(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程からなるDNA塩基配列決定のための鋳型の調製方法：
(1)塩基配列を決定すべきDNAの領域を含む標的DNAの集団、(2)レトロウイルスインテグラーゼまたはレトロトランスポゾンインテグラーゼ、および(3)該インテグラーゼの基質となる２つの平滑末端をもつ人工トランスポゾンを、標的DNAにほぼランダムに人工トランスポゾンの挿入が起きるように、in vitroでインキュベートし、
ほぼランダムに人工トランスポゾンの挿入が起きた標的DNAで宿主細胞を形質転換し、
人工トランスポゾンの挿入が起きた標的DNAで形質転換された宿主細胞を選択し、
人工トランスポゾンの挿入が起きた標的DNAで形質転換された宿主細胞から、人工トランスポゾンが挿入されてDNA塩基配列決定の鋳型として用いるのに適する標的DNAを単離する。
【請求項２】
インテグラーゼが酵母レトロトランスポゾンTy1インテグラーゼである請求項１の方法。
【請求項３】
標的DNAがプラスミドである請求項１の方法。
【請求項４】
標的DNAがコスミドである請求項１の方法。
【請求項５】
インテグラーゼがTy1ウイルス様顆粒として提供される請求項２の方法。
【請求項６】
両末端がTy1 U3配列をもつ請求項２の方法。
【請求項７】
末端が４から11塩基対からなる請求項６の方法。
【請求項８】
人工トランスポゾンが平滑末端を生じる制限酵素消化によって提供される請求項１の方法。
【請求項９】
制限酵素がXmnIである請求項８の方法。
【請求項１０】
形質転換のステップがエレクトロポレイションによって行われる請求項１の方法。
【請求項１１】
モル比が少なくとも2.5:1である請求項１の方法。
【請求項１２】
以下の工程からなるDNA塩基配列の決定方法：
(1)塩基配列を決定すべきDNAの領域を含む標的DNAの集団、(2)レトロウイルスインテグラーゼまたはレトロトランスポゾンインテグラーゼ、および(3)該インテグラーゼの基質となる２つの平滑末端をもつ人工トランスポゾンを、標的DNAにほぼランダムに人工トランスポゾンの挿入が起きるように、in vitroでインキュベートし、
ほぼランダムに人工トランスポゾンの挿入が起きた標的DNAで宿主細胞を形質転換し、
人工トランスポゾンの挿入が起きた標的DNAで形質転換された宿主細胞を選択し、
人工トランスポゾンの挿入が起きた標的DNAで形質転換された宿主細胞から、人工トランスポゾンが挿入されてDNA塩基配列決定の鋳型として用いるのに適する標的DNAを単離し、
単離した人工トランスポゾンが挿入された標的DNAに、人工トランスポゾンの末端に対して相補的なプライマーをハイブリダイズさせ、
該プライマーを伸長させ、人工トランスポゾンが挿入された単離した標的DNA内の該人工トランスポゾンの近傍のDNAのヌクレオチド配列を決定する。
【請求項１３】
インテグラーゼが酵母レトロトランスポゾンTy1インテグラーゼである請求項12の方法。
【請求項１４】
標的DNAがプラスミドである請求項12の方法。
【請求項１５】
標的DNAがコスミドである請求項12の方法。
【請求項１６】
インテグラーゼがTy1ウイルス様顆粒として提供される請求項13の方法。
【請求項１７】
両末端の各々がTy1 U3配列由来である請求項16の方法。
【請求項１８】
該末端が４から11塩基対からなる請求項17の方法。
【請求項１９】
人工トランスポゾンが平滑末端を生じる制限酵素消化によって提供される請求項12の方法。
【請求項２０】
制限酵素がXmnIである請求項19の方法。
【請求項２１】
モル比が少なくとも2.5:1である請求項12の方法。
【請求項２２】
形質転換のステップがエレクトロポレイションによって行われる請求項12の方法。
【請求項２３】
以下の段階からなるDNA塩基配列の決定方法：
レトロウイルスインテグラーゼまたはレトロトランスポゾンインテグラーゼを用いて、レトロウイルスインテグラーゼまたはレトロトランスポゾンインテグラーゼの基質となる２つの平滑末端をもつ平滑末端をもつ人工トランスポゾンを標的DNAにin vitroで挿入することにより、平滑末端をもつ人工トランスポゾンがほぼランダムに挿入された標的DNAの集団を形成し、
人工トランスポゾンの末端に対して相補的なプライマーを、該集団のそれぞれの標的DNAにハイブリダイズさせ、
該プライマーを伸長させて人工トランスポゾンの近傍の標的DNAのヌクレオチド配列を決定する。
【請求項２４】
インテグラーゼが酵母レトロトランスポゾンTy1インテグラーゼである請求項23の方法。
【請求項２５】
標的DNAがプラスミドである請求項23の方法。
【請求項２６】
標的DNAがコスミドである請求項23の方法。
【請求項２７】
インテグラーゼがTy1ウイルス様顆粒として提供される請求項24の方法。
【請求項２８】
両末端のそれぞれがTy1 U3配列に由来する請求項24の方法。
【請求項２９】
該末端が４から11塩基対からなる請求項28の方法。
【請求項３０】
モル比が少なくとも2.5:1である請求項23の方法。
【請求項３１】
以下からなるDNA塩基配列決定のキット
レトロウイルスインテグラーゼまたはレトロトランスポゾンインテグラーゼの基質となる平滑末端をもつ人工トランスポゾン、
レトロウイルスインテグラーゼまたはレトロトランスポゾンインテグラーゼ、pH6から８で１から50mMの２価の陽イオンを有する、人工トランスポゾンのin vitro転位用の緩衝液、
および、該人工トランスポゾンの末端に対して相補的なプライマー。
【請求項３２】
インテグラーゼが酵母レトロトランスポゾンTy1インテグラーゼである請求項31のキット。
【請求項３３】
インテグラーゼがTy1ウイルス様顆粒として提供される請求項32のキット。
【請求項３４】
人工トランスポゾンが平滑末端を生じる制限酵素での消化によって単離される請求項32のキット。
【請求項３５】
制限酵素がXmnIである請求項34のキット。
【請求項３６】
以下の構成からなる、線状で平滑末端の単離されたDNA分子をもつ人工トランスポゾン：
マーカーDNA、
該マーカー遺伝子の上流且つ近傍に置かれた、U5配列およびU3配列からなるグループから選択される、酵母レトロトランスポゾンTy1の末端の４から11bpからなる酵母レトロトランスポゾンTy1配列、および
該マーカー遺伝子の下流且つ近傍に置かれた、U5配列およびU3配列からなるグループから選択される、酵母レトロトランスポゾンTy1の末端の４から11bpからなる酵母レトロトランスポゾンTy1配列
からなり、酵母レトロトランスポゾンTy1配列の各々はその線状DNA分子の末端に存在する。
【請求項３７】
人工トランスポゾンを含むDNA分子を、DNAを切断するとき平滑末端を生じる制限酵素で消化して単離された請求項36の人工トランスポゾン。
【請求項３８】
制限酵素がXmnIである請求項37の人工トランスポゾン。
【請求項３９】
マーカーDNAが抗生物質耐性決定因子である請求項36の人工トランスポゾン。
【請求項４０】
マーカーDNAがデヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（dhfr）である請求項36の人工トランスポゾン。
【請求項４１】
マーカーDNAが酵母栄養要求性マーカーである請求項36の人工トランスポゾン。
【請求項４２】
マーカーDNAの近傍配列の各々が5'-AACA-3'配列である請求項36の人工トランスポゾン。
【請求項４３】
マーカー遺伝子の近傍の配列の各々がU3配列由来である請求項36の人工トランスポゾン。
【請求項４４】
以下の構成からなる、人工トランスポゾンの調製に適するDNA分子：
複製起点、
第一選択マーカーDNA、
各々少なくとも4bpからなり平滑末端を有する２つのトランスポゾン末端であって、該末端は酵母レトロトランスポゾンTy1インテグラーゼの基質となるものであり、且つ人工トランスポゾンを作る時に第２の選択マーカー遺伝子を挿入するのに使用可能な第１の制限酵素部位の近傍にあるものである、上記２つのトランスポゾン末端、
上記２つのトランスポゾン末端の近傍にある第２の制限酵素部位であって、該第２の制限酵素での消化によって両端がトランスポゾン末端である平滑末端断片が人工トランスポゾンとして遊離される、上記第２の制限酵素部位。
【請求項４５】
以下の工程からなる、in vitroでの標的DNAへの挿入方法：
(1)標的DNAの集団、(2)レトロウイルスインテグラーゼまたはレトロトランスポゾンインテグラーゼおよび、(3)該インテグラーゼの基質となる平滑末端をもつ人工トランスポゾンを、in vitroでインキュベートし、ほぼランダムに人工トランスポゾンの挿入が起きた標的DNAを形成し、
人工トランスポゾンの挿入がほぼランダムに起きた標的DNAで宿主細胞を形質転換し、
人工トランスポゾンが挿入された標的DNAで形質転換された宿主細胞を選択する。
【請求項４６】
人工トランスポゾンと標的DNAのモル比が少なくとも2.5:1である請求項46の方法。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
ＤＮＡ塩基配列決定は、遺伝子およびゲノムの研究方法に革命をもたらす手助けをし、生物学の多くの局面においてより深い理解をもたらした。それにもかかわらず、多様な生物のゲノムの地図作りおよび塩基配列決定を行う努力に伴い、ＤＮＡ塩基配列決定の効率を改良する必要性が現在ほどに大きかったことはない（１）。大きなＤＮＡ断片の塩基配列決定に伴う主要な問題の１つは、１回のプライマー伸長反応における限界を越える塩基配列の情報を得ることである。インサートＤＮＡの内側の塩基配列を得るために、いくつかの技術が一般に使用されており；以下を含む：ｉ）ＤＮＡ断片に沿って”歩く”特別あつらえのプライマーの合成（２、３）、ｉｉ）完全な塩基配列を得るために高度の手間が必要とされる、ショットガンサブクローニング（４）、またはｉｉｉ）オーバーラップしたエキソヌクレアーゼ欠失クローンの構築（３、５）。これらの方法の各々は、時間がかかり、個々の工程が異なり、それ故自動化が困難でありおよび／またはコストがかかる。
あるいは、転位可能な遺伝子要素が、ＤＮＡのマッピングおよび塩基配列決定に適応されている。その例は以下を含む：γδ（６）、Ｔｎ５（７）、Ｔｎ１０（８）、及びこれらおよび他のトランスポゾンの誘導体。これらのアプローチは一般に非常に見込みがあるけれども、挿入段階が大腸菌中でｉｎ  ｖｉｖｏにて行われる；従って転位は、標的プラスミドまたは大腸菌ゲノムの両方で起こる可能性があり、標的挿入物の回収が困難になる。さらにランダムな挿入を妨げる宿主の効果から生じる問題がある、すなわち、挿入の”ホットスポット”および”コールドスポット”がｉｎ  ｖｉｖｏにおいてしばしば観察される（９）。
