(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
フコイダン、その分解物、硫酸化単糖又はそれらの塩から選択されるものを有効成分として含有することを特徴とする育毛料。
【請求項２】
フコイダンが下記一般式：
【化１】
0003831252.tif 000029
（式中、ＲはＯＨ又はＯＳＯ３Ｈ、ｎは１以上の整数である。）、
【化２】
0003831252.tif 000030
（式中、ＲはＯＨ又はＯＳＯ３Ｈ、ｎは１以上の整数である。）、
【化３】
0003831252.tif 000031
（式中、ＲはＯＨ又はＯＳＯ３Ｈ、ｎは１以上の整数である。）、
又は、
【化４】
0003831252.tif 000032
（式中、ＲはＯＨ又はＯＳＯ３Ｈ、ｎは１以上の整数である。）、
で表される硫酸化糖を構成糖の必須成分とするフコイダンから選択されるフコイダンである請求項１記載の育毛料。
【請求項３】
フコイダンが非曳糸性フコイダンである請求項１記載の育毛料。
【請求項４】
分解物が下記式：
【化５】
0003831252.tif 000033
（式中、ＲはＯＨ又はＯＳＯ３Ｈである。）、
【化６】
0003831252.tif 000034
（式中、ＲはＯＨ又はＯＳＯ３Ｈである。）、
又は、
【化７】
0003831252.tif 000035
（式中、ＲはＯＨ又はＯＳＯ３Ｈである。）、
で表わされる化合物から選択される化合物である請求項１記載の育毛料。
【請求項５】
さらに育毛作用増強成分を含有してなるものである、請求項１〜４いずれか記載の育毛料。
【請求項６】
育毛作用増強成分が、ミノキシジル及び／又は塩化カルプロニウムである請求項５記載の育毛料。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は酸性糖化合物の化粧料への利用に関する。
背景技術
従来より、しみ、そばかす、しわは皮膚美容上の悩みであり、近年これらを防止する多くの化粧料が知られ、その有効成分としてレチノイン酸、α−ヒドロキシ酸、レチノール等が報告されている。しかしながら、これらの有効成分は皮膚刺激性や安定性等に問題点があり、且つその効果も十分なものとは言い難いものであった。
一方、育毛料は、頭髪の成長を促進又は刺激する製品であり、頭髪の脱毛を育毛により補い、頭髪の絶対数の減少を阻止する目的で使用される。一般に、頭部の脱毛の原因としては、毛根や皮脂腺の器官における男性ホルモンの活性化、毛包への血流量の低下、皮脂の分泌過剰、過酸化物の生成による頭皮の異常、栄養不良、ストレス等多様な因子が考えられる。一般的に従来の育毛料は、これらの頭部の脱毛の原因として考えられる因子を取り除いたり、軽減する作用を有する物質を配合したものである。例えばビタミンＢ、ビタミンＥ等のビタミン類、セリン、メチオニン等のアミノ酸類、センブリエキス、アセチルコリン誘導体等の血管拡張剤、紫根エキス、ヒノキチオール等の抗炎症剤、エストラジオール等の女性ホルモン剤、セファランチン等の皮膚機能亢進剤等が配合されて、脱毛の予防及び治療に用いられている。
しかしながら、前記の様に多くの試みがなされているにもかかわらず、従来の育毛料は、その脱毛予防作用や発毛作用等が弱く、必ずしも十分な育毛効果が得られなかった。
本発明の主たる目的は、皮膚美容（皮膚の老化防止、敏感肌の改善、かゆみ抑制等）に効果があり、且つ育毛料の有効成分ともなりうる物質を見出し、当該有効成分を含有する化粧料を提供することにある。
発明の開示
本発明を概説すれば、本発明はフコイダン、その分解物、硫酸化単糖又はそれらの塩から選択されるものを有効成分として含有することを特徴とする化粧料に関する。また、化粧料の製造のためのフコイダン、その分解物、硫酸化単糖又はそれらの塩から選択されるものの使用に関する。
本発明において使用するフコイダンは、皮膚美容効果（例えば、皮膚の老化防止作用、敏感肌の改善作用、かゆみ抑制作用等による）及び／又は育毛効果（例えば、発毛作用、育毛作用、養毛作用、脱毛防止作用等による）を発現し得るものであれば特に限定はない。フコイダンとしては藻類由来のフコイダン、棘皮動物由来のフコイダンが好適に使用できる。本発明において使用するフコイダンとしては、構造が明確なフコイダンが好適であり、下記一般式（Ｉ）〜（ＩＶ）で表わされる硫酸化糖をそれぞれ構成糖の必須成分とするガゴメコンブ由来のＵ−フコイダン、Ｆ−フコイダン、Ｇ−フコイダン及びオキワナモズク由来のフコイダンから選択されるフコイダンの使用が好ましい。
0003831252.tif 000002
（式中、ＲはＯＨ又はＯＳＯ３Ｈ、ｎは１以上の整数である。）
0003831252.tif 000003
（式中、ＲはＯＨ又はＯＳＯ３Ｈ、ｎは１以上の整数である。）
0003831252.tif 000004
（式中、ＲはＯＨ又はＯＳＯ３Ｈ、ｎは１以上の整数である。）
0003831252.tif 000005
（式中、ＲはＯＨ又はＯＳＯ３Ｈ、ｎは１以上の整数である。）
また、フコイダンとしては、非沈澱形成性、化粧料の基剤への溶解性等の観点から、非曳糸性フコイダンが好ましい。
フコイダンの分解物としては、例えばフコイダンの酸分解物、フコイダンの酵素分解物が使用できる。本発明に使用するフコイダンの酸分解物、フコイダンの酵素分解物としては、皮膚美容作用及び／又は育毛作用を示せば良く、それらの作用を指標に調製することができる。本発明においては下記式（Ｖ）で表される化合物、下記式（ＶＩ）で表される化合物及び下記式（ＶＩＩ）で表わされる化合物から選択される化合物が好適に使用できる。
0003831252.tif 000006
（式中、ＲはＯＨ又はＯＳＯ３Ｈである。）
0003831252.tif 000007
（式中、ＲはＯＨ又はＯＳＯ３Ｈである。）
0003831252.tif 000008
（式中、ＲはＯＨ又はＯＳＯ３Ｈである。）
本発明の化粧料の形状としては、ローション類、乳液類、クリーム類、パック類、軟膏類、浴用剤、浴用洗剤、洗顔剤、毛髪剤、育毛料、又は洗髪剤が例示される。また、医薬品、医薬部外品、食品又は飲料等の形状で提供することができる。
本発明の化粧料は、老化防止用、敏感肌改善用、かゆみ抑制用、アレルギー改善用、アトピー症状改善用化粧料等として使用することができる。
また、本発明の化粧料としては、フコイダン、その分解物、硫酸化単糖又はそれらの塩から選択されるものを有効成分として含有する育毛作用に優れた育毛料、及びさらにフコイダン、その分解物、硫酸化単糖又はそれらの塩から選択されるものと共に用いることにより育毛作用を相乗的に増強し得る成分（育毛作用増強成分）を含有する育毛料が提供される。また、かかる化粧料、育毛料は、食品又は飲料としても提供され得る。なお、好適な育毛作用増強成分としては、ミノキシジル及び塩化カルプロニウムが例示される。
発明を実施するための最良の形態
本発明の化粧料は、特に皮膚美容作用及び／又は育毛作用という生理作用を有するフコイダン、その分解物、硫酸化単糖及びそれらの塩から選択されるものを有効成分として含むことを１つの大きな特徴とする。本明細書において「選択される」とは、１種又は２種以上のものが選ばれることを意味する。
なお、本明細書において「皮膚美容作用」とは、皮膚の老化防止作用、敏感肌改善作用、かゆみ抑制作用等をいい、また、かかる作用により奏される効果を「皮膚美容効果」という。なお、皮膚の老化防止作用とは、肌にしっとり感やなめらかさを与え、かさつき、しみ等を減少させる等の皮膚の老化を抑制する作用を意味する。皮膚美容作用は、例えば、実施例１３−（８）〜（１０）に記載の方法により評価することができる。少なくとも実施例１３−（８）〜（１０）に記載の評価事項について優れた効果を示し得るフコイダン、その分解物、硫酸化単糖及びそれらの塩から選択されるものであれば、所望の皮膚美容効果を発現し得る。
また、「育毛作用」とは、発毛作用、育毛作用、養毛作用、脱毛防止作用等をいい、また、かかる作用により奏される効果を「育毛効果」という。育毛作用は、例えば、実施例１３〜２０に記載の方法により評価することができ、かかる作用を有するフコイダン、その分解物、硫酸化単糖及びそれらの塩から選択されるものは、育毛効果を発現し得る。
本発明において使用するフコイダン及びその分解物は、皮膚美容作用及び／又は育毛作用を有すれば良く、特に限定はないが、例えば藻類由来のフコイダンが使用できる。なお本発明においてフコイダンとはフコース硫酸（硫酸化フコースという場合がある）を構成糖とする多糖の総称であり、すなわち、本発明においてはフコース硫酸含有多糖、及び／又はその分解物を使用することができる。
フコース硫酸含有多糖としては、硫酸化フカン、硫酸化フコガラクタン、硫酸化フコグルクロノマンナン、硫酸化グルクロノキシロフカン、硫酸化キシロフコグルクロナン、硫酸化アスコフィラン、硫酸化グルクロノガラクトフカン、硫酸化グルクロノフカン等が例示される。
これらのフコイダンの調製はそれぞれ公知の方法で調製すれば良く、精製物又は当該フコイダン含有物等を本発明に使用することができる。
例えばガゴメコンブ、マコンブ、トロロコンブ、ヒバマタ、モズク、オキナワモズク、ワカメ、ワカメ  メカブ、クロメ、アラメ、カジメ、ジャイアントケルプ、レッソニア  ニグレセンス、アスコフィラム  ノドッサム等の昆布目、ながまつも目、ひばまた目等の海藻は特に本発明の使用に好適なフコイダンを多く含んでおり、原料として好適である。なお、紅藻由来の硫酸化多糖、例えばマグサ、オゴノリ、おばくさ（Ｐｔｅｒｏｃｌａｄｉｅｌｌａ  ｃａｐｉｌｌａｃｅａ）由来の硫酸化多糖も本発明に使用するフコイダンと同様の効果を有し、本発明に使用することができる。
本発明に使用するフコイダンとしては、前出の藻類由来のフコイダンが例示されるが、硫酸化フコースを構成成分とする多糖で皮膚美容作用及び／又は育毛作用を有するものであれば特に限定はなく、棘皮動物、例えばナマコ、ウニ、ヒトデ等由来のフコイダンを使用してもよい。
例えばガゴメコンブからフコイダンを調製し、該フコイダンを一般式（Ｉ）で表される硫酸化糖の繰返し構造を有するグルクロン酸含有フコイダン（前出Ｕ−フコイダン）と一般式（ＩＩ）で表される硫酸化糖の繰返し構造を有するグルクロン酸非含有フコイダン（前出Ｆ−フコイダン）とを分離することができ、本発明の有効成分としてそれぞれのフコイダンを好適に使用することが出来る。またガゴメコンブから一般式（ＩＩＩ）で表される硫酸化糖の繰返し構造を有する硫酸化フコガラクタン（前出Ｇ−フコイダン）を調製し、好適に使用することができる。
また、オキナワモズクより、一般式（ＩＶ）で表される硫酸化糖の繰返し構造を有するオキナワモズク由来フコイダンを調製し、好適に使用することができる。
Ｕ−フコイダン及びＦ−フコイダンはガゴメコンブから公知の方法に従ってフコイダンを調製後、陰イオン交換樹脂、界面活性剤等を用いて分離される。ガゴメコンブ由来のＵ−フコイダン及びＦ−フコイダンの存在比は重量比で約１：２である。Ｕ−フコイダンはフコース、マンノース、ガラクトース、グルクロン酸等を含み硫酸含量は約２０重量％、Ｆ−フコイダンはフコースを主成分として含み、硫酸含量は約５０重量％であり、分子量は両物質共に約２０万を中心に分布している（第１８回糖質シンポジウム要旨集、第１５９頁、１９９６年）。
例えばガゴメコンブから調製したフコイダン溶液をＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００カラムにアプライ後、ＮａＣｌ含有緩衝液にて濃度勾配法により溶出させることにより、Ｕ−フコイダンとＦ−フコイダンに分離することができる。第１図にその１例を示す。すなわち第１図はＵ−フコイダンとＦ−フコイダンの分離を示す図であり、図中前ピークがＵ−フコイダン、後ピークがＦ−フコイダンである。
また例えばヒバマタ由来フコイダン、モズク由来フコイダン、オキナワモズク由来フコイダン、ワカメ由来フコイダン、ワカメ  メカブ由来フコイダン、マクサ由来硫酸化多糖、オゴノリ由来硫酸化多糖、レッソニア由来フコイダン、アスコフィラム由来フコイダン、おばくさ由来硫酸化多糖、他の藻類由来のフコイダンもそれぞれ公知の方法で調製し、本発明に使用することができる。
本発明において好適に用いられる棘皮動物由来のフコイダンとしては、例えば特開平４−９１０２７号公報に記載のナマコに含有されるフコイダンを挙げることができ、当該公報記載の方法にてナマコより当該フコイダンを調製することができる。
