(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
鏡像異性体を含む流体溶液から当該鏡像異性体を分離する方法であって、
（ａ）前記鏡像異性体を含む流体を大環状抗生物質で処理し、前記鏡像異性体を個々に分離するステップ、ここで、前記大環状抗生物質は、アンサマクロライド、マクロライド、ポリエン及びそれらの誘導体からなるグループから選択されるか、又はスポリデスモライド、カプレオマイシン、シクロスポリン、チロシジン、トリオスチン、グラミシジン、ポリミキシン、バシトラシン、オクタペプチン、アクチノマイシン、エタマイシン、ベルナマイシン、エンニアチン、バリノマイシン、チオストレプトン、アプラスモマイシン、ボロマイシン、エンテロバクチン及びベベーリンからなる抗生物質から選択される；並びに
（ｂ）前記鏡像異性体を回収するステップ
を含む方法。
【請求項２】
前記処理ステップが、晶化法、析出法、濾過法、電気泳動法、及びクロマトグラフィー法からなるグループから選択される方法によって行われる、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記方法が、晶化法または析出法であり、前記処理ステップが、結晶化または析出を起こす効果的な量の前記大環状抗生物質を前記流体に加えることを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記方法が、膜濾過法、電気泳動法、クロマトグラフィー法であり、前記大環状抗生物質は基材に固着され、前記処理ステップが、前記基材に固着した前記大環状抗生物質に前記流体を接触させることを含む、請求項２記載の方法。
【請求項５】
前記方法が、電気泳動法またはクロマトグラフィー法であり、前記処理ステップが、移動相添加剤として前記大環状抗生物質を加えることを含む、請求項２記載の方法。
【請求項６】
処理ステップが、クロマトグラフィー分離工程を用いて行われ、前記鏡像異性体の混合物は、基材に固着されて固定相として作用する前記大環状抗生物質を含むカラムから溶出するものである、請求項４記載の方法。
【請求項７】
処理ステップが、前記鏡像異性体の混合物を、機器で分離する電気泳動を用いて行われ、前記機器では、前記大環状抗生物質は基材に固着され、固定相として作用する、請求項４記載の方法。
【請求項８】
鏡像異性体混合物を個々の鏡像異性体に分離するための、基材に固着した大環状抗生物質を含む分離材料であって、
ここで、前記大環状抗生物質は、アンサマクロライド、マクロライド、ポリエン及びそれらの誘導体からなるグループから選択されるか、又はスポリデスモライド、カプレオマイシン、シクロスポリン、チロシジン、トリオスチン、グラミシジン、ポリミキシン、バシトラシン、オクタペプチン、アクチノマイシン、エタマイシン、ベルナマイシン、エンニアチン、バリノマイシン、チオストレプトン、アプラスモマイシン、ボロマイシン、エンテロバクチン及びベベーリンからなる抗生物質から選択される、材料。
【請求項９】
基材が、シリカゲル、アルミナ、ポリスチレン、ポリウレタン、ポリビニルアルコール、ポリアミド、アガロース、セルロース、デキストラン、及び線状／分岐アミロースからなるグループから選択される請求項８記載の分離材料。
【請求項１０】
前記大環状抗生物質が、前記基材に化学的に結合している請求項９記載の分離材料。
【発明の詳細な説明】
本発明は大環状の抗生物質の新規な使用法、とくに流体（例えば気体や液体など）から特定の化合物を分離する効果を示す大環状抗生物質の新規な使用法に関する。本発明の大環状抗生物質は異性体、とくに光学異性体を分離するためのクロマトグラフィ−法や電気泳動法に用いる固定相、移動相、または液添加剤として有用である。
抗生物質は微生物から産生される化学化合物類で、希薄溶液中でバクテリアや他の微生物を破壊したりその成長を阻害したりする。今日ではある種の抗生物質は合成されている。化学的に抗生物質は種々の構造を持ち、いろいろな化合物のグル−プに属する。一般的に抗生物質物質には化学名、一般名、商品名の三つの名前がある。たとえば、一般名テトラサイクリンの化学名は４−ジメチルアミノ−1,4,4a,5,5a,6,11,12a−オクタヒドロ−3,6,10,12,12a−ペンタヒドロキシ−６メチル−1,11−ジオキソ−２−ナフトセンカルボキサマイドであり、商品名パンマイシン（Panmycin）またはテトラシン（Tetracyn）として売られている。一般に、一般名がよく用いられていて明細書と請求項では一般名を用いることとする。流体から個々の成分または化学化合物の分離するのにはいろいろな方法が利用されている。これらの方法には蒸留、抽出、晶化、析出、濾過、電気泳動、そして種々のクロマトグラフィ−がある。
晶化法や析出法では、流体から化合物を固形物として除去することを補助するための試薬を加えるバッチ法でしばしば行われる。一般的には固形物は流体の底に沈澱するかまたは上に浮かんでくる。
濾過はバッチ法かまたは連続法どちらでも行うことができる逆浸透法、限外濾過法、薄膜濾過法などがある。これらの方法ではフィルタ−の気孔率によって流体から化合物を選択的に分離する。フィルタ−そのものは流体でも固体でもよい。
クロマトグラフィ−法には液体クロマトグラフィ−、ガスクロマトグラフィ−、ペ−パ−クロマトグラフィ−、薄層クロマトグラフィ−がありバッチ法または連続法でも行うことができる。クロマトグラフィ−法では二相間、移動相と固定相間での化合物の分配の違いによって分離される。移動相は通常気体または液体であり、固定相は通常固体または液体である。分離は移動相が固定相に吸着したり、また固定相から離脱したりすることによっておこる。移動相にある化合物はその成分の二相間への親和性によって、異なる速度で移動相を移動する。
電気泳動は電場で電荷を受けた粒子の移動であり、溶液中の化合物が電場によって移動するような電気的な負荷をかけることである。電気泳動はゲルまたはクロマトグラフィ−のような固定相が存在する自由溶液中で行われる。（後者は電気クロマトグラフィ−（electrochromatography）と呼ばれている）電気泳動にはいろいろな方法がある。電気泳動は、キャピラリ−（キャピラリ−電気泳動、CE）、チュ−ブ、スラブなどで行うことができる。電気泳動は、通常はバッチ法のみである。
これらの分離法の多くは化合物の分離を補助するために、その分離を目的とした化学物質を用いる。通常は、分離する化合物と結合してその分離を補助し、または達成するためにこれらの化学物質、すなわち分離剤を流動相に加えるか、または固着した分離物質のところを通ることによって、目的とする化合物の分離が補助されまたは達成されるように、分離物質を固定相に固着し分離する化合物に作用させる。
晶化法または析出法では、分離を目的とする化合物と化合させ、分離したい化合物と分離剤との錯体の結晶化または析出をおこすために、分離剤は通常流体に加えられる。濾過法では分離剤をフィルタ−に固着するか、またはフィルタ−として作用する液体中に含有させる。クロマトグラフィ−法及び電気泳動法では分離剤は固定相に加えるかまたは溶液中に溶解する。
過去、クロマトグラフィ−法や電気泳動法において多くの異なる物質が分離剤として用いられてきた。クロマトグラフィ−法において、固定相に固着する分離剤にはアミノ酸、アミノ酸誘導体、タンパク質、シクロデキストリン、シクロデキストリン誘導体、線状または分岐炭化水素がある。電気泳動法では分離剤として、シクロデキストリン及びシクロデキストリン誘導体を壁面に固着したキラル固定相とともに用いられてきた。さらに電気泳動法では、しばしば分離剤としてシクロデキストリン、改質したシクロデキストリン、アミノ酸、溶性炭水化物を自由溶液中に溶解して用いてきた。晶化法、析出法、濾過法、電気泳動法、クロマトグラフィ−法において分離剤が用いられることは、よく知られていてまた通常行われていることである。
種々の分離剤や分離方法は、光学異性体を分離するために用いられている。光学異性体の各構成要素の相対的配置や不斉分子（chiral molecule）は、一般的に生物学または薬理学的活性や効果を決定する。不斉分子（chiral molecule）の一つの鏡像異性体が他の鏡像異性体と異なる活性を示すことはまれなことではない。したっがって、一つの鏡像異性体を他の鏡像異性体から分離できるようにすることは絶対的に必要なことである。光学異性体を分離することに用いられる分離剤は、しばしばキラルセレクタ−（chiral selectors）と呼ばれている。
大環状の抗生物質が晶化法、析出法、濾過法、クロマトグラフィ−法、電気泳動法を含む様々な分離法で、分離剤として作用することが本発明において明らかとなった。事実、クロマトグラフィ−法と電気泳動法では、本発明の大環状抗生物質によって今まで知られている分離剤では分離することができなかったある種の光学異性体を分離することができた。
そのように広範囲の分離方法において、大環状抗生物質が作用することは驚くべきことであり、予期できないことである。なぜなら、これらの大環状抗生物質の構造が大きいからである。これまで、1993年３月10日に発行されたUS特許No.５, 1914,133にあるように小さい抗生物質のみが分離物質として示唆されてきた。しかしながら'133特許は光学異性体の分離に抗生物質を用いることについては開示していない。
