(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面に各々毎に異なる塩基配列のオリゴヌクレオチドプローブを固定された複数の領域を有する基板を設置する手段と、
前記基板上にポリヌクレオチドを含む試料溶液を供給する手段と、
前記ポリヌクレオチドが吸収しない波長の光を前記領域に照射して前記領域を選択的に加熱する手段とを有することを特徴とするポリヌクレオチド分取装置。
【請求項２】
前記領域に固定された前記オリゴヌクレオチドプローブと結合し、かつ前記加熱する手段の加熱によって遊離した前記ポリヌクレオチドを回収する手段をさらに有することを特徴とする請求項１に記載のポリヌクレオチド分取装置。
【請求項３】
前記領域に交流電場を発生させる手段をさらに有することを特徴とする請求項１に記載のポリヌクレオチド分取装置。
【請求項４】
前記回収する手段は、前記基板に設置される第１電極と、少なくとも１つの他の電極と、前記第１電極と前記他の電極との極性を制御する手段とを有することを特徴とする請求項２に記載のポリヌクレオチド分取装置。
【請求項５】
前記基板は前記領域に光吸収層を有することを特徴とする請求項１に記載のポリヌクレオチド分取装置。
【請求項６】
前記基板は前記領域に断熱層とその上に設置される光吸収層を有することを特徴とする請求項１に記載のポリヌクレオチド分取装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、複数の異なる配列を持ったポリヌクレオチドの混合試料あるいは細胞より特定の塩基配列を持つポリヌクレオチドのみを選択的に分離回収する方法および装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＤＮＡの特定の塩基配列を高速かつ簡便に検出するために使用されるものの一つにＤＮＡチップがある。これは半導体微細加工技術で用いられるマイクロパターニングの技術とＤＮＡの相補性とを利用したものである。基板上の２次元に領域分割された各領域上に、様々な配列を持つ塩基長８−９程度のプローブとしての一本鎖のオリゴヌクレオチドをそれぞれ固定しておき、この基板上にＤＮＡを含む試料溶液を滴下して、基板上の各領域のプローブと結合させ、この結合の際、同時に蛍光色素を結合させることにより、このプローブと試料溶液中のＤＮＡとの結合の程度を光学的に観測することで試料溶液中のＤＮＡの塩基配列を解析する。
【０００３】
プローブとしての特定のオリゴヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を固相に捕捉する方法は、たとえば、米国特許４，４４６，２３７に開示されている。この方法では、特定のオリゴヌクレオチドを含む溶液を加熱し、オリゴヌクレオチドを変性させて一本鎖とした後、これを、ニトロセルロース膜表面に固定する。また、プローブとしての特定のオリゴヌクレオチドを固相に捕捉する他の方法は、S R Rasmussen et al, Analytical Biochemistry 198, 128〜142(1991)に記載されている。この方法では、オリゴヌクレオチドの５’末端のリン酸基を１−メチルイミダゾールと１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミドを用いて活性化し、２級アミンを導入したポリスチレンマイクロプレートの表面に固定する。この方法では２級アミンと活性化した５’末端のリン酸基が反応するのでオリゴヌクレオチドの５’末端側がマイクロプレート表面に共有結合で固定される。
【０００４】
このように、プローブとしての特定のオリゴヌクレオチドが膜表面に固定されていれば、これと相補性のあるポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を選択的にこれに結合させることができるから、試料溶液中に含まれるポリヌクレオチドを解析することができるのであり、ＤＮＡチップはこの考え方を基礎としたものである。
【０００５】
一方、選択的に分離回収しようとするポリヌクレオチドを、チップ上に固定されたプローブによって捕獲し、次にチップ全体を加熱し熱変性によって捕獲されたプローブ上のポリヌクレオチドをチップから分取する手法に関しては、すでに米国特許５，６０７，６４６に岡野らが報告している。
【０００６】
また、ゲル中のポリヌクレオチドの電気泳動の速度差を用いて、特定のポリヌクレオチドを選択的に分離回収しようとすることも広く行われている。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
上記従来技術で述べたＤＮＡチップによる遺伝子解析技術は、基板上に形成された長さが８−９塩基ほどのプローブ（特定の一本鎖オリゴヌクレオチド）と試料溶液中のポリヌクレオチド（ＤＮＡあるいはＲＮＡ）の一本鎖ポリヌクレオチドとを相補的に結合させることにより捕獲し、観察する技術であり、基板上のプローブに捕獲されたＤＮＡあるいはＲＮＡ一本鎖ポリヌクレオチドをさらに選択的に基板上から分離し回収することについては考慮されていなかった。
【０００８】
また、従来は分離、回収したいポリヌクレオチドを細胞から直接的に抽出することは考えられていなかった。
【０００９】
さらに、従来の電気泳動を用いた分離技術では、ポリヌクレオチドの移動度は互いに相対的なものであり泳動条件の変化によって変動してしまい、分離回収された試料溶液成分の同定が必要であった。また拡散により泳動中のポリヌクレオチドが互いに混ざってしまう可能性があり、正確に極微量のポリヌクレオチドを分離、精製することは困難であった。
【００１０】
本発明のポリヌクレオチド分離方法および装置は特定の塩基配列を持つ微量のポリヌクレオチド（ＤＮＡあるいはＲＮＡ）を高精度、高速に選択的に分離、回収する方法および手段を提供することを目的とする。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明は、上記目的を達成するため、基板上の分割された表面の各領域をそれぞれ異なる塩基配列のプローブ（特定のオリゴヌクレオチド）で修飾し、該プローブに試料溶液中のポリヌクレオチド（ＤＮＡあるいはＲＮＡ）を結合させ、次いで、基板の特定の領域のみを選択的に加熱して、前記プローブに相補的に結合しているポリヌクレオチドのみを該プローブから遊離させることにより、試料溶液中から希望するポリヌクレオチドのみを選択的に分離、回収することを提案するものである。
【００１２】
【発明の実施の形態】
図１は本発明のポリヌクレオチド分離方法および装置が遺伝子の解析および選択的な回収処理の中で占める位置を説明するための遺伝子処理のフロー図である。８０１および８０２は準備過程であり、それぞれ、検体細胞導入および検体液体導入の過程である。本発明は細胞自体を検体とする場合および体液を検体とする場合のいずれにも対応できる。８０３は細胞内から細胞の内容物を抽出する過程である。８０４はＰＣＲ増幅の過程であり、分取したいポリヌクレオチドの濃度の薄いときは実行される。８０５は本発明の特徴的な過程であり、複数の独立した領域に試料成分を固定する過程である。８０６は固定された試料成分の状況を観察解析する過程である。８０７は独立した領域から試料成分を分離して回収する過程である。
【００１３】
以下、具体的に説明するように、本発明では、複数の独立した領域に試料成分を固定する過程をもつことと、この領域からそれぞれの成分を分離して回収することとにより、効率的な分取が可能となる。
【００１４】
実施例Ｉ
