(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
リン酸カルシウム系セラミックス多孔体からなり、気孔径が０．１μｍ〜１０００μｍに分布する、多孔体全域に３次元的に連通する球状またはアメーバ状の気孔を有し、それらの気孔が１００μｍ以上の径を有する気孔連通部と、５μｍ以下の径を有する気孔連通部とを有し、それらの気孔のうち、気孔連通部の径が外部まで１００μｍ以上である連通気孔の全容量Ａが、多孔体の体積の１０％以上であり、かつ前記Ａが、多孔体中の気孔径１０μｍ以上の気孔の全容積の３０％以上である多孔構造を有することを特徴とする人工骨。
【請求項２】
前記リン酸カルシウム系セラミックス多孔体に、ＢＭＰ、ＦＧＦ、ＴＧＦ−β、ＰＤＧＦ、ＶＥＧＦ、ＩＧＦ、ＨＧＦ、ＰＴＨ、およびエストロゲンからなる群から選ばれた少なくとも１種を複合したことを特徴とする請求項１に記載の人工骨。
【請求項３】
組織工学的に細胞を複合する担体であって、リン酸カルシウム系セラミックス多孔体からなり、気孔径が０．１μｍ〜１０００μｍに分布する、多孔体全域に３次元的に連通する球状またはアメーバ状の気孔を有し、それらの気孔が１００μｍ以上の径を有する気孔連通部と、５μｍ以下の径を有する気孔連通部とを有し、それらの気孔のうち、気孔連通部の径が外部まで１００μｍ以上である連通気孔の全容量Ａが、多孔体の体積の１０％以上であり、かつ前記Ａが、多孔体中の気孔径１０μｍ以上の気孔の全容積の３０％以上である多孔構造を有することを特徴とする組織工学用担体。
【請求項４】
請求項３に記載の組織工学用担体に、幹細胞、骨髄未分化細胞、骨芽細胞、骨芽細胞の前駆細胞、破骨細胞、および破骨細胞の前駆細胞からなる群から選ばれた少なくとも１種を複合したことを特徴とする人工骨。
【請求項５】
前記リン酸カルシウム系セラミックスは、β−リン酸カルシウム、水酸化アパタイト、これらの複合物からなるセラミツクス、および結晶化ガラスからなる群から選ばれた１種であることを特徴とする請求項１、２または４に記載の人工骨。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、人工骨および組織工学用担体に関する。
【０００２】
【従来の技術】
整形外科等の分野において、骨欠損を修復する方法として、自家骨移植がオーソドックスな方法である。自家骨移植は、その使用実績からも信頼性は高いが、採骨量に限界があること、採骨により健常部に侵襲を加えてしまうこと、手術時間が長くなること、などの問題点があった。
【０００３】
そのため、近年、リン酸カルシウムを主成分とする多孔体を人工骨として応用する方法が開発され、上述の自家骨移植の問題を解決する手段として、多く用いられるようになっている。
【０００４】
骨は、無機成分としてリン酸カルシウムを主成分として含んでおり、一般にリン酸カルシウム化合物は、細胞がこれを足場にして骨を形成する性質である骨伝導能を有している。従って、人工骨は、リン酸カルシウム化合物を主成分とし、材料内部まで骨形成が得られるように、多孔質にデザインされるのが一般的である。
【０００５】
人工骨を構成する多孔質の性状は、補填部全域、特に材料内部までの速やかな骨形成を得るために非常に重要な点である。例えば、特開２０００−３０２５６７号公報には、連通する気孔を有し、その連通部分の平均的な直径が５０μｍ以上であり、かつ気孔径が１５０μｍ以上である性状のリン酸カルシウム多孔体が開示されている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、この公報に記載されている多孔体は、気孔の連通部分の平均的な直径を５０μｍ以上としているが、気孔の中で最小の径である連通部の径は、細胞の侵入にとって最も重要であり、平均的な連通部の径を規定するだけでは、気孔の連通状態が十分にコントロールされていない。そのため、材料の内部から外部に至るまで十分な径を有する気孔連通部が確実に存在するとは限らない。
