(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ニワトリに投与するワクチン製剤中に有効量で配合され、病原性トリレオウイルスによる攻撃に対する防御を提供し、同時投与したマレック病ワクチンの活性に干渉しない、ＡＴＣＣに寄託番号ＶＲ２４４９で寄託された２１７７株と呼称される非病原性トリレオウイルス。
【請求項２】
請求項１に記載の非病原性トリレオウイルスを含むワクチン。
【請求項３】
レオウイルスが不活化形態である請求項２に記載のワクチン。
【請求項４】
請求項１に記載の非病原性トリレオウイルスと少なくとも１種のマレック病ワクチンとを含む混合ワクチン。
【請求項５】
少なくとも１種のマレック病ワクチンがＳＢ−１、ＨＶＴ及びＣＶＩ  ９８８からなる群から選択される請求項４に記載の混合ワクチン。
【請求項６】
少なくとも１種のマレック病ワクチンがＳＢ−１及びＨＶＴからなる群から選択される請求項４に記載の混合ワクチン。
【請求項７】
請求項１に記載の非病原性トリレオウイルスと伝染性ファブリシウス嚢病ウイルスワクチンとを含む混合ワクチン。
【請求項８】
少なくとも１種のマレック病ワクチン及び少なくとも１種の伝染性ファブリシウス嚢病ウイルスワクチンと共に請求項１に記載の非病原性トリレオウイルスを含む混合ワクチン。
【請求項９】
請求項１に記載の非病原性トリレオウイルス、ニューカッスル病ウイルスワクチン及び伝染性気管支炎ウイルスワクチンを含む混合ワクチン。
【請求項１０】
鶏脳脊髄炎、鶏痘及び鶏貧血因子からなる群から選択される１種以上のウイルスのワクチンと共に請求項１に記載の非病原性トリレオウイルスを含む混合ワクチン。
【請求項１１】
請求項１に記載の非病原性レオウイルスを含む有効量のワクチンを投与することからなる、トリレオウイルス感染に対するニワトリの免疫方法。
【請求項１２】
ワクチンが有効量の少なくとも１種のマレック病ワクチンを更に含む請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
少なくとも１種のマレック病ワクチンがＳＢ−１、ＨＶＴ及びＣＶＩ  ９８８からなる群から選択される請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
少なくとも１種のマレック病ワクチンがＳＢ−１及びＨＶＴからなる群から選択される請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ワクチンが有効量の伝染性ファブリシウス嚢病ウイルスワクチンを更に含む請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
ワクチンが少なくとも１種のマレック病ワクチンと少なくとも１種の伝染性ファブリシウス嚢病ウイルスワクチンを更に含む請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
ワクチンがニューカッスル病ウイルスワクチン及び伝染性気管支炎ウイルスワクチンを更に含む請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
ワクチンが鶏脳脊髄炎、鶏痘及び鶏貧血因子からなる群から選択される１種以上のウイルスのワクチンを更に含む請求項１１に記載の方法。-
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は２１７７株と呼称される非病原性レオウイルス及び２１７７株を含むワクチンに関する。
【０００２】
【従来技術及び発明が解決しようとする課題】
ニワトリレオウイルスは商業用家禽の種々の疾病に関連付けられている。経済的に最も重要なレオウイルス疾患は関節炎／腱滑膜炎症候群である。この症状の特徴は踝関節の直上の中足腱の腱鞘の腫張とそれに起因する種々の程度の跛行である。腫張が進行すると、ニワトリは運動を厭うようになる。患部腱は硬化し、繊維症になり、腱鞘及び皮膚に癒着すると腱の部分的機能障害をもたらす［Ｊｏｈｎｓｏｎら，Ａｖｉａｎ  Ｄｉｓ．１５：８２９−８３４  （１９７１）］。高齢のニワトリでは腱断裂に至る恐れがある［Ｊｏｎｅｓ，Ｖｅｔ．Ｒｅｃ．，９６：１５３−１５４（１９７５）］。
【０００３】
レオウイルスは吸収不良又は虚弱ニワトリ症候群にも関連付けられている［Ｐａｇｅら，Ａｖｉａｎ  Ｄｉｓ．，２６：６１８−６２４（１９８２）］。この腸管症状は発育阻害、羽毛生育不良、色素減少、前胃肥大、腸炎及び足弱化により特徴付けられる。この疾患はレオウイルス感染の結果として飼料栄養の吸収不良に起因すると考えられていた［Ｈｉｅｒｏｎｙｍｕｓら，Ａｖｉａｎ  Ｄｉｓ．，２７：２４６−２５４（１９８３）］。
