(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトグルコキナーゼと、グルコキナーゼのアロステリック部位に結合するリガンドとの共結晶であって、
共結晶の単位格子の大きさが、
aおよびbは79.02Å〜80.22Åであり；
cは318.03Å〜325.03Åであり；
αおよびβは90°であり；ならびに
γは120°であって、
かつ、P6(5)22対称性を有する共結晶。
【請求項２】
ヒトグルコキナーゼの結晶であって、
結晶の単位格子の大きさが、
aおよびbは79.02Å〜80.22Åであり；
cは318.03Å〜325.03Åであり；
αおよびβは90°であり；ならびに
γは120°であって、
かつ、P6(5)22対称性を有する結晶。
【請求項３】
ヒトグルコキナーゼとグルコキナーゼのアロステリックリガンドとを共結晶化する方法であって、
9〜22 mg/mlのヒトグルコキナーゼの緩衝水溶液を提供する段階；
ヒトグルコキナーゼ水溶液にモル過剰量のアロステリックリガンドを加える段階；および
平均分子量が1,000〜20,000である10％〜30％PEG、0％w/v〜30％w/vグルコース、および0〜20 mM DTTの緩衝貯留層溶液を用いて拡散蒸着によって結晶を成長させる段階、
を含む方法。
【請求項４】
拡散蒸着によって結晶を成長させる段階が、
アロステリックリガンドを加えたヒトグルコキナーゼの緩衝水溶液によって表面に線条をつけて、タンパク質溶液の細長い液滴を形成する段階、および
緩衝貯留層溶液のほぼ等量をタンパク質溶液の細長い液滴に交差させて線条をつけて、
「X」文字のような形状の複合液滴を形成する段階、
を含む、請求項３記載の方法。
【請求項５】
請求項3または4記載の方法によって産生される結晶。
【請求項６】
以下の化合物
【化１】
0003734472.tif 000010
および薬学的に許容されるその塩。
【請求項７】
請求項６記載の化合物を含む薬学的組成物。
【請求項８】
II型糖尿病における高血糖症を治療するために、請求項６記載の化合物を含む薬剤を製造するための、請求項６記載の化合物の使用。
【請求項９】
特に、II型糖尿病における高血糖症を低下させるための治療活性物質として用いられる、
請求項６記載の化合物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、X線結晶学による構造データを得るために十分な大きさと質のグルコキナーゼの結晶型、およびそのような結晶を成長させる方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
グルコキナーゼ（GK）は、哺乳動物において認められる4つのヘキソキナーゼの1つである（非特許文献1参照）。ヘキソキナーゼは、グルコース代謝の第一段階、すなわちグルコースのグルコース-6-リン酸への変換を触媒する。グルコキナーゼは、細胞分布が限られ、主に膵臓のβ細胞および肝実質細胞に存在する。さらに、GKは、全身のグルコース恒常性において重要な役割を果たすことが知られているこれらの二つの細胞タイプにおけるグルコース代謝の律速酵素である（非特許文献2参照）。GKが半最大活性を示すグルコース濃度は約8 mMである。他の三つのヘキソキナーゼはかなり低い濃度（＜1 mM）のグルコースによって飽和される。したがって、GK経路を通してのグルコースの流れは、血中のグルコース濃度が絶食時（5 mM）から糖質を含む食事の後の食後（10〜15 mM）レベルまで増加するにつれて上昇する（非特許文献3参照）。これらの知見によって、10年以上前にGKはβ細胞および肝細胞においてグルコースセンサーとして作用するという仮説が立てられた（非特許文献4参照）。近年、トランスジェニック動物での研究によって、GKが実際に全身のグルコース恒常性において重要な役割を果たしていることが確認された。GKを発現しない動物は、出生後数日以内に重度の糖尿病のために死亡するが、GKを過剰発現する動物は、耐糖能が改善した（非特許文献5、6参照）。グルコースへの曝露が増加すると共役して、GKにより、β細胞ではインスリン分泌が増加し、肝細胞ではグリコーゲン沈着が増加し、そしておそらくグルコース産生が減少する。
【０００３】
若年者のII型成熟発症型糖尿病（MODY-2）がGK遺伝子における機能喪失変異によって引き起こされるという知見は、GKが、ヒトにおけるグルコースセンサーとしても機能することを示唆している（非特許文献7参照）。ヒトにおけるグルコース代謝の調節におけるGKの重要な役割を示唆するさらなる証拠は、酵素活性が増加したGKの変異型を発現する患者が同定されたことによって提供された。これらの患者は、血漿インスリンレベルの不適当な上昇に関連した絶食時の低血糖症を示す（非特許文献8参照）。GK遺伝子の変異は、II型糖尿病患者の大多数において発見されていないが、GKを活性化させ、それによってGKセンサーシステムの活性を増加させる化合物はそれでも、全てのII型糖尿病の特徴である高血糖症の治療において有用となるであろう。グルコキナーゼ活性化物質は、β細胞および肝細胞におけるグルコース代謝の流れを増加させ、これはインスリン分泌の増加に共役するであろう。そのような物質は、II型糖尿病を治療するために有用となるであろう。
【０００４】
キナーゼ活性化の基礎となる機構を解明する試みにおいて、そのようなタンパク質の結晶構造の決定を求められることが多い。いくつかのヘキソキナーゼの結晶構造が報告されている。例えば、非特許文献9〜11を参照のこと。これらの報告にもかかわらず、関連するヘキソキナーゼの結晶を得る方法を知ることをねらいとした研究者らが、如何なる哺乳動物グルコキナーゼの結晶でも得ようと試みたが成功しなかった。
【０００５】
【非特許文献１】
コロウィック（Colowick, S.P.）著、ボイヤー（P. Boyer）編、「酵素（The Enzymes）」、米国ニューヨーク州ニューヨーク、Academic Press、1973年、第9巻、p.1〜48
【非特許文献２】
チプキン（Chipkin, S.R.）、ケリー（Kelly, K.L.）およびルダーマン（Ruderman, N.B.）著、カーン（C.R. Khan）およびワイア（G.C. Wier）編、「ジョスリン糖尿病（Joslin's Diabetes）」、Lea and Febiger、1994年、米国ペンシルバニア州フィラデルフィア、p.97〜115
