD)のサンプルがGP面上に様々な数のPBDをもつGPを含むように、生理学的条件を整えることにより通常影響されることにも注意しなければならない。GP(vgPBD)の集団において、各PBD配列は1コ以上のGPに現出し、そして実際のPBD/GP数は、一定の範囲内で各GPごとに異なる。PBDの多様化(変えられた)集団内で、PBDxをターゲットに対して大量のアフィイティをもつPBDと仮定しよう。もしもPBD/GPの数の溶離量に直線的影響があるとすると、PBDxの最大数をもつGPは，カラム上に最も長く保持される。多くなった集団を培養すると、GP(PBDx)が増幅され、様々な数のPBDx/GPをもつ新しいGP(PBDx)を増加させる。このように、本発明のアフィニティ分離処理は、ターゲットに対する強い結合が偶然的にほんのわずかの数しかPBDをGP上に顕示させるのでないなら、GP(PBD)の溶離量に対するPBD/GP数の直線的効果を許容することができる。
IPBD/GP数と溶離量には直接的効果はないので、IPBD/GPの高度に正確な制御の必要性は必要でない。再生できる遺伝子発現は、構築された遺伝子要素よりは制御された遺伝子要素を用いてより容易に制御できる。上述の分析はGP(IPBD)はバッファ中の溶液間で平衡で、アフィイティマトリックスに結合することを推測させる。溶離速度は、アフィニティカラムクロマトグラフィでは重要なパラメータであろう。アフィイティマトリックスからのバッチ溶離あるいはアフィイティプレートからの溶離で、各バッファがアフィイティマトリックスと接触している時間は重要な変数である。マトリックス上のアフィイティ分子密度は、アフィニティ分離を最適化するのに重要な変数である。上述の分析は定性的なので、具体例を示したSec.10で我々は実験的に次の事項を最適化する。即ち、1)GP面上のIPBDの密度、2)アフィイティマトリックス上のアフィイティ分子の密度、3)初期のイオン強度、4)溶離速度、および、5)カラム上に乗せられる礎質容量に対するGP量、である。
遺伝子発現の転写制御はよく知られ、最も効果的なので、我々はプロモータに焦点を絞った。多くのプロモータは、培養媒体に加えられる特定の化学物質によって制御できることが知られている。例えば、イソプロピルチオガラクトシドが培養媒体に、例えば1.0μMから10.0mMの間で加えられると、lacUV5プロモータが導入されることになる。以下、我々は遺伝子の発現を誘発する化学物質に対する遺伝子的用語として"XINDUCE"を用いることとする。もしもosp-ipbd遺伝子の転写がXINDUCEで制御されるなら、GP当たりのOSP-IPBDの数は増加する。これはXINDUCE濃度は生きているパッケージの数が減少するまで増加することが、観察でき、あるいは十分なIPBDが採集したGP(IPBD)の表面に観察されるまで。
GP当たりのOSP-IPBDの最大数に影響する特質は、基本的に性質上構造的である。もしもOSP-IPBDが全ての野性型OSPに置き換えられると、IPBD間に立体障害や望ましくない相互作用があるだろう。OSP-IPBDの法外なレベルも、GPの溶解性や形態形勢に悪影響するだろう。細胞のGPやウイルスのGPに対しては他の固定化分子にアフィニティをもつタンパク質のたった5個という僅かなコピーがアフィニティ分離で成功している(FERE82a,FERE82b;SMIT85)。
プロモータ制御に関して他に考慮することは、osp-ipbdの制御範囲を知ることが後で役立つということである。(Sec.8)特に、XINDUCEが存在しないことが、いかにGP面上のIPBDの不在を導くか、を決定すべきである。こぼれないプロモータが好ましいのである。こぼれないということは有益である。なぜなら、a)AfM(IPBD)に対するGP(osp-ipbd)のアフィニティはosp-ipbd遺伝子によるということを示すこと、そして、b)sp-ipbdの発現が不利なら、XINDECEのないところでGP(osp-pbd)の成長を許すからである。LacIqリプレッサと連携するlacUV5プロモータは好ましい例である。
Sec.4.2：DNA配列のデザイン
本発明は遺伝子デザインの単一の方法に限ったものではない。次の操作は本発明の必要性を充足する遺伝子デザインの一つの方法の例である。
もしもOSP-IPBOのアミノ酸配列が確定していれば、全体の遺伝子を構築できる（Sec.b.1）。もしランダムDNAがipbdに融合されるのであれば、いわゆる顕示プローブが最初に構築される。次に、ランダムDNAは、機能osp-ipbd遺伝子が生体間選択あるいは同様の方法で同定される所の推定上のosp-ipbd遺伝子の集団を完成させるように挿入される（Sec.6.2）。
pbd DNA配列の特定部位に突然変異を容易に、正確に導入できる限りにおいては、正確な遺伝子融合を産生させるためいかなる遺伝子工学的方法も用いることができる（Sec.14.1）。しかしながら、ここで考慮される突然変異の方法に対しては、osp-ipbd遺伝子のDNA配列は、OCVにある他のいかなるDNAとも異なっているにちがいない。必要な相異の性質と程度は、突然変異の方法により決定できる。PBDをコードするサブ配列をvgDNAで置換すると、突然変異されるべきサブ配列は、OCV内で独特な制限部位に結合させられるにちがいない。もし一本鎖オリゴヌクレオチドで誘発される突然変異が用いられるのであれば、IPBDをコードするサブ配列のDNA配列はOCV内で独特なものになるにちがいない。
制御要素としては、a)プロモータb)Shine-Dalgarno配列、そしてc)転写ターミネータ、があり、天然から単離されるか、あるいは天然の制御領域の共通配列の知識からデザインすることができる。
合成されるべき遺伝子コード部分は、そのタンパク質レベルでデザインされ、DNAにコードされる。アミノ酸配列は次のような種々の目標を達成するために選択される。即ち、a)BPの表面上にIPBDを表示、b)IPBDの電荷の変化、そしてc)1個のSBDを選択するためのPBD集団の生成、である。遺伝子コードのambiguous(あいまい)さ、は制限部位の最適なプレイスメントを可能にし、変えられたコドンにアミノ酸の色々な分布を作り出すのに利用される。
Sec.4.3：特異的DNA配列の割り当て
コンピュータプログラムが、使用者が指定したアミノ酸配列をコードするあらゆる考え得るambiguousDNA配列を同定するのに、また、どこで部位特異的制限酵素の認識部位がアミノ酸配列を変えることなく供給され得るのか、その場所を同定するのに、用いられる。
制限部位は、部位間の最も長いセグメントができるだけ短くなるようにosp-ipbd遺伝子内に位置される。付着末端を産生する酵素が好ましい。意図したホストのコドン優位性とメッセンジャRNAの二次構造もまた考慮される。
Sec.5.1：遺伝子合成の組織化
遺伝子合成について確定された戦略は、20から50個のヌクレオチド（nts）の重なり合った(以下、「オーバーラップ」とも言う)セグメント中の遺伝子全体の両方のストランドを合成することである（THER88）。我々はvgDNAの合成にとってより適切な別法を選んだ。我々の方法はこれまでの方法（OLIP86,OLIP87,AUSU87）と次の点で異なる。a)２つの合成鎖を用いる、そしてb)拡大したDNAを真中で切断しない、とい点である。我々の目標は、a)市販のDNA合成装置でssDNAとして合成されるものよりもdsDNAのより長い一片を生成すること、そしてb)一本鎖vgDNAに相補的な鎖を生成することである。２つの合成鎖を用いて３′末端の回文配列要求を取り除く。
DNA合成装置は100ntsまでのオリゴntsを首肯できる収率（MDNA=100）で生成することができる。パラメータNw(効率的アニーリングを得るのに必要な重なりの長さ)と，パラメータNs（制限酵素が平滑末端dsDNAの末端近くで切断できるに必要なスペーサー塩基の数）とは、DNAと酵素の化学により決定される。Nw=10、および、Ns=5がよい値である。
我々は合成されるべきDNA配列を、ほとんど等しい２つの部分に分割した、その各々は全体の長さの半分より5〜8塩基長くさせ、多様化塩基を含まない10から16bp(Nw)の２部分間でオーバーラップがあるようにした。このオーバーラップは、好ましくは回文でなく、高いGC含量をもつのがよい。我々はそのオーバーラップ部分と各鎖の５′拡張鎖を合成する。これらの鎖がアニーリングされ、Klenow酵素と全ての４つのNTPとで完成されると、我々は平滑末端dsDNAとしての望ましい配列を得る。もしもDNAが付着末端をもつ他のDNAに連結されるのであれば、5から10コの（Ns）塩基がその末端に加えられる。合成dsDNAはそれから適当な制限酵素で効率よく切断できる(OLIP87)。
MDNAは厳格に100に固定されないので、全体としての通常の制限190（=2MDNA-Nw）ntsと各フラグメントでの100という値は厳格なものではなく、5あるいは10ntsの範囲で越えることができる。190と100の制限を越えると、収率が低くなるが、ある場合には容認できる。
Sec.5.2：DNA合成と精製法
本発明はDNA合成や構築のいかなる特定な方法に限ったものではない。好ましい具体例として、DNAはMilligen7500DNA合成機で標準的な方法で合成できる。Milligen7500はホスホラミン塩の入った７つの薬ビンを持っている。即ち、最初の４コはA、C、T、そしてGを含む、他の３つの薬ビンは、イノシンや塩基の混合物のような通常でない塩基を含み、いわゆる“汚れた容器”といわれる。標準のソフトフェアは2、3あるいは4コの塩基を等量ずつ混合するようにプログラムしてある。
本発明は遺伝子工学に対してDNAを精製するいかなる特定な方法に制限するものではない。IBI装置(International Biotechnologies,Inc,New Haven,CT)でのアガロースゲル電気永動と電気溶離が大きなdsDNAフラグメントを精製するのに好都合である。オリゴntsに対しては、Epigene装置（Epigene Corp,Baltimore,MD）による電気溶離やPAGEをHPLCに代えることができる。
Sce.6.1：OCVへの既知OSP-ipbd遺伝子のクローニング
都合のよい方法として、合成遺伝子は標準法（MANI82,P250）あるいは少し改良した標準法でバクテリア細胞内に形質転換されたプラスミドを用いて構築することができる。また別に、天然から誘導されたDNAフラグメントは天然から誘導されたDNAフラグメントやあるいは合成DNAフラグメントに操作的に結合させることができる。好ましい方法の多くの場合遺伝子合成は完全な遺伝子の大きなフラグメントをもつ一連のプラスミドの構築を含む。
Sec.6.2：顕示プローブへのランダムDNA(ポテンシャルosp)のクローニング
もしもランダムDNAや表現型選択、あるいはスクリーニングが、GP(IPBD)を得るために用いられるのであれば、顕示プローブ内にデザインされた制限部位の１つにランダムDNAをクローンすることができる。
ランダムDNAは色々な方法で得ることができる。退化した合成DNAも１つの候補である。また、凝ランダムDNAを天然から得ることもできるだろう。例えば、もしSphＩ部位（GCATG/C）がipbdフラグメントの１つの末端にある顕示プローブにデザインされたら、DNAを一部消化するため、ATG３′突出部をもつ多種類のフラグメントを生成するNlaIII(CATG)を用いるだろう。顕示プローブは、ランダムDNAがどちらかの末端にクローン化されるように、ipbd遺伝子の各末端で異なった制限部位を持つのが好ましい。
顕示プローブをもつプラスミドは、適当な制限酵素により消化され、フラグメント化されたランダムDNAは、標準的な方法でアニールされ連結される。連結されたプラスミドは成長した細胞を形質転換するため使用され、また抗生物質耐性遺伝子の発現のため選ばれる。プラスミドを持つGPは、まるでターゲットであるかのようにAfM(IPBD)を用いて、本発明のSec.15で述べた方法により、IPBD顕示の表現型に選ばれる。Sec.15では、結合しない大きな集団から、ターゲットに結合するGP(PBD)を単離することをデザインする。
Sec.7：GPの採集
細胞は、連結したOCVで形質転換され、OCV上の選択性マーカーに適当な試剤で適当にインキュベーションした後、OCVの取り込みに対して選択される。GPは、例えば、GPを小球状にする遠心分離、その小球にされたものを無菌媒体（細胞）中、あるいはバッファ（胞子あるいはファージ）中で、再懸濁するという、手元にあるGPに適当な方法で採集される。
Sec.8：顕示性の立証
採集されたパッケージは、次に、その表面にIPBDを顕示するかがテストされる。その場合、IPBDあるいはAfM(IPBD)の安定性に必須なものとして知られているイオンや補因子が、適当なレベルで含まれていなければならない。テストは、a)アフィニティ標識により、b)酵素的に、c)分光光度的に、d)アフィニティ分離により、あるいは、e)アフィニティ沈澱により、なされる。この段階でのAfM(IPBD)は、IPBD分子に強いアフィニティ（好ましくは、Ｋd＜１０-11Ｍ）、wtGPは小さいか皆無のアフィニティを持つように選ばれる。例えば、もしもBPTIがIPBDならば、トリプシン、アンヒドロトリプシン、あるいはBPTIの抗体が、BPTIの存在をテストするAfM(BPTI)として用いることができるであろう。195番目のセリンが、デヒドロアラニンに置換されたトリプシンの誘導体であるアンヒドロトリプシンは、タンパク質分解作用を持たないが、BPTIに対するアフィニティを保持している（AKOH72;HUBE77）。
GP面上のIPBDの存在は、IPBDに高いアフィニティを持つ可溶性の標識されたAfM(IPBD)の誘導体の使用でもって示すことができる。AfM（IPBD)の標識された誘導体は、AfM(IPBD)と記載される。
もしもランダムDNAが用いられたなら、Sec.15の操作がIPBD顕示表現型をもつクローン化された単離体を得るのに使われる。別の言い方をすればクローン化された単離体は、IPBD顕示表現型かどうかスクリーニングされる。この段階のテストは、これらクローン化された単離体の１つあるいはそれ以上に適用される。
もしもアフィニティ分子に結合する単離体がないならば、Sec.9に述べられている修正を行う。
１つまたは２以上のテストが、IPBDのGP面に顕示されていることを示しているなら、IPBDに既知のアフィニティを持つ分子の結合が、次にかかげるような通常の遺伝子的、生理学的技術を使用してキメラosp-ipbd遺伝子に依存することを立証する。
1)osp-ipbdが結合しているかを立証するため、親のGPにosp-ipbd遺伝子を転移する。
2)osp-ipbdの欠除が結合能の欠除になるかどうかを立証するため、単離されたGPからosp-ipbd遺伝子を消去する。
3)GPのAfM(IPBD)への結合は、〔XINDUCE〕に相関する（この場合osp-ipbdの発現は〔XINDUCE〕により制御される）ことを示す。そして
4)AfM(IPBD)に対するGPの結合は固定化AfM(IPBD)に特異的で支持礎質には特異的でないことを示す。
IPBDのGP面上での存在は、〔XINDUCE〕と、次のようなIPBD量に直線的に関係する作用との間の強い相関関係によって表示される。即ち、(a)可溶性AfM(IPBD)によるGPの結合、b)IPBDによりひきおこされる吸着、そしてc)IPBDの生化学的反応、である。結合はAfM(IPBD)に対して起こるという記述(4)と、遺伝子テスト(1)と(2)は重要であるが、XINDUCEによるテスト(3)はそれ程重要ではない。
構築を決定するため、我々はいくつかのクローン化した単離体のそれぞれから関連するipbd遺伝子フラグメントの配列を決定する。
我々は選ばれたAfM(IPBD)にGP(IPBD)が結合する最大塩濃度とｐＨを決定する。
もしもIPBDがGPの外部に顕示され、その顕示が導入されたosp-ipbd遺伝子により明らかにひきおこされているなら、我々は第２部に進む、そうでなければその結果を分析し、適当な修正法を採用する。
Sec.9：顕示系の完成
もしもipbdフラグメントを天然のospフラグメントに融合させようと試みるのなら、次のような選択肢がある。
1)同一ospに対して異なった融合を次の方法で選択する。即ち、
a)ospの反対の末端を用いる、
b)例えば3コか4コの残基を増やして、融合中にospからのより多くのあるいはより少ない残基を保つ、
c)既知のあるいは予想されるドメイン境界を試みる、
d)予想されるループあるいはターンの位置を試みる、
2)異なったospを選択する。あるいは
3)ランダムDNA法に切りかえる。以上である。
もしもランダムDNA法が不成功に終わったなら、次のような選択肢がある。
1)ipbdフラグメントとランダムDNA間の異なった関係を選択する（ipbdを初めに、ランダムDNAを２番目に、あるいはその逆の順）
2)部分消化の異なる度合、部分消化のための異なる酵素、せん断の異なる度合、あるいは天然のDNAの異なる起源を試みる。
あるいは
3)天然OSP法に切りかえる。以上である。
もしも現在のGPの全ての納得いくOSPを試み、そしてランダムDNA法を試み、両方とも成功しないのなら、新しいGPを選択する。
第２部
Sec.10.10：アフィニティ分離法
第２部で我々はアフィニティ分離系を最適化する。そしてそれは、ターゲットに対して増加したアフィニティをもつPBDを顕示するGP(PBD)に対するGP(vgPBD)の集団を増大させるのに第３部で用いられる。
アフィニティクロマトグラフィは好ましい手段であるが、FACS,電気泳動、その他の方法もまた用いられる。
Sec.10.1：アフィニティクロマトグラフィ分離の最適化
溶出溶媒の濃度を変化させるとカラムからGPが溶離される。しかしながら、溶離量はもっと容易に測定され、特定化される。溶出溶媒の濃度はGPを解離させる試薬であり、溶出溶媒濃度は溶離量と特定のグラジエントから計算できるということを理解すべきである。
特定の溶離状況を用いて、AfM(IPBD)を支持するアフィニティーカラムでGP(IPBD)の溶離量をwtGPの溶離量と比較する。比較は次のような色々な点につき行われる。a)IPBD/GP量、b)礎質容量(DoAMoN)に対するAfM(IPBD)の密度、c)初期のイオン強度、d)溶離速度、e)担体容積に対するGP量、f)ｐＨ，そしてg)温度、である。というのはこれらは分離の感度と効率に最もよく影響するからである。そこで我々は最もよい分離をする条件を選択した。
我々はｐＨや温度を最適化しない、それよりもむしろｐＨと温度の１または２以上の値のその他のパラメータを最適値を記録する。使用者により特定化された意図された使用条件は(Sec.11)、ｐＨまたは温度の特定化を含む。もしもｐＨが特定化されているなら、ｐＨはカラムから溶離中変化しないだろう。ｐＨを小さくすることは礎質から結合したGPを切り離すのに使用できるだろう。もしも使用しようとする条件が温度を特定しているのなら、溶離中その特定した温度でアフィニティカラムを行うが、回収中では温度を変えるかも知れない。
AFM(IPBD)はIPBDに対して中程度のアフィニティ（Kdは10-6Mから10-8Mの範囲）をもつことが知られており好ましい。GP(vgPBD)の集団がバラバラにされると、大まかに３つのサブ集団になるだろう。即ち、a)結合をもたないサブ集団、b)ある結合をもつが高濃度の塩あるいは低いｐＨで洗い落とすことができるサブ集団、そしてc)しっかりと結合し、それ自身救助されるサブ集団である。上記c)からb)を分離するのではなく、上記b)からa)を分離するためのパラメータを最適化する。PBDWをターゲットに弱い結合を持つPBDとし、PBDSを強い結合を持つPBDと仮定する。例えば高いDoAMoMは、GP(PBDW)の保持に好影響を与えるかもしれないが、生育できるGP(PBDs)を溶離することを非常に困難にする。我々は、GP(PBDs)の放出を許すのではなく、GP(PBDw)を保持するために、アフィニティ分離を最適化するだろう。なぜならしっかりと結合したGP(PBDS)はそれ自身の成育によって救助され得るからである。もしもDoAMoMが溶離量に強く影響するのなら、第３部で、SBDがターゲットに対して中程度に強いアフィニティ（Kdは10-7Mのオーダー）をもつことがわかれば、アフィニティカラム上のターゲット量を減じる。
この過程で我々は、UV吸収で検出できるシャープなバンドとしてのアフィニティマトリックスから溶離する遺伝的に純粋なGPの溶離容量を測定する。溶出するフラクションから得た標品は適当な媒体（細胞あるいは胞子）あるいは感度のより細胞（融合）やコロニーあるいはプラーク上にプレートされる。
IPBD/GP、DoAMoM、溶離速度、初期のイオン強度、および、ローディングの数個の値が調べられる。我々は、IPBD/GPとDoAMoMの最適値は相関し、それ故、一緒に最適化するべきであると予想する。初期のイオン強度、溶離速度、礎質容量に対するGP量の効果は、そんなに強く相関していないようなので、それらは個々に最適化できる。
テストされるべきパラメータの各セットのために、カラムは一定方法で溶離される。例えば、我々は溶離法１という方法を用いることができる。これはKClグラジエントが、GP(IPBD)の生存率を0.05Vv(void volumeの略で、無効量のこと)の100フラクションを許容する最大値まで10mMから開始して続け、（使用された量）0、05vの100コのフラクションでGP(IPBD)生存率に対してKClグラジェントが、100mMから許される最大量、次いで最大許容量のKClで0.05vの20コのフラクションをとる。この時のバッファのｐＨは、Trisのような都合のよいバッファで特定値に保たれる。この最適化の条件は、ターゲットへの結合の選択(Sec.15.3)に第３部で用いられる条件に類似で、また、クロマトグラフィー系からのGPの採集に第３部で用いられる条件と同じであることが重要である(Sec.15.4)。
osp-ipbd遺伝子がXINDUCEにより規制されているなら、IPBD/GPはXINDUCEを変化させることにより制御される。XINDUCEの適当値は、XINDUCEとプロモータを同定することに依存する。例えば、もしもXINDUCEがイソプロピルチオガラクトシド(IPTG)で、プロモータがlacUV5なら、IPTG濃度=0,0.1μM,1.0μM,100.0μM,1.0mMがテストにとって適当なレベルである。XINDUCEの変化範囲は、最適値が得られるか、発現の許容できるレベルが得られるまで、拡張できる。
