(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号６の５’−ＴＡＴＡＴＣＴＡＴＴＡＴＡＡＴＡＴＡＣＧＡＴＧＡＧＧＡＴＧＡ−３’または対応する相補的配列または、配列番号７の５’−ＧＧＴＡＧＴＧＧＴＡＧＴＡＴＧＴＡＡＣＡＧＣＴＴＧＡＧＡＧＡ−３’または対応する相補的配列からなるオリゴヌクレオチドを一方のプライマーとし、下面ビール酵母の５ＳｒＲＮＡをコードする１８merの遺伝子配列または相補的配列からなるオリゴヌクレオチドをもう一方のプライマーとして、遺伝子増幅処理を行い、配列番号６のオリゴヌクレオチドにより遺伝子増幅産物が得られる酵母と配列番号７のオリゴヌクレオチドにより遺伝子増幅産物が得られる酵母に下面ビール酵母を分類する方法。
【請求項２】
下面ビール酵母の５ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子配列が配列番号８のＣＡＣＣＧＴＴＴＣＣ ＣＧＴＣＣＧＡＴである請求項１記載の下面ビール酵母を分類する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、酵母を分類するのに利用可能な遺伝子及びそれを利用した酵母の分類方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、酵母の染色体構造の解析と酵母の分類法について各種の報告がある。例えば、J GEN APPL MICROBIOL, VOL. 41.NO. 3,239-247, 1995には、サッカロマイセス・バヤナス（Saccharomyces bayanus）、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、下面発酵ビール酵母について電気泳動的核型を検討し、その結果から下面発酵ビール酵母がサッカロマイセス・バヤナス（Saccharomyces bayanus）とサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）との交雑体であることが記載されている。また、日本農芸化学１９９８年大会要旨集４３ページ、2A7p24には、パルスフィールドゲル電気泳動とサザンハイブリダイゼーションにより下面発酵ビール酵母の染色体構造を検討した結果、下面発酵ビール酵母はサッカロマイセス・バヤナス（Saccharomyces bayanus）とサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）との交雑体であることが報告されている。一方、FEMS MICROBIOLOGY LETTERS 108, 259-264, 1993には、 サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、サッカロマイセス・カールスベルゲンシス(Saccharomyces carlsbergensis)、サッカロマイセス・パストリアヌス（Saccharomyces pastorianus）の３種の酵母について、２６ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子と５ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子との間のスペーサー領域のＰＣＲ産物の制限酵素断片長を比較している。さらに、本発明者らは、特開平11-56366「酵母を同定する方法」にて、ｒＤＮＡの一部のＰＣＲ産物及び制限酵素断片長多型性とを組み合わせたビール醸造用酵母と非醸造用酵母を分類同定する方法を開示している。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
これらの従来技術をもとに、検討する酵母がサッカロマイセス(Saccharomyces)属のどの種に該当するのか確認したり、ビール醸造用酵母と非醸造用酵母の分類を行うことは可能である。
しかしながら、今日では、さらにビール醸造用の下面発酵ビール酵母においても、できるだけ個々の酵母に対する細やかな分類が望まれており、その課題については従来の報告内容ではその要望は達成が困難である。
そこで、本発明では、下面発酵ビール酵母におけるより詳細な分類・同定に利用できる方法を提供することを目的とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
上記の課題を解決するために、鋭意研究を行った結果、下面発酵ビール酵母各株の２６ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子と５ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子との間のスペーサー領域を含むＤＮＡの塩基配列を決定し、この塩基配列よりプライマーを作製し、当該ＤＮＡをＰＣＲ（ポリメラーゼ・チェーン・リアクション）法にて増幅し、その増幅産物を比較することにより、下面発酵ビール酵母を分類・同定できることを見いだし、本発明を完成させた。
