(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
１ｍＭ〜１００ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンと１０ｍＭ〜５０ｍＭのエチレンジアミン四酢酸のアルカリ金属塩を含むｐＨ７．０〜１０．０の緩衝液中にＣａ／Ｐ比が１．０〜２．０のリン酸カルシウム系化合物粒子を懸濁させ、この懸濁液中に、溶菌操作の後に得られるＲＮＡとプラスミドＤＮＡを含む溶液を添加することにより該リン酸カルシウム系化合物粒子にＲＮＡを吸着させ、懸濁液の上清からプラスミドＤＮＡを回収することを特徴とするプラスミドＤＮＡの単離方法。
【請求項２】
緩衝液のｐＨが、酸及び／又はアルカリの添加により調整されたものである請求項１記載のプラスミドＤＮＡの単離方法。
【請求項３】
リン酸カルシウム系化合物粒子が１μｍ〜１ｍｍの平均粒径及び１〜３００ｍ2 ／ｇのＢＥＴ法による比表面積を有する粒子である請求項１記載のプラスミドＤＮＡの単離方法。
【請求項４】
Ｃａ／Ｐ比が１．０〜２．０のリン酸カルシウム系化合物粒子をクロマトグラフィー用カラムに充填し、１ｍＭ〜１００ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンと１０ｍＭ〜５０ｍＭのエチレンジアミン四酢酸のアルカリ金属塩を含むｐＨ７．０〜１０．０の緩衝液で平衡化した後、溶菌操作の後に得られるＲＮＡとプラスミドＤＮＡを含む溶液及び１ｍＭ〜１００ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンと１０ｍＭ〜５０ｍＭのエチレンジアミン四酢酸のアルカリ金属塩を含むｐＨ７．０〜１０．０の緩衝液を順次通水し、流出液からプラスミドＤＮＡを回収することを特徴とするプラスミドＤＮＡの単離方法。
【請求項５】
緩衝液のｐＨが、酸及び／又はアルカリの添加により調整されたものである請求項４記載のプラスミドＤＮＡの単離方法。
【請求項６】
平衡化と分離操作とに、同じ濃度及びｐＨの溶液を用いる請求項４記載のプラスミドＤＮＡの単離方法。
【請求項７】
リン酸カルシウム系化合物粒子が１μｍ〜１ｍｍの平均粒径及び１〜３００ｍ2 ／ｇのＢＥＴ法による比表面積を有する粒子である請求項４記載のプラスミドＤＮＡの単離方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、遺伝子工学の分野において最も基本的な操作の一つである核酸からプラスミドＤＮＡを単離する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来より、大腸菌プラスミドベクターに目的のＤＮＡを組み込んで培養し、目的のＤＮＡを大量に調製する方法は、遺伝子工学分野において最も頻繁に行われている操作の一つである。現在、大腸菌からのプラスミドベクターの回収は、溶菌操作の後ゲノムＤＮＡと蛋白質等を取り除いてＲＮＡとプラスミドＤＮＡの混合物を得ることによって行われ、その方法としては、アルカリ−ＳＤＳ法をはじめとしていくつかの方法が知られている。ＲＮＡとプラスミドＤＮＡの混合物からさらに精製プラスミドＤＮＡを得るためには、イオン交換樹脂を用いたカラム分離法、塩化セシウム密度勾配超遠心法などが一般的に用いられている。しかしながら、イオン交換樹脂を用いたカラム分離法では目的とするプラスミドＤＮＡが多量の溶離液で希釈されるため、溶離されたプラスミドＤＮＡの濃縮が煩雑であった。また、塩化セシウム密度勾配超遠心法では、大がかりな装置で高い回転数で長時間遠心処理を行うため、細心の注意を要し、煩雑であり、また、経済的でなかった。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ＲＮＡとプラスミドＤＮＡを含む溶液から特別な装置を必要とせずに簡単な操作で精製プラスミドＤＮＡを得る方法を提供することを目的とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明は、特定濃度のトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンとエチレンジアミン四酢酸のアルカリ金属塩を含む特定ｐＨ範囲の緩衝液を作用させると、ＲＮＡはリン酸カルシウム系化合物粒子に吸着されるのに対し、プラスミドＤＮＡは吸着されないことを見出し、この知見に基づいて完成したものである。
すなわち、本発明によるプラスミドＤＮＡの単離方法は、１ｍＭ〜１００ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンと１０ｍＭ〜５０ｍＭのエチレンジアミン四酢酸のアルカリ金属塩を含むｐＨ７．０〜１０．０の緩衝液中にＣａ／Ｐ比が１．０〜２．０のリン酸カルシウム系化合物粒子を懸濁させ、この懸濁液中に、溶菌操作の後に得られるＲＮＡとプラスミドＤＮＡを含む溶液を添加することにより該リン酸カルシウム系化合物粒子にＲＮＡを吸着させ、懸濁液の上清からプラスミドＤＮＡを回収することを特徴とする。
