(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１記載のアミノ酸配列において、２７３位のＧｌｙがＰｒｏに置換された配列を有し、且つ、ジグルコースのうちトレハロースに対する親和性を著しく喪失したα−グルコシダーゼ活性を有する蛋白質。
【請求項２】
配列番号１記載のアミノ酸配列において、２７３位のＧｌｙがＰｒｏに置換され、さらに、以下の（１）乃至（４）から選択される少なくとも１つの置換がなされた配列を有し、且つ、ジグルコースのうちトレハロースに対する親和性を著しく喪失したα−グルコシダーゼ活性を有する蛋白質：
（１）７６位のＭｅｔがＡｓｎに置換；
（２）８１位のＡｒｇがＳｅｒに置換；
（３）１１６位のＡｌａがＶａｌに置換；
（４）３４２位のＴｈｒがＡｓｎに置換。
【請求項３】
請求項１または請求項２記載の蛋白質をコードする遺伝子。
【請求項４】
請求項３記載の遺伝子を有するプラスミド。
【請求項５】
請求項４記載のプラスミドで宿主細胞が形質転換されている形質転換体。
【請求項６】
請求項１または２に記載の蛋白質の製造方法において、請求項５記載の形質転換体を培養し、当該形質転換体内で目的の蛋白質をコードする遺伝子を発現させ、培養物から当該蛋白質を採取することを特徴とする蛋白質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は新規なα−グルコシダーゼ活性を有する蛋白質に関する。詳しくは２分子のグルコース分子から構成される二糖類（ジグルコース）のうち、トレハロースに対する親和性のみを著しく喪失した新規なα−グルコシダーゼ活性を有する蛋白質に関する。更に詳しくは、配列番号１記載のアミノ酸配列において、少なくとも２７３位のＧｌｙが他のアミノ酸残基、望ましくはＰｒｏに置換された配列を有し、且つ、ジグルコースのうちトレハロースに対する親和性を著しく喪失したα−グルコシダーゼ活性を有する蛋白質である。
【０００２】
【従来の技術】
トレハロースは非還元性二糖類であり、熱安定性や耐酸性に富んでいる。この二糖類は、蛋白質や細胞を凍結や乾燥から保護するはたらきがあり、この特性を応用して食品や医薬品の安定化剤や化粧品の保湿剤に利用されている。
【０００３】
最近、マルトース又は澱粉からトレハロースを生産する方法が報告されている。例えば、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ属、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ属、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ属、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属などの微生物には、マルトースや澱粉からトレハロースを生成する酵素系を持つものがあることが明らかにされており、これらの微生物を利用したトレハロース生産が報告されている。
しかしながら、これらの方法におけるトレハロースの生成収率は、マルトース若しくはアミロースを基質とした場合で８０％、又は澱粉を基質とした場合で４０％であり、これらの製造方法は商業的製造上、満足のできる製法ではない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
従って、トレハロースの製造工程において、反応産物から残存する未反応のマルトース、マルトオリゴ糖、イソマルトース、ならびにイソマルトオリゴ糖を除去することができれば、より高純度のトレハロースを得ることが可能となるので、当該目的のためには、トレハロース以外のグルコシドに幅広く作用する一方で、トレハロースに対する親和性のみが著しく喪失した基質特異性を有するα−グルコシダーゼを触媒として用いればよい。しかしながら、このような基質特異性をもつα−グルコシダーゼはこれまでに知られていなかった。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
バチルス属の一種であるＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＳＡＭ１６０６由来のα−グルコシダーゼの基質特異性はこれまで知られているα−グルコシダーゼの中でもっとも広く、そのアミノ酸配列も既に知られている  （Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２２０，ｐ２９３−３００，１９９４；Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，Ｖｏｌ．４，ｐ３３７−３４３，１９９４；配列番号１）。即ち、本酵素はトレハロース、マルトース、ニゲロース、イソマルトース、シュクロース、ツラノース、マルトトリオース、マルトテトラオース、イソマルトトリオースのような様々な１−Ｏ−α−Ｄ−グルコシドに作用して、これらを効率よく加水分解する。特に当該酵素はトレハロースを効率よく分解しうる唯一のα−グルコシダーゼと言ってもよい。
【０００６】
本発明者らは、本酵素の基質特異性を改変する試みを様々に行ったところ、本酵素分子中のあるアミノ残基を特異的に別の残基に置換することにより、トレハロースに対する反応性のみが著しく減少した酵素を得ることができた。具体的には、当該変異型酵素は配列番号１記載のアミノ酸配列を有するα−グルコシダーゼ分子中の２７３位のＧｌｙを他のアミノ酸残基に置換することであり、望ましくはＰｒｏに置換すること（この置換をＧｌｙ２７３Ｐｒｏと表記する）を含む各種の変異型酵素である。そして、当該変異型酵素は各種の１−Ｏ−α−Ｄ−グルコシドの混合物の中でトレハロースのみを残してその他を加水分解するので上述の目的に有用であることがわかり本発明を完成するに至った。
