(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
コリネバクテリウム・ジェイケイウムの菌株から単離され、約８６Ｋｄの見かけの分子量を有する精製されたコリネバクテリアストレス蛋白質において、このストレス蛋白質は、次の特徴：
（１）回復時のコリネバクテリウム・ジェイケイウム敗血症を有する患者に、このストレス蛋白質の５２Ｋｄ分解生成物に対する抗体を誘起する；
（２）コリネバクテリウム・ジェイケイウム心内膜炎を有する患者に、このストレス蛋白質の５２Ｋｄ分解生成物に対する抗体を誘起する；
（３）ペプチド抗原ＫＶＩＲＫＮＩＶＫＫＭＩＥに対するウサギ抗血清と交叉反応性である；及び
（４）このストレス蛋白質と前記ウサギ抗血清との交叉反応は、ペプチド抗原ＫＶＩＲＫＮＩＶＫＫＭＩＥにより中和される；
を有することを特徴とする、精製されたコリネバクテリアストレス蛋白質。
【請求項２】
請求項１に記載のストレス蛋白質の分子量５２Ｋｄを有する抗原性フラグメントであって、次の特徴：
（１）ペプチド抗原ＫＶＩＲＫＮＩＶＫＫＭＩＥに対するマウスモノクローナル抗体と交叉反応性である；及び
（２）このストレス蛋白質と前記マウスモノクローナル抗体との交叉反応は、ペプチド抗原ＫＶＩＲＫＮＩＶＫＫＭＩＥにより中和される；及び
（３）コリネバクテリウム・ジェイケイウム敗血症を有する患者からの抗体と交叉反応性であり、ここで、前記の患者からの抗体は、このストレス蛋白質の５２Ｋｄ分解生成物に対して特異的である；
を有する、分子量５２Ｋｄを有する抗原性フラグメント。
【請求項３】
免疫原として使用するための、請求項１に記載のコリネバクテリアストレス蛋白質。
【発明の詳細な説明】
発明の技術分野
本発明は、細菌ストレス蛋白質、その阻害剤及び医療におけるかつ診断のためのその使用に関する。
発明の背景
環境ストレスは、原核細胞及び真核細胞中におけるいわゆる熱ショック又はストレス蛋白質の合成の速度の増加を誘起することができる［例えばSchlesinger等のHeat Shook from Bacteria to Man, Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor, New York（１９７２）参照］。ストレス蛋白質の機能はなお最終的に解明されるべきであるが、特定の細胞及びウイルス蛋白質の組立て及び構造安定化に関するいくつかの報告がなされており、高濃度でのそれらの存在は、逆の条件に露呈する間の付加的安定化作用を有しうる。
いくつかの病原微生物は、ストレス蛋白質を生産することが明らかにされている［例えば、Young D．等のProc. Natl. Acad. Sci. USA、８５、４２６７〜４２７０（１９８８）参照］。これら蛋白質は、侵入病原体を防御する助けをするために、感染症のストレスに対応して生成されると考えられている。従って例えば、ストレス蛋白質を生成する能力は、マクロファージ内の細菌病原体の生存に関係している［Christmas、M. F．等のCell ４１、７５３−７６２（１９８５）及びMorgan R. W．等のProc. Natl. Acad. Sci. U.S. A．８３、８０５９−８０６３（１９８６）参照］。
種々のヒト病原体中のストレス蛋白質の存在は、このストレス応答が感染の一般的要素であり、このストレス蛋白質は、特にサブユニットワクチンに関するカンディダート（Candidates）であると考えられていることを示していることが暗示されている［Young, D等の前記文献参照］。
