(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式
Ｘ−Ａ−Ｂ−Ｃ                    （Ｉ）
〔式中、Ｘは、水素原子、末端アミノ基を非可逆的にマスクする基であって、ハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１−６アルキルカルボニル基、Ｃ６−１０アリールカルボニル基、Ｃ１−６アルキルスルホニル基およびＣ６−１０アリールスルホニル基からなる群より選ばれる基、またはアミノ基の保護基であり；
Ａは、グリシンの残基；ＤおよびＬ体のアラニン、バリン、ノルバリン、ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、セリンおよびトレオニンのアミノ酸の残基；並びにそれらのアミノ酸の同一および相異なる２個からなるジペプチドの残基から選ばれ；
Ｂは、フェニルアラニン、パラニトロフェニルアラニン、およびチロシンのアミノ酸の残基から選ばれ；
Ｃはチオエステル結合を形成することができるチオール誘導体の残基であって
一般式
−Ｐ−Ｑ
〔ただし、Ｐは−ＳＣＨ（−Ｒ）−ＣＯ−であり、ここでＲは１から６個の炭素原子を有する脂肪族炭化水素基、６または１０個の炭素原子を有する芳香族炭化水素基、７から１１個の炭素原子を有する芳香脂肪族炭化水素基、および３から８個の炭素原子を有する脂環式炭化水素基から選ばれ；
Ｑは、
−Ｏ（ＣＨ２）ｎ−Ｎ（Ｒ１）（Ｒ２）、
【化１】
0003734109.tif 000011
【化２】
0003734109.tif 000012
【化３】
0003734109.tif 000013
【化４】
0003734109.tif 000014
【化５】
0003734109.tif 000015
または
【化６】
0003734109.tif 000016
であり、ここでｎは１から６の整数であり、Ｒ１はメチル基およびエチル基から選ばれ、Ｒ２はメチル基およびエチル基から選ばれ、Ｒ３は水素原子およびメチル基から選ばれる〕で表わされる残基である］
で表わされる化合物またはその塩。
【請求項２】
Ｂがフェニルアラニンの残基である請求項１に記載の化合物またはその塩。
【請求項３】
Ｐがβ−フェニルチオ乳酸の残基である請求項１または請求項２に記載の化合物またはその塩。
【請求項４】
Ｑがピリジンプロパノール、グリシルアミノピリジン並びにＤおよびＬ体のアラニルアミノピリジンから選ばれるピリジン誘導体の残基である請求項１〜３のいずれかに記載の化合物またはその塩。
【請求項５】
塩が、ヨウ化Ｃ１−５アルキルの塩である、請求項１〜４のいずれかに記載の化合物の塩。
【請求項６】
試料中のペプシンと、請求項１〜５のいずれかから選ばれる化合物またはその塩とを、作用させることにより、その化合物を加水分解させ、生成するチオール誘導体を測定することを特徴とするペプシン測定方法。
【請求項７】
試料中のペプシノーゲンを活性化し、生成するペプシンを、請求項６記載のペプシン測定方法により測定することを特徴とするペプシノーゲン測定方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、酵素活性測定用基質として用いることのできる新規化合物およびその塩、それらを用いたペプシン及びペプシノーゲンの測定方法、並びにそれらの測定方法に用いる試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ペプシンは消化酵素として胃液中に存在し、その前駆体であるペプシノーゲンとして胃底腺の主細胞から分泌され、ｐＨ１．５から５．０で活性化されてペプシンとなり、蛋白質を分解する。
胃液中のペプシンの測定は、ペプシンが塩酸と平衡して分泌されることから、無酸症、胃液分泌欠乏の診断に臨床上の意義があり、また、消化性潰瘍の発生因子としても重要視されている。
胃腺から分泌されたペプシノーゲンの一部は血中にはいり、更にこれはウロペプシノーゲンとして尿中に排泄される。ウロペプシノーゲンの排泄量と胃ペプシンとの分泌量にはある程度の相関性が認められている。
血清中に存在する免疫学的にグループＩに分類されるペプシノーゲンは、胃底腺機能を反映するとされ、臨床的意義が注目されている。
【０００３】
これらのペプシン及びペプシノーゲン測定には、従来ペプシンの酵素活性を測定する方法と免疫的にそれらの蛋白量を測定する方法が用いられてきた。それらの測定法を以下に述べる。
活性測定法としては以下のａ〜ｅの方法が挙げられる。
ａ．基質としてヘモグロビンを使用し、その消化蛋白をそのまま、或いはフォーリン試薬を用いて呈色させて分光光度法で測定する方法
〔ＭｃＰｈｉｅ，Ｐ：Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ７３，２５８−２６１（１９７６）〕；
ｂ．基質として牛乳を使用し、凝乳時間を測定する方法
〔ＭｃＰｈｉｅ，Ｐ：Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ７３，２５８−２６１（１９７６）〕；