本発明の大環状抗生物質はクロマトグラフィ−法及び電気泳動法の固定相、移動相または液添加剤にも使用することができる。とくに大環状抗生物質はクロマトグラフィ−法とキャピラリ−電気泳動法の固定相やキャピラリ−電気泳動法、薄層クロマトグラフィ−法、液体クロマトグラフィ−法の移動相や液添加剤として作用することが見出されてた。また本発明の大環状抗生物質はクロマトグラフィ−法で固定相に用いたときに順相でも逆相でも安定であることが見出されていた。さらに、固定相の選択は二種類のクロマトグラフィ−モ−ドでは異なると思われる。したがって、逆相での認識機構は順相での認識機構とは異なる。この現象はクロマトグラフィ−法での順相及び逆相におけるエナンチオ選択性及びキラル認識機構（chiral recognition mechanism）において見出された。
本発明の大環状抗生物質を固定相でキラルセレクタ−として用いたとき、先行例で固定相にタンパク質を用いたときよりも高い安定性と分離能力を持っていることが判った。順相で用いたときに、大環状抗生物質はタンパク質とは異なり変性したり、エナンチオ選択性が全く変化してしまうということがない。
近似の大環状抗生物質をキラルセレクタ−（chiral selector）として用いたときにいくらか似た、しかし全く同じではない選択性を示すことが判った。このことはもし一つの大環状抗生物質がある分離を示した場合、非常に近い構造の大環状抗生物質はある程度の分離や同一の作用を示すことがあるということを意味している。
【図面の簡単な説明】
図１はブロマシル、デブリノ−ル、とクマクロル（oumachlor）の鏡像異性体をシリカゲルにバンコマイシンを結合した逆相HPLCカラムでの分析を示している。
図２はＮ−（3,5−ジニトロベンゾイル）−α−メチルベンジルアミンと３−〔２−（２−ブロムアセトアミド）アセトアミド〕−プロキシル（PROXIL）の鏡像異性体をシリカゲルにバンコマイシンを結合した順相HPLCカラムでの分析を示している。
図３は５−メチル−５−フェノ−ルヒダントイン鏡像異性体をシリカゲルにバンコマイシンを結合した逆相HPLCカラムでの分離における有機改質剤の効果を示している。
図４Ａ、４Ｂ、４Ｃはシリカゲルにバンコマイシンを結合した逆相HPLCカラムでの分離効果を示している。
図５はシリカゲルにバンコマイシンを結合した逆相HPLCカラムで極性及び非極性溶媒を調整することによる分析を示している。
図６は基材に結合した大環状抗生物質の図を示している。
図７は鏡像異性体を分離、濃縮するときに用いられる発泡分離器（foam separation apparatus）を示している。
本発明の大環状抗生物質は少なくとも一つの大環状構造を持っている抗生物質である。ここで用いられる大環状構造とは少なくとも10員環さらに好ましくは15員環以上を持っているものである。ここで使われている員環とは環を構成する一原子を意味している。例えば、ベンゼンは６員環でありアントラセンは３個の環を持ちそのそれぞれは６員環である。ベンゼンもアントラセンも大環状構造を持たない。これに対して本発明の大環状抗生物質であるバンコマイシンは10個の環を持ちそのうち５個は芳香族の６員環で大環状構造ではない。２個の芳香族ではない６員環もまた大環状ではない。３個の環が10員環以上で本発明による大環状構造である。本発明の大環状抗生物質はたとえばバンコマイシンのように、１個以上の大環状構造を持っているものである。良好な結果は１個から４個の大環状構造を持つ大環状抗生物質を用いることによって得られた。
本発明で用いられる大環状抗生物質がなぜ分離剤として作用するのかは完全にわかっていない。光学異性体の分離に関して、大環状抗生物質が目的とする化合物と錯体を形成することによる種々の異なる機構の組合せによってエナンチオ選択性が起きることであると考えられている。これらの機構には錯体形成、チャ−ジ間の相互作用（charge-charge interaction）、水素結合、疎水性ポケット（hydrophobic pocket）における包括、双極子スタック（dipole stacking）、立体相互作用（steric interaction）またはそれらの組合せがある。他のキラル固定相は同じタイプの相互作用には有効であるが、単一のキラルセレクタ−や互いに近似したものではそれらの機構の複数を示すことはない。本発明に用いられる大環状抗生物質はその化学構造や大きさにより一つ以上の相互作用が有効となり、またそれぞれの相互作用は同じ分子上で起こることからそれらの相互作用は非常に接近したものとなり、互いに近い他の相互作用によって強められ、分離剤と光学異性体間の相互作用は強調されるのである。
この技術分野における通常の知識を有する者に知られているように、化合物を分離するとき、分離剤の種類によって分離効果が異なる。このことは本発明の大環状環状抗生物質においても同じである。後述の例で示されているようにある種の大環状抗生物質は他の大環状抗生物質よりも効果的に化合物を分離する。
本発明の大環状抗生物質の誘導体もまた、大環状抗生物質の相互作用機構が破壊されない限り、本発明に従って分離剤として用いることができる。大環状抗生物質の誘導体化によってその選択性を変えることが見出されている。明細書と請求項で用いている誘導体化は大環状抗生物質に化学化合物を付加することだけではなく、大環状抗生物質のある部分を取り除くというような誘導体化も意味している。大環状抗生物質のある部分を取り除くときには、大環状抗生物質の誘導体が分離剤として機能するために少なくとも一つの大環状構造は残さなければならない。例えば、ある大環状抗生物質を基材に結合させたときに大環状抗生物質のある部分が化学反応の間に失われるということが知られている。また、結合反応の間に大環状抗生物質の部分が失われることを防ぐために用いられる方法があることも知られている。
本発明の大環状抗生物質のポリマ−もまた本発明に従って分離剤として使用することが可能である。
明細書と請求項で用いられる大環状抗生物質は大環状抗生物質そのものを示すばかりでなく、上記のような大環状抗生物質の誘導体や大環状抗生物質のポリマ−も意味している。
本発明の大環状抗生物質のポリマ−は本発明によって分離剤として用いることが可能である。
同様に、本発明の大環状抗生物質は化学的に基材に結合することが可能であり分離剤として機能することが見出されている。本発明の大環状抗生物質を基材に結合するには、大環状抗生物質の相互作用の機構が破壊されない程度に大環状抗生物質の構造を変えることができる。
他の分離剤と異なり、大環状抗生物質には大環状ポリエン−ポリオ−ル（polyene-polyols）、アンサ化合物（例えば、脂肪族架橋ナフトヒドロキノン（aliphatic bridged naphthohydroquinones））、大環状グリコペプチド、ペプチド、ペプチドと複素環式化合物が共役結合したもの（peptide-heterocycle conjugate）などを含む様々な構造のものがある。一般的にこれらの化合物の分子量は60ダルトンよりも大きく2500ダルトンよりも小さい。それらには酸性、アルカリ性、中性のものがある。ある環状抗生物質は紫外線を強く吸収するが、他のものは紫外線をよく通す。
本発明に敵した大環状抗生物質はそれらの化学構造が似ていることからアンサマクロライド、マクロライド、グリコペプチドとポリエンを含む大環状ペプチドに分類される。これらは全てではなく、これら四つの部類に入らない、大環状環に少なくとも一つを持つ他の抗生物質がある。好ましい抗生物質は、アンサマクロライドと大環状ペプチド、特にグリコペプチドのグル−プから選択される。
アンサマクロライドは芳香族環の二つの隣り合わない位置に脂肪族のアンサ架橋があることによって特徴づけられる抗生物質類である。アンサマクロライドは一般的にそれらの芳香族環によって二つのグル−プに分けられる。一つのグル−プはナフトキノンを含み、他はベンゾキノン環を含む。ナフトキノイドアンサマイシンは知られているアンサマクロライドの多くが含まれている。本発明において有用なナフトキノイドアンサマイシンはストレプトバリシン（streptovaricins）、リファマイシン、トリポマイシン、ハロマイシンおよびナフトマイシンがある。本発明において有用なベンゾキノイドアンサマクロライドはゲルダナマイシン（geldanamycin）、メイタンシノイド（maytansinoids）がある。好ましいアンサマクロライドはリファマイシンであり特にリファマイシンＢである。
マクロライドは、12-,14-または16員環を有するアグリコンを形成する大環状を有する抗生物質類である。本発明に有用なマクロライドはカルコマイシン（chalcomycin）、メチマイシン（methymycin）、ネオメチマイシン（neomethymycin）、エリスロマイシン、メガロマイシン、ピクロマイシン、ナルボマイシン、オレアンドマイシン、トリアセチルオレアンドマイシン、カルボマイシン、スピラマイシン及びチロシンである。
