(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の理化学的性質を有するＤ−アミノ酸オキシダーゼ。
(1) 作用：酸素の存在下、Ｄ−アミノ酸を酸化し、過酸化水素、２−オキソ酸およびアンモニアを生成する。
(2) 基質特異性：Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−アラニン、Ｄ−バリン、Ｄ−メチオニン、Ｄ−プロリン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−チロシンに強く作用し、Ｄ−セリン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−リジン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−スレオニン、Ｄ−アスパラギンにも作用し、Ｄ−システイン、Ｄ−シスチン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸、グリシン、Ｌ−アミノ酸にはほとんど作用しない。
(3) 至適ｐＨ及びｐＨ安定性：至適ｐＨは６〜１１であり、安定なｐＨの範囲は６〜１０．７である。
(4) 至適温度および熱安定性：至適温度は４０℃付近であり、ｐＨ ８．５の条件下、１５分間の処理では５０℃まで安定である。
(5) 阻害剤：硝酸銀、塩化第二水銀、塩化カドミウム、塩化第一鉛、ｐ−クロロマーキュリ安息香酸、アミノグアニジンで強く阻害される。
(6) 分子量：ゲル濾過法で測定した分子量は約１６６，０００であり、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミド電気泳動法による測定値は約４１，２００の単一バンドを示す。
(7) 等電点：約４．８である。
(8) 基質親和性（Ｋｍ値）：Ｄ−フェニルアラニン：０．３７ｍＭ、Ｄ−アラニン：２．４ｍＭ、Ｄ−メチオニン：０．８４ｍＭ、Ｄ−プロリン：３．３ｍＭである。
【請求項２】
フザリウム  イクイセチ (Fusarium equiseti)に属し、第１の要旨に記載の耐熱性Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ生産能を有する微生物を栄養培地に培養し、培養物中に請求項１に記載のＤ−アミノ酸オキシダーゼを生成蓄積せしめ、これを採取することを特徴とする請求項１に記載の耐熱性Ｄ−アミノ酸オキシダーゼの製造法。
【請求項３】
フザリウム  イクイセチ（Fusarium equiseti)に属し、請求項１に記載の耐熱性Ｄ−アミノ酸オキシダーゼの生産能を有する微生物。
【請求項４】
フザリウム・エスピー(Fusarium sp.) ＩＫＤ−１２３８Ｂ株 (ＦＥＲＭ  Ｐ−１５３９９）又はその変異株である請求項３記載の微生物。
【請求項５】
酸素の存在下、請求項１に記載の耐熱性Ｄ−アミノ酸オキシダーゼを触媒としてＤ−アミノ酸の酸化反応を行う工程を含むＤ−アミノ酸の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ、その製造法および微生物に関し、詳しくは、診断薬用として有用な耐熱性Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ、その製造法およびフザリウム  イクイセチ（Fusarium equiseti)に属する微生物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
Ｄ−アミノ酸オキシダーゼは、酸素の存在下Ｄ−アミノ酸を酸化し、過酸化水素、２−オキソ酸、アンモニアを生成する酵素で、国際生化学連合（ＩＵＢ）の分類ではＥＣ１．４．３．３に分類される。また、この酵素は、哺乳動物の器官および微生物に広く存在していることが知られている（酵素ハンドブック：丸尾文治、田宮信雄監修、朝倉書店）。
【０００３】
Ｄ−アミノ酸オキシダーゼを産生する微生物としては、アスペルギルス・ウスタス（特公昭５５−３５１１９号公報、特公昭５９−１５６３５号公報）、セファロスポリウム・ポトロニイ（特公昭５７−３０４７９号公報）、トリゴノプシス・バリアビリス（特公昭５９−１５６３５号公報、特公昭６２−５０１６７７号公報、特開昭５４−３２６９４号公報、特開昭５６−３０９８８号公報、特開昭６２−２６２９９４号公報、特開昭６３−７１１８０号公報）、グリオクラディウム属（特公昭６０−５７８３７号公報）等の報告がある。
