(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）のペプチド：
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸残基の欠失、付加、置換又は修飾を有するアミノ酸配列からなるペプチドであって、トレポネーマ・パリダム４７Ｋダルトン抗原タンパク質を含む抗原を用いる抗トレポネーマ・パリダム抗体の免疫測定方法において非特異反応を抑制する活性を有し、トレポネーマ・パリダム４７Ｋダルトン抗原タンパク質の抗原性を示さないペプチド。
【請求項２】
以下の（ａ）又は（ｂ）のペプチド：
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸残基の欠失、付加、置換又は修飾を有するアミノ酸配列からなるペプチドであって、トレポネーマ・パリダム４７Ｋダルトン抗原タンパク質を含む抗原を用いる抗トレポネーマ・パリダム抗体の免疫測定方法において非特異反応を抑制する活性を有し、トレポネーマ・パリダム４７Ｋダルトン抗原タンパク質の抗原性を示さないペプチド。
【請求項３】
トレポネーマ・パリダム４７Ｋダルトン抗原タンパク質を用いる抗トレポネーマ・パリダム抗体の免疫測定方法において使用するための、請求項１又は２に記載のペプチドを含む非特異反応抑制剤。
【請求項４】
トレポネーマ・パリダム４７Ｋダルトン抗原タンパク質を用いる抗トレポネーマ・パリダム抗体の免疫測定方法において使用するための、請求項１又は２に記載のペプチドを含む抗トレポネーマ・パリダム抗体測定試薬。
【請求項５】
トレポネーマ・パリダム４７Ｋダルトン抗原タンパク質をさらに含む、請求項４に記載の試薬。
【請求項６】
トレポネーマ・パリダム４７Ｋダルトン抗原タンパク質が遺伝子組み換え技術を用いて産生される、請求項５に記載の試薬。
【請求項７】
トレポネーマ・パリダム４７Ｋダルトン抗原タンパク質を用いる抗トレポネーマ・パリダム抗体の免疫測定方法において、請求項１又は２に記載のペプチドを試料と接触させて非特異反応を抑制する方法。
【請求項８】
トレポネーマ・パリダム４７Ｋダルトン抗原タンパク質を用いる抗トレポネーマ・パリダム抗体の免疫測定方法であって、請求項１又は２に記載のペプチドを試料と接触させることを含む免疫測定方法。
【請求項９】
トレポネーマ・パリダム４７Ｋダルトン抗原タンパク質が遺伝子組み換え技術を用いて産生される、請求項８に記載の免疫測定方法。
【請求項１０】
請求項１又は２に記載のペプチド及びトレポネーマ・パリダム４７Ｋダルトン抗原タンパク質を固定化した担体を含む抗トレポネーマ・パリダム抗体測定用の免疫測定キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、トレポネーマ・パリダム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ Ｐａｌｌｉｄｕｍ；以下ＴＰと略すこともある）抗原を使用した抗ＴＰ抗体の測定において非特異反応を抑制する物質、該物質を用いる非特異反応抑制方法、該物質を含む抗ＴＰ抗体測定試薬及びこれらを用いる抗ＴＰ抗体測定方法に関する。
本発明は、臨床検査、免疫学及び医学などの生命科学分野、分析化学などの化学分野、食品衛生分野、並びに環境衛生分野等において有用なものである。
【０００２】
【従来の技術】
梅毒は、トレポネーマ・パリダムにより引き起こされる感染症であり、梅毒に感染しているか否かは、主に梅毒血清反応による梅毒抗体の検出により判断されている。この梅毒血清反応には、カルジオリピン又はレシチン等のリン脂質を抗原として用いる抗脂質抗体測定方法（ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ ｔｅｓｔ ｆｏｒｓｙｐｈｉｌｉｓ；以下ＳＴＳ法と略すこともある）及びＴＰ菌体又は菌体成分を抗原として用いる抗ＴＰ抗体測定方法がある。
【０００３】
ＳＴＳ法としては、ガラス板法、ＲＰＲ法等が、抗ＴＰ抗体測定方法としては、蛍光抗体法（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ａｎｔｉｂｏｄｙａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ ｔｅｓｔ；ＦＴＡ−ＡＢＳ法）、受身赤血球凝集反応（ＴＰ ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ ｔｅｓｔ；ＴＰＨＡ法）、粒子凝集法（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ Ｐａｌｌｉｄｕｍ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ；ＴＰＰＡ法）、酵素免疫測定方法（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ；ＥＬＩＳＡ法）、ラテックス凝集法（ＴＰ ｌａｔｅｘ ａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ；ＴＰＬＡ法）及びイムノクロマトグラフィー法等が日常検査に利用されている。特にＴＰ抗原を用いる抗ＴＰ抗体測定方法は梅毒に対する特異性が高く、日常検査に広く利用されている。
【０００４】
この抗ＴＰ抗体測定方法に使用されるＴＰ抗原は、従来よりＴＰ菌体から精製されたものが用いられている。例えば、ＴＰ抗原の表面抗原タンパク質を抗原として用いることができる。このような表面抗原タンパク質としては、１５Ｋダルトン抗原タンパク質、１７Ｋダルトン抗原タンパク質及び４７Ｋダルトン抗原タンパク質等の存在が知られており、これらを使用することができる。
【０００５】
また、近年では遺伝子組み換え技術を用いて、ＴＰ抗原を大腸菌等の宿主細胞に産生させることも行われている。これら表面抗原タンパク質のアミノ酸配列やその遺伝子の塩基配列は既に報告されているので（１５Ｋダルトン抗原タンパク質：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ４巻、１３７１〜１３７９頁、１９９０年；１７Ｋダルトン抗原タンパク質：Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ６１巻、１２０２〜１２１０頁、１９９３年；４７Ｋダルトン抗原タンパク質：Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ６０巻、１５６８〜１５７６頁、１９９２年）、遺伝子組み換え技術を用いてこれらの表面抗原タンパク質を産生することが可能となっている。
【０００６】
