(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２のアミノ酸配列からなり、l-アファディンおよびビンクリンと特異的に結合するマウス蛋白質ポンシン−１。
【請求項２】
配列番号４のアミノ酸配列からなり、l-アファディンおよびビンクリンと特異的に結合するマウス蛋白質ポンシン−２。
【請求項３】
請求項１のマウス蛋白質ポンシン−１をコードするマウス遺伝子のｃＤＮＡであって、配列番号１の塩基配列からなるｃＤＮＡ。
【請求項４】
請求項２のマウス蛋白質ポンシン−２をコードするマウス遺伝子のｃＤＮＡであって、配列番号３の塩基配列からなるｃＤＮＡ。
【請求項５】
請求項３のｃＤＮＡを保有する組換えベクター。
【請求項６】
請求項４のｃＤＮＡを保有する組換えベクター。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この出願の発明は、発明は、アクチン結合蛋白質ｌ−アファディン（l-afadin）およびビンクリン（vinculin）に特異的に結合する蛋白質ポンシン（ponsin）に関するものである。さらに詳しくは、この発明は、動物の個体形成に重要な役割を果たす細胞間結合および細胞−マトリックス結合に関与する新規蛋白質ポリシン−１およびポンシン−２と、これらの蛋白質を取得、利用するための遺伝子工学材料等に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
動物個体における様々な細胞現象、例えば、細胞接着、細胞運動および細胞の形状決定等においては、細胞接着分子、受容体およびチャンネル等の膜貫通蛋白質によって形成される接着装置が重要な役割を果たしている。なかでも細胞の接着結合(adherens junction:ＡＪ)は、組織の整合性を維持するのに欠くことのできない役割を担っている（参考文献12,40,41,42。以下、リスト番号のみを記載する）。このような機構的役割に加えて、ＡＪは細胞増殖や組織の形態形成のコントロールに関わっているという証拠が増えてきている（12,40,41,42）。しかしながらＡＪの分子的な理解は不十分である。ＡＪはアクチン（actin）細胞骨格が連結している細胞膜の特殊な領域であり、２つのサブタイプ（細胞-細胞間ＡＪと細胞-マトリックス間ＡＪ）に分けられる。細胞接着分子をアクチンフィラメント(Ｆ-アクチン)に連結しているタンパク質は数多く同定され、両タイプのＡＪでそれらの特性が調べられている。例えば、極性のある上皮細胞においては、細胞間結合は、閉鎖帯（zonula occludens：ＺＯ、密着帯）、接着帯（zonula adherens：ＺＡ）およびデスモソーム（desmosome）で構成される接着複合体によって成り立っている。ＺＯとＺＡはアクチン細胞骨格に連結し、デスモソームは中間体フィラメント細胞骨格に連結している。非上皮細胞における細胞間ＡＪと同じように、上皮細胞のＺＡではカドヘリン（cadherin）が細胞外表面で相互に作用して、重要な接着分子としての役目を果たしている（11,40,41,45）。
【０００３】
β−カテニン（catenin）とγ−カテニンはカドヘリンの細胞内部位と結合し、α−カテニンはβ−カテニンと結合する（1,28,31,41,45）。これらのタンパク質の中でα−カテニンがＦ-アクチンと結合し（33）、α−カテニンはさらにその他のＦ-アクチン結合タンパク質であるα−アクチニン(actinin）とビンクリンに結合する（21,46）。上皮細胞では、カドヘリンはＺＡに濃縮しているが、膜の側面全体に沿っても分布している（29）。従って、ここでは、カドヘリンが存在する細胞間結合部位を「細胞-細胞間ＡＪ」とし、電子顕微鏡で認められる特殊な細胞膜領域である「ＺＡ」と「細胞-細胞間ＡＪ」とは区別する。
【０００４】
ＺＯにおいては、４つの膜貫通部位を持つ内在性膜タンパク質であるクロウディン（claudin）ファミリーとオクルディン（occludin）が密着帯を構成しており（2,7,9）、ＺＯ−１はオクルディンの細胞内部位（8）とＦ-アクチン（18）の両方と結合する。ＺＯ−１はおそらくクロウディン・ファミリーメンバーとは直接的にも間接的にも結合する（9）。非上皮細胞では、ＺＯ−１は心筋細胞における介在板のようにカドヘリンが基本となっている細胞-細胞間ＡＪに局在しており（16,17）、α−カテニンとＦ-アクチンの両方に結合する（18）。細胞−マトリックス結合は、細胞−マトリックス間ＡＪとヘミデスモソームによって成り立っている。細胞−マトリックス間ＡＪはアクチン細胞骨格に連結していて、ヘミデスモソームは中間体フィラメント細胞骨格に連結している（12,19,23）。インテグリン（integrin）が細胞外表面で細胞間基質タンパク質に結合している細胞-マトリックス間ＡＪでは、インテグリンβサブユニットの細胞内部位が、ともにＦ-アクチンに直接結合するタリン（talin：14）とα−アクチニン（30）に直接結合する。さらにタリンはビンクリンに直接結合する（4）。
【０００５】
このように、多くのＦ-アクチン結合タンパク質がアクチン細胞骨格を接着分子に連結するリンカーの役目を果たしていることが明らかにされてきている。しかしながら、どのような分子がアクチン細胞骨格を細胞膜に結合させているかは明らかではなかった。
この点を明らかにするため、この出願の発明者等は、ラットの脳から幾つかの新規なＦ−アクチン結合蛋白質を単離し、特に神経細胞に特異的で、シナプスに多く存在する蛋白質の構造を解析し、「ニューラビン」（neurabin）と命名して既に特許出願している（特願平9-92615号）。さらにこの出願の発明者等は、新規のＦ−アクチン結合タンパク質ｌ-アファディン（afadin）を単離し（24）、特許出願している（特願平9-257043号）。
【０００６】
