(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の特性を有するマガキ由来のトランスグルタミナーゼ。
ａ）基質特異性：蛋白質あるいはポリペプチド鎖内のグルタミン酸残基のγ−カルボキシアミド基と一級アミンとの間のアシル基転移反応を触媒する。
ｂ）分子量：約８３，０００〜９５，０００ダルトン（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
ｃ）反応至適温度：３０〜５０℃
ｄ）反応至適ｐＨ：約７．５〜９．５
ｅ）活性化剤：カルシウムイオンで活性化される。但し、塩化ナトリウム及び塩化カリウムのいずれかの添加で更に活性化される。
ｆ）阻害剤：N-エチルマレイミド、モノヨード酢酸及びパラクロロマーキュリ−安息香酸のいずれかで阻害される。
ｇ）金属イオンの影響：Ｃｕ2+で阻害される。
【請求項２】
配列番号１４１又は１４２のアミノ酸配列を有する請求項１記載のトランスグルタミナーゼ。
【請求項３】
配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する請求項１記載のマガキ由来のトランスグルタミナーゼをコードする遺伝子。
【請求項４】
配列表の配列番号３記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する請求項１記載のマガキ由来のトランスグルタミナーゼをコードする遺伝子。
【請求項５】
配列表の配列番号２記載の塩基配列を有する請求項１記載のマガキ由来のトランスグルタミナーゼをコードする遺伝子。
【請求項６】
配列表の配列番号４記載の塩基配列を有する請求項１記載のマガキ由来のトランスグルタミナーゼをコードする遺伝子。
【請求項７】
請求項３〜６のいずれか１項記載の遺伝子を有するプラスミド。
【請求項８】
請求項７記載のプラスミドで形質転換された形質転換体。
【請求項９】
形質転換体が、大腸菌又はサッカロミセス・セレビシエである請求項８記載の形質転換体。
【請求項１０】
請求項８又は９記載の形質転換体を培地中で培養することによりマガキ由来のトランスグルタミナーゼを生産させ、当該マガキ由来のトランスグルタミナーゼを取得することを特徴とするマガキ由来のトランスグルタミナーゼの製造法。
【請求項１１】
請求項１記載のマガキ由来のトランスグルタミナーゼを含有するゲル化剤。
【請求項１２】
請求項１記載のマガキ由来のトランスグルタミナーゼ又は請求項１１記載のゲル化剤を、濃度０．４重量％以上の蛋白質溶液又はスラリーに作用させて、同溶液又は同スラリーをゲル化させることを特徴とする蛋白質のゲル化方法。
【請求項１３】
塩濃度を調節することにより、蛋白質溶液又はスラリーのゲル化を制御することを特徴とする請求項１２記載のゲル化方法。
【請求項１４】
塩が塩化ナトリウム又は塩化カリウムであることを特徴とする請求項１３記載のゲル化方法。
【請求項１５】
カルシウムイオン濃度を調節することにより、蛋白質溶液又はスラリーのゲル化を制御することを特徴とする請求項１３記載のゲル化方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、新規なトランスグルタミナーゼであるマガキ（学名、Crassostrea gigas）由来トランスグルタミナーゼ、それを用いた蛋白質のゲル化方法、マガキ由来のトランスグルタミナーゼをコードする遺伝子、該遺伝子を組み込んだ組換えプラスミド、該プラスミドが導入された形質転換体、及び該形質転換体を培養することを特徴とするマガキ由来のトランスグルタミナーゼの製造法等に関する。
発明の背景
トランスグルタミナーゼは蛋白質又はペプチド鎖中にあるグルタミン残基のγ−カルボシキアミド基のアシル基部分を、各種１級アミンへ転移させる反応を触媒する酵素である。
アシル基受容体として蛋白質中リジン残基ε−アミノ基が作用した場合は、分子内及び分子間にε−（γ−グルタミル）−リジン架橋結合が形成される。このため分子間で架橋が起こった場合、蛋白質が重合して架橋高分子化する。また、アシル基受容体としてリジン、リジン誘導体等の一級アミンが作用した場合は、それがアシル基供与体である蛋白質に導入される。更に、水もアシル基受容体となり得、この場合には蛋白質のグルタミン残基が脱アミド化されてグルタミン酸残基になる。
トランスグルタミナーゼはこれまで哺乳動物由来、微生物由来及び魚由来のものが同定されている。哺乳動物由来のものとしては、モルモットの肝臓由来のもの（Connellan,et al.,Journal of Biological Chemistry２４６巻４号，１０９３〜１０９８頁（１９７１））をはじめとして多くの動物種、臓器より発見、同定されている。
微生物由来のものとしては、Streptoverticillium属からカルシウムイオン（Ｃａ2+）非依存性のトランスグルタミナーゼ（以下、ＢＴＧと称する。酵素番号：ＥＣ  ２．３．２．１３）が同定された（Kanaji,et al.,Journal of Biological Chemistry２６８巻、１１５６５〜１１５７２頁（１９９３）、米国特許５，１５６，９５６）。
また、魚由来のものには、マダイ、スケソウダラ、ヒラメよりトランスグルタミナーゼのｃＤＮＡが単離され、そのアミノ酸配列が明かとなった（安枝ら、特開平６−２２５７７５、欧州出願公開ＥＰ−０５５５６４９Ａ参照）。
更に、最近ホタテガイの閉殻筋の粗抽出液中にもトランスグルタミナーゼ活性がある事が報告された（豆越ら、平成５年度日本水産学会春期大会講演要旨集、演題番号７１５、２１０頁）。ただ、このトランスグルタミナーゼは単離には至っておらず、トランスグルタミナーゼそのものの諸性質についての検討は今だされていない。
トランスグルタミナーゼの蛋白質の架橋高分子化能（蛋白質のゲル化能）を利用して、ゲル状食品、ゲル状化粧品をはじめとしてヨーグルト、ゼリー、蒲鉾及びチーズ等の製造に用いることができ（特公平１−５０３８２号公報）、さらに蛋白質薄膜の製造にも用いることができる。
またトランスグルタミナーゼによる反応産物は熱に安定であるため、マイクロカプセルの素材や固定化酵素の担体等の製造にも利用する事も可能である。
現在商品化されているトランスグルタミナーゼとして微生物由来のＢＴＧがあるが、これは酵素活性発現にカルシウムイオンを必要としない。この性質は広範な反応条件下での使用が可能であるという利点があるが、逆に微妙な活性調節が必要とされる生産物に対して活性制御が困難であるという問題点もある。
また、現在、遺伝子が単離され、遺伝子組換え体として工業利用される可能性のあるトランスグルタミナーゼとして、モルモット及び魚由来トランスグルタミナーゼが挙げられる。この両者は、活性発現にカルシウムイオン(Ca2+を必要とすることに共通した特徴がある。
このことはこれらのトランスグルタミナーゼが、カルシウムイオンの反応系への添加により活性調節を行える点で、その性質を生かした利用が期待されるトランスグルタミナーゼである。
しかし、カルシウムイオン以外に酵素活性調節が可能なトランスグルタミナーゼがあれば、反応対象とする蛋白質、反応条件、生成物等の要因に応じて様々な用途への対応が可能となる。トランスグルタミナーゼの実用化がますます進むと考えられる現在、ＢＴＧとの使い分けの可能な、多様な性質を持ったトランスグルタミナーゼへの需要は今後ますます高まるに違いない。
カルシウムイオン以外のトランスグルタミナーゼ活性調節因子としては、トランスグルタミナーゼの主たる用途として食品への応用が考えられるため、食品中に既に含まれている塩、若しくはイオンが望ましい。中でも食塩はほとんどの食品中に含まれ、人類に最も馴染み深い調味料であるのみならず、魚肉ねり製品の製造工程のひとつである“塩ずり”においては、すり身を構成する蛋白質の塩溶化という蒲鉾のゲル化に欠かせない要素となっている。
食塩で活性調節が出来るトランスグルタミナーゼがもし使えるならば十分他のトランスグルタミナーゼと比較して以下のような優位性がある。即ち、（１）従来のトランスグルタミナーゼではゲル化に大量の酵素を必要とする食品素材に対する利用においても、元々の製造工程で加えられた食塩の存在によって、少量の酵素量で十分なゲル強度を与える事が出来る可能性があるという点、及び（２）更なる活性増強も食品成分以外の物質でなく食塩で行えるという点である。
トランスグルタミナーゼの生理的意義については、諸説あるがいまだ明らかにされたものはない。しかし多くの生物種より酵素的特性の異なるトランスグルタミナーゼが発見されている事を考えても、トランスグルタミナーゼは各々の生物において、その生態に密接に関連した生理機能を担っていると考えられる。
このことから、本願発明者らは、食塩によって活性調節の可能なトランスグルタミナーゼを取得すべく、食塩がその生育環境に重要な要素となっている海棲動物、特に食用に供せられる海棲動物をターゲットとして今回探索を行った。
また、仮にある種の食用に供せられる海棲動物中に目的とするトランスグルタミナーゼが見つかったとしても、当該トランスグルタミナーゼを天然物中から抽出して得るのでは、目的とするトランスグルタミナーゼの実用化の為の量産はかなりの困難であると考える。その意味からも遺伝子組換型のトランスグルタミナーゼの生産は、実用上不可欠な課題である。
また、遺伝子組換法で大量に目的とするトランスグルタミナーゼを安価に供給できれば、現在漁獲海域の２００海里規制や、総漁獲高制限による水産資源の不足からくる水産加工品の原材料コスト高といった問題に対し、他の安価な食品蛋白質との併用により加工品中のすり身原材料の低減化や、低利用蛋白質資源の有効利用を増大させることも可能となる。
発明の開示
従って、本発明の目的は、食品に供せられる海棲動物中から食塩によって活性調節の可能なトランスグルタミナーゼを取得することにある。
本発明の別の目的は、当該トランスグルタミナーゼをコードする遺伝子を提供することにある。
本発明の別の目的は、遺伝子組換法により、目的とするトランスグルタミナーゼを製造することにある。
本発明の別の目的は、目的とするトランスグルタミナーゼにより蛋白質をゲル化する方法を提供することにある。
本発明の上記及び他の目的は以下の記載から明らかとなるであろう。
本発明者らは上記課題を達成すべく、食用に供せられる種々の海棲動物をサンプルとして鋭意検討を加えた結果、マガキ中に塩化ナトリウム（以下、「ＮａＣｌ」とすることがある）、塩化カリウム（以下、「ＫＣｌ」とすることがある）によって酵素活性が増強されるトランスグルタミナーゼが存在する事を見い出し、そのトランスグルタミナーゼの精製、単離に成功した。このマガキのトランスグルタミナーゼの酵素活性発現はカルシウムイオン（以下、「Ｃａ2+」とすることがある）依存性であったが、上述したように反応系にある濃度のＮａＣｌ及び／又はＫＣｌを添加することにより、その酵素活性を増強させることができる。従って、この性質を利用すれば、反応液組成中のＮａＣｌやＫＣｌの濃度又はカルシウムイオン濃度を適宜調節することにより蛋白質溶液を低粘性物、高粘性物またはゲル化物のいずれの性状にも制御が可能であり、食品加工上、極めて有用な技術となり得ることを見い出した。尚、念の為に述べるが、このような特性を持つトランスグルタミナーゼは今まで報告されていない。
更にマガキトランスグルタミナーゼの部分アミノ酸配列の回析によって得た情報を基に、マガキのトランスグルタミナーゼをコードする遺伝子を取得し、その塩基配列を決定する事にも成功した。また、この成果に基づいて、遺伝子工学的手法により大腸菌、酵母、カビ等の微生物を用いて該遺伝子を発現させることが可能となり、微妙な酵素活性調節という、新規であり且つ産業上有益な酵素的性質を持つマガキ由来トランスグルタミナーゼを安価に、かつ効率的に、かつ大量に生産することが出来た。また、この組換型トランスグルタミナーゼは天然のマガキ由来のトランスグルタミナーゼと同一の性質を有している。従って、本発明に於いて、マガキ由来のトランスグルタミナーゼと言えば特に拘らない限り、天然のマガキから精製したトランスグルタミナーゼ及び組換型のマガキ由来のトランスグルタミナーゼの両方を含むことにする。
上述したように、本発明者らは上記課題を完全に解決することにより、本発明を完成したのである。
すなわち、本発明は次の１）〜８）を提供する。
１）下記の特性を有する、マガキ由来のトランスグルタミナーゼ。
ａ）基質特異性：蛋白質あるいはポリペプチド鎖内のグルタミン酸残基のγ−カルボキシアミド基と一級アミンとの間のアシル基転移反応を触媒する。
ｂ）分子量：約８３、０００〜９５、０００ダルトン（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
ｃ）反応至適温度：３０〜５０℃
ｄ）反応至適ｐＨ：約７．５〜９．５
ｅ）活性化剤：カルシウムイオンで活性化される。但し、塩化ナトリウム及び塩化カリウムのいずれかの添加で更に活性化される。
ｆ）阻害剤：N-エチルマレイミド、モノヨード酢酸及びパラクロロマーキュリ−安息香酸のいずれかで阻害される。
ｇ）金属イオンの影響：Ｃｕ2+で阻害される。
２）マガキ由来のトランスグルタミナーゼをコードする遺伝子。
３）該遺伝子を有するプラスミド。
４）該プラスミドで形質転換された形質転換体。
５）該形質転換体を培地中で培養することよりマガキ由来のトランスグルタミナーゼを生産させ、当該マガキ由来のトランスグルタミナーゼを取得することを特徴とするマガキ由来のトランスグルタミナーゼの製造法。
６）上記遺伝子組換法で生産されたマガキ由来のトランスグルタミナーゼ。
７）マガキ由来のトランスグルタミナーゼを含む組成物。
８）マガキ由来のトランスグルタミナーゼ又はマガキ由来のトランスグルタミナーゼを含む組成物を、濃度０．１重量％以上の蛋白質溶液又はスラリーに反応させ、同溶液又はスラリーをゲル化させることを特徴とする蛋白質のゲル化方法。
【図面の簡単な説明】
図１は、DEAE−セファセルカラムでのマガキ由来トランスグルタミナーゼ（以下、「マガキTGase」あるいは「TGase」とする）の精製を示す。
図中、○−○は280nmの吸光値、●−●はTGase活性、点線はNaCl濃度を示す。
図２は、フェニル−セファロースカラムでのマガキTGaseの精製を示す。
図中、○−○は280nmの吸光値、●−●はTGase活性、点線は(NH4)2SO4濃度を示す。
図３は、セファクリルS-200カラムでのマガキTGaseの精製を示す。
図中、○−○は280nmの吸光値、●−●はTGase活性を示す。
図４は、モノ-QカラムでのマガキTGaseの精製を示す。
図中、○−○は280nmの吸光値、●−●はTGase活性、点線はNaCl濃度を示す。
