(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
イノシン及びデオキシイノシンからなる群より選択されるヌクレオシドとピリミジン塩基とを、リン酸又はリン酸塩存在下の水溶液中において、耐熱性プリンヌクレオシドホスホリラーゼ及び耐熱性ピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼにより塩基交換させ、この塩基交換反応により生成したヒポキサンチンを電子受容体の共存下にシュードモナス・エスピー  Ｙ−５１０（ＦＥＲＭ  Ｐ−１５１０４）の産生物である耐熱性キサンチンデヒドロゲナーゼにより尿酸に変化させることを特徴とするヌクレオシド化合物の製造方法。
【請求項２】
イノシン及びデオキシイノシンからなる群より選択されるヌクレオシドとプリン塩基とを、リン酸又はリン酸塩存在下の水溶液中において、耐熱性プリンヌクレオシドホスホリラーゼにより塩基交換させ、この塩基交換反応により生成したヒポキサンチンを電子受容体の共存下にシュードモナス・エスピー  Ｙ−５１０（ＦＥＲＭ  Ｐ−１５１０４）の産生物である耐熱性キサンチンデヒドロゲナーゼにより尿酸に変化させることを特徴とするヌクレオシド化合物の製造方法。
【請求項３】
電子受容体がメチレンブルー、ニコチンアミド  アデニン  ジヌクレオチド、ニコチンアミド  アデニン  ジヌクレオチド  リン酸から選ばれた１種以上の電子受容体である請求項１又は２記載のヌクレオシド化合物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、耐熱性酵素による核酸塩基の交換反応を利用してヌクレオシド化合物を製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、酵素による核酸塩基の交換反応を利用してヌクレオシド化合物を製造する方法が提案されているが、原料系と生成系の間に反応の平衡状態が生じ、収率が向上しない原因となっていた。これに対して、特開平４−１９７１９３号公報に、イノシン又はデオキシイノシンであるヌクレオシドと核酸塩基とをリン酸塩の水溶液中、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ及びピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼにより塩基交換反応させ、この交換反応により生成したヒポキサンチンをキサンチンオキシダーゼにより尿酸に変化させて、ヌクレオシド化合物を得る方法が開示されている。
【０００３】
しかし、該公報に開示された方法では、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ及びピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼについては耐熱性酵素を用いているが、キサンチンオキシダーゼは５０℃以上に至適生育温度を有する耐熱性キサンチンオキシダーゼは見いだされていなかったので、常温に至適生育温度を有するキサンチンオキシダーゼが用いられ、したがって反応温度は４０℃に設定されており、反応全体として耐熱性のプリンヌクレオシドホスホリラーゼ及びピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼを用いる利点が生かされていなかった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は酵素による核酸塩基の交換反応を利用してヌクレオシド化合物を得る方法において、耐熱性酵素を使用することにより、交換反応を高濃度でかつ反応速度を向上させたヌクレオシド化合物の製造方法を提供する。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上述の問題点を解決すべく、耐熱性キサンチンデヒドロゲナーゼを産生する微生物を鋭意探索した結果、土壌中から、４８〜５３℃に至適生育温度を有し、５５〜６０℃に至適反応温度を持つ耐熱性キサンチンデヒドロゲナーゼを産生する微生物を発見したものであり、該耐熱性キサンチンデヒドロゲナーゼを見出したことにより、交換反応を高濃度でかつ反応速度を向上させるという本発明を完成するに至った。
【０００６】
本発明に用いられる耐熱性プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、耐熱性ピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼ、及び耐熱性キサンチンデヒドロゲナーゼは、いかなる起源のものでも構わないが、５０℃以上に至適反応温度を有する耐熱性酵素である。
【０００７】
