(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子操作により調製されたヒト血清アルブミン産生性宿主を培養する際にオレイン酸またはその塩を１W/V%〜５W/V%含有する培地で培養することを特徴とするヒト血清アルブミンの分解抑制方法。
【請求項２】
ヒト血清アルブミン産生性宿主が酵母である、請求項１記載のヒト血清アルブミンの分解抑制方法。
【請求項３】
酵母が、ピキア属酵母である請求項２記載のヒト血清アルブミンの分解抑制方法。
【請求項４】
遺伝子操作により調製されたヒト血清アルブミン産生性宿主を培養する際に、オレイン酸またはその塩を０．５W/V%〜５W/V%含有する培地で培養することを特徴とするヒト血清アルブミンの製造方法。
【請求項５】
ヒト血清アルブミン産生性宿主が酵母である、請求項４記載のヒト血清アルブミンの製造方法。
【請求項６】
酵母が、ピキア属酵母である請求項５記載のヒト血清アルブミンの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、遺伝子操作により形質転換された宿主を培養することにより製造されたヒト血清アルブミン（以下ＨＳＡという）の分解抑制方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＨＳＡは、血漿の主要な蛋白構成成分であり、医薬として、例えば大量出血、ショックや熱傷患者あるいは低蛋白血症、胎児性赤芽球症等の治療薬として使用されている。
【０００３】
現在ＨＳＡは、主として採取した血液の分画からの産物として製造されている。しかし、この製造法では不経済でありかつ原料の血液の供給が困難である。また、血液は肝炎ウイルスのように好ましくない物質を含んでいるという問題がある。
【０００４】
近年組換えＤＮＡ技術の出現によって、多種多様の有用なポリペプチドの微生物や細胞による生産が可能となり、ＨＳＡについても遺伝子組換技術による大量生産の研究開発が活発に行われている。しかし、その生産収量は低く、さらにＨＳＡ産生性宿主によって産生されたＨＳＡが、該宿主に由来する酵素によって分解されることがあるため、大量生産することは困難である。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明はかかる技術的背景の下に、特に培養条件の改良によって、ＨＳＡ産生性宿主により産生されたＨＳＡが、該宿主由来の酵素によって分解されることを抑制し、ＨＳＡの生産量をより増大させることを課題とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決すべく研究を重ねた結果、遺伝子操作により調製されたＨＳＡ産生性宿主を培養する際に、炭素数１０〜２６の脂肪酸またはその塩を０．２W/V%〜１０W/V%含有する培地で培養を行うことにより、ＨＳＡ産生量が増大するとともに、該宿主によって産生されたＨＳＡが該宿主由来の酵素によって分解されることを抑制することができることを見出し、さらに研究を重ねて本発明を完成するに到った。
【０００７】
すなわち、本発明は遺伝子操作により調製されたＨＳＡ産生性宿主を、炭素数１０〜２６の脂肪酸またはその塩を０．２W/V%〜１０W/V%含有する培地で培養することによって、該宿主により産生されたＨＳＡの分解を抑制する方法に関する。
特に、オレイン酸またはその塩を含有する培地を用いて培養を行うことが好ましい。より好ましくはＨＳＡ産生性宿主として酵母を用い、さらに好ましくはピキア属酵母を用いる。
好ましくは、さらに消泡剤が含有される培地を用いて培養を行う。また、ファーメンターを用いて培養を行うことが好ましい。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明において用いられる遺伝子操作により調製されたＨＳＡ産生性宿主は、遺伝子操作を経て調製され、かつＨＳＡを産生し得るものであれば特に限定されず、既に公知文献記載のものの他、今後開発されるものであっても適宜利用することができる。具体的には、遺伝子操作を経てＨＳＡ産生性とされた菌（例えば、大腸菌、酵母、枯草菌等）、動物細胞などが挙げられる。特に、本発明においては、宿主として、酵母、具体的にはサッカロマイセス属、ピキア属を使用することが好ましい。また、これらの宿主の栄養要求性株や抗生物質感受性株をも使用できる。好適には、Ｇ４１８感受性株であるサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae) ＡＨ２２株（a, his 4, leu 2, can 1) 、ピキア・パストリス（Pichia pastoris)ＧＴＳ１１５株(his 4，ＮＲＲＬ寄託番号Ｙ−１５８５１) 等が用いられる。
