(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に示される塩基配列のうち、１７６番目から９２２番目までの塩基配列又はその相補的配列並びにこれらの配列を含むＤＮＡ。
【請求項２】
請求項１記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、ホスホマンナンに結合特異性を有するポリペプチドをコードするブタ由来のＤＮＡ。
【請求項３】
配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項４】
配列番号２に示されるアミノ酸配列のうち、２１番目から２４９番目までのアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項５】
配列番号２に示されるアミノ酸配列、又は配列番号２に示されるアミノ酸配列のうち２１番目から２４９番目までのアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、ホスホマンナンに結合特異性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項６】
配列番号１に示される塩基配列又はその相補的配列並びにこれらの配列を含むＤＮＡ。
【請求項７】
配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【請求項８】
配列番号２に示されるアミノ酸配列のうち、２１番目から２４９番目までのアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【請求項９】
配列番号２に示されるアミノ酸配列、又は配列番号２に示されるアミノ酸配列のうち、２１番目から２４９番目までのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、ホスホマンナンに結合特異性を有するポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ブタ血清中に存在し、表面にホスホマンナンをもつ細菌に対して選択的な傷害活性を示す新規動物レクチン及び該動物レクチンをコードする遺伝子に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、新生ブタでは、その母胎の特殊な胎盤構造により、極端に血清中の免疫グロブリン量及び補体レベルが少なく、抗体を介した免疫機能が特に弱いことが知られている。また、この新生ブタ血清はグラム陰性細菌に対してＣ１ｑ非依存的な傷害活性を有するということも知られている［Immunobiol.,vol.190,pp.399-410(1994)］。そして、このＣ１ｑ非依存的な傷害活性は、表面にホスホマンナンをもつ細菌に対して選択的な傷害活性を示すが、表面にマンナンをもつ細菌に対しては傷害活性を示さないことも知られていた。
【０００３】
一方、特定の糖構造に親和性を有し、細胞表面の糖鎖や複合糖質に結合する物質として知られているレクチンは、動物、植物、微生物界より結合特異性の異なる多くの種類のものが単離されている。例えば、動物レクチンとして、表面にマンナン（マンノース）をもつ細菌に対して特異的に傷害活性を示すマンナン結合タンパク質（ＭＢＰ）の他、ガラクトース、Ｎ−アセチルグルコサミンなどに特異的に結合するタンパク質も知られている。しかし、ホスホマンナンに特異的に結合する哺乳動物レクチンは知られていなかった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、表面にホスホマンナンをもつ細菌に対して選択的な傷害活性を示し、新規生理活性物質としての薬効が期待できる、ブタ血清中に存在する新規動物レクチン、及び該動物レクチンをコードする動物レクチン遺伝子を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、種々の表面糖構造を有する細菌に対する生体防御機構、及