本発明で有用な大環状ペプチドはスポリデスモライド（sporidesmolides）、カプレオマイシン、リストマイシン、シクロスポリン、チロシジン、トリオスチン、グラミシジン（グラミシジン５）、チロシジン、ポロミキシン、バシトラシン（bacitracins）、オクタペプチン、アクチノマイシン、エタマイシン、ベルナマイシン、エンニアチン（enniatins）、バリノマイシン、チオストレプトン、テイコマイシン  アボパルシン、アクタプラニン及びバンコマイシンである。好ましい大環状ペプチドはグリコペプチドであり特にテイコマイシン（テイコプラニン）、リストマイシン、アボパルシン、及びバンコマイシンである。チオストレプトンもまた好ましいペプチドである。
好ましいグリコペプチドは三個または四個の融合環を持っているものである。アグリコンに付加する糖は様々な数またいろいろな種類ものがある。そのような好ましいグリコペプチドは三個または四個の融合環を持っていて、それらはバンコマイシン、テイコマイシン、リストマイシン、アボパルシン、及びアクタプラニンである。テイコマイシンは異なる下記のような種々のテイコマイシンを含んでいる。
0003808500.tif 000002
また、アボパルシンにはα−アボパルシンとβ−アボパルシンがあることが知られている。さらにアクタプラニンには下記のような種々のタイプがある。
0003808500.tif 000003
ポリエンは三個から七個の二重結合を持つ大きなラクトン環を持っている。好ましいポリエンはアムフォテリシンン（アムフォテリシンＢ）、カンジシジン、カンジジン、デルモスタチン、ファンギクロミン、及びナイスタチンである。
大環状構造を持つものであれば上記の四つの一般的な分類に含まれない他の抗生物質でも本発明には有用であり、アプラスモマイシン、ボロマイシン、エンテロバクチン、ベベ−リン（bebeerin）がある。
本発明に用いる最も好ましい大環状抗生物質は、バンコマイシン、リファマイシン、テイコプラニン、アボパルシン及びチオストレプトンである。種々のリファマイシンのうちでリファマイシンＢが最も好ましい。バンコマイシンはバクテリア  ストレプトマイシン  オリエンタリス（Streptomycin orientallis）によって産生される両性のグリコペプチドである。リファマイシンＢはリファマイシン抗生物質類のうちで最もよく知られたものの一つで、バクテリア  ノカルディア  メディテラネイ（Nocardia mediterranei）から得られる。チオストレプトンは微生物ストレプトマイセス  アズレウス（Streptomyces azureus）から得られる。テイコマイシンはバクテリア  アクチノプラネス  テイコマイチカス（Actinoplanes teichomyceticus）によって産生される。
本発明に用いられる抗生物質は通常の起源から得られ、また市販されているものである。本発明に用いられる適切な大環状抗生物質の誘導体は通常の反応物を用いて通常の方法で得られる。適切な誘導体はプロピレンオキサイドで合成されるヒドロキシルプロピル誘導体、無水酢酸で合成されるアセチル誘導体、(R)-または(S)-ナフチルエチルイソシアネ−ト誘導体、3,5-ジメチルフェニルイソシアネ−ト誘導体、2,6-ジメチルフェニルイソシアネ−ト誘導体などである。
本発明に用いられる大環状抗生物質のポリマ−は、単一モノマ−から誘導されたホモポリマ−、一つ以上ののモノマ−から誘導された混合ポリマ−がある。そのようなポリマ−は通常の器具を用いて通常の方法で合成される。典型的にはある大環状抗生物質を他に結合するために架橋剤が用いられる。
固定相に使用するために、本発明の大環状抗生物質を通常の方法で基材に固着する。適切には本発明の大環状抗生物質を基材にコ−ティングするか、または基材に大環状抗生物質を化学的に結合するかによって基材に固着する。
本発明に用いられる大環状抗生物質を基材にコ−ティングするには通常の器具を用いて通常の方法で行われる。シリカゲルにコ−ティングする適切な方法の一つには、マクロ細孔の球状シリカゲルの粒子を過剰のジクロロジフェニルシランとトリエチルアミンを用いてトルエン中で還流させてシラン化することがある。それによって、シラン化したシリカゲルは大環状抗生物質でコ−ティングされる。コ−ティングしたシリカゲルは通常のカラムに用いられる。シリカゲルのコ−ティングの場合、大環状抗生物質のポリマ−またはコポリマ−は分離工程で容易に脱離しないので、大環状抗生物質のポリマ−またはコポリマ−が好ましい。
大環状抗生物質は、本発明の分離機構をもたらす大環状抗生物質の相互作用機構を破壊することのない程度で、通常の化学結合によって化学的に基材に結合される。基材と大環状抗生物質との間の化学結合は両者間の結合手（leash）、橋かけまたはスペ−サ−（spacer）によって形成される。結合手（leash）は大環状抗生物質が分離剤として機能できる程度に長くなければならないが、分離を支配する程長くてはならない。たとえば、基材が結合手（leash）に結合し、それから基材と結合手（leash）の結合したものが大環状抗生物質に結合するといった反応の順序は、基材、結合手（leash）及び大環状抗生物質の化学的性質による。図６は大環状抗生物質10が基材12に結合14で結合していることを示している。
本発明に用いられる固定相を作るための適切な基材には、シリカゲル、アルミナのような無機質材料、ポリスチレン、ポリウレタン、ポリビニルアルコ−ル及びポリアミドのような合成構高分子材料、アガロ−ス、セルロ−ス、デキストラン及び線状、分岐アミロ−スのような天然材料などがある。好ましい基材はシリカゲルである。
大環状抗生物質をシリカゲルに化学的に結合する場合、大環状抗生物質の基材への適切な結合はカルボン酸がオルガノシランに、アミンがオキシシランに、エポキシがオルガノシランに及びイソシアネ−トがオルガノシランに終止することによってなされる。オルガノシランに終止する適切なカルボン酸は10-（カルボメトキシ）エチルメチルジクロロシランと２-（カルボメトキシ）-エチルトリクロロシランである。オルガノシランに終止する適切なアミンは３-アミノ-プロピルジメチル-エトキシシランと３-アミノプロピルトリエトキシシランである。シランに終止する適切なエポキシは（３-グリシドキシプロピル）トリメチルオキシシラン、３-グリシドキシプロピルジメチルエトキシシランと３-グリシドキシプロピルトリエトキシシランである。オルガノシランに終止する適切なイソシアネ−トは３-イソシアネ−ト-プロピルトリエトキシシランと３-イソシアネ−トプロピルジメチルクロロシランである。
大環状抗生物質と結合手（leash）との間の結合にはエ−テル、チオエ−テル、アミン、アミド、カルバミン酸塩、尿素、及び炭化水素がある。
オルガノシランに終止するカルボン酸またはアミンを用いて本発明に用いられる固定相を形成するために、乾燥シリカを無水トルエン中にスラリ−化し、トルエン中のオルガノシラン溶液を終始滴下し、トルエンシリカゲルスラリ−とともに還流する。還流は110℃で終始継続する。大量の大環状抗生物質を適当量のカルボジイミド（carbodimide）脱水剤とともに加える。混合物の反応が終止した後、固定相を濾過し洗浄する。
本発明の大環状抗生物質をシリカゲル及びオルガノシランに終止するイソシアネ−トに結合するためには、無水DMF中で２または３モル過剰のオルガノシランと反応する。反応物をシリカゲルの無水DMFスラリ−に加える。ここで改質大環状抗生物質とシリカゲルとの重量比はおおよそ１：２である。溶液は攪拌して105℃で20時間反応させる。その後、反応生成物を濾過し洗浄する。
本発明の大環状抗生物質を用いて固定相を形成するためのシリカゲル及びオルガノシランに終止するエポキシは通常の方法によってトルエン中で反応させる。U.S.特許No.4,539,399を参照されたい。
シリカゲルまたはガラスビ−ズと本発明の大環状抗生物質との他の適切な化学反応は、α-アミノプロピルシラン化シリカゲルを合成し、大環状抗生物質のアミノ基をシラン化シリカゲルに結合するためにグルタ−ルアルデヒドを用いることである。このような反応は、アミノ基を有してる大環状抗生物質を用いて行われる。
アガロ−ス、セルロ−ス、デキストラン及び線状／分岐アミロ−スのような天然材料の基材の場合は、通常の器具を用いて通常の方法で大環状抗生物質を基材に結合する。”アフィニティ−  クロマトグラフィ−”化学と技術ニュ−ス（Chemical and Engineering New）1985年８月26日、17-32ペ−ジを参照されたい。
本発明の大環状抗生物質を用いるための固定相にはカプセル化したものもある。本発明に用いられる大環状抗生物質のカプセル化は、大環状抗生物質の周りに多孔質ポリマ−のかご（cage）を作るために通常の方法で通常の工程により達成される。そのような多孔質ポリマ−のかご（cage）はビ−ズとして形成され、カラムに用いられる。多孔質のケ−ジは大環状抗生物質が漏出することを防止するが、分析試料はケ−ジを通過する。このように本発明では大環状抗生物質が分離剤として機能する。
本発明に用いられる大環状抗生物質は晶化法、析出法、濾過法、電気泳動法、クロマトグラフィ−法のような通常の分離工程で通常の方法によって使用することができる。
晶化法と析出法では、目的とする化合物の結晶化や析出を起こさせるのに効果的な量の大環状抗生物質を溶液に加える。分離する流動体中の化合物の量よりも多い量が好ましいが、さらに好ましくは２から10倍の量である。
濾過法では大環状抗生物質を固体の基材に固着し、液状フィルタ−に抗生成分として含有させる。濾過法においては、大環状抗生物質は通常の器具を用いて通常の方法で用いられる。フィルタ−に用いる大環状抗生物質の量は目的とする化合物の分離に効果的な量である。
