(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の組換え蛋白質いずれか１つを用いて哺乳類細胞を接着する方法：
１）βig-h3の第２ fas-1ドメインの複数コピーからなり、哺乳動物細胞を接着する活性を有する組換え蛋白質；
２）βig-h3の第４ fas-1ドメインの複数コピーからなり、哺乳動物細胞を接着する活性を有する組換え蛋白質；または
３）βig-h3の第２ fas-1ドメインの１コピー若しくは複数コピー及びβig-h3の第４ fas-1ドメインの１コピー若しくは複数コピーからなり、哺乳動物細胞を接着する活性を有する組換え蛋白質。
【請求項２】
該第2 fas-1ドメインが、βig-h3の237〜377位のアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
該第4 fas-1ドメインが、βig-h3の498〜637位のアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項４】
該組換え蛋白質が、βig-h3の498〜637位のアミノ酸配列からなる該第4 fas-1ドメインを4重に重複して含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項５】
受託番号KCTC 0905BPで識別される大腸菌株中に保持される発現ベクター（ここで、該発現ベクターは、βig-h3の237〜377位のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを含み、βig-h3の第2 fas-1ドメインを含む組換え蛋白質を発現する能力を有する。）。
【請求項６】
請求項５記載の発現ベクターで形質転換され、受託番号KCTC 0905BPとして識別される大腸菌株。
【請求項７】
受託番号KCTC 0904BPで識別される大腸菌株中に保持される発現ベクター（ここで、該発現ベクターは、βig-h3の498〜637位のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを含み、βig-h3の第4 fas-1ドメインを含む組換え蛋白質を発現する能力を有する。）。
【請求項８】
請求項７記載の発現ベクターで形質転換され、受託番号KCTC 0904BPとして識別される大腸菌株。
【請求項９】
受託番号KCTC 0906BPで識別される大腸菌株中に保持される発現ベクター（ここで、該発現ベクターは、βig-h3の498〜637位のアミノ酸配列を4重に重複して有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡを含み、βig-h3の第4 fas-1ドメインを複数コピー含む組換え蛋白質を発現する能力を有する。）。
【請求項１０】
請求項９の発現ベクターで形質転換され、受託番号KCTC 0906BPとして識別される大腸菌株。
【請求項１１】
以下の段階を含む、請求項1記載の方法：
1) 請求項１記載の組換え蛋白質を調製する段階；
2) 該組換え蛋白質を固相支持体上にコーティングする段階；および
3) 該組換え蛋白質でコーティングした固相支持体上に細胞を添加する段階。
【請求項１２】
下記の組換え蛋白質のいずれか１つを含有する創傷治癒剤：
１）βig-h3の第２ fas-1ドメインの複数コピーからなり、哺乳動物細胞を接着する活性を有する組換え蛋白質；
２）βig-h3の第４ fas-1ドメインの複数コピーからなり、哺乳動物細胞を接着する活性を有する組換え蛋白質；または
３）βig-h3の第２ fas-1ドメインの１コピー若しくは複数コピー及びβig-h3の第４ fas-1ドメインの１コピー若しくは複数コピーからなり、哺乳動物細胞を接着する活性を有する組換え蛋白質。
【請求項１３】
該組換え蛋白質が、下記のいずれか１つである請求項１２記載の創傷治癒剤：
１）該第2 fas-1ドメインが、βig-h3の237〜377位のアミノ酸配列からなることを特徴とする組換え蛋白質；
２）該第4 fas-1ドメインが、βig-h3の498〜637位のアミノ酸配列からなることを特徴とする組換え蛋白質；または
３）βig-h3の498〜637位のアミノ酸配列からなる該第4 fas-1ドメインを4重に重複して含むことを特徴とする組換え蛋白質。
【請求項１４】
該組換え蛋白質が、固相支持体にコーティングされていることを特徴とする請求項１２または１３に記載の創傷治癒剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は細胞接着および創傷治癒に使用するペプチドに関する。より詳細には、本発明はβig-h3の第2および/または第4 fas-1ドメインを1コピーまたは複数コピー含むペプチドの、細胞接着および創傷治癒における使用に関するが、この第2および/または第4ドメインは、インテグリンへの結合に必須で、細胞接着を仲介する2つのアミノ酸、アスパラギン酸およびイソロイシンに高度の相同性を持つ。また、本発明は細胞接着および創傷治癒に有用なペプチドの発現系にも関する。
【０００２】
発明の背景
βig-h3は細胞外マトリックス蛋白質であり、その発現は、活性型TGF-βのシグナル伝達に続いて、ヒトメラノーマ細胞、乳房上皮細胞、ケラチノサイト、および肺線維芽細胞を含む種々の細胞株で誘導される（Skonier, J.ら、DNA Cell Biol. 13、571、1994）。βig-h3遺伝子は、TGF-βで処理されたヒト肺腺癌細胞株から作製されたcDNAライブラリーのディファレンシャルハイブリダイゼーションスクリーニングによって、最初に単離された。βig-h3遺伝子は、種間で高度に保存されている683アミノ酸の蛋白質をコードしている。これは、N末端に分泌シグナルペプチド、C末端にArg-Gly-Asp (RGD)モチーフを含んでいる。RGDモチーフは、細胞接着を調節する多くの細胞外マトリックス蛋白質に見出され、いくつかのインテグリンのリガンド認識配列となっている（Stonier, J.ら、DNA Cell Biol.、11、511、1992）。
【０００３】
いくつかの研究によると、βig-h3は細胞の成長および増殖、創傷治癒、ならびに細胞接着に関与していることが知られているが、これらの機能の根底にある機序は、いまだ不明である。しかし、βig-h3は様々な組織において、形態形成、および細胞と細胞外マトリックス蛋白質の相互作用に重要な働きをしていると考えられる。
【０００４】
細胞接着および剥離の仲介におけるβig-h3の役割に関連する証拠が、いくつかの研究で提供されている。例えば、精製βig-h3蛋白質は、皮膚の線維芽細胞の接着および伸展を促進するが、無血清培地中で、A549、HeLaおよびWi-38細胞の接着を阻害することがわかっている。特に、βig-h3は腫瘍細胞の増殖に阻害活性があり、コロニー形成および形態に影響を与えることが知られている。阻害活性は、βig-h3発現プラスミドをCHO（チャイニーズハムスター卵巣）細胞にトランスフェクトすると、細胞の増殖、およびこれらの細胞がヌードマウスで腫瘍を形成する能力が著しく低下したという報告によって、示されている。さらに、創傷治癒法は、薬学的に有効量のβig-h3を創傷に塗布すると、細胞、特に線維芽細胞が創傷部位に広がり、接着するという知見に基づいて、開発された。したがって、様々な細胞株においてTGF-βによって誘導される細胞接着分子であるβig-h3は、細胞の増殖、細胞の分化、創傷治癒、形態形成、および細胞接着に非常に重要な役割を果たす（Rawe, I.M.ら、Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 38、893、1997; Lebaron, R. G.ら、J. Invest. Dermatol. 104、844、1995）。
【０００５】
βig-h3は、内部の相同性を持つ140アミノ酸、すなわちfas-1ドメインの繰り返しを4つ含む。内部の繰り返しドメインは、哺乳類、昆虫、ウニ、植物、酵母、および細菌を含む様々な種の分泌蛋白質または膜蛋白質に見られる、高度に保存された配列を持つ。保存された配列を含む蛋白質の例は、ペリオスチン、ファシクリンI、ウニHLC-2、藻類のCAM、およびマイコバクテリウムMPB70である。これらの蛋白質の保存されたドメイン（以後、fas-1と呼ぶ）は、各々約10アミノ酸の2つの高度に保存された枝、H1およびH2を持つ約110アミノ酸から140アミノ酸から構成されている（Kawamoto, T.ら、Biochem. Biophys. Acta. 1395、288、1998）。
【０００６】
4つのfas-1ドメインは、βig-h3、ペリオスチン、およびファシクリンIに見られ、2つのfas-1ドメインはHLC-2、1つのみのfas-1ドメインはMPB70に見られる。これらの蛋白質の機能は明らかにされていないが、そのいくつかは、細胞接着分子として作用することが知られている。例えば、βig-h3、ペリオスチン、およびファシクリン1は、それぞれ線維芽細胞、骨芽細胞、および神経細胞の接着を仲介すると報告されている。また、藻類のCAMが藻類ボルボックスの胚に存在する細胞接着分子であることが開示されている（LeBaron, R. G.ら、J. Invest. Dermatol. 104、844、1995; Horiuchi, K.ら、J. Bone Miner. Res. 14、1239、1999; Huber, O.ら、EMBO J. 13、4212、1994）。
【０００７】
