(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
皮膚の表皮構成成分であるデスモグレイン３（Ｄｓｇ３）をコードする遺伝子が欠損しているノックアウトマウス（Ｄｓｇ３−／−マウス）に、野生型マウス（Ｄｓｇ３＋／＋マウス）の皮膚を移植する模擬遺伝子治療を施行し、植皮片が生着し、抗Ｄｓｇ３ＩｇＧ抗体を産生する、遺伝子治療における免疫応答を解析できる実験モデルマウス。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、遺伝子治療における免疫応答を解析できる実験モデルマウスに関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、様々な遺伝性疾患が多い皮膚科領域において、遺伝子診断が現実のものとなり、遺伝子診断による出生前診断が実際に施行されるようになり、基礎医学での成果が臨床に還元されるようになってきた。現在では次のステップとして、遺伝的な欠損を根本的に治す治療法の開発が待ち望まれている。遺伝子治療を現実のものとするためには、効率のよい遺伝子導入法、持続性のある遺伝子発現法の開発など遺伝子発現そのものに関しても様々な問題が存在するが、各種ウイルスベクターの開発などにより、徐々にではあるが解決法の糸口が見えつつある。
【０００３】
しかし、現在まであまり取り上げられておらず、かつ、実際の臨床応用の際には必ず克服しなければならない課題として、外来から導入した遺伝子産物に対する免疫応答の問題がある。常染色体劣性の遺伝病の場合、責任遺伝子産物（特に、細胞外構成蛋白の場合）が患者の個体発生の段階から欠損しているため、免疫系が発生・分化する過程において、患者の免疫系はその蛋白に出会っていない。つまり、患者の個体においてはその蛋白に対する免疫寛容が成立していない。従って、遺伝子欠損による症状を是正するために、外来から正しい遺伝子を導入する遺伝子治療を施行した場合、個体が即座にその遺伝子産物を異物とみなして免疫応答が生じ、遺伝子治療の治療効果が失われる可能性がある。こうした導入遺伝子産物に対する免疫応答は、その抑制の必要性が近年徐々に認識されてきつつあるが、現時点では主としてウイルスベクターを用いた、皮膚以外の臓器に対する遺伝子治療において、ベクターに対する免疫応答とともに論じられている程度であり（例えば、特表平１０−５０７７５８号公報、特表２００１−５１２１４２号公報など）、未だに十分な検討はなされていない。また、その抑制方法としては、遺伝子産物に対する免疫寛容の確立、免疫抑制剤の使用、免疫応答の確立に必要な免疫応答細胞の表面分子の結合阻害などが試みられてきたが、確立されたものはないのが現状である。以下、発明に関する先行技術を列挙する。
【０００４】
１）Amagai M, Hashimoto T, Shimizu N, and Nishikawa T: Absorption of pathogenic autoantibodies by the extracellular domain of pemphigus vulgarisantigen (Dsg3) produced by baculovirus. J Clin Invest 94:59-67, 1994
２）Amagai M, Klaus-Kovtun V, and Stanley JR: Autoantibodies against a novel epithelial cadherin in pemphigus vulgaris, a disease of cell adhesion. Cell 67:869-877, 1991
３）Amagai M, Koch PJ, Nishikawa T, and Stanley JR: Pemphigus vulgaris antigen (Desmoglein 3) is localized in the lower epidermis, the site of blister formation in patients. J Invest Dermatol 106:351-355, 1996
４）Amagai M, Tsunoda K, Suzuki H, Nishifuji K, Koyasu S, and NishikawaT: Use of autoantigen-knockout mice in developing an active autoimmune disease model for pemphigus. J Clin Invest 105:625-631, 2000
５）Chen M, O'Toole EA, Muellenhoff M, Medina E, Kasahara N, and WoodleyDT: Development and characterization of a recombinant truncated type Vlll collagen "minigene". Implication for gene therapy of dystrophic epidermolysis bullosa. J Biol Chem 275:24429-24435, 2000