電気泳動法とクロマトグラフィ−法では、本発明の大環状抗生物質は移動相の添加剤として、通常の器具を用いて通常の方法で用いられるかまたは基材に固着される。
本発明を以下の実施例を用いて説明する。
例１
本例は、本発明に用いられる大環状抗生物質の固定相を作る方法を示す。
固定相を作るために1.0gの大環状抗生物質を減圧で五酸化二リン（P2O5）を通しながら100℃で４時間乾燥した。乾燥した大環状抗生物質は攪拌棒を用いて100mlの無水N,N-ジメチルホルムアミド（DMF）に溶解し、500ml三つ口（three-neck）丸底フラスコに入れた。反応中は乾燥窒素ガスを通した。一つ目の口から乾燥窒素ガスを入れ、器具の中を通り、標準の二口アダプタ−を用いてサ−モメ−タ−を取り付けてある二つ目の口を通って出ていくようにした。丸底フラスコの三つ目の口には滴下漏斗を取り付け、付いているチュ−ブと等しい圧力になるようにした。フラスコはマントルヒ−タ−で加熱した。溶液の温度が90から95℃になったときに、フラスコを攪拌しながら、20mlのDMFに溶解した520μlの３-イソシアネ−トプロピルトリエトキシシランを滴下した（一分間に10から15滴の割合で）。反応試薬を添加した後、10時間攪拌して反応させた。これらの工程によって大環状抗生物質がオルガノシランに結合した。次に3.5gのシリカゲル（球形、５μ、孔径100Å）を減圧で五酸化二リン（P2O5）を通しながら100℃で４時間乾燥させた。乾燥シリカゲルをオルガノシランに結合した大環状抗生物質のDMF溶液に加え、105℃に加熱して20から24時間反応させる。混合物は室温まで冷却し、濾過し、DMF、メタノ−ル、トルエン、メタノ−ル、水、及びメタノ−ルで洗浄した。
この方法は表Ｉに挙げた大環状抗生物質それぞれに適用することができる。
0003808500.tif 000004
例２
この例は、種々の固定化した大環状抗生物質を固定相で分離剤として使用したものである。この例では光学異性体を分離するための分離法として、液体クロマトグラフィ−が用いられた。逆相を用いての結果は表IIに示した。
0003808500.tif 000005
0003808500.tif 000006
aこの表の化合物はα値の高いものから低いものの順に並べられている。
b最初に溶出した鏡像異性体のｋ値である。
c移動相は１％トリエチルアンモニウムアセテ−ト緩衡液に対するアセトニトリルの容量比を示している。
dカラムの略語は次のとおりである：
Van =固定相にバンコマイシンを結合したもの
Thio=固定相にチオストレプトンを結合したもの
Rif =固定相にリファマイシンＢを結合したもの
異なるキラル固定相の試験をするために、カラムには通常の方法を用いて固定相を充填した。カラムはステンレスチ−ル性で長さ25cm内径0.44cmものもを用いた。紫外吸光検出器（254nm）とクロマトパック（chromatopac）デ−タステイション付きの島津（Shimadzu）LC 6A液体クロマトグラフィ−または745Bデ−タモジュ−ル付きのウオ−タ−ズ（Waters）のモデル590HPLCが用いられた。その結果は表IIに示している。それぞれの分離は流量1.0ml/min、室温（22℃）で行った。カラムは通常の方法の逆相で、１mlに10μgの分析試料を溶解した希薄溶液５μｌを流した。キラル固定相は例１の方法に従って調整した。
分離係数αは溶出ピ−ク間の分離を示している。ピ−クの分離が大きいほどα値も大きくなる。数理的にαは二つのピ−ク間の修正保持時間の比によって定義される。すなわち、式
α＝t'2/t'1=(t2-t0)/(t1-t0)
で与えられる。ここでt'=修正した保持時間、t=未修正の保持時間、t0=保持されない化合物の時間である。通常、ピ−クの最も長い保持時間が分子にくるのでα値は１よりも大きくなる。α値が１であることは、ピ−クが分離していないことを示している（ピ−クは同時に溶出する）。
最初に流出する鏡像異性体の容量比（capacity factor）kは保持されない化合物の保持時間に対する修正した保持時間の比を示している。すなわち、式
k=(t1-t0)/t0
で与えられる。
図１はブロマシル、デブリノ−ルおよびクマクロル鏡像異性体のバンコマイシンを結合した逆相カラムによる分析を示している。分析は機器を用いて次の方法で行った。移動相はアセトニトリルと１％トリエチルアンモニウムアセテ−トの10/90緩衡液で、pHは７である。
キラル固定相を用いたときに５-シアノ-６-メトキシ-3,4-ジヒドロ-２-ピリデン（５-cyano-６-methoxy-3,4-dihydro-２-pyridene）の鏡像異性体の分離は現在まで報告されていない。
例３
この例は、例１のように調整したバンコマイシン固定相を用いてクマクロルとデブリノ−ルの分離したときのpHの効果を示している。分離法には液体クロマトグラフィ−を用いた。移動相は例２に示すものと同じで、カラムも例２と同じ方法で流した。結果は下記の表IIIに示す。
0003808500.tif 000007
ｋとα値は例２で定義したものと同じ方法で決定されている。Ｒは式、
R=2(t2-t1)/(w1+w2)
で表され、ここでw1とw2は溶出する一つめと二つめのピ−クのベ−スラインのピ−ク幅である。
例４
この例はプログルミド、５-メチル-５-フェニルヒダントインおよびN-カルバミル-D,L-フェニルアラニンの分離における温度の効果を示している。この例の分離法には液体クロマトグラフィ−を用いた。例１で調整したバンコマイシン固定相を用いた。移動相とカラムは例２で用いたものと同じで、カラムは逆相である。移動相のpHは4.1であった。この実験から得られた結果は表IVに示している。k値、α値、Rs値は例３に記した方法で決定されている。
表IVは分離する温度を低くすると分離（すなわちα）が良くなるとともに、保持時間が長くなることを示している。多くの場合、分離度（Rs）も高まることになる。このことは、分離（すなわちα）を良くすることは、低温度によってしばしば起こる物質移動（mass transfer）の低下による効果のロスには完全にはならないということを示している。
0003808500.tif 000008
例５
この例は3a,4,5,6,-テトラヒドロスクシンイミド−ル-［3,4b'］アセナフテン-10-オン（3a,4,5,6,-tetrahydrosuccinimidol［3,4-b'］acenaphthen-10-one）の分離における流量が及ぼす効果を示している。カラムは例１で調整したようにバンコマイシン固定相で充填し、移動相はイソプロパノ−ルとヘキサン50:50（容量比）の混合物を用いた。カラムに順相を用いた以外は例２と同じ条件で流した。表Ｖに示すように、流量を低下することは分離度を高めることになるが、この流量低下による物質移動（mass transfer）はα値に影響することなく、最小限に抑えられた。αとRsは例４の方法で決定した。
0003808500.tif 000009
例６
この例は、例１で調整した種々のカラムを用いていろいろなラセミ体を分離した結果を示している。この例で用いられた分離法は液体クロマトグラフィ−である。カラムに順相を用いたこと以外は例２と同じ条件で分離した。表VIにクロマトグラフィ−のデ−タを示す。αとｋは例２と同じ方法で決定した。
図２は表VIに示されているN-（3,5-ジニトロベンゾイル）-α-メチルベンジルアミンと3-［2-（ブロムアセトアミド）アセトアミド］-プロキシル（PROXYL）の分離を表すクロマトグラフィ−である。
3-［2-（ブロモアセトアミド）アセトアミド］-プロキシル（3-［2-（bromoacetamido）acetamide］-PROXYL）の分離は現在までどのようなキラル固定相を用いても達成することができなかった。
表VIの最後四つの物質は、極性有機溶媒を移動相に用いたときのみ分離することができた。
0003808500.tif 000010
a表に挙げた化合物はα値の高い順に並んでいる（異なる移動相を用いた最後の四つの化合物を除く）。
b最初に溶出した鏡像異性体のｋ値である。
c移動相のイソプラパノ−ルとヘキサンとの容量比を示している。
dカラムの略語は以下のとおりである：
Van =バンコマイシンを固定相に結合したもの
Thio=チオストレプトンを固定相に結合したもの
Rif =リファマイシンＢを固定相に結合したもの
e移動相のイソプロパノ−ル/ヘキサン/アセトニトリルの容量比を示している。
f移動相のアセトニトリル/メタノ−ル/氷酢酸/トリエチルアミンの容量比を示している。
例７
この例は、固定相にバンコマイシン誘導体を用い、液体クロマトグラフィ−による分離法を示している。この例に用いられる固定相は、例１にしたって調整された。カラムに順相を用いたことを除いて例２と同じ条件で分離した。この実験のクロマトグラフィ−のデ−タは表VIIに示す。
0003808500.tif 000011
a表に挙げた化合物はα値の高い順に並んでいる。
b最初に溶出した鏡像異性体のｋ値である。
c移動相のイソプラパノ−ルとヘキサンとの容量比を示している。
dDMP-Vanは3,5-ジメチルフェニルカルバメ−ト誘導化バンコマイシンを示している。
例８