びレクチンというタンパク質のファミリーの分子的な進化についての研究の過程で、ブタ血清中にホスホマンナンに特異的なレクチンが存在することを見い出し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち本発明は、［１］配列番号１に示される塩基配列のうち、１７６番目から９２２番目までの塩基配列又はその相補的配列並びにこれらの配列を含むＤＮＡや、［２］上記（１）記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、ホスホマンナンに結合特異性を有するポリペプチドをコードするブタ由来のＤＮＡや、［３］配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするＤＮＡや、［４］配列番号２に示されるアミノ酸配列のうち、２１番目から２４９番目までのアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするＤＮＡや、[５]配列番号２に示されるアミノ酸配列、又は配列番号２に示されるアミノ酸配列のうち２１番目から２４９番目までのアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、ホスホマンナンに結合特異性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡや、［６］配列番号１に示される塩基配列又はその相補的配列並びにこれらの配列を含むＤＮＡに関する。
【０００７】
また本発明は、［７］配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドや、［８］配列番号２に示されるアミノ酸配列のうち、２１番目から２４９番目までのアミノ酸配列からなるポリペプチドや、［９］配列番号２に示されるアミノ酸配列、又は配列番号２に示されるアミノ酸配列のうち、２１番目から２４９番目までのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、ホスホマンナンに結合特異性を有するポリペプチドに関する。
【０００８】
【発明の実施の形態】
（ブタ血清レクチンの由来）
本発明の新規ブタ血清レクチンは、ブタ血清から得られる。ブタの種類はどのような種類でもよく、例えば食肉用ブタでもよい。ブタとしては、新生ブタ、成長ブタのどちらでもよいが、新生ブタが好ましい。ブタの血清は、屠刹直後のブタから得られるものが好ましい。
【０００９】
（ブタ血清レクチンの単離・精製）
本発明のブタ血清レクチンは、ブタ血清から通常のタンパク質の精製方法を組み合わせることによって単離・精製することもできるが、ブタ血清レクチンの有するホスホマンナンとの結合特異性を利用したアフィニティークロマトグラフィーを用いることが効率よくブタレクチンを分離する上で好ましい。例えば、単離しようとするブタ血清レクチンを、カルシウムイオン存在下でホスホマンナン樹脂に結合させ、次いで、ＥＤＴＡでカルシウムをキレートすることによりレクチンとホスホマンナンとの結合をはずし、カラムから溶出させることにより、ブタ血清レクチンを単離することができる。この場合、かかるアフィニティークロマトグラフィーによる単離操作を繰り返し、非特異的なタンパク質をできる限り除去することが望ましい。
【００１０】
上記アフィニティークロマトグラフィーに用いるホスホマンナンの調製方法としては、細胞表面にホスホマンナンを有する微生物菌体をそのまま使用することもできるが、論文（J. Bacteriol.82：269-274, 1961）記載の方法を改変して行うことが好ましい。例えば、ハンセニュウラ・カプスラータ（Hansenula capsulata）ＮＲＲＬ  Ｙ−１８４２はホスホマンナンを菌体外に放出する性質があり、培地中に放出されたホスホマンナンを酢酸カリウムの存在下でメタノールによって沈殿させて回収し、ホスホマンナンの材料として用いることができる。このようにして得られたホスホマンナンを、例えばエポキシ樹脂に結合させてアフィニティークロマトグラフィー用のカラムを調製することができる。
