(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により測定した際、約２００ｋＤａの見かけ上の分子量を有し、
かつ、下記のアミノ酸配列（配列認識番号１０）：
ＮＨ2−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−
を有するモラクセラ  カタラリスの菌株に由来する単離、精製した外膜タンパク。
【請求項２】
前記モラクセラ  カタラリスの菌株が、モラクセラ  カタラリス４２２３株である、請求項１に記載のタンパク。
【請求項３】
純度が、少なくとも約９５％である、請求項１に記載のタンパク。
【請求項４】
水溶液の形態をとっている、請求項１に記載のタンパク。
【請求項５】
下記のアミノ酸配列（配列認識番号１０）：
ＮＨ2−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−
を有するペプチドに対して特異性を有する抗体調製物によって、識別可能である、請求項１に記載のタンパク。
【請求項６】
表IIIに示すアミノ酸組成を有する、請求項１に記載のタンパク。
【請求項７】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により測定した際、約２００ｋＤａの見かけ上の分子量を有する、モラクセラ  カタラリスの菌株に由来する外膜タンパクをコードしており、
図６に示すＤＮＡ配列を含む、単離、精製された核酸分子。
【請求項８】
菌株は、モラクセラ  カタラリス４２２３株である、請求項７に記載の核酸分子。
【請求項９】
それがコードするタンパクは、モラクセラ  カタラリス４２２３株においては、下記のアミノ酸配列（配列認識番号１０）：
ＮＨ2−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−
を含む請求項７に記載の核酸分子。
【請求項１０】
下記のいずれかから選択される塩基配列を有する、単離、精製された核酸分子。
（ａ）図６に規定されるＤＮＡ配列またはその相補的配列（配列認識番号１ならびに２）；および
（ｂ）図６に規定される推定アミノ酸配列（配列認識番号３）をコードするＤＮＡ配列またはその相補的配列。
【請求項１１】
請求項７または１０に記載する核酸分子を含んでなる、宿主の形質転換に適応したベクター。
【請求項１２】
請求項７または１０に記載する核酸分子と、それからモラクセラ属の菌株に由来する前記外膜タンパクを宿主において発現するため、機能的に連結された発現手段とを含んでなる、宿主の形質転換に適応した発現ベクター。
【請求項１３】
発現手段は、前記外膜タンパクを宿主より分泌するための、リーダーシーケンスをコードする塩基配列も含む、請求項１２に記載の発現ベクター。
【請求項１４】
発現手段は、前記外膜タンパクの脂質化体を宿主において発現するための、脂質化シグナルをコードする塩基配列を含む、請求項１２に記載の発現ベクター。
【請求項１５】
請求項１２に記載する発現ベクターを含んでなる、形質転換体。
【請求項１６】
請求項１５に記載する形質転換体によって、生産される組換え外膜タンパク。
【請求項１７】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により測定した際に、約２００ｋＤａの分子量を有するモラクセラ  カタラリスの菌株に由来する外膜タンパクの一部分に相当する下記のアミノ酸配列：
（１）アミノ酸配列（配列認識番号１０）
ＮＨ2−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−；
（２）アミノ酸配列（配列認識番号５）
ＮＨ2−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｘａａ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−；
（３）図６中、ペプチド１として示されるアミノ酸配列（配列認識番号１１）；
（４）図６中、ペプチド２として示されるアミノ酸配列（配列認識番号１２）；
（５）アミノ酸配列（配列認識番号６）
ＮＨ2−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−
のいずれかを含み、かつ１５０以下のアミノ酸配列からなる、ペプチド。
【請求項１８】
菌株は、モラクセラ  カタラリス４２２３株である、請求項１７に記載のペプチド。
【請求項１９】
モラクセラ  カタラリス４２２３株における、アミノ酸配列（配列認識番号５）：
ＮＨ2−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｘａａ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−；
あるいは、アミノ酸配列（配列認識番号６）
ＮＨ2−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−
を含む、請求項１７に記載のペプチド。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、免疫学の分野、特にモラクセラ属の外膜タンパク、その製造法、当該タンパクをコードした遺伝子ならびにその利用に関する。
関連特許
本願は１９９５年６月７日付けで出願した米国特許出願第０８/４７８，３７０号の継続特許であり、米国特許出願第０８/４７８，３７０号は１９９５年５月１日付けの米国特許出願第０８/４３１，７１８の継続特許である。
背景技術
中耳炎(Otitis media)は最も一般的な乳幼児の病気であり、子供の約７０％が７歳までに少なくとも１回は中耳炎を患う。慢性中耳炎は、子供の聴覚、言語および認知障害の原因となり、ストレプトコッカス  ニューモニエ(Streptococcus pneumoniae）（約５０％）、型別不能フェモフィルス  インフルエンゼ(Haemophilus influenzae）（約３０％）およびモラクセラ（ブランハメラ）カタラリス（約２０％）の感染によるものである。米国だけでも、中耳炎の治療に抗生物質ならびに扁桃摘出、咽頭扁桃摘出および鼓膜穿孔管挿入等の外科手術を含め、年間１０〜２０億ドルが費やされている。中耳炎は生涯のうち言語能力が急速に発達している時に起こるので、頻繁に中耳炎を患った子供では特に学習および聴覚に関連した能力の発達障害が報告されている。
モラクセラ  カタラリスは主として気道内に定着し、粘膜の主要な病原菌である。鼓室穿刺によって採取した中耳液を培養して行った試験で、中耳炎の症例の約２０％はモラクセラ  カタラリスによって起こることが確認されている（参考文献1−本特許では、本発明の技術分野における従来の技術を完全に記載するため各種の参考文献を括弧内に引用する。各文献の詳細な情報は明細書の最後の請求範囲の前に示す。このようにして、これら参考文献の内容を本開示に引用する。）
モラクセル  カタラリスによる中耳炎の発現頻度は、増加している。肺炎球菌および型別不能インフルエンザ菌による中耳炎は予防法が開発されているので、中耳炎の病原としてのモラクセル  カタラリスの相対的な重要性がますます増加すると思われる。
モラクセル  カタラリスは成人の下気道感染、特に慢性気管支炎および肺気腫の病因としても重要である。
（参考文献2、3、4、5、6、7および8）。モラクセル  カタラリスは子供および成人の副鼻腔炎の病因でもあり（参考文献9、10、11、12および13）、侵襲性疾病を起こすこともある（参考文献14、15、16、17、18および19）。
他のグラム陰性細菌と同様にモラクセル  カタラリスの外膜はリン脂質、リポ多糖類（LPS）および各種外膜タンパク（OMP）で構成されている。主要成分として、モラクセル  カタラリスの８種類のＭＯＰが同定されている。これらはＡからＨで表示され、ＯＭＰ  Ａは９８ｋＤａの分子量を有し、ＯＭＰ  Ｈは２１ｋＤａの分子量を有する（参考文献20）。
最近、モラクセル  カタラリスの高分子量の外膜タンパクが精製、同定されている（参考文献21）。このタンパクの見かけ上の分子量は、ナトリウム  ドデシル  硫酸ポリアクリルアミド  ゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で判断する限り、３５０ｋＤａから７２０ｋＤａの範囲にある。このタンパクは分子量のはるかに小さいタンパクまたは１２０〜１４０ｋＤａの分子量を有するそのサブユニットのオリゴマーと思われ、モラクセラ菌株の間で抗原的に保存されている（参考文献22）。
モラクセル  カタラリスが感染すると、重篤な疾病が起こる。ワクチンを含む免疫原性調製物の抗原、別の抗原および免疫原の担体、および診断薬として使用するため、モラクセル  カタラリスの別の外膜タンパクおよび当該タンパクをコードした遺伝子を提供することは大きな意義がある。
発明の概略
本発明は、モラクセル  カタラリスおよびその他のモラクセル属細菌から単離、精製した見かけ上分子量約２００ｋＤａの主要外膜タンパクならびにそれをコードした遺伝子の提供を目的とする。
すなわち、本発明の目的は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定したとき約２００ｋＤａの分子量を有するモラクセル属菌株から単離、精製した外膜タンパク、またはフラグメントまたはその類縁体を提供することである。外膜タンパクは実質的にその本来の構造を有していてもよい（したがって、実質的にモラクセル属菌株における外膜タンパクに特異的な免疫原性を保持していてもよい）し、モラクセル  カタラリス４２２３等モラクセル  カタラリス菌株から単離してもよい。単離、精製した分子量約２００ｋＤａの前記外膜タンパクは、モラクセルの非２００ｋＤａ外膜タンパク、リン脂質およびリポ多糖類を実質的に含まない。分子量約２００ｋＤａの外膜タンパクは純度が少なくとも約７０重量％であり、望ましくは少なくとも約90重量％であり、水溶液の形態であってもよい。約２００ｋＤａの前記外膜タンパクは実質的に表IIIに示すアミノ酸組成であってもよく、図６に示す推定アミノ酸配列（配列識別番号３）であってもよい。
