(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチド。
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは転位したアミノ酸配列からなり、かつ硫酸基供与体から下記式１で示されるオリゴ糖の非還元末端のＮ−アセチルグルコサミン残基の６位水酸基に硫酸基を転移する酵素活性を有するポリペプチド。
GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAc（式１）
（但し、GlcNAcはＮ−アセチルグルコサミン残基を、Galはガラクトース残基を、β1-3はβ1-3グリコシド結合を、β1-4はβ1-4グリコシド結合をそれぞれ示す）
【請求項２】
以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチド。
（ａ）配列番号４のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは転位したアミノ酸配列からなり、かつ硫酸基供与体から下記式１で示されるオリゴ糖の非還元末端のＮ−アセチルグルコサミン残基の６位水酸基に硫酸基を転移する酵素活性を有するポリペプチド。
GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAc（式１）
（但し、GlcNAcはＮ−アセチルグルコサミン残基を、Galはガラクトース残基を、β1-3はβ1-3グリコシド結合を、β1-4はβ1-4グリコシド結合をそれぞれ示す）
【請求項３】
以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドをコードするＤＮＡ。
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは転位したアミノ酸配列からなり、かつ硫酸基供与体から下記式１で示されるオリゴ糖の非還元末端のＮ−アセチルグルコサミン残基の６位水酸基に硫酸基を転移する酵素活性を有するポリペプチド。
GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAc（式１）
（但し、GlcNAcはＮ−アセチルグルコサミン残基を、Galはガラクトース残基を、β1-3はβ1-3グリコシド結合を、β1-4はβ1-4グリコシド結合をそれぞれ示す）
【請求項４】
配列番号１において塩基番号４７０〜１９１８で表される塩基配列を含むＤＮＡ。
【請求項５】
以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドをコードするＤＮＡ。
（ａ）配列番号４のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは転位したアミノ酸配列からなり、かつ硫酸基供与体から下記式１で示されるオリゴ糖の非還元末端のＮ−アセチルグルコサミン残基の６位水酸基に硫酸基を転移する酵素活性を有するポリペプチド。
GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAc（式１）
（但し、GlcNAcはＮ−アセチルグルコサミン残基を、Galはガラクトース残基を、β1-3はβ1-3グリコシド結合を、β1-4はβ1-4グリコシド結合をそれぞれ示す）
【請求項６】
配列番号３において塩基番号３９０〜１８４１で表される塩基配列を含むＤＮＡ。
【請求項７】
請求項１又は２に記載のポリペプチドを、下記式３で示される糖鎖に作用させる工程を少なくとも含む、下記式４で示される硫酸化糖の製造方法。
GlcNAc−Ｒ（式３）
（但し、GlcNAcはＮ−アセチルグルコサミン残基を、−Ｒは水素原子又はグリコシド結合した糖残基をそれぞれ示す）
(SO4-6)GlcNAc−Ｒ（式４）
（但し、GlcNAcはＮ−アセチルグルコサミン残基を、SO4-6は６位の水酸基が硫酸化されていることを、−Ｒは水素原子又はグリコシド結合した糖残基をそれぞれ示す）
【請求項８】
請求項３〜６のいずれか１項に記載のＤＮＡを細胞に移入し、次いで該細胞を培養する工程を少なくとも含む、硫酸化糖の製造方法。
【請求項９】
請求項３〜６のいずれか１項に記載のＤＮＡ及びフコシルトランスフェラーゼをコードするｃＤＮＡを共に細胞に移入する、請求項８記載の硫酸化糖の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−Ｏ−硫酸基転移酵素（Ｎ−アセチルグルコサミン−６−Ｏ−スルホトランスフェラーゼ）のポリペプチド及びそれをコードする塩基配列を有するＤＮＡに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
以下に本発明に最も近い技術について説明する。
Biochem.J.,319,209-216(1996)及びJ.Biol.Chem.,272,29493-29501(1997)には、ラット及びヒトのミクロソーム画分中にＮ−アセチルグルコサミン−６−Ｏ−硫酸基転移酵素活性が存在することが記載されている。しかし、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−Ｏ−硫酸基転移酵素のポリペプチドの単離及び物質同定についての報告はなく、またこのポリペプチドをコードするDNAについても知られていない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
Ｎ−アセチルグルコサミン−６−Ｏ−硫酸基転移酵素のポリペプチドが得られれば、L-セレクチン(リンパ球のホーミングや炎症初期に起こる白血球のローリング等に関与している)のリガンドであるGlyCAM-1等の糖鎖の合成に用いることができる。またこのポリペプチドをコードするDNAは、当該ポリペプチドの大量生産への利用や、遺伝子移入による生体内(細胞)でのGlyCAM-1(NeuAcα2-3Galβ1-4(Fucα1-3)(SO4-6)GlcNAc-構造を有する)の人工的合成等への利用が期待される。
【０００４】
すなわち本発明は、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−Ｏ−硫酸基転移酵素のポリペプチド、及びこれをコードするＤＮＡを提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAc(GlcNAcはＮ−アセチルグルコサミン残基を、Galはガラクトース残基を、β1-3はβ1-3グリコシド結合を、β1-4はβ1-4グリコシド結合をそれぞれ示す)の非還元末端のＮ−アセチルグルコサミン残基の６位水酸基に特異的に硫酸基を転移する活性を有する、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−Ｏ−硫酸基転移酵素のポリペプチドをコードするDNAのクローニングに成功した。また該DNAによりＮ−アセチルグルコサミン−６−Ｏ−硫酸基転移酵素のポリペプチドが発現されることを確認し、該ポリペプチドを同定することに成功して本発明を完成させた。
【０００６】
すなわち本発明は、以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチド（以下「本発明ポリペプチド」ともいう）を提供する。
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは転位したアミノ酸配列からなり、かつ硫酸基供与体から下記式１で示されるオリゴ糖の非還元末端のＮ−アセチルグルコサミン残基の６位水酸基に硫酸基を転移する酵素活性を有するポリペプチド。
GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAc（式１）
（但し、GlcNAcはＮ−アセチルグルコサミン残基を、Galはガラクトース残基を、β1-3はβ1-3グリコシド結合を、β1-4はβ1-4グリコシド結合をそれぞれ示す）
【０００７】
本発明ポリペプチドには、以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドも包含される。
（ａ）配列番号４のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは転位したアミノ酸配列からなり、かつ硫酸基供与体から下記式１で示されるオリゴ糖の非還元末端のＮ−アセチルグルコサミン残基の６位水酸基に硫酸基を転移する酵素活性を有するポリペプチド。
GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAc（式１）
（但し、GlcNAcはＮ−アセチルグルコサミン残基を、Galはガラクトース残基を、β1-3はβ1-3グリコシド結合を、β1-4はβ1-4グリコシド結合をそれぞれ示す）
【０００８】
また本発明ポリペプチドには、下記の性質を有するポリペプチドも包含される。
▲１▼作用：
硫酸基供与体から、下記式１で示されるオリゴ糖の非還元末端のＮ−アセチルグルコサミン残基の６位水酸基に硫酸基を転移する。
GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAc（式１）
（但し、GlcNAcはＮ−アセチルグルコサミン残基を、Galはガラクトース残基を、β1-3はβ1-3グリコシド結合を、β1-4はβ1-4グリコシド結合をそれぞれ示す）
▲２▼基質特異性：
コンドロイチン、コンドロイチン4-硫酸、コンドロイチン6-硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、脱硫酸化ケラタン硫酸、CDSNS-ヘパリン、ブタ胃由来ムチン、ウシ顎下腺由来ムチン及び下記式２で示されるオリゴ糖には硫酸基を転移しない。
Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAc（式２）
（但し、GlcNAcはＮ−アセチルグルコサミン残基を、Galはガラクトース残基を、β1-3はβ1-3グリコシド結合を、β1-4はβ1-4グリコシド結合をそれぞれ示す）
▲３▼Ｎ末端のアミノ酸配列
配列番号２におけるアミノ酸番号１〜４８で表されるアミノ酸配列からなる。
【０００９】
また本発明は、以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドをコードするＤＮＡ（以下「本発明DNA」ともいう）を提供する。
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは転位したアミノ酸配列からなり、かつ硫酸基供与体から下記式１で示されるオリゴ糖の非還元末端のＮ−アセチルグルコサミン残基の６位水酸基に硫酸基を転移する酵素活性を有するポリペプチド。
GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAc（式１）
（但し、GlcNAcはＮ−アセチルグルコサミン残基を、Galはガラクトース残基を、β1-3はβ1-3グリコシド結合を、β1-4はβ1-4グリコシド結合をそれぞれ示す）
【００１０】
また本発明DNAには、以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドをコードするＤＮＡも包含される。
（ａ）配列番号４のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは転位したアミノ酸配列からなり、かつ硫酸基供与体から下記式１で示されるオリゴ糖の非還元末端のＮ−アセチルグルコサミン残基の６位水酸基に硫酸基を転移する酵素活性を有するポリペプチド。
GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAc（式１）
（但し、GlcNAcはＮ−アセチルグルコサミン残基を、Galはガラクトース残基を、β1-3はβ1-3グリコシド結合を、β1-4はβ1-4グリコシド結合をそれぞれ示す）
【００１１】
本発明DNAとしてより好ましいものとして、配列番号１において塩基番号４７０〜１９１８で表される塩基配列を含むＤＮＡ、及び配列番号３において塩基番号３９０〜１８４１で表される塩基配列を含むＤＮＡが挙げられる。
