(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｔ部分に結合したＩ部分よりなる化合物であって、該化合物は式：
Ｉ−Ｔ
を有し、
ここに、該Ｉ部分は、
0003856463.tif 000014
であり；
該Ｔ部分は：
0003856463.tif 000015
0003856463.tif 000016
0003856463.tif 000017
よりなる群から選択される該化合物。
【請求項２】
式：
0003856463.tif 000018
［式中、Ａ-は許容される一価対アニオンを意味する］
を有する化合物。
【請求項３】
該Ａ-がクロライド、ブロマイドおよびイオダイドよりなる群から選択される請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
式：
0003856463.tif 000019
［式中、Ａ-は許容される一価対アニオンを意味する］
を有する化合物。
【請求項５】
式：
0003856463.tif 000020
［式中、Ａ-は許容される一価対アニオンを意味する］
を有する化合物。
【請求項６】
該Ａ-がクロライド、ブロマイドおよびイオダイドよりなる群から選択される請求項５に記載の化合物。
【発明の詳細な説明】
背景
本発明は、各々が、１以上の官能性化された鎖もしくは部分で誘導体化されたインターカレーター部分または置換インターカレーター部分よりなるインターカレーター化合物、およびかかる化合物の使用に関し、該化合物はＤＮＡ分子への結合に対して高い親和性を有する。これらのインターカレーター化合物は、ＤＮＡ分子へのインターカレーター挿入を要する公知の方法内でＤＮＡ分子への改良された結合を示す。さらに、本発明は、標識、捕獲、治療的挿入、アッセイ等で利用される、インターカレーターとして機能するセグメントによるＤＮＡ分子の促進された結合に関し、この結合では、化合物の利用効率の増大のためインターカレーターの能力が改善されている。
「インターカレーター」なる語は、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の隣接塩基対間への平面状の芳香族またはヘテロ芳香族化合物の挿入を記述するために、３０年以上前に化学分野に導入された。多くのＤＮＡインターカレーティング化合物は、生物学的に興味深い特性を引き出す。一般に、これらの特性はＤＮＡに対するその反応性に関係することで意見の一致が見られている。より活性な化合物を求める研究において、ＤＮＡに対する最高の可能な親和性を持つ分子を設計するのが論理的である。１９９０年に、エチジウムホモダイマーとｄｓＤＮＡとの複合体が４ないし５塩基対当たり１のダイマーの比率で起こり、アガロースゲルでの電気泳動で安定であったと報告された。これは、分離後のピコグラム感度でのＤＮＡ断片の蛍光、検出および定量ならびにバックグラウンド染色の完全な不存在を可能とした。かかる結果は、例えば、ＤＮＡインターカレーティング染料で作成された官能性化合物によって、インターカレーター化合物の種々の操作を通じて追求されてきた。これらの努力の結果、エチジウムブロマイドを利用するＤＮＡインターカレーティング剤が種々のＤＮＡ分析法で用いられてきた。
エチジウムブロマイドを利用する種々の報告されたＤＮＡインターカレーティング剤は、数多くのＤＮＡ分析法で用いられてきた：例えば、
Christenら［「ｃＤＮＡ合成の非放射性検出のためのエチジウムブロマイド−アガロースプレートアッセイ（An Ethidium Bromide-Agarose Plate Assay for the Nonradioactive Detection of CDNA Synthesis）」, Anal. Biochem., 178(2), 1989年5月1日、269-272頁］は、エチジウムブロマイドがｃＤＮＡ合成反応の成功を判断するのに用いられたことを報告している。アガロース中のエチジウムブロマイドはＲＮＡおよびＤＮＡを定量するのに使用できるので、ｍＲＮＡからの二本鎖ＤＮＡの合成をアッセイするために、二本鎖ＤＮＡのより大きな蛍光が利用できる条件が工夫された。アガロース中５マイクログラム／ｍｌのエチジウムブロマイドは、０．０３ないし０．００１５マイクログラムの範囲のｃＤＮＡの定量的検出を可能とする。ドデシル硫酸ナトリウムはｃＤＮＡの測定に対して逆効果を有していた。引き続いてアルカリゲル電気泳動および５マイクログラム／ｍｌのエチジウムブロマイドでの染色によりｃＤＮＡを分析することにより、ｃＤＮＡの正確で迅速なサイズ決定を可能とし、０．０１〜０．０５マイクログラムのｃＤＮＡを要するに過ぎなかった。
Petersen, S.E.（「簡潔な一段階エチジウムブロマイド染色プロトコルを用いるフローサイトメトリーＤＮＡ分析の正確性および信頼性（Accuracy and Reliability of Flow Cytometry DNA Analysis Using a Simple, One-Step Ethidium Bromide Staining Protocol）」, Cytometry, 7(4), 1986年7月, 301-306頁）は、変動および誤差の源を、エチジウムブロマイドで染色した、洗剤で単離した核のＤＮＡ含量の簡潔なフローサイトメトリー分析について調べたことを報告している。
「二段階カウンター免疫電気泳動によるＤＮＡに対する抗体および循環ＤＮＡの検出におけるエチジウムブロマイド（Ethidium Bromide in the Detection of Antibodies to DNA and of Circulating DNA by Two-Stage Counterimmunoelectrophoresis）」（J. Immunol. Methods, 85(1), 1985年12月17日, 217-220頁）において、Riboldi, et al. は、沈殿抗−ＤＮＡ抗体または循環ＤＮＡの検出においてカウンター免疫電気泳動の限界を克服しようとする試みにおいて、エチジウムブロマイドを用いて沈殿系の可視性を増加させ、その特異性を確認したことを報告している。
W. A. Dennyは、「抗癌剤としてのＤＮＡ−インターカレーティングリガンド：将来のデザインについての展望（DNA-Intercalating Ligands as Anti-Cancer Drugs: Prospects for Future Design）」（Anticancer Drug Des., 4(4), 1989年, 12月, 241-263頁）において、ドキソルビシン(doxsorubicin)の臨床的成功以来、抗癌剤としてのＤＮＡ−インターカレーティングリガンドにおける興味が大いに湧いてきたことを報告している。
プローブまたは標的を問わず、標識核酸の検出を容易にするために、核酸を標識する多数の薬剤が記載されてきた。適当な標識は、蛍光、放射能、比色分析、Ｘ−線回折または吸収、磁性または酵素活性によって検出可能なシグナルを供し、例えば、蛍光団、発色団、放射性同位体、酵素、特異的結合パートナーを有するリガンドを包含する。
核酸を検出するには蛍光染料が適する。例えば、エチジウムブロマイドは、遊離溶液中に存在する場合よりも二本鎖ＤＮＡに結合した場合の方が増大した蛍光を示すインターカレーティング剤である。一本鎖核酸に対するエチジウムブロマイドの親和性は比較的低いにも拘わらず、エチジウムブロマイドは一本鎖および二本鎖核酸双方を検出するのに使用できる。エチジウムブロマイドはゲル電気泳動に続いて核酸を検出するのに慣例的に使用される。適当なゲルマトリックス、例えば、アガロースまたはアクリルアミドでのサイズ分画に続き、該ゲルをエチジウムブロマイドの希薄溶液に浸漬する。
蛍光標識ポリヌクレオチドプローブおよびポリヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイの使用が報告されている。これらの方法によると、特定のアブソーバー−エミッター部分を核酸断片の３’末端および５’末端に連結させることによってプローブが調製される。該断片は、両断片がハイブリダイズしたときに該アブソーバーおよびエミッター部分が近接している結果検出可能なエミッター蛍光が生じるように、標的ＤＮＡの隣接部分にハイブリダイズすることができる。これらの方法によると、すべてのin vitro核酸重合が完結した後に、蛍光染料が標的ＤＮＡに導入される。多くの箇所で、インターカレーティング剤の核酸ポリメラーゼに対する阻害効果が記載されている。
ＤＮＡ結合染料は、鋳型に結合することに起因する核酸複製過程の阻害効果のため、抗生物質として有用である。インフルエンザまたはヘルペスウイルスの感染性をブロックするためのインターカレーティング剤の使用が報告されている。また、多数のＤＮＡ結合剤（インターカレーターおよび非インターカレーターのどちらも）が核酸複製を阻害することが報告され記載されている。例えば、エチジウムブロマイドはＤＮＡ複製を阻害する。
試料中の標的核酸を検出する方法が提供されている。該方法は、（ａ）試料、ＤＮＡ結合剤および増幅用薬剤よりなる増幅された反応混合物を供し、ここに、該ＤＮＡ結合剤は二本鎖核酸に結合した場合に検出可能なシグナルを供することを特徴とし、そのシグナルは該薬剤が結合しない場合に該薬剤によって供されるシグナルから区別可能であり；（ｂ）工程（ａ）の混合物によって生じるシグナル量を測定し、（ｃ）標的核酸を増幅する条件下で該混合物を処理し；（ｄ）工程（ｃ）の混合物によって生じる該シグナルの量を測定し、次いで（ｅ）増幅が起こったか否かを判断する工程からなる。エチジウムブロマイドまたはエチジウムホモダイマーのごときこれらのＤＮＡ結合インターカレーティング剤は種々の分子のＤＮＡとのインターカレーションの蛍光分析研究を可能とする。
ＤＮＡ結合または増幅された核酸の検出に有用なインターカレーティング剤は、核酸二重らせん中の積み重ねられた塩基対間への挿入が可能な薬剤または部分である。エチジウムホモダイマーおよびエチジウムブロマイドのごときインターカレーティング剤は、一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡに結合した場合または溶液中にある場合よりも、二本鎖ＤＮＡにインターカレートしたときの方が大きい強度で蛍光を発する。インターカレーターの他の用途は、複雑な生物学的または臨床的検体からの核酸の分離および単離または精製の分野におけるものであった。
液状の生物学的試料からデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を分離する種々の方法が当該分野で公知であるが、非常に時間を要するか、あるいは複雑で厄介なものである。ＤＮＡがニトロセルロースに付着することが知られている。ＤＮＡを含有する液状試料をニトロセルロースフィルターに通すと、該ＤＮＡは該フィルターに付着または結合する。
試料からＤＮＡを分離するもう１つの方法は、ショ糖または塩化セシウム密度勾配での超遠心である。ＤＮＡは、この方法により、浮遊密度または沈降係数に従って、蛋白質のごとき他の高分子から分離される。生物学的試料を遠心管中の密度勾配上に載置し、ＤＮＡにつき非常に長時間非常な高速で回転させて、密度勾配中を進行させる。この方法は満足すべきものであるが、非常に時間がかかり労力を要する。遠心時間は試料当たり２０時間またはそれ以上であろう。さらに、もし試料を余り長く回転させると、ＤＮＡが試料から分離されないのみならず、試料中の他の成分と共に勾配を完全に通過して遠心管のまさに底にまで至ってしまうであろう。従って、この方法は、複雑な試料からＤＮＡを分離するための速くて容易な方法としては不適当である。
また、アガロースポリアクリルアミドゲル電気泳動が生物学的試料からＤＮＡを分離するのに用いられる。この方法では、ゲルを含有するガラス製もしくはプラスチック製容器の一端に試料を適用し、該容器の長さ方向に電流を加える。負に荷電した核酸分子はアノードに向かって移動し、より大きな分子はよりゆっくりと移動する。分子の移動速度は、その分子量およびゲル物質中の架橋濃度および密度に依存する。次いで、当該ＤＮＡが位置するゲル部分を切断し、最後にＤＮＡを抽出することによって該ＤＮＡをゲルから取り出す。この方法もまた、時間がかかり労力を要し、ＤＮＡは依然ゲルから分離しなければならない。ＤＮＡを電気泳動ゲル法または遠心によって分離する場合、ＤＮＡは何らかの方法で染色して可視化しなければならない。典型的には、エチジウムブロマイド（ＥｔＢｒ）が染色剤として用いられてきた。エチジウムブロマイドは、ＤＮＡの二重らせん構造の塩基対間へのインターカレーションによって当該ＤＮＡに付着する。
より最近では、かかる分子とＤＮＡとのインターカレーションを含む蛍光実験を可能とするために、エチジウムホモダイマーが合成され、二官能性インターカレーターと共に導入されている。エチジウムホモダイマー（「ＥｔｈＤ」）はエチジウムブロマイドよりも約２桁大きい強さで二本鎖ＤＮＡ（「ｄｓＤＮＡ」）に結合すると判断されている。ＥｔｈＤのｄｓＤＮＡとの複合は、４ないし５塩基対当たり１のダイマーの比でなされ、アガロースベースでの電気泳動に対して安定であることが判明している。ｄｓＤＮＡへの結合に際し、ダイマーの蛍光量子収率はヌクレオチド配列とは独立して４０倍増加する。
所望により、安定なｄｓＤＮＡ−蛍光団(fluoropore)複合体を形成して、各々数個ないし数千個の蛍光団を得ることができる。適当な制御条件下、これらの複合体は染料を他の核酸または蛋白質に移行させない。これらの複合体の重要な特性は、その蛍光発光強度がインターカレートした染料分子の数の直線関数であるという点にある。高感度の蛍光検出装置がより一般的に入手できるようになるに従い、例えば、ＤＮＡの高感度検出のための放射能に変えて染料を使用する可能性は、次第に価値あるものとなりつつある。
染料ｄｓＤＮＡ複合体は、その組成、構造およびサイズが特定の適用にあつらえることができる広範囲の分光特性を持つ蛍光標識の新規なファミリーを表す。ＤＮＡ分子は誘導体化されて、アビジンまたは抗体によって容易に認識できるビオチン、ジゴキシゲニンまたは多数の他の置換基に結合できる。染料を負荷されたかかる誘導体化ＤＮＡ分子は、多数の応用、例えば、現在他の蛍光標識を使用するイムノアッセイ、蛍光、および染色体のin situハイブリダイゼーションにおいて、かなり高い感度の検出を可能とする。
インターカレーション部位および一本鎖領域を供して特異的標的配列のハイブリダイゼーションによる認識を可能とする二本鎖領域を持つプローブは、有用な蛍光標識を得るためのもう１つのアプローチを提供する。一本鎖および二本鎖核酸へのインターカレーターの結合の間の明瞭な区別を可能とする条件の開発は、かかるプローブの使用にとって必須の前提要件である。
蛍光プローブは、分子および細胞の分析および分離のための価値ある薬剤である。その適当ないくつかの特別の例は、蛍光、フローサイトメトリー、蛍光活性化細胞分別、および蛍光顕微鏡法の技術による細胞の混合物中における細胞の亜集団(Subpopulation)からの同定および分離である。他の適用は、第２の種に結合する特異的結合対の物質もしくはメンバー、または特異的結合対のメンバー、例えば、イムノ蛍光アッセイにおける抗原−抗体反応の濃度の測定を含む。さらにもう１つの適用は、蛍光染色の技術による、ゲルおよび他の不溶性支持体中における物質の位置決めである。
これらの目的用の蛍光物質の選択は、種々の障害によって妨げられている。その１つは蛍光物質の吸収および発光特性であるが、これは多くのリガンド、受容体および他の結合対メンバー、ならびに試料に随伴する関係のない混入物質、例えば、血液、尿および脳脊髄液が自己蛍光発光し、試料を適当な刺激剤に暴露した場合に蛍光標識によって生ずる蛍光シグナルの正確な測定または定量に干渉するからである。もう１つの考慮すべき点は、蛍光物質の量子効率である。さらにもう１つの考慮すべき点は自己クエンチングであり、これは、蛍光分子が相互に近接した場合に相互反応する時に起こり得る。更に考慮すべき点として、他の化合物とのまたはテスト容器との蛍光物質の非特異的結合がある。
ｄｓＤＮＡはビス−インターカレーターＥｔｈＤとの高度に蛍光性の複合体を形成することが示されてきた。ビス−インターカレーターＥｔｈＤに関する観察は、特有の特性を持つ高度に蛍光性で安定なｄｓＤＮＡ−染料複合体のファミリーを形成させるためにインターカレーターを利用できることを示唆している。かかる複合体はｄｓＤＮＡ断片の多重検出によって利用でき、また、異なる染料で非共有結合的に標識した適当に多様化したｄｓＤＮＡ断片を蛍光プローブのユニークなファミリーとして使用できる多くの分析用途に利用できる。
0003856463.tif 000002
しかしながら、この化合物は、ＤＮＡに結合した場合に、自己クエンチングする傾向を有する。
フローサイトメトリー装置では、細胞または他の粒子を液体流動流にて流動させて、そのある特徴の調査を容易とする。一般に、フローサイトメトリー装置は、ある種の注目する細胞または粒子の存在を同定し、ある場合には、それらの細胞または粒子を計数し、また、それらの細胞または粒子のうち注目したものを収集できるように分別能を付与するのに有用である。典型的なフローサイトメトリー装置において、各細胞が検知領域を連続的にかつ一度に実質的に１個ずつ通過するような迅速移動液体流にて、細胞を含有する試料を装置に向かわせる。細胞容量は、各細胞が検知領域を通過するときの電気的インピーダンスの変化によって測定できる。同様に、もし入射光を検知領域に向けると、通過する細胞は、それを通過するときにかかる光を散乱する。この散乱光は、細胞の形状およびサイズ、屈折率、不透明度、粒度、粗さ等の関数として与えられる。さらに、入射光の励起エネルギーを通過した結果として励起された、標識細胞または自己蛍光性細胞によって発光する蛍光は、蛍光特性を有する細胞の同定用に検出可能である。フローサイトメトリー装置によって細胞分析を行った後、もし装置がかかる能力を持つものとして設計されていると、所望の特定を有するものとして同定された細胞を分別できる。
フローサイトメトリー装置のごとき器具は、免疫系の種々の応答、反応および機能を研究する研究家や実験者に特に有用である。免疫蛍光実験、ならびに蛍光イムノアッセイは、病気の状態、実態等が適切に特徴付けられるように、注目する選択細胞を同定し標的化する点において実験者を助する。免疫系の実験に加えて、蛍光分析は、細胞物質の基質の研究を含めた、細胞生物学および形態学的研究においてもかなり有益である。
細胞についてのデータおよび情報を得るために蛍光を用いる場合において、蛍光応答についてのテストを行うメカニズムは、得られる結果と同様器具の設計での主要な考慮事項である。特に、蛍光マーカーは、かかるマーカーが蛍光性の染色剤または染料であるかを問わず、典型的には光エネルギーによって励起される。通常、使用される蛍光発色マーカーにつき最大レベルの励起を生じる最適波長がある。一旦励起されると、蛍光発光は、典型的には、励起波長とは異なる波長で起こる。蛍光分析装置は、蛍光顕微鏡、イメージアナライザーまたはフローサイトメーターを問わず、一般に、蛍光シグナルが最強となる最大発光波長での蛍光発光を検出するように設計される。
重要なインターカレーターとしてのエチジウムホモダイマーの用途の発見および公表の前においては、通常選択されるインターカレーターはエチジウムブロマイドであった。エチジウムブロマイドインターカレーターの使用は、蛍光法、アガロースゲル上におけるエチジウムブロマイドをインターカレートしたＤＮＡの定量的蛍光、エチジウムブロマイド−アガロースプレートアッセイまたは偽ＤＮＡ分析(false DNA analysis)の検出等を含む。エチジウムブロマイドおよびプロピジウムブロマイド(propidium bromide)は、さらにフローサイトメトリー、ならびに直接電子イメージングのための適用、蛍光の直接的かつ迅速な定量およびエチジウムブロマイド−染色ＤＮＡとしての適用における電気泳動ゲルで用いられた。また、エチジウムブロマイドは、沈殿系の可視性を増大させるために、および関係している抗−ＤＮＡ抗体または循環ＤＮＡの検出のための２段階カウンター免疫電気泳動における特異性を確認するためにも用いられてきた。種々の環境におけるインターカレーターとしてのエチジウムブロマイドの利用、ならびにエチジウムホモダイマーインターカレーターのより最近の利用は、文献によく記載されており、インターカレーター法および効率の最先端の情報を提供する。
エチジウムブロマイドの染色剤としてのいくぶん異なった適用において、エチジウムブロマイドは固体支持体に連結されてきた。１９７８年１０月１０日にChirikjianに発行された米国特許第４，１１９，５２１号は、活性化多糖の蛍光性ＤＮＡインターカレーティング剤の誘導体を開示している。該特許における誘導体は、短波長紫外光による励起で、ＤＮＡおよびその分画物が直接見えるようにするための蛍光染色剤として機能する。該特許で用いるインターカレーティング剤はエチジウムハライドであり、好ましい剤はエチジウムブロマイドである。この剤はアガロースのごとき活性化多糖と共有結合している。
