(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療有効量のインターフェロンを含み、該有効量が１日あたり５０００ＩＵから２０×１０6ＩＵであり、この有効量が非経口投与にてヒトに投与された場合に病的応答を誘導しない量である、ヒトの抗腫瘍形成性応答を刺激するための、口腔粘膜接触投与のためのインターフェロン組成物。
【請求項２】
治療有効量が１日当たり１×１０4から１×１０6ＩＵのインターフェロンである、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
他のサイトカイン又はインターフェロン−インデューサーを含む、請求項１記載の組成物。
【請求項４】
他の治療剤を含む、請求項１記載の組成物。
【請求項５】
他の治療剤が細胞分裂停止剤、抗癌剤および抗血管新生剤からなる群から選択される、請求項４記載の組成物。
【請求項６】
多発性骨髄腫、ヘアリー細胞白血病、慢性骨髄性白血病、低級リンパ腫、皮膚Ｔ−細胞リンパ腫、癌性腫瘍、腎臓癌、腎臓細胞癌、肝細胞癌、直腸癌、膠芽腫、肺癌、大腸癌、または悪性脳腫瘍から成る群から選択される腫瘍形成性疾患を治療するためのものである、請求項１記載の組成物。
【請求項７】
インターフェロンの有効量を一回投与量として投与する、請求項１−６のいずれかに記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は宿主哺乳類の疾患症状に対する防御系を口腔粘膜を介したインターフェロン投与によって刺激する方法に関する。より詳細には本発明は腫瘍性疾患の治療に適用可能である。
背景技術
α−インターフェロン類はヘアリー細胞白血病、慢性骨髄性白血病、皮膚T−細胞白血病などの血液性癌、および固形腫瘍例えば腎細胞腫、骨髄腫、癌性腫瘍など、そしてエイズ関連カポジ肉腫の治療に広く使われている（Gutterman, J.U., Proc.Natul.Acad.Sci.USA,1994 91:1198−1205）。インターフェロンによる抗がん作用は通常高用量投与の場合に認められ、しばしば数千万ユニットのインターフェロン-α（INF-α）が非経口投与される。インターフェロン−αはタイプＩインターフェロンであり、このクラスにはβ型およびω型のインターフェロンも含まれる。タイプIインターフェロンは通常静脈内、皮下、筋肉内、局所および病変内等とさまざまな経路により投与されるが、インターフェロン類はタンパク質分解酵素によって不活性化され、またそのままでは消化管から吸収されにくいと考えられているタンパク質であるため、通常経口投与されることはない。実際、経口投与した後、血中インターフェロンが検出されないという報告が数多くある（CantellとPyhaka, J. Gen. Virol., 1973 20:97-104; Willsら、J.IFN Res., 1984 4:399-409; Gilsonら、J.IFN Res., 1985 5:403-408）。
低容量のインターフェロンを鼻腔投与スプレーまたは経口投与用液体製剤として投与すれば、さまざまな症状、特にインフルエンザに対して有用であるとする裏付けのない逸話的な報告が数多くある。一連の特許明細書には異種由来のインターフェロンをウシの感染性鼻気管炎（シッピングフィーバー）の治療、およびネコの白血病の治療のため、他の治療たとえばワクチンの有効性の向上のため、食餌療法の効果の向上のため、そしてウシタイレリア感染症の予防のために経口投与することが開示されている。それぞれ米国特許第4,462,985号、オーストラリア特許第608519号、オーストラリア特許第583332号および米国特許第5,215,741号を参照されたい。さらに米国特許第5,017,371号にはインターフェロンを、癌化学療法および放射線療法の副作用の軽減のために、この経路で用いることが開示されている。これらの明細書において、使用されているインターフェロンはキャンテル（Cantell）の方法によって調製されたヒトインターフェロン−αであって、リン酸緩衝生理塩水溶液として体重1ポンドあたり0.01から5IUの量が投与されている。これらの明細書はかかる低用量のインターフェロンを口腔粘膜に、好ましくは口腔粘膜との接触時間を延長し得る製剤にて投与することが、癌を含む広範囲の疾患の治療に有用であり得ることを示唆するかもしれないが、シッピング熱、ネコ白血病、イヌパルボウイルスおよびタイレリア症以外の症状に対しての試験結果はその大部分が裏付けの無いものであった。特に、ヒト癌のいかなる動物モデルにおいても、癌を実質的に制御し得ることを示す試験はなかった。
これに対して、ここに開示した発明はインターフェロンの口腔粘膜投与によってヒト癌の動物モデルを制御し得ることをはじめて見出したことに基づくものである。
発明の開示
本発明は哺乳類の悪性腫瘍性疾患を、治療有効量のインターフェロンを口腔粘膜接触により投与することによる、悪性腫瘍性疾患の治療方法を提供する。投与するインターフェロンの量は非経口投与した際に病的応答が誘導される量より少ない量である。特に、本発明は多発性骨髄腫、ヘアリー細胞白血病、慢性骨髄性白血病、低級リンパ腫、皮膚T−細胞リンパ腫、癌性腫瘍、子宮頸癌、カポジ肉腫を含む肉腫、腎臓癌、腎臓細胞癌を含む癌腫、肝細胞癌、鼻咽頭癌、血液性悪性疾患、直腸癌、膠芽腫、咽頭パピローマ、肺癌、大腸癌、悪性メラノーマおよび悪性脳腫瘍を含む脳腫瘍の治療法を提供する。1の態様において、本発明の方法は一般には、非ウイルス性に生じる腫瘍の治療に適用できる。
口腔粘膜投与としては、有効用量のインターフェロンを一回投与量として投与しても、一回投与量の投与による宿主防御系刺激と等価な刺激を生じさせるのに十分なよう、小用量のものを複数回に分けて投与してもよい。同様に、インターフェロンの有効量をある一定期間持続的に投与して、一回投与量の投与で得られるものと等価な宿主防御系の刺激を得てもよい。
本発明の方法は約1500IU、好ましくは5000IUから約20×106IUのインターフェロン、より好ましくは約1×104IUから約20×106IUのインターフェロン、もっとも好ましくは約1×104IUから約1×106IUのインターフェロンであって、選択された用量が本明細書で規定する非経口投与による病的応答を誘導しない量、もしくは非経口投与した場合に病的応答を誘導する量より少ない用量を投与することによって実施し得る。この用量の範囲は一般にはヒトインターフェロン−αをヒトに投与する場合のものである。他の型のインターフェロンについて、病的応答を誘導する用量はホモロガスなインターフェロン-αをヒトに投与する場合と異なる。特定の種類のインターフェロンを用いて患者を治療している医師が、本発明に基づいて治療対象患者についての適当な用量を決定するのは容易である。
