(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の２つの独立した転写ユニット：
(a)  バキュロウイルス・ポリヘドリンをコードする核酸が、プロモーターにより転写が開始されるようにプロモーターと連結しているもの；
(b)  バキュロウイルス・ポリヘドリン、バチルス・チューリンジェンシス（Bacillus thuringiensis）結晶タンパク質およびクラゲAequorea victoriaグリーン蛍光タンパク質からなる融合タンパク質をコードする核酸が、プロモーターにより転写が開始されるようにもう一つのプロモーターと連結しているもの；
を含み、バキュロウイルス・ポリヘドリン、バチルス・チューリンジェンシス（Bacillus thuringiensis）結晶タンパク質およびクラゲAequorea victoriaグリーン蛍光タンパク質から構成される組換え多角体を産生する、組換えバキュロウイルス。
【請求項２】
請求項１記載の組換えバキュロウイルスであって、前記（ｂ）において、バキュロウイルス・ポリヘドリンがオートグラファ・カリフォルニカ（Autographa californica）核多角体病ウイルス由来のものであり、前記バチルス・チューリンジェンシス（Bacillus thuringiensis）結晶タンパク質が１番目から613番目までのアミノ酸配列を含むCry１Acタンパク質セグメントである、組換えバキュロウイルス。
【請求項３】
受託番号KCTC 0444BPを有する、請求項１記載の組換えバキュロウイルス。
【請求項４】
請求項１記載の組換えバキュロウイルスであって、前記（ｂ）における融合タンパク質が、前記バキュロウイルス・ポリヘドリン、前記バチルス・チューリンジェンシス（Bacillus thuringiensis）結晶タンパク質および前記クラゲAequorea victoriaグリーン蛍光タンパク質がＮ末端からＣ末端へ連続的に連結さている融合タンパク質である、バキュロウイルス。
【請求項５】
以下の２つの独立した転写ユニット：
(a)  バキュロウイルス・ポリヘドリンをコードする核酸が、プロモーターにより転写が開始されるようにプロモーターと連結しているもの；
(b)  バキュロウイルス・ポリヘドリン、バチルス・チューリンジェンシス（Bacillus thuringiensis）結晶タンパク質およびクラゲAequorea victoriaグリーン蛍光タンパク質がＮ末端からＣ末端へ連続的に直接連結されている融合タンパク質をコードする核酸が、プロモーターにより転写が開始されるようにもう一つのプロモーターと連結しているもの；
を含む、遺伝子導入ベクター。
【請求項６】
プラスミドｐColorBtrusである、請求項５記載の遺伝子導入ベクター。
【請求項７】
請求項６に記載のバキュロウイルス遺伝子導入ベクターｐColorBtrusを構築する方法であって、ポリメラーゼ連鎖反応によってプラスミドpGFPからグリーン蛍光タンパク質をコードするDNA断片を合成する工程、ポリメラーゼ連鎖反応によって野生型オートグラファ・カリフォルニカ（Autographa californica）核多角体病ウイルスからポリヘドリン遺伝子を合成する工程、グリーン蛍光タンパク質をコードするDNA断片の5 ’-末端がポリヘドリン遺伝子の3 ’-末端に連結されるように、グリーン蛍光タンパク質をコードするDNA断片とポリヘドリン遺伝子をバキュロウイルス発現ベクターpAcUW31へ挿入し、さらにポリヘドリン遺伝子をバキュロウイルス発現ベクターpAcUW31へ挿入してバキュロウイルス遺伝子導入ベクターpColorPolを生成する工程、ポリメラーゼ連鎖反応によってバチルス・チューリンジェンシス（Bacillus thuringiensis）Cry１Ac遺伝子を含むプラスミドpPN6.6からCry１Ac遺伝子を合成する工程、並びにCry１Ac遺伝子をポリヘドリン遺伝子とグリーン蛍光タンパク質をコードするDNA断片との間に挿入する工程を含んでなる前記方法。
【請求項８】
バキュロウイルス・ポリヘドリン、バチルス・チューリンジェンシス（Bacillus thuringiensis）結晶タンパク質およびクラゲAequorea victoriaグリーン蛍光タンパク質がＮ末端からＣ末端へ連続的に直接連結されている融合タンパク質をコードする融合遺伝子を含む遺伝子導入ベクターと、野生型バキュロスウイルスとを同時に昆虫細胞に導入して培養する工程を含んでなる、請求項１記載の組換えバキュロスウイルスの構築方法。
【請求項９】
前記遺伝子導入ベクターが請求項６に記載のpColorBtrusである、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
請求項１記載の組換えウイルスを含んでなる殺虫用組成物。
【請求項１１】
請求項５記載の遺伝子導入ベクター系を利用するタンパク質の精製方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は即効性でありながら優れた殺虫力を示す新規な組換えバキュロスウイルス、その構築方法および前記バキュロウイルスを含む殺虫用組成物に関する。
