(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程ａ)、ｂ)およびｃ)を含むことを特徴とする、タンパク質の高濃度化方法。
ａ)未精製または予備精製したタンパク質を固定化銅(II)イオンに吸着させる工程、
ｂ)吸着したタンパク質をルイス塩基溶液で洗浄する工程、および
ｃ)所望のタンパク質を０．００１Ｍを越えるイオン性化合物を含有しない脱イオン水で溶出する工程。
【請求項２】
銅(II)イオンが固定化支持体に固定化されている、請求項１の方法。
【請求項３】
固定化支持体がアガロースまたはビニルポリマーである、請求項２の方法。
【請求項４】
ルイス塩基溶液が中性もしくは低アルカリ性ｐＨ域でＮＨ4+または一級、二級もしくは三級アミンを含有するか、あるいは高アルカリ性ｐＨ域でＯＨ-を含有する、請求項１の方法。
【請求項５】
ルイス塩基溶液がＮＨ4+または一級、二級もしくは三級アミンを含有する、請求項１の方法。
【請求項６】
ルイス塩基溶液がＮＨ4+または一級アミンを含有する、請求項１の方法。
【請求項７】
ルイス塩基溶液がｐＨ９−１１の緩衝ｐＨ域でＯＨ-を含有する、請求項１の方法。
【請求項８】
ルイス塩基がエタノールアミン、シスチン、ＮＨ4ＳＣＮ、ＮＨ4Ｃｌ、ＮＨ4+ＣＨ3ＣＯＯ-、(ＮＨ4)2ＳＯ4およびＴＲＩＳ−ＨＣｌから成る群より選択されるものである、請求項１の方法。
【請求項９】
ルイス塩基を０．００１Ｍないし１Ｍの濃度で用いる請求項１の方法。
【請求項１０】
ルイス塩基溶液が一種またはそれ以上の非ルイス塩基である塩を更に含有する、請求項１の方法。
【請求項１１】
更に含有する塩がＮａＣｌまたはＫＣｌである、請求項１０の方法。
【請求項１２】
更に含有する塩を５Ｍまでの濃度で用いる、請求項１０の方法。
【請求項１３】
更に含有する塩を２Ｍまでの濃度で用いる、請求項１０の方法。
【請求項１４】
ルイス塩基をｐＨ６−９に調整する、請求項５の方法。
【請求項１５】
タンパク質が、当該タンパク質と銅(II)イオンとの間で形成される複合体がルイス塩基では分解されないようなものであることを特徴とする、請求項１の方法。
【請求項１６】
タンパク質がインターフェロン、アミラーゼ、トリプシンまたは関連のタンパク質であることを特徴とする、請求項１の方法。
【請求項１７】
タンパク質がインターフェロン−α、トリプシンおよびα−アミラーゼから成る群より選択されるものであることを特徴とする、請求項１の方法。
【請求項１８】
脱イオン水が非イオン性化合物を含有する、請求項１の方法。
【請求項１９】
脱イオン水が糖またはポリオールを含有する、請求項１の方法。
【請求項２０】
脱イオン水がマンニトールまたはグリセロールを含有する、請求項１の方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は銅キレート−アフィニティークロマトグラフィーによるタンパク質の新規精製方法に関する。
銅キレート−アフィニティークロマトグラフィーはタンパク質の近接可能な電子供与基、例えばヒスチジンを銅イオンに結合させることでその機能を果たす。該銅イオンは固定化支持体に共有結合したキレート基が保持している。通常は近接可能なヒスチジンが一個存在すれば、銅(II)−ＩＤＡ−キレート(ＩＤＡ＝イミノジアセテート)上にタンパク質を吸着せしめるのに十分である。銅キレート−アフィニティークロマトグラフィーにおけるタンパク質の保持力は、タンパク質上に張り出した該金属と相互作用し得る基の数と種類に依存する。この相互作用は種々の独立変数、例えば、ｐＨ、温度、溶媒種、塩種、塩濃度などにより影響を受ける。中性または低アルカリｐＨ領域で銅キレートに結合しているタンパク質は、通常、ｐＨ低減グラジエント法(連続もしくは段階的)あるいはバッファー中の競合試薬、例えば、イミダゾールなどのルイス塩基を増濃するグラジエント法(連続もしくは段階的)により溶出される。代替法として可能な三番目の溶出法は、ＥＤＴＡなどのキレート化剤を溶出液と共に用いる方法である。
しかしながらこれらの方法には幾つかの欠点がある。
・低選択性、すなわち、数種のタンパク質が同一条件下で溶出されること
・濃度が低いこと
・競合試薬またはキレート化剤を用いた場合、高濃度の銅(II)イオンがタンパク質と共に溶出されること
・溶出溶媒を除去するために更に精製工程を必要とすること
・選択性を高めるために、通常、連続グラジエント法を用いて所望のタンパク質を溶出しなければならないこと。
例えば、タンパク質を競合試薬またはキレート化剤を用いて溶出する場合、溶出液は当該タンパク質と共に競合試薬またはキレート化剤および遊離した銅(II)イオンを含んでいる。それ故、該競合試薬および銅(II)イオンを除去するために更に精製工程を経なければならないし、また、多くのタンパク質はその溶液中に高濃度の銅(II)イオン(酸化作用)が存在するとき、あるいはｐＨ値が低い(沈殿生成)ときには不安定となり、不活性されてしまう。
本発明は、銅キレート複合体からタンパク質を溶出するための驚異的に有利な方法を提供する。本発明方法を使用すれば、驚くべきことに脱イオン水で所望のタンパク質を溶出することが可能となる。該脱イオン水は要すれば該タンパク質の安定化剤を含有していてもよい。脱イオン水の使用には既存技術にはない幾つもの利点がある。
・競合試薬あるいはキレート化剤を使用しないので、余分の精製工程が不要である