【非特許文献３】
プリンツ（Printz, R.G.）、マグヌッソン（Magnuson, M.A.）およびグラナーGranner, D.K.）著、オルソン（R.E. Olson）、ビア（D.M. Bier）およびマコーミック（D.B. McCormick）編、「Ann. Rev. Nutrition」、Annual Review, Inc.、1993年、米国カリフォルニア州パロアルト、第13巻、p.463〜496
【非特許文献４】
メグラッソン（Meglasson, M.D.）およびマチンスキー（Matschinsky, F.M.）、「Amer. J. Physiol.」、1984年、第246巻、E1〜E13
【非特許文献５】
グルプ（Grupe, A.）、ハルトグレン（Hultgren, N.）、リャン（Ryan, A.）ら、「Cell」、1995年、第83巻、p.69〜78
【非特許文献６】
フェリー（Ferrie, T.）、リウ（Riu, E.）、ボッシュ（Bosch, F.）ら、「FASEB J.」、1996年、第10巻、p.1213〜1218
【非特許文献７】
リアン（Liang, Y.）、ケサバン（Kesavan, P.）、ワン（Wang, L.）ら、「Biochem. J.」、1995年、第309巻、p.167〜173
【非特許文献８】
グレーサー（Glaser, B.）、ケサバン（Kesavan, P.）、ヘイマン（Heyman, M.）ら、「New England J. Med.」、1998年、第338巻、p.226〜230
【非特許文献９】
アレシン（A.E. Aleshin）、ゼング（C. Zeng）、ボウレンコフ（G.P. Bourenkov）、バーツニク（H.D. Bartunik）、フロム（H.J. Fromm）およびホンザトコ（R.B. Honzatko）、「ヘキソキナーゼの調節機構：グルコースおよびグルコース-6-リン酸と複合体を形成した組換えヒト脳ヘキソキナーゼの結晶構造からの新しい洞察（The mechanism of regulation of hexokinase：new insights from the crystal structure of recombinant human brain hexokinase complexed with glucose and glucose-6-phosphate）」、「Structure」、1998年、第6巻、p.39〜50
【非特許文献１０】
ベネット（W.S. Bennett, Jr.）およびステイツ（T.A. Steitz）、「酵母のヘキソキナーゼAとグルコースIとの複合体の構造。構造決定と分解能3.5Åでの精錬（Structure of a complex between yeast hexokinase A and glucose I. Structure determination and refinement at 3.5Å resolution）」、「J. Mol. Biol.」、1978年、第140巻、p.183〜209
【非特許文献１１】
イトウ（S. Ito）、フシノブ（S. Fushinobu）、ヨシオカ（I. Yoshioka）、コガ（S. Koga）、マツザワ（H. Matsuzawa）およびワカギ（T. Wakagi）、「高好熱性古細菌からの新規グルコキナーゼのADP特異性の構造的基礎（Structual Basis for the ADP-Specificity of a Novel Glucokinase from a Hyperthermophilic Archaeon）」、「Structure」、2001年、第9巻、p.205〜214
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、X線結晶学による構造データを得るために十分な大きさと質のグルコキナーゼ結晶型、およびそのような結晶を成長させる方法を提供することを課題とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
出願人は、アロステリックリガンドを結合している、または結合していない哺乳動物グルコキナーゼの結晶化を可能にするプロトコールを発見した。結晶構造は、X線結晶学によって分解能2.7Åまで解明されている。図3および4を参照のこと。このように、本発明は、グルコキナーゼの結晶型およびグルコキナーゼとアロステリックリガンドとの複合体の結晶型に関する。本発明はさらに、アロステリックリガンドが結合している、または結合していないグルコキナーゼの結晶を形成する方法に関する。
【０００８】
本発明に係る共結晶においては、（１）哺乳動物グルコキナーゼと、グルコキナーゼのアロステリック部位に結合するリガンドとの共結晶であって、
共結晶の単位格子の大きさが、
aおよびbは79.02Å〜80.22Åであり；
cは318.03Å〜325.03Åであり；
αおよびβは90°であり；ならびに
γは120°であって、
かつ、P6(5)22対称性を有する共結晶であることを特徴とする。
【０００９】
また、本発明に係るにおいては、（２）哺乳動物グルコキナーゼの結晶であって、
結晶の単位格子の大きさが、
aおよびbは79.02Å〜80.22Åであり；
cは318.03Å〜325.03Åであり；
αおよびβは90°であり；ならびに
γは120°であって、
かつ、P6(5)22対称性を有する結晶であることを特徴とする。
【００１０】
また、本発明に係るにおいては、（３）哺乳動物グルコキナーゼとグルコキナーゼのアロステリックリガンドとを共結晶化する過程が、
9〜22 mg/mlの哺乳動物グルコキナーゼの緩衝水溶液を提供する段階；
哺乳動物グルコキナーゼ水溶液にモル過剰量のアロステリックリガンドを加える段階；および
PEGの平均分子量が約1,000〜約20,000である、約10％〜約30％PEG、約0％w/v〜約30％w/vグルコース、および0〜20 mM DTTの緩衝貯留層溶液を用いて拡散蒸着によって結晶を成長させる段階を含む過程であることを特徴とする。
【００１１】
また、本発明に係るにおいては、（４）拡散蒸着によって結晶を成長させる工程が、
アロステリックリガンドを加えた哺乳動物グルコキナーゼの緩衝水溶液によって表面に線条をつけて、タンパク質溶液の細長い液滴を形成する段階、および