また、本発明の皮膚美容作用及び／又は育毛作用を有するフコイダンの分解物は、酵素学的方法、化学的方法、物理的方法等の公知の方法にて調製し、目的の皮膚美容作用及び／又は育毛作用を有する分解物を選択し、使用することができる。
本発明で使用するフコイダンの分解物の好適な調製方法としては酸分解法及び酵素分解法があり、フコイダンを酸分解又は酵素分解することにより、皮膚美容作用及び／又は育毛作用を有する分解物を調製することができる。
本発明で使用するフコイダンの酸分解条件は、皮膚美容作用及び／又は育毛作用を有する分解物（以下、本発明の分解物と称す）が生成する条件であれば、特に限定はなく、得られる分解物の生理作用について評価することにより、その条件を決定することができる。
例えばフコイダンを酸に溶解またはけん濁し、反応させることにより、本発明の分解物が生成する。また、反応時に加熱することにより、本発明の分解物の生成に必要な時間が短縮される。
フコイダンを溶解またはけん濁する酸の種類は、特に限定するものではないが、塩酸、硫酸、硝酸等の無機酸、クエン酸、ギ酸、酢酸、乳酸、アスコルビン酸等の有機酸、また陽イオン交換樹脂、陽イオン交換繊維、陽イオン交換膜等の固体酸が使用可能である。
酸の濃度も特に限定はないが、好ましくは０．０００１〜５規定、より好ましくは０．０１〜１規定程度の濃度で使用可能である。また、反応温度も特に限定はないが０〜２００℃、好ましくは２０〜１３０℃に設定すれば良い。
また、反応時間も特に限定するものではないが、好ましくは数秒間〜数日間に設定すれば良い。酸の種類と濃度、反応温度及び反応時間は本発明の分解物の生成量、分解物の重合度により適宜選択すれば良い。例えば、フコイダンの分解物の製造に際しては、好ましくはクエン酸、乳酸、リンゴ酸等の有機酸を使用し、酸の濃度は数１０ｍＭ〜数Ｍ、加熱温度は５０〜１１０℃、より好適には７０〜９５℃、加熱時間は数分間〜２４時間の範囲から適宜選択することにより、本発明の分解物を調製することができる。フコイダンの酸分解物としてはガゴメコンブ由来フコイダンの酸分解物が例示され、当該分解物は特に皮膚美容作用及び／又は育毛作用の強い新生理機能を有する食物繊維として使用することができる。
本発明の分解物は皮膚美容作用及び／又は育毛作用を指標として分画することができ、例えば酸分解物をゲルろ過法、分子量分画膜による分画法等により分子量分画することができる。
ゲルろ過法の例としては、セルロファインＧＣＬ−３００を使用し、例えば分子量２５０００超、分子量２５０００〜１００００超、分子量１００００〜５０００超、分子量５０００以下等の任意の分子量画分を調製でき、セルロファインＧＣＬ−２５を用い、例えば分子量５０００以下の画分を分子量５０００〜３０００超、分子量３０００〜２０００超、分子量２０００〜１０００超、分子量１０００〜５００超、分子量５００以下等の任意の分子量画分に調製することができる。
また、限外ろ過膜を用いて工業的に分子量分画を行うことができ、例えばダイセル社製ＦＥ１０−ＦＵＳＯ３８２を用いることにより分子量３００００以下の画分を、同ＦＥ−ＦＵＳ−Ｔ６５３を使用することによって分子量６０００以下の画分を調製することができる。更にナノフィルター膜を用いることにより分子量５００以下の画分を得ることもでき、これらのゲルろ過法、分子量分画法を組み合せることにより、任意の分子量画分を調製することができる。例えばヒバマタ由来フコイダンの分解物は分子量３万以上の画分が強い皮膚美容作用及び／又は育毛作用を示し、本発明においては分子量３万以上のヒバマタ由来フコイダンの使用が好適である。
本発明で使用できる皮膚美容作用及び／又は育毛作用を有するフコイダンの分解物としては、式（Ｖ）で表される化合物、式（ＶＩ）で表される化合物、式（ＶＩＩ）で表される化合物が例示され、これらの化合物は、例えば、国際公開第９９／４１２８８号パンフレット、国際公開第９６／３４００４号パンフレット、国際出願番号ＰＣＴ／ＪＰ００／００９６５号明細書記載の方法で調製することができる。なお、式（Ｖ）で表される化合物を基本骨格とし、その繰返し構造を有するオリゴ糖、また式（ＶＩ）で表される化合物を基本骨格とし、その繰返し構造を有するオリゴ糖もそれぞれ本発明において使用することができる。更に、式（ＶＩＩ）で表される化合物を基本骨格とし、その繰返し構造を有するオリゴ糖もそれぞれ本発明において使用することができる。また、本発明の分解物としては、国際公開第９９／４１２８８号パンフレット、国際公開第９６／３４００４号パンフレット、国際出願番号ＰＣＴ／ＪＰ００／００９６５号明細書記載のフコイダンの分解物も例示される。
式（Ｖ）で表される化合物は前出Ｆ−フコイダンを、アルテロモナス  ｓｐ．ＳＮ−１００９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５７４７）が産生するエンド型硫酸化多糖分解酵素（Ｆ−フコイダン分解酵素）で処理し、その分解物より精製することにより得ることができる。当該化合物中の硫酸基の含量、部位についてはその分解物中より、任意のものを精製することができる。また当該分解物中には式（Ｖ）で表される化合物の多量体も含有されており、目的に応じて分離、精製することができる。
式（ＶＩ）で表される化合物は前出Ｕ−フコイダンを、フラボバクテリウム  ｓｐ．  ＳＡ−００８２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０２）が産生するエンド型硫酸化多糖分解酵素（Ｕ−フコイダン分解酵素）で処理し、その分解物より精製することにより得ることができる。当該化合物中の硫酸基の含量、部位についてはその分解物中より、任意のものを精製することができる。また当該分解物中には式（ＶＩ）で表される化合物を基本骨格とする、その多量体も含有されており、目的に応じて分離、精製することができる。
ガゴメコンブ由来フコイダンをアルテロモナス  ｓｐ．ＳＮ−１００９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５７４７）が産生するＦ−フコイダン分解酵素、及びフラボバクテリウム  ｓｐ．  ＳＡ−００８２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０２）が産生するＵ−フコイダン分解酵素で分解し、分解物を除去することにより、前出Ｇ−フコイダンを精製することができる。
フラボバクテリウム  ｓｐ．  ＳＡ−００８２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０２）はこのＧ−フコイダンを特異的に分解するエンド型硫酸化多糖分解酵素（Ｇ−フコイダン分解酵素）も産生し、当該Ｇ−フコイダン分解酵素をＧ−フコイダンに作用させることにより、当該Ｇ−フコイダンの分解物を調製し、当該分解物中より、目的に応じ分解物を精製することができる。式（ＶＩＩ）で表される化合物はその例である。当該化合物中の硫酸基の含量、部位についてはその分解物中より、任意のものを精製することができる。また当該分解物中には式（ＶＩＩ）で表される化合物を基本骨格とする、その多量体も含有されており、目的に応じて分離、精製することができる。
なお式（Ｖ）で表される化合物の例としては後述の式（ＶＩＩＩ）で表される化合物がある。また式（ＶＩ）で表される化合物の例としては後述の式（Ｘ）で表される化合物がある。更に、式（ＶＩＩ）で表される化合物の例としては後述の式（ＩＸ）で表される化合物がある。
また、前記Ｆ−フコイダン分解酵素、Ｕ−フコイダン分解酵素、Ｇ−フコイダン分解酵素の１単位（Ｕ）は、１分間に１μｍｏｌ相当のＦ−フコイダン、Ｕ−フコイダン、Ｇ−フコイダンのそれぞれのグリコシル結合を切断する酵素量と定義する。
フコイダンの塩、その分解物の塩は、フコイダン又はその分解物より通常の方法で調製することができる。また、フコイダンの分解物は所望により適宜硫酸化して使用することもでき、硫酸化の方法は公知の方法に従えばよい。
皮膚美容作用及び／又は育毛作用を有する本発明で使用するフコイダン、その分解物及びそれらの塩は、その皮膚美容作用（皮膚老化防止作用等）より、ローション類、乳液類、クリーム類、パック類、軟膏類、浴用剤、浴用洗剤、又は洗顔剤等の化粧料の有効成分として有用である。また、その育毛作用により、育毛料としての化粧料、例えば毛髪剤、育毛剤、養毛剤、脱毛防止剤の有効成分として有用であり、本発明により皮膚美容作用及び／又は育毛作用を有するフコイダン、その分解物又はそれらの塩から選択されるものを有効成分とする、皮膚美容作用及び／又は育毛作用に優れた化粧料が提供される。当該化粧料の有効成分としては、例えばＵ−フコイダン、Ｆ−フコイダン、Ｇ−フコイダン、オキナワモズク由来フコイダン及びそれらの分解物から選択されるものが好適であり、これらの物質を有効成分とするバイオ化粧料が提供できる。ここでフコイダンの分解物としては、例えば式（Ｖ）〜（ＶＩＩ）で表される化合物から選択される化合物を好適に使用することができる。
フコイダンは硫酸化フコースを含有する多糖であるが、本発明者らは硫酸化単糖にも皮膚美容作用及び／又は育毛作用があることを見出した。すなわち、本発明者らは硫酸化単糖又はそれらの塩を有効成分として含有する化粧料も提供する。
当該化粧料に使用される硫酸化単糖又はその塩は皮膚美容作用及び／又は育毛作用を有する硫酸化単糖又はその塩であれば良く、特に限定はされないが、硫酸化フコース、硫酸化グルコース、硫酸化ガラクトース、硫酸化キシロース、硫酸化２−デオキシ−グルコース、硫酸化マンノース、硫酸化タロース及びこれらの塩が例示される。
これらの硫酸化単糖は公知の合成法で合成しても良く、また天然物中より硫酸化多糖を分解し、当該分解物中より精製して調製しても良い。また常法によりその塩を調製することが出来る。
本発明の化粧料における、フコイダン、その分解物、硫酸化単糖又はそれらの塩から選択されるものの含有量は、通常、好ましくは０．０００１〜２０重量％、より好ましくは０．００１〜５重量％、更に好ましくは０．０３〜３重量％である。
本発明の化粧料は常法に従って製造することができ、通常、化粧料に使用される炭化水素類、ろう類、油脂類、エステル類、高級脂肪酸類、高級アルコール類、界面活性剤類、香料、色素、防腐剤、抗酸化剤、紫外線吸収剤、アルコール類、ｐＨ調整剤、各種薬効成分等を適宜選択して配合できる。なお、本発明の化粧料の有効成分であるフコイダン、その分解物、硫酸化単糖又はそれらの塩から選択されるもの以外の皮膚美容作用を有する成分や、育毛作用を有する発毛成分、育毛成分、養毛成分、脱毛防止成分等を所望により加えても良い。例えば、かかる皮膚美容作用を有する成分としては、レチノイン酸、α−ヒドロキシ酸、レチノール、グリセリン、ポリエチレングリコール、苛性カリ、トリエタノールアミン、その他糖類等が、かかる育毛作用を有する成分としては、ミノキシジル、塩化カルプロニウム、ヘパリン類似物質、グリセリルモノリレート、リノール酸、各種生薬エキス等が挙げられる。
本発明の化粧料に含有されるフコイダンとしては、非曳糸性のフコイダンが、非沈澱形成性、化粧料の基材への溶解性等において、曳糸性のフコイダンより優れており、非曳糸性のフコイダンが好適である。
化粧料の形態は皮膚美容作用を期待しうるものであれば特に限定はなく、ローション類、乳液類、クリーム類、パック類、軟膏類、浴用剤、浴用洗剤、洗顔剤、洗髪剤等が挙げられる
また、育毛料としての化粧料の形態は、毛髪への作用を期待しうるものであれば特に限定はなく、例えばローション類、乳液類、クリーム類、軟膏類、毛髪剤、育毛剤、養毛剤、脱毛防止剤、又は洗髪剤が挙げられる。
本発明の化粧料の一態様としての育毛料は、育毛を要する部位に塗布或いは張り付けて用いても良い。また本発明の育毛料は飲食が可能な形状にして経口的に摂取しても良い。
本発明の化粧料の使用態様は特に限定されるものではないが、例えば、前記育毛料の使用態様としては、例えば１ｍＬ中にフコイダン、その分解物、硫酸化単糖及び／又はそれらの塩が０．１ｎｇ〜１００ｍｇ含まれる該育毛料の数ｍＬを少なくとも１日１回、育毛を要する部位に、塗布、或いは同量を含むパック類等を張り付ければよい。
なお、皮膚美容作用を期待する観点から、本発明の化粧料を用いる場合も、前記育毛料と同様の使用態様で用いることにより所望の効果を得ることができる。
