(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
微小容器に微量の液体又は気体試料を採取するに当り、該試料を試料と混和しない液体媒質中へノズルから微小液滴又は微小気泡として射出し、その微小液滴又は微小気泡をレーザ光の焦点位置又は走査中心で捕捉し、その焦点位置又は走査中心を移動することにより、微小容器内に誘導し、収容することを特徴とする微小容器内への微量試料採取方法。
【請求項２】
微小容器に微量の液体又は気体試料を採取するに当り、該試料を試料と混和しない液体媒質中へノズルから微小液滴又は微小気泡として射出し、その微小液滴又は微小気泡をレーザ光の走査軌道上又は走査空洞内に捕捉し、その走査軌道又は走査空洞を移動することにより、微小容器内に誘導し、収容することを特徴とする微小容器内への微量試料採取方法。
【請求項３】
微小液滴又は微小気泡が複数個の微小ノズルから１個ずつ射出された微小液滴又は微小気泡である請求項１又は２記載の微量試料採取方法。
【請求項４】
微小液滴又は微小気泡が１個の微小ノズルから順々に射出された微小液滴又は微小気泡である請求項１又は２記載の微量試料採取方法。
【請求項５】
微小液滴又は微小気泡が複数個の微小ノズルからノズル１個当り複数の順々に射出される微小液滴又は微小気泡である請求項１又は２記載の微量試料採取方法。
【請求項６】
画像処理により微小ノズルから射出される微小液滴又は微小気泡の状態を観測しながら、射出圧、射出時間及び維持圧の中から選ばれた少なくとも１つのファクターを変えることにより、微小液滴又は微小気泡の径及び個数を制御する請求項１ないし５のいずれかに記載の微量試料採取方法。
【請求項７】
微小ノズル先端付近に超音波を印加しながら行う請求項１ないし６のいずれかに記載の微量試料採取方法。
【請求項８】
微小液滴中に固体微粒子を含有させる請求項１ないし７のいずれかに記載の微量試料採取方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、液体又は気体試料を微小ノズルから、フェムトリットルからピコリットル量の微小液滴又は微小気泡として射出し、これを微小容器内に採取する方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
最近、医療、化学分析、環境計測などの各分野において、混合・反応系、検出系、電子回路、作動ポンプなどの構成員子をマイクロ化して、システム全体をＩＣ化する技術、いわゆるμ−ＴＡＳの開発が重要な課題となってきており、その一つとして、検査試薬の微量液滴をアレイ状に配置されたマイクロ容器内に微小ノズルを利用して滴下することが行われているが、この方法では同一アレイヘ複数の液状試薬を正確な量で採取したり、固体又は気体状試薬を採取することが困難であった。
【０００３】
他方、光ピンセットやレーザ走査マニピュレーションを用いてマイクロサイズの微粒子や液滴を操作する方法が知られており、この方法を利用して化学分野や生物工学分野における微小領域での反応の解析や分析に際し、試薬や遺伝子を操作することが検討されている。
【０００４】
しかしながら、この方法では、操作しようとする液滴や微粒子を大量に用意し、その一部を顕微鏡下で観察しながら操作しなければならないため、大部分の液滴や微粒子は利用されないまま残り、これがレーザ光集光時の外乱や移動操作時の経路の障害を引き起こすという問題があり、これらの解決が試薬の必要量のみを、所定の微小容器内に円滑に採取する際の重要な課題となっていた。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、微小ノズルから液体又は気体試料を微小液滴や微小気泡として試料と混和しない液体媒質中に射出し、これを円滑に微小容器内に採取するための方法を提供することを目的としてなされたものである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、従来の技術によっては非常に困難とされていた微量の液体又は気体試料を微小容器内に採取する方法について種々研究を重ねた結果、レーザマニピュレーション技術を利用すれば、フェムトリットルからピコリットル量の液体又は気体を微小ノズルから液体媒質中に射出して発生させた微小液滴又は微小気泡を微小容器内に簡単に採取しうることを見出し、この知見に基づいて本発明をなすに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、微小容器に微量の液体又は気体試料を採取するに当り、該試料を試料と混和しない液体媒質中へノズルから微小液滴又は微小気泡として射出し、その微小液滴又は微小気泡をレーザ光の焦点位置又は走査中心で捕捉し、その焦点位置又は走査中心を移動することにより、微小容器内に誘導し、収容することを特徴とする微小容器内への微量試料採取方法、及び上記の微小液滴又は微小気泡をレーザ光の走査軌道上又は走査空洞内に捕捉し、その走査軌道又は走査空洞を移動することにより、微小容器内に誘導し、収容することを特徴とする微小容器内への微量試料採取方法を提供するものである。