緩衝貯留層溶液のほぼ等量をタンパク質溶液の細長い液滴に交差させて線条をつけて、「X」文字のような形状の複合液滴を形成する段階を含む工程であることを特徴とする。
【００１２】
また、本発明に係るにおいては、（５）(3)または(4)記載の過程によって産生される結晶であることを特徴とする。
【００１３】
また、本発明に係るにおいては、（６）グルコキナーゼのアロステリック部位に結合するリガンドであり、(1)記載の共結晶の構造座標を分析することによって同定される化合物であることを特徴とする。
【００１４】
また、本発明に係るにおいては、（７）以下の化合物
【化２】
0003734472.tif 000002
および薬学的に許容されるその塩であることを特徴とする。
【００１５】
また、本発明に係るにおいては、（８）(6)記載の化合物を含む薬学的組成物であることを特徴とする。
【００１６】
また、本発明に係るにおいては、（９）化合物が(7)記載の化合物である、(8)記載の薬学的組成物であることを特徴とする。
【００１７】
また、本発明に係るにおいては、（１０）II型糖尿病における高血糖症を治療するために、(6記載の化合物を含む薬剤を製造するための(6)記載の化合物の使用であることを特徴とする。
【００１８】
また、本発明に係るにおいては、（１１）化合物が(7)記載の化合物である、(10)記載の使用であることを特徴とする。
【００１９】
また、本発明に係るにおいては、（１２）特に、II型糖尿病における高血糖症を低下させるための治療活性物質として用いられる、(6)または(7)記載の化合物であることを特徴とする。
【００２０】
また、本発明に係るにおいては、（１３）本明細書に記載した新規結晶、過程、化合物、組成物および用途であることを特徴とする。
【００２１】
【発明の実施の形態】
本発明は、アロステリック部位でリガンドが結合した、または結合していない哺乳動物グルコキナーゼの結晶型に関し、この場合の結晶は、分解能約2.0Å〜約3.5Åで三次元X線回折構造を決定するために十分な質および大きさである。本発明はまた、グルコキナーゼを調製して結晶化する方法にも関する。グルコキナーゼの結晶構造は、その結晶構造に由来する情報と共に、アロステリック部位と相互作用する化合物を同定するために用いることができるのみならず、グルコキナーゼ活性を分析して改変するために用いることができる。
【００２２】
本発明の結晶には、アポ結晶および共結晶が含まれる。本発明のアポ結晶は、一般的に実質的に純粋なグルコキナーゼを含む。共結晶は一般的に、リガンドがアロステリック部位に結合した実質的に純粋なグルコキナーゼを含む。
【００２３】
本発明の結晶グルコキナーゼは、天然または本来のグルコキナーゼに限定されないと理解される。実際に、本発明の結晶には、本来のグルコキナーゼの変異体が含まれる。本来のグルコキナーゼの変異体は、本来のグルコキナーゼドメインにおける少なくとも一つのアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基に置換すること、あるいは本来のポリペプチド内に、または本来のポリペプチドのN末端もしくはC末端に、アミノ酸残基を付加または欠失することによって得られ、変異体が由来する本来のグルコキナーゼと実質的に同じ三次元構造を有する。
【００２４】
実質的に同じ三次元構造を有するとは、変異体が由来する本来のグルコキナーゼの原子構造の座標と重ね合わせて、本来のグルコキナーゼのα炭素原子の少なくとも約50％〜約100％が重なりに含まれる場合に、約2Å未満または2Åに等しい二乗平均平方根偏差を有するアポ結晶または共結晶からの原子構造座標の組を有することを意味する。
【００２５】
場合によっては、ポリペプチドをコードするcDNAにおいて、ポリペプチドの精製を手助けする等に都合のよいクローニング部位を提供するために、のために、本来のグルコキナーゼドメインにアミノ酸残基を置換、欠失、および／または付加することは特に有利または都合がよいかも知れない。本来のグルコキナーゼの三次元構造を実質的に変化させないそのような置換、欠失、および／または付加は、当業者に明らかであると思われる。
【００２６】
本明細書において考慮した変異体はグルコキナーゼ活性を示す必要はないことに留意すべきである。実際に、グルコキナーゼのキナーゼ活性を妨害するが、ドメインの三次元構造を有意に変化させないアミノ酸置換、付加、または欠失が本発明によって特に考慮される。そのような結晶ポリペプチド、またはそこから得られた原子構造座標を用いて、本来のドメインに結合する化合物を同定することができる。これらの化合物は、活性または本来のドメインに影響を及ぼす可能性がある。
【００２７】
本発明の誘導体結晶は一般的に、一つまたはそれ以上の重金属原子に共有結合した結晶グルコキナーゼポリペプチドを含む。ポリペプチドは、本来のまたは変異グルコキナーゼに対応していてもよい。誘導体結晶を提供するために有用な重金属原子には金および水銀が含まれるが、これらは例であって、制限するものではない。または、メチオニンをセレノ-メチオニンに置換したような、重金属を一つまたはそれ以上のアミノ酸に組み入れたタンパク質から誘導体結晶を形成することができる。
【００２８】
本発明の共結晶は一般的に、ポリペプチドのアロステリック部位で一つまたはそれ以上の化合物に会合した結晶グルコキナーゼポリペプチドを含む。会合は、共有結合であっても、非共有結合であってもよい。
【００２９】
本明細書に記載の本来および変異グルコキナーゼポリペプチドは、天然資源から単離してもよく、または分子生物学の当業者に周知の方法によって産生してもよい。用いうる発現ベクターは、本来のまたは変異グルコキナーゼポリペプチドコード配列と、適当な転写および／または翻訳制御シグナルとを含んでいてもよい。これらの方法には、インビトロ組換えDNA技術、合成技術、およびインビボ組換え／遺伝子組換えが含まれる。例えば、マニアティス（Maniatis）ら、1989、「分子のクローニング：実験マニュアル（Molecular Cloning：A Laboratory Manual）」第二版、Cold Spring Harbor Laboratory、NY；およびアウスユベール（Ausubel）ら、1989、「分子生物学の現行プロトコール（Current Protocols in Molecular Biology）」、Greene Publishing Associates and Wiley Interscience、NYを参照のこと。