また、本発明はＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定したとき約２００ｋＤａの分子量を有するモラクセラ属菌株の外膜タンパクをコードした単離、精製核酸分子、または外膜タンパクのフラグメントまたはその類縁体の提供を目的とする。核酸分子によりコードされたタンパクは、モラクセラ  カタラリス４２２３株ではアミノ酸配列ＮＨ2−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−ｘ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ（配列識別番号５）、特にｘはＬｙｓである（配列識別番号１０）またはその他のモラクセラ属菌株からの対応するアミノ酸配列を有するタンパクからなっていてもよい。
本発明の別の目的は、（ａ）図６に規定するＤＮＡ配列（配列識別番号１または２）またはその補足的な配列、（ｂ）モラクセラ属菌株の約２００ｋＤａのタンパクをコードし、アミノ酸配列ＮＨ2−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−ｘ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ（配列識別番号５）、特にｘはＬｙｓである（配列識別番号１０）またはその補足的アミノ酸配列を有するＤＮＡ配列、（ｃ）図６に規定する推定アミノ酸配列（配列識別番号３）またはその補足的配列をコードしたＤＮＡ配列、および（ｄ）厳しい条件下で（ａ）、（ｂ）または（ｃ）で規定したいずれかの配列にハイブリッド化する核酸配列のいずれかの配列を有する単離、精製した核酸を提供することである。（ｄ）で規定した核酸は、（ａ）、（ｂ）または（ｃ）で規定した配列のいずれかと少なくとも約９０％同一な配列を有することが望ましい。
ここで提供する核酸分子は、宿主の形質変換に適応したベクター中に含めてもよい。また、ここで提供する核酸分子は、宿主によるモラクセラ属菌株の約２００ｋＤａ外膜タンパクまたは外膜タンパクのフラグメントまたはその類縁体の表現のために核酸分子と共役して作用する表現手段とともに、宿主の形質変換に適応した表現ベクター中に含めてもよい。表現ベクターを含む形質変換宿主は、形質変換宿主によって生産される組換え外膜タンパクまたはそのフラグメントまたは類縁体とともに本発明の範囲に含まれる。
表現手段は、宿主からの外膜タンパクまたは外膜タンパクのフラグメントまたはその類縁体の分泌のリーダー配列をコードした核酸部分を含む。表現手段は、宿主からの外膜タンパクまたはそのフラグメントまたは類縁体の脂質化体を表現するための脂質化シグナルをコードした核酸部分を含んでいてもよい。
さらに、本発明は本発明に係わる外膜タンパクまたはそのフラグメントまたは類縁体を運搬するための生きたベクターを含み、ベクターはここで提供した核酸分子を含む。生きたベクターは、大腸菌(E. coli)、サルモネラ菌(Salmonella)、ＢＣＧ、アデノウイルス、ポックスウイルス、バクシニアおよびポリオウイルスからなる群から選んでもよい。
さらに、本発明の別の目的は、６〜１５０個のアミノ酸からなり、本発明に係わる外膜タンパクまたはそのフラグメントまたは類縁体の部分のみに相当するアミノ酸配列を有するペプチドを提供することである。ペプチドは、モラクセラ  カタラリス４２２３株のアミノ酸配列ＮＨ2−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ（配列識別番号１０）、
またはモラクセラのその他の菌株の対応するペプチドのアミノ酸配列を有する。
また、本発明の目的は、ここで提供した外膜タンパクまたはそのフラグメントまたは類縁体、核酸分子、組換え外膜タンパク、そのフラグメントまたは類縁体、生きたベクターおよび/またはペプチドからなる有効成分の免疫学的に有効な量と、その薬理学的に許容される担体とからなり、霊長類、特に人間に投与したとき免疫反応を示す免疫原性組成物を提供することである。免疫組成物は、約２００ｋＤａの外膜タンパクまたは宿主において特に約２００ｋＤａの外膜タンパクと反応する抗体を誘導することのできるタンパクを産生する細菌性病原菌によって起こる疾病を予防するために宿主にｉｎ  ｖｉｖｏで投与するためのワクチンとして製剤してもよい。特に、細菌性病原菌は、モラクセラ属、特にモラクセラ  カタラリスである。
免疫原性組成物は、微粒子カプセル、ＩＳＣＯＭまたはリポソーム調製物として製剤してもよい。免疫原性組成物は、粘膜表面等の免疫系の特定の細胞に運搬するための標的化分子と組み合わせて用いてもよい。標的化分子は、ＷＯ  ９２/１７１６７(Biotech Australia Pty. Ltd.)に記載されているようにビタミンＢ１２および細菌毒素のフラグメント、および米国特許第５，１９４，２５４号(Barberら)に記載されているようにモノクロナル抗体を含む。さらに、本発明に係わる免疫原性組成物（ワクチンを含む）は、少なくとも１種類の他の免疫原または免疫賦活剤からなり、免疫賦活剤は少なくとも１種類のアジュバントであってもよい。
本発明に使用することができるアジュバントとしてリン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、ＱＳ２１、クイルA、それらの誘導体および成分、ＩＳＣＯＭマトリックス、リン酸カルシウム、水酸化カルシウム、水酸化亜鉛、糖脂質類縁体、アミノ酸のオクタデシルエステル、ムラミル、ジペプチド、ポリホスファゼン、ＩＳＣＯＰＲＥＰ、ＤＣ−コール、ＤＤＢＡおよび脂質タンパクをあげることができるが、これらに限るものではない。有利なアジュバントの組合せは、本出願人に譲渡された米国特許出願第０８/２６１，１９４号（出願日：１９９４年６月１６日）および第０８/４８３，８５６号（出願日：１９９５年６月７日）に記載されているが、ここでは引例として参照する。さらに、本発明は、ここで提供した外膜タンパクに特異的で、ここに記載したように免疫原性組成物によって免疫賦与された宿主で生産される抗体を含む。
さらに、本発明の目的は、ここで提供した免疫原性組成物の免疫学的有効量を投与することからなる宿主における免疫反応誘導法を提供することである。免疫反応は、体液性反応であってもよいし、細胞仲介免疫反応であってもよい。免疫反応は、約２００ｋＤａの外膜タンパクまたは宿主において約２００ｋＤａの外膜タンパクと特異的に反応する抗体を誘導することのできるタンパクを産生する細菌性病原菌による疾病を予防することができる。特に、病原菌はモラクセラカタラリスを含むモラクセラ属の菌株である。疾病に対する防御を賦与される宿主としては、人間を含む霊長類をあげることができる。
さらに、本発明の目的は、約２００ｋＤａの外膜タンパクまたは宿主において約２００ｋＤａの外膜タンパクと特異的に反応するタンパクを産生する細菌性病原菌によって起こる疾病を予防するために必要な有効成分の投与量および投与頻度を決定するためにここで提供した免疫原性組成物を試験宿主に投与し、前記のように決定した投与量および投与頻度にしたがって処置宿主に投与する上で適した形態および量に有効成分を製剤することからなるワクチンの製造法を提供することである。特に、病原菌はモラクセラカタラリスを含むモラクセラ属の菌株である。処置宿主としては、人間をあげることができる。
さらに、本発明の別の目的は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定したとき約２００ｋＤａの分子量を有するモラクセラ属菌株の外膜タンパクまたはそのフラグメントまたは類縁体をコードした核酸の試料中の有無を以下の手順で測定する方法を提供することである。
（ａ）ここで提供した核酸と試料を接触させて核酸と試料中に存在する外膜タンパクをコードし、特異的ハイブリッドを形成する前記核酸分子のいずれかと２倍体を作り、
（ｂ）生成した２倍体を測定する。
さらに、本発明の目的は、約２００ｋＤａの分子量を有するモラクセラ属菌株の外膜タンパクの試料中の有無を以下の手順で測定する方法を提供することである。
（ａ）ここで提供した免疫原性組成物で検体に免疫を賦与して外膜タンパクに特異的な抗体を産生させ、（ｂ）試料と抗体を接触させて試料中に存在する外膜タンパク質のいずれかと、前記の外膜タンパクに特異的な抗体とからなる複合体を作り、
（ｃ）生成した複合体を測定する。
外膜タンパクは、モラクセラ  カタラリス菌株の一部であってもよい。
さらに、本発明の別の目的は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定したとき約２００ｋＤａの分子量を有するモラクセラ属菌株の外膜タンパクまたはそのフラグメントまたは類縁体をコードした核酸の試料中の有無を測定するための以下の組成からなる診断キットを提供することである。
（ａ）ここで提供した核酸
（ｂ）核酸分子と、試料中に存在し、核酸分子とハイブリッドを形成する前記の外膜タンパクのいずれかとからなる２倍体を作るための核酸と試料の接触手段と、
（ｃ）生成した２倍体を測定する手段。
さらに、本発明の別の目的は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定したとき約２００ｋＤａの分子量を有するモラクセラ属菌株の外膜タンパクと特異的に反応する抗体の試料中の有無を測定するための以下の組成からなる診断キットを提供することである。
（ａ）ここで提供した外膜タンパク、
（ｂ）外膜タンパクと、試料中に存在する前記抗体のいずれかとからなる複合体を作るための外膜タンパクと試料の接触手段と、
（ｃ）生成した複合体を測定する手段。
さらに、本発明の別の目的は、約２００ｋＤａの分子量を有するモラクセラ属菌株の外膜タンパクの有無を検出するための以下の組成からなる診断キットを提供することである。
（ａ）ここで提供した約２００ｋＤａの外膜タンパクに特異的な抗体、
（ｂ）外膜タンパクと、外膜タンパク抗体とからなる複合体を作るための抗体と試料の接触手段と、
（ｃ）生成した複合体を測定する手段。
また、本発明の別の目的は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定したとき約２００ｋＤａの分子量を有するモラクセラ属菌株の単離、精製した外膜タンパクの以下の手順からなる製造法を提供することである。
（ａ）モラクセラ属菌株の細胞を得、
（ｂ）細胞を破壊して細胞溶融液を得、
（ｃ）細胞溶融液を分画して実質的にその他の細胞溶融成分を含まない外膜タンパクを含む画分を得、
（ｄ）前記外膜タンパクを回収する
細菌菌株は、モラクセラ  カタラリスである。細胞溶融液は、ゲル電気泳動で分画してもよい。