コリネフォルム・バクテリアは、健康なヒトの皮膚及び粘膜の一般的障害物質（inhabitant）である。いくつかの公知病原菌例えばコリネバクテリウム・ジフテリアエ（corynebacterium diphtheriae）型の菌は、ヒトでジフテリアを起こさせる。他の菌種コリネバクテリウム・ジエイケイウム（C. jeikeium）は、好中性色素細胞減少患者で敗血症を起こさせ［例えばHande. K. R．等のAnn. Intern. Med．８５、４２３−４２６（１９７６）参照］、C．ジエイケイウム感染症は、心内膜炎を合併している［Jackman.P.J.等のSyst.Appl.Microbiol．９、（１−２）、８３−９０（１９８７）参照］。このC.ジエイケイウム菌種は、カタラーゼ陽性、オキシダーゼ−陰性、硝酸塩を還元しない醗酵性グラム陽性の好気性ロッドの特性を有する［Riley.P.S．等のJ. Clin. Microbial．９、４１８−４２４、（１９７９）参照］。これらは、アンピシリン、セファロチン、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、ゲンタマイシン、ペニシリンＧ、ストレプトマイシン及びテトラサイクリンを包含する抗生物質に対する高い耐性を有することで他のコリネフォルム菌と異なる［Jackman, P. J.、Pelczynska, S．のJ. Gen. Microbial．１３２、（Ｐｔ７）、１９１１〜１９１５（１９８６）参照］。
C．ジエイケイウム感染症に対する慣用の治療は、全身的バンコマイシン（Vancomycin）であり、これは潜在的ネフロトキシン性である。これは、発熱性好中性色素細胞減少患者での盲検使用に対して緩和作用をするので、C.ジエイケイウム感染症のマーカーの開発は重要になっている。特に、慣用の治療に伴なっている副作用の害をさける、好中性色素細胞減少患者におけるC.ジエイケイウム感染症の治療法も必要になっている。
発明の概要
ところで、ヒトにおけるC.ジエイケイウム敗血症からの回復は、見かけ上の分子量５２Kdの蛋白質に対するＩｇＭ及びＩｇＧクラスの抗体の生成を伴なっていることが判明した。公知の真菌ストレス蛋白質に対して生じた抗体を用いる他の試験は、この５２Kd蛋白質は、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）の９０Kd熱ショック蛋白質に類似している８６Kd抗原の分解生成物であることが判明した。我々はこの発見を、コリネバクテリウム感染症及び関連グラム陽性菌により惹起される疾病の改良された診断及び治療のための手段を開発するために利用した。
従って、本発明の１態様によれば、約８６Kdの見かけの分子量を有する細菌ストレス蛋白質又はそのフラグメント又はその類縁体が提供される。
ここで使用されている「見かけの分子量」とは、アマーシャム・インターナショナル（Amersham International）から供給された分子量マーカー（Prestrained Rainbow Markers, code RPN．７５６）を用いて、１０％ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定された見かけの分子量を意味している。
本発明によるストレス蛋白質は、細菌由来であってよく、例えばグラム陽性菌株から得ることができる。特別な菌株には、コリネバクテリウム属のもの例えばコリネバクテリウム・ジフテリアエ又は殊にコリネバクテリウム・ジエイケイウムの菌株及び関連コリネフォルム種菌が包含される。
本発明によるストレス蛋白質、そのフラグメント又は類縁体は、組換え蛋白質、フラグメント又は類縁体即ち組換えＤＮＡ技術を用いて生成された蛋白質、フラグメント又は類縁体であってよい。
本発明によるストレス蛋白質のフラグメントは、この蛋白質又はその類縁体の短かい分解生成物であってよい。特別なフラグメントには、見かけの分子量約５２ｋｄ又は５０ｋｄを有するものが包含される。
本発明によるストレス蛋白質の類縁体には、この蛋白質の総合的な機能は保持されていることを前提として、この蛋白質のアミノ酸の１個以上が他のアミノ酸で換えられているものが包含される。
本発明によるストレス蛋白質は、精製された形で得ることができ、従って、本発明のもう１つの態様によれば、見かけの分子量約８６ｋｄを有する実質的に純粋な細菌ストレス蛋白質又はそのフラグメント又は類縁体が提供される。
「実質的に純粋な」とは、本発明によるこのストレス蛋白質が、細菌由来の他の蛋白質を含有しないことを意味する。以後に記載の本発明の種々の態様において、この細菌ストレス蛋白質の記載には、この蛋白質の実質的に純粋な製剤（preparations）も包含されることを理解すべきである。