・酸化の問題を惹き起こすことのある高濃度の銅(II)イオンを所望タンパク質と一緒に溶出することもない
・沈殿あるいは不活化の問題を惹き起こすことのある低ｐＨ値では所望のタンパク質を溶出しない
・所望のタンパク質を特に高い純度と高い収率で回収できる
・溶出は(連続または段階的)グラジエント法を適用する代わりにワンステップで実施することができる
・溶出したタンパク質は更に処理することなく保存することができる。
発明の詳細な説明
本発明は以下の工程ａ)、ｂ)およびｃ)からなるタンパク質の高濃度化方法に関する：
ａ)未精製または予め精製したタンパク質を固定化銅(II)イオンに吸着させる工程
ｂ)吸着したタンパク質をルイス塩基溶液で洗浄する工程、および
ｃ)所望のタンパク質を脱イオン水で溶出する工程。
通常、銅(II)イオンは、固定化支持体、例えばシリカまたはポリマーマトリックスなどの無機担体に固定化する。
固定化支持体は銅(II)イオンとキレートを形成し得るものであることが必要である。そのような固定化支持体の例としては、キレート化基としてイミド酢酸(ＩＤＡ)、Ｎ,Ｎ,Ｎ'−トリス(カルボキシメチル)−エチレンジアミン(ＴＥＤ)、カルボキシメチル化アスパラギン酸(ＣＭ−ＡＳＰ)、テトラエチレン・ペンタミン(ＴＥＰＡ)ニトリロ酢酸(ＮＴＡ)またはカルボキシメチル化α、βジアミノこはく酸(ＣＭ−ＤＡＳＡ)などが該固定化支持体に共有結合したものが挙げられる。キレート化基は固定化支持体に直接結合していてもよいし、スペーサーを介して結合していてもよい。該ポリマー担体は金属イオン−アフィニティクロマトグラフィーに通常使用されるポリマー化合物であればどのようなものでもよい。そのようなポリマー物質を例示すれば、アガロース、デキストランあるいは他の合成ポリマーが例示できる；好ましくは、アガロースおよびビニルポリマー類である。固定化支持体にキレート化基が共有結合したものの製造方法は、例えば、ホチュリー(Ｈochuli)、ＣＨＩＭＩＡ(１９８６)、４０、４０８−４１２に記載されている(参照：フィゲロア(Ｆigueroa)ら、Ｊ．Ｃhromatography(クロマトグラフィー)(１９８６)、３７１、３３５−３５２；ポラス(Ｐorath)、タンパク質発現と精製(Ｐrotein expressionand purification)(１９９２)、３、２６３−２８１；エル・カゲダル(Ｌ．Ｋagedal)、タンパク質精製、原則、高分解法および応用、ジャンソン(Ｊanson)およびライデン(Ｒyden)編集(１９８９)、２２７−２５１、ＶＣＨ出版、ニューヨーク)。本発明の好ましい態様によれば、固定化支持体は、１−２００μmol／mlの固定化支持体濃度、より好ましくは１０−１００mol／mlの濃度で銅(II)イオンとキレートを形成し得る。
本発明に用いる好ましいポリマー担体は以下のような市販のものである：
・キレート化セファロース・ファスト・フロー(登録商標)(Ｃhelating−Ｓepharose Ｆast Ｆlow)(ファルマシア、ウプサラ)：本物質においてはスペーサー上のイミノ酢酸基が安定なエーテル結合を介してセファロース・ファスト・フローに結合している；
・キレート化セファロース６Ｂ(Ｃhelating Ｓepharose ６Ｂ)(ファルマシア、ウプサラ)；および
・ＴＳＫトヨパールＡＦ−キレート−６５０Ｍ(登録商標)(ＴＳＫ Ｔoyopearl ＡＦ−Ｃhelate−６５０Ｍ)(トーソーハース(Ｔoso Ｈaas)、シュトウットガルト)：本品ではイミノジ酢酸基が親水性半固形の固相化支持体に固定化されており、当該支持体はオリゴエチレングリコール、メタクリル酸グリシジルおよびジメタクリル酸ペンタエリスリトールから成る共重合体でできている。
銅(II)イオンの固定化に先立って、通常、固定化支持体を洗浄する。例えば、固定化支持体を以下の順で洗浄する；１−１０床容量、好ましくは３−７床容量の５−５０％、好ましくは１０−３０％エタノール；１−１０床容量、好ましくは３−７床容量の脱イオン水；１−１０床容量、好ましくは３−７床容量の０.０１−０.１Ｍ、好ましくは０.０３−０.０７Ｍ  ＥＤＴＡおよび０.１−１Ｍ、好ましくは０.３−０.７Ｍ ＮａＣｌ；１−１０床容量、好ましくは３−７床容量の０.０５−１Ｍ、好ましくは０.１−０.５Ｍ  ＮａＯＨおよび０.１−５Ｍ、好ましくは０.５−２Ｍ  ＮａＣｌ；１−１５床容量、好ましくは３−１０床容量の脱イオン水；および最終工程で１−１０床容量、好ましくは３−７床容量の０.０１−１％、好ましくは０.０５−０.５％ぎ酸および１−１５床容量、好ましくは３−１０床容量の脱イオン水。これら洗浄液の流速は通常単位時間当たり１−５０床容量、好ましくは５−２０床容量である。
上記の固定化支持体に銅(II)イオンを固定化するには、単に第二銅イオンを固定化支持体に負荷させることで実施できる。共通の銅(II)イオン源は銅(II)塩であり、例えば、ＣｕＣｌ2、Ｃｕ(ＣＨ3ＣＯＯ)2、および、特に、ＣｕＳＯ4などである。通常、１−１０床容量、好ましくは３−７床容量の０.００１−０.１Ｍ、好ましくは０.００３−０.０１ＭのＣｕＳＯ4×５Ｈ2Ｏ水溶液を用い、ついで固定化支持体を大過剰の水で洗浄して残存する未結合第二銅イオンを除去する。このように調製した固定化銅(II)イオン含有固定化支持体はそのまま本発明の工程に使用することができる。