しかしながら、これらのＴＰ抗原を使用した抗ＴＰ抗体測定方法においては、測定する試料によっては、試料中に抗ＴＰ抗体が存在しないにも関わらず非特異反応により偽陽性を示すことがあり、患者などの疾病の診断を誤らせる危険性があった。この現象は、検体中に含まれる抗体以外の成分が抗原等に反応することによって引き起こされるものと考えられる。
【０００７】
この非特異反応を抑制する方法として、種々の方法が提供されている。例えば、特開昭５８−１４４７４８号公報には、非特異反応を抑制するために試薬中にウシ血清アルブミンやウマ血清アルブミン等を添加する技術が示されており、特開平８−１０５８９７号公報には、非特異反応を抑制するために塩化ナトリウムを添加する技術が示されている。特開平８−１７６１９５号公報には、非特異反応を抑制するために化学修飾した還元アルブミンをブロッキング剤として使用する方法が示されている。また、特公平３−５９３８２号公報には、非特異反応を抑制するために遺伝子組み換えに用いたものと同種であるが遺伝子組み換え操作が行われていない宿主細菌成分を用いる技術が示されている。更に、特許第３２０６３１１号公報には、抗原をコードする遺伝子を含まない、抗原産生に用いたものと同種のベクターを組み込んだ培養細胞成分を用いる技術が示されている。しかし、これらの技術は、非特異反応を抑制するには必ずしも充分なものとはいえなかった。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
前記したように、ＴＰ抗原を使用した抗ＴＰ抗体の測定においては、測定する試料によっては、試料中に抗ＴＰ抗体が存在しないにも関わらず、非特異反応により、偽陽性を示すことがあるという問題があった。
従って、本発明の課題は、ＴＰ抗原を使用した抗ＴＰ抗体の免疫測定方法において非特異反応を抑制し、梅毒の診断の場において正確な測定を行うことにより、診断を誤ることを防止する手段を提供することである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、ＴＰ抗原タンパク質の抗原性を示さないが非特異反応抑制効果を有しているＴＰ抗原タンパク質の断片を非特異反応抑制剤として用いることにより、前記課題が解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
即ち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）配列番号４〜３６のいずれかに記載のアミノ酸配列を含むペプチドであって、トレポネーマ・パリダム４７Ｋダルトン抗原タンパク質を含む抗原を用いる抗トレポネーマ・パリダム抗体の免疫測定方法において非特異反応を抑制する活性を有するペプチド。
【００１１】
（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列の全部又は一部からなり配列番号１における少なくとも５個の連続したアミノ酸配列を含むペプチド、又は該ペプチドを含み、トレポネーマ・パリダム４７Ｋダルトン抗原タンパク質を含む抗原を用いる抗トレポネーマ・パリダム抗体の免疫測定方法において非特異反応を抑制する活性を有するペプチド。
【００１２】
（３）配列番号２に記載のアミノ酸配列の全部又は一部からなり配列番号２における少なくとも５個の連続したアミノ酸配列を含むペプチド、又は該ペプチドを含み、トレポネーマ・パリダム４７Ｋダルトン抗原タンパク質を含む抗原を用いる抗トレポネーマ・パリダム抗体の免疫測定方法において非特異反応を抑制する活性を有するペプチド。
【００１３】
（４）配列番号１に記載のアミノ酸配列又はその一部からなるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸残基の欠失、付加、置換又は修飾を有するアミノ酸配列からなるペプチドであって、トレポネーマ・パリダム４７Ｋダルトン抗原タンパク質を含む抗原を用いる抗トレポネーマ・パリダム抗体の免疫測定方法において非特異反応を抑制する活性を有するペプチド。
【００１４】
（５）配列番号２に記載のアミノ酸配列又はその一部からなるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸残基の欠失、付加、置換又は修飾を有するアミノ酸配列からなるペプチドであって、トレポネーマ・パリダム４７Ｋダルトン抗原タンパク質を含む抗原を用いる抗トレポネーマ・パリダム抗体の免疫測定方法において非特異反応を抑制する活性を有するペプチド。
【００１５】
（６）トレポネーマ・パリダム４７Ｋダルトン抗原タンパク質の抗原性を示さない、（１）〜（５）のいずれかに記載のペプチド。
（７）トレポネーマ・パリダム４７Ｋダルトン抗原タンパク質を用いる抗トレポネーマ・パリダム抗体の免疫測定方法において使用するための、（１）〜（６）のいずれかに記載のペプチドを含む非特異反応抑制剤。
【００１６】
（８）トレポネーマ・パリダム４７Ｋダルトン抗原タンパク質を用いる抗トレポネーマ・パリダム抗体の免疫測定方法において使用するための、（１）〜（６）のいずれかに記載のペプチドを含む抗トレポネーマ・パリダム抗体測定試薬。
（９）トレポネーマ・パリダム４７Ｋダルトン抗原タンパク質をさらに含む、（８）に記載の試薬。
【００１７】
（１０）トレポネーマ・パリダム４７Ｋダルトン抗原タンパク質が遺伝子組み換え技術を用いて産生される、（９）に記載の試薬。
（１１）トレポネーマ・パリダム４７Ｋダルトン抗原タンパク質を用いる抗トレポネーマ・パリダム抗体の免疫測定方法において、（１）〜（６）のいずれかに記載のペプチドを試料と接触させて非特異反応を抑制する方法。
【００１８】
（１２）トレポネーマ・パリダム４７Ｋダルトン抗原タンパク質を用いる抗トレポネーマ・パリダム抗体の免疫測定方法であって、（１）〜（６）のいずれかに記載のペプチドを試料と接触させることを含む免疫測定方法。
（１３）トレポネーマ・パリダム４７Ｋダルトン抗原タンパク質が遺伝子組み換え技術を用いて産生される、（１２）に記載の免疫測定方法。
（１４）（１）〜（６）のいずれかに記載のペプチド及びトレポネーマ・パリダム４７Ｋダルトン抗原タンパク質を固定化した担体を含む抗トレポネーマ・パリダム抗体測定用の免疫測定キット。
【００１９】
【発明の実施の形態】
本発明のペプチドは、トレポネーマ・パリダム抗原タンパク質を用いて試料中の抗ＴＰ抗体を測定する免疫測定方法において、非特異反応を抑制する活性を有する。本発明のペプチドを使用できる免疫測定方法は、トレポネーマ・パリダムの４７Ｋダルトン抗原タンパク質の使用を含む方法であれば特に限定されない。本発明において免疫測定方法とは、当技術分野における通常の意味を有し、抗原と抗体との抗原抗体反応を利用して、試料中の抗ＴＰ抗体の検出を行う免疫測定方法を意味する。
【００２０】