他の態様において、本発明は少なくとも1種のインターフェロンの治療有効量を含有する口腔粘膜投与のための医薬組成物を提供する。この組成物は溶液、錠剤、トローチ剤、ゲル、シロップ、ペーストまたは口腔粘膜分配系徐放性製剤であり得る。組成物は任意に緩衝剤、安定化剤、濃厚化剤、吸収および粘性増強剤などを含んでいてもよい。
一の態様において、本発明の医薬組成物は約1500IU、好ましくは5000IUから約20×106IUのインターフェロン、より好ましくは約1×104IUから約20×106IUのインターフェロン、もっとも好ましくは約1×104IUから約1×106IUのインターフェロンを含有する1用量単位として提供される。
本発明の方法は、単独の治療手段として、または化学療法もしくは放射線療法との併用療法として、あるいはインターロイキン2，12または15などの他のサイトカイン類、もしくはIFN−インデューサーと共に投与すればよい。
本発明の方法は、インターフェロン−α、β、γ、ωおよびコンセンサスインターフェロンから選択されるタイプＩまたはタイプＩＩのインターフェロンを用いて行えばよいが、最も好ましいのはインターフェロン−αである。
発明の詳細な説明
以下の定義および実施例は本発明の説明のため、参考にのみ用いられる。本明細書において言及した特許および文献は、本明細書に明示的に含まれる。
定義
本明細書において、「インターフェロン」はタイプＩまたはタイプＩＩのインターフェロンであり、一般にはインターフェロン−α、β、γ、ωと名づけられるもの、およびその混合物を含み、さらにコンセンサス配列も含む。インターフェロンは、広く市販のものが入手可能であり、数多くの適応症が承認されている。インターフェロンは天然由来のものであってもよいが、遺伝子組替えによる製品がより好ましい。本発明の目的のため、「インターフェロン」の語にはさらにインターフェロン活性を有するポリペプチドフラグメント、および例えば安定性向上等を目的として配列の改変が導入されたキメラあるいは変異体であって、本来の性質を維持しているもの（例えば米国特許第5,582,824号、第5,593,667号、および第5,594,107号参照）も含まれる。
インターフェロンを投与する際、任意にインターフェロンの合成及び放出のインデューサーを投与してもよい。インデューサーはインターフェロンと同時に投与しても別に投与してもよい。インターフェロンのインデューサーには例えばポリＩ：Ｃなどのポリヌクレオチドが含まれ、好ましくは低分子量の経口投与し得るインターフェロンインデューサーが用いられる。好ましいインデューサーは当業者に知られており、例えばティロロン（Tilorone）（米国特許第3,592,819号；Albrechtら、J.Med.Chem.1974 17:1150−1156）およびキノロン誘導体イミキモド（Imiquimod）（Savageら、Brit.J.Cancer., 1996 74：1482−1486）が挙げられる。
本発明の方法および組成物は、特定の症状の治療のための任意に1または複数の他の治療法と併用してもよく、治療に関与する医師もしくは獣医師はかかる他の治療法を状況によって適当に選択すればよい。
本発明の一態様においては、インターフェロンを上述のごとく投与することを含む、哺乳類の腫瘍形成性疾患の治療のための方法を提供する。腫瘍形成性疾患は、転移性腫瘍であってもよい。
本発明の方法は、他の剤と併用せずに行うことができるが、本発明のこの態様においては、以下の状況で用いることが特に好ましい：
ａ）アジュバント療法として、通常のプロトコルによる外科治療、化学療法または放射線療法に続いて行う、
ｂ）インターフェロン感受性腫瘍形成性疾患の治療のため、本発明の方法を単独または従来の化学療法もしくは放射線療法と併用して用いる、
ｃ）インターフェロン抵抗性腫瘍形成性疾患に対しては、本発明の方法を単独またはもっとも好ましくは従来の化学療法もしくは放射線療法と併用して用いる。
上記の方法は、疾患の緩解の誘導および/またはその維持のためのものである。「他の治療と組み合わせて」という表現は、インターフェロンを放射線療法または他の化学療法の前、その最中および/または後に投与することを意味する。もっとも適当なプロトコルは以下に示すごとき各種要因に依る。
詳細には、本発明の方法は、細胞増殖抑制薬、1または複数の他のサイトカイン類であってインターフェロンとは作用機構の異なる抗癌性を有するもの、抗−血管新生剤、およびインターフェロンの活性を増強する処理からなる群から選択される少なくとも1の他の療法と共に行うことが意図されている。好ましい第2のサイトカインはインターロイキン−1（IL-1）、インターロイキン−2（IL-2）、インターロイキン−12（IL-12）またはインターロイキン−15（IL-15）であり、好ましい抗−血管新生剤はＡＧＭ−1470［（クロロアセチル］）−カルバミン酸（3R−（3α,4α（2R*,3R*）,5β，6β））−5−メトキシ−4−（2−メチル−3−（3−メトキシ−2−ブテニル）オキシラニル）−1−オキサスピロ（2,5）オクト−6−イルエステル］であり、好ましいインターフェロン活性の増強は、高熱誘導もしくはアルギニンブチレートによって行うことである。
本発明のインターフェロンの投与と併用する好ましい細胞増殖抑制剤は、シクロフォスファミド、シスプラチン、カルボプラチン、カルムスチン（BCNU；N,N−ビス（2−クロロエチル）−N−ニトロソウレア）、メソトレキサート、アドリアマイシン、α−ジスルフォロメチルオルニチンおよび5−フルオロウラシルであるが,これらに限定されない。
本発明の方法の対象となりうる腫瘍形成性疾患には、高用量のIFN-αの非経口投与に応答する癌,例えば多発性骨髄腫、ヘアリー細胞白血病、または慢性骨髄性白血病などの血液性癌、低級リンパ腫、皮膚T−細胞リンパ腫、および固形腫瘍例えば腎細胞腫、骨髄腫、癌性腫瘍など、そしてエイズ関連カポジ肉腫が含まれるが、これらに限定はされない。特に非ウイルス性癌に有用である。