場合により、タンパク質含有溶液を負荷する前に、タンパク質の吸着の際に当該固定化支持体が膨潤あるいは収縮するのを避けるために、固定化支持体、タンパク質含有溶液のｐＨおよびイオン強度に応じて、固定化支持体を同一のｐＨおよびイオン強度を有する溶液で予め処理するのが好ましい。そのような処理が必要かどうかは少量での試験により容易に確かめることができる。この前処理は、１−１０床容量、好ましくは３−７床容量の処理液を固定化支持体に流すことで達成できる。
上記のように調製した固定化支持体にキレート形成によってタンパク質を吸着せしめるには、該タンパク質含有溶液を固定化した銅(II)イオン含有カラムに装填するだけでよい。
タンパク質溶液は種々の起源のものが可能であり、また、予め精製してもしなくてもよい。例えば、単離すべきタンパク質が、宿主が培養液中に分泌したものである場合、例えば、遠心した培養液を直接固定化支持体に加えることも可能である。生成したタンパク質が宿主中に保持されている場合には、細胞を破壊してタンパク質含有溶液を、例えば、遠心により細胞破砕物から分離しなければならない。このようにして得られたタンパク質含有溶液を上述のように直接固定化支持体に加えてもよいし、例えば当該技術分野でよく知られた沈殿法、抽出法、クロマトグラフィー法などにより更に精製してもよい。従って、該タンパク質含有溶液は種々起源のものであってもよいし、また、種々の不純物、例えば、イオン性種、外来タンパク質等を含んでいてもよい。
あるタンパク質を本発明方法で精製可能か否かは小規模の実験で決めることができる。この場合、該タンパク質を少量の銅(II)負荷固定化支持体に吸着させ、下記のごときルイス塩基で処理し、次いで脱イオン水で溶出するタンパク質量を定量し、２Ｍ  ＮＨ4Ｃｌで溶出するタンパク質量と比較する。一般に、本発明工程は下記のようなルイス塩基が当該タンパク質と銅(II)イオンとの間の複合体を破壊しないことで特徴づけられるタンパク質に適用できる。好ましいタンパク質は、インターフェロン、アミラーゼおよび関連タンパク質である。とりわけ、インターフェロン−α、トリプシン、α−アミラーゼが好ましい。
固定化支持体に装填するタンパク質含有溶液の量は、この固定化支持体に固定化した銅(II)イオン濃度、該溶液中のタンパク質濃度およびタンパク質の性質に依存する。それ故、装填すべき溶液の適量は、ＵＶモニターなどの検出器による流出液の観察により実験的に決定する。
本発明における重要な工程は、脱イオン水での流出に先立って、固定化支持体に吸着したタンパク質をルイス塩基で洗浄する工程である。ルイス塩基とはアミン、ＨＯ-、フォスファン、ホスフィンなどの電子対供与体である。それらを例示すれば、ＮＨ3、ＣＨ3ＮＨ2、(ＣＨ3)2ＮＨ、(ＣＨ3)3Ｎ、Ｃ2Ｈ5(ＣＨ3)2Ｎ、Ｃ2Ｈ5ＮＨ2、(Ｃ2Ｈ5)2ＮＨ、(Ｃ2Ｈ5)3Ｎ、Ｃ3Ｈ7ＮＨ2、Ｃ4Ｈ9ＮＨ2、Ｃ5Ｈ11ＮＨ2、Ｃ6Ｈ13ＮＨ2、ＣＨ3ＰＨ2、(ＣＨ3)2ＰＨ、(ＣＨ3)3Ｐ、アミノ酸類、シスチン、ヒドロキシル担持アミン(ＨＯＣＨ2ＮＨ2、(ＨＯＣＨ2)2ＮＨまたは(ＨＯＣＨ2)3Ｎ、ＨＯＣ2Ｈ4ＮＨ2、(ＨＯＣ2Ｈ4)2ＮＨまたは(ＨＯＣ2Ｈ4)3Ｎ、またはトリス−塩酸(ＴＲＩＳ−ＨＣｌ)など)である。
本発明の好ましい形態において、当該ルイス塩基溶液は中性または弱アルカリｐＨ領域においてＮＨ4+または一級、二級もしくは三級アミンを含んでおり、強アルカリｐＨ領域においてＯＨ-を含んでいる。より好ましい本発明の形態において、当該ルイス塩基溶液はＮＨ4+または一級、二級もしくは三級アミンを含んでおり、最も好ましい形態は、ＮＨ4+または一級アミン(エタノールアミン、シスチン、ＮＨ4ＳＣＮ、ＮＨ4Ｃｌ、ＮＨ4+ＣＨ3ＣＯＯ-、(ＮＨ4)2ＳＯ4およびＴＲＩＳ−ＨＣｌなど)含有溶液である。
所望のタンパク質をルイス塩基溶液で溶出しないようにするために、ルイス塩基濃度またはルイス塩基含有溶液のｐＨを制御する。アミン(ルイス塩基)濃度の好ましい範囲は０.００１ないし１Ｍである。
ルイス塩基の最適濃度は電子供与体に大きく依存する。例えば、シスチンの場合１ｍＭの濃度が最適であるが、ＮＨ4Ｃｌの場合には３００−５００ｍＭの濃度は最適である。幾種類かの塩についてその最適濃度を示すと、例えば、ＮＨ4ＳＣＮの場合は１０−１００ｍＭ、ＮＨ4Ｃｌでは１０−５００ｍＭ、ＮＨ4(ＣＨ3ＣＯＯ)では１０−８００ｍＭ以上、(ＮＨ4)2ＳＯ4では１０−５００ｍＭ以上などである。
ルイス塩基としてアミンを用いる場合には、ｐＨを好ましくは６−９に、より好ましくは６.５−８.５、最も好ましくは７.０−８.０に調整する。ＯＨ-をルイス塩基として用いる場合は、例えば、ほう酸塩もしくは燐酸塩バッファーで、好ましくはｐＨ９−１１に調整する。
また、異なるルイス塩基の混合物を用いて結果を改善したり、あるいはＮａＣｌもしくはＫＣｌなどの非ルイス塩基である塩を更に加えることも可能である。当該添加塩の濃度は５Ｍまで、好ましくは２Ｍまでである。
一般例として示すと、タンパク質をすでに吸着している固定化支持体は１−１０床容量、好ましくは３−７床容量の上述洗浄液で洗浄する。その際の流速は実験的に決めるが、例えば、１−１０床容量／時、好ましくは３−５床容量／時である。
上述のごとく、洗浄工程はタンパク質を脱イオン水で溶出する直前に実施するのが有利である。溶出工程を洗浄後直ちに実施する場合、この洗浄工程をタンパク質の装填と同時に実施することも可能である。