【０００５】
従って、（１）第１の発明は、配列番号１に示される塩基配列の一部または全部を含む下面発酵ビール酵母ＢＦ１の２６ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子と５ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子との間のスペーサー領域の遺伝子配列である。（２）第２の発明は、配列番号２に示される塩基配列の一部または全部を含む下面発酵ビール酵母ＩＦＯ２００３の２６ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子と５ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子との間のスペーサー領域の遺伝子配列である。
（３）第３の発明は、配列番号３に示される塩基配列の一部または全部を含む下面発酵ビール酵母ＣＢＳ１５１３の２６ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子と５ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子との間のスペーサー領域の遺伝子配列である。
（４）第４の発明は、配列番号４に示される塩基配列の一部または全部を含むサッカロマイセス・パストリアヌス（Saccharomyces pastorianus）タイプストレインＣＢＳ１５３８の２６ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子と５ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子との間のスペーサー領域の遺伝子配列である。
（５）第５の発明は、配列番号５に示される塩基配列の一部または全部を含むサッカロマイセス・バヤナス（Saccharomyces bayanus）タイプストレインＣＢＳ３８０の２６ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子と５ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子との間のスペーサー領域の遺伝子配列である。
（６）第６の発明は、下面発酵ビール酵母の２６ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子と５ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子との間のスペーサー領域の遺伝子配列が以下の配列、
５’−ＴＡＴＡＴＣＴＡＴＴＡＴＡＡＴＡＴＡＣＧＡＴＧＡＧＧＡＴＧＡ−３’
▲１▼
を有するか、または対応する相補的配列を有することを特徴とするオリゴヌクレオチドである。
（７）第７の発明は、下面発酵ビール酵母の２６ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子と５ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子との間のスペーサー領域の遺伝子配列が以下の配列、
５’−ＧＧＴＡＧＴＧＧＴＡＧＴＡＴＧＴＡＡＣＡＧＣＴＴＧＡＧＡＧＡ−３’
▲２▼
を有するか、または対応する相補的配列を有することを特徴とするオリゴヌクレオチドである。
（８）第８の発明は、上記（１）から（５）に記載された遺伝子配列より作成したオリゴヌクレオチドあるいは上記（６）及び（７）に記載されたオリゴヌクレオチドと２６ＳｒＲＮＡより作成したオリゴヌクレオチドを、核酸合成のプライマーとして機能させ、遺伝子増幅処理することによって下面発酵ビール酵母を分類する方法である。
（９）第９の発明は、上記第８の発明において得られる遺伝子増幅産物をプローブとして作用させ、サザンハイブリダイゼーションを行い、酵母を分類する方法である。
【０００６】
本発明で実施する遺伝子増幅に関する技術は既に公知である。本技術は、特定の遺伝子配列を増幅させる反応であり、迅速・高感度で高い特異性を持ちかつ簡便であることから現在広い分野で利用されている。本発明においても、Saikiらが開発したPolymerase Chain Reaction法(以下、ＰＣＲ法と略す；Science 230,1350,1985）を参考にして実施することができる。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明の概要を説明する。