本例は、上記例１で調整したように、バンコマイシン順相で充填したカラムを用いて５−メチル−５−フェノールヒダントイン鏡像異性体分離に対する有機改質剤濃度の効果を示すものである。本例では分離工程に液体クロマトグラフィーを用いた。
図３に示したように、アセトニトリル改質剤の濃度を０体積％から50体積％まで増加させると、保持値および鏡像異性体選択性が減少した。アセトニトリル濃度が50体積％と95体積％の間では、鏡像異性体選択的保持値は少なく、分析試料はカラムのデッドボリュ−ムの近くに溶出した。純粋のアセトニトリルでは、保持値は増加し、鏡像異性体選択性は回復した。
図３は、移動相組成割合によって第一および第二の溶出した鏡像異性体の逆相での保持値をプロットしたものである。図３は第一の溶出鏡像異性体を示したものであり、これは四角で示してあり、一方第二の溶出鏡像異性体は円で示してある。カラムは上記の例２の場合と同様に示してある。
例９
本例は、分離工程として液体クロマトグラフィーにより被分離分析試料の量を増加させた場合の効果を示したものである。本例で使用した分離試薬は上記例１に従って調整したバンコマイシン順相を用いた。
図４Ａ，図４Ｂ，および図４Ｃは５−メチル−５−フェニルヒダントイン光学異性体の混合物に対する異なるクロマトグラムを示したものである。図４Ａは１μｇの分析試料のクロマトグラムを示し、図４Ｂは５００μｇの分析試料のクロマトグラムを示し、更に図４Ｃは１６００μｇの分析試料のクロマトグラムを示したものである。カラムは純粋のアセトニトリルの移動相と共に上記例２の場合と同様な方法で流した。
例１０
本例は、分離工程として液体クロマトグラフィーを用い、化合物の分離に関して移動相中の極性と無極性有機溶媒の比を調整する効果を示したものである。この場合、有機溶媒は、ヘキサン、イソプロパノールであり、鏡像異性体はメチルフェニルヒダントイン異性体の混合物から得られたものであった。使用したカラムは上記例１で調整したバンコマイシン順相であり、カラムは順相モードで走行させたことを除くと、上記例２におけると同様であった。
図５は本実験による結果を示したものである。図５において、四角は鏡像異性体の第一の溶出物を示し、丸は第二の溶出物を示している。極性有機相のみが本カラムを用いて混合物の或るものを分離することが出来る点に注目すべきであり、特に例６の第ＶＩ表の最後の四つの鏡像異性体を参照されたい。
例１１
本例はリファマイシンを用いて各種の化合物を分離する状態を示したものである。本例で用いる分離工程は、電気泳動で行われ、キャピラリー電気泳動に用いるため大環状抗生物質リファマイシンＢを溶液中に溶解させたフユーズドシリカキャピラリーで構成した順相であった。本例の結果は以下の表VIIIに示した。
0003808500.tif 000012
a移動時間は分で与えられる。
bμ（a）はcm2・kV-1・min-1で表した見かけの移動度である。
cμ（e）はcm2・kV-1・min-1で表した実効移動度である。
コネチカット州ニューヘブンのクアドレックス社（Quadrex Corporation）製フューズドシリカキャピラリー内径50μm、外径375μm、および全長57.5cmを用いた。キャピラリーは、保護コートを燃やして窓を形成し、キャピラリーホルダーに挿入し、次に0.5規定水酸化カリウムで調整した。
試験には、254nmのランプを備えたウオーターズ（Waters）製、クオンタ（Quanta）4000キャピラリー電気泳動装置を用いた。キャピラリー内の検出器までの距離は50cm（有効キャピラリー長さ）であった。全ての分析試料は約１mg/mlの蒸留水中に溶解し、0.45μmのナイロンフィルターで濾過し、更に５kVで５秒間電気移動注入法を用いてキャピラリー中に導入した。試験は電圧８kV、室温（22℃）で実施した。
鏡像異性体の鏡像異性分解能、移動時間、および見かけの移動度と実効移動度は、pH７の40% ２−プロパノール、60% 0.1Mリン酸緩衡液中に25mMリファマイシンＢを用いて決定した。
見かけの移動度μ（a）は式：μ(a)=(l)/(t×E)=(l×L)/(t×V)により決定した。ここで、式中、Vは印加電圧、lは有効キャピラリー長さ（検出器までの）、Lは全キャピラリー長さ、tは、試験の開始までから検出まで測定した移動時間、Eは電場である。
実効移動度μ（e）は、見かけの移動度から中性粒子の移動度μ（EOF）を差し引くことにより、すなわち、μ（a）−μ（EOF）により決定した。見かけの移動度と実行移動度は従来の方法で測定した。
例１２
本例は、電気泳動の分離工程により分離剤としてのリファマイシンＢの濃度の効果を示したものである。本例では、上記例１１で示したカラムおよび上記例１１の装置と方法が用いられた。以下の表IXは鏡像異性体の移動時間、見かけの移動度、実効移動度、および分離度を示している。
0003808500.tif 000013
移動時間は分で、見かけの移動度μ（a）と実効移動度μ（e）はcm2・kV-1・min-1で示した。全ての分離は指示量のリファマイシンＢを用いて、pH７の70% 0.1Mリン酸塩および30% ２−プロパノールの緩衡液と共に実施した。
上記表IXからわかるように、リファマイシンＢの濃度を増加させると、電気泳動度が若干減少する結果として、移動時間がわずかに増加する傾向があった。これは、表IXに示したように、鏡像異性体の分離度を高めた。
例１３
本例は電気泳動法において分離剤としてのリファマイシンＢを用いたときのpHの効果を示したものである。本例では上記例１１の装置と方法を用いた。全ての分離は、70% 0.1Mリン酸塩および30% ２−プロパノールに25mMリファマイシンＢを溶解させたものを用いて実施した。本例の結果を以下の表Ｘに報告する。
0003808500.tif 000014
リファマイシンＢを用いた場合の移動時間および鏡像異性体分離度の両者に対するpHの効果は、シクロデキストリンなどの他の分離剤を用いた場合より複雑である。これは、リファマイシンＢがイオン化可能な官能基を有することによる。従って、pHは、電気浸透圧流に影響を与えるだけでなく、分析試料とキラルセレクターの両者の電荷および分子認識特性に影響を与える。明らかに、分離度を最大にするためにはこれらの因子の全ての均衡をとらなければならない。表Ｘに示したように、アミノ−アルコールのラセミ体の最良の分離度は、中間の電気泳動移動度と移動時間を与えるpH７で得られる。
例１４
本例では、電気泳動法でリファマイシンＢを用いた鏡像異性体の分離に対する有機改質剤の効果を示したものである。全ての分離は、以下の表XIに挙げたように、70% 0.1Mリン酸塩と30%の有機添加剤の溶液に溶解させた20mMリファマイシンＢを用いて実施した。リファマイシンＢを含有する溶液のpHは７であった。他の全ての条件は上記例１１に従って行った。
0003808500.tif 000015
表XIからわかるように、有機改質剤の効果は、鏡像異性体の分離度、電気泳動移動度、および移動時間に対して著しい。溶液に２−プロパノールを付加すると、他の等化体積％の有機改質剤と比して鏡像異性体分離度を高める傾向があった。２−プロパノールはまた、長い移動時間と低い電気泳動移動度を与える傾向があったが、これと同等またはそれ以上の長い移動時間を与える有機改質剤では同等のエナンチオ選択性は得られなかった。
例１５
本例は、分離工程として電気泳動を用いて鏡像異性体化合物の分離に対する２−プロパノール濃度の効果を示したものである。上記例１１で示した装置と方法を用い、以下の表XIIのクロマトグラフィーデータを得た。全ての分離処理は、pH７の0.1Mリン酸塩に表示した体積％の２−プロパノールを用いて実施した。これらの分離処理の各々に用いたリファマイシンＢの量も以下の表XIIに示してある。
0003808500.tif 000016
表XIIのデータから、いずれの分析試料でも低濃度の２−プロパノールでは鏡像異性体の分離を示さないことが判る。有機改質剤の濃度が増加するにつれて、電気泳動移動度は減少し、移動時間は増加し、電気−浸透圧流は減少し、鏡像異性体分離度は増加した。
例１６
本例はリファマイシンＢによる鏡像異性体の分離処理に対する塩化ナトリウムの効果を示したものである。全ての分離処理はpH６の70% 0.1Mリン酸塩と30% ２−プロパノール溶液に溶解させた25mMリファマイシンＢ溶液を用いて実施した。上記例１１の方法と装置を用いて実施した結果を以下の表XIIIに示した。
0003808500.tif 000017
これからわかるように、イオン強度を増加させることにより移動時間が増加し、電気泳動移動度が減少するにもかかわらず、鏡像異性体分離度は一様に減少した。また、イオン強度を増加させると、移動時間と電気泳動度に関して２−プロパノールの濃度を増加させることと非常に類似した効果を与えた。両者の場合、電気泳動移動度は減少し、移動時間は増加したた。
例１７
本例は、電気泳動を用いてのリファマイシンＢによる鏡像異性体の分離における緩衡液濃度と緩衡液の組成の効果を示したものである。上記例１１の装置と方法を用い、全ての分離処理は、20mMリファマイシンＢと以下の表XIVに示したように70% 水性緩衡液と30% ２−プロパノールを用いて実施した。以下の表XIVに示すように、最適濃度のリン酸塩緩衡液は0.1Mであると思われた。
