(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のアミノ酸配列を含むヒト転写関連蛋白質。
【請求項２】
請求項１記載のヒト転写関連蛋白質をコードするヒト遺伝子。
【請求項３】
請求項２のヒト遺伝子のｃＤＮＡであって、配列番号２の塩基配列を含むｃＤＮＡ。
【請求項４】
配列番号２の塩基配列における１０ｂｐ以上の連続配列からなり、請求項２の遺伝子または請求項３のｃＤＮＡに対するプローブとして機能するＤＮＡ断片。
【請求項５】
請求項３のｃＤＮＡを保有する組換えベクター。
【請求項６】
請求項１のヒト転写関連蛋白質に対する抗体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この出願の発明は、ヒト核蛋白質Ｎpw38と結合する新規なヒト転写関連蛋白質と、この蛋白質をコードしているヒト遺伝子、この遺伝子のｃＤＮＡ、および上記蛋白質に対する抗体に関するものである。この発明の蛋白質および抗体は、各種疾患の診断および治療に有用であり、ヒトｃＤＮＡは遺伝子診断用プローブや遺伝子治療用遺伝子源として有用である。また、ｃＤＮＡは、この発明の蛋白質を大量生産するための遺伝子源として用いることが出来る。
【０００２】
【従来の技術】
ヒト核蛋白質Ｎpw38は、ＷＷドメインを有する３８ｋＤａの核蛋白質として見いだされた［小室ら、第７０回日本生化学会大会講演要旨集、p.548 ］。ＷＷドメインとはＳＨ２、ＳＨ３、ＰＨ、ＰＴＢドメインと類似した蛋白質−蛋白質相互作用モチーフの新しいファミリーである。このドメインは、２個の保存されたトリプトファンを持つ約40アミノ酸残基からなり、ＳＨ３ドメインと同様にプロリンリッチなアミノ酸配列に結合することが知られている[H. I. Chen and M. Sudol. (1995 ) Proc. Natl. Sci.92, 7819-7823]。Ｎｐｗ３８のＷＷドメインは、転写活性促進作用を有することが示されている［小室ら、第２０回日本分子生物学会年会講演要旨集、ｐ．３６９］。したがって、このＷＷドメインに結合する蛋白質が、転写活性化に関与していると考えられる。
【０００３】
転写活性に関与する因子は、発生・分化などの生命現象のみならず、癌等の疾患とも密接に関係している［村松正寛編、NEW メディカルサイエンス、「転写のしくみと疾患」］。従って、これらの蛋白質は特定遺伝子の転写・翻訳を調節する低分子医薬品を開発するためのターゲット蛋白質としての可能性を秘めており、できるだけ多くの転写関連蛋白質を得ることが望まれている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
この出願の発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであり、医薬品などの開発に有用なヒト蛋白質、特に、ヒト核蛋白質Ｎpw38と結合する新規な転写関連蛋白質を提供することを課題としている。
またこの出願の発明は、この蛋白質をコードするヒト遺伝子、この遺伝子のｃＤＮＡおよび蛋白質に対する抗体などの遺伝子操作材料を提供することを課題としている。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
この出願は、上記の課題を解決する発明として、配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むヒト転写関連蛋白質を提供する。
また、この出願は、配列番号１のアミノ酸配列における１もしくは複数のアミノ酸が、欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含むヒト転写関連蛋白質を提供する。
【０００６】
さらに、この出願は、上記のヒト転写関連蛋白質をコードするヒト遺伝子、この遺伝子のｃＤＮＡであって、配列番号２の塩基配列を含むｃＤＮＡ、および配列番号２の一部配列からなるＤＮＡ断片を提供する。
さらにまた、この出願は、上記ｃＤＮＡを保有する組換えベクター、および上記のヒト転写関連蛋白質に対する抗体を提供する。