【０００４】
更に、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼを産生する微生物としては、カンジダ属（特開昭５５−２３９６６号公報）、シュ−ドモナス属（特開昭６３−６３３７７号公報）、フザリウム・ソラニ（特開平２−２００１８１号公報）、ロドトルラ・グルチニス（特開平５−２１１８９０号公報、ＥＰ５１７２００号公開公報）、不完全糸状菌クルブラリア（Curvularia）属、ロビラーダ（Robillarda）属、ミロセシウム・トリアティスポリウム（Myrothecium striatisporum)属（特開平７−２７４９５７号公報）等の報告がある。
【０００５】
これらの酵素は、抗生物質前駆体の製造（特公昭５５−３５１１９号公報、特公昭５７−１８８７９号公報、特公昭５７−３０４７９号公報、特公昭５９−１５６３５号公報、特公昭６０−５７８３７号公報、特公昭６２−５０１６７７号公報、特公平０１−２３４７３号公報、特開昭５１−１１２５９４号公報、特開昭５２−１１８９０号公報、特開昭５２−３８０９２号公報、特開昭５４−３２６９４号公報、特開昭５５−２３９６６号公報、特開昭５６−３０９８８号公報、特開昭６２−２６２９９４号公報、特開昭６３−７１１８０号公報、特開昭６３−７４４８８号公報、特開平２−２００１８１号公報、特開平４−２２９１９０号公報、特開平４−５０４３６２号公報、特開平５−２１１８９０号公報、ＥＰ４６５６００号公開公報、ＥＰ４７４２１１号公開公報、ＥＰ５１７２００号公開公報）に利用されている。
【０００６】
更に、これらの酵素は、ＤＬ−アミノ酸からのＬ−アミノ酸の製造（特開昭４３−６５４８４号公報、特開昭４８−７２３１４号公報、特開昭４８−７２３９１号公報、特開昭６３−６３３７７号公報）、ロイシンアミノペプチダーゼ活性測定法（特公昭５９−２２７８号公報、特開昭５３−６５７８７号公報）、抗生物質の分析法（ＥＰ１８１１０２号公開公報）などに利用されている。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
最近、血中のＤ−アミノ酸の測定が、腎不全の指標となる可能性が示された（Clinical Science, 73, 105-108(1987) 、Journal of Chromatography, 614, 7-17 (1993) 、北里医学, 23, 51-62(1993) ）。既に、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼを使用して、酵素的にＤ−アミノ酸を測定する方法（Analytical Biochemistry, 150, 238-242(1985) 、Clinical Science, 73, 105-108(1987) ）が長田らにより検討されているが、ブタの腎臓から抽出した酵素を使用しているため、酵素の安定性および量的な確保に問題が有った。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、前記実情に鑑み、鋭意研究を重ねた結果、耐熱性Ｄ−アミノ酸オキシダーゼを産生する菌を見いだし、本発明に至った。即ち、本発明の目的は、腎不全などの診断薬として有用な耐熱性Ｄ−アミノ酸オキシダーゼを提供することにある。
【０００９】
また、本発明の他の目的は、前記Ｄ−アミノ酸オキシダーゼの製造法を提供することにある。本発明の更に他の目的は、フザリウム属に属する耐熱性Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ生産能を有する微生物を提供することにある。各発明の要旨は、次の通りである。
【００１０】
本発明の第１の要旨は、次の理化学的性質を有するＤ−アミノ酸オキシダーゼに存する。
【００１１】
【表１】
0003795972.tif 000002
【００１２】
【表２】
0003795972.tif 000003
【００１３】
本発明の第２の要旨は、フザリウム  イクイセチ (Fusarium equiseti)に属し、第１の要旨に記載の耐熱性Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ生産能を有する微生物を栄養培地に培養し、培養物中に第１の要旨に記載のＤ−アミノ酸オキシダーゼを生成蓄積せしめ、これを採取することを特徴とする第１の要旨に記載の耐熱性Ｄ−アミノ酸オキシダーゼの製造法に存する。
【００１４】
