(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
超臨界又は液体二酸化炭素を移動相とするカラムクロマトグラフィーにより、脂肪酸及び／又は脂肪酸誘導体の混合物から、分子中に少なくとも１６個の炭素原子を有する不飽和脂肪酸又はこれらのＣ1-6アルキルエステルを回収する方法であって、固定相としてのアルカリで前処理した酸化アルミニウムで、脂肪酸がこれらのＣ1-6アルキルエステルの形態で分離され、所望ならば、そのエステルを鹸化して遊離酸とすることを特徴とする方法。
【請求項２】
アルカリで前処理した酸化アルミニウムが、ビーズ様粒子として可能な限り均一に充填されており、その粒径が約５〜２５μm である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
固定相の前処理が、粒子状酸化アルミニウムをｐＨ範囲約１０〜約１３のアルカリ金属水酸化物又はアルカリ土類金属水酸化物の水溶液と約８〜約２０時間接触させることにより行われる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
水溶液の粘性を、使用上実用的な値に調整するために、その溶液が、水混和性又は水溶性有機溶媒、特にアセトニトリル又はアセトン、で補充される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
アセトニトリルと０．１M 水酸化ナトリウム水溶液の１０：９０（v/v）混合物が、酸化アルミニウムの前処理のために使用される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
場合により前もって精製した、及び／又は化学処理した魚油が、脂肪酸及び／又は脂肪酸誘導体の混合物として使用される、請求項１〜５に記載の方法。
【請求項７】
前もってＣ1-6アルカノールでエステル化した魚油、特にエタノールでエステル化した魚油が、脂肪酸及び／又は脂肪酸誘導体の混合物として使用される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
約３０℃〜約１００℃の温度範囲、かつ約１４０バール〜約３２０バールの圧力で行われる、請求項１〜７に記載の方法。
【請求項９】
温度範囲が、約４５℃〜約７５℃であり、圧力範囲が、約２２０バール〜約２６０バールである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
エイコサペンタエン酸、ドコサペンタエン酸又はドコサヘキサエン酸を、これらのエチルエステルを介して回収するのに使用される、請求項１〜９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、不飽和で場合により誘導体の形である脂肪酸を、他の成分、例えば、飽和で場合により誘導体の形の脂肪酸、とのこれらの混合物からカラムクロマトグラフィーにより回収する方法に関する。
【０００２】
栄養学及び医学的観点からの不飽和、特にポリ不飽和脂肪酸（「ＰＵＦＡ」と略す）には長期にわたり科学的関心がもたれているところである。ある種の脂肪酸、特にＰＵＦＡは、重要な生物学的作用（とりわけ、血小板凝集、炎症並びにアレルギー）を担う、プロスタノイド化合物、とりわけプロスタグランジン、トロンボキサン及びロイコトリエンの前駆体であることは、よく知られている。特に、２つの「ω−３」−ＰＵＦＡ（最初の二重結合が、この酸の末端メチル基から３番目の炭素原子に位置する）であるエイコサペンタエン酸（「ＥＰＡ」）とドコサヘキサエン酸（「ＤＨＡ」）は、「文明病」、特に心血管疾患、例えば、心筋梗塞とコレステロールレベルの上昇、の治療と予防に有効な物質として有用である。また、ω−６−ＰＵＦＡ（最初の二重結合を６番目の炭素原子に有する）と同様ω−３−は、幼児の全身の成長と共に網膜と脳の成長において必須の役割を果たすという知見も知られている。したがって、ω−３−及びω−６−ＰＵＦＡは母乳中に検出することができる；母乳で育てられる子供が、母乳で育てられない子供よりも有意に速く発育することは確かに真実である。更には、特にエイコサペンタエン酸とドコサヘキサエン酸は、動脈硬化症の制御、コレステロールレベルと血中脂肪レベルの低下、また血小板凝集、慢性炎症（例えば、慢性関節リウマチや神経皮膚炎）、及びアレルギーの防止における有用な活性に関して、最近集中的に研究されている。
