(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
小胞形成用のウイルス不活性化化学薬品及び／又は洗剤を含有する水性組成物中の抗トロンビンIIIとトランスフェリンとからなる群から選択された水溶性血漿タンパク質を純化する方法であって、
（ｉ）０℃から７０℃までの温度において、ホフマイスター順列による高塩析効果を有する塩を０．５Ｍから２．５Ｍまでの濃度で前記水性組成物に添加させ、ウイルス不活性化化学薬品及び／又は洗剤を含有する小胞を形成し、
（ii）該小胞の全てを水性相から除去し、
（iii）そして水性相から前記たんぱく質を分離すること、
を特徴とする水溶性血漿タンパク質の純化方法。
【請求項２】
前記塩がクエン酸塩、酒石酸塩、硫酸塩、酢酸塩、又は燐酸塩、もしくはその混合物からなる群から選択された陰イオンを含有することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記塩が陽イオンとしてナトリウムを含有することを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記塩が室温において０．５Ｍから２Ｍまでの濃度で添加されることを特徴とする請求項１乃至３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記タンパク質が抗トロンビンIIIであることを特徴とする請求項１乃至４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記タンパク質がトランスフェリンであることを特徴とする請求項１乃至４のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
発明の技術分野
本発明は水溶性血漿タンパク質、特に抗トロンビンIII又はトランスフェリンを含有する水性組成物中のウイルス不活性化化学薬品及び／又は洗剤を減少させる方法に関するものである。ホフマイスター順列による高塩析効果を有する塩の温度と０．５Ｍ以上の濃度の適当な組合わせを選択することにより、ウイルス不活性化化学薬品及び／又は洗剤を含有する小胞が形成される。これらの小胞は水性相から、例えば相分離もしくは濾過により除去され、その後、そのタンパク質は水性相から分離される。水性相が室温で１Ｍ以上の濃度のクエン酸塩もしくは硫酸塩の塩から成っている時、ウイルス不活性化化学薬品又は洗剤の減少は２０００倍又はそれ以上にすることができ、最終濃度は５ｐｐｍ以下にさせ得る。
発明の背景
第VIII因子、アルブミン、第IX因子及び抗トロンビンのような血液製剤のウイルス不活性化は製造業者にとって周知の問題である。これは普通では加熱により解決されていた。血液製剤がこのような法で不活性化されない場合は、ウイルス不活性化化学薬品の添加が使用され得る。しかし、この場合においては、医療製品を使用する前に添加したウイルス不活性化化学薬品を除去する必要がある。
ヨーロッパ特許出願第０２１８０９０号明細書（マイルズ・ラボラトリーズ）は塩分配技術を用いて２液相を発生させる能力を有する成分を含有する水性系からタンパク質又は核酸を分離しかつ回収する方法を開示している。この方法においては、重合体と水溶性の塩、例えば燐酸カリウム、または燐酸ナトリウム、もしくは硫酸アンモニウムがタンパク質あるいは核酸に添加され、そこで生成された溶液がそのままの状態にされて分離される。ウイルス不活性化化学薬品又は洗剤についての情報はなく、同様にその化合物の濃度を医薬的に容認できるレベルまで低下させる技術についての情報も欠けている。
