(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ソトス症候群診断に使用するためのプローブであって、以下の(ａ)、又は(ｂ)からなるプローブ。
(ａ)配列表の配列番号１に示す、塩基配列番号１−39726で示される塩基配列からなる核酸。
(ｂ)前記塩基配列番号１−39726の塩基配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ、前記塩基配列と８０％の相同性を有する核酸。
【請求項２】
ソトス症候群診断に使用するためのプローブであって、以下の(ａ)、又は(ｂ)からなるプローブ。
(ａ)配列表の配列番号２に示す、塩基配列番号１−8511で示される塩基配列からなる核酸。
(ｂ)前記塩基配列番号１−8511の塩基配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ前記塩基配列と８０％の相同性を有する核酸。
【請求項３】
ソトス症候群診断に使用するためのプローブであって、以下の(ａ)、又は（ｂ）からなるプローブ。
(ａ)配列表の配列番号３に示す、アミノ酸配列番号１−309で示されるアミノ酸配列からなるペプチド断片。
(ｂ)当該配列番号3に示す、アミノ酸配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ前記アミノ酸配列と８０％の相同性を有するペプチド断片。
【請求項４】
ソトス症候群診断に使用するためのプローブであって、以下の(ａ)、又は(ｂ)からなるプローブ。
(ａ)配列表の配列番号４に示す、アミノ酸配列番号１−2696で示されるアミノ酸配列からなるペプチド断片。
(ｂ)当該配列番号４に示す、アミノ酸配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ前記アミノ酸配列と８０％の相同性を有するペプチド断片。
【請求項５】
ソトス症候群診断に使用するためのプローブであって、ヒト5番染色体上の以下の(a) 又は(b)からなるプローブ。
（a ） 配列表の配列番号5に示す、塩基配列番号１−１９０で示される塩基配列からなる核酸。
（ｂ）前記塩基配列番号１−１９０で示される塩基配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ、前記塩基配列と８０％の相同性を有する核酸。
【請求項６】
ソトス症候群診断に使用するためのプローブであって、ヒト5番染色体上の以下の(a) 又は(b)からなるプローブ。
（a） 配列表の配列番号６に示す、塩基配列番号１−２７５で示される塩基配列からなる核酸。
（ｂ）前記塩基配列番号１−２７５で示される塩基配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ、前記塩基配列と８０％の相同性を有する核酸。
【請求項７】
ソトス症候群診断に使用するためのプローブであって、ヒト5番染色体上の以下（a）と(b)との間に存在するいずれかの配列からなるプローブ。
（a） 配列表の配列番号5に示す、塩基配列番号１−１９０で示される塩基配列からなる核酸。
（b） 配列表の配列番号６に示す、塩基配列番号１−２７５で示される塩基配列からなる核酸。
【請求項８】
請求項２〜７項のいずれか1項に記載のプローブを用いたソトス症候群原因遺伝子又はペプチド断片のスクリーニング方法。
【請求項９】
スクリーニングを、in situ ハイブリダイゼーション法、サザンハイブリダイゼーション法、全塩基配列決定からなる群から選択される少なくとも1種を用いて行なう請求項８記載の方法。
【請求項１０】
in situハイブリダイゼーション法が、蛍光in situハイブリダイゼーション法である請求項９記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、核酸、プローブ及び当該プローブを用いたスクリーニング法に関し、特に、遺伝子診断用の核酸、プローブ及び当該プローブを用いたスクリーニング法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヒト遺伝子を染色体上に位置づけて染色体地図を作成する遺伝子マッピング法としては、従来、ヒト・げっ歯類間の体細胞雑種や部分欠失染色体のクローンパネルを利用して、残存する特定ヒト染色体あるいは染色体部分と対応づけて解析する方法と、クローン化された遺伝子をプローブとしてサザンブロット法で解析する方法が一般的である。
【０００３】
その後、ヒト遺伝子のような多数の遺伝子の特定座位と相互の配列順序の情報を効率良く得るために、ゲノムDNAからクローン化し、標識した遺伝子あるいはDNAマーカーをプローブとして、スライドグラス上の染色体標本に直接分子雑種を形成させて、その遺伝存在部分を検出する、いわゆる、in situ ハイブリダイゼーションが用いられるようになった。
【０００４】
in situ ハイブリダイゼーション法としては、ラジオアイソトープ(主として３H)標識したDNAをプローブとして、その座位をオートラジオグラフィーで検出する方法と、標識されたDNAプローブの蛍光シグナルを蛍光顕微鏡下で検出する方法がある。
【０００５】