DoAMoMは適切な過程にあるこのレベルの1％あるいは0、1％に礎質物質が結合できる最大値から変わる。我々は分離効率は粗い調整でDoAMoMの広範囲の値をカバーし、粗い調整で大まかの最大値の近辺を明らかにするようにDoAMoMのなめらかな関数になるだろうことを予期する。
最初のイオン強度のいくらかの値は1、0mM,5,0mM,10,0mMそして20、0mMで試験された。
溶離速度を達成できる最大値からその値の1/6まで前の値の1/2づつ変化させた。よい分離を与える最も速い溶離が最適値である。
最適化の目標は、塩濃度を増加させるか、ｐＨ値を下げるか、またはこの２つの組み合わせ、によりひきおこされる結合GPと非結合GP間のシャープな遷移を得ることである。この最適化は、a)使われる各温度、b)使われる各ｐＨ、そしてc)新しいGP(IPBD)が生成した時に対して実行されるのに必要である。
規制できるプロモータは多分バクテリア胞子を除いて全ての遺伝子パッケージに対して得られる。バクテリア胞子に機能的なプロモータは胞子形成プロモータと規制可能なバクテリアプロモータ（例えばlac）のハイブリッドを構築することによりあるいは胞子形成プロモータの飽和突然変異ひきつづいて規制できるプロモータの活性（OLIP86,OLIP87）により調整される。osp-ipbd遺伝子のプロモータが得られないのなら我々はDoAMoM、溶離速度、そして礎質容量に対するGP量を最適化する。もしも最適のアフィニティ分離が受け入れられないものであるときは、GP当たりのIPBD量を変化させる手段を開発しなければならない。
Sec.10.2：アフィニティ分離の感度の測定
我々はアフィニティ分離の感度（Csensi）を、大過剰のwtGPの存在下で検出されるGP(IPBD)の最小量測定により決定する。使用者は、増大工程が断念される前に実行される分離サイクル回数−−Nchrome−−を選択する。Nchromは6〜10回の範囲にあり、4回よりも大きくなければならない。増大工程はNchrom回通過する前に、望ましいGP(IPBD)を単離することにより終了される。
感度の測定はもしもGP(IPBD)とwtGPが異なった選択マーカーをもつなら著しく迅速に処理される。
GP(IPBD)とwtGPの混合物は1:Vlim比で調整される。ここでVlimとは妥当範囲、通常、1011〜104、の該当因子（例えば1/10）にわたる。Vlimの大きな値がまずテストされる。一旦、１つの値に対して肯定的な結果が得られるとVlimのそれより小さな値についてテストする必要はない。各混合物はIPBDに高いアフィニティをもつAfM(IPBD)である最適DoAMoMを保持するカラムに適用される。そしてカラムは特定の溶出溶媒組成で溶離される。生きたGPをもつ最後のフラクションとカラムの礎質物質の植え込みを培養する。もしもGP(IPBD)とwtGPが異なった選択マーカーをもっているなら、選択プレートへの転送は各コロニーを同定する。また別にGPコロニー単離体の数(例えば32)はSec.8で議論した手法でIPBDの存在に対してテストされる。
もしもIPBDが単離されたどのGPの表面でも検出されなければ、a)生きたGPを含む最後のいくらかの（例えば3から5）のフラクション、そしてb)からむ礎質から取り出された接種材料から供給される。供給されたGPは培養され、同じカラムを通し上述の方法でGP(IPBD)濃度を高める。この工程をNchronがカラムから溶離するまで、あるいはIPBDがGPに検出されるまでくり返される。もしもNchrom回通過後もGP(IPBD)が検出されないのなら、Vlimは減少し、この工程がくり返される。
CsensiはNchrom回内にGP(IPBD)を使用者が採取できるVlimの最高値に等しい。GP(IPBD)を単離するのに必要なクロマトグラフィサイクル(Kcyc)数はCeffの粗い見積もりを与える。CeffはおよびVlimの平方根のKcyc倍である。
Ceff=(approx)exp(loge(Vlim)/Kcyc
例えば、もしもVlimが4×108で、GP(IPBD)、単離に３つの分離サイクルが必要ならば、Ceff=(approx)736となる。
Sec.10.3：分離効率の測定
Ceffをもっと正確に決定するため、我々は溶離後およそ等しい量のGP(IPBD)とwtGPを産生するAfM(IPBD)カラム上に展開されたGP(IPBD)/wtGP比を決定する。
Sec.10.4：他の分離法
他の分離法もアフィニティクロマトグラフィで用いたのと同様な方法で最適化される。
FACS(例えばBechton-Dichnson Mountain View,CAから得られるFACStar)は、バクテリヤ細胞や胞子にとって最適である。というのはこの機械の感度が、分離を成就するため各GPに結合した蛍光標識分子を約1000コ必要とするからである。GPのFACS分離を最適化するため、我々は蛍光性分子で標識されたAfm(IPBD)誘導体−−Afm(IPBD)*−−を用いる。最適化されるべき変数はa)IPBD/GP量、b)Afm(IPBD)*濃度、c)イオン強度、e)GP濃度、そしてe)FACS装置の操作に関するパラメータである。Afm(IPBD)*とGPは溶液中で相互作用するので、結合はAfm(IPBD)*濃度と表示されたIPBD濃度の両方に直線関係にある。これら２つのパラメータは共に変化する方が好ましい。他のパラメータは個々に最適化される。
バクテリオファージは小さいので電気泳動が最も適している(SERW87)。電気泳動はもしもターゲットが小さくてそのターゲットをカラムあるいは蛍光性標識物に化学的に結合させることが全体のターゲットを変化させることになるとき、好ましい分離法となる。例えば、クロロ酢酸イオンはただ7コの原子を含み、いかなる結合によっても必須的に変化する。クロロ酢酸イオンに結合するGPはこのイオンに結合しないGPより陰性の電荷をもつようになりこのクラスのGPは分離されるだろう。
電気泳動を最適化するパラメータはa)IPBD/GP，b)例えばアガロースのようなゲル物質の濃度、c)Afm(IPBD)の濃度、d)イオン強度、e)電気泳動装置の大きさ、形、冷却能力、f)電圧と電流、そしてg)GPの濃度を含む。IPBD/GP比とAfm(IPBD)濃度は同時に変化させ他のパラメータは個々に最適化される。
第３部
Sec.11.0：ターゲット物質の選択
いかなる物質もターゲット物質となり得るが、次のような制約を受ける。もしもアフィニティークロマトグラフィーが用いられるのなら、
1)ターゲット物質の分子はアフィニティ分離に適当な固体の担体に適用される効果的な大きさと化学反応性をもたなければならない。
2)礎質適用後はターゲット物質は水と反応してはならない。
3)礎質適用後はターゲット物質は非特異的な様式でタンパク質と結合あるいはタンパク質を分解してはいけない、そして
4)ターゲット物質の分子はその分子が礎質に結合してもタンパク結合に必要な表面領域（リンカーに結合する原子を除いて、一般的には少なくとも500Å2）を残す程度の大きさでなければならない。もしもFACSがアフィニティ分離手段に用いられると、
1)ターゲット物質の分子は適当な蛍光色素やそれ自身蛍光剤であるターゲットと共役するに効果的な大きさと化学反応性を持たなければならない。
2)任意の必要な蛍光剤で標識後は、ターゲットは水と反応してはいけない。
3)任意の必要な蛍光剤で標識後、非特異的な様式でタンパク質と結合あるいはタンパク質を分解してはならない、そして
4)ターゲット物質の分子はその分子が適当な色素に結合してもタンパク質結合に必要な表面領域（リンカーと結合している原子を除いて、一般的には少なくとも500Å2）を残す程度の大きさでなければならない。もしもアフィニティ電気泳動が用いられたなら
1)ターゲットは荷電しているから、タンパク質に対する結合がタンパク質の電荷を変化させるような性質のどちらかを持っていなければならない。
2)ターゲット物質は水と反応してはいけない。
3)ターゲット物質は非特異的な様式でタンパク質と結合あるいはタンパク質を分解してはいけない、そして
4)ターゲットは適当なゲル物質と一緒に使用できるものでなければならない。
可能なターゲット物質は次に列挙したものを含むが、それに限定はされない。
a)可溶性タンパク質（ウマ心臓ミオグロビン、ヒト好中球エラスターゼ、活性化（血液凝固）因子Ｘ、アルファフェトタンパク質、アルファインターフェロン、メリチン、Bordetella,pertussisのアデニレート、シクラーゼ毒素、任意のレトロビールス性polプロテアーゼ、あるいはレトロビールス性gagプロテアーゼのようなもの）、
b)リポタンパク質（ヒト低密度リポタンパク質のような）、
c)グリコタンパク質（モノクローナル抗体のような）、
d)リポポリサッカランド(Salmonella enteritidisのＯ抗原のような）、
e)核酸（輸送RNA,リボソマールRNA、メッセンジャーRNA、多分配列特異性をもつdsDNAのような）、
f)可溶性の有機分子(コレステロール、リアスパルテーム、ビリルビン、モルフィン、コデイン、ジクロロジフェニルトリクロロエタン（DDT）、ベンゾ(a)ピレン、プロスタグランジンPGE2、プロトポルフィリンIX、あるいはアクチノマイシンDのような）、
g)有機金属錯体（鉄ヘムやコバルトヘムのような）、
h)有機ポリマー（セルロースやチチンのような）、
i)不溶性鉱物(アスベスト、ゼオライト、ヒドロキシルアパタイトのような、
j)ウイルスあるいはファージのコートタンパク質(インフルエンザヘマグチニンあるいはファージラムダキャプシドのような)
k)バクテリア膜あるいは外層膜タンパク質(E.coliからのLamBあるいは鞭毛タンパク質のような)、以上。
純粋なターゲット物質の数ミリグラムの供給が望まれる。不純なターゲット物質も用いることが可能かも知れないが、そのときはターゲットと結合するかわりに雑物と結合するタンパク質が得られるかも知れない。
次に示すようなターゲット物質に関する情報が高く要求される。
1)温度、ｐＨ,イオン強度の関数としての安定性、
2)尿素や塩化グアニジンのようなイオン本来の大きな陰イオン塩に対する安定性、
3)ｐＩ
4)分子量
5)ヘムやカルシウムイオンのようなイオンやあるいは補欠分子族の要請、そして
6)もしあるならタンパク質分解作用
この最も望ましい情報に加えて、1)もしもターゲットが高分子なら、ターゲットの配列、2)ターゲットの三次元構造、3)もしあれば酵素活性、そして4)もしあれば毒素を知っていることは有用である。
本発明の使用者は結合タンパク質を使用しようと企てるときあるパラメータを特定化するべきである。
1)許容できる温度範囲
2)許容できるｐＨ範囲
3)イオンや中性溶質の許容濃度
4)ターゲットとSBDに対する最大許容解離定数
KT=〔ターゲット〕〔SBD〕/〔ターゲット:SBD〕
場合によっては使用者はＴ，即ちターゲットとＮ、即ち非ターゲット間の区別を要求するかも知れない。
KT=〔Ｔ〕〔SBD〕/〔Ｔ:SBD〕で
KN=〔Ｎ〕〔SBD〕/〔Ｎ:SBD〕なら
KT/KN=([T〕〔Ｎ:SBD〕）／（〔Ｎ〕〔Ｔ:SBD〕)となる。
使用者はそれからKT/KN比に対して最大許容値を特定する。
もしもターゲットが通常のプロテアーゼなら、次の点を考慮すべきである。
1)高特異的プロテアーゼは他のターゲットと同じように処理できる。
2)ズブチリシンのような通常のプロテアーゼはOSP-PBDを含むGP上のOSPを分解するかも知れない。通常のプロテアーゼを取り扱ういくつかの別法はa)化学阻害物質をタンパク質分解を防ぐために用いる（例えばフェニルメチルフルオロスルファート（PMFS）はゼリンのプロテアーゼを阻害する）、b)1つあるいはそれ以上の活性部位残基を不活性タンパク質を作るために変異させることができよう（例えば、活性なゼリンをアラニンに変異させたゼリンプロテアーゼ）、あるいはc)1つあるいはそれ以上のタンパク質の活性部位アミノ酸を触媒作用をなくするように化学的に修飾することができよう（例えば活性なゼリンをアンヒドロゼリンに変異したゼリンプロテアーゼ）
3)プロテアーゼに結合するために選ばれたSBDは阻害剤である必要はない。ひょっとしてプロテアーゼターゲットを阻害するSBDはプロテアーゼターゲットに結合する非常に小さなサブセットである。4)我々がターゲットプロテアーゼを修飾すればする程、ターゲットプロテアーゼを阻害するSBDがより得にくくなる。そして
5)もしも使用者がSBDがターゲットプロテアーゼを阻害することを要求するならターゲットプロテアーゼの活性部位は必要以上に修飾してはならない。変異や化学的修飾で不活性化することは不活性化の好ましい方法でありタンパク質のプロテアーゼ阻害剤がIPBDの第１候補となり、例えば、本発明の方法で、BPTIをトリプシン以外のプロテアーゼと結合するように変異させることができる（TANK77;TSCH87）。
Sec.12.0：GP(IPBD)の選択
使用者はSec.2に記載事項により選択されたターゲットに適当なものとしてGP(IPBD)を取り上げるにちがいない。任意の選ばれたターゲットに対して本発明の方法により選ばれたターゲットに結合するタンパク質を工学する適当な出発点となる少なくとも集合の１メンバーになるようにGP(IPBD)の小さな集合体が集められると期待される。使用者は第２部で述べた方法により意図された使用に適当な条件のためにアフィニティ分離を最適化すべきである。
Sec.13.0：PPBDに関連して生成されるPBD群の同定
Sec.13.1：変化させられるIPBD(あるいはPPBD)上の選択残基
我々はa)IPBDの三次元構造、b)IPBDに相同の配列、c)IPBDのモデリングとIPBD変異体、のような種々のファクターを考慮して変化させるべきIPBDの残基を選んだ。結合に強く影響する残基の数は常に同時に変化する数よりも多いので、使用者はこれら残基を同時に変えるように条件を設定しなければならない。使用者はまた多様性の施行レベルを選定し、種々の配列の存在率を計算しなければならない。変化される残基のリストと各変化した残基での多様性のレベルは、複合した多様性がCsensiとMntvに等しくなるまで調整される。
重要な概念は構造化したタンパク質のみが、例えば大抵の他のことを除外して特定の化学物質と結合できるというように特異的結合を示す。それ故、変化させる残基は重要なIPBD構造を保持するように選ばれる。PBDが保持されるのを防げる置換は無差別に結合する遺伝子をGPが持つようになるので、集団から容易にとり除かれる。バルク水が除外されるように疎水性表面を埋めることは他の分子にタンパク質が結合する最も強いドライビングフォースの１つとなる。バルク水は表面が相補的であるときのみに２つの分子間領域から除外される。ターゲットに相補的な表面をみつけるため、できるだけ多くの表面をテストしなければならない。選択〜結合工程はターゲットのいくつかの表面により密接に相補的であるタンパク質を単離する。変えられた集団の実質的多様性は、タンパク質配列の数ではなく、むしろ異なった表面の数を測定することによりなされる。それ故、タンパク質配列の数よりは集団に生成した表面の数を最大にするべきである。
仮説的な例１において、図３に示したように仮定的ターゲットに結合しする仮定的PBDについて考えよう。図３は３次元の対象物の２次元的図式である仮説により、サークルの間部に示されているけれども、IPBDの残基1、2、4、6、7、13、14、15、20、21、22、27、29、31、33、34、36、37、38、39が、IPBDの３次元表面上にある。タンパク質は明確な数えられる面をもっていない。それ故、我々はセットの全てのメンバーがターゲットのいかなる原子もIPBDの主鎖にファンデルワールスの距離以内に近付くことなくターゲット物質の１つの分子と同時に接触できる残基のセットとして“相互作用セット”と定義する。残基がターゲット分子にいわゆる“接触する”という概念は後に議論する。図３の１つの仮定的な相互作用のセット即ちセットＡは残基6、7、20、21、22、33そして34から成り、正方形で表した。他の仮定的相互作用セット、即ちセットＢは残基1、2、4、6、31、37そして39より成り、円で表した。
もしも、１つの残基（例えば21番目の残基）をそれぞれ20個の全てのアミノ酸に変えると20個のタンパク質配列と相互作用セットＡの20の異なった表面が得られる。残基6は2つの相互作用セットに含まれるので、残基６を全ての20個のアミノ酸で変換すると20種類の相互作用セットＡと20個の相互作用セットＢが得られるということに注意せよ。
２つの残基をそれぞれ全ての20個のアミノ酸で変換すると400のタンパク質配列を生成することを考慮せよ。例えば変換される２つの残基が１番目と20番目なら相互作用セットＡは残基１に依存しないし、相互作用セットＢは残基21に依存しないので、ただ４０の異なった表面があるだけある。しかしながら７と21の残基が変化すると400の表面が生成されることになる。
空間的に離れたＮ個の残基が同時に変わるならば、20×Ｎ個の表面が生成される。同じ相互作用セットでＮ個の残基が変わるなら、20N個の表面が生成する。例えばもしもＮ＝７ならば、分れた残基での変換は140の表面を生成するが、一方相互作用する残基の変換は207=1.28×109個の表面を生成する。それ故、Ｎ個の残基が変わるとき生成する表面の数を最大にするには全ての残基は同じ相互作用セット内にあるべきである。
タンパク質・タンパク質の強い相互作用に埋れた表面領域の量は1000Å2から2000Å2の範囲になる。個々のアミノ酸はアミノ酸のタイプに大部分依存し、立体配座にはほとんど依存しない全表面領域をもっている。これら領域はグリシンに対しての180Å2からトリプトファンに対しての360Å2の範囲にある。公表されたタンパク質のアミノ酸の溶媒内への露呈から我々はタンパク質表面の1000Å2は4から30のアミノ酸残基に相当すると計算した。実際のタンパク質にみられるようにアミノ酸配列を変えると1000Å2のタンパク質表面を生成するのに10から25個の残基が必要である。SchulyとSchimerはタンパク質表面の１００Å2は1000回もの異なった特異性パターンを示すと見積もった。表面パターンは個々に変わることのできる領域に対して指数関数的に増える。例えば、Brookhaven Protein Data Bankに記録されているBPTIの１つ（6PTI）は3997Å2の全露呈表面領域をもっている(LeeとRichardsの方法を使用し、溶媒半径を1.4Å2とし、そして表７に示した原子半径を用いて)。もしもこの表面を自由に変えることができ、また100Å2が1000のパターンを生成するならば、BPTIの表面を変えることにより10120の異なるパターンを構築することができる。
しかしながら、１つのタンパク質骨格は、単に表面残基の側鎖基を置換するだけでは、特定の100Å2の１表面上に可能な全部のパターンを表示することはできない。タンパク質骨格はほとんど一定の位置関係で変えられた側鎖基をもつので、変換は独立ではない。それにもかかわらず我々はタンパク質の外側に面したこれらタンパク質の残基を変えることにより、異なるタンパク質外面の大きな集合体を生成することができる。
ミオグロビンと接触するBPTIの１つのモデルの実験は、残基3、7、8、10、13、39、41そして42がミオグロビンの大きさと形をもつ分子と全て同時に接触できることを示している。しかしながら、ターゲット分子のどの部分が実際にPBDにより結合される部位かを決定するためのモデルを使用することは本発明の意図ではない。
カセット式変異誘発に対しては、変異させられるべきタンパク質残基は変異DNA(vgDNA)をコードしたこれらの全てが一団となって作られる配列に十分近くにある方がよい。本発明は合成できるvgDNAの特殊な長さに限ったものではない。現在の技術でもってすると、60コのアミノ酸の長さ(180のDNA塩基)がつながれる。
広く分離した残基を変異させるため、２個あるいはそれ以上の変異プライマーを用いて１本鎖オリゴヌクレオチド指向の変異誘発のような他の変異方法を用いることができる。
別の方法として、60コ以上の残基で分けられた残基を変換すると、2コのカセットが変異される。最初のカセットは変異誘発され、例えば30,000以上のメンバーをもつ集団を産生する。変異OCVを用いて、２番目のカセットを変異誘発し望ましい多様性をもつ２番目の変異集団を産生することができる。
変異のレベルは、a)非常に多数の独立に形質転換された細胞を産生する、あるいはb)高度に変異した集団内に小さな構成要素を検出する、という一般的能力をこえるべきではない。変異レベルの制限についてはSec.13.2で議論する。
我々は1)IPBD外面上の残基の三次元構造、あるいは少なくともそのリスト、2)IPBDに相同の配列リスト、そして3)ターゲット分子のモデルあるいはターゲットの代替品を変えるのはどの残基かを決定するのに有用なIPBDとターゲットについてのデータを集めた。
これらのデータとタンパク質の異なったアミノ酸の挙動の理解は次の２つの疑問に答えるのに用いられる。
1)IPBDのどの残基が外側にあり、ターゲットに空間的に同時に接触するのに十分近付いているのか。
2)IPBDのどの残基が高い可能性で変化し、重要なIPBD構造を保持しているのか。
Ｘ線結晶解折、NMR等からターゲット物質の原子モデルはこのような実験に好ましい形であるが、必ずしも必要ではない。例えば、タンパク質が未知の三次元構造をもつタンパク質であるならば、タンパク質の量と、それが可溶性球状タンパク質、繊維状タンパク質、あるいは膜タンパク質のどちらであるかを知ることで充分である。分子代替品や比較基準として用いるために同じクラス、同じ大きさ、形の既知の構造のタンパク質を選択できる。粗い解像度では、与えられた大きさやクラスの全てのタンパク質は同じようにみえる。特異的容量は同じで、全てが多少球状をしており、それゆえ同じ大きさとクラスの全てのタンパク質はおよそ同じ半径の屈曲を持っている。２つの分子の屈曲の半径は２つの分子のいくつかが接触するようになるかを決定する。
アミノ酸が変化させられるタンパク質の鎖の残基を選択する最も適当な方法は、相互作用しうるコンピュータグラフィックによりIPBDのモデルを見ることである。ハードウェアの適当なセットはEvens＆Sntherland PS390グラフィック末端(Evens＆Sntherland Corporation、Salt Lake City,UT)とMicro VAXIIスーパーミクロコンピュータである。タンパク質モデルを眺め操作するための適当なプログラムは、a)T.A.gonesにより書かれたRice大学、（ヒューストン、TX）の生化学教室で配布されたPS-FRODO，そしてb)そしてにより開発されたPROTEUSである。