このような免疫測定方法としては、例えば、ラテックス比濁法；ラテックス凝集反応測定法などの間接凝集反応測定法；酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法、放射免疫測定法若しくは発光免疫測定法などの標識物質を用いる標識免疫測定法；ウエスタンブロット法；ＥＬＳＡ法（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｌｉｇａｎｄｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）〔Ｄａｈｌｂｅａｃｋら、Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．，７９巻、７６７〜７７２頁、１９９８年；ＷＯ９８／２３９６３号公報〕；イムノクロマトグラフィー法；又は特開平９−２２９９３６号公報及び特開平１０−１３２８１９号公報等に記載された、被検物質に対する特異的結合物質が固定化され被覆された面を有する担体並びに被検物質に対する特異的結合物質が固定化された粒子を用い、該粒子が担体における上記面に集まるか否かにより測定を行う方法等を挙げることができる。標識免疫測定法を用いる場合は、サンドイッチ法、競合法又は均一系法（ホモジニアス系法）等のいずれの方法においても本発明を適用することができる。本発明では、ラテックス比濁法、又は特開平９−２２９９３６号公報及び特開平１０−１３２８１９号公報等に記載された、被検物質に対する特異的結合物質が固定化され被覆された面を有する担体並びに被検物質に対する特異的結合物質が固定化された粒子を用い、該粒子が担体における上記面に集まるか否かにより測定を行う方法を用いるのが好ましい。
【００２１】
測定は、用手法によって行ってもよいし、分析装置等の装置を用いて行ってもよい。測定は、１ステップ法（１試薬法）により実施してもよいし、又は２ステップ法（２試薬法）等の複数の操作ステップを含む方法によって実施してもよい。
【００２２】
本発明において、上記のような抗ＴＰ抗体の免疫測定方法において使用するＴＰ抗原は、少なくともＴＰ４７Ｋダルトン抗原タンパク質が含まれているものであれば特に限定されない。ＴＰ４７Ｋダルトン抗原タンパク質に加えて、その他の抗原タンパク質を含んでいてもよい。トレポネーマ・パリダムの表面抗原タンパク質、例えば、ＴＰ１５Ｋダルトン抗原タンパク質又はＴＰ１７Ｋダルトン抗原タンパク質を含むのが好ましい。抗原として用いる抗原タンパク質は、ＴＰ４７Ｋダルトン抗原タンパク質１種類でも又は数種類の抗原タンパク質の混合物でもよいが、数種類の抗原タンパク質の混合物を使用するのが好ましい。これらの抗原タンパク質が複数結合した状態のものを用いてもよい。これらの抗原タンパク質は、トレポネーマ・パリダム菌体から精製したものであってもよいし、遺伝子組み換え技術を用いて得られたものであってもよい。ＴＰ４７Ｋダルトン抗原タンパク質は、均質なものが継続的かつ安価に調製できることから、遺伝子組み換え技術を用いて得られたものを使用するのが好ましい。
【００２３】
遺伝子組み換え技術を用いて抗原タンパク質を産生する場合には、当技術分野で通常用いられている方法を用いることができる。例えば、抗原タンパク質をコードする遺伝子をクローニングし、得られた遺伝子をプラスミド等の発現ベクターへ組み込み、この発現ベクターを大腸菌等の宿主細胞に導入し、得られた形質転換体を培養することにより目的のタンパク質を発現させることができる。遺伝子をクローニングする方法としては、例えば、ＰＣＲ法、リコンビナントＰＣＲ法、ライゲーション法又はリンカーライゲーション法等を挙げることができる。
【００２４】
そして、この遺伝子組み換え技術により人為的に調製したＴＰ４７Ｋダルトン抗原タンパク質は、他のタンパク質と融合しているものであってもよい。融合させる他のタンパク質としては、例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースバインディングプロテイン（ＭＢＰ）、チオレドキシン、β−ガラクトシダーゼ、ラクターゼ、ビオチン化タンパク質、プロテインＡ又はジーン１０等を挙げることができる。
【００２５】
トレポネーマ・パリダム菌体から抗原タンパク質を精製する場合は、界面活性剤や超音波破砕等で菌体から抽出することによって得ることができる。更に、菌体から抽出した抗原タンパク質をゲルろ過、イオン交換、又はハイドロキシアパタイト等で精製することによって得ることもできる。
【００２６】
本発明は、配列番号１に記載のアミノ酸配列の全部又は一部を含むアミノ酸数３以上、好ましくは３〜２００、より好ましくは５０〜２００のペプチドであって、ＴＰ４７Ｋダルトン抗原タンパク質を用いる抗トレポネーマ・パリダム抗体の免疫測定方法において非特異反応を抑制する活性を有し、ＴＰ抗原タンパク質の抗原性を有しないペプチドに関する。ここで配列番号１に記載のアミノ酸配列は、トレポネーマ・パリダムの４７Ｋダルトン抗原タンパク質のアミノ酸配列における１２６〜２９５番目に相当するアミノ酸配列である。このようなペプチドとしては、以下の配列番号４〜３６に記載のアミノ酸配列を含むペプチドを挙げることができる。
（１）ＥＧＡＶＡＬＡＤＲＡ（配列番号４）
（２）ＬＡＤＲＡＳＳＦＭＶ（配列番号５）
（３）ＳＳＦＭＶＤＳＥＥＹ（配列番号６）
（４）ＤＳＥＥＹＫＩＴＮＶ（配列番号７）
（５）ＫＩＴＮＶＫＶＨＧＭ（配列番号８）
（６）ＫＶＨＧＭＫＦＶＰＶ（配列番号９）
（７）ＫＦＶＰＶＡＶＰＨＥ（配列番号１０）
（８）ＡＶＰＨＥＬＫＧＩＡ（配列番号１１）
（９）ＬＫＧＩＡＫＥＫＦＨ（配列番号１２）
（１０）ＫＥＫＦＨＦＶＥＤＳ（配列番号１３）
（１１）ＦＶＥＤＳＲＶＴＥＮ（配列番号１４）
（１２）ＲＶＴＥＮＴＮＧＬＫ（配列番号１５）
（１３）ＴＮＧＬＫＴＭＬＴＥ（配列番号１６）
（１４）ＴＭＬＴＥＤＳＦＳＡ（配列番号１７）
（１５）ＤＳＦＳＡＲＫＶＳＳ（配列番号１８）
（１６）ＲＫＶＳＳＭＥＳＰＨ（配列番号１９）
（１７）ＭＥＳＰＨＤＬＶＶＤ（配列番号２０）
（１８）ＤＬＶＶＤＴＶＧＴＧ（配列番号２１）
（１９）ＴＶＧＴＧＹＨＳＲＦ（配列番号２２）
（２０）ＹＨＳＲＦＧＳＤＡＥ（配列番号２３）
（２１）ＧＳＤＡＥＡＳＶＭＬ（配列番号２４）
（２２）ＡＳＶＭＬＫＲＡＤＧ（配列番号２５）
（２３）ＫＲＡＤＧＳＥＬＳＨ（配列番号２６）
（２４）ＳＥＬＳＨＲＥＦＩＤ（配列番号２７）
（２５）ＲＥＦＩＤＹＶＭＮＦ（配列番号２８）
（２６）ＹＶＭＮＦＮＴＶＲＹ（配列番号２９）
（２７）ＮＴＶＲＹＤＹＹＧＤ（配列番号３０）
（２８）ＤＹＹＧＤＤＡＳＹＴ（配列番号３１）
（２９）ＤＡＳＹＴＮＬＭＡＳ（配列番号３２）
（３０）ＮＬＭＡＳＹＧＴＫＨ（配列番号３３）
（３１）ＹＧＴＫＨＳＡＤＳＷ（配列番号３４）
（３２）ＳＡＤＳＷＷＫＴＧＲ（配列番号３５）
（３３）ＷＫＴＧＲＶＰＲＩＳ（配列番号３６）
【００２７】
