(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面プラズモン共鳴装置を用いて生細胞に対する外部刺激の生理活性を評価する方法であって、生細胞が外部刺激に暴露された際に観察される１次シグナルの後に出現する２次シグナルを指標として、細胞に対する外部刺激の生理活性を評価することを特徴とする方法。
【請求項２】
２次シグナルとして、外部刺激が除去された後に出現するシグナルを測定する請求項１の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この出願の発明は、細胞活性の評価方法に関するものである。さらに詳しくは、この出願の発明は、表面プラズモン共鳴装置（SPR装置）を用いて、生細胞に対する外部刺激の生理活性を評価する方法に関するものであり、この方法は、例えば、薬剤や毒性物質のin vitro検査等に利用することができる。
【０００２】
【従来の技術】
リガンドの結合、温度やpH等の環境変化、機械的あるいは電気的刺激といった外部からの刺激が生細胞に与える影響を、細胞が生きたまま、かつリアルタイムで観測できれば、種々の活性物質や物理条件が細胞に与える影響をより正確に測定することが可能であり、臨床現場での迅速診断や治療戦略の確定に大きく貢献する。したがって、そのような細胞に対する生理活性を評価することを可能とする装置や診断システムの開発が望まれているが、現在のところ臨床検査等に利用可能な装置やシステムは存在していない。
【０００３】
例えば、マスト細胞を抗原刺激すると、まず高親和性IgE受容体が凝集し、数秒後にそのαおよびβ鎖がリン酸化される。その変化により種々のキナーゼ蛋白の会合とリン酸化が起こり、チロシンキナーゼ、フォスフォリパーゼC、G蛋白の活性化などの細胞内情報伝達に関わる酵素群が活性化され、数分〜数十分後にかけて分泌顆粒の細胞膜への融合による化学伝達物質の放出が引き起こされる。また同時に転写因子の活性化がおこり、数時間〜十数時間後にはTNFα、IL-4などの起炎性サイトカインが合成、遊離されることが知られている。
【０００４】
これまで細胞の脱顆粒の動態は、解析したい時間毎に反応系の上清を回収し、その中に含まれるヒスタミンやサイトカインなどの物質量を定量することにより測定していた。しかしながらこの方法では、測定のために少なくとも一部の反応上清を回収する必要があり、反応条件が変化するため測定と同時に反応を停止せざるを得ないのが現状であった。
【０００５】
さらに、細胞内カルシウム濃度の動態、pH変化、特定の蛋白の細胞内移動などは、特異的蛍光色素プローブのロードやGFPタグ付き蛋白のトランスフェクションなどによる細胞修飾を行うことにより解析可能であるが、いずれも細胞に対して予め何らかの修飾が必要である。そのため少なくともそれらの修飾の分だけは細胞機能が影響を受ける可能性があり、原則としてそれらの検査に用いた細胞を再び生体に戻して利用することはできないといった問題を有していた。
【０００６】
一方、SPR（surface plasmon resonance）装置は、表面プラズモン共鳴現象を応用し、共鳴角度変化をリアルタイムでとらえることにより、タンパク質等の生体分子間の反応・結合量の測定および速度論解析ができる装置である。この共鳴角度変化は、センサ部の金膜表面近傍における誘電率の変化に依存する。結合測定を行いたいタンパク質の片側をまず金膜上に固定する。タンパク質はそれぞれ固有の誘電率を持っている。SPRでは金膜上に固定化されたタンパク質に対しリガンドとの結合測定を行う。ここでタンパク質とリガンドの結合が起こった場合は複合体が金膜上に形成され誘電率が変化する。つまり金属膜表面の誘電率をリアルタイムに追っていくことにより、生体分子間の反応結合量・結合速度定数・解離速度定数・解離定数・親和性定数等の情報を得ることができる。
【０００７】
また、タンパク質等の生体分子だけではなく、固定した生細胞に結合するリガンドの結合量・結合速度定数・解離速度定数・解離定数・親和性定数等を測定できる装置も開発されてもいる。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
前記のとおり、生細胞を対象とすることのできるSPR装置は、細胞が外部刺激に暴露されている際の誘電率変化を測定することが可能である。今回、この出願の発明者らは、外部刺激により引き起こされる細胞自体の反応も誘電率に変化を与えることを見出した。
【０００９】
この出願は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであって、生細胞に対する外部刺激の生理活性の程度を正確に評価することのできる新しい方法を提供することを課題としている。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
この出願は、前記の課題を解決するための発明として、表面プラズモン共鳴装置を用いて生細胞に対する外部刺激の生理活性を評価する方法であって、生細胞が外部刺激に暴露された際に観察される１次シグナルの後に出現する２次シグナルを指標として、細胞に対する外部刺激の生理活性を評価することを特徴とする方法を提供する。
【００１１】