（１）まず、下面発酵ビール酵母、サッカロマイセス・バヤナス（Saccharomyces bayanus）、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）の２６ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子と５ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子との間のスペーサー領域のPCR産物について制限酵素で切断し、得られた制限酵素切断パターンを比較する。制限酵素には、MspI、ScrFIを利用できる。MspIとScrFIを制限酵素として利用した場合、その切断パターンから下面発酵ビール酵母は２タイプに分類される。
（２）次に、下面発酵ビール酵母、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、サッカロマイセス・バヤナス（Saccharomyces bayanus）の２６ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子と５ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子との間のスペーサー領域の塩基配列を決定する。塩基配列の決定方法は、公知の4000L Long ReadIR(登録商標）DNA Sequencing System(LI-COR社製)の方法を利用することができる。得られた塩基配列の相同性を比較検討し、異なる塩基配列部分を確認する。サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）及びサッカロマイセス・バヤナス（Saccharomyces bayanus）との相同性を検討すると、下面発酵ビール酵母は２タイプに分類される。配列の違う部分は、配列番号１の１０１番目から１１５７番目、配列番号２の１０１番目から１１５４番目、配列番号３の１０１番目から１１１２番目、配列番号４の１０１番目から１１１３番目、配列番号５の１０１番目から１１１２番目である。
【０００８】
（３）（２）で決定した配列のうち、同じタイプの下面発酵ビール酵母にのみＰＣＲ増幅産物が得られるようなプライマーを設計し、合成する。合成方法は既知の方法で実施できる。プライマーとなる塩基配列は、配列番号６及び７に示したものは一例であり、これに限定されるものではない。
（４）同じタイプの下面発酵ビール酵母にのみＰＣＲ増幅産物が得られるようなプライマーとそれらプライマーに組み合わせて共通して使用するプライマーを用いた。組み合わせて共通して使用するプライマー丸3のオリゴヌクレオチド配列を配列番号８に示す。但し、このプライマーはこのものに限定されるものではなく、５ＳｒＲＮＡをコードする塩基配列のものであればかまわない。これらプライマーを用いて、検討する下面発酵ビール酵母の遺伝子をＰＣＲ法で増幅させ、どちらの分類に属するかを決定する。（１）の方法はｒＤＮＡスペーサー領域の一部をＰＣＲにより増幅させ、その増幅産物を制限酵素で切断してパターンを比較する方法で、下面発酵ビール酵母を分類することができるが２段階の試験を必要とする。しかし、本方法はｒＤＮＡスペーサー領域の下面発酵ビール酵母間で確実に差異のでる部分をＰＣＲ法で増幅させて増幅の有無により分類するという簡単で確実な方法である。また、実施例以外のビール酵母にも十分応用可能な方法と考えられる。
（５）（４）の分類方法とは別の方法として、サザンハイブリダイゼーションによる分類方法がある。すなわち、（４）で増幅した産物をプローブとして、下面発酵ビール酵母のＤＮＡに作用させてサザンハイブリダイゼーションを行い、どちらの分類に属するかを決定する。
【０００９】
本発明の配列表について説明する。
配列番号１は、配列の長さが１４３２、配列の型が核酸、鎖の数が２本鎖、トポロジーが直鎖状、配列の種類がgenomicＤＮＡ。起源が下面発酵ビール酵母ＢＦ１の配列である。
配列番号２は、配列の長さが１４２９、配列の型が核酸、鎖の数が２本鎖、トポロジーが直鎖状、配列の種類がgenomicＤＮＡ。起源が下面発酵ビール酵母ＩＦＯ ２００３の配列である。
【００１０】
配列番号３は、配列の長さが１３８６、配列の型が核酸、鎖の数が２本鎖、トポロジーが直鎖状、配列の種類がgenomicＤＮＡ。起源が下面発酵ビール酵母ＣＢＳ１５１３の配列である。
配列番号４は、配列の長さが１３８７、配列の型が核酸、鎖の数が２本鎖、トポロジーが直鎖状、配列の種類がgenomicＤＮＡ。起源がサッカロマイセス・パストリアヌス（Saccharomyces pastorianus）タイプ・ストレインＣＢＳ１５３８の配列である。
配列番号５は、配列の長さが１３８６、配列の型が核酸、鎖の数が２本鎖、トポロジーが直鎖状、配列の種類がgenomicＤＮＡ。起源がサッカロマイセス・バヤナス（Saccharomyces bayanus）ＣＢＳ３８０の配列である。