【００１１】
（部分ペプチド配列の決定）
ブタ血清から、例えばホスホマンナンとの結合特異性を利用したアフィニティークロマトグラフィー、必要に応じてＨＰＬＣ処理やＳＤＳ−ＰＡＧＥ処理することにより精製されたブタ血清レクチンが得られる。精製されたブタ血清レクチンは、ブタ血清レクチン遺伝子をクローニングするために、そのペプチド配列を決定することが好ましい。現在用いられているペプチドシークエンサーはＮ末端から１０〜２０個のアミノ酸程度しか決定することができないので、例えば、還元カルボキシメチル化剤を用いてペプチド内のＳ−Ｓ架橋を切断し、遊離したＳＨ基を修飾し、次いで、エンドペプチダーゼでペプチドを断片化することにより、その部分ペプチド配列を決定することができる。かかる部分ペプチド配列の情報に基づいて、縮重プライマーを作成し、ＰＣＲ法を用いて完全長のｃＤＮＡを調製することができる。この場合、縮重プライマー部分に相当する塩基配列は本来の配列と数塩基違っていることが多いため、新たに増幅したＤＮＡの塩基配列をもとにプライマーを作製することが好ましい。
【００１２】
（ブタ血清レクチン遺伝子のクローニング）
本発明のブタ血清レクチン遺伝子のクローニング方法としては、従来公知の遺伝子のクローニング方法を用いることができるが、上記のように、目的とするレクチンタンパク質が精製され、そのアミノ酸配列が決定することができる場合は、対応するオリゴヌクレオチドを合成し、プローブとして用いる方法が好ましい。また、ブタ血清レクチンのｃＤＮＡのＤＮＡ配列情報等に基づきブタレクチンのゲノムＤＮＡを単離することも可能となる。
【００１３】
（ブタ血清レクチン遺伝子の発現）
単離されたｃＤＮＡやゲノムＤＮＡを用いて、公知の宿主−ベクター系を利用することにより、シグナルペプチドを有するブタ血清レクチンや成熟型ブタ血清レクチンを発現させることができる。また、得られたブタ血清レクチンを用いて、抗ブタレクチンモノクローナル抗体を作製することもできる。
【００１４】
本発明のホスホマンナンに特異的なレクチンは、ブタ以外の他の哺乳動物の血清、例えばマウス血清、ヒト血清には見い出すことができず、現時点ではブタ血清にのみ存在する。本発明のホスホマンナンに特異的なブタ血清レクチンのｃＤＮＡの塩基配列を図１に、ブタ血清レクチンの推定されるアミノ酸配列を図１及び図２に示す。この新規レクチンはアミノ酸配列のＮ末端側に高システイン領域、Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙの繰り返し配列を特徴とするコラーゲン様領域、Ｃ末端側に糖認識ドメインに共通する配列を有する。また、アミノ酸配列において、マウス、ラット、ヒト血清型ＭＢＰと約６１％から６６％の相同性を持つことにより、機能的、構造的にもＭＢＰと類似すると考えられる。
【００１５】
以下に、実施例を挙げてこの発明を更に具体的に説明するが、この発明の技術的範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
（ホスホマンナンの調製）
ホスホマンナン産生酵母であるハンセニュウラ・カプスラータ（Hansenula capsulata）ＮＲＲＬ  Ｙ−１８４２を、１Ｌの培地（ペプトン０．５％、酵母エキス０．３％、麦芽エキス０．３％、グルコース１．０％、ＫＨ2ＰＯ4でｐＨ６．０に調整）に植菌し、２５℃で４日間培養し、メタノールを添加して粘度を減少させた後、６０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して上澄液を分離し、この上澄液に最終濃度が０．３Ｍとなるように酢酸カリウムを加え、次いで５０容量％のメタノールを加えてホスホマンナンを沈殿させた。再度、６０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して得られたホスホマンナンを含む沈殿物に蒸留水１Ｌを加え、ホスホマンナンを溶解させた。
【００１６】
