(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
リソソーム蓄積症（ＬＳＤ）を検知し、ＬＳＤあるいはヒトまたは動物の患者における治療の効能の進行をモニタリングする方法において、前記方法は前記患者から得られる血液試料において、ＬＡＭＰ−２またはそれらの免疫相互作用的な同族体，類似体または誘導体の水準の増加を検定することを含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法において、前記ＬＡＭＰ−２の水準の検定手段は血液試料中の前記ＬＡＭＰ−２の酵素活性を測定することを含むことを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法において、前記ＬＡＭＰ−２の水準の検定手段は複合体の形成が起こるのに十分な時間および条件下で前記ＬＡＭＰ−２に特有の１種または２種以上の免疫相互作用分子で血液試料に接触させることを含むことを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項３に記載の方法において、前記免疫相互作用分子は前記ＬＡＭＰ−２に結合する抗体分子であることを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法において、前記抗体分子は前記ＬＡＭＰ−２に結合するモノクローナル分子であることを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項３〜５のいずれかに記載の方法において、前記免疫相互作用分子または抗体分子はリポーター分子で標識化されることを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項３〜５のいずれかに記載の方法において、結合が起こるのに十分な時間および条件下で、標識化免疫相互作用分子により前記ＬＡＭＰ−２と免疫相互作用分子または抗体分子の間に形成される複合体に接触させる手段を含むことを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項７に記載の方法において前記標識化免疫相互作用分子はリポーター分子により標識化されることを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項６または８に記載の方法において、前記リポーター分子は酵素分子，蛍光体分子または放射性核種分子であることを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法において、前記酵素分子，蛍光体分子または放射性核種分子はホースラディッシュペルオキシダーゼ，グリコースオキシダーゼ，β−ガラグトシダーゼ，アルカリホスファターゼ，フルオレセイン，Ｅｕ3+またはその他のランタノイド金属もしくはローダミンを含むリストから選択されることを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法において、前記蛍光体分子はＥｕ3+であることを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれかに記載の方法において、前記ＬＡＭＰ−２は、リソソームに運ばれる、あるいはリソソーム中に蓄積することを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれかに記載の方法において、前記ＬＳＤは表１に記載されるリストから選択されることを特徴とする方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の方法において、前記ＬＳＤはＭＰＳＩ，ＭＰＳＩＩ，ゴーシェ病，ポンペ病およびサッラズ病（Ｓａｌｌａ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）を含むリストから選択されることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
［技術分野］
本発明は、通常、リソソーム蓄積症と、ヒトおよびその他の動物におけるリソソーム蓄積症の診断用薬に関するものである。特に、本発明は多くのリソソーム蓄積症を発見するための診断用薬として、とりわけＬＳＤマーカーであるＬａｍｐ−１，Ｌａｍｐ−２，Ｌｉｍｐ−ＩＩ，酸性ホスファターゼ（ＡＣＰ），β−ヘキソサミニダーゼあるいはα−マンノシダーゼの使用に向けられるものである。
【０００２】
本明細書中で著者が言及した刊行物の文献目録は明細書の末尾にまとめてある。
【０００３】
本明細書中、文脈上特にことわりのない限りにおいて、“ｃｏｍｐｒｉｓｅ”という語、あるいは“ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ”や“ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ”等の変化は、述べられた要素や全体、あるいは要素や全体の集まりの包含を意味するが、その他の要素や全体、もしくは要素や全体の集まりの排除を意味しないものと理解されるであろう。
【０００４】
【従来の技術】
［背景技術］
リソソーム蓄積症（ＬＳＤ）は、３９種類の異なる遺伝病の一群を表し、それぞれの遺伝病は特定のリソソーム蛋白質の欠乏に、あるいは、ごくわずかの場合、リソソーム生合成に含まれる非リソソーム蛋白質に起因している。
【０００５】
健康管理に対するこれらの疾患の重要性は、ＬＳＤへのグループ罹患率（１：５，０００出生）が周知でかつ徹底的に研究された遺伝病と比較された場合に、明らかとなり、フェニルケトン尿症（１：１４，０００）および嚢胞性繊維症（１：２，５００）のような、新生児スクリーニングが目下のところ行われている。一般に幼児がＬＳＤに罹り、ＬＳＤは子供とその家族に対して破壊的な衝撃力を有している。罹患した個体は、特定の疾患およびそれに含まれている特定の遺伝子型に依存する広い範囲の臨床症状を現し得る。行動上の問題から重篤な精神遅滞まで、中枢神経系の機能障害は、多くのＬＳＤの特徴である。骨格異常，器管（臓器）肥大症（ｏｒｇａｎｏｍｅｇａｌｙ），角膜混濁および異形性の形質（ｄｙｓｍｏｒｐｈｉｃ  ｆｅａｔｕｒｅ）（Ｎｅｕｆｅｌｄ  ａｎｄ  Ｍｅｕｎｚｅｒ，１９９５）といった他の症状がムコ多糖症に含まれている。深刻な場合には、子供はその病気に対する恒常的な医学的処置を必要とするが、青年期に達する前に死亡してしまう。
【０００６】
ＬＳＤの症前検出は、病気の家族歴に関する場合以外には、新生児スクリーニングによってのみ成し逐げられる。現在は、臨床症状の発現後でさえ、ＬＳＤの診断は尿，血液および繊維芽細胞などの何らかの病気に関して行われる検定範囲を含む複雑な処置である。これらの検定は時間を浪費し、高価かつ侵襲性があり、これらを新生児スクリーニングに適用されるのには適していない。所定の疾患あるいは疾患の群について新生児人口全体のスクリーニングを正当化するために、満たすべき多くの基準がある。これらの基準は、２つの大まかな考慮事項として要約され得る。第１には、新生児診断は新生児および家族に対して明確な恩恵を施すのか？第２には、これらの恩恵はスクリーニングの総費用と適当につりあうのか？
【０００７】
近年、いくつかのＬＳＤの治療が可能となっている。シスチン蓄積症はシステアミンで治療され（Ｇａｈｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７；Ｍａｒｋｅｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）、ムコ多糖症（ＭＰＳ）ＩおよびＭＰＳ  ＶＩを含む多数のＬＳＤは骨髄移植片（Ｈｏｏｇｅｒｂｒｕｇｇｅ  ｅｔ  ａｌ，１９９５；Ｈｏｐｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ，１９９３）に感応しやすい。現在のところ、骨髄移植法のような酵素補充療法によって治療されているゴーシェ病は、理論上、広範囲のＬＳＤに応用することができる。ＬＳＤの多くにおいて組換え酵素の不足が特徴的であり、現在では、これらの疾患に対する酵素補充療法および遺伝子療法を評価するために用いられている多数の動物モデルがある。現在使用されている動物モデルには、フコース蓄積症（Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９）およびＭＰＳ  ＶＩＩ（Ｈａｓｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）に対するイヌモデル，ＭＰＳ  ＩおよびＭＰＳ  ＶＩ（Ｃｒａｗｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６；Ｈａｓｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）に対するネコモデル，β−マンノシドーシス（Ｊｏｎｅｓ  ａｎｄ  Ｋｅｎｎｅｄｙ，１９９３）およびＭＰＳ  ＩＩＩＤ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）に対するヤギモデルおよびＭＰＳ  ＶＩＩ（Ｓａｎｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４），ガラクトシアリドシス（Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）およびニーマン・ピック病（Ｏｔｔｅｒｂａｃｈ  ａｎｄ  Ｓｔｏｆｆｅｌ，１９９５）に対するマウスモデルが含まれる。次の５〜１０年以内にはおそらく、多くのＬＳＤに対して有効的な療法が入手されるであろう。
【０００８】
これらの療法、特に中枢神経系および骨病理学を含むこれらのＬＳＤに対する療法の有効性は、とり返しのつかない病理の発症以前の障害に対する早期の診断と治療に大いにかかっている。
【０００９】
主に中枢神経系病理（Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９）およびＭＰＳ  ＶＩネコモデル（主に骨病理）における酵素補充療法（Ｃｒａｗｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６；Ｃｒａｗｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）に関係するフコース蓄積症イヌモデルにおいて骨髄移植を含む動物研究は、治療が開始されたときの年齢と効能の間に明らかな相関性を示している。このような酵素補充療法は骨病理の予防に効果的である。
【００１０】
究極的な骨髄移植療法として、さらに進んだ考察としては、ＬＳＤの早期診断は臨床医に、本来潜在している新生児の免疫系への移植の見込みを最大化させ得るということである。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
これらの疾患の早期検出は、その後の妊娠における出生前診断という選択肢および罹患した子供の処置法とともに、両親の遺伝相談を可能にするという付加価値を有している。治療計画の進行をモニターするための正確なテクニックも必要とされている。
【００１２】