経口摂取される量としてはフコイダン、その分解物、硫酸化単糖及び／又はそれらの塩が皮膚美容作用及び／又は育毛作用を示す量が摂取できればよく、特に限定は無いが、通常、一日当たり好ましくは０．１ｍｇ〜１０ｇ、より好ましくは２ｍｇ〜５ｇ、さらに好ましくは１０ｍｇ〜２ｇである。
ところで、従来、ヒトの頭髪の成長を促進又は維持させることに使用される育毛料には種々の技術が提案され、また実際に使用されている。
従来の育毛料の有効成分としてはミノキシジル（特開平９−１６９６２２号公報）、塩化カルプロニウム（特開平９−１７５９５０号公報）等が知られている。
本発明者らは、フコイダン、その分解物、硫酸化単糖及びそれらの塩から選択されるものと共に従来の育毛料の有効成分を用いることにより育毛作用が相乗的に増強されることを見出した。
すなわち、本発明によりフコイダン、その分解物、硫酸化単糖及びそれらの塩から選択されるもの、及び育毛作用増強成分、例えば、従来の育毛料の有効成分を含有する育毛料が提供される。
前記育毛作用増強成分としては、フコイダン、その分解物、硫酸化単糖及びそれらの塩から選択されるものと共に用いることにより育毛作用を相乗的に増強し得るものであれば良く、本発明に開示の方法（例えば、実施例１９に記載の方法）に従って適宜選択することができる。かかる育毛作用増強成分として、本発明において好適に使用され得る従来の育毛料の有効成分としてはミノキシジル及び塩化カルプロニウムが例示される。なお、これらは単独で、又は混合して使用することができる。
フコイダン、その分解物、硫酸化単糖及びそれらの塩から選択されるもの、及び育毛作用増強成分を含有する育毛料における、フコイダン、その分解物、硫酸化単糖及びそれらの塩から選択されるもの、及び育毛作用増強成分の含有量は、それらによる相乗効果が発揮され得る量であれば良く、特に限定はないが、フコイダン、その分解物、硫酸化単糖及びそれらの塩から選択されるものとしては該育毛料中、好ましくは０．０１〜３０重量％、より好ましくは０．１〜１０重量％である。また、育毛作用増強成分の含有量としては、ミノキシジルの場合、該育毛料中、好ましくは０．１〜５重量％、より好ましくは０．５〜２重量％である。一方、塩化カルプロニウムの場合、該育毛料中、好ましくは０．１〜１０重量％、より好ましくは０．５〜５重量％である。本発明に使用する前記有効成分及び育毛作用増強成分が、それぞれかかる含有量範囲内で含有された育毛料は、育毛作用に非常に優れ好ましい。
また、本発明の育毛料にはミノキシジル及び／又は塩化カルプロニウムの効果を増強できるものを更に含有させても良い。例えば、かかる効果を有するものとして、エピネフリン、テトラヒドロゾリン、塩酸ナファゾリン等の局所滞留化剤、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール等の極性溶媒、シコン、ドッカツ、マオウ、カシュウ、チクセツニンジン等の生薬エキス、パンテノールエチルエーテル、水溶性キチン誘導体等を挙げることができる。
さらに、本発明の一態様として、食品又は飲料として使用され得る化粧料を提供する。かかる化粧料は、皮膚美容作用及び／又は育毛作用を有するフコイダン、その分解物、硫酸化単糖又はそれらの塩を含有、添加及び／又は希釈してなり、その皮膚美容作用及び／又は育毛作用により、例えば、皮膚美容用食品又は飲料、脱毛防止用食品又は飲料、又は育毛用食品又は飲料として極めて有用である。
本発明の皮膚美容用食品又は飲料、育毛用食品又は飲料等の製造方法は、特に限定はないが、調理、加工及び一般に用いられている公知の食品又は飲料の製造方法による製造を挙げることができ、製造された食品又は飲料に皮膚美容作用及び／又は育毛作用を有する、本発明で使用するフコイダン、その分解物、硫酸化単糖、及びそれらの塩から選択されるものが有効成分として含有、添加及び／又は希釈されていれば良い。
なお、本態様において、「含有」とは、食品又は飲料中に本発明で使用される有効成分が含まれる態様を、「添加」とは、食品又は飲料の原料に本発明で使用される有効成分を添加する態様を、「希釈」とは、本発明で使用される有効成分に食品又は飲料の原料を添加する態様をいう。
本発明の皮膚美容用食品又は飲料、又は育毛用食品又は飲料等の形状としては、特に限定はないが、例えば穀物加工品（小麦粉加工品、デンプン類加工品、プレミックス加工品、麺類、マカロニ類、パン類、あん類、そば類、麩、ビーフン、はるさめ、包装餅等）、油脂加工品（可塑性油脂、てんぷら油、サラダ油、マヨネーズ類、ドレッシング等）、大豆加工品（豆腐類，味噌、納豆等）、食肉加工品（ハム、ベーコン、プレスハム、ソーセージ等）、水産製品（冷凍すりみ、かまぼこ、ちくわ、はんぺん、さつま揚げ、つみれ、すじ、魚肉ハム、ソーセージ、かつお節、魚卵加工品、水産缶詰、つくだ煮等）、乳製品（原料乳、クリーム、ヨーグルト、バター、チーズ、練乳、粉乳、アイスクリーム等）、野菜・果実加工品（ペースト類、ジャム類、漬け物類、果実飲料、野菜飲料、ミックス飲料等）、菓子類（チョコレート、ビスケット類、菓子パン類、ケーキ、餅菓子、米菓類等）、アルコール飲料（日本酒、中国酒、ワイン、ウイスキー、焼酎、ウオッカ、ブランデー、ジン、ラム酒、ビール、清涼アルコール飲料、果実酒、リキュール等）、嗜好飲料（緑茶、紅茶、ウーロン茶、コーヒー、清涼飲料、乳酸飲料等）、調味料（しょうゆ、ソース、酢、みりん等）、缶詰・瓶詰め・袋詰め食品（牛飯、釜飯、赤飯、カレー、その他の各種調理済み食品）、半乾燥又は濃縮食品（レバーペースト、その他のスプレッド、そば・うどんの汁、濃縮スープ類）、乾燥食品（即席麺類、即席カレー、インスタントコーヒー、粉末ジュース、粉末スープ、即席味噌汁、調理済み食品、調理済み飲料、調理済みスープ等）、冷凍食品（すき焼き、茶碗蒸し、うなぎかば焼き、ハンバーグステーキ、シュウマイ、餃子、各種スティック、フルーツカクテル等）、固形食品、液体食品（スープ等）、香辛料類等の農産・林産加工品、畜産加工品、水産加工品等が挙げられる。
本発明の食品又は飲料としては、皮膚美容作用及び／又は育毛作用を有するフコイダン、その分解物、硫酸化単糖、及びそれらの塩から選択されるものが含有、添加及び／又は希釈されており、その生理機能を発現するための必要量が含有されていれば特にその形状に限定はなく、タブレット状、顆粒状、カプセル状等の形状の経口的に摂取可能な形状物も包含する。なお、皮膚美容作用及び／又は育毛作用を有する藻類由来のフコイダン及びその分解物は、当該生理作用と食物繊維機能とを合わせ持つ健康食品素材として、食品又は飲料の製造素材として極めて有用である。
本発明の皮膚美容用食品、育毛用食品等における、フコイダン、その分解物、硫酸化単糖又はそれらの塩から選択されるものの含有量は、皮膚美容作用及び／又は育毛作用を示す量が含有されておれば良く限定はないが、好ましくは０．００１〜１００重量％、より好ましくは０．０１〜１０重量％、さらに好ましくは０．０５〜５重量％である。当該皮膚美容用食品、育毛用食品等として、フコイダン、その分解物、硫酸化単糖又はそれらの塩から選択されるものをそのまま粉末として、また錠剤として摂取しても良い。
また、皮膚美容用飲料、育毛用飲料等における、フコイダン、その分解物、硫酸化単糖又はそれらの塩から選択されるものの含有量は、皮膚美容作用及び／又は育毛作用を示す量が含有されていれば良く限定はないが、好ましくは０．０００１〜１０重量％、より好ましくは０．００５〜５重量％、さらに好ましくは０．０２〜２重量％である。
皮膚美容用食品又は飲料、育毛用食品又は飲料等の使用態様は特に限定されるものではないが、皮膚美容効果及び／又は育毛効果を有効に得る観点から、一日当たり、本発明に使用する前記有効成分が好ましくは０．１ｍｇ〜１０ｇ、より好ましくは２ｍｇ〜５ｇ、さらに好ましくは１０ｍｇ〜２ｇ摂取できるように摂取するのが望ましい。
本発明に使用するフコイダン、その分解物、硫酸化単糖、及びそれらの塩はラットへの経口投与において１ｇ／ｋｇを経口単回投与しても死亡例は認められない。
また、ハーレー系モルモットの背部を剃毛し、フコイダン、その分解物、硫酸化単糖、及びそれらの塩の３％溶液を１日１回、０．０５ｍＬずつ５日間連日塗布投与し、投与開始後６日目にパッチテスト基準（日本皮膚科学会）に基づいて判定したが、無反応であり、フコイダン、その分解物、硫酸化単糖、及びそれらの塩の皮膚刺激性は認められない。
本発明により提供される化粧料は皮膚美容用及び／又は育毛用化粧料として極めて有用である。
実施例
以下、実施例を挙げて、本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらの記載に何ら限定されるものではない。なお、特に記載のない限り実施例における％は重量％を意味する。
実施例１
（１）ガゴメ昆布を充分乾燥後、乾燥物２０ｋｇを自由粉砕機（奈良機械製作所製）により粉砕し、ガゴメ昆布粉砕物を得た。
水道水９００リットルに塩化カルシウム二水和物（日本曹達社製）７．３ｋｇを溶解し、次にガゴメ昆布粉砕物２０ｋｇを混合した。液温１２℃から液温９０℃となるまで水蒸気吹込みにより４０分間昇温させ、次いで攪拌下９０〜９５℃に１時間保温し、次いで冷却し、冷却物１１００リットルを得た。
次いで固液分離装置（ウエストファリアセパレーター社製ＣＮＡ型）を用い、冷却物の固液分離を行い、約９００リットルの固液分離上清液を調製した。
固液分離上清液３６０リットルをダイセル社製ＦＥ１０−ＦＣ−ＦＵＳ０３８２（分画分子量３万）を用い、２０リットルまで濃縮した。次いで水道水を２０リットル加え、また２０リットルまで濃縮するという操作を５回行い、脱塩処理を行い、ガゴメ昆布由来の抽出液２５リットルを調製した。
該溶液１リットルを凍結乾燥し、非曳糸性のガゴメ昆布由来フコイダンの乾燥物１３ｇを得た。
上記方法に準じ、マ昆布乾燥粉砕物から非曳糸性のマ昆布由来フコイダンの乾燥物を調製した。また同様に、レッソニア  ニグレセンス（Ｌｅｓｓｏｎｉａ  ｎｉｇｒｅｓｃｅｎｓ）の乾燥粉末（商品名シーウィード  パウダー：アンデス貿易株式会社販売）から非曳糸性のレッソニア  ニグレセンス由来のフコイダン乾燥物を調製した。
（２）実施例１−（１）記載のガゴメ昆布由来フコイダン乾燥物７ｇを、５０ｍＭの塩化ナトリウムと１０％のエタノールを含む２０ｍＭのイミダゾール緩衝液（ｐＨ８．０）７００ｍＬに溶解し、遠心分離により不溶物を除去した。ＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００カラム（φ１１．４ｃｍ×４８ｃｍ）を同緩衝液にて平衡化し、遠心分離上清をアプライ後、同緩衝液で洗い、塩化ナトリウムの５０ｍＭから１．９５Ｍの濃度勾配により溶出させた（１フラクション：２５０ｍＬ）。フェノール硫酸法及びカルバゾール硫酸法にて、総糖量及びウロン酸含量を求め、溶出順にフラクション４３〜４９、フラクション５０〜５５、フラクション５６〜６７の画分を得た。次に、これらの画分を電気透析により脱塩後凍結乾燥し、フラクション４３〜４９よりＩ画分（３４０ｍｇ）、フラクション５０〜５５よりＩＩ画分（８７０ｍｇ）、フラクション５６〜６７よりＩＩＩ画分（２．６４ｇ）をそれぞれ調製した。
第１図にガゴメ昆布由来フコイダンのＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００カラム溶出パターンを示す。第１図において、縦軸はカルバゾール硫酸法での５３０ｎｍの吸光度（図中黒丸）、フェノール硫酸法での４８０ｎｍの吸光度（図中白丸）、及び電導度（ｍＳ／ｃｍ：図中白四角）、横軸はフラクション番号を示す。
実施例２
（１）アルテロモナス  ｓｐ．  ＳＮ−１００９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５７４７）を、グルコース  ０．２５％、ペプトン  １．０％、酵母エキス  ０．０５％を含有させた人工海水（ジャマリンラボラトリー社製）ｐＨ８．２からなる培地６００ｍＬを分注して殺菌した（１２０℃、２０分間）２リットルの三角フラスコに接種し、２５℃で２６時間培養して種培養液とした。ペプトン  １．０％、酵母エキス  ０．０２％、下記実施例２−（２）に記載の硫酸化多糖  ０．２％、及び消泡剤（信越化学工業社製ＫＭ７０）０．０１％を含有させた人工海水ｐＨ８．０からなる培地２０リットルを３０リットル容のジャーファメンターに入れて１２０℃、２０分間殺菌した。冷却後、上記の種培養液６００ｍＬを接種し、２４℃で２４時間、毎分１０リットルの通気量と毎分２５０回転の攪拌速度の条件で培養した。培養終了後、培養液を遠心分離して菌体及び培養上清を得た。得られた培養上清を、排除分子量１万のホロファイバーを装着させた限外ろ過機により濃縮後、８５％飽和硫安塩析し、生じた沈殿を遠心分離により集め、１０分の１濃度の人工海水を含む２０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．２）に対して充分透析し、６００ｍＬのＦ−フコイダンに選択的に作用するＦ−フコイダン分解酵素液を調製した。
