(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃ型肝炎ウイルス（HCV）由来のRNAポリメラーゼ遺伝子が組み込まれた、該RNAポリメラーゼを産生する組換え肝細胞にHCVを接触し、該組換え肝細胞を培養することを特徴とする、HCVの複製方法。
【請求項２】
肝細胞がヒト由来である、請求項１記載の複製方法。
【請求項３】
肝細胞がHepG2である、請求項２記載の複製方法。
【請求項４】
請求項１ないし３の何れか一項記載の複製方法を利用することを特徴とする、HCVの複製阻害物質の検出方法。
【請求項５】
HCVの複製阻害物質が、アンチセンス核酸物質、抗体、化学合成物質から選択される請求項４記載の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＨＣＶＲＮＡポリメラーゼを産生する組換え肝細胞及び該組換え肝細胞にＨＣＶを接触させ、これを培養することからなるＨＣＶの複製方法並びにその利用に関する。
【０００２】
【従来技術】
ウイルス性肝炎にはＡ型肝炎（伝染性肝炎）とＢ型肝炎（血清肝炎）の２種類があることは古くから知られていた。これは主として感染経路の相違に基づいたもので、Ａ型肝炎は経口感染で流行を起こし、Ｂ型肝炎は主として血液を介して伝播されるものであることが確認された。これら２つの肝炎ウイルスの確定診断方法が確立されるに従い、このいずれにも属さない非Ａ非Ｂ型肝炎の存在が明らかになってきた（Prince, A. M., et al., Lancet I p.241, 1974）。
【０００３】
この中で、血液を介して感染する輸血関連非Ａ非Ｂ型肝炎の主たる原因であるＣ型肝炎ウイルスのゲノムがクローニングされ、全塩基配列が決定された（Choo. Q. L., et al., Science 244, 359, 1989他）。その結果、ＨＣＶは約９．５ｋｂのプラス鎖ＲＮＡをゲノムとし、フラビあるいはペスティウイルスに近縁のウイルスであることが明らかとなった。しかしながら、Ｃ型肝炎は、患者血清中のウイルス濃度が１０2〜１０3と低いこと、感染実験モデルがチンパンジー、マーモセットに限られることなどの問題点のため、その研究に困難を来している。このため、Ｃ型肝炎については未だウイルス本体の分離同定はなされていない。
【０００４】
このような状況の中、ＨＣＶをインビトロ細胞培養系で複製させる試みが、多くの研究室で行われている。それには宿主細胞として初代肝細胞を用いるもの（Ito. T., et al. J. Gen. Viol. 77, 1043-1054, 1996）、リンパ球細胞を用いるもの（Kato. N., Biochem. Biophys. Res. Commun. 206, 863-869, 1995）、マウスレトロウイルスの感染したリンパ球を用いるもの（Nakajima. N., J. Virol., 70, 3325-3329, 1996）、肝癌由来の細胞株を用いるもの（Tsuboi. S., J. Med. Virol., 48, 133-140, 1996）などがあり、感染成立が報告されている。また、ＨＣＶのインビトロ培養系構築の困難さを回避する手段として、ＨＣＶの５’非翻訳領域を有するキメラポリオウイルスを構築して、ＨＣＶの５’非翻訳領域の機能を解析しているグループもある（Lu. H. H., Proc. Natl. Acad. Sci., 93, 1412-1417, 1996）。しかしながら、上記の方法では、ウイルスの複製期間が短い、あるいはウイルス複製量が少ない等の問題があり、ＨＣＶに対する阻害物質を研究する上で十分に満足できる結果を得ることが困難であった。したがって、安定で容易なＨＣＶ感受性細胞の樹立が求められていた。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、インビトロ細胞培養系において、ＨＣＶのＲＮＡポリメラーゼを産生する組換え肝細胞を用いることにより、ＨＣＶを効率よく、長期に複製させる方法を提供することを目的としている。
【０００６】
また、本発明の他の目的は、上記のＨＣＶを複製する方法を利用したＨＣＶの複製阻害物質の検出方法を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記の目的を達成するために鋭意研究を重ねた結果、ＨＣＶのＲＮＡポリメラーゼを構成的に発現する組換え肝細胞株を樹立することに成功した。更に、ＨＣＶが該組換え肝細胞に対し感受性であり、ＨＣＶを接触させた該肝細胞の培養を続けることにより、長期にわたりＨＣＶを複製させることが出来ることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
また、本発明は、ＨＣＶのＲＮＡポリメラーゼを産生し、ＨＣＶ感受性である組換え肝細胞を包含する。
【０００９】
また、本発明は、上記の組換え肝細胞にＨＣＶを接触させ、この組換え肝細胞を長期に培養することによるＨＣＶの複製方法を包含する。