【０００５】
本発明はまた、プラスミドＤＮＡを液体クロマトグラフィーによって単離する方法に関し、この方法は、Ｃａ／Ｐ比が１．０〜２．０のリン酸カルシウム系化合物粒子をクロマトグラフィー用カラムに充填し、１ｍＭ〜１００ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンと１０ｍＭ〜５０ｍＭのエチレンジアミン四酢酸のアルカリ金属塩を含むｐＨ７．０〜１０．０の緩衝液で平衡化した後、溶菌操作の後に得られるＲＮＡとプラスミドＤＮＡを含む溶液及び１ｍＭ〜１００ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンと１０ｍＭ〜５０ｍＭのエチレンジアミン四酢酸のアルカリ金属塩を含むｐＨ７．０〜１０．０の緩衝液を順次通水し、流出液からプラスミドＤＮＡを回収することを特徴とする。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明に用いるリン酸カルシウム系化合物は、Ｃａ／Ｐ比が１．０〜２．０のものであれば、特に制限はなく、例えば、Ｃａ10（ＰＯ4)6 （ＯＨ)2、Ｃａ10（ＰＯ4)6 Ｆ2 、Ｃａ10（ＰＯ4)6 Ｃl2、Ｃａ3(ＰＯ4)2 、Ｃａ2 Ｐ2 Ｏ7 及びＣａ4 Ｏ（ＰＯ4)2 のうちから選ばれた１種又は２種以上を使用することができる。これらのうち安定性や吸着性能の点からＣａ／Ｐ比が１．５〜１．８のものが好ましく、Ｃａ／Ｐ比が１．６７のハイドロキシアパタイトを主成分とするものが最も好ましい。フッ素アパタイトを用いる場合、全リン酸カルシウム系化合物中のフッ素含有率が５重量％以下であるのが好ましい。フッ素含有率が５重量％を超えると、フッ素の溶出が起こり好ましくない。これらのリン酸カルシウム系化合物は、公知の方法で合成することができる。
【０００７】
本発明においては、リン酸カルシウム系化合物粒子は、その平均粒径が１μｍ〜１ｍｍの範囲にあり、かつＢＥＴ法による比表面積が１〜３００ｍ2 ／ｇ、好ましくは５〜３００ｍ2 ／ｇの範囲内にあるものが好ましい。平均粒径が１μｍより小さいと、取扱いが困難であり、比表面積が１ｍ2 ／ｇより小さいと、低比表面積のため充分な吸着性能が得られない。一方、平均粒径が１ｍｍより大きく、比表面積が３００ｍ2 ／ｇより大きいと、それぞれ充填密度の低下、不均一な凝集体の発生などの理由から性能が劣化する。
上記のようなリン酸カルシウム系化合物は、種々のカルシウム化合物及びリン酸化合物を出発原料として合成し、造粒乾燥した後分級することにより製造することができる。上記の条件に適合した粒子を得るには、多孔質顆粒とすることが必要となることもあるが、多孔質顆粒は、常法で製造することができる。
【０００８】
本発明の方法においては、上記のようなリン酸カルシウム系化合物粒子に核酸成分中のＲＮＡを吸着させ、プラスミドＤＮＡは吸着させないために、１ｍＭ〜１００ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンと１０ｍＭ〜５０ｍＭのエチレンジアミン四酢酸のアルカリ金属塩を含むｐＨ７．０〜１０．０の緩衝液中にＣａ／Ｐ比が１．０〜２．０のリン酸カルシウム系化合物粒子を懸濁させ、この懸濁液中に、溶菌操作の後に得られるＲＮＡとプラスミドＤＮＡを含む溶液を添加する。溶菌操作は、アルカリ−ＳＤＳ法など、任意の公知の方法で行うことができる。溶菌操作により大腸菌中のゲノムＤＮＡや菌体の構成成分としての蛋白質や脂質を除去し、残りのプラスミドＤＮＡとＲＮＡを主として含む溶液を用いる。
【０００９】
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンの濃度が１ｍＭ未満であると、緩衝作用がないため、溶液のｐＨが補償されない。また、１００ｍＭを超えると、プラスミドＤＮＡのリン酸カルシウム系化合物粒子への吸着が起こる。また、本発明に用いる緩衝液は、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンの他に、１０ｍＭ〜５０ｍＭ、好ましくは２０ｍＭ〜４０ｍＭのエチレンジアミン四酢酸のアルカリ金属塩を含有するが、エチレンジアミン四酢酸のアルカリ金属塩の濃度が１０ｍＭ未満では、リン酸カルシウム系化合物粒子に対するＲＮＡの吸着は起こらず、５０ｍＭを超えると、プラスミドＤＮＡとＲＮＡが共にリン酸カルシウム系化合物粒子に吸着されてしまう。
【００１０】
