(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
鋳型として少なくとも１つの標的鎖を用いて核酸物質を増幅及び検出するためのデバイスであって、
増幅された核酸物質を検出するための検出部位並びに共同して検出可能なシグナルを発生するのに有効である標識及びシグナル発生性物質を含有する保存区画を含む複数の区画、並びに当該区画と当該検出部位とを流動的に連絡するための通路を含んでなり、
当該保存もしくは反応区画に使用される捕捉体、標識及びシグナル発生性試薬を含まない洗浄液を含有する洗浄区画を一切含まず、各区画を連続的に破裂せしめてそれぞれの区画の内容物を検出部位に連続的に進行させるために使用される外部加圧手段を有し、かつ、該検出部位の下流に廃棄物区画を有することを特徴とするデバイス。
【請求項２】
増幅された核酸物質を検出部位にハイブリダイズせしめることにより該増幅された核酸物質を検出する方法であって、請求項１に記載のデバイスを用いることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、核酸物質を増幅及び検出するのに使用される、反応パウチもしくはデバイス、並びに方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
極微量の核酸物質のＰＣＲ増幅及び増幅された物質の検出を、増幅された核酸が漏出しない単一パウチですべて実施できる方法を用いたＤＮＡ検出は、欧州特許出願 381,501号明細書に記載されている。６つの一時的にシールされたブリスター（また区画（compartment)と称される）は、検出区画の検出部位に対してそれらを連絡する通路に沿って提供される。ブリスターは、順に、ＰＣＲ反応区画；第一洗浄区画；例えば、ストレプトアビジン西洋ワサビペルオキシダーゼ（以下本明細書では、ＳＡ−ＨＲＰと称する）を含有する酵素標識区画；第二洗浄区画；酵素に応答するシグナル発生性物質を含有する区画；並びに停止溶液区画を提供する。これらの各々が言及した順序で空になって内容物が検出区画へ移動し、検出部位は、増幅された核酸物質を捕捉しそして検出可能なシグナルを発生するために使用される。
【０００３】
２つの洗浄段階を提供するために２つの洗浄区画を使用することは、核酸物質を検出する従来の試みのすべてと一致する。例えば、J. Clin. Microbiol.  845〜853  (1992年４月）の第30巻は、Roche  ( 846〜847 ページ）により使用された方法を記載する。その方法は、固体壁面に対してビオチニル化生成物をハイブリダイゼーションし、続いて、「プレートを４回洗浄緩衝剤Ｉで洗浄していずれかの未ハイブリダイゼーション生成物を除去した」と記載されている。これら４回の洗浄は、欧州特許出願 381,501号明細書のパウチの第１洗浄ブリスターの第１洗浄段階に対応するものであり、そしてまた、「ハイブリダイゼーションしていない」ＤＮＡもしくは核酸材料が検出部位へ洗い流される。その後、Roche 方法では、「37℃で15分間アビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ接合体と」インキュベーションせしめた。当然それは、ほとんど同じ目的で、EPA パウチの酵素ブリスターを空にすることに対応する。その後、Roche 方法では、「再びプレートを４回洗浄して」「未結合接合体を除去した」。勿論これは、EPA  381,501のパウチ中の酵素ブリスターとシグナル発生性物質ブリスターとの間に配置された第２洗浄ブリスターにより提供される第２洗浄段階に対応する。
【０００４】
そのような方法は、すべて洗浄によって、十分実施できるとはいえ、時間を浪費し、従って経費がかかる。更に、洗浄は、パウチの製造を複雑にする。しかしながら、それらは「非特異的シグナル」、即ち、標的ではない未結合核酸物質の存在、及び／又は標的核酸が存在しないために存在すべきではない未結合ＳＡ−ＨＲＰのどちらかによって発生するシグナルを排除するために必須であると考えられている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の目的は、信頼できないシグナルを発生することで検出中に多量のノイズを生じることなく、少なくとも１つの、好ましくは両方の、以前に必要とされた洗浄段階及び洗浄ブリスターを排除する検出順序を提供することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、EPA  381,501に記載された方法に使用されたパウチのフォーマットが、１つもしくは両方の洗浄ブリスターを排除することに役立ち、一方実質的に同じ結果を提供することを発見した。これは、洗浄が必須段階であることを指図してきた実際の歴史に著しい驚きを与えた。
【０００７】
