(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属に属し、プロピオン酸を資化せず酢酸を資化する、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．  Ｂ６５（寄託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−１６００６）よりなる細菌。
【請求項２】
請求項１記載の細菌を使用することを特徴とする酢酸測定用センサー。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
嫌気性排水処理における酸の生成過程において、生成有機酸の主成分である酢酸を選択的に測定するセンサーおよびそれに利用する細菌に関する。
【０００２】
【従来の技術】
嫌気性排水処理においては酸の生成過程が重要であり、生成有機酸の主成分である酢酸とプロピオン酸濃度をモニタリングする必要がある。特に、プロピオン酸が高濃度になるとメタン発酵を阻害すると言われており、酢酸とプロピオン酸を選択的に測定することが、嫌気性排水処理の効率化に重要と考えられている。
【０００３】
有機酸濃度の測定には、水蒸気蒸留法、直接滴定法、ガスクロマトグラフ法、イオンクロマトグラフ法等が従来から行われている。しかしいずれの方法も、排水の管理、制御に用いるには、操作が煩雑、測定機器が高価であるなどの問題がある。
【０００４】
一方、バイオセンサーを用いることができれば、簡便に有機酸を測定することができる。有機酸測定用バイオセンサーとしては、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｂｒａｓｓｉｃａｅを用いた有機酸センサーがＨｉｋｕｍａらにより報告されており（Ａｎａｌ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ、１０９，３３−３８、１９７９）、また、特開昭６３−２５５６５３および特開昭６２−７４４４２にも同様の酢酸センサーが開示されているが、これらのセンサーの場合、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ属の細菌を使用するため、酢酸とプロピオン酸へのそれぞれの応答は同程度であり、酢酸とプロピオン酸が主生成物である嫌気性排水処理の酸生成槽では、両者を分別して定量できないという問題がある。
【０００５】
したがって、嫌気性排水処理に有機酸センサーを適用するためには、酢酸およびプロピオン酸をそれぞれ選択的に測定できるバイオセンサーが必要である。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
そこで、本発明の第一の目的は、プロピオン酸を資化せず酢酸だけを資化する細菌を提供する点にある。本発明の第二の目的は、前記細菌を用いた酢酸測定用センサーを提供する点にある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明の第一は、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属に属し、プロピオン酸を資化せず酢酸を資化する、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．  Ｂ６５（寄託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−１６００６）よりなる細菌に関する。
【０００８】
本発明の第二は、前記細菌を使用することを特徴とする酢酸測定用センサーに関する。
【０００９】
本発明の酢酸選択的資化性菌の取得方法は例えば次のようにして行うことができる。
【００１０】
酢酸資化性菌の土壌からのスクリーニングに用いる培地は、通常使用される酢酸培地を利用できる。例えば、酢酸０．５％、Ｙｅａｓｔ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ（ＹＮＢ）０．６７％（平板の場合はＡｇａｒ  １．５％）、ｐＨ６．８などの条件の培地が使用可能である。
【００１１】
土壌からのスクリーニングは、次のようにして行う。酢酸培地により集積培養を繰り返し行い、次に酢酸培地の平板培地に集積培養液を接種し、平板に生育してきたコロニーを釣菌する。次に釣菌した菌を酢酸およびプロピオン酸平板培地に接種し、酢酸培地の培地にのみ生育したコロニーを選択的生育株とする。
【００１２】
酢酸を基質とした場合に高い呼吸活性を示す菌株の選択は、前記で得られた選択生育株について、細胞の呼吸活性測定を行い、酢酸に対する呼吸活性の高い菌株を選択することにより行える。
【００１３】
呼吸活性測定には、一般的に用いられるマノメータを利用した方法や細胞増殖測定用色素を利用する方法などを用いることができる。
【００１４】
細胞増殖測定用色素としては、例えばＡｌａｍａｒ  ＢｌｕｅTM〔関東化学（株）〕などがある。Ａｌａｍａｒ  ＢｌｕｅTMを用いた呼吸活性測定は、試薬に添付される標準的な呼吸活性測定法をそのまま利用できるほか、場合によっては必要に応じて改良することにより、目的とする菌株の呼吸活性を測定できる。
【００１５】
微生物電極による菌株の評価は、Ａｌａｍａｒ  ＢｌｕｅTMによる選択で得られた菌株について、小型酸素電極を用いた微生物電極を作製し、酢酸およびプロピオン酸に対する応答を測定することにより行った。
【００１６】