上述のごとく、ルイス塩基での洗浄後、所望のタンパク質は固定化支持体を脱イオン水で洗浄するだけで溶出させることができる。高純度とするためには、脱イオン水は０.００１Ｍを越えるイオン性化合物を含んでいてはならない。逆に、脱イオン水は、例えば、該タンパク質の三級もしくは四級構造を安定化する非イオン性化合物を含んでいてもよい。適当な非イオン性化合物とは、例えば、マンニトール、グルコース、ラクトース、フルクトース、グリセロール、ポリエチレングリコールなどの糖類もしくはポリオール類、あるいはタンパク質のスルフヒドリル基の酸化状態を維持する他の化合物類である。脱イオン水は、好ましくは１−１０床容量、より好ましくは３−７床容量の量で用いる。
本発明方法においては、固定化支持体に特異的に結合する殆どの外来タンパク質は脱イオン水で溶出しない。それらは吸着されたままであり、古典的な溶出液(例えば、２Ｍ ＮＨ4Ｃｌ／２５ｍＭ ＴＲＩＳ−ＨＣｌバッファー、ｐＨ７.６)で事後除去することができる。それ故、得られる生成物の濃度はとりわけ高いものとなる。例えば、インターフェロン−αＢ1Ｄ2Ｂ3Ｂ4の場合、３０％純度の吸着溶液から出発した生成物の純度は９０％と高く、先行技術である銅キレート−アフィニティークロマトグラフィーでは高々３０−５０％の純度しか達成できない。
所望のタンパク質の純度および回収率を最適化するために、適当なバッファー、例えば、ほう酸カリウムバッファー、および／または脱イオン水での一回ないし複数回の洗浄工程をタンパク質吸着工程とルイス塩基での洗浄工程の間に適宜挿入してもよい。従って、本発明のより好ましい態様においては、吸着したタンパク質をルイス塩基溶液での洗浄に先立って、ルイス塩基でないバッファーで洗浄するか、および／または脱イオン水で洗浄する。この発見は、洗浄工程と溶出工程を同一の手段、すなわち脱イオン水を用いて実施することができるという意味で驚くべきことである。
この脱イオン水を用いる中間的な洗浄工程は、例えば、副生成物の除去、特に、疎水性相互作用(特殊な銅イオンの親和性によるものではない)により固定化支持体に結合した副生物の除去に効果がある。
銅(II)キレートに基づく他の精製手法からも分かるように、単離したタンパク質溶液は僅かながら銅(II)イオンを含んでいる可能性がある。これらのイオンは、イオン交換もしくは銅(II)イオンキレート化カラムなどの既存の方法で容易に除去することができる。後者の精製工程は別途行ってもよいし、処理後直ちに行ってもよい；この工程は、例えば、当該カラムの下段に銅(II)イオン除去物質を詰めて行う。
精製終了後、銅負荷固定化支持体を洗浄し、次回の精製工程に使用してもよいが、好ましくは、再現性を良くするために固定化支持体から銅(II)イオンを競合的キレート化試薬、例えば、ＥＤＴＡを用いて除去し、次いで、上記のごとくに固定化支持体に銅(II)イオンを負荷する。
実施例
実施例１：ＩＦＮ−Ｂ／Ｄの精製
組換えヒト・ハイブリッド・インターフェロン−αＢ1Ｄ2Ｂ3Ｂ4(以下、ＩＦＮ−Ｂ／Ｄという)をＥＰ−Ａ−２０５４０４の記載に従って構築した。ＩＦＮ−Ｂ／Ｄはサッカロミセス・セレビシエ(Ｓaccharmyces cerevisiae)ＨＴ３９３株により製造する；当該株はハイネマイヤー(Ｈeinemeyer)ら(ＥＭＢＯジャーナル(１９９１)、１０、５５５−５６２；ＤＳＭ９６９７)により開示されたＥ９５−１−２Ａと同一であり、プラスミドpDP34R/PH05/IFN AM119で形質転換されている。酵母ベクターｐＤＰ３４Ｒおよび酵母酸性ホスファターゼ遺伝子プロモーターＰＨＯ5についてはヒンネン(Ｈinnen)らの著書(酵母遺伝子工学(Ｙeast Ｇenetic Ｅngineering)、バー(Ｂarr)ら監修、バターウオース(Ｂutterworths)、ボストン、(１９８９)、１９３−２１３)に引用がある。IFN AM119はＩＦＮ−Ｂ／Ｄのコード配列であり、ＥＰ−Ａ−２０５４０４に引用がある。
ＩＦＮ−Ｂ／Ｄをコードする組換えプラスミド含有の酵母ＨＴ３９３株は大規模醗酵タンク中で成長させる。醗酵終了後、生物産生有機物を遠心分離により集める。得られる細胞沈降物を０.５Ｍ ＮａＣｌ含有０.０７Ｍ燐酸カリウムバッファーで５０％湿潤細胞濃度(乾燥細胞濃度どして１０％)に希釈する。ガラス−ビーズ摩砕機を通して細胞を破砕した後、ＩＦＮ−Ｂ／Ｄタンパク質を細胞ホモジネートから水系二相系に分配することにより抽出する；該二相系は４０％重量の細胞ホモジネート、１８％重量のポリエチレングリコール１５００、４％重量の燐酸カリウム(ｐＨ７)および１mol／kg総濃度相当のＮａＣｌから成る。遠心式ディスク濃縮分離機により８１５０rpm(１３０００ｇ)で相分離した後、上層を回収、第二の水系二相系に分配して洗浄する；該二相系は４重量部の上層と２０％重量燐酸カリウム(ｐＨ７)含有１mol／kg ＮａＣｌ溶液１重量部とを混合したものである。沈降槽中で相分離した後、ＩＦＮ−Ｂ／Ｄを新たな上層から第三の水系二相系への逆抽出により回収する；該水系二相系とは第二の二相系の上層３重量部および７重量部の１.５６mol／kg硫酸マグネシウム溶液を混合して調製したものである。沈降槽中での相分離終了後、下層を回収し、２倍容量の水で希釈し、０.２ミクロンフィルターで濾過し、次いで、銅キレート−クロマトグラフィーに付す前に４℃で数日保存する。