【０００４】
レオウイルスに起因すると考えられる他の疾病は肝炎、心膜水腫、腹水、腎臓虚弱、小脾臓、心膜炎及び心筋炎である。
【０００５】
これらの諸症状は、ブロイラーの品質低下及び種畜の繁殖能の低下をもたらし、控えめに見積もっても年間１５，０００，０００ドルの経済的損失を招いている。
【０００６】
米国では、ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｈｅｉｄｅにより腱滑膜炎のフィールド症例から単離及び特徴付けされたニワトリレオウイルス株であるＳ１１３３の種々の継代段階から生ワクチンが開発されている。該株は漿尿膜（ＣＡＭ）で３７℃で２３５代、次いでニワトリ胚フィブロブラスト（ＣＥＦ）で３２℃で６５代連続増殖された。ＣＥＦで３７℃で更に１３５代継代された［ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｈｅｉｄｅら，Ａｖｉａｎ  Ｄｉｓ．，２７：６９８−７０６（１９８３）］。
【０００７】
現用の種畜ワクチン接種プログラムは、高代のＳ１１３３に由来する低毒性ワクチンを幼齢（７〜１４日）のニワトリに接種し、該ワクチンよりもやや毒性の低代Ｓ１１３３ワクチンウイルスを６〜１１週齢で生ワクチン接種し、場合によりこのやや毒性のＳ１１３３ワクチンで第３の生ワクチン接種を行った後、不活化ワクチンを接種することを推奨している。
【０００８】
ブロイラーの場合もできるだけ早期に低毒性ワクチンを接種する。
【０００９】
レオウイルスはマレック病ワクチン接種に干渉する恐れがあるので、現用ワクチンを１日齢で接種するのは推奨されない。公知レオウイルスワクチンはマレック病ワクチンに干渉するため、他の免疫感作と同時に公知レオウイルスワクチンを投与することができず、二次ワクチン接種が必要であった。Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｊ．Ｋ．，Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｐｏｕｌｔｒｙ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ，ｐｐ．５０−５１，（１９８３）。
【００１０】
更に、現用ワクチンは接種動物の腱に残存することが判明し（Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ，Ｒ．Ｄ．及びＭａｓｌｉｎ，Ｗ．Ｒ．，Ａｖｉａｎ  Ｄｉｓ．，Ｖｏｌ．３２，ｐｐ．４６１−４６８，１９８８）、増殖して関節炎や他の足障害を誘発し、卵を介して子孫に伝播（感染）される恐れがあった。
【００１１】
理想的なワクチンとは、非病原性であり、ニワトリの体内に残存せず、マレック病ワクチンに干渉せず、従って１日齢でも投与することが可能なワクチンであると考えられる。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
レオウイルス疾患を有するニワトリから単離された新規ニワトリレオウイルス株が茲に発見された。この新規ウイルスは米国、Ｒｏｃｋｖｉｌｌ，ＭａｒｙｌａｎｄのＡＴＣＣに１９９４年３月１０日付けで寄託され、寄託番号ＶＲ２４９９を付された。このウイルスの特性は非病原性であることと、ニワトリに接種するとレオウイルスの病原株に対する防御を提供することである。
【００１３】
この発見に鑑み、本発明はレオウイルスに起因する疾病に対する家禽の防御のための、レオウイルス株２１７７を含むワクチンを提供する。本発明は更に単離株２１７７に関し、該株は本質的に非病原性であることが判明し、この株を接種した家禽の体内に残存せず、幼齢(例えば１日齢)で投与することが可能である。
【００１４】
本発明のワクチンは株２１７７を単独で含んでもよいし、マレック病ウイルス、伝染性ファブリシウス嚢病ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、伝染性気管支炎ウイルス、ニワトリ脳脊髄炎ウイルス、鶏痘ウイルス及びニワトリ貧血因子のワクチン等、他の家禽用ワクチンと併用してもよい。
【００１５】
Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇｅｒは、大腿頭骨壊死及び踝関節の炎症により主に特徴付けられる症状を有する商業的に飼育された幼齢ブロイラーからの１０９個のレオウイルス単離株の単離を開示している（Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｌ．Ｕｎｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｓｏｃ．，Ｎｏ．６６，Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｉｎ  Ｐｏｕｌｔｒｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｓｙｄｎｅｙ  ＮＳＷ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ  Ａｕｇ．３１−Ｓｅｐｔ．２，１９８３）。ウイルス単離は、臨床症状を有する１日齢〜約４週齢のニワトリから抽出した足関節スワブ及び均質化組織（骨髄、肝臓、脾臓及び腱）を５〜７日齢胚形成卵の卵黄嚢に接種することにより行われた。レオウイルス単離株は、死滅した胚からの漿尿膜を回収し、群特異的レオウイルス抗原の存在を立証することにより、接種した胚で同定された。レオウイルスを含む卵黄を集め、トリプトースリン酸ブロスで希釈し、−７０℃で保存した。
【００１６】
肉趾経路で感受性１日齢ブロイラーニワトリに接種することにより１０９個のレオウイルス単離株の病原性をスクリーニングした。単離株の１１個は接種後３〜１４日の間に肉趾と足の他の部分に炎症を生じた。これらの１１個の単離株を選択して更に試験した。
【００１７】
これらの１１個の単離株の卵黄シードプールを一次ニワトリ胚フィブロブラスト（ＣＥＦ）に接種した。１個の単離株（単離株２１７７）はＣＥＦに接種した場合に細胞変性作用を生じないことが判明した。その後、細胞変性が観察されるまでこのウイルスを反復継代（１４代）した。細胞及び細胞培養液を集め、凍結及び融解し、遠心分離により清澄化し、ＣＥＦ中で成長するのに適した２１７７レオウイルス単離株を含む上清をアリコートに分割し、−７０℃で保存した。
【００１８】
標準プラークアッセイシステムを使用して細胞培養に適したレオウイルス２１７７をＣＥＦ細胞培養物で増殖させた。個別プラーク選択によりウイルスをプラーク精製した。プラーク精製したレオウイルス２１７７を６日齢ニワトリ胚形成卵の卵黄嚢に接種した。接種後２４時間以上経過後に死滅した胚から卵黄を集め、レオウイルス２１７７の精製培養ストックとして使用した。
【００１９】
このクローン化精製２１７７レオウイルスの遺伝子特徴及びニワトリにおける病原性をｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏで特徴付けた。一般に、２１７７レオウイルスはニワトリにおいて本質的に非病原性であることが判明した。従って、このウイルス株は生ワクチンとして使用するのに理想的である。
【００２０】
本発明のワクチンは生きた形態、弱毒形態又は不活化形態の２１７７ウイルスを含む。もっとも、好ましくはワクチンは生きたウイルスを含み、非病原性であるため、弱毒化又は不活化は不要である。
【００２１】
生ワクチンを製造するためには、（ＣＥＦで１４代継代後、ニワトリ胚で５〜６代継代することにより調製した）シードウイルスを細胞培養物、例えばＣＥＦ培養物もしくは他の哺乳動物細胞培養物（例えばＶＥＲＯ細胞）又は胚形成卵で増殖させる。こうして増殖したウイルスを組織培養液及び／又は細胞又は胚形成卵の組織もしくは液から回収する。生ワクチンは懸濁液として調製してもよいし、凍結乾燥してもよい。懸濁液形態を凍結保存してもよい。凍結乾燥形態では１種以上の安定剤を加えるのが好ましい。適切な安定剤としては例えば炭水化物（例えばソルビトール、マンニトール、澱粉、スクロース、デキストラン、グルコース）、タンパク質（例えばアルブミン又はカゼイン）又はその分解生成物、及び緩衝液（例えばアルカリ金属リン酸塩）を挙げることができる。任意に、アジュバント活性を有する１種以上の化合物も添加し得る。本発明のワクチンには任意の従来の安定剤及びアジュバントを添加し得る。
【００２２】
ワクチンが凍結乾燥形態であるか懸濁液形態であるかを問わず、ワクチンはウイルスを回収する細胞培地から調製することができ、このような培地は例えばウイルス、胎児、新生又は子ウシ血清及び抗生物質を含む。使用される細胞培地の型は制限されず、ウイルスを増殖する細胞培養に従来使用されている任意の培地及び助剤であり得る。凍結乾燥製剤は更に、上述のようにウイルスと安定剤を単独又は培地助剤と共に含む。不活化ウイルスを含むワクチンは例えば、油エマルジョン又はトコールエマルジョン製剤中にウイルス、胎児、新生又は子ウシ血清、抗生物質を含有する細胞培地から構成され得る。