【００１０】
更に、本発明は、ＨＣＶの複製方法を利用することによるＨＣＶの複製阻害物質の検出方法を包含する。以下に、本発明について更に詳述する。
【００１１】
本発明の組換え肝細胞及び方法は、ＨＣＶの非構造蛋白質もしくはその中のＲＮＡポリメラーゼを産生する組換え肝細胞により特徴づけられる。該組換え肝細胞の作製は、ＨＣＶの非構造領域蛋白質もしくはＨＣＶのＲＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡ断片を適当な発現ベクターに組み込み、これを肝細胞に導入することにより達成される。
【００１２】
ＨＣＶの非構造領域蛋白質もしくはＨＣＶのＲＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡ断片は、サムブルック等が述べている、ＲＮＡの抽出、逆転写酵素（ＲＴ）反応とポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるｃＤＮＡの合成と増幅、遺伝子のクローニング等の一般的な方法（J. Sambrook, et. al., Molecular Cloning. A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, 1989）に従い、ＨＣＶを含むＣ型肝炎患者血清から得られる。好ましくは、公開特許公報の「特開平５−６８５６３」に記載のＨＣＶｃＤＮＡの塩基配列に基づいて、各断片の連結とｐＢＲ３２２への挿入を行うことにより構築された、ＨＣＶゲノムの全長を含むｃＤＮＡが組み込まれたプラスミド（ｐＨＣＶ-８と称する）が使用される。
より具体的には、ＨＣＶの非構造領域蛋白質をコードするＤＮＡ断片は、ｐＨＣＶ−８を適当な制限酵素、例えば、ＥｃｏＲＶ及びＥｃｏＲＩで切断し、その末端に適当なリンカー、例えば、ＨｉｎｄＩＩＩリンカーを付加した後、アガロース電気泳動法により各ＤＮＡ断片を分離し、ゲルから非構造蛋白質をコードする遺伝子を含む約６．５ｋｂのＤＮＡ断片（６．５ＨＣＶと称する）を回収することにより取得できる。また、ＨＣＶのＲＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡ断片は、配列表の配列番号１及び２に記載した合成プライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、該ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を含むＮＳ５Ｂ領域（図１に遺伝子上の位置を記載）を増幅し、これをＳａｌＩ及びＢａｍＨＩで切断後、アガロース電気泳動法により各ＤＮＡ断片を分離し、ゲルから１．７７ｋｂのＤＮＡ断片（１．７７ＮＳ５Ｂと称する）を回収することにより取得できる。このようにして得たＤＮＡ断片が適当な発現ベクターに組み込まれる。
【００１３】
発現ベクターとしては、プラスミド、コスミド、ウイルスベクター等を用いることができ、該発現ベクターに含まれるプロモーターは、サイトメガロウイルス、ＳＶ４０初期、ＳＶ４０後期、βアクチンなどから選択される。また、ＲＮＡポリメラーゼ活性を有するものが産生されるのであれば、他の蛋白質やペプチド、例えば、ｍｙｃ、β−ガラクトシダーゼ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、マルトース結合蛋白、プロテインＡ、ヒスチジンヘキサマー等との融合蛋白として発現させることもできる。好ましくは、ＤＮＡ断片６．５ＨＣＶが発現プラスミドｐＲｃ／ＣＭＶ（インヴィトロジェン社）のＨｉｎｄＩＩＩ切断部位に、１．７７ＮＳ５Ｂが、予めｍｙｃをプロモーターの下流に挿入した発現プラスミドｐＧＳＴ−Ｅ／ＣＡＧのＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｌＩ切断部位に挿入される。かくして得られる発現プラスミドをｐＲｃＨＣＮＳ６.５及びｐＧＣＮｍｙｃＮＳ５Ｂとそれぞれ命名した。
また、マーカー遺伝子として、アミノグリコシド３’ホスホトランスフェラーゼ遺伝子やジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、グルタミン合成酵素遺伝子などを利用でき、これらの選択用添加物質としては、Ｇ−４１８、ネオマイシン、メソトレキセート等が例示される。
【００１４】
宿主細胞の形質転換は公知の方法、例えば、燐酸カルシウム共沈澱法、ＤＥＡＥデキストラン法、リポフェクチン法、エレクトロポレーション法などが利用でき、用いる宿主細胞により適当な方法を選択すればよい。好ましくは、リポフェクチン（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社）が用いられ、添付のプロトコールに従って肝細胞の形質転換が行われる。宿主の肝細胞は、ヒトもしくはチンパンジーの初代肝細胞、Ｈ８Ａｄ１７、ＲＹ５等の不死化肝細胞あるいはＨｅｐＧ２、アレキサンダー等の株化肝細胞から適当に選択されるが、好ましくはＨｅｐＧ２が使用される。培地としては、肝細胞の培養に使用可能な一般の合成培地が使用される。
