(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
マーカーとして、グルタチオン付加ヘモグロビンを用いることを特徴とする酸化ストレスの測定方法。
【請求項２】
血液中の赤血球からヘモグロビンを遊出せしめた後、かかるヘモグロビン中のグルタチオン付加ヘモグロビン量を測定することを特徴とする酸化ストレスの測定方法。
【請求項３】
前記グルタチオン付加ヘモグロビン量の測定が、質量分析法、液体クロマトグラフィー法、または酵素免疫測定法によって行なわれる請求項２記載の酸化ストレスの測定方法。
【請求項４】
前記グルタチオン付加ヘモグロビン量が、赤血球から取り出されたヘモグロビンに対する還元処理前後のグルタチオン量を測定することによって、求められる請求項２記載の酸化ストレスの測定方法。
【請求項５】
血液中の赤血球からヘモグロビンを遊出せしめた後、かかるヘモグロビン中のグルタチオン付加ヘモグロビン量を測定し、その測定値より酸化ストレスの状態乃至は酸化ストレスに関係する疾病の病態を分析・評価することを特徴とする臨床検査方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【技術分野】
本発明は、酸化ストレスの測定方法に係り、特に生体の酸化ストレスの状態、換言すれば、生体中の活性酸素乃至はフリーラジカルの量的割合を効果的に把握し得る、臨床検査に好適に用いられるマーカーに関するものである。
【０００２】
【背景技術】
従来から、生体における酸化ストレスが、生体内で生成するスーパーオキシド（Ｏ2 - ）、過酸化水素（Ｈ2 Ｏ2 ）、ヒドロキシラジカル（・ＯＨ）、一重項酸素（1 Ｏ2 ）の如き活性酸素乃至はフリーラジカルにて惹起され、また、それが腎不全や糖尿病、高脂血症、高血圧病、動脈硬化等の各種の疾病の病態に関係することも、明らかにされてきている。
【０００３】
このため、そのような生体の酸化ストレスの状態を把握すべく、各種の手法が検討されており、例えば、脂質の過酸化物がチオバルビツール酸と反応することを利用したＴＢＡ法や、ヘモグロビンを触媒として、脂質の過酸化物とメチレンブルーの誘導体が反応して、メチレンブルーを生成する現象を利用したヘモグロビン・メチレンブルー法（Ｈｂ−ＭＢ法）等が提案され、臨床検査にも利用されてきているが、抽出操作や反応生成物の測定操作が困難であったり、測定感度が低く、精度的に問題を有するものであった。
【０００４】
【解決課題】
ここにおいて、本発明は、かかる事情を背景にして為されたものであって、その課題とするところは、生体の酸化ストレスの状態を把握するのに有効な測定方法を提供することにあり、また、そのような測定に用いられるマーカーを提供することにある。
【０００５】
【解決手段】
ところで、グルタチオンには、還元型グルタチオン（ＧＳＨ）と酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）があり、その中で、還元型グルタチオンには、蛋白質のＳＨ基を維持する作用、赤血球を酸化障害から保護する作用等があることが認められている。そして、かかる還元型グルタチオン（ＧＳＨ）は、グルタチオンペルオキシダーゼによって、活性酸素と反応することで、酸化を防いでおり、そしてそのときに生成する酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）は、グルタチオン還元酵素によって還元型グルタチオン（ＧＳＨ）に還元され、かくして細胞内のＧＳＨ濃度が保たれている。
【０００６】
なお、還元型グルタチオン（ＧＳＨ）は、ヘモグロビンβ鎖９３のシステインとの間でジスルフィド結合すること（Ｈｂ−ＳＨ＋ＧＳＨ  →  Ｈｂ−Ｓ−Ｓ−Ｇ）が報告されており（「J. Biol. Chem.」 261（1986） 14704〜14709 ）、また透析患者や糖尿病患者においては、血漿や赤血球内のＧＳＨ濃度及びグルタチオンペルオキシターゼ活性の低下から、抗酸化作用が低いという報告も為されている（「Am. J. Kidney Dis.」 30 （1997） 489〜494 ）。
