(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
混合物試料を注入した液体クロマトグラフ装置から順次溶出する試料分画をＮＭＲ装置に送液し、ＮＭＲ装置において所定の高周波磁界パルスを繰り返し照射してＦＩＤ信号を観測し、観測されたＦＩＤ信号をフーリエ変換して各試料分画のＮＭＲスペクトルを取得し、取得されたＮＭＲスペクトル群の時間的な変化からＮＭＲクロマトグラムを作成し、該ＮＭＲクロマトグラムから判読される試料成分の保持時間の情報に基づいて、同一混合物試料についてのストップ＆フロー測定またはフラクション・ループ測定のための時間制御を行なうようにしたことを特徴とする液体クロマトグラフ−ＮＭＲ法。
【請求項２】
前記液体クロマトグラフ−ＮＭＲ法において、取得されたＮＭＲスペクトル群の積分値の時間的な変化からＮＭＲクロマトグラムを作成するようにしたことを特徴とする請求項１記載の液体クロマトグラフ−ＮＭＲ法。
【請求項３】
前記液体クロマトグラフ−ＮＭＲ法において、取得されたＮＭＲスペクトル群の投影スペクトルの時間的な変化からＮＭＲクロマトグラムを作成するようにしたことを特徴とする請求項１記載の液体クロマトグラフ−ＮＭＲ法。
【請求項４】
前記液体クロマトグラフ−ＮＭＲ法において、取得されたＮＭＲスペクトル群の所定の周波数におけるＮＭＲスペクトル強度の時間的な変化からＮＭＲクロマトグラムを作成するようにしたことを特徴とする請求項１記載の液体クロマトグラフ−ＮＭＲ法。
【請求項５】
混合物試料を注入した液体クロマトグラフ装置から順次溶出する試料分画をＮＭＲ装置に送液し、ＮＭＲ装置において所定の高周波磁界パルスを繰り返し照射してＦＩＤ信号を観測し、観測されたＦＩＤ信号の強度変化に基づいてＮＭＲクロマトグラムを作成し、該ＮＭＲクロマトグラムから判読される試料成分の保持時間の情報に基づいて、同一混合物試料についてのストップ＆フロー測定またはフラクション・ループ測定のための時間制御を行なわせるようにしたことを特徴とする液体クロマトグラフ−ＮＭＲ法。
【請求項６】
前記ＦＩＤ信号の強度変化は、ＦＩＤ信号を絶対値処理した後、積分して得られるＦＩＤ信号の積分強度の変化であることを特徴とする請求項５記載の液体クロマトグラフ−ＮＭＲ法。
【請求項７】
前記ＮＭＲクロマトグラムから判読される試料成分の保持時間の情報を赤外線分光装置に受け渡すことによって、液体クロマトグラフ装置によって分離された試料成分の赤外線スペクトルの測定を行なうことができるようにしたことを特徴とする請求項１、２、３、４、５または６記載の液体クロマトグラフ−ＮＭＲ法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、液体クロマトグラフ−ＮＭＲ法に関し、特に、ＵＶ検出器で検出不能なＵＶ吸収を持たない試料成分のクロマトグラムを容易に作成でき、該クロマトグラムに基づいてＮＭＲのストップ＆フロー測定やフラクション・ループ測定を好適に行なうことのできる液体クロマトグラフ−ＮＭＲ法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
図１は、液体クロマトグラフ装置（ＬＣ）から溶出する試料成分をＮＭＲ装置を用いて分析するＬＣ−ＮＭＲ装置の構成を示したものである。図中１は、高性能液体クロマトグラフ装置（ＨＰＬＣ：high performance liquid chromatography）、２は該ＨＰＬＣを制御するパーソナル・コンピュータ（ＰＣ）である。ＨＰＬＣ１は、内蔵された図示しないポンプで溶媒溜３から溶媒を吸引すると共に、同じく内蔵された図示しない試料溜から試料溶液をも吸引して、試料成分を内蔵の図示しないカラムで成分毎に展開・分離する。
【０００３】