後者の蛍光in situ ハイブリダイゼーション法（以下FISH法という。）は、RI施設を必要とせず、操作手順が簡便で、しかも短期間(2日間)で染色体バンド上での詳細なマッピングが正確に行なえる点で優れている。
【０００６】
現在、これらの方法を利用して病気の臨床診断に使用するために、種々の遺伝子治療に有用なプローブが開発されている。例えば、先天奇形症候群の微小欠失を呈する症候群を対象に種々の染色体FISH法に有用な、検査用プローブが知られている。このようなプローブは、対象となる疾患の遺伝子を検査し、検査により陽性(すなわち、欠失等の存在がある)であれば、確定診断がなされる。
【０００７】
例えば、プラダー・ウィリ症候群では患者群の約60％が欠失を有するために、この診断プローブが有効である。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上述の一部の疾患については、有用なプローブが見出されつつあるものの原因不明の疾患が未だに存在し、身体的所見と症状以外に有効な検査法や診断法が見出されていない。これら疾患の原因となる遺伝子及び／又はその相同物を利用し、プローブを見出すことができれば、遺伝子治療又は遺伝子診断の分野において非常に有益となる。
【０００９】
そこで、本発明は、核酸、及び当該核酸を用いた有用なプローブ、及び当該プローブを用いたスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するために、本発明者らは、先天奇形症候群と遺伝子との関係について鋭意研究した結果、本発明のプローブ、及び当該プローブを用いたスクリーニング方法を見出した。
【００１１】
本発明の核酸は、以下の(ａ)、又は(ｂ)、すなわち、(ａ)配列表の配列番号１に示す、塩基配列番号１−39726で示される塩基配列からなる核酸、
(ｂ)前記塩基配列番号１−39726の塩基配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ前記塩基配列と８０％の相同性を有する核酸、からなることを特徴とする。
【００１２】
また、本発明の核酸は、以下の(ａ)、又は(ｂ)、すなわち、(ａ)配列表の配列番号２に示す、塩基配列番号１−8511で示される塩基配列からなる核酸、又は、(ｂ)前記塩基配列番号１−8511の塩基配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ前記塩基配列と８０％の相同性を有する核酸、からなることを特徴とする。
【００１３】
また、本発明のプローブは、請求項1又は2項に記載の核酸からなることを特徴とする。
【００１４】
また、本発明のプローブの好ましい実施態様において、ソトス症候群診断に使用することを特徴とする。
【００１５】
また、本発明のペプチド断片は、以下の(ａ)、又は（ｂ）、すなわち、
(ａ)配列表の配列番号３に示す、アミノ酸配列番号１−309で示されるアミノ酸配列からなるペプチド断片、又は(ｂ)当該配列番号3に示す、アミノ酸配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ前記アミノ酸配列と８０％の相同性を有するアミノ酸配列からなるペプチド断片であることを特徴とする。
【００１６】
また、本発明のペプチド断片は、以下の(ａ)、又は(ｂ)、すなわち、
(ａ)配列表の配列番号４に示す、アミノ酸配列番号１−2696で示されるアミノ酸配列からなるペプチド断片、又は(ｂ)当該配列番号４に示す、アミノ酸配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ前記アミノ酸配列と８０％の相同性を有するペプチド断片であることを特徴とする。
【００１７】
また、本発明のプローブは、請求項５記載のペプチド断片からなることを特徴とする。
【００１８】
また、本発明のプローブは、ソトス症候群診断に使用するためのプローブであって、ヒト5番染色体上の以下の(a) 又は(b)、すなわち、（a ） 配列表の配列番号5に示す、塩基配列番号１−１９０で示される塩基配列からなる核酸、又は（ｂ）前記塩基配列番号１−１９０で示される塩基配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ、前記塩基配列と８０％の相同性を有する核酸からなることを特徴とする。
【００１９】
また、本発明のプローブは、ソトス症候群診断に使用するためのプローブであって、ヒト5番染色体上の以下の(a) 又は(b) 、すなわち、（a） 配列表の配列番号６に示す、塩基配列番号１−２７５で示される塩基配列からなる核酸、又は（ｂ）前記塩基配列番号１−２７５で示される塩基配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ、前記塩基配列と８０％の相同性を有する核酸からなることを特徴とする。
【００２０】
また、本発明のプローブは、ソトス症候群診断に使用するためのプローブであって、ヒト5番染色体上の以下（a）と(b) 、すなわち、（a） 配列表の配列番号5に示す、塩基配列番号１−１９０で示される塩基配列からなる核酸と、（b） 配列表の配列番号６に示す、塩基配列番号１−２７５で示される塩基配列からなる核酸との間に存在するいずれかの配列からなることを特徴とする。