【００１２】
また本発明には、上記に記載のポリペプチドを、下記式３で示される糖鎖に作用させる工程を少なくとも含む、下記式４で示される硫酸化糖の製造方法（以下「本発明製造方法１」ともいう）を提供する。
GlcNAc−Ｒ（式３）
（但し、GlcNAcはＮ−アセチルグルコサミン残基を、−Ｒは水素原子又はグリコシド結合した糖残基をそれぞれ示す）
(SO4-6)GlcNAc−Ｒ（式４）
（但し、GlcNAcはＮ−アセチルグルコサミン残基を、SO4-6は６位の水酸基が硫酸化されていることを、−Ｒは水素原子又はグリコシド結合した糖残基をそれぞれ示す）
【００１３】
また本発明は、本発明ＤＮＡを細胞に移入し、次いで該細胞を培養する工程を少なくとも含む、硫酸化糖の製造方法（以下「本発明製造方法２」ともいう）を提供する。この製造方法の好ましい態様として、本発明ＤＮＡ及びフコシルトランスフェラーゼをコードするｃＤＮＡを共に細胞に移入する態様が挙げられる。
【００１４】
【発明の実施の形態】
以下に、本発明の実施の形態を説明する。
なお、以下特にことわりがない限り、Galはガラクトース残基を、GlcNAcはＮ−アセチルグルコサミン残基を、NeuAcはＮ−アセチルノイラミン酸残基を、Fucはフコース残基を、β1-3はβ1-3グリコシド結合を、β1-4はβ1-4グリコシド結合を、α2-3はα2-3グリコシド結合を、α1-3はα1-3グリコシド結合を、SO4-6は６位の水酸基が硫酸化されていることを、Cerはセラミド残基をそれぞれ示す。
【００１５】
＜１＞本発明ポリペプチド
本発明ポリペプチドは、以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドである。
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは転位したアミノ酸配列からなり、かつ硫酸基供与体から下記式１で示されるオリゴ糖の非還元末端のＮ−アセチルグルコサミン残基の６位水酸基に硫酸基を転移する酵素活性を有するポリペプチド。
GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAc（式１）
この中でも、（ａ）のポリペプチドが好ましい。
【００１６】
なお本明細書中において、「１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは転位したアミノ酸配列からなり、かつ硫酸基供与体から下記式１(GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAc)で示されるオリゴ糖の非還元末端のＮ−アセチルグルコサミン残基の６位水酸基に硫酸基を転移する酵素活性を有するポリペプチド」とは、硫酸基供与体から、GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcの非還元末端のＮ−アセチルグルコサミン残基の６位水酸基に硫酸基を選択的に転移する活性を実質的に害さない１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入又は転位を有していてもよいことを示す。
【００１７】
すなわち、天然に存在するポリペプチドには、それをコードするDNAの多形や変異の他、生成後のポリペプチドの生体内および精製中の修飾反応などによってそのアミノ酸配列中にアミノ酸の置換、欠失、挿入又は転位等の変異が起こりうるが、それにもかかわらず変異を有しないポリペプチドと実質的に同等の生理、生物学的活性を示すものがあることが知られている。このように構造的に若干の差違があってもその機能については大きな違いが認められないものも、本発明ポリペプチドに包含される。人為的にポリペプチドのアミノ酸配列に上記のような変異を導入した場合も同様であり、この場合にはさらに多種多様の変異体を作製することが可能である。例えば、ヒトインターロイキン２（ＩＬ−２）のアミノ酸配列中の、あるシステイン残基をセリンに置換したポリペプチドがインターロイキン２活性を保持することが知られている(Science,224,1431(1984))。また、ある種のポリペプチドは、活性には必須でないペプチド領域を有していることが知られている。例えば、細胞外に分泌されるポリペプチドに存在するシグナルペプチドや、プロテアーゼの前駆体等に見られるプロ配列などがこれにあたり、これらの領域のほとんどは翻訳後、または活性型ポリペプチドへの転換に際して除去される。このようなポリペプチドは、一次構造上は異なった形で存在しているが、最終的には同等の機能を有するポリペプチドであり、本発明ポリペプチドに包含されるものである。
【００１８】
なお本明細書における「数個のアミノ酸」とは本発明ポリペプチドの活性が失われない程度の変異を起こしてもよいアミノ酸の数を示し、例えば４００アミノ酸残基からなるポリペプチドの場合、２０程度以下の数を示す。
【００１９】
なお、硫酸基供与体から、GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcで示されるオリゴ糖の非還元末端のＮ−アセチルグルコサミン残基の６位水酸基に硫酸基を転移する酵素活性は、後述の本発明ポリペプチド活性の測定方法を用いることによって測定できる。よって当業者であれば、本発明ポリペプチド活性の有無を指標として、該活性を実質的に害さない１つ以上のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入又は転位を容易に選択することができる。
【００２０】
なおこのポリペプチドは、もともとはマウスから得られたものであるが、遺伝子工学的手法や化学合成等により製造されたポリペプチドも当然に包含される。また本発明ポリペプチドには、以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドも包含される。
（ａ）配列番号４のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは転位したアミノ酸配列からなり、かつ硫酸基供与体から下記式１で示されるオリゴ糖の非還元末端のＮ−アセチルグルコサミン残基の６位水酸基に硫酸基を転移する酵素活性を有するポリペプチド。
GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAc（式１）
【００２１】
この中でも（ａ）のポリペプチド（配列番号４のアミノ酸配列からなるポリペプチド）が、前記の本発明ポリペプチドの（ａ）(配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチド)と８５％以上の相同性を有することから好ましい。このように、本発明ポリペプチドには、配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチドと８５％以上の相同性を有するポリペプチドも包含される。
【００２２】
なおこのポリペプチドは、もともとはヒトから得られたものであるが、遺伝子工学的手法や化学合成等により製造されたポリペプチドも当然に包含される。
【００２３】
また本発明ポリペプチドには、下記の性質を有するポリペプチドも包含される。
▲１▼作用：
硫酸基供与体から、下記式１で示されるオリゴ糖の非還元末端のＮ−アセチルグルコサミン残基の６位水酸基に硫酸基を転移する。
GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAc（式１）
▲２▼基質特異性：
コンドロイチン、コンドロイチン4-硫酸、コンドロイチン6-硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、脱硫酸化ケラタン硫酸、CDSNS-ヘパリン、ブタ胃由来ムチン、ウシ顎下腺由来ムチン及び下記式２で示されるオリゴ糖には硫酸基を転移しない。
Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAc（式２）
▲３▼Ｎ末端のアミノ酸配列
配列番号２におけるアミノ酸番号１〜４８で表されるアミノ酸配列からなる。
【００２４】
なお本発明ポリペプチドにおいて、硫酸基供与体としては3'-ホスホアデノシン 5'-ホスホ硫酸(以下、PAPSともいう)が好ましい。
これら本発明ポリペプチドは、本発明によりそのアミノ酸配列や性質が開示されたので、天然物からの単離・精製や、化学合成等によって製造することも可能であるが、後述の本発明DNAを用いて製造することが好ましい。本発明DNAを用いた本発明ポリペプチドの製造方法については後述する。なお本発明ポリペプチドは、必ずしも単独のポリペプチドでなくてもよく、必要により融合タンパク質の一部となっていてもよい。例えば、本発明ポリペプチドと、発現に必要な他のポリペプチドとを含む融合ポリペプチドが例示される。
【００２５】
本発明ポリペプチドは、硫酸基供与体から、GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcの非還元末端のＮ−アセチルグルコサミン残基の６位水酸基に特異的に硫酸基を転移する作用を有しているので、非還元末端のＮ−アセチルグルコサミン残基の６位特異的硫酸化やGlyCAM-1構造を有する糖鎖等の合成に利用できる。
【００２６】
＜２＞本発明DNA
本発明DNAは、以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドをコードするＤＮＡである。
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは転位したアミノ酸配列からなり、かつ硫酸基供与体から下記式１で示されるオリゴ糖の非還元末端のＮ−アセチルグルコサミン残基の６位水酸基に硫酸基を転移する酵素活性を有するポリペプチド。
GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAc（式１）
この中でも（ａ）のポリペプチドをコードするDNAが好ましい。
【００２７】
このようなDNAとして具体的には、例えば配列番号１において塩基番号４７０〜１９１８で表される塩基配列を含むＤＮＡが例示される。
なおこのDNAは、もともとはマウス由来のものであるが、その由来は限定されず遺伝子工学的手法や化学合成等により製造されたDNAも当然に包含される。
【００２８】
また本発明DNAには、以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドをコードするＤＮＡも包含される。
（ａ）配列番号４のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは転位したアミノ酸配列からなり、かつ硫酸基供与体から下記式１で示されるオリゴ糖の非還元末端のＮ−アセチルグルコサミン残基の６位水酸基に硫酸基を転移する酵素活性を有するポリペプチド。
GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAc（式１）
この中でも（ａ）のポリペプチドをコードするDNAは、当該DNAによってコードされる本発明ポリペプチドが配列番号２のアミノ酸配列からなる本発明ポリペプチドと８５％以上の相同性を有することから好ましい。
【００２９】
このようなDNAとして具体的には、例えば配列番号３において塩基番号３９０〜１８４１で表される塩基配列を含むＤＮＡが例示される。
なおこのDNAは、もともとはヒト由来のものであるが、その由来は限定されず遺伝子工学的手法や化学合成等により製造されたDNAも当然に包含される。
【００３０】
なお、遺伝暗号の縮重による異なった塩基配列を有するDNAも本発明DNAに包含されることは、当業者であれば容易に理解されるところである。
また、本発明DNAには、本発明DNAに相補的なDNA又はRNAも包含される。さらに本発明DNAは、本発明ポリペプチドをコードするコード鎖のみの一本鎖であってもよく、この一本鎖およびこれと相補的な塩基配列を有するDNA鎖またはRNA鎖からなる二本鎖であってもよい。
【００３１】
なお前記＜１＞で述べた通り、本発明ポリペプチドとは構造的に若干の差違があっても、その機能については大きな違いが認められないようなポリペプチドも本発明ポリペプチドに包含される。本発明ＤＮＡも同様に、本発明ポリペプチドとは構造的に若干の差違があっても、その機能については大きな違いが認められないようなポリペプチドをコードするＤＮＡも、本発明ＤＮＡに包含される。
