(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルブミンが培地中に分泌されるように培地で酵母を培養することを含む、アルブミンを産生および分泌するように遺伝子修飾された酵母からの分泌によりアルブミンを製造する方法であって、該酵母細胞が野生型の５０％以下のレベルの酵母アスパルチルプロテアーゼ３タンパク質分解活性を有することを特徴とする方法。
【請求項２】
タンパク質分解活性が、ポリペプチドにおける一塩基性部位におよび一対の塩基性アミノ酸に特異的なエンドプロテアーゼ活性である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
酵母がS.cerevisiaeである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
酵母が機能性ＹＡＰ３遺伝子を欠く、請求項１、２または３に記載の方法。
【請求項５】
酵母細胞が減少したレベルのS.cerevisiae  Ｋｅｘ２ｐタンパク質分解活性を更に有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
アルブミンがヒトアルブミンである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
アルブミンをコードするポリヌクレオチド配列と、第一ポリヌクレオチド配列から発現されたアルブミンを酵母から分泌させる分泌シグナルをコードする第二ポリヌクレオチド配列とを含んだ酵母細胞の培養物であって、該酵母細胞が減少したレベルの酵母アスパルチルプロテアーゼ３タンパク質分解活性を有することを特徴とする培養物。
【請求項８】
アルブミンがヒトアルブミンである、請求項７に記載の培養物。
【請求項９】
酵母がS.cerevisiaeである、請求項７または８に記載の培養物。
【請求項１０】
シグナルが、酵母からアルブミンの放出前に、酵母により開裂される、請求項７〜９のいずれか一項に記載の培養物。
【請求項１１】
酵母細胞が減少したレベルのＫｅｘ２ｐタンパク質分解活性を更に有する、請求項７〜１０のいずれか一項に記載の培養物。
【請求項１２】
分泌シグナルがＫｅｘ２ｐ以外のプロテアーゼによりアルブミンから開裂される、請求項１１に記載の培養物。
【請求項１３】
天然ヒトアルブミンと少くとも９０％の配列同一性を有する修飾ヒトアルブミンであって、４１０番目のアルギニンが存在しないか、あるいは非塩基性アミノ酸に置換されたことを特徴とする、修飾ヒトアルブミン。
【請求項１４】
天然ウシアルブミンと少くとも９０％の配列同一性を有する修飾ウシアルブミンであって、４０８番目のアルギニンが存在しないか、あるいは非塩基性アミノ酸に置換されたことを特徴とする、修飾ウシアルブミン。
【請求項１５】
アルギニンがアラニンに置換された、請求項１３または１４に記載の修飾アルブミン。
【請求項１６】
天然アルブミンに存在する一対の塩基性アミノ酸を更に欠く、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の修飾アルブミン。
【請求項１７】
一対のアミノ酸がＬｙｓ、Ｌｙｓ；Ｌｙｓ、Ａｒｇ；Ａｒｇ、Ｌｙｓ；またはＡｒｇ、Ａｒｇである、請求項１６に記載の修飾アルブミン。
【請求項１８】
ヒトアルブミンの場合には残基４１３および４１４が、ウシアルブミンの場合には残基４１１および４１２が、それぞれリジンまたはアルギニンではない、請求項１７に記載の修飾アルブミン。
【請求項１９】
アミノ酸置換Ｒ４１０Ａ、Ｋ４１３Ｑ、Ｋ４１４Ｑを有するヒトアルブミンである、請求項１８に記載の修飾アルブミン。
【請求項２０】
請求項１３〜１９のいずれか一項に記載の修飾アルブミンをコードするポリヌクレオチド。
【請求項２１】
請求項２０に記載されたポリヌクレオチドと、修飾アルブミンが酵母で発現されるような転写シグナルと、そして修飾アルブミンが酵母から分泌されるように上記ポリヌクレオチドと隣接する更なるポリヌクレオチドとを含む酵母。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は酵母種による組換えヒトアルブミン（ｒＨＡ）の産生に関する。
背景および先行技術
ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）は血清の浸透圧のかなりの割合に関与する５８５アミノ酸のタンパク質であって、内在および外来リガンドのキャリアとしても機能する。それは臨床的に重度熱傷、ショックまたは血液喪失の患者の治療に用いられ、現在ヒト血液からの抽出により商業上産生されている。微生物での組換えヒトアルブミン（ｒＨＡ）の産生は、ＥＰ  ３３０  ４５１およびＥＰ  ３６１  ９９１に開示されている。
近年、酵母種はｒＨＡ（Sleep et al,1990,1991；Fleer et al,1991）を含めた異種タンパク質（Romanos et al,1992で総説されている）の産生用の宿主生物として広く用いられている。酵母は容易に遺伝子操作しやすく、単純培地で高細胞密度まで増殖させることができ、しかも真核細胞として分泌および細胞質ゾルタンパク質の産生に適している。
S.cerevisiaeがｒＨＡを産生するために使用される場合、主要分泌タンパク質は成熟６７ｋＤａアルブミンである。しかしながら、ｒＨＡの４５ｋＤａ  Ｎ末端断片も観察される（Sleep et al,1990）。類似断片はｒＨＡがKluyveromyces sp.(Sleep et al,1990)およびPichia pastoris（ＥＰ  ５１０  ６９３）で発現されるときに得られる。その断片は成熟ｒＨＡと同様のＮ末端アミノ酸配列を有するが、カルボキシ末端は異なり、下記のようにＰｈｅ403とＶａｌ409との間にあり、最も共通した末端はＬｅｕ407およびＶａｌ409である（Geisow et al,1991）。
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産生される断片の量は、分泌される全ｒＨＡのパーセンテージとして、利用される株および分泌リーダー配列の双方に応じて変わるが、ゼロまで減少されない（Sleep et al,1990）。我々は、高細胞密度発酵（７５〜１００ｇ／ｌ細胞乾燥重量）で産生される断片の量が振盪フラスコ培養の場合より約５倍高いことも発見した。
