(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイクロチップのキャピラリ画像を採取してこの画像から蛍光強度を測定する蛍光強度測定方法において、
画像撮像部により撮像された前記キャピラリ画像の所定の位置に所定の大きさの領域を設定して、前記キャピラリ内を泳動する試料に励起光を照射し、前記試料が発する蛍光光の前記画像を採取して、採取された前記画像に基づいて前記領域内の蛍光光の強度の平均値を算出してこの平均値による時間−蛍光強度の特性測定をするものであって、前記所定の大きさの領域は、その位置と大きさが任意に選択できるものであり、さらに、前記蛍光光を受光してその受光信号に基づいて前記試料の蛍光強度を検出する蛍光強度測定部を有し、前記画像撮像部の撮像光学系と前記蛍光強度測定部の前記蛍光強度の検出光学系とが前記マイクロチップを挟んで対向して配置され、所定の周期で前記撮像光学系の蛍光励起光と前記検出光学系の蛍光励起光とを交互に前記試料に照射し、前記画像の採取と前記蛍光強度の測定とがそれぞれの前記照射光の照射タイミングに合わせて行われる蛍光強度測定方法。
【請求項２】
前記画像撮像部は、前記蛍光強度測定部の測定範囲に対してより広い視野を有するものであり、さらに、ビデオ信号録画再生装置を有し、前記所定の周期は、１／３０秒であり、前記画像撮像部は、１／３０秒おきに１フレームの画像を採取して前記ビデオ信号録画再生装置に記憶する請求項１記載の蛍光強度測定方法。
【請求項３】
マイクロチップのキャピラリ画像を採取してこの画像から蛍光強度を測定する蛍光強度測定方法において、
画像撮像部により撮像された前記キャピラリ画像の所定の位置に所定の大きさの領域を設定して、前記キャピラリ内を泳動する試料に励起光を照射し、前記試料が発する蛍光光の前記画像を採取して、採取された前記画像に基づいて前記領域内の蛍光光の強度の平均値を算出してこの平均値による時間−蛍光強度の特性測定をするものであって、前記領域内の蛍光光の強度あるいはその平均値が前記領域において前記試料が発する蛍光光の強度の最大値あるいはその平均値の最大値を越えた所定値以上のときに前記領域を前記キャピラリ画像上で移動させる蛍光強度測定方法。
【請求項４】
マイクロチップのキャピラリ画像を採取してこの画像から蛍光強度を測定する蛍光強度測定方法において、
画像撮像部により撮像された前記キャピラリ画像の所定の位置に所定の大きさの領域を設定して、前記キャピラリ内を泳動する試料に励起光を照射し、前記試料が発する蛍光光の前記画像を採取して、採取された前記画像に基づいて前記領域内の蛍光光の強度の平均値を算出してこの平均値による時間−蛍光強度の特性測定をするものであって、前記領域内の蛍光光の強度あるいはその平均値が前記領域におけるバックグランドノイズを排除できる値として設定された所定値か、これ以上のときに前記領域を前記キャピラリ画像上で移動させる蛍光強度測定方法。
【請求項５】
マイクロチップのキャピラリ画像を採取してこの画像から蛍光強度を測定する蛍光強度測定装置において、
画像撮像部により撮像された前記キャピラリ画像の所定の位置に所定の大きさの領域を設定する設定手段と、前記キャピラリ内を泳動する試料に励起光を照射する照射光学系と、前記試料が発する蛍光光の前記画像を採取する画像撮像部と、前記領域内の蛍光光の強度の平均値を算出する平均値算出手段とを備え、前記強度による時間−蛍光強度の特性測定をするものであって、前記設定手段による前記所定の大きさの領域は、その位置と大きさが任意に設定できるものであり、さらに、前記蛍光光を受光してその受光信号に基づいて前記試料の蛍光強度を検出する蛍光強度測定部と、所定の周期で前記撮像光学系の励起光と前記検出光学系の励起光とを交互に前記試料に照射する制御手段とを有し、前記画像撮像部の撮像光学系と前記蛍光強度測定部の前記蛍光強度の検出光学系とが前記マイクロチップを挟んで対向して配置されていて、前記画像の採取と前記蛍光強度の測定とがそれぞれの前記励起光の照射タイミングに合わせて行われる蛍光強度測定装置。