【００２１】
また、本発明のスクリーニング方法は、請求項3、４又は７〜１０項のいずれか1項に記載のプローブを用いることを特徴とする。
【００２２】
また、本発明のスクリーニング方法の好ましい実施態様において、スクリーニングを、in situ ハイブリダイゼーション法、サザンブロット法、塩基配列決定法                    からなる群から選択される少なくとも1種を用いて行なうことを特徴とする。
【００２３】
また、本発明のスクリーニング方法の好ましい実施態様において、in situハイブリダイゼーション法が、蛍光in situハイブリダイゼーション法であることを特徴とする。
【００２４】
【発明の実施の形態】
まず、本発明の核酸について説明すると、本発明の核酸は、以下の(ａ)、又は(ｂ)、すなわち、(ａ)配列表の配列番号１に示す、塩基配列番号１−39726で示される塩基配列からなる核酸、(ｂ)前記塩基配列番号１−39726の塩基配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ前記塩基配列と８０％、好ましくは、９０％、より好ましくは９５％の相同性を有する核酸、からなる。当該核酸は、ヒト5番染色体のNSD1由来のものであり、当該NSD1の一部に相補的な核酸である。具体的には、NSD1のエキソン1、エキソン2、及びイントロンを含むゲノムＤＮＡに相補的な核酸である。本発明の核酸には、前記塩基配列番号１−39726の塩基配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ前記塩基配列と８０％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％の相同性を有する核酸をも包含する。これは、一部が欠失、置換若しくは付加されているものであっても、後述するように例えば、プローブとして利用することができるからである。
【００２５】
また、本発明の核酸は、配列表の配列番号２に示す、塩基配列番号１−8511で示される塩基配列からなる。当該核酸は、ヒト5番染色体のNSD1由来のものであり、当該NSD1の一部に相補的な核酸である。具体的には、NSD1のエキソン1〜23のｃＤＮＡに相補的な核酸である。また、本発明の核酸は、前記塩基配列番号１−8511の塩基配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ、前記塩基配列と８０％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％の相同性を有するものをも包含する。
【００２６】
また、配列番号2に示す塩基配列に対応するアミノ酸配列は、以下の通りである。当該アミノ酸配列を、配列表の配列番号4に示す。そして、上記配列番号1に示す塩基配列の翻訳領域、すなわち、NSD1の第２エキソンに対応するアミノ酸配列を、配列番号3に示す。
【００２７】
本発明のペプチド断片は、以下の(ａ)、又は（ｂ）からなる。すなわち、(ａ)配列表の配列番号３に示す、アミノ酸配列番号１−309で示されるアミノ酸配列からなるペプチド断片、(ｂ)当該配列番号3に示す、アミノ酸配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ前記アミノ酸配列と８０％の相同性、好ましくは９０％、より好ましくは９５％の相同性を有するペプチド断片、からなる。また、本発明のペプチド断片は、以下の(ａ)、又は(ｂ)からなる。すなわち、(ａ)配列表の配列番号４に示す、アミノ酸配列番号１−2696で示されるアミノ酸配列からなるペプチド断片、(ｂ)当該配列番号４に示す、アミノ酸配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ８０％の相同性、好ましくは９０％の相同性、より好ましくは９５％の相同性を有するペプチド断片、からなる。このようなアミノ酸配列について、抗原抗体反応を利用した免疫試験に用いることができる。
【００２８】
ここで、上述の核酸についての精製、単離方法について説明する。上述の核酸は、特に限定されないが、以下の手順で精製、単離することができる。RP1-118m12というPACクローンから以下の方法でサブクローン化し得られたもので、この核酸は、NSD1のエキソン1と2を含んでいる。まず、PACDNAを精製する。そして、精製したPACDNAをMidi-Prepカラム（Qiagen，Chatsworth, CA）を使用して単離し、Sau3AI等の制限酵素を用いて一部消化する。そして、スーパーコス１コスミドベクターを製造者の指示（Stratagene, La Jolla, CA）によって調整し、T4DNAリガーゼを使用して消化PAC DNAにくくる。くくった反応生成物を、GigapackIIIゴールド抽出物（Staratagene）を使用してパッケージングし、XL1-Blue  MR 宿主細胞へトランスフェクトする。ゲノム配列に関してPCRを使用してSTSコンテントマップによって構築する。このようにして、本発明の核酸を得ることができる。
【００２９】
なお、DNAの塩基配列は、当業者に周知の方法で決定することができる。例えば、ターミネーター法などを用いて塩基配列を決定することができる。