さらに、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンとエチレンジアミン四酢酸のアルカリ金属塩（以下、ＥＤＴＡと記すこともある）を含有する緩衝液（以下、トリス−ＥＤＴＡ緩衝液と記すこともある）のｐＨを７．０〜１０．０にするのが好ましい。このｐＨが７より低いとリン酸カルシウム系化合物粒子にＲＮＡが吸着されず、ｐＨが１０より高いと、プラスミドＤＮＡが吸着されてしまう。すなわち、上記ｐＨ範囲にある緩衝液を用いたときに、ＲＮＡがリン酸カルシウム系化合物粒子に吸着され、プラスミドＤＮＡが液中に精度よく残る。上記ｐＨ範囲に調製するには、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンは、ｐＨ５．０〜９．０として用いるのが好ましく、例えば、塩酸などの酸及び／又は０．１Ｍ水酸化ナトリウムなどのアルカリを用いて上記ｐＨ範囲に調整する。なお、水酸化ナトリウムは、ＥＤＴＡを溶解する作用があるので、添加することが好ましい。
【００１１】
ＥＤＴＡはヌクレアーゼの失活を主な目的として添加したものであるが、同時にリン酸カルシウム系化合物からカルシウムイオンを遊離させてＲＮＡがリン酸カルシウム系化合物粒子に吸着され、かつプラスミドＤＮＡが吸着されない条件を同時に達成する点で非常に画期的である。
【００１２】
本発明の方法によれば、核酸成分中のＲＮＡがリン酸カルシウム系化合物粒子に吸着され、プラスミドＤＮＡだけがトリス−ＥＤＴＡ緩衝液中に残るので、この溶液からのプラスミドＤＮＡの回収は、エタノールなどを用いたアルコール沈殿法などの方法で容易に行うことができる。
上記のようなリン酸カルシウム系化合物粒子をクロマトグラフィー用カラムに充填しておき、液体クロマトグラフィーによってプラスミドＤＮＡを核酸成分から容易に単離することもでき、その際プラスミドＤＮＡは充填剤に吸着されず、流出液中に含まれる。クロマトグラフィーを行う場合、カラムにリン酸カルシウム系化合物粒子を充填し、予め平衡化してから、ＲＮＡとプラスミドＤＮＡを含む試料溶液を注入し、分離操作を行うが、その際、平衡化と分離操作の両方に同じ濃度及びｐＨのトリス−ＥＤＴＡ緩衝液を用いるのが好ましい。
【００１３】
【実施例】
次に、実施例に基づいて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれによって制限されるものではない。
【００１４】
実施例１〜１１及び比較例１〜５
アンピシリン耐性遺伝子を持った pBulescriptSK（＋）（ Stratagene 社の商品名）ベクターをＪＭ１０９コンピテントセルに形質転換し、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ−寒天培地上で３７℃で一昼夜培養して単一コロニー株を得た。これを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培養液中で３７℃で一昼夜振盪培養して菌体を得た。この菌体を遠心分離したのち、アルカリ−ＳＤＳ法により核酸濃度２００μｇ／ｍｌのプラスミド−ＲＮＡ混合溶液（以下、試料溶液と称する。）を得た。
表１に示す濃度のトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−塩酸塩と表１に示した濃度のエチレンジアミン四酢酸ナトリウムを含有し、０．１Ｍ水酸化ナトリウムで表１に示すｐＨに調製したトリス−ＥＤＴＡ緩衝液７０μｌ中に平均粒径２０μｍ、比表面積５０ｍ2 ／ｇのハイドロキシアパタイト２０ｍｇを懸濁させ、試料溶液を１５μｌ添加し、室温で５分間振盪した。その後、懸濁液の上清を回収し、０．８％アガロースゲル電気泳動を行い、臭化エチジウム染色により核酸成分の分析を行い、表２に示す結果を得た。
【００１５】
【表１】
0003831490.tif 000002
【００１６】
【表２】
0003831490.tif 000003
【００１７】
表２に示した結果から明らかなとおり、１ｍＭ〜１００ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸塩と１０ｍＭ〜５０ｍＭのエチレンジアミン四酢酸のアルカリ金属塩を含有するｐＨ７．０〜１０．０のトリス−ＥＤＴＡ緩衝液を用いて高純度の精製プラスミドＤＮＡを得ることができたが、特にＥＤＴＡ濃度が２０〜４０ｍＭである場合に、好結果が得られた。
【００１８】
実施例１２
平均粒径２０μｍ、比表面積５０ｍ2 ／ｇのハイドロキシアパタイトをクロマトグラフィー用カラムに充填し、実施例２と同様の濃度及びｐＨのトリス−ＥＤＴＡ緩衝液でカラム内を洗浄し、実施例１に記載した溶菌操作後のプラスミド−ＲＮＡ混合溶液を試料溶液とし、この試料溶液及び上記トリス−ＥＤＴＡ緩衝液をカラム容積の３倍量通水し、これを溶離液とした。溶離液を回収し、０．８％アガロースゲル電気泳動を行ない、臭化エチジウム染色により拡散成分の分析を行った結果、プラスミドＤＮＡの存在を確認した。
【００１９】
【発明の効果】
本発明の方法によれば、溶菌操作によって得られる、ＲＮＡとプラスミドＤＮＡを含む溶液から特別な装置を必要とせずに簡単な操作で精製プラスミドＤＮＡを効率よく得ることができる。また、イオン交換樹脂を用いるカラム分離法などに比べて、溶離操作を必要としないため操作工程が少なくてすみ、プラスミドＤＮＡをアルコール沈殿法などにより容易に濃縮、精製することができる。