【０００７】
以下、この発明の実施の形態について詳しく説明する。
【０００８】
【発明の実施の形態】
この発明のヒト転写関連蛋白質は、公知の方法、すなわちヒトの臓器、細胞株などから単離する方法、この発明によって提供されるのアミノ酸配列に基づき化学合成によってペプチドを調製する方法、あるいはこの発明によって提供されるｃＤＮ断片を用いて組換えＤＮＡ技術で生産する方法などにより取得することができる。例えば、組換えＤＮＡ技術によって蛋白質を取得する場合には、この発明のｃＤＮＡ断片を有するベクターからインビトロ転写によってＲＮＡを調製し、これを鋳型としてインビトロ翻訳を行なうことによりインビトロで発現できる。また翻訳領域を公知の方法により適当な発現ベクターに組換えてやれば、大腸菌、枯草菌、酵母、動物細胞等で、コードしている蛋白質を大量に発現させることができる。
【０００９】
この発明の蛋白質をインビトロ翻訳でＤＮＡを発現させて生産させる場合には、このｃＤＮＡの翻訳領域をＲＮＡポリメラーゼプロモーターを有するベクターに組換え、プロモーターに対応するＲＮＡポリメラーゼを含む、ウサギ網状赤血球溶解物や小麦胚芽抽出物などのインビトロ翻訳系に添加してやれば、この発明の蛋白質をインビトロで生産することができる。ＲＮＡポリメラーゼプロモーターとしては、Ｔ７、Ｔ３、ＳＰ６などが例示できる。これらのＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含むベクターとしては、ｐＫＡ１、ｐＣＤＭ８、ｐＴ３／Ｔ７
１８、ｐＴ７／３  １９、ｐＢluescript IIなどが例示できる。
【００１０】
この発明の蛋白質を大腸菌などの微生物でＤＮＡを発現させて生産させる場合には、微生物中で複製可能なオリジン、プロモーター、リボソーム結合部位、ｃＤＮＡクローニング部位、ターミネーター等を有する発現ベクターに、この発明のｃＤＮＡの翻訳領域を組換えた発現ベクターを作成し、この発現ベクターで宿主細胞を形質転換したのち、得られた形質転換体を培養してやれば、このｃＤＮＡがコードしている蛋白質を微生物内で大量生産することができる。この際、任意の翻訳領域の前後に開始コドンと停止コドンを付加して発現させてやれば、任意の領域を含む蛋白質断片を得ることができる。あるいは、他の蛋白質との融合蛋白質として発現させることもできる。この融合蛋白質を適当なプロテアーゼで切断することによってこのｃＤＮＡがコードする蛋白質部分のみを取得することもできる。大腸菌用発現ベクターとしては、ｐＵＣ系、ｐＢluescript II、ｐＥＴ発現システム、ｐＧＥＸ発現システムなどが例示できる。
【００１１】
この発明の蛋白質を真核細胞でＤＮＡを発現させて生産させる場合には、このｃＤＮＡの翻訳領域を、プロモーター、スプライシング領域、ポリ（Ａ）付加部位等を有する真核細胞用発現ベクターに組換え、真核細胞内に導入してやれば、この発明の蛋白質を動物細胞内で生産することができる。発現ベクターとしては、ｐＫＡ１、ｐＣＤＭ８、ｐＳＶＫ３、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐＢＫ−ＲＳＶ、ＥＢＶベクター、ｐＲＳ、ｐＹＥＳ２などが例示できる。真核細胞としては、サル腎臓細胞ＣＯＳ７、チャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯなどの哺乳動物培養細胞、出芽酵母、分裂酵母、カイコ細胞、アフリカツメガエル卵細胞などが一般に用いられるが、この蛋白質を発現できるものであれば、いかなる真核細胞でもよい。発現ベクターを真核細胞に導入するには、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法など公知の方法を用いることができる。
【００１２】