【０００９】
これらのＨＳＡ産生性宿主の調製方法は公知ならびにそれに準じた手法を採用することによって実施される。
例えばＨＳＡ産生性宿主（またはＨＳＡ産生株）の調製方法としては、例えば通常のＨＳＡ遺伝子を用いる方法（特開昭５８−５６６８４号、同５８−９０５１５号、同５８−１５０５１７号の各公報）、新規なＨＳＡ遺伝子を用いる方法（特開昭６２−２９９８５号、特開平１−９８４８６号の各公報）、合成シグナル配列を用いる方法（特開平１−２４０１９１号公報）、血清アルブミンシグナル配列を用いる方法（特開平２−１６７０９５号公報）、組換えプラスミドを染色体上に組込む方法（特開平３−７２８８９号公報）、宿主同士を融合させる方法（特開平３−５３８７７号公報）、メタノール含有培地中で変異を起こさせる方法、変異型ＡＯＸ2 プロモーターを用いる方法（特開平６−９０７６８号、特開平４−２９９９８４号公報）、枯草菌によるＨＳＡの発現（特開昭６２−２５１３３号公報）、酵母によるＨＳＡの発現（特開昭６０−４１４８７号、同６３−３９５７６号、同６３−７４４９３号の各公報）、ピキア酵母によるＨＳＡの発現（特開平２−１０４２９０号公報）などが挙げられる。
【００１０】
このうち、メタノール含有培地中で変異を起こさせる方法は、具体的には以下のように行う。すなわち、まず適当な宿主、好ましくはピキア属酵母、具体的にはピキア・パストリス  ＧＴＳ１１５株のＡＯＸ1 遺伝子領域に常法によりＡＯＸ1 プロモーター支配下にＨＳＡが発現する転写ユニットを有するプラスミドを導入して形質転換体を得る（特開平２−１０４２９０号公報を参照）。この形質転換体はメタノール含有培地中での増殖能は弱い。そこで特開平４−２９９９８４号公報に記載の方法に従い、この形質転換体をメタノール含有培地中で培養して変異を起こさせ、生育可能な菌株のみを回収する。この際、メタノール濃度としては、０．０００１％〜５％程度が例示される。培地は合成培地、天然培地のいずれでもよい。培養条件としては１５℃〜４０℃、１時間〜１０００時間程度が例示される。
【００１１】
形質転換宿主の培養に用いられる培地は、炭素数１０〜２６の脂肪酸またはその塩を０．２W/V%〜１０W/V%含有していれば他の成分は特に限定されず、通常この分野で既知の培地が使用される。当該脂肪酸の含有量は、さらに好ましくは０．２W/V%〜５W/V%である。０．２W/V%未満ではＨＳＡの宿主由来の酵素による分解を十分に抑制する効果が得られない。
前記脂肪酸としては、例えばミリスチン酸、パルミチン酸、、パルミトレイン酸、オレイン酸、ｔ−バクセン酸、リノール酸、リノレン酸、リノレイン酸、アラキドン酸などの飽和または不飽和脂肪酸が挙げられる。これらの脂肪酸の塩としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩などのアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩または有機アミン塩が挙げられる。特に、培地がオレイン酸またはその塩を含有していれば好ましい。
本発明者らは、既に、該宿主を脂肪酸またはその塩を含む培地にて培養することによってＨＳＡ産生量を増大させる方法を提案している（特公平６−７１４３２号公報）。今回、上記量の炭素数１０〜２６の脂肪酸またはその塩を培地に添加することによってＨＳＡの産生量が増加するとともに、ＨＳＡの、宿主由来の酵素による分解が抑制される効果があることが見出された。本発明によれば、炭素数が１０〜２６の脂肪酸またはその塩、好ましくはオレイン酸またはその塩の添加によって宿主のＨＳＡ産生量が増加する効果に加えて、この分解抑制効果が得られたことにより、得られるＨＳＡの総量を従来よりも大きく増大させることが可能となる。
【００１２】
培地は合成培地、天然培地のいずれでもよい。好ましくは合成培地である。また、固体培地であっても液体培地であってもよいが好ましくは、液体培地である。例えば、合成培地としては、一般に炭素源として各種糖類、窒素源として尿素、アンモニウム塩、硝酸塩など、微量栄養素として各種ビタミン、ヌクレオチドなどの他、無機塩としてＭｇ、Ｃａ、Ｆｅ、Ｎａ、Ｋ、Ｍｎ、Ｃｏ、Ｃｕなどが例示される。ＹＮＢ液体培地〔０．７％イーストナイトロジェンのベース（Difco 社製）、２％グルコース〕などが挙げられる。また天然培地としては、ＹＰＤ液体培地〔１％イーストエキストラクト（Difco 社製）、２％バクトペプトン（Difco 社製）、２％グルコース〕が例示される。メタノール資化性宿主を用いる場合は、メタノール含有培地を用いることができる。この場合メタノール濃度は０．０１〜５％程度である。
