(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
組織因子凝固系インヒビター（ＴＦＰＩ）およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を主構成成分とし、柱状の形状を有し、血管吻合時に血管内に挿入して使用され、血栓形成防止効果を有する血管支持体。
【請求項２】
ＴＦＰＩをＰＥＧと混合し、成型したことを特徴とする請求項１記載の血管支持体。
【請求項３】
ＴＦＰＩをＰＥＧで作成された支持体に塗布したことを特徴とする請求項１記載の血管支持体。
【請求項４】
ＰＥＧの分子量が4000〜6000である請求項１から３のいずれかに記載の血管支持体。
【請求項５】
ＰＥＧを沸騰水中に湯煎して透明な液体とし、約40℃になった時点でＴＦＰＩ溶液を混合し、これを適当な太さのネラトンカテーテル内に注入し、室温にて放置し再凝固させ、成型されることを特徴とする請求項１、請求項２、または請求項４のいずれかに記載の血管支持体。
【請求項６】
ＰＥＧを沸騰水中に湯煎して透明な液体とし、これを適当な太さのネラトンカテーテル内に注入し、室温にて放置し再凝固させ、成型後、ＴＦＰＩが塗布されることにより得られることを特徴とする請求項１、請求項３、または請求項４のいずれかに記載の血管支持体。
以上
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、組織因子インヒビター（ＴＦＩ）、外因系凝固インヒビター（ＥＰＩ）あるいはリポタンパク結合性インヒビター（ＬＡＣＩ）として知られ、近年組織因子凝固系インヒビター（ＴＦＰＩ：Tissue Factor Pathway Inhibitor）と名称統一された血液凝固インヒビターを用いた血栓形成防止剤に関する。さらに詳細には、ＴＦＰＩをＰＥＧなどによる血管支持体に塗布または混合し、成型されたものを、挫滅、またはその他の原因による血栓が原因で閉塞の可能性のある血管に使用することにより、血管の開存性を保ち、血流を確保することを特徴とする血栓形成防止剤に関する。
【０００２】
【従来技術及び発明で解決しようとする問題点】
出血は生体にとって最も重要な病態の一つであり、生体内ではこれを制御するための一連の血液凝固反応系が存在している。これらの反応系は内因系と外因系の２つの経路に分類される。現在、生理的な凝固反応の開始機序としては内因系凝固反応よりもむしろ、組織因子（Tissue  Factor、以下ＴＦ）に始まる外因系凝固反応の方が重要視されている［Davie,E.W.,Biochem.,30 p10363 (1991)］。外因系凝固反応は、通常血液に接触することのないＴＦが、血管の損傷や、他のなんらかの原因によって血液にさらされることにより、血漿成分である血液凝固VII因子またはその活性型VIIa因子とカルシウム依存的に速やかに結合し、その結果生じたＴＦ／VIIa因子複合体が血液凝固IX因子、Ｘ因子を分解活性化することで最終的に血液を凝固させる反応系である。
【０００３】
組織因子凝固系インヒビター（ＴＦＰＩ）は、上記ＴＦにより開始される外因系血液凝固反応の阻害物質として知られており、その阻害様式は、まず血液中のＸa因子と直接結合することにより、これを阻害し、さらに、細胞膜のリン脂質上で形成されるＴＦ／VIIa因子複合体に、Ｘa因子を介して結合することで、その活性を阻害すると考えられている［Girard,T.J., Nature, 338, p518 (1989)］。
【０００４】
