(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
膜結合融合タンパク質を有する複製阻害された細胞を含み、該膜結合融合タンパク質が異種膜付着ドメインに作動可能に融合した生物学的に活性なサイトカイン、または該サイトカインの活性フラグメントを含む、ワクチンであって、ここで、該生物学的に活性なサイトカインが顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）である、ワクチン。
【請求項２】
前記複製阻害された細胞が原核生物細胞である、請求項１に記載のワクチン。
【請求項３】
前記複製阻害された細胞が真核生物細胞である、請求項１に記載のワクチン。
【請求項４】
前記真核生物細胞が線維芽細胞である、請求項３に記載のワクチン。
【請求項５】
前記真核生物細胞が腫瘍細胞である、請求項３に記載のワクチン。
【請求項６】
前記腫瘍細胞が、メラノーマ細胞、腎臓ガン腫細胞、神経芽細胞腫細胞、グリア芽細胞腫細胞、肺ガン細胞、結腸腫瘍細胞、乳房腫瘍細胞、前立腺腫瘍細胞、膀胱ガン腫細胞および形質細胞腫細胞からなる群から選択される、請求項５に記載のワクチン。
【請求項７】
前記複製阻害された細胞がさらに疾患関連抗原またはその免疫原性エピトープを有する、請求項１に記載のワクチン。
【請求項８】
前記疾患関連抗原が前記複製阻害された細胞に対して内因性である、請求項７に記載のワクチン。
【請求項９】
前記疾患関連抗原が前記複製阻害された細胞に対して外因性である、請求項７に記載のワクチン。
【請求項１０】
前記疾患関連抗原が、腫瘍関連抗原、自己免疫疾患関連抗原、感染性疾患関連抗原、ウイルス抗原、寄生虫抗原、および細菌抗原からなる群から選択される、請求項７に記載のワクチン。
【請求項１１】
前記腫瘍関連抗原が、ｐ５３およびその変異体、Ｒａｓおよびその変異体、Ｂｃｒ／Ａｂｌ切断点ペプチド、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＨＰＶ  Ｅ６、ＨＰＶ  Ｅ７、ガン胎児抗原、ＭＵＣ−１、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ−Ｖ、ｐ１５、ｇｐ１００、ＭＡＲＴ−１／ＭｅｌａｎＡ、チロシナーゼ、ＴＲＰ−１、β−カテニン、ＭＵＭ−１およびＣＤＫ−４からなる群から選択される、請求項１０に記載のワクチン。
【請求項１２】
前記自己免疫疾患関連抗原がＴ細胞レセプター由来のペプチドである、請求項１０に記載のワクチン。
【請求項１３】
前記疾患関連抗原またはその免疫原性エピトープが、前記膜結合融合タンパク質に作動可能に融合する、請求項７に記載のワクチン。
【請求項１４】
疾患関連抗原に対する免疫応答を調節するための薬学的組成物であって、該組成物は複製阻害された細胞を含むワクチンを含み、該細胞が：
（ａ）疾患関連抗原またはその免疫原性エピトープ、および
（ｂ）異種膜付着ドメインに作動可能に融合した生物学的に活性なサイトカイン、または該サイトカインの活性フラグメントを有する、組成物であって、ここで、該生物学的に活性なサイトカインが顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）である、組成物。
【請求項１５】
前記複製阻害された細胞が原核生物細胞である、請求項１４に記載の薬学的組成物。
【請求項１６】
前記複製阻害された細胞が真核生物細胞である、請求項１４に記載の薬学的組成物。
【請求項１７】
前記真核生物細胞が線維芽細胞である、請求項１６に記載の薬学的組成物。
【請求項１８】
前記真核生物細胞が腫瘍細胞である、請求項１６に記載の薬学的組成物。
【請求項１９】
前記腫瘍細胞が、メラノーマ細胞、腎臓ガン細胞、神経芽細胞腫細胞、グリア芽細胞腫細胞、肺ガン細胞、結腸ガン細胞、乳ガン細胞、前立腺ガン細胞、膀胱ガン腫細胞および形質細胞腫細胞からなる群から選択される、請求項１８に記載の薬学的組成物。
【請求項２０】
前記疾患関連抗原が前記複製阻害された細胞に対して内因性である、請求項１４に記載の薬学的組成物。
【請求項２１】
前記疾患関連抗原が前記複製阻害された細胞に対して外因性である、請求項１４に記載の薬学的組成物。
【請求項２２】
前記疾患関連抗原が、腫瘍関連抗原、自己免疫疾患関連抗原、感染性疾患関連抗原、ウイルス抗原、寄生虫抗原、および細菌抗原からなる群から選択される、請求項１４に記載の薬学的組成物。
【請求項２３】
前記腫瘍関連抗原が、ｐ５３およびその変異体、Ｒａｓおよびその変異体、Ｂｃｒ／Ａｂｌ切断点ペプチド、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＨＰＶ  Ｅ６、ＨＰＶ  Ｅ７、ガン胎児抗原、ＭＵＣ−１、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ−Ｖ、ｐ１５、ｇｐ１００、ＭＡＲＴ−１／ＭｅｌａｎＡ、チロシナーゼ、ＴＲＰ−１、β−カテニン、ＭＵＭ−１およびＣＤＫ−４からなる群から選択される、請求項２２に記載の薬学的組成物。
【請求項２４】
前記自己免疫疾患関連抗原がＴ細胞レセプター由来のペプチドである、請求項２２に記載の薬学的組成物。
【請求項２５】
前記疾患関連抗原またはその免疫原性エピトープが、前記膜結合融合タンパク質に作動可能に融合する、請求項１４に記載の薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の背景）
本発明は一般に遺伝子治療および細胞免疫治療の分野に関し、そしてより詳細には、サイトカインのような、膜結合融合タンパク質として発現する免疫調節分子に関する。
【０００２】
自己のガン細胞由来のガン細胞性ワクチンの使用は今世紀を通じて探求されいている。残念ながら、大部分の患者の場合、このようなワクチンで達成される応答はせいぜい部分的かつ短期間のものである。ガンワクチンの効力を高める戦略はサイトカインの使用を含む。サイトカインは多面性のメディエーターであり、これは免疫応答の質および強度を調節し、方向付ける。サイトカインはときには自己分泌または内分泌ホルモンであるが、大部分はパラ分泌ホルモンであり、天然ではリンパ球および単球中で産生される。いくつかのサイトカインは組換えＤＮＡ方法論を用いて産生され、その抗ガン治療剤としての効力について評価されている。複数の抗腫瘍活性がサイトカインに帰されており、これは（１）腫瘍増殖の直接阻害（α−インターフェロン）、２）腫瘍細胞のアネルギー誘導効果の反転、および新規なＴ細胞エフェクターの増殖（インターロイキン−２）、（３）腫瘍細胞上のＭＨＣ提示ペプチドエピトープを認識するＴ細胞のエフェクター機能の増強、（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子）および（４）炎症部位への細胞の補充の増強（インターロイキン−４）を包含する。しかし、多くのサイトカインは、有効な応答のために必要とされる高い全身レベルでの投与には耐えられず、それゆえ、これらの薬剤の治療的価値は制限されている。
【０００３】
局所へのサイトカインの送達は天然の免疫応答により類似し得、これらの分子の高い全身レベルの関連する毒性を回避し得る。局所へのサイトカインの送達の１つのアプローチは遺伝子改変された腫瘍細胞の使用を含む。例えば、マウス腫瘍細胞へのインターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−７（ＩＬ−７）、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）または顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）についての遺伝子の形質導入は、遺伝子改変された腫瘍細胞の同系宿主による拒絶に至り得る。さらに、サイトカイン分泌性細胞によるワクチン接種は同様に全身性免疫を高め得、ワクチン接種された動物を非形質導入腫瘍細胞によるチャレンジから防御する。全身投与とは異なり、局所的なサイトカイントランスジーン発現は通常、毒性とは関係しない。
【０００４】
樹状細胞が非常に効率的な抗原提示細胞の系を形成し、そして有効な抗ガン治療の設計の中心となる。末梢での抗原の捕捉の後、樹状細胞はリンパ系器官に移動し、そして抗原をＴ細胞に提示する。これらの強力な抗原提示細胞は、ネイティブのＴ細胞と相互作用し、それを活性化する能力について独特であるように見える。樹状細胞の強力な抗原提示能力は、一部には、その独特なライフサイクル、および主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩおよびＩＩ分子および共刺激（ｃｏ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ）分子の高レベルの発現によるものであり得る。顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）分子は樹状細胞の成熟および機能において重要なサイトカインである。ＧＭ−ＣＳＦは樹状細胞上のレセプターに結合し、そしてこれらの細胞を刺激して成熟させ、抗原を提示し、そしてネイティブのＴ細胞をプライムする。それゆえ、ＧＭ−ＣＳＦの使用は免疫治療において特に興味深い。
【０００５】
樹状細胞のような免疫細胞の至適な刺激は強力なサイトカイン−レセプター相互作用に依存する。免疫応答の刺激の増強は、サイトカイン−レセプター対の数の増加、あるいはサイトカイン−レセプター相互作用の親和性の増大によって達成され得る。しかし、サイトカインのそのレセプターに対する天然の親和性を増大することは非実用的であり得、利用可能なサイトカイン分泌性腫瘍細胞性ワクチンが、サイトカインの高い局所濃度を生じる能力には限りがある。それゆえ、サイトカイン−レセプター親和性の高い、改善された細胞性ワクチンが必要とされる。
【０００６】
細胞性ワクチンはＧＭ−ＣＳＦのような膜結合性免疫刺激サイトカインを含み、これはアジュバント治療として、微小な転移を除去するための手術で用いられ得る。このような細胞性抗ガンワクチンはまた、特定のタイプのガンのリスクがある個体、例えばメラノーマのリスクのある個体に対して予防的治療として投与され得る。反対に、免疫抑制サイトカイン分子を含むワクチンは、慢性関節リウマチ、多発性硬化症および乾癬のような自己免疫疾患を引き起こす不適切な免疫応答を低下させるために用いられ得る。
【０００７】
従って、メラノーマ、結腸ガンまたは乳ガンのようなガン；自己免疫疾患、例えば慢性関節リウマチ、乾癬および多発性硬化症；寄生虫疾患；ならびに感染性疾患、例えばＡＩＤに対する防御および処置のための改良された細胞性ワクチンが必要とされる。本発明はこの要求を、サイトカインのような膜結合性免疫調節分子を含む改良された細胞性ワクチンを提供することによって満たす。そして同様に関連の利点を提供する。
【０００８】
（発明の要旨）
本発明は、異種膜付着ドメインに作動可能に融合した非抗体性免疫調節分子を含む膜結合融合タンパク質を有する細胞性ワクチンを提供する。本発明において有用な非抗体性免疫調節分子は、サイトカインのような免疫刺激分子および免疫抑制分子を含む。１つの実施態様では、本発明は膜結合融合タンパク質を有する細胞性ワクチンを提供し、これは異種膜付着ドメインに作動可能に融合した非抗体性免疫調節分子を含み、さらに疾患関連抗原またはその免疫原性エピトープを含む。さらに、本発明によれば、疾患関連抗原に対する免疫応答を調節する方法が提供される。この方法は個体に、異種膜付着ドメインに作動可能に融合した非抗体性免疫調節分子を含む膜結合融合タンパク質を有する細胞性ワクチンを投与する工程を包含する。
【０００９】
（発明の詳細な説明）
本発明は、異種膜付着ドメインに作動可能に融合した非抗体性免疫調節分子を含む膜結合融合タンパク質を有する細胞性ワクチンを提供する。免疫調節分子はサイトカインのような免疫刺激または免疫抑制分子であり得る。本発明のワクチンで有用なサイトカインは、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）；顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）；インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）；インターフェロンα（ＩＦＮ−α）；腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）；腫瘍壊死因子−β（ＴＮＦ−β）；インターロイキン−１（ＩＬ−１）；インターロイキン−２（ＩＬ−２）；インターロイキン−３（ＩＬ−３）；インターロイキン−４（ＩＬ−４）；インターロイキン−６（ＩＬ−６）；インターロイキン−７（ＩＬ−７）；インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）；インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、リンホタクチン（ｌｙｍｐｈｏｔａｃｔｉｎ）（ＬＴＮ）および樹状細胞ケモカイン１（ＤＣ−ＣＫ１）を包含する。
【００１０】
本明細書で記載のように、腫瘍細胞は顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）を膜結合形態で発現するように、血小板由来増殖因子レセプター由来の異種膜付着ドメインを用いて操作されている。膜結合ＧＭ−ＣＳＦを発現する生存Ｐ８１５肥満細胞腫細胞の同系動物への注入は、膜結合ＧＭ−ＣＳＦが生物学的に活性であり、かつ抗腫瘍免疫を誘発し得ることを示した。膜結合ＧＭ−ＣＳＦ発現クローンの増殖速度は最初の７から１０日間、親腫瘍細胞と同様であったが、１２日後、野生型Ｐ８１５腫瘍は増殖を続け、５０ｍｍ2を越える平均最大サイズに到達した一方で、膜結合ＧＭ−ＣＳＦ腫瘍は縮小し始め、そして高レベルの膜結合ＧＭ−ＣＳＦを発現するクローン由来の腫瘍の場合、全ての動物中で消散した（図６参照）。本明細書中でさらに開示されるように、膜結合ＧＭ−ＣＳＦは、実質的に非免疫原性かつ高度に侵襲性のガン細胞株であるＢ１６メラノーマ細胞上に操作された場合、また抗腫瘍免疫を刺激し、そして宿主動物の生存を延長した（図７参照）。加えて、照射された膜結合ＧＭ−ＣＳＦ発現腫瘍細胞を用いるワクチン接種は、動物を生存野生型腫瘍のチャレンジから防御した（図８）。従って、本発明は価値のある細胞性ワクチンを提供し、これを用いて、異なる腫瘍型に対する免疫応答を調節し得、かつ腫瘍を有する動物の生存を延長し得る。
【００１１】
本明細書で用いられる用語「非抗体性免疫調節分子」とは、抗原に対する免疫応答の産生を調節または調整する分子を意味する。本発明のワクチンは、１つ以上のこのような非抗体性免疫調節分子を膜結合形態で含む。抗体分子由来の抗原認識配列は、本発明のワクチン、方法および核酸分子から明示的に除外される。本明細書で用いられる用語「抗体」とは、免疫グロブリン分子またはその抗原結合フラグメントを意味する。
【００１２】
本明細書で用いられる用語「免疫刺激分子」とは、抗原に対する免疫応答の産生を促進または増強する免疫調節分子を意味する。
【００１３】
本明細書で用いられる用語「免疫抑制分子」とは、抗原に対する免疫応答の産生を低減または阻害する免疫調節分子を意味する。
【００１４】
サイトカインは本発明のワクチンにおいて特に有用な免疫調節分子である。本明細書で用いられる用語「サイトカイン」とは、免疫系の細胞で産生されるタンパク質のクラスのメンバーであり、免疫応答を調整または調節する。このような調整は体液性または細胞媒介性免疫応答において生じ得、そしてＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞マクロファージ、抗原提示細胞または他の免疫系細胞のエフェクター機能の調節を包含する。
【００１５】