【００３２】
具体的には、ＤＮＡの多形や変異等によって本発明ＤＮＡとは構造的に若干の差違があるが、本発明ポリペプチドとほぼ同等の機能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡが挙げられる。
【００３３】
また染色体由来の本発明ポリペプチドの遺伝子は、コード領域にイントロンを含むことが予想されるが、そのようなイントロンで分断されているＤＮＡ断片であっても、本発明ポリペプチドをコードする限り、本発明ＤＮＡに包含される。すなわち、本明細書において「コードする」とは、転写時にプロセッシング等を受けて最終的に目的のポリペプチドを発現し得る塩基配列を有することも包含する。
【００３４】
なお本発明DNAにおいて、硫酸基供与体としてはPAPSが好ましい。
【００３５】
１．本発明ＤＮＡの製造方法
本発明DNAは、その塩基配列が本発明により明らかにされたので、その配列に基づいて合成し、あるいはその配列に基づいて作成したオリゴヌクレオチドプライマーを用いるＰＣＲ法（ポリメラーゼ・チェイン・リアクション法）によって染色体ＤＮＡあるいはｍＲＮＡから本発明ＤＮＡを増幅することによって取得することも可能である。なお本発明DNAは、後記実施例に示すように、以下に示す各工程からなるcDNAクローニングによって初めて得られたものである。
【００３６】
(1)マウス由来の本発明DNAの製造
▲１▼ＰＣＲ用オリゴヌクレオチドプライマーの作製。
▲２▼マウスの全ＲＮＡを鋳型とした逆転写ＰＣＲ(ＲＴ−ＰＣＲ)による増幅。
【００３７】
▲３▼ＰＣＲ産物を用いた、マウスcDNAライブラリーからの本発明DNAのスクリーニング。
【００３８】
(2)ヒト由来の本発明DNAの製造
▲１▼上記(1)▲３▼で得られたcDNAを用いた、ヒトcDNAライブラリーからの本発明DNAのスクリーニング。
【００３９】
▲２▼得られたcDNAの塩基配列解析。
しかし本発明DNAの製造方法はこれに限定されるものではなく、他の公知のcDNAクローニングの手法によっても製造することができる。
【００４０】
以下に、本発明ＤＮＡの製造方法の一例を具体的に説明する。
【００４１】
(1)ＰＣＲ用オリゴヌクレオチドプライマーの作製。
マウスのコンドロイチン 6-スルホトランスフェラーゼの触媒部位と相同性を有するマウスの発現配列tag(expressed sequence tag)(EST)配列(Genbank accession番号：AA103962)をベースにして、オリゴヌクレオチドプライマー（センスプライマー及びアンチセンスプライマー）を作製する。オリゴヌクレオチドプライマーとして具体的には、センスプライマーとして 5'-GTCGTCGGACTGGTGGACGA-3'（配列番号５）が、アンチセンスプライマーとして 5'-CCCAGAGCGTGGTAGTCTGC-3'（配列番号６）がそれぞれ挙げられ、かつ好ましい。
【００４２】
(2)マウスの全ＲＮＡを鋳型としたＲＴ−ＰＣＲによる増幅。
全ＲＮＡは、公知の方法（例えば、Kingston, R. S., (1991) in Current Protocols in Molecular Biology, Suppl. 14, Unit 4.2, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, New Yorkなど）で得ることができる。材料は、本発明ポリペプチドのｍＲＮＡを発現している材料であれば限定されないが、マウスの胚、例えば１３日胚等を用いることができる。
【００４３】
この全RNAを鋳型とし、オリゴヌクレオチドプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲにより、本発明ポリペプチドの部分的ｃＤＮＡを増幅することができる。ＰＣＲは、通常の方法と同様に行えばよい。
【００４４】
(3)ＰＣＲ産物を用いた、マウスcDNAライブラリーからの本発明DNAのスクリーニング。
上記(2)のＲＴ−ＰＣＲで得られたＰＣＲ産物を32Ｐ等でラベルし、ｃＤＮＡライブラリーからｃＤＮＡ（本発明DNA）断片をスクリーニングするためのハイブリダイゼーションプローブとして用いることができる。用いることができるマウスcDNAライブラリーは特に限定されないが、例えばマウス胚cDNAを保持するλgt11ライブラリー(λgt11マウス胚cDNAライブラリー)を例示することができる。
【００４５】
ハイブリダイゼーションは公知の方法(例えば、J.Biol.Chem.,270,18575-18580(1995))により行うことができる。
DNAインサートはEcoRI消化によって陽性クローンから分離し、例えばpBluescript II SK-(ストラタジーン(STRATAGENE)社)等にサブクローニングする。その後塩基配列を、例えばジデオキシチェインターミネーション法(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,74,5463-5467(1977))等の公知の方法により決定することができる。
【００４６】
これら一連の方法により得られた本発明DNAの塩基配列、及びこの塩基配列から予想されるアミノ酸配列を配列番号１に、アミノ酸配列のみを配列番号２に示す。
【００４７】
(4)上記で得られたcDNA(マウス由来)を用いた、ヒトcDNAライブラリーのスクリーニング及び塩基配列解析。
上記で得られたcDNA(マウス由来)を用いてヒトのcDNAライブラリー(例えば、ヒト胎児脳のｃＤＮＡを保持するλｇｔ１１ライブラリー等)をスクリーニングすることによって、ヒト由来の本発明DNAを得ることができる。この塩基配列も、上記と同様の方法によって決定することができる。
【００４８】
この方法により得られた本発明DNAの塩基配列、及びこの塩基配列から予想されるアミノ酸配列を配列番号３に、アミノ酸配列のみを配列番号４に示す。
【００４９】
２．本発明DNAを用いた本発明ポリペプチドの製造方法
本発明ＤＮＡを移入した細胞を、好適な培地で培養し、本発明ＤＮＡがコードするポリペプチドを培養物中に生成蓄積させ、その培養物から本発明ポリペプチドを採取することによって、本発明ポリペプチドを製造することができる。
【００５０】
本発明ＤＮＡを移入した細胞は、公知の発現ベクターに本発明ＤＮＡの断片を挿入して組換プラスミドを構築し、この組換プラスミドを細胞に移入することによって得ることができる。ここで用いる本発明DNAは、本発明DNAである限りにおいて特に限定されないが、配列番号１における塩基番号４７０〜１９１８で表される塩基配列を含むDNAが好ましく、なかでも配列番号１における塩基番号４６７〜１９２１で表される塩基配列からなるDNAが特に好ましい。また配列番号３において塩基番号３９０〜１８４１で表される塩基配列を含むＤＮＡも好ましく、なかでも配列番号３における塩基番号３８７〜１８４４で表される塩基配列からなるDNAが特に好ましい。
【００５１】
細胞としては大腸菌等の原核細胞や、哺乳類細胞等の真核細胞が例示される。大腸菌などの原核細胞を用いた際は、本発明ＤＮＡの発現によって生じるポリペプチドに糖鎖の付加が起こらないため、糖鎖が付加されていない本発明ポリペプチドを得ることが可能であり、また、哺乳類細胞等の真核細胞を用いた場合は、本発明ＤＮＡの発現によって生じるポリペプチドに糖鎖が付加しうるため、糖鎖を含む本発明ポリペプチドの形態で得ることも可能である。
【００５２】
この製造方法においては、タンパク質の製造に通常用いられる宿主−ベクター系を使用することができ、例えば、ＣＯＳ−７細胞等の哺乳類由来の培養細胞と、pcDNA3発現ベクター(インビトロジェン(Invitrogen)社)等の哺乳類細胞発現ベクターとの組み合わせを採用することが好ましい。培地や培養条件は、用いる宿主すなわち細胞に合わせて適宜選択される。
【００５３】
本発明ＤＮＡは直接発現させてもよいし、他のポリペプチドとの融合ポリペプチドとして発現させてもよい。また、本発明ＤＮＡは全長を発現させてもよいし、一部を部分ペプチドとして発現させてもよい。
【００５４】
培養物からの本発明ポリペプチドの採取は、公知のポリペプチドの抽出、精製方法によって行うことができる。なお培養物には、培地および当該培地中の細胞が包含される。
【００５５】
本発明ポリペプチドの抽出方法として具体的には、ホモジナイズ、ガラスビーズミル法、音波処理、浸透ショック法、凍結融解法等の細胞破砕による抽出、界面活性剤抽出、またはこれらの組み合わせ等の処理操作が挙げられる。
【００５６】
例えば、本発明ポリペプチドを上記培養物から抽出する場合には、ホモジナイズが好ましい。
より具体的には、培養物から細胞を集め、これに緩衝液(界面活性剤を適宜含有させてもよい)を添加して細胞懸濁液とし、ホモジナイザーでホモジナイズした後、遠心分離等の分離手段で細胞残渣と上清液(抽出液)とに分離することにより抽出を行うことができ、かつ好ましい。
【００５７】
抽出液からの本発明ポリペプチドの精製方法として具体的には、例えば硫酸アンモニウム(硫安)や硫酸ナトリウム等による塩析、遠心分離、透析、限外濾過法、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ゲルろ過法、ゲル浸透クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動法等や、これらの組み合わせ等の処理操作が挙げられる。
【００５８】
精製されたポリペプチドのアミノ酸配列、作用、基質特異性等を分析し、前記＜１＞で説明した本発明ポリペプチドの物性と比較することにより、本発明ポリペプチドの製造が確認できる。
【００５９】
本発明DNAは、本発明ポリペプチドの大量生産や、生体内(細胞)でのGlyCAM-1の人工的合成等への利用が期待される。
【００６０】
＜３＞本発明製造方法１
本発明製造方法１は、本発明ポリペプチドを、下記式３で示される糖鎖に作用させる工程を少なくとも含む、下記式４で示される硫酸化糖の製造方法である。GlcNAc−Ｒ（式３）
(SO4-6)GlcNAc−Ｒ（式４）
（−Ｒは水素原子又はグリコシド結合した糖残基を示す）
【００６１】
本発明製造方法１において用いることができる本発明ポリペプチドは、本発明ポリペプチドである限りにおいて特に限定されない。またここで用いることができる本発明ポリペプチドは、本発明ポリペプチドの作用が実質的に害されない限りにおいては完全に精製されている必要はなく、部分精製されたものや、細胞抽出物であってもよい。
【００６２】
本発明製造方法１は、本発明ポリペプチドが、硫酸基供与体から硫酸基を、非還元末端に存在するＮ−アセチルグルコサミン残基の６位水酸基に特異的に転移する酵素活性を有していることを見い出し、これを硫酸化糖の製造に応用したものである。従って本発明製造方法１において最も重要かつ必須なのは上記式３及び４における−Ｒ以外の部分であり、逆に−Ｒは任意の構造で良く、糖残基の構造も特に限定されない。例えば−Ｒは、末端に脂質(例えばセラミド残基等)を有する糖鎖(糖脂質)等であってもよい。
【００６３】
上記式３及び４は、それぞれ下記式５及び６で示される糖鎖であることが好ましい。
GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAc−Ｒ’（式５）
(SO4-6)GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAc−Ｒ’（式６）
（−Ｒ’は水素原子又はグリコシド結合した糖残基を示す）
なおＲ’は、水素原子又は１〜１５糖の糖鎖が好ましく、水素原子又は１〜１０糖の糖鎖がより好ましく、水素原子又は１〜２糖の糖鎖が特に好ましく、水素原子が極めて好ましい。また−Ｒ’が糖鎖の場合、−Ｒ’は(-3Galβ1-4GlcNAcβ1-)（ラクトサミン）の繰り返し構造を基本骨格とするものが好ましい。この場合、−Ｒ’の基本骨格にはシアル酸残基、フコース残基、硫酸基等が付加していても良い。
【００６４】
本発明製造方法１において、本発明ポリペプチドを、上記式３で示される糖鎖に作用させる場合、硫酸基供与体を共存させておくことが好ましい。
