(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
変異により葉長が減少し、そして葉幅が縮小する植物遺伝子をコードするポリヌクレオチドであって、配列表の配列番号２の１位のＭｅｔから６９０位のＶａｌまでのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、または該アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む、ポリヌクレオチド。
【請求項２】
イネ由来の、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
配列表の配列番号１で示される、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規遺伝子に関する。より詳細には、植物において葉の形状を制御する機能を有するタンパク質をコードする新規遺伝子に関する。
【０００２】
【従来の技術】
トランスポゾンは、動物、酵母、細菌および植物のゲノムに遍在することが知られる変異誘発遺伝子である。トランスポゾンは、その転移（ｔｒａｎｓｐｏｓｉｔｉｏｎ）機構により２つのクラスに分類されている。クラスＩＩに属するトランスポゾンは、複製することなくＤＮＡの形態で転移する。クラスＩＩに属するトランスポゾンとして、トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）のＡｃ／Ｄｓ、Ｓｐｍ／ｄＳｐｍおよびＭｕ要素（Ｆｅｄｏｒｏｆｆ、１９８９、Ｃｅｌｌ  ５６、１８１−１９１；Ｆｅｄｏｒｏｆｆら、１９８３、Ｃｅｌｌ  ３５、２３５−２４２；Ｓｃｈｉｅｆｅｌｂｅｉｎら、１９８５、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２、４７８３−４７８７）、キンギョソウ（Ａｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ  ｍａｊｕｓ）のＴａｍ要素（Ｂｏｎａｓら、１９８４、ＥＭＢＯＪ、３、１０１５−１０１９）が知られている。クラスＩＩに属するトランスポゾンは、トランスポゾン・タッギングを利用する遺伝子単離に広く利用されている。この技術は、トランスポゾンがゲノム上で転移して、ある遺伝子中に挿入されると遺伝子の生理学的および形態学的変異が起こり、遺伝子が制御する表現型が変化することを利用する。この変化を検出することにより影響を受けた遺伝子を単離する（Ｂａｎｃｒｏｆｔら、１９９３、Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ、５、６３１−６３８；Ｃｏｌａｓａｎｔｉら、１９９８、Ｃｅｌｌ、９３、５９３−６０３；Ｇｒａｙら、１９９７、Ｃｅｌｌ、８９、２５−３１；Ｋｅｄｄｉｅら、１９９８、Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ、１０、８７７−８８７；Ｗｈｉｔｈａｍら、１９９４、Ｃｅｌｌ、７８、１１０１−１１１５）。
【０００３】
クラスＩに属するトランスポゾンは、レトロトランスポゾンとも呼ばれ、複製し、そしてＲＮＡ中間体を介して転移する。クラスＩトランスポゾンは、最初、ショウジョウバエおよび酵母で同定され、そして特徴付けられたが、最近の研究により植物ゲノム中に遍在し、そのかなりの部分を占めていることが明らかにされている（Ｂｅｎｎｅｔｚｅｎ、１９９６、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏ．、４、３４７−３５３；Ｖｏｙｔａｓ、１９９６、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７４、７３７−７３８）。レトロトランスポゾンの大部分は、非移動性の組み込みユニットであるようである。最近の研究は、これらのいくつかが、創傷、病原体の攻撃および細胞培養などのストレス条件下で活性化されることを示している（Ｇｒａｎｄｂａｓｔｉｅｎ、１９９８、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、３、１８１−１８７；Ｗｅｓｓｌｅｒ、１９９６、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．