(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌胎児性抗原（ＣＥＡ）に特異的な抗体であって、該抗原に関し５．０ｎＭ未満の解離定数（Ｋｄ）を有し、その６個の相補性決定領域（ＣＤＲｓ）はそれぞれ配列番号：２中の次の位置：Gly 52〜His 61、Trp 76〜Glu 85、Gly 125〜Tyr 135、Ser 185〜His 194、Ser 210〜Ser 216およびGln 249〜Thr 257に示される６個の配列を有する抗体。
【請求項２】
ＣＥＡに特異的な抗体であって、ＣＥＡに関し５．０ｎＭ未満のＫｄを有し、配列番号：２のGln 27〜Ser 146の配列の可変重（ＶＨ）鎖領域および配列番号：２のGlu 162〜Lys 267の配列の可変軽（ＶＬ）鎖領域を有する抗体。
【請求項３】
ＣＥＡに特異的な抗体であって、ＣＥＡに関し５．０ｎＭ未満のＫｄを有し、配列番号：２のGln 27〜Lys 267の配列の可変（Ｖ）領域を有する抗体。
【請求項４】
ＣＥＡに特異的な抗体であって、ＣＥＡに関し５．０ｎＭ未満のＫｄを有し、配列番号：２に示される配列を有する抗体。
【請求項５】
ヒト結腸直腸腺癌に結合するが、次の正常組織：肝臓、腎臓、扁桃、肺、脳、精巣、卵巣、子宮頸（cervix）、乳房、血液被膜（blood films）、胎盤、脾臓、甲状腺、食道、胃、膵臓、リンパ節および骨格筋に結合しない請求項１〜４のいずれか１つに記載の抗体。
【請求項６】
シングルチェーンＦｖ（ｓｃＦｖ）抗体である請求項１〜５のいずれか１つに記載の抗体。
【請求項７】
バクテリオファージ・ライブラリーから得ることができる請求項１〜６のいずれか１つに記載の抗体。
【請求項８】
抗腫瘍剤または検出可能な標識をそれに付加して有する請求項１〜７のいずれか１つに記載の抗体。
【請求項９】
そのＮ−末端またはＣ−末端またはその近辺に遊離のＣｙｓ残基を有する請求項１〜７のいずれか１つに記載の抗体。
【請求項１０】
99mＴｃが前記Ｃｙｓ残基に付加されている請求項９に記載の抗体。
【請求項１１】
そのＮ−末端またはＣ−末端またはその近辺に少なくとも３個の連続的Ｈｉｓ残基からなるＨｉｓ標識を有する請求項１〜７のいずれか１つに記載の抗体。
【請求項１２】
抗腫瘍剤がプロドラッグを活性化する酵素またはサイトカインである請求項８に記載の抗体。
【請求項１３】
プロドラッグを活性化する前記酵素が細菌カルボキシペプチダーゼＧ２（ＣＰＧ２）である請求項１２に記載の抗体。
【請求項１４】
前記サイトカインが腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）である請求項１２に記載の抗体。
【請求項１５】
前記サイトカインがインターロイキン−２（ＩＬ−２）である請求項１２に記載の抗体
【請求項１６】
２つの可変領域を含み、そのうちの１つが請求項１〜１５のいずれか１つに記載の抗体の可変領域である二重特異性（bispecific）抗体。
【請求項１７】
請求項１〜９および１１〜１５のいずれか１つに記載の抗体をコードするＤＮＡ分子。
【請求項１８】
請求項１７に記載のＤＮＡ分子を含む複製可能な発現ベクター。
【請求項１９】
請求項１８に記載のベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項２０】
細菌細胞である請求項１９に記載の宿主細胞。
【請求項２１】
大腸菌細胞である請求項２０に記載の宿主細胞。
【請求項２２】
哺乳動物細胞である請求項１９に記載の宿主細胞。
【請求項２３】
請求項１〜９および１１〜１６のいずれか１つに記載の抗体を産生する方法であって、
（ｉ）請求項１９〜２２のいずれか１つに記載の宿主細胞を抗体が発現されるような条件下で培養し、および
（ｉｉ）抗体を培養物から回収する、
ことを包含する方法。
【請求項２４】
治療または手術によるヒト若しくは動物の身体の処置方法、或いはヒト若しくは動物の身体に実施される診断方法に使用される請求項８〜１６のいずれか１つに記載の抗体。
【請求項２５】
結腸直腸腫瘍の手術または治療による処置、或いは結腸直腸腫瘍の診断に使用される請求項２４に記載の抗体。
【請求項２６】
請求項８〜１６のいずれか１つに記載の抗体および薬学的に許容される担体または希釈剤を含む、結腸直腸腫瘍の処置または診断のための薬学的組成物。
【請求項２７】
請求項６に記載のｓｃＦｖ抗体を得るための方法であって、
（ｉ）該抗体を発現するバクテリオファージをバクテリオファージ・ライブラリーから選択し、
（ｉｉ）選択されたバクテリオファージで細菌宿主細胞を感染させ、
（ｉｉｉ）宿主細胞を該抗体が発現されるような条件下で培養し、および
（ｉｖ）該抗体を培養物から回収する、
ことを包含する方法。
【請求項２８】
バクテリオファージ・ライブラリーが、
（ａ）非ヒト動物をＣＥＡで免疫し、
（ｂ）リンパ球を動物から得、
（ｃ）リンパ球のｍＲＮＡから、抗体のＶＨ領域およびＶＬ領域をコードするｃＤＮＡを調製し、
（ｄ）リンカーをコードする配列により、ＶＨコーディング領域とＶＬコーディング領域を結合（joining）し、および
（ｆ）結合された領域をバクテリオファージに挿入する、ことにより作製される請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
請求項１１に記載のＨｉｓ標識を含む抗体を生物学的液体から精製する方法であって、
（ｉ）金属イオンを含む固体支持体を生物学的液体と、抗体が支持体に結合するような条件下で接触させ、
（ｉｉ）支持体に結合しない生物学的液体を除去し、および
（ｉｉｉ）抗体を支持体から回収する、
ことを包含する方法。
【請求項３０】
金属イオンがＣｕ2+イオンである請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
固体支持体がアフィニティ・クロマトグラフィーカラムのマトリックスである請求項２９または３０に記載の方法。
【請求項３２】
結腸直腸腫瘍を有する患者の処置のための請求項１に記載の抗体であって、処置が、抗腫瘍剤をそれに付加して有する請求項１に記載の抗体を患者に投与することを包含する、抗体。
【請求項３３】
患者の結腸直腸腫瘍の検出のための請求項１に記載の抗体であって、検出が、
（ｉ）検出可能な標識をそれに付加して有する請求項１に記載の抗体を患者に投与し、および
（ｉｉ）標識を検出する、
ことを包含する、抗体。
【発明の詳細な説明】
本発明は、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）に対する抗体ならびに診断および治療におけるそれらの使用に関する。
ＣＥＡは、結腸直腸腫瘍のような腫瘍上に発現される抗原であり、故に、腫瘍細胞に関するマーカーである。種々の腫瘍細胞マーカーが当分野で公知であり、これら腫瘍に対する治療は、薬剤をこれらのマーカーに標的化することによって達成され得る。通常、この薬剤は、抗体もしくはそのフラグメントであり、それは細胞障害剤（cytotoxic agent）或いはプロドラッグを活性な細胞障害剤に転換し得る酵素に連結されている。
あるいは、その抗体は、画像化剤（imaging agents）に連結されることができる。これは、腫瘍細胞マーカーの発現に関連する状態の診断および予後に有用である。
標的剤としての細胞表面マーカーの使用は、ベジェント（Begent）、1990によって概説された（後掲の参照文献１参照）。
標的化される抗腫瘍治療法で使用する好適な抗体を選択するとき、考慮すべき２つの主要な基準がある。抗体は、その標的抗原に優れた親和性を有することが望ましい。これは、抗体が一旦その標的に到達したら、所望の結果、例えば、細胞障害性を達成するのに十分長い時間その標的に結合し続けることが要求されるからである。
さらに、抗体は、非標的抗原への結合がいかなる有意な程度にも起こらないように、標的抗原に対し優れた特異性を有すべきである。
多くの抗体は、組換え手段により商業的規模で産生される。これは通常、大腸菌または酵母のような宿主細胞での抗体の発現を意味する。従って、抗体は、宿主細胞において高レベルの発現が可能な核酸配列によってコードされることが望ましい。未だ十分に理解されていない理由により、幾つかの組換え核酸配列が、特定のタイプの細胞によれば、他のものよりもかなり少なく発現され得る。
ＣＥＡは、癌の画像化（参照文献８）および治療（参照文献９〜１３）に関するマーカー抗原として使用されてきた。異なる特異性と親和性を有する多数のＣＥＡ抗体が公知である（参照文献７）。当分野でＣＥＡに対し広く使用される１つの抗体は、Ａ５Ｂ７である。この抗体は、画像化および治療に有用であり、ヒトの試験で使用されてきた（参照文献９、１２、１３）。ＣＥＡに対する多くの抗体が存在するけれども、Ａ５Ｂ７抗体が、今日までのところ最も有望であると考えられてきた。
今や、Ａ５Ｂ７よりも、ＣＥＡに対する優れた特異性とより大きな親和性（約１０倍大きな親和性）を有する抗体が得られることが見出された。この抗体は、インビボでの腫瘍局在性（localisation）がＡ５Ｂ７よりも優れていることが実証され、より高い比率と量の抗体が、他の体組織よりも腫瘍に局在化している。抗体を用いた腫瘍画像化の臨床試験は、結腸直腸癌の８人の患者で、好成績な腫瘍局在性をもって開始された。非特異的な抗体の局在化は見られなかった。
抗体は、当初、バクテリオファージ・ライブラリーから得られた。抗体の遺伝子を、バクテリオファージに挿入し、得られた１０7ファージのライブラリーをＣＥＡに対する抗体発現でスクリーニングした。所望の抗体をコードする遺伝子が選択され、この遺伝子を細菌で発現させた。
本発明は、最初の実施態様で、５．０ｎＭ未満の解離定数（Kd）を有する、ＣＥＡに特異的な抗体を提供する。この抗体は一般に、０．５〜５．０ｎＭの解離定数、例えば２．５＋／−１．３ｎＭの解離定数を有する。好ましくは、この抗体は、後述するＭＦＥ−２３抗体に認識されるＣＥＡ上のエピトープに関し競合的に結合する。
抗体の特異性は好ましくは、ヒト結腸直腸腺癌に結合するが、次の正常組織：肝臓、腎臓、大腸、扁桃、肺、脳、精巣、卵巣、子宮頸（cervix）、乳房、血液被膜（blood films）、胎盤、脾臓、甲状腺、食道、胃、膵臓、リンパ節および骨格筋の幾つかまたは全てに結合しないようなものである。これは、種々の正常組織と交差反応を通常示す、多くのＣＥＡ抗体と対照的である（参照文献７参照）。
用語「抗体」は、本明細書では、完全な抗体（即ち、２本の重鎖と２本の軽鎖を有する抗体）並びに、抗原結合部位を含む抗体のフラグメント、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）2、ＦｖおよびシングルチェーンＦｖ（ｓｃＦｖ）フラグメントを包含するものとして使用される。しかしながら、本発明による抗体は、好ましくはｓｃＦｖ抗体である。ｓｃＦｖは、フレキシブル・リンカーにより、抗体の可変軽鎖（ＶＬ）が可変重鎖（ＶＨ）に連結されて構成されている。ｓｃＦｖは、抗原に結合でき、細菌で迅速に産生され得る。ｓｃＦｖは、優れた腫瘍局在性を示し、従って、インビボでの使用に利点を提供することも、現在見出されている。
本発明による特に好ましい抗体は、図３に示されるＭＦＥ−２３抗体（配列番号２）である。ＭＦＥ−２３の配列は、類似の特異性を有する他の抗体をデザインするのに使用され得る。特に、配列は、ＭＦＥ−２３の相補性決定領域（ＣＤＲｓ）を有する抗体をデザインするのに使用され得る。これらの領域は、図３（配列番号：２）中の次の位置：Gly 52〜His 61、Trp 76〜Glu 85、Gly 125〜Tyr 135、Ser 185〜His 194、Ser 210〜Ser 216およびGln 249〜Thr 257に示される。ＭＦＥ−２３の配列も、図３（配列番号：２）のGln 27〜Ser 146の配列のＶＨ鎖領域と図３（配列番号：２）のGlu 162〜Lys 267の配列のＶＬ鎖領域を有する抗体をデザインするのに使用され得る。図３（配列番号：２）のGln 27〜Lys 267の配列の可変（Ｖ）領域を有する抗体を作製することも可能である。ＭＦＥ−２３のＣＤＲｓを有するヒト化抗体を、例えば、ＥＰ−Ａ−０２３９４００（ウィンター（Winter））に開示される方法に従って作製しても良い。
さらに、上述の図３（配列番号：２）からのＣＤＲ配列に少なくとも６０％同一であるＣＤＲ配列を含む抗体をデザインすることが可能である。そのような抗体は好ましくは、図３（配列番号：２）からの配列に少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％或いは９５％も同一である配列を含む。これらの抗体は、図３（配列番号：２）からの配列に同一である配列を含む抗体の、ＣＥＡに関する高い親和性と特異性を保持しなければならない。一般に、図３からの配列の物理化学的な性質は、改変された配列を含む抗体に保持されるべきである。改変された配列中のアミノ酸は一般に、電荷、親水性／疎水性およびサイズにおいて類似であるべきである。あり得そうな置換は、下記の群の１つからのアミノ酸が同じ群からの異なるアミノ酸により置換されるものである：
Ｈ、ＲおよびＫ
Ｉ、Ｌ、ＶおよびＭ
Ａ、Ｇ、ＳおよびＴ
Ｄ、Ｅ、ＰおよびＮ
さらに、ＭＦＥ−２３の配列は、ダイアボディ（diabodies）、即ち、２つの異なる抗原に結合する二価の（bivalent）または二重特異性（bispecific）な抗体フラグメントを作製するために使用され得る。例えば、ＣＥＡおよびＣＤ１６に二重特異性なダイアボディが、ＭＦＥ−２３とハイブリドーマ３Ｇ８に由来する抗ＣＤ１６抗体のＶ遺伝子から構築された（参照文献２５）。そのようなダイアボディは、天然の細胞エフェクター・メカニズムを活用しながら、細胞破壊を標的化する強力な試薬になることを期待させる。