サイトカインは典型的には、約３０ｋＤａ未満の分子量を有する小さいタンパク質または糖タンパク質である。サイトカインはときには自己分泌または内分泌活性を示すが、大部分はパラ分泌の様式で作用し、標的細胞の膜上のレセプターに特異的に結合し、それによりシグナル形質導入経路の引き金を引き、これは遺伝子発現を変更する。サイトカインは通常、そのコグネートのレセプターに対して非常に高い親和性を示し、解離定数は約１０-9から１０-12Ｍの範囲である。この高い親和性のため、ピコモル濃度のサイトカインは生物学的効果を媒介し得る。サイトカインの構成性産生は通常低いか、あるいは存在せず、サイトカイン発現は転写または翻訳のレベルでの種々の誘導刺激によって調節される。サイトカインは典型的には、数時間から数日間続く分泌をともない一過性に発現される（Ｔｈｏｍｓｏｎ，Ｔｈｅ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ（第２版）Ｌｏｎｄｏｎ：  Ｈａｒｃｏｕｒｔ  Ｂｒａｃｅ  ＆  Ｃｏｍｐａｎｙ（１９９４）；Ｃａｌｌａｒｄ  ａｎｄ  Ｇｅａｒｉｎｇ，Ｔｈｅ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｆａｃｔｓ  Ｂｏｏｋ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．（１９９４）；Ｋｕｂｙ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（第三版）Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ（１９９７），これらの各々は本明細書中に参考として援用される）。本発明のワクチンで有用な例示的なサイトカインを表１に示す。
【００１６】
本明細書において用語サイトカインは、リンパ球および他の細胞型により分泌されるサイトカイン（リンフォカインと呼ばれる）ならびに単球およびマクロファージおよび他の細胞型によって分泌されるサイトカイン（モノカインと呼ばれる）を包含する。用語サイトカインは、インターロイキン、例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−４およＩＬ−１２を含み、これらは白血球によって分泌される分子であり、これは主として造血細胞および免疫系細胞の増殖および分化に影響を与える。用語サイトカインはまた、造血増殖因子、そして特にコロニー刺激因子、例えば、コロニー刺激因子−１、顆粒球コロニー刺激因子および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子を包含する。加えて、用語サイトカインはケモカインを包含し、これは低分子量分子であり、種々の白血球の走性を媒介し、そして白血球インテグリンの発現または接着を調節し得る。ケモカインの例は、インターロイキン−８、樹状細胞ケモカイン１（ＤＣ−ＣＫ１）およびリンホタクチン（これはγδＴ細胞の補充および粘膜免疫のために重要なケモカインである）、ならびにＣ−ＣおよびＣ−Ｘ−Ｃケモカインサブファミリーの他のメンバーを包含する（例えば、ＭｉｌｌｅｒおよびＫｒａｎｇｅｌ，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：１７−４６（１９９２），Ｓｃｈａｌｌ，「Ｔｈｅ  Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｓ」Ｔｈｏｍｓｏｎ，前出，１９９４；Ｈｅｄｒｉｃｋら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：１５３３−１５４０（１９９７），およびＢｏｉｓｍｅｎｕら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：９８５−９９２（１９９６）を参照のこと、 これらの各々は本明細書中に参考として援用される）
用語サイトカインは、本明細書で用いられる場合、Ｔヘルパー１（ＴH１）およびＴヘルパー２（ＴH２）のサブセットによって産生されるサイトカインを包含する。ＴH１サブセットのサイトカインはＴH１細胞によって産生され、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−αおよびＴＮＦ−βを含む。ＴH１サブセットのサイトカインは古典的な細胞媒介機能、例えば細胞傷害性Ｔリンパ球およびマクロファージの活性化、ならびに遅延型過敏症の原因となる。ＴH１サブセットのサイトカインは、腫瘍細胞、感染性細胞および細胞内病原体に対する免疫応答の刺激に特に有用である。
【００１７】
ＴH２サブセットのサイトカインはＴH２細胞によって産生され、サイトカインＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６およびＩＬ−１０を含む。ＴH２サブセットのサイトカインはＢ細胞活性化のためのヘルパーとして有効に機能し、そして遊離の生存細菌および腸内寄生虫に対する免疫応答の刺激に特に有用である。ＴH２サブセットのサイトカインはまたアレルギー性反応を媒介し得る。
【００１８】
免疫調節分子の活性フラグメント、例えばサイトカインの活性フラグメントもまた、本発明のワクチンに有用である。このような活性フラグメントは、指示された免疫調節分子の一部と実質的に同じアミノ酸配列を有するポリペプチドフラグメントであり、ただしこのフラグメントは免疫調節分子の少なくとも１つの生物学的活性を保持する。活性サイトカインフラグメントは当該分野で公知であり、そして例えば、ＩＬ−１β（ＶＱＧＥＥＳＮＤＫ；配列番号３）由来の９アミノ酸ペプチドを含み、これは全長ＩＬ−１βサイトカインの免疫刺激活性を保持する（Ｈａｋｉｍら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：５５０３−５５１１（１９９６），これは本明細書中に参考として援用される）。加えて、サイトカイン活性に関する種々の周知のインビトロおよびインビボアッセイ、例えば実施例Ｉに記載の骨髄増殖アッセイが、サイトカインフラグメントを活性について試験するために有用である（Ｔｈｏｍｓｏｎ、前出、１９９４参照）
【００１９】
【表１】
0003785041.tif 000002
0003785041.tif 000003
0003785041.tif 000004
0003785041.tif 000005
【００２０】
免疫調節分子は天然に存在する免疫調節分子の配列を有し得、あるいは天然に存在する免疫調節分子の配列に対して実質的なアミノ酸配列の類似性を有するアミノ酸を有し得る。従って、天然に存在する配列に対する限定された改変が、免疫調節分子の生物学的機能を損なうことなく成され得る。例えば、ポリペプチド活性を破壊しないＧＭ−ＣＳＦのわずかな改変はＧＭ−ＣＳＦの定義の範囲内に入る。これらの改変は、部位特異的変異誘発による場合のように熟慮され得るか、あるいはコード化核酸を有する宿主中での変異を通しての場合のように偶然であり得る。このような改変されたポリペプチドの全ては、免疫調節分子の少なくとも１つの生物学的機能が保持されている場合、免疫調節分子の定義に含まれる。
【００２１】
サイトカインアンタゴニストもまた本発明で有用な免疫調節分子であり得る。このようなサイトカインアンタゴニストは天然に存在するものまたは天然に存在しないものであり得、例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−α、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、リンホタクチンおよびＤＣ−ＣＫ１のアンタゴニストを含む。サイトカインアンタゴニストは、サイトカインの欠失および点変異、サイトカイン由来のペプチド、およびサイトカインレセプターの可溶性のドミナントネガティブ部分を含む。天然に存在するＩＬ−１のアンタゴニストは、例えば、本発明のワクチンで用いられ、ＩＬ−１の病態生理学的活性を阻害し得る。このようなＩＬ−１アンタゴニストはＩＬ−１Ｒａを包含し、これはＩＬ−１レセプターＩに対して、ＩＬ−１αまたはＩＬ−１βとほぼ等しい親和性で結合するが、レセプターを活性化しないポリペプチドである（Ｆｉｓｃｈｅｒら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２６１：Ｒ４４２−Ｒ４４９（１９９１）；ＤｉｎａｒｅｌｌｏおよびＴｈｏｍｓｏｎ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  １２：４０４−４１０（１９９１）、これらの各々は本明細書中に参考として援用される)。ＩＬ−１アンタゴニストはまたＩＬ−１β由来のペプチドおよびＩＬ−１ムテインを含む（Ｐａｌａｓｚｙｎｓｋｉら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１４７：２０４−２０９（１９８７）これは本明細書中に参考として援用される）。本発明に有用なサイトカインアンタゴニストはまた、例えば、ＴＮＦ−αのアンタゴニストを含む（Ａｓｈｋｅｎａｚｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  ８８：１０５３５−１０５３９（１９９１）；Ｍｉｒｅ−Ｓｌｕｉｓ，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１１：７４−７７（１９９３）これらの各々は本明細書中に参考として援用される）。
【００２２】
熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）もまた本発明のワクチンおよび方法において有用な免疫調節分子である。熱ショックタンパク質は熱ショックまたはグルコース欠乏のようなストレス誘発条件によって誘導され、全身性の抗炎症性応答を生じ得、これにより例えば腫瘍細胞または感染細胞の除去を補助する。熱ショックタンパク質はその分子量で区別され、ファミリーにグループ分けされ、ＨＳＰ１１０、ＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ６０、ＨＳＰ２５、ＨＳＰ２０およびＨＳＰ８．５を含む。いくつかの熱ショックタンパク質（ＨＳＰ６０、ＨＳＰ７０およびＨＳＰ９０を含む）はミコバクテリア感染、ＨＩＶ感染細胞または腫瘍細胞の細胞表面上に発現される（Ｍｕｌｔｈｏｆｆら, Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ６１：１−８（１９９５）、これは本明細書中に参考として援用される）。ミコバクテリアの熱ショックタンパク質ＨＳＰ６５（Ｓｉｌｖａら，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６４：２４００−２４０７（１９９６）、これは本明細書中に参考として援用される）は本発明のワクチンで有用な免疫調節分子の一例である。
【００２３】
用語「膜付着ドメイン」とは、本明細書で使用される場合、細胞膜の幅にわたるドメインの、またはその任意の部分を意味し、そしてこれはポリペプチドを細胞膜に付着させるように機能する。本発明のワクチンで有用な膜付着ドメインは、ポリペプチドを細胞表面の膜、例えば真核生物細胞の原形質膜または原核生物細胞の外膜に付着させるように機能するドメインである。当業者は適切な膜付着ドメインは、膜結合融合タンパク質を発現させる細胞のタイプに基づいて選択されることを理解する。
【００２４】
真核生物および原核生物の表面タンパク質に由来する、種々の天然に存在するおよび合成の膜付着ドメインは、本発明のワクチンにおいて有用である。高等真核生物細胞（例えば、哺乳動物細胞）における使用のために、膜付着ドメインは、例えば、細胞表面レセプターまたは細胞接着分子のような膜内因性タンパク質の膜貫通領域であり得る。本発明において有用な膜付着ドメインは、例えば、血小板由来増殖因子レセプター、上皮増殖因子レセプターまたは線維芽細胞増殖因子レセプターのような増殖因子レセプター；ホルモンレセプター；サイトカインレセプターおよびＴ細胞レセプターを含む細胞表面レセプター由来であり得る。本発明において有用な膜付着ドメインはまた、カドヘリン、インテグリン、セレクチン、および免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバー；ならびにＣＤ抗原のような他の膜内因性タンパク質由来であり得る。例示的膜付着ドメインのアミノ酸配列は、表２において提供される（ＰｉｇｏｔｔおよびＰｏｗｅｒ、Ｔｈｅ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｆａｃｔｓ  Ｂｏｏｋ  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．（１９９３）ならびにＢａｒｃｌａｙら、Ｔｈｅ  Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｆａｃｔｓ  Ｂｏｏｋ  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．（１９９３）をまた参照のこと。これらの各々が本明細書において参考として援用される）。所望される場合、融合タンパク質は、膜付着ドメインが由来する異種タンパク質の、細胞質ドメインまたはその部分を含み得る。
【００２５】
Ｉ型膜付着ドメインは、約２５の疎水性アミノ酸残基に通常塩基性アミノ酸のクラスターが続く膜貫通配列である。そのような膜付着ドメインから通常除外されるアミノ酸としては、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、およびＡｒｇが挙げられるが、ドメインが膜内で多量体複合体を形成する場合、荷電残基も存在し得る。Ｉ型膜付着ドメインは、アミノ末端部分が細胞外に存在するように配向する。そのようなＩ型膜付着ドメインは、例えば、ＣＤ２、ＣＤ４０またはＩＬ−４レセプター由来であり得る。
【００２６】
ＩＩ型膜付着ドメインは、本発明のワクチンにおいて有用な膜貫通ドメインであり得る。ＩＩ型膜付着ドメインは、カルボキシ末端部分が細胞外に存在するように、配向する。ＩＩ型膜付着ドメインの例としては、ＣＤ７２の膜貫通ドメインが挙げられる。
【００２７】
本発明の膜付着ドメインはまた、ホスファチジルイノシトール−グリカン（ＰＩ−Ｇ）アンカーであり得、これはタンパク質のカルボキシル末端残基に付着する。ＰＩ−Ｇアンカーは、例えば、ヒト胎盤アルカリホスファターゼ（ＨＰＡＰ）由来であり得、そして融合タンパク質を細胞表面にアンカーするように機能し得る（例えば、Ｗｈｉｔｅｈｏｒｎら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １３：１２１５〜１２１９（１９９５）を参照のこと。これは本明細書において参考として援用される）。ＰＩ−Ｇアンカーされた分子は、切断され、そしてＰＩ−Ｇアンカーに置換されるシグナル配列をそのカルボキシル末端に有する。ＰＩ−Ｇ付着部位およびその直後の残基は、代表的には、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、ＣｙｓまたはＳｅｒのような小さいアミノ酸である。付着残基の後には、付着部位の７〜１０残基後に始まる約１０〜２０残基の疎水性配列が存在する。そのような疎水性ＰＩ−Ｇシグナル配列は、一般的にＩ型膜付着ドメインに見出される塩基性荷電残基を欠く。
【００２８】
ＩＩＩ型膜付着ドメイン、またはそのセグメントはまた、本発明のワクチンにおいて有用であり得る。そのようなＩＩＩ型膜付着ドメインは、脂質二重膜を多数回横切る真核生物細胞表面分子由来である。本発明において有用な膜付着ドメイン人は、例えば、ＭＤＲ１、Ｇタンパク質にリンクしたレセプターまたはロドプシンスーパーファミリーのタンパク質由来の１つ以上の膜貫通ドメインであり得る。
【００２９】
【表２】
0003785041.tif 000006
【００３０】
本発明の細菌ワクチンにおいて有用な膜付着ドメインは、例えば、外膜タンパク質Ａ（ＯｍｐＡ）由来であり得る。例えば、ＯｍｐＡのアミノ酸４６〜１５９含む膜貫通ドメイン（天然のタンパク質の５〜８個の膜貫通セグメントをコードする）は、本発明において特に有用な膜付着ドメインであり得る（Ｆｒａｎｃｉｓｃｏら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９：２７１３〜２７１７（１９９２）；Ｆｒａｎｃｉｓｃｏら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １１：４９１〜４９５（１９９３）；Ｆｒａｎｃｉｓｃｏら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０：１０４４４〜１０４４８（１９９３）；ＦｒａｎｃｉｓｃｏおよびＧｅｏｒｇｉｏｕ、Ａｎｎａｌｓ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．７４５：３７２〜３８２（１９９４）、これらの各々は、本明細書において参考として援用される）。