0003808500.tif 000018
例１８
本例は、バンコマイシンを用いて、キャピラリー電気泳動法により多くのキラル（対掌性の）化合物を分離する処理を示したものである。
上記例１１の装置と方法で、長さが検出器まで25cm（全体で32.5cm）で、内径が50マイクロメートルのフューズドシリカキャピラリーを用いて行った。分離処理は0.1Mリン酸塩緩衡液に５mMバンコマイシンを溶解させたものを用いた。
一連の実験において、Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミジル−６−アミノキノリンカルバメ−ト（ＡＱＣ）のアミノ酸誘導体を分離した。各々の実験において、電圧は＋５kVであり、緩衡液のpHは7.0であった。一つの実験ではＡＱＣで誘導したα−アミノ−ｎ−酪酸のＤ体，Ｌ体混合物の分離を行い、他の実験ではＡＱＣで誘導したフェニルアライニンのＤ体，Ｌ体混合物の分離を行った。各々の場合に鏡像異性体の分離が得られ、またそれぞれのＲs値は9.71と8.07であった。
蛋白アミノ酸のＡＱＣ誘導体および多くの他のアミノ酸の誘導体を用いて他の実験を実施した。各々の場合、バンコマイシンを用いて鏡像異性体を分離することが出来た。５から１０の平均分離度を達成することができた。
他の一連の実験において、ダンシルアミノ酸誘導体の鏡像異性体を分離した。初めの二つの実験において、電圧は＋５kVであり、緩衡液のpHは4.9であった。第一の実験ではダンシル−D,L−メチオニンの混合物を分離し、第二の実験ではダンシル−D,L−α−アミノ−ｎ−酪酸の混合物を分離した。各々の場合に鏡像異性体の分離が得られ、それぞれのＲs値は19.7および20.0であった。第三の実験では、pH6.0の緩衡液を用い、−５kVの電圧でダンシル−D,L−グルタミン酸（glutanic acid）の混合物を分離した。
市販のラセミ化ダンシル誘導アミノ酸を用いて他の実験を実施した。鏡像異性体の分離度は15から20であった。
更に他の実験では、pH6.0の緩衡液を用い、−５kVの電圧でＮ−2,4−ジニトロフェニル−D,L−グルタン酸の混合物を分離した。またＮ−2,4−ジニトロフェニルアミノ酸誘導体も分離した。これらの他の誘導体は、エチオニン、シトルリン、セリン、メチオニン、ノルロイシン、ノルバリン、α−アミノ−ｎ−酪酸およびα−アミノ−ｎ−カプリン酸などであった。
本例の電気泳動工程と装置を用い、バンコマイシンを用いて各種のキラル化合物を分離する実験を実施した。エチオニン、ロイシン、セリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン、ノルロイシン、ノルバリン、およびα−アミノ−ｎ−酪酸のＮ−3,5−ジニトロフェニル誘導体を分離した。Ｎ−ベンゾイル基および3,5−ジニトロベンゾイル基により誘導したアラニン、バリン、ロイシン、フェニルアラニン、メチオニン、およびフェニルグリシンそれぞれのＤ、Ｌ混合物を分離した。Ｎ−カルボベンジルオキシアミノ酸の各種Ｄ、Ｌ混合物を分離した。Ｎ−フタリルおよびＮ−フタリル−グリコイルアミノ酸の各種Ｄ、Ｌ混合物を分解した。イブプロフェン、インドプロフェン、フルルビプロフェン（flurbiprofen）、カルプロフェン、スプロフェン、フェノプロフェン、およびヒドロキシマンデル酸の鏡像異性体を分離した。更に、中性化合物のワルファリンおよびクマクロルも分解した。
例１９
本例は、薄層クロマトグラフィーにより、本発明の大環状抗生物質を用いてキラル分子を分離する方法を示したものである。
６−アミノキノリル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバメ−ト（ＡＱＣ）誘導アミノ酸、ラセミック試薬、およびダンシルアミノ酸を薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）によって分離のためにキラル移動相添加剤として大環状抗生物質、バンコマイシンを用いた。逆相モードにおいてこれらの化合物の殆どのものは優れた分離を示した。固定相の性質および移動相の組成は共に強く鏡像異性体の分離に影響した。ジフェニル固定相を用いて最良の結果を得た。アセトニトリルは、最短の展開時間で最も有効な分離を与える有機改質剤であった。以下の表XVに各種実験の結果を示す。
0003808500.tif 000019
a移動相の組成はアセトニトリル/0.6M 塩化ナトリウム/1% トリエチルアンモニウムアセテ−ト緩衡液（pH=4.1）の体積比を示す。
bAQCは６-アミノキノリル-N-ヒドロキシスクシンイミジル  カルバメート、蛍光-タッグ-試薬（実験部分を参照）を意味する。
全てのラセミ化合物の分析試料、バンコマイシン、全てのダンシルアミノ酸および各種のAQC誘導体を生成するために使用したAQC誘導キットは市販の物を用いた。TLC板は、化学的に結合したジフェニル−Ｆ逆相板（５×20cm, 層厚 250μ）であり、市販のものを用いた。
バンコマイシンは、初めに0.6mol塩化ナトリウム溶液に溶解させ、また約15分間超音波浴槽中に配置した。次に、有機改質剤（アセトニトリル）を移動相混合物に加えた。これらのTLC板は６（内径）×23cm円筒状ガラス容器内で室温（22℃）で展開した。５×20cmTLC板を完全に展開するのに約１−３時間を要した。全ての化合物は蛍光性であった。展開したスポットは紫外ハンドランプ、固定−二重波長（254nmと365nm）を用いて観察した。
AQC誘導体は、パウロウスカ（Pawlowska）らが、クロマトグラフィ−ジャ−ナル（J. Chromatography）のVol.641,p.257（1993）が開示している、従来の方法で得た。各々の異性体化合物約100pmolをバイアル中でホウ酸ナトリウム緩衡液（0.2M,pH8.8）60μlに溶解し数秒間攪拌し、次に20μlのAQC溶液を加えた（３mg/１ｌのアセトニトリル）。バイアルはオーブン中で50℃で10分間加熱した。得られた溶液は更に精製することなくTLC中で用いた。ジフェニル−型の固定相は展開中のストリーキング（streaking）が少なくまたスポットの状態が良好であるという点で最良であった。分解したラセミ化合物は三種類、すなわち誘導化されてない薬物、AQC−アミノ酸およびダンシルアミノ酸であった。鏡像異性体的に純粋な標準物が得られたときの保持値の順序は上記表XVに示したようになった。移動相は一般に17から40体積％のアセトニトリルと0.6M塩化ナトリウム溶液で構成した。水中の塩はTLC板上のバインダー（binder）を安定化するために用いられた。ラセミ化合物の殆どはベースラインの分離より良好であった。全てのAQC−アミノ酸およびダンシルアミノ酸（これらに対して標準品が得られた）の保持値の順序が同じであったことに注目すべきである。Ｄ−鏡像異性体は常にＬ−鏡像異性体より大きなRf値を示した。
更に、バンコマイシンは、良好な分離とエナンチオ選択性を示したうえに展開中に比較的小さなスポットサイズを維持したことも注目するべきである。
例２０
本例は、気−液クロマトグラフィーによりベベーリンおよびバンコマイシン誘導体を用いて光学的異性体を部分的に分離する方法を示したものである。
エチルエーテルとジクロロメタンのコーデイング溶媒および従来のキャピラリー気−液クロマトグラフィー装置を用いた。バンコマイシンはｎ−ブチルまたはｎ−イソシアン酸ヘキシルにより誘導化した。これは従来の方法により行った。部分分離が得られた光学異性体を以下の表XVIにリストした。
0003808500.tif 000020
分離は従来のキャピラリ−気−液クロマトグラフィーにより従来の方法で実施した。ただし、この分離は一部に対してのみであった。
例２１
本例は析出法において分離剤として本発明の大環状抗性物質を用いる方法を示したものである。
25mlの水、25mlのアセトニトリル、0.25gのインドプロフェンを入れたビーカーに大環状抗生物質バンコマイシンを加えた。少量の有機溶媒成分を添加することによりこの溶液を大環状抗生物質により過飽和させた。
大環状抗生物質はインドプロフェンと錯化合物を形成し、沈殿物が析出した。この沈殿物を回収した。次に、回収した沈殿物を水に加え加熱して、大環状抗性物質とインドプロフェンの間の錯体を破壊した。さらに、大環状抗性物質からエナンチオ選択性に富む化合物を分離、回収した。大環状抗性物質を回収し、再度使用した。
例２２
本例は、シリカゲルに固着した大環状抗性物質バンコマイシンを用いて数種のラセミピリドンの分離を得る方法を示したものである。
従来のHPLC法およびpH７のアセトニトリルと１％トリエチルアンモニウムアセテ−ト緩衡液の01/90混合物の移動相を用いて行った。ほぼ純粋な形態に分離した類似体（analogues）を以下の表XVIIに示した。
0003808500.tif 000021
例２３
本例は、アフィニテイクロマトグラフィーでリファマイシンＢを用いて溶液からDNA合成酵素を分離する方法を示したものである。
本発明に従いシリカゲルにリファマイシンＢを固着した。従来の液体クロマトグラフィーカラムにリファマイシンＢを結合したシリカゲルの固体基材を充填した。次に、DNA合成酵素を含有する試料をカラムに注入した。カラムは、DNA合成酵素を分離するために、従来の装置を用い従来の方法で操作した。
例２４