【００１５】
組換え肝細胞は、形質転換処理４日後に、未形質転換肝細胞が死滅するのに十分な時間、通常数日から数週間、一般に用いられる培地、例えば、ウイリアムＥ培地にＧ４１８を添加した培地中で培養することにより得られる。かくして得られる形質転換肝細胞中のＨＣＶのＲＮＡポリメラーゼもしくは該ポリメラーゼをコードするＤＮＡ断片は、通常使用される蛋白質あるいはＤＮＡ断片の検出方法、例えば、ウエスタンブロット法、ノーザンブロット法、ＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法等に従って検出される。より具体的には、６．５ＨＣＶ及び１．７７ＮＳ５ＢのＤＮＡ断片の検出には、組換え肝細胞からｍＲＮＡ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ベーリンガー社）を用いてｍＲＮＡを精製し、ジゴキシゲニン標識したＮＳ５Ｂ領域内のＲＮＡ（３６６ｂｐ）をプローブとするノーザンブロット法が行われる。また、各プラスミドで形質転換した組換え肝細胞中のＨＣＶのＲＮＡポリメラーゼは、ウエスタンブロット法により、間接的に検出することができる。すなわち、ｐＲｃＨＣＮＳ６.５で形質転換した組換え肝細胞に対する１次抗体として、抗ＮＳ５ラビットＩｇＧもしくは抗ＮＳ３ラビットＩｇＧが、ｐＧＣＮｍｙｃＮＳ５Ｂで形質転換した組換え肝細胞に対する１次抗体として、抗ｍｙｃマウスモノクローナル抗体もしくは抗ＮＳ５ラビットＩｇＧがそれぞれ使用される。また、両形質転換肝細胞に対する１次抗体として、ＨＣＶ陽性ヒトＩｇＧを使用することも可能である。
【００１６】
ＨＣＶが上記の組換え肝細胞中で複製するか否かは、該組換え肝細胞にＨＣＶを含む血清を接触させた後、これを長期に培養し、その培養上清または細胞破砕液中のＨＣＶＲＮＡもしくはＨＣＶ抗原を、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法、蛍光抗体法、ＰＣＲ法もしくはＥＬＩＳＡ法等の通常用いられる方法を用いて検出することにより明らかとなる。より具体的には、試料中のＲＮＡが、培養上清の場合ＩＳＯＧＥＮ−ＬＳ（日本ジーン社）を、細胞沈査の場合ＩＳＯＧＥＮ（日本ジーン社）を用い、添付のプロトコールに従って抽出される。続いて、該ＲＮＡを逆転写酵素、例えば、ＭＭＬＶ（ＧＩＢＣＯ社）でｃＤＮＡに変換した後、これをＰＣＲにより増幅し、１．５％アガロースゲル電気泳動にて該ｃＤＮＡを検出することにより、ＨＣＶの複製を判定することができる。
【００１７】
かくして得られるＨＣＶ感受性の組換え肝細胞は、長期にわたりＨＣＶを効率よく複製させることができ、ＨＣＶの複製阻害物質、例えば、ＨＣＶゲノムに対し相補であるオリゴヌクレオチド（アンチセンスオリゴヌクレオチドと称することもある）、ＨＣＶに対する中和抗体またはＨＣＶの複製を阻害することのできる他の化学合成物質等のスクリーニング系の一員として利用される。
【００１８】
【発明の効果】
本発明によると、ＨＣＶのＲＮＡポリメラーゼを構成的に産生し、且つ長期にＨＣＶを効率よく複製させることの出来るＨＣＶ感受性の組換え肝細胞が提供される。
【００１９】
本発明者が見出した上記のＨＣＶ感受性組換え肝細胞を用いることにより、従来困難とされていたＨＣＶの長期にわたる効率的なｉｎ  ｖｉｔｒｏ複製系を提供することができ、このＨＣＶ複製系を利用することにより、ＨＣＶの治療薬の開発を行うことが可能となった。また、本発明のＨＣＶ複製系においては、ＨＣＶもしくはＨＣＶ構成蛋白質を生産するので、このＨＣＶ感染肝細胞及びＨＣＶ感染肝細胞溶解液は、ＨＣＶの抗原及び抗体検出系に利用することができ、ＨＣＶ感染の診断薬を構築する材料となる。
以下、実施例に沿って本発明を更に詳細に説明するが、これらの実施例は本発明の種々の具体例を説明するものであって、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００２０】
【実施例】
実施例１：ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子領域を含む発現プラスミドの構築
本実施例に用いたｐＨＣＶ−８は、公開特許公報の「特開平５−６８５６３」に記載の塩基配列に基づき、同報に記載のＨＣＶｃＤＮＡ断片が挿入されたλｇｔ１１ファージベクターの各クローンを用いてサムブルック等の方法に準じ構築された。すなわち、適当な制限酵素処理及びアガロース電気泳動法による各λｇｔ１１ベクターからのＨＣＶｃＤＮＡ断片の切り出し並びにＨＣＶｃＤＮＡ断片の連結とｐＢＲ３２２への挿入の繰り返しにより、最終的に、ＨＣＶゲノムの全長をｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩの部位に挿入したプラスミドｐＨＣＶ−８を構築した。
【００２１】