【０００７】
かかる状況下、本発明者は、健常者と共に、腎不全患者や糖尿病患者のヘモグロビンについて分析し、グルタチオン付加ヘモグロビンの動態について検討した結果、赤血球から取り出されるヘモグロビン中のグルタチオン付加ヘモグロビン量が、酸化ストレスの状態乃至は酸化ストレスに関係する疾病の病態に、良好に対応していることを見出し、それが、酸化ストレスのマーカーとして有効であることを見出したのである。
【０００８】
そして、本発明は、かかる知見に基づいて完成されたものであって、その要旨とするところは、マーカーとして、グルタチオン付加ヘモグロビンを用いることを特徴とする酸化ストレスの測定方法にあり、また、他の要旨とするところは、血液中の赤血球からヘモグロビンを遊出せしめた後、かかるヘモグロビン中のグルタチオン付加ヘモグロビン量を測定することを特徴とする酸化ストレスの測定方法にある。
【０００９】
なお、このような酸化ストレスの測定方法において、グルタチオン付加ヘモグロビン量の測定は、一般に、質量分析法、液体クロマトグラフィ法、または酵素免疫測定法によって、有利に行なわれ、また他の有効な方法によれば、赤血球から取り出されたヘモグロビンに対する還元処理前後のグルタチオン量を測定することによって、グルタチオン付加ヘモグロビン量が求められることとなる。
【００１０】
また、本発明は、血液中の赤血球からヘモグロビンを遊出せしめた後、かかるヘモグロビン中のグルタチオン付加ヘモグロビン量を測定し、その測定値より酸化ストレスの状態乃至は酸化ストレスに関係する疾病の病態を分析・評価することを特徴とする臨床検査方法をも、その要旨とするものである。
【００１１】
このように、本発明に従って、グルタチオン付加ヘモグロビンをマーカーとして用いて、それのヘモグロビン中の割合（存在量）を測定することにより、その割合が増大することに対応して、酸化ストレスが大きくなることが、容易に且つ簡便に把握され得るのであり、しかも、そのようなグルタチオン付加ヘモグロビンは、ヘモグロビン中に比較的多く存在するものであるところから、測定誤差少なく、精度の高い測定が可能となったのである。
【００１２】
【発明の実施の形態】
要するに、本発明にあっては、グルタチオン付加ヘモグロビンをマーカー（指標）として、酸化ストレスの測定を行なうものであるところから、対象となる生体から血液を採取し、その血液中の赤血球から、常法に従って、例えば通常の溶血操作にて、ヘモグロビンを遊出せしめ、次いで、その遊出したヘモグロビン中のグルタチオン付加ヘモグロビンの量を、公知の各種の測定手法にて測定するようにするのである。
【００１３】
なお、そのようなグルタチオン付加ヘモグロビン量の測定は、有利には、質量分析法（ＭＳ）、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）にて代表される液体クロマトグラフィ法、または酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）にて行なわれることとなる。具体的には、質量分析法（ＭＳ）にあっては、例えば、エレクトロスプレーイオン化液体クロマトグラフィ／質量分析法（ＥＳＩ−ＬＣ／ＭＳ）またはマトリックス・アシステッド・レーザー・デソープション・イオン化質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）が採用され、それによって得られたスペクトル図から、グルタチオン付加ヘモグロビンβ鎖のピークのインタクトβ鎖のピークに対する比を求めることにより、測定が行なわれるのであり、また、高速液体クロマトグラフィ法（ＨＰＬＣ）にあっては、グルタチオン付加ヘモグロビンのピークのヘモグロビン全体に対する存在比を求めることにより実施され、更に、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）にあっては、グルタチオン付加ヘモグロビンに特異的に反応し、インタクトのヘモグロビンには反応しないモノクローナル抗体を用いて、グルタチオン付加ヘモグロビンの量を求めることにより、測定が行なわれるのである。
