(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：２で示されるアミノ酸配列（グアノシン三リン酸シクロヒドロラーゼＩＩ／ＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩ）を有するポリペプチドをコード化するＤＮＡ。
【請求項２】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：４で示されるアミノ酸配列（２，５−ジアミノ−６−リビチルアミノ−４（３Ｈ）−ピリミジノン５−リン酸デアミナーゼ／ＤＲＡＰデアミナーゼ）を有するポリペプチドをコード化するＤＮＡ。
【請求項３】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：６で示されるアミノ酸配列（Ｌ−３，４−ジヒドロキシ−２−ブタノン４−リン酸シンターゼ／ＤＢＰシンターゼ）を有するポリペプチドをコード化するＤＮＡ。
【請求項４】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：８で示されるアミノ酸配列（６，７−ジメチル−８−リビチルルマジンシンターゼ／ＤＭＲＬシンターゼ）を有するポリペプチドをコード化するＤＮＡ。
【請求項５】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１０で示されるアミノ酸配列（リボフラビンシンターゼ）を有するポリペプチドをコード化するＤＮＡ。
【請求項６】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１２で示されるアミノ酸配列（２，５−ジアミノ−６−リボシルアミノ−４（３Ｈ）−ピリミジノン５−リン酸レダクターゼ／ＤＲＡＰレダクターゼ）を有するポリペプチドをコード化するＤＮＡ。
【請求項７】
請求項１から６までのいずれか１項に記載の１個またはそれ以上のＤＮＡを含有する発現ベクター。
【請求項８】
請求項７記載の発現系で形質転換された宿主菌株。
【請求項９】
リボフラビンを製造するための組換え法において、請求項８記載の宿主菌株を使用することを特徴とする、リボフラビンを製造するための組換え法。
【発明の詳細な説明】
本発明は、真菌類におけるリボフラビン生合成のための遺伝子、それによってコード化されたタンパク質ならびにこの遺伝子および遺伝子生産物を使用することによりリボフラビンを製造するための遺伝子工学的方法に関する。
真菌類、例えばエレモテシウム・アシュビイイ（Eremothecium ashbyii）またはアシュビア・ゴシッピイ（Ashbya gossypii）の発酵によるリボフラビンの製造は、開示された（The Merck Index，Windholz他、Merck & Co.編、第１１８３頁（１９８３））。
欧州特許第４０５３７０号明細書には、枯草菌Bacillus subtilisからのリボフラビン生合成遺伝子の形質転換によって得られた、リボフラビンを過剰生産する菌株が記載されている。
細菌類と真核生物におけるリボフラビン生合成の遺伝学は、異なるものであるので、枯草菌からの上記遺伝子は、アシュビア・ゴシッピイのような真核生産体の生物体を使用することによりリボフラビンを製造するための組換え方法には不適当である。
酵母菌のサッカロミセス・セレビシアエ（Saccharomyces cerevisiae）のリボフラビン生合成遺伝子のクローン化は、１９９２年１１月１９日付けでドイツ特許庁に出願された１つの特許明細書中に記載された。
しかし、常用のハイブリッド化法によってサッカロミセス・セレビシアエrib遺伝子を使用することによりアシュビア・ゴシッピイリボフラビン生合成遺伝子をクローン化することは、不可能であり；明らかにサッカロミセス・セレビシアエとアシュビア・ゴシッピイからのrib遺伝子の相同性は、ハイブリッド化に十分である程大きくはなかった。
本発明の目的は、こうして真核生産体の生物体中でリボフラビンを製造するための組換え方法を得るために、真核生物からリボフラビン生合成遺伝子を単離することである。
この目的は、ＧＴＰから出発するリボフラビン生合成の酵素をコード化する子嚢菌類のアシュビア・ゴシッピイ中に見い出される６個の遺伝子（rib遺伝子）の単離によって達成されることが見い出された。
本発明は、次のＤＮＡ配列に関する：
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：２で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコード化するか或いは本質的にポリペプチドの酵素活性を減少させることなしに、１個またはそれ以上のアミノ酸が欠失され、他のアミノ酸が添加されたかまたは他のアミノ酸によって代替されたＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：２で示されるポリペプチドの同族体もしくは誘導体をコード化するＤＮＡ配列。
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：４で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコード化するか或いは本質的にポリペプチドの酵素活性を減少させることなしに、１個またはそれ以上のアミノ酸が欠失され、他のアミノ酸が添加されたかまたは他のアミノ酸によって代替されたＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：４で示されるポリペプチドの同族体もしくは誘導体をコード化するＤＮＡ配列。
