(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）で示されるポリラクトサミン。
【化１】
0003795588.tif 000021
【請求項２】
下記式（２）で示されるポリラクトサミン。
【化２】
0003795588.tif 000022
【請求項３】
下記式（３）で示されるポリラクトサミン。
【化３】
0003795588.tif 000023
【請求項４】
下記式（４）で示されるポリラクトサミン。
【化４】
0003795588.tif 000024
【請求項５】
下記式（５）で示されるポリラクトサミン。
【化５】
0003795588.tif 000025
【請求項６】
下記式（６）で示されるポリラクトサミン。
【化６】
0003795588.tif 000026
【請求項７】
下記式（７）で示されるポリラクトサミン。
【化７】
0003795588.tif 000027
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のポリラクトサミンを含むことを特徴とする、Ｅ−セレクチン依存性ローリングの抑制剤。
【請求項９】
活性成分として、請求項１〜７のいずれか１項に記載のポリラクトサミンを含むことを特徴とする、抗炎症性医薬組成物。
【請求項１０】
活性成分として、請求項１に記載のポリラクトサミンと下記式（８）で示されるポリラクトサミンとを含むことを特徴とする、抗炎症性医薬組成物。
【化８】
0003795588.tif 000028
【請求項１１】
活性成分として、請求項２に記載のポリラクトサミンと請求項３に記載のポリラクトサミンとを含むことを特徴とする、抗炎症性医薬組成物。
【請求項１２】
活性成分として、請求項４〜７のポリラクトサミンの全てを含むことを特徴とする、抗炎症性医薬組成物。
【請求項１３】
薬学的に許容される担体及び請求項１〜７のいずれかに記載のポリラクトサミンを含むことを特徴とする、抗炎症剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
１．  発明の分野
本発明は、一般的には、動的流動条件下、Ｅ−セレクチン発現性細胞のローリングおよび接着を惹起する糖鎖を有する化合物に関するものである。本発明は、より特定的には、Ｅ−セレクチン発現性細胞のローリングおよび接着を惹起する一群のモノシアロフコガングリオシドの存在に関するものである。本発明は、白血球および白血病性細胞に発現された新規な糖質リガンド（「ミエロローリン」と言う。）が、動的流動条件下、炎症部位の活性化された内皮細胞に対するＥ−セレクチン依存性ローリングおよび接着を仲介するという発見に基づくものである。ミエロローリンは、末端にα２→３シアロシル残基を有し、末端から２番目のＧｌｃＮＡｃ（Ｎ−アセチルグルコサミン）以外の内部ＧｌｃＮＡｃにα１→３フコシル残基を有する、一群の非分枝ポリラクトサミン化合物である。本発明は、さらにまた、別異のミエロローリンの混合物が、動的流動条件下、Ｅ−セレクチン発現性細胞のローリングおよび接着を惹起する際に、相乗効果をもたらすという知見に基づく。本明細書においては、特に断らない限り、「ローリング」という用語は、単純ローリング、ローリング後接着および接着後ローリングを含み、「接着」という用語は、ローリングを伴わない単純接着を意味するものとする。
【０００２】
【従来の技術】
２．  発明の背景
１９８９年以来、現在では「セレクチン」といわれる、血管または血小板の接着性タンパク質のクローン化は、白血球に発現される糖質エピトープを同定することに、焦点を絞った仕事が続き（Varki, A. 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:7390-7397; Lasky, L.A., 1995, Ann. Rev. Biochem. 64:113-139 ）、活性化された内皮細胞上での白血球のセレクチン依存性「ローリング」および接着、引き続く経内皮遊走の機能がターゲットとされた。この機構が、炎症性反応で中心的な役割を演ずる（Lasky, L.A., 1995, Ann. Rev. Biochem. 64:113-139）。かかるエピトープは、炎症または受傷の後での、炎症部位への細胞の補充に関係する。現時点では、シアロシル−Ｌｅx （ＳＬｅx ）が、Ｅ−セレクチン結合のターゲット・エピトープであると、一般的に信じられている。それは、次のような主張に基づく。（ｉ）ヒト白血球、白血病性白血球および白血病性株細胞（例えば、ＨＬ６０およびＵ９３７細胞）は、ＳＬｅx を発現するが、ヒト以外の白血球は発現しない。この主張は、これらのタイプの細胞が、ＳＬｅx に直結すると信じられているｍＡｂｓと強い反応性を有することに基づく（Ito et al., 1994, Glycoconj. J. 11:232-237）。これらのＳＬｅx 発現性細胞は、Ｅ−またはＰ−セレクチンを発現する、活性化された内皮細胞または血小板と接着する（Phillips et al., 1990, Science 250:1130-1132; Polley et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:6224-6228）。（ｉｉ）シアロシル・タイプ２鎖を発現する、チャイニーズ・ハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞は、Ｅ−セレクチンと接着しないが、フコシルトランスフェラーゼＩＩＩ  ｃＤＮＡを有するこれらの細胞のトランスフェクト体は、Ｅ−セレクチンと接着する（Lowe et al., 1991, J. Biol. Chem. 266:17467-17477 ）。（ｉｉｉ）活性化されたＥＣｓに対する、ＳＬｅx 発現性細胞のＥ−セレクチン依存性接着は、ＳＬｅx ＧＳＬｓを含有するリポソームまたは末端ＳＬｅx 構造を有するオリゴ糖によって抑制される（Phillips et al., 1990, Science 250:1130-1132; Polley et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:6224-6228; Handa et al., 1991, Biochem. Biophys. Res. Commun. 181:1223-1230）。
【０００３】
これらの観察は、ＳＬｅx が、Ｅ−セレクチンと結合するエピトープであるというアイデアの受け容れを、元気づけることになった。Ｅ−およびＰ−セレクチンは、また、ＳＬｅx の位置異性体である、ＳＬｅa とも結合する（Handa et al., 1991, Biochem. Biophys. Res. Commun. 181:1223-1230; Berg et al., 1991, J. Biol. Chem. 266:14869-14872; Takada et al., 1991, Biochem. Biophys. Res. Commun. 179:713-719 ）。しかしながら、ＳＬｅa は、白血球には存在せず、造血細胞のためのセレクチンの生理的エピトープであるとは考えられていない。これまで、好中球およびＨＬ６０細胞に存在する、ＳＬｅx 含有ガングリオシドの系統的特徴付けは行われていないし、ＳＬｅx が、正常な若しくは白血病性白血球またはこれらに由来する株細胞の、Ｎ−結合またはＯ−結合糖タンパク質側鎖中に存在する主要なエピトープであることを、明白に実証するものもない。
【０００４】
好中球が仲介しかつＥ−セレクチン依存性の肺疾患に罹ったラットの、ＩｇＧ免疫複合体モデルにおいて、ＳＬｅx が、炎症性血管損傷に対して保護的な効果を有することが報告されている（Mulligan et al., 1993, J. Exp. Med. 178:623-631 ）。
【０００５】
しかし、次のような報告もある。すなわち、ヒト好中球（多形核白血球；ＰＭＮ）に関する、抗体による免疫染色の結果およびプレートに固定したＥ−またはＰ−セレクチンに対する間接的な結合アッセイの結果によれば、ヒトＰＭＮおよび前骨髄球性白血病ＨＬ６０細胞だけが、ＳＬｅx および他のラクト系エピトープ、例えば、Ｌｅx またはＬｅy を発現し、他の哺乳動物のＰＭＮ、例えば、ヒヒ、オナガザル科マカック属、ブタ、ウサギ、ラット、モルモットおよびハムスターのＰＭＮは、発現しないという（Ito et al., 1994, Glycoconj. J. 11:232-237）。また、マウスの腎臓およびマウス白血球から得られたＥ−セレクチン・リガンド糖鎖は、次のように同定されている（Osanai et al., 1996, Biochem. Biophys. Res. Commun. 218:610-615 ）。
【０００６】
【化９】
0003795588.tif 000002
および
【化１０】
0003795588.tif 000003
【０００７】
これらの報告は、人類以外の哺乳動物のセレクチン・リガンドがＳＬｅx ではないことを示した。また、動物モデルを使用して得られている、抗炎症効果のこれまで公認の成果も、疑問視されるに至った。
【０００８】
さらに、次のような開示もある。生体外で、活性化された内皮細胞に、次式の糖脂質
【０００９】
【化１１】
0003795588.tif 000004
を含むリポソームを添加し、さらにＨＬ６０細胞を添加すると、活性化された内皮細胞に対するＨＬ６０細胞の結合が選択的にブロックされる（WO91/19501およびWO91/19502）。
【００１０】
さらに、次のような報告もある。慢性骨髄性白血病の患者の白血球から抽出される糖脂質は、ポリ塩化ビニル製マイクロタイター・ウェルに吸収されるか、ＴＬＣプレート上で分離され、内皮白血球接着分子−１（ＥＬＡＭ−１）発現性ＣＯＳ細胞との結合によりスクリーニングされ、構造解析により、次式の糖脂質
【００１１】
【化１２】
0003795588.tif 000005
が検出された（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:1138-1142 [1991]）。
【００１２】
さらに、Ｓｔｒｏｕｄらの報告（Biochem. Biophys. Res. Commun. 209:777-787 [1995] ）によれば、固形腫瘍細胞および組織に共通して見出される、次式の糖脂質
【００１３】
【化１３】
0003795588.tif 000006
【化１４】
0003795588.tif 000007
および
【化１５】
0003795588.tif 000008
は、ヒト好中球およびＨＬ６０細胞には存在せず、次式の糖脂質
【００１４】
【化１６】
0003795588.tif 000009
【化１７】
0003795588.tif 000010
【化１８】
0003795588.tif 000011
【化１９】
0003795588.tif 000012
および
【化２０】
0003795588.tif 000013
が、ヒト好中球およびＨＬ６０細胞から抽出され、ＴＬＣ上で展開し、Ｅ−セレクチン発現性ＣＨＯ細胞と接触させて接着検定したところ、これらの細胞は、ごく少量の＃５を含む糖脂質＃４と接着することが判明した。
【００１５】
一方、血管内皮細胞上のセレクチンと、白血球のオリゴ糖リガンドとの間のローリング・タイプの接着が、炎症反応の開始に関与していることから、内皮上での白血球のローリングを抑制することによって、白血球の炎症組織部位への浸潤および活性化された好中球による内皮の局部的損傷が防げるのではないかと、期待されている（Lasky, 1995, Ann. Rev. Biochem. 64:113-139）。
【００１６】
【発明が解決しようとする課題】
現在公知のＥ−セレクチン・リガンド化合物は、人体内で現実に起こっている上記のローリング現象を考慮にいれることなく、せん断応力のない条件下で、選定され有効とされていた。従って、これらの化合物は、真のＥ−セレクチン・リガンド物質ではないかも知れない。これらの化合物では、生体内で活性化された、Ｅ−セレクチン発現性細胞、例えば、内皮上でのＥ−セレクチン依存性ローリングおよび接着を制御できないばかりか、ヒト炎症の特異的制御もできないかも知れない。
【００１７】
ある報告では、Ｅ−セレクチン発現性ＣＨＯ細胞は、卵レシチンのホスファチヂルコリン（ＰＣと略称する）によってＳＬｅx を固定した固相上、０．７３ｄｙｎｅ／ｃｍ2 のせん断応力下で、ぎこちなく転がったという。この実験で使用した固相は、３μｌのＳＬｅx （４μｇ／ｍｌのＰＣを含む２０：１のメタノール：ブタノール溶液中に、１μｇ／ｍｌの濃度で溶解した）を、直径４ｍｍの面積に加え、乾燥して調製されたが、該固相に加えた量に対して、１５％のＳＬｅx をＰＣによって該固相に固定した（J. Immunol. 154:5356-5366 (1995)）。しかし、上述のごとく、ヒト好中球に存在しないＳＬｅx であるから、ヒト炎症を安全かつ特異的に制御することはできないかも知れない。