６、９５９−９６１；Ｗｅｓｓｌｅｒら、１９９５、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖｅｌ．５、８１４−８２１。例えば、タバコではＴｎｔ１ＡおよびＴｔｏ１（Ｐｏｕｔｅａｕら、１９９４、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．、５、５３５−５４２；Ｔａｋｅｄａら、１９８８、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、３６、３６５−３７６）、およびイネではＴｏｓ１７（Ｈｉｒｏｃｈｉｋａら、１９９６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３、７７８３−７７８８）について、ストレス条件下における活性化が報告されている。
【０００４】
イネのレトロトランスポゾンＴｏｓ１７は、最も良く研究されている植物中のクラスＩ要素である。Ｔｏｓ１７は、Ｔｙ１−ｃｏｐｉａ群レトロ要素の間の逆転写酵素ドメインの保存アミノ酸配列を基に作成された縮重プライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲ法によりクローン化された（Ｈｉｒｏｃｈｉｋａら、１９９２、Ｍｏｌ．  Ｇｅｎ．  Ｇｅｎｅｔ．、２３３、２０９−２１６）。Ｔｏｓ１７は、４．３ｋｂの長さの、２つの同じ１３８ｂｐのＬＴＲ（長鎖末端反復）および開始メチオニンｔＲＮＡの３’末端に相補的なＰＢＳ（プライマー結合部位）を持つ（Ｈｉｒｏｃｈｉｋａら、１９９６、上述）。Ｔｏｓ１７転写は、組織培養により強く活性化され、そして培養時間とともにそのコピー数を増加する。ゲノム研究のモデルジャポニカ品種である日本晴では、Ｔｏｓ１７の当初のコピー数は２であるが、組織培養後、再生した植物では、５〜３０コピーに増加している（Ｈｉｒｏｃｈｉｋａら、１９９６、上述）。酵母およびショウジョウバエで特徴付けられたクラスＩＩトランスポゾンとは異なり、Ｔｏｓ１７は、染色体中をランダムな様式で転移し、そして安定な変異を引き起こし、そしてそれ故、イネにおける遺伝子の機能解析の逆遺伝学（Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）における強力なツールを提供する（Ｈｉｒｏｃｈｉｋａ、１９９７、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３５，２３１−２４０；１９９９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｒｉｃｅ（Ｋ．Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ編集、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、４３−５８）。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、Ｔｏｓ１７を用いて提供される植物新規遺伝子を提供する。
【０００６】
本願発明者らは、イネにおいて、新たに転移したＴｏｓ１７コピーをもつ植物の表現型およびＴｏｓ１７標的部位の隣接配列の系統的な分析を鋭意重ねた結果、Ｔｏｓ１７挿入により、細葉イネ変異体を発見し、さらにこの変異の原因遺伝子をＴｏｓ１７を目印として単離し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明は、植物の葉の形状を制御する遺伝子をコードするポリヌクレオチドであって、配列表の配列番号２の１位のＭｅｔから６９０位のＶａｌまでのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、または該アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む、ポリヌクレオチドに関する。
【０００８】
好ましくは、このポリヌクレオチドは、イネに由来する。
【０００９】
好ましくは、このポリヌクレオチドは、配列表の配列番号１で示されるヌクレオチド配列を含む。
【００１０】
さらに、本発明は、植物における葉の形状の制御方法に関する。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明は、Ｔｏｓ１７を用いて提供される植物新規遺伝子、これを含むベクター、当該新規遺伝子で形質転換された植物、および当該新規遺伝子を植物に形質転換する工程を包含する、植物の改良方法を提供する。