より詳細には、本発明の一態様に従えば、本発明の目的は、少なくとも１つの固定化プローブを含む検出部位に増幅された核酸物質をハイブリダイズせしめ、シグナル発生性物質であるか又はそれと相互作用してシグナルを生成する標識を該部位に持ってくることによりハイブリダイズして固定化せしめた核酸物質を標識し、その後にシグナル発生性物質を該部位に添加して検出可能なシグナルを生成することにより増幅された核酸物質を検出する方法であって、
標識段階が、ハイブリダイゼーション段階の後に、間に洗浄段階を必要とすることなく直接用いられるか、又は添加段階が、標識段階の後に、間に洗浄段階を必要とすることなく直接用いられる方法により達成される。このような事情で使用される「又は」が、非限定的使用であることは明らかである。
【０００８】
本発明の別の態様に従えば、増幅された核酸物質を検出するための検出部位並びに共同して検出可能なシグナルを発生するのに有効である標識及びシグナル発生性物質を含有する保存区画を含む複数の区画、並びに当該区画と当該検出部位を流動的に連絡するための通路を含んでなる、鋳型として少なくとも１つの標的鎖を用いて核酸物質を増幅及び検出するためのデバイスにより目的が達成される。該デバイスは、更に、当該保存もしくは反応区画に使用される捕捉体、標識及びシグナル発生性試薬を実質的に含まない洗浄液を含有する洗浄区画が２以上含まれることはなく、また当該洗浄区画と当該検出部位とを連絡する通路も２以上含まれることはなく、そのため、当該区画の内容物を空にして当該検出部位へ移動せしめることを含む一連の段階に２以上の洗浄工程を用いることはないように改良されている。
【０００９】
【具体的な態様】
以下の本明細書の説明は、本発明を、その好ましい態様について示すものであり、同一所有の許可された米国特許出願番号第 673,053号明細書（1991年３月21日にSchnipelsky 他により出願されたものであり、その内容は本明細書に特に組み入れられる）に教示された手段で、柔軟なパウチもしくはデバイスが提供され使用される。（幾つかの開示はEPA 381,501 に記載のものと同様である。）更に、本発明は、１つ以下の洗浄区画が、結果として１つ以下の介在する洗浄段階に含まれることを条件として、ＰＣＲが使用されるかどうかに無関係に有用であり、且つそのパウチのすべての特徴の存在に無関係に有用である。
本明細書で用いられる「洗液」もしくは「洗浄溶液」なる語は、別の区画、即ち標識区画又はシグナル発生性物質区画のどちらかに使用される捕捉体、標識及びシグナル発生性試薬を実質的に含まない溶液を意味する。
【００１０】
前記米国特許出願番号第 673,053号明細書の柔軟なパウチの、非特異的シグナルを著しく提供することなく洗浄段階を排除する能力は、完全に理解されているわけではない。しかしながら、「スラッグ」の前面が、その前の「スラッグ」により残存する結合していない試薬を洗い出すように作用するというような、各々の連続的な液体のスラッグを直線的に通過せしめるようなパウチの構成より得られると考えられる。このような「前面」で生じるいずれかの相互作用は、固定化部位で発生するシグナルに対してほとんど又は全く取るに足らないものである。更に、すべての各スラッグの液体が、検出部位を通過して効率を改良する。下記のように添加できる任意の剪断減粘性ゲルは、この能力を増強し、スラッグの前面の境界により除去される成分の後方移動を遅らせるより粘稠なスラッグを創造することは明らかである。
【００１１】
図１は、反応区画と標識区画の間の洗浄区画及び洗浄段階を排除した、本発明の一様式を具体的に示すものである。反応キュベットもしくはデバイス１０は、患者の試料液を注入するための入口２２を含み、その入口は通路２１を介してＰＣＲ反応区画２６に連絡する。シール４６は、区画２６の流出を一時的に遮断する。シール４６が破れると、液体は通路４４を通過して、好ましくは適所に定着せしめられたビーズから成る部位４１を有する検出室４０に送られる。ビーズは、区画２６から流れてきてそれらを通過するいずれかの標的分析物と複合体を形成し、次いで別の試薬区画から来る試薬と複合体を形成するであろう。それらの別の区画は区画３０，３２，３４であり、これらの内容物は各々通路４８及び５０を介して検出室４０に送られる。これらの各通路は５６で一時的にシールされており、そしてこれらの区画は適当な試薬液を含有する。
【００１２】
すべての区画及び部位４１に有用な化学物質については、前記米国特許出願番号第 673,053号明細書により詳細に説明されている。好ましくは、洗浄区画が緩衝剤、界面活性剤、ＥＤＴＡ、NaCl及び別の塩類を含む。
【００１３】
本発明に従えば、数多くの必須の区画が単一化されている。従って：
使用者により添加される患者試料に加えて、好ましくはＰＣＲ増幅に必要なすべての伝統的な試薬を含む区画２６は、場合によっては一時的にシール２５により適所に維持される。（試薬は、予めインキュベーションすることができ、又は患者試料を入れるときにそれと共に添加できる。）試薬は、バインディングペアの１メンバーに結合したプライマーを含み、その別のメンバーは下記区画３０に認められる。プライマーに付着したバインディングメンバーの有用な具体例はビオチンである。（ここで、シール２５は試料を注入することにより破裂する。）