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：６で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコード化するか或いは本質的にポリペプチドの酵素活性を減少させることなしに、１個またはそれ以上のアミノ酸が欠失され、他のアミノ酸が添加されたかまたは他のアミノ酸によって代替されたＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：６で示されるポリペプチドの同族体もしくは誘導体をコード化するＤＮＡ配列。
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：８で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコード化するか或いは本質的にポリペプチドの酵素活性を減少させることなしに、１個またはそれ以上のアミノ酸が欠失され、他のアミノ酸が添加されたかまたは他のアミノ酸によって代替されたＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：８で示されるポリペプチドの同族体もしくは誘導体をコード化するＤＮＡ配列。
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１０で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコード化するか或いは本質的にポリペプチドの酵素活性を減少させることなしに、１個またはそれ以上のアミノ酸が欠失され、他のアミノ酸が添加されたかまたは他のアミノ酸によって代替されたＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１０で示されるポリペプチドの同族体もしくは誘導体をコード化するＤＮＡ配列。
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１２で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコード化するか或いは本質的にポリペプチドの酵素活性を減少させることなしに、１個またはそれ以上のアミノ酸が欠失され、他のアミノ酸が添加されたかまたは他のアミノ酸によって代替されたＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１２で示されるポリペプチドの同族体もしくは誘導体をコード化するＤＮＡ配列。
遺伝子およびその遺伝子生産物（ポリペプチド）は、一次構造が列記されている配列で示されかつ以下のように指定されている：
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：  １：ｒｉｂ  １  遺伝子
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：  ２：ｒｉｂ  １  遺伝子生産物（ＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩ）
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：  ３：ｒｉｂ  ２  遺伝子
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：  ４：ｒｉｂ  ２  遺伝子生産物（ＤＲＡＰデアミナーゼ）
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：  ５：ｒｉｂ  ３  遺伝子
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：  ６：ｒｉｂ  ３  遺伝子生産物（ＤＢＰシンターゼ）
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：  ７：ｒｉｂ  ４  遺伝子
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：  ８：ｒｉｂ  ４  遺伝子生産物（ＤＭＲＬシンターゼ）
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：  ９：ｒｉｂ  ５  遺伝子
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１０：ｒｉｂ  ５  遺伝子生産物（リボフラビンシンターゼ）
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１１：ｒｉｂ  ７  遺伝子
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１２：ｒｉｂ  ７  遺伝子生産物（ＨＴＰレダクターゼ）
グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）は、ＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩ（ｒｉｂ１遺伝子生産物）によって２，５−ジアミノ−６−リボシルアミノ−４（３Ｈ）−ピリミジノン５−リン酸に変換される。その後に、この化合物は、ｒｉｂ７遺伝子生産物によって２，５−ジアミノ−６−リビチルアミノ−２（３Ｈ）−ピリミジノン５−リン酸に還元され、次いでｒｉｂ２遺伝子生産物によって５−アミノ−６−リビチルアミノ−２，４（１Ｈ，３Ｈ）−ピリミジンジオンに脱アミノされる。その後に、ｒｉｂ４遺伝子生産物によって触媒される１つの反応において、Ｃ４化合物ＤＢＰは、添加され、その結果６，７−ジメチル−８−リビチルルマジン（ＤＭＲＬ）が生じ、このＤＭＲＬからｒｉｂ５遺伝子生産物によって触媒される反応においてリボフラビンが製造される。Ｃ４化合物ＤＢＰ（Ｌ−３，４−ジヒドロキシ−２−ブタノン４−リン酸）は、ｒｉｂ３遺伝子生産物によって触媒される反応においてＤ−リブロース５−リン酸から形成される。