この発明の蛋白質を原核細胞や真核細胞で発現させたのち、培養物から目的蛋白質を単離精製するためには、公知の分離操作を組み合わせて行うことができる。例えば、尿素などの変性剤や界面活性剤による処理、超音波処理、酵素消化、塩析や溶媒沈殿法、透析、遠心分離、限外濾過、ゲル濾過、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーなどが挙げられる。
【００１３】
この発明の蛋白質には、配列番号１で表されるアミノ酸配列のいかなる部分アミノ酸配列を含むペプチド断片（５アミノ酸残基以上）も含まれる。これらのペプチド断片は抗体を作製するための抗原として用いることができる。この発明の蛋白質には、他の任意の蛋白質との融合蛋白質も含まれる。例えば、実施例に挙げたグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合蛋白質などである。
【００１４】
この発明の遺伝子は、上記蛋白質をコードするヒトの遺伝子であって、例えば、この発明のｃＤＮＡまたはその一部配列をプローブとして、既存のゲノムライブラリーから単離することができる。
この発明のｃＤＮＡは、例えばヒト細胞由来ｃＤＮＡライブラリーからクローン化することができる。ｃＤＮＡはヒト細胞から抽出したポリ（Ａ）＋ＲＮＡを鋳型として合成する。ヒト細胞としては、人体から手術などによって摘出されたものでも培養細胞でも良い。ｃＤＮＡは、岡山−Berg法［Okayama, H and Berg, P., Mol. Cell. Biol. 2:161-170 (1982)］、Gubler−Hoffman 法［Guler, U. and Hoffman, J. Gene 25:263-269 (1983)］等、いかなる方法を用いて合成してもよいが、完全長クローンを効率的に得るためには、実施例にあげたようなキャッピング法［Kato, S. et al. Gene 150:243-250 (1994) ］を用いることが望ましい。また市販のヒトｃＤＮＡライブラリーを用いることもできる。ｃＤＮＡライブラリーからこの発明のｃＤＮＡをクローン化するには、この発明のｃＤＮＡの任意の部分の塩基配列に基づいてオリゴヌクレオチドを合成し、これをプローブとして用いて、公知の方法によりコロニーあるいはプラークハイブリダイゼーションによるスクリーニングを行えばよい。また、目的とするｃＤＮＡ断片の両末端にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを合成し、これをプライマーとして用いて、ヒト細胞から単離したｍＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲ法により、この発明のｃＤＮＡ断片を調製することもできる。
【００１５】
この発明のｃＤＮＡは、配列番号２で表される塩基配列を含むことを特徴とするものであり、1926bpのオープンリーディングフレームを有している。このオープンリーディングフレームは、641 アミノ酸残基からなる蛋白質をコードしている。
この発明の蛋白質は、いかなる組織でも発現しているので、配列番号２に記載のｃＤＮＡの塩基配列に基づいて合成したオリゴヌクレオチドプローブを用いて、ヒト細胞から作製したヒトｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、この発明のｃＤＮＡと同一のクローンを容易に得ることができる。あるいは、これらのオリゴヌクレオチドをプライマーとして、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を用いて、目的ｃＤＮＡを合成することもできる。
【００１６】
この発明の蛋白質は、転写活性化能を有するヒト核蛋白質Ｎpw38と結合するものであり、また、ポリリボＧや一本鎖ＤＮＡとも結合する。従って、この発明の蛋白質は、転写調節において重要な役割を有していると考えられる。
一般にヒト遺伝子は個体差による多型が頻繁に認められる。従って配列番号２において、１または複数個のヌクレオチドの付加、欠失および／または他のヌクレオチドによる置換がなされているｃＤＮＡもこの発明のｃＤＮＡに含まれる。
【００１７】