本発明の第３の要旨は、フザリウム  イクイセチ（Fusarium equiseti)に属し、第１の要旨に記載の耐熱性Ｄ−アミノ酸オキシダーゼの生産能を有する微生物に存する。
本発明の第４の要旨は、第３の要旨に記載の微生物であって、フザリウム・エスピー(Fusarium sp.) ＩＫＤ−１２３８Ｂ株 (ＦＥＲＭ  Ｐ−１５３９９）又はその変異株である微生物に存する。
【００１５】
本発明の第５の要旨は、酸素の存在下、第１の要旨に記載の耐熱性Ｄ−アミノ酸オキシダーゼを触媒としてＤ−アミノ酸の酸化反応を行う工程を含むＤ−アミノ酸の測定方法に存する。
【００１６】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。先ず、本発明の耐熱性Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ(以下Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ又は本酵素と略称する）の製造法について説明する。本発明のＤ−アミノ酸オキシダーゼ生産能を有する微生物としては、フザリウム  イクイセチ (Fusarium equiseti)に属する、例えば、フザリウム・エスピー (Fusarium sp.) ＩＫＤ−１２３８Ｂ株（工業技術院生命工学工業技術研究所寄託番号、ＦＥＲＭ  Ｐ−１５３９９）が挙げられる。
【００１７】
上記の菌株（以下、本菌株と略称する）は、本発明者らによって土壌中より分離され、その菌学的性質は、下記の通りである。
【００１８】
１．形態的性質：
ポテト・デキストロース寒天培地上で生育した本菌株の光学顕微鏡下での形態的特徴を以下に記述する。菌糸は、幅１〜７μｍ、無色で、表面は滑面ときにやや粗面、隔壁を有する。分生子座は、よく発達し、桃色〜黄褐色の分生子塊を形成する。分生子柄は、無色で、隔壁を有し、菌糸から単生または２〜４回分枝を繰り返し、最後の分枝上にフィアリドを着生する。細胞の大きさは、８〜１４×２〜４μｍであり、フィアリドはこん棒形、単生または輪生（２〜５本）である。大きさは、４〜１７×２〜４μｍであり、分生子はフィアロ型で、大型分生子のみで小型分生子はみられない。
【００１９】
形は、鎌形、三日月形、船形、紡錘形で、３〜５（まれに７）隔壁を有する。先端細胞は、細く尖り、やや湾曲する。基部は、明瞭な柄足細胞となる。大きさは、３３〜６０×３〜５μｍであり、色は無色、表面は滑面である。分生子は、フィアリド先端に粘塊状に集まる。厚膜胞子は、菌糸上に頂生または菌糸間に形成され、数個が塊状に集まるか鎖状に連なることもある。形は、球形、楕円形で単細胞である。大きさは、８〜１３（まれに１５）μｍであり、色は無色のちに褐色を帯びる。表面は粗面となる。
【００２０】
２．各培地での生育：
各種培地上で、２５℃で３日間培養したときの成育状態を表３及び表４に示す。本菌株は、ポテト・デキストロース寒天培地、麦芽エキス寒天培地、オートミール寒天培地上における生育は良好で、綿毛状の集落となり、分生子座が散在し、分生子形成は良好である。集落の色は、変化に富み、培養初期の表面は、白色、淡褐色、黄白色、桃色である。裏面は、白色、クリーム色、淡褐色を呈し、後期になると、表面は、黄色、黄褐色、褐色、橙色を帯びるが、赤色系にはならない。三浦寒天培地上での生育は、普通で、気生菌糸が薄く広がり、平坦な集落となり、分生子形成は普通である。
【００２１】
【表３】
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【００２２】
【表４】
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【００２３】
３．生理的性質：
本菌株は、好気性で、麦芽エキス寒天培地における生育ｐＨ範囲は３〜１３と広く、至適ｐＨは１０付近である。また、ポテト・デキストロース寒天培地における生育至適温度は、３２℃付近であり、３７℃では生育しない。
【００２４】
以上の菌学的および生理学的性質より、本菌株は、ホークスワース (D.L.Hawksworth) 、サットン (B.C.Sutton) 、エーンズワース (G.C.Ainsworth)編、「エーンズワース・アンド・ビスビーズ・ディクショナリー・オブ・ザ・ファンジャイ  第７版 (Ainsworth and Bisby's Dictionary of the Fungi, 7th ed. (1983))」に従い、真菌門、不完全菌亜門、不完全糸状菌綱、フザリウム (Fusarium) 属のイクイセチ（equiseti) 種の菌に分類されることが明らかになった。