図５は、マガキTGaseのSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動図を示す。
図６は、マガキTGaseの反応至適温度を示す。
図７は、マガキTGaseの反応至適pHを示す。
図中、○−○は酢酸ナトリウム緩衝液、△−△はイミダゾール緩衝液、□−□はトリス緩衝液を示す。
図８は、マガキTGaseの温度安定性を示す。
図９は、マガキTGaseのpH安定性を示す。
図１０は、マガキTGase活性に及ぼすNaCl濃度の影響を示す。
図１１は、モルモット肝臓由来及び微生物由来TGase活性に及ぼすNaCl濃度の影響を示す。
図中、□−□はモルモット肝臓由来TGase、△−△は微生物由来TGaseを示す。
図１２は、マガキTGaseのCa2+依存性に及ぼすNaClの影響を示す。
図中、○−○はNaCl非存在下での値を示し、●−●はNaCl 0.5M存在下での値を示す。
図１３は、プラスミドpCGTG4Eにより発現されるβ−ガラクトシダーゼとマガキトランスグルタミナーゼの融合蛋白質のアミノ酸配列を示す。
図１４は、プラスミドpCGTG4Eの構築方法概略を示す。
図１５は、プラスミドpCGTG4Eの構築方法概略を示す。
図１６は、プラスミドpCGTG4EPの構築方法概略を示す。
図１７は、プラスミドpCGTG4Sの構築方法概略を示す。
図１８は、プラスミドpCGTG4S6Hの構築方法概略を示す。
発明を実施するための最良の態様
上記１）のａ）〜ｇ）の特定を有するトランスグルタミナーゼとしては、分子中に配列番号１４１又は１４２のアミノ酸配列を有するものが好ましい。又、ａ）にあげたアミンとしては、メチルアミン、エチルアミン、リジン、リジン誘導体等があげられる。
さて、マガキは古くより食用として馴染み深く、特に生食用としては日本のみならず、魚介類の生食の習慣の少ない欧米各国でも歴史的にかなり早くから生食されてきている。このことから、マガキ由来のトランスグルタミナーゼは世界的に最も安全上の心配のいらないトランスグルタミナーゼとして受け入れられるものと考えられる。このマガキ由来のトランスグルタミナーゼを食品産業に応用する場合には、（１）天然のマガキから精製したトランスグルタミナーゼを用いても良いし、（２）高度に精製されてはいないが、天然のマガキ由来のトランスグルタミナーゼを含む組成物を用いても良いし、又、（３）遺伝子組換法で製造した組換型トランスグルタミナーゼを用いても良いし、更には（４）組換型トランスグルタミナーゼにマンニトール、ショ糖等の賦形剤やグルタミン酸ナトリウム、5'−イノシン酸、5'−グアニル酸等の調味料を適宜配合して得た組成物を用いても良い。
実際、本発明のマガキ由来のトランスグルタミナーゼを食品産業上利用する場合には、天然型よりも組換型マガキ由来トランスグルタミナーゼが用いられる可能性が高いと考えられる。何故なら、マガキはそれ自体比較的高価なもので、マガキ由来トランスグルタミナーゼを天然物中から抽出して得たのでは、（１）コスト面及び（２）量産性という観点に問題があるからである。
また、組換型キモシンの例のように、元々食用の生物由来のものは、遺伝子組換型であっても食品用酵素として利用され得ることから、この遺伝子組換法で得たマガキ由来のトランスグルタミナーゼも同様に、安全面で全く問題がないと考えられる。以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のマガキ由来の新規トランスグルタミナーゼは、ホモジナイズ後の遠心分離によって得られる上清（粗抽出液）に存在する。この粗抽出液からのトランスグルタミナーゼの精製は、通常用いられるあらゆる手段、例えば、透析、限外濾過、ゲル濾過、イオン交換クロマト等の手段を適応できる。このようにして得られたトランスグルタミナーゼの粗抽出液あるいは精製物は、室温、好ましくは冷蔵で長期に安定であり、減圧乾燥、凍結乾燥によって粉体としても保存することができる。
トランスグルタミナーゼの活性は、ジメチル化カゼインとモノダンシルカダベリンを基質として反応を行い、取り込まれたモノダンシルカダベリンに由来するカゼインの蛍光増加を測定することにより求める。反応組成液を以下に記載する。
<反応組成液>
１．０ｍｇ／ｍｌ  ジメチル化カゼイン
０．０１５ｍＭ    モノダンシルカダベリン
３．０ｍＭ      ジチオスレイトール
５０ｍＭ      トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）
１０ｍＭ      塩化カルシウム
なお、後記実施例でも、特段の記載がない限り本条件を採用している。
上記反応組成液２．４ｍｌにトランスグルタミナーゼ溶液２０から５０μｌ加え、３７℃、３０分の反応を行った後、５００ｍＭのＥＤＴＡを１００μｌ加えて反応を停止させ、蛍光強度を測定する（島津社製ＲＦ−１５００励起波長３５０ｎｍ、蛍光波長４８０ｎｍ）。活性の単位は、１分間に１．０の蛍光強度を増加させる活性を１ユニットとする。
次に、マガキ由来のトランスグルタミナーゼを用いた蛋白質のゲル化方法について述べる。まず、本発明に於て使用される蛋白質は、反応に必要なリジン残基及びグルタミン残基を有しており、酵素の触媒を受けるものであれば、その起源及び性状に制約されるものではない。従って、植物性蛋白質、動物性蛋白質等いかなるものでも使用できる。具体的には、大豆蛋白質、乳蛋白質、魚肉蛋白質等を例示することができる。
これら蛋白質の0.1重量％、好ましくは5.0重量％以上、好ましくは5.0％〜３０％の溶液またはスラリーであれば、トランスグルタミナーゼの添加により高粘性物あるいは、ゲル化物が得られる。
さて、添加するマガキ由来のトランスグルタミナーゼは、天然のマガキの粗抽出液でも、適宜精製したものでも、単離したものでも、また、組換型のいずれでも用いられる。単離した場合はトランスグルタミナーゼそのものだけを添加してもよいし、又マンニトール等の賦形剤、グルタミン酸ナトリウム等の調味料を適宜配合した組成物のかたちで使用してもよい。
次に、添加量であるが、マガキ由来のトランスグルタミナーゼの添加量は特にその制限はない。しかし、通常、蛋白質１ｍｇに対して約０．０１〜２００ユニット、好ましくは0.1〜２０ユニット添加すればよい。
また、反応溶液のｐＨは約５〜１０、好ましくは８〜９に調整すればよい。反応温度は通常約１０〜６０℃、好ましくは２０〜４０℃で１０分から２４時間、好ましくは３０分から６時間インキュベートすると高粘性物あるいは、ゲル化物を得ることができる。
次に、トランスグルタミナーゼの有する新規な性質を用い、蛋白質ゲル化物の物性を制御する方法について述べる。本発明のトランスグルタミナーゼを用いて蛋白質又は蛋白質含有物をゲル化させることができるが、蛋白質ゲル化物を調製する際、反応組成中の塩濃度又はカルシウムイオン濃度を適宜調節することにより溶液、高粘性物、ゲル化物のいずれの性状にも制御が可能である。
添加するカルシウムイオンの量やＮａＣｌやＫＣｌの量は特に限定されないが、次のようにするのがよい。
反応系（基質）にカルシウムイオン並びにＮａＣｌ及び／又はＫＣｌが無い場合：
▲１▼  カルシウムイオンを単独で添加する場合、反応系（基質）に対してカルシウムイオンを通常約５０ｍＭ−２Ｍ、好ましくは約１００ｍＭ−１Ｍとするのがよい。
▲２▼  反応系（基質）にカルシウムイオン並びにＮａＣｌ及び／又はＫＣｌを組み合わせて添加する場合には、例えば、ＮａＣｌを反応系に0.3Ｍ添加した場合には、カルシウムイオンの添加量を通常約１０ｍＭ−２Ｍ、好ましくは約２５ｍＭ−１Ｍとするのがよい。又、カルシウムイオンを反応系に５０ｍＭ添加した場合には、ＮａＣｌの添加量を通常約０−２Ｍ、好ましくは１００ｍＭ−１Ｍとするのがよい。
反応系（基質）中に予めカルシウムイオン並びにＮａＣｌ及び／又はＫＣｌが含まれている場合には、反応系中のこれらの含量を考慮して添加すればよい。例えば、カルシウムイオンの添加量は反応系中に既に存在すると思われるカルシウムイオンの量と合わせて、通常約１０ｍＭ−２Ｍの範囲、好ましくは５０ｍＭ−１Ｍの範囲になるように添加すればよい。また、塩化ナトリウム及び／又は塩化カリウムの添加量は反応系中に既に存在すると思われる塩化ナトリウム及び／又は塩化カリウム量と合わせて、通常約３００ｍＭ−２Ｍ、好ましくは５００ｍＭ−１Ｍの範囲になるように添加すればよい。
本発明のマガキ由来のトランスグルタミナーゼをコードする遺伝子をクローニングする為に、本願発明者らは鋭意検討を行った。その結果、最終的にマガキより精製したトランスグルタミナーゼの部分アミノ酸配列より推定した塩基配列をもとに一本鎖合成DNA（配列表の配列番号５〜１３２）を化学合成し、マガキより抽出したｍＲＮＡを用いて作製したｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてＰＣＲを行い、増幅されたＤＮＡ断片をプローブとしてｃＤＮＡライブラリーより目的とするｃＤＮＡをハイブリダイゼーションにより単離する方法を採用し、その方法により目的とするｃＤＮＡを取得することができた。
尚、上記以外にプローブの候補として検討したマダイ由来のトランスグルタミナーゼの部分ｃＤＮＡ断片（配列表の配列番号１３３）、モルモットのトランスグルタミナーゼの部分ｃＤＮＡ断片（配列表の配列番号１３４）、モルモットのトランスグルタミナーゼの活性中心付近の合成ＤＮＡ断片（配列表の配列番号１３５）では目的とするマガキ由来のｃＤＮＡの単離に成功しなかった。このことから、既知のトランスグルタミナーゼの知見をもとにした手法では、目的のｃＤＮＡを取得し得なかったと考えられる。
本発明者らが目的とするマガキ由来のトランスグルタミナーゼのｃＤＮＡのクローニングに成功した方法は上述の通りであるが、それ以外に下記の方法が挙げられる。
１）マガキ由来のトランスグルタミナーゼを単離精製し、決定されるアミノ酸配列を基に全塩基配列を化学合成する。
２）クローニングはｃＤＮＡライブラリーではなく、ゲノミックライブラリーでも良い。また、ハイブリダイゼーションでなくＰＣＲを用いても良い。
３）ｍＲＮＡをホワイトジャーム又はウサギ網状赤血球のインビトロ翻訳系に供し、トランスグルタミナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするｍＲＮＡが存在する画分を決定し、そこより目的のｃＤＮＡ断片を作製、取得する。
４）抗マガキトランスグルタミナーゼ抗体を作製し、蛋白質発現型ベクターにｃＤＮＡライブラリーを載せ、適当な宿主に感染させてｃＤＮＡがコードする蛋白質を発現させ、先程の抗体を用いて目的のｃＤＮＡをスクリーニングしても良い。
さて、マガキ由来のトランスグルタミナーゼをコードする遺伝子とは発現した時にトランスグルタミナーゼ活性を有するものであれば全て含まれるが、好ましくは、配列表の配列番号１又は３記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを有する遺伝子又は配列表の配列番号２又は４記載の塩基配列を有する遺伝子である。
ここに、配列表の配列番号１又は３記載のアミノ酸配列をコードする遺伝子とは、コドンの縮重を考慮すると種々の塩基配列が包含される。即ち、このような種々の塩基配列の中から、遺伝子発現系の諸要素、例えば宿主細胞の種類等による優先コドン、転写されたＲＮＡにより形成される高次構造の回避等、を考慮して選択すればよい。選択された塩基配列は自然界からクローニングされたＤＮＡであっても、人為的に化学合成されたＤＮＡであってもよい。
尚、本発明者らが実際にクローニングした遺伝子配列は配列表の配列番号２又は４記載の配列であった。これは、本トランスグルタミナーゼのＮ末端が少なくとも２種類あることを示している。即ち、Ｎ末端がＭｅｔ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−で始まるもの（配列表の配列番号１、２参照）、Ｎ末端がＡｌａ−Ｐｈｅ−で始まるものの両方がある（配列表の配列番号３、４参照）。もちろん、どちらの遺伝子配列を用いてもトランスグルタミナーゼ活性を有するポリペプチドが発現される。
繰り返し述べるが、マガキ由来のトランスグルタミナーゼ活性を有するポリペプチドを発現できる遺伝子があれば、本発明のマガキ由来のトランスグルタミナーゼをコードする遺伝子に含まれる。
例えば、配列表の配列番号２又は４記載の塩基配列中に１又は複数個の塩基の置換、欠失、挿入、付加又は逆位が生じたものも本発明のマガキ由来のトランスグルタミナーゼをコードする遺伝子に含まれる。また、このような塩基の置換、欠失、挿入等はマガキの個体差、遺伝子の多コピー化、各器官、組織の違いに基づく場合等の天然に生じる変異も、又部位特異的変異法等による人為的な変異も含まれる。
また、（１）配列表の配列番号１若くは３記載のアミノ酸配列をコードする遺伝子又は（２）配列表の２若くは４記載の塩基配列で示される遺伝子にハイブリダイズする遺伝子も、発現した場合にマガキ由来のトランスグルタミナーゼ活性を有する限り、本発明のマガキ由来のトランスグルタミナーゼをコードする遺伝子に含まれる。
組換型マガキ由来のトランスグルタミナーゼは、上述のマガキ由来のトランスグルタミナーゼを、遺伝子組換技術で改変した微生物において発現させることにより供給される。マガキ由来のトランスグルタミナーゼをコードする遺伝子を有するプラスミドも本発明のひとつである。
さて、この時に用いる組換えプラスミドは、所望の発現系に応じた公知の発現ベクターに、マガキ由来のトランスグルタミナーゼをコードする遺伝子を有するＤＮＡを従来公知の方法によって、挿入する事により調製する事が可能である。また、大腸菌用の発現ベクターとしてはＴ７gene１０とリンカーペプチドとの融合蛋白質を高発現する発現ベクタープラスミド（インヒドロジェン社製：商品名Ｘｐｒｅｓｓ  ＳｙｓｔｅｍTM）やグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼとの融合蛋白質を高発現する発現プラスミド（ファルマシアＬＫＢ社製：商品名ｐＧＥＫ系プラスミド）などがある。
一方、パン酵母での発現ベクターとしては、ガラクトカイネースをコードする遺伝子であるＧＡＬ１のプロモーターを外来遺伝子の発現に利用できるｐＹＥＳ２（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社）などがある。もちろん、これらは一例であり、これ以外の発現プラスミドを用いてもよい。
次に、トランスグルタミナーゼ遺伝子を搭載する発現ベクターで形質転換された種々の形質転換体について説明する。
