(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（１）で示されるラセミ体シアンヒドリンに、該シアンヒドリンのシアノ基を不斉加水分解する能力を有する、ロドコッカス  エスピー（Rhodococus sp.）、ゴルドナ  テラエ（Gordona terrae）、シュードモナス  エスピー（Pseudomonas sp.）およびブレビバクテリウム  アセチリカム（Brevibacterium acetylicum）から選ばれる少なくとも1種の微生物またはその処理物を作用させることにより、該シアンヒドリンを旋光性が（＋）または（−）である下記一般式（２）で示されるα―置換―α―ヒドロキシ酢酸に変換する光学活性α―置換―α―ヒドロキシ酢酸の製造法。
【化１】
0003756541.tif 000006
【化２】
0003756541.tif 000007
〔式中、Rはピリジル基、フリル基、チエニル基またはシクロヘキシル基を表す〕
【請求項２】
微生物が、ロドコッカス  エスピー（Rhodococus sp.）HT４０−６（FERM P−１１７７４）、ロドコッカス  エスピー（Rhodococus sp.）SK９２（FERM BP−３３２４）、ゴルドナ  テラエ（Gordona terrae）MA-1（FERM BP−４５３５）、シュードモナス  エスピー（Pseudomonas sp.）BC−１８（FERM BP−４５３６）若しくはブレビバクテリウム  アセチリカム（Brevibacterium acetylicum）IAM１７９０である請求項１記載の方法。
【請求項３】
一般式（１）で示されるラセミ体シアンヒドリンに代えて該シアンヒドリンを構成するアルデヒドと青酸を用いる請求項１又は２記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は微生物の作用によりラセミ体のシアンヒドリンから光学活性α−置換−α−ヒドロキシ酢酸を製造する方法に関する。
本発明によって得られる光学活性α−置換−α−ヒドロキシ酢酸は、酸ハロゲン化物、エポキシ体、シアンヒドリン体などに誘導され、光学活性医農薬の合成原料として重要な化合物である。
【０００２】
【従来の技術とその課題】
光学活性α−ヒドロキシ酸類の製造法としては、(1) 光学活性アミンによる光学分割〔特開昭55-147236 号、、同58-177933 号および同58-29719号各公報参照〕、(2) ２−ケトカルボン酸の微生物を用いた不斉還元〔特開昭54-26397号公報、Agric. Biol. Chem., 50 2621-2631 (1986) 参照〕、(3) シアンヒドリンの不斉加水分解〔特開平2-84198 号および同5-192189号公報参照〕などの方法が知られている。
【０００３】
しかしながら、(1) の方法は原理的にラセミ体のα−ヒドロキシ酸の半分が目的化合物として得られるが、さらに収率を上げるためには除去された対立する光学活性体をラセミ化後、再度アミンによる分割を繰り返すなどの繁雑な操作を必要とする。(2) の方法は２−ケトカルボン酸が比較的高価であると共に、生産物の蓄積濃度が低いなどの問題がある。(3) の方法には微生物によるα−ヒドロキシニトリルからの光学活性なα−ヒドロキシ酸の製法に関する記載があるが、その記載は一般的であり、本発明の複素環またはシクロ環を有するシアンヒドリンから対応する光学活性α−ヒドロキシ酢酸を製造する方法に関しては、具体的な開示がない。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、複素環またはシクロ環を有するシアンヒドリンから対応する光学活性α−ヒドロキシ酢酸を製造すべく鋭意研究を行った結果、特定の複素環またはシクロ環を有するシアンヒドリンの不斉加水分解反応に微生物の触媒作用が有効であることを見い出し本発明に至った。
【０００５】
すなわち、本発明は、下記一般式(1) で示されるラセミ体シアンヒドリンに、該シアンヒドリンのシアノ基を不斉加水分解する能力を有する微生物またはその処理物を作用させることにより、該シアンヒドリンを下記一般式(2) で示される旋光性が（＋）または（−）のα−ヒドロキシ酢酸に変換することを特徴とする光学活性α−置換−α−ヒドロキシ酢酸の製造法、である。