【００３０】
本発明のプローブの使用方法としては、上述の核酸を、直接又はPCR法で増幅し高分子膜にブロットして固定した後、本発明のプローブをハイブリダイズさせればよい。ハイブリダイズの方法は、常法により特に限定されるものではないが、例えば、サザンブロッティング法、in situ ハイブリダイゼーション法、塩基配列決定法などを挙げることができる。in situ ハイブリダイゼーション法は、迅速かつ、的確にスクリーニングすることができるという観点から望ましい。in situ ハイブリダイゼーション法には、蛍光in situ ハイブリダイゼーション法(以下、FISH法という)、ラジオアイソトープin situ ハイブリダイゼーション法等がある。IR施設を要求されないという観点から、FISH法が望ましい。FISH法の概略は、例えば、スライドグラス上に染色体標本を調製し、これに標識プローブをハイブリダイズし、直接検鏡するのが一般的である。
【００３１】
また、本発明のプローブのハイブリダイズに使用される支持体としては、薄膜、粉末、粒状物、ゲル、ビーズ、繊維等の他、分散液、エマルジョン等を挙げることができる。これらは適当なカラムに充填して使用してもよい。これらのうち薄膜が好ましく、例えばニトロセルロース膜、ナイロン膜が好ましい。
【００３２】
ここで、本発明のプローブに使用される標識の例を説明する。標識の例として当業者に周知のものを使用することができ、特に限定されないが、例えば、３２P、３５Sなどの放射性原子、ビオチン基、アジピン基、または酵素類、蛍光標識等などのほか、抗原抗体系を利用する場合には、抗原を含んでいても良い。これらも本発明の範囲に包含される。
【００３３】
本発明の核酸と正常な5番染色体の一部とは、相補的に結合する。しかしながら、5番染色体に異常、すなわち、欠失異常が有ると、本発明の核酸と異常な5番染色体とは、結合しない。このような性質を利用して、本発明の核酸をプローブとして用いれば、5番染色体の異常を確認することができる。したがって、本発明のプローブは、5番染色体の6割に欠失を有するソトス症候群の診断用プローブとしても用いることができる。
【００３４】
さらに、本発明のプローブは、ソトス症候群診断に使用するためのプローブであって、ヒト5番染色体上の以下の(a) 又は(b)、すなわち、（a ） 配列表の配列番号5に示す、塩基配列番号１−１９０で示される塩基配列からなる核酸、又は（ｂ）前記塩基配列番号１−１９０で示される塩基配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ、前記塩基配列と８０％の相同性を有する核酸からなる。
【００３５】
また、本発明のプローブは、ソトス症候群診断に使用するためのプローブであって、ヒト5番染色体上の以下の(a) 又は(b) 、すなわち、a） 配列表の配列番号６に示す、塩基配列番号１−２７５で示される塩基配列からなる核酸、又は（ｂ）前記塩基配列番号１−２７５で示される塩基配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ、前記塩基配列と８０％の相同性を有する核酸からなる。
【００３６】
また、本発明のプローブは、ソトス症候群診断に使用するためのプローブであって、ヒト5番染色体上の以下（a）と(b) 、すなわち、（a） 配列表の配列番号5に示す、塩基配列番号１−１９０で示される塩基配列からなる核酸と、（b） 配列表の配列番号６に示す、塩基配列番号１−２７５で示される塩基配列からなる核酸との間に存在するいずれかの配列からなる。
【００３７】
これらのプローブがソトス症候群診断に使用することが可能であることは、ソトス症候群患者の5番染色体上の配列表の配列番号5と6の間の塩基配列が欠損しているという本発明者らの知見によるものである。したがって、配列番号５の塩基配列を単独でプローブとして用いても、配列番号６の塩基配列を単独でプローブとして用いてもよい。また、上記配列番号５と６との間に正常なヒトに存在する配列も、ソトス症候群患者には存在しないので、これらのいずれの配列もソトス症候群の診断に使用することができる。プローブの塩基長は、用いるスクリーニング方法により異なり、特に限定されるものではないが、５ｋｂ以上である。特に５〜15ｋｂが好ましく、より好ましくは、７〜１２ｋｂである。
【００３８】
上記配列番号５及び６の配列部分は、正常なヒトには存在するが、ソトス症候群患者の染色体の内の1本（1コピー）が欠失しているので、これらをもとに遺伝子診断することができる。
【００３９】
【実施例】
ここで、本発明の一実施例を説明するが、本発明は、下記の実施例に限定して解釈されることを意図するものではない。以下の実施例は、本発明の一実施態様を説明するための用いたものであり、特許請求の範囲に記載された本発明の要旨及び範囲を逸脱しない限り、いかなる変更等を排除するものではない。
【００４０】
実施例１
ソトス症候群(ＳＳ、ＯＭＩＭ  117550)は、脳性小児麻痺としても知られているが、進行した骨年齢を有する胎児発育、大きい頭蓋骨を有する特有の顔、肢端巨大及びとがった顎、時折発生する脳異常及び発作、精神障害によって特徴付けられる先天奇形症候群である。
【００４１】
