(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下に定義する成分より成る生物学的物質：
成分ａ）  繊維芽細胞、骨芽細胞、筋芽細胞、脂肪細胞、軟骨細胞及び内皮細胞より成るグループから選ばれた特定の結合組織の細胞系に部分的に又は完全に分化した自己又は同種骨髄幹細胞の培養物
及び前記結合組織細胞により生産された細胞外マトリックス、
又はそれに代わって、
成分ａ′）  以下の細胞培養物（Ｉ）又は細胞培養物（ＩＩ）により分泌され、且つ、それぞれ細胞培養物（Ｉ）、細胞培養物（ＩＩ）を含まない細胞外マトリックス、：
−（Ｉ）上記特定の結合組織細胞の１種の細胞系に部分的に又は完全に分化した自己又は同種骨髄幹細胞の培養物、
−（ＩＩ）成熟結合組織に由来した、上記特定の結合組織細胞の１種、
及び
成分ｂ）  ヒアルロン酸誘導体より成る三次元の生体親和性で且つ生分解性のマトリックス。
【請求項２】
成分（ｂ）が不織布、スポンジ、顆粒、ミクロスフェア、導管及びガーゼの形態をとり、且つ、成分（ａ）又は（ａ′）を含む、請求項１に記載の生物学的物質。
【請求項３】
成分（ｂ）が不織布の形態をとり、且つ、成分（ａ）又は（ａ′）を含む、請求項２に記載の生物学的物質。
【請求項４】
前記ヒアルロン酸誘導体がエステル化度が２５％と１００％の間より成るヒアルロン酸エステルであり、且つ、成分（ａ）又は（ａ′）を含む、請求項１−３の何れかに記載の生物学的物質。
【請求項５】
ヒアルロン酸ベンジルエステルが夫々７５％又は１００％のエステル化度を持って使用され、且つ、成分（ａ）又は（ａ′）を含む、請求項４に記載の生物学的物質。
【請求項６】
成分（ａ′）を含み、前記（ａ′）の細胞外マトリックスが骨髄幹細胞の部分的又は完全な分化に由来した、又は、同種成熟結合組織細胞に由来した同種結合組織細胞によって分泌される、請求項１−５の何れかに記載の生物学的物質。
【請求項７】
成分（ａ）を含み、前記（ａ）の骨髄幹細胞が、腐食又は変性した軟骨部分の被覆用に、軟骨細胞に部分的に又は完全に分化した、請求項１に記載の生物学的物質。
【請求項８】
成分（ａ）を含み、前記幹細胞が骨物質の損失の症例に使用のため骨芽細胞に部分的に又は完全に分化した、請求項１に記載の生物学的物質。
【請求項９】
成分（ａ）を含み、前記骨髄幹細胞がその後の移植用に自己又は同種の角化細胞の生体外播種の基質として使用するため繊維芽細胞に部分的に又は完全に分化した、請求項１に記載の生物学的物質。
【請求項１０】
成分（ａ）を含み、前記骨髄幹細胞が皮膚の外傷の手当をする代用真皮として使用する繊維芽細胞に部分的に又は完全に分化した、請求項１に記載の生物学的物質。
【請求項１１】
腐食又は変性した軟骨部分の被覆に使用のための、軟骨細胞（ＩＩ）によって分泌された、又は、部分的に又は完全に分化した骨髄幹細胞（Ｉ）に由来した成分（ａ′）を含む、請求項１に記載の生物学的物質。
【請求項１２】
骨物質の損失の症例に使用のための、成熟（ＩＩ）、又は、部分的に若しくは完全に分化した骨髄幹細胞（Ｉ）に由来した骨芽細胞により分泌された成分（ａ′）を含む、請求項１に記載の生物学的物質。
【請求項１３】
その後の移植用に自己又は同種の角化細胞の生体外播種の基質として使用するための、成熟（ＩＩ）、又は、部分的に若しくは完全に分化した骨髄幹細胞（Ｉ）に由来した繊維芽細胞により分泌された成分（ａ′）を含む、請求項１に記載の生物学的物質。
【請求項１４】
皮膚の外傷の手当をする代用真皮として使用するための、成熟（ＩＩ）、又は、部分的に若しくは完全に分化した骨髄幹細胞（Ｉ）に由来した繊維芽細胞により分泌された成分（ａ′）を含む、請求項１に記載の生物学的物質。
【請求項１５】
骨髄幹細胞の完全又は部分的な分化に由来した結合組織細胞（Ｉ）により分泌された、成分（ａ）又は成分（ａ′）を含んでいる請求項１−１４の何れかに記載の生物学的物質の調製方法において、
ｉ）  ヒアルロン酸エステルより成る前記生体親和性三次元マトリックス上への骨髄幹細胞から分離された幹細胞の移入、そして
ｉｉ）  骨髄幹細胞が支配されている分化の型の機能で選ばれた培地の中の生物質の上及び内部での前記幹細胞の成長、それにより成分（ａ）を含む生物学的物質を得る、
又は、固定（ｉｉ）に続く