上記ｐＨＣＶ−８の２μｇに、制限酵素ＥｃｏＲＶ（宝酒造社）１０ユニット及びＥｃｏＲＩ（宝酒造社）１５ユニットを加えて３７℃で２時間反応させた。この反応物をフェノール・クロロホルム処理後、エタノール沈殿を行って、ＤＮＡ断片を回収した。このＤＮＡ断片を３０μｌの水に溶解し、これにＴ４ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社）４ユニットと、２ｍＭのｄＮＴＰ混合物３μｌを加えて３７℃で３０分反応して、制限酵素により生じた切断末端を修復した。このＤＮＡ断片を前記と同様の方法で回収し、２０μｌの水に溶解した。
このうちの１０μｌの溶液にＨｉｎｄＩＩＩリンカー（宝酒造社）とＤＮＡ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（宝酒造社）の試薬を加えて、メーカーのプロトコールに従って連結反応を行った。反応終了後、前記と同様の方法でＤＮＡを回収し、これに１５ユニットのＨｉｎｄＩＩＩを加えて３７℃で２時間反応させた。この反応溶液を０.８％アガロースゲル電気泳動にかけ、非構造遺伝子領域を含む６.５ｋｂの６.５ＨＣＶをゲルより抽出・回収した。この６.５ＨＣＶをＨｉｎｄＩＩＩで処理済みの動物細胞用の発現ベクターｐＲｃ／ＣＭＶの１００ｎｇに加え、ＤＮＡ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔを用いて連結反応を行った。このようにして構築した発現プラスミドをｐＲｃＨＣＮＳ６.５と命名した（図２）。
【００２２】
ＨＣＶのＲＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子を含むＮＳ５Ｂ領域のみを発現するプラスミドは、以下のようにして構築した。まず、ｍｙｃの１０アミノ酸の付加した１２アミノ酸からなるタグをコードする塩基配列の５’末端にＨｉｎｄＩＩＩ切断配列を付加した、配列表の配列番号：３に記載のオリゴヌクレオチド、及びこれに相補であり、その５’末端にＳａｌＩ切断配列を付加した、配列番号：４に記載のオリゴヌクレオチドを合成し（サワデー社）、これらのオリゴＤＮＡをアニールさせた。このオリゴＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩおよびＳａｌＩで切断済みの動物細胞用の発現ベクターｐＧＳＴ−Ｅ／ＣＡＧの１００ｎｇに加え、ＤＮＡ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔを用いて連結反応を行った。こうして得られたプラスミドをＮ−１２と命名した（図３）。
【００２３】
次に配列番号：１及び２に記載のプライマーを合成し、これらのプライマーを用いてＰＣＲ法により、ｐＨＣＶ−８のＮＳ５Ｂ領域を増幅した。具体的には、１００ｐｍｏｌ／μｌのプライマーを各１μｌ、１０ｘＰＣＲバッファー１０μｌ、２５ｍＭＭｇＣｌ2６μｌ、２.５ｍＭｄＮＴＰミックス８μｌ、鋳型ＤＮＡ（ｐＨＣＶ−８）１００ｎｇ、組換えＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（５ｕ／μｌ）（宝酒造社）０.５μｌを混合し、これに水を加えて全量を１００μｌとした。この反応溶液をＰＣ−８００（アステック社）で３５サイクルのＰＣＲ増幅を行った。ＰＣＲは以下の条件で行った。９５℃１分、５５℃２分、７２℃２分の１サイクルの反応の後、９４℃１分、５５℃２分、７２℃２分の反応を３３サイクル、引き続き９４℃１分、５５℃２分、７２℃５分の反応を１サイクルの合計３５サイクルのＰＣＲ増幅を行った。反応終了後、フェノール・クロロホルム処理、引き続きエタノール沈殿で増幅産物を回収した。これを２０μｌの水に溶解し、ＳａｌＩ（宝酒造社）１０ユニット及びＢａｍＨＩ（宝酒造社）１０ユニットを加えて３７℃で２時間反応した。反応後１％アガロースゲル電気泳動を行い、１.７７ｋｂのＤＮＡ断片１.７７ＮＳ５Ｂを回収した（図４）。こうして得られた１.７７ＮＳ５Ｂを、ＳａｌＩ及びＢａｍＨＩで処理済みの図３に記載のＮ−１２プラスミド１００ｎｇに加え、ＤＮＡ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔを用いて連結反応を行った。得られた発現プラスミドをｐＧＣＮｍｙｃＮＳ５Ｂと命名した（図５）。
【００２４】
実施例２：１．７７ＮＳ５Ｂを含む発現プラスミドの肝細胞への導入と組換え肝細胞の取得