なお本発明製造方法１において、硫酸基供与体としてはPAPSが好ましい。
【００６５】
本発明ポリペプチドを上記式３で示される糖鎖に作用させる反応は、本発明ポリペプチド、上記式３で示される糖鎖及び硫酸基供与体を共存させることにより行うことができる。この時のｐＨは、本発明ポリペプチドの活性が保持されている限りにおいて特に限定されないが、中性ｐＨ付近（例えばｐＨ６．８程度）の条件下で反応を行うことが好ましく、該ｐＨ下で緩衝作用を有する緩衝液中で反応を行うことがより好ましい。またこの時の温度は、本発明ポリペプチドの活性が保持されている限りにおいて特に限定されないが、３０〜４０℃程度が例示される。また本発明ポリペプチドの活性を増加させる物質がある場合は、その物質を添加しても良い。反応時間は、用いる糖鎖、硫酸基供与体及び本発明ポリペプチドの量、並びにその他の反応条件に応じて当業者が適宜決定できる。反応の際、MnCl2等を共存させてもよい。
【００６６】
少量生産であれば、上記式３で示される糖鎖及び硫酸基供与体の共存下に、本発明ポリペプチドを存在させて該ポリペプチドを作用させれば良いが、大量生産する場合は、適当な固相（ビーズ等）に本発明ポリペプチドを結合させた固定化酵素や、限外濾過膜、透析膜等を用いる膜型リアクター等を用いて連続的に本発明ポリペプチドを作用させることもできる。また硫酸基供与体を再生(合成)するバイオリアクターを組み合わせて用いても良い。
【００６７】
本発明ポリペプチドの作用により、上記式３で示される糖鎖の非還元末端に存在するＮ−アセチルグルコサミン残基の６位水酸基に特異的に硫酸基が導入され、上記式４で示される糖鎖が生成する。
反応液から上記式４で示される糖鎖を回収するには、通常の糖鎖の分離、精製の手法を用いることができる。例えば吸着クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲルろ過法、ゲル浸透クロマトグラフィー、濾紙電気泳動法、濾紙クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、有機溶媒（例えばアルコール、アセトン等が好ましい）による分画、あるいはこれらの組み合わせ等の操作により行うことができるが、これらに限定されるものではない。
【００６８】
得られた上記式４で示される糖鎖は、例えばGlyCAM-1やその糖鎖基本骨格製造の中間体として利用され得る。
【００６９】
＜４＞本発明製造方法２
本発明製造方法２は、本発明ＤＮＡを細胞に移入し、次いで該細胞を培養する工程を少なくとも含む、硫酸化糖の製造方法である。
【００７０】
このような工程を少なくとも含む限りにおいては、他の工程を追加したとしても本発明製造方法２に包含される。例えば、本発明ＤＮＡを移入した細胞を好適な培地で培養し、その培養物から細胞を分離し、当該細胞上に発現した硫酸化糖を採取することによる硫酸化糖の製造方法も、本発明製造方法２に包含される。
【００７１】
なお、硫酸化糖は必ずしも細胞から分離、精製する必要はなく、硫酸化糖が細胞表面に発現した細胞自体を所望の場合は、培養物中の細胞を採取してそのまま用いることもできる。
【００７２】
本発明ＤＮＡの細胞への移入は、DEAE-デキストラン、リン酸カルシウム、ポリブレン等を用いた公知の方法や、その他遺伝子工学分野において公知の方法で行うことができる。
【００７３】
細胞に移入させる本発明DNAは、公知の発現ベクターに本発明DNAが挿入された組換プラスミドの形態で細胞に移入することが好ましい。ここで用いる本発明DNAは、本発明DNAである限りにおいて特に限定されないが、配列番号１における塩基番号４７０〜１９１８で表される塩基配列を含むDNAが好ましく、なかでも配列番号１における塩基番号４６７〜１９２１で表される塩基配列からなるDNAが特に好ましい。
【００７４】
細胞としては大腸菌等の原核細胞や、哺乳類細胞等の真核細胞が例示される。この製造方法においては、タンパク質の製造に通常用いられる宿主−ベクター系を使用することができ、例えば、ＣＯＳ−７細胞等の哺乳類由来の培養細胞と、pcDNA3発現ベクター(インビトロジェン(Invitrogen)社)等の哺乳類細胞発現ベクターとの組み合わせを採用することが好ましい。培地や培養条件は、用いる宿主すなわち細胞に合わせて適宜選択され、当該条件下で培養することによって培養物を得ることができる。
【００７５】
培養物からの硫酸化糖の採取は、公知の糖脂質の抽出、精製方法によって行うことができる。なお培養物には、培地および当該培地中の細胞が包含される。
糖脂質の抽出方法として具体的には、メタノール、クロロホルム等による有機溶媒抽出、ホモジナイズ、音波処理等の細胞破砕による抽出、またはこれらの組み合わせ等の処理操作が挙げられる。培養物中の細胞に対してこのような抽出操作を行うことにより硫酸化糖を含有する抽出物を得ることができる。
【００７６】
抽出液からの硫酸化糖の分離、精製は、通常の糖鎖の分離、精製の手法を用いることができる。例えば吸着クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲルろ過法、ゲル浸透クロマトグラフィー、濾紙電気泳動法、濾紙クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、有機溶媒（例えばアルコール、アセトン等が好ましい）による分画、あるいはこれらの組み合わせ等の操作により行うことができるが、これらに限定されるものではない。
【００７７】
本発明方法２により製造される硫酸化糖は、本発明DNAの細胞内への移入により発現された本発明ポリペプチドの作用により、糖鎖の非還元末端のＮ-アセチルグルコサミン残基の６位水酸基が硫酸化される過程を経て細胞表面に発現する。発現する硫酸化糖は、少なくとも下記式７の糖鎖骨格を有する。
【００７８】
NeuAcα2-3Galβ1-4(SO4-6)GlcNAc-R
（−Ｒは水素原子又はグリコシド結合した糖残基を示す。なお、水素原子又はグリコシド結合した糖残基には、セラミド等の脂質が結合していても良い）
この糖鎖骨格は、6-硫酸化シアリルルイスＸセラミド（6-Sulfo SLeXセラミド）及びSL2L4(NeuAcα2-3Galβ1-4(SO4-6)GlcNAcβ1-3(SO4-6)Galβ1-4(SO4-6)GlcNAc)に反応するが、6'-硫酸化シアリルルイスＸセラミド（6'-Sulfo SLeXセラミド）やシアリルパラグロボシド（ＳＰＧ）には反応しない抗体（反応に必要な最小構造がNeuAcα2-3Galβ1-4(SO4-6)GlcNAcである）により認識される。このような抗体は、6-硫酸化シアリルルイスＸセラミドを用いて、通常の抗体の調製方法により調製することができる。抗体はモノクローナル抗体であることが好ましい。
【００７９】
モノクローナル抗体の調製は、KohlerとMilsteinの方法(Nature 256,495-497(1975))によって行うことができる。例えば、6-硫酸化シアリルルイスＸセラミドをSalmonella minnesota 等の菌体に吸着させ、これを用いてマウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ等の被免疫動物の腹腔内、皮下あるいは足蹠(footpad)に投与した後に脾臓又は膝窩リンパ節を摘出し、これらから採取した細胞と腫瘍細胞株であるミエローマ細胞とを細胞融合させてハイブリドーマを樹立し、得られたハイブリドーマを連続増殖させ、さらに得られたハイブリドーマから6-硫酸化シアリルルイスＸセラミド及びSL2L4に反応するが、6'-硫酸化シアリルルイスＸセラミドやシアリルパラグロボシドには反応しない抗体（反応に必要な最小構造がNeuAcα2-3Galβ1-4(SO4-6)GlcNAcである抗体）を継続的に産生する細胞株を選別する。こうして選別された株を好適な培地で培養することにより、培地中にモノクローナル抗体が得られる。あるいは、マウスの腹腔などの生体内にて前記ハイブリドーマを培養することによって、モノクローナル抗体を大量に製造することができる。細胞融合に用いる細胞としては、脾細胞以外にリンパ節細胞および末梢血中のリンパ細胞等を用いることもできる。ミエローマ細胞株は、異種細胞種由来のものに比べ、同種細胞株由来のものが望ましく、安定な抗体産生ハイブリドーマを得ることができる。このような抗体としては、後述の実施例において説明するG72抗体等が挙げられる。
【００８０】
本発明製造方法２によって製造された硫酸化糖は、以上に説明した抗体を用いてその製造を確認することができる。抗体を用いた確認は、公知の免疫学的手法を用いることができる。例えばイムノブロッティング法、標識化免疫測定法(例えばEIA法、ELISA法、ラジオイムノアッセイ法、蛍光イムノアッセイ法等)、硫酸化糖が細胞表面に発現された細胞における当該硫酸化糖を確認する場合は、フローサイトメトリー等の手法を用いることができる。もちろん、本発明製造方法２によって製造される硫酸化糖は、公知の糖鎖構造解析技術を用いて確認することもできる。
【００８１】
なお本発明製造方法２において、本発明ＤＮＡを細胞移入する際に、同時にフコシルトランスフェラーゼをコードするｃＤＮＡも共に細胞に移入することができる。すなわち本発明製造方法２には、本発明ＤＮＡ及びフコシルトランスフェラーゼをコードするｃＤＮＡを共に細胞に移入し、次いで該細胞を培養する工程を少なくとも含む、硫酸化糖の製造方法も包含される。
【００８２】
移入するフコシルトランスフェラーゼは特に限定されないが、フコシルトランスフェラーゼIVは、フコースをN-アセチルラクトサミンに転移することによってルイスＸ構造(Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc)を形成できることが知られている(J.Biol.Chem.,266,17467-17477(1991),Cell,63,1349-1356(1990))ことから好ましい。
フコシルトランスフェラーゼをコードするcDNAは、公知のフコシルトランスフェラーゼのcDNAを適当な発現ベクターに組込んで、本発明DNAと共に細胞に移入することができる。好ましい発現ベクター等は、本発明DNAに用いる発現ベクターと同様である。
【００８３】
この方法により製造される硫酸化糖は、本発明DNAおよびフコシルトランスフェラーゼのcDNAの細胞内への移入により発現された本発明ポリペプチドおよびフコシルトランスフェラーゼの作用により、糖鎖の非還元末端のＮ-アセチルグルコサミン残基の６位水酸基が硫酸化され、またフコースがN-アセチルラクトサミンに転移される過程を経て細胞表面に発現する。発現する硫酸化糖は、少なくとも下記式８の糖鎖骨格を有する。
Galβ1-4(Fucα1-3)(SO4-6)GlcNAc-R（式８）
（−Ｒは水素原子又はグリコシド結合した糖残基を示す。なお、水素原子又はグリコシド結合した糖残基には、セラミド等の脂質が結合していても良い）
この糖鎖骨格は、6-硫酸化ルイスＸ(Galβ1-4(Fucα1-3)(SO4-6)GlcNAc；6-sulfo LeX)構造に特異的に反応し、ルイスＸ(Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc；LeX)や6'-硫酸化ルイスＸ((SO4-6)Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc；6'-sulfo LeX)構造には反応しないモノクローナル抗体により認識される。このような抗体は、6-硫酸化ルイスＸセラミド(Galβ1-4(Fucα1-3)(SO4-6)GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glcβ1-Cer)を用いて、通常の抗体の調製方法により調製することができる。抗体はモノクローナル抗体であることが好ましい。
【００８４】
モノクローナル抗体の調製は、前述と同様の方法で行うことができる。ここで免疫に用いる抗原としては、例えば、6-硫酸化ルイスＸセラミドをSalmonella minnesota 等の菌体に吸着させたものが好ましい。
【００８５】
