(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ末端から２３番目のロイシン残基のフェニルアラニン残基への置換、及びN末端から１０４番目のバリン残基のイソロイシン残基への置換のいずれかまたは両方のアミノ酸置換を有する、コリネバクテリウム・グルタミカムまたはブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム由来のホモセリンデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡ断片を保持するコリネホルム細菌を好適な培地で培養し、該培養物中にＬ−リジンを生産蓄積せしめ、該培養物からＬ−リジンを採取することを特徴とするＬ−リジンの製造法。
【請求項２】
前記コリネホルム細菌が、前記ＤＮＡ断片が染色体上のホモセリンデヒドロゲナーゼ遺伝子との相同組換えにより染色体ＤＮＡに組み込まれて形質転換されたコリネホルム細菌である、請求項１記載の製造法。
【請求項３】
前記ホモセリンデヒドロゲナーゼが、配列番号1及び2のプライマーを用いたPCRによって増幅される遺伝子によってコードされるアミノ酸配列において、Ｎ末端から２３番目のロイシン残基のフェニルアラニン残基への置換、及びN末端から１０４番目のバリン残基のイソロイシン残基への置換のいずれかまたは両方のアミノ酸置換が導入された配列を有するタンパク質である、請求項１または２に記載の製造法。
【請求項４】
前記ホモセリンデヒドロゲナーゼが、配列番号４のアミノ酸配列において、Ｎ末端から２３番目のロイシン残基のフェニルアラニン残基への置換、及びN末端から１０４番目のバリン残基のイソロイシン残基への置換のいずれかまたは両方のアミノ酸置換が導入された配列を有するタンパク質である、請求項１または２に記載の製造法。
【請求項５】
前記コリネホルム細菌が、さらに、コリネホルム細菌由来のアスパルトキナーゼ遺伝子とコリネホルム細菌細胞内で自律複製可能なベクターとを連結してなる組換えＤＮＡを細胞内に保持する細菌である、請求項1〜４のいずれか一項に記載の製造法。
【請求項６】
前記アスパルトキナーゼ遺伝子が、コリネバクテリウム・グルタミカムまたはブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム由来のアスパルトキナーゼにおいて、αサブユニットではN末端から２７９番目のアラニン残基がアラニン以外かつ酸性アミノ酸以外のアミノ酸残基に、βサブユニットではN末端から３０番目のアラニン残基がアラニン以外かつ酸性アミノ酸以外のアミノ酸残基に変化することにより、Ｌ−リジン及びＬ−スレオニンによるフィードバック阻害が実質的に解除された変異型アスパルトキナーゼをコードする遺伝子である、請求項５に記載の製造法。
【請求項７】
前記アスパルトキナーゼ遺伝子が、αサブユニットでは配列番号９のアミノ酸配列においてN末端から２７９番目のアラニン残基がアラニン以外かつ酸性アミノ酸以外のアミノ酸残基に、βサブユニットでは配列番号１１のアミノ酸配列においてN末端から３０番目のアラニン残基がアラニン以外かつ酸性アミノ酸以外のアミノ酸残基に変化することにより、Ｌ−リジン及びＬ−スレオニンによるフィードバック阻害が実質的に解除された変異型アスパルトキナーゼをコードする遺伝子である、請求項６記載の製造法。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
本発明は微生物工業に関連したものであり、詳しくは、発酵法によるＬ−リジンの製造法及びこの製造法に好適なコリネホルム細菌に関するものである。
従来、Ｌ−リジンはブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、バチルス属、またはエシェリヒア属に属するＬ−リジン生産菌を用いた発酵法により製造されており、これらの微生物の生合成系において、オキザロ酢酸からアスパラギン酸、アスパラギン酸βアルデヒド等を経由して合成される。このようなＬ−リジン生合成経路にはホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、アスパルトキナーゼ、ジヒドロジピコリン酸合成酵素などの種々の酵素が関与しているが、これらの酵素は最終生産物であるＬ−リジンや中間生成物であるアスパラギン酸などによるフィードバック阻害を受けるものが多いために、発酵法によりＬ−リジンを製造する場合、生産性を向上させるために、このような阻害を受けないような変異株が多く用いられている。
例えば、ブレビバクテリウム属やコリネバクテリウム属のようなコリネホルム細菌においては、アスパルトキナーゼ（以下、「ＡＫ」という）は、Ｌ−リジン及びＬ−リジン合成経路からの分岐経路で合成されるＬ−スレオニンによる協奏阻害を受けることが知られており、この阻害を受けないＡＫを保持する変異株がＬ−リジン生産に用いられている（J. Gen. Appl. Microbiol., 16, 373-391(1970)）。
また、Ｌ−リジンの発酵生産には、Ｌ−リジンの生産性に最も影響を与える酵素といわれているホモセリンデヒドロゲナーゼ（以下、「ＨＤ」という）を欠損した変異株も用いられている。これは、Ｌ−リジン合成系路からアスパラギン酸β−アルデヒドを介して分岐するＬ−スレオニン固有の合成系路において、第一の反応であるアスパラギン酸β−セミアルデヒドからＬ−ホモセリンを生成する反応を触媒するＨＤが欠失しているためにＬ−スレオニンが合成されず、その結果ＡＫ活性が阻害されずにＬ−リジン合成反応が進行するためである。このようなＨＤ欠損株としては、コリネバクテリウム・グルタミカムのＨＤ完全欠損株が知られている（Nakayama, K. et al.；J. Gen. Appl. Microbiol. 7(3), 145-154(1961)）。
上記のようなＨＤ完全欠損株に対し、いわゆる弱化型（leaky type）ＨＤを保持する変異株もＬ−リジン生産に有効であると考えられる。ＨＤ完全欠損株はＬ−スレオニン及びＬ−メチオニンを合成できないために、培地中にこれらのアミノ酸が存在しないと生育することができない。これに対して、Ｌ−リジン生産を抑制するほどには実質的に活性を示さないが、ごく僅かにＨＤ活性を有する弱化型ＨＤを保持するＨＤ弱化株を取得することができれば、培地にＬ−スレオニンやＬ−メチオニンを添加しなくても生育が可能となり、培地調製が簡便になる。
また、弱化型ＨＤは、基質であるアスパラギン酸β−セミアルデヒドに対する親和性が小さくなっている。したがって、ＨＤ弱化株は生育に必要なＬ−スレオニン、Ｌ−メチオニン及びＬ−イソロイシンを合成するために著量のアスパラギン酸β−セミアルデヒドを合成する。著量に合成されたアスパラギン酸β−セミアルデヒドは結果としてＬ−リジンへと流れることとなる。
その一方で、Ｌ−スレオニンの生成量を完全に抑える点でＨＤ完全欠損株は今なお有用であると考えられるが、突然変異によるＨＤの欠損は復帰変異によって活性が戻る可能性があり、そのような可能性の極めて低いＨＤ遺伝子が破壊されたＨＤ欠損株が一層有用であると考えられる。尚、ＨＤ遺伝子の塩基配列は、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebaterium glutamicum）についてはPeoplesらにより報告されている（Peoples, O. P. et al., Molecular Microbiology 2(1), 63-72 (1988)）。
また、ＨＤ弱化株及びＨＤ欠損株はＬ−スレオニンを生産しないので、ＡＫはフィードバック阻害を受けない。したがって、ＨＤ弱化株及びＨＤ欠損株の細胞中でＡＫ遺伝子が増幅されれば、Ｌ−リジン合成反応が進み、Ｌ−リジン生産性が向上すると考えられる。さらに、Ｌ−リジン及びＬ−スレオニンによるフィードバック阻害を受けないＡＫの変異とＨＤの弱化あるいは欠損とを併せてコリネホルム細菌に導入することにより、Ｌ−リジン生産性はより一層向上すると考えられる。
発明の概要
本発明は、上記観点からなされたものであり、コリネホルム細菌のＬ−リジン生産性を向上させるために、ＨＤ弱化株及びＨＤ遺伝子破壊株を得ること、及びＡＫ遺伝子が増幅されたＨＤ弱化株及びＨＤ欠損株、さらにはＬ−リジン及びＬ−スレオニンによるフィードバック阻害を受けないＡＫを保持するＨＤ弱化株及びＨＤ遺伝子破壊株を提供することを課題とする。
本発明者は、上記課題を解決するためにブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）のＨＤ弱化変異株を取得し、野生型ＨＤ遺伝子及び弱化型ＨＤ遺伝子を単離してその構造を明らかにし、弱化型ＨＤ遺伝子及び一部を欠失したＨＤ遺伝子をブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムの野生株に導入することによってＬ−リジン生産性が向上したＬ−リジン生産株を創成し、さらにこうして得られたＬ−リジン生産株の細胞中でＡＫ遺伝子を増幅することにより、あるいはＬ−リジン及びＬ−スレオニンによるフィードバック阻害を受けないＡＫをコードする遺伝子を導入することにより一層Ｌ−リジン生産性を向上させることに成功し、本発明に至った。
すなわち本願発明は、Ｎ末端から２３番目のロイシン残基及び１０４番目のバリン残基の少なくとも一方が他のアミノ酸残基に変化した変異型ホモセリンデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡ断片、Ｎ末端から２３番目のロイシン残基及び１０４番目のバリン残基の少なくとも一方が他のアミノ酸残基に変化した変異型ホモセリンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を保持するコリネホルム細菌、及び前記変異型ホモセリンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子がコリネホルム細菌の染色体上のホモセリンデヒドロゲナーゼ遺伝子との相同組換えにより染色体ＤＮＡに組み込まれて形質転換されたコリネホルム細菌を提供する。
また本願発明は、コリネホルム細菌由来のホモセリンデヒドロゲナーゼの一部をコードするＤＮＡ断片が、コリネホルム細菌の染色体上のホモセリンデヒドロゲナーゼ遺伝子との相同組換えにより染色体ＤＮＡに組み込まれることによって、ホモセリンデヒドロゲナーゼ遺伝子が破壊されたことを特徴とするコリネホルム細菌を提供する。さらに本願発明は、コリネホルム細菌由来のアスパルトキナーゼ遺伝子とコリネホルム細菌細胞内で自律複製可能なベクターとを連結してなる組換えＤＮＡを細胞内に保持し、かつ、野生型ホモセリンデヒドロゲナーゼを発現しないことを特徴とするコリネホルム細菌、コリネホルム細菌由来のアスパルトキナーゼであってＬ−リジン及びＬ−スレオニンによるフィードバック阻害が解除されたアスパルトキナーゼをコードする遺伝子が、コリネホルム細菌の染色体ＤＮＡに組み込まれて形質転換され、かつ、野生型ホモセリンデヒドロゲナーゼを発現しないことを特徴とするコリネホルム細菌を提供する。さらに本願発明は、上記コリネホルム細菌を好適な培地で培養し、該培養物中にＬ−リジンを生産蓄積せしめ、該培養物からＬ−リジンを採取することを特徴とするＬ−リジンの製造法を提供する。
尚、本明細書においては、野生型ＨＤまたは野生型ＡＫを生産する株を「野生株」、実質的にはＨＤ活性をほとんど示さないが、ごく僅かにＨＤ活性を有する弱化型（leaky type）の変異を有するＨＤを単に「変異型ＨＤ」、Ｌ−リジン及びＬ−スレオニンによるフィードバック阻害を受けないような変異を有するＡＫを「変異型ＡＫ」、さらに一部を欠失したＨＤ遺伝子を「欠失型ＨＤ遺伝子」ということがある。また、外来ＨＤ遺伝子または外来ＡＫ遺伝子とベクターとからなる組換えＤＮＡを宿主染色体ＤＮＡ上のＨＤ遺伝子またはＡＫ遺伝子との相同組換えにより染色体ＤＮＡに組み込むことを「遺伝子組込み」、この組換えＤＮＡが染色体ＤＮＡに組み込まれた状態から、１コピーのＨＤ遺伝子またはＡＫ遺伝子をベクターとともに脱落させることにより、染色体上のＨＤ遺伝子またはＡＫ遺伝子が外来ＨＤ遺伝子または外来ＡＫ遺伝子に置換された状態にすることを「遺伝子置換」という。さらに、変異型ＨＤ遺伝子を保持する突然変異株または変異型ＨＤ遺伝子で遺伝子置換された株を単に「ＨＤ変異株」、一部を欠失したＨＤ遺伝子で遺伝子置換された株を「ＨＤ欠損株」ともいう。
また、本発明にいうコリネホルム細菌とは、バージーズ・マニュアル・オブ・デターミネイティブ・バクテリオロジー（Bergey's Manual of Determinative Bacteriology）第8版599頁（1974）に定義されている一群の微生物であり、好気性，グラム陽性，非抗酸性，胞子形成能を有しない桿菌であり、コリネバクテリウム属細菌、及び従来ブレビバクテリウム属に分類されていたが現在コリネバクテリウム属細菌として統合されたブレビバクテリウム属細菌、さらにコリネバクテリウム属細菌と非常に近縁なブレビバクテリウム属細菌を含む。