【００１１】
配列番号６は、配列の長さが３０、配列の型が核酸、鎖の数が２本鎖、トポロジーが直鎖状、配列の種類がgenomicＤＮＡ。起源が下面発酵ビール酵母ＩＦＯ ２００３の配列である。
配列番号７は、配列の長さが３０、配列の型が核酸、鎖の数が２本鎖、トポロジーが直鎖状、配列の種類がgenomicＤＮＡ。起源が下面発酵ビール酵母ＣＢＳ１５１３の配列である。
【００１２】
【実施例】
以下に、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されない。
実施例１
下面発酵ビール酵母のｒＤＮＡスペーサー領域のＰＣＲ産物の制限酵素切断パターンの比較
下面発酵ビール酵母ＢＦ１、下面発酵ビール酵母ＢＦ２、下面発酵ビール酵母ＣＢＳ１５１３,下面発酵ビール酵母ＩＦＯ２００３, サッカロマイセス・パストリアヌス（Saccharomyces pastorianus）タイプ・ストレインＣＢＳ１５３８下面発酵ビール酵母ＡＴＣＣ１０５９６、下面発酵ビール酵母ＮＣＹＣ５２９、下面発酵ビール酵母ＮＣＹＣ１０４７、下面発酵ビール酵母ＩＦＯ１００１２、サッカロマイセス・バヤナス(Saccharomyces bayanus)ＣＢＳ３８０、及びサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）Ｘ２１８０−１Ａを試験に用いた。
【００１３】
上記酵母を適当な増殖用培地にて培養を行った後、菌体を遠心操作により回収した。その後、菌体からのＤＮＡ抽出は、Hoffman and Winstonの方法（Gene 57 267-272(1987)）に従って行った。このＤＮＡ溶液1-50ng/μlを鋳型に、TaKaRa ExTaq（登録商標、宝酒造）を用いてプロトコール通りに反応溶液を調整した。プライマーの合成は、先行文献〔FEMSマイクロバイオロジー  レター（FEMS Microbiology Letters）〕に記載のプライマー配列を用いて、サワディーテクノロジー（株）に委託した。ＰＣＲは、アステック社のPROGRAM TEMP CONTROL SYSTEM PC-800を用い、増幅反応を行った。反応条件は、９４℃５分間の変性後、９４℃、２分３０秒間の変性→５５℃１分３０秒間のプライマーのアニーリング→７２℃、３分間の合成反応のサイクルを２５サイクル行った。反応後、５μｌの反応液をとり、アガロースゲル電気泳動を行い、エチジウムブロマイドでＤＮＡを染色して、増幅されたＤＮＡを確認した。その後、この増幅産物の一部を取り、制限酵素ＭｓｐＩ(TAKARA)またはＳｃｒＦＩ(東洋紡社)により、３７℃、６０分間反応させた後、アガロースゲル電気泳動を行い、エチジウムブロマイドでＤＮＡを染色して、制限酵素切断パターンを比較した。
【００１４】
その結果を図１に示した。図１からも明らかなように、下面発酵ビール酵母は、２つのタイプに分類されることのが確認された。グループ１には、下面発酵ビール酵母ＢＦ１、下面発酵ビール酵母ＢＦ２、下面発酵ビール酵母ＣＢＳ１５１３、下面発酵ビール酵母ＩＦＯ２００３、下面発酵ビール酵母ＡＴＣＣ１０５９６、下面発酵ビール酵母ＮＹＣＹ５２９、下面発酵ビール酵母ＮＹＣＹ１０４７、下面発酵ビール酵母ＩＦＯ１００１２が属し、グループ２には、下面発酵ビール酵母ＣＢＳ１５１３、サッカロマイセス・パストリアヌス（Saccharomyces pastorianus）タイプ・ストレインＣＢＳ１５３８が属していた。
【００１５】
実施例２
下面発酵ビール酵母の２６ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子と５ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子との間のスペーサー領域のクローニング及び塩基配列の決定
下面発酵ビール酵母ＢＦ１、下面発酵ビール酵母ＩＦＯ２００３、下面発酵ビール酵母ＣＢＳ１５１３、サッカロマイセス・パストリアヌス（Saccharomyces pastorianus）タイプ・ストレインＣＢＳ１５３８の２６ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子と５ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子との間のスペーサー領域の塩基配列を決定した。
【００１６】