ヨーロッパ特許出願第０２３９８５９号明細書（ニューヨーク血液センター）は生体物質を油抽出物と接触させ、生成した混合物を撹拌し、上相と下相を沈降もしくは遠心分離によって分離し、そして油と抽出プロセス化学薬品を含む上相を抽出することにより生体物質からウイルス不活性化溶剤及び／又は洗剤のような脂質可溶性プロセス化学薬品を除去する方法を開示している。高塩析効果を有する有機もしくは無機の塩の添加又はそれらの存在により得られる利点についての情報は何もない。水性相中でこれらの塩がないと、抽出工程を反復することによって不活性化溶剤及び／又は洗剤の非常に低いレベルに達するには複雑な工程を必要とする。
ヨーロッパ特許出願第０１３１７４０号明細書（ニューヨーク血液センター）にはタンパク質含有組成物を好ましくは非イオン性洗剤の存在下においてジアルキルリン酸塩もしくはトリアルキルリン酸塩と接触させることによりタンパク質含有組成物についてウイルスの不活性化を行う別の方法が開示されている。この方法によれば、ジアルキルリン酸塩もしくはトリアルキルリン酸塩はタンパク質をグリシンおよび塩化ナトリウムで沈殿させることにより除去される。洗剤は分離濾過（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）、クロマトグラフ吸着及び沈殿中で選ばれたいくつかの工程により除去され得る。
これらの方法は骨の折れる時間の浪費する方法であり、しばしば洗剤とウイルス不活性化化学薬品の十分な減少を得ることができない方法でもある。
１９９１年発行の「バイオセパレーション」、第２巻、第３１５頁乃至第３２４頁のアール  エー  ラメルメイアー氏等著による論文（ａｎ  ａｒｔｉｃｌｅ  ｂｙ  Ｔ  Ａ  Ｒａｍｅｌｅｍｅｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ２，３１５−３２４，１９９１）において、疎水性酵素が発酵培養液から、例えば温度と塩の濃度を変化させて洗剤を基剤とする２相系に純化できることが知られている。０．２Ｍ以上の濃度の塩は用いられなかった。酵素は洗剤相で回収され、そして８０乃至９０％まで回収され得る。
発明の概要
特定の塩の濃度が抗トロンビン又はトランスフェリン（血漿から分別されたものか、又は組換え型の生成物）、ウイルス不活性化化学薬品、好ましくはトリ−ｎ−ブチル燐酸塩（ＴＮＢＰ）及び／又は洗剤、好ましくはトリトン（登録商標）を含む組成物中で０．５Ｍ以上に増加されると、ＴＮＢＰの濃度は１ｐｐｍ以下に減少され得るし、またトリトンの濃度も水性相で５ｐｐｍ以下に減少され得ることが以外にもわかった。
ウイルス不活性化化学薬品又は洗剤あるいはその混合物が添加されたタンパク質組成物を純化させる方法をこのようにして見出した。この１行程法は先に周知の多行程法よりも実施が容易である。その上、本方法は小胞の形成がほぼ瞬間的であるので、迅速に実施できる。さらに、本方法は最終製品に与えるウイルス不活性化化学薬品及び洗剤の量が周知の方法に比べ同じかそれ以下である。
従って、本発明は抗トロンビンIIIとトランスフェリンとからなる群から選択された水溶性血漿タンパク質を含む水性組成物中のウイルス不活性化化学薬品及び／又は洗剤の濃度を減少させる方法であって、ホフマイスター順列による高塩析効果を有する塩の０．５Ｍから２．５Ｍまでの濃度と温度との適当な組合わせを選択することによりウイルス不活性化化学薬品及び／又は洗剤を含む小胞を形成し、その後小胞のすべてを水性相から除去し、そしてタンパク質を水性相から引続き分離させることを特徴とする方法に関するものである。
本発明は０℃から７０℃までの範囲の組成物の温度で実施できる。０℃の温度以下では組成物は凍結しているか、あるいは粘度が少なくとも高い。７０℃以上の温度では、タンパク質は程度の違いはあるが変性していて、その活性を失っている。前記組成物の温度は１０℃から５０℃までの範囲、好ましくは２０℃から３０℃までの範囲が適当で好ましい。