ｉｉｉ）  浸透圧溶解による（ａ）の細胞成分の除去、それにより上述の成分（ａ′）を含む生物学的物質を得る、
の各工程から成る上記方法。
【請求項１６】
前記骨髄幹細胞の分離工程（ｉ）が以下の操作条件より成る請求項１５に記載の調製方法：
１）  ＋４℃でハンクスの食塩水溶液の存在下で、腸骨稜又は大腿骨の頭部から吸引された骨髄の液体の処理とその混合液の遠心分離；
２）  上澄み液と脂質層の吸引による除去；
３）  パーコール又はフィコール勾配法による過剰赤血球の除去、それにより間葉細胞分画を得る；
４）  間葉細胞分画の遠心分離及び固形分の回収；
５）  ５ｍｌの培地（１０％牛の胎児の血清、１％Ｌ−グルタミン２００ｍＭ、１％のペニシリン／ストレプトマイシンを補充したα−ＭＥＭ）に固形分の再懸濁；
６）  ５０−１００×１０6有核細胞／皿の密度でペトリ皿に播種；
７）  ７２時間培地で細胞の培養又非着生細胞を除去するため培地の交換。
【請求項１７】
工程（ｉｉ）が以下の操作条件に従って行われる請求項１５と１６の何れかに記載の調製方法：
１′）  通常の方法を用いて前記皿から形成されたコロニーの細胞の分離；
２′）  既にヒアルロン酸誘導体より成る三次元マトリックスの多数の断片を含んでいる、新しい培養ペトリ皿の上に１×１０4〜５×１０4細胞／ｃｍ2の密度で前記細胞を沈着させる、これらヒアルロン酸誘導体の断片はヒアルロン酸誘導体−ペトリ皿の境界への人の血漿フィブリンの添加により培養皿に養生させる。
【請求項１８】
工程（１′）で使用される通常の方法がトリプシン法である、請求項１７に記載の調製方法。
【請求項１９】
工程（ｉｉｉ）で使用される培地が以下より成るグループから選ばれる、請求項１５−１８の何れかに記載の調製方法：
Ａ）  １０％の牛の胎児の血清、１％Ｌ−グルタミン２００ｍＭ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン１０，０００Ｕ／１０，０００μｇ／ｍｌで補充されたα−ＭＥＭ；
Ｂ）  １０％の牛の胎児の血清、１％Ｌ−グルタミン２００ｍＭ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン１０，０００Ｕ／１０，０００μｇ／ｍｌ、アスコルビン酸５０μｇ／ｍｌ／日、デキサメタゾン１００〜１０００ｎＭで補充されたα−ＭＥＭ；
Ｃ）  １０％の牛の胎児の血清、１％Ｌ−グルタミン２００ｍＭ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン１０，０００Ｕ／１０，０００μｇ／ｍｌ、アスコルビン酸５０μｇ／ｍｌ／日、２％エタノールで補充されたハムのＦ１２；
Ｄ）  １０％の牛の胎児の血清、１％Ｌ−グルタミン２００ｍＭ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン１０，０００Ｕ／１０，０００μｇ／ｍｌ、デキサメタゾン１０〜１００ｎＭで補充されたα−ＭＥＭ。
【請求項２０】
幹細胞が繊維芽細胞に部分的に又は完全に分化させられた時、前記培地が組成（Ａ）であり、随意に繊維芽細胞成長因子を含んでいる、請求項１９に記載の調製方法。
【請求項２１】
幹細胞が軟骨細胞に部分的に又は完全に分化させられた時、前記培地が組成（Ｂ）である、請求項１９に記載の調製方法。
【請求項２２】
幹細胞が軟骨細胞に部分的に又は完全に分化させられた時、前記培地が組成（Ｃ）である、請求項１９に記載の調製方法。
【請求項２３】
幹細胞が骨芽細胞に部分的に又は完全に分化させられた時、工程（ｉｉ）が水酸化燐灰石を含む水で予め処理された前記マトリックス上で行われ、又培地が組成（Ｄ）である、請求項１９に記載の調製方法。
【請求項２４】
工程（ｉｖ）が５％デオキシコール酸塩の溶液を使って行われる、請求項１５−２３の何れかに記載の調製方法。
【請求項２５】
更に得られた生物学的物質の凍結保存の最終工程より成る請求項１５−２４の何れかに記載の調製方法。
【請求項２６】
以下の工程より成る請求項１−６の何れかに記載の生物学的物質であって成分（ａ′）を含み、該成分（ａ′）が成熟結合組織細胞（ＩＩ）により分泌されたものである生物学的物質、の調製方法：
ｉ′）  特定の結合組織から前記成熟細胞の分離、及び通常で且つ特定の成熟結合細胞に依存する特定の成長条件下でのこれらの成長、