【００３０】
多様な宿主発現ベクター系を利用してグルコキナーゼコード配列を発現してもよい。これらには、グルコキナーゼコード配列を含む組換えバクテリオファージDNA、プラスミドDNA、もしくはコスミドDNA発現ベクターにより形質転換した細菌等の微生物；グルコキナーゼコード配列を含む組換え酵母発現ベクターによって形質転換した酵母；グルコキナーゼコード配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）で感染させた昆虫細胞系；グルコキナーゼコード配列を含む組換えウイルス発現系（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、CaMV；タバコモザイクウイルス、TMV）で感染させた、もしくはグルコキナーゼコード配列を含む組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Tiプラスミド）によって形質転換した植物細胞系；または動物細胞系が含まれるがこれらに限定されない。これらの系の発現エレメントはその強度および特異性が異なる。利用する宿主／ベクター系に応じて、バクテリオファージμのpL、plac、ptrp、ptac（ptrp-lacハイブリッドプロモーター）等を含む多数の如何なる適した転写および翻訳エレメントを用いてもよい；昆虫細胞系においてクローニングする場合、バキュロウイルスポリヘドリンプロモーターのようなプロモーターを用いてもよい；植物細胞系においてクローニングする場合、植物細胞のゲノムに由来するプロモーター（例えば、熱ショックプロモーター；RUBISCOの小サブユニットのプロモーター；クロロフィルa/b結合タンパク質のプロモーター）、または植物ウイルス由来のプロモーター（例えば、CaMVの35S RNAプロモーター；TMVの外皮タンパク質プロモーター）を用いてもよい；哺乳動物細胞系においてクローニングする場合、哺乳動物細胞のゲノムに由来するプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）、または哺乳動物ウイルスに由来するプロモーター（例えばアデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス7.5Kプロモーター）を用いてもよい；グルコキナーゼコード配列の多数のコピーを含む細胞株を作製する場合、SV40、BPV、およびEBVに基づくベクターを適当な選択マーカーと共に用いてもよい。
【００３１】
本発明のアポ結晶、誘導体結晶および共結晶は、バッチ、液体ブリッジ、透析、拡散蒸着、および懸滴法を含むタンパク質結晶学の技術分野で周知の技術によって得ることができる（例えば、マクファーソン（McPherson）、1982、「タンパク質結晶の調製と分析（Preparation and Analysis of Protein Crystals）」、John Wiley、NY；マクファーソン（McPherson）、1990、Eur. J. Biochem. 189：1〜23；ウェバー（Webber）、1991、Adv. Protein Chem. 41：1〜36；「核酸とタンパク質の結晶化（Crystallization of Nucleic Acids and Proteins）」、アーナウド・デュクルイ（Arnaud Ducruix）およびリチャード・ギーグ（Richard Giege）、Oxford University Press；「タンパク質結晶化技術、戦略およびヒント（Protein Crystallization Techniques, Strategies, and Tips）」、テレーズ・ベルグフォー（Terese Bergfors）編、International University Line、1999を参照のこと）。一般的に、本発明のアポ結晶または共結晶は、実質的に純粋なグルコキナーゼポリペプチドを、タンパク質を沈殿させるために必要な濃度よりわずかに低い濃度の沈殿剤を含む水性緩衝液中に入れることによって成長する。次に、制御蒸発によって水を水溶液から除去して、結晶化状態をつくり、これを結晶の成長が止まるまで維持する。
【００３２】
本発明の好ましい態様において、アポ結晶または共結晶は拡散蒸着によって成長する。この方法において、ポリペプチド／沈殿剤溶液は、結晶を産生するために最適な沈殿剤濃度を有した、より大きな水性貯留層を有する密封容器中で平衡にする。一般的に、実質的に純粋なポリペプチド溶液約10 μl未満を、貯留層溶液の等量と混合して、結晶化に必要な濃度の約半分の沈殿剤濃度にする。この溶液を、カバーガラス下に液滴として懸垂させ、これを貯留層の上部で密封する。密封容器は、結晶が成長するまで1日〜1年、通常約2〜6週間放置する。
【００３３】
本発明の結晶に関して、グルコキナーゼ約2〜5μl（室温で測定してpH 7.1の20 mMトリス、50 mM NaCl、50 mMグルコース、10 mM DTT、および選択的に0.2 mM EDTA溶液中、9〜22 mg/ml）と、等量の貯留層溶液（平均分子量約8000〜約10000ダルトンの16〜25％w/vポリエチレングリコール、0.1〜0.2 Mトリスまたはビストリスまたはヘペスまたはリン酸アンモニウム緩衝液 pH 6.9〜7.5、8〜10 mM DTT、0〜30％飽和グルコース）とを含む懸滴を、貯留層緩衝液0.5〜1.0 mlの上に4〜6℃で約3〜4週間懸垂させると、高分解能X線構造決定に適した結晶が提供されることが判明した。特に好ましい条件は以下であった：グルコキナーゼ約2〜5μl（室温で測定してpH 7.1の20 mMトリス、50 mM NaCl、50 mMグルコース、10 mM DTT、および選択的に0.2 mM EDTA溶液中、10 mg/ml）と等量の貯留層溶液（平均分子量約10000ダルトンの22.5％w/vポリエチレングリコール、0.1 Mトリス pH 7.08、10 mM DTT、20％グルコース）とを、貯留層緩衝液0.5〜1.0 mlの上に4〜6℃で約3〜4週間懸垂させた。
【００３４】
