(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
並列接続された複数のカラムに試料を導入し、溶出される成分を検出器で検出しながら必要な成分を分離するクロマトグラフィーによる連続分離法において、次の工程（１）〜（３）を含むことを特徴とするクロマトグラフィーによる連続分離方法。
（１）分離すべき成分数と同数の検出器と成分受器を用意し、第１カラム出口から溶出する溶出液が第２成分検出器を経由して第１成分受器に導かれ、第ｍ成分受器に第ｍ＋１成分検出器を経由する溶出液が導かれるように初期設定する工程
（２）試料を第１カラムから順番に時間を遅らせて順次導入し、最後のカラムに導入後さらに第１カラムから順番に試料を導入する操作を繰り返す工程
（３）工程（２）の試料導入開始後に、第ｍ成分検出器に導入されている第ｎカラム溶出液中に第ｍ成分が検出されるごとに、
ａ）第ｍ＋１成分検出器に他のカラムの溶出液が導入されていない場合は、第ｎカラム溶出液を第ｍ＋１成分検出器に導き、それ以外の場合は第ｎカラム溶出液を第ｍ成分受器に導き、
ｂ）第ｎ＋１カラム溶出液がいずれの検出器にも導かれていない場合は、第ｎ＋１カラム溶出液を第ｍ成分検出器に導く、
操作を繰り返す工程
（（１）〜（３）の各工程において、ｍは１以上検出器数以下の整数であり、ｍ＋１が検出器数を越える場合はｍ＋１を１とする。ｎは１以上カラム本数以下の整数であり、ｎ＋１がカラムの本数を越える場合はｎ＋１を１とする）
【請求項２】
工程（１）における各カラムへの試料導入開始時間を一定の間隔で遅らせることを特徴とする請求項１の連続分離法。
【請求項３】
工程（１）における各カラムへの試料導入時間を一定の長さに統一することを特徴とする請求項１または２の連続分離法。
【請求項４】
工程（３）ｂ）を、第ｎカラム出口から第ｍ成分検出器の間の配管溜りを第ｍ成分受器に導いた後に行なうことを特徴とする請求項１〜３のいずれかの連続分離法。
【請求項５】
溶離液を流すことによって配管溜りを第ｍ成分受器に導くことを特徴とする請求項４の連続分離法。
【請求項６】
配管溜りを第ｍ＋１成分受器に導くために溶離液を流す時間が、工程（１）における各カラムへの試料導入時間の４割以下であることを特徴とする請求項５の連続分離法。
【請求項７】
分離すべき成分数が２、３または４であることを特徴とする請求項１〜６のいずれかの連続分離法。
【請求項８】
試料中に含まれている成分を連続分離するためのクロマトグラフであって、
分離すべき成分数と等しい数の検出器（２９、３０）および成分受器（３１、３２）、並列に接続した２以上のカラム（１３〜２０）を少なくとも備えており、
各カラムの入口には、溶離液（１）か試料（２）のいずれかを選択的に導入するためのバルブ（５〜１２）が設置されており、
各カラムの出口には、溶出液を検出器（２９、３０）および成分受器（３１、３２）のいずれかに選択的に導くためのバルブ（２１〜２８）が設置されていることを特徴とするクロマトグラフ。
【請求項９】
検出器（２９、３０）出口には、溶出液をいずれかの成分受器（３１、３２）に選択的に導くためのバルブ（３３、３４）が設置されていることを特徴とする請求項８のクロマトグラフ。
【請求項１０】
カラム出口に設置したバルブの切り替えに伴って該バルブから検出器までの配管内に溜まる溶出液を、所定の成分受器に導く手段を備えていることを特徴とする請求項９のクロマトグラフ。
【請求項１１】
溶離液を配管内に導入することによって、配管内に溜まった溶出液を所定の成分受器に導く手段を備えていることを特徴とする請求項１０のクロマトグラフ。
【請求項１２】
分離すべき成分数が２、３または４であることを特徴とする請求項８〜１１のいずれかのクロマトグラフ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、試料中に含まれている複数の成分をクロマトグラフィーを利用して連続分離する方法に関する。また、本発明は、試料中に含まれている複数の成分を分離するためのクロマトグラフにも関する。
【０００２】
【従来の技術】
液体試料中に含まれている複数の成分を分離する方法として、クロマトグラフィーによる分離法が広く用いられている。クロマトグラフィーは一般に回分式で行われるが、これを連続化することが古くからの課題とされている。これまでに代表的な連続分離法として、十字流式分離法と疑似移動層式分離法が開発されて、実際に利用されている。