本発明によるストレス蛋白質は、更に、次の特性の１以上により特徴付けられる：
（１）これは、免疫優性保護された抗原である；
（２）回復時のC.ジエイケイウム敗血症患者は、このストレス蛋白質の５２ｋｄ分解生成物に対する抗体を有する；
（３）C.ジエイケイウム心内膜炎を有する患者は、このストレス蛋白質の５２ｋｄ分解生成物に対する抗体を有する；
（４）これは、ペプチド抗原KVIRKNIVKKMIEと、このペプチド抗原に対するマウスモノクローナル抗体を用いて、交叉反応する；
（５）このストレス蛋白質及びペプチド抗原KVIRKNIVKKMIEに対するマウスモノクローナル抗体の交叉反応は、ペプチドKVIRKNIVKKMIEにより中和される。
本明細書全体にわたり、ペプチドは、各々のアミノ酸を示す単一文字を用いて同定されている。各々の文字は、アミノ酸に関する慣用の単一文字である。
本発明によるストレス蛋白質は、多くの用途を有する。例えば、この蛋白質は、細菌感染症の診断試験例えば免疫試験例えばこの蛋白質に関する抗体特異性が宿主生物中に存在するか否かを測定するための酵素結合免疫吸着検定、ラジオイムノアッセイ又はラテックス凝集検定の基礎を成すことができる。これらの試験は、一般に、宿主からの体液とこのストレス蛋白質とを接触させ、錯結合した物質を検査することにより実施することができる。
他の用途で、本発明によるこのストレス蛋白質は、使用に対する活性阻害剤を得るためのスクリーニングのための慣用法を用いて、細菌感染症の治療に使用することができる。このようなスクリーニング法は、本発明のもう１つの態様を成す。
もう１つの用途で、本発明によるストレス蛋白質は、特に抗体の生成のために好適である。従って、本発明のもう１つの態様によれば、免疫原として使用するための見かけの分子量８６ｋｄを有する細菌ストレス蛋白質又はそのフラグメント又は類縁体を提供する。
これを免疫原として使用するためにこのストレス蛋白質を用いて、標準的な免疫技術を使用することができる。従って、例えば適当な宿主にこの蛋白質を注射し、次いで血清を集め、精製及び／又は濃縮の後に、所望のポリクローナル抗−ストレス蛋白質抗体を得ることができる。この宿主の注射の前に、このストレス蛋白質を適当なベヒクル中に処方することができ、従って、本発明のもう１つの態様により、見かけの分子量８６ｋｄを有する真菌ストレス蛋白質又はそのフラグメント又は類縁体と薬剤学的に認容しうる賦形剤１種以上とより成る組成物が提供される。
抗−ストレス蛋白質抗体の精製のために、本発明の不動態化されたストレス蛋白質をアフィニティ媒体として用いるアフィニティクロマトグラフィを使用することができる。従って、本発明のもう１つの態様によれば、不溶性支持体に共有結合された見かけの分子量８６ｋｄを有する細菌ストレス蛋白質又はそのフラグメント又はその類縁体が提供される。
抗体の生成のための免疫原としての本発明によるストレス蛋白質の使用は、この蛋白質の作用の１つの型の阻害剤を形成する。一般に、このストレス蛋白質の阻害剤は、細菌感染症の診断で、殊に治療に有用であり、本発明のもう１つの態様を提供する。阻害剤には、このストレス蛋白質の作用の拮抗体又はその生成を阻止する薬剤殊に、細菌感染症の治療に使用できるものが包含される。好適な阻害剤には、例えば抗原を包含する薬物学的試薬及びこのストレス蛋白質の作用に拮抗するストレス蛋白質の化学的類縁体及びこのストレス蛋白質の生成を阻止するための抗−センス（anti−sense）ＲＮＡ及びＤＮＡオリゴヌクレオチド類縁体が包含される。好適な阻害剤は、適当なスクリーンを用いて、例えば本発明によるストレス蛋白質又はそのフラグメント又は類縁体の作用に拮抗するか又はその生成を阻止する潜在的阻害能力を測定することにより、決定することができる。
本発明のもう１つの態様によれば、細菌感染症の診断又は治療に使用するための見かけの分子量８６ｋｄを有する細菌ストレス蛋白質又はそのフラグメント又はその類縁体の阻害剤が提供される。