あるレトロウイルスおよびレトロトランスポゾンによって、それらの通常のライフサイクルの一部として用いられる完全なＤＮＡ挿入反応は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ（１０−１４）にて完全に行うことができ、ＤＮＡ塩基配列決定用のｉｎ  ｖｉｖｏのトランスポゾン挿入技術にとって代わる可能性がある。
標的のシーケンス（配列決定）を行うための一連のＤＮＡテンプレートを作成するための、当該技術分野に置いて単純で信頼のおける技術が必要である。特に、１組のプライマーを利用して塩基配列決定が自動化できるような一連のＤＮＡテンプレートが必要である。
発明の概要
ＤＮＡシーケンス用のテンプレートを提供するための方法を提供することが本発明の目的である。
このようなＤＮＡテンプレートのシーケンスを行う方法を提供することが本発明の別の目的である。
ＤＮＡシーケンス用のキットを提供することがまた本発明の別の目的である。
人工トランスポゾンを提供することがまた本発明の別の目的である。
人工トランスポゾンを調製するためのプラスミドを提供することがまた本発明の別の目的である。
標的ＤＮＡ分子の中にｉｎ  ｖｉｔｒｏで挿入を行う方法を提供することがまた本発明の別の目的である。
本発明のこれらおよび他の目的は、以下に記載した発明の態様の１つまたはいくつかによって提供される。１つの態様において、ＤＮＡシーケンス用のテンプレートを調整するための方法が提供される。その方法は以下の段階を含む：
・ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの下記成分のインキュベート：（１）シーケンスを行うＤＮＡ領域を含む標的ＤＮＡの集団、（２）レトロウイルスまたはレトロトランスポゾンインテグラーゼ、および（３）人工トランスポゾンの挿入がほぼランダムに起った標的ＤＮＡを作成するために、標的ＤＮＡに対する人工トランスポゾンのモル比が少なくても１：１の、上述のインテグラーゼの基質である、末端を２つ持つ人工的なトランスポゾン；
・人工トランスポゾンの挿入がほぼランダムに起った標的ＤＮＡ集団による宿主細胞の形質転換；
・人工トランスポゾンが挿入した標的ＤＮＡで形質転換した宿主細胞の選別；
・人工トランスポゾンが挿入した標的ＤＮＡで形質転換した宿主細胞からの、人工トランスポゾンが挿入された標的ＤＮＡであって、ＤＮＡシーケンスのテンプレートとして使用するのに適した人工トランスポゾンが挿入された標的ＤＮＡの単離。
別の態様において、ＤＮＡのシーケンスの方法が提供される。その方法は、次の段階を含む：
・ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの下記成分のインキュベート：（１）シーケンスを行うＤＮＡ領域を含む標的ＤＮＡの集団、（２）レトロウイルスまたはレトロトランスポゾンインテグラーゼ、および（３）人工トランスポゾンの挿入がほぼランダムに起った標的ＤＮＡを作成するために、標的ＤＮＡに対する人工トランスポゾンのモル比が少なくても１：１の、上述のインテグラーゼの基質である、末端を２つ持つ人工的なトランスポゾン；
・人工トランスポゾンの挿入がほぼランダムに起った標的ＤＮＡでの宿主細胞の形質転換；
・人工トランスポゾンが挿入した標的ＤＮＡで形質転換した宿主細胞の選別；
・人工トランスポゾンが挿入した標的ＤＮＡで形質転換した宿主細胞からの、人工トランスポゾンが挿入された標的ＤＮＡであって、ＤＮＡシーケンスのテンプレートとして使用するのに適した人工トランスポゾンが挿入された標的ＤＮＡの単離；
・単離した人工トランスポゾンが挿入された上述の標的ＤＮＡへの、人工トランスポゾンの末端に相補的なプライマーのハイブリダイゼーション；
・単離した人工トランスポゾンが挿入された上述の標的ＤＮＡの中の、上述の人工トランスポゾンのわきに続くＤＮＡの塩基配列を決定するためのプライマーの伸長。
また、本発明の別の態様において、ＤＮＡシーケンス方法が、提供される。その方法は、次の段階を含む：
レトロウイルスまたはレトロトランスポゾンインテグラーゼの基質である末端を持つ人工トランスポゾンがほぼランダムに挿入した標的ＤＮＡの集団を用意するに当たって、上述の人工トランスポゾン、レトロウイルスまたはレトロトランスポゾンインテグラーゼを使用して、標的ＤＮＡに対する人工トランスポゾンのモル比を少なくても１：１にして、標的ＤＮＡ中に上述の人工トランスポゾンをｉｎ  ｖｉｔｒｏで挿入することによって当該標的ＤＡＮを作成し；
集団中の個々の標的ＤＮＡと、人工トランスポゾンの末端に相補的なプライマーとをハイブリダイゼーションさせ；
上述の人工トランスポゾンのわきに続く標的ＤＮＡの塩基配列を決定するためにプライマーを伸長させる。
また、本発明の別の態様において、ＤＮＡのシーケンス用のキットが提供される。キットは、次のものを含む：
レトロウイルスまたはレトロトランスポゾンインテグラーゼの基質となる末端を持つ人工トランスポゾン；
レトロウイルスまたはレトロトランスポゾンインテグラーゼ；
ｉｎ  ｖｉｖｏにおける人工トランスポゾン転位用のバッファーで、ｐＨが６から８で１から５０ｍＭの２価陽イオンを含むバッファー；および
人工トランスポゾンの末端に相補的なプライマー。
さらに、本発明の別の態様において、人工トランスポゾンが提供される。線状ＤＮＡ分子からなるこのトランスポゾンは以下のものを含む：
マーカー遺伝子；
Ｕ５配列およびＵ３配列からなるグループから選択された配列であって、当該配列の上流端に上述のマーカー遺伝子が続き、そして該配列はＴｙ１末端配列の４から１１ｂｐを含む、酵母レトロトランスポゾンＴｙ１の塩基配列；および
Ｕ５配列およびＵ３配列からなるグループから選択された配列であって、該配列の下流端に上述のマーカー遺伝子が続き、そして該配列はＴｙ１末端配列の４から１１ｂｐを含む、酵母レトロトランスポゾンＴｙ１の塩基配列。
さらに、本発明の別の態様において、人工トランスポゾンを作成するのに有用なＤＮＡ分子が提供される。ＤＮＡ分子は以下を含む：
複製開始点；
第一の選別が可能なマーカーＤＮＡ；
人工トランスポゾンを作成するための第二の選択マーカー遺伝子の挿入に有効な第一の制限酵素部位をわきに有する、各々少なくとも４ｂｐの２つの平滑なトランスポゾン末端（これは酵母レトロトランスポゾンＴｙ１インテグラーゼの基質である）；
第二の制限酵素で消化すると両末端にトランスポゾン末端を持つ平滑末端断片となり、それによって遊離された断片が人工トランスポゾンとなるような、上述の２つのトランスポゾン末端に続く第二の制限酵素部位。
さらに、本発明の別の態様において、標的ＤＮＡ中への挿入をｉｎ  ｖｉｔｒｏで作成する方法が提供される。この方法は、次の段階を含む：
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの下記成分のインキュベート：（１）標的ＤＮＡの集団、（２）レトロウイルスまたはレトロトランスポゾンインテグラーゼ、および（３）人工トランスポゾンの挿入がほぼランダムに起った標的ＤＮＡを作成するために、標的ＤＮＡに対する人工トランスポゾンのモル比が少なくても１：１の、上述のインテグラーゼの基質である両末端を持つ、人工的なトランスポゾン；
人工トランスポゾンの挿入がほぼランダムに起った標的ＤＮＡ集団での宿主細胞の形質転換；
人工トランスポゾンが挿入された標的ＤＮＡで形質転換された宿主細胞の選別。
本発明のｉｎ  ｖｉｔｒｏシステムは、ｉｎ  ｖｉｖｏでの転位システムに対していくつかの利点を提供する：ｉ）特別のバクテリア株が必要ない、ｉｉ）潜在的な宿主効果が回避される、およびｉｉｉ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ反応では、生化学的条件の改変およびパラメーターの最適化が可能である。このように、単純かつ信頼性のある方法が、特定の生物の全ゲノムの塩基配列を決定する際に必要であるような、膨大な量の塩基配列の情報を得るために提供される。
【図面の簡単な説明】
図１．標的プラスミド中への人工トランスポゾン挿入の概観
標的プラスミド中への人工トランスポゾン挿入の作成に含まれる基本的な段階を示した。以下要素を示す：決定すべきＤＮＡ（点線）トリメトプリム耐性（ｔｒｉr）遺伝子（影をつけた囲い）；標的プラスミド（二重丸）；ＰＡＲＴ（プライマーアイランド人工トランスポゾン）（囲い）；Ｔｙ１  Ｕ３末端（黒四角）。
図２．ｐＡＴ−１およびｐＡＴ−２
図２Ａ．ｐＡＴ−１およびｐＡＴ−２に共通な骨格は、酵母ＵＲＡ３遺伝子、バクテリア複製開始点（ｏｒｉ）およびマルチクローニングサイト（ｍｃｓ）を含むことを示す。ＰＡＲＴインサートを含むｐＡＴ−２が示されている。図２Ｂ．ＸｍｎＩで消化して生じるＰＡＲＴを示す。ｄｈｆｒ（ジヒドロフォレートリダクターゼ）遺伝子（点描）、ｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴのｍｃｓ（白い囲い）、Ｔｙ１  Ｕ３カセット（黒四角）および挿入部位に続くＤＮＡの塩基配列を決定するための２つのユニークなプライマー部位を含む。図２Ｃ．Ｔｙ１  Ｕ３／ＸｍｎＩカセットの塩基配列。矢印は、ＸｍｎＩ切断部位を示す。影をつけた領域は、Ｔｙ１  Ｕ３塩基配列を示し（矢印の両サイド）、全配列はＸｍｎＩの認識部位をコードする。
図３．クローンｐ７６−２へのＰＡＲＴ挿入
酵母第３染色体断片を含むクローンｐ７６−２の８ｋｂのインサートを、７８個の独立なＰＡＲＴ挿入部位（矢印）とともに示す。トランスポゾン挿入の方向は、次のように示す：（↓）フォワード（人工トランスポゾン中のｄｈｆｒ遺伝子は左から右に転写される）、または（↑）リバース。インサート上のこの第３染色体領域は、ＰＧＫＩ遺伝子（黒い囲い）、グリシンｔＲＮＡ遺伝子（転写の方向を示す矢先のついた黒丸）、Ｔｙ１ソロデルタ（点描の囲い）およびＹＣＲ１６ｗ座位（斜め線の囲い）を含む。ＰＡＲＴ挿入位置は、挿入の１方または両方のジャンクションをシークエンスすることによって決定した。
図４．概念的コンティグマップ
７８個のＰＡＲＴ挿入位置を使用して、以下の仮定に基づく概念的コンティグマップを作成した：ｉ）各々のＰＡＲＴから２つのプライマー伸長が開始する（それぞれの方向に１つ）およびｉｉ）各々の伸長によって、２５０ｂｐの有用なＤＮＡ塩基配列情報が回収される。
図５．ｐ７６−２中のＰＡＲＴインサートの間隔の大きさ