同様に、これらの変更によって生じる、１または複数個のアミノ酸の付加、欠失および／または他のアミノ酸による置換がなされている蛋白質も、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質の活性を有する限り、この発明の蛋白質に含まれる。
この発明のＤＮＡ断片には、配列番号２で表される塩基配列のいかなる部分塩基配列を含むｃＤＮＡ断片（１０ｂｐ以上）も含まれる。また、センス鎖およびアンチセンス鎖からなるＤＮＡ断片もこの範疇に入る。これらのＤＮＡ断片は遺伝子診断用のプローブとして用いることができる。
【００１８】
この発明の蛋白質に対する抗体は、蛋白質それ自体、またはその部分ペプチドを抗原として、公知の方法によりポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体として得ることができる。
【００１９】
【実施例】
次に実施例を示しこの発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、この発明はこれらの例に限定されるものではない。なお、ＤＮＡの組換えに関する基本的な操作および酵素反応は、文献［"Molecular Cloning. Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Laboratory, 1989”］に従った。制限酵素および各種修飾酵素は特に記載の無い場合は宝酒造社製のものを用いた。各酵素反応の緩衝液組成、並びに反応条件は付属の説明書に従った。ｃＤＮＡ合成は文献［Kato, S. et al.,Gene 150:243-250, (1994)］に従った。
実施例１：ヒトＮpw38ｃＤＮＡのクローニング
ヒト胃癌細胞ｃＤＮＡライブラリー（ＷＯ97/03190記載）から選択したｃＤＮＡクローンの大規模塩基配列決定の結果、クローンＨＰ10345 を得た。このクローンは、170bp の５’非翻訳領域、798bp のオープンリーディングフレーム、52bpの３’非翻訳領域からなる構造を有していた（配列番号３）。オープンリーディングフレームは265 アミノ酸残基からなる蛋白質をコードしていた。
【００２０】
モチーフ配列検索を行ったところ、46番目から78番目までの領域が、ＷＷドメインと類似性を有していた。52番目と75番目のトリプトファン、78番目のプロリンが、これまで知られている全てのＷＷドメインに保存されているアミノ酸残基である。この蛋白質のアミノ酸配列における他の特徴として、21番目から41番目までの酸性アミノ酸残基（アスパラギン酸とグルタミン酸）に富む領域、104 番目から176 番目までの酸性アミノ酸残基と塩基性アミノ酸残基が交互に並ぶ領域があることなどが挙げられる。
実施例２：大腸菌によるＧＳＴ融合蛋白質の発現
EcoRI 認識部位を付加した翻訳開始コドンから始まる25 merのセンスプライマー(5'-CCGAATTCATGCCGCTGCCCGTTGC-3') とEcoRI 認識部位を付加した停止コドンまでを含む25 merのアンチセンスプライマー(5'-CCGAATTCTCAATCCTGCTGCTTGG-3') を用い、ｐＨＰ10345 を鋳型としてＰＣＲにより翻訳領域を増幅した。ＰＣＲ産物を EcoRIで消化し、ｐＧＥＸ−５Ｘ−１(Pharmacia社製) の EcoRI部位に挿入した。塩基配列を確認した後、宿主大腸菌ＢＬ21の形質転換を行った。ＬＢ培地中で37℃で５時間培養し、IPTGを最終濃度が0.4 mMになるように加え、さらに37℃で2.5 時間培養した。菌体を遠心により分離し、溶解溶液（50 mM Tris-HCl（pH7.5 ）, 1mM EDTA-1 % Triton X-100 , 0.2% SDS, 0.2 mM PMSF ）に溶かし、一度-80 ℃で凍結させ融解させた後、超音波破砕を行った。1000 x gで30分遠心し、上清にグルタチオンセファロース４Ｂを加え、４℃で１時間インキュベートした。ビーズを十分洗浄した後、溶出溶液（10 mM Tris-50 mMグルタチオン）で融合蛋白質を溶出した。その結果、分子量約 60 kDa の GST-HP10345融合蛋白質を得た。