【００１８】
最近では、静的条件下でＥ−セレクチンと結合する（または結合しない）、ＨＬ６０細胞およびヒト好中球の、モノシアロガングリオシドの特性についての報告がある（Stroud et al., 1995, Biochem. Biophys. Res. Commun. 209:777-787; Stroud et al., 1996, Biochemistry 35:758-769 ）。ＳＬｅx 構造はなく、内部フコシル化を有しまたは有せず、ポリ−ＬａｃＮＡｃ（Ｎ−アセチルラクトサミン）コア構造として１０糖以下の単糖単位を有する（Stroud et al., 1996, Biochemistry 35:758-769）。Ｅ−セレクチン結合性フラクションは、全て、末端のＧａｌ（ガラクトース）がα２→３シアリル化され、末端から２番目以外の内部ＧｌｃＮＡｃが２またはそれ以上α１→３フコシル化されていた（Stroud et al., 1995, Biochem. Biophys. Res. Commun. 209:777-787; Stroud et al., 1996, Biochemistry 35:770-778 ）。これらの結合性フラクションは、「ミエログリカン」と総称された。内部ＧｌｃＮＡｃがα１→３フコシル化され、ＳＬｅx 末端を有するポリ−ＬａｃＮＡｃの極小成分もあった。ヒト好中球およびＨＬ６０細胞の主要なＥ−セレクチン結合部位は、ミエログリカン・タイプであって、ＳＬｅx 含有グリカンではないと結論された。実験したミエログリカンまたはポリ−ＬａｃＮＡｃ・ＳＬｅx 構造は、いずれもＰ−セレクチン結合を示さなかった（Stroud et al., 1996, Biochemistry 35:758-769; Stroud et al., 1996, Biochemistry 35:770-778）。
【００１９】
【発明の実施の形態】
３．  本発明の要約
本発明は、一般的には、動的流動条件下において、糖鎖でコートした表面上でＥ−セレクチン発現性細胞のローリングおよび接着を可能にする該糖鎖を有する実質的に純粋な化合物に関するものである。該動的流動条件とは、人体内において発生する生理的せん断応力、例えば、血流によって生ずるせん断応力と同等な条件のことである。本発明化合物は、好ましくはヒト好中球またはそれに類する細胞に存在する糖鎖を有するものである。
【００２０】
本発明は、特に、実質的に純粋なミエロローリン、ミエロローリン疑似物または該化合物群を含む組成物に関するものである。ミエロローリンは、次の一群のＳＬｅx 非含有構造Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＸ、Ｙによって具現され、該構造は末端がα２→３シアリル化され、内部が末端から２番目のＧｌｃＮＡｃを除いた、種々のＧｌｃＮＡｃ残基においてフコシル化されている、非分枝ポリラクトサミンである。
【００２１】
【化２１】
0003795588.tif 000014
式中、→は共有結合を示し；ＲおよびＲ’はそれぞれＨ原子、複合脂質、単純脂質、オリゴ糖（但し、Ｒ’のオリゴ糖はいかなるラクトサミン残基も有しない）、セラミド残基、置換若しくは非置換のアリール基、炭素原子数１〜１０のアルキル、アルケニル若しくはヒドロキシアルキル基、薬学的に活性な成分、固体担体またはそれらの共有結合した化合物である。
【００２２】
ミエロローリン含有構造、特にガングリオシドとして人体中に存在するものは、Ｅ−セレクチン発現性細胞上にミエロローリンが惹起したローリングおよび接着をブロックする抗体と同様に、炎症性反応、特に慢性関節リウマチ、腎疾患および肝炎などの慢性状態を抑制する有用な試薬である。
【００２３】
ミエロローリンの混合物の方が、単一分子種よりむしろ、Ｅ−セレクチン発現性細胞のより強いローリングおよび接着を惹起する。従って、ミエロローリンの混合物は、炎症性反応抑制に特に有用な試薬である。
【００２４】
本発明は、Ｅ−セレクチン発現性細胞が、ミエロローリン含有ガングリオシドでコートした表面に接着しローリングしたという、驚くべき発見に基づくものである。
【００２５】
３．１  略語および定義
以下の略語は、本明細書全般にわたって用いられる：  ＢＳＡ、ウシの血清アルブミン；  ＣＩＤ、衝突活性化開裂；  ＣＨＯ  細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞；  ＥＣ、内皮細胞；  ＥＤＴＡ、エチレンジアミンテトラ酢酸；ＥＳ−ＭＳ、電子スプレー質量分析法；ＦＡＢＭＳ、高速原子衝撃質量分析法；Ｆｒ．、フラクション；  ＧＳＬ、スフィンゴ糖脂質；  Ｉｇ、免疫グロブリン；  ＩＨＷ、イソプロパノール／ヘキサン／水；  ｍＡｂ、モノクローナル抗体；  ＭＦＩ、平均蛍光強度；  ＮＭＲ、核磁気共鳴；  ＰＬＡ、ポリラクトサミン；  ＰＢＳ、リン酸緩衝生理食塩水；  Ｓｄｉｙ2 またはＳＬｅx −Ｌｅx 、シアロシルＬｅx −Ｌｅx ；  ＳＬｅx 、シアロシル−Ｌｅx ；  ＳＬｅa 、シアロシル−Ｌｅa ；  Ｓｔｒ．、構造（類）；  ＴＬＣ、薄層クロマトグラフィー。糖脂質の略語は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名委員会の勧告（Lipids 12:455-463, 1977 ）に従った；しかし、接尾語−ＯｓｅＣｅｒは、−Ｃｅｒに短縮した。特に、シアロシル−Ｌｅx およびシアロシルＬｅx −Ｌｅx は以下の構造を有する：
【００２６】
【化２２】
0003795588.tif 000015
上記式に示すように、糖内のグリコシド−ＯＨの位置を示す数字「１」および隣接糖との結合を示す矢印は、別に表示しない限り、本明細書中では、簡略化の目的から省略した。
【００２７】
４．  本発明の詳細な説明
本発明は、実質的に純粋なミエロローリン、疑似物およびそれらの組成物を提供するものである。本発明は、さらに種々の疾患の根元をなす細胞相互作用を抑制するために、ミエロローリン、疑似物およびそれらの組成物並びに抗ミエロローリン抗体の使用方法を提供するものである。ミエロローリンは、動物細胞から単離することができる。ミエロローリンおよび疑似物は、人工的に合成することも可能である。ミエロローリンは、表面をコートすると、該表面上で動的流動条件下において、Ｅ−セレクチン発現性細胞のローリング、接着および流れを惹起する能力を有する。
【００２８】
本発明のミエロローリンおよび疑似物は、適切な手順により選別することができる。それにはＶ手順が含まれ、該手順は、ヒト好中球またはそれと類似した他の細胞が発現したガングリオシドのようなプローブ物質を固相に固定し、これにヒトの体内で起こりうるせん断応力下で、Ｅ−セレクチン発現性ＣＨＯ細胞のような、Ｅ−セレクチン発現性細胞を添加し、単位時間内における該固相上での該細胞のローリング、接着および流れを観察し、かつ、その結果として、ローリングを惹起する物質を選別することを含む。ヒトの体内で起こりうるせん断応力とは、好ましくはヒト血流によって生ずるせん断応力を意味し、好ましい範囲としては、０．８〜１２ｄｙｎｅ／ｃｍ2 が挙げられる。
【００２９】
ミエロローリンまたは疑似物は、ガラス・スライドに固定されたポリスチレン・ビーズ上に接着することができる。該ポリスチレン・ビーズは、次いで平行層流チャンバー・アッセンブリー中に設置して、所定のせん断応力の動的流動条件下における、Ｅ−セレクチン発現性細胞のローリングおよび接着の測定に用いる。使用する装置は、論文（Lawrence et al., 1990, Blood 75:227 ）に記載されているものと同様のものであってもよい。
【００３０】
本発明によれば、ミエロローリンは、下記の構造を有し、それは、少なくとも６個の単糖類（３個のラクトサミン繰り返し単位が示されている）からなり、かつ末端がα２→３シアリル化され、内部が、末端から２番目のＮ−アセチルグルコサミン残基単独の場合を除き、種々のＮ−アセチルグルコサミン残基においてα１→３フコシル化されている、一群の非分枝ポリラクトサミンを包含する。
【００３１】
【化２３】
0003795588.tif 000016
式中、各Ｒ1 は、独立に、−ＯＨおよびα１→３フコース（Ｃ6 Ｈ12Ｏ5 ）から選択される。但し、少なくとも１個のＲ1 はα１→３フコースであるものとする。
【００３２】
ミエロローリンの具体例としては、以下の構造を有する化合物を含む。
【００３３】
【化２１】
式中、→は共有結合を示し；  ＲおよびＲ’は、それぞれＨ原子、複合脂質、単純脂質、オリゴ糖（いかなるラクトサミン残基も有しないＲ’を除く）、セラミド残基、置換若しくは非置換のアリール基、炭素原子数１〜１０のアルキル、アルケニル若しくはヒドロキシアルキル基、薬学的に活性な成分、固体担体またはそれらの共有結合した化合物である。
【００３４】
基ＲおよびＲ’は、上記構造式の還元末端のＧｌｃＮＡｃと、ジアミン、アミノアルコール、アミノ酸、ペプチドのような適切なスペーサーを介して、共有結合してもよい。アリール基の置換基としては、炭素原子数１〜６のアルキル、アルケニルおよびアルキニル基、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、ニトロ基並びにカルボキシル基が挙げられる。複合脂質または単純脂質の中では、セラミドが最も好ましく、また天然に産するミエロローリンの脂質担体でもある。グリセロ脂質は、ジアシルグリセロールおよび同類の中性脂質を含む。かかる脂質中のアシル基の鎖の長さおよび不飽和度は特に限定されない。
【００３５】
薬学的に活性な成分は、ＲまたはＲ’を形成し、以下の非ステロイド系抗炎症性薬剤を含むが、それのみに限定されるものではない：サリチル酸誘導体（例えば、アスピリン）；アリール酢酸誘導体（例えば、インドメタシン）；プロピオン酸誘導体（例えば、イブプロフェン）；ピラゾロン誘導体（例えば、フェニルブタゾン）；オキシカム誘導体（例えば、ピロキシカム）；およびエピリゾール並びにその類似物などが挙げられる。
【００３６】
本発明は、さらに、以下の構造を有するミエロローリン疑似物を提供するものである。該構造は、少なくとも６個の単糖類からなり、かつ末端がα２→３シアリル化され、内部が、末端から２番目のＮ−アセチルグルコサミン残基単独の場合を除き、種々のＮ−アセチルグルコサミン残基においてα１→３フコシル化された、一群の非分枝ポリラクトサミンを包含する。
【００３７】
【化１】
式中、Ｒ1 はα１→３フコース、Ｒ2 は−ＯＨまたはフコースのいずれか一方、ａは２〜６の整数、ｂは１〜６の整数を示す。
【００３８】
ミエロローリン疑似物の具体例は、以下の構造を有するものを含む。
【００３９】
【化２４】
0003795588.tif 000017
式中、→は共有結合を示し；Ｒは上記ミエロローリンのそれと同一である。
【００４０】
ミエロローリン疑似物の構造は、ミエロローリン（例えば、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＸ、Ｙ）の構造とは異なり、しかも、ポリラクトサミン鎖に沿って異なった位置（Ｆｕｃ１およびＦｕｃ２）の内部ＧｌｃＮＡｃにおける、シアロシル残基（ＳＡ）およびフコシル残基の、可能な立体的配置によってさらに限定される。ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン鎖（［３Ｇａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→］ｎ  ）が、らせん状構造を持っていることは周知である（Niemann et al., 1978, Biochem. Biophys. Res. Commun. 81:1286-1293; Rees, D.A., 1975, MTP International Review of Science 5:1-42, ed. Whelan, W., Butterworths (London) University Park Press (Baltimore); Atkins et al., 1974, Polymer 15:263-271 ）。ミエロローリンＡ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＸ、Ｙの疑似物は、立体的配置すなわち、シアル酸の位置およびフコシル残基の異なった部位に基づいて組み立てられていると考えられる。フコシル残基の配向およびこれとシアル酸位置との関係は最も重要である（第７図参照）。
【００４１】
ミエロローリンは、以下に記載する通り、ＨＬ６０細胞またはＵ９３７細胞を大規模培養することによって製造することが可能である。ミエロローリンおよび疑似物は、Ｎ−アセチルラクトサミンを重合し、ひき続いてシアロシル転移酵素およびフコシルトランスフェラーゼで、それぞれ、α２→３シアリル化およびα１→３フコシル化することによって大量に合成できる。
【００４２】
