(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
a) 下部基板;
b) 上記下部基板の表面上に形成される電極層;
c) 上記電極層の一部表面に形成され、電極層を電極系および回路連結部に分離させ電極面積を一定にする絶縁膜の役割をする接着剤;
d) 上記接着剤によって固定される電極系の表面上に形成される多孔性薄膜;
e) 上記多孔性薄膜上に形成され試料注入穴を備えた上部基板;および
f) 上記上部基板の穴に試料を導入するための両端が開いた状態の試料注入口が形成された別途の上部基板
を含み、
上部電極系および多孔性薄膜中少なくても一方は、センサー物質を含み、
摂取された全血が上記多孔性薄膜によってクロマトグラフィー的に移動し、血漿だけ電極系と接触するようにする
多孔性薄膜内蔵型バイオセンサー。
【請求項２】
a) 下部基板10; b) 上記下部基板上にJ 字形の作動電極連結線11′、補助電極連結線12′、基準電極連結線13′が形成され、各々の電極連結線にしたがって作動電極11および基準電極13が形成され; c) 酸化酵素および電子伝達媒介体は、上記作動電極上に固定させるか、または多孔性薄膜16上に固定させられ、このような多孔性薄膜16が積層され、上記多孔性薄膜を除外した部分を接着剤17で固定し; d) Y字形電極連結線20の一端に補助電極12を形成させた上部基板の穴18があけられた上部基板10′; が積層された３電極系の対面形バイオセンサー。
【請求項３】
上記バイオセンサーが a) 下部基板10; b) 上記下部基板上にJ字形の作動電極連結線11′、補助電極連結線12′、基準電極連結線13′が形成され、各々の電極連結線にしたがって作動電極11および基準電極13が形成され; c) 酸化酵素および電子伝達媒介体は、上記作動電極上に固定させるか、または多孔性薄膜16上に固定させられ、このような多孔性薄膜16が積層され、上記多孔性薄膜を除外した部分を接着剤17で固定し; d)試料注入口でY字形の対称に配列される電極連結線20の末端に補助電極12を形成させた上部基板の穴18があけられた上部基板10′; e) 一直線の両端が開いた状態の試料注入口14を含んでいる接着剤17で固定させた別途上部基板10″が順次的に積層され試料導入方向が左・右末端部である第１項記載の３電極系の対面形バイオセンサー。
【請求項４】
上記バイオセンサーが、a) 下部基板10; b) 上記下部基板上に補助電極連結線12′と作動電極連結線11′とその端末に作動電極11を形成され、上記補助電極連結線12′は、上部基板10′上に位置する電極連結線20の末端に連結され電流が流れるようになり; c) 酸化酵素および電子伝達媒介体は、上記作動電極上に固定させたりまたは多孔性薄膜16上に固定させられ、このような多孔性薄膜16が積層され、上記多孔性薄膜を除外した部分を接着剤17で固定し; d) 試料注入口でY字形の対称に配列される電極連結線20の末端に補助電極12を形成させた上部基板の穴18があけられた上部基板10′; e) 一直線の両端が開いた状態の試料注入口14を含み、接着剤17で固定させた別途上部基板10″が順次的に積層された、第１項記載の２電極系の対面形バイオセンサー。
【請求項５】
上記バイオセンサーが、a) 下部基板10; b) 上記下部基板上に補助電極連結線12′と作動電極連結線11′とその端末に作動電極11を形成させ; c) 酸化酵素および電子伝達媒介体は、上記作動電極上に固定させたりまたは多孔性薄膜16上に固定させられ、このような多孔性薄膜16が積層され、上記多孔性薄膜を除外した部分を接着剤17で固定し; d) 試料注入口でY字形の対称に配列される電極連結線20の末端に補助電極12を形成させた上部基板の穴18があけられた上部基板10′; e) 一直線の両端が開いた状態の試料注入口14を含み、接着剤17で固定させた別途上部基板10″が順次的に積層され、全電極部が炭素インクだけで構成された、第１項記載の２電極系の対面形バイオセンサー。
【請求項６】
上記バイオセンサーが a) 下部基板10; b) 上記下部基板上にJ 字形の作動電極連結線11′、補助電極連結線12′、基準電極連結線13′が形成され、各々の電極連結線にしたがって作動電極11および基準電極13が形成され; c) 酸化酵素および電子伝達媒介体は、上記作動電極上に固定させるか、または多孔性薄膜16上に固定させられ、このような多孔性薄膜16が積層され、上記多孔性薄膜を除外した部分を接着剤17で固定し; d) 試料注入口でY字形の対称に配列される電極連結線20上に補助電極12を形成させた上部基板の穴18があけられた上部基板10′; e) 試料注入口14を接着剤17で固定し、円形の別途上部基板10″が順次的に積層された、第１項記載の３電極系の対面形バイオセンサー。
【請求項７】
上記バイオセンサーが a) 下部基板10; b) 上記下部基板上に作動電極連結線11′、補助電極連結線12′が形成され、各々の電極連結線にしたがって作動電極11が形成され; c) 酸化酵素および電子伝達媒介体は、上記作動電極上に固定させるか、または多孔性薄膜16上に固定させられ、このような多孔性薄膜16が積層され、上記多孔性薄膜を除外した部分を接着剤17で固定し; d) 試料注入口でY字形の対称に配列される電極連結線20上に補助電極12を形成させた上部基板の穴18があけられた上部基板10′; e) 試料注入口14を接着剤17で固定し、円形の別途上部基板10″が順次的に積層された、第１項記載の２電極系の対面形バイオセンサー。
【請求項８】
a) 多孔性薄膜16でできた下部基板上に、b) 絶縁膜15を形成し、そして作動電極連結線11′、補助電極連結線12′、基準電極連結線13′上に炭素インクで塗布された作動電極11、補助電極12および塩化銀を塗布した基準電極13、別途の前処理層19; c) 一直線の両端が開いた状態の試料注入口14を含み、接着剤17で固定させた、別途上部の基板10″が、順次的に積層された３電極系の平面形バイオセンサー。
【請求項９】
a) 多孔性薄膜16でできた下部基板上に、b) 絶縁膜15を形成し、そして補助電極連結線12′および作動電極連結線11′とその末端に各々補助電極12および作動電極11が形成され;  別途の前処理層19; c) 一直線の両端が開いた状態の試料注入口14を含み、接着剤17で固定させた、別途上部の基板10″が、順次的に積層された２電極系の平面形バイオセンサー。
【請求項１０】
上記多孔性薄膜が、直径5μｍないし20μｍの空隙を使用することを特徴とする、第１項〜第９項の何れかに記載のバイオセンサー。
【請求項１１】
上記多孔性薄膜16が、紙、親水性有機高分子または吸湿性セラミック高分子で構成される群から選ばれることを特徴とする第１項〜第９項の何れかに記載のバイオセンサー。
【請求項１２】
上記親水性有機高分子または吸湿性セラミック高分子が、ナイロン、親水性ポリエステルスルホン膜、親水性混合セルロースエステル、ポリテトラフルオロエチレン膜、ポリビニリデンフロライド膜、イオン選択性膜、ガラス繊維、ポリエステル繊維質または改質された融合体から選ばれ、使用されることを特徴とする第１１項記載のバイオセンサー。
【請求項１３】
上記多孔性薄膜16が、ニトロセルロース紙、ポリエステル繊維質及び改質された融合体または類似性質の濾紙が使用されることを特徴とする第１項〜第９項の何れかに記載のバイオセンサー。
【請求項１４】
上記酸化酵素が、グルコース酸化酵素、ラクタート酸化酵素(lactate oxidase)、コレステロール酸化酵素(cholesterol oxidase)、グルタメート酸化酵素(glutamate oxidase)、過酸化水素酸化酵素(horse radish peroxidase)およびアルコール酸化酵素(alcohol oxidase)で構成された群から選択された酸化酵素である ことを特徴とする、第１項〜第９項の何れかに記載のバイオセンサー。
【請求項１５】