当初、βig-h3の細胞接着活性はC末端のRGDモチーフによって仲介されると考えられていた。しかし、研究の結果、RGDモチーフは軟骨細胞の伸長の促進に必要ではなく、C末端のプロセッシングによってRGDモチーフが削除された成熟可溶性βig-h3が細胞接着を阻害できることが分かり、βig-h3のRGDモチーフは、βig-h3の細胞接着活性の仲介にはなくても構わないという結論に達した。さらに、βig-h3のRGDモチーフはβig-h3の細胞接着特性の仲介には不要である一方で、βig-h3はインテグリンα1β1を介して線維芽細胞の伸長を促進することが最近報告された。最近の報告によると、βig-h3はインテグリンに特異的に結合し、RGDモチーフには関係なく、細胞接着および細胞の伸長を促進する（Ohno, S.ら、Biochem. Biophys. Acta 1451、196、1999）。さらに、βig-h3の保存されたペプチドH1およびH2は、βig-h3を介する細胞接着には影響しないことが分かった。これらの結果を合わせると、βig-h3の細胞接着活性に不可欠なアミノ酸は、H1およびH2領域以外のどこかに存在すると示される。βig-h3の繰り返しのfas-1ドメインの間のみならず他の蛋白質のfas-1ドメインの間の相同性に基づくコンピュータ検索では、H1およびH2ペプチド以外に、いくつかの高度に保存されたアミノ酸があることが明らかにされ、これは細胞接着活性にこの保存されたアミノ酸配列が関与している可能性を示唆する。
【０００８】
細胞接着に重要な役割を果たすことが知られているβig-h3のドメインのうち、第2または第4ドメインのいずれかが、本発明に係る分子の細胞接着に必須の最小のドメインと同定される。これらの知見に基づき、この必須の機能的ドメインを含む組換え蛋白質も、本発明に係る創傷治癒に有効であると同定される。
【０００９】
創傷治癒の最近の研究は、細胞生物学と分子生物学に分かれており、創傷治癒の促進は、種々の臨床分野に拡大している応用法がある。しかし、創傷治癒の細胞生物学的および分子生物学的機構は、いまだ不明である。現在までに開示された知見によると、創傷治癒は外傷に対する組織の応答で、化学走性、細胞の分化と複製、マトリックス蛋白質の合成、血管新生、および創傷の再建を含む、複雑な生物学的過程を通して組織の修復が行われる（Steed, D. L.ら、Clin. Plast. Surg. 25、397、1998）。
【００１０】
成長因子は、創傷治癒過程の初期段階に出現し、その後の創傷治癒過程を制御する、代表的な物質である。創傷治癒の全ての段階に大きな影響を持つ成長因子は、細胞の増殖、分化、および代謝を制御し、炎症と組織修復、細胞増殖に関与する種々の種類の細胞を引きつける化学走性の特性によって創傷の環境を再編成するために作用し、血管新生および細胞外マトリックスの合成および分解を刺激する。PDGF（血小板由来成長因子）は線維芽細胞を創傷に引きつけ、増殖させるが、トランスフォーミング成長因子β（TGF-β）はそれらにコラーゲンを合成させる。PDGFは創傷治癒に関与する大部分の細胞に化学走性を引き起こし、血管新生、再構成、および収縮を刺激し、創傷治癒細胞を活性化する（Mustoe, T. A.ら、J. Clin. Invest. 87、694、1991; Lepisto, J.ら、J. Surg. Res. 53、596、1992）。EGF（上皮成長因子）はケラチノサイトの移動、血管新生、および顆粒化組織発生を刺激し、ケラチノサイトおよび線維芽細胞の有糸分裂誘発を活性化する（Franklin, J. D.ら、Plast. Reconst. Surg. 64、766、1979; Buckly, A.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、82、7340、1985）。bFGF（塩基性線維芽細胞成長因子）は血管新生、上皮化、およびコラーゲン線維の沈着を刺激し、種々の形のヘパリンと会合して関連する機能を果たす（Tsuboi, R.ら、J. Exp. Med. 172、245、1990; Kinsnorth, A. N.ら、Br. J. Surg. 77、409、1990）。IGF（インスリン様成長因子）は細胞の分化を促進する。VEGF（血管内皮成長因子）は血管の透過性を上昇し、内皮の分裂を促進する。
【００１１】
創傷治癒に関与する成長因子やサイトカインのうちで、TGF-βが最も代表的である。このサイトカインは哺乳類では3つの形態で存在し（TGF-β1、TGF-β2、およびTGF-β3）、様々な細胞の増殖と分化に重要な役割を果たし、細胞増殖の制御、免疫応答の調節、骨形成の刺激、軟骨特異的高分子の誘導、および創傷治癒の促進を含む種々の複雑な機能を持つ（Bennett, N. T.ら、Am. J. Surg. 165、728、1993）。TGF-βは創傷治癒時には上皮に出現し、再上皮化の際にケラチノサイト内でインテグリン発現を刺激すると考えられている。TGF-β発現の最近の研究では、TGF-β3 mRNAは正常な皮膚の上皮ならびに急性および慢性の創傷で発現され、TGF-β1 mRNAは正常な皮膚および慢性創傷で発現されないが、急性の創傷から再生した上皮層で発現され、TGF-β2 mRNAはどこでも発現されないことが分かった（Schmid, P.ら、J. Pathol. 171、191、1993）。この作用から、機構ははっきりと確立していないものの、TGF-βは再上皮化に重要な役割を果たしていると期待される。
【００１２】
βig-h3の発現はTGF-βによって上方制御されており、これはβig-h3がTGF-βの何らかのシグナル伝達の仲介に関与していることを示唆する。βig-h3発現プラスミドで形質転換されたCHO（チャイニーズハムスター卵巣）細胞は、腫瘍発生能力が低下していることが報告されている（Skonier, J.ら、DNA Cell Biol. 13、571、1994）。反対に、βig-h3はデキサメタゾン処理した幹細胞、一部の腫瘍細胞、およびメロレオストーシスの限局性骨化過剰の皮膚病変部から培養された線維芽細胞で下方制御されている。βig-h3は骨形成の負の調節因子として働くことも報告されている（Genini, M.ら、Int. J. Cancer 66、571、1996; Schenker, T.ら、Exp. Cell. Res. 239、161、1998; Kim. J.ら、J. Cell Biochem. 77、169、2000）。これらの機能に加え、細胞接着分子として知られるβig-h3は、皮膚において線維芽細胞の接着と伸長を促進する。目の組織におけるβig-h3の分布の研究によると、この接着分子は正常な成人の角膜上皮、角膜内胎児間質細胞、ならびに創傷治癒過程における内皮および間質細胞で発現されると報告されている。さらに、βig-h3は腎臓の傍糸球体装置および近位尿細管で発現されており、その発現は真性糖尿病で増加する。さらに、正常人の冠動脈の内皮下平滑筋にも見つかっており、その量は動脈硬化の血管内皮で増加している。しかし、正常な皮膚組織および皮膚創傷におけるβig-h3の発現ははっきりと確立していない（Klintworth, G. K.ら、Am. J. Pathol. 152、743、1998; Munier, F. L.ら、Nature Genetics 15、247、1997; Streeten B. W.ら、Arch. Ophthalmol. Vis. Sci. 38、893、1997）。上述のように、正常ヒト組織におけるβig-h3の分布と発現は、まだ明らかではない。特に、皮膚創傷におけるβig-h3の発現パターンに関する報告はない。しかし、一部の研究グループらは、βig-h3は皮膚の線維芽細胞の接着と伸長を促進するように機能すると報告しているので、創傷治癒の促進に貢献すると期待される。
【００１３】
発明の概要
このような背景を考慮に入れ、本発明に至るβig-h3の仲介する細胞接着に関する集中的で徹底的な研究の結果、コンピュータ検索による分析で、βig-h3のfas-1ドメインおよび他のペプチドのfas-1ドメインの間に、H1およびH2モチーフに加えて、高度に保存されたアミノ酸配列が存在し、特に、H2領域の付近の位置のアスパラギン酸およびイソロイシン残基に高度な相同性が検出されるという知見が得られた。さらに、各々保存されたアミノ酸残基を含むβig-h3の第2および第4ドメインは、α3β1インテグリンを介した細胞接着を誘導することが分かった。さらに、βig-h3の第2および/または第4 fas-1ドメインを持つようにデザインされた組換え蛋白質は、細胞接着および伸長活性、ならびに創傷治癒効果の点では、野生型のβig-h3と同一であると同定された。
【００１４】
したがって、細胞接着、伸長、および剥離活性に必須の保存されたアミノ酸配列を含むペプチドを提供することは、本発明の目的である。
【００１５】
細胞接着および創傷治癒における該ペプチドの使用法を提供することも、本発明のもう1つの目的である。
【００１６】
該ペプチドの発現系を提供することも、本発明の更なる目的である。
【００１７】
細胞を接着する方法を提供することも、本発明のまた更なる目的である。
【００１８】
創傷治癒の方法を提供することも、本発明のさらにもう1つの目的である。
【００１９】
本発明の1つの局面により、哺乳類細胞の接着に有用なβig-h3のドメインの一部を含む組換え蛋白質が提供される。
【００２０】
本発明の別の局面により、それぞれアミノ酸237〜377位および498〜637位に対応する、βig-h3の第2および第4 fas-1ドメインを発現する能力のある発現ベクター、pβig-h3 D-II、pβig-h3 D-IV、およびpβig-h3 D-IV 4Xが提供される。
