(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の式３〜８のいずれかで示されるセラミド類似物質からなることを特徴とするアポトーシス誘導剤。
【式３】
0003747091.tif 000011
【式４】
0003747091.tif 000012
【式５】
0003747091.tif 000013
【式６】
0003747091.tif 000014
【式７】
0003747091.tif 000015
【式８】
0003747091.tif 000016
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、アポトーシス誘導剤に関する。具体的にいうと、細胞の新陳代謝等に関係に深いアポトーシスを誘導するアポトーシス誘導剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
セラミドは、次の式２で示されるスフィンゴシンのアミノ基に脂肪酸が酸アミド結合した構造を有しており、このセラミドの末端の水酸基に、糖がグルコシド結合したスフィンゴ糖脂質や、エタノールアミンリン酸がエステル結合したスフィンゴリン脂質（狭義のスフィンゴリン脂質）などとして、あるいは、遊離型として動植物界に広く存在している。
0003747091.tif 000002
【０００３】
これらのセラミドに関しては、これまで高い保湿能を有することが見いだされ、上記式２で表されるセラミドを１種又は２種以上、薬用外用皮膚剤あるいは化粧料に配合することによって、角質層の水分保持能力を根本的に改善し、荒れた角質層を健常人と同レベルまでに機能回復させることができると報告されている。
【０００４】
しかし、植物や動物によって産生されるセラミドのアポトーシス誘導作用については、これまで数々報告されているが、セラミドを産生する細菌が非常に少なく、細菌より産成されるセラミドについての報告は未だない。
【０００５】
一方、細菌の生産するスフィンゴ糖脂質についても、Ｂ細胞活性化作用についての報告はされているが、これらについてもアポトーシス誘導作用があるとの報告もない。
【０００６】
ここでアポトーシスとは、個体の細胞死の一態様であって、物理的要因や化学的要因で引き起こされるネクローシスと対比される概念であり、ネクローシスとは、一般には、細胞が膨張し、次いで細胞膜が破裂して、細胞死に至る過程を示している。
【０００７】
一方、アポトーシスとは、個体の発生段階などで見られる細胞死を言い、この細胞死では、細胞や核が凝縮して、最終的には細胞の内容物を取り込んだまま細胞自身が断片化して、個体から脱落していく現象をいう。このアポトーシスは、現段階では、あらかじめ死ぬようにようにプログラム化されており、ある一定の分化過程に達すると自らアポトーシスを発揮して、自殺死を遂げると考えられている。つまり、個体の生命を維持するためには、個体を構成する細胞の分化と増殖だけではなく、特定の時期に特定の細胞が死滅することが必要である。
【０００８】
したがって、外部からの細菌やウイルスのアポトーシスを誘導することにより、細菌からの感染治療をうながしたり、あるいは皮膚の表皮細胞のアポトーシスを誘導することにより、皮膚の新陳代謝を促進することができると考えられる。
【０００９】
そこで、本発明者らは、免疫薬理活性に関して生化学的研究、細胞学的研究等を進めた結果、細菌、特に、スフィンゴバクテリウム属から分離されたセラミド類似物質にアポトーシス誘導作用があることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
本発明は叙上の従来例の欠点に鑑みてなされたものであり、その目的とするところは、新規で有効なアポトーシス誘導剤を提供することにある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明のアポトーシス誘導剤は、次の式１
0003747091.tif 000003