本発明により得られるＨＤ変異株は、Ｌ−リジン生産性にすぐれており、培地中にＬ−メチオニン及びＬ−スレオニン、またはＬ−ホモセリンが存在していなくても生育できる。また、本発明のＨＤ欠損株は、ＨＤ遺伝子が発現しないのでＬ−リジン生産性に優れ、さらにこの性質を安定して保持することができる。
さらに、ＡＫ遺伝子が増幅されたＨＤ変異株及びＨＤ欠損株、変異型ＡＫ遺伝子を保持するＨＤ変異株及びＨＤ欠損株は、より一層Ｌ−リジン生産性に優れている。
発明の詳細な説明
以下、本発明を詳細に説明する。
＜１＞弱化型ＨＤ突然変異株及び変異型ＨＤ遺伝子の取得
弱化型変異を有するＨＤを生産する突然変異株は、野生型ＨＤを生産するコリネホルム細菌を変異処理することにより得られる。コリネホルム細菌の変異処理には、紫外線照射またはN−メチル−N'−ニトロ−N−ニトロソグアニジン（NTG）等の通常人工突然変異に用いられている変異剤による処理を行う。
変異処理した菌体からシングル・コロニー・アイソレーションを行い、各々のコロニーから弱化型ＨＤを産生するものを選択する。弱化型ＨＤ変異株は、最小培地で生育することができ、Ｌ−メチオニン及びＬ−スレオニンを過剰に加えた最小培地では生育できないが、Ｌ−ホモセリン、又はＬ−メチオニン及びＬ−スレオニンを加えた最小培地では生育できるので、これを指標に選択することができる（Shiio, I. & Sano, K., J. G. A. M., 15, 267-287 (1969)）。こうして得られた変異株が弱化型ＨＤを生産することを確認するために、菌体から粗酵素液を抽出してＨＤ比活性を野生型ＨＤと比較しておくことが好ましい。
ＨＤの酵素活性は、例えばFollettieらの方法（Follettie,M.T. et al., Molecular Microbiology 2, 53-62 (1988)）に従って菌体より調製した粗酵素液を用いて、Kalinowskiらの方法（Kalinowski,J. et al., Mol.Gen.Genet., 224, 317-324 (1990)）によって測定することができる。
得られた弱化型ＨＤ変異株から変異型ＨＤ遺伝子を単離するには、例えば、弱化型ＨＤ変異株から斎藤、三浦の方法（H.Saito and K.Miura Biochem.Biophys. Acta 72,619,(1963)）等により染色体ＤＮＡを調製し、ポリメラーゼチェインリアクション法（ＰＣＲ：polymerase chain reaction; White,T.J. et al ;Trends Genet. 5,185(1989)参照）により、ＨＤ遺伝子を増幅することによって行うことができる。増幅反応に用いるＤＮＡプライマーは、ＨＤ遺伝子の全領域あるいは一部領域を含有するＤＮＡ二重鎖の両３’末端に相補するものを用いる。ＨＤ遺伝子の一部領域だけを増幅した場合には、該ＤＮＡ断片をプライーとして全領域を含むＤＮＡ断片を染色体ＤＮＡライブラリーよりスクリーニングする必要がある。ＨＤ遺伝子の全領域を増幅した場合には、増幅されたＨＤ遺伝子を含有するＤＮＡ断片を含むＰＣＲ反応液をアガロースゲル電気泳動に供した後、目的のＤＮＡ断片を抽出することによってＨＤ遺伝子を含有するＤＮＡ断片を回収できる。
ＤＮＡプライマーとしては、例えばコリネホルム・グルタミカムについて既知となっている配列（Peoples, O. P. et al; Molecular Microbiolory, 2(1), 63-72 (1988)）を基にして適宜作成すればよいが、具体的には、ＨＤ遺伝子をコードする1150塩基からなる領域を増幅できるプライマーが好ましく、例えば配列番号１及び２に示した２種のプライマーが適当である。プライマーＤＮＡの合成は、ホスホアミダイト法（Tetrahedron Letters,22,1859(1981)参照）等の常法により、市販のＤＮＡ合成装置（例えば、Applied Biosystems社製ＤＮＡ合成機model 380B等）を用いて合成することができる。また、PCR反応は、市販のＰＣＲ反応装置（宝酒造（株）製ＤＮＡサーマルサイクラーPJ2000型等）を使用し、TaqDNAポリメラーゼ（宝酒造（株）より供給されている）を用い、供給者により指定された方法に従って行うことができる。
ＰＣＲ法により増幅された変異型ＨＤ遺伝子は、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli：以下、「E. coli」ともいう）及び／又はコリネホルム細菌の細胞内において自律複製可能なベクターＤＮＡに接続して組換えＤＮＡを調製し、これをE. coli細胞に導入しておくと、後の操作がしやすくなる。E. coli細胞内において自律複製可能なベクターとしては、プラスミドベクターが好ましく、宿主の細胞内で自立複製可能なものが好ましく、例えばpUC19、pUC18、pBR322、pHSG299、pHSG399、pHSG398、RSF1010等が挙げられる。
また、これらのベクターにコリネホルム細菌中でプラスミドを自律複製可能にする能力をもつＤＮＡ断片（例えば、pAM 330（特開昭58-67699号公報参照）、pHM 1519（特開昭58-77895号公報参照）、pCG 1（特開昭57-134500号公報参照）、pCG 2（特開昭58-35197号公報参照）、pCG 4（特開昭57-183799号公報参照）、pCG 11（特開昭57-183799号公報参照）等から調製できる）を挿入すると、E. coli及びコリネホルム細菌の両方で自律複製可能ないわゆるシャトルベクターとして使用することができる。
このようなシャトルベクターとしては、以下のものが挙げられる。尚、それぞれのベクターを保持する微生物及び国際寄託機関の寄託番号をかっこ内に示した。
0003783065.tif 000002
これらのベクターは、寄託微生物から次のようにして得られる。対数増殖期に集められた細胞をリゾチーム及びＳＤＳを用いて溶菌し、３００００×ｇで遠心分離して溶解物から得た上澄液にポリエチレングリコールを添加し、セシウムクロライド−エチジウムブロマイド平衡密度勾配遠心分離により分別精製する。
E. coliにプラスミドを導入して形質転換するにはD.M.Morrisonの方法（Methods in Enzymology, 68, 326, 1979）あるいは受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法（Mandel,M. and Higa,A.,J.Mol.,Biol.,53,159(1970)）等により行うことができる。
弱化型ＨＤ変異株から変異型ＨＤ遺伝子を単離するには、弱化型ＨＤ変異株からプラスミドベクター等を用いて染色体ＤＮＡライブラリーを作製し、このライブラリーから変異型ＨＤ遺伝子を保持する株を選択し、選択された株から変異型ＨＤ遺伝子が挿入された組換えＤＮＡを回収することによっても得られる。以下に、染色体ライブラリーの調製及びライブラリーから変異型ＨＤ遺伝子を保持する株を選択する方法の一例について述べる。
まず、弱化型ＨＤ変異株を培養して培養物を得る。用いる培地はコリネホルム細菌が生育できるものであればよく、培地中のＬ−スレオニン及びＬ−メチオニンの含有量が少ない場合には、Ｌ−スレオニン及びＬ−メチオニンあるいはＬ−ホモセリンを添加しておくことが好ましい。次に培養物を遠心分離して菌体を得、この菌体より、例えば斎藤、三浦の方法（Biochem.Biophys.Acta.,72,619,(1963)）、K. S. Kirbyの方法（Biochem.J.,64,405,(1956)）等の方法により染色体DNAを得る。
こうして得られた染色体ＤＮＡから変異型ＨＤ遺伝子を単離するために、染色体ＤＮＡライブラリーを作製する。まず、染色体ＤＮＡを適当な制限酵素で部分分解して種々の断片混合物を得る。切断反応時間等を調節して切断の程度を調節すれば、幅広い種類の制限酵素が使用できる。例えば、Sau3AIを、温度３０℃以上、好ましくは３７℃、酵素濃度１〜１０ユニット／mlで様々な時間（１分〜２時間）染色体ＤＮＡに作用させてこれを消化する。
ついで、切断された染色体ＤＮＡ断片を、E. coli細胞内で自律複製可能なベクターDNAに連結し、組換えＤＮＡを作製する。具体的には、染色体ＤＮＡの切断に用いた制限酵素Sau3AＩと同一末端塩基配列を生じさせる制限酵素、例えばBamHＩを、温度３０℃以上、酵素濃度１〜100ユニット／mlの条件下で１時間以上、好ましくは１〜３時間、ベクターＤＮＡに作用させてこれを完全消化し、切断開裂する。次いで、上記のようにして得た染色体ＤＮＡ断片混合物と開裂切断されたベクターＤＮＡを混合し、これにＤＮＡリガーゼ、好ましくはＴ４ＤＮＡリガーゼを、温度４〜１６℃、酵素濃度１〜１００ユニット／mlの条件下で１時間以上、好ましくは６〜２４時間作用させて組換えＤＮＡを得る。
得られた組換えＤＮＡを用いて、例えばE. coli K-12株を形質転換して染色体ＤＮＡライブラリーを作製する。この形質転換はD.M.Morrisonの方法（Methods in Enzymology, 68, 326, 1979）あるいは受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法（Mandel,M. and Higa,A.,J.Mol.,Biol.,53,159(1970)）等により行うことができる。
得られた染色体ＤＮＡライブラリーの中から、変異型ＨＤ遺伝子を保持する形質転換株を選択するには、例えばコリネバクテリウム・グルタミカムについて既知となっている配列（Peoples, O. P. et al., Molecular Microbiology, 2(1), 63-72 (1988)）をもとにしてオリゴヌクレオチドプローブを合成し、これを用いたコロニーハイブリダイゼーションを行えばよい。E. coliのＨＤ遺伝子は２種類（HD-1、HD-2）存在することが知られている（Zakin, M. M. et al; J.B.C., 25 8, 3028-3031 (1983)）が、これらはいずれもコリネバクテリウム・グルタミカムＨＤのＣ末端側約１００アミノ酸残基に対応する領域が存在しないので、この領域の中からプローブに用いる配列を選択すると、E. coli染色体上のＨＤ遺伝子にはハイブリダイズしないので好ましい。こうして選択された形質転換株から、変異型ＨＤ遺伝子を含有する組換えＤＮＡを、例えばP. Guerryらの方法（J. Bacteriol.,116,1064,(1973)）、D. B. Clewellの方法（J.Bacteriol.,110,667, (1972)）などにより単離することができる。
また、上記と同様にしてコリネホルム細菌からクローニングされた野生型ＨＤ遺伝子を用いて、以下のようにして弱化型ＨＤを生産する株を創成してもよい。まず、野生型ＨＤ遺伝子又は他の変異を有するＨＤ遺伝子を含有するＤＮＡをインビトロ変異処理し、変異処理後のＤＮＡと宿主に適合するベクターＤＮＡとを連結して組換えＤＮＡを得る。組換えＤＮＡを宿主微生物に導入して形質転換体を得、同形質転換体のうちで弱化型ＨＤを発現するように至ったものを選択する。また、野生型ＨＤ遺伝子又は他の変異を有するＨＤ遺伝子を含有するＤＮＡを、宿主に適合するベクターＤＮＡと連結して組換えＤＮＡを得て、その後組換えＤＮＡをインビトロ変異処理し、変異処理後の組換えＤＮＡを宿主微生物に導入して形質転換体を得、同形質転換体のうちで弱化型ＨＤを発現するように至ったものを選択してもよい。
ＤＮＡをインビトロ変異処理するための薬剤としては、ヒドロキシルアミン等が挙げられる。ヒドロキシルアミンは、シトシンをＮ4−ヒドロキシシトシンに変えることによりシトシンからチミンへの変異を起こす化学変異処理剤である。
本発明に用いる変異型ＨＤ遺伝子としては、弱化型ＨＤをコードするものであれば特に制限されないが、野生型ＨＤのアミノ酸配列において、
▲１▼Ｎ末端から２３番目のロイシン残基がロイシン残基以外のアミノ酸残基に変化する変異、
▲２▼Ｎ末端から１０４番目のバリン残基がバリン残基以外のアミノ酸残基に変化する変異、
▲３▼Ｎ末端から２３番目のロイシン残基がロイシン残基以外のアミノ酸残基に変化し、かつ、１０４番目のバリン残基がバリン残基以外のアミノ酸残基に変化する変異、
のいずれかの変異を有するＨＤをコードする遺伝子が挙げられる。ここで、野生型ＨＤのアミノ酸配列としては、具体的には配列表配列番号３及び４に示すブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム野生株由来のＨＤのアミノ酸配列が挙げられる。
上記▲１▼〜▲３▼に示した変異において、２３番目のロイシン残基にあってはフェニルアラニン残基に変化する変異が、１０４番目のバリン残基にあってはイソロイシン残基に変化する変異が挙げられる。
尚、置換されたアミノ酸残基に対応するコドンは、そのアミノ酸残基をコードするものであれば種類は特に問わない。また、菌種や菌株の違いにより保持する野生型ＨＤのアミノ酸配列がわずかに相異するものがある。このような酵素の活性に関与しない位置でのアミノ酸残基の置換、欠失あるいは挿入を有するＨＤも本発明に使用することができる。