本明細書で”約２００ｋＤａのタンパク”という用語は約１６０から約２３０ｋＤａの分子量を有するモラクセラ属の一連の外膜タンパクを定義するために用い、モラクセラ属の各種菌株で認められる天然タンパクを含むアミノ酸配列の変異を有するタンパクを含む。また、本発明に係わる約２００ｋＤａのタンパクをコードする遺伝子からなる単離、精製したＤＮＡ分子は、約２００ｋＤａのタンパクの機能的類縁体をコードしたものも含む。この明細書において、第一のタンパクが免疫学的に第二のタンパクと関連があるか、または第二のタンパクと同じ機能を有する場合、第一のタンパクは第二のタンパクの”機能的類縁体”である。機能的類縁体は、例えばタンパクのフラグメント、またはその置換変異体、付加変異体または欠失変異体、または第二のタンパクとの癒合体であったえもよい。
本発明は、
−外膜タンパクを産生するモラクセラ  カタラリスを含むモラクセラ属菌株の約２００ｋＤａの外膜タンパクを単離、精製する方法
−モラクセラ  カタラリスの約２００ｋＤａの外膜タンパクをコードした遺伝子
−モラクセラ属菌株から単離、精製した約２００ｋＤａの外膜タンパク、ならびに
−モラクセラ属およびそれに感染した宿主を特異的に同定することができる診断キットおよび免疫学的試薬からなっている。
【図面の簡単な説明】
図１Aおよび１Bは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるモラクセラ  カタラリスの細胞タンパクの分析を示す。レーンおよびタンパク源は、下記の実施例２で説明する。
図２は、多くのモラクセラ  カタラリス菌株の細胞タンパクのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる比較分析および各種モラクセラ属菌株における約２００ｋＤａタンパクの分子量の差を示す。レーンおよびタンパク源は、下記の実施例４で説明する。
図３は、モラクセラ  カタラリスから単離、精製した約２００ｋＤａの外膜タンパクのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析を示す。
図４は、約２００ｋＤａの外膜タンパクの抗ペプチド抗血清による特異的な識別を示す。レーンおよび抗血清は、下記の実施例８で説明する。
図５は、モラクセラ  カタラリスの約２００ｋＤａの外膜タンパクをコードした遺伝子を含むクローンの制限マップを示す。約２００ｋＤａの外膜タンパクのオープンリーディングフレームを陰枠で示す。制限部位は、Ｓａｌ：Ｓａｌ、Ｎ：ＮｃｏＩ、Ｂ：ＢｇｌＩＩ、Ｋ：ＫｐｎＩ、Ｘｈ：ＸｈｏＩ、ＲＶ：ＥｃｏＲＶである。
図６は、モラクセラ  カタラリスの約２００ｋＤａの外膜タンパクをコードした遺伝子のヌクレオチド配列（配列識別番号１−全体の配列、配列識別番号２−コーディング配列）および推定アミノ酸配列（配列識別番号３−同定したＧＴＧ開始コドン、配列識別番号４−推定ＡＴＧ開始コドン）を示す。ペプチド（Peptide)１（配列識別番号１１）およびペプチド（Peptide）２（配列識別番号１２）は、下線で示す。
図７Aは、単一切断制限酵素を示すモラクセラ  カタラリスの約２００ｋＤａ外膜タンパクをコードした遺伝子（配列識別番号１）の制限酵素マップである。
図７Bは、二重切断制限酵素を示すモラクセラ  カタラリスの約２００ｋＤａ外膜タンパクをコードした遺伝子（配列識別番号１）の制限酵素マップである。
図８は、モラクセラ  カタラリスの約２００ｋＤａの外膜タンパクをコードした遺伝子のＣ−末端切断表現によるＧＴＧ開始コドンの同定を示す。制限部位は、Ｎ：ＮｃｏＩ、Ｋ：ＫｐｎＩ、Ｈ：ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｈｐ：ＨｐａＩ、ＲＶ：ＥｃｏＲＶ、Ｓａｌ：ＳａｌＩである。
図９は、モラクセラ  カタラリスの約２００ｋＤａの外膜タンパクのＮ−末端ペプチドに対して特異的な抗血清を用いたＧＴＧ開始コドンの同定を示す。制限部位は、Ｎｃｏ：ＮｃｏＩ、Ｋ：ＫｐｎＩ、Ｈ：ＨｉｎｄＩＩＩ、ＲＶ：ＥｃｏＲＶ、Ｓａｌ：ＳａｌＩである。図１０は、抗ペプチド血清による２００ｋＤａタンパクの識別を示す。図１１は、モラクセラ  カタラリスの約２００ｋＤａ外膜タンパクの表現に用いるベクターの大腸菌からの構築を示す。Ｎｃｏ：ＮｃｏＩ、Ｐｓｔ：ＰｓｔＩ、Ｐｖｕ：ＰｖｕＩＩ、Ｓｃａ：ＳｃａＩ、Ｓａｌ：ＳａｌＩである。図１２は、バクテリオファージＴ７プロモーターを用いたモラクセラ  カタラリスの約２００ｋＤａ外膜タンパクのＮ−末端切断の大腸菌における表現を示す。図１３は、LacZ-α−ペプチドと融合したモラクセラカタラリスの約２００ｋＤａ外膜タンパクの大腸菌における表現を示す。図１４は、他の細菌と比較したモルモット抗２００ｋＤａ特異性抗血清による約２００ｋＤａ外膜タンパクを表現するモラクセラ  カタラリスの特異的識別を示す。レーンおよび細菌は、以下で説明する。
発明についての記述
図１Aおよび１Bならびに図２を参照し、モラクセラカタラリス各種菌株からの約２００ｋＤａの分子量を有する新規な外膜タンパクの分離について説明する。各種モラクセラ  カタラリス菌株にこの約２００ｋＤａタンパクが存在すること、特に中耳炎患者から単離した菌株にほとんど普遍的に存在することを表Iに示す。図３は、単離、精製した外膜タンパクを示す。
精製したタンパクをゲルから溶出し、モルモットにおける抗体の誘導に用いた。当該抗体は、外膜タンパクを産生するモラクセラ  カタラリスの菌株のみを特異的に識別する（表I）。
約２００ｋＤａのタンパクの内部フラグメントに相当する合成ペプチドでモルモットに誘導した抗体による約２００ｋＤａ外膜タンパクの識別を図４に示す。合成ペプチドのアミノ酸配列は、ＮＨ2−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ（配列識別番号６）であった。
約２００ｋＤａ外膜タンパクをコードした遺伝子を含むクローンの制限マップを図５に示す。図５では、約２００ｋＤａのオープンリーディングフレームを陰枠で示し、ＧＴＧ開始コドンも示す。約２００ｋＤａ外膜タンパクをコードした遺伝子のヌクレオチド配列（配列識別番号１および２）を、当該タンパクの推定アミノ酸配列（配列識別番号３）とともに、図６に示す。約２００ｋＤａのタンパクをコードした遺伝子の制限酵素マップを図７(A)および(B)に示す。約２００ｋＤａのタンパクのアミノ酸組成は、表IIIに示す。本発明の１実施例によると、本発明に係わる単離、精製した約２００ｋＤａの外膜タンパクは、中耳炎およびその他の疾患を起こすモラクセラ  カタラリスを他の細菌性病原菌と特異的に区別するために使用することができる抗体の誘導に有用である。図１４は、本発明に係わる精製した約２００ｋＤａ外膜タンパクで免疫賦与したマウスによって産生したモルモット非特異性抗２００ｋＤａ外膜タンパク抗血清の特異的反応性を示す免疫ブロットである。分析した細菌溶融液は、以下の通りである。
0003771265.tif 000002
図１４に示す結果から、本発明に係わる外膜特異性抗血清は同じような症状を示す疾病を起こす細菌性病原菌を区別する上で有用であることは明らかである。
本発明の別の実施例は、本発明に係わる外膜タンパクの免疫学的に有効量と、その生理学的に許容される担体とからなるモラクセラ属細菌に有効なワクチンを提供するものである。本発明に係わる外膜タンパクは、ヘプテン、多糖類またはペプチドの担体として、約２００ｋＤａの外膜タンパクに関連のない抗原決定基に対する共役ワクチンの製造に使用することもできる。本発明に係わる約２００ｋＤａの外膜タンパクは診断試薬として、または抗外膜タンパク抗体誘導用抗原として、またはモラクセラ属菌株によって起こる疾病に対する免疫賦与用抗原またはモラクセラ属による感染検出用の抗原として有用である。
本発明の別の実施例によると、本発明に係わる約２００ｋＤａの外膜タンパクはキメラ分子および莢膜形成細菌を含む病原性細菌に対する共役ワクチン（糖抱合体を含む）の調製に、担体分子として使用することができる。例えば、本発明の糖抱合体は、リポオリゴ糖（LOS）およびポリリボシルリン酸（PRP）を含む多糖類抗原を有するあらゆる種類の細菌によって起こる疾病および感染に対する防御能を賦与するために使用することができる。当該細菌は、例えばヘモフィルスインフルエンゼ、ストレプトコッカス  ニューモニエ、エセリシア  コライ、ナイセリア  メニンジティディス、サルモネラ  チフィ、ストレプトコッカス  ミュータンツ、クリプトコッカス  ネオフォルマンス、クレブシエラ属、スタフィロコッカス  オーレウスおよびシュードモナス  エルギノーザである。外膜タンパクと抱合体を形成する特定の抗原および当該抱合体を得る方法は、本出願人に譲渡されたＰＣＴ出願ＷＯ  ９４/１２６４１に記載されているが、引例としてここに記載する。
別の実施例によると、外膜タンパクの担体機能は、例えば腫瘍細胞の異常多糖類に対する免疫誘導に使用してもよいし、化学治療剤または生理活性物質と抱合体を形成させるための抗腫瘍抗体の誘導に使用してもよい。
本発明は、本発明に係わる核酸分子およびタンパクの医薬品としての使用およびモラクセラ属細菌の感染治療用の医薬品の製造への使用を含む。
本発明の別の実施例によると、モラクセラ属の組換え約２００ｋＤａ外膜タンパクまたはそのフラグメントまたは類縁体、または約２００ｋＤａタンパクをコードした遺伝子の少なくとも一部を含む形質変換宿主によって生産される融合タンパクが提供される。図１１には、当該タンパクを生産するための組換えベクターを示す。図１１には、バクテリオファージＴ７プロモーターの制御下でベクターｐＴ７−７に挿入した２００ｋＤタンパク遺伝子の１．９ｋｂおよび４．８ｋｂのＣ−末端領域を枠内に示す。小さな白枠は、同じ読み取り枠におけるベクターからの７個のＮ−末端アミノ酸を示す。陰付きの枠はＮ−末端のきわめて近くのＡＴＧコドンを含む２００ｋＤタンパクの５．５ｋｂＣ−末端領域を示す。この遺伝子フラグメントは、ｌａｃＺプロモーターの制御下で、ｌａｃＺ αペプチド遺伝子（枠内に示す）と融合している。ＧＴＧから出発する完全長遺伝子は、陰影を施した枠内に示す。図１２は、大腸菌における約２００ｋＤａタンパクのＮ−末端切断の表現を示す。プラスミッドｐＫＳ９４を有する大腸菌菌株ＢＬ２１（ＤＥ3)/ｐＬｙｓＳを１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを添加したＬＢブロス中で対数増殖期の初期まで培養し、ＩＰＴＧを添加した。さらに２時間培養した後、細菌を収穫し、溶融した。第一抗体として抗２００ｋＤタンパクモルモット血清を用い、溶融液をウエスターンブロットで分析した。その他の手順は図５に示す。レーン１：あらかじめ染色した分子量マーカー、レーン２：挿入が正しくないｐＴ７−７を有するＢＬ２１（ＤＥ３）/ｐＬｙｓＳ。レーン３：ｐＫＳ９４を有するＬ２１（ＤＥ３）／ｐＬｙｓＳ。
