(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
創傷治癒および非創傷治癒の糖尿病患者の間を区別する閾値を示す糖尿病の患者から得た試料中の酸化窒素関連生成物のレベルを比較する段階を包含し、酸化窒素関連生成物のレベルが、該閾値より上である場合には、患者は、創傷治癒の糖尿病患者であり、そして酸化窒素関連生成物のレベルが、概ね該閾値であるか、または下である場合には、患者は、非創傷治癒の糖尿病患者であることを特徴とする、糖尿病患者が、創傷治癒の糖尿病患者であるか、または非創傷治癒の糖尿病患者であるかを決定する方法であり、該酸化窒素関連生成物が、硝酸塩、硝酸塩の誘導体、亜硝酸塩、亜硝酸塩の誘導体、酸化窒素、L−シトルリン、cGMP、過酸化亜硝酸塩、3−ニトロチロシンまたはL−ジメチルアルギニンである方法。
【請求項２】
試料中の酸化窒素関連生成物のレベルを測定する段階をさらに包含する、請求項1記載の方法。
【請求項３】
試料が、少なくとも6時間の絶食の期間に続いて採取された試料である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
絶食期間が、6〜10時間である、請求項３記載の方法。
【請求項５】
患者が、さらに、絶食期間の直前の少なくとも6時間、900mg／kg体重／日より下の硝酸塩の取入れおよび9mg／kg体重／日より下の亜硝酸塩の取入れで食事を投与された患者である、請求項３記載の方法。
【請求項６】
患者が、食事を期間中6〜24時間投与された患者である、請求項５記載の方法。
【請求項７】
試料が、尿、血液または組織である、請求項1記載の方法。
【請求項８】
患者が、ヒトである、請求項1記載の方法。
【請求項９】
酸化窒素関連生成物が、硝酸塩、硝酸塩の誘導体、亜硝酸塩、または亜硝酸塩の誘導体である、請求項1記載の方法。
【請求項１０】
試料が、尿であり、そして閾値が、15マイクロモル濃度および50マイクロモル濃度の間の硝酸塩である、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
閾値が、20マイクロモル濃度および45マイクロモル濃度の間の硝酸塩である、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
閾値が、25マイクロモル濃度および40マイクロモル濃度の間の硝酸塩である、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
閾値が、約35マイクロモル濃度の硝酸塩である、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
試料が、血液であり、そして閾値が、2マイクロモル濃度および20マイクロモル濃度の間の硝酸塩である、請求項9記載の方法。
【請求項１５】
閾値が、3マイクロモル濃度および17マイクロモル濃度の間の硝酸塩である、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
閾値が、4マイクロモル濃度および16マイクロモル濃度の間の硝酸塩である、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
閾値が、約5マイクロモル濃度の硝酸塩である、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
酸化窒素関連生成物が、酸化窒素、L−シトルリン、cGMP、過酸化亜硝酸塩、3−ニトロチロシンまたはL−ジメチルアルギニンである、請求項1記載の方法。
【請求項１９】
（a）酸化窒素のレベルを上昇させるように設計された治療剤を投与された患者から得た試料中の酸化窒素関連生成物のレベルを測定する段階；および
（b）酸化窒素関連生成物のレベルが閾値を上回っていたら、治療効率は創傷治癒の促進に十分であり、酸化窒素関連生成物のレベルが閾値とほぼ同じかそれを下回っていたら、治療効率は創傷治癒の促進に十分でないような、創傷治癒の糖尿病患者および非創傷治癒の糖尿病患者とを区別する閾値をもつ酸化窒素関連生成物のレベルを比較する段階を含む、非創傷治癒の糖尿病患者の創傷治療の効率を監視する方法であり、該酸化窒素関連生成物が、硝酸塩、硝酸塩の誘導体、亜硝酸塩、亜硝酸塩の誘導体、酸化窒素、L−シトルリン、cGMP、過酸化亜硝酸塩、3−ニトロチロシンまたはL−ジメチルアルギニンである方法。
【請求項２０】
酸化窒素関連生成物が、硝酸塩、硝酸塩の誘導体、亜硝酸塩、または亜硝酸塩の誘導体である、請求項19記載の方法。
【請求項２１】
酸化窒素関連生成物が、酸化窒素、L−シトルリン、cGMP、過酸化亜硝酸塩、3−ニトロチロシンまたはL−ジメチルアルギニンである、請求項19記載の方法。
【請求項２２】
試料が、少なくとも6時間の絶食の期間に続いて採取された試料である、請求項19記載の方法。
【請求項２３】
患者が、請求項1の方法により非創傷治癒の糖尿病患者として同定された患者である、請求項19記載の方法。
【請求項２４】
治療剤が、L−アルギニンまたは高圧酸素である、請求項19記載の方法。
【請求項２５】
レベルが閾値を上回っている、この場合には患者は創傷治癒の糖尿病である、又は閾値とほぼ同じもしくは下回っている、この場合には患者は非創傷治癒の糖尿病である、かどうかを判定するために、患者由来の試料中の酸化窒素関連生成物のレベルを測定するための1種またはそれ以上の試薬、および一種又はそれ以上の試薬を使用するための指示を包含する、糖尿病患者が、創傷治癒の糖尿病患者または非創傷治癒の糖尿病患者であることを決定するキットであり、一種又はそれ以上の試薬が2，3−ジアミノナフタレン及びNaOHであり、該酸化窒素関連生成物が硝酸塩、硝酸塩の誘導体、亜硝酸塩、亜硝酸塩の誘導体、酸化窒素、L−シトルリン、cGMP、過酸化亜硝酸塩、3−ニトロチロシンまたはL−ジメチルアルギニンであるキット。