６）Choate KA, Medalie DA, Morgan JR, and Khavari PA: Corrective gene transfer in the human skin disorder lammelar ichthyosis. Nat Med 2:1263-1267, 1996
７）Christensen R, Jensen UB, and Jensen TG: Cutaneous gene therapy-an update. Histochem Cell Biol 115:73-82, 2001
８）Dai Y, Schwarz EM, Gu D, Zhang W-W, Sarvetnick N, and Verma IM: Cellular and humoral immune responses to adenoviral vectors containing factor lX gene: Tolerization of factor lX and vector antigens allows for long-term expression. Proc Natl Acad Sci 92:1401-1405, 1995
９）Datta SK, and Kalled SL: CD40-CD40 ligand interaction in autoimmunedisease. Arthritis Rheum 40:1735-1745, 1997
１０）Dellambra E, Vailly J, Pellegrini G, Bondanza S, Golisano O, Macchia C, Zambruno G, Meneguzzi G, and De Luca M: Corrective transduction ofhuman epidermal stem cells in laminin-5-dependent junctional epidermolysis bullosa. Hum Gene Ther 9:1359-1370, 1998
１１）Freiberg RA, Choate KA, Deng H, Alperin ES, Shapiro LJ, and Khavari PA: A model of corrective gene transfer in X-linked ichthyosis. Hum Mol Genet 6:927-933, 1997
１２）Greenhalgh DA, Rothnagel JA, and Roop DR: Epidermis: An attractivetarget tissue for gene therapy. J Invest Dermatol 103:63S-69S, 1994
１３）Hengge U, Chan EF, Foster RA, Walker PS, and Vogel JC: Cytokine gene expression in epidermis with biological effects following injection of naked DNA. Nat Genet 10:161-166, 1995
１４）Hengge UR, Walker PS, and Vogel JC: Expression of naked DNA in human, pig, and mouse skin. J Clin Invest in press, 1996
１５）Ilan Y, Prakash R, Davidson A, Jona V, Droguette G, Horwitz MS, Chowdhury NR, and Chowdhury JR: Oral tolerizationto adenoviral antigens permits long-term gene expression using recombinant adenoviral vectors. JClin Invest 99:1098-1106, 1997
１６）Jensen TG, Jensen UB, Jensen PK, Ibsen HH, Brandrup F, Ballabio A,and Bolund L: Correction of steroid sulphatese deficiency by gene transfer into basal cells of tissue-cultured epidermis from patients with recessive X-linked ichthyosis. Exp Cell Res 209:392-397, 1993
