(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）微生物の保持に適した膜で液体サンプルを濾過し、（ｂ）いずれかの微生物と共に該膜をインキュベートし、（ｃ）存在する微生物のコロニーを計数するために計数試験を該膜の表面に適用し、存在する数を計数し、（ｄ）１以上の特定された微生物の存在／不存在を判定するためにＰＮＡハイブリダイゼーションを該膜に適用し、検出された数を計数し、（ｅ）該計数工程により見出された微生物を、該ＰＮＡプローブ工程により見出された微生物のコロニーの位置と照合し、該計数試験により見出された位置に対応しない該ＰＮＡプローブアッセイにより見出された位置を排除することを含む、微生物を計数し同定するための方法。
【請求項２】
（ａ）微生物の保持に適した膜で液体サンプルを濾過し、（ｂ）いずれかの微生物と共に該膜をインキュベートし、（ｃ）該膜の一方の端に沿った特定の点を示すために該膜に位置決めマークを設け、（ｄ）存在する微生物のコロニーを計数するために計数試験を該膜の表面に適用し、存在する数を計数し、（ｅ）１以上の特定された微生物の存在／不存在を判定するためにＰＮＡハイブリダイゼーションを適用し、検出された数を計数し、（ｆ）該位置決めマークを用いて、該計数試験により見出された微生物を、該ＰＮＡプローブアッセイにより見出された微生物の位置と照合し、該計数試験により見出された位置に対応しない該ＰＮＡプローブアッセイにより見出された位置を排除することを含む、微生物を計数し同定するための方法。
【請求項３】
該液体サンプルが５０〜１０００ミリリットルであり、該膜が、疎水性部分により分離された親水性領域を有するＰＶＤＦ膜よりなる群から選ばれ、該膜を約２４℃〜約４０℃の温度で約１〜約２４時間インキュベートする、請求項２記載の方法。
【請求項４】
該膜を約３〜約８時間インキュベートする、請求項１記載の方法。
【請求項５】
該膜を約３〜約８時間インキュベートする、請求項２記載の方法。
【請求項６】
該計数試験が、デジタルイメージング系により読取られるＡＴＰ／生物発光工程である、請求項２記載の方法。
【請求項７】
該ＰＮＡプローブ工程が、Ｘ線フィルム、インスタントフィルム、該膜上の比色反応の視覚的検出、蛍光タグの視覚的検出よりなる群から選ばれる方法により又はデジタルイメージングにより読取られる、請求項２記載の方法。
【請求項８】
該計数試験が蛍光タグ吸収試験である、請求項２記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、微生物を計数し（ｅｎｕｍｅｒａｔｅ）次いで同定するための方法に関する。さらに詳しくは、本発明は、膜装置上の微生物を計数し同定するための方法に関する。
【０００２】
（発明の背景）
液体（例えば水）、食品（例えばジュース）または医薬中の微生物の存在または不存在を判定する伝統的な方法は、該液体を適当な膜で濾過して、該膜の表面上の流体中に存在する微生物を捕捉するというものである。ついで該膜を、寒天または他の適当な培地で満たされた増殖培地プレート（例えばペトリ皿）上に配置し、ついで数日間インキュベートして、その捕捉された生物からコロニーを発生させる。ついで該プレートを取り出し、視覚的に検査して、存在するコロニーの数を計数することができる。その数が十分に大きい場合には、どのような生物が存在するのかを厳密に判定するための更なる試験を行うことができる（しばしば、生物の単なる存在は、基本的には及びそれ自体は、該流体が安全でないという指標ではなく、その特定の生物を同定するための更なる研究が必要である）。
【０００３】
最近、分子的試験、例えばＤＮＡアレイ、核酸増幅および核酸配列決定が導入された。伝統的な同定は、選択培地および種々の生化学的試験を用いて行われる。
【０００４】
そのような生物の単なる計数は、ＡＴＰ−生物発光試験（例えば、米国特許第５，６２７，０４２号に教示されているもの）を用いて促進されうることが公知である。
【０００５】
また、特定の微生物の存在および数を検出するためにＰＮＡプローブアッセイが使用可能であると示唆されている。米国特許第５，７７３，５７１号を参照されたい。この系の使用の欠点の１つは、微生物の存在に由来しないスポットの存在（偽陽性）である。その位置に実際に生物が存在しないことを更なる研究が明らかにした場合には、未同定の何かが、標的生物の存在を示すシグナルの生成を引き起こしているのである。これらは、おそらく、該膜へのプローブ分子の非特異的結合により生じるのであろう。１個の標的生物の検出でさえ被検流体を不合格にするのに十分である場合が多いため、これは該試験自体を信頼無きものにする。
【０００６】
さらに、これらの試験はいずれも、大容積の流体中の低レベルの混入生物の存在を検出したり、同じサンプルについて関心のある複数の微生物を比較的短時間で迅速に同定することはできない。
【０００７】
必要とされているのは、存在する全生物の数および関心のある生物の数を測定するための、同一サンプルに関する両方の方法の長所を組合せるための簡便な方法である。
【０００８】
本発明は、そのような方法を提供するものである。
【０００９】