上記電子伝達媒介体が、ヘキサアミン塩化ルテニウム(III)(hexaammine ruthenium(III)chloride)、フェリシアン化カリウム(potassium ferricyanide)、フェロシアン化カリウム(potassium ferrocyanide)、ジメチルフェロセン(dimethylferrocene(DMF))、フェリシニウム(ferricinium)、フェロセンモノカルボキシル酸(ferocene-monocarboxylic-acid(FCOOH))、7,7,8,8,-テトラシアノキノジメタン(7,7,8,8-tetracyanoquinodimethane(TCNQ))、テトラチアフルバレン(tetrathiafulvalene(TTF))、ニッケロセン(nickelocene(Nc))、N-メチルアシディニウム(N-methylacidinium(NMA+))、テトラチアテトラセン(tetrathiatetracene(TTT))、N-メチルフェナジニウム(N-methylphenazinium (NMP+))、ヒドロキノン(hydroquinone)、3-ジメチルアミノ安息香酸(3-dimethylaminobenzoic acid(MBTHDMAB))、3- メチル-2-ベンゾチオゾリノンヒドラゾン(3-methyl-2-benzothio zolinone hydrazone)、2-メトキシ-4-アリルフェノール(2-methoxy-4-allylphenol)、4-アミノアンチピリン(4-aminoantipyrine(AAP))、ジメチルアニリン(dimethylaniline)、4-アミノアンチピレン(4-aminoantipyrene)、4-メトキシナフトール(4-methoxynaphthol)、3,3′,5,5′-テトラメチルベンジジン(3,3′,5,5′-tetramethyl benzidine(TMB))、2,2-アジノ-ジ-[3-メチル-ベンゾトリアゾリンスルホナート] (2,2-azino-di-[3-ethyl-benzothiazoline sulfonate])、o-ジアニシジン(o-dianisidine)、o-トルイジン(o-toluidine)、2,4-ジクロロフェノール(2,4-dichloro-phenol)、4-アミノフェナゾン(4-aminophenazone)、ベンジジン(benzidine)、プルシアンブルー(prussian blue)等で、酸化−還元双を成すことができる混合電子価化合物(mixed-valence compound)で構成される群から選択されることを特徴とする、第１項〜第９項の何れかに記載のバイオセンサー。
【請求項１６】
電極基板が、セラミック、プラスチック、シリコン、アルミナガラス板または高分子材料で構成されることを特徴とする、第１項記載のバイオセンサー。
【請求項１７】
上記保護膜22が、ポリエステル、ポリビニルクロライド(polyvinyl chloride)およびポリカーボネイト(polycarbonate)等の有機高分子材料を使用することを特徴とする、第１項記載のバイオセンサー。
【請求項１８】
化学的真空蒸着法またはプラズマ蒸着法で、多孔性薄膜上に直接に電極を形成することを特徴とする、第1項記載のバイオセンサー。
【請求項１９】
試料注入口14が、表面界面活性剤またはその他の方法で、改質して測定血液試料の移動性を増加させたことを特徴とする、第１項記載のバイオセンサー。
【請求項２０】
試料注入口14の末端部位にホームや他の付着物を導入した試料注入口の一部変形、大きさの変形、多孔性薄膜覆いに形成した穴の形態および位置の変形、試料注入口の形態変形を試みたことを特徴とする第１項記載のバイオセンサー。
【請求項２１】
多様な妨害物質を除去するための前処理過程として、試料注入口に試料層を導入することによって、測定の便宜性、正確性および精密性を増大させた第１項記載のバイオセンサー。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、a) 一つ以上の基板; b) 上記基板の表面上に形成される電極層; c)上記電極層の一部表面に形成され電極層を電極系および回路連結部に分離させる絶縁膜および、d) 絶縁膜によって生成された電極系の表面上に形成される多孔性薄膜を含み、上記多孔性薄膜の表面上に形成され多孔性薄膜を保護する保護膜または多孔性薄膜を保護すると同時に試料導入を可能にする試料注入口を含み、上部基板をさらに含むことにより、採取された全血が上記多孔性薄膜によってクロマトグラフィー的に移動し、血漿だけが電極系と接触するようにする多孔性薄膜内蔵型バイオセンサーに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
最近、糖尿病を診断し、予防するにあたり血液内のグルコース量を週期的に測定しなければならない必要性が増大している。従来、血液内グルコース量を測定機械としてストリップ形測定器があり、作動原理は、測色(colorimetric)方法または電気化学的(electrochemical)方法に基づいていた。
【０００３】
測色原理は、下記反応式 1のグルコース酸化酵素−測色反応に依存する。
【０００４】
（反応式１）
グルコース + Ｏ2  -----> グルコン酸+Ｈ2Ｏ2(グルコース酸化酵素触媒反応)Ｈ2Ｏ2+酸素受容体 -----> (酸化された)酸素受容体+２Ｈ2Ｏ(ペルオキシダーゼ触媒反応)
【０００５】
血液試料内のグルコースは、酸素存在下でグルコース酸化酵素の触媒反応によって酸化され、グルコン酸(gluconic acid)および過酸化水素(hydrogen peroxide)を発生させ、生成された過酸化水素は、ペルオキシダーゼの触媒反応によって酸素受容体(発色体)に酸素分子を伝達し、その結果、酸化された発色体は、発色し、発色強度を測定して血液試料のグルコースを定量する。しかし、上記測色原理は、血液試料の運搬、前処理、試料の量、反応時間および発色開始時間等が正確に調節されなければならないだけではなく、血液凝固または尿酸(uric acid)、アスコルビン酸(ascorbic acid)およびビリルビン(bilirubin)等の妨害物質によって発色反応が妨害されることがある。
【０００６】
また、随伴される光度測定法は、分析試料の低濃度と高濃度で正確性および精密度が低下する原理的限界を持っており、上記測色方法は、正確な数値測定には不適合であると知られている。
【０００７】
上記測色方法による問題点を解決するために、高い選択性と感度を持ち、試料が混濁しても試料を別途の前処理無しに使用可能で、短時間内に正確な測定が可能な電気化学的原理に基づくバイオセンサーが導入された。第2世代バイオセンサーの例として、電気化学的原理を下記反応式2を参考にして説明する。第2世代バイオセンサーは、電子伝達媒介体としてフェロセン(ferrocene)、フェロセン誘導体、キノン(quinones)、キノン誘導体、有機伝導性塩(organic conducting salt)、またはビオローゲン(viologen)等を使用し、電子伝達媒介体に酸素を利用する第1世代バイオセンサーと対比される。
【０００８】
（反応式 2）
グルコース + GOx-FAD   -->   グルコン酸 + GOx-FADH2
GOx- FADH2 + 電子伝達媒介体(酸化状態)  -->  GOx-FAD+電子伝達媒介体(還元状態)
【０００９】
上記反応式2で、GOxは、グルコース酸化酵素を示し、GOX-FADおよびGOX-FADH2は、各々グルコース酸化酵素の活性部位のFAD(flavin adeninedi nucleotide)の酸化状態および還元状態を示す。図1での電子伝達媒介体にルテニウムを例に説 明すると、グルコース酸化酵素の触媒作用によってグルコースは、グルコン酸に酸化される。この時、グルコース酸化酵素の活性部位のFADが還元され、FADH2になる。還元されたFADH2は、電子伝達媒介体との酸化還元反応を起しFADH2は、FADに酸化され、電子伝達媒介体は、還元される。還元状態の電子伝達媒介体は、電極表面まで拡散される。この時電極表面で還元状態の電子伝達媒介体の酸化電位を印加して生成される電流を測定する。この時、酸化電位は、基準電極対比-0.2Vないし0.2Vで印加し、血液試料中の妨害物質として作用する酸化電位が各々0.3V、0.4Vのアスコルビン酸および尿酸の影響を除去できる。
【００１０】
したがって、第2世代のバイオセンサーは、第1世代バイオセンサーとは違って酸素による影響を減らすことができ、適切な酸化還元電位を持つ電子伝達媒介体を使用することによって、妨害物質による誤差を減らし、分析物質の正確な測定が可能である。しかし、第2世代バイオセンサーの作動において、酸化酵素およ び電子伝達媒介体間の電子伝達反応後、電子伝達媒介体は、電極表面まで拡散されなければなれないため、電子伝達媒介体を過量注入しなければならず、上記過量使用は、酸化酵素の3次元的構造に変形を起し、酸化酵素の活動度(activity) を低下させる問題点がある。また、大部分の電子伝達媒介体は、血液内の電極活性物質と反応するという短所がある。
