(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の工程（１）〜（４）を含む、酸性多糖類及び中性多糖類を含有する多糖類混合水溶液中の酸性多糖類の分離定量法；
（１）酸性多糖類及び中性多糖類を含有する多糖類混合水溶液に、酸水溶液を加えて酸性多糖類をゲル化し、分取する工程、
（２）工程（１）のろ液にアルカリ水溶液を加えて中和し、更に二価以上の金属塩水溶液を加えて、残余の酸性多糖類をゲル化し、分取する工程、
（３）工程（１）の分取ゲルにアルカリ水溶液を加え酸性多糖類水溶液とし、工程（２）の分取ゲルにキレート剤水溶液を加えて酸性多糖類水溶液とした両者を混合し、回収酸性多糖類水溶液を得る工程、
（４）工程（３）によって得られた回収酸性多糖類水溶液中の酸性多糖類量を高速液体クロマトグラフィーにより測定する工程。
【請求項２】
次の工程（１）〜（３）を含む、酸性多糖類及び中性多糖類を含有する多糖類混合水溶液中の中性多糖類の分離定量法；
（１）酸性多糖類及び中性多糖類を含有する多糖類混合水溶液に、酸水溶液を加えて酸性多糖類をゲル化し、分取する工程、
（２）工程（１）のろ液にアルカリ水溶液を加えて中和し、更に二価以上の金属塩水溶液を加えて、残余の酸性多糖類をゲル化し、分取する工程、
（３）工程（２）のろ液として得られた中性多糖類水溶液中の中性多糖類量を高速液体クロマトグラフィーにより測定する工程。
【請求項３】
次の工程（１）〜（５）を含む、酸性多糖類及び中性多糖類を含有する多糖類混合水溶液中の酸性多糖類及び中性多糖類の分離定量法；
（１）酸性多糖類及び中性多糖類を含有する多糖類混合水溶液に、酸水溶液を加えて酸性多糖類をゲル化し、分取する工程、
（２）工程（１）のろ液にアルカリ水溶液を加えて中和し、更に二価以上の金属塩水溶液を加えて、残余の酸性多糖類をゲル化し、分取する工程、
（３）工程（１）の分取ゲルにアルカリ水溶液を加え酸性多糖類水溶液とし、工程（２）の分取ゲルにキレート剤水溶液を加えて酸性多糖類水溶液とした両者を混合し、回収酸性多糖類水溶液を得る工程、
（４）工程（３）によって得られた回収酸性多糖類水溶液中の酸性多糖類量を高速液体クロマトグラフィーにより測定する工程、
（５）工程（２）のろ液として得られた中性多糖類水溶液中の中性多糖類量を高速液体クロマトグラフィーにより測定する工程。
【請求項４】
二価以上の金属塩がカルシウム塩である請求項１〜３のいずれか１項記載の定量法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、酸性多糖類及び中性多糖類を含有する多糖類混合水溶液からそれぞれの多糖類を高回収率で分離して測定する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
昨今の健康意識の高まる中、日本人に不足がちな食物繊維を効果的に摂取する要望が高くなってきている。多量の食物繊維を無理なく摂取するには飲料形態が望ましく、更に多量の食物繊維を配合しても粘性が上がらず飲みやすいようにするためには、低分子化した粘性の低い食物繊維素材を用いることが望ましい。そのような低分子化した食物繊維素材としては、ウロン酸を構成糖に含有する水溶性酸性多糖類である低分子化アルギン酸ナトリウム、低分子化ペクチンや、水溶性中性多糖類である低分子化グアーガム、低分子化ヘミセルロース、難消化性デキストリンなどが代表的であるが、更に最近では、より高い機能を発現するために、これらを複数組み合せた試みがなされている（例えば、特開２０００−２３２８５５号公報）。食物繊維含有飲料の有効性を保証するためには、配合されている多糖類の安定性を、高速液体クロマトグラフィー等の分析機器を用いて定量することが必要とされるが、このような低分子化した多糖類が複数組合わさった飲料においては、分子量分布が重なるため、個々の多糖類の精確な定量は困難であり、個々を高回収率で分離して定量し得る簡便な分離定量方法の開発が望まれていた。