【請求項６】
前記画像撮像部は、前記蛍光強度測定部の測定範囲に対してより広い視野を有するものであり、さらに、ビデオ信号録画再生装置を有し、前記所定の周期は、１／３０秒であり、前記画像撮像部は、１／３０秒おきに１フレームの画像を採取して前記ビデオ信号録画再生装置に記憶する請求項５記載の蛍光強度測定装置。
【請求項７】
マイクロチップのキャピラリ画像を採取してこの画像から蛍光強度を測定する蛍光強度測定装置において、
画像撮像部により撮像された前記キャピラリ画像の所定の位置に所定の大きさの領域を設定する設定手段と、前記キャピラリ内を泳動する試料に励起光を照射する照射光学系と、前記試料が発する蛍光光の前記画像を採取する画像撮像部と、前記領域内の蛍光光の強度の平均値を算出する平均値算出手段とを備え、前記強度による時間−蛍光強度の特性測定をするものであって、前記領域内の蛍光光の強度あるいはその平均値が前記領域において前記試料が発する蛍光光の強度の最大値あるいはその平均値の最大値を越えた所定値以上のときに前記領域を前記キャピラリ画像上で移動させる蛍光強度測定装置。
【請求項８】
マイクロチップのキャピラリ画像を採取してこの画像から蛍光強度を測定する蛍光強度測定装置において、
画像撮像部により撮像された前記キャピラリ画像の所定の位置に所定の大きさの領域を設定する設定手段と、前記キャピラリ内を泳動する試料に励起光を照射する照射光学系と、前記試料が発する蛍光光の前記画像を採取する画像撮像部と、前記領域内の蛍光光の強度の平均値を算出する平均値算出手段とを備え、前記強度による時間−蛍光強度の特性測定をするものであって、前記領域内の蛍光光の強度あるいはその平均値が前記領域におけるバックグランドノイズを排除できる値として設定された所定値か、これ以上のときに前記領域を前記キャピラリ画像上で移動させる蛍光強度測定装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、蛍光強度測定方法および装置に関し、詳しくは、マイクロチップ泳動路（キャピラリ）上で泳動された試料（サンプル）に励起光を照射してサンプルからの蛍光を受光してその強度を測定する際に、バックグランドノイズに影響されずに、蛍光強度の時間変化特性を精度よく測定することができるような蛍光強度測定方法および装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来のマイクロチップは、板状で実質的に透明体であり、特開平１０−２４６７２１号等に記載されているように、数十μｍ〜百μｍ程度の十字の泳動路溝が透明なプラスチップ基板の内部に基板の面に沿って設けられ、溝の各端部には上部が開口したポッド（２ｍｍφ程度の穴）がリザーバとして設けられている。