この溶解液に、最終濃度が０．３Ｍとなるように酢酸カリウムを加え、次いで５０容量％のメタノールを加えてホスホマンナンを沈殿させ、６０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。得られたホスホマンナンを含む沈殿物に、５％酢酸カリウムを加えホスホマンナンを溶解させ、攪拌しながら徐々に５０容量％のメタノールを加え、糸状の沈殿を形成させた後、６０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、得られるホスホマンナンの沈殿に２．５％酢酸カリウムを加えホスホマンナンを溶解させた後、凍結乾燥して粉末状のホスホマンナンを得た。
【００１７】
（ホスホマンナンのアフィニティーカラムの調製）
ホスホマンナンのアフィニティーカラムの調製は、ホスホマンナン中のＯＨ基をエポキシと反応させる、ホスホマンナンとエポキシ樹脂とのカップリングにより行った。活性化エポキシ  セファロース６Ｂ（ファーマシア社製）を蒸留水を用いて膨潤させ、膨潤樹脂１ｍｌ当たり、ホスホマンナン濃度５ｍｇ／ｍｌのものを２ｍｌ加えて、３７℃で１６時間ゆっくりと攪拌した後、２０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、得られるホスホマンナン結合樹脂沈殿物を蒸留水、０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム溶液（ｐＨ８．０）、０．１Ｍ酢酸溶液（ｐＨ４．５）で順次洗浄後、再度２０００ｒｐｍで２分間遠心分離した。
【００１８】
得られたホスホマンナン結合樹脂沈殿物に、エポキシ樹脂中の残存する活性基をブロックするために、１Ｍエタノールアミンを添加し、３７℃で４時間ゆっくりと攪拌した後、２０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、得られるホスホマンナン結合樹脂沈殿物を０．１Ｍ酢酸溶液（ｐＨ４．５）と０．５Ｍ塩化ナトリウム溶液で洗浄後、０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）と０．５Ｍ塩化ナトリウム溶液で洗浄した。この洗浄操作を３回繰り返した後、ホスホマンナン結合樹脂をリン酸緩衝液中４℃で保存した。この樹脂をカラムに充填しアフィニティーカラムの調製した。
【００１９】
（ブタレクチンの単離）
上記アフィニティーカラム（樹脂量５０ｍｌ）をイミダゾール緩衝液（１０ｍＭ塩化カルシウム、２０ｍＭイミダゾール(ｐＨ７．８)、１．２５Ｍ塩化ナトリウム）を用い平衡化し、新生ブタ血清４００ｍｌを６ｍｌ／時間の速度でカラム内に導入した。上記イミダゾール緩衝液で洗浄し、溶出液の２８０ｎｍにおける吸光度が０．０５以下になるのを確認した後、ＥＤＴＡ緩衝液（２ｍＭＥＤＴＡ、２０ｍＭイミダゾール(ｐＨ７．８)、１．２５Ｍ塩化ナトリウム）で溶出、タンパクの溶出を示す２８０ｎｍに吸収のあるフラクションを集めレクチン活性画分を得た。
【００２０】
次に、イミダゾール緩衝液（１０ｍＭ塩化カルシウム、２０ｍＭイミダゾール(ｐＨ７．８)、１．２５Ｍ塩化ナトリウム）を用い平衡化した第２のアフィニティーカラム（樹脂量１０ｍｌ）に、上記２８０ｎｍに吸収のある溶出画分を６ｍｌ／時間の速度でカラム内に導入した。上記イミダゾール緩衝液で洗浄し、溶出液の２８０ｎｍにおける吸光度が０．０５以下になるのを確認した後、ＥＤＴＡ緩衝液（２ｍＭＥＤＴＡ、２０ｍＭイミダゾール(ｐＨ７．８)、１．２５Ｍ塩化ナトリウム）で溶出、タンパクの溶出を示す２８０ｎｍに吸収のあるフラクションを回収しレクチン活性画分を得た。このレクチン活性画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥ処理し、均質なタンパクであることを確認した。
【００２１】
（部分ペプチド配列の決定）