種々の環境で用いるインターカレーターとしてのエチジウムブロマイドの利用、及びエチジウムホモダイマーインターカレーターのより最近の利用は文献によく記載されており、インターカレーター法および効率についての最先端の情報を提供する。しかしながら、現在、インターカレーターの利用およびＤＮＡでのインターカレーターの活性を改良する要求、特に（１）ＤＮＡ分子へのインターカレーターの結合のための高親和性；（２）自己クエンチングの減少；および（３）優れた輸送動態の提供に対する要求が依然として存在する。これらの特質を有するインターカレーターにより、前記方法に関係する多くの機能のうちの１つを実行するのに要求されるインターカレーターの量を減少し、これにより、方法はより有効なものとなる。加えて、注目する種々の使用の精度および信頼性の改良が継続する関心事である。
概要
広く、本発明は、１以上の「Ｔ」部分に結合した「Ｉ」部分を有する化合物を提供する。該化合物の一般式は：
Ｉ−（Ｔ）m
［式中、該Ｉ部分は芳香族もしくはヘテロ芳香族セグメントを表し；該Ｔ部分は「テール」または「鎖」部分を表し；且つｍは１ないし５の整数を表す］
によって表される。ｍが１を超える場合はＴは相互に同一または異なり得る。
１の態様において、本発明は、１以上のＴ部分に結合したＩ部分を有する化合物を提供し、１より多いＴ部分が存在する場合、該Ｔ部分は相互に同一または異なり、該Ｔ部分は式：
0003856463.tif 000003
を有し、従って該化合物は式：
0003856463.tif 000004
［式中、Ｉは芳香族またはヘテロ芳香族セグメント；
Ｘは、窒素および硫黄よりなる群から選択されるヘテロ原子；
Ｒ、Ｒ1およびＲ2は相互に同一または異なって、アルキル基、脂環式基、ヘテロ脂環式基、芳香族基またはヘテロ芳香族基；
Ｒ3およびＲ4はＸが窒素である場合は水素；Ｒ3およびＲ4はＸが硫黄である場合はメチル基、エチル基、またはフェニル基；
ｋはゼロまたは１ないし１０の整数；
ｑはゼロまたは１ないし１０の整数；
ｎは２０ないし２０の整数；
ｍは１ないし５の整数；
ｏはゼロまたは１；および
ｐはゼロまたは１；
但し、Ｘが窒素；Ｒ3およびＲ4が水素、Ｒ、Ｒ1およびＲ2がメチレン基；ｏが１；ｐが１；ｍが１；である場合、Ｉはフェナントリジウム(phenantruidium)またはその酸付加塩ではなく；
Ｘが窒素；Ｒ3およびＲ4が水素；Ｒ、Ｒ1およびＲ2がメチレン基；ｏが１；ｐが１；ｍが２；第１のＴ部分がＩ部分に直接結合し、ここに、ｎは２、ｋは１であってｑはゼロであり、第２のＴ部分が第１のＴ部分に直接結合し、ここに、ｎは２であってｋおよびｑはゼロである場合、Ｉ部分はフェナントリジウムまたはその酸付加塩ではなく；
Ｘが窒素；Ｒ3およびＲ4が水素；Ｒ、Ｒ1およびＲ2がメチレン基；ｏが１；ｐが１；ｍが２；第１のＴ部分が該Ｉ部分に直接結合し、ここに、ｎが２、ｋが１であってｑがゼロであり、第２のＴ部分が第１のＴ部分に直接結合し、ここに、ｎが２、ｋが１であってｑが１である場合は、Ｉ部分はフェナントリジウムまたはその酸付加塩ではなく；且つ
Ｘが窒素：Ｒ3およびＲ4が水素：ｏが１；ｐが１；ｍが３；ｎが２；ｋが１；ｑがゼロである場合はＩ部分はフェナントリジウムまたはその酸付加塩ではない］
を有する化合物またはその酸付加塩である。
本発明は、官能性化鎖を有するインターカレーター部分または置換されたインターカレーター部分よりなる化合物を提供し、その化合物は、ＤＮＡ分子への結分につき高い親和性を提供し、優れた輸送動態を供しつつ自己クエンチングの減少を示す。本発明のインターカレーターは、フローサイトメトリー環境においてＤＮＡ分子と結合させたときに、同一のフローサイトメトリー環境において用いられるエチジウムホモダイマーよりも蛍光が約８ないし１０倍明るくなるような、蛍光の増大を提供することが判明した。蛍光の増大のため、ＤＮＡハイブリダイゼーションの検出は、エチジウムホモダイマーまたはエチジウムブロマイドのごとき通常のインターカレーティング剤を用いるよりもかなり低濃度の本発明のインターカレーター化合物を用いて達成することができる。同一濃度を用いると、本発明のインターカレーター化合物は、通常のインターカレーティング剤よりもかなり少量のＤＮＡハイブリダイゼーションを検出することができる。かくして、本発明のインターカレーター化合物は、ＤＮＡハイブリダイゼーションの検出において、公知のインターカレーティング剤よりもはるかに高感度である。
フローサイトメトリー、蛍光in-situハイブリダイゼーションアッセイ、ゲル電気泳動、ＤＮＡ検出、ＤＮＡについてのイムノアッセイ、および他のＤＮＡ実験における改良も大きなものである。ＤＮＡおよび多重方法でインターカレーターを使用すると、エチジウムホモダイマーが通常の染色方法、すなわち、エチジウムブロマイドを用いる方法よりも約２桁大きい明るさであることが示された。しかしながら、本発明のインターカレーター化合物は、例えば、同一環境においてＥｔｈＤのそれよりも８ないし１０倍増大した明るさ、あるいはより通常の染色方法よりも約１０００倍の改良を示す染料である。プレ染色およびポスト電気泳動検出では、ＤＮＡのラジオイムノアッセイの感度レベルが今や蛍光体で達成可能である。本発明により提供される化合物は、検出限界をＥｔｈＤを超えて１０倍まで延ばし、それにより、ＤＮＡ分析の研究、ならびに治療等のためのインターカレーターの適用における新しい用途の可能性を提供する。
図面の簡単な記載
図１は、側方散乱対前方散乱についてのＦＡＣＳｃａｎTMである。
図２は、蛍光強度（横座標）対事象の頻度（縦座標）のヒストグラムである。
図３は、側方散乱（横座標のＳＳＣ）対蛍光強度（縦座標）についてのスキャターグラムである。
図４は、側方散乱対前方散乱についてのＦＡＣＳｃａｎTMである。
図５は、蛍光強度（横座標）対事象の頻度（縦座標）のヒストグラムである。
図６は、側方散乱（横座標のＳＳＣ）対蛍光強度（縦座標）についてのスキャターグラムである。
図７は、酵素ＢａｍＨでニック処理したｐＢＲ３２２プラスミドＤＮＡについて行った、ＵＶ光照射アガロース電気泳動ゲルの写真である。
図８は、当量についてのハイブリダイゼーション飽和プロットである。
図９は、蛍光強度対当量についてのハイブリダイゼーション滴定曲線を示す。
図１０Ａは、溶解した白血球細胞(whitecells)の典型的分布のＦＡＣＳｃａｎTM（ＳＳＣ対ＦＳＣ）である。
図１０Ｂは、未染色ニワトリ赤血球核（「ＣＥＮ」）を添加した図１０Ａと同一の血液試料のＦＡＣＳｃａｎTMである。
図１０Ｃは、白血球細胞希釈剤（「ＷＢＣ  ＤＩＬ」）で溶解した同一試料のＦＡＣＳｃａｎTMである。
図１０Ｄは、図１０Ｃに示したのと同一であるが、ＣＥＮを含む試料のＦＡＣＳｃａｎTMである。
図１０Ｅは、図１０Ｄと同一の希釈剤であるが、有核赤血球細胞（「ＮＲＢＣ」）染料の０．５μｇ／ｍｌを含む希釈剤に溶解させた同一試料のＦＡＣＳｃａｎTMである。
図１０Ｆは、図１０Ｄと同一の希釈剤であるが、０．２５μｇ／ｍｌのＮＲＢＣ染料を含む希釈剤に溶解させた同一試料のＦＡＣＳｃａｎTMである。
図１１は、実施例６に記載したごとくに調製したフェナトリジニウム活性化ポリスチレン微粒子への32Ｐ放射性同位体標識した制限酵素ニック処理プラスミドＤＮＡの捕獲の効率のグラフである。
図１２は、実施例６に記載したごとくに合成したフェナトリジニウム活性化カルボキシメチルセファロースビーズへの32Ｐ放射性同位体標識プラスミドＤＮＡの捕獲効率のグラフである。
図１３Ａ、１３Ｂおよび１３Ｃは、代表的なＩ部分の構造を示す。
図１４は、化合物２４およびその前駆体の合成の反応スキームである。
図１５は、インターカレーター誘導体化固相微粒子の模式図である。
図１６は、化合物２５、２６および２７の構造式を示す。
図１７Ａ、１７Ｂおよび１７Ｃは、化合物２８ａ−４２ａの合成の反応スキームを示す。
図１８は、化合物５０およびその前駆体の合成の反応スキームを示す。
図１９は、化合物５５、５５ａおよびその前駆体の合成の反応スキームを示す。
図２０は、化合物５５ａ−５５ｐの構造式を示す。
図２１は、化合物５８、５８ａおよびその前駆体の合成の反応スキームを示す。
図２２は、化合物５８ａ−５８ｐの構造式を示す。
図２３は、化合物６４およびその前駆体の合成の反応スキームである。
図２４は、化合物６８、６８ａおよびその前駆体の合成の反応スキームである。
図２５は、化合物６８ａ−６８ｐの構造式を示す。
図２６は、化合物７１、７１ａおよびその前駆体の合成の反応スキームである。
図２７は、化合物７１ａ−７１ｐの構造式を示す。
図２８は、化合物８０およびその前駆体の合成の反応スキームである。
図２９は、化合物８５およびその前駆体の合成の反応スキームである。
図３０は、化合物９０およびその前駆体の合成の反応スキームである。
図３１は、化合物２４、エチジウムブロマイド、プロピジウムイオダイドおよびエチジウムホモダイマーによるＤＮＡ染色で得られた相対的蛍光強度の比較である。
図３２は、化合物２４、２５、２６、２７およびエチジウムブロマイドによるＤＮＡ染色から得られた相対的蛍光強度の比較である。
詳細な説明
広く、本発明は、１以上のＴ部分に結合したＩ部分を有するインターカレーターを提供する。該化合物の一般式は：
Ｉ−（Ｔ）m
［式中、Ｉ部分は芳香族もしくはヘテロ芳香族セグメントを表し；Ｔ部分は「テール」または「鎖」部分を表し；およびｍは１ないし５、好ましくは１ないし３の整数を表す］
によって表される。
Ｉ部分がモノ−第四級アンモニウム官能基を含有する場合、一価対アニオン（「Ａ-1」）が同伴する。一価対アニオンの例は、クロライド、ブロマイド、イオダイド、ヒドロキシおよびハイドロジェンホスフェートを包含する。
式：
0003856463.tif 000005
［式中、Ｉは芳香族またはヘテロ芳香族セグメント；Ｘは窒素または硫黄；Ｒ、Ｒ1およびＲ2はアルキル基、脂環式基、ヘテロ脂環式基、芳香族基またはヘテロ芳香族基；Ｒ3およびＲ4はＸが窒素である場合は水素であるか、あるいはＸがリンまたは硫黄である場合はメチル基、エチル基またはフェニル基；ｋはゼロまたは１ないし１０の整数；ｑはゼロまたは１ないし１０の整数；ｍは１ないし５の整数；ｎは２ないし２０の整数；ｏはゼロまたは１；およびｐはゼロまたは１を意味する］
を有する官能性化鎖形成化合物を持つインターカレーターセグメントを供することによって、特にエチジウムホモダイマーまたは他のビス−インターカレーターと比較した場合に、高い結合親和性、自己クエンチングの減少、および優れた輸送動態を示すインターカレーターおよび置換インターカレーターのＤＮＡ分子への結合の改良が達成される。
ヘテロ原子および脂肪族、脂環式、シクロヘキシル、芳香族セグメントまたはその組合せを含有する鎖で官能性化したインターカレーターよりなる化合物は、式：
0003856463.tif 000006
［式中、Ｉはインターカレーターセグメント；Ｘは、各々、ポリホスホニウムまたはポリスルホニウム部分を生じる主要な基元素のリンまたは硫黄；Ｒ、Ｒ1およびＲ2はアルキル基、脂環式基、ヘテロ脂環式基、芳香族基またはヘテロ芳香族基；Ｒ3およびＲ4はＸがリンまたは硫黄である場合はメチル基、エチル基またはフェニル基であり；ｋはゼロまたは１ないし１０の整数；ｑはゼロまたは１ないし１０の整数；ｍは１ないし５の整数；ｎは２ないし２０の整数；ｏはゼロまたは１；およびｐはゼロまたは１；Ｘが硫黄である場合、ｏまたはｐはゼロ；およびＸがリンである場合、ｏおよびｐは１を意味する］
を有する。
もう１つの態様において、一般構造式：
0003856463.tif 000007
［式中、Ｉは芳香族またはヘテロ芳香族セグメント；Ｘは、窒素または硫黄；Ｒ、Ｒ1およびＲ2は同一または異なっており、１ないし４個の炭素のアルキル基、５ないし６個の炭素の脂環式基、３ないし５個の炭素および窒素、酸素または硫黄の１または２個のへテロ原子のヘテロ脂環式基、ベンゼン、フェニルまたはナフチルの芳香族基、または１ないし５個の炭素および１ないし４個の窒素、酸素または硫黄のヘテロ原子のヘテロ芳香族基；Ｒ3およびＲ4はＸが窒素である場合は水素であるか、またはＸが硫黄である場合はメチル基、エチル基またはフェニル基；ｋはゼロまたは１ないし１０の整数；ｑはゼロまたは１ないし１０の整数；ｍは１ないし５の整数；ｎは２ないし２０の整数；ｏはゼロまたは１；およびｐはゼロまたは１を意味する］
を有する化合物が提供される。
さらにもう１つの態様において、式：
0003856463.tif 000008
［式中、Ｉは芳香族またはヘテロ芳香族セグメント；Ｘはポリスルホニウム部分を生じる主要な基硫黄；Ｒ、Ｒ1およびＲ2は、同一でも異なってもよく、１ないし４個の炭素のアルキル基、５ないし６個の炭素の脂環式基、３ないし５個の炭素および１または２個の窒素、酸素または硫黄のヘテロ原子のヘテロ脂環式基、ベンゼン、フェニルもしくはナフチルの芳香族基または１ないし５個の炭素および１ないし４個の窒素、酸素または硫黄のヘテロ原子のヘテロ芳香族基；Ｒ3およびＲ4はＸが窒素である場合は水素であるか、あるいはＸが硫黄である場合はメチル基、エチル基またはフェニル基；ｋはゼロまたは１ないし１０の整数；ｑはゼロまたは１ないし１０の整数；ｍは１ないし５の整数；ｎは２ないし２０の整数；ｏはゼロ；およびｐはゼロを意味する］
を有する、ヘテロ原子および脂肪族、脂環式、シクロヘキシル、芳香族セグメントまたはそれらの組合せを含有する鎖で官能性化したインターカレーターよりなる化合物、
式：
0003856463.tif 000009
［式中、Ｙは脂肪族基、脂環式基、ヘテロ脂環式基、芳香族基またはヘテロ芳香族基またはそれらの組合せにおいて正に荷電したヘテロ原子または金属イオンを有する側鎖；Ｉは芳香族またはヘテロ芳香族セグメント；Ｘはヘテロ原子；Ｒ、Ｒ1およびＲ2はアルキル基、脂環式基、ヘテロ脂環式基、芳香族基またはヘテロ芳香族基；Ｒ3およびＲ4はＸが窒素である場合は水素であるか、あるいはＸがリンまたは硫黄である場合はメチル基、エチル基またはフェニル基；ｋはゼロまたは１ないし１０の整数；ｑはゼロまたは１ないし１０の整数；ｍは１ないし５の整数；ｎは２ないし２０の整数；ｏはゼロまたは１；ｐはゼロまたは１；Ｘが硫黄である場合、ｏおよびｐはゼロ；およびＸがリンである場合、ｏおよびｐは１を意味する］
を有する正に荷電した鎖で官能性化した芳香族またはヘテロ芳香族セグメントからなる化合物、
Ｙが、式：
0003856463.tif 000010
を有する前記化合物、
さらに、式：
0003856463.tif 000011
［式中、Ｗはアルミニウム、ホウ素またはルイス酸金属；Ｉはインターカレーターセグメント；Ｒ、Ｒ1、Ｒ2およびＲ3はアルキル基、脂環式基、または芳香族基；ｋはゼロまたは１ないし１０の整数；ｑはゼロまたは１ないし１０の整数；ｍは１ないし５の整数；ｎは２ないし２０の整数を意味する］
を有する金属原子およびアルキル、脂環式もしくは芳香族セグメントまたはそれらの組合せを含有する鎖で官能性化したインターカレーターからなる化合物、
式：
0003856463.tif 000012
［式中、Ｉは芳香族またはヘテロ芳香族セグメント；Ｐはリン原子；Ｓは硫黄原子；Ｚは脂肪族、脂環式または芳香族鎖またはそれらの組合せ；ｎは２ないし２０、好ましくは、２または３；およびｍは１ないし５、好ましくは３〜１０を意味する］を有する、主要鎖ポリホスフェート、ポリホスホネートまたはポリスルフェートのポリアミンエステル基を持つ脂肪族、脂環式、芳香族またはそれらの組合せに正の電荷が存在する正の電荷を有する鎖で官能性化したインターカレーター組成物が提供される。
広く、本発明は、官能性化鎖で誘導体化した、インターカレーター部分または置換インターカレーター部分からなる化合物に関するもので、該化合物はＤＮＡ分子への結合に対して高親和性を有する。１の態様において、本発明は、ＤＮＡ分子へのインターカレーター挿入を要する公知の方法内で、ＤＮＡ分子への結合の改良を示すこれらのインターカレーター化合物の使用に関する。さらに、本発明は、当該化合物の増大した利用効率によるインターカレーターの改良された効率を持つ、標識、捕獲、治療的挿入、アッセイ等で利用されるインターカレーター官能性化セグメントによるＤＮＡ分子の改良された結合に関する。特にエチジウムホモダイマーまたは他のビスインターカレーターと比較した場合、結合に対する高親和性、減少した自己クエンチング、および優れた輸送動態を示す、インターカレーターおよび置換インターカレーターのＤＮＡ分子への改良された結合が達成される。フェナントリジニウム
当該化合物の合成および該化合物の利用を含めた本発明の種々の具体例は、図１〜９、１０Ａ〜１０Ｆ、１１〜３０に示す。これらの図に示される情報は、特にエチジウムホモダイマーまたは他のビスインターカレーターと比較した場合、結合に対する高親和性、減少した自己クエンチング、および優れた輸送動態を明瞭に示す。
図１は、ＮＲＢＣ染料フェナトリジニウム(phenathridinium)トリアミン（ＰＴＡ）２４およびＣＥＮを含むＷＢＣ  ＤＩＬ希釈剤で溶解させた白血球細胞の典型的な分布につき側方散乱対前方散乱（横座標上のＳＳＣおよび縦座標上のＦＳＣ）上のＦＡＣＳｃａｎTMである。象限閾値はＳＳＣ対ＦＳＣドットプロット上で選別した(gated)リンパ球を排除するように設定した。
図２は、フェナトリジニウムトリアミン（ＰＴＡ）２４の存在下における、染色したおよび未染色の細胞の集団についての蛍光強度（横座標）対事象の頻度（縦座標）のヒストグラムである。
図３は、蛍光強度による、ＰＴＡ２４で染色した細胞（左上方隅、ＮＷ象限）の未染色細胞（残り）からの分離を示す、側方散乱（横座標のＳＳＣ）対蛍光強度（縦座標）についてのスキャターグラムである。
図４は、ＮＲＢＣ染料エチジウムホモダイマーおよびＣＥＮを含むＷＢＣ  ＤＩＬ希釈剤で溶解した白血球細胞の典型的分布につき側方−対−前方散乱（横座標のＳＳＣおよび縦座標のＦＳＣ）についてのＦＡＣＳｃａｎTMである。象限閾値は、ＳＳＣ対ＦＳＣドットプロット上で選別したリンパ球を排除するように設定した。
図５は、エチジウムホモダイマーの存在下における染色および未染色細胞の集団についての、蛍光強度（横座標）対事象の頻度（縦座標）のヒストグラムである。
図６は、蛍光強度による、エチジウムホモダイマー（上方左側隅、ＮＷ象限）で染色した細胞の、非染色細胞（残り）からの分離を示す、側方散乱（横座標上のＳＳＣ）対蛍光強度（縦座標）についてのスキャターグラムである。
図７は、ＢＡＭＨニック処理したＰＢＲ３２２プラスミドＤＮＡについて行った紫外線照射アガロース電気泳動ゲルの写真である。ストック溶液５μｌをレーン３〜１４に負荷した。以下のＤＮＡおよびインターカレーターのストック溶液をレーン１〜１４に負荷した。レーン１：マーカー；レーン２：ブランク；レーン３：エチジウムブロマイドで染色した２０ｎｇ／ｍｌプラスミド；レーン５：エチジウムブロマイドで染色した１６０ｐｇ／ｍｌプラスミド；レーン６：エチジウムブロマイドで染色した４０ｐｇ／ｍｌプラスミド；レーン７：エチジウムホモダイマーで染色した２０ｎｇ／ｍｌプラスミド；レーン８：エチジウムホモダイマーで染色した８００ｐｇ／ｍｌプラスミド；レーン９：エチジウムホモダイマーで染色した１６０ｐｇ／ｍｌプラスミド；レーン１０：エチジウムホモダイマーで染色した４０ｐｇ／ｍｌプラスミド；レーン１１：ＰＴＡ２４で染色した２０ｎｇ／ｍｌプラスミド；レーン１２：ＰＴＡ２４で染色した８００ｐｇ／ｍｌプラスミド；レーン１３：ＰＴＡ２４で染色した１６０ｐｇ／ｍｌプラスミド；レーン１４：ＰＴＡ２４で染色した４０ｐｇ／ｍｌプラスミド。すべての場合において、染料／塩基対の比は１／２０であった。すべての場合において、染料をＤＮＡと共にプレインキュベートし、ポストゲル電気泳動染色は行わなかった。
図８は、１：４の染料塩基対比にてエチジウムホモダイマーおよびＰＴＡ２４につきＤＮＡ６．６マイクロモルおよび染料３．０８マイクロモルにおいて、ｄ（ｐＡ）９に添加したｄ（ｐＴ）９の当量についてのハイブリダイゼーション飽和プロットである。エチジウムホモダイマーおよびＰＴＡ２４を比較するために実施例２に記載したプロトコルを用いることによって得られた、ｄ（ｐＡ）９に添加された横座標の相補的オリゴヌクレオチドｄ（ｐＴ）９の当量対縦座標の相対的蛍光強度のグラフである。双方の場合における蛍光体の濃度は、エチジウムホモダイマー１モル当たりフェナントリジニウム部分２．０モル当量についての２倍統計的補正を用いて、３．０８マイクロモルであった。両曲線を相対的蛍光についてのバックグラウンドに対して標準化した。励起はこの実験では４８８ｎｍ（５３４ｎｍが励起最大）におけるものであり、発光は６２５ｎｍにおけるものであった。
図９は、６．６マイクロモルのＤＮＡならびに３．０８マイクロモルのエチジウムブロマイドおよびＰＴＡ２４における、蛍光強度対ｄ（ｐＡ）９に添加されたｄ（ｐＴ）９の当量についてのハイブリダイゼーション滴定曲線を示す。相補的オリゴヌクレオチドｄ（ｐＴ）９の当量（横座標）対相対的蛍光強度（縦座標）のグラフは、エチジウムブロマイドおよびＰＴＡ２４を比較するために実施例２に記載されたプロトコルを用いることによって得られた。双方の場合における蛍光体の濃度は３．０８マイクロモルであった。両曲線はバックグラウンドに対して標準化した。励起は４８８ｎｍ（５３４ｎｍが最大励起）おけるものであり、発光は６２５ｎｍにおけるものであって、強度は日立Ｆ−３０１０フルオロメーターを用いて測定した。