ｃ．基質としてＮ−アセチル−フェニルアラニル−ジヨードチロシン等の合成基質を使用し、アミノ基を有する分解産物をニンヒドリンを用いて発色させ、分光光度法で測定する方法
〔Ｒｙｌｅ，Ａ．Ｐ．：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １９，３  １６−３３７（１９７０）
Ｆｒｕｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．：Ａｄｖａｎｃｅ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ３３，４０１−４４２（１９７０）
Ｓａｃｈｄｅｖ，Ｇ．Ｐ．：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，９，４４６５−４４７０（１９７０）〕；
ｄ．基質としてＺ−ヒスチジル−パラニトロフェニルアラニル−フェニルアラニンメチルエステルのような合成基質を使用し、基質とパラニトロフェニルアラニル残基を含む分解産物の同一波長における分子吸光係数の差を利用し分光光度法で測定する方法
〔Ｉｎｏｕｅ，Ｋ．：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，６，１７６５−１７７７（１９６７）
Ｓａｃｈｄｅｖ，Ｇ．Ｐ．：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，８，４２３１−４２３８（１９６９）〕；
ｅ．基質としてダンシル−アラニル−アラニル−フェニルアラニル−フェニルアラニル−３−〔４−（Ｎ−メチル）−ピリジル〕−プロピル−１−オキシエステルを使用し基質分解産物を蛍光を利用して測定する方法
〔Ｄｅｙｒｏｐ，Ｃ：Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １２９，５０２−５１２（１９８３）〕。
【０００４】
免疫的測定方法としては以下のｆ及びｇの方法が挙げられる。
ｆ．ペプシンあるいはペプシノーゲンに対する抗体を使用し、放射性標識物質に基づいて測定するラジオイムノアッセイ法
〔Ｓａｍｌｏｆｆ，Ｉ．Ｍ：Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ８２，２６−３３（１９８７）〕；
ｇ．ペプシンあるいはペプシノーゲンに対する抗体を使用し、酵素標識物質に基づいて測定する酵素免疫吸着法
〔黄  士哲  ：日本消化器学会誌
８４，１３−１９（１９８７）〕。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながらこれらの測定法には種々の問題点がある。即ち、測定法ａにおいては、基質として使用するヘモグロビンの調製法が繁雑であり、かつ保存性が悪く、また、測定に際し沈殿物を除く必要があるなどの操作性の問題がある。
測定法ｂにおいては、体液中のペプシノーゲンを予め活性化しペプシンに変換する操作があり、また、凝乳時間を測定することから一度に多数の検体を測定することは困難である等の問題がある。
測定法ｃにおいては、精製されたペプシン或いはペプシノーゲンを測定することは可能であるが、血清、血漿、尿のような他の蛋白質が夾雑している体液を検体とした場合においては夾雑蛋白質中のアミノ基とニンヒドリンの反応により検体ブランク値が大きくなり正確な測定が困難であるという問題点があり、また、ニンヒドリン反応を行なう特殊な装置が必要であるという欠点もある。
測定法ｄにおいては、測定に際して、検体中の共存物質の影響が少ない初速度法による測定が可能であるが、測定波長が３１０ｎｍであるため検体の濁りの影響を受け易く測定吸光度が高くなることがあり、正確な測定が困難であるという欠点があり、また、基質と分解物のモル吸光係数（ε）の差を利用しているため、基質濃度を高くすると測定吸光度が高くなるという欠点と共に測定感度が不十分であるという問題点がある。
測定法ｅにおいては、基質の水解によるダンシル基と陽性荷電したピリジニウムとの構造変化で生じる蛍光を測定する方法であり、初速度法による測定が可能であるが、蛍光を測定するために高価な蛍光光度計あるいは分光蛍光光度計が必要であるという問題点がある。
【０００６】
免疫的測定法である測定法ｆにおいては使用する場所が限定されることおよび放射性廃棄物の問題がある。また、測定法ｆおよびｇに共通な課題であるが、手技が繁雑であり、測定に時間がかかる等の問題点がある。
更に、測定法ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ及びｇにおいては臨床検査に使用されている汎用の自動分析機での測定が困難であり、短時間で多数の検体を測定するのが困難であるという問題点がある。
そのため、従来のペプシンおよびペプシノーゲン測定法の問題点を解決することが本発明の課題である。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