【００２５】
本菌株は、フザリウム・エスピーＩＫＤ−１２３８Ｂ株 (Fusarium sp. IKD-1238B) と命名された。当該菌株は、工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託番号  ＦＥＲＭ  Ｐ−１５３９９として寄託されている。本発明においては、上記菌株の変異株も使用できる。変異株は、紫外線、エックス線などの放射線または化学的変異剤（ＮＴＧ）などの処理によって得られる。
【００２６】
本発明の菌培養には、通常のカビ用培地が使用でき、炭素源、窒素源、無機物その他使用菌が必要とする微量栄養素を程よく含有するものであれば、合成培地、天然培地のいずれも使用可能である。炭素源としては、グルコース、シュークロース、デキストリン、澱粉、グリセリン、糖蜜などが使用できる。
【００２７】
窒素源としては、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機塩類、又は、ＤＬ−アラニン、Ｌ−グルタミン酸などのアミノ酸類、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、麦芽エキス、コーンスチープリッカー等の窒素含有天然物が利用できる。無機物としては、リン酸一ナトリウム、リン酸二ナトリウム、リン酸一カリウム、リン酸二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化第二鉄などが使用できる。
【００２８】
培養は、通常、振盪培養または通気攪拌培養で行う。培養温度は、通常１０〜３５℃、好ましくは２０〜３２℃の範囲であり、培地のｐＨは、通常３〜１３、好ましくは５〜１１の範囲である。培養期間は、通常１〜７日間、好ましくは２〜４日である。斯かる方法で培養することにより、培養物中、特に菌体内にＤ−アミノ酸オキシダーゼを生成蓄積することが出来る。
【００２９】
培養物中からＤ−アミノ酸オキシダーゼを得る方法は、蛋白質における通常の精製方法が利用できる。すなわち、菌を培養後、培養液をろ過して菌体を得、次いで、適当な方法で菌体を破砕し、破砕液から遠心分離などによって上清液を得る。この上清液中に含まれるＤ−アミノ酸オキシダーゼは、塩析、透析、イオン交換クロマトグラフィー、疎水吸着クロマトグラフィー、ゲルろ過、電気泳動などの適当な精製操作を組み合わせることによって精製できる。
【００３０】
本発明のＤ−アミノ酸オキシダーゼの酵素活性は、次の２つの方法で測定できる。
(1) 過酸化水素の比色検出法（活性測定法１）
１００ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）１ｍＬ、２５ｍＭの４−アミノアンチピリン０．１ｍＬ、４２０ｍＭフェノール溶液０．１ｍＬ、１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬ西洋わさびペルオキシダーゼ０．１ｍＬ、１００ｍＭのＤ−アラニン１ｍＬ及び水０．６５ｍＬを３ｍＬ石英セルに添加し、恒温セルホルダー付き分光光度計にセットして３７℃で５分間インキュベート後、酵素溶液０．０５ｍＬを加えて攪拌し、５００ｎｍにおける５分間の吸光度変化（ΔＡＢＳ／分) を測定する。酵素活性は次の式により算出する。なお、式中のｎは希釈倍率である。
【００３１】
【数１】
0003795972.tif 000006
【００３２】
(2) ２−オキソ酸のＤＮＰ検出法（活性測定法２）
１００ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）１ｍＬ、１００ｍＭの Ｄ−アラニン１ｍＬ及び水０．９５ｍＬを試験管に添加し、３７℃の恒温槽で５分間インキュベート後、酵素溶液０．０５ｍＬを加えて攪拌し、１０分間反応させる。反応後、３０％トリクロロ酢酸１ｍＬを加えて反応を停止する。反応液２ｍＬを別の試験管に取り、０．０５％２，４−ジニトロフェニルヒドラジン（ＤＮＰ）の２Ｍ塩酸溶液２ｍＬを加えてよく攪拌し、室温下に５分間放置後、トルエン６ｍＬを加えて強く攪拌する。
【００３３】
さらに、上層（トルエン層）５ｍＬを別の試験管に移し、これに１０％炭酸ナトリウム溶液５ｍＬを加えて強く攪拌し、ＤＮＰ反応物を水層に抽出する。下層（水層）３ｍＬを別の試験管に取り、これに４Ｍ水酸化ナトリウム溶液１ｍＬを加えてよく攪拌後、４７０ｎｍにおける吸光度を測定する。酵素活性は、あらかじめピルビン酸カリウム（ｍＭ単位）で作成した検量線の値（ＰｍＭ）から、次の式により算出する。なお、式中のｎは希釈倍率である。