【請求項２６】
試料が、尿、血液または組織である、請求項25記載のキット。
【請求項２７】
酸化窒素関連生成物が、硝酸塩、硝酸塩の誘導体、亜硝酸塩、または亜硝酸塩の誘導体である、請求項25記載のキット。
【請求項２８】
酸化窒素関連生成物が、酸化窒素、L−シトルリン、cGMP、過酸化亜硝酸塩、3−ニトロチロシンまたはL−ジメチルアルギニンである、請求項25記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願は、1999年3月19日に提出された米国仮出願番号第60／125，284号、および2000年3月1日に提出された米国実用新案出願番号09／516，584号の利益を主張し、そしてそれは、全体に参照として本明細書に組み入れられる。
【０００２】
発明の技術分野
本発明は、糖尿病患者における創傷治癒の領域に関する。特に、非治癒の糖尿病における酸化窒素のレベルについてのアッセイ法に関する。
【０００３】
発明の背景
糖尿病は、米国で、概算1500万の人々に影響を及ぼす。糖尿病人口の内に、明らかな罹患率および治療費用と関連する慢性の非治癒の脚の潰瘍（LEU）を示す個人がある。慢性の非治癒のLEUは、毎年、50，000の糖尿病実験（GE  Reiber、EJ  Boyko、DG  Smith、「米国における糖尿病」で、国立衛生研究所公報番号95−1468、Bethesda,Md編、1995年、409−428頁）を越える約85％の脚の切断（LEA）を進行する。これは、この国（米国）でLEAを受けている全ての個人の半分以上を表す。糖尿病の入院治療のわずか6％が、LEUに関連しているのに対して、1992年における糖尿病の脚の合併症についての総政府払戻しは、手足の切断およびリハビリのための費用を含まずに15億を越えた。LEAについての医療の病理学上の危険因子としては、糖尿病性神経傷害、脚の虚血、および慢性の非治癒の糖尿病性脚潰瘍が挙げられる。
【０００４】
LEUを示す糖尿病における根元的な問題は、ほとんど理解されていない創傷治癒を損なう。大半の糖尿病は、「正常な」創傷治癒を示す一方で、慢性LEUを示すものは、しばしば、減少した創傷炎症、回帰的創傷感染、減少した皮膚の血管灌流、乏しい創傷コラーゲン沈着、および瘢痕成熟を示す。血小板由来の成長因子（PDGF）欠失は、慢性の糖尿病性潰瘍に関連し、そして治癒が損なわれることに寄与する（HD  Beer、MT  Longaker、S  Werner、J  Invest  Dermatol  109巻、132頁（1997年））。Regranex（登録商標）を用いた治験は、評価された患者のただ半分またはそれ未満で、慢性の脚の潰瘍の治癒を改善する上での効力を示した（DL  Steed、J．Vasc  Surg、21巻、71頁（1995年））。
【０００５】
創傷炎症、組織修復、および微細血管恒常性における酸化窒素（NO）の役割における最近の研究は、我々に、創傷治癒の一次制御因子としてNOを考えさせた（D  Bruch−Gerharz、T  Ruzicka、V  Kolb−Bachofen、J  Invest  Dermatol．110巻、1頁（1998年）；MR  Schafferら、Surgery  121巻、513頁（1997年））。上皮由来のNOの全身性欠失が、全ての糖尿病で観察され（A  Vevesら、Diabetes、47巻、457頁（1998年）；M  Huszkaら、Thrombosis  Res、86（2）巻、173頁（1997年）；SB  Williams、JA  Cusco、MA  Roddy、MT  Hohnston、MA  Creager、J．Am．Col．Cardiol．27（3）巻、567頁（1996年））、それによりNOが、慢性の非治癒LEUの病理学における基本的役割を果すことを示唆する。結局、糖尿病における創傷治癒能力とNO産生を関連させる必要がある。このような相関関係は、それらのNOの生成に基づいた糖尿病の創傷治癒能力を推定する方法の開発を可能にし、そして適切な治療を選択するための根拠として働きうる有用な医療指標を提供する。
【０００６】
発明の概要
糖尿病患者が、創傷治癒の糖尿病患者であるか、または非創傷治癒の糖尿病患者であるかを決定する方法を提供することが本発明の目的である。その方法は、（a）患者から試料を採取すること；（b）試料中の酸化窒素関連生成物のレベルを測定すること；および（c）創傷治癒および非創傷治癒の糖尿病患者の間を区別する閾値を示す試料での酸化窒素関連生成物のレベルを比較する段階を包含する。酸化窒素関連生成物のレベルが、該閾値より上である場合、それにより患者は、創傷治癒の糖尿病患者である。酸化窒素関連生成物のレベルが、概ね該閾値であるか、またはより下である場合、それにより患者は、非創傷治癒の糖尿病患者である。
【０００７】
糖尿病患者を治療する方法を提供することも、本発明の目的である。その方法は、（a）患者から試料を採取すること；（b）試料中の酸化窒素関連生成物のレベルを測定すること；および（c）創傷治癒および非創傷治癒の糖尿病患者の間を区別する閾値を示す患者から得た試料中の酸化窒素関連生成物のレベルを比較すること；および（d）創傷治癒の糖尿病患者であるか、または非創傷治癒の糖尿病患者であるかにより、患者を治療する段階を包含する。
【０００８】
非創傷治癒の糖尿病患者の治療の効率を監視する方法を提供することが、本発明のさらなる目的である。その方法は、（a）患者における酸化窒素のレベルを上昇させるように設計された治療剤を、患者に投与すること；（b）患者から試料を採取すること；および（c）治療の効力の測定値として、患者から得た試料中の酸化窒素関連生成物のレベルを測定する段階を包含する。