なお、配列番号１記載の遺伝子を有するプラスミドｐＵＳＵ３３４により形質転換された大腸菌（ｐＵＳＵ３３４／Ｗ３１１０）株が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＳＡＭ１９５４と命名され、１９９２年２月１４日付けで工業技術院生命工学工業技術研究所に微工研条寄第３７４９号（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３７４９）として寄託されている。
【０００７】
ＳＡＭ１６０６由来のα−グルコシダーゼは、同じバチルス属細菌のオリゴー１，６−グルコシダーゼと極めて高い配列類似性をもつ。オリゴ−１，６−グルコシダーゼはイソマルトオリゴ糖のα−１，６−結合に特異的に作用する酵素であり、トレハロース、マルトース、およびシュクロースには作用しない。酵素の活性部位近傍に存在し基質特異性の決定に重要であると示唆される領域のアミノ酸配列は、両酵素でさらに高い類似性を示す。
【０００８】
この領域におけるＳＡＭ１６０６由来α−グルコシダーゼの５つのアミノ酸残基、即ち、７６位のＭｅｔ、８１位のＡｒｇ、１１６位のＡｌａ、２７３位のＧｌｙ、３４２位のＴｈｒは、オリゴ−１，６−グルコシダーゼでは各々特異的にＡｓｎ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｐｒｏ、Ａｓｎに置換されている。従って、これらの残基のいずれか若しくはそれらの組み合わせ又は全ての残基の相違がＳＡＭ１６０６酵素の広い特異性の原因に、言い換えればトレハロース、マルトース及びシュクロースに対する反応性の相違の原因となっている可能性が考えられた。
【０００９】
【発明の実施の形態】
そこで、本酵素分子中の７６位のＭｅｔ、８１位のＡｒｇ、１１６位のＡｌａ、２７３位のＧｌｙ、３４２位のＴｈｒを部位特異的に他のアミノ酸残基に置換することを考え、例えば、オリゴ−１，６−グルコシダーゼにおいて相当するアミノ酸残基、即ち、各々Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｐｒｏ、Ａｓｎに置換して、これらの一重ならびに多重変異型酵素を作成した（この置換を各々Ｍｅｔ７６Ａｓｎ、Ａｒｇ８１Ｓｅｒ、Ａｌａ１１６Ｖａｌ、Ｇｌｙ２７３Ｐｒｏ、Ｔｈｒ３４２Ａｓｎと表記する）。
【００１０】
以下、本明細書においては当該各変異、即ち、Ｍｅｔ７６Ａｓｎ、Ａｒｇ８１Ｓｅｒ、Ａｌａ１１６Ｖａｌ，Ｇｌｙ２７３Ｐｒｏ、Ｔｈｒ３４２Ａｓｎを各々変異１、２、３、４及び５とし、変異の多重度（ｓｉｎｇｌｅ，ｄｏｕｂｌｅ，ｔｒｉｐｌｅ，ｑｕａｄｒｕｐｌｅ，およびｆｉｖｅ−ｆｏｌｄ）を各々略号Ｓ、Ｄ、Ｔ、Ｑ、Ｆで示す。
本発明において調製した変異型酵素は、例えば以下のとおりである。
【００１１】
略号変異の多重度    変異
Ｓ１  一重変異型酵素Ｍｅｔ７６Ａｓｎ、
Ｓ２  一重変異型酵素  Ａｒｇ８１Ｓｅｒ、
Ｓ３  一重変異型酵素  Ａｌａ１１６Ｖａｌ、
Ｓ４  一重変異型酵素  Ｇｌｙ２７３Ｐｒｏ、
Ｓ５  一変異型酵素  Ｔｈｒ３４２Ａｓｎ、
Ｆ    五重変異型酵素  Ｍｅｔ７６Ａｓｎ／Ａｒｇ８１Ｓｅｒ／Ａｌａｌ１６Ｖ
ａｌ／Ｇｌｙ２７３Ｐｒｏ／Ｔｈｒ３４２Ａｓｎ
【００１２】
本発明に係る変異型酵素の変異戦略の概略を図１に示す。また、この戦略に関係のある部分の配列を図２に示す。ＳＡＭ１６０６由来のα−グルコシダーゼ遺伝子を大きく４つの領域（Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、及びＩＶ）に分け、これらのＤＮＡフラグメントの境界が制限酵素サイトとなるようプライマーをデザインして、ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  （ＰＣＲ）法（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ．  ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．第２版、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ編、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８９参照）でこれらのフラグメントを増幅した。
【００１３】
フラグメント１１には変異１、２及び３の部位が含まれており、それらの一重変異（Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３）、二重変異（Ｄ１／２、Ｄ２／３、Ｄ１／３）及び三重変異（Ｔ１／２／３）はｇａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ法（Ｗ．Ｋｒａｍｅｒ，Ｈ．Ｊ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１５４，１９８７参照）により導入した。また、フラグメントＩＩＩには変異４の部位が含まれている。
【００１４】
変異４をフラグメントＩＩＩに導入する際には、変異４の部位を境界としてさらに２つのフラグメント（ＩＩＩ−１、ＩＩＩ−２）に分け、各フラグメントをＰＣＲで増幅する際にプライマーにより変異を導入した。その際、ＳｍａＩサイトも生成するので、このサイトでＩＩＩ−１とＩＩＩ−２を連結した。
【００１５】
一方、フラグメントＩＶには変異５の部位が含まれる。これをＰＣＲで増幅する際にプライマーにより変異を導入した。なお、ＰＣＲに用いた各プライマー（図１参照）の配列は以下のとおりである。
【００１６】
Ｆ１：ＣＡＧＧＡＴＣＣＡＣＣＧＣＣＴＴＧＡＣＧ          （配列番号２）