【００１２】
本発明によれば、葉の形状を制御し得る植物遺伝子をコードするポリヌクレオチドが提供される。本願明細書で用いる用語「葉の形状を制御し得る」は、植物において、葉長および／または葉幅を変化させ、それによって光合成能力の向上、倒伏耐性の付与等をし得るように葉の形状を変化させ得ることをいう。用語「植物」は、単子葉植物、双子葉植物を包含する。
【００１３】
本発明の葉の形状を制御し得る植物遺伝子をコードするポリヌクレオチドは、代表的には、配列表の配列番号２の１位のＭｅｔから６９０位のＶａｌまでのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、または該アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む、ポリヌクレオチドである。
【００１４】
本発明の葉の形状を制御し得る植物遺伝子をコードするポリヌクレオチドは、植物において葉の形状を制御し得る限り、配列表の配列番号２の１位のＭｅｔから６９０位のＶａｌまでのアミノ酸配列と、少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、最も好ましは少なくとも９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを包含する。用語「配列の同一性」は、対比される２つのポリヌクレオチド配列が同一であることを意味し、対比される２つのポリヌクレオチド配列間の配列同一性の割合（％）は、対比される２つのポリヌクレオチド配列を最適に整列させた後、同一の核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、またはＩ）が両方の配列で生じて適合した位置の数を得て適合位置数とし、適合した位置の数を比較ポリヌクレオチド総数で除し、そして、この結果に１００を乗じて計算される。配列同一性は、例えば、以下の配列分析用ツールを用いて算出し得る：ＵｎｉｘベースのＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ（Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｍａｎｕａｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅＷｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ８、１９９４年９月、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ  Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、ＵＳＡ５３７１１；Ｒｉｃｅ、Ｐ．（１９９６）Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｍａｎｕａｌ  ｆｏｒ  ＥＧＣＧ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｐｅｔｅｒ  Ｒｉｃｅ、Ｔｈｅ  Ｓａｎｇｅｒ  Ｃｅｎｔｒｅ、Ｈｉｎｘｔｏｎ  Ｈａｌｌ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＣＢ１０  １ＲＱ、Ｅｎｇｌａｎｄ）およびｔｈｅ  ＥｘＰＡＳｙ  Ｗｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂ分子生物学用サーバー（Ｇｅｎｅｖａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  ａｎｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｖａ、Ｇｅｎｅｖａ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）。
【００１５】
本願明細書で用いる用語「制御配列」は、機能的プロモーターおよび、任意の関連する転写要素（例えば、エンハンサー、ＣＣＡＡＴボックス、ＴＡＴＡボックス、ＳＰＩ部位など）を有するＤＮＡ配列をいう。
【００１６】
本願明細書で用いる用語「作動可能に連結」は、遺伝子が発現し得るように、ポリヌクレオチドが、その発現を調節するプロモーター、エンハンサー等の種々の調節エレメントとが宿主細胞中で作動し得る状態で連結されることをいう。
