(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
サルモネラ属、シゲラ属、エシェリシア属、ビブリオ属およびエルシニア属に属する微生物から選ばれる食中毒の原因微生物に対して抗微生物活性を有する物質を産生するラクトバチラス・アシドフィラス（Lactobacillus acidophilus ）グループに属するラクトバチラス・アミロボラス（Lactobacillus amylovorus）ＩＭＣ−１であることを特徴とするラクトバチラス属乳酸菌。
【請求項２】
発酵食品の中から分離した請求項１記載のラクトバチラス属乳酸菌を培養して産生したサルモネラ属、シゲラ属、エシェリシア属、ビブリオ属およびエルシニア属に属する微生物から選ばれる食中毒の原因微生物に対して抗微生物活性を有する物質を含み、前記食中毒の原因微生物に起因する食中毒予防を目的とする健康食品として利用できることを特徴とする培養物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ラクトバチラス属に属する乳酸菌およびその培養物に関し、更に詳細には、サルモネラ属、シゲラ属、エシェリシア属、ビブリオ属およびエルシニア属に属する食中毒の原因微生物に対して抗微生物活性を有する物質（以下、抗菌物質と称すことがある）を産生し、食中毒予防を目的とする保健食品に有効に利用することのできるラクトバチラス属に属する乳酸菌およびその培養物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、食品の微生物汚染が原因とされる食中毒の発生が大きな社会問題となっている。その主たる原因微生物として、病原性大腸菌、腸チフス菌、腸炎ビブリオ菌などが挙げられるが、その他にも赤痢菌やコレラ菌も重篤な食中毒症を引き起こす原因微生物として知られている。
これらの食中毒原因微生物の汚染源となる食品は、牛乳、生肉、魚介類、野菜などの生鮮食品であり、その予防法として、調理環境の整備・美化に加え、抗菌剤や合成保存料といった化学薬品の添加が有効とされている。しかしながら、食品添加物の使用については安全性の面においてしばしば問題が生じるところであり、その使用にあたっては細心の注意を払わなくてはならない。
【０００３】
一方、ヨーグルトに代表される発酵乳の摂取が食中毒の予防に効果があるのではないかと期待されている。事実、ヨーグルトに含まれている乳酸菌の代謝産物である乳酸や酢酸などの有機酸が食中毒原因微生物に対して殺菌的に作用することが認められており、製品の保存性向上に大きな役割をはたしている。
しかしながら、食品としてヨーグルトを摂取した場合、中性（ｐＨ）領域の消化管内において、有機酸が有効に殺菌作用を持続しつづけるのかどうかについては不明な点が多い。こうした観点から、最近有機酸以外の抗菌物質を産生する乳酸菌の発酵乳への応用が試みられている。
【０００４】
乳酸菌が抗菌物質を産生することは広範に報告されており［「乳酸菌の科学と技術」、乳酸菌研究集談会編、学会出版センター、Ｐ２０５〜２１５（１９９６）］、その代表的な菌種としては、抗菌物質ナイシン（Nisin ）を産出するラクトコッカス・ラクチス・亜種ラクチス（Lactococcus lactis subsp. lactis）（特開平６−９６９０号公報）、抗菌物質ガセリシン（Gassericin）を産生するラクトバチラス・ガセリ（Lactobacillus gasseri ）［Toba、T.、Yoshioka、E. およびItoh、T．：Lett.Appl.Microbiol.、 １２、Ｐ２２８〜２３１（１９９１）］、抗菌物質ヘルベチシン（Helveticin）を産生するラクトバチラス・ヘルベチカス（Lactobacillus helveticus）［Joerger、M.C.およびKlaenhammer、T.R.：J.Bacteriol.、 １６７、４３９（１９８６）］等が挙げられる。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら現在のところ、乳酸菌の産生する抗菌物質が、前述の食中毒原因微生物に対して幅広く有効に作用するという報告はなされていない。
このことから、現在幅広い抗菌スペクトルを有し、さまざまな食中毒原因微生物に対して有効に抗菌作用が発揮される物質を産生する乳酸菌の検索とそれを応用した発酵乳製品の開発が望まれている。
