(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２の塩基配列で示されるレバンフルクトトランスフェラーゼ（ＬＦＴａｓｅ）遺伝子のＤＮＡを含有するプラスミドで形質転換してなる形質転換体エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）−ｐＥＴ／ＬＦＴｓａ（ＦＥＲＭ  Ｐ−１７８９６）。
【請求項２】
請求項１に記載の形質転換体を使用すること、を特徴とする下記の理化学的性質を有する新規ＬＦＴａｓｅの製造方法。
（１）作用
β−２，６フラクトシド結合を有する、ポリフラクタンのレバンを分解し、ジフルクトース・ジアンヒドリドIV（ＤＦＡ  IV）を合成する作用を有する。
（２）基質特異性
レバン及び鎖長が３から７のレバンオリゴ糖に作用する。
（３）至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲
至適ｐＨ：６．０
安定ｐＨ範囲：４．０〜１２．０
（４）至適温度及び安定温度範囲
至適温度：５０℃
安定温度範囲：本酵素は４０℃まで安定であった。
（５）分子量
分子量：約５０，０００Ｄａ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ゲル濃度７．５％）
（６）酵素の誘導性
本酵素の誘導発現にはレバンを要しない。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、レバンフルクトトランスフェラーゼ（以下、ＬＦＴａｓｅということもある）に関するものであり、更に詳細には、酵素活性がきわめて高く、しかもその生成にレバンの存在を必要としない従来未知にして新規な遺伝子組換え型ＬＦＴａｓｅに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ＬＦＴａｓｅはβ−２，６ポリフラクタンを還元末端から二糖単位で切断する作用を有し、β−２，６結合型のポリフラクタン（すなわち、フラクトフラノースのβ−２，６結合による連鎖からなる多糖類）であるレバンに作用させることにより、ジフルクトース・ジアンヒドリドＩＶ（以下、ＤＦＡ  ＩＶということもある））を生成する酵素である。
【０００３】
ＤＦＡ  ＩＶは、難消化性の二糖類であって、低カロリーで且つフルクトース系の冷涼感のある甘味を有し、またカルシウム吸収促進作用も有する等、甘味料のほか機能性食品としても有用であることが確認されているが、更に新たな有用な用途の開発も期待され、その量産で希求されている。そのために、高純度のＬＦＴａｓｅを大量に工業生産する方法の確立が望まれており、また、ＬＦＴａｓｅ自体も、試薬あるいは生化学用薬品等としての需要が高まっており、やはりその工業生産が強く望まれている。
【０００４】
ＬＦＴａｓｅは、アルスロバクター・ニコチノボランスＧＳ−９株（Arthrobacter nicotinovorans GS-9（以下、ＧＳ−９菌ということもある））を培養中、培地中のレバンにより誘導発現される誘導酵素である。しかしながら、この酵素の発現量は微量であって、工業的応用は困難であるし、更に、ＬＦＴａｓｅ酵素溶液の生産にはレバンを必須とするため、工程が複雑となり、工業生産上大きな障害となっているだけでなく、現時点においては、レバン自体の工業的大量生産が確立されておらず、この方法によるＬＦＴａｓｅ生産性の低下は否めない。
【０００５】
また、上記したような天然型ＬＦＴａｓｅの製法のほかに、遺伝子組換え型ＬＦＴａｓｅの製造についても検討された。すなわち、ＧＳ−９由来のＬＦＴａｓｅ遺伝子がＳａｉｔｏら（Saito et al. : Biosci. Biotech. Biochem., 1997, 61(12), 2076-2079）によってクローン化されており、その１次配列が解明されるとともに、ｐＵＣプラスミドベクター系を利用し、大腸菌を宿主とした発現系が構築されている。しかしながら、その発現量は充分に満足できるものとはいえず、未だ改良の余地が残されている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記した技術の現状に鑑み、上記した欠点のない新しいタイプのＬＦＴａｓｅを新たに開発する目的でなされたものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明は、上記目的を達成するためになされたものであって、各方面から検討の結果、遺伝子工学的手法に着目し、更に発現効率を高めるためにシステムの設計を行うこととした。