このｌ−アファディンには、ｓ−アファディンという名の小さなスプライシング変異型がある。ｌ−アファディンは普偏的な臓器に発現しているが、ｓ−アファディンは神経組織に豊富に存在する。また、ｌ−アファディンは中間領域にＰＤＺドメインが１つあり、これに３つのプロリンリッチドメインが続き、Ｃ末端にＦ−アクチン結合ドメインが１つある。ｓ−アファディンにはＰＤＺドメインが１つあるが、３番目のプロリンリッチドメインとＦ−アクチン結合ドメインを欠いている。ｓ−アファディンはヒトＡＦ−６遺伝子のラットカウンターパートであり、このＡＦ−６遺伝子はある種の急性白血病（6）においてＡＬＬ−１遺伝子（32）と融合遺伝子を形成する相手として見いだされたものである。免疫蛍光法や免疫電子顕微鏡での分析によれば、ｌ−アファディンは小腸の吸収上皮細胞のＺＡ、あるいは心筋細胞の介在板（24）のような非上皮細胞でカドヘリンが基本になっている細胞-細胞間ＡＪに局在している。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
以上のとおり、アクチン細胞骨格と膜貫通蛋白質との結合蛋白質として、ニューラビンおよびｌ−アファディンが既に発見され、細胞接着に関与する分子機構が明らかにされつつある。
しかしながら、この発明者等の観察によれば、ｌ-アファディンはα−カテニンやβ−カテニンあるいはＥ−カドヘリンの細胞内部位とは直接結合しない（50）ことから、上皮細胞におけるＺＡにはｌ-アファディンの特異的な局在を決定するメカニズムが存在することが示唆される。
【０００８】
このようなｌ-アファディン局在の分子メカニズムを明らかにすることは、細胞接着の分子機構の全容を解明するための重要な情報を提供するばかりか、例えば癌腫の浸潤、転移のメカニズムの解明につながる可能性もあり、癌腫の悪性度の診断やその治療法、治療薬等の開発への応用も期待される。
この発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであって、細胞−細胞間接着結合および細胞−マトリックス間接着結合に関与する新規な蛋白質を提供することを目的としている。
【０００９】
また、この発明は、この蛋白質を遺伝子工学的に生産するための材料を提供することも目的としている。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
この発明は、上記の課題を解決する発明として、配列番号２のアミノ酸配列を有するマウス蛋白質ポンシン−１と、配列番号４のアミノ酸配列を有するマウス蛋白質ポンシン−２を提供する。
この出願はまた、配列番号２および４の各々のアミノ酸配列における１もしくは複数のアミノ酸残基が欠失、付加もしくは他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を有するマウス蛋白質ポンシン−１およびポンシン−２を提供する。
【００１１】
この出願はさらに、前記のマウス蛋白質ポンシン−１およびポンシン−２をコードするマウス遺伝子と、この遺伝子のｃＤＮＡであって、配列番号１および３の塩基配列をそれぞれ有するｃＤＮＡ、これらのｃＤＮＡの一部配列からなるＤＮＡ断片を提供する。
またこの出願は、前記のｃＤＮＡまたはＤＮＡ断片を保有する組換えベクターと、前記のマウス蛋白質ポンシン−１およびポンシン−２に対する抗体を提供する。
【００１２】
この発明の蛋白質ポンシン−１およびポンシン−２（以下、これらを「ポンシン」と記載することがある）は、ブロット・オーバーレイ（blot overlay）法を用いてｌ−アファディン結合蛋白質として同定された新規分子であり、命名はラテン語で「橋」を意味するポンス（pons）に由来している。なお、コンピューターによるホモロジー検索の結果、この蛋白質ポンシン−１およびポンシン−２がともに新規蛋白質であることが確認されている。
【００１３】
以下、この発明の蛋白質ポンシンについて実施の形態を詳しく説明する。
【００１４】
【発明の実施の形態】
この発明のマウス蛋白質ポンシン−１は、配列番号１に塩基配列を示した2314bpのｃＤＮＡにコードされた蛋白質であり、配列番号２に示した714のアミノ酸配列を有している。そして、このアミノ酸配列には、３つのＳＨ３ドメイン（アミノ酸番号473−532；547−608：653−714）が含まれている。
【００１５】
また、この発明のマウスポンシン−２は、配列番号３に塩基配列を示した2344bpのｃＤＮＡにコードされた蛋白質であり、配列番号４に示した724のアミノ酸配列を有している。そして、このアミノ酸配列には、３つのＳＨ３ドメイン（アミノ酸番号483−542；557−618：663−724）が含まれている。
これらの蛋白質ポンシンは公知の方法、すなわち後記する精製方法と同様にしてラット組織から単離する方法、その精製方法に準じてマウス組織から単離する方法、この発明によって提供されるアミノ酸配列に基づき化学合成によってペプチドを調製する方法、あるいはこの発明によって提供されるｃＤＮＡ断片を用いて組換えＤＮＡ技術で生産する方法などにより取得することができる。例えば、組換えＤＮＡ技術によってポンシンを取得する場合には、この発明のｃＤＮＡ断片を有するベクターからインビトロ転写によってＲＮＡを調製し、これを鋳型としてインビトロ翻訳を行なうことによりインビトロで発現できる。また翻訳領域を公知の方法により適当な発現ベクターに組換えれば、大腸菌、枯草菌、酵母、動物細胞等で、ｃＤＮＡがコードするポンシンを大量に発現させることができる。
【００１６】
この発明の蛋白質ポンシンを大腸菌などの微生物で発現させる場合には、微生物中で複製可能なオリジン、プロモーター、リボソーム結合部位、ｃＤＮＡクローニング部位、ターミネーター等を有する発現ベクターに、この発明のｃＤＮＡの翻訳領域を挿入結合して組換えた発現ベクターを作成し、この発現ベクターで宿主細胞を形質転換したのち、得られた形質転換体を培養すれば、ｃＤＮＡがコードしているポンシンを微生物内で大量生産することができる。あるいは、他の蛋白質との融合蛋白質として発現させることもできる。得られた融合蛋白質を適当なプロテアーゼで切断することによって、ｃＤＮＡがコードする蛋白質部分のみを取得することもできる。