（２）乾燥したガゴメ昆布２ｋｇを直径１ｍｍのスクリーンを装着させたカッターミル（増幸産業社製）により粉砕し、得られた昆布のチップを２０リットルの８０％エタノール中に懸濁し、２５℃で３時間攪拌し、ろ紙でろ過後、残渣を充分洗浄した。得られた残渣を、９５℃に加温した４０リットルの５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．５に懸濁し、時々攪拌しながら９５℃で２時間処理し、硫酸化多糖を抽出した。
抽出液中の懸濁物を、ろ過し、ろ液を調製した後、ろ過残渣を３．５リットルの１００ｍＭ塩化ナトリウムにより洗浄し、更にろ液を得た。
両ろ液を合わせた後、３０℃まで温度を下げ、３０００Ｕのアルギン酸リアーゼ（ナガセ生化学工業社製）を添加後、エタノールを４リットル加え２５℃で２４時間攪拌した。次に遠心分離を行い、得られた上清を排除分子量１０万のホロファイバーを備えた限外ろ過機により４リットルに濃縮し、更に、１０％のエタノールを含む１００ｍＭの塩化ナトリウムにより、着色性物質がろ過されなくなるまで限外ろ過を続けた。
非ろ過液中に生じた沈殿は遠心分離により除去し、この上清を５℃まで温度を下げ、０．５Ｎ塩酸によりｐＨを２．０とした後、生じたタンパク質等の沈殿を遠心分離により除去し、得られた上清を速やかに１Ｎ水酸化ナトリウムによりｐＨを８．０とした。
次に、排除分子量１０万のホロファイバーを装着させた限外ろ過機により限外ろ過を行い、２０ｍＭ塩化ナトリウムｐＨ８．０により完全に溶媒置換後、再度ｐＨを８．０として遠心分離後、凍結乾燥を行い、約９５ｇの硫酸化多糖を調製した。
（３）乾燥したガゴメ昆布２ｋｇを直径１ｍｍのスクリーンを装着させたカッターミルにより粉砕し、得られた昆布のチップを２０リットルの８０％エタノール中に懸濁し、２５℃で３時間攪拌し、ろ紙でろ過後、残渣を充分洗浄した。得られた残渣を、３０ｍＬの上記実施例２−（１）で調製したＦ−フコイダン分解酵素、１０％のエタノール、１００ｍＭの塩化ナトリウム、５０ｍＭの塩化カルシウム、及び５０ｍＭのイミダゾールを含む２０リットルの緩衝液（ｐＨ８．２）に懸濁し、２５℃で４８時間攪拌した。この懸濁液を網目の直径３２μｍのステンレス金網でろ過し、残渣を５０ｍＭの塩化カルシウムを含む１０％のエタノールで洗浄した。更にその残渣を１０リットルの５０ｍＭ塩化カルシウムを含む１０％のエタノール中に懸濁し、３時間攪拌後、ステンレス金網でろ過、洗浄した。更にその残渣を同条件で懸濁後、１６時間攪拌し、直径３２μｍのステンレス金網でろ過、洗浄した。
こうして得られたろ液及び洗浄液を集め、排除分子量３０００のホロファイバーを装着させた限外ろ過機により限外ろ過し、ろ過液と非ろ過液に分離した。
このろ過液をロータリーエバポレーターで約３リットルに濃縮後、遠心分離して上清を得た。得られた上清を排除分子量３００の膜を装着させた電気透析器により脱塩し、この溶液に０．１Ｍとなるように酢酸カルシウムを添加し、生じた沈殿を遠心分離により除去した。この上清をあらかじめ５０ｍＭの酢酸カルシウムにより平衡化させたＤＥＡＥ−セルロファイン（樹脂量４リットル）にかけ、５０ｍＭの酢酸カルシウム及び５０ｍＭの塩化ナトリウムで充分洗浄後、５０ｍＭ〜８００ｍＭの塩化ナトリウムのグラジエントにより溶出させた。この時の分取量は１本当り５００ｍＬで行った。分取した画分をセルロースアセテート膜電気泳動法［アナリティカル  バイオケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第３７巻、第１９７〜２０２頁（１９７０）］により分析したところ塩化ナトリウム濃度が約０．４Ｍで溶出される硫酸化糖（フラクションナンバー６３付近）が均一であった。
そこで、まずフラクションナンバー６３の液を１５０ｍＬに濃縮後、濃度が４Ｍとなるように塩化ナトリウムを添加し、あらかじめ４Ｍの塩化ナトリウムにより平衡化したＰｈｅｎｙ１−セルロファイン（樹脂量２００ｍＬ）にかけ、４Ｍの塩化ナトリウムにより充分洗浄した。非吸着性の硫酸化糖画分を集め、排除分子量３００の膜を装着させた電気透析器により脱塩し、脱塩液５０５ｍＬを得た。
得られた脱塩液のうち４０ｍＬを１０％のエタノールを含む０．２Ｍの塩化ナトリウムによって平衡化させたセルロファインＧＣＬ−９０のカラム（４．１ｃｍ×８７ｃｍ）にかけて、ゲルろ過を行った。分取は１フラクション当り９．２ｍＬで行った。
全フラクションに対して総糖量の分析をフェノール硫酸法〔アナリティカル  ケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第２８巻、第３５０頁（１９５６）〕により行った。
この結果、硫酸化糖は１つのピークを形成したので、そのピークの中央部分、フラクションナンバー６３〜７０を集め、排除分子量３００の膜を装着させた電気透析器により脱塩後、凍結乾燥し、１１２ｍｇの下記式（ＶＩＩＩ）で表される化合物の乾燥品を得た。以下、該化合物を７−１２ＳＦｄ−Ｆと称す。
0003831252.tif 000009
（４）実施例１−（２）で調製したＩＩＩ画分（Ｆ−フコイダン）の２．５％水溶液８０ｍＬに１Ｍ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．６）を１６ｍＬ、１Ｍ  ＣａＣｌ２水溶液を１６ｍＬ、４Ｍ  ＮａＣｌ水溶液を２４ｍＬ、実施例２−（１）で得たＦ−フコイダン分解酵素液を８ｍＬ、蒸留水を１７６ｍＬ添加し、３０℃で３時間加熱した。この酵素処理Ｆ−フコイダン溶液を酵素処理Ｆ−フコイダンの最終濃度が２％になるようにロータリーエバポレーターで濃縮し、その後蒸留水中で透析操作を行い、２％酵素処理Ｆ−フコイダン水溶液を調製した。この試料をＨＰＬＣ（カラム：ＳＢ８０２．５、カラム温度：３５℃、移動相：５０ｍＭ  ＮａＣｌ、流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ、検出：ＲＩ  ＡＴＴ＝８）で分析した。その結果、試料中の約４０％が式（ＶＩＩＩ）記載の７−１２ＳＦｄ−Ｆであることが明らかになった。
実施例３
（１）乾燥ガゴメ昆布２ｋｇを穴径１ｍｍのスクリーンを装着したカッターミル（増幸産業社製）により破砕し、２０リットルの８０％エタノール中で２５℃、３時間攪拌後ろ過、洗浄した。得られた残渣を５０ｍＭの塩化カルシウム、１００ｍＭの塩化ナトリウム、１０％のエタノール、及び参考例２−（１）で調製したアルテロモナス  ｓｐ．  ＳＮ−１００９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５７４７）Ｆ−フコイダン分解酵素を１Ｕ含む２０リットルの３０ｍＭイミダゾール緩衝液（ｐＨ８．２）に懸濁し、２５℃で２日間攪拌し、次いで穴径３２μｍのステンレス金網でろ過し、洗浄した。得られた残渣を１００ｍＭの塩化ナトリウム、１０％のエタノール、及び４ｇのアルギン酸リアーゼ（ナガセ生化学工業製）を含む４０リットルのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．６）に懸濁し、２５℃、４日間攪拌後、遠心分離し上清を得た。得られた上清中に含まれるアルギン酸の低分子化物を除去するため排除分子量１０万のホロファイバーを装着した限外ろ過機により２リットルに濃縮後、１０％のエタノールを含む１００ｍＭの塩化ナトリウムで溶液交換した。この溶液に等量の４００ｍＭ酢酸カルシウムを添加攪拌後、遠心分離し、得られた上清を氷冷しながら、１Ｎの塩酸でｐＨ２とした。生じた沈殿を遠心分離により除去し、得られた上清を１Ｎの水酸化ナトリウムによりｐＨ８．０とした。この溶液を限外ろ過により１リットルに濃縮後、１００ｍＭの塩化ナトリウムで溶液交換した。この時生じた沈殿は遠心分離により除去した。得られた上清中の疎水性物質を除去するため、上清に１Ｍとなるように塩化ナトリウムを加えて、１Ｍの塩化ナトリウムで平衡化した３リットルのフェニルセルロファインカラム（生化学工業製）にかけ、素通り画分を集めた。この画分を限外ろ過機により濃縮後、２０ｍＭの塩化ナトリウムで溶液交換し、凍結乾燥した。凍結乾燥物の重量は２９．３ｇであった。
（２）上記の凍結乾燥物１５ｇを、国際公開第９７／２６８９６号パンフレット記載の、フラボバクテリウム  ｓｐ．ＳＡ−００８２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０２）を培養し、該培養物から得られたエンド型硫酸化多糖分解酵素（Ｕ−フコイダン分解酵素）を９Ｕ、及び４００ｍＭの塩化ナトリウムを含む１．５リットルの５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液に溶解し、２５℃で６日間反応後、エバポレーターで約３００ｍＬに濃縮した。濃縮液を排除分子量３５００の透析チューブに入れて徹底的に透析し、透析チューブ内に残った液を、５０ｍＭの塩化ナトリウムで平衡化した４リットルのＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００にかけ、５０ｍＭ塩化ナトリウムで充分洗浄後、５０〜６５０ｍＭの塩化ナトリウムの濃度勾配による溶出を行った。更に同カラムを６５０ｍＭの塩化ナトリウムで充分溶出させた。溶出画分のうち６５０ｍＭの塩化ナトリウムで溶出した画分を硫酸化フコガラクタン画分として集め、排除分子量１０万の限外ろ過機により濃縮後、１０ｍＭの塩化ナトリウムで溶液を置換し、凍結乾燥して非曳糸性の硫酸化フコガラクタンの凍結乾燥物０．８５ｇを得た。得られた硫酸化フコガラクタン（Ｇ−フコイダン）は、構成糖としてガラクトースとフコースを含有し、そのモル比は、約２：１であった。
（３）Ｇ−フコイダン分解酵素の生産のため、フラボバクテリウム  ｓｐ．  ＳＡ−００８２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０２）を、グルコース０．１％、ペプトン１．０％、酵母エキス０．０５％を含む人工海水（ジャマリンラボラトリー製）ｐＨ７．５からなる培地６００ｍＬを１２０℃、２０分間殺菌した後、該培地に接種し、２４℃で２３時間培養して種培養液とした。実施例３−（１）の方法で調製したガゴメ昆布由来のフコイダン画分０．２％、ペプトン２．０％、酵母エキス０．０１％、及び消泡剤（ＫＭ７０、信越化学工業製）０．０１％を含む人工海水（ｐＨ７．５）からなる培地２０リットルを３０リットル容のジャーファーメンターにいれ１２０℃で２０分間殺菌した。冷却後、上記の種培養液６００ｍＬを接種し、２４℃で２３時間、毎分１０リットルの通気量と毎分１２５回転の攪拌速度の条件で培養した。培養終了後、培養液を遠心分離して菌体を得た。
得られた菌体を、１２００ｍＬの０．４Ｍ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁し、超音波破砕後、遠心分離して菌体抽出液を得た。得られた菌体抽出液を同じ緩衝液で充分透析し、遠心分離して上清を得た。得られた上清に終濃度が９０％飽和となるように硫安を添加し生じた沈殿を遠心分離して集めた。得られた沈殿を１５０ｍＬの５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解させ、同じ緩衝液で充分透析し、遠心分離した。得られた上清を同じ緩衝液で平衡化した５００ｍＬのＤＥＡＥ−セファロースＦＦ（アマシャムファルマシア社製）のカラムにかけ、同じ緩衝液で洗浄後、５０ｍＭから６００ｍＭの塩化ナトリウムの濃度勾配により溶出させ、活性画分を集めた。
