(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
バチルス・ブレビス（Bacillus brevis）31-OK株（FERM BP-4573）。
【請求項２】
請求項１に記載の変異バチルス・ブレビス株からなる遺伝子組換え用宿主菌。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、新規な変異バチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）に関する。より具体的には、本発明はプロテアーゼ活性を実質的に示さない変異バチルス・ブレビスに関する。
したがって、本発明の変異菌は、特に遺伝子組換え用の宿主として有用である。
【０００２】
【従来の技術】
一般に、遺伝子組換え技術を利用した異種蛋白質の生産は、大腸菌を宿主として利用している。しかし、大腸菌は生産した異種蛋白質を菌体内に蓄積するため、生産量が制限され、異種蛋白質の回収、精製操作が煩雑になる等の問題点がある。また、異種蛋白質を菌体外に分泌することを特徴とする枯草菌を利用した異種蛋白質生産系も確立されたが、分泌された異種蛋白質が枯草菌由来のプロテアーゼの作用により分解され、その蓄積量は著しく少ないという問題点に直面している。
【０００３】
一方、鵜▲高▼らは、バチルス属細菌バチルス・ブレビス４７（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ４７）（ＦＥＲＭ  Ｐ−７２２４）を宿主とする異種蛋白質生産系を確立し、提案した（例えば、特開昭６０−５８０７４号、同６２−２０１５８３号公報参照）。
バチルス・ブレビス４７は菌体外に多量の蛋白質を生産し、菌体外プロテアーゼ活性が弱い特徴をもち、遺伝子組換え技術を利用した異種蛋白質の生産に於いて、大腸菌、枯草菌の欠点を克服した優れた宿主として注目されている。
【０００４】
鵜▲高▼らは、バチルス・ブレビス４７を用いてα−アミラーゼ（特開昭６２−２０１５８３号公報、H.Yamagata et.al.,J.Bacteriol 169,1239（1987）参照）やブタペプシノーゲン（鵜▲高▼重三、日本農芸化学会昭６２年度大会講演要旨集ｐ８３７−８３７、塚越規弘、日本農芸化学会誌６１，６８（１９８７）参照）等の分泌生産に成功している。さらに鵜▲高▼らは、バチルス・ブレビス４７に比べ菌体外プロテアーゼ活性が著しく低い新規バチルス・ブレビスＨＰＤ３１（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓＨＰＤ３１）（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０８７、Ｈ１０２株と同一菌株である）（特開昭６３−５６２７７号公報参照）を分離し、異種蛋白質生産の宿主として利用している。
【０００５】
かかる生産系をヒト上皮細胞増殖因子（ｈＥＧＦ）に適用すると、バチルス・ブレビス４７（１５mg／Ｌ）に対して約１５倍の高効率でｈＥＧＦの生産することが見い出されている（特開平２−３１６８２号公報参照）。また、発現ベクターの最適化によりその生産量は、最高１．２ｇ／Ｌにも達している（Ｓ．Ｅｂｉｓｕら、Biosci.Biotech.Biochem.,56(5),812-813,1992参照）。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
前記のように、バチルス・ブレビスを宿主として用いる異種蛋白質の分泌生産系は大腸菌、枯草菌と比べ非常に効率のよい系であることが認識されている。しかしながら、バチルス・ブレビスＨＰＤ３１を始めとする従来既知のバチルス属細菌を宿主として用いた異種蛋白質生産系であっても、ヒト成長ホルモン（以下、「ｈＧＨ」と略記する場合もある）、インターロイキン２（以下、「ＩＬ２」と略記する場合もある）等の特定の異種蛋白質の生産に適用すると菌体外に分泌されたそれらの蛋白質が宿主自体のプロテアーゼ活性により分解を受け、その蓄積量が著しく低下するとの問題が生じており、産業上、より安定に異種蛋白質を蓄積する宿主が求められている。