【０００８】
【発明の実施の形態】
次に、本発明方法を、添付図面に従って説明する。
図１は微小ノズル２、例えばマイクロピペットから、試料と混和しない液体媒質１例えば水の中へ射出された液体試料例えば流動パラフィンの微小液滴３をレーザ光の焦点位置（＋印）に捕捉して移動する状態を示す顕微鏡写真である。
この図においてマイクロピペット２から水１の中へインジェクション圧Ｐｉ、インジェクション時間Ｔｉで射出された極微量の流動パラフィンは、直径約３μｍの油滴３を形成し［図１（ａ）］、さらにＰｉをＴｉ秒間加えて、次の油滴３´が射出されると最初の油滴３が図１（ａ）の十字位置にあるレーザ光の焦点位置に捕捉される［図１（ｂ）］。そして、このように捕捉された油滴３は左下位置へ移動され［図１（ｃ）］、さらにＰｉをＴｉ秒間加えて油滴３″が射出されると、２本目のレーザ光により油滴３´は油滴３の隣へ移動する［図１（ｄ）］。
したがって、左下の位置に微小容器を配置しておけば油滴３，３´，３″…を順次この中へ誘導し、収容することができる。
【０００９】
次に図２は、２本の微小ノズル２，２´より種類の異なった液体試料を微小液滴３，３´として射出し、微小容器７，７´内に採取する場合の説明図であって、微小ノズル２より液滴３、微小ノズル２´より液滴３´が試料と混和しない液体媒質１で満たされた透明基板６を加工することによって作製された微小容器７，７´上部へ射出され、それぞれレーザ光Ａ及びＢに捕捉される。そして、ここで捕捉された液滴３，３´は、レンズ８により集光された各レーザ光Ａ、Ｂの焦点位置をノズル近傍から微小容器底辺位置まで三次元的に移動させることによって、正確に微小容器７，７´の中に誘導し、採取することができる。
【００１０】
このような微小ノズルからの液滴の射出は、射出する液滴の性質とノズル材質、形状の関係により、射出後の液滴がノズル先端に付着して確実に行われない場合が生じるが、そのような場合は、微小水槽壁面４，４´に形成あるいは取り付けた圧電磁器薄膜などの超音波発生素子５、５´により、微小ノズル先端近傍の溶液に超音波を照射することで、液滴のノズルからの解離と射出を行うことができる。また、射出する液滴の径、個数は、射出圧、射出時間、維持圧を変更することにより行われる。
【００１１】
本発明方法においては、液滴の代りに微粒子含有液滴を微小ノズル２，２´から射出させることもできるので、この場合、固体試料と液体試料を同時に誘導し、採取することもできる。また、液滴の種類を媒質と同じにする場合は、液滴が微小ノズルから離れると同時に液滴部分が消失し、含有されていた微粒子のみが媒質中に放出された状態と同じになる。
【００１２】
また、採取する液体試料の種類に応じて、微小容器底面を親水性又は疎水性の処理をしておけば、採取後の固定化も可能である。微粒子を含む場合の固定化は、紫外線硬化性の液滴と微粒子を同じ微小容器内に採取後に紫外線照射するなどの処理によって行うことができる。
【００１３】
なお、媒質１の屈折率より低屈折率の液滴を捕捉し、微小容器内へ誘導し、収容する場合は、液滴の周りを走査するレーザ走査マニピュレーション法を使用する。
【００１４】
次に、図３は、２本のレーザ光の焦点位置を微小ノズル近傍から微小容器内まで三次元的に誘導し、収容するシステム構成の１例を説明するためのシステム図であり、この図において光源１０からのレーザ光は、ビームエクスパンダ１１で径を変換され、半波長板１２を通り、第１偏光ビームスプリッタ１３、１３´により分解され、それぞれ電磁シャッタ１４、１４´を介した後に、顕微鏡下での焦点位置座標ＸＹＺが所望の位置になるように、コンピュータＣｐによって制御されるガルバノミラー対及び焦点位置変更レンズで構成される焦点位置移動機構１５、１５´により経路が制御されている。
【００１５】
上記の分解されたレーザ光は、再び第二偏光ビームスプリッタ１６、１６´で同軸とされた後、リレーレンズ１７により落射照明光の軸と一致させて顕微鏡１８内に導入し、各々を集光レンズ８により波長サイズ程度、例えば１μｍ程度のスポットサイズに微小ノズル近傍でなるように集光して照射することで、射出液滴を捕捉する。その後、図２においてすでに述べたように、焦点位置移動機構１５、１５´で、その焦点位置を所望の微小容器７の位置まで三次元的に移動することで、正確に液滴を採取することができる。
【００１６】
この際、２本のレーザ光は偏光方向が直交するので干渉を起こすことはなく、したがって、２本のビームの相対位置により強度分布が変化することはないので、各々のレーザ光で安定した状態で目的とする液滴を捕捉、誘導できる。また、２本のレーザ光の焦点位置の移動経路、移動速度、走査位置、走査速度、同期走査位相差及び走査パターンは、液滴の射出の状態、レーザ光による捕捉、運搬状態をＣＣＤカメラ１９で観測し、その画像を画像処理装置２０で処理することにより、その目的に応じて自動的に変更することができる。
【００１７】
このようにして、本発明方法においては、図１に示したように、1個の微小ノズルから順々に射出される微小液滴のみでなく、図２に示すように複数個の微小ノズルから1個ずつ射出される微小液滴あるいは複数個の微小ノズルからノズル1個当り複数の順々に射出される微小液滴を正確に微小容器内に誘導し、収容することができる。