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１、３、５、７、９、１１に記載されたＤＮＡ配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：２、４、６、８、１０、１２に記載されたポリペプチドをコード化する。
また、配列表に記載されたものは別として、適当なＤＮＡ配列は、遺伝子コードの縮重の結果として、１つの異なるＤＮＡ配列を有しているがしかし同じポリペプチドをコード化するものである。
また、本発明は、遺伝子生成物がなお本質的に配列表に記載された遺伝子生成物と同じ生物学的性質を有している限り配列表に詳説されたもの以外の一次構造を有する１つの遺伝子生成物（ポリペプチド）をコード化するようなＤＮＡ配列に関する。生物学的性質とは、殊にリボフラビンの生合成を引き起こす酵素活性を意味する。
本質的に同じ生物学的性質を有するこのように修飾された遺伝子生成物は、１つまたはそれ以上のアミノ酸またはペプチドの欠失または付加によって得ることができるかまたは他のアミノ酸によるアミノ酸の代替によって得ることができるか、或いはアシュビア・ゴシッピイ以外の有機体から単離されることができる。
修飾された遺伝子生成物をコード化するＤＮＡ配列は、概して配列表に示されたＤＮＡ配列をもって８０％またはそれ以上の程度の相同性を有している。このようなＤＮＡ配列は、例えば常用のハイブリッド化法またはアシュビア・ゴシッピイ以外の真核生物からのＰＣＲ技術を用いてＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１、３、５、７、９、１１に記載されたＤＮＡ配列から出発して単離されることができる。これらのＤＮＡ配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１、３、５、７、９、１１に記載されたＤＮＡ配列で標準条件下にハイブリッド化する。
標準条件とは、例えば０．１〜１×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ：ＮａＣｌ  ０．１５モル、クエン酸ナトリウム１５ミリモル、ｐＨ７．２）の濃度を有する緩衝水溶液中の４２〜５８℃の温度を意味する。ＤＮＡハイブリッド化のための実験条件は、遺伝子工学の教科書、例えばサムブルック（Sambrook）他著、“モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）”,Cold Spring Harbor Laboratory，１９８９に記載されている。
また、本発明は、適当なポリペプチドをコード化するＤＮＡ配列の５′方向の上流に位置している制御配列、殊にプロモーター配列にも関する。この制御配列は、配列表に記載されかつ以下に詳説されている。
ｒｉｂ１遺伝子のための制御配列：
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１  ヌクレオチド１〜２４２
ｒｉｂ２遺伝子のための制御配列：
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：３  ヌクレオチド１〜４５０
ｒｉｂ３遺伝子のための制御配列：
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：５  ヌクレオチド１〜３１４
ｒｉｂ４遺伝子のための制御配列：
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：７  ヌクレオチド１〜２７０
ｒｉｂ５遺伝子のための制御配列：
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：９  ヌクレオチド１〜５２４
ｒｉｂ７遺伝子のための制御配列：
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１１  ヌクレオチド１〜３５２
制御配列は、機能の点で無視してよい減少を伴って５′および／または３′の方向で端が切り取られていてもよい。
制御作用について本質的なものは、概して上記の配列範囲からの３０〜１００、有利に４０〜７０のヌクレオチドの断片である。
また、この制御配列は、天然の配列を比較して直接的な突然変異誘発によって機能の点で最適化されることもできる。
本発明による制御配列は、アシュビア・ゴシッピイ中の遺伝子、殊にリボフラビン生合成を確実なものにする遺伝子の過剰表現に適している。
また、本発明は、本発明によるＤＮＡ配列１個またはそれ以上を含有する表現ベクターに関する。このような表現ベクターは、本発明によるＤＮＡ配列に適当な機能的制御信号を供給することによって得られる。このような制御信号は、表現を確実なものにするＤＮＡ配列、例えばプロモーター、オペレーター、エンハンサー、リボソーム結合部位であり、かつ宿主有機体によって認められかつ宿主有機体に従うものである。
また、例えば宿主有機体中の組換えＤＮＡの複製または組換えを制御する他の制御信号を表現ベクターに充当することも可能である。
本発明は、同様に本発明によるＤＮＡ配列または表現ベクターで形質転換された宿主有機体にも関する。真性有機体は、有利に宿主有機体、特に好ましくはサッカロミセス（Saccharomyces）属、カンディダ（Candida）属、ピキア（Pichia）属、エレモテシウム（Eremothecium）属またはアシュビア（Ashbya）属のものが宿主有機体として使用される。特に好ましい種は、サッカロミセス・セレビシアエ、カンディダ・フラベリ（Candida flaveri）、カンディダ・ファマタ（Candida famata）、エレモテシウム・アシュビイイ（Eremothecium ashbyii）およびアシュビア・ゴシッピイである。
