(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロテアーゼ、セルラーゼ及びアミラーゼから選ばれる酵素を当該酵素の生産菌を用いて生産するための培地であって、ヒダントイン又はヒダントイン酸を含有する酵素生産培地。
【請求項２】
ヒダントイン又はヒダントイン酸の配合量が、０．１〜２．０ｗ／ｖ・培地である請求項１記載の培地。
【請求項３】
酵素生産菌が、バチルス属細菌である請求項１又は２記載の培地。
【請求項４】
プロテアーゼ、セルラーゼ及びアミラーゼから選ばれる酵素を当該酵素の生産菌を用いて生産する方法であって、ヒダントイン又はヒダントイン酸を含有する培地で酵素生産菌を培養することを特徴とする当該酵素の生産方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は菌体増殖を抑え目的酵素の生産性を向上させる酵素生産培地、及びこの培地を用いた酵素の生産方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
微生物の生育培地には、従来、カゼイン、獣肉、大豆タンパクなどの各種タンパク質の酵素あるいは酸による部分加水分解物であるペプトン類が窒素源として使用されている。しかしながら、これらはいずれも工業的には高価であり、より安価な窒素源が求められてきた。その中から大豆粉やかつおエキス（Fujiwara et al., J. Ferment. Technol., 65, 345-348, 1987）、ケラチン（特開平２−９７３８４号）、卵白の酵素分解物とコーンスチープリカー（特開平５−３３６９５４号）、ホエー（特開昭６１−１３５５８４号）といった安価な窒素源を用いる方法などが開示されている。
【０００３】
一方、微生物を利用した酵素の生産においては、微生物の生育に良好な窒素源が必ずしも目的酵素の生産性に有効とは限らない。例えばアミノ酸の中には微生物によって酵素生産に有効なものとそうでないもの、菌体増殖にのみ効果を示すもの等があることが知られており（掘越ら編、好アルカリ性微生物、252-254, 1993）、前述のタンパク質を窒素源として用いる場合には酵素生産に効果のないあるいは阻害的に働くアミノ酸の培地への混入を避けることはできない等の問題点があった。また、酵素生産の誘導因子としての効果を期待して難分解性タンパク質を窒素源に用いた場合には、培養終了時に未分解の高分子物質が残り、目的酵素の分離工程において菌体とともに悪影響を与えることが懸念されてきた。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は酵素生産に有効で、酵素分離工程において悪影響を与える菌体や高分子物質の生成を抑える窒素源を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らはヒダントイン、ヒダントイン酸あるいはそれらの誘導体を酵素生産培地の窒素源として用いることによって上記課題を解決できることを見出した。
【０００６】
すなわち、本発明はプロテアーゼ、セルラーゼ及びアミラーゼから選ばれる酵素を当該酵素の生産菌を用いて生産するための培地であって、ヒダントイン又はヒダントイン酸を含有する酵素生産培地、及び当該培地で酵素生産菌を培養する酵素の生産方法を提供するものである。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明で用いるヒダントイン類としては、一般式（１）
【０００８】
【化１】
0003771750.tif 000002
【０００９】
（式中、Ｒ1 は水素原子、メチル基、イソプロピル基、イソブチル基、２−メチルチオエチル基、ベンジル基又はシアノエチル基を示し、Ｒ2 及びＲ3 は同一又は異なって、水素原子又はアセチル基を示す。）
又は一般式（２）
【００１０】
【化２】
0003771750.tif 000003
【００１１】
（式中、Ｒ4 は水素原子、メチル基、イソプロピル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ベンジル基、４−ヒドロキシベンジル基、シアノエチル基、３，４−ジメトキシベンジル基又は３，４−メチレンジオキシベンジル基を示す。）
から選ばれる１種以上を挙げることができる。
【００１２】
