(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
バイオ材料の処理方法であって、
（１）６．０と８．０との間のｐＨを有する水性緩衝液中にメタノール、エタノール、プロパノール、およびイソプロパノールからなる群より選ばれた水溶性脂肪族アルコールを５０容量％以上含んでなる処理溶液を形成する工程；
（２）グルタルアルデヒド前処理されたバイオ材料であって、哺乳動物から得られ、ウシ囲心嚢、ブタ大動脈心臓弁、伏在バイパス移植片、大動脈同種移植片、および硬膜からなる群より選ばれたコラーゲン質材料であるバイオ材料を、該処理溶液に、２０分〜９６時間の範囲内の該バイオ材料を石灰化抵抗性にするのに十分な時間接触させる工程；および
（３）接触させたバイオ材料を洗浄液で洗浄する工程を包含する処理方法。
【請求項２】
石灰化抵抗性にされる前記バイオ材料が、生体内病的石灰化抵抗性にされる請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記接触工程が、前記バイオ材料を前記処理溶液中に浸漬させることからなる請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記処理溶液を７．０と７．６との間の範囲内のｐＨに緩衝する請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記処理溶液をｐＨ７．４に緩衝する請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記アルコールが、前記処理溶液の６０容量％と８０容量％との間の量で存在する請求項３記載の方法。
【請求項７】
前記アルコールが前記処理溶液の８０容量％の量で存在する請求項４記載の方法。
【請求項８】
前記処理溶液がさらに抗石灰化剤を含んでいる請求項３記載の方法。
【請求項９】
前記抗石灰化剤が、前記処理溶液に溶解可能なＡｌ+3およびＦｅ+3の塩からなる群より選ばれた多価金属陽イオンである請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記抗石灰化剤が、０．１Ｍ〜０．００１Ｍの濃度範囲のＡｌＣｌ3である請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記バイオ材料が大動脈弁尖であり、前記アルコールがエタノールである請求項３記載の方法。
【請求項１２】
前記バイオ材料が大動脈弁壁であり、前記抗石灰化剤がエタノール中アルミニウム塩である請求項８記載の方法。
【請求項１３】
前記バイオ材料が架橋結合されている請求項１記載の方法。
【請求項１４】
前記処理されたバイオ材料を、無菌の、グルタルアルデヒドを含まない環境中に保存する工程をさらに含む請求項１記載の方法。
【請求項１５】
前記処理されたバイオ材料を、低級脂肪族アルコールとグルタルアルデヒドとからなる保存溶液中に保存する工程をさらに含む請求項１記載の方法。
【請求項１６】
前記保存溶液が、６０〜８０容量％のエタノールと０．２〜０．５％のグルタルアルデヒドとを含有する水性溶液である請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
前記バイオ材料を消毒する工程をさらに含む請求項１記載の方法。
【請求項１８】
ヒトまたは動物の体内で使用するための石灰化抵抗性バイオ材料の製造方法であって、
（ａ）グルタルアルデヒド前処理された生物人工組織であって、哺乳動物から得られ、ウシ囲心嚢、ブタ大動脈心臓弁、伏在バイパス移植片、大動脈同種移植片、および硬膜からなる群より選ばれたコラーゲン質材料である生物人工組織を、６．０と８．０との間のｐＨを有する水性緩衝液中にメタノール、エタノール、プロパノール、およびイソプロパノールからなる群より選ばれた水溶性脂肪族アルコールを少なくとも５０容量％含んでなる水性処理溶液に、２０分〜９６時間接触させる工程；および
（ｂ）該生物人工組織を洗浄する工程を包含する処理方法。
【請求項１９】
ヒトまたは動物の体内で使用するための石灰化抵抗性バイオ材料の製造方法であって、
（ａ）グルタルアルデヒド前処理された生物人工組織であって、哺乳動物から得られ、ウシ囲心嚢、ブタ大動脈心臓弁、伏在バイパス移植片、大動脈同種移植片、および硬膜からなる群より選ばれたコラーゲン質材料である生物人工組織を、６．０と８．０との間のｐＨを有する水性緩衝液中にメタノール、エタノール、プロパノール、およびイソプロパノールからなる群より選ばれた水溶性脂肪族アルコール４０容量％と有機溶剤４０容量％とを含んでなる水性処理溶液に、２０分〜９６時間接触させる工程；および
（ｂ）該生物人工組織を洗浄する工程を包含する処理方法。
【請求項２０】