本発明の医薬組成物を調製する際には、当業者には明らかであるIFNのための広範囲の媒体および賦形剤を用いることができる。代表的な製剤の方法は、レミントン「ザサイエンスアンドプラクティスオブファーマシー（The Science and Practice of Pharmacy）第19版、マックパブリッシング社、アメリカ合衆国ペンシルバニア州イーストン1995年およびこの前の版に開示されている。本発明のIFN製剤には米国特許第4,496,357号に記載のごときグリシンまたはアラニンのごとき安定化増強剤を添加してもよく、及び/または1または複数の担体、例えば担体タンパク質を添加してもよい。例えば、ヒトに医薬グレードのヒト血清アルブミンを投与する場合には、任意にリン酸緩液が希釈剤として、通常用いられる。ヒトIFNのための賦形剤がヒト血清アルブミンの場合には、ヒト血清アルブミンはヒトの血清由来のものであっても、組替えにより得られるものであってもよい。通常、血清アルブミンを用いる場合には、同種由来のものが用いられる。
IFNはIFNが投与対象の口腔粘膜洞と接触するようないずれかの方法で投与すればよい。すなわち本発明はいかなる特定の製剤にも限定されるものでないことが理解されなくてはならない。本明細書においてIFNを深部口腔粘膜洞内に投与する方法を提供する。これは、液状、固形状、エアロゾル状製剤によっても、また点鼻剤またはスプレーによっても、達成し得る。従って、本発明は液状、固形状、シロップ剤、トロ−ーチ剤、頬錠剤、およびネブライザーの処方を含むが、これらに限定はされない。当業者であればエアロゾルまたはネブライザー処方の場合に、製剤の粒子サイズが重要であり得ることを認識し、粒子サイズを調節する適当な方法を見出し得る。
ひとつの態様において、インターフェロンは毎日一回投与量を投与する。他の態様においては、インターフェロンはより低い容量のものを複数回投与して、あるいは一定時間の間持続的に分配させて、高用量の単回投与と均等な効果を得るようにしてもよい。この持続分配の一例としては、放出遅延あるいは放出調節装置を咽頭腔内に付着もしくは埋め込み、インターフェイスの高濃度一回投与量に匹敵する量を一定期間放出させるようにする方法がある。
インターフェイスの口腔粘膜投与のための代表的な製剤は以下の処方である（％はｗ/ｗを示す）：
錠剤：デキストロースＢＰ  45％；ゼラチンＢＰ  30％；小麦デンプンＢＰ  11％；ナトリウムカーメロース（carmellose sodium）ＢＰ  5％；卵アルブミンＢＰＣ  4％；ロイシンＵＳＰ  3％；プロピレングリコールＢＰ  2％；およびIFN-α2  1×106IU。この錠剤はそのまま用いて口内でゆっくり溶解させても、水中に溶解させたものを必要に応じて口中に保持して口腔粘膜と接触させてもよい。
インターフェロンペーストの製剤例は米国特許第4,675,184号に開示されている。グリセリン  45％、ナトリウムＣＭＣ  2％、クエン酸緩衝液（pH4．5）  25％，蒸留水  全体を100％とする量、およびIFN-α2  1×106IU。インターフェロンペーストは、頬粘膜に貼り付ければよい。
同様に、含嗽剤またはシロップの場合には所望の量のインターフェロンを市販のマウスウオッシュもしくは咳止めシロップの処方に加えて調製すればよい。
上記特定の用量の範囲内において、個々の症例における最適な治療は症状、疾患の段階、先に行った治療、他の継続している治療、対象哺乳類の総合的な健康状態とインターフェロンに対する感受性などに依存するものであり、従って、医師もしくは獣医師によりこれらの状況すべてを考慮して、その裁量により決定される。治療期間は当然のことながら治療すべき症状によって異なり、例えば前立腺癌のごとき成長の遅い癌の治療と、肝細胞癌のごとき急激に成長する癌の治療の場合とでは異なるコースの治療が採用される。
本明細書に開示した有効用量は、哺乳類に非経口投与した場合に病的応答を生じさせないものである。病的応答は、急性、慢性もしくは累積的なものであり得、白血球減少などの血液化学的な変化、骨髄の減少、または他の病理パラメーターによって見出される。本明細書において、病的応答の語には熱、倦怠あるいは流感様症状、静脈炎のごとき血管の反応および注射部位の局所炎症反応などの好ましくない副作用を含むものとする。かかる応答は患者個々のインターフェロンに対する感受性の相違からしても、患者間でかなり異なるものである。インターフェロンの口腔粘膜投与による治療のための許容される低用量を決定するための簡単な試験は、患者の年齢、体重、適応症、進行度などから推定される許容量を注射し、この注射が上記に規定する病的応答を導くかどうかを確認することである。この際、注射部位の局所的な炎症の有無がもっとも容易な確認方法となる。副作用が認められない場合は、その同じ用量を口腔粘膜に投与し得る。望ましくない応答が認められる場合には、より低用量でこのプロセスの繰り返しを、病的応答を惹起しない用量を特定するまで行う。
多くの患者にとっての、口腔粘膜投与のための用量は現在承認されている非経口投与において耐容性があり、有効であると知られている用量とほぼ同じであると予測される。従って、特異性の目的のため、許容される低用量のインターフェロンの用量は、一日あたり約1500IU、好ましくは5000IUから約20×106IUのインターフェロンである。より好ましい一日用量は約1×104IUから約20×106IUのインターフェロン、もっとも好ましくは約1×104IUから約1×106IUのインターフェロンであって、非経口投与による病的応答を誘導しない用量である。本発明の一態様においては、同じ総用量となるように低用量を複数回にわけて一定期間投与しても、持続的に分配させてもあるいは口腔粘膜内に接着もしくは埋め込んだ調節放出装置によって脈動的に投与してもよい。
インターフェロンおよびインターフェロン処方
マウスインターフェロン−α/β
マウスIFN-α/β（Mu IFN-α/β）は、公知の方法にてニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）で誘導した培養Ｃ243−3より調製し、精製した（Toveyら、Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1974 146:809-815）。ここで調製した標品は4×106国際単位（IU）/mlの力価を有しており、水泡性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）でチャレンジしたマウス929細胞を用いて、以前に開示されたごとく（Toveyら，Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1974 146:809-815）アッセイしたところ、5×107IU/mgタンパク質の特異活性を示した。標品は国立衛生局（NIH）のマウスIFN-α/βの国際基準試料（G−002−9004−5411）に基づき標準化した。