【０００６】
0003756541.tif 000002
【０００７】
式中、Ｒは置換または無置換のピリジル基、フリル基、ピロリル基、チエニル基、イミダソリル基、シクロプロピル基またはシクロヘキシル基を表す。
【０００８】
これらの基の置換基としては、例えば、アルキル基、アルコキシ基、アリール基、アリールオキシ基、アシル基、塩素、臭素等のハロゲン、ヒドロキシル基、アミノ基、ニトロ基、チオール基等が挙げられる。
【０００９】
本発明は、一般式(1) で示されるラセミ体シアンヒドリンの代わりに、これを構成するアルデヒドと青酸を使用しても、これらと該シアンヒドリンとの間で速やかに解離平衡が形成され同様に目的が達成される。
【００１０】
また、一般式(1) で示されるシアンヒドリンは、この解離平衡により中性ないし弱アルカリ性の水溶液中で容易にラセミ化する性質を有するので、本発明においては該シアンヒドリンの全てを一方の光学活性を有するα−置換−α−ヒドロキシ酢酸に変換することが可能である。
【００１１】
本発明で得られる一般式(2) で示される光学活性なα−ヒドロキシ酢酸の代表例としては、以下の化合物ならびにこれらの置換体を挙げることができる。
（−）−α−ヒドロキシ−α−（２−ピリジル）酢酸
（＋）−α−ヒドロキシ−α−（２−ピリジル）酢酸
（−）−α−ヒドロキシ−α−（３−ピリジル）酢酸
（＋）−α−ヒドロキシ−α−（３−ピリジル）酢酸
（−）−α−ヒドロキシ−α−（４−ピリジル）酢酸
（＋）−α−ヒドロキシ−α−（４−ピリジル）酢酸
（−）−α−ヒドロキシ−α−（２−チエニル）酢酸
（＋）−α−ヒドロキシ−α−（２−チエニル）酢酸
（−）−α−ヒドロキシ−α−（３−チエニル）酢酸
（＋）−α−ヒドロキシ−α−（３−チエニル）酢酸
（−）−α−ヒドロキシ−α−（２−ピロリル）酢酸
（＋）−α−ヒドロキシ−α−（２−ピロリル）酢酸
（−）−α−ヒドロキシ−α−（３−ピロリル）酢酸
（＋）−α−ヒドロキシ−α−（３−ピロリル）酢酸
（−）−α−ヒドロキシ−α−（２−イミダゾリル）酢酸
（＋）−α−ヒドロキシ−α−（２−イミダゾリル）酢酸
（−）−α−ヒドロキシ−α−（４−イミダゾリル）酢酸
（＋）−α−ヒドロキシ−α−（４−イミダゾリル）酢酸
（−）−α−ヒドロキシ−α−（５−イミダゾリル）酢酸
（＋）−α−ヒドロキシ−α−（５−イミダゾリル）酢酸
（−）−α−ヒドロキシ−α−（２−フリル）酢酸
（＋）−α−ヒドロキシ−α−（２−フリル）酢酸
（−）−α−ヒドロキシ−α−（３−フリル）酢酸
（＋）−α−ヒドロキシ−α−（３−フリル）酢酸
（−）−α−ヒドロキシ−α−シクロヘキシル酢酸
（＋）−α−ヒドロキシ−α−シクロヘキシル酢酸
（−）−α−ヒドロキシ−α−シクロプロピル酢酸
（＋）−α−ヒドロキシ−α−シクロプロピル酢酸
【００１２】
本発明に用いられる微生物は、一般式(1) で示されるラセミ体シアンヒドリンのシアノ基を不斉加水分解する能力を有する、例えば、ロドコッカス(Rhodococcus) 属、ブレビバクテリウム(Brevibacterium)属、ゴルドナ(Gordona) 属またはシュードモナス(Pseudomonas) 属に属する微生物であり、具体的には、ロドコッカス  エスピー (Rhodococcus sp.)ＨＴ４０−６(FERM P-11774)、ロドコッカスエスピー (Rhodococcus sp.)ＳＫ９２(FERM BP-3324)、ゴルドナ  テラエ (Gordona terrae) ＭＡ−１(FERM BP-4535)、シュードモナス  エスピー (Pseudomonas sp.)ＢＣ−１８(FERM BP-4536)およびブレビバクテリウム  アセチリカム (Brevibacterium acetylicum)ＩＡＭ１７９０等の菌株を挙げることができる。
【００１３】
これらの微生物のうち、ＩＡＭ１７９０株は公知であり、東京大学分子細胞生物研究所から容易に入手することができる。その他の微生物は本出願人により自然界から分離されたものであり、それぞれ上記寄託番号にて工業技術院  生命工学工業技術研究所に寄託されている。また、ＨＴ４０−６ならびにＳＫ９２株、ＭＡ−１株およびＢＣ−１８株の菌学的性質は、それぞれ前記特開平5-192189号、同6-237789号および同6-284899号公報に記載されている。
