(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の検出ゾーンの一つには、梅毒トレポネーマ表面抗原の分子量４７ｋＤａの遺伝子組換えＴＰ４７抗原が固定され、
他の少なくも一つの検出ゾーンには、梅毒トレポネーマ表面抗原の分子量１５ｋＤａの遺伝子組換えＴＰ１５抗原、分子量１７ｋＤａの遺伝子組換えＴＰ１７抗原、及びこれらのＴＰ抗原が融合した遺伝子組換え融合ＴＰ抗原から選ばれた抗原をそれぞれ固定することにより、
複数の検出ゾーンが形成された毛細管作用により輸液可能なマトリックスに、検体と標識された遺伝子組換え梅毒トレポネーマ抗原とを展開し、
前記梅毒トレポネーマ抗原に、抗梅毒トレポネーマ抗体を介して結合する、前記標識された遺伝子組換え梅毒トレポネーマ抗原を検出することにより、
異なる複数の抗梅毒トレポネーマ抗体を対象とした分析を行うこと
を特徴とする検体中の抗梅毒トレポネーマ抗体の免疫分析方法。
【請求項２】
前記標識された遺伝子組換え梅毒トレポネーマ抗原と検体を、
展開液中に含ませて、マトリックスに点着し展開すること
を特徴とする請求項１に記載の検体中の抗梅毒トレポネーマ抗体の免疫分析方法。
【請求項３】
前記標識された遺伝子組換え梅毒トレポネーマ抗原は、
あらかじめマトリックス上に点着され、標識試薬ゾーンを形成しているものであること
を特徴とする請求項１に記載の検体中の抗梅毒トレポネーマ抗体の免疫分析方法。
【請求項４】
前記標識は、
酵素、放射性同位元素、ラテックス、金属コロイド粒子、蛍光粒子又は着色粒子のいずれかであること
を特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の検体中の抗梅毒トレポネーマ抗体の免疫分析方法。
【請求項５】
前記標識は、
酵素標識であって、標識された遺伝子組換え梅毒トレポネーマ抗原の検出が、酵素活性を測定することにより行われること
を特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の検体中の抗梅毒トレポネーマ抗体の免疫分析方法。
【請求項６】
毛細管作用により輸液可能なマトリックスに、
複数の検出ゾーンの一つには、梅毒トレポネーマ表面抗原の分子量４７ｋＤａの遺伝子組換えＴＰ４７抗原が固定され、
他の少なくも一つの検出ゾーンには、梅毒トレポネーマ表面抗原の分子量１５ｋＤａの遺伝子組換えＴＰ１５抗原、分子量１７ｋＤａの遺伝子組換えＴＰ１７抗原、及びこれらのＴＰ抗原が融合した遺伝子組換え融合ＴＰ抗原から選ばれた抗原をそれぞれ離間固定して複数の検出ゾーンとし、
この検出ゾーンにより、抗体を介して前記梅毒トレポネーマ抗原に結合する、複数の異なる標識された遺伝子組換え梅毒トレポネーマ抗原をそれぞれ別個に検出すること
を特徴とする検体中の抗梅毒トレポネーマ抗体の免疫分析装置。
【請求項７】
前記マトリックスは、
標識された遺伝子組換え梅毒トレポネーマ抗原からなる標識試薬ゾーンをも具備すること、
を特徴とする請求項６に記載の検体中の抗梅毒トレポネーマ抗体の免疫分析装置。
【請求項８】
前記マトリックスは、
検体液を点着するための検体点着ゾーンと、展開液を供給するための展開液ゾーンと、展開液を吸収するための展開液吸収ゾーンをも具備すること
を特徴とする請求項６又は７に記載の検体中の抗梅毒トレポネーマ抗体の免疫分析装置。
【請求項９】
前記マトリックスは、
標識用酵素の活性を測定するための基質が点着されている基質ゾーンをも具備すること
を特徴とする請求項６〜８のいずれかに記載の検体中の抗梅毒トレポネーマ抗体の免疫分析装置。
【請求項１０】
前記展開液ゾーンは、
標識用酵素の活性を測定するための基質が点着されているものであること
を特徴とする請求項８に記載の検体中の抗梅毒トレポネーマ抗体の免疫分析装置。
【請求項１１】
前記展開液を供給するための展開液ゾーンは、
検体液を点着するための検体点着ゾーンを兼ねるものであることを
を特徴とする請求項８に記載の検体中の抗梅毒トレポネーマ抗体の免疫分析装置。
【請求項１２】
前記標識試薬ゾーンは、
その上面に検体点着ゾーンを設けたこと
を特徴とする請求項７〜１１のいずれかに記載の検体中の抗梅毒トレポネーマ抗体の免疫分析装置。
【請求項１３】
前記標識試薬ゾーンは、
前記免疫分析装置のマトリックス上に付設した、酵素標識された遺伝子組換え梅毒トレポネーマ抗原を含有した吸水性パッドからなること
を特徴とする請求項７〜１２のいずれかに記載の検体中の抗梅毒トレポネーマ抗体の免疫分析装置。
【請求項１４】
前記標識試薬ゾーンは、
酵素、放射性同位元素、ラテックス、金属コロイド粒子、蛍光粒子又は着色粒子のいずれかで標識された遺伝子組換え梅毒トレポネーマ抗原を含有するものであること