核酸塩基は、一般に常温で水に対する溶解度が低く、高温になるにつれて急激に溶解度が上昇する。したがって、耐熱性酵素を用いることにより、初めて高濃度反応が可能となる。また、一般に化学反応は温度が１０℃上昇すると、反応速度が２倍になるので、触媒としての酵素の能力が同一であれば、耐熱性酵素を用いることにより、反応速度の向上が図られる。更に、耐熱性酵素を用いると、低温殺菌の温度に近い温度で反応を行うことになるので、微生物汚染が少なく、酵素の寿命が長くなる。
【０００８】
本発明で用いた耐熱性プリンヌクレオシドホスホリラーゼ及び耐熱性ピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼは、この２種の酵素を同時に産生するバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）  ＪＴＳ８５９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６８８５）より調製した。
【０００９】
耐熱性キサンチンデヒドロゲナーゼは、本発明者が土壌中から５５〜６０℃に至適反応温度を有するキサンチンデヒドロゲナーゼを産生する微生物より調製した。本菌株は、シュードモナス・エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）Ｙ−５１０であり、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されており、寄託番号はＦＥＲＭ  Ｐ−１５１０４である（本菌株の寄託の際の表示はシュードモナス・サーモカルボキシドボランス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｔｈｅｒｍｏｃａｒｂｏｘｙｄｏｖｏｒａｎｓ）ＹＧＫ−０５１０であり、寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１５１０４であったが、その後記載事項変更届を提出し、表示をシュードモナス・エスピー  Ｙ−５１０と変更した）。
【００１０】
本菌株の菌学的性質を、バージェイズ・マニュアル・オブ・システマテック・バクテリオロジー第２巻に準じて検討した結果は次のようである。
１．形態
桿菌：１．６〜３．２μｍ×０．６〜０．７μｍ
２．培養的性質
ＮＢ培地：５０℃、２日間培養
平板上：黄色。光沢あり、透明、盛り上がらない。コロニーの形は円形。
スラント上：黄色。光沢あり、透明、盛り上がらない。生育は中程度。
【００１１】
３．生化学的性質
（１）グラム染色                    陰性
（２）嫌気的性質                    生育せず
（３）運動性                        あり、単極毛
（４）オキシダーゼ                  陽性
（５）カタラーゼ                    陰性
（６）ゼラチンの変化                液化能なし
（７）ＯＦテスト                    陰性
【００１２】
（８）グルコースからの酸の産生      産生せず
（９）ラクトースからの酸の産生      産生せず
（１０）キシロースからの酸の産生      産生せず
（１１）ガラクトースからの酸の産生    産生せず
（１２）硝酸塩の還元                  陽性
（１３）硝酸カリウムの脱窒能          陰性
（１４）無機窒素源の利用
ＮＯ3 を唯一の窒素源として    生育しない
ＮＨ4 を唯一の窒素源として    生育した
【００１３】
（１５）独立栄養の基質
ＣＯを唯一の炭素源として    生育しない
（１６）生育温度                      ４０〜５５℃で生育
至適                        ４８〜５３℃
（１７）尿素の加水分解                分解能なし
（１８）クエン酸の利用                陰性
（１９）インドールの産生              陰性
（２０）ＧＣ含量                      ６７．７％
【００１４】
以上の菌学的性質に基づき、本菌株はシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）に属することが判明した。本菌株に最も近い種としてはシュードモナス・サーモカルボキシドボランス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｔｈｅｒｍｏｃａｒｂｏｘｙｄｏｖｏｒａｎｓ）を挙げることができる。しかしながら、比較検討の結果、本菌株は一酸化炭素を資化できない点が該菌と異なっていた。
【００１５】
本菌株から調製した耐熱性キサンチンデヒドロゲナーゼは以下の性質を有する。
１．作用：ヒポキサンチンからキサンチンを経て尿酸にする。
２．基質特異性：ヒポキサンチン又はキサンチンに対して作用する。
３．至適ｐＨ：８．２〜９．５
４．至適反応温度：５５〜６０℃
５．安定性：ｐＨ７．０において４０〜５０℃、６０分処理で安定