上記のペプチドのうち、トレポネーマ・パリダムの４７Ｋダルトン抗原タンパク質のアミノ酸配列における１６５〜２４４番目に相当する配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むペプチドが好ましく。配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むペプチドがより好ましい。本発明のペプチドには、配列番号１又は２に記載のアミノ酸配列又はその一部からなるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸残基の欠失、付加、置換又は修飾を有するアミノ酸配列からなるペプチドであって、トレポネーマ・パリダム４７Ｋダルトン抗原タンパク質を含む抗原を用いる抗トレポネーマ・パリダム抗体の免疫測定方法において非特異反応を抑制する活性を有し、ＴＰ４７Ｋダルトン抗原タンパク質の抗原性を有しないペプチドも包含される。ここで数個とは１〜１０個、好ましくは１〜５個を意味する。これらのペプチドの長さは、特に限定されないが、アミノ酸数３以上、好ましくはアミノ酸数３〜２００、より好ましくはアミノ酸数５０〜２００である。
本発明においてペプチドとは、２個以上のアミノ酸がペプチド結合により結合したものを意味し、オリゴペプチド、ポリペプチド及びタンパク質を包含する。
【００２８】
更に、本発明に使用されるペプチドは、非特異反応抑制効果が維持され、かつ融合体自体が非特異反応を起こさないものであれば、他のタンパク質、ペプチド、炭水化物、脂質残基又はアミノ酸等が結合しているものであってもよい。ここで、他のタンパク質としては、本発明のペプチドを効率よく発現又は精製等させるためのタンパク質、例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースバインディングプロテイン（ＭＢＰ）、チオレドキシン、β−ガラクトシダーゼ、ラクターゼ、ビオチン化タンパク、プロテインＡ又はジーン１０等を挙げることができる。
【００２９】
上記のような本発明のペプチドは、当技術分野で通常用いられる方法で調製することができ、このような方法としては特に限定されないが、例えば、化学合成法、遺伝子組み換え技術等の方法を用いることができる。
遺伝子組み換え技術を用いる場合は、例えば、まず目的とするペプチドをコードする遺伝子をクローニングし、得られた遺伝子をプラスミド等の発現ベクターへ組み込む。この発現ベクターを大腸菌等の宿主細胞に導入し、得られた形質転換体を培養することにより目的のペプチドを発現させることができる。
【００３０】
遺伝子をクローニングする方法としては、例えば、ＰＣＲ法、リコンビナントＰＣＲ法、ライゲーション法又はリンカーライゲーション法等を挙げることができる。例えば、ＰＣＲ法を用いる場合には、目的とする塩基配列をプライマーを用いて増幅させることができる。
【００３１】
例えば、配列番号１に記載のアミノ酸配列の全体からなるペプチドを発現させるためには、まず、ＰＣＲ法を用いてＴＰ４７Ｋダルトン抗原タンパク質のアミノ酸配列中における配列番号１のアミノ酸配列をコードする遺伝子の塩基配列を、プライマーを用いて増幅することにより得る。このようにして得られた遺伝子の塩基配列をライゲーション法等により発現ベクターに組み込み、この発現ベクターを大腸菌に導入し、得られた形質転換体を培養することにより、配列番号１に記載のアミノ酸配列の全体に一致するアミノ酸配列からなるペプチドを発現させることができる。
【００３２】
本発明のペプチドを用いて抗体測定における非特異反応を抑制する場合の、該ペプチドの使用方法は、測定しようとする試料と本発明の非特異反応抑制ペプチドを接触させることができれば特に限定されない。例えば、緩衝液等に含有させた本発明のペプチドを、抗体測定反応の前に試料と接触させ、あらかじめ非特異反応を抑制させる方法が挙げられる。又は、ＴＰ４７Ｋダルトン抗原タンパク質を含む抗原が存在する試薬中に本発明のペプチドを含有させ、この試薬と試料を接触させて抗体測定反応を行い、試料中の抗ＴＰ抗体と抗原との反応の際に本発明のペプチドを共存させる方法でもよい。あるいは、これらの２つの方法を組み合わせた方法でもよい。
【００３３】
本発明において試料とは、抗ＴＰ抗体が存在する可能性があり、かつ抗ＴＰ抗体の存在の有無又は含有量（濃度）の測定を行う対象を意味し、例えば、ヒト又は動物の血液、血清、血漿、尿、唾液等の体液等を挙げることができる。
使用するペプチドの量は、抗ＴＰ抗体測定時に生じる非特異反応の強さに応じて変えることができ、非特異反応を吸収するのに充分な濃度を適宜設定すればよい。例えば、抗体測定時に存在する本発明のペプチドの濃度が、好ましくは０．０００１％（ｗ／ｖ）以上、より好ましくは０．０００１〜１％（ｗ／ｖ）、さらに好ましくは０．０１〜１％（ｗ／ｖ）の濃度となるような量で使用するのが好ましい。
【００３４】
本発明のペプチドを含有させる上記緩衝液は、特に限定されないが、例えば、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液、リン酸緩衝液若しくはリン酸緩衝生理食塩水などの各種緩衝液等を挙げることができる。緩衝液中に反応促進剤及び安定剤等の添加剤をさらに含有させてもよい。従来技術において使用されているような別の非特異反応抑制物質等と共に使用することもできる。
【００３５】
例えば、抗ＴＰ抗体測定方法としてラテックス比濁法を使用して２ステップ法により測定を行う場合は、緩衝液からなる第１試薬に本発明のペプチドを含有させ、これをあらかじめ試料と接触させることにより、抗ＴＰ抗体の測定を行う前に非特異反応を抑制させ、その後これをＴＰ抗原が固定化されたラテックス粒子が存在する第２試薬と接触させることができる。また、ＴＰ抗原が固定化されたラテックス粒子が存在する第２試薬中に本発明のペプチドを含有させ、この第２試薬を、試料と第１試薬との混合物に接触させて抗体測定反応を行い、抗ＴＰ抗体の測定反応時に本発明のペプチドを共存させてもよい。あるいは、これらの２つの方法を組み合わせて使用してもよい。
抗体測定方法として担体を用いる測定方法を使用する場合、使用する担体の種類や形状は特に限定されず、当技術分野で通常使用されるものを用いることができる。
【００３６】
ラテックス比濁法に使用可能な担体としては、特に限定されないが、例えば、ポリスチレン・ラテックス粒子、スチレン−スチレンスルホン酸塩共重合体・ラテックス粒子、アクリロニトリル−ブタジエン−スチレン共重合体・ラテックス粒子、塩化ビニル−アクリル酸エステル共重合体・ラテックス粒子、酢酸ビニル−アクリル酸共重合体・ラテックス粒子、ポリアクロレイン・ラテックス粒子、スチレン−メタクリル酸共重合体・ラテックス粒子、スチレン−グリシジル（メタ)アクリル酸共重合体・ラテックス粒子、メタクリル酸重合体・ラテックス粒子、又はアクリル酸重合体・ラテックス粒子などの合成高分子粒子を均一に懸濁させたラテックス粒子等を挙げることができる。
【００３７】