【０００７】
また、気孔径が１５０μｍ以上としただけでは、細胞との親和性の確保やリン酸カルシウムの化学的な作用、例えば周囲の化学的な状況を刺激する微妙な溶解などをもたらし得ない。
【０００８】
本発明は、このような事情の下になされ、細胞との親和性に優れ、細胞をスムースに材料内部に侵入させることを可能とする人工骨および組織工学用担体を提供することを目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するため、本発明は、リン酸カルシウム系セラミックス多孔体からなり、気孔径が０．１μｍ〜１０００μｍに分布する、多孔体全域に３次元的に連通する球状またはアメーバ状の気孔を有し、それらの気孔が１００μｍ以上の径を有する気孔連通部と、５μｍ以下の径を有する気孔連通部とを有し、それらの気孔のうち、気孔連通部の径が外部まで１００μｍ以上である連通気孔の全容量Ａが、多孔体の体積の１０％以上であり、かつ前記Ａが、多孔体中の気孔径１０μｍ以上の気孔の全容積の３０％以上である多孔構造を有することを特徴とする人工骨を提供する。また、この人工骨は、組織工学用担体として用いることが可能である。
【００１１】
上記人工骨は、リン酸カルシウム系セラミックス多孔体に、ＢＭＰ、ＦＧＦ、ＴＧＦ−β、ＰＤＧＦ、ＶＥＧＦ、ＩＧＦ、ＨＧＦ、ＰＴＨ、およびエストロゲンからなる群から選ばれた少なくとも１種を複合したものとすることが出来る。
【００１２】
また、本発明は、組織工学的に細胞を複合する担体であって、リン酸カルシウム系セラミックス多孔体からなり、気孔径が０．１μｍ〜１０００μｍに分布する、多孔体全域に３次元的に連通する球状またはアメーバ状の気孔を有し、それらの気孔が１００μｍ以上の径を有する気孔連通部と、５μｍ以下の径を有する気孔連通部とを有し、それらの気孔のうち、気孔連通部の径が外部まで１００μｍ以上である連通気孔の全容量Ａが、多孔体の体積の１０％以上であり、かつ前記Ａが、多孔体中の気孔径１０μｍ以上の気孔の全容積の３０％以上である多孔構造を有することを特徴とする組織工学用担体を提供する。
【００１３】
更にまた、本発明は、上記組織工学用担体に、幹細胞、骨髄未分化細胞、骨芽細胞、骨芽細胞の前駆細胞、破骨細胞、および破骨細胞の前駆細胞からなる群から選ばれた少なくとも１種を複合したことを特徴とする人工骨を提供する。
【００１４】
以上説明した人工骨において、リン酸カルシウム系セラミックスは、β−リン酸カルシウム、水酸化アパタイト、これらの複合物からなるセラミツクス、および結晶化ガラスからなる群から選ばれた１種とすることが出来る。
【００１５】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態について説明する。
【００１６】
本発明に係る人工骨は、リン酸カルシウム系セラミックス多孔体により構成される。
既に知られているように、リン酸カルシウム化合物は骨伝導能を有しているため、従来より人工骨の成分として用いられている。リン酸カルシウム化合物の中でも、水酸化アパタイト（ＨＡＰ）およびβ−リン酸カルシウム（β−ＴＣＰ）は、より骨伝導能に優れており、人工骨成分として好ましい。
【００１７】
これらの中でも、特にβ−ＴＣＰは、骨伝導能に優れているだけでなく、骨組織内で吸収される性質も併せて有している。即ち、β−ＴＣＰを骨組織に補填すると、骨芽細胞が材料を足場にして骨を形成し、それと同時に破骨細胞が材料を吸収し、補填部が経時的に自家骨に置換されるという特徴がある。従って、β−ＴＣＰは、本発明に係る人工骨の成分として最適な材料である。