【０００３】
【課題を解決するための手段】
本発明は、次の工程（１）〜（４）を含む、酸性多糖類及び中性多糖類を含有する多糖類混合水溶液中の酸性多糖類の分離定量法を提供するものである。
（１）酸性多糖類及び中性多糖類を含有する多糖類混合水溶液に、酸水溶液を加えて酸性多糖類をゲル化し、分取する工程、
（２）工程（１）のろ液にアルカリ水溶液を加えて中和し、更に二価以上の金属塩水溶液を加えて、残余の酸性多糖類をゲル化し、分取する工程、
（３）工程（１）の分取ゲルにアルカリ水溶液を加え酸性多糖類水溶液とし、工程（２）の分取ゲルにキレート剤水溶液を加えて酸性多糖類水溶液とした両者を混合し、回収酸性多糖類水溶液を得る工程、
（４）工程（３）によって得られた回収酸性多糖類水溶液中の酸性多糖類量を高速液体クロマトグラフィーにより測定する工程。
また、本発明は、次の工程（１）〜（３）を含む、酸性多糖類及び中性多糖類を含有する多糖類混合水溶液中の中性多糖類の分離定量法を提供するものである。
（１）酸性多糖類及び中性多糖類を含有する多糖類混合水溶液に、酸水溶液を加えて酸性多糖類をゲル化し、分取する工程、
（２）工程（１）のろ液にアルカリ水溶液を加えて中和し、更に二価以上の金属塩水溶液を加えて、残余の酸性多糖類をゲル化し、分取する工程、
（３）工程（２）のろ液として得られた中性多糖類水溶液中の中性多糖類量を高速液体クロマトグラフィーにより測定する工程。
さらに本発明は、次の工程（１）〜（５）を含む、酸性多糖類及び中性多糖類を含有する多糖類混合水溶液中の酸性多糖類及び中性多糖類の分離定量法を提供するものである。
（１）酸性多糖類及び中性多糖類を含有する多糖類混合水溶液に、酸水溶液を加えて酸性多糖類をゲル化し、分取する工程、
（２）工程（１）のろ液にアルカリ水溶液を加えて中和し、更に二価以上の金属塩水溶液を加えて、残余の酸性多糖類をゲル化し、分取する工程、
（３）工程（１）の分取ゲルにアルカリ水溶液を加え酸性多糖類水溶液とし、工程（２）の分取ゲルにキレート剤水溶液を加えて酸性多糖類水溶液とした両者を混合し、回収酸性多糖類水溶液を得る工程、
（４）工程（３）によって得られた回収酸性多糖類水溶液中の酸性多糖類量を高速液体クロマトグラフィーにより測定する工程、
（５）工程（２）のろ液として得られた中性多糖類水溶液中の中性多糖類量を高速液体クロマトグラフィーにより測定する工程。
【０００４】
【発明の実施の形態】
本発明の多糖類の定量方法は、酸性多糖類及び中性多糖類の混合水溶液から、それぞれの多糖類を分離して定量するものである。
酸性多糖類は、カルボキシル基、硫酸基又はリン酸基等の酸性極性基を有しており、陽イオン交換能を持っているものであって、ペクチン、カラギーナン、フコイダン、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、アルギン酸類等が挙げられる。その中でもペクチン、アルギン酸類等のウロン酸を構成糖中に含有する酸性多糖類が好ましい。アルギン酸類としては、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、低分子アルギン酸ナトリウム、アルギン酸カリウム等のアルギン酸塩、アルギン酸プロピレングリコールエステル等のアルギン酸エステルが挙げられる。その中でもアルギン酸塩が好ましい。
【０００５】
中性多糖類は、分子中に酸性基、塩基性基を持たないものであって、グアーガム、低分子グアーガム、ヘミセルロース、低分子ヘミセルロース、アラビアガム、コンニャクマンナン、ローカストビーンガム、プルラン、キサンタンガム、ジェランガム、難消化性デキストリン、ポリデキストロース、寒天等が挙げられ、低分子グアーガム、低分子ヘミセルロース、難消化性デキストリン等が好ましい。