６．活性化：メチレンブルー、ＮＡＤ（ニコチンアミド  アデニン  ジヌクレオチド）、ＮＡＤＰ（ニコチンアミド  アデニン  ジヌクレオチド  リン酸）などの電子受容体を必要とする。
【００１６】
本発明における核酸塩基の交換反応を用いるヌクレオシド化合物の製造方法について、まず、核酸塩基としてピリミジン塩基を用いた場合で反応を説明する。
（１）耐熱性プリンヌクレオシドホスホリラーゼにより、イノシン又はデオキシイノシンとリン酸又はリン酸塩から、ヒポキサンチンとリボース−１−リン酸又はデオキシリボース−１−リン酸が生成する。
【００１７】
（２）次に、生成したリボース−１−リン酸又はデオキシリボース−１−リン酸が、耐熱性ピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼにより、ピリミジン塩基と置換反応を行う。これにより、リボース−１−リン酸とピリミジン塩基との反応からピリミジンヌクレオシドが生成し、デオキシリボース−１−リン酸とピリミジン塩基との反応からはピリミジンデオキシヌクレオシドが生成する。
（１）と（２）の反応を整理すると、イノシン又はデオキシイノシンとピリミジン塩基を用いて耐熱性プリンヌクレオシドホスホリラーゼ及び耐熱性ピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼにより、塩基交換反応を行い、ピリミジンヌクレオシド又はピリミジンデオキシヌクレオシドとヒポキサンチンが生成する。
【００１８】
（３）反応系に耐熱性キサンチンデヒドロゲナーゼと、メチレンブルー、ＮＡＤ、ＮＡＤＰなどの電子受容体とを共存させることにより、イノシン又はデオキシイノシンの分解で生成したヒポキサンチンは不可逆的にキサンチンを経て尿酸となる。生成した尿酸は、耐熱性プリンヌクレオシドホスホリラーゼ及び耐熱性ピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼの基質にはなり得ないので、基質の交換反応には関与せず反応系から除外される。これにより、反応の平衡を目的物のヌクレオシド化合物が生成する側へ移動させ、目的物が定量的に得られる。
【００１９】
例えば、出発原料のヌクレオシドとしてイノシンを、ピリミジン塩基としてチミンを用いて目的物のヌクレオシド化合物として５−メチルウリジンを得る場合は、
【００２０】
【化１】
0003731237.tif 000002
（式中、▲１▼は耐熱性プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、▲２▼は耐熱性ピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼを示す）
（１）と（２）から
【００２１】
【化２】
0003731237.tif 000003
（式中、▲１▼と▲２▼は前記と同一）
【００２２】
【化３】
0003731237.tif 000004
（式中、▲３▼は耐熱性キサンチンデヒドロゲナーゼを示す）
【００２３】
一方、交換反応を行う核酸塩基としてプリン塩基を用いた場合は次のようである。（１）と（３）の反応は上述と同じであるが、（２）では、イノシン又はデオキシイノシンから生じたリボース−１−リン酸又はデオキシリボース−１−リン酸が、耐熱性プリンヌクレオシドホスホリラーゼにより、プリン塩基と置換反応を行う。これにより、リボース−１−リン酸とプリン塩基との反応からプリンヌクレオシドが生成し、デオキシリボース−１−リン酸とプリン塩基との反応からはプリンデオキシヌクレオシドが生成する。
すなわち、イノシン又はデオキシイノシンとプリン塩基を用いて耐熱性プリンヌクレオシドホスホリラーゼにより、塩基交換反応を行い、プリンヌクレオシド又はプリンデオキシヌクレオシドとヒポキサンチンが生成する。
【００２４】
例えば、出発原料のヌクレオシドとしてイノシンを、プリン塩基としてアデニンを用いて目的物のヌクレオシド化合物としてアデノシンを得る場合は、
【００２５】
【化４】
0003731237.tif 000005
（式中、▲１▼は前記と同一）
（１）と（２）から
【００２６】
【化５】
0003731237.tif 000006
（式中、▲１▼は前記と同一）
【００２７】
【化６】
0003731237.tif 000007
（式中、▲３▼は前記と同一）
【００２８】
本発明で核酸塩基としてピリミジン塩基を用いる場合は、（２）の反応において、耐熱性プリンヌクレオシドホスホリラーゼ及び耐熱性ピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼが必要である。一方、プリン塩基の場合は、耐熱性プリンヌクレオシドホスホリラーゼのみが必要であるが耐熱性ピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼを含んでいても反応には差し支えない。
【００２９】
本発明は、工業的に生産が可能であり、安価に容易に入手可能であるイノシンを原料とし、核酸塩基の反応を行うことにより、医薬用原料やＤＮＡ合成試薬原料として有用な化合物であるヌクレオシド化合物を容易にかつ収率よく製造するものである。