ｉｉ′）  ヒアルロン酸誘導体より成る前記三次元マトリックス上に前記成熟結合組織細胞を移入、
ｉｉｉ′）  該三次元マトリックスの上及び内部での前記結合組織細胞の成長と発生、
ｉｖ′）  浸透圧溶解による細胞成分の除去。
【請求項２７】
工程（ｉｖ′）が５％デオキシコール酸塩の溶液を用いて行われる請求項２６に記載の調製方法。
【請求項２８】
更に得られた生物学的物質の凍結保存の最終工程より成る、請求項２６及び２７の何れかに記載の調製方法。
【発明の詳細な説明】
発明の技術分野
本発明は生物学的物質、その調製工程及びそれの組織移植への用法に関する。
発明の背景
例えば外傷性とか代謝性のような種々の原因による皮膚の損失は屡々非常に治癒が遅いことが証明できる。このことは代謝性又は局部循環系の原因、患者の悪い健康状態又は広範囲な火傷の症例のような傷の大きさのせいに出来る。薬理学的療法の無効性は医者を可能な時は何時でも同じ患者からの皮膚移植片を用いた再建手術に頼らせる。斯かる外傷の治療における重要な進展は生体外細胞培養技術の使用である。
代用皮膚の調製におけるもう一つの問題は生体親和性のマトリックス上に播種する繊維芽細胞の供給によって代表される。事実皮膚組織から繊維芽細胞を分離することは、特に老人や極度に弱った被験者の場合には、何時も容易ではない。この問題に対する一つの解決が骨髄組織中に存在する間葉細胞により与えられた。これらの細胞は非常に活性であり又適正な条件下では種々の細胞系の中で適当に分化できる。これらの幹細胞からは繊維芽細胞、脂肪細胞、筋芽細胞、骨芽細胞、軟骨細胞のような分化した細胞を得ることができる。
レインワルドとグリーン（Cell, 6, 1975, 331-344）は臨床診療で皮膚の傷をうまくカバーできた角化細胞を初めて培養した（ギャリコほか,N. Engl. J. Med.,311, (1984), 448-451）。然しこの画期的な技術は限界がある、上皮層の極度の脆弱性と非常に低い生着率である。これらの限界を克服するために、角化細胞が成長できるように皮膚誘導体が構成された。ヤンナス等（サイエンス，215, (1982), 174-176）は皮膚物質の損失により特徴付けられる外傷について代用皮膚として役立つ再吸収可能な多孔質材料を得るのにコラーゲンとグリコサミノグリカン類の混合物を使用した。
ボイスとハンスブロー（Surgery, 103 (1988), 421-431）は次に移植用の角化細胞を成長させる支持体としてコラーゲンとグリコサミノグリカン類の層状物の使用を記載した。
皮膚代用品の調製のもう一つの方式は合成又は半合成重合体に基づいた生体親和性の三次元マトリックス上の繊維芽細胞培養に代表される。天然の結合組織のそれに類似の細胞外マトリックスの製造が可能になったことから、これら構造物上に繊維芽細胞を播種して成長させることは可能である。
代用皮膚の周知の数例を挙げる：
１）  アドバンスドディシュサイエンス社（カルフォルニア）により開発されたデルマグラフト、ポリ乳酸、ポリグリコール酸又はポリガラクトシド酸より作られたマトリックス上に人の繊維芽細胞を播種して培養したもの。これら繊維芽細胞を入植したマトリックスには続いてより生理学的成長を高めるために角化細胞を播種する；
２）  オルガノジェネシス社（米国ボストン）によるグラフト-スキン、異種人間の繊維芽細胞が播種されたコラーゲン基質より構成されている；
３）  ライフセル社（米国テキスト）により製造されたアロデルム、無傷で残され低温で保存された人又は豚の皮膚より構成されている。使用前に、自己の繊維芽細胞と角化細胞を播種してから移植に利用可能である。
これらの製品は生体外培養の良い生物学的支持体を代表するけれども、それらを生体内に適用するに就いては、ウイルス性汚染の危険ばかりでなく非自己蛋白質成分に対する免疫学的反応に起因する制限を幾分受ける。
最後に、ヒアルロン酸誘導の他の製品がそれらの高い生体親和性と生分解性物質（ベネデッチほか，バイオマテリアル，14 (1993) 1154-1160；コルチボほか，バイオマテリアル，12 (1991) 727-730）及びそれらの免疫反応性の欠如のおかげで皮膚移植に使用されることが知られている。事実、ヒアルロン酸は細胞外マトリックスの一成分であるからそれは組織内での分解の間完全に天然の断片を放出する。
発明の概要
本発明は以下の二成分より成る生物学的物質に関する：