【００１８】
そして、これらの誘導に際しては、画像処理により微小ノズルから射出される微小液滴の状態を観測しながら、あるいは事前に測定したデータにより、射出圧、射出時間及び維持圧の中から選ばれた少なくとも１つのファクターを変えることにより、微小液滴の径及び個数を制御することができる。
【００１９】
以上、本発明方法について、試料と混和しない液体媒質中に微小液滴又は微粒子含有微小液滴を射出し、レーザ光の焦点位置を用いた例で説明したが、微小ノズルから液体媒質中に射出された微小気泡及び走査中心、走査軌道又は走査空洞の移動を用いた場合も同様にして所定の微小容器中に誘導し、収容することができる。
この場合は、容器の開口部を下向きとし、底部を上向きにして、微小気泡を捕集するのが有利である。
【００２０】
【実施例】
次に、実施例により本発明をさらに詳細に説明する。
【００２１】
実施例１
図２又は図３に示すシステムにおいて、液滴捕捉用のレーザ光として、連続発振のＮｄ：ＹＡＧレーザ（波長１０６４ｎｍ、直線偏光）を用い、顕微鏡カバーガラスをエッチング処理して作成した微小容器を底面に有する微小水槽を蒸留水（屈折率１．３３）で満たしたものに、顕微鏡の油浸対物レンズ（倍率１００倍）を通して下方より２本のレーザ光を照射することで、ガラスキャピラリを加工して作成した微小ノズルより射出した微小液滴（流動パラフィン、屈折率１．４６）の捕捉と、微小容器への誘導を行った。
すなわち、微小ノズルよりポンプで射出圧、射出時間、維持圧を制御して、大きさ３μｍの液滴を１個ずつ計２個射出し、各々を２本のレーザ光による光ピンセット法で捕捉、移動して微小容器へ誘導し、収容する様子を顕微鏡で観察した結果を図１に示す。
【００２２】
図１（ａ）は、微小ノズルに射出圧（３０００ｈＰａ）を設定射出時間（０．１秒間）加えた後の状態であり、ノズル先端に大きさ３μｍの液滴が１個形成される。図中の白十字はノズル先端近傍に設定したレーザ光の焦点位置を画像処理してリアルタイムで示したものである。図１（ｂ）は、２回目の射出圧（３０００ｈＰａ）を０．１秒間加えた後の状態であり、ノズル先端の液滴が射出され、白十字位置にあるレーザ光の焦点位置に捕捉された状態を示している。この際、ノズル先端には次の液滴が準備されている。図１（ｃ）は、捕捉された液滴を図３の焦点位置移動機構１５のコンピュータ制御により、微小容器位置まで移動した状態を示している。図１（ｄ）は、さらに３回目の射出圧（３０００ｈＰａ）を０．１秒間加えて２個目の液滴を射出した後、２本目のビームで液滴を捕捉し、図１（ｃ）の液滴の隣の位置へＸ方向に並べた状態を示している。
【００２３】
実施例２
実施例１と同様のシステムを用い、射出圧、射出時間、維持圧を変更することで、径の異なった液滴を１個ずつ計２個射出し、各々をレーザ光による光ピンセット法で捕捉、移動して微小容器内への採取を行った。図４は、射出された大小２個の液滴を２本のビームで各々を捕捉した後、微小容器上のＹ方向に並べた状態を示している。これにより、射出圧、射出時間、維持圧を制御することで、大きさの異なる液滴を選択的に射出し、それらを精密に移動し、微小容器内へ採取しうることが分かる。
【００２４】
本発明は、以上の実施例に限定されるものではなく、レーザ光導入の光学系、微小ノズルと超音波発生素子の位置、形状及び個数など、適宜設計変更できるものである。
【００２５】
【発明の効果】
本発明によれば、μ−ＴＡＳを構築するための極微量の液体、気体及び粒子状試薬をミクロンサイズのアレイ状容器への自動的な採取が可能になるばかりでなく、過剰量の試薬による外乱場の発生や汚染のない、感度のよいμ−ＴＡＳやマイクロメートルオーダーの化学反応場、微生物の成育場の構築が可能となり、それによってその反応や成長の制御を行うことも可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  本発明によって、微小ノズルより射出された液滴が、微小容器内へ採取される過程を示す顕微鏡写真図。
【図２】  本発明の採取方法の１例を示す説明図。
【図３】  本発明の構成の１例を示すシステム図。
【図４】  径の異なる液滴が射出、移動し、微小容器内に採取された状態を示す顕微鏡写真図。
【符号の説明】
１  媒質
２，２´微小ノズル
３，３´微小液滴
４，４´微小水槽壁面
５，５´超音波発生素子
６  透明基板材料
７，７´微小容器
８  集光レンズ
９  ポンプ
１０  レーザ光源
１１  ビームエクスパンダ
１２  半波長板
１３，１３´第１偏光ビームスプリッタ
１４，１４´電磁シャッタ
１５，１５´焦点位置移動機構
１６，１６´第２偏光ビームスプリッタ
１７  リレーレンズ
１８  顕微鏡
１９  ＣＣＤカメラ
２０  画像処理装置
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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