【０００２】
背景技術
バキュロウイルスは昆虫に対して病原性を有し、そのためそれらのウイルスが増殖すると宿主が死滅する。さらに、バキュロウイルスは脊椎動物に対しては病原性が無く、野外環境(fields)においてその活性を長時間維持する。これらの利点から、20種ものウイルスが開発され殺虫剤として市販されている。しかし、バキュロウイルスはその宿主範囲が狭く、また殺虫効果が比較的低い。これらの不利な点により、害虫の制御薬剤としての該ウイルスの使用には制限がある。
【０００３】
最近では、特異的な害虫制御薬剤としてのバキュロウイルスの有用性を改善しようとする研究が活発になされ、現在も続けられている。これに関して、遺伝子操作技術により、かかる目的のための有用な手段が提供されている。事実、種々の外来遺伝子をバキュロウイルスに導入することで殺虫速度を改善した該ウイルスを製造するために、幾つかの試みがなされている。この目的に沿う外来遺伝子としては、Buthus eupeus昆虫毒素-1(Carbonellら、Gene,73,409-418(1988))、Manduca sexta利尿ホルモン(Maeda、Biochem．Biophys．Res.Commun,，165,1177-1183(1989))、Heliothis virescens幼若ホルモンエステラーゼ(Hammockら、Nature,344,458-461(1990)；Bonningら、Insect Biochem.Mol．Biol.,22,453-458(1992))、Pyemotes tritici TxP-Ｉ毒素(TomalskiおよびMiller,Nature,352,82-85(1991))、Androctonus australis AalT毒素(Stewartら、Nature,352,85-88(1991))ならびに昆虫特異的なクモ毒素(Hughesら、Ｊ.Invertebr,Pathol.,69,112-118(1997))をコードする遺伝子が含まれる。このうち、サソリ毒素をコードする遺伝子のみが組換えバキュロウイルスの病原性を増大させることができる。しかしながら、この遺伝子を担持するバキュロウイルスでさえ、その殺虫速度は依然として遅い。
【０００４】
Bacillus thuringiensis(グラム陽性細菌。以後、「Bt」と称する)のデルタエンドトキシンはBtの胞子形成時に大量に蓄積される昆虫特異的毒素であって、優れた殺虫力を有しかつヒトおよび家畜に対して無害である点から、害虫個体数を制御するための有効な手段であることが示されてきた(Feitelsonら、Bio/Technology,10,271-275(1992))。このエンドトキシンの殺虫機構は、酵素による切断により開始される。感受性昆虫に取り込まれた場合、該エンドトキシンは消化管のアルカリ性環境内で可溶化され、消化管分泌液中に存在するプロテアーゼの作用により切断されてより小さな活性化タンパク質となる。この活性化タンパク質が消化管の上皮細胞と結合することにより、消化管の破壊が起こる。感受性の昆虫は、消化液と体液のpH変化により麻痺症状を見せ、摂食をやめて最終的には24〜48時間で死に至る。例えば、Btエンドトキシンの一種である鱗翅目特異的結晶タンパク質(Cry１)は全体で130〜140 kDaの大きさであるが、該タンパク質がプロテアーゼにより切断されて約60〜70kDaのより活性の高い断片(該タンパク質のN末端側半分に相当する)となった場合、その毒性は大いに増強される(Aronsonら、Microbiol,Rev.,50,1-24(1986))。
【０００５】
Btエンドトキシンタンパク質をバキュロウイルスで発現させることによりウイルスの殺虫力を改善することについての注目すべき研究がなされた(BonningおよびHammock,Annu.Rev.Entomol.,41,191-210(1996))。しかし、この組換えバキュロウイルスは昆虫の血液リンパ中でBtエンドトキシンタンパク質を多量に生産するものの、該ウイルスの病原性の増強は見られなかった。この結果は、プロテアーゼおよび消化管上皮細胞の存在下で実行されるBtエンドトキシンの殺虫機構を考慮に入れなかったことに起因する。すなわち、血液リンパ中でプロモーターPpolの制御下において発現される単一のBtエンドトキシンタンパク質は、消化管内では活性化されない。
【０００６】
発明の開示
本発明者らは、バキュロウイルス・ポリヘドリンが消化管内のアルカリ性環境下でプロテアーゼにより活性化されるという点に着目して、短時間のうちに優れた殺虫力を示す新規なバキュロウイルスを開発するための研究を重ね、遂に、Bacillus thuringiensis結晶タンパク質とバキュロウイルス・ポリヘドリンを融合させることによって、殺虫力と殺虫時間を大幅に改善し得ることを見出した。
【０００７】
従って、本発明の目的は、先行技術で認められた上記問題点を克服し、短時間のうちに優れた殺虫力を示す新規な組換えバキュロウイルスを提供することである。
【０００８】