a)  特定の結合組織の細胞系に部分的に又は完全に分化した自己又は相同な骨髄幹細胞の有効培養物及び更に前記結合組織の細胞により生産された細胞外マトリックスより成る、
又はそれに代って
a′)  以下より選ばれた細胞外マトリックス：
−  特定の結合組織に部分的に又は完全に分化した骨髄幹細胞、又は代りに、
−  特定の相同な成熟結合組織細胞、
どんな細胞成分からも自由な前記細胞外マトリックス、
及び
b)  ヒアルロン酸誘導体より成る三次元の生体親和性で且つ生分解性のマトリックス。
本発明は更に前記生物学的物質の調製工程に関する。
本発明に従う生物学的物質が骨髄幹細胞の部分的な又は完全な分化に由来する結合組織細胞により分泌された細胞外マトリックスである成分(a)又は(a′)を含む場合、その工程は以下の諸段階より成る：
i)  骨髄から前記相同又は自己幹細胞を分離する、
ii)   ヒアルロン酸エステルより成る前記生体親和性の三次元マトリックス上に前記分離した幹細胞を移入する、そして
iii)  好ましい結合組織細胞が繊維芽細胞とは異なる場合には分化因子も含んでいる培地に前工程から由来した生物学的物質を浸すことによって、生体物質の上と内部に前記幹細胞を成長及び発達させる、それにより成分(a)を含む生物学的物質を得る、
又場合によっては
iv)  浸透圧細胞溶解により(a)の自己細胞成分を除くことにより、上記成分(a′)を含む生物学的物質を得る。
成熟特定結合組織細胞により分泌された成分(a′)を含む本発明に従う生物学的物質調製の工程は以下の段階より成る：
i′)  特定の結合組織から前記成熟細胞を分離する、そして通常の及び特定の成熟結合細胞に依存する特定の成長条件下でそれらを成長させる、
ii′)  前記ヒアルロン酸誘導体より成る前記三次元マトリックス上に前記成熟結合組織細胞を移入する、
iii′)  前記三次元マトリックスの上部と内部に前記結合組織細胞を成長及び発達させる、
iv′)  浸透圧細胞溶解により細胞成分を除去する。
更に本発明は組織移植片中の前記生物学的物質の用法にも関する。
【図面の簡単な説明】
図１：モノクローナル抗体とＩ型コラーゲンの免疫組織化学的マーキング（アビジン／ビオチン；200×）：
A:  HYAFFR-11  骨髄間葉織からの人の繊維芽細胞が播種された不織布。２週間の培養後  I型コラーゲンの存在が観察できる。
B:  HYAFFR-11  皮膚起源の人の繊維芽細胞を含む。この場合も又、Ｉ型コラーゲンについて明確な陽性がある。
図２：モノクローナル抗体とIII型コラーゲンの免疫組織化学的マーキング（アビジン／ビオチン；200×）：
A:  HYAFFR-11  播種後２週間の骨髄間葉繊維芽細胞付、反応に陽性がマークされる。
B:  HYAFFR-11  播種後２週間の皮膚起源の繊維芽細胞付、反応に陽性がマークされる。
図３：IV型アンチコラーゲン抗体との免疫反応（アビジン／ビオチン；100×）：
A:  HYAFFR-11  播種後２週間の骨髄間葉繊維芽細胞付、
B:  HYAFFR-11  ２週間の培養後の皮膚の繊維芽細胞付。
二つの違ったタイプの繊維芽細胞が同じ方法でのIV型コラーゲン合成を表現する。
図４：モノクローナル抗体とフィブロネクチンの免疫組織化学的マーキング（アビジン／ビオチン；100×）：
A:  HYAFFR-11  播種後２週間の骨髄からの繊維芽細胞付、
B:  HYAFFR-11  ２週間の培養後の皮膚起源の繊維芽細胞付。
免疫反応陽性は両タイプの繊維芽細胞とも認められた。
図５：モノクローナル抗体とラミニンの免疫組織化学的マーキング（アビジン／ビオチン；200×）：
A:  HYAFFR-11  播種後２週間の骨髄からの繊維芽細胞付、
B:  HYAFFR-11  播種後２週間の皮膚繊維芽細胞付。
ラミニンの存在は両タイプの培養物とも非常に顕著である。
発明の詳細な説明
なるべくなら本発明に従う生物学的物質の三次元マトリックスを形成するヒアルロン酸誘導体は米国特許No. 4,851,521で公開され我々が参考にしたようなヒアルロン酸エステルが望ましい。
更に望ましいのはエステル化度が25%から100%まで変動するベンジルエステルである。
特に望ましい実施例によればヒアルロン酸ベンジルエステルはエステル化度が夫々75%（HYAFFR-11p75）及び100%（HYAFFR-11）のものの使用である。