【００１４】
区画３０は、好ましくは、複合剤、例えば、アビジン、即ち、バインディングペアの一方のメンバーに結合した酵素を初めとする標識を含み、そのペアのもう一方のメンバーは上記反応区画２６で増幅中に標的分析物の一部となるプライマーに結合している。よって、区画３０中の有用な試薬は、ストレプトアビジン西洋ワサビペルオキシダーゼ（以下本明細書では、ＳＡ−ＨＲＰ）である。従って、そのバインディングペアのもう一方のメンバーはビオチンである。
【００１５】
また酵素以外の標識も有用である。例えば、蛍光標識、放射性標識及び化学ルミネセンス標識もこのような用途について周知である。また好ましくは、化学ルミネセンス標識が、酵素標識について以下に検討されている、シグナル発生性試薬を含有する区画３４に使用される。
好ましくは、区画３２は試薬として洗浄溶液を含む。
【００１６】
好ましくは、区画３４は、シグナル発生性物質及び有用であるいずれかの色素安定剤を含む。従って、例えば、区画３４中の有用な試薬溶液は、区画３０の酵素の伝統的な基質であるロイコ色素の溶液である。またH2O2及びいずれかの剪断減粘性ゲルも含まれる。
区画４２は、場合によって吸収体を含有する廃棄物収集区画である。
【００１７】
ローラー６０は、各区画を連続的に破裂せしめて、それぞれの区画の内容物を検出室４０に連続的に進行させるために使用される外部加圧手段を例示するものである。処理中、すべての区画及び通路が封じられたままなので、デバイスから外部への漏出が生じることは全くなく、そして繰越汚染も防止される。入口２２のシーリングは、折り曲げ線７２でコーナー７０を折り曲げて、孔７４を入口２２の上に嵌め、そして通路２１を挟みつぶすことにより達成される。次いでクロージャーキャップを用いてコーナー７０を折り曲げた状態に維持する。
【００１８】
デバイス１０を処理するのに有用な処理装置は、EPA 402,994 に示されている。そのような処理装置を用いて、支持体表面上にデバイス１０をきちんと並べて置き、そして加圧メンバー、例えば、ローラーを、各キュベットを処理する位置に平行に乗せる。便宜上ローラーを数個から１つもしくは複数の車軸にジャーナルせしめる。これらの車軸はギアを付けることにより更に進歩する。好ましくは、支持体表面が水平であるか、又は水平より約15°上向きに傾斜している。更にヒーターは、所望により、固定状態であるか、あるいはローラーと共に運ぶことができる。
【００１９】
従って、区画４０の部位４１でＳＡ−ＨＲＰをインキュベーションした後に洗浄段階を提供して、いずれの未結合ＳＡ−ＨＲＰも除去するために、唯一の洗浄区画３２が使用される。検出部位に向けられた各試薬がそのステーションに入る次の試薬によりほとんど洗い流されるので、増幅された核酸物質及びＳＡ−ＨＲＰの、部位４１へのそれぞれの連続的な移動の間に洗浄段階もしくは洗浄液は全く必要とされないと考えられる。各区画の少量の内容物がこれを行うのに十分であることは、驚くべきことである。
【００２０】
あるいは（図示せず）、洗浄液が区画３０にのみ配置されており、ＳＡ−ＨＲＰがここで区画３２に配置されているが、図１と全く同じ構造のものが有用である。この配置では、方法は、部位４１でＳＡ−ＨＲＰをインキュベーションした直後に、洗浄段階を間に入れることなく、区画３４のシグナル発生性物質を部位４１と直接相互作用するように進行させる。これが実施できる理由は、先の態様について記載の通りである。
【００２１】
どちらの態様においても、所望であれば更なる洗浄液を備えた洗浄区画を補充できる。これを行う便利な方法（図２）は、始めに第１洗浄区画を空にして検出部位へ流し、次いで第２洗浄区画を空にして検出部位へ流すために、第１洗浄区画に隣接した洗浄区画を加えることである。これらの前記と同様の部分には、同様の参照数字を付与し、区別するためにそれの末尾に「Ａ」を付ける。
【００２２】
従って、パウチ１０Ａは、更に一時的にシールした洗浄液の区画３６を区画３２Ａと３４Ａの間に置いたことを除いて、図１の態様におけるものと全く同じ特徴を含む。通路５２は、区画３６のシール５６Ａが破裂した後に、それを区画４０Ａに連絡するものである。
あるいは、大量の洗液を備えた単一洗浄区画が使用できる。
図３に示すように、結果としていかなる洗浄区画又はいかなる洗浄段階の存在も必要ではない。これらの前記と同様の部分には、同様の参照数字を付与し、区別するためにそれの末尾に「Ｂ」を付ける。
【００２３】