【００１１】
現在商用化されているグルコースセンサーは、大部分第2世代バイオセンサーであり、商用化されたグルコースセンサーに使用されている電子伝達媒介体は、血液内妨害物質のアスコルビン酸、アセトアミノフェンおよび尿酸の酸化電位と似た電位で酸化されるため、血液内妨害物質による影響を完全に除去することはできない。また、商用化されたグルコースセンサーは、血液試料を一定に導入するために毛細管現象(capillarity)を利用して血液試料を導入する方式を採用している。上記方法を具現するために疏水性(hydrophobic)支持体上に親水性(hydrophilic)高分子をコーティングしなければならない過程が要求され、製作過程が複雑になる短所がある。
【００１２】
最近では、妨害物質を除去する方法として免疫クロマトグラフィー(immunochromatograph)を利用して多孔性薄膜上段部に電極体を形成し、下段部に試料前処 理層をおき、試料のクロマトグラフィー的移動を通して特別な前処理方法を経ずに試料中の測定対象物質による電気量の変化として、試料中対象物質を定量できると報告されたことがある(Cui, G. ; Kim, S. J. ; Choi, S. H. ; Nam, H. ; Cha, G.  S. ; Paeng, K.-J., Anal. Chem., 2000,  72, 1925-1929, Cha, G. S.  et al., U. S. Patent 09/381788, 1999, Farm, M. L. ; Road, O. H. ; Park, H. et al.,  International Patent WO 00/00827 2000)。
【００１３】
上記クロマトグラフィー的試料移動方法は、多孔性薄膜に電極体および前処理層を導入し処理する工程上の短所を持っており、これを解決するためにプラスチック基板上に電極体を形成し、試料導入部分に多孔性薄膜を使用した例もあるが、上記方法は、電極体および試料導入部分の多孔性薄膜の接着が不良になり、センサーの再現性が落ちるという短所を持っていた。
【００１４】
また、免疫クロマトグラフィーを利用したバイオセンサーは、多孔性薄膜下段部に前処理層があり、試料が前処理層を通過して電極表面まで到達するのに時間が長くかかり、測定時間が長いという短所を持っていた。
【００１５】
上記の問題点を解決できる方法として本発明者達は、クロマトグラフィー的に血球と血漿を分離して試料を注入させられる多孔性薄膜を電極上に置いて、これらを他の覆いで圧着して製作したバイオセンサーを提示したことがある(大韓民国特許第2000-41962号)。また、多孔性薄膜にルテニウム系統の電子伝達物質を使用して酸化電位を低めることによって、妨害物質に対する誤差を減らすことができた。
【００１６】
しかし、多孔性薄膜内蔵型バイオセンサーは、血球/血漿比による誤差と簡単に酸化する物質による誤差を画期的に減らすことができ、固定された酵素および電極活性物質等を密閉された二枚の板の間に挿入することにより、外部大気から隔離し、別途の包装することなしに寿命を延長させられた反面、粘性が大きい血液試料を導入することが難しい短所を持っていた。
【００１７】
それで、本発明者達は、上記の問題点を解決するために努力中、a) 基板; b) 上記基板の一端にセンサー物質を含む電極系; c) 上記電極系上に酸化酵素および電子伝達媒介体を持った多孔性薄膜; および d) 上記多孔性薄膜の同じ大きさの保護膜; または試料注入口が含まれた上部基板が順次的に積層されたバイオセンサーを製作し、血液試料導入時クロマトグラフィー的移動によって、上記多孔性薄膜の空隙通過が不可能な血球を予備分離して測定でき、多孔性薄膜と固定されたセンサー物質が上部基板で密閉されているため、長時間保存に有利で、試料注入口を含み一定少量の血液を速く導入することによって多孔性薄膜内蔵型バイオセンサーの性能を極大化し、センサーの小型化と操作の容易性により大量生産および測定場所の制約を受けないことを明らかにして本発明を完成した。
【００１８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、a) 一つ以上の基板; b) 上記基板の表面上に形成される電極層; c) 上記電極層の一部表面に形成され電極層を電極系および回路連結部に分離させる絶縁膜および; d) 絶縁膜によって生成された電極系の表面上に形成される多孔性薄膜を含み; および e) 上記多孔性薄膜上部に保護膜が順次的に積層された差等式平面形および 差等式対面形バイオセンサーを提供することである。
【００１９】
本発明の他の目的は、上記バイオセンサーが a) 下部基板; b) 上記下部基板の表面上に形成される電極層; c) 上記電極層の一部表面に形成され電極面積を一定にする絶縁膜役割をする接着剤; d) 上記接着剤によって固定される電極系の表面上に形成される多孔性薄膜; e) 上記多孔性薄膜上に対面形に構成する電極系および上部基板の穴; および f) 上記多孔性薄膜を保護すると同時に試料導入を可能にする試料注入口を含む上部基板を含む対面形または平面形バイオセンサーを提供することである。
【００２０】
本発明のまた他の目的は、上記試料注入口の変形を試み、一定少量血液が速く試料導入されるようにすることによって、精密性および再現性を高めるバイオセンサーを提供することである。
【００２１】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するために、本発明は、a) 下部基板; b) 上記下部基板の表面上に形成される電極層; c) 上記電極層の一部表面に形成され、電極層を電極系および回路連結部に分離させ電極面積を一定にする絶縁膜の役割をする接着剤; d) 上記接着剤によって固定される電極系の表面上に形成される多孔性薄膜; e) 上記多孔性薄膜上に形成され試料注入穴を備えた上部基板;および f) 上記上部基板の穴に試料を導入するための両端が開いた状態の試料注入口が形成された別途の上部基板を含み、上部電極系および多孔性薄膜中少なくても一方は、センサー物質を含み、摂取された全血が上記多孔性薄膜によってクロマトグラフィー的に移動し、血漿だけ電極系と接触するようにする多孔性薄膜内蔵型バイオセンサーを提供する。
【００２２】
【発明の実施の形態】
以下、添付された図面を基礎に本発明を詳細に記述する。
図２は、本発明の3電極系の差等式平面形バイオセンサーの一例を図示したもので、より詳細には、下部基板10; 上記基板上に長さ方向に一定間隔塗布された多数の回路連結部9; 一端に各々塗布された作動電極11; 補助電極12; および基準電極13;上に電極系を除外した部分を絶縁膜15で覆い; 上記電極系上部に同じ大きさの多孔性薄膜16; 上記多孔性薄膜を除外した部分を接着剤17によって上部保護膜22と下部の電極系に固定し、下部基板10背面に上記の平面形バイオセンサーが対称に結合した形態である。
【００２３】
差等回路連結部90; 差等作動電極110; 差等補助電極120; 差等基準電極130; が同じ平面上に置かれ、電極系を除外した部分を差等絶縁膜150で覆い; 上記電極系上に差等多孔性薄膜160; および上記差等多孔性薄膜上に積層された差等保護膜220がさらに順次的に積層され、上記差等保護膜は、差等接着剤170によって近鄰の差等絶縁膜150に固着される。
【００２４】
また、本発明は、上記と同一の構造を含み、上記回路連結部9一端に作動電極および補助電極が形成された2電極系の差等式平面形バイオセンサーを提供できる。
【００２５】
上記多孔性薄膜16にグルコース酸化酵素および電子伝達媒介体を固定し、差等多孔性薄膜160に牛血清蛋白質(bovine serum albumin)を固定させ、差等式平面形バイオセンサーを製作できる。
【００２６】
