(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
分子内ジスルフィド結合の還元開裂により形成されたＳＨ基の少なくとも１つが、分子内ジスルフィド結合への再結合を阻止することができる化学修飾を施されている還元変性血清アルブミンとトレポネーマ抗原とからなる複合体が、不溶性担体の表面に担持されていることを特徴とする、トレポネーマ抗体測定用材料。
【請求項２】
前記不溶性担体が、ポリスチレンラテックスである請求項１に記載のトレポネーマ抗体測定用材料。
【請求項３】
トレポネーマ抗体の免疫学的測定方法において、被検試料に請求項１又は２に記載のトレポネーマ抗体測定用材料を接触させることを特徴とする、トレポネーマ抗体の免疫学的測定方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、還元変性血清アルブミン、その製造方法、前記の還元変性血清アルブミンを利用した梅毒トレポネーマ抗原感作材料、及びその梅毒トレポネーマ抗原感作材料を用いるトレポネーマ抗体の免疫学的測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来より、抗原抗体反応を利用した各種検出法及び測定法が、研究分野及び診断分野等で利用されている。病原性ウイルスや細菌に感染した際に上昇する血中抗体価を測定する方法として、ウイルスや細菌をそのまま血清と混合し、その凝集度から抗体価を測定する方法がある。しかし、これらウイルスや細菌は病原性をもつことが多く、この方法は日常の検出法としては適当ではない。また、細菌などを超音波処理などで物理的に破壊し、凝集反応の抗原として用いることができるが、そのまま用いたのでは著しく検出感度が低い。高感度に血中抗体を検出する方法として、ヒツジ赤血球や高分子ラテックスなどの不溶性担体に抗原を感作して凝集反応を起こさせる方法や、プレートに抗原を固定化し、酵素免疫測定法でＩｇＧ又はＩｇＭ抗体を検出する方法が知られている。これらの方法では膜タンパク質などの不溶性抗原を使用する場合が多く、抗体を感度よく検出するためには、これら抗原を十分可溶化してから不溶性担体又はプレートに固定化する方法が一般に利用されている。
【０００３】
膜タンパク質の可溶化法としては、界面活性剤や尿素を用いる方法、アルカリ処理や酵素による方法などが報告されている。膜タンパク質を可溶化する界面活性剤としては、ドデシル硫酸ナトリウム（以下、ＳＤＳと称する）や、非イオン性界面活性剤のポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル類（例えば、商品名Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）など種々知られているが、一般に界面活性剤存在下では、不溶性担体又はプレートへの固定化効率は悪く、一方、界面活性剤を除去してからこれら不溶性担体又はプレートに固定化しようとしても界面活性剤を完全に除去することができないという問題点があった。
【０００４】
最近、温和な条件下で膜タンパク質を可溶化し、透析などの処理で簡単に取り除くことのできる界面活性剤として、オクチル−ｎ−グリコシドをはじめ、ｎ−オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド（以下、ＭＥＧＡ  ９と称する）、３−〔（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ〕プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳ）などが開発され、膜タンパク質の再構成の実験に使用されるようになった。
【０００５】
梅毒トレポネーマ抗原は、これらの界面活性剤により可溶化することができる。更に、可溶化された抗原は、透析処理後、高分子ポリスチレンや９６穴プレートに感作してトレポネーマ抗体（以下、ＴＰ抗体と称する）測定系の構築に利用することができる。しかし、大きな問題点は、このような方法で感作した抗原が、目的とするＴＰ抗体だけではなく、他の血清成分と非特異的に反応してしまうところにある。この現象は、尿素を用いて可溶化した膜タンパク質についても同様にみられる。尿素は、界面活性剤に比較して可溶化能が弱いが、条件が温和であるためタンパク質の可溶化によく用いられる。梅毒トレポネーマ抗原はこの尿素により可溶化されるが、高分子担体やプレートウエルに感作した場合、やはり目的以外の血清成分と非特異反応を起こしてしまい、問題点は依然として解消されないままである。
