(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
白血球細胞が血管内皮細胞へ接着するのを阻害する成分としてテオブロマカカオ(Theobroma cacao)の種実の抽出物を含有することを特徴とする細胞接着阻害剤。
【請求項２】
テオブロマ カカオの種実が脱脂した胚乳部である請求項１に記載の細胞接着阻害剤。
【請求項３】
抽出物が水、酸溶液、アルカリ溶液又はアルコール溶液を用いて抽出したものである請求項１又は２に記載の細胞接着阻害剤。
【請求項４】
抽出物が抽出液又はその濃縮液である請求項１〜３のいずれか１つに記載の細胞接着阻害剤。
【請求項５】
抽出物が抽出液を乾燥したものである請求項１〜４のいずれか１つに記載の細胞接着阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、嗜好飲料の原料となる植物体の抽出物を投与して白血球細胞が血管内皮細胞へ接着するのを阻害する細胞接着阻害剤に関するものである。
【００２】
すなわち、この発明は、白血球細胞が血管内皮細胞に接着するのを防ぐ細胞接着阻害剤に関するものであり、生体内又は生体外の実験系に利用することができる。これにより、白血球細胞の血管内皮細胞へ接着する能力を測定して生体への影響を予測したり、人体へ直接使用して血管や心臓などの循環器系の障害の防止、更には脳溢血などの脳障害の予防のための製剤の一成分として用いることなどが期待できる。
【００３】
【発明が解決しようとする課題】
接着因子の発現を誘導させる物質、すなわちサイトカインあるいはエンドキシンにより誘導された血管内皮細胞は、その表面にＥ−セレクチンを発現させる。このＥ−セレクチンと血液中を流れる白血球細胞とは、互いに緩い接着とその分離を繰り返すため、白血球細胞は血管内壁をローリングしながらその速度を落として行く。やがて白血球細胞は、他の接着因子により血管内皮細胞と強固に接着し、さらに細胞間接合部を通過して血管内皮下に定着する。白血球細胞が血管内皮下に定着し、泡沫細胞化すると血管を狭くし、血管壁を硬化する。さらに、血栓や血管閉塞の原因ともなるなど、循環器や脳の障害へと進むことが知られている。従って、白血球細胞が血管内皮細胞へ接着する能力を測定したり、白血球細胞が血管内皮細胞へ接着することを阻害することは、循環器系や脳の障害を防止する上で重要なことである。
【００４】
【課題を解決するための手段】
この発明の発明者は、テオブロマ カカオ (Theobroma cacao)の種実などの嗜好飲料の原料となる植物の抽出物が、白血球細胞が血管内皮細胞へ接着するのを阻害することを見いだし、この発明を完成させた。すなわち、本発明の細胞接着阻害剤は、白血球細胞が血管内皮細胞へ接着するのを阻害する成分としてテオブロマカカオ (Theobroma cacao)の種実の抽出物を含有することを特徴とする。
【００５】
［原料の嗜好飲料植物］この発明に用いる原料の嗜好飲料植物としてテオブロマカカオの種実が利用されるが、テオブロマ カカオの種実として胚乳部、特に脱脂した胚乳部であるココアに好ましい効果がみられた。
【００６】
［抽出物の調製法］原料であるココアなどの嗜好飲料植物を水又はアルコールなどに浸漬して抽出した後、濾過、遠心分離、フィルタープレスなどの公知の方法により抽出残渣と分離して抽出液とする。水にて抽出する場合、酢酸、クエン酸、乳酸、酢酸などの酸を加えた酸性溶液やアンモニア、炭酸アルカリ塩、有機酸アルカリ塩などを加えたアルカリ性溶液として抽出してもよい。すなわち、抽出するときｐＨ２〜１２の範囲で行うことが可能である。また、アルコールとして、水を加えたアルコール溶液を用いることも可能である。
【００７】
抽出は、常温、常圧にて行ってもよいが、好ましい濃度とするには時間がかかるので加熱して行うのがよい。加熱は、８０℃以上とするのがよく、加圧して１００℃以上で行うのが望ましい。
このようにして得た抽出液は、そのまま、又は濃縮液として用いる。濃縮は、加熱濃縮、減圧濃縮、凍結濃縮などの公知の方法が用いられる。また、抽出液又は濃縮液を加熱乾燥、噴霧乾燥、泡沫乾燥、減圧乾燥、凍結乾燥などにより乾燥して乾燥物として用いることもできる。
【００８】
このようにして得たココアなどの嗜好飲料植物の抽出物は、白血球細胞の血管内皮細胞へ接着するのを阻害した。すなわち、血管内皮細胞を培養プレートで培養し、培養プレートの各ウエルの器壁に血管内皮細胞の単層を形成させ、そこに血管内皮細胞の接着因子を誘導する因子と嗜好飲料植物の抽出物とを加え、所定時間インキュベートしてから白血球細胞を加え、一定時間培養後各ウエル内の血管内皮細胞に接着した白血球細胞の数を数えた結果、嗜好飲料植物抽出物を加えずに同様に処理したときの数に比べ、血管内皮細胞に接着した白血球細胞の数が極端に少なくなった。