疑似移動層式分離法は、溶離液と充填剤が擬似的に向流に移動するように設定された分離法である。この方法は、分離すべき成分の分配係数差が約０．３以下であり、充填剤粒子径が約５０μｍ以上である系において行なうのが好ましいとされている（Hashimotoら，6th Conference of the Asia Pacific Confederation of Chemical Engineering, Australia, Official Proceedings Vol.２，３０７−３１２（１９９３））。疑似移動層式分離法は、今日ではとくに多糖を分離する際に有効に利用されている。しかしながら、この方法を実施するためのクロマトグラフは配管群が複雑であることから、医薬品成分のように少量で精密な分画を必要とする場合には利用することができないという問題がある。
【０００３】
十字流式分離法は、Journal of chromatography，７，４７７−４８４（１９６２）に記載される方法や、特開平６−２３２３７号公報に記載されている連続円環式クロマトグラフィー法によって行われている。十字流式分離法は、成分の分配係数差が約０．３以上であり、充填剤粒子径が約５０μｍ以下である系において行なうのが好ましいとされている。この方法には、疑似移動層式分離法のように複雑な系は要求されない。しかしながら、十字流式分離法を実施するためのクロマトグラフは、各カラムの性能が完全に同一であって同じクロマトグラムを描くことを前提にして設計されている。このため、何らかの外乱によってピークにずれが生じると、対応することができないという問題がある。したがって、医薬品成分のように高い純度が要求される成分の分離には、有効に利用することができなかった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
そこで本発明は、このような従来技術の問題点を解消し、何らかの外乱によってピークのずれが生じても、精密な分画を連続的に行なうことができるクロマトグラフィー連続分離法を提供することを目的とした。また、本発明は、分離すべき成分の分配係数差や充填剤の粒子径による制約を受けることなく利用することができるクロマトグラフィー連続分離法を提供することも目的とした。さらに、本発明は、そのようなクロマトグラフィー分離法を行なうことができるクロマトグラフを提供することをも目的とした。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
これらの課題を解決するために鋭意検討を進めた結果、本発明者らは、カラム出口に設置したバルブと検出器を特定の条件にしたがって連動させることによって、極めて精度の高い分画を連続的に行なうことができることを見出して、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、並列接続された複数のカラムに試料を導入し、溶出される成分を検出器で検出しながら必要な成分を分離するクロマトグラフィーによる連続分離法において、次の工程（１）〜（３）を含むことを特徴とするクロマトグラフィーによる連続分離方法を提供するものである。
（１）分離すべき成分数と同数の検出器と成分受器を用意し、第１カラム出口から溶出する溶出液が第２成分検出器を経由して第１成分受器に導かれ、第ｍ成分受器に第ｍ＋１成分検出器を経由する溶出液が導かれるように初期設定する工程
（２）試料を第１カラムから順番に時間を遅らせて順次導入し、最後のカラムに導入後さらに第１カラムから順番に試料を導入する操作を繰り返す工程
（３）工程（２）の試料導入開始後に、第ｍ成分検出器に導入されている第ｎカラム溶出液中に第ｍ成分が検出されるごとに、
ａ）第ｍ＋１成分検出器に他のカラムの溶出液が導入されていない場合は、第ｎカラム溶出液を第ｍ＋１成分検出器に導き、それ以外の場合は第ｎカラム溶出液を第ｍ成分受器に導き、
ｂ）第ｎ＋１カラム溶出液がいずれの検出器にも導かれていない場合は、第ｎ＋１カラム溶出液を第ｍ成分検出器に導く、
操作を繰り返す工程
上記（１）〜（３）の各工程において、ｍは１以上検出器数以下の整数であり、ｍ＋１が検出器数を越える場合はｍ＋１を１とする。ｎは１以上カラム本数以下の整数であり、ｎ＋１がカラムの本数を越える場合はｎ＋１を１とする。
【０００６】