特徴とする請求項７〜１３のいずれかに記載の検体中の抗梅毒トレポネーマ抗体の免疫分析装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、毛細管作用により輸液可能なマトリックスに、梅毒トレポネーマ（トレポネーマパリダム；以下、ＴＰという。）抗原を固定した検出ゾーンとを設けてなる免疫分析装置に、標識された遺伝子組換えＩＰ抗原検体を添加して展開し、検出ゾーンに結合した検体中の抗梅毒トレポネーマ抗体（以下、抗ＴＰ抗体という。）の検出を行うことのできる検体中の抗梅毒トレポネーマ抗体の免疫分析方法、及びその分析を行うための免疫分析装置に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
血液や尿等に含まれる生体成分や薬物の分析は、病態の診断や治療経過の判定に重要である。
そこで、この生体成分、薬物等を、抗原抗体反応を利用し、検体中から簡便に分析する方法として、反応試薬を含浸させたストリップ状の濾紙からなるストリップ分析装置を用いる方法が見出された。
【０００３】
この分析法は、ストリップ分析装置の濾紙上に設けた検体点着ゾーンに検体を加え、溶液を展開させ、濾紙上に設けた検出ゾーンに表示される発色の度合いから診断する方法で、このストリップ分析装置では、反応形式に応じた必要試薬（酵素標識抗体、基質、発色試薬等）が含まれる濾紙を用い、その発色から分析を行うため、特別な判定装置を用いる必要性がなく、簡便な方法で実施することができる。
【０００４】
また、カラーラテックス、金属コロイド等の粒子を標識物として用いる分析方法も知られているが、この分析方法では、検出すべき抗原又は抗体と反応する抗体又は抗原を粒子に結合した試薬を用い、検出ゾーンに結合された粒子像を検出することにより行われていた。
【０００５】
さらに、従来、抗ＴＰ抗体の検出には、血球にＴＰ菌体成分を結合させたＴＰＨＡ試薬を用いる方法、人工粒子にＴＰ抗原を結合させて製造した間接凝集免疫測定試薬を用いる方法、ＴＰ抗原結合固相と標識抗グロブリン抗体からなる酵素免疫測定試薬を用いる方法等が知られていた。これらの分析方法では、いずれも測定を開始して結果を得るまでに２時間以上を要し、判定には測定機器を用いるため、緊急な検査やベッドサイドでの短時間での測定には対応することができなかった。
【０００６】
一方、前記のストリップ分析装置を用いた測定では、測定時間の短縮化は図れるが、従来のストリップ分析装置を用いた抗ＴＰ抗体の測定法においては、検体中に存在する多量のグロブリンと標識抗体との間で反応が起こり、測定を行うことができなかったので、ストリップ分析装置に洗浄槽を付加した装置（特開平５−１２６８３２号公報参照）、展開液に標識物により起こるシグナルを防止するゾーンを設けた装置（特表平１−５０３４３９号公報参照）等を用いる方法が見出された。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
これらの分析方法は、いずれも操作が煩雑であり、測定操作を常に一定の条件で実施することが難しい。また、検体中に含まれるグロブリン等の影響により、感度よく測定を行うには満足することのできる方法ではなかったので、検体中の抗ＴＰ抗体の測定を行うにあたり、固相に結合したＴＰ抗原と標識ＴＰ抗原とによりサンドイッチ法で検出することが試みられたが、従来の生体中で培養され得られたＴＰ抗原の混合物に標識物を導入することは容易ではない。また、常に一定の標識物が置換された標識抗原試薬を継続的に得ることができず、これまで標識ＴＰ抗原を用いる方法は知られていなかった。さらに、従来の抗ＴＰ抗体の測定法は、操作が複雑で、精度の高い分析を短時間に行うとができないという問題がある。
【０００８】
本発明はかかる現状に鑑み、従来の分析方法に比べ簡便な操作で、かつ短時間で、複数の抗梅毒トレポネーマ抗体の検出が行える、検体中の抗梅毒トレポネーマ抗体の免疫分析法と、その分析を実施するための免疫分析装置の提供を目的とするものである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
前記の目的を達成するため、本発明の請求項１に記載の発明は、
複数の検出ゾーンの一つには、梅毒トレポネーマ表面抗原の分子量４７ｋＤａの遺伝子組換えＴＰ４７抗原が固定され、
他の少なくも一つの検出ゾーンには、梅毒トレポネーマ表面抗原の分子量１５ｋＤａの遺伝子組換えＴＰ１５抗原、分子量１７ｋＤａの遺伝子組換えＴＰ１７抗原、及びこれらのＴＰ抗原が融合した遺伝子組換え融合ＴＰ抗原から選ばれた抗原をそれぞれ固定することにより、
複数の検出ゾーンが形成された毛細管作用により輸液可能なマトリックスに、検体と標識された遺伝子組換え梅毒トレポネーマ抗原とを展開し、