【００１７】
制御配列のタイプおよび種類が、宿主細胞に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。例えば、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、ノパリンシンターゼプロモーターなどが当業者に周知である。植物体への遺伝子の導入には、当業者に公知の方法が用いられ得る。例えば、アグロバクテリウムを介する方法と直接細胞に導入する方法とが周知である。アグロバクテリウムを介する方法は、例えば、Ｎａｇｅｌらの方法（Ｍｉｃｒｉｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．、６７、３２５（１９９０））が用いられ得る。この方法は、まず、例えば発現ベクターをエレクトロポレーションによってアグロバクテリウムに形質転換し、ついで、形質転換されたアグロバクテリウムをＰｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＢｉｏｌｏｇｙＭａｎｕａｌ（Ｓ．Ｂ．Ｇｅｌｖｉｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）に記載の方法で植物細胞に導入する方法である。遺伝子を直接細胞に導入する方法としては、エレクトロポレーション法、遺伝子銃法が知られている。
【００１８】
遺伝子が導入された細胞は、まずハイグロマイシン耐性等の薬剤耐性で選択され、ついで、常法により、植物体に再生され得る。
【００１９】
本明細書中、以下で使用される名称、および以下で記載される実験室手順は、当該分野で周知で一般的に用いられる手順を使用する。標準的な技術は、組換え法、ポリヌクレオチド合成、ならびに微生物培養および形質転換（例えば、エレクトロポレーション）について使用される。この技術および手順は、一般的に、当該分野、およびこの書類を通じて提供される種々の一般的な参考文献（一般的には、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版（１９８９）  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．を参照。これらは、本明細書中で参考として援用される。
【００２０】
本発明のポリヌクレオチドは、代表的には、本明細書に記載の方法に従って得られるが、本発明に開示された配列を基に、化学合成によっても得られ得る。例えば、本発明のポリヌクレオチドは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏ  Ｓｙｓｔｅｍｓのポリヌクレオチド合成機を用いて製造業者によって提供される仕様書に従って合成され得る。
【００２１】
ＰＣＲ増幅の方法は、当該分野で周知である（ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ、ＨＡ  Ｅｒｌｉｃｈ編、Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ、ＮｅｗＹｏｒｋ、ＮＹ（１９９２）；ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｉｎｎｉｓ、Ｇｅｌｆｌａｎｄ、Ｓｎｉｓｋｙ、およびＷｈｉｔｅ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ（１９９０）；Ｍａｔｔｉｌａら（１９９１）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １９：  ４９６７；Ｅｃｋｅｒｔ、Ｋ．Ａ．およびＫｕｎｋｅｌ、Ｔ．Ａ．（１９９１）ＰＣＲＭｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  １：  １７；ＰＣＲ、ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ、Ｑｕｉｒｋｅｓ、およびＴａｙｌｏｒ、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、これらは、本明細書中で参考として援用する。
【００２２】
【実施例】