さらに、（ｃ）前記生物人工組織を、０．２〜０．５％グルタルアルデヒドと少なくとも６０％のエタノールとを含む無菌緩衝溶液中で保存する工程を含む請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記バイオ材料が大動脈弁尖であり、前記アルコールがエタノールである請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記処理溶液が、Ａｌ+3およびＦｅ+3の塩からなる群より選ばれた多価金属陽イオンである抗石灰化剤をさらに含有している請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記バイオ材料が大動脈弁壁であり、前記抗石灰化剤がエタノール中アルミニウム塩である請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
請求項１、１８または１９に記載の方法によって製造されたバイオ材料。
【請求項２５】
前記アルコールが、前記処理溶液の６０容量％と８０容量％との間の量で存在する請求項１８記載の方法。
【請求項２６】
前記アルコールが、前記処理溶液の８０容量％の量で存在する請求項１８記載の方法。
【発明の詳細な説明】
発明の背景：
本発明は一般に生体内石灰化に抵抗性のある材料に関し、さらに詳細には、生体内に移植するために適当な生物人工組織のごときバイオ材料に関する。
毎年100000以上の心臓弁人工代用物が患者体内に移植されている。心臓弁の病気の処置のための唯一の手段が弁交換手術である場合は多い。最近使用されている代用弁の例はポリウレタンのような合成重合体材料から全体が構成されているメカニカル弁；ウシの心嚢またはブタの大動脈弁から得られる生物人工弁；大動脈同種移植片などである。
メカニカル弁の使用は血栓症ならびに心臓弁膜症を招く組織肥大によってしばしば面倒になる。生物人工心臓弁はメカニカル弁代用物と比較して向上されたトロンボーン形成およびヘモダイナミック特性を有する。しかし、石灰化がブタ大動脈弁またはウシ心嚢からつくられた生物人工心臓弁の臨床失敗例の最も多い原因である。ヒト大動脈同種移植片も、生物人工心臓弁よりは速度は遅いが、心臓弁膜組織と隣接大動脈壁の両方で病理学的石灰化を蒙ることが観察されている。狭窄および／または逆流のような形で心臓弁膜症を招く生理学的石灰化は再移植が必要となる。したがって、この組織の石灰化のため、生物人工心臓弁と同種移植片の使用は限られてきた。実際に、小児科の患者は石灰化の速度が加速されることが判明しているため、このグループに対しては生物人工心臓弁の使用には反対がある。
残念ながら、病理学的石灰化は合成心臓移植片や他の人工心臓装置たとえば心室補助装置の使用を一層困難にしている。なぜならば、石灰化がそれら装置を製造するために使用された合成重合体の柔軟性に影響を与えるからである。
心臓血管組織の病理学的石灰化のメカニズムは完全には解明されていない。一般に“病理学的石灰化”という言葉はリン酸カルシウム無機塩類の望ましくない沈着を意味する。石灰化の原因には宿主の要因、移植片の要因および外的要因たとえば機械的ストレスなどがる。カルシウムの沈着が活力を失った細胞、特にその細胞膜に関係があるという証拠がいくつかある。活力を失った細胞では低細胞内カルシウムレベルを維持する役割のカルシウムポンプ（Ca+2-Mg+2-ATPアーゼ）がもはや機能していないかまたは機能不全に陥っている。石灰化はカルシウムとリンの堆積と共に始まり、これがヒドロキシアパタイトとして存在して小結節の中まで広がり、その結果場合によっては心臓弁膜症が起こることが観察されている。
移植に先立つ生物人工組織の調製は一般にその組織を後の生体内酵素分解に対して安定化する処理、一般的には分子、特にコラーゲンを組織上と組織内で架橋結合する処理を含む。このためにはグリオキサール、ホルムアルデヒド、グルタールアルデヒドを含む各種アルデヒドが試用された。しかし、選ばれた剤はグルタールアルデヒドである。組織の固定化に加えて、グルタールアルデヒドは優れた消毒剤でありそしてこれは組織の抗原性を減少させる。今日までグルタールアルデヒドは水性条件下生理学的pHで使用されうる移植組織製造のための唯一の効果的架橋剤である。残念なことに、今日ではグルタールアルデヒドが石灰化を促進することが公知である。したがって、当技術分野では、グルタールアルデヒドのごとき架橋剤の石灰化促進作用を逆転させる手段が求められている。臨床品位のバイオ材料の製造のための既存のプロトコールに抗石灰化剤を組み入れることが特に望ましい。
ポリエポキシド（たとえばNagasi Chemicals, Osaka, JapanによってDenacolの商品名で販売されているポリグリセロールポリグリシジルエーテル）のごとき非アルデヒド架橋剤が開発された。しかし、ポリエポキシドで架橋された組織が生体内で有効であることを証明する決定的研究はまだ存在しない。
生物人工組織の石灰化を防止する研究は最初は組織を洗剤またはジホスホナート抗石灰化剤で前処理することに集中されていた。非共有結合洗剤たとえばナトリウムドデシルサルフェート（ＳＤＳ）や共有結合洗剤たとえばアミノオレイン酸を使用した洗剤前処理は循環血液に接触される材料に有効であることが実証されている。しかしながら、洗剤もジホスホナートも、血液と材料との相互作用のために時間の経過と共に移植された組織を洗い出してしまう傾向がある。すなわち、これらの処理は不可避な石灰化のプロセスを単に遅らせるだけである。したがって、生体内で病理学的石灰化の作用を受ける生物人工心臓弁や他の移植可能なバイオ材料または装置に長期の石灰化抵抗性を与える手段も求められている。