従って、ＴＦＰＩがＴＦに対する特異的な阻害物質であることを応用して、最近、ＴＦＰＩをＴＦ惹起の汎発性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）［Kathleen, C. Day., Blood, 76, p1538 (1990)］や血管内皮損傷に伴う動脈血栓症［Haskal,E.J., Circulation, 84, p821 (1991)］へ適応することが検討され始めている。  一方、血管外科領域において血管の吻合は基礎的な手術手技であると共に、吻合可能な血管も大血管から微小血管まで多岐に亙ってきたが、末梢の微小血管において、挫滅等による損傷を受けた血管では、吻合後に閉塞しやすいことが知られている。近年、微小血管吻合術の一つとして、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で作製した溶解性血管支持体とフィブリン糊を用いて吻合を行なうことにより、１２例中、１０例で良好な開存が得られたことが報告されている（上地ら，形成外科, 29, p.372-376(1986)）。しかしながら、上記報告の実験のように血管が鋭利に切断された場合は、血管吻合、損傷部位の除去並びに吻合後の血管開存性の確保は比較的容易であったものと推察される。
【０００５】
これに対して、挫滅等により損傷を受けた場合、その切断端が複雑であり、かつ損傷部位の範囲と程度を術中に識別して切除することが極めて困難であるため、実際には一部に損傷を受けた部位を含んだまま血管吻合をしている場合が多い。このように損傷を受けた部位を含んだまま血管吻合を行うと血栓形成が生じ易くなり、吻合血管の開存性に直接影響するために、損傷血管に対する効果的な血栓形成防止剤の開発が待たれていた。さらに、近年、「患者の生活や人生の質的な面（Quality of Life：ＱＯＬ）に重点をおいて、より質の高い、きめ細かい医療を行なおう」という考え方が定着しつつあり、この観点からも吻合血管の血栓形成による閉塞は解決すべき問題の一つであった。
【０００６】
このように、血管外科領域においては、血管の開存性が、組織の生着や機能の回復に大きく関係していることから、血管の開存性の確保は重要な課題であった。特に挫滅等により血管内皮細胞が損傷を受け、当該細胞中のＴＦが露出すると、ＴＦ／VIIa因子複合体が形成し、外因系の凝固が開始し、血栓が形成されることにより血管の閉塞が起こるものと考えられる。今日、機械吻合機の使用が進むに従って、血管閉塞の頻度も高まり、問題となっている。
【０００７】
【問題点を解決するための手段】
上記の問題点を解決するために、本発明者らは、ＴＦＰＩを血管吻合時に使用することにより、ＴＦＰＩが血栓形成防止剤として有効であることを見いだした。しかしながら、ＴＦＰＩを液状または粉状でそのまま使用した場合、時間の経過に伴い、血管が閉塞する検体数の増加が観察され、持続性に問題があることがわかった。
そこで、本発明者らはさらに鋭意研究を重ねた結果、ＴＦＰＩをＰＥＧで作製した血管支持体に塗布または混合して成型したものを血管吻合手術の際、血管内に挿入することにより、血管内血液凝固を持続的に阻止することができることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
本発明で使用されるＴＦＰＩは、血漿由来のもの、あるいは遺伝子組換えにより作製されたものもいずれも使用可能である。しかしながら、ＴＦＰＩは血漿中には微量しか存在しないので（約100ng/ml）、実用化を考慮した場合、遺伝子組換えにより大量に作製されたものを使用することが好ましい。本発明においては、例えば、亀井らの方法［特願平5ー188746号］に従い、遺伝子組換えにより作製されたＴＦＰＩを使用した。まず、ＴＦＰＩのｃＤＮＡをニワトリβアクチンプロモーターを有するシャトルベクター［特願平3-243262号］に連結環状化し、ＴＦＰＩ発現プラスミドを構築し、これをチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）等の動物細胞中に導入し、得られるＴＦＰＩ高発現株を硫酸化ポリサッカライドを含む培地で培養する。このようにして得られる遺伝子組換え型ＴＦＰＩは濃縮後、公知の方法、例えば抗体アフィニティークロマトグラフィー等により精製されて使用される。また、得られるＴＦＰＩを凍結乾燥する場合は、例えばソルビトール、マンニトール、デキストロース等の糖、および糖アルコール類、アミノ酸、グリセロール、ヒト血清アルブミン等の安定剤を加えることができる。