このポッドの１つあるいはいくつかから電気泳動液（GEL）が溝に注入されて充填された後に、ポッドの１つにサンプルが充填される。そして、そのポッドに対して同じ溝の対向する側のポッドに＋Ｖの高電圧が印加されてサンプルを導入溝に沿って電気泳動させる（導入処理）。所定の時間経過後に泳動の途中で導入溝の十字路のクロスポイントに目的のものが泳動してきたタイミングを見計らって、ポッドの電圧印加を切り換えて泳動溝を分画溝側に切り換える。さらに、目標のポッドに向けてサンプルを所定の一定時間泳動させる（分画処理）。これにより、例えば、ＤＮＡ解析などでは泳動路で分画され分離されたサンプル（例えば目的のＤＮＡバンド部分）を光学的なレーザ光等を用いた検出装置で検出し、その鎖長解析などが行われる。あるいは、一定時間経過後に目的の位置に到達した分画されたサンプル、例えば、分画された目的のＤＮＡバンド部分に励起光を照射してその蛍光強度を測定するとともに、目的とするＤＮＡを切り出してポッドに回収する。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
ＤＮＡ塩基配列の長いものはその長さに応じて泳動速度も遅くなり、発光幅も広がって、連続塩基による波形の重なりが起こる。この場合の検出波形信号は、単独塩基による正規波形の信号とならずに、検出波形が隣接波形信号と重なって連接波形信号となってしまう。
また、泳動の際に発生する各塩基のスマイリングやピッチ変動によっても波形信号の重なりが発生して連接波形信号を発生させる原因になる。さらに、本来のＤＮＡ塩基配列と同時にデオキシ状態で反応が停止したＤＮＡ塩基が検出されるので、それが各完全結合のＤＮＡ塩基の検出信号に対してゴースト信号となって現れてくる。このような信号波形も波形の連接を発生させる原因になる。
しかも、対象となる目的のＤＮＡ自体がポッドに注入されていないのに、あるいは分画されていない状態で検査や測定が行われることも多々ある。
【０００４】
蛍光強度の測定としては、発光ダイオードからの照射光をサンプルに照射し、受光素子として、例えば、ＡＰＤ（アバランシ・ホト・ダイオード）を用いてピンポイントで蛍光強度を測定することが行われている。しかし、キャピラリの泳動路にゴミやほこりがあって、それが蛍光を発し、それがバックグランドノイズとして測定値に乗り、蛍光強度の測定精度を低下させる問題がある。また、キャピラリの側壁は、平坦度がよいと言えず、ギザギザしていて、測定位置が側壁近傍に位置すると、側壁に滞留した蛍光物質からノイズが発生して、それにより誤検出することがある。その結果、サンプル本来の蛍光強度に対応した測定データが得られない欠点がある。
しかし、現在のところ、ピンポイントの測定位置がキャピラリの適正な位置になっているか否かを確認する手段はない。
一方、蛍光顕微鏡採取した画像をＣＣＤカメラを介して電気信号に変換してコンピュータを介してその画像表示することで、広い視野の観察画像を得ることも可能である。しかし、これでは、蛍光強度の時間的な変化特性を測定することはできない。
この発明の目的は、このような従来技術の問題点を解決するものであって、バックグランドノイズに影響されずに、蛍光強度の時間変化特性を精度よく測定することができる蛍光強度測定方法および装置を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
このような目的を達成するためのこの第１の発明の蛍光強度測定方法および装置の特徴は、画像撮像部により撮像されたキャピラリ画像の所定の位置に所定の大きさの領域を設定して、キャピラリ内を泳動するサンプルに励起光を照射し、サンプルが発する蛍光光の画像を採取して、採取された画像に基づいて領域内の蛍光光の強度の平均値を算出してこの平均値による時間−蛍光強度の特性測定をするものである。しかも、前記の所定の大きさの領域は、その位置と大きさが任意に選択できるものであり、さらに、蛍光光を受光してその受光信号に基づいて試料の蛍光強度を検出する蛍光強度測定部を有し、画像撮像部の撮像光学系と蛍光強度測定部の蛍光強度の検出光学系とがマイクロチップを挟んで対向して配置され、所定の周期で撮像光学系の蛍光励起光と検出光学系の蛍光励起光とを交互に試料に照射し、画像の採取と蛍光強度の測定とがそれぞれの照射光の照射タイミングに合わせて行われるものである。