１７）Katsumi A, Emi N, Abe A, Hasegawa Y, Ito M, and Saito H: Humonal and cellular immunity to an encoded protein induced by direct DNA injection. Hum Gene Ther 5:, 1994
１８）Kay MA, Hotlterman AX, Meuse L, Allen G, Ochs HD, Linsley PS, andWilson CB: Long-term hepatic adenovirus-mediated gene expression in micefollowing CTLA4Ig administration. Nat Genet 11:191-197, 1995
１９）Khavari PA: Gene therapy for genetic skin disease. J Invest Dermatol 110:462-467, 1998
２０）Khavari PA: Genetic correction of inherited epidermal disorders. Hum Gene Ther 11:2277-2282, 2000
２１）Koch PJ, Mahoney MG, Ishikawa H, Pulkkinen L, Uitto J, Shultz L, Murphy GF, Whitaker-Menezes D, and Stanley JR: Targeted disruption of thepemphigus vulgaris antigen (desmoglein 3) gene in mice causes loss of keratinocyte cell adhesion with a phenotype similar to pemphigus vulgaris. J Cell Biol 137:1091-1102, 1997
２２）Larregina AT, and Falo LD: Generating and regulating immune responses through cutaneous gene delivery. Hum Gene Ther 11:2301-2305, 2000
２３）Morral N, O'neal W, Zhou H, Langston C, and Beaudet A: Immune response to reporter proteins and high viral dose limit duration of expression with adenoviral vectors: comparison of E2a wild type and E2a deletedvectors. Hum Gene Ther 8:1275-1286, 1997
２４）Ohyama M, Amagai M, Tsunoda K, Ota T, Koyasu S, Hata J, Umezawa A,and Nishikawa T: Immunologic and histopathologic characterization of active disease mouse model for pemphigus vulgaris. J Invest Dermatol 118:199-204, 2002
２５）Seitz CS, Giudice GI, Balding SD, Marinkovich MP, and Khavari PA:BP180 gene delivery in junctional epidermolysis bullosa. Gene Ther 6:42-47, 1999Spirito F, Meneguzzi G, Danos O, and Mezzina M: Cutaneous gene transferand therapy; the present and the future. J Gene Med 3:21-31, 2001
２６）Stein CS, Martins I, and Davidson BL: Long-term reversal of hypercholesterolemia in low density lipoprotein receptor (LDLR)-deficient miceby adenovirus-mediated LDLR gene transfer combined with CD154 blokade.J Gene Med 2:41-51, 2000
２７）Tripathy SK, Black HB, Goldwasser E, and Leiden JM: Immune responses to transgene-encoded proteins limit the stability of gene expresson after injection of replication-defective adenovirus vectors. Nat Med 2:545-550, 1996
