(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ガラクトースがα−結合したガラクトシド化合物と糖受容体とからα1-3ガラクトシド結合を選択的に形成する作用を有するペニシリウム フニキュロサム(Penicillium funiculosum)由来で次の理化学的性質を有するα−ガラクトシダーゼ
（１）至適pHおよび安定pH：至適pHはpH3.0〜3.5。pH3.5〜6.5において37℃の処理を10分行っても失活しない。
（２）至適温度および作用適温の範囲：至適温度は50℃、pH3.48において25〜40℃では30分処理しても安定。
（３）分子量：44000（TSKゲルＧ300SWによるゲルろ過法）。
【請求項２】
請求項１記載のα−ガラクトシダーゼ を用いることを特徴とするα1-3ガラクトシド結合を有する糖質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、微生物由来の新規なα−ガラクトシダーゼおよびα1-3ガラクトシド結合を有する糖質の製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、免疫抑制剤などの進歩により臓器移植の成績は画期的に向上している。それに伴い、臓器移植の適応範囲も驚異的に拡大し、急激なドナー不足の状態が欧米を中心に出現している。その対策として、免疫学的にも生理学的にもヒトに近いブタをドナーとしたいわゆる"discordant"異種移植が検討されている。
【０００３】
ところで、ブタをドナーとして発生する超急性拒絶反応を抑制するための手段として、１）ヒト補体抑制因子（DAF、HRF-20、MCP-1）の導入、２）ヒトがブタに対して持っている自然液性抗体〔大部分はブタのガラクトース糖鎖抗原：Galα1-3Galに対するもの〕の不活性化の２つが考えられる。
糖鎖抗原Galα1-3Galに対する液性抗体（ヒト抗Galα1-3Gal抗体）の不活性化の例として、Galα1-3Gal構造を有する糖質を投与すると、該抗体が中和され、超急性拒絶反応が抑制されるという報告がある(D. K. C. Cooper, E. Koren, and R. Oriol, Xeno, vol.2, 22-25(1994)。すなわち、Galα1-3Gal構造を有する糖質の有効量投与は、異種移植患者の拒絶反応を抑制する作用がある。
【０００４】
α1-3ガラクトシド結合を有する糖質の合成法に関しては、α−ガラクトシダーゼを用いた転移反応による合成法についての報告がある（P. M. Dey, Phytochemistry, 1979, vol.18, 35-38および特公平8-24592）が、本報告のα−ガラクトシダーゼを用いた転移反応では、α1-6結合したガラクトオリゴ糖が主生成物として得られ、α1-3結合したガラクトオリゴ糖を安価で安定的に合成することは不可能である。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
従って本発明の目的は、α1-3ガラクトシド結合を有する糖質を安価で安定的に合成するための微生物由来の新規なα−ガラクトシダーゼ、および該酵素を用いた当該糖質合成法を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決すべく種々検討した結果、前記α1-3ガラクトシド結合を有する糖質を選択的に合成できる新規の微生物由来α−ガラクトシダーゼ[EC3.2.1.22]を見出し、本発明を完成した。すなわち、本発明は、特許請求の範囲に記載の各請求項からなる。以下本発明を詳細に説明する。
【０００７】
【発明の実施の形態】
【０００８】
本発明のα−ガラクトシダーゼを産生する微生物としては、例えば、ペニシリウム(Penicillium)属、アスペルギルス(Aspergillus)属、あるいはストレプトミセス(Streptomyces)属に属する菌などがあげられる。このうち、ペニシリウム・フニキュロサムもしくはアスペルギルス・オリザエが好ましい。これらの微生物からα−ガラクトシダーゼを得るには、公知の方法、すなわち、当該微生物を培養して、その培養液上清あるいは微生物菌体から取得する方法が適用できる。あるいは、市販酵素、例えば、セルラーゼ製剤等に混在したα−ガラクトシダーゼを精製して用いることができる。
【０００９】
次にα1-3ガラクトシド結合を有する糖質の製造法について述べる
【００１０】
α−ガラクトシダーゼは本来加水分解酵素であるが、基質濃度を高めると糖転移作用を触媒するようになる。糖供与体としては、ラフィノース、メリビオース等の天然の糖質、パラニトロフェニル−α−ガラクトピラノシド(pNP-α-Gal)等の合成基質を用いることができるが、α−ガラクトシル結合を非還元末端に持つ糖質であればいずれでもよい。糖受容体としては、ガラクトース、ガラクトオリゴ糖、種々の糖、種々のアルコール類などのヒドロキシル基を持つ化合物を用いることができる。α1-3ガラクトシド結合を有する糖質を合成する際は、ガラクトース供与体とガラクトース受容体との量比は、1:0.1〜1:10であるが好ましくは1:0.2〜1:5である。尚、糖供与体と糖受容体とが同一化合物であっても何ら差し支えない。α1-3ガラクトシド結合した糖質の製造には、精製した酵素を用いることが好ましいが、部分精製酵素あるいは培養液をそのまま、または培養液を粉末化した粗酵素を用いても何ら差し支えない。また、固定化酵素であっても構わない。
【００１１】
以下、本発明の実施例を示し、さらに詳しく説明するが本発明はこれらの実施例に限定されない。
【００１２】
【実施例】
実施例１  酵素の精製