で示されるセラミド類似物質（ただし、式１中、Ｒ１基はアシル基、Ｒ２基は飽和アルキル基、Ｘは、水素、エタノールアミンリン酸基、単糖類リン酸基、イノシトールリン酸基のいずれか１種である。）のうち、前記式３〜式８のいずれかで示されるセラミド類似物質からなることを特徴としている。つまり、本願発明は、式３〜式８のいずれかで示されるセラミド類似物質をアポトーシス誘導剤として使用するものである。
【００１２】
本発明のアポトーシス誘導剤である式１に示されるセラミド類似物質は、主としてスフィンゴバクテリウム（Ｓｐｈｉｎｇｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属によって産生される物質であって、スフィンゴバクテリウム（Ｓｐｈｉｎｇｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属の細菌を培養することにより、主として菌体中に当該化合物を生成せしめ、かかる菌体から抽出することによって得ることができる。例えば、Ｓ．Ｓｐｉｒｉｔｉｖｏｒｕｍ、Ｓ．ｍｕｌｔｉｖｏｒｕｍ、Ｓ．ｖｅｒｓａｔｉｌｉｓ、Ｓ．ｍｉｚｕｔａｅなどの菌種を培養することにより、本発明のセラミド類似物質を得ることができる。また、これらの菌種に限られず、その他の近縁菌、あるいはＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ及びその他の近縁菌からも得ることができる。
【００１３】
これらの細菌から得られるセラミド類似物質は、特に、Ｒ２基として飽和アルキル基が結合している。これまで、自然界にセラミドにあっては、スフィンゴシンに代表されるように、不飽和のアルキル基がほとんどであったが、本発明においては、例えばスフィンガニン（ジヒドロスフィンゴシン）に代表されるように、飽和のアルキル基を有している。
【００１４】
また、従来のセラミドにあっては、Ｒ１基、Ｒ２基ともに、直鎖アルキル基が主たるものであったが、本発明のセラミド類似物質にあっては、Ｒ１基、Ｒ２基ともに分岐鎖を有しており、特に、イソ体であることを特徴としている。
【００１５】
さらに、本発明にあっては、Ｒ１基に水酸基を有するものが好ましく、具体的には、２位の炭素に水酸基が結合した２−ヒドロキシアシル基が望ましい。
【００１６】
また、自然界においては、Ｒ１基では偶数個の炭素数を有するアシル基及びＲ２基では奇数個の炭素数（末端の水酸基までは偶数個の炭素数）を有するものが一般的であるが、本発明に係るセラミド類似物質は、Ｒ１基の炭素数が奇数個であり、Ｒ２基の炭素数が偶数個である。
【００１７】
具体的には、例えば、式１のＸ基が水素である
0003747091.tif 000004
（以下、「ＬＣＢＦＡ−１」と称す。）
又は、式１のＸ基としてエタノールアミンリン酸がエステル結合した
0003747091.tif 000005
（以下、「ＣｅｒＰＥ−１」と称す。）
に示すように、Ｒ１基として、ＣＨ３ＣＨ（ＣＨ３）（ＣＨ２）１０ＣＨ２ＣＯ基（炭素数１５）であり、Ｒ２基として、ＣＨ３ＣＨ（ＣＨ３）（ＣＨ２）１１基（炭素数１４）であるものを得ることができる。
【００１８】
また、式１のＸ基が水素である
0003747091.tif 000006
（以下、「ＬＣＢＦＡ−２」と称す。）
又は、式１のＸ基としてエタノールアミンリン酸がエステル結合した
0003747091.tif 000007
0003747091.tif 000008
（以下、「ＣｅｒＰＥ−２」と称す。）
に示すように、Ｒ１基として、ＣＨ３ＣＨ（ＣＨ３）（ＣＨ２）１０ＣＨ（ＯＨ）ＣＯ基（炭素数１５）であり、Ｒ２基として、ＣＨ３ＣＨ（ＣＨ３）（ＣＨ２）１１基（炭素数１４）であるものを得ることができる。
【００１９】
さらに、本発明のセラミド類似物質の単糖類としては、グルコース、マンノース、フルクトースなどが挙げられる。また、スフィンゴバクテリウム属からは、イノシトールが結合したものが得られ、例えば、
0003747091.tif 000009
（以下、「ＣｅｒＸ−１」と称す。）
又は、
0003747091.tif 000010
（以下、「ＣｅｒＸ−２」と称す。）