【０００９】
糖尿病患者が、創傷治癒の糖尿病であるか、または非創傷治癒の糖尿病患者であるかどうかを決定するキットを提供することが、本発明のさらに別の目的である。そのキットは、試料中の酸化窒素関連生成物のレベルを測定するための試薬、および試薬を使用して、試料を得るための指示を包含し、そしてそれにより結果が解釈される。
【００１０】
本発明のこれらのおよび他の目的は、下に記述される具体例の1つまたはそれ以上によって供される。
【００１１】
発明の詳細な説明
本発明の方法およびキットは、制御条件下で患者から取られた試料におけるNOの分解生成物の測定に基づいて、乏しい創傷治癒能力を示す糖尿病患者を検出、治療および監視するように設計される。本発明は、糖尿病患者が、NO合成許容力の持続的試料を表すこと、およびその試料の下部末端が、創傷治癒機能を損なったことと見なす。NOは、正常に、安定な生成物硝酸塩および亜硝酸塩に代謝され、そしてそれは、糖尿病患者から得られる尿、血漿、組織または他の試料で分析されうる。試料中の硝酸塩および亜硝酸塩の濃度は、患者におけるNO合成のレベルの指標として役割を果しうる。発明者の知見は、糖尿病患者でのNOの閾値レベルより下で、正常な創傷修復は、達成されないことを示し、そしてそれはLEUで生じる。
【００１２】
NOは、血管拡張、神経伝達、および腸管ぜん動のような自律的機能についての重要な生理学的メディエーターである小さな疎水性の気体遊離ラジカルである。NOは、環状グアノシンモノホスフェート（cGMP）の細胞内の濃度を上昇させるその標的分子グアニル酸シクラーゼの活性化により、細胞の信号発生を提供する（JS  Beckman、「酸化窒素（Nitric  Oxide）」，J．Lancaster，Jr．編（アカデミック・プレス、ニューヨーク）、第1章）。細胞の信号発生は、チャンネルまたは細胞膜レセプターの介在なしに行われ、そして細胞の環境におけるNOの濃度に依存する。
【００１３】
NOは、生物学上の組織における約5秒の半減期を示す。それは、酸化窒素シンターゼ（NOS）の3つのイソ型によって発生され、そしてそれは、L−アルギニンおよび分子の酸素を、シトルリンおよびNOに代謝する。3つのイソ型の内の2つは、神経の細胞（nNOS）で、そして上皮細胞（eNOS）で記述される構築的酵素システム（cNOS）である（D  Bruch−Gerharz、T  Rusicka、V  Kolb−Bachofen、J  Invest  Dermatol．110巻、1頁（1998年））。これらのイソ型と共に、細胞内のカルシウムの増加したレベルが、カルモジュリンを介して酵素を活性化する。カルシウム依存性cNOSシステムは、低い（ピコモル濃度）濃度のNOを生成する。第三のシステムは、カルシウム依存性である誘導性イソ型（iNOS）である。iNOSの発現は、炎症サイトカインまたは細菌のリポ多糖（LPS）のような組織特異的刺激によって誘導される。誘導性イソ型は、cNOSより非常に高い（ナノモル濃度）濃度でNOを放出し、そして強力な内毒素効果を示す。
【００１４】
最近、cNOS酵素は、皮膚恒常性を制御および維持することに関与するようである（S  Moncada、A  Higgs、N  Eng  J  Med  329巻、2002頁（1993年））。iNOS酵素は、特定の皮膚疾病にも関与する炎症および免疫反応に主に関連するようである。ヒト皮膚ケラチノサイトで、繊維芽および上皮細胞は、cNOSおよびiNOSイソ型の両方を保有する。創傷マクロファージおよびケラチノサイトは、iNOSイソ型を保有する。創傷治癒研究では、NO合成は、創傷およびマクロファージが、主要な細胞源であると見られる後に長期間（10〜14日）起こることが示された（MR  Schaffer、U  Tantry、RA  vanWesep、A  Barbul．J  Surg  Res、71巻、25頁（1997年））。組織修復のメディエーターとして、NOは、血管形成（A  Papapetropoulos、G  Garcia−Cardena、JAA  Madri、WC  Sissa．J  Clin  Invest、100（12）巻、3131頁（1997年））および細胞の移動（E  Noiriら、Am．J．Physiol．279巻：C794頁（1996年））を促進し、創傷コラーゲン沈着およびコラーゲン架橋を増加させ（MR  Schaffer、U  Tantry、SS  Gross、HL  Wasserburg、A  Barbul、J  Surg  Res、63巻、237頁（1996年））、微細血管の恒常性を制御し（血管拡張）（D  Bruch−Gerharz、T  Ruzicka、V  Kolb−Bachofen、J  Invest  Dermatol．110巻1頁（1998年））、血小板凝集を阻害し（JS  Beckman、「酸化窒素」で、J．Lancaster，Jr．編、（アカデミック・プレス、ニューヨーク）、第1章）、上皮白血球接着の形成を阻害し（AM  Lefer、DJ  Lefer、Cardiovascular  Res、32巻743頁（1996年））、上皮増殖およびアポトーシスを調節し（YH  Shen，XL  Wang，DE  Wilcken，FEBS  Lett，433（1−2）巻、125頁（1998年））、任意の皮弁の生育可能性を増大し（SC  Umら、Plast  Reconstr  Surg．101巻、785頁（1998年）；GF  Pierceら、Proc  Natl  Acad  Sci  USA、86巻、2229頁（1989年））、そして細胞の免疫調節および細菌の細胞毒性を増強する（JS  Beckman、「酸化窒素」で、J．Lancaster，Jr．編、（アカデミック・プレス、ニューヨーク）、第1章）ことが示された。