図５は、本発明の3電極系の差等式対面形バイオセンサーを図示したもので、より詳細には、下部基板10; 上記基板上に長さ方向に一定間隔塗布された多数の回路連結部9; 上記回路連結部9一端に各々塗布された補助電極12; および基準電極13; 上記電極系を除外した下部基板10を絶縁膜15で覆い; 上記電極系上部に電極系と同じ大きさの多孔性薄膜16; 上記多孔性薄膜を除外した部分を接着剤17によって固定し;  上記作動電極11を連結する別途の電極連結部9′; 上記作動電極を除外した部分を別途の絶縁膜15′でおおい、上部基板10′が形成され、下部基板10背面に上記の対面形バイオセンサーが対称に結合した形態である。
【００２７】
差等回路連結部90; 上記差等回路連結部90一端に各々塗布された差等基準電極130; および差等補助電極120; 上記電極系を除外した部分を差等絶縁膜150で覆い; 上記電極系上に電極系と同じ大きさの差等多孔性薄膜160; 上記多孔性薄膜を除外した部分を差等接着剤170によって固定し; 上記差等作動電極110を連結する別途の回路連結部90; 上記作動電極を除外した部分を覆う別途の差等絶縁膜150′; 差等基板100で成り立っている。
【００２８】
また、本発明は、上記と同一の構造を含み、上記回路連結部9一端に補助電極を形成し上部基板上に作動電極が形成された2電極系の差等式対面形バイオセンサーを提供できる。
【００２９】
上記多孔性薄膜16にグルコース酸化酵素および電子伝達媒介体を固定し、差等多孔性薄膜160に牛血清蛋白質(bovine serum albumin)を固定させ差等式対面形バイオセンサーを製作できる。
【００３０】
また、本発明は、a) 下部基板;  b) 上記下部基板の表面上に形成される電極層; c) 上記電極層の一部表面に形成され電極面積を一定にする絶縁膜役割をする接着剤; d) 上記接着剤によって固定される電極系の表面上に形成される多孔性薄膜; e) 上記多孔性薄膜上に対面形に構成する電極系および上部基板の穴; および f) 上記多孔性薄膜を保護すると同時に試料導入を可能にする試料注入口を含む上部基板を含む対面形または平面形バイオセンサーを提供する。
【００３１】
図８は、本発明の3電極系の対面形バイオセンサーの一例を図示したものである。a) 下部基板10; b) 上記下部基板上にJ字形の作動電極連結線11′、補助電極連結線12′、基準電極連結線13′が形成され、各々の電極連結線によって作動電極11および基準電極13が形成され; c) 酸化酵素および電子伝達媒介体は、上記作動電極上に固定させたり、または多孔性薄膜16上に固定させられる。このような多孔性薄膜16が積層され、上記多孔性薄膜を除外した部分を接着剤17で固定し; d) Y字形電極連結線20の末端に補助電極12を形成させた上部基板の穴18があいた上部基板10′;が積層された対面形バイオセンサーを提供するものである。
【００３２】
上記作動電極連結線11′は、銀インクで印刷し、その上に炭素インクで印刷した作動電極11を構成し、基準電極連結線13は、銀インクで印刷し、その上に塩化銀を塗布して基準電極13を構成し、上部基板の電極連結線20と連結された補助電極連結線12′を銀インクで印刷し、上部基板10′上にその末端に置かれた補助電極12は、炭素インクで印刷する。
【００３３】
上記バイオセンサーを図９に図示されたように上部基板10′の上部基板の穴18を通して注入された全血試料から上部と下部基板間の多孔性薄膜16によってA領域で全血中、血小板および血球等を分離してB領域で血漿成分だけを対面形に配列された作動電極11と補助電極12に到達するようにし、試料の血漿成分だけを検出する。
【００３４】
このような多孔性薄膜内蔵型バイオセンサーは、別途の試料注入口を含み、多孔性薄膜に吸収され得る試料の量が一定に調節でき、試料注入口でY字形の対称に配列された電極によって2〜5倍に増幅された検出信号を提供できる。
【００３５】
図10は、本発明の3電極系バイオセンサーの試料注入口を電極の横方向に構成した対面形バイオセンサーであり、a) 下部基板10; b) 上記下部基板上にJ字形の作動電極連結線11′、補助電極連結線12′、基準電極連結線13′が形成され各々の電極連結線によって作動電極11および基準電極13が形成され; c) 酸化酵素 および電子伝達媒介体は、上記作動電極上に固定させたり、または多孔性薄膜16上に固定させられ、このような多孔性薄膜16が積層され、上記多孔性薄膜を除外した部分を接着剤17で固定し; d) Y字形電極連結線20の末端に補助電極12を形成させた上部基板の穴18が開けられた上部基板10′; e)  一直線の両端が開いた状態の試料注入口14を含んでいる、接着剤17で固定させた別途上部基板10″が順次的に積層され、試料導入方向が左・右末端部の対面形バイオセンサーを構成する。
【００３６】
上記作動電極連結線11′は、銀インクで印刷し、その上に炭素インクで印刷した作動電極11を構成し、基準電極連結線13′は、銀インクで印刷し、その上に塩化銀で塗布して基準電極13を構成し、上部基板の電極連結線20と連結された補助電極連結線12′を銀インクで印刷し、上部基板10′上にその末端に置かれた補助電極12は、炭素インクで印刷する。上記バイオセンサーの試料注入口14は、別途上部基板10″をプラスチック材質とし、金型で押さえるか両面テープのような接着剤17に多孔性薄膜16の幅と同じ狭いすきまを作り、その上に被せて形成できる。
【００３７】
また、上記バイオセンサーは、身体の一部からランセットを利用して血液試料を採取後、試料注入口14の一端に接触させ試料注入口に3μL未満の試料を充たし、この試料が上部基板の穴18を通して多孔性薄膜16に伝達されるようにする。
【００３８】
図12は、本発明の3電極系バイオセンサーの試料注入口を電極の前面部に構成した対面形バイオセンサーであり、a) 下部基板10; b) 上記下部基板上にJ字形の 作動電極連結線11′、補助電極連結線12′、基準電極連結線13′が形成され各々の電極連結線によって作動電極11および基準電極13が形成され; c) 酸化酵素および電子伝達媒介体は、上記作動電極上に固定されたり、または多孔性薄膜16上に固定させられ、このような多孔性薄膜16が積層され、上記多孔性薄膜を除外した部分を接着剤17で固定し; d) Y字形電極連結線20の末端に補助電極12を形成させた上部基板の穴18が開けられた上部基板10′; e)  一直線の前面部の端が開いた状態の試料注入口14及び上記試料注入口14の一方の末端に別途の上部基板の穴18′を含んでいる接着剤17で固定させた別途上部基板10″が順次的に積層され、試料導入方向が電極の前面部を向くようにしたバイオセンサーを構成する。
【００３９】
上記バイオセンサーは、図10とは、形態が異なる試料注入口が備えられたもので、試料注入口の方向がバイオセンサーの前面部を向くようにし、別途上部基板の穴18′を置いて、センサー末端から試料の注入が容易にできるように製作したことが特徴である。
【００４０】
図13は、本発明の2電極系バイオセンサーの試料注入口を電極の横方向に構成した対面形バイオセンサーであり、 a) 下部基板10; b) 上記下部基板上に補助電 極連結線12′とY 字形作動電極連結線11′と、その末端に作動電極11を形成し、上記補助電極連結線12′は、上部基板10′上に位置する電極連結線20の末端に連結され電流が流れるようになり; c) 酸化酵素および電子伝達媒介体は、上記作 動電極上に固定させたり、または多孔性薄膜16上に固定させられ、このような多孔性薄膜16が積層され、上記多孔性薄膜を除外した部分を接着剤17で固定し; d) Y 字形電極連結線20上に補助電極12を形成させた上部基板の穴18が開けられた 上部基板10′; e) 一直線の両端が開いた状態の試料注入口14を含み、接着剤17 で固定させた別途上部基板10″が順次的に積層された対面形バイオセンサーである。
【００４１】
上記バイオセンサーは、下部基板には、Y字形作動電極連結線11′を銀インクで印刷し、その上に作動電極11を炭素インクで印刷した。上部基板10′の電極連結線20と連結される補助電極連結線12′を銀インクで印刷した。中間層膜は、補助電極連結線12′と電極連結線20の末端部を連結させられる隙間と多孔性薄膜16を下部基板上にのせておける隙間を持った、絶縁膜兼接着剤17の役割をする層で、Y字形の電極連結線20の末端に炭素インクで印刷された補助電極12、そして試料を注入できる上部基板の穴18がある上部基板10′を持っている。
【００４２】