ｐ７６−２中の個々のＰＡＲＴインサートの間隔の大きさ（すなわち、隣接する挿入部位間のｂｐ単位での距離）を、グループ分けし、各々のグループに分類される間隔の数をグラフ化して示す。
図６．プラスミドｐＷＡＦｐ中のＰＡＲＴインサートの分布
プラスミドｐＷＡＦｐは、ＷＡＦ１プロモーターをコードする５ｋｂのヒトＤＮＡインサートを含む。我々は、ＰＣＲで調製した人工トランスポゾンを使用して、このトランスポゾンをＢｂｓＩで消化して、上流および下流端に各々Ｕ３およびＵ５配列を持つようにして、この標的中にＰＡＲＴ挿入を作成した。解析した４５個のインサートのうち、１２個はｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴベクター断片にマップされ（黒で示す）、１３個はＷＡＦ−１インサートの１．５ｋｂのＮｏｔＩ／ＰｓｔＩ断片にマップされ、１２個はＷＡＦ−１の２．５ｋｂＰｓｔＩ断片にマップされた（ＷＡＦ−１塩基配列は白で示す）。従って、インサートはこの標的プラスミドの全領域から回収され、挿入頻度は標的ＤＮＡ１ｋｂ当たり４．１インサート／ｋｂから１０インサート／ｋｂの範囲である。その後、このインサートセットは、ＷＡＦ−１ＤＮＡ塩基配列の９０％以上を直接回収するのに使用された。
図７．酵母第三染色体中へのインサートの分布
各々４ｂｐの長さのＵ３およびＵ５末端を持つ人工トランスポゾンを、ＰＣＲで作成し、ＢｂｓＩで消化して、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノーフラグメントでフィルインした。インサートの分布は、標的プラスミドに含まれる第三染色体ＤＮＡ部分のマップ上に示す。
図８Ａ−８Ｂ．ｐＡＴ−１の塩基配列
図９Ａ−９Ｂ．ｐＡＴ−２の塩基配列
図１０．ｐＡＴ−２のＰＡＲＴの塩基配列
図１１．コスミドＦ１３５４４の８ｋｂの領域のコンティグマップの塩基配列
１６９個の独立なＡＴ−２インサートを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ挿入によりコスミドＦ１３５４４中に作成した。制限酵素マッピングにより８ｋｂの領域にマップされた４３個のインサート済のものを集め、ＡＢＩプリズム技術と共にＳＤ１１８および１１９プライマーを使用して塩基配列を決定した。塩基配列決定プロジェクトのコンティグマップを示す。各々の矢印は、一回のプライマー伸長を表す。下は、完全な塩基配列のマップである。黒い領域は両鎖の塩基配列決定を示し、斜線の領域は片方の鎖のみである。
図１２．人工トランスポゾン
ＡＴ−１塩基配列および構造を含む、８個の異なる人工トランスポゾンを示す。各々は、ｐＡＴ−１またはｐＡＴ−２由来であり、これらのプラスミドにたいして用いたのと同じ、ＸｍｎＩストラテジーによりプラスミドから調製する。
好適な態様の詳細な記載
完全にｉｎ  ｖｉｔｒｏで行うトランスポゾン挿入技術を、ＤＮＡ塩基配列決定を含む様々な問題に適用することが可能であるということが、本発明の発見である。この技術は、プラスミドコンストラクトを使用して得られる人工トランスポゾンを用いおよび、ウイルスまたはウイルス様粒子（ＶＬＰ）の形で提供され、トランスポゾンを標的のＤＮＡ分子中に挿入するのを仲介するレトロウイルスまたはレトロトランスポゾンインテグラーゼを用いる。
我々は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで人工トランスポゾンを作成し、これらのトランスポゾンを標的ＤＮＡ中に効率的に挿入する新しい方法を開発した。過程には３つの鍵となる局面がある：ｉ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ挿入反応が高度に効率的で、１回の反応につき何千もの挿入を起こすものである；殆どの標的プラスミドについては、この効率は１つのホスホジエステルボンドにつき１つの挿入に近い、ｉｉ）挿入過程は、十分にランダムであり、トランスポゾンの挿入が標的のプラスミド配列に対してまんべんなく起こる、およびｉｉｉ）原理的には、実際にいかなるＤＮＡ配列または配列の組み合わせでも、人工トランスポゾンとして利用できる。これらの３つの特徴が合わさって、組換えＤＮＡ分子を作成するための極めて万能な方法を作り出すのである。
人工トランスポゾンは、ＤＮＡ塩基配列決定に理想的である：ｉ）１回の挿入反応から多くのトランスポゾンが挿入したものが容易に集められ、ＤＮＡ断片の塩基配列決定を促進するような、適当に間隔を開けたインサートの回収が可能になり、ｉｉ）トランスポゾンは、ＤＮＡのマッピングまたは塩基配列決定に有用な好ましい形態を含むように作成でき、およびｉｉｉ）各々のトランスポゾンは２つの特徴のあるプライマー部位を持っているので、各々のインサート部位のわきにある塩基配列をすばやく効率的に決定できる。人工トランスポゾンが挿入された一連のプラスミドは、一定のプライマーの組を使用してすべてのプラスミドを平行して塩基配列決定を行うことができるため、特に有益である。これは、各々の配列を次のプライマーを特定するために使用するプライマーウォーキングの非効率的な”連続式ズ”のアプローチと対照的である。従って、人工トランスポゾンは、小さいまたは大きなＤＮＡ塩基配列決定プロジェクトの両方に有効なＤＮＡシーケンス用の基質を作成するのに柔軟で極めて効率的である。
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ挿入反応には３つの巨大分子成分がある：ｉ）人工トランスポゾン、ｉｉ）レトロウイルスまたはレトロトランスポゾンインテグラーゼおよびｉｉｉ）標的ＤＮＡ。これら３つの成分を、適当なバッファーおよび補因子を含む反応液中に一緒に混合する。酵母レトロトランスポゾンＴｙ１の場合には、反応液は摂氏３０度および摂氏３７度で軽くインキュベートし、ＥＤＴＡを加えて摂氏６５度で暖めることによって終了する。最後に、核酸を、フェノール／クロロホルム抽出し、エタノール沈澱する。回収したＤＮＡは、宿主細胞が薬剤耐性（または他の適切な選択マーカー）になるように形質転換するのに使用し、それによってトランスポゾン挿入を受けた標的分子の同定が可能になる（図１）。それからトランスポゾンを持つ一連の標的ＤＮＡ分子を、トランスポゾン末端に対応する２つのプライマーを使用して、挿入部位に続くＤＮＡ配列を直接得るために使用できる；このような挿入コレクションは、興味のある領域のＤＮＡ塩基配列情報を効率的に回収するのに使用可能である。
我々は、この技術の特別な応用を開発すること、すなわち、ＤＮＡマッピングおよび塩基配列決定の目的で標的プラスミド中にｉｎ  ｖｉｔｒｏで人工トランスポゾンの”プライマー島”（ＰＡＲＴ：primer island artificial transposon）を挿入することに最初に焦点をあてた。上記に述べた特徴（挿入の効率、挿入のランダムさ、およびトランスポゾンの柔軟性）に加えて、このシステムには、現存する方法と比較して他の利点もあり、それらは以下を含む：ｉ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏプロトコールは、初心者にとっても単純で非常に信頼性が高い、ｉｉ）ＰＡＲＴは、Ｔｎ５およびＴｎ１０に基づくシステムのように、インサートのジャンクションに続く塩基配列に近づくのを妨げる大きな末端繰り返しを含まない、およびｉｉｉ）反応は、完全にｉｎ  ｖｉｔｒｏで行われるため、生化学的条件の変更およびパラメーターの最適化が可能である；これは、タンデムな繰り返し配列、高ＧＣ含量、または特殊なトポロジーのテンプレートを含むような特別な標的にするのが困難なＤＮＡテンプレートについて特に有用である。
重要なことに、標的中へのトランスポゾンの挿入は、インサートが標的ＤＮＡのあらゆる領域から回収されるのに十分にランダムであった。従って、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＴｙ１インテグラーゼによって仲介される挿入は、控えめに見てもほぼランダムな過程であり、実際上完全にランダムである。これは、種々の形状のＤＮＡ配列を含む標的をたくさん試験して明らかになることではある。それにもかかわらず、我々の最近の結果は、目立った大きな偏りがなく、ほぼランダムな挿入モデルであることを強く支持している。反対に、この特徴は、ＤＮＡ塩基配列決定に適した他のトランスポゾンシステムには一般に観察されない；それどころか、挿入のホットスポットおよびコールドスポットによりしばしばインサートがランダムでない分布になるため、これらのシステムではＤＮＡ配列の大きな断片、または他の領域中に存在する高程度の無駄な繰り返しを調べることはできない。これらの問題は、異なる標的特異性を示す変異トランスポゾン（mutant transposon）を用いたいくつかのシステムにおいて克服されてきた（９）。しかし、そのようなアプローチは、トランスポゾン特異的な標的特異性を限られた範囲で緩和したにすぎない。Ｔｎ１０（９，９ａ）およびＴｙ１（２８）の両方について、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける標的特異性に宿主の細胞因子が寄与することが知られている；このような標的特異性は本明細書中に示したようにｉｎ  ｖｉｔｒｏのシステムを使用することによって排除される。幸運にも、Ｔｙ１インテグラーゼのような、レトロウイルスおよびレトロトランスポゾンインテグラーゼによるｉｎ  ｖｉｔｒｏの人工トランスポゾン挿入過程は、ほとんどランダムなふるまいを示し（図２）、これはＤＮＡ塩基配列決定の目的には理想的である。本発明によるほぼランダムとは、少なくとも１ｋｂにつき１つの挿入の距離間隔で、実際上いかなる配列中にも挿入が得られるということを意味する。現実には、挿入は、最大距離が少なくとも５００ｂｐにつき１つの挿入、または４００ｂｐにつき１つの挿入が得られた。反対に、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＴｙ１転位の標的中には大きなコールドスポットが見いだされている。