さらに、第２の発明の蛍光強度測定方法および装置の特徴は、前記の領域内の蛍光光の強度の最大値あるいはその平均値が前記の領域において試料が発する蛍光光の強度あるいはその平均値の最大値を越えた所定値以上あるいはバックグランドノイズを排除できる所定値以上のときに前記の領域をキャピラリ画像上で移動させるものである。
【０００６】
【発明の実施の形態】
このように、第１の発明にあっては、キャピラリ内を泳動するサンプルに励起光を照射してサンプルが発する蛍光光の画像を採取して、キャピラリ画像の所定の位置に所定の大きさで設定された領域内での蛍光光の平均値を算出して時間−蛍光強度の特性を測定するようにしている。このように、ある限定された領域における平均値を算出して蛍光強度を得るようにしているので、ゴミやほこりなどからの蛍光光が検出データに混在していてもほとんど影響されないで所望の測定値を得ることができる。
また、ここで設定される領域は、サンプル、例えば、目的とするＤＮＡバンドの泳動時間に合わせた大きさの領域を設定することが可能であり、かつ、ゴミやほこり、キャピラリの側壁などを避けて領域設定することができる。これによりバックグランドノイズに影響されずに、精度の高い測定値を得ることができる。さらに、第２の発明にあっては、設定された領域内にあるいはその近傍にゴミ等があるときに、さにには、測定位置が側壁近傍の不適切な位置に設定されているときなどに、設定領域をキャピラリ画像上で移動させることにより、そのような位置を回避して領域設定ができるので、蛍光強度の大きいゴミやほこりなどからの蛍光光が検出データに混在することがなくなり、所望の測定値を得ることができる。
その結果、蛍光強度の時間変化特性を精度よく測定することができる蛍光強度測定方法および装置を容易に実現できる。
【０００７】
【実施例】
図１は、この発明の蛍光強度測定方法を適用したＤＮＡ蛍光強度測定装置の一実施例のブロック図、図２は、その測定処理のタイミングチャート、図３は、その外観説明図、図４は、蛍光強度の測定波形の説明図、図５は、観測画像の説明図、図６は、観測画像における領域設定と泳動時間対蛍光特性の説明図、そして図７は、指定領域内の蛍光強度測定処理のフローチャート、図８は、この発明の蛍光強度測定方法を適用したＤＮＡ蛍光強度測定装置の他の実施例のブロック図、そして図９は、キャピラリにおける指定領域とゴミとの関係の説明図である。
図１において、１は、ＤＮＡ蛍光強度測定装置であって、図３に示すように、マイクロチップ２を挟んで、上部に観察画像撮像部３が設けられ、下部に一点蛍光強度の蛍光強度測定部４が設けられている。観察画像撮像部３により生成されたビデオ信号は、画像処理・制御装置５とＶＴＲ６とに入力され、蛍光強度測定部４により検出された信号は、画像処理・制御装置５に入力されて所定の処理（後述）が行われる。
【０００８】
観測画像撮像部３は、図１に示すように、励起光照射系３１と受光系３２、ビデオ信号処理回路３３、そしてシャッタ駆動回路３４とが内蔵されていて、励起光照射系３１は、冷陰極放電灯(例えば、水銀放電灯、メタルハライドランプなどの蛍光励起波長を有する白色光源)の光源３１１からの光をシャッター３１２、バンドパスフィルタ３１３を経て波長λ＝５１０〜５６０ｎｍの光を通過させて、これをマイクロチップ２に対して垂直な受光系の光軸Ｌ1に対して波長分離面が４５°の角度で配置されたダイクロイックミラー３１４に照射する。このダイクロイックミラー３１４により照射光は、落射方向に反射されて、マイクロチップ２の表面に対峙する形でこれの垂直上部に設けられた対物レンズ３２１を経てマイクロチップ２の表面にキャピラリを含む広い視野範囲で照射される。