【００１７】
Ｒ１：ＴＴＧＡＧＧＴＡＧＴＣＡＡＧＣＴＴＣＧＡＧＡＧＧ      （配列番号３）
【００１８】
Ｆ２：ＣＡＴＣＣＴＣＴＣＧＡＡＧＣＴＴＧＡＣＴＡＣＣＴＣ    （配列番号４）
【００１９】
Ｒ２：ＧＣＧＡＧＧＡＴＣＴＡＧＡＣＴＣＧＡＴＧＡＡＣＣ    （配列番号５）
【００２０】
Ｆ３：ＡＴＣＧＡＧＴＣＴＡＧＡＴＣＣＴＣＧＣＧＣ          （配列番号６）
【００２１】
Ｒ３：ＴＧＴＣＧＴＣＡＣＣＣＣＧＧＧＧＧＴＣＴＣＧ        （配列番号７）
【００２２】
Ｆ４：ＡＧＡＣＣＣＣＣＧＧＧＧＴＧＡＣＧＡＣＡＡＡＧＧＧ  （配列番号８）
【００２３】
Ｒ４：ＴＡＣＡＧＧＧＡＡＴＴＣＣＡＧＧＣＣＴＴＧＣ        （配列番号９）
【００２４】
Ｆ５：ＧＧＣＣＴＧＧＡＡＴＴＣＣＣＴＧＴＡＣＴＧＧ        （配列番号１０）
【００２５】
Ｒ５：ＧＴＴＧＴＧＧＡＧＣＴＣＧＡＣＧＴＣＣＣ            （配列番号１１）
【００２６】
Ｍ１：ＧＡＡＴＧＡＣＧＡＣＡＡＴＧＧＣＴＡＴＧＡＣ        （配列番号１２）
【００２７】
Ｍ２：ＣＴＡＴＧＡＣＡＴＣＡＧＣＧＡＣＴＡＣＴＡＣ          （配列番号１３）
【００２８】
Ｍ３：ＧＧＡＣＣＴＧＧＴＧＧＴＣＡＡＣＣＡＴＡＣＣＴ        （配列番号１４）
【００２９】
Ｍ５：ＣＴＧＧＡＡＴＴＣＣＣＴＧＴＡＣＴＧＧＡＡＣＡＡＣＣ    （配列番号１５）
【００３０】
Ｅ１：ＣＧＡＡＴＴＣＧＡＡＣＡＣＣＣＴＧＧＧ              （配列番号１６）
【００３１】
Ｂ１：ＣＣＡＴＡＡＧＧＡＴＣＣＴＣＣＡＧ                （配列番号１７）
【００３２】
最終的に各種のＩ〜ＩＶのフラグメントを連結することにより、変異が様々な組み合わせで導入された各種の変異型酵素をコードする遺伝子を調製することができた。
上記のようにして得られた各変異型酵素をコードする遺伝子は、常法により当該遺伝子を発現し得るプラスミドに組み込み、更に宿主細胞に導入して形質転換体を得ることができる。
【００３３】
ここで、宿主細胞としては、大腸菌やバチルス属細菌を用いることができ、プラスミドとしては大腸菌内で目的の遺伝子を複製できるｐＵＣ１８、ｐＢＲ３２２等や、バチルス属細菌内で目的の遺伝子を複製できるｐＵＢ１１０、ｐＥ１９４ｐＣ１９４等の公知のプラスミドを用いることができる。更に、目的の遺伝子の発現に必要な遺伝子、例えばプロモータ、ターミネーター、アテニュエーター等に係る遺伝子を上記プラスミド中の目的遺伝子に結合させて発現ベクターとして用いることができる。本発明に係るプラスミドとしてはｐＧＢＳＵ５やｐＧＢＳＵＭ等が挙げられる。
【００３４】
目的の各変異型酵素は、その遺伝子をコードするプラスミドを保持する宿主細胞の培養物から、例えば除核酸、硫安分画、イオン交換ならびにゲルクロマトグラフィー等のような公知の精製手段あるいはその組み合わせにより精製・採取することができる。
【００３５】
上記のようにして得られた各変異型酵素及びＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＳＡＭ１９５４から得られた野生型酵素について、さまざまな糖類に対する親和性（Ｋｍ値）を調べた結果を図３に示す。既に述べたように、本発明における変異の標的部位としたＳＡＭ１６０６α−グルコシダーゼの５つのアミノ酸残基、即ち、７６位Ｍｅｔ、８１位Ａｒｇ、１１６位Ａｌａ、２７３位Ｇｌｙ、３４２位Ｔｈｒは、オリゴ−１，６−グルコシダーゼでは各々特異的にＡｓｎ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｐｒｏ、Ａｓｎに置換されており、これらの残基の何れか１箇所若しくはそれらの組み合わせ又は全てのアミノ酸残基の相違がＳＡＭ１６０６酵素の広い特異性、言い換えればトレハロース、マルトース、およびシュクロースに対する反応性を説明できるものと当初予想された。
【００３６】
しかしながら、上記の変異型酵素Ｓ４とＦにおいては特異性が変化していたが、全く予期せぬことに、トレハロースに対する親和性のみが大きく減少し、マルトースおよびシュクロースに対する親和性は殆ど影響を受けないことがわかった。両酵素は何れも配列番号１記載のアミノ酸配列において、２７３位のＧｌｙが他のアミノ酸残基に置換されたものである。
【００３７】
従って、本発明に係る蛋白質は、配列番号１記載のアミノ酸配列において、少なくとも２７３位のＧｌｙが他のアミノ酸残基、望ましくはＰｒｏに置換された配列を有し、且つ、ジグルコースのうちトレハロースに対する親和性を著しく喪失したα−グルコシダーゼ活性を有する蛋白質である。
【００３８】
【実施例】
以下、本発明を実施例により詳細に説明する。
実施例１ フラグメントＩＩの増幅と変異導入
ｐＵＳＵ３３４を鋳型に、Ｆ２とＲ２をプライマーとしてＰＣＲによりフラグメントＩＩを増幅した。増幅したフラグメントＩＩを制限酵素  （Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ、Ｘｂａ  Ｉ）により切断し、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ−Ｘｂａ  Ｉ  フラグメントをＧＥＮＥ  ＣＬＥＡＮ  ＩＩキット（ＢＩＯ  １０１Ｉｎｃ．）により精製した。
【００３９】