これらのＬＳＤの１共通点としては、通常はリソソーム内で分解され、リソソーム膜を横切って運ばれる物質が蓄積および貯蔵されることである。これは、細胞内のリソソームの数および大きさが総細胞量の約１％から５０％までにも増加する結果となることが一般に認められている。しかし、罹患した細胞中のリソソーム蓄積液胞の形成は周知であるが、リソソーム生合成が起こる過程、特にその過程に含まれる遺伝子および酵素の性質と役割はあまり理解されていない。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
［発明の開示］
本発明を導く研究において、発明者らはリソソーム蓄積症のマーカー（以下、“ＬＳＤマーカーと呼ぶ”）として役目を果たすことができるタンパク質核酸分子，オリゴ糖，ガングリオシドおよびリソソームの生合成に含まれる過程を見極めようとした。発明者らによって確認されたＬＳＤマーカーは、１度の検定で全てのＬＳＤの症候前の検出を容易にするための手順の開発を含む、ヒトおよびその他の動物の治療に関する幅広い診断用および治療用の試薬の開発を提供するものである。
【００１４】
従って、本発明の第１の要旨は、リソソーム蓄積症（ＬＳＤ）を検知し、ここで定義する、前記患者から得た生体試料におけるＬＳＤマーカーの発現水準を検定することを含む、ＬＳＤまたは、ヒトもしくは他の動物の患者におけるＬＳＤの治療の効能をモニターする診断方法を提供することである。
【００１５】
ここで用いる“ＬＳＤマーカー”という用語あるいは似たような用語は、酵素，タンパク質，ポリペプチドもしくはその他の生体分子，ヒトあるいはその他の動物のリソソームから得られるそれらの同族体，類似体もしくは変異体を称するのに用いることし、それらの発現の常在度あるいは水準は前記動物における少なくとも１つのＬＳＤの発生，発達もしくは発症に関係している。ＬＳＤマーカーは一般に、正常な個体から観察されるものとは異なる水準でＬＳＤを有する患者から得られる細胞内で発現する。
【００１６】
本発明はとりわけ、ポンペ病，サッラ病（Ｓａｌｌａ  ｄｉｓｅａｓｅ），ゴーシェ病，ＭＰＳ  Ｉ，ＭＰＳ  ＩＩ，ＭＰＳ  ＩＩＩＩＡ，ＭＰＳ  ＩＩＩＢ，ＭＰＳ  ＩＩＩＩＣ，ＭＰＳ  ＩＶＡおよびＭＰＳ  ＶＩを含むムコ多糖症（ＭＰＳ），ＭＬ  ＩＩ／ＩＩＩを含むＩ細胞病，テイ・サックス病，ファブリー病，異染性白質萎縮症（ＭＬＤ），ニーマン・ピック病および多種スルファターゼ欠損症を含むリストから選択される広範囲のＬＳＤ診断用のＬＳＤマーカーの検定に及ぶものであるが、これらに限られるものではない。
【００１７】
当該技術分野において熟達した者であれば、マーカーは病気に対する遺伝子疾病素質を診断するために、また、病気を発見するために用いられるということに気づくであろう。したがって、本発明は、患者の遺伝子疾病素質１またはそれ以上、あるいは先に論じたＬＳＤを測定するためのＬＳＤマーカーの検定に及ぶものである。
【００１８】
【発明の実施の形態】
本発明にかかるＬＳＤマーカーは、ＬＳＤに特有の、あるいは、ＬＳＤに罹っている患者のリソソーム中の増加率において少なくとも蓄積されたリソソーム増殖の結果として上昇するあらゆるリソソーム酵素，タンパク質，ポリペプチドあるいはその他の生体分子であればよい。関連技術分野における熟練者であれば、本願の目的に最も適したＬＳＤマーカーは、ＬＳＤにおかされた患者の細胞において、罹患していない患者よりも、少なくとも２倍、好ましくは少なくとも５倍、より好ましくは少なくとも１０倍、さらにより好ましくは少なくとも２０倍高く発現されるそれらの酵素，タンパク質，ポリペプチドあるいはその他の生体分子である。
【００１９】
本発明は、ＬＳＤマーカーとてとりわけＬａｍｐ−１，Ｌａｍｐ−２，Ｌｉｍｐ−ＩＩ，マンノース−６−リン酸受容体，酸性ホスファターゼ（ＡＣＰ），β−ヘキソサミニダーゼあるいはα−マンノシダーゼのいずれか１種またはそれ以上の使用に及ぶものである。
【００２０】
本発明はさらに、ヒトもしくは動物の患者に対するＬＳＤの診断および／または治療用の組成物または薬剤の製造における前記ＬＳＤマーカーの使用に及ぶものである。
【００２１】
本発明のとりわけ好適な実施形態において、前記ＬＳＤマーカーはリソソームＬａｍｐ−１タンパク質である。本明細書中の実施例において記述するように、本発明者らはタンパク質であるＬａｍｐ−１の水準は、正常な個体におけるＬａｍｐ−１の発現水準と比較した場合、ＬＳＤに病む患者の広い範囲において上昇しているということを発見した。たとえば、Ｌａｍｐ−１タンパク質の水準は、非罹患者と比較してＭＰＳ  Ｉに罹っている患者から得た血漿においては、３倍から６倍高くなっている。
【００２２】
本発明の一実施形態において、前記ＬＳＤマーカーの発現水準は前記ＬＳＤマーカーの酵素活性の水準を測定することによって検定される。生体試料から得られる特定の酵素の検定には様々な方法が利用できる。当該技術分野における熟練者であれば、検定方法は基質の選択性および共同因子の必要性を含む問題となるＬＳＤマーカーの性質と、それが得られる組織あるいは器官次第で変更し得るということを理解するであろう。リソソーム酵素であるＡＣＰ，β−ヘキソサミニダーゼ，α−Ｌ−イズロニダーゼおよびα−マンノシダーゼに関する検定方法は、単に例示の目的で明細書中に組みこんでいる。
【００２３】
別の実施形態において、前記ＬＳＤマーカーはタンパク質，ポリペプチドあるいはその他の蓄積された基質のいずれかであり、前記ＬＳＤマーカーの発現水準は免疫学的検定法によって検定され得る。当該技術分野における熟練者であれば、その幅広い文脈において、“免疫学的検定法”は試験試料をたとえば抗体のような前記ＬＳＤマーカーに特定の１種またはそれ以上の免疫相互作用分子をそれらに結合させるのに十分な時間および条件下でインキュベートすることと前記結合を検出することを含んでいる。ＬＳＤマーカーの変化した水準、とりわけ非罹患者において検知された水準と比較されたＬＳＤマーカーＬａｍｐ−１の上昇した水準がＬＳＤを表すであろう。
【００２４】
抗体を試験試料でインキュベートする条件は検定において利用される形式，利用される検出方法および検定において用いられる抗体分子の型および性質次第で変更される。当該技術分野における熟練者であれば、たとえば放射標識免疫検定法，酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ），オクタロニー拡散法，ロケットゲル免疫電気泳動あるいはｉｎ  ｓｉｔｕ免疫検定法のような通常利用可能な免疫学的検定法の形式のいずれかが本願の目的に容易に適用され得ることを理解されるであろう。このような検定形式の例はＣｈａｒｄ（１９８６），Ｂｕｌｌｏｃｋ（１９８２，１９８３，１９８４）あるいはＴｉｊｓｓｅｎ（１９８５）に見出される。通常、検定形式は試験試料に対し最も高い感度の検出が与えられるように選択されるであろう。
【００２５】
免疫学的検定法は試験試料中，特に血液試料もしくは独立気泡から得られる試験試料中のＬＳＤマーカーの定量化において、前記ＬＳＤマーカーの水準が非罹患者において検知し得る通常の水準と比較して高くなっているかどうかを測定するのにとりわけ有用である。その結果、このような免疫学的検定法は患者がリソソーム蓄積症を有しているかどうかを測定する場合に特に有用である。本明細書中で記述される本発明は、これらの実行のために前記免疫学的検定が必要な免疫相互作用分子および診断検定のこのような全ての使用法に及ぶものである。
【００２６】
アメリカ特許番号４，０１６，０４３，４，４２４，２７９および４，０１８，６５３に記載されるような広範囲の免疫学的検定法の技術を使用することができる。一例として、Ｌａｍｐ−１タンパク質に対して産生された抗体は第１の複合体を形成するために固形の基質上に固定され、患者からの生物試験試料を結合分子に接触させる。抗体−Ｌａｍｐ−１の第２の複合体を形成させるのに十分な、適当なインキュベーション期間の後、検知可能信号を作ることができるリポーター分子で標識化された第２のＬａｍｐ−１抗体は、抗体−Ｌａｍｐ−１−標識化抗体の第３の複合体を形成させるのに十分な時間で加えられ、インキュベートされる。あらゆる未反応物質は洗い流され、第３の複合体の存在はリポーター分子によって作られる信号を観察することで測定される。この結果は、可視信号の単純観察によって定性的であるか、もしくはハプテンの既知量を含む対称サンプルと比較することによって定量化されてもよい。この検定の変形例としては、試料と標識化抗体の両方が同時に結合抗体に加えられる同時検定、あるいは、検定される標識化抗体および試料が最初に結合され、インキュベートされ、次いで結合抗体に同時に加えられる逆転検定（ｒｅｖｅｒｓｅ  ａｓｓａｙ）が含まれる。これらの技術は当該技術における熟練者にとっては周知であり、小規模の変形の可能性があることはきわめて明らかである。上記で使用される抗体はモノクローナルまたはポリクローナルでよい。
【００２７】
固体基質は一般にガラスまたはポリマーで、最もよく用いられるポリマーはセルロース，ポリアクリルアミド，ナイロン，ポリスチレン，ポリ塩化ビニルまたはポリプロピレンである。固体支持体は、管状，ビーズ状，円盤状またはマイクロプレート状あるいは免疫学的検定を行うのに適するその他のあらゆる表面形状であればよい。結合方法は当該技術分野において周知であり、通常は架橋共有結合あるいは不溶性担体に対する分子の物理吸着からなる。
【００２８】
本発明において用いられている“リポーター分子”は、抗原−結合抗体を検知させる分析的に確認可能な信号を、その化学的性質によって、作り出す分子を意味する。検知は定性的あるいは定量的のいずれかであればよい。この種の検定において最もよく用いられるリポーター分子は酵素，蛍光体あるいは分子を含む放射性核種（すなわち、放射性同位元素）のいずれかである。酵素免疫検定法の場合、酵素は通常グルタルアルデヒドまたは過沃素酸塩によって第２の抗体に結合される。しかし、当該技術分野において熟達する者であれば、容易に利用できる多種多様の異なる結合技術が存在することは容易にわかるであろう。一般に用いられる酵素には、とりわけホースラディッシュペルオキシダーゼ，グルコースオキシダーゼ，β−ガラクトシダーゼおよびアルカリホスファターゼが含まれる。特定の酵素に用いられる基質は通常、加水分解により検出可能な色変化を生じるものから選択される。蛍光生成物を産出する蛍光原基質を使用することも可能である。
【００２９】
また、フルオレセイン，Ｅｕ3+あるいはその他のランタニド金属およびローダミンのような蛍光化合物は、その結合能力を変えることなく、抗体に化学的に結合される。特定波長の光で照明することによって反応させた場合、光学顕微鏡で視覚的に検知可能な特徴的な色で光を放出することに続いて、蛍光色素標識化抗体は分子中に興奮状態を誘起する光エネルギーを吸着する。ＥＩＡの場合と同じように、蛍光標識化抗体は第１の抗体−ハプテン複合体に結合させられる。非結合試薬を洗い落とした後、残りの複合体は適当な波長の光にさらされ、観察される蛍光は対象であるハプテンの存在を表す。免疫蛍光検査法およびＥＩＡの技術はともに、当該技術分野において非常によく確立されており、本発明の方法においてとりわけ好適である。しかし、放射性同位元素，化学発光または生物発光の分子のようなその他のリポーター分子も使用することができる。熟達した専門技術者であれば要求された目的に適うように手順を変更する方法はきわめて明白であろう。