具体的には、ミエロローリン誘導体は、（ａ）非還元末端にα２→３シアロシル残基を有し、内部のＧｌｃＮＡｃにα１→３フコシル残基を有しているが、該フコシル残基が末端から２番目のＧｌｃＮＡｃにだけではない、非分枝ポリラクトサミンを、直接またはスペーサーを介して、（ｂ）置換若しくは非置換のアリールハライド、１〜１０の炭素原子を有するアルキル、アルケニル若しくはヒドロキシルアルキルハライド、複合脂質、単純脂質、オリゴ糖、セラミド、薬学的に活性な成分、固体担体またはそれらの共有結合した化合物と、還元末端の糖残基のグリコシル化のような既知方法を用いて、反応させることによって得ることができる。
【００４３】
本発明は、また、第２の細胞（例えば、内皮細胞または他のＥ−セレクチン発現性細胞）上に発現されたＥ−セレクチン依存性ローリングおよび接着を惹起するリガンドを発現する第１の細胞（例えば、ヒト好中球または白血球）を、少なくとも６個の単糖類を含み、かつ末端がα２→３シアリル化され、内部が種々のＮ−アセチルグルコサミン残基においてα１→３フコシル化されているが、該フコシル化は、末端から２番目のＮ−アセチルグルコサミン残基単独ではない、少なくとも１種の非分枝ポリラクトサミンの、Ｅ−セレクチン依存性ローリングおよび接着を抑制する量に、暴露することを含む、細胞相互作用の抑制方法を提供する。
【００４４】
更に、本発明は、第２の細胞（例えば、内皮細胞または他のＥ−セレクチン発現性細胞）上に発現されたＥ−セレクチンに依存するローリングおよび接着を惹起するリガンドを発現する第１の細胞（例えば、ヒト好中球または白血球）を、少なくとも６個の単糖類を含み、かつ末端がα２→３シアリル化され、内部が種々のＮ−アセチルグルコサミン残基においてα１→３フコシル化されているが、該フコシル化は末端から２番目のＮ−アセチルグルコサミン残基単独ではない、非分枝ポリラクトサミンと結合する抗体の、Ｅ−セレクチン依存性ローリングおよび接着を抑制する量に、暴露することを含む、細胞相互作用の抑制方法を提供する。しかも、該抗体は、生体外での動的流動条件下における上記第１の細胞と第２の細胞との接着を抑制することによって更に特徴付けられている。
【００４５】
ＨＬ６０細胞からのミエロローリン調製
ＨＬ６０細胞。  ＨＬ６０細胞は、最初、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）から取得し、かつ１０％ＦＣＳを補充したＲＰＭＩ内で増殖させた。細胞を３７℃の温度で、５％ＣＯ2 の中で維持し、回転瓶内で２サイクルにわたって拡大して、多量の細胞を集めた後、遠心分離にかけることによって採取する。この方法により培養されたＨＬ６０細胞は、ＣＯ2 培養器の中で継続的に培養されたＨＬ６０細胞と同レベルのＥ−セレクチン結合活性を示した。すなわち、この方法により回転瓶内で大規模培養しても、Ｅ−セレクチン結合活性を殆ど低下させなかった。概して、１２００ｍＬのパックされたＨＬ６０細胞は、約４００ｍＬのパックされた部分に分け、各部分は、次節で記載する方法で抽出した。
【００４６】
糖脂質抽出。  おおよそ１００ｍＬのパックされたヒト好中球または４００ｍＬのパックされたＨＬ６０細胞を、ＩＨＷ（５５：２５：２０）の下相の１０容量を用い、Ｗａｒｉｎｇ混合機の中でホモジナイズして抽出した。該抽出物をＷｈａｔｍａｎ＃１フィルターを通して濾過し、残渣は上記のようにして再抽出した。該抽出／濾過手順を、もう一度繰り返し行い、寄せ集めた濾液はＢｒｉｎｋｍａｎｎ回転減圧蒸発機を使用して減圧下４０℃の温度で濃縮した。該濃縮抽出物は、水５００ｍＬを含む３Ｌのクロロフォルム／メタノール（Ｃ／Ｍ；２：１）中に残渣を溶解させて、Ｆｏｌｃｈ分配にかけた。該抽出物を激しく振盪した後、２つの半透明相が現れるまで（約８時間）分離にまかせた。上相を除去し、下相はＣ／Ｍ／１％ＫＣｌ（１：１０：１０）を元の容積になるまで添加して、再抽出した。該液体抽出手順を２度繰り返し、寄せ集めた上相は、回転減圧蒸発機で濃縮し、水中で再構成し、かつＳｐｅｃｔｒｏｐｏｒ  ３透析チューブ（ＭＷ  カットオフ＝３５００）を使用し、脱イオン水に対して、徹底的に透析した。
【００４７】
陰イオン交換クロマトグラフィー。  透析に続いて、上相抽出物を上記のように蒸発乾固し、加温（３７℃）と超音波処理の組み合わせにより、５０ｍＬのＣ／Ｍ／水（３０：６０：８）に溶解した。不溶性物質は１０分間１０００ｘｇで遠心分離にかけ除去し、同じ溶媒５０ｍＬを追加して、超音波処理により再抽出した。上記の遠心分離に引き続いて、寄せ集められた上清をＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘカラム（ベッド・ボリューム３００ｍＬ；酢酸塩型）にかけ、２ＬのＣ／Ｍ／水（３０：６０：８）で洗浄し、全ての中性脂質を除去した。該カラムは、５００ｍＬのメタノールで平衡化し、モノシアロガングリオシド・フラクションは、２Ｌの０．０５  Ｍ  ＮＨ4 ＯＡｃ含有メタノールで溶出した。引き続いてジ−、トリ−、およびポリシアロシルガングリオシドの除去を、それぞれ、０．１５Ｍ、０．４５Ｍおよび１．０ＭのＮＨ4 ＯＡｃによる段階的溶出によって行った。該溶出ガングリオシド・フラクションを回転減圧蒸発により乾燥し、水に対して透析し、かつ上記のように乾燥した。
【００４８】
ＨＬ６０細胞からのモノシアロガングリオシドの精製：
高性能液体クロマトグラフィー。  該モノシアロガングリオシド・フラクションを、１０ｍＬのＩＨＷ中に可溶化し、蒸発用フラスコから１５ｍＬ試験管へ移した。サンプルは、Ｎ−ＥＶＡＰ（Organomation Inc. ）を使用し、Ｎ2 下で完全に乾燥し、２ｍＬのＩＨＷ中で超音波処理により再構成した。該サンプルを、ＩＨＷ（５５：４０：５）で前もって平衡化した、調製用イアトロビーズ・カラム（６ＲＳ−８０１０；０．８ｘ６０ｃｍ；Iatron Laboratories Inc., Kanda/Tokyo, Japan）上に注入し、かつ、１ｍＬ／分の流速で、ＩＨＷ５５：４０：５から５５：２５：２０の直線勾配に委ねた。４ｍＬのフラクションを集めるのに、４００分以上かかった。各フラクションを、ＨＰＴＬＣプレート上にスポットし、適正な溶媒系（以下に記載）で展開し、０．５％オルシノール含有２Ｎ硫酸をスプレーして可視化し、移動を基準にプールした。ＴＬＣで１つ以上のバンドを含むプールしたフラクションは、Ｎ2 下で乾燥し、１ｍＬのＩＨＷ中に再溶解し、かつ、半調製用のイアトロビーズ・カラム（０．４ｘ６０ｃｍ）上に注入した。流速０．５ｍＬ／分で、２００分以上、ＩＨＷ５５：４０：５から５５：２５：２０の直線勾配を使用した。１ｍＬのフラクションを集め、ＨＰＴＬＣの移動を基準にプールした。ＨＰＴＬＣで単一バンドを含むフラクションは、Ｃ／Ｍ／０．５％ＣａＣｌ2 （５０：５５：１９）中の移動の順序に従って標識した；すなわち、最も速い移動バンドは＃１と、最も遅いものは＃２０と標識した。複数バンドを含むフラクションは、調製用ＨＰＴＬＣにより更に精製した。
【００４９】
高性能薄層クロマトグラフィー。  モノシアロガングリオシド・フラクションは、ＨＰＴＬＣによっては単一バンドには分離されなかったので、調製用ＨＰＴＬＣによって分離した。バンド１〜７を含むフラクションは、Ｃ／Ｍ／０．５％ＣａＣｌ2 （５０：４０：１０）溶媒系中で分離した。バンド８〜１４を含むフラクションは、Ｃ／Ｍ／０．５％  ＣａＣｌ2 （５０：５５：１９）中で分離した。Ｆｒ．１２および１３は、イソプロパノール／水／ＮＨ4 ＯＨ（６：３．２：１）の溶媒系を使用して、更に（それぞれ、Ｆｒ．１２−１〜１２−５および１３−１〜１３−３）に分離した。調製用ＴＬＣは、５０μＬのサンプルを１０ｘ２０ｃｍＨＰＴＬＣシリカゲル・プレート（ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ  ６０；EM Science, Gibbstown, NJ ）を横切るようにすじ状に塗布して行い、乾燥し、かつ、適正な溶媒系で展開した。該プレートは乾燥し、かつ、バンドは、０．０３％プリムリン含有８０％アセトンをスプレーして可視化した。該バンドは、ＵＶ光線下において、鉛筆でマークした。マークされたバンドは、かみそりの刃を用いてプレートからかき取り、ガングリオシドは、ＩＨＷ（５５：２５：２０；２ｍＬ／バンド）中で２０分間、超音波処理してシリカから抽出した。該シリカは、１０００ｘｇで１０分間遠心分離にかけて除去し、上記のように再抽出し、よせ集めた上清は、Ｎ2 下で乾燥した。サンプルは、５ｍＬのメタノールと５ｍＬの水で順に洗った後、１ｍＬのＰＢＳに溶かした。それをあらかじめＰＢＳで平衡化したカラムにかけ、１ｃｃのｔＣ−１８  Ｓｅｐ−Ｐａｋカートリッジ（Waters, Milford, MA ）にかけることできれいにされた。サンプルを保持させたら、該カラムを１０ｍＬの水に続いて１０ｍＬの５０％メタノールで洗浄し、次いで１０ｍＬの１００％メタノール中に溶出した。該サンプルは、Ｎ2 下で乾燥し、１ｍＬのＩＨＷ（５５：２５：２０）中に溶解し、次いで上記したように、ＩＨＷ５５：４０：５から５５：２５：２０の直線勾配、流速１ｍＬ／分、１００分間かけて、イアトロビーズ・カラム（０．４ｘ６０ｃｍ）上に注入した。１ｍＬのフラクションを集め、オルシノール−硫酸反応を用いて、ＨＰＴＬＣにより可視化した。オルシノール陽性画分を、構造解析に先だって、プールしかつＮ2 下で乾燥した。
【００５０】
抗体調製
Ｂａｌｂ／ｃマウスは、既に記載されたように、静脈内または腹腔内いずれかに、ヒト好中球またはＨＬ６０細胞の繰り返し注射を行い、引き続きサルモネラ・ミネソタに吸着させたミエロローリン・フラクションを含むモノシアロガングリオシドの追加接種を行って、免疫する（Fukushi et al., 1984, J. Biol. Chem. 259:10511-10517; Nudelman et al., 1988, J. Biol. Chem. 263:13942-13951 ）。追加接種の３日後、脾臓細胞を採取し、かつ、ＮＳ−１と融合し、該ハイブリドーマは、精製ミエロローリンでコートした９８−ウェルおよびＳＬｅx またはシアロシルパラグロボシドでコートしたウェルの結合実験によりスクリーニングした。ミエロローリンをコートしたプレートとは特異的に反応するが、ＳＬｅx またはシアロシルパラグロボシドをコートしたプレートとは反応しない抗体を分泌するハイブリドーマをクローン化した。ミエロローリンへの特異的反応性をもったリクローニングに続くクローンの拡大が必要である。
【００５１】
治療的投与
本発明の抗炎症性ミエロローリン組成物は、予防的炎症抑制または発症後炎症緩和の必要のある患者に投与する。対象ミエロローリン組成物は、好ましくは薬学的に許容される担体と共に投与される。例えば、リポソームに含ませたり、または適正なデザインを有する担体特異分子と結合させたりすることができる。その性格は、投与方法によって異なる。例えば、経口投与には、通常、固体担体が要求される。すなわち、ミエロローリン疑似物は、経口投与の時にはそのように構成されるが、一方、静脈投与時には、通常、液体塩溶液担体またはリポソーム懸濁物が要求される。典型的には、注射可能な組成物は、液体溶液または懸濁物として調製する。また、注射に先立って、液体ビヒクルに溶解、または懸濁するのに好適な固体形態で調製することもできる。該化合物をリポソーム・ビヒクル中に乳化させてもよいし、また該活性成分をカプセルで包んだものとしてもよく、より高い活性を示させるためにはより望ましい。
【００５２】
好適なビヒクルとしては、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール、または類似物、およびそれらの組み合わせが挙げられる。加うるに、望むならば、該ビヒクルは、湿潤若しくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤などの補助物質を少量含有してもよい。かかる投与形態の実際的調製方法は、当業者には知られており、また明らかとなる。例えば、論文（Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 17th edition, 1985 ）を参照のこと。
【００５３】
薬学的に許容される製剤には、例えば、医薬品級のマンニトール、ラクトース、でんぷん、ステアリン酸マグネシウム、サッカリン・セルローズ・ナトリウム、炭酸マグネシウム、および類似物を含む、種々の賦形剤を用いることができる。経口組成物は、溶液、懸濁物、錠剤、ピル、カプセル、持続性徐放製剤、若しくは粉末の形状で服用される。特に有用なのは、対象ミエロローリン分子を、ＤＭＳＯなど浸透増進剤を含む経皮組成物の形で、直接投与することである。他の局所製剤を、皮膚の炎症の処置に、投与することもできる。加うるに、経粘膜性投与は、胆汁酸塩またはフシジン酸誘導体などの浸透剤を使用し、必要ならば、追加的な界面活性剤分子と組み合わせて、実施することもできる。これらの製剤は、例えば、座薬、鼻腔スプレーの調製に有用である。座薬用には、ビヒクル組成物は、ポリアルキレングリコールまたはトリグリセリドなど、慣用の結合剤および担体を含む。かかる座薬は、約０．５から約１０％（Ｗ／Ｗ）、好ましくは約１％から約２％の範囲内の、活性成分を含む混合物から形成してもよい。
