(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ガンウイルスＳＶ４０のＴ抗原を膵臓β細胞で発現するトランスジェニックマウスのインスリノーマから樹立されたβ細胞株の形質転換体であって、そのゲノムＤＮＡ中にヒトインスリン遺伝子およびヘルペスチミジンキナーゼ遺伝子を保持し、ブドウ糖反応性ヒトインスリン分泌能を有するとともに、ガンシクロビルの接触によって細胞増殖が停止することを特徴とする膵臓β細胞株。
【請求項２】
トランスジェニックマウスのインスリノーマから樹立されたβ細胞株が、細胞株ＭＩＮ６である請求項１の膵臓β細胞株。
【請求項３】
ＭＩＮ６−ｈｉｎｓ５１（ＦＥＲＭ Ｐ−１５００６）である請求項２の膵臓β細胞株。
【請求項４】
β細胞特異的なインスリンプロモーター配列にＳＶ４０Ｔ抗原遺伝子を結合した融合遺伝子を保有するトランスジェニックマウスのインスリノーマから樹立したβ細胞株に、ヒトインスリン遺伝子、ヘルペスチミジンキナーゼ遺伝子および薬剤耐性遺伝子を組み込んだ発現ベクターを導入し、薬剤耐性を指標として形質転換クローンを選択し、さらにブドウ糖反応性ヒトインスリン発現能およびガンシクロビル投与による細胞障害を指標として選択したクローンを株化することを特徴とする膵臓β細胞株の作成方法。
【請求項５】
トランスジェニックマウスのインスリノーマから樹立したβ細胞株が、細胞株ＭＩＮ６である請求項４の膵臓β細胞株の作成方法。
【請求項６】
薬剤耐性遺伝子が、ｎｅｏ耐性遺伝子である請求項４の膵臓β細胞株の作成方法。
【請求項７】
請求項１ないし３の膵臓β細胞株、あるいは請求項４ないし６の方法によって作成した膵臓β細胞株が高分子膜に封入されたバイオハイブリッド型人工膵島。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
この発明は、ブドウ糖の量に反応してヒトインスリンを分泌する膵臓β細胞株と、この細胞株の作成方法、並びにこのβ細胞株を用いたバイオハイブリッド型人工膵島に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
現在、わが国の糖尿病患者は５００万人以上と推定され、今後さらに増加していく傾向にある。これらの患者の多くが将来、腎症や網膜症などの合併症のために悩まされることは、これからの大きな社会問題になると思われる。これらの合併症の進展を防止するためには、従来のインスリン投与治療や抗糖尿病薬に代わる抜本的な療法が求められており、その一つの可能性を担うものとして、人工膵臓（島）がある。ただし、これまでに提案されている人工膵島は、人体とは別体の機器に膵臓の機能を代用させようとするものであり、機械自体が大掛かりになることや血糖のセンサーの問題などから、未だ実用化の見通しは立っていない。
【０００３】
一方、このような装置仕立ての人工膵島に代わるものとして、膵島細胞を半透膜等に包み込んだバイオハイブリッド型人工膵島が注目されている。これを人体に植え込むことにより、長期にわたって特別なメンテナンスなしに血糖がコントロールされるならば、他に比べ格段に優れた治療法として普及するものと期待される。
【０００４】
実際にアメリカの研究グループは、膵島細胞を封入する膜を工夫することにより、糖尿病モデルのイヌ（膵摘出犬）にバイオハイブリッド型人工膵島を植え、半年以上も血糖をコントロールすることに成功している（Proc.Natl.Acad.Sci. USA., 90: 5843-5847, 1993)。
ところで、これまでに検討されているバイオハイブリッド型人工膵島では、膜に封入する膵島としてブタの膵臓から抽出した培養細胞が用いられているが、ヒトに用いるのに十分な量の膵島をブタから得ることは困難である。一般に、インスリン依存型糖尿病を膵島移植によって治療するのに必要な細胞の数は、体重１ｋｇにつき約１万個であると言われる。従って、たとえ動物実験であっても、１０ｋｇの成犬（膵摘出犬）に必要な膵島細胞は１×１０5 個であり、新生児ブタ２０頭が必要となる。これだけ多量の膵島細胞を確保することは、実験的な研究を行う上でも困難であり、ましてや人体に対する臨床的な使用は極めて非現実的であると言わざるを得ない。
【０００５】
そこで、このような問題を解決するための一つの手段として、膵臓β細胞の腫瘍（インスリノーマ）等に由来するβ細胞株の利用が提案されている。このようなβ細胞株は、腫瘍細胞の活発な増殖能を受け継いでいるため、特定の条件下で培養することによって、バイオハイブリッド型人工膵島に必要な細胞数を得ることが可能となる。