【００１４】
次に本発明の一般的実施態様について説明する。
本発明に使用される微生物の培養は、資化し得る炭素源（グリセロール、グルコース、サッカロース、ラクトース、フルクトースなど）、窒素源（肉エキス、酵母エキス、麦芽工キスなど）および各微生物の生育に必須の無機塩（塩化マグネシウム、硫酸ナトリウム、塩化カルシウム、硫酸マンガン、塩化鉄、硫酸亜鉛など）を含有した通常の培地を用いて行われる。
【００１５】
培養初期または中期に生育を阻害しない濃度のニトリル類（ｏ−アミノベンゾニトリル、１−シクロヘキセニルアセトニトリル、ケイ皮酸ニトリル、ｎ−ブチロニトリルなど）、アミド類（ε−カプロラクタムなど）を添加することはより高い酵素活性が得られるので好ましい。
【００１６】
培養液のｐＨは４〜１０の範囲で、培養は５〜５０℃の温度範囲で、１〜７日程度好気的に行い、活性が最大となるまで継続すればよい。
【００１７】
不斉加水分解反応は、上記に準じて培養した微生物の培養液から分離した菌体または菌体処理物（乾燥菌体、菌体の破壊物、分離された粗・精製酵素、固定化菌体・酵素等）を水または緩衝液などの水性媒体中に懸濁し、これに基質である一般式(1) で示されるラセミ体のシアンヒドリンまたはこのシアンヒドリンに対応するアルデヒドと青酸の混合物を接触させることによって行うことができる。
【００１８】
基質は粉末または液状のまま水性媒体中に加えることができ、その濃度は一般式(1) で示されるラセミ体のシアンヒドリンの濃度として通常０．１〜１０重量％、好ましくは０．２〜５．０重量％である。
基質に対する微生物の使用量は乾燥菌体として通常０．０１〜５．０重量％、反応温度は０〜５０℃、好ましくは１０〜３０℃で０．１〜１００時間反応させればよい。
反応中、ｐＨは４〜１１、好ましくは６〜１０に調整する。
【００１９】
尚、アルデヒドによる酵素阻害を軽減するために、亜硫酸ナトリウム、酸性亜硫酸ナトリウム、亜硫酸カリウム、酸性亜硫酸カリウム、亜硫酸アンモニウム、酸性亜硫酸アンモニウムなどの添加が有効であり、その添加量は、反応液中に１〜３００ｍＭの範囲でよい。
【００２０】
一方、使用菌株の活性がアルデヒド以上に青酸によって強い阻害を受ける場合には、青酸による酵素阻害を軽減するために該アルデヒドを別途添加することも有効であり、その添加量は０．１〜１０重量％でよい。
【００２１】
本発明における目的生成物の回収は、次のようにして行われる。
反応終了液より菌体等の不溶物を除去した後、ｐＨを強アルカリ、好ましくは１０〜１２に調整した後、ベンゼン、ジエチルエーテル、クロロホルム、酢酸エチル等の有機溶媒により、不純物を抽出除去し、次にｐＨを強酸性、好ましくは１〜３に調整し、ベンゼン、ジエチルエーテル、クロロホルム、酢酸エチル等の有機溶媒により、再び抽出操作を行い目的生成物を回収する。
さらに、目的物の精製は、液体クロマトグラフィーを用いて分取するか、または結晶として析出させることにより行われる。
【００２２】
【実施例】
次に、本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。
実施例１
ＭＡ−１株を、誘導剤として０．０２％  ｏ−アミノベンゾニトリルを添加した下記の培地中で、３０℃、３日間好気的に培養した。
【００２３】
グリセロール                        ２０ｇ
酵母エキス                            ６ｇ
金属塩混合液                          ５ｍｌ
１Ｍ硫酸ナトリウム                    ２ｍｌ
５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．５）  ９３３ｍｌ
金属塩混合液；硫酸ナトリウム５６ｇ、塩化マグネシウム８ｇ、塩化カルシウム０．８ｇ、硫酸マンガン０．６ｇ、塩化第二鉄０．１２ｇ、硫酸亜鉛０．０６ｇ／１００ｍｌ蒸留水
【００２４】
培地から菌体を採取し、遠心分離により菌体を５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄した。得られた沈澱菌体を５０ｍｌの上記緩衝液に懸濁し、これにα−ヒドロキシ−α−（３−ピリジル）アセトニトリル１ｇを加えて、３０℃で２４時間反応させた。