図１０Ａは、ＮＲＢＣ染料またはＣＥＮを含まないＣＤ４０００  ＷＢＣ  ＤＩＬで溶解した白血球細胞の典型的な分布のＦＡＣＳｃａｎTM（ＳＳＣ対ＦＳＣ）である。象限閾値は、ＳＳＣ対ＦＳＣドットプロット上で選別したリンパ球を排除するように設定した。
図１０Ｂは、未染色ＣＥＮを添加した図１０Ａにおけるのと同一の血液試料のＦＡＣＳｃａｎTMである。分かるごとく、未染色ＣＥＮはいくらかのＦＲＬ３自己蛍光を示す。領域１は、テスト試料中の染色細胞が領域２で計数されるように、この未染色試料におけるすべてのＦＬ３＋事象を含むよう設定した。領域３は、集団の平均ＦＬ３を測定するだけのためにＣＥＮ集団を含めるよう設定した。
図１０Ｃは、１．０μｇ／ｍｌのＮＲＢＣ染料を含有するＷＢＣ  ＤＩＬで溶解した同一試料のＦＡＣＳｃａｎTMである。ＦＬ２＋事象の１．３％は選別したリンパ球からμＬにて検出され、ＦＬ３＋事象の１．０８％は非選別合計白血球集団から検出された。
図１０Ｄは、図１０Ｃで示したとの同一であるがＣＥＮを含む試料のＦＡＣＳｃａｎTMである。非選別集団のＦＬ３ヒストグラムの領域２は、３３１９．８の平均ＦＬ３を有する染色されたＣＥＮ集団を示す。
図１０Ｅは、図１０Ｄと同一の希釈剤であるが、０．５μｇ／ｍｌのＮＲＢＣ染料を含む希釈剤中で溶解した同一試料のＦＡＣＳｃａｎTMである。
図１０Ｆは、図１０Ｄと同一の希釈剤であるが、０．２５μｇ／ｍｌのＮＲＢＣ染料を含む希釈剤中で溶解された同一試料のＦＡＣＳｃａｎTMである。分かるごとく、染色されたＣＥＮは白血球から依然十分に分離されている。
図１１は、実施例６に記載したごとく合成したフォナントリジニウム活性化ポリスチレン微粒子への32Ｐ放射性同位体標識プラスミドＤＮＡの捕獲の効率のグラフ表示である。Ａ：合計ＤＮＡ濃度を有する溶液中における初期放射能カウント；Ｂ：実施例６に記載したようにして遠心によりＤＮＡを除去した後に溶液中に残存する放射能カウント；Ｃ：ＮａＯＨによって放出が開始される前におけるフェナントリジン（phenthridine）部位によって微粒子に結合したＤＮＡについての初期放射能カウント；Ｄ：ＮａＯＨでのＤＮＡの除去後に固体上に残存する放射能カウント。
図１２は、実施例６に記載したごとくに合成されたフェナントリジニウム活性化カルボキシメチルセファロースビーズへの32Ｐ放射性同位体標識プラスミドＤＮＡ捕獲の効率のグラフである。Ａ：合計ＤＮＡ濃度を有する溶液中における初期放射能カウント；Ｂ：実施例６に記載したようにして遠心によりＤＮＡを除去した後に溶液中に残存する放射能カウント；Ｃ：ＮａＯＨによって放出が開始される前におけるフェナントリジン部位によって微粒子に結合したＤＮＡについての初期放射能カウント；Ｄ：ＮａＯＨでのＤＮＡの除去後に固体上に残存する放射能カウント。
本発明のインターカレーター化合物は、多官能性（ビス）インターカレーターに対し、実質的にモノインターカレーターである。本発明によるモノインターカレーターは、種々の「鎖またはテール」（Ｔ）［ここに、ＴはＲ、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｗ、Ｘ、ＹおよびＺよりなり、前記した式において括弧で囲った鎖である］と組み合わされ、かつそれで官能性化された多重インターカレーターまたは置換インターカレーターを用いる用途に最も適し、これは、ＤＮＡおよびＲＮＡへの高結合ならびに自己クエンチングの欠如および優れた輸送動態を提供する。代表的な「Ｉ」部分は図１３に示す。
さらに、本発明はさらに実施例によって説明するが、これは図面の根拠を提供し、また、例示的なものであって、限定的なものではない。
実施例１
フェナントリジニウムトリアミン（ＰＴＡ）２４および前駆体中間体２０〜２３の合成
ＰＴＡ２４、すなわち本発明の化合物は、図１４に模式的に示す手順により合成した。生成物２４を得るのに用いた実験手法を説明する。
中間体２１  出発中間体２０、３，８ジアミノ６−フェニルフェナトリジン（２５．０ｇ、０．０８７６ｇモル）はアルドリッチ・ケミカル・カンパニー(Aldrich Chemical Company)(Milwaukee、WI)から入手し、アルゴン下、磁気撹拌棒および還流コンデンサーを装備した３．０リットルの一首丸底フラスコに添加した。この容器に、乾燥ピリジン１．０リットルを撹拌しつつ添加した。得られた懸濁液の撹拌は、すべての固体が溶解するまで１５分間継続した。触媒量のＮ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン（１．０７ｇ、０．００８６モル）を撹拌しつつこの溶液に添加した。次いで、無水酢酸（４６２ｇ、４．９モル）を添加し、得られた反応混合物を８〜１２時間還流した。次いで、反応混合物を冷却し、溶媒を真空中で除去した。生成物ＩＩの精製には、２．０リットルの４５／４０／１０／５酢酸エチル／ヘキサン／ＣＨ2Ｃｌ2ＣＨ3ＯＨ、続いて１．０リットルの４０／４０／１０／１０ＥｔＯＡｃ／ヘキサン／ＣＨ2Ｃｌ2／ＣＨ3ＯＨを用いて、シリカゲルカラム勾配溶離を行った。１０．０ｍｌずつの画分を収集し、適当な画分を再度合し、真空中で溶媒を除去した。次いで、粘性ガム様残渣を熱ＥｔＯＨ（２２０ｍｌ）に溶解し、０℃に冷却することによって沈殿させた。母液をデカンテーションし、２００ｍｌの新鮮なＥｔＯＨ２００ｍｌを添加した。加熱することによって固体を再溶解し、−４℃で４８時間結晶化させた。結晶を母液と第２の再結晶の両方から収集し、少量の冷ＥｔＯＨで洗浄し、高真空下で数時間乾燥した。カラムクロマトグラフィーおよび２回の再結晶後の純粋生成物の単離した収率は３２％であった。1ＮＭＲ  ＣＤ3ＯＤ（３００ＭＨｚ）９．１（ｄ，１Ｈ，８．８２Ｈｚ）、９．０（ｄ，１Ｈ，８．７５Ｈｚ）、８．０８（ｓ，１Ｈ）、７．９５（ｓ，１Ｈ）、７．９２（ｄ，１Ｈ，４．５Ｈｚ）、７．８（ｍ，３Ｈ）、７．６５（ｍ，３Ｈ）、２．４５（ｓ，６Ｈ）、２．３５（ｓ，６Ｈ）；13  ＮＭＲ  ＣＤ3ＯＤ（７５．４５ＭＨｚ）１７４．５、１６３．７、１４５．３、１４２．１、１４０．６、１３９．９、１３４．４、１３３．８、１３０．８、１３０．６、１２９．８、１２７．３、１２５．９、１２５．６、１２４．８、２７．１、正確な分子量（exact mass）Ｃ27Ｈ23Ｎ3Ｏ4として、計算値４５３．１６８８、正確な分子量、実測値：４５３．１６８３；ＣＨ分析Ｃ27Ｈ23Ｎ3Ｏ4として計算値Ｃ：７１．５１  Ｈ：５．１１  Ｎ：９．２７  実測値Ｃ：７１．７７  Ｈ：５．１０  Ｎ：９．２０
中間体２２  中間体２２は３，８ジアミノ−６−フェニルフェナントリジンのジアミドの第四級化についての文献の方法（Gaugain et al., Biochemistry, Vol.17, No.24, 1978, pp5071-5078）の変法により、ジアミド２１から合成した。ジアミド２１（１０．５ｇ、０．０２３モル）を、アルゴン下、磁気撹拌棒および還流コンデンサーを装備した２．０リットルの丸底フラスコに入れた。１，３ジブロモプロパン（１．０リットル、９．８６モル）をこのフラスコに添加し、得られた混合物を７時間還流した。溶液を一晩冷却し、沈殿を濾過し、ジエチルエーテルで洗浄した。１０．４４ｇ（６８．７％）の粗製物質２２が得られた。この物質をＣＨ3ＯＨから再結晶して５．３ｇのジアセチルブロマイド２２が得られた。1Ｈ  ＮＭＲ  ＣＤ3ＯＤ（３００ＭＨｚ）デルタ１０．７５（ｓ，１Ｈ）、１０．４５（ｓ，１Ｈ）、９．３（ｓ，１Ｈ）、９．０９（ｄ，９．２Ｈｚ，１Ｈ）、９．０４（ｄ，９．２Ｈｚ，１Ｈ）、８．４５（ｄ，９．１Ｈｚ，２．２Ｈｚ，１Ｈ）、８．１２（ｓ，１Ｈ）、８．０７（ｄ，９．０Ｈｚ，１Ｈ）、７．９５（ｍ，３Ｈ）、７．８５（ｍ，３Ｈ）、５．０（ｔ，９．０Ｈｚ，３Ｈ）、３．６（ｔ，６．０Ｈｚ，２Ｈ）、２．６５、２．３８、７．７５  13Ｃ  ＮＭＲ26ＤＭＳＯ［????］（７５．４５ＭＨｚ）デルタ１６９．９、１６９．３、１６３．８、１４２．１、１３９．９、１３４．２、１３１．５、１３０．５、１２９．５、１２８．４、１２５．９、１２５．４、１２３．６、１２２．３、１２１．６、１１９．０、１０７．７、５５．７、３０．７、２４．５、２４．２；正確な質量、計算値  Ｃ26Ｈ29Ｎ3Ｏ2Ｂｒ2遊離塩として（ＦＡＢ＋）４９０．１１３１  実測値４９０．１１３９；ＣＨ分析計算値Ｃ26Ｈ29Ｎ3Ｏ2Ｂｒ2として  Ｈ：４．４１  Ｃ：５４．６６  Ｎ：７．３６  実測値Ｈ：４．２５  Ｃ：５４．６５  Ｎ：７．３０。
中間体２３  中間体２２（５．３ｇ、０．００９３モル）を磁気撹拌棒および還流コンデンサーを装備した２５０ｍｌ丸底フラスコに添加した。次いで、窒素下で撹拌しつつメタノール（１５０ｍｌ）をこのフラスコに添加し、撹拌を継続しつつジエチレントリアミン（２９．２ｇ、０．２８３モル）を添加した。得られた透明溶液を窒素下で一晩加熱還流した。次いで、この溶液を室温まで冷却し、蒸留水に注いだ。次いで、この混合物を水のみが残存するまで真空中で濃縮した。さらに水５０〜７０ｍｌを添加し、溶液を０℃まで冷却した。次いで、固体を濾過し、氷冷水で洗浄した。次いで、この物質をＥｔＯＨに再溶解し、１０Ｎ  ＨＣｌで沈殿させた。懸濁液の濾過の後、得られた固体を、熱エタノールから１５分間で０℃まで冷却して再結晶した。また、第２濾液から放置によりまた、第１濾液からＥｔＯＨで沈殿させることによって、第２の結晶を収集した。次いで、これらの固体を合し、一晩の高真空後に最終生成物２３（２．５ｇ）を得た。1Ｈ  ＮＭＲ  ＣＤ3ＯＤ（３００ＭＨｚ）デルタ９．２（ｓ，１Ｈ）、９．０５（ｄ，１Ｈ）、８．９５（ｄ，１Ｈ）、８．４（ブロードｓ，２Ｈ）、８．３（ブロードｓ，１Ｈ）、７．９（ブロードｍ，３Ｈ）、７．７（ブロードｍ，２Ｈ）、５．１（ブロードｍ、１Ｈ）、３．９（ブロードｓ，３Ｈ）、３．４５（ブロードｍ，２Ｈ）、３．８５（ブロードｍ，２Ｈ）、２．５（ブロードｍ，３Ｈ）、２．３（ブロードｍ，３Ｈ）；ＭＳ、計算値  遊離塩Ｃ30Ｈ37Ｎ6Ｏ2として（ＦＡＢ＋）５１３  実測値：５１３。
生成物２４  フェナントリジニウムトリアミン、ＰＴＡ２４の合成および精製は以下のプロトコルによって行った。トリアミン２３（２．３５ｇ、０．００３６モル）をメタノール７５．０ｍｌに溶解し、４Ｎ  ＨＣｌ  ７５ｍｌを添加した。混合物を２時間還流し、冷却した。エタノールをこの溶液に添加し、得られた沈殿を濾過し、最小量の冷エタノールで洗浄した。濾液を再度濃縮し、新鮮なエタノールおよび濃塩酸を添加した。この得られた沈殿も濾過した。次に、この濾液を乾固近くまで濃縮し、Ｅｔ2Ｏを添加し、固体を濾別した。次いで、最後に残存する濾過不能な残渣を濃塩酸に溶解し、ＥｔＯＨで沈殿させた。この物質を濾過し、エタノールで洗浄し、前記手順からのすべての固体物質を合し、この物質を一晩高真空に付して合計２．０３ｇの高親和性蛍光ＤＮＡ染料ＰＴＡ２４を得た。1Ｈ  ＮＭＲ  ｄ6−ＤＭＳＯ（３００ＭＨｚ）、デルタ１０．０（ブロードｓ，２Ｈ）、９．６５（ブロードｓ，２Ｈ）、８．６８（ｄ，１４．２Ｈｚ，２Ｈ）、８．３５（ブロードｓ，２Ｈ）、７．７５（ｍ，４Ｈ）、７．６５（ｓ，１Ｈ）、７．５５（ｄ，９．２Ｈｚ，２Ｈ）、７．３５（ｄ，９．２Ｈｚ，２Ｈ）、６．２８（ｓ，１Ｈ）、４．５（ブロードｓ，２Ｈ）、４．０（ブロードｓ，８Ｈ）、３．４（ブロードｓ，２Ｈ）、３．０（ブロードｓ，２Ｈ）、２．３（ブロードｍ，２Ｈ）；13Ｃ  ＮＭＲ  ｄ6−ＤＭＳＯ（７５．４５ＭＨｚ）δ１５９．７、１５１．１、１３４．６、１３１．７、１３０．９、１２９．４、１２８．８、１２８．４、１２４．９、１２２．９、１２０．１、１１７．４、９９．６、５１．４、４３．８、４２．５、４０．３、３４．９、１８．５；高分解能マススペクトル  Ｃ26Ｈ33Ｎ6（ＦＡＢ＋）として  計算値４２９．２７６７、実測値：４２９．２７６６；ＣＨ分析Ｃ26Ｈ37Ｎ6Ｃｌ4・３Ｈ2Ｏとして  計算値Ｈ：６．８９  Ｃ：４９．６１  Ｎ：１３．３５  実測値Ｈ：６．１６；Ｃ：４９．７４；Ｎ：１３．０８
実施例２
ハイブリダイゼーションアッセイ
ＰＴＡ２４を用いて、標的オリゴヌクレオチドをその相補的パートナーで滴定する場合のハイブリダイゼーションを定量した。以下のプロトコルによる、このハイブリダイゼーションの検出についての、エチジウムブロマイド染色対ＰＴＡ２４の比較は図９に見い出すことができ、以下のプロトコルによる、エチジウムホモダイマー対ＰＴＡ２４の比較は図８に見い出すことができる。ＤＮＡの相補鎖（オリゴデオキシチミジル酸、ｄ（ｐＴ）9およびオリゴデオキシアデニル酸（ｄ（ｐＡ）9）はシグマ・ケミカル・カンパニー（Sigma Chemical Co.）（St. Louis, MO)から入手した。ｄ（ｐＡ）９のストック溶液は０．０５Ｍ  トリス、０．２Ｎ  ＮａＣｌ、１ＭＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．４で５ユニット／ｍｌにて作成した。ポリＡについては、ε＝８．４ＡＵ／ｍＭ  ｃｍまたは８４００Ｍ-1ｃｍ-1；従って、ｄ（ｐＡ）９についての９塩基対では、εは７５，６００Ｍ-1ｃｍ-1である。次いで、このストック溶液を１０倍希釈して、６．６１×１０-6Ｍまたは６．６μＭのストックを得た。ｄ（ｐＴ）。ストックを２５ユニット／５．０ｍｌにて作成し、同一緩衝液中でさらに希釈することなく滴定で用いた。ポリＴについてのεは１塩基対につき８．１５ＡＵ／ｍＭ  ｃｍもしくは８，１５０Ｍ-1ｃｍ-1であるか、あるいはオリゴ当たり７３，３５０Ｍ-1ｃｍ-1であるので、オリゴストックの濃度はＤＮＡ分子中６８μＭであった。０．５ｍｌのミクロセルを装備した日立Ｆ−４０１０蛍光光度計を用いて滴定を行って、十分に補正されたスペクトルならびに４８８〜５５０ｎｍ（５３４あたりが最適）の励起波長および６００〜６５０ｎｍ（６２５あたりが最適）の発光波長が得られた。以下の増分にて、当量のｄ（ｐＴ）9を添加した：０．０２、０．０５、０．０８０、０．１５０、０．３００、０．５００、０．７００、１．００、２．００、５．００当量。滴定曲線における各試料は、最初のｄ（ｐＡ）９ストックを１０×１．０ｍｌアリコートに分けることによって個々に調製した。次いで、相補物の添加は、ｄ（ｐＴ）９ストックの適量（各々、２、５、８、１５、３０、５０、７０、１００、２００および５００μｌ）を１０アリコートのシリーズの各々にマイクロピペットで加えることによって達成した。２種の相補鎖の暫時増大するモル比を有する各アリコートを室温にて１５分間インキュベートし、０．０５Ｍトリス、０．２Ｎ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．４緩衝液中の染料の１５４μＭ溶液の２０．０μｌアリコートとして染料を添加した。これは、相補的オリゴでの飽和状態における１／２０の染料／ＤＮＡｂ．ｐ．比に対応する。同一ストック溶液から種々の増分の添加を用いるため、染料およびオリゴの総濃度は飽和プロットにおいて変化する。さらに１５分のインキュベーションの後、次いで、相対的蛍光強度を６２５ｎｍで読み、記録して、標準曲線を得たが、これは、これらの条件下でのｄｓＤＮＡハイブリダイゼーションまたは標的配列の量に直接比例している。次いで、バックグラウンド蛍光、または最初の残存蛍光を、同一グラフ上の種々の滴定曲線の比較のためすべての曲線について定数として差し引いた。
実施例３
ゲル電気泳動適用
アガロースゲルを泳動させて、エチジウムブロマイド（Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI）、エチジウムホモダイマー−１（Molecular Probes, Cat. # E 1169, Eugene, Oregon）、およびＰＴＡ２４染色剤の染色強度を比較した。７ｍｌのストック中２．１ｍｇのプラスミドｐＢＲ３２２を、１０×Ｒｅａｃｔ２緩衝液２ｍｌを含むＢＡＭＨ制限酵素１ｍｌと共に３７℃で１時間インキュベートし、１０ｍｌの水で合計２０ｍｌまで希釈した。次いで、この混合物を用いて、各バイアルにつき６ｍｌ当たり０．６３ｍｇにて、ニック処理したｐＢＲ３２２プラスミドの３ストックを調製した。これらのストックの各々をさらに水および２０％グリセロールで希釈して、全１２ストックの各々につき、ＤＮＡ塩基対に対する染料の比を１：４とし、２０ｎｇ／ｍｌ、８００ｐｇ／ｍｌ、１６０ｐｇ／ｍｌおよび４０ｐｇ／ｍｌの最終ＤＮＡストックとした。各ストックの５ｍｌアリコートをアガロースゲルの１２の別々のレーンに負荷し、０．０１ｍＭ  ＥＤＴＡ緩衝液を含む４ｍＭトリス、ｐＨ８．２にて電気泳動を３０分間行った。次いで、該ゲルを取り出し、通常のゲルボックス中、紫外光に暴露して写真を取った。
実施例４
インターカレーター活性化カルボキシメチルスチレン微粒子捕獲試薬の合成についてのプロトコル
インターカレーター誘導体化固相微粒子（ＭＰ）捕獲試薬の合成は、以下に記載したスキームにより達成され、以下の方法によって行った：
０．２７５±μｍ微粒子（Seradyne, Indianapolis, IN）の４５アリコートを４ｍｌバイアルに入れ、Bio-Rex 501-Dイオン交換混合ベッド樹脂（Bio-Rad, Richmond, CA）を用いて、界面活性剤を交換した。２時間穏かに振盪した後、減圧捕集チャンバーを装備した粗フリットガラス漏斗を用いることによって樹脂を混合物から濾過して取り出した。試料を１０重量％固形物のＭＰ濃度まで希釈した。反応性カルボン酸の合計当量を販売業者の滴定仕様から計算した。
スルホＮ−ヒドロキシスクシンイミド（Pierce, Rockford, IL）のストック溶液は水中１１ｍｇ／ｍｌ（２０ｍＭ）にて作成し、ＥＤＡＣ（Sigma Chemical Co., St.Louis, MO）のストック溶液は水中１０ｍｇ／ｍｌ（５ｍＭ）にて作成した。５当量のＥＤＡＣ（２９０μｌストック）、続いて５．０当量のスルホＮ−ヒドロキシスクシンイミド（３３０μｌ）をカルボキシ微粒子反応混合物に添加した。この混合物を室温で２時間インキュベートし、次いで、２．０モル当量のＰＴＡ２４（４ｍｇ）を、ｐＨ８．０  ０．１Ｎ  ＮａＣｌ  ０．１Ｎ  Ｐｉリン酸緩衝液中８ｍｇ／４００μｌ、即ち２．０ｍｇ／１００μｌの濃度にて添加した。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（Pierce）は、もしそれをＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）にまず溶解するのであれば、スルホＮ−ヒドロキシスクシンイミドの代わりに置き換えることができ、前記したごとくにアリコートできる。２４時間で反応を完結させた後、次いで、溶液が清澄化し、もはや染料が試料から抽出されなくなるまで、遠心、母液の除去、および再懸濁の何回かの試行によって遊離染料を除去した。次いで、精製した捕獲試薬を水中２〜４％固形物のストックまで希釈した。
本実施例の一般的模式的表示は図１５に示す。
実施例５
固相ＤＮＡ捕獲
ＣＭ（カルボキシ修飾）Sepharoseは、エタノール／水の混合液中にて、Sigma Chemical Co.（St. Louis, MO）から入手した。溶液は、長時間放置した際に固体および液体部分によって占められる合計容量に基づいて固体５０％と見積もられた。次いで、この懸濁液を均一に混合し、固体１０％に希釈した。このストック２００μｌを取り出し、０．１２ｍｅｑ／グラムと計算され、これは酸が全体で０．０１２ｍｅｑであった。ＥＤＡＣおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミドのストックを調製し、５．０当量の各活性化試薬をこの懸濁液に添加した。この調製には、１３．２ｍｇ（１．３２ｍｌ中）ＨＯＳｕｃおよび１１．２５ｍｇＥＤＡＣ（１．０２ｍｌ中）ならびに合計８．０ｍｇのＰＴＡ２４インターカレーターを用いた。２〜２４時間のインキュベーションの後、次いで、もはや希釈に際して固体から着色物が取り出されなくなるまで、反復して洗浄および穏かな遠心工程を行うことによって該懸濁液を清浄化させた。水中固体１０％にてストックを調製した。ＰＴＡ２４修飾および非修飾固相と共に対照を泳動させ、非誘導体化物質に関しては起こったＤＮＡの非特異的捕獲は最小限であったことに注意されたい。
実施例６
インターカレーター修飾固相によるＤＮＡ捕獲についてのプロトコル
１．５０μｌの活性化微粒子を１．５ｍｌのエッペンドルフに入れる。
２．１５０μｌのＰＢＳおよび32Ｐで末端標識した１〜２０ｕの５．０ｋｂ線状化プラスミドを添加する。別法として、１〜５０μｌの生物学的試料またはもう１つの精製したＤＮＡを添加する。
３．室温で１時間回転することによって混合する。
４．５０００ｒｐｍで５分間遠心することによって微粒子をペレット化する。
５．２００μｌのＰＢＳで１回または２回洗浄する。
６．５０μの０．５Ｍ  ＮａＯＨを添加し室温で１５分間混合することによってＤＮＡを放出させる。
７．遠心し、上清を収集する。この上清は放出されたＤＮＡを含有している。