本発明の別の目的は、感染昆虫をモニタリングする手段を備えた新規な組換えバキュロウイルスを提供することである。
【０００９】
本発明のさらなる目的は、組換えバキュロウイルスの構築方法を提供することである。
【００１０】
本発明のさらなる目的は、組換えバキュロウイルス用の遺伝子導入ベクター(transfer vector)の構築方法を提供することである。
【００１１】
本発明のさらに別の目的は、強力な殺虫活性と即効性を示し、かつ過剰使用を防止し得る殺虫用組成物を提供することである。
【００１２】
本発明のさらに別の目的は、タンパク質の簡便な精製方法を提供することである。
【００１３】
本発明の一態様によれば、バキュロウイルス・ポリヘドリン(PH)、Bacillus thuringiensis結晶タンパク質(CP)およびクラゲAequorea victoriaグリーン蛍光タンパク質(GFP)から構成される組換え多角体を産生する組換えバキュロウイルスが提供される。
【００１４】
本発明の別の態様によれば、ポリメラーゼ連鎖反応によってプラスミドpGFPからグリーン蛍光タンパク質(GFP)をコードするDNA断片を合成する工程、ポリメラーゼ連鎖反応によって野生型Autographa californica核多角体病ウイルス(Nucleopolyhedrovirus)からポリヘドリン(PH)遺伝子を合成する工程、グリーン蛍光タンパク質をコードするDNA断片の5’-末端がポリヘドリン遺伝子の3’-末端に連結されるようにグリーン蛍光タンパク質をコードするDNA断片とポリヘドリン遺伝子をバキュロウイルス発現ベクターpAcUW31へ挿入してバキュロウイルス遺伝子導入ベクターpColorPolを生成する工程、ポリメラーゼ連鎖反応によってBacillus thuringiensis Cry１Ac遺伝子を含むプラスミドpPN6.6からCry１Ac遺伝子を合成する工程、Cry１Ac遺伝子をポリヘドリン遺伝子とグリーン蛍光タンパク質をコードするDNA断片との間に挿入する工程を含んでなる、バキュロウイルス遺伝子導入ベクターpColorBtrusの構築方法が提供される。
【００１５】
本発明のさらなる目的によれば、バキュロウイルス・ポリヘドリン、Bacillus thuringiensis結晶タンパク質およびクラゲAequorea victoriaグリーン蛍光タンパク質がＮ末端からＣ末端へ連続的に直接連結されている融合タンパク質をコードする融合遺伝子を含む遺伝子導入ベクターと、野生型バキュロスウイルスとを同時に昆虫細胞に導入して培養する工程を含んでなる、前記組換えバキュロスウイルスの構築方法が提供される。
【００１６】
本発明のさらなる目的によれば、前記組換えウイルスを含む殺虫用組成物が提供される。
【００１７】
本発明のさらに別の目的によれば、前記遺伝子導入ベクター系を利用するタンパク質の精製方法が提供される。
【００１８】
発明を実施するための最良の形態
本明細書において、用語「バキュロウイルス」は、多角体(Polyhedra)内に封入されたビリオンを意味する。多角体は感染末期に感染昆虫細胞の核に現れる多角体形状のポリヘドリン(PH)の集合体である。特に言及しない限り、用語「組換え多角体」は、PH-CP-GFP融合タンパク質からなる多角体を意味する。
【００１９】
PH-CP-GFP融合タンパク質は、PHタンパク質のＣ末端がCPのＮ末端に連結し、CPのＣ末端がGFPのＮ末端に連結するような構造をしている。
【００２０】
構造タンパク質として、PH自体は殺虫性を示さず、環境に対してウイルス粒子を保護する。昆虫に摂取されると、PHは消化管のアルカリ性環境下で可溶化され、プロテアーゼによって切断されてウイルス粒子を放出する。
【００２１】
CPはBtエンドトキシンであり、例としては、Cry１Ac、Cry１Ab、Cry1E、これらの殺虫特性を含むタンパク質セグメントが挙げられる。１番目から613番目までのアミノ酸配列を含むCry１Acタンパク質セグメントが好適である。PH同様、CPは消化管のアルカリ条件下で可溶化され、プロテアーゼによって切断されて活性化殺虫性セグメントを遊離する。例えば、Cry１Acの殺虫性セグメントは27番目から607番目までのアミノ酸配列である。
【００２２】
従って、本発明の融合タンパク質はバキュロウイルスの組換え多角体を構成する一方、消化管のアルカリ環境下でプロテアーゼの作用によって分解される。即ち、融合したPHが分解されてウイルスを放出すると同時に、CPが切断されて活性化殺虫性セグメントが遊離し、遊離した殺虫性セグメントが消化管の上皮細胞に結合して消化管を破壊する。結果として、本発明の融合タンパク質を摂取した昆虫は、摂食を中断し、消化液と体液のpH変化によって麻痺症状を示して最終的に24〜48時間以内に死に至る。
【００２３】
本発明で使用するGFPは、クラゲAequorea victoria由来のものであり、紫外線で励起されると緑色の光を発する非常に安定なタンパク質である。このGFPは、害虫を制御する目的で組換えウイルスに導入されたことがある(Chao  et  al.、Nature,380，396-397，1996)。本発明では、組換えバキュロウイルスに感染した幼虫と生態系におけるその分布の検出およびモニタリングを容易にし、その結果、無分別な殺虫剤の濫用を防止する。