人工トランスポゾンを構築する我々の方法は非常に融通がきくため、様々な配列を含むトランスポゾンが多くの特定の応用のために構築可能である。例えば、ｐＡＴ−１のマルチクローニングサイト（ｍｃｓ）に、酵母および哺乳類の薬剤で選択可能な遺伝子または栄養要求増遺伝子（これらには限られない）などの他のマーカーを挿入することが可能で、トランスポゾンとして働くことのできるマーカーカセットを生み出す。このような人工トランスポゾンは、”マーカーの付加”、すなわち、興味あるプラスミドのクローニングできる領域に有用な栄養要求因子マーカーを挿入すること、に使用可能である。例えば、バクテリアまたは酵母中での使用のために、ｍｃｓに様々な選択マーカーを含むｐＡＴ−１誘導体を作成でき、好みのたマーカー（栄養要求性、薬剤耐性、サプレッサー、など）を、単純なｉｎ  ｖｉｔｒｏ挿入反応で標的プラスミドに加えられる。実際、１回の挿入反応の産物を、各々のクローンが特定のホスホジエステルボンドに１つのインサートを含む、挿入物のコレクションを含む”挿入ライブラリー”と見なすことができる。必要であるならば、特定のホスホジエステルボンドのインサートを、ジャンクションのオリゴヌクレオチドをプローブとして、慣用のライブラリースクリーニング方法で同定することが可能である。従って、作成した人工トランスポゾンを使用し、および適切なスクリーニング方法を適用して、所望のい構造の組換え分子が回収できる。
人工トランスポゾンに加えて、システムの他の２つの成分、すなわち、インテグラーゼおよび標的もまた融通がきく。例えば、他のインテグラーゼまたはトランスポサーゼ（transposase）も、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ挿入反応に等しくまたは同じくらい等しく効果的である。さらに、変異インテグラーゼもまた有用である。このようなインテグラーゼの特別な特質は、より広い範囲の挿入嗜好性または頻度を提供するかも知れない。また、インテグラーゼはウイルス粒子またはＶＬＰの形態で提供する代わりに、精製したインテグラーゼを使用することもできる。これらによって、ＶＬＰに結合したインテグラーゼと比較して、活性または安定性の程度を変えられるかもしれない。
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ挿入反応は、様々な標的ＤＮＡに対して使用できる。コスミド、人工染色体を含むプラスミドは、バクテリオファージまたはウイルスベクターと同様に有用である。バクテリオファージラムダＤＮＡは、ウイルス粒子の形態で提供されたモロニーマウス白血病ウイルス（１０）およびＴｙ１インテグラーゼを使用した同様の反応中に置いて、標的として使用された。
ＤＮＡ塩基配列決定用のテンプレートを作成するためのＰＡＲＴに基ずくシステムは、効率よく、大量にＤＮＡ塩基配列決定を平行して行うストラテジーの開発に容易に応用できる。この挿入が高度にランダムで、大多数のクローンが有用な塩基配列データを生み出すことから、Ｐ１およびバクテリア人工染色体のみならずコスミドを含む、大きな組換えプラスミドの塩基配列を決定するためのショットガンアプローチに非常に適していて、自動化も可能である。ランダムな二重薬剤耐性コロニーを選択し、そのＤＮＡを抽出し、直接自動塩基配列決定装置にかけることが可能である。これらの段階はすべて、自動化可能である。最適なプライマー１組が一連のプラスミド誘導体のすべての塩基配列を決定することに使用できるため、すべての段階は、プライマーのデザインおよび選択などに関して操作する人の介入なしで平行して行うことができる。従って、人工トランスポゾンによって促進されるＤＮＡ塩基配列決定は、小スケールの塩基配列決定プロジェクトにも非常に有用であると予測されるけれども、現在進行中のヒトゲノムのマップ作りおよび塩基配列決定のような巨大なプロジェクトにさえもさらに有用であろう。
本発明に従って使用する人工トランスポゾンは、３’末端にヒドロキシ基を含み、平滑末端である。このような分子の調製は、非平滑的に切断する制限酵素を使用し、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノーフラグメントのようなＤＮＡポリメラーゼで”フィルイン”反応して行う。あるいは、人工トランスポゾンは、ＰＣＲによっても調製できる。典型的には、ＰＣＲ産物の末端は、平滑末端になるように”トリミング”する必要がある。従って、平滑末端を作るＸｍｎＩのような制限酵素を、ＰＣＲ産物を削減するのに使用できる。最も単純には、プラスミド中に含まれる人工トランスポゾンを、平滑末端を作るＸｍｎＩのような制限酵素によりプラスミドから単離することができる。このことは１段階で均一な平滑末端の断片を調製する。
インテグラーゼ活性は、酵母レトロトランスポゾンＴｙ１の場合にはウイルス様粒子、またはレトロウイルス粒子の場合には細胞内核蛋白複合体によって提供される。または、精製したインテグラーゼを使用する。人工トランスポゾンは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転位用インキュベーション混合物中にタンパク質の含まれないＤＮＡ調製物として加えるのが望ましい。調製したインテグラーゼの中にはいくつかの天然のトランスポゾンＤＮＡが存在するかも知れないが、典型的には、このようなトランスポゾンには遺伝学的なマーカーが付けられておらず、人工トランスポゾンよりも有意に低いモル数しか存在しないであろう。
トランスポゾン末端に含まれるＤＮＡは、任意の望ましいマーカーであるかまたは潜在配列（cryptic sequence）ですらありうる。原核生物または真核生物のいずれにも有用な抗生物質耐性遺伝子は、しばしば有用である。栄養要求マーカーも有用であり、特に酵母ではそうである。プロモーターのようなシスに働く制御エレメントもまた、インサートに続く予め知られていなかった領域の機能を確定するために望ましい。マーカーＤＮＡもまた、制限部位、プライマー結合（ハイブリダイゼーション）部位、などのような他の非コード領域も含む。
標的ＤＮＡに対する人工トランスポゾンの比率は、反応の効率において重要な因子となることが分かった。望ましくは、分子比は少なくても１：１で、さらに好適には分子比は少なくとも２．５：１、１０：１または５０：１である。
宿主細胞は、形質転換（トランスフェクション）、形質導入（トランスダクション）、エレクトロポレーションなどを含む、当該技術分野において既知の方法で形質転換する。形質転換（トランスフォーム）された細胞の選択は、典型的かつ慣用的には遺伝的選択手段によって行われるが、遺伝学的および生化学的スクリーニング方法もまた使用されうる。
Ｔｙ１トランスポゾンの場合には、完全なＵ３またはＵ５末端配列の使用は必要でないことが分かった。従って、Ｕ３および／またはＵ５の４ｂｐ程に小さい末端配列が使用できる。（Ｕ３およびＵ５の配列は、参考文献１２の図５に明らかになっている。）１つのトランスポゾン末端が結合した産物を作成するには、他の無関係な配列がインテグラーゼ酵素の基質として適しているといういくつかの証拠もあるが（１４）、このような配列は、本発明に必要なトランスポゾン末端を２つ持つ、完全な挿入産物を作成するのには適していないようである。
本発明に従った塩基配列決定用のプライマーは、ダイデオキシタイプの塩基配列決定法として当該技術分野で既知のものである。これらは、典型的に、長さ約１２−６０塩基の合成されたシングルストランドのオリゴヌクレオチドである。本発明に従うと、挿入したトランスポゾンに続く塩基配列それぞれを決定するためのプライマーが決まっている（ユニークである）ことが望ましい。それ故、もし２つのトランスポゾン末端が同一であれば（そういう可能性はあるのだが）、各々のプライマーがトランスポゾンの片方の端にのみハイブリダイゼーションするように、プライマーの相補性は、”マーカー領域”まで伸ばすかまたは完全にマーカー領域に由来しなければならない。”人工トランスポゾンの末端に相補的”なプライマーは、人工トランスポゾンの末端およそ１５０ｂｐに由来する長さ１２から６０塩基のオリゴヌクレオチドである。ＤＮＡ塩基配列決定用に最適化されたプライマー配列は、人工トランスポゾン中に容易に導入できる。
本発明に従ったウイルス粒子は、感染した細胞の細胞抽出物より単離した核蛋白複合体である。酵母レトロトランスポゾンＴｙ１の場合には、粒子はウイルス様粒子として知られる。インテグラーゼ活性は、当該技術分野で既知のタンパク精製技術を使用してこのような粒子から精製できる。Ｔｙ１を本出願中で例示したが、それに密接な関係のある酵母レトロトランスポゾンＴｙ２も等しく有用であると信じられている。
さらに、レトロウイルスおよび他のインテグラーゼもまた本発明に従って使用できる。鳥白血病ウイルス（ＡＭＶ）インテグラーゼは、人工トランスポゾンを標的ＤＮＡ中へいっせいに挿入することを仲介させるために使用できる（３０）。マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）およびヒト免疫不全性ウイルス（ＨＩＶ）レトロウイルスインテグラーゼは、標的ＤＮＡに対して人工トランスポゾンのほぼランダムな挿入を仲介する（３１）。ＨＩＶ−１インテグラーゼのコアドメインの３次元構造は、バクテリアトランスポサーゼ、ＭｕＡと同様であることが示された（３２）。従って、バクテリアのトランスポサーゼも、同様に使用できる。
２つの陽イオンが転位に必要であることが見いだされた。マグネシウムイオンまたはマンガンイオンの最適濃度は、約１から約５０ｍＭの範囲である。好適には、その濃度は約５と４５ｍＭの間である。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転位に適したｐＨの範囲は、ｐＨ６から８と広範囲で、望ましくはｐＨ７からｐＨ８である。
ＤＮＡ塩基配列決定に対するＰＡＲＴ技術の応用に加えて、ＰＡＲＴ挿入の高い効率性およびランダムさのために、多くの他の応用が可能である。これらのいくつかを以下に概略する。
１．ＤＮＡ塩基配列決定およびマッピング
ｉ）小スケールのＤＮＡ塩基配列決定
例：３．５ｋｂのＤＮＡ断片を、プラスミドクローニングベクターにクローン化する。研究者は、ポリメラーゼに基づく（サンガー）ダイデオキシ塩基配列決定法を使用して、この３．５ｋｂのインサートの完全なヌクレオチド配列を、両鎖ともに得たいとする。ＰＡＲＴ挿入をｉｎ  ｖｉｔｒｏでプラスミドに作成する。個々のＰＡＲＴインサートがプラスミド骨格またはインサートに位置するかを決定するために、得られたプラスミドの集合を制限地図作りによってスクリーニングし、インサート中に１００−２００ｂｐごとに挿入が入っている標的プラスミドの集合を回収する。それからＰＡＲＴ末端に相補的な特異的なプライマーを使用して、挿入の両サイドのＤＮＡ塩基配列を決定するのに各々のＰＡＲＴを使用する。標準的なダイデオキシ塩基配列決定プロトコールによって２００−３００ｂｐ（またはそれ以上）の有効な塩基配列情報が回収されるため、３．５ｋｂインサートの完全な塩基配列は、両鎖について回収される。
ｉｉ）大スケール塩基配列決定