【０００３】
天然の油脂、特に魚油、海洋動物油及び植物油は、ω−３−及びω−６−ＰＵＦＡの重要な供給源であり、これらは主にグリセリドやリン脂質の形で存在し、多くの好ましくない二次産物や不純物を伴っている。前述のω−３−ＰＵＦＡであるエイコサペンタエン酸とドコサヘキサエン酸は主に魚油中にあり、一方例えばω−６−ＰＵＦＡであるアラキドン酸やリノール酸は主に動物脂肪や植物油、例えばトウモロコシ油、中に存在する。前述した、ＰＵＦＡを摂取又は投与することによる利点と、食事でとる油脂中の目的の長鎖ＰＵＦＡの全含有量が約１０〜２１％の範囲である（例えば、魚油中のω−３−及びω−６−ＰＵＦＡは約１２〜１８％の範囲にある）という事実からすると、適切な摂取量のω−３−ＰＵＦＡをとるためには日常の食事で大量の魚を消費しなければならない。しかしこのことは、種々の理由により実際的でない。したがって幾つかの製造業者は、何十年も市販されていた天然濃度の油を含有する魚油を販売することに加えて、エステル又は再置換したトリグリセリドとして可能な限り純粋な形の濃縮ＰＵＦＡを含有するカプセルを販売している。可能な限り純粋な個々のＰＵＦＡに対する需要は依然としてある。
【０００４】
【従来の技術】
ＰＵＦＡを含有する混合物、例えば、魚油、海洋動物油又は植物油自体、あるいはこれらの精製したもの、のアルカリ加水分解、続いてアルコール、特にエタノール、による再エステル化により、対応するアルキルエステルが生成する。続くアルキルエステル混合物の分離技術については、とりわけ超臨界ガス、特に二酸化炭素、による向流抽出により、存在する炭素原子の数に応じて実質的な分離が行われることは知られている。このように、同じか又は比較的近い炭素原子数を有する比較的高純度のＰＵＦＡ、例えばエイコサペンタエン酸（Ｃ20）とドコサヘキサエン酸（Ｃ22）の６０％純度の混合物、の画分が得られる。経験上、このような飽和度（二重結合の数）に応じて分離しようとすることは可能ではない。しかし、個々のＰＵＦＡの生理学的活性を研究するために、かなり高純度の画分が必要である。従前の分離方法は不適切なため、とりわけ、例えば個々のω−３−ＰＵＦＡであるエイコサペンタエン酸とドコサヘキサエン酸が別々に作用するのか、あるいは相乗的に作用するのかを解明することは未だできていない。このことはドコサヘキサエン酸と常に一緒に投与されることとなるドコサペンタエン酸にも当てはまる。
【０００５】
ＰＵＦＡ、特に分子内に少なくとも１６個の炭素原子を有する栄養学的に及び医学的に興味がもたれるＰＵＦＡを分離することにより、炭素原子数のみでなく二重結合の数に応じてそれぞれのＰＵＦＡが利用できるようになり、こうしてＰＵＦＡは日常の栄養補給としてだけでなく、特に医薬として投与することができることとなる。
【０００６】
幾つかの文献が分取用超臨界流体クロマトグラフィー（「ＳＦＣ」と略す）の分野で出されており、これらの大部分はM. Perrut の率いるグループの業績によるものである〔例えば、LC-GC (Magazine of Liquid and Gas Chromatography) 6, 10 (1988), 914 を参照〕。これらの文献によると、魚油から得られ、対応するエチルエステルに再エステル化されたドコサペンタエン酸とドコサヘキサエン酸は、ＳＦＣを使用する充填カラムで分離して分取することができる。シリカ充填カラムを使用すると、エイコサペンタエン酸とドコサヘキサエン酸はそれぞれ９６％と８５％の純度を達成することができた。ドコサペンタエン酸の分離に関する情報はないが、ドコサヘキサエン酸で達成された８５％という相対的に低い純度から考えて、この方法ではドコサペンタエン酸を分離することは不可能であることが示唆される。
【０００７】