以下、本願発明を実施例を挙げて説明する。以下の実施例は、本発明の例示するものであって、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００２３】
（実施例１）培養によるＴｏｓ１７の活性化
ジャポニカ種の変種Ｎｉｐｐｏｎｂａｒｅの完熟種子を出発材料に用い、先に記載のように（Ｈｒｏｃｈｉｋａら、１９９６、前述）カルス開始培養および細胞懸濁培養を行った。Ｔｏｓ１７の活性化は、大槻（１９９０）の方法（イネ・プロトプラスト培養系、農林水産技術情報協会）に従って行った。要約すれば、イネの完熟種子を２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）（２ｍｇ／ｍｌ）を添加したＭＳ培地（大槻（１９９０）、前述）で培養し（２５℃、１ヶ月間）、カルス誘導を行った。得られたカルスを、２，４−Ｄを添加したＮ６液体培地（大槻（１９９０）、前述）で５ヶ月間培養したのち、再分化培地（大槻（１９９０）、前述）に移し再分化イネ（第１世代（Ｒ１）植物）を得た。
【００２４】
（実施例２）細葉変異体の単離および同定
得られたＲ１イネの各々を１株とし、それぞれの株から約１０００個のＲ１種子を回収し、圃場に展開し第２世代（Ｒ２）植物を得て形態分析を行った。Ｒ２集団の各植物の表現型を観察した結果、１つの株ＮＣ０６０８のＲ２集団の約１／４が図１に見られるような「細葉」様の表現型を示すことが観察された。野生型（図１右）に比べて、Ｔｏｓ１７挿入細葉変異体（図１左）では、圃場において、その葉長が止葉およびその下位第３葉まで全て約９０％に縮小し、そして葉幅は止葉およびその下位第３葉まで順に野生型の約７８％、７０％、７１％、６９％にまで縮小した。このことは、ＮＣ０６０８の細葉化が、単一の遺伝子座の劣性変異により引き起こされることを示唆していた。
【００２５】
（実施例３）細葉変異の原因遺伝子の単離
実施例２で得られたＮＣ０６０８株の示す細葉変異の原因遺伝子を同定単離するために、細葉変異が分離する集団を用いてＴｏｓ１７遺伝子との連鎖解析を行った。単一の遺伝子座の劣性変異により引き起こされることを示すために、まず、ＮＣ０６０８株におけるＴｏｓ１７が転移挿入された標的部位（Ｔｓ）の隣接部位を増幅した。
【００２６】
実施例２で得られたＲ２イネ（ＮＣ０６０８株の自殖後代）の集団から細葉変異を示す個体と正常個体とを識別し、それぞれからＣＴＡＢ法（ＭｕｒｒａｙおよびＴｈｏｍｐｓｏｎ、１９８０、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．８、４３２１−４３２５）によりＤＮＡを調製した。細葉変異を示す個体と正常個体から得られたＤＮＡを、それぞれ制限酵素ＸｂａＩで切断し、アガロース電気泳動後、ナイロンメンブレンに吸着させた。Ｔｏｓ１７をＸｂａＩとＢａｍＨＩによって得られるＤＮＡ断片を32Ｐ−ｄＣＴＰで標識してプローブとして用いて、サザンハイブリダイゼーションを行った（図２左）。図２左に示されるサザン解析のオートラジオグラムに示されるように、矢印で示されるＴｏｓ１７のバンド（約６６００ｂｐ）は細葉変異体ではホモとして観察されたが、正常個体ではホモとして観察されず、そして矢印で示されるＴｏｓ１７のバンドは細葉変異表現型と完全に連鎖していたことがわかった。これらの結果より、矢印で示されるＴｏｓ１７プローブとハイブリダイズするバンドで示されるＤＮＡが細葉変異を引き起こす原因遺伝子を含み、このバンドで表されるゲノム領域にＴｏｓ１７が挿入し、遺伝子型がホモになる際に細葉変異体が生じると結論された。そこでこのＤＮＡを鋳型としてＴＡＩＬ−ＰＣＲによりＴｏｓ１７に隣接する配列、つまり細葉変異の原因遺伝子の一部の単離を行った。Ｔｏｓ１７標的部位配列の増幅は、総ＤＮＡを用いるＴＡＩＬ−ＰＣＲ（Ｌｉｕ  Ｙ−Ｇ．ら、１９９５、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、２５、６７４−６８１、Ｌｉｕ  Ｙ−Ｇ．ら、１９９５、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．、８、４５７ー４６３）により実施した。要約すれば、まず、新たなＴｏｓ１７標的部位を持つ再生植物からの総ＤＮＡを鋳型として用い、以下に示す３セットのプライマーを用いる３回のＴＡＩＬ−ＰＣＲにより増幅反応を行った。第１回：Ｔｏｓ１７  Ｔａｉｌ３、ＧＡＧＡＧＣＡＴＣＡＴＣＧＧＴＴＡＣＡＴＣＴＴＣＴＣおよびＡＤ１（ａｒｂｉｔｒａｒｙ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ｐｒｉｍｅｒ１）  ＮＧＴＣＧＡ（Ｇ／Ｃ）（Ａ／Ｔ）ＧＡＮＡ（Ａ／Ｔ）ＧＡＡ。第２回：Ｔｏｓ１７  Ｔａｉｌ４、ＡＴＣＣＡＣＣＴＴＧＡＧＴＴＴＧＡＡＧＧＧおよびＡＤ１。第３回：Ｔｏｓ１７  Ｔａｉｌ５、ＣＡＴＣＧＧＡＴＧＴＣＣＡＧＴＣＣＡＴＴＧおよびＡＤ１。次にそれぞれのＴＡＩＬ−ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動後に簡易カラム精製し、直接的にシークエンサー（ＡＢＩ社、Ｍｏｄｅｌ３７７）を用いて配列を決定した。