さらに加えて、洗剤は組織に不利に作用し、コラーゲンの変性温度または収縮温度（Ts）を下げる。これは材料の強度、耐久性および一体性にとって重要なことである。場合によっては、洗剤の使用は局部毒性をもたらす。したがって、洗剤のもつ品質悪化作用を伴わないで生物人工組織に抗石灰化特性を付与する有効な方法が求められている。
さらに、上記した技術はいずれも、外移植試料のカルシウム含量で測定して、いぜんとしてかなりの程度の生体内病理学的石灰化を生じさせる。したがって、より高レベルの石灰化抑制を結果する処理が必要とされている。
バイオ材料処理プロトコールでアルコールを使用することは公知である。しかしながら、その使用は一般に溶剤および／または消毒剤としての使用に限定されている。たとえば、アルコールは消毒洗浄剤として、また、貯蔵用溶液として使用されてきた。エタノールが病理学的石灰化の防止のために有効であることを教示または示唆するものはこれまで全くなかった。この良く知られた化合物が生物人工組織に石灰化抵抗性をもたせるため既存のプロトコールで使用することができれば誠に有利である。
したがって、本発明の１つの目的はバイオ材料を生体内病理学的石灰化に対して抵抗性にするため、バイオ材料特にグルタールアルデヒドで前処理された生物人工組織を処理する方法を提供することである。
本発明のいま１つの目的は生体内の病理学的石灰化に対して長期間、または、従来よりも延長された抵抗性を持たせるためのバイオ材料処理方法を提供することである。
本発明のさらにいま１つの目的はバイオ材料を生体内病理学的石灰化に対して抵抗性にさせるバイオ材料の処理方法であって、バイオ材料の処理のための既存プロトコールに容易に組み入れることのできる、たとえば、架橋剤グルタールアルデヒドが引き続き使用できる方法を提供することである。
本発明のいま１つの目的はバイオ材料を生体内病理学的石灰化に対して抵抗性にさせるバイオ材料の処理方法であって、物理的または機械的特性たとえば収縮温度（Ts）に対してほとんど不利な作用を持たない方法を提供することである。
本発明のさらにいま１つの目的は哺乳動物体内に移植するために適当なバイオ材料であって、生体内病理学的石灰化に対して向上された抵抗性を有するバイオ材料を提供することである。
発明の要約
上記およびその他の目的は、バイオ材料、好ましくはグルタールアルデヒドで前処理された生物人工組織たとえばブタ大動脈弁成分またはウシ心嚢をアルコールで処理してそのバイオ材料を石灰化に対して抵抗性とする処理方法を提供する本発明によって達成される。アルコールは好ましくは低級脂肪アルコール（Ｃ１乃至Ｃ３）たとえばメタノール、エタノール、プロパノールまたはイソプロパノールである。好ましい実施例においてはアルコールはエタノールである。
ここで使用される“バイオ材料”という言葉は種々の動物、一般的には哺乳動物から得られるコラーゲン質材料を指す。このバイオ材料は一般に移植のため適当な、たとえば、生物人工組織などであるが、本発明はこれに限定されない。非限定的に例示すれば、心臓弁、特にブタの心臓弁、大動脈根、壁および／または尖頭：ウシの心嚢、硬膜のごとき材料から得られた結合組織；同種移植片たとえば大動脈同種移植片および伏在バイバス移植片；腱、靭帯、皮膚パッチ、動脈、血管などである。もちろん、生体内に使用するために適当な公知または公知となるであろう他の生物学的に得られた材料も本発明の範囲内である。
本発明の好ましい実施例によれば、バイオ材料はグルタールアルデヒドで前処理される。したがって、本発明のアルコール処理は移植用生物人工組織調製のための公知のプロトコールや基準に組み入れることができる。もちろん、他の架橋剤によるバイオ材料の処理も本発明の範囲内である。バイオ材料がグルタールアルデヒドで架橋結合される実施例においては、各種のグルタールアルデヒド前処理のための任意の技術を使用することができる。代表的なグルタールアルデヒド前処理プロトコールにおいては、バイオ材料はそのバイオ材料の上および内部の分子を架橋結合するために適当な条件下でグルタールアルデヒド緩衝液に接触されるおよび／または液中に保存される。たとえば、バイオ材料は適当な温度（約４℃から約２５℃まで）かつ適当なpH（約６乃至約８、好ましくは７．１乃至７．４）でグルタールアルデヒドに接触させることができる。その前処理溶液中のグルタールアルデヒド濃度は一般に約０．２乃至０．８％w/vまたはそれ以上、好ましくは０．６％である。
本発明の方法によれば、処理液中のアルコールの濃度は約５０容量％以上、好ましくは６０乃至８０％の範囲である。バイオ材料がアルコールに暴露または接触される時間は生物人工組織を生体内病理学的石灰化に対して抵抗性とせしめるのに十分な時間である。例示すれば約２０分間（すなわち、エタノールをたとえば生物人工組織内に拡散させるために要する時間）から９６時間以上までの時間である。ある種のバイオ材料ではアルコールに過度にさらすとアルコールの抗石灰化効果が低下したり、その組織の再水和が必要になったりする場合がある。