この吸着溶液は以下の特性を有する：ｐＨ５.６、伝導率約４３ｍＳ／cm(主にＭｇＳＯ4による)、ポリエチレングリコール濃度６mg／ml、ＩＦＮ−Ｂ／Ｄ濃度約０.１−０.１５mg／ml、ＩＦＮ−Ｂ／Ｄ濃度総タンパク質含量の約３０％。
銅キレート−クロマトグラフィーは１００mlのキレート化セファローズ・ファスト・フロー(登録商標)(Ｓepharose Ｆast Ｆlow)(ファルマシア、ウプサラ)を充填したカラム(直径４４mm)を用いて室温で行う。固定化支持体は以下の順序で連続的に洗浄する：２０％エタノール５床容量、脱イオン水５床容量、０.０５Ｍ ＥＤＴＡおよび０.５Ｍ ＮａＣｌ ５床容量，０.２５Ｍ ＮａＯＨおよび１Ｍ ＮａＣｌ ５床容量、脱イオン水７床容量、０.１％ぎ酸５床容量、および脱イオン水７床容量；流速は単位時間当たり１２床容量である。次いで固定化支持体に第二銅イオンを負荷するが、その際、０.００８Ｍ ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ溶液５床容量を装填し、次いで大量の脱イオン水ですすぐ；そうすることで残存未反応の銅が除去される。吸着工程に先立って、カラムは５００mlバッファー溶液で平衡化する；該バッファー溶液は０.６８Ｍ ＭｇＳＯ4および０.０９２Ｍ酢酸ナトリウムから成り、ｐＨは酢酸で５.６に調整してあり、吸着溶液と略同じ伝導率、すなわち４３ｍＳ／cmを有する。次いで、５０００mlのＩＦＮ−Ｂ／Ｄ吸着溶液を流速３００ml／ｈで当該カラムに流す。流出液は波長２８０nmに設定したＵＶ−モニターで追跡する。
カラムに添加後、５００ml／ｈの流速で洗浄を連続して３回実施する；最初の洗浄は吸着前にすでに使用したｐＨ５.６の平衡用バッファー５００mlで行う；二度目の洗浄は脱イオン水５００mlで行う；三度目の洗浄は０.２Ｍ ＮＨ4Ｃｌおよび１Ｍ ＮａＣｌを含有する０.０２５Ｍ ＴＲＩＳ−ＨＣｌバッファー(ｐＨ７.６)５００mlで行う。次いで、ＩＦＮ−Ｂ／Ｄを再び脱イオン水４００mlを用いて流速５００ml／ｈで溶出する。３回の洗浄液および水溶出液はＵＶ−モニターで制御しながら採取する。
吸着溶液、３回の洗浄液および水流出液のそれぞれのＩＨＮ−Ｂ／Ｄ濃度を逆相ＨＰＬＣ分析により測定した(カラム：ヴァイダック(Ｖydac)Ｃ−１８、３０nm、粒子サイズ５ミクロン；移動相Ａ：０.１％トリフルオロ酢酸・水；移動相Ｂ：８０％アセトニトリル、１９.９１％水および０.０９％トリフルオロ酢酸；流速１ml／min；注入量０.０５ml；２１６nmにてＵＶ検出)。
３回の洗浄液中のＩＦＮ−Ｂ／Ｄ量は無視し得る。すべての予想に反して、約７０％の収量で回収される高純度のＩＦＮ−Ｂ／Ｄを含んでいる；これは総タンパク質含量の約９０％である(すなわち、ファクター３によるＩＦＮ−Ｂ／Ｄの高濃度化)。
この水流出液が特に驚異的なのは、２度目の洗浄液にはＩＦＮ−Ｂ／Ｄが検出されないことである(５％以下の回収率)；この２度目の洗浄液は全く同一の液体、すなわち精製水である。
この水流出液は低塩濃度とｐＨ約８で特に高いＩＦＮ−Ｂ／Ｄ濃度(約１mg／ml)を示し、４℃での貯蔵に安定である；ＩＦＮ−Ｂ／Ｄの沈殿は数日以上生じない。
実施例２：水溶出により得られる種々ＩＦＮ−Ｂ／Ｄ溶液の特徴づけ
ＩＦＮ−Ｂ／Ｄ水溶液は実施例１に記載した方法と同様に水での溶出により得られる。ただし、溶出に用いる水の容量を変えるか、および／または水溶出に先行する洗浄工程のバッファーの組成を変える。
第一のＩＦＮ−Ｂ／Ｄ溶液は実施例１で述べたと同じ洗浄バッファー(０.２Ｍ ＮＨ4Ｃｌおよび１Ｍ ＮａＣｌ含有０.０２５Ｍ ＴＲＩＳ−ＨＣｌバッファーｐＨ７.６)を用い、且つ、溶出には脱イオン水約０.６７床容量のみを用いて得られる。
第二のＩＦＮ−Ｂ／Ｄ溶液は洗浄バッファーとして０.２Ｍ ＮＨ4Ｃｌ含有０.０２５Ｍ燐酸カリウムバッファーｐＨ７.６を用い、且つ、溶出には脱イオン水１.５床容量を用いて得られる。
第三のＩＦＮ−Ｂ／Ｄ溶液は洗浄バッファーとして０.０２５Ｍ ＴＲＩＳ−ＨＣｌバッファー７.６(ＮＨ4Ｃｌを含まず、ＮａＣｌも含まない)を用い、且つ、溶出には脱イオン水４床容量を用いて得られる。三種のＩＦＮ−Ｂ／Ｄ溶液の特性を表１に示す。
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第一の溶液は特に高いインターフェロン濃度(７mg／ml)を有し、４℃で保存した場合驚く程安定であることが分かる；ＩＦＮ−Ｂ／Ｄの沈殿は一夜生じない。比較のために示すと、純ＩＦＮ−Ｂ／Ｄの溶解性は０.１Ｍ燐酸カリウムバッファーｐＨ７.６または０.１Ｍ炭酸ナトリウムバッファーｐＨ８.０では０.５mg／ml以下である。
第二および第三の溶液を４℃で数日間保存する。これら両溶液について逆相ＨＰＬＣ分析(実施例１に記載のとおり)によりインターフェロン濃度を測定すると、１週間後にも不変であることが分かる。この安定性は第三の溶液の場合特に驚異的である；第三の溶液は１.５mg／mlという高いインターフェロン濃度で非常に低い塩濃度(伝導率＜０.５ｍＳ／cm)を示す。
実施例３：ＩＦＮ−Ｂ／Ｄ溶出における回収率の評価