【００２７】
ＮＣ０６０８株におけるＴｏｓ１７の隣接配列の配列決定の結果、４つの新たなＴｏｓ１７挿入の標的（Ｔｓ）部位が確認された。
【００２８】
次いで、Ｔｏｓ１７の隣接配列の１つ、ＮＣ０６０８＿０＿１０２をサブクローニングしてプローブとして用いたサザン解析を行った。結果を図２の右に示す。図２の右のオートラジオグラムに示されるように、Ｔｏｓ１７隣接配列ＮＣ０６０８＿０＿１０２は、Ｔｏｓ１７をプローブとして用いたサザン解析と同じ位置にあるＤＮＡ断片とハイブリダイズした。これは調べられた６２株についてすべて一致した結果を与えた。このことは、サブクローンＮＣ０６０８＿０＿１０２が細葉変異の原因遺伝子の一部を含み、ＮＣ０６０８＿０＿１０２が細葉変異の原因遺伝子の隣接配列であることを示す。
【００２９】
（実施例４）細葉変異の原因遺伝子の構造解析
実施例３で得られた隣接配列を手がかりに、ｃＤＮＡライブラリーとＣａｐ  Ｓｉｔｅ  ｃＤＮＡ（Ｎｉｐｐｏｎｇｅｎｅ）を用いたＰＣＲスクリーニングにより、隣接配列ＮＣ０６０８＿０＿１０２を含む遺伝子から転写されるｃＤＮＡの完全な構造決定を試みた。また野生型（日本晴）ＤＮＡを鋳型として、ｃＤＮＡから設計されたプライマーを用いたＰＣＲと前述のＴＡＩＬ−ＰＣＲにより、ＮＣ０６０８＿０＿１０２を含む遺伝子のゲノミックＤＮＡの完全な構造決定を試みた。
【００３０】
ｃＤＮＡライブラリーは、当研究室で先に調製されたものを用いた。調製法を要約すると、まず、ＩＳＯＧＥＮ溶液（Ｎｉｐｐｏｎｇｅｎｅ）を用いて、前述のＭＳ培地で培養させた野生型イネのカルスから総ＲＮＡを抽出した。ｍＲＮＡ精製キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に含まれるオリゴ（ｄＴ）セルロースカラムを用いて、総ＲＮＡからポリ（Ａ）ｍＲＮＡを得た。得られたポリ（Ａ）ｍＲＮＡから常法に従いｃＤＮＡを合成し、ｃＤＮＡライブラリーをＨｙｂｒｉ  ＺＡＰ−ＩＩベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中に構築した。
【００３１】
隣接配列ＮＣ０６０８＿０＿１０２を含む遺伝子のｃＤＮＡおよびゲノミックＤＮＡは以下に示すそれぞれ４段階、３段階のＰＣＲによりそれぞれ部分的に増幅され、その全ての増幅断片が３７７シークエンサー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いてその両方向について配列決定された。
ｃＤＮＡ
第１段階：ｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、隣接配列ＮＣ０６０８＿０＿１０２に特異的な以下に示す１対のプライマーを用いてＰＣＲを行い、この隣接配列の一部がｃＤＮＡライブラリーに含まれていることを確認した：ＮＣ０６０８＿０＿１０２Ｆ  ＡＣＧＧＡＧＡＣＡＣＣＴＣＧＴＡＡＡＣＣ、およびＮＣ０６０８＿０＿１０２Ｒ１  ＡＡＧＧＣＣＧＡＣＴＡＴＴＧＴＴＧＡＣＣ。
第２段階：ｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、Ｈｙｂｒｉ  ＺＡＰ−ＩＩベクターに特異的なプライマー、Ｈｙｂｒｉ  ＺＡＰ  Ｂ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）およびＮＣ０６０８＿０＿１０２Ｆを用いてＰＣＲを行い、ＮＣ０６０８＿０＿１０２と一部が重複し、ポリ（Ａ）結合部位を伴うｃＤＮＡの３’領域を含む断片を得た。
