(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトから採取した試料中に含まれるゲノムＤＮＡから、アポリポプロテインＥ遺伝子の遺伝子多型を分析し、ビタミンＫ２の骨粗鬆症治療効果の度合いが高いヒト由来の試料であることを予測する方法であって、
前記アポリポプロテインＥ遺伝子の遺伝子多型は、Ｅ２／２、Ｅ２／３、Ｅ２／４、Ｅ３／３、Ｅ３／４またはＥ４／４であり、
Ｅ３／３、Ｅ２／３またはＥ３／４である試料は、Ｅ２／２、Ｅ２／４またはＥ４／４である試料よりもビタミンＫ２に対する感受性が高いヒト由来の試料である
と予測するビタミンＫ２感受性予測方法。
【請求項２】
Ｅ３／３である試料が、ビタミンＫ２の骨粗鬆症治療効果の度合いが最も高いヒト由来の試料であると予測する請求項１に記載のビタミンＫ２感受性予測方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はビタミンＫ２感受性予測方法に関し、特にヒトから採取した試料中に含まれるゲノムＤＮＡから、アポリポプロテインＥ（以下、ＡｐｏＥ）遺伝子の遺伝子多型を分析し、その結果から、該試料が、ビタミンＫ２に対する感受性において特定の優先性を示すヒト由来のものであるかどうかを予測する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、高齢者、特に閉経後の女性において、骨粗鬆症の発生が問題となっている。その患者数は、高齢化に伴い、既に約１０００万人を越えたとも言われ、その発症により、骨折あるいは寝たきりへとつながるため、重大な社会問題のひとつとなっている。
このような骨粗鬆症に関して、現在、治療薬としては、カルシウム製剤、ビタミンＤ３、ビタミンＫ２、エストロゲンなどの種々の薬剤が用いられている。しかし、その治療効果は患者の体質によって、それぞれ異なり、これらの薬剤をどのように使い分けるかについては、現在のところ、正確な検討はほとんどされていない。
【０００３】
また、骨粗鬆症の治療は、患者には高齢者が多く、治療も長期に渡るため、単剤投与が原則とされている。しかし、投与する治療薬が効果的であるかを調べる方法は、現在のところ、実際に数年間、患者に該薬剤を投与して、その結果を見て判断するより方法がなく、きわめて非効率的であり、効果のない治療薬を用いた場合には、患者のＱＯＬ（Quality of Life）を損なうこととなる。
【０００４】
骨粗鬆症に関する治療法、治療薬の研究は近年、盛んであり、それにつれて、治療薬と体質（遺伝的要因）に関する研究もすすめられている。たとえば、骨粗鬆症と遺伝的要因の研究としては、N.A.MorrisonらによるビタミンＤ受容体遺伝子多型の研究（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:6665-6669,1992）を皮切りとして、多くの研究が行われている。
【０００５】
本発明者らは既に、ビタミンＤ受容体遺伝子、ＡｐｏＥ遺伝子およびエストロゲン遺伝子が、骨粗鬆症のビタミンＤ治療、ビタミンＫ２治療およびエストロゲン治療の治療効果と関係があることを見いだした（1997年、骨代謝学会、要旨集第52頁）。また、ＡｐｏＥ遺伝子に関しては、ＡｐｏＥ遺伝子の遺伝子多型に４型を含む群（４／４、３／４、２／４型）は、４型を含まない群（２／２、２／３、３／３）に対して、ビタミンＫ２に対する反応が有意に低かったことを発表している（Osteoporosis Japan、第５巻、第２号、第187〜191頁、1997年）
【０００６】
【発明が解決しようとしている課題】