【００１７】
この発明の蛋白質ポンシンを動物細胞で発現させる場合には、この発明のｃＤＮＡの翻訳領域を、動物細胞用プロモーター、スプライシング領域、ポリ(A)付加部位等を有する動物細胞用発現ベクターに組換え、動物細胞内に導入すれば、この発明の蛋白質ポンシンを動物細胞内で発現できる。
以上のとおり方法によって得られるマウス蛋白質ポンシンは、例えば、この蛋白質を特異的に認識する抗体を作成するための抗原として使用することができる。
【００１８】
この発明の蛋白質ポンシンには、配列番号２または４で表されるアミノ酸配列のいかなる部分アミノ酸配列を含むペプチド断片（５アミノ酸残基以上）も含まれる。これらのペプチド断片もまた抗体を作製するための抗原として用いることができる。
この発明の遺伝子は、上記の蛋白質ポンシン−１およびポンシン−２をコードするマウスの遺伝子であって、例えば、この発明のｃＤＮＡまたはその一部配列をプローブとして、既存のゲノムライブラリー等から単離することができる。
【００１９】
この発明のｃＤＮＡは、配列番号１または３で表される塩基配列を有することを特徴とするものであり、この発明の前記蛋白質ポンシン−１またはポンシン−２をコードしている。この発明の蛋白質ポンシンはマウスのほとんど全ての組織で発現しているので、配列番号１または３の塩基配列に基づいて合成したオリゴヌクレオチドプローブを用いて、マウスｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、この発明のｃＤＮＡと同一のクローンを容易に得ることができる。あるいは、これらのオリゴヌクレオチドをプライマーとして、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を用いて、目的ｃＤＮＡを合成することもできる。
【００２０】
一般に哺乳動物の遺伝子は個体差による多型が頻繁に認められる。従って配列番号２において、１または複数個のヌクレオチドの付加、欠失および／または他のヌクレオチドによる置換がなされているｃＤＮＡもこの発明に含まれる。
同様に、これらの変更によって生じる１または複数個のアミノ酸残基の付加、欠失および／または他のアミノ酸残基による置換がなされているタンパク質も、配列番号２または４で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質の活性を有する限り、この発明に含まれる。
【００２１】
この発明のＤＮＡ断片には、配列番号１または３で表される塩基配列のいかなる部分塩基配列を含むｃＤＮＡ断片（１０ｂｐ以上）、あるいはそれらのアンチセンス鎖からなるＤＮＡ断片も含まれる。
この発明の蛋白質ポンシンに対する抗体は、蛋白質それ自体、またはその部分ペプチドを抗原として、公知の方法により、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体として得ることができる。
【００２２】
以下、この発明のポンシンの取得過程および得られた蛋白質の機能特定の詳細について説明する。
１．材料と方法
１．１  35Ｓ標識ｌ−アファディンのブロット・オーバーレイ
ｌ-アファディン結合蛋白質を同定するために、35Ｓ標識ｌ−アファディンを用いたブロット・オーバーレイ法を採用し、公知の方法（5,37）に若干の改良を加えた。すなわち、ｌ−アファディンへの35Ｓ標識はＴＮＴ転写/翻訳システム（Promega）を用い、製品プロトコールに従って行った。また、Bio-Spin 6クロマトカラム（Bio-Rad）を用いてフリーの35Ｓメチオニンを取り除き、カラムからの溶出物をプローブとした。サンプルはＳＤＳ−ＰＡＧＥで分画し、ニトロセルロース膜に転写し、５％の無脂肪粉ミルクと１％のトリトンX-100を含んだＰＢＳで膜をブロックし、さらに５％の無脂肪粉ミルクと１％のトリトンX-100を含んだＰＢＳ １mlに35Ｓ標識ｌ−アファディン・プローブを40μl加えた反応液の中に膜を浸して４℃で16時間反応させた。反応後、５％の無脂肪粉ミルクと１％のトリトンX-100を含んだＰＢＳで膜を洗い、イメージアナライザー(Fujix BAS-2000II)でオートラジオグラフィーを行った。
１．２  ポンシンの精製
以前に報告された方法（44）に基づいて、80匹のラットの肝臓を用いてＡＪ濃縮分画を作成し、−80℃で保存した。このＡＪ濃縮分画の半分を抽出液［20mMトリス塩酸 pH 9.0、８M尿素、1mMDTTおよび1％脱水素トリトンX-100（CALBIOCHEM）］に溶解した。超音波処理ののち、室温で溶液を１時間ゆっくり攪拌し、20℃にて30分100,000gで遠心分離した。上清を緩衝液（20mMトリス塩酸 pH 9.0、1m MDTT）で希釈し、最終濃度が６M尿素、0.75％脱水素トリトンX-100になるよう調整した。サンプル（135mlで91mgの蛋白質を含む）をモノQ HR 10/10カラム（Amersham-Pharmacia）にかけ、緩衝液Ａ(20mMトリス塩酸 pH 9.0、６M尿素、0.75％CHAPSおよび1mM DTT)で平衡化した。70mlの緩衝液Ａでカラムを洗ったのち、160mlの緩衝液Ａに塩化ナトリウムを加え、直線濃度勾配（0-0.3M）によりサンプルを溶出し、各1.5mlずつの画分を収集した。各画分を35Ｓ標識ｌ−アファディン・ブロット・オーバーレイに供し、14から25までの画分に放射性バンドが検出された。これらの活性のある画分（18mlで3.1mgの蛋白質を含む）を収集した。ＡＪ濃縮分画の残りの半分は上述したのと同じ方法でモノＱカラム・クロマトグラフィーにかけ、２つのモノＱカラム・クロマトグラフィーの活性のある画分を混ぜ合わせた。混ぜ合わせたサンプルをヒドロキシアパタイト・カラム(0.75×7.5 cm;トーソー)にかけ、緩衝液Ｂ（8mMリン酸カリウム pH 7.8、６M尿素、0.75％CHAPSおよび1mM DTT）で平衡化した。カラムを15mlの同緩衝液で洗浄したのち、25mlのpH7.8の緩衝液Ｂでリン酸カリウムの直線濃度勾配(8-100mM)にてサンプルを溶出した。分画はそれぞれ0.5mlずつ集めた。各画分を35Ｓ標識ｌ−アファディン・ブロット・オーバーレイにかけ、25から33の画分に放射性バンドを認めた。活性のある画分を集め（4.5mlで1mgの蛋白質を含む）、モノＳ PC1.6/5カラムにかけ、2mlの緩衝液Ｃ（50mM酢酸ナトリウム pH 4.0、６M尿素、0.75％CHAPSおよび1mM DTT）で平衡化した。0.15Mの塩化ナトリウムを含む0.7mlの緩衝液Ｃでカラムを洗浄したのち、緩衝液Ｃで塩化ナトリウム濃度勾配(0.15−0.4M)にてサンプルを溶出した。分画はそれぞれ0.1ml集めた。各画分を35Ｓ標識ｌ−アファディン・ブロット・オーバーレイにかけると放射性バンドは９から13の画分に認められた（図１参照）。活性のある画分を−80℃にて保存した。