得られた活性画分を０．１Ｍ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で充分透析し、同じ緩衝液で平衡化した１００ｍＬのＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００（チッソ社製）のカラムにかけ、同じ緩衝液で洗浄後、０．１Ｍから０．４Ｍの塩化ナトリウムの濃度勾配により溶出させ、活性画分を集めた。得られた活性画分に４Ｍとなるように塩化ナトリウムを添加し、４Ｍの塩化ナトリウムを含む１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化した２０ｍＬのＰｈｅｎｙ１−セルロファイン（チッソ社製）のカラムにかけ、同じ緩衝液で洗浄後、４Ｍから１Ｍの塩化ナトリウムの濃度勾配により溶出後、さらに１Ｍの塩化ナトリウムを含む１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で充分溶出させ、活性画分を集めた。得られた活性画分に３Ｍとなるように塩化ナトリウムを添加し、３Ｍの塩化ナトリウムを含む１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化した１０ｍＬのＰｈｅｎｙ１−セルロファイン（チッソ社製）のカラムにかけ、同じ緩衝液で洗浄後、３Ｍから０．５Ｍの塩化ナトリウムの濃度勾配により溶出後、さらに０．５Ｍの塩化ナトリウムを含む１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で充分溶出させ、活性画分を集めた。このようにして得られた精製酵素をＧ−フコイダン分解酵素として用いた。
（４）実施例３−（２）記載のＧ−フコイダンに上記の精製Ｇ−フコイダン分解酵素を作用させ低分子化物を調製した。すなわち、１．９４ｇのＧ−フコイダンを０．２Ｍの塩化ナトリウムを含む２５ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解後、１８６ｍＵのＧ−フコイダン分解酵素を加え、２５℃で、６日間反応させた。反応液をエバポレーターにより８０ｍＬに濃縮し、セルロファインＧＣＬ−１０００（チッソ社製）のカラム（４×９０ｃｍ）による分子量分画を行った。分子量１５，０００以下の画分を集め、Ｇ−フコイダン酵素消化物画分とした。
（５）上記Ｇ−フコイダン酵素消化物画分をエバポレーターで５００ｍＬに濃縮後、電気透析装置により脱塩し、あらかじめ１０ｍＭの塩化ナトリウムを含む１０ｍＭのイミダゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ８）で平衡化した１リットルのＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００（チッソ社製）のカラムにかけ、同緩衝液で洗浄後、１０ｍＭから９００ｍＭの塩化ナトリウムのグラジエントにより溶出させた。溶出画分は６１ｍＬずつ分取し、それぞれの糖含量をフェノール−硫酸法により測定した。２７０ｍＭ付近の塩化ナトリウムで溶出される画分が糖含量のピークを形成していたので、それを集め２７０ｍＭ溶出画分（ロ）とした。
また上記の２７０ｍＭ溶出画分（ロ）に関しては、１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む１０ｍＭのイミダゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ８）と同じ電導度になるように水を添加し、あらかじめ１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む１０ｍＭのイミダゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ８）で平衡化した２００ｍＬのＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００（チッソ社製）のカラムにかけ、同緩衝液で洗浄後、１５０ｍＭから３００ｍＭの塩化ナトリウムのグラジエントにより溶出させた。溶出画分は１２ｍＬずつ分取し、それぞれの糖含量をフェノール−硫酸法により測定した。１６０ｍＭから１８０ｍＭ付近の塩化ナトリウムで溶出される画分を集め、スピードバック（サバントインストルメンツ社製；ＳＡＶＡＮＴ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｃ．）で２ｍＬに濃縮後、あらかじめ１０％のエタノールで平衡化した２００ｍＬのセルロファインＧＣＬ−２５（チッソ社製）のカラムにかけ、同溶液で溶出させた。溶出画分は２ｍＬずつ分取し、それぞれの糖含量をフェノール−硫酸法により測定した。糖含量がピークを形成している画分を集め、（Ｄ）とした。
上記画分（Ｄ）について電気透析装置により脱塩後、凍結乾燥し、糖組成及び分子量を分析した。また、定法により重水で置換後ＮＭＲ分析による構造解析を行った。
（Ｄ）の物性
分子量；１３５８
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）
δ；５．１９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．３Ｈｚ，Ｆ１−１−Ｈ），４．９３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．７Ｈｚ，Ｆ２−１−Ｈ），４．６２（１Ｈ，ＨＯＤと重複，Ｇ１−１−Ｈ），４．５９（１Ｈ，ＨＯＤと重複，Ｇ２−１−Ｈ），４．５４（１Ｈ，ｄ−ｄ，Ｊ＝１０．６，２．７Ｈｚ，Ｆ１−３−Ｈ），４．４６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，Ｇ３−１−Ｈ），４．４６（１Ｈ，ｍ，Ｆ２−３−Ｈ），４．４１（１Ｈ，ｂｒ−ｓ，Ｇ２−４−Ｈ），４．４１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，Ｇ４−１−Ｈ），４．３７（１Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，Ｆ２−５−Ｈ），４．２７（１Ｈ，ｍ，Ｇ２−３−Ｈ），４．２４（１Ｈ，ｂｒ−ｓ，Ｇ３−４−Ｈ），４．２１（１Ｈ，ｍ，Ｇ３−３−Ｈ），４．１９（１Ｈ，ｍ，Ｇ４−３−Ｈ），４．１５（１Ｈ，ｂｒ−ｓ，Ｇ４−４−Ｈ），４．１３（１Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，Ｆ１−５−Ｈ），４．０９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．７Ｈｚ，Ｆ１−４−Ｈ），４．０４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．８Ｈｚ，Ｆ２−４−Ｈ），３．９８（１Ｈ，ｍ，Ｇ２−６−Ｈ）、３．９６（１Ｈ，ｄ−ｄ，Ｊ＝１０．６，４．３Ｈｚ，Ｆ１−２−Ｈ），３．９３（１Ｈ，ｍ，Ｇ３−６−Ｈ），３．８８（１Ｈ，ｂｒ−ｓ，Ｇ１−４−Ｈ），３．８６（１Ｈ，ｍ，Ｇ２−５−Ｈ），３．８１（１Ｈ，ｍ，Ｇ２−６−Ｈ），３．８１（１Ｈ，ｍ，Ｆ２−２−Ｈ），３．８０（１Ｈ，ｍ，Ｇ３−５−Ｈ），３．８０（１Ｈ，ｍ，Ｇ３−６−Ｈ），３．６６（１Ｈ，ｍ，Ｇ１−３−Ｈ），３．６５（１Ｈ，ｍ，Ｇ２−２−Ｈ），３．６４（１Ｈ，ｍ，Ｇ１−６−Ｈ），３．６４（１Ｈ，ｍ，Ｇ４−６−Ｈ），３．６１（１Ｈ，ｍ，Ｇ４−５−Ｈ），３．５８（１Ｈ，ｍ，Ｇ１−２−Ｈ），３．５６（１Ｈ，ｍ，Ｇ１−６−Ｈ），３．５６（１Ｈ，ｍ，Ｇ４−６−Ｈ），３．５５（１Ｈ，ｍ，Ｇ４−２−Ｈ），３．５４（１Ｈ，ｍ，Ｇ１−５−Ｈ），３．５４（１Ｈ，ｍ，Ｇ３−２−Ｈ），１．２０（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．７，Ｆ１−６−Ｈ），１．１４（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．４，Ｆ２−６−Ｈ）
糖組成（モル比）  Ｌ−フコース：Ｄ−ガラクトース＝２：４
硫酸基            ５分子
なお、１Ｈ−ＮＭＲにおけるピークの帰属の番号は下記式（ＩＸ）の通りである。以下、該化合物を６−５ＳＦｄ−Ｇと称する。
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実施例４
実施例２−（２）で調製した硫酸化多糖１２０ｇを２０ｍＭの塩化カルシウム、３００ｍＭの塩化ナトリウム、１０％のエタノール、及び１０Ｕの実施例２−（１）で調製したＦ−フコイダン分解酵素を含む８リットルの２０ｍＭイミダゾール緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁し、２５℃で３日間攪拌し、排除分子量１０万のホロファイバーを装着させた限外ろ過装置を用い、上記緩衝液を添加しながら限外ろ過した。
限外ろ過内液に３４Ｕの実施例３−（２）記載のＵ−フコイダン分解酵素を添加して、２５℃で２日間攪拌し、排除分子量１０万のホロファイバーを装着させた限外ろ過を行い、水を添加しながら限外ろ過した。
ろ液を集め、エバポレーターで１．５リットルに濃縮後、脱塩装置により完全に脱塩し、あらかじめ３０ｍＭの塩化ナトリウムを含む５ｍＭのイミダゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ６．５）で平衡化した３リットルのＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００のカラムにかけ、６リットルの同緩衝液で洗浄後、３０ｍＭから５００ｍＭの塩化ナトリウムの濃度勾配による溶出を行った。溶出に要した液量は４８リットルであった。溶出液は１８０ｍＬずつ分取し、その糖含量をフェノール−硫酸法により測定した。また、２３２ｎｍにおける吸光度も同時に測定した。１３０ｍＭから１７０ｍＭの塩化ナトリウム溶出画分が一つのピークを形成したので、これらの画分を集め、脱塩装置により脱塩後、凍結乾燥し、５．８５ｇのオリゴ糖を得た。このオリゴ糖は質量分析により、分子量１１２８でありＮＭＲ分析により下記式（Ｘ）で表される化合物であることを確認した。以下、該化合物を６−２ＳＦｄ−Ｕと称す。
0003831252.tif 000011
実施例５
（１）ガゴメ昆布５００ｇを細断し、１０リットルの８０％エタノールで洗浄後、５０リットルの１ｍＭ塩化カリウムを含有する１０％エタノール中にて内径４０ｃｍの容器で２５℃で２日間、１分間当り１２０回転の速度で攪拌し、フコイダンを抽出し、抽出物を網目３２μｍのステンレス金網でろ過し、フコイダン溶液を調製した。
該フコイダン溶液４６リットルに、１ｇのパームオイル（花王社製：化粧品用）を１リットルのエタノールに溶解し調製した、パームオイル溶液１リットルを攪拌しながら添加し、更に１リットルのグリセロールを添加し、化粧水を調製した。また、同様の方法で、各実施例に記載のフコイダン及びその分解物についても化粧水を調製した。
（２）実施例５−（１）で調製したフコイダン溶液に、終濃度が０．０２％となるようにゼラチン及び香料を添加しゼラチン使用の化粧水を得た。また同様にコラーゲンを添加しコラーゲン使用の化粧水を得た。また、同様の方法で、各実施例に記載のフコイダン及びその分解物についても化粧水を調製した。
（３）実施例５−（１）で調製したフコイダンに香料を添加し、毛髪剤を調製した。また同様に、各実施例に記載のフコイダン及びその分解物についても毛髪剤を調製した。
実施例６
市販のワカメ  メカブの乾燥物１ｋｇを穴の径が１ｍｍのスクリーンを装着させたカッターミルにより破砕後、１０リットルの８０％エタノール中に懸濁し、３時間攪拌後、ろ紙によりろ過し、残渣を得た。残渣を５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む４０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）２０リットルに懸濁し９５℃で２時間処理した。処理液を３７℃まで冷却後、１０％となるようにエタノールを添加し、市販のアルギン酸リアーゼＫ（ナガセ−生化学工業社製）を１２０００Ｕ添加後、室温で２４時間攪拌した。得られた処理液を遠心分離し、その上清を排除分子量１０万のホロファイバーを装着させた限外ろ過機により２リットルに濃縮後、生じた沈殿を遠心分離により除去した。得られた上清を５℃に冷却後０．５Ｎの塩酸を添加してｐＨを２．０とした後３０分間攪拌し、生じた沈殿を遠心分離により除去した。上清のｐＨを０．５Ｎの水酸化ナトリウムにより８．０とし、限外ろ過により溶液を２０ｍＭの塩化ナトリウムに置換した。溶液のｐＨを８．０に調整後、遠心分離して得られた上清を凍結乾燥し、９０．５ｇの非曳糸性のワカメ  メカブ由来フコイダンを得た。