【００３１】
非抗体性免疫調節分子に作動可能に融合された膜付着ドメインに関して本明細書において使用される場合、用語「異種」とは、非抗体性免疫調節分子をコードする遺伝子以外の供給源に由来する膜付着ドメインを意味する。異種膜付着ドメインは、合成的であり得るか、またはそれが融合される非抗体性免疫調節分子をコードする遺伝子とは異なる遺伝子によってコードされ得る。
【００３２】
非抗体性免疫調節分子および異種膜付着ドメインに関して本明細書において使用される場合、用語「作動可能に融合される」とは、免疫調節分子および膜付着ドメインが正確な読み枠において融合され、その結果、適切な条件下において全長融合タンパク質が発現されることを意味する。当業者は、そのような融合タンパク質は、例えば、カルボキシル末端の異種膜付着ドメインと作動可能に融合されたアミノ末端の免疫調節分子を含み得るか、または、カルボキシル末端の免疫調節分子と作動可能に融合されたアミノ末端の異種膜付着ドメインを含み得ることを、認識する。
【００３３】
本明細書の融合タンパク質に関して本明細書において使用される場合、用語「膜結合」とは、細胞膜に安定的に付着することを意味する。本発明のワクチンにおいて、本発明の膜結合融合タンパク質は、細胞の表面上に発現する。
【００３４】
本明細書において使用する場合、用語「融合タンパク質」とは、合成的か、または異種アミノ酸配列を含む、ハイブリッドタンパク質を意味する。融合タンパク質は、例えば、作動可能に連結される異種遺伝子配列を含むハイブリッド遺伝子から生成され得る。
【００３５】
本発明のワクチンに関して本明細書において使用する場合、用語「細胞」とは、その細胞表面上に膜結合融合タンパク質を発現し得る任意の原核生物または真核生物細胞を意味する。用語細胞は、生存細胞、弱毒化細胞、死滅細胞を含み、そして初代細胞、正常細胞、不死化細胞、形質転換細胞、腫瘍細胞、または感染細胞を含む。本発明の方法において、細胞は、ワクチンが投与される個体に対して、自己由来か、同種異系か、または異種であり得る。本発明のワクチンにおいて有用な細胞は、哺乳動物細胞、および、特に種々の細胞型のヒト細胞を含む。さらに、本発明の細胞性ワクチンは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓおよびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓのような細菌細胞から、作製され得る。
【００３６】
遺伝的に改変される腫瘍細胞は、例えば、ガンを有する被験体由来の生検から取得され得、次に、腫瘍細胞は、異種膜貫通ドメインと作動可能に連結された非抗体性免疫調節分子を含む膜結合融合タンパク質を含むように改変される。あるいは、ドナー腫瘍細胞、または腫瘍細胞株由来の細胞は、遺伝的に改変され得、そして本発明のワクチンを産生し得る。
【００３７】
種々の腫瘍細胞、特にメラノーマ細胞、結腸腫瘍細胞、乳房腫瘍細胞、前立腺腫瘍細胞、グリア芽細胞腫細胞、腎ガン細胞、神経芽細胞腫、肺ガン細胞、膀胱ガン細胞、プラスマ細胞腫またはリンパ腫細胞のようなヒト腫瘍細胞は、例えば、遺伝的に操作され得、そして異種膜付着ドメインと作動可能に融合された非抗体性免疫調節分子を含む膜結合融合タンパク質を発現し得る。メラノーマに対して防御するか、またはこれを処置するためのワクチンにおいて、Ｍ１２、Ｍ２４、Ｍ１０１およびＳＫ−ＭＥＬ細胞株のようなヒトメラノーマ細胞株は、本発明のワクチンの調製において有用であり得る（Ｃｈｉら、Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５０：２１４３〜２１５２（１９９７）、これは本明細書において参考として援用される）。
【００３８】
本発明のワクチンはまた、結腸ガンに対して防御するか、またはこれを処置するために使用され得る。結腸腫瘍細胞は、切除された腫瘍の培養物からか、またはＨＣＴ  １１６、Ｃｏｌｏ２０５、ＳＷ４０３またはＳＷ６２０のような株化ヒト結腸腫瘍細胞株から得られ得る。そのような細胞は、当業者にとって、例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ；Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から入手可能である。
【００３９】
本発明のワクチンはまた、乳ガンに対して防御するか、またはこれを処置するために使用され得る。外科的に切除された腫瘍から培養された初代乳房腫瘍細胞、またはＢＴ−２０株のようなヒト乳房腫瘍細胞株はまた、乳ガンに対する防御またはこの処置のためのワクチン調製において有用であり得る。
【００４０】
本発明のワクチンはまた、前立腺ガンに対して防御するか、またはこれを処置するために使用され得る。前立腺ガンは、合衆国における男性の二番目に最も頻繁に発症する腫瘍である。そのようなワクチンにおいて使用されるための前立腺細胞は、外科的に切除された腫瘍から得られた初代前立腺細胞、またはＬＮＣａＰ株のような前立腺腫瘍細胞株であり得る（Ｈｏｒｏｓｚｅｗｉｃｚら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４３：１８０９（１９８３）、これは本明細書において参考として援用される）。
【００４１】
脳腫瘍に対する防御またはその処置のために、初代ヒト神経膠腫細胞または株化ヒトグリア芽細胞腫または神経膠星状細胞腫株由来の細胞を使用して、本発明のワクチンを調製し得る。神経膠腫細胞の初代培養物は、Ｗａｋｉｍｏｔｏら（Ｊａｐａｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．８８：２９６〜３０５（１９９７）、これは本明細書において参考として援用される）に記載されるように、外科的に切除された腫瘍組織から株化され得る。Ｕ−８７  ＭＧまたはＵ−１１８  ＭＧのようなヒトグリア芽細胞腫細胞、あるいはＣＣＦ−ＳＴＴＧ１またはＳＷ１０８８のようなヒト神経膠星状細胞腫株（Ｃｈｉら、前出、１９９７）は、ＡＴＣＣから入手可能であり得る。そのような細胞のいずれかは、ヒト脳腫瘍に対する防御またはその処置のために、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＴＮＦ−αまたはＩＦＮ−γのような免疫調節分子を含むワクチンの生成のために使用され得る。
【００４２】
投与される腫瘍細胞は、生存可能であり得ることが認識される。しかし、当業者は、被験体に対する生存可能な腫瘍細胞性ワクチンの投与には、腫瘍細胞が被験体において増殖しないように不活化する必要があることを理解する。不活化は、例えば、細胞の複製する能力を阻害するが、当初は腫瘍細胞を死滅させない用量で細胞に与えられる照射によることを含む、任意の種々の方法によって達成され得る（実施例ＩＩを参照のこと）。そのような生存可能な腫瘍細胞は、膜結合融合タンパク質を発現し得るが、新しい腫瘍を形成する増殖をなし得ない。
【００４３】
線維芽細胞、筋芽細胞、白血球、肝細胞、内皮細胞および樹状細胞、ならびに特に非形質転換ヒト細胞を含む非形質転換細胞はまた、本発明のワクチンにおいて有用である。特に、疾患関連抗原または免疫原性エピトープが単離されている場合、本発明の線維芽細胞に基づくワクチンは、操作され得、そして目的の疾患関連抗原または免疫原性エピトープを含み得る。そのような疾患関連抗原およびその免疫原性エピトープ（腫瘍関連抗原および自己免疫疾患関連抗原を含む）は、さらに以下に記載される。本発明において有用な線維芽細胞としては、ワクチン接種される個体から得られる自己由来の線維芽細胞が挙げられる。そのような初代ヒト線維芽細胞は、例えば、皮膚の穿孔生検からか、あるいは肺、肝臓または骨髄のような組織から容易に得られる。本発明において有用な線維芽細胞はまた、ＨＦＬ−１細胞；ＭＲＣ−９線維芽細胞株；ならびに、ＫＭＳＴ−６、ＳＵＳＭ−１、およびＯＵＭＳ−２４Ｆ株（Ｉｉｊｉｍａら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ６６：６９８〜７０２（１９９６）、これは本発明明細書において参考として援用される）のような４−ニトロキノリン１−オキシドまたは60ＣＯγ線を用いて不死化された細胞株を含む不死化線維芽細胞株のような初代線維芽細胞であり得る。線維芽細胞は、本発明のワクチンにおいて特に有用である。なぜなら、線維芽細胞は、容易に培養され、そしてインビトロで増殖するからである（Ｔｒｅｃｏら、「Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ」、Ｃｈａｎｇ（編）、Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ（１９９５）、これは本明細書において参考として援用される）。
【００４４】
複数のドナー細胞または細胞株から産生されるワクチンのパネルは、種々の罹患した細胞を表し得、そして、種々の異なる疾患関連抗原を発現し得るか、または発現している。例えば、複数のドナー腫瘍細胞、腫瘍細胞株、またはトランスフェクトされた非腫瘍性細胞株から産生される抗腫瘍ワクチンのパネルは、種々の組織学的腫瘍型を示し得、そしてＭＺ２−Ｅまたはムチンのような種々の公知の腫瘍抗原を発現し得る（Ｆｉｎｎら、前出、１９９３を参照のこと）。そのような抗腫瘍ワクチンのパネルは、例えば、特定の腫瘍型を発症しやすい個体への投与のために容易に利用可能な形態において、細胞貯蔵において維持され得る。当業者は、例えば、個体が罹患するか、または発症しやすい腫瘍の組織学的な型に基づくパネルから、適切に遺伝的に改変されたドナー腫瘍細胞を選択し得る。
【００４５】
細菌細胞はまた、本発明の細胞性ワクチンにおいて有用である。例えば、細菌の弱毒化種を使用する生存細菌ワクチンは、特に有用である。なぜならそのような生ワクチンは、不活化ワクチンよりも、一般的に、より強力であり、より長期に持続する免疫応答をもたらし得るからである。生存細菌ワクチンは、宿主において、天然の感染の初期の段階を模倣し、そして天然の免疫応答をもたらす、限定された感染を確立し得、そして拡大した免疫をもたらし得る。なぜなら、細菌は、宿主において、長期間生存しつづけるからである。さらに、細菌の外膜タンパク質、リポポリサッカライド（ＬＰＳ）および分泌細菌毒素は、強力な免疫原であり、そして組換え抗原に対する免疫応答を増強する天然のアジュバントとして作用し得る。さらに、そのような生存細菌ワクチンは、例えば、経口的に容易に投与される（ＦｒａｎｃｉｓｃｏおよびＧｅｏｒｇｉｏｕ、前出、１９９４）。
【００４６】
種々の非病原性の細菌種は、生ワクチンとしての使用のために開発されている。本発明の細胞性ワクチンにおいて有用な細菌としては、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｅ、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｄｏｎｉｉ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、ｓｈｉｇｅｌｌａ、ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓおよびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓが挙げられる（例えば、Ｃｕｒｔｉｓｓ、「Ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｓｔｒａｉｎｓ  ａｓ  Ｌｉｖｅ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｆｏｒｅｉｇｎ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ」、Ｗｏｏｄｒｏｗ  およびＬｅｖｉｎｅ（編）、Ｎｅｗ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、Ｉｎｃ．（１９９０）；ＣａｒｄｅｎａｓおよびＣｌｅｍｅｎｔｓ、Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５：３２８〜３４２（１９９２）；Ｃｉｒｉｌｌｏら、Ｃｌｉｎ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．２０：１００１〜１００９（１９９５）；ならびにＦｏｒｔａｉｎｅら、Ｒｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４１：９０７〜９１２（１９９０）を参照のこと、これらの各々は、本明細書において参考として援用される）。本発明のワクチンにおいて有用な細菌としてはまた、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ、ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓおよびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｘｙｌｏｓｕｓが挙げられる（Ｒｙｄら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｐａｔｈｏｇｅｎ．１２：３９９〜４０７（１９９２）；ｖａｎ  Ｄａｍｍｅら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．１０３：５２０〜５３１（１９９２）；ならびにＲｅｎａｕｌｄ−Ｍｏｎｇｅｎｉｅら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９３：７９４４〜７９４９（１９９６）、これらの各々は、本明細書において参考として援用される）。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのような酵母細胞もまた、本発明のワクチンにおいて、特に活性のための翻訳後修飾を必要とする膜結合融合タンパク質の発現において、有用であり得る。
【００４７】
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ細胞は、本発明のワクチンにおいて特に有用である。ａｒｏＡ、ａｒｏＣ、ａｒｏＤ、ｃｙａ、ｃｒｐ、ｇａｌＥ、およびｐｈｏＰ／ｐｈｏＱのような遺伝子において変異を有するＳａｌｍｏｎｅｌｌａ株は、哺乳動物細胞内において増殖を維持し得ない。しかし、そのような生存弱毒化株は、免疫応答を刺激するために十分長期間、細胞内において増殖する。弱毒化Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ株としては、芳香族代謝産物の生合成が欠損する株、ならびに、生物体をＰＡＢＡおよび２、３−ジヒドロキシ安息香酸の栄養要求性にする株のような、栄養要求性株を含む。これらの弱毒化株は、ａｒｏ遺伝子において変異を有し、例えば、ａｒｏＡ、ａｒｏＣまたはａｒｏＤ遺伝子の１つ以上において欠失を有する。アデニル酸シクラーゼ（ｃｙａ）およびサイクリック３’、５’−ＡＭＰレセプタータンパク質（ｃｒｐ）遺伝子における欠失はまた、弱毒化Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ株の生成において有用である。生存弱毒化Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａワクチンは、例えば、ΔａｒｏＡ  ΔａｒｏＤ  ＢＲＤ５０９、ＩＳＰ１８２０  ΔａｒｏＣ  ΔａｒｏＤ、Ｔｙ２  ΔａｒｏＣ  ΔａｒｏＤおよびＴｙ２  Δｃｙａ  ΔｃｒｐのようなＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ株を使用して調製され得る（例えば、Ｔａｃｋｅｔら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６０：５３６〜５４１（１９９２）；Ｔｕｒｎｅｒら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６１：５３７４〜５３８０（１９９３）；Ｄｕｎｓｔａｎら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６４：２７３０〜２７３６（１９９６）；Ｌｏｎｄｏｎｏら、Ｖａｃｃｉｎｅ  １４：５４５〜５５２（１９９６）を参照のこと、これらの各々は、本明細書において参考として援用される）。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａにおける使用のための発現ベクターとしては、ｐＫＫ２３３−２が挙げられ、これは当該分野において周知である（ＡｍａｎｎおよびＢｒｏｓｉｕｓ、Ｇｅｎｅ  ４０：１８３〜１９０（１９８５）；また、Ａｎｄｅｒｓｏｎら、「Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｓｔｒａｉｎｓ  ｔｈａｔ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ」Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ：Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪを参照のこと、これらの各々は本明細書において参考として援用される）。
