(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ガン関連抗原をコードする単離核酸分子であって、前記ガン関連抗原は配列番号１のヌクレオチド５４〜５９３によってコードされるアミノ酸配列を含む、ガン関連抗原をコードする単離核酸分子。
【請求項２】
配列番号１のヌクレオチド５４〜５９３からなる、請求項１の単離核酸分子。
【請求項３】
配列番号１のヌクレオチド５４〜５９３を含む、請求項１の単離核酸分子。
【請求項４】
配列番号１のヌクレオチド１〜７４７のヌクレオチド配列の一部からなる請求項１の単離核酸分子であって、前記単離核酸分子が少なくとも配列番号１のヌクレオチド５４〜５９３のヌクレオチド配列を含む、請求項１の単離核酸分子。
【請求項５】
プロモーターに操作可能にリンクした、請求項１の単離核酸分子を含む発現ベクター。
【請求項６】
プロモーターに操作可能にリンクした、請求項４の単離核酸分子を含む発現ベクター。
【請求項７】
請求項５の発現ベクターでトランスフォームまたはトランスフェクトされた、真核細胞ラインまたは原核細胞株。
【請求項８】
請求項６の発現ベクターでトランスフォームまたはトランスフェクトされた、真核細胞ラインまたは原核細胞株。
【請求項９】
請求項１の単離核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含む単離ガン関連抗原。
【請求項１０】
請求項１の単離核酸分子でトランスフォームまたはトランスフェクトされた、真核細胞ラインまたは原核生物細胞株。
【請求項１１】
前記細胞ラインが線維芽細胞ラインである、請求項１０の真核細胞ライン。
【請求項１２】
変異または弱毒化ウイルスベクターである、請求項１の単離核酸分子を含む発現ベクター。
【請求項１３】
前記ウイルスがアデノウイルスである、請求項１２の発現ベクター。
【請求項１４】
（ｉ）請求項９の単離ガン関連抗原をコードする核酸分子を含む第１のベクター、および
（ｉｉ）前記ガン関連抗原に由来する抗原を提示するＭＨＣまたはＨＬＡ分子をコードする核酸分子を含む第２のベクター、
を含む、細胞をトランスフェクトするための発現システム。
【請求項１５】
配列番号１のヌクレオチド５４〜５９３によってコードされるアミノ酸配列を含む、単離ガン関連抗原。
【請求項１６】
請求項１５の単離抗原および製剤学的に許容されるアジュバントを含む免疫原性組成物。
【請求項１７】
前記アジュバントが、サイトカイン、サポニン、またはＧＭ−ＣＳＦである、請求項１６の免疫原性組成物。
【請求項１８】
配列番号１によってコードされるタンパク質中に見出されるアミノ酸配列からなる単離ペプチドであって、前記単離ペプチドがＨＬＡ分子に結合し、ノナマー、デカマーまたはウンデカマーであり、そして配列番号７のアミノ酸配列と、１から３のさらなるＮ−末端側のアミノ酸と、４までのさらなるＣ−末端側のアミノ酸を含む、配列番号１によってコードされるアミノ酸配列に由来する単離ペプチド。
【請求項１９】
前記ＨＬＡ分子がＨＬＡ−Ａ２である、請求項１８の単離ペプチド。
【請求項２０】
配列番号４、配列番号５および配列番号６からなるグループから選択される、請求項１８の単離ペプチド。
【請求項２１】
請求項１５の抗原に対して特異的な単離抗体または抗体のフラグメントであって、前記抗体又は前記フラグメントは請求項１５の抗原に対して特異的に結合する、抗体又は抗体フラグメント。
【請求項２２】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項２１の単離抗体。
【請求項２３】
請求項２１の単離抗体であって、前記抗体は、キメラ抗体である単離抗体。
【請求項２４】
請求項２１の単離抗体であって、前記抗体は、ヒト化抗体である単離抗体。
【請求項２５】
請求項２２のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞系。
【発明の詳細な説明】
関連出願
本出願は、参考文献として本出願にその内容を合体させる、１９９６年１０月３日出願の第０８／７２５，１８２号の一部継続出願である。
発明の分野
本発明は、ガンに関連する抗原、およびそれをコードする核酸分子、そしてそれらの利用方法に関する。
背景および従来技術
感染症、ガン、自己免疫異常などの多くの病的状態が、特定の分子の不適当な発現によって特徴づけられるということは非常によく認識されている。これらの分子は、したがって、特定の病的または異常状態のための“マーカー”として役立つ。診断上の“標的”、即ちこれら異常状態を診断するために同定される物質、としての利用の他に、これら分子は診断および／または治療の薬剤を作るために利用可能な試薬として役立つ。限定されるものではないこの例は、特定のマーカーに対して特異的な抗体を産生するためのガンマーカーの利用である。更に別の非限定的な例は、異常細胞に対する細胞溶解性Ｔ細胞を生じさせるための、ＭＨＣ分子と複合体を形成するペプチドの利用である。
そのような物質の調製は、もちろん、それらを製造するために用いられる試薬のソースを必要条件とする。細胞からの精製はそれを行うための１つの方法であるが、手間がかかり、確実な方法ではない。その他の好適な方法は、特定のマーカーをコードする核酸分子を単離し、その後、単離したコード分子を用いてその所望の分子を発現させるというものである。
今日までに、例えば、ヒト腫瘍における抗原などの検出のために２つのストラテジーが用いられてきた。これらを、遺伝的アプローチおよび生化学的アプローチと称する。遺伝的アプローチは、例えば、参考文献として本出願にその内容を合体させる、デ・プレーン（dePlaen）他，Proc. Natl. Sci. USA 85: 2275（1988）によって例証されている。このアプローチでは、腫瘍から得たｃＤＮＡライブラリーの数百プールのプラスミドを、ＣＯＳ細胞などの受容細胞に、または、特定の抗原の発現についてテストされる腫瘍細胞ラインの抗原−陰性変異体に、トランスフェクトする。例えば、参考文献として本出願にその内容を合体させる、カワカミ（Kawakami）他，Nature 369: 69（1994）によって例証されている、生化学的アプローチは、腫瘍細胞のＭＨＣ−クラスＩ分子に結合したペプチドを酸で溶出し、その後逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を行うことに基づくものである。抗原ペプチドは、抗原プロセシングに欠陥のある突然変異体細胞ラインの空の（empty）ＭＨＣ−クラスＩ分子に結合し、細胞傷害性Ｔリンパ球による特異的反応を誘発した後に同定される。これらの反応には、ＣＴＬ増殖の誘発、ＴＮＦ放出、およびＭＴＴアッセイまたは51Ｃｒ放出試験において測定可能な標的細胞の溶解、が含まれる。
