(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２で表されるBCRPタンパク質の第５膜貫通領域において、
第554番目の残基がLeu554Proである置換を有する変異型BCRPタンパク質。
【請求項２】
上記BCRPタンパク質が配列番号１に示す塩基配列でコードされたものである、請求項１に記載の変異型BCRPタンパク質。
【請求項３】
請求項１に記載の変異型BCRPタンパク質をコードしてなる遺伝子。
【請求項４】
請求項３に記載の遺伝子を含有する発現ベクター。
【請求項５】
上記発現ベクターが、レトロウイルス、アデノウイルス、又はリポソームである、請求項４に記載の発現ベクター。
【請求項６】
請求項４又は５に記載の発現ベクターを含んでなる抗癌剤薬剤耐性阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、変異型BCRPタンパク質に関し、更に詳細には抗癌剤等の薬剤耐性の低下した変異型BCRPタンパク質に関する。
【０００２】
【従来の技術】
種々の癌に対する治療手段の一つとして広く行われている化学療法において、抗癌剤に対する耐性は臨床的に重要な問題の一つである。
抗癌剤耐性に関与するタンパク質として、P-糖タンパク質やMRP1等の種々のABC（ATP結合カセット）タンパク質ファミリーが知られている。これらのタンパク質は、抗癌剤を細胞外に排出することによって、耐性に関与することが報告されている（Bradley, G.ら、Biochim. Biophus. Acta, 948:87-128, 1988；Zaman, G.J.R.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 91:8822-8826, 1994）。
【０００３】
近年、輸送タンパク質ABCファミリーの別のメンバーであるBCRPタンパク質（ABCPタンパク質と称される場合もある）が、薬剤耐性において重要な機能を有していることが報告された。このタンパク質は、胎盤で高い発現を示すABCトランスポーターであり、トポII阻害剤であるメトトレキセートへの暴露によって選択した多くの耐性細胞系で過剰発現し（Ross, D.D.ら、J. Natl. Cancer Inst., 91:429-433, 1999；Miyake, K.ら、Cancer Res.,）、またメトトレキセートに対する耐性を有するこれらの細胞系は、SN-38及びミトキサントロン等の他の抗癌剤に対しても交差耐性を示すことが報告されている（Maliepaard, M.ら、Cancer
Res., 59, 4559-4563, 1999）。
【０００４】
野生型BCRPタンパク質は、図１に示すように、６５５個のアミノ酸からなり、６個の膜貫通領域を有している。上記P-糖タンパク質が同じ構造のドメインを２個有する２unit型タンパク質であるのに対し、BCRPタンパク質は１unit型であり（図１）、その機能発現には２分子のBCRPタンパク質が必要である可能性も考えられる。
【０００５】
ヒトBCRP遺伝子の全長cDNA配列は、米国の独立した２つの研究グループにより報告されている。ABCPと名付けられた遺伝子はGenBankのaccession number AF103796に登録されており、Allikmets, R.ら、Cancer Res. 58(23), 5337-5339 (1998)等に発表されている。一方、BCRPと名付けられた遺伝子はGenBankのaccession number AF098951に登録されており、Doyle, L.A.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95(26), 15665-15670 (1998)等に発表されている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
抗癌剤に対する耐性が現れた場合、癌に対する化学療法を成功させるためには、上記耐性のメカニズムを解明し、それを克服するための手段をとることが必要である。例えば抗癌剤耐性に関与するタンパク質としてよく知られているP-糖タンパク質の場合には、その薬剤排出機能に対する阻害剤を使用すること等によって耐性に対抗し得ることが報告されている（Tsuruoら、Cancer Res. 41:1967-1972(1998)）。
【０００７】
しかしながら、BCRPタンパク質については、その性状や機能が解明されつつある段階であり、BCRPタンパク質の関与する抗癌剤耐性の克服については、未だ十分検討されていなかった。また、BCRPタンパク質の示す耐性が、抗癌剤だけでなく、他の薬剤耐性に関与する可能性もあると考えられる。