粒子凝集反応測定法又はラテックス凝集反応測定法などの間接凝集反応測定法において使用可能な担体としては、特に限定されないが、例えば、ポリスチレン、リポソーム、ラテックス、ゼラチン、ポリアクリルアミド、マイクロカプセル若しくはエマルジョン等の有機高分子物質よりなる粒子、ガラス、シリカゲル、カーボン若しくはベントナイト等の無機高分子物質よりなる粒子又はその他の人工担体等を挙げることができる。
【００３８】
上記の担体粒子は、色素を被覆するか又は色素を粒子中に分散若しくは封入させることにより着色したものでもよい。担体粒子の粒径については、特に限定されないが、その平均粒子径が０．０１〜１００μｍの範囲内にあることが好ましく、０．１〜１０μｍの範囲内にあることがより好ましい。また、これらの粒子の比重は、１〜１０の範囲内にあることが好ましく、１〜２の範囲内にあることがより好ましい。
【００３９】
また、間接凝集反応測定法においては、例えば、ガラス、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル又はポリメタクリレートなどからなる試験管、マイクロプレート（マイクロタイタープレート）又はトレイ等の容器を担体として使用することもできる。このような容器の溶液収容部分、すなわち、マイクロプレートのウェル等の底面の形状は、特に限定されないが、Ｕ型、Ｖ型又はＵＶ型のように底面中央から周辺にかけて傾斜をもつ形状であることが好ましい。
【００４０】
また、酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法、放射免疫測定法若しくは発光免疫測定法などの標識物質を用いる標識免疫測定法において使用できる担体としては、特に限定されないが、例えば、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリビニルトルエン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ナイロン、ポリメタクリレート、ポリアクリルアミド、ラテックス、リポソーム、ゼラチン、アガロース、セルロース、セファロース若しくはガラス等の材質よりなる粒子、マイクロカプセル、ビーズ、マイクロプレート（マイクロタイタープレート）、試験管、スティック又は試験片等を挙げることができる。
【００４１】
また、特開平９−２２９９３６号公報及び特開平１０−１３２８１９号公報などに記載された、被検物質（被検物質）に対する特異的結合物質が固定化され被覆された面を有する担体並びに被検物質（被検物質）に対する特異的結合物質が固定化された粒子を用いる測定法において使用できる担体としては、特に限定されないが、例えば、ポリスチレン、ガラス、ポリ塩化ビニル、ポリアクリレート、ポリプロピレン、ナイロン、ポリエチレン、ポリカーボネート、ポリメタクリレート等の非吸水性の材料からなる担体が挙げられる。
本発明においては、上記の担体を強磁性体で被覆するか又は担体成型時に強磁性体を含有させて調製した磁性担体等を用いることもできる。
【００４２】
標識免疫測定法において使用される標識は、当技術分野で通常用いられるものであれば、特に限定されないが、酵素標識を用いるのが好ましい。酵素標識としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、ウレアーゼ、リゾチーム、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、リボヌクレアーゼ等が挙げられる。
【００４３】
本発明において抗ＴＰ抗体測定試薬とは、前記した抗ＴＰ抗体の免疫測定方法において使用するための試薬を意味する。抗ＴＰ抗体測定試薬としては、本発明のペプチドを含む試薬、さらにＴＰ４７Ｋダルトン抗原タンパク質を含む試薬が挙げられる。抗原タンパク質は担体に固定化されていてもよい。抗ＴＰ抗体測定試薬は、その他の抗原タンパク質などのさらなる成分を含んでいてもよい。抗ＴＰ抗体測定試薬に含まれる本発明のペプチドの量は、抗ＴＰ抗体の測定における反応を阻害せず、非特異反応抑制効果を有するのであれば特に限定されないが、好ましくは０．０００１〜１％（ｗ／ｖ）、より好ましくは０．０１〜１％（ｗ／ｖ）である。
【００４４】
本発明の抗ＴＰ抗体測定試薬は、特にこれらに限定するものではないが、例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、カゼイン若しくはその塩などのタンパク質；各種塩類；各種糖類；脱脂粉乳；正常ウサギ血清などの各種動物血清；アジ化ナトリウム若しくは抗生物質などの各種防腐剤；活性化物質；反応促進物質；ポリエチレングリコールなどの感度増加物質；非特異的反応抑制物質等の１種又は２種以上を適宜含有していてもよい。これらの成分の抗ＴＰ抗体測定試薬における濃度は特に限定されるものではないが、０．００１〜１０％（ｗ／ｖ）が好ましく、特に０．０１〜５％（ｗ／ｖ）が好ましい。
【００４５】
本発明の抗ＴＰ抗体測定試薬の製造においては、その溶媒として各種の水系溶媒を用いることができる。水系溶媒としては、特に限定されないが、例えば、精製水、生理食塩水、又はトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液、リン酸緩衝液若しくはリン酸緩衝生理食塩水などの各種緩衝液等を挙げることができる。
【００４６】
抗ＴＰ抗体測定試薬のｐＨについては、適宜適当なｐＨを選択して用いればよく、特に制限はないものの、通常は、ｐＨ３〜１２の範囲内のｐＨが選択される。本発明においては、アルカリ性領域のｐＨを用いるのが好ましい。ｐＨがｐＨ７．３以上、例えば、ｐＨ８〜１０であるとより好ましい。
【００４７】
本発明の抗ＴＰ抗体測定試薬は、そのもの単独でも又はその他の試薬と組み合わせて使用してもよい。他の試薬としては、例えば、緩衝液、試料希釈液、試薬希釈液、標識物質を含有する試薬、発色などのシグナルを生成する物質を含有する試薬又はキャリブレーションを行うための物質を含有する試薬等を挙げることができる。
本発明における抗ＴＰ抗体測定試薬を用いて、試料中の抗ＴＰ抗体の測定を行うには、使用する免疫測定方法の測定原理に基づく操作法に従って操作を行えばよい。
【００４８】
本発明はまた、抗ＴＰ抗体測定試薬、上記の他の試薬及び担体等を、使用する測定法の原理に基づいて適宜組み合わせた免疫測定用のキットを包含する。このようなキットとしては、例えば、標識免疫測定法で使用する場合は、抗ＴＰ抗体測定試薬と標識抗原及び抗体希釈液等を含むものが好ましく、間接凝集反応測定法で使用する場合は、抗ＴＰ抗体測定試薬と粒子分散液等を含むものが好ましい。
以下、本発明を実施例により更に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００４９】
【実施例】
〔実施例１〕
非特異反応を抑制する活性を有するペプチドの調製