４５ｋＤａアルブミン断片は血清由来ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）で観察されず、組換え産物中では非天然同一物質としてその存在は望ましくない。本発明で扱われる問題は、産物中における４５ｋＤａ断片の量を減少させることである。最も簡単で明らかなアプローチでは、ＥＰ  ５２４  ６８１（特に、第４頁１７〜２２行目参照）でGist-brocadesにより提案されたように、全鎖長アルブミンからそれを精製しなければならなかった。しかしながら、我々は異なるアプローチ、即ち初めてその産生を回避する試みを選択した。
Sleep et al(1990)では、ｒＨＡ断片が細胞内で産生されて、細胞外タンパク質分解の結果ではないと仮定していた。これらの著者はＧｌｕ382からＳｅｒ419でＨＳＡ  ｃＤＮＡをコドン最適化したが、これはｒＨＡ断片の産生に効果を有しなかった。彼らは、ｒＨＡアミノ酸配列に存在しうるＫｅｘ２ｐプロセッシング部位Ｌｙｓ413Ｌｙｓ414が断片の異種カルボキシ末端に極めて近接しているが、ｋｅｘ２宿主株（即ち、Ｋｅｘ２ｐプロテアーゼを産生しないような変異をＫＥＸ２遺伝子に有した株）の使用だけでなく、Ｌｙｓ414に関するコドンの部位特異的変異誘発による起こりうる開裂部位の除去でもその断片の量を減少させないと述べた。
（S.cerevisiaeで）ｙｓｃＡ、ｙｓｃＢ、ｙｓｃＹ、ｙｓｃＳ、他の液胞プロテイナーゼ、ｙｓｃＤ、ｙｓｃＥ、ｙｓｃＦ（ｋｅｘ２ｐに相当）、ｙｓｃα、ｙｓｃＩＶ、ｙｓｃＧ、ｙｓｃＨ、ｙｓｃＪ、ｙｓｃＥおよびｋｅｘ１を含めて、望ましいタンパク質産物を原則として分解できる酵母プロテアーゼは多数ある。
Bourbonnais et al(1991)は一塩基性部位に特異的なS.cerevisiaeエンドプロテアーゼ活性について記載しており、その例（Ａｒｇ410）はアルブミンのこの領域に存在する。この活性は酵母アスパルチルプロテアーゼ３（Ｙａｐ３）によることが後でわかり（Bourbonnais et al,1993）、その酵素はそれが対合塩基性残基の箇所で開裂するという特異性の点でＫｅｘ２ｐと類似したエンドプロテアーゼとしてEgel-Mitani et al(1990)により初めて記載された。更に研究では、Ｙａｐ３ｐが一塩基性部位と、塩基性残基対間およびそのＣ末端側を開裂できて、双方のタイプの部位における開裂が配列関係に依存していることを示唆した（Azaryan et al,1993;Cawley et al,1993）。
既に開示されたように、ｒＨＡ断片のＣ末端の領域は一塩基性（Ａｒｇ410）および二塩基性部位（Ｌｙｓ413Ｌｙｓ414）の双方を含んでいる。しかしながら、Ｋｅｘ２ｐ様タンパク質分解活性がヒト細胞に存在して、一対のアルギニン残基のＣ末端側にあるＨＳＡのプロ配列の開裂に関与するとしても、上記断片はヒトで産生されないことが知られている。これは塩基性残基Ａｒｇ410、Ｌｙｓ413およびＬｙｓ414がこのＫｅｘ２ｐ様プロテアーゼにより認識されないことを示し、ひいては分子のこの領域が分泌経路でプロテアーゼに接近できないことを示唆している。このため、Ｙａｐ３ｐプロテアーゼは４５ｋＤａ断片の産生に関与していることが予想できなかった。加えて、Egel-Mitani et al(1990,Yeast，6,127-137)はＭＦαプロフェロモンを開裂する上でＹａｐ３ｐがＫｅｘ２ｐと類似していることを示した。Ｋｅｘ２ｐ機能の除去だけでは産生される断片の量を減少させないが、Ｙａｐ３ｐ機能の除去が有益であるとは考えられたなかった。実際に、Bourbonnais et al(1993)では、ｙａｐ３株がプロソマトスタチンをプロセッシングする上で減少した能力を有することを示し、したがって異種タンパク質の産生でｙａｐ３株を用いることから離れるように勧めた。
発明の概要
上記問題の解決法は、本発明によれば、アルブミンの精製中に断片を除去するよりむしろ、初期発酵で断片の産生を避けるかまたは少くとも減少させることである。我々は、これまで存在することが知られた２０種以上の酵母プロテアーゼの中から、酵母で産生されるｒＨＡの４５ｋＤ断片に主に関与しているのが事実上Ｙａｐ３ｐプロテアーゼであることを発見した。本発明は、ｒＨＡが酵母種から分泌されるときに、産生される４５ｋＤａ断片の量を実質上減少させるための方法を提供する。断片量の減少は精製プロセスでｒＨＡの回収率を改善し、しかも最終産物の品質を高くする。酵母のｙａｐ３株を用いた更にかつ完全に予想外な効果は、それらがＹａｐ３ｐ機能を有する株よりも３０〜５０％多くｒＨＡを産生できることである。この効果は〜１５％から３-５％へのｒＨＡ断片の減少によるだけでは説明できない。
このように、本発明の一面では、アルブミンが培地中に分泌されるように培地で酵母を培養することを含む、アルブミンを産生および分泌するように遺伝子修飾された酵母からの分泌によりアルブミンを製造するための方法を提供し、この方法は酵母細胞が減少したレベルの酵母アスパルチルプロテアーゼ３タンパク質分解活性を有することを特徴とする。
好ましくは、上記タンパク質分解活性は、ポリペプチドにおける一塩基性部位におよび対合塩基性アミノ酸に特異的なエンドプロテアーゼ活性である。
適切には、酵母は機能性ＹＡＰ３遺伝子を欠いたS.cerevisiaeである。しかしながら、本発明は、S.cerevisiaeの使用に限定されず、その理由は４５ｋＤａ断片産生の問題が他の酵母属、例えばPichiaおよびKluyveromycesでもみられ、それらが等価なプロテアーゼ（即ち、Ｙａｐ３ｐタンパク質分解活性）を有することを示しているからである；Clerc et al(1994),page 253参照。我々は、非Saccharomyces属でＹａｐ３ｐのホモローグを位置決めするハイブリッド形成分析でこのことを確認した。遺伝子は、一般的に翻訳産物の配列がＹａｐ３ｐと５０％以上の配列同一性を有するならば、ホモローグとみなされる。非Saccharomyces属において、Ｙａｐ３ｐ様プロテアーゼとその遺伝子は別々に命名してもよいが、勿論これでそれらの本質が変わるわけではない。
断片のレベルは、前記のようにＫｅｘ２ｐ機能の除去だけでは断片のレベルに影響を与えないが、Ｋｅｘ２ｐ機能を実質上除去するだけでなくＹａｐ３ｐタンパク質分解活性も実質的に除去されるならば、更に一層減少させることができる。Ｙａｐ３ｐの場合のように、Ｋｅｘ２ｐ機能もSaccharomycesに限定されない；Gellissen et al(1992)参照、特に４１５〜４１６頁ではPichiaがＫｅｘ２ｐ機能を有することを示している。Kluyveromyces lactisおよびYarrowia lipolyticaでＫｅｘ２ｐ等価活性をコードする遺伝子がクローニングされた（Tanguy-Rougeau et al,1988；Enderlin & Ogrydziak,1994）。