従って、図３のパウチ１０Ｂは、全く洗浄区画が存在しないことを除いて、前記態様のすべての特徴を含む。存在する区画は、サーマルサイクリング反応区画２６Ｂ、標識含有区画３０Ｂ（例えば、ストレプトアビジン西洋ワサビペルオキシダーゼを含む）、並びにシグナル発生性物質、例えば、H2O2を含有し、すぐ後に記載する剪断減粘性ゲル及び標識酵素と反応して色素を生成するロイコ色素を任意に含有する区画３４Ｂのみである。シール４６Ｂ及び５６Ｂは、ローラー６０Ｂにより連続的に破裂せしめられ、内容物はそれぞれ通路４４Ｂ及び４８Ｂを介して検出部位４０Ｂに流れ、次いで廃棄物区画４２Ｂに流れる。
【００２４】
すべての態様において、シグナル発生性物質と共に含まれる任意の成分は、検出区画中の検出部位での色生成を安定化するための約 0.5％のアガロース溶液である。アガロースは、約40℃で測定した場合、この濃度付近での粘度が剪断速度１〜102sec-1の間で約２．７Ｐａ・ｓ（約27ポアズ）低下する（その低下量の60％を越える）が、102 を越える速度ではさらに０．３Ｐａ・ｓ（３ポアズ）しか低下しないという剪断減粘性挙動を示す。同様の粘度挙動を示しそして低いパーセンテージ濃度を示す別の剪断減粘性ゲルが使用できる。
【００２５】
以前は洗浄段階が検出部位への増幅された物質もしくは標識のどちらかの添加と次の試薬の添加の間に必須であると考えられていたので、上記のように、驚くべきことにどのようにしてパウチを用いて洗浄段階を排除することが許容されるのか、完全に理解されているわけではない。図４Ａ〜４Ｃは、例えば、図３の態様を用いて仮定したメカニズムを具体的に説明する際の補助として含めた。しかしながら、同様の原理がすべての態様に作用していると信じられている。
【００２６】
示されているものは、前記EPA 381,051 に記載のような固定化ビーズを含む、拡大した検出部位４１Ｂである。図４Ａに示される段階では、ビオチン尾部を有する増幅された標的核酸物質を「〜〜〜Ｂ」と示す。そのような物質は既にビーズにハイブリダイズせしめられている。更に、標識ＳＡ−ＨＲＰを含有する区画が空になりその部位へ流れてくる。（ＳＡ−ＨＲＰは、標識アビジンとして「Ａ* 」と示す。）そのＳＡ−ＨＲＰの幾つかは、既に標的のビオチンに結合しているが、しかし幾つかはビーズ上に及び区画４０Ｂの表面上に結合していないもの又は「遊離しているもの」として示す。
【００２７】
シグナル発生性物質、例えば、ロイコ色素（「Ｌ．Ｄ．」と示す）を含有する次の区画が破裂すると、ロイコ色素は「スラッグ」１００，図４Ｂ，として前進する。その先導メニスカス１０２は、それが移動することにより（矢印１０４）、部位４１Ｂに接近する。「スラッグ」１００が図４Ｃの部位４１Ｂを通過するとき、それはメニスカス１０２で結合していない前の試薬（Ａ* ）を運び去り、結合した標識のみを残してスラッグ１００の後ろに引きずる部分で反応し、部位４１Ｂで色素を生成する。それは読み取られるか又は検出される領域１１０であるので、下流（メニスカス１０２）で生成されたいずれかの余分な色素は無関係である。このような検出部位への余分な色素の後方への移動は、所望により前記剪断減粘性ゲルを使用することにより更に遅くなる。
【００２８】
【実施例】
以下の例示的な実施例は、本発明を説明する際に役立つであろう。
すべての実施例及び比較例は、特に断らない限り、以下のように調製された試薬を用いた。
【００２９】
Ａ．  評価するためのＨＵＴ／ＨＩＶ分析物の調製
細胞１つ当たりＨＩＶのコピーを１つ含有するＨＵＴ／ＡＡＶ／７８細胞を標準フェノール・クロロホルム抽出方法で処理してＤＮＡを単離し、そして得られたＤＮＡの量を分光光度計で定量した。以下に同定される各プライマー（各々１マイクロモル（μＭ））、緩衝剤〔塩化マグネシウム10ミリモル（mM）、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ）50mM、塩化カリウム50mM、及びゼラチン 0.1mg/mL 〕、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰデオキシヌクレオチド三リン酸  各々 1.5mM、並びにサーマス・アクアティクス（Thermus aquaticus ）より得られるＤＮＡポリメラーゼ  40単位、を含有するカクテル中で、回収したＤＮＡ（ＨＩＶ 100,000コピー）をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅した。
【００３０】
二組のプライマーを使用した。一組はＥＮＶ領域に相補的であり、そしてもう一組はＨＵＴ／ＨＩＶ  ＤＮＡのＧＡＧ領域に相補的であり、それらは多重に使用されることが知られている。各組の１つのプライマーが検出を促進するためにビオチニル化された。米国特許第 4,914,210号明細書の教示に従って、２つのテトラエチレングリコールスペーサー基をオリゴヌクレオチドに付着させた。
【００３１】