例：大きなＤＮＡ断片のクローニングに使用する酵母人工染色体（ＹＡＣ）、バクテリア人工染色体（ＢＡＣ）、または他の運搬手段は、ＤＮＡ塩基配列決定解析に必要な大きなヒトＤＮＡ断片を含む。４００ｋｂのＹＡＣを使用すると仮定すると、ＹＡＣは融点の低いアガーで作ったパルスフィールドゲルで分離し、切り出す。ＰＡＲＴ挿入は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＹＡＣの中に作成する。ＰＡＲＴインサートを容易に回収することを可能にするために、酵母の選択可能なマーカーを含む特定のＰＡＲＴ誘導体を使用し、コレクションを酵母中にプロトプラスト融合により形質転換し、栄養要求性が相補されたものを選択する。ＰＡＲＴインサートは、この方法でＹＡＣ全体から回収される。それから各々のＰＡＲＴインサートを、熱に耐性なポリメラーゼを使用して、サイクルシーケンスによってわきのＤＮＡの配列を両方向から回収するために使用する。ＰＡＲＴインサートを持つＹＡＣは、完全な配列が回収されるまで、ショットガン方式で塩基配列を決定する。配列の本来のリンケージは手法を通じて維持されるため、多くの大スケール塩基配列決定法よりもデータの収集が簡単である。最後に、この過程の多くの局面は、自動化可能である。
ｉｉｉ）ＤＮＡマッピング
上記に記載したようなＰＡＲＴインサートを使用して、ＰＡＲＴマップを興味あるＤＮＡ断片中に作ることができる。ＰＡＲＴは有用な制限部位（６ｂｐおよび８ｂｐ切断）を幾つも含むので、インサートの端からみた挿入位置を、ＮｏｔＩのような酵素でクローンを切断し、適切なゲルでその産物を泳動することによって決定することができる。産物の大きさにより、端および既知の遺伝子またはＮｏｔＩ部位のような他の部位からみた相対的なＰＡＲＴ挿入位置について情報が得られる。それからこのようなＰＡＲＴインサートから得られる塩基配列情報は、マップの位置と関連づけられる。このアプローチは、マップの位置に対して塩基配列をすばやく帰属させることを可能にし、特に全ゲノムの塩基配列を決定する場合には、全配列を完全決定する過程に置いて有用な中間情報となる。他の利点は、様々なマップ位置の本来のリンケージがマッピングを行う過程で維持されることである。または、ＰＣＲマッピング技術を使用して、トランスポゾン末端に対応する一つのＰＣＲプライマーと標的プラスミド中の既知の位置に対応する一つのプライマーとを使用して、挿入の位置をマップすることもできる。生じたＰＣＲ産物の大きさによって、挿入位置および方向が決定されるのである。
２．挿入破壊による遺伝子マッピング
例：酵母遺伝子が、プラスミド中に大きな、例えば１５ｋｂのＤＮＡ断片としてクローン化されている。研究者は、この１５ｋｂの中のどこに当該遺伝子が存在するかを知りたい。このクローンは、酵母での変異表現型を相補することによって最初単離された；従って、遺伝子存在の機能解析が可能である。一連のＰＡＲＴ挿入を、標的プラスミド中に作成し、それから酵母中に形質転換する；相補しないクローンは、興味ある遺伝子中に挿入を含むはずである。選択可能な酵母遺伝子（例えば、ＵＲＡ３，ＴＲＰ１またはＨＩＳ３）を、人工トランスポゾン中に組み込むことが可能で、これによってトランスポゾンが挿入したクローンを酵母中で選択することが単純となり、且つ後に宿主細胞ゲノム中の興味ある遺伝子を直接破壊するのに使用できる遺伝子破壊クローンを容易に同定することができる。
３．他のＤＮＡ断片への機能的または非機能的ＤＮＡシスエレメント、配列、または配列の組み合わせの導入
ｉ）マッピング、欠失の作成、新たなＤＮＡ断片／配列の付加用の制限部位
制限酵素は、多様な目的に使用できる道具である。望みの位置に特定の酵素部位を挿入することによって、その部位は、マッピング、欠失の作成または標的ＤＮＡへの制限部位の付加に使用できる。
例１：選択マーカーの両側に続く２つのＮｏｔＩ制限部位を含む人工トランスポゾンを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで標的プラスミド中に挿入する。少量調製したＤＮＡ（miniprep DNA）を、望ましい領域の中に人工トランスポゾンが位置することを地図作りによってスクリーニングする。または、標的クローン全体に人工トランスポゾンの挿入が含まれる挿入ライブラリーを、どの特定のホスホジエステルボンドに挿入しているかを同定するために、ジャンクションのオリゴヌクレオチドでスクリーニングする。一度適切に位置したトランスポゾンが同定されれば、プラスミドをＮｏｔＩで切断し、トランスポゾンの大部分を除去してＮｏｔＩ制限部位をもつ末端を作成する。ｐＡＴ−１およびｐＡＴ−２の選択マーカーには多くの部位が続くため、このアプローチは、選択できる遺伝子を除去しその部位のインサートのクローニングを可能にする酵素のセットの使用に適用することができる。この一般的なアプローチは、部位特異的突然変異導入法によって制限エンドヌクレアーゼ部位を生み出す方法の代替法もまた提供する。
例２：８００ｋｂのヒトＤＮＡを含む酵母人工染色体（ＹＡＣ）を、人工トランスポゾン挿入を作成するための標的として使用する。挿入を回収すると、１つは機能遺伝子を含まないと考えられる部位の近くの位置にマップされる。人工トランスポゾンは１つのＮｏｔＩ部位を含み、染色体はＮｏｔＩ部位を欠くため、単一の部位は新たな遺伝子をこの位置に挿入するために使用できる。
ｉｉ）プロモータ、エンハンサー、ターミネーター、イントロン、エキソン
例：人工トランスポゾンを、９９個のプロリンの次に３３個のヒスチジンとそれから１１個のチロシンが続くものをコードすることがわかっている遺伝子Ｗの第３エキソンを含むように作成した。通常の哺乳類５’スプライス供与部位、３’スプライス受容部位、およびブランチ受容部位を、選択マーカーと一緒に正しいスプライシングが起こるように適切な位置にトランスポゾン中に組み込む。このトランスポゾンをプラスミド上の遺伝子Ｘ中に挿入し、引き続きプラスミドを培養している哺乳類細胞中に形質転換する。エキソンは、すべてのエキソンでない配列を正確に除いて、遺伝子Ｘの転写されたｍＲＮＡ中に適切に組み込まれたことが分かった。このエキソンによってコードされる領域のタンパク化学は、新たなタンパクにて現在研究されている。
ｉｉｉ）バクテリア、植物、酵母、昆虫、ショウジョウバエ、虫、げっし類、ヒト、一般的な哺乳類を含む、実験的または非実験的生物に有用な薬剤選択または栄養要求マーカー
”マーカー交換（marker swap）”または”マーカー付加”トランスポゾン
目的：制限酵素よりもむしろ挿入反応を使用して、興味あるベクター中への遺伝的マーカーの導入または交換。ＰＡＲＴに似ているが、トランスポゾン末端の間に異なる薬剤耐性（クロラムフェニコール、カナマイシン）または酵母選択マーカー（ＵＲＡ３，ＴＲＰ１，ＨＩＳ３，ＬＥＵ２）を含むトランスポゾンを、選択した標的プラスミド中に挿入できる。生じるプラスミドは、新しいマーカーの取得によって選択し、もし望めば前に存在したマーカーの欠失でスクリーニングできる。
例：興味ある遺伝子と共にアンピシリン耐性マーカーを含むプラスミドがあるとする。後の実験のために、クロラムフェニコール耐性マーカーを含むプラスミドを望み、そのプラスミドはアンピシリン遺伝子が欠失していることが必要であるとする。従って、最終目的は、興味ある遺伝子、クロラムフェニコール耐性マーカーを持ち、およびアンピシリン耐性マーカーはない１つのプラスミドを得ることである。これを達成するために、クロラミフェニコール遺伝子を含む人工トランスポゾンでｉｎ  ｖｉｔｒｏ挿入を行い、クロラムフェニコール耐性になったプラスミドを選択する。次に、プレートをアンピシリンを含むプレートにレプリカし、クロラムフェニコール耐性／アンピシリン感受性のクローンを同定する。新たなマーカーは、アンピシリンマーカー内に挿入されている。
ｉｖ）遺伝子。いかなる興味ある遺伝子もｐＡＴ誘導体中にクローン化でき、標的ＤＮＡ中にトランスポゾンとして直接挿入できる。
例：遺伝子治療を行う医者は、嚢胞性繊維症の原因のヒト遺伝子である嚢胞性繊維トランスメンブレンレギュレーター（ＣＦＴＲ）遺伝子の運搬役として試験するために、多様な新しいアデノウイルス構築物を作成することを望むとする。アデノウイルスゲノムおよびＣＦＴＲｃＤＮＡはどちらも極めて大きいため、制限酵素に基づくストラテジーでは、容易に同定できない。そのかわり、遺伝子治療を行う医者は、選択マーカーを持つｐＡＴ誘導体中にＣＦＴＲプロモーターによって転写されるＣＦＴＲｃＤＮＡをクローン化し、ＣＦＴＲ遺伝子をもつ作成した人工トランスポゾンをアデノウイルスベクター中に挿入する。このように、様々な構築物が迅速に作成され、試験できる。
ｖ）機能的または非機能的ＤＮＡ
任意の塩基配列または組み合わせ配列のＤＮＡ断片も、人工トランスポゾンに組み込ませて、挿入反応を通して標的との組換えを可能にすることができる。
ｖｉ）コドン挿入変異導入
まれに切断する制限酵素（例えば、ＳｒｆＩ、ＧＣＣＣＧＧＧＣを切断する）の制限部位を、人工トランスポゾンの末端のすぐ内側で、選択マーカー（例えばｄｈｆｒ）のわきに位置させることができる。この制限部位は、マーカー（例としてｄｈｆｒ）を含むＳｒｆＩ断片の欠失後、標的プラスミド中に必要な数のコドンを実際に挿入し、その結果新たな塩基が導入されるような位置である（これらは、標的部位の重複、人工トランスポゾン末端の塩基対、および制限部位と、適切な読み枠を確保するのに必要な１つまたは２つの塩基対の付加を含む）。このような人工トランスポゾンを標的プラスミドまたは興味あるコスミド中に挿入して、挿入変異プラスミドまたはコスミドの集団をＳｒｆＩでまとめて消化し、希釈してセルフライゲーションさせる。それから、これらの欠失プラスミドを宿主細胞中に形質転換し、その結果、コドンが挿入された変異体の集団を得る。これらのコドン挿入変異体は、標的ＤＮＡ中にどのような機能がコードされているかを生物学的に研究するために使用できる。制限部位は、ここでもまたコドン挿入を早急にマッピングするのに非常に有用であろう。コドン挿入変異導入の他の方法は、当該技術分野で知られている（３３、３４）。
４．「運搬」転位
人工トランスポゾンは、トランスポゾンを含む標的ＤＮＡの選択を可能にする薬剤耐性マーカー／またはいくつかのマーカーを持つ。トランスポゾンはまた、マーカーの隣に他のＤＮＡ配列（遺伝子のような）を含む。従って、このような構造の人工トランスポゾンにより挿入（インテグレーション）が起こると、薬剤マーカーおよび興味ある遺伝子の両方が導入される。
５．融合タンパク質構築物
人工トランスポゾンは、機能遺伝子の読みわく中に挿入されると融合タンパク質が生産されるようにデザインされる。融合体は、機能遺伝子の読みわくの部分と共に、活性のある融合タンパク質を同定することに使用できるレポーターを含むことができる。