プロテアーゼの活性を除去する適切な手段は、プロテアーゼをコードする宿主遺伝子を壊して、それによりプロテアーゼに関する遺伝子の全部または一部を欠いた非復帰株を作ることである（Rothstein,1983）。一方、活性は古典的変異誘発操作によるか、または移転（transplacement）のプロセスで特異的点変異の導入により減少または除去させることができる（Winston et al.1983）。好ましくは、酵素の活性は野生型レベルの多くて５０％、更に好ましくは２５％、１０％または５％以下まで減少させ、最も好ましくは検出されない。Ｙａｐ３ｐタンパク質分解活性のレベルは、４５ｋＤａ断片の産生を調べるか、またはCawley et al(1993)でも用いられたAzaryan et al(1993)の125Ｉ-βｈ-リポタンパク質アッセイにより測定される。Ｋｅｘ２ｐタンパク質分解活性も同様に、例えばFuller et al(1989)で示されたような、公知アッセイにより測定される。
アルブミンはヒトアルブミンまたはその変種でも、いずれか他の動物からのアルブミンであってもよい。
“変種”として、我々は保存的または非保存的な挿入、欠失および置換を含み、このような変化はアルブミンの腫瘍的な（oncotic）、有用なリガンド結合または非免疫原性を実質上変えない。特に、我々はヒトアルブミンの天然多型性変種；Ｙａｐ３ｐにより開裂される領域を含んだヒトアルブミンの断片、例えばＹａｐ３ｐ開裂領域（即ち、ｎは４０３-４１９である）を含む十分長いＥＰ  ３２２  ０９４に開示された断片（即ちＨＳＡ（１-ｎ）、ｎは３６９-４１９である）；アルブミン（またはそのＹａｐ３ｐ開裂しうる部分）と他のタンパク質との融合体、例えばＷＯ  ９０／１３６５３に開示された種類を含めている。
“保存的置換”とは、Ｇｌｙ、Ａｌａ；Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ；Ａｓｐ、Ｇｌｕ；Ａｓｎ、Ｇｌｎ；Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；Ｌｙｓ、Ａｒｇ；およびＰｈｅ、Ｔｙｒのようなグループ内での交換を意味する。
このような変種は、下記のようなタンパク質工学および部位特異的変異誘発の方法を用いて作ってもよい。
本発明の第二面では天然アルブミンと少くとも９０％の配列同一性を有する修飾アルブミンを提供するが、該天然アルブミンは酵母で発現されたときにS.cerevisiae酵母アスパルチルプロテアーゼ３（Ｙａｐ３ｐ）による開裂をうけやすく、その修飾アルブミンはこのような開裂を受けにくいことを特徴する。
好ましくは、修飾アルブミンは天然アルブミンタンパク質に存在する一塩基性アミノ酸を欠く。適切には、上記一塩基性アミノ酸はアルギニンである。好ましくは、修飾アルブミンは天然アルブミンに存在する一対の塩基性アミノ酸、特にＬｙｓ、Ｌｙｓ；Ｌｙｓ、Ａｒｇ；Ａｒｇ、Ｌｙｓ；またはＡｒｇ、Ａｒｇのいずれかを更に欠いている。このため、１つの具体的態様において、天然アルブミンはヒトアルブミンであり、修飾タンパク質はＡｒｇ410と場合によりＬｙｓ413Ｌｙｓ414リジンの一方または双方を欠いている。例えば、修飾アルブミンはアミノ酸置換（change）Ｒ４１０Ａ、Ｋ４１３Ｑ、Ｋ４１４Ｑを有するヒトアルブミンである。牛血清アルブミンにおける等価修飾は、Ａｒｇ408および／またはＡｒｇ411Lyss412の一方または双方を置換する。当業者であれば、他のアルブミンで一塩基性部位と塩基性残基の対を容易に特定することができる。
残基の番号付けは正常成熟ヒトアルブミンの配列に相当する。アルブミンが特定された位置のＮ末端側で残基の正味欠失または付加を有した変種（例えば多型体）であるならば、番号付けは２つの配列が見掛け相同性を最大にするように並べられたときに正常アルブミンの番号位置と整合させた変種アルブミンの残基に関する。
本発明の第三面では、このような修飾アルブミンをコードしたポリヌクレオチドを提供する。
ＤＮＡはアルブミンを産生するために適切な酵母（そのＤＮＡが修飾アルブミンに関するものか、またはＹａｐ３ｐ機能を欠いた酵母）で発現される。このため、アルブミンをコードするＤＮＡは公知技術に従い用いられ、発現ベクターを構築するためにここに含まれた開示から適切に修飾され、その後アルブミンの発現および産生のため適切な酵母細胞を形質転換させるために用いられる。
アルブミンをコードするＤＮＡは、適切な宿主中に導入のため様々な他のＤＮＡ配列に結合させてもよい。他のＤＮＡは宿主の性質、宿主中へのＤＮＡの導入方式と、エピソーム保持または組込みが望まれるかどうかに依存する。
通常、ＤＮＡは発現のため適正な向きおよび正しい読み枠でプラスミドのような発現ベクター中に挿入される。対いでベクターは標準技術で宿主中に導入されるが、通常形質転換される宿主細胞と合うように選択することが必要である。
次いで、本発明の組換えＤＮＡで形質転換された宿主細胞は、アルブミンを発現および分泌させるために、ここで開示された教示から当業者に知られる適切な条件下で十分な時間にわたり培養され、次いで公知のように回収することができる。
有用な酵母プラスミドベクターはｐＲＳ４０３-４０６およびｐＲＳ４１３-４１６であり、通常Stratagene Cloning Systems,La Jolla,CA 92037,USAから入手できる。プラスミドｐＲＳ４０３、ｐＲＳ４０４、ｐＲＳ４０５およびｐＲＳ４０６はYeast Integratingプラスミド（ＹＩｐ）であり、酵母選択マーカーＨＩＳ３、ＴＲＰ１、ＬＥＵ２およびＵＲＡ３を組込む。プラスミドｐＲＳ４１３-４１６はYeast Centromereプラスミド（ＹＣｐ）である。他の酵母発現プラスミドはＥＰ-Ａ-２５８  ０６７、ＥＰ-Ａ-２８６  ４２４およびＥＰ-Ａ-４２４  １１７に開示されている。
本発明の修飾アルブミンをコードするポリヌクレオチドコード配列は、修飾アルブミンを産生する上で必要な追加の相違を加えてもよい。例えば、原コドンと同様のアミノ酸をコードする異なるコドンに代えることができる。一方、置換コドンはアルブミンの活性または免疫原性に影響を与えないか、あるいはその活性または免疫原性を改善し、しかもＹａｐ３ｐプロテアーゼ活性に対するその感受性を減少させる、異なるアミノ酸をコードしていてもよい。例えば、部位特異的変異誘発または他の技術もBotstein and Shortle(1985)に記載されたように、置換、挿入、欠失および転位のような単一または複数変異を作るために用いることができる。このような修飾コード配列はここに含まれる教示への公知技術の適用により得られるため、このような修飾コード配列は本発明の範囲内に属する。