トレポネーマ・パリダムを継代培養したウサギ睾丸の破砕物より、トレポネーマ・パリダム菌体を抽出し、遺伝子を抽出した。ＴＰ４７Ｋダルトン抗原タンパク質の塩基配列は、既述のように既に知られており、その全アミノ酸配列は配列番号３に示すとおりである。このアミノ酸配列を下記に示す５つの領域に分け、各々のＴＰ４７Ｋダルトン抗原タンパク質断片を以下の方法により調製した。
実施例１：配列番号３の１２６〜２９５番目の配列からなるペプチド
比較例１：配列番号３の１〜１６４番目の配列からなるペプチド
比較例２：配列番号３の２４４〜４１５番目の配列からなるペプチド
比較例３：配列番号３の１〜２９５番目の配列からなるペプチド
比較例４：配列番号３の１２６〜４１５番目の配列からなるペプチド
【００５０】
まず、ＴＰ４７Ｋダルトン抗原タンパク質断片をコードする塩基配列の両端の２０塩基程度のオリゴヌクレオチドを各々プライマーとして合成した。ここで５つの領域に分けた前記の塩基配列を鋳型とし、上記のプライマーを用いて、ＰＣＲ法により５種類のＴＰ４７Ｋダルトン抗原タンパク質断片をコードする塩基配列を増幅した。次に、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）をコードする塩基配列を含むベクター（ファルマシア社製；ｐＧＥＸ４Ｔ３）に、得られた５種類の塩基配列を各々挿入した。このベクターを大腸菌に導入し、菌体の培養を行った。その後、ＴＰ４７Ｋダルトン抗原タンパク質の断片が十分に発現した大腸菌を超音波処理により破砕し、これを遠心分離しその沈殿を８Ｍ尿素で可溶化し、その後透析して尿素を除去した。これをさらに遠心分離し、その上清を回収することによって純度５０％以上のＴＰ４７Ｋダルトン抗原タンパク質の断片５種類を得た。
【００５１】
〔実施例２〕
トレポネーマ・パリダムに対する抗体（抗ＴＰ抗体）の測定における、上記ペプチド断片の非特異反応抑制効果を、ＥＬＩＳＡ法を用いて確認した。
（１）ＴＰ４７Ｋダルトン抗原タンパク質固定化プレートの調製
▲１▼  洗浄液の調製
０．０２％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝生理食塩水を調製し、洗浄液とした。
▲２▼  ブロッキング液の調製
０．５％（ｗ／ｖ）カゼインナトリウムを含むリン酸緩衝生理食塩水を調製し、ブロッキング液とした。
▲３▼  ＴＰ４７Ｋダルトン抗原タンパク質固定化プレートの調製
【００５２】
トレポネーマ・パリダムの４７Ｋダルトン抗原タンパク質を、Ｌ．Ｗｅｉｇｅｌ，Ｍ．Ｎｏｒｇａｒｄらの方法（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、６０巻、１５６８〜１５７６頁，１９９２年）に従い、遺伝子組み換え技術により調製した。このＴＰ４７Ｋダルトン抗原タンパク質を、２μｇ／ｍＬとなるように、リン酸緩衝生理食塩水に加えた。これを９６穴マイクロタイタープレート（ヌンク社製）のウェルに各５０μＬずつ分注し、その後４℃で一晩放置して、ＴＰ４７Ｋダルトン抗原タンパク質を各ウェルの内壁に固定化させた。
【００５３】
次に、この９６穴プレートの各ウェル内の液を除き、前記▲１▼の洗浄液で２回洗浄した。その後、各ウェルに前記▲２▼のブロッキング液を２００μＬずつ分注して、各ウェルのブロッキングを行った。そして、このプレートの各ウェル内の液を除き、前記洗浄液で２回洗浄を行った。以上の操作により調製したものを、ＴＰ４７Ｋダルトン抗原タンパク質固定化プレートとした。
【００５４】
（２）ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）標識抗体の調製
ＰＯＤ標識ウサギ抗ヒトＩｇＧ抗体溶液（ダコ社製；Ｐ０４０６）を０．５％（ｗ／ｖ）カゼインナトリウムを含むリン酸緩衝生理食塩水で１０００倍に希釈した。
【００５５】
（３）試料希釈液の調製
０．５％（ｗ／ｖ）カゼインナトリウムを含むリン酸緩衝生理食塩水を調製し、これに実施例１で調製した実施例１及び比較例１〜４のペプチド断片を終濃度で０．０２％（ｗ／ｖ）となるように添加した。また、いずれのペプチドも添加しないものを対照例とした。
【００５６】
（４）抗ＴＰ抗体測定における非特異反応抑制効果
（３）で調製した試料希釈液で２００倍希釈した偽陽性血清（１試料）又は抗ＴＰ抗体陽性血清（１４試料）５０μＬずつを、前記（１）で調製したＴＰ４７Ｋダルトン抗原タンパク質固定化プレートの各ウェルに添加し、３７℃で４時間反応させた。その後、このプレートのウェル内の血清液を除き、前記洗浄液で洗浄した。
更に、前記（２）で調製したＰＯＤ標識ウサギ抗ヒトＩｇＧ抗体溶液を各ウェルに５０μＬずつ添加し、室温で４時間反応させた。次いで、各ウェルを前記洗浄液にて洗浄した。
【００５７】
この後、発色液（４ｍＭ ο−フェニレンジアミン、１０３ｍＭリン酸水素二ナトリウム、４９ｍＭクエン酸を含む緩衝液１ｍＬに対して３３μＬの０．３％過酸化水素を使用直前に添加したもの）１００μＬを各ウェルに添加し、室温で２０分間反応させた後、４Ｎ硫酸水溶液５０μＬを各ウェルに添加し、反応を停止させた。
その後、マイクロプレートリーダー（バイオラッド社製；３５５０型）を用いて各ウェルの４９０ｎｍの吸光度を測定した。得られた吸光度を、表１に示す。
【００５８】
【表１】
0003799410.tif 000002
【００５９】
（５）考察
表１より、比較例１及び比較例２のペプチドを使用した場合には、偽陽性試料を測定した場合の試料との反応性は、対照例を１００％とした場合に、比較例１では、８６．４％、比較例２では、８５．９％となっており、非特異反応を抑制できていないことが分かる。更に、陽性試料を測定した場合には、試料によっては、陽性試料に含まれていた抗ＴＰ抗体を吸収してしまっているために、対照例と比較して吸光度が減少してしまっている。すなわち比較例１及び比較例２のペプチドは、非特異反応を抑制する活性がなく、しかも、ＴＰ４７Ｋダルトン抗原タンパク質としての抗原性が残っているために感度の低下を引き起こし、正確な測定ができていないことが分かる。
【００６０】
また、比較例３及び比較例４のペプチドを使用した場合には、偽陽性試料を測定した場合の試料との反応性は、対照例を１００％とした場合に、比較例３では、３５．６％、比較例４では、１４．５％となっており、非特異反応を抑制できているが、陽性試料を測定した場合には、試料によっては、陽性試料に含まれていた抗ＴＰ抗体を吸収してしまっているために、対照例と比較して吸光度が減少してしまっている。すなわち比較例３及び比較例４のペプチドには、ＴＰ４７Ｋダルトン抗原タンパク質としての抗原性が残っており、このために感度の低下を引き起こし、正確な測定ができていないことが分かる。
【００６１】
これに対して、実施例１のペプチドを使用した場合には、偽陽性試料を測定した場合の試料との反応性は、対照例を１００％とした場合に、２０．４％となっており、非特異反応を抑制できていることが分かる。更に、陽性試料を測定した場合にも、試料によるばらつきはあるものの、陽性試料との反応性が維持されており、本発明のペプチドにはＴＰ４７Ｋダルトン抗原タンパク質としての抗原性は殆ど残っていないことが分かる。