また、この発明方法においては、２次シグナルとして、外部刺激が除去された後に出現するシグナルを測定することを好ましい態様としてもいる。
【００１２】
以下、この発明の実施形態について詳しく説明する。
【００１３】
【発明の実施の形態】
この出願の発明方法において、外部刺激とは、細胞表面の受容体に対するリガンド、温度やpH等の環境変化、機械的あるいは電気的刺激など、細胞の活性（例えば、細胞内の情報伝達系の賦活等）に対して作用する全ての刺激を包含する。
【００１４】
この発明の方法においては、生細胞を対象とする通常のSPR測定と同様にして、細胞を装置に固定し、前記の刺激を細胞に与え、通常の手続に従って誘電率変化のシグナルを測定するが、細胞が刺激されている期間のシグナル（１次シグナル）だけではなく、１次シグナルに引き続き出現する２次シグナルを指標として外部刺激の細胞活性を評価することを特徴としている。
【００１５】
例えば、SPR装置内に固定した生細胞にリガンドが結合すると、その量に比例してベースラインが上昇し、安定化する（１次シグナル）。リガンドが細胞に対して生理活性を持つ場合、初期シグナルに続いて、単なる結合シグナルとは明らかに異なるベースラインの上昇あるいはベースラインの周期的な変動（２次シグナル）が観測される。このような２次シグナルは生理活性が確認されているリガンドを添加したときにのみ現れることから、リガンドが生細胞へ結合することにより引き起こされる何らかの生体反応を反映していると考えられる。
【００１６】
このように、この発明の方法では、細胞に対する外部刺激の生理活性を正確に評価することが可能であるため、例えば、抗原刺激あるいはサイトカインや薬剤の投与等により患者本人の細胞に生じる変化をリアルタイムで追跡することができ、その解析結果を迅速に臨床現場へフィードバックさせることにより、治療効果の判定や予測、治療方針の策定に利用できる。さらに具体的には、以下のような臨床診断に利用することができる。
(1)  生体より採取した生細胞（血液、生検材料など）の迅速なアレルギー反応検査、人体を使った誘発試験。
(2)  手術中に得られたガン細胞などの病変部細胞をガンマーカー等で刺激し、迅速に機能検査や正常細胞か悪性細胞かの判定を行う。術中に結果が出せるため、そのデータを基に切除領域を決定できる。
(3)  個人による異なる必要薬剤量の解析：現在、遺伝子変異解析(SNP)により個人毎の薬剤反応性の違いを検査し、いわゆるテーラーメード医療の実現が目指されている。この発明の方法により、個人毎の末梢血細胞(リンパ球、好塩基球、好酸球、抗原提示細胞など)の薬剤反応性を解析することにより、個人毎に異なる薬剤の必要量の算定を行うことができる。
(4)  薬剤アレルギーの診断：臨床治験によりほとんどのヒトに安全性が確認されている薬剤でも、稀に重篤なアレルギー反応を起こすことがある。しかしながら複数の薬剤を投与されている場合は原因薬剤を同定することは困難である。この発明の方法により、患者白血球の薬剤への反応性を解析することにより薬剤アレルギーの原因薬剤を同定することができる。
(5)  体外受精させた受精卵の着床率はそれほど高いものではない。そこで、この発明の方法では、細胞を生きたまま扱えることから、着床率の高い受精卵を選別し子宮に戻すことも可能である。これによって体外授精の精度を高めることが出来ると同時に、人工授精を望む女性の精神的、肉体的負担を大きく軽減できる。
(6)  細胞を何らかの物質または物理的条件の変化により刺激した際におこる反応（例えば、受容体分子および関連する細胞内情報伝達分子の凝集・会合、リン酸化、脱リン酸化、膜へのトランスロケーションなど細胞内転位等）を測定する。これらの情報は治療薬の選択、治療効果の判定に有用である。
(7)  動物細胞等を培養する際、培地に加えられる血清はロット間でバラツキが大きく、このためにデータの再現性が失われることはしばしば経験するところである。血清存在下での細胞の反応をSPRでモニターする事により、血清のロット管理が迅速に行える。
【００１７】
【実施例】
以下、実施例を示してこの発明方法についてさらに詳細かつ具体的に説明するが、この発明は以下の例に限定されるものではない。なお。以下の実施例においては、SPR装置はSPR-CELLIA（日本レーザ電子株式会社）を使用した。また、アミンカップリング用センサーチップの調整は以下のとおりに行った。
【００１８】
10 μM 4,4-Dithiodibutyric acid エタノール溶液にセンサーチップを浸して30分間撹拌した。終了後、無水エタノールによる洗浄を行い、乾燥させた。25mgの水溶性カルボジイミドを1mlのミリＱ水に、15 mgのN-hydroxysuccinimideを1,4-Dioxane 9mlにそれぞれ溶解し、この2つの溶液を直前に混合し、乾燥させたセンサーチップを浸して10分間撹拌した。ついで10 mlのミリＱ水を加えて5分間撹拌し、ミリＱ水で洗浄した後、ミリＱ水中で保存した。
実施例１：CTLL-2細胞（浮遊細胞）とIL-2の反応