ＰＣＲプロトコールを、P. N. Schnipelsky 他，EPA 381,051 及び1991年３月21日に出願された（現在は許可された）米国特許出願番号第 673,053号明細書に記載のタイプのＰＣＲ分析要素のＰＣＲ反応ブリスター中で前記カクテル 250μＬを用いて実施した。より詳細には、図７のパウチ１０Ｃを使用した。これらの前記と同様の部分には、同様の参照数字を付与し、区別するためにそれの末尾に「Ｃ」を付ける。従って、配置又は以下本明細書に記載することを除いて、区画２６Ｃ、３０Ｃ、３２Ｃ、３６Ｃ及び３４Ｃ；通路４４Ｃ、４８Ｃ、５０Ｃ及び５２Ｃ；検出部位４０Ｃ並びに廃棄物区画４２Ｃを前記のように使用した。１つは、ＰＣＲ増幅を試験パウチ１０Ｃとは別個のパウチで行ったことであり、すべての反復試験、例えば、実施例１では３２回における結果が矛盾しないように、増幅した物質をプールし、次いで区画２６Ｃに注入した。
【００３２】
EPA 402,994 に記載のタイプのサーマルサイクリング処理装置を使用した。
標的ＤＮＡを予め90℃で10秒間加熱し、次いで96℃で30秒間変性し、そして70℃まで60秒間かけて冷却してプライマーをアニールし、そしてプライマー伸長生成物を生成した。後者の２つの段階（96℃で加熱し、次いで70℃にする）は、計40サイクル繰り返した。このＰＣＲプロセスを64回反復し、そして新たに生成したＰＣＲ生成物を含有する流体を64個のＰＣＲブリスターから共通の容器に写してＰＣＲ生成物のプールを調製した。このプール由来の試料を前記ＰＣＲ緩衝剤で１：20に希釈して、以下本明細書に記載される試験に使用した。
【００３３】
Ｂ．  洗浄溶液の調製（使用した場合）
リン酸ナトリウム10ミリモル、塩化ナトリウム 150ミリモル及びエチレンジアミン四酢酸１ミリモルを含有するリン酸緩衝塩化ナトリウム溶液中にデシル硫酸ナトリウム１％を含み、pH 7.4となるように洗浄溶液を調製した。
【００３４】
Ｃ．  ストレプトアビジン／西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＳＡ−ＨＲＰ）接合体溶液の調製
Zymed Labs (San Francisco, CA)より入手したストレプトアビジン及び西洋ワサビペルオキシダーゼの接合体を、チメロサール防腐剤（0.01％）を含有するリン酸緩衝溶液（pH 7.3）中にカゼイン（ 0.5％）を含む溶液で１：8000に希釈した。
【００３５】
Ｄ．  ロイコ色素組成物の調製
水 100mL中にポリビニルピロリドン25ｇを含む溶液を、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド１mL中に４，５−ビス（４−ジメチルアミノフェニル）−２−（４−ヒドロキシ−３，５−ジメトキシフェニル）イミダゾールブルー生成性ロイコ色素0.20ｇを含む溶液と混合し、そして１時間攪拌した。次いでこれを、水1900mLに溶解したリン酸一ナトリウム一水和物2.76ｇ、ジエチレントリアミン五酢酸溶液（ 0.1Ｍ） 0.2mL及び４′−ヒドロキシアセトアニリド1.51ｇを混合し、そして50％水酸化ナトリウム溶液でpH6.82に調整することにより調製した溶液に添加した。次いで30％過酸化水素２mLを添加し、そして混合物を攪拌して色素分散物を生成せしめた。最終的に、得られた色素分散物 24.75mLを水性25μＭジメドン0.25mL及びアガロース 0.125ｇと混合して 0.5％アガロースを含有する色素生成性組成物を生成した。アガロースが溶解するまで組成物全体を80℃で加熱攪拌し、次いで室温まで冷却した。
【００３６】
Ｅ．  プローブ試薬の調製
米国特許出願番号第 654,112号明細書（Ponticello他により1991年 2月12日出願）及びSutton他によるEPA 462,644 に記載の方法を用いて、ポリ〔スチレン−コ−３−（ｐ−ビニルベンジルチオ）プロピオン酸〕（モル比97.6:2.4, 重量比95:5，平均直径１μｍ）水性ポリマー粒子分散物を調製し、そして以下本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドをポリマー粒子の一部分に共有結合せしめ、そして別のオリゴヌクレオチドをポリマー粒子の別の部分に共有結合せしめた。オリゴヌクレオチドを２つのテトラエチレングリコールスペーサー、３−アミノ−１，２−プロパンジオール部分及びチミン塩基を介してポリマー粒子に連結させた。米国特許第 4,962,029号明細書の方法により、各オリゴヌクレオチドを３−アミノ−１，２−プロパンジオール部分のアミノ基を介してポリマー粒子に付着せしめて試薬を生成した。
【００３７】
ポリマー／オリゴヌクレオチド粒子プローブを、ポリ（メチルアクリレート−コ−ナトリウム  ２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホネート−コ−２−アセトアセトキシエチルメタクリレート）（重量比90:4:6）のラテックス接着剤と、粒子対接着ポリマーの乾燥重量比約4/0.1 （接着剤 2.5％）で混合した。水性分散物は固体含有量約４％であった。
【００３８】