一般的に、多量の電解液を新液性ゾル、すなわち極めて小さい親水性粒子を含む組成物に添加することは分散物質を沈降させることになる。その効果を“塩析”と称する。塩析効果はイオン、主として陰イオンの性質に依存するが、陽イオンも関連する。イオンはコロイド溶液から親液性物質を除去する能力の順に配列され得る。これは時にはホフマイスター順列、特に一般的には離液順列と呼ぶ。ここで参考までに１９４６年４月トロントのヴァンノストランド社発行、エス・グラストーン著「テキストブック  オブ  フィジカル  ケミストリ」、第２版、第１２５４頁乃至第１２５９頁（Ｓ．Ｇｌａｓｓｔｏｎｅ，Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖａｎ  Ｎｏｓｔｒａｎｄ  Ｃｏ．，Ｔｏｒｏｎｔｏ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ａｐｒｉｌ  １９４６，ｐ．１２５４−１２５９）を引用する。ホフマイスター順列による高塩析効果を有する塩は塩化物イオンよりも高い塩析効果を有する陰イオンを有するものである。この範囲の陰イオンは１価、２価及び３価陰イオンを含む。２価もしくは３価陰イオンは本発明に適切に使用され、好ましくは３価陰イオンが適切に用いられる。この範囲の陰イオンの主たる例はクエン酸塩、酒石酸塩、硫酸塩、酢酸塩、燐酸塩およびフッ化物であって、クエン酸塩、酒石酸塩及び硫酸塩が好ましい。本発明において有利に用いることができる陽イオンはリチウム、ナトリウム、アンモニウム及びカリウムのような１価の陽イオンである。単純性と医薬的に容認できる添加物であるが故に、ナトリウム、アンモニウム又はカリウムが好ましく、そのうちナトリウムがもっとも好ましい。従って、本発明で特に好ましい塩はクエン酸ナトリウム、酒石酸ナトリウム及び硫酸ナトリウムである。上述したような異なる陰イオン及び／又は陽イオンを有する塩の混合物が有利に使用されえることも本発明の範囲内である。さらに、上述したものと同一もしくは異なる塩の添加は有利に順次実施できる。
本発明においては、塩の濃度が本発明に従って０．５Ｍ以上に増加された場合に、ウイルス不活性化化学薬品及び／又は洗剤が沈降する代りに、溶液中に小胞好ましくはミセルを形成することがわかった。小胞の形成とそれにより達成できるウイルス不活性化化学薬品及び／又は洗剤の濃度減少は水性相における高塩析効果を有する塩の濃度と温度の組合わせに依存する。室温における塩の濃度は１Ｍ以上であることが好ましい。温度を室温以上に上昇させることにより、より低い濃度の塩を使用できる。より低い温度ではより高い濃度の塩が必要である。温度は０℃と７０℃との間にすることができるが、そのときの塩の濃度はそれぞれ１．５Ｍ以上と０．５Ｍ以上とすべきである。塩の濃度は２．５Ｍ以上を超えてはならない。それ以上であれば塩及び／又はタンパク質の沈降をもたらすことになる。塩の濃度は２．０Ｍ以下であることが好ましい。
小胞は水性相から例えば相分離、濾過又は遠心分離あるいはその順序により、好ましくは相分離の後の濾過の順序により除去され得る。小胞が相分離により除去されるとき、組成物は滞留時間の間そのままの状態にし、ウイルス不活性化化学薬品及び／又は洗剤が事実上完全に水性相の上面で回収されるか、あるいは油が存在する場合、油相中もしくは油相の上面で回収される。従って、油、たとえば大豆油を好ましくは相分離前に組成物に添加させる。この方法において、小胞はタンパク質含有水性相から迅速かつ非常に完全に分離される。油が存在する適当な滞留時間は約１０分から約２時間までの範囲にある。油が存在しない適当な滞留時間は約１５分から４時間までの範囲にある。濾過を用いて小胞を除去する時、これは小胞が本発明の慎重に選ばれた条件下で瞬時的に形成されるので、すぐに実施できる。