ヒアルロン酸誘導体より成る三次元マトリックスはなるべくなら不織布、スポンジ、顆粒、ミクロスフェア、導管及びガーゼの形が良い。
特に望ましい実施例によれば本発明に従う生物学的物質の三次元生体親和性マトリックスはなるべくなら不織布の形が良い。
ヒアルロン酸誘導体特にヒアルロン酸エステル類の中にある特定エステルより成る前記不織布の調製はここでも参照に取入れた米国特許No. 5,520,916に公開されている。
本発明に従う生物学的物質の中で、(a)に含まれる骨髄幹細胞の完全又は一部の分化から由来する特定の結合組織細胞はなるべくなら繊維芽細胞、骨芽細胞、筋芽細胞、脂肪細胞、軟骨細胞及び内皮細胞より成るグループから選ばれる。
それ故、(a)が軟骨組織を形成できる軟骨細胞より成る場合、本発明に従う生物学的物質は腐食したり変性した軟骨の部位を被覆するのに使用できる。
(a)が骨組織を形成できる骨芽細胞より成る場合、本発明に従う生物学的物質は骨物質の損失の症例に使用できる。
(a)が繊維芽細胞より成る場合、本発明に従う生物学的物質は損傷した皮膚の上に移植され、(b)はその生分解性のおかげで与えられた時間内に吸収されその場所での新生皮膚組織を離れる。
自己結合組織細胞がヒアルロン酸誘導体より成るマトリックス上に播種された場合、それらは新しく形成された結合組織に残ることが出来て種々の成長因子とそれらが分泌する細胞外マトリックスによって傷の回復に寄与する。
相同な骨髄細胞の部分的又は完全な分化又は相同な成熟結合組織に由来する結合組織だけが適用可能である場合、本出願人は成分(a)に代って成分(a′)を含む生物学的物質によって、好ましくない免疫反応を避けることが可能であることを見出した。
それ故望ましい実施例によればこの生物学的物質中で細胞外マトリックスを生産する結合組織細胞は相同な骨髄の部分的に又は完全に分化した幹細胞から又は相同な成熟結合組織から誘導できる、成分(a′)を分泌する相同な成熟結合組織細胞は繊維芽細胞、骨芽細胞、筋芽細胞、脂肪細胞、軟骨細胞及び内皮細胞より成るグループから選ばれる。
成熟繊維芽細胞は剖検又は生検のどちらかの由来の皮膚組織から、成熟軟骨細胞は剖検軟骨から、成熟骨細胞は骨細胞の生検断片から、成熟筋細胞は筋肉組織の生検断片から、成熟内皮細胞は小さな脈管の生検断片又は皮膚それ自身から、成熟脂肪細胞は脂肪組織の生検断片から分離できる。
それ故成分(a′)を含む本発明に従う生物学的物質は成分(a)を含む生物学的物質に意図されるものと同じ目的に使用できる。
特に本発明に従う生物学的物質はそれが骨髄幹細胞の部分的又は完全な分化から由来する繊維芽細胞を含む成分(a)より成る場合、及びそれが相同又は成熟繊維芽細胞か又は相同な部分的又は完全に分化した幹細胞から誘導した繊維芽細胞のどちらかから選ばれた成分(a′)より成る場合の両者ともに、それに続く移植用に自己又は相同角化細胞の生体外播種のための基質として役立ち得る。
この生物学的物質は物質が損失した皮膚の外傷に皮膚基質として使用するのに適している。
骨髄幹細胞の部分的又は完全な分化により得られた相同な結合組織細胞より選ばれた成分(a)又はそれに代る成分(a′)を含む生物学的物質のそれぞれの調製工程において、工程(i)はなるべくなら以下の操作条件より成る：
1)  腸骨稜又は大腿骨の頭部より骨髄を吸引する；
2)  段階(1)からの液体を４℃でハンクスの食塩水溶液で処理するそして出来た混合液を遠心分離にかける；
3)  上澄み液と脂質層を吸引で除く；
4)  パーコール又はフィコール勾配法を用いて過剰の赤血球を除く、それにより間葉細胞分画を得る；
5)  間葉分画を遠心分離にかけて固形分を回収する；
6)  10%牛の胎児の血清、1%L-グルタミン200mM、1%ペニシリン／ストレプトマイシン10,000U/10,000μg/mlを補充したα-MEMを含む培地に固形分を再懸濁する；
7)  50〜100×106有核細胞／皿の密度でペトリ皿に播種する；
8)  72時間培地に細胞を定温培養し着生しない細胞を除くために培地を交換する。
前記工程中の工程(ii)はなるべくなら以下の操作条件に従って行われる：
1′)トリプシン消化法のような通常の方法を用いて前記皿から形成されたコロニーの細胞を分離する、