例えば、後記実施例に示すように、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム２２５６株（ATCC 13869）に由来するＨＤのアミノ酸配列を、コリネバクテリウム・グルタミカムのＨＤについて報告されているアミノ酸配列（Peoples, O. P. et al; Molecular Microbiology 2(1) 63-72 (1988)）と比較したところ、Ｎ末端から１４８番目のアミノ酸残基はコリネバクテリウム・グルタミカムのＨＤではグリシン残基であるのに対し、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＨＤではアラニン残基であることが明らかとなっている。このようなコリネバクテリウム・グルタミカムのＨＤにおいても、上記▲１▼〜▲３▼のいずれかの変異を導入すると弱化型ＨＤが得られることが予想される。
＜２＞野生型ＡＫ遺伝子及び変異型ＡＫ遺伝子の取得
本発明に用いる野生型ＡＫ遺伝子は、コリネホルム細菌野生株から調製することができる。また、Ｌ−リジン及びＬ−スレオニンによる相乗的なフィードバック阻害が実質的に解除されたＡＫをコードする遺伝子は、ＡＫ活性に対するＬ−リジン及びＬ−スレオニンにより相乗的なフィードバック阻害が実質的に解除された変異株から調製することができる。このような変異株は、例えば、コリネホルム細菌野生株に、通常の変異処理法、紫外線照射またはＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）等の変異剤処理を施し、変異処理した細胞群の中から取得することができる。ＡＫ活性の測定は、Miyajima,R et al;The Journal of Biochemistry(1968),63(2),139-148に記載される方法を用いることができる。
ＡＫ遺伝子の供与菌としては、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム野生株ATCC13869、及びATCC13869株より変異処理により誘導されたＬ−リジン生産菌AJ3463（FERM P-1987）が最も好ましい供与菌である。
コリネホルム細菌からＡＫ遺伝子を単離するには、例えば、斎藤、三浦の方法（H.Saito and K.Miura Biochem.Biophys.Acta, 72,619,(1963)）等により染色体ＤＮＡを調製し、ポリメラーゼチェインリアクション法（ＰＣＲ：polymerase chain reaction; White,T.J. et al ;Trends Genet. 5,185(1989)参照）により、ＡＫ遺伝子を増幅することによって行うことができる。
増幅に用いるＤＮＡプライマーはＡＫ遺伝子の全領域あるいは一部領域を含有するＤＮＡ二重鎖の両3'末端に相補するものを用いる。ＡＫ遺伝子の一部領域だけを増幅した場合には、該領域のＤＮＡ断片をプライマーとして用い、全領域を含むＤＮＡ断片を増幅することにより遺伝子ライブラリーよりスクリーニングする必要がある。全領域を増幅した場合には、該ＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動に供した後、目的のバンドを切り出すことによってＡＫ遺伝子を含有するＤＮＡ断片を回収できる。
ＤＮＡプライマーとしては、例えば、コリネバクテリウム・グルタミカムにおいて既知となっている配列（Molecular Microbiology(1991),5(5),1197-1204, Mol.Gen.Genet.(1990)224,317-324参照）を基にして、ＡＫ遺伝子をコードする約1643bpの領域を増幅すべく、5'-TCGCGAAGTAGCACCTGTCACTT-3'（配列表配列番号５）と5'-ACGGAATTCAATCTTACGGCC-3'（配列表配列番号６）という配列の23mer及び21merの一本鎖ＤＮＡが最適である。ＤＮＡの合成はApplied Biosystems社製ＤＮＡ合成機model 380Bを使用し、ホスホアミダイト法を用いて（Tetrahedron Letters(1981),22,1859参照）常法に従って合成できる。PCR反応は、宝酒造（株）製DNAサーマルサイクラーPJ2000型を用い、TaqDNAポリメラーゼを用い、供給者により指定された方法に従って行うことができる。
ＰＣＲ法により増幅された変異型ＡＫ遺伝子は、E. coli及び／又はコリネホルム細菌の細胞内において自律複製可能なベクターＤＮＡに接続して組換えＤＮＡを調製し、これをE. coli細胞に導入しておくと、後の操作がしやすくなる。E. coli細胞内において自律複製可能なベクターとしては、プラスミドベクターが好ましく、宿主の細胞内で自立複製可能なものが好ましく、例えばpUC19、pUC18、pBR322、pHSG299、pHSG399、pHSG398、RSF1010等が挙げられる。
また、これらのベクターにコリネホルム細菌中でプラスミドを自律複製可能にする能力をもつＤＮＡ断片を挿入すると、E. coli及びコリネホルム細菌の両方で自律複製可能ないわゆるシャトルベクターとして使用することができる。E. coliにプラスミドを導入して形質転換するにはD.M.Morrisonの方法（Methods in Enzymology, 68, 326, 1979）あるいは受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法（Mandel,M. and Higa,A.,J.Mol.,Biol.,53,159(1970)）等により行うことができる。
上記のようにしてＡＫ野生株からＡＫ遺伝子を単離すれば野生型ＡＫ遺伝子が得られ、ＡＫ変異株からＡＫ遺伝子を単離すれば変異型ＡＫ遺伝子が得られる。
本発明に用いる変異型ＡＫ遺伝子としては、Ｌ−リジン及びＬ−スレオニンによる相乗的なフィードバック阻害が解除されたＡＫをコードするものであれば特に制限されないが、野生型ＡＫのアミノ酸配列において、αサブユニットではＮ末端から２７９番目のアラニン残基がアラニン以外かつ酸性アミノ酸以外のアミノ酸残基に、βサブユニットでは３０番目のアラニン残基がアラニン以外かつ酸性アミノ酸以外のアミノ酸残基に変化する変異が挙げられる。ここで、野生型ＡＫのアミノ酸配列としては、具体的にはαサブユニットでは配列表配列番号９に示すアミノ酸配列が、βサブユニットでは配列表配列番号１１に示すアミノ酸配列が挙げられる。
また、上記のアラニン以外かつ酸性アミノ酸以外のアミノ酸残基としては、スレオニン残基、アルギニン残基、システイン残基、フェニルアラニン残基、プロリン残基、セリン残基、チロシン残基及びバリン残基が挙げられる。
尚、置換されるアミノ酸残基に対応するコドンは、そのアミノ酸残基をコードするものであれば種類は特に問わない。また、菌種や菌株の違いにより保持する野生型ＡＫのアミノ酸配列がわずかに相違するものがあると予想される。このような酵素の活性に関与しない位置でのアミノ酸残基の置換、欠失あるいは挿入を有するＡＫも本発明に使用することができる。
＜３＞ＨＤ変異株及びＨＤ欠損株の取得
ＨＤ変異株は、＜１＞に記載したように、野生型ＨＤを生産するコリネホルム細菌を紫外線照射または変異剤による処理を行い、変異処理した菌体から変異型ＨＤを産生する株を選択することによって得られる。また、そのようにして得られたＨＤ変異株から単離した変異型ＨＤ遺伝子を、野生型コリネホルム細菌細胞に導入し、染色体上のＨＤ遺伝子との相同組換えにより遺伝子置換を行うことによっても、野生型ＨＤを発現しないＨＤ変異株が得られる。
変異型ＨＤ遺伝子を、宿主染色体上のＨＤ遺伝子と置換するには以下のようにすればよい（図１参照）。すなわち、プラスミドベクターにブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム由来の温度感受性複製起点と変異型ＨＤ遺伝子とクロラムフェニコール等の薬剤に耐性を示すマーカー遺伝子とを挿入して組換えＤＮＡを調製し、この組換えＤＮＡでコリネホルム細菌を形質転換し、温度感受性複製起点が機能しない温度で形質転換株を培養し、続いてこれを薬剤を含む培地で培養することにより、組換えＤＮＡが染色体ＤＮＡに組み込まれた形質転換株が得られる。
こうして染色体に組換えＤＮＡが組み込まれた株は、染色体上にもともと存在するＨＤ遺伝子配列との組換えを起こし、染色体ＨＤ遺伝子と変異型ＨＤ遺伝子との融合遺伝子２個が組換えＤＮＡの他の部分（ベクター部分、温度感受性複製起点及び薬剤耐性マーカー）を挟んだ状態で染色体に挿入されている。したがって、この状態では野生型ＨＤが優性であるので、最小培地で野生株と同等の生育を示す。
次に、染色体ＤＮＡ上に変異型ＨＤ遺伝子のみを残すために、２個のＨＤ遺伝子の組換えにより１コピーのＨＤ遺伝子を、ベクター部分（温度感受性複製起点及び薬剤耐性マーカーを含む）とともに脱落させる。例えば、染色体組込み株を培養し、培養菌体を薬剤を含まない平板培地にまいて培養する。生育したコロニーを、薬剤を含む平板培地にレプリカして培養し、薬剤感受性株を取得する。得られた薬剤感受性株の染色体からベクター部分が脱落していることを、サザン・ハイブリダイゼーションにより確認し、さらに変異型ＨＤを発現していることを確認する。
上記の変異型ＨＤ遺伝子のかわりに、ＨＤの一部をコードするＨＤ遺伝子、すなわち一部を欠失したＨＤ遺伝子を用いて遺伝子置換を行うと、染色体ＨＤ遺伝子が一部を欠失したＨＤ遺伝子に置換されたＨＤ欠損株が得られる。
後記実施例１に示すように、ＨＤはＮ末端側の領域が活性に関与していると予想される。したがって、ＨＤ遺伝子のうち欠失させる部位としては、Ｎ末端側の領域、例えばＮ末端から３５０アミノ酸以内の領域、例えば１００〜２００番目、あるいは２５０〜３５０番目のアミノ酸の領域が挙げられる。尚、ＨＤ遺伝子は、その下流に存在するホモセリンキナーゼと同一オペロン内にあるので、ホモセリンキナーゼの発現を阻害しないようにＨＤ遺伝子のプロモーター部位は欠失させないことが好ましい。
組換えＤＮＡをコリネホルム細菌の細胞内に導入するには、E. coli K-12について報告されている様に受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法（Mandel,M.and Higa,A.,J.Mol.,Biol.,53,159(1970)、またはバチルス・ズブチリスについて報告されている様に細胞がＤＮＡを取り込み得る様に増殖段階（いわゆるコンピテントセル）に導入する方法（Duncan,C.H.,Wilson,G.A.and Young,F.E.,Gene,1,153(1977)））により可能である。あるいは、バチルス・ズブチリス、放線菌類および酵母について知られている様に（Chang,S.and Choen,S.N.,Molec.Gen.Genet.,168.111(1979);Bibb,M.J.,Ward,J.M.and Hopwood,O.A.,Nature,274,398(1978);Hinnen,A.,Hicks,J.B.and Fink,G.R.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,75, 1929(1978)）、DNA受容菌を、組換えＤＮＡを容易に取り込むプロトプラストまたはスフェロプラストにして組換えＤＮＡ受容菌に導入することも可能である。
プロトプラスト法では上記のバチルス・ズブチリスにおいて使用されている方法でも充分高い頻度を得ることができるし、特開昭57-183799に記載されたコリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属のプロトプラストにポリエチレングリコールまたはポリビニルアルコールと二価金属イオンとの存在下にＤＮＡをとり込ませる方法も当然利用できる。ポリエチレングリコールまたはポリビニルアルコールの代りに、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、フィコール、ブルロニックＦ６８（セルバ社）などの添加によってＤＮＡのとり込みを促進させる方法でも同等の結果が得られる。
さらには、電気パルス法（杉本ら,特開平2-207791号公報）によっても、組換えＤＮＡをブレビバクテリウム属またはコリネバクテリウム属細菌に属する受容菌へ導入できる。
変異型ＨＤ遺伝子または欠失型ＨＤ遺伝子を導入する野生型コリネホルム細菌としては、コリネバクテリウム属細菌、及び従来ブレビバクテリウム属に分類されていたが現在コリネバクテリウム属細菌として統合されたブレビバクテリウム属細菌、さらにコリネバクテリウム属細菌と非常に近縁なブレビバクテリウム属細菌が挙げられるが、特にコリネバクテリウム属（ブレビバクテリウム属）のグルタミン酸生産性細菌が本発明においては、最も好ましいものである。コリネバクテリウム属（ブレビバクテリウム属）のグルタミン酸生産性細菌の野性株の例としては次のようなものが挙げられ、これらの野生株、あるいは同株にＬ−リジン生産性の性質を付与した株も同様に本発明に使用することができる。
0003783065.tif 000003