１．３  ペプチドのアミノ酸配列決定とポンシンのｃＤＮＡクローニング
モノＳカラム・クロマトグラフィーにより、35Ｓ標識ｌ−アファディン・ブロット・オーバーレイにより３本の放射性バンドが同定された。分子量はそれぞれ約95KD(p95),93KD(p93)および70KD(p70)であった（図１参照）。モノＳで精製したサンプルのうち、ｐ９３とｐ９５に相当する分画10と、ｐ７０に相当する分画12および13をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（８％ポリアクリルアミドゲル）で分離した。Ｐ９３、ｐ９５およびｐ７０に相当する蛋白質バンドをゲルから別々に切り出し、リシル・エンドペプチダーゼで分解し、得られたペプチドをＴＳＫgel ＯＤＳ−80Ｔs(4.6×150mm、トーソー)逆相ＨＰＬＣで文献（15）に従って分離した。ペプチドのアミノ酸配列はペプチド・シークエンサーで決定した。GenBankデータベースのBLASTサーチによれば、これらの配列はマウスのＳＨ３Ｐ12遺伝子産物（GenBank/EMBL/DDBJ アクセス番号U58883）の配列とほぼ同一であることが判明した。ＳＨ３Ｐ12の配列を基に配列番号５および６のオリゴヌクレオチドプライマーを作成し、マウス脳のｃＤＮＡ（CLONTECH）を鋳型としてＰＣＲ反応を行った。ＤＮＡ配列の決定はジデオキシヌクレオチド・ターミネーション法によりＤＮＡシークエンサー（ABI 373）を用いて行った。
１．４  組換えポンシン−１の発現
ポンシン−１の全長ｃＤＮＡ（配列番号１）を標準の分子生物学的方法（34）でpＣＭＶ-Ｍycベクター（24）に挿入し、この組換えベクターをＤＥＡＥデキストラン法（13）によりＣＯＳ７細胞に導入した。Ｍycをタグにした組換え蛋白質は、以下に記載した方法で抗Ｍyc抗体により細胞抽出物から沈降させた。沈降物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで展開し、35Ｓ標識ｌ−アファディン・ブロット・オーバーレイにより分析した。
１．５  免疫沈降
ポンシン−１の全長ｃＤＮＡ（配列番号１）をpＦＬＡＧ-ＣＭＶ２ベクター（Eastman Kodak Scientific Imaging Systems）に挿入した。全長ｌ−アファディンのpＣＭＶ-Ｍyc組換えベクターは公知の方法に準じて作成した（24）。すなわち、全長ｌ−アファディン（特願平9-257043号の配列番号１のアミノ酸配列）とｓ−アファディン（特願平9-257043号の配列番号１の１−1663番目アミノ酸配列に相当）のｃＤＮＡをpＣＭＶ５ベクター（35）に挿入した。Ｃ末端から半分のビンクリンｃＤＮＡ（マウスのビンクリンｃＤＮＡ（49）の533−1066番目までのアミノ酸配列に相当：ビンクリン−Ｃ）はpＣＭＶ−Ｍycベクターに挿入した。これらの組換えベクターを公知のＤＥＡＥデキストラン法によりＣＯＳ７細胞に導入した（13）。プロテアーゼ阻害剤（20μg/ml leupeptin、1μg/ml pepstatinＡおよび 1mM ＰＭＳＦ）を含む溶解緩衝液（pH7.5の20mMトリス塩酸、150mM塩化ナトリウム、１％トリトンX-100, 1mM EDTAおよび1mM EGTA）を遺伝子導入したＣＯＳ７細胞に加えた。100,000g回転で１時間遠心分離することにより得た細胞抽出物(蛋白質1.2mg)を11.5μgの抗Ｍyc抗体（39）あるいは13.5μgの抗ＦＬＡＧＭ２抗体(Eastman Kodak Scientific Imaging Systems)を加え、４℃で３時間反応させた。20μlのprotein G Sepharose 4 Fast Flow（Amersham-Pharmacia）を加え、さらに４℃で１時間反応を続けた。ビーズを溶解緩衝液で洗浄したのち、ＳＤＳサンプル緩衝液で10分煮沸することにより結合した蛋白質ををビーズから分離した。これらのサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥで展開したのち、Coomassie brilliant blue染色あるいはウエスタンブロット分析を行った。
１．６  抗体
抗原としての組換え蛋白質を作成するために、ポンシン−１ｃＤＮＡの約150bp断片（配列番号１の1543−1707塩基配列に相当）をpＧＥＸベクター（Amersham-Pharmacia）に挿入して作成したグルタチオンＳトランスフェラーゼ(ＧＳＴ)-ポンシン−１−Ｓ１により形質転換した大腸菌が発現したＧＳＴ融合蛋白質をグルタチオン-セファロース（Amerdham-Pharmacia）で精製した。精製したＧＳＴ-ポンシン−１−Ｓ１を用いてポンシン−１に対するウサギ抗血清を作成した。ＧＳＴ-ポンシン−１−Ｓ１を共有結合したＮＨＳ活性化セファロース（Amerdham-Pharmacia）でこの抗血清を親和精製して、抗ポンシン・ポリクローナル抗体を調製した。マウスの抗ｌ−アファディン・モノクローナル抗体は文献の方法（50）に基づき作成した。ｌ−アファディンとｓ−アファディンの両方を認識する抗ｌ−、ｓ−アファディン・ウサギポリクローナル抗体は文献に記載されている方法（24）により作成した。マウス抗ビンクリン・モノクローナル抗体はシグマから購入した。ラット抗Ｅ−カドヘリン・モノクローナル抗体(ECCD2)は宝酒造より購入した。