本発明の目的は、骨粗鬆症患者もしくは将来、骨粗鬆症を発症する可能性のあるヒトが、ビタミンＫ２に対して、いかなる感受性を有するかを予測する手段を提供することであり、それによって、患者のＱＯＬを向上させることである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記目的を達成するために種々鋭意検討を重ねた結果、ヒト由来の試料から得たゲノムＤＮＡを、ＡｐｏＥ遺伝子の遺伝子型について分析することにより、得られた遺伝子型に基づいて、ビタミンＫ２に対して、いかなる感受性をもつヒト由来の検体であるかを予測可能であることを見いだした。すなわち、本発明者らは、ＡｐｏＥ遺伝子の遺伝子多型がＥ３／４型である場合も、ビタミンＫ２に対する感受性が高い傾向を示すことを見い出した。このことより、これまで発表されたＡｐｏＥ遺伝子の４型（Ｅ２／４、Ｅ３／４、Ｅ４／４型）を有する場合が、ビタミンＫ２感受性が低いのではなく、ＡｐｏＥ遺伝子の３型遺伝子を有さない場合（Ｅ２／２、Ｅ２／４、Ｅ４／４型）が、ビタミンＫ２感受性が低いのであり、ＡｐｏＥ遺伝子の３型（Ｅ２／３、Ｅ３／３、Ｅ３／４型）遺伝子を有する場合が、ビタミンＫ２感受性が高く、さらに、３型遺伝子多型のホモ・タイプであるＥ３／３型の場合に、最も感受性が高くなる傾向を示すことを見いだし、本発明に到達した。
【０００８】
すなわち、本発明はヒトから採取した試料中に含まれるゲノムＤＮＡから、アポリポプロテインＥ遺伝子の遺伝子多型を分析し、該試料がビタミンＫ２に対する感受性において特定の優先性を示すヒト由来のものであると予測するビタミンＫ２感受性予測方法である。
【０００９】
また、前記アポリポプロテインＥ遺伝子の遺伝子多型は、Ｅ２／２、Ｅ２／３、Ｅ２／４、Ｅ３／３、Ｅ３／４またはＥ４／４であり、Ｅ３／３である試料はビタミンＫ２に対する感受性が非常に高いヒト由来のものであり、Ｅ２／３またはＥ３／４である試料はビタミンＫ２に対する感受性が高いヒト由来のものであり、およびＥ２／２、Ｅ２／４またはＥ４／４である試料はビタミンＫ２に対する感受性が低いまたはほとんど有さないヒト由来の試料であると予測する上記ビタミンＫ２感受性予測方法である。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明において、アポリポプロテインＥ（以下、ＡｐｏＥ）とは、リポプロテインの粒子の構造を維持、安定化する機能および脂質代謝の補助因子としての機能を有する、２９９個のアミノ酸残基からなる、分子量約３４，２００の蛋白質である。該蛋白質は末梢から肝臓へのコレステロールの逆輸送系に重要な役割を果たしている。該ＡｐｏＥをコードする遺伝子は、ヒト第１９染色体上に存在して、４つのエクソンと３つのイントロンからなる。該遺伝子には、２、３、４の３つの遺伝子型が存在する。該ＡｐｏＥは、古くから２型蛋白質がIII型高脂血症の原因であることが判明しており、近年、４型蛋白質がアルツハイマー型痴呆の発症との関連を言われいている。また、最近は、骨量などとの関係も言われるようになった（特開平9-299337号公報）。
【００１１】
また、ＡｐｏＥ遺伝子には、主に３つの遺伝子型（遺伝子多型、２型、３型および４型）が存在しており、１１２番目のアミノ酸をシステイン、１５８番目のアミノ酸をアルギニンとコードしている遺伝子を３型もしくは野生型とよび、１１２番目のアミノ酸をアルギニンとコードしている遺伝子を４型、１５８番目のアミノ酸をシステインとコードしている遺伝子を２型とよぶ。
【００１２】
本発明において、ＡｐｏＥ遺伝子の遺伝子型（遺伝子多型）とは、２本鎖ＤＮＡが有する遺伝子多型から、Ｅ２／２、Ｅ２／３、Ｅ２／４、Ｅ３／３、Ｅ３／４またはＥ４／４の６種である。
【００１３】
本発明に供されるヒト由来試料とは、ヒトゲノムＤＮＡを含有するものであれば、特に限定されない。好ましくは、全血や分画された血球細胞、表皮細胞や毛髪などの入手が容易な細胞や組織などが用いられる。この場合、細胞を破砕した上で、フェノール、クロロホルム、イソアミルアルコール混合溶液などによる慣用法によってＤＮＡの抽出を行い、遺伝子多型検出の試料とする。