【００１８】
リン酸カルシウム化合物の骨伝導能や生体吸収性は、その製造プロセスによっても大きく左右される。人工骨用のβ−ＴＣＰは、原材料粉末として、湿式磨砕するメカノケミカル法により合成されたβ−ＴＣＰ粉末を用いて得たものであることが望ましい。
【００１９】
得られたβ−ＴＣＰ粉末は、次いで、水、解膠剤、界面活性剤とともにスラリー化され、乾燥および焼成され、セラミックス多孔体とされる。
次に、以上説明したリン酸カルシウム系セラミックス多孔体の気孔性状について説明する。
【００２０】
本発明に係る人工骨および組織工学用担体を構成するリン酸カルシウム系セラミックス多孔体は、気孔径０．１μｍ〜１０００μｍに分布する球状またはアメーバ状の気孔が、多孔体全域に３次元的に連通する構造である必要がある。球状気孔とは、多数の球状気孔が繋がった気孔であり、アメーバ状気孔とは、アメーバ状に延びた気孔である。
【００２１】
このような多孔体において、気孔径の大きなマクロ側の気孔は、細胞の侵入、移植後の血管の新生などに必要であり、気孔径の小さなミクロ側の気孔は、細胞との親和性、周囲への化学的刺激（イオンの微量溶出など）のために必要である。
【００２２】
なお、本発明に係るセラミックス多孔体は、気孔径０．１μｍ〜１０００μｍに分布する連通気孔を有するが、従来、人工骨用に用いられているセラミックス多孔体が、気孔径１５０μｍ以上の気孔を有するのに対し、それよりはるかに小さい側にも分布を有する点で、基本的に相違する。
【００２３】
また、人工骨における骨形成と材料の吸収、組織工学用担体における培養細胞との複合が効果的に行われるためには、材料の外部から内部まで、十分な径の連通部を介して連通する気孔を十分に確保した構造とすることが必要である。
【００２４】
すなわち、このような多孔体において、気孔の連通部の径は、１００μｍ以上を確保し、かつ外部に至るまで確実に連通する気孔を有することが重要である。気孔の連通部とは、気孔とそれに隣接する気孔の間の部分であって、気孔径よりも小さい径を有している。従って、細胞の侵入等のためには、気孔の連通部の径を大きく確保することが重要である。
【００２５】
従って、本発明に用いるセラミック多孔体は、気孔連通部の径が外部まで１００μｍ以上である連通気孔の全容量Ａが、多孔体の体積の１０％以上であること、およびＡが、多孔体中の気孔径１０μｍ以上の気孔の全容積の３０％以上である構造を有する。Ａが、多孔体の体積の１０％未満では、細胞が浸入し得る気孔が少なく、十分な骨形成が得にくくなり、好ましくない。
【００２６】
また、Ａが、多孔体中の気孔径１０μｍ以上の気孔の全容積の３０％未満では、同様に細胞が浸入し得る気孔が少なく、十分な骨形成が得にくくなり、好ましくない。
【００２７】
或いは、、本発明に用いるセラミック多孔体は、多孔体中の気孔連通部の径が５μｍ以上ある気孔において、気孔連通部の径が外部までＢμｍ以上である連通気孔の全容積をＣとした場合、微分ｄＣ／ｄＢの最大値がＢ＞１００μｍで得られる構造を有する。
【００２８】
微分ｄＣ／ｄＢは、気孔連通部の径の変化に対する連通気孔の全容積の変化を示し、その曲線が１００μｍを越えるＢの値においてピークを有することを意味する。
【００２９】
微分ｄＣ／ｄＢの最大値が１００μｍ以下のＢで得られるような多孔構造では、連通部の径の分布において１００μm以上を確保する気孔が少なくなり、好ましくない。
【００３０】
以上説明した、リン酸カルシウム系セラミックス多孔体を用いることにより、細胞をスムースに多孔体内部に侵入させ、かつ細胞との親和性を最適なものとし、多孔体内部まで速やかな骨形成が得られる人工骨を得ることが可能である。