に示すように、ホスホリルイノシトール誘導体が、優れたアポトーシス誘導作用を発揮する。
【００２０】
これらのセラミド類似物質を産生するスフィンゴバクテリウム属の培養法としては、従来から用いられている公知の合成培地および天然培地を用いることができ、特にスフィンゴバクテリウム属に属する細菌の培養に用いられる培地であれば、すべての培地が使用できる。
【００２１】
例えば、生育炭素源としては、グルコース、フルクトース、マンノースなどの単糖類、スクロース、トレハロース等の二糖類等を用いることができる。また、窒素源としては、例えば、硝酸カリウム、硝酸ナトリウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機窒素化合物、ペプトン、肉エキス、コーンスティーブリカー等の有機窒素化合物を利用できる。また、無機塩として、ナトリウム、カリウム、カルシウム、亜鉛、マグネシウム、マンガン、リン酸等を、さらに、成長因子として、各種ビタミン、アミノ酸類、または、それらを豊富に含む酵母エキスを適宜加えることにしてもよい。
【００２２】
培地のｐＨは５〜９、特に７〜７．５が至適範囲であり、培養温度は１０〜４０℃、好ましくは３０〜３７℃が適している。培養は、液体培養または固体培養で好気的条件下に行うことが好ましい。また、培養時間は、通常１〜７日程度とするのが適当である。
【００２３】
このようにして得られる菌体から、本発明のセラミド類似物質を得るには、菌体成分を採取する通常の方法を用いることができる。例えば、培養液を遠心分離をして集菌したのち、有機溶媒を加えて溶媒抽出すればよい。具体的に言うと、有機溶媒として、クロロホルムとメタノールの混液や、クロロホルムとメタノール、アセトンの混液のように、クロロホルムなどの疎水性溶媒やメタノールやアセトンなどの親水性溶媒とを単独、あるいは混合したものを用いるとよい。
【００２４】
次に、抽出した菌体成分をシリカゲルやモレキュラシーブなどに吸着させ、その後、先に述べたような溶媒で溶出して、さらに精製を加える。そして、溶媒に対する溶解度差やイオン結合力の差などを利用し、それぞれ単独の方法で、または２以上の方法を適当に組み合わせて、あるいは同様な操作を数回繰り返すことにより、本発明のセラミド類似物質等をほぼ純粋な物質として分離精製することができる。
【００２５】
こうして精製されたセラミド類似物質は、そのまま、あるいは適当な溶媒で希釈したり、さらに適当な賦形剤と混合することにより用いることができ、慣用の製剤化手段によって、各種軟膏剤、外用皮膚剤に用いることができる。例えば、クリーム、乳液等に代表される各種の水／油、油／水型乳化化粧料、口紅、ファンデーション、皮膚洗浄剤、育毛剤等として適用することができる。
【００２６】
また、セラミド類似物質としては、菌体から上述した方法により抽出し、純粋なものにまで精製する必要もなく、また、各種のセラミド類似物質の混合物として用いることとしてもよい。また、セラミド類似物質としては、炭素数の異なるものが混合した状態で得られるが、炭素数の異なるものそれぞれにまで分離精製する必要もない。さらに、毒性が発揮されず、適度なアポトーシス誘導作用を発揮する程度に、粗精製した菌体抽出物として用いてもよい。もちろん、合成によってもセラミド誘導体を得ることとしてもよく、合成した場合には純度の高いセラミド類似物質を得ることができる。
【００２７】
【実施例】
以下に本発明の実施例について具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
（実施例１）
〔菌体の培養〕
スフィンゴバクテリウム属（Ｓ．ｓｐｉｒｉｔｉｖｏｒｕｍ）を１白金耳採り、ハートインフージョンの平面寒天培地（日本製薬社製）に画線し、３０℃で２日間培養する。２日間培養したシャーレから１コロニーを白金耳で採り、ハートインフージョンの斜面寒天培地へ画線し、３０℃で１日間培養する。この斜面培地から培養菌体を１白金耳採り、ｐＨ７．０に調整した、以下に示す組成の培養用ＰＹＧ（Ｍ、Ｆ）培地２００ｍｌに植菌し、３０℃で１〜２日間、振とう培養法によって前培養した。この前培養菌液１０〜５０ｍｌ（前培養菌液の菌体濃度により、液量を適宜調整する。）を、同じ組成のＰＹＧ（Ｍ、Ｆ）培地１．５ｌに加え、３０℃で１〜７日間、本培養した。