（３）Ｎpw38結合蛋白質の精製
HeLa-S3 細胞（1 x 1010個）に低張バッファー（20 mM Hepes (pH7.4), 10 mM KCl, 1.5 mM MgCl2）を加え、4 ℃で10分間放置し、ダウンス型ホモジェナイザーにより均一化した。1000 x g, 15分の遠心により核画分を得た。核画分を0.5 ％NP-40 を含む低張バッファーで２回洗浄した後、高張バッファー（20 mM Hepes (pH7.4), 250 mM NaCl, 1.5 mM MgCl2, 0.5% NP-40）により４℃、30分間抽出し、核抽出液とした。
【００２１】
上記の核抽出物40 ml にGST-Ｎpw38融合蛋白質25 mg を加え、４℃、ローテーターにて２時間攪拌した。グルタチオンセファロース４Ｂを加え、さらに、４℃、２時間インキュベートし、ビーズを十分洗浄した後、10 mM Tris、50 mM グルタチオンで溶出した。溶出液をSDS-PAGEにかけたところ、約100kDaの蛋白質が含まれていた。この蛋白質をＮpw38ＢＰ１と命名した。SDS-PAGEゲル上のバンドをPVDF膜に転写後、100 kDa のバンドをプロテインシーケンサーG1000A (HEWLETT PACKARD 社) にのせ、Ｎ末端アミノ酸配列を決定した。その結果、配列番号４で表されるアミノ酸配列が得られた。
実施例４：Ｎpw38ＢＰ１をコードするｃＤＮＡのクローニング
決定したアミノ酸配列25残基を用いてデータベースをサーチしたところ、この配列はＥＳＴクローン（GenBankTM登録番号AA206624）がコードする蛋白質のアミノ酸配列と一致した。このＥＳＴクローンの塩基配列をもとにして、６アミノ酸残基をコードする領域に対するアンチセンスプライマー（5'-TGTAGATCTCCGTCCCAT-3'）を合成した。ヒトフィブロサルコーマ細胞株ＨＴ−1080ｃＤＮＡライブラリー（ＷＯ98/11217に記載）を鋳型とし、アンチセンスプライマーとＴ７プライマーを用い、Ｎpw38ＢＰ１ｃＤＮＡの5'上流領域をＰＣＲにより増幅したところ約200bp のｃＤＮＡ断片を得た。このｃＤＮＡ断片をプローブとしてヒトフィブロサルコーマ細胞株ＨＴ−1080ｃＤＮＡライブラリー（ＷＯ98/11217記載）をスクリーニングした結果、クローンＨＰ00169 を得た。このクローンは、配列番号２に示したとおり、1,926 bpのオープンリーディングフレームを有していた。また、オープンリーディングフレームは配列番号１に示した６４１アミノ酸残基からなる蛋白質をコードしていた。
実施例５：インビトロ翻訳による蛋白質合成
Ｎpw38ＢＰ１ｃＤＮＡを有するプラスミドベクターを用いて、ＴNＴウサギ網状赤血球溶解物キット（プロメガ社製）によるインビトロ転写／翻訳を行なった。その際に［35Ｓ］メチオニンを添加し、発現産物をラジオアイソトープでラベルした。いずれの反応もキットに付属のプロトコールに従って行なった。プラスミド２μg を、ＴNＴウサギ網状赤血球溶解物12.5μl 、緩衝液（キットに付属）0.5 μl 、アミノ酸混合液（メチオニンを含まない）２μl 、［35Ｓ］メチオニン（アマーシャム社）２μl （0.3 ＭＢq/μl ）、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ0.5 μl 、ＲＮasin20Ｕを含む総量25μl の反応液中で30℃で90分間反応させた。反応液３μl にＳＤＳサンプリングバッファー（125mM トリス塩酸緩衝液、pH6.8 、120mM ２−メルカプトエタノール、２％ＳＤＳ溶液、0.025 ％ブロモフェノールブルー、20％グリセロール）２μl を加え、95℃３分間加熱処理した後、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた。オートラジオグラフィーを行なったところ、約100kDaの翻訳産物のバンドが得られた。オープンリーディングフレームから予想されるＮpw38ＢＰ１の分子量は、約70kDa である。翻訳産物の分子量はそれよりも大きい値を示すが、細胞から単離したＮpw38ＢＰ１の分子量も約100kDaであることから、この蛋白質の見かけの分子量は約100kDaであることが判明した。