【００４８】
Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓはまた、本発明のワクチンにおいて有用な細菌である。Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓに基づくワクチンは、例えば、インフルエンザウイルス感染に対する免疫応答を刺激するために有用である（Ｉｋｏｎｏｍｉｄｉｓら、Ｖａｃｃｉｎｅ  １５：４３３〜４４０（１９９７）、これは本明細書において参考として援用される）。さらに、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓは、操作されて、疾患関連抗原またはその免疫原性エピトープ（例えば、ガンに対する防御またはその処置のための免疫応答を刺激するための、腫瘍関連抗原）を発現し得る（例えば、ＰａｔｅｒｓｏｎおよびＩｋｏｎｏｍｉｄｉｓ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８：６６４〜６６９（１９９６）、これは本明細書において参考として援用される）。
【００４９】
Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ（ＢＣＧ）の弱毒化株はまた、本発明のワクチンにおいて使用され得る（ＩｒｖｉｎｅおよびＲｅｓｔｉｆｏ、Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ６：３３７〜３４７（１９９５）；Ｓｔｏｖｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ３５１：４５６〜４６０（１９９１）、これらの各々は、本明細書において参考として援用される）。ＢＣＧは、結核ワクチンとして首尾よく投与されており、そしてＢＣＧの細胞壁の成分は強力なアジュバント活性を有する。本発明のワクチンにおける膜結合タンパク質、そして所望される場合、疾患関連抗原またはその免疫原性エピトープの発現について有用なＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｌ発現ベクターは、当該分野において周知である（Ｊａｃｏｂｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ３２７：５３２〜５３５（１９８７）およびＳｎａｐｐｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  ８５：６９８７〜６９９１（１９８８）、これらの各々は、本明細書において参考として援用される）。当業者は、これらのおよび他の真核生物および原核生物宿主細胞が本発明のワクチンおよび方法において使用され得ることを理解する。
【００５０】
本発明の細胞性ワクチンにおいて有用な発現ベクターとしては、原核生物および真核生物発現ベクターが挙げられる。プラスミド、コスミド、ならびにバクテリオファージ、バキュウロウイルス、レトロウイルスおよびＤＮＡウイルスベクターのようなウイルスベクターを含むそのような発現ベクターは、当該分野において周知である（例えば、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．Ｖｏｌ．１８５、Ｄ．Ｖ．Ｇｏｅｄｄｅｌ、編（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．、１９９０）、およびＫａｐｌｉｔｔおよびＬｏｅｗｙ（編）、Ｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．、１９９５）を参照のこと、これらの各々が本明細書において参考として援用される）。発現ベクターは、膜結合融合タンパク質をコードする核酸分子の、構成性または誘導性の転写を達成するために必要なエレメントを含む。サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、またはシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーター／エンハンサーエレメントを含むベクターのような、高レベルの維持された発現を生じる真核生物発現ベクターは、本発明のワクチンにおいて特に有用である。強力なプロモーター／エンハンサーエレメントを有する市販の発現プラスミドとしては、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）からのｐＨＯＯＫTM−１、ｐＨＯＯＫTM−２、ｐＨＯＯＫTM−３、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐｃＤＮＡ３．１／ＨｙｇｒｏおよびｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏが挙げられる。ｐＨＯＯＫTM−１、ｐＨＯＯＫTM−２およびｐＨＯＯＫTM−３発現プラスミドは、ヒト血小板由来増殖因子βレセプター膜付着ドメインをコードするヌクレオチド配列を含み、従って、本発明のワクチンにおいて特に有用である（実施例Ｉを参照のこと）。原核生物または真核生物宿主系が特定のベクターに適合することは、当業者にとって公知である。
【００５１】
膜結合融合タンパク質をコードする発現ベクターは、細胞に導入され得、当該分野において公知でありそして記載される任意の種々の方法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｙ  Ｍａｎｕａｌ、２ｎｄ  Ｅｄ、Ｖｏｌｓ  １  ｔｏ  ３、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）、およびＡｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、ＭＤ（１９９４）、これらの各々は、本明細書において参考として援用される）によって、本発明のワクチンを産生し得る。そのような方法として、例えば、組換え発現ベクターを真核生物細胞中に導入する、リポフェクションまたはエレクトロポーレーションを介するトランスフェクションが挙げられる。ｐＨＯＯＫTM．１発現ベクターのＣＴ−２６細胞への導入は、実施例Ｉにおいて記載される。
【００５２】
１つの実施態様において、細胞性ワクチンはさらに、疾患関連抗原またはその免疫原性エピトープを含む。疾患関連抗原は、細胞に対して、内因性か、または外因性であり得、そして腫瘍関連抗原、自己免疫疾患関連抗原、感染性疾患関連抗原、ウイルス抗原、寄生虫抗原および細菌抗原を含む。
【００５３】
本明細書において使用する場合、用語「疾患関連抗原」とは、細胞媒介性免疫応答または体液性免疫応答を誘導し得る疾患細胞の表面上に存在する分子を意味する。疾患関連抗原は、特定の疾患細胞において選択的に発現され得るか、または疾患細胞および正常細胞の両方の細胞上に発現され得る。
【００５４】
疾患関連抗原に関して、本明細書において使用される場合、用語「その免疫原性エピトープ」とは、疾患関連抗原に対する細胞媒介性免疫応答または体液性免疫応答を誘導する抗原決定基として作用する抗原の部分を意味する。Ｔ細胞エピトープおよびＢ細胞エピトープの両方は、用語免疫原性エピトープに含まれる。
【００５５】
疾患関連抗原および細胞に関して本明細書において使用される場合、用語「内因性」とは、細胞内を起源とする疾患関連抗原を意味する。
【００５６】
疾患関連抗原および細胞に関して本明細書において使用される場合、用語「外因性」とは、細胞内を起源とする疾患関連抗原を意味する。外因性疾患関連抗原は、当該分野で周知の組換え方法を使用して、膜結合融合タンパク質を有する細胞において、都合よく発現され得る。
【００５７】
種々の腫瘍関連抗原は、本発明のワクチンおよび方法において有用である（表３を参照のこと）。そのような腫瘍関連抗原は、腫瘍特異的な抗原、ならびに腫瘍選択的な抗原を含む。腫瘍関連抗原は、ｐ５３およびその変異体、Ｒａｓおよびその変異体、Ｂｃｒ／Ａｂｌ切断点ペプチド、ＨＥＲ−２／Ｎｅｕ、ＨＰＶ  Ｅ６、ＨＰＶ  Ｅ７、ガン胎児抗原、ＭＵＣ−１、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ−Ｖ、ｐ１５、ｇｐ１００、ＭＡＲＴ−１／ＭｅｌａｎＡ、チロシナーゼ、ＴＲＰ−１、βカテニン、ＭＵＭ−１およびＣＤＫ−４が挙げられる。
【００５８】
腫瘍関連抗原は、変異していない過剰発現ガンタンパク質、または変異している独特のガンタンパク質のような、発ガン性タンパク質であり得る（ＤｉｓｉｓおよびＣｈｅｅｖｅｒ、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８：６３７〜６４２（１９９６）；Ｃｏｒｎｅｌｉｓら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８：６５１〜６５７（１９９６）、これらの各々は、本明細書において参考として援用される）。例えば、ｐ５３における変異は、ヒト悪性疾患の約５０％において存在し、そして変異Ｐ５３タンパク質またはそのペプチドフラグメントは、本発明において有用な腫瘍関連抗原であり得る（Ｙａｎｕｃｋら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３：３２５７〜３２６１（１９９３）；Ｎｏｇｕｃｈｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  ９２：２２１９〜２２２３（１９９５）、これらの各々は、本明細書において参考として援用される）。本発明のワクチンにおいて有用な腫瘍関連抗原はまた、正常ｐ５３タンパク質またはそのペプチドフラグメントであり得る（Ｔｈｅｏｂａｌｄら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  ９２：１１９９３〜１１９９７（１９９５）；Ｈｏｕｂｉｅｒｓら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：２０７２〜２０７７（１９９３）、これらの各々は、本明細書において参考として援用される）。ｐ５３は、正常細胞および腫瘍細胞の両方において存在するが、正常ｐ５３ペプチドを含むワクチンは、腫瘍細胞の細胞質におけるｐ５３蓄積の相対的増加に起因して、腫瘍細胞に対する選択的免疫応答を促進し得る。
【００５９】
Ｒａｓにおける変異は、ヒト悪性疾患の約１５％において存在する。変異Ｒａｓタンパク質およびそのペプチドフラグメントは、そのような悪性疾患の処置のためのワクチンにおいて有用な腫瘍関連抗原であり得る。変異Ｒａｓタンパク質は、残基１２または６１に、通常、単一アミノ酸置換を有する；この変異セグメントにわたるＲａｓペプチドは、有用な腫瘍関連抗原であり得る（Ｃｈｅｅｖｅｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１４５：３３〜５９（１９９５）；Ｇｊｅｒｔｓｅｎら、Ｌａｎｃｅｔ  ３４６：１３９９〜１４００（１９９５）；Ａｂｒａｍｓら、Ｓｅｍｉｎａｒｓ  Ｏｎｃｏｌ．２３：１１８〜１３４（１９９６）；Ａｂｒａｍｓら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２６：４３５〜４４３（１９９６）、これらの各々は、本明細書において参考として援用される）。
【００６０】
ＨＥＲ−２／ｎｅｕはまた、腫瘍関連抗原であり、そしてＨＥＲ−２／ｎｅｕプロトガン遺伝子由来のペプチドは、本発明のワクチンおよび方法において有用であり得る（Ｄｉｓｉｓら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５４：１０７１〜１０７６（１９９４）；Ｂｅｒｎｈａｒｄら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５５：１０９９〜１１０４（１９９５）；Ｍａｙｏｒｄｏｍｏら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．１：１２９７〜１３０２（１９９５）、これらの各々は、本明細書において参考として援用される）。ＨＥＲ−２／ｎｅｕは、乳ガンおよび卵巣ガンの３０％において、ならびに広範囲に種々の他の腺ガンにおいて、過剰発現される増殖因子レセプターである。
【００６１】
本発明のワクチンにおいて有用な腫瘍関連抗原はまた、上皮細胞増殖因子レセプター（ＥＧＦＲ）またはその免疫原性エピトープ、あるいは変異ＥＧＦＲ改変体またはその免疫原性エピトープであり得る。例えば、ＥＧＦＲ欠失変異ＥＧＦＲｖＩＩＩは、乳房ガン腫のサブセットにおいて、および非小細胞肺ガン腫および悪性神経膠腫において発現する。ＥＧＦＲｖＩＩＩ疾患関連抗原（例えば、新規のＥＧＦＲｖＩＩＩ融合接合部に対応するペプチド）は、そのような腫瘍に対する免疫応答を刺激することにおいて有用であり得る（Ｗｉｋｓｔｒａｎｄら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５５：３１４０〜３１４８（１９９５）；Ｍｏｓｃａｔｅｌｌｏら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７：１４１９〜１４２４（１９９７）、これらの各々は、本明細書において参考として援用される）。従って、ＥＧＦＲまたはＥＧＦＲｖＩＩＩ疾患関連抗原またはその免疫原性エピトープは、乳ガン腫および肺ガン腫、ならびに悪性神経膠腫の処置のためのワクチンにおいて、そしてこれらのガンを発症する高い危険性を有する個体を防御するために、有用であり得る。
【００６２】
腫瘍関連抗原はまた、Ｂｃｒ−Ａｂｌのようなキメラガンタンパク質の結合領域セグメントであり得る（Ｔｅｎ−Ｂｏｓｃｈら、Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ９：１３４４〜１３４８（１９９５）；Ｔｅｎ−Ｂｏｓｃｈら、Ｂｌｏｏｄ  ８７：３５８７〜３５９２（１９９６）、これらの各々は、本明細書において参考として援用される）。
【００６３】
本発明のワクチンにおいて有用な腫瘍関連抗原はまた、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｅ６またはＥ７ウイルスガン遺伝子またはその免疫原性エピトープのような、Ｅ６またはＥ７ウイルスガン遺伝子であり得る。例えば、ＨＰＶ１６は、子宮頚ガンと関連する主要なヒトパピローマウイルス型の１つであり、ＨＰＶ１６  Ｅ６およびＥ７によってコードされる免疫原性ペプチドエピトープは、子宮頚ガンの予防および処置のためのワクチンにおいて有用であり得る（Ｒｅｓｓｉｎｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：５９３４〜５９４３（１９９５）；Ｒｅｓｓｉｎｇら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５６：５８２〜５８８（１９９６）、これらの各々は、本明細書において参考として援用される）。