本発明は、まず、生物の合計数を計数するためのＡＴＰ生物発光アッセイまたはフルオレセイン指示試験などの計数試験を用い、ついで選択または標的化された生物の存在を判定するためのＰＮＡプローブアッセイを用いて、大容積の流体中の特定の種の微生物を計数し同定するための方法に関する。本方法の重要な特質は、同じ膜および生物サンプルを両方の試験に使用することである。これにより、両方の試験のための１つのサンプルを作製しインキュベートするだけで、存在する生物の迅速な検出および同定が可能となる。さらに、両方の試験に使用する同じサンプルおよび膜を使用することにより、各試験により示された生物の位置と１以上の位置決め（ｒｅｇｉｓｔｒａｔｉｏｎ）マークとを比較し、両方の試験で同じ位置に出現しないものを排除することにより、偽陽性を排除することができる。
【００１０】
本発明のもう１つの目的は、
（ａ）微生物の保持に適した膜で液体サンプルを濾過し、
（ｂ）いずれかの微生物と共に該膜をインキュベートし、
（ｃ）存在する微生物を計数するために計数試験を該膜の表面に適用し、存在する数を計数し、
（ｄ）１以上の特定された微生物の存在／不存在を判定するためにＰＮＡハイブリダイゼーションを該膜に適用し、検出された数を計数することを含む、微生物を計数し同定するための方法を提供することである。
【００１１】
本発明のもう１つの目的は、
（ａ）微生物の保持に適した膜で液体サンプルを濾過し、
（ｂ）いずれかの微生物と共に該膜をインキュベートし、
（ｃ）存在する微生物を計数するために計数試験を該膜の表面に適用し、存在する数を計数し、
（ｄ）１以上の特定された微生物の存在／不存在を判定するためにＰＮＡハイブリダイゼーションを適用し、検出された数を計数し、
（ｅ）（ｃ）により検出された生物の位置を、（ｄ）により検出されたものと比較し、各試験により同じ位置に見出されないものを該分析から排除することを含んでなる、微生物を計数し同定するための方法を提供することである。
【００１２】
本発明の更にもう１つの目的は、
（ａ）微生物の保持に適した膜（これは、該膜上の特定の位置を示す位置決めマークを有する）で液体サンプルを濾過し、
（ｂ）いずれかの微生物と共に該膜をインキュベートし、
（ｃ）存在する微生物を計数するために計数試験を該膜の表面に適用し、存在する数を計数し、
（ｄ）１以上の特定された微生物の存在／不存在を判定するためにＰＮＡハイブリダイゼーションを適用し、検出された数を計数し、
（ｅ）該位置決めマークとの比較により、（ｃ）により検出された生物の位置を、（ｄ）により検出されたものと比較し、各試験により同じ位置に見出されないものを該分析から排除することを含んでなる、微生物を計数し同定するための方法を提供することである。
【００１３】
（図面の簡単な説明）
図１は、本発明の好ましい実施形態のブロックダイアグラムを示す。
図２は、本発明の第２の好ましい実施形態のブロックダイアグラムを示す。
【００１４】
（明細書の詳細な説明）
本発明は、流体または可溶性固体（例えば粉末、塩、クリーム、錠剤など）中の微生物の迅速な計数および同定のための方法に関する。そのような流体には、水（例えば飲料水）、乳製品（例えばミルク）、ビール、ワイン、ソフトドリンク、果汁、医薬品、非経口薬品、細菌空気計数（ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ａｉｒ  ｃｏｕｎｔｓ）などが含まれる。
【００１５】
図１は、本発明の第１の好ましい方法を示す。この方法においては、第１工程として、診断する産物から流体形態のサンプルを得る。例えば、上水道などの環境サンプルの採取においては、河川、井戸または貯水場から水のサンプルを得る。食品または医薬品では、該ストック（典型的には、これは最終ストックであるが、そうである必要はない）からサンプルを得る。液体形態では、それを単にそのままで用いたり、あるいは、粘性に応じて必要に応じて、脱イオン水で希釈することができる。固体形態では、それを適当な液体、典型的には水またはバッファー、または存在する生物を殺すこともそれに過度なストレスを与えることもない他の媒体に溶解または分散させる。
【００１６】
ついで、それを第２工程で膜フィルターで濾過し、ついで該フィルターを増殖培地、例えば寒天（典型的にはペトリ皿中に含有されているもの）上に配置し、第３工程として、捕捉された生物からミクロコロニー（ＡＴＰ生物発光およびイメージングを用いて可視化されるが、肉眼では見えない）が生じうるようにインキュベートする。
【００１７】