本例はキャピラリー電気泳動でキラルセレクターとしてリストセチンＡを用いる方法を示したものである。
アミノ酸誘導体、非ステロイド系抗炎症剤、カルボン酸の鏡像異性体がリストセチンによって分離され、それらの分離度、移動時間、見かけの、および実効移動度が得られた。リストセチンのpHおよび濃度を示した。結果を以下の表XVIに示した。
この方法は、陰イオン、中性分子の有力な分離手法である。この方法はまた、殆どのＮ−誘導アミノ酸を分離することが出来ると思われる。いくつかの代表的な例を以下に示した。
0003808500.tif 000022
0003808500.tif 000023
0003808500.tif 000024
0003808500.tif 000025
a 第一溶出鏡像異性体の移動時間（分）
b 第二溶出鏡像異性体の移動時間（分）
c μe １）およびμe ２）はcm2・kV-1・min-1で表した第一および第二の溶出鏡像異性体の実効電気泳動移動度
d 緩衡液に添加した２mM リストセチン
e 緩衡液に添加した５mM リストセチン
f 10% ２-プロパノールと共に緩衡液に添加した２mM リストセチン
g 20% ２-プロパノールと共に緩衡液に添加した２mM リストセチン
h 30% ２-プロパノールと共に緩衡液に添加した２mM リストセチン
i これはフォリニン酸のジアステレオマーの分離である。
これらの試験は、固定波長のＵＶランプを備えたクアンタ（Quanta）4000（ウオ−タ−ズ（Waters））キャピラリー電気泳動装置を用いて実施した。全てのキラル分離は、クアドレックス社（Quadrex Corporation）から得られた50μm（内径）×32.5cm（検出器まで25cm）のフユーズドシリカキャピラリーを用いて実施し、254nmで検出した。キャピラリーは毎日0.1M水酸化カリウムで10分間状態を調節し準備した。次に、キャピラリーは５分間蒸留水で洗浄し、さらに５分間適当な濃度とpHの緩衡液を用いて洗浄した。0.1Mリン酸ナトリウム緩衡液をメスフラスコ中に準備し、水酸化ナトリウムで所望のpHに調整した。メスフラスコ中でリストセチン溶液を準備し、適当なリン酸衡液で溶解し、超音波処理によりガス抜きした。水溶性緩衡液／有機改質剤（２−プロパノール）混合物は体積で調整した。全ての試料は蒸留水中に溶解し、注入前にアルテック（Alltech）の0.45μmナイロンシリンジフィルターで濾過した。全ての分離に用いた電圧は＋５kVであった。試料は圧力を抑えるように３または５秒間かけて注入した。キラル分離は0.1mg/mlの溶液を用い室温（22℃）で実施した。この試験での全ての材料は従来のものを使用した。
120以上のラセミ化合物を分離し、表XIIIにはリストセチンＡの希薄溶液を用いて分離したそれらの化合物中代表的なものを選択しリストした。これには、全ての種類のＮ−ブロックアミノ酸と多くの他の酸性または陰イオン性化合物が含まれている。非ステロイド抗炎症剤は特に分離が容易である。リストセチンＡの鏡像異性体選択性はバンコマイシンのものに多少類似しているように思われる。しかし、バンコマイシンでは分離出来ないカルボン酸官能基を含む数種のキラル化合物をリストセチンＡで分離することができた。これらには、特にマンデリン酸、２−メトキシマンデリン酸、ｏ−アセチルマンデリン酸、３−メトキシマンデリン酸、β−フェニルラクトン酸、トロピック酸、２−ブロモ−３−メチルブチル酸、１−ベンゾシクロブテン−カルボン酸およびｐ−クロロマンデリン酸がある。リストセチンＡは、CEキラルセレクターとして用いたときリファマイシンＢとヘパリン（陽イオン化合物を分離する）を相補すると思われる。前述のバンコマイシンをベ−スにした分離法に比してリストセチンＡをベ−スにしたCE分離法には少なくとも四つの特徴がある。先ず、２mMから５mM リストセチンＡの濃度において（添加した有機補助溶剤改質剤なしに）分離時間はバンコマイシンを用いたときよりかなり短かかった。キラルセレクターとしてのバンコマイシンを用い、また類似の条件での分離時間は通常40分から70分であった。第二に、後述するように、有機改質剤は、リストセチンＡを用いたとき鏡像異性体分離能を増強するために使用することができるが、バンコマイシンを用いたときにはそれほど増強しなかった。第三に、リストセチンＡの水溶液はバンコミシンのものよりゆっくり分離するように思われた。最後に、バンコマイシンの現在のコストはリストセチンＡの場合よりはるかに低い。
例２５
本例は鏡像異性体の移動時間、実効移動度、分離度に対するリストセチン濃度の効果を示したものである。使用緩衡液はpH6.0の0.1Mリン酸塩バッファーであり、表示した濃度のリストセチンを含有するものであった。結果は以下の表XIXに示した。これらの試験は上記の例２４の場合と同様に実施した。
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a 鏡像異性体の移動時間t（１）とt（２）は分で与えられる。
b 電気浸透流に対応する時間t（eof）は分で与えられる。eof速度の減少はt（eof）の増加をもたらす。
c 実効移動度μe（１）とμe（２）はcm2・kV-1・１min-1で与えられる。
表XIXに示したように、緩衡液中のリストセチンＡの濃度はCEの分離に対して大きな効果を示す。一般に、キラルセレクターの濃度が高いと、鏡像異性体の分離能はより大きくなり、分離時間はより長くなる。分析試料溶出時間の増加の理由は、リストセチンの濃度が高くなると、電気浸透圧流がゆっくりになることによる。これは、これらのpHで、正に帯電したリストセチンはキャピラリーの壁面と相互作用を起こす傾向にあることによる。リン酸塩緩衡液の濃度を増加すると、壁面との相互作用はわずかに小さくなる。しかし、緩衡液濃度を増加させると熱を生成し、従ってベースラインノイズを増加させ、通常は使用電圧の減少を起こすという”トレードオフ”になる。本プロジェクトを通して使用した緩衡液濃度（すなわち、0.1Mリン酸塩）は前述の因子全てを考慮した結果である。同様の”壁面−相互作用”は、バンコマイシンについては既に注目された。壁面への吸収は、全ての実験条件が一定に保持される限りは実験の再現性に影響するとは思われない。
分析試料（電気浸透圧流の方向に逆の電気移動を有している）の実効移動度（μ、ｅ）は、リストセチンＡの濃度が増加するにつれ減少する。これは、キラルセレクターの濃度を増加したとき、かなりの量の分析試料がリストセチンＡに作用することによる。従って、リストセチンＡのより高い濃度における鏡像異性体分離の改良は次の二つの因子によると思われる。すなわち、（１）質量作用に起因するキラルセレクターと分析試料の作用する時間を大きくする（２）電気浸透圧流の減少に起因するキラルセレクターと分析試料の作用する時間が大きくするということである。
例２６
本例は、キラルセレクターとしてのリストセチンを用いたときの鏡像異性体の移動時間、実効移動度、および分離度に対するpHの効果を示したものである。全ての分離処理は0.1Mリン酸塩緩衡液に２mM リストセチンを用いて実施した。
以下の表XXに結果を示す。
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a 鏡像異性体の移動時間t（１）とt（２）は分で与えられる。
b 電気浸透圧流に対応する時間t（eof）は分で与えられる。eof速度の減少はt（eof）の増加をもたらすことに注目せよ。
c 実効移動度μe（１）とμe（２）はcm2・kV-1・１min-1で与えられる。
これらの結果は上記例２６の手順に従って得られた。
表XXは通常のラセミ化合物分析試料の鏡像異性体分離に対するpHの効果を示したものである。一般に、わずかに低いpHはより良好な鏡像異性体分離能を与える。しかし、pHを低下させると電気浸透圧流がかなり減少し、これにより分析時間を増加させるのでpHを低下させることには限界があり、結果的には分析試料にプロトンを付加し、中性にする。極端に低いpHでは、上記二つの効果はCEエナンチオ選択性を阻害または無効にする。
例２７
本例はキラルセレクターとしてのリストセチンを用いたとき、鏡像異性体の移動時間、実効移動度、分離度に対する有機添加剤としての２−プロパノールの濃度の効果を示したものである。以下の表XXIはこれらの結果をリストしたものである。
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全ての分離処理は、指示した体積％の有機溶剤とともに0.1Mリン酸塩緩衡液（pH７）に２mM リストセチンを用い実施した。
a 鏡像異性体の移動時間t（１）とt（２）は分で与えられる。
b 電気浸透圧流に対応する時間は分で与えられる。EOF速度の減少はt（EOF）の増加をもたらすことに注目せよ。
c 実効移動度μe（１）とμe（２）はcm2・kV-1・min-1で与えられる。
これらの結果は上記例２４で略述した工程に従って得られた。