【０００７】
したがって、本発明の目的は、従来既知のバチルス・ブレビスに比べて菌体外プロテアーゼ活性が有意に低い変異バチルス・ブレビスを提供することである。この変異バチルス・ブレビスは、代表的な例として、ｈＧＨ及びＩＬ２の生産に適する菌株である。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
前記課題は、本発明による、プロテアーゼ活性を実質的に示さない変異バチルス・ブレビスの提供により解決できる。また、本発明はかかる変異バチルス・ブレビスの宿主菌としての用途も提供する。
【０００９】
本発明の変異バチルス・ブレビスを宿主菌として使用すれば、特定の異種蛋白質、特にｈＧＨ及びＩＬ２の生産効率を高めることができる。すなわち、本発明の菌株を異種蛋白質をコードするＤＮＡを含有するベクターと組み合わせて使用すると、そのＤＮＡの発現により産生され、そして菌体外に分泌された異種蛋白質を安定に維持、蓄積することが可能である。
【００１０】
このような作用及び効果を奏するには、バチルス・ブレビスに、菌体外プロテアーゼ活性を有意に低下させるような変異を誘発することが必要である。本発明にいう「プロテアーゼ活性を実質的に示さない」とは、ｈＧＨやＩＬ２その他の蛋白質に対して本発明の変異菌自体がそれらの生産に悪影響を及ぼす程度に作用しないことを意味する。したがって、本発明の変異菌は、少なくともｈＧＨ及びＩＬ２を完全に失活または分解するようなプロテアーゼの産生能を有さないことが好ましいが、これらの異種蛋白質の生産系、例えば培養物中での異種蛋白質の生産に許容できる範囲で失活または分解するものであってもよい。
【００１１】
また、当然のことに、本発明の変異菌にはｈＧＨ及びＩＬ２に加え、他の有用な異種蛋白質に対してもプロテアーゼ活性を実質的に示さないものも包含される。
本発明の変異菌の親菌としては、後述する変異誘発法によって目的の変異菌を創製できるものであれば、バチルス・ブレビスのいずれの種または株に属するものでも使用できる。これらのうち、具体的に好ましいものとしては、本発明者の一人が異種蛋白質の生産用宿主として提案した、バチルス・ブレビス４７（ＦＥＲＭ  Ｐ−７２２４）（特開昭６２−２０１５８３号公報参照）、バチルス・ブレビスＨＰＤ３１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０８７）（特開昭６３−５６２７７号公報参照）を挙げることができる。
【００１２】
これらの親菌から本発明の変異菌へと変異する方法としては、微生物に変異を誘発させる方法であればどのような手段を用いてもよいが、たとえば紫外線照射、ガンマー線照射またはニトロソグアニジンのような薬剤処理などが挙げられる。得られる各種変異菌から目的の菌株を選択する方法としては、予めｈＧＨまたはＩＬ２をコードするＤＮＡを含むプラスミドで親菌を形質転換しておき、これらの形質転換体に前記変異処理を行った後、変異菌のｈＧＨまたはＩＬ２の産生能を調べることにより、目的の変異菌株を選ぶのが都合よい。
【００１３】
こうして得られた本発明の変異菌の具体的なものの一つは、平成４年１１月１１日付で微生物工業技術研究所の特許微生物寄託センターに微工研菌寄第１３２７４号（ＦＥＲＭ  Ｐ−１３２７４）として寄託され、平成６年２月１７日にＦＥＲＭ  ＢＰ−４５７６としてブダペスト条約に基く国際寄託に移管されたバチルス・ブレビスＯＫ（本明細書におけるバチルス・ブレビス３１−ＯＫと同一菌株）と命名された菌株を挙げることができる。
【００１４】
前述のように本発明の変異菌株は、遺伝子組換え用の宿主菌として有利に使用することができる。したがって、その有用性は以下の使用例によって確認できるであろう。まず、本発明の宿主菌を形質転換するのに使用するｈＧＨまたはＩＬ２をコードするＤＮＡを含有する発現プラスミドを調製する。発現プラスミドは、バチルス・ブレビスで機能するプロモーターを含有しているものが好ましい。