【００２８】
〔ＰＹＧ（Ｍ、Ｆ）培地の組成〕
・ｐｏｌｙｐｅｐｔｏｎ（日本製薬製）            ０．５％
・ｙｅａｓｔｅｘｔｒａｃｔ（ＤＩＦＣＯ製）      ０．５％
・糖  （Ｄ（＋）−Ｇｌｕｃｏｓｅ、
和光純薬製）                            １％
【００２９】
〔セラミド類似物質の抽出精製〕
こうして得られた培養菌液を、７５００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、菌体を集菌する。次に集菌された菌体を、クロロホルムとメタノールの混液（容積比で２：１）を加え、超音波ホモジナイザーにて１５分間、超音波処理を行う。この処理した溶液を分液ロートに移し、水を加えて２層に分離させ、溶媒相を分取する。そして、分取した溶媒をエバポレーターにて濃縮し、脂質成分を得た。
【００３０】
ついで、この脂質成分を、水酸化カリウムの濃度が０．５Ｎとなるように調整したクロロホルムとメタノール混液（容積比１：２）に溶解させ、３７℃で２時間振盪して加水分解（弱アルカリ水解）を行い、その後、水酸化ナトリウムでｐＨを中性にして、アルカリ安定脂質とする。
【００３１】
さらに、得られたアルカリ安定脂質を薄層クロマトグラフィーにより展開して、分離精製した。つまり、アルカリ安定脂質を少量のクロロホルムなど適当な溶媒に溶かし、シリカゲルからなる分取用薄層板（ＵＮＩＰＬＡＴＥ  ＳＩＬＩＣＡ  ＧＥＬ  Ｇ  ＭＥＲＣＫ社製）上に、スポットした。そして、クロロホルムとメタノール、酢酸の混液（容量比１００：１０：５）にて展開した。次に、この薄層板上で分離された各脂質部分を掻き取り、掻き取ったシリカゲルを、それぞれ、ガラスカラムに充填して、クロロホルムとメタノールの混液（容量比３：１）で溶出し、薄層クロマトグラム上で単一スポットになるまで繰り返し行う。最後に溶媒を留去して、ＣｅｒＦＡ−１及びＣｅｒＦＡ−２で示すセラミド類似物質を得た。
【００３２】
また、分離されたリン脂質部分（ＣｅｒＰＥ−１、ＣｅｒＰＥ−２、ＣｅｒＸ−１、ＣｅｒＸ−２を含む部分）は、さらにクロロホルムとメタノール、酢酸、水の混液（容量比１００：２０：１２：５）で、３回展開し、薄層板上で分離された各成分を掻き取り、掻き取ったシリカゲルをガラスカラムに充填し、クロロホルムとメタノールの混液（容量比、２：１）で溶出し、薄層クロマトグラム上で単一スポットになるまで繰り返し行う。最後に溶媒を留去して、ＣｅｒＰＥ−１、ＣｅｒＰＥ−２、ＣｅｒＸ−１、ＣｅｒＸ−２をそれぞれ得た。
【００３３】
次に、こうして得られた各種のセラミド類似物質について、本発明の効果を確認するため、以下の試験を行なった。
【００３４】
アポトーシス誘導作用を検出する際には、細胞壊死であるネクローシスとの違いを明らかにする必要がある。アポトーシスが誘導された細胞は、上述したように、まず細胞が縮小し、クロマチンが凝縮し、凝縮した核は断片化する。また、細胞表面の微絨毛は消失して平滑化し、自己認識機構を担う細胞表面分子マーカーを徐々に喪失していく。さらに、細胞表面に大小の突起が出現し、やがてアポトーシス小体に断片化する。このアポトーシス小体は、生体内においてはやがてマクロファージのような貪食細胞によって除去される。
【００３５】
そこで、これらの現象に着目して、ヒト骨髄性白血病細胞ＨＬ−６０に本発明のセラミド類似物質を添加し、数時間後、アポトーシスが誘導されたかどうかを検出するため、以下のような複数の方法を用いて、実験を行った。
【００３６】
〔細胞形態の解析〕
まず、上記実施例で得られたセラミド類似物質、ＬＣＢＦＡ−２を用いて実験を行なった。ＬＣＢＦＡ−２をエタノールとドデカンの混液（容量比４９：１）に溶解させ、最終濃度が１．５μｇ／ｍｌ、ＨＬ−６０細胞が５×１０５個／ｍｌとなるように調整した。このものを３７℃、５％炭酸ガス存在下で４時間培養した。そして、１０００ｒｐｍ５分間遠心処理した後、上清液を捨てる。再び、細胞をｐＨ７．１のリン酸緩衝液に浮遊させ、さらに１０００ｒｐｍ５分間遠心処理にて洗浄を行なった。その後、洗浄したＨＬ−６０細胞を採取し、７０％エタノールで固定した後、これらの細胞についてフローサイトメトリーで解析を行った。