前記梅毒トレポネーマ抗原に、抗梅毒トレポネーマ抗体を介して結合する、前記標識された遺伝子組換え梅毒トレポネーマ抗原を検出することにより、
異なる複数の抗梅毒トレポネーマ抗体を対象とした分析を行うこと
を特徴とする検体中の抗梅毒トレポネーマ抗体の免疫分析方法である。
【００１０】
また、本発明の請求項６に記載の発明は、
毛細管作用により輸液可能なマトリックスに、
複数の検出ゾーンの一つには、梅毒トレポネーマ表面抗原の分子量４７ｋＤａの遺伝子組換えＴＰ４７抗原が固定され、
他の少なくも一つの検出ゾーンには、梅毒トレポネーマ表面抗原の分子量１５ｋＤａの遺伝子組換えＴＰ１５抗原、分子量１７ｋＤａの遺伝子組換えＴＰ１７抗原、及びこれらのＴＰ抗原が融合した遺伝子組換え融合ＴＰ抗原から選ばれた抗原をそれぞれ離間固定して複数の検出ゾーンとし、
この検出ゾーンにより、抗体を介して前記梅毒トレポネーマ抗原に結合する、複数の異なる標識された遺伝子組換え梅毒トレポネーマ抗原をそれぞれ別個に検出すること
を特徴とする検体中の抗梅毒トレポネーマ抗体の免疫分析装置である。
【００１１】
【発明の実施の形態】
以下、本発明にかかる検体中の抗梅毒トレポネーマ抗体の免疫分析方法と、免疫分析装置の実施の形態を添付の図面に基づいて詳細に説明する。
【００１２】
この発明において、検体中の抗梅毒トレポネーマ抗体の免疫分析方法に用いる免疫分析装置としては、図１に示すような、毛細管作用により輸液可能なマトリックス１に、標識された遺伝子組換え梅毒トレポネーマ抗原からなる標識試薬ゾーン４と、遺伝子組換え梅毒トレポネーマ抗原を固定した検出ゾーン５とを設けた免疫分析装置を挙げることができる。
この発明における免疫分析装置は、図４に示されるように、複数の検出ゾーン５、８を有することを特徴とするもので、前記マトリックス１は、毛細管作用により輸液可能な吸水性材料で構成される。
【００１３】
このマトリックス１を構成する好ましい材料としては、例えば、セルロース、ニトロセルロース等のセルロース又はその誘導体、ガラス繊維等により形成された濾紙、多孔質膜等である。
このマトリックスの大きさには制限はないが、例えば幅３ｍｍ〜１０ｍｍ、長さ３０ｍｍ〜１００ｍｍ程度のストリップ状のものが、取扱が容易で好ましく、マトリックスの厚さは１００μｍ〜１ｍｍのものを用いることが好ましい。
また、マトリックス１は、その一部を蛋白質の非特異反応による吸着を防止するために、例えば、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼイン、シュークロース等でブロッキングして用いることもできる。
【００１４】
＜標識試薬ゾーン＞
前記標識試薬ゾーン４は、マトリックス１に設けられた標識された遺伝子組換えＴＰ抗原を含むゾーンであって、展開液ゾーン２からの展開液の輸液方向で、前記検出ゾーン５の上流側に設けることができる。具体的には、トリックス１に、標識された遺伝子組換えＴＰ抗原を点着する方法、標識された遺伝子組換えＴＰ抗原を含む吸水性のパッドをマトリックス上に付設する方法等により設けることができる。
【００１５】
ＴＰの細胞表面には各種分子量の表面抗原が存在することが知られ、主なものとして、分子量４７ｋＤａ（ＴＰ４７）、４２ｋＤａ（ＴＰ４２）、１７ｋＤａ（ＴＰ１７）、１５ｋＤａ（ＴＰ１５）、５０ＫＤａ（ＴＰＮ５０）、ＴｍｐＡ等の抗原が知られている。
【００１６】
これらの抗原をコードする遺伝子は既にクローニングされており、遺伝子工学的に抗原が生産されている（特表平２−５００４０３号公報、INFECTION AND IMMUNITY, Vol.57, No.17, PP.3708-3714, 1989; Molecular Microbiology, 4(8),1371-1379, 1990等参照）。
【００１７】
本発明の遺伝子組換えＴＰ抗原は、前記した分子量４７ｋＤａ（ＴＰ４７）、１７ｋＤａ（ＴＰ１７）、１５ｋＤａ（ＴＰ１５）の抗原を、例えば、ノルガード（Norgard）らの方法（INFECTION AND IMMUNITY, Vol.61,PP.1202-1210, 1993 ）に記載の方法に従い、ベクターに組み込み形質転換した大腸菌を培養し、この培養液から周知の方法を組み合わせて精製することにより製造することができる。
【００１８】
また、本発明の遺伝子組換えＴＰ抗原には、前記各分子量の抗原蛋白質の誘導体も存在し、例えば、蛋白質のＮ末端にグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）が融合したＴＰ抗原を遺伝子工学的に製造したものを用いることもできる（特開平７−２８７０１７号公報参照）。
【００１９】
更に、遺伝子組換えＴＰ抗原には、前記分子量１７ｋＤａ（ＴＰ１７）と１５ｋＤａ（ＴＰ１５）の抗原を融合させて製造した、ＴＰ１５−１７抗原、及びこれらの順序を入れ換えた融合ＴＰ抗原であってもよい。