図14は、本発明の2電極系バイオセンサーの試料注入口を電極の前面部に構成した対面形バイオセンサーであり、a) 下部基板10; b) 上記下部基板上に補助電極連結線12′とY字形作動電極連結線11′と、その末端に作動電極11を形成し; c) 酸化酵素および電子伝達媒介体は、上記作動電極上に固定させたりまたは多孔性薄膜16上に固定させられ、このような多孔性薄膜16が積層され、上記多孔性薄膜を除外した部分を接着剤17で固定し; d) Y 字形電極連結線20上に補助電極12を形成させた上部基板の穴18が開けられた上部基板10′; e) 一直線の前面部の 端が開いた状態の試料注入口14及び上記試料注入口14の一方の末端に別途の上部基板の穴18′を含み、接着剤17で固定させた別途上部基板10″が順次的に積層された対面形バイオセンサーである。
【００４３】
上記バイオセンサーは、図13の 2電極系の型式で構成されたバイオセンサーであり、試料注入口14は、別途の上部基板10″上に接着剤17を使用しないことによって形成された空間であり、多孔性薄膜16の幅と同じ隙間を電極の前面部に作り、センサーの末端部から試料注入を可能なように製作したものである。試料は、試料注入口14を通して伝達され上部基板の穴18を通して多孔性薄膜16に伝達される。
【００４４】
図16は、本発明の2電極系バイオセンサーの試料注入口を電極の横方向にして、全電極系を炭素インクだけで構成した対面形バイオセンサーである。より詳しくは、a) 下部基板10;  b) 上記下部基板上に補助電極連結線12′とY 字形作動電極連結線11′と、その末端に作動電極11を形成し; c) 酸化酵素および電子伝達媒介体は、上記作動電極上に固定したりまたは多孔性薄膜16上に固定でき、このような多孔性薄膜16が積層され、上記多孔性薄膜を除外した部分を接着剤17で固定し; d) Y  字形電極連結線20の末端に補助電極12を形成させた上部基板の穴18が開けられた上部基板10′; e) 一直線の両端が開いた状態の試料注入口14を含み、接着剤17で 固定させた別途上部基板10″が順次的に積層され、全電極部をを炭素インクだけで構成し、試料の導入方向を左・右末端部にした対面形バイオセンサーである。
【００４５】
上記バイオセンサーは、下部基板10の作動電極連結線11′を炭素インクで印刷し、そして、上部基板10′の電極連結線20と連結される補助電極連結線12′も、やはり炭素インクで 印刷されている。中間層膜は、接着剤17で補助電極連結線12′と電極連結線20の末端部が連結できる隙間と多孔性薄膜16を下部基板上にのせておける隙間を持った絶縁膜兼接着剤の役割を果たすようにする。Y字形の電極連結線20とその末端に補助電極12、そして試料を注入できる上部基板の穴18を含む上部基板10′を持っており、銀インクの印刷することなしに炭素インクだけで全電極系が構成されていることを特徴とする。
【００４６】
センサーの末端部に試料注入口14が具備され、上記バイオセンサー上部基板10′の上部基板の穴18を通して注入された全血試料が上部と下部基板間の多孔性薄膜16に流入し、クロマトグラフィー的移動をして、多孔性薄膜に吸収された試料の量が一定に調節されるようにする。
【００４７】
図17は、本発明の2電極系バイオセンサーの上部基板10′に空間をあけ、試料注入口を電極の前面部にして電極部を炭素インクだけで構成した対面形バイオセンサーであり、a) 下部基板10; b)  上記下部基板上に補助電極連結線12′とY字形作動電極連結線11′と、その末端に作動電極11を形成し; c)  酸化酵素および電子伝達媒介体は、上記作動電極上に固定したりまたは多孔性薄膜16上に固定でき、このような多孔性薄膜16が積層され、上記多孔性薄膜を除外した部分を接着剤17で固定し; d) Y 字形電極連結線20の末端に補助電極12を形成させた、一直線の前面部の端に開いた状態の試料注入口14を備えた上部基板10′; e) 別途上部基板の穴18′を含む、接着剤17で固定させた別途上部基板10″が順次的に積層され、全電極系を炭素インクだけで構成し、試料の導入方向が電極の前面部を向くようにした対面形バイオセンサーである。
【００４８】
上記上部基板10′上に形成された試料注入口14は、多孔性薄膜16の幅と同じ隙間を電極の前面部に作って、センサーの末端から試料注入を可能にしたものである。
【００４９】
また、本発明は、上記試料注入口の変形を試み、一定少量の血液試料導入が速くできるようにすることによって、精密性および再現性を高めるバイオセンサーを提供する。
【００５０】
図19は、本発明の3電極系バイオセンサーの試料注入口に円形の空間を置いて形態を変形した対面形バイオセンサーであり、より詳しくは、a) 下部基板10; b) 上記下部基板上にJ 字形の作動電極連結線11′、補助電極連結線12′、基準電極連結線13′が形成され、各々の電極連結線にしたがって作動電極11及び基準電極が形成され; c) 酸化酵素および電子伝達媒介体は、上記作動電極上に固定し たりまたは多孔性薄膜16上に固定でき、このような多孔性薄膜16が積層され、上記多孔性薄膜を除外した部分を接着剤17で固定し; d) Y  字形電極連結線20の末端に補助電極12を形成させた上部基板の穴18が開けられた上部基板10′; e) 試料注入口14を接着剤17で固定し円形の別途上部基板10″が順次的に積層された対面形バイオセンサーである。
【００５１】
上記バイオセンサーは、図10と同じ型式のバイオセンサーに丸い形態の別途上部基板10″を接着剤17で固定させ、 試料導入口14の形態を変形させて形成したことを特徴とする。
【００５２】
同時に、本発明は、上記と同一の構造を含み、下部基板上に補助電極連結線12′およびY字形の作動電極連結線11′とその末端に作動電極11が形成され、上部基板10′に補助電極12が形成された2電極系のバイオセンサーを提供できる。
【００５３】
図20は、本発明の3電極系バイオセンサーの試料注入口を電極の前面部に構成した平面形バイオセンサーであり、a) 下部基板10; b) 上記下部基板上に作動電極連結線11′、補助電極連結線12′、基準電極連結線13′とその末端に作動電極11、基準電極13および J字形の補助電極12が形成され; c) 酸化酵素および電子伝達媒介体は、上記作動電極上に固定させるか、または多孔性薄膜16上に固定させられ、このような多孔性薄膜16が積層され、上記多孔性薄膜を除外した部分を接着剤17で固定し; d) 上部基板の穴18が開けられた上部基板10′; e) 一直線の前面部の端が開いた状態の試料注入口14及び上記試料注入口14の一方の末端に別途の上部基板の穴18′を含み、接着剤17で固定させた別途上部基板10″が順次的に積層された平面形バイオセンサーである。
【００５４】
上記バイオセンサーは、下部基板10に作動電極連結線11′、補助電極連結線12′、基準電極連結線13′を銀インクで印刷し、その上に炭素インクで作動電極11および補助電極12を印刷し、塩化銀インクで塗布して基準電極13を平面形に構成した。
【００５５】
また、多孔性薄膜16を基板上に載せておける隙間を持った絶縁膜兼接着剤17の役割を果たせる中間層膜を形成し平面形に製作した。そして、試料を注入できる上部基板の穴18がある上部基板10′を備えていて、上部基板10′上に別途の上部基板10″を置いて、センサーの前面部に試料注入口14を持っていることを特徴とする。
【００５６】
同時に、本発明は、上記と同一の構造を含み、下部基板上に補助電極連結線12′および作動電極連結線11′とその末端に補助電極および作動電極11を形成した2電極の平面形バイオセンサーを提供できる。
【００５７】
図21は、本発明の多孔性薄膜基板を使用し、試料注入口を電極の横方向に構成した平面形バイオセンサーであり、a) 多孔性薄膜16でできている下部基板上にb) 絶縁膜15を形成し、そして、作動電極連結線11′、補助電極連結線12′、基準電極連結線13′上に炭素インクで塗布された作動電極11、補助電極12および塩化銀を塗布した基準電極13、別途の前処理層19; c) 一直線の両端に開いた状態の試料注入口14を含み、接着剤17で固定させた別途上部の基板10″が順次的に積層された、試料導入方向を左・右末端部とする3電極系の平面形バイオセンサーである。
【００５８】