先に構築した発現プラスミドｐＲｃＨＣＮＳ６．５あるいはｐＧＣＮｍｙｃＮＳ５Ｂを、リポフェクチン（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社）を用いてＨｅｐＧ２肝細胞（ＡＴＣＣ寄託番号：  ＨＢ−８０６５）に導入した。導入方法はメーカー添付のプロトコールに従った。具体的には、発現プラスミド１μｇを１００μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ社）に加えたＤＮＡ溶液ならびに１０μｌの１ｍｇ／ｍｌリポフェクチンを１００μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地に加えた溶液をそれぞれ調製した後、室温でゆっくり混合し１０−１５分静置した。この混合溶液２００μｌにＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地を８００μｌ加え、全量を３５ｍｍの培養ディッシュに１ｘ１０5で播種したＨｅｐＧ２肝細胞に添加した。この細胞を３７℃ ＣＯ2インキュベーターで一夜静置した後、１０％ ＦＢＳを含むウイリアムＥ培地に置換して４８時間更に培養を続けた。培養ディッシュ一面に増殖した細胞を回収し、ウイリアムＥ培地で１０倍希釈して１０ｃｍの培養ディッシュに拡張した。翌日、選択マーカーＧ４１８（シグマ社：ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ）を終濃度１ｍｇ／ｍｌとなるように添加したウイリアムＥ選択培地に置換して、培養を継続した。３−５日毎に上記選択培地で培地交換を行い、２−３週後にＧ４１８耐性の細胞を取得して分離・拡張した。
【００２５】
実施例３：挿入遺伝子産物の発現の確認
Ｇ４１８耐性の細胞をそれぞれ１５クローンずつ分離・拡張し、挿入遺伝子に由来する発現をＲＮＡレベル及び蛋白レベルで解析した。
ＲＮＡレベルでの解析はノーザンブロット法によった。すなわち、２５ｃｍ2培養ディッシュでコンフルエントとなった上記の組換え体肝細胞を回収し、１０7相当の細胞からｍＲＮＡ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ベーリンガー社）を用いてｍＲＮＡを精製し、常法に従って１％アガロース電気泳動を行った後、ＨｙｂｏｎｄＮ＋（アマシャム社）に転写した。次いで、ＨＣＶゲノムのＮＳ５Ｂ領域に相当する配列表の配列番号：５に記載のＤＮＡ断片を鋳型として合成したジゴキシゲニン標識の３６６ｂｐのＲＮＡプローブを用いて、目的のＲＮＡを検出した。その結果、組換え体細胞に特異的なシグナルを検出した。
【００２６】
蛋白レベルでの解析はウエスタンブロット法によった。すなわち、２５ｃｍ2培養ディッシュより組換え体肝細胞を回収し、細胞処理バッファー（５ｍＭＴｒｉｓＨＣｌ、５％ＳＤＳ、２．５％２−メルカプトエタノール、１２．５％グリセロール、０．０１％ＢＰＢ）で細胞を処理後、レーン当たり１０5の細胞を１０−２０％のグラディエントゲル（第一化学社）にかけた。４０ｍＡの定電流で１時間泳動後、ＳＥＭＩ−ＤＲＹ  ＴＲＡＮＳＦＥＲ  ＣＥＬＬ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）でＰＶＤＦ膜（ミリポア社）に蛋白を転写し、常法に従い検出反応を行った。一次抗体には、抗ＮＳ５ラビットＩｇＧ、抗ＮＳ３ラビットＩｇＧ、抗ｍｙｃマウスモノクローナル抗体もしくはＨＣＶ陽性ヒトＩｇＧを用いた。ＰＶＤＦ膜上に転写された蛋白質の検出は、化学発光を利用したＢＭ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｋｉｔ（ベーリンガー社）を用い、添付のプロトコールに従って行った。その結果、組換え体肝細胞に特異的な予想されるサイズのシグナルを検出した（図６）。かくして得られたｐＲｃＨＣＮＳ６．５が組み込まれ、ＨＣＶ構成蛋白質であるＮＳ３及びＮＳ５を産生する組換え肝細胞をＨｅｐＧ２ Ｄｅｃ４と命名した。また、ｐＧＣＮｍｙｃＮＳ５Ｂが組み込まれ、ＮＳ５Ｂを発現する組換え肝細胞をＮｍｙｃＮＳ５Ｂ−３と命名した。
【００２７】
実施例４：ＨＣＶ感染実験（その１）
ＨＣＶの感染力価が高く、且つ、ノーザンブロット解析で全長のＨＣＶＲＮＡが検出された３種の血漿６６８４、５２６９及び７８７８を等量混合し、これを更に血清無添加のウイリアムＥ培地で２倍に希釈した材料を感染材料として用いた。
１０％ＦＢＳを含むウイリアムＥ培地に懸濁したＨｅｐＧ２ Ｄｅｃ４を２４ウェル培養プレートにウェル当たり１ｘ１０5個播種し、一夜吸着させた。翌日、各ウエルに上記の感染材料１ｍｌを添加して３７℃ＣＯ2インキュベーター内で一夜吸着させた。翌日、上清を吸引除去しＰＢＳで３回洗浄した後、１０％ＦＢＳ入りウイリアムＥ培地を１ｍｌ加えて培養を開始した。感染材料接種４日後、細胞を６ウェル培養プレートに拡張し、さらに４日後２５ｃｍ2フラスコに拡張した。さらに、４日後に２％あるいは１０％ＦＢＳ入りウイリアムＥ培地で培地のみ交換し、さらに３日後に細胞を継代した。この１週間単位の培地交換及び細胞継代を繰り返し、細胞を継代する毎にＰＣＲアッセイのための培養上清と細胞のサンプリングを行った。
【００２８】