上述の方法で作製したハイブリドーマから、6-硫酸化ルイスＸ構造に特異的に反応し、ルイスＸや6'-硫酸化ルイスＸ構造には反応しないモノクローナル抗体を継続的に産生する細胞株を選別する。こうして選別された株を好適な培地で培養することにより、培地中にモノクローナル抗体が得られる。あるいは、マウスの腹腔などの生体内にて前記ハイブリドーマを培養することによって、モノクローナル抗体を大量に製造することができる。細胞融合に用いる細胞についても上述と同様である。
【００８６】
このような抗体としては、後述の実施例において説明するAG223抗体等が挙げられる。
この方法によって製造された硫酸化糖は、以上に説明した抗体を用いてその製造を確認することができる。抗体を用いた確認は、公知の免疫学的手法を用いることができ、もちろん公知の糖鎖構造解析技術を用いて確認することもできる。これらの説明は上述と同様である。
【００８７】
得られた上記式７又は８で示される糖鎖は、例えばGlyCAM-1やその糖鎖基本骨格製造の中間体として利用され得る。
【００８８】
【実施例】
以下に、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
＜１＞本実施例中で共通して用いた材料及び方法
（１）材料
【００８９】
35S-PAPS(3'-ホスホアデノシン 5'-ホスホ硫酸；58.1GBq/mmol)（デュポンNEN(DuPont NEN)社）
3H-NaBH4(16.3GBq/mmol)及びα-32P-dCTP(110GBq/nmol)（アマシャム(Amersham)社）
【００９０】
コンドロイチン硫酸Ａ(クジラ軟骨由来)、コンドロイチン硫酸Ｃ(サメ軟骨由来)、デルマタン硫酸、ＣＤＳＮＳ−ヘパリン(N,O-硫酸基を脱硫酸化後、再N-硫酸化したヘパリン；completely desulfated and N-resulfated heparin)及びストレプトコッカス β-ガラクトシダーゼ(Streptococcus β-galactosidase)（生化学工業株式会社）
【００９１】
非標識PAPS、ブタ胃ムチン、ウシ顎下腺由来ムチン（シグマ(Sigma)社）
Hiload Superdex 30 HR 16/60、高速脱塩カラム(fast desalting column)HR 10/10（ファルマシアバイオテク(Pharmacia Biotech)社）
Partisil SAX-10（ワットマン(Whatman)社製）
【００９２】
マウス７日胚 5'-STRETCH PLUS λgt11 cDNAライブラリー（クローンテック(CLONTECH)社）
抗ルイスＸ(Lewis X)抗体 LeuM1（ベクトン・ディッキンソン(Becton Dickinson)社）
【００９３】
ケラタン硫酸(ウシ角膜由来)、Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAc(本明細書中において「L1L1」ともいう)（生化学工業株式会社）
【００９４】
部分的脱硫酸化ケラタン硫酸(硫酸基／グルコサミン＝0.62)は、角膜由来のケラタン硫酸から(J.Biol.Chem.,272,32321-32328(1997),J.Biochem.(Tokyo)86,1323-1329(1979))記載の方法で調製した。
【００９５】
GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcは、L1L1をβ-ガラクトシダーゼ消化することにより調製した。β-ガラクトシダーゼ消化のための反応混合液100μLには、２mgのL1L1、5μmolesの酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.5)、40mUのβ-ガラクトシダーゼを含有させた(J.Biochem.(Tokyo)80,9-17(1976))。この反応混合液を37℃で24時間インキュベートした。β-ガラクトシダーゼ消化後、GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcをSuperdex 30クロマトグラフィーで精製し、凍結乾燥により脱塩した。
【００９６】
Galβ1-4-3H-(SO4-6)2,5-アンヒドロマンニトール(anhydromannitol)及び(SO4-6)2,5-3H-アンヒドロマンニトールは、ケラタン硫酸をＮ−脱アセチル化、脱アミノ化、NaB3H4還元、部分的酸加水分解の順に反応させて製造した(Glycobiology,6,51-57(1996),Biochem.J.235,225-236(1986))。
【００９７】
本実施例で用いた合成糖脂質は次の通りである；シアリルルイスＸセラミド(sialyl Lewis X ceramide)＝NeuAcα2-3Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glcβ1-Cer；6-硫酸化シアリルルイスＸセラミド(6-sulfo sialyl Lewis X ceramide)＝NeuAcα2-3Galβ1-4(Fucα1-3)(SO4-6)GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glcβ1-Cer；6'-硫酸化シアリルルイスＸセラミド(6'-sulfo sialyl Lewis X ceramide)＝NeuAcα2-3(SO4-6)Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glcβ1-Cer； 6,6'-bis-硫酸化シアリルルイスＸセラミド(6,6'-bis-sulfo sialyl Lewis X ceramide)＝NeuAcα2-3(SO4-6)Galβ1-4(Fucα1-3)(SO4-6)GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glcβ1-Cer(Carbohydr.Res.,209,c1-c4(1991)、Carbohydr.Res.,285,c1-c8(1996)、J.Med.Chem.,39,1339-1343(1996))。これらの糖脂質は岐阜大学農学部の木曾 真博士より恵与されたものを使用した。アシアロ(asialo)化合物は、対応する合成糖脂質をArthrobacter ureafaciens由来ノイラミニダーゼ(neuraminidase)（ナカライテスク(Nakarai Tesque)社）で消化することにより調製した。シアリル化パラグロボシド(sialylated paraglobosides；NeuAcα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glcβ1-Cer及びNeuAcα2-6Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glcβ1-Cer)は、ヒトの腸癌及び肝癌組織より調製した。
【００９８】
NeuAcα2-3Galβ1-4(SO4-6)GlcNAcβ1-3(SO4-6)Galβ1-4(SO4-6)GlcNAc(本明細書中において「SL2L4」ともいう)及びGlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcは生化学工業株式会社の吉田圭一より供与され、前者については還元的アミノ化によりコレステリルアニリン(cholesteryl aniline)に結合させた(Blood,82,2797-2805(1993))。
【００９９】
（２）本発明DNAの分離
（２−１）マウス由来の本発明DNAの分離
マウスのコンドロイチン 6-スルホトランスフェラーゼの触媒部位と相同性を有するマウスの発現配列tag(expressed sequence tag)(EST)配列(Genbank accession番号：AA103962)を、マウスの１３日胚の全ＲＮＡを鋳型としたＲＴ−ＰＣＲ法により増幅した。
【０１００】
センスプライマー GTCGTCGGACTGGTGGACGA（配列番号５）及びアンチセンスプライマー CCCAGAGCGTGGTAGTCTGC（配列番号６）をＰＣＲ増幅に用いた。ＰＣＲ増幅は、94℃で３分、次いで94℃で0.5分、60℃で１分及び72℃で１分を35サイクルで行った。ＰＣＲ産物(368bp)を、MegaprimeTM DNA labeled kit(アマシャム(Amersham)社)で32P-ラベルし、λgt11マウス７日胚のcDNAライブラリーのスクリーニングに用いた。
【０１０１】
ハイブリダイゼーションは(J.Biol.Chem.,270,18575-18580(1995))に記載の方法により行った。DNAインサートはEcoRI消化によって陽性λgt11クローンから分離し、pBluescript II SK-(ストラタジーン(STRATAGENE)社)にサブクローニングした。塩基配列は、アプライド・バイオシステム(Applied Biosystems)社の自動シークエンサーを用いたジデオキシチェインターミネーション法(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,74,5463-5467(1977))により決定した。
【０１０２】
（２−２）ヒト由来の本発明DNAの分離
上記で得られたマウス由来の本発明DNAを、メガプライム DNA ラベリングシステム(Megaprime DNA labeling systems；アマシャム(Amersham)社)を用いて32Ｐラベルした。これをプローブとして、ヒト胎児脳のcDNAを保持するλgt11ライブラリー(クローンテック(CLONTECH)社)をスクリーニングした。ハイブリダイゼーションは、J.Biol.Chem.,272,32321-32328(1997)に記載の方法で行った。
【０１０３】
DNAインサートはEcoRI消化によって陽性λgt11クローンから分離し、pBluescript II SK-(ストラタジーン(STRATAGENE)社)にサブクローニングした。塩基配列は、前記のマウス由来の本発明DNAと同様の方法で決定した。
【０１０４】
（３）発現ベクターの構築
本発明ポリペプチドのオープン・リーディング・フレームをコードするcDNAフラグメント(マウス由来の本発明DNA)を、クローニングしたマウス由来のcDNAフラグメントを鋳型としてＰＣＲにより増幅した。センスプライマー ACGAATTCGGGATGAAGGTATTTCGCAGG（配列番号７）及びアンチセンスプライマー ATGAATTCTCAAAGCCGGGGCTTCCTGAG（配列番号８）をＰＣＲ増幅に用いた。ＰＣＲ増幅は、５％(v/v)ジメチルスルホキシド中、94℃で３分、次いで94℃で１分、60℃で１分及び72℃で２分を35サイクルで行った。本発明ポリペプチドのオープンリーディングフレームを含むＰＣＲ産物(配列番号１における塩基番号467-1921)をEcoRIで消化し、pcDNA3発現ベクター(インビトロジェン(Invitrogen)社)にサブクローニングした。DNAフラグメントが正しい方向に挿入された組換えプラスミド(pcDNA3-GlcNAc6ST)を発現に用いた。DNAフラグメントが逆方向に挿入された組換えプラスミド(pcDNA3-GlcNAc6STA)は対照実験に用いた。
【０１０５】
また、ヒト由来の本発明DNAを用いて上記と同様に発現ベクターを構築した。すなわち、CTGAATTCGGAATGAAGGTGTTCCGTA（配列番号９）及び GAGAATTCTTAGAGACGGGGCTTCCGA（配列番号１０）をプライマーとし、クローニングしたヒト由来のcDNAフラグメントを鋳型としてＰＣＲを行い、本発明ポリペプチドのオープンリーディングフレームを含むＰＣＲ産物(配列番号３における塩基番号387-1844)を得た。これをEcoRIで消化し、pcDNA3発現ベクターにサブクローニングした。DNAフラグメントが正しい方向に挿入された組換えプラスミド(pcDNA3-hGlcNAc6ST)を発現に用い、DNAフラグメントが逆方向に挿入された組換えプラスミド(pcDNA3-hGlcNAc6STA)は対照実験に用いた。
【０１０６】
既にクローニングされているマウスのフコシルトランスフェラーゼIV遺伝子の1544bpのフラグメント(J.Biochem.(Tokyo)119,302-308(1996))を、上述と同様にpcDNA3発現ベクターのBamHI及びEcoRI部位にサブクローニングした。DNAフラグメントが正しい方向に挿入された組換えプラスミド(pcDNA3-FucTIV)を用いた。