上記レクチン活性画分のブタレクチンの部分ペプチド配列を決定するに際し、アミノ酸解析を容易にするため、還元カルボキシメチル化剤を用い、ペプチド内のＳ−Ｓ架橋を切断し、遊離したＳＨ基を修飾した。次いで、リシルエンドペプチダーゼ（リジンのC末端でペプチド結合を切断するタンパク分解酵素）でタンパクを断片化し、ペプチドシークエンサーで部分ペプチド配列を決定し、配列番号３〜５で示される以下の３つの部分ペプチド配列情報を得た。
ペプチド▲１▼  EIKTCEDAQKTCSVITCGIPVTNG
ペプチド▲２▼  AIQDMAPDVAFLGI
ペプチド▲３▼  SNEPNDHGSGEDCVILQ
【００２２】
（縮重プライマーの合成）
上記３つの部分ペプチド配列情報に基づき、縮重の少ない６〜７個のアミノ酸からなるペプチド部分を選択し、縮重プライマーを合成した。
ペプチド▲１▼より以下に示すアミノ酸の縮重をもとに、最初のＧのコドンの３つ目のヌクレオチドをイノシンとして作製し、最後の１ベースは使用していない、全部で２０mer からなる３８４種類（1×3×4×4×4×2×1=384）のセンスプライマーを作製した。
0003799180.tif 000002
【００２３】
ペプチド▲２▼より以下に示すアミノ酸の縮重をもとに、全部で１８mer からなる１２８種類（2×2×1×4×4×2=128）のセンスプライマー及びアンチセンスプライマーをそれぞれ作製した。
0003799180.tif 000003
【００２４】
ペプチド▲３▼より以下に示すアミノ酸の縮重をもとに、最後の１ベースは使用していない、全部で２０mer からなる２５６種類（2×4×2×2×2×4×1=256）のアンチセンスプライマーを作製した。
0003799180.tif 000004
【００２５】
（ブタ肝臓 cＤＮＡを鋳型としてＲＴ−ＰＣＲ）
屠刹した直後の新鮮なブタ肝臓細胞からｍＲＮＡを抽出し、逆転写酵素を用いて常法によりｃＤＮＡを調製した。この調製後のｃＤＮＡを鋳型として、上記の縮重プライマーの混合物を用いて、常法によりＰＣＲを実施した。ＰＣＲの結果、ペプチド▲１▼によるセンスプライマーとペプチド▲２▼によるアンチセンスプライマーの組み合わせで増幅された約４３０ｂｐのＤＮＡ断片と、ペプチド▲２▼によるセンスプライマーとペプチド▲３▼によるアンチセンスプライマーの組み合わせで増幅された約１３０ｂｐのＤＮＡ断片が得られた。
【００２６】
（決定した塩基配列をもとにプライマーを合成）
得られたＤＮＡ断片の塩基配列を、ＤＮＡシークエンサーを用いて決定した。縮重プライマー部分に相当する塩基配列は本来の配列と数塩基違っていることが多いため、新たに決定できた塩基配列をもとに、上記縮重プライマーに挟まれた部分のＤＮＡ配列からなる、センスプライマーとして配列番号６で示される（5′-GCGAGATGGACGCAAAGGAG-3′）とアンチセンスプライマーとして配列番号７で示される（5′-CTCTTCCAGTTGCTGTAGGT-3′）を作製した。ｃＤＮＡを鋳型として、これらセンスプライマーとアンチセンスプライマーを用いて、常法によりＰＣＲを実施した。得られたＤＮＡ断片約５５０ｂｐの塩基配列（中央部分）を、ＤＮＡシークエンサーを用いて決定した。
【００２７】
（５′末端及び３′末端の決定）
前記ＤＮＡ配列の塩基配列をもとにして、５′−ＲＡＣＥ(Rapid Amplification of cDNA ends)用のアンチセンスプライマーとして配列番号８〜１０で示される（5′-CTCCTTTGCGTCCATCTCGC-3′）、（5′-CCCTTTTCTCCTTTGCG-3′）及び（5′-GGCCCTGGTTCTCCCTT-3′）の３種のプライマーを作製し、ｃＤＮＡを鋳型として、５′−ＲＡＣＥ法により５′末端のＤＮＡ断片を得て、その塩基配列を決定した。また、同様に、３′−ＲＡＣＥ用のセンスプライマーとして配列番号１１〜１３で示される（5′- GGAGGAAGGATGACCTACAG -3′）、  （5′- ATGACCTACAGCAACTGGA -3′）及び（5′- TACAGCAACTGGAAGAG -3′）の３種のプライマーを作製し、３′−ＲＡＣＥ法により３′末端のＤＮＡ断片を得て、その塩基配列を決定した。
【００２８】