阻害剤は、単独でも又は適当な場合には他の薬剤例えば他の抗細菌剤又は抗真菌剤と組み合せて使用することができる。
本発明の態様による阻害剤の特に有用な群は、このストレス蛋白質を認識し、これに結合することのできる抗体である。
従って、本発明のもう１つの態様によれば、細菌感染症の診断又は治療で使用するための、見かけの分子量８６ｋｄを有する細菌ストレス蛋白質又はそのフラグメント又はその類縁体のエピトープ１種以上に対して特異的な抗体が提供される。
この抗体は、全抗体又はその抗原結合フラグメントであってよく、かつ一般に、免疫グロブリンクラスに属していてよい。従って、これは免疫グロブリンＭ抗体又は特に免疫グロブリンＧ抗体であってよい。この抗体又はフラグメントは、動物例えば哺乳動物由来であってよく、例えば、ネズミ科動物、ラッテ又はヒト由来であってよい。これは天然の抗体又はそのフラグメントであってよいか又は所望の場合には、組換え抗体又は抗体フラグメント即ち組換えＤＮＡ技術を用いて製造された抗体又は抗体フラグメントであってよい。
特別な組換え抗体又は抗体フラグメントには次のものが包含される：（１）少なくともその１部分が異なる抗体から誘導されている抗原結合部位を有するもの例えば１抗体の超可変又は相補的決定領域が、第２の異なる抗体の可変枠領域内にグラフトされているもの（欧州特許第２３９４００号明細書に記載）；（２）不変ドメイン配列が他の異なる抗体からの不変ドメイン配列により置換されている組換え抗体又はフラグメント（欧州特許第１２０６９４号、同第１２５０２０標を合せる］、任意に、他の薬剤例えば他の抗細菌剤又は抗真菌剤と組み合せて使用することができる。治療のために、この抗体を慣用の方法で、例えば、処置すべき感染症、患者の年令及び症状に応じて薬剤学的に認容性の担持剤又は賦形剤例えば適当な用量での適用のための等張食塩水と共に処方することができる。
本発明のこの態様による特に有用な抗体は、ペプチドKVIRKNIVKKMIEを認識するものであり、本発明のもう１つの態様によれば、細菌感染症の治療又は診断で使用するためのペプチドKVIRKNIVKKMIEを認識することのできる抗体又はその類縁体が提供される。
所望によれば、抗体の混合物を、診断又は治療のために使用することができ、例えば、本発明による細菌ストレス蛋白質の異なるエピトープを認識する抗体２種以上の混合物及び／又は、異なるクラスの抗体の混合物例えば本発明の細菌ストレス蛋白質の同一又は異なるエピトープを認識するＩｇＧ及びＩｇＭ抗体の混合物を使用することができる。
本発明によるストレス蛋白質は、種々の方法で、適当な細菌細胞培養物例えばC.ジエイケイウム細胞培養物を出発物質として用いて製造することができる。こうして、例えば、適当な細菌細胞を収穫し、溶解させかつ、細胞片の分離の後に生じる細胞抽出物を慣用の分離法例えばイオン交換及びゲルクロマトグラフィ及び電気泳動及び免疫精製法例えば蛋白質を認識することのできる抗体例えばペプチドKVIRKNIVKKMIEを認識することのできる抗体を用いるアフィニティクロマトグラフィを用いて、分別することができる。この製造の間の所望の蛋白質の存在は、例えば蛋白質上のエピトープを認識することのできる抗体例えばペプチドKVIRKNIVKKMIEを認識することのできる抗体を基礎とする適当な標準的分析法を用いてモニターすることができる。前記技術の使用により、精製された形のストレス蛋白質が得られることが予期できる。
この蛋白質は、適当なC.ジエイケイウムゲノムライブラリイから出発し、かつ標準スクリーニング法及び組換えＤＮＡ技術を用いてクローン化しかつ発現させることもできる。
【図面の簡単な説明】
次に、本発明の種々の実施態様を、添付図面と関連させて記載する：
第１図は、C.ジエイケイウム敗血症に感染し、生存した患者におけるC.ジエイケイウム敗血症に対するＩｇＧ応答の逐次イムノブロット（sequential immunoblots）を示している。
第２図は、C.ジエイケイウム心内膜炎に感染し、生存した患者のC.ジエイケイウム心内膜炎に対するＩｇＭ及びＩｇＧ応答のイムノブロットを示している。