【００５４】
鼻腔内製剤は、通常、鼻粘膜を刺激せず、繊毛機能を著しく妨げることもないビヒクルを含有する。本発明では、水、生理食塩水または他の既知物質などの希釈剤を使用することができる。鼻腔製剤は、また、クロロブタノールおよび塩化ベンザルコニウムなど（但し、限定するものではない）の保存料を含有してもよい。鼻粘膜による、対象リガンドの吸収を増進するために、界面活性剤を存在させてもよい。
【００５５】
典型的には、本発明の組成物は、１％未満から約９５％の活性成分、好ましくは、１０％から約５０％を含む。より好ましくは、小児に対しては、約１０ｍｇから５０ｍｇを、成人に対しては約５０ｍｇから１０００ｍｇを投与する。投与回数は、患者の反応性に基づいて、細心の注意で決定される。その他の有効な投与量は、当業者であれば、投与反応曲線を確定する慣例的試行を通して、容易に決定することができる。
【００５６】
投与量の決定において、注意しなければならないのは、全セレクチン分子を完全にブロックすることは、必ずしも望ましくないことである。正常な炎症過程が進行するためには、少なくともいくつかの白血球または好中球が、損傷、感染または疾患が発生している部位の組織内に運ばれてこなければならない。ブロッキング剤として投与するセレクチン・リガンドの量は、患者の個別な必要に応じて、かつ、処置される疾患のタイプなど、種々の要因を考慮した上で注意深く調節しなければならない。
【００５７】
本発明の抗炎症性組成物が、ミエロローリンに対する抗体である場合、薬学的に許容される希釈剤を採用することができ、該抗体は、ヒト型にされるべきであり、かつ、Ｆａｂフラグメント化されるべきである。採用される特定の薬学的に許容される希釈剤は、それらに対して決定的ではない。かかる希釈剤の例としては、生理的食塩水、Ｒｉｎｇｅｒの溶液、ビタミン・カクテルおよびアミノ酸ビタミン・カクテルなどが挙げられる。
【００５８】
本発明の抗体の、投与さるべき薬学的有効量は、処置する患者の年齢、体重および性別によって変わる。一般に、薬学的有効量は、１回の注射につき、約１．０〜５．０μｇ／１００ｇ体重である。一般に、５から１０回の抗体の注射が使用されるが、本発明はそれのみに限定されるものではない。
【００５９】
本発明の化合物は、広い範囲の疾患、例えば、慢性関節リウマチおよび多発性硬化症などの、自己免疫疾患の処置に有用である。本発明の組成物は、組織損傷、腫張、炎症および／または苦痛、特にＥ−セレクチンが仲介する慢性炎症性状態を引き起こす程度に、白血球の組織内蓄積を起こし、人体に免疫システムがはたらいているのであれば、いかなる疾患状態の処置にも適応することができる。
【００６０】
本発明の製剤は、心臓発作を惹起する急性炎症状態に起因する組織損傷の好ましくない残効を防止するために、投与することもできる。これには、Ｐ−セレクチン阻害剤またはＰ−セレクチン・リガンドの併用が、特に好ましい。何故なら、Ｅ−セレクチンではなく、Ｐ−セレクチンが、心臓発作または発作などの急性炎症反応において、重要な役割をするからである。心臓発作が起り、抗凝固剤または血栓溶解剤（例えば、ｔＰＡ）を適用することなどで、患者が回復した場合、凝血塊ができた内皮の表層は、しばしば損傷をうけている。抗血栓剤が凝血塊を除去すると、酸素を奪われた、凝血塊下の損傷を受けた組織および内皮表層の他の損傷を受けた組織は、活性化してくる。該活性化された内皮細胞は、細胞が損傷を受けて数時間もすると、一種のセレクチンであるＥＬＡＭ−１受容体を合成する。該受容体は、血管内に広がり、白血球細胞の表面上の糖脂質リガンド分子と接着する。大量の白血球細胞が、すばやく捕捉され、活性化された内皮細胞部位を取り囲む組織内に運ばれて、炎症、腫張および壊死に至り、患者の生存の可能性を低下させる。
【００６１】
心臓発作に起因する外傷を患っている患者の治療に加え、急性肉体的外傷を患う患者の治療にも、本発明の製剤を使用し、ひどい外傷にさらされている肉体部位に後遺する炎症および腫張を和らげることができる。本発明の製剤を使用して治療しうる、その他の状態には、様々なタイプの関節炎および成人呼吸窮迫症候群が含まれる。当業者は、本発明明細書を読めば、本発明の製剤を投与することによって治療および／または緩和される、その他の疾患状態および／または症状が何かを認識するであろう。
【００６２】
（１）ミエロローリン：（Ａ）Ｆｒ．１０−２、（Ｂ）Ｆｒ．１０−１とＦｒ．１０−２の混合物、または（Ｃ）Ｆｒ．１４、および（２）薬学的に許容できる担体、例えば、但し、限定されないが：（Ｄ）ポリアルキレングリコール、（Ｅ）トリグリセリド、（Ｆ）脂肪油、（Ｇ）合成脂肪酸エステル、（Ｈ）リポソーム、（Ｉ）カルボキシメチルセルロース、（Ｊ）ソルビトール、または（Ｋ）デキストランを含有する種々の組成物は、例えば、関節炎、慢性関節リウマチ、多発性硬化症など（但し、限定されない）の炎症性疾患を患う患者に、治療上有効量が投与される。
【００６３】
【実施例】
５．  実施例
我々は、先に、好中球およびヒト前骨髄球性白血病ＨＬ６０細胞に、末端にα２→３シアリル化を、また内部の種々の（但し、末端から２番目ではない）ＧｌｃＮＡｃ残基にα１→３フコシル化を有するポリラクトサミン・ガングリオシドの存在を探知した。我々は、該ガングリオシドの糖鎖を有するこれらの化合物を、「ミエロローリン」と総称する。対照的に、ポリラクトサミン鎖の内部α１→３フコシル化を有しない決定基であるＳＬｅx −Ｌｅx は、かかる細胞には欠如している。本試験において、我々は、Ｅ−セレクチン発現性細胞の接着およびローリングを惹起するミエロローリン（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｘ、Ｙ、上記）系列の活性について検討した。接着試験は、静的および動的流動の両条件下で行った。それに対して、ガングリオシドをコートした表面でのＥ−セレクチン発現性細胞のローリング試験は、動的流動条件下で行った。
【００６４】
本試験から、以下のことが結論される。ＳＬｅx を含む構造は、ローリングを惹起せず、好中球およびＨＬ６０細胞には事実上存在せず、かつ、好中球のローリング、接着および浸潤に何らの生理的役割を演じない。好中球のローリング、接着および浸潤を惹起する原因になるのは、ＳＬｅx を含む構造ではなく、むしろ「ミエロローリン」（すなわち、末端のα２→３シアリル化および内部のフコシル化［末端から２番目のＧｌｃＮＡｃ残基単独の場合を除いた、種々のＧｌｃＮＡｃ残基において］を有する非分枝ポリラクトサミン）と総称される一群のＳＬｅx を含まない構造である。種々のタイプのミエロローリンは、混合物において、ミエロローリンの単一分子と比較して、相乗的なＥ−セレクチン依存性ローリングおよび接着を惹起する。ミエロローリンは、ＨＬ６０細胞およびヒト白血球の主要グリカンおよびガングリオシドである。ミエロローリン機能のブロッキングは、Ｅ−セレクチン依存性ローリングおよび接着を惹起する、ミエロローリンに含まれる最小必要構造によって達成される。ミエロローリンの糖鎖に対して、非常に特異的な抗体は、ただちに調製し、選別し、かつ、抗炎症性薬品調製に使用することができる。
【００６５】
５．１  材料および方法
ＧＳＬｓおよびモノシアロガングリオシド
第１表は、本明細書中に開示する、ガングリオシドの構造（Ｆｒ．またはＳｔｒ．で同定される）を示す。該ガングリオシドの構造は、先に記載の通り、 1Ｈ−ＮＭＲ、 +イオン  ＦＡＢＭＳ、およびメチル化体のＣＩＤを有するＥＳ−ＭＳによって実証される（Stroud et al., 1995, Biochem. Biophys. Res. Comm. 209:777-787; Stroud et al., 1996, Biochemistry 35:758-769; Stroud et al., 1996, Biochemistry 35:770-778）。Ｆｒ．９−１、９−２、１０−１、および１０−２の構造は、エンド−β−ガラクトシダーゼ消化（Fukuda et al., 1979, J. Biol. Chem. 254:5458-5465 ）、メチル化分析、および +イオンＦＡＢＭＳによって更に確認されている。
【００６６】
【表１】
0003795588.tif 000018
【００６７】
【表２】
0003795588.tif 000019
【００６８】
細胞および結合実験
Ｅ−セレクチンｃＤＮＡでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞は、先に記載の通り、確立された（Handa, et al., 1995, Int. J. Oncol. 6:773-781 ）。Ｅ−セレクチン発現性トランスフェクト体は、抗Ｅ−セレクチンｍＡｂ  Ｅ１Ａを使用してサイトフルオロメトリーによって単離した。Ｅ−セレクチン依存性細胞接着の抑制は、濃度１０μｇ／ｍＬで、抗Ｅ−セレクチンｍＡｂ  Ｅ１Ｃを使用して行われた。これらのｍＡｂｓは、Ｅ−またはＰ−セレクチンを発現するＮＳ１細胞によるＢＡＬＢ／ｃマウスの免疫化を通して確立された。
【００６９】
プラスチック・プレート上、静的条件下での
Ｅ−セレクチン依存性細胞の種々のＧＳＬｓに対する接着
９６−ウェル・プレートを用いた静的接着実験：５０％エタノール中に溶解したポリ−ＬａｃＮＡｃガングリオシド（例えば、ＳＬｅX −ＬｅX およびＦｒ．９、１０−１、１０−２および１２−２）を、９６−ウェル・プレート（最初のウェルは２００ｎｇ含む）に逐次的に希釈し、かつ、該プレートを３７℃で５時間かけて乾燥した。ｍＡｂ  Ｅ１Ｃの存在下での、対照細胞接着のために、ポリ−ＬａｃＮＡｃガングリオシドを同様に逐次的希釈したプレートを準備した。Ｅ−セレクチン発現性ＣＨＯ細胞（Handa et al., 1995, Int. J. Oncol. 6:773-781）は、代謝的に［ 3Ｈ］チミジンで標識し、２日間培養した。培養細胞を２ｍＭ  ＥＤＴＡ処理して細胞懸濁物（２×１０6 ／ｍＬ）を調製した。この細胞懸濁物の５０μＬ画分（１×１０5 細胞を含む；約５０００ｃｐｍ）を各ウェルに加え、１時間培養した。対照として、ＥＤＴＡ−採取した細胞をＤＭＥＭで洗浄し、３０分間氷上で、ｍＡｂ  Ｅ１Ｃと共に培養し、引き続きｍＡｂ  Ｅ１Ｃ含量１０μｇ／ｍＬとした以外は上記と同様にして、細胞懸濁物を調製した。画分を各ウェルに添加し、上記と同様に培養した。細胞は、吸取紙上でプレートを逆さにすることによってＰＢＳで３回洗浄した。接着細胞の数は、 3Ｈ活性の測定により決定した。
【００７０】
静的条件下でポリスチレン・ビーズに固定した
ガングリオシドへのＥ−セレクチン依存性細胞接着
動的接着実験で使用したものと同じマトリックスで静的接着を観察するために、以下の手順を用いた。対物顕微鏡スライドに固定した１μｍまたは４μｍ直径のポリスチレン・ラテックス・ビーズ（ＩＤＣ  ＳｐｈｅｒｅｓTM；ＩＤＣ，Ｐｏｒｔｌａｎｄ，ＯＲ）を、ポリ−ＬａｃＮＡｃ  ＧＳＬｓの担体として使用した。直径４μｍのビーズ懸濁物３０μＬ（２×１０9 ビーズ／ｍＬを含む）または１μｍビーズ懸濁物６０μＬ（１×１０11ビーズ／ｍＬを含む）をエッペンドルフ管内に置き、無水エタノールで３回洗浄した。沈殿させた４μｍビーズは５００ｍＬのエタノール中に、また沈殿させた１μｍビーズは２ｍＬのエタノール中に、それぞれ懸濁した。これら懸濁物の１μＬ画分は、新たに開いた顕微鏡スライド（Labcraft Superfrost Plus, Curtin Matheson Scientific, Houston, TX ）上に載置した。ビーズは、ガラス表面上直径約１ｃｍの円形スポット内に均質に分布させた。該スライドを、１５０℃で５０秒間加熱した。それによって、ビーズは、種々の速度の水流によって洗い流されない程度に、強力に表面に接着した。同じモル濃度で、イソプロパノール−ヘキサン−水に溶解したガングリオシドを、該スライドに固定したビーズに接触させた。すなわち、５０〜１００ｎｇのガングリオシドを含む１μＬの画分を、該円形スポットの中心に設置した。これにより、ガングリオシドはビーズ表面に固定された。室温で１時間、スライドをＰＢＳ中の３％ＢＳＡに浸漬し、かつＣａ2+／Ｍｇ2+を含むＰＢＳで３回洗浄した。
【００７１】
新しく採取し、動かさずに１５分間、ＲＰＭＩ培養液中に懸濁した５×１０5 のＣＨＯ細胞でスライドは重層された。通常、ＲＰＭＩによる３回の洗浄で、非接着細胞をビーズから除去するに充分であった。しかし、対象ビーズ上の細胞が洗い流されるまでには、入念な顕微鏡試験を繰り返し行わねばならなかった。その後、スライドは、ＰＢＳに溶かした１％グルタルアルデヒドで固定し、ポリ−ＬａｃＮＡｃガングリオシドをコートしたビーズの層に接着した細胞数をカウントした。
【００７２】
動的流動条件下の種々のＧＳＬｓによる