【００３７】
この解析には、細胞の大きさを表す指標としてｆｏｒｗａｒｄ  ｓｃａｔｔｅｒ（ＦＳＣ）、細胞内部の顆粒や構造状態を表すｓｉｄｅ  ｓｃａｔｔｅｒ（ＳＳＣ）を用いて、セラミド類似物質（ＬＣＢＦＡ−２）の添加によるＨＬ−６０細胞の形態変化を観察した。また、コントロールとして、ＬＣＢＦＡ−２の希釈溶媒として用いたエタノールとドデカンの混液（容量比４９：１）を用いて同様に処理を行ったＨＬ−６０細胞を用いて、ＨＬ−６０細胞の形態変化を観察した。その結果を、それぞれ図１（ａ）（ｂ）に示す。なお、フローサイトメトリーには、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製のＦＡＣＳｃａｎを用いた。
【００３８】
図１の各図において、縦軸はＳＳＣ強度（ＳＳＣ−Ｈｅｉｇｈｔ）を、横軸はＦＳＣ強度（ＦＳＣ−Ｈｅｉｇｈｔ）を示すが、ＦＳＣ強度が大きいほど細胞の大きさは大きく、ＳＳＣ強度が大きいほど細胞の構造状態は複雑であることを示している。図１（ａ）（ｂ）を比較して見るに、ＬＣＢＦＡ−２を加えた系〔図１（ａ）〕の方が、コントロール〔図１（ｂ）〕に比較して、ＦＳＣ強度の小さい領域が増大しており、細胞が縮小していることが分かる。
【００３９】
〔細胞表面抗原の解析〕
アポトーシスが誘導された細胞は、上記に示したように細胞が小片化した後、食細胞によって貪食されるように細胞表面にある自己認識マーカーが消失する。次に、この現象を確認するために、自己認識マーカーであるＭＨＣｃｌａｓｓＩ分子の発現量をフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）により蛍光標識した抗体を用いて解析した。
【００４０】
上記形態変化の解析で行なったのと同様、ＬＣＢＦＡ−２をエタノールとドデカンの混液（容量比４９：１）に溶解して、ＬＣＢＦＡ−２の最終濃度が１．５μｇ／ｍｌ、ＨＬ−６０細胞が５×１０５個／ｍｌとなるように調整した。このものを３７℃、５％炭酸ガス存在下で４時間培養した。そして、１０００ｒｐｍ５分間遠心処理した後、上清液を捨てる。再び、細胞をｐＨ７．１のリン酸緩衝液に浮遊させ、さらに１０００ｒｐｍ５分間遠心処理にて洗浄を行なった。その後、フローサイトメーターによって測定した。また、コントロールとして、ＬＣＢＦＡ−２の希釈に用いたエタノールとドデカンの混液（容量比４９：１）を添加したＨＬ−６０細胞を用いて同様に処理を行ない、自己認識マーカの消失した細胞を測定した。その結果を図２に示す。
【００４１】
図２において、横軸にＦＩＴＣが結合した細胞を検出する波長５３０ｎｍにおける蛍光強度を示し、縦軸にはその細胞数（Ｃｏｕｎｔｓ）を示した。コントロールにおいては、ほぼ同一の蛍光強度を持った細胞による単一のピークが現れているのに対し、本発明のセラミド類似物質（ＬＣＢＦＡ−２）で処理すると、蛍光強度が小さい細胞数が多くなり、アポトーシスが誘導されたことが確認された。
【００４２】
〔細胞周期の解析〕
ＨＬ−６０のように株化された培養細胞では、細胞周期を解析すると、ＤＮＡ複製を行うＳ期と細胞分裂の起こるＭ期、そしてその２つの間にあるＧ０／Ｇ１期、Ｇ２期の細胞の割合が一定となる。ここにおいて、アポトーシスが起こると、一定であった細胞周期が乱れる。そこで、ヨウ化プロピジウムにより細胞のＤＮＡを染色し、細胞周期の解析を行った。
【００４３】
上記形態変化の解析で行なったのと同様、ＬＣＢＦＡ−２をエタノールとドデカンの混液（容量比４９：１）に溶解して、ＬＣＢＦＡ−２の最終濃度が１．５μｇ／ｍｌ、ＨＬ−６０細胞が５×１０５個／ｍｌとなるように調整した。このものを３７℃、５％炭酸ガス存在下で４時間培養した。そして、１０００ｒｐｍ５分間遠心処理した後、上清液を捨てる。再び、細胞をｐＨ７．１のリン酸緩衝液に浮遊させ、さらに１０００ｒｐｍ５分間遠心処理にて洗浄を行なった。その後、７０％の冷エタノールで固定した後、５０μｇ／１のヨウ化プロピジウム水溶液を添加し、１０分後にフローサイトメータを用いて解析を行った。また、コントロールとして、ＬＣＢＦＡ−２の希釈に用いたエタノールとドデカンの混液（容量比４９：１）を添加したＨＬ−６０細胞を用いて同様に処理を行い、解析を行なった。その結果を図３に示す。