第３図及び第４図は、各々、C.アルビカンスのプレセート（pressate）及びペプチドＬＫVIRKNIVKKMIE−Cysに対して生じたウサギ抗血清及び同じペプチドに対して生じたモノクローナル抗体（双方共、ペプチドLKVIRKNIVKKMIEでの交叉吸着の前及び後）で試験されたC.ジエイケイウム単離体のイムノブロットを示している。
次の実施例につき本発明を詳述する。
例  １
次に、C.ジエイケイウム敗血症又は心内膜炎を有する患者からのイムノブロッティング血清の結果を記載し、ＪＫコリネフォルムに関して陰性であった血清から得られたイムノブロットを有するデータと比較する（Jackman, P.J. H．及びPelezynska J．の、J. Gem. Microbiology（１９８６）、１３２、１９１１−１９１５）。
患者
対照−発熱性好中性色素細胞減少性白血病（ここで全ての培養物は、ＪＫコリネフォルムに関して陰性であった）１８検体からの血清を試験した。これには血液及び内在静脈系から採取したものを包含する。
敗血症
C.ジエイケイウム敗血症を有する１４患者からの２〜５逐次血清の間で試験をした。１４症例の１３例はバンコマイシン治療により回復した好中性色素細胞減少患者から得た。これらの発熱は、C.ジエイケイウムで陽性の血液培養物と関連していた。これらの症例の３例は、急性リンパ性白血病を有し、残りの１０例は、急性骨髄性白血病を有した。第１４番目の例は、交通事故に引続き強力な治療単位を施した患者から得た。彼は、好中性色素細胞減少症ではなく、彼のC.ジエイケイウム敗血症は、長時間内在−中心系（indwelling centralline）のコロニー化（colonization）の結果として起った。彼はバンコマイシン治療に応答した。
心内膜炎
C.ジエイケイウムによりコロニィ化された静脈内供給系を有する潰瘍性結腸炎を有する患者から１５例を得た。患者に、引続き、陽性エコー心電図で判定されるような心内膜炎及び連続的発熱を起こさせた。血液培養物の３組はC.ジエイケイウムを増殖し、全身的バンコマイシン治療後に患者は徐々に回復した。
菌株
敗血症例から得たC.ジエイケイウムの臨床単離法を全搬的に使用した。
蛋白質抽出物の製造
C.ジエイケイウム単離体をコロンビア血液−寒天（Oxid）上で継代培養し（Sub−cultured）、３５℃で４８時間好気的にインキュベートした。このプレートからループで蒸留水中に収穫し、生じる細胞懸濁液を６０００gで２０分間回転させた。このペレットを同量の無菌蒸留水中に再懸濁させ、Ｘプレス（Ｘpress）内に置いた。−２０℃でこれを粉砕し、１２０００Ｇで２０分間遠心分離機にかけた。上澄みを、引続く実験で用い、−２０℃で貯蔵した。これを標準化して蛋白質含分１０mg／mlにした。
患者血清のイムノブロッティング
クラッキング緩衝液［ドデシル硫酸ナトリウム２.６％、２−メルカプト−エタノール１.３％、グリセロール６％、ブロモフェノールブルー０.２％、トリスHCl（ｐＨ６.８）０.０５％Ｍ］と共に１０℃で２分間加熱の後に、C.ジエイケイウムプレセート（pressate）３０μgを、１０％ポリアクリルアミドゲルの各々のウエル上に載せた。電気泳動及びトランスブロッティングを、マチウ（Matthews）R. C．等により記載されたように実施した［Lancet, ii １４１５−１４１８（１９８４）；及びJ. Clin. Microbiol．２５、２３０−２３７（１９８７）］。このゲルをＬＫＢトランスブロッター（ＬＫＢ Laboratories）中のニトロセルロース膜上に移した。緩衝液は、ｐＨ８.３でメタノール（２０％）、トリス２５ｍＭ及びグリシン１９２ｍＭを含有し、２５℃で４５分間移動を進行させた。このニトロセルロース紙を、緩衝食塩水（ＮａＣｌ ０.９％及びトリス１０ｍＭ、ｐＨ７.４）中の牛血清アルブミン（３％）中、４℃で１晩ブロックした。次いで、ニトロセルロースを、牛血清アルブミン（３％）及びツィーン（Tween）２０（０.０５％）を含有する緩衝食塩水中で１：１０に希釈された患者血清と共に３５℃で２時間インキュベートした。食塩水（０.９％）及びツィーン２０（０.