上記酵母を適当な増殖用培地にて培養を行った後、菌体を遠心操作により回収した。その後、菌体からのＤＮＡ抽出は、Hoffman and Winstonの方法（Gene 57 267-272(1987)）に従って行った。このＤＮＡ溶液1-50ng/μlを鋳型に、TaKaRa ExTaq（登録商標、宝酒造）を用いてプロトコール通りに反応溶液を調整した。プライマーの合成は、 FEMS MICROBIOLOGY LETTERS 108,259-264,1993に記載のプライマー配列を用いて、サワディーテクノロジー（株）に委託した。ＰＣＲは、アステック社のPROGRAM TEMP CONTROL SYSTEM PC-800を用い、増幅反応を行った。反応条件は、９４℃５分間の変性後、９４℃、２分３０秒間の変性→５５℃１分３０秒間のプライマーのアニーリング→７２℃、３分間の合成反応のサイクルを２５サイクル行った。但し、使用したプライマーはこれに限定されず、５ＳｒＲＮＡ及び２６ＳｒＲＮＡをコードする塩基配列のものでかまわない。ＰＣＲ終了後の増幅ＤＮＡ ５００ｎｇを、ＴＡクローニングキット（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社）に含まれるプラスミドｐＣＲ２．１を２μｌ、リガーゼを１μｌ、バッファーを１μｌ、滅菌水を全量１０μｌになるように加え、１６℃、一晩反応させた後、その２μｌと０．５Ｍメルカプトエタノール２μｌをともに大腸菌INVα‘Ｆコンピテントセルに加え、氷中、３０分間放置したのち、４２℃、３０秒間熱処理し、大腸菌へのプラスミドの形質転換を行った。形質転換した大腸菌にＳＯＣ培地（２．０％ Ｔｒｙｔｏｎｅ、０．５％Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ、１０ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭＭｇＣｌ2−６Ｈ2Ｏ、２０ｍＭ ｇｌｕｃｏｓｅ）２５０μlを加え、３７℃、６０分間振とうした後、５０μｇ／ｍｌアンピシリン及び４０μｇ／ｍｌ Ｘ−Ｇａｌを含むＬＢ平板培地に植菌し、３７℃、一晩培養した。現れた白色のコロニーを５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含む２ｍｌのＬＢ液体培地に接種し、３７℃、一晩培養した。培養後、大腸菌よりプラスミド  ミニ  キット（ＱＵＩＡＧＥＮ社）を用いてプラスミド抽出した。得られたプラスミドの一部を取り、制限酵素ＥｃｏＲＩ(宝酒造社)により３７℃、６０分間反応させた後、アガロース電気泳動を行い、エチジウムブロマイドの染色により、２６ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子と５ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子との間のスペーサー領域が挿入されていることを確認した。
【００１７】
このようにして得られたプラスミドを鋳型とし、シークエンス反応をおこなった。シークエンスプライマーはIRD41 Infared Dye Labeled m13 Forwardプライマー及びIRD41 Infared Dye Labeled m13 Reverseプライマー(日清紡社製造、アロカ（株）販売)を、反応液はSequiTherm（登録商標）Long-Read(登録商標)Cycle SEQUENCING Kit-LC(EPICENTRE TECHNOLOGIES社製)を使用した。塩基配列決定は、4000L Long ReadIR（登録商標）DNA Sequencing System（LI-COR社製）を用いた。
【００１８】
その結果、得られた各下面発酵ビール酵母の２６ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子と５ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子との間のスペーサー領域塩基配列を配列表に記載した。
【００１９】
配列番号１は、下面発酵ビール酵母ＢＦ１の塩基配列を示す。
配列番号２は、下面発酵ビール酵母ＩＦＯ２００３の塩基配列を示す。
配列番号３は、下面発酵ビール酵母ＣＢＳ１５１３の塩基配列を示す。
配列番号４は、サッカロマイセス・パストリアヌス（Saccharomyces pastorianus）タイプ・ストレインＣＢＳ１５３８の塩基配列を示す。
配列番号５は、サッカロマイセス・バヤナス（Saccharomyces bayanus）ＣＢＳ３８０の塩基配列を示す。
【００２０】
実施例３
プライマーの合成
実施例２の塩基配列の相同性を比較した結果、塩基配列上からも下面発酵ビール酵母は、下面発酵ビール酵母ＢＦ１と下面発酵ビール酵母ＩＦＯ２００３のグループと、下面発酵ビール酵母ＣＢＳ１５１３とサッカロマイセス・パストリアヌス（Saccharomyces pastorianus）タイプ・ストレインＣＢＳ１５３８のグループに分類されることが確認された。そこで、その差異が確認された部分を参考に、ＰＣＲの増幅用にプライマーを設計し合成した。
【００２１】