【００４４】
図３において、横軸にヨウ化プロピジウムを結合した細胞を検出する波長５８５ｎｍにおける蛍光強度を示し、細胞中に存在する染色されたＤＮＡ含量を意味している。また、縦軸にはその細胞数（Ｃｏｕｎｔｓ）を示した。正常な細胞は、コントロールに示すような蛍光強度分布を示すが、アポトーシスが誘導されると、通常の細胞周期からずれ、核の断片化を経て、核の小体を形成するために、ヨウ化プロピジウムによって染色される１細胞当たりのＤＮＡ量が減少し、蛍光強度が減少する。
【００４５】
図３から分かるように、本発明のアポトーシス誘導剤であるＬＣＢＦＡ−２を添加すると、ＤＮＡ含量の少ない細胞が多く見られ、通常の細胞周期からはずれた細胞が多くなった。この減少によっても、ＬＣＢＦＡ−２によりアポトーシスが誘導されたことが分かる。
【００４６】
〔ＤＮＡ断片化の解析〕
アポトーシスが誘導された細胞は、ＤＮＡの断片化が生じている。そこで、細胞よりＤＮＡを抽出し、アガロースゲル電気泳動を行い、ＤＮＡの断片化を観察した。
【００４７】
上記形態変化の解析で行なったのと同様、ＬＣＢＦＡ−２をエタノールとドデカンの混液（容量比４９：１）に溶解して、ＬＣＢＦＡ−２の最終濃度が１．５μｇ／ｍｌ、ＨＬ−６０細胞が５×１０５個／ｍｌとなるように調整した。このものを３７℃、５％炭酸ガス存在下で４時間培養した。そして、１０００ｒｐｍ５分間遠心処理した後、上清液を捨てる。再び、細胞をｐＨ７．１のリン酸緩衝液に浮遊させ、さらに１０００ｒｐｍ５分間遠心処理にて洗浄を行なった。その後、プロテイナーゼＫを加えて３７℃で一晩反応させた後、常法により、フェノールで抽出し、エタノール沈殿法によってＤＮＡを回収した。回収したＤＮＡは、常法に従い、アガロースゲル電気泳動にかけ、エチジウムブロマイドで発色させた。また、コントロールとして、ＬＣＢＦＡ−２の希釈に用いたエタノールとドデカンの混液（容量比４９：１）を添加したＨＬ−６０細胞を用いて同様に処理を行い、解析を行なった。その結果を図４に示す。
【００４８】
図４に示すように、コントロール〔図４（ａ）〕においては、ＤＮＡの断片化はほとんど見られなかったが、ＬＣＢＦＡ−２で処理したＨＬ−６０細胞〔図４（ｂ）〕には、断片化したＤＮＡからなる梯子状の泳動像が見られ、アポトーシスの特徴であるＤＮＡの断片化が観察された。
【００４９】
以上の各試験から分かるように、本発明のＬＣＢＦＡ−２にはアポトーシス誘導作用があることが確認された。
【００５０】
また、これ以外のセラミド類似物質（ＬＣＢＦＡ−１、ＣｅｒＰＥ−１、ＣｅｒＸ−１等）についても同様に試験を行なったところ、それぞれにアポトーシス誘導作用のあることが確認された。
【００５１】
次に、実施例１で得たＬＣＢＦＡ−２を用いて、各種の化粧品を作製した。
（実施例２）
次に示す処方１にしたがって、油中水型のクリームを作製した。
〔処方１〕クリーム
配合成分                              配合量（重量％）
（１）ＬＣＢＦＡ−２                                    ０．１
（２）スクワラン                                        ８．０
（３）ミリスチン酸オクチルドデシル                      １．０
（４）バチルアルコール                                  ５．０
（５）ポリオキシエチレン（１０Ｅ．Ｏ．）硬化ヒマシ油    １．０
（６）モノステアリン酸ソルビタン                        ０．５
（７）防腐剤                                            適  量