従って、化学療法をより効果的なものにするために、BCRPタンパク質の関与する薬剤耐性を克服する手段が必要とされている。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
そこで、本発明者等は、BCRPタンパク質の機能を詳細に検討するために、遺伝子組換え技術等を使用してBCRPタンパク質の種々の変異体を作製し、野生型及び変異型のBCRPタンパク質を発現ベクターに組み込み、マウス等の宿主細胞で発現させてその変異と機能との関連を検討した。その結果、BCRPタンパク質のＮ末端から５番目の膜貫通領域（アミノ酸547番目から566番目までの20アミノ酸と推定されている）において変異が生じた変異型BCRPタンパク質を導入した細胞において、野生型BCRPタンパク質が導入された細胞において観察された抗癌剤耐性が見られないことを見出した。このことは、第５膜貫通領域において変異が生じたBCRPタンパク質は抗癌剤耐性が低下していることを示す。これにより、こうした変異型BCRPタンパク質を、遺伝子治療等の方法により、薬剤耐性を示す患者及び薬剤耐性の予想される患者に対する治療において、抗癌剤等の薬剤と組み合わせて、又は単独で使用することができる。
【０００９】
従って、本発明は、以下の（１）〜（１３）を提供する。
（１）  BCRPタンパク質の第５膜貫通領域において、野生型BCRPタンパク質のアミノ酸配列に対して１個又は複数のアミノ酸が欠失、置換又は付加からなる変異を有することを特徴とする、変異型BCRPタンパク質、又は上記変異を含む断片。
（２）  上記変異が１個のアミノ酸の置換である、上記（１）に記載の変異型BCRPタンパク質、又は上記変異を含む断片。
（３）  上記置換が野生型BCRPタンパク質のアミノ酸配列における554番目の残基における置換である、上記（２）に記載の変異型BCRPタンパク質、又は上記変異を含む断片。
【００１０】
（４）  上記置換がLeu554Proである、上記（３）に記載の変異型BCRPタンパク質、又は上記変異を含む断片。
（５）  薬剤に対する耐性が低下したものである、上記（１）から（４）のいずれかに記載の変異型BCRPタンパク質、又は上記変異を含む断片。
（６）  上記野生型BCRPタンパク質が配列番号１に示す塩基配列でコードされたものである、上記（１）から（５）のいずれかに記載の変異型BCRPタンパク質、又は上記変異を含む断片。
（７）  上記野生型BCRPタンパク質が配列番号２に示すアミノ酸配列からなるものである、上記（１）から（５）のいずれかに記載の変異型BCRPタンパク質、又は上記変異を含む断片。
【００１１】
（８）  上記（１）から（７）のいずれかに記載の変異型BCRPタンパク質をコードしてなる遺伝子又はその断片。
（９）  上記（８）に記載の遺伝子を含有する発現ベクター。
（１０）  上記発現ベクターが、レトロウイルス、アデノウイルス、又はリポソームである、上記（９）に記載の発現ベクター。
【００１２】
（１１）  上記（９）又は（１０）に記載の発現ベクターを含んでなる医薬。
（１２）  配列番号１に示す塩基配列である野生型BCRP遺伝子。
（１３）  配列番号２に示すアミノ酸配列からなる、野生型BCRPタンパク質。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明者等はまず、マウスPA317細胞を用い、ヒト胎盤で高い発現を示すBCRPタンパク質の遺伝子を導入し、in vitroでの抗癌剤耐性を確立させた。
尚、本発明の実施において、PCR（ポリメラーゼ連鎖反応）、制限酵素によるDNAの切断、プラスミドベクターへのサブクローニング、大腸菌等の宿主細胞の形質転換、塩基配列決定等の基本的な遺伝子工学・生化学的操作については、例えば村松正實編、ラボマニュアル遺伝子工学増補版（丸善、1990）などに記載の一般的な方法に従って行えば良く、特に限定されるものではない。
【００１４】
ヒト胎盤のcDNAを鋳型とし、ヒトBCRP（ABCP）の全長cDNA配列をもとに設計したプライマーを用いて、PCRによってBCRP cDNAを増幅し、単離した。
得られた野生型遺伝子を発現ベクターに組み込み、適当な宿主細胞に導入する。
【００１５】
本発明において使用可能なベクターとしては、例えばAusubelら（Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, New York, New York, 1987）に記載されたものが挙げられ、特に限定されるものではなく、使用する宿主細胞によって選択し得る。
上記発現ベクター中には、細胞内における該遺伝子の転写を促進するプロモーター配列等の調節配列、複製開始点、選択マーカーをコードする遺伝子等を有していても良い。
【００１６】