【０１０７】
（４）本発明DNAのCOS-7細胞における一過性発現
DEAE-デキストラン法(Aruffo,A.(1991)in Current Protocols in Molecular Biology, Suppl.14, Unit 16.13, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, New York)により、15μgの発現プラスミドをCOS-7細胞(理研細胞バンクより入手；3x106細胞／10cmディッシュ)にトランスフェクトした。これを10％ウシ胎児血清(fetal calf serum)を含むダルベッコの改変最小必須培地(Dulbecco-modified minimum essential medium)中で65時間培養した。その後細胞をリン酸緩衝生理食塩液(PBS)で洗浄し、デイッシュをこすって細胞をはがした。この細胞を集めて0.25M シュークロース、10mM Tris-HCl(pH7.2)及び0.5％ Triton X-100を含有する溶液(１ディッシュあたり1.5mL)中で、ダウンスホモジナイザー(Dounce homogenizer)を用いてホモジナイズした。ホモジネートを10,000 x gで15分間遠心し、上清を集めた。この上清を以下「抽出物」という。FACS(fluorescence-activated cell sorter)による分析のために、トランスフェクトされた細胞を48時間培養し、25cm2培養フラスコに移して(3x105細胞／フラスコ)さらに36時間培養した。
【０１０８】
（５）種々の高分子量基質への硫酸基転移活性の分析
種々のグリコサミノグリカンを基質(受容体)として用い、硫酸基転移活性を公知の方法で測定した(J.Biol.Chem.,272,32321-32328(1997))。ムチンを受容体として用いた場合は、2.5μmolのイミダゾール-塩酸(pH6.8)、0.25μmolのCaCl2、0.1μmolのジチオスレイトール、0.1μmolのNaF、0.1μmolのAMP、2.0μgのムチン、50pmolの35S-PAPS(約5.0x105cpm)及び５μLの抽出物を含む50μLの溶液を37℃で１時間インキュベートした。
【０１０９】
高速脱塩カラムを用いてムチンを単離し、ムチンに取り込まれた放射活性を測定した。
【０１１０】
（６）オリゴ糖への硫酸基転移活性の分析
2.5μmolのイミダゾール-塩酸(pH6.8)、0.5μmolのMnCl2、0.1μmolのAMP、1.0μmolのNaF、25nmolのオリゴ糖、50pmolの35S-PAPS(約5.0x105cpm)及び５μLの抽出物を含む50μLの溶液を反応混合液とした。この反応混合液を30℃で５時間インキュベートし、反応チューブを沸騰水中に１分間浸すことによって反応を停止させた。35S-ラベルされたオリゴ糖を、Superdex 30 ゲルクロマトグラフィーによって35SO4及び35S-PAPSから分離し、放射活性を測定した。GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcを受容体として用いた場合、硫酸基転移反応は分析条件下において５時間まで直線的に進行した。
【０１１１】
（７）Superdex 30 クロマトグラフィー、濾紙電気泳動、濾紙クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ(高速液体クロマトグラフィー)及びＴＬＣ(薄層クロマトグラフィー)
Hiload Superdex 30 16/60カラムを0.2M NH4HCO3で平衡化した。流速は１mL/分で行った。１mLの画分を集め、４mLのクリアゾル(Clearsol；ナカライテスク(Nakarai Tesque)社)と混合し、放射活性を測定した。オリゴ糖は210nmの吸光度でモニターした。濾紙電気泳動は、ワットマン(Whatman) No.3濾紙(2.5cm x 57cm)を用い、ピリジン／酢酸／水(体積比１：10：400, pH4)中、30V/cmで40分間行った。濾紙クロマトグラフィー用のサンプルは、Whatman No.3濾紙(2.5cm x 57cm)にスポットし、1-ブタノール／酢酸／1M NH4OH(体積比３：２：１)で展開した。濾紙電気泳動または濾紙クロマトグラフィー後、濾紙を乾燥させ、この濾紙を1.25cmの小片に切り、放射活性を液体シンチレーションカウンティングにより測定した。
【０１１２】
35S-ラベルされた硫酸化GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcから得られた35S-ラベルされた産物のＨＰＬＣ分析は、５mM KH2PO4で平衡化されたPartisil SAX-10 カラム(4.5mm x 25cm)で行った。このカラムを５mMのKH2PO4で展開した。なお流速は１mL/分で、カラム温度は40℃で行った。0.5mLづつ画分を採取し、４mLのクリアゾルと混合し、放射活性を測定した。ＴＬＣは、0.1mm厚のセルロースでコートされたアルミニウムシート(メルク(Merck)社)を用い、エチルアセテート／ピリジン／テトラヒドロフラン／水／酢酸(体積比50：22：15：15：４)中で行った(Biochem.J.,319,209-216(1996))。
【０１１３】
（８）35S-ラベルされた硫酸化GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcのＮ−脱アセチル化、脱アミノ化及びNaBH4還元
35S-ラベルされた硫酸化GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcは、発現させた本発明ポリペプチド(抽出物中の蛋白量として2.1μg)を用い、35S-PAPS量を６倍増やし、インキュベーション時間を25時間にする以外は前記と同様の方法で製造した。Superdex 30カラムから溶出された35S-ラベルされた硫酸化GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcは、凍結乾燥し、濾紙電気泳動で精製し、1.0％ヒドラジン硫酸を含む70％ヒドラジン中で95℃、６時間脱アセチル化した(Anal.Biochem.176,96-104(1989))。脱アセチル化した物質はSuperdex 30クロマトグラフィーにより精製し、亜硝酸(pH4)中で脱アミノ化し、NaBH4中で還元した(Biochem.J.235,225-236(1986))。最終的に、サンプルを60μLの水に溶解し、濾紙クロマトグラフィーに付した。
【０１１４】
（９）免疫学的手法
6-硫酸化ルイスＸ(6-sulfo Lewis X；Galβ1-4(Fucα1-3)(SO4-6)GlcNAc)に反応するマウスIgMモノクローナル抗体(AG223)を産生するハイブリドーマセルライン AG223は、KohlerとMilsteinの方法(Nature 256,495-497(1975))により作製し、抗糖鎖抗体の産生に用いた(Kannagi,R.,and Hakomori,S.(1986) in Handbook of ExperimentalImmunology, Vol.4, Applications of immunological methods in biomedical sciences (Weir,D.M.,Herzenberg,L.,Blackwell,C.,and Herzenberg,L.A.,eds)pp.117.1-117.20, Blackwell Scientific Pub. Inc., Boston)。6-硫酸化ルイスＸセラミド(Galβ1-4(Fucα1-3)(SO4-6)GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glcβ1-Cer)をSalmonella minnesota R595株に吸着させ、BALB/cマウスの腹腔内免疫に用いた。免疫は、０日目(5μg糖脂質)、３日目(10μg)、７日目(15μg)、12日目(20μg)、17日目(25μg)及び31日目(35μg)と、繰り返し行った。最終免疫から３日後、脾臓細胞を採取し、マウスミエローマ P3/X63-Ag8U1と融合させた。同じ糖脂質を、クローニングの際に行うハイブリドーマ培養上清のELISAの抗原として用いた。ELISAは、96ウエルの培養プレートの底に固相化した糖脂質抗原を用い、標準的な方法(Hakomori,S.,and Kannagi,R.(1986) in Handbook of Experimental Immunology, Vol.1, Immunochemistry(Weir,D.M.,Herzenberg,L.,Blackwell,C.,and Herzenberg,L.A.,eds)pp.9.1-9.39, Blackwell Scientific Pub. Inc., Boston)で行った。ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスIgM(μ鎖特異的、カペル社(Cappel Inc.)）を二次抗体として用いた。
【０１１５】
6-硫酸化シアリルN-アセチルラクトサミン(NeuAcα2-3Galβ1-4(SO4-6)GlcNAc)構造に反応するマウスIgMモノクローナル抗体(G72)を産生するハイブリドーマセルライン G72は、6-硫酸化シアリルルイスＸセラミドを用いて同様に作製した。
【０１１６】
6-硫酸化シアリルルイスＸセラミドに反応するが、6'-硫酸化シアリルルイスＸセラミド、6,6'-bis-硫酸化シアリルルイスＸセラミド、6-硫酸化ルイスＸセラミド、ルイスＸセラミド等には反応しない（従って、6-硫酸化シアリルルイスＸ抗原を認識する）マウスIgMモノクローナル抗体(G152)は、6-硫酸化シアリルルイスＸセラミドを抗原として、J.Biol.Chem.,273,11225-11233(1998)に記載の方法で作製した。
【０１１７】
CSLEX-1モノクローナル抗体（Cancer Res.,44,5279-5285(1984)；シアリルルイスＸ抗原に反応する）は、シアリルルイスＸ抗原を検出するために用いた。
抗原エピトープの細胞表面上での発現は、FACScan(ベクトン・ディッキンソン(Becton Dickinson)社)を用いたFACS（Biochem.Biophys.Res.Commun.,230,546-551(1997)）で解析した。
【０１１８】
（１０）ノーザン及びゲノムサザンブロット解析
（１０−１）マウス
C57 BL/6Jマウスの組織から、Anal.Biochem.,162,156-159(1987)に記載の方法で全RNA(20μg)を調製した。マウスD3胚性幹細胞から調製したゲノムDNA(10μg)(J.Embryol.Exp.Morphol.,87,27-45(1985))を適当な制限酵素で４時間消化した。放射性プローブは、マウス７日胚cDNAライブラリーのスクリーニングに用いたものと同じものを用いた。ブロットは、55℃条件下で2xSSPE(塩化ナトリウム／リン酸ナトリウム／EDTA緩衝液)、0.1％ SDS中で、最終的には0.1xSSPE、0.1％ SDS中で55℃条件下で洗浄した。メンブランはBAS-イメージングプレート(BAS-imaging plate)に露光し、メンブラン上の放射活性をBAS2000ラジオイメージアナライザー(富士写真フィルム)で測定した。
【０１１９】
（１０−２）ヒト
ヒトの組織から、上記（１０−１）と同様の方法で全RNAを調製した。ヒト由来の本発明DNAのBpu1102 I-BamH I 368bpフラグメント(配列番号３における塩基番号910-1277)をプローブとして用いた。ブロットは、上記（１０−１）と同様に行った。
【０１２０】
（１１） In situ ハイブリダイゼーション