第３段階：ｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、Ｈｙｂｒｉ  ＺＡＰ−ＩＩベクターに特異的なプライマー、Ｈｙｂｒｉ  ＺＡＰ  Ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）およびＮＣ０６０８＿０＿１０２に特異的なプライマー、ＮＣ０６０８＿０＿１０２Ｒ２  ＣＣＴＧＣＡＡＴＧＴＴＡＣＣＴＣＴＧＧＣを用いたＰＣＲにより、ＮＣ０６０８＿０＿１０２と一部が重複する５’側の断片を得た。
第４段階：Ｃａｐ  Ｓｉｔｅ  ｃＤＮＡ（Ｎｉｐｐｏｎｇｅｎｅ）を鋳型として、Ｃａｐ  Ｓｉｔｅ特異的プライマー、１ＲＣ２（Ｎｉｐｐｏｎｇｅｎｅ）および第３段階で得られた断片に特異的なプライマー（ＴＧＡＣＡＧＧＴＣＡＧＡＣＴＧＡＴＣＡＡＣＣＧＧ）を用いたＰＣＲにより、第３段階で得られた断片と一部が重複し、転写開始点（ｃａｐ  ｓｉｔｅ）を伴うｃＤＮＡの５’領域を含む断片を得た。
ゲノミックＤＮＡ
第１段階：日本晴の総ＤＮＡを鋳型として、以下に示す２セットのプライマーを用いる２回のＴＡＩＬ−ＰＣＲを行い、ＮＣ０６０８＿０＿１０２と一部が重複する５’側の断片を得た。第１回：ＮＣ０６０８＿０＿１０２Ｒ２および実施例３で用いたＡＤ１。第２回：ＮＣ０６０８＿０＿１０２Ｒ３  ＴＡＧＧＣＡＡＴＣＣＧＧＣＡＡＴＧＴＣＣおよびＡＤ１。
第２段階：日本晴の総ＤＮＡを鋳型として、第１段階で得られた断片に特異的なプライマー（ＣＴＡＧＡＡＧＣＡＡＡＡＴＣＴＴＧＡＡＧＣＴＧＣ）およびｃＤＮＡ第４段階で得られた断片に特異的なプライマー（ＡＧＴＧＴＴＣＴＴＣＧＣＡＣＣＴＣＧＣＧ）を用いたＰＣＲにより、第１段階で得られた断片と一部が重複する５’側の断片を得た。
第３段階：日本晴の総ＤＮＡを鋳型として、第２段階で得られた断片に特異的なプライマー（ＴＧＣＣＴＣＧＣＣＣＴＣＧＧＣＧＡＴＧＧ）およびｃＤＮＡ第４段階で得られた断片の５’末端領域特異的プライマー（ＡＡＴＡＴＴＴＣＡＡＡＴＣＡＣＡＣＴＡＣ）を用いたＰＣＲにより、第２段階で得られた断片と一部が重複する５’側の断片を得た。
【００３２】
細葉遺伝子のｃＤＮＡおよびゲノミックＤＮＡの構造をまとめて図３に示した。この遺伝子は１１のイントロンをもち、６９０アミノ酸をコードしており、データベースには類似の遺伝子の登録がないことから、全く新規の遺伝子であることがわかった。Ｔｏｓ１７は第１２エキソン領域の５’末端から９−１０塩基間に挿入していた。この遺伝子がコードするアミノ酸配列は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ．における機能未定の遺伝子と非常に高い相同性を示した。
【００３３】
上記の実施例は、本発明の種々の局面、および本発明の特定のオリゴヌクレオドがどのように作成され、および利用されるのかを例示して記載している。本発明の範囲を制限するものではない。
【００３４】
【発明の効果】
植物育種に利用可能な葉の形状を制御し得る新規ポリヌクレオチドが提供される。当該ポリヌクレオチドを植物に導入し、葉の形状を人為的に制御することにより、光合成効率の向上、倒伏耐性の付与等が可能になると期待される。
【００３５】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】Ｔｏｓ１７挿入細葉変異体、および野生型イネの植物体を示す写真である。向かって左は、Ｔｏｓ１７挿入細葉変異体、そして右は、野生型の植物体である。
【図２】細葉変異体ＮＣ６０８株の自殖後代（Ｒ２集団）から抽出したＤＮＡと野生型イネから抽出したＤＮＡのサザン分析のオートラジオグラムを示す図である。左は、Ｔｏｓ１７をプローブとして用い、右はＴｏｓ１７挿入部位隣接配列の１つのＮＣ０６０８＿０＿１０２をサブクローニングしプローブとして用いて行ったサザン分析のオートラジオグラムを示す。Ｍで示されるレーンは、λ／ＨｉｎｄＩＩＩマーカーのレーン、Ｃで示されるレーンは、野生型イネ（日本晴）から得たＤＮＡを泳動したコントロールレーン、そしてｍｔで示されるレーンは、細葉変異体から得たＤＮＡを泳動したレーンである。
【図３】本発明の葉の形状を制御する遺伝子の構造の概略を示す図である。図中の白い箱は、イントロンを示し、そして黒い箱はエキソンを示す。図右側の、第１２エキソンの上にある下向きの矢印は、Ｔｏｓ１７の挿入位置を示す。５’末端および３’末端近傍にある２つの下向きの小さい矢印は、開始または終結コドン部位をそれぞれ示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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