【００１４】
本発明の遺伝子多型の分析方法は、ＡｐｏＥ遺伝子の遺伝子多型を区別し得る方法であれば、特に制限されず、各種のハイブリダイゼーション法、シークエンス法、ＲＦＬＰ法などの通常のＤＮＡの検出、分析法を利用することが出来る。また、ＡｐｏＥ蛋白質を含む試料から、等電点電気泳動などの方法により、ＡｐｏＥ蛋白質の表現形を検出し、そこからＡｐｏＥ遺伝子の遺伝子多型を検出することも可能である。
【００１５】
上記分析方法として、例えば、リバース・ハイブリダイゼーション法では、ヒトゲノムＤＮＡより選択的にＡｐｏＥ遺伝子を標識プライマーでＰＣＲで増幅した後、増幅ＤＮＡを担体上に固定化された各遺伝子型に対応した捕捉プローブとハイブリダイズさせ、該ハイブリダイズした増幅ＤＮＡの標識を検出することにより、遺伝子多型を分析する。
また、例えばＰＣＲ−ＲＦＬＰ法では、ヒトゲノムＤＮＡより選択的にＡｐｏＥ遺伝子を増幅した後、制限酵素HhaIによって制限酵素処理を行い、その後に電気泳動をおこない、検出されたバンド・パターンによってＡｐｏＥ遺伝子の遺伝子多型を分析することが出来る。
また、ＰＣＲ後に各種のＤＮＡ塩基解析装置（シークエンサー）を用いて、増幅ＤＮＡの塩基配列を解析し、その結果よりＡｐｏＥ遺伝子の遺伝子多型を分析することもできる。
【００１６】
本発明において、ビタミンＫ２とは脂溶性のビタミンであるビタミンＫの一種であり、オステオカルシンのGla化を促進して骨形成を促進し、破骨細胞の形成を抑制して骨吸収を抑制していると考えられている。また、ここでビタミンＫ２に対する感受性とは、該治療薬の骨粗鬆症治療効果の度合いの大きさを意味する。本発明においては、薬剤投与前と投与後（6ヶ月から数年後）の腰椎骨密度の変化率を比較し、その増大率が大きい（もしくは減少率が少ない）程、薬剤感受性が高いと定義する。すなわち、ビタミンＫ２に対する感受性において、「非常に高い」とは、腰椎骨密度の変化率が投与６ヶ月後において、＋０．５％を越える場合をいい、また、「高い」とは、投与６ヶ月後の腰椎骨密度の変化率が正である場合をいい、さらに、「低いまたはほとんど有さない」とは、投与６ヶ月後の腰椎骨密度の変化率が−１％以下である場合を言う。
【００１７】
【実施例】
以下、参考例および実施例を用いて本発明を詳細に説明する。
参考例１
無作為に選んだ原発性骨粗鬆症患者１０１人より血液を採取し、血球細胞を分画して、常法によりゲノムＤＮＡを抽出精製した。該ゲノムＤＮＡを鋳型として下記のプライマー対を用いてＡｐｏＥ遺伝子断片をＰＣＲ法で増幅したのちに、制限酵素HhaIを用いたＲＦＰＬで、ＡｐｏＥ遺伝子の遺伝子多型を検出した（Restriction isotyping of human apolipoprotein E by gene amplification and cleavage with HhaI, James E.Hixson et al. Journal of Lipid Research vol.31,1990 page.545の方法に従った）。
ＡｐｏＥ遺伝子断片増幅用プライマー
forward:  5'-TAAGCTTGGCACGGCTGTCCAAGGA-3'  （配列番号１）
reverse:  5'-ACAGAATTCGCCCCGGCCTGGTACAC-3'  （配列番号２）
増幅条件は、変性:９５℃、1分、アニーリング:６０℃、１分、伸張:７２℃、２分（30サイクル）で行った。
【００１８】