０５％）中で３０分間にわたり５回洗浄の後に、ニトロセルロースを３５℃でアルカリホスファターゼと接合された羊抗−血清免疫グロブリン（IgM）又はＩｇＧ（Sigma Chemical Co．）と共に１時間インキュベートした。再び洗浄の後に、この膜を、２５℃で、ニトロブルーテトラゾリウム６６μl／１０ml（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（７０％）、１０ml当りＮＢＴ５０mg）と５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート３３μg／１０ml（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（７０％）中のＢＣＩＰ５０mg／ml）との混合物を含有する緩衝液（トリスＨＣｌ １００ｍＭ  ｐＨ９.５、ＮａＣｌ １００ｍＭ、ＭｇＣｌ2 ５ｍＭ）と共に１５分間インキュベートした。水中での洗浄により反応を停止させた。全てのイムノブロットを検査し、痕跡応答（ここでは、反射濃度計は４０mmより低い痕跡を生じた）及び陽性応答（ここでは高さが４０mmより大きかった）に分けた。
分子量マーカーは、プレスティンド・レインボウ・マーカース（Prestained Rainbow Markers ; code ＲＰＮ．７５６Amersham International）であった。これらは、ミオシン（２００ｋＤａ）；ホスホリラーゼｂ（９２.５ｋＤａ）；牛血清アルブミン（６９ｋＤａ）；オバルブミン（４６ｋＤａ）；カルボニックアンヒドラーゼ（３０ｋＤａ）；トリプシン阻害剤（２１.５ｋＤａ）；及びリソツィーム（１４.３ｋＤａ）であった。
結果
１８対照患者からの結果を第１表に示す。６バンドを検査し、最も一搬的な抗体応答は、１１０ｋＤａでのバンドに対してであった。抗体応答があり、そのパターンが少なくとも２週間にわたり変化しなかった４患者で、逐次的血清を得た。次表に痕跡及び陽性結果（前記）をまとめた。
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敗血症患者
これらからの結果を第２表及び第３表にまとめる。これらは、４基準により示されている。これらは、一定の痕跡反応、一定の陽性反応、反射濃度計で測定された強度の少なくとも２倍の輝度の増加及び最後に、新抗原バンドの出現である。C.ジエイケイウム感染の前に採取した血清からの結果を、感染後のそれに比べた。ＩｇＭレベル（第２表）は、１５４、８６、８０、７０、６５、６０及び４３ｋＤａにおけるバンドに関して静止していた（定位であった）。２患者の最大は、１７０、１６０、１５８、１４８及び５７ｋＤａのバンドで変化を示した。１１０、５２及び５０ｋＤａのバンドに対するＩｇＭの増加又は出現は、感染の間に起こった最大マークされた変化であった。ＩｇＧレベル（第３表）は、ＩｇＭと同様の像を示した。１２患者は、１１０ｋＤａのバンドに対するより明確な抗体応答を示した。回復時の全ての患者は、５２ｋＤａのバンドに対するＩｇＧを製造し、この１例は第１図に示されている。この患者は交通事故であり、血清中で１１０ｋＤａのバンドに対するＩｇＧのレベルをも増加した。トラクト（tract）１は、敗血症の前であり、トラクト２及び３は、それぞれ、バンコマイシン治療の停止直後と５日後に採取した。この１４患者の９例は５０ｋＤａバンドに対するＩｇＧを生じた。
心内膜炎の場合（第２図）は、敗血症患者に関して先に記載した全抗原性バンドに対するＩｇＭ及びＩｇＧを有した。治療の成功によりＩｇＭ応答が消失したが、ＩｇＧは５０及び５２ｋＤａバンドに対して増加した。
概要
前記結果は、敗血症からの回復は、５０、５２及び１１０ｋＤａの抗原バンドに対するＩｇＭ及びＩｇＧの双方の生成を伴なったことを示している。対照中には１１０ｋＤａバンドに対する抗体が存在したが、５０及び５２ｋＤａバンドに対する抗体は、C.ジエイケイウムに感染しているか以前に感染した患者に特異的であった。C.ジエイケイウム心内膜炎回復の場合にも、５０及び５２ｋＤａバンドに対する血清変化を伴なった。このことは、肺血症試験のベースとしてのこれら抗原のどちらかの使用の可能性を説明している。