データを収集するのに十分な大きさの結晶を成長させるために最適な技法には、最初にカバーガラス上でタンパク質溶液3〜4μlによって線条をつけて、次にウェル溶液3〜4μlをタンパク質の細長い液滴と交差するように線条をつけ、「X」文字のような形状の液滴を形成することが必要とされた。この交差液滴技術を発見するまでは、ほとんどの液滴では、データ収集目的には十分な大きさではない小さな結晶が多数生じていた。交差した液滴によって、タンパク質と沈殿剤の溶液が徐々に混合するにつれて二つの溶液の勾配を形成することができ、得られた結晶の核形成および成長の速度論は、それぞれの交差液滴において少数の大きい結晶を成長させるために最適である。タンパク質と沈殿剤溶液とを一つの丸い液滴中で共に単に混合するだけでは、成長した最終的な大きさがデータ収集目的には小さすぎる核が大量に産生ることが多かった。結晶は通常、実験開始の5日以内に出現した。結晶は、６角形の両錐体型であり、典型的に0.2×0.2×0.4 mmの大きさに達するが、これより大きい結晶もしばしば認められる。図1は成長した結晶を示す。
【００３５】
結晶は、データ収集の前に凍結してもよい。結晶は、（a）結晶化開始時に存在する20〜30％飽和グルコース、（b）15〜20％となるように加えたエタノール、（c）10〜20％となるように加えたエチレングリコールおよび25％にしたPEG10,000のいずれかによって凍結から保護された。結晶は、凍結保存剤に短時間浸すか、または１日中凍結保存剤に浸した。凍結は、液体窒素浴に結晶を浸すことによって、または100 Kの窒素ガス流に結晶を入れることによって行った。
【００３６】
凍結結晶のモザイク状の成長は時に、焼きなましによって減少させることができ、この場合、冷窒素ガス流を短時間遮断して、凍結した結晶を瞬間的に融解してから窒素ガス流において再凍結する。データ収集において時に有用なもう一つの技術は、X線ビームを結晶の中央部よりむしろ６角形の両錐体の末端の一つに集中させることであった。モザイク状の成長は時に、この技術によって減少させることができる。
【００３７】
典型的に2.7Åまで及ぶ回折データは、ニューヨーク州ブルックヘイブンにある国立シンクロトロン光源のシンクロトロンビームラインX8Cでの凍結結晶から収集した。最適な条件において、2.2Åまでのデータを記録した。説明に関しては、図3および4を参照のこと。結晶の空間群は、結晶構造の解析過程においてP6(5)22であると決定された。結晶の単位格子の大きさは、a＝b＝79.62±0.60Å、c＝321.73±3.70Å、αγ＝β＝90°、γ＝120°である。結晶は、P6(5)22対称性を有する６方晶系である。
【００３８】
当然のこととして、当業者は上記の結晶化条件が変更できることを認識すると思われる。そのような変更は単独、または組み合わせて行ってもよく、濃度1 mg/ml〜60 mg/mlのポリペプチド、pHを約6.5〜約7.6に維持することができる如何なる市販の緩衝液系、濃度10 mM〜200 mMのトリス塩酸、濃度0 mM〜20 mM、好ましくは8〜10 mMのジチオスレイトール、ジチオスレイトールをβメルカプトエタノールまたは他の当技術分野で認識される同等物に置換したもの、濃度0％w/v〜30％w/vのグルコース、またはグルコキナーゼに結合することが知られている他の糖をグルコースの代わりに置換したものを含むポリペプチド溶液と；濃度約10％〜約30％のポリエチレングリコール（PEG）、平均分子量約1000〜約20,000ダルトンのポリエチレングリコール、pHを約6.5〜約7.6に維持することができる如何なる市販の緩衝剤系、濃度0 mM〜20 mMのジチオスレイトール、ジチオスレイトールをβメルカプトエタノールもしくは当技術分野で認識される-SH基を含む同等物に置換したもの、またはグルコキナーゼに結合することが知られている他の糖をグルコースの代わりに置換したものを含む貯留層溶液とが含まれていてもよく、および温度4〜20℃であってもよい。
【００３９】
本発明の誘導体結晶は、X線結晶学の技術分野の当業者に既知の技法に従って、重金属原子の塩を含む母液にアポ結晶または共結晶を浸すことによって得ることができる。
【００４０】
本発明の共結晶は、アロステリック部位に結合するリガンドを含む母液中にアポ結晶を浸すことによって得るか、またはアロステリック部位に結合する一つもしくはそれ以上のリガンドの存在下でグルコキナーゼポリペプチドを共結晶化することによって得ることができる。好ましくは、共結晶は、それぞれが参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第6,320,050号；2000年3月21日に提出された米国特許出願第09/532,506号；2000年9月28日に提出された米国特許出願第09/675,781号；2000年12月１日に提出された米国特許出願第09/727,624号；2001年4月25日に提出された米国特許出願第09/841,983号；2001年4月26日に提出された米国特許出願第09/843466号；2001年5月1日に提出された米国特許出願第09/846,820号；2001年5月1日に提出された米国特許出願第09/846,821号；2001年7月13日に提出された米国特許出願第09/905,152号；2001年8月8日に提出された米国特許出願第09/924,247号；2000年12月6日に提出された米国特許仮出願第60/251,637号；または2001年9月13日に提出された米国特許仮出願第60/318,715号に開示されたグルコキナーゼ活性化剤と共に形成される。
【００４１】
本明細書に開示の結晶グルコキナーゼの三次元構造と同様に原子構造座標を得る方法は、当技術分野で周知である（例えば、マクリー（D.E. McRee）、「実践タンパク質結晶学（Practical Protein Crystallography）」、Academic Pressから出版、San Diego（1993）、およびそこに引用されている引用文献を参照のこと）。
【００４２】
本発明の結晶、および特にそこから得られる原子構造座標は、幅広い用途を有する。例えば、本明細書に記載の結晶および構造座標は、新しい治療物質を開発するためのアプローチとしてグルコキナーゼを活性化する化合物を同定するために特に有用である。そのような一つの化合物は、3-シクロペンチル-2-ピリジン-4-イル-N-チアゾール-2-イル-プロピオンアミドおよび薬学的に許容されるその塩である。上記の化合物の薬学的組成物は開発することができ、II型糖尿病における高血糖症を治療するために上記の化合物を含む薬剤の製造に上記の化合物を用いることができる。