また、本発明は、試料中に含まれている成分を連続分離するためのクロマトグラフであって、
分離すべき成分数と等しい数の検出器（２９、３０）および成分受器（３１、３２）、並列に接続した２以上のカラム（１３〜２０）を少なくとも備えており、
各カラムの入口には、溶離液（１）か試料（２）のいずれかを選択的に導入するためのバルブ（５〜１２）が設置されており、
各カラムの出口には、溶出液を検出器（２９、３０）および成分受器（３１、３２）のいずれかに選択的に導くためのバルブ（２１〜２８）が設置されていることを特徴とするクロマトグラフを提供するものでもある。
【０００７】
以下において、まず本発明のクロマトグラフから説明する。
図１は、本発明のクロマトグラフの典型的な構成例を示したものである。このクロマトグラフは、試料中に含まれている２つの成分を分離するための装置である。
本発明のクロマトグラフは、複数のカラム（１３〜２０）で構成されており、各カラムの入口と出口にはそれぞれバルブが設置されている。入口のバルブ（５〜１２）は、溶離液か試料を選択的に導入するために設置されており、例えば図３に示すバルブを使用することができる。図３のバルブをＥ方向に開いてポンプ（３）を稼動させれば、溶離液貯槽（１）内の溶離液がバルブを通ってカラムに導入される。また、図３のバルブをＦ方向に開いてポンプ（４）を稼動させれば、試料貯槽（２）内の試料がバルブを通ってカラムに導入される。
各カラムの出口に設置されるバルブ（２１〜２８）は、カラムからの溶出液を各検出器（２９、３０）および各成分用の受器（３１、３２）のいずれかに選択的に導くために設置されており、例えば図２に示すバルブを使用することができる。カラム出口からの溶出液は、図２のバルブをＡ方向に開けば第２成分検出器（２９）に導かれ、Ｂ方向に開けば第２成分受器（３２）に導かれる。さらに、Ｃ方向に開けば第１成分検出器（３０）に導かれ、Ｄ方向に開けば第１成分受器（３１）に導かれる。
【０００８】
入口と出口にバルブを設置した各カラムは並列に接続する。本明細書において、並列に接続するとは、他のカラムを経由することなく直接試料や溶離液をカラムに導入し、カラムから溶出される溶出液を他のカラムを経由することなく直接検出器や成分受器に導く接続方式をいう。並列接続の方式は特に制限されないが、効率よく安定な分離を行なうためには、すべてのカラムを差別なく同等に接続しておくのが好ましい。また、カラムの形状、容積、材質、厚み、充填剤の種類、粒径および量などについてもとくに制限されないが、これらの条件はすべてのカラムで実質的に同じにしておくのが好ましい。さらに、各カラムの入口に設置されるバルブ（５〜１２）および出口に設置されるバルブ（２１〜２８）も、それぞれ実質的に同じものを用いるのが好ましい。
【０００９】
第２成分検出器（２９）を通る溶出液は、図１に示すように、バルブ（３３）によって第１成分受器（３１）または第２成分受器（３２）のいずれかに選択的に導かれるようにしておくのが好ましい。本発明のクロマトグラフィーによる連続分離法によって分離を行なうと、第２成分検出器（２９）を通過する成分のほとんどは第１成分であり、第２成分は配管溜り程度に過ぎない。この配管溜りの第２成分が第１成分に混入することが許容される場合には、バルブ（３３）を設置せずに第２成分検出器の出口を直接第１成分受器（３１）に接続したクロマトグラフを用いても問題はない。
同様に、第１成分検出器（３０）を通る溶出液は、バルブ（３４）によって第２成分受器（３２）または第１成分受器（３１）のいずれかに選択的に導かれるようにしておくのが好ましい。
【００１０】
また、本発明のクロマトグラフには、前述の配管溜りを所定の成分受器に導くための洗浄手段が設置されているのが好ましい。たとえば、図１のクロマトグラフでは、第２成分検出器（２９）入口前の配管に溜まった第２成分を主とする溶出液を第２成分受器（３２）に入れるために、バルブ（３３）をＧ方向に開き、バルブ（３５）を開けてポンプ（３７）を稼動させれば洗浄することができるようになっている。こうすることによって、溶離液貯槽（１）内の溶離液が配管に溜まった溶出液を押し出すことができる。同様に、第１成分検出器（３０）入口前の配管に溜まった第１成分を主とする溶出液は、バルブ（３４）をＧ方向に開き、バルブ（３６）を開けてポンプ（３７）を稼動させることによって、第１成分受器（３１）に入れることができる。
【００１１】