本発明の第１の目的は、サルモネラ属、シゲラ属、エシェリシア属、ビブリオ属およびエルシニア属などに属する食中毒の原因微生物に対して抗微生物活性を有する物質を産生することのできる新規なラクトバチラス属に属する乳酸菌を提供することであり、本発明の第２の目的は、そのラクトバチラス属乳酸菌を培養して産生した食中毒の原因微生物に対して抗微生物活性を有する物質を含む培養物であって、食中毒予防を目的とする保健食品などに有効に利用することのできる培養物を提供することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、乳酸菌が産生する抗菌物質に着目し鋭意研究を重ねた結果、サルモネラ属、シゲラ属、エシェリシア属、ビブリオ属およびエルシニア属などに属する食中毒原因微生物に対して抗微生物活性を有する物質を産生する新規な乳酸菌がいることを見出し、本発明に至った。
【０００７】
上記課題を解決するための請求項１の発明は、サルモネラ属、シゲラ属、エシェリシア属、ビブリオ属およびエルシニア属に属する微生物から選ばれる食中毒の原因微生物に対して抗微生物活性を有する物質を産生するラクトバチラス・アシドフィラス（Lactobacillus acidophilus ）グループに属するラクトバチラス・アミロボラス（Lactobacillus amylovorus）ＩＭＣ−１であることを特徴とするラクトバチラス属乳酸菌である。
【００１１】
本発明の請求項２の発明は、発酵食品の中から分離した請求項１記載のラクトバチラス属乳酸菌を培養して産生したサルモネラ属、シゲラ属、エシェリシア属、ビブリオ属およびエルシニア属に属する微生物から選ばれる食中毒の原因微生物に対して抗微生物活性を有する物質を含み、前記食中毒の原因微生物に起因する食中毒予防を目的とする健康食品として利用できることを特徴とする培養物である。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明の食中毒原因微生物に対して抗微生物活性を有する物質を産生する乳酸菌は、種々の発酵食品や自然界の中から、以下に示す検索法にて分離・採取できる。すなわち、
１）乳酸菌を含む試料、たとえば発酵食品を適量分取し、滅菌生理食塩水にて１０8 まで段階希釈した後、希釈液をＢＣＰ加プレートカウント寒天培地或いはＭＲＳ寒天培地と混和して平板培地を作成する。その後、培地が黄変するまで培養する。なお、培養温度は２０〜４０℃の範囲であれば任意に設定できる。
【００１３】
２）培養後、集落数が５０個以下の平板培地よりすべての菌集落を釣菌し、分離培養を繰り返すことで乳酸菌の純粋菌株を得る。
【００１４】
３）分離乳酸菌株を脱脂乳培地或いはＭＲＳ液体培地に接種し、各菌株の至適温度にて２４〜７２時間培養する。得られた培養液を塩酸或いは水酸化ナトリウム溶液でｐＨ５．０〜７．０に調整後、遠心分離および濾過滅菌操作を行ない、無菌培養上清液とする。
【００１５】
４）上記無菌培養上清液を適量分取し、滅菌したペーパーディスクに浸み込ませる。
【００１６】
５）一方、試験に供する被検微生物、すなわちサルモネラ属、シゲラ属、エシェリシア属、ビブリオ属およびエルシニア属に属する食中毒原因微生物を、ミューラー・ヒントンブロス或いはニュートリエントブロス中、３７℃にて１８時間程培養し、１０8 〜１０9 個／ｍｌの菌数に調整する。
【００１７】
６）上記５）で得た各培養液０．０５ｍｌとあらかじめ滅菌、溶解しておいた感性ディスク用培地−Ｎ（５ｍｌ）を混和し、ただちに滅菌シャーレに分注して固化させる。
【００１８】
７）上記４）で調整したペーパーディスクを上記の被検微生物を混和した寒天平板培地上に置き、３７℃で２４時間培養する。
【００１９】
８）ペーパーディスク周辺に形成される透明な抗菌帯（阻止円）の直径を測定する。
上記の検出法では、ペーパーディスクに浸み込ませた抗菌物質が寒天ゲル内を拡散し、被検微生物の発育を阻害することによって抗菌帯が形成される。
【００２０】
また、乳酸菌培養上清液は濃縮することで抗菌活性の感度を上げることができる。この際の濃縮操作は、溶剤抽出、イオン交換カラムおよびゲル濾過カラムなど常法に従って行なうことができる。
【００２１】
なお、脱脂乳培地で乳酸菌を培養する際、必要に応じて乳酸菌の生育促進物質を適量添加することができる。その場合の添加される生育促進物質としては酵母エキスや大豆ペプチドのほか、カゼイン加水分解物等を挙げることができる。また、乳糖資化性のない株或いはそれが弱い株を培養するには、脱脂乳培地に適量のグルコースを添加することができる。