実験にはＦＰＬＣ(登録商標)クロマトグラフィーシステム(ファルマシア、ウプサラ)およびキレート−セファローズ・ファスト・フロー(登録商標)(ファルマシア、ウプサラ)５mlを充填したガラスカラム(直径１０mm)を使用し、室温で実験する。流速はカラムにポンプで送るすべての溶液について６０ml／ｈに固定する。流出液は波長２８０nmに設定したＵＶ−モニターに送る。固定化支持体の調製および再生は実施例１記載のとおりに行うが、その際以下の溶液をポンプでカラムに送る：０.０５Ｍ ＥＤＴＡおよび０.５Ｍ ＮａＣｌ ２５ml、０.２５Ｍ ＮａＯＨおよび１Ｍ ＮａＣｌ ２５ml、脱イオン水３５ml、０.１％ぎ酸２５ml、脱イオン水３５ml、０.００８Ｍ ＣｕＳＯ4×５Ｈ2Ｏ ２５mlおよび脱イオン水４０ml。
最初の実験では、精製したＩＦＮ−Ｂ／Ｄ(純度：タンパク質含量として９９.９％；濃度：約０.３mg／ml)０.２Ｍマンニトールおよび０.０３Ｍ燐酸ナトリウムｐＨ７.６に溶解した溶液約８０mlをカラムに流し込む。０.３Ｍ塩化アンモニウムバッファーｐＨ７.６ ３５mlで洗浄後、インターフェロンを脱イオン水３５mlで溶出する。次いで、２Ｍ塩化アンモニウム含有０.０２５Ｍ ＴＲＩＳ−ＨＣｌバッファーｐＨ７.６ ３５mlをポンプでカラムに送り、流出液中のインターフェロンが完全に固定化支持体に結合したことを確認する。回収した各フラクションのインターフェロン濃度を実施例１に記載した逆相ＨＰＬＣ分析法により測定する。得られる各回収率を表２に示す。
０.３Ｍ塩化アンモニウムｐＨ７.６の代わりに、０.１Ｍほう酸カリウムｐＨ７.６を洗浄用バッファーとして用い、同じ実験を繰り返す。
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表２に示すように、溶出に先立って洗浄工程で使用するバッファーの組成は水での溶出に大きく影響する。
実施例４：洗浄工程の影響
実施例３で述べたと同じ実験を洗浄バッファーの組成のみを変えて数回実施した。試験した種々洗浄バッファーおよび相応する回収率を表３に示す。
0003833255.tif 000004
表３に示すごとく、水での溶出は洗浄バッファーのｐＨを塩基性域(例えば、０.１Ｍほう酸カリウムｐＨ９.５)としても、あるいは洗浄バッファーが略中性ｐＨ域にあって、アミンもしくはアンモニウム塩を含有していたとしても(例えば、０.３Ｍ酢酸アンモニウムｐＨ７.６；しかし、０.３Ｍ酢酸カリウムｐＨ７.６は不可)、収率がよい(６０％以上)。この場合、アミンは一級(例、トリエタノールアミン)、二級(例、ジエタノールアミン)もしくは三級(例、トリエタノールアミン)であってもよいが、四級アミン(例、塩化テトラメチルアンモニウム)は不可である。洗浄バッファーの最適濃度は使用するアミンに大きく依存する；例えば、シスチンｐＨ７.６の場合には約１ｍＭ、ＮＨ4Ｃｌ ｐＨ７.６の場合には３００−５００ｍＭである。
実施例５：ルイス塩基処理後の第２回目洗浄工程の影響
実施例３で述べたと同じ実験を繰り返す；ただし、２回目の洗浄工程は０.１Ｍほう酸カリウムバッファーｐＨ７.６ ３５mlで行い、０.３Ｍ塩化アンモニウムバッファーｐＨ７.６ ３５mlでの第一回目洗浄工程と水での溶出との間に挿入する。回収率は以下のとおりである。
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少量のＩＦＮ−Ｂ／Ｄが水溶出液中に検出される。しかし、第一回目洗浄工程にアンモニウムが存在したにかかわらず、回収率は低い(約２２％)；この事実は溶出直前の洗浄工程が如何に大きく影響するかを示している。
実施例６：洗浄工程がない場合のＩＦＮ−Ｂ／Ｄ溶出回収率
実施例３で述べたと同じ実験を繰り返す；ただし、吸着工程と水溶出工程との間の洗浄工程を省く。
第一回目の実験は実施例３に述べたと全く同一の流出溶液(０.２Ｍマンニトールおよび０.０３Ｍ燐酸ナトリウムｐＨ７.６に溶解した０.３mg／mlＩＦＮ−Ｂ／Ｄ)を使用し実施する。第二回目の実験も同一の流出溶液で実施するが、該流下液は更に０.３Ｍol／Ｌ濃度の塩化アンモニウムを含有している。それぞれの回収率を表４に示す。
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表４に示すごとく、溶出直前の流下バッファー組成は水での溶出に大きく影響する。
実施例７：塩析効果の影響
部分精製したＩＦＮ−Ｂ／Ｄ(純度：タンパク質含量として約９０％)の水溶液を実施例１に記載の方法と同様に水溶出により調製する。この溶液の一定分量を凍結し、−５ないし−１０℃で貯蔵後、使用前に融解する。
この貯蔵液の組成は以下のとおりである：
ＩＦＮ−ＢＤ：              ０.５−１mg／ml
ＴＲＩＳ−ＨＣｌ：          約０.０２Ｍ
ＮａＣｌ：                  約０.０１Ｍ
Ｎａ−酢酸塩：              約０.０１Ｍ
ＮＨ4Ｃｌ：                 約０.００２Ｍ
Ｃｕ2+：                    約１μＭ
ｐＨ：                      ８
伝導率：            ２.２ｍＳ／cm
実施例３に述べたと同一の実験を数回実施する；この際、保存液５０mlを送液し、洗浄バッファーの組成のみを変更する。試験した種々洗浄バッファーおよびそれから得られる対応回収率を表５に示す。
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試験した洗浄液のすべてがｐＨ７.６でアンモニウム塩である。対イオンとして用いるアニオンを表５に列記してあるが、その順番は水構造を崩壊する傾向(カオトロピック効果)を示し、疎水性相互作用の強度を相対的に減少していくものから、疎水性相互作用を増大する(塩析効果)のに特に効果のあるものの順に並べてある。