ヒトIFN-α−1−8
組替えヒトIFN-α 1−8（Hu IFN-α 1−8；ＢＤＢＢロット番号ＣＧＰ35269−1、チバガイギー、スイス国バーゼル）は先に開示されているごとく（Meisterら、J.Gen.Virol.1986 67:1633-1643）調製及び精製したものである。この研究に用いられた標品をＶＳＶでチャレンジした同種ヒトWISH細胞上で既知の方法（Toveyら、Nature 1977 267:455−457））によりアッセイしたところ70×106IU/mlの力価を、そして異種マウスL929細胞でアッセイしたところ1×106IU/mlの力価を有していた。試料はNIHヒトIFN-α国際基準試料（G-023-901-527）およびマウスIFN-α/β基準試料（G-002-9004-5411）に対して標準化した。このIFN試料の特異活性は2×108IU/ｍｇタンパク質であった。
組替えマウスインターフェロン-α
組替えマウスインターフェロン−αはライフ・テクノロジーズ・インコーポレイテッドより購入した。この試験に用いた試料（ロット番号ＨＫＫ404）はＶＳＶでチャレンジしたマウスのＬ929細胞で調べた場合（Toveyら、Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1974 146:406-415）6×106IU/mlの力価、特異活性は6×108IU/ｍｇタンパク質であった。
組替えマウスインターフェロンβ
組換えマウスインターフェロンβはＲ＆Ｄシステムズ・インコーポレイテッドより購入した。この実験に使用した試料（ロット番号1976-01S）は既知の方法でＶＳＶにてチャレンジしたマウスL929細胞にて測定した場合（Toveyら，Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1974 146:406-415）、3.2×104IU/mlの力価で、特異活性は8×106IU/ｍｇタンパク質であった。
組替えマウスインターフェロンγ
組替えマウスンターフェロンγはＲ＆Ｄシステムズ・インコーポレイテッドより購入した。この実験に使用した試料（ロット番号2580-03SA）は既知の方法でＶＳＶにてチャレンジしたマウスL929細胞にて測定した場合（Toveyら、Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1974 146:406-415）、2×105IU/mlの力価で、特異活性は1×107IU/ｍｇタンパク質であった。
すべてのインターフェロン試料は、同時に同じアッセイにて力価測定を行い、米国国際衛生局（NIH）のマウスインターフェロン−α/βの基準試料（G-002-9004-5411）に対して標準化した。
マウスインターフェロン−α/βおよび組替えインターフェロンは投与に先立ち賦形剤フェリミュン（商標;FerimmuneTM）に溶解して用いた。
賦形剤
インターフェロン試料はウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有する、リン酸緩衝生理塩水で希釈した。ウシ血清アルブミンフラクションＶ（ＲＩＡグレード；イムノグロブリン含まず;カタログ番号Ａ7888（米国シグマ社）を最終濃度が100μｇ/mlとなるよう、ＰＢＳ（pH7.4）にて希釈し、フィルターを通して（0.2μ、ミリレックスＧＶ，米国ミリポア社）滅菌した。
明細書に記載した試験において、インターフェロン試料は適当な賦形剤で希釈して用いた。使用した賦形剤は以下の通り、錠剤（ファルマパシフィック社フェリミュン（商標））として提供されるものである。
0003806446.tif 000002
錠剤1個を1.5mlのリン酸緩衝生理塩水に溶解させ、16,000ｇにて15分間遠心分離し、そしてろ過滅菌（0.2ミクロン、ミレックス-GV、ミリポア）した後に4℃にて使用する前まで保存した。賦形剤は使用前に毎日調製した。
インターフェロン分配系
予備試験において、5μのクリスタルバイオレットを正常成体マウスの両鼻腔へＰ20エッペンドルフマイクロピペットを用いて投与すれば、ほとんどその直後に染料が口腔咽頭洞表面の全体に広がることが示された。口腔咽頭洞の染色は、染料投与約30分後においても依然明白であった。本質的に同じ結果が、125I-標識化組換えヒトIFN-α1-8を同じ方法で投与した場合にも得られた。従って、以下の実施例ではこの投与方法を用いた。
本明細書の動物実験の記載において、IFN投与経路に関しての「口腔粘膜」、「口腔咽頭」または「鼻腔内/経口」または「鼻腔内プラス経口」または「in/or］の用語は、IFN試料の深部鼻腔洞へ口腔粘膜洞内に迅速に分配されるよう投与することを意味する。すなわち投与対象哺乳類のの口および喉に投与して、その洞内の粘膜層と接触させるのである。
フレンド赤白血病細胞
フレンド赤白血病細胞（ＦＬＣ）のIFN-α/β抵抗性クローンである3Ｃ18株はローマのアフラブリス博士（E. Affrabris）より入手した。この細胞についてはアフラブリスらにより1982年に詳しく報告されている（Virology, 20:441-452）。細胞をその後、インビボ継代により維持した。簡単に方法を説明する。およそ100LD50の3C18細胞をDBA/2マウス腹腔内投与（ip）し、1週間後に腫瘍細胞を当該マウスの腹腔から回収し、数を数え、そしてまた他のマウスにふたたび100LD50の3C18細胞を投与した。この方法を60から100代繰り返した。60代目から100代目の継代した3C18細胞は、肝臓及び脾臓への転移率が非常に高い事が示されている（Gresserら、Int. J.Cancer 1987 39:789-792）。IFN抵抗性フェノタイプはインビボ継代して得た細胞をその都度インビトロでIFN-α/β存在下で培養して確認した（Belardelliら，Int. J. Cancer,1982 30:813-820）。
本発明のインターフェロン組成物は、我々の研究所にあるL1210リンパ腫細胞のL12106クローンに対しても作用を有する（Grasserら、1974、インターフェロンと細胞分化  ＩＸインターフェロン抵抗性L1210細胞：性質と由来J.Nat.Cancer Inst.，52:553-559）。さらに、化学誘癌物質1−2ジメチルベンズアンセリンを注射したマウスから誘導されたEL4移植可能腫瘍に対しても、作用を有した（Gorer,P.A.,Br.J.Cancer4:372-381）。