展開・分離された試料成分は、ＵＶ波長帯に吸収を示すものが多いので、ＵＶ検出器４を通過する際にＵＶ検出器４によって順次検出され、ＵＶクロマトグラムを与える。その後、試料はＮＭＲのマグネット５に挿入されたＮＭＲプローブ６に導入され、ＮＭＲスペクトルの測定に供される。このＮＭＲ測定は、ＵＶ検出器４からの検出信号、すなわち、ＵＶクロマトグラムに同期させて（ただし、ＵＶ検出器４で検出された試料成分がＮＭＲプローブ６に移動するまでの遅延時間（タイム・ラグ）を設けて）行なわれることにより、ＨＰＬＣ１で分離された試料成分毎のＮＭＲスペクトルを得ることができる。このときのＮＭＲ測定は、主にスペクトロメータ７によって行なわれ、該スペクトロメータ７はシステム８によって制御される。また、取得されたＮＭＲデータの処理・解析は、主にシステム８によって行なわれる。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
このような構成において、ＨＰＬＣ１によって分離されてくる試料成分のＮＭＲ測定を行なおうとすれば、ＮＭＲは検出感度が良くないため、ストップ＆フロー法によって試料成分がＮＭＲプローブ６に到達した段階で送液を一時的に止めてＮＭＲの積算測定を行なわせたり、フラクション・ループ法によって試料溶液の流路を切り換えて試料溶液の一部をフラクション・ループに蓄え、ＨＰＬＣ１による分離終了後に各成分をフラクション・ループから順次ＮＭＲプローブ６に送液してＮＭＲの積算測定を行なわせたりすることにより、測定時間を稼ぎ、ＮＭＲの検出感度を上げることが広く行なわれる。
【０００５】
ところが、ストップ＆フロー法やフラクション・ループ法を行なうためには、試料成分がＨＰＬＣ１から溶出する正確な時間（ＨＰＬＣによる試料成分の保持時間（リテンション・タイム））が判らなければならない。そこで、従来は、ＵＶ検出器４からの検出信号（ＵＶクロマトグラム）がこの目的のために用いられてきた。しかしながら、ＨＰＬＣ１から溶出する全ての試料成分がＵＶ波長帯に吸収を持つとは限らず、試料成分の種類によってはＵＶ吸収を持たないものもある。その場合は、ＵＶ検出器４による検出はできないため、ＨＰＬＣ１から溶出した試料成分のＮＭＲ測定を行なうことは困難であった。
【０００６】
本発明の目的は、上述した点に鑑み、ＵＶ検出器では捉えることのできないＨＰＬＣからの試料成分をＮＭＲ装置で測定するための新しい手法を備え、しかもストップ＆フロー法やフラクション・ループ法のための時間設定を自動で行なうことのできるＬＣ−ＮＭＲ法を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
この目的を達成するため、本発明にかかるＬＣ−ＮＭＲ法は、混合物試料を注入した液体クロマトグラフ装置から順次溶出する試料分画をＮＭＲ装置に送液し、ＮＭＲ装置において所定の高周波磁界パルスを繰り返し照射してＦＩＤ信号を観測し、観測されたＦＩＤ信号をフーリエ変換して各試料分画のＮＭＲスペクトルを取得し、取得されたＮＭＲスペクトル群の時間的な変化からＮＭＲクロマトグラムを作成し、該ＮＭＲクロマトグラムから判読される試料成分の保持時間の情報に基づいて、同一混合物試料についてのストップ＆フロー測定またはフラクション・ループ測定のための時間制御を行なうようにしたことを特徴としている。
【０００８】
また、前記液体クロマトグラフ−ＮＭＲ法において、取得されたＮＭＲスペクトル群の積分値の時間的な変化からＮＭＲクロマトグラムを作成するようにしたことを特徴としている。
【０００９】
また、前記液体クロマトグラフ−ＮＭＲ法において、取得されたＮＭＲスペクトル群の投影スペクトルの時間的な変化からＮＭＲクロマトグラムを作成するようにしたことを特徴としている。
【００１０】
また、前記液体クロマトグラフ−ＮＭＲ法において、取得されたＮＭＲスペクトル群の所定の周波数におけるＮＭＲスペクトル強度のみを抽出して、その時間的な変化からＮＭＲクロマトグラムを作成するようにしたことを特徴としている。
【００１１】