図１は、分離すべき成分の数が２つである場合に用いるクロマトグラフを例示したものであるが、分離すべき成分数が３つ以上である場合にも図１と同様の基本構成を有するクロマトグラフを使用することができる。
たとえば、分離すべき成分数が３であるときは、検出器および成分受器を３つにし、カラム出口に設置するバルブの出口数は検出器と成分受器の数を足した値である６にする。分離すべき成分数が４以上の場合も同様にして計算する。なお、検出器出口に設置するバルブの出口数は、分離すべき成分数に関係なく２でよい。
なお、複数の化合物の混合物として分離するときには、その混合物が１つの「分離すべき成分」であるものとして「分離すべき成分数」を計算する。例えば、Ａ成分とＢ成分の混合物とＣ成分を分離する場合は、「分離すべき成分数」は２となり、検出器数および成分受器数も２つでよい。
一方、分離したい成分数は本明細書でいう「分離すべき成分数」に必ずしも一致しない。例えば、Ａ成分とＣ成分の２成分を分離したい場合であっても、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分の順に溶出するために３成分をそれぞれ個別に分離せざるを得ない場合には、「分離すべき成分数」は３になる。
以上の説明における検出器の数やバルブの出口数は、本発明に必要な最小限の数を挙げたものである。クロマトグラフにさらに別の機能をもたせるためにこれらの数を増やしたり、別の目的で追加のカラムを接続したりしても構わない。これらの付加や改変は、当業者が適宜行ない得る。
【００１２】
以下において、本発明のクロマトグラフィーによる連続分離法について説明する。
本発明の分離法を実施する際には、少なくとも分離すべき成分の数と同じ数の検出器、各成分を含む溶出液を入れるための成分受器、並列接続された複数のカラムから構成されるクロマトグラフを用いる必要がある。クロマトグラフの構成の詳細は、本発明の連続分離法を実施することができるものであれば特に制限されない。好ましいクロマトグラフは、上述の本発明のクロマトグラフである。
本発明の連続分離法を実施する前に、試料中に含まれる成分をあらかじめクロマトグラフィー法によって確認しておくのが好ましい。この予備試験は、本発明の連続分離法を実施するクロマトグラフのカラムと、サイズや充填剤が同じカラムを用いて行なうのが好ましい。また、クロマトグラフのカラムの中から１本を選択して予備試験を行なってもよい。この予備試験によって得られたクロマトグラムに基づいて、分離すべき成分数、試料濃度、試料導入速度、試料導入時間などを好ましい値に適宜設定することができる。
【００１３】
予備試験などによって分離すべき成分数を決定したならば、その成分数と同じ数の検出器と成分受器を用意して初期設定を行なう。各検出器はそれぞれ１種類の成分の溶出開始時間を決定するために用いられる。たとえば、第１成分検出器であれば、溶出液中に第１成分が初めて検出された時点を決定するために使用される。
各検出器を通過した溶出液は、それぞれ検出器が検出しようとしている成分の前に溶出する成分を入れる受器に導かれるようにしておく。たとえば、第１成分、第２成分、第３成分の順に溶出する試料を分離する場合には、第２成分検出器を通過した溶出液が第１成分受器に入り、第３成分検出器を通過した溶出液が第２成分受器に入り、第１成分検出器を通過した溶出液が第３成分受器に入るように配管しておく。また、試料導入前に、最初に試料を導入する第１カラムからの溶出液が第２成分検出器に導かれるように初期設定しておく。
【００１４】
初期設定後、第１カラムから順に、第２カラム、第３カラムへと導入開始時間を遅らせながら試料を導入して行く。最後のカラムへの導入が終わったら、再度第１カラムから導入を繰り返す。各カラムへの試料導入開始時間のずれや、試料導入時間、試料導入速度はとくに制限されない。これらの条件は、望ましい純度を達成できる範囲内で効率よく分離できるように決定するのが望ましい。精度の高い分離を行なうには、これらの条件をすべて一定にし、同種のカラムを用いて行なうのがよい。
試料導入後には溶離液を導入して試料をカラム内で移動させる。溶離液は次の試料導入があるまで流し続けてもよいし、カラム出口から最後の成分が溶出した後にいったん止め、次の試料導入を行なった後に再び流し始めてもよい。好ましいのは、カラムに常に試料または溶離液を交互に導入し、成分のピークが重ならない範囲でそのサイクルを短くする場合である。