上記バイオセンサーでは、下部基板に多孔性薄膜16を使用した。下部基板に使用した多孔性薄膜の上には、試料と連結線(11′、12′、13′)間の絶縁の為に絶縁膜15を先に構成した。絶縁膜上に連結線(11′、12′、13′)を銀インクを使用して印刷した。その上に炭素インクを使用して作動電極11および補助電極12、そして、塩化銀を使用して基準電極13を塗布して電極を構成した。電極面積の均一化と連結線(11′、12′、13′)間の絶縁の為にもう一度絶縁膜15を印刷した。一定量の試料を注入できる試料注入口14を別途上部の基板10″で構成した。注入した試料は、多孔性薄膜16によって作動電極11に到達する前に分離され試料の血漿成分だけが検出され、電極に試料が導入される前に妨害物質を酸化させられる別途の前処理層19を置いて、目的試料だけの正確な値を得られるようにすることを特徴とする。
【００５９】
また、上記と同一の構造を含み、多孔性薄膜16でできている下部基板上に補助電極連結線12′および作動電極連結線11′とその末端に各々補助電極12および作動電極11が形成された2電極系のバイオセンサーを提供できる。
【００６０】
上記基板10が、セラミック、プラスチック、シリコン、アルミナガラス板または高分子材料を使用でき、望ましくは、ポリエステル、ポリビニルクロライド(polyvinyl chloride)およびポリカーボネイト(polycarbonate)等の有機高分子材 料が使用できる。
【００６１】
上記作動電極11、補助電極12および基準電極13の材料としては、銀、銀エポキシ、パラジューム、胴、金、白金、銀/塩化銀、銀/銀イオン、水銀/酸化水銀、伝導性炭素、重金属酸化物が使用できる。望ましくは、基準電極材料としては、銀、銀エポキシ、銀/塩化銀または、銀/銀イオンが使用でき、作動電極材料としては、伝導性炭素、コバルトフタロシアニンペースト、金、白金またはパラジュームを使用できる。
【００６２】
補助電極材料としては、伝導性炭素、金または白金が使用できる。上記基準、補助および作動電極材料は、スクリーン印刷または物理的蒸気着床法によって塗布され、電極を形成できるが、多様な電極材料適用が容易で、経済的で、良好な再現性および感応性を確保できるスクリーン印刷法が望ましく、上記スクリーン印刷法は、開放されたパターンに対して、ゴムローラー(squeegee)に一定の力を加えながら動かすことによって行われ、インクまたはペーストを特定基質(substrate)上に順次的にパターン導入可能なだけではなく、電極を活性化させること ができる長所がある。
【００６３】
上記絶縁膜15は、絶縁性高分子ペーストをスクリーン印刷した後、熱処理によって形成され、上記絶縁膜は、電極面積を一定に維持させ再現性を向上させられる。
【００６４】
上記保護膜22は、酸化酵素および電子伝達媒介体が固定された多孔性薄膜16を物理的に保護し、加工性が良好なポリエステルポリビニルクロライド(polyvinyl chloride)およびポリカーボネイト(polycarbonate)等の有機高分子材料を使用できる。
【００６５】
上記接着剤17は、多孔性薄膜と保護膜を電極体上に固着させ、基板間を固定する役割をする。上記接着剤17には両面テープまたは通常の強力接着剤等を使用できるが、望ましくは、多孔性薄膜の厚みと同一の厚みの両面テープを使用する。
【００６６】
上記多孔性薄膜16は、直径が5ないし20μｍの空隙を多数含み、紙、親水性有機 高分子または吸湿性セラミック高分子で製造でき、具体的には、ナイロン(nylon)、親水性ポリエステルスルホン膜(polyestersulfone membrane)、親水性混合セルロースエステル(hydrophilic mixed cellulose esters)、ポリテトラフルオロエチレン膜(polytetrafluoroethylene membrane)、ポリビニリデンフロライド膜(polyvinyllidene fluoride membrane)、イオン選択性膜(Ionic exchange membrane)、ガラス繊維(glass fiber)、ポリエステル繊維質(polyester fibrous)または改質された融合体、親水性有機高分子または吸湿性セラミック高分子で製造でき、より、望ましくは、ニトルセルロース(niterocellulose)紙、ポリエステル 繊維質(polyester fibrous)及び改質された融合体、または類似性質の濾紙が使 用できる。
【００６７】
上記多孔性薄膜に固定される電子伝達媒介体は、(1) 水溶液中で酸化-還元状態が安定で可逆的で、(2)  還元された電子伝達媒介体は、酸素と反応してはならず、(3) 作動電位が、電子伝達媒介体の形式電位によって決定され、妨害物質の影響を最小化するには、電子伝達媒介体の形式電位が充分に低くなければならず、(4) 還元された電子伝達媒介体の酸化は、相対的にpHに敏感であってはならず(5) 電気化学的妨害物質のアスコルビン酸、アセトアミノペンおよび尿酸と反応しない電気化学的特性を持っていなければならない。
【００６８】
上記要件を満足する伝達伝達媒介体は、ヘキサアミン塩化ルテニウム(III)(hexaammine ruthenium(III)chloride)、フェリシアン化カリウム(potassium ferricyanide)、フェロシアン化カリウム(potassium ferrocyanide)、ジメチルフェロセン(dimethylferrocene(DMF))、フェリシニウム(ferricinium)、フェロセンモ ノカルボキシル酸(ferocene-monocarboxylic-acid(FCOOH))、7,7,8,8,-テトラシアノキノジメタン(7,7,8,8-tetracyanoquinodimethane(TCNQ))、テトラチアフルバレン(tetrathia fulvalene(TTF))、ニッケロセン(nickelocene(Nc))、N-メチ ルアシディニウム(N-methylacidinium(NMA+))、テトラチアテトラセン(tetrathiatetracene(TTT))、N-メチルフェナジニウム(N-methylphenazinium (NMP+))、ヒドロキノン(hydroquinone)、3-ジメチルアミノ安息香酸(3-dimethylaminobenzoic acid(MBTHDMAB))、3-メチル-2-ベンゾチオゾリノンヒドラゾン(3-methyl-2-benzothio zolinone hydrazone)、2-メトキシ-4-アリルフェノール(2-methoxy-4-allylphenol)、4-アミノアンチピリン(4-aminoantipyrine(AAP))、ジメチルアニ リン(dimethylaniline)、4-アミノアンチピレン(4-aminoantipyrene)、4-メトキシナフトール(4-methoxynaphthol)、3,3′,5,5′-テトラメチルベンジジン(3,3 ′,5,5′-tetramethyl benzidine(TMB))、2,2-アジノ-ジ-[3-メチル-ベンゾトリアゾリンスルホナート](2,2-azino-di-[3-ethyl-benzothiazoline sulfonate]) 、o-ジアニシジン(o-dianisidine)、o-トルイジン(o-toluidine)、2,4-ジクロロフェノール(2,4-dichloro-phenol)、4-アミノフェナゾン(4-aminophenazone)、 ベンジジン(benzidine)、プルシアンブルー(prussian blue)等で、酸化-還元双 を構成される混合電子価化合物(mixed-valence compound)が使用できるが、望ましくは、ヘキサアミン塩化ルテニウム(III)が使用される。
【００６９】
上記試料注入口14は、上部基板10′または別途の上部基板10″に形成させられ、上記基板下部に接着剤17を使用しないことによって形成された接着剤17の厚み程度の空き空間である。上記試料注入口14を形成するために使用できる物質としては、ポリエステル、ポリビニルクロライド(polyvinyl chloride)等の高分子物質があるが、本発明では、ポリエステル材質を使用した。
【００７０】
グルコース製作過程に使用される界面活性剤は、試料を速く移動させる為に使われ、ポリエチレングリコール(polyethylene glycol)、Oxyethylated alkylphoenols (neonols)、Triton X-100、polyoxyethylated 系統のような非イオン性界面活性剤または、Sodium decyl sulfate 系統のような陰イオン性界面活性剤ま たはDecylpuridinium chloride、Tetradecylpyridinium chlorideと同じpyridinium系統の陽性子性界面活性剤中から選択されたTriton X-100を一般的に使用し 、また、分散剤は、酵素および電子伝達媒介体を分散させる役割をし、CMC(carboxymethylcellulose)、PVP(polyvinylpyrrolidone)、PVA(polyvinylalcohol)の ような物質を使用して製作できる。