図２は本発明の第１の実施例の基本構成を示す模式図である。１は基板であり、その表面に分離、回収したい標的ポリヌクレオチドを捕獲固定する。１３は基板ベースである。１４は標的ポリヌクレオチド捕獲領域であり、基板ベース１３の表面に光露光技術により１ミクロン四方程度に分割され、２次元に展開されている。この標的ポリヌクレオチド捕獲領域１４の表面には、各領域ごとに配列の異なる塩基長８−９塩基程度のプローブ（一本鎖オリゴヌクレオチド）が複数本結合している。このプローブは試料溶液中の標的ポリヌクレオチドと相補性のあるオリゴヌクレオチドである。したがって、標的ポリヌクレオチド捕獲領域１４の面に試料溶液が来ると、プローブと標的ポリヌクレオチドとが結合する。すなわち、標的ポリヌクレオチドがプローブに捕獲される。そして、プローブと標的ポリヌクレオチドとが結合するとき蛍光色素が同時に結合するものとされている。３１はヒーターであり、基板１の背面に設けられ、基板１の全体の表面を室温程度から９５℃程度まで加熱することが出来る。１５は対物レンズである。前記基板１は対物レンズ１５の光軸に対して垂直に配置されている。１６は蛍光観察用光源、１７は集束光照射用赤外レーザー光源であり、光源のそれぞれは対物レンズ１５の光軸に対して垂直に配置される。１８１，１８２はそれぞれダイクロイックミラーであり、対物レンズ１５の光軸とそれぞれの光源１６、１７の光軸とが交わる位置に配置されて、光源１６、１７から照射された光を対物レンズ１５に誘導する。また、ここで用いられる光源１６の光、蛍光色素の発する蛍光、光源１７の光の波長は互いに異なっているものを用いることが望ましい。１５１はバンドパスフィルターであり、光源１６の光はこれを通過することにより前記蛍光色素を励起するのに適当な波長に絞られる。対物レンズ１５に誘導された励起光は集光され、基板１上に捕獲、固定された標的ポリヌクレオチドとともに結合した蛍光色素を励起する。励起された蛍光色素は、基板上の各領域のプローブに捕獲された標的ポリヌクレオチドの量に比例した強度の蛍光を発する。１８３はミラーであり、前記標的ポリヌクレオチドの量に比例した強度で発生された蛍光が再び対物レンズ１５を介して集められた光を反射する。１５２はエミッションフィルターであり、検出したい蛍光の波長域の光のみを選択的に透過させるものである。１９１は検出器であり、エミッションフィルター１５２を透過した蛍光の強度を検出する。
【００１５】
したがって、対物レンズ１５と基板１とを相対的に動かして、基板１の表面を対物レンズ１５に誘導された励起光によって順次スキャンして、蛍光色素が発する蛍光強度の空間的な分布を蛍光像より知ることにより、基板に固定されたプローブに捕獲された試料溶液中の標的ポリヌクレオチドの量の空間的な分布を蛍光像として得ることができる。ここで標的ポリヌクレオチドの蛍光を観察する場合に用いる励起光は、標的ポリヌクレオチドとともに結合した蛍光色素を励起する場合には可視領域の波長の光で蛍光を発する蛍光色素を用いることが望ましい。標的ポリヌクレオチドとともに結合した蛍光色素による発光に代えて、標的ポリヌクレオチドの自家蛍光を観察することができる。この場合には励起光の波長として２８０ｎｍから４００ｎｍの近紫外波長領域を用いることが望ましい。
【００１６】
前記蛍光色素の蛍光強度は、熱消光効果により、温度上昇の割合に応じて減少する。これを利用して、本実施例では基板上の標的ポリヌクレオチド捕獲領域の局所的な温度上昇を計測することができる。図２で示した装置では、検出器１９１で検出した標的ポリヌクレオチドとともに結合した蛍光色素の蛍光強度の変化を、解析装置１９２で蛍光強度変化の温度依存性をもとに解析し、標的ポリヌクレオチド捕獲領域の温度を見積もることができる。
【００１７】
赤外レーザー光源１７で発生した赤外光は、ダイクロイックミラー１８２により下方に反射され、対物レンズ１５により集光され、基板１上に形成された標的ポリヌクレオチド捕獲領域１４に照射される。標的ポリヌクレオチド捕獲領域１４では基板１の上に形成された薄膜層あるいは微粒子層が赤外光を吸収し、熱を発生するので試料溶液中の局所的な温度を上昇させることができる。対物レンズ１５によって基板１表面で集束されるレーザー光源からの集束光の集束位置は、対物レンズ１５を移動させるか、あるいは基板１を移動させることによって任意に決定できる。また捕獲されている標的ポリヌクレオチドの損傷を避けるため、標的ポリヌクレオチドが吸収を持つ波長領域の光を用いないことが望ましい。たとえば波長８００ｎｍ以上の近赤外光、波長４００ｎｍ以上の可視光を用いるのがよい。
【００１８】
一般にＤＮＡやＲＮＡなどの一本鎖ポリヌクレオチドは、プローブなどの他の一本鎖ポリヌクレオチドと相補的関係がある時、水素結合による塩基対を形成して二本鎖ポリヌクレオチドを形成するが、試料溶液の温度を９５℃程度以上に上昇させると、この水素結合に由来する核酸塩基対の二本鎖ポリヌクレオチドが解離し一本鎖ポリヌクレオチドになることが知られている。従って、基板上の特定の標的ポリヌクレオチド捕獲領域１４に赤外集束光を照射し、その温度を９５℃まで上昇させることにより、特定の標的ポリヌクレオチド捕獲領域でプローブに結合した標的ポリヌクレオチドを選択的に分離させることができる。
【００１９】
また、基板１上に面電極を配置して、この面電極と基板１との間に交流電場を印加すると、基板１上のプローブおよび基板１上の試料溶液中のポリヌクレオチドを伸長させることができる。その結果、プローブと試料溶液中のポリヌクレオチドの非特異結合を減少させるとともに、集束光によるプローブと標的ポリヌクレオチド対の解離を効果的に達成することができる。
【００２０】
また、プローブとハイブリダイズした標的ポリヌクレオチドの解離温度は、その結合した水素結合の量に比例して高くなるため、解離温度を調節することによって標的ポリヌクレオチドとプローブとの結合のマッチングの程度に応じた選択的なポリヌクレオチドの分取も可能である。すなわち、プローブに結合した標的ポリヌクレオチドは温度を徐々に上げて行くと水素結合が少ない標的ポリヌクレオチドから解離を始める。したがって、前記解析装置部１９２で得られた温度の情報をもとにレーザー光源１７の出力を帰還制御し、標的ポリヌクレオチド捕獲領域１４の温度を調節することによって、特異的結合の程度を勘案しながら選択的に標的ポリヌクレオチドを分取できる。
【００２１】
また、テトラエチルアンモニウムクロライド等の４級アンモニウム塩を試料溶液中に加えることで、プローブに結合した標的ポリヌクレオチドの解離温度のばらつきをほぼそろえることも可能である。
【００２２】
図３に基板上の標的ポリヌクレオチド捕獲領域１４の特定の領域を加熱する第１の手段を示す。本実施例では、基板ベース１３は表面に配置された導電性膜１３１と熱伝導性絶縁基板１３２とより構成されている。導電性膜１３１上には、複数の標的ポリヌクレオチド捕獲領域１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６が配置されている。各標的ポリヌクレオチド捕獲領域は酸化アルミ薄層などの光吸収層２１と断熱層２２の二層構造となっている。また、各標的ポリヌクレオチド捕獲領域の表面には、塩基長８−９塩基程度のプローブ（オリゴヌクレオチド）４１、４２、４３、４４、４５、４６が結合している。図では、これらのプローブの内、プローブ４１、４２、４３、４６のみに、標的ポリヌクレオチド４１’、４２’、４３’、４６’が結合している状態を模式的に示している。したがって、標的ポリヌクレオチド捕獲領域を蛍光観察によって同定することで、試料溶液中のポリヌクレオチドのうち、プローブと結合した標的ポリヌクレオチドの対応を見積もることができる。図の例では、領域１４１、１４２、１４３、１４６ではプローブと標的ポリヌクレオチドが相補的結合をしているが、領域１４４、１４５では相補的結合がなされていない。このことより試料溶液中には領域１４４、１４５に配置されたプローブと相補的関係を持つポリヌクレオチドがないことがわかる。
【００２３】
つぎに、プローブ４２に標的ポリヌクレオチド４２’が結合している標的ポリヌクレオチド捕獲領域１４２に、対物レンズ１５より集束光５１を照射する。領域１４２の光吸収層２１が集束光５１を吸収し発熱する。領域１４２の光吸収層２１の発熱により、領域１４２の近傍が９５℃程度の高温になると、プローブ４２と標的ポリヌクレオチド４２’の間の水素結合がはずれ、領域１４２に捕獲されていた標的ポリヌクレオチド４２’のみが選択的に基板１よりはずれる。このとき集束光の集光された領域の大きさが一つの標的ポリヌクレオチド捕獲領域の大きさより小さい場合は、この標的ポリヌクレオチド捕獲領域内に集光領域が収まるように光軸を調節すればよい。また、標的ポリヌクレオチド捕獲領域が集束光の集束領域より小さい場合には、各標的ポリヌクレオチド捕獲領域間の隙間を十分にとって、一つの領域のみが集束光によって加熱されるように、標的ポリヌクレオチド捕獲領域を配置することが望ましい。なお、本図では、図を見やすくするために、標的ポリヌクレオチド捕獲領域にプローブ１本のみを示したが、実際には、各領域とも同一の塩基配列を持ったプローブが複数固定されているのが普通である。