該フィルターを保持するための好ましい装置は、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｅｄｆｏｒｄ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓから入手可能な５０ｍｍの半径および１００ｍｌの容量を有するＭＩＬＬＩＦＬＥＸ（商標）フィルター漏斗である。その代わりに、他の膜ホルダー、例えばガラスまたはステンレス鋼フィルターホルダーまたは漏斗を使用することができる。そのような装置は当技術分野でよく知られており、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｅｄｆｏｒｄ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ  ａｎｄ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ，ｏｆ  Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａを含む種々の入手源から入手可能である。好ましい膜は、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｅｄｆｏｒｄ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓから入手可能なＭｉｃｒｏＳｔａｒ（商標）フィルターである。このフィルターは、該フィルターの深さ全体にわたり伸長する疎水性部分により分離された一連の親水性区画を有する０．４５の公称孔径のＰＶＤＦフィルターである。本発明で有用な他のフィルターには、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｅｄｆｏｒｄ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓから入手可能なＥＺ−Ｐａｋ（商標）フィルター、Ｓ−Ｐａｋ（商標）フィルター、Ｓ−Ｐａｋ（商標）ＰｌｕｓフィルターおよびＡＯ（商標）またはＳＯ（商標）フィルターが含まれる。
【００１８】
該フィルター／増殖培地を第３工程で短時間、典型的には１〜約２４時間インキュベートする。インキュベーションの長さは、該試験に要求される精度、検出する生物の成長速度、該生物が付されるストレス（生物に課されるストレスが著しければ著しいほど、より長いインキュベーション時間が必要である）、検出する生物のタイプ、およびその生物の存在を判定するために用いる試験の感度（該試験の感度が低ければ低いほど、該標的生物のコロニーが適当なサイズに成長するのを保証するためには、より長いインキュベーション時間が必要となる）、該試験の所望の速度と該試験結果の精度との対比、および他のそのような要因に左右される。インキュベーションのための温度は、ほぼ室温（２４℃）〜約４０℃でありうる。検出したい生物およびそれらの最適インキュベーション温度に応じて、より高い又はより低い温度を用いることができる。
【００１９】
該計数試験およびＰＮＡ試験の両方で本発明において行うアッセイは、該膜上に捕捉された単細胞から発生する微生物のミクロコロニーに関するものであると理解されるべきである。すなわち、個々の生物を直接的に検出するのではなく、同じ単一生物から増殖分裂により生じるコロニーの検出により試験サンプル中の単一生物の数を計数するのである。
【００２０】
該培地上のフィルターに関する適当なインキュベーション時間の後、該フィルターを該培地から取り出し、乾燥させ、ついでそれに試薬を噴霧し、それを計数試験４に付す。
【００２１】
好ましい計数試験は、ＡＴＰ／生物発光試験である。そのような試験においては、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｅｄｆｏｒｄ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓから入手可能なＭｉｃｒｏＳｔａｒ試薬キット（ＲＭＬＬ０００００）からの適当な透過性上昇剤（例えばＡＴＰ放出剤）に該サンプルをさらす。ついで、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｅｄｆｏｒｄ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓから入手可能なＭｉｃｒｏＳｔａｒ試薬キットからのＢｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ｒｅａｇｅｎｔなどの生物発光試薬の使用により、ＡＴＰを検出する。ついでイメージプロセッサーを備えたＣＣＤカメラなどのイメージング装置により、視覚的またはデジタル的に該発光を読取る。１つのそのような系は、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｅｄｆｏｒｄ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓから入手可能なＭｉｃｒｏＳｔａｒ（商標）系として販売されている。使用するどのような手段によっても、検出する微生物コロニーの計数および位置決定を行うことができる。
【００２２】
あるいは、米国特許第５，６２７，０４２号（その教示の全体を本明細書に組み入れることとする）の方法を用いることができる。この方法では、ＡＴＰを、Ｌｕｍａｃ  Ｃｏ．から入手可能なＮＲＢ（商標）などの抽出剤の使用により膜上の生きた生物から抽出し、ついでＬｕｍａｃ  Ｃｏ．からのＬｕｍｉｔ−ＰＭ（商標）などの生物発光剤に付す。ついで、該ＡＴＰ／試薬反応により放出された光の位置を検出し記録する装置上で、該発光を測定する。しかし、この方法は、細胞壁を実際に破裂させてその内容物を該膜表面上に漏出させるため、好ましくない。該膜が疎水性部分を有する場合であっても、ある程度の交差汚染が生じないことを保証することはできない。