また、本発明は、リボフラビンを製造するための組換え方法を包含し、この場合には、本発明による形質転換された宿主有機体を常法で発酵によって培養し、発酵の間に生産されたリボフラビンを発酵媒体から単離し、必要に応じて精製する。
ｒｉｂ遺伝子および遺伝子生成物は、実施例中および配列表中に記載されたように単離されかつ特性決定されることができる。
例１
アシュビア・ゴシッピイのリボフラビン生合成遺伝子の単離（ｒｉｂ遺伝子）
ａ．アシュビア・ゴシッピイｃＤＮＡバンクの構成
ＹＥＰＤ媒体上での培養後の後期対数増殖期でリボフラビンを過剰生産する菌株のアシュビア・ゴシッピイＡＴＣＣ１０１９５のミセリウム（mycelium）からＲＮＡを完全に抽出した（Sherman他、“Methods in yeast genetics”，Cold Spring Harbor，New York，1989）。
オリゴ（ｄＴ）セルロース上での吸着およびオリゴ（ｄＴ）セルロースからの溶出によってポリ（Ａ）+ＲＮＡを２回精製した（AvivおよびLeder，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 69，1972，1408〜1412）。ｃＤＮＡをグブラー（Gubler）およびホフマン（Hoffmann）の一般的な方法（Gene 25，1983，263）によって単離し、合成ＥｃｏＲＩアダプターを平滑断端を有するｃＤＮＡ分子の端部に添加した。その後に、ＥｃｏＲＩでの切断後のｃＤＮＡ断片をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを使用することによりリン酸化し、ＥｃｏＲＩで切断された脱リン酸化ベクターｐＹＥｕｒａ３にクローン化した。ｐＹＥｕｒａ３（Clonetech Laboratories，Inc．，California）は、ガラクトース誘発性ＧＡＬ１およびＧＡＬ１０プロモーターならびにＵＲＡ、ＣＥＮ４およびＡＲＳ１を含有する１つの酵母表現ベクターである。この酵母要素は、酵母細胞中でクローン化されたＤＮＡ断片の形質転換および表現を可能にする。
連結反応からのアリコートを高度に受容能のある（Hanahan，DNA Cloning，D.M. Glover編；IRL Press，Oxford 1985，109）大腸菌ＸＬ１−ブルー（Bullock他、Biotechniques 5（1987）376〜378）を形質転換するために使用し、形質転換体をアンピシリン耐性に基づいて選択した。
アンピシリン耐性細胞約３×１０5を合わせ、かつ増幅させ、プラスミドＤＮＡを該細胞から単離した（BirnboimおよびDoly，Nucleic Acids Res．7，1979，1513）。
ｂ．リボフラビン生産酵素をコード化するアシュビア・ゴシッピイｃＤＮＡクローンの単離
リボフラビン生産酵素をコード化するアシュビア・ゴシッピイからのｃＤＮＡクローンをリボフラビン生合成に包含されるサッカロミセス・セレビシアエ突然変異体の機能的相補によって単離した。
菌株ＡＪ８８（Mata leu2 his3 rib::URA3 ura3-52）、ＡＪ１１５（Matalpha leu2 inos1 rib2::URA3 ura3-52）、ＡＪ７１（Matalpha leu2 inos1 rib3::URA3 ura3-52）、ＡＪ１０６（Matalpha leu2 inos1 rib4::URA3 ura3-52）、ＡＪ６６（Mata canR inos1 rib5::URA3 ura3-52）、およびＡＪ１２１（Matalpha leu2 inos1 rib7::URA3 ura3-52）は、サッカロミセス・セレビシアエにおけるリボフラビン生合成に包含される６個の遺伝子（rib1〜rib5およびrib7）の中の１個を破壊することによって生産された突然変異菌株である。
これらの菌株をそれぞれアシュビア・ゴシッピイｃＤＮＡバンクからのｃＤＮＡ２５μｇで形質転換し、かつリボフラビンなしにガラクトース含有媒体上に置いた。約１週間の増殖後、ｒｉｂ+形質転換体を培養皿から分離した。
それぞれ形質転換された突然変異体（Rib1+，Rib2+，Rib3+，Rib4+，Rib5+およびRib7+）からの１つの突然変異体をそのつど分析し、全ての場合にＲｉｂ+表現型はガラクトース媒体中でのみ表現され、グルコース媒体中では表現されないことを見い出した。
この結果は、Ｒｉｂ+表現型がプラスミド上に位置したガラクトース誘発性ＧＡＬ１０プロモーターの制御下に表現されることを証明している。
プラスミドＤＮＡを大腸菌の形質転換によるＲｉｂ１+、Ｒｉｂ２+、Ｒｉｂ３+、Ｒｉｂ４+、Ｒｉｂ５+およびＲｉｂ７+の突然変異体から単離し、かつｐＪＲ７１５、ｐＪＲ６６９、ｐＪＲ７８８、ｐＪＲ７３３、ｐＪＲ６８１およびｐＪＲ８２７と呼称した。
前記プラスミド中に存在するｃＤＮＡ挿入断片の部分配列により、このｃＤＮＡ挿入断片がサッカロミセスからのｒｉｂ遺伝子生産物のタンパク質に類似しているタンパク質をコード化することが確認された。
ｃ．リボフラビン生産酵素をコード化するアシュビア・ゴシッピイのゲノムクローンの単離。
アシュビア・ゴシッピイのリボフラビン生産遺伝子のゲノムコピーを単離するために、アシュビア・ゴシッピイＡＴＣＣ  １０１９５のゲノムバンクをコスミド超Ｃｏｓ１（Stratagene Cloning Systems，California）中で構成させ、かつアシュビア・ゴシッピイのｒｉｂ１、ｒｉｂ２、ｒｉｂ３、ｒｉｂ４、ｒｉｂ５およびｒｉｂ７の遺伝子のｃＤＮＡコピーから誘導された32Ｐ標識化された試料を用いてスクリーニングした。