また、混合物試料を注入した液体クロマトグラフ装置から順次溶出する試料分画をＮＭＲ装置に送液し、ＮＭＲ装置において所定の高周波磁界パルスを繰り返し照射してＦＩＤ信号を観測し、観測されたＦＩＤ信号の強度変化に基づいてＮＭＲクロマトグラムを作成し、該ＮＭＲクロマトグラムから判読される試料成分の保持時間の情報に基づいて、同一混合物試料についてのストップ＆フロー測定またはフラクション・ループ測定のための時間制御を行なわせるようにしたことを特徴としている。
【００１２】
また、前記ＦＩＤ信号の強度変化は、ＦＩＤ信号を絶対値処理した後、積分して得られるＦＩＤ信号の積分強度の変化であることを特徴としている。
【００１３】
また、前記ＮＭＲクロマトグラムから判読される試料成分の保持時間の情報を赤外線分光装置に受け渡すことによって、液体クロマトグラフ装置によって分離された試料成分の赤外線スペクトルの測定を行なうことができるようにしたことを特徴としている。
【００１４】
【発明の実施の形態】
以下、図面を参照して、本発明の実施の形態を説明する。図２は、本発明にかかる、ＬＣから溶出する試料成分をＮＭＲ装置を用いて分析するＬＣ−ＮＭＲ装置の構成を示したものである。図中１は、ＨＰＬＣ、２は該ＨＰＬＣを制御するＰＣである。ＨＰＬＣ１は、内蔵された図示しないポンプで溶媒溜３から溶媒を吸引すると共に、同じく内蔵された図示しない試料溜から試料溶液をも吸引して、試料成分を内蔵の図示しないカラムで成分毎に展開・分離する。
【００１５】
成分毎に展開・分離された試料成分は、ＵＶ波長帯に吸収を示すものが多いので、ＵＶ検出器４を通過する際にＵＶ検出器４によって順次検出される。その後、試料溶液はＮＭＲのマグネット５に挿入されたＮＭＲプローブ６に導入され、ＮＭＲスペクトルの測定に供される。このＮＭＲ測定は、ＵＶ検出器４からの検出信号、すなわち、ＵＶクロマトグラムに同期させて（ただし、ＵＶ検出器４で検出された試料成分がＮＭＲプローブ６に移動するまでの遅延時間（タイム・ラグ）を設けて）行なわれることにより、ＨＰＬＣ１で分離された試料成分毎のＮＭＲスペクトルを得ることができる。
【００１６】
しかしながら、分離された試料成分がＵＶ吸収を持たない場合には、ＵＶ検出器４によって試料成分を検出することはできないので、ＵＶ検出器４の代わりにＮＭＲ装置自身を検出器として用いて、オン・フロー法により、予備的にＮＭＲクロマトグラムの測定を行なわせるようにする。そして、本発明では、得られたＮＭＲクロマトグラムのピーク位置に基づいて、各試料成分の正確な保持時間（リテンション・タイム）を求め、そのデータに基づいて、試料溶液の移動の停止や流路の切り換えに関する情報を、システム８からＰＣ２やＵＶ検出器４とＮＭＲプローブ６の間に挿入される図示しないフラクション・ループ・ユニットに対して、ケーブル９を介して自動で設定し、ストップ＆フロー法やフラクション・ループ法に基づいた正式なＮＭＲ測定を行なわせるようにした。このように、システム８からＰＣ２や図示しないフラクション・ループ・ユニットに対して自動で条件設定する機能を設けたことにより、手動設定ではしばしば起きる入力ミスを、完全になくすことができるようになった。
【００１７】
尚、このような構成において、ＮＭＲクロマトグラムを得るには、いくつかの方法がある。１つは、図３に示すように、先ず第１段階として、オン・フロー法でＨＰＬＣ１から溶出する試料溶液をそのままＮＭＲプローブ６内に流通させながら、連続的にＮＭＲを測定し、ＦＩＤ信号をシステム８内に時系列的に並べて２次元データとして取り込み、Ｆ２軸をフーリエ変換して一連のＮＭＲスペクトル群を得る（図３の（ａ））。このとき、所定の高周波磁界パルスを試料溶液に照射することにより、溶媒由来のＮＭＲシグナルを消去して、試料成分由来のＮＭＲスペクトルが選択的に観測されるようにする。次に、第２段階として、２次元で取り込まれた各ＮＭＲスペクトルを積分して、ＮＭＲスペクトルの積分値を得る（図３の（ｂ））。次に、第３段階として、積分値を時系列的に配列して、スケールをＨＰＬＣ１からの試料成分の溶出時間を表わす時間軸としてシステム８の画面に表示する（図３の（ｃ））。