【００１５】
糖尿病患者では、正常な創傷修復は、傷つけられうる。一般に、創傷治癒過程の間、NOは、組織酸素利用性、修復機構の炎症介在、並びに創傷マトリックス開発および再造形の増強を供する（図1）。NOについての主要な代謝経路は、硝酸塩および亜硝酸塩に対するものであり、そしてそれは、組織、血漿および尿内で安定な代謝である（S  Monocada、A  Higgs、N  Eng  J  Med  329頁、2002頁（1993年））。ヒトにおけるトレーサー研究は、おそらく50％の総体重硝酸塩／亜硝酸塩が、NO合成についての基質、L−アルギニンから起こることを示した（PM  Rhodes、AM  Leone、PL  Francis、AD  Struthers、S  Moncada、Biomed  Biophys  Res．Commun．209巻、590頁（1995年）；L．Castilloら、Proc  Natl  Acad  Sci  USA  90巻、193頁（1993年））。硝酸塩および亜硝酸塩が、生物学的に活性なNOの測定値でないが、適切な期間の絶食の後、そして都合により制御食（低硝酸塩／低アルギニン）の投与の後に患者から得た血漿および尿のサンプルが、NO活性の指数として硝酸塩および亜硝酸塩の使用を可能にする（C  Baylis、P  Vallance、Curr  Opin  Nephrol  Hypertens  7巻、59頁（1998年））。
【００１６】
本発明は、糖尿病患者が、創傷治癒の糖尿病患者であるか、または非創傷治癒の糖尿病患者であるかを決定する方法を提供する。「創傷治癒の糖尿病患者」は、その創傷治癒許容力が、非糖尿病患者のものと概ね同じである糖尿病の患者に該当する。「非創傷治癒の糖尿病患者」は、その創傷治癒許容力が、非糖尿病患者のものから減少され、そして結局、LEUについて危険な状態にある糖尿病の患者に該当する。例えば、1つの臨床研究では、非創傷治癒糖尿病患者は、Regranex（登録商標）（実施例1参照）の20週間後、不完全な治癒のままで1つまたはそれ以上の糖尿病性の脚の潰瘍の病歴を示すような患者であると考えられる。本発明による患者は、真性糖尿病のような糖尿病症状を示す任意のヒトまたは動物でありうる。糖尿病症状を示すヒトまたは動物は、インシュリンの不十分な産生、またはインシュリンの生理学上の効果に抵抗のある結果としてその血漿中グルコース濃度の調節に、欠点があるヒトまたは動物である。例えば、患者は、I型またはII型の糖尿病のいずれかを示すとして内科医によって診断されるヒトの患者であってよい。
【００１７】
糖尿病患者が、創傷治癒の糖尿病患者であるか、または非創傷治癒の糖尿病患者であるかを決定する1つの方法は、糖尿病の患者から試料を採取すること、試料中の酸化窒素関連生成物の濃度を測定すること、および創傷治癒および非創傷治癒の糖尿病患者の間を区別する閾値を示す試料での硝酸塩または亜硝酸塩の濃度を比較することを包含する。亜硝酸塩および硝酸塩に加えて、NO合成または分解に関連した他の分子種（他の「NO関連生成物」）は、患者から得られる血液、尿、組織、または他のサンプル中で定量されうる。例えば、NOまたはcGMPを生成する反応の産物であり、そしてグアニン酸シクラーゼのNO活性化の結果として産生されるL−シトルリンの血漿中濃度は、患者における全身性NO合成の反映として測定されうる（FL  KiechleおよびT  Malinski、Ann．Clin．Lab．Sci．26巻、501頁（1996年））。同様に、NOSの別の産物であるL−ジメチルアルギニンは、ヒト血清でのHPLCによって検出され、そして非常に特異的指数の全身性NOS活性として使用されうる。（J  Meyerら、Anal．Biochem．247巻、11頁（1997年））。NOは、ヒト血漿中のスーパーオキシド陰イオンと反応させることによって分解して、過酸化亜硝酸塩を生成でき、そしてそれは、その結果、電子常磁性共鳴（EPR）分光法を用いて検出されうるアスコルビル基およびアルブミン−チニル基のような様々の基を生じ得た。（J  Vasquez−Vivarら、Biochem．J．314巻、869頁（1996年））。ペロキシ亜硝酸塩の別の生成物は、質量分光測定法（E  Schwedhelmら、Anal．Biochem．276巻、195巻（1999年））、逆相HPLC（H  Ohshimaら、Nitric  Oxide  3巻、132頁（1999年））または抗ニトロチロシン抗体を使用したELISA法（JC  ter  Steegeら、Free  Radic．  Biol．Med．  25巻、953頁（1998年））と連動した気体クロマトグラフィーによってヒト血漿または他の体液中に検出されうる3−ニトロチロシンである。硝酸塩または亜硝酸塩と違い、これらの生成物のほとんどは、食物摂取による妨げを受けない。さらに、NOのインサイチュー検出それ自身は、できる限りNO濃度を定量する生物センサーの援助を伴い、そして刺激に応じたNO濃度に変化する。例えば、NOについての自然のレセプターである可溶性グアニル酸シクラーゼのヘムドメインは、蛍光レポーター染料で標識され得て、そして蛍光強度における変化は、光学繊維を介して測定され、そして体内の任意の望ましい配置で、例えば創傷部位で、またはその付近で、NO濃度を示すように目盛りを調整しうる（SL  Barkerら、Anal．Chem．71巻、2071頁（1999年））。生物学上の流動体中のNOの迅速な分解が示された場合、NOの直接検出は、試料の採取に続くいずれかの時よりむしろインサイチューで行われるべきである。
【００１８】