本明細書に記載されている実施例におけるアルコール接触時間は例示的なものであり、当技術分野に通常の知識を有する者によって変更されうるものである。バイオ材料がアルコールの液体処理溶液中に浸漬またはソーキングされる本発明の実施例の場合、その接触時間は好ましくは約２４乃至９６時間である。しかしながら、本発明の範囲内でより長い接触時間も、後記のごとく適当な貯蔵条件が維持されるならば、許容される。注意すべきことは、そのような時間の間に生物人工組織に悪影響が観察されないことである。
バイオ材料をアルコールに接触させる方法を非限定的に例示すればアルコールの蒸気、プラズマ、液体の付与および／または低温貯蔵である。接触方法のいかんにかかわらず、接触時間は石灰化を抑制するアルコール−コラーゲン相互作用を促進するのに十分な長さであるべきである。しかし、アルコールにより修復不可能な脱水が起こるほど長時間であってはならない。
本発明の方法によれば、アルコール処理溶液は好ましくは液体、そして水性である。すなわち、約アルコール５０％以上、好ましくは６０乃至８０容量％の、pH６．０乃至８．０、好ましくは７．０乃至７．６、より好ましくは７．４に緩衝された水性溶液である。また、本発明の実施に際しては、２種またはそれ以上の有機溶剤の混合物を使用することもできる。ただし、それら有機溶剤の合計容量は約４０％以上、好ましくは約５０％以上でなければならない。たとえば、約４０％のエタノールと約４０％のアセトンとの混合物が有効であることが証明されている（実施例７参照）。
本発明の実施のために使用しうる適当な緩衝剤は生理学的に許容されるpH価を保持するために十分な緩衝能を有し、そしてバイオ材料に有害な作用を生じさせないあるいは処理工程に干渉しないような緩衝剤である。非限定的にかかる緩衝剤を例示すればＮ−Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペリジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（HEPES）またはモルホリンプロパンスルホン酸（MOPS）；およびホウ酸塩、炭酸水素塩、炭酸塩、カコジル酸塩を含有する緩衝剤である。
本発明の好ましい実施例においては、バイオ材料はアルコール処理溶液との接触の間、振とうまたは撹拌される。振とうは任意の方法で、たとえば、オービタルシェーカーあるいはシェーカースタンドを使用して行うことができる。アルコール処理は一般に室温（２５℃）で実施される。しかしながら、組織に有害でない任意の温度、たとえば４℃から約３７℃までの温度が本発明の実施のために使用できる。
本明細書で処理溶液中のアルコール濃度、たとえば、５０％またはそれ以上の濃度が論じられているが、エタノールのようなアルコールは迅速に組織内に拡散されるので溶液中のアルコール濃度は組織内のアルコールの局地的濃度とほとんど同じであることを理解されたい。したがって、“接触”という言葉の定義も十分に広く解釈されるべきであり、移植された組織内でのアルコールの現場での遊離、たとえば、テトラエチルエステルの加水分解から生じるようなアルコールの現場での遊離をも包含されるべきである。
本発明の好ましい実施例においては、上記のごとく石灰化を低減させるために処理されたバイオ材料は、過剰のアルコールおよび生成された成分またはバイオ材料処理プロトコールにおいて使用された他の有害成分、たとえば、グルタールアルデヒド前処理から由来するアルデヒドフラグメントなどを除去するため、移植前に洗浄される必要がある。ここで使用する“洗浄”という言葉は当該バイオ材料を洗浄液の処理にかけるをことを意味し、洗浄処理は連続式またはバッチ式処理を包含する。すなわち、バイオ材料が洗浄液に入れられ、その洗浄液が予定された間隔で定期的に除去されそして新鮮な液と交換されるような洗浄処理を包含する。洗浄の間、組織は好ましくは振とうまたは間欠的に撹拌され洗浄液が均等に分散されるようにする。洗浄はたとえばpH７．４の新鮮なHEPES緩衝液のごとき洗浄液でバイオ材料を処理することによっても実施できる。たとえば、洗浄は、バイオ材料を新鮮な洗浄液に漬け、その洗浄液を約５乃至１５分間で３回交換することにより実施することができる。別のやり方として、洗浄液を２４時間の洗浄時間にわたり６乃至８時間またはそれ以下の時間間隔で交換することもできる。好ましい実施例においては、HEPES緩衝液が２４時間の洗浄期間の間１時間ごとに交換される。本明細書では長い洗浄時間のことを“洗濯”という。
洗浄液の例をあげれば水、塩水、PBS、HEPES緩衝塩水、リンゲルラクトエート（pH７．４）、炭酸水素ナトリウム（pH７．４）、トリス（pH７．４）、イミダゾール（pH７．４）などである。
洗浄した後、処理された生物人工組織は移植できる。また、消毒して使用時まで保存しておくこともできる。臨床品位の生物人工組織の長期保存のために一般に使用されているタイプの標準グルタールアルデヒド溶液に入れて保存すると本発明のアルコール処理によって達成される望ましい効果を部分的に損なわれる可能性がある（Ｆｉｇ．２参照）。本発明のいくつかの実施例によれば、処理されたバイオ材料は、好ましくは石灰化抑制および／または無菌性を保持するために十分な量のエタノー性グルタールアルデヒド溶液に入れて保存される。１つの好ましい実施例においては、処理されたバイオ材料はアルコールが約６０％以上、好ましくは約６０乃至約８０％そしてグルタールアルデヒドが約０．５％以下、好ましくは約０．２乃至０．５％であるグルタールアルデヒド含有緩衝アルコール溶液に入れて保存される。特に好ましい実施例では保存溶液はエタノールが６０％そしてグルタールアルデヒド０．２％である（後記表６参照）。