我々は従来法の問題点を解決すべく鋭意研究した結果、チオール誘導体の残基を分子中に含む特定の新規化合物を基質として用いてペプシンと反応させると、ペプシンにより該新規化合物が加水分解されてチオール誘導体の残基由来のチオール化合物が生成し、このチオール化合物の生成量をチオール検出試薬によって測定することによって、ペプシンを正確に簡便に定量することができ、かかる定量法は汎用の自動分析機に適用可能であり、従ってペプシン及びペプシノーゲンの極めて有利な測定法となり得ることを見出し本発明を完成させた。
【０００８】
従って、本発明は、一般式
Ｘ−Ａ−Ｂ−Ｃ                    （Ｉ）
〔式中、Ｘは、水素原子、末端アミノ基を非可逆的にマスクする基、およびペプチド化学において通常使用されるアミノ基の保護基から選ばれ；
Ａは、グリシンの残基；ＤおよびＬ体のアラニン、バリン、ノルバリン、ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、セリンおよびトレオニンのアミノ酸の残基；並びにそれらのアミノ酸の同一および相異なる２個からなるジペプチドの残基から選ばれ；
Ｂは、フェニルアラニン、パラニトロフェニルアラニン、およびチロシンのアミノ酸の残基から選ばれ；
Ｃはチオエステル結合を形成することができる１から３０個の炭素原子およびそれらに結合する水素原子から構成され、そのさい１から１０個の炭素原子が酸素、窒素および／または硫黄原子に、そして、２から１０個の水素原子が酸素、窒素あるいは硫黄原子のような元素により置換されていることができるチオール誘導体の残基を示す〕
で表わされる化合物またはその塩に関する。
【０００９】
更に本発明は、試料中のペプシンと、上記化合物またはその塩とを、作用させることにより、その化合物を加水分解させ、生成するチオール誘導体を測定することを特徴とするペプシン測定方法に関する。
更に本発明は、ペプシン測定用試薬であって、
ｉ）上記化合物およびその塩から選ばれるペプシン測定用基質、および
ｉｉ）チオール基定量用試薬
を必須成分として含む、ペプシン測定用試薬に関する。
【００１０】
【発明の実施の形態】
一般式（Ｉ）の化合物またはその塩は、ペプシンの基質として機能し得るものであり、本発明のペプシン及びペプシノーゲンの正確で簡便な測定法を可能にするものである。
一般式（Ｉ）において、Ｘは、水素原子、末端アミノ基を非可逆的にマスクする基またはペプチド化学において通常使用されるアミノ基の保護基である。末端アミノ基を非可逆的にマスクする基としては、ホルミル、アセチル、トリフルオロアセチルなどのハロゲン原子で置換されていてもよいＣ1-6 アルキルカルボニル基；ベンゾイルなどのＣ6-10アリールカルボニル基；メシルなどのＣ1-6 アルキルスルホニル基；トルエンスルホニル、ベンゼンスルホニルなどのＣ6-10アリールスルホニル基等が挙げられる。
ペプチド化学において通常使用されるアミノ基の保護基としては、例えば、ベンジルオキシカルボニル、ｔ−ブチルオキシカルボニル、メチルスルホエチルオキシカルボニル、９−フルオレニルメチルオキシカルボニルなどの、アミノ基の保護基として周知のものが挙げられる。
【００１１】
一般式（Ｉ）のＡは、グリシンの残基、ＤまたはＬ体のアラニンの残基、ＤまたはＬ体のバリンの残基、ＤまたはＬ体のノルバリンの残基、ＤまたはＬ体のロイシンの残基、ＤまたはＬ体のイソロイシンの残基、ＤまたはＬ体のノルロイシンの残基、ＤまたはＬ体のセリン、ＤまたはＬ体のトレオニン、あるいはそれらのアミノ酸の同一および相異なる２個からなるジペプチドの残基を表わす。
それらのアミノ酸の同一および相異なる２個からなるジペプチドの残基としては、例えばＬ−グリシル−Ｌ−グリシル、Ｌ−グリシル−Ｌ−アラニル、Ｌ−グリシル−Ｌ−バリル、Ｌ−グリシル−Ｌ−ロイシル、Ｌ−グリシル−Ｌ−ノルロイシル、Ｌ−グリシル−Ｄ−バリル、Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル、β−アラニル−Ｌ−アラニル、Ｌ−アラニル−Ｌ−バリルなどが挙げられる。
【００１２】
一般式（Ｉ）においてＢは、フェニルアラニンの残基、パラニトロフェニルアラニンの残基、あるいはチロシンの残基を表わす。特にフェニルアラニンの残基が好ましい。
一般式（Ｉ）においてＣは、チオエステル結合を形成することができるチオール誘導体の残基であって、１から３０個の炭素原子およびそれらに結合する水素原子から構成され、その際１から１０個の炭素原子が酸素、窒素および／または硫黄原子に、そして２から１０個の水素原子が酸素、窒素あるいは硫黄原子のような元素により置換されていてもよいチオール誘導体の残基を表わす。
【００１３】
Ｃのチオール誘導体の残基としては、より具体的には一般式
−Ｐ−Ｑ
〔ただし、Ｐは−ＳＣＨ（−Ｒ）−ＣＯ−であり、ここでＲは１から６個の炭素原子を有する脂肪族炭化水素基、６または１０個の炭素原子を有する芳香族炭化水素基、７から１１個の炭素原子を有する芳香脂肪族炭化水素基、および３から８個の炭素原子を有する脂環式炭化水素基から選ばれ；
Ｑは、
−Ｏ（ＣＨ2 ）n −Ｎ（Ｒ1 ）（Ｒ2 ）、