タンパク質のダイナミックシミュレーションのような理論計算は親のタンパク質の三次元構造上の特定のアミノ酸のタイプの特異的残基に対する置換の効果を評価するのに使われる。このような計算は特定の置換はタンパク質の柔軟性に大いに影響するだろう。
Sec.13.1.1：基本のセット
どんな残基がIPBDの表面にあるのかという知識を用いて、我々はいかなるターゲット原子からファンデルワールスの距離（すなわり4.0から5.0Å）以外に近付くいかなるIPBDの主鎖原子をもたないで同時にターゲット分子に接触するためIPBDの表面に十分に接近できる残基を選択する。IPBDの残基はもしもa)主鎖の原子がターゲット分子のどれかの原子にファンデルワースの距離（すなわち4.0から5.0Å）内にあるとき、あるいはb)側鎖原子がその原子と接触できるようにCbetaがターゲット分子のどれかの原子のDcutoff内にあるときターゲットといわば“接触する”。側鎖基は大きさが異なる（表35参照）ので、Dcutoffを選択するにはいくらかの判断が要求される。好ましい具体例として、我々はDcutoff＝8.0Åを用いるだろうが、6.0Åから10Åの範囲の他の値も用いることができる。もしもIPBDが残基にＧを持つと、我々は正確な結合の長さと角度をもつ凝Cbetaを構築でき、この凝Cbetaからターゲットに接触できる残基の能力を判定することができる。
別法として、セットの残基により境界が定められる表面の屈曲がセットの全ての残基とターゲットの分子間の接触を妨げる程は大きくないようにIPBD表面の残基のセットを選択する。IPBDから誘導されたPBDは高分子の一部にのみ接触できるので、この方法はもしターゲットが高分子であるとき適当である。
重要なIPBDの構造は残基の基本セットの各残基での置換に抵抗するといういくらかの示唆があるが我々も同感である。この示唆はa)同族配列、b)統計的コンピュータモデリングあるいはc)ダイナミックコンピュータシミュレーションといった色々な情報源による。
基本セットの残基はタンパク質配列が連続している必要はない。変化されるべき残基のアミノ酸が全て原子の重なりなく同時にターゲット物質の分子に接触できることが要求される。例えばもしもターゲットがウマ心臓ミオグロビンでまたIPBDがBPTIならば、表34に示したBPTIの１つの相互作用セットにおける残基のどのセットを選択してもよい。
基本セットは８コから16コの残基を含むのが好ましい。残基のこの数は表面がターゲットに対して相補的であることを許容するが、表面の重要なフラクションが同時に変化することができるのに充分なくらい小さいものである。
Sec.13.1.2：２番目のセット
２番目のセットは基本の残基に接触する残基より成り、残基がa)内部にある、b)高度に保護されている、あるいは表面にある、ので残基から除外される。しかし、IPBD表面の屈曲が残基をセットの１コあるいはそれ以上の残基としてターゲットに同時に接触することを妨げている。
内部の残基は、しばしば保護されているにもかかわらず、ＩからＬ、あるいはＦからＹのようないくらかの保護された変化を妨げる。これらの変化は隣接するタンパク質残基の詳細な配置とダイナミックスに影響し、一旦、SBDがみられたなら、このような変異は有用となろう。
２番目の表面残基は最もしばしばセットの末梢に位置し、セットの全ての他の残基とターゲットとに同時に直接接触しない。しかしながらこれら残基の１つのアミノ酸上の電荷は結合に強い影響をもつ。SBDを改良するためにこれら残基のいくらかあるいは全てを変えることは適当である。例えば塩基１で等モルのＡとＧ，塩基２で等モルのＣとＡ、そして塩基３でＡをもつ変異コドンは等しい確率でアミノ酸Ｔ，Ａ，ＫそしてＥを生成する。
Sec.13.1.3：最初に変化させるべき残基の選択
漸次保証される変化の許容レベルはどれだけ多くの残基を一度に変化させ得るかを決定する。即ち幾何学がどれだけかを決定する。
使用者は多くの方法で変化させるべき残基を選択でき、好ましい方法は次のようである。基本セットの面に沿って正反対に対比した一対の残基を選択する。このような対の２つが表面の上／下、右／左の範囲を定めるのに使われる。別法として、表面上にできるだけ大きな領域をもつ三角形を形成する３つの残基が選ばれる。１コから３コの他の残基が相互作用に沿ってチェッカー盤様に選ばれる。広く別れた残基で好ましい相互作用がおこる前に全ての干渉し合う残基は許容できる相補性をもつにちがいないので、変化させる空間的により広い残基を選ぶことは高い特異性を生み出す可能性がある。
選択された残基の数はSec.13.2で議論した制約でそれぞれが変化するような範囲で一対にされる。最初の一巡においてIPBDとターゲット間のどのような結合も確認できない。それで進展は問題とならない。最初の一巡で使用者はvgDNAの各分子が例えば10コのコドンの非制限変異(約2010=1013)を通して変異のレベルを産生するように選出する。DNA合成機の1回の工程は約100ntsの長さの1013コドンの分子を生成する。連続反応と形質転換上の非有効性は実際にテストされるタンパク質数を107〜5×108に減じる。このような非常に高い変異レベルでの過程の多数の相互作用は再現できる結果を与えない。使用者はこのことが重要なのかどうかを決定しなければならない。
Sec.13.2：突然変異の各部位での変化の度合
変化の全レベルは変えられた各残基の変異体の数の積である。各変異残基は2〜20の異なる可能性を産生する変異の異なった図式をもつ。我々はこの過程が発展的であることを要求する。即ち、各変異サイクルに対してよい出発物質を生成するというように。
注意：変化レベルをppbd配列とppbd配列に関係する多くの配列が検出できる量で存在するようにセットすることはこの過程が発展的であることを保証する。もしも変化レベルが高すぎて形質転換がPPBDを顕示しない程の低レベルでppbd配列が存在するだけなら、次の一巡の最もよいSBDはPPBDよりも悪くなり得る。極度に高い変化のレベルにおいては、突然変異誘発の各一巡、一巡は、先の一巡には依存しないし発展性の保証もない。この方法は価値ある結合タンパク質に導くことができるが、この変化レベルでの実験の繰り返しは発展性ある結果を生じない。極度の変異は好ましくないのである。
もしも変化レベルが親の配列と各単一のアミノ酸変化が選択できるように存在するなら、我々は選択した配列が最適値に近いか、親と同じであるということを知ることができる。一方、もしも非常に高い変化レベルが使われたなら、配列はそれが親の配列に勝っているからではなく偶然に親と改良された配列が存在しないので選択されるかも知れない
発展性はオール オア ナッシングではない。先の変化(多様化)サイクルから得られた大部分の情報が保持され、PPBD表面に関する多くの異なった表面が産生される限りは、その過程は発展的である。もしも変化レベルがppbd遺伝子が検出されない程高いのなら発展性の保証は減少する。もしも回収されたPPBDの可能性が無視されるのなら、発展的挙動の可能性もまた無視できる。
我々のデザインの考えに相対する力はPBDは検出できる量までの集団において有用であるということである。即ち検出量以上は浪費される。それ故、我々はPPBDが検出できる限界内でできるだけ多くのPPBDに関する表面を生産する。
我々はa)変えられたコドンに対する真のnt分布を特定する、そしてb)特定したnt分布と実際のnt分布間の相異の効果を試験するまでは正確にどれだけの多様化が許されるかどうかという特定を遅らせる。
Sec.13.3：vgDNAをコードしたPBDファミリーのデザイン
我々はコドン内の変化が、変化させられるべき残基にどのように分配するかを決定しなければならない。この決定は遺伝子コードの性質により影響される。vbDNAが合成されたら、コドンの第一塩基での変化は(WATS87のP87にある表３〜６に示してあるように）遺伝子コード表の同じカラムのアミノ酸を含む集団を生成し、コドンの第２の塩基での変化は遺伝子コード表の同じ列のアミノ酸を含む集団を生成し、コドンの第３の塩基での変異は同じ箱のアミノ酸を含む集団を生成する。同じコドンの２コあるいは３コの塩基が変化すると、パターンはもっと複雑になる。タンパク質の三次元構造モデルでの作業は、所与の残基で置換されるべきアミノ酸の特定のセットを示唆するが、この変化方法は、より多いかより少ない種類のアミノ酸が含まれていることを要求する。例えばモデルについての考察は、所与の残基にNあるいはQの置換を示唆するだろう。コドンの順列組合せの変化は、１つの場所にNとQを混合することが同じ残基に、KとHを含むことを可能として要求する。1)Nのみ、2)Qのみ、あるいは3)N,K,HそしてQの混合したものを入れるのか選択しなければならない。本発明はどのアミノ酸が各残基に位置されるのか正確な予想をするというよりはむしろ変化させられるべきなのはどの残基かということに焦点を絞っている。
タンパク質に相違を生成する多くの方法がある。１の極端な場合はタンパク質の１つあるいは若干の残基をできるだけ多く変化させることである。我々はこうした制御を“焦点突然変異誘発”とよぶ。焦点突然変異誘発は新しいターゲット物質に結合するタンパク質を検索するという最初の段階と同じように、IPBDや他のPPBDがターゲットにほとんどあるいは全く結合しない時、適当である。PPBDとターゲット間に結合がないとき、我々は５つから７つの残基のセットを選択し、全ての20の可能性を通して各が変化させる。
突然変異誘発の他の計画（“拡張突然変異誘発”）はより限られた選択のセットを通してより多くの残基を変えることである。このことは１つまたは２以上の他の活性化されたntsの少量によりDNA合成(例えばnt-フォスホラミダイト)に対して活性化された各々の純粋なntsをスパイク[spike]することにより成就される。一般的慣例とは反対に、本発明は非常に少ないパーセント（例えば１％から0.00001％）の最終生成物が最初のDNA配列を含むようにスパイクのレベルをセットするものである。多くの1重、２重、３重の、さらに多重の突然変異がおこるが、塩基配列の再現は可能である。Nbを変えられるべき塩基数とし、Ｑを親の配列をもつ全ての配列のフラクションとすると、主要素である混合物のフラクション、Ｍは
Ｍ＝exp（loge（Ｑ／Ｎb）＝10（log10(Ｑ)／Ｎb）
となる。
例えば、もしもDNA鎖上の30コの塩基対が変化させられ、生成物の１％が親の配列をもつならば、各混合nt基質は86％の親nt、14％の他のntを持つことになる。表8は30コの塩基が主要素のフラクションＭを含む試薬で合成されたとき、ｎ個の親でない塩基をもつDNAのフラクション(fn)を示している。M=0.63096のとき、フラクション24(f24)やそれ以上のフラクションは10-8より小さい。表8の「最高」[most]とは、最も高い可能性をもつ変化の数である。マルチプル置換の相当な可能性は、親配列のフラクション（f0）が10-6付近に落ち込むことを許容されている場合にのみおこる。この種の突然変異誘発はどのような時でもタンパク質のどの部分にも適用できるが、ターゲットに対するいくらかの結合が完成する時最も適当である。混合試薬で合成されたDNA鎖の塩基対Nbは隣近している必要はない。それらはNb/3からNb間でコドンが色々な度合で影響されるように選択される。変異のために選ばれた残基はもしもわかっているならIPBDの三次元構造との関係で選択される。例えば、基本そして第２のセットにある残基の全てあるいはほとんどを選択できよう。同族体配列あるいは他のデータに根ざしたこれら各残基び異の程度に制限を課することができよう。親のでないntの混合物はランダムである必要はない。むしろ混合物は特定のアミノ酸に各コドンに現れる。特定の可能性を与えるように片寄らせることができる。例えば、１つの残基は全ての既知の同族配列に疎水性アミノ酸を含むかも知れない。そのような場合、コドンの１番目と３番目の塩基は変化するが、２番目の塩基はＴにセットされる。この拡散構造指向の突然変異誘発はタンパク質の２つあるいはそれ以上の残基で同時におこる変化を要求するようなそれ程微妙ではない変化をするいくらかのものと同じように、例えばVからIというような、穏やかな間部変化と相関するタンパク質骨格に可能な微妙な変化を明らかにする。
焦点突然変異誘発に関しては、各変異コドンに挿入されるntsの分布を考えよう。各コドンは異なってプログラミングされる。特殊なアミノ酸あるいは１つのクラスのアミノ酸が適当であるという情報がないのなら、１つのpbdを検出レベル以上に表すことは浪費なので、同等の可能性で全てのアミノ酸置換することに努力すべきである。コドンの各位置に全ての４つのntsの等量は各アミノ酸がそのアミノ酸をコード化したコドンの数に比例して存在するようなアミノ酸分布を与える。この分布は全ての酸性残基に対して与えられた2つの塩基性残基については不利となる。さらに、R,S,そしてLはWあるいはMに対して6倍となる。もしもこの分布をもつ５つのコドンが合成されたなら、５つのRをエンコードした配列は５つのWをエンコードした配列よりも7776倍より豊富である。W-W-W-W-Wの存在を検出できるレベルで得ようとするとR-R-R-R-Rが7776倍も過剰に存在しないといけない。
Abun(x)を、コドンの各塩基におけるntsの分布で定義されるアミノ酸xをコードするDNA配列の存在率としよう。いかなる分布についても、存在率Abun(mfaa)の最も好ましいアミノ酸(mfaa)と、存在率Abun(lfaa)の最も好ましくないアミノ酸(lfaa)とがある。我々は全てのアミノ酸を許容し、酸性アミノ酸と塩基性アミノ酸の等量ということで、できるだけ最小のストップコドンという２つの制約条件下で最も大きなAbun(lfaa)／Abun(mfaa)比を与えるnt分布をさがした。それ故Abun(E)+Abun(D)=Abun(R)+Abun(K)を与えるnt分布のみを考えると最大となる関数は次のようになる。
｛(１−Abun(ストップ))（Abun(lfaa)／Abun(mfaa)）｝
我々は、３番目の塩基をＴあるいはＧ（ＣあるいはＧも等価である）に制限することにより最適ｎｔ分布の検索を簡易化した。すべてのアミノ酸が可能であるが、ＴＧＡとＴＡＡのコドンが制限されるので、実行されるストップコドンの数は減少する。アミノ酸Ｆ、Ｙ、Ｃ、Ｈ、Ｎ、ＩそしてＤは３番目の塩基としてＴを必要とするが、Ｗ、Ｍ、Ｑ、ＫそしてＥはＧを必要とする。それ故、我々は３番目の塩基としてＴとＧの等モル混合物を用いた。
本発明の一部として書かれ“Find Optimum vgCodon  最適vgコドンを発見せよ”（表９）と名づけられた計算プログラムは工程0.05で塩基１と２の組成を変えると、量｛(Abun(lfaa)／Abun(mfaa)(1-Abun(stop)))｝の最大値を与える組成を知らせる。vgコドンは各塩基でのnt分布により象徴的に表される。
0003771253.tif 000005
ｔ１＋ｃ１＋ａ１＋ｇ１＝１．０
ｔ２＋ｃ２＋ａ２＋ｇ２＝１．０
ｔ３＝ｇ３＝０．５、ｃ３＝ａ３＝０
ｔ１、ｃ１、ａ１、ｇ１、ｔ２、ｃ２、ａ２、そしてｇ２量の変化は、Abun(Ｅ)＋Abun(Ｄ)がAbun(Ｋ)＋Abun(Ｒ)に等しいという式に制約される。
Abun(Ｅ)＋Abun(Ｄ)＝ｇ１×ａ２
Abun(Ｋ)＋Abun(Ｒ)＝ａ１×ａ２／２＋ｃ１×ｇ２＋ａ１×ｇ２／２
ｇ１×ａ２＝ａ１×ａ２／２＋ｃ１×ｇ２＋ａ１×ｇ２／２
ｇ２について解くと
ｇ２＝（ｇ１×ａ２−0.5×ａ１×ａ２）／（ｃ１＋0.5×ａ１）
を得る、さらに
ｔ１＝１−ａ１−ｃ１−ｇ１
ｔ２＝１−ａ２−ｃ２−ｇ２
我々は、ａ１、ｃ１、ｇ１、ａ２とｃ２を変化させｔ１、ｇ２そしてｔ２を計算した。最初、変化は５％の工程にある。一旦、およそのnt最適分布が決定されると、領域はさらに１％の工程で拡げられる。このプログラムの論理は表９に示してある。最適分布は
0003771253.tif 000006
で、表１０に示した存在率で各タイプのアミノ酸をコードするＤＮＡ分子を生成する。
Milligen 7500のようなＤＮＡ合成機を制御するコンピュータはいくらかのnt基質（例えばntホスホルアミダイト）を２つあるいはそれ以上の貯蔵器からとることによりいかなるnts分布をもつオリゴntのいかなる塩基をも合成するようにプログラムすることができる。それともなければ、nt基質はいかなる割合でも混合できいわゆる“汚染容器”合成に対する余分の貯蔵器の１つに入れることができる。
得られた実際のnt分布はa)nt基質の異なった本来備わっている反応性、そしてb)試薬の悪といった種々の理由により特定化されたnt分布から異なる。これらの効果を部分的に相殺することはできるが、いくらかの残基のエラーはおこるだろう。我々は特定されたntフラクションと観察されたntフラクションの平均的相違をＳerrとして示した。
Ｓerr＝平方根2（平均［（ｆobs−ｆspec）／ｆspec］
ここでｆobsは１つの塩基にみられるntの１つのタイプの量であり、ｆspecは同じ塩基に特定化されたntのタイプの量である。平均はすべてのntの特定化したタイプと（例えば１０あるいは２０）の異なった変えられた塩基上でなされた。仮説により、変えられた塩基での実際のnt分布は特定化された分布の５％以内にある。実際のＤＮＡ合成機とＤＮＡ合成化学は異なったエラーレベルをもっている。使用したＤＮＡ合成機と化学に対してＳerrを決定することは使用者の対応である。
アミノ酸分布上のnt組成におけるエラーの可能な効果を決定するため次の４つの方法で“Find Optimum vgCodon”のプログラムを修正した。
1)最初の２つの塩基での各ntのフラクションは７つの同じステップでその最適値回（１−Ｓerr）から最適値回（１＋Ｓerr）まで変化することが許される。（Ｓerrは使用者がとり入れた仮定的なフラクションレベルである）。１つの塩基でのntフラクションの合計は常に1.0に等しい。
2)ｇ２はａ２と同じ様式で変化する。即ちAbun(Ｄ)＋Abun(Ｅ)＝Abun(Ｋ)＋Abun(Ｒ)という制限をとる。
3)ｔ３とｇ３は、３つの等しい工程における０．５×（１−Ｓerr）から０．５×（１＋Ｓerr）まで変化する．
4)最小のAbun(lfaa)／Abun(mfaa)比をさがす。
実際の実験では、我々は上に示した最適ＤＮＡ分布の“最適vgコドン”を与えるように合成機を指示した。しかしながらＤＮＡ化学上の不完全な制御はもしも全てのntフラクションが“最適vgコドン”で特定化した量の５％以内のとき得られる最悪の次に示したような分布を実際に得る原因となった。相当する表は、表１１に与えられているようにプログラム“与えられた分布のＳerr間で最悪vgコドンを見つけよ、Find worst vgCodon within Serr of given distribution”を用いて与えられたＳerrに対して計算することができる。
0003771253.tif 000007
この分布は異なったアミノ酸をコードするＤＮＡを表１２に示す存在率で与える。
もしもnt分布“最適vgコドン”を産生するように試薬を混合して５つのコドンを合成するなら、あるいは実際にnt分布“最適vgコドン、最悪５％エラー”が得られたのなら５つのコドンの全てにmfaaをコードするＤＮＡ配列は５つのコドンの全てにlfaaをコードするＤＮＡ配列よりも277倍好ましくなる。即ちＤＮＡ配列の約２４％は５つのコドンの１つあるいはそれ以上にストップコドンをもつだろう。
５つのコドンが塩基１としての等モルの混合物を用いて合成されると(Abun(mfaa)／Abun(lfaa))5=7776となる。もしも最適nt分布が５％以内でプログラムされると、(Abun(mfaa)／Abun(lfaa))5＝277となる。異なるＰＢＤの総数は変わらないのが、最も好ましくない配列は約２８倍より存在率を増す。等モルのntsをもつ４つの残基を各々の変化する塩基で変えるとき最も好ましくないアミノ酸配列を検出することには、最適化されたnt分布をもつ５つの残基を変えるとき最も好ましくないアミノ酸を検出するのと同様の感度良い分離系が要求される。
仮説によると、分布“最適コドン”は仮説的な例２の２番目の変化の２番目のバージョンに用いられる。しかしながら各タイプのアミノ酸をコードするＤＮＡの存在率は表１２からわかる。親のアミノ酸配列をコードするＤＮＡの存在率は
量（親の配列）
0003771253.tif 000008
である。
それ故、非常に多くの関係する配列と同様ＰＰＢＤ配列をコードするＤＮＡは検出される充分な量で存在するだろうし、我々は、この工程は発展的であると確信する。
ＰＰＢＤを採取する変化レベルは次の２つの特性をもつ。
1)ＰＰＢＤが得られるので、あともどりはできない
2)選択に対し、ＰＰＢＤに関する多くの変化が得られるので、これらの変化を検出できるし、それから利益も得ることもできる。
使用者は計算された変化がMntvとCsensiによる結合セット内にあるようになるまで変化させられる残基のリストと各残基での変化レベルを調節しなければならない。
我々はまた変化部位とそれをとりまくＤＮＡ間の相互作用についても考察するのがよい。使用される突然変異誘発の方法がカセットの置換であるなら、変化は無償制限部位を生成するかどうか、そしてそれらは多様性の意図した導入をきびしく防げるかどうか考察しなければならない。我々は、変異部位の適当な選択と変異部位に隣接するコドンの静かな変換[silent alteration]により無償制限部位を減じるか、とり除く。詳細な例をみよ。
Sec.14.3：プラスミドへの合成ＤＮＡの挿入
カセット式突然変異誘発に対しては制限部位がデザインされ、合成され、またＯＣＶにvg合成ＤＮＡを導入するのに用いられる。制限消化と連結反応は標準的な方法で実施される。一本鎖オリゴヌクレオチド指向の突然変異誘発の場合、合成vgＤＮＡがベクターに多様性を創りだすのに用いられる。
Sec.14.2：細胞の形質転換
本発明はＤＮＡで細胞を形質転換するいかなる１つの方法に限ったものではない。ＭＡＮＩ８２で述べられた方法のような標準的な方法は特定のホストとＯＣＶに対して最適化されるだろう。目的は好ましくは107かそれ以上の多くの独立した形質転換細胞を産生することである。形質転換とアフィニティ分離の内で形質転換細胞を単離する必要はない。我々は、形質転換細胞が比較的少ない平板に密にコロニーが形成するように高濃度で形質転換細胞をもつ方が好ましい。
Sec.14.3：ＧＰ(vgＰＢＤ)集団の成長