【００２３】
ワクチン接種は任意の年齢で実施することができる。一般に生ワクチンは１２週齢までに接種し、不活化ワクチンは１４〜１８週齢で接種する。ｉｎ  ｏｖｏワクチン接種は胚発生の最後の４分の１に実施する。ワクチンは皮下、スプレー、経口、眼内、気管内、鼻側又はｉｎ  ｏｖｏのいずれの経路で投与してもよい。好ましくは、１日齢のニワトリにワクチン接種する。それ以後のニワトリは加齢耐性を生じると思われるが、ブリーダーニワトリは例えば８及び３０週（２回接種）でもワクチン接種することができる。２１７７を接種した場合にはウイルスは残存せず、子孫に垂直伝播（感染）しないことが判明した。これに対して、Ｓ１１３３株は子孫に伝播される。
【００２４】
一般に、ワクチン中の２１７７ウイルスの力価は１．０〜９．０ｌｏｇ10ＴＣＩＤ50／用量、より好ましくは２．０〜７．５ｌｏｇ10ＴＣＩＤ50／用量、最適には約４．０ｌｏｇ10ＴＣＩＤ50／用量である。
【００２５】
２１７７株を含むワクチンの固有の特徴の１つは、干渉を生じることなく他のレオウイルスも含めた他のウイルスと組み合わせて多価ワクチンを形成できることである。レオウイルスはワクチン中で他のウイルスの活性に干渉することが示されているので、この特徴は固有である。これはマレック病ワクチンの場合に特に問題であった。例えばＰｏｕｌｔｒｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．６２：１４８８，１９８３を参照されたい。２１７７ウイルスは以下のワクチン製剤：（ａ）血清型１（例えばＣＶＩ  ９８８）、血清型２（例えばＳＢ−１）及び血清型３（ＨＶＴ）の全３種の血清型のマレック病ワクチン；（ｂ）従来株（例えばＤ７８）、デラウェア変異株（例えば変異株Ｅ，８９−０３）及び他の変異株（例えばＧＬＳ）を含む伝染性ファブリシウス病ウイルス（ＩＢＤＶワクチン）；（ｃ）マレック病及びＩＢＤＶ両者のワクチン；（ｄ）ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）／伝染性ファブリシウス嚢病ウイルス（ＩＢＶ）ワクチン；（ｅ）ニワトリ脳脊髄炎（ＡＥ）；（ｆ）鶏痘；並びに（ｇ）ニワトリ貧血因子と組み合わせることができる。
【００２６】
【実施例】
以下、実施例により本発明を説明する。
【００２７】
実施例１．レオウイルス２１７７病原性
Ａ．ブロイラーにおける特徴付け
１．３経路でブロイラーに接種することによる特徴付け
ａ．手順
腹腔内、大脳内及び肉趾経路で１日齢ニワトリに接種することにより上記１１個の単離株のｉｎ  ｖｉｖｏ特徴付けを行った。
【００２８】
ｂ．結果
単離株のうちの数個は全経路で病原性が高く、壊死、炎症、出血及び肝周囲炎を含む肝障害により特徴付けられる有意死亡率を生じることが判明した。２週間以上生存したニワトリの多くは肝周囲炎を発症した。他の単離株の病原性は多様であり、ただ１個のウイルス（２１７７）のみが比較的非病原性であった。
【００２９】
これらの結果を表１に示す。
【００３０】
【表１】
0003756219.tif 000002
【００３１】
２．体重減少、死亡率及び抗体産生
ａ．手順
上記レオウイルス単離株をｉｎ  ｖｉｖｏで更に特徴付けるために、より自然な感作経路（経口及び気管内）で１日齢及び２週齢のブロイラーニワトリにウイルスを接種した。体重、死亡率及び抗体産生を接種後数週間モニターした。
【００３２】
ｂ．結果
結果は、２１７７が比較的非病原性であるという最初の分類を裏付けるものであった。病原性の高い殆どのウイルス単離株はレオウイルス２１７７に比較して死亡率が高く（表２）、平均体重が低く（表３）、高頻度の抗体応答を誘発した（表４）。これとは対照的に、２１７７を注射したニワトリの死亡率及び平均体重は対照の死亡率及び平均体重と同等であった。更に、２１７７を注射したニワトリにおける血清抗体応答は、より毒性の単離株を注射したニワトリにおける抗体応答より低頻度であった。この実験及び結果は、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇｅｒら，Ａｖｉａｎ  Ｄｉｓ．３３：５３５−５４４（１９８９）に報告されている。
【００３３】
【表２】
0003756219.tif 000003
【００３４】
【表３】
0003756219.tif 000004
【００３５】
【表４】
0003756219.tif 000005
【００３６】
３．組織向性及び組織病理
ａ．手順