【００６４】
本発明のワクチンにおいて有用な腫瘍関連抗原はまた、ガン胎児抗原（ＣＥＡ）であり得る。この抗原は、結腸直腸、胃、および膵臓ガン腫の大多数において、高度に発現する（Ｔｓａｎｇら、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．８７：９８２〜９９０（１９９５）、これは本明細書において参考として援用される）。
【００６５】
ＭＵＣ−１ムチン遺伝子産物（上皮細胞上に存在する膜内因性糖タンパク質）はまた、本発明において有用な腫瘍関連抗原である。ムチンは、ほとんど全てのヒト上皮細胞の腺ガン（乳房、卵巣、膵臓、肺、膀胱、前立腺および子宮内膜のガン腫を含む）において発現し、全てのヒト腫瘍の過半数を表す（例えば、Ｆｉｎら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１４５：６１〜８９（１９９５）；Ｂａｒｒａｔｔ−Ｂｏｙｅｓ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．４３：１４２〜１５１（１９９６）、これらの各々は、本明細書において参考として援用される）。従って、全長ムチンまたはその免疫原性エピトープを含む本発明のワクチンは、乳房ガン腫のような上皮細胞腺ガンに対して防御するためか、またはこれを処置するために使用され得る（Ｌａｌａｎｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１５４２０〜１５４２６（１９９１）、これは、本明細書において参考として援用される）。
【００６６】
副組織適合抗原もまた、本発明のワクチン中の腫瘍関連抗原として使用され得る（Ｇｏｕｌｍｙ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８：７５〜８１（１９９６）；Ｄｅｎ  Ｈａａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６８：１４７８〜１４８０（１９９５）；Ｗａｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６９：１５８８〜１５９０（１９９５）、これらの各々は本明細書中に参考として援用される）。例えば、ＨＬＡ−Ａ２抗原は、ヒト腎細胞ガンを処置するための本発明のワクチン中で使用され得る（Ｂｒａｎｄｌｅら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８３：２５０１〜２５０８（１９９６）、これは本明細書中に参考として援用される）。
【００６７】
種々の広範に共有されるメラノーマ抗原もまた、本発明のワクチンに有用な腫瘍関連抗原であり得る（ＲｏｂｂｉｎｓおよびＫａｗａｋａｍｉ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８：６２８〜６３６（１９９６）；ＣｅｌｌｉおよびＣｏｌｅ，Ｓｅｍｉｎａｒｓ  Ｏｎｃｏｌ．２３：７５４〜７５８（１９９６）、これらの各々は本明細書中に参考として援用される）。例えば、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−３、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ−１およびＧＡＧＥ−２腫瘍関連抗原またはそれらの免疫原性エピトープ（例えば、ＭＺ２−Ｅ）は、メラノーマに対する防御およびメラノーマの処置のための本発明のワクチン中で使用され得る（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｂｒｕｇｇｅｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：１６４３〜１６４７（１９９１）、これは本明細書中に参考として援用される）。正常な成体組織中において、ＭＡＧＥ関連遺伝子産物の発現は、精巣および胎盤に限定される；しかし、これらの腫瘍関連抗原は、広範な腫瘍型（乳ガンおよび肉腫を含む）中で発現される。本発明のワクチン中において有用な、広範に発現されるメラノーマ腫瘍関連抗原はまた、例えば、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ−Ｖ（これは約５０％のメラノーマ中で有意なレベルで発現され、そして正常組織には存在しない（Ｇｕｉｌｌｏｕｘら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８３：１１７３〜１１８３（１９９６）、これは本明細書中に参考として援用される））であり得る。
【００６８】
メラノーマ腫瘍関連抗原はまた、正常メラノサイトにより発現される分化抗原であり得る。このようなメラノーマ腫瘍関連抗原には、ＭＡＲＴ−１／ＭｅｌａｎＡ；ｇｐ１００；チロシナーゼ（色素合成における重要な酵素）；およびチロシナーゼ関連タンパク質ＴＲＰ−１（ｇｐ７５）が挙げられる。
【００６９】
独特なメラノーマ関連抗原はまた、本発明のワクチンに有用な腫瘍関連抗原であり得る（Ｍｕｍｂｅｒｇら、Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．８：２８９〜２９３（１９９６）、これは本明細書中に参考として援用される）。このような独特な腫瘍関連抗原には、ＭＵＭ−１、β−カテニンおよびサイクリン依存キナーゼＣＤＫ４メラノーマ抗原が挙げられる（Ｃｏｕｌｉｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ９２：７９７６〜７９８０（１９９５）；Ｗｏｌｆｅｌら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６９：１２８１〜１２８４（１９９５）；Ｒｏｂｂｉｎｓら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８３：１１８５〜１１９２（１９９６）、これらの各々は本明細書中に参考として援用される）。
【００７０】
【表３】
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0003785041.tif 000008
0003785041.tif 000009
【００７１】
本発明の疾患関連抗原はヒト免疫不全Ｉ型（ＨＩＶ−１）抗原であり得る。このような抗原には、ｇｐ１２０エンベロープ糖たんぱく質およびその免疫原性エピトープ（例えば、主要中和決定因子（ｐｒｉｎｃｉｐａｌ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ（ＰＮＤ））；ｇｐ１６０；およびＨＩＶ−１コアタンパク質由来の免疫原性エピトープ（Ｅｌｌｉｓ（編）、Ｖａｃｃｉｎｅｓ：Ｎｅｗ  Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｐｒｏｂｌｅｍｓ  Ｓｔｏｎｅｈａｍ，ＭＡ：Ｒｅｅｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｉｎｃ．（１９９２）これは本明細中に参考として援用される）が挙げられる。
【００７２】
本発明のワクチンはまた、自己免疫疾患関連抗原を含み得、そして慢性関節リュウマチ、乾癬、多発性硬化症、全身性エリトマトーデスおよび橋本病、Ｉ型糖尿病、重症筋無力症、アディソン病、自己免疫性胃炎、グレーヴス病および白斑のような疾患に対する防御において、またはそれを処置するにおいて有用であり得る。自己免疫疾患関連抗原は、例えば、Ｔ細胞レセプター由来ペプチド（例えば、Ｖβ１４、Ｖβ３、Ｖβ１７、Ｖβ１３およびＶβ６由来ペプチド）であり得る。また、自己免疫疾患関連抗原には、アネキシン（例えば、ＡＸ−１、ＡＸ−２、ＡＸ−３、ＡＸ−４、ＡＸ−４、ＡＸ−５およびＡＸ−６、これらは全身性エリトマトーデス、慢性関節リウマチおよび炎症性腸疾患のような自己免疫疾患に関する自己抗原である）が挙げられる（Ｂａｓｔｉａｎ，Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ．Ｓｃｉ．５３：５５４〜５５６（１９９７）これは本明細書中に参考として援用される）。さらに、アネキシンは本発明のワクチンに有用な主要関連抗原であり得る。
【００７３】
種々の他の疾患関連抗原はまた、本発明のワクチンに含まれ得る。このような疾患関連抗原には、ウィルス性、寄生虫性、酵母性および細菌性抗原が挙げられる。例えば、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉは表層性胃炎の主要な原因因子であり、そして消化性潰瘍疾患の原因において中心的な役割を果たす。Ｈ．ｐｙｌｏｒｉの感染はまた、胃がんの危険性を増加させるようである。本発明のワクチンは、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ感染に対する防御に有用であり得る。このようなワクチンは、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ疾患関連抗原（例えば、ウレアーゼタンパク質、９０ｋＤａ空胞形成（ｖａｃｕｏｌａｔｉｎｇ）細胞毒素（ＶａｃＡ）、またはＨ．ｐｙｌｏｒｉの１２０〜１４０ｋＤａ免疫優性タンパク質（ＣａｇＡ））あるいはそれらの免疫原性エピトープ（ＣｌｙｎｅおよびＤｒｕｍｍ，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６４：２８１７（１９９６）；Ｒｉｃｃｉら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６４：２８２９〜２８３３（１９９６）、これらの各々は本明細書中に参考として援用される）を含む。
【００７４】
本発明のワクチンはまた、成人の歯周疾患を生じる歯の支持組織の慢性炎症状態を予防するために使用され得る。詳細には、Ｐｏｒｐｈｙｏｒｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓは、このような疾患の重要な病原因子として認識されており、そしてＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ由来の疾患関連抗原は、歯周疾患の予防および処置のための本発明のワクチンに包含され得る。Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ疾患関連抗原には、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓのＡｒｇＩ、ＡｒｇＩＡおよびＡｒｇＩＢアルギニン特異的プロテアーゼ、ならびにそれらの免疫原性エピトープ（これはＧＶＳＰＫＶＣＫＤＶＴＶＥＧＳＮＥＦＡＰＶＱＮＬＴ（配列番号４６）のエピトープを含む（例えば、Ｃｕｒｔｉｓら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６４：２５３２〜２５３９（１９９６）を参照のこと、これは本明細書中に参考として援用される））。
【００７５】
本発明のワクチンに有用なさらなる疾患関連抗原には、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓのＭＰ６５抗原（Ｇｏｍｅｚら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６４：２５７７（１９９６）、これは本明細書中に参考として援用される）；蠕虫性抗原；Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｌ抗原（Ｍ．ｂｏｖｉｓおよびＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ抗原）；Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ抗原；Ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ抗原；コレラ抗原；マラリア抗原；インフルエンザウイルス抗原；ＲＳウイルス抗原；Ｂ型肝炎抗原；ポリオウイルス抗原；単純ヘルペス抗原；ロタウイルス抗原およびフラビウイルス抗原が挙げられる（Ｅｌｌｉｓ，前述、１９９２）。
【００７６】
さらなる実施態様において、このワクチンは膜結合型融合タンパク質へと作動可能に融合された疾患関連抗原またはその免疫原性エピトープを含む。このようなワクチンは外因性疾患関連抗原を発現する場合に特に有用である。そして、このワクチンは、非抗体性免疫調節分子を含む膜結合型融合タンパク質の発現のため、および疾患関連抗原または免疫原性エピトープの発現のために、単一の発現ベクターのみが使用される、という利点を有する。
【００７７】
以前より、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＦＮ−γまたはＩＬ−Ｉβペプチドに融合されたイディオタイプの抗原を含むもののような可溶性サイトカイン抗原融合タンパク質が発現されてきた（ＴａｏおよびＬｅｖｙ，Ｎａｔｕｒｅ３６２：７５５〜７５８（１９９３）；Ｈａｋｉｍら、前述、１９９６；Ｃｈｅｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５３：４７７５（１９９４）、これは本明細書中に参考として援用される）。このような可溶性サイトカイン抗原融合タンパク質は、マウスを腫瘍チャレンジから防御する抗イディオタイプ応答を誘発し、そしてこのことは、融合タンパク質として発現された場合に種々のサイトカインが活性を保持していることを示す。
【００７８】
本発明のワクチンにおいて、膜結合型融合タンパク質は、疾患関連抗原またはその免疫原性エピトープに作動可能に融合されたアミノ末端非抗体性免疫調節分子を含み得、これはカルボキシル末端異種膜付着ドメインへと作動可能に融合される。疾患関連抗原またはその免疫原性エピトープを含む膜結合型融合タンパク質は、組換え方法によって容易に産生され得る。例えば、実施例Ｉに記載されるＧＭ−ＣＳＦ／ＰＤＧＦＲ膜付着ドメイン構築物は、ｐＨＯＯＫTM−１．ＧＭ−ＣＳＦのＳａｌＩ部位で抗原をコードするヌクレオチド配列をクローニングすることによって、改変されて作動可能に融合された疾患関連抗原を含み得る。
【００７９】
本発明のワクチンはまた、異種膜付着ドメインへと作動可能に融合された非抗体性免疫調節分子を含む膜結合型融合タンパク質に加えて、膜結合型または可溶性形態で第二の免疫調節分子を含み得る。例えば、単独のサイトカインによって産生された応答と比較して相乗的な応答であるような増強された免疫応答を産生し得る、サイトカインの組合せは、本発明のワクチンにおいて特に有用である。例えば、本発明のワクチンにおいて、ＧＭ−ＣＳＦは、ＩＬ−４との組み合わせで使用され得る；ＩＬ−１は、ＴＮＦ、ＩＬ−２、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦまたはＩＬ−３との組合せで使用され得る；あるいはＩＬ−２はＩＬ−４との組み合わせで使用され得る。同様に、ＩＬ−６は、例えば、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−２またはＭ−ＣＳＦとの組合せで使用され得、そしてＩＬ−７はＩＬ−２またはＩＬ−４のようなサイトカインとの組合せにおいて使用され得る（Ｔｈｏｍｓｏｎ，前述、１９９４；Ｗａｋｉｍｏｔｏら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｖａｃｃｉｎｅ  ５６：１８２８〜１８３３（１９９６）を参照のこと、これは本明細書中に参考として援用される）。
【００８０】