【００２３】
もう１つの代替手段は、ＡＴＰの検出に依存しないが生物の存在および数の測定のための何らかの他のメカニズムを用いる計数のための系を用いるものである。１つのそのような系は、Ｃｈｅｍｕｎｅｘから入手可能なＳｃａｎＲＤＩである。それは、ＡＴＰを使用する代わりに、該生物により吸収され（蛍光タグ吸収試験）次いで蛍光下で検出される蛍光タグを使用する。
【００２４】
ついで、該計数試験の後、該サンプルを該標的生物のためのＰＮＡプローブアッセイ５に付す。ＰＮＡプローブは、（ＤＮＡに基づくプローブというよりは）ペプチド核酸プローブであり、細胞に進入しその細胞のＲＮＡまたはＤＮＡ鎖の選択部分にハイブリダイズするように設計されている。それらは、単一種だけに又は属全体に特異的にハイブリダイズするように設計されうる。該プローブは、該細胞内のそれらの存在を示すタグ（例えば、酵素、ハプテン、発蛍光団または放射性同位元素など）を含有する。そのようなプローブは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の検出のためのＥｃｏ０６（商標）プローブおよび全細菌の簡便な検出のためのＢａｃＵｎｉ（商標）プローブなどの商標で、Ｂｏｓｔｏｎ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ  ｏｆ  Ｂｅｄｆｏｒｄ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓを含む種々の入手源から入手可能である。そのようなプローブの製造および使用方法は、米国特許第５，７１４，３３１号、第５，７３６，３３６号、第５，７７３，５７１号、第５，９１２，１４５号および第５，９８５，５６３号ならびにＰＣＴ公開出願ＷＯ  ９８／２４９３３および９９／４９２９３（それらの教示の全体を本明細書に組み入れることとする）に教示されている。
【００２５】
この工程では、同じフィルター上の生物を、再度、透過性上昇および固定剤（例えば、エタノールおよびグルタルアルデヒド）に付し、ＰＮＡプローブを該透過性細胞に適用する。１以上の種の生物を検出するために、１以上のＰＮＡプローブを選択することができる。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）またはサルモネラ種（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐ．）、エル・ブレビス（Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ）などの個々の生物に対するものもあれば、より普遍的で細菌または酵母または真菌の存在を検出するにすぎないものもある。該プローブの適用の後、該膜を一定時間、典型的には１０分間〜１時間配置し、ついで洗浄して、ハイブリダイズしていないプローブを除去する。選択したプローブおよび検出可能なタグをそれに取込むのに用いる方法に応じて、Ｘ線フィルム、インスタントフィルム、蛍光、比色計、または該生物のＤＮＡまたはＲＮＡにハイブリダイズしたプローブのタグの存在を検出するための他のそのような装置を使用し、それにより、存在する各標的生物の数およびタイプを同定することができる。
【００２６】
化学発光物質を使用し、ついで写真またはデジタルイメージャー、例えば、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｅｄｆｏｒｄ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓから入手可能なＭｉｃｒｏＳｔａｒ（商標）系により、化学光の存在を検出することが好ましい。
【００２７】
図２は、本発明のもう１つの好ましい実施形態を示す。該参照番号が図１と同じ工程を示す場合には、該参照番号は同じままである。
【００２８】
この実施形態においては、該計数およびＰＮＡプローブ工程が完了した後、各試験の結果を互いに比較して、一方の試験に関する生物のコロニーの指標が、他方の試験の同じ位置には見出されない或る位置に存在するか否かを判定する。これは、該結果から偽陽性を排除することを可能にする。これはＰＮＡプローブ試験の場合に特に当てはまる。なぜなら、ＰＮＡ試験において或る位置に生物のコロニーが含まれるとされた場合であっても、更なる分析において、その位置にコロニーの存在が全く示されないことがあるからである。これを行うための最も簡便な手段は、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｅｄｆｏｒｄ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓから入手可能なＭｉｃｒｏＳｔａｒ（商標）系を使用し、それらの２つのイメージを重ね合わせるか又は平行して検査することである。あるいは、それらの２つの試験結果を自動的に比較し、両方の試験で同じ位置に見出されないスポットを無視するために、ソフトウェアプログラムを使用することができる。