【００２０】
この遺伝子組換えＴＰ抗原には、標識物を結合させて試薬とするが、その標識物としては、例えば、酵素、放射性同位元素、ラテックス、金属コロイド粒子、蛍光粒子、着色粒子等を挙げることができる。
【００２１】
前記の酵素としては、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）に用いられる各種酵素を挙げることができ、その酵素として、例えば、アルカリホスファターゼ、パーオキシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ等を挙げることができる。
【００２２】
また、放射性同位元素としては、例えば、ヨウ素、トリチウム、炭素等の同位元素を挙げることができる。
【００２３】
ラテックスとしては、例えば、ポリスチレンラテックス等の高分子化合物の粒子を挙げることができる。
【００２４】
金属コロイド粒子としては、例えば、各種金属コロイドからなる粒子で、セレニウム、白金、金等の金属コロイドを挙げることができ、その粒径は、直径１０ｎｍ〜１μｍのものを用いることが好ましい。
【００２５】
蛍光粒子としては、例えば、フルオレセイン、ローダミン、シアン化白金等の蛍光物質を含むポリスチレン、スチレン−ブタジエン共重合体、スチレン−アクリル酸共重合体、ガラス等の粒子を挙げることができる。
【００２６】
着色粒子は、各種染料又は顔料により着色した有機高分子化合物又は無機化合物で構成される粒子で、例えば、ポリスチレン、ポリメチルアクリレート、ポリアルキルアミド、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ガラス等を単独又は混合した材料で構成されるもので、これらの蛍光粒子及び着色粒子の粒径は、１０ｎｍ〜１μｍのものを用いることが好ましい。
【００２７】
また、標識物と遺伝子組換えＴＰ抗原との結合方法は、公知の共有結合又は非共有結合を作る方法を利用して製造することができ、結合の方法には、例えば、グルタルアルデヒド法、過ヨウ素酸法、マレイミド法、ピリジル・ジスルフィド法、各種架橋剤を用いる方法等を挙げることができる（例えば「蛋白質核酸酵素」別冊３１号、３７〜４５頁（１９８５）参照）。
【００２８】
架橋剤を用いる結合方法では、架橋剤としては、例えば、Ｎ−スクシンイミジル−４−マレイミド酪酸（ＧＭＢＳ）、Ｎ−スクシンイミジル−６−マレイミドヘキサン酸、Ｎ−スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸等を用いることができる。
【００２９】
共有結合による方法では、遺伝子組換えＴＰ抗原に存在する官能基を用いることができる他、組換えＴＰ抗原に、例えば、チオール基、アミノ基、カルボキシル基、水酸基等の官能基を常法により導入したのち前記結合法により標識遺伝子組換えＴＰ抗原を製造することができる。
【００３０】
非共有結合による方法としては、物理吸着法等を挙げることができる。
【００３１】
遺伝子組換えＴＰ抗原に放射性同位元素を用いて標識する方法としては、例えば、ボルトンハンター試薬等を用いて行うことができる。
【００３２】
標識試薬ゾーンに含有される標識遺伝子組換えＴＰ抗原の量は、マトリックスに点着又は吸水性パッドに含有させる方法、検査対象物、測定に用いる検体量により適宜変更することができるが、通常乾燥重量で０．０１μｇ〜５μｇ程度である。
【００３３】
標識遺伝子組換えＴＰ抗原としては、前記ＴＰ４７、ＴＰ１７、ＴＰ１５、それらの融合ＴＰ抗原等の遺伝子組換えＴＰ抗原を、標識した抗原が用いられ、標識試薬ゾーンに添加して用いることができる。
【００３４】
＜検体点着ゾーン＞
検体点着ゾーン３は、前記展開液ゾーン２の、展開液の輸液方向の下流側で、検出ゾーン５の上流側のマトリックス１に特に試薬等を含まずに設けることができる。（図１参照）
【００３５】
さらに、この検体点着ゾーン３は、展開液ゾーン２の展開液輸液方向の下流側で標識試薬ゾーン４の上流側、標識試薬ゾーン４の下流側で検出ゾーン５の上流側、又は標識試薬ゾーン４の上に設けることができる。
【００３６】
また、前記標識試薬ゾーン４の上に検体点着ゾーン３を設けた免疫分析装置においては、標識試薬ゾーンとして、標識された遺伝子組換えＴＰ抗原を含有する吸水性パッドを付設することが効率よく分析を行う上で好ましい。（図２〜図４参照）
【００３７】
このパッドを付加する免疫分析装置では、多量の検体液を点着することができるため、検体中の微量成分を、検出感度を高めて分析を行うことができる。
【００３８】