【００１８】
この方法で得られるＮＭＲクロマトグラムは、強度がＮＭＲスペクトルの積分値となっているので、溶出分画中に含まれているプロトン（1Ｈ−ＮＭＲの場合）の含有量に比例し、クロマトグラムの強度自体に物理的な意味を有する点が特徴である。
【００１９】
尚、ＮＭＲスペクトルを積分してＮＭＲクロマトグラムを得る代わりに、ＮＭＲスペクトルを時間軸に投影して投影スペクトルを得ることによってＮＭＲクロマトグラムを得るか、または、ＮＭＲスペクトル群を所定の周波数でスライスして、所定の周波数におけるＮＭＲスペクトル強度のみを抽出することによってＮＭＲクロマトグラムを得ても良い。
【００２０】
また、別の方法としては、次のような方法でＮＭＲクロマトグラムを得ることもできる。すなわち、先ず第１段階として、オン・フロー法でＨＰＬＣ１から溶出する試料溶液をそのままＮＭＲプローブ６内に流通させながら、連続的にＮＭＲを測定し、ＦＩＤ信号をシステム８内に時系列的に並べて２次元データとして取り込む（図４の（ａ））。このとき、所定の高周波磁界パルスを試料溶液に照射することにより、溶媒由来のＦＩＤ信号を消去して、試料成分由来のＦＩＤ信号が選択的に観測されるようにする。次に、第２段階として、ＦＩＤ信号の強度がそれ自身で相殺されないように、ＦＩＤ信号を一度絶対値処理した後、積分を行なってＦＩＤ信号の積分値を得る（図４の（ｂ））。次に、第３段階として、積分値を時系列的に配列して、スケールをＨＰＬＣからの試料成分の溶出時間を表わす時間軸としてシステム８の画面に表示する（図４の（ｃ））。
【００２１】
この方法は、ＦＩＤ信号のフーリエ変換を行なわないので、処理速度が非常に速く、ほとんどリアルタイムでＮＭＲクロマトグラムが得られるという特徴がある。従って、前述のように予備実験を行なってＮＭＲクロマトグラムを得た後に、改めて本実験を行なわなくても、リアルタイムでＮＭＲクロマトグラムを測定しながら、ストップ＆フロー法やフラクション・ループ法を用いた本実験を行なうことが可能になり、試料の節約になる。
【００２２】
尚、このようにして得られたＮＭＲクロマトグラムにおける各試料成分の保持時間に関する情報をフーリエ変換赤外線分光装置（ＦＴ−ＩＲ）などの分析機器に受け渡せば、ＨＰＬＣによって分離された各試料成分毎に赤外線吸収スペクトルを取得することも可能となる（ＬＣ−ＩＲ）。
【００２３】
【発明の効果】
以上述べたごとく、本発明のＬＣ−ＮＭＲ法によれば、ＮＭＲ法を応用してＮＭＲクロマトグラムを取得し、該ＮＭＲクロマトグラムに基づいて、ストップ＆フロー法のための試料溶液送りを停止させるタイミングや、フラクション・ループ法のための試料溶液の流路の切り換えのタイミングを、システム側からＨＰＬＣ側に対して自動設定できるようにしたので、手動入力の場合のような設定の間違いをする恐れがなくなった。
【図面の簡単な説明】
【図１】従来のＬＣ−ＮＭＲ装置を示す図である。
【図２】本発明のＬＣ−ＮＭＲ装置を示す図である。
【図３】本発明のＮＭＲクロマトグラムの作り方の一実施例を示す図である。
【図４】本発明のＮＭＲクロマトグラムの作り方の別の実施例を示す図である。
【符号の説明】
１・・・ＨＰＬＣ、２・・・ＰＣ、３・・・溶媒溜、４・・・ＵＶ検出器、５・・・マグネット、６・・・ＮＭＲプローブ、７・・・スペクトロメータ、８・・・システム、９・・・ケーブル。
【図１】
0003842931.tif 000002
【図２】
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【図３】
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【図４】
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