【０００８】
すなわち本発明者らは、Ｓａｉｔｏらが構築するのに成功したＬＦＴａｓｅ遺伝子の発現系を大幅に改良して発現効率を高めるため、そしてそれと同時に従来未知の新規にして活性の高い酵素を新規に開発するため、ＬＦＴａｓｅ遺伝子のオープンリーディングフレーム（以下、ＯＲＦということもある）のみの新規作成を試み、各種設計の結果、遂にＯＲＦの塩基配列の決定に成功した。そして、ＰＣＲ法によってそのＯＲＦの作成を行うこととし、それを実施するため、検討の結果、センスプライマー及びアンチセンスプライマーの塩基配列の決定及びそれらの人工合成を試みそれらにも成功した。そしてＧＳ−９の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行うことにより、ＯＲＦのみの調製に成功した。
【０００９】
これを、ｐＥＴ系プラスミドベクター、例えばｐＥＴ−３ａプラスミドベクターのマルチクローシングサイトに連結して、新たな発現プラスミドｐＥＴ／ＬＦＴｓａを構築した。ＯＲＦの切り出しは、ＬＦＴａｓｅ遺伝子の開始および終止コドン部に、部位特異的変換法で制限酵素ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ部位を作製することで行い、特にＯＲＦのフレームを合わせた。このプラスミドベクターには大腸菌中で外来遺伝子として連結された遺伝子を効率的に転写、翻訳できる、Ｔ７Ｌａｃプロモーターが導入されており、Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（ＩＰＴＧということもある）により高発現が可能となり、簡易的な操作で部分精製が行えるように工夫した。
【００１０】
このプラスミドベクターを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に形質転換した形質転換体をＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）−ｐＥＴ／ＬＦＴｓａと命名し、工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ  Ｐ−１７８９６として寄託した。このようにして創製した形質転換体は、非常に高いＬＦＴａｓｅ活性を取得しており、本発明によれば、元株（ＧＳ−９菌）の５〜５０倍、Ｓａｉｔｏらが構築するのに成功した、ＤＮＡ分子ｐＢＢ−１を導入した大腸菌ＪＭ１０９株（大腸菌ＪＭ１０９／ｐＬＦＴ−ＢＢＩ：特開平１１−６９９７８、ＦＥＲＭ  Ｐ−１６３１６）の２〜２０倍もの高活性を取得できるようになり、更にスクリーニングすれば、これら以上の数十倍の活性を取得することも可能である。また、本発明によれば、酵素製造に従来必要であったレバンが不必要になるという著効が得られることも確認された。
【００１１】
このようにして創製した形質転換体を培養することにより、ＬＦＴａｓｅの大量発現が可能となった。なお、本形質転換体は、ＬＦＴａｓｅを菌体内に生産したため、培養終了後、菌体を破砕し、上清を無細胞抽出液とし、この無細胞抽出液から酵素精製の常法にしたがい、透析、クロマト処理、濃縮、限外濾過処理等を適宜組み合わせて行い、精製酵素を得る。
【００１２】
本発明に係るＬＦＴａｓｅは、遺伝子設計によりきわめて綿密な計算の結果、人工的に創製されたものであって、下記する理化学的性質を有する新規酵素であり、しかもその酵素生産量はきわめて高く、その生成にレバンの存在を必須とする誘導酵素ではない等すぐれた効果も有するものである。このようにして調製したＬＦＴａｓｅは、これをレバンに作用させることにより、ＤＦＡ  ＩＶを効率的に製造することができる。その際ＬＦＴａｓｅは、単離精製したもののほか、部分精製したもの、あるいは上記した無細胞抽出液（又はその濃縮液）を使用することもできる。