大部分の場合は、散発性のものであるが、病気の時折胎児での伝達が知られている。ＳＳ患者は、良性又は悪性腫瘍の3.9％を有していると推定される。まず、新規なｔ(5:8)(ｑ35;ｑ24.1)を持つ患者の5ｑ35ブレークポイントから位置クローニングによって、ＮＳＤ１遺伝子を単離した。遺伝子は、ＳＥＴ、ＰＨＤフィンガー、及びＰＷＷＰ領域、及び核受容体(ＮＲｓ)との相互作用を有する、2,696アミノ酸をコードする。38人のＳＳ患者の間で、直接配列決定によって調査し、ナンセンス突然変異体)1310Ｃ->Ａ，Ｓ４３７Ｘ)、1つのbP欠失(3536delA)、１つのbp挿入物(5998insT)、及びスプライス−ドナー部位突然変異体(6151＋１G−A)を含む4つの新規点突然変異体を、ＮＳＤ１(10.5％)において検出した。中期及び/又は間期細胞がFISH研究に有用な33人のSS患者において、NSD1を含む20人の極微小物体の欠失(66.7％)も同定した。結局、SS患者の７７％がNSD1突然変態体を有していると推定された。この結果は、NSD1の機能不全症は、ソトス症候群を引き起こし、NSD1は、ヒトの成長及び脳の発育に重要な役割を有することを示した。
【００４２】
新規相互転座、46、XX，t(5;8)(q35;q24．1)(患者 BP)に関連するソトス症候群を有する女性に会った。5q35領域は、SSの遺伝子座をかくまっているようである。なぜなら、それらは別のトランスロケーション(転座)、及びそれぞれSS又はSS類似の特徴と関係する5q35[del(5)(q35．1qter)]を含む欠失を持っていたからである。このことは、我々に5q35ブレークポイントをクローン化させた。５q35にマップされるFGFR4にまず焦点を絞り、解析したこの遺伝子ファミリーにおける突然変異体は、いくつかの頭蓋と顔面及び成長異常と関連することが知られている。FGFR4をカバーするPACクローン(RP1-251c21)を単離し、それが、FISH分析によって、5q35ブレークポイントをカバーすることを確認した。その後、ブレークポイント周辺の遺伝子を有効とするために、BAC/PAC/コスミド系フィジカルマップ(物理地図)を作成した(図１a)。FISH分析は、RP1-118m12及びそのコスミドサブクローンc2B、c4D、c6A及びc6Bはブレークポイントをカバーすることを示した(図１b)。さらに、別の遺伝子、JAZ(ジーンバンク登録番号XM  012279)を、フィジカルマップ内で配列(CTC-286c20に対するAC027314、CTC-549a4に対するAC008570)を通じて同定した。JAZのコード領域を、12例の患者において配列決定したが、いずれもヌクレオチド変更は観察されなかった。BlastN似てc6B相当配列の部分的ゲノム配列(AC027314)を使用して調べたところ、マウスNsd1に相同な部分が存在した。タンパク質に結合する核受容体(NR)をコードするNsd１は、転写調節に関連する可能性があるため、そのヒトオーリログ、NSD1は、魅力的な候補遺伝子となり、それを単離した。NSD１は、8.088bpのオープンリーデングフレームを有し、少なくとも23のエキソンからなる(ジーンバンク  登録番号AF395588を我々が登録した。 )。
【００４３】
ブレークポイントはNSD１内に位置し、c6Bを使用したFISH分析は、患者のder(5)及びder(8)染色体の両方にシグナルを与えて、各シグナル強度は、ほとんど等しかった(図1a及びb)。図１aは、フィジカルマップを示す。黒太の線は、BAC/PACコスミドクローンを示す。赤線、及び青線は、それぞれ、FISH分析による５q３５ブレークポイントをカバーするクローン、及び完全なゲノム配列を示す。矢印は候補の遺伝子を示す。図１ｂは、患者BPの染色体上のc6B、コスミドを使用したFISH分析である。赤矢印、及び黄色矢印は、それぞれ通常の染色体５のシグナル、及び誘導染色体５と８のシグナルを示す。40セットのプライマーを設計し、遺伝子の全コード領域を増幅した。SSを有する通常の患者の38個の無関係な全部からのゲノムDNAを直接配列決定によって分析した。
【００４４】
その後、NSD1の4つの異なる点突然変異体を39人の患者の4人において、患者BP以外に同定した(図2、表1)。図２は、NSD1のゲノム構造、及びソトス症候群を有する患者において検出された突然変異体を示す。特別の領域を色付きのボックスで示し、NR相互作用領域(NID)−Lとして水色、NID+Lとしてピンク、PHDフィンガー領域(finger domains) として青色、PWWP領域として緑、及びSET領域として赤で示す。突然変異体は、エキソン５におけるナンセンス突然変態体(1310C->A、S437X)、エキソン５の1つ塩基欠失(3535delA)、エキソン19における1つの挿入物(5998insT)、及びイントロン20におけるスピリット ドナー部位での塩基置換(6151+1G->A)を含んでいた。由来の明らかな両親で、そのような変異がなかったので、4つの突然変異体はすべて新規タイプであった。TCA(Ser)−＞TAA(終止)ナンセンス突然変異体は、アミノ酸の位置437でNSD1タンパク質（S437X）の切り取り物を誘導すると推定される。