また、本発明に用いることができるコリネホルム細菌として、上記のようなグルタミン酸生産性を有する野性株のほかにグルタミン酸生産性を有するまたはグルタミン酸生産性を失った変異株も含まれる。現在、Ｌ−リジン生産菌としてコリネホルム・グルタミン酸生産菌の種々の人工変異株が用いられており、これらの株も本発明に使用することができる。このような人工変異株としては次のようなものがある。ＡＥＣ（Ｓ−（２−アミノエチル）−システイン）耐性変異株、その成長にＬ−ホモセリンのようなアミノ酸を必要とする変異株（特公昭４８−２８０７８号，特公昭５６−６４９９号），ＡＥＣに耐性を示し、更にＬ−ロイシン、Ｌ−ホモセリン，Ｌ−プロリン，Ｌ−セリン，Ｌ−アルギニン，Ｌ−アラニン，Ｌ−バリン等のアミノ酸を要求する変異株（米国特許第３７０８３９５号及び第３８２５４７２号），ＤＬ−α−アミノ−ε−カプロラクタム，α−アミノ−ラウリルラクタム，アスパラギン酸−アナログ，スルファ剤，キノイド，Ｎ−ラウロイルロイシンに耐性を示すＬ−リジン生産変異株，オキザロ酢酸脱炭酸酵素（デカルボキシラーゼ）または呼吸系酵素阻害剤に耐性を示すＬ−リジン生産変異株（特開昭５０−５３５８８号，特開昭５０−３１０９３号，特開昭５２−１０２４９８号，特開昭５３−９３９４号，特開昭５３−８６０８９号特開昭５５−９７８３号，特開昭５５−９７５９号，特開昭５６−３２９９５号，特開昭５６−３９７７８号，特公昭５３−４３５９１号，特公昭５３−１８３３号），イノシトールまたは酢酸を要求するＬ−リジン生産変異株（特開昭５５−９７８４号，特開昭５６−８６９２号），フルオロピルビン酸または３４℃以上の温度に対して感受性を示すＬ−リジン生産変異株（特開昭５５−９７８３号，特開昭５３−８６０９０号）、エチレングリコールに耐性を示し、Ｌ−リジンを生産するブレビバクテリウムまたはコリネバクテリウムの変異株（米国特許出願第３３３４５５号参照）。
＜４＞ＨＤ変異株又はＨＤ欠損株におけるＡＫ遺伝子増幅
ＡＫは、Ｌ−リジン及びＬ−スレオニンが共存することによってフィードバック阻害を受けるが、野生型ホモセリンデヒドロゲナーゼを発現しないコリネホルム細菌はＬ−スレオニンを生産できないので、ＡＫはフィードバック阻害を受けない。したがって、野生型ホモセリンデヒドロゲナーゼを発現しないコリネホルム細菌の細胞中でＡＫ遺伝子を増幅すれば、Ｌ−リジン生産性が向上すると考えられる。また増幅するＡＫ遺伝子として阻害解除型ＡＫ遺伝子を用いると、一層フィードバック阻害を受けないので、さらにＬ−リジン生産性が向上すると考えられる。
ＡＫ遺伝子を導入する野生型ホモセリンデヒドロゲナーゼを発現しないコリネホルム細菌としては、上記＜３＞のようにして得られるＨＤ変異株又はＨＤ欠損株が挙げられるが、突然変異処理によって得られるＨＤ完全欠損株を用いても、同様にＡＫ遺伝子増幅によるＬ−リジン生産性向上効果が得られる。
これらの野生型ホモセリンデヒドロゲナーゼを発現しないコリネホルム細菌細胞中でＡＫ遺伝子または変異型ＡＫ遺伝子を増幅するには、ＡＫ遺伝子または変異型ＡＫ遺伝子とコリネホルム細菌細胞内で自律複製可能なベクターとからなる組換えＤＮＡで該コリネホルム細菌を形質転換すればよい。
ここで用いるベクターは、コリネホルム細菌細胞内において自律的に複製し得るものであればどのようなものでも良い。具体的には、前述したpAJ655、pAJ1844、pAJ611、pAJ3148、pAJ440等が例示できる。
コリネホルム細菌の形質転換方法としては、E. coli K-12について報告されている様に受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法（Mandel,M.and Higa,A.,J.Mol.,Biol.,53,159(1970)、またはバチルス・ズブチリスについて報告されている様に細胞がＤＮＡを取り込み得る様に増殖段階（いわゆるコンピテントセル）に導入する方法（Duncan,C.H.,Wilson,G.A.and Young,F.E.,Gene,1,153(1977)）等が挙げられる。あるいは、バチルス・ズブチリス、放線菌類および酵母について知られている様に（Chang,S.and Choen,S.N.,Molec.Gen.,Genet.,168.111(1979);Bibb,M.J.,Ward,J.M.and Hopwood,O.A.,Nature,274,398(1978);Hinnen,A.,Hicks,J.B.and Fink,G.R.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,75, 1929(1978)）、DNA受容菌を、組換えＤＮＡを容易に取り込むプロトプラストまたはスフェロプラストにして組換えＤＮＡ受容菌に導入することも可能である。
また、ベクターに薬剤耐性などのマーカー遺伝子や、宿主の栄養要求性を相補する遺伝子などを保持させることにより、組換えＤＮＡの宿主中での安定性を向上させることができる。
さらに、ＡＫ遺伝子または変異型ＡＫ遺伝子の発現には、ＡＫ遺伝子固有のプロモーターをそのまま用いてもよいが、コリネホルム細菌で機能する他の遺伝子のプロモーターを用い、これをＡＫまたは変異型ＡＫをコードするＤＮＡ配列に連結してもよい。
＜５＞ＨＤ変異株又はＨＤ欠損株の染色体ＤＮＡへの変異型ＡＫ遺伝子の導入
上記＜４＞で述べたように、ＨＤ変異株又はＨＤ欠損株の細胞中でＡＫ遺伝子増幅を行うと、Ｌ−リジン生産性を向上させることができるが、ＨＤ変異株又はＨＤ欠損株に導入したＡＫ遺伝子の安定性を増すためには、ＡＫ遺伝子を染色体ＤＮＡ中に組み込むことが好ましい。ここで染色体ＤＮＡに組み込むＡＫ遺伝子としては、変異型ＡＫ遺伝子を用いることが好ましい。
変異型ＡＫ遺伝子を、宿主染色体ＤＮＡに組み込むには、変異型ＨＤ遺伝子あるいは欠失型ＨＤ遺伝子の場合と同様に遺伝子組込みを行えばよい。すなわち、プラスミドベクターにブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム由来の温度感受性複製起点と変異型ＡＫ遺伝子とクロラムフェニコール等の薬剤に耐性を示すマーカー遺伝子とを挿入して組換えＤＮＡを調製し、この組換えＤＮＡでコリネホルム細菌を形質転換し、温度感受性複製起点が機能しない温度で形質転換株を培養し、続いてこれを薬剤を含む培地で培養することにより、組換えＤＮＡが染色体ＤＮＡに組み込まれた形質転換株が得られる。
こうして染色体に組換えＤＮＡが組み込まれた株は、染色体上にもともと存在するＡＫ遺伝子配列との組換えを起こし、染色体ＡＫ遺伝子と変異型ＡＫ遺伝子との融合遺伝子２個が組換えＤＮＡの他の部分（ベクター部分、温度感受性複製起点及び薬剤耐性マーカー）を挟んだ状態で染色体に挿入されている。この状態では変異型ＡＫが優性であるので表現型は変異型となる。したがって、遺伝子組込み株のままでもよいが、染色体ＤＮＡ上でほぼ同一の配列が並列に並んでいると再び組換えを起こして一方のＡＫ遺伝子が脱落しやすいので、染色体ＤＮＡ上に変異型ＡＫ遺伝子のみが残った遺伝子置換株を得ることが好ましい。すなわち、２個のＡＫ遺伝子の組換えにより、１コピーのＡＫ遺伝子をベクター部分（温度感受性複製起点及び薬剤耐性マーカーを含む）とともに脱落させる。例えば、染色体組込み株を培養し、培養菌体を薬剤を含まない平板培地にまいて培養する。生育したコロニーを、薬剤を含む平板培地にレプリカして培養し、薬剤感受性株を取得する。得られた薬剤感受性株の染色体からベクター部分が脱落していることを、サザン・ハイブリダイゼーションにより確認し、さらに変異型ＡＫを発現していることを確認する。
尚、変異型ＨＤ遺伝子または欠失型ＨＤ遺伝子による遺伝子置換の場合と異なり、野生型ＡＫ遺伝子が染色体ＤＮＡ上に完全な形で残っていてもさしつかえないので、変異型ＡＫ遺伝子は染色体ＤＮＡ上のＡＫ遺伝子以外の部位に組み込まれていてもよい。
＜６＞Ｌ−リジンの製造
上記のようにして得られるＨＤ変異株、ＨＤ欠損株、ＡＫ遺伝子を増幅したこれらの株、または変異型ＡＫ遺伝子を組み込んだＨＤ変異株もしくはＨＤ欠損株を、好適な培地で培養することにより、培養物中にＬ−リジンを生産蓄積せしめることができる。
使用する培地としては、炭素源、窒素源、無機イオン及び必要に応じその他の有機成分を含有する通常の培地が挙げられる。
炭素源としては、グルコース、ラクトース、ガラクトース、フラクトースやでんぷんの加水分解物などの糖類、フマール酸、クエン酸、コハク酸等の有機酸類を用いることができる。
窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガス、アンモニア水等を用いることができる。
有機微量栄養源としては、ビタミンＢ１、Ｌ−ホモセリンなどの要求物質または酵母エキス等を適量含有させることが望ましい。これらの他に、必要に応じてリン酸カリウム、硫酸マグネシウム、鉄イオン、マンガンイオン等が少量添加される。
また、ＨＤ欠損株を用いる場合には、培地中に適当量のＬ−スレオニン及びＬ−メチオニン、またはＬ−ホモセリンを加える。
培養は好気的条件下で１６〜７２時間実施するのがよく、培養温度は２５℃〜３７℃に、培養中ｐＨは５〜７に制御することが好ましい。尚、ｐＨ調整には無機あるいは有機の酸性あるいはアルカリ性物質、更にアンモニアガス等を使用することができる。培養物からのＬ−リジンの採取は通常のイオン交換樹脂法、沈澱法その他の公知の方法を組み合わせることにより実施できる。
【図面の簡単な説明】
図１は、遺伝子組込み及び遺伝子置換の概念図、
図２は、各種微生物のＨＤ遺伝子のアミノ酸配列を比較した図、
図３は、各種微生物のＨＤ遺伝子のアミノ酸配列を比較した図（続き）、
図４は、p399AK9B及びp399AKYBの構築の過程を示す図、
図５は、ＨＤ変異株及びＨＤ欠損株のＬ−リジン生産性及び培養後のＯＤを示す図、
図６は、ＡＫ遺伝子を増幅したＨＤ変異株及びＨＤ欠損株のＬ−リジン生産性及び培養後のＯＤを示す図、
図７は、変異型ＡＫ遺伝子が染色体に組み込まれたＨＤ変異株及びＨＤ欠損株のＬ−リジン生産性及び培養後のＯＤを示す図である。
好適な実施例の説明
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
実施例１ 野生型ＨＤ遺伝子、弱化型ＨＤ遺伝子
及び阻害解除型ＨＤ遺伝子の解析
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム野生株から、弱化型ＨＤ変異株及びＬ−スレオニンによるフィードバック阻害が解除されたＨＤを産生する変異株を創成し、これらの野生株及び変異株から、野生型ＨＤ遺伝子、弱化型ＨＤ遺伝子及び阻害解除型ＨＤ遺伝子を単離し、構造解析を行った。野生株としては、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ12036株（FERM BP-734）を、弱化型ＨＤ変異株としてはブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ12472株及びAJ12937株を、阻害解除型ＨＤ変異株としてはブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAI6080株を用いた。これらの変異株は以下のようにして得た。
AJ12036株は、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム２２５６株（ATCC 13869）から、もともと存在するプラスミドpAM330を脱落させた株であり、ＨＤに関しては野生型ＨＤを産生する株である。
一方、AJ12472株及びAJ12937株は、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム２２５６株（ATCC 13869）からＬ−リジン生産性を指標として突然変異による育種を繰り返した結果得られた株であり、弱化型ＨＤを産生する株である。また、AI6080株はブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム２２５６株（ATCC 13869）から、Ｌ−スレオニン生産性を指標として突然変異による育種を繰り返した結果得られた株であり、阻害解除型ＨＤを産生する株である。
＜１＞ＰＣＲ法によるＨＤ遺伝子の増幅
ＨＤ遺伝子の塩基配列は、コリネバクテリウム・グルタミカムにおいて報告されており（Peoples, O. P. et al; Molecular Microbiology 2(1) 63-72 (1988)）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムとコリネバクテリウム・グルタミカムの各々のＨＤ遺伝子の配列は類似性が高いことが予想されたので、コリネバクテリウム・グルタミカムの配列を基にＰＣＲ法に用いる合成プライマーＤＮＡを作製した。