本発明に於いて形質転換体となりうる生物には、大腸菌、枯草菌等の原核細胞並びに酵母、カビ等の真核細胞が挙げられる。この中でも大腸菌及びサッカロミセス属の酵母が好ましい。Escherichia coliＪＭ１０９株及びSaccharomyces cerevisiaeＩＮＶＳＣ２株が更に好ましい。これら形質転換体を適切な培地中で培養することにより、トランスグルタミナーゼ遺伝子の発現産物であるマガキ由来のトランスグルタミナーゼを細胞内又は培地中へ産生、蓄積させる。
尚、形質転換は通常用いられる方法により行われる。例えば、カルシウムクロライド法、リチウムクロライド法等である。もちろん、他の方法を用いても構わない。
最後に、上記の形質転換体を培地中で培養する事により、組換型トランスグルタミナーゼを製造する方法について説明する。
培養条件は、形質転換体の種類に応じて当業者が適宜決定し得るものである。また、発現され細胞内に蓄積又は培地中へ分泌された当該トランスグルタミナーゼは、従来から公知の種々の方法で単離、精製される。前述した天然のマガキからの精製方法と同様の手法により、遺伝子組換型トランスグルタミナーゼも精製できる。
現時点では、天然型のマガキ由来トランスグルタミナーゼには糖鎖が付与されているという報告はないが、大腸菌を宿主として製造した遺伝子組換型トランスグルタミナーゼには糖鎖は付加されず、一方、酵母を宿主とした場合には、酵母細胞内のグリコシレーション機能によって、糖鎖の付加も考えられる。しかし、糖鎖の有無はトランスグルタミナーゼ活性に影響を与えないと推測されるので、いずれの組換型も本発明のマガキ由来のトランスグルタミナーゼに含まれる。
尚、本発明により得られた組換型トランスグルタミナーゼは天然のマガキ由来のトランスグルタミナーゼと同一の性状、活性を有している。
以下、本発明を実施例に従って更に詳細に説明する。尚、本発明は実施例に限定されるものではない。
実施例１  マガキからのトランスグルタミナーゼの精製
マガキ５６ｇに１０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭジチオスレイトールを含む２０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）２３０ｍｌを加え、炭酸ガスにより冷却を行いながらホモジナイザーにより破砕した。この破砕液を４℃において３、０００rpm、２０分の遠心分離（日立社製Ｈｉｍａｃ  ＣＲ  ２０Ｂ２、ローターＲＰＲ２０−２）を行った。次いで上清をさらに４℃において３７、０００ｒｐｍ、１時間遠心分離（日立社製７０Ｐ−７２、ローターＲＰ−７０Ｔ）を行い、上清を０．４５μｍのフィルター（ＧＬサイエンス社製ＧＬクロマトディスク）にかけ粗抽出液２９０ｍｌを得た。
次に、粗抽出液に対して８０％となるように固形硫酸アンモニウムを加え、３時間かく拌放置して、蛋白質の塩析を行った。その後、３、０００ｒｐｍ、３０分の遠心分離で得た沈澱を１０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭジチオスレイトールを含む２０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）に透析し、あらかじめ同溶液で平衡化してあるＤＥＡＥ−セファセル充填カラム（ファルマシア社製φ２．６×１６ｃｍ）に通液した。
その結果、トランスグルタミナーゼは、吸着された。ＮａＣｌ濃度勾配により蛋白質の溶出を試みたところ、トランスグルタミナーゼは、ＮａＣｌ濃度約０．１５Ｍ付近から溶出（図１）し、活性画分１５６ｍｌを得た。
次に、得られた活性画分に対して終濃度１５％となるように固定硫酸アンモニウムを加え、あらかじめ１５％硫酸アンモニウム、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭジチオスレイトールを含む２０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化してあるフェニル−セファロース充填カラム（ファルマシア社製φ１．６×１０ｃｍ）に通液した。その結果、トランスグルタミナーゼは吸着された。
その後、硫酸アンモニウム濃度の低下により蛋白質の溶出を試みたところ、トランスグルタミナーゼは、硫酸アンモニウム濃度約９％で溶出し（図２）、活性画分約１３０ｍｌを得た。
次に、活性画分をポリエチレングリコール２０、０００にて濃縮後、２ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．２ｍＭジチオスレイトールを含む１０ｍＭビストリス緩衝液（ｐＨ６．２５）であらかじめ平衡化してあるセファクリルＳ−２００充填カラム（ファルマシア社製φ２．６×６０ｃｍ）によるゲル濾過に供した。同緩衝液で蛋白質の溶出を行った結果、トランスグルタミナーゼはＫａｖ＝０．３１付近に溶出し（図３）、活性画分約２６ｍｌを得た。
更に、得られた活性画分をあらかじめ２ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．２ｍＭジチオスレイトールを含む１０ｍＭビストリス緩衝液（ｐＨ６．２５）で平衡化してあるＭｏｎｏ−Ｑ充填カラム（ファルマシア社製φ０．５×５ｃｍ）に供した。その結果、マガキ由来のトランスグルタミナーゼは、吸着された。その後、ＮａＣｌ濃度勾配により蛋白質の溶出を試みたところ、目的とするトランスグルタミナーゼは、ＮａＣｌ濃度約０．２４Ｍ付近から溶出し（図４）、活性画分約３．４ｍｌを得た。
本活性画分の蛋白質濃度は、約７７μｇ／ｍｌであった。また、全活性は、３５８ユニットであり、比活性は、１４０４ユニット／ｍｇ蛋白質であった。
この画分中には、以下に示したように電気泳動上に分子量約８４、０００−９４、０００の単一バンドを示す蛋白質のみが存在した。ここに、マガキ由来のトランスグルタミナーゼが精製し、取得された。得られた精製溶液の比活性は、粗抽出液の約２５０倍であり、回収率約７％であった。表１に精製の結果をまとめた。
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つぎに得られた精製トランスグルタミナーゼの特性を検討した。
ａ）電気泳動分析
精製トランスグルタミナーゼを３０μｌとり、同量の１０％メルカプトエタノール、４％ＳＤＳ、２０％グリセリン、０．００２％ブロムフェノールブルーを含む０．１２５Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ６．８）を加え、沸騰浴中で１分加熱し、泳動試料とした。泳動試料４０μｌをアトー（株）製５−２０％ポリアクリルアミド既製ゲルに供し、０．１％ＳＤＳを含む０．０２５Ｍトリスグリシン緩衝液で２０ｍＡ、約７０分泳動を行った。
泳動終了後、５０％メタノール、７％酢酸を含む０．１２％クマシーブリリアントブルー溶液で一晩染色し、５０％メタノールを含む７％酢酸溶液にて脱色を行った。その結果、分子量約８３．０００〜９５．０００、より詳細には約８４．０００〜９４．０００の位置に単一バンドを得た（図５）。
b)反応至適温度
基質としてジメチル化カゼインとモノダンシルカダベリンを用いた場合、ｐＨ８．５、３０分の反応条件で反応の至適温度は３０〜５０℃、より好ましい至適温度は３５〜４５℃付近であった（図６）。
c)反応至適ｐＨ
基質としてジメチル化カゼインとモノダンシルカダベリンを用いた場合、３７℃、３０分の反応条件で反応至適ｐＨは、約７．５〜９．５、より好ましい至適ｐＨは約８〜９であった（図７）。
d)温度安定性
精製トランスグルタミナーゼをｐＨ６．２５で２から５０℃の各温度で１０分処理を行った後に、基質としてジメチル化カゼインとモノダンシルカダベリンを用い、３７℃、３０分の反応を行った。その結果、２から２５％の範囲でトランスグルタミナーゼは、安定であった（図８）。
e)ｐＨ安定性
精製トランスグルタミナーゼを２５℃で、ｐＨ４から９．８の各ｐＨで３０分処理を行った後に、基質としてジメチル化カゼインとモノダンシルカダベリンを用い、３７℃、３０分の反応を行った。その結果、ｐＨ５から９の範囲で、より厳格にはｐＨ６から８．５の範囲でトランスグルタミナーゼは安定であった（図９）。
f)阻害剤及び金属イオンの影響
精製トランスグルタミナーゼに各種酵素阻害剤、各金属イオンを終濃度で1mMとなるように添加し、２５℃、１０分の処理を行った後に、基質としてジメチル化カゼインとモノダンシルカダベリンを用い、３７℃、３０分の反応を行った。その結果を表２に示した。
フェニルメチルサルフォンフルオライドでは、活性阻害効果は、ほとんどなかったが、モノヨード酢酸、N-エチルマレイミド、パラクロロマーキュリー安息香酸では、阻害効果は大きかった。また、金属イオンでは、Ｂａ2+、Ｍｇ2*、Ｓｒ2+では活性阻害はほとんど認められないものの、Ｃｏ2+、Ｐｂ2+、Ｃｕ2+では強く阻害を受けた、とりわけＣｕ2+での阻害効果は顕著であった。
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g)活性に及ぼすＮａＣｌ及びＣａ2+の影響
基質としてジメチル化カゼインとモノダンシルカダベリンを用いた場合、活性は、ＮａＣｌ濃度の増加に従って増加した（図１０）。一方、モルモット肝臓及び微生物由来トランスグルタミナーゼにおいては、ＮａＣｌ濃度の増加による活性の増加は認められず（図１１）、マガキ由来トランスグルタミナーゼが従来知られていない新規な性質を持つ事が示された。
また、活性は、Ｃａ2+依存性を示すが、ＮａＣｌ存在下ではＣａ2+濃度１０ｍＭ程度で最大となり、以後低下する傾向を示した。一方、ＮａＣｌ非存在下ではＣａ2+濃度１００ｍＭ程度で最大となった。また、ＮａＣｌ存在下では、非存在下の場合に比べて、最大活性で約２倍高い値が得られることが示された（図１２）。この特性も従来知られているトランスグルタミナーゼには存在しないものである。
このＮａＣｌ及びＣａ2+に対する本トランスグルタミナーゼの特異的な挙動は、食品産業上極めて利用価値があるものと考える。
また、本酵素はＫＣｌでも活性が増強されるという特徴がある。
h)基質特異性
精製トランスグルタミナーゼの各種合成基質とヒドロキシルアミンとの反応を調べた。
合成基質がベンジルオキシカルボニルアスパラギニルグリシン、ベンジルオキシカルボニルグルタミン、グリシルグルタミニルグリシンの場合反応しない。
しかし、合成基質がベンジルオキシカルボニルグルタミニルグリシンの場合の反応性はあった。
すなわち、CBZ-Gln-Gly,CBZ-Gln-Gly-OEt,OBZ-Gln-Gln-Gly及びCBZ-Gly-Gly-Gln-Glyについては反応したが、CBZ-Gln,CBZ-Asn-Gly及びGly-Gln-Glyについては反応しなかった。
なお、CBZはベンジルオキシカルボニル基の略であり、Glnはグルタミル基の略であり、Glyはグリシル基の略であり、Asnはアスパラギニル基の略である。
実施例２  蛋白質のゲル化
スケソウダラ冷凍すり身から、高士らの方法［高士ら,Nippon Suisan Gakkai-shi,36(2),169(1970)］に従いアクトミオシンを調製した。すなわち、スケソウダラ冷凍すり身２５ｇに３倍量の０．４５Ｍ  ＫＣｌを含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を加え、２℃で３時間抽出を行い、希釈沈澱後、０．３Ｍ  ＮａＣｌを含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）溶液に透析し、２０、０００ｇ、１時間の遠心分離を行った上清をアクトミオシンとした。蛋白質濃度は、０．４重量％であった。このアクトミオシン溶液に５ｍＭとなるように塩化カルシウムを加え、トランスグルタミナーゼの粗抽出液（蛋白質１ｍｇ当たり５．７０ユニットを示す）を蛋白質１ｍｇあたり２．３ユニット加え、よくかく拌し、３７℃、９０分反応させた。
ゲル化の判定は、試験管倒置により判定したが、その結果、トランスグルタミナーゼを添加しなかったものでは、浴液状態のままであったが、トランスグルタミナーゼを添加したものでは、ゲル化が認められた。また、塩化カルシウムを添加せずにトランスグルタミナーゼを添加してもゲル化は認められなかった。
実施例３  ゲル化の制御
蛋白質濃度１重量％のカゼイン（シグマ社製）水溶液に対して、ＮａＣｌを０、０．１または０．３Ｍとなるように加え、塩化カルシウム濃度を０から２００ｍＭの範囲でゲル化を検討した。尚、添加した精製トランスグルタミナーゼは、蛋白質１ｍｇあたり４．０ユニット添加した。３７℃、９０分反応後、ゲル化の判定を行い、表３に結果を示した。ＮａＣｌが存在しない場合は、Ｃａ2+濃度１００ｍＭ以上でゲル化が認められ、ＮａＣｌ濃度０．１Ｍでは、Ｃａ2+濃度５０から１００ｍＭの範囲でゲル化が認められた。また、ＮａＣｌ濃度０．３Ｍでは、Ｃａ2+濃度２５ｍＭ以上でゲル化が認められた。
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上記の結果は、蛋白質のゲル化を容易に制御できること、すなわち同一蛋白質濃度であっても、添加する塩化カルシウムまたは塩化ナトリウム濃度を調節することにより、溶液または高粘性物またはゲル化物を得ることが可能であることを示すものである。
実施例４  マガキ中のトランスグルタミナーゼ活性の高い組織部位の同定
マガキの殻を除き、更に貝柱も除いたのこりの組織を、大まかに消化網嚢、鰓、外套膜並びにその他の組織に分けた。それぞれの組織を１０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ並びに２０ｍＭイミダゾール塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）よりなる溶液中で破砕して調製した液を、１８，０００ｒｐｍで３０分間遠心処理した後、上清をＧＬクロマトディスク（ＧＬサイエンス社製）でフィルター濾過し、粗抽出液を得た。
次に、粗抽出液中のトランスグルタミナーゼ活性を、モノダンシルカダベリンのメチル化カゼインへの結合による蛍光強度（３５０ｎｍの励起波長光による４８０ｎｍの蛍光強度）の増加を指標とした活性検出法にて検討した。本活性検出法は、Ｎｉｐｐｐｎ  Ｓｕｉｓａｎ  Ｇａｋｋａｉｓｈｉ（１９９１年）の第５７巻、ページ１２０３から１２１０に記載されている方法を基に、若干の修正を加えたものである。即ち、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液(ｐＨ８．５)、１ｍｇ／ｍｌメチル化カゼイン、１５μＭモノダンシルカダベリン並びに１０ｍＭ塩化カルシウムの組成よりなる溶液２ｍｌに２０μｌの各粗抽出液を２０μｌ添加し、撹拌後、３７℃で２０分間保温した。反応後、５００ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液を１００μｌ添加し、各反応溶液の蛍光強度を蛍光光度計（島津ＲＦ−１５００、島津製作所製）により測定した。