【００２１】
本発明の更なる局面により、それぞれ発現ベクターpβig-h3 D-II、pβig-h3 D-IV、およびpβig-h3 D-IV 4Xで形質転換された大腸菌（E. coli）株が提供され、これらは大腸菌 BL21/Hisβ-g（受託番号KCTC 0905BP）、大腸菌 BL21/Hisβ-e（受託番号KCTC 0904BP）および大腸菌 BL21/Hisβ-e4x（受託番号KCTC 0906BP）として識別された。
【００２２】
本発明のまた更なる別の局面により、以下の段階を含む、細胞を接着する方法が提供される：発現ベクターを用いてβig-h3の第2および/または第4ドメインを1コピーまたは複数コピー含む組換え蛋白質を調製する段階；組換え蛋白質を固相支持体にコーティングする段階；および蛋白質でコーティングされた固相支持体に細胞を添加する段階。
【００２３】
本発明のさらに別の局面により、細胞接着における組換え蛋白質の使用が提供される。
【００２４】
本発明のさらに別の局面により、創傷治癒における組換え蛋白質の使用が提供される。
【００２５】
本発明のまたさらに別の局面により、以下の段階を含む、創傷治癒方法が提供される：βig-h3の第2および/または第4ドメインを1コピーまたは複数コピー含む組換え蛋白質で固相支持体をコーティングする段階；固相支持体に皮膚細胞を接着させる段階；および固相支持体を創傷に当てる段階。
【００２６】
発明の詳細な説明
本発明では、βig-h3の第2および第4 fas-1ドメインに基づいて組換え蛋白質が調製され、単独または組み合せて細胞接着および伸長のために使用される。第2および第4ドメインを選択するために、細胞接着および伸長で活性なβig-h3のドメインが同定された。そのために、いくつかのインテグリンでリガンド認識配列として知られるC末端配列Arg-Gly-Asp (RGD)について、βig-h3の細胞接着特性に対するその影響を調べた。細胞接着活性は、接着した細胞の数および表面積を用いて測定された。その結果、βig-h3はRGDモチーフとは無関係に、細胞接着および伸長を促進することが分かった。
【００２７】
この結果を元にして、化学試薬を用いて、βig-h3の細胞接着活性の特異性を調べ、βig-h3の細胞表面受容体の性質に関するさらなる手がかりを得た。化学試薬を用いて得られたデータは、βig-h3の細胞接着活性に関与しているβig-h3の細胞表面受容体が、RGD依存性インテグリンの1つで、βig-h3との相互作用には2価の陽イオンが必要である可能性を示唆する。
【００２８】
次に、βig-h3の細胞接着機能に必須の最小ドメインを同定するために、各fas-1ドメインが細胞接着を仲介する能力を調べた。
【００２９】
この実験は、fas-1ドメインが、βig-h3、ペリオスチン、ファシクリンI、HLC-2、および藻類CAMのような様々な細胞接着分子に見られ、そのような接着分子中に存在するfas-1ドメインの数が蛋白質によって異なるという事実に基づいていた。この事実から、βig-h3の細胞接着活性には4つのfas-1ドメインすべてが必要ではない可能性があり、極端な場合には1つのドメインのみがβig-h3の細胞接着活性を仲介する可能性があると推論された。本発明では、βig-h3の第2または第4 fas-1ドメインのいずれかで、βig-h3の細胞接着機能には十分であることが明らかである。これらの結果により、βig-h3の4つのドメインに共通のH1およびH2配列は、βig-h3の細胞接着活性の仲介には必須ではないという結論に至る。さらに、2つのアミノ酸、すなわち第2および第4 fas-1ドメイン内のH2領域付近の位置でアスパラギン酸およびイソロイシンが高度に保存されていることが見出され、これはこれらのアミノ酸残基が細胞接着関連モチーフを構成することを示した。細胞接着にこの2つの保存されたアミノ酸が必須であることは、βig-h3の第4 fas-1ドメインの置換変異体を用いて同定された。
【００３０】
本発明の別の態様では、βig-h3の第2および第4 fas-1ドメインが、個別にまたは組み合せて使用される創傷治癒法が提供される。
【００３１】
細胞接着活性ドメインのみを含む変異βig-h3蛋白質と、ドメインの一部を含む野生型βig-h3 (βig-h3-WT) の創傷治癒効果が比較された。このため、細胞接着活性ドメインを含む組換え蛋白質がラットに塗布された。
【００３２】
βig-h3の第4 fas-1ドメインを含む組換え蛋白質が軟膏の薬学的に有効な成分として使用されると、再上皮化および膠原線維の形成に加えて、創傷の収縮が観察された。最終的には、これらの結果は、保存されたアスパラギン酸およびイソロイシンの存在するβig-h3の第2または第4 fas-1ドメインの1つが、創傷治癒に有用で、このため創傷の治療薬の開発に用いることができることを意味する。
【００３３】
また、βig-h3の第2 fas-1ドメインまたは第2および第4ドメインを含む組換え蛋白質を用いると、優れた細胞接着および創傷治癒効果が得られた。
【００３４】
全てのドメインを含む蛋白質と比較して、ドメインの一部を含む組換え蛋白質は、水溶性の形態で合成されるので変性を受けないために、大量に生成できるという利点を有する。
【００３５】
実施例
以下の実施例を考慮すると本発明がより良く理解できるが、以下の実施例は本発明の説明のためであり、本発明を制限すると解釈されるべきものではない。
【００３６】
実施例１
RGD非依存性βig-h3蛋白質の細胞接着活性の同定
1-1  組換えβig-h3蛋白質の生成
実際に細胞接着および伸長活性を持つβig-h3のドメインを見つけるために、リガンド認識配列として知られるC末端配列Arg-Gly-Asp (RGD)をβig-h3の細胞接着特性に対する影響について調べた。そのため、RGDの削除された組換えβig-h3蛋白質（βigh3-ΔRGD）および野生型組換えβig-h3蛋白質（βigh3-WT）が調製された。
【００３７】
まず、pBluescriptにクローニングされた全長ヒトβig-h3 cDNA (pBsβig-h3)がNdeIおよびBglIIで消化された。このDNA断片は、pET-29b(+) (Novagen Inc.)のEcoRV-EcoRI部位にサブクローニングされた。βigh3-WTはβig-h3 cDNAから切り出された1351 bpのNcoI断片をこのクローンのNcoI部位に導入して調製された。βigh3ΔRGDは、図1に示すように、βigh3-WTプラスミドの3’ 断片をAoCIおよびNotIで切り出して、平滑末端化および自己連結させることによって、βigh3-WTから誘導された。
【００３８】
各組換えプラスミドで形質転換した大腸菌 BL 21 DE3は、595 nmにおける光学濃度(OD)が0.5〜0.6に達するまで、50μg/mlカナマイシンを含むLB培地中で37℃で培養された。組換えβig-h3蛋白質は、1 mMイソプロピル-β-D-(-)-チオガラクトピラノシド (IPTG)を用いて37℃で3時間誘導された。沈殿を溶解緩衝液（50 mMトリス塩酸(pH 8.0)、100 mM NaCl、1mM EDTA、1% トライトンX-100、1 mM PMSF、0.5 mM DTT）に再懸濁して、その後超音波処理した。封入体を20 mMを含む8M尿素の変性緩衝液で溶解し、変性した蛋白質をNi-NTA樹脂（Qiagen）を用いて精製した。組換え蛋白質は200 mMイミダゾール溶液で溶出し、その後50 mM NaClを含む20 mMトリス塩酸緩衝液中で尿素を高濃度から低濃度に順次下げて透析した。これらの組換え蛋白質は、図2に示すようにSDS-PAGEを用いて解析した。
【００３９】
1-2 組換えβig-h3 fas-1ドメイン蛋白質の細胞接着活性についてのアッセイ法  このアッセイ法に使用したヒト角膜上皮 (HCE) 細胞は、15% 牛胎児血清、ゲンタマイシン(40μg/ml)、インスリン（5μg/ml）、コレラ毒素（0.1μg/ml）およびヒト上皮成長因子（hEGF）を補充したDMEM (EMEM/F-12、Gibco BRL)で、5% CO2中で37℃で培養された。
【００４０】
細胞接着アッセイ法は以下のように実行された。まず、組換えβig-h3蛋白質または他の細胞外マトリックス蛋白質を、37℃で1時間インキュベートして96穴マイクロ培養プレート（Falcon）の底に接着させ、0.2% BSAを含むPBSでブロッキングした。コーティングされた細胞外マトリックス蛋白質は、ヒト血漿ビトロネクチン（Promega）、精製ヒト血漿フィブロネクチン（pFN）、ニワトリI型およびII型コラーゲン（Chemicon International Inc.）、ウシIVおよびVI型コラーゲン（Chemicon）、マウスラミニン（Chemicon）、およびウシ血清アルブミン(BSA)(Sigma)だった。細胞をトリプシン処理し、2 x 105細胞/mlの濃度で培地中に再懸濁した。細胞懸濁液0.1 mlを組換え蛋白質でコーティングされたプレートの各ウェルに添加した。
【００４１】
37℃で1時間インキュベーション後、接着しなかった細胞をPBSで洗い流した。接着した細胞をヘキソサミニダーゼの基質として3.75 mM p-ニトロフェノール-N-アセチル 1-β-D-グリコサミニドおよび0.25% トライトンX-100を含む50 mMクエン酸緩衝液pH 5.0中で37℃で1時間インキュベートし、その後5 mM EDTAを含む50 mMグリシン緩衝液pH 10.4を添加して酵素活性を阻害した。マルチスキャン MCC/340マイクロプレートリーダー（Multiskan MCC/340 microplate reader）によって405 nmの吸光度を測定した。