試料は、硝酸塩、亜硝酸塩または他のNO関連生成物の濃度の測定を可能にするために十分な量で、患者から得られる流動体または組織の任意のサンプルであってよい。例えば、試料は、尿、血液（血漿を含めた）、または組織のサンプルでありうる。試料は、好ましくは、硝酸塩、亜硝酸塩または他のNO関連生成物のレベルを、安定な基本線のレベルに達しさせるために、絶食の期間の後に、患者から得られる。絶食の期間は、NO分解に関連しない硝酸塩または亜硝酸塩の食物および代謝源からの妨げを減少させる。絶食の期間じゅう、全ての固形および液体食の患者の消費は、少なくとも50％、60％、70％、80％、90％または100％まで、患者の平均消費から減少される。好ましくは、全ての固形および液体食の患者の消費は、少なくとも90％まで減少される。さらに好ましくは、全ての固形および液体食の患者の消費は、100％まで減少される。最も好ましくは、患者は、絶食の期間じゅうなんら固形または液体食を消費しない。患者の水の消費は、一般に、絶食期間じゅう制限されない；しかし、ある種の態様では、患者は、絶食期間じゅう水も全く消費しない。絶食の期間は、安定な基本線に、パラメーターが測定されるべきものに達しさせるために十分な期間のものであるべきである。安定な基本線は、測定されたパラメーター、例えば尿の硝酸塩が、一般に再現可能であり、そして繰返した測定の間の大きな変動、またはNO対処に関係ない食事、代謝または他の源からの不当な妨げのかからない状態である。好ましくは、絶食の期間は、少なくとも3、4、5、6、7、8、9、10、12、16、20または24時間である。さらに好ましくは、絶食の期間は、4〜12時間、または6〜10時間、または8〜10時間、または10〜12時間である。
【００１９】
ある種のこのような生成物が、食事によって影響を及ぼされがたいので、絶食についてのあらゆる要求は、NO関連生成物が定量されつつあることに依り；他方は、ただ簡便な絶食を必要とする可能性があると解される。例えば、血漿中L−ジメチルアルギニン（J  Meyerら、Anal．Biochem．247巻、11頁（1997年））は、食事によって影響されないのに対して、一夜の絶食が、試料を採取する前に行われる場合、尿の硝酸塩／クレアチニン比は、食事によって影響されない（PS  Grabowskiら、Arthritis  Rheum．39巻、643頁（1996年））。
【００２０】
ある種の態様では、絶食の期間は、その間に患者が、食事の硝酸塩および亜硝酸塩の源について十分に低い食事を投与して、NO代謝産物が、試料で測定さるものはどれでも安定な基本線の値に達する期間まで直ぐ前に置かれる。例えば、食事は、全ての植物性および硝酸塩または亜硝酸塩保存食が、排除されたものでありうる。食事は、患者の正常な食事に比べてL−アルギニンの濃度が減少されていることを示した。例えば、1つの食事は、900mg／kg体重／日未満の硝酸塩濃度、および9mg／kg体重／日未満の亜硝酸塩濃度を供する。
【００２１】
試料での硝酸塩または亜硝酸塩のレベルは、適切な感受性および再現性を供する当技術分野において知られる任意の方法によって定量されうる。例えば、グリース反応は、生物学上の流動体サンプルにおける硝酸塩および亜硝酸塩の敏感な測定を供する硝酸塩についての分光光度測定アッセイ法である（M  Marzinzigら、Nitric  Oxide  1巻、177頁（1997年））。グリース反応または別の亜硝酸塩アッセイ法は、硝酸塩から亜硝酸塩への還元を伴うこと、および伴わないことの両方で行われる場合、それにより硝酸塩値は、還元サンプルについて得られた亜硝酸塩値と、非還元サンプルとの間の差異として得ることができる。蛍光生成物が、例えば亜硝酸塩を2，3−ジアミノナフタレンと反応させることによって得られる場合、グリースアッセイ法は、いっそう敏感になりうる（TP  Miskoら、Anal．Biochem．214巻、11頁（1993年））。最初に亜硝酸塩および硝酸塩（RS  BramanおよびSA  Hendrix、Anal．Chem．61巻、2715頁（1989年））または任意のNO関連化合物（M  Sonodaら、Anal．Biochem．247巻、417頁（1997年））を検出用のNOに、特定の化学ルミネッセンス試薬を用いて還元する非常に敏感なアッセイ法も利用可能である。種々のプロトコールは、イオンクロマトグラフィー（例えば、SA  Everettら、J．Chromatogr．706巻、437頁（1995年）；JM  Monaghanら、J．Chromatogr．770巻、143頁（1997年））、高速液体クロマトグラフィー（例えば、M  Kelmら、Cardiovasc．Res．41巻、765頁（1999年））およびキャピラリー電気泳動（MA  Friedbergら、J．Chromatogr．781巻、491頁（1997年））によって生物学上の流動体中の亜硝酸塩および硝酸塩濃度を検出および定量することについても記述されている。
【００２２】
硝酸塩、亜硝酸塩、または他のNO関連生成物の「レベル」は、通常、試料中の、または試料の流動体部分中の硝酸塩または亜硝酸塩の濃度（リットル当たりモル、リットル当たりマイクロモル、または他の適切な単位で）に該当する。しかし、測定の他の単位は、硝酸塩または亜硝酸塩のレベルを表すためにも使用されうる。例えば、特に、その量が、考慮中で試料中の一定量（例えば、グラム、キログラム、ミリリットル、リットル、または他の適切な単位）まで戻って引用する場合、絶対量（マイクログラム、ミリグラム、ナノモル、モル、または他の適切な単位での）が、使用できる。多数の市販で入手可能なキットが使用できる。そのようなキットの1つは、実施例2に記述されている。
【００２３】