動物
本研究で用いたマウスは特別無菌コロニーで生育されたマウスである（IFFA  ＣＲＥＤＯ、フランス）。使用マウスは、ヴィレジュー（Villejuif）にあるインスティテュートフェデラティフＣＮＲＳ内の、EEC基準に基づく特別な無菌状態の部屋で飼育して用いた。
インターフェロンバイオアッセイ
インターフェロンのアッセイは常套の方法に基づいて行った。簡単に説明すると、試料（20μl）を、2％熱非動化ウシ胎児血清（FCS）（フランス、ギブコ社）含有イーグル最小限必要培地（MEM）（フランス、ギブコ社）80μlに希釈して、多チャンネルマイクロピペット（フィンピペット、ラブシステム社50-300マイクロリトル）を用い、マイクロタイタープレート（ファルコン社、カタログ番号3072）の各ウエルへ添加した。WISHまたはＬ929細胞（2×104細胞/ウエル）を2％FCS含有MEM100μlに希釈し、各ウエルへ添加し、37℃、空気中のCO25％という環境下にて（フォーミュラ3029 CO2インキュベーター）一晩インキュベートした。細胞をその後10倍の対物レンズを装着したオリンパスIM ＧＬＤＷ倒立顕微鏡にて観察し、毒性を示す兆候がないかどうかを調べた。検出可能な毒性を示さなかった試料につき連続的二倍希釈物を調製した。最初の全量200μlの2％FCS含有イーグルMEM培地で1：10希釈しているものから出発し、その100μlを多チャンネルマイクロピペットで取り、これを新しい2％FCS含有イーグルMEM培地を各ウエルにつき100μl入れておいたマイクロプレートに移した。NIHヒトIFN-α基準試料（G-023-901-527）およびNIH  Mu IFN-α/β基準試料（G-002-9004-5411）をそれぞれ二倍希釈して基準試料も調製した。100μlの2％FCS含有イーグルMEMにWISHもしくはL929細胞（2×104細胞/ウエル）を分散したものを、各基準試料プレートに添加して、37℃で一晩、空気中5％CO2という条件下でインキュベートした。細胞単層を観察して、明らかな毒性が認められるかどうかをチェックし、その後明らかな毒性の認められなかったものは培養液を吸い取り、100TCID50のＶＳＶを含む（WISH細胞に対しては2×10-4ＶＳＶ23、L929細胞に対しては10-5ＶＳＶ23）FCS含有イーグルMEMに培地を置き換えた。プレートを37℃、5％CO2空気という条件下でさらに一晩インキュベートした。ウイルス特異的細胞病理学的影響を細胞単層をオリンパスIM  ULWD倒立顕微鏡を用いて観察して調べた。インターフェロンの力価は相互希釈であって、ウイルス特異的細胞病理学的影響から50％保護する希釈濃度の逆数から決定し、国際基準単位/mlとして示した（IU/ml）。
実施例1
インターフェロン−αをフレンド赤白血病細胞でチャレンジしたマウスの口腔咽頭内に投与した場合の抗腫瘍活性、
経鼻/口ルート（in/or）でIFN-αを投与した場合に高転移性FLC細胞をチャレンジしたマウスの生存度が増加するかどうかを調べるために、一群6匹の7−8週令オスDBA/2マウスに、1×105FLCをip投与した（0日）。
各群のマウスには104IUの天然複合マウスIFN-αサブタイプ（Mu IFN-α）混合物を10μlのBSA−PBSで希釈して、一日2回、10日間連続して投与した。あるいは、ウイルスインデューサーを作用させない以外はIFN試料と同様にして調製した、偽インターフェロン試料等量を同じスケジュールにて投与した。精製Mu IFN-αと平行してアッセイしたところ、偽IFN試料は検出可能なIFN活性を示さなかった。結果を標に示す。
0003806446.tif 000003
104IUのMu IFN-αの1日2回の口腔粘膜投与によって、ＦＬＣ細胞を注入したマウスの生存期間が劇的に延びた。実際に、5匹のうちの2匹は、20日目にインターフェロン−αの投与を止めたのにもかかわらず、2×104LD50のFLC注入の100日後にも生存し、良好な状態であり、治癒したと言える。一群10匹の成体DBA/2マウスに2×104ＬＤ50ＦＬＣを注入し、口腔粘膜上に103IUの組替えマウスインターフェロンβまたは103IUの組替えマウスIFNγを投与した場合にも、同様の結果が得られた。
実施例2
フレンド赤白血病細胞注入マウスへにおける、インターフェロン−αの低用量口腔粘膜投与の抗腫瘍活性を調べる大規模試験
実施例1の結果を確認するため、より規模の大きな試験を行った。150匹の8週令メスDBA/2マウスへ、1×105FLC（2×104FLC  ＬＤ50）をiv投与した（0日）。マウスへは、表に示した種類および用量のIFNを、in/or経路により10μlの量として1日2回、10日間続けて投与した。各投与群10匹のマウスを用いた。結果を表2にまとめた。
0003806446.tif 000004
FLCをivにより移植したマウスへのin/or経路によるIFN-α投与によって、顕著な抗腫瘍活性が認められた。実際のところ、4から5個のFLC細胞があれば1匹のマウスが死亡するのに十分であるという系において、100,000個のFLCを投与した後100日以上にわたって生存するマウスがいるということより、一部のIFN処置マウスは治癒したものとみなすことができる。
このモデルにおいて、単一組換えIFN-αサブタイプ、IFN-α 1-8、天然の複合IFN-αサブタイプ混合物、Mu IFN-α、組替えマウスIFN-β、および組替えIFN-γの精製試料をin/or経路で投与した際に顕著な抗腫瘍活性が示された。この結果は、IFN試料を口腔粘膜投与した際に認められた抗腫瘍活性が、投与した試料のIFN化合物そのものの活性に起因するものであることを強く示唆する。
実施例3
抗腫瘍活性における、インターフェロンの投与経路の影響
IFNのin/or投与の効果を、従来の投与経路でIFNを投与する場合と比較した。8週令メスDBA/2マウスへ、1×105FLC（2×104FLC ＬＤ50）をiv投与した（0日）。マウスへは、表に示した経路にてMu IFN-α104IUを、1日2回、10日間続けて投与した。この用量は、実施例2で得られた最適用量である。各投与群は6匹であり、各ケースにおいてMu IFN-αの賦形剤はBSAのPBS溶液である。結果を表3にまとめた。
0003806446.tif 000005
