(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
分析のためのセンサであって、
それ自体が複数の電極の組み立て体であり、前記複数の電極は微小電極であって、微小電極のそれぞれがレドックス状態依存の導電性有機重合体の層により被覆されている作用電極と、
対向電極と、
容器に収容された導電性媒体と、前記導電性媒体中には前記２つの電極が配置されるとともに、分析される物質が導入されており、
２つの電極間に交流の極間電位を与える手段と、
分析対象物質の存在する作用電極と対向電極の面の間の電気伝導度特性の変化を検出する手段と
からなるセンサ。
【請求項２】
前記導電性媒体が導電性溶液である請求の範囲第１項に記載のセンサ。
【請求項３】
検出される前記電気伝導度特性が、（作用電極―対向電極）平面間のインピーダンスである、請求の範囲第１項に記載のセンサ。
【請求項４】
前記電動度特性の変化が、印加する周波数の関数として検出される、請求の範囲第１項に記載のセンサ。
【請求項５】
前記電動度特性の変化が単一の適用周波数で検出される、請求の範囲第１項に記載のセンサ。
【請求項６】
前記導電性有機重合体が、化学蒸着または光重合により電気化学的に堆積される、請求の範囲第１項〜第５項のいずれか１項に記載のセンサ。
【請求項７】
前記導電性有機重合体のマトリックス中には、酵素が捕捉されている、請求の範囲第１項〜第６項のいずれか１項に記載のセンサ。
【請求項８】
前記酵素が、グルコースオキシダーゼ、アルコールオキシダーゼ、またはアルコールデヒドロゲナーゼである、請求の範囲第７項に記載のセンサ。
【請求項９】
前記作用電極が、平板電極に絶縁性重合体を被覆し、絶縁性重合体被覆を超音波加工により粗面化して複数の微孔を形成し、かつ該微孔内にレドックス状態依存導電性有機重合体を堆積させることにより製造される、請求の範囲第１項に記載のセンサ。
【請求項１０】
前記絶縁性重合体が、ポリジアミノベンゼンジヒドロクロリド、テフロン、ＰＣＶまたはポリエチルビニルベンゼンである、請求の範囲第９項に記載のセンサ。
【請求項１１】
平板電極に絶縁性重合体を被覆し、絶縁性重合体被覆を超音波加工により粗面化して複数の微孔を形成し、かつ該微孔内にレドックス状態依存導電性有機重合体を堆積させることからなる作用電極組み立て体の製造方法。
【請求項１２】
前記導電性有機重合体が、化学蒸着または光重合により電気化学的に堆積される、請求の範囲第１１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記導電性有機重合体のマトリックス中には、酵素が捕捉されている、請求の範囲第１１項または第１２項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は、溶液中に存在する液体検出用センサに関する。
ポリピロール、ポリアニリンおよびポリインドール等のレドックス状態依存導電性有機重合体（redox state dependent conducting organic polymers）に基づく電気伝導度センサは良く知られている。一般に、このようなセンサは、微小間隔を隔てて配置された２つの電極を架橋する導電性有機重合体の層を有し、かつ一般に、重合体の抵抗すなわちＡＣ抵抗の変化の検出に基づいている。この抵抗変化は、液体（溶液またはガス相に存在する）と、重合体との間の相互作用により引き起こされる。重要な用途領域は、有機重合体中に酵素を導入し、生物学的に重要な検体の定量的検出ができる「バイオセンサ」を作ることにある。検体中に酵素が暴露されると検体活性が誘起され、これにより重合体マトリックスを捕捉する酵素内に電気伝導度合の変化を誘起する。電気伝導度の変化の正確な本質は明らかではない（重合体と酵素との種々の組合せにより異なるかもしれない）が、局部的Ｈ+濃度効果と、オキシダーゼ、ケトンおよびアルデヒドの場合にはＨ2Ｏ2の発生とに関係がある。概していえば、重合体の電気伝導度は、検体への暴露時の酵素のレドックス挙動により乱される。酵素−基質の相互作用は一般に非常に特殊であるため、関連するバイオセンサは、高度に選択的な検体検出方法であることを意味する。
しかしながら、通常、電極が幾分微小間隔（一般に２０μｍ以下）を隔てて配置されている場合には、有機重合体の電気化学的成長により電極を架橋できるに過ぎない。この上限は、測定した信号の大きさに制限を加え、かつ正確な電極形状を必要とするため、スクリーン印刷またはシリコンチップ製造技術等の技術的に厳格で費用の嵩む製造方法を必要とする。