（cＤＮＡ全塩基配列の決定）
このようにして、決定されたｃＤＮＡのＤＮＡ配列を配列表の配列番号１に示す。また、上記ブタレクチンの部分ペプチド配列に関する知見から、このＤＮＡ配列における翻訳領域が、配列番号１に示される塩基配列のうち、１７６番目から９２２番目までの塩基配列に相当することがわかった。配列番号１に示されるＤＮＡ配列と、それから推定されるアミノ酸配列を図１に示す。なお図１中、「ｓ」はセンス鎖を、「ａｓ」はアンチセンス鎖を意味する。
【００２９】
配列番号２に示される本発明のブタ血清レクチンは、全長２４９アミノ酸からなり、図２に示されるように、３個のシステインを含むシステイン−リッチ構造や、多量体形成に関与すると考えられるコラーゲン様構造に特徴的なＧｌｙ−Ｘ−Ｙ（Ｘ及びＹは、Ｇｌｙ以外のアミノ酸）の１９回の繰返し部分を有する。また、動物レクチンの糖認識ドメイン（ＣＲＤ）で共通に保存されている１８個のアミノ酸が存在しており、この近傍のアミノ酸により糖特異性が決定されていると思われる。この図２に示された糖認識ドメイン（ＣＲＤ）に共通な配列は、マンナン、ガラクトース、Ｎ−アセチルグルコサミンに特異的なレクチンを含めて多くの動物レクチンに存在する（Kidny Int., 32：167-168, 1987）。
【００３０】
また、図３は本発明のブタ血清レクチンのハイドロパシー分析の結果を示すもので、図３に示すように、全長２４９アミノ酸からなる本発明のブタ血清レクチンのＮ−末端から最初の２０残基は、非常に疎水性が高く、典型的なシグナルペプチドと考えられ、成熟型のブタ血清レクチンは２２９個のアミノ酸からなり、その分子量は２６，５１４と算出された。
【００３１】
図４は、本発明のブタ血清レクチンのアミノ酸配列と、マンナンに特異的に結合するタンパク質である本出願前公知のマウス血清ＭＢＰ（ｍＭＢＰ−Ａ）、ラット血清ＭＢＰ（ｒＭＢＰ−Ａ）、マウス肝臓ＭＢＰ（ｍＭＢＰ−Ｃ）、ラット肝臓ＭＢＰ（ｒＭＢＰ−Ｃ）及びヒトＭＢＰ（ｈＭＢＰ）のアミノ酸配列との比較を示す図であり、図４からわかるように、本発明のブタ血清レクチンは、ｍＭＢＰ−Ａと６９．６％、ｒＭＢＰ−Ａと６６．５％、ｍＭＢＰ−Ｃと５３．６％、ｒＭＢＰ−Ｃと５２．０％、ｈＭＢＰと６１．４％の相同性を示した。また、ＣＲＤ上に本発明のブタ血清レクチンにのみ存在するアミノ酸が４ヶ所存在しており、ホスホマンナンへの特異性を規定している可能性も考えられる。
【００３２】
ブタ血清中に存在し、殺菌作用をもつタンパク質は、アミノ酸配列中にコラーゲン様領域やＣＲＤで共通のアミノ酸配列を持つことからＭＢＰと非常に類似したレクチンであると考えられる。また、マウスやラットの血清型ＭＢＰと構造的に高いホモロジーを持つことも分かった。しかし、本レクチンはホスホマンナンに結合特異性があり、傷害活性を示す細菌の種類がＭＢＰとは異なることが示されている。ブタ血清中にはマンナンに特異性を示すレクチンも存在しており、互いに機能的な役割分担を行っている可能性も考えられる。
【００３３】
【発明の効果】
本発明のブタレクチンは新規生理活性物質としての薬効が期待される。また本発明により、種々の表面糖構造を有する細菌等に対する生体防御機構、及びレクチンというタンパク質のファミリーの分子的な進化についての研究の進展を図ることができる。
【００３４】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のブタ血清レクチンのｃＤＮＡの塩基配列と、それから推定されるアミノ酸配列を示す図である。
【図２】本発明のブタ血清レクチンのアミノ酸配列を示す図である。
【図３】本発明のブタ血清レクチンのハイドロパシー分析の結果を示す図である。
【図４】本発明のブタ血清レクチンのアミノ酸配列と、本出願前公知のマンナンに特異的に結合するタンパク質のアミノ酸配列との比較を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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