１．７  免疫蛍光顕微鏡分析
ラットの各組織の凍結切片について、文献記載の方法（16）により免疫蛍光顕微鏡分析を行った。すなわち、各種の組織サンプルを液体窒素中で凍結させ、クリオスタットで凍結切片（〜10μm）を作成した。サンプルをスライドグラスにセットし、風乾し、95％エタノールで４℃にて30分、さらに100％アセトンで室温１分間固定した。１％ＢＳＡを含むＰＢＳでサンプルを洗浄したのち指示された抗体を加えて反応させた。反応ののち、１％ＢＳＡと0.1％トリトンX-100を含むＰＢＳで洗浄し、ローダミンを結合させたロバ抗ウサギＩgＧ抗体と、ＦＩＴＣを結合させた羊抗マウスＩgＧ抗体を加え反応させた。サンプルをＰＢＳで洗浄したのち、包埋し、共焦点画像システム（Bio-Rad：MRC-1024）で観察した。
【００２３】
一方、マウスの乳癌ＭＴＤ−１Ａ細胞の免疫蛍光顕微鏡分析は文献記載の方法（16）に従い行った。すなわち、細胞をカバーグラス上で培養し、１％フォルムアルデヒドを含むＰＢＳで固定した。固定したサンプルを0.2％トリトンX-100で処理し、ＰＢＳで３回洗浄し、１％ＢＳＡを含むＰＢＳでサンプルをすすいだのち、記載された抗体と反応させた。反応ののち、１％ＢＳＡを含むＰＢＳで洗浄し、ローダミン結合の抗ウサギＩgＧ抗体と、ＦＩＴＣ結合抗マウスＩgＧ抗体を加えた。反応ののち、ＰＢＳでサンプルを洗浄し、95％のグリセロールを含むＰＢＳで包埋し、共焦点画像システム（Bio-Rad：MRC-1024）で観察した。
１．８  免疫電子顕微鏡分析
銀増強法（silver-enhancement techniques）を用いた免疫電子顕微鏡分析を文献に報告された方法（27）に従って行った。すなわち、４％パラフォルムアルデヒドを含むＰＢＳで成体ラットの小腸を潅流した。サンプルを抗ｌ−アファディン抗体と反応させたのち、抗ウサギＩgＧ抗体を結合した1.4nmの金粒子（Nanoprobes Inc.）を加え、さらに反応させた。サンプルを洗浄したのち、１％グルタールアルデヒドを含むＰＢＳで15分間固定した。サンプルに結合した金粒子をＨＱシルバーキット（Nanoprobes Inc.）により18℃で８分間銀増強した。サンプルを再び洗浄し、pH 7.3, 100mMのカコジル緩衝液中の0.5％酸化オスミウムで後固定した。サンプルはエタノール（段階的に50,70,90,100％）およびプロピレンオキシドにより脱水したのち、エポキシ樹脂に包埋した。このサンプルで超薄切片を作成し、酢酸ウラニールとクエン酸鉛で染色し、電子顕微鏡（JEM-1200EX, JEOL）で観察した。
１．９  その他の方法
蛋白質濃度は、ＢＳＡ（3）を対象蛋白質として決定した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは公知の方法（22）に従って行った。蛍光in situハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）分析は公知の方法（26,27）によって行った。
２．結果
２．１  ポンシンの精製とそのｃＤＮＡの分子クローニング
ｌ−アファディン結合タンパクを同定するために、前記のとおり、35S標識ｌ−アファディンを用いたブロット・オーバーレイ法を行った、ラットの肝細胞分画をＳＤＳ−ＰＡＧＥで展開し、ブロット・オーバーレイを行い、ＡＪ濃縮分画に分子量約93KD(p93)の放射活性バンドを検出した。尿素とトリトンX-100の組合せでこの分画からｐ９３を可溶化し、モノＱ、ハイドロアパタイトおよびモノＳカラムによる連続クロマトグラフィーで高度に精製した。最後のモノＳカラムによるクロマトグラフィーにおいて、ｌ−アファディン結合活性を伴う放射性バンドは分子量約93KDの蛋白質によく一致した（図１）。Ｐ９３とともに、分子量約95KD(p95)と70KD(p70)のバンドも精製した。それらも、分子量95KDと70KDの染色蛋白質とよく一致した。
【００２４】
これらの蛋白質バンドを別々にゲルから切り出し、リシル・エンドペプチダーゼで分解した。分解したペプチドをＨＰＬＣで分離し、これらの蛋白質のペプチドマップを得た。それらのマップは互いによく似ていたが、ｐ９５とｐ９３のマップには、ｐ７０には見られないペプチドのピークがいくつか認められた。そこで、Ｐ９５、ｐ９３およびｐ７０に共通の２つのペプチドピークを分離し、アミノ酸配列を決定すると、これら３種のタンパクには、ペプチド−１（配列番号７）およびペプチド−２（配列番号８）が含まれていた。
【００２５】
GenBankデータベースのBLASTサーチによれば、これらの配列はマウスのＳＨ３Ｐ12遺伝子産物の配列（GenBank/EMBL/DDBJ アクセス番号U58883）とほぼ同一であることが判明した。ＳＨ３Ｐ12遺伝子産物は元々Ｓrc相同領域３(SH3)を含む蛋白質として同定されたものである（38）。これらの結果は、ｐ９５、ｐ９３およびｐ７０がＳＨ３Ｐ12と関連があることを示唆している。
【００２６】
そこで、マウスの脳のｃＤＮＡを鋳型として用い、ＳＨ３Ｐ12のｃＤＮＡを増幅するためにＰＣＲを行い、少なくとも12のクローンを単離した。それらの制限酵素地図は似てはいたが、それぞれ少しずつ異なっていた。これらのうちの２つ（クローン２と17）の塩基配列を決定した。各クローンは予想開始コドンの上流にインフレーム・ストップコドンを有していた。クローン２にコードされている蛋白質は724アミノ酸から成り、推定分子量は81,217(GenBank/ EMBL/DDBJ：アクセス番号AF078666)であり、クローン17にコードされている蛋白質は714アミノ酸から成り、推定分子量は79,492(genBank/EMBL/DDBJ：アクセス番号 AF078667)であった（図２Ａ）。両蛋白質はごく一部を除いてペプチド−１とペプチド−２のアミノ酸配列と同一であった。すなわち、ペプチド−１の９番目のアミノ酸残基Leuと18番目のアミノ酸残基GluがそれぞれValとAspに置換され、ペプチド−２では14番目のアミノ酸残基LysがArgに置換されていた。このアミノ酸残基の差異はラットとマウスという種の違いによるものと思われる。クローン２、クローン17およびＳＨ３Ｐ12の塩基配列を比較すると、それらの間の差異には偏りがあり、配列全体に分布しているわけではなかった。