本発明の好ましいワクチンには、ＩＬ−４との組合せにおいてＧＭ−ＣＳＦを包含する。本発明のこのような細胞性ワクチンには、例えば、異種膜付着ドメインへと作動可能に融合されたＧＭ−ＣＳＦを含む膜結合型融合タンパク質に加えて、膜結合型または可溶性形態でのＩＬ−４を包含し得る。本発明のこのような細胞性ワクチンはまた、異種膜付着ドメインへと作動可能に融合されたＩＬ−４を含む膜結合型融合タンパク質に加えて、膜結合型または可溶性形態でのＧＭ−ＣＳＦを有し得る。
【００８１】
さらに、所望される場合、本発明のワクチンはＢ７−１（ＣＤ８０）またはＢ７−２（ＣＤ８６）共刺激分子あるいはＣＤ４０またはＣＤ４０リガンドを含み得る（Ｃｈｅｎら、Ｃｅｌｌ  ７１：１０９３〜１１０２（１９９２）；Ｃｈｅｎら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７９：５２３〜５３２（１９９４）；Ｌｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５３：４２１〜４２８（１９９４）；およびＹａｎｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：２７９４〜２８００（１９９５）、これらの各々は本明細書中に参考として援用される）。ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γまたはＩＦＮ−αのような非抗体性免疫調節分子を含む膜結合型融合タンパク質に加えて、Ｂ７−１またはＢ７−２共刺激分子を有するワクチンは、異種膜付着ドメインへと作動可能に融合した。
【００８２】
本発明はまた、疾患関連抗原に対する免疫応答を調節する方法を提供する。本発明の方法において、個体は疾患関連抗原またはその免疫原性エピトープおよび異種膜付着ドメインへと作動可能に融合された非抗体性免疫調節分子を有する細胞を含むワクチンを投与される。本発明の方法は、単独で、例えば、腫瘍に対して防御するためまたは腫瘍を処置するために使用され得るか、あるいは外科的療法、放射線治療および化学療法のような慣用的な処置による腫瘍の縮小（ｄｅｂｕｌｋｉｎｇ）の後のアジュバント治療として使用され得る。
【００８３】
免疫応答を調節するための本発明の方法は、腫瘍およびガン、自己免疫疾患，細菌、寄生虫またはウイルス性病因の感染性疾患および障害を含む、種々の疾患、状態ならびに障害を処置するために使用され得る。１つの実施態様において、本発明の方法は、メラノーマ、結腸直腸ガン、前立腺ガン、乳ガン、卵巣ガン、子宮頚ガン、子宮内膜ガン、グリア芽細胞腫、腎ガン、膀胱ガン、胃ガン、膵ガン、神経芽細胞腫、肺ガン、白血病およびリンパ腫のようなガンを含むガンに対する防御または処置をのための免疫応答を調節するために使用され得る。本発明の方法はまた、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）のような感染性疾患に対して防御する、またはこれを処置するために使用され得る。
【００８４】
さらに、本発明の方法は、慢性関節リュウマチ、乾癬、多発性硬化症、全身性エリトマトーデスおよび橋本病、Ｉ型糖尿病、重症筋無力症、アディソン病、自己免疫性胃炎、グレーヴス病および白斑のような自己免疫疾患の発症に対して防御するため、または既に存在するこのような疾患を処置するために使用され得る。枯草熱、ぜん息、全身アナフィラキシーまたは接触皮膚炎のようなアレルギー反応もまた、免疫応答を調節するための本発明の方法を使用して処置され得る。
【００８５】
種々の細菌、寄生虫、酵母またはウイルス性病因の疾患または状態もまた、免疫応答を処置するための本発明の方法を使用して予防および処置され得る。このような疾患および状態には、胃炎および消化性潰瘍疾患；歯周疾患；Ｃａｎｄｉｄａ感染；蠕虫感染；結核；細菌性髄膜炎のようなＨｅｍｏｐｈｉｌｕｓ媒介性疾患；百日咳のような百日咳ウイルス媒介性疾患；コレラ；マラリア；インフルエンザ感染；ＲＳ抗原；肝炎；ポリオ；陰部および非陰部単純ヘルペスウイルス感染；急性乳児胃腸炎および下痢のようなロタウイルスが媒介する状態；ならびに黄熱病および脳炎のようなフラビウイルス媒介疾患が挙げられる。
【００８６】
本明細書中に開示されるように、本発明の方法は、このような疾患または状態の１つを有する個体あるいはこのような疾患または状態の１つを有すると疑われる個体を処置するために使用され得る。本発明の方法はまた、このような疾患または状態の１つを発症する危険のある個体を急性疾患の発症から防御するために使用され得る。特定の型のガンのような、特定の疾患の発症を受け易い個体は、遺伝子スクリーニング方法を使用して同定され得る（例えば、Ｍａｏら、Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．５４（補遺）：１９３９ｓ〜１９４０ｓ（１９９４）；ＧａｒｂｅｒおよびＤｉｌｌｅｒ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｅｄｉａｔｒ．５：７１２〜７１５（１９９３）を参照のこと、これらの各々は本明細書中に参考として援用される）。このような個体は、例えば、メラノーマ、網膜芽腫、乳ガンまたは結腸ガンを発症し易いか、あるいは多発性硬化症または関節リュウマチを発症し易い。
【００８７】
本発明の方法に有用な免疫調節性分子には、サイトカインおよび熱ショックタンパク質のような免疫刺激性分子および免疫抑制性分子が挙げられる。本発明の方法に有用なサイトカインには、例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−α、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、リンホタクチンまたはＤＣ−ＣＫ１、本明細書中に上記の別のサイトカイン、あるいは当該分野において公知の別のサイトカイン分子であり得る。顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）が本発明の方法に特に有用である。
【００８８】
本発明の方法に有用な細胞には、原核生物細胞ならびに線維芽細胞および腫瘍細胞のような真核生物細胞が挙げられる。上記のように、有用な腫瘍細胞は、例えば、メラノーマ細胞、腎ガン細胞、神経細胞腫細胞、グリア芽細胞腫細胞、肺ガン細胞、結腸ガン細胞、乳ガン細胞、前立腺ガン細胞、膀胱ガン細胞またはプラスマ細胞腫細胞であり得る。本発明の方法において、細胞はワクチンが投与される個体に対して同系、同種異系または異種であり得る。ヒトの処置については、同種異系細胞には、ＨＬＡ適合細胞および非適合細胞が挙げられる。ＨＬＡ適合細胞によって、ワクチン細胞上の１つ以上の主要組織適合性複合体分子が、ワクチン細胞が投与される個体の細胞上の１つ以上のＭＨＣ分子と同一であることが意味される。このようなＨＬＡ適合同種異系細胞には、例えば、ＨＬＡ−Ａ２適合細胞が挙げられる。
【００８９】
種々の疾患関連抗原が使用されて、疾患関連抗原に対する免疫応答を調節し得る。上に議論するように、疾患関連抗原は、膜結合型融合たんぱく質を有する細胞に対して内因性または外因性であり得る。このような疾患関連抗原は、例えば、腫瘍関連抗原、自己免疫疾患関連抗原、感染性疾患関連抗原、ウイルス性抗原、寄生虫性抗原または細菌性抗原であり得る。腫瘍関連抗原には、ｐ５３およびその変異体、Ｒａｓおよびその変異体、Ｂｃｒ／Ａｂｌ切断点ペプチド、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＨＰＶ  Ｅ６、ＨＰＶ  Ｅ７、ガン胎児抗原、ＭＵＣ−１、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＶ、ｐ１５、ｇｐ１００、ＭＡＲＴ−１／ＭｅｌａｎＡ、チロシナーゼ、ＴＲＰ−１、β−カテニン、ＭＵＭ−１およびＣＤＫ−４が挙げられる。自己免疫疾患関連抗原には、例えば、Ｔ細胞レセプター由来ペプチドが挙げられる。所望される場合、疾患関連抗原またはその免疫原性エピトープは、膜結合型融合タンパク質へと作動可能に融合され得る。
【００９０】
本発明の方法に従う、個体に投与されるワクチン細胞の数は、疾患関連抗原に対する免疫応答を調節し得る細胞数である。投与されるワクチン細胞の有効な数は、個体にワクチンを投与した後に免疫効果細胞の活性を決定するためのアッセイを使用して、または以下に記載のように周知のインビボ診断アッセイを使用して治療の有効性をモニターすることによって、決定され得る。一般的に、約１×１０4〜１×１０8細胞、および好ましくは、１×１０7〜１×１０8細胞を含むワクチンは、免疫応答を調節するために有用である。当業者は、投与されるワクチン細胞の数が、例えば、ワクチンの投与されるべき回数および所望される応答のレベルに依存することを理解する。
【００９１】
本発明のワクチン細胞は、生理食塩水のような薬理学的に受容可能な溶液または適切なアジュバントとともに投与され得る。免疫するために有用な、多くの薬理学的に受容可能な溶液およびアジュバントが、当該分野で公知である。本発明のワクチン細胞は、このような溶液またはアジュバント中で安定であるべきであることが認識される；例えば、細胞溶解を生じる薬理学的に受容可能な溶液は、本発明の方法において有用ではない。
【００９２】
ワクチン投与は、皮下、皮内もしくは筋肉内注射、腫瘍病変への直接的な注射、および経口投与を含む種々の方法のうちのいずれかによって達成され得る。当業者は、経口投与がＳａｌｍｏｎｅｌｌａワクチンのような原核生物ワクチンのために特に有用であることを理解する。皮内もしくは皮下投与、またはそれらの組み合わせは、膜結合ＧＭ−ＣＳＦを含むワクチンの投与のために特に有用である。腫瘍の処置については、投与は、腫瘍部位であり得るか、または原発性腫瘍部位以外の位置であり得る。ワクチンによって接触させる領域を増加させるための複数の投与経路および複数部位での投与はまた、本発明によって想到される。例えば、数ヶ月ごとに投与される追加免疫のワクチンはまた、本発明の方法に従う疾患関連抗原に対する免疫応答を調節するに有用であり得ることが認識される。
【００９３】
当業者は、治療の有効性が、患者において免疫機能をモニターすることによって決定され得ることを認識している。抗腫瘍治療において、例えば、患者の癌細胞に対する免疫効果細胞の細胞溶解性活性は、実施例ＩＩに記載の方法を使用してアッセイされ得る。さらに、腫瘍のサイズまたは増殖速度は、診断画像の方法を使用してインビボでモニターされ得る。治療期間に患者をモニターすることによって、主治医は、本発明のワクチンの反復投与を用いるべきか否かを認識する。
【００９４】
本明細書においてさらに提供されるものは、中性または塩基性ｐＨにて機能的な膜付着ドメインをコードする異種ヌクレオチド配列に作動可能に連結された非抗体性免疫調節分子をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子である。非抗体性免疫調節分子は、免疫刺激性または免疫抑制性分子であり得る。例えば、サイトカインおよび熱ショックタンパク質は、本発明の核酸分子において有用な免疫調節分子である。このようなサイトカインは、例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−α、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、リンホタクチン（ｌｙｍｐｈｏｔａｃｔｉｎ）、およびＤＣ−ＣＫ１であり得る。サイトカインであるＧＭ−ＣＳＦは、本発明の核酸分子において特に有用である。
【００９５】
中性または塩基性ｐＨにて機能的な膜付着ドメインをコードする異種ヌクレオチド配列に作動可能に連結された非抗体性免疫調節分子をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子は、所望されるならば、疾患関連抗原またはその免疫原性エピトープをコードする、作動可能に連結されたヌクレオチド配列をさらに含み得る。
【００９６】
サイトカイン−ジフテリアトキシン融合タンパク質をコードする核酸は、以前に記載されている（ｖａｎｄｅｒＳｐｅｋら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３８：１５１−１５６（１９９４）；ＭｕｒｐｈｙおよびｖａｎｄｅｒＳｐｅｋ，Ｓｅｍｉｎａｒｓ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ．６：２５９−２６７（１９９５）、これらの各々は、本明細書中に参考として援用される）。これらの融合タンパク質は、ジフテリアトキシンの疎水性ドメインを含み、このドメインは、エンドサイトーシス小胞から細胞質ゾルへの送達において酸性ｐＨで機能する。しかし、このようなジフテリアトキシンの疎水性ドメインは、例えば、細胞質膜への膜結合において、中性ｐＨでは機能しない。従って、ジフテリアトキシン融合タンパク質をコードする核酸は、本発明の核酸から除外される。
【００９７】
疾患関連抗原は、例えば、腫瘍関連抗原、自己免疫疾患関連抗原、感染症関連抗原、ウイルス抗原、寄生体抗原または細菌抗原であり得る。腫瘍関連抗原としては、ｐ５３およびその変異体、Ｒａｓおよびその変異体、Ｂｃｒ／Ａｂ１切断点ペプチド、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＨＰＶ  Ｅ６、ＨＰＶ  Ｅ７、癌胎児性抗原、ＭＵＣ−１、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ−Ｖ、ｐ１５、ｇｐ１００、ＭＡＲＴ−１／ＭｅｌａｎＡ、チロシナーゼ、ＴＲＰ−１、β−カテニン、ＭＵＭ−１およびＣＤＫ−４、ならびに当該分野で公知の他の腫瘍関連抗原が挙げられる。自己免疫疾患関連抗原としては、例えば、Ｔ細胞レセプター由来のペプチドが挙げられる。
【００９８】
本発明はさらに、膜結合ドメインがジフテリアトキシンに由来しないという条件で、膜付着ドメインをコードする異種ヌクレオチド配列に作動可能に連結した非抗体性免疫調節分子をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を提供する。
【００９９】
以下の実施例は、例示であって、本発明を限定しないことが意図される。
【０１００】
（実施例Ｉ）
（膜結合ＧＭ−ＣＳＦを含む細胞性ワクチンの生成）
この実施例は、膜結合ＧＭ−ＣＳＦ融合タンパク質を含む細胞性ワクチンの調製および使用を記載する。
【０１０１】
（ｐＨＯＯＫTM−１、ＧＭ−ＣＳＦ発現構築物の調製）
マウスＧＭ−ＣＳＦ  ｃＤＮＡを単離するために、総ＲＮＡを、 Ｂａｌｂ／ｃマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓ，Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）から単離した、コンカナバリンＡで刺激した脾臓細胞から調製した。刺激した脾臓細胞を、ＴｒｉｚｏｌTM（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ；Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）で、５×１０6細胞／ｍｌ  ＴｒｉｚｏｌTMの濃度で溶解し、そして−７０℃で凍結した。次いで、細胞を融解し、２００μｌのクロロホルムを添加し、そしてサンプルを１５〜３０秒ボルテックスした。次いで、サンプルを室温で１０分間インキュベートし、１２，０００×ｇで１５〜２０分間、４℃で遠心分離した。無色の水相を新たなチューブに移し、そして５〜２０μｌのグリコーゲンを２０μｇ／μｌのストック溶液から添加した。５００μｌのイソプロピルアルコールを添加した後に、サンプルを１５〜３０℃で１時間インキュベートし、次いで、１２，０００×ｇにて、４℃で１０分間遠心分離した。上清を除去し、ペレットを１ｍｌの７５％エタノールを用いてボルテックスし、続いて、７，５００×ｇにて４℃で５分間遠心分離によって洗浄した。次いで、洗浄したペレットを１０分間風乾させ、そして３０μｌの水に溶解した。
【０１０２】