抗原の分子定義のためのこれら２つのアプローチは、以下の欠点を有する。第１に、これらは途方もなくめんどうであり、時間がかかり、そして高価なものである；第２に、これらは、あらかじめ定義された特異性を有する細胞傷害性Ｔ細胞ライン（ＣＴＬ）の確立に依存するものである。
抗原の同定、および分子定義のための、前記２つの既知のアプローチに固有の問題点は、今までのところこれら両方の方法は、ヒト腫瘍において非常に少数の新規な抗原の定義のみにおいてしか成功していないという事実によってよく実証されている。例えば、ファン・デア・ブルッゲン（van der Bruggen）他，Science 254:1643-1647（1991）；ブリチャード（Brichard）他，J. Exp. Med. 178: 489-495（1993）;クーリエ（Coulie）他，J. Exp. Med. 180: 35-42（1994）;カワカミ（Kawakami）他，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 3515-3519（1994）を参照。
さらに、前記した方法論は、考慮するタイプのガンの確立された永久細胞ラインの入手の可能性に依存する。例えば、エットゲン（Oettgen）他，Immunol. Allerg. Clin.North. Am. 10: 607-637（1990）によって示されているように、特定のタイプのガンから細胞ラインを確立するのは非常に難しい。ある種の上皮細胞タイプのガンは、イン・ヴィトロでのＣＴＬに対する感受性が非常に低く、ルーチン的な分析が適用できないことも知られている。これらの問題点により、当該技術分野においてガン関連抗原を同定するための別の方法論を開発することが刺激された。
１つの鍵となる方法論は、参考文献として本出願にその内容を合体させる、サヒン（Sahin）他，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 11810-11913（1995）によって記載されている。また、それぞれ、１９９５年６月７日出願および１９９６年１月３日出願の、米国特許出願番号第０８／５８０，９８０号および出願番号第０８／４７９，３２８号も参照。これら３つの文献すべてを参考文献として本出願にその内容を合体させる。要約すると、この方法は、原核生物の宿主におけるｃＤＮＡライブラリーの発現を含む（ライブラリーは、腫瘍サンプルから確保されるものである）。この発現ライブラリー（expressed libraries）を、次に、高い力価の体液性応答を誘発するような抗原を検出する目的で、吸収処理および希釈された血清で、イムノスクリーニングする。この方法論はＳＥＲＥＸ方法（"Serological identification of antigens by Recombinant Expression Cloning"：組換え発現クローニングによる抗原の血清学的同定）として知られている。この方法論は、以前に同定された腫瘍関連抗原の発現の確認、および、新規な抗原の検出のために用いられてきている。上記に引用した特許出願および、サヒン（Sahin）他前出、そしてクルー（Crew）他，EMBO J 144:2333-2340（1995）を参照。
前記ＳＥＲＥＸ方法を食道ガンサンプルに適用したところ、１つの抗原が今回同定され、そしてそれをコードする核酸分子が単離およびクローニングされた。この抗原は、比較的広範なガンに分布していることが判明したが、非ガン性の細胞においては見られなかった。これが、とりわけ、以下の開示においてより詳細に記載される本発明の課題である。
【図面の簡単な説明】
図１は、様々な組織タイプにおける、ＮＹ−ＥＳＯ−１抗原のＲＮＡの発現パターンを示す。
図２は、ＮＹ−ＥＳＯ−１  ｍＲＮＡのノザンブロット分析を示す。これ（ＮＹ−ＥＳＯ−１  ｍＲＮＡ）は、精巣および細胞ラインＳＫ−ＭＥＬ−１９において見られたが、種々の他の細胞および組織サンプルにおいては見られなかった。
図３は、ＮＹ−ＥＳＯ−１の推定アミノ酸配列の、修飾の可能性のある部位を示す。
図４は、ＮＹ−ＥＳＯ−１の親水性プロットであり、アミノ末端における親水性ドメイン、および、カルボキシル末端の近くの長い疎水性の広がりを示す。
図５は、ＨＬＡ−Ａ２について陽性、ＮＹ−ＥＳＯ−１について陽性、両方について陽性、またはいずれについても陽性でない、種々の細胞を用いたＣＴＬ溶解研究の結果を示す。
図６は、ＨＬＡ−Ａ２が、配列番号１由来ペプチドの提示についての提示分子であるということを証明するデータを示す。
好適実施例の詳細説明
例１
トータルＲＮＡを、高度から中程度に分化した食道の扁平上皮ガンの、急凍結した試料から周知の方法を用いて抽出した。そのような方法については、例えば、チョムジンスキー（Chomzynski），J. Analyt. Biochem. 162: 156-159（1987）を参照。このＲＮＡを用いてｃＤＮＡライブラリーを調製し、そしてライブラリーを、製造業者の指示に従ってλＺＡＰファージベクターにトランスフェクトした。このλＺＡＰライブラリーを次に大腸菌にトランスフェクトしたところ、１．６ｘ１０6の一次単離物（primary isolates）が得られた。
次に、参考文献として本出願にその内容を合体させる、サヒン（Sahin）他，Proc.Natl. Acad. Sci. USA 92: 11810-11813（1995）の、前記ＳＥＲＥＸ方法を使用した。簡単に説明すると、自己の血清から、大腸菌に内在する分子に対する抗体を除去した。これは、前記血清と、食道ガン細胞からのｃＤＮＡクローンを含まないファージλＺＡＰでトランスフェクトした大腸菌の溶菌液とを混合することによって行った。