形質転換細胞は初めプラスミド遺伝子の発現を許す非選択的条件下で成長する、それから形質転換細胞を殺すように選択される。形質転換細胞はそれからSec.10.1で決定したように、導入の適当なレベルでｏｓｐ-ｐｂｄ遺伝子の発現をひきおこす。ＩＰＢＤをもつＧＰはパッケージに適当な方法で採集される。
多様性の高レベルは試験管内の変化ＤＮＡ合成により作り出され、この多様性はこれといった選択的圧力なしに有機体の数世代にわたり受動的に維持される。有害な突然変異の頻度を減ずるかなくすることは本発明の目的に有益である。２．３の世代が経過する前に選択が実行されるのが好ましい。更に、ひきつづく研究のため小さいサンプル(10％以下)を取り除くことにより有機体に増幅を引きおこす前に変化集団を細分することは多様性を失うことになる。それ故、全てあるいはほとんどの合成ＤＮＡやほとんどのあるいは全ての形質転換細胞を用いるべきである。
Sec.15.：ターゲット結合表現型をもつＧＰ(ＰＢＤ)の単離
採集されたパッケージは礎質に固定化されたターゲット物質を含むアフィニティ分離を用いることによりターゲット結合表現型を多くすることができる。ターゲット物質に結合できなかったパッケージは洗い流される。もしもパッケージがバクテリオファージか内性胞子ならばバクテリアの成長を防ぐためバッファ中にアジドのようなバクテリオシン試薬を含むことが望ましいだろう。
Sec.15.1：カラムへのターゲット物質の吸着
アフィニティーカラムクロマトグラフィーはアフィニティ分離の好ましい方法であるが、他のアフィニティ分離法も用いることができるだろう。色々な市販品として得られる担体物質がアフィニティークロマトグラフィーに用いられる。これらにはターゲット物質が共有結合した誘導されたビーズやターゲット物質が不可逆的に結合した非誘導物質が含まれる。
アフィニティークロマトグラフィーに体する支持物質の供給者は、Applied Protain Technologies(Cambridge,MA),Bio-Rad・Laboratories,(Rodevill Center,NY),Pierce Chemical Company,(Rockgord,IL)がある。ターゲット物質はそのターゲットのよい発現を考慮して作成された各礎質の意図に一致するように礎質に吸着させる。
Sec.15.2：非特異的結合による選択の減少
我々は、そのような２つの方法でターゲットに結合する礎質に対するＧＰ（ＰＢＤ）の非特異的結合を減少させた。
1)ＧＰ(vgＰＢＤ)の集団のクロマトグラフィーをする前に、遺伝子欠陥のあるＧＰあるいはタンパク質の溶液のような遮断試薬でカラムを処理する。
2)アフィニティークロマトグラフィーに先立ちＧＰ(vgＰＢＤ)の集団をターゲットを含まないかあるいは実際のターゲットと同じクラスの異なるターゲットを含む礎質上に通す。
上のステップ(1)はアフィニティ礎質が野生型ＧＰあるいは一般のタンパク質に対して示すいかなる非特異的結合をも飽和し、ステップ(2)は礎質あるいはターゲットと同じクラスの分るに非特異的結合を示す集団の組成を取り除く。例えばもしもターゲットがウマ心臓ミオグロビンなら、ウシ血清アルブミンを担体とするカラムはタンパク質に対し強い非特異的結合をするＰＢＤを示すＧＰをトラップするのに用いることができる。もしもコレステロールがターゲットなら、p-t-ブチルベンジルアルコールのような疎水性化合物が疎水性化合物に強い非特異的結合をもつＰＢＤを表示するＧＰを取り除くのに用いることができる。包み込まれないあるいは時期尚早に末端化したＰＢＤは非特異的に結合力が強いと予想される。付着性ＰＢＤを無差別に取り除いた最初のカラム容量はターゲット分子を保持しているカラムよりより大きい（例えば、５倍大きい）。
ＳＢＤをもつクローンの分析において支持物質（ポリスチレン、ガラス、アガロース等）の変化はターゲットというよりは支持物質と結合するパッケージの強化を取り除くのに用いられる。
Sec.15.3：カラムからの溶離
ＧＰの集団は結合タンパク質の意図した使用を併用できる条件下でアフィニティマトリックスに適用できる、そしてこの集団はカラムでいくつかの溶出溶媒のグラジェントの過程で分別される。この過程はターゲットにアフィニティをもつＰＢＤを高め、ターゲットに対するアフィニティは用いた溶出溶媒ではほとんど影響されない。
（ＩＰＢＤから誘導された）ＰＢＤやターゲットの安定化に必要なイオンあるいは補因子は適当なレベルでバッファに含まれる。我々はまずターゲットに結合しないＧＰ（ＰＢＤ）を初めのバッファが（260nmあるいは280nmで）光学密度がベースラインにもどりそれから１から５の空の量（Ｖv）なる量で礎質を洗浄することにより取り除く。カラムはそれからグラジェントでa)塩、b)Ｈ+濃度（ＰＨの減少）、c)中性溶質、d)温度(上げるかあるいは下げる)、あるいはe)これらファクターのいくつかの組合せ、を増加グラジエントせしめて溶離する。塩がグラジェンと形成には最もよい溶質である。一般に非共有性の相互作用を弱める他の溶質もまた用いられる。“塩”は次のようなイオン種のどのようなものをも含む溶液をさす。
0003771253.tif 000009
他のイオン性、あるいは中性溶質も使われる。総ての溶質も遺伝子パッケージを殺さないという必要性が要求される。エタノール、アセトン、エテール、あるいは尿素のような中性溶質はときどきタンパク質精製に用いられるが、これらの多くは低濃度以上はバクテリアやバクテリオファージに害を及ぼす。一方、バクテリア胞子は多くの中性溶質に対して影響をうけない。Sec.15の工程が何回か繰り返される。異なる分析では異なる溶質が使われる、例えばある分析では塩が、次のではｐＨが、という具合である。
Sec.15.4：パッケージの回収
アフィニティカラムに結合を示すパッケージの回収は次のような色々な方法で成就される。
1)上述のグラジエントで溶離したフラクション
2)可溶性ターゲット物質で溶離したフラクション
3)礎質で成長した細胞
4)礎質のいくらかの部分とインキュベートした細胞
5)ターゲットと礎質とを結びつける結合を化学的あるいは酵素的に分解した後溶離するフラクション
6)パッケージの分解後ＧＰの再生と回収されたOCV DNA
これらの方法を組合わせて用いることも可能である。アフィニティマトリックスから回収しようと我々が欲しているものはＧＰそれ自体ではなく、それらについての情報であることを記憶すべきである。変えられたＧＰの回収は非常に強く望まれ、遺伝物質の回収は必須である。
ＧＰの不意の不活性化は非常に害を及ぼす。ＧＰを不活性化しないあるいはターゲットやカラムを変性しない溶質の最大値を決定することは好ましいことである。ＧＰを溶離するカラムを変性する条件が用いられるかも知れない。ターゲットが変性する前に、アフィニティ礎質のタンパク質が植え込みとしての可能性のある使用を除外される。ＧＰがタンパク質−タンパク質相互作用や他の非共有的分子の相互作用で結合しているので、分子パッケージがアフィニティ礎質上のターゲット分子にしっかりと結合しているので、ＧＰがウイルスの形で洗い流されない場合もある。このことは非常に強い結合があるときにのみおこる。このような場合には、上の方法(3)から(5)が結合パッケージや遺伝情報がアフィニティ礎質から得ることができる。
溶離条件の巧みな操作により、あるｐＨ（ｐＨb）ではターゲットに結合するが、他のｐＨ（ｐＨ0）ではターゲットに結合しないｓｂｄを単離することが可能である。集団はｐＨbで適用され、カラムはｐＨbで充分に洗浄した。カラムはそれからｐＨoバッファで溶離させ、そして新しいｐＨで溶離したＧＰを集め培養した。同じような手法が例えば温度のような他の溶液パラメータに用いられるだろう。例えば、ＧＰ（vgPBD）がインシュリンを担体としたカラムに適用される。塩でインシュリンに全く結合しないか、ほとんど結合しないＧＰを取り除き、塩あるいはグルコースで溶離することにより、競合的にインシュリンあるいはグルコースに結合するＰＢＤを表示のＧＰを単離する。
Sec.15.5：高濃度パッケージの増幅
選択された結合特性をもつ生きているＧＰは適当な媒体の培養液で増幅される。あるいはファージの場合はそのように培養されたホストに接種することにより増幅される。もしもＧＰがクロマトグラフィにより不活性化されると、osp-pbd遺伝子をもつＯＣＶはＧＰから回収され、新しい生きているホストに導入されるにちがいない。
Sec.15.6：さらに増加が必要かの決定
改良された結合性をもつＧＰを単離する可能性は各分離サイクルをもつCeffにより増加する。Ｎを変異により産生された明確なアミノ酸配列としよう。我々はＳＢＤの単離を試みる前に分離サイクルＫを実施しよう。ここでＫは単一のＳＢＤ単離の確率が0.10かそれ以上である。
Ｋ＝最小の整数≧log10(0.10N)／log10(Ceff)
例えば、もしもＮが1.0×107でCeff＝6.31×102なら
log10(1.0×106)／log10(6.31×102)＝6.0000／2.8000
＝2.14となる。それ故我々は第３番目の分離サイクル後にSBDの単離を試みるだろう。ただ２回の分離サイクル後に１個のSBDをみつける確率は、(6.31×102)2／(1.0×107)＝0.04となりSBD単離の試みは有益である。
いかなる生きているＧＰを含むSec.15.3で溶離した最後のフラクションからのクローン化した単離体はアフィニティ礎質からとった植え付けを培養することにより得られたクローン化した単離体と同様に培養される。もしも分離サイクルＫが完成したなら、これらクローン化した単離体の例えば３２といった番号からのサンプルは、（ターゲット）カラム上の溶離特性につきテストされる。もしもターゲットに対して改良された結合を示す単離された遺伝子に純粋なＧＰがないのなら、あるいはＫサイクルがまだ完成していないのなら、Sec.14.3で設定したのと同じような方法で我々は生きているＧＰを含む溶離した最後の2,3のフラクションからのＧＰそしてカラムの礎質からとられた植え付けを培養することにより得られるＧＰからのＧＰをたくわえ、培養する。我々はそれから、Sec.15に述べた増加操作をくり返す。このサイクルの増加法はNchrom回、またはSBDが単離されるまで続ける。
もしも単離されたＧＰの１つあるいはそれ以上が（ターゲット）カラムに改良された保持をもつなら、我々は候補ＳＢＤの保持はターゲット物質に対するアフィニティによるのかどうかを決定する。ターゲット物質は最適密度で異なる支持礎質に結合するそして候補ＧＰ（ＳＢＤ）の溶離量が測定される。我々は最も高い溶離量をもつものか、溶離後もカラム上に残るものどちらかの候補を選択する。もしもＧＰ（このラウンドではＰＰＢＤ）よりもより高い溶離量をもつ候補ＧＰ（ＳＢＤ）がないのなら、生きているＧＰを含む最後の2,3のフラクションからのＧＰとカラム礎質からとられた植え付けを培養することにより得られるＧＰを貯え、培養する。我々はそれからSec.15の増加操作を繰り返す。
もしも全てのＳＢＤがこのラウンドでＰＰＢＤよりも優れている結合を示すなら、我々は生きているＧＰを含む最後のフラクションからのＧＰとカラムからとられた植え付けからのＧＰをたくわえ培養する。この集団はＫdに根ざしたＧＰをさらに分別するために少なくとも１回、再度クロマトグラフィされる。
もしもＲＮＡファージがＧＰとして用いられたなら、そのＲＮＡは助人ファージの助けで培養されるか、逆転写される。そしてDNAが増幅する。増幅されたＤＮＡはそれから適当なプラスミドに配列されるかサブクローン化される。
Sec.15.7：集団の特性化
我々は望ましい結合特性を示す集団のメンバーを遺伝的そして生化学的方法で特徴づけた。我々はクローン化した単離体を得、そしてこれらの菌株をターゲットへの結合に関する遺伝子型、表現型かを決定するため遺伝子そしてアフィニティ的方法によりテストする。結合を示す数種の遺伝的に純粋な単離体に対し、結合はosp-sbd遺伝子を切除し、それを親ＧＰに交差させる人工キメラ遺伝子によりひきおこされると提案する。我々はまたosp-sbdがとり除かれた各ＧＰの欠失した骨格を連結し、各骨格それだけではＧＰ上のターゲットに結合をもたらすことはできないことを提案した。我々は数種のクローン化された単離体からのosp-sbd遺伝子を配列した。
Sec.15.8：結合アフィニティのテスト
１つあるいはそれ以上のクローン化された単離体に対して、我々は、ospフラグメントなしに、各ＳＢＤが遊離タンパク質として産生されるようにsbd遺伝子フラグメントを表現ベクターにサブクローンする。各ＳＢＤタンパク質はアフィニティクロマトグラフィを含む通常の方法で純化される。結合の強さの物理的測定は各遊離ＳＢＤタンパク質に対し次の1)ターゲット物質の結合の関数としてStokes半径の変化がアガロースのような分子サイズのカラムからの溶離の特性により測定する、2)ターゲット物質を添付したスパンアフィニチィーカラム上の放射性原子で標識したＳＢＤの保持、あるいは3)ＳＢＤを添付したスパンアフィニティーカラム上の放射性原子で標識されたターゲット物質の保持といった方法のどちらかの１つでなされる。各遊離ＳＢＤと対する結合の測定はＰＰＢＤに対する結合の相当する測定と比較される。
各分析で、我々は各タンパク質の濃度、他の関係ある物理的そして化学的パラメータの関数として結合の程度を測定する。
さらに、各ラウンドからのターゲットに対して再興のアフィニティをもつSBDをすぐ前のラウンドの最善のSBD（第１のラウンドに対してはIPBD）とそしてターゲット物質にたいするアフィニティに関してのＩＰＢＤとに比較する。突然変異誘発のひき続いてのラウンドと結合を通しての選択は望ましいレベルが成就されるまで、増加するアフィニティを生じる。
もしも結合がまだ充分でないと、どの残基を次に変えなければならないかを決定しないといけない（Sec.16.0をみよ）。
Sec.15.9：他のアフィニティ分離方法
ＦＡＣがPartIIで決定した最適パラメータをもつ蛍光標識したターゲットを結合するＧＰを分離するのに使われる。我々は構造的に異なるものとして２つあるいはそれ以上の異なった色素を用いることにより蛍光標識への人工的結合を区別する。
電気泳動アフィニティ分離はバッファ中の別のイオンのみが人工的結合を与えるような未変化ターゲットを用いる。ゲル物質への人工的結合はフィールド方向には無関係に遅延をまねく、それで容易に除去できる。ＧＰの変異集団は色々な電荷をもつだろう
最初に、ＧＰの変異集団はターゲット物質を含まないゲルで電気泳動する。電気泳動はＧＰガレーンの長さに沿って分布されるまで続けられる。最初の電気泳動が実施されるターゲットのないレーンは除去できる妨害剤により、ターゲット物質を含む四角のゲルから分離される。妨害剤をとり除き、２回目の電気泳動を最初のとは直角に行う。ターゲットと結合しないＧＰは変わらない移動性でもって動くが、一方ターゲットに結合するＧＰはターゲットと結合しない大部分から分離するだろう。非結合性ＧＰの斜めの線が生成する。この場はけずりとり捨てられる。ゲルの残りの部分を溶解させ培養する。
Sec.16.0：次の多様化(変化)サイクル
ＰＢＤのどの残基が次の変化サイクルで変化させるべきだろうか？一般的な法則はできるだけ多くの集積された情報を保存することである。丁度変化したアミノ酸は最もよく決定されるものである。他の残基の環境が変わると、それらを再び変化させるのに適当となる。同時に変化させることができるよりも基本セットや第２セットには常に多くの残基があるので、我々は決して変化しない（最優先性）か、１つあるいはそれ以上のサイクルで変化しないかのどちらかでの残基を選択することから始める。もしも前のサイクルで変化するものを除いて全ての残基の変化が充分高いレベルの多様性を許さないことをみつけたなら前のサイクルで変化した残基は再び変化するだろう。例えば、もしも産生できる個々の形質転換体の数とアフィニティ分離の感度が７つの残基が変化する程であるなら、またもしも基本セットと第２セットが１３個の残基を含むなら、たとえいくらかの残基が連続して２回変化したとしても、我々は７つの残基を常に変化させるだろう。このような場合、我々は丁度変化した残基を使用した変化コドンに高い存在率で存在するアミノ酸を含むものとして選択する。
ＳＢＤとターゲット間の結合を産生するタンパク質配列を選択するための過程を許すのは情報の蓄積である。タンパク質と他の分子の境界は２０あるいはそれ以上の残基を含む。２０個の残基の完全な変化は１０26の異なるタンパク質を生成する。互いに空間的に近くにある残基を５個から２０個の残基の重なったグループに分けることにより、我々は大きな表面を変化させえるが、一度に１０7から１０9以上の候補をテキストする必要はないので、１０19から１０17倍節約になる。
変化させるべき残基を選択し、我々は再び、13.2で設定した原理により各残基の変化範囲を設定し、望ましい突然変異体をコードしたvgＤＮＡをデザインし（Sec.13.3）、ＧＰにvgＤＮＡをクローン化し（Sec.14）、そしてＳＢＤをもつＧＰをターゲットに結合させて選択する（Sec.15）。
Sec.17.0：他の考察
Sec.17.1：選択の組合せ
物質Ａには結合するが、物質Ｂには結合しない分子を選択するのに上述の方法のアフィニティ分離を修飾できる。物質Ａと物質Ｂをもつ２つの分離カラムを調整する必要がある。遺伝子パッケージの集団は上述の方法で調整するが、その集団をＡに適用する前に、Ｂに対して高いアフィニティをもつ集団のメンバーをとり除くために集団をカラムＢに通す。集団をＡに通す前にＢに結合しない集団を増幅する必要があるかも知れない。もしもＡとＢがある意味で同じで、Ａに対すアフィニティをもつものとしてＰＰＢＤが選択されたなら増幅が最も必要であるように思われる。
例えばＡには結合するがＢには結合しないＳＢＤを得るために、３つのカラムが一連のa)ＡでもＢでもないある化合物を支持するカラムあるいは礎質物質のみを支持するカラム、b)Ｂを支持するカラム、そしてc)Ａを支持するカラムに連結できる。ＧＰ（vgＰＢＤ）の集団はこの一連のカラムに適用でき、そのカラムはその応用で用いられる一定イオン強度のバッファで洗浄される。その２つのカラムははなされ、３番目のカラムはＡには結合するがＢとは結合しないＧＰ（ＰＢＤ）を単離するためグラジエンドで溶離される。
ＡとＢ両方に結合する分子を生成することもできる。この場合、我々は三次元モデルを用い、Ａに結合するように問題となる分子の１つの面を突然変異させる。それから、Ｂに結合する異なった面を突然変異させる。
物質ＡとＢは単に１つか２，３の残基が異なるタンパク質かも知れない。例えば、Ａは遺伝子がクローン化された天然のタンパク質かも知れないし、ＢはＡの全ての三次元構造を保持したＡの突然変異体かも知れない。Ａには結合するがＢには結合しないように選択されたＳＢＤはＢで変異された残基の近くでＡと結合するにちがいない。もしも突然変異がＡの活性部位（Ａが活性部位をもつと仮定して）でおこったとすると、Ａとは結合するがＢとは結合しないＳＢＤはＡの活性部位に結合し、Ａの阻害物質になるように思われる。
ＡとＢ両方に結合するタンパク質を得るために、我々は別々に、まずＡに結合するＳＢＤとＢに結合する別のＳＢＤを得る。それから我々はこれらのドメインをコードする遺伝子を２つのドメイン単一ポリペプチドが生成されるよう結びつけることができる。融合タンパク質はＡとＢ両方にアフィニティをもつだろう。
結合タンパク質の同じ部位に競合的なＡとＢに対してアフィニティをもつ結合タンパク質を生成できる。ＡとＢに対する部位を重ね合わすことにより競合を保証する。初めにターゲット基質Ａに結合する分子を構築する。それからa)Ａに結合するように変化させられた残基、加えてb)三次元空間でセット(a)の残基によく似るが、間的であり、ＡやＢと直接的には結合するようには思えない残基として定義される残基の１つのセットを変化させる。セット(b)の残基はＡとＢに対するアフィニティが少しだけ変化するような、セット(a)の残基の位置づけに小さな変化を生み出すように思える。これら集団のメンバーはＡとＢ両方のアフィニティに選択される。
Sec.17.2：非結合の選択
本発明の方法は選択されたターゲットには結合しないタンパク質を選択するのに用いることができる。ストレプトキナーゼのような望ましくない程度で抗原である薬理的に重要なタンパク質について考えてみよう。我々は薬理的に重要なタンパク質をＩＰＢＤとして、またそれに対する抗体をターゲットとすることができる。薬理的に重要なタンパク質の表面上の残基を変異し、抗体カラムに結合しないＧＰ（ＰＢＤ）を集め、培養した。表面残基はa)三次元構造から、b)疎水性の考察から、あるいはc)化学的標識のようないくつかの方法で同定した。薬理的に重要なタンパク質の三次元構造はもとの表面を変化させないままにするのをできるだけ少なくするように広い範囲で残基を選択するのを除いては、変化させるべき残基を選択する都合な指標を残している。
結合のしばしばの切断は結合境界にある単一のアミノ酸が変化させられることのみを要求する。もしもポリクロナール抗体が用いられたなら、我々は全てのあるいはほとんどの強いエピトープが単一分子間で変化させられるという問題に直面する。それ故、１つのモノクロナール抗体か、狭い範囲の抗体種が望まれる。もしも我々が一連のモノクロナール抗体のカラムをもつなら各モノクロナール抗体に対する結合をストップする１つあるいはそれ以上の突然変異を得ることになる。我々はそれからこれら突然変異のいくつかあるいは全てを１つの分子間に結びつけ、モノクロナール抗体としては認識されない薬理的に重要なタンパク質を産生する。このような突然変異体は薬理的に興味ある性質が突然変異により許容できない程度で変化してないかどうかをテストされなければならない。
典型的には、ポリクロナール抗体は抗原に対する結合定性の範囲を表示する。たとえ、我々が薬理的に重要なタンパク質に結合するポリクロナール抗体のみをもったとしても、我々は次のように進めるだろう。我々は複写できるＧＰの表面に表れるよう薬理的に重要なタンパク質を工学的に作る。我々はＧＰの集団が得られるように薬理的に重要なタンパク質の表面にある残基にあるいは薬理的に重要なタンパク質の表面にあると思われる残基に突然変異を導入する。ポリクロナール抗体とカラムに接着し、ＧＰの集団を低密度の塩でカラムに適用する。カラムを塩グラジエントで溶離する。最小の塩濃度で溶離するＧＰは薬理的に重要なタンパク質に最大のアフィニティをもつ抗体に結合することをとり除く方法で突然変異させられた薬理的に重要なタンパク質をもつものである。最小塩濃度で溶離したＧＰは単離され、培養される。単離されたＳＢＤは抗原決定基はひきつづいてとり除かれるように変異のひきつづいてのラウンドに対してＰＰＢＤになる。
Sec.17.3：構造の保持に対するＰＢＤの選択