例：ベータガラクトシダーゼ遺伝子を含む人工トランスポゾンを作成する。読みわくは、トランスポゾン末端からベータガラクトシダーゼ遺伝子まで開いている。標的遺伝子中に読み枠を合わせて挿入すると、融合タンパク質はベータガラクトシダーゼ活性を示すものとして生産される。
６．トランスジェニックな構築物
研究中の生物に有用な薬剤選択マーカーを、宿主ゲノム中に下記ＤＮＡ断片を導入するという最終目的のために、クローニングベクター中の遺伝子またはＤＮＡの望ましい領域に導入する。このような一般的なアプローチは、バクテリア、酵母、ショウジョウバエ、線虫、およびマウス並びに他の哺乳類について報告されており、Ｍ．カペッチの研究室より報告されているような挿入破壊（インテグラティブ・ノックアウト）を含む。
例１：研究者は、２０ｋｂのマウスＤＮＡ断片のプロモーター活性を培養細胞および生体内の細胞において調べたいとする。クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ルシフェラーゼ、またはβ−ガラクトシダーゼのようなレポーター遺伝子を含む人工トランスポゾンを、上記２０ｋｂ領域中に挿入し、制限地図によってスクリーニングする。次に、挿入物を細胞培養または一時的な筋注入測定にて発現を試験する。最後に、発現を示す構築物を、トランスジェニク動物を作成するために使用できる。このような動物は、様々な組織または発生段階に置けるプロモーターによる発現をレポーター活性の測定によって研究するのに使用できる。
例２：人工トランスポゾンを、心臓発生の初期の間の心筋組織でのみ機能するヒトの転写のエンハンサー要素を含むように作成する。（プラスミド上にクローン化された）興味ある遺伝子の上流、下流、およびイントロン領域にこのトランスポゾンのコピーを挿入することによって、遺伝子がエンハンサーによって組織特異的および時間的に制御されるような構築物を作成した。これらの構築物は、このような方式で遺伝子が発現されるトランスジェニック動物を作成するのに使用される。
例３：トランスジェニック破壊（ノックアウト）構築物。ＮＥＯ遺伝子を含む人工トランスポゾンを作成し、興味ある遺伝子の５’部分を持つプラスミドクローン中に挿入する。挿入物をスクリーニングし、単一の挿入が遺伝子の第一エキソン中で、翻訳開始コドンＡＵＧのすぐ下流に生じたものを同定する。生じたコンストラクトは、ＥＳ技術によってトランスジェニック動物を作成することによって直接遺伝子を破壊するのに使用される。第二のタイプでは、ホモロガスおよび非ホモロガスな挿入を区別するためにコンストラクトの３’末端に逆選択マーカーを付加することを含む。この逆選択マーカーは、第二の人工トランスポゾンに持たせることができる。この一般的なアプローチは、特定の遺伝子の機能が欠如した”ノックアウトマウス”を作成するためにシャペッチ等によって報告された。
実施例
ｐＡＴ−１の構築
ｐＡＴ−１（ｐＳＤ５４４）およびｐＡＴ−２（ｐＳＤ５４５）は以下のように構築した。まず、プラスミドｐＲＳ３１６（参考文献１５；ｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ誘導体、ストラタジーン）を、アンピシリン耐性（ａｍｐr）遺伝子を除去するように修飾した。これは、ｐＲＳ３１６の２つの断片をライゲーションすることによって行い（２．１ｋｂのＳｓｐＩ断片および２．１ｋｂのＢｓａＩ／ＳｓｐＩ断片）、このようにして機能的なｂｌａ遺伝子を欠いたプラスミドｐＳＤ５２８を作成した；このプラスミドは、このコンストラクト上の酵母ＵＲＡ３遺伝子がバクテリアｐｙｒＦの栄養要求性を相補することから、ピリミジン要求性大腸菌株ＭＨ１０６６中で増殖することができる（１６）。ｐＡＴ−１およびｐＡＴ−２は、図２に示した構造を作成するのに適した配列を含むポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）アダプターでｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴのマルチクローニングサイト（ｍｃｓ）（ただ１つのＫｐｎＩ部位からただ１つのＳａｃＩ部位まで）を置き換えることによってプラスミドｐＳＤ５２８より構築した。これらのＰＣＲアダプターは、プラスミドｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴおよびｐＳＤ５１１をテンプレートとして、プライマーＳＤ１２２（ＪＢ６６１）（５’−ＡＡＡＡ−ＧＣＴＧＧＧ−ＴＡＣＣＧＡ−ＡＣＡＴＧＴＴ−ＣＴＣＧＡＧＧＴＣＧＡＣＧＧＴＡＴＣＧ−３’）およびＳＤ１１３（ＪＢ６６２）（５’−ＧＣＧＡＡＴＴＧＧＡ−ＧＣＴＣＧＡＡＣ−ＡＴＧＴＴＣＡＣＣＧＣ−ＧＧＴＧＧ−ＣＧＧＣＣＧＣＴＣ−３’）を使用して作成した。生じたＰＣＲ産物は、ＫｐｎＩおよびＳａｃＩで消化し、ＫｐｎＩ／ＳａｃＩで消化したｐＤＳＤ５２８にライゲーションしてｐＡＴ−１およびｐＡＴ−２を作成した。これらのコンストラクトの構造は、制限酵素地図および塩基配列解析により確認した。
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ反応条件
典型的なｉｎ  ｖｉｔｒｏＤＮＡ挿入は、２０μｌの反応量で行い、以下を含む。１００−５００ｎｇ人工トランスポゾン（０．８ｋｂ）、１μｇ  ＣｓＣｌで精製した標的プラスミド（標的に対するトランスポゾンのモル比は１０対１）、２μｌの１０Ｘ反応バッファー（１５０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１００ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１００ｍＭ  ＫＣｌ，および１０ｍＭ  ＤＴＴ）、５μｌの２０％［ｗ／ｖ］ＰＥＧ８０００、２μｌ  ＶＬＰ，および水で２０μｌにする。反応液は、摂氏３０度で３０分インキュベートしてから摂氏３７度で１０分インキュベートし、それから１．０μｌ  ０．５ＭＥＤＴＡを加え摂氏６５度で２０分加熱することによって終結させた。最後に、核酸をフェノール／クロロホルム抽出し、エタノール沈澱し、遠心により集め、７０％エタノールで洗浄して、１０μｌＴＥ（１０ｍＭトリス、ｐＨ８．０、１ｍＭＥＤＴＡ）に再懸濁した。１μｌを、エレクトロポレーションによって薬剤耐性になるように６μｌの大腸菌ＤＨ１０Ｂ（ギブコ／ＢＲＬ）に形質転換するのに使用した。
ＰＣＲ，シーケンス、プライマー、プラスミド構築物、ＣｓＣｌ調製
ＰＣＲは、パーキンエルマーから入手した試薬を使用して、文献に記載されたようにして行った（１７）。ＤＮＡシーケンスは、シークエナーゼ（ＵＳＢ）を使用して行い、文献に記載されたようにして解析した（１８）。特注のオリゴヌクレオチドプライマーは、オペロンテクノロジーズ、Ｉｎｃ（アラメダ、カリフォルニア）より入手した。ＰＡＲＴ内側からのシーケンスに使用した２つのプライマーは、ＳＤ１１１（ＪＢ５６３）（５’−ＧＡＣＡＣＴＣＴＧＴＴＡ−ＴＴＡＣＡＡＡＴＣＧ−３’）およびＳＤ１１０（ＪＢ５３２）（５’−ＧＧＴＧＡＴＣＣＣＴＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧ−３’）であった。各々のＰＡＲＴ挿入の挿入部位は、これらのプライマーの１つまたは両方を使用して決定し、ウィスコンシンＧＣＧプログラムの助けをかりて解析した。プラスミドは標準的なＤＮＡクローニング方法（１９）を使用して構築し、ＳＴＥＴ少量調製（２０）またはアルカリ溶解の後ＣｓＣｌ上でバンドにすること（２１）によって大腸菌培養から精製した。
ｐＡＴ−１および誘導体からの人工トランスポゾンの調製
２０μｇのＣｓＣｌで精製したプラスミドＤＮＡを、５０ユニットのＸｍｎＩ（ベーリンガーマンハイム）で４時間摂氏３７度で消化した。生じた断片を、１％アガリース／ＴＢＥゲルで分離し、トランスポゾン断片はＩＢＩ電気溶出装置を使用してゲルから電気溶出した。
アンピシリン／トリメトピリンプレートを使用したトランスポゾン挿入物を保持するクローンの回収
トランスポゾンが挿入されたプラスミドを持つ大腸菌クローンを、１．０ｍＭチアミンＨＣｌ、５０μｇ／ｍｌアンピシリン（Ａｍｐ）および１００μｇ／ｍｌトリメトプリム（Ｔｒｉ；シグマ）を含むＭ９最小培地プレート（２２）上で選択することによって同定した。摂氏３７度で１日から２日インキュベートした後、Ｍ９／Ａｍｐ／Ｔｒｉプレート上に増殖するコロニーの多くは、トランスポゾンが挿入したプラスミドを含んでいた。形質転換体の希釈を、ルーチンに５０μｇ／ｍｌのＡｍｐを含むＬＢプレート上にまいた（２２）；このコントロールは、手法によって獲得が成功した標的プラスミドの数を数えた。Ｍ９／Ａｍｐ／Ｔｒｉプレート上のコロニー数と比較すると、トランスポゾンの挿入頻度を見積もることができた（挿入頻度＝［＃Ｍ９／Ａｍｐ／Ｔｒｉプレート上のコロニー］／［＃ＬＢ／Ａｍｐプレート上のコロニー］）。ＡｍｐRおよびＴｒｉRマーカーの両方を含む陽性のコントロールプラスミドｐＳＤ５１１は、これらの条件下でＬＢ／Ａｍｐ（５０μｇ／ｍｌ）、Ｍ９／Ｔｒｉ（１００μｇ／ｍｌ）、またはＭ９／Ａｍｐ／Ｔｒｉ（５０／１００μｇ／ｍｌ）上で、常にコロニー数が等しかった。
大腸菌の形質転換
この実験に置いて通常形質転換した２つの株は、ＤＨ５α（２３）およびＤＨ１０Ｂ（２４）であった。ＤＨ５αは、文献に記載されたようにエレクトロポレーション用に調製し（２５）、エレクトロコンピテントなＤＨ１０Ｂ細胞はギブコ／ＢＲＬより購入した。エレクトロポレーションによる形質転換は、１ｍｍキュベットおよび以下の条件でバイオラッドジーンパルサーを使用して両株について行った：電流：２５μＦＤ；電圧：１．８ｋＶおよび抵抗：２００オーム。試験プラスミドとしてｐＵＣ１９またはｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴを使用して、調製したてのエレクトロコンピテントＤＨ５αは、一般に１０7−１０8コロニー／μｇＤＮＡの形質転換効率を示す一方、ＢＲＬ／ギブコから購入したエレクトロコンピテントＤＨ１０Ｂは、一般に５Ｘ１０8から５Ｘ１０9コロニー／μｇＤＮＡの効率を示した。
ＶＬＰ調製
ＶＬＰは、文献に記載されたように酵母培養から調製した（２６）。インテグラーゼ活性を含む最終ショ糖勾配から得られる画分を分別し、６ヶ月以上は安定に摂氏−７０度で凍結した。
標的プラスミド上のクローン化した酵母第３染色体セグメント中へのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける”プライマーアイランド”トランスポゾンの挿入