【００２７】
クローン２とクローン17が同一の遺伝子座に由来するのかどうかを確認するために、ｃＤＮＡをプローブとして用いたＦＩＳＨ法による染色体マッピングを行ったところ、クローン２とクローン17は同じ遺伝子座に位置することが確認された。これらの結果は、クローン２とクローン17は同じ遺伝子のスプライシング変異型であることを示唆している。
【００２８】
次いで、クローン２あるいはクローン17が、ｐ９５、ｐ９３またはｐ７０のマウス・カウンターパートであるのか否かを調べるために、それぞれのＤＮＡでＭycをタグにした哺乳類発現ベクターを作成し、ＣＯＳ７細胞で蛋白質を発現させた。Ｍycをタグにした組換え蛋白質を抗Ｍyc抗体で免疫沈降し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで展開したのち、35Ｓ標識ｌ−アファディン・ブロット・オーバーレイを行った。クローン17にコードされた蛋白質はＳＤＳ−ＰＡＧＥと35Ｓ標識ｌ−アファディン結合活性においてラット肝臓より精製されたｐ９３と似たような挙動を示した（図２Ｂ）。従って、アミノ酸配列から計算した分子量とＳＤＳ−ＰＡＧＥ上での推定分子量に差がある理由は不明であるが、クローン17がｐ９３マウスカウンターパートの全長ｃＤＮＡをコードしていると結論し、これをポンシン−１と命名した。一方、クローン２は、35Ｓ標識ｌ−アファディン結合活性は有するものの、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上ではｐ９３とｐ９５の間の易動度を示した。従って、このｐ９５がクローン２にコードされているかどうか結論を出すことはできなかったが、このクローン２にコードされている蛋白質をポンシン−２と命名した。ポンシン−１とポンシン−２の親水性分析を行ったところ、これらの蛋白質には膜貫通部位はないと考えられた。シグナルドメインのコンピューター分析の結果、ポンシン−１とポンシン−２はＣ末端側に３つのＳＨ３ドメインを持っていたが、そのほかの既に知られているシグナルドメインは認められなかった（図２Ａ）。
２．２  ｌ−アファディンのポンシンへの結合
免疫沈降によりｌ−アファディンのポンシンへの結合を確認した。Ｍycをタグにしたｌ−アファディンとＦＬＡＧをタグにしたポンシン−２をＣＯＳ７細胞で暫定的に共発現させた。ポンシン−２を抗ＦＬＡＧ抗体で免疫沈降するとｌ−アファディンが共沈し（図３Ａ１）、逆にｌ−アファディンを抗Ｍyc抗体で免疫沈降するとポンシン−２が共沈した。２つの沈降したタンパクのモル比は、Coomassie brilliant Blueで染色することにより推定すると0.3：１であった（図３Ａ２）。同様の条件下でＣ末端の３番目のプロリンリッチドメインとＦ−アクチン結合ドメインを欠くｓ−アファディンは、ポンシン−２では有意には共免疫沈降しなかった（図３Ｂ）。同様の結果はポンシン−１を用いても得られた。これらの結果は、ｌ−アファディンがポンシンに結合するというさらなる証拠を提供し、少なくともｌ−アファディンの３番目のプロリンリッチドメインがｌ−アファディンのポンシンへの結合に必要であることを示唆している。
２．３  ポンシンのビンクリンへの結合
前記のとおり、ポンシン−１とポンシン−２は細胞質に存在する蛋白質であると予想されるために、これらの蛋白質だけでｌ−アファディンのＺＡへの特異的局在を決定づけることはできない。ｌ−アファディンがそこに局在するのに必要なほかの分子を探るために、さらに、ポンシン結合タンパクの同定を試みた。
【００２９】
蛋白質を同定するために、35Ｓ標識ポンシン−２を用いたブロット・オーバーレイを採用した。すなわち、ラットの肝細胞分画をＳＤＳ−ＰＡＧＥで展開したのち、ブロット・オーバーレイを行った。分子量約120KDの放射活性をもつバンドが検出され、ＡＪ濃縮画分に相対的に濃縮された（図４Ａ）。ポンシンを精製するのに使ったモノＱカラムによるクロマトグラフィーの各画分を35Ｓ標識ポンシン−２ブロット・オーバーレイにかけた。分子量約120KDの放射活性を持ったバンドは19から29の画分で検出された（図４Ｂ１）。放射活性を持つバンドはCoomassie brilliant Blue染色により同定される分子量約120KDのバンドと良く一致した。また、この蛋白質は抗ビンクリン抗体によって認識されることから、ポンシンは直接ビンクリンと結合していることが示唆される（図４Ｂ２）。
【００３０】
そこで、このことを確認するために免疫沈降を行った。ビンクリンは分子内でＣ末端部分とＮ末端部分が会合していることが示されているので（20）、ビンクリンのＣ末端部分（ビンクリン−Ｃ）を用いた。ＦＬＡＧをタグにしたポンシン−２とＭycをタグにしたビンクリン−ＣをＣＯＳ７細胞に暫定的に共発現させた。ポンシン−２を抗ＦＬＡＧ抗体で免疫沈降するとビンクリン−Ｃが共沈し（図４Ｃ）、逆にビンクリン−Ｃを抗Ｍyc抗体で免疫沈降するとポンシン−２が共沈した。ポンシン−１でも本質的に同じ結果が得られた。これらの結果は、ポンシンはｌ−アファディンだけではなく、ビンクリンともそのＣ末端を介して非細胞系においても細胞系においても結合していることを示している。
２．４  ポンシンの組織分布と細胞内局在