2′)既に多数のヒアルロン酸誘導体より成る三次元マトリックスを含んでいる新しい培養ペトリ皿上になるべくなら1×104〜5×104細胞／cm2の密度で前記細胞を沈着させる、これら多数のヒアルロン酸誘導体をヒアルロン酸誘導体−ペトリ皿の境界領域に人のプラズマフィブリンを添加することで培養皿に着生させる。
工程(iii)で使用される培地は分化骨髄幹細胞のタイプの機能次第で選定される。例えば幹細胞が繊維芽細胞に部分的に又は完全に分化されるべき時には、前記培地はどんな分化因子も含んでなくて、出来ればbFGF（基礎繊維芽細胞成長因子）のような繊維芽細胞成長因子を含むべきである。
この場合幹細胞は三次元マトリックスの上に移入される前に部分的分化が既に起っている。
幹細胞が軟骨細胞に部分的に又は完全に分化されるべき時には、その培地はなるべくなら、10%牛の胎児の血清、1% L−グルタミン200mM、1%ペニシリン／ストレプトマイシン10,000U/10,000μg/ml、アスコルビン酸50μg/ml/日、デキサメタゾン100〜1000nMを補充したα-MEMを含む。この培地は出来れば一週間に二回交換する。
別案ではこの培地は10%の牛の胎児の血清、1% L−グルタミン200mM、1%ペニシリン／ストレプトマイシン10,000U/10,000μg/ml/日、アスコルビン酸50μg/ml/日、2%エタノールで補充したハムのF12を含む。
幹細胞が骨芽細胞に部分的に又は完全に分化されるべき時には、工程(ii)即ち三次元マトリックス上への幹細胞の移入は予め水酸化燐灰石を含んでいる水で処理された前記マトリックス上で起る。
工程(iii)用に意図されたこの場合の培地は10%の牛の胎児の血清、1% L−グルタミン200mM、1%のペニシリン／ストレプトマイシン10,000U/10,000μg/ml、アスコルビン酸50μg/ml/日、デキサメタゾン10〜100nMを補充したα-MEMである。
工程(iv)、即ち成分(a′)を得るための浸透圧溶解はなるべくなら5%デオキシコール酸塩の水溶液を用いて行われる。成熟結合組織細胞によって分泌された成分(a′)を含む生物学的物質の調製工程でも、工程(iv)即ち浸透圧溶解はなるべくなら前述のデオキシコール酸塩溶液を用いて行われる。本発明に従う生物学的物質は凍結保存が出来るので、移植片材料の供給又は角化細胞の培養を支持するために組織バンクを建てることが出来る。
その結果として上述の生物学的物質調製の各工程には更に得られた生物学的物質を通常の方法に従って凍結保存する最終工程が加わる。
純粋に表示する目的で、新しく形成された組織の特徴付けの数例をこの後で述べる。
実施例  １  幹細胞の分離と培養
約5〜10mlの骨髄を腸骨稜又は大腿骨の頭部から吸引する。
ストローマ骨片も含んでいるこの液体を50mlの無菌管に入れ+4℃で20〜25mlのハンクス食塩水溶液を補充する。管は約1000rpmで5分間遠心分離にかけられ上澄み液と脂質層は吸引除去される。パーコール又はフィコール型勾配法を用いて過剰の赤血球は除去され、その後間葉細胞を含んでいる分画は取出されて1000rpmで5分間遠心分離にかけられる。取出されて遠心分離にかけられたペレットは5mlの培地（牛の胎児の血清、1% L−グルタミン200mM、1%ペニシリン／ストレプトマイシン10,000U/10,000μg/mlで補充されたα-MEM)に再懸濁されて50〜100×106有核細胞／皿の密度で直径100mmのペトリ皿に播種される。
実施例  ２  HYAFFR-11及びHYAFFR-11p75より成る三次元マトリックスへの幹細胞の移入と幹細胞の繊維芽細胞への分化
そこで細胞は37℃で約5%の炭酸ガスインキュベーターで72時間放置される、その後培地はどんな着生しなかった細胞でも除去するために交換させられる。皿に残っている間葉細胞は更なる継代接種により増幅できて（一般に分割比1:3）培地に成長因子bFGF(1ng/ml)を加えたHYAFFR-11及びHYAFFR-11p75の不織布マトリックスに移入させられる。ある時間後（1〜2週間）生物質内の細胞は繊維芽細胞の外観をとり結合マトリックスの代表的分子（I，II，III，IV型コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン）の生産による繊維芽細胞の表現型を表す。
実施例  ３  以下の調製：
真皮  α  以下を含む：