【００１５】
プロモーターの具体的なものとしては、例えば前記バチルス・ブレビス４７及び同ＨＰＤ３１のプロモーター領域を含有するＤＮＡを挙げることができる。プロモーター領域を含有するＤＮＡは、上記プロモーター以外に、ＳＤ配列、翻訳開始コドンなどを有していることが必要であり、さらに主要菌体外蛋白質遺伝子の一部を含んでいてもよい。
【００１６】
例えば、ｈＧＨはバチルス・ブレビスの菌体内、菌体外のいずれに蓄積されても良いが、菌体外にこれらの蛋白質を蓄積する場合、プロモーター領域を含有するＤＮＡの３′末端側にシグナルペプチドをコードする領域が含まれている必要がある。シグナルペプチドとしては、例えば、バチルス・ブレビス４７または同ＨＰＤ３１の主要菌体外蛋白質のシグナルペプチドなどが挙げられる。特に、前者ＭＷＰ（Ｍｉｄｄｌｅ  Ｗａｌｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）のシグナルペプチドはその一例である。
【００１７】
遺伝子の発現に用いる発現ベクターとしては、例えば、ｐＨＹ５００，ｐＮＵ２００（特開平２−３１６８２号公報、鵜▲高▼重三、日本農芸化学会誌、６１，６６９（１９８７）参照）などが挙げられる。
上記のＤＮＡを用いて作成したｈＧＨ発現プラスミドはｐＮＵ２００−ＧＨなどが挙げられる。
【００１８】
これらのプラスミドを構築する方法としては、例えばMolecular Cloning 2nd.Ed.,A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory (1990)参照）に記載の方法などが挙げられる。プラスミドの構築に用いる宿主としては、大腸菌、枯草菌、バチルス・ブレビスに属する微生物であればいずれでもよく、例えば大腸菌ＨＢ１０１、大腸菌ＪＭ１０９、枯草菌ＲＭ１４１（J.Bacteriol ., 158,1054(1984) 参照）、バチルス・ブレビス４７（ＦＥＲＭ  Ｐ−７２２４）などが挙げられる。
【００１９】
バチルス・ブレビスを形質転換する方法としては、例えば、Takahashi らの方法（J.Bacteriol ., 156, 1130(1983)参照）あるいはエレクトロポレーションによる方法（H.Takagiら、Agric.Bio.Chem.,53, 3099-3100(1989))などが挙げられる。
培養に用いる培地には、炭素源、窒素源の他、無機塩類が必要に応じて含まれる。また、糖と無機塩類を主とする合成培地を用いて培養してもよい。栄養要求性を示す菌株を用いる場合には、その成育に必要な栄養物質を培地に添加する。さらに必要であれば、培地に抗生物質や消泡剤などを加えてもよい。培地の初発pHは５．０〜９．０であり、好ましくは６．５〜７．５である。
【００２０】
培養温度は、通常１５℃〜４２℃、好ましくは２４〜３７℃であり、培養時間は通常１６〜３６０時間、好ましくは２４〜１４４時間である。
培養終了後、例えば遠心分離、ろ過などで菌体と上清を分離する。菌体内に産生されたｈＧＨは、当該技術分野における通常の方法、例えば超音波破砕法、フレンチプレス法などにより菌体を破砕し、さらに必要ならば界面活性剤を加えることにより抽出される。このようにして得られた培養上清あるいは菌体抽出液中に含まれるｈＧＨは、常用の蛋白質精製法、例えば塩析、等電点沈澱、ゲルろ過、イオン交換、逆層クロマトグラフィーなどの各種クロマトグラフィーなどにより精製され、こうして目的とする異種蛋白質を得ることができる。
【００２１】
以上により、有用性が確認されるように、本発明における新規な変異菌は、前述のとおり組換えＤＮＡ技術により産生された異種蛋白質を効率よく菌体外に分泌蓄積し、安定に維持可能であることから、遺伝子組換えにおける宿主菌として極めて優れた物である。
【００２２】
【実施例】
以下、本発明を参考例及び実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明をこれらのいずれかに限定することを意図するものでない。