【００３０】
免疫相互作用分子，とりわけ抗体分子は、ＬＳＤマーカータンパク質を生成する場合に、あるいはヒトまたは動物の患者におけるＬＳＤの診断および／または治療用の化合物または薬剤の製造においても有用である。抗体を用いるタンパク質の親和精製の方法は、当該技術分野の熟練者であれば周知である。
【００３１】
特に好ましい実施形態において、本発明において使用される免疫学的検定法はＥＬＩＳＡである。Ｅｕ3+あるいはその他のランタノイド金属で標識化された抗体は、これらの化合物によって観察された時間遅延蛍光に基づく免疫学的検定法における検知分子としても有用である。
【００３２】
本発明における免疫検定の試験試料はリソソームを含む器官，組織あるいはその他の生体試料から得ることができる。したがって、本発明の診断検定は、もし試料が既知の検定形式を用いて検知される前記ＬＳＤマーカーの十分な水準を含むとすれば、胎芽，胎児，新生児または成体動物を含むあらゆる成長段階のヒトまたは他の動物から得られる試験試料を用いて行われる。適当な試験試料としては、とりわけ繊維芽細胞，培養細胞系，尿，血液および血清あるいは血漿のような血液由来産物のような細胞から粗製あるいは部分精製した抽出物が含まれるが、これらに限られるものではない。
【００３３】
前記方法において用いられる試験試料は検定形式，検知方法の性質および検定される試料として用いられる組織，細胞または抽出物に基づいて変更し得る。細胞のタンパク質抽出物を調製する方法は当該技術分野においては周知であり、選択される検定形式に適した試料を得るように容易に適合され得る。
【００３４】
本発明の特に好ましい実施形態において、試験試料は血液試料あるいは血漿，たとえばガスリーカード（Ｇａｔｈｒｉｅ  ｃａｒｄ）から得られる血斑である。
【００３５】
前述した診断方法はＬＳＤの出産前スクリーニングにおいて有用である。本発明はまた、乳児から収集した乾燥血斑を用いる生後７日間までの新生児のスクリーニングにおいて特に有用である。しかし、本発明はＬＳＤマーカーを検知するためのあらゆる形式またはテスト試料の使用に及ぶものである。
【００３６】
本発明の第２の要旨は、ヒトまたは他の動物におけるリソソーム蓄積症の検知を容易にするための生体分子を提供するものである。前記生体分子は、ヒトまたは他の動物から得られる生体試験試料に関するＬＳＤマーカーの発現水準を測定するための検定に用いる場合、本明細書中で定義されるようにＬＳＤマーカーに結合することができる。
【００３７】
本発明の本要旨によれば、前記生体分子は抗体分子のような酵素基質分子，共同因子，免疫相互作用分子であればよい。
【００３８】
一実施形態において、本発明の本要旨にかかる生体分子は免疫相互作用分子である。
【００３９】
本明細書中で用いられる“免疫相互作用分子”とは、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体、あるいはそれらの機能誘導体（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）、たとえば、抗原結合部位（Ｆａｂ），ＳＣＡＢ（単鎖抗体）または酵素に結合される抗体、放射性，生磁性または蛍光性の標識（ｔａｇ）を称するのに用いることとし、唯一の要件としては、前記免疫相互作用分子はＬＳＤマーカーまたはそれらの誘導体，パート（ｐａｒｔ），フラグメント，類似体または同族体に結合することができるということである。
【００４０】
好ましくは、免疫相互作用分子はポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のような抗体の形である。本発明はこれらの抗体の免疫相互作用フラグメント，パート，誘導体，同族体または類似体に及ぶものである。このような抗体は、タンパク質基底に免疫グロブリンを少なくとも２５％（ｗ／ｗ），より好ましくは少なくとも５０％（ｗ／ｗ），さらに好ましくは少なくとも６０〜７５％（ｗ／ｗ），さらにより好ましくは少なくとも８０〜９５％（ｗ／ｗ）含む分離形または精製形である。また、抗体は分離ハイブリドーマ，培養上澄，組織エキス，血清または全血，もしくは腹水の形で存在している。
【００４１】
免疫相互作用分子を調製するのに従来の方法を使用することができる。標準方法によって、本明細書中で定義されているＬＳＤマーカーのすべてまたはフラグメントを含むポリペプチドを用いて、ポリクローナル抗血清またはモノクローナル抗体が作られる。たとえば、あらゆる哺乳動物（たとえば、マウス，ハムスターあるいはウサギ）は哺乳動物において抗体反応を引き出すためのＬＳＤマーカーを含む抗原の免疫原性の形で免疫となりうる。抗原に免疫原性を付与する技術には、担体への結合または当該技術分野において周知のその他の方法が含まれる。たとえば、抗原はアジュバントの存在下で投与されうる。免疫感作の経過は血漿または血清中の抗体価の検知によってモニターされうる。標準ＥＬＩＳＡまたはその他の免疫学的検定法が抗体の水準を査定するための抗原として免疫原と一緒に用いられうる。もし、ポリクローナル抗体に対応する所望の免疫グロブリンＧ分子が血清から分離される場合には、免疫感作に続いて抗血清を得ることができる。
【００４２】
モノクローナル抗体を産生するために、抗体産生細胞（リンパ球）は免疫化動物から回収され、標準体細胞の融合手順により骨髄腫細胞と共に融合され、このようにしてこれらの細胞が不死化し、ハイブリドーマ細胞がつくられる。このような技術は当該技術分野においては周知である。たとえば、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）によって本来開発されたハイブリドーマ技術はもちろん、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３），ヒトモノクローナル抗体を産生するためのＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５），組合わせ抗体ライブラリーのスクリーニング（Ｈｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９）のようなその他の技術がある。ハイブリドーマ細胞は、分離された抗原およびモノクローナル抗体により明確な反応を示す抗体を産生するために免疫化学的にスクリーニングされうる。
【００４３】
抗体を引き出すための全ての免疫原性組成物に関して、本発明のポリペプチドの免疫原性上の有効量は実験的に決定されなければならない。考慮される要素としては、自然抗原の免疫原性，抗原がアジュバントあるいは担体タンパク質またはその他の担体で合成されるかあるいはそれらに共有結合されるか否か，組成物の投与経路、つまり、静脈内，筋肉内，皮下等の投与経路、および投与される免疫量の数が含まれる。これらのような要素は当該術分野において周知であり、必要以上の実験をせずにこれらの決定をするには、免疫学者の技量内であれば十分である。
【００４４】
本明細書中で用いられる“抗体”という用語は、擬態者（ｍｉｍｉｃｓ）を含むポリペプチドで明確に反応するか、あるいは、本明細書中で技術した実施形態に基づくＬＳＤマーカー、とりわけＬａｍｐ−１のＢ細胞エピトープまたはＴ細胞エピトープによって交差反応するそれらのフラグメントを含むことが意図されている。抗体は、従来の技術を利用して分解することができ、そのフラグメントは抗体全体に対して前述のように、効用のためにスクリーニングされる。たとえば、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントはペプシンで抗体を処理することによって生成される。生成されたＦ（ａｂ’）２フラグメントはＦａｂ’フラグメントを産生するジスルフィド架橋を還元するために処理される。
【００４５】
先に論じた第１の抗体に基づくあらゆる第２の抗体（モノクローナル，ポリクローナルまたは抗体のフラグメント）は本発明の範囲内である。第１の抗体および第２の抗体の両方が検知検定に用いられるか、あるいは第１の抗体が市販の抗免疫グロブリン抗体と共に用いられる。ここで企図されている抗体は、擬態者（ｍｉｍｉｃｓ）を含むポリペプチドのあらゆる領域に特有なあらゆる抗体を含み、先に定義したＬＳＤマーカーのＢ細胞エピトープまたはＴ細胞エピトープで交差反応する。
【００４６】
ポリクローナル抗体，モノクローナル抗体またはキメラモノクローナル抗体はＬＳＤマーカーあるいは、たとえばＥＬＩＳＡ，放射標識免疫検定法または組織科学的方法において用いられる様々の生体試料におけるそれらの誘導体，同族体または類似体を検知および／または定量するのに用いられる。このようにして、抗体はＬＳＤマーカーまたは試料中のそれらの誘導体，同族体あるいは類似体に結合することを検査するのに、あるいはＬＳＤマーカーのＢ細胞エピトープまたはＴ細胞エピトープを測定するのに用いられる。
【００４７】
したがって、本発明の他の実施形態において前記抗体はｉｎ  ｖｉｖｏ，ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｓｉｔｕのいずれかで行われる免疫学的検定法において、それらの使用を容易にするために探知可能に標識化される。抗体は、とりわけビチオン、アビジン等のアフィニティー標識，ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等の酵素標識，フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ローダミン等の蛍光標識，あるいは正磁性原子を用いるＥＵ+3等の放射性同位元素を使用することによって検知可能に標識化される。このような標識化を遂行する手順は当該技術分野において周知である。
【００４８】
抗体はタンパク質またはポリペプチドに対して産せられるのが好ましい。しかし、特に好ましい実施形態において、本発明は明細書中で記載されるＬａｍｐ−１，Ｌａｍｐ−２，またはＬｉｍｐ−ＩＩのいずれかを認識することができる抗体を提供するものである。
【００４９】
本発明のさらなる要旨は、リソソーム蓄積症を有する疑いのあるヒトまたはその他の動物から得られる生体試料中のＬＳＤマーカーの発現水準を測定するための診断キットを企図するものである。
【００５０】
本発明のこの要旨に関する好適な実施形態において、前記キットは、ＬＳＤマーカー酵素，タンパク質，ポリペプチドまたは、それらの誘導体，同族体あるいは類似体を組換え型または合成の形で含むように改造され、それらに任意に吸着される数個の第１コンテナーと、前記ＬＳＤマーカーまたはそれらのＢ細胞エピトープあるいはＴ細胞エピトープを認識する抗体を含むように改造された数個の第２コンテナーからなる第１コンパートメントが構成され、前記抗体は上述した検知可能な信号を作成可能なリポーター分子で任意に標識化される。第１の抗体を認識し、リポーター分子に任意に結合される第２の抗体を含む第３のコンテナーも備えられる。また、リポーター分子が酵素であれば、酵素：抗体：ＬＳＤマーカー複合体、あるいは、第２の抗体が用いられる酵素：抗体：ＬＳＤマーカー複合体の検知を容易にするための前記酵素に対する基質分子を含む第４のコンテナーが備えられる。このキット内で用いられるリポーター分子は、とりわけ放射性同位元素，蛍光分子または生物発光分子であればよい。
【００５１】