【００１３】
（１）作用
本酵素は、β−２，６フラクトシド結合を有するポリフラクタンのレバンを分解し、ＤＦＡ  ＩＶを合成する作用を有する。
【００１４】
（２）力価の測定法
本酵素活性は、Ｓａｉｔｏら（Saito et al. : Biosci. Biotech. Biochem., 1997, 61(12), 2076-2079）の方法に準じて行った。
０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）中で、終濃度が１０ｇ／Ｌとなる様にレバンを溶解させた基質溶液に、酵素溶液を混合して、３７℃で１０分間反応した。その後、反応溶液を沸騰水中で５分間保持することで反応停止とした。生成したＤＦＡ  ＩＶをＨＰＬＣにより定量し、活性値を算出した。
ここで、酵素１単位は、本酵素反応条件下で、１分間当たりに１μｍｏｌの反応生成物を生じる酵素量とした。
【００１５】
（３）基質特異性
本酵素の触媒可能な糖質関連物質を調査した。その結果、本酵素は、レバンと、鎖長が３から７のレバンオリゴ糖に作用することが判明した。その他の各種糖質には作用しなかった。
【００１６】
（４）至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲
本酵素のｐＨに対する影響を調査した。安定性の検討は、酵素溶液を各ｐＨの緩衝液中で２４時間、４℃で保持した後、溶液をｐＨ６．０の緩衝液で置換し、定法に従い酵素活性を測定した。その結果、本酵素の至適ｐＨは６．０であり、ｐＨ４．０から１２．０の幅広い範囲で安定であった。
【００１７】
（５）至適温度及び安定温度範囲
本酵素の温度に対する影響を調査した。安定性の検討は、酵素溶液を各温度で２０分間保持した後、素早く４℃に冷却し、定法に従い酵素活性を測定した。その結果、至適温度は５０℃であり、４０℃まで安定であった。
【００１８】
（６）ｐＨ、温度等による失活の条件
（４）及び（５）の記載のｐＨ及び温度の条件、特に安定性において、相対活性が低下している範囲以上が失活の条件であると考察される。また、酵素溶液を沸騰水中に５分間保持した後の酵素活性消失は確認している。
【００１９】
（７）阻害、活性化及び安定化
Ｈｇ2+イオン、およびＡｇ2+イオン存在下で、著しく活性が阻害された。
【００２０】
（８）精製方法
形質転換大腸菌の無細胞抽出液を調製した後、ＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ６５０Ｍ（東ソ社製）陰イオン交換樹脂などで、効率的に部分精製できる。
【００２１】
（９）分子量及び分子量の測定方法
ＬＦＴａｓｅタンパク質の分子量測定は、タンパク質の精製純度検定と同時に、Ｌａｅｍｍｌｉ（Laemmli : Nature(London), 1970, 227, 680-685）の方法に従いＳＤＳ−ＰＡＧＥにより行った。ゲルの濃度は７．５％とした。タンパク質の染色はＣｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｂｌｕｅを用いた。その結果、分子量は、およそ５０，０００Ｄａと測定された。この値は、遺伝子のＤＮＡ塩基配列から推定されるアミノ酸配列から算出される分子量５３，１５３Ｄａと類似しており、信頼性がある。
【００２２】
（１０）反応生産物の同定
本酵素により生産されたオリゴ糖を精製後、Ｃ13−ＮＭＲにより、スペクトル分析をした。その結果、反応生成物は、ＤＦＡ  ＩＶと同定された。
【００２３】
（１１）酵素の誘導性
本酵素の誘導発現にはレバンを要しない。
【００２４】
本発明に係る新規酵素は、上記した理化学的性質を有する酵素であればすべてのものが包含され、例えば配列番号１のアミノ酸配列（図１）で示されるタンパク質もその１例として例示される。その製造方法にしても、その遺伝子（その塩基配列を配列番号２、図２に示す）を含有した新規形質転換体（ＦＥＲＭ  Ｐ−１７８９６）を培養することにより本発明に係る新規酵素を得ることができるし、その新規アミノ酸配列の１例が明らかにされたので（配列番号１）、合成によっても本酵素を得ることができる。