不飽和脂肪酸又はその誘導体を、これらを含有する植物又は動物混合物から回収するＳＦＣカラムクロマトグラフィー法はヨーロッパ特許（ＥＰ）第５５８，９７４号により公知となった。この方法では超臨界又は液体二酸化炭素が移動相として使用され、特に規定されたコーティング相が固定相として使用される。この固定相は、通常シリカゲル又は酸化アルミニウムよりなる基本構造を特徴とし、この基本構造が、それぞれ、例えばアミノ基（例えばアミノプロピル中に）又はニトロ基、あるいはフェニル基又はシアノ基（例えばシアノプロピル中に）を含有する物質中に存在するような、遊離電子対及び／又は多重結合を有するコーティング相と共に提供されることが必要である。二酸化炭素を移動相とするが、コーティングされていない基本構造（特に酸化アルミニウム）を使用するＳＦＣカラムクロマトグラフィーによって個々のＰＵＦＡの分離が有効に行えることは、ヨーロッパ特許（ＥＰ）第５５８，９７４号では何ら示唆されていない。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、脂肪酸及び／又は脂肪酸エステルの混合物からカラムクロマトグラフィーにより、有用な不飽和脂肪酸をそのまま又はその誘導体の形で、特に前もって調製したこれらの脂肪酸の低級アルキルエステルとして、回収するための新規な方法を提供することであり、即ち技術の現状の問題点を大部分解決した方法を提供することである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明の方法は、脂肪酸及び／又は脂肪酸誘導体の混合物から、固定相として酸化アルミニウム、場合によりアルカリで前処理したものを使用することを特徴とし、超臨界又は液体二酸化炭素を移動相としたカラムクロマトグラフィーにより分子中に少なくとも１６個の炭素原子を有する不飽和脂肪酸又はこのような脂肪酸の誘導体を、回収する方法である。
【００１０】
【発明の実施の形態】
原則本発明の方法は、前もって減圧下にしておくこともできる脂肪酸及び／又は脂肪酸誘導体の混合物を、超臨界又は液体二酸化炭素の移動相と一緒にして、全混合物を、場合により次に移動相を追加して、前述の固定相を充填したクロマトグラフィーカラムに適用し、次いで溶出し、この溶出は、固定相と混合物の個々の成分との間の強力な相互作用を考慮して、温度と圧力条件を選択して行われるのであり、これらの成分の一時的な分離が達成され、検出手段により測定される受器中での連続的検出（測定）後にカラムから逐次溶出される二酸化炭素に溶解されている成分（溶出液）を集めて、集めた物質から減圧（揮発化）により二酸化炭素を除去し、最終的に得られた分離された成分、即ち「画分」（とりわけ目的の不飽和の脂肪酸又は脂肪酸誘導体）は、個々の受器中においては、二酸化炭素を含まない。必要であれば、カラムからの溶出脱離の後、溶出液は、成分を更に十分に分離するために１つ以上の更なるこのようなクロマトグラフィー法を行うことができる。これは、必要な純度に達していない任意の画分についても適用される。
【００１１】
本発明の方法を実施すると、少なくとも１６個の炭素原子を有する不飽和脂肪酸の混合物中に元々存在する誘導体、例えば、低級アルキルエステル又は天然トリグリセリドが用いた混合物から得られるが、脂肪酸自体を目的とするならば、これは従来法、例えば、低級アルキルエステル又はトリグリセリドを鹸化することにより、その誘導体から得ることができる。また、このような化学処理後に得られた不飽和脂肪酸の濃縮が十分でない場合には、各々の生成物について、得られる溶出物で必要な純度が達成されるまで本発明の方法を行うことができる。
【００１２】
少なくとも１６個の炭素原子を分子中に有する少なくとも１つの不飽和脂肪酸又はその誘導体を含有する任意の混合物が、本発明の方法で使用される脂肪酸及び／又は脂肪酸誘導体の混合物として適切である。即ち、とりわけトリグリセリド、アミド、リン脂質、ラクトン及び塩の形の目的の脂肪酸、更には他の脂肪酸やこれらのトリグリセリドのような誘導体、ステロール、例えばコレステロール、ビタミン、例えばトコフェロール、及び不純物と通常考えられている物質、例えばポリクロロビフェニル（ＰＣＢ）、ポリ芳香族炭化水素（ＰＡＨ）、除草剤、ダイオキシン、重金属、飽和脂肪酸又はその誘導体の酸化生成物及び分解産物、前段階で使用した濃縮又は精製工程などからの残留溶媒又は試薬を含む植物又は動物（海洋動物を含む）由来の油脂を使用することができる。