キットはさらに、反応が行われる１セクションにおいてマイクロタイターウェル（ｍｉｃｒｏｔｉｔｒｅ  ｗｅｌｌ）を含むパッケージに、任意に備えられる。したがって、一実施形態において、マイクロタイターウェル（ｍｉｃｒｏｔｉｔｒｅ  ｗｅｌｌ）は上述の第１コンパートメントと同等物であってもよく、それらに吸着されるＬＳＤマーカーまたはそれらの誘導体，同族体あるいは類似体を含んでいる。
【００５２】
前記キットの第１，第２，第３および第４のコンテナーはさらに、使いやすさから任意に色分けすることができる。
【００５３】
サブジェクトキット（ｓｕｂｊｅｃｔ  ｋｉｔ）の使用例において、第１コンテナーの内容物はパッケージ内に備えられるマイクロタイターウェル（ｍｉｃｒｏｔｉｔｒｅ  ｗｅｌｌ）に結合され、もし前記内容物が前記マイクロタイターウェル（ｍｉｃｒｏｔｉｔｒｅ  ｗｅｌｌ）に吸着される形式に備えられなければ、試験される生体試料は前記マイクロタイターウェル（ｍｉｃｒｏｔｉｔｒｅ  ｗｅｌｌ）に抗原−抗体複合体を形成するのに十分な時間と条件下で添加され、インキュベートされる。非結合抗体およびその他の非結合タンパク質を取り除く洗浄ステップに続いて、第３のコンテナーの内容物がマイクロタイターウェル（ｍｉｃｒｏｔｉｔｒｅ  ｗｅｌｌ）に備えられる抗原−抗体複合体に加えられ、第３の抗原−抗体−抗体複合体を形成させるのに十分な時間および条件下で反応が進められる。抗原−抗体複合体を形成するのに適した時間および条件下で第２のコンテナーの内容物が第１のコンテナーの内容物に加えられる対照反応（ｃｏｎｔｒｏｌ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）も行われる。もし、第２のコンテナーの抗体がリポーター分子で標識化されていない場合には、第３のコンテナーの内容物が、形成される第３の抗原−抗体−抗体複合体の形成に適した時間および条件下で加えられる。対照反応（ｃｏｎｔｒｏｌ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）および試験試料の第３の抗原−抗体−抗体複合体はその後、検知手段にかけられる。あるいは、もし、第２のコンテナーの内容物がリポーター分子で標識化された場合には、対照反応（ｃｏｎｔｒｏｌ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）の抗原−抗体複合体は直接に検知手段にかけられる。第２の抗原−抗体もしくは第３の抗原−抗体−抗体複合体の検知手段は上述のように多数あり、当該技術分野に熟達した者には周知である。前記手段は酸素反応であり、第４のコンテナーの内容物が前記第２または第３の複合体に加えられ、このようにして酵素反応を起こさせるのに適した時間および条件下で形成される。
【００５４】
サブジェクトキットを用いて得られた結果を分析する場合、対照反応（ｃｏｎｔｒｏｌ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）において含まれるＬＳＤマーカーの量は正常な非罹患者から得られる結果と一致する結果を与えるように予め決定される。したがって、対照反応（ｃｏｎｔｒｏｌ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）は試験試料と比較するための基底を与えるものである。コントロールから得られる信号よりも高い、試験試料から得られる信号は、試験される被験ＬＳＤマーカーの高い水準を示すものである。このような結果は患者がリソソーム蓄積症に病んでいるということを示すものである。
【００５５】
本発明はさらに、ヒトまたはその他の動物におけるリソソーム蓄積症を検知できる生体分子を備えるあらゆるキットに及ぶものであり、前記キットは上述したようにＬＳＤマーカーの発現を検知するための検定に適した形態である。本発明は、１種以上のＬＳＤマーカーの検知を容易にするために前記生体分子を複数備えるキットにも及ぶものである。
【００５６】
単に例示を目的として、本発明はさらに以下の図および実施例に記載される。
【００５７】
【実施例】
（実施例１）
（ＬＡＭＰ−１に対する抗体の製造）
抗−ＬＡＭＰ−１モノクローナル抗体（クローンＢＢ６）および抗−ＬＡＭＰ−１ポリクローナル抗体は、前もって説示されており、一般に対しても手頃に入手することができる（Ｃａｒｌｓｓｏｎ  ａｎｄ  Ｆｕｋｕｄａ，１９８９；Ｄａｈｌｇｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）。抗−ＬＡＭＰ−１モノクローナル抗体クローン４Ｆ５を製造するために、マウスはヒトの胎盤から精製されたリソソーム膜で免疫化される（Ｍｅｉｋｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）。膜は１％（ｖ／ｖ）の２−メルカプトエタノールおよびクロロホルム／メタノール（２：１）×２で抽出された、ペレットされた膜（ｐｅｌｌｅｔｅｄ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）で５分間煮沸することで変性させられる。雌Ｂａｌｂ／Ｃマウスは以下のスケジュールにしたがって免疫化される。５０μｇの抗原を４００μｌ  ＰＢＳに脾内注射し、１４日後に５０μｇの抗原を２００μｌの不完全フロイントアジュバントエマルションに腹腔内注射し、２１日後に５０μｇの抗原を２００μｌ  ＰＢＳに腹腔内注射する。４日後に脾臓細胞が回収され、Ｚｏｌａ  ａｎｄ  Ｂｒｏｏｋｓ（１９８２）で説示されたようなＰ３．６５３骨髄腫細胞で融合される。
【００５８】
（実施例２）
（ＬＡＭＰ−１の精製）
ヒトの胎盤からの総膜は以下のように調製される。新鮮な胎盤（４５０ｇ）が１〜２ｃｍの細片に切り裂かれ、０．２５Ｍ寒冷スクロース，ｐＨ７．０の１ｍＭ  ＥＤＴＡで３回洗われ、同一の緩衝液８００ｍｌ中で切り刻まれ、均質化処理（１分間オムニミックス（Ｏｍｎｉｍｉｘ），全速力）した。細胞の破片は７５０×ｇで１０分間ペレットし（ｐｅｌｌｅｔｅｄ）、さらに２回均質化処理された。上澄みを結合し、コットンガーゼを介して濾過したのち、１０ｍＭ  ＣａＣｌ2が作られた。１時間後、胎盤膜を４℃で、９０分間、１，０００×ｇでペレットした（ｐｅｌｌｅｔｅｄ）。膜を１Ｍ  ＮａＣｌ（３２０ｍｌ）で再懸濁し、３回凍結／解凍したのち、１時間、１００，０００×ｇでペレットした（ｐｅｌｌｅｔｅｄ）。１Ｍ  ＮａＣｌの洗浄を繰り返し、膜を最終的に３２０ｍｌの可溶化緩衝液（５０ｍＭ  ＭＯＰＳ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，１０％（ｖ／ｖ）グリセロール、１％（ｗ／ｖ）Ｔｈｅｓｉ，ｐＨ７．０）に溶かし、４℃で１６時間攪拌した。不溶性物質は１時間、１００，０００×ｇでペレットし（ｐｅｌｌｅｔｅｄ）、上澄みを回収した。
【００５９】
上澄みから３ｍＭ  ＣａＣｌ2および３ｍＭ  ＭｇＣｌ2を作り、ＣａＣｌ2，３ｍＭ  ＭｇＣｌ2を含む可溶化緩衝液に、予め平衡させられたコンカナバリンＡセファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，ウプサラ，スゥェーデン）の７０ｍｌカラムに加えた。カラムを同一の緩衝液で洗い、ＬＡＭＰ−１を含む結合タンパク質を１０％（ｗ／ｖ）α−メチルマンノシドを含む可溶化緩衝液で溶出した。溶出液をＲｅｄ  Ｄｙｅ  Ｎｏ．７８（Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＬａＴｒｏｂｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｔｙ，バンドゥーラ，オーストラリア）のカラムに加え、ＬＡＭＰ−１は流れの間中に回収される。
【００６０】
抗−ＬＡＭＰ−１モノクローナル抗体４Ｆ５（２０ｍｇ）をＡｆｆｉｇｅｌ（１０ｍｌ）に結合し、ＬＡＭＰ−１のアフィニティー精製に用いた。流れているＲｅｄ  Ｄｙｅ（１２０ｍｌ）は抗−ＬＡＭＰ−１アフィニティーゲルと混合し、４℃で１６時間、穏やかに振動させた。ゲルをカラムに注出し、ＰＢＳで洗った。ＬＡＭＰ−１をｐＨ１１．５の１００ｍＭトリエチルアミンで溶出し、水に対して透析し、凍結乾燥させた。
【００６１】
リソソーム膜酵素アセチル補酵素Ａ：α−グルコサミニドＮ−アセチルトランスフェラーゼの６０％以上がこれらの膜に関係しているという事実にもかかわらず、総胎盤膜の調製は胎盤中に存在する総ＬＡＭＰ−１の２５％のみがＬＡＭＰ−１収量となる。
【００６２】
しかし、膜の可溶化、コンカナバリンＡセファロースにおけるクロマトグラフィーおよびそれに続く赤色染料（ｒｅｄ  ｄｙｅ）クロマトグラフィーはすべてＬＡＭＰ−１の８０％以上の回収をもたらす。１つの胎盤からは流れる赤色染料（ｒｅｄ  ｄｙｅ）カラムにおいて約１ｍｇのＬＡＭＰ−１が回収される。
【００６３】
この試料からのＬＡＭＰ−１の連続する免疫沈降反応は、沈降反応につき約１００μｇの回収となる。
【００６４】
クーマシー染色（ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  ｓｔａｉｎｅｄ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図示しない）に基づく均一結合として出現する精製ＬＡＭＰ−１はビシンコニン酸法によって定量され、続いてＬＡＭＰ−１タンパク質の免疫定量化の標準として用いられる。
【００６５】
（実施例３）
（ＬＡＭＰ−１の免疫定量化）
方法：ＬＡＭＰ−１の測定は時間分解蛍光免疫検定法（Ｔｉｍｅ  Ｒｅｓｏｌｖｅｄ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）（ＴＲＦＩＡ）を利用して実行する。この検定において、検知抗体は、Ｎ1−（ｐ−イソチオシアナートベンジル）−ジエチレントリアミン−Ｎ1，Ｎ2，Ｎ3−四酢酸にキレート化されるランタノイド金属（通常はユーロピウム）で標識化する。標識化抗体の検知は抗体および２−ナフトイルトリフルオロアセトンおよびトリ−ｎ−オクチルホスフィンオキシドにより、続く複合体の形成からＥｕ3+を解放するようにｐＨを下げることによって行う。形成された複合体はバックグラウンドの干渉を取り除くために時間分析蛍光検知を利用させうる比較的長い半減期に関して高い蛍光性である（Ｄｉａｍａｎｄｉｓ，１９８８；Ｈｅｍｍｉｌａ，１９８８）。
【００６６】
抗−ＬＡＭＰ−１モノクローナル抗体（クローンＢＢ６）をＤＥＬＦＩＡ（登録商標）Ｅｕ3+−ラベリングキット（Ｗａｌｌａｃ  Ｉｎｃ．ノースライド，オーストラリア）を用いるユーロピウムで標識化する。標識化抗体は凝集化抗体およびｐＨ７．８で、５０ｍＭ  ＴＲＩＳ／ＨＣｌ，０．９％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌで溶離するＰｈａｒｍａｃｉａ  Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  １２  Ｆａｓｔ  Ｐｈａｓｅ液体クロマトグラフィーカラム（１．５×３０ｃｍ）における自由Ｅｕ3+標識から精製される。各抗体分子に結合されるＥｕ3+の水準は接合体のタンパク質および蛍光体水準から測定される。
【００６７】
試料は第１ステップまたは第２ステップのいずれかにより、ＬＡＭＰ−１に関して検定する。