【００２４】
本発明では、新規な組換えバキュロウイルスColorBtrusを開発した。この組換えバキュロウイルスは、AcNPV由来のPH、１番目から613番目までのアミノ酸配列からなるCry１Acタンパク質セグメント、およびGFPが順次に連結された融合タンパク質から構成される組換え多角体を産生するものである。バキュロウイルスColorBtrusは、韓国生命工学研究所付設遺伝工学研究所に1998年3月10日付けで受託番号KCTC 0444BP号で寄託した。
【００２５】
新規な組換えバキュロウイルスColorBtrusを開発する妥当なアプローチは、PH-CP-GFPタンパク質をコードする融合遺伝子を含むバキュロウイルス遺伝子導入ベクターを構築するものである。融合遺伝子の場合、PH、CPおよびGFPをそれぞれコードする３つの塩基配列断片を連続的に連結させる。PHをコードする遺伝子は入手可能であり、AcNPV由来のもの、Spodoptera exigua核多角体病ウイルス由来のもの、またはBonbix mori核多角体病ウイルス由来のものがあり、AcNPV由来のPH遺伝子が好適である。また、CPをコードする塩基配列の例としては、Cry１Ac(Adang，M．J．et  al．，Gene,36，289-300(1985)）、Cry１Ab,  Cry１Eまたはこれらの殺虫特性を含むタンパク質セグメントをコードするものが挙げられる。１番目から613番目までのアミノ酸配列からなるCry１Acタンパク質セグメントに対応する塩基配列が好適である。GFPをコードする塩基配列としては、クラゲAequorea victoria由来のGFP遺伝子を含むのが好ましい。これらの塩基配列は、対応の遺伝子を含むベクターからPCRまたは酵素切断によって得ることができ、また、化学的に合成することもできる。
【００２６】
これらの配列は、PHをコードする塩基配列の5’-末端とGFPをコードする塩基配列の3’-末端が、得られる塩基配列の両末端となるように連続的に連結させる。この融合配列を、既知のバキュロウイルス遺伝子導入ベクター、例えば、PAcUW31(GenBank  登録番号UO2452)に挿入してPH-CP-GFP融合タンパク質をコードする融合遺伝子を含む新規なバキュロウイルス遺伝子導入ベクターを取得することができる。
【００２７】
詳細には、GFP遺伝子とPH遺伝子は、それぞれプラスミドpGFP(Clonetech)および野生型AcNPVからPCRによって増幅させればよい。GFP遺伝子の5’-末端をPH遺伝子の3’-末端へ連結させ、連結した配列をバキュロウイルス発現ベクターpAcUW31(Clonetech)に挿入してバキュロスウイルス遺伝子導入ベクターpColorPolを構築する(図１b)。Cry１Ac遺伝子は、プラスミドpPN6.6(Adang博士より入手)からPCRによって増幅させ、pColorPol上のPH遺伝子とGFP遺伝子の間に挿入してプラスミドpColorBtrusを取得する(図１c)。pColorBtrusでは、PH、Cry１AcおよびGFPのそれぞれをコードする３つの遺伝子が順次に融合されている。組換え多角体を安定的に産生するためには、同一の細胞内で本来のポリヘドリンと融合タンパク質を同時に発現させる必要がある。この場合、図１bおよび１cに示すように、p10プロモーターとポリヘドリン遺伝子プロモーターの２つのプロモーターを有する組換えウイルスを作製する方法がある。これらの２つのプロモーターはそれぞれ、本来のポリヘドリンと融合タンパク質の転写を開始させるものである。これら２つの独立した転写ユニットは、互いに反対方向を向いている。これらのベクター系では、本来のPH遺伝子と融合遺伝子をそれぞれプロモーターPP10およびPPHの下流に導入する。
【００２８】
このようにして得たバキュロウイルス遺伝子導入ベクターと野生型バキュロウイルスのゲノムDNAを20mM HEPES緩衝液に溶解したDNA溶液を、LipofectinTM (Gibco)と混合し、室温で放置した。その後、このLipofectin-DNA複合溶液を、Sf９細胞(InVitrogen)を播種した細胞培養ディッシュへ滴下し、インキュベートして組換えバキュロウイルスを産生させる。このトランスフェクションには、宿主細胞としてSf21およびTn5を用いることもできるが、Sf９細胞が好適である。多角体の観察には、倒立位相差顕微鏡が有用である。所定の時間が経過した後、培養物を遠心分離して組換えウイルスColorBtrusを上清より取得する。
【００２９】
本発明の組換えバキュロウイルスは、野生型AcNPVに比べて100倍以上の殺虫活性を示し、かつ殺虫時間が３分の１に短縮されている。殺虫剤として用いる場合には、組換えバキュロウイルスを顆粒剤、粉剤、液相剤、および水性液剤へ製剤化することができ、水性液剤が好適である。例えば、水性液剤には、組換えバキュロウイルス粒子２×1010個、ホワイトカーボン100g、スクロース100g、ポリビニルアルコール50g、Triton X-100 10mlおよびベントナイト10gが含まれ、最終容量が10リットルとなるように水を添加する。