フラグメントＩＩをＭ１３ｔｖ１８（宝酒造（株））のＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｂａＩサイトに挿入し、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９（宝酒造（株））を指示菌にしてそのファージのシングルプラークを形成させ、そこからｓｓＤＮＡを調製した。このｓｓＤＮＡとｄｓＤＮＡ溶液をアニールさせ、ギャップドＤＮＡ（ｇｄＤＮＡ）を形成させた。合成プライマー（Ｍ１、Ｍ２又はＭ３）の５’末端をＴ４ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｋｉｎａｓｅにてリン酸化し、ｇｄＤＮＡとアニーリングさせた（Ｍ１：５８℃で１５分間、ついで３７℃で１５分間；Ｍ２：５５℃で１５分間、ついで３７℃で１５分間；Ｍ３：６５℃で１５分間、ついで３７℃で１５分間）。アニーリング後、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡｌｉｇａｓｅとＴ４  ＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅにより相補鎖を合成した。
【００４０】
実施例２ ＰＣＲによるフラグメントＩ、ＩＩＩ、ＩＶの増幅
ｐＵＳＵ３３４を鋳型に、合成プライマーＦ１とＲ１、Ｆ３とＲ４及びＦ５とＲ５をプライマーとしてＰＣＲにて増幅された断片を各々制限酵素ＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩ、ＸｂａＩとＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＩとＡａｔＩＩで消化した。各々の断片をフラグメントＩ、ＩＩＩ、ＩＶとした。
【００４１】
実施例３ フラグメントＩＩＩ、ＩＶへの変異の導入
プラスミドｐＵＳＵ３３４を鋳型に、合成プライマーＦ３とＲ３及びＦ４とＲ４をプライマーとしてＰＣＲにより増幅された断片を制限酵素ＳｍａＩとＸｂａＩ、ＳｍａＩとＥｃｏＲＩで消化し、フラグメントＩＩＩ−１、ＩＩＩ−２とした。両者をＳｍａＩサイトで連結することにより変異を導入したフラグメントＩＩＩを得た。
【００４２】
一方、ｐＵＳＵ３３４を鋳型に合成プライマーＦ５とＲ５をプライマーとしてＰＣＲにより増幅し、制限酵素ＥｃｏＲＩ−ＡａｔＩＩで消化することにより、変異が導入されたフラグメントＩＶを得た。
【００４３】
実施例４ フラグメントの連結ならびに全長α−グルコシダーゼ遺伝子に係る発現ベクターの構築
プラスミドｐＳＰ８０１（当該プラスミドにより形質転換された大腸菌が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＳＡＭ００３８と命名され、１９８８年１月３０日付けで工業技術院生命工学工業技術研究所に微工研条寄第１６８６号（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１６８６）として寄託されている）を制限酵素ＭｌｕＩ及びＨｐａＩで切断して約２．９５ｋｂのＤＮＡ断片を得、これをフィルイン（ｆｉｌｌｉｎ）し、両端にＢａｍＨＩリンカーを連結する。次に、これをｐＢＲ３２２のＢａｍＨＩサイトに挿入することによりプラスミドｐＬＢＴ２９１を得た（特開昭６１−１３９３８９、Ｇｅｎｅ（Ａｍｓｔ．），Ｖｏｌ．３４，ｐ２４３−２５１，１９８５参照）。
【００４４】
次に、ｐＬＢＴ２９１が有するｉｃｐ遺伝子のプロモーター領域を得るために、ｐＬＢＴ２９１を鋳型としてＰＣＲを行った。合成プライマーＥ１により、ｉｃｐ遺伝子に係る開始コドン（ＡＴＧ）の約１５０ｂｐ上流にＥｃｏＲＩサイトが導入され、また、合成プライマーＢ１により、当該開始コドンの直前にＢａｍＨＩサイトが導入された。増幅された０．１５ｋｂのＤＮＡフラグメントをプラスミドｐＧＥＭ４（Ｐｒｏｍｅｇａ社）のＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩサイトに挿入してプラスミドｐＧＢＴＰを得た（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２２０，ｐ２９３−３００，１９９４参照）。ｐＧＢＴＰを制限酵素ＥｃｏＲＩで消化し、Ｂｌｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ（宝酒造（株））の処方に従って末端を平滑化した後連結することによりプラスミドｐＧＢＴＰ２を構築した。
【００４５】
上記ｐＧＢＴＰ２を制限酵素ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ｐＵＳＵ３３４の０．７ｋｂのＡａｔＩＩ−ＨｉｎｄＩＩ断片とフラグメントＩ、ＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶを各々対応する制限酵素サイトで順に連結した１．２ｋｂのＢａｍＨＩ−ＡａｔＩＩ断片を挿入することにより、全長のα−グルコシダーゼ遺伝子に係る発現ベクターｐＧＢＳＵ５を得た。また、上記の任意の変異を導入した各フラグメントで、それに対応するｐＧＢＳＵ５のフラグメントを置換することにより、任意の変異を導入したα−グルコシダーゼ遺伝子に係る発現ベクターｐＧＢＳＵＭを得た。
【００４６】
実施例５ α−グルコシダーゼ遺伝子の発現と各種変異型酵素の精製
α−グルコシダーゼ遺伝子に変異を導入した各種プラスミドｐＧＢＳＵＭでＥ．ｃｏｌｉＷ３１１０株を形質転換した。得られた形質転換株の終夜培養液をアンピシリンを含むＬＢ培地５０ｍｌに１％植菌し３７℃で８〜１２時間振とう培養した。
続いてその全量をアンピシリンを含むＬＢ培地５１に植菌し３７℃で終夜で振とう培養した。Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０株の菌体（湿重量、約２０ｇ）と、その湿重量の２倍量の細胞磨砕用酸化アルミニウムを乳鉢に入れて、氷冷しながら乳棒で菌体を約１０分間磨砕した。
【００４７】