除去処理した血清を次に希釈し、そしてファージプラークを含むニトロセルロースメンブランと混合した。プラークを室温で一晩インキュベートした。次に洗浄し、そしてフィルターをアルカリホスファターゼ共役（conjugated）ヤギ抗ヒトＦＣγ二次抗体とともにインキュベートした。そして反応性のファージプラークを、５−ブロモ−４−クロロ−インドリルホスフェイト（phosphate）およびニトロブルーテトラゾリウムとインキュベートすることによって可視化した。全部で１３の陽性クローンが見つかった。
例２
同定に続いて、前記の反応性のクローンを希釈クローニングおよびヒト血清でのテストによって単クローン性となるようにサブクローニングした。これらのクローンを次に精製し、イン・ヴィトロで切り出し、そして製造業者の指示に従って、ｐＢＫ−ＣＭＶプラスミドフォームに変換した。挿入されたＤＮＡを次に、ＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ制限マッピングを用いて評価し、異なるインサートを判定した。８つの異なるインサートが同定され、それらは、約５００から約１．３キロベース対のサイズの範囲であった。これらクローンをＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ自動化シークエンサーを用いて配列決定した。
表１は、結果を要約するものである。１つの遺伝子は４つの重複するクローンによって、第２の遺伝子は３つの重複するクローンによって、そして残りの６つの遺伝子は１つのクローンのみによって表されるものであった。
ホモロジーサーチにより、ＮＹ−ＥＳＯ−２、３、６、７と称されるクローンは既知のものであることが明らかになった。エリセイ（Elisei）他，J. Endocrin. Invest.16: 533-540（1993）;スプリッツ（Spritz）他，Nucl. Acids Res. 15: 10373-10391（1987）;ラビッツ（Rabbits）他，Nature Genetics 4: 175-180（1993）;クロザット（Crozat）他，Nature 363: 640-644（1993）; GenBank H18368およびD25606を参照。これらクローンの内２つ（ＮＹ−ＥＳＯ−３およびＮＹ−ＥＳＯ−６）は以前に、種々の正常ヒト組織において発現することが示されている。系統制限（lineage restriction）の証拠は見られなかった。ＮＹ−ＥＳＯ−６（ｃＤＮＡ）はＦＵＳ／ＴＬＳ遺伝子の３’−非翻訳部分と考えられる。ここでは報告しない実験におけるＮＹ−ＥＳＯ−６のシークエンシングおよびサザンブロット分析では、ガンにおける転座または点突然変異の証拠は示されなかった。これらクローンの内４つ、即ちＮＹ−ＥＳＯ−１、４、５および８は、調査したデータベースにおける配列に対して強いホモロジーを示さず、したがってさらに研究した。
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例３
ＮＹ−ＥＳＯ−１、４、５および８クローンのｍＲＮＡ発現を評価するための研究を行った。これを行うために特異的オリゴヌクレオチドプライマーをそれぞれの配列に対して、３００−４００塩基対のｃＤＮＡセグメントが増幅できるように、そしてプライマーの融解温度が６５−７０℃の範囲となるように、デザインした。そして市販の材料および標準的プロトコールを用いて逆転写−ＰＣＲを行った。様々な正常および腫瘍細胞タイプについてテストした。クローンＮＹ−ＥＳＯ−４およびＮＹ−ＥＳＯ−８は広範に分布していたので更なる研究は行わなかった。ＮＹ−ＥＳＯ−５はもとの（original）腫瘍および正常食道組織において高レベルの発現を示し、このことはそれが分化のマーカーであるということを示唆していた。
ＮＹ−ＥＳＯ−１は、腫瘍ｍＲＮＡおよび精巣において発現しており、正常大腸、腎臓、肝臓、または脳組織では発現していないということが判明した。この発現パターンは、その他の腫瘍拒絶抗原前駆体と一致する。
例４
前述のＲＴ−ＰＣＲアッセイを、より完全な正常および腫瘍組織のセットに対してＮＹ−ＥＳＯ−１について行った。表２、３および４はそれらの結果を示す。簡単に説明すると、ＮＹ−ＥＳＯ−１は正常精巣および卵巣細胞において強く発現していることが判明した。正常の子宮の子宮筋層においては少量のＲＴ−ＰＣＲ産物が見られ、子宮内膜においては見られなかった。しかし、この陽性の表示は一貫性のないものであった。正常食道および皮膚を含む様々な細胞タイプの扁平上皮も陰性であった。
関連のない細胞系統の腫瘍についてテストした場合、１１のメラノーマ細胞ラインの内２つは強い発現を示し、また、６７のメラノーマ試料の内１６、３３の乳ガン試料の内６、および４の膀胱ガンの内４つも強い発現を示した。その他の腫瘍タイプにおいては散発性の発現が見られた。
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ガン患者の血清における抗ＮＹ−ＥＳＯ−１抗体の存在を、ＥＬＩＳＡによって判定することができるか否かを確かめるために更なるセットの実験を行った。簡単に説明すると、後述する方法によって生産した組換えＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質を、標準的方法を用いて固体表面にコーティングした。血清サンプルを正常患者および様々なガンを有する患者から採取した。抗ＮＹ−ＥＳＯ−１抗体はそれ（固体表面）に対して結合するはずである。これらを次にアルカリ性ペルオキシダーゼで標識したヤギ−抗ヒトＩｇＧに接触させ、そして基質で可視化した。結果を以下の表に示す：
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例５
次に、ＮＹ−ＥＳＯ−１転写産物のサイズを調べるため、および組織発現パターンを確かめるためにノザンブロット分析を行った。オースベル（Ausubel）他，Current Protocols In Molecular Biology（John Wiley & Sons, 1995）の方法を用いた。具体的には、レーン当たり２０ｕｇのトータルＲＮＡをホルムアミドおよびホルムアルデヒド含有バッファーに溶解させ、６５℃に加熱し、そして３％ホルムアルデヒドとともに１．２％アガロースゲルで分離し、その後ニトロセルロースペーパーにトランスファーした。次にハイブリダイゼーションを32Ｐ標識化プローブを使用して行い、その後高いストリンジェンシーの洗浄を行った。最後の洗浄は、０．１ｘＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳにて６０℃で１５分間行った。