（８）１、３−ブチレングリコール                        ５．０
（９）精製水                                            残  量
上記成分（１）〜（７）を混合し、７５℃で加熱溶解させて油相とする。これとは別に（８）（９）を混合した水相を加え乳化した。この後、撹拌しながら３０℃まで冷却し、クリームを得た。
【００５２】
（実施例３）
次に示す処方２にしたがって、化粧水を作製した。
〔処方２〕化粧水
配合成分                              配合量（重量％）
（１）ＬＣＢＦＡ−２                                    ０．１
（２）エタノール                                      １０．０
（３）ポリオキシエチレン
ノニルフェニルエーテル（１０Ｅ．Ｏ．）        ０．１
（４）グリセリン                                        ２．０
（５）防腐剤                                            適  量
（６）精製水                                            残  量
上記成分（１）〜（３）を室温にて混合し、さらに、（４）〜（６）を混合溶解して、化粧水を得た。
【００５３】
（実施例４）
次に示す処方３にしたがって、乳液を作製した。
〔処方３〕乳液
配合成分                              配合量（重量％）
（１）ＬＣＢＦＡ−２                                    ０．１
（２）ステアリン酸                                      ２．０
（３）セタノール                                        １．５
（４）スクワラン                                        ５．０
（５）自己乳化型モノステアリン酸グリセリン              ２．０
（６）グリセリン                                        ２．０
（７）１、３−ブチレングリコール                        ６．０
（８）水酸化ナトリウム                                  ０．０３
（９）防腐剤                                            適  量
（１０）精製水                                          残  量
上記成分（１）〜（５）を混合し、７０℃で加熱溶解して油相とする。これとは別に（６）〜（１０）を混合溶解して、７０℃に加熱した水相に、前記油相を加え、ホモミキサーで均一に乳化した。その後、撹拌しながら３０℃まで冷却し、乳液を得た。
【００５４】
（実施例５）
次に示す処方４にしたがって、エッセンスを作製した。
〔処方４〕エッセンス
配合成分                              配合量（重量％）
（１）ＬＣＢＦＡ−２                                    ０．１
（２）エタノール                                      １０．０
（３）グリセリン                                      １０．０
（４）カルボキシメチルセルロースナトリウム              ０．１
（５）防腐剤                                            適  量
（６）精製水                                            残  量
上記成分（１）（２）を室温にて混合したのち、（３）〜（６）を添加撹拌して、エッセンスを得た。
【００５５】
（実施例６）