C57 BL/6Jマウスから作製した標本を、ヘマトキシリン−エオシン染色又は in situ ハイブリダイゼーションに付した。本発明ポリペプチドのプローブとして、cDNAの0.6kbp Pst Iフラグメント(配列番号１における塩基番号962-1561)を pBluescript II SK-にサブクローニングした。センス及びアンチセンス cRNAプローブは、DIG RNAラベリングキット(ベーリンガー・マンハイム(Boehringer Mannheim))を用いたin vitro転写により調製した。
【０１２１】
（１２）蛍光 in situ ハイブリダイゼーション分析
蛍光 in situ ハイブリダイゼーション(fluorescence in situ hybridization(FISH)分析は、ヒト由来の本発明DNA(配列番号３における塩基番号１〜２４０９)をプローブとして用いて、Genomics,17,514-515(1993)に記載の方法に従って行った。
【０１２２】
＜２＞結果
（１）本発明DNAのクローニング
マウスのコンドロイチン 6-スルホトランスフェラーゼが既にクローニングされており、ESTデータベースによる探索の結果、マウスのコンドロイチン 6-スルホトランスフェラーゼの触媒部位に相同性を有する短い配列(Genbank accession番号：AA103962)が見つかった。相当するcDNAフラグメントをＲＴ−ＰＣＲで得た(配列番号１における塩基番号1139-1506)。このcDNAフラグメントをプローブとして、約8x105プラークのマウス７日胚cDNAライブラリーをスクリーニングし、６つの独立のクローンを得た。最も長いcDNAインサート(2.2kb)の塩基配列を決定した(配列番号１)。決定された2150bpのcDNAは、483アミノ酸残基（分子量：52829ダルトン(Da)、Ｎ−結合グリコシレーションが可能な部位(potential N-linked glycosylation sites)を４つ有している）からなる単一のオープンリーディングフレームを含んでいた(配列番号１)。最初のATGコドンの周辺の配列はKozakのルール(Cell,44,283-292(1986))に適合しており、上流領域はインフレーム停止コドン(in-frame stop codon)を含んでいた。ヒドロパシープロット分析により、アミノ末端側に２０残基(８番目のAla〜２７番目のLeu)からなる１つの顕著な疎水性領域が存在することが示され、このことから本発明ポリペプチドはII型膜貫通タンパク質であることが示唆された (図１)。本発明ポリペプチドは、マウスのコンドロイチン 6-スルホトランスフェラーゼ及びヒトのケラタン硫酸 Gal-6-スルホトランスフェラーゼ(J.Biol.Chem.,272,32321-32328(1997))に対し、それぞれ25％及び27％の相同性を有していた。しかしながら、このタンパク質のアミノ酸配列と他の公知のスルホトランスフェラーゼ(J.Biol.Chem.,267,15744-15750(1992)、J.Biol.Chem.,272,13980-13985(1997)、J.Biol.Chem.,272,28008-28019(1997)、J.Biol.Chem.,272,29942-29946(1997)、J.Biol.Chem.,272,4864-4868(1997))のアミノ酸配列との間に有意な相同性は見られなかった。
【０１２３】
また配列番号１で示されるDNAを用いてヒト胎児脳ｃＤＮＡを保持するλｇｔ１１ライブラリーをスクリーニングすることによって、ヒト由来の本発明DNAを得た（配列番号３）。得られたDNAは2409bpからなり、484アミノ酸残基からなる単一のオープンリーディングフレームを含んでいた（配列番号３）。ヒドロパシープロット分析により、このポリペプチドは、アミノ末端側に膜貫通ドメインを有するII型膜貫通タンパク質であることが示唆された。
【０１２４】
最初のATGコドンの周辺の配列はKozakのルール(Cell,44,283-292(1986))に適合していた。
なお最初のATGコドンの41塩基上流に他のATGコドンが存在している。このATGコドンの周辺もKozakのルールに適合しており、このATGコドンはマウス由来の本発明DNAの対応する部分にも存在している。ヒト由来、マウス由来のいずれにおいても、最初のATGコドンとこのATGコドンの間に終止コドンは存在していない。従って本発明DNAにおいては上記２箇所のATGコドンのいずれもが開始コドンとして機能しうると考えられる。
【０１２５】
配列番号１のDNAによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号２に、配列番号３のDNAによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号４にそれぞれ示す。配列番号２及び配列番号４の間の相同性は８５％以上であった。
【０１２６】
（２）本発明DNAからの本発明ポリペプチドの発現
5'-及び3'-の非コード領域を除去した本発明DNA(配列番号１における塩基番号467-1921)を哺乳類発現ベクター pcDNA3に挿入し、COS-7細胞中で過剰発現させた。35S-ラベルしたPAPSを硫酸基供与体、種々の複合糖質を硫酸基受容体として用い、トランスフェクトされた細胞の抽出物の硫酸基転移活性を調べた結果、コンドロイチン、コンドロイチン 4-硫酸、コンドロイチン 6-硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、脱硫酸化ケラタン硫酸、CDSNS-ヘパリン、ブタ胃由来ムチン及びウシ顎下腺由来ムチンには硫酸基が転移されなかった。
【０１２７】
GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcを硫酸基受容体として実験した。反応混合物のSuperdex 30クロマトグラフィーの結果、正しい方向のcDNA(センスcDNA)が挿入されたベクター(pcDNA3-GlcNAc6ST)でトランスフェクトした細胞では受容体よりもわずかに高い放射活性ピークが示され、受容体が硫酸化されていることが示された(図２A)。トランスフェクトしなかった細胞や、逆方向のcDNA(アンチセンスcDNA)が挿入されたベクター(pcDNA3-GlcNAc6STA)でトランスフェクトした細胞では、硫酸基転移活性は非常に低かった(表１)。
【０１２８】
【表１】
0003809277.tif 000002
(Superdex 30クロマトグラフィー(図２A)の画分番号85-89の放射活性から算出。受容体存在下での測定値から受容体非存在下での測定値を差し引いた値を示す。３回実験したS.D.も併せて示した)
【０１２９】
これに対し、Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcは受容体とはならなかった(図２B)。このことから本発明ポリペプチドは、GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcには硫酸基を転移するが、Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcには硫酸基を転移しないことが確認された。
【０１３０】
また、5'-及び3'-の非コード領域を除去した本発明DNA(配列番号３における塩基番号387-1844)を上記と同様にCOS-7細胞にトランスフェクトし、この細胞の抽出物の硫酸基転移活性（硫酸基受容体として、GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAc を用いた）を上記と同様に調べた。その結果、正しい方向のcDNA(センスcDNA)が挿入されたベクター(pcDNA3-hGlcNAc6ST)でトランスフェクトした細胞は、トランスフェクトしなかった細胞や、逆方向のcDNA(アンチセンスcDNA)が挿入されたベクター(pcDNA3-hGlcNAc6STA)でトランスフェクトした細胞に比べて５倍以上硫酸基転移活性が高かった（表２）。
【０１３１】
【表２】
0003809277.tif 000003
(Superdex 30クロマトグラフィー画分の放射活性から算出。受容体存在下での測定値から受容体非存在下での測定値を差し引いた値を示す。３回実験したS.D.も併せて示した)
【０１３２】
（３）本発明ポリペプチドにより硫酸基が転移される位置の決定（本発明ポリペプチド活性の測定方法）
GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcに転移された35SO4の位置を決定するため、放射活性産物をＮ−脱アセチル化、脱アミノ化及びNaBH4還元の順に処理して分解した。分解後、濾紙クロマトグラフィーにより２つの放射活性産物が検出された(図３A)。早く移動するピークは(SO4-6)2,5-アンヒドロマンニトールの位置に移動した。35SラベルされたGlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcを長時間ヒドラジン分解処理すると遅く移動するピークが減少することから、遅く移動するピークは不完全な脱アセチル化による非分解産物であると考えられる。早く移動するピークをＨＰＬＣにより解析した結果、35S-放射活性は(SO4-6)3H-2,5-アンヒドロマンニトールと共に溶出された(図３B)。35S-及び3H-放射活性は、6-硫酸化 2,5-アンヒドロマンニトールを4-硫酸化又は3-硫酸化 2,5-アンヒドロマンニトールから分離できる溶媒系(Biochem.J.,319,209-216(1996))を用いたＴＬＣ上でも共に移動した。これらの結果から、35SO4は、GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcの非還元末端のGlcNAcの６位に転移することが示された。従ってクローニングされた本発明DNAは本発明ポリペプチドをコードしていることが示された。
【０１３３】
（４）本発明DNAの細胞内への移入による、硫酸化糖の発現
マウス由来の本発明DNAでトランスフェクトしたCOS-7細胞における、新しい抗原エピトープの発現を調べた。G72抗体を用いて硫酸化シアリル-N-アセチルラクトサミン構造の発現解析を行った。この抗体は6-硫酸化シアリルルイスＸセラミド及びSL2L4に反応するが、6'-硫酸化シアリルルイスＸセラミドやシアリルパラグロボシドには反応しない(図４)。このことは、この抗体の反応に必要な最小構造がNeuAcα2-3Galβ1-4(SO4-6)GlcNAcであることを示している。本発明DNAでトランスフェクトしたCOS-7細胞がG72抗原を発現することが示された(図５B)。トランスフェクトしていない細胞(図５A)及びアンチセンスcDNAでトランスフェクトした細胞(図５C)はこの抗体に反応しなかった。ノイラミニダーゼ処理すると抗原性は消失した(図５E)。これらの結果から、本発明ポリペプチドはNeuAcα2-3Galβ1-4(SO4-6)GlcNAc抗原の合成に関与していると結論された。
【０１３４】
本発明ポリペプチドが6-硫酸化N-アセチルラクトサミン構造の形成に関与していることの証拠を更に得るため、COS-7細胞をマウス由来の本発明DNA及びフコシルトランスフェラーゼIVのcDNAで二重にトランスフェクトした。フコシルトランスフェラーゼIVは、フコースをN-アセチルラクトサミンに転移することによってルイスＸ構造(Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc)を形成できることが知られている(J.Biol.Chem.,266,17467-17477(1991),Cell,63,1349-1356(1990))。トランスフェクションによる細胞表面の変化をモニターするために、6-硫酸化ルイスＸ(Galβ1-4(Fucα1-3)(SO4-6)GlcNAc)構造に特異的に反応し、ルイスＸ(Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc)や6'-硫酸化ルイスＸ((SO4-6)Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc)構造には反応しないモノクローナル抗体 AG223を用いた(図4)。本発明DNA及びフコシルトランスフェラーゼのcDNAでトランスフェクトした結果、細胞は6-硫酸化ルイスＸ抗原陽性となった(図６C)。しかしどちらか一方のcDNAだけでトランスフェクトした場合、細胞は6-硫酸化ルイスＸ抗原陽性にはならなかった(図６A、B)。フコシルトランスフェラーゼのcDNAだけでトランスフェクトした場合、細胞はルイスＸ抗原陽性となった(図６D)。