口腔粘膜（もしくはin/or）経路の投与は、静脈内（iv）、筋肉内（im）および皮下（sc）投与という従来用いられている投与経路と比し、有意により有効であるとは言えないまでも、少なくとも同等の効果を導いた。このin/or経路は実際、ip投与と同等の効果であり、このip投与はＦＬＣをivにて導入したマウスにおいて最も有効であると考えられている経路である。これに対して、同用量のIFNを直接口へ投与した場合は、鼻腔内投与と口腔内投与とを組み合わせた場合より効果が低く、また管によってIFNを直接胃内に投与した場合にはかなり効果が低かった。
実施例4
細胞タンパク質の発現に対するインターフェロン口腔粘膜投与の効果
IFN-αは細胞表面のレセプターに結合して数多くの細胞タンパク質の発現を誘導する事が知られている.これらのタンパク質は、IFNのマーカーとして有用であると考えられている。
われわれは、in/or経路でIFN-αを投与した場合の3種類のIFN誘導タンパク質、MHCクラスI抗原、Ly6 A/E抗原および2'5'-オリゴアデニル酸合成酵素の発現を調べた。
ip投与した場合にはたった20IUのMu IFN-αによって末梢血単球および顆粒球のＨ−2Ｋd抗原の発現が顕著に増加する系において、DBA-2マウス（H-2Kd）に対し、20,000IUまでのMu IFN-αをin/or経路にて投与したが、末梢血リンパ球、単球もしくは顆粒球上のH-2Kdの発現の有意な増加は認められなかった。実際には、単球上への発現は少し減少した。
同様に、20,000IUまでのMu IFN-αのin/or経路による投与は、Ly6 A/E抗原の発現に対して、有意な効果を及ぼさなかった。一方では、Ｉ型IFNの腹腔内投与によって、リンパ球細胞上のLy6 A/E抗原の発現は顕著に増強されている（Dumontら、J.Immunol, 1986 137:201-210）。同様の結果がMu IFN-αもしくはHu IFN-α 1-8の200および20,000IUをin/or経路で投与した場合にも得られた。
スイスまたはDBA/2マウスのいずれにおいても20IUという少量のMu IFN-αを腹腔内に投与すると、末梢血単核球および脾細胞の両方に顕著な2'5'-オリゴアデニル酸成酵素活性の上昇が認められた。これに対して、同じ試験において、20,000IUまでのMu IFN-αをin/or経路に投与しても、2'5'-オリゴアデニル酸合成酵素発現の有意な増加は認められなかった。さらに、Mu IFN-αもしくはHu IFN-α 1-8の200および20,000IUをin/or経路で投与した場合、IFNの投与開始後10日間にわたるいずれの時点においても、2'5'-オリゴアデニル酸合成酵素発現の有意な変化は認められなかった。
実施例5
インターフェロンの口腔粘膜投与後の生体利用度
IFNの生体利用度および薬物動態を調べるため、かかる研究に最も適した薬物-血液量比を有するマウスを用いた。マウスに、単一高用量の組替えIFN-αを投与したが、この際に、可能な限り高い比放射能の125Iで標識したものを用いた。
精製した70×106IUのHu IFN-α 1-8を1.4mlのＰＢＳに溶解させ、Mogensenら（Int.J.Cancer,1981 28:575-582）による、HunterとGreenwood（Nature，1962 194:495-496）のクロラミン-T法の改良法を用いてヨウ素化した。
ヒトWISH細胞をVSVに暴露したものでは、125I標識Hu IFN-α 1-8（ロット番号CGP35269-1）は2×107IU/mlの生物活性を示し、L929細胞をVSVに暴露したものでは1×106IU/mlの活性を示した。
6−7週令のメスのスイスマウスにiv、ipもしくはin/orにて2×107IU、即ち1×106マウスIUに等しい量の125I Hu IFN-α 1-8（1.0369×107cpm/マウス）を投与した。示した時間において、各群3匹をマウスを殺し、血液を集め、その量を測定した。腎臓、肝臓、肺、脾臓、および胃/食道を取り、水分を吸い取った後に±10μｇの精度にて重量を測定した。各試料の放射活性をガンマカウンターを用いてそれぞれ測定した。次いで全血を遠心分離（800g×10分、4℃）で分離して、血清を分取し、計測した後に-80℃にて凍結した。血清はヒトWISH細胞およびマウスL929細胞の両方による上記標準バイオアッセイによってIFN濃度を調べた。血清試料中の放射活性物質を次いでアフィニティー免疫沈降によって単離させ、SDS-PAGEにて分析した。
1.0369×107cpm/マウスの125I標識Hu IFN-α 1-8のiv一括投与5分後に、非常に高レベルの放射活性（＞2×106cpm/ml）が動物の末梢血から検出された。全血の放射活性は15分及び30分の時点では連続的に低下した。1.0369×107cpm/マウスの125I標識Hu IFN-α 1-8のip一括投与5分後に動物の末梢血から検出された放射活性は、iv一括投与の5分後に検出されたものの約20倍低かった。放射活性のレベルはip注射後15分及び30分において累進的に増加した。125I標識Hu IFN-α 1-8のin/or投与後、5、10または15分後に動物の血中に検出される放射活性レベルは、同じ量の放射線標識IFNをip投与した後同じ時間に認められた量より、有意に低かった。これら3つの経路による投与において、125I標識Hu IFN-α 1-8のin/or投与後、全血より血清により高いレベルの放射活性が検出された。全血1ミリリットルあたりの放射活性が、同じ量の血清よりも低いということは、全血の細胞成分を除けば測定される血清の量が有意に多くなることによる。
すべてのマウスからの血清サンプルにつき、生理活性IFNの存在の有無を、上記標準的バイオアッセイ法を用いて調べた。その結果、ivまたはipの経路で125I標識Hu IFN-α 1-8を投与したすべてのマウスにおいて、計測したいずれの時間においても容易に検出し得るレベルのIFNが認められた。これに対して、125I標識Hu IFN-α 1-8をip/or投与した群では、血清中に比較的高いレベルの放射活性が認められたのにもかかわらず、試験を行ったいずれの動物、いずれの時間においても生物活性を有するIFNは検出されなかった。