実施例６：Ｎpw38ＢＰ１の大腸菌による発現
EcoRI 認識部位を付加した翻訳開始コドンから始まる26mer のセンスプライマー（5'-CCGAATTCATGGGACGGAGATCTACA-3'）とSalI認識配列を付加した停止コドンまでを含む26mer のアンチセンスプライマー（5'-CCGTCGACTCACAGTAGCCCTTCCAT-3'）を用い、クローンHP00169 を鋳型としてＰＣＲにより翻訳領域を増幅した。ＰＣＲ産物をEcoRI とSalIで消化し、ｐＧＥＸ−５Ｘ−１(Pharmacia社製) のEcoRI とSalI部位に挿入した。塩基配列を確認した後、宿主大腸菌ＪＭ109 の形質転換を行った。ＬＢ培地中で37℃で５時間培養し、IPTGを最終濃度が0.4 mMになるように加え、さらに37℃で4 時間培養した。菌体を遠心により分離し、溶解溶液（50 mM Tris-HCl pH7.5, 1mM EDTA, 0.2 mM PMSF ）に溶かし、一度-80 ℃で凍結させ融解させた後、超音波破砕を行った。10,000 x gで30分遠心し、上清にグルタチオンセファロース４Ｂを加え、４℃で１時間インキュベートした。ビーズを十分洗浄した後、溶出溶液（10 mM Tris-HCl, 50 mM グルタチオン）で融合蛋白質を溶出した。
実施例７：抗体作製
上記の融合蛋白質を抗原として家兔に常法により免疫を行い抗血清を得た。抗血清はまず、40％飽和硫安沈殿画分をGST アフィニティーカラムによりGST 抗体を除いた。素通り画分をさらにGST-HP00169 の抗原カラムにより精製した。
実施例８：ウェスタンブロット
HeLa-S3 細胞ライセートを SDS-PAGE により分離し、PVDF膜ブロットした後、５％スキムミルクを含む0.05 % Tween20 -PBS （TPBS）で１時間室温でブロッキングし、抗体をTPBSで10,000倍希釈したものと１時間インキュベートした。TPBSで３回洗浄し、さらにTPBSで10,000倍希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギ IgGと１時間インキュベートした。TPBSで４回洗浄し、ECL 試薬（Amersham社製）により発光させて検出したところ、約100kDaの位置にシグナルが得られた。
実施例９：Ｎpw38ＢＰ１の核酸結合能
Ｎpw38ＢＰ１ｃＤＮＡを鋳型とした、ウサギ網状赤血球インビトロ翻訳産物と種々の核酸との結合能を検討した。ポリリボＡアガロース、ポリリボＧアガロース、ポリリボＵアガロース、ポリリボＣアガロース、二本鎖ＤＮＡセルロース、一本鎖ＤＮＡセルロース（いずれもファルマシア社製）とインビトロ翻訳産物をHKN 緩衝液［Hepes(pH7.4), 150 mM NaCl, 0.01% NP40 ］中で室温、20分間インキュベートした。HKN 緩衝液で５回洗浄し、担体に結合した蛋白質をSDS-PAGEにより分析したところ、Ｎpw38ＢＰ１はポリリボＧならびに一本鎖ＤＮＡに特異的に結合することがわかった。
【００２２】
【発明の効果】
以上詳しく説明したとおり、この発明によって、癌などの病態の診断および治療等に有用な新規なヒト転写関連蛋白質とその抗体が提供される。また、この発明のｃＤＮＡ等の遺伝子操作材料を用いることによって、このヒト蛋白質を大量に製造することができる。そして、この蛋白質と結合する低分子化合物をスクリーニングすることによる、新しい型の抗腫瘍剤などの医薬を探索することが可能となる。
【００２３】
【配列表】
0003832973.tif 000002
0003832973.tif 000003
0003832973.tif 000004
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