２８）Uitto J, and Pulkkinen L: The genodermatoses: candidate disease for gene therapy. Hum Gene Ther 11:2267-2275, 2000
２９）Vaily J, Gagnoux-Palacios L, Del'Ambra E, Romero C, Pinola M, Zambruno G, De Luca M, Ortonne J-P, and Meneguzzi G: Corrective gene transfer of keratinocytes from patients with junctional epidermolysis bullosa restores assembly of hemidesmosomes in reconstructed epithelia. Gene Ther1322-1322, 1998
３０）Vogel JC: Keratinocyte gene therapy. Arch Dermatol 129:1478-1483,1993
３１）Vogel JC: Nonviral skin gene therapy. Hum Gene Ther 11:2253-2259,2000
３２）Yamada A, and Sayegh MH: The CD154-CD40 costimulatory pathway in transplantation. Transplantation 73:S36-S39, 2002
３３）Yang Y, Su Q, Grewal IS, Schilz R, Flavell RA, and Wilson JM: Transient subversion of CD40 ligand function diminishes immune response to adenovirus vectors in mouse liver and lung tissues. 1996 70:6370-6377, 1996
３４）Yao SN, Farjo A, Roessler BJ, Davidson BL, and Kurachi K: Adenovirus-mediated transfer of huma factor lX gene in iummunodeficient and normal mice. Viral Immunol 9:141-153, 1996
３５）Zeng L, Sarasin A, and Mezzina M: Retrovirus-mediated DNA repair gene transfer into xeroderma pigmentosum cells. Cell Biol Toxicol 14:105-110, 1998
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
欠損遺伝子が知られている先天性の遺伝性疾患の治療には、欠損遺伝子を補充する遺伝子治療を施すことが必要とされるが、遺伝子欠損患者には欠損している遺伝子産物に対して免疫寛容が成立していないため、正しい遺伝子を導入した際に入れた遺伝子産物に対する免疫応答を惹起し、自己免疫を誘導してしまい、最終的に入れた遺伝子を正しく機能させることができない。本発明の課題は、劣性遺伝性疾患等の遺伝性疾患の遺伝子治療における導入遺伝子産物に対する免疫応答を抑制することができる遺伝子治療用薬剤や、かかる遺伝子治療用薬剤を用いての劣性遺伝性疾患等の遺伝性疾患の治療方法を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
従来からの遺伝子治療における導入遺伝子産物に対する免疫応答の評価、そしてその抑制の試みにおいては、１）不適切な免疫応答が生じる可能性は、発生の段階において導入遺伝子産物を完全に欠く、つまり常染色体劣性遺伝の表現型を有する個体に欠損遺伝子を導入した際に極めて高くなるにも関わらず、こうした遺伝子欠損個体を対象としておらず、単に被験対象個体に遺伝子導入を行い、産物に対する免疫応答の抑制法を評価している、２）遺伝子導入法としては、主としてアデノウイルスなどのウイルスベクターを用いた方法がとられており、ウイルスベクターに対する治療対象個体の免疫応答と関連のない、純粋に導入遺伝子産物のみに対する免疫応答、応答の抑制が評価されていない、３）ウイルスを用いない遺伝子導入法を用いた系では、抑制法の適応対象となる、導入遺伝子産物に対する免疫応答を評価できる程の安定した遺伝子発現が得られない、４）効率がよく、副作用の少ない免疫応答抑制法の評価が不十分である、などの問題点があった。
【０００７】