【００３０】
本発明の製剤化した殺虫用組成物は、ネギ(stone-leek)、キャベツ、桑の葉、果樹、花卉植物、園芸作物(garden stuff)等の植物の表面に適用することが可能であり、植物を栽培する土壌に適用することも可能である。また、収穫した野菜類を輸送または貯蔵する際に殺虫用組成物で処理することも可能である。
【００３１】
本発明の殺虫剤の対象には、Plutella xylostella、Sopdoptera exiguaおよびHyphantria Cunea等の鱗翅目昆虫が含まれる。
【００３２】
以下の実施例を考慮することにより、本発明をより明確に理解できるであろう。  以下の実施例は例示を目的としたものであり、本発明を限定するものではない。
【００３３】
実施例I 組換えバキュロウイルス遺伝子導入ベクターの構築
(1)遺伝子導入ベクターpAcGの構築
クラゲAequorea Victoria由来のGFP遺伝子を、プラスミドpGFP(Clonetech社製)から下記の配列１と２のプライマーを用いるPCRによって増幅した。
【００３４】
配列１
５'-AAGGATCCATGAGTAAAGGAGAAGAAC-３'
配列２
５'-AACTGCAGCTATTTGTATAGTTCATCCATGCC-３'
増幅されたこのGFP遺伝子をBamHIとPstIで消化し、発現ベクターpBacPAK８(Clonetch社製)のBamHI-PstＩ部位に挿入して遺伝子導入ベクターPAcGを作製した。このベクターでは、GFP遺伝子はポリへドリンプロモーター(PＰＨ)の下流に位置する(図１a)。
【００３５】
(2)遺伝子導入ベクターpColorPolの構築
野生型バキュロウイルスAcNPVのゲノムDNAから下記の配列３と４のプライマーを使用するPCRによりPH遺伝子を増幅した。
【００３６】
配列３
５'-AGTTGCTGATATCATGG-３'
配列４
５'-AACTCGAGATACGCCGGACCAGTG-３'
上記配列３で下線部はEcoRV認識部位である。
【００３７】
増幅されたこのPH遺伝子をEcoRVとXhoIで消化し、pBacPAK６のEcoRV-XhoI部位に挿入して遺伝子導入ベクターpPolを作製した。
【００３８】
別個に、GFP遺伝子を、下記配列５と６のプライマーを使用するPCRによりpGFPから合成した。
【００３９】
配列５
５'-AACTCGAGATGAGTAAAGGAGAAGAAC-３'
配列６
５'-CTATTTGTATAGTTCATCCATGCC-３'
上記配列５で下線部はXhoＩ認識部位である。
【００４０】
このGFP遺伝子をXhoIとSnaBIで消化し、プラスミドpPolのXhoＩ-SnaBＩ部位に挿入して遺伝子導入プラスミドpPo１GFPを作製した。SnaBIとBamHIで消化した後、PH-GFP融合遺伝子を、独立した二重のプロモーターを有する発現ベクターpAcUW31(UO2452)のSnaBI-BamHI部位に挿入し、一方、野生型AcNPV PH遺伝子を発現ベクターのEcoRＩ-BglII部位に挿入して、遺伝子導入ベクターpColorPo１を作製した。このベクターpColorPo１でGFP-PH融合遺伝子およびAcNPV PH遺伝子はPHプロモータ(PＰＨ)およびp10プロモーター(PＰ１０)の下流に位置する(図１b)。
【００４１】
(3)遺伝子導入ベクターpColorBtrusの構築
Bt. Cry１Ac遺伝子を含むプスミドpPN6.6(Adang,M.J.ら，Gene,36,289-300(1985))から下記配列７と８のプライマーを使用してPCRを実施してCry１AC DNA断片を合成した。
【００４２】
配列７
５'-AACTCGAGATGGATAACAATCCGAAC-３'
配列８
５'-AACTCGAGTGTTGCAGTAACTGG-３'
前記配列７と８で下線部はXhoＩ認識部位である。
【００４３】
このCry１Ac  DNA断片をXhoIで消化した後、pColorPo１のXhoＩ部位に挿入して遺伝子導入ベクターpColorBtrusを作製した。PColorBtrusではPH-Cry1Ac-GFP融合遺伝子がPＰＨの下流に位置した(図１c)。
【００４４】
実施例II 組換えバキュロウイルスの製造
各細胞培養ディッシュに接種したSodoptera frugiperda(InVitrogen社製、Cat. No. BB25-01)１〜1.5×106個を27℃でインキュベートし、ディッシュ上に付着させた。遺伝子導入ベクターpAcG,pColorPo１またはpColorBtrus DNA５μgと野生型AcNPVゲノムDNA(BacPAK６,(Clontch社製、Cat．No.6144-１)１μgを20mM HEPES緩衝液中に加えたDNA溶液を、滅菌水で最終容積を50μlに調整した後、リポフェクチンTM(Lipofectin,Gibco)50μlを加え、室温で15分間インキュベートした。この細胞を無血清のTC-100培地（Sigma）で2回洗浄した。各ディッシュにTC-100(1．5ml)を添加した。ディッシュを静かに揺らしながら該細胞を覆うように培地にリポフェクチン-DNA複合体を滴下した。細胞を27℃、６時間インキュベートした後、10％FBS（gibco BRL）と抗生物質を補充したTC-100 1．5mlを各ディッシュに加え、27℃でインキュベーションを続けた。トランスフェクションして４または5日後に上澄みを取り、7,000gで５分間遠心分離して、組換えバキュロウイルスAcG,ColorPolまたはColorBtrusを得た。