配列番号１をもとに、DNASIS（日立ソフトエンジニアリング（株））を用いて下面発酵ビール酵母ＢＦ１を含むグループに特異的な配列を解析した。その結果、配列番号１の下面発酵ビール酵母ＢＦ１の２６ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子と５ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子との間のスペーサー領域の遺伝子配列上の１０２１番目から１０５０番目までの配列を選定した。プライマーの合成は、サワディーテクノロジー（株）に委託した。合成したプライマー▲１▼のオリゴヌクレオチド配列を配列番号６に示す。
【００２２】
また、同様の解析により、配列番号３をもとに,下面発酵ビール酵母ＣＢＳ１５１３を含むグループに特異的な配列を解析した。その結果、配列番号３の下面発酵ビール酵母ＣＢＳ１５１３の２６ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子と５ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子との間のスペーサー領域の遺伝子配列上の９７１番目から１０００番目までの配列を選定した。このオリゴヌクレオチドを実施例１と同様の方法で化学合成した。合成したプライマー▲２▼のオリゴヌクレオチド配列を配列番号７に示す。
また、両プライマーと組み合わせて利用するプライマーとしては、FEMS MICROBIOLOGY LETTERS 108,259-264,1993の中に報告されているＥＴＳ２プライマーを利用することとし、前記合成法と同様に合成した。合成したプライマー▲３▼のオリゴヌクレオチド配列を配列番号８に示す。
【００２３】
実施例４
プライマーの違いによるPCR増幅産物に基づく下面発酵ビール酵母の分類
下面発酵ビール酵母ＢＦ１、下面発酵ビール酵母ＢＦ２、下面発酵ビール酵母ＣＢＳ１５１３、下面発酵ビール酵母ＩＦＯ２００３、サッカロマイセス・パストリアヌス（Saccharomyces pastorianus）タイプ・ストレインＣＢＳ１５３８、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）Ｘ２１８０−１Ａ、上面発酵ビール酵母ＴＦ１、サッカロマイセス・バヤナス（Saccharomyces bayanus）ＣＢＳ３８０を試験に用いた。
【００２４】
上記酵母より、実施例１と同様にＤＮＡを抽出し、上記合成プライマー▲１▼及び▲３▼を用いてＰＣＲを行った。 ＰＣＲは実施例１と同様に行った。ＰＣＲ反応後、５μｌの反応液をとり、アガロースゲル電気泳動を行い、エチジウムブロマイドでＤＮＡを染色して、増幅されたＤＮＡを確認した。ゲルの観察または撮影した写真より、増幅産物の塩基長を分子量マーカーとの相対移動度から求めた。その結果、図２Ａに示されるように、下面発酵ビール酵母ＢＦ１、下面発酵ビール酵母ＢＦ２、下面発酵ビール酵母ＩＦＯ２００３（レーン４、５、６）にのみ約１１００ｂｐのバンドが検出された。同様に、上記合成プライマー▲２▼及び▲３▼を用いてＰＣＲを行い、増幅産物の塩基長を調べたところ、図２Ｂに示されるように、下面発酵ビール酵母ＣＢＳ１５１３、サッカロマイセス・パストリアヌス（Saccharomyces pastorianus）タイプ・ストレインＣＢＳ１５３８、（レーン７、９）にのみ約１０００ｂｐのバンドが検出された。
【００２５】
【発明の効果】
本発明により、下面発酵ビール酵母ＢＦ１、ＣＢＳ１５１３、ＩＦＯ２００３、サッカロマイセス・パストリアヌス（Saccharomyces pastorianus）タイプ・ストレインＣＢＳ１５３８、及びサッカロマイセス・バヤナス（Saccharomyces bayanus）タイプ・ストレインＣＢＳ３８０の、２６ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子と５ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子との間のスペーサー領域の遺伝子が明らかになり、この遺伝子配列の全部または一部を用いた、下面発酵ビール酵母を分類する方法が提供された。そして、それらのスペーサー領域を本発明のプライマーを用いて、ＰＣＲ法にて増幅し、その増幅産物を比較することにより、より詳細な下面発酵ビール酵母の分類、同定が可能となり、ビールの製造や品質管理に大きな貢献をするものと期待できる。
【００２６】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１における電気泳動図。
【図２】実施例４における電気泳動図。
【図１】
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【図２】
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