【０００６】
しかしながら、従来のβ細胞株（例えば、RINm5F細胞: Biochem J., 210, p345, 1983 ; HIT 細胞: Proc.Natl.Acad.Sci.USA., 78, p4339, 1981) の場合には必ずしも膵臓β細胞の性質を正確に発現するようなものではなかった。特に、β細胞としての最も重要な性質は、ブドウ糖に反応してインスリンを分泌するということであるが、これまでに報告されたβ細胞株で、ブドウ糖に反応して成熟インスリンを分泌する性質を長期に維持しているものはなかった。
【０００７】
これに対して、この発明の発明者等は、膵臓β細胞に特異的なインスリンプロモーターにガンウイルスＳＶ４０のＴ抗原遺伝子を結合した融合遺伝子を用いてトランスジェニックマウスを作成し、このマウスに発生したインスリノーマから、ブドウ糖に対してよく反応してインスリンを分泌する唯一のβ細胞株（ＭＩＮ６）を樹立することに成功している（Endocrinology, 127, p126-132, 1990）。そして実際に、このＭＩＮ６細胞をチャンバーに封入してバイオハイブリッド型人工膵島を試作し、これをストレプトゾトシン糖尿病ラットに移植した結果、ラットの血糖レベルが３ヵ月以上に渡って正常に維持されることを見いだしている（Cell Treansplantation, 4, p89-93, 1994) 。また、このＭＩＮ６細胞を利用した人工膵島の発明を既に特許出願してもいる（特願平６−４０１８８号）。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
上記のとおり、この発明者等の作成したβ細胞株ＭＩＮ６は、膵臓β細胞の最も重要な性質であるブドウ糖反応性インスリン分泌能を有するという点において極めて画期的なものであるが、この細胞株を用いて人体用または大型実験動物用のバイオハイブリッド型人工膵島を作成することは、以下の点において困難性が指摘される。
【０００９】
すなわち、ＭＩＮ６細胞はマウスに由来する細胞株であるため、当然のことながらマウスのインスリンを分泌する。このため、ヒトはもちろんのこと、大型の動物実験（イヌ等）にこの細胞を移植した場合には、体内にマウスインスリンに対する抗体ができる恐れがある。
また、ＭＩＮ６細胞は、ガン遺伝子を導入されたマウスの腫瘍細胞から樹立したものであるため、これを生体内に移植した場合には、腫瘍細胞の増殖能に基づく危険性も存在する。
【００１０】
このため、たとえブドウ糖反応性インスリン分泌能を有するβ細胞株が得られているにも係わらず、人体にも適応可能なバイオハイブリッド型の人工膵島の実現には至っていないのが現状であった。
この発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであって、ブドウ糖に反応してヒトのインスリンを分泌し、しかもその増殖を体外からコントロールすることのできる新しい膵臓β細胞株を提供することを目的としている。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
この発明は、上記の課題を解決するものとして、ガンウイルスＳＶ４０のＴ抗原を膵臓β細胞で発現するトランスジェニックマウスのインスリノーマから樹立されたβ細胞株の形質転換体であって、そのゲノムＤＮＡ中にヒトインスリン遺伝子およびヘルペスチミジンキナーゼ遺伝子を保持し、ブドウ糖反応性ヒトインスリン分泌能を有することを特徴とする膵臓β細胞株を提供する。
【００１２】
また、この発明は、β細胞特異的なインスリンプロモーター配列にＳＶ４０Ｔ抗原遺伝子を結合した融合遺伝子を保有するトランスジェニックマウスのインスリノーマから樹立したβ細胞株に、ヒトインスリン遺伝子、ヘルペスチミジンキナーゼ遺伝子および薬剤耐性遺伝子を組み込んだ発現ベクターを導入し、薬剤耐性を指標として形質転換クローンを選択し、さらにブドウ糖反応性ヒトインスリン発現能およびガンシクロビル投与時の細胞障害を指標として選択したクローンを株化することを特徴とする膵臓β細胞株の作成方法を提供する。
【００１３】
さらにこの発明は、上記の膵臓β細胞株、あるいは上記の方法によって作成した膵臓β細胞株が高分子膜に封入されたバイオハイブリッド型人工膵島をも提供する。
【００１４】
【作用】