我々は、次に様々な標的プラスミドを使用してｉｎ  ｖｉｔｒｏでＰＡＲＴ挿入を作成した。初めに試験したクローンの内１つは、酵母第３染色体の１３６，１５５から１４４，３３３塩基が広がる８．０ｋｂのインサートを持つｐＲＳ２００骨格（ｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴの誘導体）からなっていた；このプラスミドをｐ７６−２と呼ぶ。１回のｉｎ  ｖｉｔｒｏ挿入反応で、我々はｐ７６−２中におよそ１３，０００個のＰＡＲＴ挿入物を回収した（表１）。
0003832851.tif 000002
反応１）負の形質転換コントロール（ＤＮＡを添加しない）；２）正の形質転換コントロール（ｐＳＤ５１１，ＡｍｐRおよびＴｒｉRマーカーを両方含む）；３）標的としてｐ７６−２を使用した完全な挿入反応；４）反応３と同様、但しＥＤＴＡを添加した（インテグラーゼ活性を阻害する）
ａ．＋、ＥＤＴＡを２５ｍＭになるように添加
ｂ．ＡｍｐR形質転換体の全数
ｃ．ＡｍｐR／ＴｒｉR形質転換体の全数
ｄ．標的プラスミド（ＡｍｐR／ＴｒｉRコロニー）中の転位の数を、形質転換体全数（ＡｍｐRコロニー）で割った
形質転換してアンピシリン耐性になったコロニー数とトリメトプリムおよびアンピシリン耐性になったコロニー数とを比較することによって、我々は、トランスポゾン挿入の回収頻度はおよそ４．２Ｘ１０−5（すなわち、２．４Ｘ１０4標的分子に対して１個の挿入；表１）であると決定した。この頻度は最適化の上限を表すようではないが、多くの挿入が容易に回収されるために十分高く、一方で１個の標的に対して一般に１個のトランスポゾン挿入に限られる程度に十分低い（１個の標的中に２個のトランスポゾン挿入があると、ある目的には有用であるが、その分子はシーケンステンプレートとしては有用でなくなる）。
１５６個のランダムに選択したＡｍｐR／ＴｒｉRコロニーの解析によって、ＰＡＲＴ挿入は、制限酵素地図および／またはシーケンス解析によって決定したところ、ｐＲＳ２００骨格（６．０ｋｂ）および８．０ｋｂの第３染色体インサートの両方を含む標的プラスミドの全領域に起きた（表２）。
0003832851.tif 000003
ａ．このクラスは、制限酵素マッピングにより決定したところ、標的中に２つの独立なインサートを持つようにみられるいくつかのプラスミド、およびインサートのジャンクションを読むことができるＤＮＡシーケンスにより２個の二重の配列が観察されたプラスミドを含む。
これら１５６クローンの８６％以上（１３４個）は、容易に同定できるＰＡＲＴインサートを持っていた；これらのうち、７８個（５０％）はクローニングした８ｋｂインサート中であり、５６個（３６％）はベクター中であった。クローンのうち少数は、二重の制限酵素地図および／またはシーケンスを持つことが分かった。この結果に対するもっともらしい説明としては、２個のプラスミドが１個の大腸菌クローンを形質転換した、または１個の標的プラスミド中に２個のトランスポゾン挿入が起こったという可能性を含む；得られた証拠は、これらのクローンのほとんどはこのような機構によって説明できることを示す。従って、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ挿入反応から回収したクローンの１部は、この理由から直接的なＤＮＡシーケンスには適さない（この実施例では１２％、表２）。同様にベクターへの挿入は挿入物のシーケンスに役に立たない。それにもかかわらず、この１回の反応から解析されたＡｍｐR／ＴｒｉRコロニーの２つに１つは、クローン化したインサートからＤＮＡ配列を得るのに直接使用できた。さらに、たった１５６個の少量調製の解析から、８ｋｂのインサート中に７８個の有用な挿入が得られたということは、１００塩基におよそ１個の挿入という期待された分布に対応する。
隣合ったインサートに対する人工トランスポゾンの個々の挿入の分布は、表３に示す。
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酵母第３染色体の全塩基配列は、既に決定されているので（２７）、我々はインサートのジャンクションの塩基配列を決定することでトランスポゾン挿入の正確な位置を容易に同定できた。実際、７８個のＰＡＲＴ挿入は、８ｋｂインサート全体に渡って分布していた（図３）。これらの挿入の半分より少し少ないものが、正方向であり（３４／７８または４４％）、これはこの標的には方向に関して若干の好み（バイアス）があることを示す。しかし、プライマー伸長はＰＡＲＴの向きに関係なくインサートの両サイドのわきの配列に向けて始まるため、方向の好みはＤＮＡ塩基配列決定の目的のＰＡＲＴ挿入の有用性には影響しない。隣合った挿入間の平均距離は、全体に渡って１０２．３＋／−８８．１であった。間隔のうち６つのみが２５０塩基よりも大きく、これらの内の最大はたった３７７塩基であった。従って、隣合ったトランスポゾンインサート間の間隔のほとんど大多数は、シーケンスの条件下における平均的なプラーマー伸長によって到達できる最大距離以下であった。Ｔｙ１インテグラーゼの特性は、挿入の際に挿入部位のわきに特徴的な５塩基対の標的配列を重複させることである（１０−１２，２８）。予測されるように、５ｂｐ標的部位の重複は、調べたＰＡＲＴ挿入部位のいずれにも見いだされた（この実施例では、挿入の一部のみ両末端をシーケンスした）。欠失またはリアレンジは観察されなかった。
我々の結果に基づいた概念的なプライマー伸長のコンティグマップを、図４に示す。我々は、各々のプライマー伸長により、２５０ｂｐの有用なシーケンス情報を回収できると仮定した。図３に示した７８個のＰＡＲＴ挿入を使用して片鎖または両鎖より１００％のシーケンスが回収できる。ギャップは６つのみが存在する（３つは上の鎖、および３つは下の鎖；各々＜１５０ｂｐ）。しかし、このようなギャップに続く２つの最初のプライマーの伸長は、反対側の鎖の中間でクロスするため、中断されていないＤＮＡ配列は、どちらかの鎖より回収されるであろう。しかしながら、残りの鎖上のギャップは、次のいずれかの方法で埋めることができる：ｉ）適切な制限酵素地図により同定した必要な領域へＰＡＲＴ挿入を追加する、ｉｉ）特別注文プライマーを用いる、またはｉｉｉ）シーケンスの泳動を長くする。もちろん、我々は一回のプライマー伸長から２５０ｂｐのみの塩基配列情報が回収されると仮定した；実際には、通常は自動シーケンサーでは４００ｂｐ以上得られ、開発中の自動シーケンサーでは８００から１０００ｂｐ得ることが可能になっている。従って、解読可能なシーケンスが平均４００塩基に伸びれば、塩基配列の１００％を、７８個よりも少ないＰＡＲＴ挿入を使用して容易に回収できる。
試験した他の標的
酵母第３染色体由来のＤＮＡインサートを含むクローン７６−２に加えて、我々は他の標的プラスミドを試験した。これらのプラスミドは、様々な骨格構造を持ち、様々なクローニングされたインサートを保持していた（表３）。骨格はｐＵＣ１９およびｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴその他を含み、インサートＤＮＡは酵母およびヒトを含む種々の種由来であった。各々の場合において、クローン７６−２で見られた結果と同様の結果が得られた：ｉ）挿入はこれらのプラスミドの全領域にマップされ、ｉｉ）多くの挿入が、個々の標的を使用した反応により容易に回収され、およびｉｉｉ）回収された挿入は常にシーケンス用のテンプレートとして使用できた。さらに、ｐ７６−２以外の２つの場合において（ｐＣＡＲ１４３およびｐＷＡＦ−１；表３）、このシステムは既知でない配列を持つクローンから９０−１００％の塩基配列を回収するのに使用された。従って、人工トランスポゾンのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの挿入は、ほとんどすべてのプラスミドについてよく機能すると期待され、一般に有用なシーケンス技術、および組換えＤＮＡ分子を作成するための標的プラスミド中に新たなＤＮＡ配列を挿入する一般的な手法を提供するものである。
人工トランスポゾンを用いるコスミドＤＮＡのマッピング及び配列決定
我々は、人工トランスポゾンが、Ｔｙ１インテグラーゼを使用してｉｎ  ｖｉｔｒｏで非常に多様な標的プラスミド中に効率よく挿入できることを示した。我々のデータは、プラスミドについて使用したのと同様のプロトコールを使用して、コスミドもまた挿入の標的として使用できることを示している。従って、ＤＮＡマッピング、シーケンス（配列決定）および機能遺伝学的解析を、コスミドクローニングベクター中に増やした大きな（３０−５０ｋｂ）ＤＮＡインサートについて直接行うことが可能である。これらの結果は、人工トランスポゾン挿入の標的が柔軟であることを確立する；原理的には、いかなるＤＮＡ分子もｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける人工トランスポゾンの挿入のための標的として使用できる。生じた組換え体は、インサートの周囲の領域を解析すること、または機能遺伝学的解析および組換えＤＮＡ工学を含めて、組換えＤＮＡ分子によって一般に提供される他の目的に使用することができるが、こられは非限定的例である。
支持するデータ
１．ＡＴ−２挿入をプラスミド中にＡＴ−２挿入を作製したのと同じ方法を使用して、４つの異なるコスミド中に作製した。これらはローリスト（Lawrist)クローニングベクターおよびヒト第１９染色体由来の約３０−５０ｋｂのインサートをそれぞれ含む、ローレンスリバーモアゲノムセンターより入手したＦ２３９３２，Ｆ１３５４４，およびＦ２００８０の３つのコスミド、およびさらにもう１つの、約３０−５０ｋｂのインサートを持つＪＥＤＩ−Ｃコスミドを含む。
２．制限地図。挿入が標的コスミドのあらゆる領域にマップされたことは、プラスミドに付いて観察されたのと同様にほぼランダムな挿入モデルを支持している。
３．ＡＴ−２／コスミド組換え体は、ＡＢＩプリズムサイクルシーケンス技術でのシーケンス用テンプレートとして成功裏に使用された。１００個以上のコスミド組換え体（以前に同定されていなかったコスミド、Ｆ２３９３２由来の１７個を含む）が、シーケンス用テンプレートとして評価され、大多数は（＞９０％）各々のプライマー伸長で非常に精密に（＞９５％）３００から６００ｂｐの配列を読むことが可能であった。
４．以前に同定したコスミドＦ１３５４４の８ｋｂの配列を、ＡＴ−２挿入およびプリズムシーケンス技術で再解析した（図１１参照）。あらゆる入手可能なデータより、他の従来の方法に比較して、この方法は正確な配列情報が十分に回収できるということを示す。