本発明の実施に有用と考えられる例示酵母属はPichia、Saccharomyces、Kluyveromyces、Candida、Torulopsis、Hansenula（現在Pichiaに再分類されている）、Histoplasma、Schizosaccharomyces、Citeromyces、Pachysolen、Debaromyces、Metschunikowia、Rhodosporidium、Leucosporidium、Botryoascus、Sporidiobolus、Endomycopsisなどである。好ましい属はPichia、Saccharomyces、Kluyveromyces、YarrowiaおよびHansenulaからなる群より選択されるものである。Saccharomyces sp.の例はS.cerevisiae、S.italicusおよびS.rouxiiである。Kluyveromyces sp.の例はK.fragilisおよびK.lactisである。Hansenula(Pichia)sp.の例はH.polymorpha（現在Pichia angusta）、H.anomala（現在P.anomala）およびP.pastorisである。Y.lipolyticaが適切なYarrowia種の例である。
S.cerevisiaeの形質転換方法はＥＰ  ２５１  ７４４、ＥＰ  ２５８  ０６７およびＷＯ  ９０／０１０６３で概説されており、それらすべてが引用することにより本明細書の開示の一部とされる。S.cerevisiaeに適したプロモーターには、ＰＧＫ１遺伝子、ＧＡＬ１またはＧＡＬ１０遺伝子、ＣＹＣ１、ＰＨＯ５、ＴＲＰ１、ＡＤＨ１、ＡＤＨ２、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、グルコキナーゼ、α-接合因子フェロモン、α-接合因子フェロモンに関する遺伝子に伴うプロモーター、ＰＲＢ１プロモーター、ＧＰＤ１プロモーター、および５′調節領域の一部と他のプロモーターの５′調節領域の一部または上流活性化部位とのハイブリッドからなるハイブリッドプロモーター（例えば、ＥＰ-Ａ-２５８  ０６７のプロモーター）がある。
Schizosaccharomyces pombeで使用上便利な調節プロモーターは、Maundrell(1990)で記載されたようなｎｍｔ遺伝子からのチアミン抑制プロモーターと、Hoffman & Winston(1990)で記載されたようなグルコース抑制ｆｂｐ１遺伝子プロモーターである。
外来遺伝子の発現のためにPichiaを形質転換させる方法は例えばCregg et al(1993)および様々なPhillips特許（例えば、引用することにより本明細書の開示の一部とされるＵＳ  ４  ８５７  ４６７）で開示され、Pichia発現キットはInvitrogen BV,Leek,NetherlandsおよびInvitrogen Corp.San Diego,Californiaから市販されている。適切なプロモーターにはＡＯＸ１およびＡＯＸ２がある。
上記Gellissen et al(1992)論文とGleeson et al(1986)J.Gen.Microbiol.,132,3459-3465にはHansenulaベクターの情報と形質転換を含んでいて、適切なプロモーターはＭＯＸ１およびＦＭＤ１であり、一方ＥＰ  ３６１  ９１９、Fleer et al(1991)とRhone-Poulenc Rorerの他の公開文献ではKluyveromyces spp.で外来タンパク質を発現させる方法について開示していて、適切なプロモーターはＰＧＫ１である。
転写終結シグナルは、好ましくは、転写終結およびポリアデニル化に適したシグナルを含む真核細胞遺伝子の３′フランキング配列である。適切な３′フランキング配列は、例えば用いられる発現コントロール配列と天然で結合される遺伝子の配列、即ちプロモーターに相当する。一方、それらは異なっていてもよく、その場合にはS.cerevisiae  ＡＤＨ１遺伝子の終結シグナルが好ましい。
アルブミンは最初に分泌リーダー配列で発現されるが、それは選択された酵母で有効ないかなるリーダーであつてもよい。S.cerevisiaeで有用なリーダーには接合因子αポリペプチド（ＭＦα-１）からのものと、ＥＰ-Ａ-３８７  ３１９のハイブリッドリーダーがある。このようなリーダー（またはシグナル）は、成熟アルブミンが周囲培地中に放出される前に酵母で開裂される。酵母株がＫｅｘ２ｐ活性（または相当物）を欠いている場合とｙａｐ３である場合には、Ｋｅｘ２ｐによりアルブミンから開裂される必要のない分泌リーダーを選択することが有利である。このようなリーダーには特開昭６２-０９６０８６（９１／０３６５１６として特許）に開示されたS.cerevisiaeインベルターゼ（ＳＵＣ２）、酸ホスファターゼ（ＰＨＯ５）、ＭＦα-１のプレ配列、β-グルカナーゼ（ＢＧＬ２）およびキラー毒素；S.diastaticusグルコアミラーゼII;S.carlsbergensis  α-ガラクトシダーゼ（ＭＥＬ１）；K.lactisキラー毒素；Candidaグルコアミラーゼのものがある。
本発明の様々な非制限態様は例により、しかも添付図面を参考にして記載される：
図１は変異ｒＨＡ発現プラスミドの構築に関する全体スキームであり、ＨＡはヒトアルブミンコード配列、Ｌは分泌リーダーをコードする配列、ＰはＰＲＢ１プロモーター、ＴはＡＤＨ１ターミネーター、ａｍｐはアンピシリン耐性遺伝子、およびＬＥＵ２はロイシン選択マーカーである。
図２はS.cerevisiaeにより分泌される変異ｒＨＡのWesternブロット分析を表した図であり、トラックＡはＤＢ１  ｃｉｒ°ｐＡＹＥ３１６（正常ｒＨＡ）からの培養上澄を表し、トラックＢはＤＢ１  ｃｉｒ＋ｐＡＹＥ４６４（改変１）からの培養上澄を表し、トラックＣはＤＢ１  ｃｉｒ＋ｐＡＹＥ４６８（改変３）からの培養上澄を表す。
図３はｐＡＹＥ５１５の構築スキームである。
図４は非還元１０％ＳＤＳ／ＰＡＧＥにより分離された振盪フラスコ培養物からの培養上澄の抗ＨＳＡWesternブロットの図として表された野生型およびプロテアーゼ破壊株によるｒＨＡ断片産生の比較であり、トラックＡはＤＢ１  ｃｉｒ°ｐＡＹＥ３１６に相当し、トラックＢはＤＸＹ１０  ｃｉｒ°ｐＡＹＥ３１６（ｙａｐ３株）に相当し、トラックＣはＡＢＢ５０  ｃｉｒ°ｐＡＹＥ３１６）ｙａｐ３、ｋｅｘ２株）に相当する。
図５は図４と同様であるが、フィードバッチ発酵からの培養上澄のCoomassie Brilliant Blue染色１２．５％ＳＤＳ Phastgel(Pharmacia)について示し、即ちトラックＤはＨＳＡ標準、トラックＥはＤＢ１  ｃｉｒ°ｐＡＹＥ３１６、トラックＦはＤＢ１  Δｋｅｘ２  ｃｉｒ°ｐＡＹＥ５２２、およびトラックＧはＤＸＹ１０  ｃｉｒ°ｐＡＹＥ５２２に関する。
図６はｐＡＹＥ５１９の構築スキームである。
発明の具体的な説明