こうした従来技術の問題点に鑑み、本発明者らは、１）遺伝子治療の対象とする疾患モデル動物の選定にあたっては、機能が十分に解明されている単一遺伝子の欠損を有し、かつ、その病態生理が十分に解明されているものとする、２）ウイルスを用いない遺伝子導入法を用いて純粋に導入遺伝子産物に対する免疫応答と、その抑制法のみ評価する、３）安定した遺伝子発現が得られない場合には、遺伝子導入が成功した状態を模擬する適切な系を確立する、４）薬剤などによらず、免疫応答の惹起に必須の生体内での経路を生物学的に遮断する生理活性物質を使用することで効率のよい免疫応答の抑制を実現する、ことをコンセプトとし、皮膚の構成成分が欠損しているノックアウトマウスに、正しい遺伝子を導入する遺伝子治療を施行し、その遺伝子産物に対する免疫応答の有無を確認し、遺伝子治療における免疫応答を解析できる実験動物モデルの系を作製した後、外来遺伝子産物に対する免疫応答を抑制するために、免疫寛容を成立させるなどの各種方法を検討した。
【０００８】
具体的には、表皮構成成分で細胞膜蛋白であるデスモグレイン３（Ｄｓｇ３）を欠損させたＤｓｇ３ノックアウト（Ｄｓｇ３−／−）マウスを用いた。このマウスは、細胞間接着分子であるＤｓｇ３が欠損しているために、口腔内における水疱・びらんの形成、ならびに休止期（telogen）にある被毛の脱毛を生じる。このマウスに対する遺伝子治療として、発現ベクターに組み込んだ正しい遺伝子配列を持ったマウスＤｓｇ３遺伝子を、ＮａｋｅｄＤＮＡ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ法を用いて表皮細胞に導入したところ、導入Ｄｓｇ３遺伝子が表皮ならびに毛嚢において発現することが確認できた。また、発現したＤｓｇ３に対する抗体産生が持続することが確認されたが、遺伝子治療に先立ち、免疫抑制剤として抗ＣＤ４０Ｌモノクローナル抗体を導入することにより、遺伝子治療の治療効果を損なう可能性のある導入遺伝子産物Ｄｓｇ３に対する免疫応答が効果的に抑制されることも確認することができた。本発明はこれら知見に基づいて完成するに至ったものである。
【０００９】
すなわち本発明は、皮膚の表皮構成成分であるデスモグレイン３（Ｄｓｇ３）をコードする遺伝子が欠損しているノックアウトマウス（Ｄｓｇ３−／−マウス）に、野生型マウス（Ｄｓｇ３＋／＋マウス）の皮膚を移植する模擬遺伝子治療を施行し、植皮片が生着し、抗Ｄｓｇ３ＩｇＧ抗体を産生する、遺伝子治療における免疫応答を解析できる実験モデルマウスに関する。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明は、免疫抑制剤と、遺伝性疾患の責任遺伝子とを備えたことを特徴とする遺伝性疾患の遺伝子治療用薬剤であれば特に制限されるものではなく、ここで遺伝性疾患とは、欠損遺伝子を補充する遺伝子治療を施した場合、欠損している遺伝子産物に対して免疫寛容が成立していない遺伝性の疾患をいい、常染色体劣性遺伝性疾患や伴性劣性遺伝性疾患等の劣性遺伝性疾患を挙げることができ、上記常染色体劣性遺伝性疾患としては、劣性遺伝性栄養障害型先天性表皮水疱症、接合部型先天性表皮水疱症、ヘミデスモゾーム型先天性表皮水疱症、先天性魚鱗癬、白児症（白皮症）、ティ・サックス病、ウィルソン病、嚢胞性線維症、フェニルケトン尿症、糖原病Ｉ型、ガラクトース血症等を具体的に例示することができ、伴性劣性遺伝性疾患としては、色盲、血友病Ａ、Duchenne型筋ジストロフィー等を具体的に例示することができる。
【００１１】
上記免疫抑制剤としては、遺伝子治療を施した場合に欠損していた遺伝子産物により惹起される免疫応答を抑制しうるものであれば、公知の免疫抑制剤をも含め、特に制限されるものではなく、シクロスポリンＡ、タクロリムス(FK506)、シクロホスファミド、アザチオプリン、ミゾリビン、ステロイド、メソトレキセート等の他、Ｔ細胞表面上の接触依存性のヘルパーエフェクター機能を媒体する受容体ＣＤ４０Ｌと、抗原提示細胞表面上の受容体ＣＤ４０との間の相互作用を阻害するアンタゴニストを好適に例示することができ、かかるアンタゴニストとしては、ＣＤ４０Ｌに対して向けられた抗体（例えばＣＤ４０Ｌに対するモノクローナル抗体）、ＣＤ４０Ｌに対して向けられた抗体のフラグメント（例えばＦａｂ又は（Ｆａｂ'）2フラグメント）、キメラ抗体、ヒト化抗体、可溶性ＣＤ４０若しくは可溶性ＣＤ４０Ｌ及びそれらのフラグメント、又はその他のＣＤ４０ＬとＣＤ４０との相互作用を阻害する化合物を挙げることができる。
【００１２】
上記遺伝性疾患の責任遺伝子は、通常、ウイルスベクターの形態、裸ＤＮＡ（naked DNA）の形態、リポソーム包摂形態等で用いられ、責任遺伝子は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＤＮＡ又は合成ＤＮＡであってもよい。上記ウイルスベクターは、ＤＮＡ又はＲＮＡウイルスをもとに作製できるが、由来するウイルス種は特に限定はされず、ＭｏＭＬＶベクター、ヘルペスウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ＨＩＶベクター、センダイウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター等のいかなるウイルスベクターであってもよい。