【０１３５】
また、ヒト由来の本発明DNAでトランスフェクトしたCOS-7細胞における、新しい抗原エピトープの発現を調べた。
CSLEX-1抗体（Cancer Res.,44,5279-5285(1984)；シアリルルイスＸ抗原に反応する）、G72抗体、およびG152抗体（6-硫酸化シアリルルイスＸセラミドに反応するが、6'-硫酸化シアリルルイスＸセラミド、6,6'-bis-硫酸化シアリルルイスＸセラミド、6-硫酸化ルイスＸセラミド、ルイスＸセラミド等には反応しない）を用いて、上記と同様に細胞表面上での硫酸化糖の発現解析を行った。結果を図７に示す。
【０１３６】
その結果、トランスフェクトしなかった細胞はいずれの抗体にも反応しなかった。フコシルトランスフェラーゼのcDNAのみでトランスフェクトした細胞はCSLEX-1抗体のみに反応した。またヒト由来の本発明DNAのみでトランスフェクトした細胞はG72抗体のみに反応した。またヒト由来の本発明DNA及びフコシルトランスフェラーゼのcDNAでトランスフェクトした細胞はCSLEX-1抗体、G72抗体及びG152抗体のいずれにも反応した。
【０１３７】
これらの結果から、本発明DNAを細胞に移入することによって6-硫酸化シアリル-N-アセチルラクトサミン構造を有する硫酸化糖を製造することができ、また本発明DNA及びフコシルトランスフェラーゼのcDNAを共に細胞に移入することにより、6-硫酸化シアリルルイスＸ構造を有する硫酸化糖を製造することができることが示された。
【０１３８】
（５）ノーザンブロット及びサザンブロット解析
成体マウスの組織（小脳、大脳、眼球、心臓、肺、筋肉、脾臓、胸腺、肝臓、膵臓、腎臓、胃、小腸、子宮、卵巣及び精巣）を用いて調べた結果、本発明ポリペプチドは大脳、小脳、目、肺及び膵臓で強く発現していた(図８A)。腸、子宮、卵巣、腸間膜リンパ節およびその周辺に中等度のシグナルが観察された(図８A)。主要な転写産物のサイズは3.9kbであった。サザンブロットにおいて、Eco RI、Rco RV又はSac Iによる消化産物が、いずれも単一のバンドでプローブに反応した。このことは本発明ポリペプチドの遺伝子は単一コピー遺伝子(single copy gene)であることを示している(図８B)。
【０１３９】
またヒトの組織（心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、膵臓、脾臓、胸腺、前立腺、精巣、卵巣、小腸、結腸、末梢血リンパ球、胃、甲状腺、脊髄、リンパ節、気管、副腎、骨髄）を用いて調べた結果、本発明ポリペプチドは骨髄、末梢血リンパ球、脾臓、脳、脊髄、卵巣及び胎盤で強く発現していた。リンパ節、胸腺、心臓、肺、気管、胃、小腸、結腸、甲状腺、前立腺及び副腎に中程度のシグナルが観察された。主要な転写産物のサイズは3.6kbであった。
【０１４０】
（６）In situハイブリダイゼーション分析
本発明ポリペプチドの発現部位を決定するためにIn situハイブリダイゼーションを行った。成体マウスの脳においては、海馬のCA3野の錐状体細胞、小脳核及びプルキンエ細胞で強いシグナルが検出された。CA1野を含む海馬の他の部分、視床、橋核、嗅結節、嗅球で中等度のシグナルが検出された。
【０１４１】
リンパ系組織内での本発明DNAの転写産物の局在を、腸間膜リンパ節を用いて調べた。HEV(高内皮細静脈；high endothelial venules；L-セレクチンのリガンドが局在している(J.Cell Biol.,113,1213-1221(1991)))が傍皮質中に存在していた。HEVは、長円形の大きな核と少量の細胞質とからなる立方内皮である。本発明ポリペプチドのシグナルは、これら内皮に特異的に発現していた。
【０１４２】
（７）蛍光 in situ ハイブリダイゼーション分析
ヒト由来の本発明DNAの染色体上での位置を決定するため、蛍光 in situ ハイブリダイゼーション分析を行った。その結果、ヒト由来の本発明DNAは染色体７ｑ３１部位に存在することが示された。
【０１４３】
（８）図面の説明
図１   マウス由来の本発明ポリペプチドのヒドロパシープロット。ヒドロパシープロットは、Kyte 及び Doolittle(J.Mol.Biol.,157,105-132(1982))の方法で、11アミノ酸のウインドウで算出した。
【０１４４】
図２  マウス由来の本発明ポリペプチドの基質特異性。A：GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcを硫酸基受容体として用いた場合。B：Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAc(L1L1)を硫酸基受容体として用いた場合。酵素反応後、生成物をSuperdex 30 ゲルクロマトグラフィーで分析した。●は受容体存在下、○は受容体非存在下での結果を示す。矢印は受容体の溶出位置を示す。
【０１４５】
図３  A：35SラベルされたGlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcをＮ−脱アセチル化、脱アミノ化分解及び還元し、濾紙クロマトグラフィーで分離した。矢印１、２及び３は標準物質の移動位置を示す。１は(SO4-6)Galβ1-4(SO4-6)2,5-アンヒドロマンニトールを、２はGalβ1-4(SO4-6)2,5-アンヒドロマンニトールを、３は(SO4-6)2,5-アンヒドロマンニトールを示す。
Ｂ：A中の横棒で示した画分(35Sラベルされた(SO4-6)2,5-アンヒドロマンニトール画分)を3H-ラベルされた(SO4-6)2,5-アンヒドロマンニトール(標準品)と混合し、SAX-10カラムを用いたＨＰＬＣで分析した。それぞれの画分の3H放射活性(○)及び35S放射活性(●)を測定した。
【０１４６】
図４  ELISAによるAG223及びG72モノクローナル抗体の特異性の解析。糖脂質を96ウエルの培養プレート底面に固相化し、ELISA解析を行った。SはNeuAcを、LexはルイスＸセラミドを、PGはパラグロボシドを、SL2L4はNeuAcα2-3Galβ1-4(SO4-6)GlcNAcβ1-3(SO4-6)Galβ1-4(SO4-6)GlcNAc-コレステリルアニリン(cholesteryl aniline)を示す。
【０１４７】
図５  マウス由来の本発明DNAのトランスフェクションによるG72抗原の発現。トランスフェクション前のCOS-7細胞(A及びD)、センス(正しい方向の)cDNAでトランスフェクトした細胞(B及びE)又はアンチセンス(逆方向の)cDNAでトランスフェクトした細胞(C及びF)を、G72モノクローナル抗体と反応させ、FACSで解析した。太線は抗体と反応後のパターンを、細線は抗体と反応前のパターンを示す。-NANaseはノイラミニダーゼ消化前、+NANaseは0.02ユニット/mLPBS(pH7.4)の Arthrobacter ureafaciens由来ノイラミニダーゼで37℃下、30分間消化後の結果を示す。
【０１４８】
図６  マウス由来の本発明DNAとフコシルトランスフェラーゼIV cDNAとのダブルトランスフェクションによるAG223抗原(6-硫酸化ルイスＸ)の発現。フコシルトランスフェラーゼ cDNAのみでトランスフェクトしたCOS-7細胞(A及びD)、本発明DNAのみでトランスフェクトしたCOS-7細胞(B及びE)、両方のDNAでトランスフェクトしたCOS-7細胞(C及びF)を、AG223モノクローナル抗体と反応させ(A-C)、又はLeuM1(抗ルイスＸ抗体)と反応させ(D-F)、FACSで解析した。太線は抗体と反応後のパターンを、細線は抗体と反応前のパターンを示す。
【０１４９】
図７  ヒト由来の本発明DNAのトランスフェクションによるG72抗原（6-硫酸化シアリル-N-アセチルラクトサミン抗原）の発現、並びにヒト由来の本発明DNAとフコシルトランスフェラーゼIV cDNAとのダブルトランスフェクションによるG152抗原(6-硫酸化シアリルルイスＸ抗原)の発現。データは、トランスフェクトされた細胞における抗原陽性群の平均蛍光強度である。
【０１５０】
図８  マウス由来の本発明ポリペプチドのノーザン及びサザンブロット解析。A：ノーザンブロット解析。矢印は、13.5、9.8及び3.9kbの異なるmRNAを示す。リボゾームRNAの位置は左側に示した。グリセロアルデヒド 3-リン酸デヒドロゲナーゼプローブとのハイブリダイゼーションでは、膵臓のバンド強度が弱かった以外は、それぞれのレーンで同程度のバンド強度を呈した。B：ゲノムサザンブロット解析。EcoRI、EcoRV又は SacIによる消化後、単一バンドが検出された。
【０１５１】
【発明の効果】
本発明ポリペプチドは、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−Ｏ−硫酸基転移酵素のポリペプチドであり、糖鎖の非還元末端のＮ−アセチルグルコサミン残基の６位水酸基に特異的に硫酸基を転移する作用を有するので、GlyCAM-1(抗炎症剤等への利用が期待されている)等の機能性糖鎖の合成に有用である。また本発明DNAは、本発明ポリペプチドの大量合成や生体（細胞）におけるGlyCAM-1等の機能性糖鎖の人工的発現等に用いることができる。
本発明方法１および２は、GlyCAM-1等の機能性糖鎖またはその合成中間体の製造方法として有用である。
【０１５２】
【配列表】
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【０１５３】
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【０１５４】
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【０１５５】
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【０１５６】
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【０１５７】
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【０１５８】
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【０１５９】
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【０１６０】
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【０１６１】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  マウス由来の本発明ポリペプチドのヒドロパシープロットを示す。
【図２】  マウス由来の本発明ポリペプチドの基質特異性を示す。
【図３】  マウス由来の本発明ポリペプチドによる硫酸基転移産物の解析結果を示す。
【図４】  ELISAによるAG223及びG72モノクローナル抗体の特異性の解析結果を示す。
【図５】  マウス由来の本発明DNAの移入（トランスフェクション）によるG72抗原の発現を示す。
【図６】  マウス由来の本発明DNAとフコシルトランスフェラーゼIV cDNAとのダブルトランスフェクションによるAG223抗原(6-硫酸化ルイスＸ)の発現を示す。
【図７】  ヒト由来の本発明DNAのトランスフェクションによるG72抗原の発現、並びにヒト由来の本発明DNAとフコシルトランスフェラーゼIV cDNAとのダブルトランスフェクションによるG152抗原の発現を示す。
【図８】  マウス由来の本発明ポリペプチドのノーザン及びサザンブロット解析結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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