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ12036株、AJ12472株、AJ12937株及びAI6080株から常法により染色体ＤＮＡを調製した。これらの染色体ＤＮＡからＨＤ遺伝子を含む約1500bpのＤＮＡ断片をＰＣＲ法により増幅するために、ＡＢＩ社製ＤＮＡ合成機model381A型を用いて、５’側プライマーＨ１(841)5'-CTGGGAAGGTGAATCGAATT-3'(860)：配列表配列番号１）及び３’側プライマーＨ２（(2410)5'-TCCGAGGTTTGCAGAAGATC-3'(2391)：配列表配列番号２）の２種類のプライマーを合成した。尚、かっこ内の数字はPeoplesらが発表した塩基配列（Peoples, O. P. et al., Molecular Microbiology 2(1) 63-72 (1988)）における位置を示す。得られた合成プライマーは、逆相ＨＰＬＣにて精製した。
ＰＣＲ反応は、ＰＣＲ増幅装置（ＤＮＡサーマルサイクラーPJ2000：宝酒造（株））及びＰＣＲキット（Takara GeneAmpTM kit：宝酒造（株））を用い、以下に示す組成で行った。
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ＰＣＲ反応におけるＤＮＡの変性、ＤＮＡのアニーリング、及びポリメラーゼ反応の条件は、各々94℃、１分、37℃、２分、75℃、３分とし、各温度間の遷移は１秒で行った。この反応サイクルを25サイクル繰返すことによりＤＮＡの増幅を行った。こうして得られた増幅反応生成物の大きさをアガロースゲル電気泳動により確認した結果、約1.4KbpのＤＮＡ断片の増幅が認められた。
こうしてAJ12036株、AJ12472株、AJ12937株及びAI6080株の各株の染色体ＤＮＡから増幅されたＤＮＡ断片を各々制限酵素KpnIを用いて切断して得られるＤＮＡ断片を、ベクタープラスミドpHSG399（Takeshita, S. et al.;Gene(1987),61,63-74参照）のKpnI部位に挿入して組換えＤＮＡを得た。AJ12036株由来の増幅断片を含む組換えＤＮＡをpHDW、AJ12472株由来の増幅断片を含む組換えＤＮＡをpHDMI、AJ12937株由来の増幅断片を含む組換えＤＮＡをpHDMII、AI6080株由来の増幅断片を含む組換えＤＮＡをpHDMIIIと命名し、各々のプラスミドをE. coli JM109株に導入して形質転換体を得た。
＜２＞ＨＤ遺伝子の塩基配列の決定及び変異点の解析
（１）野生型及び変異型ＨＤ遺伝子の塩基配列の比較
上記のようにして得られたブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ12036株、AJ12472株、AJ12937株及びAI6080株のＨＤ遺伝子断片の塩基配列の決定をダイデオキシ法により行った。
決定されたAJ12036株の野生型ＨＤ遺伝子の塩基配列及びこの配列から推定されるアミノ酸配列を、配列表配列番号３に示す。さらに、アミノ酸配列を配列表配列番号４に示す。この配列とPeoplesら報告したコリネバクテリウム・グルタミカムのＨＤ遺伝子の配列（Peoples, O. P. et al., Molecular Microbiology, 2(1), 63-72 (1988)）を比較したところ、４ヶ所に塩基の相違があり、そのうち１ヶ所はアミノ酸レベルでの相違であった。この相違点をコリネバクテリウム・グルタミカムのＨＤ遺伝子の配列を基準として以下に示す。
▲１▼531Ｇ→Ｃ（148Gly→148Ala）
▲２▼1222Ｇ→Ｃ
▲３▼1318Ｇ→Ｔ
▲４▼1324Ｃ→Ｇ
コリネホルム細菌の各野生株のＨＤ遺伝子の配列の間に認められるこのような相違は、ＨＤ活性に影響するものではなく、コリネバクテリウム・グルタミカムのＨＤ遺伝子の配列も配列番号３に示されるブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムのＨＤ遺伝子の配列と同等のものとして扱うことができる。
また、AJ12036株の野生型ＨＤ遺伝子の塩基配列及びこの配列から推定されるアミノ酸配列をAJ12472株、AJ12937株及びAI6080株のＨＤ遺伝子の塩基配列及びアミノ酸配列と比較した結果、AJ12472株では２ヶ所、AJ12937では１ヶ所、AI6080では１ヶ所の変異点があり、全てアミノ酸置換を伴っており、さらにAJ12472株及びAJ12937株のＨＤ遺伝子には全く同一の変異が１ヶ所共通して存在していることがわかった。各変異点を以下に示す。
0003783065.tif 000005
以下、155Ｃ→Ｔ（23Leu→Phe）の変異点を変異点１、398Ｇ→Ａ（104Val→Ile）の変異点を変異点２、さらに1266Ｃ→Ｔ（393Ser→Phe）の変異を変異点３という。
（２）ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム、バチルス・サブチリス及びE. coliのＨＤアミノ酸配列及び変異点の比較
E. coliにはＨＤ遺伝子が２種類（HD-1、HD-2）存在し、いずれもＡＫと２機能酵素となっていることが知られている（Zakin, M. M. et al; J.B.C. 258 3028-3031 (1983)）。また、バチルス・サブチリスのＨＤ遺伝子の塩基配列も決定されている（Parsot, C and Cohen, G. N.; J.B.C. 263(29) 14654-14660 (1988)）。これらのアミノ酸配列とブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム野生型ＨＤのアミノ酸配列を比較したものを図２及び図３に示す。
この結果から、相同性の高い部位はＮ末端側の領域に多く、特にブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＨＤのアミノ酸配列においてアミノ酸番号１００〜２３０の領域に相同性が高い部位が集中していることがわかる。このことと、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＨＤの２箇所の変異点はＮ末端から約１００アミノ酸残基内にあり、特に変異点１はＮ末端から２３アミノ酸残基の位置であって、しかも２つの変異点は、E. coliのHD-1、HD-2、バチルス・サブチリスのＨＤ及びブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＨＤとの間で保存性の高いアミノ酸残基であったこと、さらに、E. coliのHD-1及びHD-2は、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＨＤのＣ末端側約１００アミノ酸残基に対応する配列は存在しないことから、ＨＤの活性領域はＮ−末端側にあると推定される。
一方、Ｌ−スレオニンによる阻害が解除されたコリネバクテリウム・グルタミカムＨＤの遺伝子の塩基配列が発表されている。すなわち、Sahmら（Reinscheid,D.J. et al; J.Bacteriol. 173(10) 3228-3230 (1991)）は点変異によるＣ末端から６８番目の１アミノ酸の置換を、またSinskeyら（Archer, J. A. C. et al; Gene 107 53-59 (1991)）は、点変異によるフレームシフトでのＣ末端から１７番目以降のアミノ酸の変化、及び７番目以降のアミノ酸の欠失を報告している。また、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAI6080株の阻害解除型ＨＤでは、アミノ酸残基の変異はＣ末端から５３アミノ酸残基目の位置であった。さらに、E. coliのHD-1及びHD-2には存在しないＣ−末端側の領域が、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＨＤと同様にＬ−スレオニンによるフィードバック阻害を受けるバチルス・サブチリスのＨＤには存在することから、ＨＤのＬ−スレオニンによるフィードバック阻害に関わる領域はＣ−末端側にあると推定される。
実施例２  野生型ＡＫ遺伝子及び変異型ＡＫ遺伝子の取得と解析
＜１＞野生型及び変異型ＡＫ遺伝子、及びそれらを含有するプラスミドの作製
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム２２５６株（ATCC 13869）、及び２２５６株より変異処理により得られたＬ−リジン生産性変異株AJ3463（FERM P-1987）より常法に従い、染色体DNAを調製した。染色体DNAよりPCR法（polymerase chain reaction ; White,T.J. et al ;Trends Genet. 5,185(1989)参照）によりＡＫ遺伝子を増幅した。増幅に用いたDNAプライマーはコリネバクテリウム・グルタミカムにおいて既知となっている配列（Molecular Microbiology(1991)5(5),1197-1204, Mol.Gen.Genet.(1990)224,317-324参照）を基にしてＡＫ遺伝子をコードする約1643bpの領域を増幅すべく、5'-TCGCGAAGTAGCACCTGTCACTT-3'（配列番号５）と5'-ACGGAATTCAATCTTACGGCC-3'（配列番号６）という配列の23mer及び21merの一本鎖ＤＮＡを合成した。ＤＮＡの合成はApplied Biosystems社製ＤＮＡ合成機model 380Bを使用し、ホスホアミダイト法を用いて（Tetrahedron Letters(1981),22,1859参照）常法に従って合成した。
PCR反応は、宝酒造（株）製ＤＮＡサーマルサイクラーPJ2000型を用い、TaqDNAポリメラーゼを用い、供給者により指定された方法に従って遺伝子増幅を行なった。増幅された1643kbの遺伝子断片をアガロースゲル電気泳動により確認した後、ゲルより切り出した該断片を常法により精製し、制限酵素NruI（宝酒造（株）製）及びEcoRI（宝酒造（株）製）にて切断した。
遺伝子断片のクローン化用ベクターにはpHSG399（Takeshita, S et al;Gene(1987),61,63-74参照）を用いた。pHSG399を制限酵素SmaI（宝酒造（株）製）及び制限酵素EcoRIにて切断し、増幅されたＡＫ遺伝子断片と接続した。ＤＮＡの接続はＤＮＡライゲーションキット（宝酒造（株）製）を用い、指定された方法にて行なった。この様にしてpHSG399にブレビバクテリウム染色体より増幅されたＡＫ遺伝子断片が接続されたプラスミドを作製した。野生株である２２５６株（ATCC 13869）由来のＡＫ遺伝子を有するプラスミドをp399AKY、Ｌ−リジン生産菌であるAJ3463由来のＡＫ遺伝子を有するプラスミドをp399AK9と命名した。
p399AKYおよびp399AK9に、それぞれコリネバクテリウム属細菌中でプラスミドを自律複製可能にする能力をもつＤＮＡ断片（以下「Coryne.-ori」と記す）を導入し、コリネバクテリウム属細菌中で自律複製可能なＡＫ遺伝子を搭載したプラスミドを作製した。Coryne.-oriは、エシェリヒア・コリと、コリネバクテリウム属細菌の双方の菌体中で自律複製可能なプラスミドベクターからCoryne.-oriを調製した。このようなプラスミドベクターはいくつか報告があるが、ここでは、コリネホルム細菌細胞内で自律複製可能なプラスミドpAJ1844(特開昭58-216199参照)とエシェリヒア・コリ細胞内で自律複製可能なプラスミドpHSG298(S.Takeshita et al：Gene 61,63-74(1987)参照)から作製したシャトルベクターpHK4を用いた。
pHK4の作製法については、特開平５−７４９１号公報に詳細に記載されているが、概略を示せば以下の通りである。pAJ1844を制限酵素Sau3AIで部分切断し、制限酵素BamHIで完全切断したpHSG298と連結した。連結後のＤＮＡをブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ12036(FERM-P7559)に導入した。形質転換の方法は、電気パルス法(特開平2-207791参照)を用いた。形質転換体の選択は、カナマイシン25μg/mlを含むM-CM2Gプレート（グルコース5g、ポリペプトン10g、酵母エキス10g、NaCl15g、DL-メチオニン0.2g、寒天15gを純水1lに含む。pH7.2）にて行った。形質転換体からプラスミドを調製し、大きさの最も小さいものを選択し、pHK4と命名した。このプラスミドは、エシェリヒア・コリと、コリネホルム細菌中で自律複製でき、宿主にカナマイシン耐性を付与する。
上記のようにして得られたpHK4を、制限酵素KpnI（宝酒造（株）製）にて切断し、切断面を平滑末端化した。平滑末端化はDNA Blunting kit（宝酒造（株）製）を用い、指定された方法にて行なった。平滑末端化後、リン酸化済みBamHIリンカー（宝酒造（株）製）を接続し、pHK4よりCoryne.-ori部分のDNA断片をBamHIのみによる切断によって切り出される様改変した。このプラスミドをBamHIにより切断し、生じたCoryne.-oriＤＮＡ断片を同じくBamHIにて切断したp399AKY、p399AK9に接続し、コリネバクテリウム属細菌中で自律複製可能でかつＡＫ遺伝子を含むプラスミドを作製した。