これらの試薬製剤を用いて、ＨＵＴ／ＨＩＶについてのアッセイ用に捕捉プローブとして試薬を含有する一連の分析デバイスを製造した。対照試薬オリゴヌクレオチド配列は、ＨＩＶゲノム由来の配列であり、そしてナンセンス配列として使用した。このナンセンスプローブはいかなるＨＵＴ／ＨＩＶ分析物配列も捕捉すべきではなく、従って、対照試薬では色素の出現が全く起こらないはずである。別のプローブ試薬配列は、ＨＵＴ／ＨＩＶ  ＤＮＡのＥＮＶ領域の配列に相補的であった。
【００３９】
上記試薬を用いて、各々試薬区画（それらの１つは、試料分析物を最初に入れるＰＣＲ反応ブリスターである）、検出区画及び廃棄物貯蔵室を有する一連の分析要素（パウチ）を生成した。分析デバイス（もしくは要素）は、ポリ（エチレンテレフタレート）／ポリエチレンラミネート（SCOTCHPAK(商標)241, 3M Co.）のシートを成形ステーション（もしくは型）で加熱してシートの一方の側にきちんと配列された窪み（ブリスター）を形成し、そしてシートのもう一方の側の末端の近くに、主溝が最終的に導かれる大きな窪みを形成し、第１ブリスターから最後までの主溝を形成し、そして後でカバーシートに積層する際に、得られたパウチが、Schnipelsky 他による前記米国特許出願番号第 673,053号明細書に記載のデバイスに類似の窪みから主溝へ導く狭い溝を有するように、各ブリスターから主溝までの支流溝を形成した。各々主溝の末端の１つを除いて、各窪みを適当な試薬組成物で満たした。カバーシートを積層して窪み及び溝の上にカバーを形成し、そしてシールして各窪みの間に破裂性シールを作り（最後の１つを除く）、そしてそこから主溝へ導く溝を作った。しかしながら、最初にカバーシートをコロナ放電で全体的に処理した。次いで上記プローブ試薬製剤（Invention & Control)を、各スポットが以下本明細書に記載されるように製剤 0.9〜1.1 μＬを有するように、直ちに処理表面上に４つおきにスポットした。支持体の反対側を約95℃のアイロンで加熱しながら、配置した製剤を約30秒間室温の気流中で乾燥した。
【００４０】
実施例１：標識区画とシグナル発生性物質区画の間にのみ存在せしめた洗浄区画図２の態様を具体的に説明するために、16個の反復試験片を製造した。上記の如く製造した16個の反復試験片の各々のシートのブリスターを、以下のような実施例の試験における試薬で満たした。
【００４１】
【表１】
0003795540.tif 000002
【００４２】
（従って、余分な洗浄物質を供給したが、ブリスター２からブリスター５を分離することのみに有効であり、ブリスター１からブリスター２を分離することには有効ではなかった。）
EPA 381,501 に示されるものに類似する比較例として（「停止溶液」区画が省略されている，正確に読み取るためとしては、その段階は明らかに不必要である）別の一組の16個の反復試験パウチを、第１洗液並びにブリスター２及び３中のＳＡ−ＨＲＰ接合体の位置、そして各々の量を逆にしたこと、即ち、 350μＬの洗浄溶液及び 235μＬのＳＡ−ＨＲＰ溶液を使用したことを除いて実施例１と同様に製造した。
【００４３】
次いでカバーシートを積層し、そして３段階でシールした。最初に、サンドウイッチを、試薬溶液を含有するブリスターの周囲及び廃棄物ブリスターの周囲のみ加圧して約 149℃で加熱することによりシールした。破裂性シールを包含する試料受容ＰＣＲブリスター及び溝の成形は、約 163℃で適当な造形加熱ジョーの間で試験パックを加熱することにより完成した。第３段階は、試験パックの周囲のシールの形成であり、そして上部取付板の温度 199℃で、一方下部取付板の温度は周囲温度のままですべてのブリスター周囲シールを再シールした。完成した試験パック（もしくは要素）中に成形された溝及びブリスターは、試薬ブリスターを含有する要素の部分を横切ってローラーが通過すると、ブリスターのシールが連続的に破裂し、そして各ブリスターから出口の溝へ試薬が押し出され、それに沿って主溝へ進み、捕捉プローブを含有する領域に導かれるように配置した。捕捉プローブスポット（被覆物）を含有するカバーシートが、主溝に適当に整列したプローブ被覆物を有する完成した要素の底となるように、完成した要素を逆にして、検出ステーションを形成した。４つのプローブスポットを、幾つかの試料で主溝の異なる部位に配置した。
【００４４】
実施例１及び比較例の両方とも、主溝の末端に配置した最終洗浄区画は別のものよりも大きいものであり、且つ吸収剤と合わせて洗浄液用の貯蔵室とした。
実施例１及び比較例の完成パウチを用いて、以下の試薬製剤を評価した。
各試験デバイス中のブリスターを前記ＰＣＲ生成物の20倍（×）希釈物（ 190〜210 μＬ）で満たして以下のように処理した。
【００４５】
実施例１