ＨＣＶＲＮＡの検出は、サンプルからＲＮＡを抽出し、ＲＴ反応によりｃＤＮＡを合成した後、配列表の配列番号：６ないし１７に記載の合成プライマーを用いたＰＣＲによりＨＣＶｃＤＮＡを増幅し、１．５％アガロースゲル電気泳動を行い、目的のサイズを有するｃＤＮＡ断片を検出することにより行った。ＰＣＲは外側プライマーセットと内側プライマーセットの２段階で行った。用いたプライマー領域は３カ所有り、それぞれの場所と配列を図７に示す。より具体的には、まず、２５０μｌの培養上清に７５０μｌのＩＳＯＧＥＮ−ＬＳを、２−４ｘ１０6個の細胞沈査には１ｍｌのＩＳＯＧＥＮをそれぞれ加え、添付のプロトコールに従って抽出したＲＮＡに２０μｌのＨ2Ｏを加え溶解し、６５℃で５分間加熱後急冷した。これにＨ2Ｏ ２２．６７μｌ、１０ｘ反応バッファー５μｌ、リボヌクレアーゼインヒビター（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社）０．１８μｌ、各２５ｍＭのｄＮＴＰ混合液０．４μｌ、配列表の配列番号：６及び９に記載の５０μＭのプライマーを各０．５μｌ、ＭＭＬＶ０．５μｌ、ａｍｐｌｉ  Ｔａｑ（Ｐｅｒｋｉｎ社）０．２５μｌを加え、全量を５０μｌとして４２℃３０分間ＲＴ反応を行い、引き続きＰＣ−８００（アステック社）で３５サイクルのＰＣＲ増幅を行った。２段階目のＰＣＲ増幅を行うため、１段階目のＰＣＲ産物２．５μｌを分取し、これにＨ2Ｏ １９．５５μｌ、１０ｘ反応バッファー２．５μｌ、各２５ｍＭのｄＮＴＰ混合液０．１μｌ、配列表の配列番号：７及び８に記載の５０μＭのプライマーを各０．１２５μｌ、ａｍｐｌｉ  Ｔａｑ０．１μｌを加え、全量を２５μｌとして３５サイクルのＰＣＲ増幅を行った。２段階目のＰＣＲ産物を１０μｌ採取し、１．５％アガロースゲル電気泳動を行い、ＨＣＶの複製を判定した。９９日間の観察結果を表１に示す。●がＨＣＶ陽性を、○がＨＣＶ陰性を表す。９９日間にわたり断続的にＨＣＶが検出された。
【００２９】
【表１】
0003831035.tif 000002
【００３０】
実施例５：ＨＣＶ感染実験（その２）
ＮｍｙｃＮＳ５Ｂ−３の組換え肝細胞を用いてＨＣＶの感染実験を行った。感染材料を組換え細胞に添加した後、３７℃ＣＯ2インキュベーター内で４時間吸着させた以外は、全て実施例４と同様の方法で行った。５６日間の観察経過を表２に示す。●がＨＣＶ陽性を、○がＨＣＶ陰性を表す。その結果、５６日間にわたりＨＣＶが検出された。ＮＳ５Ｂ遺伝子を導入していないＨｅｐＧ２細胞では、２８日間の観察期間にはＨＣＶは検出されなかった。
【００３１】
【表２】
0003831035.tif 000003
【００３２】
実施例６：Ｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーション
Ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによる細胞内ＨＣＶ ＲＮＡの検出を行った。
１０％ＦＢＳを含むウイリアムＥ培地に懸濁した感染細胞を、４ウェルＬａｂＴｅｋ  Ｃｈａｍｂｅｒ（ヌンク社）の各ウェルに５ｘ１０4個播種し、３７℃で一夜吸着させた。翌日、パラホルムアルデヒドで細胞を固定した後、０．２μｇ／ｍｌのｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋを５分間作用させた。この試料にジゴキシゲニン標識ＲＮＡプローブを加えて、５５℃で一夜ハイブリダイゼーションを行った。ＨＣＶゲノムを検出するためのプローブは以下のようにして調製した。まず、ＨＣＶの翻訳開始コドンである３４２番目の塩基より７００番目の塩基までの３５９塩基をＰＣＲで増幅した。その際、下流側のプライマーにはＴ７ ＲＮＡポリメラーゼの認識配列を付加しておいた。このようにして増幅された配列表の配列番号：８に記載のＨＣＶＤＮＡをＲＮＡプローブ合成の鋳型として用いた。ＲＮＡプローブの合成は、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ（ベーリンガー社）及び試薬を用いて、添付のプロトコールに従い、ジゴキシゲニン標識法で行った。
【００３３】
ハイブリダイゼーション後、同じく５５℃で５ｘＳＳＣ（２０ｘＳＳＣを４倍希釈したもの。２０ｘＳＳＣは１７５.３ｇのＮａＣｌと、８８.２ｇのクエン酸ナトリウムをＨ2Ｏで１リットルとしてｐＨ７.０に調製したもの）液で約１分、更に２ｘＳＳＣで２０分、引き続き０.２ｘＳＳＣで２０分を２回の洗浄操作を行った。洗浄操作終了後、アルカリフォスファターゼ標識抗ジゴキシゲニン抗体（ベーリンガー社）を室温で３０分反応させた。次に基質溶液のＢＣＩＰ３３μｌおよびＮＢＴ４４μｌを加えて、室温にて６時間あるいは一夜反応させた。反応後、アセトカルミン液で細胞を染色して脱水した後、封入して光学顕微鏡で観察した。
【００３４】
実施例７：蛍光抗体法
１０％ＦＢＳを含むウイリアムＥ培地に懸濁した感染細胞を、４ウェルのＬａｂ  Ｔｅｋ  Ｃｈａｍｂｅｒ（ヌンク社）の各ウェルに５ｘ１０4個播種し、３７℃で一夜吸着させた。翌日８０％の冷エタノールで細胞を固定した後、常法に従い蛍光抗体反応を実施した。一次抗体にはＨＣＶゲノムのコア蛋白を大腸菌で発現させて精製した抗原を、マウスに免疫して調製したモノクローナル抗体を用いた。このモノクローナル抗体を１０μｇ/ｍｌの濃度で一次抗体反応を行った。二次抗体にはＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧ（カッペル社）を用いた。