【化７】
0003734109.tif 000002
【化８】
0003734109.tif 000003
【化９】
0003734109.tif 000004
【化１０】
0003734109.tif 000005
【化１１】
0003734109.tif 000006
または
【化１２】
0003734109.tif 000007
であり、ここでｎは１から６の整数であり、Ｒ1 はメチル基およびエチル基から選ばれ、Ｒ2 はメチル基およびエチル基から選ばれ、Ｒ3 は水素原子およびメチル基から選ばれる〕
で表わされるチオール誘導体の残基が挙げられる。
【００１４】
ここでＲの１から６個の炭素原子を有する脂肪族炭化水素基としては、例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシルなどのＣ1-6 アルキル基；ビニル、アリル、１−プロペニル、１−ブテニル、１−ペンテニル、１−ヘキセニルなどのＣ2-6 アルケニル基；エチニル、２−プロピニル、２−ブチニル、１−ペンチニルなどのＣ2-6 アルキニル基等が挙げられる。６個または１０個の炭素原子を有する芳香族炭化水素基としては、例えば、フェニル、ナフチルなどが挙げられる。７から１１個の炭素原子を有する芳香脂肪族炭化水素基としては、例えば、ベンジル、フェネチル、１−メチル−１−フェニルエチルなどのＣ1-5 アルキルフェニル基が挙げられる。３から８個の炭素原子を有する脂環式炭化水素基としては、例えばシクロプロピル、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ3-8 シクロアルキル基を挙げることができる。
一般式−Ｐ−Ｑのチオール誘導体の残基において、Ｐとしては、β−フェニルチオ乳酸の残基、チオ乳酸の残基が好ましく、Ｑとしては、ピリジンプロパノールの残基、グリシルアミノピリジンの残基、ＤあるいはＬ体のアラニルアミノピリジンの残基などが好ましい。
【００１５】
本発明の一般式（Ｉ）の化合物は、塩であってもよく、かかる塩としては、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩などの無機酸の付加塩；コハク酸塩、クエン酸塩、リンゴ酸塩などの有機酸の付加塩；ヨウ化メチル、ヨウ化エチル、ヨウ化プロピルなどのハロゲン化Ｃ1-6 アルキルとの塩等が挙げられる。これらのなかでも、特にヨウ化メチル、ヨウ化エチルなどのヨウ化Ｃ1-5 アルキルとの塩が好ましい。
【００１６】
本発明の化合物（Ｉ）またはその塩は、通常使用される有機合成法、特にペプチド合成法（合成化学シリーズ  ペプチド合成、泉屋信夫  等著、丸善株式会社）等の周知の合成法により合成され、例えば以下に示した方法で合成される。
先ず、チオール誘導体（Ｃ）のチオール基とアミノ酸またはジペプチド（Ｂ）のカルボキシル基を結合させる。その際、アミノ酸またはジペプチド（Ｂ）のα−アミノ基をｔ−ブトキシカルボニル基などのラセミ化に抵抗性のある保護基で保護し、結合反応はアミノ酸またはジペプチド（Ｂ）のカルボキシル基を活性化する方法であるＤＣＣ法などが用いられる。
次いで、アミノ酸またはジペプチド（Ｂ）のα−アミノ基の保護基を所定の脱離条件で除去した後、更にアミノ酸（Ａ）と結合反応を行ない、本発明の化合物（Ｉ）またはその塩を合成する。あるいは、チオール誘導体（Ｃ）にアミノ酸を順次結合してペプチド鎖を延長させる方法によっても合成できる。ペプチド鎖の延長の際には保護アミノ酸を用いて段階的に延長する方法或いは予めジペプチドを合成しておき結合反応を行なう方法が使用される。この際、活性エステル法、ＤＣＣ法、混合酸無水物などのＣ端活性化法、アジド法などが用いられる。
かくして得られる本発明の化合物（Ｉ）を、塩酸、硫酸などの酸、あるいはヨウ化メチルなどのハロゲン化Ｃ1-6 アルキル等と通常の方法で処理することによって、所望の化合物（Ｉ）の塩を得ることができる。
【００１７】
本発明の化合物（Ｉ）またはその塩を用いたペプシン或いはペプシノーゲンの測定は、酸性の水溶液或いは緩衝液にペプシン、ペプシノーゲン或いはそれらを含む体液などの試料を加え、ペプシノーゲンの場合には活性化した後、基質試薬である本発明の化合物（Ｉ）またはその塩およびチオール基比色定量試薬を加え、一定時間内の吸光度変化を測定することによって行われる。
ペプシンあるいはペプシノーゲンの測定を式に示すと以下のようになる。
【化１３】
0003734109.tif 000008
【００１８】
ペプシノーゲンからペプシンへの活性化およびペプシンと基質との反応は、ともに、酸性水溶液中で行なわれる。その酸性水溶液は塩酸、硫酸、硝酸、燐酸等の無機酸或いはぎ酸、酢酸、しゅう酸、くえん酸、マレイン酸、マロン酸、りんご酸等の有機酸水溶液が用いられ、また、種々の酸性緩衝液も使用される。反応ｐＨは必要に応じてｐＨ１．５からｐＨ５．５、好ましくはｐＨ２からｐＨ４に調整される。