【００３４】
【数２】
0003795972.tif 000007
【００３５】
次に、本発明の第１の要旨に係るＤ−アミノ酸オキシダーゼ( 実施例１で得られる酵素）について説明する。
(1) 作用：
酸素の存在下、Ｄ−アミノ酸を酸化し、過酸化水素、２−オキソ酸およびアンモニアを生成する酵素で、国際生化学連合（ＩＵＢ）の分類ではＥＣ１．４．３．３に分類される。一例として、Ｄ−アラニンが基質の場合の反応式を次に示す。
【００３６】
【化１】
Ｄ−アラニン＋Ｏ2 ＋Ｈ2 Ｏ    →  ピルビン酸＋Ｈ2 Ｏ2 ＋ＮＨ3 
【００３７】
(2) 基質特異性、基質親和性および最大反応速度：
活性測定法１でＤ−アラニン及び他の各種アミノ酸（いずれも終濃度３３mM）を使用した場合の相対反応性（基質特異性）は、表５及び表６のようであった。Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−アラニン、Ｄ−バリン、Ｄ−メチオニン、Ｄ−プロリン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−チロシンに強く、Ｄ−セリン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−リジン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−スレオニン、Ｄ−アスパラギンには弱く作用した。
【００３８】
また、Ｄ−システイン、Ｄ−シスチン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸、グリシン、Ｌ−アミノ酸（２１種）には、ほとんど作用しなかった。更に、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−アラニン、Ｄ−メチオニン、Ｄ−プロリンについての基質親和性（Ｋｍ）及び最大反応速度（Ｖｍａｘ）は、表５及び表６のようであった。
【００３９】
【表５】
0003795972.tif 000008
【００４０】
【表６】
0003795972.tif 000009
【００４１】
（３）至適ｐＨ及びｐＨ安定性：
活性測定法２の緩衝液を、図１に示した各種ｐＨを有する酢酸緩衝液、２−モルホリノエタンスルホン酸緩衝液（ＭＥＳ）、リン酸カリウム緩衝液、トリス・塩酸緩衝液、グリシン緩衝液、ユニバーサル緩衝液（各緩衝液とも３３mM）に代え、精製酵素の酵素活性を測定した。結果を図１に示す。図１から、本酵素の至適ｐＨの幅は広く、ｐＨ６〜１１の範囲にあることがわかる。
【００４２】
精製酵素を、図２に示した各種のｐＨを有する酢酸緩衝液、ＭＥＳ緩衝液、リン酸カリウム緩衝液、トリス・塩酸緩衝液、グリシン緩衝液、ユニバーサル緩衝液中（各緩衝液とも５０mM）に溶解し、３０℃で３０分間保持後、活性測定法１を使用して残存酵素活性を測定した。結果を図２に示す。図２から、本酵素の安定ｐＨ範囲は、６〜１０．７であることがわかる。
【００４３】
(4) 至適温度および熱安定性：
活性測定法２で反応温度を変えて精製酵素の酵素活性を測定した。結果を図３に示す。３図から、本酵素の至適温度は、４０℃付近であることがわかる。精製酵素を５０ｍＭのＮ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）緩衝液（ｐＨ８．５）に溶解し、各温度で１５分間保持後、活性測定法１を使用して残存酵素活性を測定した。結果を図４に示す。４図から、本酵素は、５０℃まで安定であることがわかる。
【００４４】
(5) 阻害剤：
活性測定法２の系に、１ｍＭ濃度になるように各種添加物を添加し、精製酵素の酵素活性を測定した。無添加物のコントロ−ルに対し、添加物により表７及び表８のような阻害効果および増強効果が認められた。本酵素は、硝酸銀、塩化第二水銀、塩化カドミウム、塩化第一鉛、ｐ−クロロマーキュリ安息香酸、アミノグアニジンで強く阻害されることがわかる。
【００４５】
【表７】
0003795972.tif 000010
【００４６】
【表８】
0003795972.tif 000011
【００４７】
(6) 分子量：
本酵素の分子量は、ゲル濾過法で測定した結果、約１６６，０００であった。また、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による測定値は、約４１，２００の単一バンドを示した。従って、本酵素の分子量は、約４１，２００のサブユニットの４量体からなるものと考えられる。