また、上記ベクターを用いて本発明に係るポリペプチドを産生するために導入し得る宿主細胞としては、例えば大腸菌のような原核生物の細胞、例えば酵母、昆虫、哺乳動物の培養細胞のような真核生物の細胞が挙げられる。
ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための方法は当該分野において公知である。例えば上記Ausubelらに記載の形質転換法、リン酸カルシウム沈降法、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、感染などが挙げられる。
【００１７】
具体的には、宿主が大腸菌（Escherichia coli）の場合、発現ベクターとして、pHa-IRES-DHFRプラスミドベクター（Zhangら、Methods in Enzymology 292:474-480(1998)）、プラスミドベクターpET-3（Rosenberg, A. H. et al., Gene 56, 125-35 (1987)）、pGEX-1（Smith, D. B. and Johnson, K. S., Gene 67, 31-40 (1988)）などが用いられる。大腸菌の形質転換は、Hanahan法（Hanahan, D., J. Mol. Biol.166, 557-580 (1983)）、エレクトロポレーション法等で行う。酵母の形質転換は、例えば、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等により行なわれる。
【００１８】
一方、宿主がほ乳動物細胞、例えば、マウスPA317細胞、チャイニーズハムスター卵巣由来細胞CHO、ヒトHeLa細胞などの場合、pMSG（クロンテク社）などのベクターが用いられる。ほ乳動物細胞への組換えDNAの導入は、リン酸カルシウム法、DEAE-デキストラン法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法等で行われる。宿主が昆虫細胞の場合には、バキュロウイルスベクターpBacPAK8/9（クロンテク社）などが用いられる。昆虫細胞の形質転換は、例えば、バイオ／テクノロジー（Bio/Technology）,6, 47-55(1980)などに記載の方法に従って行うことができる。
【００１９】
上記のようにして野生型BCRPをマウスPA317細胞に発現させたところ、形質転換された細胞がSN-38、ミトキサントロンに対して耐性になることが観察された（図２）。この耐性は、Ｎ末端にＨＡタグ、Ｍｙｃタグ等のタグを結合させて融合タンパク質の形態で発現させても同じであった。得られた抗癌剤耐性細胞をMycABCPと命名した。
【００２０】
次いで、上記の野生型BCRPの遺伝子にランダムに突然変異を導入した。突然変異変異としては、コードされるタンパク質において１個又は複数のアミノ酸が欠失、置換又は付加された変異が含まれる。変異型BCRP遺伝子及びタンパク質を得る方法は当分野において公知の方法を用いれば良く、特に限定するものではないが、簡便であること、ランダムに突然変異が入るので導入される変異に偏りがないこと、分子あたりの突然変異の数を制御可能であることなどから、PCRを用いる方法が好ましい。
種々の変異を導入した変異型BCRP遺伝子を、野生型BCRPタンパク質を発現するようになった抗癌剤耐性細胞MycABCPに、同様にして導入する。導入された細胞におけるタンパク質の発現は、ウエスタンブロット等によって確認する。
【００２１】
このようにして野生型及び種々の変異型BCRP遺伝子を導入した各細胞において、SN-38、ミトキサントロン等の抗癌剤を添加し、耐性の強さを検討した。具体的には、抗癌剤耐性細胞MycABCPに変異型BCRP遺伝子を導入後にメトトレキセートで選択して得られた細胞、親株の耐性細胞MycABCP、及び感受性細胞PA317を、種々の濃度のSN-38又はミトキサントロンの存在下で培養した。抗癌剤添加６日後の細胞数を計測し、抗癌剤に対する感受性を調べた。
【００２２】
その結果、BCRPタンパク質の第５膜貫通領域において、野生型BCRPタンパク質のアミノ酸配列に対して１個又は複数のアミノ酸が欠失、置換又は付加からなる変異を有する変異型BCRPにおいて、抗癌剤耐性が顕著に低下することが示された。薬剤耐性に関与するタンパク質において、変異型タンパク質の共存によって阻害効果が示された報告はこれまでになく、この結果は予想外のものであった。変異は、第５膜貫通領域内におけるものであれば良く、部位及び変異の種類が特に限定されるものではないが、好ましくは１個のアミノ酸の置換である。より好ましくは、この置換は野生型BCRPタンパク質のアミノ酸配列における554番目の残基における置換である。さらに好ましくは、この置換は野生型BCRPタンパク質のアミノ酸配列における554番目の残基におけるロイシンからプロリンへの置換（Leu554Pro）である。また、該変異型タンパク質は、第５膜貫通領域以外にも別の変異を有するものであっても良い。