125I標識Hu IFN-α 1-8投与動物の血清から検出された放射活性物質が実際に本来のIFNの存在を示すものであるかどうかを調べるため、試料をタンパク質Ａ−Ｇアガロースを用いて免疫沈降させ、試料中にある免疫グロブリンを沈降させるため、アフィニティ-精製ずみポリクローナル抗IFN-α抗体で処理し、さらに免疫沈降を行った。試料を次いで上記のごとくＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＤＳＤ−ＰＡＧＥ）にかけた。
125I標識Hu IFN-α 1-8のivまたはip投与の後の血清内の放射活性物質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって、非投与125I標識Hu IFN-α 1-8と同一の電気泳動パターンを示して移動する、単一の均一なバンドが認められた。この物質の見かけ上の分子量はおよそ20000ダルトンであると測定されたが、これはそのままのHu IFN-α 1-8の分子量に対応する。一方、in/or経路により125I標識Hu IFN-α 1-8を投与したマウスの血清サンプルにおいては、各ゲルに等量の放射活性物質が検出されたが、いずれもがそのままのIFNと類似の見かけの分子量を有する物質を含有していなかった。
放射線標識した物質の臓器分布を調べたところ、125I標識Hu IFN-α 1-8のiv投与5分後に、非常に高いレベルの活性が腎臓に、高レベル活性が肝臓、肺および脾臓に認められた。これら4つの臓器の放射活性のレベルはそれぞれ、その後15分及び30分後には迅速に減少していくのが認められた。これに対して胃の放射活性レベルは15分及び30分において迅速に増加し、iv一括投与後30分の血清内と同じレベルにまで達することが認められた。
125I標識Hu IFN-α 1-8のip投与では、調べたすべての臓器において15分以内に活性がピークに達し、30分では減少した。同様に、125I標識Hu IFN-α 1-8のin/or投与の場合でも調べたすべての臓器における放射活性のピークレベルは15分後に達成され、30分後の測定では放射活性はいくらか減少していた。125I標識Hu IFN-α 1-8をin/or投与した場合の胃/食道における放射活性のレベルは、in/or投与で他の臓器にて検出された量より1オーダー多く、同量の放射線標識Hu IFN-α 1-8をiv  ipのいずれかの経路で投与した場合よりもかなり高い。
実施例6  口腔内/鼻内投与したインターフェロンの薬動態学、
Hu IFN-α 1-8の精密な動態を調べるため、1.0369×107cpm/マウスの125I標識Hu IFN-α 1-8をiv、ipまたはin/orにてマウスに投与し、全血および血清の放射活性のレベルを24時間にわたり、一定時間毎に調べた。
一回のiv一括投与後のマウス血中125I標識Hu IFN-α 1-8の薬動態は、ほぼ対数カーブに沿ったものであった。これは非常によく似た分子である組換えヒトαA/D（Bgl）（Bohoslawedら、J.IFN Res 1986 6:207-213）を用いてマウスで行われた先の試験の結果と合致する。生物学的利用可能物質の量、即ち濃度対時間のカーブの下領域から計算される量もまた、ヒトαA/Dと同様であった。2相性時間消費クリアランスカーブが125I標識Hu IFN-α 1-8のiv一括投与後に認められたが、これは腎臓で排除されるもののカーブであり、この結果は実施例4の結果と合致する。125I標識Hu IFN-α 1-8をip投与した場合の薬物動態は、先に報告されているIFNをim投与した場合のものと非常によく似ていた。
容易に検出し得るレベルの生物活性IFNが、125I標識Hu IFN-α 1-8のiv一括投与あるいはip投与後のいずれにおいても、すべての動物の血清に認められた。
フレンド赤白血病モデルは、抗腫瘍活性の非常に厳しい前臨床試験となっている、というのはＦＬＣはivで移植した場合に高い悪性度と肝臓および脾臓への転移を示すからである。実際、このモデルを用いて得られた結果は、ヒト癌治療のためのIFN-αの非経口投与の採用の基礎となったものである。即ち、この研究において行われたすべての試験において、非処理マウスおよびコントロール試料を投与されたすべてのマウスは10から11日目に死亡している。たった4または5個のFLC細胞を移植しただけで、何ら処置をしなければマウスは死ぬ。これに対して、口腔粘膜経路にてマウスIFN-αを投与したマウスでは、そのうちの一部が、105のＦＬＣの移植100日後でもなお生存しており、治癒したとみなし得た。
実際に、先の研究に示されているFLCを移植されたマウスの生存日数を数日のみ延長するシクロフォスファミド、5-フルオロウラシルまたはメトトレキサートを非経口投与にて投与する場合（Gresserら、J.Natl.Cancer Inst1988 80:126-131）より口腔粘膜経由で投与されたIFN-αは、有効である。また、シスプラチン、ビンクリスチン、デオキソルブリシン、ブレオマイシンまたはエトポシドのごとき他の薬物はこの腫瘍には効果が無い（Gresserら、J.Natl.Cancer Inst1988 80:126-131）。
また、口腔粘膜経由で投与されたIFN-αは、IL-1β、IL-2およびTNF-αなどの、このモデルにおいて全身投与で非常に低い活性を示す他のサイトカインよりも、明らかにＦＬＣに対してより有効である。
先の研究では、IFNの非経口投与がこのモデルにおいて最も活性のある抗腫瘍薬であり、腫瘍の転移がすでに始まり、肝臓に腫瘍が存在する場合でもIFN治療が有効であるということが示されている（Gresserら、Intl. J. Cancer, 1987 39:789-792）。本結果は口腔粘膜経路へのIFN投与がこれと同等あるいはこれにもまして有効であることを示すものである。
リンパ腫の形成が認められた後、IFN-αを一回投与量のシクロフォスファミドと共に毎日注射することによって、リンパ腫を有するAKRマウスの生存期間を、いずれかを単独投与する場合と比して延長することが報告されている（Gresserら、Eur. J. Cancer, 1978 14:97-99）。IFN-αZβおよびＢＣＮＵ、シス−ＤＤＰ（シスプラチン）、メトトレキセート、アドリアマイシンおよびα−ジフルオロメチルオルニチンを用いた組み合わせ治療の成功例もまた、様々な前臨床動物腫瘍モデルにおいて報告されている。5−フルオロウラシル（5−ＦＵ）とIFNはまた、ヒトの大腸癌の転移の治療にも有用であることが報告されている（Ernstoffら、Journal of Clinical Oncology, 1989 7:1764-1765）。しかしながら、他の報告においては、これらとIFN治療を組み合わせると抗腫瘍活性が低下するという報告もあり、サイクロホスファミド（Marquetら、J.Cancer, 1983 31:223-226；Leeら,Biochem. Pharmacol.,1984 33:4339-3443）、アドリアマイシン（Blackwillら、Cancer Res., 1984 44:904-908）または5−Fu（Marquet，1985 109:156-158）などの使用とIFNの組み合わせが報告されている。これらは、IFN非経口投与と組み合わせて有益な効果を生むと報告されている、まさにその同じ薬品である。IFNと他の化学療法剤との併用の効果を、ここに説明した方法を用いて容易に試験することができる。