ｒｉｂ１、ｒｉｂ２、ｒｉｂ３、ｒｉｂ４、ｒｉｂ５およびｒｉｂ７のＤＮＡを有するコスミドクローンをコロニーハイブリッド化によって単離した（GrusteinおよびHogness，Proc．Natl．Acad．USA 72，1975，3961〜3965）。更に同じｒｉｂ特異性ｃＤＮＡ試料を使用することにより酵素的に切断されたコスミドＤＮＡのサザン分析により、アシュビア・ゴシッピイのｒｉｂ１、ｒｉｂ２、ｒｉｂ３、ｒｉｂ４、ｒｉｂ５およびｒｉｂ７の遺伝子を含有する定義された制限断片を同定することができた。
３．１ｋｂの長さでありかつＧＴＰシクロヒドラーゼＩＩをコード化するアシュビア・ゴシッピイの完全ｒｉｂ１遺伝子を含有するＢａｎＨＩ−ＣｌａＩ  ＤＮＡ断片を見い出した。この断片をアガロースゲルから単離し、ＢａｍＨＩおよびＣｌａＩで切断されたｐブルースクリプトＫＳ（＋）ファージミド（phagemid）にクローン化し、こうしてプラスミドｐＪＲ７６５を得た（図２）。
１３２９ｂｐの長さでありかつ５′−非コード化領域の９０６ｂｐ、２４２ｂｐおよび３′−非コード化領域の１８１ｂｐのｒｉｂ１開放読み枠を含有するＤＮＡ配列（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１）を得た。
ＤＲＡＰデアミナーゼをコード化する完全アシュビア・ゴシッピイｒｉｂ２遺伝子を、３．０ｋｂの長さでありかつｐブルースクリプトＫＳ（＋）にクローン化されプラスミドｐＪＲ７５８を生じるＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩ断片上に見い出した（図３）。
ｒｉｂ２の開放読み枠１８３０ｂｐ、５′−未翻訳領域４５０ｂｐおよび３′−未翻訳領域３４７ｂｐを有するＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩ挿入断片からの長さ２６２７ｂｐの領域を配列した（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：３）。
ＤＢＰシンターゼをコード化する完全アシュビア・ゴシッピイｒｉｂ３遺伝子を、１．５ｋｂの長さでありかつｐブルースクリプトＫＳ（＋）にクローン化されプラスミドｐＪＲ７９０を生じるＰｓｔＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片上に見い出した（図４）。
ｒｉｂ３の開放読み枠６３９ｂｐ、５′−未翻訳領域３１４ｂｐおよび３′−未翻訳領域１２９ｂｐを有するＰｓｔＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ挿入断片からの長さ１０８２ｂｐの領域を配列した（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：５）。
ＤＭＲＬシンターゼをコード化するアシュビア・ゴシッピイｒｉｂ４遺伝子を、３．２ｋｂの長さでありかつｐブルースクリプトＫＳ（＋）にクローン化されプラスミドｐＪＲ７６２を生じるＰｓｔＩ−ＰｓｔＩ断片上に見い出した（図５）。
ｒｉｂ４の開放読み枠５１９ｂｐ、５′−未翻訳領域２７０ｂｐおよび３′−未翻訳領域２０７ｂｐを有するＰｓｔＩ−ＰｓｔＩ挿入断片からの長さ９９６ｂｐの領域を配列した（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：７）。
リボフラビンシンターゼをコード化する完全アシュビア・ゴシッピイｒｉｂ５遺伝子を、２．５ｋｂの長さでありかつｐブルースクリプトＫＳ（＋）にクローン化されプラスミドｐＪＲ７９０を生じるＰｓｔＩ−ＰｓｔＩ断片上に見い出した（図６）。
ｒｉｂ５の開放読み枠７０８ｂｐ、５′−未翻訳領域５２４ｂｐおよび３′−未翻訳領域２７９ｂｐを有するＰｓｔＩ−ＰｓｔＩ挿入断片からの長さ１５１１ｂｐの領域を配列した（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：９）。
最後に、ＤＲＡＰレダクターゼをコード化するアシュビア・ゴシッピイｒｉｂ７遺伝子を、４．１ｋｂの長さでありかつｐブルースクリプトＫＳ（＋）にクローン化されプラスミドｐＪＲ８４５を生じるＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ断片上に見い出した（図７）。
ｒｉｂ７の開放読み枠７４１ｂｐ、５′−未翻訳領域３５２ｂｐおよび３′−未翻訳領域５０３ｂｐを有するＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ挿入断片からの長さ１５９６ｂｐの領域を配列した（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１１）。
例２
アシュビア・ゴシッピイｒｉｂ遺伝子のｍＲＮＡ分析
ｒｉｂ特異性転写物を同定するためにノーザン分析を実施した。全ＲＮＡを例１の記載と同様にアシュビア・ゴシッピイ菌株ＡＴＣＣ  １０１９５から単離した。菌株からのＲＮＡ試料（５μｇ）をアガロースホルムアルデヒドゲル０．８％上での電気泳動法によってＲＮＡサイズマーカーと一緒に分別し、かつ真空中でナイロン膜上でブロットした（Thomas，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，77，1980，5201〜5205）。
ナイロン膜を４２℃で５×ＳＳＣ中でホルムアミド５０％の存在下に32Ｐ−標識化されたｒｉｂ特異性ＤＮＡ試料を用いて別個にハイブリッド化した。アシュビア・ゴシッピイｒｉｂ１遺伝子をヌクレオチド約１１５０個の独特のメッセージとして表現し、これをプラスミドｐＪＲ７６５からの長さ０．７ｋｂのＳｍａＩ−ＳａｃＩ試料によって双方の菌株中で検出した（図８）。