その結果、表４に示した各組織部分の粗抽出液中の全蛋白質量当たりの蛍光強度の上昇値から、鰓部分に最も高いトランスグルタミナーゼ活性があることが判明した。このことより、マガキは鰓においてトランスグルタミナーゼの発現量が高い事が明かとなった。
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実施例５  マガキのトランスグルタミナーゼをコードする遺伝子を有するＤＮＡ断片の取得
上記実施例の結果を踏まえて、マガキの鰓より抽出したｍＲＮＡを用いてｃＤＮＡライブラリーを作製し、その中からマガキのトランスグルタミナーゼをコードするcDNAを取得する事にした。それに付いて、以下説明する。
マガキの鰓１１．３ｇを５Ｍグアニジンチオシアネート、１％β−メルカプトエタノールの溶液（９０ｍｌ）中で、ポリトロン、そしてテフロンホモジナイザーを用いて破砕した。この細胞破砕液中に最終濃度０．５％のラウリル硫酸ナトリウムを加え溶解させた後、この溶液を室温で１００００ｒｐｍ、２０分間遠心処理し、上清を採取した。この上清を２５ゲージの注射針に２０回通す事で、溶液中の染色体ＤＮＡを細断化した。さらにこの溶液を前述と同様に遠心処理したのち、その上清を常法に従いＣｓＣｌの密度勾配遠心操作を経て、全ＲＮＡを精製した（Sambrook et al.,Molecular Cloning:a laboratory manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor Press(1989)参照）。得られた全ＲＮＡ量は４．１６ｍｇであった。この全量をオリゴ−（ｄＴ）セルロースカラムを用いたｍＲＮＡ精製キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）にかけ、ｍＲＮＡ分子を精製し、７３．５４μｇのｍＲＮＡを得た。
得られたｍＲＮＡの内、６．７２μｇをｃＤＮＡ作製のための鋳型として用いた。ｃＤＮＡ合成には、ランダムプライマーを用い、２本鎖ｃＤＮＡを合成するＴｉｍｅ−Ｓａｖｅｒ  ｃＤＮＡ合成キット（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）のプロトコールに従って作製した。得られたｃＤＮＡはλファージベクターλＺａｐＩＩ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）の制限酵素切断部位ＥｃｏＲＩに組み込んだ後、Ｇｉｇａｐａｃｋ  ＩＩ  Ｇｏｌｄ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）のパッケージングキットを用いて、ファージタンパク質中に取り込まれた形で、マガキのｃＤＮＡライブラリーとして作製し、取得した。
なお、本ライブラリのタイターは１．２Ｘ１０6ｐｆｕ／μｇベクターであった。
上記のマガキｃＤＮＡライブラリーから１．４Ｘ１０5ｐｆｕに相当するファージを宿主細胞ＸＬＩ−Ｂｌｕｅに感染させた後、直径１５０ｍｌの寒天プレート７枚に、プレート当たり２．０Ｘ１０4ｐｆｕとなるように蒔いた。これを３７℃で約６．５時間培養した後、プレート上に形成されたファージプラークをナイロンメンブレン（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ）に転写した。
次に、転写されたナイロンメンブレンをアルカリで処理してＤＮＡを変性させ、中和した後に洗浄した。その後、ナイロンメンブレンを８０℃で２時間処理する事でＤＮＡをメンブレン上に固定した。
得られたナイロンメンブレンに対して４２℃で３時間、プレハイブリダイゼーションを行い、ついで、４２℃で１５時間のハイブリダイゼーションを行った。
なお、プレハイブリダイゼーションの溶液の組成は６ＸＳＳＣ（１ＸＳＳＣの組成は、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、５ＸＤｅｎｈａｒｄｔ’ｓ溶液（１ＸＤｅｎｈａｒｄｔ’ｓ溶液の組成は、０．０２％ＢＳＡ、０．０２％Ｆｉｃｏｌｌ、０．０２％ポリビニルピロリドン）、２０％フォルムアミド、１００μｇ／ｍｌの大腸菌染色体ＤＮＡ、０．１％ＳＤＳからなる。
また、ハイブリダイゼーションの際、ＤＮＡプローブとして、モルモットのトランスグルタミナーゼの活性中心付近の合成ＤＮＡ断片（IKura et al.,Biochemistry 27,2898-2905(1988)：配列表の配列番号１３５）を〔γ−32Ｐ〕ＡＴＰでラベリングしたものを用いた。しかし、このスクリーニングにおいては陽性と考えられるクローンを検出することができなかった。
続いて、既知のトランスグルタミナーゼのｃＤＮＡをハイブリダイゼーションにおけるＤＮＡプローブとして用いることにした。使用したのはモルモットトランスグルタミナーゼ、マダイトランスグルタミナーゼの両方の活性中心近傍のｃＤＮＡ部分を〔α−32Ｐ〕ｄＣＴＰでラベリングしたものを用いた（配列表の配列番号１３４、１３３）。
しかし、このスクリーニングにおいても陽性と考えられるクローンを検出することができなかった。
以上の結果より、マガキトランスグルタミナーゼは、既知のトランスグルタミナーゼとは構造上あまり相同性がないことが考えられたので、既知のトランスグルタミナーゼの配列情報を基にしたスクリーニング方法は断念することにした。
そこで、マガキのトランスグルタミナーゼを精製してその部分アミノ酸配列を解析し、得られたアミノ酸配列情報を基にＰＣＲ法を用いてマガキトランスグルタミナーゼの部分ｃＤＮＡ断片を取得し、スクリーニングのハイブリダイゼーションの際のプローブとする事にした。
実施例６  マガキのトランスグルタミナーゼの部分アミノ酸配列解析
精製したトランスグルタミナーゼ約２０μｇを含む溶液を、遠心濃縮により乾固させ、蒸留水１．０mlを加え、３７℃、３０分間撹拌し、再溶解させた。これにリジルエンドペプチダーゼ（和光純薬製）を添加し、３７℃で２０時間反応させ、ペプチド断片へと分解した。反応はトリフルオロ酢酸（以下ＴＦＡ）を終濃度０．１％となるように添加して終了させた。
次に、本反応液を逆相ＨＰＬＣ（ｖｙｄａｃ  Ｃ18逆相ＨＰＬＣカラムφ４．６Ｘ２５０ｍｍサイプレスインターナショナル社製）に供し、溶媒は０．１％ＴＦＡとして、アセトニトリルの濃度勾配による溶出条件下にて、各ペプチド断片を分離、取得した。
取得したペプチド断片をプロテインシークエンサー（ＰＰＳＱ−１０島津製作所製）に供し、それらのアミノ酸配列を分析したところ、次の５つの配列が得られた。
すなわち、Asn-His-His-Thr-Asn-Glu-Phe-Glu-Lys、Asp-Cys-Thr-Val-Pro-Trp-Lys、Trp-Thr-Gly-Ser-Val-Ala-Ile-Ile-Lys、Asp-Gly-Thr-Met-Glu-Val-Ser-Gln-Ile-Asp-His-Ser-Ala-Val-Gly、Tyr-Glu-Glu-Asn-Glu-Ser-Met-Ile-Ile-Leu-Phe-Asnであった。
実施例７  部分アミノ酸配列情報を基にしたＰＣＲ法による、マガキ由来トランスグルタミナーゼｃＤＮＡスクリーニングのための部分ｃＤＮＡ断片の取得
上記の如く得られたマガキ由来トランスグルタミナーゼの部分アミノ酸配列のうち、His-His-Thr-Asn-Glu-Phe-Glu（配列表の配列番号１４１）、Tyr-Glu-Glu-Asn-Glu-Ser-Met（配列表の配列番号１４２）を基にその部分アミノ酸配列をコードすると考えられる一本鎖ＤＮＡを化学合成し（塩基配列は配列表配列番号５〜１３３に記載）、マガキ由来ｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてＰＣＲを行い、約４００塩基対（塩基対は以下ｂｐで表す）のＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片を精製し、〔α−32Ｐ〕ｄＣＴＰでランダムラベルしたものをハイブリダイゼーションの際のプローブとして用いることによって、ようやく１次スクリーニングで陽性クローンの候補株を得ることができた。更に２次スクリーニングを行う事により、最終的に１個の陽性クローンを取得した。
上記の陽性クローンを保持する感染大腸菌に、ヘルパーファージ（Ｅｘａｓｓｉｓｔ  ｈｅｌｐｅｒ  ｐｈａｇｅ（STRATAGENE社製）)を共感染させる事で、陽性クローンに由来するｃＤＮＡをプラスミドベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ-に組み込まれた形態へと変換した。この陽性クローンの挿入ｃＤＮＡの長さは約３．５Ｋｂｐであった。そしてこのクローンをｐＣＧＴＧ４と命名した。
ｐＣＧＴＧ４の挿入ｃＤＮＡの塩基配列の解析にはＴａｑ  ＤｙｅＤｅｏｘｙ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製）を用いる従来公知の方法で行った。
その結果、配列表中の配列番号１３６に示す３３９４塩基対の配列よりなる塩基配列が明かとなった。この配列中には、本発明者らが用いたＤＮＡプローブの塩基配列と一致する部分が存在した。また、この塩基配列から翻訳されるアミノ酸配列を配列表中の配列番号１３６に示す。なお、以上のようにして取得したマガキ由来のトランスグルタミナーゼcDNAを含むプラスミドｐＣＧＴＧ４を保持する大腸菌株、即ち、Escherichia coliＳＯＬＲ／ｐＣＧＴＧ４（ＡＪ  １３０４８）は通産省工業技術院生命工学工業技術研究所（以下、生命研と略する）に寄託されている。そのEscherichia coliＡＪ  １３０４８の寄託番号はＦＥＲＭ  ＢＰ−４９６１である（尚、ＦＥＲＭ  ＢＰ−４９６１は生命研に寄託されている国内寄託ＦＥＲＭ  Ｐ−１４５８０から移管されたものである。）。
実施例８  マガキのトランスグルタミナーゼ遺伝子を発現するプラスミドｐＣＧＴＧ４Ｅの構築、大腸菌への導入と生理活性発現の検定
続いて、取得したｐＣＧＴＧ４の挿入ｃＤＮＡがマガキトランスグルタミナーゼをコードするかどうかを検定するため、マガキトランスグルタミナーゼをβ−ガラクトシダーゼとの融合蛋白質の形で大腸菌体内で発現させてみた。即ち、ｌａｃプロモーター支配下にβ−ガラクトシダーゼとの融合蛋白質を発現しうる大腸菌発現プラスミドｐＵＣ１９に、ｏｐｅｎ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅと推定されるｐＣＧＴＧ４の塩基配列部分を組み込むことにした。（図１３）。
このプラスミドをｐＣＧＴＧ４Ｅと命名した。その構築方法を以下の文章及び図１４、１５に示す。図１４、１５に示すように、ｐＣＧＴＧ４を制限酵素ＤｒａＩ並びにＳｐｅＩで消化して得られた約２００ｂｐのＤＮＡ断片Ａと、ｐＣＧＴＧ４を制限酵素ＳｐｅＩ並びにＮｃｏＩで消化して得られた約１６００ｂｐのＤＮＡ断片Ｂと、ｐＣＧＴＧ４をＮｃｏＩ並びにＥｃｏＲＩで消化して得られた約７００ｂｐのＤＮＡ断片Ｃと、発現プラスミドｐＵＣ１９(Takara)をＳｍａＩ並びにＥｃｏＲＩで消化して得られた２７００ｂｐのＤＮＡ断片Ｄを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで連結する事により、マガキトランスグルタミナーゼｃＤＮＡ発現プラスミドｐＣＧＴＧ４Ｅを得た。
このｐＣＧＴＧ４Ｅを公知の方法により大腸菌ＪＭ１０９に導入し、形質転換体、Escherichia coliＪＭ１０９／ｐＣＧＴＧ４Ｅ(ＡＪ１３０４９)を作製した。なお、Escherichia coliＡＪ  １３０４９は生命研に寄託されており、その寄託番号はＦＥＲＭ  ＢＰ−４９６２である（尚、ＦＥＲＭ  ＢＰ−４９６２は生命研に寄託されている国内寄託ＦＥＲＭ  Ｐ−１４５８１から移管されたものである。）。
取得した形質転換体（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４９６２）のコロニーを、５０ｍｇ／ｌのアンピシリン、１０ｍＭのＩＰＴＧを含む、ＬＢ培地（１０ｇ  Ｔｒｙｐｔｏｎｅ、５ｇ  Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ、１０ｇ  ＮａＣｌ（ｐＨ7.0）／１ｌの組成よりなる）５０ｍｌを含む坂口フラスコに接種し、２６℃で２１時間培養、菌体を集菌した。
集菌した菌体を、０．９ｍｌの菌体破砕液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ7.5）、３０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡよりなる溶液、以下組成略）に懸濁し、さらに１０ｍｇ／ｍｌリゾチーム溶液を０．１ｍｌ加え、氷上に1.5時間静置した。その後、菌体懸濁液を超音波破砕し、これを遠心処理（１５０００ｒｐｍで２分間）し、菌体破砕上清を調製した。また、同様に、ｐＵＣ１９のみを保持する大腸菌からも菌体破砕液の遠心上清液を調製した。
各々の上清液のトランスグルタミナーゼ活性を、前述した方法にて検定した。その結果を表５に示す。対照として用いたモルモットＴＧａｓｅ（Ｔａｋａｒａ社製）の結果も同様に示した。
0003758187.tif 000006
その結果、表５に見られるように上記実施例で得られたマガキトランスグルタミナーゼｃＤＮＡを含む発現プラスミドを保持する大腸菌の菌体抽出液には、明らかにトランスグルタミナーゼ活性が存在する事が判明した。このことより、我々の取得したｃＤＮＡがトランスグルタミナーゼをコードするものである事が明かとなった。
実施例９  マガキのトランスグルタミナーゼの予想全アミノ酸配列を発現するプラスミドｐＣＧＴＧ４ＥＰの構築及び大腸菌への導入
更に、本発明者らはマガキ由来のトランスグルタミナーゼのｃＤＮＡ配列から演繹される全アミノ酸配列のみが大腸菌菌体内で発現するようにしたプラスミドｐＣＧＴＧ４ＥＰを構築した（図１６参照）。
プラスミドｐＣＧＴＧ４ＥＰの構築法としては、まず、マガキトランスグルタミナーゼｃＤＮＡの翻訳開始コドン付近の塩基配列５’−ＴＣＡＴＧＧ−３’（アンダーラインが開始コドン、配列表配列番号１３６参照）を５’−ＣＣＡＴＧＧ−３’に変換して制限酵素ＮｃｏＩ認識配列を導入したＤＮＡ断片を得るため、ｐＣＧＴＧ４の挿入塩基配列を基に作製した一本鎖合成ＤＮＡである変異導入用プライマー（配列表配列番号１３７）と、それよりさらに下流の塩基配列部分から作製した一本鎖合成ＤＮＡ（配列表配列番号１３８）をプライマーとしてＰＣＲを行い、増幅されたＤＮＡ断片をｐＵＣ１８の制限酵素ＨｉｎｃＩＩ認識切断部位に組み込み、シークエンスで目的のＤＮＡ断片がクローニングされた事を確認した。その後、プラスミドｐＣＧＴＧ４を制限酵素ＮｃｏＩ、ＳｐｅＩで分解する事により、マガキトランスグルタミナーゼのＮ末端近傍をコードするＤＮＡ断片Ａ’を作製した。