【００２３】
従って、BCRPタンパク質の発現によって薬剤耐性を示す細胞において、上記変異型BCRPタンパク質、又は上記変異を含む断片を共存させることにより、同細胞の薬剤耐性を低下させることができる。断片としては、上記変異を含む、アミノ酸３０個以上の断片であるのが好ましい。また、対象となる薬剤は、SN-38、ミトキサントロン、イリノテカン等の抗癌剤等の薬剤が挙げられる。従って、本発明に係るタンパク質、又は上記変異を含む断片を、薬剤耐性克服のための医薬として使用することができる。
【００２４】
また、上記変異型BCRPタンパク質をコードする遺伝子又はその断片を用い、遺伝子治療に利用することも可能である。断片としては、発現するポリペプチドが上記変異を含むような、９０個以上の塩基であることが好ましい。遺伝子治療に用いる場合には、ヒト細胞への遺伝子導入のために、発現ベクターとして、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、リポソームなどを用いる方法が用いられる。
【００２５】
本発明において、医薬としては、薬剤耐性の生じた当該薬剤、特に抗癌剤と組み合わせて、又は単独で、上記タンパク質若しくは上記変異を含む断片、上記遺伝子若しくはその断片を投与するものが挙げられる。対象疾患としては、白血病、リンパ腫、乳癌及び肺癌等の癌等が挙げられ、これらの治療のために、薬剤耐性となった患者、又は薬剤耐性となるおそれのある患者に対して投与することができる。また、上記必須成分の他、製薬上許容される担体、賦形剤、緩衝剤等の医薬において通常使用される成分を適宜含ませることができる。患者への投与法としては、骨髄移植、皮下注射、静脈注射などが用いられる。投与量は、患者の年齢、性別、体重、疾患の程度などに応じて、適宜決定される。
【００２６】
【実施例】
［実施例１］  野生型BCRP遺伝子の単離
PCR法を用いてヒトBCRP cDNAの単離を行った。PCRでは、Clontech社のHuman placenta Marathon-ready cDNAを鋳型とし、ヒトBCRP cDNAの５’側のプライマー１S（CCTGAGATCCTGAGCCTTTGGTT：配列番号７）、及び３’側のプライマー5AS（GATGGCAAGGGAACAGAAAACAACA：配列番号８）の２本のオリゴヌクレオチドをプライマーとして、Clontech社のAdvantage cDNA PCR kitを用いて、９４℃で１分間の反応を１回行った後、９４℃で３０秒間、６８℃で３分間の反応を３５回繰り返し、最後に９４℃で３０秒間、６８℃で１５分間の反応を１回行い、約2150bpの増幅されたcDNAを得た。
【００２７】
これをpCR2.1プラスミド（インビトロジェン社）にサブクローニングしてPerkin Elmer社のABI PRISM 377 DNA Sequencerを用いて塩基配列を決定した。独立した４個のクローンの塩基配列を決定し、PCRによる変異と推定される部分は除いて、本遺伝子のコーディング領域の塩基配列（配列番号１）と、それから推定されるアミノ酸配列（配列番号２）を決定した。これらの配列を、本明細書において、それぞれ野生型BCRPの塩基配列及びアミノ酸配列とする。得られたBCRP遺伝子の塩基配列は、従来報告されていた配列と相違していることが見出された。この野生型BCRPの塩基配列と、GenBankにaccession number AF103796として登録されているABCPの配列、及びaccesion number AF098951として登録されているBCRPの配列の相違点を表１に示した。
【００２８】
【表１】
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【００２９】
［実施例２］  変異型BCRP遺伝子の作製
実施例１で得られた野生型BCRP cDNAにランダムに変異を入れるために、２度目のPCRを行った。２度目のPCRでは、上記のPCR反応で得られたヒトBCRP cDNAを鋳型とし、５’側のプライマー5HA-204S（CCCCGCGGCATGTACCCATACGACGTCCCAGACTACGCTATGTCTTCCAGTAATGTCGAAGTTTTTATCCCAGTGTC：配列番号９）及び３’側のプライマー8AS（CGCCTCGTGGATGGCAAGGGAACAGAAAACAACA：配列番号１０）の２本のオリゴヌクレオチドをプライマーとして、Clontech社のAdvantage cDNA PCR kitを用いて、９４℃で１分間の反応を１回行った後、９４℃で３０秒間、６８℃で３分間の反応を３５回繰り返し、最後に９４℃で３０秒間、６８℃で１５分間の反応を１回行い、約2200bpの増幅されたcDNAを得た。