我々は既知の結合タンパク質の三次元構造を保持する挿入あるいは削除を選択できる。その表面にＢＰＴＩを表現するＧＰについて考えよう。bpti-osp遺伝子で、我々は５つの変えられたコドン（3.2×106配列）をもつＫ２６やＡ２７でコドンを置換できる。Ｋ２６とＡ２７はターンにあり、トリプシン結合表面からほど遠い。我々はトリプシンに対し高い特異的アフィニティを保持するＢＰＴＩの変異体を発現するＧＰを単離するため結合を通して選択を用いた。
Sec.17.4：珍しくない生成した結合タンパク質
各ターゲットに対し、本発明の方法でみつけることができる多くのＳＢＤがある。集団にあるいくらかのＰＢＤはターゲットに結合するだろうという可能性を増すために、我々は我々が便利に結合を通しての選択に適用できる程大きな集団を生成する。この方法を管理すの重大な疑問は“いかに多くの形質転換体を我々は生成できるか？”と“いかに少なく結合を通しての選択を通して我々は要素をみつけられるか”ということである。遺伝学者は簡単な強い選択を用いて１０10分の１の頻度で突然変異を日常的にみつけることができる。変化の最適レベルは形質転換体の最大数と、選択の感度により決定される。それでいかなる納得できる感度に対し、我々は選択されたターゲット物質に対してより高いアフィニティをもつ一連のタンパク質を得るために斬新的な過程を用いるだろう。アフィニティプレートから１回の溶離過程で1000倍の増加が示されている。
異なる変異図式を用いることは異なる結合タンパク質を生成する。いかなる所与のターゲットに多くのタンパク質が結合するだろう。それ故、もしも１つの結合タンパク質がいくらかの理由（例えば、余りに抗原性）で適当となると、操作は異なる変異パラメータでくり返される。例えば、変化させる異なった残基が選ばれるかも知れないし、新しいアミノ酸の分布が同じ残基でテストされるように変化コドンでの異なったnt分布が選択される。たとえ残基の同じ基本セットが用いられたとしても、変化させるサブセットを選択する順序が変わると、異なったＳＢＤが得られるだろう。
Sec.17.5：可能な突然変異誘発の他の様式
ここで議論するＧＰの集団に多様性を創造する様式は可能な唯一の様式ではない。少なくとも１つの選択から得られる情報の大きなフラクションを保存し、そして同じドメインに他の突然変異を導入する突然変異誘発のいかなる方法も効力をもつ。制限要素は生成される個々の形質転換体の数とアフィニティ分離を通して成就できる強化量である。それ故、好ましい具体例はＰＢＤの結合特性に最も影響するように思われる残基に突然変異をおこさせ、またＩＰＢＤの重要な構造をこわすとは思えない方法を用いることである。
突然変異の他の様式は考えるべき他のＧＰを許すだろう。例えば、ラムダバクテリオファージは制限部位過剰のためカセット式突然変異の有用なクローニング伝達手段ではない。しかしながら、特別な制限部位の必要なしにラムダ上に一本鎖オリゴ-nt指向の突然変異が用いられる。何人といえども本発明に要求される高レベルの多様性を導入するための一本鎖オリゴ-nt指向突然変異を用いることはできないが、もしも可能なら、このような方法はおおきなゲノムをもつファージを用いることは許される。
例１
ＨＨＭｂに結合するＢＰＴＩ派生の結合タンパク質Ｍ１３ファージで表示
下記は通常のＥ．ｃｏｌｉバクテリオファージＭ１３を遺伝子パッケージとして用いるウマ心臓ミオグロビン(ＨＨＭｂ)のためのアフィニティと結合するＢＰＴＩからの新規な結合分子を増殖するプロトコルの仮説的な実施例である。なお、所望の結果を得るには、ここに開示された所に従ってより適切な最適化が必要であることは了解されたい。好ましい方法での可能な変形例はこの仮説的実施例の種々のステップの次に続いて論述される。
仮説により我々は次の技術的可能性を設定した。
0003771253.tif 000010
実施例１
第１部
この実施例では、我々は複製可能GPとしてM13を、そしてIPBDとしてBPTIを用いる。第１部において、M13誘導体の外面上において顕示されたBPTIを得ることだけを取り扱うこととする。可変DNAはosp-ipbd遺伝子中に導入し得ようが、BPTIのトリプシン結合性域をコードする域内には導入できない。BPTIがひとたびM13誘導体のM13外面上に顕示したら、アフィニティ分離の処理を最適化する第２部に進む。
この実施例のために、我々はE.coli.のフィラメント状バクテリオファージ、M13を選んでいる。我々は、成長能力のある細菌の細胞よりも、ファージは物質代謝力が非常に少ない故にファージを良しとする。我々は、胞子よりもファージを良しとする。それはウイルス粒子生成の分子メカニズム及びウイルス粒子の三次元構造が、胞子の胞子生成及び構造の相当する成立プロセスの理解よりも非常によく理解されるからである。
M13は大変よく研究されたバクテリオファージであり、DNA配列のためまた遺伝子ベクターとして広く使用されており、それはフィラメント状ファージの群の典型的メンバーである。ファージの中から選ばれることができるM13及び他のファージに関する事項は、Sec.1.3.1に引用されている。
他のバクテリオファージに比して、フィラメント状ファージは一般に魅力あるもので、特にM13は次のことから魅力あるものである。
1)ウイルス粒子の三次元構造が知られている、
2)コートタンパク質の処理法がよく理解されている、
3)ゲノムが膨張性である、
4)ゲノムが小さい、
5)ゲノムの塩基配列が知られている。
6)ウイルス粒子が物理的にせん断力、熱、冷却、グアニジニウムＣ１、低ｐＨ及び高塩に対して抵抗性である、及び
7)ファージは、塩基配列化が、特に容易であるので、配列化ベクターである。
8)抗生物質耐性の遺伝子が予測可能な結果をもってゲノムにクローンされている(HINE80)。
Sec.1.0.及び1.3に列挙されている他の基準も同様に満足される。即ち、M13は容易に培養され貯蔵され得る(FRITS85)、感染後、各感染細胞は100〜1000のM13子孫を生ずる。M13は異常又は高価な媒質を必要とすることなく、また容易に産生され濃縮される(SALI64,YAMA70,FRIT85)。M13は物質的作用、即ち温度(85℃、30分で10%のファージが生存)、せん断(ワーリング  ブレンダーで殺せない)、デシケーター（適用不能）、放射線（適用不能）、経時（数年間安定）に対して安定である。
M13は化学薬品に対して安定である。即ち、pH(<2.2(SMIT85))、表面活性剤：適用不能、シャオトロープ（グアニジニウムHCl=6.0M）、イオン（特に感受性なし）、有機溶媒（エーテル及び他の有機溶媒は致死（MARV78）、プロテアーゼ（適用不能、HHMbは、非プロテアーゼ）。M13は他の酵素に感能するとは知られていない。
M13ゲノムは6423b.p.であって、その配列は公知である(SCHA78)。ゲノムは小さく、カセット[cassette]突然変異誘発は一本鎖オリゴnt支配の変異誘発と同様に、RF M13(AUSUS7)上で実際的である。M13はプラスミドであってそれ自体形質転換システムであり、そして理想的な配列付ベクターである。M13はE.coliのRec株上で成長させることができる。M13ゲノムは膨張性である(MESS78,FRIT85)。M13は何等有益とはならないが、細胞を溶解することがない。遺伝子VIIIの配列は知られており、アミノ酸配列はLacUV5プロモータを用いて合成遺伝子上にコードすることができ、そしてLacＩリプレッサと共同して用いられる。lacUV5プロモータはIPTGにより生起される。遺伝子VIIIタンパク質は十分研究されたプロセスにより分解され、A23とA24の間で分割される。遺伝子VIIIタンパク質の残基18、21、22、及び23は分割を制御する。成熟した遺伝子VIIIタンパク質は円状ssDNAの周りにシース[sheath]を作る。f1ウイルス粒子の三次元構造は中程度のリゾルーションにおいて[at medium resolution]知られ、遺伝子VIIIタンパク質のアミノ末端はウイルス粒子の表面上ある。M13遺伝子VIIIタンパク質への融合は何ら報告されていない。M13コートタンパク質の二次元構造は三次元構造において暗示的である。成熟M13遺伝子VIIIタンパク質は１つのドメインのみを有する。４個の微量な[minor]タンパク質即ち遺伝子III、VI、VII及びIXがある。これらの微量タンパク質の各々は、ウイルス粒子当り約５コピーであって、形態形成又は感染に係わっている。主要なコートタンパク質は、ウイルス粒子当り2500コピーより多く存在する。
M13遺伝子VIIIの他の遺伝子への融合は報告されていないが、ウイルス粒子三次元構造の知得は、IPBDの成熟M13コートタンパク質(M13 CP)のアミノ末端への付加を全く興味深くさせる。BPTIのM13CPへの直接的融合が、BPTIをM13表面上に顕示させない万一の場合には、BPTI配列の１部及び／またはBPTIとM13CPとの間の挿入体の短いランダムDNA配列を変化させる。スミス（SMIT85）及びデラクルス等(CRUZ88)は、遺伝子III中への挿入は、新しいタンパク質ドメインを生ぜしめ、ウイルス粒子外面上に出現することを示した。bpti遺伝子をm13cp遺伝子に融合させることによって、BPTIをウイルス粒子外面上に出現させることができないならば、我々はbptiを、遺伝子IIIにスミスによりまたデラクルス等により用いられた部位か、末端の１つに、融合させるであろう。我々は若干の変化させられていない遺伝子IIIタンパク質が存在するように、遺伝子IIIの第２の合成コピーを使用するであろう。
遺伝子VIIIタンパク質は、多くのコピーに存在する故、またウイルス粒子中の位置及び配向[orientation]が知られている故に、OSPとして選ばれる。コートタンパク質自体のアルファ螺線軸についてコートタンパク質の方位の不確かさは重要でないことに留意されたい。
f1の三次元モデルは、BPTIのM13CPの末端への融合が、他の融合部位よりも可能性高く官能性タンパク質を生ぜしめることを強調している。(Sec.1.3.3.参照)
M13プレコート（SCHA78）のアミノ酸配列(AA-seq 1と呼ぶ)は、次の通りである。
0003771253.tif 000011
アミノ酸の単一文字コード及び不明瞭[ambiguous]DNAのためのコードは国際的に認められているものである(GEOR87)。新規タンパク質ドメインをM13CPに挿入するため最良の部位はA23のあとであり、これはSP-ＩがA23の後のプレコートタンパク質を切るからである(矢印に示す)。分泌され得るタンパク質はそのアミノ末端において成熟M13CPに結合するであろう。成熟M13CPのアミノ末端はウイルス粒子の外面に位置するから、導入ドメインは外側で顕示するだろう。
BPTIはすべての基準と合致もしくはそれを越えているので、この実施例のIPBDとして選ばれる。即ちそれは小さく、周知の三次元構造を有する非常に安定なタンパク質である。Marks等(MARK86)は、phoAシグナル ペプチド遺伝子フラグメントとBPTIの成熟形をコードするDNAとの融合は、天然のBPTIをE.cdliの細胞周辺(periplasm)に出現させたと報告し、これはBPTIの構造においてそれが分泌されることを妨げるものは何もないことを物語っている。
Marks等（Mark87）はまた、BPTIの構造はシスチン ブリッジの１つを除去しても安定であることを示した。彼はこれをC14,C38の両者を２個のアラニン又は２個のスレオニンの何れかで置き換えることによって行った。彼らが除去したC14/C38シスチン ブリッジはBPTI中の切れ易い結合に非常に近接しているものであって、驚いたことには、両者の変異分子は、トリプシン インヒビターとしての作用があった。このことは、BPTIは過剰に安定であり、そこまで数多くの表面の変異にもかかわらず略同じ構造にたたみこまれているようである。相同体の知得を用いて(下記参照)、我々は、基本のBPTI構造が維持されるべきであるとすると、変化されてはいけない残基はどれかを推論することができる。
BPTIの三次元構造がＸ-線回折により(HUBE77,MARQ83、WLOD84、WLOD87a、WLOD87b)また中性子回折(WLOD84)更にはNMR(WAGN87)により高度分解能において測定された。寄託されたX-回折構造の１つ「６PTI」の中に、A58は何らA58の電子密度はなく、A58は特異的に決定された一致を有しないことを示した。そこで我々は、カルボキシ基がたたみこまれた構造中でなんらか重要な相互反応をなさないことを知る。BPTIのアミノ末端基はカルボキシ末端基に非常に近い。ゴルデンベルグとクレートンは、円形化した[circularized]BPTIと円形に順列を入れ換えた[circuraly permuted]BPTIについて報告した（GOLD83）。BPTIに相同な若干のタンパク質は何れかの末端に多少の残基を有する。
BPTIは「タンパク質の折りたたみの水素原子[the hydrogen atom of protein folding]と呼ばれ、無数の実験的または理論的研究の主題であった(STAT87,SCHW87,GOLD83,CHAZ83)。
BPTIは、少なくとも32個の相同タンパク質が知られているという付加的利点を有する(表１３に示される)。イオン性グループの符号[tally]は、表１４に示され、各々の残基に生ずるアミノ酸のタイプの複合体[composite]は表１５に示される。
BPTIは自由に水に溶け金属イオンとの結合は知られていない。BPTIは何ら知られた酵素活性を有しない。BPTIはトリプシンに結合する、（Kd=6.0×10-14M(TSCH87)。BPTIは毒性ではない。BPTIのK15がLに変化すると、変異BPTIとトリプシンとの間に測定できる結合はなくなる(TSCH87)。
保存[conserve]された残基のすべては埋められ、７個の十分保存された残基のうちG37のみが観察可能の露出を有する。BPTIにおける各残基のソルベント アクセスビリティは表16にあげられ、それはBrookhaven Protein Data Bankの登録「6PTI」のソルベントラジウス[solvent radius]1.4 A,表７で与えられた原子半径及びリー及びリチャーズの方法（LEEB71）から計算された。
保存されていない51個の残基は各々、アミノ酸の２種類以上を収容することができる。各々の残基において、その残基に既に観察されたアミノ酸だけを独立的に置換することにより、我々は略7×1042個の異なるアミノ酸配列を得ることができた。それら配列の大半は、BPTIと非常に類似した構造に重なっているであろう。
BPTIは巨大分子用のIPBDとして有用であろう(Sec.2.1.1)。BPTIとBPTI相同体は多くの酵素を、かたくまた高い特異性をもって結合する。
BPTIは非常に高いpHでは例外だが、強くプラスに荷電され、そこでBPTIは、意図する使用条件のもとであまり強くないプラスのターゲットのためのIPTIとして有用である(Sec.2.1.2)。かし全く異なる電荷を有するBPTI相同体が存在する(即ち,-7におけるBombyx moriからのSCI-III及び-1におけるウシ初乳からのトリプシン インヒビタ)。表面上にBPTIを顕示するM13の誘導体が発見されたら、BPTIドメインの配列は、酸性または中性のBPTIを産生する相同配列の１つで置き換えることができる。
BPTIは酵素ではない(Sec.2.1.3参照)。BPTIは非常に小さいが、もしこれが薬学的な問題を引き起こすのであれば、２以上のBPTI-誘導ドメインを、２個のドメインを有するヒトのBPTI相同体におけると同様に、結び付けてもよい。
M13誘導体は好ましいOCVである(Sec.3参照)。「ファージミド[phargemid]」は、ファージとプラスミドとのハイブリッドであって、この発明に用いられる。ファージミドを有する細胞から遊離された二本鎖プラスミドDNAは標準協約により命名されている（例えばPXY24）。これらの細胞から調整されたファージはXY24と表示されたであろう。Bluescript K/S（Stratagene発売）のようなファージミドは、我々の目的には適当でない。それはBluescriptはM13の全部のゲノムを含んでいなくて、助人ファージとともに共感染により救済しなければならないからである。このような共感染には、本発明のためには不適当なヘテロジーナスなファージを生ずる遺伝子組み換えに導く可能性がある。
バクテリオファージM13 bla 61(ATCC 37039)は、野性型M13からベータ ラクタマーゼ遺伝子の挿入を介して導かれる。このファージはDNA 8.13kbを含有する。M13 bla cat 1(ATCC 37040)は、M13 bla 61から、クロラムフェニコール耐性遺伝子（HINE80）を更に追加挿入することを通じて導かれる。M13 bla cat１はDNA 9.88kbを含む。M13のこれらの変異株の何れも複製のColE 1源を含んでいないが、何れも本実施例のための有用なクローニング  ベクター構成用の出発物として使用できよう。
この実施例のOCVは、図４に示された方法によって構築される。本実施例のため構築されたプラシミド及びファージミドのすべてについての簡単な記述は第17に見られる。
ss oligo-nt部位指向の変異誘発のためには、多くのプライマーが高い効率に導く。３種の非変異誘発性プライマー、wt M13の2326-2352塩基、wt M13の4854-4875塩基、及びpBR322の3431-3451塩基の補体が使用される。pLG2及びその誘導体は、＋DNA鎖中にampR遺伝子のアンチセンス ストランド[anti-sense strand]を含有している。セグメントは高BC含有量にするため、またpLG７ゲノムを略等長の数個のセグメントに分けるために取りあげられる。
OCVを構築するのに必要な遺伝子工学手順は、商業的に入手できる制限酵素を推奨された条件で用いる標準的なものである。DNAのすべての制限フラグメントはHPLC又は電気泳動法により精製される。M13及びその工学処理された誘導体は、E.coli株PE384(F+、Rec-、Sup-、Amps)に感染させられる。M13の誘導体プラスミドDNAは，カルチャー中で多数回の感染を避けるようにE.coli株PE383(F-、Rec-、Sup+、Amps)に形質転換される。M13ファージの取り出しは、Salivar et,al.（SALT64）の手続きにより、複製可能の形（RF）M13の取り出しはJazwinski et,al.(JAZW73a及びJAZW73)の手段による。複製の源ColE1を含有するプラスミドの遊離はMaviatis（MANI182）の方法による。
我々は、便利な抗生物質抵抗遺伝子として、pBR322からampR遺伝子を選ぶ。カナマイシンのような別の抵抗遺伝子も用い得る。pBR322のAcc I-から-AatIIのフラグメントは、anyR及びCol E1オリジンを便利に得られる源である。
M13mp18（NewEngland BioLabs）はAatII、AccＩの何れの部位も有しない。それ故我々は、ampR遺伝子及びColEＩの複製オリジンを有するpBR322のAatII-〜-AccＩフラグメントを挿入することを得しめるアダプターを、M13mp18の所望の位置に挿入する。M13mp18はlacUV5プロモータ及びlacZ遺伝子を含有し、これらは本発明の目的には、有益ではない。M13mp18をAvaII及びBsu36Iでカットし、略600の中間塩基ペアを除くことにより、我々は、bpti遺伝子VIII遺伝子を作り出すために有用な数種の酵素の認識部位のすべてを除去する。
次のアダプターが合成される。
0003771253.tif 000012
アンニールしたアダプターはRF M13mp18で連結される。RF M13mp18はあらかじめAvaII及びBsu36Ｉで切断されPAGE又はHPLCにより精製されたものである。形質転換された細胞はアンピシリンでプラスミド取りこみのためとりあげる。生じた構築はpLG1と呼ぶ。
pLG1からのDNAは、AatII及びAccＩ両者でカットされる。pBR322のAatII-〜-AccＩフラグメントは、LG1のバックボーンに連結される。正しい構築物をpLG2と命名する。
AccＩ制限部位はもはやベクター構築には必要ない。この部位を除去するため、RF pLG2 dsDNAがAccＩでカットされ、クレノウ  フラグメント及びdATP及びdTTPで処理されてブラントとし、次いで再連結される。クローニング  ベクター（pLG3と命名）はosp-ipbd遺伝子の段階的挿入に万全である。
我々は今やBPTIドメインをM13誘導体、LG7の外面に出現させるであろう遺伝子をデザインするに十分である。
M13の外側に付着した新規タンパク質ドメインを得るために、我々は、M13のプレコートタンパク質のA23の後に成熟BPTIをコードするDNAを挿入する。成熟BPTIは荷電アルギニン残基で始まり、シグナル  ペプチダーゼＩによる切離がかかる場合通常である。シグナル  ペプチダーゼＩ（SP-Ｉ）は、M13コートタンパク質とBPTIとのキメラをA23の後でカットし、そのカルボキシ末端でM13CPのアミノ末端に付着された成熟BPTIを残す。
次のアミノ酸配列（AA-seq２と呼ぶ）が、成熟BPTIのための配列（下記）をM13プレコートタンパク質（矢印で示す）のシグナル配列の直後でM13CP配列の前に挿入することにより構築される。
0003771253.tif 000013
融合タンパク質の配列番号は特記しない限りコードされた融合を引用する。かくしてM13CP開始のアラニンは、「82番」、「M13CPの１番」または「成熟BPTI-13M融合の59番」と呼ばれている。
osp-ipbd遺伝子はlacUV5プロモータにより調整され、tripA転写ターミネータにより終結する。ホスト株のE.coliはlacＩq遺伝子を入居[harbor]させる。osp-ipbd遺伝子が発現され、野性型遺伝子VIIIと平行に処理される。M13CPドメインとつながったBPTIよりなる新規タンパク質は、コートのフラクションのみを形成する。アフィニティ分離はアフィニティマトリックス（SMIT85）に対して高い親和力を有する５個または６個のみの分子コピーを含有することができる。キメラタンパク質の１％組入れは、表面露出した約30コピーのタンパク質を生ずる。これが不十分であるなら、追加のコピーは例えばIPTGを増加することにより提供される。