分析物を予め95℃で 120秒間加熱し、そしてそのブリスターをローラーにかけてシールを破裂させ、溶液を検出ステーション（プローブ被覆物）に向けて前進させた。分析物及びプローブ試薬を検出ステーションで42℃で５分間ハイブリダイズせしめ、一方第２ブリスター中のＳＡ−ＨＲＰ接合体を予め65℃に加熱した。接合体ブリスターをローラーにかけ、シールを破裂させ、そして溶液を検出領域に向けて分析物と置き換わるようにした。５分後、予め55℃に加熱した第１洗浄溶液を含有する第３のブリスターを破裂させ、そして洗液を検出ステーションに向け、そしてそこに５分間維持し、一方第２洗浄溶液を予め55℃に加熱した。次いで第２洗浄溶液を含有するブリスターを破裂せしめ、そして洗浄液を検出ステーションに向けた。最終的に、予め加熱することなく色素シグナル発生性組成物を含有するブリスターをローラーにかけ、そしてシールを破裂せしめ、そして組成物を検出ステーションに向け、そこで５分間インキュベーションした後に以下本明細書に記載する色チャートを用いて色スコアを読み取った。色スコアを第Ｉ表に記録し、そして図５にグラフで示す。
【００４６】
比較例
各要素中に分析物を含有するブリスターを予め約95℃で 120秒間加熱し、次いでそのブリスターをローラーにかけてシールを破裂させ、４つのプローブ試薬の固定化被覆物を含有する領域、即ち、接着剤で付着せしめた２つの対照プローブ及び２つのＨＵＴ／ＨＩＶプローブに向けて溶液を前進させた。分析物及びプローブ試薬を検出ステーションで42℃で５分間ハイブリダイズせしめ、一方洗浄溶液を含有するブリスターを予め55℃に加熱した。次いで洗浄溶液ブリスターをローラーにかけ、シールを破裂させ、そして洗浄溶液を検出領域に向けて主溝を一掃して未結合分析物を検出領域から除去した。次いで、予め加熱することなく、ストレプトアビジン／西洋ワサビペルオキシダーゼ接合体ブリスターをローラーにかけ、シールを破裂させ、そして溶液を検出領域に向け、ここで５分間に亘ってそれを固定化ビオチニル化分析物と結合せしめた。この期間中に、第２洗浄溶液を予め55℃に加熱し、次いでローラーを用いてブリスターのシールを破裂せしめ、そして洗浄液を検出ステーションに向け、そこでそれを未結合標識と置き換えた。最終的に、ローラーを用いて最終ブリスター中の色素シグナル発生性組成物のシールを破裂せしめ、そして流体を検出ステーションに向け、そこでそれを第２洗浄溶液と置き換えた。５分間プローブ被覆物上で色素生成を行ってから、色濃度スコアを読み取った。各プローブ被覆物の色を、０が濃度なしであり且つ10が最高濃度である色チャートを用いて湿潤色素濃度の比較により評価した。色スコアを第II表に記録し、そして図６のグラフに図示する。（第Ｉ表及び第II表の「ＬＴＲ」及び「ＥＶＮ」の語は、それぞれ、対照ナンセンスプローブ被覆物及び分析物中のＨＩＶゲノムのＥＶＮ領域に相補的なプローブ被覆物を表す。これらは、検出区画中の各々４つのビーズ部位を表す。左から右へ、以下の液体が出会う最初のビーズは「ＬＴＲ」である。第２のビーズは「ＥＮＶ」であり、第３のビーズは「ＬＴＲ」であり、そして最後は右手側の縦欄中の「ＥＮＶ」である。）
【００４７】
【表２】
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【００４８】
【表３】
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【００４９】
容易に認められるように、特に図５及び図６の比較から、検出部位へ増幅された核酸物質をハイブリダイズした後の、及び標識試薬を添加する前の洗浄段階の排除は、結果に害を及ぼさない。実際に、良い結果が生じた。定量的には、これもまた、16個の反復試験片すべてについての実施例１の第２及び第４のビーズ「ＥＮＶ」を平均して比較例のものと比較することにより認めることができる。実施例１については、平均が 6.0及び5.69であり、それに対して比較例については平均が両方の場合について5.44であった。
【００５０】
上記結果は、特定のアッセイに限られる訳ではない−またそれらは、例えば、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）についてアッセイするときにも起こる。どのようなアッセイが１つ又は両方の洗浄段階を排除できることを示すために使用されるかということは重要ではないと信じられているので、オリゴヌクレオチド配列は特に同定していない。
【００５１】
図１に示したパウチを製造して、実施例１のものと比較可能な結果が、第２洗浄区画を省略する場合にも得られることを示している。即ち、そのようなパウチでは、洗浄区画及び洗浄段階は、標識区画及び段階（ＳＡ−ＨＲＰを用いる）とシグナル発生性物質区画及び段階（ロイコ色素及びH2O2を用いる）との間にのみ存在する。
【００５２】
同様に、そのような、唯一の洗浄区画を有するがそれが核酸物質を増幅するために使用される反応区画と標識区画との間に配置されている４−区画パウチが、各反応区画（ハイブリダイゼーション段階）及び標識区画（標識段階）の後に洗浄区画（及び段階）を有する従来の構造と比較可能である結果を生じることが認められている。