次に菌体量の３倍容の標準緩衝液を加えて磨砕物を懸濁し、懸濁液を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ×２０分間、４℃）してその上清を粗酵素液とした。粗酵素液に、ポリエチレンイミンの終濃度が０．１２％（ｗ／ｖ）になるように３％ポリエチレンイミン水溶液を加えてよく攪拌し、４℃で３０分間放置した。
【００４８】
遠心分離（１０，０００ｒｐｍ×２０分間、４℃）後、上清をポリエチレンイミン処理画分とした。ポリエチレンイミン処理画分を試験管（１．５ｃｍ×１０．５ｃｍ）に約３ｍｌずつ分注し、メタルブロック恒温槽にて６０℃で３０分間熱処理後、ただちに氷冷した。遠心分離（１０，０００ｒｐｍ×２０分間、４℃）により沈澱を除き、上清を熱処理画分とした。
【００４９】
熱処理画分に磨砕硫安を２０％飽和になるように溶解し、３０分以上４℃で放置した。遠心分離（１０，０００ｒｐｍ×２０分間、４℃）により沈澱を除いた。その上清にさらに磨砕硫安を５０％飽和になるように溶解し、３０分以上４℃で放置した。遠心分離（１０，０００ｒｐｍ×２０分間、４℃）を行ない、上清を除いた。
【００５０】
活性画分を標準緩衝液に対して４℃で一晩透析した（５００倍）。標準緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−６Ｂカラム（３．５ｃｍ×２０ｃｍ、約２００ｍｌ）に透析内液を負荷し、次いでカラム体積の５倍容の平衡化緩衝液でカラムを洗浄した。平衡化緩衝液４００ｍｌと、０．６Ｍ  ＮａＣｌを含む平衡化緩衝液４００ｍｌとの間の直線的濃度勾配にてα−グルコシダーゼ活性を溶出した。流速は平均約１３０ｍｌ／ｈｒ（重力落下方式）とし、１分画あたり約９ｍｌずつ８０本に分取した。
【００５１】
α−グルコシダーゼ活性は分画番号４０〜６０番付近に溶出された。活性画分を約３〜５ｍｌにまで濃縮した。０．２Ｍ  ＮａＣｌを含有する標準緩衝液にて平衡化したＳｅｐｈａｃｒｙ１  Ｓ−２００（２．６ｃｍ×６６．５ｃｍ、約３５３ｍｌ）に濃縮試料を負荷し、平衡化緩衝液をペリスタポンプにて１ｍｌ／ｍｉｎの流速で展開しながら、カラムからの溶出液を３．５ｍｌずつ分取した。いずれの変異型酵素の場合も活性画分は純粋なα−グルコシダーゼを含んでいた。
【００５２】
実施例６ 親和性の測定
各々濃度の異なる基質（マルトース、イソマルトース、シュクロース及びトレハロース；１〜５００ｍＭ）を溶解した０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）１００μｌを５５℃で１０分間インキュベートした。各変異型酵素（Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４、Ｓ５及びＦ）を４μｌを加えて、よく攪拌し、正確に５５℃で１０分間インキュベートした。続いて１００℃で３分間加熱することにより酵素反応を停止した。ブランクには、酵素の代わりに水を加えて同様に操作を行なったものを用いた。
【００５３】
反応混液に、ベーリンガーマンハイム社製の新ブラッドシュガーテスト１ｍｌを加えよく攪拌し、３７℃で３０分間放置した。また、概知濃度のグルコースとそのブランクを用意し、同様に操作を行なった。６６０ｎｍにおける吸光度をＳｈｉｍａｄｚｕ  ＵＶ−１６０分光光度計にて測定した。基質に対するＫｍ値を非線型回帰分析により求めた。結果を図４に示す。Ｓ４及びＦはトレハロース以外のグルコシドに作用する一方でトレハロースに対する親和性のみが著しく喪失していた。
【００５４】
実施例７ 変異型酵素（Ｆ）の基質特異性
各々１０ｍＭのマルトース、イソマルトース、シュクロースおよびトレハロースを含有する０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０、１ｍｌ）に変異型酵素（Ｆ）を１μｇ加え、５５℃で１時間インキュベートした。続いて１００℃で３分間加熱することにより酵素反応を停止した。反応液中に残存する各２糖類の量を、高速液体クロマトグラフィー（Ｓｈｏｄｅｘ  Ｉｏｎｐａｋ  ＫＳ８０１あるいはＡｓａｈｉｐａｋ  ＮＨ２Ｐ５０）、薄層シリカゲルクロマトグラフィー、および酵素法（β−フラクトフラノシダーゼ）を併用することにより定量した。
各２糖類の残存量は各々３％、２％、２％及び９３％であった。
【００５５】
【発明の効果】
配列番号１記載のアミノ酸配列において、少なくとも２７３位のＧｌｙが他のアミノ酸残基に置換された配列を有するα−グルコシダーゼ活性を有する蛋白質（変異型酵素）は、トレハロース以外のグルコシドに作用する一方でトレハロースに対する親和性のみが著しく喪失している。従って、トレハロースの製造工程において、本発明に係る蛋白質を用いることにより、反応産物から残存する未反応のマルトース、マルトオリゴ糖、イソマルトース及びイソマルトオリゴ糖を除去することができるので、より高純度のトレハロースを得ることが可能となる。
【００５６】
【配列表】
配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１
配列の長さ（ＳＥＱＵＥＮＣＥ  ＬＥＮＧＴＨ）：１７５８
配列の型（ＳＥＱＵＥＮＣＥ  ＴＹＰＥ）：核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）
鎖の数（ＳＴＲＡＮＤＥＤＮＥＳＳ）：二本鎖（ｄｏｕｂｌｅ）
トポロジー（ＴＯＰＯＬＯＧＹ）：直鎖状（ｌｉｎｅａｒ）
配列の種類（ＭＯＬＥＣＵＬＥ  ＴＹＰＥ）：Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ
ハイポセティイカル配列（ＨＹＰＯＴＨＥＴＩＣＡＬ  ＳＥＱＵＥＮＣＥ）：Ｎｏ
アンチセンス（ＡＮＴＩ−ＳＥＮＳＥ）：Ｎｏ
起源（ＯＲＩＧＩＮＡＬ  ＳＯＵＲＣＥ）
生物名（ＯＲＧＡＮＩＳＭ）：Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．