【０００６】
これらの酸性多糖類及び中性多糖類は、いずれも水溶性であって、ゲルろ過、液体クロマトグラフィー法での平均分子量が５０万以下、特に１千〜２０万のものが分離効率の点で好ましい。
【０００７】
本発明の酸性多糖類と中性多糖類の混合水溶液から、それぞれの多糖類を分離する工程は、酸性多糖類を酸水溶液でゲル化し分取する工程（１）及び二価以上の金属塩水溶液でゲル化し分取する工程（２）の、二工程で酸性多糖類を混合水溶液から分取するものである。この工程（１）及び（２）は、先ず工程（１）で分取して後、次いで工程（２）で分取する分離方法が、工程の操作的に好ましい。第二番目の工程は、第一番目の工程で得られたろ液を用いて酸性多糖類と中性多糖類として分離される。
【０００８】
第一番目の工程（１）は、多糖類混合水溶液に、酸水溶液を加えて、酸性多糖類をゲル化し、次いで生成ゲルを分取する工程である。
ゲル化に使用する酸は、無機強酸が好ましく、塩酸、硫酸、硝酸等が挙げられる。これらのうち、塩酸、硫酸が更に好ましく、特に塩酸が好ましい。酸の濃度は、０．２mol／Ｌ以上、好ましくは０．２〜６．０mol／Ｌであって、多糖類混合水溶液に対して、０．５倍容量以上、好ましくは０．７５〜５倍容量を加えて、pHを２以下としてゲル化するのがよい。酸水溶液を加えた多糖類混合水溶液は、充分にゲルが生成する迄、例えば５〜４０℃で１〜３０分間位静置する。特に好ましくは、１０分程度静置する。
ゲル生成が完了したら、ゲルをろ過、遠心分離、透析、デカンテーション等の分離手段で分取するが、工程の簡便さの点でろ過による分取が好ましい。ろ過膜は、細孔径が１μｍ以下、好ましくは０．５μｍ以下のものがよく、例えば、メンブランフィルター、透析膜等限外ろ過膜が好ましい。特に細孔径０．５μｍ以下のナイロン製メンブランフィルターが好ましい。ろ過速度、圧力等のろ過条件は、容量、ろ過法により異なり、圧力を用いたろ過においては、圧力は９８０kPa以下であり、４９０〜６９０kPaが好ましい。
【０００９】
工程（２）は、多糖類混合水溶液に二価以上の金属塩水溶液を加えて、酸性多糖類をゲル化し分取する工程である。この工程（２）は、工程の簡便さの点で、第一番目の工程を工程（１）とした第二番目の工程として実施するのがよい。この際は、工程（１）のろ液（多糖類混合水溶液）は酸性となっているのでアルカリ水溶液を加えて中和してから行う。ここで使用するアルカリ水溶液は、アルカリ金属の水酸化物が好ましく、特に水酸化ナトリウムが好ましい。濃度は、０．２mol／Ｌ以上が好ましく、特に０．２〜６mol／Ｌが好ましい。中和後に二価以上の金属塩水溶液を加えて、酸性多糖類のゲル化を行う。
【００１０】
多糖類混合水溶液へ加えて酸性多糖類をゲル化するに用いる二価以上の金属塩は、マグネシウム、カルシウム、亜鉛、アルミニウム、銅等の金属等の水溶性の無機塩等であって、安定なゲル生成が容易なカルシウム塩、特に塩化カルシウム等が好ましい。二価以上の金属塩の濃度は、１０重量％以上、特に２０〜５０重量％が好ましく、多糖類混合水溶液の０．２５〜１．０倍容量、特に０．５〜１．０倍容量加えるのが好ましい。次いで５〜４０℃で１〜３０分間静置してゲル化を完了させて後、工程（１）と同様にしてゲルを分取する。
【００１１】
工程（１）及び（２）で分取されたゲル化した酸性多糖類は、集めて同時に水溶液化をしてもよいが、工程（１）、（２）毎に水溶液化してから分離した酸性多糖類として集める方が工程が簡便で好ましい。
工程（１）で分取されたゲルは、アルカリ水溶液を加えて再溶解するが工程（２）で使用したアルカリ水溶液と同じアルカリ種を用いた水溶液を加えて再溶解するのが好ましい。ここで使用するアルカリ水溶液の液量は、多糖類混合水溶液の２倍容量以上、好ましくは５〜１５倍容量である。次いで酸で中和するが、工程（１）で使用した酸水溶液と同じ酸種を用いた水溶液が好ましく、再度ゲル化しないようにして中和を行う。