本発明で用いられる培地は、従来公知の培地に所定量の当該脂肪酸を添加することによって簡便に調製することができる。
本発明で用いられる培地には、さらに消泡剤が添加されていてもよい。
【００１３】
他の培養条件としては、一般的な常法に準じた条件が挙げられる。
培養温度としては、通常２０℃〜３７℃が例示される。宿主が酵母の場合は２０℃〜３０℃であることが好ましく、細菌の場合は３０℃〜３７℃であることが好ましい。培養時間は通常１時間〜１０００時間程度が例示される。
【００１４】
培養は静置または振盪、攪拌、通気下に回分（バッチ）培養法や半回分（フェッドバッチ）培養法あるいは連続培養法により実施され、好ましくは、ファーメンターを用いた半回分培養法が用いられる。例えば、フェッドバッチ培養により、高濃度のグルコースを適度に少量ずつ供給し、産生菌体に対する高濃度基質阻害を避けて高濃度の菌体と産生物を得る方法（特開平３−８３５９５号公報）などが挙げられる。
【００１５】
なお、当該培養に先立って前培養を行うことが好ましい。前培養の培地としては、例えばＹＮＢ液体培地やＹＰＤ液体培地が使用される。また、前培養の培養条件としては、好ましい態様として、培養時間は１０時間〜１００時間、温度は酵母では３０℃程度、細菌では３７℃程度が例示される。
【００１６】
かくして培養終了後、ＨＳＡは培養上清または濾液、または菌体、細胞からそれぞれ公知の分離、精製手段により採取される。
【００１７】
【実施例】
以下に実施例によって本発明を詳細に説明するが、本発明はこれにより何ら限定されるものではない。
実施例１
（１）使用菌株の調製
特開平２−１０４２９０号公報に記載のＡＯＸ1 プロモーター支配下にＨＳＡが発現する転写ユニットをもつプラスミドｐＨＳＡ１１３から、ＨＳＡ遺伝子の５’ノンコード領域を除去したＨＳＡ発現プラスミドｐＰＧＰ１を作成した。ｐＰＧＰ１は、正常ＨＳＡのアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡを有する［正常ＨＳＡのアミノ酸配列および正常ＨＳＡをコードする染色体ＤＮＡ配列は、J. Biol. Chem., 261, 6747-6757(1986)に記載されている。］。そして、特開平２−１０４２９０号公報に述べられている方法に従い、ピキア・パストリス（Pichia pastoris)  ＧＴＳ１１５株（ｈｉｓ４）のＡＯＸ1 遺伝子領域を、ＨＳＡ発現プラスミドｐＰＧＰ１をＮｏｔ１制限酵素で切断して得られる断片で置換して、形質転換体ＰＣ４１３０を得た。この株はＡＯＸ1 遺伝子が存在しないためにメタノールを炭素源とする培地での増殖能が低くなっている（Ｍｕｔ−株）。
【００１８】
ＰＣ４１３０をＹＰＤ培地（１％イーストエキストラクト、２％バクトペプトン、２％グルコース）３mlに植菌し、２４時間後に初期ＯＤ540 ＝０．１となるようにＹＰＤ培地５０mlに植菌した。３日間３０℃で培養後に初期ＯＤ540 ＝０．１となるようにＹＰＤ培地５０mlに植菌した。さらに３日毎に同様の継代を繰り返した。継代毎に菌体を１０7 cells/plate になるように滅菌水で希釈して２％ＭｅＯＨ−ＹＮＢｗ／ｏａ．ａ．プレート（０．７％イーストナイトロジェンベースウィズアウトアミノアシッド、２％メタノール、１．５％（寒天末）に塗布し、３０℃５日間培養してコロニーの有無を判断した。その結果、１２日間継代後に塗布した２％ＭｅＯＨ−ＹＮＢｗ／ｏａ．ａ．プレートから２０個のコロニーが生じた。このプレートではＭｕｔ−株はほとんど生育できず、Ｍｕｔ＋株は生育できる。すなわち、このプレートではコロニーが生じるということはメタノールの資化性が上昇し、Ｍｕｔ＋に変換した株が得られたことを示している。生じたコロニーの内の１つを適当に滅菌水で希釈して２％ＭｅＯＨ−ＹＮＢｗ／ｏａ．ａ．プレートに拡げシングルコロニーに単離した。その１つをＧＣＰ１０１と名付けた。
【００１９】
ＧＣＰ１０１株から単離したＡＯＸ２プロモーター [変異型。天然ＡＯＸ２プロモーター (YEAST, 5, 167-177 (1988)またはMol. Cell, Biol., 9, 1316-1323 (1989) 中、開始コドン上流２５５番目の塩基がＴからＣに変異したもの] を用いてＨＳＡ発現用プラスミドｐＭＭ０４２を構築し、ピキア・パストリス（Pichia pastoris)ＧＴＳ１１５株に導入し、形質転換体ＵＨＧ４２−３株を得た（特開平４−２９９８４号公報）。