【００６８】
第１ステップの方法において、マイクロタイタープレート（Ｉｍｍｕｌｏｎ  ４  Ｄｙｎａｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｌｅｓ，Ｉｎｅ．ヴァージニア州，アメリカ合衆国）を抗−ＬＡＭＰ−１ポリクローナル抗体（０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ3に１００μｌ／ｗｅｌｌ希釈）で５μｇ／ｍｌ，３７℃で４時間かけて被覆し、ＤＥＬＦＩＡ（登録商標）洗浄緩衝液（ｗａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒ）で６回洗われる。試料を抗−ＬＡＭＰ−１モノクローナル抗体（１００μｌ／ｗｅｌｌ）を標識化したＥｕ3+２００ｎｇ／ｍｌを含むＤＥＬＦＩＡ（登録商標）検定緩衝液（ａｓｓａｙ  ｂｕｆｆｅｒ）に希釈し、４℃で一晩中ウェル（ｗｅｌｌｓ）内でインキュベートする。プレートは室温で１時間インキュベートした後に６回洗われる。ＤＥＬＦＩＡ（登録商標）強化緩衝液（ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  ｂｕｆｆｅｒ）を加え、プレートを室温で１０分間振動させ、１２３４  ＤＥＬＦＩＡ（登録商標）調査蛍光計（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ）によって蛍光が測定される。
【００６９】
第２ステップの方法において、もし試料がＥｕ3+標識（たとえば、ＤＥＴＡ，クエン酸塩）と適合しない化学物質を含むのであれば、プレートをポリクローナル抗体で被覆し、上述したように洗う。試料をＥｕ3+標識化抗体を含まないＥＤＬＦＩＡ（登録商標）検定緩衝液（ａｓｓａｙ  ｂｕｆｆｅｒ）に希釈し、４℃で一晩中インキュベートしたのち、室温で１時間インキュベートし、６回洗う。２００ｎｇ／ｍｌのＥｕ3+を標識化した抗−ＬＡＭＰ−１モノクローナル抗体（１００μｌ）を含む検定緩衝液（ａｓｓａｙ  ｂｕｆｆｅｒ）を各ウェル（ｗｅｌｌｓ）に加え、室温で２時間インキュベートする。その後プレートを６回洗い、強化緩衝液（ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  ｂｕｆｆｅｒ）を加え、上述のように蛍光を測定する。
【００７０】
血斑中のＬＡＭＰ−１の測定に関して、第１ステップは以下の変更を加えて使用することができる。
【００７１】
血斑は２００ｎｇ／ｍｌのＥｕ3+を標識化した抗−ＬＡＭＰ−１モノクローナル抗体を含む検定緩衝液（ａｓｓａｙ  ｂｕｆｆｅｒ）（２００μｌ）でインキュベートされる。プレートは４℃で一晩インキュベートする前に室温で１時間振動させ、その後洗浄および検定緩衝液（ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  ｂｕｆｆｅｒ）の添加の前に、再び室温で１時間振動させる。
【００７２】
結果：Ｅｕ3+でＢＢ６モノクローナル抗体を標識化することにより抗体分子ごとに約５つのＥｕ3+原子が得られる。上述したような第１ステップの免疫定量化検定を利用する場合、これらはＬＡＭＰ−１に０．１ｎｇ〜１２．５ｎｇ／ｗｅｌｌの範囲を越える線形応答をもたらす。５μｇ／ｍｌのポリクローナル抗体を被覆したプレートにより得られた反応は、１０μｇ／ｍｌの場合と比較して低い（図１）。第２ステップの検定では２５ｎｇ／ｗｅｌｌまでの直線飛程で第１ステップ検定の信号の約５０％が与えられる。線形応答は、非罹患者またはＬＳＤ罹患者のいずれかにより、全血または血漿（１−５０μｌ）を検定した場合にも観察される。検定内の変異係数は９％以下であった。４日間の異なる日において実行された９回の検定による基準曲線点の変異係数から測定されるように、検定間の変化は検定の直線飛程を横切る２％から９％に位置する。基準曲線は線形回帰分析がなされ、０．２６ｎｇ／ｗｅｌｌ平均で、０．１４および０．４５ｎｇ／ｗｅｌｌの間の推定値の標準誤差に対する値が与えられる。インターセプト値（ｉｎｔｅｒｃｅｐｔ  ｖａｌｕｅ）は０．１６ｎｇ／ｗｅｌｌの標準偏差で０．０８ｎｇ／ｗｅｌｌの平均値を有する。
【００７３】
血漿試料に関しても正確な調査を行う。３００から１２００ｎｇ／ｍｌのＬＡＭＰ−１濃度に位置する５つの血漿試料を個別に検体作成し、各３回検定し、検定間の変異が８％未満であるのに対して、検定内での変異は６％未満であった。
【００７４】
分析回収の調査は、第２ステップの検定において血漿の変異量に対する精製ＬＡＭＰ−１の既知量を加えることによって行われ、この結果は血漿の水準と外因的に加えられたＬＡＭＰ−１の回収との間において逆関係を表した。１０ｍｌの血漿がウェル（ｗｅｌｌ）（検定される最大量）ごとに含まれる場合には、外因性ＬＡＭＰ−１の回収は６８％であった。
【００７５】
検定におけるＥｕ3+標識化抗体の濃度に関する影響についても調査した。図２に表されるデータは、信号中の増加量は４００ｎｇ／ｍｌまでの抗体濃度に関してほぼ直線相関を示しているということを表している。
【００７６】
行われた全ての実験検定において、２００ｎｇ／ｍｌの標識化抗体が適当な感度をもたらすものであった。
【００７７】
（実施例４）
（血液中のＬＡＭＰ−１水準）
患者試料：本調査で使用される血斑は南オーストラリアの住民である新生児から収集された定常試料（ｒｏｕｔｉｎｅ  ｓａｍｐｌｅ）の一部である。ＬＳＤスクリーニングでＮａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｆｅｒｒａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙに寄託された試料および定常の生化学で処理された試料からの血漿試料が用いられる。
【００７８】
血斑：ＬＳＤに関する新生児スクリーニングのマーカーとしてのＬＡＭＰ−１の適合性を測定するために、われわれは１８６人の非罹患新生児から採取した血漿試料に存在するＬＡＭＰ−１を免疫定量した。１．３７ｎｇ／ｓｐｏｔの中央値と共に百分位数の５番目と９５番目はそれぞれ０．７６ｎｇ／ｓｐｏｔおよび３．３ｎｇ／ｓｐｏｔである、特徴的な傾斜分布が観察された（図３）。ＬＡＭＰ−１水準と新生児の年齢，性別または出生時体重との間には何ら相関性がなかった。
【００７９】
血漿：ＬＳＤ罹患者におけるＬＡＭＰ−１の水準を調査するために、われわれは、２５種類の疾患を表す３２０人のＬＳＤ罹患者と、非罹患者にあたる１５２人（中央値＝７，範囲＝０〜６６）の部門別の記録から血漿試料を回収した。これらの試料中のＬＡＭＰ−１の水準は、正常な個体においては、中央値が３０３ｎｇ／ｍｌで百分位数の５番目と９５番目がそれぞれ１７５ｎｇ／ｍｌおよび４４８ｎｇ／ｍｌと狭い分布を示した。ＬＳＤ罹患者の大多数は、対照個体の中央値水準の１０倍にまで達する個体もあり、通常の範囲を超えた（対照個体の百分位数の９５番目以上が７２％）ＬＡＭＰ−１水準であった。
【００８０】
個々の疾患により分析した場合、試験された２５の疾患群の１６の群においては、対照個体の百分位数の９５番目以上の個体が８８％以上であり、１２の群において百分位数の９５番目以上が１００％であることが認められた。
【００８１】
ＬＡＭＰ−１水準と正常個体の年齢との間には、ピアソン相関係数が−０．３７で、０．００１未満の有意水準によって有意な相関性が認められた。罹患者の群では、ファブリーおよびゴーシェだけが相関性を試験するのに十分な数および年齢範囲を有していた。ゴーシェの群ではＬＡＭＰ−１水準と年齢との間に有意な相関性を示さなかったが、ファブリーの群では有意水準が０．０２で、−０．４９のピアソン相関係数を示した。
【００８２】
全血：６人の罹患者からの全血の試料を分画し、白血球，赤血球および血漿中に存在するＬＡＭＰ−１の比率を測定した。末梢血白血球および血漿はＫａｍｐｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９６７）の方法によってヘパリン化チューブ（ｈｅｐａｒｉｎｉｓｅｄ  ｔｕｂｅｓ）に収集された全血から分離し、白血球ペレットを１％（ｖ／ｖ）Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０（細胞溶解緩衝液（ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ））を含む食塩に再懸濁する。同様の手順で分離された赤血球は細胞溶解緩衝液（ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ）で再懸濁する前に、食塩で２回洗う。食塩による洗浄は元々の白血球ペレットと結合する白血球をペレットするために遠心分離され、上澄みはＬＡＭＰ−１タンパク質を測定するために血漿とともにプールされる。
【００８３】
全血試料はＬＡＭＰ−１の分布が血漿中で５３±７％，赤血球ペレット中で３２±５％および白血球ペレット中で１５±５％で、平均２２６±３１ｎｇ／ｍｌのＬＡＭＰ−１を有していた。
【００８４】
（表１）
（血漿中の上昇ＬＡＭＰ−１水準に基づくリソソーム蓄積症の検知）
【００８５】
【表１】
0003837711.tif 000002
（実施例５）
（追跡治療したＬＳＤ患者のＬＡＭＰ−１水準）
ＬＡＭＰ−１の血漿水準は、実施例３で記述したように、骨髄移植法（ＭＰＳ  ＩおよびＭＰＳ  ＶＩ用）または酵素補充療法（コーシェ病用）を含む治療前および後のＬＳＤ罹患者から得られた血漿サンプルによって測定する。それぞれのケースにおいて、血漿ＬＡＭＰ−１水準は追跡治療（表２）の正常範囲内にあるいは近くに低下するということを結果により示されている。これらのデータはＬＡＭＰ−１が療法の進行および効能のマーカーとして有用であるということを示唆している。
【００８６】
（表２）
（追跡治療したＬＳＤ患者のＬＡＭＰ−１水準）
【００８７】
【表２】
0003837711.tif 000003
（実施例６）
（ゴーシェ罹患シブリングスにおける血漿ＬＡＭＰ−１の水準）
２人のゴーシェ病罹患シブリングスの血漿中においてＬＡＭＰ−１を測定した。両方の個体が同じ突然変異を有するためにゲノタイプされ（ｇｅｎｏｔｙｐｅｄ）たが、一方は７歳で無症候性となったのに対し、他方で４歳で深刻な臨床表現型となった。無症候性シブリングは４１７ｎｇ／ｍｌ（正常範囲内）のＬＡＭＰ−１水準を有し、罹患シブリングは７８７ｎｇ／ｍｌ（正常範囲以上）のＬＡＭＰ−１水準を有していた。
【００８８】
これらのデータはＬＡＭＰ−１が臨床の発病度，療法の必要性および療法の有効性の指標として有用であるということを示唆している。
【００８９】
（実施例７）
（ＬＡＭＰ−２の免疫定量化）
ＬＡＭＰ−２に対するモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体，および純粋ＬＡＭＰ−２は、ウーメオ，Ｓ−９０１  ８７，スウェーデン，Ｕｍｅａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，医学的生化学および物理学部（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ）のＤｒ．Ｓ．Ｃａｒｌｓｓｏｎによって供給された。
【００９０】