【００３１】
更に速やかな骨形成を得るために、上述した構造のリン酸カルシウム系セラミック多孔体に、骨形成を促進する成長因子、細胞増殖因子、ホルモンなどを複合することができる。骨形成を促進する因子であれば、特に限定されないが、例えばＢＭＰ、ＦＧＦ、ＴＧＦ−β、ＰＤＧＦ、ＶＥＧＦ、ＩＧＦ、ＨＧＦ、ＰＴＨ、エストロゲンなどを複合することが出来る。
【００３２】
また、上述したリン酸カルシウム系セラミック多孔体は、組織工学用担体としても、培養細胞の内部までの速やかな侵入という点で優れている。特に、骨形成、骨のリモデリング、骨代謝に寄与する細胞と複合することにより、優れた人工骨を得ることが出来る。複合する細胞は、骨形成、骨のリモデリング、骨代謝に寄与する細胞であれば、特に限定されないが、幹細胞、骨髄未分化細胞、骨芽細胞、骨芽細胞の前駆細胞、破骨細胞、破骨細胞の前駆細胞などを用いることができる。幹細胞は骨髄由来のものをはじめ、様々なものを複合することが出来る。
【００３３】
以下、本発明の種々の実施例を示し、本発明の効果をより具体的に説明する。
【００３４】
＜実施例１＞
本実施例は、リン酸カルシウム系セラミックスとしてβ−ＴＣＰを用いて得た多孔体の製造例について示す。
【００３５】
β−ＴＣＰの合成は、メカノケミカル法により以下のようにして行った。即ち、炭酸カルシウム粉末とリン酸水素カルシウム２水和物粉末をモル比で１：２の割合で秤量し、純水とともにボールミルポットに入れ、約１日ボールミルにて混合粉砕した。得られたスラリーを約８０℃で乾燥し、その後７５０℃で焼成した。得られた粉末は、焼結性に優れた高純度のβ−ＴＣＰであった。
【００３６】
このようにして得たβ−ＴＣＰ粉末に純水とアクリル酸アンモニウム系の解膠剤とポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル系の界面活性剤を添加し、混合攪拌して発泡スラリーを調製した。この発泡スラリーを乾燥させ、その後１０５０℃で焼成してβ−ＴＣＰ多孔体を得た。
【００３７】
この多孔体について、その気孔性状を評価した。まず重量および体積を測定し、それらの値を用いて気孔率を算出すると、７５％であった。また、ＳＥＭ観察により、マクロな気孔として、１００〜４００μｍの径の気孔が多く存在することを確認した。
【００３８】
材料外部からの気孔連通性は、水銀圧入法により測定した。水銀圧入法は、測定精度上、連通部の径で１００μｍが評価の上限であり、その範囲において、連通部径と、その値以上の連通部径を満たして外部まで連通している全気孔の容積との関係を測定することができる。１００μｍを越える連通部径の全気孔容積は、気孔率と水銀圧入量の差引によって求められる。
【００３９】
水銀圧入法による多孔体の気孔連通性の測定は、前処理として試料を１１０℃で５時間真空乾燥したのち乾燥炉より取り出し、約３０分自然放冷させた後、オートポアIIIS４２０（商品名：Micromerities社製）を用いて行った。その結果、多孔体単位体積（１ｍｌ）当たりの連通部径と気孔容積の関係は、下記表１に示す通りとなった。
【００４０】
【表１】
0003739715.tif 000002
【００４１】
上記表１に示す結果から、多孔体の単位体積中、連通部径が１００μｍ以上である気孔で、外部までこの連通部の径１００μｍ以上を満たす気孔により連通している気孔の全容量Ａは０．２４ｍｌであり、これは多孔体の体積（１ｍｌ）に対して２４％であることがわかる。また、Ａの多孔体中の気孔径１０μｍ以上の気孔の全容積に対する割合は、３０％以上であることは明らかである。
【００４２】
更に、多孔体中の気孔連動部の径が５μｍ以上ある気孔において、外部まで連通部の径Ｂμｍ以上を満たす気孔により連通する全気孔の容積をＣとした場合、ｄＣ／ｄＢ値の最大値はＢ＞１００μｍで得られることも明らかである。