【００１４】
また、他の望ましいヘモグロビン付加グルタチオン測定法によれば、血液から赤血球を分離、採取した後、その溶血液からヘモグロビンをエタノール沈殿、トリクロロ酢酸沈殿、膜濾過等の公知の手段によって分離せしめ、更に、その得られたヘモグロビンに対して、還元処理が施される。そして、この還元処理の前後で、グルタチオン量を測定することにより、かかる還元によって遊離したグルタチオン量を求め、その値から、グルタチオン付加ヘモグロビンの量を求めるようにするのである。
【００１５】
そして、このようにして得られるグルタチオン付加ヘモグロビン量は、生体内において生成する活性酸素乃至はフリーラジカルの存在量に比例し、従って酸化ストレスの状態に対応するものであるところから、その測定値の大小により、酸化ストレスの大小の状態が直ちに把握され得ることとなるのであり、また、その測定値から、酸化ストレスに関係する疾病、例えば腎不全や糖尿病、高脂血症、高血圧病、動脈硬化等の病気の病態が、効果的に分析乃至は評価され得ることとなるのである。
【００１６】
特に、このように、本発明にてマーカーとして用いられるグルタチオン付加ヘモグロビンは、赤血球のヘモグロビン中に、比較的高い割合において存在するものであるところから、通常の臨床検査において採用されるＨＰＬＣ技術等を利用して、容易に実施することが出来ることは勿論、測定誤差が測定値に与える影響も少なく、それ故に、より正確な測定も可能となったのである。
【００１７】
【実施例】
以下に、本発明の幾つかの実施例を示し、本発明を更に具体的に明らかにすることとするが、本発明が、そのような実施例の記載により、何等の制約をも受けるものでないことは、言うまでもないところである。また、本発明には、以下の実施例の他にも、更には上記した具体的記述以外にも、本発明の趣旨を逸脱しない限りにおいて、当業者の知識に基づいて種々なる変更、修正、改良等を加え得るものであることが、理解されるべきである。
【００１８】
実施例  １
透析患者、糖尿病患者及び健常者から、それぞれ、血液を採取し、ヘパリンまたはＥＤＴＡを添加した後、冷凍保存により、溶血させた。次いで、この溶血試料より、遠心分離手法にて、膜成分を取り除いた後、得られた溶血赤血球を蒸留水で５０倍希釈し、更に、０．２ｗ／ｖ％酢酸水溶液にアセトニトリルを２容量％の濃度で加えてなるＡ液を用いて１０倍希釈し、次いで、０．４５μｍフィルタを通して、目的とする測定試料を調製した。そして、この得られた測定試料の１０μＬを、エレクトロスプレーイオン化液体クロマトグラフィ／質量分析（ＥＳＩ−ＬＣ／ＭＳ）装置に注入して、分析を行なった。
【００１９】
なお、かかるＥＳＩ−ＬＣ／ＭＳ分析は、逆相カラム（TSKgel Phenyl-5PWRP ：東ソー株式会社製、内径：４．６ｍｍ×長さ：７．５ｃｍ）を装着した、トリプルステージ四重極型質量分析計（米国：サーモクエスト社製ＴＳＱ７０００）を用いる一方、逆相カラムの溶離液には、０．２ｗ／ｖ％酢酸水溶液に２容量％のアセトニトリルを添加してなるＡ液と、０．２ｗ／ｖ％酢酸水溶液にアセトニトリルを９０容量％の割合で添加してなるＢ液とを用い、流速を０．５ｍＬ／分として、かかるＢ液を１５〜４５％／３０分のグラジエントとなるようにして、分析を実施した。
【００２０】