欠失(3535delA)は、時期尚早のストップコドンを3651〜3653で誘導し、挿入(5998insT)も時期尚早のストップコドンを6022〜6024で生じる。スプライス部位突然変異体(6151+1G->A)は、スキップエキソン20と推測され、エキソン19後、より小さいcDNAを生産し、9つのアミノ酸を加えた不完全なタンパク質を生じた。エキソン20を消去したより短いcDNAは、RT-PCR及び患者の不死化リンパ芽球細胞株における直接配列決定によって確認した(図3)。図３aは、PT-PCR分析の結果である。黒矢印、及び赤矢印は、それぞれ、正常な471-bp産物、及び異常な329-bp産物を示す。Ptは、患者24を、Wtは、通常のコントロールを示す。＋は、逆転写酵素を使用したことを、−は、逆転写酵素を使用しなかったことを示す。図３bにおいて、上の線はエキソン１９、２０及び２１を示し、小さい赤の円は、スプライスドナー部位(splice-donor site)での突然変異を示す。329bp産物の配列分析は、エキソン２０のスキッピングを示し、フレームシフトし、エキソン２１の１０コドンで新規なストップコドンを生じた。エキソン5及びエキソン23において5つの他の塩基置換(３つの同義型と2つの非同義変異)を同定したが、それらは、通常のコントロールにおいて共通に観察され、多型、すなわち、単一塩基多型（スニップ(SNPs)）であった(表1)。驚くべきことに、39人の患者のうちの29人は、全てのこれらの5つのSNP座で同型接合体パターンを示した。これらのデータは、NSD1を含む欠失の存在を強く示唆する一方、12の普通のコントロール個体におけるデーターは、ハーディワインベルグ平衡と一致した。プローブとしてRP1-118m12を使用するFISH分析は、中期、及び/又は間期が利用できる30の患者のうちの20(66.7％)において欠失を検出した（図4）。赤矢印、黄色矢印は、それぞれ、正常な染色体５上のシグナルを示し、削除された染色体５上のシグナルのないことを示す。このFISH分析は、点突然変異用のデータと共に（4／38）は、この系においてSS患者の７７％はNSD1突然変異体を有していた（表1）。同定した変異全ては、タンパク質切断を引き起こすか、完全な欠失（半接合）であった。それゆえ、NSD1のハプロ不全がソトス症候群の主要な原因であるようである。
【００４５】
NSD1は，2作用性の核タンパク質であり、核受容体の共同受容体として、またはNRsのリガンド結合領域と相互作用することによって共同活性化物質として作用する。ヒトNSD1は、NID−L及びNID＋Lと呼ばれる2つの明確なNR相互作用領域、SET（su（Var）3−９、エンハンサー、）、PWWP（プロリン−トリプトファン−トリプトファン−プロリン）、及びPHD（植物ホメオ領域）フィンガー領域等の保存領域を有する。SS患者において観察した2つのタンパク質停止（PT）突然変異体（S437X及び3536delA）は、PHD−I、PHD−II、PWWP−II、SET、PHD−III領域の欠失を生じる可能性がある。1つのbp挿入物（5989insT）、スライス部位突然変異体（6151＋1G＞A）は、SET及びPHD−III領域を欠失する可能性がある。これらの知見は、SS患者におけるタンパク質のうちSET及びPHD‐IIIの最小欠失が、このタンパク質において機能的に重大なものと示唆される。
【００４６】
PHDフィンガー領域は、他のタンパク質と相互作用する可能性があり、クロマチン調節を伴う。
【００４７】
最近、NSD1誘導キメラタンパク質が、NSD１をNSD1のイントロン５でNUP98と融合したｔ（5:11）（q35;p15.5）と関連する胎児急性骨髄白血病（AML）から単離された。患者BPにおいて染色体ブレークは、イントロン2に位置すると推測される。よって、2つの状況、すなわち、ソトス症候群とAMLではその成立におけるメカニズムは異なる可能性がある。
【００４８】
NSD1は、ヌクレオチドレベルで、165kbのウォルフーヒルシュホルン症候群（WHS）の最小欠失領域から単離したWHSC1(NSD2)に対して75％の相同性を示した。WHS（OMIM 194190）は、４Pの多型異型、厳格な知能障害、精神面の欠陥、半接合欠失によって特徴付けられている。さらに、ｔ（4;14）によってIgH遺伝子と融合したとき、NSD2は、多型ミエローマの形を引き起こす。
両方の遺伝子（NSD1、NSD2）が細胞成長はもちろん、ヒト成長及び脳の発育に対して重要であるようである。
【００４９】
SSは、遺伝的に異質と考えられた。SSが、母親及び二人の娘、二人の兄弟、及び3人の兄弟姉妹（一卵性の双子）に記載されたとき、常染色体劣性遺伝を要求した。新規ｔ（3;6）（p21;p21）、mos dup（20）（p11.2−p12.1）［12/66］、t（2;21）（q33，3；q15）matを持つ患者を記述した。それゆえ、上記染色体のブレークポイント又はセグメントは、別のSS座である可能性がある。
【００５０】
しかしながら、今回のデータは、SS患者の殆ど（77％まで）がNSD1突然変異体を有することを示す。ソトス症候群におけるNSD1欠失の知見は、SSの診断を容易にし、ヒトの知能障害及び成長障害のメカニズムを理解する上で、光を与えた。
【００５１】
フィジカルマップ構築