PBSに懸濁したCTLL-2細胞（2×105 cells/ml）30μlずつを活性化させたセンサーチップの測定部とコントロール部の両側に直接滴下し、1%BSA50μlでblockingした。センサーチップをSPR装置に装着し、温度を37℃に設定してPBSを15 μl/minの流速で流した。測定部側に62.5 ng/mlのIL-2を60μl注入し、そのままPBSを流し続け、シグナル変化を測定した。IL-2を注入しない側はコントロールとした。
【００１９】
結果は図１に示したとおりである。測定部とコントロール部から得られるシグナルの差をとると、約10分間程度の周期性を持つ特徴的なシグナルが見いだされた。これは生細胞においてのみ観測される。一方、IL-3、bFGF、aFGF、プレイオトロフィンなど、本来CTLL-2細胞とは結合しない試薬を添加したときにはシグナルは観測されなかった。このことは、生細胞がリガンドと結合したときに生じる何らかの現象をSPRが捉えていることを示す。
実施例２：Papilla細胞（間葉系系細胞）とbFGFの反応
シャーレから0.02% EDTAでpapilla細胞を剥がし、DMEM10培地に懸濁させた。2×105 cells/ml 400μlを実施例１と同様にしてセンサーチップに固定化した。
【００２０】
流速15 μl/min、設定温度37℃でPBSを流し、コントロール部は1μg/ml bFGFのみ、測定部には1μg/ml bFGF＋50μMリン酸化阻害剤（SU4984）60μlを注入し、42秒後に回路を閉じてシグナル変化を測定した。
【００２１】
結果は図２に示したとおりである。注入10分後からSU4984を加えているほうのシグナルがプラトーになったのに対し、bFGFのみではシグナルは上昇しつづけた。これは、bFGFの結合によって引き起こされるシグナル伝達がリン酸化阻害剤によって抑えられたことを反映している。
実施例３：mast cell（肥満細胞）の抗原に対する反応
mast cell（2×105 cells/ml 70μl）を実施例１と同様にセンサーチップに固定し、測定部にIgEを加え、CO2インキュベーター中で37℃、一夜培養した。チップをSPR装置に装着し、流速15 μl/min、設定温度37℃でランニングバッファ（PIPES buffer、pH7.2）を流した。DNP-HSA（dinitrophenyl-human serum albumin）100 ng/mlまたはDNP-lysine 10μg/mlを60μl注入し、そのままランニングバッファを流しつづけ、シグナル変化を測定した。なお、PIPES（Piperazine-N,N'-bis[2-ethane-sulfonic acid];1,4-Piperazine-diethanesulfonic acid）バッファの組成は表１のとおりである。
【００２２】
【表１】
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結果は図３に示したとおりである。DNP-HSAを添加すると、IgEで感作しているmast cellでは特異的な抗原抗体反応による活性化を反映した強いシグナルが観測されるが、未感作のmast cellでは特徴的な変化は認められなかった。また、IgEには結合するが細胞は活性化しないDNP-lysoneを添加した場合には、DNP-lysineの結合に伴う１次シグナルは観察されたが、２次シグナルは認められなかった（図４）。これらの結果から、この発明方法により、細胞の活性化を迅速に測定可能であることが確認された。
【００２３】
【発明の効果】
以上詳しく説明したとおり、この出願の発明によって、外部刺激による細胞活性の有無や程度を簡便かつ正確に評価することが可能となる。これにより、例えば、患者本人から採取した細胞を生きたまま用い、この細胞に対する薬剤やアレルギー物質等の作用を判定できることから、臨床上有益な情報を得られる。また、診断に用いた細胞を患者に再移植できることから、体外受精のみならず、細胞移植やex vivoタイプの遺伝子治療等への応用も可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  CTLL-2細胞に対するIL-2の作用を測定した結果である。a：IL-2、b：コントロール、c：aとbの差。T1−T2間でIL-2添加。T1−T2間の反応が１次シグナル、T2以降の反応が２次シグナル。
【図２】  Papilla細胞に対するbFGFの作用を測定した結果である。a：bFGF、b：bFGF＋阻害剤、c：aとbの差。T1時点でbFGF（および阻害剤）を添加。T1−T2間の反応が１次シグナル、T2以降の反応が２次シグナル。
【図３】  mast cellに対する抗原作用を測定した結果である。a：IgE未感作細胞にDNP-HAS刺激、b：IgE感作細胞にDNP-HSA刺激、c：aとbの差。T1時点でDNP-HASを添加。T1以降の反応が２次シグナル。２次シグナルが強く出現しているため、１次シグナルは記録されていない。
【図４】  mast cellに対するDNP-lysineの作用を測定した結果である。T1時点でDNP-lysineを添加。T1−T2間の反応が１次シグナル。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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