このように、コスミドは構造および配列の両局面において人工トランスポゾン技術にて解析できる。コスミド組換え体はまた、機能遺伝学的解析に使用できることが予測された。大きな組換えコスミド分子として増殖できるＤＮＡインサートを直接解析することの利点は、以下のようである。１）直接的な解析により、インサートの本来のリンケージが解析を通じて保持され、それによってショットガンシーケンスにおけるようにリンケージの破壊に伴う問題を回避でき、２）直接的な解析により、複雑な繰り返し構造を含む”困難な”ＤＮＡインサートを解析でき、および３）１回のトランスポゾン挿入由来のマップおよびシーケンス情報をまとめて使用でき、配列を集めるスキームが簡素化される。
人工トランスポゾンのヌクレオチド配列および構造の多様化
我々の最初の実験は、人工トランスポゾンＡＴ−２について行った。我々の結果は、人工トランスポゾンの配列および構造は自由に変えられるようであることを示唆した。我々は多様な配列および形状を持つ人工トランスポゾンをデザインし、構築することによってこの仮定を試験した。ＡＴ−２のように、これらの人工トランスポゾンは、これらのプラスミドの構築と同じマルチクローニングサイトを使用し、ベクターからトランスポゾンを調製する際には同じＸｍｎＩ制限ストラテジーを使用して、ｐＡＴ−１またはｐＡＴ−２ベクターまたは誘導体中に作製した（図１２）（各々の場合において、人工トランスポゾンがもとのプラスミドに対して持つ関係は、ＡＴ−２に対するｐＡＴ−２と同様である）。実際我々の研究結果は、人工トランスポゾンの配列はトランスポゾン活性を保持しながら実質的に多様性を有しうることを示す。従って、プラスミドまたは線形ＤＮＡ分子工学に適用できる方法を使用して、原理的には如何なる望みの形状でも、人工トランスポゾン中に組み込むことが可能である。以下の人工トランスポゾンを構築し、示したところでは転位または他について試験した。
１．ＡＴ−２。人工トランスポゾンＡＴ−２は、末端に４ｂｐのＴｙ１Ｕ３末端配列（５’−ＡＡＣＡ−３’）；ＰＣＲまたはシーケンスに使用される副末端プライマー部位ＳＤ１１０，１１１，１１８および１１９；マッピング及び遺伝子操作のための、いくつかの副末端制限部位；大腸菌中で抗生物質のトリメトプリムに対する耐性に関して薬剤選択できるｄｈｆｒカセットを含む。ＡＴ−２はプラスミドｐＡＴ−２中に構築された。
２．ＡＴ−２−ＴＲＰ１。このトランスポゾンは、酵母栄養要求マーカーＴＲＰ１をｐＡＴ−２中に存在するただ１つのＨｉｎｄＩＩＩ部位に付加したこと以外はＡＴ−２と同一である。全体のトランスポゾンは、約１．６ｋｂの長さである。ＴＲＰ１マーカーは、バクテリアおよび酵母の両方で選択可能である。ＡＴ−２−ＴＲＰ１は、ＡＴ−２について確立した方法を使用してｉｎ  ｖｉｔｒｏで転位する。挿入は、ほぼランダムに分布していた。標的プラスミドへの挿入および酵母中への形質転換に続いて、標的プラスミド上の機能活性領域の位置が、挿入による不活性化によってマップされた。例えば、酵母ＵＲＡ３およびＬＹＳ２遺伝子（ｐＳＤ５５３）を含む１つの標的プラスミドでは、ＡＴ−２−ＴＲＰ１挿入は、その読み枠の内部に挿入して遺伝子を不活性化して、酵母はＵｒａ−またはＬｙｓ−の表現型になったことが分かった（表４）。しかし、挿入が同じ標的の中でもこれらの遺伝子の外側で起こると、プラスミドは酵母中でＵｒａ＋、Ｌｙｓ＋の表現型を産することができた。すべての場合において、トランスポゾンのＴＲＰ１マーカーによるＴｒｐ＋の表現型は酵母中で観察された。
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脚注：酵母中でのｐＳＤ５５３組換え体の機能解析の結果
２０個の独立なｐＳＤ５５３のＡＴ−２ＴＲＰ１組換え体の機能解析の結果を表にする。組換え体は、最初ｉｎ  ｖｉｔｒｏで作製し、トリメトプリム耐性で選択することで大腸菌中に回収した。挿入部位をマッピングしたのち、各々の組換え体を酵母株ｙＰＨ４９９（ｕｒａ３５２，ｌｙｓ８０１，ｔｒｐ１Ｄ６３）に形質転換し、ウラシル、リジン、またはトリプトファンの欠乏した合成培地上にまいた。最後に、形質転換体を各々の培地プレートにレプリカしてその表現型を調べた。Ｒ＝耐性；Ｓ＝感受性；＋＝特定の栄養を欠く培地上の増殖；−＝増殖しない。シーケンス解析により決定した６つの挿入部位は、最後の欄に示す。
３．ＡＴ−２−ＬａｃＺ。このトランスポゾンは、ＬａｃＺマーカーをｐＡＴ−２のただ１つのＳａｌＩおよびＸｈｏＩ部位の間に挿入したこと以外はＡＴ−２と同等である。全体のトランスポゾンは、約４ｋｂの長さである。ＡＴ−２−ＬａｃＺは、ＡＴ−２について確立した方法でｉｎ  ｖｉｔｒｏにて転位する。挿入が標的に存在する読み枠にフレームをあわせておきた場合、生じた組換え体は、Ｘ−ｇａｌのような指示基質を使用して適切な宿主中で機能を測定できる融合タンパク質をコードする。我々はこのアプローチを８ｋｂの酵母第３染色体断片に付いて試験し、ＡＴ−２−ＬａｃＺはクローン上に存在する既知の遺伝子の位置を正確に予測した。このように、人工トランスポゾンは、レポーター融合タンパク質を作製することによって遺伝子の位置を機能的にマップするのに使用できる。
４．ＡＴ−２−ｎｅｏ。このトランスポゾンは、ｎｅｏカセットがｐＡＴ−２中のただ１つのＨｉｎｄＩＩＩ部位に付加していること以外はＡＴ−２と同等である。このトランスポゾンは、機能を試験していない。
５．ＡＴ−３。このトランスポゾンは、ｎｅｏ遺伝子をコードするカセットをｐＡＴ−１のただ１つのＢａｍＨＩ部位に付加することによって、ｐＡＴ−１から作成した。このｎｅｏカセットは、酵母中ではＧ４１８およびバクテリア中ではカナマイシン耐性を与える。ＡＴ−３は、ＡＴ−２について確立した方法でｉｎ  ｖｉｔｒｏで転位する。ｎｅｏカセットの方向は、左から右で、カセットの左にはＡＴ−３のただ１つのＮｏｔＩ部位、右にはただ１つのＸｈｏＩ部位がある。
６．ＡＴ−４。このトランスポゾンは、ｎｅｏカセットが逆向きであること以外はＡＴ−３と同等である。ＡＴ−４は、ＡＴ−３について確立した方法でｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて転位する。
７．ＡＴ−５。このトランスポゾンは、ｂｌａ（アンピシリン耐性）遺伝子を含むようにデザインされ、他のＡＴ−３と同等である。ＡＴ−５は、デザインしたが作成も試験もしていない。
これらの結果をまとめると、人工トランスポゾンのシス配列は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの転移機能およびほぼランダムな挿入を保持しながら、極めて多様になり得る。従って、望みの形状を持つトランスポゾンを構築し、様々な目的に使用することが可能である。そのような形状としては、機能的および非機能的ＤＮＡ配列、プライマー部位、制限酵素部位、および他の有用な配列を含む。
配列表
(2)SEQ ID NO:1:の情報
(i)配列の特性
(A)  長さ：4164塩基対
(B)  型：核酸
(C)  鎖の数：二本鎖
(D)  トポロジー：輪状
(ii)  分子の種類：ＤＮＡ（ゲノミック）
(iii)ハイポセチカル：NO
(iv)  アンチセンス：NO
(vii)直接の起源：
(B)  クローン：pAT-1
(xi)  配列：SEQ  ID  NO:1:
0003832851.tif 000008
0003832851.tif 000009
0003832851.tif 000010
(2)SEQ ID NO:2:の情報
(i)配列の特性
(A)  長さ：4933塩基対
(B)  型：核酸
(C)  鎖の数：二本鎖
(D)  トポロジー：輪状
(ii)  分子の種類：ＤＮＡ（ゲノミック）
(iii)ハイポセチカル：NO
(iv)  アンチセンス：NO
(vii)直接の起源：
(B)  クローン：pAT-2
(xi)  配列：SEQ  ID  NO:2:
0003832851.tif 000011
0003832851.tif 000012
0003832851.tif 000013
(2)SEQ ID NO:3:の情報
(i)配列の特性
(A)  長さ：864塩基対
(B)  型：核酸
(C)  鎖の数：二本鎖
(D)  トポロジー：線状
(ii)  分子の種類：ＤＮＡ（ゲノミック）
(iii)ハイポセチカル：NO
(iv)  アンチセンス：NO
(vii)直接の起源：
(B)  クローン：PART
(xi)  配列：SEQ  ID  NO:3:
0003832851.tif 000014
(2)SEQ ID NO:4:の情報
(i)配列の特性
(A)  長さ：22塩基対
(B)  型：核酸
(C)  鎖の数：一本鎖
(D)  トポロジー：線状
(ii)  分子の種類：ｃＤＮＡ
(iii)ハイポセチカル：NO
(iv)  アンチセンス：NO
(vii)直接の起源：
(B)  クローン：JB563
(xi)  配列：SEQ  ID  NO:4:
0003832851.tif 000015
(2)SEQ ID NO:5:の情報
(i)配列の特性
(A)  長さ：20塩基対
(B)  型：核酸
(C)  鎖の数：一本鎖
(D)  トポロジー：線状
(ii)  分子の種類：ｃＤＮＡ
(iii)ハイポセチカル：NO
(iv)  アンチセンス：NO
(vii)直接の起源：
(B)  クローン：JB532
(xi)  配列：SEQ  ID  NO:5:
0003832851.tif 000016
(2)SEQ ID NO:6:の情報
(i)配列の特性
(A)  長さ：42塩基対
(B)  型：核酸
(C)  鎖の数：一本鎖
(D)  トポロジー：線状
(ii)  分子の種類：ｃＤＮＡ
(iii)ハイポセチカル：NO
(iv)  アンチセンス：NO
(vii)直接の起源：
(B)  クローン：JB661
(xi)  配列：SEQ  ID  NO:6:
0003832851.tif 000017
(2)SEQ ID NO:7:の情報
(i)配列の特性
(A)  長さ：43塩基対
(B)  型：核酸
(C)  鎖の数：一本鎖
(D)  トポロジー：線状
(ii)  分子の種類：ｃＤＮＡ
(iii)ハイポセチカル：NO
(iv)  アンチセンス：NO
(vii)直接の起源：
(B)  クローン：JB662
(xi)  配列：SEQ  ID  NO:7:
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文献リスト
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２】
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