【００４８】
(7) 等電点：
等電点電気泳動法で測定した本酵素の等電点（ｐＩ）は、約４．８であった。
【００４９】
次に、本発明の第１の要旨に係るＤ−アミノ酸オキシダーゼ（実施例１で得られる酵素）の安定性について、これまで広くＤ−アミノ酸またはＤ−アミノ酸を介する測定法に使用されてきたブタ腎由来のＤ−アミノ酸オキシダーゼ（シグマ社製、Type II）と比較しながら説明する。
【００５０】
(8) 溶液保存安定性：
それぞれの酵素を、０．６〜０．８Ｕ／mLとなるように５０ｍＭのＴＡＰＳ緩衝液（ｐＨ８．５）に溶解して冷蔵庫（４℃）に保存し、０〜８１日目に、活性測定法１を使用して残存酵素活性を測定した。結果を表９及び表１０に示す。表９及び表１０から、ブタ腎由来の酵素と比較して本発明のＤ−アミノ酸オキシダーゼは、極めて安定であることがわかる。
【００５１】
【表９】
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【００５２】
【表１０】
0003795972.tif 000013
【００５３】
次に、本発明によって得られたＤ−アミノ酸オキシダーゼの用途について説明する。Ｄ−アミノ酸オキシダーゼは、酸素の存在下にＤ−アミノ酸の酸化反応を触媒し、過酸化水素、２−オキソ酸およびアンモニアを生成する酵素であるから、この反応による変化が利用できるものであれば、用途は、特に制限されない。
【００５４】
直接反応生成物を利用するものとしては、２−オキソ酸の製造法および前駆原料のＤ−アミノ酸側鎖を酸化し、抗生物質の原料などを製造する方法、例えば、セファロスポリンＣから７−アミノセファロスポラン酸の製造が挙げられる。また、間接的に利用するものとしては、ＤＬ−アミノ酸からＤ−体だけを酸化し、Ｌ−アミノ酸を製造する方法および反応生成物の量的変化を直接または間接的にシグナルとして検出する基質のＤ−アミノ酸、抗生物質などの測定法が挙げられる。
【００５５】
また、Ｄ−アミノ酸の生成を伴う別な酵素反応系の後にＤ−アミノ酸測定法を結合した、末端にＤ−アミノ酸を有する前駆基質、例えば、ペプチド等の測定法、逆に、Ｄ−アミノ酸を有する合成ペプチドを基質として添加するエクソプロテアーゼ、ぺプチターゼ等の酵素活性の測定法、例えば、ロイシンアミノペプチダーゼ活性の測定などが挙げられる。
【００５６】
本発明のＤ−アミノ酸オキシダーゼは、従来の酵素より安定性に優れ、従来使用が制限されていた領域にも応用可能になることは、言うまでもない。基質を測定する方法の一例として、Ｄ−アラニンの定量法を使用して詳しく説明する。Ｄ−アラニンが基質の場合、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼが触媒する反応の式を以下に示す。
【００５７】
【化２】
Ｄ−アラニン＋Ｏ2 ＋Ｈ2 Ｏ  →  ピルビン酸＋Ｈ2 Ｏ2 ＋ＮＨ3 
【００５８】
上記の反応式から明らかな様に、反応生成物のピルビン酸、過酸化水素、アンモニアのいずれを検出してもＤ−アラニンを定量することが出来る。具体的には、反応生成物のピルビン酸を検出する場合、通常の生化学検査で使用されている乳酸脱水素酵素を利用するピルビン酸の測定方法、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼの酵素活性測定で前記した「２−オキソ酸のＤＮＰ検出法」などが利用できる。
【００５９】
反応生成物の過酸化水素を検出する場合、過酸化水素の検出法として公知の方法が利用でき、例えば、前記の「過酸化水素の比色検出法」を例示することが出来る。反応生成物のアンモニアを検出する場合、通常のアンモニア測定法が利用でき、例えば、グルタミン酸脱水素酵素を使用するアンモニアの測定系がある。
【００６０】
また、これらの測定法は、反応速度上から、レート法またはエンドポイント法の２つに分類されているが、いずれであってもよく、測定系、反応時間、基質のＤ−アラニンの濃度、検体の種類などの条件により、適宜選択される。
【００６１】
基質Ｄ−アミノ酸を測定する場合、基質を含有する試料およびＤ−アミノ酸オキシダーゼを、約ｐＨ６〜１１の緩衝液に加えて反応させればよい。Ｄ−アミノ酸オキシダーゼは、溶液状態の他、必要に応じて凍乾品、マイクロカプセル化または担体に固定し、不溶化して使用することも出来る。緩衝液としては、リン酸緩衝液、トリス・塩酸緩衝液、グッド緩衝液、グリシン緩衝液などが使用される。酵素は、通常１〜５００μM 濃度の基質に対し、０．５〜５０Ｕ／mLの濃度で使用される。