本発明の別の実施例においては、本発明の方法によって処理されたバイオ材料はアルデヒドを含有していない環境中で保存される。好ましい実施態様においては、処理されたバイオ材料は無菌袋に入れられそしてガンマ線照射のごとき殺菌照射処理を受ける。もちろん、本発明のエタノール処理は他の公知の殺菌保存済および／または公知であるかまたは当業者によって将来開発されるであろう技術と両立しうる。
本発明の方法のさらに別の実施態様において、アルコール処理溶液は１種またはそれ以上の付加的な抗石灰化剤、たとえば、Ａｌ+3またはＦｅ+3のごとき金属陽イオンの適当な塩を好ましくは０．１Ｍ乃至０．００１Ｍの濃度範囲で含有しうる。本発明の実施に使用するために適当な付加的抗石灰化剤の例は水溶性アルミニウム塩である。ただし、これに限定されるものではない。水溶性アルミニウム塩の例を非限定的に示せば塩素酸アルミニウム、ラクトン酸アルミニウム、硫酸カリウムアルミニウム、硫酸ナトリウムアルミニウム、硫酸アルミニウム、硝酸アルミニウム、塩化アルミニウムなどである。好ましい実施例においては、水溶性塩としてAlCl3が０．１Ｍ濃度で使用される。さらに本発明の範囲内で特に考慮される付加的抗石灰化剤は水溶性第二鉄塩、たとえば、塩化第二鉄、硝酸第二鉄、臭化第二鉄、エデン酸ナトリウム第二鉄、硫酸第二鉄、ギ酸第二鉄などである。もちろん、処理溶液の溶剤系に溶解可能なアルミニウムまたは鉄の任意の塩が本発明を実施するために使用できる。
本発明のいま１つの対象は本発明の方法により製造されたバイオ材料である。本発明の好ましい実施例においては、それらバイオ材料は向上された抗石灰化特性および／または生体内病理学的石灰化に対する長期間抵抗性を示す。
【図面の簡単な説明】
本発明は添付の図面を参照した後記の詳細な説明を読むことによってさらによく理解されるであろう。添付図面中、
Fig.１は本発明の方法によって処理されたブタの大動脈弁試料（cusps）の場合の、ラット皮下モデル中でのブタ大動脈石灰化の抑制を示すグラフである；
Fig.２は本発明の方法によって処理され、続いてラットの皮下に２１日間移植されたブタの大動脈弁試料のカルシウム含量（μg/ｍg）を示すグラフである；
Fig.３はヒツジの体内に１５０日間移植された各種ブタ大動脈弁試料のカルシウム含量（μg/ｍg）を示すグラフである；
Fig.４は本発明の方法に従ってエタノールの水性溶液（４０％と８０％）で処理された、または、洗剤（１％ナトリウムドデシルサルフェート、ＳＤＳ）で処理されたグルタールアルデヒド前処理ブタ大動脈弁と比較して、グルタールアルデヒド前処理ブタ大動脈弁の14Ｃコレステロール含量、μg/ｍg、を示すグラフである；
Fig.５は組織から脂質を除去するため公知の各種溶剤の処理にかけたグルタールアルデヒド前処理ブタ大動脈弁の石灰化濃度を示すグラフである；
Fig.６は各種エタノール処理と保存を行ったブタ大動脈弁の場合のＴ1、℃を示すグラフである。
発明の詳細な説明
以下、本発明の原理による石灰化抵抗性バイオ材料の製造のためのいくつかの特定例を記載する。
これらの例は石灰化抵抗性心臓弁の製造に主として向けられているが、そこに記載されている技術は他のバイオ材料、特に移植に適する他の人工代用物または生物人工組織の製造のためにも適用できるものである。
また、結果はラット皮下移植およびヒツジ生物人工心臓弁交換試験の形で呈示されているが、これら動物モデル系はヒト組織の臨床−病理学的外植片で観察されるものと酷似した石灰化沈着物を生じることを理解されたい。これら動物モデルとヒト病理学との相似性は光学顕微鏡と電子顕微鏡の両者の分析で実証されている。
グルタールアルデヒド前処理ブタ大動脈弁がステントの形およびフリースタイル（ステントレス）の形の両者でSt. Jude Medical, Inc., St. Paul, MNおよびMedtronic, Inc., Irvine, CAから入手されそして以下に記載する実施例で使用された。一般に、バイオ材料はグルタールアルデヒド中で安定化と前処理を受け、そのあと、たとえば、緩衝液中グルタールアルデヒドの０．５％溶液中に取り入れられる。
実験の部：
実施例１
薬物濃度−反応試験を実施した。その結果がFig.１にグラフで示されている。グルタールアルデヒド前処理ブタ大動脈弁の試料をエタノール濃度０％乃至８０％のエタノール水溶液に入れ２４時間浸漬した。エタノール溶液はHEPES（０．０５Ｍ）でpH７．４に緩衝されていた。処理されたブタ大動脈弁試料を離乳したての複数のラット（オス、ＣＤ、Sprague-Dawley、重さ５０−６０ｇ）の腹腔壁の切開した２つの皮下嚢内に移植した。２１日経過後、試料を取り出しそして試料中のＣａ+2イオン濃度レベルを測定することによって石灰化の状態を調べた。エタノール濃度が５０％以またはそれ以上であった場合には、グルタールアルデヒドで前処理された対照と比較してブタ大動脈弁内のカルシウムの沈着は実質的に防止された。