この発明の膵臓β細胞株は、ガンウイルスＳＶ４０のＴ抗原を膵臓β細胞で発現するトランスジェニックマウスのインスリノーマから樹立された株化β細胞の形質転換体である。こような株化β細胞は、例えばこの発明者等の開発したＭＩＮ６細胞株であり、この細胞株は、ブドウ糖反応性インスリン分泌能を本来的に有している。そして、この発明の膵臓β細胞株は、上記の株化β細胞にヒトインスリン遺伝子が組み込まれており、ブドウ糖に反応してヒトインスリンも分泌する。このため、この膵臓β細胞株を人体に移植した場合にも、マウスインスリンのに対する抗体が生じてもヒトインスリンの分泌とその作用への影響はない。
【００１５】
さらに、この発明の膵臓β細胞株は、そのゲノムＤＮＡ中にヘルペスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）遺伝子を保有している。このＨＳＶ−ｔｋ遺伝子産物は、ガンシクロビル（Ganciclovir)の存在下で細胞致死的に作用するため、人体中での膵臓β細胞株の増殖を外部からコントロールすることが可能である。
この発明の膵臓β細胞株は、選択的透過性（β細胞の分泌産物のみを通過させ、生体の免疫担当細胞や抗体等の進入を防止する）に優れた高分子多孔膜に封入することによってバイオハイブリッド型人工膵島を作製することができる。高分子膜は、例えばポリエステル、ポリカーボン、シリコン等を用いることができ、円盤状や筒状等のチャンバーとすることができる。
【００１６】
以下、実施例を示して、この発明についてさらに詳細かつ具体的に説明するが、この発明は以下の例に限定されるものではない。
【００１７】
【実施例】
実施例１
ニワトリβアクチンのプロモーター配列を有するプラスミドｐＣＸＮ２（Gene, 108, p193-200, 1991 ）に、ヒトインスリン遺伝子（ATCC No. 57398) 、ｎｅｏ耐性遺伝子、およびＨＳＶ−ｔｋ遺伝子を組み込み、図１にその構成図を示した発現ベクターｐＣＸ−ｈｉｎｓを作製した。
【００１８】
次いで、このｐＣＸ−ｈｉｎｓを、公知のリポフェクション法を用いてＭＩＮ６細胞（Endocrinology, 127, p126-127, 1990）に導入し、ｎｅｏ耐性クローンを約１００個単離した。これらのクローンのヒトインスリン分泌能を調べ、高い発現を示すクローンを２０個選択した。さらに、これら２０クローンから、ブドウ糖に対して正常な反応性を示し、しかもヒトインスリン分泌の良好な５クローンを選択した。最後に、得られた５クローンに対して、ガンシクロビル投与時のＨＳＶ−ｔｋ遺伝子発現による細胞障害を調べ、感受性のある３クローンを同定して、この発明の膵臓β細胞株ＭＩＮ６−ｈｉｎｓを作成した。
【００１９】
この細胞株ＭＩＮ６−ｈｉｎｓは、３ヵ月の培養後もその形質を安定に保持し、特に、図２に示したとおり、そのブドウ糖反応性ヒトインスリン分泌能は極めて良好であった。
なお、得られた３クローンのうち、ＭＩＮ６−ｈｉｎｓ５１を平成７年６月２７日付で工業技術院生命工学工業技術研究所へ寄託し、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１５００６を得た。
実施例２
実施例１の細胞株ＭＩＮ６−ｈｉｎｓを用いてバイオハイブリッド型人工膵島を作成した。
【００２０】
先ず、シリコン性の０型リングの上下面にポリエステル製の高分子膜を貼り、これらをリングホルダーで固定した円盤タイプのチャンバーを作成した。次いでこのチャンバー内に、培養基質と混ぜ合わせたＭＩＮ６−ｈｉｎｓ細胞を注入して人工膵島を作成した。
この人工膵島を、培養液中に入れて封入細胞の培養を続け、その間もＭＩＮ６−ｈｉｎｓ細胞が安定したブドウ糖反応性ヒトインスリン分泌能を維持することを確認した。また、培養液中にガンシクロビルを添加することにより、封入細胞の増殖が停止可能であることを確認した。
【００２１】
【発明の効果】
以上、詳しく説明したとおり、この発明によって、ブドウ糖に反応してヒトのインスリンを分泌し、しかもその増殖を体外からコントロールすることのできる新しい膵臓β細胞株が提供される。これにより、糖尿病の抜本的な治療法として有望なバイオハイブリッド型人工膵島の開発に新たな途が拓ける。
【図面の簡単な説明】
【図１】この発明の膵臓β細胞株の作成に使用することのできる発現ベクターｐＣＸ−ｈｉｎｓの構成図である。
【図２】この発明の膵臓β細胞株ＭＩＮ６−ｈｉｎｓにおけるブドウ糖濃度に依存したヒトインスリン分泌量を示す。
【図１】
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【図２】
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