【００６２】
生成した過酸化水素の検出には、比色法、蛍光法、化学発光法、電極法などのいずれも使用できる。比色法では、ペルオキシダーゼ等の触媒により、過酸化水素でペルオキシダーゼの基質を酸化発色させ、発色濃度を分光光度計で測定する。ペルオキシダーゼの基質としては、o −フェニレンジアミン、５−アミノサリチル酸、４−アミノアンチピリンとフェノール、２，２’−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）、ビス〔３−ビス（４−クロロフェニル）メチル−４−ジメチル−アミノフェニル〕アミン等が利用できる。
【００６３】
蛍光法では、ペルオキシダーゼ等の触媒により、過酸化水素で基質を酸化して蛍光物質を生成させ、その蛍光強度を蛍光光度計で測定する。ペルオキシダーゼの基質としては、ｐ−ヒドロキシフェニル酢酸、ｐ−ヒドロキシフェニルプロピオン酸などが利用できる。
【００６４】
化学発光法では、ペルオキシダーゼ等の触媒により、過酸化水素で基質を酸化して発光させ、その発光強度をルミノメーターで測定する。化学発光する基質としては、ルミノール化合物、ルシゲニン、アリルシュウ酸エステル類の化合物などが利用できる。
【００６５】
Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ及びＤ−アミノ酸の検出に必要な前記の試薬成分を含む試薬を調製し、Ｄ−アミノ酸の測定キットとして診断薬に組み立てることが出来る。
【００６６】
【実施例】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、本発明はその要旨を超えない限り、以下の実施例によって限定されるものではない。
【００６７】
実施例１（フザリウム属の菌によるＤ−アミノ酸オキシダーゼの製造）
ポリペプトン（和光純薬）１．７％、ソイトン（Ｄｉｆｃｏ）０．３％、グルコース（和光純薬）２．５％、塩化ナトリウム（ナカライテスク）０．５％、リン酸水素二カリウム（ナカライテスク）０．２５％、リン酸二水素カリウム（ナカライテスク）１．０％、ＤＬ−アラニン（ナカライテスク）１．０％、アデカノール（旭電化）ＬＧ  １２６を０．１％及びクロラムフェニコール（和光純薬）０．０１％を含む培地（ｐＨ５）を、２００ｍＬ容の培養フラスコ２本に各６０ｍＬずつ分注し、１２１℃で２０分間殺菌して冷却した。
【００６８】
各培養フラスコにフザリウム・エスピー (Fusarium sp.) ＩＫＤ−１２３８Ｂ株（工業技術院生命工学工業技術研究所寄託番号、ＦＥＲＭ  Ｐ−１５３９９）を一白金耳接種し、２７℃で２日間振とう培養して種培養液とした。前記と同じ組成の培地１．５Ｌを入れた２Ｌ容のジャーファーメンター１１本を、１２１℃で２０分間殺菌冷却後、前記の種培養液を各１５ｍＬずつ接種し、２２℃で６０時間、１．２Ｖ／Ｖ／ｍの通気量および３００ｒｐｍの攪拌速度の条件で培養した。培養終了後、培養液をろ過して湿菌体６５８ｇを得た。
【００６９】
得られた菌体を、１ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭエチレンジアミン四酢酸及び０．２ｍＭの４−（２−アミノエチル）−ベンゼンスルホニルフルオリド塩酸塩を含有する２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁し、冷却下に破砕装置ダイノミルを使用して菌体を破砕した。得られた破砕液を遠心分離して菌体残渣を除き、粗酵素液５５５０ｍＬを得た。この粗酵素液を５０℃の湯浴上で３０分間処理し、続いて氷浴上で２０℃まで冷却した。
【００７０】
冷却した粗酵素液に終濃度１ｍｇ／ｍＬとなるようにストレプトマイシン硫酸塩を添加し、氷浴上に２時間置いた後、遠心分離して上清液５２９０ｍＬを得た。この上清液に硫安を４０％飽和になるように加え、一昼夜放置後、析出した沈殿物を遠心分離により除き、得られた上清液に９０％飽和となるように硫安を追加し、再度一昼夜放置し、遠心分離により析出した沈殿物を得た。
【００７１】
得られた沈殿物を、１ｍＭジチオスレイトール含有２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）２００ｍＬに溶解後、透析膜を使用して同組成の緩衝液にて脱塩した。脱塩液を、あらかじめ１ｍＭジチオスレイトール含有２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したＤＥＡＥ−セルロファインＡ−５００ｍカラム（直径４．７ｃｍ×長さ７．８ｃｍ）に通して酵素を吸着させ、同組成の緩衝液で洗浄した。