あるいは、前もって精製及び／又は化学処理、特にエステル化又は再エステル化した粗物質（油脂）を使用することができる。好適には、トリグリセリドが存在するとき、対応する油脂、場合により前もって精製されたもの、を酸又はアルカリ加水分解して、ここに含まれるトリグリセリドを対応する酸に変換するか、あるいは低級アルキルアルコール、特にＣ1-6 −アルキルアルコール、特にエタノールでエステル化して、不飽和及び飽和脂肪酸のトリグリセリドをエステル交換して対応する低級アルキルエステルにする。この加水分解又はエステル化は従来法で行うことができる。好適な原料、場合により前もって精製及び／又は化学処理されたものは、魚油、例えばサーディン油及びマグロ油、これらは最も需要のあるエイコサペンタエン酸及びドコサヘキサエン酸の有用な供給源であるため、更には動物脂肪及び植物油、例えばトウモロコシ油、こちらも多くの需要のあるアラキドン酸及びリノール酸の有用な供給源であるため、であり、魚油が特に好適な原料である。
【００１３】
脂肪酸及び／又は脂肪酸誘導体の混合物は通常希釈せずに超臨界又は液体二酸化炭素と一緒に、本発明で使用される固定相を充填したクロマトグラフィーカラムに適用されるが、前もって適切な溶媒、例えば低級アルカン、好適にはｎ−ヘキサンに溶解してもよい。しかし好適にはこの混合物は希釈しないで使用される。
【００１４】
本発明の方法に使用される超臨界二酸化炭素は、公知のように少なくとも約３１℃の温度で少なくとも約７３バールの圧力で維持される二酸化炭素の形態であり、純粋に液体でも純粋に気体でもないが、この２つの物理的形態のハイブリッドである。本発明の方法でそれに代えて使用できる液体二酸化炭素は、約３１℃未満の温度と約７３バールを超える圧力を有する。二酸化炭素を使用する利点は、その非毒性、非引火性であることと、分離した不飽和脂肪酸又はその誘導体に有害な可能性のある残留物を残さないで、集めた溶出液を減圧にすることにより容易に除去できることにある。更に二酸化炭素は、高純度かつ安価に広く入手可能であり、そして必要であれば、移動相の一部として有機共溶媒（「モディファイアー」）、例えば、上述のｎ−ヘキサン、更には低級アルカノール、例えばメタノール又はエタノール、及び低級脂肪族ケトン、例えばアセトンと共に使用することができる。二酸化炭素の臨界温度は室温よりそれほど高くないという、また本発明により回収すべき不飽和脂肪酸又は脂肪酸誘導体は温度感受性（熱不安定性）であるという、これらの理由により、二酸化炭素は、本発明の方法で用いる移動相として非常に適切である。
【００１５】
本発明の方法で固定相として使用される酸化アルミニウム、そして、これは本発明の特徴であるが、有利には非対称形又は好適にはビーズ様（球形）の粒子として存在し、これは可能な限り均一に充填され、粒径は約５〜２５μm である。このようなビーズ様酸化アルミニウムは市販品として容易に購入することができる。市販されている酸化アルミニウムの例としては、アルスファー（Aluspher）（登録商標）Ａｌとスフェリソルブ（Spherisorb）アルミナを挙げることができ；前者は、比表面積ＳBET １７０m2/g、細孔容積Ｖp ０．５ml/g、孔径Ｄ  １００Å、及び粒径ｄｐ50５μm を有し、一方後者は、ＳBET ９３m2/g、Ｄ  １３０Å、及びｄｐ50は同様に５μm を有する。種々の製造業者、例えばＩＣＮバイオメディカル社（ICN Biomedicals Inc.）から破砕物質は入手可能である。これらの酸化アルミニウムは、粒度分布３〜６μm 、７〜１２μm 、１０〜１８μm 又は１８〜３２μm を特徴とする。これらの物質の比表面積ＳBET は２００m2/gであり；細孔容積と孔径は球形物質と同等である。
【００１６】