この吸水性のパッドとしては、例えば、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、不織布、セルロース等の多孔質の合成又は天然の高分子化合物からなる材料を単独又は組み合わせて構成することができる。このパッドの大きさ及び厚さは限定されないが、通常縦と横が３ｍｍ〜１０ｍｍ程度で厚さが０．５ｍｍ〜４ｍｍ程度のパッドを用いることが効率よく測定を行うためには好ましい。
【００３９】
＜検出ゾーン＞
検出ゾーン５は、展開液の輸液方向で展開液吸収ゾーン６の上流側で、かつ検体点着ゾーン３の下流側に、異なるＴＰ抗原を固定し、それぞれ離間した状態で複数、すなわち、図4に５、８と示されるように、設けられる。
このゾーンは、ＴＰ抗原をマトリックス１に共有結合等の化学結合、物理吸着等の方法により固定化することにより設けることができる。また、ＴＰ抗原を不溶性の担体に結合させ、これをマトリックスに固定させてもよい。
【００４０】
前記の不溶性の担体としては、ゼラチン、アラビアゴム及びヘキサメタリン酸ナトリウムからなる混合物を不溶化して得られる粒子（特公昭６３−２９２２３号公報参照）、ポリスチレンラテックス、各種動物赤血球、ガラス繊維等を挙げることができる。
【００４１】
不溶性の担体とＴＰ抗原との結合には、前記化学結合又は物理吸着により結合させることができる。
【００４２】
複数形成される検出ゾーン５及び８等は、どのような形状でもよいが、展開液の輸液方向と直交するように線状に形成し、ＴＰ抗原を固定することが検出感度を向上させるためには好ましい。
【００４３】
また、複数の検出ゾーン５、８等は、その一つには前記したＴＰ４７が、他の少なくとも一つには、ＴＰ１７、ＴＰ１５及びそれらの融合ＴＰ抗原等の遺伝子組換えＴＰ抗原から選択される抗原を、それぞれ単独に、または混合してマトリックス上に固定することにより形成されるものである。
【００４４】
２以上の検出ゾーン５、８等が設けられた免疫分析装置では、それぞれの抗原に対する抗体を分別して検出することが可能である。
【００４５】
またさらに、この検出ゾーンには、遺伝子組換えＴＰ抗原以外に当業者には周知の方法に従い、例えば、ウサギ睾丸等の生体内で培養したＴＰ（ニコルス株）の菌体を分解し、抽出、遠心分離等の方法を組み合わせて精製し取得した所謂培養ＴＰ抗原（特開昭５８−７１４５７号公報参照）を組み合わせることも可能である。
【００４６】
＜展開液ゾーン＞
展開液ゾーン２は、マトリックス１の一端に設けられ展開液が供給されるゾーンであって、測定を開始するには、この展開液ゾーン２を、少なくとも展開液吸収ゾーン６に達する量の展開液の入った容器に浸し行うことができるもので、展開液の供給には、展開液ゾーン６に展開液の入った液槽を付加し、この液槽を破って展開液とマトリックス１を接触させて測定を開始することもできる。
【００４７】
展開液には、界面活性剤、緩衝剤等を適宜含有することができ、緩衝剤を含む緩衝液としては、例えば、酢酸緩衝液、ほう酸緩衝液、トリス−塩酸緩衝液、ジエタノールアミン緩衝液等を挙げることができる。
【００４８】
また、展開液ゾーン２には、展開液の供給形態により、さらに吸水性の濾紙等を付設することもできる。
【００４９】
この展開液ゾーン２としては、マトリックスに放射性同位元素、ラテックス、金属コロイド粒子、蛍光粒子又は着色粒子のいずれかで標識された遺伝子組換えＴＰ抗原と検体とを含む展開溶液を供給するためのゾーンを形成したものであってもよい。
【００５０】
＜展開液吸収ゾーン＞
展開液吸収ゾーン６は、マトリックス１の一端に設けられた前記展開液ゾーン２に対して他端に設置されるもので、マトリックス１に供給される展開液を吸収し、分析を円滑に行うために設けられる。
【００５１】
この展開液吸収ゾーン６は、マトリックス１を長く形成して確保することもできるとともに、マトリックス１に吸水性材料を付設し、展開を促進することもできる。
【００５２】
この吸水性材料を付加する場合には、天然高分子化合物、合成高分子化合物等からなる保水性の高い濾紙、スポンジ等を用いることができ、吸収性材料は、マトリックスに積層することにより、小型化した免疫分析装置を製造することができる。
【００５３】
本発明の免疫分析装置としては、標識物の種類により各種装置形態をとることができるが、標識物として酵素を用いる場合には、毛細管作用により輸液可能なマトリックス１に、基質を含む展開液ゾーン２と、酵素標識された遺伝子組換えＴＰ抗原からなる標識試薬ゾーン４と、ＴＰ抗原をマトリックスに固定した複数の検出ゾーン５、８と、検体点着ゾーン３と、展開液吸収ゾーン６とを設けた抗ＴＰ抗体の免疫分析装置を挙げることができる。
【００５４】
標識物として、前記酵素を用いる免疫分析装置では、酵素活性を測定するために各種基質を用いることができ、この基質としては、酵素に対応して以下に示す各種発色基質、蛍光基質、発光基質等を用いることができる。