更にｐＣＧＴＧ４を制限酵素ＳｐｅＩ、ＢａｍＨＩで分解してＤＮＡ断片Ｂ’を、ｐＴ１３ｓＮｃｏ(Tonouchi N.et al.,Journal of Biochemistry,104,30-34,1988)をＮｃｏＩ、ＢａｍＨＩで分解する事によりＤＮＡ断片Ｃ’を作製した。これら３つのＤＮＡ断片を常法通りにＴ４  ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、マガキトランスグルタミナーゼ大腸菌発現プラスミドｐＣＧＴＧ４ＥＰを構築した。この発現プラスミドは、ｐＴ１３ｓＮｃｏ由来のトリプトファンプロモーター支配下にマガキトランスグルタミナーゼを大腸菌菌体内において発現する事の出来るものである。その構築方法の概略を図１６に示した。
このｐＣＧＴＧ４ＥＰを公知の方法で大腸菌ＨＢ１０１に導入し、形質転換体Escherichia coliｐＣＧＴＧ４ＥＰ／ＨＢ１０１を作製した。
取得した形質転換体のコロニーを、５０ｍｇ／ｍｌのアンピシリンを含む、Ｍ９合成培地（１２．８ｇ  Ｎａ2ＨＰＯ4、３ｇ  ＫＨ2ＰＯ4、０．５ｇ  ＮａＣｌ、１ｇ  ＮＨ4Ｃｌ、０．４ｇ  ｇｌｕｃｏｓｅ、２ｍＭ  ＭｇＳＯ4、１μＭ  ＣａＣｌ2、５０ｍｇ  Ｐｒｏｌｉｎｅ及びＬｅｕｃｉｎｅ、２ｇ  ｃａｓａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ／１ｌの組成よりなる）５０ｍｌを含む坂口フラスコに接種し、３７℃で２１時間培養、菌体を集菌した。
集菌した菌体を、0.9mlの菌体破砕液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、３０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡよりなる溶液、以下組成略）に懸濁し、さらに１０ｍｇ／ｍｌリゾチーム溶液を0.1ｍｌ加え、氷上に1.5時間静置した。その後、菌体懸濁液を超音波破砕し、これを遠心処理（１５０００ｒｐｍで２分間）し、菌体破砕上清を調製した。また、同様に、ｐＵＣ１８のみを保持する大腸菌からも菌体破砕液の遠心上清液を調製した。
各々の上清液のトランスグルタミナーゼ活性を、実施例７と同様の方法にて検定した。その結果、マガキトランスグルタミナーゼｃＤＮＡを含む発現プラスミドを保持する大腸菌ｐＣＧＴＧ４ＥＰ／ＨＢ１０１の菌体抽出液には、微弱であるが、トランスグルタミナーゼ活性が認められる。
これより、我々の取得したｃＤＮＡがトランスグルタミナーゼをコードするものである事、またｃＤＮＡより推定されるアミノ酸配列がＴＧａｓｅ活性を持つ事が明かである。
実施例１０  大腸菌において発現された組換型マガキトランスグルタミナーゼのＮ末端アミノ酸配列の確認
続いて、ｐＣＧＴＧ４ＥＰ／ＨＢ１０１に於いて発現された組換型マガキトランスグルタミナーゼのＮ末端部分のアミノ酸配列をシークエンスし、今回取得したｃＤＮＡをもとに発現された組換型マガキトランスグルタミナーゼの実際のＮ末端アミノ酸残基を同定した。
ｐＣＧＴＧ４ＥＰ／ＨＢ１０１は５０ｍＭアンピシリンを含むＭ９合成培地５０ｍｌに播種し、２８℃にて１２時間坂口フラスコ中で振とう培養、菌体を集菌し、実施例７と同様の方法で菌体破砕液を調製した。この破砕液の一部をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、組換え型マガキトランスグルタミナーゼを泳動ゲル上で分離した後、ＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）にエレクトロブロットした。泳動ゲルから蛋白質を転写されたＰＶＤＦ膜から組換え型マガキトランスグルタミナーゼの転写された部分を切りとり、プロテインシークエンサー（ＰＰＳＱ−１０島津製作所製）に供した。その結果、Ｎ末端よりAla-Phe-Trp-Gly-Val-Phe-Tyr及びMet-Ala-Phe-Trp-Gly-Val-Phe-Tyrというアミノ酸残基であることが分かった。即ち、大腸菌の菌体内で発現している組換型マガキトランスグルタミナーゼは、ｃＤＮＡより予想されるアミノ酸配列から、開始コドンであるメチオニンが除去されたものも、メチオニンが除去されないものも含まれていた。
実施例１１  酵母においてマガキのトランスグルタミナーゼ遺伝子を発現するプラスミドｐＣＧＴＧ４Ｓの構築、パン酵母Saccharomyces cerevisiaeへの導入と生理活性発現の検定
まず、前出のマガキトランスグルタミナーゼをコードするｃＤＮＡを含むプラスミドｐＣＧＴＧ４Ｅを、制限酵素ＰｖｕＩＩ、ＢａｍＨＩ並びにＢｇｌＩで消化し、マガキトランスグルタミナーゼｃＤＮＡを有する約２８００ｂｐのＤＮＡ断片を得た。
一方、パン酵母での発現プラスミドとしては、ガラクトキナーゼをコードする遺伝子であるＧＡＬ１のプロモーターを外来遺伝子の発現に利用できるｐＹＥＳ２（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社製）を用いた。同プラスミドを制限酵素ＸｈｏＩで消化し、次にクレノウ酵素でＤＮＡ切断端を平滑化した後に、制限酵素ＢａｍＨＩで消化し、約５８００ｂｐのＤＮＡ断片を得た。
上記の２つのDNA断片を常法に従い、Ｔ４ＤＮＡリガーゼにて連結反応を行うことにより、マガキトランスグルタミナーゼ酵母発現ベクターｐＣＧＴＧ４Ｓを得た（図１７）。これを大腸菌ＨＢ１０１に公知の方法により導入し、形質転換体、Escherichia coliＨＢ１０１／ｐＣＧＴＧ４Ｓ  ＡＪ１３０５０を作製した。なお、Escherichia coliＨＢ１０１／ｐＣＧＴＧ４Ｓ  ＡＪ１３０５０は生命研に寄託されたおり、その寄託番号はＦＥＲＭ  ＢＰ−４９６３である（尚、ＦＥＲＭ  ＢＰ−４９６３は生命研に寄託されている国内寄託ＦＥＲＭ  Ｐ−１４５８２から移管されたものである。）。
このように作製した形質転換菌からアルカリＳＤＳ法に従いｐＣＧＴＧ４Ｓを調製し、アルカリカチオン法酵母形質転換キット（Ｂｉｏ１０１社製）を用いて、酵母Saccharomyces cerevisiaeＩＮＶＳＣ２株（ＭＡＴα、ｈｉｓ３−△２００、ｕｒａ３−１６７）に導入した。なお、形質転換体の選択には、ヒスチジン５０ｍｇ／ｍｌを含むグルコース合成最少培地プレート（合成最少培地の組成は０．１７％Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ  Ｗ／Ｏ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  Ａｍｍｏｎｉｕｍ  Ｓｕｌｆａｔｅ（Ｄｉｆｃｏ社製）、０．５％硫安である。これにグルコースを終濃度２％になるよう入れ、２％の寒天で９０ｍｍシャーレに固めたもの）を用いた。こうして形質転換体、Saccharomyces cerevisiaeＩＮＶＳＣ２／ｐＣＧＴＧ４Ｓ  ＡＪ１４６９７を取得した。尚、Saccharomyces cerevisiaeＩＮＶＳＣ２／ｐＣＧＴＧ４Ｓ  ＡＪ１４６９７は生命研に寄託されており、その寄託番号はＦＥＲＭ  ＢＰ−４９６４である（尚、ＦＥＲＭ  ＢＰ−４９６４は生命研に寄託されている国内寄託ＦＥＲＭ  Ｐ−１４５８３から移管されたものである。）。
この形質転換体を、先ず５０ｍｌのグルコース合成最少培地（上記合成最少培地に２％のグルコース、ヒスチジン５０ｍｇ／ｌを入れたもの）を入れた坂口フラスコに接種し、３０℃にて２４時間振とう培養して菌体量を増やした。その後、菌体を遠心集菌し、菌体を５０ｍｌのガラクトース合成最少培地（上記合成最少培地に２％のガラクトースとヒスチジン５０ｍｇ／ｌを入れたもの）を入れた坂口フラスコに懸濁し、３０℃にて２４時間振とう培養して、ＧＡＬ１プロモーターからの転写を誘導した。同様に当該プラスミドを含まないＩＮＶＳＣ２株も上記グルコース、ガラクトース合成最少培地にウラシル５０ｍｇ／ｌを更に添加した培地を用いて培養した。
培養後、培養液３０ｍｌ中の菌体を遠心集菌し、菌体破砕液（前出）１ｍｌに懸濁した。この菌体懸濁液１ｍｌを１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに入れ、さらに０．５ｍｌ容のガラスビーズ（直径０．５ｍｍ）を加えて２分間強く撹拌処理して菌体を破砕した。その後、１５０００ｒｐｍで２分間遠心し、得られた上清をトランスグルタミナーゼ活性測定用サンプルとした。
各々の菌体破砕後の遠心上清液０．３５ｍｌのトランスグルタミナーゼ活性を上記実施例８と同様にして検定した（表６）。その結果、ＧＡＬ１プロモーターの転写誘導を行ったマガキトランスグルタミナーゼ発現プラスミド（ｐＣＧＴＧ４Ｓ）を含有する形質転換酵母（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４９６４）の菌体破砕抽出液には、明らかにトランスグルタミナーゼ活性が存在する事が判明した。このことより、我々の取得したｃＤＮＡが活性のあるトランスグルタミナーゼを酵母に於いても発現させ得るものである事が明かとなった。
0003758187.tif 000007
更に我々は、酵母で発現したトランスグルタミナーゼがマガキのトランスグルタミナーゼの持つ酵素反応の特質を有しているかどうかを検定するため、以下の実験を行った。
上記のSaccharomyces cerevisiaeｐＣＧＴＧ４Ｓ／ＩＮＶＳＣ２  ＡＪ１４６９７（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４９６４）の菌体破砕抽出液を、反応液中のＮａＣｌ濃度を変えてトランスグルタミナーゼ活性を検定し、比較を行った（表７）。
この結果、Saccharomyces cerevisiaeｐＣＧＴＧ４Ｓ／ＩＮＶＳＣ２  ＡＪ１４６９７（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４９６４）の菌体破砕抽出液においても、天然型マガキトランスグルタミナーゼと同様に、高ＮａＣｌ濃度存在下におけるトランスグルタミナーゼ活性の上昇がみられた。この現象は、天然型マガキトランスグルタミナーゼと同様の挙動を示したことになり、組換型トランスグルタミナーゼも天然から抽出したトランスグルタミナーゼと同様の性質を有していることが分かった。また、このように調製した組換型トランスグルタミナーゼの他の性質、すなわち、基質特異性、分子量、至適温度、至適ｐＨ、温度安定性活性化剤の影響、阻害剤の影響等も天然のマガキ由来のトランスグルタミナーゼと同じである。
また、このことは我々の取得したｃＤＮＡがマガキのトランスグルタミナーゼをコードするＤＮＡである事を示している。
0003758187.tif 000008
実施例１２  酵母において発現された組換え型マガキトランスグルタミナーゼのN末端アミノ酸配列の確認
続いて、酵母に於いて発現された組換え型マガキトランスグルタミナーゼのＮ末端部分のアミノ酸配列をシークエンスし、今回取得したｃＤＮＡをもとに発現された組換え型マガキトランスグルタミナーゼの実際のＮ末端アミノ酸残基を同定した。
まず、組換え蛋白質の精製を容易にするために、ｏｐｅｎ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅのＣ末端（アスパラギン酸残基）に、さらに６個のヒスチジン残基を付加されたマガキトランスグルタミナーゼを発現するプラスミドｐＣＧＴＧ４Ｓ６Ｈを構築した。その方法の概略を以下の文章及び図１８に示した。
まず前述のプラスミドｐＣＧＴＧ４を鋳型として、一本鎖合成ＤＮＡである配列表の配列番号１３９、１４０をプライマーとしてＰＣＲを行い、増幅されたＤＮＡ断片をｐＵＣ１８の制限酵素ＨｉｎｃＩＩ認識切断部位に組み込み、シークエンスで目的のＤＮＡ断片が増幅された事を確認後、制限酵素ＳａｌＩ、ＳｐｈＩで分解する事によりＤＮＡ断片''を作製した。
更にｐＣＧＴＧ４Ｓを制限酵素ＳａｌＩ、ＳｐｈＩで分解してＤＮＡ断片Ｂ''を作製した。これら２つのＤＮＡ断片を常法通りにＴ４  ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、ｐＣＧＴＧ４Ｓ６Ｈを構築した。その方法の概略を図１８に示した。
このｐＣＧＴＧ４Ｓ６Ｈを公知の方法で大腸菌ＨＢ１０１に導入し、形質転換体Escherichia coliｐＣＧＴＧ４Ｓ６Ｈ／ＨＢ１０１を作製した。
このように作製した形質転換体ｐＣＧＴＧ４Ｓ６Ｈ／ＨＢ１０１からアルカリＳＤＳ法に従いプラスミドｐＣＧＴＧ４Ｓ６Ｈを調製し、アルカリカチオン法酵母形質転換キット（Ｂｉｏ１０１社製）を用いて、酵母Saccharomyces cerevisiaeＩＮＶＳＣ２株（ＭＡＴα、ｈｉｓ３−△２００、ｕｒａ３−１６７）に導入した。
なお、形質転換体の選択には、ヒスチジン５０ｍｇ／ｌを含むグルコース合成最少培地プレート（合成最少培地の組成は０．１７％Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ  Ｗ／Ｏ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  Ａｍｍｏｎｉｕｍ  Ｓｕｌｆａｔｅ（Ｄｉｆｃｏ社製）、０．５％硫安である。これにグルコースを終濃度２％になるよう入れ、２％の寒天で９０ｍｍシャーレに固めたもの）を用いた。こうして形質転換体、Saccharomyces cerevisiaeＩＮＶＳＣ２／ｐＣＧＴＧ４Ｓ６Ｈ  ＡＪ１４６９８を取得した。なお、Saccharomyces cerevisiaeＩＮＶＳＣ２／ｐＣＧＴＧ４Ｓ６Ｈ  ＡＪ１４６９８は生命研に寄託されており、その寄託番号はＦＥＲＭ  ＢＰ−４９６０である。
この形質転換体を、まず５０ｍｌのグルコース合成最少培地（上記合成最少培地に２％のグルコース、ヒスチジン５０ｍｇ／ｌを入れたもの）や入れた坂口フラスコに接種し、３０℃にて２４時間振とう培養して菌体量を増やした。その後、菌体を遠心集菌し、菌体を５０ｍｌのガラクトース合成最少培地（上記合成最少培地に２％のガラクトースを入れたもの）を入れた坂口フラスコに懸濁し、３０℃にて２４時間振とう培養して、ＧＡＬ１プロモーターからの転写を誘導した。
同様に上記プラスミドを含まないSaccharomyces cerevisiaeＩＮＶＳＣ２株も上記グルコース、ガラクトース合成最少培地にウラシル５０ｍｇ／ｌを更に添加した培地を用いて培養した。