インターロイキン−1（IL-1）とIFN-α/βの併用療法は、FLCを注入したマウスにおいて、相乗的抗腫瘍効果を示す（Belardelliら、Int. J. Cancer, 1991 49:274-278）。同じ処置は、Ｅｂリンパ腫の転移性変異株（ｐ11−Ｒ−Ｅｂ）に対して有効であるが、この株にはいずれの剤も単独では効果が無い（Gabrieleら、Invasion Metastasis, 1993 13:147-162）。タイプI  IFN療法と併用する場合、IL-1がすべての試験したサイトカインのうちで最も有効であった。
血管新生抑制剤AGM-1470［（クロロアセチル）-カルバミックアシッド（3R-（3α,4α（2R*,3R*,5β,6β））-5-メトキシ-4-（2-メチル-3-（3-メトキシ−2−ブテニル）オキシラニル）-1-オキサスピロ（2,5）オクト-6-イルエステル］をIFN-α/βと同時に投与すると、いずれか一方を単独で投与した場合と比して顕著な抗腫瘍効果の増強が認められる（Bremら,J. Peridatric Surgery, 1993 28:1253-1257）。
温熱療法がIFN-α/βのルイス肺癌腫に対する抗腫瘍作用を高めることが報告されている（Yerushalmiら、Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 1982 169:413-415）。アルギニンブチレートもまた、IFN-αの抗腫瘍活性を増強することが示されている（ChanyとCerutti, Int. J. Cancer, 1982 30:489-493）。
適当な型および用量のIFNを口腔粘膜経路にて投与する場合の保護の程度を、全身投与（ip注射）によって得られる結果と比べてみても、一部のケースにおいてはIFNの非経口投与が口腔粘膜投与よりわずかに有効であるが、他のケースにおいては口腔粘膜投与を超えるというわけではない。
生物マーカーのパイロット試験では、試験に供した3つの生物マーカー（MHCクラスＩ抗体、Ly6 A/E抗体および2'5'-オリゴアデニル酸合成酵素活性）では、口腔粘膜経路で投与されたIFN-αによって示された非常に強い抗腫瘍活性を適当に反映するものがないことを非常にはっきり示している。
行ったすべての試験において、たった20IUのIFNのip投与に続いて、3つすべてのIFN-誘導性タンパク質の発現が非常に顕著に増加したのに対し、20,000IUまでのIFN-αを口腔粘膜投与しても生物マーカーに何ら検出可能な影響を及ぼさないということは、印象的である。
生物マーカーのうちのいずれかに対する効果が、より早い時期、もしくは中間時において認められるかもしれない可能性を除くことはできないが、これはありそうにない。というのは、IFNがこれらのタンパク質をコードする遺伝子の転写に影響を及ぼすよう働き、そのためにIFN処置後数時間まではいずれかの生物マーカー上の効果が認められるということは通常は考えられないからである。
また、他の多数のIFN誘導性タンパク質がIFN-αの口腔粘膜経路投与の後に何らかの全身性作用を及ぼす可能性も除くことはできないが、特定のIFN-誘導遺伝子の発現の分化制御を含むことになり、この可能性も低い。しかしながら、IFNバイオマーカーへの影響が局所で、例えば口腔粘膜経路でIFN-αを投与した後、鼻リンパ球上で観察され得る可能性は高い。
試験した生物マーカーの検出可能な影響が認められなかったことと対応して、IFNの口腔粘膜投与療法中にモニターした血液学的または血液化学的パラメーターには、20000IUまでのIFN-αを投与された動物でさえはっきりした変化は認められなかった。
容易に検出し得るレベルの放射性標識物質が125I標識IFN-α 1-8の口腔粘膜投与後の全血および血清に認められた。この結果は大量の非標識IFNの経口投与後の動物の血清にもIFNを検出することができなかったとする先の結果と反する。しかしながら、口腔粘膜投与の後に全血および血清の両方に検出された放射活性物質は、生物的には不活性であった。さらに、SDS-PAGE分析の結果から、この物質は低分子量のものであり、胃及び小腸におけるIFNの消化後の分解生成物である可能性が最も高い。口腔粘膜投与後の放射標識物質の組織移行分析では、他のいずれの臓器よりも顕著に高いレベルの放射活性が胃に認められた。これらの結果は、生物的に活性なIFNは口腔粘膜投与の後には吸収されないにもかかわらず、この投与によって統計的に有意な抗腫瘍活性がインビボで示されるということをはっきりと示す。
見出された有用な効果を今まで提案されている機構と結びつけようというつもりはない。われわれの結果は、口腔粘膜経路で投与されたIFNが、現在まだ見出されていない新規な機構によって腫瘍細胞に影響を及ぼしていることを示唆するものである。この新規な機構は、外部から投与されたIFNの直接作用を含まず、また体内のIFNの誘導も含まないものである。これは、検出し得るレベルの循環IFNが認められなかったこと、または3つの生物マーカー試験で支持される。この機構は少なくともその一部分には、鼻腔及び口腔をとりまく大量のリンパ組を刺激することによるものであると考えられる。われわれは、口腔粘膜IFNが全身投与したインターフェロンと少なくとも同等の効力を有することを示したが、この結果は本発明のIFNを腫瘍形成性疾患の治療において口腔粘膜経路で投与することを強力に支持するものである。これは、IFNの臨床使用に、重要なかかわりを持ち得る。
発明が明確に説明され、そして理解されるため、発明を一部かなり詳しく説明したが、本技術分野においての通常の知識を有する者にとっては、開示した態様および方法の様々な改良および改変は本明細書に開示した発明のコンセプトの範囲からはずれることなく、実施され得ることは明らかである。