【００７１】
本発明は、血糖測定バイオセンサーを実施例として説明するが、グルコースの適用と同一に多孔性薄膜または作動電極上に特定酵素を導入することによって多様な代謝物質、例えばコレステロール(cholesterol)、ラクタート(lactate)、クレアチニン(creatinine)、蛋白質、過酸化水素、アルコール、アミノ酸、酵素、例えばGPT(glutamate pyruvate transaminase)、GOT(glutamate oxaloacetate transminase)等の生体試料と環境試料、農・工業試料または食品試料中の多様な 有機物または無機物濃度を定量できるのは、もちろんである。
【００７２】
【実施例】
以下、実施例によって、本発明を詳細に説明する。但し、下記実施例は、発明を例示しただけのもので、本発明が実施例によって限定されるものではない。
【００７３】
<実施例 1> 差等式平面形グルコースセンサーの製作
<段階 1> 単一電極体製作
ポリエステル基板10上に銀/塩化銀をスクリーン印刷し、回路連結部9および基準電極13を形成させた。その後、伝導性炭素ペースト(conducting  carbon  paste)を利用してスクリーン印刷して作動電極11および補助電極12を形成後、絶縁 高分子ペースト(insulator paste、商品名:LS-405)を使用して絶縁膜15を形成し、その後140℃で5分間熱処理して平面形バイオセンサーの単一電極体を製作した。
【００７４】
<段階 2> 平面形グルコースセンサー製作
ニトロセルロース(nitrocellulose)多孔性薄膜(2×100mm)を10%(v/v)MeOHで30分間処理した後、脱イオン水で洗浄し、約1時間乾燥し多孔性薄膜を活性化させた。100mMヘキサアミン塩化ルテニウム(III)、0.5%(wt/wt)分散剤(Carboxymethylcellulose:CMC)、0.2 %(wt/wt)界面活性剤(商品名: Triton X-100)および10mg/mLグルコース酸化酵素が混合された溶液に上記活性化された多孔性薄膜16を1時 間ないし2時間浸漬し、物理的に吸着させた後、上記多孔性薄膜をデシケーター 内で24〜26℃および50〜55%湿度条件で16時間放置した。
【００７５】
上記製作された平面形単一電極体電極上部に上記多孔性薄膜を積層させ、ポリエステル材質の保護膜22を覆い、両面テープを利用して上記保護膜を単一電極体上の絶縁膜15と接着させ平面形グルコースセンサーを製作した。
【００７６】
<段階 3> 差等式平面形グルコースセンサー製作
上記段階3での実施例1でと同一の方法で同一下部基板10背面に平面形センサーを固定させた。図２ないし図４に図示したように、100mMポタシュームペリシアナイトおよび10mg/mL牛血清蛋白質(bovin serum albumin: BSA)が固定された差等多孔性薄膜160を具備した差等式平面形グルコースセンサーを完成した。
【００７７】
<実施例 2> 差等式対面形グルコースセンサー製作
<段階 1> 二重電極体製作
第1電極体は、上記単一電極体の作動電極部だけを除外した、平面形バイオセンサーの単一電極体と類似の方法で製作した。第2電極体は、上部基板10′上に長さ方向に銀/塩化銀ペーストを利用し、スクリーン印刷して別途の回路連結部9′を形成し、上記別途の回路連結部9′の一端に伝導性炭素ペーストを利用して作動電極11を形成して対面形バイオセンサーの二重電極体を製作した。
【００７８】
<段階 2> 対面形グルコースセンサー製作
ヘキサアミン塩化ルテニウム(III)およびグルコース酸化酵素が固定された多孔性薄膜16は、上記実施例1の段階2と同一の方法で製作した。
【００７９】
上記実施例1の段階2で製作された多孔性薄膜16を第1電極体の基準電極13および補助電極12上部に積層し、上記製作された第2電極体の作動電極11が上記積層された多孔性薄膜16と重なるように上記第1電極体上に覆い両面テープを利用し上記第2電極体を第1電極体上の絶縁膜15と接着剤17で接着させ対面形グルコースセンサーを製作した。
【００８０】
<段階 3> 差等式対面形グルコースセンサー製作
上記実施例1の段階2と同一の方法で100mMポタシュームペリシアナイとおよびグルコース酸化酵素が固定された多孔性薄膜16が具備された平面形グルコースセンサーを製作した後、図５ないし図７に図示されたように実施例1の段階3と同一の方法で同一下部基板10背面に100mMポタシュームペリシアナイとおよび10mg/mL牛血清蛋白質(bovin serum albumin: BSA)が固定された差等多孔性薄膜160が具備された差等式対面形グルコースセンサーを完成した。
【００８１】
<実施例 3> 試料注入口を備えた対面形グルコースセンサー製作
<段階 1> 試料注入口が、具備された二重電極体製作
ポリエステル下部基板10上に、銀ペーストで電極連結線20を印刷し、伝導性炭素ペースト(conducting carbon paste)を利用して作動電極11を描き、塩化銀で基準電極を形成させ、第1電極体を形成した。また、銀ペーストと伝導性炭素ペーストを利用して電極連結線20および補助電極12を形成し、第2電極体を製作した。上記第2電極体に1×2mmの大きさの穴を開け試料の移動路を作った。
【００８２】
<段階 2> 試料注入口を備えた対面形グルコースセンサー製作
上記実施例1の段階2で製作された多孔性薄膜16を物理的吸着処理した後、上記多孔性薄膜16を第1電極体の上部に積層し、多孔性薄膜と重なるように第2電極体を積層し圧着すると同時に第2電極体を第1電極体上に接着剤で接着した。試料の移動路を持った第2電極体上には、接着剤を付けてもう一度基板を着け試料注入口を作りグルコースセンサーを完成した。(図８および図９)
【００８３】
以下、本発明のバイオセンサーの特性を下記のように実験した。
【００８４】
<実験例1>   試料注入口が備えられたグルコースセンサーに投入される試料の量に対する検証
上記実施例3で製作された多孔性薄膜が備えられたグルコースセンサーに別途に試料注入口が備えられたグルコースセンサーに対して個々のセンサーに投入される血液試料の量を測定するために実験した。
【００８５】
上記図22から分かるように、総回数を20回にして測定した結果、センサーに投入される平均量は、2.38μLであり、標準偏差(standard deviation)は、±0.11μLであり、試料注入量の精密度が非常に高まった。
【００８６】
<実験例 2> 平面形グルコースセンサーでの妨害物質による影響検証
図23は、実施例1の段階2によって製作された平面形グルコースセンサーでのグルコース、アスコルビン酸、アセトアミノフェン、尿酸のような妨害物質および緩衝溶液に対する影響を測定した動的感応曲線(dynamic curve)である。図23でのa曲線は、グルコース200mg/dL(11.1 mM)、b曲線は、アスコルビン酸570μM、c曲線は、アセトアミノフェン660μM、d曲線は、尿酸916μM、そして、e曲線は、緩衝溶液(140 mM NaCl、pH 7.4  PBSバッファー)の条件での測定結果である。
【００８７】
上記図23から分かるように、基準電極(Ag/AgCl)に対する印加電位0.0Vで、上記妨害物質に対する妨害作用が微微であることが分かった。
【００８８】
<実験例 3> 平面形グルコースセンサーでの血蛋白質に対する影響検証
図24は、実施例1の段階2による平面形グルコースセンサーを利用した血蛋白質による影響度を測定したものである。
【００８９】
a曲線は緩衝溶液(140mM NaCl、pH 7.4 PBSバッファー)、b曲線は全血(whole blood)、そして、c曲線は血漿(plasma)を対象に基準電極に対して印加電位0.35Vで、時間に対する電流値を測定した結果図である。
【００９０】