【００４３】
本明細書に記載の構造座標は、さらなる本来のグルコキナーゼまたは変異グルコキナーゼの結晶構造と、アロステリック阻害剤または活性化剤が結合したそのようなグルコキナーゼの共結晶の構造とを決定するための位相調整モデルとして用いることができる。構造座標と、そこから得られる三次元構造のモデルとを用いてNMRによって得られるような、本来のグルコキナーゼまたは変異グルコキナーゼの溶液に基づく構造解明にも役立てることができる。このように、本発明の結晶および原子構造座標は、グルコキナーゼの構造および機能を解明するための簡便な手段を提供する。
【００４４】
分かりやすく説明するために、本発明の結晶を、例示として特定のグルコキナーゼアポ結晶および共結晶を参考にして記述する。当業者は、本明細書に記載の原理が一般的に、図2のグルコキナーゼを含むがこれに限定されない如何なる哺乳動物のグルコキナーゼの結晶にも応用可能であることを認識すると思われる。
【００４５】
本明細書において用いられるように、「アロステリック部位」とは、一般的に酵素の活性部位以外の哺乳動物グルコキナーゼ上の如何なるリガンド結合部位をも意味する。
【００４６】
本明細書において用いられるように、「アポ結晶」とは、アロステリックリガンドが結合せずに形成された哺乳動物グルコキナーゼの結晶を意味する。
【００４７】
本明細書において用いられるように、「アロステリックリガンド」とは、哺乳動物グルコキナーゼ上でのアロステリック部位に特異的に結合する如何なる分子をも意味する。
【００４８】
【実施例】
実施例１：グルコキナーゼの発現と精製
GKの発現
グルコキナーゼ（GK）は、大腸菌（Escherichia coli）におけるグルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）融合タンパク質として発現された。融合タンパク質のアミノ酸配列を図2に示す。発現構築物は、リアン（Y. Liang）、ケサバン（P. Kesavan）、ワン（L. Wang）、ニスウェンダー（K. Niswender）、タニザワ（Y. Tanizawa）、パーマット（M.A. Permutt）、マグヌッソン（M.A. Magnuson）、マチンスキー（F.M. Matschinsky）、Biochem. J. 309、167、1995）に記載されるように、ファルマシア社からのpGEX-3Xベクターに基づく。構築物は、ヒトGKの二つの肝イソ酵素の一つをコードする。GSTタグは、構築物のN末端に存在し、GKのコード配列とは第Xa因子切断部位によって分離されている。GST融合タンパク質の精製後、GST融合タグは、GKのN末端からの5残基も同様に除去する第Xa因子プロテアーゼによって除去した。
【００４９】
GKの精製
GST-GKを発現する大腸菌細胞を、プロテアーゼ阻害剤の存在下で溶解緩衝液（50 mMトリス、200 mM NaCl、5 mM EDTA、5 mM DTT、1％NP-40、pH 7.7）に浮遊させて、200 μg/mlのライソザイムと共に室温で30分間インキュベートして、4℃で30秒間の超音波処理を4回行った。遠心して不溶性材料を除去した後、上清をグルタチオン-セファロースにローディングして、溶解緩衝液によって洗浄した後、NP-40を除去した溶解緩衝液によって洗浄した。GST-GKは、50 mM D-グルコースおよび20 mMグルタチオンを含む溶解緩衝液（NP-40を除く）によって溶出した。溶出タンパク質を濃縮して、20 mMトリス、100 mM NaCl、0.2 mM EDTA、50 mM D-グルコース、1 mM DTT、pH 7.7中で透析した。第Xa因子をタンパク質比1：100 GST-GKで加えた後、CaCl2を1 mMとなるように加え、試料を4℃で48時間インキュベートした。試料をグルタチオンセファロースに加えて、未結合の分画を回収して濃縮した。次に、試料をベンザミジンセファロースと共にインキュベートして、第Xa因子を除去し、未結合の分画を回収して、25 mMビストリスプロパン、50 mM NaCl、5 mM DTT、50 mM D-グルコース、および5％グリセロール（pH 7.0）で平衡にしたQセファロースカラム上にローディングした。タンパク質は、50〜400 mMのNaCl勾配によって溶出した。精製GKを含む分画をプールして濃縮し、濾過した。
【００５０】
実施例２：アポ結晶の形成
グルコキナーゼ4μlと沈殿剤4μlとを混合して、4℃で沈殿剤溶液に対して平衡にした。グルコキナーゼ溶液は、実施例1において調製した22 mg/mlグルコキナーゼの20 mMヘペス pH 7.5、50 mM NaCl、10 mM DTT、および50 mMグルコース溶液で構成された。沈殿剤は、22.5％PEG 10000、0.1 Mトリス pH 7.08、10 mM DTT、20％グルコースで構成された；沈殿剤溶液は、液滴の微小核とするために結晶の核を含んだ。結晶は、結晶化プレートを4℃で放置した後、液滴として現れた。
【００５１】
実施例３：3-シクロペンチル-2-ピリジン-4-イル-N-チアゾール-2-イル-プロピオンアミドとの共結晶の形成
３（a）：
グルコキナーゼ4μlと沈殿剤4μlとを混合して、4℃で沈殿剤溶液に対して平衡にした。グルコキナーゼ溶液は、実施例1において調製した13 mg/mlグルコキナーゼの20 mMトリス pH 7.0、50 mM NaCl、10 mM DTT、50 mMグルコース、およびタンパク質の５倍濃度のグルコキナーゼ活性化剤3-シクロペンチル-2-ピリジン-4-イル-N-チアゾール-2-イル-プロピオンアミドを含む溶液からなった。沈殿剤は、22.5％PEG 10000、0.1 Mトリス pH 7.08、10 mM DTT、20％グルコースで構成された。結晶は、結晶化プレートを4℃で放置した後、液滴として現れた。
【００５２】
３（b）：
または、結晶は、実施例3（a）を以下のように変更して成長させた：グルコキナーゼ4μlおよび沈殿剤4μlの代わりにそれぞれ2μlを用いた；グルコキナーゼ溶液はpH 7.0の代わりにpH 7.08のトリス緩衝液中に11 mg/mlグルコキナーゼを含んだ；グルコキナーゼ溶液は0.2 mM EDTAを含んだ；沈殿剤として22.5％PEG 10000の代わりに18％PEG 8000を用いた；沈殿剤溶液は、液滴の微小核とするために結晶の核を含んだ。