【００４２】
細胞接着活性の指標として細胞面積を決定するため、4 x 104細胞を48穴プレート中の基質に添加した。接着した細胞を8%グルタルアルデヒド（Sigma）で固定し、20%メタノール中の0.25%クリスタルバイオレット（Sigma）で染色した。細胞面積の測定は、イメージプロプラスソフトウェア（Image-Pro plus software)（Media Cybernetics）によって行なった。各実験では1部位につき200または300の測定を3回繰り返して行なった。データは特定の時点における平均面積±平均の標準誤差として報告する。
【００４３】
図3に示すように、βigh3-WTおよびβigh3-ΔRGDを用いた細胞接着および伸長活性の測定の結果では、βigh3-WTに接着したHCE細胞の数および表面積の方が、陰性対照であるアルブミンに接着したものより明らかに大きく、フィブロネクチンに接着した細胞と同程度だった。図4Aおよび4Bに示すように、βig-h3の細胞接着および伸長活性は、濃度依存的であった。RGDモチーフを欠失しているβig-h3ΔRGDは、細胞の接着および伸長を支持する点で同等に有効だった（図5Aおよび5B）。これらの結果を合わせると、βig-h3がRGDモチーフには依存せずに細胞接着および伸長を支持することが確認される。
【００４４】
実験例1：βig-h3の細胞接着活性に関与するβig-h3の細胞表面受容体の同定
1-1：マトリックスペプチドおよび試薬を用いた細胞接着活性の同定
βig-h3蛋白質の細胞接着活性に関与する細胞表面受容体を同定するために、種々の試薬を用いた阻害アッセイ法が行われた。
【００４５】
まず、プラスチックの培養皿に10μg/mlフィブロネクチン、βigh3-WT、またはβigh3-ΔRGDがコーティングされた。HCE細胞を5 mM EDTA、100μg/ml βigh3-WT、100μg/ml βigh3-ΔRGD、1 mM RGD、1 mM RGEまたは100μg/mlフィブロネクチンを含むまたはそれらをいずれも含まない培地中で30分間あらかじめインキュベートし、実施例1のように細胞接着についてアッセイした。
【００４６】
βig-h3の細胞接着は、βig-h3自体、RGDペプチドおよびEDTAで著しく阻害され、フィブロネクチンおよびEGTAで部分的に阻害されたが、RGEペプチドでは阻害されなかった。図6Aに示すように、フィブロネクチンに対する細胞接着も、フィブロネクチン自体、RGDペプチドおよびEDTAで著しく阻害され、βig-h3およびEGTAで部分的に阻害されたが、RGEペプチドでは阻害されなかった。これらの結果は、βig-h3の細胞接着活性に関与しているβig-h3の細胞表面受容体が、RGD依存性インテグリンの1つである可能性を示す。
【００４７】
1-2：細胞接着活性に対する２価陽イオンの効果
βig-h3の仲介する接着の２価陽イオンに対する感受性を分析するために、細胞を2 x 105細胞/mlの濃度でHEPES緩衝生理食塩水(HBS)(150 mM NaCl、25 mM HEPES、2 mM EDTA、pH 7.4)に懸濁し、37℃で30分間インキュベートした。その後、HBSで２度洗い、同じ緩衝液に再懸濁した。その後、細胞の一部（50μl）をマイクロプレートウェルに添加し、最終濃度の2倍の濃度の２価陽イオン（MnCl2、MgCl2またはCaCl2）を含むHBSアリコート 50μlと、加湿した5％CO2大気中で、37℃で30分間インキュベートした。続いて、これをリガンドでコーティングした皿に播き、接着アッセイ法を行なった。
【００４８】
図6Bに示すように、βig-h3への細胞接着は、Mn2+で強く促進され、程度は落ちるがMg2+で促進されるが、Ca2+ではわずかに促進されるのみだった。これらを合わせると、この結果はβig-h3の細胞表面受容体が、βig-h3との相互作用に２価陽イオンを必要とするRGD依存性インテグリンの一種であることを示す。
【００４９】
1-3：インテグリンに対するモノクローナル抗体を用いたβig-h3の細胞表面受容体の同定
βig-h3の受容体を同定するために、インテグリンのサブユニットの機能を阻害するモノクローナル抗体の、βig-h3でコーティングされた表面へのHCE細胞の接着に対する効果を検討した。このため、まず、HCE (3 x 105細胞/ml)を、種々のインテグリンに対するモノクローナル抗体（5μg/ml）の各々の存在下で、インキュベーション溶液中で、37℃で30分間あらかじめインキュベートした。あらかじめインキュベートされた細胞を、βig-h3蛋白質であらかじめコーティングされたプレートに移し、さらに37℃で1時間インキュベートし、ヘキソサミニダーゼ基質に結合するβig-h3の定量分析を行なった。値は、モノクローナル抗体の非存在下でβig-h3に接着する細胞数に対する割合で示される。
【００５０】
βig-h3でコーティングされた表面への接着は、α3サブユニットに対する抗体によって、特異的に阻害された。インテグリンα3サブユニットは、インテグリンβ1サブユニットとカップルすることが知られているので、図6Cに示すように、抗β1抗体はβig-h3に対する細胞接着を著しく阻害した。HT1080細胞を用いても、同様な結果が観察された。
【００５１】
機能阻害抗体の対照実験として、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、およびI型コラーゲンが基質として用いられた。HCE細胞はインテグリンサブユニットに対する機能阻害モノクローナル抗体とあらかじめインキュベートし、10μg/mlフィブロネクチン、ビトロネクチン、I型コラーゲン、またはラミニンでコーティングされたウェルに移した。インキュベーション後、接着した細胞数が分析された。
【００５２】
フィブロネクチンに対する細胞接着は、インテグリンα3およびα5に対する抗体で、明らかに阻害された。図6Dに示すように、ビトロネクチンおよびI型コラーゲンヘの接着は、それぞれインテグリンαvおよびα2に対する抗体で阻害されたが、ラミニンに対する細胞接着は、インテグリンα3およびα6に対する抗体で阻害された。一方で、β1インテグリンに対する抗体は、上述の全てのリガンドに対する細胞接着を効果的に阻害した。
【００５３】
別の対照実験として、α5インテグリンは発現するがα3インテグリンは発現しないことが既知のK562細胞が使用された。K562細胞を、βigh3-WT、フィブロネクチン、ラミニン、またはI型コラーゲンでコーティングされたプレートに播き、1時間インキュベートした後、ヘキソサミニダーゼ分析を行なった。K562細胞はβig-h3には接着しなかったが、フィブロネクチンとビトロネクチンには接着した。これらの結果を合わせると、図6Eに示すように、インテグリンα3β1はHCE細胞においてβig-h3の特異的な受容体であることが示唆される。
【００５４】
実施例2：βig-h3の細胞接着活性に必須のドメインの同定
βig-h3の細胞接着活性を付与する必須のアミノ酸を同定するために、各繰り返しドメインが細胞接着を仲介する能力があるか決定するために調べた。
【００５５】
4つの繰り返しドメインにそれぞれ対応する4つの組換え蛋白質が調製された：図7のように、アミノ酸129〜241位、237〜377位、368〜506位、および498〜637位をそれぞれコードしている4つのβig-h3 cDNA断片をPCRで増幅し、pET-29b (+)のEcoRV-XhoI部位にクローニングし、得られた4つの発現ベクターpβig-h3 D-I、pβig-h3 D-II、pβig-h3 D-III、およびpβig-h3 D-IVを用いて、組換え蛋白質が調製された。発現ベクターpβig-h3 D-IIおよびpβig-h3 D-IVによる大腸菌形質転換体は、大腸菌BL21/Hisβ-gおよび大腸菌BL21/Hisβ-eと命名され、それぞれ受託番号KCTC 0905BPおよびKCTC 0904BPとして、韓国バイオサイエンス・バイオテクロノジー研究所（Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology） (KRIBB)のコリアンコレクションフォータイプカルチャー（Korean Collection for Type Culture）に2000年12月4日に寄託された。
【００５６】
組換え蛋白質βig-h3 D-I、βig-h3 D-II、βig-h3 D-III、およびβig-h3 D-IVの発現および精製は、実施例1-1に記述される手順に従い、図8に示すようにSDS-PAGEで同定された。
【００５７】
図9に示すように、細胞接着の仲介に関して、第2および第4 fas-1ドメインは野生型βig-h3と比較して同様に活性であるが、第1のfas-1ドメインは弱く、第3のfas-1ドメインは全く活性を持たなかった。
【００５８】
インテグリンサブユニットに対する機能阻害抗体を用いた実験では、図10に示すように、第2および第4 fas-1ドメインに仲介される細胞接着のいずれも、α3およびβ1インテグリンに対する抗体でほぼ完全に阻害され、これは第2および第4 fas-1ドメインの両方が、α3β1インテグリンとの相互作用に必須のアミノ酸を持つことを示唆する。第1および第3ドメインはH1またはH2配列を持つが、細胞接着活性は持たないので、これらの結果はまた、H1配列もH2配列もβig-h3の細胞接着活性を仲介しないという結論を支持する。
【００５９】
実施例3：βig-h3の細胞接着に必須の保存されたアミノ酸配列の同定
3-1：アミノ酸配列のアライメントによる、保存されたモチーフの同定