ＬＡＭＰ−２の免疫検量は、抗−ＬＡＭＰ−２モノクローナル抗体がＥｕ3+で直接標識化する代わりに第２のＥｕ3+が標識化された家兎抗マウス免疫グロブリンＧが使用されることを除いて、本質的にはＬＡＭＰ−１に関して記載されたものと同じである。
【００９１】
マイクロタイタープレート（Ｉｍｍｕｌｏｎ  ４  Ｄｙｎａｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．ヴァージニア州，アメリカ合衆国）は抗−ＬＡＭＰ−２ポリクローナル抗体（０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ3に１００μｌ／ｗｅｌｌ希釈）で５μｇ／ｍｌ，３７℃で４時間かけて被覆し、ＤＥＬＦＩＡ（登録商標）洗浄緩衝液（ｗａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒ）で６回洗い。試料を抗−ＬＡＭＰ−２モノクローナル抗体（１００μｌ／ｗｅｌｌ）１０００ｎｇ／ｍｌを含むＤＥＬＦＩＡ（登録商標）検定緩衝液（ａｓｓａｙ  ｂｕｆｆｅｒ）に希釈し、４℃で一晩中ウェル（ｗｅｌｌｓ）内でインキュベートする。その後、プレートを６回洗い、Ｅｕ3+が標識化された家兎抗マウス免疫グロブリンＧ  ＤＥＬＦＩＡ（登録商標）によって２０℃で２時間インキュベートした。プレートを６回洗い、強化緩衝液（ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  ｂｕｆｆｅｒ）（ウェル（ｗｅｌｌ）につき２００μＬ）を加えた。プレートは室温で１０分間振動させ、１２３４ＤＥＬＦＩＡ（登録商標）調査蛍光計（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ）によって蛍光を測定した。
【００９２】
ＬＡＭＰ−２は１４人のＬＳＤ罹患者および４人の非罹患者からの血漿サンプルによって測定した。非羅患者は３．１ｕｇ／ｍｌの平均水準を有し、ＬＳＤ罹患者の範囲は１．２から１７．７ｕｇ／ｍｌに及んでいた（図５）。全ての症例においてみとめられたＬＡＭＰ−２の上昇は観察されたＬＡＭＰ−１の上昇であり、さらにＬＡＭＰ−１の上昇が見られなかったポンペ罹患者はＬＡＭＰ−２の上昇を示した。血漿中のＬＭＡＰ−２の水準は血液試料におけるＬＡＭＰ−２の検出を容易にさせるＬＭＡＰ−１の水準よりも約１０倍高かった。
【００９３】
（実施例８）
（リソソーム蓄積症のモデルとしてのスクロソーム形成）
細胞培養：ヒトの倍数繊維芽細胞はオーストラリア，アデレードのウィメンズアンド  チルドレンズ  ホスピタルが診断用に寄託した皮膚の生検から確立されている（Ｈｏｐｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８２）。細胞系は、特に記載しない限り、イーグルの基本培地（ＢＭＥ）において確立された方法にしたがって、１０％（ｖ／ｖ）牛胎児血清（ＦＣＳ）および抗生物質、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ2雰囲気インキュベーターで維持される。
【００９４】
皮膚繊維芽細胞はＢＭＥ培地で７５ｃｍ2のフラスコに張り付けられ、融合点（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）に到達するようにされている。１回の融合（ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）で、対照細胞はＢＭＥ上に残るが、スクロソーム形成を引き起こすために、細胞を１〜３５日間、１００ｍＭスクロースを含むＢＭＥ培地で成長させる。ＬＳＤに罹患した細胞系は、スクロースがない同様の条件下で成長させる。電子顕微鏡用に、同一の条件下で２５ｃｍ2の組織培養フラスコ内で繊維芽細胞を成長させる。
【００９５】
スクロソーム含有細胞はＢＭＥ培養培地への転化酵素の添加（０．１ｍｇ／ｍｌ，Ｇｒａｄｅ  ＶＩＩ，〜４００Ｕ／ｍｇ；Ｓｉｇｍａ）により補正するか、あるいは、細胞はスクロースを含まないＢＭＥ培地に配置する。ＬＳＤに罹患した細胞は、ポンペ病細胞に対してＦｕｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ，（１９９５）に記載されているようにα−グルコシダーゼ（５０ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｌ）を、ＭＰＳ−ＩＩに対してイズロン酸２−スルファターゼ（５０ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｌ）（Ｂｉｅｌｉｃｋｉ  ｅｔ  ａｌ，１９９３）を、ＭＰＳ−ＶＩに対して補正する（Ａｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，１９９２）。
【００９６】
細胞抽出物の調製：細胞はダルベッコ燐酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗われ、トリプシネーション（ｔｒｙｐｓｉｎａｔｉｏｎ）（３７℃で５分間フラスコごとに２ｍｌ）トリプシン−ベルセン溶液（ＣＳＬ  Ｌｉｍｉｔｅｄ，メルボルン，オーストラリア））によってフラスコから取り除く。細胞はすぐに寒冷ＰＢＳで２回洗い、各時点の１つのフラスコからの細胞を１％（ｖ／ｖ）Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ４０を含む２００μＬ食塩水において再懸濁する。細胞溶解産物を凍結／解凍の５サイクルで調製し、マイクロ遠心沈殿法（１０００×ｇ，５分）により浄化し、リソソーム酵素およびタンパク質に関して検定する。
【００９７】
タンパク質／酵素検定：タンパク質は牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を標準としてビシンコニン酸法を用いて測定する（Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ，１９８５）。以下の酵素活性は蛍光原基質を用いて測定する。酸性リン酸塩活性は４−メチルウンベリフェリル−リン酸塩（Ｋｏｌｏｄｎｙ  ａｎｄ  Ｍｕｍｆｏｒｄ，１９７６）で、β−ヘキソサミニダーゼは４−メチルウンベリフェリル２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシダーゼ（Ｌｅａｂａｃｋ  ａｎｄ  Ｗａｌｋｅｒ，１９６１）で，α−マンノシダーゼは４−メチルウンベリフェリル−α−Ｌ−マンノピラノシド（Ａｖｉｌａ  ａｎｄ  Ｃｏｎｖｉｔ，１９７３）で、α−イズロニダーゼは４−メチルウンベリフェリル−α−イズロニド（Ｃｌｅｍｅｎｔｓ  ｅｔ  ａｌ，１９８５）で測定する。α−ケトグルタレートデヒドロゲナーゼはＳｉｎｇｈ  ｅｔ  ａｌ，（１９８７）で説明されたように、α−［１−14Ｃ］ケトグルタル酸が［１−14Ｃ］グルタメートの元の位置で生成される放射化学検定により測定する。ガラクトシル転移酵素は3Ｈ−ＵＴＰ−ガラクトースが14Ｃ−ＵＴＰ−ガラクトースの代わりに用いられるＲｏｍｅ  ｅｔ  ａｌ，（１９７９）の変形によって測定される。酵素活性水準は総蛋白含有量に対して正常化される。
【００９８】
ＬＡＭＰ−１の免疫定量化：ＬＡＭＰ−１の測定は実施例３において記載されるようにして行われる。
【００９９】
電子顕微鏡検査法：繊維芽細胞を回収し、その後ｐＨ７．２で５ｍＭ塩化カルシウムを含む０．１Ｍカコジラート緩衝液に２％（ｖ／ｖ）ホルムアルデヒドおよび２％（ｖ／ｖ）グルタルアルデヒドを２〜３時間固定する。標本には、ｐＨ７．２の０．１Ｍカコジラート緩衝液および５ｍＭ塩化カルシウム中に１％（ｗ／ｖ）四酸化オスミウムが後置される。標本を等級付けした一連の水性エタノールで脱水し、Ｓｐｕｒｒ’ｓの低粘度エポキシ樹脂（ＴＡＡＢ，バークシャー，イギリス）に包埋する。
【０１００】
半薄（Ｓｅｍｉ−ｔｈｉｎ）（厚さ１μｍ）のサーベイセクションはＵｌｔｒａｃｕｔ  Ｕｌｔｒａｍｉｃｒｏｔｏｍｅ（Ｌｅｉｃａ，ウィーン，オーストリア）を用いて得られ、１％（ｗ／ｖ）トルイジンで１％（ｗ／ｖ）ホウ砂に染色する。各ブロックは、切出し（ｓｅｃｔｉｏｎｉｎｇ）用に正確に配置された領域が選択される。銀色干渉色の極薄セクション（厚さ６０−９０ｎｍ）をカットし、１００メッシュのヘキサゴナル銅（Ｇ  １００  ＨＥＸ）グリッド（Ｇｉｌｄｅｒ  Ｇｒｉｄｓ，Ｇｒａｎｔｈａｍ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）上に載せる。セクションをレイノルズクエン酸鉛法にしたがって２％（ｗ／ｖ）酢酸ウラニルで５０％（ｖ／ｖ）水性エタノール中で染色し、Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｈ−７０００透過電子顕微鏡（日立，東京，日本）を７５ｋＶの加速電圧で作動させて検査する。
【０１０１】
免疫蛍光法：免疫蛍光法に関する細胞（〜１０5ｃｅｌｌｓ）を回収した後、スクロースを加えたまたは引いた培地内、または必要である場合には０．１ｍｇ／ｍ１転化酵素を含む培地内の組織培養チャンバースライド（Ｎｕｎｃ）に配置し、３７℃で２４時間さらに成長させる。細胞をＰＢＳで２回洗い、４℃で３０分間ＰＢＳ内で１％（ｖ／ｖ）ホルムアルデヒドにより固定し、メタノールで２回洗った後に、風乾する。スライドはさらに加工するまで、−２０℃で貯蔵する。
【０１０２】
スライドを室温に戻し、ＰＢＳ中で１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳによりブロッキング（３×１５分）する前に、ＰＢＳで２回洗う。スライドを０．０５％（ｗ／ｖ）ジギトニンを含む一次抗体（抗−ＬＡＭＰ−１モノクローナル抗体；ハイブリドーマ上澄）を用いて室温で３時間インキュベートする。その後スライドを３回、５分間洗い、卵白アルブミン／ＢＳＡ結合Ａｆｆｉｇｅｌ（各２ｍｇ／ｍｌ）に対して吸収された抗マウス免疫グロブリン（Ｓｉｌｅｎｕｓ）を接合したＦＩＴＣを用いて暗がりで４℃にて１時間インキュベートした。最後にスライドをＰＢＳで３回、５分間洗い、かぶせガラスを２％（ｗ／ｖ）ＤＡＢＣＯ（ジアザビシクロ［２．２．２．］オクタン）を含む５０％（ｖ／ｖ）グリセロールに載せ、エピ蛍光顕微鏡（ｅｐｉ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）で検査した。
【０１０３】
結果（リソソーム生合成をスクロソーム形成により上方修正する）：皮膚繊維芽細胞におけるスクロソームはスクロースを培地に取り入れてから２４時間以内であれば光学顕微鏡で見ることができる。一連のスクロース濃度（５０ｍＭ，１００ｍＭ，１５０ｍＭ，２００ｍＭ，２５０ｍＭスクロース）によりリソソーム酵素発現および細胞形態に関するそれらの効果を比較する。繊維芽細胞は、通過することなくそれらに何日間も調査させることができる接触阻止（ｃｏｎｔａｃｔ  ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ），融合（ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ），正常細胞単層として成長する。繊維芽細胞は、それらが回収されリソソーム酵素を検定した後に７日間各種スクロース濃度でインキュベートする。２００ｍＭおよび２５０ｍＭスクロース含有の培地においてインキュベートした細胞には、７日後に浸透ストレスの徴候が表れた。１００ｍＭのスクロース濃度の場合には、細胞が浸透ストレスの徴候を全く表さないという点で最適であり、酵素水準が最大限に上昇する（結果は示さない）ということが判明し、培地中の１００ｍＭスクロースはスクロソーム誘導に関して機械的に用いられる。