ポンシンの組織分布と細胞内局在を分析した。ポンシン−２をプローブとして用いたノーザンブロット分析では、ポンシンは調べた限りのマウスの組織、すなわち心臓、脳、脾臓、肺、肝臓、骨格筋、腎臓および精巣ですべてに普遍的に発現していた（図５Ａ）。心臓、脳、肝臓および骨格筋では複数のバンドが認められ、ポンシンにはいくつかのスプライシング変異型があるという前記の結果を支持した。抗ポンシン抗体を用いたウエスタンブロット分析では、ポンシンはｌ−アファディンとともに肝臓のＡＪ濃縮画分に濃縮していた（図５Ｂ）。この抗体はｐ９３（ポンシン−１）、ｐ９５およびｐ７０を特異的に認識する。ビンクリンはあらゆる画分に認められたが、相対的にはＡＪ濃縮画分に集中していた（図５Ｂ）。
【００３１】
次いで、ポンシンの細胞内局在を明らかにするために、培養したマウスの乳癌MTD-1A細胞とラットの各種組織を用いて、免疫蛍光顕微鏡分析を行った。MTD-1A細胞の接着レベルでは、ポンシンはｌ−アファディンとビンクリンとともに細胞-細胞間ＡＪに局在していた（図６、ＡとＢ）。基底レベルでは、ポンシンはｌ−アファディンの存在しない細胞-マトリックス間ＡＪにビンクリンとともに局在していた（図６Ｃ）。ラットの小腸の凍結切片を抗Ｅ−カドヘリン・モノクローナル抗体で二重染色すると、ポンシンは吸収上皮細胞の結合複合体領域にＥ−カドヘリンとともに濃縮されていたが、濃縮の程度はポンシンの方が強かった（図７Ａ）。ラットの心臓の凍結切片を抗ビンクリン・モノクローナル抗体で二重染色すると、ポンシンは介在板にビンクリンとともに局在していた。それらはまた、心筋細胞の側面境界に沿ってドット状に局在していた（図７Ｂ）。肝臓では、ポンシンは毛細胆管に沿ってベルトのように局在していた（図７Ｃ）。この局在は肝臓の細胞分画による局在の検討に一致している（図５Ｂ参照）。これらの結果は、ポンシンが細胞-細胞間ＡＪと細胞-マトリックス間ＡＪの両方に局在していることを示している。
【００３２】
さらに、結合複合体領域でのポンシンの正確な局在を調べるために、銀増強法を用いてラット小腸の吸収上皮細胞の免疫電子顕微鏡分析を行った。ポンシンはｌ−アファディンが局在しているＺＡの裏打ち構造に存在していた（24）（図７Ｄ）。
【００３３】
【発明の効果】
以上詳しく説明したとおり、この発明の蛋白質ポンシン−１およびポンシン−２は、２つのＦ−アクチン結合蛋白質（ｌ−アファディンとビンクリン）と相互作用する新規な蛋白質であり、この蛋白質は、細胞結合の分子機構の全容を解明するための重要な情報を提供するばかりか、例えば癌腫の浸潤、転移のメカニズムの解明につながる可能性もあり、癌腫の悪性度の診断やその予防・治療法、治療薬等の開発に有用である。
【００３４】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  35Ｓ標識ｌ−アファディン結合タンパクのモノＳクロマトグラフィーの結果である。（Ａ）は280nmでの吸光度(A280)であり、（Ｂ）は35Ｓ標識ｌ−アファディンのブロット・オーバーレイの結果を示すブロット図である。（Ｃ）はCoomassie brilliant blueによる蛋白質染色の結果を示すブロット図であり、白抜きの矢先がｐ９５、黒い矢先がｐ９３、矢印はｐ７０をそれぞれ示す。
【図２】（Ａ）はポンシン−１とポンシン−２の構成図であり、黒塗り部分はＳＨ３ドメインを示す。（Ｂ）はポンシン−１とポンシン−２のｌ−アファディン結合活性を示すブロット図である。Ｂ１は35Ｓ標識ｌ−アファディンのブロット・オーバーレイ、Ｂ２は蛋白質染色である。
【図３】  In vivoでのｌ−アファディンのポンシンへの結合を試験した結果である。（Ａ）はｌ−アファディンとポンシン−２の免疫沈降分析の結果を示すブロット図であり、Ａ１はウエスタンブロット分析、 Ａ２は蛋白質染色の結果である。（Ｂ）はｓ-アファディンとポンシン−２の免疫沈降分析の結果である。
【図４】  In vitroと in vivoにおけるポンシンのビンクリンへの結合を試験した結果である。（Ａ）はラット肝臓の細胞分画における35Ｓ標識ポンシン−２結合蛋白質の分布を示すブロット図であり、Hoはホモジネート、S１は可溶化分画、P１は沈殿分画、BCfは毛細胆管を濃縮した分画、AJfは接着接合(AJ)を濃縮した分画を示す。（Ｂ）は35Ｓ標識ポンシン−２結合蛋白質のモノＱカラムクロマトグラフィーの結果であり、Ｂ１は35Ｓ標識ポンシン−２のブロット・オーバーレイ、Ｂ２はウエスタンブロット分析の結果である。（Ｃ）はポンシン−２とビンクリン−Ｃの免疫沈降分析の結果である。
【図５】組織と細胞分画でのポンシン分布を試験した結果である。（Ａ）はノーザンブロット分析の結果を示すブロット図であり、Ａ１は48時間感光、Ａ２は８時間感光の結果を示す。（Ｂ）はラット肝臓の細胞分画での分布を示すブロット図である。
【図６】マウス乳癌細胞株ＭＴＤ−１Ａにおけるｌ−アファディン、ポンシンおよびビンクリンの局在を示す図面に代わる写真である。（Ａ）は接合レベルにおける抗ポンシン抗体と抗ｌ−アファディン抗体による二重染色であり、Ａ１はポンシン、Ａ２はｌ−アファディンである。（Ｂ）は接合レベルにおける抗ポンシン抗体と抗ビンクリン抗体による二重染色であり、Ｂ１はポンシン、Ｂ２はビンクリンである。（Ｃ）は基底レベルにおける抗ポンシン抗体と抗ビンクリン抗体による二重染色であり、Ｃ１はポンシン、Ｃ２はビンクリンである。バーの長さは50μmを示す。
【図７】ラットの各種組織でのポンシン、Ｅ−カドヘリンおよびビンクリンの局在を示す図面に代わる写真である。（Ａ）は小腸吸収上皮細胞の抗ポンシン抗体と抗E-カドヘリン抗体による二重染色であり、Ａ１はポンシン、Ａ２はＥ−カドヘリンであり、星印は頂端側を示す。（Ｂ）は心臓の抗ポンシン抗体と抗ビンクリン抗体による二重染色であり、Ｂ１はポンシン、Ｂ２はビンクリンであり、矢印は介在盤、矢先は側面を示す。（Ｃ）は肝臓の抗ポンシン抗体による染色である。（Ｄ）は小腸吸収上皮細胞におけるポンシンの超微細構造上の局在を示し、白抜きの矢印は密着帯、矢印は接着帯、白抜きの矢先はデスモソームを示す。また、バーは長さは（Ａ、Ｃ）は10μm、（Ｂ）は50μm、（Ｄ）は0.1μmである。
【参考文献】
１．Aberle et al., J. Cell Sci. 107:3655-3663, 1994