工程（２）で分取されたゲルは、キレート剤水溶液と混合してゲルを再溶解させる。キレート剤としては、エチレンジアミン四酢酸塩、ポリカルボン酸塩、クエン酸塩、縮合リン酸塩等が挙げられ、特にエチレンジアミン四酢酸塩等が好ましい。キレート剤水溶液は、０．５〜１．５重量％、特に０．５〜１．０重量％のものを、ゲル量に対し２倍容量以上、特に５〜１５倍容量を用いるのがよい。
【００１２】
このようにして、ゲルを再溶解した水溶液は、次いで混合して酸性多糖類水溶液とする。また中性多糖類は、工程（１）又は（２）で最後の生成ゲルを分取した残余の水溶液中に存在し、該水溶液を中性多糖類水溶液とする。
【００１３】
これら一連の分離工程は、多糖類の強酸による分解を極力防ぐために、１０時間以内、好ましくは数時間以内で行うのがよい。
【００１４】
【実施例】
実施例１
アルギン酸ナトリウム（分子量５万）１重量％及びヘミセルロース（分子量５万）１重量％を含有する水溶液１mLに水３mLを加え、次いで、１mol／Ｌ塩酸１mLを加え、攪拌後、２０℃、１０分間静置しゲル化を完了させた。細孔径０．２μｍのナイロン製メンブランフィルターを装置したシリンジでろ過し、フィルター上のゲルに、１mol／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液１０mLを添加し、ゲル化した酸性多糖類を水溶液として回収した。ろ液部は、１mol／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液で中和した後、３０重量％塩化カルシウム水溶液０．７５mLを加え、攪拌後、２０℃、１０分間静置しゲル化を完了させた。細孔径０．２μｍのナイロン製メンブランフィルターを装置したシリンジでろ過し、ろ液を回収中性多糖類水溶液とした。フィルター上のゲルに１重量％エチレンジアミン四酢酸ナトリウム水溶液１０mLを添加し、ゲル化した酸性多糖類を水溶液として回収した。回収した２種の酸性多糖類水溶液を混合して、回収酸性多糖類水溶液とした。
【００１５】
上記の分離工程で回収した、回収酸性多糖類水溶液と回収中性多糖類水溶液を、それぞれに水を加えて正確に５０mLとして後、下記条件での液体クロマトグラフィー測定により、酸性多糖類及び中性多糖類の回収率を求めたが、それぞれ９３％、９３％と高回収率であった。
【００１６】
液体クロマトグラフィー測定条件：
カラム    ：長さ３０cm、内径８mmのＧＰＣカラム［昭和電工製 SB 806MHQ］
カラム温度：４０℃
検出器    ：示差屈折計
移動相    ：０．１mol／Ｌ硝酸ナトリウム、０．０１mol／Ｌリン酸、０．００１mol／Ｌエチレンジアミン四酢酸ナトリウム  pH６．８
流速      ：０．８mL／min
注入量    ：１００μＬ
なお、アルギン酸ナトリウム又はヘミセルロースを１ｇ精秤し水を加えて正確に１００mLとした標準サンプルを使用して検量線を作成した。
【００１７】
比較例
アルギン酸ナトリウム（分子量５万）１重量％及びグアーガム（分子量２万）１重量％を含有する水溶液１００mLに、塩酸１００mLを加えてpH３．０以下としてゲルを生成させた後、細孔径１．０μｍのＰＴＦＥ（ポリテトラフルオロエチレン）メンブランフィルターでろ過し、ゲル化したアルギン酸ナトリウムを回収した。乾燥重量に基づく回収率は７０％であった。ろ液中に残ったアルギン酸ナトリウムの分離回収は困難であった。
【００１８】
【発明の効果】
酸性多糖類及び中性多糖類を含有する多糖類混合水溶液から、簡便にかつ高回収率で、酸性多糖類及び中性多糖類とを分離して定量できる。