p399AKY由来の野生型ＡＫ遺伝子を含むプラスミドをp399AKYBと命名し、p399AK9由来の変異型ＡＫ遺伝子を含むプラスミドをp399AK9Bと命名した。p399AK9B、p399AKYB構築の過程を図４に示す。ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム野生型株であるAJ12036株（FERM-P7559）に変異型ＡＫプラスミドp399AK9Bを導入した株AJ12691は、１９９２年４月１０日に通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号FERM-P12918として寄託され、１９９５年２月１０日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、FERM BP-4999の受託番号で寄託されている。
＜２＞ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムの野生型ＡＫ及び変異型ＡＫ遺伝子の塩基配列の決定
野生型ＡＫ遺伝子を含むプラスミドp399AKY及び変異型ＡＫ遺伝子を含むプラスミドp399AK9を各々の形質転換体から調製し、野生型及び変異型ＡＫ遺伝子の塩基配列の決定を行なった。塩基配列の決定はサンガーらの方法（F.Sanger et al：Proc.Natl.Acad.Sci.74,5463(1977)などがある）によった。
p399AKYにコードされている野生型ＡＫ遺伝子の塩基配列を配列表の配列番号７に示す。一方、p399AK9にコードされている変異型ＡＫ遺伝子の塩基配列は野生型ＡＫと比べ、配列番号７において１０５１番目のＧがＡに変化しているという１塩基の変異のみを有していた。ＡＫ遺伝子は、同一のＤＮＡ鎖にα、βの２本のサブユニットが同一のリーディングフレームでコードされていることが知られているが（Kalinowski,J et al;Molecular Microbiology(1991)5(5),1197-1204参照）、相同性から判断して本遺伝子も同一のＤＮＡ鎖にα、βの２本のサブユニットが同一のリーディングフレームでコードされていると考えられる。
ＤＮＡ塩基配列より推定される野生型ＡＫタンパク質のαサブユニットのアミノ酸配列をＤＮＡ配列と同時に配列表の配列番号８に示す。このアミノ酸配列のみを配列番号９に示す。また、ＤＮＡ塩基配列より推定される野生型ＡＫタンパク質のβサブユニットのアミノ酸配列をＤＮＡと同時に配列表の配列番号１０に示す。このアミノ酸配列のみを配列番号１１に示す。尚、各サブユニットとも、開始コドンにＧＴＧが用いられており、対応するアミノ酸をメチオニンと表記しているが、これは、メチオニン、バリン、またはフォルミルメチオニンを表すものである。
一方、変異型ＡＫ遺伝子配列上の変異は、野生型ＡＫタンパク質のアミノ酸配列（配列番号８、１０）において、αサブユニットでは２７９番目のアラニン残基がスレオニン残基に、βサブユニットでは３０番目のアラニン残基がスレオニン残基にというアミノ酸残基置換を起こしていることを意味する。
＜３＞変異型ＡＫ遺伝子発現産物のＡＫ活性及び阻害解除の評価
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（コリネバクテリウム・グルタミカム）野生型株であるAJ12036株（FERM-P7559）に野生型ＡＫプラスミドp399AKYB及び変異型ＡＫプラスミドp399AK9Bを各々導入した株を作製した。コリネバクテリウムへの遺伝子導入は、電気パルス法によった。宿主のブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（コリネバクテリウム・グルタミカム）AJ12036株、野生型ＡＫプラスミドを保持するAJ12690株および、変異型ＡＫプラスミドを保持するAJ12691(FERM-P12918)株のＡＫ活性を測定した。活性測定は、常法に従った（Miyajima,R et al;The Journal of Biochemistry(1968)63(2),139-148参照）。
表３に示す様にＡＫプラスミド導入によりＡＫの比活性が約１０〜１５倍に増大していること、及び変異型ＡＫプラスミド導入株についてのみ、Ｌ−リジン及びＬ−スレオニンによる相乗阻害が解除していることを確認した。表３は、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム野生型株AJ12036株、及びそれに野生型ＡＫプラスミドを保持させたAJ12690株、変異型ＡＫプラスミドを保持させたAJ12691株の菌体破砕液のＡＫ比活性、及びそのＬ−リジン及びＬ−スレオニンによる相乗阻害の程度を表わしたものである。阻害剤のＬ−リジン、及びＬ−スレオニンは各々最終濃度１ｍＭとなるよう添加した。
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＜４＞変異型ＡＫ遺伝子の部位特異的変異による改良
上記のようにして得られた変異型ＡＫをさらに改良するために、部位特異的変異により、変異型ＡＫの変異点（279Ala→Thr）を他のアミノ酸残基に置換することにした。目的部位に目的の変異を起こす部位特異的変異法としてはＰＣＲを用いる方法(Higuchi,R.,61,in PCR technology（Erlich,H.A.Eds.,Stockton press(1989)）)、ファージを用いる方法(Kramer,W. and Frits,H.J.Meth. in Enzymol.,154,350(1987);Kunkel,T.A. et al.,Meth. in Enzymol.,154,367(1987))などがある。
変異によって導入されるアミノ酸残基の種類としては、20種類のアミノ酸を極性や分子構造などの各々の性質により分類し、代表的なもの８種(Arg,Asp,Cys,Phe,Pro,Ser,Tyr,Val)を選んだ。各々の変異点のアミノ酸変異、及び塩基置換を表４に示す。
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変異の導入方法としては、変異が導入される279番目のAla残基のコドンを目的のアミノ酸残基のコドンに置換した23merの合成ＤＮＡ８種を考案し（Arg導入用合成ＤＮＡは5'-GCCAGGCGAG CGT GCCAAGGTTT-3'：配列番号１２、Asp導入用合成ＤＮＡは5'-GCCAGGCGAG GAT GCCAAGGTTT-3'：配列番号１３、Cys導入用合成ＤＮＡは5'-GCCAGGCGAG TGT GCCAAGGTTT-3'：配列番号１４、Phe導入用合成ＤＮＡは5'-GCCAGGCGAG TTT GCCAAGGTTT-3'：配列番号１５、Pro導入用合成ＤＮＡは5'-GCCAGGCGAG CCT GCCAAGGTTT-3'：配列番号１６、Ser導入用合成ＤＮＡは5'-GCCAGGCGAG TCT GCCAAGGTTT-3'：配列番号１７、Tyr導入用合成ＤＮＡは5'-GCCAGGCGAG TAT GCCAAGGTTT-3'：配列番号１８、Val導入用合成ＤＮＡは5'-GCCAGGCGAG GTT GCCAAGGTTT-3'：配列番号１９である）、その相補配列と併せて１６種類の23mer一本鎖ＤＮＡを合成した。
たとえばArg残基を導入する場合、5'-GCCAGGCGAG CGT GCCAAGGTTT-3'（配列番号１２）なる配列を有する一本鎖ＤＮＡ、その相補鎖一本鎖ＤＮＡ、配列番号５の配列を有する一本鎖ＤＮＡ、及び配列番号６の配列を有する一本鎖ＤＮＡをプライマーとし、p399AKYを鋳型にしてPCR法を行った。非特異的変異の導入を除くため、作製されたＤＮＡから変異点を含む約280塩基対を制限酵素（NaeI-AvaII）を用いて切り出し、p399AKYの該当部位と置換して組換えプラスミドを作製した。置換した領域については塩基配列の確認を行った。
得られた８種類の各々の組換えプラスミドが保持する変異型ＡＫの酵素活性を測定、評価するにあたり、宿主としてE. coliのＡＫ完全欠損株Gif106M1を用いた（Boy, E and Patte, J.C., J. Bacteriol.112, 84-92 (1972), Theze, J. et al., J. Bacteriol.117, 133-143 (1974)）。コリネホルム細菌にはＡＫ欠損株が知られていないために、宿主のＡＫとプラスミド由来のＡＫが混在してしまい、正確に測定できないと考えられたためである。多くのコリネホルム細菌の遺伝子はE. coli中で発現することが知られており、またＡＫ遺伝子はpHSG399上のlacプロモーター下流に連結されているため、エシェリヒア・コリ中で発現可能であると予想された。
野生型及び８種類の組換えプラスミドでE. coli Gif106M1を形質転換し、各々の形質転換株から無細胞抽出液を調製し、酵素解析を行った。ＡＫ活性の測定は、Miyajima,R et al;The Journal of Biochemistry(1968)63(2),139-148に記載される方法により行った。表５にＬ−リジン5mM、Ｌ−スレオニン5mM、あるいはＬ−リジン及びＬ−スレオニン2mMづつ添加したときの阻害解除度及び比活性を示す。
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その結果、Aspのような酸性アミノ酸に変化させた場合はＡＫは失活したが、その他のいずれのアミノ酸に変化させた場合もＬ−リジン及びＬ−スレオニンによる阻害は解除された。
実施例３ ＨＤ変異株及びＨＤ欠損株のＬ−リジン生産性の評価
２種類の変異型ＨＤ及びＨＤ欠損がＬ−リジン生産性に与える効果を比較するために、変異型ＨＤ遺伝子又は配列の一部を欠失させたＨＤ遺伝子を同じ宿主の染色体に組込んだ遺伝子置換株を作製し、各々をＨＤ変異株及びＨＤ欠損株としてＬ−リジン生産性を評価した。
＜１＞変異型ＨＤ遺伝子置換用プラスミド及び欠失型ＨＤ遺伝子置換用プラスミドの作製
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ12036株（FERM BP-734）（ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム２２５６株（ATCC 13869）から、クリプティックプラスミドpAM330を脱落させたもの）の染色体ＤＮＡに、変異型ＨＤ遺伝子又は配列の一部を欠失させたＨＤ遺伝子を相同組換えにより導入するために遺伝子置換用プラスミドを作製した。
（１）変異点１を有するＨＤ遺伝子の作製
実施例１で得られた変異型ＨＤ遺伝子は、変異点１（155Ｃ→Ｔ(23Leu→Phe)）及び変異点２（398Ｇ→Ａ(104Val→Ile)）を有する変異型ＨＤ遺伝子（AJ12472株由来）、及び変異点２のみを有する変異型遺伝子（AJ12937株由来）の２種類であった。変異点１がＨＤ活性およびＬ−リジン生産性に与える影響を調べるために、変異点１のみを有する変異型ＨＤ遺伝子を作製した。以下、変異点１を有する変異型ＨＤをHD-M1、変異点２を有する変異型ＨＤをHD-M2、変異点１及び変異点２を共に有するＨＤをHDM-12と呼ぶ。
HDM-12遺伝子を含むプラスミドpHDMIを、変異点１及び変異点２の両変異点の間を切断する制限酵素TthIII１、及びベクターとＨＤ遺伝子との連結点を切断するKpnIを用いて切断し、変異点１を持つ５’側ＨＤ断片を得た。同様に野生型ＨＤ遺伝子を有するpHDWをTthIII１及びKpnIで切断して３’側ＨＤ断片を得た。こうして得られた５’側ＨＤ断片と３’側ＨＤ断片とを結合することによって、変異点１のみを有するHD-M1遺伝子を得た。
（２）遺伝子置換用プラスミドの構築
上記のようにして得られた変異点１のみを有するHD-M1遺伝子を、クロラムフェニコール耐性（Cmr）遺伝子を有するベクタープラスミドpHSG398のKpnI部位に挿入し、さらに、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム野生株由来の温度感受性複製起点（TSori）をpHSG398のBamHI部位に挿入することによって、HD-M1遺伝子置換用プラスミドpTSHDM1を構築した。TSoriは、Coryne. -oriを有するプラスミドpHK4をインビトロでヒドロキシルアミン処理し、処理後のプラスミドＤＮＡでブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ12036を形質転換し、高温（３４℃）で生育できない形質転換株から回収して得られたプラスミドpHSC4（特開平５−７４９１号公報参照）から調製した。尚、Coryne. -oriは、pHSC4からBamHIとKpnIで切り出すことができるが、BamHI切断のみでCoryne. -oriを切り出せるようにプラスミドを改変した。pHSC4を制限酵素KpnI（宝酒造（株）製）にて切断し、切断面を平滑末端化した。平滑末端化はDNA Blunting kit（宝酒造（株）製）を用い、指定された方法にて行なった。平滑末端化後、リン酸化済みBamHIリンカー（宝酒造（株）製）を接続し、pHSC4よりTSori部分のDNA断片をBamHIのみによる切断によって切り出される様改変した。pHSC4を保持するエシェリヒア・コリAJ12571は、１９９０年１０月１１日に通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号FERM P-11763として寄託され、１９９１年８月２６日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、FERM BP-3524の受託番号で寄託されている。