正確な電極整合の問題を回避する１つの魅力的な選択肢として、検体溶液と平板作用電極とを架橋する重合体のインピーダンスまたはアドミタンスを測定する方法があり、このような構成では、測定は、（作用電極−重合体−検体溶液−対向電極）の平面内で行なわれる。検体の検出は、重合体と検体との間の相互作用により誘起される重合体のインピーダンスまたはアドミタンスの変化を検出することにより行なわれる。しかしながら、この構成で作用する線形物質移動レジーム（linear mass transport regime）のため、有効な測定を行なう上で信号の大きさが不充分なものとなってしまうことは不可避である。
本発明は、導電性有機重合体被覆形微小電極配列からなる作用電極組立体を、上記構造内に導入する概念に基づいている。このような電極は、検体を半径方向に移動させ、該構造をセンサとして使用可能にする。
本発明はまた、このような微小電極の例および該微小電極の製造方法を提供する。
国際出願（WO 91/08474）には、光粗面化（photoablation）による微小電極の製造方法が記載されている。微小電極は、重金属を検出する電流検定法に使用されている。
本発明の一態様によれば、作用電極組立体を備えた検体用センサにおいて、作用電極組立体が、微小電極配列を有し、各微小電極がレドックス状態依存導電性有機重合体の層で被覆されており、対向電極と、導電性媒体受容体とを有し、該受容体内には電極が配置されかつ分析すべき物質が導入され、電極間に交流の電気分極電位を印加する手段と、検体の存在する（作用電極−対向電極）平面間の電気伝導度特性の変化を検出する手段とを更に有する検出用センサが提供される。
導電性媒体受容体は導電性溶液で構成できる。
電気伝導度特性は、（作用電極−対向電極）平面間のインピーダンスにすることができる。
電気伝導度特性の変化は、適用周波数の関数として検出できる。
電気伝導度特性の変化は、単一の適用周波数で検出できる。
作用電極は、平板電極に絶縁性重合体を被覆し、絶縁性重合体被覆を超音波加工により粗面化して複数の微孔を形成し、かつ該微孔内にレドックス状態依存導電性有機重合体を堆積させることにより製造できる。導電性有機重合体は、電気化学的に、または化学蒸着、光重合技術、その他の薄膜または厚膜表面被覆技術等の他の手段により堆積できる。
導電性有機重合体のマトリックス中には、酵素を捕捉させることができる。半導体有機重合体は、ポリアニリン、ポリピロール、ポリインドールまたはこれらの均等物で構成できる。酵素は、グルコースオキシダーゼ、アルコールオキシダーゼまたはアルコールデヒドロゲナーゼ等のレドックス酵素で構成できる。また、平板電極は、貴金属またはカーボン等の導電性材料で構成でき、絶縁性重合体は、ポリジアミノベンゼンジヒドロクロリド、テフロン、ＰＶＣまたはポリエチルビニルベンゼンで構成できる。
本発明の第２の態様によれば、平板電極に絶縁性重合体を被覆し、絶縁性重合体被覆を超音波加工により粗面化して複数の微孔を形成し、かつ該微孔内にレドックス状態依存導電性有機重合体を堆積させることからなる作用電極組立体の製造方法が提供される。
有機重合体は、化学蒸着、光重合技術、その他の薄膜または厚膜表面被覆技術により電気化学的に堆積させることができる。
有機重合体のマトリックス中には、酵素を捕捉させることができる。
以下、本発明によるセンサおよび作用電極組立体の製造方法を、添付図面を参照して説明する。
第１図は、電極構成を示す概略図である。
第２図は、制御構成を示す概略図である。
第３図は、可能性のある等価回路を示す図面である。
第４図は、種々の検体濃度でのインピーダンスと周波数との関係を一般的な対数で示すグラフである。
第１図および第２図は、作用電極組立体１０と、対向電極１２と、導電性溶液１４とからなる本発明による検体検出センサを示す。作用電極組立体１０は微小電極配列からなり、各微小電極は、レドックス状態依存導電性有機重合体の層で被覆されている。センサは更に周波数応答分析器１６を有し、該周波数応答分析器１６は、ｉ）電極構成１８間に交流分極電位を印加し、かつii）溶液中に検体が存在するときには、（作用電極基質−重合体−溶液−対向電極）平面間の選択された電気伝導度特性のあらゆる変化を検出する。別の構成として、位相感応検出器によりこの変化を検出することができる。周波数応答分析器の制御およびデータの収集は、特に、適当なインターフェースを介してコンピュータ２０により行われる。