以下、本発明の実施例について述べる。
【００２５】
【実施例１】
（１）Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｎｉｃｏｔｉｎｏｖｏｒａｎｓ  ＧＳ−９株のレバンフルクトトランスフェラーゼ（ＬＦＴａｓｅ）遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）のみの調製
本明細書において多用する遺伝子組み換え操作実験の基礎技術は、斯界において公知のものであり、特に断らない限りＳａｍｂｒｏｏｋらの方法（Sambrook et al. : モレキュラー・クローニング・ア・ラポラトリー・マニュアル、第２版、1989年）に従って行った。
【００２６】
ＬＦＴａｓｅ遺伝子の発現と活性に必要な部分のみを調製する目的で、遺伝子組み換えを行った。ここで指す「必要な部分のみ」とは、「成熟ＬＦＴａｓｅに相当する遺伝子のみ」という意味である。Ｓａｉｔｏら（Saito et al. : Biosci. Biotech. Biochem., 1997, 61, 2076-2079）が解明した遺伝子情報を基に設計した。
ＬＦＴａｓｅ遺伝子を含む遺伝子ＤＮＡの塩基配列を配列番号４（図４）に示し（塩基配列９１番目から塩基配列１６４４番目までがＬＦＴａｓｅ遺伝子のＯＲＦ）、それから推定されるＬＦＴａｓｅのアミノ酸配列を配列番号３（図３）に示した。
【００２７】
まず設計は、配列表の配列番号４において、塩基配列１番目から９０番目までと、ＬＦＴａｓｅの構造遺伝子の一部である塩基配列９１番目から１８９番目までを除去する。塩基配列９１番目から１８９番目までは、ＬＦＴａｓｅの最初のシグナルペプチド配列に相当するカ所（アミノ酸配列１番目から３３番目）で、除去されても成熟部が機能し、酵素活性には全く問題がない。そしてさらに、新たに開始コドンを付加する。また、開始コドンの直前、および終始コドンの直後で、遺伝子が任意に切断できる様に、塩基配列を強制的に置換して、適当な制限酵素部位を設定する。
【００２８】
実際には、塩基配列１８７番目から１８９番目に開始コドン配列（ａｔｇ）を付加し、直前を切断できる様に、制限酵素ＮｄｅＩ（ｃａｔａｔｇ）部位を、そして終始コドン部にＢａｍＨＩ（ｇｇａｔｃｃ）部位を設計した。置換予定の塩基配列を含む２０塩基ほどのプライマーを作製し、ＧＳ−９菌の染色体ＤＮＡを鋳型にＰＣＲ反応を行った。Ｔａｑポリメラーゼは宝酒造製を用いた。ＰＣＲ反応後、産物を回収・精製し、制限酵素ＮｄｅＩとＢａｍＨＩで処理後、適当なプラスミドベクターに連結し、塩基配列の置換具合をＤＮＡシーケンスにより確認した。なお、ＬＦＴａｓｅの構造遺伝子中には、制限酵素ＮｄｅＩとＢａｍＨＩ部位は存在しないので、途中で切断されない。
【００２９】
まとめると、置換された塩基は、次のようになった。
配列番号１８６番をｃからＴへ、
配列番号１８７番をｇからＡへ、
配列番号１８８番をｃからＴへ、
配列番号１８９番をｃからＧへ、
【００３０】
配列番号１６４６番をｃからＧへ、
配列番号１６４７番をｃからＡへ、
配列番号１６４９番をｇからＣへ、変換した。
配列番号２（図２）に示すように、本発明で使用する重要な個所を切り出したものであって、制限酵素ＮｄｅＩ（ｃａｔａｔｇ）とＢａｍＨＩ（ｇｇａｔｃｃ）部位を強制的に作り出した。あとの配列（ハイフン部）は、使用しない。
【００３１】
上記した設計の実施は、ＰＣＲ法で行った。ＬＦＴａｓｅのＯＲＦのみを調製するために、Ｓａｉｔｏら（Saito et al. : Biosci. Biotech. Biochem., 1997, 61(12), 2076-2079）の解析したＤＮＡ塩基配列を参考にして、下記のＤＮＡ塩基配列を有する、２７塩基の２種類の合成オリゴヌクレオチドプライマーを作製した。これらのプライマーは、ＤＮＡ合成装置（アプライド・バイオシステムズ社製）を用いて人工的に合成した。
【００３２】