チオール基比色定量試薬としては４，４−ビス（ジメチルアミノ）ベンツヒドロール、５，５−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）、２，２−ジチオビス（５−ニトロピリジン）、２，２−ジチオジピリジン、４，４−ジチオジピリジン等が用いられる。チオール基の比色定量は使用する試薬によりｐＨ範囲が限定されるため必要に応じてｐＨが調整される。
測定は酸性水溶液或いは酸性緩衝液と基質試薬、チオール検出試薬を別々に使用してもよいし、それぞれを混合して使用してもよい。
上記から明らかなように、本発明のペプシン測定用試薬は、本発明の化合物（Ｉ）またはその塩から選ばれるペプシン測定用基質、およびチオール基定量用試薬から構成される。
【００１９】
【実施例】
以下、本発明を実施例により更に詳細に説明する。本発明の化合物（基質）の合成例を実施例１および２に示す。
実施例１６に基質、チオール検出試薬、生成物の吸収スペクトルの１例を示す。また、実施例１７に各合成基質のＫｍ値およびＶｍａｘ値を、更に実施例１８に測定例としてペプシンの希釈直線性を示す。
以下の実施例において使用する略号の意味は以下の通りである。
Ｚ＝ベンジルオキシカルボニル
Ｔｏｓ＝パラトルエンスルホニル
Ｄｎｓ＝ダンシル
Ｔｒｔ＝トリチル
Ｇｌｙ＝グリシン
Ａｌａ＝アラニン
Ｌｅｕ＝ロイシン
Ｉｌｅ＝イソロイシン
Ｎｌｅ＝ノルロイシン
Ｐｈｅ＝フェニルアラニン
Ｐｔｌ＝β−フェニルチオ乳酸
Ｔｌ＝チオ乳酸
３ＰＰ＝３−ピリジンプロピルオキシ
４ＰＰ＝４−ピリジンプロピルオキシ
３ＡＰ＝３−アミノピリジン
４ＡＰ＝４−アミノピリジン
Ｍｅ＝メチル
ＷＳＣ＝水溶性カルボジイミド
ＤＣＣ＝ジシクロヘキシルカルボジイミド
ＤＭＡＰ＝ジメチルアミノピリジン
ＨＯＢＴ＝ハイドロキシベンツトリアゾール
ＤＭＦ＝ジメチルホルムアミド
薄層クロマトグラフィーの展開溶媒
Ｓ＝クロロホルム：メタノール：酢酸：水＝８０：２０：２．５：５
Ｔ＝ｎ−ブタノール：酢酸：水＝４：１：２
Ｕ＝酢酸エチル：ヘキサン＝２：１
Ｖ＝酢酸エチル：ヘキサン＝３：１
【００２０】
実施例の薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）分析は、シリカゲルＦ254 （メルク社製）を使用した。アミノ酸は特にことわらなければＬ−体を示す。
【００２１】
実施例１
Ｚ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｐｔｌ−Ｇｌｙ−４ＡＰ+ −Ｍｅ・Ｉ- の合成
▲１▼  Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−４ＡＰ
Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ  ３．５０ｇ（２０ｍｍｏｌｅ）、４−アミノピリジン１．８８ｇ（２０ｍｍｏｌｅ）をピリジン２０ｍｌに溶解し、氷冷下、ＷＳＣ４．２２ｇ（２２ｍｍｏｌｅ）を加え、１時間氷冷下で攪拌反応する。次いで、反応温度を室温まで上昇させ、１夜攪拌反応する。反応終了後、溶媒を留去し、酢酸エチル５０ｍｌに溶解し、水２５ｍｌ×２、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液２５ｍｌ×２、飽和食塩水×２にて洗浄後、無水硫酸マグネシウムにて乾燥する。乾燥後、無水硫酸マグネシウムを濾別し、減圧下溶媒を留去し、残渣を酢酸エチル−ｎ−ヘキサンにより再結晶を行ない、Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−４ＡＰ  ２．６５ｇ（５２．７％）を得る。
Ｒｆ（Ｓ）＝０．５４
▲２▼  ２ＨＣｌ・Ｈ−Ｇｌｙ−４ＡＰ
Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−４ＡＰ  ２．５１ｇ（１０ｍｍｏｌｅ）を酢酸３ｍｌに溶解後、２Ｎ塩酸／酢酸３０ｍｌを加え、室温で１時間攪拌反応する。反応終了後、ジエチルエーテル４００ｍｌを加え、析出物を濾取し、２ＨＣｌ・Ｈ−Ｇｌｙ−４ＡＰ  ２．２０ｇ（９８．２％）を得る。
Ｒｆ（Ｔ）＝０．０９
▲３▼  Ｔｒｔ−Ｐｔｌ−Ｇｌｙ−４ＡＰ
Ｔｒｔ−Ｐｔｌ−ＯＨ  ２．２４ｇ（１０ｍｍｏｌｅ）、２ＨＣｌ・Ｈ−Ｇｌｙ−４ＡＰ（１０ｍｍｏｌｅ）を取り塩化メチレン２０ｍｌに溶解する。次いで、ＮＥＭ２．６ｍｌを加え、０℃に冷却する。０℃に冷却下、ＷＳＣ・ＨＣｌ  ２．１１ｇ（１１ｍｍｏｌｅ）を加え、０℃で１時間、室温で１夜攪拌反応する。反応終了後、反応液を水２０ｍｌ×２、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液２０ｍｌ×２、飽和食塩水２０ｍｌ×２洗浄し、無水硫酸マグネシウム上で乾燥する。乾燥終了後、無水硫酸マグネシウムを濾別し、溶媒留去し、酢酸エチル−ジエチルエーテルで再結晶し、Ｔｒｔ−Ｐｔｌ−Ｇｌｙ−４ＡＰ  １．３０ｇ（２３．３％）を得る。
Ｒｆ（Ｓ）＝０．７６
【００２２】
▲４▼  Ｈ−Ｐｔｌ−Ｇｌｙ−４ＡＰ