【００３５】
実施例８：アンチセンスオリゴヌクレオチドによるＨＣＶの複製阻害
１０％ＦＢＳを含むウイルアムＥ培地に懸濁したＮｍｙｃＮＳ５Ｂ-３細胞を２４ウェルプレートにウェル当り５ｘ１０4播種し、３７℃で培養した。培養液の容量は１ｍｌとした。２日後、細胞をＰＢＳで洗浄し、２％のＦＢＳを含むウイリアムＥ培地に置換した。次に、配列表の配列番号１９に記載の、ホスホロチオエート結合を骨格に持ち、ＨＣＶの塩基配列に対し、相補であるオリゴヌクレオチド（グライナージャパン社）および、同じ配列を持ち、３’にコレステロールを付加したオリゴヌクレオチドを、終濃度が前者の場合１０μＭ、後者の場合１μＭとなるように添加して１日培養した。陰性対象としてＨＣＶとは無関係の配列を有し、その他の構成要素は同じであるオリゴヌクレオチドを用いて、同様に処理した。翌日細胞をＰＢＳで２回洗浄し、ＨＣＶを感染させた。ＨＣＶの感染は感染材料５２６９および７８７８の各血漿を当量混合して使用し、３７℃で２時間吸着させた点以外は実施例４に記載の方法で行った。ウイルス吸着後、細胞をＰＢＳで５回洗浄し１０％のＦＢＳを含むウイリアムＥ培地を１ｍｌ添加して培養を開始した。感染材料接種３日後に感染細胞をオリゴヌクレオチドで再度処理した。すなわち、感染細胞をＰＢＳで１回洗浄後、２％のＦＢＳを含むウイリアムＥ培地１ｍｌに置換し、これに上述した濃度となるようにオリゴヌクレオチドをそれぞれ添加した。翌日終濃度が１０％となるように８０μｌのＦＢＳを加えて、培養を継続した。更に４日後に同じヌクレオチド処理操作を繰り返した。この３度目のオリゴヌクレオチド処理から４日後に培養上清および細胞を回収し、実施例４に記載の方法でＨＣＶＲＮＡの検出を行った。
【００３６】
その結果を図８に示す。図の番号１、２は正常ヒト血清の結果を示す。３〜６はオリゴ処理したＨＣＶ感染ＮｍｙｃＮＳ５Ｂ-３細胞の結果を示す。３は配列番号：１９のオリゴヌクレオチドによる処理、４は陰性対象のオリゴヌクレオチドによる処理、５は３’端にコレステロールを付加した配列番号：１９のオリゴヌクレオチドによる処理、６は３’端にコレステロールを付加した陰性対象のオリゴヌクレオチドによる処理をそれぞれ示す。７はオリゴヌクレオチド未処理のＨＣＶ感染ＮｍｙｃＮＳ５Ｂ-３細胞を示す。８はオリゴ未処理のＨＣＶ感染ＨｅｐＧ２細胞を示す。９はＨＣＶ非感染のＮｍｙｃＮＳ５Ｂ-３細胞を示す。１０はＨＣＶ陽性血漿の結果を示す。配列番号：１９のオリゴヌクレオチド処理を行った場合にＨＣＶの複製阻害効果が見られた。
【００３７】
【配列表】
配列番号：１
配列の長さ：３０
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列
0003831035.tif 000004
【００３８】
配列番号：２
配列の長さ：３３
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列
0003831035.tif 000005
【００３９】
配列番号：３
配列の長さ：４２
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列
0003831035.tif 000006
【００４０】
配列番号：４
配列の長さ：４２
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列
0003831035.tif 000007
【００４１】
配列番号：５
配列の長さ：３６６
配列の型：核酸
鎖の数：２本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ  ｔｏ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ＲＮＡ
他の情報：ＨＣＶゲノム１ｂ型の塩基配列の９０４１〜９４０６番目に相当する。
配列
0003831035.tif 000008
【００４２】
配列番号：６
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列
0003831035.tif 000009
【００４３】
配列番号：７
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列
0003831035.tif 000010
【００４４】
配列番号：８
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列
0003831035.tif 000011
【００４５】
配列番号：９
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列
0003831035.tif 000012
【００４６】
配列番号：１０
配列の長さ：２１