例１（参考例）：ヒト成長ホルモン遺伝子を含むプラスミドｐＮＵ２００−ＧＨの構築
池原ら（Ikehara ら.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,81,5956-5960 (1984) 参照）により公表されたヒト成長ホルモンをコードするＤＮＡ（ＨｉｎｆＩ−ＳａｌＩ断片）をプラスミドｐＧＨ−Ｌ９（Ikehara ら.,同上）より単離した。
【００２３】
その断片にＭＷＰのシグナルペプチドとｈＧＨをインフレームで結合するための合成リンカーをＴ４ＤＮＡリガーゼで連結した後、制限酵素ＮｃｏＩとＳａｌＩで処理し、５９６ｂｐのＮｃｏＩ−ＳａｌＩ断片を得た。バチルス・ブレビス４７の主要膜蛋白質の一つＭＷＰ（Ｍｉｄｄｌｅ  Ｗａｌｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）のＣ末端領域を含むプラスミドｐＢＲ−ＡＮ２（特開平２−２５７８７６号公報）から２７ｂｐ  ＮｃｏＩ−ＳａｌＩ断片を除去し、これに前記の５９６ｂｐ  ＮｃｏＩ−ＳａｌＩ断片を挿入してプラスミドｐＢＲ−ＡＮ２−ＧＨを得た。
【００２４】
プラスミドｐＢＲ−ＡＮ２−ＧＨを制限酵素ＡｐａＬＩ，ＨｉｎｄIII で処理して６５６ｂｐ  ＡｐａＬＩ−ＨｉｎｄIII 断片を単離した。一方、プラスミドｐＮＵ２００（鵜▲高▼重三、日本農芸化学会誌、61、６６９−６７６（１９８７）参照）を制限酵素ＡｐａＬＩ−ＨｉｎｄIII で切断し、その大きい断片と上記６５６ｂｐ  ＡｐａＬＩ，ＨｉｎｄIII 断片をＴ４ＤＮＡリガーゼで連結させた反応液を用いてTakahashi らの方法（J.Bacteriol., 156, 1130(1983) 参照）によってバチルス・ブレビス４７（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１６６４，ＩＦＯ  １４６９８）の形質転換を行った。得られたエリスロマイシン耐性の形質転換体からプラスミドを単離し、これをｐＮＵ２００−ＧＨと命名した。
【００２５】
例２（実施例）．バチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）３１−ＯＫの創製
例１で得たプラスミドｐＮＵ２００−ＧＨを、Takahashi らの方法により親株バチルス・ブレビスＨＰＤ３１（特開昭６３−５６２７７号公報、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０８７）に導入し、バチルス・ブレビスＨＰＤ３１（ｐＮＵ２００−ＧＨ）を得た。
【００２６】
その形質転換体をＴ２培地に希釈懸濁し、Ｔ２プレートに塗抹した後、紫外線（２Ｊ／ｍ2 ）に暴露した。３０℃で一晩培養し、得られたコロニーを５ＹＣ培地に植菌し、３０℃で６日間培養した。３日目と６日目の培養液を採取し、培養上清液中に含まれるｈＧＨ量を酵素免疫測定法により測定した。この際に、３日目から６日目にかけて培養上清中のｈＧＨ量が増加している１株を選択分離した。
【００２７】
変異株と親株を比較すると、親株では培養上清中のｈＧＨ量が３日目から６日目にかけて減少するのに対して、得られた変異株は、３日目以降もｈＧＨ量が増加するという顕著な違いを示した。変異株よりプラスミドを除去するために、変異株をエリスロマイシンを含まないＴ２培地で繰り返し継代培養した後、エリスロマイシン感受性でかつｈＧＨを生産しない株が容易に得られた。本菌株をバチルス・ブレビス３１−ＯＫと命名した。
【００２８】
バチルス・ブレビス３１−ＯＫ（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４５７３）の菌学的性質は、親菌株バチルス・ブレビスＨＰＤ３１（特開昭６３−５６２７７７号公報参照）と特定の異種蛋白質に対する作用が異なる点を除きほぼ同様な性状を示した。以下に、その主要な性質を示す。
【００２９】
生理学的性質
硝酸塩の還元                            −