MARVIN及び共同研究者(BANN81)のf1のためのモデルの後のM13コート及びBrookhaven Protein Data Bank登録「6PTI」からとられたBPTIドメインよりなるモデルが標準的モデル構築法により構築された。この標準法は共有供給の長さと角度が許容される値に近いことを確かめる方法である。モデルは融合タンパク質が、M13CP又はBPTIドメインの何れもの内部構造を損なうことなく立体化学的に受け入れられる融合における超分子構造に適合し得たことを示す。
AA-seq２のためのあいまいなDNA配列コーディングは、制限酵素にとっての認識部位がアミノ酸配列を変えることなく何処で創られ得たか、その場所をコンピュータプログラムによって検査される（Sec.4.3参照）。酵素のマスターテーブルが酵素供給者のカタログから収集される。OCVを切らない酵素である（好ましくは上記のように構成される）。
Sec.4.3において与えられた手順を用いて、我々は、表25に示されるもののようなipbd遺伝子をデザインする。ある制限酵素（例、BanＩ又はHphＩ）はOCVをあまりしばしば切りすぎて価値がない。
注訳付きのm13cp-bpti融合の全DNA配列は表25に示される。有用制限部位及び生物学的に重要な特徴、即ちlacUV5プロモータ、lacOオペレータ、シャイン−ダルガルノの配列、アミノ酸配列、ストップコドン及び複写ターミネーターを示している。
ipbd遺伝子は、Sec.5.1記載の方法を用い数段階を経て合成され、150〜190塩基対のdsDNAフラグメントを発生する。
我々がm13cp-bpti遺伝子（本実施例のosp-ipbd遺伝子）の合成フラグメントをpLG3及びその誘導体にクローンする４つの段階は図５に図示される。
pLG3に導入されるべき配列は、a)RsrIIからAvrII(表25)までのセグメント、b)スペーサー配列（gccgctcc）、及びc)AsuIIからSauＩまでのセグメントよりなっている。セグメントは158の塩基長であって、明細書のSec.5.1に記載されているように、２個のより短い合成oligo-ntsから合成される。
表27は挿入すべき配列のアンチセンス鎖を示す。99塩基フラグメントは上方のケースレター中に示され、次の(5'-CCGTCC....CCTCG-3'=olig#3)が標準方法で合成される。同様にセンス鎖の100塩基長フラグメントは下方のケースに示され、（5'-cgctca....aattg-3'=olig#4）が合成される。アニーリングの後、二本鎖領域は、クレノウフラグメントで既記の手順により膨張され、全長179塩基の２本鎖にする。重複領域は23塩基対長であり、14のCGペアと９のATペアを含有する。AVrIIとAsuIIとの間のDNAは最終のpbd遺伝子において何もコードしない。それは、次の工程で同時にAvrIIとAsuII両者により切られ得るようにそこにある。８塩基がRsrIIの左に加えられ、９の塩基がSauＩの左に加えられた（Bsu36Ｉと同じ特異性と切断様式）。末端におけるこれらの塩基は最終産物の部分をなさない。これらは、制限酵素が合成DNAを縛りそして切って、特定の粘着性ある末端を作るため存在しなければならない。
合成DNAはSauＩ及びRsrII両者で切られ、そして同様に切られたpLG3のdsDNAに連結される。正しい挿入を有する構築をpLG4と呼ぶ。
OCVの構築の第２工程は表28に示されている。pLG4の構築と同様に、一重鎖DNA２片が合成される。p25末端のアンチ-センス鎖の99塩基長フラグメント及び（p18で出発する）99塩基長フラグメントである。両者の合成dsDNA及びdsRF pLG4はAvII及びAsuII両者で切られ、そして連結され、そしてE.coliを形質転換するために用いられる。この第２の挿入を運ぶ構築物をpLG5と呼ぶ。
pLG6の構築はpLG5の構築と同じように進行する。配列は表30に示される。２個の一重鎖セグメント（１つはN66で終わるアンチ-センス鎖からのもの、他はY58のコドンの３番目の塩基で出発するセンス鎖からなるもの）が合成、アンニールされそしてクレナウフラグメントで膨張される。合成DNA及びRF pLG5の両者は、BssHI及びAsuII両者で切られ、精製され、そして適当な片が連結されE.coliの形質転換に用いられる。
pLG7の構築は表32に示され、pLG4、pLG5及びpLG6の構築と同様に行われる。２個の一重鎖セグメント（１つはV110のためのコドンの１番目の塩基で終わるアンチ-センス鎖からのもの、他はE101で始まるもの）が合成され、アンニールされそしてクレノウフラグメントで膨張される。合成DNA及びRF pLG6の両者は、Bbe及びAsuII両者で切られ精製されそして適当な片が連結されそしてE.coliの形質転換に用いられる。正しい４番目の挿入をもつ構築物はpLG7と呼ばれ、pLG7の外面上のBPTIの発現はSec.8の方法で証明される。
Ml3am429は、M13から導かれるファージのためのアフィニティマトリックスにより非特異的結合を減少させるために用いられるM13のamber変異である。MBam429はwtM13から標準的遺伝子操作方法によって導かれる。
ファージLG7が、培地に加えられた種々の濃度のIPTGを含むLB培地中でE.cole株PE384上で成長され、osp-ipbd遺伝子を誘発する。ファージLG7はIPTG0.0、0.1,1.0,10.0,又は100.0M又は1.0mMで成長された細胞から得られ、Saliver法（SALI64）により回収され、そして濃縮されてMessing法（MESS83）により1012pfy/mlのタイターを得る。
LG7がその表面でBPTIを発現するかどうかを決定する好ましい方法は、これらのファージがトリプシン(trp)又はアンヒドロトリプシン（AHtrp）の標識誘導体を、非結合のtrp又はAHtrpの通過を許すフィルター上に止めることができるかどうかを試験することである。トリプシンは10個のチロジン残基を有し、標準方法により125Ｉでヨード化され得る。この標識トリプシンを我々は「trp」を、そして標識アンヒドロトリプシンを「AHtrp」で示す。他の型の標識は、例えばビオチン又は、蛍光標識であり得る。AHtrp又はtrpは0.3uCi/ugの活性まで標識される。1012LG7(10mMIPTG)のサンプルが、10mMKclバッファー1.0ml中の1.0ugのtrp又はAHtrpと混合され、１mMKzHPO4/KHZPO4でpH8.0に調整される。混合物は、Mr=300,000より小のタンパク質を通過せしめる外層膜フィルタを固定したアミコンMSP1系統を通させる。フィルタは分析に先立ちtrip又はAHTrpを含むバッファに漬けられる。フィルタはtrip又はAHTrpを含有するバッファ0.5mlで２回洗浄する。フィルタ上に止まった放射活性をシンチレーション  カウンター又は他の適当な手段で定量する。各ウイルス粒子がBPTIの１つのコピーを発現するならば、0.05ugのタンパク質が結合し、フィルタ上で３×104/minを引き起こす。
BPTIのLG7表面上の定量的発現に対するも１つの方法は、トリプシンとBPTIとの化学当量論的結合を用いBPTIを滴定することである。各ウイルス粒子が非感染であるならばファージ1012pfu/mlのタイター溶液は略1.6×10-9ファージである。pfu対トータル  ファージの比は、wtM13に比較した時のLG7の増加長を補正する260nmと280nmにおける分子吸光係数を使用してスペクトロメトリーにより決定することができる。例えば、1.0mMのIPTGと共に成長した1012pfuのLG7ファージを含有する溶液1.0mlが、4.8×10-Mまでトリプシン溶液を阻害するとすれば、我々は略300BPTI/GP(即ち(BPTI4.8×10-7分子／１)／（ファージ1.6×10-9／１）)が存在すると計算する。特定濃度の阻止は、ペプチド-リンク染料、例えばＮ-ベンゾイル-Arg-Nau（TSCH87）を用いるスペクトロメトリーにより最も容易に測定される。
更には、アフィニティコラムへの結合が、ファージLG7の表面上のBOTIの存在を明らかにするため使用されてもよい。BioRad Affi-ゲル10マトリックス及びアフィニティ材としてのAHtrp30mgを有する全容2.0mlのアフィニティコラムをBioRadの方法で調整する。このコラムの空隙容（Ｖｖ）を1.0としよう。このコラムを（AHtrp）で示す。
1012M13am429のサンプルを、KH2PO4／K2HPO4でpH8.0に緩衝化した10mMKcl1.0ml中の(AHtrp)に適用する。次にコラムを同じバッファで、エフルエントの280nmにおける光学密度のベースライン又は4×Vv(何れが最初としても)への復帰がコラムを通じて過ぎてしまうまで洗浄する。LG7又はLG10は次に閉鎖した同じバッファ1.0ml中1012pfu/mlにおいて(AHTrp)コラムに適用する。この洗浄の次に、Kclの(3×Vvにおける)10mMから2Mのグラジェントをリン酸塩でpH8.0に緩衝化しコラムに通ずる。次に最初のKclグラジェントを3×Vv中2Mから5MのKclグラジェント溶離にかける。第２のKclグラジェントは5MKcl中2×Vvにおける0.0Mから2.0Mのグアニジウムclのグラジェント溶離(リン酸塩緩衝化pH8.0)を次に行う。50ulのフランクションを集め、各フランクション４ulを適当に希釈して感応細胞上におくことによりファージ分析を行う。コラム上のファージ保留は、コラムからコントロールファージLG10又はwtM13よりも著しく遅く溶出するフランクションにおけるLG7の出現により示される。BPTIを表現するLG7の単離の成功は検証され、bpti挿入及び供給は配列分析され、そしてこの単離体は以下に示す更なる実施に用いられる。
vgDNAをBPYI変異体とM13CPの間の官能融合を得るために使用するならば（下記参照）、クローン単離体からのDNAは変化を与えられた領域において配列分析する。次に有用な制限酵素には必要のない制限サイトを、できればからコドン変化により、除去する。OSP-IPBD中の残基の配列の数は他からの挿入により変化するであろう。この後我々は、しかし、残基23の後に挿入された残基を23a、23bなどと表す。残基81の後の挿入体を81a,81bなどと表す。これはC5とC55との間の残基の番号付を維持する。BPTI中の残基C5は融合体中で常に28として表示され、残基C55は常に78として表示され、そして中間残基は一定の数を有する。
10mMIPTGと共に成長した細胞からのLG7ファージがその表面にBPTIを発現しないならば、我々は若干の選択を持つ。我々は構築が何故に期待するような働きを欠いたかを決めようとする。色々な可能性ある欠損モードがある。それには、a)BPTIはM13シグナル配列から切り離されていない、b)BPTIはM13CPから切り離されている、そしてc)キメラタンパク質が作られそしてジグナル配列の後で切り離されるが、生じたタンパク質がM13コートに組み込まれていない。BPTIはE.coleから分泌された（MARK86）が、M13コートタンパク質は使用されなかった。それ故、ジグナル配列から由来する問題は一様ではないが可能である。我々はtry又はAntryを用いるアッセイによりBPTIがLG7-感染細胞のペリプラスム或は細胞の内幕への境界に存在するかどうかを測定することができた。ペリプラスム内のタンパク質は濃縮スクロース溶液中のリゾチーム及びFDTAを使用するスフェロフラスト生成を介して遊離となり得る（BIRD67,MALA64）。BPTIがペリプラスム中で遊離となったならば、上澄中で見出されたであろう。tryを上澄と混合し、非変性分子量測定コラムに通じてラジオアクチブなフラクションを集めたであろう。次にラジオアクチブフラクションをSDS-PAGEにより分析し銀染色によりBPTI-サイズのバンドを試験したであろう。
スフェロプラスト生成は、内膜にアンカーしたタンパク質を露出させる。スフェロプラストをAHTrpと混合し、ロ過か遠心分離の何れかで未供給のAHTrpからそれらを分離する。高張バッファで洗浄した後、スフェロプラストを、AHTrp結合の程度を求めて分析するか、又はウェスターン分析により分析するかにより分析する。BPTIがペリプラスム中に遊離に見出されるならば、キメラタンパク質が、BPTIとM13成熟コート配列との間及びBPTIとシグナル配列との間、両者において切り離されつつあったことを予測したであろう。その場合において、我々はAA-seqの残基−78〜82のためのコドンにおいてngDNAを挿入することによって、BPTI／M13cp結合を変えたであろう。
BPTIが内膜に付加すると見られるならば、２つの期待できそうな説明がある。第１のものは、キメラタンパク質がシグナル配列の後で切られるがLG7ウイルス粒子に組み込まれないというものであり、処理はまたAA-seg2の残基-78と82との間にvgDNAを挿入することであろう。別の仮説は、シグナル配列が切り離されてもBPTIはたたむことができそしてトリプシンと反応することができたということである。細胞のホモジネートから単離されたトリプシン-結合性材料のN-末端アミノ酸配列付は、どのような過程がおこりつつあるかを決定する。シグナル配列が切り離されようとしていたならば、C78とA82との間の残基を変化させるために上記の手段を用いたであろう。続いての道は残基81の後に残基を加えることであろう。もしシグナル配列が切り離されていなかったならば、我々はAA-seq2の23と27との間の残基を変化させよう。次の道程は、プロセスが23の後に残基を加えることであろう。
BPTIがペリプラズムにも内膜にも見出されなかった場合は、この欠損はシグナル配列又はシグナル-配列-BPTI結合中にあると予想したであろう。この場合における処理は23と27との間のタンパク質を改変することとなろう。bpti-遺伝子VIII融合に変化を誘発する若干の実験が可能であり、それらは次のものを包含する：
1)olig#2およびolig#13を使用する残基78と82の間の3個の変化を与えたコドン、
2)olig#14とolig#15を使用する残基23と27間の3個の変化を与えたコドン
3)olig#13およびolig#12aを使用する残基78と82の間の5個の変化を与えたコドン、
4)olig#15とolig#14aを使用する残基23と27間の5個の変化を与えたコドン
5)olig#13およびolig#12bを使用する残基78と82の間の7個の変化を与えたコドン、
6)olig#15とolig#14bを使用する残基23と27間の7個の変化を与えたコドン
BPTI-M13CP結合を変化するために、我々は78と82の間のタンパク質のためのコドンに変化を与えたDNAを、pLG7のSphＩ及びSfＩ部位に導入する。最後のシスティンの後のタンパク質はBPTIに相同のアミノ酸配列において組成並びに長さ両者とも変異性が高い。25にこれらのタンパク質はG79,G80及びA81として表示されている。M13CPの最初の部分はA82、E83及びG84で表されている。oligo-ntsの1つ、olig#12,olig#12a又はolig12b及びプライマーoligo#13は標準方法で合成される。oligo-ntsは次の通りである。
0003771253.tif 000014
ここで、qは(0.26T,0.18C,0.26A及び0.3G)の混合物であり、fは(0.22T,0.16C,0.40A及び0.22G)の混合物であり、そしてｋはＴ部とＧ部の同部混合物である。下方のケースにおいて何れかの末端に示される塩基はスペーサーであって、クローンした遺伝子には組み込まれない。プライマーは長鎖のoligo-ntsの各々の３′-エンドに相補性である。変異付与oligo-ntsの１つとプライマーoligo#13が当モル量組合わせられアンニールされる。dsDNAはすべての４（nt）TPs及びクレノウフラグメントをもって完成される。生成dsDNA及びRF pLG7はSfiＩ及びSphＩ両者で切られ、精製され、混合されそして連結される。この連結混合物はSec.15記載のプロセスを通して進行させる。このプロセス中で我々は、IPTGで誘発された時AHTrpを結合する形質変換したクローンを選ぶ。
M13シグナル配列BPTIとの間の結合の変法として、我々は23と27間のタンパク質のためのコドンのところで変化を与えたDNAをPLG7のKpnＩ及びXhoＩの部位に導入する。最初の３個のタンパク質はBPTIに相同なアミノ酸配列において高い変動性である。相同体配列はアミノ末端における長さにおいても変動する。oligo-ntsの１つ、oligo#14、oligo14a又はoligo#14b及びプライマーoligo#15は標準方法で合成される。これらのoligo-ntsは次に記載される。
0003771253.tif 000015
ここでｑは（0.26T,0.18C,0.26A及び0.30G）の混合物であり、ｆは（0.22T,0.16C,0.40A及び0.22G）混合物であり、ｋはＴ部とＧ部との同部混合物である。下方のケースにおいて何れかの末端部に示される塩基はスペーサーである。変えられたoligo-ntsの１つとプライマーとが当モル量組合わせられ、そしてアンニールされる。dsDNAはすべての４個の（nt）TPsとクレノウフラグメントをもって完成される。生成dsDNA及びRF PLG7 KpmＩ及びXhaＩ両者でカットされ、精製され、混合されそして連結される。この連結混合物は、Sec.15記載のプロセスを通して進行させる。そのプロセスにおいて、我々はIPTGで誘発した時、AHTrpまたはtripを結合する形質転換したクローンを選択する。
これらのアプローチの何れもが作用あるキメラタンパク質を産生しないならば、我々は異なったシグナル配列、又はM13中の異なったOSP(例えば融合(フュージョン)データが存在する遺伝子III（CRUZ88）、又は別の遺伝子パッケージを試すことができる。
例１
第２部
BPTIは、トリプシンに（kd＝6.0×10-14Ｍ）およびアンヒドロトリプシンに非常に堅固に結合するので、これらの武士はLG７上に顕示するための量のBPTIまたはカラムに付着させる量の親和性分子を、最適化するためには好ましくない。Tscheche等は、数種のBPTI誘導体の種々のプロテアーゼへの結合について報告している：
0003771253.tif 000016
Tscheche等の報告から、我々は、「＋」の印を付けた分子対は3.5×10-6Ｍより大きいkdを有することを意味し、そして「−」を付けた分子対は3.5×10-6Ｍよりさらに大きいkdを有することを意味するものとする。BPTIおよび種々の突然変異種のトリプシンおよびその他プロテアーゼに対する結合に係るデータが豊富であることから（TSCH87）、種々の方法を進めることができる。(その他のPBDに関しては、２種の異なるモノクローナル抗体を得ることができる。これらのモノクローナル抗体のうちの１つは10-11Ｍの程度のkdを有する高い親和性を有し、そして他の１つは、10-6Ｍの程度のkdを有する、中程度の親和性を有する)。この例では、a)BPTIとヒト白血球エラスターゼ（HuLE1）との間の中程度の結合、b)ブタエラスターゼのBPTI（V15）に対する、中位に強い結合、あるいはc)トリプシン（弱いが検知可能）またはブタ膵臓エラスターゼに対するBPTI（A15）Cpbd遺伝子内の残基38）の結合、を使用することができる。
{AHTrp}に対する、LG７ビリオンの保持を野性型Ｍ13の保持と比較する。野性型Ｍ13より多いＤＮＡを有するＭ13誘導体は相当して長いビリオンを有する。従って、osp-ipbd遺伝子のコドン２およびコドン３に、ストップコドンを有し、そしてコドン７に変更されたＬコドンを有する点でだけpLG７とは異なっているpLG８を創造することにする。ファージLG８は、LG７と正確に同一の数のＤＮＡを有するものと考えられ、従って、LG８ビリオンは、LG７ビリオンと、正確に同一の長さを有する。しかしながら、LG８はその表面上にBPTIを顕示することはできない。
ことなるＭ13-誘導ファージの固定を促進するために、標準方法によって、LG８のampr遺伝子をpBR322からのtetr遺伝子と置き換えた。このpBR322のフラグメントを有するBSMI-to-ACT II tetrを、XbaＩおよびAatIIで切断したpLG８からのＤＮＡ中にリゲートする。9.2kbを有するこの正しい構築物はpBR322と容易に区別される。これをLG10と称する。
このファージLG10を培地中で、種々のIPTGレベルで増殖させ、従来開示されている方法で収穫する。2.0mlの床容積を有し、そしてBioRad AffiGel 10(TM)またはAffi-Gel 15(TM)１ml当たり0.1mg〜30.0mgの範囲から得られる量のHuLE１を支持しているアファニテイカラムを選ぶ｛HuLE１｝。このカラムにおけるHuLE１の適当な一連の濃度は（0.1mg／ml、0.5mg／ml、2.0mg／ml、8.0mg／ml、15.0mg／mlおよび30.0mg／ml）である。｛HuLE１｝のVvは、0.1mlであると仮定する。LG７ファージの溶出は、種々の付加量のHuLE１を有する｛HuLE１｝におけるLG10の溶出と比較する。これらのカラムは下記の標準方法で溶出する
1)280nmにおける光学濃度がベースラインまたは４×Vvまで降下するまで(どちらか早い方)、リン酸塩でpH8.0に緩衝されている10mM Kcl。
2)３×Vvで、10mM〜２Ｍ勾配のKcl、pHはリン酸塩で8.0に保持する。
3)３×Vvで、２Ｍ〜５Ｍ勾配のKcl、リン酸塩でpH８に緩衝する。
4)２×Vvで、一定の５ＭKcl＋０〜0.8グアニジニウムcl、リン酸塩でpH8.0に緩衝する。
好ましい誘発レベル（IPTGoptimal）およびマトリックス上の親和性分子の量（DoAMoMoptimal）は、BPTIを担持していないLG８に比較して有意の遅延を示す。最も鋭いLG７溶出ピークを与えるようにセットする。最良の分離はBPTI／GPの量が、細胞が10.0uM IPTGで誘発される場合に生成される量および4.0mg HuLE１／mlがBioRad Affi-Gel 10(TM)に適用される場合に、生成される量であるときに生じるものと仮定する。
BPTI／GPの量およびHuLE１の量／（支持体の容積）が最適にされている場合には、溶出速度、初期イオン強度、およびGPの量／（支持体の容積）を最適にすることに頼った。これらのパラメーターは、別々に最適にすることができる。
最適のBPTI／GPおよびHuLE１／支持体の容積を使用して、溶出速度を変えて、すなわち最大流速の１倍、1/2倍、1/4倍、1/8倍および1/16倍に変えて、LG７およびLG８の溶出容積を測定する。最大溶出速度の1/4は、1/2よりも良好であるが、1/8は1/4とほぼ同一であると予想される。したがって、1/4最大溶出速度を使用する。