使用されるウイルス不活性化化学薬品は洗剤分子の少なくとも一部分であるので、一般的に疎水性である。用いられるウイルス不活性化化学薬品は１乃至１０の炭素原子を適切に有する枝状もしくは枝なし、又は置換あるいは置換していないアルキル基を備えたジアルキル燐酸塩またはトリアルキル燐酸塩にすることができる。適当なトリアルキル燐酸塩の例はアルキル基がｎ−ブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ヘキスル、２−エチルヘキスルおよびｎ−デシルであるものである。ウイルス不活性化化学薬品はなるべくならトリ−ｎ−ブチル燐酸塩（ＴＮＢＰ）であることが好ましい。各種のジアルキル燐酸塩の混合物も各種のトリアルキル燐酸塩の混合物と同様に使用できる。ジアルキル燐酸塩とトリアルキル燐酸塩の混合物も本発明の範囲内での使用が可能である。
洗剤は適当なものとしてポリオキシエチレンエーテル、例えばトリトン（登録商標）、又はポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、例えばポリオキシエチレン−（２０）−ソルビタンモノラウラートもしくはポリオキシエチレン−（２０）−ソルビタンモノオレアートのような非イオン系洗剤である。なるべくなら洗剤はトリトンＸ−１００（登録商標）であることが好ましい。
処理されるタンパク質は血漿を分別する一般的な方法及び血漿タンパク質を分離する一般的方法により又は組換え方法により製造できる。
ウイルス不活性化工程は水溶液中のタンパク質に洗剤（たとえば、トリトン（登録商標）及び／又はトリトンＸ−１００（登録商標））とウイルス不活性化化学薬品、例えばトリ−ｎ−ブチル燐酸塩（ＴＮＢＰ）を添加することを含む。その後、水溶液は撹拌される。組成物の温度と塩濃度は小胞を形成させるために調整される。不活性化溶液には、好ましくは油を添加（例えば約５％）させる。その後、混合物は分離装置例えば分離漏斗で相分離され得る。タンパク質は水性相から、例えば分離濾過、脱塩、クロマトグラフィーもしくは沈殿により容易に分離できる。
ｐｈは普通では５以上、好ましくは６以上である。
ウイルスの不活性化化学薬品及び洗剤の医薬的に容認できる濃度は特定の化合物に依存して変化する。本方法において、５ｐｐｍ以下の洗剤と１ｐｐｍ以下の不活性化化学薬品は普通では水性相中で見出される。これらの濃度はこのような化合物の通常認められている医薬的に容認できる濃度を十分に下回るものである。これはタンパク質の分離以外に、普通のさらなる精製工程を必要としないことを意味し、これは血漿タンパク質の製造に大きい利点である。
次の実施例は本発明の範囲を制限することなく本発明を具体的に例示するものである。
実施例１
抗トロンビンIII（ＡＴIII）がスウェーデン国のファーマシア  アクチボラーグ社により血漿から製造された。前記ＡＴIIIはヘパリンセファロースのゲルを用いて血漿から分離された。
１００ｍｌの２％のＡＴIII溶液には、１．５ｇの保管溶液（３部のＴＮＢＰと１０部のトリトンＸ−１００）が添加された。前記ＴＮＢＰとトリトンＸ−１００はそれぞれドイツ国のメルク社と米国のユニオンカーバイド社製の市販品であった。前記溶液の温度を２４℃に調整し、その溶液を少なくとも３時間のあいだ撹拌した。２Ｍのクエン酸ナトリウムと０．０５Ｍの燐酸ナトリウムを含む１００ｍｌの緩衝液をゆっくりと添加した。クエン酸塩の生成濃度はそれ故１Ｍであった。前記溶液を添加中にゆるやかに撹拌した。そこで大豆油を約５％にまで添加した。前記溶液を３０分間ゆるやかに撹拌し、そしてその後、９０分間そのままの状態にして相分離させた。