すべての標準組換えＤＮＡ操作は、他で指摘されないかぎりSambrook et al(1989)に記載された通りである。ＨＳＡをコードするＤＮＡ配列は、ＥＰ  ２０１  ２３９に開示されたｃＤＮＡに由来している。
例１：ＨＳＡ  ｃＤＮＡの修飾
ｒＨＡ断片の作製でエンドプロテアーゼの役割を調べるために、ＨＳＡ  ｃＤＮＡ〔ＳＥＱ１（ＷＯ  ９０／０１０６３の人工分泌リーダー配列をコードする配列を含んでいる）〕を部位特異的変異誘発により修飾した。３つの別々な変化をＨＳＡ配列（ＳＥＱ２）に加えた。変異原性プライマーＦＯＧ１を用いた第一の場合ではＡｒｇ410コドンだけを変化させ、それをＡｌａコドンに代えて、二塩基性部位Ｌｙｓ413Ｌｙｓ414をそのままに残した。プライマーＦＯＧ２を用いた第二の変化では、ＬｅｕＬｅｕＶａｌからＡｌａＶａｌＡｌａに、断片のＣ末端残基を含めた残基４０７-４０９を変化させた。プライマーＦＯＧ３を用いた第三の変化では、ＡｒｇＴｙｒＴｈｒＬｙｓＬｙｓ（ＳＥＱ３）からＡｌａＴｙｒＴｈｒＧｌｎＧｌｎ（ＳＥＱ４）に、残基４１０-４１４を変化させた。そのオリゴヌクレオチドはそうしたアミノ酸変化だけでなく、変化した配列の検出を容易にするために変異体でＰｖｕIIまたはＳｐｅＩ制限部位を作る保存的塩基変化についてもコードしていた。
ＨＳＡ  ｃＤＮＡを含んだＭ１３ｍｐ１９クローン、ｍｐ１９．７（ＥＰ  ２０１  ２３９；図２）の一本鎖ＤＮＡを、製造業者の指図に従いIn Vitro Mutagenesis System,Version 2(Amersham International plc)を用いて変異誘発反応用の鋳型として用いた。個々のプラークを選択および配列決定して、変異の存在について確認した。次いで二本鎖ＲＦ  ＤＮＡを予想された変化のあるクローンから作り、変異のあるＤＮＡをＸｂａＩ／ＳａｃＩ断片で切り出した（図１）。これはｐＡＹＥ３０９（ＥＰ  ４３１  ８８０；図２）の対応野生型断片を置換するために用いた。プラスミド内における変異ＸｂａＩ／ＳａｃＩ断片の存在は、適宜にＰｖｕIIまたはＳｐｅＩで切断することによりチェックした。これらのＨｉｎｄIII断片を切り出し、発現ベクターｐＡＹＥ２１９（図１）中に挿入して、プラスミドｐＡＹＥ６４（改変１、Ｒ４１０Ａ）、ｐＡＹＥ４７０（改変２、Ｌ４０７Ａ、Ｌ４０８ＶおよびＶ４０９Ａ）およびｐＡＹＥ４６８（改変３、Ｒ４１０Ａ、Ｋ４１３Ｑ、Ｋ４１４Ｑ）を作製した。これらの発現プラスミドは、後にＡＤＨ１転写ターミネーターを続けた変異ＨＡコード配列と枠内で融合されたＨＳＡ／ＭＦα１リーダー配列（ＷＯ  ９０／０１０６３）の発現を行うS.cerevisiae  ＰＲＢ１プロモーター（ＷＯ  ９１／０２０５７）を含んでいる。プラスミドは、複製機能を示す２μｍプラスミドの部分と、形質転換株選択用のＬＥＵ２遺伝子も含んでいる。
ｐＡＹＥ４６４、ｐＡＹＥ４７０およびｐＡＹＥ４６８を形質転換によりS.cerevisiae  ＤＢ１  ｃｉｒ＋（ａ、ｌｅｕ２；Sleep et al,1990）中に導入し、個々の形質転換株をＹＥＰＳ（１％ｗ／ｖ酵母抽出物、２％ｗ／ｖペプトン、２％ｗ／ｖスクロース）１０ｍｌ中３０℃で３日間増殖させ、その後上澄をｒＨＡ断片の存在について抗ＨＳＡWesternブロットにより試験した。Westernブロットでは断片がｐＡＹＥ４６４保有株によりなお産生されることを明らかに示したが、そのレベルは野生型ｒＨＡを発現するコントロールと比較してやや減少していた。プラスミドｐＡＹＥ４７０における変異は、断片の形成に影響を有しないようであった。しかしながら、ＤＢ１  Ｃｉｒ＋ｐＡＹＥ４６８ではＨＳＡ関連バンドの新たなパターンを示し、断片がほとんどまたは全くない。
ＤＢ１  ｃｉｒ＋ｐＡＹＥ４６４およびＤＢ１  ｃｉｒ＋ｐＡＹＥ４６８の各々の１例について、醗酵槽中最少培地でフィードバッチ培養により高細胞密度まで増殖させた（Collins,1990）。簡単に言えば、１０ｌ作業容量の醗酵槽に５０ml/lの濃縮塩混合液（表１）、１０ml/lの微量元素溶液（表２）、５０ml/lのビタミン混合液（表３）および２０g/lのスクロースを含有した初期バッチ培地で５lまで満たした。１００ml/lの塩混合液、２０ml/lの微量元素溶液、１００ml/lのビタミン溶液および５００g/lのスクロースを含有した等容量のフィード培地を計量ポンプで醗酵槽に接続された別のリザーバーに保った。ｐＨは水酸化アンモニウムまたは硫酸の自動添加により５．７±０．２で維持し、温度は３０℃に維持する。スターラー速度は１v/v/min空気流速度で＞２０％空気飽和の溶解酸素率を示すように調整した。
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醗酵槽に緩衝最少培地〔Yeast窒素ベース（アミノ酸なし、硫酸アンモニウムなし、Difco）１．７g/l、（ＮＨ４）２ＳＯ４５g/l、クエン酸一水和物６．０９g/l、Ｎａ２ＨＰＯ４２０．１６g/l、スクロース２０g/l、ｐＨ６．５〕で増殖させたS.cerevisiaeの一夜培養物１００ｍｌを接種した。初期バッチ発酵を炭素源が消費されるまで進行させてから、計量ポンプのスイッチを入れ、フィードの添加をWang et al(1979)により開発されたものに基づくアルゴリズムを用いてコンピューター制御した（マイクロＭＦＣＳシステム、B.Braun,Melsungen,Germany）。質量分析器は、発酵からの排ガスをモニターして、セットした増殖速度（例えば０．１ｈ-1）を維持するようにフィードの添加をコントロールするために、コンピューターコントロールシステムと併用した。バイオマスへの炭素基質の最大変換は呼吸係数を１．２以下に維持することで行い（Collins,1990）、こうすると約１００g/l細胞乾燥重量の細胞密度が得られる。培養上澄をCoomassie染色ＳＤＳ／ＰＡＧＥおよびWesternブロットにより野生型ｒＨＡ産生株の場合と比較した。これらは、一塩基性Ａｒｇ410の除去（ｐＡＹＥ４６４）が有用な量まで断片のレベルを減少させるが、双方の存在しうるプロテアーゼ部位の除去（ｐＡＹＥ４６８）だと４５ｋＤａ断片をほぼ消失させることを示した（図２）。
存在しうるＫｅｘ２ｐ部位Ｌｙｓ413Ｌｙｓ414の除去効果の不在（Sleep et al,1990およびここで記載されていない他の研究でも確認）はＡｒｇ410の除去と組み合わされていないので複雑な原因であることを示唆したが、上記データはｒＨＡ断片の生成が内部タンパク質分解攻撃によることを示唆した。変異ｒＨＡと共に断片の量の減少は、原則として、プロテアーゼ開裂部位の除去によるのではなく、分子の折りたたみの動力学上における変化の影響によるものであった。
例２：ＹＡＰ３遺伝子の破壊