本発明による抗体は、抗腫瘍剤または検出可能な標識に連結しても良い。これにより、抗体は、抗腫瘍剤または検出可能な標識を腫瘍に標的化させ、この結果、腫瘍の損傷／破壊または検出が可能になる。従って、この抗体は、治療または手術（例えば、放射性免疫誘導手術（radioimmunoguided surgery））によるヒト若しくは動物の身体の処置方法に、或いはヒト若しくは動物の身体に実施される診断方法に好適に使用される。特に、この抗体は、結腸直腸腫瘍の手術または治療による処置に、或いは結腸直腸腫瘍の診断に好適に使用される。診断および治療における抗体の使用の概説は、参照文献２６に示されている。
抗体に連結される抗腫瘍剤は、抗体が連結した、或いは抗体が連結した細胞の環境の中で、腫瘍を破壊する若しくは損傷を与える、あらゆる薬剤であって良い。例えば、抗腫瘍剤は、化学療法剤もしくは放射性同位元素のような毒性物質、プロドラッグを活性化する酵素またはサイトカインであって良い。
好適な化学療法剤は、当業者に公知であり、アントラサイクリン類（anthracyclines）（例えば、ダウノマイシンおよびドキソルビシン）、メトトレキサート、ピンデシン、ネオカルチノスタチン、シス−プラチナム（cis-platinum）、クロルアンブシル（chlorambucil）、シトシンアラビノシド（cytosine arabinoside）、５−フルオロウリジン（5-fluorouridine）、メルファラン、リシン（ricin）およびカリケアミシン（calicheamicin）を含む。化学療法剤は、慣用されている方法を用いて、抗体と複合体化され得る（例えば、参照文献２７参照）。
抗腫瘍剤としての使用に好適な放射性同位元素も、当業者に公知である。例えば、131Ｉまたは211Ａｔのようなアスタチンが使用され得る。これらの放射性同位元素は、慣用されている技法を用いて、抗体に付加（attached）され得る（例えば、参照文献１１参照）。
抗体に付加される抗腫瘍剤はまた、プロドラッグを活性化する酵素であって良い。これは、腫瘍部位において不活性なプロドラッグをその活性な細胞障害性形態に活性化させ、「抗体指向性酵素プロドラッグ療法（antibody-directed enzyme prodrug therapy）」（ＡＤＥＰＴ）と呼ばれる。臨床業務では、抗体−酵素複合体は、患者に投与され、治療されるべき腫瘍の領域に局在化する。次に、プロドラッグは、細胞障害薬への転換が、局在化された酵素の影響下に治療されるべき腫瘍領域に局在化されるように、患者に投与される。
好ましい酵素は、細菌カルボキシペプチダーゼＧ２（ＣＰＧ２）であり、その使用は、例えば、ＷＯ８８／０７３７８に記載されている。本発明の抗体とＣＰＧ２との複合体は、優れた腫瘍局在性を示す。抗体−酵素複合体は、腫瘍の近辺ではない身体の各領域からのクリアランスを促進するために、所望されるならばＷＯ８９／００４２７の教示に従って、改変されても良い。抗体−酵素複合体はまた、ＷＯ８９／００４２７に従って、例えば、腫瘍の近辺ではない身体の各領域中の酵素を不活化する更なる成分を提供することにより、使用され得る。
抗体に複合体化される抗腫瘍剤はまた、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）または腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）のようなサイトカインであって良い。抗体は、サイトカインを腫瘍に標的化させ、その結果、サイトカインは、他の組織に影響を与えることなく、腫瘍に対する損傷または破壊に介在する。サイトカインは、慣用されている組換えＤＮＡ技術を用いて、ＤＮＡレベルで抗体に融合されても良い。
抗体に付加される検出可能な標識は、残存時間の短い放射性同位元素、例えば、111Ｉｎ、125Ｉまたは99mＴｃのような腫瘍画像化のための画像化剤であって良い。ＣＥＡ抗体を用いる癌画像化の概説は、参照文献８に示されている。
99mＴｃは、主としてそれが抗原結合部位から離れた位置で抗体に付加でき、これにより腫瘍局在性に改善がもたらされるので、好ましい画像化剤である。99mＴｃは、抗体のＮ−末端もしくはＣ−末端またはその付近で提供される遊離のCys残基により、抗体に連結され得る。そのような遊離のCys残基を有する抗体は、組換えＤＮＡ技術、例えば、抗体−Cys融合をコードするベクターを作製し、細菌宿主細胞のような宿主細胞で抗体−Cys融合を発現することにより、調製され得る。Cys残基は、代表的には、抗体の末端にあるが、例えば、末端から第２〜第２０番目の残基であっても良い。
本発明による検出可能な標識を含む抗体は、腫瘍の診断に有用であることに加えて、放射性免疫誘導手術（ＲＩＧＳ、参照文献３０および３１）に有用である。ＲＩＧＳは、患者に標識抗体を投与し、その後抗体が結合したあらゆる組織を外科的に取り除くことを包含する。従って、標識抗体は、外科医を腫瘍組織に誘導し、正常組織から区別するのに役立つ。
本発明による抗体はまた、ＣＥＡのインビトロでの検出または定量測定に使用され得る。例えば、抗体は、組織サンプル中のＣＥＡの酵素連結免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタン・ブロッティングまたはin situ検出に使用され得る。従って、抗体は、サンプル中のＣＥＡを検出し又は定量測定する方法に使用され得、該方法は、
（ｉ）サンプルを標識抗体と接触させ、および
（ｉｉ）サンプル中のあらゆるＣＥＡと結合した標識抗体を検出または定量測定する、ことを包含する。
代表的には、本発明による抗体を用いるサンプル中のＣＥＡを検出または定量測定するＥＬＩＳＡ法は、
（ｉ）固体支持体上に本発明による非標識抗体を固定化し、
（ｉｉ）サンプルを添加してサンプル中のあらゆるＣＥＡを非標識抗体で捕捉し、
（ｉｉｉ）本発明による標識抗体を添加し、および
（ｉｖ）あらゆる結合した標識抗体を検出または定量測定する、ことを包含する。
本発明の抗体はまた、例えば、免疫蛍光法または免疫電子顕微鏡法により、ＣＥＡのin situ検出または定量測定のために組織学的に使用されても良い。in situ検出または測定は、患者から組織標本を取り出し、標識抗体を標本中のあらゆるＣＥＡに結合させることにより遂行され得る。そのような手順の使用により、ＣＥＡの存在のみでなく、その空間的分布もまた知ることが可能である。
本発明の抗体は、ＣＥＡを精製するために使用され得る。抗体を用いて抗原を精製する、慣用されている方法が使用されても良い。そのような方法は、免疫沈降およびイムノアフィニティ・カラム法を含む。イムノアフィニティ・カラム法では、本発明による抗体を、カラムの不活性マトリックスに結合（coupled）させ、ＣＥＡを含むサンプルはカラムを流されて、ＣＥＡが保持される。続いて、ＣＥＡを溶出する。
上述の検出、測定および精製の方法に使用されるＣＥＡを含むサンプルは、患者からの組織標本または細胞抽出物であり得る。あるいは、サンプルは、組換えＤＮＡ法の結果として産生されるもの、例えば、ＣＥＡを発現する宿主細胞の培養物の抽出物であって良い。
インビトロでの使用のために抗体に付加される検出可能な標識は、放射性同位元素（例えば、32Ｐまたは35Ｓ）、ビオチン（ペルオキシダーゼに複合体化されたアビジンまたはステプトアビジン（steptavidine）により検出され得る）、ジゴキシゲニン、アルカリ性ホスファターゼまたは蛍光標識（例えば、フルオレセインまたはローダミン）であり得る。
本発明は、本発明による抗体をコードするＤＮＡ分子を含む。ＤＮＡ分子は、例えば、図３（配列番号：１）に示される配列、または図３（配列番号：１）のヌクレオチド79〜ヌクレオチド438のＶＨ鎖コーディング領域および図３（配列番号：１）のヌクレオチド484〜ヌクレオチド801のＶＬ鎖コーディング領域を含み得る。
本発明のさらなる実施態様は、本発明の抗体をコードするＤＮＡの複製および発現のためのベクターを与える。ベクターは、例えば、複製起点、必要に応じて前記ＤＮＡの発現のためのプロモーターを前記ＤＮＡに作動可能に連結して（operably linked）備えた、プラスミド、ウイルスまたはファージのベクターであり得る。「作動可能に連結される」とは、プロモーターおよび抗体のコーディング配列が、プロモーターの制御下に該コーディング配列を発現可能にする関係にある並置（juxtaposition）を指す。ベクターはまた、プロモーターのレギュレーター（regulator）を含み得る。ベクターは、１種以上の選択可能なマーカー遺伝子、例えば、細菌プラスミドの場合はアンピシリン耐性遺伝子あるいは哺乳動物ベクターに関してはネオマイシン耐性遺伝子を含み得る。ベクターは、例えば、ＤＮＡに対応するＲＮＡの産生のために、或いは宿主細胞をトランスフェクトまたは形質転換するために、インビトロで使用され得る。
本発明はまた、本発明による抗体をコードするＤＮＡの複製および発現のためのベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。細胞は、ベクターと適合性（compatible）であるように選択され、例えば、細菌、酵母、昆虫または哺乳動物のものであり得る。細菌の細胞、特に大腸菌細胞は、高レベルの抗体を可溶性形態で産生可能にするので好ましい。本発明は、本発明による抗体を産生する方法を含み、該方法は、
（ｉ）前記のような宿主細胞を抗体が発現されるような条件下で培養し、および
（ｉｉ）抗体を培養物から回収する、ことを包含する。
この方法は、本発明による抗体の大規模な産生に好適であるが、抗体の最初の分離を行うためには無論使用され得ない。最初の分離は、バクテリオファージ・ライブラリーを、ＣＥＡ抗体を発現するファージについてスクリーニングすることにより行われる。このシステムは、より大きな親和性と、より大きな特異性を有する抗体を分離可能にすることが見出された。分離方法は、一般に、
（ｉ）前記抗体を発現するバクテリオファージをバクテリオファージ・ライブラリーから選択し、
（ｉｉ）選択されたバクテリオファージで細菌宿主細胞を感染させ、
（ｉｉｉ）宿主細胞を前記抗体が発現されるような条件下で培養し、および
（ｉｖ）前記抗体を培養物から回収する、ことを包含する。
バクテリオファージは一般に、繊維状バクテリオファージである。細菌宿主細胞は一般に、大腸菌細胞である。
バクテリオファージ・ライブラリーは、
（ａ）動物をＣＥＡで免疫し、
（ｂ）リンパ球を動物から得、
（ｃ）リンパ球のｍＲＮＡから、抗体のＶＨ領域およびＶＬ領域をコードするｃＤＮＡを調製し、
（ｄ）リンカーをコードする配列により、ＶＨコーディング領域とＶＬコーディング領域を連結（joining）し、および
（ｅ）連結された領域をベクテリオファージに挿入する、ことにより作製され得る。
工程（ａ）においてＣＥＡで免疫される動物は、好適には、マウス、ラット、ウサギまたはヤギである。工程（ｂ）において、リンパ球は代表的には、動物の脾臓から得られる。工程（ｃ）において産生されるＶＨ領域およびＶＬ領域をコードするｃＤＮＡは通常、それらが工程（ｄ）において連結される前に増幅することが必要である。増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により行われ得る。
本発明による抗体を臨床的使用に好適なレベルまで精製する方法は、見出されている。この方法は、少なくとも３個の連続的His残基からなるHis標識（His tag）を、抗体のＮ−末端またはＣ−末端に、またはその近辺に提供することを包含する。この標識は、抗体が金属イオンを含む固体支持体に結合するのを促進し、これにより抗体を他の成分から分離可能とする。従って、本発明は、His標識を含む抗体を生物学的液体から精製する方法を与え、該方法は、
（ｉ）金属イオンを含む固体支持体を生物学的液体と、抗体が支持体に結合するような条件下で接触させ、
（ｉｉ）支持体に結合しない生物学的液体を除去し、および
（ｉｉｉ）抗体を支持体から回収する、ことを包含する。
我々は、この方法が、イムノアフィニティおよびイオン交換クロマトグラフィーのような、抗体を精製する慣用されている方法より優れていることを見出した。特に；（１）より高い収量の抗体が産生され、（２）スケールアップが単純で廉価であり、および（３）腫瘍由来抗原を支持体から浸出する（leaching）危険性を取り除く。
抗体中のHis標識の長さおよび位置は、抗原結合に影響を与えることなしに、金属イオンへの結合を最適化するよう選択される。His標識は、例えば、３〜２０個のHis残基、好ましくは３〜１０個のHis残基、最も好ましくは５または６個のHis残基を含み得る。抗体の末端に最も近い、標識配列の末尾（end）にあるHis残基は、末端から、好ましくは１５番目以下、より好ましくは５番目以下のアミノ酸である。この標識は、組換えＤＮＡ技術を用いて、抗体の中に設計され得る。
金属イオンは一般に、遷移金属イオン、好ましくは、Ｎｉ2+、Ｚｎ2+およびＣｕ2+のような２＋電荷を有する遷移金属イオンである。Ｃｕ2+イオンは、抗体を精製するのに非常に効果的であると見出されたので、好ましい。
ビーズのような他の支持体が使用され得るが、固体支持体は、好ましくはアフィニティ・カラム（例えば、イミノ二酢酸（ＩＤＡ）のカラム）のマトリックスである。アフィニティ・カラムを使用するとき、生物学的液体をカラム上にロードし、非結合液体を底部で集め、続いて結合抗体をカラムから溶出する。ビーズを使用するとき、生物学的液体をビーズに接触させ、ビーズを非結合液体から分離し、そして結合抗体をビーズから回収する。生物学的液体は一般に、抗体を発現する宿主細胞（例えば、細菌細胞）の培養物からの液体である。
本発明は、抗腫瘍剤または検出可能な標識を本発明の抗体に付加して有する抗体および薬学的に許容される担体または希釈剤を含む薬学的組成物を含む。臨床的使用では、抗体は通常、非経口的に、即ち、経静脈的または腹腔内に投与される。従って、薬学的組成物は通常、非経口（例えば、経静脈的または腹腔内）投与に好適なものである。そのような組成物は、都合良くは、抗体および希釈剤として等張食塩水または重炭酸塩を含む。抗体の用量は、究極的には医師の裁量にあり、医師は、治療または診断のタイプのような要因、並びに患者の体重、健康状態および年齢を考慮に入れる。抗体の好適な用量は、当分野で公知であり；例えば、参照文献９、１１、１３および２９を参照のこと。好適な用量は、ヒトの患者に対して、０．０１〜１００ｍｇ、好ましくは０．１〜１０ｍｇであり得る。本発明による抗体は、公知のＣＥＡ抗体に対するのと類似の方法で使用することができる（参照文献８〜１３）。