【００５３】
３（c）：
もう一つの代わりの方法において、結晶は、実施例3（a）を以下のように変更して成長させた：グルコキナーゼ4μlおよび沈殿剤4μlの代わりにそれぞれ2μlを用いた；グルコキナーゼ溶液は、pH 7.0の代わりにpH 7.08のトリス緩衝液中に11 mg/mlグルコキナーゼを含んだ；グルコキナーゼ溶液は0.2 mM EDTAを含んだ；沈殿剤として22.5％PEG 10000の代わりに20％PEG 8000を用いた；沈殿剤溶液は、液滴の微小核とするために結晶の核を含んだ。
【００５４】
３（d）：
もう一つの代わりの方法において、結晶は、実施例3（a）を以下のように変更して成長させた：グルコキナーゼ4μlおよび沈殿剤4μlの代わりにそれぞれ2μlを用いた；グルコキナーゼ溶液は、pH 7.0の代わりにpH 7.08のトリス緩衝液中に12 mg/mlグルコキナーゼを含んだ；グルコキナーゼ溶液は0.2 mM EDTAを含んだ；沈殿剤として22.5％PEG 10000の代わりに16％PEG 10000を用いた；グルコースは沈殿剤の成分として存在しなかった；沈殿剤溶液は、液滴の微小核とするために結晶の核を含んだ。
【００５５】
３（e）：
さらにもう一つの代わりの方法において、結晶は、実施例3（a）を以下のように変更して成長させた：グルコキナーゼ溶液は、pH 7.0の代わりにpH 7.1のトリス緩衝液中に11 mg/mlグルコキナーゼを含んだ；グルコキナーゼ溶液は0.2 mM EDTAを含んだ；沈殿剤として22.5％PEG 10000の代わりに25％PEG 10000を用いた。
【００５６】
３（f）：
さらにもう一つの代わりの方法において、結晶は、実施例3（a）を以下のように変更して成長させた：グルコキナーゼ溶液は、pH 7.0の代わりにpH 7.1のトリス緩衝液中に11 mg/mlグルコキナーゼを含んだ；グルコキナーゼ溶液は0.2 mM EDTAを含んだ；沈殿剤として22.5％PEG 10000の代わりに21.25％PEG 10000を用いた；沈殿剤中、pH 7.08で緩衝作用を有するトリスの代わりに、pH 7.52で緩衝作用を有するトリスを用いた。
【００５７】
３（g）：
さらにもう一つの代わりの方法において、結晶は、実施例3（a）を以下のように変更して成長させた：グルコキナーゼ溶液は、pH 7.0の代わりにpH 7.08のトリス緩衝液中に12 mg/mlグルコキナーゼを含んだ；グルコキナーゼ溶液は0.2 mM EDTAを含んだ；沈殿剤中でpH 7.08で緩衝作用を有するトリスの代わりに、pH 6.89で緩衝作用を有するヘペスを用いた；沈殿剤中の20％グルコースの代わりに200 mMグルコースを用いた。
【００５８】
３（h）：
さらにもう一つの代わりの方法において、結晶は、実施例3（a）を以下のように変更して成長させた：グルコキナーゼ溶液は、pH 7.0の代わりにpH 7.08のトリス緩衝液中に12 mg/mlグルコキナーゼを含んだ；グルコキナーゼ溶液は0.2 mM EDTAを含んだ；沈殿剤中、pH 7.08で緩衝作用を有する0.1 Mトリスの代わりに、pH 7.03で緩衝作用を有する0.2 Mリン酸アンモニウムを用いた；沈殿剤中の20％グルコースの代わりに200 mMグルコースを用いた。
【００５９】
３（i）：
さらにもう一つの代わりの方法において、結晶は、実施例3（a）を以下のように変更して成長させた：グルコキナーゼ溶液はpH 7.0の代わりにpH 7.08のトリス緩衝液中に10 mg/mlグルコキナーゼを含んだ；グルコキナーゼ溶液は0.2 mM EDTAを含んだ；沈殿剤として22.5％PEG 10000の代わりに20％PEG 10000を用いた；沈殿剤中、pH 7.08で緩衝作用を有するトリスの代わりに、pH 7.05で緩衝作用を有するトリスを用いた；沈殿剤中の10 mM DTTの代わりに、8 mM DTTを用いた；グルコースは沈殿剤の成分として存在しなかった。
【００６０】
３（j）：
さらにもう一つの代わりの方法において、結晶は、実施例3（a）を以下のように変更して成長させた：グルコキナーゼ溶液は、pH 7.0の代わりにpH 7.08のトリス緩衝液中に12 mg/mlグルコキナーゼを含んだ；グルコキナーゼ溶液は0.2 mM EDTAを含んだ；沈殿剤として22.5％PEG 10000の代わりに22％PEG 8000を用いた；グルコースは沈殿剤の成分として存在しなかった；沈殿剤溶液は液滴の微小核とするために核結晶を含んだ。
【００６１】
３（k）：
さらにもう一つの代わりの方法において、結晶は、実施例3（a）を以下のように変更して成長させた：グルコキナーゼ溶液は、pH 7.0の代わりにpH 7.1のトリス緩衝液中に11 mg/mlグルコキナーゼを含んだ；グルコキナーゼ溶液は0.2 mM EDTAを含んだ；沈殿剤中の20％グルコースの代わりに30％グルコースを用いた。
【００６２】
実施例４：N-(5-ブロモ-ピリジン-2-イル)-2-(3-クロロ-4-メタンスルホニル-フェニル)-3-シクロペンチル-プロピオンアミドとの共結晶の形成
結晶は、実施例3（a）を以下のように変更して成長させた：グルコキナーゼ溶液は、pH 7.0の代わりにpH 7.1のトリス緩衝液中に9 mg/mlグルコキナーゼを含んだ；グルコキナーゼ溶液は0.2 mM EDTAを含んだ；実施例3（a）のグルコキナーゼ活性化剤の代わりに、グルコキナーゼ溶液は、グルコキナーゼ活性化剤N-(5-ブロモ-ピリジン-2-イル)-2-(3-クロロ-4-メタンスルホニル-フェニル)-3-シクロペンチル-プロピオンアミドを含んだ；沈殿剤中の20％グルコースの代わりに200 mMグルコースを用いた。
【００６３】
実施例５：2-(3-クロロ-4-メタンスルホニル-フェニル)-3-シクロペンチル-N-(5-トリフルオロメチル-ピリジン-2-イル)-プロピオンアミドとの共結晶の形成