図１３は、大腸菌におけるβ−ガラクトシダーゼαペプチドと約２００ｋＤａタンパクとからなる溶融タンパクの表現を示す。大腸菌ＤＨ５αは、ｐＫＳ１４０を有する。プラスミッドｐＫＳ１４０は、同じ読み取り枠におけるＬａｃＺ−α−ペプチドのＮ−末端部分の後の２００ｋＤタンパク遺伝子のＣ−末端５．５ｋｂフラグメントを有する。大腸菌菌株を静置培養し、収穫し、溶融した。溶融液をウエスターンブロットで分析した。レーン１：あらかじめ染色した分子量マーカー、レーン２：ｐＫＳ１４０を有するＤＨ５α（総タンパク０．５μｇ）、レーン３：モラクセラ  カタラリス４２２３株の超音波抽出液（総タンパク１０μｇ）。
当該技術分野の専門家にとっては、本発明に係わる各種の実施例がワクチン接種、診断、モラクセラ属細菌の感染治療および免疫原性試薬の分野で広い適用性を有することを予想することはきわめて容易なことである。このような用とを以下に記載するが、本発明はこれに限るものではない。
１．ワクチンの調製および使用
ワクチンとしての使用に適したものを含む免疫原性組成物は、ここで開示した約２００ｋＤａの外膜タンパクならびに免疫原性フラグメントまたはその融合体を細菌から精製するか、または遺伝子組換え技術によって製造することによって調製することができる。当該ワクチンは検体において抗２００ｋＤａ外膜タンパク抗体および食作用または殺菌作用を有する抗体を含む抗体を産生することによって免疫反応を示す。ワクチン接種を行った検体がモラクセラ属細菌または２００ｋＤａ外膜タンパクを特異的に識別する抗体を誘導するタンパクを産生するその他の細菌による攻撃を受けると、抗体が細菌に結合し、不活性化する。さらに、食作用または殺菌作用を有する抗２００ｋＤａ外膜タンパク抗体は、別の機構により防御作用を提供する。
ワクチンを含む免疫原性組成物は、注射液、溶液または乳化液として調製することができる。約２００ｋＤａの外膜タンパクは、約２００ｋＤａの外膜タンパクと相容性のある薬理学的に許容される添加剤と混合してもよい。このような添加剤としては、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールおよびこれらの混合物をあげることができる。免疫原性組成物およびワクチンは、さらに水和剤または乳化剤、緩衝剤またはアジュバント等の補助剤を添加し、その効果を増強させてもよい。免疫原性組成物およびワクチンは、皮下注射または皮内注射により非経口的に投与することができる。別の方法として、本発明にしたがって形成させた免疫原性組成物を、粘膜表面において免疫反応を誘発するような方法で製剤し、投与することもできる。すなわち、免疫原性組成物を例えば経鼻または経口（胃内）経路により、粘膜表面に投与する。さもなくば、座薬および経口製剤を含むその他の投与法が望ましい。座薬のためには、例えばポリアルカレングリコール類またはトリグリセライド類等のバインダーおよび担体を添加してもよい。経口製剤は、例えば医薬品級のサッカリン、セルロースおよび炭酸マグネシウム等の一般に使用されている添加剤を含む。これらの組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、ピル、カプセル、徐放剤、または粉末等の形態とし、約２００ｋＤａの外膜タンパクを約１〜９５％添加してもよい。免疫原性組成物およびワクチンは、用法にしたがって製剤し、治療的、予防的および免疫学的に有効量を投与する。投与量は被処置者、例えば個人の免疫系の抗体誘導能力および必要であれば細胞仲介免疫反応誘導能力によって異なる。投与すべき有効成分の正確な量は、医師の判断によるが、適当な用量範囲は当該分野の専門家によって容易に設定することができ、約２００ｋＤａの外膜タンパクとしてミリグラムのオーダーである。初回投与およびブースター投与に適当な用法も変化するが、初回投与後追加投与を行う。また、用量は投与経路に依存し、宿主の大きさによって変えてもよい。
ワクチンを含む免疫原性組成物は、免疫賦与剤として、少なくとも約２００ｋＤａタンパクをコードした遺伝子の一部または少なくとも直接免疫誘導に使用される遺伝子の一部からなるヌクレオチドベクターからなっていてもよい。
本発明に係わる免疫原性組成物中の約２００ｋＤａ外膜抗原の濃度は、一般に約１〜９５％である。１種類の病原体のみを対象とした抗原を含むワクチンは、単価ワクチンである。数種の病原体を対象とした抗原を含むワクチンは複合ワクチンであり、これも本発明に含まれる。このような複合ワクチンは、例えば各種病原体からの材料、または同じ病原体の各種系統からの材料または各種病原体の組み合わせからの材料を含む。
抗原をアジュバントと一緒に投与する（通常リン酸緩衝生理食塩水中０．０５〜０．１％溶液として使用される）と、免疫原性が著しく向上する。アジュバントは抗原の免疫原性を向上させるが、それ自体必ずしも免疫原性を有さない。アジュバントは抗原を投与部位の近くに保持し、抗原の徐々に、かつ長期にわたる免疫系細胞への放出を助長することによってデポー効果をもたらす。また、アジュバントは免疫系細胞を貯蔵抗原に誘引し、細胞の免疫反応を刺激する。
免疫賦活剤またはアジュバントは、例えばワクチンに対する宿主の免疫反応の向上に長年使用されている。リポ多糖類等の内的アジュバントは、通常ワクチンとして使用する殺菌または弱毒化細菌の成分である。外的アジュバント免疫調整物質であり、典型的に抗原と非共有結合をし、宿主の免疫反応を向上させるために製剤されている。したがって、アジュバントは非経口的に投与した抗原の免疫反応を向上させるものと考えられている。しかし、これらアジュバントの一部は毒性を有し、望ましくない副作用をもたらすため、人間および多くの動物には使用できないものもある。事実、人間および家畜用のワクチンにアジュバントとして定常的に使用されているのは、水酸化アルミニウムとリン酸アルミニウム（包括的にアルムと呼ばれている）のみである。アルムのジフテリアおよび破傷風トキソイドに対する抗体反応増強効果は広く認識されており、ＨＢｓＡＧワクチンにはアジュバントとしてアルムが使用されている。アルムの有用性はある場面ではよく認識されているが、同時に限界もある。例えば、インフルエンザワクチンにはアルムの効果が十分でなく、細胞仲介免疫反応の発現に一貫性がない。
広い範囲の外的アジュバントが、抗原の免疫反応の増強を示す。これらのアジュバントは、サポニン/膜タンパク抗原複合体（免疫賦活複合体）、鉱物油添加プルロニックポリマー、殺菌マイコバクテリア鉱物油、フロイントの完全アジュバント、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）およびリポ多糖類（ＬＰＳ）等の細菌製品、ならびに脂質Ａおよびリポソームである。
体液性免疫反応（ＨＩＲ）および細胞仲介免疫反応（ＣＭＩ）を効果的に誘導するため、典型的に抗原はアジュバントで乳化されている。多くのアジュバントは毒性を有し、顆粒腫、急性および慢性炎症（フロイントの完全アジュバント−ＦＣＡ）、細胞融解（サポニンおよびプルロニックポリマー）、発熱原性、関節炎および前ブドウ膜炎（ＬＰＳおよびＭＤＰ）を誘発する。
ＦＣＡは優れたアジュバントであり、研究に広く用いられているが、その毒性のため人間または家畜用のワクチンに使用することは承認されていない。
理想的なアジュバントの望ましい特性は、
（１）毒性を有さないこと
（２）持続性の長い免疫反応を刺激すること
（３）製造が容易で、貯蔵安定性が長いこと
（４）必要に応じて、各種の経路で投与した抗原に対してＣＭＩおよびＨＩＲの両方を発揮すること
（５）多のアジュバントと相乗効果を有すること
（６）抗原提供細胞（ＡＰＣ）と選択的な相互作用を示すこと
（７）特に適切なＴH１またはＴH２細胞特異的免疫反応を発揮すること
（８）抗原に対する適当な抗体アイソタイプレベル（例えば、ＩｇＡ）の選択的な増加を示すこと
ここに引用した１９８９年８月８日付けのLockhoffらの米国特許第４,８５５,２８３号には、免疫調整物質またはアジュバントとして、それぞれアミノ酸を介して糖残基に置換したＮ−グリコシルアミド類、Ｎ−グリコシルウレア類およびＮ−グリコシルカーバメート類が開示されている。すなわち、Lockhoffら（米国特許第４,８５５,２８３号および参考文献２７）は、糖リン脂質および糖グリセロ脂質等の天然糖脂質と構造的に類似したＮ−糖脂質類縁物質が単純疱疹ウイルスワクチンおよび仮性狂犬病ウイルスワクチンの免疫反応を増強すると報告している。直鎖アルキルアミン類と脂肪酸類を用いていくつかの糖脂質類が合成されているが、これらはアノマー炭素原子を介して糖と直接結合したもので、天然の脂質残基と同様な機能を示す。
本出願人に譲渡され、ここに引用したMolobeyの米国特許第４,２５８,０２９号には、オクタデシルチロシン塩酸塩（ＯＴＨ）が破傷風トキソイドおよびホルマリン不活性化ポリオウイルスＩ、ＩＩおよびＩＩＩ型ワクチンと複合するとアジュバントとして機能することが開示されている。また、Nixon-Georgeら（参考文献２４）は、遺伝子組換えＢ型肝炎表面抗原と複合した芳香族アミノ酸のオクタデシルエステルが宿主のＢ型肝炎ウイルスに対する免疫反応を向上させることを開示している。
また、脂質化合成ペプチドも免疫原性向上に使用されている。すなわち、Wiesmuller（参考文献２５）はグラム陰性細菌のリポタンパクのＮ−末端部分の合成類縁体であるアジュバント、すなわちトリパルミチル−Ｓ−グリセリル−システインニルセリルセリンと共役させた口蹄疫ウイルスタンパクと相同な配列を有するペプチドを報告している。さらに、Deresら（参考文献２６）は、リポペプチド、すなわちＮ−パルミチル−Ｓ−２,３−ビス（パルミチルオキシ）−（２ＲＳ）−プロピル−[Ｒ]−システイン（ＴＰＣ）に結合させることにより修飾したインフルエンザウイルス核タンパク由来合成ペプチドからなる合成リポペプチドワクチンによるウイルス特異性細胞毒性Ｔリンパ球細胞のｉｎ  ｖｉｖｏにおける初回抗原刺激を報告している。