【００４５】
実施例III 組換え多角体の顕微鏡観察
組換えバキュロウイルスAcG,ColorPolまたはColorBtrusを60mm×15mm培養プレート当り2.0×106個の集団で接種し、１時間静置してSf９細胞に感染させた。この感染においては、sf９細胞1個あたり約５個のウイルスが好適であった。組換えポリヘドリンまたは融合タンパク質の発現を特徴付けるために、組換えバキュロウイルスを感染させた細胞を、感染4日後に、光学顕微鏡と蛍光顕微鏡(Axiophot Universal Microscope, Zeiss製、×1,000倍率)で観察した。この際、対照としては野生型バキュロウイルスAcNPV(Clontech社製、Cat．No. K1601-D)を用いた。
【００４６】
その結果は図２a〜２hの通りである。図２aと２bはそれぞれ野生型AcNPVに感染したSf９細胞の光学顕微鏡と蛍光顕微鏡の写真であり、図２cと２dはそれぞれAcGに感染したSf９細胞の光学顕微鏡と蛍光顕微鏡の写真であり、図２eと２PはそれぞれColorpolに感染したSf９細胞の光学顕微鏡と蛍光顕微鏡の写真であり、図２gと２hはそれぞれColorBtrusに感染したSf９細胞の光学顕微鏡と蛍光顕微鏡の写真である。
【００４７】
図２e〜２hから見られる通り、ColorPolおよびColorBtrusの融合タンパク質類は，正常な多角体形態を有しており、紫外線下で緑色の光を発する。従って、組換えバキュロウイルスColorPolとColorBtrusによって感染された細胞の顕微鏡観察により、蛍光活性をもつGFPが多角体中で融合されたことが示された。これに反し、野生型バキュロウイルスAcNPVから産生された多角体は正常な外観を示すが、紫外線下での緑色の光の発光なない。AcGについては、産生されたGFPによる明るいグローが細胞全体に現れた。
【００４８】
実施例IV 組換え多角体のウュスタンブロット(Western Blot)分析
実施例IIIにおけると同様の方法で組換えバキュロウイルスAcG,ColorPolまたはColorBtrusでSf９細胞を感染させ、感染して３日が経過したときに4,000×gで５分間遠心分離して細胞を回収した。PBSで洗浄後に、沈殿物に５x試料緩衝液〔0.6mlの１M Tris-HCl(pH6.8),５mlの５０％グリセロール，２mlの10％SDS，0.5mlのβ-メルカプトエタノール,1mlの１％ブロモフェノールブルー,0.9ml水〕を加えて混合し、100℃で５分間沸騰水で加熱し、室温に暫く静置した後、7,000×gで５分間遠心分離して清澄化した。細胞溶解物の上清を10％ポリアクリルアミドゲルとSDS含有の３％積層ゲルを用いて電気泳動を行った。ゲル上を泳動したタンパク質をニトロセルロース膜に転写した。その後、膜に、それぞれの抗GFP抗体(Clontech社製、Cat．No. 8363-２)、抗AcNPV PH抗体(ソウル大学、応用生物化学、昆虫病理遺伝子工学研究室所有)または抗BT Cry１Ac抗体(ソウル大学、応用生物化学、昆虫病理遺伝子工学研究室所有)を結合させた後、室温でアルカリホスファターゼをコンジュゲートした抗ヤギ抗ウサギIgG (Sigma)と一緒にインキュベートした。
【００４９】
抗GFP抗体、抗PH抗体および抗Cry１Ac抗体を用いて得られたウェスタンブロットの結果は、それぞれ図３a、３bおよび３cに示されている。図３a〜３cから見られる通り、組換えバキュロウイルスColorPolの多角体は分子量60KDaのPH-GFP融合タンパク質で構成されており、組換えバキュロウイルスColorBtrusの多角体はPH-Cry１Ac-GFP融合タンパク質で構成されていることが示された。
【００５０】
実施例V 免疫金標識した組換え多角体の顕微鏡観察
実施例IIIにおけると同様の組換えバキュロウイルスColorBtrusまたは野生型AcNPV培養物を40〜65％スクロース密度勾配下せ超遠心分離してサンプルを得た。ColorBtrus多角体は56％勾配領域に分離された。これらのサンプルを１％(w/v)パラフォルムアルデヒドを含む0.1M PBS（pH7.5）で固定した後、0.1Mグリシン(pH7.5)で洗浄し、脱水した。脱水されたサンプルをロウイクリル(Lowicryl)K４M(Ploysciences社製)に包埋した。包埋した多角体を超薄切片にした後、ニッケルグリッド(nickel grid)上で抗GFP抗体、抗Cry１Ac抗体および抗PH抗体で処理した。これに更に二次抗体〔例えば金コロイドをコンジュゲートしたヤギ抗ウサギ抗体 (Biocell社製)〕を結合させた後、0.2％クエン酸鉛と２％酢酸ウラニール(Uranyl acetate)溶液で染色して透過型電子顕微鏡(日立M-600)で観察した。