塩析効果を増大：ＳＣＮ-＜Ｃｌ-＜ＣＨ3ＣＯＯ-＜ＳＯ42-
表５に示すごとく：
−ＮＨ4ＳＣＮの場合(低塩析効果)、アンモニウム濃度が高すぎると(≧０.３Ｍ)、ＩＦＮ−Ｂ／Ｄは洗浄バッファーでそのまま溶出される。ＮＨ4ＳＣＮ濃度を≦０.１Ｍとすると水での溶出が高収率(≧９０％)で進行する。
−ＮＨ4Ｃｌの場合は、ＣＨ4Ｃｌ濃度を≦０.５Ｍとするとき水での溶出が高収率で進行する。
−ＮＨ4−酢酸塩の場合、０.８Ｍという高い濃度を用いることが可能となり、水での溶出も高収率となる。
−(ＮＨ4)2ＳＯ4の場合(高塩析効果)、アンモニウムを１.０Ｍと高くすることが可能であり、水での溶出も高収率となる。
実施例８：ｐＨおよび濃度の影響
実施例７で述べたと同一の実験を繰り返すが、この際、洗浄バッファーの組成を変える。試験した種々洗浄バッファーおよびそれから得られる対応回収率を表６に示す。
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表６に示すごとく：
−Ｋ−酢酸塩ｐＨ５.６(低ｐＨ値；アミンなし)およびトリス−塩酸ｐＨ５.６(低ｐＨ値；アミン存在)の場合、水溶出によって得られる回収率は非常に低い。
−トリス−塩酸ｐＨ７.６(略中性ｐＨ値；アミン存在)の場合、水溶出によって得られる回収率はよい(６０％以上)。アミン濃度が高すぎる(＞０.３Ｍ)とき、洗浄バッファーでもＩＦＮ−Ｂ／Ｄの部分溶出が起こる。アミン濃度が低すぎる(＜０.１Ｍ)場合は、水溶出が定量的でなくなり、ＩＦＮ−Ｂ／Ｄの残量を引き続き２Ｍ ＮＨ4Ｃｌ＋０.０２５Ｍ ＴＲＩＳ−ＨＣｌバッファーｐＨ７.６で溶出することとなる。この後者の問題を避けるためにＮａＣｌを(１.７Ｍ濃度で)含有させるが、ＮａＣｌは固定化支持体とインターフェロンタンパク質との間のイオン性相互作用を失活させることになる。
実施例９：グラジエントでの溶出
実施例７で述べたと同じ実験を、洗浄バッファーとして０.１Ｍ ＴＲＩＳ−ＨＣｌ ｐＨ７.６を用い実施する。水溶出での回収率は８９％である。残余のＩＦＮ−Ｂ／Ｄ(１１％)は引き続き２Ｍ ＮＨ4Ｃｌ＋０.０２５Ｍ ＴＲＩＳ−ＨＣｌバッファーｐＨ７.６で溶出する。
この実験を同一の洗浄バッファー(２０ml ０.１Ｍ ＴＲＩＳ−ＨＣｌ ｐＨ７.６)により繰り返すが、この洗浄工程に続いて直線的グラジエント溶出を１２床容量(６０ml)分、１００％洗浄バッファーないし１００％脱イオン水の条件で実施する。カラムを更に水５５mlですすぎ、次いで２度目の直線的グラジエント溶出を７床容量(３５ml)分、１００％水ないし２Ｍ ＮＨ4Ｃｌ＋０.０２５Ｍ ＴＲＩＳ−ＨＣｌバッファーｐＨ７.６１００％の条件で行う。最後にカラムをこの後者のバッファーですすぐ。
ＩＦＮ−Ｂ／Ｄは最初のグラジエントの終段階、すなわち、約１０ないし５ｍＭ ＴＲＩＳ−ＨＣｌ ｐＨ７.６で溶出されることが分かる；回収率は６０％である。残余のＩＦＮ−Ｂ／Ｄ(４０％)は二度目のグラジエントの中間段階、すなわち、約１Ｍ ＮＨ4Ｃｌ＋１２.５ｍＭ ＴＲＩＳ−ＨＣｌ ｐＨ７.６の対応する濃度で溶出される。
実施例１０：流出溶液の組成
実施例７に述べたと同じ実験を繰り返す；この場合、洗浄バッファーとして０.１Ｍ ＴＲＩＳ−ＨＣｌ ｐＨ７.６の溶液を常時用いるが、最初の溶出溶液の組成、すなわち、溶出のための水の組成を変化させる。試験した種々溶出溶液およびそれから得られる対応回収率を表７に示す。
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表７に示したごとく：
−ＩＦＮ−Ｂ／Ｄの溶出液を５０％以上の回収率で得るためには、水中の残余塩濃度は極度に低い(＜０.０００１Ｍ)ことが必要である。
−マンニトールあるいはグリセロールなどの未変化溶質は高濃度(１Ｍの範囲)で溶出溶液中に存在してもよいが、双性イオンは不可である。例えば、ＭＥＳ(２−[Ｎ−モルホリノ]エタンスルホン酸)は回収率をよくするために０.００１Ｍ以下でなければならない。
−溶出溶液の伝導率を、ＩＦＮ−Ｂ／Ｄ溶出液の存否予測のために基準として用いることはできない。
実施例１１：ＩＦＮ−ＢおよびＩＦＮ−Ｄ
ヒト・ハイブリッド・インターフェロン−αＢ1Ｄ2Ｂ3Ｂ4(ＩＦＮ−Ｂ／Ｄ)に代えて、実施例３記載のようにヒト・インターフェロン−αＢ(ＩＦＮ−Ｂ)またはヒト・インターフェロン−αＤ(ＩＦＮ−Ｄ)を用い、０.５mlのキレート化セファロース・ファスト・フロー(登録商標)(ファルマシア、ウプサラ)のみを充填した小型ガラスカラム(直径５mm)を使用し、実験を行う。カラムにポンプ送液する際の対応する流速および液量はファクター１０まで規模縮小する。
ＥＰ−Ａ−２０５４０４に記載のＩＦＮ−Ｂ／Ｄ親分子であるＩＦＮ−ＢおよびＩＦＮ−Ｄは、酵母(Ｓaccharomyces coervisiae)組換えＤＮＡの発現、醗酵、回収および部分精製により製造する。
ＩＦＮ−Ｂは、０.０２５Ｍ ＴＲＩＳ−ＨＣｌバッファーｐＨ７.６の保存液として得られ、その保存液中のインターフェロン濃度は０.０５mg／mlであり、実施例７記載のＩＦＮ−Ｂ／Ｄ保存液と同じ純度を示す。
ＩＦＮ−Ｄは保存液として得られ、その組成は実施例１記載のＩＦＮ−Ｂ／Ｄ吸着溶液と同じであり、純度も略同一である。