独立して細胞接着を示すβig-h3の第2および第4 fas-1ドメインにおける細胞接着を担うアミノ酸配列を見つけるために、βig-h3の繰り返しfas-1ドメイン間のみならず、他の蛋白質のfas-1ドメイン間の相同性に基づくコンピュータ検索が行われた。その結果、図11に示すように、H2領域の近くの2つのアミノ酸、アスパラギン酸およびイソロイシンが、種々の蛋白質間で高度に保存されていることが分かった。さらに、アスパラギン酸およびイソロイシンは、いずれも高度な細胞接着活性を持つβig-h3の第2および第4 fas-1ドメイン中で保存されているが、中程度の細胞接着活性を示す第1 fas-1ドメインではアスパラギン酸しか保存されていないことが分かった。細胞接着活性を示さない第3 fas-1ドメインは、2つのアミノ酸のいずれも持たない。この事実は、さらにH2領域近くのアスパラギン酸およびイソロイシン残基が、細胞接着および伸長活性の仲介には不可欠であるという根拠となる。
【００６０】
3-2：置換変異体を用いた保存されたアミノ酸配列の細胞接着活性の同定
2つのアミノ酸が細胞接着に必須であることをさらに確認するために、βig-h3の第4 fas-1 ドメインを含む組換え蛋白質に、図12に示すように置換によって変異を導入した。βig-h3 D-IVの置換変異体をPCRによって調製し、塩基配列決定で配列を確認した。変異蛋白質は、実施例1-1と同様に単離および精製し、図13に示すようにSDS-PAGEで確認した。
【００６１】
βigh3 D-IVのPro616、Asp617およびIle618が組み合せでそれぞれSer、AlaおよびSerで置換されている変異蛋白質の細胞接着活性が調べられた。Asp617の代わりにAlaを持つD617A (βigh3 D-IV-PaI)と命名された変異蛋白質、およびIle618の代わりにSerを持つI618S (βigh3 D-IV-PDs)と命名された変異蛋白質は、細胞接着を著しく阻害したが、Pro616の代わりにSerを持つP616S (βigh3 D-IV-sDI)と命名された変異蛋白質は、細胞接着活性に影響がないことがわかった。3つのアミノ酸が変異しているP616S/D617A/I618S (βigh3 DIV-sas)と命名された変異蛋白質も、図14に示すように、細胞接着を阻害した。
【００６２】
Asp617およびIle618に変異のある第1 fas-1ドメインにおいて、第1 fas-1ドメインを介した細胞接着活性がほぼ完全に失われたことは、617番目の位置のアスパラギン酸および618番目の位置のイソロイシンが、βigh3の細胞接着活性の仲介に非常に重要なことを証明した。
【００６３】
実施例4：創傷治癒をもたらすβigh3ドメインの同定
4-1：組換えβigh3蛋白質の発現および精製
細胞接着において活性のあるβig-h3ドメインのみで、4つ全てのfas-1ドメインを含む天然型βig-h3のような創傷治癒機能を示すかどうかを調べるため、図15に示すような種々の組換えβigh3蛋白質が調製された：4つのfas-1ドメインを全て含むHis-β-b；第4ドメインのみを含むβigh3-D-IV；および各々少なくとも1つの第4ドメインを含むβigh3-D-IV、βigh3-D-IV 2X、βigh3-D-IV 3Xおよびβigh3-D-IV 4X。実施例1で調製されたβigh3-WTと同じ細胞接着活性を示す組換えβig-h3蛋白質His-β-bは、組換え発現ベクターpET-29βから、そのEcoRV-EcoRI部位にβig-h3 cDNAからあるアミノ末端領域を削除して得られたAsp718-BglII断片を結合して、調製された。組換え蛋白質His-β-bおよびβigh3-D-IVは、実施例1-1および実施例3と同様にして発現および精製された。
【００６４】
βigh3-D-IV、βigh3-D-IV 2X、βigh3-D-IV 3Xおよびβigh3-D-IV 4Xのように少なくとも1つの第4ドメインを含む組換え蛋白質は、以下のように調製された。第4ドメインに対応するアミノ酸498〜637位をコードするDNA断片をPCRで調製し、このPCR産物をクレノウ酵素によって平滑末端にした。この平滑末端cDNA断片をβig-h3の第4ドメインを含むpβig-h3 D-IVのEcoRV部位に挿入し、得られた発現ベクターをpβig-h3 D-IV 2Xと命名した。pβig-h3 D-IV 2Xの挿入断片はEcoRVおよびXhoIによる消化によって切り出し、クレノウ処理で平滑末端にし、この平滑末端断片をpβig-h3 D-IVおよびpβig-h3 D-IV 2XのEcoRV部位に挿入した。得られた発現ベクターはpβig-h3 D-IV 3Xおよびpβig-h3 D-IV 4Xと命名された。全ての組換え蛋白質の発現は、1 mM IPTGの存在下で3時間誘導され、Ni-NTA樹脂（Qiagen）を用いて単離された。単離された組換え蛋白質は、50 mM NaClおよび300 mMイミダゾールを含む20 mMトリス塩酸によって溶出して精製した。図16Aに示すように、βig-h3 D-IV 2X、βigh3-D-IV 3Xおよびβigh3-D-IV 4Xは、4つの全てのドメインを含むβig-h3組換え蛋白質とは異なり、可溶性の形態で合成され、変性を受けないので、大量に生成可能である。図16Bに示すように、非変性ゲルを用いた電気泳動では、βig-h3 D-IVはポリマーを形成しないが、2Xは部分的にポリマーを形成し、3Xおよび4Ｘはそれぞれ簡単にポリマーを形成することが分かった。
【００６５】
βig-h3の第4ドメインを4つ含む発現ベクターpβig-h3 D-IV 4Xを持つ大腸菌BL21/His β-e4Xは、受託番号KCTC 0906BPとして、韓国バイオサイエンス・バイオテクロノジー研究所（Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology) (KRIBB)のコリアンコレクションフォータイプカルチャー（Korean Collection for Type Culture）に2000年12月4日に寄託された。
【００６６】
陽性対照のフィブロネクチンは、ラットクエン酸血漿から、ゼラチン-セファロース4Bを用いたアフィニティクロマトグラフィーによって精製した。血漿は非置換セファロース4Bから室温で濾過され、溶出液は0.05 M EACA（εアミノカプロン酸）、0.02 Mクエン酸ナトリウム、および0.02%アジ化ナトリウムを含む0.05 Mトリス塩酸で平衡化したゼラチンセファロース4Bに添加した。溶出後、大部分の血漿蛋白質は、1 M塩化ナトリウムを含む緩衝液で洗い出された。その後、吸収されたフィブロネクチンは3 M尿酸等張緩衝液で溶出し、その後、これをPBS、pH 7.2に対して約48時間透析してフィブロネクチンを精製した。濃度は280 nmのUV吸光度で決定し、凍結乾燥してから-20℃で保存した。
【００６７】
4-2：第4ドメインを含むβig-h3 D-IVの創傷治癒活性の測定
天然型βig-h3蛋白質のように4つのfas-1ドメイン全てを含む組換えβig-h3蛋白質His-β-bと、第4ドメインのみを含む組換えβig-h3蛋白質βigh3-D-IVの創傷治癒活性を比較するために、組換え蛋白質を含む軟膏基剤が以下のように試験された。
【００６８】
各々直径が2 cmの4つの真皮層全体の創傷を、ラットの背中に作製し、塗布される軟膏によって試験群1-A、1-B、1-Cおよび1-Dに分割した。
【００６９】
1-A：物質と混合しない軟膏基剤を1日1 gmの用量でコーティングした。
【００７０】
1-B：フィブロネクチンが100μg/mlの濃度で基剤と混合された軟膏を1日1 gmの用量でコーティングした。
【００７１】
1-C：Hisβ-b蛋白質が100μg/mlの濃度で基剤と混合された軟膏を1日1 gmの用量でコーティングした。
【００７２】
1-D：βigh3-D-IV蛋白質が100μg/mlの濃度で基剤と混合された軟膏を1日1 gmの用量でコーティングした。
【００７３】
エーテル麻酔したラットの背中を刈り込み、ベタジン溶液で刈り込んだ領域を滅菌した。試験群1では、各ラットの背中をNo.15の外科用ナイフを用いて切り、真皮層全体を貫通する直径2 cmの4つの円形の創傷を作製した。試験群1-A、1-B、1-Cおよび1-D用の軟膏を創傷に約1 gの量で塗布し、これを合成ドレッシング（テガダーム(Tegaderm）3M（登録商標)）で覆い、軽く包帯を当てた。軟膏の塗布は、毎日行なった。
【００７４】
各軟膏には、水性物質（SamA基剤）と共に、1 gあたり、鯨蝋38 mg、ステアリルアルコール116 mg、ポリエチルグリコール38 mg、濃縮グリセリン192 mg、エタノール23 mg、ラウリル硫酸ナトリウム mg（？？）、エチルパラオキシベンゾエート0.87 mg、ブチルパラオキシベンゾエート0.12 mg、および精製水が含まれていた。
【００７５】
まず、創傷の形態が観察された。各創傷の近くに同一のものさしを置き、各創傷から同一の距離で写真を撮影した。写真はコンピュータでスキャンし、NIHイメージ解析システム（Bio-Optics）を用いて創傷の面積の測定に用いた。写真をとるために、ラットをエーテル麻酔し、筋肉を完全に弛緩させた。測定は22日目まで、1日おきに1回行なった。試験群間の比較のために、ANOVA検定およびシェファー（Scheffer）検定にしたがって、測定値を解析した。
【００７６】