下記の実施例は、本発明を説明する。
【図面の簡単な説明】
図１は、ファージでｓｃＦｖフラグメントを産生する方法を示す。工程（ｉ）において、免疫されたマウスのリンパ球をｍＲＮＡの源として使用し、抗体のＶ−遺伝子のｃＤＮＡを調製する。工程（ｉｉ）において、抗体Ｖ−遺伝子をＰＣＲによりｃＤＮＡから増幅させ、その後リンカーを用いてｓｃＦｖに組み立てる。工程（ｉｉｉ）において、連結されたＶ遺伝子はファージ中にクローン化され、遺伝子産物はファージの表面にｓｃＦｖフラグメントとして表われる（displayed）。工程（ｉｖ）において、ＣＥＡに結合するファージを、ストレプトアビジンでコートされた磁気ビーズ上に捕捉することにより、選択する。工程（ｖ）において、臨床的使用のために、可溶性ｓｃＦｖが細菌で産生される。
図２は、ヒト結腸癌の異種移植片（xenograft）における125Ｉ−ＭＦＥ２３の局在化を示す。これらの画像は、注入から２９時間後（下の一組）および３５時間後（上の一組）のガンマ・カメラ画像である。
図３は、抗体ＭＦＥ２３の配列および対応するヌクレオチド配列を示す。抗体配列は、アミノ酸Gln 27から開始されると考えられる。ＣＤＲｓ、フレームワーク領域およびリンカーの位置は、次の通りである：
フレームワーク  Ｈ１：Gln 27〜Ser 51
ＣＤＲ  ＨＩ：Gly 52〜His 61
フレームワーク  Ｈ２：Trp 62〜Gly 75
ＣＤＲ  Ｈ２：Trp 76〜Glu 85
フレームワーク  Ｈ３：Tyr 86〜Glu 124
ＣＤＲ  Ｈ３：Gly 125〜Tyr 135
フレームワーク  Ｈ４：Trp 136〜Ser 146
リンカー：Gly 147〜Ser 161
フレームワーク  Ｌ１：Glu 162〜Cys 184
ＣＤＲ  Ｌ１：Ser 185〜His 194
フレームワーク  Ｌ２：Trp 195〜Tyr 209
ＣＤＲ  Ｌ２：Ser 210〜Ser 216
フレームワーク  Ｌ３：Gly 217〜Cys 248
ＣＤＲ  Ｌ３：Gln 249〜Thr 257
フレームワーク  Ｌ４：Phe 258〜Lys 267
図４および図５は、ヒト結腸直腸癌異種移植片を担持するマウスで、２４時間後および４８時間後の、抗体ＭＦＥ−２３およびＡ５−ＳＣの生物学的分布を、組織１グラム当りの注入活性および組織対血液比のそれぞれについて、示す。抗体Ａ５−ＳＣは、モノクローナル抗体Ａ５Ｂ７由来のｓｃＦｖ抗体である。テストされた組織について、Ｌｉは肝臓であり、Ｋｉは腎臓であり、Ｌｕは肺であり、Ｓｐは脾臓であり、Ｃｏは結腸であり、Ｍｕは筋であり、Ｔｕは腫瘍であり、そしてＢｌは血液である。
図６は、ＭＦＥ−ｃｙｓをクローン化するのに使用されるｐＵＣ１１９構築物を示す。このベクターは、システイン−ヒスチジン標識を含む。フレキシブル・リンカーは、１５個のアミノ酸（Gly 4 Ser）×３から成る23。ｐｅｌＢシグナル配列は、抗体フラグメントを細菌ペリプラズム中に向かわせ（direct）、そこでそれらは抗原結合コンホメーションに折り畳まれる24。図６のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、それぞれ配列番号５および配列番号６である。
図７は、ＬＳ１７４Ｔ結腸異種移植片中の、99mＴｃ−ＭＦＥ−ｃｙｓおよびＩ−１２５  ＭＦＥ−２３の局在化を示す：結果を、注入より２４時間後および４８時間後の、組織グラムごとの注入された活性のパーセントとして表す。血液（Ｂｌ）、肝臓（Ｌｉ）、腎臓（Ｋｉ）、肺（Ｌｕ）、脾臓（Ｓｐ）、結腸（Ｃｏ）、筋（Ｍｕ）、大腿（Ｆｅ）、および腫瘍（Ｔｕ）。１群につき、４匹のマウス。棒（bars）：標準偏差。
図８は、注入より２４時間後および４８時間後の、ＬＳ１４７Ｔ結腸異種移植片中の、99mＴｃ−ＭＦＥ−ｃｙｓの、組織対血液の比率を示す：肝臓（Ｌｉ）、肺（Ｌｕ）、脾臓（Ｓｐ）、結腸（Ｃｏ）、筋（Ｍｕ）、大腿（Ｆｅ）、および腫瘍（Ｔｕ）。１群につき、４匹のマウス。
図９および図１０は、ＬＳ１７４Ｔ結腸異種移植片中の、125Ｉ  ＭＦＥ２３−ＣＰＧ２および125Ｉ  ＣＰＧ２の局在化を示す。結果を、２４時間後（図９）および４８時間後（図１０）の、組織グラムごとの注入された活性のパーセントとして表す。
図１１は、Ｃ−末端に６×Ｈｉｓを含む発現のためにサブクローン化されたＭＦＥ−２３の図式的描写である。抗体発現のために、ベクターは、Ｐｅｌ  Ｂシグナル配列を含み、該配列は、ｓｃＦｖを細菌ペリプラズムに向かわせ；ここからｓｃＦｖは上清中に放出される。
★は、停止コドンを示す。図１１のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、それぞれ配列番号７および配列番号８である。
実施例１：抗体の産生
抗体遺伝子を繊維状バクテリオファージに挿入することにより、１０7又はそれ以上の抗体のライブラリーの産生と選別が可能になる。各ファージは、その表面上に抗体を発現し、対応する抗体遺伝子を含有する。所望の特性を有する抗体をコードする遺伝子は、容易に選択され、それらの抗体は、大腸菌（Escherichia coli.）の中で可溶性タンパクとして発現される。このシステムは、現在、使用されている抗体よりも高い親和性と良好な腫瘍特異性を有する、癌胎児性抗原に対する抗体の製造に使用された。結果は、ファージシステムが、一般的な診断および治療に使用される抗体を製造するための選択方法であることを示唆している。この実施例の内容は参照文献１５に報告されている。
癌胎児性抗原（ＣＥＡ）に対する放射性標識抗体は、結腸直腸の腫瘍を画像化するために使用でき、もし標的効率が改善され得るなら治療に有用かもしれない1。これはより高い親和性を有する抗体により達成され2、改良された腫瘍特異性もまた価値がある。ファージテクノロジーは、バクテリオファージの表面で機能性抗体フラグメントが呈示されることに基づく抗体製造のための新しい方法である3（総説については、参照文献４を参照）。そのような抗体の大きなライブラリーは、数回の（抗原を駆使した（antigen driven））の選択5の後に、作成され、これらから得られた抗原結合性ファージがクローン化され得る。ファージテクノロジーはまた所望の特性を有する抗体の選択を可能にする。例えば、高親和性抗体、およびそれらの抗原からゆっくり解離する抗体は、選択条件を操作することにより単離されるかもしれない6。ここでは、ファージシステムの有用性を、腫瘍標的化に対して改善された特性を有するＣＥＡに対する抗体を製造することにより例証する。
（慣用のモノクローナル抗体の製造に関する限り）免疫された動物の脾臓由来のｍＲＮＡが、所望の抗体遺伝子を非常に多く含み、適切な出発点を提供することから、マウスをＣＥＡで免疫した。抗体の可変部領域遺伝子を、特異的なプライマーを用いてｃＤＮＡから増幅し、１０7構成物からなるライブラリーを産生するバクテリオファージベクターに、単鎖Ｆｖ（single chain Fv）（ｓｃＦｖ）（可撓性のリンカー（flexible linker）により結合されたＶＨ及びＶＬ）としてクローン化した。この方法における各ステップを図１に概説する。ＣＥＡに対して特異性を有する抗体は、ファージライブラリーをビオチン化ＣＥＡに結合させ、続いてストレプトアビジン被覆ビーズで該結合ファージを捕獲することによって選択された6。選択されたファージは、大腸菌（Escherichia coli.）に感染させ、終夜増殖させることにより、数の上で増幅された。数回にわたる選択を実施し、その経過をファージＥＬＩＳＡ3によりモニターした。ＣＥＡとの陽性反応は、第一回目の選択後に得られ（原ライブラリーのＯ.Ｄ.  ０．０１３と比較してＯ.Ｄ.  ０．１３）、逐次的な２回の繰り返しでシグナルの強さはＯ.Ｄ.  １．１２まで上昇した。この時点で、個々のクローンについて、ＤＮＡシークエンシングを行い、シークエンスされた２５のクローンのうち少なくとも９つの異なるクローンが確認され、このことは異なる抗−ＣＥＡ抗体の存在を示している。低濃度でＣＥＡと結合する（換言すれば、高親和性）ｓｃＦｖを取得するために、我々は、低濃度のビオチン化ＣＥＡ（５ｎＭ）を用いて更に２回の選択を行い、次いでライブラリーを再度分析した。個々のクローン５０個のうち３４個がＥＬＩＳＡで陽性であり、またＤＮＡシークエンシングにより、最も強いＥＬＩＳＡシグナルを有する５つのものは同じクローンに由来するものであることが明らかとなった。このクローンは、ＭＦＥ−２３と命名された。
ＭＦＥ−２３は、タンパク精製の間中、同定を助けるために、Ｃ末端にｍｙｃ標識を結合した可溶性ｓｃＦｖとして発現するようサブクローン化された。細菌の培養物からのタンパク産生物（約２０ｍｇ／リットル）は、２４時間後に得られ、ｓｃＦｖをＣＥＡ−セファロースアフィニティー・クロマトグラフィー及びサイズ排除ゲル濾過により精製された。ＭＦＥ−２３の解離定数（Ｋｄ）は、蛍光消光（fluorescence quench）により２．５＋／−１．３ｎＭであることが示され、現在のところ、いくつかの最も良好な結腸直腸の腫瘍標的を産生するモノクローナル抗体であるＡ５Ｂ７についてのＫｄ値が同じ測定法で２５ｎＭである1のに比較して、ＣＥＡに高い結合親和性を示した。ｍｙｃ標識に対して向けられた第２抗体を用いる、精製ｓｃＦｖでの免疫組織化学は、10/10ヒト結腸直腸腺癌において典型的なＣＥＡ−反応性パターンを示した。正常域のヒト組織に対する特異性が調べられ、唯一大腸（large bowl）と弱い反応を示した−これは、一般に種々の正常組織と交差反応を示す多くの抗−ＣＥＡモノクローナル抗体とは対照的である7。特に我々は、ｓｃＦｖはヒト結腸直腸腺癌に結合するが、次の正常組織：肝臓、腎臓、大腸（large intestine）、扁桃、肺、脳、精巣（睾丸）、卵巣、子宮頸（cervix）、乳房、血液膜（blood films）、胎盤、脾臓、甲状腺、食道、胃、膵臓、リンパ節及び骨格筋、と結合しないことを見つけた。
インビボでの腫瘍局在性が、ヌードマウス中のＬＳ１７４Ｔヒト結腸直腸腫瘍異種移植片を用いて研究された。図２は、125ヨウ素標識化ＭＦＥ−２３を使用した腫瘍画像化を示す；腫瘍のみが視覚化される。別の実験で、組織は除去され、限局化された放射能が評価された；結果は、腫瘍：血液比が、ＭＦＥ−２３の投与後２４時間で１１：１、４８時間で５３：１であった。
ＭＦＥ−２３は、ファージテクノロジーにより製造された高親和性、高特異性抗−腫瘍抗体の最初の例であり、我々のデータは、結腸直腸癌の画像化及び治療の改良の可能性を示す。しかしながら、広い範囲の応用のために所望の特性（characterises）を有する抗体は同様の方法で得ることができるので、該システムはこの目的に限定されない。またファージテクノロジーを用いて製造された抗体は、これらの遺伝子は既にクローン化されているという長所を有するので、抗体と酵素又は毒素との融合タンパクのような遺伝的に計画された抗体誘導生成物がたやすく生産され得る4。単離の容易性およびＭＦＥ−２３の特性の有利な組み合わせは、このアプローチの効率を例証し、ファージ抗体システムが将来抗体を製造するために使用されることを示唆する。
実施例２：繊維状ファージライブラリーに由来する本発明によるｓｃＦｖとモノクローナル抗体に由来するｓｃＦｖとの比較
ｓｃＦｖは、モノクローナル抗体から得られるか、もしくは、所望の結合及び精製特性を有する抗体が容易にライブラリーから選択される繊維状ファージテクノロジーを用いて直接的に製造され得る。後者のアプローチがより有用であるという仮説を調べるために、我々はこれら２つの異なるアプローチにより製造された２つの抗−ＣＥＡ  ｓｃＦｖを比べた。精製工程及び生物学的分布パターンの両者についての我々の研究は、繊維状ファージテクノロジーによって製造されるＭＦＥ−２３は、モノクローナル抗体Ａ５Ｂ７から得られるＡ５−ＳＣと比べて好ましい結果を与えることを示した。このことは、繊維状ファージのアプローチが、腫瘍を標的にするｓｃＦｖの取得のために有用であることを示している。
方法及び材料
ｓｃＦｖのクローニング
Ａ５−ＳＣ：Ａ５Ｂ７モノクローナル抗−ＣＥＡ由来のＦｖ、及びヒト定常領域16を有するキメラ組換え体Ｆａｂ（ｒｃＦａｂ）が、Ａ５Ｂ７可変領域をコードするプラスミドＤＮＡの原料として使用された。Ａ５Ｂ７  ＶＨは、酵素ＰｓｔＩ及びＢｓｔＥ IIを用いて制限され、２％ＮｕＳｉｅｖｅアガロース中での電気泳動により単離され、次いでプロメガ（Promega）の“マジックＰＣＲ（Magic PCR）”ＤＮＡ精製システムを用いて精製された。Ａ５Ｂ７  ＶＬは、３’末端にＮｏｔ Ｉ部位を作るため、プライマーＶＫＢＡＣＫ17及び正プライマーＶＫ４ＦＯＲ−Ｎｏｔ  １18を用いるＰＣＲを使用して、同じｒｃＦａｂプラスミドから得られた。ＰＣＲフラグメントはプロメガの“マジックＰＣＲ”精製システムを用いて精製され、Ｓａｃ Ｉ及びＮｏｔ Ｉで切断された。Ａ５Ｂ７ＶＨ及びＶＬは、順次ｓｃＦｖ  ｐＵＣ１１９発現プラスミドのそれらに相当する制限部位にクローン化され、構造物Ａ５−ＳＣが得られた19。
ＭＦＥ−２３：ＭＦＥ−２３は、実施例１で述べられたように、繊維状ファージテクノロジーにより製造され、Ａ５−ＳＣと同じｓｃＦｖ  ｐＵＣ１１９発現ベクターにサブクローン化された。
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）でのｓｃＦｖの発現
プラスミドで形質転換されたＸＬ１  Ｂｌｕｅ（ストラタジーン：Stratagene）Ｅ．ｃｏｌｉ細胞は、１００μｇ／ｍｌアンピシリン及び０．１％グルコースを含む２×ＴＹ培地、３７℃で、６００ｎｍでのＯ.Ｄ.が０．９になるまで振盪された。次いで、１ｍＭのイソプロピル・ベータ−Ｄ  チオガラクトシドが添加され、終夜３０℃でインキュベーションされることにより、タンパク発現が誘導された。次いで、細胞はペレットにされ、ｓｃＦｖを含む上清がデカントされ４℃で保存された。２つのｓｃＦｖについて、抗−ＣＥＡ活性が、ＣＥＡでコートされたウエル（２μｇ／ｍｌ）を用いてＥＬＩＳＡにより調べられた。結合ｓｃＦｖは、９Ｅ１０抗−ｍｙｃ抗体（Dr. Gerrard Evan、ICRF Londonからの進呈物）、及びそれに続く抗−マウスＩｇ−ＨＲＰ接合体（ジャックソン：Jackson）によって検出され、基質としてｏ−フェニレンジアミン・ジハイドロクロライド（シグマ）を使用して視覚化された。