Ｅ−セレクチン依存性細胞のローリングおよび接着
上記の手順を用いて、ポリスチレン・ビーズ（４．２±３．７％μｍまたは１μｍ）を調製し、顕微鏡スライドに固定した。同じモル濃度で、ＩＨＷに溶解したガングリオシドを該スライドに固定したビーズに接触させた。すなわち、５０〜１００または０．０５〜０．１ｎｇガングリオシドを含む１μＬの画分を、円形スポットの中心に設置した。
【００７３】
スライドを、室温で１時間、３％ＢＳＡ含有ＰＢＳ中に浸漬し、かつ、Ｃａ2+／Ｍｇ2+を含むＰＢＳで３回洗浄した。スライドを、注入ポンプ（モデル９３５、Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）に連結している平行プレート層流チャンバー内に設置した。該装置は、論文（Lawrence et al., 1990, Blood 75:227-237; Lawrence & Springer, 1991, Cell 65:859-873）によって記載されているように、生理的微小血管環境の中にある流動せん断応力をシミュレートする。規定速度および壁面せん断応力の層流は、流動チャンバーの入口に連結している、注入ポンプの手操作によって実現する。ＥＤＴＡにより培養物から新たに採取し、洗浄し、１％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ培地中に再懸濁した、Ｅ−またはＰ−セレクチン発現性ＣＨＯ細胞（第２Ａ−２Ｅ図では１×１０5 細胞／ｍＬ；第５Ａ図では２×１０5 細胞／ｍＬ；第５Ｂ図、第４Ａ図および第４Ｂ図では５×１０5 細胞／ｍＬ）を、種々の層流速度で、装置内に注入した。細胞の動きは、倒立位相差顕微鏡（ Diaphot-TMD、ニコン）下で観察し、継時露出撮影ビデオカセット・レコーダにより記録した。細胞のローリングおよび接着が観察され、０．６〜１２．０ｄｙｎｅｓ／ｃｍ2 のせん断応力下、２分間のローリングおよび接着細胞の数を、ビデオテープの少なくとも１０視域（フィールド）でカウントした。壁面せん断応力（Ｔ）は、論文（Lawrence et al., 1990, Blood 75:227-237 & Lawrence et al., 1987, Blood 70:1284-1290 ）記載の下記式によって計算した：
【００７４】
【数１】
Ｔ＝３μＱ／２ｂａ2 
式中、μ＝粘性係数（１．０ｃＰ）、Ｑ＝容積流速（ｃｍ3 ／秒）、ａ＝半チャンネル高（この場合、５．７×１０-3ｃｍ）、およびｂ＝チャンネル幅（１．３ｃｍ）である。
【００７５】
蛍光分析によるＥ−またはＰ−セレクチンと
ミエロローリンガングリオシドとの直接結合デモンストレーション
５×１０6 ポリスチレン・ビーズ（直径４．２±３．７％μｍ）（IDC SpheresTTM;IDC，Portland, OR）を、遠心分離によりエタノールで洗浄した。洗浄したビーズに、５０μＬのエタノール中の１μｇのＧＳＬを加え、該混合物を窒素流下で蒸発させた。該ビーズは１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ（＋）中に再懸濁し、遠心分離により２回洗浄した。洗浄したビーズは、３％ＢＳＡ含有ＰＢＳ（＋）により室温で２時間ブロックした。遠心分離後、ビーズを、１％ＢＳＡおよび０．１％アジ化物を含むＰＢＳ（＋）中に再懸濁し、４℃で貯蔵した。黄緑蛍光硫酸化ラテックス・ビーズ（直径１μｍ）（Molecular Porbes, Inc., Portland, OR）を、ヤギの抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ−フラグメント特異的）抗体（Jackson Immunoresearch Lab, West Grove, PA）で、製造業者のプロトコルに従って、コートした。ＰＢＳによる３回の洗浄の後、該ビーズは、４℃で２時間、３％ＢＳＡ含有ＰＢＳでブロックした。ブロックされたビーズ（約５×１０8 ）は、ＣＨＯトランスフェクト体（Handa et al., 1995, Int. J. Oncol. 6:773-781）からのＥ−またはＰ−セレクチン−Ｉｇ融合タンパク質含有培養上清（約１μｇ／ｍＬ融合タンパク質）１．５ｍＬと、血液ミキサーを使用して４℃で、６〜１８時間混合した。この混合手順を、該融合タンパク質を含む、新しい培養上清を用いて３回繰り返した。ＰＢＳで洗浄後、ビーズを、５０μｇのヒトＩｇＧ（Jackson Immunoresearch）を含む１ｍＬのＰＢＳ中で培養した。対照ビーズ調製のため、融合タンパク質の代わりに、１μｇ／ｍＬのヒトＩｇＧを使用した。ガングリオシドでコートしたビーズは、室温で、かつ様々な期間、蛍光性ビーズと混合した。その結果生じた懸濁物は、フローサイトメトリー分析にかけた。各実験条件は、以下に詳述する。
【００７６】
５．２  結果
静的条件下でのＥ−セレクチン依存性接着
静的条件下における、Ｅ−セレクチン発現性細胞のミエロローリン・ガングリオシドおよびＳＬｅX 含有ガングリオシドとの接着を、「材料および方法」に記載の、２つの異なった方法によって検討した。一つの方法では、９６−ウェル・プレート表面に、ガングリオシドを直接コートし、引き続きＢＳＡでブロッキングし、しかも［ 3Ｈ］チミジン標識したＥ−セレクチン発現性細胞を添加し、抗Ｅ−セレクチン抗体存在下および不存在下で、培養した。その結果、静的条件下においては、Ｅ−セレクチン発現性細胞は、ＳＬｅX −ＬｅX をコートした表面には結合したが、ミエロローリン（Ｆｒ．１０−１、１０−２、９および１２−２）をコートした表面には結合しないことが判明した（第１Ａ図）。結合反応におけるｍＡｂ  Ｅ１Ｃの存在は、Ｅ−セレクチン発現性細胞のＳＬｅX −ＬｅX でコートした表面への結合を阻害した。
【００７７】
データを第１Ａ図に示す、本実験の追加的詳細は、以下の通りである：５０％エタノールに溶解した、ＳＬｅX −ＬｅX およびポリ−ＬａｃＮＡｃガングリオシド（Ｆｒ．９、１０−１、１０−２および１２−２）を、適正に希釈し、９６−ウェル・プレートのウェル上にコートした（横座標に示したとおり２５〜２００ｎｇ量）。ウェルは３７℃にて５時間乾燥した。２つの全く同じプレート（１および２）を以下のように調製した。プレート１においては、１×１０5 の、［ 3Ｈ］チミジンで代謝的に標識したＥ−セレクチン発現性ＣＨＯ細胞を含む、ＲＰＭＩ５０μＬ画分をウェルに添加した。プレート２においては、１×１０5 のＥ−セレクチン発現性ＣＨＯ細胞および抗Ｅ−セレクチンｍＡｂ  Ｅ１Ｃ（１０μｇＩｇ／ｍＬ）によりプレインキュベートしたｍＡｂ  Ｅ１Ｃ細胞を含む、ＲＰＭＩ５０μＬ画分をウェルに添加した。プレート１および２を、２５分間培養し、以下のように、ＰＢＳで洗浄した。各ウェルには、２００μＬのＰＢＳを入れ、注意深く振盪し、プレートは、１０分間吸い取り紙の上で逆さにした。全ての非接着細胞は、沈殿し、該吸い取り紙の上に吸収された。ウェル上に残った接着細胞をカウントした。細胞数は、測定された放射能に基づいて計算した。
【００７８】
もう一つの方法では、ガラス顕微鏡スライド上に固定したポリスチレン・ビーズ（直径１μｍ）を使用した。ガングリオシドは、定量的にビーズ上に吸着された。このマトリックスに、放射能標識してないＥ−セレクチン発現性ＣＨＯ細胞を加え、培養し、洗浄し、「材料と方法」に記載した方法で、接着細胞の数をカウントした。結果は、以下の通りである。ＳＬｅX −ＬｅX （VI3NeuAcV3FucIII3FucnLc6Cer ）は、Ｆｒ．１３−１（X3NeuAcVII3FucV3FucnLc10Cer; Str.7）よりわずかに高い細胞接着を示した。Ｆｒ．１４（Ｓｔｒ．９、１０、１１および１２の混合物）は、中程度の接着（ＳＬｅX −ＬｅX よりわずかに低い）を示した。同じ条件下で、Ｆｒ．１０−１（VIII3NeuAcV3FucnLc8Cer; Str. 4）、Ｆｒ．１０−２（VIII3NeuAcIII3FucnLc8Cer; Str. 5) ）、およびＦｒ．１２−２（X3NeuAcVII3FucnLc10Cer）は、Ｆｒ．１３−１またはＦｒ．１４よりはるかによわい細胞接着を示した（第１Ｂ図）。内部フコシル化を持たないシアロシル・ポリ−ＬａｃＮＡｃ（例えば、VI3NeuAcnLc6Cer; Fr. 7）は、細胞接着を示さなかった。
【００７９】
第１Ａ図および第１Ｂ図に示した、重要な知見は次の通り。静的条件下においては、１）ＳＬｅX −ＬｅX はミエロローリン（Ｆｒ．１３−１および１４）よりはるかに強い接着活性を示す；２）内部α１→３フコシル化を１つ有するシアロシル・ポリ−ＬａｃＮＡｃ（Ｆｒ．９、１０−１、１０−２および１２−２）およびフコシル化を持たないシアロシル・ポリ−ＬａｃＮＡｃ（Ｆｒ．７）は、ほとんどまたは全く接着活性を示さない；および３）ｍＡｂ  Ｅ１Ｃは、Ｅ−セレクチン発現性細胞のＳＬｅX −ＬｅX をコートした表面への接着をブロックする。
【００８０】
動的流動条件下でのＥ−セレクチン依存性細胞の
ポリスチレン・ビーズに固定されたガングリオシドへの結合
上記結果とは対照的に、Ｅ−セレクチン発現性ＣＨＯ細胞のローリングおよび接着は、動的流動条件下では、Ｆｒ．１０、１３−１および１４（それぞれ、Ｓｔｒ．４−５、Ｓｔｒ．７−８およびＳｔｒ．９−１２を含有する）をコートしたビーズ上で生じた。ポリスチレン・ビーズは、ガラス顕微鏡スライドに固定した。種々のガングリオシドを「材料と方法」に記載のとおり、コートした。スライドは、１％または２％のウシ血清アルブミン含有ＰＢＳ中に１時間置いてブロックし、次いで、「材料と方法」に記載のとおり、平行層流チャンバー内に組み立てた。Ｅ−セレクチン発現性ＣＨＯ細胞を、新たに採取し、ＲＰＭＩ培地内に懸濁した（１×１０5 細胞）。細胞懸濁物は、流動チャンバーに連結した注入ポンプに設置し、種々の層流速で、装置内に注入した。細胞の動きを位相差顕微鏡の下で観察し、かつ、ビデオカセット・レコーダーで記録した。少なくとも、１０顕微鏡視域で、ローリング細胞数をカウントし、その平均数を記録した。その結果を、第４Ｃ図に示す。
【００８１】
細胞ローリングは、ミエロローリン構造を有するがＳＬｅX エピトープを欠く、Ｆｒ．１０またはＦｒ．１４をコートしたビーズ上で最も強かった（第４Ｃ図）。ローリングは、特に、２．４および４．８ｄｙｎｅｓ／ｃｍ2 のせん断応力で明らかであった。ＳＬｅX −ＬｅX をコートしたビーズ上では、せん断応力に関係なく、ローリングは観察されなかった。このことは、ミエロローリンＦｒ．１３−１またはＦｒ．１４をコートしたビーズ上では、かなりのローリング後接着が観察されたことと際立った対照をなすものであった。動的流動条件下において、ＳＬｅX −ＬｅX をコートしたビーズは、細胞結合をしたが、ミエロローリン・フラクションをコートしたビーズよりもより少程度であった。Ｓｔｒ．１または２をコートしたビーズでは、細胞接着は見られなかった。
【００８２】
種々のせん断応力下、動的流動系中でのＥ−セレクチン依存性の単純ローリング、ローリング後接着、および接着については、第６Ａ図および第６Ｂ図で対比させた。ＳＬｅX −ＬｅX をコートしたビーズでは、せん断応力（１２〜１．２ｄｙｎｅｓ／ｃｍ2 ）に関係なく、殆どまたは全くローリングは観察されなかった。少数の細胞（５以下／視域）は接着したが、ローリングは示さなかった。それと対照的に、ミエロローリンをコートしたビーズ上では、せん断応力条件下（４．８および１２ｄｙｎｅｓ／ｃｍ2 ）で、かなりの数の単純ローリング細胞が見られた。単純ローリングおよびローリング後接着を示した細胞数は、試験した全てのミエロローリン（Ｆｒ．１３−１、Ｆｒ．１４およびＦｒ．１０）において、２．４ｄｙｎｅｓ／ｃｍ2 が、最も多かった。せん断応力条件（０．６および１．２ｄｙｎｅｓ／ｃｍ2 ）下で、ローリング後接着細胞数は、大きく増加した。
【００８３】
第６Ａ図および第６Ｂ図を参照し、さらに詳細にみると、規定された壁面せん断応力条件（１２、４．８、２．４、１．２および０．６ｄｙｎｅｓ／ｃｍ2 ）下における、単純ローリング細胞およびローリング後接着細胞数は、らせん矢印つきのブロックで示した。第６Ａ図：パネルＩ、ＳＬｅX −ＬｅX （Ｓｄｉｙ2 ）に対する細胞接着。試験した全てのせん断応力条件下で、ローリングは見られなかった。低レベルだがローリングのない接着が、４．８〜１．２ｄｙｎｅｓ／ｃｍ2 せん断応力で、観察された。壁面せん断応力は異なっても、接着細胞数に変化は見られなかった。ａ，ローリング細胞数；ｂ、非ローリング性接着細胞数；パネルＩＩ、ガングリオシドＦｒ．１３−１（Ｓｔｒ．７）をコートしたビーズに対する単純ローリング細胞およびローリング後接着細胞。ローリングは２．４ｄｙｎｅｓ／ｃｍ2 で最高で、より小さいせん断応力では減少した。ａ、ローリング細胞数；ｂ、ローリング後接着細胞数。第６Ｂ図：パネルＩＩＩ、Ｆｒ．１４（Ｓｔｒ．９、１０、１１および１２の混合物）でコートしたビーズに対する単純ローリングおよびローリング後接着細胞。高いローリング後接着が、２．４〜１．２ｄｙｎｅｓ／ｃｍ2 で観察された。ａ、ローリング細胞数；ｂ、ローリング後接着細胞数。パネルＩＶ、Ｓｔｒ．４および５の混合物である、Ｆｒ．１０−１および１０−２の混合物をコートしたビーズに対する単純ローリング細胞およびローリング後接着細胞。ローリング後接着の最大値は、２．４ｄｙｎｅｓ／ｃｍ2 で観察された。ａ、ローリング細胞数；ｂ、ローリング後接着細胞数。