その他に、アルカリ処理や酵素により可溶化を行う方法があるが、タンパク質の分解や変性により、本来期待すべき抗原性が失われる場合があるので、一般的に用いられる方法ではなく、複数の抗原からなる梅毒トレポネーマ抗原の可溶化には特に適さない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
前記のように、ＴＰ抗体以外の血清成分との非特異的反応を起こさずに、検出対象であるＴＰ抗体のみを特異的に高感度に検出する測定系を構築するためには、従来法では確立されていなかった、梅毒トレポネーマ抗原の可溶化法を開発する必要がある。
本発明者は、通常の免疫学的測定法において非特異的反応を防止するために不溶性担体表面に塗布して用いられる血清アルブミンを処理して得た還元変性アルブミンを用いると、従来法の欠点を解消したＴＰ抗体の優れた検出手段を提供することができることを見出した。本発明はこうした知見に基づくものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
従って、本発明は、分子内ジスルフィド結合の還元開裂により形成されたＳＨ基の少なくとも１つが、分子内ジスルフィド結合への再結合を阻止することができる化学修飾を施されている還元変性血清アルブミンとトレポネーマ抗原とからなる複合体が、不溶性担体の表面に担持されていることを特徴とする、トレポネーマ抗体測定用材料に関する。
本発明のトレポネーマ抗体測定用材料の好ましい態様においては、前記不溶性担体が、ポリスチレンラテックスである。
また、本発明は、トレポネーマ抗体の免疫学的測定方法において、被検試料に前記トレポネーマ抗体測定用材料を接触させることを特徴とする、トレポネーマ抗体の免疫学的測定方法にも関する。
【０００８】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明による還元変性アルブミンは、例えば、血清アルブミンに（１）還元処理及び（２）固定処理を施すことによって調製することができる。
本発明で用いられる血清アルブミンの由来は特に限定されず、哺乳類、例えばヒト、ウサギ、ラット、モルモット、トリ、ウシ由来の血清アルブミンを用いることができる。特に、ウシ血清アルブミン（以下、ＢＳＡと称する）を用いるのが好ましい。ＢＳＡは分子量約６万のタンパク質であり、タンパク質表面に１個の遊離のＳＨ基が存在し、タンパク質内部には１７個のジスルフィド結合（以下、Ｓ−Ｓ結合と称する）が存在することが知られている。本発明では、これらのＳ−Ｓ結合を還元開裂してタンパク質内部の隠れた部分（すなわち疎水性領域）を露出させ、更に、還元開裂によって形成された遊離のＳＨ基を化学修飾してＳＨ基が再び分子内で再結合できないように処理し、前記の還元変性状態を固定することによって、表面に疎水性領域を有する還元変性血清アルブミンを得ることができる。
【０００９】
血清アルブミンの還元処理は、血清アルブミン分子内のＳ−Ｓ結合を開裂することのできる条件で実施する。還元処理は、アルカリ条件下で実施するのが好ましく、例えば、アルカリ領域の緩衝に用いられる緩衝液（例えば、ジエタノールアミン緩衝液、又は炭酸緩衝液）の中で、強力な還元剤の存在下で実施するのが好ましい。更に、タンパク質変性剤（例えば、尿素、又は塩酸グアニジン）を共存させると、完全に還元処理を実施することができるため好ましい。還元処理に用いる血清アルブミン濃度は、好ましくは０．１重量％〜１０重量％、より好ましくは１〜５重量％である。血清アルブミン濃度が０．１重量％未満ではその後の複合体形成工程又は感作工程において濃縮操作が必要となり、１０重量％を越えると血清アルブミンが溶解しにくく、更に還元されにくくなることがあるからである。また、１〜５重量％の範囲内であると、反応効率がよく、また、そのままトレポネーマ抗原との複合体形成に使用できる点で特に好ましい。アルカリ条件としては、反応ｐＨは好ましくは８〜１２、より好ましくは１０〜１１である。ｐＨ８未満では還元開裂されにくく、ｐＨ１２を越えると不可逆的なタンパク質変性が起こることがあるからである。また、ｐＨ１０〜１１では反応効率がよいので好ましい。