アフィニティーおよびサイズ排除ゲルクロマトグラフィーによるｓｃＦｖの精製
上清は、スパイラル・カートリッジ（Spiral cartridge）（S1Y10アミコン（Amicon））を用いて５−１０倍に濃縮され、次いでＰＢＳ／Ａｚ（０．０２％のアジ化ナトリウムを含む５０ｍＭ  フォスフェート、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ７）に対して透析された。該濃縮物は、７ｍｇのＣＥＡを含む７ｍｌのＣＥＡ／セファロース−４Ｂカラムに付された。非結合物質はＰＢＳ／Ａｚで除去された。結合Ａ５−ＳＣは、２段階で溶出された。最初に、５０ｍＭ  ジエチルアミン（ｐＨ１１）が付され、次いで二回目に３Ｍ  チオシアン酸アンモニウムが付された。結合ＭＦＥ−２３は、５０ｍＭ  ジエチルアミン（ｐＨ１１）で溶出された。両方の場合とも、ジエチルアミン画分は直ちに１Ｍ  リン酸塩緩衝液（ｐＨ７．５）で中和された。収集された画分は溜められ、ＰＢＳ／Ａｚに対して透析され、濃縮されて、サイズ排除による分離のためにセファクリルＳ−１００（Ｓ−１００）（Sephacryl S-100）（ファルマシア）にかけられた。単離、精製されたｓｃＦｖは、さらに０．５−１ｍｇ／ｍｌまで濃縮され、４℃で保存された。両抗体の抗−ＣＥＡ活性は、陽性のＥＬＩＳＡで確認された。
ｓｃＦｖのｐＩ：
アンファラインＰＡＧプレート（Amphaline PAG plate）ｐＨ３．５−９．５（ファルマシア）を用い、製造元の指示に従って、ｓｃＦｖの等電点電気泳動点が得られた。
ヨウ素化：
７５μｇのＡ５−ＳＣ及びＭＦＥ−２３を、クロラミンＴ／Ｌ−チロシン法20を用いて０．５ｍＣｉの１２５−Ｉでヨウ素化した。放射性標識物は、１２５−Ｉの取り込み効率を示すために薄層クロマトグラフィーにより試験され、次いでマウスに投与する前にＣＥＡ結合性を調べるため、ＣＥＡを１ｍｇ含む１ｍｌのＣＥＡ／セファロースカラムに付されて試験された。放射性標識物の安定性は、Ｓ−１００上でゲル濾過することにより調べられた。
異種移植研究
放射性標識抗体が、ＬＳ１７４Ｔヒト結腸直腸癌異種移植片21を担持したヌードマウスの尾静脈を介して投与された。各マウスに、４．３μｇ／３０．１２μＣｉのＡ５−ＳＣまたは４．３μｇ／７．７３μＣｉのＭＦＥ−２３が与えられた。マウスは、２４時間および４８時間で殺され、組織が除去され、ガンマ・カウンターを用いて活性が評価された。各時間点毎に４匹のマウスが使用された。
結果：
精製中の収量：
アフィニティー・クロマトグラフィー及びサイズ排除ゲル濾過後に、ｓｃＦｖの収率が２８０ｎｍで測定の光学密度を用いて評価された。式：分子量／チロシン残基の数×１０００＋トリプトファン残基の数×５０００を用いて、Ａ５−ＳＣの吸光率は０．６、ＭＦＥ−２３は０．７と計算された。全ての結果は、１リットルの上清からのタンパク収量として表されている。アフィニティー・クロマトグラフィー及びタンパク濃縮後、ＭＦＥ−２３が４．３ｍｇであるのに対して、０．６５ｍｇのＡ５−ＳＣが得られた。Ｓ−１００ゲル濾過及びタンパク濃縮後、Ａ５−ＳＣの収量は非常に少ないことが明らかとなり、ＭＦＥ−２３最終産物が２．７６ｍｇである（１３．８倍高い）のに比較して、わずか０．２ｍｇであった。Ｓ−１００からの溶出プロファイルは、Ａ５−ＳＣについては２つのピークを示し、それに対してＭＦＥ−２３は１ピークだけであった。ＭＦＥ−２３のピークとＡ５−ＳＣの第二番目のピークは分子量２７ｋＤに相当し、ｓｃＦｖ単量体であると予想された。Ａ５−ＳＣ  Ｓ−１００プロファイルの最初のピークは、二量体Ａ５Ｂ７であると考えられた。そこで、これについて調べ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した。
ｓｃＦｖのｐＩ：
Ａ５−ＳＣのｐＩは９−９．５であり、それに対してＭＦＥ−２３のｐＩはより低く４．５−５．５であることから、該等電点電気泳動点は、Ａ５−ＳＣがＭＦＥ−２３より、塩基性であることを示した。
ヨウ素化後の安定性：
放射性標識後のｓｃＦｖの安定性が、Ｓ−１００上でのゲル濾過により調べられた。Ａ５−ＳＣの溶出プロファイルは単一ピークを示した。二量体形成の形跡はなく、凝集体も検出されなかった。ＭＦＥ−２３のＳ−１００プロファイルは同様に一つのピークを示した。これらの結果から、ヨウ素化後のＡ５−ＳＣ単量体及びＭＦＥ−２３の物理的安定性が確認された。
両者の放射性標識物のＣＥＡ−活性が、ＣＥＡ／セファロースに結合させることにより調べられた。回収された計数パーセントは、Ａ５−ＳＣについては３０．８％、ＭＦＥ−２３については３８．７％であると計算された。
ヒト腫瘍異種移植片中のＡ５−ＳＣ及びＭＦＥ−２３の腫瘍局在性
Ａ５−ＳＣ及びＭＦＥ−２３の生物学的分布が、投与後２４時間および４８時間において測定された。組織グラム当たりのパーセント注入活性及び血液に対する組織の比率が評価された。投与後２４時間に、腫瘍中にＡ５−ＳＣについて１．２％の注入活性が局在しており、これに対してＭＦＥ−２３は３．２％であった（図４）。４８時間では、これらの腫瘍中の絶対量は両タンパクとも下がり、Ａ５−ＳＣについては０．４６％、ＭＦＥ−２３については１．２％であった（図４）。しかし、ｓｃＦｖの急速な血液クリアランスのため、これらの量は、この時点で好ましい腫瘍：血液比を生じさせた。これらは、Ａ５−ＳＣについては１１：１であり、ＭＦＥ−２３については２４：１であった（図５）。２４時間の時点では、Ａ５−ＳＣについては６：１で、ＭＦＥ−２３については１３：１であった。
Ａ５−ＳＣについて有意な活性量が腎臓で検出された。両方の時点での％注入量は、腫瘍中で検出されたものよりむしろ高く、２４時間で３．２％、４８時間で２．４％であった（図４）。これは、高い腎臓対血液比を生じさせた（２４時間で１９．７：１、４８時間で９７．２：１）。ＭＦＥ−２３は腎臓でもまた幾分の活性を示したが、これは２４時間で腎臓対血液比４．７：１及び４８時間で９．６：１を各々与えるＡ５−ＳＣで観察されるものより非常に低かった。両者の場合とも、これは、腫瘍中に局在する量よりも少なかった。Ａ５−ＳＣの取り込みは、肝臓及び脾臓でもまた観察され、組織対血液比は、４８時間でそれぞれ１５．６：１及び８．６：１であった。これは、これらの器官に局在することを示さないＭＦＥ−２３とは対照的であった。高分子量物質が放射性標識後のＡ５−ＳＣのＳ−１００プロファイルで検出されなかったことから、Ａ５−ＳＣの肝臓及び腎臓取り込みは、凝集化に起因していないようである。
結論：
この実施例は、異なる方法に由来する２つの抗−ＣＥＡ  ｓｃＦｖ（モノクローナル抗体から得られたＡ５−ＳＣ及びファージテクノロジーによって製造されたＭＦＥ−２３）についての比較研究について記載するものである。結果は、Ａ５−ＳＣと比較してＭＦＥ−２３は、より高い絶対量及び良好な腫瘍対血液比を有する、好ましい生物学的分布を示した。また、ＭＦＥ−２３は精製がより容易であった。
実施例３：結腸直腸腫瘍の画像化ためのＣ末端システインを有する本発明による抗体の99mＴＣ放射性標識化
ｓｃＦｖは、速やかな腫瘍侵入性及び早い時期での高い腫瘍対組織比を有するため、臨床上の画像研究についての可能性を有する。テクネチウムでｓｃＦｖを標識するためには、遊離のチオール基が必要である。これを達成するために、遊離のシステインをｓｃＦｖのＣ末端に結合させることのできるベクターが構築された。ＭＦＥ−２３はこのベクターにクローン化され、システイン標識したＭＦＥ−２３が、Ｄ−グルカレート転移法（D-glucarate transfer method）を用いてテクネチウムで標識された。該放射性標識物は、インビボ及びインビトロの双方で安定であることが明らかとされ、初期にインビボで好ましい腫瘍対血液比（２４時間で４：１、４８時間で８：１）を示した。ヨウ素化ＭＦＥと比べて、99mＴｃ標識化ＭＦＥは、腫瘍中で高い％注入活性を示した。
材料と方法：
ＭＦＥ−ｃｙｓの発現ベクターとクローニング：
Ｃ末端尾部にシステインを有する新しい発現ベクターを作成するために、逆ＰＣＲ部位特異的突然変異誘発28が、以前述べられた19、Ｃ末端にヘキサヒスチジン標識を含むｐＵＣ１１９に基づく発現ベクター中のヒスチジンを置換するために用いられた。変更は、オリゴヌクレオチドＣｙｓ−Ｈｉｓ−Ｆｏｒ（５’−ＴＧＧＴＧＡＴＧＡＣＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＣＣＧＴＴＴＧＡＴ−３’、配列番号：３）及びＨｉｓ６−Ｂａｋ（５’−ＴＣＡＴＣＡＣＴＡＡＴＡＡＧＡＡＴＴＣＡＣＴＧＧＣＣＧ-３’、配列番号：４）を用いての２５回のＰＣＲ、それに続く再結合（セルフ・ライゲーション）を使用して行われた。所望の配列（図６）を有するクローンがＤＮＡシークエンジングにより確認された。ＭＦＥ−２３は、Ｎｃｏ１／Ｎｏｔ１フラグメントとしてこのベクターにサブクローン化された。
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中でのＭＦＥ−ｃｙｓの発現
Ｅ．ｃｏｌｉ‘Ｓｕｒｅ’細胞（ストラタジーン）は、図６で示されるプラスミド構築物で形質転換された。細胞は、１００μｇ／ｍｌアンピシリン及び０．１％グルコースを含む２×ＴＹ培地中で３７℃で、６００ｎｍでの光学密度が１．０になるまで振盪された。タンパクの発現は、３０℃で終夜、１ｍＭイソプロピル・ベータ−Ｄ・チオガラクトシドを加えておくことにより誘導された。次いで、細胞はペレットにされ、ＭＦＥ−ｃｙｓを含む上清がデカントされ、４℃で保存された。
ＭＦＥ−ｃｙｓの精製：
上清は、スパイラルカートリッジ（Ｓ１Ｙ１０  アミコン）を用いて１０倍に濃縮され、ＰＢＳ／Ａｚ（０．０２％アジ化ナトリウムを含む、５０ｍＭ  フォスフェート、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ７）に対して透析された。該濃縮物は、７ｍｇのＣＥＡを含むＣＥＡ／セファロース−４Ｂカラムに付された。非結合物は、ＰＢＳ／Ａｚで洗い出された。結合ＭＦＥ−ｃｙｓは５０ｍＭジエチルアミン（ｐＨ１１）で溶出され、その後、該タンパクを含む画分は直ちに１Ｍ  リン酸塩緩衝液（ｐＨ７．５）で中和された。収集された画分は溜められ、ＰＢＳ／Ａｚに対して透析され、４℃で保存された。溜められた溶出液は、次いでＤｉａｆｌｏ限外濾過膜（ＹＭ１０アミコン）を用いて濃縮され、その後濃縮物はセファクリルＳ−１００（ファルマシア）上でのサイズ排除ゲル濾過により精製された。精製工程中のＭＦＥ−ｃｙｓの収量は、２８０ｎｍで測定された光学密度を用いて評価された。ＭＦＥ−ｃｙｓの吸光度は、式：分子量／チロシン残基の数×１０００＋トリプトファン残基の数×５０００を用いて、０．７であると計算された。精製されたＭＦＥ−ｃｙｓ単量体は、濃縮され、４℃で保存された。
ＭＦＥ−ｃｙｓの標識化：
ＭＦＥ−ｃｙｓは、99mＴｃ-Ｄ-グルカレート転移法22を用いて、99mＴｃで放射性標識された。１ｍｌの99mＴｃ過テクネチウム酸ナトリウム（４０．５ｍＣｉ）が、１２．５ｍｇのＤ−グルカレート一カリウム、１６．８ｍｇの重炭酸ナトリウム及び１００μｇの塩化第一スズ（塩化第一スズは、使用する直前に０．２ｍｇ／ｍｌ濃度に調製された。）に添加された。この溶液は、室温で１分間放置された。次いで、０．５ｍｌをＰＢＳ／１ｍＭ  ＥＤＴＡ中の２００μｇ  ＭＦＥ−ｃｙｓと混合した。該混合物を室温下で３０分間インキュベートし、次いでＰＤ１０カラム（ファルマシア；ＰＢＳ中の３％ヒト血清アルブミンで満たされたもの）に付し、放射性標識タンパクを遊離のパーテクネテートから分離した。99mＴｃ取り込み効率が、展開溶媒（running solvent）としてアセトニトリル／水（３０：２０）を使用する薄層クロマトグラフィーにより調べられた。ＣＥＡ−バインディングを調べるために、希釈された放射性標識ｓｃＦｖ（ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０中で１：３０）の一部（１００μｌ）が、１ｍｇのＣＥＡを含む１ｍｌのＣＥＡ−セファロースカラムに付された。該カラムは、８容量のＰＢＳ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄され、３Ｍ  チオシアン酸アンモニウムを添加することにより結合物質が得られた。さらに、標識ｓｃＦｖの安定性について、該生成物（１：３０に希釈されたもの）をセファクリルＳ−１００にかけることにより調べられた。インビボでの、放射性標識物の安定性を調べるために、投与後２４時間に標識ｓｃＦｖを注入されたマウスから採られた血清がまた、セファクリルＳ−１００に付された。99mＴｃ−標識物の安定性についてもまた、次のようにゲルオートラジオグラフィーにより調べられた：放射性標識ＭＦＥ−ｃｙｓは、１５％非還元アクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥに供された。次いで、該タンパクはイモビロンＰ（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ  Ｐ：ミリポア）の上でウエスタンブロットされ、コダックＸ−Ｏｍａｔｉｃカセット及びハイパーフィルム−ＭＰ  フィルム（Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ−ＭＰ  ｆｉｌｍ：アマシャム）により視覚化された。
異種移植研究：