【００２５】
反応終了後、反応液より遠心分離により菌体を除去し、上清液のｐＨを１１．０に調整した後、酢酸エチル５０ｍｌを添加して、未反応原料を抽出除去した。次いで、水層をｐＨ１．５に調整した後、酢酸エチル５０ｍｌによる抽出を３回行い、この抽出液をエバポレーターで蒸発乾固し、水に溶解させ、ＨＣｌを加え、ＭｅＯＨ；酢酸エチルで結晶化させたところ８１０ｍｇのα−ヒドロキシ−α−（３−ピリジル）酢酸・塩酸塩が得られた。これを光学分割カラム（SUMICHIRAL OA-5000，キャリアー；１ｍＭ  ＣｕＳＯ4 ）および旋光度計により光学特性を測定したところ、それぞれ９８％e.e.および〔α〕D 23＝−８１．４２（ c＝０．５  Ｈ2 Ｏ）であった。
尚、以下の実施例も同様にして光学特性の測定を行った。
【００２６】
実施例２
実施例１と同様にして得たＨＴ４０−６株の懸濁液１０ｍｌにα−ヒドロキシ−α−（３−ピリジル）アセトニトリルを１００ｍｇ添加し、３０℃で２４時間反応させた。
反応終了後、実施例１と同様にしてα−ヒドロキシ−α−（３−ピリジル）酢酸・塩酸塩５０ｍｇを得た。その光学純度は１００％e.e.および旋光性は（＋）であった。
【００２７】
実施例３
実施例１と同様にして得たＩＡＭ１７９０、ＳＫ９２およびＢＣ１８株の懸濁液各１ｍｌに、それぞれα−ヒドロキシ−α−（３−ピリジル）アセトニトリル２０ｍＭを添加し、３０℃で２４時間反応させた。
反応終了後、実施例１と同様の操作を行い、得られたα−ヒドロキシ−α−（３−ピリジル）酢酸の光学特性を測定し、以下に示す結果を得た。
【００２８】
0003756541.tif 000003
【００２９】
実施例４
実施例１と同様にして得たＭＡ−１の懸濁液１０ｍｌにα−ヒドロキシ−α−（２−チエニル）アセトニトリルを１００ｍｇ添加し、３０℃で２４時間反応させた。
反応終了後、実施例１と同様の抽出操作を行った後、クロロホルム；へキサンで晶析を行いα−ヒドロキシ−α−（２−チエニル）酢酸５０ｍｇを得た。その光学純度は１００％e.e.および旋光性は（−）であった。
【００３０】
実施例５
実施例１と同様にして得たＳＫ９２株の懸濁液１ｍｌにα−ヒドロキシ−α−（２−チエニル）アセトニトリルを２０ｍＭ添加し、３０℃で２４時間反応させた。
反応終了後、実施例４と同様の操作を行い、得られたα−ヒドロキシ−α−（２−チエニル）酢酸の光学特性を測定したところ、光学純度は２１．０％e.e.および旋光性は（＋）であった。
【００３１】
実施例６
実施例１と同様にして得たＭＡ−１株の懸濁液１０ｍｌに２−フルアルデヒド１００ｍｇとシアン化カリウム９３ｍｇを添加し、３０℃で２４時間反応させた。
反応終了後、菌体を除去酢酸エチルによる抽出、硫酸ナトリウムによる脱水および濃縮操作を行いα−ヒドロキシ−α−（２−フリル）酢酸６３ｍｇを得た。その光学純度は１００％e.e.および旋光性は［α］D 24＝−１５４．３（ c＝０．２  ＭｅＯＨ）であった。
【００３２】
実施例７
実施例１と同様にして得たＩＡＭ１７９０、ＳＫ９２、ＢＣ１８およびＨＴ４０−６株の懸濁液各１ｍｌに、それぞれα−ヒドロキシ−α−（２−フリル）アセトニトリルを２０ｍＭ添加し、３０℃で２４時間反応させた。
反応終了後、実施例６と同様の操作を行い、得られたα−ヒドロキシ−α−（２−フリル）酢酸の光学特性を測定し、以下に示す結果を得た。
【００３３】
0003756541.tif 000004
【００３４】
実施例８
実施例１と同様にして得たＭＡ−１、ＨＴ４０−６、ＩＡＭ１７９０およびＳＫ９２株の懸濁液各１ｍｌに、それぞれα−ヒドロキシシクロヘキサンアセトニトリルを２０ｍＭ添加し、３０℃で２４時間反応させた。
反応終了後、実施例６と同様の操作を行い、得られたα−ヒドロキシ−α−シクロヘキシル酢酸の光学特性を測定し、以下に示す結果を得た。
【００３５】
0003756541.tif 000005
【００３６】
【発明の効果】
本発明によれば、微生物の作用によりα位に複素環またはシクロアルキル環を有するラセミ体のシアンヒドリン、または該シアンヒドリンを構成するアルデヒドと青酸から、その全てを旋光性が（＋）または（−）のα−置換−α−ヒドロキシ酢酸に変換することが可能であり、極めて効率のよい光学活性α−置換−α−ヒドロキシ酢酸の製造法を提供し得る。