【００１０】
還元剤としては、例えば、水素化ホウ素ナトリウム、又は亜硫酸塩、好ましくは強力な還元剤、例えば、チオール還元剤（例えば、グルタチオン、２−メルカプトエタノール、ジチオトレイトール、又はジチオエリスリトール）を用いることができる。特にジチオトレイトール又はジチオエリスリトールが好適に用いられる。また、還元剤の濃度は、好ましくは５〜５００ｍＭ、より好ましくは１０〜４０ｍＭである。５ｍＭ未満では還元処理が不充分になることがあり、５００ｍＭを越えると還元開裂によって生じたＳＨ基を修飾するためのアルキル化剤が過剰に必要になることがあるからである。また、１０〜４０ｍＭでは、反応後の還元剤を容易に除去できる点でも好ましい。この還元処理の時間は特には限定されず、好ましくは５分間以上、より好ましくは１０分〜２時間である。処理時間が５分間未満であるとＳ−Ｓ結合の還元開裂が不充分となり、２時間を越えると還元剤自身が酸化され、その能力が低下することがある。
【００１１】
好ましい還元工程は、ジエタノールアミン緩衝液又は炭酸緩衝液中にて、ｐＨ８〜１２（特には１０〜１１）で、５〜４０ｍＭ還元剤（特にはグルタチオン、２−メルカプトエタノール、ジチオトレイトール、又はジチオエリスリトール）の存在下で、０．１重量％〜１０重量％血清アルブミンを５分〜２時間実施する。
【００１２】
前記還元工程に続いて、好ましくは同一反応系内で、固定工程を行う。これは、還元処理により生じたＳＨ基を化学修飾して、Ｓ−Ｓ結合の再形成を防止することを目的とする。ＳＨ基の化学修飾には、遊離のＳＨ基を修飾してチオール−ジスルフィド交換反応を防ぐことのできる各種の化合物（ＳＨ修飾試薬）を使用することができる。ＳＨ修飾試薬としては、アルキル化剤（例えば、ヨードアセトアミド、モノヨード酢酸、エチレンイミン、若しくはメチル−ｐ−ニトロベンゼンスルホン酸ナトリウム）、有機水銀化剤（例えば、ｐ−クロロマーキュリ安息香酸、若しくはフェニル酢酸水銀）、又はヒ素化剤（例えば、三酸化ヒ素、若しくは亜ヒ酸塩）を用いることができる。特にはアルキル化剤であるヨードアセトアミド又はモノヨード酢酸を用いるのが好ましい。ＳＨ修飾試薬の添加量は、前記工程で用いた還元剤の濃度に対して過剰量（例えば、モル濃度で１．５〜１０倍）加えることが好ましい。１．５倍未満ではＳＨ基の修飾が不充分になり、Ｓ−Ｓ結合の再形成を防止することができない場合があり、１０倍を越えるとタンパク質のメチオニン残基、リジン残基、又はヒスチジン残基が修飾されることがあるからである。還元工程と固定工程とを同一反応系内で実施する場合は、２８０ｎｍの吸光度の変化によって還元処理が終了したことを確認してから、ＳＨ修飾試薬を添加すればよい。また、反応時間も特には限定されず、少なくとも５分間以上、好適には１０分〜２時間の反応時間で充分である。
【００１３】
本発明による前記の還元変性血清アルブミンと可溶化トレポネーマ抗原とから複合体を形成し、この複合体で感作した不溶性担体を用いてトレポネーマ抗体の検出を行うと、夾雑物質による非特異的反応に妨害されず、ＴＰ抗体に特異的な検出を実施することができる。
前記の複合体の形成に用いるトレポネーマ抗原は、梅毒の病原体であるトレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ）の菌体又は菌体成分から、膜タンパク質可溶化用の公知の界面活性剤（例えば、オクチル−ｎ−グリコシド又はＭＥＧＡ  ９）で可溶化し、タンパク質の精製に用いる公知の精製方法（例えば、超遠心分離、液体クロマトグラフィー）によって、精製したトレポネーマ抗原を用いることができる。
【００１４】
本発明の還元変性血清アルブミンと可溶化トレポネーマ抗原とからなる前記の複合体は、還元変性血清アルブミンと前記の可溶化トレポネーマ抗原と、適当な緩衝液中で、常温にて単に混合することによって調製することができる。トレポネーマ抗原の可溶化に用いた界面活性剤は、複合体の形成後に除去するのが好ましい。界面活性剤は、透析などの手段、例えば２０ｍＭリン酸緩衝溶液（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ：以下、ＰＢＳと称する）（ｐＨ７．０）に透析することにより、行うことができる。