前述したアッセイにおいてＮＹ−ＥＳＯ−１につき陽性であった、精巣およびメラノーマ細胞ライン（ＳＫ−ＭＥＬ−１９）からのＲＮＡは、約０．８−０．９ｋｂのＲＮＡ転写産物を示した。食道ガンの試料は０．４−０．９ｋｂの範囲にスメア（なすりつけたようにバンドが尾を引くこと）なバンドを示し、これは部分的な分解を反映していた。テストしたその他の組織または細胞ラインからのＲＮＡは、転写産物を示さなかった。
全長の転写産物をコードするｃＤＮＡを得るために、食道ｃＤＮＡライブラリーを、プラークハイブリダイゼーションにより、もとのｃＤＮＡクローンをハイブリダイゼーションプローブとして用いて再スクリーニングした。３ｘ１０5のクローンをスクリーニングしたところ、６つの陽性のものが見つかった。最も長い３つのクローンについて配列決定した。オープンリーディングフレームの分析により、３つのすべてがコード領域全体、およびいろいろなサイズの５’−非翻訳領域を含んでいることが示された。最も長いあるクローンは、７５５塩基対の長さであり（ポリＡを除く）、５４３塩基対のコード領域とともに、５’末端における５３の非翻訳塩基および３’−末端における１５１の非翻訳塩基対を含む。配列番号１を参照（図３も参照）。
この長いＯＲＦは、ＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質の推定配列は１８０アミノ酸であることを示していた。１つの免疫陽性のクローンはこれらのうち１７３をコードする配列を含むものであった。推定分子量は１７，９９５ダルトンである。
分析によると、Ｎ−末端部分においてグリシン残基が豊富に存在する（最初の８０残基の内３０、残る１００残基の内４）ことが示されている。親水性分析は、この分子のＮ−末端側半分において親水性抗原性配列があり、そして交互に現れる疎水性と親水性配列が続き、最後に長いＣ−末端の疎水性尾部（アミノ酸１５２−１７２）とその後に短い親水性尾部があるということを示すものであった。このパターンは、膜貫通ドメインを示唆する。いくつかの潜在的Ｎ−ミリストイル化部位、３つのリン酸化部位があるが、Ｎ−グリコシル化部位の証拠はない。
例６
１９９５年に、悪性メラノーマを患う患者からメラノーマ細胞ライン“ＮＷ−ＭＥＬ−３８”が確立された。この対象（subject患者）から、血清サンプル、末梢血リンパ球、および腫瘍サンプルを採取し、本出願に記載する研究を行うまで凍結しておいた。この患者における抗腫瘍Ｔ細胞応答を評価することを予想して、この患者をＨＬＡ−Ａ１およびＨＬＡ−Ａ２であるとしてＨＬＡタイプしておいた。
この患者からのメラノーマがＮＹ−ＥＳＯ−１を発現するかどうかを判定するために、腫瘍サンプルおよび細胞ラインＮＷ−ＭＥＬ−３８の両方から、標準的技術を用いてトータルＲＮＡを単離した。次に各サンプルからトータルＲＮＡのうち２マイクログラムを、標準的技術を用いたｃＤＮＡ合成のために用いた。
ｃＤＮＡを次に以下のプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲ実験において使用した：
５’−ＣＡＣＡＣＡＧＧＡＴ  ＣＣＡＴＧＧＡＴＧＣ  ＴＧＣＡＧＡＴＧＣＧ  Ｇ’−３’
（配列番号２）、
および
ＣＡＣＡＣＡＡＡＧＣ  ＴＴＧＧＣＴＴＡＧＣ  ＧＣＣＴＣＴＧＣＣＣ  ＴＧ−３’
（配列番号３）
これらのプライマーは配列番号１のヌクレオチド２７１から５９９にわたるセグメントを増幅するはずである。
増幅は、６０℃のアニーリング温度を用いて３５サイクル以上行った。ＰＣＲ産物は、１．５％アガロースゲル上でエチジウムブロミド染色により可視化した。
結果は、腫瘍および細胞ラインの両方が配列番号１を発現していることを示すものであった。この細胞ラインと腫瘍サンプルを以後の実験において使用した。
例７
前述の単離したｃＤＮＡ分子を次に組み換えタンパク質を作るために使用した。具体的には、標準的技術を用いてｃＤＮＡをＰＣＲ増幅し、そしてＨｉｓタグを含む市販のプラスミドベクター、即ちｐＱＥ９にクローニングした。ここでは詳細には記載しない研究において、第２のベクターであるｐＱＥＫも使用した。これはＰＱＥ９とは以下の点において異なる。即ち、アンピシリン耐性ではなく、カナマイシン耐性がｐＱＥ９Ｋによって与えられる。
プラスミドベクターを大腸菌株ＸＬ１−Ｂｌｕｅにトランスフォームし、陽性のトランスフォーマントを制限マッピングおよびＤＮＡシークエンシングによって同定した。組換えタンパク質の生産は、イソプロピルβ-D-チオガラクトシドを用いて誘導し、タンパク質をＮｉ2+イオンクロマトグラフィーカラムで周知の方法に従って精製した。タンパク質を１５％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染色で分析したところ、約２２キロダルトンの分子量を有するタンパク質であるとして同定された。これはその配列から予測されるタンパク質のサイズと一致する。
次に真核生物のトランスフェクタントを作った。これを行うために、ＮＹ−ＥＳＯ−１コード配列を前述のｐＱＥ９ベクターから単離し、そして真核生物の発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１のＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩサイトにクローニングした。次にこのベクターでＣＯＳ−７細胞をトランスフェクトした。これは細胞サンプルを、１５０ｎｇの前述のプラスミドと、１５０ｎｇのＨＬＡ−Ａ２．１に対するｃＤＮＡまたはＨＬＡ−Ａ１に対するｃＤＮＡのいずれかを含むプラスミドｐｃＤＮＡ１Ａｍｐとに接触させることによって行った。周知のＤＥＡＥ−デキストランクロロキン法を用いた。細胞を次に３７℃で４８時間インキュベートし、その後それらをＣＴＬ刺激アッセイにおいてテストした。具体的にはこのアッセイは、参考文献として本出願にその内容を合体させる、トラヴァーサリ（Traversari）他，Immunogenetics 35: 145-148（1992）に従った。簡単に説明すると、１００％ヒト血清および２５Ｕ／ｍｌの組換えＩＬ−２を追加した１００ｕｌのＲＰＭＩ中の、２５００のＣＴＬ（ＮＷ３８−ＩＶＳ−１、後述の例９を参照）は、ＣＯＳ−７トランスフェクタントを含むマイクロウェル（２０，０００細胞／ウェル）に添加した。２４時間後、各ウェルから上清５０ｕｌを収集し、そして標準的アッセイ、即ち、ＷＥＨＩ１６４クローン１３細胞に対する細胞傷害（反応）をテストするＭＴＴを用いたアッセイ、においてＴＮＦ−αレベルを測定した。陽性の細胞を後述の例において記載するウェスタンブロット分析において使用した。