このうち一般式（１）で表わされる化合物としては、ヒダントイン、ＤＬ−５−メチルヒダントイン、ＤＬ−５−イソプロピルヒダントイン、ＤＬ−５−イソブチルヒダントイン、ＤＬ−５−（２−メチルチオエチル）ヒダントイン、ＤＬ−５−ベンジルヒダントイン、ＤＬ−５−シアノエチルヒダントイン、５−ヒダントイン酢酸、１，３−ジアセチルヒダントインが好ましく、特に、ヒダントイン、５−ヒダントイン酢酸が好ましい。また、一般式（２）で表わされる化合物としては、ヒダントイン酸、Ｎ−カルバミル−ＤＬ−バリン、Ｎ−カルバミル−ＤＬ−ロイシン、Ｎ−カルバミル−ＤＬ−イソロイシン、Ｎ−カルバミル−ＤＬ−フェニルアラニン、Ｎ−カルバミル−ＤＬ−チロシン、Ｎ−カルバミル−ＤＬ−アラニン、Ｎ−カルバミル−ＤＬ−シアノエチルグリシン、Ｎ−カルバミル−３，４−メチレンジオキシ−ＤＬ−フェニルアラニン、Ｎ−カルバミル−３，４−ジメトキシ−ＤＬ−フェニルアラニンが好ましく、特にヒダントイン酸が好ましい。また、ヒダントイン酸は、塩を形成していてもよい。
【００１３】
本発明で用いるヒダントイン類の配合量は、好ましくは０．１〜２．０ｗ／ｖ％・培地、特に好ましくは０．５〜１．５ｗ／ｖ％・培地である。
【００１４】
本発明の酵素生産培地は、ヒダントイン類を含んでいれば特に制限されないが、更に酵素生産菌が資化しうる炭素源、窒素源及びその他の補助的栄養源を適当量含んでいることが好ましい。
【００１５】
本発明の酵素生産培地に用いることができる炭素源及び窒素源については、例えば炭素源としては、資化しうる炭素源、例えばアラビノース、キシロース、グルコース、マンノース、フラクトース、ガラクトース、蔗糖、麦芽糖、乳糖、ソルビトール、マンニトール、イノシトール、グリセリン、可溶性澱粉や廉価な廃糖蜜、転化糖等、また資化しうる有機酸、例えば酢酸等が挙げられる。また、窒素源としてはコーングルテンミール、大豆粉、コーンスチープリカー、カザミノ酸、酵母エキス、ファーマメディア、イワシミール、肉エキス、ペプトン、ハイプロ、アジパワー、コーンミール、ソイビーンミール、コーヒー粕、綿実油粕、カルチベーター、アミフレックス及びアジプロン、ゼスト、アジックス等が挙げられる。また、その他、リン酸、Ｍｇ2+、Ｃａ2+、Ｍｎ2+、Ｚｎ2+、Ｃｏ2+、Ｎａ+、Ｋ+等の無機塩や、必要であれば、無機、有機微量栄養源を培地中に適宜添加することもできる。
【００１６】
本発明の酵素生産培地の調製は、ヒダントイン類と炭素源、窒素源及び補助的栄養源を同時に混合して滅菌（加熱、濾過等）してもよく、またそれぞれ別個に滅菌してから混合してもよい。また、ヒダントイン類は、培養途中から添加してもよく、添加回数は制限されず、１回又は複数回に分けて添加してもよい。添加方法としては、水又は他の培地成分を含む水溶液等に溶解させ、これを添加することが好ましい。
【００１７】
本発明の酵素生産方法は、上記の培地中で酵素生産菌を培養し、酵素を生産するものであればよい。従って、酵素としても、特に制限されないが、プロテアーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ等が挙げられ、このうちプロテアーゼ、アミラーゼが好ましく、特に、特開平４−３４９８８２号公報記載のアルカリプロテアーゼＫ−１６及びＷＯ９４／２６８８１記載の液化型アルカリα−アミラーゼが好ましい。また、酵素生産菌としては、野性株でも形質転換体でもよく、取り扱い易さの点から大腸菌、バチルス属細菌等が好ましい。
【００１８】
本発明において、酵素生産菌の培養方法における、培地組成、培養温度、培養時間等は、使用する微生物の種類、目的とする酵素などによってそれぞれの最適条件に設定すればよい。培地に添加する前記ヒダントイン等は目的の酵素及び生産微生物の種類によって適宜最適な添加量を設定することができる。
本発明の方法により得られた培養物から目的の酵素を採取するためには、それぞれの酵素に応じて既に確立されている回収・精製方法をそのまま用いればよい。特に菌体分離工程においては本発明の培養液中の菌体量が比較的少ないことから回収率が向上する。
【００１９】
ヒダントインはヒダントイナーゼ及びカルバモイルラーゼの二つの酵素反応でアミノ酸とアンモニアに分解されることが知られている。上記酵素生産品においても、ヒダントインは同じ酵素反応でグリシンとアンモニアに分解され、それぞれが窒素源として利用されていると予想される。また、これらの酵素の基質特異性は比較的広いことから、ヒダントインだけでなく、ヒダントイン酸等の各種誘導体も同様にして窒素源として利用できるものと考えられる。
【００２０】
【実施例】
実施例１
アミノ酸液Ｋ（味の素製）１％、酵母エキス（Difco社製）０．６％、メチオニン０．２％、硫酸マグネシウム０．０５％、水飴１２％、炭酸ナトリウム０．３％、リン酸２カリウム０．５％、消泡剤０．００２％、金属混液*０．２％、（*金属混液組成：硫酸マグネシウム１０％、硫酸マンガン２％、硫酸第２鉄０．５％、硫酸亜鉛０．３％、硫酸ニッケル０．１％、硫酸銅０．３％）からなる培地を基本培地として、ヒダントインを０〜０．６％の範囲で添加した培地を調製した。このものを５００mL容ひだ付三角フラスコに１０mL仕込み、バチルス