【０００９】
本発明で血管支持体の材料としては、ＰＥＧが使用される。ＰＥＧの分子量は、加工性や強度を考慮した場合、４０００〜６０００のものが好ましい。
ＰＥＧ血管支持体は、ＰＥＧを沸騰水中にて湯煎して透明な液体とし、これを適当な太さのネラトンカテーテル（３，４号）内に注入し、室温にて放置し再凝固させることにより得られる。凝固したＰＥＧをネラトンカテーテルごと数cm長に細切りし、使用時にこのネラトンカテーテルをメスで切開し、円柱状のＰＥＧを取り出す。このＰＥＧ支柱を長さ６〜８mmにさらに細切りし、この両端を先細りとなるように削る。次に、このＰＥＧ支柱を少量の水で濡らし、手指内で丸めるように転がしながら、吻合しようとする血管の直径（外径よりやや細い程度）と同程度の太さにして用いた。このようにして得られるＰＥＧ血管支持体は、血管内に挿入されると数十秒のうちに完全に溶解した。
【００１０】
本発明で使用されるＴＦＰＩ−ＰＥＧ血管支持体の剤型は特に限定される物ではないが、ＴＦＰＩをＰＥＧと混合し、成型させたもの（ＴＦＰＩ含有ＰＥＧ血管支持体）が好ましいが、ＰＥＧ血管支持体に直接ＴＦＰＩを塗布したもの（ＴＦＰＩ塗布ＰＥＧ血管支持体）でもよい。
ＴＦＰＩ含有ＰＥＧ血管支持体は、ＰＥＧを溶解後、温度が40℃になった時点で、溶液状のＴＦＰＩを混合し（最終濃度が20μg/mlの濃度になるように）、適当な大きさのネラトンカテーテル（３号、４号）内に注入し、再凝固させる。その後は、上記と同様に行なう。
ＴＦＰＩ塗布ＰＥＧ血管支持体は、40μg/mlの濃度で凍結乾燥させ、粉状にしたＴＦＰＩ0.25gを、上記で得られたＰＥＧの表面に塗布することにより得られる。
【００１１】
吻合実験は、吻合しようとする血管を露出した後、目無し持針器により挫滅、引き抜きを加え、切断し、その後切断された血管をナイロン糸にて縫合し、血流を再開した。
本発明のＴＦＰＩ−ＰＥＧ血管支持体の血管内凝固阻止効果をみるために、ＴＦＰＩを使用しないコントロール群、ＴＦＰＩを液状または粉状で使用する群と比較実験を行なった。なお、下記の血管開存率とは開存例数を供試験例で除したものを百分率で表したものである。
【００１２】
その結果、ＴＦＰＩを使用しないコントロール群では、術後１５分、１時間、24時間及び７日目のいずれにおいても血管開存率は０％であった。一方、液状のＴＦＰＩ、粉状のＴＦＰＩ並びにＴＦＰＩ−ＰＥＧ血管支持体を血管吻合時に使用した場合、いずれも15分後、100％の血管開存率を示し、ＴＦＰＩが挫滅血管における血栓形成防止剤として有効であることがわかった。しかしながら、１時間後、ＰＥＧ血管支持体を用いない液状及び粉状のＴＦＰＩの実験群においては、血管開存率が60〜70％に、さらに７日目には40〜50％に減少し、血栓形成防止効果の持続性に問題があることがわかった。
【００１３】
これに対して、本発明のＴＦＰＩ−ＰＥＧ血管支持体を使用した群では、１時間後も80〜100％の開存率を確保し、さらに、ＴＦＰＩ含有ＰＥＧ血管支持体を使用した群では、24時間及び７日経過後も90％の高い血管開存率を示した。
【００１４】
さらに当該血管支持体の血管吻合後血栓形成防止効果を確認するために、ラットの血管柄付移植皮膚片の移植実験を行なった。移植後７日目の観察で、コントロール群は移植した皮膚片の血流が悪く、移植皮膚片は壊死してしまった。また、液状または粉状のＴＦＰＩを用いた群は、壊死には至らなかったものの、移植皮膚片が腫脹し、周辺の皮膚組織と比較したとき、明らかな差異が認められ、形成外科的には問題となる。
【００１５】
これに対して、ＴＦＰＩ−ＰＥＧ血管支持体使用した群では、移植した皮膚片が周辺の皮膚組織と同じ色調であり、完全に生着したことを示し、形成外科的に成功と言える。
【００１６】