ＶＰテストアセトインの生成              −
インドールの生成                        −
硫化水素の生成
ＴＳＩ寒天培地                        −
酢酸鉛寒天培地                        ＋
クエン酸の利用                          ＋
無機窒素源の利用
硝酸塩                                −
アンモニウム塩                        ＋
【００３０】
色素の生成（キング培地）                −
ウレアーゼ                              −
オキシダーゼ                            ＋
アシルアミダーゼ                        −
カタラーゼ                              ＋
Ｏ−Ｆテスト                        分解せず
ゼラチンの分解                          −
グルコースから酸の生成                  −
キシロース分解                          −
ラクトース分解                          −
マルトース分解                          −
アルギニン加水分解                      −
生育できる  ｐＨ                  ５．５〜８．５
【００３１】
0003739101.tif 000002
【００３２】
例３（実施例）培養上清の蛋白質分解活性の測定
変異株バチルス・ブレビス３１−ＯＫ、参考例としての親株バチルス・ブレビスＨＰＤ３１及び比較例としての枯草菌（ＩＦＯ３０４４株）をＴ2 培地中、３０℃、６日間振盪培養した。培養液を１０，０００rpm 、１０分間遠心分離し、得られた上清を活性測定用の試料とした。５ｇのアゾカゼイン（Sigma,Ａ２７６５）を、０．１ＭのTris−ＨＣｌ（pH８．０）１リッターに溶かし、基質溶液とした。
【００３３】
０．１mlの上記基質溶液にこれと等量の試料を加え、３７℃で５時間反応させた後、０．２mlの１０％トリクロロ酢酸溶液を加えて反応を止めた。そして室温に２０分間静置した後、１５，０００rpm で１０分間遠心分離して上清画分をとり、０．４mlの０．５Ｎ  ＮａＯＨを加え、４４０nmで吸光度を測定した。その結果を表１に示す。
【００３４】
【表１】
0003739101.tif 000003
表１において、分解活性は５時間の吸光度変化で表した。この際、５時間で吸光度を１０変化させる酵素活性を１ユニットと定義した。
【００３５】
例４（実施例）培養上清中の蛋白質分解酵素の解析
例３において変異株バチルス・ブレビス３１−ＯＫ及び親株バチルス・ブレビスＨＰＤ３１より得た前記培養上清にゲルローディングバッファー〔５％ＳＤＳ、２０％グリセロール、４０mM  Tris−ＨＣｌ（pH６．７）〕を等量加え、室温に３０分放置し、ゼラチン−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゼラチン−ＰＡＧＥ）に供した。
【００３６】
ゼラチン−ＰＡＧＥは０．５％ゼラチン、７．５％アクリルアミドの濃度で、E.Strydom らの方法（Appl. Microbiol. Biotechnol., 24, 214-217 (1986)) に従って行った。蛋白質分解酵素はゼラチンの分解により生ずるクリアバンドにより検出した。その結果を示す図１より、変異株バチルス・ブレビス３１−ＯＫでは、培養上清に存在する主要な蛋白質分解酵素が欠失していた。
【００３７】
例５（実施例）  バチルス・ブレビス３１−ＯＫによるヒト成長ホルモンの分泌生産
例１で得られたプラスミドｐＮＵ２００−ＧＨをTakahashi の方法によりバチルス・ブレビス３１−ＯＫに導入し、バチルス・ブレビス３１−ＯＫ（ｐＮＵ２００−ＧＨ）を得た。