−骨髄幹細胞からの繊維芽細胞
−不織HYAFFR-11より成る三次元マトリックス
真皮  α′（対照）  以下を含む：
−人の真皮由来の繊維芽細胞
−不織HYAFFR-11より成る三次元マトリックス
真皮  β  以下を含む：
−骨髄幹細胞からの繊維芽細胞
−不織HYAFFR-11 p75より成る三次元マトリックス
真皮  β′（対照）  以下を含む：
−人の真皮由来の繊維芽細胞
−不織HYAFFR-11 p75より成る三次元マトリックス
HYAFFR-11p75及びHYAFFR-11の両者より成る組織片（1.5×1.5cm）は別々にフィブリンクロットによって培養皿の上に付けられる。皮膚の外植片から又は実施例１で述べた如く骨髄から分離成長させられた間葉幹細胞から得られた人の繊維芽細胞は0.2mlの培地に104細胞×cm2の密度で生物質上に別々に播種されゆっくりと浸漬される。約30分後、DMEM培地に10%の牛の胎児の血清とL-アスコルビン酸50μg/mlが添加され皿は37℃で培養される。
培地は48時間毎に交換されて培養は位相差顕微鏡で観察される。
HYAFFR-11p75より作られた生物質片は7日間だけ培養できて、HYAFFR-11p75上の繊維芽細胞培養の場合、生物質が7日後には培地中に溶解し始めることが観察された。他方、HYAFFR-11はずっと長期間（約6週間）培養を維持できる。この場合、HYAFFR-11の断片は7、14及び21日の期間細胞と共に培養される。
培養期間の終りには、幹細胞からの繊維芽細胞を含んでいるヒアルロン酸ベンジルエステルHYAFFR-11p75とHYAFFR-11のマトリックス及び人の皮膚からの繊維芽細胞を含んでいる相当物な結石酵素を用いないで皿から分離され二つの部分に分けられる。
一つは規定の組織学的試験用にホルマリンで固定される又他の一つは液体窒素に凍結されて次の免疫組織化学的研究用に保存される。
ホルマリンで固定された断片はヘマトキシリン／エオシンで又はバン・ギーソンの方法で染色される、一方凍結された物質はフィブロネクチン、Ｉ、II及びIV型コラーゲン、ラミニンの存在を示すためのモノ又はポリクローナル抗体で免疫組織化学的に染色される。
組織学的染色の結果
ヘマトキシリン／エオシン
典型的な繊維芽細胞の形態と共に長く伸びた細胞がHYAFFR-11p75及びHYAFFR-11生物質の両方で観察される。形態学的見地から、真皮から得られた繊維芽細胞と骨髄間葉細胞から得られたそれとは同様な外見を呈する。HYAFFR-11の場合、生物質の繊維は良く保存されているが、一方HYAFFR-11p75繊維は分解の兆しを示す。
生物質の分析はバン・ギーソン法での染色で薄桃色がかった赤に変る細い原繊維の微妙な網目の存在を示し、それらが繊維芽細胞によって新しく合成されたコラーゲン原繊維であることを確認した。
免疫組織化学的特徴付け
以下の抗体は細胞外マトリックス中の最も代表的な分子を明らかにするのに用いられた：
1)  人のI型アンチコラーゲンモノクローナル抗体
2)  人のIII型アンチコラーゲンモノクローナル抗体
3)  人のIV型アンチコラーゲンモノクローナル抗体
4)  人のアンチフィブロネクチンモノクローナル抗体
5)  人のアンチラミニンモノクローナル抗体。
真皮及び骨髄間葉誘導の両者の繊維芽細胞を沈着した細胞外マトリックスは上記免疫反応に陽性であることを証明した。特に、IV型コラーゲンだけでなく、重要な繊維性コラーゲン（I型とIII型）成分も観察された。真皮組織の特徴である代表的接着性分子、フィブロネクチンとラミニンはこれら繊維芽細胞により明らかに表現され、完全な細胞外足場が本出願人により用いられたマトリックスの中に構成できることを示した。
実施例  ４  実施例３で記述した調製された真皮αと真皮βの凍結保存
低温貯蔵中の幹細胞培養から得られた人工真皮の保存の可能性を証明するために、その細胞を含む生物質の断片は低温貯蔵剤（ジメチルスルオキシド）の存在下で凍結させられた。培養物は取出されて4℃まで冷されたDMEM、牛の胎児の血清及び10%のジメチルスルホキシドを含むカプセルに入れられてその5分後に-80℃まで凍結される。