ＤＮＡ捕獲の効率は、前記したプロトコルにおける32Ｐ放射性同位体標識プラスミドＤＮＡを用いて測定した。結果は、実施例４で調製したインターカレーター修飾ポリスチレン微粒子を用いている図１１、および実施例５で調製したインターカレーター修飾ＣＭSepharoseビーズを用いている図１２で見い出される。データは、インターカレーター修飾固相へのＤＮＡ結合は特異的であって、インターカレーター２４の固相への共有結合によって誘導されたことを示す。
実施例７
ニワトリ赤血球核（ＣＥＮ）のフローサイトメトリー実験におけるエチジウムホモダイマーおよびフェナントリジニウムトリアミン２４の相対的染色強度
プロトコル：ＮＲＢＣ染料を含まないもの、及び１μｇ／ｍｌ濃度でＮＲＢＣ染料を含むものであって４０℃で予備加温したＷＢＣ  ＤＩＬ１．０ｍｌに、２つのイン−ハウス（in−house）ドナーからの全血試料５０μｌおよび３μｌのＣＥＮ懸濁液を添加し、混合し、ＦＡＣＳｃａｎTMに導入し、２０”の読みを得た。ニワトリ赤血球核（ＣＥＮ）を用いて、ＦＬ３染色の明るさを測定した（ＣＥＮの平均ＦＬ３）。用いた全血試料は約４〜５時間経過のものであった。この実験についてのデータは図１〜６に示す。
実施例８
エチジウムホモダイマーに対するフェナントリジニウムトリアミン２４染料濃度を減少させたときの性能の比較
エチジウムホモダイマーに対するＰＴＡ２４染料の濃度の減少の効果（図１０Ａ−Ｆ）は以下のごとくに測定した：
方法：染料の濃度と、ＦＬ１対ＦＬ２ドットプロット上でのＵＬ象限におけるＦＬ２＋事象のパーセントとの間の相関を示すように、実験を設計した。用いたＷＢＣ  ＤＩＬは、１リットル当たり、０．５％重量／容量の塩化アンモニウム、０．０７５％容量のホルムアルデヒド、０．０１％重量／容量のサポニン、０．０１％重量／容量の重炭酸カリウム、およびｐＨ約６．０であって約２７０ｍＯｓｍの重量オスモル濃度である２０ｍＭ酢酸緩衝液を含有するものであった。ＮＲＢＣ染料を含まないもの及び種々の濃度（０．２５、０．５０、０．７５および１．０μｇ／ｍｌ）のＮＲＢＣ染料を含む４０℃で予備加温したＷＢＣ  ＤＩＬ１．０ｍｌに、２つのイン−ハウスドナー各々からの全血試料５０μｌを添加し、混合し、ＦＡＣＳｃａｎTMに導入し、２０”の読みを得た。ニワトリ赤血球核（ＣＥＮ）懸濁液を用いて、ＦＬ３染色の明るさ（ＣＥＮの平均ＦＬ３）を測定した。本実験で用いた全血試料は約６時間経過のものであった。
ＣＥＮ  ＤＮＡはＰＴＡ２４無くしてバックグラウンドから実質的に区別できず（図１０Ｂ）、染料濃度はエチジウムホモダイマーのそれの７５％まで減少させることができ（図５）、バックグラウンドからの許容できる分離をなお維持する（図１０Ｆ）ことが観察された。かかる減少は、非特異的結合の有意な減少および染料使用における実質的節約に導くことができる。
実施例９
Coulter EliteTMフローサイトメーターにおける染料に対する生存性
細胞単離プロトコル：  フィコール単離した細胞の各試験管を以下のごとくに処理した：０．１％アジ化ナトリウムおよび１．０％アルブミンを含むＰＢＳ(Sigma catalogue#1000-3)、比重１．１１９のフィコール（Sigma Histopague catalogue #1119-1）。
１０ｍｌの全血（ＥＤＴＡ抗凝固剤）を１０ｍｌのＰＢＳＷで希釈した。４つの１５ｍｌ円錐底試験管中にて、希釈血液５ｍｌをフィコール５ｍｌに載置した。該試験管を４００×Ｇで３０分間回転させた。リンパ球、単球、顆粒球および血小板を含有する界面層を吸引し、試験管を３００×Ｇで６分間遠心することによって５ｍｌＰＢＳ中で１回洗浄した。細胞ペレットをＰＢＳに再懸濁し、細胞を計数し、１ｍｌ当たり８．５×１０6細胞に調整した。
細胞染色プロトコル：
染料溶液：
ＰＴＡ２４を０．１％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳに溶解することによって作成したＰＴＡ２４−ストック溶液１０ｕｇ／ｍｌ
プロピジウムイオダイド(propidium iodide)（Ｐ．Ｉ．）を０．１％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳに溶解することによって作成したＰ．Ｉ．−ストック溶液０．５ｍｇ／ｍｌ
Ｐ．Ｉ．染色：
１２×７５ｍｍ試験管において、１１７．６μｌの細胞を１４．７μｌのＰ．Ｉ．ストック染料溶液と穏やかに混合した。２０秒間後、該試験管をCoulter Elite TMフローサイトメーターに取り付け、データを収集した。
Sakaiらによる「Discrimination of Viable and Non-Viable Cells Using Prodidium Iodide in Two Color Immunofluore scence」（Cytometry, Vol.8, 1987, pp.413-420）からの方法を用いた。
ＰＴＡ２４染色：
１２×７５ｍｍ試験管中、２３．５μｌ細胞をＰＴＡ２４ストック染料溶液７６μｌと穏やかに混合した。２０秒後、該試験管をCoulter Elite TMフローサイトメーターに取り付け、データを収集した。
トリパンブルー（Trypan Blue）染色：
１２×７５ｍｍ試験管中、トリパンブルーの作用溶液５μｌおよび細胞５μｌを穏やかに混合し、標準的な白色光照明を用いてメハサイトメーター（mehacytometer）で細胞を計数した。最小５００細胞を染色から３分間以内に計数した。
Mishell and ShiigiによるSelected Methods Immunology, 1980, pp.16〜17からの方法を用いた。
フローサイトメータープロトコル：EliteTMフローサイトメーター（CoulterElectronics, Inc.）で分析した細胞
４８８ｎｍにての出力１５ｍＷのアルゴンレーザーで試料を励起した。データは、赤血球細胞、血小板および夾雑物を排除するサイズおよび粒度をベースとして、選別した。未染色細胞を対照として用いて、選別した分布の直線染料蛍光（linear dye fluorescence）を分析した。陽性事象（死滅した細胞）のパーセントおよび死滅した細胞分布の平均蛍光を記録した。
0003856463.tif 000013
実施例１０
化合物２５の合成
磁気撹拌棒および還流コンデンサーを装備した５０ｍｌの丸底フラスコに化合物２２（０．０７５ｇ、０．０００１３モル）を添加した。次いで、窒素下で撹拌しつつメタノール（１０ｍｌ）をこのフラスコに添加し、撹拌を継続しつつトリス（２−アミノエチル）アミン（１．０１６ｇ、０．００５１８モル）を添加した。得られた透明溶液を窒素下で一晩加熱還流した。次いで、この溶液を室温まで冷却し、蒸留水に注いだ。次いで、この混合物を水のみが残存するまで真空中で濃縮した。さらに５０〜７５ｍｌの水を添加し、溶液を０℃まで冷却した。次いで、固体を濾過し、氷冷水で洗浄した。次いで、この物質をＥｔＯＨに再溶解し、１０Ｎ  ＨＣｌで沈殿させた。懸濁液を濾過した後、得られた固体を、熱エタノールから０℃まで１５分間で冷却して再結晶した。また、第２濾液から放置して、また第１の濾液からＥｔＯＨで沈殿させることによって第２結晶を収集した。次いで、これらの固体を合し、一晩の高真空の後、最終生成物２３（２．５ｇ）が得られた。次いで、物質を次の工程である加水分解に送った。
前記からのアミン残渣を１０．０ｍｌのメタノールに溶解し、４Ｎ  ＨＣｌ  １５ｍｌを添加した。混合物を２時間還流し、冷却した。エタノールをこの溶液に添加し、得られた沈殿を濾過し、最小量の冷エタノールで洗浄した。濾液を再度濃縮し、新鮮なエタノールおよび濃塩酸を添加した。この得られた沈殿を濾過した。次に、この濾液を乾固近くまで濃縮し、Ｅｔ2Ｏを添加し、固体を濾別した。次いで、最後に残存する濾過不可能な残渣を濃塩酸に溶解させ、ＥｔＯＨで沈殿させた。この物質を濾過し、エタノールで洗浄し、前記手順からの固体物質を合し、この物質を一晩の高真空に付して、高親和性蛍光ＤＮＡ染色フェナントリジニウムアミン誘導体２５を得た。高分解能質量分析Ｃ28Ｈ38Ｎ7（ＦＡＢ＋）として計算値４７２．３１８９、実測値：４７２．３１９１
化合物２５の構造式は図１６に示す。
実施例１１
化合物２６の合成
磁気撹拌棒および還流コンデンサーを装備した５０ｍｌの丸底フラスコに中間体２２（０．２ｇ、０．４０６ミリモル）を添加した。次いで、窒素下で撹拌しつつメタノール（１０ｍｌ）をこのフラスコに添加し、撹拌を継続しつつ１，４ビスアミノ（３−アミノプロピル）ピペラジン（３．３ｇ、１６．２６ミリモル）を添加した。得られた透明溶液を窒素下で一晩加熱還流した。次いで、この溶液を室温まで冷却し、蒸留水に注いだ。次いで、この混合物を水のみが残存するまで真空中で濃縮した。さらに５０〜７５ｍｌの水を添加し、溶液を０℃まで冷却した。次いで、固体を濾過し、氷冷水で洗浄した。次いで、この物質をＥｔＯＨに再溶解し、１０Ｎ  ＨＣｌで沈殿させた。懸濁液を濾過した後、得られた固体を熱エタノールから０℃まで１５分間で冷却して再結晶した。また、第２濾液から放置により、また第１の濾液からＥｔＯＨで沈殿させることによって第２の結晶を収集した。次いで、これらの固体を合し、一晩の高真空の後、ジアミンアミン生成物が得られた。次いで、物質を次の工程の加水分解に送った。
前記からのアミン残渣を１０．０ｍｌのメタノールに溶解し、４Ｎ  ＨＣｌ  １５ｍｌを添加した。混合物を２時間還流し、冷却した。エタノールをこの溶液に添加し、得られた沈殿を濾過し、最小量の冷エタノールで洗浄した。濾液を再度濃縮し、新鮮なエタノールおよび濃塩酸を添加した。この得られた沈殿を濾過した。次に、この濾過を乾固近くまで濃縮し、Ｅｔ2Ｏを添加し、固体を濾別した。次いで、最後に残存する濾過不可能な残渣を濃塩酸に溶解させ、ＥｔＯＨで沈殿させた。この物質を濾過し、エタノールで洗浄し、前記手順からの固体物質を合し、この物質を一晩の高真空に付して、高親和性蛍光ＤＮＡ染色フェナントリジニウムアミン誘導体２６を得た。質量分析Ｃ26Ｈ30Ｎ5（ＦＡＢ＋）として計算値４１２、実測値：４１２
化合物２６の構造式を図１６に示す。
実施例１２
化合物２７の合成
磁気撹拌棒および還流コンデンサーを装備した５０ｍｌの丸底フラスコに中間体２２（０．０６ｇ、０．１２ミリモル）を添加した。次いで、窒素下で撹拌しつつメタノール（１０ｍｌ）をこのフラスコに添加し、撹拌を継続しつつピペラジン−１−カルボキシアルデヒド（１．３７ｇ、１２．０ミリモル）を添加した。得られた透明溶液を窒素下で一晩加熱還流した。次いで、この溶液を室温まで冷却し、蒸留水に注いだ。次いで、この混合物を水のみが残存するまで真空中で濃縮した。さらに５０〜７５ｍｌの水を添加し、溶液を０℃まで冷却した。次いで、固体を濾過し、氷冷水で洗浄した。次いで、この物質をＥｔＯＨに再溶解し、１０Ｎ  ＨＣｌで沈殿させた。懸濁液を濾過した後、得られた固体を、０℃で１５分間冷却するに際し、熱エタノールから再結晶した。また、第２濾液から放置により、また第１の濾液からＥｔＯＨで沈殿させることによって第２の結晶を収集した。次いで、これらの固体を合し、一晩の高真空の後、ジアミンアミン生成物が得られた。次いで、物質を次の工程の加水分解に送った。
前記からのアミン残渣を１０．０ｍｌのメタノールに溶解し、４Ｎ  ＨＣｌ  １５ｍｌを添加した。混合物を２時間還流し、冷却した。エタノールをこの溶液に添加し、得られた沈殿を濾過し、最小量の冷エタノールで洗浄した。濾液を再度濃縮し、新鮮なエタノールおよび濃塩酸を添加した。この得られた沈殿を濾過した。次に、この濾液を乾固近くまで濃縮し、Ｅｔ2Ｏを添加し、固体を濾別した。次いで、最後に残存する濾過不可能な残渣を濃塩酸に溶解させ、ＥｔＯＨで沈殿させた。この物質を濾過し、エタノールで洗浄し、前記手順からの固体物質を合し、この物質を一晩の高真空に付して、高親和性蛍光ＤＮＡ染色フェナントリジニウムアミン誘導体２７を得た。質量分析  Ｃ32Ｈ44Ｎ7（ＦＡＢ＋）として計算値５２６、実測値：５２６
化合物２７の構造式を図１６に示す。
実施例１３
化合物２８ａ−４２ａおよびその関連化合物の合成
化合物２８ａ−４２ａおよびその関連化合物の一般的合成の反応スキームは図１７に示す。
一般に、磁気撹拌棒および還流コンデンサーを装備した２５０ｍｌの丸底フラスコに中間体２２（０．００８１モル）を添加する。次いで、窒素下で撹拌しつつメタノール（１５０ｍｌ）をこのフラスコに添加し、撹拌を継続しつつ適当なアミン（０．２８３ミリモル）を添加する。得られた溶液を窒素下で一晩加熱還流する。次いで、この溶液を室温まで冷却し、蒸留水に注ぐ。次いで、この混合物を水のみが残存するまで真空中で濃縮する。さらに５０〜７５ｍｌの水を添加し、反応混合物を０℃まで冷却する。固体を濾過し、氷冷水で洗浄する。次いで、この物質をＥｔＯＨに再溶解し、１０Ｎ  ＨＣｌで沈殿させる。懸濁液を濾過した後、得られた固体を、熱エタノールから１５分間で０℃まで冷却して再結晶する。また、第２濾液から放置により、また第１の濾液からＥｔＯＨで沈殿させることによって第２の結晶収集する。次いで、これらの固体を合し、反応を行うのに用いたアミンに応じた最終生成物が得られ、一晩の高真空に付す。当業者によく知られた正確な原子質量式から遊離塩基アミンの分子質量を計算し、得られた質量を、当業者によく知られた高分解能質量分析分子量決定法によって得られたそれと比較することによって、キャラクタリゼーションを行うことができる。
それら対応する出発アミンから得ることができる生成物を以下にリストする。
化合物２８ａを得るための４−アミノ−１−ベンジルピペリジン
化合物２９ａを得るためのスペルミン
化合物３０ａを得るためのピリジン
化合物３１ａを得るための２−（２−アミノエチル）−１−メチルピロリジン
化合物３２ａを得るための１−（２−アミノエチル）ピロリジン
化合物３３ａを得るための１−（２−アミノエチル）ピペリジン
化合物３４ａを得るための２−（２−アミノエチル）ピリジン
化合物３５ａを得るための１−（２−アミノエチル）ピペラジン
化合物３６ａを得るための４−（２−アミノエチル）モルホリン
３７ａを得るための１−アミノ−４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン
３８ａを得るための４−（アミノメチル）ピペリジン
３９ａを得るための２−（アミノメチル）ピリジン
４０ａを得るためのアニリン
４１ａを得るための１−（３−アミノプロピル）イミダゾール
４２ａを得るための４−（３−アミノプロピル）モルホリン。
用いる出発アミド２８ａ−４２ａに応じて、最終生成物２８ｂ−４２ｂの合成および精製は以下の一般的な方法によって行うことができる。適当なアミド（０．００３６モル）を７５．０ｍｌのメタノールに溶解し、４Ｎ  ＨＣｌ  ７５ｍｌを添加する。混合物を２時間還流し、冷却する。エタノールをこの溶液に添加し、得られた沈殿を濾過し、最小量の冷エタノールで洗浄する。濾液を再度濃縮し、新鮮なエタノールおよび濃塩酸を添加する。この得られた沈殿を濾過する。次に、この濾液を乾固近くまで濃縮し、Ｅｔ2Ｏを添加し、固体を濾別する。次いで、最後に残存する濾過不可能な残渣を濃塩酸に溶解させ、ＥｔＯＨで沈殿させた。この物質を濾過し、エタノールで洗浄する。前記手順からのすべての固体物質を合し、一晩の高真空に付して、前記した用いるアミンに応じた高親和性蛍光ＤＮＡ染料１ｂ−１５ｂを得る。当業者によく知られた正確な原子質量式から遊離塩基アミンの分子質量を計算し、得られた質量を、当業者によく知られた高分解能質量分析分子量決定法によって得られたそれと比較することによって、キャラクタリゼーションを行うことができる。
その対応する出発アミンから得ることができる生成物を以下にリストする。
生成物２８ｂを得るためのアミド２８ａ
生成物２９ｂを得るためのアミド２９ａ
生成物３０ｂを得るためのアミド３０ａ
生成物３１ｂを得るためのアミド３１ａ
生成物３２ｂを得るためのアミド３２ａ
生成物３３ｂを得るためのアミド３３ａ
生成物３４ｂを得るためのアミド３４ａ
生成物３５ｂを得るためのアミド３５ａ
生成物３６ｂを得るためのアミド３６ａ
生成物３７ｂを得るためのアミド３７ａ
生成物３８ｂを得るためのアミド３８ａ
生成物３９ｂを得るためのアミド３９ａ
生成物４０ｂを得るためのアミド４０ａ
生成物４１ｂを得るためのアミド４１ａ
生成物４２ｂを得るためのアミド４２ａ
実施例１４
化合物５０およびその関連化合物の合成
化合物５０およびその前駆体の一般的合成の反応スキームは図１８に示す。
P.L.Southwick and A.S. Waggoner et al.（米国特許第４，９８１，９７７号）またはErnst et al., Cytometry, 10, 1989, pp.3-10に見い出されるごとき方法を適用することによって、アルドリッチ・ケミカル・カンパニー（Aldrich Chemical Company（Milwaukee, WI））からの２−メチルベンザチアゾール４３を、ヨウ化メチルを用いてアルキル化して化合物４４を得る。化合物４５はアルドリッチ・ケミカル・カンパニーから得られ、これを、Gaugain, et al., Biochemistry, Vol.17, No.24, 1978, pp.5071-5078の方法を適用することにより、３−ブロモ−１−プロパノール（やはり、アルドリッチ・ケミカル・カンパニーから得られる）と反応させる。化合物４４と４６との縮合は、Hamer, Francisの“Heterocyclic Compounds, Cyanine Dyes and Related Compounds, Wiley, 1964, pg.37”に見い出される方法を適用することによって行い、化合物４７を得る。次いで、化合物４８は、Wiberg et al., J. Am. Chem. Soc., 92(3), 1970, pp.553-564に見い出される方法を用いることによって、アルコールをトシレートに変換することにより得ることができる。次いで、トシレート４８を、Wilt, J., J. Org. Chem., 35(8), 1970, pp.2803-2806の方法により、臭化ナトリウムでの求核置換反応によりブロマイドまで変換して、化合物４９を得る。別法として、Hooz, J. et al., Can. J. Chem.,46, 1968, pp.86-87で提供されているような一段階法が可能である。次いで、化合物４９を以下の手法によってジエチレントリアミン（アルドリッチ・ケミカル・カンパニーから入手可能）と反応させることができる。
磁気撹拌棒および還流コンデンサーを装備した２５０ｍｌの丸底フラスコに化合物４９（０．００８１モル）を添加する。次いで、窒素下で撹拌しつつメタノール（１５０ｍｌ）をこのフラスコに添加し、撹拌を継続しつつ、アルドリッチ・ケミカル・カンパニーから入手できるジエチレントリアミン（０．２８３）を添加する。得られた溶液を窒素下で一晩加熱還流する。次いで、この溶液を室温まで冷却し、蒸留水に注ぐ。次いで、この混合物を水のみが残存するまで真空中で濃縮する。さらに５０〜７５ｍｌの水を添加し、反応混合物を０℃まで冷却する。固体を濾過し、氷冷水で洗浄する。次いで、この物質をＥｔＯＨに再溶解し、１０Ｎ  ＨＣｌで沈殿させる。懸濁液を濾過した後、得られた固体を、熱エタノールから１５分間で０℃に冷却して再結晶する。また、第２濾液から放置により、また第１の濾液からＥｔＯＨで沈殿させることによって、第２の結晶を収集する。次いで、これらの固体を合し、最終生成物５０が得られ、これを一晩の高真空に付す。当業者によく知られた正確な原子質量式から遊離塩基アミンの分子質量を計算し、得られた質量を、当業者によく知られた高分解能質量分析分子量決定法によって得られたそれと比較することによって、キャラクタリゼーションを行うことができる。
化合物４９のアミン誘導体は以下のごとくに合成できる。磁気撹拌棒および還流コンデンサーを装備した２５０ｍｌの丸底フラスコに化合物４９（０．００８１ミリモル）を添加する。次いで、窒素下で撹拌しつつメタノール（１５０ｍｌ）をこのフラスコに添加し、撹拌を継続しつつ、アルドリッチ・ケミカル・カンパニーから入手できる以下のリストから選択される適当なアミン（０．２８３モル）を添加する。得られた溶液を窒素下で一晩加熱還流する。次いで、この溶液を室温まで冷却し、蒸留水に注ぐ。次いで、この混合物を水のみが残存するまで真空中で濃縮する。さらに５０〜７５ｍｌの水を添加し、反応混合物を０℃まで冷却する。固体を濾過し、氷冷水で洗浄する。次いで、この物質をＥｔＯＨに再溶解し、１０Ｎ  ＨＣｌで沈殿させる。懸濁液を濾過した後、得られた固体を、熱エタノールから０℃まで１５分間で冷却して再結晶する。また、第２濾液から放置により、また第１の濾液からＥｔＯＨで沈殿させることによって、第２の結晶を収集する。次いで、これらの固体を合し、最終生成物４９ａ〜４９ｏが得られ、これを一晩の高真空に付す。
その対応するアミンから得られる生成物を以下にリストする。
４９ａを得るための４−アミノ−１−ベンジルピペリジン
４９ｂを得るためのスペルミン
４９ｃを得るためのピリジン
４９ｄを得るための２−（２−アミノエチル）−１−メチルピロリジン
４９ｅを得るための１−（２−アミノエチル）ピロリジン