【００２２】
食中毒の予防にとって、経口摂取した抗菌物質産生乳酸菌が腸管に到達し、定住することは非常に重要なことである。そのため本発明の抗菌物質産生乳酸菌は、胃酸や消化酵素、胆汁酸に対して耐性をもった乳酸菌、例えば、ラクトバチラス・アシドフィラスグループの乳酸菌の中から選択されるのが好ましい。
【００２３】
次に、本発明で得た食中毒原因微生物に対して抗微生物活性を有する物質を産生する乳酸菌の代表例として、ラクトバチラス・アシドフィラスグループに属する乳酸菌株、ラクトバチラス・アミロボラスＩＭＣ−１株の菌学的性質を表１に示す。
なおラクトバチラス・アミロボラスＩＭＣ−１株は、本発明者が国内外のさまざまな発酵食品の中から分離した乳酸菌である。
比較のために、ＪＣＭ1126T （ラクトバチラス・アミロボラス標準株）、ＪＣＭ1185T （ラクトバチラス・クリスパタス標準株）、ＪＣＭ1132T （ラクトバチラス・アシドフィラス標準株）についても菌学的性質を表１に示す。
【００２４】
【表１】
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【００２５】
ＩＭＣ−１株は、胞子を形成せず、非運動性で、カタラーゼを産生しないグラム陽性の桿菌であり、１５℃では生育せず４５℃で生育すること、グルコースからガスを生成しないことから、高温性ホモ発酵型乳酸桿菌と推定される。さらに生成乳酸の旋光性がＤＬ型であることから、ＩＭＣ−１株はラクトバチラス・アシドフィラスグループに属する乳酸菌と考えられる。
【００２６】
ラクトバチラス・アシドフィラスグループに属する乳酸菌菌種としては、ラクトバチラス・アシドフィラス（Lactobacillus acidophilus ）、ラクトバチラス・アミロボラス（Lactobacillus amylovorus）、ラクトバチラス・クリスパタス（Lactobacillus crispatus ）、ラクトバチラス・ガリナラム（Lactobacillus gallinarum）、ラクトバチラス・ガゼリ（Lactobacillus gasseri ）およびラクトバチラス・ジョンソニ（Lactobacillus johnsonii ）の６菌種が挙げられるが［Fujisawa、T.、Benno、Y.、Yaeshima、T.およびMitsuoka、T. ：Int.J.Syst.Bacteriol.、４２、Ｐ４８７〜４９１（１９９２）］、ＩＭＣ−１株は４％食塩中において生育しないことから、それら６菌種の中でも、ラクトバチラス・アミロボラス、ラクトバチラス・クリスパタス、およびラクトバチラス・アシドフィラスのいずれかの菌種に属するものと推定される。さらに糖の資化性パターンから、ＩＭＣ−１株はラクトバチラス・アミロボラスに属する菌種であることが確認される。
【００２７】
本菌株ラクトバチラス・アミロボラス（Lactobacillus amylovorus）ＩＭＣ−１は、一般的に知られている食中毒原因微生物に対して抗微生物活性を有する物質を産生することから、ラクトバチラス・アシドフィラスグループ乳酸菌の中でも新規な菌株と考えられ、平成１０年２月４日付けにて工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託した［（受託番号）ＦＥＲＭ  Ｐ−１６６２３］。
【００２８】
本発明の抗菌物質産生乳酸菌は、液体培地（ＭＲＳ培地）或いは脱脂乳培地で培養することによって、培地中にサルモネラ属、シゲラ属、エシェリシア属、ビブリオ属およびエルシニア属に属する食中毒原因微生物に対して抗微生物活性を有する物質を産生する。
【００２９】
本発明の抗菌物質産生乳酸菌は、培地中において、食中毒原因微生物に対して抗微生物活性を有する物質を産生することから、当該乳酸菌で発酵させた食品、例えば発酵乳や乳酸菌飲料を摂取しつづけることにより、食中毒予防が期待できる。
【００３０】
とくに、腸管内での定住性の高い本発明乳酸菌であるラクトバチラス・アシドフィラスグループの菌株を用いれば、腸内における食中毒原因微生物を除去することが十分に期待できる。
【００３１】
【実施例】
次に実施例を挙げ、更に詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００３２】
（実施例１）