【００２９】
これは、微生物の計数および同定が必要である又は望ましい用途に特に有用である。
【００３０】
（実施例）
密接に関連した２つの微生物である大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）およびサルモネラ・コレレスイス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ）を計数し識別するために本方法を使用しうるか否かを判定するために、試験を行った。
【００３１】
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）およびサルモネラ・コレレスイス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ）の純粋培養を、無菌０．８５％生理的食塩水中１００μｌ当たり推定５０コロニー形成単位まで希釈した。それらの２つの培養のいくつかを混合し、混合物として濾過し、一方、その残りをガラスフィルターホルダー中のＭｉｃｒｏＳｔａｒ（商標）フィルターディスク（共に、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｅｄｆｏｒｄ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓから入手可能）で別々に濾過した。
【００３２】
ついで該膜を６時間インキュベートした。各膜上のコロニーの数を測定するために、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｅｄｆｏｒｄ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓから入手可能なＭｉｃｒｏＳｔａｒ（商標）Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ  ＲＭＬＬ０００００を使用して、各組（混合された及び個々の生物）からの膜をＡＴＰ−生物発光計数アッセイに付した。また、各組のサンプルを通常の培地増殖プレート上で保存し、３０℃で一晩インキュベートした。
【００３３】
ついで同じ膜を、Ｂｏｓｔｏｎ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．ｏｆ  Ｂｅｄｆｏｒｄ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓから入手可能な大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）特異的Ｅｃｏ０６（商標）プローブを使用するＰＮＡプローブアッセイ、およびこの試験で使用した２つの細菌を含む全細菌を決定するためのＰＮＡプローブアッセイ（Ｂｏｓｔｏｎ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．ｏｆ  Ｂｅｄｆｏｒｄ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓから入手可能なＢａｃＵｎｉ（商標）プローブ）に付した。
【００３４】
生物の混合物が同じ膜上に濾過される膜上では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に特異的なＰＮＡプローブを使用して検出されたコロニーの数は、濾過された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞の数に等しく、一方、該普遍的細菌プローブで認められたコロニーは、存在する両方の生物の合計に等しかった。
【００３５】
一方、該大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）だけを濾過した膜上では、いずれかのプローブを使用して同等のコロニー数が検出された。該サルモネラ・コレレスイス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ）だけを濾過した膜は、該普遍的プローブを使用して検出されたに過ぎなかった。
【００３６】
また、該膜またはその汚染により引き起こされた偽陽性を排除するために、該ＰＮＡプローブにより検出された生物を、該ＡＴＰ−生物発光アッセイにより見出された位置と照合した。
【００３７】
これらの結果は、該ＡＴＰアッセイにより又は該増殖対照プレート上で検出されたコロニーの数と一致した。このことは、同じ膜上でＡＴＰおよびＰＮＡプローブアッセイの組合せを用いて特定の微生物種が検出され計数されうることを示している。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、本発明の好ましい実施形態のブロックダイアグラムを示す。
【図２】  図２は、本発明の第２の好ましい実施形態のブロックダイアグラムを示す。
【図１】
0003808773.tif 000002
【図２】
0003808773.tif 000003