ヒト結腸腺癌細胞系ＬＳ１７４Ｔが、異種移植腫瘍モデル11を創るために用いられた。99mＴｃ放射性標識ＭＦＥ−ｃｙｓ（マウスあたり１１μｇ／３６．４ｕＣｉ）が、尾部の静脈から投与された。マウスは投与後２４時間および４８時間で殺され、血液、肝臓、腎臓、肺、脾臓、結腸、筋、大腿（テクネチウム標識ＭＦＥ−ｃｙｓについてのみ）及び腫瘍が取り除かれた。活性は、７Ｍ  ＫＯＨで消化した後に、ガンマ・カウンター（LKB、Bromma、Sweden、Wallac 1284 Compugamma）で計測することにより評価された。活性は、組織グラムあたりの％注入量として表された。４匹のマウスが各時間毎に使用された。
結果：
ＭＦＥ−ｃｙｓの精製中の収量
アフィニティー・クロマトグラフィーおよびタンパク濃縮後に、４リットルの上清から１３．３ｍｇの収量のＭＦＥ−ｃｙｓが得られた。セファクリルＳ−１００からの溶出プロファイルは二つのピークを示した：第二番目のピークは、ＭＦＥ−ｃｙｓ単量体の正しい分子量である分子量２７ｋＤと一致した。最初のピークは、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で二量体のＭＦＥ−ｃｙｓであることが示された。ＭＦＥ−ｃｙｓ単量体を濃縮した後、８ｍｇの最終収量が得られ、それに対して二量体のピークからはわずか１ｍｇであった（比８：１）。単量体ＭＦＥ−ｃｙｓの精製度がＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認され、正しい分子量位置で唯一のバンドを示した。
99mＴｃ−標識ＭＦＥ−ｃｙｓの分析
ＭＦＥ−ｃｙｓは、99mＴｃ−Ｄ−グルカレート転移法を用いて標識された。薄層クロマトグラフィーは、タンパク内の99mＴｃ結合は８０％より多いことを示した。放射性標識物のＣＥＡ−結合活性は非常に良好であり、放射性標識物をＣＥＡ／セファロースカラムにかけた後、５５％のカウントが結合画分に回収された。
インビトロでのその安定性を、放射性標識物をセファクリルＳ−１００にかけることにより確認したが、殆ど分解は検出されなかった。二量体形成の形跡は見られず、凝集物も検出されなかった。この結果と一致して、ゲルオートラジオグラフィーは、ｓｃＦｖの正しい分子量位置で単一のバンドを示した。投与後２４時間に、99mＴｃ標識化ｓｃＦｖで注入されたマウスからの血清をセファクリルＳ−１００に供すると、正しい分子量位置で単一のピークが観察され、それにより、またインビボでのその安定性が確認された。
インビボ研究：
99mＴｃ−標識ＭＦＥ−ｃｙｓの生物学的分布が、４８時間かけて調べられた。組織グラムあたりの％注入活性及び組織対血液比が評価された。結果を図７及び図８に示す。これらの結果は、両者の時間において、注入された活性の約４％を示す99mＴｃ標識ＭＦＥ−ｃｙｓが２４時間で腫瘍中に局在し、また４８時間で２．４％が局在した。このｓｃＦｖの速やかなクリアランスのため、これらの量は、両方の時間で、好ましい腫瘍対血液比を生じさせた。これらは、２４時間で４：１、４８時間で８：１であった。
正常組織での顕著な活性は、腎臓でのみ観察された。テクネチウム標識ＭＦＥ−ｃｙｓは、腫瘍中よりも腎臓中で高い％注入活性を示し、それは、両時間において、高い腎臓対血液比（２４時間で１０：１及び４８時間で１７：１）を生じさせた。
結論
テクネチウム標識ＭＦＥ−ｃｙｓは、初期の診断的画像化に、インビボで好ましい生物学的分布特性を示した。テクネチウムの迅速な有効性、その低いコスト、ガンマ・カメラ画像化に対する理想的な特性、放射性核種ミリキューリーあたりの患者の放射線被爆の低さ、及び最後には、甲状腺ブロッキング剤（thyroid blocking agent）が不要であるという事実であることから、テクネチウムはイムノシンチグラフィー（immunoscintigraphy）にとても実用的なものとされる。
実施例４：カルボキシペプチダーゼＧ２（ＣＰＧ２）に融合された本発明抗体の生物学的分布
この実施例は、ＬＳ１７４Ｔ腫瘍モデル中での125Ｉ  ＭＦＥ２３−ＣＰＧ２と125Ｉ  ＣＰＧ２との生物学的分布を比較するものである。
異種移植組織の小片が、ヌードマウスの脇腹の皮下に配置された。腫瘍は、実験開始前２−３週間増殖させられた。時点あたり１グループ４匹のマウスが用いられた。
１．最初のグループ（１２マウス）には、尾静脈中に、２．８μｇ／３μＣｉ／８．６Ｕ／０．２ｍｌの125Ｉ  ＭＦＥ２３−ＣＰＧ２を静脈注射して与えた。
２．第二のグループ（８マウス）には、尾静脈中に、２．８μｇ／２１μＣｉ／０．２ｍｌの125Ｉ  ＣＰＧ２を静脈注射して与えた。
マウスは、２４時間及び４８時間で、脱血して組織を除去した。
組織グラム当たりのパーセント注入活性が、二つの時点で評価された。結果を図９及び図１０に示す。２４時間後、125Ｉ  ＭＦＥ２３−ＣＰＧ２は９．４：１の腫瘍：血液比を、一方125Ｉ  ＣＰＧ２は２：１の比を示した。４８時間後、125Ｉ  ＭＦＥ２３−ＣＰＧ２は１２．６：１の比を示し、一方125Ｉ  ＣＰＧ２は１．１：１の比を示した。このように、125Ｉ  ＭＦＥ２３−ＣＰＧ２は、腫瘍に対する好ましい限局性を示した。
実施例５：Ｈｉｓ  ＴＡＧを用いる本発明抗体の精製
この実施例は、本発明抗体の精製についての新しい方法に関する。抗体Ｃ末端に融合させたヘキサ−ヒスチジン尾部を挿入することにより、イミノ二酢酸（ＩＤＡ）誘導体化固相マトリックスに固定化された遷移金属イオンに選択的に結合するアフィニティー標識が提供される。次に示すように、この方法が、標準のＣＥＡ抗原アフィニティー・クロマトグラフィーよりも優れた方法であることが証明された。
（１）より高い収量が得られた（リットルあたり１０ｍｇであり、細菌の上清１リットルあたり２．２ｍｇとは対照的である）。後者の値は、固定化されたＣＥＡ抗原の限られた利用率（limited availability）（カラムサイズ）により大きく影響を受けた。（２）スケールアップが比較的容易でかつ経費がより少ない。（３）カラムから溶脱する腫瘍由来の抗原の危険性がない。結果は、固定化されたＣｕ2+イオンが、溶出に関して９０％純粋な生成物を与えるＨｉｓ標識物を保持している点で、Ｎｉ2+及びＺｎ2+よりも効果的であることを示した。臨床的等級の物質が、凝集した物質を除去するためにサイズ排除クロマトグラフィーを、さらに細菌の内毒素を除去するためにＤｅｔｏｘｉゲルを使用して製造された。汚染（夾雑物）レベルを評価するために、ＤＮＡ、銅及び内毒素を測定する確認アッセイが実施された。ＭＦＥ−２３  Ｈｉｓは、４℃で６ヶ月保存した後は８４％の抗原結合性を、また放射性標識後は７５％以上の抗原結合性を保持していた。更なる実験により、Ｈｉｓ尾部は、ヒト結腸直腸の腫瘍異種移植片を担持したヌードマウスにおける生物学的分布及び腫瘍局在性に影響しないことが確認された。
材料及び方法：
臨床的等級物質（clinical grade materials）の調製には、実験用生成物（laboratory products）の調製には必要とされない特別の用心深さが要求される。ここで製造された臨床的等級のｓｃＦｖは、組換生成物のためのキャンサー  リサーチ  キャンペーン管理操作マニュアル32中で詳述されているガイドラインに従ったものである。臨床的生成物の品質および安全性のためのガイドラインの要約は、以下のことを包含する：
１．精製産物の汚染を防ぐ、指定の滅菌作業領域および設備
２．発現システム及びＤＮＡシークエンシングを含む製品開発についての十分詳細な説明
３．保存上の均質性及び反応性のための試験を含む臨床上の種ロット（seed lot）の調製
４．精製の詳細および再現性
５．汚染レベル、効力、生物活性および毒性を含む、最終産物の特徴付け
基本操作方法（standard operating procedures：ＳＯＰ’s）は、上で概説する製造法の個々の段階について作成されている。
ポリヒスチジン尾部のサブクローニングと発現
ＭＦＥ−２３をコードする遺伝子は、Ｃ末端に６×Ｈｉｓを含むようｐＵＣ１１９発現ベクターにサブクローン化された（図１１−ＭＦＥ−２３  Ｈｉｓベクター）。該構築物はＥ．ｃｏｌｉ  ＴＧ１細胞にエレクトロポレーションを用いてトランスフェクトされ、１００μｇ／ｍｌアンピシリン及び１％グルコースを含む２×ＴＹ寒天上で培養された。個々のコロニーは、安全ガイドラインに従い、種ロットの製造に用いられ、同一性を確認するためＤＮＡシークエンシングが採用された。発現のため、種ロットの一部を１００μｇ／ｍｌアンピシリン及び１％グルコースを含む２×ＴＹ培地中で、３７℃、１６−２０時間振盪しながら培養した。細胞は、６００ｎｍでの光学密度（ＯＤ）が０．９に達する細胞密度まで増殖された。ｓｃＦｖの産生は１ｍＭイソプロピル  β−Ｄ−チオガラクトシドを添加し、温度を３０℃に下げて更に１６時間培養することにより促進された。細胞は１１，３００ｘｇでペレットとされ、次いでＭＦＥ−２３  Ｈｉｓを含む上清を、０．４５μｍ、続いて０．２μｍの１リットル容量のナルゲン・ディスポーザブル・フィルター（Nalgene disposable filters：Fisons，Loughborough，UK）に通過させた。
ＭＦＥ−２３  Ｈｉｓ上清の濃縮及び透析
微生物の上清は、ＲＡ２０００リザーバーとＳ１Ｙ１０スパイラルカートリッジが合体した、１０ｋＤａの分子量遮断を伴うアミコンＣＨ２限外濾過システム（アミコン、Stonehouse，Glocestershire，UK）を使用して濃縮された。臨床的等級物質用の限外濾過システムを滅菌するために、Ｈｏｓｐｅｃ中性界面活性剤の中で、続いて０．１Ｍ  水酸化ナトリウム、及び中和するため発熱物質を含まない水（Baxter,Norfolk，UK）により洗浄された。ＭＦＥ−２３  Ｈｉｓ培養上清（１−４リットル）は、２００−３００ｍｌまで濃縮され、滅菌リン酸塩緩衝化生理食塩水（ｐＨ７．２）（Dulbecco's PBS-Sigma，Poole，UK）に対して圧力透析された。粗精製のＭＦＥ−２３  Ｈｉｓは４℃、６，３００ｘｇで２０分間遠心分離され、滅菌及び濃縮ステップの間に形成されたかもしれない大きなタンパク凝集物を除去するために、０．４５μｍ及び０．２μｍのナルゲンフィルターを使用して再度濾過された。
精製
ＩＭＡＣ精製は、非滅菌条件を用いて小スケールで最適化された。臨床上の精製工程は、滅菌ガラス製品、使い捨て品及び薬剤を使用して、厳格な条件下で行われた。全ての緩衝液は、発熱物質を含まない水で作られた。イミダゾール溶液は、イオンの相互作用を抑制するために、１Ｍ  塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を含むダルベッコの滅菌ＰＢＳ（Dulbecco's sterile PBS）で緩衝化され、これにより、ヒスチジンリガンドに対する金属の選択性が改善された33。
ＩＭＡＣ
１０／２．５cmエコノカラム（Econocolumu：Bio-Rad，Hemel Hempsted，UK）は、４０ｍｌキレーティング・セファロース・ファスト・フロー［chelating Sepharose fast flow：（ファルマシア・バイオテク．、St Albans，UK）］で充填し、１００ｍｌの水を使用して重力下で平衡化した。金属イオン（１００ｍｌ）を。水中の０．１Ｍ硫酸銅、塩化亜鉛または塩化ニッケル（シグマ）としてかけ、同量の平衡化緩衝液（ＰＢＳ／１Ｍ  ＮａＣｌ）で洗浄した。カラムから金属イオンが溶脱するのを防ぐため、濃縮した透析上清に、ＮａＣｌが、最終濃度１Ｍになるよう添加された33。上清を３００ｍｌまで付し、非結合物質を集めた。４０、６０、８０、１００及び１２０ｍＭのイミダゾールグラジエントを用いて、各階段で結合産物のバッチ方式で２５０ｍｌを収集するといった競合的溶出が行われた。カラムは、１００ｍｌの５０ｍＭ  ＥＤＴＡで金属イオンを奪うことにより再生され、数カラム容量の水で再び平衡化された。
全ての画分は、カラムから溶脱してきた塩、溶出剤および金属イオンを取り除くために、ＰＢＳ中で透析された。次いで、画分は溜められ、ＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析のために攪拌セル限外濾過（stirred cell ultrafiltration）およびＰＭ１０膜（アミコン）を使用して濃縮された。臨床的物質の回収量を上げるため、その後１２０ｍＭイミダゾール画分を除く全ての透析画分が溜められ、カラムに再度付された。
ゲル濾過
ＩＭＡＣ精製物質は、凝集物と金属イオンを除去するために、さらにサイズ排除により精製された。濃縮され、０．２２μｍ滅菌フィルター（Gelman，Northampton，UK）で透析された１２０ｍＭ  イミダゾール画分は、３５０ｍｌのセファクリルＳ−１００（ファルマシア・バイオテク．）カラム（ＸＫ１６／１００−ファルマシア・バイオテク．）に付された。該画分は、ＯＤ  ２８０ｎｍで測定され、関連のある画分が溜められ、攪拌セル限外濾過を使用して濃縮され、４℃で保存された。
アフィニティー・クロマトグラフィー
濃縮後、ＰＢＳ（４００ｍｌ）中で透析された２リットルのＭＦＥ−２３  Ｈｉｓは、ＣＥＡ（８ｍｇ）を結合する、６ｍｌの臭化シアン活性化セファロース４Ｂ（ファルマシア・バイオテク）アフィニティーカラムを使用して精製された。ＣＥＡは、患者の結腸直腸腫瘍の肝臓転移物から、過塩素酸を用いて抽出することにより得られた34。３０ｍｌの上清が、一カラムに一回あたり通過される。
細菌内毒素の除去
１０×２．５cmエコノカラム（Bio-Rad）は、１０ｍｌＤｅｔｏｘｉゲル（Pierce Warriner，Chester，UK）を用いて、重力下で充填され、滅菌ＰＢＳで平衡化された。１０ｍｌの濃縮精製物がかけられ、注意深くゲルと混合され、密封したカラム中で室温下で終夜インキュベートされた。生成物は３０ｍｌのＰＢＳで洗浄することにより溶出された。
最終生成物の試験