増幅されたＰＣＲ産物（ＬＦＴａｓｅのＯＲＦのみを指す）の両端が、制限酵素処理で切断でき、プラスミドベクターに連結可能とするために、強制的に塩基配列を置換し、制限酵素部位を作製した。制限酵素部位も開始コドン側と終止コドン側が識別できる様に、ＮｄｅＩとＢａｍＨＩの２種類を設定した。センスプライマー、アンチセンスプライマーを配列番号５、６（図５、６）に示し、図中、置換された塩基は下線表示した。
【００３３】
これとは別にＳａｉｔｏらの手法により調製したＧＳ−９菌の染色体ＤＮＡと、上記２種類のプライマー、およびＰＣＲ反応用試薬とを混合し、ＰＣＲ反応を行った。ＴａｑＤＮＡポリメラーゼは宝酒造製の標準品を用いた。ＰＣＲ反応条件は、総液量が１００マイクロリットル、サイクル数が３５回、１サイクルが９８℃の１分間、６８℃の３分間とした。
増幅されたＬＦＴａｓｅのＯＲＦ断片、約１，５００塩基対のＤＮＡ塩基配列、特に置換された部位のＤＮＡ塩基配列の確認は、シーケンスレベルで行った。得られたＤＮＡ塩基配列を配列番号２（図２）に示す。
【００３４】
（２）ＬＦＴａｓｅのＯＲＦとプラスミドベクターの連結
（１）のＰＣＲ反応液（ＬＦＴａｓｅのＯＲＦ断片を含む）をエタノール沈殿法で回収・精製後、制限酵素ＮｄｅＩとＢａｍＨＩで２重消化した。これを更にエタノール沈殿法で回収・精製した。
これとは別にｐＥＴ−３ａプラスミドベクター（宝酒造製）を制限酵素ＮｄｅＩとＢａｍＨＩで２重消化し、エタノール沈殿法で回収・精製したものを調製し、先に精製されたＰＣＲ産物とライゲーション反応により連結した。ここで作製されたプラスミドベクターを、ｐＥＴ／ＬＦＴｓａと命名した（図７）。なお、従来のｐＬＦＴ−ＢＢ１の構築も示した。
【００３５】
（３）プラスミドベクターｐＥＴ／ＬＦＴｓａの形質転換
（２）で作製した、プラスミドベクターｐＥＴ／ＬＦＴｓａはＨａｎａｈａｎ（D. Hanahan : Techniques for transformation of E. coli, in DNA Cloning : A Practical Approach, Vol.1, ed. by D. M. Glover, IRL Press, Oxford, 1985, 109-135)の手法に従い、ヒートショック法で、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株のコンピテント細胞（宝酒造製）に形質転換した。選択培地で培養し、単一化された遺伝子組換え大腸菌をEscherichia coli BL21(DE3)-pET/LFTsaと命名し、これを工業技術院生命工学工業技術研究所に、ＦＥＲＭ  Ｐ−１７８９６として寄託した。
【００３６】
（４）Escherichia coli BL21(DE3)-pET/LFTsaによるＬＦＴａｓｅの生産
Escherichia coli BL21(DE3)-pET/LFTsa（FERM P-17896）を、１００マイクログラム／ｍｌのアンピシリンを含む５ｍｌのＬＢ培地で、対数増殖中期まで培養した（３７℃）。この菌液０．２ｍｌを、終濃度で１ｍＭとなる様にIsopropyl-β-D-thiogalactopyranoside(IPTG)を含む１００ｍｌの同培地に接種し、３７℃で２４時間振とう培養した。培養後、大腸菌菌体を遠心分離し培養上清とに分けた。菌体は１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で２回洗浄後、同緩衝液に再懸濁し、超音波破砕機で破砕した。破砕液を遠心分離し、この上清を無細胞抽出液とした。この溶液が、ＬＦＴａｓｅ溶液である。
【００３７】
このようにして調製した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）−ＰＥＴ／ＬＦＴｓａの無細胞抽出液のＬＦＴａｓｅ活性を定法にしたがい測定したところ、１０５．１単位／培養液（ｍｌ）であった。本発明によれば、元株（ＧＳ−９菌）の約３０倍、Ｓａｉｔｏらの系の約５倍と非常に高い生産性が得られた。なお、遺伝子組換え体は菌体内に酵素を生産したため（ＧＳ−９菌は菌体外に分泌発現）、酵素単位は培養液１ｍｌ当りの数値に換算して比較した（表１）。
【００３８】
0003734689.tif 000002
【００３９】