４９ｆを得るための１−（２−アミノエチル）ピペリジン
４９ｇを得るための２−（２−アミノエチル）ピリジン
４９ｈを得るための１−（２−アミノエチル）ピペラジン
４９ｉを得るための４−（２−アミノエチル）モルホリン
４９ｊを得るための１−アミノ−４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン
４９ｋを得るための４−（アミノメチル）ピペリジン
４９ｌを得るための２−（アミノメチル）ピリジン
４９ｍを得るためのアニリン
４９ｎを得るための１−（３−アミノプロピル）イミダゾール
４９ｏを得るための４−（３−アミノプロピル）モルホリン
当業者によく知られた正確な原子質量式から遊離塩基アミンの分子質量を計算し、得られた質量を、当業者によく知られた高分解能質量分析分子量決定法によって得られたそれと比較することによって、キャラクタリゼーションを行うことができる。
化合物４９ａ〜４９ｏの構造は前記した一般的方法から明確であるので、それらの構造は示さない。
実施例１５
化合物５５および５５ａ−５５ｂの合成
化合物５５、５５ａおよびその前駆体の一般的合成の反応スキームは図１９に示す。化合物５５ａ−５５ｐの構造式は図２０に示す。
２−メチルベンザチアゾール４３はアルドリッチ・ケミカル・カンパニー（Aldrich Chemical Company（Milwaukee, WI））から得られる。Gaugain, et al., Biochemistry, 17(24), 1978, 5071-5078に見い出されるごとき方法を適用することにより、３−ブロモ−１−プロパノールを用いて、これをアルキル化して化合物５１を得る。化合物４５はアルドリッチ・ケミカル・カンパニーから得られ、これを、Gaugain, et al., Biochemistry, 17(24), 1978, 5071-5078に見い出だされるごとき方法を適用することにより、３−ブロモ−１−プロパノール（やはり、アルドリッチ・ケミカル・カンパニーから得られる）と反応させる。化合物５１と５２との縮合は、Hamer, Francis,“Heterocyclic Compounds, Cyanine Dyes and Related Compounds, Wiley, 1964, pg.37”に見い出される方法を適用することによって行い、化合物５２を得る。次いで、化合物５３は、Wiberg, k. et al., J. Am. Chem. Soc., 92(3), 1970, pp. 553-564に見い出されるごとき方法を用いることによって、アルコールをトシレートに変換することにより得られる。次いで、トシレート５３を、Wilt, J., J. Org. Chem. , 35(8), 1970, pp.2803-2806の方法により、臭化ナトリウムでの求核置換反応を介してブロマイドまで変換して、化合物５４を得る。
別法として、Hooz, J. et al., Can. J. Chem., 46, 1968, pp.86-87で提供されるような一段法が可能である。
次いで、化合物５４を以下の方法によってジエチレントリアミンまたは他の適当なアミン（アルドリッチ・ケミカル・カンパニーから入手可能）と反応させて、化合物５４ａ−５４ｐを得ることができる。
磁気撹拌棒および還流コンデンサーを装備した２５０ｍｌの丸底フラスコに化合物５４（０．００８１モル）を添加する。次いで、窒素下で撹拌しつつメタノール（１５０ｍｌ）をこのフラスコに添加し、撹拌を継続しつつ、アルドリッチ・ケミカル・カンパニーから入手できるジエチレントリアミンまたは他の適当な塩基（０．２８３モル）を添加する。得られた溶液を窒素下で一晩加熱還流する。次いで、この溶液を室温まで冷却し、蒸留水に注ぐ。次いで、この混合物を水のみが残存するまで真空中で濃縮する。さらに５０〜７５ｍｌの水を添加し、反応混合物を０℃まで冷却する。固体を濾過し、氷冷水で洗浄する。次いで、この物質をＥｔＯＨに再溶解し、１０Ｎ  ＨＣｌで沈殿させる。懸濁液を濾過した後、得られた固体を、熱エタノールから０℃まで１５分間で冷却して再結晶する。また、第２濾液から放置により、また第１の濾液からＥｔＯＨで沈殿させることによって、第２の結晶を収集する。次いで、これらの固体を合し、最終生成物９ａ−ｐが得られ、これを一晩の高真空に付す。当業者によく知られた正確な原子質量式から遊離塩基アミンの分子質量を計算し、得られた質量を、当業者によく知られた高分解能質量分析分子量決定法によって得られたそれと比較することによって、キャラクタリゼーションを行うことができる。
試薬および溶媒の比率を一定に保つ限り、当業者によく知られた比率および割合の方法を用いて、試薬量をスケールアップまたはスケールダウンすることができる。
その対応する出発アミンから得られる生成物を以下にリストする。
化合物５４ａを得るためのジエチレントリアミン
化合物５４ｂを得るための４−アミノ−１−ベンジルピペリジン
化合物５４ｃを得るためのスペルミン
化合物５４ｄを得るためのピリジン
化合物５４ｅを得るための２−（２−アミノエチル）−１−メチルピロリジン
化合物５４ｆを得るための１−（２−アミノエチル）ピロリジン
化合物５４ｇを得るための１−（２−アミノエチル）ピペリジン
化合物５４ｈを得るための２−（２−アミノエチル）ピリジン
化合物５４ｉを得るための１−（２−アミノエチル）ピペラジン
化合物５４ｊを得るための４−（２−アミノエチル）モルホリン
５４ｋを得るための１−アミノ−４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン
５４ｌを得るための４−（アミノメチル）ピペリジン
５４ｍを得るための２−（アミノメチル）ピリジン
５４ｎを得るためのアニリン
５４ｏを得るための１−（３−アミノプロピル）イミダゾール
５４ｐを得るための４−（３−アミノプロピル）モルホリン
実施例１６
化合物５８および５８ａ−５８ｐの合成
化合物５８、５８ａおよびその前駆体の一般的合成の反応スキームは図２１に示す。化合物５８ａ−５８ｐの構造式は図２２に示す。
２−メチルベンザチアゾール４３はアルドリッチ・ケミカル・カンパニー（Aldrich Chemical Company）（Milwaukee, WI））から得られる。Gaugain, et al. Biochemistry, Vol,17, No.24, 1978, pp.5071-5078の方法を適用することにより、３−ブロモ−１−プロパノールを用いて、これをアルキル化して化合物５１が得られる。化合物４５はアルドリッチ・ケミカル・カンパニーから得られ、これを、Southwick et al.（米国特許第４，９８１，９７７号、１９９１年１月１日）またはErnst et al., Cytometry, 10, 1989, pp.3-10に見い出される方法を用いて、ヨウ化メチル（やはり、アルドリッチ・ケミカル・カンパニーから得られる）と反応させて、化合物５５を得る。化合物５１と５５との縮合は、Hamer, Francis,“Heterocyclic Compounds, Cyanine Dyes and Related Compounds, Wiley, 1964, pg.37”に見い出されるごとき方法を適用することによって行い、化合物５６を得る。次いで、化合物５７は、Wiberg, k. et al., J. Am. Chem. Soc., 92(3), 1970, pp.553-564に見い出されるごとき方法を用いることによって、アルコールをトシレートに変換することにより得られる。次いで、トシレート５７を、Wilt, j., J. Org. Chem. , 35(8), 1970, pp.2803-2806）の方法により、臭化ナトリウムでの求核置換反応を介してブロマイドまで変換して、化合物５８を得る。
別法として、Hooz, J. et al. (Can. J. Chem., 46, 1968, pp.86-87）で提供されているような一段階法も可能である。
化合物５８を以下の  ようにしてジエチレントリアミンまたは他の適当なアミン（アルドリッチ・ケミカル・カンパニーから入手可能）と反応させることができる。
磁気撹拌棒および還流コンデンサーを装備した２５０ｍｌの丸底フラスコに化合物５８（０．００８１モル）を添加する。次いで、窒素下で撹拌しつつメタノール（１５０ｍｌ）をこのフラスコに添加し、撹拌を継続しつつ、アルドリッチ・ケミカル・カンパニーから入手できるジエチレントリアミンまたは他の適当な塩基（０．２８３モル）を添加する。得られた溶液を窒素下で一晩加熱還流する。次いで、この溶液を室温まで冷却し、蒸留水に注ぐ。次いで、この混合物を水のみが残存するまで真空中で濃縮する。さらに５０〜７５ｍｌの水を添加し、反応混合物を０℃まで冷却する。固体を濾過し、氷冷水で洗浄する。次いで、この物質をＥｔＯＨに再溶解し、１０Ｎ  ＨＣｌで沈殿させる。懸濁液を濾過した後、得られた固体を、熱エタノールから０℃まで１５分間で冷却して再結晶する。また、第２濾液から放置により、また第１の濾液からＥｔＯＨで沈殿させることによって、第２結晶を収集する。次いで、これらの固体を合し、最終生成物５８ａ−５８ｐが得られ、これを一晩の高真空に付す。当業者によく知られた正確な原子質量式から遊離塩基アミンの分子質量を計算し、得られた質量を、当業者によく知られた高分解能質量分析分子量決定法によって得られたそれと比較することによって、キャラクタリゼーションを行うことができる。試薬および溶媒の比率を一定に保つ限り、当業者によく知られた比率および割合の方法を用いて、試薬量をスケールアップまたはスケールダウンすることができる。
その対応するアミンから得られる生成物を以下にリストする。
化合物５８ａを得るためのジエチレントリアミン
化合物５８ｂを得るための４−アミノ−１−ベンジルピペリジン
化合物５８ｃを得るためのスペルミン
化合物５８ｄを得るためのピリジン
化合物５８ｅを得るための２−（２−アミノエチル）−１−メチルピロリジン
化合物５８ｆを得るための１−（２−アミノエチル）ピロリジン
化合物５８ｇを得るための１−（２−アミノエチル）ピペリジン
化合物５８ｈを得るための２−（２−アミノエチル）ピリジン
化合物５８ｉを得るための１−（２−アミノエチル）ピペラジン
化合物５８ｊを得るための４−（２−アミノエチル）モルホリン
５８ｋを得るための１−アミノ−４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン
５８ｌを得るための４−（アミノメチル）ピペリジン
５８ｍを得るための２−（アミノメチル）ピリジン
５８ｎを得るためのアニリン
５８ｏを得るための１−（３−アミノプロピル）イミダゾール
５８ｐを得るための４−（３−アミノプロピル）モルホリン
実施例１７
化合物６４およびその関連化合物の合成
化合物６４およびその前駆体の一般的合成の反応スキームは図２３に示す。
２−メチルベンゾオキサゾール５９はアルドリッチ・ケミカル・カンパニー（Aldrich Chemical Company（Milwaukee, WI））から得られる。Southwick et al.（米国特許第４，９８１，９７７号、１９９１年１月１日）またはErnst et al., Cytometry, 10, 1989, pp.3-10に見い出されるごとき方法を用い、ヨウ化メチルを用いて、これをアルキル化して化合物６０が得られる。化合物４５はアルドリッチ・ケミカル・カンパニーから得られ、これを、Gaugain, et al., Biochemistry, Vol.17, No.24, 1978, pp.5071-5078の方法を適用することにより、３−ブロモ−１−プロパノール（やはり、アルドリッチ・ケミカル・カンパニーから得られる）と反応させる。化合物６０と４６との縮合は、Hamer, Francis, “Heterocyclic Compounds, Cyanine Dyes and Related Compounds, Wiley, 1964, pg.37”に見い出される方法を適用することによって行い、化合物６１を得る。次いで、化合物６２は、Wiberg, k. et al., J. Am. Chem. Soc., 92(3), 1970, pp.553-564に見い出されるごとき方法を用いることによって、アルコールをトシレートに変換することにより得られる。次いで、トシレート６２を、Wilt, J., J. Org. Chem. , 35(8), 1970, pp.2803-2806によって記載されている方法により、臭化ナトリウムでの求核置換反応を介してブロマイドまで変換して、化合物６３を得る。
別法として、Hooz, J. et al. Can. J. Chem., 46, 1968, pp.86-87に提供されているような一段階法も用い得る。
化合物６３を以下の方法によってジエチレントリアミン（アルドリッチ・ケミカル・カンパニーから入手可能）と反応させることができる。
磁気撹拌棒および還流コンデンサーを装備した２５０ｍｌの丸底フラスコに化合物６３（０．００８１モル）を添加する。次いで、窒素下で撹拌しつつメタノール（１５０ｍｌ）をこのフラスコに添加し、撹拌を継続しつつ、アルドリッチ・ケミカル・カンパニーから入手できるジエチレントリアミン（０．２８３モル）を添加する。得られた溶液を窒素下で一晩加熱還流する。次いで、この溶液を室温まで冷却し、蒸留水に注ぐ。次いで、この混合物を水のみが残存するまで真空中で濃縮する。さらに５０〜７５ｍｌの水を添加し、反応混合物を０℃まで冷却する。固体を濾過し、氷冷水で洗浄する。次いで、この物質をＥｔＯＨに再溶解し、１０Ｎ  ＨＣｌで沈殿させる。懸濁液を濾過した後、得られた固体を、熱エタノールから０℃まで１５分間で冷却して再結晶する。また、第２濾液から放置により、また第１の濾液からＥｔＯＨで沈殿させることによって、第２の結晶を収集する。次いで、これらの固体を合し、最終生成物６４が得られ、これを一晩の高真空に付す。当業者によく知られた正確な原子質量式から遊離塩基アミンの分子質量を計算し、得られた質量を、当業者によく知られた高分解能質量分析分子量決定法によって得られたそれと比較することによって、キャラクタリゼーションを行うことができる。
化合物６３のアミン誘導体は以下のごとくに合成することができる。磁気撹拌棒および還流コンデンサーを装備した２５０ｍｌの丸底フラスコに化合物６３（０．００８１モル）を添加する。次いで、窒素下で撹拌しつつメタノール（１５０ｍｌ）をこのフラスコに添加し、撹拌を継続しつつ、アルドリッチ・ケミカル・カンパニーから入手できる以下のリストから選択される適当なアミン（０．２８３モル）を添加する。得られた溶液を窒素下で一晩加熱還流する。次いで、この溶液を室温まで冷却し、蒸留水に注ぐ。次いで、この混合物を水のみが残存するまで真空中で濃縮する。さらに５０〜７５ｍｌの水を添加し、反応混合物を０℃まで冷却する。固体を濾過し、氷冷水で洗浄する。次いで、この物質をＥｔＯＨに再溶解し、１０Ｎ  ＨＣｌで沈殿させる。懸濁液を濾過した後、得られた固体を、熱エタノールから０℃まで１５分間で冷却して再結晶する。また、第２濾液から放置により、また第１の濾液からＥｔＯＨで沈殿させることによって、第２の結晶を収集する。次いで、これらの固体を合し、最終生成物３０ａ−３０ｏが得られ、これを一晩の高真空に付す。
その対応するアミンから得られる生成物を以下にリストする。
６３ａを得るための４−アミノ−１−ベンジルピペリジン
６３ｂを得るためのスペルミン
６３ｃを得るためのピリジン
６３ｄを得るための２−（２−アミノエチル）−１−メチルピロリジン
６３ｅを得るための１−（２−アミノエチル）ピロリジン
６３ｆを得るための１−（２−アミノエチル）ピペリジン
６３ｇを得るための２−（２−アミノエチル）ピリジン
６３ｈを得るための１−（２−アミノエチル）ピペラジン
６３ｉを得るための４−（２−アミノエチル）モルホリン
６３ｊを得るための１−アミノ−４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン
６３ｋを得るための４−（アミノメチル）ピペリジン
６３ｌを得るための２−（アミノメチル）ピリジン
６３ｍを得るためのアニリン
６３ｎを得るための１−（３−アミノプロピル）イミダゾール
６３ｏを得るための４−（３−アミノプロピル）モルホリン
当業者によく知られた正確な原子質量式から遊離塩基アミンの分子質量を計算し、得られた質量を、当業者によく知られた高分解能質量分析分子量決定法によって得られたそれと比較することによって、キャラクタリゼーションを行うことができる。加水分解は必要ないことに注意されたい。
化合物６３ａ−６３ｏの構造は前記した一般的方法から明確であるので、その構造は示さない。
実施例１８
化合物６８および６８ａ−６８ｐの合成
化合物６８、６８ａおよびその前駆体の一般的合成の反応スキームは図２４に示す。化合物６８ａ−６８ｐの構造式は図２５に示す。
２−メチルベンゾオキサゾール５９はアルドリッチ・ケミカル・カンパニー（Aldrich Chemical Company（Milwaukee, WI））から得られる。Gaugain, et al.,Biochemistry, Vol.17, No. 24, 1978, pp.5071-5078の方法を適用することにより、３−ブロモ−１−プロパノールを用い、それをアルキル化して化合物６５を得る。化合物４５はアルドリッチ・ケミカル・カンパニーから得られ、これを、Gaugain, et al.,Biochemistry, Vol. 17, No.24, 1978, pp.5071-5078に見い出されるごとき方法を適用することにより、３−ブロモ−１−プロパノール（やはり、アルドリッチ・ケミカル・カンパニーから得られる）と反応させる。化合物６５と４６との縮合は、Hamer, Francis,“Heterocyclic Compounds, Cyanine Dyes and Related Compounds, Wiley, 1964, pg.37”に見い出される方法を適用することによって行い、化合物６０を得る。次いで、化合物６７は、Wiberg, K. et al.,J. Am. Chem. Soc., 92(3), 1970, pp.553-564に見い出されるごとき方法を用いることによって、アルコールをトシレートに変換することにより得られる。次いで、トシレート６７を、Wilt, J., J. Org. Chem., 35(8), 1970, pp.2803-2806の方法により、臭化ナトリウムでの求核置換反応を介してブロマイドまで変換して、化合物６８を得る。
別法として、Hooz, J. et al.,Can. J. Chem., 46, 1968, pp.86-87で提供されているような一段階法も用いることができる。
次いで、化合物６８を以下の手法によってジエチレントリアミンまたは他の適当なアミン（アルドリッチ・ケミカル・カンパニーから入手可能）と反応させることができる。
磁気撹拌棒および還流コンデンサーを装備した２５０ｍｌの丸底フラスコに化合物６８（０．００８１モル）を添加する。次いで、窒素下で撹拌しつつメタノール（１５０ｍｌ）をこのフラスコに添加し、撹拌を継続しつつ、アルドリッチ・ケミカル・カンパニーから入手できるジエチレントリアミンまたは他の適当なアミン（０．２８３モル）を添加する。得られた溶液を窒素下で一晩加熱還流する。次いで、この溶液を室温まで冷却し、蒸留水に注ぐ。次いで、この混合物を水のみが残存するまで真空中で濃縮する。さらに５０〜７５ｍｌの水を添加し、反応混合物を０℃まで冷却する。固体を濾過し、氷冷水で洗浄する。次いで、この物質をＥｔＯＨに再溶解し、１０Ｎ ＨＣｌで沈殿させる。懸濁液を濾過した後、得られた固体を、熱エタノールから０℃まで１５分間で冷却して再結晶する。また、第２濾液から放置により、また第１の濾液からＥｔＯＨで沈殿させることによって、第２の結晶を収集する。次いで、これらの固体を合し、最終生成物６８ａが得られ、これを一晩の高真空に付す。当業者によく知られた正確な原子質量式から遊離塩基アミンの分子質量を計算し、得られた質量を、当業者によく知られた高分解能質量分析分子量決定法によって得られたそれと比較することによって、キャラクタリゼーションを行うことができる。
試薬および溶媒の比率を一定に保持する限り、当業者によく知られた比率および割合の方法を用いて、試薬量のスケールアップまたはスケールダウンを行うことができる。
その対応するアミンから得られる生成物を以下にリストする。
化合物６８ａを得るためのジエチレントリアミン
化合物６８ｂを得るための４−アミノ−１−ベンジルピペリジン
化合物６８ｃを得るためのスペルミン
化合物６８ｄを得るためのピリジン
化合物６８ｅを得るための２−（２−アミノエチル）−１−メチルピロリジン
化合物６８ｆを得るための１−（２−アミノエチル）ピロリジン
化合物６８ｇを得るための１−（２−アミノエチル）ピペリジン
化合物６８ｈを得るための２−（２−アミノエチル）ピリジン
化合物６８ｉを得るための１−（２−アミノエチル）ピペラジン
化合物６８ｊを得るための４−（２−アミノエチル）モルホリン