試料は、定量法によって必要とされる場合、または結果を改善するために、または調査者の便宜のために、硝酸塩または亜硝酸塩の測定の前に加工されうる。例えば、加工は、サンプルを遠心分離すること、濾過すること、または均質化することに関与しうる。サンプルが、全血である場合、血液は、遠心分離して、細胞を除去でき、そして硝酸塩または亜硝酸塩アッセイ法を、血漿または血清のフラクションで行いうる。細胞が、組織である場合、組織は、硝酸塩または亜硝酸塩の測定の前に当技術分野において知られた任意の方法によって分散または均質化されうる。遠心分離または別の方法によって細胞および他の残骸を除去すること、およびサンプルの流動体部分のみ、またはサンプルの細胞外の流動体フラクションを使用して、硝酸塩または亜硝酸塩のレベルを測定することが好ましい可能性がある。サンプルは、後の測定のために、例えば尿または血漿サンプルを凍結することによって、保存もされうる。適切な場合、添加剤は、試料に導入されて、硝酸塩または亜硝酸塩アッセイ法での使用のためにその特徴を保存または改善しうる。
【００２４】
硝酸塩、亜硝酸塩、または他のNO関連生成物の閾値は、上に記述される検出の方法を使用しながら、正常および乏しい創傷治癒能力を示す糖尿病の患者を比較することによって決定されうる。例えば、好ましくは低硝酸塩食の投与に続いて、および絶食期間の後に、非創傷治癒の糖尿病患者の群の尿中硝酸塩レベルを、創傷治癒の糖尿病患者または正常な患者の群と比較することによって、2つの群の硝酸塩レベルは、実施例2でのとおり比較されうる。閾値は、得られたデータから選択されうる。例えば、閾値は、非創傷治癒群の尿の硝酸塩レベルの平均よりわずかに高い値として選択されうる；閾値は、試験された非創傷治癒糖尿病患者の少なくとも70％、80％、90％、95％、98％、または99％の尿中硝酸塩レベルが、その閾値に入るか、または下になるように選択されるべきである。ヒト患者については、尿中の硝酸塩についての閾値は、15および50マイクロモル濃度の間である。好ましくは、ヒトの尿中の硝酸塩の閾値は、20および45マイクロモル濃度の間であるか、または25および40マイクロモル濃度の間である。さらに好ましくは、ヒトの尿中の硝酸塩についての閾値は、20マイクロモル濃度、25マイクロモル濃度、28マイクロモル濃度、30マイクロモル濃度、32マイクロモル濃度、35マイクロモル濃度、37マイクロモル濃度または40マイクロモル濃度である。ヒト患者については、血漿中の硝酸塩についての閾値は、2マイクロモル濃度および20マイクロモル濃度の間である。好ましくは、ヒト血漿中の硝酸塩についての閾値は、3マイクロモル濃度および17マイクロモル濃度の間であるか、または4マイクロモル濃度および16マイクロモル濃度の間である。さらに好ましくは、ヒト血漿中の硝酸塩についての閾値は、2マイクロモル濃度、4マイクロモル濃度、6マイクロモル濃度、8マイクロモル濃度、10マイクロモル濃度、12マイクロモル濃度、14マイクロモル濃度、16マイクロモル濃度、18マイクロモル濃度、または20マイクロモル濃度である。付与された型の試料、例えばヒトの尿または血漿で使用するための硝酸塩、亜硝酸塩または他のNO関連生成物の閾値を選択する場合、標準化の異なるアッセイまたは方法の使用が、ここで提供されるこれらから得られる膨大な範囲に移行しうる。
【００２５】
本発明の別の態様は、糖尿病の患者を治療する方法である。この態様を実施するために、患者は、上に記述される方法により、または別の方法により、創傷治癒の糖尿病患者または非創傷治癒の糖尿病患者のいずれかとして最初に同定される。本発明によって同定されるとおり、非創傷治癒の糖尿病患者は、減少したNO活性に悩まされているので、彼らは、NO生成を増加するように設計された任意の療法によって治療されうる。このような療法としては、それに限定されないが、食事中のそれの存在を増加させることを介したL−アルギニンの投与、任意の薬学上許容しうる形態でL−アルギニンを含む補助食の経口投与、またはL−アルギニンを包含する薬学上許容しうる製品の非経口もしくは静脈内注射が挙げられる。投与量は、患者におけるNO生成を増加するように設計された、当技術分野によって知られる任意のプロトコールから選択されうる。NO生成を増加する別の療法は、高圧酸素療法である。選択的に、患者におけるNO生成を増加する任意の療法の投与は、患者におけるNOレベルを増強する上でその療法の効率を監視するための下に記述される方法と合せることができる。患者が、創傷治癒の糖尿病患者であることが分かっている場合、好ましい治療は、患者におけるNO生成を増加するように設計された治療剤を包含しない。創傷治癒の糖尿病患者の場合には、様々の型の療法が、使用できる。例えば、PDGFのRegranex（登録商標）、または別のPDGF製品）の投与は、創傷治癒の糖尿病患者における創傷治癒を促進するのに有効である可能性がある。
【００２６】
本発明は、特定の糖尿病患者について不利でありうる療法を避けるためにも使用されうる。創傷治癒を促進する上で酸化窒素の合成またはそれの効率における任意の負の治療的影響が、本発明の使用を介して最少にされうる。例えば、グルココルチコイド薬剤は、それらの抗炎症効果のためにLEUを示す糖尿病患者にしばしば投与される。しかし、グルココルチコイドは、iNOSの発現を選択的に阻害することが知られており（MW  Radomski、RM  Palmer、S  Moncada、Proc  Natl  Acad  Sci  USA  87巻、10043頁（1990年）、そして創傷流動体中の亜硝酸塩／硝酸塩の量を減少さすることが示された（AE  Ulland、JD  Shearer、MD  Caldwell、J  Surg  Res  70巻、84頁（1997年））。そのNO合成許容量は、創傷治癒の糖尿病患者と比較して減少されることが予測される非創傷治癒の糖尿病患者として同定された患者については、患者におけるさらにNOレベルを抑制するステロイドの使用は、望ましくない。したがって、本発明の1つの態様により、非創傷治癒の糖尿病患者と同定された患者は、患者におけるNOレベルを減少すると疑われるグルココルチコイドまたは他の薬剤で治療されない。