酵母アスパルチルプロテアーゼ３をコードするＹＡＰ３遺伝子はＹＡＰ３コード配列の部分を効果的に欠失させる遺伝子破壊プロセス（Rothstein,1983）により変異させ、それにより活性ＹＡＰ３ｐの産生を妨げた。
ＹＡＰ３遺伝子の５′および３′末端のＰＣＲ増幅に適した４種のオリゴヌクレオチド（Egel-Mitani et al,1990）を、Applied Biosystems 380B Oligonucleotide Synthesiserを用いて合成した。読者を助けるために、我々はＳＥＱ１５としてＹＡＰ３遺伝子の配列を含めたが、その５４１-２２５０はコード配列である。
0003795073.tif 000006
ＰＣＲ反応を行って、S.cerevisiaeゲノムｃＤＮＡ（Clontech Laboratories Inc.）からのＹＡＰ３遺伝子の５′および３′末端を個別に増幅させた。条件は次の通りであった：２．５μg/mlゲノムＤＮＡ、５μg/mlの各プライマーで４０サイクルにわたり、９４℃で６１秒間変性、３７℃で１２１秒間アニーリング、７２℃で１８１秒間伸長させ、その後４℃浸漬し、製造業者の勧めに従いPerkin-Elmer-Cetus Thermal CyclerおよびPerkin-Elmer-Cetus  ＰＣＲキットを使用した。産物はゲル電気泳動で分析したところ、予想サイズであることがわかった。５′断片をＳｐｈＩで切断し、ｐＵＣ１９ＨＸ（ＨｉｎｄIIIを欠いたｐＵＣ１９）のＳｐｈＩ部位中にクローニングして、ｐＡＹＥ５１１（図３）を得たが、その方向はＹＡＰ３がｐＵＣ１９ＨＸポリリンカーのＫｐｎＩ部位に転写されるようになっている。３′ＹＡＰ３断片をＨｉｎｄIIIおよびＡｓｐ７１８（ＫｐｎＩのアイソシゾマー）で切断し、ＨｉｎｄIII／Ａｓｐ７１８で切断されたｐＵＣ１９中に結合させて、ｐＡＹＥ５１２を得た。プラスミドＤＮＡ配列決定をインサートで行って、望ましい配列がクローニングされたことを確認した。次いでｐＡＹＥ５１２のＨｉｎｄIII／Ａｓｐ７１８をｐＡＹＥ５１１の対応部位中にサブクローニングしてｐＡＹＥ５１３（図３）を得たが、ＹＡＰ３の５′および３′領域はそれらの間にユニークＨｉｎｄIII部位を有して正しい向きをとっている。ＵＲＡ３遺伝子をＨｉｎｄIII断片としてＹＥｐ２４(Botstein et al,1979)から単離し、その後この部位中に挿入して、ｐＡＹＥ５１５（図３）を得たが、そこではＵＲＡ３がＹＡＰ３の５′および３′領域に隣接していて、ＹＡＰ３の反対方向に転写される。
株ＤＢ１  ｃｉｒ°ｐＡＹＥ３１６（Sleep et al,1991）のｕｒａ３誘導体をランダム化学的変異誘発と５-フルオロオロチン酸耐性の選択により得た（Boeke et al,1987）。その株を緩衝最少培地１００ｍｌで一夜増殖させ、細胞を遠心により集め、その後滅菌水で１回洗浄した。次いで細胞を滅菌水１０ｍｌに再懸濁し、そのうち２ｍｌを別の１５ｍｌ  Falcon管に入れた。次いでＮ-メチル-Ｎ′-ニトロ-Ｎ-ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）の５mg/ml溶液を次のように管に加えた：０μｌ、２０μｌ、４０μｌ、８０μｌまたは１６０μｌ。次いで細胞を３０℃で３０分間インキュベートし、その後遠心して、滅菌水で３回洗浄した。最後に、細胞を１ｍｌＹＥＰ（１％ｗ／ｖ酵母抽出物、２％ｗ／ｖBactoペプトン）に再懸濁し、４℃で貯蔵した。変異原性処理から生き延びた細胞のパーセンテージは、２％ｗ／ｖスクロース含有ＹＥＰプレート上にサンプルの希釈物を塗布して、３０℃で３日間インキュベートすることにより決定した。約５０％生存率を示した処理からの細胞を２％ｗ／ｖスクロース含有ＹＥＰプレート上で増殖させ、その後２％ｗ／ｖスクロース含有ＹＮＢ最少培地上でレプリカ培養し、５-フルオロオロチン酸（１mg/ml）およびウラシル（５０μg/ml）で補充した。この培地で増殖できるコロニーを精製し、それらがウラシル補充なしだと増殖できずに、この欠陥が形質転換によるＵＲＡ３遺伝子の導入で直せることを試験して確かめた。１つのこのような株、ＤＢＵ３  ｃｉｒ°ｐＡＹＥ３１６をｐＡＹＥ５１５のＳｐｈＩ／Ａｓｐ７１８  ＹＡＰ３-ＵＲＡ３-ＹＡＰ３断片で形質転換し、Ｕｒａ＋コロニーについて選択した。いくつかの形質転換株の切断ゲノムＤＮＡのサザンブロットをＹＡＰ３遺伝子の５′および３′末端でプロービングして、ＹＡＰ３遺伝子の破壊を確かめた。２形質転換株のＹＥＰＳ振盪フラスコ上澄の抗ＨＳＡ Westernブロットでは、ＹＡＰ３の破壊がｒＨＡ断片レベルを著しく減少させることを示した。
ＤＸＹ１０  ｃｉｒ°ｐＡＹＥ３１６と表示される、ＤＢＵ３  ｃｉｒ°ｐＡＹＥ３１６の１つのｙａｐ３誘導体を、最少培地で高細胞乾燥重量までフィードバッチ発酵により数回増殖させた。上澄をCoomassie染色ＰＡＧＥおよび抗ＨＳＡ Westernブロットで試験したところ（図４および５）、ｒＨＡ  ４５ｋＤａ断片レベルの減少は明白であり、分解産物の量の評価はＹＡＰ３親でみられたレベルの１／３〜１／５である。産生されたｒＨＡの量はｙａｐ３変異で悪影響をうけず、実際にＤＸＹ１０  ｃｉｒ°ｐＡＹＥ３１６はＹＡＰ３相当物、ＤＢ１  ｃｉｒ°ｐＡＹＥ３１６よりも３０〜５０％多くｒＨＡを産生することがわかった。ＨＡ配列からのリーダー配列の開裂が１対の塩基性残基に対してＣ末端側にあるという事実にもかかわらず、ｒＨＡは正しいＮ末端を有することがわかった。
発酵ブロスを遠心して細胞を除去し、その後次のようにアフィニティクロマトグラフィー精製に付した。培養上澄をCibacron Blue F3GA Sepharoseカラム(Pharmacia)に通して、その後ｐＨ８．０の０．１Ｍリン酸グリシン緩衝液で洗浄した。次いでｒＨＡを２Ｍ  ＮａＣｌ、０．１Ｍリン酸グリシン、ｐＨ８．０でカラムから溶出させたところ、それは純度＞９５％であった。それは当業界で知られる技術により更に精製してもよい。
一方、アルブミンは血清または発酵培地からアルブミンを精製するための様々な公知技術、例えばＷＯ  ９２／０４３６７、Maurel et al(1989)、Curling(1980)およびＥＰ  ５２４  ６８１に開示された技術により培地から精製してもよい。
例３：ｙａｐ３株におけるＫＥＸ２遺伝子の破壊