【００１５】
とくに好ましいのは、分離に用いるカラムと同じカラムに試料を導入して各成分のピーク時間と分散をあらかじめ求めておき、これらの関数として溶出曲線を描くシミュレーションを行なうことによって、良好な分離を行なうことができる試料導入時間とカラムの本数を求めて分離を行なう場合である。以下に、２成分を分離する場合についてこの方法を具体的に説明する。
まず、予備試験として、導入時間が無視し得る程度の微量の試料をカラムに導入して、第１成分のピーク時間μ01と分散σ012、第２成分のピーク時間μ02と分散σ022を求める。この系において、試料の導入量を増やして試料導入時間がｈになった場合の第１成分のピーク時間μ1と分散σ12、第２成分のピーク時間μ2と分散σ22は、以下の式で表される（Kubin, M,"Beitrag zur Theorie der Chromatographie", Collect. Czech.Chem.Commun.,30,1104-1118(1965)）。
【数１】
μ1 ＝  μ01  ＋  ｈ／２
μ2 ＝  μ02  ＋  ｈ／２
σ12 ＝  σ012 ＋  ｈ2／１２
σ22 ＝  σ022 ＋  ｈ2／１２
吸光度Ａは、μとσの関数ｆ（μ，σ）であることから、溶出曲線は以下の式で表される。
【数２】
Ａ  ＝  ｆ1（μ1，σ1）  ＋  ｆ2（μ2，σ2）
【００１６】
関数ｆはガウス分布であることから、同じカラムに試料を繰り返して導入した場合の溶出曲線は、以下の式で表される。
【数３】
Ａ  ＝  Σ｛ｆ1（μ1＋ｉＴ，σ1）  ＋  ｆ2（μ2＋ｉＴ，σ2）｝
（ｉ＝０，１，２，３・・・）
上式において、Ｔは試料導入開始から次の試料導入開始までの時間である。この式を利用してシミュレーションを行なえば、分離後の第１成分と第２成分の純度を予測することができる。成分の純度を許容できる範囲内に維持しながら、可能な限りｈを大きくし、Ｔを小さくすることによって、ｈmaxとＴminを求めることができる。また、Ｔmin／ｈmaxによって最低限必要なカラムの本数を求めることもできる（小数点以下繰り上げ）。このようにして求めた試料導入時間ｈmaxで必要最小限のカラムに順次試料を導入して行けばもっとも効率のよい分離を行なうことができる。
【００１７】
各カラムから排出される溶出液は所定の成分受器に導かれる。その途中で、一部の溶出液に対して検出器による成分の検出がなされる。成分の検出は、溶出液に紫外線等を照射して吸光度を調べることによって行なうのが一般的である。成分の検出法はとくに制限されない。ただし、安定に検出することができない場合には、検出値に対して一次おくれの変換方式を用いるのが好ましい。
検出器が成分の検出を行なうごとに溶出液の流路を変更する。その変更は、以下のａ）およびｂ）にしたがって行う。これらは、第ｍ成分検出器によって第ｎカラムの溶出液内に第ｍ成分が検出された場合について一般化して記載したものである。なお、ｍ＋１が検出器数を越える場合はｍ＋１を１とし、ｎ＋１がカラムの本数を越える場合はｎ＋１を１とする。
ａ）第ｍ＋１成分検出器に他のカラムの溶出液が導入されていない場合は、第ｎカラム溶出液を第ｍ＋１成分検出器に導き、それ以外の場合は第ｎカラム溶出液を第ｍ成分受器に導き、
ｂ）第ｎ＋１カラム溶出液がいずれの検出器にも導かれていない場合は、第ｎ＋１カラム溶出液を第ｍ成分検出器に導く、
【００１８】
この流路の変更を具体的に説明する。
カラムに導入された試料は、順次第１カラム出口から溶出される。初期設定にしたがって、第１カラムから排出された溶出液は第２成分検出器を経由して第１成分受器に入り、その他のカラムから排出された溶出液は第１成分受器に検出器を経由せずに入る。第１カラムからの第１成分溶出が完了し、第２成分の溶出が始ったところで第２成分検出器が検出を知らせる（ｍ＝２、ｎ＝１）。これに伴って、上記ａ）にしたがって、第１カラム溶出液は第３成分分析器を経由して第２成分受器へと導かれる。また、上記ｂ）にしたがって、第２カラム溶出液が第２成分分析器を経由して第１成分受器へと導かれる。
その後、第２成分分析器と第３成分分析器がそれぞれ成分を検出すると、互いに独立に上記ａ）およびｂ）にしたがって流路の変更を行なう。