実施例２
最適抗石灰化効果を得るために必要なアルコール処理溶液との接触時間の長さを決定するためブタ大動脈弁試料に対する試験を実施した。Fig.２は８０％エタノールに２４時間または７２時間あらかじめ接触させ、そしてラットの皮下嚢に移植して２１日経過したグルタールアルデヒド前処理ブタ大動脈弁試料のカルシウム含量（μg/ｍg）をグラフで表したものである。一般に、エタノールに７２時間接触させた場合には２４時間接触させた場合よりも多量のカルシウム沈着が生じる。しかしながら、エタノールに７２時間接触させた試料の石灰化レベルは、それにもかかわらず、常に対照（グルタールアルデヒドで前処理たブタ大動脈弁cusps）のレベルを下回っている。対照試料のカルシウム含量は178.2±6.166μg/mg乾燥組織であった。これに対して、８０％エタノールに２４時間接触させ、続いてHEPES緩衝塩水（pH７．４）１００mlで約１０乃至１５分間３回洗浄した試料のカルシウム含量は2.248±0.186μg/mgであった。これは９９％の抑制率を表す。すなわち実質的な防止である。
再びFig.２を見ると、エタノールで処理し、続いてグルタールアルデヒド含有溶液で洗浄した、あるいは、グルタールアルデヒド含有溶液中で保存されたブタ大動脈弁試料のカルシウム含量が示されている。すなわち、１つの場合（"Glut. Rinse"）では、エタノールで処理された試料はpH７．４（HEPES）に緩衝された０．２％グルタールアルデヒド各１００mlで約１５分間にわたり３回洗浄された。その次の場合（"Glut. Storage"）では、エタノールで処理された試料はpH７．４（HEPES）に緩衝された０．２％グルタールアルデヒド中に３０日間保存され、そしてそのあと移植前にHEPES緩衝塩水で洗浄された。グルタールアルデヒド含有溶液で洗浄したまたはその溶液中で保存した場合にはグルタールアルデヒドと追加的な接触を受けないままであった試料の場合よりも多くのカルシウム沈着が観察された。
実施例３
次の表１に報告されているように、洗浄または洗濯は２１日間及び６０日間のラット皮下移植試験において石灰化のレベルにかなりの影響を及ぼすことが判明した。表１は１セットのブタ大動脈心臓弁試料をラットの皮下嚢に移植した後の試料のカルシウム含量を示している。試料はSt. Jude Medical, Inc. から入手された未処理のグルタールアルデヒド前処理ブタ大動脈心臓弁（対照）と８０％エタノールに２４時間接触させられた、処理されたグルタールアルデヒド前処理ブタ大動脈心臓弁であった。８０％エタノールで処理された試料は、そのあと、最後の“洗濯”（pH７．４HEPES緩衝塩水の中に２４時間浸漬、１時間ごとに液交換）を受けるか、または、“洗浄”（pH７．４HEPES緩衝塩水を使用し各回１００mlで１分間、３回洗浄すること）を受けた。８０％エタノールで付加処理された試料がpH７．４（HEPES）に緩衝されたエタノール８０％とグルタールアルデヒド０．２％の溶液中で１か月保存されそしてそのあと“洗浄”または“洗濯”を受けた。
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グルタールアルデヒドで前処理したウシ心嚢の試料を８０％エタノール中で処理し、そのあと２４時間洗濯した。ラット皮下に移植後２１日目のカルシウム含量は2.95±0.78μg/mgであった。これと比較して、未処理対照試料のカルシウム含量は121.16±7.49μg/mgであった。
実施例４
生体内での石灰化抵抗性を得るための本発明の方法の有効性を吟味するため、グルタールアルデヒド前処理ブタ大動脈心臓弁試料を使用して試験を実施した。グルタールアルデヒド前処理ブタ大動脈心臓弁試料はSt. Jude Medical, Inc.（St. Jude）およびMedtronic, Inc.,（Hancock I）から入手した。対照試料はアルコール処理にかけなかった。実験試料は８０％エタノールに７２乃至９６時間接触させた。対照試料と実験試料は僧帽弁代替物として若ヒツジに移植された。移植後５か月目にその弁を体外移植してカルシウム含量を調べた。その結果はFig.３に示されている。すなわち、Fig.３は１５０日目に体外移植された試料（１グループあたりヒツジ１０頭）のカルシウム含量をグラフで示したものである。エタノール処理によって石灰化が完全に防止されれたことが示されている。比較のために、新しい未移植のブタ大動脈心臓弁試料のカルシウム含量も示されている。
実施例５
特定の理論に固執することは望まないが、アルコールはグルタールアルデヒド前処理された生物人工組織の活性を失った膜を不可逆的に変えるものと考えられる。プロトンＮＭＲ分析はアルコール処理後の水との会合の変化を示している。表２は新鮮なブタ大動脈心臓弁試料ならびにグルタールアルデヒドで前処理された試料および本発明の原理に従って８０％エタノール中で処理されたグルタールアルデヒド前処理試料に対して実施されたプロトンＮＭＲ測定（7.5 Tesla測定器）のＴ１とＴ２の弛緩時間を示す。エタノールによる処理は明らかに延長されたＴ１およびＴ２弛緩時間をもたらしている。この延長はリン酸カルシウム沈着物への伝導性のはるかに低い水リッチな環境を意味している。