他の大環状抗性物質（リファマイシンＢ）の場合に見出したように、有機改質剤を用いるといくつかの場合に鏡像異性体分離度を大きく変化することが出来た。２−プロパノールを使用緩衡液に加えると殆どの分析試料に対して鏡像異性体分離度を増強する傾向があった。また、有機改質剤は電気浸透流速度の減少の結果として分析（溶出）時間を大きく増強させた。有機改質剤の添加により鏡像異性体分離能を増強させる効果は分析試料により変化した。最終的には、有機改質剤の量は、鏡像異性体分離度を低下させるまでに達した。更に、CE中に水素化（hydro）−有機溶剤の混合物をより長時間にわたって用いたときは、再現性、分析時間、分離度などに影響する、溶剤によって異なる気化の現象を防止するように注意しなければならない。
リストセチンＡは水溶液中で時間とともに分離に作用する。このプロセスは酸性または塩基性pHでまた温度上昇で加速される。例えば、酸加水分解は分子からフラグメントに含まれる糖及びアミンを除去する。興味深いのは、分解生成物はグラム陽性菌に対して活性のままである。しかし、通常のCE操作条件（例えば、pH5-7, 温度15-25℃）の下でのリストセチンＡの全体にわたる安定性はバンコマイシンよりも勝ると思われる。本報告では、リストセチンＡの溶液が−４℃で冷蔵保存される場合は最高４週間まで使用し、またはそうでないときは使用しなかった。
例２８
本例は、非常に近い構造の大環状抗性物質が、キラルセレクターとして用いられたとき、わずかに類似のしかし同等ではない選択性を有することを示すものである。本例では、キラル固定相としてバンコマイシンとテイコプラニンを比較した。結果を以下の表XXIIに示した。
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（１）カラムは25cm×0.44cm（内径）バンコマイシン結合ＣＳＰ（５μm シリカゲル）であった。移動相は、10:90 アセトニトリル−１％pH4.1 トリエチルアンモニウムアセテ−ト緩衡液（体積による）、1.0ml/minで構成した。
（２）カラムは25cm×0.44cm（内径）テイコプラニン結合ＣＳＰ（５μm シリカゲル）であった。移動相は上記（１）のものと同じであった。
（３）カラムは25cm×0.44cm（内径）バンコマイシン結合ＣＳＰ（５μm シリカゲル）であった。移動相は、10:90 メタノ−ル１％pH4.1 トリエチルアンモニウムアセテート緩衡液（体積による）、1.0ml/minで構成した。
（４）カラムは25cm×0.44cm（内径）テイコプラニン結合ＣＳＰ（５μm シリカゲル）であった。移動相は上記（３）のものと同じであった。
（５）カラムは25cm×0.44cm（内径）バンコマイシン結合ＣＳＰ（５μm シリカゲル）であった。移動相は、30:70 メタノ−ル１％pH4.1 トリエチルアンモニウムアセテート緩衡液（体積による）、1.0ml/minで構成した。
（６）カラムは25cm×0.44cm（内径）テイコプラニン結合ＣＳＰ（５μm シリカゲル）であった。移動相は上記（５）のものと同じであった。
テイコプラニンカラムに関して見出されたことの一つは、誘導化してないアミノ酸および若干のジペプチドの分離が良好であったということである。
これらの試験は、結合した大環状抗生物質を除いて同等のカラムを用い従来の液体クロマトグラフィーを用いて実施した。
例２９
本例はキラル定常相としてバンコマイシンを用いて得られた良好な結果を示したものである。表XIIIにこれらの結果をリストした。
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カラム操作パラメータ
（１）移動相：テトラヒドロフランの20mMアンモニウム硝酸塩に対する体積比、10:90、pH5.5
流量：１ml/min
注入量：１μｌ
試料濃度：２mg/ml
（２）移動相：ヘキサンとエチルアルコ−ルの体積比、70:30
流量：１ml/min
注入量：１μｌ
試料濃度：２mg/ml
（３）移動相：テトラヒドロフランの20mMアンモニウム硝酸塩に対する体積比、10:90、pH5.5
流量：1.2ml/min
注入量：１μｌ
試料濃度：２mg/ml
（４）移動相：テトラヒドロフランの0.1%トリエチルアンモニウム硝酸塩に対する体積比、20:80、pH5.5
流量：1.2ml/min
注入量：３μｌ
試料濃度：２mg/ml
（５）移動相：テトラヒドロフランの20mMアンモニウム硝酸塩に対する体積比、10:90、pH5.5
流量：1.1ml/min
注入量：15μｌ
試料濃度：0.5mg/ml
（６）移動相：テトラヒドロフランの20mMアンモニウム硝酸塩に対する体積比、10:90、pH5.5
流量：1.1ml/min
注入量：６μｌ
試料濃度：0.5mg/ml
（７）移動相：エチルアルコ−ルのヘキサンに対する体積比、25:75
流量：１ml/min
注入量：30μｌ
試料濃度：0.1mg/ml
（８）移動相：100％エチルアルコールアンモミウム硝酸塩、pH5.5
流量：1.5ml/min
注入量：５μｌ
試料濃度：４mg/ml
カラムは順相
（９）移動相：テトラヒドロフランの20mMアンモニウム硝酸塩に対する体積比、90:10、pH5.5
流量：１ml/min
注入量：４μｌ
試料濃度：３mg/ml
カラムは逆相
（10）移動相：ヘキサンのエチルアルコ−ルに対する体積比、70:30、
流量：0.5ml/min
注入量：10μｌ
試料濃度：４mg/ml
（11）移動相：テトラヒドロフランの20mMアンモニウム硝酸塩に対する体積比、10:90、pH5.5
流量：１ml/min
注入量：３μｌ
試料濃度：２mg/ml
（12）移動相：アセトニトリルの0.1%トリエチルアンモニウムアセテート緩衡液に対する体積比、10:90、pH5.5
流量：1.1ml/min
注入量：15μｌ
試料濃度：0.5mg/ml
（13）移動相：エチルアルコ−ルのヘキサンに対する体積比、25:75
流量：１ml/min
注入量：１μｌ
試料濃度：４mg/ml
（14）移動相：テトラヒドロフランの0.1%トリエチルアンモニウムアセテート緩衡液に対する体積比、20:80、pH5.5
流量：1.1ml/min
注入量：１μｌ
試料濃度：４mg/ml
（15）移動相：ヘキサンのエチルアルコ−ルに対する体積比、90:10
流量：0.5ml/min
注入量：１μｌ
試料濃度：２mg/ml
（16）移動相：テトラヒドロフランの20mMアンモニウム硝酸塩に対する体積比、20:80、pH5.5
流量：１ml/min
注入量：２μｌ
試料濃度：２mg/ml
カラム、カラム準備および測定装置
異なる鏡像異性体を分離するために、従来の方法でバンコマイシンまたはテイコマイシンとシリカビ−ズ（５μ）の固定相を準備し、25cm×4.6mm（4.4cm内径）のステンレススチールカラムに充填した。ＵＶ検出器（254nm）を備えた従来の液体クロマトグラフィーを用い分離を測定した。カラムは室温（25℃）で従来の方法により操作し、チャート速度は0.5cm/minであった。
例３０
本実施例は、本発明による大環状抗性物質を用い、吸収バブル（absorption bubble）法（例えば、浮選、気泡（foam）浮選、起泡（froth）浮選、フロック（floc）浮選、フロック起泡（floc-foam）浮選）を介して分離する方法を示したものである。
図７に示した装置に用いると、試料室10には試料とキラルセパレータ12を充填する。本例においては、アセトニトルと12mg/mlの濃度のバンコマイシンを適当なバッファーにより約１％に希釈した。次に、１mlのラセミ化合物溶液と19mlのバンコマイシン希釈溶液を試料室10に入れた。試料室10の上部にはガラスビーズを充填した起泡カラム14を設置した。空気18をパイプ20、フリット（frit）22を通して試料室10に吹き込んだ。試料12を通過した気泡は発泡した。その泡の高さは空気の量により制御した。この泡はガラスビーズ16を通過したとき破壊され、液体の薄膜を形成し、カラムを流下した（すなわち、気泡の流れとは逆の流れ）。安定した向流還流を確立した後、空気18の流量を増加させることにより容器24中に気泡部分を収集した。次に、ラセミ化合物溶液中の鏡像異性体の一つを容器24に収集した。
キラルセレクターおよびラセミ混合物の濃度は、pHと同様に各々の場合に最適にしなければならない。
このようにして、大環状抗性物質を用い、吸収バブル法を利用して鏡像異性体を分離した。
例３１
本例はキラル固定相としてテイコマイシンを用いる方法を示したものである。上記例２９の手順に従って、テイコマイシンを固定相として用いて以下の鏡像異性体を分離した。カラムは、以下の点を除いては例２９と同様に操作した。
Ｄ、Ｌ−フェニルアラニン
移動相：メチルアルコールと水の体積比、40:60
流量：１ml/min
注入体積：１μｌ
試料濃度：２mg/ml
ｄ、ｌ−ＤＯＰＡ
移動相：メチルアルコールと水の体積比、40:60
流量：１ml/min
注入体積：１μｌ
試料濃度：５mg/ml
２、６−ジメチルチロシン
移動相：エチルアルコールと水の体積比、20:80
流量：１ml/min
注入体積：５μｌ
試料濃度：２mg/ml
添付した請求項は、本発明の精神と範囲から逸脱せずに説明のためにここに選択した本発明の好適な実施例の全ての変更と変形を考慮していることは理解されるであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
0003808500.tif 000036
【図４】
0003808500.tif 000037
【図６】
0003808500.tif 000038
【図７】
0003808500.tif 000039