【００２４】
また、本実施例では基板ベース１３表面に導電性膜１３１が配置されているから、上述したように、基板１の上面に対向する電極板（図示しない）を設け、両者の間に、交流電場を印加することでプローブやポリヌクレオチドを引き伸ばすことができる。これによって、結合時の誤った結合や、標的ポリヌクレオチド捕獲領域を加熱して標的ポリヌクレオチドをプローブから解離させるとき立体構造的な絡まり等を防ぎ、効率的に処理を行うことができる。
【００２５】
さらに基板ベース１３に熱伝導性絶縁基板１３２を用いることで、集束光５１を照射しない場合の冷却効果を改善することもできる。
【００２６】
本実施例での光吸収層２１は蒸着によって作製してもよいが、塗布、散布によって作製してもよい。また標的ポリヌクレオチド捕獲領域の形状は、光リソグラフィのマスクを用いることで、正方形、長方形あるいは集束光の形状にあった円形あるいは楕円形の形状をとってもよい。
【００２７】
図４に、基板１上の特定の領域を加熱する第２の手段を示す。図３の例では、光吸収特性を持った薄層２１が標的ポリヌクレオチド捕獲領域に形成されていたが、本実施例では光吸収特性を持ち、かつ標的ポリヌクレオチド捕獲領域の大きさに比して十分に小さな光吸収特性を持った微粒子２３が標的ポリヌクレオチド捕獲領域に分散して配置されている。微粒子は各領域に１個以上載っているものとする。本実施例でも、断熱層２２を各領域に設けて、その上面に微粒子２３を配置する。基板１が、導電性膜１３１と熱伝導性絶縁基板１３２とより構成されている基板ベース１３から構成されている点は図３の例と同じである。
【００２８】
集束光５１を特定の標的ポリヌクレオチド捕獲領域１４２に照射すると、領域中の微粒子２３が光を吸収して発熱し、領域１４２の近傍のみ昇温させることができるから、表領域１４２の面のプローブに結合している標的ポリヌクレオチドのみを特異的にプローブから解離させることができる。この実施例では、微粒子２３を用いることで、図３の例の集束光の集束範囲より小さな領域を特異的に加熱することが可能であるが、標的ポリヌクレオチド捕獲領域と集束光の集束領域の大きさの関係は図３の例と同じである。本実施例での微粒子２３からなる光吸収層は微粒子の塗布、散布によって作製することができる。また形状についても、図３の例と同様、任意の形状がとれる。
【００２９】
図５に基板１上の特定の領域を加熱する第３の手段を示す。本実施例では、図４と同様に、集束光の波長領域に吸収を持つ微粒子２４による昇温を利用するが、この微粒子２４を集束光５１によって、光ピンセットの要領で捕獲し、この捕獲した微粒子２４をプローブと標的ポリヌクレオチドを解離させたい標的ポリヌクレオチド捕獲領域に配置する点において異なる。このとき、光ピンセットの特性より対物レンズ１５の開口数は１２以上であることが望ましい。なお、本実施例でも、断熱層２２を各領域に設ける。基板１が、導電性膜１３１と熱伝導性絶縁基板１３２とより構成されている基板ベース１３から構成されている点は図３の例と同じである。光ピンセットの要領で微粒子２４を捕獲する点を除けば、図４と同様であるので、図に関するその他の説明は省略する。
【００３０】
本実施例では、微粒子２４による昇温は、微粒子２４が配置された領域の微粒子２４の近傍のみであるから、標的ポリヌクレオチド捕獲領域の大きさと集束光の集束領域の大きさとは本質的に関係ない。すなわち、集束光の集束領域が複数の標的ポリヌクレオチド捕獲領域を覆う場合にも、微粒子２４による昇温は微粒子２４が配置された領域の微粒子２４の近傍のみであるから、解離される標的ポリヌクレオチドは微粒子２４が配置された標的ポリヌクレオチド捕獲領域のものにかぎられる。したがって、本実施例では、標的ポリヌクレオチド捕獲領域の密度を高くすることができるメリットがある。
【００３１】
図６に、図２で示した本実施例の基本構成を用いたポリヌクレオチド分離セル７の基板１との関係を中心としたより詳しい構造の例を示す。
【００３２】
この図ではポリヌクレオチド分離セル７の一部を内部が見えるように切り欠いて示している。また図７にこのポリヌクレオチド分離セルのＡ−Ａ断面図を、図８にＢ−Ｂ断面図を示す。
【００３３】
ポリヌクレオチド分離セル７には、セル上板７２１、セル下板７２２と複数のスペーサー７２３によって仕切られた３つの試料溶液室７３１、７３２、７３３がある。セル上板７２１は光透過性の素材で作れられている。３つの試料溶液室は、それぞれ、試料溶液出入り口７１１、７１２、７１３から試料溶液の出し入れを行うことができる。また、各試料溶液室間は連通孔７１４、７１５があり、この孔を通じて試料溶液の移動が行われる。図２で示したプローブが固定された基板１は、試料溶液室７３２のセル下板７２２上に固定されており、また基板１上には電場を印加する電極板１３１が組み込まれている。また、試料溶液室７３１、７３２、７３３それぞれの側壁面には電極７５１、７５２、７５４、７５５が付加されており、セル上板内面にも試料溶液室７３２の上方に電場が加えられるように、メッシュ状に電極７５３が配置されている。基板１の温度は放熱板３３付きのペルチエ素子３２、３４、３５によって０℃から９５℃まで調節することができる。また試料溶液室７３１、７３２、７３３それぞれの温度をペルチエ素子３２、３４、３５それぞれを独立に動作させることによって０℃から９５℃まで調節することができ、各試料溶液室で他の部屋の温度を変化させることなくＰＣＲ反応を行ったり、変性反応を行うことが出来る。また対物レンズ１５で観察する基板１の位置を移動させるために、セル７は治具７４１によってレール７４２、７４３、７４４上に固定されており、ステッピングモーター（図示しない）によって自在に２次元面上を移動させることができる。
【００３４】
図９Ａ−Ｃに、図６−８で示したポリヌクレオチド分離セルを用いた核酸分離プロセスを説明するタイムテーブルを示す。まず試料溶液室７３１に導入されたポリヌクレオチドを含む試料溶液は図９Ａに示されたような経時的な温度変化を２０〜３０サイクル程度与えることで前処理としてのＰＣＲ増幅がなされる。すなわち、最初の変性の過程で二本鎖ポリヌクレオチドが一本鎖ポリヌクレオチドとされる。次いで、試料溶液中のプローブとのアニーリング、これに続くポリメラーゼ伸長反応を行わせて、ポリヌクレオチドを倍増する過程を繰り返し行う。この時の温度制御はペルチエ素子３２によって行われ、試料溶液室７３１内の試料溶液全体に対して行われるものである。つぎに、増幅されたポリヌクレオチドを含む試料溶液は、図９Ｂに示されるような過程で特定の塩基配列を持ったポリヌクレオチドのみが分離される。すなわち、試料溶液導入過程では電極７５１、７５５を陰極に、電極７５４と基板１上の電極を陽極にして、試料溶液室７３１の試料溶液中のポリヌクレオチドを試料溶液室７３２に誘導する。次にペルチエ素子３４によって試料溶液室７３２内の試料溶液を９５℃まで加熱し試料溶液中のポリヌクレオチドの水素結合をはずし、一本鎖とする。次に３７℃まで温度を下げて基板１上の標的ポリヌクレオチド捕獲領域のプローブとの結合を行わせる。そして、捕獲領域のプローブと結合しなかった試料溶液中のポリヌクレオチドを、今度は電極７５１を陽極とすることで再び試料溶液室７３１に戻す。つぎに蛍光観察技術によって基板１上のどの領域に標的オリゴヌクレオチドが結合したか確認する。そして標的ポリヌクレオチドが基板１上のプローブと結合した領域の情報（図２の蛍光の強度検出器１９１の出力）を基に、基板１上の一つの標的ポリヌクレオチド捕獲領域に集束光を照射することでその領域でプローブと結合した標的ポリヌクレオチドをプローブからはずすことができる。このとき電極７５３と基板１表面の電極１３１との間で交流電場を発生させて標的ポリヌクレオチドを伸長させておく。さらにレンズ１５から集束光５１を与えて、基板１上の特定の標的ポリヌクレオチド捕獲領域の標的ポリヌクレオチドのみをプローブから解離させながら電極７５５を陽極とすることで試料溶液室７３３に目的とする標的ポリヌクレオチドのみを導入する。このとき、電極７５１を陽極に保ち、電極７５２を陰極にすることで、試料溶液室７３１にある試料溶液中のプローブと結合しなかったポリヌクレオチドは、試料溶液室７３１に保持され、試料溶液室７３２あるいは７３３に移動することはない。さらに、電極に電場を加えつづけながら溶液出入り口７１３より試料溶液室７３３にＰＣＲに必要な成分を導入する。その後、図９Ｃで示した後処理ＰＣＲをペルチエ素子３５によって２０〜３０サイクル程度行うことで試料溶液室７３３に導入された試料溶液から希望するポリヌクレオチドを選択的に高精度にかつ高速に分離、回収、増幅することができる。また、一度、試料溶液室７３３の増幅された試料溶液を回収した後、基板１を移動させて、基板１上の他の標的ポリヌクレオチド捕獲領域に対して、再び同様に図９Ｂで示された分離過程、図９Ｃで示された後処理ＰＣＲ過程を繰り返せば、順次、基板１の各標的ポリヌクレオチド捕獲領域に捕獲されたポリヌクレオチドを選択回収、増幅することができる。