２．免疫検定
本発明に係わる約２００ｋＤａ外膜タンパクは、抗００ｋＤａ外膜タンパク抗体の誘導を目的とした抗原として、また酵素結合免疫吸着検査法（ＥＬＩＳＡ）、ＲＩＡｓおよびその他の非酵素結合抗体結合検査法等の免疫検査法または公知の抗細菌、抗モラクセラ、抗２００ｋＤａ外膜タンパク抗体の検出手順の免疫原として有用である。ＥＬＩＳＡ検査法では、約２００ｋＤａ外膜タンパクを特定の表面、例えばポリスチレン製ミクロタイタープレート等タンパクを吸着することのできる表面に固定する。吸着が不完全な約２００ｋＤａ外膜タンパクを洗浄、除去した後、試験試料に関して抗原的に中性であることが知られている牛血清アルブミン（ＢＳＡ）溶液等の非特異的タンパクをその上に結合させる。これによって、固定表面上の非特異的吸着部位をブロックし、表面への抗血清の非特異的結合によって起こるバックグラウンドを少なくする。
ついで、免疫複合体（抗原/抗体）を形成させる場合と同様に固定表面を臨床試料または生物試料等の試験試料と接触させる。これには、ＢＳＡ溶液、牛ガンマーグロブリン（ＢＧＧ）溶液および/またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）/ツイン溶液等の希釈剤による試料の希釈が含まれる。ついで、試料を約２０〜３７℃の温度で２〜４時間インキュベーションする。インキュベーション後、試料と接触させた表面を洗浄し、免疫複合体を形成していない材料を除去する。洗浄手順は、ＰＢＳ／ツインまたは硼酸緩衝液等の溶液による洗浄を含む。試験試料と結合した約２００ｋＤａ外膜タンパクの間で特異的免疫複合体を形成させた後、洗浄し、最初の抗体に対して特異性を有する第二の抗体に免疫複合体を接触させることにより、生成した免疫複合体の定性的および定量的測定を行う。試験試料が人間に由来するものであれば、第二の抗体は人間の免疫グロブリン、一般にＩｇＧに特異的な抗体を用いる。検出手段を与えるため、第二の抗体が例えば適当な呈色基質とともにインキュベーションしたとき発色が得られるように酵素活性等の活性を持たせてもよい。ついで、例えば可視分光光度計を用いて、呈色の程度を測定することにより定量を行う。
３．ハイブリッド化のプローブとしての配列の利用
本発明に係わるヌクレオチドの配列は約２００ｋＤａタンパク遺伝子の配列からなり、ここでモラクセラ属のあらゆる菌株から約２００ｋＤａタンパク遺伝子の識別およびクローン化が可能になった。
本発明に係わる約２００ｋＤａタンパク遺伝子の配列からなるヌクレオチド配列は、別の約２００ｋＤａタンパク遺伝子の相補ストレッチと２倍体分子を選択的に形成することができることから有用である。用途に応じて各種のハイブリッド化条件を用い、他の遺伝子に対するプローブの選択性を調整することができる。高い選択性を得るためには、比較的厳密な条件、すなわち低塩濃度および/または高温条件、例えば０．０２〜０．１５ＭのＮａＣｌを用い、約５０〜７０℃の温度で２倍体を形成させる。用途によってはそれほど厳密な条件を必要としない。例えば０．１５〜０．９Ｍの塩濃度を用い、約２０〜５５℃の温度でハイブリッド化を行う。ハイブリッド化の条件は、ハイブリッドを不安定にするため、ホルムアミドの添加量を増加することによってもさらに厳密にすることができる。このように、特定のハイブリッド化条件を容易に選択することが可能で、一般に方法を選択することによって望ましい結果がえられる。一般に５０％ホルムアミドの存在下で行う共有ハイブリッド化温度は、標的フラグメントと９５〜１００％相同なプローブには４２℃、９０〜９５％相同なプローブには３７℃、８５〜９０％相同なプローブには３２℃である。
臨床診断薬の実施例で、本発明に係わる約２００ｋＤａタンパク遺伝子のヌクレオチド配列は、標識等の適当なハイブリッド化判定手段と組み合わせて用いることができる。従来広範なインジケーター手段が知られてており、これらには放射能、酵素またはアビジン/ビオチンおよびジゴキシゲニン標識等検出シグナルを提供するその他のリガンドが含まれる。また、診断薬のいくつかの実施例では、放射能標識の代わりにウレアーゼ、アルカリホスファターゼまたはペルオキシダーゼ等の酵素標識を用いてもよい。酵素標識の場合には、薬２００ｋＤａタンパク遺伝子配列を含む試料との特異的ハイブリッド化を識別するため、肉眼または分光光度計で可視化できる手段を提供する呈色指示基質が知られている。
本発明に係わる薬２００ｋＤａタンパク遺伝子のヌクレオチド配列は、溶液ハイブリッド化および固相ハイブリッド化におけるハイブリッド化プローブとして有用である。固相法を用いた実施例では、分泌物、体液（例えば、血清、羊水、中耳滲出液、痰、気管支肺胞洗浄液）または組織を含む臨床試料等の試料中の被験ＤＮＡ（またはＲＮＡ）を特定のマトリックスまたは表面に吸着させるか、さもなくば固定する。ついで、固定した単鎖核酸を、本発明に係わる約２００ｋＤａのタンパクをコードした遺伝子またはそのフラグメントまたは類縁体の核酸配列からなる特定のプローブと望ましい条件下で特異的ハイブリッド化に供する。このときの条件は、例えばＧ＋Ｃ含有量、標的核酸の種類、核酸の起源、ハイブリッド化プローブの大きさ等によって要求される特定の基準に基づいて選ぶ。ハイブリッド化表面を洗浄して非特異的に結合したプローブ分子を除去し、標識手段によって特異的ハイブリッドを検出または定量する。核酸配列は、モラクセラ属菌株が保有している部分を選ぶことが望ましい。選ぶプローブは少なくとも１８ｂｐであって、約３０〜９０ｂｐの範囲にあればよい。
４．約２００ｋＤａタンパク遺伝子の表現
宿主細胞と相容性のある種に由来するレプリコンおよび制御配列を含むプラスミッドベクターは、表現系における約２００ｋＤａタンパクをコードした遺伝子の表現に使用することができる。ベクターは通常複写部位ならびに形質変換細胞で形質表現の選択を提供するマーキング配列を有している。例えば、大腸菌はアンピシリンおよびテトラサイクリン耐性遺伝子を含むｐＢＲ３２２を用いて形質変換を行うことができ、したがって形質変換細胞を容易に識別できる手段が得られる。プラスミッドまたはファージは、宿主細胞によってそれ独自のタンパクを表現するときに使用されるプロモータを含むか、含むように修飾されなければならない。
さらに、宿主と相容性のあるレプリコンおよび制御配列を含むファージベクターは、これらの宿主と関連して形質変換ベクターとして使用することができる。例えば、ラムダＧＥＭTM−１１のファージは、大腸菌ＬＥ３９２等の宿主細胞の形質変換に使用することができる組換えファージベクターの構築に使用することができる。
組換えＤＮＡの構築に広く使用されているプロモータには、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）、ラクトースプロモータ系および米国特許第４,９５２,４９６号に記載されているようなＴ７プロモータ系等の微生物系プロモータが含まれる。プロモータのヌクレオチド配列の詳細は公知であり、当該分野の専門家はこれらのプロモータを遺伝子で結紮することができる。どのようなプロモータを用いるかは選択の問題であり、目的とする結果によって異なる。約２００ｋＤａのタンパク遺伝子、そのフラグメント、類縁体または変異体の表現に適切な宿主は、大腸菌、バチルス属、ヘノフィルス属、糸状菌、酵母、ボルデテラ属であり、またバキュロウイルス表現系を用いても良い。
本発明によると、特にモラクセラ属の培養細胞から精製した天然の約２００ｋＤａタンパクが痕跡の有毒物質または汚染物質を含んでいる場合、遺伝子組換え法によってタンパクを合成することが望ましい。このような問題は、精製物中の汚染物質が最少限となるような方法で宿主から単離できる非相同系で遺伝子工学的に合成したタンパクを用いることによって回避することができる。この点に関して特に望ましい宿主は、ＬＰＳを有さず、したがってエンドトキシンを含まないグラム陽性細菌である。このような宿主としてはバチルス属をあげることができ、特に非発熱性の約２００ｋＤａタンパク、またはそのフラグメントまたは類縁体の製造に有用である。
生物試料の寄託
ここで開示または引用したモラクセラ  カタラリス４２２３株の約２００ｋＤａ外膜タンパクをコードした遺伝子のオープンリーディングフレームを有する遺伝子の一部を含むある種のプラスミッドは、ブダペスト条約および３７  ＣＦＲ  １．８０８に基づいて、本特許出願前にアメリカン  タイプ  カルチャー（ＡＴＣＣ−12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, 20852，米国）に供託した。これらのプラスミッドに存在する各遺伝子部分の識別は図５に示す。
供託したプラスミッドのサンプルは、本米国特許が成立した時点で入手することができる。供託した実施例は本発明を説明することが目的であったに過ぎず、ここに開示し、請求した発明は供託したプラスミッドによって範囲が限定されるものではない。ここに開示した抗原と同等または類似の抗原をコードした同等または類似のプラスミッドは、本発明の範囲に含まれる。
0003771265.tif 000003
実施例
上記の開示は、本発明の一般的記載である。以下の実施例を参照することにより、本発明をより完全に理解することができる。これらの実施例は、本発明を説明することのみを目的としたもので、本発明の範囲を限定するものではない。形態の変更および同等品による置換は、模倣とみなすべきである。ここでは特定の用語を使用したが、これらの用語は記述のために用いたものであり、制限を目的としたものではない。
分子遺伝学、タンパク生化学および免疫学の方法を用いたが、本開示では正確に記載されているとはいえないが、当該技術分野の専門家には容易に理解できる範囲にある。
実施例１
この実施例はモラクセラ  カタラリスの非集塊菌株（ＲＨ４０８）の培養を説明するものである。
脳加熱輸液（ＢＨＩ）ブロス２０ｍＬを含む数本のフラスコにモラクセラ  カタラリスの集塊株（モラクセラ属細菌の一般的性質）４２２３株を接種し、３７℃で一夜振とう培養した。各一夜培養液から５ｍＬを採り、それぞれ1mL容の試験管５本に移し、３〜８時間室温に静置して細菌を沈殿させた。各培養液の透明な上清１００μＬを用い、２５ｍＬのＢＨＩブロスに接種し、上記と同様に３７℃で一夜培養した。透明な培養液２５μＬを２５ｍＬのＢＨＩに接種し、それぞれ一夜培養し、このような植継ぎを６回繰り返した。植継ぎ菌株の沈降率をもとのモラクセラ  カタラリス４２２３株と比較するため、３時間ごとにＡ578における吸光度を測定することにより、非集塊細菌を識別した。モラクセラ  カタラリスＲＨ４０８株を含む非集塊変異株は、３時間で凝集しなかった。ＲＨ４０８株は、ＢＨＩ寒天培地上で全ての非集塊菌株に特有な形態のコロニーを形成した。ＲＨ４０８株は、すでにブダペスト条約に基づき米国特許第０８/３２８,５８９に関連してＡＴＣＣに供託した（１９９４年１２月１３日、供託番号５５６３７）。