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＊処理を受けなかったブタ大動脈心臓弁尖（未処理）；０．６％グルタールアルデヒドで処理されたブタ大動脈心臓弁尖（グルタールアルデヒド）；８０％エタノールで処理されたブタ大動脈心臓弁尖（エタノール）。すべての処理液はpH７．４に緩衝されていた。
実施例６
アルコールは組織からほとんど完全に全コレステロールおよびリン脂質を除去しそしてプラズマリポタンパク質のバイオ材料の中への吸収を阻止するようである。グルタールアルデヒド前処理ブタ大動脈弁（cusps）の各試料を４０％エタノール中、８０％エタノール中または洗剤（１％ＳＤＳ）中で２４時間処理した。未処理の、グルタールアルデヒド前処理ブタ大動脈弁試料は対照として使用された。これらの試料をウシ血清中14Ｃ−コレステロール溶液に２４時間浸漬した。Fig.４はこれら処理された試料ならびに対照のコレステロール含量μg/mgをグラフで示したものである。ブタ大動脈弁試料によって吸収されたコレステロールは８０％エタノールで２４時間処理された試料では激減されていることがわかる。これは多分プラズマリポタンパク質の吸収を阻止する永久的な材料効果を示すものであろう。洗剤で処理された組織はかなり高いコレステロール吸収を示した。
表３はグルタールアルデヒド前処理ブタ大動脈弁試料を表中に記載したアルコールまたはクロロホルム−メタノール混合物の緩衝水性溶液中で２４時間処理した場合の総コレステロール（ＣＳ）とリン脂質（ＰＬ）の含量を示す。
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表３に示されているように、８０％エタノール処理の場合はブタ大動脈弁組織に含まれていたコレステロールとリン脂質はほとんど全部除去される。洗剤（ＳＤＳ）も、６０％またはそれ以上のエタノールに比較して、組織コレステロールとリン脂質含量に対してかなりの低減効果を示す。
実施例７
コレステロールと脂質を抽出することが公知の他の溶剤も抗石灰化作用の可能性について試験した。グルタールアルデヒド前処理ブタ大動脈弁（cusps）の各試料を次のものに２４時間接触させて処理した：８０％メタノール、８０％プロパノール、８０％エタノール、クロロホルム／メタノール（２：１）、８０％アセトニトリル、および８０％アセトン。これら試料をラットの皮下嚢内に２１日間移植しそして外培養でカルシウム含量を調べた。Fig.５はその結果を示す。メタノールとアセトンはエタノールに匹敵する抗石灰化作用を示すが、それら溶剤の使用には問題がある。なぜならば残留メタノールは移植環境中で潜在毒性でありそしてアセトンは石灰化原因物質であるうるからである。驚くべきことは、脂質抽出のための標準液であるクロロホルム／メタノール混合物がエタノールよりもはるかに低い効果を示したことである。
別の関連試験において、４０％エタノールと４０％アセトンの組み合わせの濃度効果が観察された。この２つの溶剤はいずれも個々では４０％濃度では効果を示さない（Fig.１の４０％濃度におけるエタノールの効果参照）。４０％アセトンで処理した後２１日間ラットの皮下嚢内に移植されたブタ大動脈心臓弁のカルシウム含量は141.07±28.91μg/mgであった。これに対して、４０％エタノールト４０％アセトンとの混合物で処理された試料のカルＳシウム含量は1.54±0.16μg/mgである。すなわち、複数の有機溶剤の合計量が５０％以上であれば、２種またはそれ以上の溶剤混合物も本発明の実施において使用可能である。
実施例８
Fig.６に示されているように、材料の強度、耐久性、一体性の重要な尺度であるＴsは本発明のエタノール処理によってほとんど完全に影響されない。Fig.６下記の各種処理スキームにより、特にエタノール（８０％または１００％）と洗剤（ＳＤＳ）で２４時間接触処理されたグルタールアルデヒド前処理ブタ大動脈弁（cusps）の試料についてのコラーゲン変性温度（℃）をグラフで表したものである。処理スキームの種類：洗浄を伴わない８０％エタノール処理；洗浄を伴わない１００％エタノール処理；HEPES緩衝塩水での１時間の洗濯を後続させた１００％エタノール処理；HEPES緩衝塩水での洗浄および０．２％グルタールアルデヒド中での２４時間の保存を後続させた８０％エタノール処理；HEPES緩衝塩水での洗浄を後続させた１％ＳＤＳ処理；およびHEPES緩衝塩水での１時間の洗濯洗浄を後続させた１％ＳＤＳ処理。対照は受け取ったまま（"Glu."）またはpH７．４HEPES緩衝塩水中で洗浄しそして保存されたSt. Jude Medical, Inc.から入手したグルタールアルデヒド前処理ブタ大動脈弁試料であった。データを得るためには示差走査発熱測定法が使用された。水性洗浄と適当な保存条件によるエタノール処理はＴsに影響を与えなかった。これに対し洗剤処理はかなりＴsを下げた。