次に、同様にして、変異点２のみを持つHD-M2遺伝子を有するプラスミドpHDIIをKpnIで切断してHD-M2遺伝子断片を得、これをpHSG398のKpnI部位に挿入し、さらに、TSoriをBamHI部位に挿入することによりHD-M2遺伝子置換用プラスミドpTSHDM2を構築した。
また、変異点１及び変異点２を共に有するHD-M12遺伝子を有するプラスミドpHDMIをKpnIで切断してHD-M12遺伝子断片を得、これをpHSG398のKpnI部位に挿入し、さらに、TSoriをBamHI部位に挿入することによりHD-M12遺伝子置換用プラスミドpTSHDM12を構築した。
さらに、野生型ＨＤ遺伝子を有するプラスミドpHDWをAatIIで切断し、ＨＤ遺伝子内に存在する２つのAatII部位（配列番号３において塩基番号716〜721、1082〜1087）間を欠失させることにより一部を欠失したＨＤ遺伝子（HD-Δ遺伝子）を含むプラスミドを作製した。このプラスミドをKpnIで切断してHD-Δ遺伝子断片を得、これをpHSG398のKpnI部位に挿入し、次にTSoriをBamHI部位に挿入することによりHD-Δ遺伝子置換用プラスミドpTSHDΔを構築した。
（３）ＨＤ変異株及びＨＤ欠損株の作製
上記で得られた変異型ＨＤ遺伝子置換用プラスミドpTSHDM1、pTSHDM2、pTSHDM12、及び欠失型ＨＤ遺伝子置換用プラスミドpTSHDΔを用いて、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ12036株の形質転換を、電気パルス法（杉本ら,特開平2-207791号公報）によって行った。
得られた形質転換株を、M-CM2G培地を用いて25℃にてフルグロース（約1〜2×109/ml）になるまで培養した。培養菌体を、プレート１枚あたり105細胞となるよう希釈し、クロラムフェニコール（５μg/mL）を含むM-CM2G平板培地にまき、34℃にて2〜7日培養してコロニーを取得した。得られたコロニーについて、細胞中にプラスミドが含まれていないことを確認し、さらに直鎖状のpHSG398をプローブに用いたサザン・ハイブリダイゼーション解析により、遺伝子置換用プラスミドの染色体への組込みを確認した。
上記のようにして得られた染色体組込み株は、染色体上にもともと存在するＨＤ遺伝子と変異型もしくは欠失型ＨＤ遺伝子との融合遺伝子２個が、ベクター（TSoriを含む）を挟んだ状態で挿入されている。
次に、変異型ＨＤ遺伝子あるいは欠失型ＨＤ遺伝子のみを染色体に残すために、野生型ＨＤ遺伝子及びベクターを染色体ＤＮＡから脱落させて、変異型ＨＤ遺伝子置換株及び欠失型ＨＤ遺伝子置換株を得た。野生型ＨＤ遺伝子及びベクターの脱落は次のようにして行った。
各組込み株を、クロラムフェニコール（10μg/mL）を含むM-CM2G培地で34℃にてフルグロース（1〜2×109/ml）になるまで培養した。培養菌体を、クロラムフェニコールを含まないM-CM2G平板培地に１枚あたり50〜200コロニーとなるようにまき、34℃にて培養した。生育したコロニーを、クロラムフェニコール（５μg/mL）を含むM-CM2G平板培地にレプリカし、34℃にて培養してクロラムフェニコール感受性株を取得した。得られたクロラムフェニコール感受性株の染色体からベクターが脱落していることを、サザン・ハイブリダイゼーションにより確認し、さらに変異型ＨＤあるいは欠失型ＨＤを発現していることを確認した。こうして得られた遺伝子置換株は、染色体ＤＮＡの塩基配列決定により、変異点が導入されていることを確認した。
こうして得られたHD-M1遺伝子置換株をＨＤＭ１株、HD-M2遺伝子置換株をＨＤＭ２株、HDM-12遺伝子置換株をＨＤＭ１２株、HD-Δ遺伝子置換株をＨＤΔ株と呼ぶ。
＜２＞ＨＤ変異株及びＨＤ欠損株のＬ−リジン生産性
ＨＤ変異株であるＨＤＭ１株、ＨＤＭ２株、ＨＤＭ１２株、及びＨＤ欠損株であるＨＤΔ株のＬ−リジン生産性を検討した。シングルコロニーアイソレーションを行ったこれらのＨＤ変異株、ＨＤ欠損株及びＨＤに関しては野生株であるAJ12036株を、下記に示すＬ−リジン生産培地20mLを入れた500mLフラスコ中で、31.5℃にて72時間振盪培養し、最終ＯＤ（ＯＤ562）及びＬ−リジン蓄積量を調べた。
（Ｌ−リジン生産培地）
下記成分（１Ｌ中）を溶解し、ＫＯＨでｐＨ８．０に調製し、１１５℃で１５分殺菌した後、別に乾熱殺菌したＣａＣＯ3を５０ｇ／Ｌ加える。
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結果を図５に示す。尚、残糖はいずれの株でも認められなかった。この結果から明らかなように、Ｌ−リジンの蓄積はAJ12036株ではほとんど認められないのに対して、ＨＤＭ１株では約4g/l、ＨＤＭ２株では約17g/l、ＨＤＭ１２株では約7.5g/l、ＨＤΔ株では約30g/lであり、いずれの株でもＬ−リジンの蓄積が認められ、特にＨＤΔ株ではＬ−リジン生産性が飛躍的に向上した。また、ＨＤへの変異点１のみの導入によってもＬ−リジンが蓄積されることが明らかとなった。
尚、ＨＤΔ株は最小培地またはＬ−スレオニンもしくはＬ−メチオニンを単独で添加した最小培地では生育せず、Ｌ−ホモセリンまたはＬ−スレオニン及びＬ−メチオニンの添加により生育が回復した。また、ＨＤＭ１株、ＨＤＭ２株及びＨＤＭ１２株は、いずれもＬ−スレオニン及びＬ−メチオニンを含まない最小培地で生育が可能であった。
尚、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＨＤΔ株は、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ12846と命名され、１９９４年３月１日に通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号FERM P-14197として寄託され、１９９５年２月９日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、FERM BP-4995の受託番号で寄託されている。
実施例４ ＨＤ変異株及びＨＤ欠損株におけるＡＫ遺伝子の増幅効果
実施例３に示したように、変異型ＨＤ遺伝子及び欠失型ＨＤ遺伝子を野生株に導入すると、Ｌ−リジンの生産性が向上することが明らかとなったが、さらにこれらの変異型ＨＤ遺伝子及び欠失型ＨＤ遺伝子とＡＫ遺伝子増幅との組合せによる効果を調べた。
ＡＫはＬ−リジン及びＬ−スレオニンによる協奏阻害を受けるが、各々単独では阻害の程度は低いことが知られている。したがって、ＨＤ変異株及びＨＤ欠損株ではＬ−スレオニンが生産されないので、野生型ＡＫ遺伝子の増幅によってもＬ−リジンの生産性が向上することが予想される。さらに、実施例２で得られたＬ−リジン及びＬ−スレオニンによる阻害を受けない変異型ＡＫをコードする遺伝子を導入すれば、より一層Ｌ−リジン生産性が向上することが期待される。
このような変異型ＨＤ遺伝子あるいは欠失型ＨＤ遺伝子の導入とＡＫ遺伝子増幅との組合せ効果を検討するため、実施例３で得られたＨＤ変異株及びＨＤ欠損株にＡＫ遺伝子を含むプラスミドを導入し、Ｌ−リジン生産性を評価した。
野生株であるAJ12036、ＨＤ変異株であるＨＤＭ１、ＨＤＭ２及びＨＤＭ１２、及びＨＤ欠損株であるＨＤΔの各株を各々宿主として、野生型ＡＫ遺伝子及びCoryne.-oriを持つプラスミド（p399AKYB））と変異型ＡＫを持つプラスミド（p399AK9B）を用いて形質転換した。すなわち、宿主５株について２種類のプラスミドで形質転換を行い、合計１０種類の形質転換株を得た。
AJ12036、ＨＤＭ１、ＨＤＭ２、ＨＤＭ１２、ＨＤΔ及び各々の形質転換株について２株づつを前述のＬ−リジン生産培地を用いて培養し、Ｌ−リジン生産性を調べた。但し、p399AKYBプラスミド及びp399AK9Bプラスミドを保持する形質転換株については、前培養に用いた培地及びＬ−リジン生産培地ともに10μg/mLのクロラムフェニコールを添加して培養した。培養は、培地20mLを入れた500mLフラスコ中で、31.5℃にて７２時間振盪しながら行った。
結果を図６に示したように、AJ12036株では、野生型ＡＫプラスミドを導入してもＬ−リジン生産性の向上は認められないのに対し、ＨＤ変異株及びＨＤ欠損株では、野生型ＡＫプラスミド導入によりＬ−リジン蓄積量の増加がみられた。また、変異型ＡＫプラスミドを導入した場合には、ＨＤ変異株及びＨＤ欠損株のいずれにおいても野生型ＡＫプラスミドを導入したときよりもＬ−リジン生産性がさらに向上した。さらに、野生型ＨＤ遺伝子を保持するAJ12036株でも、変異型ＡＫプラスミドの導入により、約22g/LのＬ−リジン蓄積が認められた。
実施例５ ＨＤ変異株及びＨＤ欠損株における変異型ＡＫ遺伝子置換の効果
＜１＞変異型ＡＫ遺伝子及び変異型ＨＤ遺伝子置換株、及び変異型ＡＫ遺伝子及び欠失側ＨＤ遺伝子置換株の創成
実施例４ではＨＤ変異及びＨＤ欠損とＡＫ遺伝子増幅との組合せの効果を調べたが、本実施例では変異型ＨＤ遺伝子あるいは欠失型ＨＤ遺伝子が染色体上に組み込まれるとともに変異型ＡＫ遺伝子が染色体上に組み込まれた株を創成し、Ｌ−リジン生産性を評価した。
変異型ＡＫ遺伝子を染色体ＤＮＡに組み込むための遺伝子置換用プラスミドは次のようにして得た。
実施例２で得られたプラスミドをp399AK9（pHSG399に染色体より増幅されたブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ3463株由来の変異型ＡＫ遺伝子断片が接続されたプラスミド）のベクター部分に存在するBamHI部位に、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムの温度感受性複製起点（TSori）を挿入することによって、変異型ＡＫ遺伝子置換用プラスミドpAK9Tを構築した。
変異型ＡＫ遺伝子及びHD-M1遺伝子が導入された株〔（AKFBR+HDM1）株〕は、実施例４で得られたＨＤＭ１株を親株として、変異型ＡＫ遺伝子置換用プラスミドpAK9Tを用いて変異型ＡＫ遺伝子を組み込むことによって得た。ＨＤＭ１株にpAK9Tを電気パルス法（杉本ら,特開平2-207791号公報）によって導入し、得られた形質転換株を、M-CM2G培地を用いて25℃にてフルグロース（約1〜2×109/ml）になるまで培養した。培養菌体を、プレート１枚あたり105細胞となるよう希釈し、クロラムフェニコール（５μg/mL）を含むM-CM2G平板培地にまき、34℃にて2〜7日培養してコロニーを取得した。得られたコロニーについて、細胞中にプラスミドが含まれていないことを確認し、さらに直鎖状のpHSG399をプローブに用いたサザン・ハイブリダイゼーション解析により、pAK9Tの染色体への組込みを確認した。
上記のようにして得られた染色体組込み株は、染色体上にもともと存在するＡＫ遺伝子と変異型ＡＫ遺伝子との融合遺伝子２個が、ベクター（TSoriを含む）を挟んだ状態で染色体に挿入されている。次に、変異型ＡＫ遺伝子のみを染色体ＤＮＡ上に残すために、野生型ＡＫ遺伝子及びベクターを脱落させて、変異型ＡＫ遺伝子置換株を得た。ベクターの脱落は次のようにして行った。
変異型ＡＫ遺伝子組込み株を、クロラムフェニコール（10μg/mL）を含むM-CM2G培地で34℃にてフルグロース（1〜2×109/ml）になるまで培養した。培養菌体を、クロラムフェニコールを含まないM-CM2G平板培地に１枚あたり50〜200コロニーとなるようにまき、34℃にて培養した。コロニーを形成するクローンのうち、Ｌ−リジン生産性が親株であるＨＤＭ１株よりも向上している株を選択した。
同様に、変異型ＡＫ遺伝子とHD-M12遺伝子を持つ株〔（AKFBR+HDM12）株〕は、ＨＤＭ１２株を親株として、pAK9Tを用いた遺伝子置換を上記と同様にして行い、ＨＤＭ１２株よりもＬ−リジン生産性が向上している株を選択した。
一方、変異型ＡＫ遺伝子とHD-M2遺伝子を導入した株〔（AKFBR+HDM2）株〕は、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ12036株にpAK9Tを導入して親株として変異型ＡＫ遺伝子が導入されたＡＫFBR株を創成し、続いてHD-M2遺伝子の導入を行った。すなわち、AJ12036株にpAK9Tを電気パルス法（杉本ら,特開平2-207791号公報）によって導入し、得られた形質転換株を、M-CM2G培地を用いて25℃にてフルグロース（約1〜2×109/ml）になるまで培養した。培養菌体を、プレート１枚あたり105細胞となるよう希釈し、クロラムフェニコール（５μg/mL）を含むM-CM2G平板培地にまき、34℃にて2〜7日培養してコロニーを取得した。得られたコロニーについて、細胞中にプラスミドが含まれていないことを確認し、さらに直鎖状のpHSG399をプローブに用いたサザン・ハイブリダイゼーション解析により、pAK9Tの染色体への組込みを確認した。