【００３８】
ポリペプトン３％、酵母エキス０．２％、グルコース３％、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ  ０．０１％，ＣａＣｌ2 ・７Ｈ2 Ｏ  ０．０１％，ＭｎＳＯ4 ・４Ｈ2 Ｏ０．００１％，ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ  ０．００１％，ＺｎＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ０．０００１％およびエリスロマイシン１０mg／Ｌ（pH７．２）よりなる培地に、バチルス・ブレビス３１−ＯＫ（ｐＮＵ２００−ＧＨ）及び対照としてバチルス・ブレビスＨＰＤ３１（ｐＮＵ２００−ＧＨ）を３０℃で振盪培養し、培養上清中のｈＧＨを抗ヒト成長ホルモン抗体を用いた酵素免疫測定法により定量した。
【００３９】
変異株バチルス・ブレビス３１−ＯＫ（ｐＮＵ２００−ＧＨ）は、培養６日目には１６．５mg／ＬのｈＧＨを培養上清中に生産していた。一方、親株バチルス・ブレビスＨＰＤ３１（ｐＮＵ２００−ＧＨ）のｈＧＨ量は０．７mg／Ｌであり、変異株は親株の約２５倍のｈＧＨを生産した。
【００４０】
例６（実施例）．バチルス・ブレビス３１−ＯＫにより生産されたｈＧＨの性質
例５で得られた培養上清を、Laemmli の方法（Nature,  227,680(1970)参照）に準じてＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた後、Ｂｕｒｎｅｔｔｅの方法（Anal.Biochem., 112,195(1981)参照）に準じて抗ヒト成長ホルモン抗体（生化学工業（株）製）を用いてウェスタンブロティングを行った。バチルス・ブレビス３１−ＯＫ（ｐＮＵ２００−ＧＨ）の生産するｈＧＨはヒト脳下垂体より抽出精製した標準品（生化学工業（株）製）と同じ分子量を示したが、親株の生産したｈＧＨは、分解を受け、低分子量化していた。
【００４１】
例７（実施例）  バチルス・ブレビス３１−ＯＫによるヒトインターロイキン２（ｈＩＬ２）の分泌生産
ヒト  インターロイキン２（ｈＩＬ２）遺伝子を有するプラスミドｐＩＬ−５０Ａ（T.Taniguchi ら, Nature   302, 305-310 (1983)参照）を、制限酵素ＨｇｉＡＩとＤｒａＩで消化し、ｈＩＬ２遺伝子を含むＤＮＡ断片を得た。
【００４２】
一方、ＭＷＰシグナル配列の疎水領域にＬｅｕ３個、正電荷領域にＡｒｇ２個を付加した改変シグナル配列を有するプラスミドｐＮＵＲ２Ｌ４ＭＮを制限酵素ＰｓｔＩとＨｉｎｄIII で消化した後、ＨｉｎｄIII 切断部位を埋めて平滑化し、ｈＩＬ２遺伝子を含むＤＮＡ断片とリガーゼで結合してｐＮＵＲ２Ｌ４ＭＮ−ｈＩＬ２を得た。
【００４３】
このプラスミドｐＮＵＲ２Ｌ４ＭＮ−ｈＩＬ２をバチルス・ブレビスＨＰＤ３１及びバチルス・ブレビス３１−ＯＫに導入して得られたそれぞれの形質転換菌をＰＹ培地で３０℃にて３日間培養した。培養上清のｈＩＬ２量は、バチルス・ブレビスＨＰＤ３１の形質転換菌では約２０mg／Ｌであったのに対し、バチルス・ブレビス３１−ＯＫの形質転換菌では約８０mg／Ｌに生産量が向上していた。
【００４４】
【発明の効果】
本発明によれば、異種蛋白質の生産用変異菌を用いて遺伝子組換えに有利に使用できる宿主菌が提供される。本発明の変異菌は、特に、ヒト成長ホルモンまたはインターロイキン２の生産に適する。例えば、ヒト成長ホルモンをコードするＤＮＡを含有する適当なプラスミドで形質転換して得られる形質転換体は、異種蛋白質の生産に優れていることが知られている宿主菌を使用した場合に比し、有意に高い生産、蓄積性を示す。
【図面の簡単な説明】
【図１】例４（実施例）で得られた培養上清中の蛋白質分解酵素をゼラチン−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により解析した結果を示す図面である。
【図１】
0003739101.tif 000004