６８ｋを得るための１−アミノ−４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン
６８ｌを得るための４−（アミノメチル）ピペリジン
６８ｍを得るための２−（アミノメチル）ピリジン
６８ｎを得るためのアニリン
６８ｏを得るための１−（３−アミノプロピル）イミダゾール
６８ｐを得るための４−（３−アミノプロピル）モルホリン
実施例１９
化合物７１および７１ａ−７１ｐの合成
化合物７１、７１ａおよびその前駆体の一般的合成の反応スキームは図２６に示す。化合物７１ａ−７１ｐの構造式は図２７に示す。
２−メチルベンゾオキサゾール５９はアルドリッチ・ケミカル・カンパニー(Aldrich Chemical Company(Milwaukee, WI))から得られる。化合物１３を得るためのGaugain, et al. ,Biochemistry, Vol.17, No.24, 1978, pp.5071-5078に見い出されるごとき方法を適用することにより、３−ブロモ−１−プロパノールを用い、それをアルキル化して化合物６５を得る。化合物４５はアルドリッチ・ケミカル・カンパニーから得られ、これを、Southwick et al.（米国特許第４，９８１，９７７号、１９９１年１月１日）またはErnst et al., Cytometry, 10, 1989, pp.3-10に見い出される方法を適用することにより、ヨウ化メチル（やはり、アルドリッチ・ケミカル・カンパニーから得られる）と反応させて、化合物５５を得る。化合物６５と５５との縮合は、Hamer, Francis, “Heterocyclic Compounds, Cyanine Dyes and Related Compounds, Wiley, 1964, pg.37”に見い出される方法を適用することによって行い、化合物６９を得る。次いで、化合物７０は、Wiberg, K. et al., J. Am. Chem. Soc., 92(3), 1970, pp.553-564に見い出されるごとき方法を用いることによって、アルコールをトシレートに変換することにより得られる。次いで、トシレート７０を、Wilt, J., J. Org. Chem., 35(8), 1970, pp.2803-2806の方法により、臭化ナトリウムでの求核置換反応を介してブロマイドまで変換して、化合物２０を得る。
別法として、Hooz, J. et al.,Can. J. Chem., 46, 1968, pp.86-87に提供されているような一段階法も用い得る。次いで、化合物７０を以下の方法によってジエチレントリアミンまたは他の適当なアミン（アルドリッチ・ケミカル・カンパニーから入手可能）と反応させることができる。
磁気撹拌棒および還流コンデンサーを装備した２５０ｍｌの丸底フラスコに化合物７１（０．００８１モル）を添加する。次いで、窒素下で撹拌しつつメタノール（１５０ｍｌ）をこのフラスコに添加し、撹拌を継続しつつ、アルドリッチ・ケミカル・カンパニーから入手できるジエチレントリアミンまたは他の適当なアミン（０．２８３モル）を添加する。得られた溶液を窒素下で一晩加熱還流する。次いで、この溶液を室温まで冷却し、蒸留水に注ぐ。次いで、この混合物を水のみが残存するまで真空中で濃縮する。さらに５０〜７５ｍｌの水を添加し、反応混合物を０℃まで冷却する。固体を濾過し、氷冷水で洗浄する。次いで、この物質をＥｔＯＨに再溶解し、１０Ｎ  ＨＣｌで沈殿させる。懸濁液を濾過した後、得られた固体を、熱エタノールから０℃まで１５分間で冷却することにより再結晶する。また、放置により第２濾液から、また第１の濾液からＥｔＯＨで沈殿させることによって、第２の結晶を収集する。次いで、これらの固体を合し、最終生成物７１ａ−７１ｐが得られ、これを一晩の高真空に付す。当業者によく知られた正確な原子質量式から遊離塩基アミンの分子質量を計算し、得られた質量を、当業者によく知られた高分解能質量分析分子量決定法によって得られたそれと比較することによって、キャラクタリゼーションを行うことができる。
試薬および溶媒の比率を一定に保持する限り、当業者によく知られた比率および割合の方法を用いて、試薬量のスケールアップまたはスケールダウンを行うことができる。
その対応するアミンから得られる生成物を以下にリストする。
化合物２０ａを得るためのジエチレントリアミン
化合物２０ｂを得るための４−アミノ−１−ベンジルピペリジン
化合物２０ｃを得るためのスペルミン
化合物２０ｄを得るためのピリジン
化合物２０ｅを得るための２−（２−アミノエチル）−１−メチルピロリジン
化合物２０ｆを得るための１−（２−アミノエチル）ピロリジン
化合物２０ｇを得るための１−（２−アミノエチル）ピペリジン
化合物２０ｈを得るための２−（２−アミノエチル）ピリジン
化合物２０ｉを得るための１−（２−アミノエチル）ピペラジン
化合物２０ｊを得るための４−（２−アミノエチル）モルホリン
２０ｋを得るための１−アミノ−４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン
２０ｌを得るための４−（アミノメチル）ピペリジン
２０ｍを得るための２−（アミノメチル）ピリジン
２０ｎを得るためのアニリン
２０ｏを得るための１−（３−アミノプロピル）イミダゾール
２０ｐを得るための４−（３−アミノプロピル）モルホリン
実施例２０
化合物８０およびその関連化合物の合成
化合物８０およびその前駆体の一般的合成の反応スキームは図２８に示す。
化合物７２はアルドリッチ・ケミカル・カンパニーから入手可能である。各々、Dervan et al.,J. Am. Chem. Soc., Vol. 100, No.6, 1978, pp.1968-1970またはそこで引用された二次文献の方法に準じて、化合物７３は化合物７２から合成でき、化合物７４は化合物７３から合成でき、化合物７５は化合物７４から合成できる。
化合物７６はGaugain, et al.,Biochemistry, Vol.17, No. 24, 1978, pp.5071-5078の方法によって化合物７５から合成できる。化合物７７は、Dervan, P.B., Becker, M.M., J. Am. Chem. Soc., 1978, Vol.100, No.6, 1968-1970またはそれに含まれる二次文献の方法によって化合物７６から合成できる。化合物７８は、Lee et al., J. Am. Chem. Soc., 88(14), 1966, pp.3440-3441またはそこに含まれる文献の方法によって化合物７７から合成できる。化合物７９は以下の方法によって合成できる。磁気撹拌棒および還流コンデンサーを装備した２５０ｍｌの丸底フラスコに化合物７８（０．００８１モル）を添加する。次いで、窒素下で撹拌しつつメタノール（１５０ｍｌ）をこのフラスコに添加し、撹拌を継続しつつ、アルドリッチ・ケミカル・カンパニーから入手できるジエチレントリアミン（０．２８３モル）を添加する。得られた溶液を窒素下で一晩加熱還流する。次いで、この溶液を室温まで冷却し、蒸留水に注ぐ。次いで、この混合物を水のみが残存するまで真空中で濃縮する。さらに５０〜７５ｍｌの水を添加し、反応混合物を０℃まで冷却する。固体を濾過し、氷冷水で洗浄する。次いで、この物質をＥｔＯＨに再溶解し、１０Ｎ  ＨＣｌで沈殿させる。懸濁液を濾過した後、得られた固体を、熱エタノールから０℃まで１５分間で冷却して再結晶する。放置により第２濾液から、また第１の濾液からＥｔＯＨで沈殿させることによって、第２の結晶を収集する。次いで、これらの固体を合し、最終生成物７９が得られ、これを一晩の高真空に付す。当業者によく知られた正確な原子質量式から遊離塩基アミンの分子質量を計算し、得られた質量を、当業者によく知られた高分解能質量分析分子量決定法によって得られたそれと比較することによって、キャラクタリゼーションを行うことができる。最終化合物８０はDervan, P.B., Becker, M.M., J. Am. Chem. Soc., 1978, 100(6), 1968-1970の還元方法を用いることによって得られる。すべての中間体のキャラクタリゼーションおよび精製は当業者によく知られた方法を用いて達成できる。
化合物７８のアミン誘導体は以下のごとくに合成することができる。磁気撹拌棒および還流コンデンサーを装備した２５０ｍｌの丸底フラスコに化合物７８（０．００８１モル）を添加する。次いで、窒素下で撹拌しつつメタノール（１５０ｍｌ）をこのフラスコに添加し、撹拌を継続しつつ、アルドリッチ・ケミカル・カンパニーから入手できる以下のリストから選択される適当なアミン（０．２８３モル）を添加する。得られた溶液を窒素下で一晩加熱還流する。次いで、この溶液を室温まで冷却し、蒸留水に注ぐ。次いで、この混合物を水のみが残存するまで真空中で濃縮する。さらに５０〜７５ｍｌの水を添加し、反応混合物を０℃まで冷却する。固体を濾過し、氷冷水で洗浄する。次いで、この物質をＥｔＯＨに再溶解し、１０Ｎ  ＨＣｌで沈殿させる。懸濁液を濾過した後、得られた固体を、熱エタノールから０℃まで１５分間で冷却して再結晶する。放置により第２濾液から、また第１の濾液からＥｔＯＨで沈殿させることによって、第２の結晶を収集する。次いで、これらの固体を合し、最終生成物７８ａ−７８ｏが得られ、これを一晩の高真空に付す。当業者によく知られた正確な原子質量式から遊離塩基アミンの分子質量を計算し、得られた質量を、当業者によく知られた高分解能質量分析分子量決定法によって得られたそれと比較することによって、キャラクタリゼーションを行うことができる。
その対応するアミンから得られる生成物を以下にリストする。
７８ａを得るための４−アミノ−１−ベンジルピペリジン
７８ｂを得るためのスペルミン
７８ｃを得るためのピリジン
７８ｄを得るための２−（２−アミノエチル）−１−メチルピロリジン
７８ｅを得るための１−（２−アミノエチル）ピロリジン
７８ｆを得るための１−（２−アミノエチル）ピペリジン
７８ｇを得るための２−（２−アミノエチル）ピリジン
７８ｈを得るための１−（２−アミノエチル）ピペラジン
７８ｉを得るための４−（２−アミノエチル）モルホリン
７８ｊを得るための１−アミノ−４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン
７８ｋを得るための４−（アミノメチル）ピペリジン
７８ｌを得るための２−（アミノメチル）ピリジン
７８ｍを得るためのアニリン
７８ｎを得るための１−（３−アミノプロピル）イミダゾール
７８ｏを得るための４−（３−アミノプロピル）モルホリン
最終生成物７８ａａ−７８ｏｏの合成および精製は、以下に示す対応する最終生成物を得るための以下のプロトコルによって達成できる。ニトロ化合物７８ａ−７８ｏは、Dervan et al.,J. Am. Chem. Soc., 100(6), 1978, pp.1968-1970の方法を用いることによって適当なアミンに変換できる。
その対応する中間体前駆体から得られる生成物を以下にリストする。
７８ａａを得るための７８ａ
７８ｂｂを得るための７８ｂ
７８ｃｃを得るための７８ｃ
７８ｄｄを得るための７８ｄ
７８ｅｅを得るための７８ｅ
７８ｆｆを得るための７８ｆ
７８ｇｇを得るための７８ｇ
７８ｈｈを得るための７８ｈ
７８ｉｉを得るための７８ｉ
７８ｊｊを得るための７８ｊ
７８ｋｋを得るための７８ｋ
７８ｌｌを得るための７８ｌ
７８ｍｍを得るための７８ｍ
７８ｎｎを得るための７８ｎ
７８ｏｏを得るための７８ｏ
当業者によく知られた正確な原子質量式から遊離塩基アミンの分子質量を計算し、得られた質量を、当業者によく知られた高分解能質量分析分子量決定法によって得られたそれと比較することによって、キャラクタリゼーションを行うことができる。
化合物７８ａ−７８ｏおよび７８ａａ−７８ｏｏの構造は前記した一般的方法から明確であるので、その構造は示さない。
実施例２１
化合物８５およびその関連化合物の合成
化合物８５およびその前駆体の一般的合成の反応スキームは図２９に示す。
出発物質８１（０．０８７６モル）はアルドリッチ・ケミカル・カンパニー（Aldrich Chemical Company(Milwaukee, WI)）から入手し、アルゴン下、磁気撹拌棒および還流コンデンサーを装備した３．０リットルの一首丸底フラスコに添加する。この容器に、乾燥ピリジン１．０リットルを撹拌しつつ添加する。得られた懸濁液の撹拌は、すべての固体が溶解するまで１５分間継続する。触媒量のＮ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン（１．０７ｇ、０．００８７６モル）を撹拌しつつこの溶液に添加する。次いで、無水酢酸（４６２ｇ、４．９モル）を添加し、得られた反応混合物を８〜１２時間還流する。次いで、反応混合物を冷却し、溶媒を真空中で除去する。生成物４２の精製には、薄層クロマトグラフィーのごとき当業者によく知られた方法を用いて決定した適当な溶媒系を用い、シリカゲルカラムの勾配溶離を行う。１０．０ｍｌずつの画分を収集し、適当な画分を再び合し、真空中で溶媒を除去する。次いで、残渣を熱ＥｔＯＨ（２２０ｍｌ）に溶解し、０℃まで冷却することによって沈殿させる。母液をデカンテーションし、２００ｍｌの新鮮なＥｔＯＨを添加する。加熱することによって固体を再溶解し、−４℃で４８時間結晶化させる。結晶を母液と２番目の再結晶の両方から収集し、少量の冷ＥｔＯＨで洗浄し、高真空下で数時間乾燥する。得られた化合物８２は当業者によく知られた高分解能質量分析によってキャラクタリゼーションすることができる。
化合物８３は、３，８ジアミノ−６−フェニルフェナントリジンのジアミドの第四級化についての文献の方法（Gaugain et al., Biochemistry, Vol.17, No.24, 1978, pp5071-5078）の変法により、イミド４２から合成することができる。イミド８２（０．０２３モル）を、アルゴン下、磁気撹拌棒および還流コンデンサーを装備した２．０リットルの丸底フラスコに入れる。１，３ジブロモプロパン（１．０リットル、９．８６モル）をこのフラスコに添加し、得られた混合物を約７時間還流する。溶液を一晩冷却し、沈殿を濾過し、Ｅｔ2Ｏで洗浄する。この物質をＣＨ3ＯＨから再結晶してジアセチルブロマイド８３が得られ、これは、質量分析および当業者に公知の他の方法によってキャラクタリゼーションすることができる。
磁気撹拌棒および還流コンデンサーを装備した２５０ｍｌの丸底フラスコに化合物８３（０．００８１モル）を添加する。次いで、窒素下で撹拌しつつメタノール（１５０ｍｌ）をこのフラスコに添加し、撹拌を継続しつつ、アルドリッチ・ケミカル・カンパニーから入手できるジエチレントリアミン（０．２８３モル）を添加する。得られた溶液を窒素下で一晩加熱還流する。次いで、この溶液を室温まで冷却し、蒸留水に注ぐ。次いで、この混合物を水のみが残存するまで真空中で濃縮する。さらに５０〜７５ｍｌの水を添加し、反応混合物を０℃まで冷却する。固体を濾過し、氷冷水で洗浄する。次いで、この物質をＥｔＯＨに再溶解し、１０Ｎ  ＨＣｌで沈殿させる。懸濁液を濾過した後、得られた固体を、熱エタノールから０℃まで１５分間で冷却して再結晶する。放置により第２濾液から、また第１の濾液からＥｔＯＨで沈殿させることによって、第２の結晶を収集する。次いで、これらの固体を合し、生成物８４が得られ、これを一晩の高真空に付す。当業者によく知られた正確な原子質量式から遊離塩基アミンの分子質量を計算し、得られた質量を、当業者によく知られた高分解能質量分析分子量決定法によって得られたそれと比較することによって、キャラクタリゼーションを行うことができる。
最終生成物８５の合成および精製は以下のプロトコルによって達成できる。イミド（０．００３６モル）８４をメタノール７５．０ｍｌに溶解させ、４Ｎ  ＨＣｌ  ７５ｍｌを添加する。混合物を約２時間還流し、冷却する。エタノールをこの溶液に添加し、得られた沈殿を濾過し、最小量の冷エタノールで洗浄する。濾液を再度濃縮し、新鮮なエタノールおよび濃塩酸を添加する。また、得られた沈殿を濾過する。次に、この濾液を乾固近くまで濃縮し、Ｅｔ2Ｏを添加し、固体を濾別する。次いで、最後に残存する濾過不可能な残渣を濃塩酸に溶解し、ＥｔＯＨで沈殿させる。この物質を濾過し、エタノールで洗浄する。前記手順からのすべての固体物質を合し、一晩高真空に付して８５を得る。当業者によく知られた正確な原子質量式から遊離塩基アミンの分子質量を計算し、得られた質量を、当業者によく知られた高分解能質量分析分子量決定法によって得られたそれと比較することによって、キャラクタリゼーションを行うことができる。
化合物８３のアミン誘導体は以下のごとくに合成することができる。磁気撹拌棒および還流コンデンサーを装備した２５０ｍｌの丸底フラスコに化合物８３（０．００８１モル）を添加する。次いで、窒素下で撹拌しつつメタノール（１５０ｍｌ）をこのフラスコに添加し、撹拌を継続しつつ、アルドリッチ・ケミカル・カンパニーから入手できる以下のリストから選択される適当なアミン（０．２８３モル）を添加する。得られた溶液を窒素下で一晩加熱還流する。次いで、この溶液を室温まで冷却し、蒸留水に注ぐ。次いで、この混合物を水のみが残存するまで真空中で濃縮する。さらに５０〜７５ｍｌの水を添加し、反応混合物を０℃まで冷却する。固体を濾過し、氷冷水で洗浄する。次いで、この物質をＥｔＯＨに再溶解し、１０Ｎ  ＨＣｌで沈殿させる。懸濁液を濾過した後、得られた固体を、熱エタノールから０℃まで１５分間で冷却して再結晶する。放置によって第２濾液から、また第１の濾液からＥｔＯＨで沈殿させることによって、第２の結晶を収集する。次いで、これらの固体を合し、最終生成物８３ａ−８３ｏが得られ、これを一晩の高真空に付す。当業者によく知られた正確な原子質量式から遊離塩基アミンの分子質量を計算し、得られた質量を、当業者によく知られた高分解能質量分析分子量決定法によって得られたそれと比較することによって、キャラクタリゼーションを行うことができる。
その対応するアミンから得られる生成物を以下にリストする。
８３ａを得るための４−アミノ−１−ベンジルピペリジン
８３ｂを得るためのスペルミン
８３ｃを得るためのピリジン
８３ｄを得るための２−（２−アミノエチル）−１−メチルピロリジン
８３ｅを得るための１−（２−アミノエチル）ピロリジン
８３ｆを得るための１−（２−アミノエチル）ピペリジン
８３ｇを得るための２−（２−アミノエチル）ピリジン
８３ｈを得るための１−（２−アミノエチル）ピペラジン
８３ｉを得るための４−（２−アミノエチル）モルホリン
８３ｊを得るための１−アミノ−４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン
８３ｋを得るための４−（アミノメチル）ピペリジン
８３ｌを得るための２−（アミノメチル）ピリジン
８３ｍを得るためのアニリン
８３ｎを得るための１−（３−アミノプロピル）イミダゾール
８３ｏを得るための４−（３−アミノプロピル）モルホリン
最終生成物８３ａａ−８３ｏｏの合成および精製は、以下に示す対応する最終生成物を得るための以下のプロトコルによって達成できる。イミド（０．００３６モル）８３ａ−８３ｏをメタノール７５．０ｍｌに溶解させ、４Ｎ  ＨＣｌ  ７５ｍｌを添加する。混合物を約２時間還流し、冷却する。エタノールをこの溶液に添加し、得られた沈殿を濾過し、最小量の冷エタノールで洗浄する。濾液を再度濃縮し、新鮮なエタノールおよび濃塩酸を添加する。また、得られた沈殿を濾過する。次に、この濾液を乾固近くまで濃縮し、Ｅｔ2Ｏを添加し、固体を濾別する。次いで、最後に残存する濾過不可能な残渣を濃塩酸に溶解し、ＥｔＯＨで沈殿させる。この物質を濾過し、エタノールで洗浄する。前記手順からのすべての固体物質を合し、一晩高真空に付して８３ａａ−８３ｏｏを得る。当業者によく知られた正確な原子質量式から遊離塩基アミンの分子質量を計算し、得られた質量を、当業者によく知られた高分解能質量分析分子量決定法によって得られたそれと比較することによって、キャラクタリゼーションを行うことができる。
その対応する中間体出発物質から得られる生成物を以下にリストする。
８３ａａを得るための８３ａ
８３ｂｂを得るための８３ｂ
８３ｃｃを得るための８３ｃ
８３ｄｄを得るための８３ｄ
８３ｅｅを得るための８３ｅ
８３ｆｆを得るための８３ｆ
８３ｇｇを得るための８３ｇ
８３ｈｈを得るための８３ｈ
８３ｉｉを得るための８３ｉ
８３ｊｊを得るための８３ｊ
８３ｋｋを得るための８３ｋ
８３ｌｌを得るための８３ｌ
８３ｍｍを得るための８３ｍ
８３ｎｎを得るための８３ｎ
８３ｏｏを得るための８３ｏ
化合物８３ａ−８３ｏおよび８３ａａ−８３ｏｏの構造は前記した一般的方法から明確であるので、その構造は示さない。
実施例２２
化合物９０およびその関連化合物の合成
化合物９０およびその前駆体の一般的合成の反応スキームは反応スキームは図３０に示す。