【００６２】
従って、本発明のペプチドを使用することにより、非特異反応を抑制することができ、かつ試料に含まれている抗ＴＰ抗体を吸収してしまうことがなく感度を高く保つことができるので、試料中の抗ＴＰ抗体を正確に測定できることが確かめられた。
【００６３】
また、本発明、比較例１及び比較例２の結果から、本発明のペプチドのアミノ酸配列のうち、比較例１及び比較例２のＴＰ４７Ｋダルトン抗原タンパク質断片のアミノ酸配列に含まれない１６５〜２４４番目に相当する配列が、非特異反応の抑制に関与していると考えられる。
【００６４】
〔実施例３〕
特開平９−２２９９３６号公報及び特開平１０−１３２８１９号公報等に記載された測定方法を用い、トレポネーマ・パリダムに対する抗体（抗ＴＰ抗体）測定における本発明のペプチドの非特異反応抑制効果を確認した。
【００６５】
（１）ペプチドの調製
実施例１と同様にして、本発明のペプチド（実施例１）を調製した。
（２）抗ＴＰ抗体測定器具の作製
アクリル樹脂押出板１（幅１０ｍｍ、奥行き３８ｍｍ、厚さ１ｍｍ）〔アクリサンデー社製〕の手前の端から１５ｍｍより１８ｍｍの部分（図１の３の位置）に、実施例２の（１）の▲３▼と同じ方法で遺伝子組み換えにより調製したＴＰ４７Ｋダルトン抗原タンパク質２μｇ／ｍＬをピペットを用いて載せ、３７℃で３時間静置することにより抗原の固定化を行った。
【００６６】
次いで、溶液をピペットで吸引除去後、０．５％（ｗ／ｖ）カゼインを含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．５，５０ｍＭ）（以下、これを希釈液Ａという）０．３ｍＬをここに加えて、４℃で一晩放置し、これをピペットで吸引除去することによりマスキングを行い、判定部３とした。
【００６７】
次に、図１のＡに示すように、中央に２本の枠４（奥行き１６ｍｍ、高さ０．５ｍｍ、枠間の間隔５ｍｍ）を形成した透明板よりなるカバー２（幅１２ｍｍ、奥行き４０ｍｍ、厚さ２．５ｍｍ）及び試料吸収部８（ベルクリンＥ２、鐘紡社製、厚さ２ｍｍのものを幅４ｍｍ、奥行き５ｍｍに裁断したもの）を、前記のアクリル樹脂押出板１の上に、図２のＡに示すように組み合わせることにより、図２のＡに示すアクリル樹脂押出板１とカバー２で囲まれた高さ０．５ｍｍ、奥行き１６ｍｍ、幅５ｍｍの空間を有する通路６を設けた。そして、カバー２に設けられた開口部５（幅５ｍｍ、奥行き２ｍｍ、厚さ２．５ｍｍ）が試料供給部５となる。なお、図１のＢはカバー２の横断面図、図１のＣはカバー２を裏側から見た図である。
【００６８】
更に、図１のＡに示すように、中央部に前記試料供給部と同じ大きさの穴を有し、かつ、この穴の片側面が上部にかけて広がるように成型した透明な障害物７（幅７ｍｍ、奥行き８ｍｍ、高さ１ｍｍ）を、前記試料供給部５の上にアクリル接着剤で張り付けた。これを抗ＴＰ抗体測定器具とした。図２のＢは抗ＴＰ抗体測定器具の縦断面図である。
【００６９】
（３）ＴＰ４７Ｋダルトン抗原タンパク質固定化粒子の調製
粒子（磁性粒子）〔Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ−４５０ ｕｎｃｏａｔｅｄ、ダイナル社製、粒径：４．５μｍ、粒径のＣ．Ｖ．５％以下、比重１．５、濃度６％（ｗ／ｖ）〕と実施例２の（１）の▲３▼と同じ方法で調製したＴＰ４７Ｋダルトン抗原タンパク質（ｐＨ７．０の１０ｍＭリン酸緩衝液に濃度１００μg／ｍＬで溶解したもの）１ｍＬを混合し、３７℃で１時間反応させた。これに０．５％（ｗ／ｖ）カゼインを含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．５、５０ｍＭ）を約２０倍量加えてマスキングを行い、得られた粒子を希釈液Ａにて洗浄した。この粒子を濃度が約０．２％（ｗ／ｖ）となるようにグリシン緩衝液（ｐＨ９．５、５０ｍＭ）に再分散させた。このようにして、ＴＰ４７Ｋダルトン抗原タンパク質固定化粒子分散液を調製した。
【００７０】
（４）抗ＴＰ抗体測定におけるペプチドの非特異反応抑制効果
前記（３）で調製したＴＰ４７Ｋダルトン抗原タンパク質固定化粒子分散液に前記（１）で調製したペプチドを終濃度で０．２％（ｗ／ｖ）となるように添加した。また、ペプチドを添加しないものを、対照例とした。
偽陽性血清（３試料）又は抗ＴＰ抗体陽性血清（１試料）５０μＬずつを、上記（２）で作製した抗ＴＰ抗体測定器具の各試料供給部５にピペットを用いて載せることにより、判定部３に接触させた。
【００７１】
これにより試料は、前記測定器具の通路６内を移動して判定部３に接触した後、試料吸収部８に吸収される。
この判定部３に接触させた偽陽性試料又は陽性試料が試料吸収部８に吸収除去された後、上記(３)で作製したＴＰ４７Ｋダルトン抗原タンパク質固定化粒子分散液を、この抗ＴＰ抗体測定器具の各試料供給部５にピペットを用いて載せることにより、判定部３に接触させた。
【００７２】
その後、この抗ＴＰ抗体測定器具の判定部３が形成された側面方向に磁石を配置することにより、ＴＰ４７Ｋダルトン抗原タンパク質固定化粒子が移動するよう、試料供給部５から試料吸収部８の方向に磁束密度４０〜６０ガウスの磁場を発生させた。
【００７３】
磁場を発生させてから１分後の判定結果を表２に示す。なお、＋は判定部３に粒子の像が認められた場合、＋Ｗは判定部３に粒子の弱い像が認められた場合、−は判定部３に粒子の像が認められなかった場合を示している。
【００７４】
【表２】
0003799410.tif 000003
【００７５】
（５）考察
表２に示したとおり、対照例では、偽陽性試料１の判定結果は＋（判定部３に粒子の像が認められた）を示し、偽陽性試料２及び３の判定結果は＋Ｗ（判定部３に粒子の弱い像が認められた）を示しており、非特異反応を抑制できていないことが確かめられた。
【００７６】
これに対して、本発明のペプチドを用いた場合は、偽陽性試料１〜３の全ての判定結果が−（判定部３に粒子の像が認められなかった）を示しており、非特異反応を抑制できていることが確かめられた。更に、陽性試料を測定した場合の判定結果も＋を示しており、本発明の非特異反応抑制ペプチドにはＴＰ４７Ｋダルトン抗原タンパク質としての抗原性は残っていないことが分かる。
【００７７】
従って、本発明のペプチドを使用することにより、非特異反応を抑制することができ、かつ試料に含まれていた抗ＴＰ抗体を吸収してしまうことがなく感度を高く保つことができるので、試料中の抗ＴＰ抗体を正確に測定できることが確かめられた。
【００７８】
〔実施例４〕
トレポネーマ・パリダムに対する抗体（抗ＴＰ抗体）測定における、本発明のペプチドの非特異反応抑制効果をラテックス凝集法を用いて確認した。
（１）第１試薬の調製