【００８４】
動的流動条件下におけるＥ−セレクチン
発現性細胞のローリングおよび接着
第２Ａ〜２Ｅ図は、上記実験で得られたと同様の、せん断応力条件下における、Ｅ−セレクチン発現性ＣＨＯ細胞のローリングおよび接着結果を示す。第２Ａ図は、ＳＬｅX −ＬｅX をコートしたビーズ上では、全てのせん断応力で、接着は見られたが、ローリング細胞は見られなかったことを示す。
【００８５】
第２Ｂ図は、Ｆｒ．１２−２をコートしたビーズ上での、細胞のローリングおよび接着結果を示す。ローリングは、４．８ｄｙｎｅｓ／ｃｍ2 で最も高かった。ローリングおよび接着は、何れも、Ｆｒ．１３−１または１４をコートしたビーズ上より、低かった（それぞれ、第２Ｃ図および第２Ｅ図）。しかし、ＳＬｅX −ＬｅX をコートしたビーズ上でのそれに匹敵した。
【００８６】
第２Ｃ図は、Ｆｒ．１３−１（Ｓｔｒ．７）をコートしたビーズ上での細胞のローリングおよび接着結果を示す。ローリング細胞数は、４．８および２．４ｄｙｎｅｓ／ｃｍ2 で、１．２ｄｙｎｅｓ／ｃｍ2 より高かった。
【００８７】
第２Ｄ図は、Ｆｒ．１３−１をコートしたビーズ上での、細胞のローリングおよび接着結果を示す。ローリング細胞数は、４．８ｄｙｎｅｓ／ｃｍ2 で最も高かった。１．２ｄｙｎｅｓ／ｃｍ2 では、接着はより高かったが、ローリングはより低かった。
【００８８】
第２Ｅ図は、Ｆｒ．１４をコートしたビーズ上での、細胞のローリングおよび接着結果を示す。ローリングおよび接着は、２．４および４．８ｄｙｎｅｓ／ｃｍ2 で最も高かった。ローリングは、１．２ｄｙｎｅｓ／ｃｍ2 で、より低かった。
【００８９】
ミエロローリン同族体は、生理的せん断応力の動的流動条件下、
ＳＬｅX −ＬｅX より高い
Ｅ−セレクチン依存性ローリングおよび接着を示した
１００ｎｇのポリ−ＬａｃＮＡｃガングリオシド（Ｆｒ．１３−１、Ｆｒ．１４またはＳＬｅX −ＬｅX ）を、顕微鏡スライドに固定したビーズに接着し、その後、「材料および方法」で記載した動的流動系に置いた。この系で、種々のせん断応力下において、Ｅ−セレクチン発現性ＣＨＯ細胞のローリングおよび接着を、測定した。ポリ−ＬａｃＮＡｃガングリオシドをコートしたビーズへの、細胞接着の傾向は、４μｍビーズでも１μｍビーズでも、本質的に同様であった（それぞれ、第２Ｃ図および第２Ｄ図）。Ｆｒ．１３−１またはＦｒ．１４は、４．８または２．４ｄｙｎｅｓ／ｃｍ2 で、強いローリングおよび接着を引き起こした。ローリング細胞数は、１．２ｄｙｎｅｓ／ｃｍ2 では、より低かった（第２Ｃ図、第２Ｄ図および第２Ｅ図）。ＳＬｅX −ＬｅX をコートしたビーズ上での接着細胞数は、Ｆｒ．１３−１または１４をコートしたそれよりも、かなり低かった。ＳＬｅX −ＬｅX をコートしたビーズでは、いかなるローリング細胞も観察されなかった（第２Ａ図）。
【００９０】
動的流動条件下、種々のガングリオシドに対するＥ−セレクチン発現性細胞のローリング／接着に関する一連の実験で、ＳＬｅX を有する構造がローリングを惹起しないことが明らかとなった。Ｆｒ．１０および１４に見られるような、異なったＧｌｃＮＡｃで、α１→３結合した、一つのＦｕｃ（フコース）を有するシアロシル・ポリ−ＬａｃＮＡｃが、強いローリングを引き起こした。二つのα１→３Ｆｕｃ残基を有する本質的に純粋な成分である、Ｆｒ．１３−１も、また、強いローリングを惹起した。接着細胞を除いて、ローリング細胞をカウントし、第４Ｃ図にその結果を示した。
【００９１】
ミエロローリン混合物は、精製ミエロローリンより、
より強いローリングおよび接着を惹起した
第３Ａ図、第４Ｂ図、第４Ｃ図、第５Ａ図、第５Ｂ図、第６Ａ図および第６Ｂ図に示した、動的条件下における、細胞ローリングおよび接着に関するデータ（ＳＬｅX −ＬｅX に関するデータを除く）は、ミエロローリン混合物に関するものである。更なる実験の結果、「ミエロローリン混合物」は、精製ミエロローリンより高い、Ｅ−セレクチン依存性ローリング後接着を惹起する能力を示すことが、明らかになった（第２表参照）。
【００９２】
ミエロローリン混合物は、また、静的条件下においても、精製ミエロローリンより強い接着活性を有する。例えば、Ｓｔｒ．６の純粋化合物である、Ｆｒ．１１は、Ｅ−セレクチン発現性細胞との弱い接着を示した；一方、Ｓｔｒ．４および５の混合物である、Ｆｒ．１０は、Ｅ−セレクチン発現性細胞との際立った強い接着を示した（第３Ａ図）。
【００９３】
フローサイトメトリーにより測定された、
ミエロローリンのＥ−およびＰ−セレクチンへの直接結合
我々の先の研究において、二つのα１→３Ｆｕｃ残基を有する、ポリ−ＬａｃＮＡｃガングリオシド（例えば、Ｆｒ．１２−３、１３−１および１４）は、静的条件下においては、Ｅ−セレクチン発現性細胞との結合のみが可能であった。内部ＧｌｃＮＡｃに、１つのα１→３Ｆｕｃ残基を有するポリ−ＬａｃＮＡｃガングリオシド（Ｆｒ．９、１０および１２−１）への、静的条件下における細胞接着は、観察しなかった（Stroud et al., 1995, Biochem. Biophys. Res. Commun. 209:777-778; Stroud et al., Biochemistry 35:758-769; Stroud et al., 1996, Biochemistry 35:770-778 ）。これらの知見は、その後の実験データによって、確認された（第１Ａ図および第１Ｂ図に示す）。
【００９４】
対照的に、動的流動条件下においては、内部ＧｌｃＮＡｃに、１つのα１→３Ｆｕｃ残基を有するポリ−ＬａｃＮＡｃガングリオシド（Ｆｒ．９、１０および１２−１）は、Ｅ−セレクチン発現性細胞と結合し、強いローリングを惹起した。これらのミエロローリン・フラクションは、好中球およびＨＬ６０細胞の主要細胞表面成分であるので、他の方法によって、それらのＥ−セレクチン結合能力を確認することは、重要である。
【００９５】
Ｅ−またはＰ−セレクチン結合の種々のガングリオシドへの接着は、Ｅ−またはＰ−セレクチンをコートした蛍光性ビーズを使用する、新規かつ鋭敏な方法で評価した。接着は、ミエロローリンをコートしたポリスチレン・ビーズ、およびセレクチンをコートした蛍光性ビーズの凝集により測定した。ガングリオシドを、非蛍光性ポリスチレン・ビーズにコートし、次いで、ＥＤＴＡの存在または不存在下、Ｅ−またはＰ−セレクチンをコートした蛍光性ビーズと混合した。凝集は、短く強い攪拌下で起こるので、該過程は、「静的」でも「動的」接着でもなく、その中で、ミエロローリンは、不動の固相として存在した。結合は、サイトフルオロメトリーによって測定した。結合指数は、ガングリオシド・フラクションの平均蛍光強度（ＭＦＩ）を、シアリルパラグロボシド（IV3NeuAcnLc4Cer ）のＭＦＩで割ったものとして定義した。
【００９６】
結果は、第３Ａ図に示すとおり。ミエロローリンをコートしたビーズのＥ−セレクチンをコートしたビーズへの結合は、ＥＤＴＡの存在下において、完全に阻害された；ミエロローリンをコートしたビーズは、Ｐ−セレクチンをコートしたビーズと結合できなかった。ＳＬｅX 末端をもたず、ＧｌｃＮＡｃ−ＩＩＩおよびＧｌｃＮＡｃ−Ｖにおいて、内部α１→３フコシル化された、Ｓｔｒ．４および５の混合物をコートしたビーズは、Ｅ−セレクチンをコートしたビーズと強く結合した。Ｆｒ．１３−１（Ｓｔｒ．７および８を１０：１の割合で含む）およびミエロローリンＳｔｒ．９−１２を含むＦｒ．１４をコートしたビーズは、同様に、Ｅ−セレクチンをコートしたビーズと明白な結合を示した。これと対照的に、内部フコシル化を持たない、Ｆｒ．７（Ｓｔｒ．１を含む）またはＦｒ．８（Ｓｔｒ．２を含む）をコートしたビーズは、Ｅ−セレクチンをコートしたビーズとの結合を示さなかった。ＳＬｅX 末端を有し、内部α１→３フコシル化を有するＳｔｒ．３をコートしたビーズは、予期したとおり、Ｅ−セレクチンをコートしたビーズとの結合を示した。
【００９７】
第３Ｂ図は、抗Ｅ−セレクチン抗体の、Ｅ−セレクチンをコートしたビーズと種々のミエロローリン・フラクションをコートしたビーズとの結合に対する、抑制効果を示す。Ｅ１Ｃは、ＨＬ６０細胞へのＥ−セレクチン結合に対する抑制効果に基づいて選択された、抗Ｅ−セレクチンｍＡｂｓの一つである。結合反応における、ｍＡＢ  Ｅ１Ｃの含有は、Ｅ−セレクチンをコートしたビーズと被験ガングリオシドの何れかをコートしたビーズとの結合を、本質的に阻害する（第３Ｂ図）。
【００９８】
異なったＧｌｃＮＡｃ残基においてα１→３結合したフコシルを有する
２つのポリ−ＬａｃＮＡｃガングリオシドによる、
強化された細胞接着およびローリング
第５Ａ図および第５Ｂ図は、Ｅ−セレクチン発現性細胞の接着およびローリングに対するミエロローリンの併用による相乗効果を示す。Ｆｒ．１０−１および１０−２は、それぞれ、ＧｌｃＮＡｃ−ＶおよびＧｌｃＮＡｃ−ＩＩＩにα１→３フコシル化を有するポリ−ＬａｃＮＡｃガングリオシドである。１００ｎｇのどちらか一方のフラクションをコートしたビーズは、４．８および２．４ｄｙｎｅｓ／ｃｍ2 で、同等の細胞ローリングおよび接着を惹起した（第５Ａ図、プロット１および２）。Ｆｒ．１０−１および１０−２の各５０ｎｇの混合物でコートしたビーズは、これらと同じせん断応力下において、より高い細胞ローリングおよび接着を惹起した（プロット３）。三つのプロット間の相違の統計学的有意性（対応のないスチューデントのｔ−検定からのＰ値）は、第５Ａ図の挿入表に示した。
【００９９】
細胞ローリングおよび接着に対する、Ｆｒ．１０−１およびＦｒ．１０−２の混合物の、何れか一方のフラクションだけと比較した相乗効果は、Ｆｒ．１０−１およびＦｒ．１０−２を１０００倍低い濃度で使用した時、より明らかであった（第５Ｂ図）。Ｆｒ．１０−２は、この低レベル（０．１ｎｇ／スポット）において、なお、いくらかの細胞ローリングおよび接着を引き起こしたが（第５Ｂ図、プロット２）、Ｆｒ．１０−１は、起こさなかった（プロット１）。これとは対照的に、Ｆｒ．１０−１および１０−２の各０．０５ｎｇの混合物は、生理的せん断応力下（２．４〜４．８ｄｙｎｅｓ／ｃｍ2 ）、かなりの細胞ローリングおよび接着を惹起した（プロット３）。プロット間の統計学的有意性（対応のないスチューデントのｔ−検定からのＰ値）は、第５Ｂ図の挿入表に示した。
【０１００】
ＳＬｅX −ＬｅX 並びに
Ｆｒ．１０−１およびＦｒ．１０−２の混合物の、
低濃度での細胞ローリングおよび接着の比較
第４Ａ図は、０．０５ｎｇのＳＬｅx −Ｌｅx （静的条件下においては、最も強い接着を引き起こした化合物）は、二つの反復実験（プロット１および２）で、動的条件下において、ローリングも接着も惹起しなかったことを示している。対照的に、第４Ｂ図は、Ｆｒ．１０−１およびＦｒ．１０−２の各０．０５ｎｇは、同じせん断応力下で、高い細胞ローリングおよび接着を惹起したことを示している（プロット１および２）。更に実験を重ねた結果、０．１ｎｇのＳＬｅX −ＬｅX は、細胞ローリングおよび接着を惹起しないことを示した。
【０１０１】
５．３  討議
炎症性刺激に対する反応における、ＥＣｓ上のＥ−およびＰ−セレクチンの発現は、ＥＣｓと好中球および他の白血球との相互作用を引き起こし、ローリング後接着および白血球の経内皮遊走をもたらす。Ｅ−セレクチン依存性ローリング後接着およびＥ−セレクチン依存性接着は、Ｅ−セレクチンにより、白血球上に発現されるＳＬｅX エピトープの認識が、仲介すると考えられていた。この概念は、種々の観察に基づいていたが、しかし、好中球上に存在する、真の糖質エピトープについての絶対的化学的同定を含んではいなかった。ヒト好中球、他の白血球および白血病性白血球株細胞（ＨＬ６０およびＵ９３７）は、以前にはＳＬｅX に結合すると主張された、種々のｍＡｂｓと強い反応性を示した。しかしながら、これら細胞に、化学的に検出できるＳＬｅX の量は、極端に小さい。白血病性白血球の、Ｎ−結合構造のメチル化側鎖に対するプラスイオンＦＡＢＭＳは、わずかに検出できるＳＬｅX をあらわす構造、ｍ／ｚ９９９シグナルを与えた（Fukuda et al., 1984, J. Biol. Chem. 259:10925-10935 ）。好中球または骨髄性白血病細胞のＮ−またはＯ−結合構造の側鎖中のＳＬｅx の存在は、推定されていたが（Asada et al., 1991, Biochemistry 30:1561-1571; Patel et al., 1994, Biochemistry 33:14815-14824）、しかし、絶対的化学的分析によっては裏付けられていなかった。
【０１０２】