各精製段階でのサンプルについて、内毒素のレベルが、製造者の勧める指示に従ってリムルス・アメーバー細胞分解産物（Limulus ameobocyte lysate:LSL）ゲル・クロット・バイアル（Atlas bioscan，Bognor Regis，UK）を使用して分析され、さらに、アリコート（患者投与量の３倍）を、ウサギ（Safepharm Laboratories；Derby，UK）に注射して調べられた。ＭＦＥ−２３  Ｈｉｓを含む細菌の上清、半精製されたＭＦＥ−２３  Ｈｉｓ及び最終生成物について、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）ＤＮＡ標識化及び検出アッセイ（ベーリンガー・マンハイム、Lewes，UK）を使用して、細菌ＤＮＡの存在が調べられた。プローブは、ＭＦＥ−２３プラスミドＤＮＡと全細菌ＤＮＡとを等しい割合で含む混合物を使用して構築された。ＤＩＧ標識化ＤＮＡプローブは、抗−ＤＩＧアルカリフォスファターゼ複合体を使用する酵素結合免疫測定法（enzyme-liked immunoassay）により、サンプルを標的化するハイブリダイゼーション後に検出された。プローブは、１２ｐｇのＤＮＡに対して感受性を有していた。最終生成物は、炎光光度計（Trace Element laboratory-University of Surrey）を使用して、Ｃｕ2+量が測定され、初期の各精製段階のものと比較された。また最終生成物の均質性及びペリプラズム中でｐｅｌＢリーダー配列が切断されることが確認するため、アリコートについて、ＣＲＣプロティン・シークエンシング機器（ユニバーシティ・カレッジ・オブ・ロンドン）によるアミノ酸分析を用いてタンパクの配列が調べられた。抗体の安定性は、アリコートを４℃及び−７０℃で保存し、次いで一定の時間をおき、スーパーロース（Superose）１２ＨＲ１０／３０（ファルマシア）ＦＰＬＣカラムを用いてサンプルを分析することにより評価された。４℃で６ヶ月間保存した後の抗原結合性の保持が、ＣＥＡアフィニティーカラムに既知量の精製抗体をかけ（セクション２．７参照）、％結合（比活性）を計算することにより測定された。これらの値について、同じカラムを使用して、既に精製されている既知量のＭＦＥ−２３  Ｈｉｓをかけることによって比較した。
ＭＦＥ−２３  Ｈｉｓのヨウ素化
ＭＦＥ−２３  Ｈｉｓの125ヨウ素（125Ｉ）での放射性標識は、クロラミンＴ法35を使用して行われた。典型的に、０．５ｍｌ容量で精製物の６７−２５０μｇが放射性標識され、１６７−４８１ＭＢｑ／μｇの比活性が得られた。
放射性標識生成物の分析
125Ｉ取り込み％を測定するために、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）が行われた。またＣＥＡ連結セファロース４Ｂ（１ｍｇ  ＣＥＡ；１ｍｌカラム容量）に放射性標識の希釈物を付することにより、抗原結合性が評価された。非結合画分は２倍のカラム容量のＰＢＳで、また結合画分は同量の３Ｍ  チオシアン酸アンモニウムで洗い出された。ＣＥＡに特異的でないコントロールｓｃＦｖ  Ｂ１．８及びｃ−ｍｙｃ標識を含むＭＦＥ−２３（ＭＦＥ−２３  ｍｙｃ）を、比較物として試験した。非結合及び結合画分について、ガンマ・カウンターを使用して125Ｉ活性が測定された。安定性評価は、放射性標識物及び非結合生成物のサンプルを１５％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥミニゲルにかけることにより行った。125Ｉ−ＭＦＥ−２３  Ｈｉｓは、オートラジオグラフィーにより、また非結合生成物はクマーシー・ブルー染色により視覚化された。また125Ｉ−ＭＦＥ−２３  Ｈｉｓは、１００ｍｌのセファクリルＳ−１００カラム（１１５×１ｃｍ）にかけられた。１．５ｍｌの画分が集められ、125Ｉ活性が計測された。
インビボ異種移植実験
125Ｉ−ＭＦＥ  Ｈｉｓの腫瘍局在性及び生物学的分布が、ＬＳ１７４Ｔヒト腫瘍異種移植片を担持したヌードマウスで調べられた。既に、特徴付けられ、アフィニティー評価がなされ、かつヒト腫瘍異種移植片中に局在することが示されているＭＦＥ−２３  ｍｙｃ（実施例１）が、比較物として含まれた。腫瘍の重量が約０．５ｇである時、放射性標識抗体がマウスの尾静脈中に投与された。各マウスに、５μｇ／１０μＣｉの125Ｉ標識抗体が与えられ、各群から４匹のマウスが２４時間後に犠牲になった。組織及び血液サンプルは除かれ、重量が測定され、７Ｍ  水酸化カリウム中で２４時間消化されて、次いでガンマ・カウンターを用いて活性が評価された。
結果
最適化ＩＭＡＣ
Ｎｉ2+、Ｚｎ2+及びＣｕ2+について，ＩＭＡＣ固体支持体に対する金属イオンとしての効力が比較された。ＳＤＳ  ＰＡＧＥ電気泳動により、一般に非特異的タンパクの大多数のものが、カラムから非結合画分中に洗い出されることが示された。さらに、不純物は、１０−４０ｎＭの低濃度のイミダゾールと競合させることにより溶出された。イミダゾールの濃度の増加は、金属結合部位と競合して、Ｈｉｓ標識化物の溶出をもたらした。この段階的イミダゾール・グラジエントは、Ｎｉ2+、Ｚｎ2+及びＣｕ2+固定化金属イオンに結合している抗体の効力及び純粋な生成物がカラムから溶出したレベルを比較するのに有用であった。カラムをＥＤＴＡを用いて剥がすと、残りの物が溶出された。カラムをＮｉ2+で満たした（primed）場合、不純物が全てのイミダゾール溶出物及びＥＤＴＡ画分中に存在していた。カラムに対するＮｉ2+の弱い結合親和性に反映して、イミダゾール溶出において、Ｎｉ2+の明らかな溶脱があった。これに対して、カラムがＺｎ2+で満たされた場合は、Ｎｉ2+を使用する場合よりも、純粋な生成物の製造においてイミダゾールグラジエントがより有効であった。しかしながら、８０−１２０ｍＭイミダゾール及びＥＤＴＡ画分は、ある程度残存する不純物を含んでいた。最適な溶出プロファイルは、Ｃｕ2+イオンでカラムを満たしておくことにより得られ、純粋な生成物は６０−１２０ｍＭイミダゾール及びＥＤＴＡ画分で溶出された。
純粋な生成物は、ＥＤＴＡ画分中にも溶出されるが、多回数の透析後ですら除去することが困難な銅イオンが高レベルで存在しているため、臨床的使用のための更なる処理は施されなかった。この画分は、透析され、カラムに再び付された。
これらの結果から、銅が、ＭＦＥ−２３  Ｈｉｓの臨床的製造のための固定化金属イオンとして選択された。大量の臨床用バッチの操作を容易にするために、イミダゾール濃度４０ｍＭ及び１２０ｍＭのステップ・グラジエントが採用された。不純物は、単一のクロマトグラフィーのステップ中で、２５０ｍｌの４０ｍＭイミダゾールで溶出することにより、１２０ｍＭイミダゾール（２５０ｍｌ）での純粋生成物から分離された。
精製度及び収量
臨床的等級のＭＦＥ−２３  Ｈｉｓをゲル濾過することにより、一回の精製ステップ後の生成物の９０％が単量体の形態を有するものであることが明らかになった。大きい分子量の物質は、生成物から効率的に分離された。臨床用バッチの最終生成物の収量は、上清（ＯＤ２８０ｎｍでの吸光率が０．７）１リットル当たり約１０ｍｇであった。アフィニティー精製された物質について、カラムを一回通過させて得られるリットル当たりの収量は、２．２ｍｇであった。
最終生成物の評価
臨床的等級のＭＦＥ−２３  Ｈｉｓの各クロマトグラフィーステップにおける、細菌内毒素及び銅での汚染レベルを表Ｉに示す。
0003783143.tif 000002
結果は、Ｄｅｔｏｘｉゲルが、精製ｓｃＦｖから収率の減少を伴うことなく、細菌内毒素を少なくとも１対数スケールで除去するのに有効であることを示した。また最終生成物には、インビボのウサギ試験により、発熱性物質が含まれないことが確認された。溶脱するリガンドの量もまた、Ｃｕ2+分析により測定された。銅のレベルは、多数回の透析後に非常に減少し、最終物中には極めて低レベル存在するのみであった。ＤＮＡは、最終精製産物中には検出されなかった（測定感度＝１２ｐｇ）。タンパクの初めの１５Ｎ末端アミノ酸のプロテイン・シークエンシングは、ＤＮＡ配列と矛盾しないことを示した。これはまた、ｐｅｌ  Ｂリーダーがペリプラズム中で切断されることを確認するものである。４℃及び−７０℃での６ヶ月までの安定性評価は、ＦＰＬＣ分析上の単一ピークがｓｃＦｖの分子量と一致し、凝集物が存在しないことを示した。
４℃で６ヶ月間保存した際における抗原結合の保持を表IIに示す。これは、平均値７５％の結合が達成されたことを示した。
表II．ＩＭＡＣ（ａ−ｃ）及びＣＥＡ抗原アフィニティー・クロマトグラフィー（ｄ）を使用して精製されたＭＦＥ−２３  Ｈｉｓの比活性
比活性は、透析や濃縮ステップで幾らか喪失されるので、回収された抗体レベルを基準とした。ＩＭＡＣ精製物（ａ−ｃ）についての平均の％結合比活性は、７５％である。
0003783143.tif 000003
放射性標識ＭＦＥ−２３  Ｈｉｓ
放射性標識物について、ＴＬＣ分析を使用して％取り込みを調べたところ、９５−９９％の125ヨウ素が抗体に結合するという結果が示された。抗原結合性の保持は、放射標識後、抗原に対する結合性を測定することにより評価された。放射標識された臨床用ＭＦＥ−２３  Ｈｉｓバッチのサンプルは、ＣＥＡカラムにかけられた。回収された全計測数（１７１０ｃｐｍ）のうち、４３５ｃｐｍ（２５％）が非結合画分に洗いだされ、１２７５ｃｐｍ（７５％）が結合画分中に溶出した。非結合画分は、引き続き再びカラムに付され、更に、付された総数の５８％のものが結合画分に回収された。希釈された放射性標識ＭＦＥ−２３  ｍｙｃ及びＢ１．８のサンプルがまたＣＥＡカラムに付された。ＭＦＥ−２３  ｍｙｃについては、回収された全計測数（４０９０１ｃｐｍ）の５６％（２３０２３ｃｐｍ）のものがカラムに結合し、１７８７８ｃｐｍ（４３％）が非結合物として洗い出された。非特異的コントロール抗体Ｂ１．８については、全回収計測数（１２７１７ｃｐｍ）のわずか１０％（１３０１ｃｐｍ）のものがカラムに結合し、８９％（１１４１６ｃｐｍ）もが非結合画分に含まれた。放射性標識物の安定性が、ＳＤＳ  ＰＡＧＥ及びゲル濾過により調べられ、モノマー、無傷であり、かつ凝集していないことが明らかとされた。
インビボ研究
125Ｉ−ＭＦＥ−２３  Ｈｉｓは、選択的に腫瘍に局在し、治療上の腫瘍対血液比２２：１を示した。ＭＦＥ−２３  ｍｙｃも腫瘍対血液比について同様な結果（９：１）を生じた。正常組織中でのＭＦＥ−２３  Ｈｉｓの取り込みについてもまた、抗体の主たるクリアランス経路である腎臓中で高いレベルであるのを除けば、既に特徴付けられているＭＦＥ−２３  ｍｙｃに匹敵した。
参照文献（REFERENCES）
1.  ベジェント  アールエッチジェイ（Begent RHJ）：ターゲッティッド  セラピーズ（Targeted therapies）：セル  サーフィス  ターゲッツ（cell surface targrts）．イン：ポンダー  ビー編（In：Ponder B. ed.）キャンサー  バイオロジー  アンド  メディシン（Cancer Biology and Medicine），第２巻（vol.2）．クレワー  アカデミック  パブリケーションズ（Klewer Academic Publications），1990；161-184
2.  シュロム  ジェイ（Schlom J），エーゲンシュペルガー  ディー（Eggensperger D），コルヒャー  ディー（Colcher D），モリノロ  エイ（Molinolo A），ホウシェンス  ディー（Houchens D），ミラー  エルエス（Miller LS），ヒンクル  ジー（Hinkle G）及びシラー  ケイ（Siler K.）セラピューティック  アドバンテージ  オブ  ハイ−アフィニティー  アンチカルチノーマ  ラジオイムコンジュゲーツ（Therapeutic advantage of high-affinity anticarcinoma radioimmunoconjugates）．キャンサー  リサーチ（Cancer Res）1992；52；1067-1072．
3.  マクカファーティー  ジェイ（McCafferty J），グリフィス  エイディー（Griffiths AD），ウインター  ジー（Winter G）及びチスウェル  ディージェイ（Chiswell DJ）：ファージ  アンチボディーズ（Phage antibodies）：フィラメンタス  ファージ  ディスプレイング  アンチボディー  バライアブル  ドメインズ（filamentous phage displaying antibody variable domains）．ネイチャー（Nature）1990；348；552-554．
4.  ホーキンズ  アールイー（Hawkins RE），レウェリン  エムビー（Llewelyn MB）及びラッセル  エスジェイ（Russell SJ）：モノクローナル  アンチボディーズ  イン  メディシン（Monoclonal Antibodies in Medicine）．アダプティング  アンチボディーズ  フォー  クリニカル  ユース（Adapting antibodies for clinical use）．ビーエムジェイ（BMJ）1992；305；1348-1352．
5.  クラクソン  ティー（Clackson T），ホーゲンブーム  ジェイジェイアール（Hoogenboom JJR），グリフィス  エイディー（Griffiths AD）及びウインター  ジー（Winter G）：メイキング  アンチボディー  フラグメンツ  ユージング  ファージ  ディスプレイ  ライブラリーズ（Making antibody fragments using phage display libraries）．ネイチャー（Nature）1991，352；624-628．
6.  ホーキンズ  アールイー（Hawkins RE），ラッセル  エスジェイ（Russell SJ）及びウインター  ジー（Winter G）．セレクション  オブ  ファージ  アンチボディーズ  バイ  バインディング  アフィニティー（Selection of phage antibodies by binding affinity）：ミミッキング  アフィニティー  マチュレーション（mimicking affinity maturation）．ジャーナル  オブ  モレキュラー  バイオロジー（J. Mol. Biol.）1992；226；889-896．