ｃＤＮＡ合成を、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔTM  ＩＩ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）を用いて、本質的に以下のとおり行った。簡潔には、オリゴｄＴプライマー（０．５μｇ）を２．５μｇのＲＮＡサンプルに添加した。容量を水で１１μｌに調節し、サンプルを−７０℃で１０分間インキュベートした後、少なくとも１分間氷上に静置した。以下の混合物を調製して、サンプルに添加した：ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔTM  ＩＩキットからの２μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液；２μｌの２５ｍＭ  ＭｇＣｌ2；１μｌの１０ｍＭ  ｄＮＴＰ；および２μｌの０．１Ｍ  ＤＴＴ。混合物を、４２℃で５分間インキュベートした後、１μｌ（２００ユニット）のＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔTM  ＩＩ逆転写酵素を添加して、さらに４２℃で５０分間インキュベートした。反応を、−７０℃で１５分間インキュベートし、次いで氷上で冷却することによって停止させた。短時間遠心分離した後、混合物を３７℃で２０分間、ＲＮＡｓｅＨとともにインキュベートし、そして容量を水で１００μｌに調節した。
【０１０３】
マウスＧＭ−ＣＳＦを本質的に以下のとおりに増幅した。５’ＰＣＲマウスＧＭ−ＣＳＦプライマー（配列番号４７）は、ＡｐａＩ制限部位を含み、以下の配列を有する：５’−ＧＣＧＧＡＧＧＧＧＣＣＣＴＡＧＣＡＣＣＣＡＣＣＣＧＣＴＣＡＣＣＣＡＴＣＡＣＴ−３’。３’ＰＣＲマウスＧＭ−ＣＳＦプライマー（配列番号４８）は、ＳａｌＩ制限部位を含み、以下の配列を有する：５’−ＡＣＣＧＣＧＧＴＣＧＡＣＴＴＴＴＴＧＧＡＣＴＧＧＴＴＴＴＴＴＧＣＡＴＴＣＡＡＡＧＧＧＧ−３’。これらのＧＭ−ＣＳＦ特異的プライマーを、各ＧＭ−ＣＳＦプライマーの１０μＭストックを５μｌ含む反応において使用した；コンカナバリンＡで刺激したマウス脾臓細胞から単離した、２μｌのＧＭ−ＣＳＦ  ｃＤＮＡ；４μｌの１０ｍＭ  ｃＤＮＡ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）；１０μｌの１０×Ｔａｑポリメラーゼ緩衝液（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）；１０μｌの２５ｍＭ  ＭｇＣｌ2；および６９μｌの水。サンプルを、１００℃に５分間加熱し、８０℃に冷却して、５分間インキュベートした後、２ユニットのＴａｑポリメラーゼを添加した。次いで、サンプルを、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ  ＤＮＡサーモサイクラーにおいて、５５℃のアニーリング温度で３５サイクル増幅した。
【０１０４】
図１に示すように、ｐＨＯＯＫTM−１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）は、マウスκ鎖シグナルペプチドと血小板由来増殖因子レセプター（ＰＤＧＦＲ）膜付着ドメインコード配列との間に位置する単鎖抗体についてのコード配列を含む。ｐＨＯＯＫTM−１ベクターはまた、アンピシリン耐性、カナマイシン耐性、およびネオマイシン耐性をコードする配列を含む。マウスＧＭ−ＣＳＦ  ＰＣＲフラグメントを精製し、そしてｐＨＯＯＫTM−１．ＧＭ−ＣＳＦを産生するためにｐＨＯＯＫTM−１のＡｐａＩおよびＳａｌＩ部位へクローニングした。ＪＭ１０９細胞を連結混合物で形質転換し、引き続いて、制限消化分析を使用して、ＧＭ−ＣＳＦ挿入物について陽性であったクローンを同定した。エンドトキシンを含まないｐＨＯＯＫTM−１．ＧＭ−ＣＳＦプラスミド物質の大規模な調製を、Ｑｉａｇｅｎプラスミド精製系（Ｑｉａｇｅｎ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）を使用して、製造業者の説明書に従って調製した。可溶性ＧＭ−ＣＳＦの発現についてのコントロール構築物を同様に調製したが、ＳａｌＩ部位の前に停止コドンを含む。
【０１０５】
（トランスフェクションおよびクローン選択）
マウス結腸腺癌ＣＴ−２６細胞をＳｉｄｎｅｙ  Ｋｉｍｍｅｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ（ＳＫＣＣ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）から得た。そして、この細胞は、Ｆａｋｈｒａｉら、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ６：５９１−６０１（１９９５）およびＳｈａｗｌｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｅｍｐｈａｓｉｓ  Ｔｕｍｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７：２０１−２０８（１９９５）に記載される（これらの各々は、本明細書中に参考として援用される）。ＣＴ−２６細胞を、Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いるエレクトロポレーションによって、製造業者の説明書に従ってトランスフェクトした。クローンを、１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）を含有する、１０％ウシ血清アルブミン（ＦＢＳ）、ペニシリン−ストレプトマイシン、Ｌ−グルタミン酸、およびβ−メルカプトエタノールを補充したＲＰＭＩ  １６４０培地で選択した。トランスフェクトした細胞株を選択培地で維持した。
【０１０６】
（逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応）
膜結合ＧＭ−ＣＳＦを発現する細胞を、ＦＡＣＳによる上記のＲＴ−ＰＣＲによるＧＭ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡの存在について、さらに分析した。ＲＮＡをＴｒｉｚｏｌTM（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）を用いて調製し、そしてｃＤＮＡを製品プロトコルに記載されたように単離した。上記のプライマー（配列番号４７および４８）は、ｐＨＯＯＫTM−１．ＧＭ−ＣＳＦテンプレート由来の３７０ｂｐのフラグメントを増幅する。図３に示されるように、１２のＧ４１８耐性ＣＴ−２６トランスフェクタントのうち８つは、３７０ｂｐのＰＣＲ増幅フラグメントを有し、これらの株がＧＭ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡについて陽性であったことを示した。ＧＭ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡを示す３７０ｂｐフラグメントは、陽性コントロールのコンカナバリンＡで刺激したＢａｌｂ／ｃ脾臓細胞において明らかであるが、予測されるように、野生型ＣＴ−２６細胞には存在しない。
【０１０７】
（フローサイトメトリー）
Ｇ４１８含有培地における選択の４週間後、ＧＭ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡについて陽性のコロニーを、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＦＡＣＳＴＡＲ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）でフローサイトメトリーによって膜結合ＧＭ−ＣＳＦの発現についてスクリーニングした。簡潔には、細胞を採取して、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中の１％ＦＢＳ中で洗浄し、そして抗ＧＭ−ＣＳＦフルオレセイン標識モノクローナル抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）とともに、氷上で１時間インキュベートした。細胞をＰＢＳ中の１％ＦＢＳで洗浄し、そして膜結合ＧＭ−ＣＳＦの発現について分析した。ＲＴ−ＰＣＲ分析により、マウスＧＭ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡを有する８つのＧ４１８耐性株のうち、６つは、蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）によって細胞表面発現ＧＭ−ＣＳＦを有することが示された。
【０１０８】
（ｐＨＯＯＫTM−１、ＧＭ−ＣＳＦトランスフェクトされたＣＴ２６細胞の二重染色ＦＡＣＳ分析）
トランスフェクトされた細胞のＧＭ−ＣＳＦに特異的な抗体を用いた染色を、本質的に上記のとおり行い、種々のマーカー（抗−Ｈ−２ＫdクラスＩ  ＭＨＣマーカー、抗ＩＦＮ−γ、抗Ｉ−ＡdクラスＩＩ  ＭＨＣマーカー）についての同時染色抗体コントロールを添加した。
【０１０９】
トランスフェクトされたクローンのいくつかの結果は、抗ＧＭ−ＣＳＦ抗体を用いて陽性染色を示したが、他のマーカータンパク質に対する抗体は、陰性であった。陽性コントロールである抗−Ｈ−２Ｋd抗体は、野生型コントロールと同じ規模で、全てのｐＨＯＯＫTM−１．ＧＭ−ＣＳＦトランスフェクトＣＴ−２６細胞において陽性シグナルを示した。陰性コントロールである抗ＩＦＮ−γおよび抗Ｉ−Ａd抗体は、全ての細胞について有意に低いかまたは陰性であった。
【０１１０】
ｐＨＯＯＫTM−１．ＧＭ−ＣＳＦ  ＣＴ２６トランスフェクト体「Ｃ３」の代表的なＦＡＣＳ分析を、図４に示す。パネルＢ、Ｃ、およびＤのＸ軸にそって示した、抗−Ｈ−２Ｋd抗体での染色によって、この陽性コントロール抗体について予測されたように、陽性シグナルを得た。抗ＩＬ−４での染色をパネルＢのＹ軸に沿って示し、そして抗ＩＦＮ−γでの染色をパネルＣのＹ軸に沿って示す。これらのパネルに示されるように、ｐＨＯＯＫTM−１．ＧＭ−ＣＳＦトランスフェクトＣＴ−２６細胞は、細胞表面ＩＬ−４またはＩＦＮ−γを発現しなかった。しかし、パネルＤに示されるように、抗ＧＭ−ＣＳＦでの染色は、陽性であった。これらの結果は、ＧＭ−ＣＳＦが、ｐＨＯＯＫTM−１．ＧＭ−ＣＳＦトランスフェクト細胞の細胞表面上で発現されることを示す。
【０１１１】
（放射性免疫沈降アッセイ）
ＧＭ−ＣＳＦの表面発現を、本質的に、Ｋｒａｎｚら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：５７３−５７７（１９８４）（これは、本明細書中に参考として援用される）に記載のとおり、ｐＨＯＯＫTM−１．ＧＭ−ＣＳＦトランスフェクト細胞の表面ヨウ素化および免疫沈降法によってさらにアッセイする。簡潔には、トランスフェクト細胞をＩｏｄｏ−Ｂｅａｄｓ（登録商標）（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を用いて、製造業者の説明書に従って表面をヨウ素化する。抗ＧＭ−ＣＳＦ抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）をＡｆｆｉ−ｇｅｌ（登録商標）（ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）に結合体化した後、結合体化したＡｆｆｉ−ｇｅｌ（登録商標）ビーズを、氷上で１時間、ヨウ素化した細胞とともにインキュベートする。続いて、混合物を最終濃度０．１％までのＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００とともに氷上でさらに１５分間インキュベートする。未結合のタンパク質を除去するために、Ａｆｆｉ−ｇｅｌ（登録商標）ビーズを氷冷したＰＢＳ中の１％ＦＢＳで５回洗浄する。ＳＤＳロード染料を、洗浄したビーズに添加し、そして混合物を１００℃まで２分間加熱する。免疫沈降した産物を１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上の電気泳動によって分析し、そしてこのゲルを乾燥して、オートラジオグラフィーによって分析する。
【０１１２】
膜結合ＧＭ−ＣＳＦ／ＰＤＧＦＲ融合タンパク質を発現するＣＴ−２６トランスフェクタントは、約２０ｋＤａの標識タンパク質を有する。このタンパク質は、陰性コントロールである野生型ＣＴ−２６細胞には存在しない。
【０１１３】
（骨髄増殖アッセイ）
生物学的活性について膜結合ＧＭ−ＣＳＦを試験するために、ｐＨＯＯＫTM−１．ＧＭ−ＣＳＦトランスフェクトＣＴ−２６細胞をＢｕｌｋｗｉｌｌ（編）、Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｐｒｅｓｓ（１９９５）第２４７−２６８頁（これは、本明細書中に参考として援用される）に記載されるように新鮮な骨髄細胞の増殖を刺激する能力についてアッセイする。簡潔には、ｐＨＯＯＫTM−１．ＧＭ−ＣＳＦトランスフェクトＣＴ−２６細胞またはコントロールのトランスフェクトしていないＣＴ−２６細胞（ウェルあたり２×１０5細胞）を９６ウェルプレート中で、同じ数の同系のマウス骨髄細胞とともにインキュベートする。２日後、ウェルを１μＣｉの3Ｈ−チミジンでパルスし、もう１日インキュベートする。細胞を、バキュームマニホールドを用いてフィルター上に採取し、続いて、3Ｈ−チミジンの量を分析する。3Ｈ−チミジンの量によって示されるように、骨髄増殖は、トランスフェクトしていないＣＴ−２６細胞と比較すると、ｐＨＯＯＫTM−１．ＧＭ−ＣＳＦトランスフェクトＣＴ−２６細胞とともにインキュベートした細胞について有意に多い。
【０１１４】
（実施例ＩＩ）
（膜に結合したＧＭ−ＣＳＦを含む、細胞性ワクチンを使用する腫瘍防御）
この実施例は、膜に結合したＧＭ−ＣＳＦ／ＰＤＧＦＲ融合タンパク質を発現する細胞性ワクチンが腫瘍防御のために使用され得ることを実証する。
【０１１５】
（腫瘍防御実験）
ｐＨＯＯＫTM−１．ＧＭ−ＣＳＦでトランスフェクトしたＣＴ−２６細胞をＳｈａｗｌｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｅｍｐｈａｓｉｓ  Ｔｕｍｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７：２０１−２０８（１９９５）（これは、本明細書中で参考として援用される）に本質的に記載されるように、野生型ＣＴ−２６結腸腺ガン細胞を接種したマウスを防御する能力についてアッセイする。手短に言えば、ｐＨＯＯＫTM−１．ＧＭ−ＣＳＦでトランスフェクトしたＣＴ−２６細胞に、60コバルト線源を備える、ＪＬＳｈｅｐａｒｄ  ａｎｄ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  Ｍｏｄｅｌ  １０９−８５  Ｉｒｒａｄｉａｔｏｒを使用して、２５，０００ラドで照射する。Ｂａｌｂ／ｃマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓ）に、１×１０4照射ｐＨＯＯＫTM−１．ＧＭ−ＣＳＦトランスフェクトＣＴ−２６細胞をワクチン接種し、そして１×１０4細胞で、１週間に２度追加免疫する。続いて、マウスに、１×１０4の生存する野生型ＣＴ−２６細胞を反対側の脇腹へチャレンジする。ワクチンの効力を評価するために、腫瘍の寸法を１日おきにスコア付けする。
【０１１６】
ｐＨＯＯＫTM−１．ＧＭ−ＣＳＦでトランスフェクトしたＣＴ−２６ワクチン細胞は、野生型ＣＴ−２６細胞でワクチン接種した動物と比較して、およびワクチン接種していない動物と比較して、腫瘍増殖を有意に減少させる。さらに、ｐＨＯＯＫTM−１．ＧＭ−ＣＳＦトランスフェクトＣＴ−２６ワクチン細胞は、マウスＧＭ−ＣＳＦの可溶性形態を産生するＣＴ−２６細胞をワクチン接種した動物と比較して、腫瘍増殖を有意に減少させる。
【０１１７】
（細胞傷害性Ｔリンパ球アッセイ）