Ｙａｐ３およびＫｅｘ２ｐ活性を双方とも欠いた株を作製するために、酵母株ＤＸＹ１０  ｃｉｒ°（ｐＡＹＥ３１６）のｌｙｓ２誘導体をランダム化学的変異誘発とα-アミノアジペート耐性の選択により得た(Barnes and Thorner,1985)。細胞を例２のように変異誘発させ、その後２％ｗ／ｖスクロース含有ＹＮＢ最少培地に塗布し、唯一窒素源として２mg/mlＤＬ-α-アミノアジペートおよび３０μg/mlリジンで補充した。この培地で増殖できるコロニーを精製し、それらがリジン補充なしだと増殖できずに、この欠陥が形質転換によるＬＹＳ２遺伝子の導入で直せることを試験して確かめた。次いでこの株はＫＥＸ２コード配列の部分を効果的に破壊する遺伝子破壊のプロセスにより変異させ、それにより活性Ｋｅｘ２ｐの産生を妨げた。ＫＥＸ２遺伝子の配列をＳＥＱ１４としてここに再現しているが、その１３２９-３７７３はコード配列である。
ＫＥＸ２遺伝子の５′および３′末端のＰＣＲ増幅に適した４種のオリゴヌクレオチド(Fuller et al,1989)を、Applied Biosystems 380B Oligonucleotide Synthesiserを用いて合成した。
0003795073.tif 000007
ＰＣＲ反応を行って、S.cerevisiaeゲノムｃＤＮＡ（Clontech Laboratories Inc.）からのＫＥＸ２遺伝子の５′および３′末端を個別に増幅させた。条件は次の通りであった：２．５μg/mlゲノムＤＮＡ、５μg/mlの各プライマーで４０サイクルにわたり、９４℃で６１秒間変性、３７℃で１２１秒間アニーリング、７２℃で１８１秒間伸長させ、その後４℃浸漬し、製造業者の勧めに従いPerkin-Elmer-Cetus Thermal CyclerおよびPerkin-Elmer-Cetus  ＰＣＲキットを使用した。産物はゲル電気泳動で分析したところ、予想サイズであることがわかった（５′産物の場合０．９ｋｂおよび３′産物の場合０．６２ｋｂ）。５′産物をＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄIIIで切断し、３′産物をＨｉｎｄIIIおよびＳａｌＩで切断して、その後２つの断片をＢａｍＨＩおよびＳａｌＩで切断されたｐＵＣ１９ＨＸ中に一緒にクローニングした。次いでS.cerevisiae  ＬＹＳ２遺伝子(Barnes & Thorner,1985)を含んだ４．８ｋｂＨｉｎｄIII断片を得られたプラスミド中にＨｉｎｄIII（即ち２つのＫＥＸ２断片間）のところで挿入して、ｐＡＹＥ５１９（図６）を形成させた。
ＤＸＹ１０  ｃｉｒ°（ｐＡＹＥ３１６）のｌｙｓ２誘導体、ｌｙｓ２-１６をｐＡＹＥ５１９の６．０ｋｂ  ＫＥＸ２-ＬＹＳ２-ＫＥＸ２断片で形質転換し、Ｌｙｓ＋コロニーについて選択した。いくつかの形質転換株の切断ゲノムＤＮＡのSouthernブロットをＫＥＸ２遺伝子の５′および３′末端でプロービングして、ＫＥＸ２遺伝子の破壊を確かめた。これら形質転換株のＹＥＰＳ振盪フラスコ培養上澄の抗ＨＳＡ Westernブロットでは、下記例４でＫＥＸ２のみの破壊効果の欠如にもかかわらず、ｙａｐ３株におけるＫＥＸ２の破壊がｒＨＡ断片レベルを更になお減少させることを示した。１つのこのような株ＡＢＢ５０で産生されるｒＨＡの分析では、リーダー配列が不正確にプロセッシングされて、異常Ｎ末端になることを示した。
株ＡＢＢ５０（ｐＡＹＥ３１６）をそのプラスミドから直して（Sleep et al,1991）、類似プラスミドｐＡＹＥ５２２で形質転換させたところ、ハイブリッドリーダー配列はS.cerevisiaeインベルターゼ（ＳＵＣ２）リーダー配列に置き換わって、コードされるリーダーおよびＨＳＡ配列とのジャンクションが下記の通りになった：
0003795073.tif 000008
この構築体では、ＨＳＡからリーダー配列の開裂がＫｅｘ２プロテアーゼの活性に依存していない。株ＡＢＢ５０（ｐＡＹＥ５２２）は同様に非常に低いレベルのｒＨＡ断片と共にｒＨＡを産生することがわかったが、この場合だとＮ末端は血清由来ＨＳＡのものに相当しており、即ちリーダー配列の効率的で正確な除去があった。
例４：ＫＥＸ２遺伝子単独の破壊（比較例）
例３に開示された場合と同様の方法により、ＫＥＸ２遺伝子をS.cerevisiaeで破壊した。この株はＹａｐ３ｐタンパク質分解活性を有しており、したがって本発明の範囲内に属さなかった。この株をフィードバッチ発酵で増殖させたとき、産生されたｒＨＡは完全ＫＥＸ２遺伝子を有する株で産生された場合と同様の断片量を含有していた。加えて、ｒＨＡの全体レベルも減少しており、リーダー配列は正確にプロセッシングされずに、異常Ｎ末端を生じた。
例５：Pichiaで相当プロテアーゼの同定
前記のように、非Saccharomyces酵母も同様にｒＨＡの望ましくない断片を産生し、したがってＹａｐ３ｐタンパク質分解活性を有している。我々はプローブとしてS.cerevisiae  ＹＡＰ３遺伝子を用いてPichia angusta  ＤＮＡのSouthernハイブリッド形成を行うことによりこれを確認した。特異的ＤＮＡ断片を同定したところ、P.angustaにＹａｐ３ｐタンパク質分解活性が存在するだけでなく、ＹＡＰ３遺伝子の特異的ホモローグも存在することを示した。
ＹＡＰ３ホモローグの検出に用いられたSouthernハイブリッド形成の方法は、標準操作(Sambrook et al,1989)を用いてPichia  ＤＮＡのゲノムＤＮＡライブラリーから遺伝子配列をクローニングするために応用することができる。Pichia sp.におけるＹＡＰ３ホモローグの破壊も、Saccharomycesについて上記で用いられた場合と同様の技術を用いて行うことができる(cregg and Madden,1987)。
0003795073.tif 000009
0003795073.tif 000010
配列表
配列情報  ＮＯ：１：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：１８３０塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ｃＤＮＡ  ｔｏ  ｍＲＮＡ
(iii)ハイポセティカル：ＮＯ
(iv)アンチセンス：ＮＯ
(vi)起源：
(A)生物名：Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ
(ix)配列の特徴：
(A)ＮＡＭＥ／ＫＥＹ：ＣＤＳ
(B)存在位置  ７３．．１８２７
(xi)配列：ＮＯ：１：
0003795073.tif 000011
0003795073.tif 000012
0003795073.tif 000013
配列情報  ＮＯ：２：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：５８５アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列：ＮＯ：２：
0003795073.tif 000014
0003795073.tif 000015