仮に第３成分分析器が先に第１カラム溶出液中に第３成分を検出したとすると（ｍ＝３、ｎ＝１）、上記ａ）にしたがって第１カラム溶出液は第４成分検出器を経由して第３成分受器へと導かれる。この段階では、第２カラム溶出液は依然として第２成分検出器に導かれているので、上記ｂ）による流路変更はない。このように、第２カラム溶出液中に第２成分の溶出が検出されるまでは、第１カラム溶出液中に所定の成分が検出されるたびに上記ａ）による流路変更のみがなされることになる。
【００１９】
一方、第３成分分析器が成分を検出する前に、第２成分分析器が第２カラム溶出液中に第２成分の溶出を検出したとすると（ｍ＝２、ｎ＝２）、上記ａ）にしたがって第２カラム溶出液は検出器を経由せずに直接第２成分受器に導かれる。また、上記ｂ）にしたがって第３カラム溶出液が第２成分分析器を経由して第１成分受器へと導かれる。この段階では、第３成分検出器には第１カラム溶出液が導かれ、第２成分分析器には第３カラム溶出液が導かれているが、さらに第２成分分析器が先に第２成分の溶出を検出したとすると（ｍ＝２、ｎ＝３）、上記ａ）にしたがって第３カラム溶出液は検出器を経由せずに直接第２成分受器に導かれ、上記ｂ）にしたがって第４カラム溶出液が第２成分検出器を経由して第１成分受器に導かれる。このように、第１カラム溶出液中に第３成分の溶出が検出されるまでは、第２成分検出器が検出をするたびに上記ａ）の「それ以外の場合」およびｂ）による流路変更がなされることになる。
このように各検出器による成分検出と流路変更は、上記ａ）およびｂ）にしたがって互いに独立に行われる。このような成分検出と流路変更は、検出器やカラムの数の多少にかかわらず同様に行なうことができる。
【００２０】
また、すべての検出器またはカラムを利用した後は、再度最初の検出器またはカラムから利用を始める。たとえば、検出器を３台使用する場合には、３番目の検出器による検出が終了した溶出液は、次に最初の検出器による検出を行なうことになる。こうすることによって、連続的な分離が可能になる。
検出器による検出に伴う流路の変更は、当業者に周知の方法のいずれかを用いて行なうことができる。もっとも簡便で好ましい方法は、バルブによる制御である。例えば、図１に示すクロマトグラフのように、カラム（１３〜２０）出口にバルブ（２１〜２８）を設置しておき、検出器（２９、３０）による検出のたびに所定のバルブが指定された向きになるようにコンピューター制御する方法がある。
【００２１】
なお、本発明の連続分離法を実施するにあたっては、試料を最初に導入したカラムから順番に各成分の溶出が始まる限り、各カラムごとに設定条件を変えてもよい。すなわち、試料を第１カラム、第２カラム、第３カラムの順に導入したときに、第１カラム、第２カラム、第３カラムの順に分離すべき成分の溶出が始るのであれば、各カラムの容積、流速、形状、導入試料の量などを適宜変えてもよい。換言すれば、各カラムの条件は必ずしも統一する必要はなく、成分溶出順に変動がない範囲で条件のばらつきがあっても許容される。許容される条件の範囲は、分離しようとする成分の試料中濃度、溶出時間などによる影響を受けるため、具体的なケースごとに予備試験を行なって決定すべきである。このように、本発明の連続分離法は使用する各カラムの条件を厳密に統一することが必ずしも要求されないことから、突発的な外乱によってクロマトグラムに変動が生じたとしてもその影響を受け難いという特徴を有する。また、厳密性が要求されないことから、本発明を実施するためのクロマトグラフの作製が比較的容易であるという利点もある。また、なお、厳密な分離が要求される場合には、各カラムの条件は統一しておくのが好ましい。
【００２２】
本発明の連続分離法を用いれば、検出器の使用台数を少なくすることができるという利点がある。従来のクロマトグラフでは、カラム出口にそれぞれ検出器を接続して各カラムごとに溶出液の分析をしていたため、カラム本数分の検出器が必要であった。このため、カラムの本数を増やすと処理能力は上がるものの、高価な検出器が多数必要になり、検出器ごとに検出に応じたバルブ制御装置等が必要になるという問題があった。このため、カラム本数を増やすとクロマトグラフが複雑化してコストがかかる反面、カラム本数を減らすと十分な処理能力が得られないというジレンマがあった。
本発明の連続処理方法によれば、カラム本数を増やしても検出器の台数は分離すべき成分数に限られるため、このような問題は生じない。これは、試料導入順に各カラムから成分が溶出するため、成分の溶出が検出されるたびに次に該成分の溶出が予定されているカラム出口に検出器を接続する操作を繰り返しているためである。したがって、本発明の連続分離法には、複雑なクロマトグラフが要求されず、コストも抑制することができるという特徴もある。