実施例７
粉砕したヒバマタ（Ｆｕｃｕｓ  ｖｅｓｉｃｕｌｏｓｕｓ）の乾燥物１ｋｇを、１０リットルの８０％エタノール中に懸濁し、３時間攪拌後、ろ紙によりろ過し、残渣を得た。残渣を１００ｍＭの塩化ナトリウムを含む３０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）３０リットルに懸濁し９５℃で２時間処理した。処理液を３７℃まで冷却後、１００ｇの活性炭を添加し３０分間攪拌した。市販のアルギン酸リアーゼＫを３０００Ｕ添加後、１０％となるようにエタノールを添加し室温で２４時間攪拌した。得られた処理液を遠心分離し、その上清を排除分子量１０万のホロファイバーを装着させた限外ろ過機により２リットルに濃縮後、生じた沈殿を遠心分離により除去した。この上清に抽出液を加えながら限外ろ過し、色素を除去した。得られた非ろ過液を５℃に冷却後０．５Ｎの塩酸を添加してｐＨを２．０とした後３０分間攪拌し、生じた沈殿を遠心分離により除去した。上清のｐＨを０．５Ｎの水酸化ナトリウムにより８．０とし、限外ろ過により溶液を２０ｍＭの塩化ナトリウムに置換した。溶液のｐＨを８．０に調整後、遠心分離して得られた上清を凍結乾燥し、７１ｇの非曳糸性のヒバマタ由来フコイダンを得た。
上記方法に準じ、アスコフィラム  ノドッサム（Ａｓｃｏｐｈｙｌｌｕｍ  ｎｏｄｏｓｕｍ）の乾燥粉末（商品名アルギンゴールド：アンデス貿易株式会社販売）から非曳糸性のアスコフィラム  ノドッサム由来フコイダンを調製した。
実施例８
実施例１−（１）記載の方法で調製したガゴメ昆布由来フコイダン２ｇを１００ｍＬの水に溶解し、そのｐＨをクエン酸にてｐＨ３に調整後、１００℃で３時間処理し、当該フコイダンの酸分解物を調製した。この加水分解物をセルロファインＧＣＬ−３００、又はセルロファインＧＣＬ−２５によるゲルろ過で分子量分画し、セルロファインＧＣＬ−３００を用い分子量２５０００超（Ａ画分）、２５０００〜１００００超（Ｂ画分）、１００００〜５０００超（Ｃ画分）、セルロファインＧＣＬ−２５を用い５０００〜２０００超（Ｄ画分）、２０００〜５００超（Ｅ画分）、５００以下（Ｆ画分）に分画した。更にこれらの画分及び酸分解物をそれぞれ脱塩後凍結乾燥を行い、酸分解物及び酸分解物の各分画物を調製した。
実施例９
市販の塩蔵モズク５ｋｇをはさみで細断し、２０リットルのエタノールと混合した。１晩放置後ろ紙でろ過し、得られた残渣を１２．５リットルの水に懸濁し、９５℃で２時間処理した。処理液をろ紙によりろ過後、３５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む２．５％の塩化セチルピリジニウム溶液を２６００ｍＬ添加し３日間放置した。上清部分を廃棄し、沈殿部分を遠心分離して、その上清も廃棄した。得られた沈殿に２．５リットルの３５０ｍＭの塩化ナトリウムを添加後、ホモジナイザーで均一にし遠心分離した。この洗浄操作を３回繰り返した。得られた沈殿に４００ｍＬの４００ｍＭ塩化ナトリウムを添加後、ホモジナイザーで均一にし、８０％となるようにエタノールを添加して３０分間攪拌後ろ紙でろ過した。得られた残渣に５００ｍＬの塩化ナトリウム飽和８０％エタノールを添加後、ホモジナイザーで均一にし、１リットルとなるように塩化ナトリウム飽和エタノールを添加して３０分間攪拌後ろ紙でろ過した。この洗浄操作をろ液の２６０ｎｍの吸光度がゼロになるまで繰り返した（通常５回）。得られた残渣を１．５リットルの２Ｍの塩化ナトリウムに溶解後、不溶物を遠心分離により除去し、あらかじめ２Ｍの塩化ナトリウムにより平衡化した１００ｍＬのＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００のカラムを素通りさせた。素通り画分を排除分子量１０万のホロファイバーを装着させた限外ろ過機により２リットルに濃縮後、限外ろ過により溶液を２ｍＭの塩化ナトリウムに置換した。この溶液を遠心分離して得られた上清を凍結乾燥し、２２．９ｇのモズク由来フコイダンを得た。
実施例１０
（１）乾燥したマクサ５０ｇをはさみで細断し、５００ｍＬの８０％エタノール中に懸濁後２５℃で３時間攪拌し、ろ紙でろ過した。得られた残渣を１リットルの１００ｍＭの塩化ナトリウムを含む３０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）に懸濁し、９５℃で２時間処理後、穴径１０６μｍのステンレス製ふるいでろ過した。得られたろ液に上記のリン酸ナトリウム緩衝液を加え、３リットルとし、５ｇの活性炭を添加し、２５℃で１晩攪拌後、遠心分離した。得られた上清を排除分子量１０万のホロファイバーを装着させた限外ろ過機で２００ｍＬに濃縮後、限外ろ過機により溶液交換して１０ｍＭ塩化ナトリウム溶液とした。溶液中の不溶物を遠心分離により除去後、凍結乾燥し、マクサ由来硫酸化多糖画分の乾燥物を２．３ｇ得た。
（２）実施例１０−（１）記載の方法により乾燥オゴノリ５０ｇよりオゴノリ由来硫酸化多糖４．４ｇを調製した。また、同様に乾燥おばくさ（Ｐｔｅｒｏｃｌａｄｉｅｌｌａ  ｃａｐｉｌｌａｃｅａ）より、おばくさ由来硫酸化多糖１．０ｇを調製した。
（３）−▲１▼  市販の乾燥レッソニア  ニグレセンスの粉末１ｋｇを１０リットルの８０％エタノール中に懸濁後２５℃で３時間攪拌し、ろ紙でろ過した。得られた残渣を２０リットルの１００ｍＭの塩化ナトリウムを含む３０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）に懸濁し、９５℃で２時間処理後、穴径１０６μｍのステンレス製ふるいでろ過した。得られたろ液に１００ｇの活性炭、２．４リットルのエタノール、６，０００Ｕのアルギン酸リアーゼＫを添加し、２５℃で２２時間攪拌後、遠心分離した。得られた上清を排除分子量１０万のホロファイバーを装着させた限外ろ過機で１．２リットルに濃縮後、遠心分離により不溶物を除去し、５℃で２４時間放置した。生じた沈殿を遠心分離により除去し、得られた上清を限外ろ過機により溶液交換して１００ｍＭ塩化ナトリウム溶液とした。この溶液を４℃以下に冷却後、塩酸によりｐＨを２．０とし、生じた沈殿を遠心分離により除去した。得られた上清のｐＨを水酸化ナトリウムにより８．０とし、２リットルに濃縮後、限外ろ過機により２０ｍＭの塩化ナトリウムに溶液交換した。この溶液中の不溶物を遠心分離により除去後、凍結乾燥し、非曳糸性のレッソニア由来フコイダン画分の乾燥物を４１ｇを得た。
（３）−▲２▼  上記の凍結乾燥物６ｇを１００ｍＭの塩化ナトリウムを含む６００ｍＬの２０ｍＭイミダゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ６）に溶解し、あらかじめ同緩衝液で平衡化した５リットルのＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００にかけ、１０リットルの同緩衝液で洗浄後、１００〜１６００ｍＭの塩化ナトリウムの濃度勾配による溶出を行った。溶出に使用した液量は１３リットルで、分取は１本あたり５００ｍＬで行った。溶出画分のうち２５０ｍＭ、５３０ｍＭ、及び７００ｍＭ付近の塩化ナトリウム溶出画分をそれぞれ５００ｍＬずつ純水で透析し、凍結乾燥して凍結乾燥物をそれぞれＤＥＡＥ３３画分、ＤＥＡＥ３７画分、ＤＥＡＥ４０画分と命名し、それぞれ５７ｍｇ、２４ｍｇ、及び６２ｍｇを得た。
実施例１１
マナマコを５ｋｇ解体し、内臓を除去し、体壁を集めた。体壁湿重量２００ｇ当り５００ｍＬのアセトンを加え、ホモジナイザーで処理後ろ過し、残渣をこれ以上着色物質がでなくなるまでアセトンで洗浄した。この残渣を吸引乾燥し、１４０ｇの乾燥物を得た。この乾燥物に０．４Ｍの食塩水２．８リットルを加え、１００℃で１時間処理後、ろ過し、残渣を０．４Ｍの食塩水で充分洗浄し、抽出液３．７リットルを得た。この抽出液に５％のセチルピリジニウムクロリドをこれ以上沈殿が生じなくなるまで加え、生じた沈殿を遠心分離で集めた。この沈殿を０．４Ｍの食塩水に懸濁後再度遠心分離し、得られた沈殿に１リットルの４Ｍ食塩水を添加し、ホモジナイザーで処理後、攪拌しながら４リットルのエタノールを添加し、１時間攪拌後、ろ過し、沈殿を得た。この沈殿に対して、８０％エタノールに懸濁後ろ過という工程を上清の２６０ｎｍの吸光度がほぼ０になるまで繰り返した。得られた沈殿を２リットルの２Ｍ食塩水に懸濁し、不溶物を遠心分離により除去した。上清を排除分子量３万の膜を備えた限外ろ過装置により限外ろ過し、完全に脱塩後、凍結乾燥し３．７ｇのナマコ由来フコイダンを得た。
実施例１２
（１）市販の塩蔵オキナワモズク６２５ｇを４３７５ｍＬの３０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）に懸濁し、ホモジナイザーにより８０００回転／分、５分処理後、９５℃、１時間処理し、遠心分離により上清を得た。得られた上清に１０ｇの活性炭を添加後３０分間攪拌し、遠心分離により上清を得た。得られた上清を排除分子量１０万のホロファイバーを装着させた限外ろ過機により２リットルに濃縮後、２０ｍＭの塩化ナトリウムで溶液置換し、凍結乾燥して１０．９ｇの非曳糸性のオキナワモズク由来のフコイダンの乾燥物を得た。
（２）当該フコイダンにフコフィラス  フコイダノリティカス（Ｆｕｃｏｐｈｉｌｕｓ  ｆｕｃｏｉｄａｎｏｌｙｔｉｃｕｓ）ＳＩ−１２３４（ＦＥＲＭ  Ｐ−１７５１７）の生産するフコイダン分解酵素を作用させ、得られた酵素分解物のＮＭＲ、ＭＡＳＳ等による機器分析の結果、当該フコイダンは前記一般式（ＩＶ）の構造を繰返し単位とするフコイダンであることが判明した。また当該フコイダンはフコースとグルクロン酸を３５：１０〜４４：１０のモル比で含有するフコイダンで、その平均分子量は約１００万であった。
実施例１３
（１）雄性Ｃ３Ｈ／Ｈｅマウスを日本ＳＬＣ社から購入し、予備飼育の後５週齢より実験に用いた。実施例１−（１）で調製したガゴメ昆布由来フコイダンをエタノールで３％濃度に懸濁溶解し、マウスの背部に１匹あたり２００μＬづつ塗布した。対照群にはエタノールを同様に塗布した。投与は１日１回とし、連日８日間行った。投与開始９日目に背部の毛を一部脱毛し、顕微鏡下でカリパーを用いて毛の長さを測定した。また、脱血致死後皮膚を剥離し、裏側皮膚色を画像解析ソフト（ＮＩＨ  Ｉｍａｇｅ）により解析処理した。
結果を表１に示す。なお、表中、毛の長さについては５例の平均値±標準誤差で示し、皮膚色については対照群の色合いを１００とした時の色調の黒さの５例の平均値で示す。
対照群では明らかに休止期に移行している状態が観察され、皮膚色は白色に移行していた。一方、フコイダン投与群では成長期を維持しており、皮膚色は対照群より灰色がかっていた。毛の長さはフコイダン投与群では対照群より長かった。すなわち、フコイダン投与群では育毛効果が確認された。
0003831252.tif 000012
Ｃ３Ｈ／Ｈｅマウスは、育毛効果の評価に繁用される。５週齢時の毛髪は成長期に相当し、毛および毛包が盛んに成長する時期である。かかる時期では、毛包細胞における色素や酵素の分泌が盛んであるため、皮膚色はかなり黒っぽく見える。しかし、毛髪の状態が成長期から休止期に移行し始めると毛は成長を止め、毛包も小さくなり分泌機能も衰える。そのため、皮膚色は次第に薄くなり、ピンクから白っぽく見えるようになる。毛髪のサイクルはもともと生理的なものであるが、成長期を維持することができれば、成長している毛髪の割合が増加することになり、育毛剤として有用である（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ  １０：４５−５４，１９８３．）。
また、各実施例に記載のフコイダン及びその分解物について同様の試験を行ったところ、同様な育毛効果が確認できた。
（２）雄性Ｃ３Ｈ／Ｈｅマウスを日本ＳＬＣ社から購入し、予備飼育の後８週齢より実験に用いた。マウスの背部をバリカンで毛刈りした。
実施例１−（１）で調製したガゴメ昆布由来フコイダンをエタノールで３％濃度に懸濁溶解し、マウスの背部に１匹あたり２００μＬづつ、上記の毛刈り部位に塗布した。対照群にはエタノールを同様に塗布した。投与は１日１回とし、連日行った。