固定相として（未処理の）酸化アルミニウムを直接使用する代わりに、酸化アルミニウムを使用前にアルカリ前処理することもできる。この前処理は原則的に、約１０〜約１３のｐＨ範囲で数時間以上、有利には約８〜約２０時間以上、粒状酸化アルミニウムを、アルカリ金属水酸化物又はアルカリ土類金属水酸化物、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム又は水酸化カルシウムの水溶液と接触させるものである。アルカリ金属水酸化物又はアルカリ土類金属水酸化物水溶液の濃度は、有利には約０．０１M 〜約０．１M の範囲である。必要であれば、使用上実用向きの値にその水溶液の粘性を調整するために、アルカリ金属水酸化物又はアルカリ土類金属水酸化物水溶液に、水混和性又は水溶性有機溶媒を補充することができる。これは、例えば、極性有機溶媒であるアセトニトリル又はアセトンを用いて行える。約１３のｐＨ値を有する、アセトニトリルと０．１M 水酸化ナトリウム水溶液の１０：９０（v/v)混合物が特に適切であることが判った。
【００１７】
実用上の理由で酸化アルミニウムのアルカリ前処理は、有利には既にクロマトグラフィーカラムに充填した酸化アルミニウムに、数時間以上、好適には約１２〜１６時間でアルカリ性溶液を連続的に流して、次にこうして前処理した酸化アルミニウムを、カラムから出てくる洗液が中性になるまで蒸留水で洗うことにより行われる。前処理した酸化アルミニウムから残留水を除去するために、カラムを５０℃と９０℃の間で約４〜１０時間加熱して、続いて低級アルカン、好適にはｎ−ヘプタンで数時間、好適には８〜２０時間前処理した酸化アルミニウムを洗うことが適切である。次いで、こうして前処理した酸化アルミニウムを本発明の方法の固定相として使用することができる。アルカリで前処理した酸化アルミニウムの使用は、本発明の方法の好適な一面である。
【００１８】
本発明の方法における移動相として使用される二酸化炭素を超臨界又は液体範囲に維持するために、固定相を充填したクロマトグラフィーカラム中に二酸化炭素を導入する間だけでなく続いての溶出の間も、ある温度と圧力条件を維持する必要がある。本方法は有利には約３０℃〜約１００℃の温度範囲で約１４０バール〜約３２０バールの圧力で行われるが、未処理の酸化アルミニウムの代わりにアルカリで前処理した酸化アルミニウムが使用される時には、他は同等の条件であるが、適切な圧力はもっと低い。好適には、温度範囲は約４５℃〜約７５℃であり、対応する圧力範囲は約２２０バール〜約２６０バールである。二酸化炭素の濃度は圧力と温度を介して調整することができ、前記温度と圧力範囲では最適な二酸化炭素濃度は、約７２０kg/m3 〜約８５０kg/m3 である。
【００１９】
本発明の方法の実施において、固定相として酸化アルミニウムを用いることにより、種々の不飽和の脂肪酸又は脂肪酸誘導体、存在する場合には飽和の脂肪酸又は脂肪酸誘導体を、一方では鎖の長さ（Ｃ原子の数）により、そしてもう一方では飽和度（二重結合の数：この数が大きいほど、飽和度が低い）によりクロマトグラフィーでの分離ができる。二重結合の一定の数からは、飽和度による選択性が支配的であると考えられる。分離すべき脂肪酸又は脂肪酸誘導体が、例えばエルカ酸（２２個のＣ原子、１個の二重結合：“２２：１”）のようにただ１個の二重結合を有するならば、鎖の長さによる選択性は明らかに従属的であり、この脂肪酸又は誘導体は、より短いが不飽和度の高い不飽和脂肪酸又は誘導体、例えば２０：５の脂肪酸であるエイコサペンタエン酸、のレンジの前に溶出する。一方、２０：５、２２：５及び２２：６の脂肪酸（各々エイコサペンタエン酸、ドコサペンタエン酸及びドコサヘキサエン酸）の溶出において、同じ数の二重結合を有する短い鎖の酸に対してより長い鎖の酸、そして、飽和度の高い酸に対して飽和度の低い酸は各々の場合に固定相に長く残留するため、最初に２０：５の脂肪酸が溶出し、次いで２２：５の脂肪酸、そして最後に２２：６の脂肪酸が溶出する。特に後者のレンジ（Ｃ原子の数２０〜２２及び／又は二重結合の数５〜６）に、栄養学及び医学の分野で非常に重要な不飽和脂肪酸があり、ここでは過剰なテーリングなしに明確なクロマトグラフィー分離が達成される必要がある。
【００２０】