【０１０４】
１００ｍＭスクロースの存在または非存在下で１〜２８日間インキュベートした繊維芽細胞に関して期間−コース実験を行った。細胞は各スクロース含有培地または通常の培地のいずれかにおいて培養してから、１，２，４，７，１４，２１および２８日後に回収した。スクロース含有培地において成長させた細胞の電子顕微鏡写真は、期間−コースの間、蓄積のさらなる増加で、わずか２４時間後にはスクロソームにおいて劇的な増加を示した（図６，パネルＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ）。抗−ＬＡＭＰ−１モノクローナル抗体を含むこれらの細胞の共同免疫蛍光標識（Ｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔ  ｉｍｍｕｎｏ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｌａｂｅｌｉｎｇ）はリソソームと関係する蛍光標識において上昇を示した（図６，パネルＥ，Ｆ，Ｇ，Ｈ）。
【０１０５】
ＬＡＭＰ−１タンパク質の水準は２１日の期間をこえて、スクロースの存在下において２５倍に上昇した（図７）。スクロソーム含有細胞におけるＬＡＭＰ−１の免疫蛍光局在化は、ＬＡＭＰ−１が血漿膜において有意に増加はせず、スクロソーム膜において存在するということを表している（図６，パネルＥ，Ｆ，Ｇ，Ｈ）。ＬＡＭＰ−１の増加は大き１さにおける増加（図６Ａと図６Ｂを比較）の２１〜２８日までに細胞質の大部分を占めるスクロソームによるのみならず、これらのリソソーム蓄積症液胞の数の顕著な増加（図６Ｂと図６Ｄを比較）を明らかにする電子顕微鏡によって測定されるスクロソームの形成にも相関性がある。しかし、スクロソームの存在が１日後に明らかではあるが、電子顕微鏡（図６Ｂ）および免疫蛍光標識化（図６Ｆ）の両者によったとしても、スクロソーム量における初期の増加を示唆する、この時点における（図７）ＬＡＭＰ−１中の対応する増加は、膨潤のために認識されない。ＬＡＭＰ−１は、４日目まで増加しないが、２１日目には（図７）、この時点の間（図６Ｄ）にスクロソーム数の明白な増加に関連する高い上昇が観察される。
【０１０６】
スクロソームの誘導の間の酸性リン酸塩，β−ヘキソサミニダーゼ，α−イズロニダーゼ，α−マンノシダーゼ，ガラクトシルトランスフェラーゼおよびα−ケトグルタレートデヒドロゲナーゼの酵素活性水準を調査した。細胞中の酸リン酸塩，β−ヘキソサミニダーゼおよびα−マンノシダーゼの水準はＬＡＭＰ−１に関してみられるものと似たようなプロフィールを示すが、２１日後にはそれぞれ３，４，５倍に上昇する（表３）。α−イズロニダーゼ，ガラクトシルトランスフェラーゼ（ゴルジマーカー）およびα−ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ（ミトコンドリアマーカー）の活性水準は、リソソーム蓄積の間に上昇するものとは思われなかった。タンパク質と酵素の活性水準は、われわれがＬＡＭＰ−１，β−ヘキソサミニダーゼ，α−マンノシダーゼが細胞から分泌されているということを観察した培地において測定される（表４）。ＬＡＭＰ−１，β−ヘキソサミニダーゼはスクロース含有培地において細胞を成長させた場合の分泌水準において対応する増加を示す一方で、α−マンノシダーゼにはこのような増加がみられなかった。細胞中に表れる水準で比較した、分泌されたα−マンノシダーゼの量は、スクロソーム含有細胞において認められるα−マンノシダーゼの活性度の５倍の上昇はα−マンノシダーゼ合成における増加によるものではなく、むしろリソソームに取り引きされるα−マンノシダーゼの割合における増加であるということを表している。
【０１０７】
（表３）
（２週間の融合後（ｐｏｓｔ  ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ）における皮膚繊維芽細胞におけるタンパク質／酵素水準）
【０１０８】
【表３】
0003837711.tif 000004
（表４）
（スクロソーム含有細胞および培地におけるタンパク質水準）
【０１０９】
【表４】
0003837711.tif 000005
【０１１０】
（実施例９）
（リソソーム蓄積症を補正する１モデルとしてのスクロソームの消滅）
実施例８に記載したように、細胞培養法、抽出物の調製，タンパク質／酵素検定，ＬＡＭＰ−１の免疫定量，電子顕微鏡方法および免疫蛍光法を行った。
【０１１１】
リソソーム生合成に対する蓄積補正効果を検討するために、繊維芽細胞を１００ｍｍスクロースの存在または非存在下で、細胞を通常の培地；転化酵素を含む培地に取り換えるかもしくはスクロース含有培地で継続させる時点まで１４日間インキュベートする。通常の培地で０日から成長させた細胞は、この培地で継続する。
【０１１２】
スクロース含有培地において１４日間成長させた細胞はスクロソームを含んでいたということ（図８Ａおよび８Ｂ）およびスクロソームは２８日目まで蓄積しつづけたということ（図６Ｄ）が電子顕微鏡によって検証された。スクロソームの数はスクロソーム含有細胞が通常培地あるいは転化酵素を含む培地に戻されてから２４時間以内に著しく減少する（図８Ｃおよび８Ｄ）。細胞は４日以内（期間−コースの１８日目）に通常に戻る（図８Ｅおよび８Ｆ）。転化酵素に配置されたスクロソーム含有細胞は、２４時間以内でスクロソーム数の大幅な減少により、より早い補正を表した。
【０１１３】
免疫蛍光法による調査は、補正後のＬＡＭＰ−１蛍光標識化において減少を示した。この標識化は細胞表面の染色がほとんどあるいは全く検知されない特徴的なリソソーム（ＬＡＭＰ−１ポジティブ，ＭＰＲネガティブ）であった。ＬＡＭＰ−１免疫蛍光における減少は、細胞が通常培地または転化酵素を含む培地に移動されてから２４時間以内に認められ、通常培地において継続して成長させた細胞においてみられたのと同様に（データは示してない）この時点においてＬＡＭＰ−１の標識化が認められた。
【０１１４】
ＬＡＭＰ−１タンパク質の水準は３５日間の期間−コース（図９）にわたってスクロースの存在下で成長させた細胞においては２８倍にまで増加した。この水準はスクロソームを含んだ細胞が転化酵素を含む培地に移された３日後以内に正常に戻る。しかし、通常の培地に配置された細胞がＬＡＭＰ−１の水準を正常化させるには７〜１４日必要となる。
【０１１５】
スクロース含有培地で１４日間成長させ、続けて通常の培地に配置させた細胞における酵素水準は正常の水準に戻るまで７〜１４日必要となる。ＬＡＭＰ−１に関して、転化酵素含有培地に交換された細胞は、酵素水準を１〜４日以内で正常または正常以下に減少する最も劇的な変化を表した。これら転化酵素による結果は、通常の培地に配置された細胞には液胞の消滅と酵素／タンパク質の水準における減少との間に後れ時間（ｌａｇ  ｔｉｌｍｅ）が見られるのに対して、電子顕微鏡および免疫蛍光法により観察された蓄積液胞の形成と消滅に大いに関連性がある。
【０１１６】
スクロソーム含有細胞の補正の間、ＬＡＭＰ−１およびリソソーム酵素活性は細胞および培地中で測定される（表４）。
【０１１７】
これは、細胞が転化酵素によって補正された場合、ＬＡＭＰ−１の総合水準が１４単位（補正前の細胞中，１４日目（＋スクロース））から１３，８，９単位（それぞれ１５日目，１８日目、２１日目において、培地を加えた細胞中の合計）にまで減少するが、細胞がＢＭＥ培地に交換された場合には（スクロースはない）、同じ期間にわたって上昇する、ということを示している。これとは対照的に、いずれかの方法で補正する間、総酵素活性水準は上昇する。
【０１１８】
（実施例１０）
（ＬＳＤに罹患した皮膚繊維芽細胞におけるリソソームタンパク質／酵素水準）
実施例８に記載したように、細胞培養法、抽出物の調製，タンパク質／酵素検定，ＬＡＭＰ−１の免疫定量，電子顕微鏡方法および免疫蛍光法を行った。
【０１１９】
本調査で使用される正常な皮膚の繊維芽細胞系は、ＳＦ３９２１，ＳＦ４１１７，ＳＦ１４１５３，ＳＦ４２０４およびＳＦ４２２７が含まれる。培養した罹患細胞系には、ポンぺ病用のＳＦ３９６０，サッラ病（Ｓａｌｌａ  ｄｉｓｅａｓｅ）用のＳＦ１５９４，ＭＰＳ−ＩＩ用のＳＦ１７７９およびＭＰＳ−ＶＩ用のＳＦ３１６８が含まれる。細胞系はオーストラリア、アデレード，ウィメンズ  アンド  チルドレンズホスピタルの化学的病理学部が所有するＮａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｆｅｒｒａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙセルバンクを参照する。
【０１２０】
スクロソーム誘導に関してみられる増加と同じように、リソソーム酵素における上昇はＬＳＤ患者の細胞系においても認められる。本調査においては、４種類のＬＳＤ繊維芽細胞系（ポンペ，サッラ病，ＭＰＳ−ＩＩおよびＭＰＳ−ＶＩ）および４種類の異なる正常な対照繊維芽細胞系を調査した。
【０１２１】
免疫蛍光法による調査は、正常な対照繊維芽細胞（図６Ａ）と比較した場合、ポンペ細胞における（図１０Ａ）ＬＡＭＰ−１の染色が高い水準であることを示した。サッラ，ＭＰＳ−ＩＩおよびＭＰＳ−Ｖ１細胞はＬＡＭＰ−１免疫蛍光よりも低い水準を示したが、それでもなお対照細胞よりは高がった。４つの疾患細胞系すべてにおいて、この標識化は細胞内小器官と関連している（図１０）。電子顕微鏡によってポンペ，サッラおよびＭＰＳ−ＩＩに関連する大量のリソソーム蓄積液胞の存在が検証されたが、ＭＰＳ−ＶＩ細胞に関しては比較的関係が薄かった（図１１）。抗−ＬＡＭＰ−１抗体による免疫蛍光の研究は、一度細胞が融合（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ）に到達すると時間と共に染色が増加することを明らかにした。電子顕微鏡は、正常な繊維芽細胞と比較する場合、融合（ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）期間後１４日にわたって（結果は示さない）サッラ（Ｓａｌｌａ），ポンペおよびＭＰＳ−ＩＩ細胞の上昇した水準を検証した。ＭＰＳ−ＶＩ細胞は１４日間のインキュベーションを過ぎても蓄積液胞において明確な増加を示さなかった。
【０１２２】
サッラ病（Ｓａｌｌａ  ｄｉｓｅａｓｅ）細胞は１４日間の期間−コースを越えても安定したままであったＬＡＭＰ−１タンパク質（正常な対照の７倍以上）の最も高い上昇を示した。ポンペ病も、正常な線維芽細胞におけるＬＡＭＰ−１の水準と比較した場合には、より高いＬＡＭＰ−１の水準（正常な細胞の５倍以上）を引き起した。ＭＰＳ−ＩＩ病細胞は１４日間の期間−コースを通じてＬＡＭＰ−１の２倍の増加が認められた、ＭＰＳ−ＶＩ細胞においては有意な上昇は見られなかった。
【０１２３】