培地中（IPTG中2.0mM中で増殖された細胞から得られるLG７の溶出容積を109、1010、1011および1012pfuの負荷について、最適のDoAMoMおよび溶出速度で測定する。純粋なLG７の1012pfuはカラムに負担をかけすぎ、そして格別の数のファージがKcl勾配におけるそれらの特徴的位置以前を溶出するものと考えられる。1011pfuはカラム僅かにだけ負担をかけすぎること、および1010pfuはカラムに負担をかけすぎないことも見いだされる。Sec.15におけるアフイニテイ分離を使用すると、シグナル構成員が104で１部より多くない集団を含むことになるので、変えられた集団の1012pfuは、いずれの試料に関しても、負担をかけすぎることなく、1.0mlの最大容積を有するカラムに適用できるものと結論した。この1.0mlカラムの1012pfuによる過負担は、無差別に接着するファージを捕獲するための最初のカラムが、ターゲット物質を支持するカラムに対して５〜10倍長くあるべきであることをまた示している。IPTG中2.0mMである培地中で増殖された細胞から得られるLG７およびLG10の溶出容積を、最適条件において、かつまた、種々のイオン強度、すなわち1.0mM、5.0mM、10.0mM、20.0mMおよび50.0mMで1010pfuの負荷の場合について、測定する。これにより、たとえばLG10は1.0mM Kclで負荷した場合には、カラムによって僅かに遅延されるが、LG７は上記勾配で、その特徴的場所においてカラムから常に流出することを見い出すことができる。残りのアフィニティ分離の全部で、初期イオン強度として10.0mMを使用する。
種々のBPTIがそれらの表面上に顕示するファージのクロマトグラフィ感度を測定するために（Sec.10.1）、BPTIドメイン中の残基の１個だけが異なっている、２種の密接に関連するファージの人工混合物を調製する。これらのファージのうちの１つは、この工程で使用するカラムに対して、協力な親和性を有するが、他の１つのファージはカラムに対して親和性を有していない。これらの混合物をクロマトグラフィ処理し、カラムに結合しない多量のファージの中からどの位に少量のカラムに結合するファージを、検知することができるのかを見い出す。
これらの試験では、AfM（BPTI）としてAHTrpを選択した。２mlの床面積を有するカラムを、（DoAMoMoptimal mgのAHTrp）／（Affi-Gel 10(TM)ml）を用いて調製する。このカラムを｛AHTrp｝と記する。このカラムはVv＝1.0mlを有する。
IPBDとしてBPTI(Ｋ15、野性型)を顕示するLG７と比較して、IPBDとしてBPTI（Ｖ15）を顕示する。新規ファージLG９を調製する。BPTIの残基15は、osp-ipbd遺伝子の残基38である。osp-ipbd遺伝子のApaＩとStuＩとの間の短いセグメントを置き換えることによって、ＶにＫ38の変更を導入する。この正しい構築物をPLG９と記する。LG７ファージとLG9-誘導体ファージとの間の識別を促進するために、LG９のampr遺伝子をpBR322からのtetr遺伝子と置き換える。BsmＩ（1353、ブラントされたもの）とAatII（1428）との間の、pBR322からのＤＮＡを、XbaＩ（ブラントされたもの）およびAatIIで切断された、pLG９からのdsＤＮＡにリゲートする。この正しい構築物は9.2Kbを有し、pBR322とは、容易に識別される。この構築物をLG11と記する。ファージLG11からのＤＮＡの配列を、新しく挿入されたtetR遺伝子の接合部の近くで測定し、この構築物の確認を行う。
LG７およびLG11は、最適IPTG（2.0mM）を用いて増殖させ、収穫する。混合物は下記の比率で調製する。
LG７：LG11＝１：Vlim
ここでVlimは、10のファクターで1010〜105の範囲にある。まず、Vlimの大きい方の値を試験する。LG７を取り戻すことを可能にするVlimが見い出されたならば、小さい方の値のVlimは試験しない。
リン酸塩でpH８に緩衝されている10mMKcl 100μl中のＭ13am429 1011ビリオンで処理することによって、先ずカラム｛AHTrp｝をブロックする。このカラムを、OD260がベースラインに戻るか、または４×Vvがカラムを通過するまで（どちらか早い方）、同一緩衝液で洗浄する。同一緩衝液１ml中にpfu1012を含有する。LG11とLG７との混合物のうちの１つを｛AHTrp｝に適用する。このカラムは下記の標準方法で溶出する：
1)リン酸塩でpH８に緩衝されている10mMKcl；280mMにおける光学濃度がベースラインまたは４×Vvに達するまで（どちらか早い方）、（流出液は捨てる）。
2)３×Vvで、10mM〜２ＭKcl勾配；pHはリン酸塩で8.0に維持する（３×100μlフラクション）。
3)３×Vvで、２Ｍ〜５ＭKcl勾配；リン酸塩でpH８に緩衝する（30〜100μlフラクション）。
4)２×Vvで、一定の５ＭKcl＋０〜0.8Ｍグアニジニウムcl；リン酸塩でpH8.0に緩衝する（２×100μlフラクション）。
5)1.2×Vvで、一定の５ＭKcl＋0.8Ｍグアニジニウムcl；リン酸塩でpH8.0に緩衝する（12×100μlフラクション）。
各フラクションからの４μlづつの試料を、ファージ感受性Sup+細胞上に、適当に希釈して置く（ここでは、Ｍ13am429は増殖しない）。ファージ感受性Sup+細胞用の接種には、カラムマトリックスの試料をまた、使用する。プラークをアンピシリン含有LB寒天に移し、AmpRコロニイを、trpRまたはAHTrpRを用いて、BPTI（Ｋ15）の顕示に関して試験する。
LG７を採取することができるVlina最大値は4.0×108であると推定される。すなわち、Csensi＝4.0×108であると推定される。LG７の単離には、これらのクロマトグラフィサイクルが必要であり、これによるCeffの最初の推定値は740（＝exp(loge（4.0×108）／３)）である。
ここで、このアフイニテイ分離の効率を測定する（Sec.10.2）。これは次のとおりにして行う：
a)１：Ｑの比率でLG７とLG11との混合物を調製する。
b)１回の分離サイクル毎に、LG７の集団を富化する。次いで、
c)最後のファージ保有フラクション中のLG７のフラクションを決定する。Ｑが1.5×104である場合には、コロニイのうちの３％がBPTI陽性である。Ｑが1.5×103である場合には、コロニイのうちの60％がBPTI陽性である。従って、計算により、Ceff＝0.60×1.5×103＝900である。
我々が推定したLG７は、各ビリオンにおいて、１個または２個以上のBPTIドメインを顕示すべきである。osp-ipbd遺伝子はlacUV５プロモーターの管理下にあり、従って、発現レベルのBPTI-Ｍ13  CPは、［IPTG］を用いて、処理することができる。この構築物は、多くの異なる結合タンパク質（これらはいずれもBPTIにもとづくものである）の発現に使用することができる。誘発の最適レベルおよびAfM（PBD）の量（＝DoAMoMoptimum＝2.0mg／（支持体ml））を決定しなければならない。Sec.15.1に記載の方法において、ターゲット物質をこの量でカラムに適用する。これらの最適レベルは、全てのターゲットおよびLG７にもとづくＭ13の誘導体上に顕示される全ての種類のBPTIに適することができるが、異なるpHまたは温度も使用する場合には、若干の追加の最適化が必要であることもある。
新規LG７誘導体の表面上にPBDが現れるという点で高い可能性を有する。pLG７中のbpti遺伝子の代わりに、別のpbd遺伝子フラグメンを置き換えることができる。
例１
第３部
代表的タンパク質ターゲットとして、HHMbを選択する。しかし、他のタンパク質を使用することもできる。HHMbは、ターゲットとしての全ての要件、すなわち1)アフイニテイマトリックスに適用するのに充分の大きさを有する；2)マトリックスに付着した後に、反応性ではない；そして3)付着した後に、複数のPBDによる特異的結合を可能にするのに充分の不変の表面を有する、という要件を満たしている。
HHMbに関する基本的情報は周知である、すなわち
1)HHMbは、pH4.4〜9.3において、少なくとも70℃まで、安定である。
2)HHMbは、1.6Ｍグアニシニウムclまで、安定である。
3)HHMbのPIは7.0である。
4)HHMbに係るＭγは16,000である。
5)HHMbはヘムを必要とする。
6)HHMbは、タンパク質分解活性を有していない。
さらにまた、HHMbおよびその他のミオグロブリンに関して、下記の情報を得ることができる：
1)HHMbの配列、2)マッコウクジラミオグロブリンの３Ｄ構造（HHMbは19のアミノ酸差異を有し、一般に、その３Ｄ構造はほとんど同一であると見放されている）、3)その酵素活性の欠落、4)その毒性の欠落。
ＳＢＤ仕様の下記のとおりにセットする：
1)Ｔ＝25℃、
2)pH＝8.0、
3)許容溶質：
A)結合に係り、
i)緩衝剤として、リン酸塩０〜20mMおよびii)Kcl、10mM、
B)カラム溶出に係り、
i)緩衝剤として、リン酸塩０〜30mM ii)Kcl、５Ｍまで、およびiii)グアニジニウムcl、3.8Ｍまで。
4)許容Kb＜1.0×10-8Ｍ。
GP（IPBD）としてはLG7も選択した。
相互作用性コンピューターグラフィックを使用して、変換しようとする残基を部分的に、取り出し、その構造を可視化する。この切断において、全ての残基の数はBPTIに帰する。全ての残基が１個のターゲット分子と接触できるように、表面を形成する残基セットを取り出す。変えるためのBPTI残基の選択に関する情報には、次の情報が含まれる：
1)その３Ｄ構造、2)各残基の溶剤利用可能性（LEEB71）、3)BPTIに相同性の別のタンパク質の配列の収集、および異なるアミノ酸タイプの構造特徴の知識。
表16および34には、BPTIの残基が、a)実質的に表面露呈部を有し、そしてb)その他の密接に関連するタンパク質中の他のアミノ酸を許容することが知られている、ということを示している。露呈されており、かつまた可変性である、８〜20の残基セットのピックアップに、相互作用性コンピューターグラフィックを使用する。これらのセットにおいて、１つのセットの中の全員が一度に、ターゲット物質の分子に接触できるようにする。BPTIが、与えられた残基において、小さいアミノ酸を有する場合には、このアミノ酸は相互作用性セット内の他の残基の全部と同時に、ターゲットと接触することができないことがあるが、さらに大きいアミノ酸は充分に接触することができる。帯電したアミノ酸は、直接に接触しなくても、結合に影響を及ぼすことができる。このような場合には、このような残基を相互作用性セット内に包含させるべきであり、この場合にも、大きい残基が有用でありうることに留意すべきである。同様に、相互作用性セットの幾何学的中心近くの大きいアミノ酸は、この大きいアミノ酸の両側上の残基が同時に接触するのを防ぐことができる。しかしながら、大きいアミノ酸を、小さいアミノ酸で置き換えると、その表面はさらに平坦になり、両側の残基が同時に接触できるようになる。このような残基は相互作用性セットに包含されるべきであり、この場合には、小さいアミノ酸も有用であることがある。
表35は、標準モデル部分から作成したものであり、各タイプの側鎖基の断片とＣpetaとの間の最高距離を示している。Ｃβはタンパク質主鎖に堅固に結合することから、Ｃβを使用する。Ｃα−Ｃβ結合に関する回転は側鎖基の位置の決定に関して、最も重要な自主性を有する。
表34には、一定の条件に適合する５種の表面が示されている。第１の表面は、Brookhaven Protein Data Bankに“１TPA”として報告されているように、トリプシンとBPTIとの複合体中で、トリプシンを接触する残基セットよりなる。このセットは数字「１」で示されている。このセットの残基の露呈表面（表16から得られる）は全体で、1148Å2であり、そしてBPTIとトリプシンとの間の接触面積にほぼ等しい。
２〜５の数字で示されている。その他の表面は、先ず、露呈されている可変性の残基をピックアップし、次いで表面が確定されるまで、近隣の残基をピックアップして行くことによって取り出した。表34に示される残基セットの選択は、決定的なものでも、あるいは独特のものでもなく、別の可変性表面の残基セットを取り出すこともできる。以後の記載において、Ｋ15は分子の頂上部にあるものとし、一方、カルボキシおよびアミノ末端は底部にあるものとする。
溶剤利用可能性（solvent accessibilites）は、残基の露呈を示すために、有効で、容易な指示要素である。溶剤利用可能性は、多少注意して使用しなければならない。すなわち、小さいアミノ酸は下方に示されており、そして大きいアミノ酸は上方に示されている。BPTIの構造中に置き換えられた場合に、異種のアミノ酸の溶剤利用可能性がどうなるのかを、使用者は考えなければならない。
BPTIの誘導体とHHMbとの間の特異結合を創造するために、セット＃２中の残基を変えてみた。このセットは、12個の基本残基を包含している：17(Ｒ)、19(Ｉ)、21(Ｙ)、27(Ａ)、28(Ｇ)、29(Ｌ)、31(Ｑ)、32(Ｔ)、34(Ｖ)、48(Ａ)、49(Ｅ)および52(Ｍ)（Sec.13.1.1）。セット＃２の中で、表34に記載の配列例を完全に同一の残基は無い。滋賀他って、隠れている構造を保有する可能性が高いものを変えることができる。この残基に見い出されるアミノ酸タイプの、これらの12の残基のそれぞれにおける独立した置き換えが、ほぼ4.4×109のアミノ酸配列および同数の表面を生成する可能性がある。
BPTIは非常に塩基性のタンパク質である。この性質は、BPTIおよびその相同体の単離および精製に使用されており、高頻度のアルギニン残基およびリジン残基は単離における傾向に反映することはあるが、構造体が必須とするものではない。Bombyx mariからのSCI-IIIＧＡ塩基性基よりも７個多い酸性基を含有することは確かである（SASA84）。
残基17は、高度に可変性であり、かつまた充分に露呈されており、Ｒ、Ｋ、Ａ、Ｙ、Ｈ、Ｆ、Ｌ、Ｍ、Ｔ、Ｇ、Ｙ、ＰまたはＳを含有することができる。全てのタイプのアミノ酸に、大きい、小さい、帯電している、中性である、そして疎水性である物性が見い出される。見い出された酸性基の中で、サンプル中の傾向の要因でありうるものは存在しない。
残基19はまた、可変性であり、かつまた充分に露呈されており、Ｐ、Ｒ、Ｉ、Ｓ、Ｋ、ＱおよびＬを含有する。
残基21は非常に可変性ではなく、そして33の場合のうちの31でＦまたはＹを含有し、そしてのこりの場合に、ＩおよびＷを含有する。Ｙ21の側鎖基は残基47および48の主鎖とＴ32との間空間を溝している。Ｙ側鎖基の先端のOHは溶剤中に突出する。明らかにＹまたはＦを置き換えることによって、表面を変えることができ、その表面を、その領域で、疎水性または親水性のどちらかにすることができる。さらにまた、他の芳香族アミノ酸（すなわち、Ｈ）あるいは他の疎水性アミノ酸（Ｌ、ＭまたはＶ）が許容されうる可能性もある。
残基27は、ほとんどしばしばＡを含有するが、Ｓ、Ｋ、ＬおよびＴもまた、見い出される。構造的に見ると、この残基は多分、いずれの親水性アミノ酸も、そして多分、いずれのアミノ酸をも許容するものと考えられる。
残基28は、BPTIにおいて、Ｇである。しかしながらこの残基自体は、形状的にグリシンに特有ではない。６個のその他のタイプのアミノ酸がこの残基に見い出されている；Ｋ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、ＨおよびＮ。この残基における小さい側鎖基は、残基17および34と同時には、HHMbと接触しない。大きい側鎖基は、残基17および34と同時にHHMbと相互反応することができる。この残基における帯電した側鎖基は基本的セット中の他の残基によって定められている表面上で、HHMbの結合に影響を及ぼすことができる。多分、Ｐをのぞいて、すべてのアミノ酸が許容されるべきである。
残基29は、高度に可変性であり、最もしばしば、Ｌを含有する。この残基の充分に露呈された部分は、多分Ｐを除く、ほとんどすべてのアミノ酸を許容するものと見放される。
残基31、32および34は、高度に可変性であり、露呈されており、そして延長した形状を有する；すべてのアミノ酸が許容されるべきである。
残基48および49はまた、高度に可変性であり、かつまた充分に露呈されており、すべてのアミノ酸が許容されるべきである。
残基52は、アルファヘリックス中に存在する。多分Ｐを除いて、すべてのアミノ酸が許容されうる。
ここで、基本セットの近隣にある第２の残基セット（Sec.13.1.2）の変更可能性について考えてみる。後続の段階で変えることができる、近隣の残基には、９(Ｐ)、11(Ｔ)、15(Ｋ)、16(Ａ)、18(Ｉ)、20(Ｒ)、22(Ｆ)、24(Ｎ)、26(Ｋ)、35(Ｙ)、47(Ｓ)、50(Ｄ)および53(Ｒ)が含まれる。
残基９は高度に可変性であり、伸びており、そして露呈されている。残基９と残基48および49とは、残基31〜34の立ち上っている鎖によって生じる突出物によって分離されている。残基９と残基48および49とが同時に、結合に関与している場合には、ターゲットは、31〜34の鎖が適合することができる溝を有しなければならないか、あるいはこれら３つの残基（９、48および49）がいずれも、BPTI誘導体の曲率半径を効果的に減少させる、大きいアミノ酸を有していなければならないかのどちらかである。
残基11は、高度に可変性であり、伸びており、そして露呈されている。残基11は残基９と同様に、基本残基によって定められている表面から僅かに離れており、同一環境で結合に関与する。
残基15は、高度に可変性である。残基15の側鎖基は、セット＃２によって定められている面から離れた位置にある。残基15において電荷を変えると、残基セット＃２によって定められている表面における結合が影響を受けることがある。
残基16は可変性であるが、基本セットによって定められている表面から離れて位置している。この残基の電荷を変えると、セット＃２によって定められている表面における結合が影響を受けることがある。
残基18はBPTIにおいてＩである。この残基は、伸びている形状であり、そして露呈されている。この残基には５種のアミノ酸が見い出されている：Ｍ、Ｆ、Ｌ、Ｖ、およびＴ。Ｔだけは親水性である。側鎖基は、残基セット＃２によって定められている表面から直接に離れた位置にある。この残基の帯電アミノ酸を置き換えると、残基セット＃２によって定められている表面における結合が影響を受けることがある。
残基20は、BPTIではＩである。この残基は、伸びている形状を有し、そして露呈されている。この残基には、４種の別のアミノ酸が見い出されている：Ａ、Ｓ、Ｌ、およびＱ。側鎖基は、残基セット＃２によって定められている表面から、直接に離れた位置にある。この残基で、電荷を変えると残基セット＃２によって定められている表面における結合が影響を受けることがある。
残基22は、僅かにだけ可変性であり、33の場合のうちの30で、Ｙ、ＦまたはＨである。しかしながら、この残基には、Ａ、Ｎ、およびＳが見い出される。ここでは、Ｌ、Ｍ、ＩまたはＱなどのアミノ酸を試みることができる。残基22における変換は、残基21の移動性に影響することがある；残基22における電荷の変更は、残基セット＃２によって定められている表面における結合に影響を及ぼすことがある。
残基24は、若干の可変性を示すが、多分、基本セット中の残基の全部と同時に、ターゲットの分子の１つと相互反応することはできない。この残基の電荷を変えると、基本セットによって定められている表面における結合に対し、作用を有することがある。
残基26は、高度に可変性であり、そして露呈されている。電荷の変更は、残基セット＃２によって定められている表面における結合に影響することがある。置換はまた、基本セット中に存在する残基27の移動性に影響することがある。
残基35は、最も多くの場合に、Ｙであり、Ｗも見い出されている。残基35の側鎖基は、隠されているが、ＦまたはＷの置換は、残基34の移動性に影響することがある。
残基47は、使用された配列サンプルにおいて、常に、ＴまたはＳである。そのＤガンマは、アルファヘリックス中の残基50のNHからの水素結合を、多分受け入れる。しかしながら、この残基から、他のタイプのアミノ酸を排除する。不可抗的な立体上の理由は存在しない。特に、その側鎖基が水素結合を受け入れることができる別のアミノ酸、すなわちＮ、Ｄ、ＱおよびＥを受け入れることができる。
残基50は、多くの場合に、酸性アミノ酸であるが、他のアミノ酸も可能である。
残基53は、多くの場合に、Ｒであるが、この残基には他のアミノ酸も見い出される。電荷の変更は、相互作用セット＃２中のアミノ酸に対する結合に影響することがある。
公開モデル（HuBE77、WLOD84）の場合には、Ｒ39が、セット＃２中の残基によって定められている表面から、BPTIの反対側にあることを見ることができる。従って、セット＃２中の若干の残基を変えると同時に、残基39を変えると、セット＃２中の他の残基を変える場合と比較して、表面＃２に沿って生じる結合の改良にはあまり好ましくはない。
12の基本残基および13の第２次残基に加えて、２つの他の残基、すなわち30(Ｃ)および33(Ｆ)が存在する。これらは、多分変えない、少なくとも後続の工程まで変えない、表面＃２内に含まれている。これらの残基は、BPTIの内側に隠されており、保存されている側鎖基を有する。これらの残基の変更は、基本セット中の残基の変更によって生じるほどの変化を表面に与えない。しかしながら、これらの隠されており、保存されている残基は、表面＃２の表面積に関係する。残基セット＃２の表面は、トリプシン結合性表面の面積に匹敵する。基本残基17、19、21、27、28、29、31、32。34、48、49および52は、946.9Å2の総合溶剤利用可能面積を有する。第２次残基９、11、15、16、18、20、22、24、26、35、47、50および53は、1041.7Å2の総表面を有する。残基30および33は、全体で38.2Å2の露呈表面を有する。従って、これら３つの残基群の総合表面は、2026.8Å2である。
残基30はBPTI中でＣであり、すべての相同配列中に保存されている。しかしながら、Ｃ14／Ｃ38がすべての天然配列中に保存されており、しかもMarks等がＣ14とＣ38との両方をＡ、ＡまたはＴ、Ｔに変えると、官能性のトリプシンインヒビターが生成されることを示していることに留意すべきである。従って、Ｃ30を置き換えた場合には、BPTI様の分子が混じることが可能になる。