そして、このようなＥＳＩ−ＬＣ／ＭＳ分析の結果、ヘモグロビンα鎖（１５１２８Ｄａ）とβ鎖（１５８６８Ｄａ）のスペクトルが得られ、同時に＋１６２Ｄａ及び＋３０５（〜＋３０７）Ｄａシフトした分子が検出された。この＋１６２Ｄａシフトした分子は、α鎖とβ鎖の両方に見られ、グリコヘモグロビンであると考えられた。また、＋３０５（〜＋３０７）Ｄａシフトした分子は、β鎖のみに認められ、還元剤であるジチオスレイトール処理により、殆ど消失したことから、グルタチオン付加体であると同定した。
【００２１】
また、ヘモグロビンとグルタチオンをインキュベートすると、０時間後では＋３０５（〜＋３０７）Ｄａシフトした分子は殆ど検出されないが、１日後〜２週間後にかけて検出され、その割合が徐々に増加することを認めた。
【００２２】
さらに、ヘモグロビンβ鎖に対するグルタチオン付加ヘモグロビンβ鎖の割合をデコンボリュートＥＳＩマススペクトル上のピーク強度から求め、比較した結果、下記表１に示すように、透析患者、糖尿病患者には、健常者に対して顕著に高値を示した。また、透析前後で比較したところ、グルタチオン付加ヘモグロビンβ鎖に有意な変化は、認められなかった。なお、ここで得られた透析患者と健常者のスペクトル図を、それぞれ、図１及び図２に示した。
【００２３】
また、糖尿病患者に対して、還元剤であるビタミンＥ（ニコチン酸トコフェロール）を、６００ｍｇ／日の割合にて、８週間投与した結果、下記表２に示されるように、グルタチオン付加ヘモグロビンβ鎖の割合は、顕著に減少した。
【００２４】
【表１】
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【００２５】
【表２】
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【００２６】
実施例  ２
ＨＰＬＣ装置として、それぞれ日本分光株式会社製の、ポンプ：Ｍｏｄｅｌ８８０−ＰＵ、デガッサー：Ｍｏｄｅｌ  ８８０−５０、ＵＶ／ＶＩＳ検出計：Ｍｏｄｅｌ  ８７５−ＵＶ、記録計：Ｍｏｄｅｌ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｃｏｒｄｅｒ  １２を用いて、実施例１で得られた測定試料の２０μＬを注入し、４１５ｎｍの波長で検出した。
【００２７】
なお、逆相カラムとして、東ソー株式会社製ＴＳＫｇｅｌＧＬＹＣＯ  ＨＳｉ（内径：４．５ｍｍ×長さ：１０ｃｍ）を装着せしめる一方、Ａ液として１０μＭリン酸ナトリウム水溶液（ｐＨ：６．０）を用いると共に、Ｂ液としては１０μＭリン酸ナトリウム水溶液に、２００μＭ過塩素酸ナトリウム水溶液を添加してなる混合液（ｐＨ＝６．０）を用い、流速を１ｍＬ／分として、かかるＢ液を１４〜１００％／４５分のグラジエントとして、ＨＰＬＣ分析を行なった。
【００２８】
そして、かかるＨＰＬＣ分析におけるグルタチオン付加ヘモグロビンのピークを分取して、実施例１と同様に、ＥＳＩ−ＬＣ／ＭＳにて確認し、全体のヘモグロビンに対するグルタチオン付加ヘモグロビンのピークの割合（％）を算出した。その結果を、下記表３に示すが、それより明らかなように、糖尿病患者や腎不全患者では、健常者に比較して、顕著に増加しているのである。
【００２９】
【表３】
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【００３０】
実施例  ３
グルタチオン付加ヘモグロビンを酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）にて測定するために、先ず、モノクローナル抗グルタチオン付加ヒトヘモグロビン抗体を、次のようにして作製した。即ち、グルタチオン付加ヒトヘモグロビンを、フロイント完全アジュバントと共にマウスの腹腔内に注射した。更に、フロイント不完全アジュバントと共にグルタチオン付加ヒトヘモグロビンを、２週間間隔で、５回投与した。そして、この処置を受けたマウスの脾臓から得られた脾細胞を骨髄腫細胞と細胞融合し、ハイブリドーマ細胞を作製した。更に、家兎抗マウス免疫グロブリン抗体被覆プレート、グルタチオン付加ヒトヘモグロビン、ペルオキシダーゼ標識家兎抗ヒトヘモグロビン抗体を用いた酵素免疫測定法により、抗グルタチオン付加ヒトヘモグロビンに対する抗体を産生するハイブリドーマ細胞をスクリーニングした。かくして得られたハイブリドーマ細胞を、マウスの腹腔内に注射し、その得られた腹水から、抗グルタチオン付加ヒトヘモグロビン抗体を精製した。