一週間後、HYAFFR-11p75の断片は解凍されて37℃まで急速に加熱され、ジメチルスルホキシドを除くために10%の牛の胎児の血清とDMEMで数回洗滌される。それらは24時間インキュベーター中に放置され、その後培養物は同じ大きさのHYAFFR-11p75生物質の新しい断片上に移入されて培養皿に付着させられた。元の不織布は7日後には媒質中に分解し始めるので、この段階は細胞に新しい支持体を与えるために必要である。
一方、HYAFFR-11の断片は上述の条件下で冷凍後の培養に再利用される。すべての解凍された生物質は7日間培養された後実施例１で述べたように分析される。これらの新しい試験結果は実施例１で述べたものと同様でありトリパンブルー染色で実行したテストはHYAFFR-11マトリックス中に存在する細胞が解凍後も尚成育可能であることを示した。
図１〜５／Ａ−Ｂは骨髄及び真皮からの人の繊維芽細胞が播種されたHYAFFR-11不織生物質の組織学的写真を示す。各図は、I、III、IV型コラーゲン、フィブロネクチン及びラミニンの相対的免疫学化を描いている。HYAFFR-11及びHYAFFR-11から作られた種々の生物質（ガーゼ、スポンジ、膜類）は繊維芽細胞の成長と細胞外マトリックスの沈着に関する限りお互いに何ら本質的な差異はない。
実施例    真皮α、α′、β及びβ′の細胞成分の溶解に由来する生物学的物質  上述の方法、続いて細胞成分の除去による生体外で人工真皮を得る可能性は以下の如く査定された：
実施例１と２で述べた培養工程の後、HYAFFR-11生物質の断片は存在する繊維芽細胞を溶解するために蒸留水で、続いて5%デオキシコール酸ナトリウムで処理される。これら二つの処理は細胞溶解と膜の可溶化に導き、大体無傷で細胞外成分を分離する。此の処理に続いて、生物質断片の組織学的及び免疫組織学的試験が前実施例に述べた如く実行される。
特定の抗体での細胞外マトリックスの染色は、細胞成分の除去の手法が細胞外マトリックスの構築又は組成を変えず、それが細胞除去以前の出発マトリックスのそれと全く同様に見えることを示している。
実施例  ６  軟骨形成へ向っての幹細胞分化の促進条件
実施例１で記述した如く分離された幹細胞は不織HYAFFR-11のマトリックスの上に置かれ特別の組成：10%の牛の胎児の血清、1% L−グルタミン200mM、1%のペニシリン／ストレプトマイシン10,000U/10,000μg/ml、アスコルビン酸50μg/ml/日、デキサメタゾン100〜1000nMで補充されたα-MEMの培地で成長させられる。細胞は高濃度で播種される（集団培養技術）：平均密度5〜104細胞／cm2。培地は通常週に二回交換される。別案として以下の培地も使用可能である：牛の胎児の血清、1% L−グルタミン200mM、1%のペニシリン／ストレプトマイシン10,000U/10,000μg/ml、アスコルビン酸50μg/ml/日、2%エタノールで補充されたハムのF12。
適当な形質（軟骨細胞）発現は以下の如く監視される：
−光学顕微鏡での形態学的観察；
−アルシアンブルー、トルイジンブルー及びII型アンチコラーゲンモノクローナル抗体での組織学的標本の特定染色；
−グリコサミノグリカンとII型コラーゲンの生産の上澄み液の数量化。
デキサメタゾンで補充された培地及び2%エタノールを含むそれとの両方で、軟骨細胞への幹細胞の高い割合の分化が観察できる。
実施例  ７  骨形成へ向っての幹細胞分化の促進条件
骨形成への分化を促進するために間葉細胞は以下の組成の培地で不織HYAFFR-11の上に成長させられる：10%の牛の胎児の血清、1% L−グルタミン200mM、1%のペニシリン／ストレプトマイシン10,000U/10,000μg/ml、アスコルビン酸50μg/ml/日、デキサメタゾン10〜100nM。
播種の前に、HYAFFR-11物質は12〜24時間水酸化燐灰石を含んだ水で処理される。培地は通常週に二回交換される。
適当な形質（骨細胞）発現は以下によって監視される：
−光学顕微鏡での形態学的観察；
−フォン・コッサにより組織学的標本の特定の染色；
−存在するアルカリ燐酸酵素活性を明らかにする組織化学的染色。
これらの実験条件で、如何にしてHYAFFR-11中の水酸化燐灰石結晶の存在が骨細胞へ間葉細胞を誘導するか観察することが可能である。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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