【００５５】
（ａ）発色基質
・パーオキシダーゼ用；過酸化水素と組合せた２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）、３，３’，５，５’−テトラメチルベンチジン（ＴＭＢ）、ジアミノベンチジン（ＤＡＢ）
・アルカリホスファターゼ用；５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸（ＢＣＩＰ）
【００５６】
（ｂ）蛍光基質
・アルカリホスファターゼ用；４−メチルウムベリフェニル−ホスフェート（４ＭＵＰ）
・β−Ｄ−ガラクトシダーゼ用；４−メチルウムベリフェニル−β−Ｄ−ガラクトシド（４ＭＵＧ）
【００５７】
（ｃ）発光基質
・アルカリホスファターゼ用；３−（２’−スピロアダマンタン）−４−メトキシ−４−（３”−ホスフォリルオキシ）フェニル−１，２−ジオキセタン・２ナトリウム塩（ＡＭＰＰＤ）
・β−Ｄ−ガラクトシダーゼ用；３−（２’−スピロアダマンタン）−４−メトキシ−４−（３”−β−Ｄ−ガラクトピラノシル）フェニル−１，２−ジオキセタン（ＡＭＧＰＤ）
・パーオキシダーゼ用；過酸化水素と組み合わせたルミノール、イソルミノール
【００５８】
これら基質は、通常、展開液中に添加して用いられるが、図３に示すように、基質をマトリックス１上に基質ゾーン７として設けることもでき、通常は、展開液の輸液方向で検出ゾーン５の上流、好ましくは、標識試薬ゾーン４より上流に設けるもので、このマトリックス１に基質ゾーン７を設けるには、通常基質を溶液に溶解してマトリックスに添加した後、乾燥させることにより形成することができる。
【００５９】
さらに、本発明の免疫分析装置の態様として、毛細管作用により輸液可能なマトリックスに、放射性同位元素、ラテックス、金属コロイド粒子、蛍光粒子又は着色粒子のいずれかで標識された標識遺伝子組換え梅毒トレポネーマ抗原と検体とを含む展開溶液を添加するための展開液ゾーン２と、ＴＰ抗原を固定した複数の検出ゾーン５、８と、展開液吸収ゾーン６とを設けた抗ＴＰ抗体の免疫分析装置を挙げることができる。
【００６０】
この免疫分析装置は、展開液ゾーン２が放射性同位元素、ラテックス、金属コロイド粒子、蛍光粒子又は着色粒子のいずれかで標識された標識遺伝子組換えＴＰ抗原と検体とを、それぞれ添加するゾーンであることが前記免疫分析装置とは相違する。
【００６１】
前記の展開液ゾーン２に、前記の標識遺伝子組換えＴＰ抗原と検体とを添加するには、前記標識遺伝子組換えＴＰ抗原と検体とを含む溶液をそれぞれ添加する方法、標識遺伝子組換えＴＰ抗原と検体との混合液を添加する方法により行うことができ、この展開溶液には、所望により前記界面活性剤、緩衝剤等を含む展開液を添加することができる。
【００６２】
この展開液ゾーン２に添加する標識遺伝子組換えＴＰ抗原は、放射性同位元素、ラテックス、コロイド粒子又は着色粒子で標識された標識遺伝子組換えＴＰ抗原で、前記免疫分析装置で用いた標識遺伝子組換えＴＰ抗原の中から選択して用いることができ、さらに、この免疫分析装置の検出ゾーン５、８及び展開液吸収ゾーンは、前記免疫分析装置と同じゾーンとすることができる。
【００６３】
＜使用方法＞
本発明の免疫分析装置を用いて、各種検体中の抗ＴＰ抗体の分析を行うことができるもので、この免疫分析装置で分析を行うには、まず、検体を免疫分析装置のマトリックスに供給した後、展開液により展開を行う。
【００６４】
展開液は、毛細管作用により展開液吸収ゾーン６に達し、検出ゾーン５及び８に結合されなかった検体中の成分、標識遺伝子組換えＴＰ抗原が吸収され展開が完了する。
【００６５】
展開終了後、前記検出ゾーン５、８に固定化された検体液中の抗梅毒トレポネーマ抗体に依存する量の標識物を、直接的又は間接的に検出することにより抗ＴＰ抗体の分析を行うことできる。
【００６６】
この検出は、標識物によりそれぞれ対応する目視又はシンチレーションカウンター、比色計、蛍光光度計、フォトカウンター、感光フィルム等の測定装置を用いて実施することができる。
【００６７】
分析では、例えば、酵素を標識物として用い、発色基質により生成する色素の有無を定性的に目視で測定する方法が簡便であるが、この免疫分析方法では、抗ＴＰ抗体の濃度に対応した色票（カラーチャート）を用いることにより半定量的な分析が可能となる。
【００６８】
また、前記マトリックス１は、プラスチック、金属、紙等の支持部材上に積層し固定して用いることもでき、さらに、マトリックス１は、プラスチック等のケースに固定し、展開液を含む液槽を展開液ゾーン２に付設し、前記各ゾーン部分に穴の開いたカバーをすることにより、取扱の容易な装置を構成することができる。
【００６９】