株名（ＳＴＲＡＩＮ）：ＳＡＭ１６０６
配列（ＳＥＱＵＥＮＣＥ  ＤＥＳＣＲＩＰＴＩＯＮ）
0003811215.tif 000002
0003811215.tif 000003
0003811215.tif 000004
0003811215.tif 000005
0003811215.tif 000006
【００５７】
配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：２
配列の長さ（ＳＥＱＵＥＮＣＥＬＥＮＧＴＨ）：２０
配列の型（ＳＥＱＵＥＮＣＥＴＹＰＥ）：核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）
鎖の数（ＳＴＲＡＮＤＥＤＮＥＳＳ）：一本鎖（ｓｉｎｇｌｅ）
トポロジー（ＴＯＰＯＬＯＧＹ）：直鎖状（ｌｉｎｅａｒ）
配列の種類（ＭＯＬＥＣＵＬＥＴＹＰＥ）：他の核酸  合成ＤＮＡ（Ｏｔｈｅｒｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）
ハイポセティカル配列（ＨＹＰＯＴＨＥＴＩＣＡＬ  ＳＥＱＵＥＮＣＥ）：Ｎｏアンチセンス（ＡＮＴＩ−ＳＥＮＳＥ）：Ｎｏ
配列（ＳＥＱＵＥＮＣＥＤＥＳＣＲＩＰＴＩＯＮ）
ＣＡＧＧＡＴＣＣＡＣＣＧＣＣＴＴＧＡＣＧ  ２０
【００５８】
配列番号（ＳＥＱＩＤ  ＮＯ）：３
配列の長さ（ＳＥＱＵＥＮＣＥＬＥＮＧＴＨ）：２４
配列の型（ＳＥＱＵＥＮＣＥＴＹＰＥ）  ：核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）
鎖の数（ＳＴＲＡＮＤＥＤＮＥＳＳ）：一本鎖（ｓｉｎｇｌｅ）
トポロジー（ＴＯＰＯＬＯＧＹ）：直鎖状（ｌｉｎｅａｒ）
配列の種類（ＭＯＬＥＣＵＬＥＴＹＰＥ）  ：他の核酸  合成ＤＮＡ（Ｏｔｈｅｒ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）
ハイポセティカル配列（ＨＹＰＯＴＨＥＴＩＣＡＬ  ＳＥＱＵＥＮＣＥ）：Ｎｏアンチセンス（ＡＮＴＩ−ＳＥＮＳＥ）：Ｎｏ
配列（ＳＥＱＵＥＮＣＥ  ＤＥＳＣＲＩＰＴＩＯＮ）
ＴＴＧＡＧＧＴＡＧＴ  ＣＡＡＧＣＴＴＣＧＡ  ＧＡＧＧ  ２４
【００５９】
配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：４
配列の長さ（ＳＥＱＵＥＮＣＥＬＥＮＧＴＨ）：２５
配列の型（ＳＥＱＵＥＮＣＥＴＹＰＥ）：核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）
鎖の数（ＳＴＲＡＮＤＥＤＮＥＳＳ）：一本鎖（ｓｉｎｇｌｅ）
トポロジー（ＴＯＰＯＬＯＧＹ）：直鎖状（ｌｉｎｅａｒ）
配列の種類（ＭＯＬＥＣＵＬＥＴＹＰＥ）：他の核酸  合成ＤＮＡ（Ｏｔｈｅｒｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）
ハイポセティカル配列（ＨＹＰＯＴＨＥＴＩＣＡＬＳＥＱＵＥＮＣＥ）：Ｎｏ
アンチセンス（ＡＮＴＩ−ＳＥＮＳＥ）：Ｎｏ
配列（ＳＥＱＵＥＮＣＥ  ＤＥＳＣＲＩＰＴＩＯＮ）
ＣＡＴＣＣＴＣＴＣＧ  ＡＡＧＣＴＴＧＡＣＴ  ＡＣＣＴＣ  ２５
【００６０】
配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：５
配列の長さ（ＳＥＱＵＥＮＣＥ  ＬＥＮＧＴＨ）：２４
配列の型（ＳＥＱＵＥＮＣＥ  ＴＹＰＥ）：核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）
鎖の数（ＳＴＲＡＮＤＥＤＮＥＳＳ）  ：一本鎖（ｓｉｎｇｌｅ）
トポロジー（ＴＯＰＯＬＯＧＹ）：直鎖状（ｌｉｎｅａｒ）
配列の種類（ＭＯＬＥＣＵＬＥ  ＴＹＰＥ）：他の核酸  合成ＤＮＡ（Ｏｔｈｅｒ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）
ハイポセティカル配列（ＨＹＰＯＴＨＥＴＩＣＡＬ  ＳＥＱＵＥＮＣＥ）：Ｎｏアンチセンス（ＡＮＴＩ−ＳＥＮＳＥ）：Ｎｏ
配列（ＳＥＱＵＥＮＣＥ  ＤＥＳＣＲＩＰＴＩＯＮ）
ＧＣＧＡＧＧＡＴＣＴ  ＡＧＡＣＴＣＧＡＴＧ  ＡＡＣＣ  ２４
【００６１】
配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：６
配列の長さ（ＳＥＱＵＥＮＣＥ  ＬＥＮＧＴＨ）：２１
配列の型（ＳＥＱＵＥＮＣＥ  ＴＹＰＥ）：核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）
鎖の数（ＳＴＲＡＮＤＥＤＮＥＳＳ）：一本鎖（ｓｉｎｇｌｅ）
トポロジー（ＴＯＰＯＬＯＧＹ）：直鎖状（ｌｉｎｅａｒ）
配列の種類（ＭＯＬＥＣＵＬＥ  ＴＹＰＥ）：他の核酸  合成ＤＮＡ（Ｏｔｈｅｒ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）
ハイポセティカル配列（ＨＹＰＯＴＨＥＴＩＣＡＬ  ＳＥＱＵＥＮＣＥ）：Ｎｏアンチセンス（ＡＮＴＩ−ＳＥＮＳＥ）：Ｎｏ
配列（ＳＥＱＵＥＮＣＥ  ＤＥＳＣＲＩＰＴＩＯＮ）
ＡＴＣＧＡＧＴＣＴＡ  ＧＡＴＣＣＴＣＧＣＧ  Ｃ  ２１
【００６２】
配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：７
配列の長さ（ＳＥＱＵＥＮＣＥ  ＬＥＮＧＴＨ）：２２
配列の型（ＳＥＱＵＥＮＣＥ  ＴＹＰＥ）：核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）
鎖の数（ＳＴＲＡＮＤＥＤＮＥＳＳ）：一本鎖（ｓｉｎｇｌｅ）
トポロジー（ＴＯＰＯＬＯＧＹ）：直鎖状（ｌｉｎｅａｒ）