【００１５】
こうして得られるトレポネーマ抗原・還元変性血清アルブミン複合体を不溶性担体に担持させることにより、本発明によるトレポネーマ抗体（ＴＰ抗体）測定用材料を調製することができる。不溶性担体としては、例えば、凝集法に用いるポリスチレンラテックス、ヒツジ赤血球、若しくはゼラチンパーティクル、又は酵素免疫測定法に用いるプレート、若しくはポリスチレンビーズを用いることができる。トレポネーマ抗原・還元変性血清アルブミン複合体を不溶性担体に担持させるには、公知の感作方法、例えば、物理吸着による固定化法や、化学結合法を用いることができる。化学結合法の場合には、化学架橋試薬として、例えば、従来公知のカルボジイミドやグルタルアルデヒドを利用することができる。
【００１６】
本発明による前記のＴＰ抗体測定用材料を用いて、被検試料中のＴＰ抗体を測定することができる。本発明によるＴＰ抗体測定法は、前記のＴＰ抗体測定用材料を用いることを除けば、その他の点では従来の免疫学的ＴＰ抗体測定法と代わる点はない。従って、本発明によるＴＰ抗体測定法を、例えば、凝集法（例えば、ラテックス凝集法、ヒツジ赤血球凝集法）、酵素免疫測定法（例えば、サンドイッチＥＬＩＳＡ法）、化学発光免疫法などに適用することができる。
また、被検試料としても、従来法と同様に、ＴＰ抗体が存在する疑いのある試料、例えば、血清、血漿、髄液等の生体液試料を用いることができる。
【００１７】
本発明方法を利用してラテックス凝集法を実施する場合には、トレポネーマ抗原・還元変性血清アルブミン複合体によってポリスチレンラテックス（不溶性担体）を感作し、被検試料と接触させ、その凝集を目視的、又は分光学的に測定する公知の方法で凝集の程度を観察すればよい。
【００１８】
本発明方法を利用して酵素免疫測定法を実施する場合には、トレポネーマ抗原・還元変性血清アルブミン複合体によってマイクロプレート（不溶性担体）を感作し、血清などＴＰ抗体が存在する疑いのある被検試料を反応させた後、ペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼ標識抗ヒトＩｇＧ及び／又はＩｇＭでＴＰ抗体を検出すればよい。
【００１９】
【作用】
次に、本発明によるＴＰ抗体測定法の原理を図１に示す推論に沿って説明するが、本発明は以下の説明によって限定されるものではない。
従来のＴＰ抗体測定法においては、界面活性剤によってトレポネーマ抗原（１）を可溶化して膜（２）から単離し、得られた可溶化トレポネーマ抗原をそのまま使用して不溶性担体を感作していた。トレポネーマ抗原（１）を膜（２）から単離すると、疎水性領域（３）が露出する。その疎水性領域（３）が露出されたトレポネーマ抗原（１）を不溶性担体に担持させた場合には、すべてのトレポネーマ抗原（１）が疎水性領域（３）側で不溶性担体と付着するとは限らないので、疎水性領域（３）が外側に露出した状態で不溶性担体上に担持される。この疎水性領域（３）が、非特異的反応の原因になるものと考えられる。
【００２０】
これに対して、本発明では、血清アルブミン（４）から還元変性血清アルブミン（５）を形成すると、Ｓ−Ｓ結合の開裂によって血清アルブミン（４）内の疎水性領域（６）が露出される。この還元変性血清アルブミン（５）を前記の可溶化トレポネーマ抗原と混合すると、可溶化トレポネーマ抗原の疎水性領域（３）が還元変性血清アルブミン（５）の疎水性領域（６）によってマスクされて、複合体（７）が形成される。本発明では、疎水性領域がマスクされた複合体によって不溶性担体を感作するので、感作不溶性担体上には、露出された疎水性領域が事実上存在しない。こうして、本発明方法によれば、非特異的反応を防止することができるものと考えられる。
【００２１】
【実施例】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
実施例１：還元変性牛血清アルブミンの調製