使用したＣＴＬは、参考文献として本出願にその内容を合体させる、クヌート（Knuth）他，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3511-3515（1984）に従って調製したＣＴＬ  ＮＷ３８−ＩＶＳ−１であった。具体的には、前記対象から採取した１０5の自己ＮＷ３８  ＭＥＬ−１腫瘍細胞と１０6の末梢血リンパ球を混合することによって、混合リンパ球Ｔ細胞培養を行った。サイトカインＩＬ−２を添加し、そして前記混合培養を３７℃で１週間インキュベートした。腫瘍細胞を除去し、そして５ｘ１０4の腫瘍細胞の新しいアリコットをＩＬ−２とともに添加した。51Ｃｒ標識したＮＷ−ＭＥＬ−３８細胞に対してテストした際に強い応答が見られるようになるまでこのプロセスを毎週繰り返した。反応Ｔ細胞を収集し、さらなる実験において使用するまで凍結しておいた。
例８
前述の血清サンプル、前述の細胞ラインＮＷ−ＭＥＬ−３８および前述のＣＯＳ−７トランスフェクタントから得た細胞可溶化液、そして前述の精製組換えタンパク質を用いてウェスタンブロット分析を行った。血清サンプルは患者の治療における種々の点から採取した。結果に差異はなかった。
これらのアッセイにおいて、１ｕｇの組換えＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質または５ｕｌのいずれかのタイプの細胞可溶化液をＳＤＳ中に希釈して５分間ボイルし、そして１５％ＳＤＳゲルで電気泳動にかけた。ニトロセルロース（０．４５ｕｍ）への一晩のブロッティングおよび３％ＢＳＡでのブロッキングの後、１：１０００、１：１０，０００、そして１：１００，０００に希釈した血清とともに、または、ポジティブコントロールとして１：５０に希釈したＮＹ−ＥＳＯ−１に対するモノクローナル抗体とともに、ブロットをインキュベートした。このモノクローナル抗体は以下のようにして調製した。ＢＡＬＢ／Ｃマウスを、２−３週間隔で５回組換えＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質を皮下注射することによって免疫した。免疫製剤は、アジュバント中に５０ｕｇの組換えタンパク質を含むものであった。最初の注射には完全フロイントアジュバントを使用し、その後は不完全フロイントアジュバントを使用した。脾臓細胞を前記の免疫したマウスから採取し、マウスミエローマ細胞ラインＳＰ２／０と融合させてハイブリドーマを作成した。
ハイブリドーマが作成されると、それらをクローン化し、そしてマイクロタイタープレートでの標準的固相ＥＬＩＳＡを用いてそれらの上清を組換えタンパク質に対してスクリーニングした。アッセイは参考文献として本出願にその内容を合体させる、ディッポルド（Dippold）他，Proc. Natl. Acad. Sci.USA 77: 6114-6118（1980）に従って行った。組換えＮＹ−ＥＳＯ−１を用いて、一連のネガティブコントロールも行った。前述のように大腸菌によって生産された組換えタンパク質に結合した血清抗体を、１：１０，０００に希釈したアルカリホスファターゼで標識したヤギ抗−ヒトＩｇＧを使用し、そしてＮＢＴ−ホスフェイトにより可視化した。トランスフェクトされていないＣＯＳ−７細胞もコントロールとして使用した。健康な個体からの血清もコントロールとして使用した。
組換えタンパク質に対する強い反応性が、１：１００，０００まで希釈した血清において見られ、またＮＷ−ＭＥＬ−３８の可溶化液に対する反応性もあった。トランスフェクトされていないＣＯＳ−７細胞に対する反応性は無く、健康な個体からの血清も反応性を示さなかった。
例９
前述のＣＯＳ−７トランスフェクタントのテストにおいて、およびこの例に記載するアッセイにおいて、細胞溶解性Ｔ細胞ライン“ＮＷ３８−ＩＶＳ−１”を使用した。この“ＣＴＬ”は、腫瘍細胞ラインＮＷ−ＭＥＬ−３８を用い、前述した末梢血リンパ球のイン・ヴィトロでの刺激によって作った。これは標準的技術を用いて行った。
このＣＴＬを、ＮＷ−ＭＥＬ−３８（これはＨＬＡ−Ａ１、Ａ２陽性、ＮＹ−ＥＳＯ−１陽性であった）、ＮＹ−ＥＳＯ−１およびＨＬＡ−Ａ２陽性の２つの同種（異系）細胞ライン（ＳＫ−ＭＥＬ−３７とＭＺ−ＭＥＬ−１９）、ＭＨＣクラスＩ陰性である細胞ライン（ＳＫ−ＭＥＬ−１９）、ＨＬＡ−Ａ２陽性であるがＮＹ−ＥＳＯ−１陰性である細胞ライン（ＮＷ−ＭＥＬ−１４５）、コントロール細胞ラインＫ５６２、そして自己フィトヘムアグルチニン刺激芽細胞とともに、細胞傷害試験において使用した。様々なエファクター／標的比を用い、51Ｃｒ標識した標的細胞の溶解が測定されたパラメーターであった。図５にこれを示す。
結果はＣＴＬ  ＮＷ３８−ＩＶＳ−１が、自己細胞ラインＮＷ  ＭＥＬ−３８と、ＨＬＡ−Ａ２およびＥＳＯ−１陽性の同種（異系）細胞ラインとの両方を溶解するということを示すものであった。従って、このＣＴＬは同種（異系）の物質に対して反応性であった。図６を参照。
例１０
患者ＮＷ３８はＨＬＡ−Ａ１およびＨＬＡ−Ａ２陽性であったので、どちらのＭＨＣ分子が提示分子であるのかを判定するための実験を行った。
ＣＯＳ−７細胞を用いた前述の実験と同様の実験を行った。但し、これらの実験においては、ＨＬＡ−Ａ１ｃＤＮＡまたはＨＬＡ−Ａ２ｃＤＮＡの両方ではなくいずれか一方でトランスフォームされた、共トランスフォーマント（共形質転換体）の別々のグループを確保するように注意した。これらの結果は、ＣＴＬ  ＮＷ３８−ＩＶＳ−１はもっぱらＮＹ−ＥＳＯ−１とＨＬＡ−Ａ２との両方を含有するＣＯＳ−７トランスフェクタントを溶解したということを示している。図６を参照。この研究はまた、前記ＣＴＬの特異性も示している。というのは、例９に記載したＮＹ−ＥＳＯ−１陰性、ＨＬＡ−Ａ２陽性細胞は、ＨＬＡ−Ａ２によって提示されるペプチドへとプロセシングされるその他の既知の分子について陽性であるからである。