本発明の電気伝導度センサは、活性検体検出媒体としてレドックス状態依存導電性有機重合体を使用するが、この種類の重合体を使用する従来技術の電気伝導度測定装置とは非常に異なる検出構造を有する。より詳しくは、従来技術の装置は、一般に、導電性有機重合体により架橋される微小間隔（この場合には、約１５〜２０μｍ以下）を隔てた電極を有する。このおおよその上限は、最も一般的に用いられている導電性重合体堆積方法である電気化学的成長重合体により、大きな間隔を隔てて分離した電極を有効に架橋するのが困難なことによる。この困難性の理由は、電極の分離量が重合体鎖の長さより大きく、このため非常に高い抵抗および劣った機械的品質をもたらすことによる。従って、正確な電極形状が必要とされ、このため、スクリーン印刷またはシリコンチップ製造技術等の技術的に厳格で費用の嵩む方法を用いる必要がある。
本発明の構成は、電極ブリッジとして導電性重合体を使用せず、従って、電極同士を正確に整合させる必要はない。また、半導体有機重合体で被覆された慣用的な平板作用電極を使用すると検体の線形物質移動が生じ、これが、実用不可能なほど小さい検出信号にしてしまうことに留意すべきである。微小電極の導入により、検体の物質移動が本質的に半径方向になり、卓越した感度での検体検出が可能になる。
検体の検出は、対向電極と、作用電極からなる重合体被覆形微小電極配列との間の複素平面インピーダンス（complex plane impedance）の変化を検出すつことにより達成される。しかしながら、コンダクタンスまたはサセスタンス等の他の電気伝導度特性の検出も本発明の範囲内にある。いずれにせよ、例えば重合体抵抗の検体誘起変化の所望の測定を、装置の他の電気伝導度成分から分離する必要がある。第３図は、対向電極と作用電極との間の電気伝導度挙動が、下記ｉ）〜iv）すなわち、
ｉ）補償されない溶液抵抗Ｒu
ii）電気的二重層によるキャパシタンスＣdl
iii）ワールブルクインピーダンス（Warburg impedance）Ｗおよび電荷移動抵抗ＲCtからなる反応抵抗
iv）重合体層のキャパシタンスＣpf
に分解されることを表示するランドルの等価回路（Randles equivalent circuit）を示す。ワールブルクインピーダンスＷは、高励起周波数（一般に、１００Ｈｚ以下）では無視でき、従って、検体−重合体の相互作用により変調される電荷移動抵抗ＲCtおよび重合体層のキャパシタンスＣplを求めることができる。
第４図には、インピーダンスが、適用周波数および検体濃度の関数として変化する態様が示されている。応答曲線ａ、ｂ、ｃ、ｄは、検体濃度が増大する順に示されている。検体の存在は、或る範囲の適用周波数に亘って応答関数の変化をモニタリングすることにより検出される。或いは、固定周波数でのインピーダンスの変化を検出する方が好都合なこともある。この固定周波数は、第４図にＡで示す周波数のように、問題とする検体−重合体の組合せにより特別大きなインピーダンス変化が誘起される周波数が有効である。コンピュータ２０は、溶液１４中に検体が存在しないときに得られる応答すなわち応答関数を基準信号として記憶し、かつこの基準信号と、検体が存在するときに得られる応答すなわち応答関数とを比較するのに使用される。
フーリエ変換分析技術を適用することもできる。しかしながら、センサ抵抗の大きなＤＣ測定法は満足できるものではない。なぜならば、この抵抗に最も大きく寄与するものは、浮動値の原因となる回路内のキャパシタンスの荷電によるものだからである。
本発明はまた、半導体有機重合体被覆形微小電極配列（semiconducting organic polymer coated micro-electrodes）および該電極配列の製造方法を提供する。概略的にいえば、本発明の作用電極は、平板電極に絶縁性重合体を被覆し、該絶縁性重合体被覆を超音波粗面化して複数の微孔を形成し、かつ該微孔内に導電性有機重合体を堆積することにより製造される。微小電極配列は、絶縁性重合体被覆電極を超音波加工することにより製造できることは、NA Madigan、CRS HaganおよびLA Coury, J.による論文（Electrochem. Soc.、１４１巻、１９９４年、１０１４頁）に開示されているが、微小電極に列導電性有機重合体を被覆すること、およびこのような微小電極配列をセンサとして使用することは何ら示唆されていない。絶縁性重合体膜の例として、ポリジアミノベンゼン−ジヒドロクロリド、ＰＶＣ、テフロン、ポリエチルビニルベンゼン等がある。基板電極材料の例として、金、プラチナ、ルテニウム、金／プラチナ合金およびガラス質カーボンがある。超音波加工には、水、デカンおよびジオキサン等の溶剤が一般に使用される。