１０ｍＭジエタノールアミン緩衝液（ｐＨ１１）に牛血清アルブミン（ＢＳＡ：シグマ社製、ＲＩＡ  Ｇｒａｄｅ）を１ｍｇ／ｍｌになるように溶解した。得られた溶液に２−メルカプトエタノールを２０ｍＭとなるように加え、３７℃で２時間反応させた。その後、この反応液に、２−メルカプトエタノールに対して２倍モル量のヨード酢酸を加え、室温で１５分間放置した。この処理後、生成物（還元変性ＢＳＡ）及び前記処理前のＢＳＡ溶液の波長２８０ｎｍにおける吸光度を測定すると、表１に示すように、処理前のＢＳＡに比較して、本発明の還元変性ＢＳＡは吸光度が約３倍に上昇した。これは、内部のＳ−Ｓ結合が開裂して隠れていた内部領域が露出したことを示すものと考えられる。
【００２２】
【表１】
0003783084.tif 000002
【００２３】
実施例２：還元変性牛血清アルブミンを用いたトレポネーマ抗体の測定
界面活性剤ＭＥＧＡ  ９（５０ｍＭ）で可溶化した梅毒トレポネーマ抗原（１００μｇ／ｍｌ）（常盤化学）１００μｌに、前記実施例１で調製した還元変性ＢＳＡ（１ｍｇ／ｍｌ）２０μｌを添加した後、全量を１ｍｌにして室温で１５分間放置した。その後、２０ｍＭリン酸緩衝溶液（以下、ＰＢＳと称する）（ｐＨ７．０）で透析して、界面活性剤を除いた。このトレポネーマ抗原・還元変性ＢＳＡ複合体に、１０％ポリスチレンラテックス（粒径：０．４５５μｍ）／１％ドデシル硫酸ナトリウム（以下、ＳＤＳと称する）懸濁液１００μｌを加え、室温で１時間攪拌感作した。２０ｍＭ−ＰＢＳ（ｐＨ７．０）で２回遠心洗浄した後、同じ２０ｍＭ−ＰＢＳ（ｐＨ７．０）に懸濁した。
対照として、従来法により感作したラテックスを調製した。すなわち、５０ｍＭ界面活性剤ｎ−オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド（以下、ＭＥＧＡ  ９と称する）で可溶化した梅毒トレポネーマ抗原（１００μｇ／ｍｌ）１００μｌを、上記と同様の１０％ポリスチレンラテックス懸濁液に加え、１時間室温で撹拌した後、１％ＢＳＡでラテックスをブロッキングし、２０ｍＭ−ＰＢＳ（ｐＨ７．０）で２回遠心洗浄した後、同様に２０ｍＭ−ＰＢＳ（ｐＨ７．０）に懸濁した。
【００２４】
こうして調製した２種類のラテックス試薬を用い、梅毒トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  Ｐａｌｌｉｄｕｍ：以下、ＴＰＨＡと称する）陽性患者血清及びＴＰＨＡ陰性血清を免疫自動分析装置（ＬＰＩＡ１００：ラテックスフォトメトリックイムノアッセイシステム；ダイアヤトロン社）で測定した。操作条件は、被検試料として血清１０μｌ、安定化液（０．１Ｍトリス（ｐＨ８．０）、０．９％塩化ナトリウム、０．５％デキストラン硫酸、及び０．１％ＢＳＡ）２００μｌ、押出し緩衝液（０．１Ｍトリス（ｐＨ８．０）、０．９％塩化ナトリウム、及び０．１％ＢＳＡ）５０μｌ、ラテックス試薬４０μｌを注入し、１０分間反応させた。従来法により調製した対照用ラテックス試薬を用いた場合の結果を図２に、本発明によるラテックス試薬を用いた場合の結果を図３に示す。図２及び図３において、横軸は血清希釈列、縦軸は平均速度Ｖを表し、●はＴＰＨＡ陽性血清、○はＴＰＨＡ陰性血清の結果を示す。図２に示すとおり、従来の感作法で調製したラテックス試薬は、ＴＰＨＡ陰性血清での非特異的反応が観察されるが、図３に示すように、本発明によるラテックス試薬は、非特異的反応もなく、測定対象物質であるトレポネーマ抗体を特異的に測定することができた。
【００２５】
【発明の効果】
本発明による還元変性血清アルブミンを用いて調製したトレポネーマ抗体測定用材料によれば、非特異的反応なしに、ＴＰ抗体を高感度・特異的に測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の測定法の原理を模式的に示す説明図である。
【図２】実施例２において、従来法によるラッテクス試薬を用いて行ったトレポネーマ抗体測定の結果を示すグラフである。
【図３】実施例２において、本発明によるラッテクス試薬を用いて行ったトレポネーマ抗体測定の結果を示すグラフである。
【図１】
0003783084.tif 000003
【図２】
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【図３】
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