例１１
提示ＭＨＣ分子がＨＬＡ−Ａ２であると同定されたので、参考文献として本出願にその内容を合体させる、ダマロ（D'Amaro）他，Human Immunol. 43: 13-18（1995）およびドレイフホウト（Drijfhout）他，Human Immunol. 43: 1-12（1995）によって示されるモデルを用いて、このモチーフを満足するすべてのペプチドを同定するために、ＮＹ−ＥＳＯ−１についてアミノ酸配列のスクリーニングを行った。これによって推定されるすべてのアミノ酸配列に対応するペプチドを、標準的技術を用いて合成し、参考文献として本出願にその内容を合体させる、クヌート（Knuth）他，Proc.Natl. Acad. Sci. USA 81: 3511-3515（1984）による細胞傷害試験において使用した。具体的には、細胞ラインＣＥＭＸ７２１．１７４．Ｔ２（以後“Ｔ２”と称する）を使用した。なぜならば、それは抗原をＭＨＣと複合するペプチドへとプロセシングしないため、ここで記載するタイプの実験にとって理想的であるからである。標準的方法を用いてＴ２細胞のサンプルを１００ｕＣｉのＮａ（51Ｃｒ）Ｏ4で標識し、そして３回洗浄し、その後１０ｕｇ／ｍｌのペプチドと２．５ｕｇ／ｍｌのβ２−ミクログロブリンとともにインキュベートした。インキュベーションは一時間室温で行った。次に反応細胞（１００ｕｌのＣＴＬ  ＮＷ３８−ＩＶＳ−１の懸濁液）を、エフェクター／標的比９０：１にて添加し、５％ＣＯ2を含む水飽和雰囲気中、３７℃で４時間インキュベートした。次に、プレートを２００ｘｇで５分間遠心分離し、１００ｕｌの上清を取り出して放射能を測定した。51Ｃｒ放出のパーセンテージを周知のストラテジーに従って測定したところ、ペプチドＳＬＬＭＷＩＴＱＣＦＬ（配列番号４）、ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ（配列番号５）、およびＱＬＳＬＬＭＷＩＴ（配列番号６）の３つが、最も好くＣＴＬを刺激するものであることが判明した。先に示したように、ＮＷ−ＭＥＬ−３８および細胞ラインＳＫ−ＭＥＬ−３７およびＭＺ−ＭＥＬ−１９を標的として使用した場合に匹敵する結果が見られた。
前述の諸例は食道ガン関連抗原をコードする核酸分子の単離について記載するものである。ここで“関連”という用語を用いたのは、食道ガンによって問題の分子が発現することは明らかであるが、メラノーマ、乳ガン、前立腺ガン、肺ガンなどのその他のガンもこの抗原を発現するからである。
本発明は、ここに記載された抗原をコードする核酸分子およびストリンジェントな条件下で引用配列、配列番号１にハイブリダイズする核酸分子に関する。ここで用いた“ストリンジェントな条件”とは、米国特許第５，３４２，７７４号において特定されているような条件、即ち、６５℃で１８時間のハイブリダイゼーション、その後の４回の２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでの１時間の洗浄、そして０．２ｘＳＳＣ、より好ましくは０．１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでの３０分間の最終洗浄のような条件、そして同レベルのストリンジェンシーを与えるその他の条件、およびよりストリンジェントな条件のことを指す。
本発明の核酸分子をプロモーターに操作可能な連結（即ち、“操作可能にリンクした”）において組み込んだ発現ベクターも、本発明の一部をなす。そのようなベクターの構築、および、問題の分子をコードする真核細胞ラインまたは原核細胞株を作るための細胞のトランスフォーメーションまたはトランスフェクションは当業者の技術範囲内のものである。このような方法において利用可能な宿主細胞の例には、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、酵母細胞、昆虫細胞（例えば、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）、ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞などがある。大腸菌およびその他の細菌などの原核細胞も利用できる。また、（ｉ）本発明の単離ガン関連抗原をコードする核酸分子を含む第１のベクター、および、（ｉｉ）前記ガン関連抗原に由来する抗原を提示するＭＨＣまたはＨＬＡ分子をコードする核酸分子を含む第２のベクター、を含む、細胞をトランスフェクトするのに有用な発現システム、をも本発明の一部となす。
オリジナルのペプチド形態および翻訳後修飾された形態の両方における、ここに記載した抗原も本発明の一部をなす。この分子は、いかなる翻訳後修飾無しでも抗原性となるのに十分に大きく、したがって、それは前駆体および翻訳後修飾された形態の両方において、アジュバントと組み合わせて（またはそれ無しで）免疫原として有用である。この抗原を用いて作られたポリクローナルおよびモノクローナル両方の抗体、およびモノクローナル抗体を作るハイブリドーマ細胞系も、本発明の一部である。それはタンパク質全体として、または以下に記載するように部分として、治療において利用可能である。この抗原に対する抗体は、ポリクローナル、モノクローナル、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）2’のような反応性フラグメント、その他のフラグメント、およびキメラ抗体、ヒト化抗体、組換えによって産生された抗体などのどのようなものでもまた、本発明の一部をなす。
前記開示から明らかなように、本発明のタンパク質および核酸分子を診断において利用することもできる。ここで記載したＳＥＲＥＸ方法は症状（pathology）関連抗原に対する免疫応答を前提とする。したがって、問題の症状について、例えば対象の血清などの体液サンプルを抗原自体との反応性についてテストすることによって、アッセイすることができる。反応性は症状の存在の可能性を示すものと見なされるであろう。そしてまた、当業者に周知であってここで詳細に説明する必要はない、あらゆる標準的核酸ハイブリダイゼーションアッセイによって抗原の発現についてアッセイすることもできる。標準的イムノアッセイを用いて問題の分子に対する抗体についてアッセイすることもできる。