感染組織の組織向性とそれに続く組織病理試験の結果も同様に、２１７７が他の単離株よりも非病原性であることを示した。１日齢ブロイラーニワトリに経口及び気管内経路で種々のレオウイルス単離株を接種した。接種後（ＰＩ）４、７、１０及び１４日目に各接種材料群からのニワトリを殺し、膵臓、肝臓、気管、腓腹筋及び腸の３領域の切片を採取し、ウイルス単離及び組織病理評価を行った。
【００３７】
ｂ．結果
結果によると、より毒性な単離株である１７３３及び２４０８は１４日間のサンプリング期間を通して全組織から単離された。２１７７単離株は接種後１７日目に肝臓、気管及び腸から回収されたが、１０及び１４日目にはウイルスが単離される器官とされない器官があった。２１７７単離株は腱からはどの時点でも単離されなかった（表５参照）。
【００３８】
これらの組織の組織病理評価の結果、２１７７を除く全レオウイルス単離株は顕微的病変を誘発することが判明した（表６）。単離株２１７７を接種したニワトリでは顕微的病変は検出されなかったので、同単離株は表から省略した。
【００３９】
【表５】
0003756219.tif 000006
【００４０】
【表６】
0003756219.tif 000007
【００４１】
実施例２：ＳＰＦレグホンにおける２１７７の特徴付け
１．３種の異なる経路でレグホンに接種することによる特徴付け
ａ．手順
ＳＰＦレグホンで同様にレオウイルス２１７７のｉｎ  ｖｉｖｏ特徴付けを行った。これは、レオウイルス２１７７、２０３５、Ｓ１１３３、２４０８及び１７３３の連続希釈液を調製し、経口、気管内又は肉趾経路で１日齢ニワトリに接種することにより実施した。ニワトリの肉趾炎症、死亡率及び体重減少の相違を観察した。
【００４２】
ｂ．結果
１）肉趾炎症
結果は、肉趾炎症を生じさせるために必要なウイルスの量が非常に少量であることを示した。２１７７を除く全単離株は１．０ｌｏｇ10胚致死量（ＥＬＤ）50未満で炎症を誘発した。レオウイルス２１７７で炎症を誘発するには２．２ｌｏｇ10ＥＬＤ50が必要であった（表７参照）。
【００４３】
２）死亡率
ニワトリの死亡率の結果によると、一定した死亡率パターンをもたらした唯一の接種経路は肉趾接種経路であった。また、２１７７は高ウイルス濃度（４．３ｌｏｇ10ＥＬＤ50）で接種したニワトリで死亡が生じなかったので、非病原性であることが判明した。他のレオウイルス単離株の場合には、ニワトリ５０％致死量は１．６〜３．７ｌｏｇ10ＥＬＤ50であった（表８参照）。
【００４４】
３）体重減少
気管内及び肉趾経路で接種したニワトリで成長率の低下が生じた。経口接種したニワトリでは１７３３を最高濃度で接種した場合のみに体重減少を生じた。体重減少が最も顕著であったのは肉趾経路で接種したニワトリであった。レオウイルス単離株２４０８及び１７３３は夫々＜０．７及び１．０ｌｏｇ10ＥＬＤ50で２６％もの体重減少を生じた。単離株２０３５及びＳ１１３３も体重減少を生じた。単離株２１７７は試験ウイルス濃度では全く体重減少を生じなかった（表９参照）。
【００４５】
【表７】
0003756219.tif 000008
【００４６】
【表８】
0003756219.tif 000009
【００４７】
【表９】
0003756219.tif 000010
【００４８】
２．ＳＰＦレグホンにおける２１７７感染の組織向性及び組織病理試験
ａ．手順
３種のレオウイルス単離株２１７７、２０３５及び１７３３を使用して気管内（ＩＴ）経路で１日齢ＳＰＦレグホンに接種した。接種後種々の時点で各ウイルス群からの３羽のニワトリから採血し、殺して胸腺（ｔｈ）、気管（ｔｒ）、肝臓（ｌｉ）、腸（ｉｎ）、盲腸扁桃（ｃｔ）、脾臓（ｓｐ）、ファブリシウス嚢（ｂｕ）、腱（ｔｅ）、赤血球（ＲＢＣ）、白血球（ＷＢＣ）及び血漿（ｐ）を取り出した。組織を処理してウイルス単離及び組織病理を試験した。
【００４９】
ｂ．結果
１）肉眼的病変及び死亡率
剖検における肉眼的病変の出現及び死亡率百分率は１７３３を接種したニワトリで最大であった（表１０参照）。１７３３及び２０３５の両者は感染及び致死性の兆候を示したが、２１７７接種群では際立った致死性又は病変は観察されなかった。
【００５０】
２）ウイルス単離
１日齢で３種の疾病型を接種したニワトリからのウイルス単離の結果、１７３３は感染組織数が多く、最も毒性であることが判明した（表１１参照）。他方、２１７７はウイルスが主に盲腸扁桃から再単離されたので、非毒性であった。
【００５１】
３）残存性
高毒性単離株である１７３３は最も長期間残存することが立証された。ウイルスは接種後２２週目にもニワトリの腱から再回収された。単離株２０３５も腱に残存することが観察されたが、接種後４９日間に過ぎなかった。単離株２１７７は腱ではどの時点でも検出されず、２８日齢まで盲腸扁桃で検出されたのみであった。