培養後、培養液５０ｍｌ中の菌体を遠心集菌し、バッファーＡ（６Ｍグアニジン塩酸、０．１Ｍリン酸二水素ナトリウム、０．０１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）に懸濁した。この菌体懸濁液１ｍｌを１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに入れ、さらに０．５ｍｌ容のガラスビーズ（直径０．５ｍｍ）を加えて２分間強く撹拌処理して菌体を破砕した。その後、１５０００ｒｐｍで２分間遠心し、得られた上清を予めバッファーＢ（８Ｍ尿素、０．１Ｍリン酸二水素ナトリウム、０．０１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）で平衡化しておいたＮｉ−ＮＴＡ（Ｎｉｔｒｉｌｏ−Ｔｒｉ−Ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）カラム（Ｑｕｉａｇｅｎ社製）に通した。カラムをバッファーＣ（８Ｍ尿素、０．１Ｍリン酸二水素ナトリウム、０．０１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ６．３）で洗浄後、樹脂に吸着された組換え蛋白質をバッファーＥ（８Ｍ尿素、０．１Ｍリン酸二水素ナトリウム、０．０１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ４．５）で溶出し、組換え蛋白質の精製品を得た。
上記の如く精製した組換え型マガキトランスグルタミナーゼをＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）に吸着させ、そのままプロテインシークエンサー（ＰＰＳＱ−１０島津製作所製）に供した。その結果、Ｎ末端よりAla-Phe-Trp-Gly-Val-Phe-Tyrというアミノ酸残基であることが分かった。即ち、酵母菌体内で発現している組換え型マガキトランスグルタミナーゼは、ｃＤＮＡより予想されるアミノ酸配列から、開始コドンであるメチオニンが除去された形であった。
なお、Saccharomyces cerevisiaeＩＮＶＳＣ２／ｐＣＧＴＧ４Ｓ６Ｈ  ＡＪ１４６９８（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４９６０）の菌体破砕液にトランスグルタミナーゼ活性があることは実施例１１と同様の方法にて確認した。
マガキは古来より人類にとって親しみ深い食物であり、世界各地で生食されてきたが、そのマガキより新規なトランスグルタミナーゼの単離に成功した。そしてマガキ由来のトランスグルタミナーゼは、活性発現のためのＣａ2+要求性が大きく異なり、さらにＮａＣｌによりその活性が影響を受ける等、独特の性質を持っていることを見いだした。
これは従来知られている他のトランスグルタミナーゼと比べて、全く新規な性質であり、この性質を利用した酵素活性の調節による反応産物の性状の制御が可能となり、産業上のトランスグルタミナーゼの利用範囲を大きく広げるものとなり得る。
更にその供給の確立のためマガキのトランスグルタミナーゼをコードする遺伝子の取得し、大腸菌、酵母において遺伝子組換え型トランスグルタミナーゼの発現に成功した。このことにより高価なマガキそのものを原材料とせずにマガキのトランスグルタミナーゼを大量生産することが可能となった。さらに、該産生酵素の特性を生かして、食品蛋白質の物性改善、栄養価改善の他、医薬品や化成品への応用等、これまで以上にトランスグルタミナーゼが産業上重要なものとなることが期待される。
配列表
配列番号：1
配列の長さ：770
配列の型：Ｄアミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：蛋白質
起源
生物名：マガキ(Crassostorea gigas)
配列
0003758187.tif 000009
0003758187.tif 000010
0003758187.tif 000011
0003758187.tif 000012
配列番号：2
配列の長さ：2310
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：cDNA to mRNA
起源
生物名：マガキ(Crassostrea gigas)
配列の特徴
特徴を表す記号：CDS
存在位置：1..2310
特徴を決定した方法：E
0003758187.tif 000013
0003758187.tif 000014
0003758187.tif 000015
配列番号：3
配列の長さ：771
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：蛋白質
起源
生物名：マガキ(Crassostrea gigas)
配列
0003758187.tif 000016
0003758187.tif 000017
0003758187.tif 000018
0003758187.tif 000019
配列番号：4
配列の長さ：2313
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：cDNA to mRNA
起源
生物名：マガキ(Crassostorea gigas)
配列の特徴
特徴を表す記号：CDS
存在位置：1..2054
特徴を決定した方法：E
0003758187.tif 000020
0003758187.tif 000021
0003758187.tif 000022
配列番号：5
配列の長さ：21
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列の特徴：９番目のＮはデオキシイノシンを表す
配列
0003758187.tif 000023
配列番号：6
配列の長さ：21
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列の特徴：９番目のＮはデオキシイノシンを表す
配列
0003758187.tif 000024
配列番号：7
配列の長さ：21
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列の特徴：９番目のＮはデオキシイノシンを表す
配列
0003758187.tif 000025
配列番号：8
配列の長さ：21
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列の特徴：９番目のＮはデオキシイノシンを表す
配列
0003758187.tif 000026
配列番号：9
配列の長さ：21
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列の特徴：９番目のＮはデオキシイノシンを表す
配列
0003758187.tif 000027
配列番号：10
配列の長さ：21
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列の特徴：９番目のＮはデオキシイノシンを表す
配列
0003758187.tif 000028
配列番号：11
配列の長さ：21
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列の特徴：９番目のＮはデオキシイノシンを表す
配列
0003758187.tif 000029
配列番号：12
配列の長さ：21
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列の特徴：９番目のＮはデオキシイノシンを表す
配列
0003758187.tif 000030
配列番号：13
配列の長さ：21
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列の特徴：９番目のＮはデオキシイノシンを表す
配列
0003758187.tif 000031
配列番号：14
配列の長さ：21
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列の特徴：９番目のＮはデオキシイノシンを表す
配列
0003758187.tif 000032
配列番号：15
配列の長さ：21
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列の特徴：９番目のＮはデオキシイノシンを表す
配列
0003758187.tif 000033
配列番号：16
配列の長さ：21
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列の特徴：９番目のＮはデオキシイノシンを表す
配列
0003758187.tif 000034
配列番号：17
配列の長さ：21
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列の特徴：９番目のＮはデオキシイノシンを表す
配列
0003758187.tif 000035
配列番号：18
配列の長さ：21
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列の特徴：９番目のＮはデオキシイノシンを表す
配列
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配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列の特徴：９番目のＮはデオキシイノシンを表す
配列
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配列番号：20
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配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列の特徴：９番目のＮはデオキシイノシンを表す
配列
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配列の型：核酸
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配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列の特徴：９番目のＮはデオキシイノシンを表す
配列
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配列
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配列
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配列
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配列の型：核酸
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配列
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配列の型：核酸
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配列
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配列
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配列
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配列
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配列の型：核酸
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配列の特徴：９番目のＮはデオキシイノシンを表す
配列
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配列の型：核酸
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配列の特徴：９番目のＮはデオキシイノシンを表す
配列
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配列
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配列
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配列の型：核酸
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配列
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配列の型：核酸
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配列
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配列の型：核酸
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配列
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配列の型：核酸
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配列
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配列
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配列
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配列
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配列
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配列の型：核酸
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配列の特徴：９番目のＮはデオキシイノシンを表す
配列