【００２７】
異なる態様では、本発明は、非創傷治癒の糖尿病患者の治療の効率を監視する方法として使用されうる。この態様では、患者は、患者における酸化窒素のレベルを上昇させるように設計された治療剤の投与を含む治療を受けている。このような治療剤の例としては、上に記述されるL−アルギニンおよび高圧酸素治療が挙げられる。治療剤の投与に続いて、上に記述されるとおり、患者から試料中の硝酸塩または亜硝酸塩を検出する方法によってその治療の効率について、患者を監視する。試料中の硝酸塩、亜硝酸塩、または他のNO関連生成物レベルは、患者が、創傷治癒の糖尿病患者または非創傷治癒の糖尿病患者であるかを決定するための閾値にあるか、またはより下である場合、それにより治療剤の効率は、創傷治癒を促進するのには不十分である。その場合には、治療は、例えば、治療剤の用量または効力を増加すること、または治療剤にさらす期間を増加することによって、順次調節されうる。関連した態様では、患者を監視する方法が繰返され、そして治療剤の用量または効力、または治療剤にさらす期間は、さらに増加される。好ましくは、この態様では、治療剤の用量を監視および増加する方法は、患者から得られる試料における硝酸塩または亜硝酸塩レベルが、閾値の上である限り増加される。それなら、患者の創傷が、治癒されるまで、必要とされる限り最も有効な用量で療法を維持することが望みうる。
【００２８】
さらに別の態様は、創傷治癒の糖尿病患者または非創傷治癒の糖尿病患者であることを決定するためのキットである。そのキットは、糖尿病の患者から得られる試料中の硝酸塩または亜硝酸塩レベルを測定するための1種またはそれ以上の試薬を包含する。試薬または試薬類は、試料中の硝酸塩または亜硝酸塩レベルを測定するための当技術分野において知られる任意の方法によって必要とされるものである。キットは、上に記述されるとおり、創傷治癒の糖尿病患者または非創傷治癒の糖尿病患者であることを決定する方法を行うために試薬を使用することについての1組の指示も包含する。指示の組は、使用者に、適切な試料を収集させ、その試料を加工させ、試料中の硝酸塩、亜硝酸塩または他のNO関連生成物のレベルを測定する試薬または試薬類を使用させ、そして得られた結果を解釈させる、すなわち、創傷治癒の糖尿病患者または非創傷治癒の糖尿病患者であることを決定する任意の適切なフォーマット（例えば、紙に、またはディスケット、CD−ROM上の電子フォーマットに印刷された、またはウエブサイトもしくは印刷された出版物を参照して）における情報を提供する。
【００２９】
上の開示は、全般的に、本発明を説明する。さらに完全な理解は、続く特定の実施例を参照することによって得ることができ、そしてそれは、例示のみの目的のために、本明細書に供され、そして本発明の範囲を限定することは意図されない。
【００３０】
実施例1
創傷治癒および非創傷治癒の糖尿病患者から得られる試料収集
非創傷治癒の糖尿病患者が、損傷を受けたNO活性を示すという仮説を探究するために、血漿および尿のNO代謝産物である硝酸塩および亜硝酸塩の以下の研究を、Regranex（登録商標）を用いた糖尿病性潰瘍創傷治癒の研究に続いて行った。結果は、慢性の非治癒LEU糖尿病患者の集団が、明らかに減少した尿中硝酸塩分泌によって特徴づけられる。
【００３１】
臨床研究については、十名（10）の1つまたはそれ以上の糖尿病性の脚部潰瘍の病歴で表す健康な、糖尿病患者が選択された。全ての患者は、先に、綿密な臨床的観察下でRegranex（登録商標）を用いた局所の潰瘍治療を受けた。この群の半分（n＝5）は、観察の20週目まで、潰瘍の完全な治癒を受けた経験がある（治癒した糖尿病／HD）。この群の残りの半分（n＝5）は、観察の20週目まで、完全な治癒を受けた経験がなかった（治癒しなかった糖尿病／HD）。完全なRegranex（登録商標）治療に続いて、10名の糖尿病患者（HDおよびUHD）および10名の健康な非糖尿病の対照（C）は、尿および血漿中硝酸塩／亜硝酸塩分析に掛けられた。この分析の前に、活発な悪性疾病、リューマチ性またはコラーゲンの血管疾病、慢性腎不全、炎症性腸疾患、アルコール／薬剤乱用、蜂巣炎、骨髄炎および血管再生手術を示す患者を排除するために、全ての患者を、医療上の病歴、身体検査、および基本線の血液学、血清および尿の化学で篩いに掛けた。伸展性の理由のため、乏しい糖尿病対照を示すことが決定された患者を、不適任と判断された。さらに、放射線療法、全身性コルチコステロイド、および免疫抑制または化学療法剤を受けているものは、不適任と判断された。インフォームドコンセンサスは、全ての研究の参加者から得た。
【００３２】
全ての群から得た患者を、10時間の期間、絶食させた後、病院環境に至らせた。絶食中の尿および血漿試料は、患者の基本線の硝酸塩および亜硝酸塩のレベルの指標を供する承認（1日目）により各患者から得た。さらに、化学パネル、CBC、および尿検査から構成される日常の実験室作業は、病院承認による全ての患者から得られた。患者は、時間活動のレベル、食物摂取、および他の環境因子が制御される24時間の病院設定に制限された。全ての患者は、バスルーム特権つきのベッドでの休息に制限され、そして24時間の入院の間同じ食事を消費した（2,581Kcal；124.2gタンパク質；5,779mgアルギニン：表１参照）。全ての患者には、喫煙およびアルコール消費を慎むことが要求された。通常、肥料から高い硝酸塩含有量を示す野菜、および硝酸塩および亜硝酸塩保存食は、研究食から除去され、そしてそれは、下に表1で示された。基本線の投薬を付随して投与され、そして血中グルコースの監視は、彼らの通常の家庭の日常当たり糖尿病の対照（diabetic subject）によって行われた。投薬および食事摂取並びに尿排出は記録され、そして24時間の制限期間の間、研究チームによって評価された。制限の日の午後9時に、全ての患者は更に10時間の絶食期間を始めることが要求された。病院の設定から開放される前に、患者は再度、絶食中の血漿および尿試料を提供した（2日目）。生命徴候が、制限期間中毎日監視され、そして全ての患者は、開放される前に有害事象について評価された。全ての得られた血漿および尿試料は、実験室分析のための準備で、-20℃で直ちに凍結された。