全ての試験群において、創傷面積は創傷の形成直後から次第に低下した。フィブロネクチンおよび組換えβig-h3蛋白質が塗布された試験群では、軟膏基剤のみが塗布された試験群よりも創傷面積が早く低下した。軟膏塗布の7日目以降に、創傷面積に有意差が見られた。統計的には、I-A群間および他の群間に、有意差（p<0.05）が見られたが、それらの群の間では、有意差は見られなかった。結果を以下の表1および図17に示す。
【００７７】
【表１】
組換えβig-h3蛋白質と混合した軟膏基剤の創傷に対する治癒効果
0003795805.tif 000002
値：平均±標準偏差
*：ANOVAおよびシェファー検定でp<0.05
a, b：垂直的に統計的有意差のあるデータ
【００７８】
組織学的分析は、光学顕微鏡下で行なった。創傷部位の生検は、3日目、7日目、10日目、14日目および20日目に採取し、10%ホルマリンで固定し、パラフィンで固めた。サンプルの6μmの切片をヘマトキシリン-エオシン（H&E）およびマッソン３色染色法で染色してから顕微鏡で観察した。各試験物質の時間による創傷治癒効果は、再上皮化および膠原線維の形成で評価した。再上皮化については、上皮層がない場合をゼロ、上皮化の開始を1+、不完全な上皮層構造を2+、完全な上皮層構造を3+として、上皮の形成を半定量化した。試験群間の比較および各郡内での時間による差については、ANOVA検定およびシェファー検定を用いて、測定値を統計的に解析した。膠原線維の形成については、3色染色で膠原線維の形成があまり観察されない場合に1+、膠原線維がまばらに形成されている場合に2+、密な膠原線維が観察されれば3+と等級付けした。
【００７９】
光学顕微鏡観察では、再上皮化は試験群1-B、1-C、および1-Dでは7〜10日目に開始し、20日に完了した。これに対して対照群1-Aでは、再上皮化は14日でもまだ開始しておらず、20日には完了していない。結果を以下の表2および図18に示す。
【００８０】
【表２】
創傷の再上皮化
0003795805.tif 000003
【００８１】
膠原線維形成の結果を以下の表3に示す。表3に見られるように、試験群1-Aおよび1-Dでは、7日目まで等級+1が継続し、膠原線維はあまり形成されていないが、試験群1-Bおよび1-Cでは2+となっている。しかし、10日目には全ての試験群で2+となり、比較的豊富な膠原線維が見られた。図19に示すように、14日目には、膠原線維が密に形成され、きちんと配列されていた。当然、膠原線維がより密であれば、創傷治癒過程が改善していることを意味する。
【００８２】
【表３】
創傷における膠原線維の形成挙動
0003795805.tif 000004
膠原線維の形成段階
0：なし
1+：あまりない
2+：まばらに形成
3+：非常に密
【００８３】
4-3：少なくとも1つの第4ドメインを含む組換え蛋白質βigh3-D-IV、βig-h3 D-IV 2X、βigh3-D-IV 3Xおよびβigh3-D-IV 4Xの創傷治癒効果
第4ドメインのみを含むβigh3-D-IVが創傷治癒に有効であるという知見に基づいて、創傷治癒活性をアッセイするために、第4ドメインをそれぞれ2重、3重および4重に含むβigh3-D-IV 2X、βigh3-D-IV 3Xおよびβigh3-D-IV 4Xが調製された。
【００８４】
実施例1-2と同様にして、組換え蛋白質のHCE細胞接着活性をアッセイした。結果は図20に示されている。組換え蛋白質βig-h3-D-IV、βig-h3 D-IV 2X、βigh3-D-IV 3Xおよびβigh3-D-IV 4Xは、すべてHCE細胞の接着の誘導に有効であることがわかった。
【００８５】
組換え蛋白質の創傷治癒効果を調べるために、以下の実験を行なった。
【００８６】
体重250〜300 gmのSD（Spraque-Dawley）系統のラットを、一定の温度および湿度で、標準的飼料を用いて飼育した。
【００８７】
試験群2では、各ラットの背中に、真皮層全体を通る4つの円形創傷が形成され、関心のある材料と混合したキトサン基剤でコーティングされた。
2-A：キトサン基剤のみでコーティングした創傷
2-B：500μg/mlのフィブロネクチンと混合したキトサン基剤でコーティングされた創傷
2-E：500μg/mlのβig-h3 D-IV 3X蛋白質と混合したキトサン基剤でコーティングされた創傷
2-F：500μg/mlのβig-h3 D-IV 4X蛋白質と混合したキトサン基剤でコーティングされた創傷
【００８８】
キトサン基剤の複合物は、以下のように調製された。分子量600,000 Daの可溶性キトサン（ポリ(1-4) 2-アミノ-2-デオキシ-β-D-グルカン）1 gを無菌蒸留水100 mlに溶解し、得られた1%溶液を2 mlずつ12穴のプレート（Corning、米国）に分注し、その後、1ウェルあたり100μgのゲンタマイシンを添加した。フィブロネクチン、βigh3 D-IV 3Xおよびβigh3 D-IV 4Xは、濃度が500μg/mlになるように個々に添加し、-70℃で凍結し、凍結乾燥機（Ilshin）で12時間凍結乾燥して円盤型の複合物を得た。
【００８９】
エーテル麻酔したラットの背中を刈り込み、刈り込んだ部分をベタジン溶液で滅菌した。真皮層全体を貫通する直径7 mmの4つの円形の創傷を各ラットの背中に形成した。創傷を試験群2-A、2-B、2-Eおよび2-Fに使用した複合物でそれぞれ覆い、テガダーム（登録商標） (3M)で覆って、軽く包帯を当てた。複合物は、3日ごとに新しいものに交換した。
【００９０】
実施例4-2のように、創傷治癒効果は創傷の外見によって評価した。
【００９１】
組換え蛋白質βig-h3 D-IV 3Xまたはβig-h3 D-IV 4Xを含む複合物から、高い創傷治癒効果が得られた。
【００９２】
試験群2-Aの全てのラット、試験群2-Bの1匹、および試験群2-Eおよび2-F各々における2匹ずつを除いて、全てのラットは12日から15日目で創傷から完全に回復した。全ての創傷は、創傷の形成直後にサイズが縮小した。試験群2-Aでは、創傷面積は治癒期間全体にわたって、比較的ゆっくりと低下することが観察された。他の試験群では、創傷面積は最初の3日間に大きく低下し、9日目まで次第に低下し、その後、再び大きく低下した。創傷間の比較に注目すると、表4および図21に示されるように、試験群2-Aよりも、試験群2-B、2-E、および2-Fにおいて、15日間の全期間に大きな有意差（p<0.05）が見られた。
【００９３】
【表４】
創傷面積の低下（mm2）
0003795805.tif 000005
値：平均±標準偏差
+：ANOVA検定でp<0.05
a, b：統計的有意差のあるデータ
【００９４】
したがって、βig-h3の第2および第4ドメインを含む本発明の組換え蛋白質は、単独または組み合せ、または複数で、細胞接着および創傷治癒に有効であり、究極的に細胞培養および創傷治癒剤の開発に用いることができる。
【００９５】
産業への応用可能性
本発明では、インテグリンとの会合に必須であることが既知の1つのアスパラギン酸残基および1つのイソロイシン残基が高度に保存されている、βig-h3の第2および第4ドメインを少なくとも1つ含む組換え蛋白質が提供される。また、組換え蛋白質自体は、細胞接着および創傷治癒に有用であり、細胞培養法および創傷治癒剤の開発に貢献できる。
【００９６】
本発明は例証を挙げて説明されており、使用された用語は限定ではなくむしろ説明のためのものであると意図され、理解されるべきである。上記の開示を考慮すると、本発明の多くの修正または変法が可能である。したがって、添付の特許請求の範囲内で、本発明は具体的に記述された以外の方法で実施され得ることを理解されるべきである。
0003795805.tif 000006
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【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110>    REGEN BIOTECH INC.
<120>    METHOD FOR CELL ADHENSION AND WOUND HEALING
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<213>    Artificial Sequence
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Thr Val Asn Cys Ala Arg Leu Leu Lys Ala Asp His His Ala Thr Asn
1               5                  10                  15
Gly Val Val His Leu Ile Asp Lys Val Ile
20                  25
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<212>    PRT
<213>    Artificial Sequence
<220>
<223>    BIGH3_PIG
<400>    2
Thr Val Asn Cys Ala Arg Leu Leu Lys Ala Asp His His Ala Thr Asn
1               5                  10                  15
Gly Val Val His Leu Ile Asp Lys Val Ile
20                  25
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<211>    26
<212>    PRT