この波長λ＝５１０〜５６０ｎｍの光の照射により、マイクロチップ２のキャピラリ（泳動路）上を泳動する蛍光強度測定途上のサンプルは、励起されて蛍光を発生する。その蛍光光は、受光系３２の対物レンズ３２１を経てダイクロイックミラー３１４に至り、上部へと抜けて蛍光光の波長に対応するλ＝５９０ｎｍの通過帯域を持つロングパスフィルタ３２２を通り、ＣＣＤイメージセンサ３２３により受光される。
これによる受光光は、電気信号に変換され、その検出信号は、ＣＣＤイメージセンサ３２３からビデオ信号処理回路３３のビデオ信号生成回路３２４に入力される。ここで検出信号は、ビデオ信号として生成され、ビデオ信号処理回路３３に内蔵されたＡ／Ｄ変換器（Ａ／Ｄ）３２５によりＡ／Ｄ変換されてデジタル値として画像処理・制御装置５の画像メモリ（フレームメモリ）５１に転送される。
なお、Ａ／Ｄ３２５は、コントローラ３２６からの制御によりＡ／Ｄ変換処理をする。
ところで、励起光は、ショートパスフィルタあるいはバンドパスフィルタを通して試料に照射されるので、ここでのショートパスフィルタはバンドパスフィルタが用いられてもよい。また、試料からの蛍光は、ロングパスフィルタあるいはバンドパスフィルタを通して受光されるので、ここでのロングパスフィルタはバンドパスフィルタが用いられてもよい。これらのことは、後述する蛍光強度測定部４においても同様である。
【０００９】
ビデオ信号生成回路３２４は、ビデオ信号処理回路３３のコントローラ３２６の制御下でＡ／Ｄ変換前のビデオ信号をＶＴＲ６に転送して観測画像としてＶＴＲ６に記録する。ビデオ信号生成回路３２４は、ビデオ信号生成回路３２４でビデオ信号を生成する際に偶数番目のフレームコマ落とし制御をするコントローラ３２６を有していて、奇数番目のフレームのビデオ信号のみ、ＶＴＲ６と画像メモリ５１に送出する。このとき、奇数番目のフレームのビデオ信号を次の偶数番目のフレームに差し込んで送出する。また、このとき同時にコマ落としタイミング信号ＦＳを画像処理・制御装置５に送出する。さらに、ビデオ信号生成回路３２４は、このコマ落としタイミング信号ＦＳをシャッタ駆動回路３４にも送出する。シャッタ駆動回路３４は、この信号ＦＳを受けて奇数番目のフレームの期間（タイミング信号ＦＳがＨＩＧＨレベル（以下“Ｈ”），図２（ａ）参照）の間にシャッター３１２をＯＮにして開き、偶数番目のフレームの期間の間（タイミング信号ＦＳがＬＯＷレベル（以下““Ｌ”））、シャッター３１２をＯＦＦにして閉じる。なお、タイミング信号ＦＳは、垂直同期信号Ｖsync信号をフリップフロップ等を介して１／２分周することで得ることができる。
コントローラ３２６は、画像処理・制御装置５からの制御信号ＳＲを受けたときには、これに応じてＶＴＲ６から記録されたビデオ信号を読出してＡ／Ｄ変換器３２５によりＡ／Ｄ変換してそれを画像メモリ５１に順次転送して記録する処理を行う。なお、画像処理・制御装置５からの制御信号は、前記の制御信号ＳＲのほか、ＶＴＲ６に対する録画、再生、巻き戻し、早送りなど、通常のＶＴＲ６の操作のための制御信号が送出される。コントローラ３２６は、これら制御信号を画像処理・制御装置５から受けて、これらに応じてＶＴＲ６に対して指定された操作する。
【００１０】