Ｔｒｔ−Ｐｔｌ−Ｇｌｙ−４ＡＰ  １．３０ｇ（２．３ｍｍｏｌｅ）、アニソール０．７４ｍｌを取り、２５％臭化水素酸／酢酸４．６ｍｌを加え、室温で２時間攪拌反応する。反応終了後、ジエチルエーテル８０ｍｌを加え、析出物を濾取する。析出物を水３０ｍｌに溶解し、酢酸エチル２０ｍｌ×２抽出洗浄後、水相をｐＨ８．０に調整する。ｐＨ調整後、酢酸エチル２０ｍｌ×３、抽出し、抽出液を合せ、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液２０ｍｌ×２、飽和食塩水２０ｍｌ×２洗浄し、無水硫酸マグネシウム上で乾燥する。乾燥終了後、無水硫酸マグネシウムを濾別し、溶媒留去し、シリカゲルクロマト（クロロホルム：メタノール＝３０：１）にて精製し、Ｈ−Ｐｔｌ−Ｇｌｙ−４ＡＰ  ０．２４ｇ（３３．１％）を得る。
Ｒｆ（Ｓ）＝０．５８
▲５▼  Ｂｏｃ−Ｐｈｅ−Ｐｔｌ−Ｇｌｙ−４ＡＰ
Ｂｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ  ０．２０ｇ（０．７６ｍｍｏｌｅ）、Ｈ−Ｐｔｌ−Ｇｌｙ−４ＡＰ  ０．２４ｇ（０．７６ｍｍｏｌｅ）、ＤＭＡＰ  ９．６ｍｇ（７．６μｍｏｌｅ）を塩化メチレン５ｍｌに溶解し、０℃に冷却する。次いでＷＳＣ０．１６ｇ（０．８３６ｍｍｏｌｅ）を加え、０℃で１時間、室温で１夜攪拌反応する。反応終了後、クロロホルム１５ｍｌを加え、水１０ｍｌ×３、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液１５ｍｌ×２、飽和食塩水１５ｍｌ×２洗浄後、無水硫酸マグネシウム上乾燥する。乾燥終了後、溶媒を留去し、シリカゲルクロマト（クロロホルム：メタノール＝５０：１）で精製し、Ｂｏｃ−Ｐｈｅ−Ｐｔｌ−Ｇｌｙ−４ＡＰ  ０．２５ｇ（５８．５％）を得る。
Ｒｆ（Ｓ）＝０．７２
▲６▼  ２ＨＣｌ・Ｈ−Ｐｈｅ−Ｐｔｌ−Ｇｌｙ−４ＡＰ
Ｂｏｃ−Ｐｈｅ−Ｐｔｌ−Ｇｌｙ−４ＡＰ  ０．２５ｇ（０．４４ｍｍｏｌｅ  ）２Ｎ塩酸／酢酸５ｍｌを混合し、室温で１時間反応する。反応終了後、２００ｍｌのジエチルエーテルを加え、析出物を濾取し、２ＨＣｌ・Ｈ−Ｐｈｅ−Ｐｔｌ−Ｇｌｙ−４ＡＰ０．２０ｇ（９１．１％）を得る。
Ｒｆ（Ｔ）＝０．６０
【００２３】
▲７▼  Ｚ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｐｔｌ−Ｇｌｙ−４ＡＰ
Ｚ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−ＯＨ  ０．１２ｇ（０．４ｍｍｏｌｅ）、２ＨＣｌ・Ｈ−Ｐｈｅ−Ｐｔｌ−Ｇｌｙ−４ＡＰ  ０．２０ｇ（０．４ｍｍｏｌｅ）をＤＭＦ  ５ｍｌに溶解し、ＮＥＭ  ０．１１ｍｌを加え、０℃に冷却する。次いで、ＷＳＣ  ０．０９ｇ（０．４７ｍｍｏｌｅ）を加え、０℃で１時間、室温で１夜攪拌反応する。反応終了後、溶媒を留去し、酢酸エチル２０ｍｌ、水１０ｍｌに溶解し、水１０ｍｌ×２、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液１０ｍｌ×２、飽和食塩水１０ｍｌ×２洗浄後、無水硫酸ナトリウム上乾燥する。乾燥終了後、無水硫酸ナトリウムを濾別し、溶媒を留去後、シリカゲルクロマト（酢酸エチル）精製し、Ｚ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｐｔｌ−Ｇｌｙ−４ＡＰ０．２１ｇ（  ６９．７％）を得る。
Ｒｆ（Ｓ）＝０．６６
▲８▼  Ｚ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｐｔｌ−Ｇｌｙ−４ＡＰ+ −Ｍｅ・Ｉ- 
Ｚ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｐｔｌ−Ｇｌｙ−４ＡＰ  ０．２１ｇ（０．２３ｍｍｏｌｅ）を５ｍｌのアセトンに溶解し、ヨウ化メチル０．５ｍｌを加え、室温で１夜攪拌反応する。反応終了後、ジエチルエーテル１５０ｍｌを加え、析出物を濾取し、Ｚ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｐｔｌ−Ｇｌｙ−４ＡＰ  + −Ｍｅ・Ｉ-   １２９ｍｇ（６１．５％）を得る。
Ｒｆ（Ｓ）＝０．１９
比旋光度＝−１７．３°（Ｃ＝１、メタノール）
元素分析（Ｃ41Ｈ47Ｎ6 Ｏ7 ＳＩ）
理論値  Ｃ：５５．０３  Ｈ：５．２９  Ｎ：９．３９
実測値  Ｃ：５５．２０  Ｈ：５．１８  Ｎ：９．２８
【００２４】
実施例２
Ｚ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｐｔｌ−４ＰＰ+ −Ｍｅ・Ｉ- の合成
▲１▼  Ｔｒｔ−Ｐｔｌ−４ＰＰ
Ｔｒｔ−Ｐｔｌ−ＯＨ  ３６．８ｇ（８６．７ｍｍｏｌｅ）、Ｈ−４ＰＰ１１．９ｇ（８６．７ｍｍｏｌｅ）を塩化メチレン１７３ｍｌに溶解し、０℃に冷却する。次いで、ＷＳＣ  １６．６０ｇ（９５．４ｍｍｏｌｅ）を加え、０℃で１時間、室温で１夜攪拌反応する。反応終了後、水１００ｍｌ×３、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液１００ｍｌ×２、飽和食塩水１００ｍｌ×３洗浄し、無水硫酸マグネシウム上乾燥する。乾燥後、無水硫酸マグネシウムを濾別し、溶媒を留去し、シリカゲルクロマト（クロロホルム）精製し、Ｔｒｔ−Ｐｔｌ−４ＰＰ３５．９ｇ（７６．１％）を得る。