次に示す処方５にしたがって、ファンデーションを作製した。
〔処方５〕ファンデーション
配合成分                              配合量（重量％）
（１）ＬＣＢＦＡ−２                                    ０．１
（２）１、３−ブチレングリコール                        ５．０
（３）カルボキシメチルセルロースナトリウム              ０．１
（４）ケイ酸アルミニウムマグネシウム                    ０．５
（５）精製水                                            残  量
（６）黄酸化鉄                                          ０．０７
（７）黒酸化鉄                                          ０．０１
（８）ベンガラ                                          ０．０２
（９）酸化チタン                                        ５．０
（１０）タルク                                          ４．０
（１１）ステアリン酸                                    ２．０
（１２）セタノール                                      １．０
（１３）スクワラン                                      ５．０
（１４）自己乳化型モノステアリン酸グリセリン            ２．０
（１５）防腐剤                                          適  量
上記成分（１）〜（５）を混合し、７０℃で加熱溶解させた後、（６）〜（１０）を混合したものを加え、充分に撹拌し水相とする。この水相を、（１１）〜（１４）を混合溶解後、加熱し７０℃にした油相に加え、ホモミキサーで均一に乳化した。その後、撹拌しながら３０℃まで冷却し、ファンデーションを得た。
【００５６】
（実施例７）
次に示す処方６にしたがって、パックを作製した。
〔処方６〕パック
配合成分                              配合量（重量％）
（１）ＬＣＢＦＡ−２                                    ０．１
（２）ポリビニルアルコール                            １０．０
（３）酢酸ビニル樹脂エマルジョン                      １０．０
（４）エタノール                                        ５．０
（５）カオリン                                        １５．０
（６）グリセリン                                        １．０
（７）防腐剤                                            適  量
（８）精製水                                            残  量
上記成分（８）に（６）を混合した後、（３）及び（５）を添加し、更に（４）の一部に湿潤させた（２）を添加し、７０℃に加熱し溶解させた。次に残りの成分（４）に（１）及び（７）を加えて溶解したものを添加した後、冷却し、パックを得た。
【００５７】
【発明の効果】
本発明のアポトーシス誘導剤を用いることにより、細胞サイクルを制御することが可能になり、化粧品や外用剤などとして皮膚への塗布することによって、皮膚の新陳代謝を促進するなどの、細胞賦活化効果が期待できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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