同様に、独特のヌクレオチドの長さ１９００個のｒｉｂ２、ヌクレオチドの長さ９００個のｒｉｂ３、ヌクレオチドの長さ８００個のｒｉｂ４、ヌクレオチドの長さ１０５０個のｒｉｂ５およびヌクレオチドの長さ１０００個のｒｉｂ７の転写物を、ｐＪＲ７５８からの長さ０．５ｋｂｐのＳｍａＩ−ＳｍａＩ断片、ｐＪＲ７９０からの長さ０．６ｋｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ−ＫｐｎＩ断片、ｐＪＲ７３９からの長さ０．５ｋｂｐのＳｃａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片およびｐＪＲ８４５からの長さ０．３ｋｂｐのＰｓｔＩ−ＰｓｔＩ断片を特異的試料として使用することによりブロットして検出した。
例３
サッカロミセス・セレビシアエにおけるアシュビア・ゴシッピイｒｉｂ遺伝子の表現
例１と同様にして、補足的アシュビア酵素をコード化するプラスミドを存在させる場合にリボフラビンなしに培地上でのリボフラビン生合成の１つの段階では不完全である、十分に研究されたサッカロミセス・セレビシアエの突然変異体を増殖させることは、可能である。アシュビア・ゴシッピイｒｉｂ遺伝子生成物の機能を試験するために、フラビンを生産する酵素活性を、表現プラスミドのｐＪＲ７１５、ｐＪＲ６６９、ｐＪＲ７８８、ｐＪＲ７３３、ｐＪＲ６８１およびｐＪＲ８２７の１つを存在させるサッカロミセス・セレビシアエ突然変異体からの細胞不含の抽出液中で測定した。
ｐＹＥｕｒａ３から誘導されかつ例１に記載されている前記プラスミドは、ガラクトース誘発性のＧＡＬ１０プロモーターの制御下にアシュビア・ゴシッピイｒｉｂ特異性ｃＤＮＡ断片を含有する。
サッカロミセス・セレビシアエからの細胞不含タンパク質抽出液を、液状媒体中でＯＤ約２の光学密度に増殖した培養液から得た。
細胞を収集し、冷たいトリスＨＣｌ  ２０ミリモル、ｐＨ７．５で洗浄し、かつフェニルエチルスルホニルフルオリド１ミリモルで補足された同じ緩衝液中に再懸濁させた。
細胞溶解物をガラス玉の存在下での渦動および３０００ｇおよび４℃で２０分間の遠心分離によって調製した。
ＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩ、ＤＲＡＰデアミナーゼ、ＤＢＰシンターゼ、ＤＭＲＬシンターゼ、リボフラビンシンターゼおよびＤＲＡＰレダクターゼ酵素の活性を刊行物の記載と同様にして測定した（Shavlovsky他、Arch．Microbiol．124，1980，255〜259; Richter他、J．Bacteriol．175，1993，4045〜4051; KleinおよびBacher，Z．Naturforsch．35b，1980，482〜484; Richter他、J．Bacteriol．174，1992，4050〜4056; Nielsen他、J．Biol．Chem．261，1986，3661; PlautおよびHarvey，Methods Enzymol．18B，1971，515〜538; HollanderおよびBrown，Biochem．Biophys．Res．Commun．89，1979，759〜763; Shavlovski他、Biochem．Biophys．Acta，428，1976，611〜618）。
タンパク質をピーターソン（Peterson）法によって定量化した（Anal．Biochem．83，1977，346〜356）。第１表から明らかなように、プラスミドｐＪＲ７１５は、サッカロミセス・セレビシアエ突然変異体ＡＪ８８中でＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩ活性の表現を引き起こす。更に、この活性は、ガラクトース媒体上で増殖した細胞中にのみ存在し、このことは、アシュビア・ゴシッピイのｒｉｂ１ｃＤＮＡ表現がガラクトース誘発性のＧＡＬ１０の制御下に生じることを示す。
それ故、この結果は、ｒｉｂ１がアシュビア・ゴシッピイ中のＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩをコード化することを証明する。同様に、前記真菌類において、ｒｉｂ２はＤＲＡＰデアミナーゼをコード化し、ｒｉｂ３はＤＢＰシンターゼをコード化し、ｒｉｂ４はＤＭＲＬシンターゼをコード化し、ｒｉｂ５はリボフラビンシンターゼをコード化し、かつｒｉｂ７はＨＴＰレダクターゼをコード化することが示された。
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配列表
（１）一般的情報：
（ｉ）出願人：
（Ａ）名：バスフ・アクチエンゲゼルシャフト
（Ｂ）通り：カール−ボッシュ−シュトラーセ３８
（Ｃ）市：ルートビヒスハーフェン
（Ｅ）国：ドイツ連邦共和国
（Ｆ）郵便番号：Ｄ−６７０５６
（Ｇ）電話番号：０６２１／６０４８５２６
（Ｈ）テレファックス：０６２１／６０４３１２３
（Ｉ）テレックス：１７６２１７５１７０
（ii）発明の名称：真菌類におけるリボフラビン生合成
（iii）配列数：１２
（iv）コンピューターで読み取り可能な形式：
（Ａ）媒体のタイプ：フロッピーディスク
（Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ  ＰＣコンパチブル
（Ｃ）オペレーティングシステム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ
（Ｄ）ソフトウェア：パテントイン（Patent In）リリース＃１．０、バージョン＃１．２５（ＥＰＯ）
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１についての情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ：１３２９個の塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖数：二本
（Ｄ）形状：線状
（ii）分子型：ｃＤＮＡないしｍＲＮＡ
（iii）仮説：なし
（iv）アンチセンス：なし
（vi）出所：
（Ａ）有機体：アシュビア・ゴシッピイ