微生物電極の作製方法およ測定方法は、Ｈｉｋｕｍａらが用いた酸素電極を使用した微生物電極作成方法〔Ａｎａｌ．  Ｃｈｉｍ．  Ａｃｔａ，  １０９，  ３３−３８（１９７９）〕と同様の方法を用いることができる。微生物電極で酢酸にしか応答しない菌株について、さらに市販のＢＯＤセンサーを用いて酢酸センサーとしての応答を検討する。微生物固定化膜は、アセチルセルロース製等のメンブランフィルターに吸着固定した微生物をガス透過性多孔質テフロン膜で挟み込んで作製できる。
【００１７】
以下に実施例をあげて具体的に説明するが、本発明はこれにより何ら限定されるものではない。
【００１８】
実施例１（酢酸選択的資化性菌の取得）
（選択資化性菌の検索方法）：
酢酸資化性菌の土壌からのスクリーニングに、酢酸ナトリウム０．５％、Ｙｅａｓｔ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ（ＹＮＢ）  ０．６７％、（平板の場合はＡｇａｒ１．５％）、ｐＨ６．８の酢酸培地を用いた。次に土壌からのスクリーニングした菌について、酢酸培地において集積培養を繰り返し行い、次に酢酸培地に集積培養液を接種し、平板に生育してきたコロニーを釣菌する。次に釣菌した菌を酢酸培地（酢酸ナトリウム含有培地）およびプロピオン酸平板培地（プロピオン酸ナトリウム含有培地）に接種し、一方の培地にのみ生育したコロニーを選択的生育株とした。
【００１９】
（酢酸を基質とした場合に高い呼吸活性をしめす菌株の選択）：
前記工程により得られた選択生育株について、細胞増殖測定用色素Ａｌａｍａｒ  ＢｌｕｅTM〔関東化学（株）〕を用い次に示すような方法で呼吸活性測定を行い、酢酸またはプロピオン酸に対する呼吸活性の高い菌株を選択した。
【００２０】
培養した前記選択的生育株を集菌洗浄した後、リン酸緩衝液に懸濁し一晩飢餓状態に置き、再度集菌洗浄後、適切な濃度になるようにリン酸緩衝液に懸濁する。呼吸活性の測定は、丸底の９６穴ウェルを用いて行った。各ウェルに菌株懸濁液５０μｌ、リン酸緩衝液１００μｌ、Ａｌａｍａｒ  ＢｌｕｅTM２５μｌを加え、さらにそのうちの２４個の穴ウェルには水２５μｌを、他の２４個の穴ウェルには５重量％グルコース基質水溶液２５μｌを、他の２４個の穴ウェルには５重量％酢酸ナトリウム基質水溶液２５μｌを、他の２４個の穴ウェルには５重量％プロピオン酸ナトリウム基質水溶液２５μｌをそれぞれ加え、室温で１５分反応させた後に蛍光（励起波長５７０ｎｍ、検出波長５９０ｎｍ）を測定する。呼吸活性は、基質が水（対照）のウェルの蛍光測定値に対する各基質ウェルの蛍光測定値の比率と定義して評価した。
【００２１】
（微生物電極による菌株の評価）：
前記Ａｌａｍａｒ  ＢｌｕｅTMにより、呼吸活性の高いものを選択して得られた菌株について、小型酸素電極を用いた微生物電極を作製し、酢酸、プロピオン酸に対する応答を測定した。微生物電極の作製方法および測定方法は、常法に従って行った。用いた酸素電極は、（株）バイオット製ガルバニ型小型酸素電極ＤＧ−５である。ＤＧ−５を用いた電極で酢酸にしか応答しない菌株について、さらに市販のＢＯＤセンサー（中埜酢店製ＢＯＤ  ＭＥＴＥＲ）を用いて酢酸センサーとしての応答を検討した。微生物固定化膜は、Ｈｉｋｕｍａらの方法（１）を用いアセチルセルロース製メンブランフィルター（φ２５ｍｍ）に吸着固定した微生物をガス透過性多孔質テフロン膜で挟み込んで作製した。
【００２２】
（酢酸センサー用微生物の検索および得られた菌株の評価）：
酢酸選択資化性菌の検索には、各地の食酢醸造場から採取した土壌、排水、全国から採取した各種土壌、余剰汚泥可溶化物などを用いた。この検索により酢酸選択的生育株が多数得られた。その中から酢酸に対する呼吸活性が高い菌株の選択し、（株）バイオット製ガルバニ型小型酸素電極ＤＧ−５を用いたセンサー応答の検討により、酢酸センサーとして使用できる可能性が示唆された菌株１株（Ｂ６５）が得られた。
【００２３】
このようにして得られた菌株Ｂ６５は市販簡易同定キットによりＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ属であると推定された。
【００２４】
Ｂ６５株の特性を表１に示す。
【表１】
0003833764.tif 000002
【００２５】
実施例２（酢酸選択性資化性菌を用いた酢酸センサー）
そこで得られたＢ６５株について、市販のＢＯＤセンサー（中埜酢店製ＢＯＤＭＥＴＥＲ）を用いて酢酸センサーとしての特性を検討した。微生物固定化膜は、Ｈｉｋｕｍａらの方法（１）を用いアセチルセルロース製メンブランフィルター（φ２５ｍｍ）に吸着固定した微生物をガス透過性多孔質テフロン膜で挟み込んで作製した。酢酸、プロピオン酸、ギ酸、酪酸および吉草酸に対する応答の経時変化を表２に示した。
【００２６】
【表２】
0003833764.tif 000003
酢酸に対する応答を１００として表現した。
【００２７】
表２に示したように、Ｂ６５株は測定開始時には酢酸のみに応答し、プロピオン酸には応答しないという酢酸センサーとして優れた応答を示した。
【００２８】
【効果】
（１）以上の結果から、本発明の酢酸選択的資化性菌を用いることにより、測定可能時間は短いが、酢酸を選択的に測定できるバイオセンサーを構築できることが示された。
（２）また、本発明の酢酸センサーを用いることにより、バイオセンサーによる酢酸の簡便な計測および酢酸とその他の有機酸の分別計測が可能となる。
（３）このことにより、嫌気性処理における酸生成過程を管理、制御することができ、メタン発酵の効率化が可能となる。