２．Ando-Akatsuka et al., J. Cell Biol. 133:43-47, 1996
３．Bradford, Anal. Biochem. 72:248-254, 1976
４．Burridge and Mangeat, Nature. 308:744-746, 1984
５．Chevesich et al., Neuron. 18:95-105, 1997
６．Cimino et al., Cancer Res. 51:6712-6714, 1991
７．Furuse et al., J. Cell Biol. 123:1777-1788, 1993
８．Furuse et al., J. Cell Biol. 127:1617-1626, 1994
９．Furuse et al., J. Cell Biol. 141:1539-1550, 1998
10．Geiger et al., Pro. Natl. Acad. Sci. USA. 77:4127-4131, 1980
11．Geiger and Ginsberg, Cell Motil. Cytoskeleton. 20:1-6, 1991
12．Gumbiner, Cell. 84:345-357, 1996
13．Hata et al., J. Biol. Chem. 270:13022-13028, 1995
14．Horwitz et al., Nature. 320:531-533, 1986
15．Imaizumi et al., Biochem. Biophy. Res. Commun. 205:1409-1416, 1994
16．Itoh et al., J. Cell Biol. 115:1449-1462, 1991
17．Itoh et al., J. Cell Biol. 121:491-502, 1993
18．Itoh et al., J. Cell Biol. 138:181-192, 1997
19．Jockush et al.,Ann. Rev. Cell Dev. Biol. 11:379-416, 1995
20．Johnson and Craig, Nature. 373:261-264, 1995
21．Knudsen et al., J. Cell. Biol. 130:67-77, 1995
22．Laemmli, Nature. 227:680-685, 1970
23．Luna and Hitt, Science. 258:955-964, 1992
24．Mandai et al., J. Cell Biol. 139:517-528, 1997
25．Matsuda et al., Cytogenet. Cell Genet. 61:282-285, 1992
26．Matsuda and Chapman, Electrophoresis. 16:261-272, 1995
27．Mizoguchi et al., Biochem. Biophy. Res. Commun.202:1235-1243, 1994
28．Nagafuchi et al., Cell. 65:849-857, 1991
29．Nelson et al., J. Cell Biol. 110:349-357, 1990
30．Otey et al., J. Cell Biol. 111:721-729, 1990
31．Ozawa et al., EMBO J. 8:1711-1717, 1989
32．Prasad et al., Cancer Res. 53:5624-5628, 1993
33．Rimm et al., Pro. Natl. Acad. Sci. USA. 92:8813-8817, 1995
34．Sambrook et al., Molecular Cloning: a laboratory manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989
35．Satoh et al., J. Biol. Chem. 273:3470-3475, 1998
36．Schultz et al., Pro. Natl. Acad. Sci. USA. 95:5857-5864, 1998
37．Shieh and Zhu, Neuron. 16:991-998, 1996
38．Sparks et al., Nat. Biotechnol. 14:741-744, 1996
39．Takaishi et al., Oncogene. 11:39-48, 1995
40．Takeichi, Development. 102:639-655, 1988
41．Takeichi, Science. 251:1451-1455, 1991
42．Takeichi, Curr. Opin. Cell Biol. 5:806-811, 1993
43．Tanaka et al., Eur. J. Biochem. 151:291-297, 1985
44．Tsukita et al., J. Cell Biol. 108:31-41, 1989
45．Tsukita et al., Curr. Opin. Cell Biol. 4:834-839, 1992
46．Weiss et al., J. Cell Biol. 141:755-764, 1998
47．Yamamoto et al., J. Cell Biol. 139:785-795, 1997
48．Yu et al., Cell. 76:933-945, 1994
49．Watanabe-Uchida et al., J. Cell Biol., 142:847-857, 1998
50．Sakisaka et al., Oncogene, 8:1609-1617, 1999
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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