本発明の方法を実施する時の温度と圧力条件だけでなく、固定相として未処理酸化アルミニウムを使用するかアルカリで前処理した酸化アルミニウムを使用するかいずれを選択するかによって分離の結果が影響される。一般に、温度を上げるか圧力をさげると異なった脂肪酸の溶出液は、経時的に分れて溶出し、圧力を上げるか温度を下げると一緒に溶出されるため、これらのパラメーターを任意に変化させて本発明の方法の経時変化を決定することができる。酸化アルミニウムのアルカリ前処理により、その表面上の活性中心（ルイス酸及び塩基が支配的）をブロックすることができるため、この酸化アルミニウムはその極性が弱められる。溶出の順序はこの処理により改変されないが、極性多重不飽和脂肪酸のテーリングは減少して溶出時間は大幅に短くなる。例えば、未処理酸化アルミニウムで６５℃で２８０バールで本発明の方法が実施される時、最後に溶出される２２：６の脂肪酸が、かなりのテーリングを伴って約３０分後には溶出されるとすると、アルカリ処理した酸化アルミニウムで同じ温度と圧力下で行うと、テーリングは非常に減少して、溶出がほぼ１／３時間後に達成される。このため、アルカリで前処理した酸化アルミニウムを使用することは本発明の方法において未処理の中性酸化アルミニウムを使用することよりも好適である。
【００２１】
クロマトグラフィーカラムから連続して溶出する二酸化炭素に溶解された成分（溶出液）の検出は、好適にはＵＶ検出器と、次にフレームイオン化検出器（ＦＩＤ）で連続して行われる。ＵＶ検出器は二重結合の数による成分の評価ができるため、個々の成分について構造の評価を限定的に行うことができる。ＦＩＤを使用することにより、受器中の異なる溶出液の区分が電子的に行われる。このような技術は、各コレクションから二酸化炭素を除去（減圧により）する方法同様、それ自体公知である。
【００２２】
本発明の方法は、２０：５の脂肪酸であるエイコサペンタエン酸、及び２２：６の脂肪酸であるドコサヘキサエン酸の回収、それぞれ直接に又はその誘導体として、好適にはエチルエステル、としての回収に特に適している。
【００２３】
【実施例】
本発明は以下の実施例に基づき説明される。
【００２４】
実施例１
本方法の実施
エタノールでエステル化した魚油からの成分、特に不飽和脂肪酸エチルエステルのクロマトグラフィーによる回収を研究するために、カルロエルバ・インスツルメンツ（Carlo Erba Instruments）による装置（図１参照）を使用した。この装置に二酸化炭素（ＣＯ2)シリンダーを介して連続的に移動相を供給した。移動相は、超臨界範囲（約３１℃以上、約７３バール以上のＣＯ2)又は臨界以下の範囲で圧力と温度条件を選択して操作することができる。
【００２５】
ＣＯ2 はシリンダーからポンプチャンバー中に引き入れて、そこでサーモスタットを使用して最初に−６℃に凝縮した。フラスコをステップモーターを介して操作して、移動相を目的の圧力に圧縮した。スプレーポンプの圧力とカラムオーブンの温度はコンピュータにより調整することができた。移動相は目的の圧力で装置内を流れて、最初に注入系を通過する。ここで流動して通過する移動相に、双方向バルブを介して試料を添加した。この添加時間は場合により０から９９９msecの間で変化させてもよい。添加する試料の容量は常に０．５μl であった。次に試料は移動相と共にカラムへと進んだ。ここで、固定相と試料溶液の個々の成分との間の相互作用の強度が異なることに基づいて、混合物の分離が起こった。混合物の個々の成分は（理想的な場合）連続してカラムから溶出した。カラムはオーブン内に置いてあるため、温度によって溶出挙動を変化させることも可能であった。カラムで分離した物質（とりわけ不飽和脂肪酸エチルエステル）の検出（測定）は、ＵＶ検出器と、次にフレームイオン化検出器（ＦＩＤ）で連続して行った。
【００２６】
実施例２
酸化アルミニウム固定相のアルカリ前処理
酸化アルミニウムを充填したクロマトグラフィーカラムを、数時間（１２〜２４時間）アセトニトリル中の０．１M 水酸化ナトリウム水溶液の混合物（９０：１０％v/v)で濯ぎ処理した。結果としてこの溶液のｐＨ値は１３になった。カラムを蒸留水で洗浄して中性にし、約４〜１０時間５０℃と９０℃の間に加熱して、続いてｎ−ヘプタンで１２〜１８時間コンディショニングさせた。
【００２７】
実施例３
本方法の実施（別の実施態様）