配列番号１の分析は、５’および３’非コード領域がそこに存在していることを示している。本発明は、少なくともコードセグメント、即ち配列番号１のヌクレオチド５４−５９３を含む単離核酸分子、および配列番号１のヌクレオチド１−５３および／または５９４−７４７のいくつかまたはすべてを含む単離核酸分子に関する。
前述のように、更なる分析は、前記分子が細胞溶解性Ｔ細胞による溶解を引き起こすペプチドへとプロセシングされるということを示している。例７においてＨＬＡ−Ａ２分子についてどのようにしてこのタイプのモチーフ分析が行うことができるかを示した。ここで適用できる、様々なＭＨＣまたはＨＬＡ分子についてのモチーフについて、非常に多くの研究がなされてきた。したがって、本発明の更なる側面は治療方法であり、ここで患者の腫瘍細胞の表面上のＨＬＡ分子に結合する１つまたは複数のペプチドを、そのペプチドがＭＨＣ／ＨＬＡ分子に結合し、Ｔ細胞による溶解を引き起こすのに十分な量、患者に投与する。ＨＬＡ−Ａ２分子について先に示した実例は、利用可能なこの投与の唯一のタイプであるわけではない。あらゆる組み合わせのペプチドが利用できる。これらペプチドは、単独でまたは組み合わせて用いることができ、また、タンパク質全体またはその免疫反応性の部分を、静脈内、皮内、皮下、経口、直腸内、および経皮の投与などの、あらゆる標準的な投与タイプを用いて、それを必要とする対象に投与することができる。標準的な製剤のキャリア、サポニン、ＧＭ−ＣＳＦ、およびインターロイキンなどのアジュバントも利用できる。更に、これらペプチドおよびタンパク質を上記にリストした物質とともに製剤してワクチンとすることができる。関連性のＭＨＣ／ペプチド複合体を提示する樹状細胞またはその他の細胞も同様である。
同様に本発明は、アデノウイルスを基礎とするベクターなどのベクターにＮＹ−ＥＳＯ−１をコードする核酸分子を組み込んで、ヒト細胞などの真核細胞にそれをトランスフェクトできるようにすることを含む治療も考慮するものである。同様に、１つまたは複数のペプチドをコードする核酸分子をこれらのベクターに組み込むこともでき、それは核酸を基礎とする治療の主要な構成成分である。
これらのアッセイのいずれも進行／退行研究においても使用可能である。ＮＹ−ＥＳＯ−１の発現に関係する異常の経過を、単に前記タンパク質のレベル、その発現などを前述の方法のいずれかまたはすべてを用いてモニタリングすることによって、モニターすることができる。
これらの方法は、治療法（therapeutic regime）の有効性を追跡するのにも利用できることが明らかであろう。基本的に、ＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質のベースラインの値を前述のいずれかのアッセイを用いて調べ、所与の治療薬を投与し、そしてその後前記タンパク質のレベルをモニターして、ＮＹ−ＥＳＯ−１レベルの変化を養生法（regime）の有効性の指標（indicia）として観察することができる。
先に示したように、本発明はとりわけ、ＮＹ−ＥＳＯ分子に対する“統合された”免疫応答の認識に関する。この１つの効果は、ガンの治療の経過をモニターする能力である。本発明の一部であるこの方法において、治療を必要とする対象はここに記載したタイプのワクチン接種を受ける。そのようなワクチン接種の結果、例えば、それら細胞上にＨＬＡ／ペプチド複合体を提示する細胞に対するＴ細胞応答が起こる。応答は抗体応答も含み、これは恐らくＴ細胞による細胞の溶解による、抗体を誘発するタンパク質の放出の結果である。したがって、抗体応答をモニタリングすることによってワクチンの効果をモニターすることができる。先に示したように、抗体のタイターの上昇はワクチンによる進歩の指標であり、逆もまた同じであると考えることができる。したがって、本発明の更なる側面は、ワクチンの有効性のモニタリング方法であり、これはワクチンの投与後、ワクチンそれ自体またはワクチンがその一部である大きな分子に対して特異的な、対象における抗体のレベルを測定することによって行われる。
ＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質がガンなどの病理状態に関係するものであるという同定は、上述したものに加えて数多くの治療上のアプローチがあることも示唆している。前述の実験は前記タンパク質の発現に応答して抗体が産生されるということを確立するものである。したがって、本発明の更なる態様は、ＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質の異常な（aberrant）または特異な（abnormal）レベルによって特徴づけられる状態の治療であり、これはヒト化抗体、抗体フラグメントなどの抗体を投与することによって行われる。これらを適切な細胞増殖抑制性または細胞傷害性の試薬によってタグ付加または標識することができる。
Ｔ細胞を投与することもできる。Ｔ細胞はイン・ヴィトロで樹状細胞、リンパ球またはその他の免疫応答性の細胞などの免疫応答性細胞を用いて誘発することができ、そして治療される対象に再灌流されることができるということが注目される。
Ｔ細胞および／または抗体の生成は、前述したエピトープなどの応答のための関連するＴ細胞またはＢ細胞エピトープを提示する、好ましくは非−増殖性となるように処理された細胞を投与することによっても達成することができることに注目されたい。
治療上のアプローチはアンチセンス療法も含む。この療法において、好ましくは１０から１００ヌクレオチドの長さのアンチセンス分子が、“正味（混合物を含まない）”で、または、細胞への取り込みを促進するためにリポソームなどのキャリア中にて対象に投与され、その後タンパク質の発現が阻害される。そのようなアンチセンス配列を、ウイルス性のベクター（例えば、ワクシニア）、既知のＢＣＧワクチンの変異体などの細菌性のコンストラクトなどの、適切なワクチンに組み込むこともできる。
以下のコア配列を有するものとして規定される、ノナマー、デカマー、またはウンデカマーのいずれでもよいペプチドも本発明の一部をなす：
ＬＬＭＷＩＴ（配列番号７）