実施例３に記載のごとく、カラムに装填したインターフェロンは適当なバッファーで連続的に洗浄し、脱イオン水で溶出し、２Ｍ塩化アンモニウム含有０.０２５Ｍ ＴＲＩＳ−ＨＣｌ ｐＨ７.６で溶出する。収集したフラクションのインターフェロン濃度は、実施例１に記載したように逆相ＨＰＬＣ分析法により測定し、ウシ細胞(マジン−ダーバイ(Ｍadin−Ｄarby)ウシ細胞)を用いて水泡性口内炎ウイルスに対する生物学的抗ウイルス作用の試験管内分析により確認する。試験した種々洗浄バッファーおよびそれから得られる対応回収率を表８に示す。
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表８に示すように、ＩＦＮ−ＢおよびＩＦＮ−Ｄは水で溶出することができる。
実施例１２：α−アミラーゼおよびトリプシン
ＩＦＮ−Ｂ／Ｄについて実施例３に記載したと同様に、種々のタンパク質について実験する；その際、同一のＦＰＬＣ(登録商標)クロマトグラフィーシステム、同じ量(５ml)のキレート化セファロース・ファスト・フロー(登録商標)および同一のクロマトグラフィー条件を用いる。
試験したタンパク質は、バシラス種(Ｂacillus species)からのα−アミラーゼ(シグマ(Ｓigma)製品Ｎｏ.Ａ６３８０)、ウシ膵臓からのトリプシン(セルヴァ(Ｓerva)製品Ｎｏ.３７２６０)を使用する。実験を行うに当たっては、相当するタンパク質溶液約５０ml(０.５mg／ml濃度)を装填するが、ＴＲＩＳ−ＨＣｌを次工程洗浄バッファーとして用いる場合は、０.０１Ｍ ＴＲＩＳ−ＨＣｌバッファーｐＨ７.６溶液とし、また、Ｋ−ほう酸塩を次工程洗浄バッファーとして用いる場合あるいは洗浄工程を省略する場合は、０.０１Ｍほう酸カリウムバッファーｐＨ７.６溶液とする。
実施例３に記載のごとく、カラムに装填したタンパク質を連続的にバッファー(ＴＲＩＳ−ＨＣｌまたはＫ−ほう酸塩)で洗浄し、脱イオン水で溶出し、次いで、２Ｍ塩化アンモニウム含有０.０２５Ｍ ＴＲＩＳ−ＨＣｌバッファーｐＨ７.６で溶出する。収集したフラクションのタンパク質濃度をバイオ−ラッド(Ｂio−Ｒad)タンパク質アッセイ法(バイオ−ラッド製品Ｎｏ.５００−０００６、微量アッセイ手技)により測定する。試験したタンパク質および洗浄バッファー、並びに対応する回収率を表９に示す。
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表９に示したように：
−α−アミラーゼ(バシラス種由来)は以下の場合水で溶出できる(回収率：約９０−１００％)：洗浄バッファーのｐＨ値が塩基性領域にある場合(例えば、０.１Ｍほう酸カリウムｐＨ９.５)、または洗浄バッファーが略中性ｐＨ値、且つ適正な濃度でアミンを含有している場合(０.０２５ないし０.１Ｍ ＴＲＩＳ−ＨＣｌ ｐＨ７.６)。
−トリプシン(ウシ膵臓由来)もまた、例えば、洗浄バッファーとして０.０２５Ｍ ＴＲＩＳ−ＨＣｌを使用することにより、水で溶出することができる(回収率：４０％以上)。
実施例１３：クロマトグラフ媒体
実施例７に述べたと同じ実験を二度行うが、その際、洗浄バッファーとして０.１ＭＴＲＩＳ−ＨＣｌｐＨ７.６を常時使用し、クロマトグラフィーの媒体を変化させる。
最初の実験で用いる媒体は、実施例１ないし１２同様のキレート化セファローズ・ファスト・フロー(登録商標)(ファルマシア、ウプサラ)である。ビーズ径は０.０４５−０.１６５mmである。キレート化セファローズ・ファスト・フローはスペーサー上にイミノジ酢酸を有し、該イミノジ酢酸は安定なエーテル結合を介してセファローズ・ファスト・フロー(登録商標)に結合されている：
[セファローズ・ファスト・フロー]-O-CH2-CHOH-CH2-O-CH2-CHOH-CH2-N-(CH2COOH)2
基本マトリックス−セファローズ・ファスト・フロー−は交差結合アガロースである。
第二の実験で用いる媒体はＴＳＫトヨパール(登録商標)(Ｔoyopearl)ＡＦ−キレート−６５０Ｍ(トーソーハース、シュトウットガルト)である。ビーズ径は約０.０６５mmである。ＴＳＫトヨパール(登録商標)とは親水性半固体ゲルであって、オリゴエチレングリコール、グリシジルメタクリレートおよびペンタエリスロールジメタクリレートから成る共重合体である。配位子は固定化イミノジ酢酸基から成る。
各実験を実施するに当たり、ガラスカラム(直径１０mm)に各ゲル５mlを充填する。実施例３に示したと同じ調製法(銅イオンの負荷)および再生法をキレート化セファロース・ファスト・フロー(登録商標)媒体およびＴＳＫトヨパールＡＦ−キレート−６５０Ｍ(登録商標)媒体に適用する。使用するＩＦＮ−Ｂ／Ｄの吸着溶液は実施例７に記載した保存溶液である。対応する回収率を表１０に示す。水での溶出により、両方の場合において良好な回収率が得られる。
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微生物の寄託
下記の微生物株をドイツ微生物寄託機関(Ｄeutsche Ｓammlung von Ｍikroorganismen(ＤＳＭ))、マッシェローデル・ウエッグ・１Ｂ、Ｄ−３８１４２ブラウンシュバイク、ドイツ国に寄託した(受託番号および寄託日を示す)。
サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)HT393  DSM9697  1995年１月27日