【００３５】
なお、図９Ａ−Ｃで説明したタイムスケジュールでは、温度の低下については特別な操作をすることを説明しなかったが、たとえば、図６のペルチェ素子３２、３４および３５を積極的に放熱に使用よるしてそれぞれの部屋全体の冷却を短時間で行うことができる。また、標的ポリヌクレオチド捕獲領域のプローブに結合しているポリヌクレオチドを解離させるための局所変性後の冷却のために、各に標的ポリヌクレオチド捕獲領域毎にペルチェ素子を設けることが可能であることは言うまでもなかろう。
【００３６】
実施例ＩＩ
本実施例は、実施例Ｉがプローブと結合した標的ポリヌクレオチドを解離させるために、各標的ポリヌクレオチド捕獲領域の温度制御を収束光照射によって行ったのに代えて、基板１に埋め込まれた発熱体を利用する構造とした点において異なるのみで、その他の点においては本質的に同じである。以下図１０−１５を参照しながら説明する。
【００３７】
図１０は本発明の第２の実施例の標的ポリヌクレオチド捕獲領域を持つ基板１と標的ポリヌクレオチド捕獲領域における捕獲状態を検知するための光学系との関係を示す図である。図１０と図２，３と対照して明らかなように、本実施例では、基板１は、表面に標的ポリヌクレオチド捕獲領域を配置する導電性膜１３１、次いで、温度制御部１３３と熱伝導性絶縁基板１３２とよりなる基板ベース１３から構成されている。また、導電性膜１３１の表面には、複数の標的ポリヌクレオチド捕獲領域１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６が配置されるとともに、温度制御部１３３の内部には各標的ポリヌクレオチド捕獲領域を独立に温度制御するための電極およびこれによって発熱させられる発熱体が埋め込まれている。各標的ポリヌクレオチド捕獲領域は酸化アルミ薄層などのプローブ結合層２２１と電気的な絶縁体層２２２の二層構造となっている。さらに、各標的ポリヌクレオチド捕獲領域の表面には、塩基長８−９塩基程度のプローブ（オリゴヌクレオチド）４１、４２、４３、４４、４５、４６が結合している。図では、これらのプローブの内、プローブ４１、４２、４３、４６のみに、これらと相補的な関係を持つ標的ポリヌクレオチド４１’、４２’、４３’、４６’が結合している状態を模式的に示している。
【００３８】
また、本実施例でも、標的ポリヌクレオチド４１’、４２’、４３’、４６’がプローブ４１、４２、４３、４６と結合するとき蛍光色素を同時に結合する構成としたときは、蛍光色素を励起して、これが発する蛍光を検知して、各領域についてのプローブと標的ポリヌクレオチドとの結合の程度を蛍光強度より見積もることができる。さらに、温度上昇による熱消光効果により蛍光色素の蛍光強度が温度上昇の割合に応じて減少することを利用して、標的ポリヌクレオチド捕獲領域の局所的な温度上昇を計測することができる。また、蛍光色素の蛍光強度の変化を、蛍光強度変化の温度依存性をもとに解析し標的ポリヌクレオチド捕獲領域の温度を見積もることができる。なお、本実施例でも実施例Ｉと同じ物または均等物には同じ参照符号を付した。
【００３９】
図１１に、図１０に示す基板１のＡ−Ａ断面図を示す。基板１は熱伝導性絶縁基板１３２、温度制御部１３３および導電性膜１３１が積層された構造である。最上層の導電性膜１３１の表面には標的ポリヌクレオチド捕獲領域となるプローブ結合層２２１と電気的な絶縁体層２２２の二層構造が形成されている。温度制御部１３３には面電極２２６の層、発熱体２２５の層および面電極２２４の層が形成されている。面電極２２６の層と面電極２２４の層のそれぞれの電極はマトリクッス状に交差する形であり、この交差する位置が各発熱体２２５の位置に対応するとともに各標的ポリヌクレオチド捕獲領域の位置と対応するように形成されている。熱伝導性絶縁基板１３２には、各標的ポリヌクレオチド捕獲領域に対応して温度計測用のサーミスタ２３１の層が埋め込まれており、各標的ポリヌクレオチド捕獲領域の温度を計測することができる。
【００４０】
図１２Ａ−図１２Ｃに、第２の実施例の基板１の温度制御部１３３のＢ−Ｂ断面、Ｃ−Ｃ断面およびＤ−Ｄ断面の断面図を示す。面電極２２６と面電極２２４は直交する形であり、この交差点に発熱体層２２５を挟み込んでいる。従って面電極２２６と面電極２２４とに電位差を与えて電流を流すと、この交差点にある発熱体２２５のみが発熱する。すなわち、面電極２２６と面電極２２４とを適当に選択して電位差を与えるとこの交差点に対応する位置の標的ポリヌクレオチド捕獲領域の温度をあげることができる。
【００４１】
図１０に示す基板１を前述した図６−８に示したポリヌクレオチド分離セル７の基板１として置換することができるが、ここでは、もっとシンプルな例を説明する。
【００４２】
図１３に第２の実施例のポリヌクレオチド分離セル２５１とその関連装置のブロック図を示す。図１４に第２の実施例のポリヌクレオチド分離セル２５１のＧ−Ｇ断面図を示す。ポリヌクレオチド分離セル２５１は光透過性を持った容器によって作られておりセル内の基板１を光学的に観察することができる。セル２５１にはポリヌクレオチドを含む試料を注入する試料溶液注入管２５２と、基板１の特定の標的ポリヌクレオチド捕獲領域で捕獲された標的ポリヌクレオチドを取り出す取り出し管２５３が接合しており矢印５７，５８の方向に前記溶液を流すことができる。またセル２５１内上面には透明電極（図示しない）が配置されており、基板１の導電性膜１３１との間に電位差を持たせることができる。特定の標的ポリヌクレオチド捕獲領域に対応する発熱体を発熱させたり、標的ポリヌクレオチド捕獲領域に直流電場あるいは交流電場を発生させるために、本実施例は直流電源２５４，交流電源２５５，制御回路２５６を持っており、後に示す手順に従って、サーミスタ２３１からの温度情報をもとに基板１の状態を制御することができる。
【００４３】
図１５に第２の実施例のポリヌクレオチド分離セルの分離プロセスを説明するタイムテーブルを示す。
【００４４】
セル２５１に導入された試料は、図１５に示されるような過程で特定の塩基配列を持ったポリヌクレオチドのみが分離される。
【００４５】
（１）試料溶液の導入過程では基板１の導電性膜１３１を陽極に、セル上面の透明電極を陰極にして、溶液中のポリヌクレオチドを基板１の表面に誘導する。また、基板１の導電性膜１３１とセル上面の透明電極との間で交流電場を発生させることでポリヌクレオチドを伸長させてもよい。この状態では、温度制御部１３３中のすべての電極２２４、２２６を導通させ、すべての発熱体２２５を発熱させ、基板１の表層の温度を９５℃まで上昇させる。
【００４６】
（２）次に３７℃まで温度を低下させる。これで標的ポリヌクレオチド捕獲領域に固定されたプローブと試料溶液中の標的ポリヌクレオチドは結合する。
【００４７】
（３）つぎに、基板１の表層を７２℃程度まで上昇させ、基板１の導電性膜１３１を陰極に、セル上面の透明電極を陽極にして非特異的にプローブに結合したポリヌクレオチドを試料溶液とともに除去する。
【００４８】