【００７２】
次いで、１ｍＭジチオスレイトール含有２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）から０．４ＭのＮａＣｌ及び１ｍＭジチオスレイトールを含有する１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）への直線グラジエントにて溶出し、酵素の活性画分を集めた。この活性画分を透析膜を使用して１ｍＭジチオスレイトール含有２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）にて脱塩した。
【００７３】
この脱塩液を、あらかじめ１ｍＭジチオスレイトール含有２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したＤＥＡＥ−セルロファインＡ−５００ｍカラム（直径４．７ｃｍ×長さ７．８ｃｍ）に通して酵素を吸着させ、同組成の緩衝液で洗浄後、０．１ＭのＮａＣｌ及び１ｍＭジチオスレイトール含有２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で溶出し、酵素の活性画分を集めた。
【００７４】
この活性画分を透析膜を使用して０．１ｍＭジチオスレイトール含有５０ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）にて脱塩した。この脱塩液に硫安を加えて１０％飽和となるように調製後、あらかじめ１０％飽和硫安および０．１ｍＭジチオスレイトールを含有する５０ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）で平衡化したブチルトヨパール６５０Ｍカラム（直径２．１ｃｍ×長さ３．２ｃｍ）に素通し、酵素の活性画分を集めた。
【００７５】
次に、この活性画分を限外ろ過膜（アミコン社製、セントリプラス−１０：分画分子量１万）で濃縮後、高速液体クロマトグラフィーのカラムＴＳＫ−ＧＥＬＧ３０００ＳＷ（東ソー社製；直径２．１５ｃｍ×長さ６０ｃｍ）に、移動相０．５ＭのＮａＣｌを含有する０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）、流速３．０ｍＬ／分の条件で注入し、活性画分を分取した。分取した酵素は、ＳＤＳ電気泳動で単一のバンドを示した。各精製工程の収率および比活性の関係を表１1 に示す。
【００７６】
【表１１】
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【００７７】
実施例２（Ｄ−アラニン定量法への応用）
０．３８５ｍｇ／ｍＬの４−アミノアンチピリン、１１．７ｍｇ／ｍＬのＮ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）アニリン、７．６９Ｕ／ｍＬの西洋わさびペルオキシダーゼを含む７６．９ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）（第１試薬）１３０μＬに、Ｄ−アラニン溶液１００μＬを添加し、３７℃で５分間インキュベートして恒温化した。次に、０．２Ｕ／ｍＬの実施例１で得られたＤ−アミノ酸オキシダーゼを含む５０ｍＭのＴＡＰＳ緩衝液（ｐＨ８．５）（第２試薬）２０μＬを加えて３７℃で５分間インキュベートして発色させ、マイクロプレートリーダーで５９５ｎｍにおける吸光度増加速度を測定した。検量線の測定結果を図５に示した。検量線は、５から５０ｍｇ／Ｌまで直線となり、Ｄ−アラニンの測定が可能であった。
【００７８】
【発明の効果】
本発明により臨床診断薬として極めて有用なＤ−アミノ酸オキシダーゼ及びその工業的生産に適した製造法が提供された。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のＤ−アミノ酸オキシダーゼの至適ｐＨを示す図
【図２】本発明のＤ−アミノ酸オキシダーゼのｐＨ安定性を示す図
【図３】本発明のＤ−アミノ酸オキシダーゼの至適温度を示す図
【図４】本発明のＤ−アミノ酸オキシダーゼの温度安定性を示す図
【図５】Ｄ−アラニン測定の検量線を示す図
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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