これは、最初のＬ残基の末端側に少なくとも１つのさらなる残基を有し、それは好ましくはセリンであり、そして３残基まで有するものであってよく、そこにおいてセリンはＬに対して−ＳＬ−を形成するように結合し、そしてＣ−末端側に０−４のさらなるアミノ酸を有するものである。そしてこれは、先に示したようにＨＬＡ−Ａ２分子に結合し、それによってＣＴＬ応答を引き起こすものである。これらのペプチドは、ＨＬＡ−Ａ２陽性であって症状に関連してＮＹ−ＥＳＯ−１を発現する患者に投与することによって治療において利用可能であり、そして診断においても、即ちＨＬＡ−Ａ２陽性細胞が存在するか、または、関連性のあるＣＴＬが存在するかなどを判定するために利用可能である。
ＨＬＡ−Ａ２分子はＭＨＣクラスＩ分子であり、ペプチドとクラスＩ分子との複合体に応答するＴ細胞は一般的にＣＤ８+細胞である。もう１つのサブセットのＴ細胞はＣＤ４+細胞であり、これはＭＨＣ−クラスＩＩ分子とペプチドとの複合体に応答し、そして自己培養樹状細胞によって提示される、組換えＮＹ−ＥＳＯ−１に対するＭＨＣ−クラスＩＩに制限されたＣＤ４+細胞応答は、メラノーマ患者において検出されている。具体的には、ここでは記載しない結果において、ＣＤ４+細胞は周知の技術を用いてＰＢＬまたは血清サンプルから、その他の細胞から分離された。そしてそれらはＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質でパルスしておいた樹状細胞と混合された。ＣＤ４+細胞の増殖が観察され、それはここで記載した統合された免疫応答の更なる局面をもたらすものであった。したがって、本発明の更なる側面は、これらＣＤ４+Ｔ細胞、ＭＨＣ−クラスＩＩ分子に結合するペプチド、そしてそれらの治療における利用である。
本発明のその他の特徴および適用は当業者に明らかであり、ここで記載する必要はない。
ここで使用した用語および表現は、限定ではなく記載のための用語として用いたのであり、そのような用語および表現を使用するにあたって図示および記載された特徴構成またはその部分のいかなる均等物も除外する意図はなく、本発明の枠内で様々な改変が可能であることが認識されるべきである。
（１）一般情報：
（i）出願人：  ヤオ−ツェン  チェン；  スカンラン，マシュー；ギュア，アリ；  オールド，ロイド；  クヌート，アレキサンダー；ジェイガー，エルケ；  ドレイフホウト，ヤン，ダブリュ
（ii）発明の名称：  食道ガン関連抗原をコードする単離核酸分子、その抗原、およびそれらの利用方法
（iii）配列の数：  ７
（iv）  連絡先：
（Ａ）宛名    ：  フェルフェ・アンド・リンチ
（Ｂ）通り名  ：  サード・アベニュー805
（Ｃ）都市名  ：  ニューヨーク・シティ
（Ｄ）州名    ：  ニューヨーク
（Ｅ）アメリカ合衆国
（Ｆ）郵便番号：  10022
（v）  コンピュータ読み取り可能フォーム
（Ａ）  媒体型式：  3.5インチ フロッピーディスク，144kbメモリ
（Ｂ）  コンピュータ：  IBM
（Ｃ）  オペレーティング・システム：  PC-DOS
（Ｄ）  ソフトウェア：  ワードパーフェクト（Wordperfect）
（vi）  現在の出願データ：
（Ａ）  出願番号：
（Ｂ）  出願日  ：
（vii）  先の出願データ：
（Ａ）  出願番号：  US 08/752,182
（Ｂ）  出願日  ：  1996年10月３日
（Ｃ）  分類    ：  935
（viii）弁理士／代理人情報：
（Ａ）  氏名    ：  ハンソン，ノーマン，ディ
（Ｂ）  登録番号：  30,946
（Ｃ）  参照／書類番号：  LUD 5466.1-PCT
（ix）  通信情報：
（Ａ）  電話  ：      （212）688-9200
（Ｂ）  ファックス：  （212）838-3884
（２）配列番号１の情報：
（i）  配列特徴：
（Ａ）  長さ：    752塩基対
（Ｂ）  タイプ：  核酸
（Ｃ）  鎖の数：  二本鎖
（Ｄ）  トポロジー：  直鎖状
（xi）  配列の記述：  配列番号１：
0003799483.tif 000007
（２）配列番号２の情報：
（i）  配列特徴：
（Ａ）  長さ：    31塩基対
（Ｂ）  タイプ：  核酸
（Ｃ）  鎖の数：  一本鎖
（Ｄ）  トポロジー：  直鎖状
（xi）  配列の記述：  配列番号２:
0003799483.tif 000008
（２）配列番号３の情報：
（i）  配列特徴：
（Ａ）  長さ：    32塩基対
（Ｂ）  タイプ：  核酸
（Ｃ）  鎖の数：  一本鎖
（Ｄ）  トポロジー：  直鎖状
（xi）  配列の記述：  配列番号３:
0003799483.tif 000009
（２）配列番号４の情報：
（i）  配列特徴：
（Ａ）  長さ：    11アミノ酸
（Ｂ）  タイプ：  アミノ酸
（Ｄ）  トポロジー：  直鎖状
（xi）  配列の記述：  配列番号４:
0003799483.tif 000010
（２）配列番号５の情報：
（i）  配列特徴：
（Ａ）  長さ：    9アミノ酸
（Ｂ）  タイプ：  アミノ酸
（Ｄ）  トポロジー：  直鎖状
（xi）  配列の記述：  配列番号５:
0003799483.tif 000011
（２）配列番号６の情報：
（i）  配列特徴：
（Ａ）  長さ：    9アミノ酸
（Ｂ）  タイプ：  アミノ酸
（Ｄ）  トポロジー：  直鎖状
（xi）  配列の記述：  配列番号６:
0003799483.tif 000012
（２）配列番号７の情報：
（i）  配列特徴：
（Ａ）  長さ：    6アミノ酸
（Ｂ）  タイプ：  アミノ酸
（Ｄ）  トポロジー：  直鎖状
（xi）  配列の記述：  配列番号７:
0003799483.tif 000013
【図１】
0003799483.tif 000014
【図２】
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【図３】
0003799483.tif 000016
【図４】
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【図５】
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【図６】
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