測定した結果、ヘマトクリット(hematocrit)が存在する全血とヘマトクリット(hematocrit)が存在しない血漿での電流値が一致することが分かった。したがって、本発明によるグルコースセンサーは、多孔性薄膜のクロマトグラフィー的試料移動によってヘマトクリット(hematocrit)は、薄膜の空隙を通過できず、予備除去されるため、従来バイオセンサーで電極表面に吸着するヘマトクリット(hematocrit)量が変り再現性が低下する問題点が本発明によるバイオセンサーでは、克服されたことを確認できた。
【００９１】
<実験例 4> 平面形グルコースセンサーのグルコース標準溶液に対する検定
図25は、実施例1の段階2によって製作された平面形グルコースセンサーを利用して測定したグルコース標準溶液に対する検定曲線である。
【００９２】
各々のグルコース濃度が0、50、100、150、200、250、300、350および400mg/dLの標準溶液で各濃度当り10回ずつ基準電極に対する印加電位0.0Vで電流値を測 定した。この時、傾きは、0.0298[μA/(mg/dL)]で、線形性は、0.996と良好な直線性感応を示した。
【００９３】
<実験例 5> 差等式平面形グルコースセンサーのグルコース標準溶液に対する検定
実施例3によって製作された差等式平面形グルコースセンサーを利用してグルコース標準溶液および妨害物質(1mM アセトアミノフェン、1mMアスコルビン酸、0.8 mM尿酸)が存在するグルコース標準溶液に対して一つの濃度当り5回ずつ基準電極に対する印加電位0.35Vで電流値を測定した検定曲線を図26に図示した。
【００９４】
その結果、妨害物質と関係なく傾きは、0.0333[μA/(mg/dL)]で、線形性は、0.996と良好な直線性感応を示した。
【００９５】
また、実施例1によって製作された差等式平面形グルコースセンサーを利用して正常血清(normal serum)と非正常血清(abnormal serum)に対して各々20回測定した結果を表1に示した。
【００９６】
【表１】
0003842989.tif 000002
【００９７】
上記表1によると、正常血清および非正常血清に対する分散度(coefficient of
variation)は、各々5.1 %と5.2 %と正確な精密度を示した。
【００９８】
<実験例 6> 対面形グルコースセンサーのグルコース標準溶液に対する検定
上記実施例2の段階2によって製作された対面形グルコースセンサーを利用して、グルコース標準溶液に対する検定テストを行った結果を図27に図示した。
【００９９】
各々のグルコース濃度が0、50、100、150、200、250、300、350および400mg/dLの標準溶液から各濃度当り10回ずつ基準電極に対する印加電位0.0Vで電流値を 測定した。この時傾きは、0.1615 [μA/(mg/dL)]で、線形性は、0.997と良好な直線性感応を示した。
【０１００】
また、実施例3による対面形グルコースセンサーを利用して、正常血清および非正常血清に対して各々30回測定した結果を表2に示した。
【０１０１】
【表２】
0003842989.tif 000003
【０１０２】
上記表2の結果によると、正常血清および非正常血清に対する分散度は、各々5.5 %と4.0 %と、正確な精密度を示した。
【０１０３】
【発明の効果】
以上、詳しく見たように、本発明は、多孔性薄膜内蔵型バイオセンサーに一定少量の試料を迅速に導入できる試料注入口を含むバイオセンサーを製作して前処理過程なしに便利で再現性よく導入でき、電極間の再現性が非常に高く、測定時間が早く手頃に大量生産できるだけではなく、家庭や病院で患者自らが血液試料に含まれる各種体内疾病有無判断と関係した代謝物質の測定を簡便にできる。
このような形態のバイオセンサーは、全般的に正確性及び精密性を求める定量装置として広範囲に作用可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１】バイオセンサー電極面で酸化酵素および電子伝達媒介体との反応基作図である。
【図２】本発明の3電極系の差等式平面形バイオセンサーの分解斜視図である。
【図３】本発明のバイオセンサーの斜視図である。
【図４】図３のバイオセンサーに表示されたA〜A′部分の断面図である。
【図５】本発明の3電極系の差等式対面形バイオセンサーの分解斜視図である。
【図６】本発明のバイオセンサーの斜視図である。
【図７】図６のバイオセンサーに表示されたA〜A′部分の断面図である。
【図８】本発明の3電極系の対面形バイオセンサーの分解斜視図である。
【図９】図８のバイオセンサーにA〜A′で表示された部分の断面図である。
A : 全血(whole blood) 領域;
B : 分離された血漿(separated plasma)領域
【図１０】本発明の3電極系バイオセンサーの試料注入口を電極の横方向に構成した対面形バイオセンサーの分解斜視図である。
【図１１】図10のバイオセンサーにA〜A′で表示された部分の断面図である。
【図１２】本発明の3電極系バイオセンサーの試料注入口を電極の前面部に構成した対面形バイオセンサーの分解斜視図である。
【図１３】本発明の2電極系バイオセンサーの試料注入口を電極の横方向に構成した対面形バイオセンサーの分解斜視図である。
【図１４】本発明の2電極系バイオセンサーの試料注入口を電極の前面部に構成した対面形バイオセンサーの分解斜視図である。
【図１５】図14のバイオセンサーのA〜A′で表示された部分の断面図である。
【図１６】本発明の2電極系バイオセンサーの試料注入口を電極の横方向に設け、全電極系を 炭素インクだけで構成した対面形バイオセンサーの分解斜視図である。
【図１７】本発明の2電極系バイオセンサーの上部基板に空間を開け、試料注入口を電極の前面部に設け、全電極系を炭素インクだけで構成した対面形バイオセンサーの分解斜視図である。
【図１８】図17のバイオセンサーのA〜A′で表示された部分の断面図である。
【図１９】本発明の3電極系バイオセンサーの試料注入口に円形の空間を置き、形態を変形した対面形バイオセンサーの分解斜視図である。
【図２０】本発明の3電極系バイオセンサーの試料注入口を電極の前面部に構成した平面形バイオセンサーの分解斜視図である。
【図２１】本発明の3電極系バイオセンサーの多孔性薄膜基板を使用し、試料注入口を電極の横方向に構成した平面形バイオセンサーの分解斜視図である。
【図２２】本発明の試料注入口を含んだバイオセンサーに投入される試料の量に対する測定結果図である。
【図２３】本発明の3電極系の平面形バイオセンサーの妨害物質による影響測定図である。
【図２４】本発明の3電極系の平面形バイオセンサーの血蛋白質による影響測定図である。
【図２５】本発明の3電極系の差等式平面形バイオセンサーのグルコース標準溶液に対する検定曲線である。
【図２６】本発明の3電極系の平面形バイオセンサーのグルコース標準溶液に対する検定曲線である。
【図２７】本発明の対面形グルコースセンサーに対する全血および標準溶液に対する動的感応曲線である。
【符号の説明】
9: 回路連結部                 10: 下部基板
11: 作動電極                  12: 補助電極
13: 基準電極                  14: 試料注入口
15: 絶縁膜                    16: 多孔性薄膜
17: 接着剤                    18: 上部基板の穴
19: 前処理層                  20: 電極連結線
21: 試料                      22: 保護膜
10′: 上部基板                10″: 別途の上部基板
11′: 作動電極連結線          12′: 補助電極連結線
13′: 基準電極 連結線         15′: 別途の絶縁膜
18′: 別途上部基板の穴        90: 差等回路連結部
100: 差等基板                 110: 差等作動電極
120: 差等補助電極             130: 差等基準電極
150: 差等絶縁膜               160: 差等多孔性薄膜
170: 差等接着剤               220: 差等保護膜
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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