油相の上面中に又は油相の上面上にミセルが見られた。ＡＴIIIが見られる水性相の底部において、トリトンＸ−１００の含有量は５ｐｐｍ以下であり、そしてＴＮＢＰの含有量は１ｐｐｍ以下であったＡＴIIIの活性度の回復率は９５％以上であった。
実施例２
スウェーデン国のファーマシア  アクチボラーグ社の製造にかかるトランスフェリンが「コーンの低温エタノール法」でＦｒＩＶから分離され、そしてさらにクロマトグラフィーにより精製された。
１００ｍｌの２％のトランスフェリン溶液に１．５ｇの保管溶液（３部のＴＮＢＰと１０部のトリトンＸ−１００）を添加した。前記溶液の温度を２４℃に調整し、そしてその溶液を少なくとも３時間のあいだ撹拌した。２Ｍのクエン酸ナトリウムと０．０５Ｍの燐酸ナトリウムを含む１００ｍｌの緩衝液をゆるやかに添加した。クエン酸塩の生成濃度はそれ故に１Ｍであった。前記溶液を添加中にゆるやかに撹拌し、そしてその後３０分間そのままの状態にして相分離させた。
前記溶媒洗剤処理液を３等分量に分割した。
第１分量において、ミセルを濾過により直ちに分離した。
第２分量をさらなる処理を行わないでそのままの状態にして相分離させた。その後、底部相のＴＮＢＰとトリトンＸ−１００の分析を行った。水性相の上面中に又はその上面上にミセルが見出された。
第３分量に大豆油を添加し、実施例１により引続き処理した。油相中又はその上面上にミセルが見出された。
タンパク質溶液からミセルを分離する３つの方法のすべてにおいて、水性相におけるトランスフェリンの活性度の回収率は９５％以上であった。前記３つの方法の全てにおいて、ＴＮＢＰの含有量は１ｐｐｍ以下であり、そしてトリトンＸ−１００の含有量は５ｐｐｍ以下であった。
実施例３
抗トロンビンIII（ＡＴIII）はスウェーデン国のファーマシア  アクチボラーグ社により血漿から製造された。前記ＡＴIIIはヘパリンセファロースのゲルを用いて血漿から分離された。
１００ｍｌの２％のＡＴIII溶液に、１．５ｇの保管溶液（３部のＴＮＢＰに１０部のトリトンＸ−１００を加えたもの）を添加した。前記溶液の温度を２４℃に調整し、そしてその溶液を少なくとも３時間の間撹拌した。２Ｍの硫酸ナトリウムと０．０５Ｍの燐酸ナトリウムを含む１００ｍｌの緩衝液をゆるやかに添加した。硫酸塩の生成濃度はそれ故に１Ｍであった。前記溶液を添加中にゆるやかに撹拌し、そしてその後３０分間のあいだそれをそのままの状態にして相分離した。前記溶液をそこで直ちに濾過した。濾液中において、抗トロンビンIII活性度の９５％以上が回復した。トリトンＸ−１００の含有量は５ｐｐｍ以下であり、そしてＴＮＢＰの含有量は１ｐｐｍ以下であった。
比較のための実施例
スウェーデン国のファーマシア  アクチボラーグ社の製造にかかるアルブミンが「コーンの低温エタノール方法」の変形例により分離された。
１００ｍｌの２％アルブミン溶液に、１．５ｇの保管溶液（３部のＴＮＢＰに１０部のトリトンＸ−１００を加えたもの）を添加した。前記溶液の温度を２４℃に調整し、その溶液を少なくとも３時間のあいだ撹拌した。２Ｍのクエン酸ナトリウムと０．０２Ｍの酢酸ナトリウムを含む１００ｍｌの緩衝液をゆるやかに添加した。クエン酸塩の生成濃度はそれ故に１Ｍであった。前記溶液を添加中にゆるやかに撹拌し、そしてその後３０分間それをそのままの状態にして相分離させた。前記溶液をそこで直ちに濾過した。濾液中のアルブミン活性度の９５％以上が回復された。トリトンＸ−１００の含有量は２５０ｐｐｍであり、そしてＴＮＢＰの含有量は３５ｐｐｍであった。
アルブミン溶液中のウイルス不活性化剤のこれらの比較的高い濃度は疎水剤と結合するアルブミンの能力で説明がつく。アルブミンの１つの目的は血液中の疎水性分子を輸送することにある。従って、アルブミンにおいては例えばクロマトグラフ工程もしくは分離濾過（ダイアフィルトレーション）のさらなる分離を必要とする。