【００５２】
４）顕微的病変
ウイルス単離に陽性であった組織（胸腺、肝臓、脾臓、ファブリシウス嚢及び腱）を選択し、更に顕微的病変を評価した。これらの感染組織及び病変評点系で観察された病変を表１２に示す。これらの病変の重篤度は単離株に依存した（表１３参照）。単離株１７３３は胸腺で中度の病変を示し、脾臓、ファブリシウス嚢及び腱で重度の病変を示したので、他の単離株よりも毒性であると思われた。２０３５の重篤度は著しく低く、２１７７は顕微的病変を生じなかった。
【００５３】
【表１０】
0003756219.tif 000011
【００５４】
【表１１】
0003756219.tif 000012
【００５５】
【表１２】
0003756219.tif 000013
【００５６】
【表１３】
0003756219.tif 000014
【００５７】
３．ＳＰＦレグホンにおける２１７７の免疫抑制試験
ａ．手順
１日齢にＳＰＦレグホンに２１７７、２０３５又は１７３３をＩＴ経路で接種した。７日及び２１日齢に採取した末梢血液リンパ球（ＰＢＬ）でマイトジェン刺激アッセイを実施した。
【００５８】
ｂ．結果
１日齢のレグホンに単離株１７３３を接種後７日目にＰＢＬの芽体発生トランスフォーメーション能の顕著な低下が観察された（表１４参照）。ニワトリから採取したＰＢＬの刺激指数は３８．０に過ぎず、これに対して非接種対照並びに２１７７及び２０３５からのＰＢＬはいずれも８４．４〜１１６．９という著しく高い刺激指数を示した。
【００５９】
【表１４】
0003756219.tif 000015
【００６０】
接種後２１日目にニワトリからＰＢＬを採取した処、１７３３の抑制作用はもはや観察されず、２０３５又は２１７７を接種したニワトリでは免疫抑制は観察されなかった。
【００６１】
実施例３：分子特徴付け
ニワトリレオウイルスは２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の１０セグメントから構成されるゲノムを有する。生化学的特徴付けによると、種々の単離株の２本鎖セグメントの泳動パターンには顕著な相違が存在することが立証されている。参考資料として本明細書の一部とするＧｏｕｖｅａ及びＳｃｈｎｉｔｚｅｒ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，４３：４６５−４７１（１９８２）を参照されたい。
【００６２】
感染細胞からの細胞質ＲＮＡをＳｈａｒｐｅ及びＦｉｅｌｄｓ（Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３８：３８９−３９２，１９８１）により記載されているように抽出した。Ｃｒｏｓｓ及びＦｉｅｌｄｓ（Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９：１６２−１７３，１９７６）により記載されているように不連続Ｔｒｉｓ−グリシン緩衝液系中、スラブゲル中でポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を実施した。Ｘ−Ｏｍａｔフィルム（Ｋｏｄａｋ）を−７０℃で乾燥ゲルに密着させることによりラジオオートグラフィーを実施し、標準写真技術により現像した。
【００６３】
数年間にわたって採取されたフィールドサンプルである相当数の種々のニワトリレオウイルス単離株をコネチカット州及びデラウェア州から入手した。更に、米国内の他の地域、英国、スコットランド及びドイツから入手したレオウイルス単離株並びに原型日本株も分析した。これらのデータによると、同一地域内から単離されたウイルスのｄｓＲＮＡ泳動パターンが最もよく似ていた。他方、単離株２１７７は同一地域内で得られた他の単離株と著しく異なる泳動パターンを示した。恐らく、２１７７に感染したニワトリは他の単離株に感染したニワトリと同様の育種に由来するものであった。更に、地理的にすぐ近接する地域以外からのニワトリは最近は導入されていなかった。
【００６４】
特に、同一地域から得た他の全単離株からの同一ＲＮＡバンドに比較して、Ｍ２  ＲＮＡバンドはゆっくりと泳動し、Ｓ３  ＲＮＡバンドは迅速に泳動した。
【００６５】
実施例４．生レオウイルスワクチンの最小防御量試験
本試験の目的は、皮下（ＳＣ）経路で１日齢ＳＰＦニワトリに接種した場合に生成物継代におけるレオウイルス単離株２１７７の効力を立証することであった。この試験及びその後のワクチン試験のために、ＣＥＦで１４代継代後、ニワトリ胚で５〜６代継代することによりマスターシードを調製した。細胞培養物（ＣＥＦ）で更に４代継代することにより所謂生成物継代を得た。