配列の種類（ＭＯＬＥＣＵＬＥ  ＴＹＰＥ）：他の核酸  合成ＤＮＡ（Ｏｔｈｅｒ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）ハイポセティカル配列（ＨＹＰＯＴＨＥＴＩＣＡＬ  ＳＥＱＵＥＮＣＥ）：Ｎｏ
アンチセンス（ＡＮＴＩ−ＳＥＮＳＥ）：Ｎｏ
配列（ＳＥＱＵＥＮＣＥ  ＤＥＳＣＲＩＰＴＩＯＮ）
ＴＧＴＣＧＴＣＡＣＣ  ＣＣＧＧＧＧＧＴＣＴ  ＣＧ  ２２
【００６３】
配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：８
配列の長さ（ＳＥＱＵＥＮＣＥ  ＬＥＮＧＴＨ）：２５
配列の型（ＳＥＱＵＥＮＣＥ  ＴＹＰＥ）：核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）
鎖の数（ＳＴＲＡＮＤＥＤＮＥＳＳ）：一本鎖（ｓｉｎｇｌｅ）
トポロジー（ＴＯＰＯＬＯＧＹ）：直鎖状（ｌｉｎｅａｒ）
配列の種類（ＭＯＬＥＣＵＬＥ  ＴＹＰＥ）  ：他の核酸  合成ＤＮＡ（Ｏｔｈｅｒ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）
ハイポセティカル配列（ＨＹＰＯＴＨＥＴＩＣＡＬ  ＳＥＱＵＥＮＣＥ）：Ｎｏアンチセンス（ＡＮＴＩ−ＳＥＮＳＥ）：Ｎｏ
配列（ＳＥＱＵＥＮＣＥ  ＤＥＳＣＲＩＰＴＩＯＮ）
ＡＧＡＣＣＣＣＣＧＧ  ＧＧ  ＴＧＡＣＧＡＣＡ  ＡＡＧＧＧ  ２５
【００６４】
配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：９
配列の長さ（ＳＥＱＵＥＮＣＥ  ＬＥＮＧＴＨ）：２２
配列の型（ＳＥＱＵＥＮＣＥ  ＴＹＰＥ）：核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）
鎖の数（ＳＴＲＡＮＤＥＤＮＥＳＳ）：一本鎖（ｓｉｎｇｌｅ）
トポロジー（ＴＯＰＯＬＯＧＹ）：直鎖状（ｌｉｎｅａｒ）
配列の種類（ＭＯＬＥＣＵＬＥ  ＴＹＰＥ）：他の核酸  合成ＤＮＡ（Ｏｔｈｅｒ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）ハイポセティカル配列（ＨＹＰＯＴＨＥＴＩＣＡＬ  ＳＥＱＵＥＮＣＥ）：Ｎｏ
アンチセンス（ＡＮＴＩ−ＳＥＮＳＥ）：Ｎｏ
配列（ＳＥＱＵＥＮＣＥ  ＤＥＳＣＲＩＰＴＩＯＮ）
ＴＡＣＡＧＧＧＡＡＴ  ＴＣＣＡＧＧＣＣＴＴ  ＧＣ  ２２
【００６５】
配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１０
配列の長さ（ＳＥＱＵＥＮＣＥ  ＬＥＮＧＴＨ）：２２
配列の型（ＳＥＱＵＥＮＣＥ  ＴＹＰＥ）：核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）
鎖の数（ＳＴＲＡＮＤＥＤＮＥＳＳ）：一本鎖（ｓｉｎｇｌｅ）
トポロジー（ＴＯＰＯＬＯＧＹ）：直鎖状（ｌｉｎｅａｒ）
配列の種類（ＭＯＬＥＣＵＬＥ  ＴＹＰＥ）：他の核酸  合成ＤＮＡ（Ｏｔｈｅｒ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）
ハイポセティカル配列（ＨＹＰＯＴＨＥＴＩＣＡＬ  ＳＥＱＵＥＮＣＥ）：Ｎｏアンチセンス（ＡＮＴＩ−ＳＥＮＳＥ）：Ｎｏ
配列（ＳＥＱＵＥＮＣＥ  ＤＥＳＣＲＩＰＴＩＯＮ）
ＧＧＣＣＴＧＧＡＡＴ  ＴＣＣＣＴＧＴＡＣＴ  ＧＧ  ２２
【００６６】
配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１１
配列の長さ（ＳＥＱＵＥＮＣＥ  ＬＥＮＧＴＨ）：２０
配列の型（ＳＥＱＵＥＮＣＥ  ＴＹＰＥ）：核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）
鎖の数（ＳＴＲＡＮＤＥＤＮＥＳＳ）：一本鎖（ｓｉｎｇｌｅ）
トポロジー（ＴＯＰＯＬＯＧＹ）：直鎖状（ｌｉｎｅａｒ）
配列の種類（ＭＯＬＥＣＵＬＥ  ＴＹＰＥ）：他の核酸  合成ＤＮＡ（Ｏｔｈｅｒ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）
ハイポセティカル配列（ＨＹＰＯＴＨＥＴＩＣＡＬ  ＳＥＱＵＥＮＣＥ）：Ｎｏアンチセンス（ＡＮＴＩ−ＳＥＮＳＥ）：Ｎｏ
配列（ＳＥＱＵＥＮＣＥ  ＤＥＳＣＲＩＰＴＩＯＮ）
ＧＴＴＧＴＧＧＡＧＣ  ＴＣＧＡＣＧＴＣＣＣ  ２０
【００６７】
配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１２
配列の長さ（ＳＥＱＵＥＮＣＥ  ＬＥＮＧＴＨ）：２２
配列の型（ＳＥＱＵＥＮＣＥ  ＴＹＰＥ）  ：核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）
鎖の数（ＳＴＲＡＮＤＥＤＮＥＳＳ）：一本鎖（ｓｉｎｇｌｅ）
トポロジー（ＴＯＰＯＬＯＧＹ）：直鎖状（ｌｉｎｅａｒ）
配列の種類（ＭＯＬＥＣＵＬＥ  ＴＹＰＥ）  ：他の核酸  合成ＤＮＡ（Ｏｔｈｅｒ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）
ハイポセティイカル配列（ＨＹＰＯＴＨＥＴＩＣＡＬ  ＳＥＱＵＥＮＣＥ）：Ｎｏ
アンチセンス（ＡＮＴＩ−ＳＥＮＳＥ）：Ｎｏ
配列（ＳＥＱＵＥＮＣＥ  ＤＥＳＣＲＩＰＴＩＯＮ）
ＧＡＡＴＧＡＣＧＡＣ  ＡＡＴＧＧＣＴＡＴＧ  ＡＣ  ２２
【００６８】
配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１３
配列の長さ（ＳＥＱＵＥＮＣＥ  ＬＥＮＧＴＨ）：２２
配列の型（ＳＥＱＵＥＮＣＥ  ＴＹＰＥ）：核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）