【００５１】
図４には、免疫金標識した組換え多角体の透過型電子顕微鏡写真が示されている。図４aは野生型AcNPV多角体に対する透過型電子顕微鏡写真であり、図４bは組換えバキュロウイルスColorBtrus多角体に対する透過型電子顕微鏡写真である。写真中、GFPは直径30nmの金粒子、Cry１Acは直径20nmの金粒子、PHは直径10nmの金粒子として区別される。図から見られる通り、図４aには抗PH抗体を有する金粒子のみが示されているが、抗PH抗体、抗GFP抗体および抗Cry１Ac抗体を有する金粒子はColorBtrus多角体に同時に観察される。従って、この透過型電子顕微鏡観察により、組換えバキュロウイルスColorBtrusの多角体はPH，Cry１AcおよびGFPの融合タンパク質で構成されていることが示された。
【００５２】
実施例VI 蚕の消化液で処理された組換え多角体のウェスタンブロット分析
野生型AcNPV多角体、組換えパキュロウイルスColorBtrus多角体またはBT Cry１Acタンパク質に、５齢幼虫蚕に電流で衝撃を与えて蚕が吐き出した消化液を等容量で添加し、室温で５分間放置した。実施例IVにおけると同様の方法で10％SDS-PAGE、抗BT Cry１Ac抗体を用いたウェスタンブロットを実施した。この際、対照感染(mock infection)には水を用いた。
【００５３】
図５にウエスタンブロットを示す。レーンでは、約65ｋDaのバンドが検出され、これはCryl Acが切断されて得られた活性タンパク質であると同定された。すなわち、これらのデータから、昆虫から取られたColorBtrusの組換え多角体を蚕の消化液のアルカリ環境中に即座に可溶化し、その中に存在するプロテアーゼの作用によって活性化トキシンに切断される。
【００５４】
実施例VII  組換えウイルスの殺虫力バイオアッセイ
野生型AcNPVを対照として用いて、紋白蛾(Diamondback moth)であるPlutella xylostellaに対する組換えウイルスColorBtrusの毒性を測定した。半致死量(median lethal dose：LD50)を決定するために、ハクサイの葉の上で２齢幼虫50匹に８種の２倍連続希釈したウイルスのストック(幼虫一匹当り5120,1280,640,320,160,80,40または20個の多角体)を与えた。24時間で前記用量を消費した幼虫を新鮮なハクサイの葉に移し、毎日試験した。LD50を決定するために、死亡率を所定の時間に対してスコアリングした。この手順を３回繰り返した。
【００５５】
半生存時間(median survival time：ST50)を決定するために、ハクサイの葉の上で２齢幼虫50匹それぞれにウイルス懸濁物(幼虫１匹当り1500個の多角体)を与えた。
【００５６】
結果を下記表１に示す。
【００５７】
【表１】
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半致死量(LD50)および半生存時間(ST50)の両方が減少したことから、ColorBtrusの組換え多角体の改善された殺虫力が示された。P.Xylostellaの幼虫では、組換えウイルスColorBtrusは野生型AcNPVウイルスに比べて100倍増大した殺虫力と５倍減少した殺虫時間を示す。従って、本発明の組換えウイルスは、かなり少量で使用した場合でも、短時間内に害虫を死滅させることができる。
【００５８】
図６には、P.Xylostellaの幼虫に対する組換えバキュロウイルスColorBtrusの蓄積された殺虫力が示されている。P.Xylostellaの幼虫１匹当たりに5120個(●)および1280個(○)の用量の組換え多角体を与えた場合、死亡率は３日のうちにそれぞれ約100％および90％に達した。後者の場合、死亡する幼虫の数は処置の６日目から再度増え始め、最終的に死亡率は94％に達した。
【００５９】
図７ａには、ColorBtrusの組換え多角体に感染してから３日後のP.Xylostellaの幼虫を示し、図７bはColorBtrusに感染してから６日後の死亡幼虫から得た脂肪体(fat body)を示す蛍光顕微鏡写真である。感染後３日で死亡した幼虫はBt Cry1Acに起因する典型的な徴候を見せ(a)、ColorBtrus感染後６日で死亡した幼虫の脂肪体からはColorBtrusによる組換え多角体の産生が確認される(b)。これらのデータから、組換えバキュロウイルスColorBtrusは感染後３日目まで結晶タンパク質から付与された殺虫力を有し、感染後６日目からはウイルス複製により幼虫を死滅させることが分かる。
【００６０】
図８には、ColorBtrusに感染したP.Xylostellaの幼虫による給餌ダメージ(feeding damage)の減少が示されている。ColorBtrusの多角体(図８ａ)および野生型AcNPVの多角体(図８ｂ)をハクサイの葉の上で処理した。見てわかるように、ColorBtrusの組換え多角体で処理したP.Xylostellaの幼虫では、野生型AcNPVに感染した幼虫に比べて葉のダメージがずっと少なかった。