脾臓を、ワクチン接種し、そして照射ｐＨＯＯＫTM−１．ＧＭ−ＣＳＦトランスフェクトＣＴ−２６細胞を追加免疫したマウスから取り出す。ＣＴ−２６腫瘍細胞に特異的な細胞傷害性Ｔリンパ球の存在を検出するために、単一細胞懸濁液を脾臓から作製し、そして標準の４時間のクロム放出アッセイ（Ｋｒａｎｚら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：７９２２−７９２６（１９８４）、これは、本明細書中で参考として援用される）でエフェクター細胞として使用する。手短に言えば、標的細胞は、３７℃の水浴において１時間、完全培地中で１２５μＣｉの51Ｃｒで受動的に標識される、野生型ＣＴ−２６細胞である。ＣＴ−２６標的細胞を完全培地で３回洗浄し、そして５％のＣＯ2加湿インキュベーションチャンバー中でワクチン接種動物からの、漸増数の脾臓細胞と共に４時間インキュベートする。比溶解（クロム放出）のパーセントを、以下の式に従って計算する。
【０１１８】
【数１】
0003785041.tif 000010
【０１１９】
（Ｔ細胞増殖アッセイ）
ワクチン接種動物を、野生型ＣＴ−２６細胞に特異的な、漸増集団のＴ細胞についてアッセイする。本質的に、ワクチン接種した動物の脾臓を取り出し、そして上記に記載したように、単一細胞懸濁液を調製した。約２×１０5脾臓細胞を、３７℃にて５％のＣＯ2において３日間、漸増数の照射した野生型ＣＴ−２６細胞と共にインイキュベートする。２日めに、これらの細胞を、１μＣｉの3Ｈチミジンでパルスする。これらの細胞をガラス繊維フィルター上で収集し、そして3Ｈチミジンの量を計数する。刺激の量（刺激指数）を、完全培地へのみ曝露されたＴ細胞の3Ｈチミジン量によって除算された、実験ウェルの3Ｈチミジンの量として計算する。
【０１２０】
（血清抗体のＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳ分析）
ワクチン接種した動物をＣＴ−２６に特異的な抗体を誘発する能力についてアッセイする。ワクチン接種した動物の眼窩後部を出血させて血清を得る。この血清を１：５０、１：１００および１：５００に希釈し、そして全野生型ＣＴ−２６細胞と共にインキュベートする。引き続いて、これらの細胞を、１％ＢＳＡを含む冷ＰＢＳで２回洗浄し、そしてマウス免疫グロブリンに特異的なＦＩＴＣ結合体化二次抗体と共にインキュベートする。これらの細胞を、もう一度洗浄し、そして染色について、ＦＡＣＳによって分析する。
【０１２１】
ＥＬＩＳＡアッセイのために、ＣＴ−２６細胞を、９６ウェルのプレート様式においてグルタルアルデヒドで固定して、そして１％のＢＳＡを含むＰＢＳで洗浄する。引き続いて、固定した細胞単層を、室温にて１時間、１％のＢＳＡを含むＰＢＳでブロックする。これらの細胞を室温にて１時間、ワクチン接種した動物からの希釈抗血清と共に染色する。ブロッキング緩衝液を用いる洗浄後、ＨＲＰ結合体化ヤギ抗マウスＩｇ二次抗体を、室温にて１時間添加する。この２次試薬を洗浄し、そしてこの固定化細胞をＨＲＰ基質と反応させる（ＫｉｒｋｅｇａａｒｄおよびＰｅｒｒｙ  Ｌａｂｓ，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）
（実施例ＩＩＩ）
（膜結合ＧＭ−ＣＳＦを含む腫瘍細胞の免疫原性）
この実施例は、膜結合ＧＭ−ＣＳＦ（ｍｂ−ＧＭＣＳＦ）融合タンパク質を発現する肥満細胞腫およびメラノーマ腫瘍細胞が、野生型腫瘍細胞よりも免疫原性であり、そして抗腫瘍免疫を誘発するために使用され得ることを実証する。
【０１２２】
（膜結合ＧＭ−ＣＳＦを発現するＰ８１５肥満細胞腫腫瘍細胞の増殖）
Ｐ８１５細胞株（もともと、ＤＢＡ／２マウス株に由来する中程度に免疫原性マウス肥満細胞腫細胞株）を、アメリカンタイプティシューコレクションから得た。ｐＨＯＯＫTM−１．ＧＭ−ＣＳＦ発現ベクターの調製は、以下の５’プライマー  ５’−ＧＣＧＧＡＧＧＧＧＣＣＣＧＣＡＣＣＣＡＣＣＣＧＣＴＣＡＣＣＣＡＴＣＡＣＴ−３’（配列番号４９）をマウスＧＭ−ＣＳＦ  ｃＤＮＡを増幅するために使用したということを除いて、上記の実施例Ｉに記載の通りであった。５００万個のＰ８１５細胞を、３５０ボルトの電圧でのエレクトロポレーションによって、トランスフェクトし、そして０．８ｍｇ／ｍｌのＧ４１８（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）で選択した。２つの膜結合ＧＭ−ＣＳＦ陽性Ｐ８１５クローンを、１Ｄ１および１Ｄ６と命名した。１Ｄ６のサブクローンを１Ｅ５と命名した。
【０１２３】
次いで、膜結合ＧＭ−ＣＳＦ発現について陽性のクローンを、上記に記載したようにＦＡＣＳ分析によってスクリーニングした。手短に言えば、１０6個の細胞を２．５％のウシ胎仔血清を含むＰＢＳで洗浄し、そして１００μｌの容量で、１０μｇ／ｍｌのラット抗マウスＧＭ−ＣＳＦモノクローナル抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）と共に、洗浄緩衝液中に再懸濁した。これらの細胞を氷上で３０分間インキュベートし、次いで、２回洗浄した。引き続き、これらの細胞を、１０μｇ／ｍｌのヤギ抗ラットＦＩＴＣ標識二次抗体中で３０分間インキュベートした。洗浄後、これらの細胞を、４％のパラホルムアルデヒドで固定するか、またはＦＡＣＳ分析のために直接使用するかのいずれかとした。
【０１２４】
いくつかのＰ８１５クローンの代表的なＦＡＣＳ分析を、図５（パネルＡおよびＢ）に示す。パネルＡ、Ｂ、およびＣのＸ軸に沿って示される、抗ＧＭ−ＣＳＦ抗体を用いた染色は、「Ｍ１」ピークに対応する陽性シグナルを生じた。このことは、ＧＭ−ＣＳＦがＰ８１５肥満細胞腫細胞の細胞表面上で発現することを実証する。ＦＡＣＳ分析は、１Ｄ６クローンが、中程度のレベルの膜結合ＧＭ−ＣＳＦを発現する１Ｄ１クローンと共に、高レベルの膜結合ＧＭ−ＣＳＦを発現したことを示した。
【０１２５】
膜結合ＧＭ−ＣＳＦを発現する細胞の免疫原性を、同系の宿主マウスにおける腫瘍細胞の増殖の測定によって決定した。手短に言えば、膜結合ＧＭ−ＣＳＦ（１Ｄ１、１Ｄ６）を保有する、野生型Ｐ８１５肥満細胞腫細胞またはクローンを、同系のＤＢＡ／２マウスの脇腹へ、皮内的にまたは皮下的のいずれかで生きたまま注射した。注射については、５０μｌの容量の１０6細胞を片方の脇腹へ注射した。次いで、腫瘍のサイズを、目盛り付きマイクロメーターで測定し、そして、最も長い直径に最も短い直径を乗算した積（ｍｍ2）として表した。測定を、示された日数について１週間に３度実施した。
【０１２６】
生存Ｐ８１５肥満細胞腫細胞をＤＢＡ／２マウスへ注射した場合、腫瘍は、７から１０日間以内で観察され、有意な大きさへと成長していた触知可能な腫瘍を生じた。膜結合ＧＭ−ＣＳＦを発現するＰ８１５細胞から生じる腫瘍サイズを、野生型細胞株に対して比較した。図６Ａで示されるように、最初の７日から１０日の間について、２つの膜結合ＧＭ−ＣＳＦクローンの増殖速度は、親の野生型Ｐ８１５腫瘍細胞と同様であった。このことは、クローンと野生型細胞株との間の腫瘍生存率において差異は存在しなかったことを示す。しかし、１２日後、野生型Ｐ８１５腫瘍は、５０ｍｍ2のサイズより大きな最大平均に達するまで増殖し続けたが、１Ｄ１および１Ｄ６クローンは縮み始め、そしてより多く発現しているクローン１Ｄ６の場合、全ての動物において消滅した（図６Ａおよび６Ｂを参照のこと）。これらのデータは、膜結合ＧＭ−ＣＳＦが、生物学的に活性であり、そして、同系の宿主において抗腫瘍免疫を誘発し得ることを示す。
【０１２７】
（膜結合ＧＭ−ＣＳＦを発現するＢ１６メラノーマ腫瘍細胞の増殖）
Ｂ１６メラノーマ細胞（これはもともと、Ｃ５７ＢＬＫ／６マウス株に由来する）を、ＡＴＣＣから得た。Ｂ１６細胞株は、実質的に非免疫原性であり、そしてインビボにおいて非常に侵襲性の増殖を示すことが知られている。上記に記載されるＢ１６腫瘍およびＰ８１５腫瘍は、免疫抑制性サイトカインである、有意なレベルのトランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）を分泌することが知られている。
【０１２８】
ポジティブな膜結合ＧＭ−ＣＳＦクローンを、Ｐ８１５システムについて、上記に記載されるように得た。クローン４Ｃ３は、このような１つの膜結合ＧＭ−ＣＳＦポジティブＢ１６クローン（上記に記載されるようなＦＡＣＳ分析によって実証されたように（図５Ｃを参照のこと）、これは、細胞表面上でＧＭ−ＣＳＦを発現する）であった。同系のＣ５７ＢＬＫ／６宿主マウス（１群あたり１０匹）に、１０6の生存野生型Ｂ１６細胞、または膜結合ＧＭ−ＣＳＦを発現する生存４Ｃ３細胞を、皮内注射した。腫瘍サイズを１週間あたり３回スコアした。
【０１２９】
この侵襲性のメラノーマモデルにおいて予想されたように、野生型Ｂ１６細胞の注射は、非常に大きな腫瘍塊の増殖を生じた。野生型Ｂ１６腫瘍の増殖とは対照的に、膜結合ＧＭ−ＣＳＦを発現するＢ１６細胞（クローン４Ｃ３）のインビボ増殖は、有意に遅延し、そして４Ｃ３腫瘍は、野生型サイズの何分の一かまで増殖しただけであった（図７）。これらの結果は、侵襲性のメラノーマのガンモデルにおいて、腫瘍細胞の表面上での膜結合ＧＭ−ＣＳＦの発現が、抗腫瘍免疫原性を増強し得ることを示す。上記に開示されたＰ８１５肥満細胞腫細胞の結果と組合わせて、これらの結果は、膜結合免疫調節分子の発現が、異なる腫瘍型に対して抗腫瘍応答を誘導することにおいて有用であり得ることを示す。
【０１３０】
メラノーマ細胞を発現する膜結合ＧＭ−ＣＳＦを保有するマウスはまた、野生型Ｂ１６細胞を注射したマウスと比較して、生存の増加を示した。ところが、４０日まで、野生型Ｂ１６腫瘍を保有するマウスは３匹しか生存しなかったが、４Ｃ３クローンを発現する膜結合ＧＭ−ＣＳＦを保有するマウスは、７匹が生存した。（図７の挿入図を参照のこと）。これらの結果は、腫瘍細胞の表面上でのＧＭ−ＣＳＦの発現が、腫瘍細胞をより免疫原性にし、そしてこのような増強した免疫原性が、生存へ正に影響し得ることを実証する。
【０１３１】
（実施例ＩＶ）
（膜結合ＧＭ−ＣＳＦを発現する照射された細胞を用いるワクチン接種は、インビボにおける野生型腫瘍チャレンジに対して防御的である）
この実施例は、膜結合ＧＭ−ＣＳＦ融合タンパク質を発現する、照射されたＰ８１５肥満細胞腫瘍細胞でのワクチン接種が、インビボにおいて後の野生型腫瘍チャレンジに対して防御的であることを実証する。
【０１３２】
膜結合ＧＭ−ＣＳＦでトランスフェクトされ、照射されたＰ８１５細胞（クローン１Ｅ５）を、野生型Ｐ８１５肥満細胞腫細胞を用いてチャレンジした場合に、腫瘍増殖から宿主マウスを防御する能力についてアッセイした。野生型Ｐ８１５細胞またはクローン１Ｅ５に、60コバルト線源を備えた、ＪＬＳｈｅｐｅｒｄ  ａｎｄ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  Ｍｏｄｅｌ  １０９−８５  Ｉｒｒａｄｉａｔｏｒを使用して、２０，０００ラドまで照射した。ナイーブな同系ＤＢＡ／２マウスの、片脇腹へ１０6個の照射した野生型細胞または１Ｅ５細胞を皮内注射し、そして１５日後に、同じ脇腹へ同数の細胞を追加免疫した。最後のワクチン接種の５日後、マウスの反対の脇腹へ生存野生型Ｐ８１５細胞をチャレンジした。腫瘍サイズを上記に記載したようにスコア付けした。
【０１３３】
照射した野生型細胞または膜結合ＧＭ−ＣＳＦ発現細胞のいずれかでワクチン接種した動物における生存野生型Ｐ８１５腫瘍の増殖を、図８に示す。全てのマウスは、最初の２週間で、触知可能な腫瘍を進達させた。しかし、膜結合ＧＭ−ＣＳＦクローン（１Ｅ５）でワクチン接種した動物においてのみ、腫瘍は、測定され得ないところまでサイズが減少することが観測された。腫瘍サイズは、膜結合ＧＭ−ＣＳＦワクチン接種動物と比較して、野生型ワクチン接種動物において有意に大きかった。そして３０日までに、膜結合ＧＭ−ＣＳＦワクチン接種を受けた動物は、１００％が腫瘍を含まず、そして実験の継続期間（４５日）の間、腫瘍を含まないままであった。野生型細胞をワクチン接種したマウスは、大きな腫瘍を増殖させ、そして５０％のマウスが、これらの腫瘍負荷によって死亡した（図８の挿入図）。これらの結果は、膜結合ＧＭ−ＣＳＦタンパク質を含む細胞性ワクチンは、インビボにおける抗腫瘍応答を発達させるために使用され得、そしてこのような抗腫瘍応答は、宿主動物の生存を延長し得ることを実証する。
【０１３４】
括弧内にあるかまたはそうではない、上記で提供された、全ての雑誌論文、参考文献および特許の引用物は、以前に記載されていようとまたはそうではなかろうと、本明細書中に参考として援用される。
【０１３５】
本発明は、開示された実施態様を参照して記載されるが、当業者は、詳述した特定の実験が、本発明の例示にすぎないことを容易に理解する。種々の改変が、本発明の精神から逸脱することなくなされ得ることが理解されるべきである。従って、本発明は特許請求の範囲によってのみ限定される。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】  （Ａ）マウスＧＭ−ＣＳＦ  ｃＤＮＡをｐＨＯＯＫTM−１中にクローニングするためのストラテジーを示す。
【図１Ｂ】  （Ｂ）得られたｐＨＯＯＫTM−１．ＧＭ−ＣＳＦ発現ベクターを示す。
【図２】
図２は、ｐＨＯＯＫTM−１．ＧＭ−ＣＳＦ融合タンパク質のヌクレオチド配列（配列番号１）およびアミノ酸配列（配列番号２）を示し、これはマウス顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）およびヒト血小板由来増殖因子レセプター（ＰＤＧＦＲ）β鎖膜貫通ドメインを含む。図２はまた、ヌクレオチド６５８〜６６０の終止コドンに続く領域の、ヌクレオチド配列（配列番号４９）およびアミノ酸配列（配列番号５０）も、示す。
【図３】  図３は、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を用いて分析した、ｐＨＯＯＫTM−１．ＧＭ−ＣＳＦ  ＣＴ−２６細胞トランスフェクタント中のＧＭ−ＣＳＦ発現を示す。レーン１：φＸ１７４分子量マーカー。レーン２から１３：ＣＴ−２６  ｐＨＯＯＫTM−１．ＧＭ−ＣＳＦトランスフェクタントＡ３、Ａ５、Ａ６、Ｂ４、Ｂ５、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｄ３およびＤ５。レーン１４：未トランスフェクションＣＴ−２６細胞。レーン１５：コンカナバリンＡ刺激Ｂａｌｂ／ｃ脾臓細胞。
【図４】  図４は、「Ｃ３」ｐＨＯＯＫTM−１．ＧＭ−ＣＳＦトランスフェクションされたクローンの二重染色ＦＡＣＳ分析の例を示す。
【図５】  図５は、種々の膜結合ＧＭ−ＣＳＦ発現細胞株のＦＡＣＳ分析を示す。（Ａ）Ｐ８１５クローン１Ｄ１上でのＧＭ−ＣＳＦ発現のＦＡＣＳ分析。（Ｂ）Ｐ８１５クローン１Ｄ６上でのＧＭ−ＣＳＦ発現のＦＡＣＳ分析。（Ｃ）Ｂ１６メラノーマクローン４Ｃ３上でのＧＭ−ＣＳＦ発現のＦＡＣＳ分析。
【図６Ａ】  （Ａ）生存野生型Ｐ８１５肥満細胞腫細胞および膜結合ＧＭ−ＣＳＦ発現Ｐ８１５肥満細胞腫細胞の同系宿主マウス中への皮内注射の結果得られる腫瘍のサイズ（ｍｍ2）を示す。黒い棒は野生型Ｐ８１５腫瘍を有する１０匹のマウスの腫瘍の平均サイズを表す。網掛けの棒は１Ｄ１腫瘍を有する１０匹のマウスの腫瘍の平均サイズを表す。白い棒は１Ｄ６腫瘍を有する１０匹のマウスの腫瘍の平均サイズを表す。
【図６Ｂ】  （Ｂ）個々の同系宿主マウスにおける生存野生型（Ｐ８１５）および２つの膜結合ＧＭ−ＣＳＦ発現クローン（１Ｄ１および１Ｄ６）の腫瘍サイズ（ｍｍ2）を示す。
【図７Ａ】  図７Ａは、生存野生型Ｂ１６細胞または膜結合ＧＭ−ＣＳＦ発現Ｂ１６細胞（クローン４Ｃ３）の同系宿主マウス中への注射の結果得られる腫瘍の平均腫瘍サイズ（ｍｍ2）を示す。
【図７Ｂ】  図７Ｂは、４０日間の実験にわたる宿主マウスの生存を示す。
【図８Ａ】  図８Ａは、生存野生型Ｐ８１５細胞での同系宿主マウスへのチャレンジの結果得られる腫瘍の平均腫瘍サイズ（ｍｍ2）を示す。このマウスは照射された野生型Ｐ８１５細胞または膜結合ＧＭ−ＣＳＦを発現する照射されたＰ８１５細胞（クローン１Ｄ６．１Ｅ５、１Ｄ６のサブクローン）のいずれかでワクチン接種されている。
【図８Ｂ】  図８Ｂは、野生型Ｐ８１５細胞でチャレンジされた後の処置されたマウスの生存を示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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