【００９】
◎血管内皮細胞へ接着した白血球細胞の数と阻害率の求め方
血管内皮細胞としてヒト臍帯静脈内皮細胞（森永生科学研究所製）を２４ウエル培養プレートの各ウエルに２.５×１０5cells／０.５０ml／well添加し、５％炭酸ガスインキュベーターで３７℃にて一晩培養して増殖した細胞が各ウエルの底部に単層を形成するようにした。このとき牛胎児血清を１０％加えたＭＣＤＢ１０５に５μg／mlのゲンタマイシンを添加した培地を用いた。次いで、接着因子の発現を誘導させるためにＬＰＳ（リポポリサッカライド）を終濃度で１μg／mlと、同時に所要量の嗜好飲料植物の抽出物を加え、３時間培養した。
【０１０】
次いで、ＬＰＳの含まれた培地を除き、各ウエルをＬＰＳが入っていない新たな培地で洗浄してから、ヒト由来白血球細胞株（ＨＬ−６０株、又はＵ−９３７株）を２.０×１０6cell／mlとなるように各ウエルに加え、次いで培地中に浮遊している細胞を各ウエルの底部に接するよう室温にて培養プレートを２分間５００回／分の遠心処理してから、３７℃にて５％炭酸ガス雰囲気中で１５分間培養し、接着反応を行わせた。
【０１１】
次いで、血管内皮細胞に接着しなかった白血球細胞を燐酸緩衝液で洗浄して取り除いてから、顕微鏡下で血管内皮細胞に接着した白血球細胞の数を測定し、更に写真に撮影した。写真では、血管内皮細胞の黒色のバックに白血球細胞が白い斑点として写り、容易に計数することができた。写真に写った白血球細胞の数を（抽出物添加接着細胞数）とした。また、嗜好飲料植物抽出物を加えずに同様に接着因子発現のための誘導処理及び接着反応を行ったときの血管内皮細胞に接着した白血球細胞の数を（対象接着細胞数）とし、次の式により嗜好飲料植物の抽出物による血管内皮細胞への白血球細胞の接着に対する阻害率を計算した。
【０１２】
【数１】
0003817311.tif 000002
【０１３】
【実施例】
実施例１
ソックスレー抽出器を用いてｎ−ヘキサンで脱脂したココア１３ｇを１回当たり２００mlのｎ−ヘキサンを用いて２回洗浄して、更に脱脂処理した。この脱脂処理したココアに８０％エチルアルコールを１回に２００ml用いて３回抽出処理して各回の抽出液を合わせてアルコール抽出液とした。
【０１４】
次いで、アルコール抽出したときの残渣に１.０％酢酸水溶液１００mlを加え抽出処理して酸抽出液とした。
【０１５】
更に、酢酸抽出処理した残渣に１.４％アンモニア水溶液１５０mlを加え抽出処理してアルカリ抽出液とした。
各抽出液は、減圧濃縮により１０mlに濃縮し、溶媒を水に置換した後、０.２μmフィルターで滅菌濾過して白血球細胞の血管内皮細胞への接着を阻害する抽出物とした。
【０１６】
実施例２
実施例１と同様にして脱脂処理したココア、緑茶、ウーロン茶、紅茶などの嗜好飲料植物の各５ｇにそれぞれ１００mlずつの水を加え、オートクレーブに入れ、１２１℃で１５分間加熱した後濾過してそれぞれの抽出液を得た。なお、各々の抽出液は、抽出処理のときの加熱により滅菌されており、このまま白血球細胞の血管内皮細胞への接着を阻害する物質として利用できた。
【０１７】
実施例３
市販のココア５ｇを炭酸水素ナトリウムでｐＨ１２とした溶液１００mlに加え、オートクレーブに入れ、１２１℃で１５分間加熱した後濾過して抽出液を得た。この抽出液を減圧濃縮して１０mlの白血球細胞の血管内皮細胞への接着を阻害する抽出物とした。
また、同様に処理して得た濃縮液１０mlを減圧乾燥して、０.７ｇの粉末状の白血球細胞の血管内皮細胞への接着を阻害する抽出物とした。
【０１８】
［測定結果１］
実施例１に記載のアルコール溶液、酸性溶液、アルカリ性溶液で抽出して得たそれぞれの嗜好飲料植物の抽出物を接着因子誘導時に培地の２５０分の１加え、血管内皮細胞に接着した白血球細胞の数を測定し、またその数から接着の阻害率を計算した結果を表１にに示す。なお、対象は、嗜好飲料植物の抽出物を加えないで同様に処理したときの血管内皮細胞へ接着した白血球細胞の数である。
【０１９】
【表１】
0003817311.tif 000003
【０２０】
［測定結果２］
実施例２で得た脱脂ココア、緑茶、ウーロン茶、紅茶などの嗜好飲料植物から抽出した抽出物を測定結果１と同様に培地の２５０分の１となる量加え、血管内皮細胞へ接着した白血球細胞の数及び接着の阻害率を求めた結果を表２に示す。なお、対象細胞接着数は、抽出物を加えないで同様に処理したときの血管内皮細胞に接着した白血球細胞の数である。また、阻害率は、各嗜好飲料植物を加えたときの接着細胞数を抽出物添加接着細胞数、対象の接着細胞数を対象接着細胞数として求めた。
【０２１】
【表２】
0003817311.tif 000004