結晶は、実施例3（a）を以下のように変更して成長させた：グルコキナーゼ溶液はpH 7.0の代わりにpH 7.1のトリス緩衝液中に10 mg/mlグルコキナーゼを含んだ；グルコキナーゼ溶液は0.2 mM EDTAを含んだ；実施例3（a）のグルコキナーゼ活性化剤の代わりに、グルコキナーゼ溶液は、グルコキナーゼ活性化剤2-(3-クロロ-4-メタンスルホニル-フェニル)-3-シクロペンチル-N-(5-トリフルオロメチル-ピリジン-2-イル)-プロピオンアミドを含んだ；沈殿剤として22.5％PEG 10000の代わりに、21.25％PEG 10000を用いた。
【００６４】
実施例６：(2S)-2-[3-シクロペンチル-2-(3,4-ジクロロ-フェニル)-プロピオニルアミノ]-チアゾール-4-カルボン酸メチルエステルとの共結晶の形成
結晶は、実施例3（a）を以下のように変更して成長させた：グルコキナーゼ溶液は、pH 7.0の代わりにpH 7.1のトリス緩衝液中に10 mg/mlグルコキナーゼを含んだ；グルコキナーゼ溶液は0.2 mM EDTAを含んだ；実施例3（a）のグルコキナーゼ活性化剤の代わりに、グルコキナーゼ溶液は、グルコキナーゼ活性化剤(2S)-2-[3-シクロペンチル-2-(3,4-ジクロロ-フェニル)-プロピオニルアミノ]-チアゾール-4-カルボン酸メチルエステルを含んだ；沈殿剤として22.5％PEG 10000の代わりに、21.25％PEG 10000を用いた；沈殿剤中、pH 7.08で緩衝作用を有するトリスの代わりに、pH 7.0で緩衝作用を有するビストリスを用いた。
【００６５】
実施例７：(2S)-{2-[3-シクロペンチル-2-(3,4-ジクロロ-フェニル)-プロピオニルアミノ]-チアゾール-5-イル}-オキソ酢酸エチルエステルとの共結晶の形成
結晶は、実施例3（a）を以下のように変更して成長させた：グルコキナーゼ溶液は、pH 7.0の代わりにpH 7.1のトリス緩衝液中に10 mg/mlグルコキナーゼを含んだ；グルコキナーゼ溶液は0.2 mM EDTAを含んだ；実施例3（a）のグルコキナーゼ活性化剤の代わりに、グルコキナーゼ溶液は、グルコキナーゼ活性化剤(2S)-{2-[3-シクロペンチル-2-(3,4-ジクロロ-フェニル)-プロピオニルアミノ]-チアゾール-5-イル}-オキソ酢酸エチルエステルを含んだ；沈殿剤として22.5％PEG 10000の代わりに、21.25％PEG 10000を用いた。
【００６６】
実施例８：(2S)-{3-[3-シクロペンチル-2-(3,4-ジクロロ-フェニル)-プロピオニル]-ウレイド}-酢酸メチルエステルとの共結晶の形成
結晶は、実施例3（a）を以下のように変更して成長させた：グルコキナーゼ溶液は、pH 7.0の代わりにpH 7.08のトリス緩衝液中に9 mg/mlグルコキナーゼを含んだ；グルコキナーゼ溶液に0.2 mM EDTAを含んだ；実施例3（a）のグルコキナーゼ活性化剤の代わりに、グルコキナーゼ溶液は、グルコキナーゼ活性化剤(2S)-{3-[3-シクロペンチル-2-(3,4-ジクロロ-フェニル)-プロピオニル]-ウレイド}-酢酸メチルエステルを含んだ；沈殿剤中の20％グルコースの代わりに、200 mMグルコースを用いた。
【００６７】
実施例９：(2S)-1-[3-シクロペンチル-2-(3,4-ジクロロ-フェニル)-プロピオニル]-3-(3-ヒドロキシ-プロピル)-ウレアとの共結晶の形成
結晶は、実施例3（a）を以下のように変更して成長させた：グルコキナーゼ溶液は、pH 7.0の代わりにpH 7.08のトリス緩衝液中に14 mg/mlグルコキナーゼを含んだ；グルコキナーゼ溶液は0.2 mM EDTAを含んだ；実施例3（a）のグルコキナーゼ活性化剤の代わりに、グルコキナーゼ溶液は、グルコキナーゼ活性化剤(2S)-1-[3-シクロペンチル-2-(3,4-ジクロロ-フェニル)-プロピオニル]-3-(3-ヒドロキシ-プロピル)-ウレアを含んだ；沈殿剤中の20％グルコースの代わりに、200 mMグルコースを用いた。
【００６８】
実施例１０：(2S)-{3-[3-シクロペンチル-2-(3,4-ジクロロ-フェニル)-プロピオニル]-ウレイド}-酢酸エチルエステルとの共結晶の形成
結晶は、実施例3（a）を以下のように変更して成長させた：グルコキナーゼ溶液は、pH 7.0の代わりにpH 7.08のトリス緩衝液中に14 mg/mlグルコキナーゼを含んだ；グルコキナーゼ溶液は0.2 mM EDTAを含んだ；実施例3（a）のグルコキナーゼ活性化剤の代わりに、グルコキナーゼ溶液は、グルコキナーゼ活性化剤(2S)-{3-[3-シクロペンチル-2-(3,4-ジクロロ-フェニル)-プロピオニル]-ウレイド}-酢酸エチルエステルを含んだ；沈殿剤中、pH 7.08で緩衝作用を有するトリスの代わりに、pH 7.05で緩衝作用を有するトリスを用いた。
【００６９】
実施例１１：3-シクロペンチル-2-ピリジン-4-イル-N-チアゾール-2-イル-プロピオンアミドの合成
3-シクロペンチル-2-ピリジン-4-イル-N-チアゾール-2-イル-プロピオンアミドは、以下の反応式に従って周知の有機合成技術を用いて調製することができる：
【化３】
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【００７０】
3-シクロペンチル-2-ピリジン-4-イル-N-チアゾール-2-イル-プロピオンアミドは、グルコキナーゼのアロステリック活性化剤として、およびグルコキナーゼの共結晶の形成を補助するために有用である。
【００７１】
【発明の効果】
本発明により、X線結晶学によって構造データを得るために十分な大きさおよび質の哺乳動物グルコキナーゼの結晶型、およびそのような結晶を成長させる方法が提供された。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  図1は、P6(5)22対称性を有するグルコキナーゼ共結晶を示す図である。
【図２】  図2は、結晶化のために用いられる発現されたグルコキナーゼのアミノ酸配列を示す図である。
【図３】  図3は、αヘリックスおよびβシートを示すグルコキナーゼ構造のリボン図を示す図である。
【図４】  図4は、3-シクロペンチル-2-ピリジン-4-イル-N-チアゾール-2-イル-プロピオンアミドに結合したグルコキナーゼの原子構造座標を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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