【００１３】
例えば、アデノウイルスベクターとしては、ＩＴＲ（逆位末端反復配列）と包膜配列とを含んでおり、Ｅ１アデノウイルス領域の総て又は一部を欠いているものが好ましく、さらに、Ｅ３アデノウイルス領域の総て又は一部を欠いていてもよいが、糖タンパク質ｇｐ１９ｋをコードするＥ３領域の一部を保持していることが好ましい。また、ＨＩＶベクターは導入した核酸を染色体に組み込むため、該核酸である薬物遺伝子を長期間に渡って発現することができ、また、ＨＩＶベクターは、細胞表面分子であるＣＤ４陽性Ｔ細胞への選択的な遺伝子導入が可能である上に、細胞が分裂していない静止期でも染色体に組み込むことが可能であるため、例えば、ＨＩＶの外皮タンパク質であるＥｎｖタンパク質を、小水痘性口内炎ウイルス（Vesicular stomatitis virus）の外皮タンパク質であるＶＳＶ−Ｇタンパク質に置換したシュードタイプ型のＨＩＶウイルスベクターを用いれば、骨髄幹細胞、造血幹細胞、神経細胞、筋肉細胞などの静止期にある、いかなる細胞へも効率的に薬物遺伝子を導入することが可能となる。
【００１４】
裸ＤＮＡ（naked DNA）形態として、プラスミドＤＮＡの形態を好適に例示することができ、かかるプラスミドとしては公知の動物細胞用発現ベクタープラスミドを挙げることができる。かかるベクタープラスミドは、ウイルスプロモーター、例えば、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター、ＲＳＶ（ラウス肉腫ウイルス）プロモーター、ＨＳＶ−１ウイルスＴＫ遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０（シミアンウイルス４０）初期プロモーター、アデノウイルスＭＬＰ（主要後期プロモーター）プロモーターを含むものが好ましい。その他、トランスフェクトされた細胞を選択又は同定することができるマーカー遺伝子を含んでいてもよく、かかるマーカー遺伝子としては、抗生物質Ｇ４１８に対する耐性を付与するｎｅｏ遺伝子（ネオマイシンホスホトランスフェラーゼをコードしている）、ｄｈｆｒ（ジヒドロ葉酸還元酵素）遺伝子、ＣＡＴ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）遺伝子、ｐａｃ（ピューロマイシンアセチルトランスフェラーゼ）遺伝子、ｇｐｔ（キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ）遺伝子を挙げることができる。
【００１５】
上記のように、本発明の遺伝性疾患の遺伝子治療用薬剤は、免疫抑制剤と遺伝性疾患の責任遺伝子とを備えたものであるが、免疫抑制剤が例えばＣＤ４０Ｌのようにタンパク質又はペプチドからなる場合、かかるタンパク質又はペプチドをコードするＤＮＡと責任遺伝子とを、ウイルスベクターやプラスミドベクターにコインテグレイトして、免疫抑制剤と遺伝性疾患の責任遺伝子とを含む遺伝性疾患の遺伝子治療用薬剤とすることもできる。本発明の遺伝子治療用薬剤は、遺伝性疾患の患者に投与することができる他、遺伝性疾患の発症が予想される患者に対しても投与することができる。
【００１６】
本発明の遺伝性疾患の治療方法は、上記本発明の遺伝性疾患の遺伝子治療用薬剤を１回又は２回以上用いることにより行われ、免疫抑制剤と遺伝性疾患の責任遺伝子とを同時に、あるいは遺伝性疾患の責任遺伝子で遺伝子治療を施こす前後に免疫抑制剤を投与することができるが、投与部位を異にしてもよい。投与は、注射等の非経口投与又は経口投与により、皮下、静脈内、筋肉内、腹膜内、滑液内、肺内、胃内、鼻腔内、気管内等に行うことができる。本発明の遺伝子治療用薬剤の剤形は、投与方法により適宜選択され、例えば、注射用途に適した医薬組成物としては、滅菌水溶液（水溶性の場合）又は分散液及び滅菌注射溶液又は分散液を即座に調製するための滅菌粉末を挙げることができる。また、投与量は、治療効果を期待できる十分な量であり、患者の年齢、性差、薬剤に関する感受性、投与方法、疾患の履歴などにより適宜選択しうる。
【００１７】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
実施例１［Ｎａｋｅｄ ＤＮＡ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ法によるＤｓｇ３−／−マウス表皮へのＤｓｇ３遺伝子の導入］