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：５′ＵＴＲ
（Ｂ）位置：１．．２４２
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：ＣＤＳ
（Ｂ）位置：２４３．．１１４８
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：３′ＵＴＲ
（Ｂ）位置：１１４９．．１３２９。
（xi）配列の記載：ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１：
0003756180.tif 000008
0003756180.tif 000009
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：２についての情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ：３０１個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）形状：線状
（ii）分子型：タンパク質
（xi）配列の記載：ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：２：
0003756180.tif 000010
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：３についての情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ：２６２７個の塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖数：二本
（Ｄ）形状：線状
（ii）分子型：ｃＤＮＡないしｍＲＮＡ
（iii）仮説：なし
（iv）アンチセンス：なし
（vi）出所：
（Ａ）有機体：アシュビア・ゴシッピイ
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：５′ＵＴＲ
（Ｂ）位置：１．．４５０
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：ＣＤＳ
（Ｂ）位置：４５１．．２２８０
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：３′ＵＴＲ
（Ｂ）位置：２２８１．．２６２７
（xi）配列の記載：ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：３：
0003756180.tif 000011
0003756180.tif 000012
0003756180.tif 000013
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：４についての情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ：６０９個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）形状：線状
（ii）分子型：タンパク質
（xi）配列の記載：ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：４：
0003756180.tif 000014
0003756180.tif 000015
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：５についての情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ：１０８２個の塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖数：二本
（Ｄ）形状：線状
（ii）分子型：ｃＤＮＡないしｍＲＮＡ
（iii）仮説：なし
（iv）アンチセンス：なし
（vi）出所：
（Ａ）有機体：アシュビア・ゴシッピイ
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：５′ＵＴＲ
（Ｂ）位置：１．．３１４
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：ＣＤＳ
（Ｂ）位置：３１５．．９５３
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：３′ＵＴＲ
（Ｂ）位置：９５４．．１０８２
（xi）配列の記載：ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：５：
0003756180.tif 000016
0003756180.tif 000017
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：６についての情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ：２１２個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）形状：線状
（ii）分子型：タンパク質
（xi）配列の記載：ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：６：
0003756180.tif 000018
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：７についての情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ：９９６個の塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖数：二本