配列情報  ＮＯ：３：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：５アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ペプチド
(iii)ハイポセティカル：ＮＯ
(iv)アンチセンス：ＮＯ
(v)フラグメント型：中間部
(xi)配列：ＮＯ：３：
0003795073.tif 000016
配列情報  ＮＯ：４：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：５アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ペプチド
(iii)ハイポセティカル：ＮＯ
(iv)アンチセンス：ＮＯ
(v)フラグメント型：中間部
(xi)配列：ＮＯ：４：
0003795073.tif 000017
配列情報  ＮＯ：５：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：３９塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ(Genomic)
(iii)ハイポセティカル：ＮＯ
(iv)アンチセンス：ＮＯ
(xi)配列：ＮＯ：５：
0003795073.tif 000018
配列情報  ＮＯ：６：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：４２塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ(Genomic)
(iii)ハイポセティカル：ＮＯ
(iv)アンチセンス：ＹＥＳ
(xi)配列：ＮＯ：６：
0003795073.tif 000019
配列情報  ＮＯ：７：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：４２塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ(Genomic)
(iii)ハイポセティカル：ＮＯ
(iv)アンチセンス：ＮＯ
(xi)配列：ＮＯ：７：
0003795073.tif 000020
配列情報  ＮＯ：８：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：４１塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ(Genomic)
(iii)ハイポセティカル：ＮＯ
(iv)アンチセンス：ＹＥＳ
(xi)配列：ＮＯ：８：
0003795073.tif 000021
配列情報  ＮＯ：９：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：４４塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ(Genomic)
(iii)ハイポセティカル：ＮＯ
(iv)アンチセンス：ＮＯ
(xi)配列：ＮＯ：９：
0003795073.tif 000022
配列情報  ＮＯ：１０：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：３５塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ(Genomic)
(iii)ハイポセティカル：ＮＯ
(iv)アンチセンス：ＹＥＳ
(xi)配列：ＮＯ：１０：
0003795073.tif 000023
配列情報  ＮＯ：１１：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：３７塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ(Genomic)
(iii)ハイポセティカル：ＮＯ
(iv)アンチセンス：ＮＯ
(xi)配列：ＮＯ：１１：
0003795073.tif 000024
配列情報  ＮＯ：１２：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：４４塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ(Genomic)
(iii)ハイポセティカル：ＮＯ
(iv)アンチセンス：ＹＥＳ
(xi)配列：ＮＯ：１２：
0003795073.tif 000025
配列情報  ＮＯ：１３：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：２４アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ペプチド
(iii)ハイポセティカル：ＮＯ
(iv)アンチセンス：ＮＯ
(v)フラグメント型
(xi)配列：ＮＯ：１３：
0003795073.tif 000026
配列情報  ＮＯ：１４：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：４１０６塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ(Genomic)
(iii)ハイポセティカル：ＮＯ
(iv)アンチセンス：ＮＯ
(vi)起源：
(A)生物名：Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
(xi)配列：ＮＯ：１４：
0003795073.tif 000027
0003795073.tif 000028
0003795073.tif 000029
配列情報  ＮＯ：１５：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：２５２６塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ(Genomic)
(iii)ハイポセティカル：ＮＯ
(iv)アンチセンス：ＮＯ
(vi)起源：
(A)生物名：Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
(xi)配列：ＮＯ：１５：
0003795073.tif 000030
0003795073.tif 000031
【図１】
0003795073.tif 000032
【図２】
0003795073.tif 000033
【図３】
0003795073.tif 000034
【図４】
0003795073.tif 000035
【図５】
0003795073.tif 000036
【図６】
0003795073.tif 000037