Ｄｓｇ３は表皮細胞間の接着機構、デスモゾームの構成成分である細胞表面蛋白である。ＣＭＶのプロモーターを用いた発現ベクターであるｐｃＤＮＡ（Invitrogen corporation, Carlsbad, CA）にマウスＤｓｇ３（ｍＤｓｇ３）をサブクローニングし作製したプラスミド（ｐｃＤＮＡ：ｍＤｓｇ３）をＰＢＳで１〜１０μｇ／μｌの濃度に希釈した溶液を、既報のＮａｋｅｄＤＮＡ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎの方法に従いＤｓｇ３−／−マウスの真皮浅層に注入した。注入１８時間後に、プラスミド導入部位を生検して得られた組織切片を、抗ｍＤｓｇ３モノクローナル抗体を用いた蛍光抗体直説法で観察したところ、ｐｃＤＮＡ：ｍＤｓｇ３を導入した部位の表皮細胞間にｍＤｓｇ３の発現が確認された（図１ａ）。コントロールとしてｐｃＤＮＡを導入した部位ではこのような所見は見られなかった（図１ｂ）。以上のことより、ＮａｋｅｄＤＮＡ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ法によりＤｓｇ３が通常のマウス個体内における発現部位に導入されうることが明らかとなった。
【００１８】
実施例２［Ｄｓｇ３遺伝子導入による抗Ｄｓｇ３ ＩｇＧ抗体産生の検討］
ＮａｋｅｄＤＮＡ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ法により、表皮にＤｓｇ３遺伝子を導入したＤｓｇ３−／−マウスにおいて、導入遺伝子産物に対する抗体が産生されるか否かを、バキュウロウイルス発現系を用いて得られた組換えｍＤｓｇ３を用いたenzyme-linked immunosorbent assay（ＥＬＩＳＡ）法により検討した。遺伝子治療のプロトコールとして、１）５０μｇ／個体のｐｃＤＮＡ：ｍＤｓｇ３を週１回投与、２）５０μｇ／個体のｐｃＤＮＡ：ｍＤｓｇ３を週２回投与、３）１００μｇ／個体のｐｃＤＮＡ：ｍＤｓｇ３を週１回投与、４）１００μｇ／個体のｐｃＤＮＡ：ｍＤｓｇ３を週２回投与、５）２００μｇ／個体のｐｃＤＮＡ：ｍＤｓｇ３を１回のみ投与、６）２００μｇ／個体のｐｃＤＮＡ：ｍＤｓｇ３を２週に１回投与、のような投与方法を設定し、各プロトコールにつき２個体のＤｓｇ３−／−マウスを使用した。このうち、２）から４）までの投与方法で遺伝子を導入したＤｓｇ３−／−マウス各１個体、６）の方法で投与した２個体の血清中にＥＬＩＳＡ法にて抗Ｄｓｇ３ＩｇＧ抗体の産生が確認された。特に６）の方法で遺伝子を導入した２個体では６０日という長期にわたり抗体産生が持続することが確認された（図２）。
【００１９】
実施例３［遺伝子治療により産生された抗Ｄｓｇ３ ＩｇＧ抗体の導入遺伝子産物への結合性の検討］
Ｄｓｇ３遺伝子導入で産生された抗Ｄｓｇ３抗体が、実際に個体内で遺伝子導入により発現させたＤｓｇ３を認識するか否かを確認した。ＥＬＩＳＡ法で抗体価の上昇が確認されたＤｓｇ３−／−マウスの表皮に前述の手法をもちいて遺伝子導入をした後、治療部位を生検した。得られた組織切片を、抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体を用いた蛍光抗体直接法を用いて観察したところ、遺伝子導入部位に一致して表皮細胞間にＩｇＧの沈着が確認された（図３）。以上より、遺伝子治療の副産物として産生された導入遺伝子産物に対する抗体が、実際に導入遺伝子産物に結合する可能性が示された。
【００２０】
実施例４［安定した遺伝子導入を模擬する実験系；Ｄｓｇ３＋／＋マウス皮膚をＤｓｇ３−／−マウスに移植する系の確立］
以上までの検討により、Ｄｓｇ３−／−マウスにＤｓｇ３遺伝子を導入することにより導入遺伝子産物に対して抗体産生が生じ、かつ生じた抗体は導入遺伝子産物を認識しうることが示された。しかし、この検討で用いたＮａｋｅｄＤＮＡｉｎｊｅｃｔｉｏｎ 法は、ヒト、ブタなどの表皮に厚みを持つ動物では比較的安定した遺伝子導入が期待できるが、マウスでは表皮がきわめて薄いため安定した遺伝子導入が期待できない。そこで、さらに遺伝子治療における免疫応答の検討を進めるため、Ｄｓｇ３＋／＋マウスの皮膚をＤｓｇ３−／−マウスに移植する系を確立した。植皮片が生着した個体（図４）では、局所的に表皮へのＤｓｇ３導入が成功した状態が模擬されていると考えられる。また、この系（以下Ｄｓｇ３＋／＋グラフト系と略す）では植皮後約２週間で、Ｎａｋｅｄ ＤＮＡ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ法による遺伝子導入を行った場合と同様に、抗Ｄｓｇ３ＩｇＧ抗体の産生が生じることが前述のＥＬＩＳＡ法を用いた検討で確認された。そこで、以後の検討においては、安定したＤｓｇ３＋／＋グラフト系を用いて遺伝子治療における免疫応答と、その抑制法を評価することとした。
【００２１】
実施例５［抗ＣＤ４０Ｌモノクローナル抗体を用いたＤｓｇ３＋／＋グラフト系における抗Ｄｓｇ３ ＩｇＧ抗体産生の抑制の検討］