【００３３】
【表１】
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【００３４】
実施例2
創傷治癒および非創傷治癒の糖尿病患者における尿および血漿の硝酸塩および亜硝酸塩濃度の測定
尿および血液の試料は、実施例1で記述されるとおり、創傷治癒および非創傷治癒の糖尿病患者から得られた。
【００３５】
尿および血漿サンプルは、製造業者の指示によって、市販のキット（Cayman  Chemical、ミシガン州アンアーバー（Ann  Arbor、MI））を用いて亜硝酸塩および硝酸塩のレベルについて蛍光測定法により分析された。使用された方法は、Gilliamら（Anal．Biochem．212巻、359頁（1993年））によって記述されるものである。血液を、ガラス管に採取し、遠心分離し、そして血漿を採取し、そしてアッセイまで凍結させた。サンプルを解凍させ、渦巻攪拌し、そして10kDaサイズの排除フィルター（Millipore、マサチューセッツ州ベッドフォード（Bedford、MA））で濾過した。硝酸塩の測定のために、亜硝酸塩レダクターゼおよびNADPを添加し、そして2時間、室温でインキュベートさせた。インキュベーションに続いて、2，3−ジアミノナフタレン、続いてNaOHを添加し、そして蛍光を、365nmでの励起および405nmでの発光を使用した蛍光光度計で測定した。亜硝酸塩濃度は、硝酸塩還元段階が排除される以外は同じ方法を使用して測定された。尿を、濾過が排除される以外は同様の形態で加工した。全てのサンプルは、三重に分析された。患者のサンプルにおける濃度（リットル当たりマイクロモル）は、標準硝酸塩および亜硝酸塩溶液に対する比較によって測定された。Tukey−Kramer後試験（Ludbrook、Clin．Exp．Pharmacol．Physiol．18巻、379頁（1991年））を用いた一方向のANOVAを、Windows98用のCraphPad  InStatソフトウェア）、バージョン4．10を使用して行った。P値＜0.05は、有為であると考えられた。
【００３６】
群CおよびHDについての一日目の絶食中の尿中硝酸塩のレベル（マイクロモル／1±S.E.）（それぞれ、55.88±4.49および554.14±3.32）は、明らかな異なりはなかった（図2）。しかし、群UHD絶食中の尿硝酸塩のレベル（30.35±3.61）は、群C（p＜0.001）またはHD（p＜0.01）より明らかに低かった。群CおよびHDについての2日目の絶食中の尿の硝酸塩のレベルは、低かった（それぞれ、42.60±1.92および45.57±5.10）が、しかしさらに、明らかな差異はなかった。同様に、群UHD絶食中の尿中硝酸塩のレベル（22.74±3.13）は、一日目の値より低く、そして群C（p＜0.05）またはHD（p＜0.05）よりさらに明らかに低かった［表2］。群C（4.80±0.85）および群UHD（4.05±0.37）についての1日目の絶食中の血漿中硝酸塩のレベル（マイクロモル／1±S.E.）は、明らかに異なるものではなかった（図3）。しかし、群HD（11.71±2.08）は、UHDより高かったが、しかしCより明らかに高いのみであった（p＜0.05）。2日目の絶食中の血漿中硝酸塩のレベルは、群C（2.92±0.37）および群UHD（3.16±0.61）についてわずかに低かったが、しかしこれらが明らかに異なっていない前のとおりである。しかし、群HD（11.94±4.46）は、ここで、群C（p＜0.01）および群UHD（p＜0.05）のいずれかのものより明らかに高かった。尿および血漿の硝酸塩のレベルは、亜硝酸塩よりおよそ100倍大きく、そしてこの方法論によって任意に未検出性のものであった。これらの理由のため、尿および血漿中ニトリックレベルは、報告されなかった。
【００３７】
【表２】  絶食中の尿および血漿中硝酸塩値
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【図面の簡単な説明】
【図１】  創傷修復制限における酸化窒素（NO）の役割の全体的代表を表す。創傷NO指向性「細胞の信号発生」は、修復の炎症介在、創傷酸素有用性、および創傷マトリックス改造および成熟を増強するようである。
【図２】  研究の1および2日目での、対照（C）、治癒糖尿病患者（HD）、および未治癒糖尿病患者（UHD）についての絶食中の尿中硝酸塩のレベル（リットル当たりマイクロモル）のグラフ表現である。結果は、各日での、C（Pc）およびHD（PHD）に比較した場合にP値で、平均±S.E.として表される。
【図３】研究の1および2日目での、対照（C）、治癒糖尿病患者（HD）、および未治癒糖尿病患者（UHD）についての絶食中の血漿中硝酸塩のレベル（リットル当たりマイクロモル）のグラフ表現である。結果は、2日目についてHDとUHDを比較すること以外は、各日での、CおよびHDに比較した場合にP値で、平均±S.E.として表される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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