【００２０】
（２）培地組成
前培養には、ＹＰＤ培地（２％バクトペプトン、１％イーストエキストラクト、２％グルコース) を使用した。本培養に使用したバッチ培地の組成を表１に、フィード培地の組成を表２に示す。さらに、表１および表２中の＊２の溶液の組成を表３に示す。表１および表２に示すように、実施例１において使用したバッチ培地およびフィード培地中のオレイン酸の含有量は０．５W/V%とした。
【００２１】
【表１】
0003837775.tif 000002
【００２２】
【表２】
0003837775.tif 000003
【００２３】
【表３】
0003837775.tif 000004
【００２４】
（３）ファーメンターを用いた培養方法
▲１▼  前培養
凍結ストックバイアルより、菌体懸濁液１mlをＹＰＤ培地５０mlを含むバッフル付きの３００ml容三角フラスコに植菌し、３０℃、２４時間振盪培養した。
【００２５】
▲２▼  本培養
バッチ培地７００mlに前培養液１４mlを植菌し、ミニジャーファーメンターを用いて通気攪拌培養した。培養温度は、培養２４時間までは３０℃とし、培養２４時間目より後は、２５℃とした。通気量は槽内を０．５ｋｇｆ／ｃｍ2 に加圧した状態で３．２Ｌ／ｍｉｎとした。攪拌速度は培養７時間目までは２００ｒｐｍ、培養７時間目より後は１０００ｒｐｍとした。ｐＨは５．８５とした。消泡は、必要に応じてアデカノールＬＧ−１０９（旭電化工業製）を培地中に適宜添加した。
【００２６】
バッチ培養において酵母が十分高密度に増殖し、培地中のグリセロールが消費された後、フィード培地の添加を開始し、３６０時間培養を行った。
培養終了後、培養液をサンプリングし、下記の参考例に記載した方法にて菌体濃度、ＨＳＡ濃度、分解率を測定した。その結果を表４に示す。後述の実施例２、実施例３および実施例４についてもそれぞれ同様に測定し、それらの結果も合わせて表４に示す。
【００２７】
実施例２
フィード培地中のオレイン酸濃度を１W/V%としたこと以外は実施例１と同様にして培養を行った。
【００２８】
実施例３
フィード培地中のオレイン酸濃度を５W/V%としたこと以外は実施例１と同様にして培養を行った。
【００２９】
実施例４
フィード培地中のオレイン酸濃度を０．２W/V%としたこと以外は実施例１と同様にして培養を行った。
【００３０】
【表４】
0003837775.tif 000005
【００３１】
オレイン酸の添加量を上げるにつれて、ＨＳＡの産生量が増加し、また低分子体への分解が抑制されることが判明した。
【００３２】
参考例１    菌体濃度の測定
培養終了後、培養液をサンプリングし、蒸留水で測定時のＯＤ540 値が０．３以下となるよう適当に希釈したのち分光光度計（ＵＶ１２００型、島津製作所製）を用いて５４０ｎｍにおける吸光度を測定した。本実験において、吸光度から乾燥菌体量への変換はＯＤ540 値／５．６とした。
【００３３】
参考例２    ＨＳＡ濃度の定量
培養終了後、培養液をサンプリングし、15,000ｒｐｍで５分間遠心した。得られた上清をウルトラフリーＣ３ＨＶにより清澄濾過後、ＨＰＬＣによるゲル濾過分析を実施した。
カラム              ：東ソー  ＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷX1
移動相              ：0.3M NaCl, 50mM Na-Phosphate, 0.1% NaN3 ,pH6.5
流速                ：0.7 ml/min
インジェクション量  ：50μｌ
検出                ：Ａ28O 、Ａ350 （２波長）
【００３４】
参考例３  分解率の算出
参考例２におけるＨＰＬＣ分析の結果から、次式によって分解率を求めた。
分解率（％）＝ＨＳＡ分解物（43kd）ピーク高さ／ＨＳＡモノマー（67kd）ピーク高さ×１００
【００３５】
【発明の効果】
本発明によれば、ＨＳＡ産生性宿主が産生するＨＳＡの産生量を増大させることができると共に、ＨＳＡが、宿主自身が分泌する酵素によって分解されることを抑制することができるため、ＨＳＡの採取量を増大させることができる。本発明は、炭素数１０〜２６の脂肪酸またはその塩を所定量添加した培地でＨＳＡ産生性宿主を培養すればよく、簡易な方法によって実施することができる。