（４）セル２５１中の溶液を交換した後、温度制御部１３３中の電極２２４、２２６のそれぞれ一つを導通させ、発熱体２２５の一つを発熱させ、標的ポリヌクレオチド捕獲領域の一つを９５℃まで昇温させ、この領域のプローブと結合している標的ポリヌクレオチドを解離させ溶液とともに回収する。
【００４９】
（５）同様な手順を各標的ポリヌクレオチド捕獲領域について行うことで、各領域のプローブに結合した標的ポリヌクレオチドを順次取り出すことができる。
【００５０】
この場合、実施例Ｉで説明したと同様に、あらかじめ、各標的ポリヌクレオチド捕獲領域についての標的ポリヌクレオチドの結合状況を検出器１９１、解析装置１９２からの温度情報をもとに検出して、回収したいポリヌクレオチドの結合している標的ポリヌクレオチド捕獲領域についてのみ、上述の温度制御を行うものとすれば、処理効率を上げることができる。
【００５１】
実施例ＩＩＩ
第３の実施例は、プローブを安定に固定するように工夫された標的ポリヌクレオチド捕獲領域を持つ基板１の構成に関するものである。具体的には、捕獲領域の表面を酸化膜層とした金属膜とするとともに、シランカップリング反応でプローブを安定に固定できる構造とした基板１を提案するものである。
【００５２】
本実施例による基板１の製作手順を説明する。厚さ０４ｍｍで２４ｍｍ角のガラス基板を用意してＮａＯＨ（１Ｍ）溶液に浸し、３０分間超音波洗浄する。超純水で流水洗浄した後、１１０℃１５分間ベークする。真空蒸着装置を用いてクロム（Ｃｒ）を蒸着する。厚みは３ｎｍである。エタノールで洗浄する。３−グリシドキシプロピルトリメトキシシランの原液に５分間浸淅した後、５０％のエタノール溶媒に溶解した４％の３−グリシドキシプロピルトリメトキシシランの溶液に３０分間浸し、時々撹拌する。溶液から取り出して、１１０℃で３０分間ベークし、シランカップリング試薬で金属表面にグリシドキシ基を導入して基板１を得る。
【００５３】
図１６は第３の実施例による基板１でプローブを安定に固定できた様子を示す図である。本実施例の基板１はガラス基板３０２の表面にＣｒ層３０３が蒸着されさらにその表面が酸化膜３０４になっている。シランカップリング層３０５によりプローブが固定されている。プローブを安定に固定できることを確認するために、本実施例では、標的ポリヌクレオチド捕獲領域３０６および３０７のそれぞれに、シランカップリング層３０５を介して固定されたプローブ３１１および３１２に末端が蛍光色素スルフォローダミン１０１で標識された５２１ｂｐおよび６２５ｂｐの長さのポリヌクレオチドをそれぞれ結合させた。
【００５４】
本実施例による基板１の効果を確認するために行った比較実験の結果について説明する。
【００５５】
まず、本実施例の構成の基板、Ｃｒに代えてアルミニューム（Ａｌ）をガラス３０２の表面に蒸着した基板およびガラス３０２の表面に直接シランカップリング処理した基板のそれぞれについて比較する。本実施例の構成の基板としてＣｒをガラス３０２の表面の全面にわたって５４ｎｍ蒸着した二つの基板を調製した。６００ｎｍ〜８００ｎｍの光透過率は５３〜５６％であった。Ｃｒに代えてＡｌをガラス３０２の表面の全面にわたって蒸着した基板のＡｌ膜の厚さは１５ｎｍのものを用意した。製作の手順は本実施例と同じである。この基板の６００ｎｍ〜８００ｎｍの光透過率は１９〜２５％であった。金属膜を蒸着しないガラス自体の６００ｎｍ〜８００ｎｍの光透過率はほぼ８４％である。この程度の透過率であれば、蛍光色素、たとえば、スルホローダミン１０１（吸収極大５９４ｎｍ、蛍光６１５ｎｍ）で標識した標的ポリヌクレオチドを励起光アルゴン（Ａｒ、５１４ｎｍ）やヘリーム−ネオン（Ｈｅ−Ｎｅ、５４５ｎｍ）で励起することによる蛍光でプローブに捕獲された標的ポリヌクレオチドを検出することができる。
【００５６】
図１７（Ａ）から図１７（Ｃ）は第３の実施例の基板による効果を確認する実験結果を説明する図である。
【００５７】
図１７（Ａ）はＣｒを５４ｎｍ蒸着した第３の実施例の基板、図１７（Ｂ）はＣｒに代えてＡｌを１５ｎｍの厚みに蒸着した基板、図１７（Ｃ）は金属蒸着膜を持たない基板のそれぞれについて、シランカップリング層３０５を介して固定されたプローブ３１１および３１２に末端が蛍光色素スルフォローダミン１０１で標識された５２１ｂｐおよび６２５ｂｐの長さのポリヌクレオチドをそれぞれ結合させる処理を行った。この状態でレーザー共焦点顕微鏡でスキャンした結果を相対蛍光強度および透過率について測定した結果を示す。横軸に基板上のスキャン位置を、縦軸に実線３３０はレーザー顕微鏡で検出される蛍光（５８０ｎｍ以上）分布と透過光強度分布をそれぞれ示す図である。波線３３１は３８０ｎｍから４５０ｎｍの透過率分布を示す。
【００５８】
図１７（Ａ）から分かるように、本実施例の基板では、蛍光色素スルフォローダミン１０１で標識されたポリヌクレオチドが結合している領域ＣＡ全域にわたって一定の蛍光強度３３０が得られた。他の部分からの蛍光強度３３０は十分低い。また、３８０ｎｍから４５０ｎｍの透過率は、いずれの部位においてもほぼ一定である。このことは、プローブの固定から標的ポリヌクレオチドの結合までの種々の反応操作においてＣｒ層が安定に保持されており、ガラス３０２の表面からの剥離が無いことを示している。
【００５９】
図１７（Ｂ）から分かるように、Ｃｒに代えてＡｌを蒸着した基板では、蛍光色素スルフォローダミン１０１で標識されたポリヌクレオチドが結合している筈の領域ＣＡの透過率が顕著に高くなっている。これは、プローブの固定反応においてＡｌ蒸着面が溶解していることを意味する。Ａｌ蒸着面はＤＮＡやＲＮＡを溶解させる一般的な溶液である１０ｍＭトリス塩酸−１ｍＭ  ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ７５）で溶解してしまう結果が得られ、Ａｌを蒸着した基板は水溶液を用いる反応系には利用できないことがわかる。この結果、プローブの固定は実質的に出来ておらず、したがって、蛍光色素スルフォローダミン１０１で標識されたポリヌクレオチドの結合もなく、全体に蛍光強度３３０は十分低い。
【００６０】
図１７（Ｃ）から分かるように、ガラス表面を直接シランカップリング反応させてプローブを固定した基板では、蛍光色素スルフォローダミン１０１で標識されたポリヌクレオチドが結合している領域ＣＡが他のプローブを固定していない部分より蛍光強度３３０が高くなっているから、プローブを固定する機能を果たすことが出来ていることはわかる。しかし、本実施例の基板と比較して蛍光強度３３０が場所によってバラ付いている。これはプローブが均一に固定されていないことを示唆するものである。
【００６１】
これらの結果から明らかなように、Ｃｒを蒸着した本実施例による基板がプローブを安定に保持し標的ポリヌクレオチドを捕獲するのに有利であることが分かる。なお、Ｃｒに限らず弱アルカリ溶液に安定な金属で数ｎｍから１０ｎｍの厚さに、ガラス基板に蒸着したものが優れていることがわかる。具体的には、表面が酸化膜で覆われ、９５℃の弱アルカリ溶液に溶解しずらいものであれば良いが、金や白金は酸化膜を作らないためシランカップリング反応を行うことができないので利用できない。ステンレスは、弱アルカリに安定で、酸化膜を形成するなど、Ｃｒと良く似た性質をもつ。しかし、理由はわからないがシランカップリング反応を用いた活性残基の導入ができないので除外する。同様な検討から少なくてもＴｉ、Ｖ、Ｃｒ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｍｏ、Ｗ、のいずれかの金属が有効であることがわかっている。
【００６２】
次ぎに、図１８（Ａ）、図１８（Ｂ）を参照して、本実施例による基板によってプローブに捕獲された標的ポリヌクレオチドを効果的に解離させ回収できることについて説明する。図１８（Ａ）および図１８（Ｂ）は図１６に示した領域３０６および３０７のそれぞれに、シランカップリング層３０５を介して固定されたプローブに捕獲された５’末端がスルフォローダミン１０１で標識された５２１ｂｐおよび６２５ｂｐのポリヌクレオチドについての実験結果である。基板表面は２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７５）２０マイクロリットルで覆われている。
【００６３】