投与開始から経時的に投与部位を観察し、皮膚色調の変化をスコア化して判定した。すなわちスコア化の基準は、スコア０；皮膚色の変化無し、スコア１；皮膚色が青色に変化、スコア２；皮膚色が青黒〜灰色に変化、スコア３；発毛が見られる、スコア４；ほぼ毛刈り前の状態に復帰、とした。
各群のスコアの平均値を求め、その結果を表２に示す。
表２に示すように対照群に対して、ガゴメ昆布由来フコイダン投与群は早期より、皮膚色の変化が観察され、育毛が促進され、最終的には発毛に至った。すなわち、育毛効果が確認できた。また各実施例に記載のフコイダン及びその分解物について同様の試験を行ったところ、同様な育毛効果が確認できた。
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（３）雄性Ｃ３Ｈ／Ｈｅマウスを日本ＳＬＣ社から購入し、予備飼育の後８週齢より実験に用いた。マウスの背部をバリカンによる毛刈り後、更に剃刀により毛剃りした。
実施例１−（１）で調製したガゴメ昆布由来フコイダン、又は実施例２−（３）で調製した７−１２ＳＦｄ−Ｆを用い、実施例１３−（２）と同様の方法でそれらの育毛効果について試験した。
各群のスコアの平均値を求め、その結果を表３に示す。
表３に示すように対照群に対して、ガゴメ昆布由来フコイダン投与群、７−１２ＳＦｄ−Ｆ投与群で各々、皮膚色の変化が早期に観察され、育毛が促進され、最終的には発毛に至った。なお、ガゴメ昆布由来フコイダン投与群、７−１２ＳＦｄ−Ｆ投与群を比較すると、７−１２ＳＦｄ−Ｆ投与群が、やや早い時期から皮膚色の変化が見られはじめた。また各実施例に記載のフコイダン及びその分解物について同様の試験を行ったところ、同様な育毛効果が確認できた。
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（４）雄性Ｃ３Ｈ／Ｈｅマウスを日本ＳＬＣ社から購入し、予備飼育の後５週齢より実験に用いた。実施例２−（３）で調製した７−１２ＳＦｄ−Ｆをエタノールで３％濃度に懸濁溶解し、マウスの背部に１匹あたり２００μＬづつ塗布した。対照群にはエタノールを同様に塗布した。投与は１日１回とし、連日８日間行った。投与開始９日目に脱血致死後皮膚を剥離し、裏側皮膚色を画像解析ソフトにより解析処理した。
結果を表４に示す。表中の数字は、５例の平均値±標準誤差を表す。表中の＊印は、対照群に対して、５％以下の危険率で有意な差を有することを意味する。皮膚色調は白色を０、黒色を１００とした時の色調の程度を表す。
対照群では明らかに休止期に移行している状態が観測され、皮膚色は白色に移行していた。一方、７−１２ＳＦｄ−Ｆ投与群では成長期を維持しており、皮膚色は対照群より灰色がかっていた。以上より、７−１２ＳＦｄ−Ｆは後期成長期維持作用、すなわち、実施例１３−（１）と同様に育毛作用を示すことが分かった。また各実施例に記載のフコイダン及びその分解物について同様の試験を行ったところ、同様な育毛効果が確認できた。
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（５）雄性Ｃ３Ｈ／Ｈｅマウスを日本ＳＬＣ社から購入し、予備飼育の後８週齢より実験に用いた。マウスの背部をバリカンによる毛刈り後、更にカミソリにより毛剃りした。実施例２−（３）で調製した７−１２ＳＦｄ−Ｆをエタノールで３％濃度に懸濁溶解し、マウスの背部に１匹あたり２００μＬづつ、上記の毛剃り部位に塗布した。対照群にはエタノールを同様に塗布した。投与は１日１回とし、連日行った。投与開始日（毛剃りの翌日）から２１日目に発毛した面積を測定し、毛剃りした面積に対する割合（％）で表した。
結果を表５に示す。表中の数字は、７〜８例の平均値±標準誤差を表す。
対照群に比し、７−１２ＳＦｄ−Ｆ投与群では明らかに休止期から成長期への移行が促進されており、発毛に至った割合が多かった。また各実施例に記載のフコイダン及びその分解物について同様の試験を行ったところ、同様な育毛効果が確認できた。
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（６）実施例１３−（５）と同様の方法で実施例１−（１）で調製したガゴメ昆布由来フコイダン、後述の実施例１６−（２）で調製したＦ−ｒｉｃｈフコイダンを用いてその育毛効果を確認した。結果を表６に示す。対照群に比し、フコイダン投与群、Ｆ−ｒｉｃｈフコイダン投与群では発毛に至った割合が高かった。
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（７）雄性Ｃ３Ｈ／Ｈｅマウスを日本ＳＬＣ社から購入し、予備飼育の後８週齢より実験に用いた。マウスの背部をバリカンによる毛刈り後、更にカミソリにより毛剃りした。実施例２−（３）で調製した７−１２ＳＦｄ−Ｆをエタノールで３％濃度に懸濁溶解し、マウスの背部に１匹あたり２００μＬづつ、上記の毛剃り部位に塗布した。対照群にはエタノールを同様に塗布した。投与は１日１回とし、連日行った。投与開始日（毛剃りの翌日）から２１日目に脱血致死後背部皮膚を剥離し、ホモジナイズにより抽出液を作製した。背部皮膚抽出液中のグルコース−６−リン酸脱水素酵素活性（Ｇ−６−ＰＤＨ活性）をロッシュ・ダイアグノスティックス株式会社製のテストキットで、また、アルカリホスファターゼ活性（ＡＬＰ活性）を和光純薬工業株式会社製のテストキットで測定した。なお、Ｇ−６−ＰＤＨおよびＡＬＰは育毛効果の見られた組織においてその酵素活性の上昇することが知られている。
それらの結果を表７に示す。表中の数字は、７〜８例の平均値±標準誤差を表す。対照群に比し、７−１２ＳＦｄ−Ｆ投与群では明らかに皮膚組織中の酵素活性が上昇しており、休止期から成長期への移行が促進されていることが示された。すなわち、育毛効果が確認された。また各実施例に記載のフコイダン及びその分解物について同様の試験を行ったところ、同様な育毛効果が確認できた。
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（８）実施例５−（１）記載の本発明のガゴメ昆布由来フコイダン含有化粧水と、フコイダンを含有しない対照の化粧水とを比較して、２０〜３５才の成人女性２５人に対しブラインドで官能検査を行った。その結果、より有効と判定した人数を表８に示す。
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以上の結果、フコイダン配合の本発明の化粧水は肌のしっとりさ、なめらかさ、はりのいずれの事項についても優れた検査結果を示し、皮膚美容作用のある化粧水であることが示された。
また、その他のフコイダン及びその分解物を含有する化粧水について、それぞれ同様の試験を行ったところ、同様な皮膚美容効果が確認できた。
（９）実施例１−（１）記載のガゴメ昆布由来フコイダンを２００ｍｇ含有する５０ｍＬ容の清涼飲料（麦芽糖溶液３％、梅粉末０．０５％、１／５レモン透明果汁０．２％、無水クエン酸０．０２％）を作製し、この飲料の皮膚美容効果を検討した。当該飲料を毎日１本３ヵ月飲用したところ、皮膚のかゆみ、目のかゆみが抑制され、しみの減少が確認された。また毛髪の増毛、白髪の進行抑制も認められた。更に乾燥肌も改善された。
またその他のフコイダン及びその分解物を含有する飲料についても、それぞれ同様の試験を行ったところ同様の皮膚美容効果、育毛効果が確認された。
（１０）実施例１−（１）記載のガゴメ昆布由来フコイダンを用い、以下の成分の乳液を調製した。なお、「部」は重量部を表わす。
流動パラフィン                                            ２３．０部
ミリスチン酸イソプロピル                                    ５．０部
ワセリン                                                    ６．０部
ミツロウ                                                    ５．０部
ステアリン酸                                                ２．０部
ベヘニルアルコール                                          １．０部
モノステアリン酸ソルビタン                                  ３．０部
ポリオキシエチレン（２０）モノステアリン酸ソルビタン        ３．０部
１，３−ブチレングリコール                                  ３．０部
パラベン                                                    ０．３部
フコイダン                                                  １．０部
香料                                                            適量
精製水                                                          残余
敏感肌の人６名に上記乳液を朝晩２回、連日３ヵ月使用させたが、炎症等の好ましくない現象は全く現れず、肌状態も全員改善した。
実施例１４
（１）Ｄ−（＋）−グルコース２００ｍｇ（１．１ｍｍｏｌ）をピリジン１０ｍＬに溶解し、室温にてＰｙｒｉｄｉｎｅ  Ｓｕｌｆｕｒ  Ｔｒｉｏｘｉｄｅ  Ｃｏｍｐｌｅｘ（Ｐｙｒ・ＳＯ３：東京化成製）１．０５ｇ（６．６ｍｍｏｌ）を添加した後、室温にて数分間、さらに６０℃で１時間攪拌した。反応液を水で希釈し、飽和水酸化バリウム水溶液でｐＨを中性付近に調整してから減圧乾固した。得られた濃縮物に再度水を添加し再び減圧乾固した。この操作をもう一度繰り返した。得られた濃縮物に少量の水を添加し遠心で硫酸化バリウムの沈殿を除去し、得られた上清を陽イオン交換カラム〔アンバーライト  ＩＲＡ−１２０（Ｎａ＋）（オルガノ）〕に供じた。最終的に、得られたカラム素通り画分を減圧濃縮し硫酸化（−ＳＯ３−Ｎａ＋）Ｄ−（＋）−グルコース７００ｍｇを得た。又、同様にして硫酸化フコース、硫酸化マンノース、硫酸化ガラクトース、硫酸化キシロース、硫酸化２−デオキシ−グルコース、硫酸化タロースを調製した。
（２）実施例１３−（３）と同様の方法で実施例１４−（１）で調製した硫酸化グルコースの育毛効果について検討した。ただし、硫酸化グルコースは、５０％エタノールに３％になるように溶解し、マウスの背部に１日１回２００μＬづつ塗布した。対照群には５０％エタノールのみを塗布した。その結果、表９に示すように対照群に対して、硫酸化グルコース投与群では、皮膚色の変化が早期に観測され、育毛が促進されて、最終的には発毛に至った。また、硫酸化フコース、硫酸化マンノース、硫酸化ガラクトース、硫酸化キシロース、硫酸化２−デオキシ−グルコース、硫酸化タロースについて同様の試験を行い、同様な育毛効果を確認した。
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実施例１５
（１）生後２日齢の雄性Ｃ３Ｈ／Ｈｅマウスを母獣と一緒に日本ＳＬＣ社から購入し、５日齢で実験に用いた。マウスを脱血致死させ、ハサミとピンセットを用いてヒゲを、皮下組織ごと採取した。さらに、Ｏｇａｗａらの方法（Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ  １０３：３０６−３０９，１９９４）に従い、顕微鏡下、シャーレの中でヒゲを毛包ごと分離した。一匹の左右より１４〜１６本のヒゲを採取した。