【００２３】
また、本発明の連続分離法では、配管溜りによる純度ロスの回避を行なうのが好ましい。
検出器によって成分の検出がなされた時点では、すでにカラム出口から検出器までの配管にはその成分を含む溶出液が入っている。このため、これを放置したまま次のカラム溶出液の検出を始めると、この配管溜りの溶出液が不純物として成分受器に混入してしまう。たとえば、第２成分検出器が第２成分を検出した後に、そのまま次のカラム溶出液を流通させると、配管溜りの第２成分が第１成分受器に流れ込んでしまう。これによる純度低下が許容範囲内であれば問題はないが、できるだけ高い純度で分離することが必要とされている場合には配管溜りを所定の成分受器に導くための洗浄工程を行なう必要がある。また、充填剤の粒子径が小さい場合には、配管溜りの影響を受けやすいので洗浄工程を行なうのが好ましい。
【００２４】
洗浄工程は、所定の成分受器に向かって配管溜りに溶離液を流すことによって行なうことができる。この洗浄用溶離液は、検出器へ向かって流してもよいし、その逆の方向に流してもよい。洗浄用溶離液を検出器に向かって流す場合には、検出器出口にバルブを設置し、洗浄液が所定の成分受器に流れ込むようにしておくのが好ましい。例えば、図１のクロマトグラフを使用する場合には、第２成分検出器（２９）入口前の配管に溜まった第２成分を主とする溶出液を第２成分受器（３２）に入れるために、バルブ（３３）をＧ方向に開き、バルブ（３５）を開けてポンプ（３７）を稼動させればよい。洗浄の時間は、各カラムへの試料導入時間を越えない範囲で設定する。とくに、カラムへの試料導入時間の４割以下にするのが好ましい。
この洗浄工程を行なう場合、上記の流路変更操作ａ）は検出器が成分を検出した時点で行ない、ｂ）は検出器の洗浄が完了した時点で行なう。第ｍ＋１成分検出器が洗浄中である場合は、条件ａ）の「それ以外の場合」に該当する。このようにすることによって、洗浄を組み入れた自動制御が可能になる。本発明の連続分離法にこのような洗浄工程を入れることによって、分離する成分の純度をさらに高めることができる。
【００２５】
【実施例】
以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する。以下の実施例に示すクロマトグラフの構成、試料組成、操作条件、操作順序等は、本発明の精神から逸脱しない限り適宜変更することができる。したがって、本発明の範囲は以下の実施例に示す具体例に制限されるものではない。
本実施例では、図１に示すクロマトグラフを使用して、下記構造を有するフマル酸セモチアジル（Ｒ体）とその光学異性体（Ｓ体）からなるラセミ体を光学分割した（Ｒ体とＳ体の分配係数差１以上）。
【化１】
0003783984.tif 000002
ラセミ体は４重量％のエタノール溶液として、試料貯槽（２）に入れた。また、１００％エタノールを溶離液とし、溶離液貯槽（１）に入れた。
カラムは、内径４．６ｍｍ、長さ２５０ｍｍの Chiralpak AS （ダイセル化学（株）製：充填剤粒子径１０μｍ）を８本使用した。また、Ｒ体およびＳ体を検出するために、溶出液に３００ｎｍの紫外線を照射してその吸光度変化を測定するように検出器を設定した。
【００２６】
クロマトグラフのカラム入口に設置した各バルブの向きは、バルブ（５）のみＦ方向とし、その他のバルブ（６〜１２）はＥ方向とした。また、カラム出口に設置した各バルブの向きは、バルブ（２１）をＡ方向とし、バルブ（２２〜２８）をＤ方向とした。また、検出器出口に設置したバルブ（３３、３４）の向きはＨ方向とした。また、洗浄用溶離液の流路に設置されたバルブ（３５、３６）は共に閉じておいた。
ポンプ（４）を稼動して試料貯槽（２）中のラセミ体溶液を第１カラム（１３）から順番に０．６ｍｌ／分で導入した。各カラムへの導入時間は２分とした。１本のカラムへの導入が終了した時点で、そのカラムの入口バルブをＥ方向にして溶離液の導入を開始し、同時に次のカラムの入口バルブをＦ方向にしてラセミ体溶液の導入を開始した。このようにして第１カラム（１３）にラセミ体溶液の導入を開始してから１６分後に第８カラム（２０）への導入が完了した。その後も、続けて第１カラム（１３）から同様にラセミ体溶液の導入を継続し、計１時間導入を行なった。その後、全カラムからＲ体およびＳ体が溶出するまで溶離液をカラムに導入し続けた。