内径を大きくしたカラム操作のため、結果として流量を増加させるために、ニューウェイズオブアナリティクス（New Ways of Analytics)装置（図４参照）を使用した。この装置にＣＯ2 導管を介して連続的に移動相を供給した。この移動相は、超臨界範囲（約３１℃以上、約７３バール以上のＣＯ2)又は臨界以下の範囲で、圧力と温度条件を選択したものに従って操作することができた。この目的のため、ＣＯ2 容器から圧力モジュールＰＭ−１０１のサーモスタット中に流入するＣＯ2 を、サーモスタットを使用して−６℃に凝縮した。空気フラスコポンプで移動相を３００バール〜４００バールの圧力に圧縮した。圧縮した移動相を、ここに連結した圧力低下モジュールＰＲ−１０２で目的の圧力に低下させて、圧力モジュールＰＭ−１０１の操作により起こる更なる圧力変動を抑制した。移動相は、圧力低下モジュールＰＲ−１０２で選択した圧力で装置内を流れて、最初に注入バルブを通過する。ここで６方向バルブ（レオダイン（Rheodyne）７１２５）を介して、流動する移動相に試料を注入した。注入する試料の容量は、５μl から数ミリリットルまでの適切な試料サイズを種々選択することができる。次に試料は移動相と共にカラムへと進んだ。ここで、固定相と試料溶液の個々の成分との間の相互作用の強度が異なることに基づいて、混合物の分離が起こった。理想的な場合、混合物の個々の成分は連続してカラムから溶出した。カラムは加熱キャビネット内に置いてあるため、温度によって溶出挙動に影響を及ぼすことも可能であった。カラムで分離した物質は、ＵＶ検出器を介して記録して、そこからクロマトグラフィーソフトウェアに伝達した。このソフトウェアによって、分離された成分の流出を可能にするバルブのスイッチ切り替えができた。続いて圧力放出ユニットＰＥ−１０３を介して超臨界相の圧力放出を行った。
【００２８】
本発明の実施態様として以下のものが挙げられる。
【００２９】
１．酸化アルミニウム又はアルカリで前処理した酸化アルミニウムが、ビーズ様粒子として可能な限り均一に充填されており、その粒径が約５〜２５μm である、請求項１に記載の方法。
２．アルカリで前処理した酸化アルミニウムが、固定相として使用され、この前処理は、粒子状酸化アルミニウムをｐＨ範囲約１０〜約１３のアルカリ金属水酸化物又はアルカリ土類金属水酸化物の水溶液と約８〜約２０時間接触させることにより行われる、請求項１又は上記１に記載の方法。
３．水溶液の粘性を、使用上実用的な値に調整するために、その溶液が、水混和性又は水溶性有機溶媒、特にアセトニトリル又はアセトン、で補充される、上記２に記載の方法。
４．アセトニトリルと０．１M 水酸化ナトリウム水溶液の１０：９０（v/v)混合物が、酸化アルミニウムの前処理のために使用される、上記３に記載の方法。
【００３０】
５．場合により前もって精製した、及び／又は化学処理した魚油が、脂肪酸及び／又は脂肪酸誘導体の混合物として使用される、請求項１又は、上記１〜４に記載の方法。
６．前もってエステル化した魚油、特にエタノールでエステル化した魚油が、脂肪酸及び／又は脂肪酸誘導体の混合物として使用される、上記５に記載の方法。
７．カラムクロマトグラフィ工程が、約３０℃〜約１００℃の温度範囲、好ましくは約４５℃〜約７５℃で、かつ約１４０バール〜約３２０バールの圧力、好ましくは約２２０バール〜約２６０バールで行われる、請求項１又は、上記１〜６に記載の方法。
８．エイコサペンタエン酸又はドコサヘキサエン酸を、そのまま又はそのエチルエステルとして回収するのに使用される、請求項１又は、上記１〜７に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【図１】成分のクロマトグラフィーからの回収を調べるのに用いたカルロエルバ・インスツルメンツによる装置。
【図２】得られたクロマトグラム。
【図３】得られたクロマトグラム。
【図４】内径の大きなカラムの操作に用いたニューウェイズオブアナリティクス（ＮＷＡ）装置。
【図５】ＮＷＡ装置を用いて得られた、固定相として粉砕酸化アルミニウムを用いた後のＵＶクロマトグラム。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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