ＬＳＤ罹患細胞系においてはリソソーム酵素も上昇する。β−ヘキソサミニダーゼは、正常な皮膚繊維芽細胞における酵素水準と比較した場合（表３）、サッラ，ポンペおよびＭＰＳ−ＩＩ細胞系において２〜３倍上昇した。α−マンノシダーゼもサッラ，ポンペおよびＭＰＳ−ＩＩ細胞の２倍にまで上昇する。酸リン酸塩はサッラおよびＭＰＳ−ＩＩ細胞の２倍にまで上昇することが認められるが、ポンペ細胞においては酸リン酸塩の上昇は測定されなかった。α−イズロニダーゼはサッラ病細胞においてのみ上昇し、ポンペ，ＭＰＳ−ＩＩおよびＭＰＳ−ＶＩにおいては上昇が測定されないことがわかった。４種類の疾患細胞系の調査に関して、正常な皮膚繊維芽細胞における酵素水準と比較した場合（表３）、ＭＰＳ−ＶＩは検定された４つの可溶性リソソーム酵素の水準において上昇がなかったことを表した。
【０１２４】
（実施例１１）
（ＬＳＤに罹患した皮膚繊維芽細胞における補正後のリソソームタンパク質／酵素水準）
実施例８に記載したように、細胞培養法、抽出物の調製，タンパク質／酵素検定，ＬＡＭＰ−１の免疫定量，電子顕微鏡方法および免疫蛍光法を行った。
【０１２５】
組換え型酵素を細胞の培地に添加することにより、患者の細胞系において蓄積の補正が成し逐げられる。使用された全ての組換え型酵素の濃度はリソソーム蓄積の補正に帰着することが既に明らかに示されている（Ｆｕｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ，１９９５；Ｂｉｅｌｉｃｋｉ  ｅｔ  ａｌ，１９９３；Ａｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，１９９２）。電子顕微鏡は蓄積液胞の大きさが酵素の添加後７日以内に劇的に縮小するということで、ポンペおよびＭＰＳ−ＩＩに罹患した細胞における補正を確認するものである。ＭＰＳ−ＶＩに罹患した細胞の場合には、電子顕微鏡により検知すると、ほんのわずかの蓄積液胞が存在するが、蓄積は最小限になることが観察される。したがって、補正においては何の変化も認められない。抗−ＬＡＭＰ−１モノクローナル抗体に関する免疫蛍光の調査は補正の結果、ＬＡＭＰ−１の染色において減少が認められた。しかし、ポンペ罹患細胞はＬＡＭＰ−１抗体で標識化することにより、補正の３日以内で、強力な蛍光を表す。ポンペ細胞は正常化され、蛍光標識において減少することとなる（図示しない）。ＭＰＳ−ＩＩおよびＭＰＳＶＩ細胞の補正およびそれに続く正常化もリソソーム標識における７日以内の減少を表している。
【０１２６】
ポンペおよびＭＰＳ−ＩＩの補正の結果として、上昇したＬＡＭＰ−１タンパク質水準は３〜７日以内に正常コントロールの水準にまで減少することが認められた（図１２）。リソソーム酵素である酸リン酸塩，β−ヘキソサミニダーゼ，α−イズロニダーゼおよびα−マンノシダーゼの活性水準は、正常な繊維芽細胞の水準と比較した場合、その全てがＭＰＳ−ＩＩとポンペ病細胞において２〜３倍に上昇する。イズロネート−２−スルファターゼによるＭＰＳ−ＩＩの補正は、これらのリソソーム酵素を補正の７日以内に正常の範囲に戻すこととなる。ＬＡＭＰ−１水準において現象を伴うのみならず、蓄積液胞における減少が電子顕微鏡および免疫蛍光調査により検知されるが、上昇したリソソーム活性水準においてはポンペ病細胞の補正によって驚くべき有意な変化は認められなかった。ＭＰＳ−ＶＩ細胞は検定されたリソソーム酵素のいずれにおいても上昇した水準を示さず、ＬＡＭＰ−１における増加は、通常その他の蓄積障害によってはみとめられなかった（結果は示さない）。このようにして、罹患した細胞と補正した細胞の間にはわずかな相違点が存在し、有意な変化は補正の結果としては検出されない。
【０１２７】
【表５】
0003837711.tif 000006
【０１２８】
【表６】
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【０１２９】
【表７】
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【０１３０】
【表８】
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【０１３１】
【表９】
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【０１３２】
【表１０】
0003837711.tif 000011
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は免疫精製された（ｉｍｍｕｎｏｐｕｒｉｆｉｅｄ）Ｌａｍｐ−１に対して産出されたポリクローナル抗血清の交差感受性を示すグラフ図である。マイクロタイターウェルは、実施例３に記載される第１ステップ定量方法を用いて、ポリクローナル抗体が５μｇ／ｍｌ（白丸）または１０μｇ／ｍ１（白四角）の水準で被覆されている。
【図２】  図２はＬａｍｐ−１に対するＥｕ3+標識化抗体の交差感受性を示すグラフ図である。１０ｎｇ／ｍｌ（黒丸），２０ｎｇ／ｍｌ（白四角）または４０ｎｇ／ｍｌ（白丸）のいずれかを含むＬａｍｐ−１の標準溶液が調製され、各サンプルへの蛍光反応は実施例３に記載される第１ステップ定量方法を用いて遅延時間（ｔｉｍｅ−ｄｅｌａｙｅｄ）蛍光免疫検定法におけるＥｕ3+標識化抗体の濃度範囲で測定される。
【図３】  図３は実施例３に記載される第１ステップ定量方法を用いて測定される１８６人の新生児から得られる血斑中のＬａｍｐ−１の水準を示すグラフ図である。ｘ軸はＬａｍｐ−１の水準（ｎｇ／血斑（ｂｌｏｏｄ  ｓｐｏｔ））を表している。Ｌａｍｐ−１水準の各範囲内の個体数はｙ軸に表される。
【図４】  図４は２５種類のリソソーム蓄積症を表す３２０人のＬＳＤ罹患者と１５２人の非罹患者から得られる血漿中のＬａｍｐ−１水準を示すグラフ図である。Ｌａｍｐ−１水準は実施例３に記載される第２ステップ定量方法において５〜１０μｌの試料を用いて測定される。中央の棒は各疾患におけるＬａｍｐ−１水準の中央値を表し、陰影部分は百分位数の２５番目と７５番目を表し、上部および下部の棒は範囲の境界を表している。異常値（白丸）ならびに極度の異常値（*）も表示する。ＧＭ１＝ＧＭ１ガングリオシドーシス；  ＭＬＤ＝異染性白質ジストロフィー；  ＭＳＤ＝複数のスルファターゼ欠損症；  Ｎ−Ｐ＝ニーマン・ピック病；  ＳＡＳ＝シアル酸蓄積；ＴＳＤ＝テイ・サックス病。
【図５】  図５は１４人のＬＳＤ罹患者および４人の（正常な）非罹患者から得られる血漿試料中のＬａｍｐ−２水準を示すグラフ図である。個体の状態はｘ軸に表される。
【図６】  図６はスクロソームモデル（Ｓｕｃｒｏｓｏｍｅ  Ｍｏｄｅｌ）からの繊維芽細胞の電子顕微鏡および免疫蛍光検査顕微鏡の写真図である。パネルＡ，Ｂ，ＣおよびＤは、（Ａ）０日；（Ｂ）１日；（Ｃ）７日；（Ｄ）２８日にわたって１００ｍＭスクロースを含んだ培地における繊維芽細胞成長の電子顕微鏡写真である。パネルＥ，Ｆ，ＧおよびＨは、（Ａ）０日；（Ｂ）１日；（Ｃ）７日；（Ｄ）２８日にわたって１００ｍＭスクロースを含んだ培地における繊維芽細胞成長の免疫蛍光検査顕微鏡写真である。免疫蛍光検査写真は、相対強度の比較を可能にするために同じ時間（４５秒）露光させた。スケールバー（ｓｃａｌｅ  ｂａｒ）は電子顕微鏡写真においては４μで免疫蛍光顕微鏡写真においては２０μである。
【図７】  図７はスクロソームモデル（Ｓｕｃｒｏｓｏｍｅ  Ｍｏｄｅｌ）における相対的なＬａｍｐ−１タンパク質水準を示すグラフ図である。皮膚の繊維芽細胞を１００ｍＭスクロースの存在または非存在下で２８日間成長させた。細胞は所定の時点で回収され、Ｌａｍｐ−１はスクロースの存在下（黒四角）および非存在下（白四角）で成長した細胞内で測定される。Ｌａｍｐ−１の値は総蛋白含有量に対して正常化される。
【図８】  図８はスクロソームモデル（Ｓｕｃｒｏｓｏｍｅ  Ｍｏｄｅｌ）における蓄積の補正を示す電子顕微鏡の写真図である。正常な培地（パネルＡ）またはスクロースを含むメディア（パネルＢ〜Ｈ）において成長した繊維芽細胞の電子顕微鏡写真。細胞を１４日間成長させ、すぐに回収（パネルＡおよびＢ），ＢＭＥ培地に移しかえられ、１日（パネルＣ）；３日（パネルＥ）および７日（パネルＧ）後に回収、あるいは、転化酵素を含むメディアに移しかえられ、１日（パネルＤ）；３日（パネルＦ）および７日（パネルＨ）後に回収される。スケールバー（ｓｃａｌｅ  ｂａｒ）は２μである。
【図９】  図９はスクロソームモデルに関する蓄積補正後のＬａｍｐ−１蛋白の相対的水準を示すグラフ図である。皮膚の繊維芽細胞は貯蔵液胞を蓄積するためにスクロースの存在下で１４日間成長させた。細胞は、さらに２１日目まで、スクロースを含む培地内で成長を続けるか、あるいは細胞をＢＭＥ培地もしくは転化酵素を含むＢＭＥ培地に移しかえることによって補正される  Ｌａｍｐ−１は２１日を経た時点で測定され、プロットされる。細胞はスクロースのみを含む培地上（黒四角）、スクロースを含む培地上で１４日間、その後ＢＭＥ培地に配置される（黒三角）、スクロースを含む培地上で１４日間、その後転化酵素を含む培地に配置される（黒丸）または期間−コースを通じてＢＭＥ培地上（白四角）で成長させられる。
【図１０】  図１０は抗−Ｌａｍｐ−１モノクローナル抗体を用いて標識化した罹患細胞系からの繊維芽細胞を示す免疫蛍光検査顕微鏡の写真図である。繊維芽細胞はポンペ（パネルＡ），サッラ（パネルＢ），ＭＰＳ−ＩＩ（パネルＣ）およびＭＰＳ−ＶＩ（パネルＤ）の罹患細胞系からである。写真は相対強度の比較を可能にするために同じ時間（４５秒）露光させた。スケールバー（ｓｃａｌｅｌ  ｂａｒ）は２０μである。
【図１１】  図１１は患者の細胞系における蓄積の補正を示す電子顕微鏡の写真図である。細胞系はポンペに罹患した細胞（パネルＡ）；ポンペを補正した細胞（パネルＢ）；ＭｌＰＳ−ＩＩに罹患した細胞（パネルＣ）；ＭＰＳ−ＩＩを補正した細胞（パネルＤ）；ＭＰＳ−ＶＩに罹患した細胞（パネルＥ）；ＭＰＳ−ＶＩを補正した細胞（パネルＦ）からである。電子顕微鏡写真は、酵素の添加後７日以内に貯蔵液胞の大きさが劇的に縮小した（パネルＢ，Ｄ，Ｆ）ということから、ポンペ（パネルＡおよびＢ），ＭＰＳ−ＩＩ（パネルＣおよびＤ）およびＭＰＳ−ＶＩ（パネルＥおよびＦ）に罹患した細胞において補正を確認した。スケールバー（ｓｃａｌｅ  ｂａｒ）は２μである。
【図１２】  図１２はポンペに罹患した繊維芽細胞および補正されたポンペ繊維芽細胞における相対的なＬａｍｐ−１の水準を示すグラフ図である。ポンペに罹患した繊維芽細胞および正常な皮膚の繊維芽細胞は融合（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ）まで成長させられ、さらに１４日間まで正常な培地で続けられるかもしくは、細胞をα−グルコシダーゼを含む培地に移しかえることで補正される。相対的なＬａｍｐ−１の水準は２度目の１４日間の期間が経過した時点で測定され、プロットされる。通常の細胞は（黒三角）で、ＢＭＥ培地のポンペ罹患細胞は（黒四角）で、α−グルコシダーゼを含むポンペ罹患細胞は（白四角）で表される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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