８０％エタノールに２４時間接触させた後でブタ大動脈弁試料を再水和するために必要な時間の長さを調べるため、示差走査発熱測定法を使用した。ここで使用される“再水和”という言葉は対照（pH７．４HEPES緩衝塩水中で２４時間洗浄されたグルタールアルデヒド前処理ブタ大動脈弁試料）の値までＴsを戻すことを意味する。エタノール処理された試料（cusps）を１回のリンスから１時間の洗浄まで時間を変えてHEPES緩衝塩水（pH７．４）で処理した。結果が表４に示されている。２分間の洗浄で処理された試料のＴsは対照のＴs値と統計学的にほとんど差がない値まで戻された。
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実施例９
ブタ大動脈弁の全タンパク質組成ならびに管形態は、完全アミノ酸分析および化学分析のための電子スペクトル分析（ＥＳＣＡ）によって立証されるように、アルコール処理によって影響されない。事実、アルコール処理はブタ大動脈尖頭の表面の滑らかさと異方性を増強させ、新鮮な尖頭に匹敵する表面化学を結果する。これとは対照的に、グルタールアルデヒド前処理された（対照）または洗剤（ＳＤＳ）処理された組織は顕著な違いを示す。表５は記載した溶液中に２４時間浸漬させたブタ大動脈弁試料中の表面炭素（Ｃｌs）、窒素（Ｎｌs）および酸素（Ｏｌs）の濃度（％）を示す。
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グルタールアルデヒド前処理ブタ大動脈弁と比較して、エタノール処理されたグルタールアルデヒド前処理ブタ大動脈弁の完全アミノ酸分析はエタノール処理が実質的にアミノ酸組成にまったく影響を及ぼさない、すなわち、その生物人工組織のタンパク質組成分のいかなるものも有意味程度までは抽出しないことを示している。
機械的および生理学的弁機能についての生体内機能試験の結果は本発明によるエタノール処理によって機械的機能が向上されることを示した。
実施例１０
本発明のさらに別の実施例に対する一連の実験において、グルタールアルデヒド前処理ブタ大動脈弁が各種のプロトコールで６０％エタノールで処理された。“ブタ大動脈弁”という言葉は一般に弁尖部分と大動脈壁部分の両者を包含するけれども、上記に報告した実験は一義的に弁尖組織に対して実施された。今回の実験では組織のこの２つの部分を分離しそしてデータを別々に表６に報告する。
St. Jude Medical, Inc.から入手したグルタールアルデヒド前処理生物人工組織心臓弁試料を対照として使用した。このグルタールアルデヒド前処理組織の試料を次に６０％エタノールまたは６０％エタノールと０．１モルAlCl3の処理溶液で２４時間処理した。エタノール処理に続いて、組織を中性緩衝液、特定的にはHEPES中、pH７．４で２４時間洗浄した。洗浄後、組織試料を殺菌して１４日間保存した。いくつかの保存プロトコールでは組織は中性緩衝液中にパックされそして殺菌照射を受ける。他の保存プロトコールでは、組織は６０％エタノールとグルタールアルデヒド（０．２％または０．５％）との混合液の中に入れて保存される。さらに別の保存プロトコールでは、保存液はさらに０．１モルAlCl3を含有する。
上記のごとく調製された組織がラットの皮下嚢内に移植されそして２１日後にカルシウム含量が調べられた。結果は次の表６に示されている。
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表６に示されているように、バイオ材料が特に大動脈壁組織である場合には、処理液または保存液にＡｌ+3を入れることによってアルコール溶液で処理された場合よりもかなり高い石灰化抑制が達成される。
実施例１１
グルタールアルデヒド前処理ブタ大動脈壁の試料をつぎの水性（pH７．４緩衝HEPES）処理溶液で２４時間処理した：０．１モルFeCl3；０．０１モルFeCl3；８０％エタノール；８０％エタノールと０．１モルFeCl3；８０％エタノールと０．０１モルFeCl3。処理後、組織を中性緩衝液、特定的にはHEPES、pH７．４の各１００mlで三回洗浄した。対照としてSt. Jude Medical, Inc.から入手したグルタールアルデヒド前処理大動脈壁に試料が使用された。上記のごとく調製された組織試料をラットの皮下嚢内に移植しそして２１日後にカルシウム含量が調べるため分析した。結果は下記表７に示されている。
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表７はアルコール処理液および／または保存液にFe+3イオンを入れるとブタ大動脈壁試料において石灰化に対する向上された抵抗性が生じることを示す。
以上、本発明を特定実施例および使用例について詳細に記載したが、当技術分野に通常の知識を有する者は請求の範囲に記載された本発明の範囲と精神から逸脱することなくこれら記載の教示のもとでさらに種々の実施例を創出することができる。したがって、添付図面と本明細書の記載は本発明の理解に資するためのものであって、本発明の範囲を限定するものではないことを理解されたい。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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