実施例２
この実施例は、モラクセラ  カタラリスの約２００ｋＤａの外膜タンパクの識別を説明するものでる。
モラクセラ  カタラリス４２２３、ＲＨ４０８、５１９１、８１８５、Ｍ２、Ｍ５、ＡＴＣＣ  ２５２４０、３、５６、１３５、５８５株をＢＨＩブロスに接種し、通気しながら３７℃で一夜培養した。
モラクセラ  カタラリスの細胞を超音波処理し、ＢＣＡ検査系（Pierce, Rockford, IL）を用い総タンパクを測定した。０．３ＭトリスＨＣｌ（ｐＨ  ８．０）、５０％グリセロール、１０％ＳＤＳ、２０％β−メルカプトエタノールおよび０．０１％ブロモフェノールブルーを含むＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液と総タンパク１０μｇを混合し、５分間煮沸し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（厚さ０．７５ｍｍ、７．５％アクリルアミド）の各レーンに載せた。２００Ｖで１時間展開した。０．１３％クーマシーブリリアントブルー、１０％酢酸および４５％メタノールを含む溶液でタンパクを染色した。５％エタノールおよび７．５％酢酸からなる洗浄液で洗浄し、過剰な染料を除いた。
この手順で分離した各種モラクセラタンパクを図１Aおよび１Bに示す。試験したモラクセラ  カタラリス菌株は、以下の通りであった。
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0003771265.tif 000005
約２００ｋＤａの外膜タンパクは、すべての中耳炎菌株（モラクセラ  カタラリス４２２３、５１９１および１３５株）から明瞭に認められ、鼻咽頭から分離した１株（８１８５）および痰から分離した１株（Ｍ２）からも検出された。しかし、痰から分離した３株（３、５６およびＭ５）および起源不明の１株（ＡＴＣＣ  ２５２４０）からは、約２００ｋＤａの外膜タンパクが検出されなかった。菌血症の患者の血液から分離した菌株（５８５）からはきわめて狭いバンドが認められ、このバンドは免疫ブロットで抗２００ｋＤａ特異的モルモット血清が識別した。ＲＨ４０８株は４２２３株から分離した自然発生的非集塊変異株（実施例１参照）であり、約２００ｋＤａタンパクを表現しないことが確認された。
さらに長時間展開すると、モラクセラ  カタラリスの各種菌株で、約２００ｋＤａ外膜タンパクの見かけ分子量に差が認められた（図２）。図２で分析した菌株は、以下の通りであった。
0003771265.tif 000006
Ｈ１２株（レーン３）は中耳液から分離した天然株であったが、約２００ｋＤａのタンパクを産生しなかった。
約２００ｋＤａの範囲には、少なくとも３種類の分子量の異なるタンパクが存在しているものと考えられる。しかし、モラクセラ  カタラリスの１株（４２２３）の約２００ｋＤａ外膜タンパクで誘導した抗体は、モラクセラ  カタラリスの各種菌株に存在する約２００ｋＤａのタンパクを識別することができなかった。しかし、特に免疫組成物では例えばワクチンとして、また特に診断薬の実施例では、各種モラクセラ  カタラリス分離株（免疫学的に広い分離株）からの約２００ｋＤａの外膜タンパクを必要とするものと考えられる。
実施例３
この実施例は、モラクセラ  カタラリスによる中耳炎が回復期にある患者から採取した血清中の約２００ｋＤａ外膜タンパクに特異的な抗体の検出について説明する。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した細菌タンパクを、ポリアクリルアミドゲルから調製したＰＶＤＦ（臭化ポリビニリデン；Millipore）メンブランに移し、３ｇ/Ｌのトリス、１４．４ｇ/Ｌのグリシンおよび２００ｍＬ/Ｌのメタノールからなる緩衝液中、４℃、７０Ｖの一定電圧で１．５時間展開した。移したタンパクを含むメンブランをＴＢＳ（０．１Ｍトリス、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ）で希釈したブロック試薬（Boehringer Mannheim製）を用い室温で３０分間ブロックし、た。ブロットを、０．１％ツイン２０を含むブロック試薬/ＴＢＳで１：５００に希釈した回復期抗血清に室温で２時間暴露させた。この患者は中耳炎に罹っており、中耳液から分離したモラクセラ  カタラリスはモラクセラ  カタラリスＣＪ７であった。ついで、ブロットをツイン添加ブロック試薬/ＴＢＳ中で、１回１５分間、合計２回洗浄した。レポーター抱合体、タンパクＧと抱合体を形成させたカラシペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）をツイン添加ブロック試薬/ＴＢＳで１：４０００に希釈し、洗浄したメンブランを室温で３０分間浸漬した。ブロットを上記のように２回洗浄し、ついでＴＢＳで洗浄した。ＬｕｍｉＧｌｏ(Kirkegaard and Perry)化学蛍光検出システムを用い、製造業者の指針にしたがって結合抗体を検出した。処理したブロットをＸ−線フィルムに露出した。この回復期血清から検出された抗体は、モラクセラ  カタラリスＣＪ７の約２００ｋＤａ外膜タンパクと反応した。これらの結果から、約２００ｋＤａの外膜タンパクはモラクセラ  カタラリスの免疫原性タンパクであり、モラクセラ  カタラリスによる自然感染の過程で免疫反応が発現したものと考えられる。
実施例４
この実施例は、約２００ｋＤａ外膜タンパクの単離、精製を説明するものである。
２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行い、モラクセラ  カタラリス４２２３細胞を収穫し、凍結した。凍結細胞を解凍し、２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）に懸濁させ、細胞が破壊されるまで超音波処理をした。また、凍結し、解凍した細胞を、４％ＳＤＳおよび０．２ｍＭのＥＤＴＡを含む２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８）中で５分間煮沸し、細胞溶融を行い、細胞溶融液を得た。超音波による細胞抽出液および細胞溶融液をＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）試料緩衝液に懸濁させ、５分間煮沸し、ゲル（厚さ１．５ｍｍ、７．５％アクリルアミド）上のＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。ゲル上の約２００ｋＤａタンパクの推定位置を切り取り、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ展開緩衝液と同じ緩衝液を用いた電気溶出によりゲルからタンパクを抽出した。単離した約２００ｋＤａの外膜タンパクは、図３に示すようにＳＤＳ−ＰＡＧＥで均一な単一バンドであることが確認された。図３で分析した試料は、以下の通りである。
0003771265.tif 000007
図３に示す単離、精製したモラクセラ  カタラリスの２００ｋＤａの外膜タンパクの純度は、少なくとも７０％であった。少なくとも純度９５％の精製した約２００ｋＤＡの外膜タンパクを容易に得ることができた。
実施例５
この実施例では、モラクセラ  カタラリスから精製した約２００ｋＤａタンパクによるモルモットの免疫賦与を説明する。
電気溶出によりモラクセラ  カタラリス４２２３株から単離した約２００ｋＤａタンパク約３０〜４０μｇをフロイントの完全アジュバント（ＦＣＡ）と混合し、モルモットに皮下注射した。２週間後に、ほぼ同じ量の約２００ｋＤａタンパクとフロイントのアジュバント（ＩＦＡ）の混合物を動物に追加免疫投与した。２週間後にモルモットから血液を採取し、抗血清を得た。
抗血清１点について、世界の各地（カナダ、米国およびフィンランド）から分離された５４種類のモラクセラ  カタラリス菌株に存在する約２００ｋＤａタンパクとの反応性をウエスターンブロット法で検査した（下表１を参照）。約２００ｋＤａタンパクは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのクーマシーブリリアントブルー染色で約２００ｋＤａタンパクの存在が確認された全ての菌株の抗血清を識別した。これらの結果から、約２００ｋＤａタンパクに共通のエピトープが、このタンパクを有する全てのモラクセラ  カタラリス菌株に存在しているものと考えられる。さきにも述べたように、このタンパクは必ずしもモラクセラ  カタラリスの全ての菌株に存在しているとは限らないが、中耳炎患者の中耳液から分離したほとんど全ての菌株はこのタンパクを有している（表１）。
実施例６
この実施例は、ＥＬＩＳＡ検査法による抗２００ｋＤａタンパクモルモット血清によるモラクセラ  カタラリス４２２３株の特異的識別について説明するものである（下表２参照）。
モラクセラ  カタラリス４２２３、ＲＨ４０８（２００ｋＤａタンパク陰性変異株）およびＨ−１２株を６０ｍＬのＢＨＩブロス中で一夜培養した。大腸菌ＢＬ２１株（ＤＥ３）も、６０ｍＬのブロス中で一夜培養した。培養液を３本の遠心管に分け、遠心分離した。
モラクセラ  カタラリス４２２３株は、１５００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。Ｈ−１２株は２０００ｒｐｍで１０分間、ＲＨ４０８株および大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）は３０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。１本の遠心管中のペレットをダルベコーのリン酸緩衝生理食塩水（Ｄ−ＰＢＳ）２０ｍＬに懸濁させ、ｐＨ９．６のコーティング緩衝液（０．０５Ｍの炭酸/重炭酸緩衝液）で１/５００に希釈した。細菌懸濁液１００μＬを各ウエルに接種し、室温で１時間培養した。０．２％グルタールアルデヒド１００μＬを各ウエルに添加し、室温で１０分間培養して細胞をウエルに付着させた。０．１％ツインおよび０．１％ＢＳＡ（洗浄用緩衝液）を含むＰＢＳでウエルを洗浄し、０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳを用い室温で３０分間ブロックした。洗浄用緩衝液で１０秒間、５回洗浄した後、洗浄用緩衝液でモルモット抗血清を連続希釈し、ウエルに接種し、室温で６０分間培養を続けた。洗浄後、カラシペルオキシダーゼと抱合体を形成させたヤギ抗モルモットＩｇＧを１/２０、０００の比で各ウエルに添加した。室温で６０分間培養した後、ウエルを洗浄し、３，３，５，５−テトラメチルベンジデン（ＴＭＢ）および過酸化水素を用いて呈色させた。