【００３０】
このcDNAの両末端をSstII及びXhoIの２種の制限酵素で切断後、SstII及びXhoIで切断したpHa-IRES-DHFRプラスミドベクター（Zhangら、Methods in Enzymology 292:474-480(1998)）とT4 DNA ligaseを用いてライゲーションした。このライゲーション反応液を用いてE.coli DH5α（ギブコ社）を形質転換し、pHa-IRES-DHFRプラスミドベクターのSstII部位とXhoI部位の間にBCRP cDNAが挿入されたクローンを多数得た。E.coliを培養してプラスミドを精製し、Perkin Elmer社のABI PRISM 377 DNA Sequencerを用いてpHa-IRES-DHFRプラスミドベクターに挿入されたBCRP cDNAの塩基配列を決定した。
【００３１】
得られたBCRP cDNAクローンのうちの一つであるクローン15の塩基配列を配列番号３（5'末端の30個はＨＡエピトープであり、31個目以降がBCRP遺伝子）、推定されるアミノ酸配列を配列番号４（Ｎ末端の10個はＨＡエピトープであり、11個目以降がBCRPアミノ酸配列）に示す。BCRP cDNAクローン15は、野生型BCRPに比して、233番目のリシンがアルギニンに、418番目のアスパラギンがセリンに、554番目のロイシンがプロリンに、と３個のアミノ酸置換が起こっていた（図１）。このうち554番目の変異はBCRPタンパク質の第５膜貫通領域における変異であった。
【００３２】
［実施例３］  554番目のロイシンがプロリンに変異したBCRP cDNAクローン15Bの作製
ＨＡタグで標識した野生型BCRP cDNA（配列番号１）をMscI部位で切断し、５’側の断片を得た。次にBCRP cDNAクローン15（配列番号３）のcDNAをMscI部位で切断し、３’側の断片を得た。この両断片をライゲーションし、pHa-IRES-DHFRプラスミドベクターのSstII部位とXhoI部位の間に挿入した。このBCRP cDNAクローン15Bの塩基配列を配列番号５（5'末端の30個はＨＡエピトープであり、31個目以降がBCRP遺伝子）、推定されるアミノ酸配列を配列番号６（Ｎ末端の10個はＨＡエピトープであり、11個目以降がBCRPアミノ酸配列）に示す。
【００３３】
［実施例４］  変異型BCRP cDNAクローン15及び15Bの導入と発現による野生型BCRPの抗癌剤耐性の克服
マウスPA317細胞にMycタグで標識した野生型BCRP cDNAをトランスフェクトしてBCRPを発現するようになった抗癌剤耐性細胞MycABCPに、pHa-IRES-DHFRプラスミドベクターのSstII部位とXhoI部位の間にBCRP cDNAクローン15又は15Bが挿入されたプラスミドをリン酸カルシウム法を用いてトランスフェクションした。遺伝子導入後の細胞を120ng/mlのメトトレキセートで選択し、導入遺伝子を発現している細胞を得た。
【００３４】
MycABCPにクローン15を導入後にメトトレキセートで選択して得られた細胞をMyc-15/MTX、MycABCPにクローン15Bを導入後にメトトレキセートで選択して得られた細胞をMyc-15B/MTXと名付けた。これらの細胞及び親株の耐性細胞MycABCP、感受性細胞PA317を、種々の濃度のSN-38又はミトキサントロンの存在下で培養した。抗癌剤添加６日後の細胞数を計測し、抗癌剤に対する感受性を調べた。その結果、MycABCPはPA317に比してSN-38及びミトキサントロンに対する耐性を示したが、Myc-15/MTX及びMyc-15B/MTXでは、MycABCPの抗癌剤耐性が顕著に低下し、ほとんどPA317に近い抗癌剤感受性を示した（図２）。
BCRP cDNAクローン15Bでは、554番目のロイシンがプロリンに変異しているが、このアミノ酸はBCRPの推定される構造では５番目の膜貫通領域の中にあり、この領域がBCRPの抗癌剤耐性の克服に有用であると考えられる。
【００３５】
【発明の効果】
上記したように、本発明により、BCRPタンパク質の関与する薬剤耐性を克服し、化学療法をより効果的なものにすることができる。
【００３６】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  BCRPタンパク質の構造を模式的に示す。
【図２】野生型BCRP発現細胞へのMyc-15/MTX又はMyc-15B/MTXの導入により感受性細胞と同程度に抗癌剤耐性が低下することを示す。
【図１】
0003856632.tif 000023
【図２】
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