図１８（Ａ）および図１８（Ｂ）はそれぞれの領域３０６および３０７を、それぞれの領域をまたいでレーザースキャニング（５１４ｎｍ）を行い、蛍光検出（５１０ｎｍ〜５８０ｎｍ）した結果を示す。横軸に基板上のスキャン位置を、縦軸にレーザー顕微鏡で検出される相対蛍光強度分布を示す。３３５は相対蛍光強度を示す線であり、領域３０６および３０７のいずれも全域にわたってほぼ一定の蛍光が検出される。次に領域３０６のみ１０５３ｎｍのＹＡＧレーザー１０ｍＷ（スポット径５ｎｍ）でスキャニングする。その結果、図１８（Ａ）では破線３３６に示すように、スキャニング後の相対蛍光強度分布はＹＡＧレーザーによるスキャニングの部位３３３では相対蛍光強度が約１／１０に低下していた。領域３０７については、相対蛍光強度３３５、３３６ともに変化はない。
【００６４】
図１９は本実施例によるポリヌクレオチドの分取について説明する電気泳動の結果を模式的に示す図である。
【００６５】
３４０はマーカーのレーンである。３４１と３４２は基板１の領域３０６と３０７で捕獲したポリヌクレオチドと同じ物を準備して電気泳動で測定した結果を示すレーンである。それぞれ、５２１ｂｐと６２５ｂｐのバンドが明瞭に現われている。３４３および３４４は、基板１の領域３０６を１０５３ｎｍのＹＡＧレーザー１０ｍＷ（スポット径５ｎｍ）でスキャニングした後の基板１の表面の緩衝液を回収しＰＣＲ増幅し、ＰＣＲ増幅産物を２％アガロースゲル電気泳動で測定した結果を示すレーンである。レーン３４３には５２１ｂｐのバンドが明瞭に検出されが、レーン３４４には６２５ｂｐのバンドが表れていない。このことは、回収された緩衝液をＰＣＲ増幅した溶液中にはＹＡＧレーザー１０ｍＷ（スポット径５ｎｍ）でスキャニングした領域３０６から解離されたポリヌクレオチドのみが存在していたことを示す。本実施例によれば、プローブの固定および捕獲したポリヌクレオチドの効果的な分取ができる。
【００６６】
実施例ＩＶ
上述の実施例Ｉ−ＩＩＩが基板１が平面であったのに対し、第４の実施例では、細管の内面を利用する構造として、ポリヌクレオチドの分取に必要となる試料溶液の量を低減する。
【００６７】
図２０および図２１は第４の実施例で採用できる細管の外面およびＡ−Ａ断面図である。
【００６８】
４０１は細管であり、ガラス細管等の光透過性の細管である。４１２は管壁であり、この内面にはクロム等の実施例ＩＩＩで示した金属からなる管内被覆４１３が施されている。この被覆面の表面は金属の空気酸化によって生じた安定酸化物となっている。被覆面上に円筒状にプローブが固定された標的ポリヌクレオチド捕獲領域４１４、４１５が配置されている。各標的ポリヌクレオチド捕獲領域４１４、４１５、には、各領域固有のプローブが密に固定されており、試料溶液中のポリヌクレオチドのうちこれらと相補的なポリヌクレオチドのみをそれぞれの領域に捕獲することができる。また、細管４０１の外面にはマーカー４１１が内面の各標的ポリヌクレオチド捕獲領域の境界位置に記されており、細管外面から各標的ポリヌクレオチド捕獲領域の位置を確認することができる。
【００６９】
図２２は標的ポリヌクレオチド捕獲領域にプローブを固定するための構造の例を説明する図である。
【００７０】
実際、図２１で示したように同心円状に独立したオリゴヌクレオチドのプローブ層を細管内面に形成するには、たとえば以下のような手法を用いる。まず、細管４０１の管内全域をシラノール基とエポキシ基を両端に持つ二価性試薬と反応させることでエポキシ基４１６を管内表面の全領域に生やす。すると管内壁は撥水性を持つようになり試料水溶液を弾くようになる。つぎに特定の領域４１５の表面に結合させたい核酸試料溶液を液滴の形態で管４０１内に導入する。すると管内壁は撥水性を持つため液は球状となり管内壁と最小限の接触面積で同心円状に接触する。この液滴を領域４１５まで誘導し、しばらく放置することで所定の領域のみで前記エポキシ基４１６の自由端と５末端をアミノ基修飾した核酸プローブとを結合させる。反応させた核酸プローブを含む試料液滴は反応後すみやかに細管４０１から取り出す。同様に異なる試料液滴を導入して別の領域で反応させることを繰り返すことで図２１に示したような構造を形成することができる。
【００７１】
この第４の実施例により試料溶液中の標的ポリヌクレオチドを分取するためのタイムテーブルは、図１５に示す図と同じであるので、説明は省略する。
【００７２】
図２３は第４の実施例のポリヌクレオチド分離装置の全体構成を示す図である。４３１はポリヌクレオチド分離モジュールであり、内部に図２０および図２１で説明した細管４０１が組み込まれている。細管４０１の両端は細管接合部４３２、４３３に接合されている。容器４３４に保持された試料溶液、容器４３５に保持された洗浄液、容器４３６に保持された洗浄液およびエアフィルタ４３７を通過した空気がセレクタ４３８によって選択され、ポンプ４３９によって細管接合部４３２に導入される。４００はコントローラーであり、本実施例の装置のコントロールおよび電源供給手段を代表して示すものである。ポリヌクレオチド分離モジュール４３１より排出された溶液は、細管接合部４３３を通過して、ＰＣＲ増幅等の後処理プロセス４４１へ送られる。コントローラー４００には装置の各部から必要なデータが集められ、これに応じて各部に必要な操作信号が送出されるわけであるが、これらの具体的な構成と装置各部との接続については詳細を省略する。上述のタイムテーブルおよび以下の説明によって当業者が容易に実現できる。
【００７３】
図２４は第４の実施例のポリヌクレオチド分離モジュール４３１のＢ−Ｂ断面を示す図である。モジュール４３１内には、細管４０１の管壁に光を導入する光源４４２、細管４０１の各標的ポリヌクレオチド捕獲領域に対応してドーナツ状の発熱源４４３、細管より内面へプラズモン励起された励起光によって励起された標的ポリヌクレオチド捕獲領域の蛍光あるいは細管表面のマーカー４１１を検出する光検出プローブ４４４および細管の温度を検出する熱検出プローブ４４５が並列に配置されている。また、細管接合部４３２、４３３内にはそれぞれ電極４５１、４５２が配置されており、細管４０１内の試料溶液成分を電気泳動によって回収することができる。また電極コネクタ４５３によって細管４０１の内面被覆４１３に電位を与えることができ、これによって細管内面の表面から核酸成分を遠ざけたり引き寄せたりすることができる。
【００７４】
図２５は図２４に示した実施例のポリヌクレオチド分離モジュール４３１の変形例を示す図である。本例では基本構成は図２４に示した実施例と同じであるが、分離されたポリヌクレオチドを回収するときに導入する洗浄液を液滴４７１にしたところが異なる。図２３に示したセレクタ４３８を調節することで、細管４０１内にタンク４３６の洗浄液の液滴４７１を導入した後、エアフィルタ４３７を通過した空気によって液滴４７１を押し出し、回収したい標的ポリヌクレオチド捕獲領域まで進ませ、液滴４７１がその領域を覆うようにする。次にリークバルブ４６１、４６２を開放させ発熱源４４３による局所発熱によって膨張した細管４０１内の空気を逃がすことで、液滴４７１の位置が移動しないようにする。その後、その領域の温度を解離温度以上に上げてプローブから標的ポリヌクレオチドを解離させる。次いで、リークバルブ４６１、４６２を閉じ、エアフィルタ４３７を通過した空気によって液滴４７１を細管接合部４３３まで押し出し標的ポリヌクレオチドを回収する。本例の場合、液滴が接するのは特定の標的ポリヌクレオチド捕獲領域であるため、仮に、他の領域の温度が解離温度に達したとしても、液滴中に混入することがなく、より高精度に分離された回収を行うことができる。また、本例では発熱はポリヌクレオチド分離モジュール４３１内の発熱源４４３による局所発熱としたが、標的ポリヌクレオチド捕獲領域全体を覆う形状の一つの発熱源を用いる場合にも、同様に高精度の分離、回収が出来る。
【００７５】
図２６は図２４に示した実施例のポリヌクレオチド分離モジュール４３１の変形例を示す図である。本例では、細管４０１の内部に設けられた光源４４２、発熱源４４３、光検出プローブ４４４および熱検出プローブ４４５を省略し、これに代わる光学系を細管４０１の外部に設けたものである。すなわち、実施例Ｉの実施例である図２，６に示す構造で基板１に代えて細管４０１を利用した形である。したがって図２の光学系と同じ物が使えるが、図では簡略化するため対物レンズ１５のみを示した。