本発明の免疫分析装置では、検体として特に制限はなく、例えば、血清、血漿、全血、尿等の各種体液中の抗ＴＰ抗体の検出に適用することができる。
【００７０】
【実施例】
以下、参考例及び実施例により本発明を更に詳細に説明する。
【００７１】
参考例１
アルカリホスファターゼ標識された遺伝子組換えＴＰ１７抗原の作製
特開平７−２８７０１７号公報に記載の方法に従い製造し、ＧＳＴの結合した遺伝子組換えＴＰ１７抗原０．１２ｍｇに２−イミノチオラン２００ｎｍｏｌを加え、温度３０℃で６０分間放置し、チオール化ＴＰ抗原を得た。
次に、アルカリホスファターゼ３ｍｇに３００ｎｍｏｌのＮ−スクシンイミジル−４−マレイミド酪酸（ＧＭＢＳ）を加え温度３０℃で６０分間放置し、マレイミド化アルカリホスファターゼを得た。
その後、前記チオール化ＴＰ抗原１００μｇと、マレイミド化アルカリホスファターゼ２．５ｍｇとを混合し、温度４℃で一夜反応を行った後、ゲルろ過カラムにより未反応の抗原及び酵素を除いて、アルカリホスファターゼ標識した遺伝子組換えＴＰ１７抗原を得た。
【００７２】
参考例２
抗ＴＰ１７抗体分析用装置
図２に示すように、幅５ｍｍ、長さ５０ｍｍのセルロース膜（ミリポア社製）のマトリックス１に、上端から１５ｍｍの位置に参考例１で用いた遺伝子組換えＴＰ１７抗原を塗布装置でライン状に点着後乾燥して検出ゾーン５を作成した。
参考例１で製造したアルカリホスファターゼ標識された遺伝子組換えＴＰ１７抗原溶液２０μｌを、幅５ｍｍ、長さ５ｍｍに切ったポリビニルアルコール（ＰＶＡ）シートに点着し乾燥したパッドをマトリックスの上端から２５ｍｍの位置に置き標識試薬ゾーン４と検体点着ゾーン３とした。
また、マトリックス１の下端１０ｍｍの位置に幅５ｍｍ、長さ２０ｍｍの濾紙（ミリポア社製）を付設し、展開液ゾーン２とした。
更に、展開液吸収ゾーン６として、マトリックスの上端１０ｍｍの位置に幅１０ｍｍ、長さ２０ｍｍ、厚さ約１ｍｍの濾紙を付設して抗ＴＰ１７抗体分析用の装置を得た。
【００７３】
参考例３
抗ＴＰ１７抗体の測定
参考例２で作成した分析装置を用いて抗ＴＰ抗体の分析を行った。
まず、検体１５μｌを点着ゾーン３に添加後、０．３％の５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸（ＢＣＩＰ）を含有する溶液２００μｌを展開液ゾーン２に滴下し吸収展開し、１５分後に検出ゾーン５の呈色を目視判定した。
ヒト血清検体８９例について測定を行い、その結果を表１に示す。着色が見られたものを陽性、着色が見られなかったものを陰性と判定した。
また、同一の検体について、希釈列を作り、従来の抗ＴＰ抗体の間接凝集免疫測定試薬（セロディア−ＴＰ・ＰＡ（登録商標）；富士レビオ社製）で測定した結果を表１に示す。
【００７４】
参考例４
抗ＴＰ４７抗体の測定
ノルガード(Norgard)らの方法（INFECTION AND IMMUNITY, Vol.61,PP.1202-1210, 1993 ）に従い、製造し精製した遺伝子組換えＴＰ４７抗原を用いて、参考例１及び２の方法に従いアルカリホスファターゼ標識した組換えＴＰ４７抗原を製造し、さらに抗ＴＰ４７抗体分析用の装置を得た。この抗体分析装置を用いて表１に記載の検体について測定を行った。参考例３及び４の結果を表１に示す。
参考例３及び４とを組み合わせて、少なくとも一方の抗体分析装置で陽性を示す検体を陽性判定とすると、表１の「ＴＰ１７抗体分析装置とＴＰ４７抗体分析装置との組合せによる測定」欄に示す結果の通り、すべての検体で間接凝集免疫測定試薬による間接凝集法
と同じ測定結果を得た。
【００７５】
【表１】
0003831759.tif 000002
【００７６】
実施例１
抗１７ＴＰ抗体及び抗４７ＴＰ抗体分析用装置
図４に示すように、幅５ｍｍ、長さ５０ｍｍのセルロース膜（ミリポア社製）のマトリックス１の上端から１２ｍｍの位置に遺伝子組換えＴＰ１７抗原、１７ｍｍの位置に遺伝子組換えＴＰ４７抗原を塗布装置でライン状に点着後乾燥して検出ゾーン５及び８を作成した。
参考例１で作成したアルカリホスファターゼ標識した組換えＴＰ１７抗原、及び参考例４で作成したアルカリホスファターゼ標識した組換えＴＰ４７抗原の混合溶液２０μｌを幅５ｍｍ、長さ５ｍｍに切ったＰＶＡシートに点着し乾燥したコンジュゲートパッドをマトリックスの上端から２５ｍｍの位置に置き標識試薬ゾーン４と検体点着ゾーン３とした。
また、参考例２と同様に、展開液ゾーン２と展開液吸収ゾーン６の濾紙を付設して抗ＴＰ１７抗体及び抗４７ＴＰ抗体分析用の装置を作成した。
【００７７】
実施例２
抗１７ＴＰ抗体及び抗４７ＴＰ抗体の測定
実施例１で作成した抗体分析装置を用い、間接凝集免疫測定法で陽性を示した検体について抗ＴＰ抗体の測定を行った。