正常ヒト白血球および前骨髄球性白血病ＨＬ６０細胞のガングリオシドに関する、我々の最近の系統的な研究は、１０糖以上のコアを有する非分枝モノシアロガングリオシドのみが、Ｅ−セレクチン結合の原因となることを示唆した（Stroud et al., 1995, Biochem. Biophys. Res. Commun. 209:777-787 ）。種々のタイプのヒト固形癌中に豊富に存在しているＳＬｅX 構造を有するガングリオシド（例えば、IV3NeuAcIII3FucnLc4Cer、VI3NeuAcV3FucnLc6Cer、VI3NeuAcV3FunIII3FucnLc6Cer ）（Yang and Hakomori, 1971 J. Biol. Chem. 246:1192-1200; Fukushi et al., 1984, J. Biol. Chem. 259:10511-10517）は、白血球およびＨＬ６０細胞には全く存在しなかった。８−、１０−、または１２−糖コアを有する、長鎖のＰＬＡ脂質の中には、内部フコシル化を持たず、ＳＬｅX エピトープを有する構造（例えば、VIII3NeuAcVII3FucnLc8Cer、 X3NeuAcIX3FucnLc10Cer、 XII3NeuAcXI3FucnLc12Cer）は、全く存在しなかった。その代わり、内部フコシル化を有しＳＬｅX を持つ、微量成分が存在した（例えば、X3NeuAcIX3FucVII3FucnLC10Cer）（Stroud et al., 1995, Biochem. Biophys. Res. Commun. 209:777-787 ）。白血球およびＨＬ６０細胞に存在する、主要構造は、末端α２→３シアリル化および内部α１→３フコシル化を有する、一連の非分枝長鎖ＰＬＡｓであった。代表的構造Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＸおよびＹを以下に示す：
【０１０３】
【化２１】
式中、→は、共有結合を示し、Ｒは、セラミド残基である。
【０１０４】
構造Ａは、Ｓｔｒ．４および６に共通である。構造Ｂは、Ｓｔｒ．５および１０に共通である。構造Ｃは、Ｓｔｒ．７および１１に共通である。構造Ｄは、Ｓｔｒ．１２の中に見出せる。これら４つの構造は、何れもＳＬｅX エピトープを含有しない。
【０１０５】
構造Ａは、先に、慢性骨髄性白血病細胞（Fukuda et al.,1984, J. Biol. Chem. 259:10925-10935）およびヒト結腸ガンから単離したガングリオシド中に発見され、ＡＣＦＨ−１８抗原として同定された（Nudelman et al., 1988, J. Biol. Chem. 263:13942-13951）。構造Ａは、また、ｍＡｂ「ＶＩＭ−２」により決められるものとして同定され（Macher et al., 1988, J. Biol. Chem. 263:10186-10191 ）、しかも、一時は、Ｅ−セレクチン結合性エピトープであると主張された（Tiemeyer et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:1138-1142）。しかしながら、ＶＩＭ−２−陽性、ＳＬｅX −陰性ＣＨＯ細胞は、Ｅ−セレクチン依存性接着を示さなかったので（Lowe et al, 1991, J. Biol. Chem. 266:17467-17477; Walz et al., 1990, Science 250:1132-1135）、ＶＩＭ−２エピトープは、かかる接着とは、関係がないように思われる。ＶＩＭ−２抗原が有力なＥ−セレクチン・リガンドである可能性は、ＶＩＭ−２抗体が、接着をブロックできなかったという事実、およびＳＬｅX 構造を含まず、ＶＩＭ−２抗原を含む細胞が、組み換え型のＥ−セレクチンとも活性化内皮細胞とも結合できなかったという事実によって、否定された（Lowe et al., 1991, J. Biol. Chem. 266:17467-17477; Walz et al., 1990, Science 250:1132-1135 ）。事実、ＶＩＭ−２エピトープを有するガングリオシドＳｔｒ．４および６は、静的条件下で、識別できる接着は示さなかった。
【０１０６】
我々は、ここに、ガングリオシドをコートしたラテックス・ビーズとＥ−またはＰ−セレクチン−Ｉｇ融合タンパク質をコートした蛍光性ビーズとの間の相互作用に基づく、新規実験を導入する。該相互作用は、適正なゲート操作によるフローサイトメトリーによって容易にモニターできる。本実験を用いて、Ｆｒ．１０−１および１０−２の混合物（Ｓｔｒ．４および５を含む）、Ｆｒ．１３−１（主として、Ｓｔｒ．７を含む）、およびＦｒ．１４（主要成分として、Ｓｔｒ．９および１１を含む）は、Ｅ−セレクチンと強力に結合することを発見した。特に重要なことは、異なったタイプのミエロローリン混合物が、ローリング後接着を非常に増進することを観察したことである。これは、フローサイトメトリー法のみでなく、動的流動チャンバー内での細胞接着によっても、明白に実証された（第２表参照）。
【０１０７】
【表３】
0003795588.tif 000020
【０１０８】
要約すると、Ｓｔｒ．１および２（内部フコシル化を持たない）は、Ｅ−セレクチンをコートした表面が何であれ、結合しなかった。これらフラクションの中で、唯一Ｆｒ．１３−１は、微量のＳｔｒ．８（末端にＳＬｅX 決定基を有するが、更に、内部フコシル化も有する）を含有していた。その他のＥ−セレクチン結合性フラクションは、いずれもＳＬｅX エピトープを含まなかった。Ｓｔｒ．３（結腸ガン、胃ガン、および肺ガンなどのヒト固形ガン中に豊富に存在する）は、ＳＬｅX および内部フコシル化を有し、Ｅ−セレクチンをコートした表面と結合した。
【０１０９】
末端がα２→３シアリル化され、かつ内部がα１→３フコシル化されたＰＬＡｓを有する、モノシアロガングリオシドは、好中球および骨髄性白血病細胞の主要成分であり、「ミエロローリン」と総称される。以前に、ＳＬｅX 決定基に結合すると同定された、ｍＡｂｓ  ＦＨ６（Fukushi et al., 1984, J Biol. Chem. 259:10511-10517）、ＣＳＬＥＸ（Fukushima et al., 1984, Cancer Res. 44:5279-5285）、並びにＳＮＨ３およびＳＮＨ４（Muroi et al., 1992, Blood 79:713-719）は、全てのミエロローリンと反応することが判明した。ＳＬｅX に特異的な、すなわち、ミエロローリンと交差反応しないｍＡｂｓはなかった。これらｍＡｂｓの特異性は、なお、究明中である。
【０１１０】
我々は、動的流動および静的条件下において、顕微鏡スライドに固定した、ガングリオシドをコートしたラテックス・ビーズに対する、Ｅ−およびＰ−セレクチン発現性ＣＨＯ細胞のローリングおよび接着を比較した。ミエロローリン（Ｆｒ．１０−１とＦｒ．１０−２の混合物、Ｆｒ．１３−１またはＦｒ．１４）だけが、動的流動条件下で、細胞のローリング後接着を引き起こした。Ｆｒ．１０および１４（微量のＳＬｅX も含まず、ミエロローリンだけからなる）は、特に０．６〜２．４ｄｙｎｅｓ／ｃｍ2 のせん断応力下で、最も強いローリングおよび接着効果を示した。Ｓｔｒ．３（内部フコシル化されたＳＬｅX エピトープを有する）は、低レベルの接着は引き起こしたが、細胞のローリングは引き起こさなかった。静的条件下においては、対照的に、Ｓｔｒ．３は、ミエロローリンよりはるかに高い接着を惹起した。
【０１１１】
細胞ローリング後接着（ローリングに続く接着）は、セレクチン依存性ローリングおよび接着の特徴的特質と考えられるので、我々は、Ｓｔｒ．４、５、７、１０、１１等により例証したように、ミエロローリンは、ＥＣｓ上でのセレクチン発現によって仲介される、白血球の接着において主要な役割を演ずると推定した。この結論は、次の事実に基づいてなされた：すなわち、（ｉ）ミエロローリンは、好中球およびＨＬ６０細胞に存在する主要構造である。（ｉｉ）ミエロローリンだけが（内部フコシル化の有無に関係なく、ＳＬｅX ではなく）細胞ローリング後接着を引き起こした。（ｉｉｉ）内部フコシル化のないＳＬｅX は、好中球およびＨＬ６０細胞には全く存在しない。
【０１１２】
我々の研究において、静的条件下、末端α２→３シアリル化および多数の内部α１→３ポリフコシル化を有するフラクション（例えば、上記構造ＣおよびＤ、またはこれら構造の混合物）だけが、32Ｐ−標識された、永続的Ｅ−またはＰ−セレクチン発現性ＣＨＯ細胞を用いた、ＴＬＣ重層技術応用下において、明らかなＥ−セレクチン結合を示した。末端α２→３シアリル化および内部α１→３モノフコシル化を有するポリ−ＬａｃＮＡｃ（例えば、構造ＡおよびＢ）は、これら条件下では、Ｅ−セレクチン結合を示さなかった。これらの結合特性は、ガラス・プレートに固定した、糖脂質をコートしたポリスチレン・ビーズ上に重層した、Ｅ−セレクチン発現性ＣＨＯ細胞を使用する、静的接着実験システムにおいて確認された。典型的なＳＬｅX 構造を有する糖脂質（ＳＬｅX −ＬｅX ；VI3NeuAcV3FucIII3FucnLc6Cer ）は、静的系において、最も高い接着を示した。対照的に、ガラス・プレートに固定した、同じ糖脂質をコートしたビーズを使用した、動的流動系において、ＳＬｅX −ＬｅX は、全くローリングは起こさず、Ｆｒ．１０−１、１０−２、１３−１および１４に比べて、弱い接着しか引き起こさなかった。強い細胞ローリングおよび接着は、構造ＸおよびＹを使用した時に観察された。典型的な例は、Ｆｒ．１０−１、１０−２、Ｆｒ．１３−１およびＦｒ．１４（構造Ａ、Ｂ、ＣおよびＤの混合物）であり、また、生理的せん断応力条件下で、強いローリングおよび接着を引き起こした。
【０１１３】
ミエロローリン構造の混合物（例えば、Ｆｒ．１４）が、生理的せん断応力下において、最も強いローリングおよび接着を惹起するという発見を得て、我々は、Ｆｒ．１０−１、Ｆｒ．１０−２およびＦｒ．１０−１と１０−２の等量の混合物を、更に念入りに究明した。生理的せん断応力下において、１００ｎｇの純粋Ｆｒ．１０−１およびＦｒ．１０−２が惹起したローリングおよび接着は、相互に同等であった。興味深いことに、これら二つの成分、各５０ｎｇの混合物は、特に、生理的せん断応力下において、はるかに高いローリングおよび接着を引き起こした。この傾向は、より少ない量の糖脂質を使用した時、さらに明白であった。最も劇的な強化は、０．１ｎｇの何れかの成分だけを使用した時に比較して、それぞれ０．０５ｎｇのＦｒ．１０−１および１０−２を使用した時に見られた。これらの知見は、非常に少量のＦｒ．１０−１および１０−２でも、互いに影響し合って、動的流動条件下において、Ｅ−セレクチンがローリングおよび接着を惹起するのに、好適な構造を形成することを示唆している。この相乗的効果のメカニズムは、未知のままである。
【０１１４】
静的条件下で、最も強いＥ−セレクチン依存性接着を引き起こす、ＳＬｅX −ＬｅX 構造は、動的流動条件下においては、ミエロローリン構造より、弱かった（第２Ａ図と第２Ｃ図、第２Ｄ図および第２Ｅ図を比較のこと）。この相違は、非常に低い濃度において、更に、際立っていた。ＳＬｅX −ＬｅX は、０．０５ｎｇの濃度において、本質的に細胞ローリングおよび接着を惹起しなかった（第４Ａ図）、ところが、Ｆｒ．１０−１および１０−２の混合物（それぞれ０．０５ｎｇ、０．０５ｎｇのＳＬｅX −ＬｅX と同じモル濃度を与える）は、強いローリングおよび接着を惹起した（第４Ｂ図）。Ｆｒ．１０−１および１０−２の混合物による強化は、いずれか一方のフラクションだけの場合と比較して、高濃度（５０〜１００ｎｇ）時よりむしろ、低濃度（例えば、０．０５〜０．１ｎｇ）時により明白であった。Ｆｒ．１０−１および１０−２の効果と対照的に、ＳＬｅX −ＬｅX は、低濃度（例えば、０．０５〜０．１ｎｇ）でのＥ−セレクチン発現性細胞のいかなるローリングまたは接着も惹起しなかった。
【０１１５】
これらの結果は、ＳＬｅX −ＬｅX よりむしろ、ミエロローリンが、生理的動的流動条件下における、血管内皮細胞上の骨髄細胞のＥ−セレクチン依存性ローリングおよび接着に対する、主要リガンドであることを示している。
【０１１６】
我々の結果は、また、何故、異なった位置のα１→３フコシル化および末端シアリル化を有する、一連のポリ−ＬａｃＮＡｃ構造が、好中球表面に存在し、かつ配列を形成するのか、という疑問に対する説明を暗示している。特異的構造の組み合わせは、高−、中−または低−せん断応力動的流動条件下において、最適条件でＥ−セレクチンと結合するために、高−、中−または低−親和性結合部位を形成するのかもしれない。ポリ−ＬａｃＮＡｃが、らせん構造を形成することは、知られている。ミエロローリンおよびミエログリカンは、多数または一個のフコシル残基が結合し、かつ異なった方向に配向している、らせん骨格構造を有しているかもしれない。かかるらせん構造は、フコシル残基の位置に基づいて、互いに影響し合うことができた。
【０１１７】