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列
0003831035.tif 000013
【００４７】
配列番号：１１
配列の長さ：２１
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列
0003831035.tif 000014
【００４８】
配列番号：１２
配列の長さ：２１
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列
0003831035.tif 000015
【００４９】
配列番号：１３
配列の長さ：２１
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列
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【００５０】
配列番号：１４
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列
0003831035.tif 000017
【００５１】
配列番号：１５
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列
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【００５２】
配列番号：１６
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列
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【００５３】
配列番号：１７
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列
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【００５４】
配列番号：１８
配列の長さ：３５９
配列の型：核酸
鎖の数：２本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ  ｔｏ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ＲＮＡ
他の情報：ＨＣＶゲノム１ｂ型の塩基配列の３４２〜７００番目に相当する。
配列
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【００５５】
配列番号：１９
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
他の情報：ＨＣＶゲノム１ｂ型の塩基配列の３４０〜３５９番目に相当し、これに相補的な配列で、ホスホロチオエート結合を骨格に持つ。
配列
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【図面の簡単な説明】
【図１】ＨＣＶゲノムの遺伝子構造を示す図である。
【図２】発現ベクターｐＲｃ／ＣＭＶにＨＣＶの非構造タンパク質をコードする遺伝子領域を含むＤＮＡ断片（６．５ＨＣＶ）を挿入した発現プラスミドｐＲｃＨＣＮＳ６．５の構築の概略図を示す。
【図３】発現ベクターｐＧＳＴ−Ｅ／ＣＡＧにｍｙｃタグを挿入した発現プラスミドＮ−１２の構築の概略図を示す。ｍｙｃの１０アミノ酸を含む１２アミノ酸をコードするオリゴヌクレオチドと、これの相補鎖を合成し、アニールさせた後、発現ベクターのプロモーターの下流に挿入した。
【図４】ＨＣＶのＲＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片（１．７７ＮＳ５Ｂ）を作製するための概略図を示す。
【図５】図３のＮ−１２のｍｙｃタグの下流に図４の１．７７ＮＳ５Ｂを挿入した発現プラスミドｐＧＣＮｍｙｃＮＳ５Ｂの構築の概略図を示す。
【図６】ｐＲｃＨＣＮＳ６.５を導入した肝細胞ＨｅｐＧ２Ｄｅｃ４、及びｐＧＣＮｍｙｃＮＳ５Ｂを導入したＮｍｙｃＮＳ５Ｂ−３をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、ウエスタンブロット法でＨＣＶ遺伝子に由来するタンパク質の発現を同定した結果を示す模式図である。
【図７】ＲＴ−ＰＣＲに用いたプライマーのＨＣＶゲノム上の位置を示す図である。Ａ領域、Ｂ領域あるいはＣ領域を用いて、ＲＴ−ＰＣＲを行ない、感染細胞内のＨＣＶを検出した。
【図８】それぞれのサンプルよりＲＮＡを抽出し、ＲＴ-ＰＣＲを行った後、アガロース電気泳動にかけ、エチジウムブロミドで染色した結果を示す図面で、アンチセンスオリゴヌクレオチドによるＨＣＶの複製阻害効果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
0003831035.tif 000029
【図８】
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