まず、検体１５μｌを標識試薬ゾーン４に設けた点着ゾーン３に添加後、０．３％のＢＣＩＰを含有する溶液２００μｌを展開液ゾーンに滴下し吸収展開させた。
１５分後に検出ゾーン５及び８の呈色を目視判定した。
着色が見られたものを陽性、着色が見られなかったものを陰性と判定した。
【００７８】
前記間接凝集免疫測定試薬で陽性又は陰性と判定された検体について、実施例１の抗体分析装置で測定を行った。その結果を表２に示す。
また、既知の梅毒感染初期検体、感染二期検体及び感染晩期検体についてそれぞれ間接凝集免疫測定及び実施例１の分析装置で測定を行った。その結果を表３に示す。
【００７９】
【表２】
0003831759.tif 000003
【００８０】
【表３】
0003831759.tif 000004
【００８１】
参考例５
アルカリホスファターゼ標識ＴＰ１５−１７抗原の作成
ＴＰ１５抗原とＴＰ１７抗原とが融合した遺伝子組換えＴＰ１５−１７抗原を製造し、更に実施例１と同じ方法に従いアルカリホスファターゼ標識遺伝子組換えＴＰ１５−１７抗原を得た。
【００８２】
参考例６
抗ＴＰ１５−１７抗体分析用装置
参考例２と同じ方法に従い、マトリックス１上に参考例５で製造したアルカリホスファターゼ標識遺伝子組換えＴＰ１５−１７抗原、及び遺伝子組換えＴＰ１５−１７抗原とを点着して、抗ＴＰ１５−１７抗体分析用装置を得た。
【００８３】
参考例７
抗ＴＰ１５−１７抗体分析用装置による抗ＴＰ抗体の測定
参考例６で製作した抗体分析装置を用い、抗ＴＰ抗体の分析を参考例３の方法に従いヒト血清検体５例について行った。その結果を表４に示す。
更に、同一の検体について、前記間接凝集免疫測定試薬、及び抗ＴＰ４７抗体分析装置での結果を併せて表４に示す。
【００８４】
【表４】
0003831759.tif 000005
【００８５】
【発明の効果】
本発明の検体中の抗梅毒トレポネーマ抗体の免疫分析方法は、毛細管作用により輸液可能なマトリックスに、異なる梅毒トレポネーマ抗原、すなわちＴＰ４７抗原とその他の抗原をそれぞれ離間して固定した検出ゾーンを複数設けてなる抗梅毒トレポネーマ抗体の免疫分析装置に、標識された遺伝子組換え梅毒トレポネーマ抗原と、検体を添加するというきわめて簡便な手段によって、検体中の抗梅毒トレポネーマ抗体を複数、高感度で検出することができ、また、例えば、血清中の抗ＴＰ抗体を約１５分間で分析を行い、結果を得ることができる。
【００８６】
さらに、抗ＴＰ抗体の抗体価が高い検体の測定時に観察されるプロゾーン現象は、本発明の分析方法では見られない。また、本発明の方法を用いると、検体中の複数の抗ＴＰ抗体が分別して分析できるため、感染時期を推定することができ、梅毒の治療にも有用である。
【００８７】
本発明の検体中の抗梅毒トレポネーマ抗体の免疫分析装置は、毛細管作用により輸液可能なマトリックスに、異なる梅毒トレポネーマ抗原を固定した検出ゾーンを複数設けられていると共に標識された遺伝子組換え梅毒トレポネーマ抗原が用いられているといった簡便な構成のため、操作が簡単で、かつ、検体を添加するというきわめて簡便な手段によって、検体中の複数の抗梅毒トレポネーマ抗体を高感度で検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  本発明の免疫分析装置を構成する各ゾーンの位置を模式的に示す平面図である。
【図２】  本発明の免疫分析装置において、標識遺伝子組換えＴＰ抗原を含むパッドからなる標識試薬ゾーンを付加した際の状態を示す断面図である。
【図３】  本発明の免疫分析装置において、マトリックスに基質ゾーンを設けた際の状態を示す断面図である。
【図４】  本発明の免疫分析装置において、マトリックスに２か所の検出ゾーンを設けた際の状態を示す断面図である。
【図５】  本発明の免疫分析装置において、展開液ゾーンに放射性同位元素、ラテックス、金属コロイド粒子、蛍光粒子又は着色粒子のいずれかで標識された遺伝子組換えＴＰ抗原と検体混合溶液とを供給し測定する際の状態を示す平面図である。
【符号の説明】
１      マトリックス
２      展開液ゾーン
３      検体点着ゾーン
４      標識試薬ゾーン
５      検出ゾーン
６      展開液吸収ゾーン
７      基質ゾーン
８      検出ゾーン
９      標識遺伝子組換えＴＰ抗原と検体との混合溶液
【図１】
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【図２】
0003831759.tif 000007
【図３】
0003831759.tif 000008
【図４】
0003831759.tif 000009
【図５】
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