<213>    Artificial Sequence
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<223>    BIGH3_CHICK
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Thr Val Asn Cys Ala Arg Leu Leu Lys Ala Asp His His Ala Thr Asn
1               5                  10                  15
Gly Val Val His Val Ile Asp Lys Val Ile
20                  25
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<211>    27
<212>    PRT
<213>    Artificial Sequence
<220>
<223>    BIGH3_HUMAN
<400>    4
Ile Asn Gly Lys Ala Ile Ile Ser Asn Lys Asp Ile Leu Ala Thr Asn
1               5                  10                  15
Gly Val Ile His Tyr Ile Asp Glu Leu Leu Ile
20                  25
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<212>    PRT
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<223>    BIGH3_PIG
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Ile Asn Gly Lys Pro Ile Ile Ser Asn Lys Asp Val Leu Ala Thr Asn
1               5                  10                  15
Gly Val Ile His Phe Ile Asp Glu Leu Leu Ile
20                  25
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<212>    PRT
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<223>    BIGH3_CHICK
<400>    6
Leu Asn Gly Arg Ala Ile Ile Ala Asn Lys Asp Ile Leu Ala Thr Asn
1               5                  10                  15
Gly Val Val His Phe Val Asn Glu Leu Leu Ile
20                  25
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<212>    PRT
<213>    Artificial Sequence
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<223>    OSF2_HUMAN
<400>    7
Val Asn Gly Ile Lys Met Val Asn Lys Lys Asp Ile Val Thr Asn Asn
1               5                  10                  15
Gly Val Ile His Leu Ile Asp Gln Val Leu Ile
20                  25
<210>    8
<211>    27
<212>    PRT
<213>    Artificial Sequence
<220>
<223>    OSF2_MOUSE
<400>    8
Ile Asn Gly Ile Lys Met Val Asn Lys Lys Asp Ile Val Thr Lys Asn
1               5                  10                  15
Gly Val Ile His Leu Ile Asp Glu Val Leu Ile
20                  25
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<211>    25
<212>    PRT
<213>    Artificial Sequence
<220>
<223>    BIGH3_HUMAN
<400>    9
Val Asn Lys Glu Pro Val Ala Glu Pro Asp Ile Met Ala Thr Asn Gly
1               5                  10                  15
Val Val His Val Ile Thr Asn Val Leu
20                  25
<210>    10
<211>    25
<212>    PRT
<213>    Artificial Sequence
<220>
<223>    BIGH3_PIG
<400>    10
Val Asn Lys Glu Pro Val Ala Glu Ala Asp Ile Met Ala Thr Asn Gly
1               5                  10                  15
Val Val His Thr Ile Asn Thr Val Leu
20                  25
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<211>    25
<212>    PRT
<213>    Artificial Sequence
<220>
<223>    BIGH3_CHICK
<400>    11
Val Asn Lys Glu Pro Val Ala Glu Ser Asp Ile Met Ala Thr Asn Gly
1               5                  10                  15
Val Ile His Ala Val Ser Ser Val Leu
20                  25
<210>    12
<211>    28
<212>    PRT
<213>    Artificial Sequence
<220>
<223>    SLL1735 homolog
<400>    12
Val Lys Asn Ala Thr Val Leu Ala Ala Asp Ile Glu Ala Asp Asn Gly
1               5                  10                  15
Ile Ile His Val Ile Asp Asn Val Ile Leu Met Gly
20                  25
<210>    13
<211>    28
<212>    PRT
<213>    Artificial Sequence
<220>
<223>    SLL1735
<400>    13
Val Lys Asn Ala Thr Val Ile Ile Pro Asp Ile Glu Ala Asp Asn Gly
1               5                  10                  15
Ile Ile His Val Ile Asp Asn Val Ile Leu Met Gly
20                  25
<210>    14
<211>    26
<212>    PRT
<213>    Artificial Sequence
<220>
<223>    SLL1483
<400>    14
Val Asn Lys Ala Thr Val Ile Ser Ala Asp Val Asp Ala Ser Asn Gly
1               5                  10                  15
Val Ile His Val Ile Asp Gln Val Ile Leu
20                  25
<210>    15
<211>    25
<212>    PRT
<213>    Artificial Sequence
<220>
<223>    OSF2_HUMAN
<400>    15
Val Asn Glu Leu Lys Ser Lys Glu Ser Asp Ile Met Thr Thr Asn Gly
1               5                  10                  15
Val Ile His Val Val Asp Lys Leu Leu
20                  25
<210>    16
<211>    25
<212>    PRT
<213>    Artificial Sequence
<220>
<223>    OSF2_MOUSE