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配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
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配列の特徴：９番目のＮはデオキシイノシンを表す
配列
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配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
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配列
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配列の型：核酸
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配列
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配列の特徴：９番目のＮはデオキシイノシンを表す
配列
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配列の型：核酸
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配列の特徴：９番目のＮはデオキシイノシンを表す
配列
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配列の型：核酸
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配列
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配列
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配列
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配列
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配列
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配列
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配列
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配列
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配列
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配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
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配列
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配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列の特徴：９番目のＮはデオキシイノシンを表す
配列
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配列の長さ：21
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列の特徴：９番目のＮはデオキシイノシンを表す
配列
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配列番号：66
配列の長さ：21
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列の特徴：９番目のＮはデオキシイノシンを表す
配列
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配列番号：67
配列の長さ：21
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列の特徴：９番目のＮはデオキシイノシンを表す
配列
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配列番号：68
配列の長さ：21
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列の特徴：９番目のＮはデオキシイノシンを表す
配列
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配列番号：69
配列の長さ：21
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列の特徴：３番目のＮはデオキシイノシンを表す
配列
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配列番号：70
配列の長さ：21
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列の特徴：３番目のＮはデオキシイノシンを表す
配列
0003758187.tif 000088
配列番号：71
配列の長さ：21
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列の特徴：３番目のＮはデオキシイノシンを表す
配列
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配列番号：72
配列の長さ：21
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列の特徴：３番目のＮはデオキシイノシンを表す
配列
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配列番号：73
配列の長さ：21
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列の特徴：３番目のＮはデオキシイノシンを表す
配列
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配列番号：74
配列の長さ：21
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列の特徴：３番目のＮはデオキシイノシンを表す
配列
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配列番号：75
配列の長さ：21
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列の特徴：３番目のＮはデオキシイノシンを表す
配列
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配列番号：76
配列の長さ：21
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列の特徴：３番目のＮはデオキシイノシンを表す
配列
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配列番号：77
配列の長さ：21
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列の特徴：３番目のＮはデオキシイノシンを表す
配列
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配列番号：78
配列の長さ：21
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列の特徴：３番目のＮはデオキシイノシンを表す
配列
0003758187.tif 000096
配列番号：79
配列の長さ：21
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列の特徴：３番目のＮはデオキシイノシンを表す
配列
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配列番号：80
配列の長さ：21
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列の特徴：３番目のＮはデオキシイノシンを表す
配列
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配列の長さ：21
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
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配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列の特徴：３番目のＮはデオキシイノシンを表す
配列
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配列番号：82
配列の長さ：21
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
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配列
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配列の長さ：21
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列の特徴：３番目のＮはデオキシイノシンを表す
配列
0003758187.tif 000101
配列番号：84
配列の長さ：21
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列の特徴：３番目のＮはデオキシイノシンを表す
配列
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配列番号：85
配列の長さ：21
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列の特徴：３番目のＮはデオキシイノシンを表す
配列
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配列番号：86
配列の長さ：21
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列の特徴：３番目のＮはデオキシイノシンを表す
配列
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配列番号：87
配列の長さ：21
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列の特徴：３番目のＮはデオキシイノシンを表す
配列
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配列番号：88
配列の長さ：21
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列の特徴：３番目のＮはデオキシイノシンを表す
配列
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配列番号：89
配列の長さ：21
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列の特徴：３番目のＮはデオキシイノシンを表す
配列
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配列番号：90
配列の長さ：21
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列の特徴：３番目のＮはデオキシイノシンを表す
配列
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配列番号：91
配列の長さ：21
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列の特徴：３番目のＮはデオキシイノシンを表す
配列
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配列番号：92
配列の長さ：21
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列の特徴：３番目のＮはデオキシイノシンを表す
配列
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配列番号：93
配列の長さ：21
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列の特徴：３番目のＮはデオキシイノシンを表す
配列
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配列番号：94
配列の長さ：21
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列の特徴：３番目のＮはデオキシイノシンを表す
配列
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配列番号：95
配列の長さ：21
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列の特徴：３番目のＮはデオキシイノシンを表す
配列
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配列番号：96
配列の長さ：21
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
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配列の長さ：21
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
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配列