乳酸菌の分離：国内外より採取した発酵乳製品の試料を各々適当量分取し、滅菌生理食塩水に懸濁後、その懸濁液１ｍｌを常法に従い滅菌生理食塩水を用いて１０8 まで段階希釈した。各希釈液１ｍｌとあらかじめ滅菌、溶解しておいたＢＣＰ加プレートカウント寒天培地（２０ｍｌ）を滅菌シャーレ中にて混和し、平板培地を作成した。各段階希釈液につき、上記の平板培地を３枚ずつ作成し、おのおの１枚づつ、２０℃、３０℃および３７℃にて培地が黄変するまで培養した。
培養後、集落数が５０個以下の平板培地より、すべての集落を釣菌し、ＢＣＰ加プレートカウント寒天培地上で分離培養を繰り返すことで乳酸菌の純粋菌株を得た。
【００３３】
抗菌物質の生産と抽出：分離乳酸菌株を０．５％濃度の酵母エキスを含む１０％脱脂乳培地３００ｍｌに１％接種し、３７℃で３日間培養した。次にこの培養物に４０％水酸化ナトリウム溶液を滴下しｐＨ４．５に調整後、遠心分離にかけ（４０００×Ｇ、２０分）沈澱画分を除去した。得られたホエー画分１部に対して冷エチルアルコール９部を加え、４℃にて２時間攪拌後、遠心分離（７０００×Ｇ、２０分）にかけ、沈澱画分を除去した。その後、上清画分を減圧乾固して、抗菌物質を含む粉末試料を約１８ｇ得た。粉末５ｇを少量の滅菌水で溶解した後、４０％水酸化ナトリウム溶液を加えてｐＨ６．０〜７．０に調整し、最終濃度５００ｍｇ／ｍｌの抗菌物質溶液を作製した。さらにこの抗菌物質溶液については２倍希釈液および４倍希釈液を作製した。
【００３４】
抗菌活性の測定：被検微生物であるサルモネラ・ティフィ（Salmonella typhi）、サルモネラ・ティフィムリウム（Salmonella typhimurium）、サルモネラ・エンテリティディス（Salmonella enteritidis）、シゲラ・ディセンテリエ（Shigella dysenteriae）、シゲラ・ゾンネイ（Shigella sonnei ）、シゲラ・フレキシネリ（Shigella flexneri ）、毒素原性エシェリシア・コリＯ−１５７（Escherichia coli O-157）、腸管侵襲性エシェリシア・コリ（Escherichia coli）、エルトール型ビブリオ・コレラ（Vibrio cholerae ）、ビブリオ・パラヘモリティカス（Vibrio parahaemolyticus ）およびエルシニア・エンテロコリティカ（Yersinia enterocolitica ）をミューラー・ヒントンブロスに接種し、３７℃にて一晩培養した。各培養液０．０５ｍｌとあらかじめ滅菌、溶解しておいた感性ディスク用培地−Ｎ（５ｍｌ）を混和し、ただちにシャーレに分注して固化させた。
【００３５】
滅菌した抗生物質検定用ペーパーディスク（φ１３．０ｍｍ）に１２５ｍｇ／ｍｌ、２５０ｍｇ／ｍｌ、５００ｍｇ／ｍｌ濃度の抗菌物質溶液を０．１  ｍｌづつ浸み込ませ、上記の各被検微生物を混和した寒天培地の表面に置き、３７℃で培養した。２４時間培養ののち、ペーパーディスク周辺に形成された透明な阻止円の直径を測定し、抗菌活性の有無を判定した。得られた結果を表２に示した。
【００３６】
【表２】
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【００３７】
表２から、本発明の抗菌物質産生乳酸菌ラクトバチラス・アミロボラスＩＭＣ−１株は各食中毒原因微生物に対して抗微生物活性を有することが判る。
【００３８】
【発明の効果】
本発明のラクトバチラス属乳酸菌は、サルモネラ属、シゲラ属、エシェリシア属、ビブリオ属およびエルシニア属に属する微生物に対して抗微生物活性を有する物質を産生するので、この乳酸菌で発酵させた食品を摂取することにより、食中毒原因微生物の汚染が原因とされる食中毒に対して予防効果が期待できる。
さらに、腸内での定住性の高い本発明のラクトバチラス・アシドフィラス（Lactobacillus acidophilus ）グループに属する乳酸菌を用いれば、腸内フローラとして定住することが可能となり、その結果、腸内において食中毒の原因となる微生物を除去ならびに抑制することが期待される。
本発明の抗菌物質産生乳酸菌は、液体培地（ＭＲＳ培地）或いは脱脂乳培地で培養することによって、培地中にサルモネラ属、シゲラ属、エシェリシア属、ビブリオ属およびエルシニア属に属する食中毒原因微生物に対して抗微生物活性を有する物質を産生することから、本発明の乳酸菌で発酵させた食品、例えば発酵乳や乳酸菌飲料を摂取しつづけることにより、食中毒予防が期待できる。