これらの実験結果より本発明のＴＦＰＩをＰＥＧで作製した血管支持体に塗布または混合して成型したＴＦＰＩ−ＰＥＧ血管支持体が優れた血栓形成防止効果を有し、特にＴＦＰＩ含有ＰＥＧ血管支持体が長時間に渡り血管内血栓形成防止剤として極めて有効であることを見いだした。
以下、本発明の実施例を記載するが、本発明の実施態様はこれに限られるものではない。
【００１７】
【実施例】
《参考例１》  遺伝子組換えＴＦＰＩの調製
特願平5ー188746号の方法に従い、遺伝子組換えＴＦＰＩを調製した。まず、ＴＦＰＩのｃＤＮＡをニワトリβアクチンプロモーターを有するシャトルベクター［特願平3-243262号］に連結環状化し、ＴＦＰＩ発現プラスミドを構築し、これをチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）の動物細胞中に導入し、得られるＴＦＰＩ高発現株を硫酸化ポリサッカライドを含む培地で培養する。このようにして得られる遺伝子組換え型ＴＦＰＩは限外濾過膜で濃縮後、抗体アフィニティークロマトグラフィーにより精製されて使用される。また、得られるＴＦＰＩを凍結乾燥により粉末とする場合は、たとえばソルビトール、マンニトール、デキストロース等の糖、および糖アルコール類、アミノ酸、グリセロール、ヒト血清アルブミン等の安定剤を加えることができる。
【００１８】
《実施例１》  ＴＦＰＩ−ＰＥＧ血管支持体の作製
(１)  ＰＥＧ血管支持体の作製
ＰＥＧ４０００（和光純薬社製）２ｇを沸騰水中にて湯煎して透明な液体とし、これを適当な太さのネラトンカテーテル（３，４号）内に注入し、室温にて放置し再凝固させることにより得られる。凝固したＰＥＧ４０００をネラトンカテーテルごと数cm長に細切りし、使用時にこのネラトンカテーテルをメスで切開し、円柱状のＰＥＧを取り出す。このＰＥＧ支柱を長さ６〜８mmにさらに細切りし、この両端を先細りとなるように削る。次に、このＰＥＧ支柱を少量の水で濡らし、手指内で丸めるように転がしながら、吻合しようとする血管の直径と同程度の太さ（外径よりやや細い程度）にして用いた。このようにして得られるＰＥＧ血管支持体は、血管内に挿入されると数十秒のうちに完全に溶解した。
【００１９】
(２)  ＴＦＰＩ塗布ＰＥＧ血管支持体
ＴＦＰＩ塗布ＰＥＧ血管支持体は、40μg/mlの濃度（１％アルブミン＋３％マンニトール＋20mMクエン酸ナトリウム＋0.15Ｍ塩化ナトリウム，pH7.4）で凍結乾燥させ、粉状にしたＴＦＰＩ0.25gを、実施例１(１)で得られたＰＥＧの表面に塗布することにより得られた。
【００２０】
(３)  ＴＦＰＩ含有ＰＥＧ血管支持体
ＴＦＰＩ含有ＰＥＧ血管支持体は、実施例１(１)において液状にしたＰＥＧの温度が40℃になった時点で、ＴＦＰＩ溶液（20mMクエン酸ナトリウム＋0.15Ｍ塩化ナトリウム，pH7.4）を最終濃度が20μg/mlの濃度になるように混合し、適当な大きさのネラトンカテーテル（３号、４号）内に注入し、再凝固させる。その後は、実施例１(１)と同様に行なった。
【００２１】
《実施例２》  ＴＦＰＩの血栓形成防止実験
体重200から400gのウイスター系のラットを血管吻合実験に使用した。ラットにネンブタールを20mg/kgの割合で腹腔内注射を行ない、麻酔した。大腿動脈を露出した後、二連クリップを用いて阻血し、その中央で大腿動脈を目無し持針器により挫滅、引き抜きを加え、切断した。その後、各実験群を下記に従って準備した。
［コントロール群］
血管に挫滅引き抜き損傷を加え、切断し、10-0ナイロン糸で縫合した後、コントロールとしてリンゲル液0.5mlを患部の血管内に１分間充満させた後、クリップを静かにはずし、血流を再開させた。
［液状ＴＦＰＩ群］
血管に挫滅引き抜き損傷を加え、切断し、10-0ナイロン糸で縫合した後、20μg/mlの液状ＴＦＰＩ（20mMクエン酸ナトリウム＋0.15Ｍ塩化ナトリウム，pH7.4）0.5mlを患部の血管内に１分間充満させた後、クリップを静かにはずし、血流を再開させた。
［粉状ＴＦＰＩ群］