出発物質８６（０．０８７６モル）はアルドリッチ・ケミカル・カンパニー（Aldrich Chemical Company(Milwaukee、WI)）から入手し、アルゴン下、磁気撹拌棒および還流コンデンサーを装備した３．０リットルの一首丸底フラスコに添加する。次いで、無水酢酸（４６２ｇ、４．９モル）を添加し、得られた反応混合物を８〜１２時間還流する。次いで、反応混合物を冷却し、溶媒を真空中で除去する。生成物８７の精製には、当業者によく知られた方法を用いて決定した適当な溶媒系を用い、シリカゲルカラムの勾配溶離を行う。１０．０ｍｌずつの画分を収集し、適当な画分を再び合し、真空中で溶媒を除去する。次いで、残渣を熱ＥｔＯＨ（２２０ｍｌ）に溶解し、０℃に冷却することによって沈殿させる。母液をデカンテーションし、２００ｍｌの新鮮なＥｔＯＨを添加する。加熱することによって固体を再溶解し、−４℃で４８時間結晶化させる。結晶を母液及び２回目の再結晶の両方から収集し、これらの結晶を少量の冷ＥｔＯＨで洗浄し、高真空下で数時間乾燥する。得られた化合物８７は当業者によく知られているように高分解能質量分析によってキャラクタリゼーションする。
化合物８８は、３，８ジアミノ−６−フェニルフェナントリジンのジアミドの第四級化についての文献の方法（Gaugain et al., Biochemistry, Vol.17, No.24, 1978, pp5071-5078）の変法により、ジアミド８７から合成する。ジアミド８７（０．０２３モル）を、アルゴン下、磁気撹拌棒および還流コンデンサーを装備した２．０リットルの丸底フラスコに入れる。１，３ジブロモプロパン（１．０リットル、９．８６モル）をこのフラスコに添加し、得られた混合物を７時間還流する。溶液を一晩冷却し、沈殿を濾過し、Ｅｔ2Ｏで洗浄する。この物質をＣＨ3ＯＨから再結晶してジアセチルブロマイド８８が得られ、これは、質量分析および当業者に公知の他の方法によってキャラクタリゼーションすることができる。
磁気撹拌棒および還流コンデンサーを装備した２５０ｍｌの丸底フラスコに化合物８８（０．００８１モル）を添加する。次いで、窒素下で撹拌しつつメタノール（１５０ｍｌ）をこのフラスコに添加し、撹拌を継続しつつ、アルドリッチ・ケミカル・カンパニーから入手できるジエチレントリアミン（０．２８３モル）を添加する。得られた溶液を窒素下で一晩加熱還流する。次いで、この溶液を室温まで冷却し、蒸留水に注ぐ。次いで、この混合物を水のみが残存するまで真空中で濃縮する。さらに５０〜７５ｍｌの水を添加し、反応混合物を０℃まで冷却する。固体を濾過し、氷冷水で洗浄する。次いで、この物質をＥｔＯＨに再溶解し、１０Ｎ  ＨＣｌで沈殿させる。懸濁液を濾過した後、得られた固体を、熱エタノールから０℃まで１５分間で冷却して再結晶する。第２濾液の放置により、また第１の濾液からＥｔＯＨで沈殿させることによって、第２の結晶を収集する。次いで、これらの固体を合し、生成物８９が得られ、これを一晩の高真空に付す。当業者によく知られた正確な原子質量式から遊離塩基アミンの分子質量を計算し、得られた質量を、当業者によく知られた高分解能質量分析分子量決定法によって得られたそれと比較することによって、キャラクタリゼーションを行うことができる。
最終生成物９０の合成および精製は以下のプロトコルによって達成できる。ジアミド（０．００３６モル）８９をメタノール７５．０ｍｌに溶解させ、４Ｎ  ＨＣｌ  ７５ｍｌを添加する。混合物を約２時間還流し、冷却する。エタノールをこの溶液に添加し、得られた沈殿を濾過し、最小量の冷エタノールで洗浄する。濾液を再度濃縮し、新鮮なエタノールおよび濃塩酸を添加する。また、得られた沈殿を濾過する。次に、この濾液を乾固近くまで濃縮し、Ｅｔ2Ｏを添加し、固体を濾別する。次いで、最後に残存する濾過不可能な残渣を濃塩酸に溶解し、ＥｔＯＨで沈殿させる。この物質を濾過し、エタノールで洗浄する。前記手順からのすべての固体物質を合し、一晩高真空に付して化合物９０を得る。当業者によく知られた正確な原子質量式から遊離塩基アミンの分子質量を計算し、得られた質量を、当業者によく知られた高分解能質量分析分子量決定法によって得られたそれと比較することによって、キャラクタリゼーションを行うことができる。
化合物８８のアミン誘導体は以下のごとくに合成することができる。磁気撹拌棒および還流コンデンサーを装備した２５０ｍｌの丸底フラスコに化合物８８（０．００８１モル）を添加する。次いで、窒素下で撹拌しつつメタノール（１５０ｍｌ）をこのフラスコに添加し、撹拌を継続しつつ、アルドリッチ・ケミカル・カンパニーから入手できる以下のリストから選択される適当なアミン（０．２８３モル）を添加する。得られた溶液を窒素下で一晩加熱還流する。次いで、この溶液を室温まで冷却し、蒸留水に注ぐ。次いで、この混合物を水のみが残存するまで真空中で濃縮する。さらに５０〜７５ｍｌの水を添加し、反応混合物を０℃まで冷却する。固体を濾過し、氷冷水で洗浄する。次いで、この物質をＥｔＯＨに再溶解し、１０Ｎ  ＨＣｌで沈殿させる。懸濁液を濾過した後、得られた固体を、熱エタノールから０℃まで１５分間で冷却して再結晶する。また、第２濾液から放置によって、また第１の濾液からＥｔＯＨで沈殿させることによって、第２の結晶を収集する。次いで、これらの固体を合し、最終生成物４８ａ−４８ｏが得られ、これを一晩の高真空に付す。当業者によく知られた正確な原子質量式から遊離塩基アミンの分子質量を計算し、得られた質量を、当業者によく知られた高分解能質量分析分子量決定法によって得られたそれと比較することによって、キャラクタリゼーションを行うことができる。
フェナントリジニウム誘導体２８ａ−４２ａおよび２８ｂ−４２ｂの合成についての一般的方法を、ブロマイド化合物８８、８３、７８、６３または４９の合成についての前記方法と組み合わせることによって、化合物４９および６３の誘導体については、加水分解工程が必要でなく、従って、加水分解工程が除かれること以外は、既に述べたプロマイドのアミンでのアルキル化についての一般的方法を用いて、アミンテール−インターカレーター分子セグメントのいずれの組合せも合成することができる。化合物７８の誘導体の場合において、加水分解工程は必要ではないが、Dervan et al.,J. Am. Chem. Soc., 100(6), 1978, pp.1968-1970の方法に従った還元工程が必要である。
実施例２３
化合物の「マトリックス」を形成するための一般的方法
最終生成物８８ａａ−８８ｏｏの合成および精製は、以下に示す対応する最終生成物を得るための以下のプロトコルによって達成できる。イミド（０．００３６モル）８８ａ−８８ｏをメタノール７５．０ｍｌに溶解し、４Ｎ  ＨＣｌ  ７５ｍｌを添加する。混合物を約２時間還流し、冷却する。エタノールをこの溶液に添加し、得られた沈殿を濾過し、最小量の冷エタノールで洗浄する。濾液を再度濃縮し、新鮮なエタノールおよび濃塩酸を添加する。また、得られた沈殿を濾過する。次に、この濾液を乾固近くまで濃縮し、Ｅｔ2Ｏを添加し、固体を濾別する。次いで、最後に残存する濾過不可能な残渣を濃塩酸に溶解し、ＥｔＯＨで沈殿させる。この物質を濾過し、エタノールで洗浄する。前記手順からのすべての固体物質を合し、一晩高真空に付して８８ａａ−８８ｏｏを得る。当業者によく知られた正確な原子質量式から遊離塩基アミンの分子質量を計算し、得られた質量を、当業者によく知られた高分解能質量分析分子量決定法によって得られたそれと比較することによって、キャラクタリゼーションを行うことができる。
その対応する中間体前駆体から得ることができる生成物を以下にリストする。
８８ａａを得るための８８ａ
８８ｂｂを得るための８８ｂ
８８ｃｃを得るための８８ｃ
８８ｄｄを得るための８８ｄ
８８ｅｅを得るための８８ｅ
８８ｆｆを得るための８８ｆ
８８ｇｇを得るための８８ｇ
８８ｈｈを得るための８８ｈ
８８ｉｉを得るための８８ｉ
８８ｊｊを得るための８８ｊ
８８ｋｋを得るための８８ｋ
８８ｌｌを得るための８８ｌ
８８ｍｍを得るための８８ｍ
８８ｎｎを得るための８８ｎ
８８ｏｏを得るための８８ｏ
化合物８８ａ−８８ｏおよび８８ａａ−８８ｏｏの構造は一般的方法から明確であるので、その構造は示さない。
実施例２４
化合物２４−２７を用いるハイブリダイゼーションアッセイ
４つの別々の実験において、ＰＴＡ２４、化合物２５、化合物２６および化合物２７を用いて、標的オリゴヌクレオチドをその相補的パートナーで滴定する場合のハイブリダイゼーションを定量した。また、３つの同時でしかし独立した実験を行うことによって、エチジウムブロマイド染色、プロピジウムイオダイド染色およびエチジウムホモダイマー染色対ＰＴＡ２４の比較を行った。結果は図３１に見い出すことができる。以下のプロトコルに従う、エチジウムブロマイド染色、化合物２４（ＰＴＡ）染色、化合物２５染色、化合物２６染色および化合物２７染色の比較結果は図３２に見い出される。ＤＮＡオリゴデオキシチミジル酸の相補鎖、ｄ（ｐＴ）9、およびオリゴデオキシアデニル酸の相補鎖、（ｄ（ｐＡ）9）は、St. Louis, MOのSigma Chemical Co.から得た。ｄ（ｐＡ）9のストック溶液は、０．００４Ｍトリス、０．００１Ｍ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．２緩衝液から５．０ユニット／０．５ｍｌにて作成した。ポリＡについては、ε＝８．４ＡＵ／ｍＭｃｍまたは８４００Ｍ-1ｃｍ-1；従って、ｄ（ｐＡ）9についての９塩基対では、該εは７５６００Ｍ-1ｃｍ-1である。次いで、このストックを１００倍希釈して、６．６１×１０-7Ｍまたは０．６６μＭのストックを得た。ｄ（ｐＴ）９ストックは２５ユニット／５．０ｍｌで作成し、同緩衝液での１０倍希釈の後に滴定に使用した。ポリＴについてのεは塩基対当たり８．１５ＡＵ／ｍＭｃｍまたは８１５０Ｍ-1ｃｍ-1、あるいはオリゴ当たり７３３５０Ｍ-1ｃｍ-1であるので、オリゴストックの濃度はＤＮＡ分子において６．８μＭであった。ポリスチレンの使捨可能な４．０ｍｌキュベットを用い、日立Ｆ−４０１０蛍光分光光度計を用いて滴定を行って、十分に補正されたスペクトルならびに４８８−５５０ｎｍ（この実験では４８８ｎｍを使用）の励起波長および６００−６５０ｎｍ（この実験では６２５ｎｍを使用）の発光波長が得られた。以下の増分にて、ｄ（ｐＴ）9の当量を添加した：０．０２０、０．０８０、０．１５０、０．３００、０．５００、０．７００、１．０００、２．０００、５．０００当量。滴定曲線における各試料は、１０×１．０ｍｌ増分にて最初のｄ（ｐＡ）9ストックを分けることによって個々に調製した。次いで、相補物の添加は、マイクロピペットで、ｄ（ｐＴ）9。ストックの適量（各々、２、５、８、１５、３０、５０、７０、１００、２００および５００μｌ）を、１０アリコートのシリーズの各々に加えることによって行った。暫時大きくなるモル比の２つの相補鎖を含有する各アリコートを室温で１時間４５分インキュベートし、対応する染料を、０．００４Ｍトリス、０．００１Ｍ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．２緩衝液中の対応する染料の１５μＭ溶液の１００．０μｌアリコートとして添加した。これは、相補オリゴでの飽和状態における１／４の染料／ＤＮＡｂ．ｐ．比に対応する。染料およびオリゴの総濃度は、同一ストック溶液からの種々の増分の添加の使用のため、飽和状態プロットにおいて変化する。対応する適当な染料の添加後にさらに４５分間インキュベートした後、６２５ｎｍで相対的蛍光強度を読み取り、記録して標準曲線が得られ、これは同一条件下でのｄｓＤＮＡハイブリダイゼーションまたは標的配列の量に直接���例している。次いで、バックグラウンドまたは最初の残存する蛍光を、同一グラフの種々の滴定曲線の比較のためにすべての曲線につき一定値として差し引く。
本発明のインターカレーター化合物２４、２５、２６または２７の高結合親和性は、エチジウムブロマイドのごとき通常のインターカレーターに比して特に有用である（図３２）。図３２（実施例２４）において、インターカレーター化合物２４、２５、２６および２７の存在下におけるｄｓ−ＤＮＡ濃度に対する感度または応答をエチジウムブロマイドと比較して示す。オリゴヌクレオチドの濃度が１０-6Ｍ未満である場合、かかる高親和性インターカレーターの利点は特に明らかである。
エチジウムホモダイマーのごときホモ二官能性インターカレーターに対するＰＴＡ２４の比較（図３２）において、再度、明瞭な利点は感度であることが観察されている。この場合、感度の上昇はＰＴＡ２４における自己クエンチングの減少ならびにＤＮＡに対するその高親和性に関係し得る。
図８および図９において、ｄｓ−ＤＮＡの濃度はより高く、エチジウムブロマイドおよびＰＴＡ２４（図９）とエチジウムホモダイマーおよびＰＴＡ２４（図８）との間の差異は、用いたＤＮＡの高濃度のため有意ではなかった。
まとめると、本発明は、当該分野で現在利用可能なまたは知られている通常の染色方法よりも低い濃度でｄｓ−ＤＮＡハイブリダイゼーションの検出を可能とする明瞭な利点を提供する。
実施例２５
インターカレーター化合物１、２、３、２４、２５、２６、２７、２８ｂ、２９ｂ、３０ｂ、３１ｂ、３２ｂ、３３ｂ、３４ｂ、３５ｂ、３６ｂ、３７ｂ、３８、３９ｂ、４０ｂ、４１ｂ、４２ｂまたは８０を用いるハイブリダイゼーションアッセイ
ＤＮＡインターカレーター１、２、３、２４、２５、２６、２７、２８ｂ、２９ｂ、３０ｂ、３１ｂ、３２ｂ、３３ｂ、３４ｂ、３５ｂ、３６ｂ、３７ｂ、３８、３９ｂ、４０ｂ、４１ｂ、４２ｂまたは８０を用いて、標的オリゴヌクレオチドをその相補的パートナーで滴定する場合のハイブリダイゼーションを定量することができる。また、ＤＮＡオリゴデオキシチミジル酸の相補鎖、ｄ（ｐＴ）9、およびオリゴデオキシアデニル酸の相補鎖、（ｄ（ｐＡ）9）は、St. Louis, MOのSigma Chemical Co.から得ることができる。ｄ（ｐＡ）9のストック溶液は、０．０５Ｍトリス、０．２Ｎ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．４または他の適当な緩衝液で５ユニット／ｍｌにて作成する。ポリＡについては、ε＝８．４ＡＵ／ｍＭｃｍまたは８４００Ｍ-1ｃｍ-1；従って、ｄ（ｐＡ）9についての９塩基対では、該εは７５６００Ｍ-1ｃｍ-1である。次いで、このストックを希釈して、０．０６６−６６μＭのストックを得る。ｄ（ｐＴ）9ストックは２５ユニット／５．０ｍｌで作成し、同緩衝液でさらに希釈することなく滴定に使用する。ポリＴについてのεは塩基対当たり８．１５ＡＵ／ｍＭｃｍまたは８１５０Ｍ-1ｃｍ-1、あるいはオリゴ当たり７３３５０Ｍ-1ｃｍ-1であるので、オリゴストックの濃度はＤＮＡ分子において０．００６８−６６０μＭである。４８８−５５０ｎｍ（５３４あたりが最適）の励起波長および６００−６５０ｎｍ（６２５あたりが最適）の発光波長を用い、蛍光分光光度計を用いて滴定を行うことができる。以下の増分にて、ｄ（ｐＴ）9の当量を添加する：０．０２、０．０５、０．０８０、０．１５０、０．３００、０．５００、０．７００、１．００、２．００、５．００当量。滴定曲線における各試料は、最初のｄ（ｐＡ）9ストックを１０×１．０ｍｌアリコートに分けることによって個々に調製される。次いで、相補物の添加は、ｄ（ｐＴ）９ストークがｄ（ｐＡ）９ストックの１０倍希釈濃度である場合、マイクロピペットで、ｄ（ｐＴ）9ストックの適量（各々、２、５、８、１５、３０、５０、７０、１００、２００および５００μｌ）を、１０アリコートのシリーズの各々に加えることによって行う。暫時大きくなるモル比の２の相補鎖を含有する各アリコットを室温で０．２５−２．５時間インキュベートし、０．０５Ｍトリス、０．２Ｎ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．４緩衝液または他の適当な緩衝液中の染料の１−１０００μＭ溶液の１−５００μｌアリコートとして染料を添加する。これは、相補オリゴでの飽和状態における１／１−１／１０００の染料／ＤＮＡｂ．ｐ．比に対応する。染料およびオリゴの総濃度は、同一ストック溶液からの種々の増分の添加の使用のため、飽和プロットにおいて変化する。さらに１５分間インキュベートした後、５８０−６８０ｎｍの間で相対的蛍光強度を読み取り、記録して標準曲線が得られ、これは同一条件下でｄｓＤＮＡハイブリダイゼーションまたは標的配列の量に直接比例している。
実施例２６
インターカレーター化合物１、２、３、２４、２５、２６、２７、２８ｂ、２９ｂ、３０ｂ、３１ｂ、３２ｂ、３３ｂ、３４ｂ、３５ｂ、３６ｂ、３７ｂ、３８、３９ｂ、４０ｂ、４１ｂ、４２ｂまたは８０を用いるｄ（ｐＴ）９およびｄ（ｄＡ）９以外の相補的結合対のハイブリダイゼーションの測定
実施例２５に前記した方法を用いることにより、当業者に予測される相補性領域の程度に応じて当業者が決定する適当な濃度にて、ｄ（ｐＴ）９を適当な相補的ＤＮＡで置き換え、ｄ（ｄＡ）９を適当な標的ＤＮＡで置き換えることによって、インターカレーター化合物１、２、３、２４、２５、２６、２７、２８ｂ、２９ｂ、３０ｂ、３１ｂ、３２ｂ、３３ｂ、３４ｂ、３５ｂ、３６ｂ、３７ｂ、３８、３９ｂ、４０ｂ、４１ｂ、４２ｂまたは８０を用いて、いずれの他の相補性ＤＮＡ鎖のハイブリダイゼーションの量も測定することができる。各場合において、４５０−５５０ｎｍ（５３４ｎｍにおいて最適）の励起波長を用いることができ、次いで、５８０−６８０ｎｍの間で相対的蛍光強度を読み取り、記録して標準曲線が得られ、これは同一条件下でのｄｓＤＮＡハイブリダイゼーションまたは標的配列の量に直接比例している。
実施例２７
インターカレーター化合物７、８、５０、５４ａ、５４ｂ、５４ｃ、５４ｄ、５４ｅ、５４ｆ、５４ｇ、５４ｈ、５４ｉ、５４ｊ、５４ｋ、５４ｌ、５４ｍ、５４ｎ、５４ｏ、５４ｐ、５８ａ、５８ｂ、５８ｃ、５８ｄ、５８ｅ、５８ｆ、５８ｇ、５８ｈ、５８ｉ、５８ｊ、５８ｋ、５８ｌ、５８ｍ、５８ｎ、５８ｏ、５８ｐ、６４、６８ａ、６８ｂ、６８ｃ、６８ｄ、６８ｅ、６８ｆ、６８ｇ、６８ｈ、６８ｉ、６８ｊ、６８ｋ、６８ｌ、６８ｍ、６８ｎ、６８ｏ、６８ｐ、７１ａ、７１ｂ、７１ｃ、７１ｄ、７１ｅ、７１ｆ、７１ｇ、７１ｈ、７１ｉ、７１ｊ、７１ｋ、７１ｌ、７１ｍ、７１ｎ、７１ｏ、または７１ｐを用いるハイブリダイゼーションアッセイ
実施例２６の前記手法を用いることにより、励起および発光の波長をアッセイを行う前に当業者によって決定されたごとくに最適化した以外は実施例２６に記載したごとくに、インターカレーター化合物７、８、５０、５４ａ、５４ｂ、５４ｃ、５４ｄ、５４ｅ、５４ｆ、５４ｇ、５４ｈ、５４ｉ、５４ｊ、５４ｋ、５４ｌ、５４ｍ、５４ｎ、５４ｏ、５４ｐ、５８ａ、５８ｂ、５８ｃ、５８ｄ、５８ｅ、５８ｆ、５８ｇ、５８ｈ、５８ｉ、５８ｊ、５８ｋ、５８ｌ、５８ｍ、５８ｎ、５８ｏ、５８ｐ、６４、６８ａ、６８ｂ、６８ｃ、６８ｄ、６８ｅ、６８ｆ、６８ｇ、６８ｈ、６８ｉ、６８ｊ、６８ｋ、６８ｌ、６８ｍ、６８ｎ、６８ｏ、６８ｐ、７１ａ、７１ｂ、７１ｃ、７１ｄ、７１ｅ、７１ｆ、７１ｇ、７１ｈ、７１ｉ、７１ｊ、７１ｋ、７１ｌ、７１ｍ、７１ｎ、７１ｏ、または７１ｐを用いて、いずれの２の相補鎖のハイブリダイゼーションも測定することができる。各場合において、次いで、相対的蛍光強度を読み取り、記録して標準曲線が得られ、これは同一条件下でｄｓＤＮＡハイブリダイゼーションまたは標的配列の量に直接比例している。
実施例２８
インターカレーター化合物７、８、５０、５４ａ、５４ｂ、５４ｃ、５４ｄ、５４ｅ、５４ｆ、５４ｇ、５４ｈ、５４ｉ、５４ｊ、５４ｋ、５４ｌ、５４ｍ、５４ｎ、５４ｏ、５４ｐ、５８ａ、５８ｂ、５８ｃ、５８ｄ、５８ｅ、５８ｆ、５８ｇ、５８ｈ、５８ｉ、５８ｊ、５８ｋ、５８ｌ、５８ｍ、５８ｎ、５８ｏ、５８ｐ、６４、６８ａ、６８ｂ、６８ｃ、６８ｄ、６８ｅ、６８ｆ、６８ｇ、６８ｈ、６８ｉ、６８ｊ、６８ｋ、６８ｌ、６８ｍ、６８ｎ、６８ｏ、６８ｐ、７１ａ、７１ｂ、７１ｃ、７１ｄ、７１ｅ、７１ｆ、７１ｇ、７１ｈ、７１ｉ、７１ｊ、７１ｋ、７１ｌ、７１ｍ、７１ｎ、７１ｏ、または７１ｐを用いるｄ（ｐＴ）９およびｄ（ｐＡ）９についてのハイブリダイゼーションアッセイ
当業者によって決定された各化合物についての最適波長に波長を置き換える以外は実施例２５に記載した方法を用いることによって、相補的オリゴヌクレオチドｄ（ｐＡ）９およびｄ（ｐＡ）９ハイブリダイゼーションを測定することができる。
実施例２９
インターカレーター化合物１、２、３、２５、２６、２８ｂ、２９ｂ、３０ｂ、３１ｂ、３２ｂ、３３ｂ、３４ｂ、３５ｂ、３６ｂ、３７ｂ、３８ｂ、３９ｂ、４０ｂ、４１ｂ、４２ｂ、または８０を用いるゲル電気泳動への適用
アガロースゲルで泳動させて、化合物１、２、３、２５、２６、２７、２８ｂ、２９ｂ、３０ｂ、３１ｂ、３２ｂ、３３ｂ、３４ｂ、２７、３５ｂ、３６ｂ、３７ｂ、３８ｂ、３９ｂ、４０ｂ、４１ｂ、４２ｂ、または８０を用いてＤＮＡを検出することができる。７ｍｌストック中２．１ｍｇのプラスミドｐＢＲ３２２を、２ｍｌの１０×React2緩衝液と１ｍｌのＢＡＭＨ制限酵素と共に３７℃で１時間インキュベートし、水１０ｍｌで合計２０ｍｌまで希釈する。別法として、いずれかの他の適当なＤＮＡ試料で前記した「ニック処理した」プラスミドが置き換えられる。次いで、この混合物を用いて、各バイアルにつき６ｍｌ当たり０．６３ｍｇにて、ニック処理したｐＢＲ３２２プラスミドの３ストックを調製する。これらのストックの各々をさらに水および２０％グリセロールで希釈して、合計１２ストックの各々においてＤＮＡ塩基対に対する染料の比１：４にて２０ｎｇ／ｍｌ、８００ｐｇ／ｍｌ、１６０ｐｇ／ｍｌおよび４０ｐｇ／ｍｌの最終ＤＮＡストックとする。各ストックの５μｌアリコートをアゲロースゲルの１２の別々のレーンに負荷し、０．０１ｍＭ  ＥＤＴＡ緩衝液を含む４ｍＭトリス、ｐＨ８．２にて、電気泳動を３０分間行う。次いで、ゲルを取り出し、通常のゲルボックス中にて、紫外光へ暴露して写真を取る。別法として、蛍光検出または可視化方法として蛍光共焦点顕微鏡またはチャージカップルド(charge coupled)装置イメージングを用いてゲルを走査する。