【００３０】
【発明の実施の形態】
本発明で用いられる耐熱性プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、耐熱性ピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼ及び耐熱性キサンチンデヒドロゲナーゼは、５０℃以上に至適反応温度を有する耐熱性酵素であり、その使用形態は、該酵素を産生する菌体、その破砕物又は抽出物として用いられる。
【００３１】
本発明の原料として用いられるヌクレオシドは、市場に容易に入手可能なイノシン及びイノシンから容易に化学的に変換可能である２’−デオキシイノシン、３’−デオキシイノシンが挙げられる。
【００３２】
用いられるピリミジン塩基は特に制限されない。例えば、ウラシル、チミンなどの天然型ピリミジン塩基、５−フルオロウラシル、５−クロロウラシル、５−ブロモウラシル、５−ヨードウラシル、５−エチルウラシル、５−トリフルオロメチルウラシル、５−カルボキシウラシルなどの非天然型ピリミジン塩基が挙げられる。
【００３３】
また、キサンチンデヒドロゲナーゼはヒポキサンチンに作用してキサンチンを経て尿酸とするので、用いられるプリン塩基としては、ヒポキサンチン及びキサンチン以外のプリン塩基であれば特に制限されない。例えば、アデニン、グアニンなどの天然型プリン塩基、２−クロロプリン、６−クロロプリン、２，６−ジクロロプリン、２−アミノ−６−クロロプリン、２，６−ジアミノプリン、６−メルカプトプリン、６−メチルチオプリン、２−アミノプリンなどの非天然型プリン塩基が挙げられる。
【００３４】
本発明において、用いられるヌクレオシドの初期濃度は５〜１００ｍＭであり、好ましくは１０〜５０ｍＭである。また、核酸塩基の初期濃度は５〜１００ｍＭであり、好ましくは１０〜５０ｍＭである。リン酸又はリン酸塩の初期濃度は１〜２０ｍＭであれば十分である。また、ヌクレオシドと核酸塩基は同一の初期濃度で用いる。ヌクレオシドとリン酸又はリン酸塩との濃度比は大きい方が目的物のヌクレオシド化合物の収率は増加する。
【００３５】
反応液のｐＨは、７．０〜９．５であり、好ましくは８．２〜９．５である。核酸塩基の中には５−トリフルオロメチルウラシルのようにアルカリ側で不安定なものもあるので、用いる原料の性質に応じて好ましい反応液のｐＨを設定すればよい。反応温度は５０〜６０℃であり、好ましくは５０〜５５℃である。
なお、反応液からの生成物の採取は、クロマトグラフィーなどにより行うことができる。
【００３６】
【実施例】
以下、製造例及び実施例にて本発明を更に説明するが、本発明はこれら製造例及び実施例に限定されるものではない。
【００３７】
製造例１
耐熱性プリンヌクレオシドホスホリラーゼと耐熱性ピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼの酵素液の調製
バチルス・ステアロサーモフィルス  ＪＴＳ８５９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６８８５）を以下の手順で培養した。菌の培養には、バクトトリプトン１０ｇ、イーストエキス５ｇ、グルコース３ｇ、食塩３ｇ、イノシン１ｇ及び水１ＬよりなるｐＨ６．２の培地を用いた。この培地１．５Ｌにバチルス・ステアロサーモフィルス  ＪＴＳ８５９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６８８５）の胞子３×１０7 個を添加し、撹拌翼（直径７０ｍｍ、上下部各２枚）を有するジャーファーメンターを用い、撹拌翼を７８０ｒｐｍで回転させつつ、通気量１ｖｖｍ、培養温度６５℃、ｐＨ６．０〜６．４で５時間培養した。
培養終了後、菌体を遠心分離（１０，０００ｇ、４℃、１５分）により集菌した。次いで、酵素液を以下のようにして調製した。
【００３８】
得られた湿菌２０ｇを１０ｍＭリン酸カリウム溶液（ｐＨ７．０、［緩衝液（ｐＨ７）と略す］）に懸濁し、超音波破砕装置で菌体を破砕した。続いて、緩衝液（ｐＨ７）を添加して全体を５０ｍｌとした後、超遠心分離（３０，０００ｇ、４℃、２０分）を行い、上清３０ｍｌを得た。この上清を熱処理した後、−１０℃に冷却したアセトン２４ｍｌを添加し、１５分間撹拌後、遠心分離（１０，０００ｇ、４℃、１０分）を行って上清を得た。この上清に更にアセトン１８ｍｌを添加し、１５分間撹拌の後、遠心分離（１０，０００ｇ、４℃、１０分）を行い、沈殿物を得た。この沈殿物を３ｍｌの緩衝液（ｐＨ７）に懸濁させ、アセトン処理済み酵素液（酵素液［１］と略す）として３．５ｍｌを得た。
【００３９】
製造例２
耐熱性キサンチンデヒドロゲナーゼの酵素液の調製