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配列番号：98
配列の長さ：21
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
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配列
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トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列の特徴：３番目のＮはデオキシイノシンを表す
配列
0003758187.tif 000117
配列番号：100
配列の長さ：21
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列の特徴：３番目のＮはデオキシイノシンを表す
配列
0003758187.tif 000118
配列番号：101
配列の長さ：21
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列の特徴：３番目のＮはデオキシイノシンを表す
配列
0003758187.tif 000119
配列番号：102
配列の長さ：21
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列の特徴：３番目のＮはデオキシイノシンを表す
配列
0003758187.tif 000120
配列番号：103
配列の長さ：21
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列の特徴：３番目のＮはデオキシイノシンを表す
配列
0003758187.tif 000121
配列番号：104
配列の長さ：21
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列の特徴：３番目のＮはデオキシイノシンを表す
配列
0003758187.tif 000122
配列番号：105
配列の長さ：21
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列の特徴：３番目のＮはデオキシイノシンを表す
配列
0003758187.tif 000123
配列番号：106
配列の長さ：21
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列の特徴：３番目のＮはデオキシイノシンを表す
配列
0003758187.tif 000124
配列番号：107
配列の長さ：21
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列の特徴：３番目のＮはデオキシイノシンを表す
配列
0003758187.tif 000125
配列番号：108
配列の長さ：21
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列の特徴：３番目のＮはデオキシイノシンを表す
配列
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配列番号：109
配列の長さ：21
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列の特徴：３番目のＮはデオキシイノシンを表す
配列
0003758187.tif 000127
配列番号：110
配列の長さ：21
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列の特徴：３番目のＮはデオキシイノシンを表す
配列
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配列番号：111
配列の長さ：21
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列の特徴：３番目のＮはデオキシイノシンを表す
配列
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配列番号：112
配列の長さ：21
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列の特徴：３番目のＮはデオキシイノシンを表す
配列
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配列番号：113
配列の長さ：21
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列の特徴：３番目のＮはデオキシイノシンを表す
配列
0003758187.tif 000131
配列番号：114
配列の長さ：21
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列の特徴：３番目のＮはデオキシイノシンを表す
配列
0003758187.tif 000132
配列番号：115
配列の長さ：21
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列の特徴：３番目のＮはデオキシイノシンを表す
配列
0003758187.tif 000133
配列番号：116
配列の長さ：21
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列の特徴：３番目のＮはデオキシイノシンを表す
配列
0003758187.tif 000134
配列番号：117
配列の長さ：21
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列の特徴：３番目のＮはデオキシイノシンを表す
配列
0003758187.tif 000135
配列番号：118
配列の長さ：21
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列の特徴：３番目のＮはデオキシイノシンを表す
配列
0003758187.tif 000136
配列番号：119
配列の長さ：21
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列の特徴：３番目のＮはデオキシイノシンを表す
配列
0003758187.tif 000137
配列番号：120
配列の長さ：21
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列の特徴：３番目のＮはデオキシイノシンを表す
配列
0003758187.tif 000138
配列番号：121
配列の長さ：21
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列の特徴：３番目のＮはデオキシイノシンを表す
配列
0003758187.tif 000139
配列番号：122
配列の長さ：21
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列の特徴：３番目のＮはデオキシイノシンを表す
配列
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配列番号：123
配列の長さ：21
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列の特徴：３番目のＮはデオキシイノシンを表す
配列
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配列番号：124
配列の長さ：21
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列の特徴：３番目のＮはデオキシイノシンを表す
配列
0003758187.tif 000142
配列番号：125
配列の長さ：21
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列の特徴：３番目のＮはデオキシイノシンを表す
配列
0003758187.tif 000143
配列番号：126
配列の長さ：21
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列の特徴：３番目のＮはデオキシイノシンを表す
配列
0003758187.tif 000144
配列番号：127
配列の長さ：21
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列の特徴：３番目のＮはデオキシイノシンを表す
配列
0003758187.tif 000145
配列番号：128
配列の長さ：21
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列の特徴：３番目のＮはデオキシイノシンを表す
配列
0003758187.tif 000146
配列番号：129
配列の長さ：21
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列の特徴：３番目のＮはデオキシイノシンを表す
配列
0003758187.tif 000147
配列番号：130
配列の長さ：21
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列の特徴：３番目のＮはデオキシイノシンを表す
配列
0003758187.tif 000148
配列番号：131
配列の長さ：21
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列の特徴：３番目のＮはデオキシイノシンを表す
配列
0003758187.tif 000149
配列番号：132
配列の長さ：21
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列の特徴：３番目のＮはデオキシイノシンを表す
配列
0003758187.tif 000150
配列番号：133
配列の長さ：325
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：cDNA to mRNA
起源
生物名：マダイ(Pagrus major)
組織の種類：肝臓
配列の特徴
特徴を表す記号：CDS
存在位置：1..325
特徴を決定した方法：E
配列
0003758187.tif 000151
配列番号：134
配列の長さ：1345
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：cDNA to mRNA
起源
生物名：モルモット(Cavia porecllus)
組織の種類：肝臓
配列の特徴
特徴を表す記号：CDS
存在位置：1..1345
特徴を決定した方法：E
配列
0003758187.tif 000152
0003758187.tif 000153
配列番号：135
配列の長さ：29
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
起源
生物名：モルモット(Cavia porecllus)
組織の種類：肝臓
配列
0003758187.tif 000154
配列番号：136
配列の長さ：3394
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：cDNA to mRNA
起源
生物名：マガキ(Crassostrea gigas)
配列の特徴
特徴を表す記号：CDS
存在位置：305..2617
存在を決定した方法：E
0003758187.tif 000155
0003758187.tif 000156
0003758187.tif 000157
0003758187.tif 000158
0003758187.tif 000159
0003758187.tif 000160
0003758187.tif 000161
0003758187.tif 000162
0003758187.tif 000163
配列番号：137
配列の長さ：18
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列
0003758187.tif 000164
配列番号：138
配列の長さ：18
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列
0003758187.tif 000165
配列番号：139
配列の長さ：41
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列
0003758187.tif 000166
配列番号：140
配列の長さ：18
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列
0003758187.tif 000167
配列番号：141
配列の長さ：7
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源
生物名：マガキ(Crassostrea gigas)
配列
0003758187.tif 000168
配列番号：142
配列の長さ：7
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源
生物名：マガキ(Crassostrea gigas)
配列
0003758187.tif 000169
【図１】
0003758187.tif 000170
【図２】
0003758187.tif 000171
【図３】
0003758187.tif 000172
【図４】
0003758187.tif 000173
【図５】
0003758187.tif 000174
【図６】
0003758187.tif 000175
【図７】
0003758187.tif 000176
【図８】
0003758187.tif 000177
【図９】
0003758187.tif 000178
【図１０】
0003758187.tif 000179
【図１１】
0003758187.tif 000180
【図１２】
0003758187.tif 000181
【図１３】
0003758187.tif 000182
【図１４】
0003758187.tif 000183
【図１５】
0003758187.tif 000184
【図１６】
0003758187.tif 000185
【図１７】
0003758187.tif 000186
【図１８】
0003758187.tif 000187