【００６６】
１６１日齢ニワトリを各４０羽ずつの３群と各２０羽ずつの２群に分け、ステンレス鋼負圧アイソレーターユニットに入れた。各４０羽を含む群にＳＣ経路で接種物（マスターシードウイルスから第４代目の継代でニワトリ胚フィブロブラストで調製し、トリプトースリン酸ブロスで希釈したレオウイルス株２１７７）０．１ｍｌを接種し、１羽当たり約２．５、３．０及び３．５ｌｏｇ10ＴＣＩＤ50の用量の２１７７を与えた。各２０羽を含む２群は一緒に１つのアイソレーターに入れ、非ワクチン接種非攻撃対照及び非ワクチン接種攻撃対照として使用した。
【００６７】
ワクチン接種後３週目に全ニワトリをコロニーハウスに移した。ワクチン接種動物と一方の非ワクチン接種動物群に肉趾経路でＳ１１３３攻撃ウイルス０．１ｍｌで攻撃した（攻撃ウイルスはＴＰＢで１：１０，０００に希釈したＵ．Ｓ．Ｄ．Ａ．Ｓ１１３３とした）。非ワクチン接種非攻撃対照は攻撃せずにおいた。
【００６８】
攻撃後６〜１４日目の肉趾読み取りを使用して防御百分率を決定した。レオウイルス攻撃後５日以内に生じる腫張は非特異的であると見なされるので４及び５日目の読み取りは使用しなかった。各ニワトリの肉趾炎症得点の９日間累積を求めた。
【００６９】
非ワクチン接種攻撃対照の肉趾腫張の平均及び標準偏差を使用して防御を決定した。肉趾炎症累積値が非ワクチン接種攻撃対照の肉趾炎症の平均から２つの標準偏差を減じた差よりも小さい場合にニワトリは防御されていると判定した。
【００７０】
この試験の結果を下記表１５に示す。データによると、肉趾炎症により判定した場合、ワクチン接種後３週目にＳ１１３３攻撃ウイルスで攻撃したニワトリではこの試験で使用したレオウイルス２１７７の最小用量である２．５ｌｏｇ10ＴＣＩＤ50で有効である。このデータによると更に、２．５ｌｏｇ10ＴＣＩＤ50の用量でレオウイルス２１７７をワクチン接種したニワトリの１００％が防御されたことから、レオウイルス２１７７の最小防御量は＜２．５ｌｏｇ10ＴＣＩＤ50であると思われる。
【００７１】
【表１５】
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【００７２】
実施例５：レオウイルス単離攻撃モデル、生レオウイルスワクチン
この試験の目的は、ウイルス単離攻撃モデルを分析し、一般に吸収不良症候群に関連する毒性レオウイルス（１７３３株）で攻撃した際のレオウイルス単離株２１７７の効力を立証することであった。
【００７３】
要約すると、１日齢ニワトリを４群に分け、群１及び３は皮下経路で０．１ｍｌ用量当たり約５．０ｌｏｇ10ＴＣＩＤ50の２１７７をワクチン接種した（ワクチン調製物は実施例４と同一とした）。群１のニワトリは気管内（ＩＴ）経路で攻撃した。群３のニワトリは肉趾経路で攻撃した。群２及び４は対照群としてワクチン接種しなかった。結果を下記表１６に示す。
【００７４】
攻撃ウイルスは、０．１ｍｌ用量当たり約４．０ｌｏｇ10ＴＣＩＤ50を含有するようにＴＰＢで希釈したレオウイルス１７３３の調製物とした。
【００７５】
ワクチン群１及び２のニワトリは気管内経路で０．１ｍｌ用量当たり４．０ｌｏｇ10ＴＣＩＤ50のレオウイルス１７３３を１６日齢で攻撃した。ワクチン接種群３及び４のニワトリは肉趾経路で攻撃１７３３レオウイルスの同一調製物で攻撃した。
【００７６】
攻撃日にワクチン接種動物（群１）からの５羽及び非ワクチン接種対照（群２）からの５羽を殺し、脾臓を取り出してウイルス単離した。この時点で単離されたウイルスはワクチンウイルスであった。
【００７７】
ＩＴ経路で攻撃したニワトリ（群１及び２）を攻撃後５日目に殺して脾臓を取り出し、ウイルス単離した。攻撃後５日目から出発して、肉趾経路で攻撃したニワトリ（群３及び４）に肉趾の腫張が生じたか否かを５日間毎日観察した。
【００７８】
ニワトリから取り出した脾臓を、０．７５％ネオマイシンを含有するＴＰＢ  １ｍｌ中に置いた。組織を組織グラインダーで粉砕した。サンプルに更に１．０ｍｌを加え、５日齢胚形成卵に０．１ｍｌを接種した。卵を１０日間毎日明かりに透かして死亡率を調べた。１０日間以内に死滅した胚から漿尿膜を取り出し、寒天ゲル沈殿によりレオウイルス抗原の存在を試験した。未知サンプルと陽性公知レオウイルスサンプルとの間に同一線が形成された場合に組織はレオウイルス陽性であると判定した。
【００７９】
【表１６】
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【００８０】