ペニシリウム・フニキュロサム(Penicillium funiculosum)起源酵素標品セルラーゼ（シグマ社製）8.37gを水25.1mlに懸濁し、４℃で攪拌した。約12時間後遠心分離（10,000 x g,10分）を行い、上清を10mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.4)で平衡化したQ-Sepharose FFカラム（2.5cmx25cm）に添加した。ついで、1M塩化ナトリウムを含む10mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.4)の濃度勾配によりα−ガラクトシダーゼを溶出させた。流速は1ml/minであった。
【００１３】
▲１▼作用：
【００１４】
【化２】
0003856405.tif 000002
【００１５】
R-OHは、ガラクトース、ガラクトオリゴ糖、種々の糖、種々のアルコール及び種々のフェノール類などのヒドロキシル基を持つ化合物を示す。
【００１６】
▲２▼至適pHおよび安定pH
本発明のα−ガラクトシダーゼ1μlを含む緩衝液(pH1.81〜11.2はブリトン・ロビンソン緩衝液、pH3.34〜6.22は酢酸緩衝液、pH1.17〜3.72はグリシン緩衝液)2mlと5mM pNP-α-Gal 500μlを混合し、37℃で反応させた。10分後、0.2M炭酸ナトリウム溶液2mlを加え、反応を停止させた。加水分解によって生成したパラニトロフェノール量を指標にした比活性を図１に示す。pH3.0〜3.5の間において高い酵素活性が認められた。
【００１７】
安定pHを調べるために本発明のα−ガラクトシダーゼ1μlを含む各pHのブリトン・ロビンソン緩衝液100μlを37℃で保持した。20時間後、至適pHの測定と同様の方法で加水分解によって生成したパラニトロフェノール量を測定した。結果を図２に示す。
【００１８】
酵素活性はpH3.5〜6.5において37℃の処理を10分しても失活しなかった。
【００１９】
▲３▼至適温度および作用適温の範囲
本発明のα−ガラクトシダーゼ1μlを含むブリトン・ロビンソン緩衝液(pH2.49)100μlと5mM pNP-α-Gal 500μlを混合し、20〜70℃で反応させた。10分後、0.2M炭酸ナトリウム溶液2mlを加え、反応を停止させた。加水分解によって生成したパラニトロフェノール量を指標にした比活性を図３に示す。
【００２０】
図３から、本発明のα−ガラクトシダーゼの至適温度は50℃であり、70℃では完全に失活した。
【００２１】
また、本発明のα−ガラクトシダーゼ1μlを含むブリトン・ロビンソン緩衝液(pH3.48)100μlを25〜60℃で30分間保持した。その後、至適pHの測定と同様の方法で加水分解によって生成したパラニトロフェノール量を測定した。結果を図４に示す。
【００２２】
pH3.48においては25〜40℃では30分処理しても安定であった。
【００２３】
▲４▼分子量
TSKゲルＧ300SW（東ソー社製）によるゲルろ過法では44000であった。
【００２４】
実施例２  オリゴ糖の製造法
100mgのpNp-α-Galを300μlのジメチルホルムアミドおよび700μlの0.1Mのリン酸カリウム緩衝液(pH6.0)からなる溶液に溶解し、これに13.3単位のα−ガラクトシダーゼ（ペニシリウム・フニキュロサム起源）を加え、37℃で振盪した。６日後、反応液を100℃で５分間加熱して酵素を熱失活させた。この反応液をセファデックスＧ−１０カラム（5cm x 100cm）に供して生成物の精製を行い、6.1mgのGalα1-3Galα1-OpNPを得た。該二糖誘導体のパラニトロフェニル基は既知の方法（特願平7-319022）により脱離することができ、遊離の二糖Galα1-3Galとすることが可能である。
【００２５】
糖の溶出パターンを図５に、生成物の13Ｃ−ＮＭＲ(D2O, 125MHz)を図６に示す。
【００２６】
また、アスペルギルス・オリザエ（商品名「オリエンターゼＯＮＳ（阪急バイオインダストリー社製）」）あるいはストレプトミセス属起源（商品名「グルコースイソメラーゼ（ナガセ生化学工業社製）」）の酵素剤中に含まれるα−ガラクトシダーゼを用いて転移反応を行った時の反応液のＨＰＬＣを図７に示す。さらに、
【発明の効果】
本発明の微生物由来の新規なα−ガラクトシダーゼを用いて、異種臓器移植における超急性拒絶反応を有効に抑えることのできる二糖Galα1-3Gal誘導体を効率的に合成できる。
【００２７】
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のペニシリウム・フニキュロサム起源α−ガラクトシダーゼのpH依存性を示す。○、□および△は、それぞれブリトン・ロビンソン緩衝液、酢酸緩衝液およびグリシン緩衝液を用いて測定したときの比活性を示す。
【図２】本発明のペニシリウム・フニキュロサム起源α−ガラクトシダーゼのpH安定性を示す。
【図３】本発明のペニシリウム・フニキュロサム起源α−ガラクトシダーゼの温度依存性を示す。
【図４】本発明のペニシリウム・フニキュロサム起源α−ガラクトシダーゼの温度安定性を示す。
【図５】実施例２におけるガラクトオリゴ糖の溶出パターンを示す。
【図６】  Galα1-3Galα1-OpNPの13Ｃ−ＮＭＲを示す。
【図７】実施例２において(a)アスペルギルス・オリザエあるいは(b)ストレプトミセス属起源の酵素剤中に含まれるα−ガラクトシダーゼを用いて転移反応を行った時の反応液のＨＰＬＣを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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