【００５３】
実施例２：実施例１のパウチと洗浄溶液を全く含有しないパウチとの比較
以下のことを除いて実施例１の方法により二組のＰＣＲ分析パウチを製造した。
１．第３プローブ組成物を、ＨＵＴ／ＨＩＶ  ＤＮＡのＧＡＧ領域由来の配列に相補的な配列を含めて実施例１の方法により調製した。
【００５４】
２．各々３つのプローブの唯一のスポット（被覆物）を、（１）上記ＧＡＧ領域由来の新規プローブ、（２）実施例１の対照プローブ、そして（３）実施例１の試薬プローブ、の順序で各要素に取り入れた。
３．一組のパウチが、実施例１の逆洗浄フォーマットの５−ブリスターパウチであり（第２ブリスター中にＳＡ−ＨＲＰ接合体があり、且つ第３ブリスター中に洗浄液がある）、そしてその組のパウチを実施例１に記載のように処理した。
【００５５】
４．第２組のパウチは、図３に示されるように、３つの試薬区画のみを使用し、全く洗浄区画を使用しなかった。それらは、プール由来の分析物組成物を包含する同様の組成物、及び実施例１の第１組（従来の洗浄フォーマットの組）の要素中の対応する組成物と同じ量を含み、そしてブリスターは以下の順序であった。
【００５６】
【表４】
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残りのブリスターもしくは区画は空のままであった。
【００５７】
第２組のパウチを以下のように処理した。
ＰＣＲブリスター中の分析物を予め95℃で 120秒間加熱し、そしてそのブリスターをローラーにかけてシールを破裂させ、分析物を検出ステーション中の３つのプローブ被覆物に向けて前進させた。42℃で５分間ハイブリダイゼーションを行い、一方第２ブリスター中のＳＡ−ＨＲＰ溶液を予め65℃に加熱した。次いで第２ブリスターをローラーにかけてシールを破裂させ、そして溝を介して溶液を検出ステーションに向けた。接合体を５分間検出ステーションでインキュベーションし、次いで、予め加熱することなく、色素生成性検出分散物を含有するブリスターをローラーにかけ、シールを破裂させ、そして分散物を検出ステーションに向けてＳＡ−ＨＲＰと置き換えた。検出ステーション中の色素分散物を５分間インキュベーションした後、実施例１のように色チャートを用いて色スコアを読み取った。両組の要素の色スコアを第IIＡ表及び第IIＢ表に記録し、そして図７及び図８にそれぞれグラフで示す。
【００５８】
データは、３−ブリスターパウチ配置が５−ブリスター（実施例１の洗浄パウチフォーマット）のものと比較可能な陽性シグナルを与えるが、しかしながら、ナンセンス（対照）ビーズでわずかに高いシグナルを与えることを示す。これは、大量の色素生成性検出分散物を用いることにより３−ブリスター配置で低減又は排除できる。３−ブリスター配置は少量の試薬の使用、より低い単位製造経費、狭いパウチ保存スペース、短い処理時間、並びにより小さくあまり複雑ではない処理装置を許容する。
【００５９】
【表５】
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【００６０】
【発明の効果】
以前は所望の結果を得るために必要であると考えられていた少なくとも１つの洗浄段階を回避する、核酸物質を増幅及び検出するための方法及びデバイスを提供することが、本発明の優れた技術効果である。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明に従って構成された反応デバイスの平面図である。
【図２】図２は、図１のものと同様の平面図であるが、本発明の別の様式を示すものである。
【図３】図３は、図１のものと同様の平面図であるが、本発明の別の様式を示すものである。
【図４】図４は、本発明について仮定されたメカニズムを具体的に説明する部分断面図である。
【図５】図５は、本発明の実施中に達成された反復色スコアを示すグラフである。
【図６】図６は、比較例の実施中に達成された反復色スコアを示すグラフである。
【図７】図７は、本発明の実施中に達成された反復色スコアを示すグラフである。
【図８】図８は、本発明の実施中に達成された反復色スコアを示すグラフである。
【図９】図９は、図２のものと同様の平面図であるが、実施例に使用した変形パウチを示すものである。
【符号の説明】
１０…デバイス
２１…通路
２２…入口
２５…シール
２６…ＰＣＲ反応区画
３０…区画
３２…区画
３４…区画
３６…区画
４０…検出室
４１…検出部位
４２…廃棄物収集区画
４４…通路
４８…通路
５０…通路
５２…通路
５６…シール
６０…ローラー
７０…コーナー
７２…折り曲げ線
７４…孔
１００…スラッグ
１０２…メニスカス
１０４…矢印
１１０…読み取り領域又は検出領域
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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