<400>    16
Val Asn Glu Leu Lys Ser Lys Glu Ser Asp Ile Met Thr Thr Asn Gly
1               5                  10                  15
Val Ile His Val Val Asp Lys Leu Leu
20                  25
<210>    17
<211>    26
<212>    PRT
<213>    Artificial Sequence
<220>
<223>    Midline Fasciclin
<400>    17
Ile Asn Asn Leu Ala Lys Ile Ile Asp Ala Asp Ile Met Gly Thr Asn
1               5                  10                  15
Gly Val Leu His Val Ile Asp Thr Leu Leu
20                  25
<210>    18
<211>    26
<212>    PRT
<213>    Artificial Sequence
<220>
<223>    HLC-32
<400>    18
Ser Lys Ala Ser Arg Val Ile Leu Arg Asp Ile Pro Thr Thr Asn Gly
1               5                  10                  15
Val Ile Gln Val Ile Asp Arg Val Ile Leu
20                  25
<210>    19
<211>    27
<212>    PRT
<213>    Artificial Sequence
<220>
<223>    Midline Fasciclin
<400>    19
Lys Ile Glu Asn Ala Gly Val Thr Lys Cys Asp Val Val Ala Thr Asn
1               5                  10                  15
Gly Ile Leu His Glu Ile Asn Asp Ile Ile Val
20                  25
<210>    20
<211>    26
<212>    PRT
<213>    Artificial Sequence
<220>
<223>    HLC-32
<400>    20
Thr Ala Asn Gly Ala Arg Val Val Glu Ala Asp Arg Lys Ala Ser Ser
1               5                  10                  15
Gly Leu Ile His Val Val Asp Lys Val Ile
20                  25
<210>    21
<211>    29
<212>    PRT
<213>    Artificial Sequence
<220>
<223>    consensus
<400>    21
Val Asn Asn Ala Ala Arg Val Val Lys Ala Asp Ile His Ala Thr Asn
1               5                  10                  15
Gly Val Ile His Val Ile Asp Lys Val Leu Ile Met Gly
20                  25
【図面の簡単な説明】
【図１】  組換え蛋白質βigh3-WTおよびβigh3-ΔRGDを示す模式図であり、保存された領域は
0003795805.tif 000009
【図２】  組換え蛋白質βigh3-WTおよびβigh3-ΔRGDのSDS-PAGEの結果を示す写真である。
【図３】  クリスタルバイオレット染色の、組換え蛋白質βigh3-WTおよびβigh3-ΔRGDのHCE細胞接着および伸長効果を示す顕微鏡写真である。
【図４】  組換え蛋白質βigh3-WTおよびβigh3-ΔRGDのHCE細胞の接着および伸長活性が、接着した細胞の数(A)および表面積(B)で測定したところ、濃度依存的であることがわかる曲線を示す。
【図５】  組換え蛋白質βigh3-WTおよびβigh3-ΔRGDのHCE細胞接着活性を、接着した細胞の数(A)および表面積(B)について比較したヒストグラムを示す。
【図６Ａ】  組換え蛋白質βigh3-WTおよびβigh3-ΔRGDのHCE細胞接着活性に対する種々の化合物の効果を示すヒストグラムである。
【図６Ｂ】  組換え蛋白質βigh3-WTのHCE細胞接着活性に対する種々の2価の陽イオンの影響を示すヒストグラムである。
【図６Ｃ】  組換え蛋白質βigh3-WTのHCE細胞接着活性に対する抗インテグリンモノクローナル抗体の阻害効果を示すヒストグラムである。
【図６Ｄ】  種々の蛋白質のHCE細胞接着活性に対する抗インテグリンモノクローナル抗体の阻害効果を示すヒストグラムである。
【図６Ｅ】  組換え蛋白質βigh3-WTおよびマトリックス蛋白質へのK562細胞の接着特異性を示すヒストグラムである。
【図７】  βig-h3のfas-1ドメインのそれぞれを持つ組換え蛋白質を示す模式図である。
【図８】  βig-h3のfas-1ドメインを含む組換え蛋白質のSDS-PAGE結果を示す写真である。
【図９】  βig-h3のfas-1ドメインを含む組換え蛋白質のHCE細胞接着活性を示すヒストグラムである。
【図１０】  βig-h3のfas-1ドメインを含む組換え蛋白質のHCE細胞接着活性に対する抗インテグリン抗体の阻害効果を示すヒストグラムである。
【図１１】  fas-1ドメインを含む種々のマトリックス蛋白質のアミノ酸配列の一部を示す。
【図１２】  βig-h3の第4ドメインの置換変異体を示す模式図である。
【図１３】  βig-h3の第4ドメインの組換え置換変異体のSDS-PAGE結果を示す写真である。
【図１４】  βig-h3の第4ドメインの置換変異体の細胞接着活性を示すヒストグラムである。
【図１５】  βig-h3の第4ドメインを1コピー、2コピー、3コピー、および4コピー含む、組換え蛋白質βigh3-D-IV、βigh3-D-IV 2X、βigh3-D-IV 3X、およびβigh3-D-IV 4Xを示す模式図である。
【図１６】  10% SDS-PAGE (A)および8%非変性PAGE (B)で流した、Ni-NTAアガロース樹脂を用いて精製した組換え蛋白質βigh3-D-IV、βigh3-D-IV 2X、βigh3-D-IV 3X、およびβigh3-D-IV 4Xの写真を示す。
【図１７】  軟膏基剤単独(A)を塗布された、およびこの軟膏基剤とフィブロネクチン(B)、His-β-b (C)、およびβig-h3-D-IV (D)を合わせて塗布した創傷の光学写真を示す。
【図１８】  軟膏基剤単独(A)で治療された、およびこの軟膏基剤とフィブロネクチン(B)、His-β-b (C)、およびβig-h3-D-IV (D)を合わせて治療された後の、再上皮化の過程にある創傷の顕微鏡写真を示す。
【図１９】  軟膏基剤単独(A)で治療された、およびこの軟膏基剤とフィブロネクチン(B)、His-β-b (C)、およびβig-h3-D-IV (D)を合わせて治療された後に形成された膠原線維を持つ創傷の光学写真である。
【図２０】  βig-h3の第4ドメインを少なくとも1コピー含む組換え蛋白質βigh3-D-IV、βigh3-D-IV 2X、βigh3-D-IV 3X、およびβigh3-D-IV 4XのHCE細胞接着活性を示すヒストグラムである。
【図２１】  キトサン基質単独(A)で治療された、およびこの軟膏基剤とフィブロネクチン(B)、βig-h3 3X (C)、およびβig-h3 4X (D)を合わせて治療された後に面積が縮小した創傷の光学写真を示す。
【図１】
0003795805.tif 000010
【図２】
0003795805.tif 000011
【図３】
0003795805.tif 000012
【図４】
0003795805.tif 000013
【図５】
0003795805.tif 000014
【図６Ａ】
0003795805.tif 000015
【図６Ｂ】
0003795805.tif 000016
【図６Ｃ】
0003795805.tif 000017
【図６Ｄ】
0003795805.tif 000018
【図６Ｅ】
0003795805.tif 000019
【図７】
0003795805.tif 000020
【図８】
0003795805.tif 000021
【図９】
0003795805.tif 000022
【図１０】
0003795805.tif 000023
【図１１】
0003795805.tif 000024
【図１２】
0003795805.tif 000025
【図１３】
0003795805.tif 000026
【図１４】
0003795805.tif 000027
【図１５】
0003795805.tif 000028
【図１６】
0003795805.tif 000029
【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
0003795805.tif 000033
【図２１】
0003795805.tif 000034