導電性有機重合体は電気化学的に堆積され、重合化方法の正確な詳細は、良く知られた文献に記載された方法と実質的に異なるものではない（例えば、CooperおよびEAH Hallの文献「バイオセンサおよびバイオエレクトロニクス(Biosensors & Bioelectronics)」、第７巻、１９９２年、ダイヤモンド４７３頁参照）。電気重合化可能な導電性有機重合体の例として、ポリアニリン、ポリピロール、ポリインドールおよびポリ−Ｎ−メチルピロールがあるが、この列挙は非限定的なものであり、文献から、適当な導電性有機重合体の多くの例を見出すことができよう。化学蒸着、光重合技術その他の薄膜または厚膜表面被覆技術も本発明の範囲内にある。
本発明の重要な特徴は、導電性有機重合体中に酵素を導入して、例えば生物学的に重要な検体を検出できるバイオセンサを作ることにある。重合体中への酵素の導入は、文献に記載の多くの優れた特徴をもつ任意の方法により行なうことができる。例えば、重合体は、単量体および酵素の両方を含有する溶液から電気化学的に重合化できる。
本発明のセンサの特定の一例は、グルコースの存在に感応する装置である。作用電極は、ポリジアミノベンゼンジヒドロクロリドで被覆された金の平板電極を水中で超音波加工し、次に、グルコースオキシダーゼが存在するアニリンを電気重合化することにより製造した。超音波加工は、一般に、１５ＫＨｚの周波数で１分間行なわれる。グルコースオキシダーゼは、触媒作用によりグルコースを酸化させる。すなわち、
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導電性有機重合体としてのポリアニリンの選択は、過酸化水素の存在下でのポリアニリンの安定性により影響を受ける。しかしながら、他の導電性有機重合体および他の酵素の使用も本発明の範囲内にあることに留意すべきである。グルコース検体の変化する濃度での適用周波数の関数としてのインピーダンスプロファイルの測定は、この形式のグルコースセンサを使用して行なった。この結果は、選択された周波数で測定されたインピーダンス値の変化が、低い（＜５ｍＭ）濃度レジームでの溶液中のグルコース濃度に比例することを示している。一例として、11.3Ｈｚの周波数で行なわれる測定は、グルコースが存在しない場合には重合体膜のインピーダンスがｃａ．４００Ωであるが、５ｍＭのグルコース溶液が存在する場合にはこのインピーダンスがｃａ．２００Ωに低下することを示している。これは、使用した装置の検出限度を遙に上回る極めて大きい信号であり、約0.1Ω以下の抵抗変化を検出できることを示すものである。
酵素としてアルコールオキシダーゼを導入するセンサ（この場合には、エタノールが検体である）でも同様な結果が得られた。これは、本発明が種々の検体−酵素組合せに適用できることを証明するものである。１５ｍＭのエタノール濃度の場合には、ｃａ．４００Ωからｃａ．２００Ωへのインピーダンスの低下が観察された。
本発明の範囲および精神の範囲内で、他の多くの変更が可能である。例えば、各作用電極が異なる重合体および／または酵素を有する一装置内では、幾つかの作用電極を組み合わせることが望ましい。一例では、各作用電極に、重合体マトリックス中に導入された異なる酵素を設けることができ、また酵素は異なる検体に感応するものでもよい。この結果得られる装置は、多数の特定検体の存在に感応するものとなるであろう。或いは、酵素のような検体受容剤を導入していない半導体有機重合体ベースの電気伝導度センサが、通常、或る範囲の検体に感応することは良く知られている。従って、ＤＣ抵抗の変化の測定に基づく従来技術の装置では、単一重合体を導入する単一センサで検体の正確な識別を行なうには１つの問題がある。この点で、本発明は、周波数の関数としてのセンサ応答が、単一の大きなＤＣ抵抗測定値に匹敵する特別な検出次元数を与えかつ検出された検体の「指紋」であると考えることができるため優れている。しかしながら、各々が異なる半導体有機重合体を備えている複数の作用電極を有する装置を製造するのが望ましく、このような装置では、複数の作用電極間の応答パターンが特定検体を表示するように構成される。実際に、このような装置の応答パターンから、混合物の個々の成分を推測できることが証明されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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