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例  ２
慣用法を用いて、ペプチドLKVIRKNIVKKMIE−Cysに対しかつC.アルビカンスのプレセートに対するウサギ高度免疫抗血清を生ぜしめた［例えばBurnie, J．のJ. Immunol. Meth．（１９８５）、８２、２６７−２８０参照］。LKVIRKNIVKKMIE−Cys−KLHに対してネズミ科動物抗体を生ぜしめた。Balb／c及びＣＢＡ×Balb／cＦ1マウスに、無菌完全フロインドアジュバント中の免疫原５０μgを皮下注射し、その後、１４日間隔で、不完全フロインドアジュバント中の免疫原５０μgを腹膜内に、血清変化が起るまで注射した。
無菌生理食塩水中の免疫原５０μgの静脈内注射の最終免疫化の後４日目に融合させた。融合、ハイブリドーマスクリーニング、クローナル選択及び抗体分析を、主としてde St. Groth S. F．及びScheidegger D．によりJ. Immnol. Methods３５、１−２１（１９８０）に記載された標準的方法に従って実施した。選択されたハイブリドーマを、C.アルビカンス４７ｋｄ抗原に対する活性に関して、C.アルビカンスに対するイムノブロッティングによりスクリーニングした。陽性ハイブリドーマを再クローニングさせ、再検定した。
モノクローナル抗体の特徴付け
前記方法により得られた新規ハイブリドーマセルライン（ＣＡ−ＳＴＲ７−１）は、酵母及びミセル形の双方中で３７℃で生長したC.アルビカンスのイムノブロットで、C.アルビカンス４７ｋＤａ抗原及び約９２ｋＤａの抗原の双方を認識するモノクローナル抗体を生成した。２３℃で、この４７ｋＤａ抗原は、可視であったが、このモノクローナル抗体で９２ｋｄ抗原は見えなかった。
イムノブロッティング
C.ジエイケイウム単離体（例１参照）を試験するために、前記のウサギ抗血清及びモノクローナル抗体を用いた。
第３図及び第４図は、ペプチドKVIRKNIVKKMIE（１mg／ml後記）との交叉吸着の前及び後に得られたイムノブロットを示している（方法は例１参照）。
第３図  トラクト１  ５２ｋｄバンドと交叉反応するLKVIRKNIVKKMIE-Cysに対するモノクローナル
トラクト２  交叉吸着後のLKVIRKNIVKKMIE-Cysに対するモノクローナル（反応しない）
トラクト３  ５２ｋｄバンドと交叉反応するLKVIRKNIVKKMIE-Cysに対するウサギ高度免疫抗血清
トラクト４  交叉吸着後のLKVIRKNIVKKMIE-Cysに対するウサギ高度免疫抗血清（反応しない）
トラクト５  ５２ｋｄバンドと交叉結合するC.アルビカンスのプレセートに対するウサギポリクローナル高度免疫
第４図  トラクト１  交叉吸着後のLKVIRKNIVKKMIE−Cysに対するウサギ高度免疫抗血清（８６ｋｄバンドと反応しない）
トラクト２  ８６ｋＤａバンドと交叉反応するLKVIRKNIVKKMIE−Cysに対するウサギ高度免疫抗血清
トラクト３  LKVIRKNIVKKMIE-Cysに対するマウスモノクローナル（反応なし）
トラクト４  交叉吸着後のLKVIRKNIVKKMIE-Cysに対するマウスモノクローナル（反応なし）
概要
抗血清及びモノクローナル抗体は、各々、C.ジエイケイウムを検出し、それらの診断試験での使用の可能性を示している。
ウサギ高度免疫血清は、８６ｋｄ及び５２ｋｄでバンドと交叉反応した。これらは、双方共、ペプチドL-LKVIRKNIVKKMIEにより１mg／mlで中和された。このモノクローナル抗体は５２ｋｄバンドと反応し、相応するペプチドで中和された。C.アルビカンスのプレセートに対するウサギ高度免疫血清は、５２ｋｄバンドと交叉反応した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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