エスピー（Bacillus sp.）ＫＳＭ−Ｋ１６（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３３７６、特開平４−３４９８８２号参照）の種培養液を０．２mL接種後、３４℃、２３０r/minで２日間培養した。菌の生育度は、培養液を５％食塩水に適当に希釈し６００nmの吸光度測定することにより判定した。得られた培養液を２５００r/min、１５分間遠心分離し培養上清のプロテアーゼ活性を測定した。プロテアーゼの活性測定は、カゼイン１％を含むホウ酸−ＮａＯＨ緩衝液（pH１０）１mLを０．１mLの酵素溶液と混合し、４０℃、１０分間反応させた後、反応停止液（０．１２３Ｍトリクロロ酢酸−０．２４６Ｍ酢酸ナトリウム−０．３６９Ｍ酢酸）２mLを加え、３０℃、２０分間放置した。次に濾紙（ワットマン社製、Ｎｏ．２）で濾過し、濾液中の蛋白分解物をフォーリン・ローリー法の改良法によって測定した。培養結果を表１に示した。尚、プロテアーゼ活性はヒダントイン無添加の場合の活性を１００とした相対値で示した。表１に示したようにヒダントインの添加量の増加と共にプロテアーゼの生産量は増大した。
【００２１】
【表１】
0003771750.tif 000004
【００２２】
実施例２
実施例１で使用した基本培地を用いヒダントイン及び従来培地の窒素源として主に用いられてきた各種成分について、窒素添加量として０．５６ｇ／Ｌとして培地をそれぞれ調製した。このものを実施例１と同様に５００mL容ひだ付三角フラスコに１０mL仕込み、バチルス  エスピー（Bacillus sp.）ＫＳＭ−Ｋ１６（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３３７６）の種培養液を０．１mL接種後、３４℃、２５０r/minで２日間培養した。菌の生育度を実施例１と同様にして測定した。得られた培養液を２５００r/min、１５分間遠心分離し培養上清のプロテアーゼ活性を実施例１と同様に測定した。培養結果を表２に示した。
【００２３】
【表２】
0003771750.tif 000005
【００２４】
表２から明らかなようにヒダントインが最もプロテアーゼ生産量が高く、また、菌体あたりの酵素生産量も優れていた。
【００２５】
実施例３
アミラーゼ高発現プラスミドｐＨＳＰＬＡＭＹ２で枯草菌ＩＳＷ１２１４株を形質転換し得られた形質転換体を培養試験に供した。本プラスミドはバチルス
エスピー（Bacillus sp.）ＫＳＭ−ＡＰ１３７８株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３０４８、ＷＯ９４／２６８８１参照）由来の液化型アルカリα−アミラーゼ遺伝子を我々が独自に開発した発現ベクタープラスミドｐＨＳＰ６４に導入したものである（Sumitomo et al., Biosci. Biotech. Biochem., 59, 2172-2175, 1995）。得られた形質転換体をテトラサイクリン１５ppm含有培地で種培養の後、酵母エキス（Difco社製）０．３％、魚肉エキス１％、水飴１６％、メチオニン０．２％、ロイシン０．２％、リン酸２カリウム０．０５％、塩化カルシウム０．０４％、消泡剤０．００２％、金属混液*０．２％（*金属混液組成：硫酸マグネシウム１０％、硫酸マンガン２％、硫酸第２鉄０．５％、硫酸亜鉛０．３％、硫酸ニッケル０．１％、硫酸銅０．３％）からなる基本培地に、ヒダントインを０〜０．６％添加した培地に接種し、３０℃、４日間培養を行った。培地は５００mL容坂口フラスコに２０mL仕込み１２５r/minで振とう培養を行った。菌の生育度を実施例１と同様にして測定した。得られた培養液について生育度を測定した後、２５００r/min、１５分間遠心分離し培養上清のアミラーゼ活性を測定した。アミラーゼ活性は、０．５％可溶性澱粉を含む４０mMグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（pH１０）０．９mLに、適当に希釈した培養上清０．１mLを加え、５０℃で反応させ、生成する還元糖を３，５−ジニトロサリチル酸（ＤＮＳ）法により定量した。すなわち、反応液１．０mLにＤＮＳ試薬１mLを加え、５分間、加熱発色させ、氷水中で冷却後、４．０mLの脱イオン水を加えて希釈し、波長５３５nmで比色定量した。培養結果を表３に示した。尚、酵素活性はヒダントイン無添加の場合の値を１００とした相対値で表した。表３に示したようにヒダントイン添加量の増加に伴い酵素活性の顕著な向上が認められた。また、この時菌体生成量はほとんど変化なく、菌体あたりのアミラーゼ生産量もヒダントイン添加量の増加とともに向上した。
【００２６】
【表３】
0003771750.tif 000006
【００２７】
【発明の効果】
本発明によれば、酵素の生産において、より少ない窒素源添加量で目的物質を効率よく生産させることができる。更にその際、菌体の増殖が抑えられていることから培養液中から目的物質を分離するのも容易である。