本実験の目的は、吸収不良症候群に一般に結び付けられるレオウイルスである１７３３株で攻撃した場合にレオウイルス２１７７が腱滑膜炎攻撃株（Ｓ１１３３）よりもニワトリを防御することができたか否かを判定することであった。実験は、防御を決定するための手段として肉趾攻撃の代わりに脾臓からのウイルス単離を使用するように設計した。胚形成卵に粉砕脾臓サンプルを接種し、寒天ゲル沈殿試験で漿尿膜にレオウイルス抗原が存在するか否かを試験することによりウイルス単離を実施した。
【００８１】
その結果、ウイルス単離法で試験したワクチン接種ニワトリの９０％が防御され、これに対して肉趾経路で攻撃したニワトリの防御は１００％であった。非ワクチン接種対照では、ウイルス単離法で試験したニワトリの９５％が感受性であり、これに対して肉趾炎症法で試験したニワトリでは９１％が感受性であった。
【００８２】
この試験の結果は以下の２点を立証するものである。（１）レオウイルス２１７７株でワクチン接種し且つ腱滑膜炎株Ｓ１１３３の代わりにレオウイルス吸収不良株１７３３で攻撃したニワトリにおける防御を判定するために、ウイルス単離法を使用することができる。（２）２１７７ワクチンは吸収不良１７７３で攻撃した際にニワトリに防御を提供する。
【００８３】
実施例６：レオウイルス株２１７７のＨＶＴ／ＳＢ−１ワクチン接種干渉試験
本試験の目的は、レオウイルス株２１７７がＨＶＴ／ＳＢ−１ワクチン接種効力に干渉するか否かを判定することであった。試験の設計を下記表１７に示す。
【００８４】
【表１７】
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【００８５】
ワクチン接種日にＨＶＴのアンプル２個及びＳＢ−１のアンプル２個を融解し、一緒にしてマレック希釈剤４００ｍｌに再懸濁した。次いで、この混合物を１００ｍｌずつ４つのアリコートに分割した。１つのアリコートはＨＶＴ／ＳＢ−１ワクチン接種群として別にした。残りのアリコートの１つに１ｍｌのレオウイルス２１７７を加え、２１７７／ＨＶＴ／ＳＢ−１群とした。残りの２つのアリコートは使用しなかった。
【００８６】
ワクチン接種日に再懸濁ＨＶＴ／ＳＢ−１組み合わせを１０回反復滴定した。これらの反復滴定の５回は一次ＣＥＦ細胞で実施してＳＢ−１力価を測定し、これらの反復滴定の５回は二次ＣＥＦで実施し、ＴＶＴ力価を測定した。
【００８７】
レオウイルス２１７７／ＨＶＴ／ＳＢ−１を含有するワクチンを凍結し、レオウイルス２１７７を一次ＣＥＦで５回反復滴定した。
【００８８】
用量当たり約５００プラーク形成単位のマレック病ウイルスのＲＢ１Ｂ株を使用して５日齢のニワトリに腹腔内攻撃した。マレック病はマレック病の肉眼的病変及び臨床兆候が観察されるまでに約３〜４週間のインキュベーション期間を有するので、攻撃後第１週以内に死亡したニワトリは非特異的原因で死亡したと判断した。これらのニワトリと攻撃前に死亡したニワトリは防御評価から除外した。この攻撃期間後１週間後に病変を有するか又は死亡したニワトリの数を攻撃後第１週後に生存し続けているニワトリの合計数で除して、防御されたニワトリの百分率を決定した。
【００８９】
各ウイルスで反復滴定した結果、２種のワクチンの調製物は下記ウイルス力価を含むことが判明した。
【００９０】
【表１８】
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【００９１】
防御結果から明らかなように、ＨＶＴ／ＳＢ−１ワクチン接種動物ではニワトリの８８％が防御された。２１７７／ＨＶＴ／ＳＢ−１をワクチン接種した群では８９％が防御された。非ワクチン接種攻撃対照ではニワトリの４％は病変を示さなかった（下記表１９参照）。換言するならば、結果はレオウイルス株２１７７を含むＨＶＴ／ＳＢ−１ワクチンの効力がレオウイルス２１７７を含まないＨＶＴ／ＳＢ−１の同一調製物と相違しないことを示す。従って、レオウイルス２１７７をＨＶＴ／ＳＢ−１ワクチンに加えてもマレック病ワクチンの効力に干渉しない。
【００９２】
【表１９】
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【００９３】
更に、ＨＶＴ／ＳＢ−１ワクチンが２１７７ワクチンの効力を干渉したか否かについて試験した。その結果、用量当たり４．２ｌｏｇ10ＴＣＩＤ50のレオウイルス２１７７、用量当たり５６３６ＰＦＵのＨＶＴ及び５７３３ＰＦＵのＳＢ−１を含有するワクチンを調製した処、レオウイルス２１７７ワクチンの効力に何ら影響しなかった。混合ワクチンの防御百分率は９３％であり、これに対してレオウイルス２１７７を単独で使用した場合の防御は１００％であった。