【００７６】
細管接合部４３２、４３３に接合された細管４０１をレール４４６上で移動させ、対物レンズ１５により所定のポリヌクレオチド捕獲領域の細管内の状態を観察すると同時に集束光を細管の前記領域に照射することによって、細管内の集束点近傍のみを局所加熱することができる。この時、細管を円周方向に回転することのできる構造とすれば、細管内の円周面方向の領域全体のポリヌクレオチドの捕獲状況を観察、加熱し回収することができる。
【００７７】
図２７は図２６に示した実施例のポリヌクレオチド分離モジュール４３１の変形例を示す図である。本例は、細管４０１の外部に光学系を設けたものである点については図２６と同じであるが、細管内部の各標的ポリヌクレオチド捕獲領域に設けたと同じ光学系を一組だけ細管外部に配置したモジュール４３１として、これを細管４０１に対してレール４８１上を移動させる構造とした点において異なる。これにより、装置を全体的に小型化できる。
【００７８】
実施例  Ｖ
上記実施例Ｉ−ＩＶにおいては、標的ポリヌクレオチドが試料溶液の中にある場合であったが、本実施例は、細胞自体から、直接、標的ポリヌクレオチドを分取することを狙いとするものである。もちろん、本実施例でも、結局はポリヌクレオチドを含む試料溶液の形になった状態で分取するわけであるが、標的ポリヌクレオチド捕獲領域に細胞を導入した上で試料溶液の形にするものであるので、試料溶液中の標的ポリヌクレオチドの存在比率が高いものとなり、前処理としてのＰＣＲ等を省略できるケースが増加する。また、本実施例によれば、細胞毎に細胞の核酸、蛋白質などの内容物を得ることもできる。
【００７９】
図２８は本実施例の基本要素を示す図である。
【００８０】
１は基板であり、その表面に、先の実施例で説明したのと同様の標的ポリヌクレオチド捕獲領域５１１が形成されている。５２１はコントローラーであり、標的ポリヌクレオチド捕獲領域５１１に細胞５６１を捕獲固定するために、捕獲領域５１１の電極と、基板１に対向して設けられた接地電極５１４との間に直流あるいは交流電場を印加する。５２６は直流あるいは交流電場を印加しあるいは接地するための電源回路、５２５は選択スイッチである。５１２はペルチエ素子、５１３は温度センサーであり、各標的ポリヌクレオチド捕獲領域に近接して基板１内に埋め込まれている。５２３は温度計測および制御部であり、温度センサー５１３の信号を入力するとともに、ペルチエ素子５１２により、各標的ポリヌクレオチド捕獲領域を独立してその表面温度を制御する。どの領域の温度を制御するかはコントローラー５２１からの指示による。
【００８１】
図２９は図２８で説明した基本要素を持つポリヌクレオチド分離セルと光学系を組み合わせた本実施例の基本構成を示す図である。図３０は図２９で説明した分離セルのＡ−Ａ断面を示す図である。
【００８２】
５４１はポリヌクレオチド分離セルであり、５４２および５４３は試料導入管および試料排出管であり、これらを通じて細胞試料、あるいは洗浄液等が分離セルに導入され、また分離セルより細胞残骸、蛋白質、精製した核酸試料等が回収される。分離セル５４１の内部には図３０に示すように、基板１上に標的ポリヌクレオチド捕獲領域が形成されるとともに、本実施例では、試料導入管５４２から導入された細胞試料を標的ポリヌクレオチド捕獲領域に導くための電極５５１、５５２、５５３、−−−−が配列され、これらに配線が接続されている。この図では上部電極５１４は表れない。各標的ポリヌクレオチド捕獲領域には、それぞれの標的ポリヌクレオチドと相補的な一本鎖オリゴヌクレオチドであるプローブが固定されている。
【００８３】
ポリヌクレオチド分離セル５４１の内部は図２で説明したのと同じ光学系で監視できる。すなわち、前記基板１を対物レンズ１５の光軸に対して垂直に配置し、蛍光観察用光源１６からの励起光をバンドパスフィルター１５１、ダイクロイックミラー１８１を介して対物レンズ１５に誘導する。対物レンズ１５に誘導された励起光によって、基板１上に捕獲、固定された標的ポリヌクレオチドとともに結合した蛍光色素は励起され、励起された蛍光色素は、基板上の各領域のプローブに捕獲された標的ポリヌクレオチドの量に比例した強度の蛍光を発する。前記標的ポリヌクレオチドの量に比例した強度で発生された蛍光が再び対物レンズ１５を介して集められ、エミッションフィルター１５２を介して、検出したい蛍光の波長域の光のみを選択的に検出器１９１に導入して分離セル５４１の内部を知ることができる。
【００８４】
一般に、細胞は加熱することにより細胞膜の一部が破れ核酸、蛋白質などの内容物の遊離が見られる。したがって、細胞を含む試料溶液をポリヌクレオチド分離セル５４１に導入した後、基板１上の特定の標的ポリヌクレオチド捕獲領域の温度を９５℃まで上昇させることにより、その領域にある細胞を破壊して内容物を遊離させるとともに、二本鎖ポリヌクレオチドを一本鎖ポリヌクレオチドに解離させることができる。その後、この捕獲領域の温度を３７℃まで下げると、これらの標的ポリヌクレオチドの内その領域のプローブと相補的な一本鎖ポリヌクレオチドをプローブに捕獲することができる。特定の捕獲領域の温度を制御するためには、この領域に対応するペルチエ素子５１２を選択して電流を流せば良い。
【００８５】
以下図３１（Ａ）−図３１（Ｅ）および図３２（Ａ）−図３２（Ｄ）を参照して本実施例によって血液細胞から直接に細胞の内容物および標的ポリヌクレオチドを分取する方法を説明する。
【００８６】
まず、血液試料のイオン強度を低下させ、赤血球を破壊し、血液試料中の細胞が白血球のみになるように調製する。図３１（Ａ）は基板１の表面に標的ポリヌクレオチド捕獲領域５５１、５５２、５５３−−−が形成されている状態を示す図である。図３１（Ｂ）はポリヌクレオチド分離セル５４１に血液試料がセル内に導入され白血球５６１が基板１の表面上を漂遊している状態を示す図である。この状態で、標的ポリヌクレオチド捕獲領域５５１、５５２、５５３−−−の電極と電極５１４との間に交流電場を印加し、白血球５６１を標的ポリヌクレオチド捕獲領域に引き寄せる。このときは電極５１４と各標的ポリヌクレオチド捕獲領域の電極間に生ずる電場密度の勾配が、各標的ポリヌクレオチド捕獲領域において密となる。また、この時用いる交流電場としては周波数１ｋＨｚ以上、１０Ｖ／ｍｍ以上が望ましい。図３１（Ｃ）は交流電場によって白血球が標的ポリヌクレオチド捕獲領域に引き寄せられ、各領域に白血球が配置された状態を示す図である。この状態で、蛍光標識した抗原物質をセル５４１内に導入する。図３１（Ｄ）は抗原物質に対して抗体反応する白血球（図にハッチングを付した白血球５６２、５６３）のみが標識された蛍光を発する様になった状態を示す図である。ただし、このとき基板表面の温度は４℃程度に冷却し、細胞中のｍＲＮＡ等の量がマーカー抗原との結合によって変化しないように制御することが望ましい。温度が低下した場合でもＢ細胞等の表面に存在する抗体部の結合能に顕著な差は見られない。そこで、図２９で説明した光学系により、蛍光を発する白血球のある標的ポリヌクレオチド捕獲領域の位置を検出器１９１の出力により同定することができる。この後、これらを一つづつ順番に加熱し、破壊することで、前記抗原物質と反応性をもつ細胞の内容物を試料溶液中に遊離させることが出来る。図３１（Ｅ）は各領域に固定された白血球のうち白血球５６３のみが破壊された結果、これが基板１上から無くなった状態を示す図である。したがって、この状態で、交流電場を他の細胞には印加したままで、ポリヌクレオチド分離セル５４１中の試料溶液を回収すれば特定の白血球中の内容物を取り出すことが出来る。
【００８７】