RPCI-1-3、ヒトPACライブラリーを前述したようにSTSを使用してPCRによってスクリーニングした。コスミドサブクローンをこれを転座をカバーするPACから調整した。精製したPACDNAをMidi-Prepカラム（Qiagen，Chatsworth, CA）を使用して単離し、Sau3AIで部分消化した。スーパーコス１コスミドベクターを製造者の指示（Stratagene, La Jolla, CA）によって調整し、T4DNAリガーゼを使用して消化PAC DNAに連結した。この反応生成物を、GigapackIIIゴールド抽出物（Staratagene）を使用してパッケージングし、XL1-Blue  MR 宿主細胞へトランスフェクトした。ゲノム配列に関してPCRを使用してSTSコンテントマップによって構築した。BAC/PAC/コスミドDNAをMidi−Prepカラムで抽出した。新しいSTSをBAC用T7/SP6プライマー又はコスミド用T7/T3を使用してクローン末端配列から発生させた。配列決定反応を、鋳型として2μgのBAC/PAC DNA又は１μgのコスミドDNA、及び40pmol プライマーを使用して、ABIプリズム BigDye Terminator Cycleシークエンシング Ready Reaction Kit（PE Applied Biosystems、 Foster,  CA）で行なった。
【００５２】
サイクルシークエンシングを、96℃で10秒間、50℃で5秒間、60℃で4秒間50サイクル行った。
【００５３】
FISH分析
BAC/PAC/コスミドDNAを使用したFISH法を、SS患者及び通常のコントロールから中期染色体及び/又は間期細胞で行なった。クローン化したDNAを、ニックトランスレーションによってSpectrum Green−11-dUTP又はSpectrum Orange−11-dUTP（Vysis、Doowners Grove,IL）で標識し、76℃で10分間変性した。プローブ−ハイブリダイゼーション混合物（10μl）を染色体へ適用し、37℃で16時間インキュベーションし、その後、上述したように洗浄した。蛍光顕微鏡写真を、単一バンド励起フィルターをもつクワッドフィルターセットを備えるZeiss Axioskop顕微鏡下で行なった（84000、Chroma Technology Corp.、 Brattleboro、VT）。冷却したCCDカメラ（TEA/CCD-1317-G1、Princeton Instruments、Trenton, NJ.）及びIPLab/MACソフトウエア（Scanalytics Inc. Fairfax、VA）を使用して画像を集め、融合した。
【００５４】
患者及び親のサンプル
同意書を得た後、DNAをソトス症候群を持つ散発的な患者の末梢血管白血球又はリンパ芽球細胞株から抽出した。いくつかのケースにおいて、サンプルをそれらの親からも収集した。しかし、患者のうち一例を除き、残り全ては、日本人の起源であった。実験的なプロトコールは、長崎大学医学部の遺伝子研究所のEthical Committeeによって承認された。
【００５５】
突然変異体の分析
コード領域をカバーする２２のNSD1エキソン（エキソン2-23）をPCRによって増幅した。PCRを、95℃で30秒間、50℃で30秒間、72℃で1秒間、1.5mM MgCl2、0.2mMの各dNTP、1μMのプライマー、2.5UtaqGolｄ ポリメラーゼ（PE Applied Biosystems）を有する1×PCR緩衝液を含む50μlの体積で35回サイクルした。
【００５６】
PCR産物を、以前に述べたように、標準的なプロトコール（PE Applied Biosystems）によってQIAクイックPCR精製キット（Qiagen, Chatsworth, CA）を使用して精製し、BigDyeダイターミネーターで両鎖で配列決定した。
【００５７】
RT−PCR分析
トリゾール剤（Gibco-BRL、Gaithersburg、MD）を使用して全RNAを患者及び通常のプロトコールから設計したリンパ芽球細胞株から調製した。
【００５８】
製造者のプロトコールに従い、逆転写を、RT-PCR（Gibco-BRL）用のランダムヘキサマー及びSuperscript 第一鎖合成系 を使用して行なった。cDNAをプライマー、NSD1RTA1F、５‘−ATTTGTGAATGAGTATGTGG-3’（nt 5898-5917）、及びNSD1RT１R、5’’-CTAAAACACTCATCTTCTCG-３‘（nt 6349-6368）を用いて、35サイクルに対して48℃のアニーリング温度でPCRによって増幅した。PCR産物を直接的に配列決定した。
【００５９】
ジーンバンク関連番号
ヒトNSD1、AF395588、NSD2、XM 055926； FGFR4、XM 030308；JAZ、XM 012279；マウスNsd１、NM  008739；BACクローンCTC286c20、AC027314、 CTC-549a４、AC008570．
【００６０】
【表１】
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【００６１】
実施例２
次に、配列表の配列番号５及び６の間に存在するプローブを用いて、ソトス症候群患者であるかどうか調べた。FISH法については、実施例1と同様の条件で行なった。