【００４３】
＜実施例２＞
実施例１において作製したβ−ＴＣＰ多孔体（試料ａとする）を、兎の大腿骨に補填して評価した。対照として、実施例１と同様にしてメカノケミカル法により作製したβ−ＴＣＰ粉末に、グリセリン系界面活性剤を添加物として用い、同様な湿式発泡法により作製した多孔体（試料ｂとする）を、同様に兎の大腿骨に補填して評価した。
【００４４】
なお、この試料ｂは、気孔率が試料ａと同様に７５％であり、ＳＥＭ観察により１００〜３００μｍの気孔が確認されたが、気孔連通性を水銀圧入法により評価すると、実施例１で示したＡ値は極く僅か（多孔体体積の１０％未満）であり、ｄＣ／ｄＢの最大値は５μｍの時に得られ、連通性が悪いものであった。
【００４５】
３ｋｇの雌の兎の大腿骨顆部にφ５×８ｍｍの骨欠損を作製し、これに同サイズの試料を補填した。コントロールは何も補填しないものとした。２週、４週、６週経過後に補填部を摘出し、非脱灰標本を作製して評価した。また、標本上の新生骨の面積率と材料の面積率を計測した。
【００４６】
その結果、試料ａについては、２週の早期に、周辺部から中心部に向かうように骨形成が進行しており、４週では骨形成は中心部まで達していた。これに対し、試料ｂでは、４週までは材料周辺部での骨形成しか得られなかった。
【００４７】
新生骨の面積率、材料の面積率を下記表２に示す。
【００４８】
【表２】
0003739715.tif 000003
【００４９】
以上の結果より、試料ａにおいては、速やかな骨の形成と材料の吸収の進行を確認することができた。これは、試料ａが良好な気孔連通性を有するためと考えられる。
【００５０】
＜実施例３＞
実施例１において作製したβ−ＴＣＰ多孔体（試料ａ）に、細胞増殖因子を複合した。細胞増殖因子としてはｒｈ  ＢＭＰ−２を用い、これを緩衝液に溶解したものを、多孔体１ｃｍ３あたり１０〜１０００μｇ含有するように多孔体に染み込ませ、減圧乾燥し、または凍結乾燥を行い、人工骨を得た。
【００５１】
この人工骨は、細胞との親和性に優れ、細胞をスムースに材料内部に侵入させることが可能であるとともに、細胞の増殖を促進させる優れた人工骨であった。
【００５２】
＜実施例４＞
実施例１において作製したβ−ＴＣＰ多孔体（試料ａ）に培養細胞を複合し、評価した。対照として実施例２に示す試料ｂについても同様に培養細胞を複合し、評価した。
【００５３】
まず、フィッシャーラット大腿骨より骨髄細胞を採取し、ＦＢＳを１５％加えたＭＥＭ培地で８日間初期培養を行い、トリプシン処理により細胞を剥がして１０６個／ｍｌの濃度とした細胞浮遊液を、試料ａ、ｂのβ−ＴＣＰ多孔体に浸透させた。次いで、β−ＴＣＰ多孔体にDexamethasone 10mM、β・Glycerophosphate 10mM、Ascorbic acid 50μg/mlを新たに加えて２週培養した後、フィッシャーラット背部の皮下に移植して評価した。
【００５４】
皮下移植前の試料をＳＥＭ観察したところ、試料ａには培養細胞が材料内部まで侵入していることが確認できたが、試料ｂでは細胞は観察されなかった。また、皮下移植後４週で、試料ａについて材料内部での異所性骨形成を確認することが出来たが、試料ｂでは骨形成は認められなかった。
【００５５】
これらの結果より、試料ａは良好な気孔連通性を有しており、in vitroにおいても良好な細胞の侵入が行われることが確認された。
【００５６】
【発明の効果】
以上、詳細に説明したように、本発明によれば、所定の気孔性状のセラミック多孔体を用いることにより、特に細胞との親和性に優れ、細胞をスムースに材料内部に侵入させることが可能な人工骨および組織工学用担体を提供することができる。