血管に挫滅引き抜き損傷を加え、切断した後、20μg/mlの濃度で凍結乾燥させたＴＦＰＩを粉状にし、0.5ｇを患部の血管内に散布し、10-0ナイロン糸で縫合し、クリップを静かにはずし、血流を再開させた。
［ＴＦＰＩ塗布ＰＥＧ血管支持体（支持体Ａ）群］
挫滅引き抜き損傷を加えられた血管の切断部位の片方の内腔に実施例１(２)で得られた支持体Ａの半分を挿入し、ついでもう一方の内腔に他端を挿入後、10-0ナイロン糸で縫合し、クリップを静かにはずして血流を再開させた。
［ＴＦＰＩ含有ＰＥＧ血管支持体（支持体Ｂ）群］
挫滅引き抜き損傷を加えられた血管の切断部位の片方の内腔に実施例１(３)で得られた支持体Ｂを半分を挿入し、ついでもう一方の内腔に他端を挿入後、10-0ナイロン糸で縫合し、クリップを静かにはずして血流を再開させた。
【００２２】
上記各実験群とも、それぞれ10匹のラットに対して行なった。血管の開存性を術後15分、１時間、24時間及び７日目の時点で観察した。その結果を表１に示す。なお、開存率（血管開存率）は開存例数を供試験数（10）で除したものを百分率で表した。
コントロール群においては術後15分、１時間、24時間及び７日目は全て血管開存率は０％であった。一方、ＴＦＰＩを使用した実験群ではいずれも術後15分における血管開存率は100％でＴＦＰＩが血液凝固阻止効果を有することがわかった。しかし、血管支持体を使用しない液状及び粉状ＴＦＰＩ実験群では、術後１時間で、血管開存率が60〜70％に低下し、さらに７日目には40〜50％に低下し、血栓形成防止効果の持続性に問題があることがわかった。
これに対して、血管支持体を使用した実験群では、術後１時間も80〜100％と高い開存率を示した。特にＴＦＰＩを含有させたＰＥＧ支持体を使用した支持体Ｂ群においては、術後７日目においても90％と極めて高い血管開存率を示し、本態様が長時間に渡り、血栓形成防止効果を有することがわかった。
【００２３】
【表１】
0003795546.tif 000002
【００２４】
《実施例３》  ラットの血管柄付移植皮膚片の移植実験
さらに、本発明のＴＦＰＩ−ＰＥＧ血管支持体の血栓形成防止効果を確認するために、ラットの血管柄付移植皮膚片の移植実験を行なった。
［コントロール群］
ラットの腹部皮膚片を血管柄付で切離し、同部位に血管縫合、皮膚片縫合を実施し、７日後に同部位を観察した。
［液状ＴＦＰＩ群］
同上の実験系において、血管縫合後、20μg/mlの液状ＴＦＰＩを血管内に１分間充満させた後、クリップを静かにはずし、血流を再開させ、皮膚片縫合を実施し、７日目に同部位を観察した。
［粉状ＴＦＰＩ群］
液状ＴＦＰＩ群と同様の操作において、20μg/mlの濃度で凍乾したＴＦＰＩ粉末を0.5g塗布し、上記の観察をした。
［支持体Ａ群］
上記と同様の操作で血管内へ実施例１(２)で得た支持体Ａを半分挿入し、ついでもう一方の内腔に他端を挿入し、縫合して血流を再開した。
［支持体Ｂ群］
支持体Ａ群の操作において、実施例１(３)で得られた支持体Ｂを用いた。
【００２５】
上記の実験の結果を表２に示した。このように、コントロール群では移植皮膚片が完全に壊死し、生着することができなかった。一方、液状及び粉状ＴＦＰＩ群は一応生着はしたが、腫脹しており、形成外科的に問題があった。
これに対して、支持体Ａ及びＢ群は、皮膚片が完全に生着し、色調も周辺組織と同じであり、形成外科的にも問題は無かった。
【００２６】
【表２】
0003795546.tif 000003
【００２７】
【発明の効果】
本発明のＴＦＰＩをＰＥＧで作製した血管支持体に塗布、または混合し、成型させたＴＦＰＩ−ＰＥＧ血管支持体が、挫滅損傷血管の血栓形成防止剤として長時間にわたり極めて有効であることが確認された。これまで、血管吻合を行なっても、血液凝固によって血管が閉塞されることにより、組織の生着や機能の回復が困難とされてきた。しかしながら、本発明のＴＦＰＩ−ＰＥＧ血管支持体を血管吻合時に使用することによって、血栓形成を防止し、血管の開存性を確保することにより、血管外科領域における手術成績の向上と患者のＱＯＬの向上に大きく貢献することが期待される。