この増幅法により、多型部位を含む２４４ｂｐのＡｐｏＥ遺伝子断片が増幅された。これを制限酵素HhaIで処理した後、ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動にかけた。電気泳動終了後にエチジウムブロマイドでゲルを染色し、バンド・パターンよりＡｐｏＥ遺伝子の遺伝子多型を判別した。
2/2型 16,18,38,81,91bp
2/3型 16,18,33,38,48,81,91bp
2/4型 16,18,19,33,38,48,72,81,91bp
3/3型 16,18,33,38,48,91bp
3/4型 16,18,19,33,38,48,72,91bp
4/4型 16,18,19,33,38,48,72bp
【００１９】
ＡｐｏＥ遺伝子の遺伝子型３型の数に従って、3/3型をＡｐｏＥ３+/+型、2/3、3/4型をＡｐｏＥ３+/-型、2/2、2/4、4/4型をＡｐｏＥ３-/-と分類する。
上記１０１人のうち、ＡｐｏＥ３+/+型であった者は７９人、ＡｐｏＥ３+/-型であった者は１８人、ＡｐｏＥ３-/-型であった者は４人であった。
【００２０】
上記のようにして遺伝子多型分析を行った１０１人の腰椎骨密度を測定した。これらの患者には、ビタミンＫ２を４５ｍｇ/日、２年間以上投与した。ほぼ６ヶ月、１年後、２年後に腰椎骨密度を測定し、骨密度の変化率を求めた。これとは別に、骨粗鬆症治療薬を何も投与しなかった患者４３人について、コントロール群として同様に６ヶ月後の骨密度の変化を測定した。その骨密度の変化率の平均値は、−１．５８％であった。その結果を表１および図１に示す。
【００２１】
【表１】
0003831935.tif 000002
表中の数字は、腰椎骨密度の変化率の平均値（％）を示し、かっこ内はその標準偏差を示す。
【００２２】
上記表１および図１より明らかなように、ＡｐｏＥ遺伝子の遺伝子多型が３型を含む３／３、２／３、３／４型の場合は、３型を含まない２／２、２／４、４／４型に比べて、明らかに骨密度の変化率が高く、ビタミン感受性が高かった。また、３型を２つ含む３／３型の場合が最も感受性が高かった。３型を含まない２／２、２／４、４／４型の場合、その骨塩変化率は治療を行わなかったコントロール群とほぼ同じであり、これらの遺伝子多型の場合、ビタミンＫ２に対する感受性がほとんどなく、ビタミンＫ２が骨粗鬆症治療薬としてほとんど機能していないことが示された。
【００２３】
実施例１
ある日本人の骨粗鬆症と診断された患者から血液を採取し、血球細胞を分画して、常法によりゲノムＤＮＡを抽出精製する。該ゲノムＤＮＡを鋳型とし、参考例１と同様の方法で、ＡｐｏＥ遺伝子の多型を分析する。得られた遺伝子多型がＥ２／２、Ｅ２／３、Ｅ２／４、Ｅ３／３、Ｅ３／４またはＥ４／４であり、Ｅ３／３である試料はビタミンＫ２に対する感受性が非常に高いヒト由来のものであり、Ｅ２／３またはＥ３／４である試料はビタミンＫ２に対する感受性が高いヒト由来のものであり、およびＥ２／２、Ｅ２／４またはＥ４／４である試料はビタミンＫ２に対する感受性が低いまたはほとんど有さないヒト由来の試料であると予測する。
【００２４】
【発明の効果】
本発明によれば、ビタミンＫ２投薬前に、対象となる患者がビタミンＫ２に対して高い感受性をもっているかどうかを高確率で予測することができる。したがって、その治療薬を投与すべきか、別の治療薬を投与すべきかについて適切な判断をする上で、非常に役立つ指針となり、治療効果の低い薬剤を長期投与することを回避でき、患者のＱＯＬを向上する上できわめて有用である。
【００２５】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  アポリポプロテインＥ遺伝子の遺伝子多型とビタミンＫ２治療に対する応答を示す図である。図中、ＬＢＭＤは腰椎骨塩量変化を示す。
【図１】
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