7.  ナップエム（Nap M），ハンマーストローム  エム−エル（Hammerstrom M-L），ボルマー  オー（Bormer O），ハンマーストローム  エス（Hammerstrom S），ワーグナー  シー（Wagner C），ハント  エスら（Handt S，et al.）スペシフィシティー  アンド  アフィニティー  オブ  モノクローナル  アンチボディーズ  アゲインスト  カルチノエンブリオニック  アンチゲン（Specificity and affinity of monoclonal antibodies against carcinoembryonic antigen），キャンサー  リサーチ（Cancer Res）1992；52；2329-2339．
8.  ゴールデンバーグ  ディーエム（Goldenberg DM）．キャンサー  イメージング  ウイズ  シーイーエイ  アンチボディーズ（Cancer imaging with CEA antibodies）：ヒストリカル  アンド  カレント  パースペクティブズ（historical and current perspectives）．ザ  インターナショナル  ジャーナル  オブ  バイオロジカル  マーカーズ（The International Journal of Biological Markers）1992；7；183-188．
9.  レダーマン  ジェイエイ（Ledermann JA），ベジェント  アールエッチジェイ（Begent RHJ），マソフ  シー（Massof C），ケリー  エイエムビー（Kelly AMB），アダム  ティー（Adam T）及びバグシャウェ  ケイディー（Bagshawe KD）：ア  フェーズ  −  アイ  スタディー  オブ  リピーティッド  セラピー  ウイズ  ラジオラベルド  アンチボディー  トゥー  カルチノエンブリオニック  アンチゲン  ユージング  インターミッテント  オア  コンテキニュアス  アドミニストレーション  オブ  シクロフポリン  エイ  トゥー  サプレス  ザ  イミューン  レソポンス（A phase - I study of repeated therapy with radiolabelled antibody to carcinoembryonic antigen using intermittent or continuous administration of cyclosporin A to suppress the immune response），Int．J，Cancer 1991；47；659-664．
10.  ペドレイ  アールビー（Pedley RB），デール  アール（Dale R），ボーデン  ジェイエイ（Boden JA），ベジェント  アールエッチジェイ（Begent RHJ），キープ  ピーエイ（Keep PA），グリーン  エイジェイ（Green AJ）．ジ  エフェクト  オブ  セカンド  アンチボディー  クリアランス  オン  ザ  ディストリビューション  アンド  ドシメトリー  オブ  ラジオラベルド  アンチ−シーイーエイ  アンチボディー  イン  ア  ヒューマン  コロニック  テュモア  キセノグラフト  モデル（The effect of second antibody clearance on the distribution and dosimetry of radiolabelled anti-CEA antibody in a human colonic tumour xenograft model）．Int．J．Cancer 1989；43；713-318．
11.  ペドレイ  アールビー（Pedley RB），ボーデン  ジェイエイ（Boden JA），ボーデン  アール（Boden R），デール  アール（Dale R），ベジェント  アールエッチジェイ（Begent RHJ），コンパラティブ  ラジオイムノセラピー  ユージング  インタクト  オア  F（ab'）2フラグメンツ  オブ  131I  アンチ−シーイーエイ  アンチボディー  イン  ア  コロニック  キセノグラフト  モデル（Comparative radioimmunotherapy using intact or F（ab'）2 fragments of 131I anti-CEA antibody in a colonic xenograft model）．ブリティッシュ  ジャーナル  オブ  キャンサー（Br．J．Canncer）1993；68；69-73．
12.  レダーマン  ジェイエイ（Ledermann JA），ベジェント  アールエッチジェイ（Begent RHJ），バグシャウェ  ケイディー（Bagshawe KD），リッグス  エスジェイ（Riggs SJ），サール  エフ（Searle F），グレーサー  エムジー（Glaser MG），グリーン  エイジェイ（Green AJ），デール  アールジー（Dale RG）．リピーティッド  アンチテュモア  アンチボディー  セラピー  イン  マン  ウイズ  サプレッション  オブ  ザ  ホスト  レスポンス  バイ  シクロスポリン  エイ（Repeated antitumour antibody therapy in man with suppression of the host response by Cyclosporin A．ブリティッシュ  ジャーナル  オブ  キャンサー（Br．J．Cancer）1988；58；654．
13.  ボクサー  ジーエム（Boxer GM），ベジェント  アールエッチジェイ（Begent RHJ），ケリー  エイエムビー（Kelly AMB），サウスオール  ピージェイ（Southall PJ），ブレアー  エスビー（Blair SB），テオドロン  エヌエイ（Theodoron NA），ダウソン  ピーエム（Dawson PM），レダーマン  ジェイエイ（Ledermann JA）．ファクターズ  インフルエンシング  バライアビリティー  オブ  ローカリゼーション  オブ  アンチボディーズ  トゥー  カルチノエンブリオニック  アンチゲン（CEA）イン  ペイシャンツ  ウイズ  コロレクタル  カルチノーマ  −  インプリケーションズ  フォー  ラジオムノセラピー（Factors influencing variability of localisation of antibodies to carcinoembryonic antigen（CEA）in patients with colorectal carcinoma - implications for radiommunotherapy）．ブリティッシュ  ジャーナル  オブ  キャンサー（Br．J．Cancer）1992；65；825-831．
14.  ウインター  ジー（Winter G）及びミルシュタイン  シー（Milstein C）．マンメイド  アンチボディーズ（Man-made antibodies）．ネイチャー（Nature）1991；349；293-299．
15.  チェスター  ケイエイ（Chester KA），ベジェント  アールエッチジェイ（Begent RHJ），ロブソン  エル（Robson L），キープ  ピー（Keep P），ぺドレイ  アールビー（Pedley RB），ボーデン  ジェイエイ（Boden JA），ボクサー  ジー（Boxer G），グリーン  エイ（Green A），ウインター  ジー（Winter G），コシェット  オー（Cochet O），ホーキンズ  アールイー（Hawkins RE）．ファージ  ライブラリーズ  フォー  ジェネレーション  オブ  クリニカリー  ユースフル  アンチボディーズ（Phage libraries for generation of clinically useful antibodies）．Lancet Feb 1994；343；455-456．
16.  チェスター  ケイエイ（Chester KA），ロブソン  エル（Robson L），キープ  ピーエイ（Keep PA），ペドレイ  アールビー（Pedley RB），ボーデン  ジェイエイ（Boden JA），ボクサー  ジーエム（Boxer GM），ホーキンズ  アールイー（Hawkins RE），ベジェント  アールエッチジェイ（Begent RHJ）．プロダクション  アンド  テュモア  バインディング  キャラクタリセーション  オブ  アキメリック  アンチ-CEA FAB  イクスプレスト  イン  エシェリヒア  コリ（Production and tumour binding characterisation of a chimeric anti-CEA FAB expressed in Escherichia coli）．Int．J．Cancer，57，62-72（1994b）．
17.  オルランディ  アール（Orlandi R），グソウ  ディーエイチ（Gussow DH），ジョーンズ  ピーティー（Jones PT），ウインター  ジー（Winter G）．クローニング  イムノグロブリン  バライアブル  ドメインズ  フォー  イクスプレッション  バイ  ザ  ポリメラーゼ  チェイン  リアクション（Cloning immunoglobulin variable domains for expression by the polymerase chain reaction），Proc．nat．Acad．Sci．（Wash．），86，3383-3837（1989）．
18.  クラクソン  ティー（Clackson T），ホーゲンブーム  エイチアール（Hoogenboom HR），グリフィス  エイディー（Griffiths AD），ウインター  ジー（Winter G）：メイキング  アンチボディー  フラグメンツ  ユージング  ファージ  ディスプレイ  ライブラリーズ（Making antibody fragments using phage display libraries）．ネイチャー（Nature）352，624-28（1991），
19.  ホーキンズ  アールイー（Hawkins RE），ズー  ディー（Zhu D），オベッカ  エム（Ovecka M），ウインター  ジー（Winter G），ハンブリン  ティージェイ（Hamblin TJ），ロング  エイ（Long A），スティーブンソン  エフケイ（Stevenson FK）．イディオタイピック  ワクシネーション  アゲインスト  B-セル  リンフォーマ（Idiotypic vaccination against B-cell lymfoma）．レスキュー  オブ  バライアブル  リージョン  ジーン  シークエンシーズ  フロム  バイオプシー  マテリアル  フォー  アッセンブリー  アズ  シングル−チェイン  Fv  ワクチンズ（Rescue of variable region gene sequences from biopsy material for assembly as single-chain Fv vaccines）．ブラッド（Blood），83，3279（1994）．
20.  ハンター  ダブリューエム（Hunter WM），グリーンウッド  エフシー（Greenwood FC）．プレパレーション  オブ  イオジン-131  ラベルド  ヒューマン  グロース  ホルモン  オブ  ハイ  スペシフィック  アクティビティ（Preparation of Iodine-131 labelled human growth hormone of high specific activity）．ネイチャー（Nature），194，495-496（1932）．
21.  ペドレイ  アールビー（Pedley RB），ベジェント  アールエッチ（Begent RH），ボーデン  ジェイエイ（Boden JA），ボーデン  アール（Boden R），アダム  ティー（Adam T），バグシャウェ  ケイディー（Bagshawe KD）．ジ  エフェクト  オブ  ラジオセンシタイザーズ  オン  ラジオ−イムノセラピー，ユージング  131I-ラベルド  アンチ-CEA  アンチボディーズ  イン  ア  ヒューマン  コロニック  キセノグラフト  モデル（The effect of radiosensitizers on radio-immunotherapy，using 131I-labelled anti-CEA antibodies in a human colonic xenograft model）．Int．J．Cancer，47，597-602（1991）．
22.  パク  ケイワイ（Pak KY），ネーデルマン  エムエイ（Nedelman MA），タム  エスエイチ（Tam SH），ウイルソン  ビー（Wilson B），ダドナ  ピーイー（Daddona PE）．ラベリング  アンド  スタビリティー  オブ  ラジオラベルド  アンチボディー  フラグメンツ  バイ  ア  ディレクト  99mTc-ラベリング  メソッド（Labelling and stability of radiolabeled antibody fragments by a direct 99mTc-labelling method）．Nucl．Med．Biol．1992；19；699-677．
23.  ヒューストン  ジェイエス（Huston JS），マクカートニー  ジェイ（McCartney J），タイ  エムエスら（Tai MS，et al），メディカル  アプリケーションズ  オブ  シングル−チェイン  アンチボディーズ（レビュー）（Medical  Applications of single-chain antibodies（review））．Int．Rev．Immunol．1993；10（2-3）：195-217．