また、ＥＬＩＳＡプレートウエルを、総タンパク１０μｇ/ｍＬの超音波抽出液をコーティング緩衝液に懸濁させてコーティングを行い、固定操作を行わずブロックし、上記と同様に検査した。
表２に示す結果から、約２００ｋＤａ外膜タンパク特異性モルモット抗血清は約２００ｋＤａのタンパクを産生するモラクセラ  カタラリスの菌株を識別するものと考えられる。抗血清は無傷の細胞でも識別することから、タンパクは細菌細胞の表面に存在しているものと考えられる。
実施例７
この実施例では、２００ｋＤａ外膜タンパクの内部アミノ酸配列の測定について説明する。
上記のように、電気溶出を用い、モラクセラ  カタラリス４２２３株から約２００ｋＤａ外膜タンパクを単離した。タンパクをＣＮＢｒ分解に供し、タンパク分解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ＰＶＤＦメンブランに移した。約４０ｋＤａに相当する位置に移動するペプチドをメンブランから切り取り、そのＮ−末端アミノ酸配列を測定した。別の実験では、約２００ｋＤａタンパクのＣＮＢｒ分解産物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離することなく、直接Ｎ−末端アミノ酸配列の測定に供した。両分析で２０個のアミノ酸と１７番目に位置する１個の未同定アミノ酸からなる全く同じＮ−末端配列が認められた。２００ｋＤａ外膜タンパクの内部配列は、
ＮＨ2−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−ｘ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ（配列番号５）であった。
実施例８
この実施例は、約２００ｋＤａ外膜タンパクの内部フラグメントに相当するペプチドによるモルモットの免疫賦与および生成した抗血清の分析について説明するものである。
上記のように約２００ｋＤａ外膜タンパクの内部フラグメントのアミノ酸配列を測定した結果に基づいて、アミノ酸１６個からなるペプチドの配列、すなわちＮＨ2−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ（配列識別番号６）を、標準的な手順にしたがって合成した。
インジェクト  マレイミド  アクチベーテッドＫＬＨ（Pierce, Rockford, IL）をもちいて、この１６員ペプチドをＫＬＨと抱合体を形成させ、上記と同じ免疫投与およびブースター投与計画にしたがって抱合体約５００μｇをモルモットに注射した。１６員内部アミノ酸配列（配列識別番号６）で誘導されたモルモット抗血清を免疫ブロット分析で検査したところ、モラクセラ  カタラリス４２２３株の超音波細胞抽出液中の２００ｋＤａ外膜タンパクを特異的に識別することが確認された。結果は図４に示すが、抗ペプチドモルモット抗血清はモラクセラ  カタラリス４２２３株の２００ｋＤａタンパクを特異的に識別することが認められた。図４で分析した試料は、以下の通りであった。
0003771265.tif 000008
得られた結果から、配列識別番号５および６に相当するペプチドが２００ｋＤａ外膜タンパクから得られたことが確認された。
実施例９
この実施例では、モラクセラ  カタラリスのゲノムライブラリーの作成について説明する。
染色体ＤＮＡは、以下のように単離した。
モラクセラ  カタラリス細胞ペレットを２０ｍＬのトリス−ＥＤＴＡ（ＴＥ）緩衝液（ｐＨ７．５）に再懸濁させた。プロナーゼ（最終濃度５００μｇ/ｍＬ）およびＳＤＳ（最終濃度１％）を添加し、懸濁液を３７℃で２時間インキュベーションした。フェノールで１回、フェノール−クロロホルム（１：１）で２回、クロロホルム−イソアミルアルコール（２４：１）で１回順次抽出して、ＤＮＡを単離した。抽出したＤＮＡを４℃で１ＭのＮａＣｌに対して４時間透析した。さらに、４℃でＴＥ緩衝液（ｐＨ７．５）に対して４８時間透析した（緩衝液は３回交換）。透析液にエタノールを添加し、ＤＮＡを沈殿させた。ガラス棒で撹拌して分子量の大きいＤＮＡを集め、風乾し、３ｍＬの水に溶解させた。染色体ＤＮＡ（最終容量１０μＬ）の小規模Ｓａｕ３Ａ（New England BioLabs）制限消化を行い、分子量１５〜２３ｋｂの染色体ＤＮＡをできるだけ多量に得るための条件を検討した。最適消化条件を確立した後、大規模消化を１回行った。大規模消化は、以下の条件で行った。染色体ＤＮＡ（２９０μｇ/ｍＬ）５０μＬ、水３３μＬ、Ｓａｕ３Ａ緩衝液(New England BioLabs)１０μＬ、ＢＳＡ（１０ｍｇ/ｍＬ，New England BioLabs）１μＬ、Ｓａｕ３Ａ（０．０４U/μＬ）６．３μＬ、３７℃で１５分間インキュベーション。１０倍のローディング緩衝液（１００ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ８、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％ブロモフェノールブルー、５０％グリセロール）１０μＬを添加して、反応を停止させた。消化したＤＮＡを０．５％アガロースゲル（トリス−酢酸−ＥＤＴＡ（ＴＡＥ）で調製）に載せ、５０Ｖで５時間分画した。分子量１５〜２３ｋｂのＤＮＡに相当するゲルの部分を切り取り、３ｍＬのＴＡＥを入れた透析管（ＢＲＬ）に移した。１Ｖ/ｃｍの電流を一夜流し、ＤＮＡをゲル切片から溶出させた。電気溶出させたＴＡＥ中のＤＮＡをフェノールで１回、フェノール−クロロホルム（１：１）で１回抽出し、エタノールを加えて沈殿させた。乾燥させたＤＮＡペレットを、水５μＬに溶解させた。分子量分画した染色体ＤＮＡを最終容量９μＬとし、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用い、ＢａｍＨＩカットＥＭＢＬ３アーム（Promega）で結紮した。市販の詰め込みキット(Amersham)を用い、製造業者のプロトコールにしたがって全体の結紮反応をファージλ中に詰め込んだ。
詰め込んだＤＮＡライブラリーを固体培地上に増幅させた。これは、１０ｍＭのＭｇＳＯ4に懸濁させた大腸菌ＮＭ５３９株細胞を詰め込みＤＮＡライブラリー１５〜２５μＬとともに３７℃で１５分間インキュベーションして行った。吸着したファージとともに細菌を３ｍＬのＢＢＬトップ−アガロース（寒天の代わりに０．６％のアガロースを用いた以外、ＢＢＬプレートと同じ）を用いてＢＢＬプレート（１ＬあたりＢＢＬトリプティケースペプトン１０ｇ、ＮａＣl  ５ｇ、寒天１５ｇ）に播種し、３７℃で一夜インキュベーションした。プレートに３ｍＬのＳＭ緩衝液（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、８ｍＭのＭｇＳＯ4、１００ｍＭのＮａＣｌ、0.01％のジェラチン）を加えてトップ−アガロースからファージを溶出し、４℃に７時間放置した。ファージを含むＳＭ緩衝液をプレートから集め、ねじ蓋付き試験管に移し、クロロホルムを添加して４℃で保存した。
実施例１０
この実施例では、モラクセラ  カタラリスの２００ｋＤａ外膜タンパクをコードした遺伝子のクローニングについて記載する。
抗２００ｋＤａタンパクモルモット抗血清を用い、ファージ  ラムダＥＭＢＬ３中のモラクセラ  カタラリスのゲノムライブラリーをスクリーニングした。約２００ｋＤａのタンパクを表現したラムダファージクローン８ＩＩは、約２００ｋＤａ外膜特異性抗血清を用いたファージ溶融液の免疫ブロット検査で確認した。
この遺伝子組換えファージのプレート培養細胞溶融液を調製し、ウイザード  ラムダ  プレップ  ＤＮＡ精製システム（Promega Corp, Madison, WI）を用い、製造業者の指針にしたがってプレート溶融液からＤＮＡを抽出した。このファージクローンは、分子量薬１６ｋｂのＤＮＡ挿入物を有する（その制限マップは図５に示す）。ファージＤＮＡを制限酵素ＳａｌＩとＸｈｏＩの混合物で消化し、アガロースゲル電気泳動で分離した。分子量約５ｋｂと１１ｋｂの２本のＤＮＡバンドをゲルから切り取り、ジェネクリーンキット（BIO 101 Inc., LaJolla, CA）を用い、製造業者の指針にしたがって抽出した。
分子量の小さい５ｋｂのフラグメントを、あらかじめＳａｌＩおよびＸｈｏＩで消化したプラスミッドベクター、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ  ＋／−（Stratagene Cloning Systems, LaJolla, CA）に結紮し、プラスミッドｐＫＳ５を構築した。大きな１１ｋｂフラグメントはプラスミッドベクターｐＳＰ７２(Promega Corp., Madison, WI)中に結紮し、プラスミッドｐＫＳ９を構築した。両結紮プラスミッドを用い、大腸菌ＤＨ５αの形質変換を行った。
また、ＸｈｏＩとＫｐｎＩの混合物を用いてラムダファージＤＮＡの消化を行い、上記と同様にアガロースゲル分画により約１．２ｋｂのフラグメントを分離した。この１．２ｋｂフラグメントをプラスミッドベクターｐＧＥＭ−７Ｚｆ（＋）(Promega Corp., Madison, WI)に結紮し、プラスミッドｐＫＳ４７を構築した。プラスミッドクローンの制限マップを図５に示す。
実施例１１
この実施例では、モラクセラ  カタラリスの約２００ｋＤａ外膜タンパクをコードした遺伝子の配列について記載する。