【００６１】
本発明の他の態様に従うと、野生型AcNPVの多角体に外来タンパク質を導入することができるため、組換えバキュロウイルスColorBtrusで明らかなように、多くの外来タンパク質を発現し、その単離を容易にする新規なバキュロウイルス発現ベクター系を構築することができる。従来の発現ベクターで発現されるタンパク質の殆ど全ては可溶性形態で存在するため、精製が難しいのみならず、精製時に高価な装置を必要とする。対照的に、前記多角体遺伝子を担持する新規なバキュロウイルス発現系は、導入された外来タンパク質を精製、例えば遠心分離のみによる精製、に都合の良い形態で発現する。従って、時間および経費の面から見てかなり経済的な利益をもたらしうる。本発明のバキュロウイルス発現ベクター系で発現させることができるタンパク質としては、ネコやイヌ用のインターフェロン等の獣医用薬品、ならびに抗癌剤、インスリンおよびインターフェロン、抗菌剤、抗生物質等のヒト用医薬品を挙げることができる。
【００６２】
さらに、本発明の組換え多角体をワクチン開発に応用することができる。ワクチンとして使用するための外来タンパク質をコードする遺伝子を、前記バキュロウイルス発現ベクター系の多角体タンパク質をコードする遺伝子に融合する場合、身体に無害な多角体タンパク質と共に前記外来タンパク質を結晶形態として生産することができる。そのため、該タンパク質はアジュバントの補助が無くてもワクチン機能を維持することができる。
【００６３】
産業上の適用性
本明細書中で既に記載したように、本発明の組換えバキュロウイルスColorBtrusはPH-CP-GFP融合タンパク質からなる多角体を発現する。ここでCP部分は昆虫の消化管分泌液のアルカリ性環境下で可溶化され、プロテアーゼにより切断されて活性形態となると同時にビリオンが放出される。従って、ColorBtrusの組換え多角体のバキュロウイルス殺虫剤は、Bt結晶タンパク質と昆虫におけるAcNPVのウイルス複製との２重の作用様式を用いるものであり、そのため、その病原性および宿主範囲が改善される。さらに、前記組換え多角体はUV光の下で緑色の蛍光を発するため、野外環境(fields)において感染昆虫をモニタリングおよび／または検出するために適用できる。さらに、このモニタリング手段により殺虫剤の過剰使用を防止することができる。
【００６４】
本発明を実例を示すことにより記載してきたが、使用した用語は限定というよりむしろ説明を意図した性質のものであることが理解されよう。
【００６５】
前述した技術を考慮すれば、本発明の多くの改変および変法が可能である。従って、特に記載した以外の発明であっても、本発明の特許請求の範囲内であれば実施できることが理解されよう。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１a、１b、１cは、それぞれpAcG、pColorPolおよびpColorBtrusのバキュロウイルス遺伝子導入ベクター地図である。
【図２】  図２aおよび２bは、それぞれ対照(野生型)AcNPVに感染したSf９細胞の光学顕微鏡写真および蛍光顕微鏡写真であり、図２cおよび２dは、それぞれ組換えバキュロウイルスAcGに感染したSf９細胞の光学顕微鏡写真および蛍光顕微鏡写真であり、図２eおよび２fは、それぞれ組換えバキュロウイルスColorPolに感染したSf９細胞の光学顕微鏡写真および蛍光顕微鏡写真であり、図２gおよび２hは、それぞれ組換えバキュロウイルスColorBtrusに感染したSf９細胞の光学顕微鏡写真および蛍光顕微鏡写真である。
【図３】  図３a、３b、３cは、組換え多角体に対してそれぞれ抗GFP抗体、抗PH抗体および抗Cry１Ac抗体を使用してウェスタンブロットを行った結果である。
【図４】  図４aおよび４bは、それぞれ野生型AcNPV多角体と組換えColorBtrus多角体を免疫金標識した透過型電子顕微鏡写真である。
【図５】  図５は、組換え多角体に対して抗Cry１Ac抗体を利用してウェスタンブロットを行った結果である。
【図６】  図６は、P. Xylostella幼虫に対する組換えバキュロウイルスColorBtrusの殺虫活性を積算したグラフである。
【図７】  図７aは、ColorBtrusの組換え多角体を感染させた３日後のP. Xylostella幼虫の写真であり、図７bは、ColorBtrusを感染させた６日後の致死した幼虫の脂肪体の蛍光顕微鏡写真である。
【図８】  図８aおよび８bは、ColorBtrus感染P. Xylostella幼虫によるハクサイの葉に対する給餌ダメージの減少を示す顕微鏡写真である。それぞれColorBtrusおよび野生型AcNPVの多角体をハクサイの葉の上で処理した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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