【００６２】
具体的には、RPCI-11  １４７K7及びRPCI-11  １００６E８を用いてFISH分析を行なった。RPCI-11  １４７K7及びRPCI-11  １００６E８は、例えば、遺伝子バンクから容易に入手することができる。
【００６３】
この結果、ソトス症候群患者の９割で欠失が確認された。このことから、本プローブを用いることにより遺伝子診断が可能であることが判明した。
【００６４】
最終的に、ソトス症候群であるか否かの確定判断は、NSD1領域の本発明の核酸をプローブとして同様にFISH分析を行なえばよい。
【００６５】
【発明の効果】
本発明の核酸、及び当該核酸を用いたプローブによれば、遺伝子診断、及び遺伝子治療にも用いることができるという有利な効果を有する。
【００６６】
また、特に、蛍光in situ ハイブリダイゼーションを用いた本発明によれば、RI施設を必要とせず、操作手順が簡便で、しかも短期間(2日間)で染色体バンド上での詳細なマッピングが正確に行なえるという点で優れており、それによって、迅速、かつ、安全な遺伝子診断にも有用であるという有利な効果を奏する。
【００６７】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  フィジカルマップ(物理地図)）を示す図である。
【図２】  ＮＳＤ１の種々の突然変異体を示す図である。
【図３】  患者の不死化リンパ芽球細胞株における直接配列決定の結果を示す図である。
【図４】  ＦＩＳＨ分析の結果を示す図である。
【図５−１】  配列表１の塩基配列を示す図である。
【図５−２】  配列表１の塩基配列を示す５−１のつづき図である。
【図５−３】  配列表１の塩基配列を示す５−２のつづき図である。
【図５−４】  配列表１の塩基配列を示す５−３のつづき図である。
【図５−５】  配列表１の塩基配列を示す５−４のつづき図である。
【図５−６】  配列表１の塩基配列を示す５−５のつづき図である。
【図５−７】  配列表１の塩基配列を示す５−６のつづき図である。
【図５−８】  配列表１の塩基配列を示す５−７のつづき図である。
【図５−９】  配列表１の塩基配列を示す５−８のつづき図である。
【図５−１０】  配列表１の塩基配列を示す５−９のつづき図である。
【図５−１１】  配列表１の塩基配列を示す５−１０のつづき図である。
【図５−１２】  配列表１の塩基配列を示す５−１１のつづき図である。
【図５−１３】  配列表１の塩基配列を示す５−１２のつづき図である。
【図５−１４】  配列表１の塩基配列を示す５−１３のつづき図である。
【図６−１】  配列表２の塩基配列を示す図である。
【図６−２】  配列表２の塩基配列を示す６−１のつづき図である。
【図６−３】  配列表２の塩基配列を示す６−２のつづき図である。
【図６−４】  配列表２の塩基配列を示す６−３のつづき図である。
【図６−５】  配列表２の塩基配列を示す６−４のつづき図である。
【図７−１】  配列表４のアミノ酸配列を示す図である。
【図７−２】  配列表４のアミノ酸配列を示す７−１のつづき図である。
【図８】  配列表５の塩基配列を示す図である。
【図９】  配列表６の塩基配列を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図５−４】
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【図５−５】
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【図５−６】
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【図５−７】
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【図５−８】
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【図５−９】
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【図５−１０】
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【図５−１１】
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【図５−１２】
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【図５−１３】
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【図５−１４】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図６−４】
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【図６−５】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【図９】
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