Ｒｆ（Ｕ）＝０．５０
▲２▼  Ｈ−Ｐｔｌ−４ＰＰ
Ｔｒｔ−Ｐｔｌ−４ＰＰ３５．９ｇ（６６．０ｍｍｏｌｅ）、アニソール２１．２ｍｌ、２５％臭化水素酸／酢酸１３２ｍｌを混合し、室温で１時間攪拌反応する。反応終了後、水４７０ｍｌを加え、ジエチルエーテル４７０ｍｌ×３抽出洗浄した後、水相を炭酸水素ナトリウムを用いてｐＨ８に調整し、酢酸エチル４７０ｍｌ×１、２３５ｍｌ×２抽出する。抽出液を合せ、飽和炭酸水素ナトリウム４７０ｍｌ×２、飽和食塩水４７０ｍｌ×２洗浄し、無水硫酸マグネシウム上乾燥する。乾燥終了後、無水硫酸マグネシウムを濾別し、減圧化で溶媒留去し、残渣をシリカゲルクロマト（酢酸エチル：ｎ−ヘキサン＝２：１）精製し、Ｈ−Ｐｔｌ−４ＰＰ６．４４ｇ（３２．６％）を得る。
Ｒｆ（Ｕ）＝０．３６
▲３▼  Ｂｏｃ−Ｐｈｅ−Ｐｔｌ−４ＰＰ
Ｂｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ５．７０ｇ（２１．５ｍｍｏｌｅ）、Ｈ−Ｐｔｌ−４ＰＰ６．４８ｇ（２１．５ｍｍｏｌｅ）、ＤＭＡＰ  ０．２６ｇ（２．１ｍｍｏｌｅ）を塩化メチレン５０ｍｌに溶解し、０℃に冷却する。次いで、ＷＳＣ４．５３ｇ（２３．７ｍｍｏｌｅ）を加え、０℃で１時間、室温で１夜攪拌反応する。反応終了後、水３０ｍｌ×３、飽和炭酸水素ナトリウム３０ｍｌ×２、飽和食塩水３０ｍｌ×２洗浄し、無水硫酸マグネシウム上乾燥する。乾燥終了後、減圧下で溶媒留去し、残渣をシリカゲルクロマト（酢酸エチル：ｎ−ヘキサン＝１：１）精製し、Ｂｏｃ−Ｐｈｅ−Ｐｔｌ−４ＰＰ８．２２ｇ（６９．７％）を得る。
Ｒｆ（Ｖ）＝０．５３
【００２５】
▲４▼  ２ＨＣｌ・Ｈ−Ｐｈｅ−Ｐｔｌ−４ＰＰ
Ｂｏｃ−Ｐｈｅ−Ｐｔｌ−４ＰＰ  ８．２２ｇ（１５．０ｍｍｏｌｅ）、２Ｎ塩酸／酢酸４５ｍｌを混合し、室温で１時間攪拌反応する。反応終了後、ジエチルエーテル１５００ｍｌに反応液を加え、析出物を濾取し、２ＨＣｌ・Ｈ−Ｐｈｅ−Ｐｔｌ−４ＰＰ６．２３ｇ（７９．６％）を得る。
Ｒｆ（Ｔ）＝０．４１
▲５▼  Ｚ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｐｔｌ−４ＰＰ
Ｚ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−ＯＨ  １．５４ｇ（５．０ｍｍｏｌｅ）、２ＨＣｌ・Ｈ−Ｐｈｅ−Ｐｔｌ−４ＰＰ２．６１ｇ（５．０ｍｍｏｌｅ）、ＨＯＢｔ  ０．７７ｇ（５．０ｍｍｏｌｅ）をＤＭＦ  ５ｍｌに溶解し、ＮＥＭ１．３０ｍｌを加え、０℃に冷却する。次いで、ＷＳＣ  １．０５ｇ（５．５ｍｍｏｌｅ）を加え、０℃で１時間、室温で１夜攪拌反応する。反応終了後、減圧下で溶媒を留去し、酢酸エチル２０ｍｌ、水１０ｍｌに溶解し、水１５ｍｌ×２、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液１５ｍｌ×２、飽和食塩水１５ｍｌ×２洗浄し、無水硫酸マグネシウム上乾燥する。乾燥終了後、減圧下で溶媒を留去し、残渣をシリカゲルクロマト（クロロホルム：メタノール＝１００：１）精製し、Ｚ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｐｔｌ−４ＰＰ２．０４ｇ（５５．２％）を得る。
Ｒｆ（Ｓ）＝０．６１
▲６▼  Ｚ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｐｔｌ−４ＰＰ+ −Ｍｅ・Ｉ- 
Ｚ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｐｔｌ−４ＰＰ  １．８３ｇ（２．５ｍｍｏｌｅ）をアセトン５０ｍｌに溶解し、ヨウ化メチル２５ｍｌを加え、室温で１夜攪拌反応する。反応終了後、ジエチルエーテル１５００ｍｌを加え、析出物を濾取し、Ｚ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｐｔｌ−４ＰＰ+ −Ｍｅ・Ｉ-   ２．０４ｇ（９３％）を得る。
Ｒｆ＝０．２３
比旋光度＝−１８．５°（Ｃ＝１、メタノール）
元素分析（Ｃ42Ｈ49Ｎ4 Ｏ7 ＳＩ）
理論値  Ｃ：５７．２７  Ｈ：５．６１  Ｎ：６．３６
実測値  Ｃ：５６．９８  Ｈ：５．６０  Ｎ：６．５２
【００２６】
実施例３〜１５
実施例１及び２と同様にして各種の基質を合成した。合成した基質及びその物性値を表１にまとめて示した。
尚、表１には、実施例１及び２の基質も一緒に示した。
【００２７】
【表１】
0003734109.tif 000009
【００２８】
実施例１６
紫外吸収スペクトルの測定
▲１▼  １００ｍＭくえん酸ナトリウム緩衝液  ｐＨ３．０
▲２▼  Ｚ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｐｔｌ−４ＰＰ+ −Ｍｅ・Ｉ- 