実施例３０
インターカレーター化合物２５、２６、２７、２９ｂ、３５ｂ、３８ｂ、５０、５４ａ、５４ｃ、５８ａ、５８ｃ、６４、６８ａ、６８ｃ、７１ａ、７１ｃ、８０、８５または９０を用いるインターカレーター活性化カルボキシメチルスチレン微粒子捕獲試薬の合成についてのプロトコル
インターカレーター誘導体化固相微粒子（ＭＰ）捕獲試薬の合成は、以下の方法によって行うことができる：
０．２７５±μｍ微粒子（Seradyne, Indianapolis, IN）の４５アリコットを４ｍｌバイアルに入れ、Bio-Rex 501-Dイオン交換混合ベッド樹脂（Bio-Rad, Richmond, CA）を用いて、界面活性剤を交換する。２時間穏かに振盪した後、減圧収集チャンバーを装備した粗フリットガラス漏斗を用いることによって樹脂を混合物から濾過して取り出す。試料を１０重量％固形物のＭＰ濃度まで希釈する。反応性カルボン酸の合計当量を販売業者の滴定仕様から計算する。スルホＮ−ヒドロキシスクシンイミド（Pierce, Rockford, IL）のストック溶液は水中１１ｍｇ／ｍｌ（２０ｍＭ）にて作成し、ＥＤＡＣ（Sigma Chemical Co., St.Louis, MO）のストック溶液は水中１０ｍｇ／ｍｌ（５ｍＭ）にて作成する。５当量のＥＤＡＣ（２９０μｌストック）、続いて５．０当量のスルホＮ−ヒドロキシスクシンイミド（３３０μｌ）をカルボキシ微粒子反応混合物に添加する。この混合物を室温で２時間インキュベートし、次いで、インターカレーター化合物２５、２６、２７、２９ｂ、３５ｂ、３８ｂ、５０、５４ａ、５４ｃ、５８ａ、５８ｃ、６４、６８ａ、６８ｃ、７１ａ、７１ｃ、８０、８５または９０（４ｍｇ）の２モル当量を、ｐＨ８．０  ０．１Ｎ  ＮａＣｌ  ０．１Ｎ  Ｐｉリン酸緩衝液中８ｍｇ／４００μｌ、または２．０ｍｇ／１００μｌの濃度にて添加する。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（Pierce）は、もしそれをＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）のストックにまず溶解するのであれば、スルホＮ−ヒドロキシスクシンイミドの代わりに置き換えることができ、前記したごとくにアリコットできる。２４時間で反応を完結させた後、次いで、溶液が清澄化し、もはや染料が試料から抽出されなくなるまで、遠心、母液の除去、および再懸濁の何回かの試行によって遊離染料を除去する。次いで、精製した捕獲試薬を水中固体２〜４％のストックまで希釈する。
実施例３１
化合物２５、２６、２７、２９ｂ、３５ｂ、３８ｂ、５０、５４ａ、５４ｃ、５８ａ、５８ｃ、６４、６８ａ、６８ｃ、７１ａ、７１ｃ、８０、８５または９０に由来する固相を用いる固相ＤＮＡ捕獲
実施例３０に記載した各インターカレーター２５、２６、２７、２９ｂ、３５ｂ、３８ｂ、５０、５４ａ、５４ｃ、５８ａ、５８ｃ、６４、６８ａ、６８ｃ、７１ａ、７１ｃ、８０、８５または９０から合成した適当な固相で置き換える以外は実施例５に記載した誘導体化方法を用いて、ＤＮＡの固相への捕獲を行うことができる。
また、カルボキシル化ポリスチレン微粒子またはカルボキシル化磁性微粒子のごとき他の適当な固相をＣＭセファロースの代わりに用いることもできる。
実施例３２
化合物２５、２６、２７、２９ｂ、３５ｂ、３８ｂ、５０、５４ａ、５４ｃ、５８ａ、５８ｃ、６４、６８ａ、６８ｃ、７１ａ、７１ｃ、８０、８５または９０によって修飾したインターカレーター修飾固相によるＤＮＡ捕獲のプロトコル
ＰＴＡ２４誘導体化インターカレーターよりもむしろインターカレーター化合物２５、２６、２７、２９ｂ、３５ｂ、３８ｂ、５０、５４ａ、５４ｃ、５８ａ、５８ｃ、６４、６８ａ、６８ｃ、７１ａ、７１ｃ、８０、８５または９０に由来する対応する固相を用いる以外は実施例６に記載したごとくに固相よりＤＮＡを放出させることができる。
実施例３３
ニワトリ赤血球核（ＣＥＮ）のフローサイトメトリー実験における蛍光染色
プロトコル：化合物１、２、３、２５、２６、２７、２８ｂ、２９ｂ、３０ｂ、３１ｂ、３２ｂ、３３ｂ、３４ｂ、３５ｂ、３６ｂ、３７ｂ、３８、３９ｂ、４０ｂ、４１ｂ、４２ｂまたは８０を１μｇ／ｍｌの濃度で含むもの及びこれらを含まないものであって４０℃で予備加温したＷＢＣ  ＤＩＬ１．０ｍｌに、２のイン−ハウスドナーからの全血試料５０μｌおよびＣＥＮ懸濁液３μｌを添加し、混合し、ＦＡＣＳｃａｎTMに導入し、２０”の読みを得る。ニワトリ赤血球核（ＣＥＮ）を用いて、ＦＬ３染色の明るさ（ＣＥＮの平均ＦＬ３）を測定する。用いた全血試料は約４〜５時間経過のものである。
実施例３４
化合物１、２、３、２５、２６、２７、２８ｂ、２９ｂ、３０ｂ、３１ｂ、３２ｂ、３３ｂ、３４ｂ、３５ｂ、３６ｂ、３７ｂ、３８、３９ｂ、４０ｂ、４１ｂ、４２ｂまたは８０を用いるCoulter Eliteフローサイトメーターでの染料存在下での生存性
細胞単離プロトコル：フィコール単離した細胞の各試験管は以下のごとくに処理できる：０．１％アジ化ナトリウムおよび１．０％アルブミンを含むＰＢＳ（Sigma catalogue #1000-3）、比重１．１１９のフィコール（Sigma Histopague cataloge #1119-1）。
全血試料（ＥＤＴＡ抗凝固剤）１０ｍｌをＰＢＳＷ１０ｍｌで希釈する。４つの１５ｍｌ円錐底試験管に、５ｍｌの希釈血液を５ｍｌフィコールに載置する。該試験管を４００×Ｇで３０分間回転させる。リンパ球、単球、顆粒球および血小板を含有する界面層を吸引し、３００×Ｇで６分間試験管を遠心することによって５ｍｌＰＢＳで１回洗浄する。細胞ペレットをＰＢＳに再懸濁し、細胞を計数し、１ｍｌ当たり８×１０6細胞に調整する。
細胞染色プロトコル：
染料または化合物溶液：
０．１％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳに染料を溶解させることによって作成した化合物１、２、３、２５、２６、２７、２８ｂ、２９ｂ、３０ｂ、３１ｂ、３２ｂ、３３ｂ、３４ｂ、３５ｂ、３６ｂ、３７ｂ、３８、３９ｂ、４０ｂ、４１ｂ、４２ｂまたは８０−ストック溶液１０μｇ／ｍｌ
化合物１、２、３、２５、２６、２７、２８ｂ、２９ｂ、３０ｂ、３１ｂ、３２ｂ、３３ｂ、３４ｂ、３５ｂ、３６ｂ、３７ｂ、３８、３９ｂ、４０ｂ、４１ｂ、４２ｂまたは８０の染色：
１２×７５ｍｍ試験管中、２３．５μｌの細胞を該化合物ストック溶液７６μｌと穏やかに混合する。２０秒後、試験管をEliteフローサイトメーターにセットし、データを収集する。
フローサイトメータープロトコル：Eliteフローサイトメーター（Coulter Electronics, Inc.）で分析した細胞
試料は４８８ｎｍの出力１５ｍＷのアルゴンレーザーで励起することができる。データは、赤血球細胞、血小板および夾雑物を排除するために、サイズおよび粒度に基づいて選別した。対照として未染色細胞を用い、選別した分布の直線染料蛍光を分析する。パーセント陽性事象（死滅した細胞）および死滅細胞分析の平均蛍光を記録する。
実施例３５
二本鎖核酸をコンジュゲーション鋳型として用いるインターカレーター誘導体化抗体およびインターカレーター誘導体化アルカリ性ホスファターゼのコンジュゲート
オリゴヌクレオチドの相補鎖、センスおよびアンチセンス１４ないし２０量体は、完全に自動化されたＤＮＡ合成器で合成でき、Bioconjugate Chemistry, 4, pp.94-102（1993）に記載されているごとくに精製できる。酵素に仔ウシ腸アルカリ性ホスファターゼとＩｇＧの間のコンジュゲートの合成は以下のごとくに達成できる。
ａ）３０原子ヘテロ二官能性リンカーアーム、４−［（Ｎ−マレイミドメチル）トリカプロアミド］シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＴＣＣ）でのインターカレーターＰＴＡ２４の誘導体化
ＰＴＡ２４、０．１００ｇ（２．３×１０-4モル）を５０％水性ＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）５ｍｌに溶解する。Bieniarz et al.（米国特許第４９９４３８５号、第５００２８８３号、第５０５３５２０号および第５０６３１０９号）に記載されているごとくに合成した３０原子ヘテロ二官能性リンカー、４−［（Ｎ−マレイミドメチル）トリカプロアミド］シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＴＣＣ）、０．１５７ｇ（２．３×１０-4モル）をＤＭＦ  ３ｍｌに溶解し、１度に該溶液に添加し、室温で２４時間にわたり撹拌する。得られたマレイミド誘導体化ＰＴＡ２４を、溶離剤として１０％メタノール性アセトンを用いるシリカゲルカラムで精製する。
ｂ）仔ウシ腸アルカリ性ホスファターゼのイミノチオランでの誘導体化
ＰＢＳ緩衝液１ｍｌ中の仔ウシ腸アルカリ性ホスファターゼ、６ｍｇ（４×１０-9モル）を、室温における３０分間の、４５０倍モル過剰のイミノチオラン（ＰＢＳ緩衝液中１５ｍｇ／ｍｌ溶液１６４ｍｌ）での処理によってチオール化する。ＰＢＳ緩衝液で平衡化したSephadexＧ−２５カラム（１×４５ｃｍ）でのゲル濾過によって過剰の試薬を除去する。誘導体化酵素を含有する画分をプールし、該プール中の該酵素の濃度を２８０ｎｍにおける吸光度によって計算する。
ｃ）ｂ）からのチオール化仔ウシ腸アルカリ性ホスファターゼに対するＳＭＴＣＣ誘導体化ＰＴＡ２４のコンジュゲーション  パートｂ）からのチオール化仔ウシ腸アルカリ性ホスファターゼおよびパートａ）からのマレイミド誘導体化ＰＴＡ２４を１：１の比率で合し、５℃で１８時間インキュベートする。５ｍＭ  Ｎ−エチルマレイミドを０．３ｍＭの最終濃度まで添加することによって未反応チオール基をキャッピングし、続いて、室温で１時間インキュベートする。
ｄ）ＩｇＧのＦｃ領域の部位特異的官能性化を用いるチオレートでのＩｇＧの誘導体化
チオレートのＩｇＧのＦｃ領域への部位特異的導入は、Bieniarz et al.（米国特許第５１９１０６６号）に記載されているごとくに行う。この方法では、４および１０の間のチオレートをＩｇＧのＦｃ領域に導入する。
ｅ）パートａ）からのマレイミド誘導体化ＰＴＡ２４でのパートｄ）からのＦｃチオール化ＩｇＧの誘導体化
パートｄ）からのＦｃチオール化ＩｇＧおよびパートａ）からのマレイミド誘導体化ＰＴＡ２４を、ＳＭＴＣＣ誘導体化ＰＴＡ２４に対するチオール化ＩｇＧの１：５のモル比で合する。溶液を５℃で１８時間、リン酸緩衝液ｐＨ７．０中でインキュベートし、コンジュゲートをゲル濾過カラムセファデックスＧ−２５で精製する。蛋白質を含有する画分をプールし、Amicon濃縮器を用いて濃縮する。最終溶液の蛋白質含量は、Pierce Companyからのクーマシー染料結合アッセイを用いて確認する。
ｆ）オリゴの相補鎖よりなる二本鎖２０量体オリゴヌクレオチドを用いるパートｃ）からのＰＴＡ２４誘導体化仔ウシ腸アルカリ性ホスファターゼに対するパートｅ）からのＰＴＡ２４誘導体化ＩｇＧのコンジュゲーション
オリゴヌクレオチドの相補鎖を、Bioconjugate Chemistry, 4, pp.94-102, (1993)に記載されているごとくにハイブリダイズさせ調べる。パートｅ）からのＰＴＡ２４誘導体化ＩｇＧ、ＰＴＡ２４仔ウシ腸アルカリ性ホスファターゼおよびコンジュゲーション鋳型として用いる二本鎖オリゴヌクレオチド２０量体を、室温にて１：１：１のモル比にて、ｐＨ７．０で１８時間一晩インキュベートする。コンジュゲートをゲル濾過カラムＧ−２５を通して濾過する。蛍光原（fluorogenic）基質４−メチルウンベリフェリルホスフェートを用いて画分をアルカリ性ホスファターゼ活性についてアッセイし、フルオレセインで標識した抗イディオタイプＩｇＧを用いて抗体活性についてアッセイする。
また、ゲル濾過ＨＰＬＣカラムによってコンジュゲートを調べる。
実施例３６
二本鎖ＤＮＡへのインターカレーター誘導体化リポソームのコンジュゲーション
リポソームの調製はFiechtner et al.（米国特許第４，９１２，２０８号）に記載されているごとくに行う。これらのリポソームはジホスファチジルエタノールアミン脂質から調製するので、その表面に第一級アミンを呈する。リポソームの調製は、米国特許第４，９１２，２０８号に開示されている膜不透過性蛍光染料の存在下で行う。かくして、蛍光染料の分子はリポソーム内にて実質的に非常に高い自己クエンチング濃度であり、その結果、それらは非蛍光性である。リポソームの表面アミンは、チオレートを実施例３５で記載したアルカリ性ホスファターゼに導入するのに用いたのと実質的に同一の方法によってチオレートで誘導体化する。これまでの実施例で開示したＰＴＡ２４および他のインターカレーターは、実施例３５に記載したごとくにＳＭＴＣＣ試薬を用いてマレイミドで誘導体化する。チオレート誘導体化リポソームおよびマレイミド誘導体化ＰＴＡ２４または他のインターカレーターを、実施例３５で記載したのと実質的に同一の条件下で容器中で一緒にインキュベートする。多重インターカレーターで誘導体化したリポソームを含有する蛍光染料を、固相に被覆したまたは固定化した低濃度の二本鎖ＤＮＡを含有する試料と共に、５ないし９の範囲のｐＨにて、好ましくはｐＨ７．０にてインキュベートする。インキュベートションに続いて、洗浄し、洗剤を添加する。これに伴うリポソーム膜の溶解の結果、蛍光原染料がこぼれ出て、蛍光が脱クエンチングされ、シグナルが出現する。
別法として、プローブ多量体一本鎖ＤＮＡを固相に固定化することができ、相補的一本鎖ＤＮＡを含有することが疑われる患者の試料を該プローブの存在下でインキュベートし、リポソーム−インターカレーターをハイブリダイズした試料と接触させ、容器の内容物をインキュベートし、数回洗浄して、過剰のＰＴＡ２４誘導体化リポソームを除去する。もしプローブが患者試料中で相補的配列を見い出せば、洗剤の添加の結果、リポソームが溶解し、シグナルが得られる。しかしながら、もしプローブと患者試料ＤＮＡとが相補的でないならば、二本鎖ＤＮＡは存在せず、実質的にすべてのＰＴＡ２４誘導体化リポソームは固相から洗い出され、シグナルは得られない。
実施例３７
インターカレーター化合物２４、２５、２６、２７、２９ｂ、３５ｂ、３８ｂ、５０、５４ａ、５４ｃ、５８ａ、５８ｃ、６４、６８ａ、６８ｃ、７１ａ、７１ｃ、８０、８５または９０に由来する蛍光インターカレーターコンジュゲートを用いるＤＮＡの検出
インターカレーター化合物２５、２６、２７、２９ｂ、３５ｂ、３８ｂ、５０、５４ａ、５４ｃ、５８ａ、５８ｃ、６４、６８ａ、６８ｃ、７１ａ、７１ｃ、８０、８５または９０をＰＴＡ２４の代わりに用いる以外は実施例３５に既に記載した手法によって、インターカレーターマレイミド官能性化インターカレーターの合成を行うことができる。実施例３５に記載したごとくに調製したチオール化蛋白質上のチオレートを介して、フィコエリトリンまたはアロフィコシアニンのごとき適当なシグナル発生体をこのマレイミド誘導体化インターカレーターに共有結合させる。コンジュゲートのインターカレーター部分が固定化ｄｓ−ＤＮＡ分子に複合する時間放置し、未結合コンジュゲートを洗い流した後、次いで、二本鎖ＤＮＡ分子へのインターカレーター部分の結合によって局所化されたフィコエリトリンの蛍光を用い、二本鎖ＤＮＡ分子が固相または他の固定化物上で検出される。当業者によって決定された効果的な励起に適する波長で蛍光性蛋白質を励起しつつ、当業者に知られた方法を用いて、蛍光発光をほぼ５８０ｎｍで読み取る。
実施例３８
インターカレーター化合物２４、２５、２６、２７、２９ｂ、３５ｂ、３８ｂ、５０、５４ａ、５４ｃ、５８ａ、５８ｃ、６４、６８ａ、６８ｃ、７１ａ、７１ｃ、８０、８５または９０に由来する酵素インターカレーターコンジュゲートを用いるＤＮＡの検出
インターカレーター化合物２５、２６、２７、２９ｂ、３５ｂ、３８ｂ、５０、５４ａ、５４ｃ、５８ａ、５８ｃ、６４、６８ａ、６８ｃ、７１ａ、７１ｃ、８０、８５または９０をＰＴＡ２４の代わりに用いる以外は実施例３５に既に記載した手法によって、インターカレーターマレイミド官能性化インターカレーターの合成を行うことができる。実施例３５に記載したごとくに調製したチオール化蛋白質のチオレートを介して、アルカリ性ホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、エステラーゼ、またはβ−ラクタマーゼのごとき適当なシグナル発生体をこのマレイミド誘導体化インターカレーターに共有結合にて結合させる。コンジュゲートのインターカレーター部分が固定化ｄｓ−ＤＮＡに結合する時間放置し、未結合コンジュゲートを洗い流した後、適当な酵素の非蛍光または非化学ルミネッセンス基質の当業者によって各々決定された蛍光または化学ルミネッセンス体への代謝回転により供された蛍光または化学ルミネッセンスによって、固相またはコロイドもしくは微粒子のごとき他の固定化物上で二本鎖ＤＮＡが検出される。次いで、当業者に各々知られている蛍光励起または化学ルミネッセンスの検出の標準的な方法を用いることによって、蛍光発光または化学ルミネッセンスを適当な波長で読み取る。
実施例３９
インターカレーター化合物２４、２５、２６、２７、２９ｂ、３５ｂ、３８ｂ、５０、５４ａ、５４ｃ、５８ａ、５８ｃ、６４、６８ａ、６８ｃ、７１ａ、７１ｃ、８０、８５または９０に由来するインターカレーター−ケミルミノホア（Chemilumino phore）コンジュゲートを用いるＤＮＡの検出
インターカレーター化合物２５、２６、２７、２９ｂ、３５ｂ、３８ｂ、５０、５４ａ、５４ｃ、５８ａ、５８ｃ、６４、６８ａ、６８ｃ、７１ａ、７１ｃ、８０、８５または９０をＰＴＡ２４の代わりに用いる以外は実施例３５に既に記載した手法によって、インターカレーターマレイミド官能性化インターカレーターの合成を行うことができる。当業者によって設計できるごとくマレイミドに対して反応性となるように調製された化学ルミネッセンス性のチオレートによって、アクリジニウムスルホンアミドのごとき適当な活性化可能な化学ルミネッセンスシグナル発生体をこのインターカレーターに共有結合により結合させることができる。ｄｓ−ＤＮＡのインターカレーター−ケミルミノホアコンジュゲートとの結合の後、過剰のまたは未結合のコンジュゲートを洗い去り、次いで、化学ルミネッセンス体に導く過酸化水素のごとき適当な活性化試薬の添加によってトリガーされた直接的化学ルミネッセンスによって、いずれの二本鎖ＤＮＡも固相または他の固定化体上で検出され、次いで、当業者に知られた化学ルミネッセンスの標準的検出方法を用いることによって、化学ルミネッセンスを適当な波長にて読み取る。
実施例４０
インターカレーター誘導体化デンドリマーの合成
インターカレーター誘導体化デンドリマー（dendrimer）は、PolySciencesから得られる樹状ポリマーから合成することができる。ジメチルホルムアミドまたは他の適当な有機溶媒中で０．２５−７２時間、３０〜９０℃まで加熱することによって、インターカレーターブロマイド中間体２２、４９、５８、６３、７１、８３または８８を用いて、３、４、５、６、７、８、９または１０番目の発生デンドリマー上(generation dendrimer)のアミンをアルキル化する。次いで、インターカレーター化合物５８、６３または７１を用いる場合は、水または適当な水性緩衝液にてＧ−２５セファデックスTMカラム上のサイズ排除クロマトグラフィーを用いることによって、生成物を精製し、インターカレーター誘導体化デンドリマーが得られる。インターカレーター化合物２２、８３または８８の場合は、Ｇ−２５カラムを水で溶離し、次いで、保護されたインターカレーター誘導体化デンドリマーを単離する。次いで、この物質を４Ｎ  ＨＣｌ中における９０℃での２〜４時間の加熱に付して、芳香族アミン保護基を加水分解し、次いで、溶液をｐＨ４〜１０に中和し、Ｇ−２５カラムを最終生成物につき適当な緩衝液で溶離して、純粋なインターカレーター誘導体化デンドリマーが得られる。
本発明およびその利点を詳細に記載してきたが、当業者ならば、添付の請求の範囲によって定義される本発明の精神および範囲を逸脱することなく種々の変形、置換および改変をなすことができることを理解されたい。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１０Ｆ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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