シュードモナス・エスピー  Ｙ−５１０（ＦＥＲＭ  Ｐ−１５１０４）を以下の手順で調製した。菌の培養には、ニュートリエントブロス（ディフコ社製）８ｇ、ヒポキサンチン１ｇ及び水１ＬよりなるｐＨ７．０の培地を用いた。この培地５００ｍｌにシュードモナス・エスピー  Ｙ−５１０（ＦＥＲＭ  Ｐ−１５１０４）の菌体３×１０7 個を添加し、２Ｌ容の三角フラスコを用い、２００ｒｐｍで回転させつつ、培養温度５０℃で１５時間培養した。
培養終了後、菌体を遠心分離（１０，０００ｇ、４℃、１５分）により集菌した。次いで、酵素液を以下のようにして調製した。
【００４０】
得られた湿菌１３ｇを緩衝液（ｐＨ７）に懸濁し、超音波破砕装置で菌体を破砕した。続いて、緩衝液（ｐＨ７）を添加して全体を４０ｍｌとした後、超遠心分離（３０，０００ｇ、４℃、２０分）を行い、上清３０ｍを得た。この上清に対して２５重量％になるように硫酸アンモニウムを添加し、２０分間撹拌した後、遠心分離（１０，０００ｇ、４℃、１０分）により沈殿を除去し、上清を得た。この上清に対して更に４５重量％になるように硫酸アンモニウムを添加し、２０分間撹拌の後、遠心分離（１０，０００ｇ、４℃、１０分）により沈殿物を得た。
【００４１】
この沈殿物を１０ｍｌの緩衝液（ｐＨ７）に懸濁させ、緩衝液１Ｌ中で、２０時間透析を行い、硫酸プロタミンを０．２５重量％になるように添加し、５分間撹拌した後、遠心分離（１０，０００ｇ、４℃、１０分）により沈殿を除き、粗酵素液１５ｍｌを得た。得られた粗酵素液をＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ｆａｓｔ  ｆｌｏｗ（ファルマシア社製）８０ｍｌを充填したカラム（φ１８ｍｍ×３２ｍｍ）に添加した。次いで、１０ｍＭから６００ｍＭのリン酸カリウム（ｐＨ７．０）直線濃度勾配で溶出を行い、キサンチンデヒドロゲナーゼ活性の認められた分画４５ｍｌを分取し、酵素液（酵素液［２］と略す）とした。
【００４２】
実施例１
１０ｍＭのイノシン（東京化成製・特級）、１０ｍＭのチミン（淀川製薬製）、１．２５ｍＭのリン酸カリウム、０．０５ｍＭのメチレンブルー（和光純薬製・生体染色用）、酵素液［１］０．０３ｍｌ及び酵素液［２］０．０５ｍｌを含む１ｍｌの１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）中で５０℃、５時間反応させ、反応液中に含まれる各成分の濃度を測定した。その結果を図１に示す。
原料のチミンは微かに残存が認められたが、イノシンは完全に消失した。目的物の５−メチルウリジンは８．４ｍＭ（収率８４％）生成した。目的物の５−メチルウリジンの生成量が非常に高く、定量的に生成していることを示している。
【００４３】
比較例１
また、耐熱性キサンチンデヒドロゲナーゼを添加しないこと以外はすべて実施例１と同一の手順と条件で反応を行い、反応液中に含まれる各成分の濃度を測定した。その結果を図２に示す。
目的物である５−メチルウリジンの生成は２．８ｍＭ（収率２８％）で反応は平衡状態に達したことを示している。
【００４４】
実施例２〜３
チミンに代えて表１に示す核酸塩基を用いた以外は、実施例１と同様の条件で５０℃、５．５時間反応させた。なお、比較のため耐熱性キサンチンデヒドロゲナーゼを添加しないこと以外はすべて実施例２〜３と同様の条件で反応させた。その結果を表１に示す。
【００４５】
【表１】
0003731237.tif 000008
【００４６】
実施例４〜９
イノシンに代えて２’−デオキシイノシン（ヤマサ醤油製）を用い、また、チミンに代えて表２に示す核酸塩基を用いた以外は、実施例１と同様の条件で５０℃、５．５時間反応させた。なお、比較のため耐熱性キサンチンデヒドロゲナーゼを添加しないこと以外はすべて実施例４〜９と同様の条件で反応させた。その結果を表２に示す。
【００４７】
【表２】
0003731237.tif 000009
【００４８】
実施例１０
イノシン（東京化成製・特級）とチミン（淀川製薬製）を各１０ｍＭ使用して、表３に示す各種温度で実施例１と同様の操作を行い、３０分反応後に生成した５−メチルウリジンを測定した。その結果を表３に示す。反応速度（ｍＭ／分）は５−メチルウリジン生成量（ｍＭ）を３０分で除した数値である。反応温度４０℃のとき反応速度が０．０２ｍＭ／分であるが、反応温度が５０℃以上になると反応速度が約０．１ｍＭ／分と立ち上がっている。
【００４９】
【表３】
0003731237.tif 000010
【００５０】
【発明の効果】
核酸塩基の交換反応を利用したヌクレオシド化合物の製造方法において耐熱性酵素を用いることにより、交換反応が高濃度で可能となり、また、反応速度の向上が図られる。更に、低温殺菌の温度に近い温度で反応を行うことになるので、微生物汚染が少なく、酵素の寿命が長くなるという効果が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１における反応液中の各成分の濃度の経時変化を示すグラフである。
【図２】比較例１における反応液中の各成分の濃度の経時変化を示すグラフである。
【図１】
0003731237.tif 000011
【図２】
0003731237.tif 000012