図３２（Ａ）は標的ポリヌクレオチド捕獲領域の一つ６１６にプローブ６７１が固定されている状況を示す図である。図３２（Ｂ）は、上述のようにして、該捕獲領域６１６に白血球６６２が誘引され、捕獲された状態を示す図である。このように白血球６６２が捕獲領域６１６に誘引された後、試料溶液を交換し、このｐＨを４程度まで低下させる。これは、蛋白質のｐＫ値がほぼ４以上であり、ｐＨを４以下にすることで蛋白質が持つ総電荷が正となり、ポリヌクレオチドが持つ電荷が負であることから容易に直流電場中で分離することが出来るためである。このようなｐＨ条件下でペルチェ素子５１２によって捕獲領域６１６の温度を上げ、白血球を破壊する。そこで、標的ポリヌクレオチド捕獲領域６１６の電極を陽極、対向する面の電極５１４を陰極とすると、ポリヌクレオチド６６４は捕獲領域６１６に集まり、蛋白質６６３は対向する電極５１４の面に電気泳動される。図３２（Ｃ）は、ポリヌクレオチド６６４および蛋白質６６３が電気泳動により移動する様子を模式的に示す図である。この状態で容器内の溶液を交換することで、蛋白質とポリヌクレオチドを簡単に分離することが出来る。なお、この時、当然のことながら、標的ポリヌクレオチド捕獲領域に固定されているプローブ６７１と相補的なポリヌクレオチドはこれと結合する。
【００８８】
次に、標的ポリヌクレオチド捕獲領域の電極を陰極、対向する電極５１４を陽極とすると、捕獲領域６１６上でプローブ６７１に結合した標的ポリヌクレオチド６６６は領域６１６上に残るが、結合しなかったポリヌクレオチドは試料溶液中に遊離する。したがって、この時の試料溶液を回収すると、白血球６６２中のポリヌクレオチドの内、プローブ６７１と結合しなかったものを溶液中に回収することが出来る。図３２（Ｄ）は、プローブ６７１に結合しなかったポリヌクレオチド６６５が電気泳動により移動する様子を模式的に示す図である。
【００８９】
最後に、特定の標的ポリヌクレオチド捕獲領域の温度を９５℃程度まで上昇させることで、その領域のプローブに結合した特定の標的ポリヌクレオチドが遊離することから、この時の試料溶液を回収することで目的としたｍＲＮＡなどの標的ポリヌクレオチドを回収することが出来る。
【００９０】
一つの白血球について本手順を終了した後、同様に次の白血球に付いて同じ手順をとれば、順次１白血球ずつ目的とするｍＲＮＡ等の標的ポリヌクレオチドを回収することができる。また、マーカー標識による染色で、異なる２種類以上のマーカーで染色し、異なるフィルターで観察することで、複数の条件に合致する細胞を選択し、回収してもよい。
【００９１】
また、標的ポリヌクレオチド捕獲領域のプローブに標的ポリヌクレオチドが結合した状態で、標的ポリヌクレオチドの総量を、光学系の信号により、定量的に測定することが出来る。したがって、本実施例は、Ｂ細胞等の白血球中のｍＲＮＡの総量を検査することにも応用でき、特定の抗原に対して反応性を持った白血球の活性を見積もることにより、高速かつ簡便に病状を知ることも出来る。
【００９２】
もちろん、この実施例が白血球に限らず、任意の細胞について行えるものであることは言うまでもない。
【００９３】
【発明の効果】
本発明によれば、効率良く且つ高精度に標的ポリヌクレオチドを分取できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のポリヌクレオチド分離方法および装置が遺伝子の解析および選択的な回収処理の中で占める位置を説明するための遺伝子処理のフロー図である。
【図２】本発明の第１の実施例の基本構成を示す模式図である。
【図３】第１の実施例の基板上の特定の領域を加熱する第１の手段を示す模式図である。
【図４】第１の実施例の基板上の特定の領域を加熱する第２の手段を示す模式図である。
【図５】第１の実施例の基板上の特定の領域を加熱する第３の手段を示す模式図である。
【図６】第１の実施例のポリヌクレオチド分離セルの具体的な構造を示す模式図である。
【図７】図６で示したセルのＡ−Ａ断面図である。
【図８】図６で示したセルのＢ−Ｂ断面図である。
【図９】Ａ−Ｃは本発明の第１の実施例の核酸分離プロセスを示すタイムテーブルである。
【図１０】本発明の第２の実施例の標的ポリヌクレオチド捕獲領域を持つ基板１と標的ポリヌクレオチド捕獲領域における捕獲状態を検知するための光学系との関係を示す図である。
【図１１】図１０に示す基板１のＡ−Ａ断面図を示す。
【図１２】Ａ−Ｃに第２の実施例の基板１の温度制御部１３３のＢ−Ｂ断面、Ｃ−Ｃ断面およびＤ−Ｄ断面の断面図を示す。
【図１３】第２の実施例のポリヌクレオチド分離セル２５１とその関連装置のブロック図を示す。
【図１４】第２の実施例のポリヌクレオチド分離セル２５１のＧ−Ｇ断面図を示す。
【図１５】第２の実施例のポリヌクレオチド分離セルの分離プロセスを説明するタイムテーブルを示す。
【図１６】本発明の第３の実施例による基板１でプローブを安定に固定できた様子を示す図である。
【図１７】（Ａ）から（Ｃ）は第３の実施例の基板による効果を確認する実験結果を説明する図である。
【図１８】（Ａ）、（Ｂ）は第３の実施例による基板によってプローブに捕獲された標的オリゴヌクレオチドが効果的に解離、回収出来ることを説明する図である。
【図１９】本実施例による二本鎖ポリヌクレオチドの分取について説明する電気泳動の結果を模式的に示す図である。
【図２０】第４の実施例で採用できる細管の外面図である。
【図２１】第４の実施例で採用できる細管のＡ−Ａ断面図である。
【図２２】標的ポリヌクレオチド捕獲領域にプローブを固定するための構造の例を説明する図である。
【図２３】第４の実施例のポリヌクレオチド分離装置の全体構成を示す図である。
【図２４】第４の実施例のポリヌクレオチド分離モジュール４３１のＢ−Ｂ断面を示す図である。
【図２５】図２４に示した実施例のポリヌクレオチド分離モジュール４３１の変形例を示す図である。
【図２６】図２４に示した実施例のポリヌクレオチド分離モジュール４３１の変形例を示す図である。
【図２７】図２６に示した実施例のポリヌクレオチド分離モジュール４３１の変形例を示す図である。
【図２８】第５の実施例の基本要素を示す図である。
【図２９】図２８で説明した基本要素を持つポリヌクレオチド分離セルと光学系を組み合わせた本実施例の基本構成を示す図である。
【図３０】図２９で説明した分離セルのＡ−Ａ断面を示す図である。
【図３１】（Ａ）は図２８で説明した基板の表面に標的ポリヌクレオチド捕獲領域が形成されている状態を示す図、（Ｂ）はポリヌクレオチド分離セル内に血液試料が導入され白血球が基板の表面上を漂遊している状態を示す図、（Ｃ）は交流電場によって白血球が標的ポリヌクレオチド捕獲領域に引き寄せられ、各領域に白血球が配置された状態を示す図、（Ｄ）は抗原物質に対して抗体反応する白血球のみが標識された蛍光を発する様になった状態を示す図、（Ｅ）は標的ポリヌクレオチド捕獲領域の各領域に固定された白血球のひとつのみが破壊された結果、これが基板上から無くなった状態を示す図である。
【図３２】（Ａ）は標的ポリヌクレオチド捕獲領域の一つにプローブが固定されている状況を示す図、（Ｂ）は標的ポリヌクレオチド捕獲領域に白血球が誘引され、捕獲された状態を示す図、（Ｃ）はポリヌクレオチドおよび蛋白質が電気泳動により反対方向に移動する様子を模式的に示す図、（Ｄ）は標的ポリヌクレオチド捕獲領域のプローブに結合しなかったポリヌクレオチドが電気泳動により移動する様子を模式的に示す図である。
【符号の説明】
１…基板、１３…基板ベース、１３１…導電性膜、１３２…熱伝導性絶縁基板、１４、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６…核酸結合領域、１５…対物レンズ、１５１…バンドパスフィルター、１５２…エミッションフィルター、１６…蛍光観察用光源、１７…レーザー光源、１８１、１８２…ダイクロイックミラー、１８３…ミラー、１９１…検出器、１９２…解析装置部、２１…光吸収層、２２…断熱層、２３、２４…微粒子、３１…ヒーター、３２、３４、３５…ペルチエ素子、３３…冷却板、４１、４３、４４、４７…基板上に固定したオリゴヌクレオチドと結合した核酸試料、４２、４５、４６…基板上に固定したオリゴヌクレオチド、５１…集束光、７…核酸分離セル、７１１、７１２、７１３…試料出入り口、７１４…孔、７２１…セル上板、７２２…セル下板、７２３…スペーサー、７３１、７３２、７３３…試料室、７４１…核酸分離セル保持治具、７４２、７４３、７４４…レール、７５１、７５２、７５３、７５４、７５５…電極。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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