【００２７】
カラム出口のバルブ（２１〜２８）の向きは、以下のａ）およびｂ）にしたがって制御した。条件ａ）およびｂ）は、第ｍ成分検出器によって第ｎカラムの溶出液内に第ｍ成分を検出した場合について一般化して記載したものである（第１成分がＲ体、第２成分がＳ体に対応する）。成分を検出した時点でａ）にしたがってバルブを操作し、ただちに検出器の洗浄を開始した。検出器の洗浄が完了した時点で、さらにｂ）にしたがってバルブを操作した。なお、以下のａ）およびｂ）において、ｍ＋１が２を越える場合はｍ＋１を１とし、ｎ＋１が８を越える場合はｎ＋１を１とする。
ａ）第ｍ＋１成分検出器に他のカラムの溶出液が導入されていない場合は、第ｎカラム溶出液を第ｍ＋１成分検出器に導き、それ以外の場合は第ｎカラム溶出液を第ｍ成分受器に導いた。
ｂ）第ｎ＋１カラム溶出液がいずれの検出器にも導かれていない場合は、第ｎ＋１カラム溶出液を第ｍ成分検出器に導いた。
【００２８】
検出器の洗浄は、成分が検出された時点で溶離液のポンプ（３７）を駆動し、バルブ（３５、３６）を開き、検出器出口のバルブ（３３、３４）をＧ方向にして溶離液を３．６ｍｌ／分で３０秒間流すことによって行なった。洗浄終了時には、ポンプ（３７）を止め、バルブ（３５、３６）を閉じて、検出器出口のバルブ（３３、３４）をＨ方向に戻した。
この方法にしたがって、ラセミ体溶液を１時間カラムに導入し続けた後、溶離液を流すことによってすべてのＲ体およびＳ体の溶出が完了したところで系を止めた。第１成分受器に入っているＲ体の純度と、第２成分受器に入っているＳ体の純度を測定したところ、ともに純度は９９％を越えていた。なお、本明細書でいう純度は、Ｒ体とＳ体の濃度差を、Ｒ体とＳ体の総濃度で割った値である。
また、同じ方法によって、ラセミ体溶液導入時間だけを３時間に延長して分離した場合も、Ｒ体およびＳ体の純度の悪化は認められなかった。
【００２９】
さらに、比較のために、検出器を用いないで、カラムへのラセミ体溶液導入開始から所定の時間が経過するごとにカラム出口のバルブ（２１〜２８）を自動的に切り替える方法を用いて分離を行なった。バルブ（２１〜２８）の切り替えのタイミングは、上記実施例の第１カラムに最初のラセミ体溶液を導入したときの出口バルブ（２１）切り替えのタイミングを採用した。この方法は、図１のクロマトグラフを用いて行ったが、バルブ（３３、３４）は常にＨ方向とし、バルブ（３５、３６）は閉じたままにした。ラセミ体溶液のカラムへの導入条件等は、上記実施例と同じにして１時間分離を行なった。その結果得られたＲ体およびＳ体の純度はともに約９６％であった。
【００３０】
【発明の効果】
本発明のクロマトグラフィーによる連続分離法によれば、外乱による影響を受けることなく、多量の試料を効率よく分離することができる。また、本発明の連続分離法は、成分の分配係数差や充填剤の粒子径による制約を受けることなく利用することができる。さらに、バルブ切り替えに伴って検出器とカラム出口の間に溜まる配管溜りを洗浄して所定の受器に導くことによって、分離される成分の純度をより高めることができる。本発明のクロマトグラフを用いれば、本発明の連続分離法を良好に実施することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のクロマトグラフの全体構成を示す概略図である。
【図２】カラム出口に接続されたバルブ（２１〜２８）の概略図である。
【図３】カラム入口に接続されたバルブ（５〜１２）の概略図である。
【図４】検出器出口に接続されたバルブ（３３、３４）の概略図である。
【符号の説明】
１：  溶離液貯槽
２：  試料貯槽
３、４、３７：  ポンプ
５〜１２：  バルブ（３方弁：図３参照）
１３〜２０：  カラム
２１〜２８：  バルブ（５方弁：図２参照）
２９：  第２成分検出器
３０：  第１成分検出器
３１：  第１成分受器
３２：  第２成分受器
３３、３４：  バルブ（３方弁：図４参照）
３５、３６：  開閉バルブ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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