実施例１−（１）記載のガゴメ昆布由来フコイダンおよび実施例２−（３）記載の７−１２ＳＦｄ−Ｆは、ＲＰＭＩ−１６４０培地に溶解し、所定濃度の２０倍濃度液を調製し、培養系には２０分の１量を加えた。対照群には同量の培地を加えた。なお、各添加サンプルの所定濃度は表１０に、培地１ｍＬ当たりの濃度（ｍｇ／ｍＬ）として、それぞれ示す。ヒゲの培養は、組織培養用ディッシュＦａｌｃｏｎ  ３０３７（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｌａｂｗａｒｅ社製）を用い、中央のウエルに０．７ｍＬの２０％ＦＣＳ添加ＲＰＭＩ−１６４０培地を入れ、その上に滅菌したステンレスメッシュ（池田理化株式会社製）とレンズペーパー（ティーシーケース株式会社製）を敷いた。ヒゲはその上に載せて培養した。ガゴメ昆布由来フコイダンおよび７−１２ＳＦｄ−Ｆは、予め培地の中に添加した。培養は３５℃、５％ＣＯ２存在下で６日間行った。ヒゲの長さは、培養開始前と終了後に、顕微鏡下でカリパーを用いて０．１ｍｍの位まで測定した。各サンプル濃度の一群について３〜５本のヒゲを用いて測定し、伸長した長さを平均値±標準誤差で表示した。また、有意差検定はステューデントのｔ検定を行い、対照群に対してＰ値を求めた。その結果を表１０に示す。
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その結果、ガゴメ昆布由来フコイダンおよび７−１２ＳＦｄ−Ｆは、対照に比べて濃度依存的にマウスのヒゲを伸長させた。すなわち、ガゴメ昆布由来フコイダンおよび７−１２ＳＦｄ−Ｆに育毛効果があることが確認できた。また各実施例に記載のフコイダン及びその分解物について同様の試験を行ったところ、同様な育毛効果が確認できた。
（２）生後２日齢の雄性Ｃ３Ｈ／Ｈｅマウスを母獣と一緒に日本ＳＬＣ社から購入し、９日齢で実験に用い実施例１５−（１）と同様の方法で、実施例１−（１）記載のガゴメ昆布由来フコイダン及び実施例２−（３）記載の７−１２ＳＦｄ−Ｆの育毛効果について調べた。その結果を表１１に示す。
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その結果、９日齢のマウスのヒゲを用いた場合にも、ガゴメ昆布由来フコイダンおよび７−１２ＳＦｄ−Ｆは、対照に比べて有意にマウスのヒゲを伸長させた。すなわち、ガゴメ昆布由来フコイダンおよび７−１２ＳＦｄ−Ｆに育毛効果があることが確認できた。また各実施例に記載のフコイダン及びその分解物について同様の試験を行ったところ、同様な育毛効果が確認できた。
実施例１６
（１）実施例１−（１）記載のガゴメ昆布由来フコイダン３０ｇを蒸留水１２リットルに室温で３０分間攪拌溶解した。この懸濁液を１００００×ｇで４０分間遠心分離し、その上清を集めた。これをメンブレンフィルター（０．２２μｍ）（ミリポア社製）で無菌ろ過し、凍結乾燥品２１．４ｇを得た。これをＴａＫａＲａコンブフコイダンＢｆ（以下、フコイダンＢｆと称す）とした。
（２）乾燥ガゴメ昆布５００ｇを細断し、１０Ｌの８０％エタノールで洗浄後、５０リットルの１ｍＭ塩化カリウムを含有する１０％エタノール中にて、２５℃で３日間攪拌し、網目の直径３２μｍのステンレス金網でろ過してろ液約４５リットルを得た。このろ液３４リットルを８０℃で３時間加熱した後、５０℃まで冷却した。これを分子量１万カットの限外ろ過ＯＭＥＧＡカセット（フィルトロン社製）で液温５０℃に保ちながら濃縮した。さらに５０℃に加温した蒸留水５リットルで脱塩を行い、同蒸留水２００ｍＬを加えて流路を２回洗浄して回収し濃縮液１．５リットルを得た。これを凍結乾燥し、８．２ｇのＦ−ｒｉｃｈフコイダンを得た。
（３）生後２日齢の雄性Ｃ３Ｈ／Ｈｅマウスを母獣と一緒に日本ＳＬＣ社から購入し、１４日齢で実験に用い実施例１５−（１）と同様の方法で、実施例１６−（１）記載のフコイダンＢｆ及び実施例１６−（２）記載のＦ−ｒｉｃｈフコイダンの育毛効果について調べた。ヒゲの長さは、培養開始前と終了後に、顕微鏡下でカリパーを用いて０．１ｍｍの位まで測定し、伸長した長さを平均値±標準誤差で表示した。また、有意差検定はステューデントのｔ検定を行い、対照群に対してＰ値を求めた。その結果を表１２に示す。
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その結果、フコイダンＢｆおよびＦ−ｒｉｃｈフコイダンは、対照に比べて有意にマウスのヒゲを伸長させた。すなわち、育毛効果があることが確認できた。また、各実施例に記載のフコイダン及びその分解物について同様の試験を行ったところ、同様な育毛効果が確認できた。
実施例１７
生後２日齢の雄性Ｃ３Ｈ／Ｈｅマウスを母獣と一緒に日本ＳＬＣ社から購入し、５日齢で実験に用い実施例１５−（１）と同様の方法で、実施例１６−（２）記載のＦ−ｒｉｃｈフコイダン、実施例６記載のワカメ  メカブ由来フコイダン、実施例７記載のヒバマタ由来フコイダン、実施例９記載のモズク由来フコイダン及び実施例１２記載のオキナワモズク由来フコイダンの育毛効果について調べた。その結果を表１３に示す。
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その結果、これらのフコイダンは対照に比べて有意にマウスのヒゲを伸長させた。また、Ｆ−ｒｉｃｈフコイダンおよびヒバマタ由来フコイダンは、特に良くマウスのヒゲを伸長させた。すなわち、フコイダンの種類によってマウスのヒゲを伸長させる作用には強弱があり、ガゴメ昆布由来のＦ−ｒｉｃｈフコイダンおよびヒバマタ由来フコイダンには他に比べて強い育毛効果があることが確認できた。また、各実施例に記載のフコイダン及びその分解物について同様の試験を行ったところ、育毛効果が確認できた。
実施例１８
生後２日齢の雄性Ｃ３Ｈ／Ｈｅマウスを母獣と一緒に日本ＳＬＣ社から購入し、６日齢で実験に用い実施例１５−（１）と同様の方法で、実施例１４−（１）記載の硫酸化グルコースの育毛効果について調べた。その結果を表１４に示す。
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その結果、硫酸化グルコース１ｍｇ／ｍＬは、対照に比べて有意にマウスのヒゲを伸長させた。すなわち、この実験系においても硫酸化グルコースに育毛効果があることが確認できた。また、実施例１４に記載の各硫酸化単糖についても同様の効果があることが確認できた。
実施例１９
雄性Ｃ３Ｈ／Ｈｅマウスを日本ＳＬＣ社から購入し、予備飼育の後８週齢より実験に用いた。マウス背部をバリカンによる毛刈りの後、更にカミソリにより毛剃りした。実施例１６−（１）記載のフコイダンＢｆのみ、又はフコイダンＢｆ及び市販育毛剤の有効成分である塩化カルプロニウム若しくはミノキシジルが３０％エタノール溶液中、表１５に記載の濃度となるように溶解して各エタノール溶液を調製した。マウスの背部に１匹あたり２００μＬづつ、上記の毛剃り部位に該エタノール溶液を塗布した。対照群には３０％エタノールを同様に塗布した。投与は１日１回とし、連日行った。投与開始日（毛剃りの翌日）から経時的に投与部位を観察し、毛剃り後２１日目に発毛した面積を測定し、毛剃り面積に対する割合（％）で表した。各群６匹の平均値±標準誤差を表１５に示した。
市販育毛剤である育毛剤Ａの有効成分である塩化カルプロニウムの塗布投与による育毛効果は、本実験系においては認められず、従って対照群との差は認められなかった。しかしながら、フコイダンＢｆと塩化カルプロニウムとの併用投与群では、早期より皮膚色の変化が観察され、発毛に至った。発毛割合も対照群より高かった。６０％以上の発毛割合を示した個体は、対照群および塩化カルプロニウム投与群では認められなかったのに対し、フコイダンＢｆ併用投与群では、６例中３例に認められた。
一方、市販育毛剤Ｂの有効成分であるミノキシジルは１％濃度で塗布することにより育毛効果が認められ、早期より皮膚色の変化が観察され、発毛に至った。０．１％濃度では効果は弱かった。更に、フコイダンＢｆとミノキシジルとの併用投与群では、育毛効果が促進される傾向が認められた。すなわち、実験終了時に６０％以上の発毛割合を示した個体は、ミノキシジルの１％投与群では６例中４例であったのに対し、フコイダンＢｆ併用投与群では、６例全例が良好な発毛状態を呈していた。一方、効果の弱かったミノキシジルの０．１％投与群では６例中１例のみであったのに対し、フコイダンＢｆ併用投与群では、６例中３例であった。
以上から、フコイダンＢｆと共にミノキシジル又は塩化カルプロニウムを用いることで育毛作用が相乗的に増強されることが分かった。また他のフコイダン、フコイダン分解物、硫酸化単糖等に対しても同様な試験を行ったところ、同様な結果が得られた。
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実施例２０
雄性Ｃ３Ｈ／Ｈｅマウスを日本ＳＬＣ社から購入し、予備飼育の後８週齢より実験に用いた。マウス背部をバリカンによる毛刈りの後、更にカミソリにより毛剃りした。実施例１６−（１）記載のフコイダンＢｆを３％濃度になるように軟膏基剤〔親水軟膏（丸石製薬社製）〕に混合（フコイダン軟膏）し、マウスの背部に１匹あたり０．２ｇづつ、上記の毛剃り部位に塗布した。対照群には軟膏基剤のみを塗布した。投与は１日１回とし、連日行った。投与開始日（毛剃りの翌日）から経時的に投与部位を観察し、皮膚色調の変化をスコア化して判定した。すなわち、スコア化の基準は、スコア０；変化なし、スコア１；皮膚色が青色に変化、スコア２；皮膚色が青黒〜灰色に変化、スコア３；発毛が見られる、スコア４；ほぼ毛剃り前の状態に復帰、とした。各群のスコアについては、６例の平均値±標準誤差として表１６に示す。また、毛剃り後２１日目に発毛した面積を測定し、毛剃り面積に対する割合（％）で表した。有意差検定はステューデントのｔ検定を行い、対照群に対してＰ値を求めた。その結果を表１７に示す。なお、表中の発毛割合は、各群６例の平均値±標準誤差として示す。
その結果、フコイダン軟膏を塗布することにより顕著な育毛効果が認められた。対照群に比し、早期より皮膚色の変化が観察され、発毛に至った。また、実験終了時には、全例が毛剃り前の状態にほぼ復帰していた。また各実施例に記載のフコイダン及びその分解物についても同様にして軟膏を調製し、同様の試験を行ったところ、同様な育毛効果が確認できた。
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寄託された生物材料
（１）寄託機関の名称・あて名
通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所
日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号３０５）
（２）寄託された微生物
（ｉ）アルテロモナス（Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ）  ｓｐ．ＳＮ−１００９
原寄託日              ：  平成８年２月１３日
国際寄託への移管請求日：  平成８年１１月１５日
受託番号：  ＦＥＲＭ  ＢＰ−５７４７
（ｉｉ）フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）  ｓｐ．ＳＡ−００８２
原寄託日              ：  平成７年３月２９日
国際寄託への移管請求日：  平成８年２月１５日
受託番号：  ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０２
産業上の利用可能性
本発明によりフコイダン、その分解物、硫酸化単糖又はそれらの塩から選択されるものを有効成分とする安全性に優れたバイオ化粧料が提供される。またフコイダン、その分解物、硫酸化単糖又はそれらの塩から選択されるものを有効成分とする皮膚美容用食品又は飲料、及び育毛用食品又は飲料等として使用され得る化粧料も提供され、これらの食品又は飲料は皮膚美容作用及び／又は育毛作用を有する機能性食品又は飲料として有用である。特にフコイダン、その分解物、硫酸化単糖又はそれらの塩から選択されるものを有効成分とする飲料は飲む化粧料、育毛料として日常的に摂取でき、皮膚美容維持、皮膚老化防止、皮膚老化予防、毛髪維持・養毛・増毛等に極めて有用である。
また、本発明に使用される前記有効成分と共に従来の育毛料の有効成分（育毛作用増強成分）を用いることで育毛作用が相乗的に増強され得、従って、本発明により、前記有効成分及び育毛作用増強成分を含む、従来に比し非常に優れた育毛作用を有する育毛料が提供される。
【図面の簡単な説明】
第１図は、ガゴメコンブ由来フコイダンのＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００カラム溶出パターンを示す図である。
【図１】
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