24.  スケラ  エイ（Skerra A），プルクツン  エイ（Plucktun A）．アッセンブリー  オブ  ア  ファンクショナル  イムノグロブリン  フラグメント  イン  エシェリヒア コリ（Assembly of a functional immunoglobulin fragment in Escherichia coli）．サイエンス（Science）1988；240；1038-1041．
25.  コシェット  オー（Cochet O），プロスペロ  ティー（Prospero T），チェスター  ケイエイ（Chester KA），テイランド  ジェイ−エル（Teilland J-L），ウインター  ジー（Winter G），ホーキンズ  アールイー（Hawkins RE）．ビバレント  アンド  ビスペシフィック  ダイアボディーズ  フォー  コロレクタル  テュモア  ターゲッティング（Bivalent and bispecific diabodies for colorectal tumour targeting）．アブストラクト  オブ  キーストーン  シンポジウム（Abstract of Keystone Symposium），7-13  March 1994，レイク  タホエ（Lake Tahoe），カリフォルニア（California）．J．Cellular Biochem 1994 518D 211，アブストラクト  ナンバー（abstract no．）T  508．
26.  ワルドマン（Waldmann）．モノクローナル  アンチボディーズ  イン  ダイアグノーシス  アンド  セラピー（Monoclonal Antibodies in Diagnosis and Therapy）．サイエンス（Science）1991，252，1657-1661．
27.  ヘルメンティン  アンド  セイラー（Hermentin and Seiler）．インベスティゲーションズ  ウイズ  モノクローナル  アンチボディー  ドラッグ  （アンスラサイクリン）コンジュゲーツ（Investigations with monoclonal antibody drug（anthtacycline）conjugates）．Behring Inst．Mitt．1988，82，197-215．
28.  ヘムスレイ  エイ（Hemsley A），アーンハイム  エヌ（Arnheim N），トネイ  エムディー（Toney MD），コルトパシ  ジー（Cortopassi G），ガラス  ディージェイ（Galas DJ）（1989）．ア  シンプル  メソッド  フォー  サイト−ディレクティッド  ミュータジェネシス  ユージング  ザ  ポリウネラーゼ  チェイン  リアクション（A simple method for site-directed mutagenesis using the polyunerase chain reaction）．Nucl．Acids Res.17：6545-6551．
29.  バグシャウェら（Bagshawe et al）．アンチボディ，イムノコンジュゲーツ，アンド  ラジオファーマシューティカルズ（Antibody，Immunoconjugatrs，and  Radiopharmaceuticals）（1991），4，915-922．
30.  ブレアー  エスディー（Blair SD），テオドロウ  エヌエイ（Theodorou NA），ベジェント  アールエッチジェイら（Begent RHJ et al）（1990）．コンパリズン  オブ  アンチ−フェタル  コロニック  マイクロビルス  アンド  アンチ-CEA  アンチボディーズ  イン  ペロペラティブ  ラジオイムノローカリゼーション  オブ  コロレクタル  キャンサー（Comparison of anti-fetal colonic microvillus and anti-CEA antibodies in peroperative radioimmunolocalisation of colorectal cancer），Br．J．Cancer，61，891．
31.  ツトル  エスイー（Tuttle SE），ジェウェル  エスディー（Jewell SD），モジシク  シーエムら（Mojzisik CM et al）（1988）．イントロペラティブ  ラジオイムノローカリゼーション  オブ  コロレクタル  カルチノーマ  ウイズ  ア  ハンド−ヘルド  ガンマ  プローブ  アンド  MAb  B72.3（Introperative radioimmunolocalisation of colorectal carcinoma with a hand-held gamma probe and MAb B72.3）：コンパリズン  オブ  イン ビボ  ガンマ  プローブ  カウンツ  ウイズ  イン ビトロ  MAb  ラジオローカリゼーション（comparison of in vivo gamma probe counts with in vitro MAb radiolocalisation）．Int．J．Cancer，42，352．
32.  ベジェント  アールエッチジェイ（Begent RHJ），チェスター  ケイエイ（Chester KA），コノーズ  ティー（Connors T），クロウザー  ディー（Crowther D），フォックス  ビー（Fox B），グリフィス  イー（Griffiths E），ヒンス  ティーエイ（Hince TA），レダーマン  ジェイエイ（Lederman JA），マクビー  ジェイジー（McVie JG），マイノー  ピー（Minor P），セッヒャー  ディーエス（Secher DS），シュバルツマン  ジー（Schwartsmann G），トープ  アール（Thorpe R），ウィルビン  シー（Wilbin C），ツヴィルジナ  エイチ（Zwierzina H）．（1993）キャンサー  リサーチ  キャンペーン  オペレーション  マニュアル  フォー  コントロール  リコメンデーションズ  フォー  プロダクツ  デライブド  フロム  リコンビナント  DNA  テクノロジー  プリペアード  フォー  インベスティゲーショナル  アドミニストレーション  トゥー  ペイシャンツ  ウイズ  キャンサー  イン  フェーズ  I  トライアルズ（Cancer Resarch Campaign Operation Manual for control recommendations for products derived from recombinant DNA technology prepared for investigational administration to patients with cancer in phase I trials）．Eur．J．Cancer．29A，1907．
33.  スルコウスキー  イー（Sulkowski E），（1985）．ピューリフィケーション  オブ  プロテインズ  バイ  IMAC（Purification of proteins by IMAC）．Trends Biotechnol．3，1．
34.  キープ  ピーエイ（Keep PA），リーケ  ビーエイ（Leake BA），ロジャース  ジーティー（Rogers GT）（1978）．イクストラクション  オブ  CEA  フロム  テュモア  ティシュー，フェタル  コロン  アンド  ペイシャンツ  セラ，アンド  ジ  エフェクト  オブ  パークロリック  アシッド（Extraction of CEA from tumour tissue，foetal colon and patients sera，and the effect of perchloric acid）．Br．J．Cancer，37，171．
35.  グリーンウッド  エフシー（Greenwood FC），ハンター  ダブリューエム（Hunter WM）（1963）．ザ  プレパレーション  オブ  131I−ラベルド  ヒューマン  グロース  ホルモン  オブ  ハイ  スペシフィック  ラジオアクティビティー（The preparation of 131I-labelled human growth hormone of high specific radioactivity）．Biochem．J．89，114．
配列表
（1）  一般的情報
（i）出願人
（A）名称：キャンサー  リサーチ  キャンペーン  テクノロジー  リミテッド
（B）ストリート：リージェンツ  パーク  ケンブリッジ  テラス  6-10  ケンブリッジ  ハウス．
（C）シティ：ロンドン
（D）ステート：適用なし
（E）カントリー：英国
（F）郵便番号：エヌダブリュ1  4ジェイエル
（A）氏名：チェスター  ケリー  アン
（B）ストリート：シーアールシー  ラボラトリーズ，ローヤル  フリー  ホスピタル  スクール  オブ  メディシン
（C）シティ：ロンドン
（D）ステート：適用なし
（E）カントリー：英国
（F）郵便番号：エヌダブリュ3  2ピーエフ
（A）氏名：ホーキンズ，ロバート  エドワード
（B）ストリート：デパートメント  オブ  クリニカル  オンコロジー  アンド  エムアールシー  センター，ヒルズ  ロード
（C）シティ：ケンブリッジ
（D）ステート：適用なし
（E）カントリー：英国
（F）郵便番号：シービー2  2キューエイチ
（A）氏名：ベジェント，リチャード  ヘンリー  ジョン
（B）ストリート：シーアールシー  ラボラトリーズ，ローヤル  フリー  ホスピタル  スクール  オブ  メディシン
（C）シティ：ロンドン
（D）ステート：適用なし
（E）カントリー：英国
（F）郵便番号：エヌダブリュ3  2ピーエフ
（ii）発明の名称：腫瘍抗体
（iii）配列の数：８
（iv）コンピューター  リーダブル  フォーム：
（A）メディウム  タイプ：フロッピー  ディスク
（B）コンピューター：IBM PC  コンパティブル
（C）オペレーティング  システム：PC-DOS/MS-DOS
（D）ソフトウエア：PatentIn Release #1.0，Version #1.30（EPO）
（2）  配列番号：１の情報
（i）配列の特徴
（A）長さ：８１０塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：二本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ix）配列の特徴：
（A）名称／記号：ＣＤＳ
（B）位置：１．．８１０
（xi）配列：配列番号：１：
0003783143.tif 000004
0003783143.tif 000005
（2）  配列番号：２の情報
（i）配列の特徴
（A）長さ：２７０アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質（protein）
（xi）配列：配列番号：２：
0003783143.tif 000006
（2）  配列番号：３の情報
（i）配列の特徴
（A）長さ：２９塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号：３：
0003783143.tif 000007
（2）  配列番号：４の情報
（i）配列の特徴
（A）長さ：２７塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号：４：
0003783143.tif 000008
（2）  配列番号：５の情報
（i）配列の特徴
（A）長さ：１８３塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：二本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ix）配列の特徴：
（A）名称／記号：ＣＤＳ
（B）位置：４０．．１７７
（xi）配列：配列番号：５：
0003783143.tif 000009
（2）  配列番号：６の情報
（i）配列の特徴
（A）長さ：４６アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質（protein）
（xi）配列：配列番号：６：
0003783143.tif 000010
（2）  配列番号：７の情報
（i）配列の特徴
（A）長さ：２４塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：二本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ix）配列の特徴：
（A）名称／記号：ＣＤＳ
（B）位置：１．．２４
（xi）配列：配列番号：７：
0003783143.tif 000011
（2）  配列番号：８の情報
（i）配列の特徴
（A）長さ：８アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質（protein）
（xi）配列：配列番号：８：
0003783143.tif 000012
【図１】
0003783143.tif 000013
【図２】
0003783143.tif 000014
【図１１】
0003783143.tif 000015
【図３】
0003783143.tif 000016
0003783143.tif 000017
【図４】
0003783143.tif 000018
【図５】
0003783143.tif 000019
【図６】
0003783143.tif 000020
【図７】
0003783143.tif 000021
【図８】
0003783143.tif 000022
【図９】
0003783143.tif 000023
【図１０】
0003783143.tif 000024