鎖の数（ＳＴＲＡＮＤＥＤＮＥＳＳ）：一本鎖（ｓｉｎｇｌｅ）
トポロジー（ＴＯＰＯＬＯＧＹ）：直鎖状（ｌｉｎｃａｒ）
配列の種類（ＭＯＬＥＣＵＬＥ  ＴＹＰＥ）  ：他の核酸  合成ＤＮＡ（Ｏｔｈｅｒ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）
ハイポセティカル配列（ＨＹＰＯＴＨＥＴＩＣＡＬ  ＳＥＱＵＥＮＣＥ）：Ｎｏアンチセンス（ＡＮＴＩ−ＳＥＮＳＥ）：Ｎｏ
配列（ＳＥＱＵＥＮＣＥ  ＤＥＳＣＲＩＰＴＩＯＮ）
ＣＴＡＴＧＡＣＡＴＣ  ＡＧＣＧＡＣＴＡＣＴ  ＡＣ  ２２
【００６９】
配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１４
配列の長さ（ＳＥＱＵＥＮＣＥ  ＬＥＮＧＴＨ）：２３
配列の型（ＳＥＱＵＥＮＣＥ  ＴＹＰＥ）：核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）
鎖の数（ＳＴＲＡＮＤＥＤＮＥＳＳ）：一本鎖（ｓｉｎｇｌｅ）
トポロジー（ＴＯＰＯＬＯＧＹ）：直鎖状（ｌｉｎｅａｒ）
配列の種類（ＭＯＬＥＣＵＬＥ  ＴＹＰＥ）：他の核酸  合成ＤＮＡ（Ｏｔｈｅｒ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）
ハイポセティカル配列（ＨＹＰＯＴＨＥＴＩＣＡＬ  ＳＥＱＵＥＮＣＥ）：Ｎｏアンチセンス（ＡＮＴＩ−ＳＥＮＳＥ）：Ｎｏ
配列（ＳＥＱＵＥＮＣＥ  ＤＥＳＣＲＩＰＴＩＯＮ）
ＧＧＡＣＣＴＧＧＴＧ  ＧＴＣＡＡＣＣＡＴＡ  ＣＣＴ  ２３
【００７０】
配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１５
配列の長さ（ＳＥＱＵＥＮＣＥ  ＬＥＮＧＴＨ）：２６
配列の型（ＳＥＱＵＥＮＣＥ  ＴＹＰＥ）：核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）
鎖の数（ＳＴＲＡＮＤＥＤＮＥＳＳ）：一本鎖（ｓｉｎｇｌｅ）
トポロジー（ＴＯＰＯＬＯＧＹ）：直鎖状（ｌｉｎｅａｒ）
配列の種類（ＭＯＬＥＣＵＬＥ  ＴＹＰＥ）：他の核酸  合成ＤＮＡ（Ｏｔｈｅｒ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）
ハイポセティカル配列（ＨＹＰＯＴＨＥＴＩＣＡＬ  ＳＥＱＵＥＮＣＥ）：Ｎｏアンチセンス（ＡＮＴＩ−ＳＥＮＳＥ）：Ｎｏ
配列（ＳＥＱＵＥＮＣＥ  ＤＥＳＣＲＩＰＴＩＯＮ）
ＣＴＧＧＡＡＴＴＣＣ  ＣＴＧＴＡＣＴＧＧＡ  ＡＣＡＡＣＣ  ２６
【００７１】
配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１６
配列の長さ（ＳＥＱＵＥＮＣＥ  ＬＥＮＧＴＨ）：１９
配列の型（ＳＥＱＵＥＮＣＥ  ＴＹＰＥ）：核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）
鎖の数（ＳＴＲＡＮＤＥＤＮＥＳＳ）：一本鎖（ｓｉｎｇｌｅ）
トポロジー（ＴＯＰＯＬＯＧＹ）：直鎖状（ｌｉｎｅａｒ）
配列の種類（ＭＯＬＥＣＵＬＥ  ＴＹＰＥ）  ：他の核酸  合成ＤＮＡ（Ｏｔｈｅｒ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）
ハイポセティカル配列（ＨＹＰＯＴＨＥＴＩＣＡＬ  ＳＥＱＵＥＮＣＥ）：Ｎｏアンチセンス（ＡＮＴＩ−ＳＥＮＳＥ）：Ｎｏ
配列（ＳＥＱＵＥＮＣＥ  ＤＥＳＣＲＩＰＴＩＯＮ）
ＣＧＡＡＴＴＣＧＡＡ  ＣＡＣＣＣＴＧＧＧ  １９
【００７２】
配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１７
配列の長さ（ＳＥＱＵＥＮＣＥ  ＬＥＮＧＴＨ）：１７
配列の型（ＳＥＱＵＥＮＣＥ  ＴＹＰＥ）  ：核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）
鎖の数（ＳＴＲＡＮＤＥＤＮＥＳＳ）：一本鎖（ｓｉｎｇｌｅ）
トポロジー（ＴＯＰＯＬＯＧＹ）：直鎖状（ｌｉｎｅａｒ）
配列の種類（ＭＯＬＥＣＵＬＥ  ＴＹＰＥ）：他の核酸  合成ＤＮＡ（Ｏｔｈｅｒ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）
ハイポセティカル配列（ＨＹＰＯＴＨＥＴＩＣＡＬ  ＳＥＱＵＥＮＣＥ）：Ｎｏアンチセンス（ＡＮＴＩ−ＳＥＮＳＥ）：Ｎｏ
配列（ＳＥＱＵＥＮＣＥ  ＤＥＳＣＲＩＰＴＩＯＮ）
ＣＣＡＴＡＡＧＧＡＴ  ＣＣＴＣＣＡＧ  １７
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、制限酵素部位が示されたα−グルコシダーゼ遺伝子の模式図における変異の戦略を示す図である。下部にアラビア数字が付された丸印は変異の部位を示し、各矢印はＰＣＲのプライマーを示す。上記模式図の下部に位置する、上部にローマ数字等が付された長い四角は、上記プライマーにより増幅されたα−グルコシダーゼ遺伝子の断片を示す。
【図２】図２は、α−グルコシダーゼ遺伝子の中で変異と関係のある部分の配列を示す。上向き及び下向きで示された各矢印は変異部位を示し、変異後の配列を各矢印の先端に示す。塩基配列の下にふされている下線は変異導入用オリゴヌクレオチドの部分を示す。塩基配列の上に別の塩基配列と共に付された矢印はフラグメントＩＩを増幅するためのＰＣＲプライマーを示す。
【図３】図３は、マルトース、トレハロース、シュクロース又はイソマルトースに対する野性型及び変異型酵素のＫｍ値を示す。
【図１】
0003811215.tif 000007
【図２】
0003811215.tif 000008
【図３】
0003811215.tif 000009