（Ｄ）形状：線状
（ii）分子型：ｃＤＮＡないしｍＲＮＡ
（iii）仮説：なし
（iv）アンチセンス：なし
（vi）出所：
（Ａ）有機体：アシュビア・ゴシッピイ
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：５′ＵＴＲ
（Ｂ）位置：１．．２７０
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：ＣＤＳ
（Ｂ）位置：２７１．．７８９
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：３′ＵＴＲ
（Ｂ）位置：７９０．．９９６
（xi）配列の記載：ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：７：
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（２）ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：８についての情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ：１７２個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）形状：線状
（ii）分子型：タンパク質
（xi）配列の記載：ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：８：
0003756180.tif 000020
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：９についての情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ：１５１１個の塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖数：二本
（Ｄ）形状：線状
（ii）分子型：ｃＤＮＡないしｍＲＮＡ
（iii）仮説：なし
（iv）アンチセンス：なし
（vi）出所：
（Ａ）有機体：アシュビア・ゴシッピイ
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：５′ＵＴＲ
（Ｂ）位置：１．．５２４
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：ＣＤＳ
（Ｂ）位置：５２５．．１２３２
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：３′ＵＴＲ
（Ｂ）位置：１２３３．．１５１１
（xi）配列の記載：ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：９：
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（２）ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１０についての情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ：２３５個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）形状：線状
（ii）分子型：タンパク質
（xi）配列の記載：ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１０：
0003756180.tif 000023
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１１についての情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ：１５９６個の塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖数：二本
（Ｄ）形状：線状
（ii）分子型：ｃＤＮＡないしｍＲＮＡ
（iii）仮説：なし
（iv）アンチセンス：なし
（vi）出所：
（Ａ）有機体：アシュビア・ゴシッピイ
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：５′ＵＴＲ
（Ｂ）位置：１．．３５２
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：ＣＤＳ
（Ｂ）位置：３５３．．１０９３
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：３′ＵＴＲ
（Ｂ）位置：１０９４．．１５９６
（xi）配列の記載：ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１１：
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（２）ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１２についての情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ：２４６個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）形状：線状
（ii）分子型：タンパク質
（xi）配列の記載：ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１２：
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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