抗原特異的な免疫応答の抑制法としては、すでに様々な方法が報告されている。当初、本発明者らは経口寛容により免疫反応を抑制することを計画し、大腸菌発現ベクターを用いてＤｓｇ３蛋白を作製しマウスに経口投与したが、良好な結果を得ることはできなかった。そこで、免疫応答の確立に重要な役割を担っているＣＤ４０とＣＤ４０Ｌの結合を阻害することにより、Ｄｓｇ３＋／＋グラフト系における抗Ｄｓｇ３抗体産生の抑制を試みた。ＣＤ４０Ｌは抗原刺激を受けた活性化Ｔ細胞に一過性に発現されるII型細胞膜貫通蛋白であり、その受容体であるＣＤ４０はＢ細胞、樹状細胞、単球／マクロファージ、内皮細胞などに発現されている。ＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ間結合はサイトカイン産生などを促すことで細胞性免疫において重要な役割を担うのみならず、Ｂ細胞の増殖、抗体産生などにおいてもきわめて重要であることが明らかとなっており、この結合を阻害する抗ＣＤ４０Ｌモノクローナル抗体を用いて、自己免疫性疾患、臓器移植などにおける免疫応答を抑制するこころみがなされている。前述のごとくＤｓｇ３＋／＋グラフト系においては、植皮後約２週間で、ＥＬＩＳＡ法を用いて血清中に検出される抗Ｄｓｇ３ＩｇＧ抗体産生がすべての植皮をうけた個体で生じる。しかし、ハムスター由来抗マウスＣＤ４０Ｌ抗体であるＭＲ１を、植皮後０日（１０００μｇ／個体）、２日、４日、７日、１４日、２１日、２８日（５００μｇ／個体）のスケジュールで腹腔内投与すると、この抗体産生は、有意に抑制されることがＥＬＩＳＡ法を用いて示された（図５）。
【００２２】
実施例６［Ｄｓｇ３＋／＋グラフト系で産生される抗Ｄｓｇ３ＩｇＧ抗体のインビボでのＤｓｇ３分子への結合の評価］
Ｄｓｇ３＋／＋グラフト系において産生される抗Ｄｓｇ３抗体が、実際にインビボでＤｓｇ３分子に結合することを示すために、植皮後４〜５週の時点で植皮片を生検し、表皮細胞間へのＩｇＧの沈着を抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体をもちいた蛍光抗体直接法にて評価した。ＭＲ１を投与したＤｓｇ３−／−マウス群では植皮片は生着し続けるが（図６ａ左）、コントロールとしてハムスターＩｇＧを投与した群では植皮片は約３週で脱落する。そこで、この群においては植皮片が脱落した時点で、再植皮を行い、再植皮後５〜７日目に再植皮片の生着を確認した（図６ａ右）後に生検を行った。コントロール群では、表皮細胞間にＩｇＧの明らかな沈着が確認されたが（図６ｂ）、ＭＲ１投与群ではこのような沈着は明らかではなかった（図６ｃ）。以上より、Ｄｓｇ３＋／＋グラフト系においてＭＲ１が抗Ｄｓｇ３ ＩｇＧ抗体の産生を抑制することがインビボ、インビトロの両方のレベルで示された。
【００２３】
【発明の効果】
本発明により、治療に先立ち抗ＣＤ４０Ｌモノクローナル抗体を導入することにより、劣性遺伝性疾患モデルマウスにおいて成功した遺伝子治療の治療効果を損なう可能性のある導入遺伝子産物に対する免疫応答が効果的に抑制されることが明らかになった。すなわち本発明によると、劣性遺伝性疾患に対する遺伝子治療を成功させるためには、導入遺伝子産物に対する免疫産物に対する免疫応の抑制が必要であり、かつ抗ＣＤ４０Ｌモノクローナル抗体がその抑制に有用であることが示された。
【図面の簡単な説明】
【図１】Ｎａｋｅｄ ＤＮＡ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ法によるＤｓｇ３−／−マウス表皮へのｐｃＤＮＡ：ｍＤｓｇ３の導入によるＤｓｇ３の発現を示す、蛍光抗体直接法の結果を示す図である。
ａ：ｐｃＤＮＡ：ｍＤｓｇ３を導入した部位（矢印）
ｂ：ｐｃＤＮＡを導入した部位（スケール：５０μｍ）
【図２】導入遺伝子産物Ｄｓｇ３に対するＩｇＧ抗体の産生を示す、ＥＬＩＳＡ法の結果を示す図である。（縦軸：ＥＬＩＳＡ法のＯＤ値、横軸：治療開始後の日数）
【図３】遺伝子治療により産生した抗Ｄｓｇ３ ＩｇＧ抗体の、遺伝子治療により発現させたＤｓｇ３への結合（矢印）を示す、蛍光抗体直接法の結果を示す図である（スケール：５０μｍ）。
【図４】Ｄｓｇ３＋／＋マウスの植皮片（矢印）が生着したＤｓｇ３−／−マウスを示す図である。
【図５】Ｄｓｇ３＋／＋をグラウト系における抗Ｄｓｇ３ＩｇＧ抗体の産生を示す、ＥＬＩＳＡ法の結果を示す図である。コントロールとしてハムスターＩｇＧの投与を受けた群では約２週間で抗Ｄｓｇ３ＩｇＧ抗体の産生が生じる（実線）が、ＭＲ１の投与をうけた群（点線）ではこのＩｇＧ産生が有意に抑制されている。（縦軸：マウスＤｓｇ３ＩｇＧＥＬＩＳＡ法のＯＤ値、横軸：植皮からの日数）
【図６】Ｄｓｇ３＋／＋グラフト系で産生される抗Ｄｓｇ３ＩｇＧ抗体のインビボでのＤｓｇ３分子への結合を示す、蛍光抗体直接法の結果を示す図である。
ａ：ＭＲ１を投与したＤｓｇ３−／−マウス群での植皮片の生着（図６ａ左）と、再植皮後５〜７日目における再植皮片の生着（図６ａ右）（スケール：１ｃｍ）。
ｂ：ハムスターＩｇＧ投与群では植皮片に表皮細胞間へのＩｇＧの沈着が認められる（スケール：５０μｍ）。
ｃ：ＭＲ１投与群では植皮片に表皮細胞間へのＩｇＧの沈着が認められない（スケール：５０μｍ）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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