この無細胞抽出液から発現ＬＦＴａｓｅの部分精製を行った。この無細胞抽出液を１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）に対し一晩透析した。そして担体として緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ  Ｂｉｏ−Ｇｅｌ  Ａ（バイオ−ラッド製）を用いた陰イオン交換カラムクロマトグラフィーに供した。
吸着したタンパク質の溶出は緩衝液中に含まれる塩化ナトリウム濃度を０−０．４Ｍまで直線的に変化させて行った。定法に従い、ＬＦＴａｓｅ活性画分を測定し、活性画分を遠心限外ろ過膜で濃縮した。
この粗酵素液を１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）に対し一晩透析した。この溶液を組み換え酵素の部分精製液（１００Ｕ／ｍｌ）とした。
【００４０】
（５）ＬＦＴａｓｅを用いたＤＦＡ  ＩＶの製造
セラチアＮＮ菌（Serratia levanicum NN株 : FERM P-17895)を、Yokotaら(Biosci, Biotech. Biochem., 1993, 57, 745-749)及びKojimaら(J. Ferment. Bioeng., 1993, 75, 9-12)の方法にしたがい、前培養した後、本培養した。なお、本培養においては、２００Ｌの発酵タンクを使用し、蔗糖は４０ｋｇ使用し、温度３０℃、攪拌８０ｒｐｍ、通気１ｖｖｍで培養し、温度、ｐＨ、粘度を経時的に測定した。
【００４１】
培養１０時間後を目安とし、培養液粘度が最も増加して、ｐＨが４．０付近まで低下した時に培養を中止し、ｐＨを５．５に調整し、温度を４℃に冷却した。この条件は１週間以上保持される様に制御した。粘度は４０であった。
【００４２】
このようにして得たレバン含有液２００Ｌに、（４）で得たＬＦＴａｓｅ液（１００Ｕ／ｍｌ）１０ｍｌを添加して、４０℃で２４時間インキュベートした。
【００４３】
得られた酵素反応液（ＤＦＡ  ＩＶ  ３２０ｇを含有）１０Ｌにパン酵母（ニッテンイースト、商品名）３００ｇ（水分６６％）を添加し、３０℃で２４時間通気培養した。その培養液を濾過した後、濃縮してＢｘ５０に調整した。内径１２ｃｍ高さ７９ｃｍの樹脂製カラムにＮａ型とした強酸性陽イオン交換樹脂Amberlite CR-1310(商品名）７．６Ｌを充填し、これに前記濃縮液を０．０２から０．１０Ｌ／Ｌ−Ｒ／１サイクル、空間速度０．１３〜０．５３、温度８０℃の条件で通液し、温水で押し出した。ＤＦＡ  ＩＶ純度の高い画分を採取し、ＤＦＡＩＶ画分とした。この操作を１０回実施して得られたＤＦＡ  ＩＶ画分を混合し、混合液６．６ｋｇに活性炭を加えて脱色した。珪藻土濾過によって活性炭を除去し、濾液を７０℃で減圧濃縮した。その後、冷却結晶化（７０→２５℃）を行い、その結晶化物を遠心分離機で分離し、純度９９．９％のＤＦＡ  ＩＶ結晶１２０ｇを得た。
【００４４】
【発明の効果】
本発明に係るＬＦＴａｓｅは（同酵素遺伝子も同様）、従来未知の新規物質である。本酵素はβ−２，６ポリフラクタンを還元末端から二糖単位で切断する作用を有する。本酵素は非常に活性が高く、これをレバンに作用させることにより、各種機能性を有するＤＦＡ  ＩＶを効率的に製造することができる。しかも本酵素は、遺伝子組換え型であり、活性が高いだけでなく、工業的に大量生産できるという特徴も有する。
【００４５】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に係るＬＦＴａｓｅのアミノ酸配列を示す。
【図２】本発明に係るＬＦＴａｓｅ遺伝子ＤＮＡの塩基配列を示す。
【図３】ＧＳ−９由来のＬＦＴａｓｅのアミノ酸配列を示す。
【図４】ＧＳ−９由来のＬＦＴａｓｅ遺伝子ＤＮＡの塩基配列を示す。
【図５】センスプライマーの塩基配列を示す。
【図６】アンチセンスプライマーの塩基配列を示す。
【図７】ＬＦＴａｓｅの大量発現系の構築図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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