本研究を通して、試験したガングリオシドが何であれ、Ｐ−セレクチン依存性結合は、上記のフローサイトメトリー法によっても、また、Ｐ−セレクチン発現性ＣＨＯ細胞のガングリオシドをコートしたプレートへの接着によっても、静的または動的流動条件下何れにおいても、観察されなかった。Ｐ−セレクチン依存性接着は、特異的糖質構造に加えて、明らかに「ＰＳＧＬ−１類似の」集合分子を要求する（Handa et al., 1995, Int. J. Oncol. 6:773-781; Sako et al., 1993, Cell 75:1179-1186）。Ｐ−セレクチン結合のために、要求される糖質エピトープに関する、より進んだ研究は進行中である。
【０１１８】
ミエロローリンのポリラクトサミン鎖上のシアル酸（ＳＡ）およびフコシル残基（Ｆｕｃ）の組立に関する、三つのあり得るスキームを第７図に示した。反復的なＧａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→３Ｇａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→３Ｇａｌは、らせん構造を形成する（Atkins et al., Polymer 15:263-271, 1974; Rees DA, MTP Intl Review of Science 5:1-42, 1975; Niemann et al., Biochem Biophys Res Commun 81:1286-1293, 1978）。二重または三重のらせん構造が、水素結合を通して形成される可能性は高い(Rees DA, MTP Intl Review of Science 5:1-42, 1975; Frey-Wyssling A.,Submicroscopic  morphology of protoplasm, Elsevier Publ. Co., Amsterdam, 1953)。スキームＡは、一個のＦｕｃを異なった内部ＧｌｃＮＡｃ残基に有する二つのミエロローリン分子が取りうる二重らせん会合である（位置は、１および２で示した；Ｆｕｃ残基は、「Ｆｕｃ１」および「Ｆｕｃ２」で示した）（第７図、パネルＡ）。スキームＢ：それぞれ二個のＦｕｃ残基を有する、二個の同一ミエロローリン分子が取りうる二重らせん会合；位置１および２に一つづつ；残基は、上記のように、「Ｆｕｃ１」および「Ｆｕｃ２」で示した（第７図、パネルＢ）。スキームＣは、末端から二番目のＧｌｃＮＡｃにＦｕｃ「Ｘ」を有するＳＬｅX の配置である（第７図、パネルＣ）。
【０１１９】
動的流動条件下でのＥ−セレクチン発現性細胞のローリング／接着は、恐らく、ＳＡおよびＦｕｃの立体的配置および相互関係によって、すなわち；らせんポリラクトサミン骨格に沿った、これらの角度差および配向性によって支配される。
【０１２０】
らせん骨格の軸に沿って見た、ＳＡおよびＦｕｃ間のあり得る配置および相互関係は、第７図のパネルＤに示した（ＩはスキームＡと；ＩＩはスキームＢと；ＩＩＩはスキームＣと対応する）。異なったＦｕｃ位置を有する二個のミエロローリン分子間に形成されている（Ｆｕｃ１［黒］およびＦｕｃ２［白］）配置Ｉは、Ｆｒ．１０−１および１０−２の混合物によって例証されたように、ローリングおよび接着能力を大いに高めるであろう。恐らく、Ｆｕｃ１およびＦｕｃ２は、図示されたように、らせんポリラクトサミン骨格に沿って対称の位置にある。
【０１２１】
スキームＢの様に会合し、かつ軸に沿って見たときＩＩの様にみえる、ミエロローリン分子間のローリングおよび接着能力は、スキームＡのように会合した二個の分子の場合と殆ど同じである。恐らく、二個の分子上の、Ｆｕｃ１およびＦｕｃ２は、ＩＩに示したとおり、対称の位置にある。
【０１２２】
ＳＬｅX は、非常に異なった配置を有し（スキームＣ；図ＩＩＩ）、ローリングを惹起できないのであろう。
【０１２３】
本発明の好ましい実施態様については、図解し、かつ詳述したが、本発明の意図するところおよび範囲から離脱せず、種々の変更が可能であることが理解されるだろう。
【０１２４】
種々の出版物を、本明細書で引用しており、その開示事項は、そっくりそのまま参考文献として組み入れられる。
【図面の簡単な説明】
【図１】静的条件下における、Ｅ−セレクチン発現性ＣＨＯ細胞の、種々の量のポリ−ＬａｃＮＡｃガングリオシドでコートした９６−ウエル・プレートのウエルへの接着。各点は、３重実験の平均実験値マイナス対照値を表す。記号「●」は、ＳＬｅｘ−Ｌｅｘを表す。他の記号は、Ｆｒ．９、１０−１、１０−２、１２−２を表す。
（図１を、発明の詳細な説明の項では、第１Ａ図と表記した。）
【図２】静的条件下における、Ｅ−セレクチン発現性ＣＨＯ細胞の、種々のポリ−ＬａｃＮＡｃガングリオシドでコートしたポリスチレン・ビーズ（直径１μｍ）への接着。各点は、１実験の結果を表す。水平線は、算術平均を示す。
（図２を、発明の詳細な説明の項では、第１Ｂ図と表記した。）
【図３】動的流動条件下における、Ｅ−セレクチン発現性ＣＨＯ細胞の、種々のガングリオシド（ＧＳＬ）でコートしたポリスチレン・ビーズへのローリングおよび接着。
ガングリオシドは、材料と方法の章に記載した、ガラス顕微鏡スライドに固定したビーズに定量的に吸着させた。ガラス・プレートに固定したポリスチレン・ビーズは、動的流動に耐性がある。スライドは、２％ＢＳＡを含むＰＢＳ中、室温で１時間培養することによってブロックして、平行板層流チャンバー中に組み立てた。Ｅ−セレクチン発現性ＣＨＯ細胞は、新規に採取し、ＲＰＭＩ培地（１×１０５細胞／ｍＬ）に懸濁した。細胞懸濁物は、層流チャンバーと連結した注入ポンプ中におき、種々の層流速度で該装置に注入した。細胞の動きは、位相差顕微鏡で観察し、ビデオカセットレコーダーに記録した。４または５の異なるせん断応力（ｄｙｎｅ／ｃｍ２  ；横軸参照）で、少なくとも１０の顕微鏡視野で見られた、ローリング細胞の数（〇）並びにローリングおよび接着細胞の合計数（●）をプロットした。各図で、円の数は４を超えても単に４で表した。（以上、図４〜７についても、同じ）
ＳＬｅｘ−Ｌｅｘでコートした４μｍビーズ上での細胞のローリング・接着。（図３を、発明の詳細な説明の項では、第２Ａ図と表記した。）
【図４】Ｆｒ．１２−２でコートした４μｍビーズ上での細胞のローリング・接着。
（図４を、発明の詳細な説明の項では、第２Ｂ図と表記した。）
【図５】Ｆｒ．１３−１でコートした４μｍビーズ上での細胞のローリング・接着。
（図５を、発明の詳細な説明の項では、第２Ｃ図と表記した。）
【図６】Ｆｒ．１３−１でコートした１μｍビーズ上での細胞のローリング・接着。
（図６を、発明の詳細な説明の項では、第２Ｄ図と表記した。）
【図７】Ｆｒ．１４でコートした１μｍビーズ上での細胞のローリング・接着。
（図７を、発明の詳細な説明の項では、第２Ｅ図と表記した。）
【図８】静的条件下における、Ｅ−セレクチンでコートしたビーズの、種々のガングリオシドでコートしたビーズへの接着。白い柱は、Ｅ−セレクチンでコートしたビーズ；薄い影付の柱は、５ｍＭのＥＤＴＡ存在下Ｅ−セレクチンでコートしたビーズ；濃い影付の柱は、Ｐ−セレクチンでコートしたビーズ；黒い柱は、ヒトＩｇＧでコートしたビーズ。
（図８を、発明の詳細な説明の項では、第３Ａ図と表記した。）
【図９】種々のミエロローリン・フラクションでコートしたビーズと結合するＥ−セレクチンでコートしたビーズに対する、抗−Ｅ−セレクチン抗体の抑制効果。白い柱は、対照マウスＩｇＧでプレインキュベートした、Ｅ−セレクチンでコートしたビーズ；黒い柱は、ｍＡｂ  Ｅ１Ｃでプレインキュベートした、Ｅ−セレクチンでコートしたビーズ。
（図９を、発明の詳細な説明の項では、第３Ｂ図と表記した。）
【図１０】動的流動条件下における、非常に少量のＳＬｅｘ−Ｌｅｘまたはフラクション１０−１およびフラクション１０−２でコートしたビーズ上での、Ｅ−セレクチン発現性ＣＨＯ細胞のローリングおよび接着。（以上、図１１〜１２についても、同じ）
プロット１。  ７．７、３．１および１．５ｄｙｎｅｓ／ｃｍ２のせん断応力における、０．０５ｎｇのＳＬｅｘ−Ｌｅｘでコートしたビーズ上での、Ｅ−セレクチン発現性ＣＨＯ細胞のローリングおよび接着の合計（●）並びにローリング（○）。  プロット２。  プロット１と同一条件下での反復実験。
（図１０を、発明の詳細な説明の項では、第４Ａ図と表記した。）
【図１１】プロット１。  各０．０５ｎｇのＦｒ．１０−１および１０−２の混合物（注：これで、分子数は０．０５ｎｇのＳＬｅｘ−Ｌｅｘと同じになる。ＳＬｅｘ−Ｌｅｘの分子量が、Ｆｒ．１０−１および１０−２の２倍だから。）でコートしたビーズ上での、Ｅ−セレクチン発現性ＣＨＯ細胞のローリングおよび接着の合計（●）並びにローリング（○）。図１０と同一のせん断応力。  プロット２。
プロット１と同一条件下での反復実験。
（図１１を、発明の詳細な説明の項では、第４Ｂ図と表記した。）
【図１２】動的流動条件下における、Ｅ−セレクチン発現性ＣＨＯ細胞のローリング。異なるせん断応力の動的流動系における、種々のガングリオシド（各１００ｎｇ）でコートしたビーズ（直径４μｍ）上でのローリング細胞数の平均値。縦軸：ローリング細胞の数（注：接着細胞数を含む）。横軸：  壁面せん断応力（ｄｙｎｅｓ／ｃｍ２）。各せん断応力のグループにおいて、柱は、ビーズをコートするのに使用した材料と関係し、左から右に、ＳＬｅｘ−Ｌｅｘ；Ｆｒ．１０（Ｆｒ．１０−１と１０−２の混合物）；Ｆｒ．１３−１；およびＦｒ．１４。
（図１２を、発明の詳細な説明の項では、第４Ｃ図と表記した。）
【図１３】動的流動条件下における、Ｆｒ．１０−１、Ｆｒ．１０−２並びに１０−１および１０−２の混合物でコートしたビーズ上での、Ｅ−セレクチン発現性ＣＨＯ細胞のローリングおよび接着。（以上、図１４についても、同じ）
（プロット１）１００ｎｇのＦｒ．１０−１；（プロット２）１００ｎｇのＦｒ．１０−２；（プロット３）各５０ｎｇのＦｒ．１０−１および１０−２の混合物でコートしたビーズ上での、Ｅ−セレクチン発現性ＣＨＯ細胞のローリングおよび接着の合計（●）並びにローリング（○）。
ガングリオシドは、１μｍのビーズに吸着した。２．４および４．８ｄｙｎｅｓ／ｃｍ２のせん断応力に対する値を図示した。種々のデータ群間の差異に統計学的有意性があるかどうかは、対応のないスチューデントのｔ−検定によって評価し、Ｐ値は、挿入表に要約した。
（図１３を、発明の詳細な説明の項では、第５Ａ図と表記した。）
【図１４】（プロット１）０．１ｎｇのＦｒ．１０−１；（プロット２）０．１ｎｇのＦｒ．１０−２；（プロット３）各０．０５ｎｇのＦｒ．１０−１および１０−２の混合物でコートしたビーズ上での、Ｅ−セレクチン発現性ＣＨＯ細胞のローリングおよび接着の合計（●）並びにローリング（○）。
ガングリオシドは、１μｍのビーズに吸着した。３つの異なるせん断応力値を図示した。ローリング／接着は、このように低いガングリオシド濃度でも惹起された。ローリングおよび接着細胞の数は、ガングリオシド混合物（プロット３）で最大となった。Ｐ値は、図１３と同様、挿入表に要約した。
（図１４を、発明の詳細な説明の項では、第５Ｂ図と表記した。）
【図１５】動的流動条件下における、種々のガングリオシドでコートしたビーズに対する、Ｅ−セレクチン発現性ＣＨＯ細胞の接着およびローリング後接着。
（図１５を、発明の詳細な説明の項では、第６Ａ図と表記した。）
【図１６】動的流動条件下における、種々のガングリオシドでコートしたビーズに対する、Ｅ−セレクチン発現性ＣＨＯ細胞の接着およびローリング後接着。
（図１６を、発明の詳細な説明の項では、第６Ｂ図と表記した。）
【図１７】シアロシル残基（ＳＡ）およびポリラクトサミン鎖上異なる位置の内部ＧｌｃＮＡｃにつくフコシル残基（Ｆｕｃ１およびＦｕｃ２）の、可能性のある立体的配置。
パネルＡ：  異なる位置にＦｕｃ１またはＦｕｃ２を有するモノフコシルガングリオシド（例えば、Ｓｔｒ．４および５またはＳｔｒ．９および１０）の２重螺旋構造の、可能性のある配置。この構造を、ＳＡの存在する末端側から見ると、ＳＡおよびＦｕｃ１、Ｆｕｃ２の立体的配置は、パネルＤのＩのように見えるだろう。
パネルＢ：  位置は異なるが同じポリラクトサミン鎖にＦｕｃ１およびＦｕｃ２を有するジフコシルガングリオシド（例えば、Ｓｔｒ．７，Ｓｔｒ．１１）の２重螺旋構造の、可能性のある配置。この構造を、ＳＡの存在する末端側から見ると、ＳＡ並びにＦｕｃ１および２の立体的配置は、パネルＤのＩＩのように見えるだろう。
パネルＣ：  Ｆｕｃが末端から２番目のＧｌｃＮＡｃにある（Ｆｕｃ  ｘ）、ＳＬｅｘ構造。ＳＡとＦｕｃ  ｘの間の位置関係は、パネルＤのＩＩＩのように見える。
パネルＤ：  パネルＡ〜Ｃに図示したガングリオシドを末端側から見た図。
（図１７を、発明の詳細な説明の項では、第７図と表記した。）
【図１】
0003795588.tif 000029
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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