【００３１】
次いで、グルタチオン付加ヒトヘモグロビンの競合サンドイッチ酵素免疫測定法のために、先ず、実施例１において調製された測定試料（２５μＬ）、または標準グルタチオン付加ヘモグロビン溶液（０〜２００ｍｇ／Ｌ）を、グルタチオン付加ヘモグロビン被覆マイクロプレート内で、ペルオキシダーゼ標識抗グルタチオン付加ヘモグロビン抗体と０．２５％牛血清アルブミンを含むリン酸緩衝液中で、室温にて１時間インキュベートした後、リン酸緩衝液で４回洗浄し、そしてｏ−フェニレンジアミン（１００μＬ）を、マイクロプレート内に添加した。更に、１．６Ｍ硫酸（１００μＬ）を添加し、反応を終了させた後、６２０ｎｍをコントロールとして、４９２ｎｍの吸光度を測定することにより、ＥＬＩＳＡを実施した。
【００３２】
かかるＥＬＩＳＡによる測定結果を、下記表４に示すが、グルタチオン付加ヘモグロビン量は、糖尿病患者や腎不全患者において、健常者に比較して、顕著に増加していることを認めることが出来る。
【００３３】
【表４】
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【００３４】
実施例  ４
透析患者、糖尿病患者及び健常者から、それぞれ、血液を採取し、ヘパリンまたはＥＤＴＡを添加した後、冷凍保存により、溶血させた。次いで、その溶血液（０．１ｍＬ）に、蒸留水：０．４ｍＬとエタノール：０．５ｍＬを添加し、攪拌した後、遠心分離して、沈殿した蛋白質を得た。次いで、この沈殿蛋白質に対して、５０％エタノール水溶液を添加して、遠心分離することにより、上澄み液を得た後、その上澄み液中のグルタチオン量をＨＰＬＣにて測定した。一方、上記の沈殿した蛋白質を、ジチオスレイトールにより還元して得られる液中のグルタチオン量を、「Clin.Chem.」 41 （1995） 1509 〜 1517 に記載の方法に従って、測定した。そして、かかる還元処理前のグルタチオン量と還元処理後のグルタチオン量とから、グルタチオン付加ヘモグロビン量を求め、その結果を、下記表５に示した。
【００３５】
【表５】
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【００３６】
【発明の効果】
以上の説明から明らかなように、本発明は、酸化ストレスのマーカーとして、グルタチオン付加ヘモグロビンを用いるものであって、これにより、各種の測定手法にて、その量的割合が、簡便に且つ容易に測定され得ることとなったのであり、また、それが比較的大きな割合で存在するものであるところから、測定精度も効果的に高められ得て、生体の酸化ストレスの状態が容易に且つ正確に把握され得ることとなった他、そのような酸化ストレスに関係する疾病の病態も、グルタチオン付加ヘモグロビン量に応じて、有利に評価し得るのである。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１において求められた質量分析法による透析患者の血液試料のスペクトル図である。
【図２】実施例１において求められた質量分析法による健常者の血液試料のスペクトル図である。
【図１】
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【図２】
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