▲３▼  ４，４−ジチオジピリジン
▲４▼  ４−ピリジンチオール
試薬▲２▼▲３▼及び▲４▼をそれぞれ０．１ｍＭの濃度に試薬▲１▼で溶解し、Ｕ−３２００分光光度計（日立）を使用してそれぞれの紫外吸収スペクトルを測定した。
結果を図１に示す。
それぞれのスペクトルから基質（試薬▲２▼）およびチオール検出試薬（試薬▲３▼）は、汎用の自動分析機に設定されている３４０ｎｍにおいて吸収をほとんどもたず、基質（試薬▲２▼）の分解生成物とチオール検出試薬（試薬▲３▼）との反応生成物（試薬▲４▼）のみが十分な吸収を有することがわかる。
このことから本発明の基質はペプシンにより加水分解を受けた際、生体試料中の夾雑物質の影響を受けにくくかつ汎用の自動分析機に適用可能な３４０ｎｍの波長により基質の分解量を測定することが可能であることがわかる。
【００２９】
実施例１７
各合成基質のＫｍおよびＫｃａｔ値
▲１▼  １００ｍＭくえん酸ナトリウム緩衝液  ｐＨ３．０
▲２▼  基質
▲３▼  ４，４−ジチオジピリジン
▲４▼  ブタペプシン（シグマ社）１０μｇ／ｍｌ溶液
表１に示した各基質を０．１ｍＭ単位で１．０ｍＭまで、試薬▲３▼を０．５ｍＭの濃度で試薬▲１▼に溶解し基質試薬を調製する。基質試薬４００μｌに２０μｌの試薬▲４▼を加え３７℃で反応を行ない３４０ｎｍにおける吸光度変化から反応速度を求め、ラインウェーバー・バークプロットを用いてＫｍ値およびＫｃａｔ値を求めた。結果を表２に示す。この結果から本発明における基質は従来基質と異なるチオールエステルであるにもかかわらずペプシンにより加水分解がなされることがわかる。また、夾雑物質の影響のすくない初速度法による測定が可能であることがわかる。
【００３０】
【表２】
0003734109.tif 000010
【００３１】
実施例１８
ペプシン希釈系列の自動分析機による測定
▲１▼  １００ｍＭくえん酸ナトリウム緩衝液  ｐＨ３．０
▲２▼  ２．０ｍＭ  Ｚ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｐｔｌ−４ＰＰ+ −Ｍｅ・Ｉ- 
２．０ｍＭ  ４，４−ジチオジピリジン  ５０％ＤＭＳＯ水溶液
▲３▼  ブタペプシン（シグマ社）０から１５μｇ／ｍｌ溶液
第一試薬として試薬▲１▼３００μｌ、試料として試薬▲３▼２０μｌを反応セル中に分注し、５分間３７℃で加温後、第二試薬として試薬▲２▼１００μｌを添加した。第二試薬添加後８０秒から１９５秒までの吸光度変化を波長３４０ｎｍで測定した。測定は日立７０７０自動分析機により行った。反応動態を図２に、希釈直線性を図３に示す。
図２より測定区間内で直線的に反応しており初速度法の適用が可能であることがわかる。また、図３よりペプシン０から１５μｇ／ｍｌの濃度と単位時間当りの吸光度変化量とは直線性が得られていることがわかる。
このことから本発明の化合物を基質として使用した場合、汎用の自動分析機によるペプシン活性の初速度法による測定が可能であり、２点検量線を用いて低濃度から高濃度までのペプシン活性を測定できることがわかる。
【００３２】
【発明の効果】
本発明の一般式（Ｉ）の化合物またはその塩を基質として用いてペプシンと反応させることによって、加水分解されてチオール誘導体が生成され、このチオール誘導体をチオール検出試薬によって定量することによって、ペプシンを定量することができる。ペプシノーゲンを活性化してペプシンに変換して定量することにより、同様にしてペプシノーゲンを定量することができる。
本発明の定量法により従来の問題点が解決される。本発明の定量法の利点は次のとおりである。
▲１▼特殊な装置を必要とせず一般の分光光度計での測定が可能である。
▲２▼終末点法のみならず検体中の共存物質の影響を受け難い初速度法による測定が可能である。
▲３▼ニンヒドリンによる発色にみられる夾雑蛋白の影響をほとんど受けないため生体試料の正確な測定が可能である。
▲４▼短時間での測定が可能であり、また汎用の自動分析機に適応可能であることから更に短時間で多数の試料を測定できる。
以上のごとく、本発明の一般式（Ｉ）の化合物またはその塩を合成基質として使用したペプシンおよびペプシノーゲン測定法は従来法の有する問題点を解決し、正確かつ簡便なそして迅速な測定法を提供するものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の合成基質▲２▼、チオール検出試薬▲３▼、及び本発明の合成基質からの加水分解生成物とチオール検出試薬との反応生成物▲４▼のそれぞれの紫外吸収スペクトルを示す。
【図２】本発明の合成基質と各種濃度のペプシンとの反応動態を示す。
【図３】本発明の合成基質を用いて各種濃度のペプシンを測定した時の希釈直線性を示す。
【図１】
0003734109.tif 000017
【図２】
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【図３】
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