試料の希釈液として、下記の第１試薬を調製した。
４％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、０．２％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール及び１５ｍＭアジ化ナトリウムを含有する５０ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）に実施例１で調製した本発明のペプチドを各々終濃度で０．００８％（ｗ／ｖ）又は０．０８％（ｗ／ｖ）となるように添加した。また、ペプチドを添加しないものを、対照例とした。
【００７９】
（２）第２試薬の調製
▲１▼  トレポネーマ・パリダムの４７Ｋダルトン抗原タンパク質を、Ｌ．Ｗｅｉｇｅｌ，Ｍ．Ｎｏｒｇａｒｄらの方法（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ６０巻、１５６８〜１５７６頁、１９９２年）に従い、遺伝子組み換え技術により調製した。
▲２▼  前記▲１▼にて調製したトレポネーマ・パリダムの４７Ｋダルトン抗原タンパク質を、最終濃度が５０μｇ／ｍＬとなるように、５０ｍＭグリシン緩衝液（ｐＨ９．０）に添加し、溶解させた。
【００８０】
▲３▼  ラテックス粒子〔積水化学社製、平均粒径０．４μｍ、ポリスチレン〕を、０．５％（ｗ／ｖ）となるように、５０ｍＭグリシン緩衝液（ｐＨ９．０）に添加し、懸濁させた。
▲４▼  前記▲２▼のトレポネーマ・パリダムの４７Ｋダルトン抗原タンパク質の溶液の０．２ｍＬと、前記▲３▼のラテックス粒子の懸濁液の０．２ｍＬを混合した。
その後、３７℃で３時間静置して、前記トレポネーマ・パリダムの４７Ｋダルトン抗原タンパク質の前記ラテックス粒子への固定化を行った。
【００８１】
▲５▼  前記▲４▼のトレポネーマ・パリダムの４７Ｋダルトン抗原タンパク質を固定化したラテックス粒子の懸濁液に、１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含有する５０ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−塩酸緩衝液（ｐＨ７．２）の１ｍＬを添加し、３７℃で２時間静置して、担体であるラテックス粒子の表面のブロッキング処理（マスキング処理）を行った。
【００８２】
▲６▼  前記▲５▼のブロッキング処理（マスキング処理）の後、回転数１４，０００ｒｐｍで、１０℃にて２０分間遠心分離を行った。
遠心分離後、デカンテーションにより上清を除き、沈殿物であるラテックス粒子（トレポネーマ・パリダムの４７Ｋダルトン抗原タンパク質を固定化したラテックス粒子）を得た。
▲７▼  ０．２５％（ｗ／ｖ）の前記▲６▼で調製したラテックス粒子を含む、３００ｍＭ塩化ナトリウム、１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ及び１５ｍＭアジ化ナトリウムを含有する５０ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−塩酸緩衝液（ｐＨ７．２）を調製し、第２試薬とした。
【００８３】
（３）抗ＴＰ抗体測定におけるペプチドの非特異反応抑制効果
▲１▼  ９６穴マイクロタイタープレート（ヌンク社製）のウェルに前記の第１試薬の８７．５μＬを添加し、次にこれに偽陽性血清（２試料）又は抗ＴＰ抗体陽性血清（１試料）１０μＬずつを加え混合した。
▲２▼  このウェルに更に、前記の第２試薬の１２．５μＬを添加し、混合した後、直ちに、このウェル内の混合液の吸光度（主波長：４９０ｎｍ、副波長：６５５ｎｍ）をマイクロプレートリーダー（３３５０型、バイオラッド社製）で測定した。
【００８４】
▲３▼  前記の吸光度の測定の後、直ぐに前記マイクロタイタープレートを３７℃で静置した。
▲４▼  前記▲２▼における吸光度の測定から１０分後に、前記のウェル内の反応混合液の吸光度を前記▲２▼の場合と同様にして測定した。
▲５▼  前記▲４▼において測定した吸光度から前記▲２▼において測定した吸光度を差し引き、吸光度差を得た。この吸光度差は試料に含まれる抗ＴＰ抗体の量（濃度）に比例することとなる。
【００８５】
（４）測定結果
前記（３）において、試料中の抗ＴＰ抗体の測定を行って得られた吸光度差を、表３に示す。
【００８６】
【表３】
0003799410.tif 000004
【００８７】
（５）考察
表３に示したとおり、対照例では、吸光度差が偽陽性試料１では０．００２１、偽陽性試料２では０．００６９を示し、非特異反応を抑制できていないことが確かめられた。
【００８８】
これに対して、本発明のペプチドを用いた場合は、偽陽性試料１では、本発明のペプチドの濃度が０．００８％の場合には吸光度差が０．０００１、濃度が０．０８％の場合には吸光度差が−０．０００１を示しており、非特異反応を抑制できていることが確かめられた。また、偽陽性試料２では、本発明のペプチドの濃度が０．００８％の場合には吸光度差が０．００４４であるが、濃度を０．０８％に増加した場合には吸光度差が０．０００６を示しており、非特異反応を抑制できていることが確かめられた。更に、陽性試料を測定した場合は、本発明のペプチドの濃度が０．００８％の場合には吸光度差が０．００３２であり、濃度が０．０８％の場合も０．００３４を示している。これは、本発明のペプチドを含有しない対照例での吸光度差（０．００３０）とほぼ同じ値であり、本発明の非特異反応抑制剤にはＴＰ４７Ｋダルトン抗原タンパク質としての抗原性は残っていないことが分かる。
【００８９】
従って、本発明の非特異反応抑制剤を使用することにより、非特異反応を抑制することができ、かつ試料に含まれていた抗ＴＰ抗体を吸収してしまうことがなく感度を高く保つことができるので、試料中の抗ＴＰ抗体を正確に測定できることが確かめられた。
【００９０】
【発明の効果】
本発明により、抗ＴＰ抗体の測定において非特異反応を抑制することができ、さらに、測定において抗ＴＰ抗体を吸収して免疫反応を阻害することもないため、疾患の診断等の場において正確な測定を行うことができる。
【００９１】
【配列表】
0003799410.tif 000005
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【図面の簡単な説明】
【図１】Ａは本発明の抗ＴＰ抗体測定器具の分解斜視図を表す。Ｂはカバー２の横断面図、Ｃはカバー２を裏側から見た図である。
【図２】本発明の抗ＴＰ抗体測定器具の斜視図及び縦断面図を表す。
【図３】表１の結果を、対照例の反応性に対する反応性％としてグラフに表したものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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