次に、変異型ＡＫ遺伝子組込み株を、クロラムフェニコール（10μg/mL）を含むM-CM2G培地で34℃にてフルグロース（1〜2×109/ml）になるまで培養した。培養菌体を、クロラムフェニコールを含まないM-CM2G平板培地に１枚あたり50〜200コロニーとなるようにまき、34℃にて培養した。生育したコロニーを、クロラムフェニコール（５μg/mL）を含むM-CM2G平板培地にレプリカし、34℃にて培養してクロラムフェニコール感受性株を取得した。得られたクロラムフェニコール感受性株の染色体からベクターが脱落していることを、サザン・ハイブリダイゼーションにより確認し、さらに変異型ＡＫを発現していることを確認した。こうして得られた遺伝子置換株は、染色体ＤＮＡの塩基配列決定により、変異点が導入されていることを確認した。
こうして得られた変異型ＡＫ遺伝子置換株ＡＫFBR株の染色体に、HD-M2遺伝子置換用プラスミドpTSHDM2を上記と同様に電気パルス法にて導入し、さらにプラスミドが脱落した遺伝子置換株を得た。遺伝子置換株の選択は、Ｌ−リジン生産性の向上及びＬ−スレオニン又はＬ−メチオニンに対する感受性により行った。
同様に、変異型ＡＫ遺伝子とHD-Δ遺伝子を導入した株〔（AKFBR+HDΔ）株〕は、変異型ＡＫ遺伝子置換株ＡＫFBR株を親株とし、pTSHDΔを用いた遺伝子置換を上記と同様にして行い、ＨＤ欠損によるＬ−メチオニン及びＬ−スレオニン要求性のクローンを選択した。
上記のようにして得られた各遺伝子置換株は、最終的に染色体ＤＮＡの塩基配列決定によって変異点が導入されていることを確認し、さらにサザンハイブリダイゼーションによるプラスミド脱落の確認を行った。
＜２＞変異型ＡＫ遺伝子及び変異型ＨＤ遺伝子置換株、及び変異型ＡＫ遺伝子及び欠失型ＨＤ遺伝子置換株のＬ−リジン生産性の評価
上記で得られた４株、すなわち（AKFBR+HDM1）株、（AKFBR+HDM2）株、（AKFBR+HDM12）株、及び（AKFBR+HDΔ）株について、Ｌ−リジン生産性の評価を行った。
これらの各株を、前述のＬ−リジン生産培地20mLを入れた500mLフラスコ中で、31.5℃にて72時間振盪培養し、培養後の培養液のＯＤ及びＬ−リジン蓄積量を測定した。
結果を図７に示す。Ｌ−リジン生産量は、ＡＫFBR株が約19g/Lであったのに対し、（AKFBR+HDM1）株では約21g/L、（AKFBR+HDM2）株では約22g/L、（AKFBR+HDM12）株では約20g/L、（AKFBR+HDΔ）株では約35g/Lであり、変異型ＨＤ遺伝子あるいは欠失型ＨＤ遺伝子を単独で導入した場合よりも、これらの遺伝子と変異型ＡＫ遺伝子と組み合わせて導入した方がＬ−リジン生産性がより一層向上することが示された。
培養終了後の培地のＯＤに関しては、（AKFBR+HDM1）株、（AKFBR+HDM2）株、及び（AKFBR+HDM12）株ではいずれもＡＫFBR株との差はほとんど無かったが、（AKFBR+HDΔ）株では欠失型ＨＤ遺伝子単独による遺伝子置換株の場合よりもさらにＯＤは低下した。尚、培養終了後の残糖はいずれの株においても認められなかった。
（AKFBR+HDM2）株はAJ12848（FERM P-14198）、（AKFBR+HDM12）株はAJ12849（FERM P-14199）、及び（AKFBR+HDΔ）株はAJ12850（FERM P-14200）と命名され、各々かっこ内の受託番号で、１９９４年３月１日に通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託され、１９９５年２月９日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、それぞれ順にFERM BP-4996、FERM BP-4997、FERM BP-4998の受託番号で寄託されている。
実施例６  ＨＤ完全欠失株の復帰変異頻度の測定
染色体上の遺伝子置換により取得したＨＤの完全欠失株であるHDΔ株及びAKFBR+HDΔ株について、ホモセリン要求性の復帰変異頻度を、通常の変異処理剤であるＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）により生菌体を処理して得られたＨＤ欠損株であるＡＴＣＣ１３２８７と比較した。
それぞれの保存菌株を栄養培地にて前培養し、Ｌ−リジン生産培地に植菌し、７２時間振盪培養した後に培養液を適宜希釈し、Ｍ−ＣＭ２Ｇ平板培地にてコロニーを形成させた後、Ｌ−メチオニン、Ｌ−スレオニンを含まないブレビバクテリウム用最小培地にレプリカし、最小培地に生育したコロニーの数と、栄養培地に生育したコロニーの数との比率を復帰変異率とした。この方法で復帰変異株のコロニーが観察できない場合には、最小培地に塗布する菌数を増やし、他方栄養培地には希釈したものを塗布し、そのコロニー形成数から最小培地に塗布した菌数を推定し、復帰変異率を算出した。
この方法によって、上記３株の復帰変異率を測定した結果を表６に示す。ＡＴＣＣ１３２８７株では、培養終了時に顕著な復帰変異株の出現を認めたのに対し、染色上の遺伝子置換により作製したHDΔ株及びAKFBR+HDΔ株では復帰変異株が全く認められなかった。また、Ｌ−リジン蓄積量は、復帰変異の出現しないHDΔ株及びAKFBR+HDΔ株の方が、ＡＴＣＣ１３２８７株より多かった。
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配列表
配列番号：1
配列の長さ：20
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成DNA
配列
0003783065.tif 000011
配列番号：2
配列の長さ：20
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成DNA
配列
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配列番号：3
配列の長さ：1478
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：genomic DNA
起源
生物名：ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）
株名：AJ12036
配列の特徴
特徴を表す記号：CDS
存在位置：89..1423
特徴を決定した方法：S
配列
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配列番号：4
配列の長さ：445
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
配列
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0003783065.tif 000018
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配列番号：5
配列の長さ：23
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成DNA
配列
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配列番号：6
配列の長さ：21
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成DNA
配列
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配列番号：7
配列の長さ：1643
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：genomic DNA
起源
生物名：コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）
株名：ATCC 13869
配列
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配列番号：8
配列の長さ：1643
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：genomic DNA
起源
生物名：コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）
株名：ATCC13869
配列の特徴：mat peptide
存在位置：217..1479
特徴を決定した方法：S
配列
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0003783065.tif 000025
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配列番号：9
配列の長さ：421
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
配列
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0003783065.tif 000029
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配列番号：10
配列の長さ：1643
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：genomic DNA
起源
生物名：コリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）
株名：ATCC13869
配列の特徴：mat peptide
存在位置：964..1479
特徴を決定した方法：S
配列
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0003783065.tif 000032
配列番号：11
配列の長さ：172
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
配列
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配列番号：12
配列の長さ：23
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成DNA
配列
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配列番号：13
配列の長さ：23
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成DNA
配列
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配列番号：14
配列の長さ：23
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成DNA
配列
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配列番号：15
配列の長さ：23
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成DNA
配列
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配列番号：16
配列の長さ：23
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成DNA
配列
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配列番号：17
配列の長さ：23
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成DNA
配列
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配列番号：18
配列の長さ：23
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成DNA
配列
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配列番号：19
配列の長さ：23
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成DNA
配列
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【図１】
0003783065.tif 000042
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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