約２００ｋＤａの外膜タンパクをコードした遺伝子の配列は、アプライド  バイオシステムス  シーケンサーを用いて分析した。プラスミッドｐＫＳ５における挿入ＤＮＡの１本鎖の配列は、エレーズ−エー−ベース  システム（Promega Corp., Madison, WI）を用いて重生欠失セットを構築した後分析した。まずＸｈｏＩおよびＫｐｎＩでプラスミッドｐＫＳ５を消化し、エキソヌクレアーゼＩＩＩで処理し、挿入ＤＮＡに重生欠失セットを生成させ、最後に製造業者の指針にしたがって再環化した。このようにして欠失を起こさせた一連のプラスミッドを用い、大腸菌ＤＨ５αの形質変換を行った。クイアゲン  ミディ  プラスミッド単離キット(Qiagen)を用いて形質変換株からプラスミッドを単離し、制限酵素で消化した後、アガロースゲル電気泳動によりプラスミッドの分子量を検査した。欠失を有するプラスミッドの挿入ＤＮＡは、プライマーとしてバクテリオファージＴ７プロモーターシーケンスを用い配列を分析した。
配列に基づいて、ヌクレオチドプライマーを合成した。合成したヌクレオチドプライマーを用い、エレーズ−エー−ベース  システムでは配列の分析ができなかった配列ギャップを測定した。
プラスミッドｐＫＳ４７およびｐＫＳ７１における挿入ＤＮＡの配列は、合成ヌクレオチドプライマーを用い、両端から分析した。遺伝子のヌクレオチド配列は、図６（配列識別番号２）に示すようにモラクセラカタラリスの約２００ｋＤａ外膜タンパクをコードした遺伝子のオープンリーディングフレームを有する。この配列は、以下のヌクレオチド配列を含み、
５’−ＡＡＴＧＴＣＡＡＡＴＣＡＧＴＣＡＴＴＡＡＣＡＡＡＧＡＡＣＡＡＧＴＡＡＡＴＧＡＴＧＣＣＡＡＴＡＡＡＡＡＧＣＡＡＧＧＣＡＴＣ−３’（配列識別番号９）
上記のように測定した約２００ｋＤａ外膜タンパク（配列識別番号５）の内部アミノ酸配列をコードしている。このような結果は、クローン遺伝子がモラクセラ  カタラリスの約２００ｋＤａ外膜タンパクをコードした遺伝子のオープンリーディングフレームを有することと一致した。この遺伝子は１９９２個のアミノ酸からなるタンパクをコードし、算出した分子量は２０４,６７７で、算出したアミノ酸組成は表IIIに示す通りである。タンパクの推定アミノ酸配列は、図６（配列識別番号３）に示す。
実施例１２
この実施例では、モラクセラ  カタラリスの約２００ｋＤａ遺伝子をコードした遺伝子の開始コドンの同定について記載する。
２００ｋＤａタンパク遺伝子の翻訳開始コドンおよびプロモーター領域を同定するため、ｐＫＳ５およびｐＫＳ４７からプラスミッドｐＫＳ８０を構築した（図５）。この構築物は、ＡＴＧの上流約２５０個の塩基対のＤＮＡからなる。ＫｐｎＩおよびＸｈｏＩで、プラスミッドｐＫＳ５を消化した。０．８％アガロースゲルで消化物を分離し、約８ｋｂのＤＮＡフラグメントをゲルから切り取り、抽出した。また、別のプラスミッドｐＫＳ４７を２種類の酵素で消化し、約１．１ｋｂのＤＮＡフラグメントを抽出した。１．１ｋｂのフラグメントを８ｋｂのフラグメントに結紮し、ｐＫＳ８０を構築した。抗２００ｋＤタンパクモルモット血清を用いたウエスターンブロット分析では、ｐＫＳ８０を有する形質変換体の溶融液から２００ｋＤタンパクを検出することができなかった。
大腸菌で表現されるためには構築物が長すぎるのか否か確認するため、図８に示すように大きさの異なる３種類のＣ−末端切断物を構築した。まず、ｐＫＳ８０中の挿入ＤＮＡ全体をＫｐｎＩおよびＢａｍＨＩによる消化で切断した後、あらかじめ同じ２種類の酵素で消化した別のベクタープラスミッドｐＧＥＭ７Ｚｆ（＋）（Promega, Madison, WI）に挿入した。得られたプラスミッドｐＫＳ１０５をゲル精製した次の酵素（１）ＨｉｎｄＩＩＩ、（２）ＨｐｓＩおよびＳｍａＩまたは（３）ＥｃｏＲＶのいずれかでさらに消化し、再環化し、それぞれｐＫＳ１３０、ｐＫＳ１３６およびｐＫＳ１４４を構築した。ｐＫＳ１３０、ｐＫＳ１３６およびｐＫＳ１４４のいずれで形質変換した大腸菌の変異株も、抗２００ｋＤタンパクモルモット血清を用いたウエスターンブロット法で検査したとき、トランケートタンパクの産生は認められなかった。
ついで、開始コドンがＧＴＧか否か、プロモーター領域がＧＴＧよりもさらに上流にあるのか否か検討するため、ＡｐａＩおよびＫｐｎＩを用いて約０．９ｋｂのフラグメントをｐＫＳ７１から切り離し、あらかじめＡｐａＩおよびＫｐｎＩで消化したｐＫＳ１３０、ｐＫＳ１３６およびｐＫＳ１４４に結紮した。ｐＫＳ７１からの０．９ｋｂフラグメントはＮｃｏＩ−ＫｐｎＩフラグメントを有し、ＧＴＧから約７００ｂｐ上流に開始コドンＧＴＧを含んでいると思われる（図８）。
得られた構築物ｐＫＳ１５９、ｐＫＳ１４９およびｐＫＳ１５５は、ウエスターンブロット法で抗２００ｋＤａタンパクモルモット血清によって識別されるトランケートタンパクを産生した。また、ＡｐａＩおよびＫｐｎＩフラグメントをＣ−末端トランケートを有さないｐＫＳ１０５に結紮し、ｐＫＳ１６４を構築した。ｐＫＳ１６４を有する形質変換体は完全長の２００ｋＤａタンパクを産生し、ウエスターンブロットで同じ抗血清で識別された。これらの結果から、大腸菌独自のプロモーターから約２００ｋＤａタンパク遺伝子を表現するためには、ＧＴＧコドンおよびその上流配列を含む遺伝子の５’−領域が必要であり、約２００ｋＤａタンパク遺伝子の翻訳開始コドンはＧＴＧであると考えられる。
遺伝子の開始コドンがＧＴＧであることを確認するため、図６に示すヌクレオチド配列から推定されたアミノ酸配列にしたがって、図９に示す２種類のペプチドを合成した。ペプチド１（Ｐｅｐｔｉｄｅ１；配列識別番号１２）はＧＴＧ開始コドンから３０個のアミノ酸を有し、ペプチド２（Ｐｅｐｔｉｄｅ２；配列識別番号１２）は次の３０個のアミノ酸を有するペプチドであった。図６では、ペプチドを下線で示す。モルモットでこれら２種類のペプチドに対する抗血清を誘導させ、抗血清を得た。図１０に示すように、これら２種類のペプチドで誘導された抗血清は、ウエスターンブロットで、モラクセラ  カタラリス４２２３株の２００ｋＤａタンパクを明らかに識別した。モラクセラ  カタラリス４２２３株を超音波抽出した。超音波抽出物中のタンパクをＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離し、ＰＶＤＦメンブランに移した。メンブランを帯状に切り、第一の抗体として抗ペプチド１または抗ペプチド２モルモット血清で処理した。第二の抗体として、カラシペルオキシダーゼ（Jackson ImmunoResearch Lab. Inc., West Grove, PA）と抱合体を形成させたヤギ抗モルモットＩｇＧを用いた。最後にメンブランをＣＮ／ＤＡＢ基質（Pierce, Rockford, IL）で処理し、呈色させた。レーン１：あらかじめ染色した分子量マーカー、レーン２：抗２００ｋＤタンパク血清、レーン３：モルモット１の抗ペプチドＩ血清、レーン４：モルモット１からあらかじめ採取した血清、レーン５：モルモット２の抗ペプチド１血清、レーン６：モルモット１からあらかじめ採取した血清、レーン７：モルモット３の抗ペプチド２血清、レーン８：
モルモット３からあらかじめ採取した血清、レーン９
：モルモット４の抗ペプチド２血清、レーン１０：
モルモット４からあらかじめ採取した血清
図１０に示す結果から、ＧＴＧは約２００ｋＤａタンパクをコードした遺伝子の翻訳開始コドンであると考えられる。
ＧＴＧで開始される約２００ｋＤａタンパク遺伝子のコード配列は５９７６ｂｐであり、１９９２個のアミノ酸からなるタンパクをコードし、算出した分子量は２０４,６７７である。２００ｋＤａタンパク遺伝子の位置を図５に示す。ＮｃｏＩとＳａｌＩの間の配列およびそのアミノ酸翻訳を図６に示す。約２００ｋＤａタンパクの計算により求めたアミノ酸組成は表IIIに示す。
Ｔ７プロモーターの制御下で大きさの異なる２種類のＮ−末端トランケート遺伝子を構築するため（図１１参照）、約２００ｋＤａタンパク遺伝子の約１．９ｋｂ３’−領域を有するＳｃａＩ−ＳａｌＩフラグメントをｐＫＳ５から切り取り、約４．８ｋｂ３’−領域を有するＰｖｕＩＩ−ＳａｌＩフラグメントをｐＫＳ８０から切り取った。２種類のフラグメントをあらかじめSmaIおよびSalIで消化したプラスミッドｐＴ７−７に結紮し、それぞれｐＫＳ９４およびｐＫＳ９１を構築した。これらの結紮により、ベクターから７個のＮ−末端アミノ酸を有する１．９ｋｂおよび４．８ｋｂの３’−領域の融合が得られた。ｐＫＳ９４またはｐＫＳ９１のいずれかを有する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）/ｐＬｙｓＳの形質変換株をＩＰＴＧで誘導すると、多量のＮ−末端トランケート２００ｋＤａタンパクを産生した。図１２は、ｐＫＳ９４プラスミッドを有する形質変換体の１つによるトランケートタンパクの表現を示すウエスターンブロットである。
約２００ｋＤａタンパク遺伝子の３’−５．５ｋｂフラグメントのＬａｃＺ融合は、図１１に示す通りである。約２００ｋＤａのタンパク遺伝子の３’−５．５ｋｂ領域を含む５．８ｋｂのフラグメントはＰｓｔＩ消化によってｐＫＳ８０から切除し、ゲルで精製し、あらかじめ同じ酵素で消化したｐＧＥＭ５Ｚｆ（＋）（Promega, madison, WI）に結紮した。同一方向に遺伝しを有し、LacZαペプチドとしてリーディングフレームを有する大腸菌ＤＨ５αクローンを、制限酵素分析によって選んだ。これらのクローンは、図１３に示すように本質的に融合タンパクを表現した。
開示の要約
開示を予約すると、本発明は約２００ｋＤａの分子量を有するモラクセラ属菌株、特にモラクセラ  カタラリスの単離、精製した外膜タンパクならびに外膜タンパクをコードした単離、精製したＤＮＡ分子を提供する。また、本発明は外膜タンパクの一部に相当する類縁体、トランケートおよびペプチドを提供する。タンパク、ＤＮＡ配列、これらに由来する組換えタンパクおよびペプチドは、診断、免疫賦与、および診断薬および免疫学的試薬の製造に有用である。本発明の範囲内で修飾が可能である。
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参考文献：
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７（ａ）】
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【図７（ｂ）】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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