残基33は、BPTI中およびすべての相同配列中でＩである。BPTI構造を観察すると、Ｙ、Ｍ、ＨまたはＩの置換が許容されうることが示唆される。
我々の仮定上のアフィニティ分離感受性、Csensiを得るために、我々は６個の残基を変えることに決めたが、多様化塩基の実際の塩基組成における誤りに若干の余地が残った。最高の認識を得るために、我々はできるだけ全くかけ離れている基本セットから残基を選択した。表36には、基本セット（principal set）および末梢セット（peripheral set）中の残基のベータ炭素間の距離が示されている。Ｒ17およびＶ34は、基本表面の一端にある。残基Ａ27、Ｇ29、Ｌ48、Ｅ49およびＭ52は他の一端にあり、約２０Å離れている。これの中で、我々は、残基17、27、29、34および48を変える。残基28、49および52は、後続の工程で変える。
残りの基本残基の中で、21は後刻に変える。残基19、31および32の中では、19を無作為に取り出し、変える。
６個の残基の無制限の変更は、6.4×107のアミノ酸配列をもたらす。Csensiは４×108中の１であると仮定する。表37には、選択された残基の計画された変更が示されている。親配列は5.5×107中の一部として存在するが、最も好ましくない配列が4.2×109中の一部にだけ存在する。PPBDから１個だけアミノ酸を置き換えたものの中で、最も好ましくない配列は、Ｆ17-Ｉ19-Ａ27-Ｌ29-Ｖ34-Ａ48であり、1.6×108中の一部の計算された存在率を有する。最適gfkコドンを使用することにより、親配列を取り戻すことができ、また実際のnt組成がプログラムされた組成の５％以内に入る場合には、PPBDに対する１個のアミノ酸置換の全部を取り戻すことができる。形質転換細胞の数はMntv＝1.0×109であり（仮定である）、プログラムされた配列のうちのほとんどを生成することができる。
上記の残基番号は突然変異BPTIに関係する。表25はプレ-Ｍ13CP-BPTIタンパク質に関するものであるので、突然変異BPTI配列の番号はいずれも、１つの配列23の長さだけ長くなっている。従って、我々は、残基40、42、50、52、57および71を変えようと考えた。これらのコドンの全部を含有するＤＮＡ配列は、osp-pbd遺伝子の塩基309のSphＩ部位と塩基191の（ApaＩ）部位との間に見い出される。ＡｐａＩ，ＤｒａIIおよびＰｓｓＩの中では、ＡｐａＩが好ましい。これは、ＡｐａＩがいずれの曖昧さも伴わずに６個の塩基を認識し、ｖｇＤＮＡで数少ない配列を切断するからである。理由のない制限部位は、コドン曖昧型[ambiguous]を使用することによって、ある場合には回避することができる。すなわちＧＧＣからＧＧＴまでのｇ５１に係るコの変更は、コ５０、５１および６＝５２に於けるＡｐａＩ部位の創成を不可能にする。
合成しようとするｄｓＤＮＡの各断片は、制限酵素による切断を可能にするために、どちらかの末端に付加されている６〜８個の塩基を必要とし、これは表３７に示されている。最初の合成塩基（ＡｐａＩおよびＡｐｈＩで切断する前の）は１８４であり、そして最後は３２２である。合成される塩基は１４２である。合成される断片の中心はＱ５４とＶ５７との間にある。このオーバーラップは変更された塩基を含むことができないので、１２塩基長いオーバーラップとして、塩基２４５〜２５６を選択した。Ｆ５６に係るコドンがＴＴＣに変えられ、オーバーラップのＧＣ含量を増加することに留意すべきである。変更されるアミノ酸は、その上に＋を付けてＸとして印を付ける。コドン５７および７１は、センス[sense]（底部）ストランド上に合成される。このデザインをアンチセンス[antisense]ストランドで、“gfk”と称する。したがって、このセンスストランド（５’から３’まで）は、ａ）等しい部分ＣおよびＡ（すなわちＫの相補）、およびｃ）（０．２６Ｔ，０．２６Ａ，０．３０Ｃ，０．１８Ｇ）を含有する。
“gfk”によってコードされる各残基は、２１の可能な結果を有する。これらのアミノ酸はそれぞれ、ストップコドンを加えて有する。表１２には、“gfk”によってコードされるアミノ酸の分布が、誤差を５％と仮定して示されている。親配列の存在率は、Ｒ×Ｉ×Ａ×Ｌ×Ｖ×Ａの存在率の積である。最も好ましくない配列の存在率は、４．２×１０9のうちの１である。
olig#27およびolig#28をアニーリングし、次いでクレノウフラグメントおよび全部で４つの(nt)TPで延長する。ｄｓ合成ＤＮＡおよびＲＦ  ｐＬＧ７の両方を、ＡｐａＩ，およびＳｐｈＩの両方で切断する。切断ＤＮＡを精製し、相当する断片をリゲートし（Sec.14.2）、正当なPE383の形質転換に使用する(Sec.14.2)。十分の数の形質転換細胞を生成するために、５．０リットルの細胞を用いて開始する。
1)LBブロス5.0リットル中で、37℃においてE.coliを培養し、細胞濃度を５×107〜７×107細胞／mlにする。
2)氷上で65分間冷却し、この細胞懸濁液を４℃で５分間、4000gで遠心処理する。
3)上澄液を捨て、細胞を60mM Cacl2の水冷無菌溶液1667ml中に再懸濁する。
4)氷上で１５分間冷却させ、次いで４℃で５分間、4000gで遠心処理する。
5)細胞を氷冷無菌の60mM Cacl2２×400ml中に再懸濁し、細胞を４℃で２４時間保存する。
6)リチゲーション[litigation]またはTEバッファ20ml中にDNA(100μg)を加え、混合し氷上で数分間インキュベートする。
7)200μlづつに分け、細胞に42℃で２０秒間、熱ショックを与える。
8)Ｌｂロブス200mlを加え、37℃で１時間、インキュベートする。
9)３５〜１００μg／mlのアンピリシンを含有するLBブロス2,0lに、培養物を加え、次いで37℃で１夜にわたり培養する。
10)６時間後に200mlを取り出し、軟寒天上塗技法でLb寒天上にlogファージJM107で、0.5mlづつ板状に塗布する。ファージは軟寒天から調整する。
11)１夜培養物を遠心処理し、細胞を除去証、ファージをペレット化する。
12)Salivar等の方法によってウイルス粒子を収穫する。
次の点が重要である。リゲーションで合成されるｖｇＤＮＡの全部または殆ど全部を使用する、b)リゲーション混合物の全部または殆ど全部を細胞の形質転換に使用する、および、c)形質転換細胞の全部または殆ど全部を培養する。これらの尺度は、可変因子の維持に関するものである。
形質転換細胞の全部または殆ど全部を試料にする方法で、ウイルス粒子を採取することは重要である。形質転換にＦ'細胞が使用されることから、複数の感染は１夜ファージ産生では、問題にならない。Ｆ'細胞は寒天中におけるファージ産生に使用される。
ＨＨＭｂは、7.0のｐＨを有するので、ＨＨＭｂが僅かに陰性であり、一方、BPTIおよびその突然変異体の殆どが陽性であるように、ｐＨ8.0でクロマトグラフィを行う。ＨＨＭｂを2.0mlカラムのAffi-Gel 10(TM)またはAffi-Gel 15(TM)に第４類  せっけん類（薬剤に属するものを除く）歯みがき  化粧品（薬剤に属するものを.0mg／支持マトリックスmlの割合出固定する。この濃度は、カラム支持trpに最適の濃度突然同じである。
いずれのタンパク質に対しても、あるいは支持マトリックスに対して、強力な無差別の結合性を有する種々のBPTIを除去するために(Sec.15.2)ウイルス粒子の変えられている集団をウシ血清アルブミン(BSA)を含有するカラムに通し、その後で{ＨＨＭｂ}カラムに、この集団を加える。Affi-Gel 10(TM)またはAffi-Gel 15(TM)を使用し、マトリックスが最高レベルでBSAを支持するレベルで、BSAを不動化する。10.0mlのカラムに、Affi-Gel結合-BSA5,0mlを入れる。このカラムを{BSA}と記す。このカラムは、Ｖv＝５．０mlを有する。10mM Kcl,1mMリン酸塩、ｐＨ8.0バッファ1ml(0.2×Ｖv)中にpfu 1012を含有する、このウイルス粒子の変えられている集団を、{BSA}に適用する。{BSA}を、5,0mM Kcl,1mMリン酸塩、ｐＨ8.0バッファ4,5ml(0.9 X Vv)で洗浄する。この50mM塩を用いる洗浄によって、BSAに僅かい接着するウイルス粒子は溶出され、一方、強力に結合するウイルス粒子は溶出されない。{BSA}カラムの集められた溶出液は、約13mM Kcl 5.5mlである。
カラム{ＨＨＭｂ}は、まづリン酸塩で、ｐＨ8.0に緩衝されている１０ｍＭＫｃｌ１００μｌ中のＭ１３（ａｍ４２９）のウイルス粒子１０”で処理することによってブロックする。このカラムを、ＯＤ260がベースラインに戻るかまたは２×Ｖｖがカラムを通過するまで（どちらか早い方）、同一バッファで洗浄する。｛BSA｝から集められた溶出液を１３ｍＭＫｃｌ，１ｍＭリン酸塩、ｐＨ8.0のバッファ5.5ml中の{ＨＨＭｂ}に加える。このカラムを次の方法で溶出する(Sec.15.3)：
1)リン酸塩でｐＨ8.0に緩衝えている１０ｍＭＫｃｌ；280nmにおける光学濃度がベースラインまたは2×Ｖｖに達するまで(どちらが早い方)、(溶出液は捨てる)、
2)３×Ｖｖで、１０ｍＭ〜２ＭＫｃｌ勾配；ｐＨはリン酸塩で8.0に維持する（３０×１００μlフラクション）
3)３×Ｖｖで、２Ｍ〜５ＭＫｃｌ勾配；リン酸塩でｐＨ8.0に緩衝（３０×１００μlフラクション）
4)２×Ｖｖで、一定の５ＭＫｃｌ＋0〜0.8Ｍグアニジウムｃｌ；リン酸塩でｐＨ8.0に緩衝（２０×１００μlフラクション）および
5)１×Ｖｖで、一定の５ＭＫcl＋0.8Ｍグアニジウムcl；リン酸塩でｐＨ8.0に緩衝、(10×100μlフラクション)。
これらの溶出フラクションに加えて、カラムから試料を採取し、フアージ感受性Sup+細胞用の接種物として使用する(Sec.15.4)。各フラクションからの４μlの試料をフアージからSup+細胞上に板状に付与する。かなり多すぎるコロニーを生成するフラクションは、さらに低い希釈度にして、再付与する。各フラクションの大体の力価を計算する。力価を測定した最後のフラクションから開始し、最初のフラクションに向かって順次操作し、約１０9のフアージが集まるまで、すなわちカラムに適用されたフアージ1000のうちの約１が集まるまで、フラクションを集める。この集団をLBロブシス3000ml中の３×１０”フアージ感受性PE384中に感染させる。多様度が低い感染物を選び、多種感染の可能性を排除する。30分後に、生存しているフアージは、受容細胞に入れるが、まだ新しいフアージを産出しはじめない。フアージ産出遺伝子をこのフアージで発現させる。非感染細胞を殺すアンピシリンを添加することができる。これらの細胞は依然として、F-piliを有しており、フアージを吸着して多種感染を防止する。
F+細胞における多種感染度での増殖によっては解決することができない問題を、多種感染が持ち込まざるを得ない場合には、この問題の解決に、次の方法を使用することができる。アフィニティ分離から得られるウイルス粒子をF+ E.coli中に感染させ、次いで培養して、遺伝情報を増幅させる(Sec.15.5)。RF DNAを収穫することによって、あるいはssフアージDNAにアニーリングされたプライマーのインビトロ拡張によってCCC DNAを得る。このCCC DNAを使用し、高い細胞対DNA比で、Ｆ-細胞を形質転換させる。この方法で得られる各ビリオンは、その中のDNAによってだけコードされるタンパク質を有していなければならないものとなる。
この変更は6.4×107ほどのかなりの異なるアミノ酸配列を生成する。Ceffは900である。従って、２回分の分離サイクルの後に、１つだけのSBDが単離される確率は、0.10より少ない。３回のサイクルの後では、この確率は0.10以上に高められる。
このファージミド(phargemid)集団を増殖させ、３回、クロマトグラフィ処理し、次いでSBDに係し検査する。各分離サイクルにおいて、生きているファージを含有する、最後の３つのフラクションからのファージを、支持マトリックスの若干を除去することによって接種物として得られるファージと一緒に集める。各サイクルでは、約1012のファージをカラムに加え、次回の分離サイクル用に、約109のファージを培養する。３回の分離サイクルの後に、生きているファージを含有する最後のフラクションから、32のコロニイを取り出す。これらのコロニイからのファージをSBD１、SBD２・・・およびSBD32で表わす。
これらのSBSをそれぞれ、培養し、HHMbを含有しているPep-Tieカラムにおける保持に関して試験する(Sec.15.8)。ファージLG7(SBD11)は、Pep-Tie{HHMb}カラムで最大の保持を示し、これは、367mM Kclで溶出する。一方、wt M13は20mM Kclで溶出する。SBD11は、2回目の変化サイクルに対する親のアミノ酸配列になる。
この仮定の実験の結果が表３８に示されている。R40はDに変更され、L42はQに変更され、A50はEに変更され、L52はLのまま残され、そしてA71はWに変更された。
次回の変化工程（Sec.16）が表３９に示されている。変換しようとする残基は、a)親セット内の、１回目の工程で変更されなかった残基のうちのいくつかを選択し（すなわち、この融合体の残基42、44、51、54、55、72または75）、次いで、第２次セット内の、いくつかの残基を選択することによって、選び出す。全部で20のアミノ酸および不可避のストップを通して、残基51、54、55および72を変える。残基44は、ＹとＦとの間でだけ変える。第２次セット内の若干の残基は制限範囲の中でだけ変える、これによって、第一に異なる電荷（＋、０、−）が明らかになる。残基38は、K,R,EまたはGの中で変える。残基41は、I,V,KまたはEの中で変える。残基43は、R,S,G,N,K,D,E,TまたはAの中で変える。
olig#29およびolig#30を合成し、アニーリングし、拡張し、次いでApaＩ／SphＩ部位で、pLG7中にクローン形成させる。このリゲーション混合物を使用し、可能性を有するPE383細胞５lを形質転換させ、109の形質転換細胞を得る。工程１で使用した支持マトリックスと同一の支持マトリックスを使用し、新しい{HHMb}を構築する。収穫されたLG7のうちの1012の試料を{HHMb}に適用し、アフィニティ分離する。カラムから流出する最後の109のファージと接種物とを集め、培養する。この培養されたファージミドを、３回の分離サイクルで再クロマトグラフィ処理する。３回の分離サイクルの流出液から、32のクローン単離物（SBD11-1,SBD11-2、・・・SBD11-32で表わす）を得る。これらの単離物をPep-Tie{HHMb}カラムにおける結合に関して試験する。このセットの中で、SBD11-13はPep-Tir{HHMb}カラムで最大保持を示す。これは692mK Kclで溶出する。
この安定上の選択の結果が表４０に示されている。残基38(BPTIのK15)はEに変えられ、41はVになり、43はNになり、44はFになり、51はFになり、54はSになり、55はAになり、そして72はQになっている。
osp-pbd遺伝子のうちのsbd11-23部分を発現ベクター中にクローン形成し、ペリプラズム中で、BPTI(E15,D17,V18,Q19,N20,F21,E27,F28,L29、S31,A32,S34,W71,Q72)を発現させる。このタンパク質を標準方法によって単離し、そのHHMbに対する結合を試験する。Kbは4.5×10-7Mであることが見い出される。
３回目の変化工程では、PPBDとしてSBD11-23を使用する。この工程は表41に示されており、ここで８個のアミノ酸が変えられる。基本セット内で、残基40、55および57は、全部で20のアミノ酸を通して変えられている。残基32は、P,Q,T,K,AまたはEの中で変えられている。残基34は、T,P,Q,K,A,またはEの中で変えられている。残基44は、F,L,Y,C,Wまたはストップの中で変えられている。残基50は、E,KまたはQの中で変えられている。残基52は、L,F,I,MまたはVの中で変えられている。
この変更の結果が表４２に示されている。選ばれたSBDは、SBD11-23-5で表わされており、これは980mK Kclで、Pep-Tie{HHMb}カラムから溶出する。このSBD11-23-5セグメントを発現ベクター中にクローン形成し、BPTI(E9,Q11,E15,A17,V18,Q19,N20,W21,Q27,F28,M29,S31,L32,H34,W71,Q72)を産生させる。この時点で、そのKbは7.3×10-9Mである。
この実験は仮説によるものである。10-8Mの解離定数を得るためには、さらに多くの変化サイクルが必要であると予想される。若干の変化サイクルにおいては、３回より多くの分離サイクルが、必要であることもある。実際のDNA化学およびDNA合成では、我々が仮定した５％より大きい誤差があることがある。Serr＞0.05である場合には、一度に６個の残基を変えることはできないかもしれない。一度に５個の残基の変化は、確実に可能である。
0003771253.tif 000017
0003771253.tif 000018
0003771253.tif 000019
0003771253.tif 000020
0003771253.tif 000021
0003771253.tif 000022
0003771253.tif 000023
0003771253.tif 000024
0003771253.tif 000025
0003771253.tif 000026
0003771253.tif 000027
0003771253.tif 000028
0003771253.tif 000029
0003771253.tif 000030
0003771253.tif 000031
0003771253.tif 000032
0003771253.tif 000033
0003771253.tif 000034
0003771253.tif 000035
0003771253.tif 000036
0003771253.tif 000037
0003771253.tif 000038
0003771253.tif 000039
0003771253.tif 000040
0003771253.tif 000041
0003771253.tif 000042
0003771253.tif 000043
0003771253.tif 000044
0003771253.tif 000045
0003771253.tif 000046
0003771253.tif 000047
0003771253.tif 000048
0003771253.tif 000049
0003771253.tif 000050
0003771253.tif 000051
0003771253.tif 000052
0003771253.tif 000053
0003771253.tif 000054
0003771253.tif 000055
0003771253.tif 000056
0003771253.tif 000057
0003771253.tif 000058
0003771253.tif 000059
0003771253.tif 000060
0003771253.tif 000061
0003771253.tif 000062
0003771253.tif 000063
0003771253.tif 000064
表１０に示されている配列
＋はＫ＋Ｒ＋ＮＨ−Ｄ−Ｅ−Ｃｏ2の合計、ｐＨ７．０における分子でほぼ帯電。
＃はＫ＋Ｒ＋ＮＨ＋Ｄ＋Ｅ＋Ｃｏ2の合計、すなわちｐＨ７．０におけるイオン化した基の数。
0003771253.tif 000065
0003771253.tif 000066
0003771253.tif 000067
0003771253.tif 000068
Protein Data Bankに示されている位置
「全面積」とは、残基中の原子だけを考慮した場合の、半径１．４Åの回転面で測定された領域を意味する。これには形状が考慮される。
「Ｍ/Ｃにより被覆されていない」とは、主鎖中の全原子を考慮した場合の、半径１．４Åの回転面で測定された面積を意味し、フラクションは露出面積／全面積である。主鎖原子によって埋もれている表面は側鎖原子で被覆されている表面よりも確実に被覆される。
「全く被覆されていない」とは、タンパク質の全原子を考慮した場合の、半径１．４Åの回転面で測定された領域を意味する。
0003771253.tif 000069
0003771253.tif 000070
0003771253.tif 000071
0003771253.tif 000072
0003771253.tif 000073
0003771253.tif 000074
0003771253.tif 000075
0003771253.tif 000076
0003771253.tif 000077
0003771253.tif 000078
0003771253.tif 000079
0003771253.tif 000080
0003771253.tif 000081
0003771253.tif 000082
0003771253.tif 000083
0003771253.tif 000084
0003771253.tif 000085
0003771253.tif 000086
0003771253.tif 000087
0003771253.tif 000088
0003771253.tif 000089
ＰＰＢＤから最も好ましくない１個のアミノ酸の置き換えが１．６×１０7のうちの１つに存在する
0003771253.tif 000090
0003771253.tif 000091
ＰＰＢＤから最も好ましくない１個のアミノ酸の置き換えが１．２×１０7のうちの１つに存在する。
0003771253.tif 000092
0003771253.tif 000093
ＰＰＢＤから最も好ましくないアミノ酸の置き換えが３×１０7のうちの１つに存在する。
0003771253.tif 000094
【図１】
0003771253.tif 000095
【図２】
0003771253.tif 000096
【図３】
0003771253.tif 000097
【図４】
0003771253.tif 000098
【図５ａ】
0003771253.tif 000099
【図５ｂ】
0003771253.tif 000100
【図５ｃ】
0003771253.tif 000101
【図５ｄ】
0003771253.tif 000102