蛍光強度測定部４は、図１に示すように、励起光照射系４１と受光系４２とが内蔵されていて、励起光照射系４１は、青色ＬＥＤの光源４１１からの光をバンドパスフィルタ４１２を経て波長λ＝５１０〜５６０ｎｍの光を通過させて、これをマイクロチップ２に対して垂直な受光系の光軸Ｌ2に対して波長分離面が４５°の角度で配置されたダイクロイックミラー４１３に照射する。ダイクロイックミラー４１３により照射光は、ここで垂直上方に反射されて、マイクロチップ２の裏面に対峙する形でこれの垂直上部に設けられた対物レンズ４２１を経てマイクロチップ２の裏面から測定位置にピンポイントで照射される。
マイクロチップ２の測定位置の泳動路にこの波長λ＝５１０〜５６０ｎｍの光がピンポイント照射されると、マイクロチップ２の泳動路を泳動する測定対象のサンプルは、蛍光を発し、その蛍光光は、受光系４２の対物レンズ４２１を経てダイクロイックミラー４１３に至り、蛍光光の波長に対応するλ＝５９０ｎｍを下方に通過させ、ロングパスフィルタ４２２を通って、ＡＰＤ（アバランシー・ホト・ダイオード）センサ４２３により受光される。
これによる受光光の検出信号は、ＡＰＤセンサ４２３からバッファアンプ４２４に入力されてここで増幅され、Ａ／Ｄ変換回路（Ａ／Ｄ）４２５に入力されてＡ／Ｄ変換回路４２５によりＡ／Ｄ変換されてデジタル値として画像処理・制御装置５に転送される。なお、Ａ／Ｄ４２５の制御信号は、図示していないが、画像処理・制御装置５から変換制御のタイミング信号を受けてもよい。
【００１１】
画像処理・制御装置５は、マイクロプロセッサ（ＭＰＵ）５０と、画像メモリ５１、波形メモリ５２、メモリ５３、ＣＲＴディスプレイ（ＣＲＴ）５４、キーボード５５、マウス５５ａ、プリンタ（図示せず）、そしてインタフェース５６等からなり、バス５７を介してこれら回路がＭＰＵ５０と相互に接続されている。
ＡＰＤセンサ４２３で受光した蛍光強度を示す信号は、インタフェース５６を介して受けて時間対蛍光強度の波形データ（図４参照）として波形データメモリ５２に記憶され、ＣＲＴディスプレイ５４あるいはプリンタに出力される。さらに、バス５７を介して接続されたＨＤＤ（ハードディスク装置）等の記憶装置５８には測定した画像データ（画像メモリ５１に記憶されたもの）がファイルとして記憶され、また、測定に必要な各種データファイル、プログラムなどがこれに格納されている。
【００１２】
ＭＰＵ５０は、バス５７を介してコマ落としタイミング信号ＦＳの立下がり信号（図２（ａ）参照、タイミング信号ＦＳが“Ｈ”から“Ｌ”の時点）を割込み信号として受けて、このタイミング信号ＦＳに同期してインタフェース５６を介して青色ＬＥＤの光源４１１を駆動する。そのための駆動信号ＤＳを光源４１１に送出する（図２（ｃ）参照）。これにより、この信号ＤＳを受けて奇数番目のフレームの期間の間光源４１１がＯＦＦし、偶数番目のフレームの期間の間、光源４１１がＯＮになって、サンプルを励起して蛍光を発生させる。発生した蛍光は、透明なマイクロチップ２から外部へと放射される。
その結果、図２に示すように、シャッター３１２が閉じているとき、言い換えれば、マイクロチップ２に光源３１１からの光が照射されていないときに光源４１１からの光がマイクロチップ２（そのキャピラリ部分）に照射されて、これによりサンプルの蛍光強度を測定することができる。逆に、シャッター３１２が開いているときには、言い換えれば、マイクロチップ２に光源４１１からの光が照射されていないときには光源３１１からの光がマイクロチップ２に照射されて、蛍光による映像を観測画像として採取することができる。
なお、シャッター３１２は、インタフェース５６、シャッタ駆動回路３４を介してＭＰＵ５０により開閉制御される。
【００１３】
ＡＰＤセンサ４２３により検出された蛍光強度は、バッファアンプ４２３，Ａ／Ｄ変換回路４２４を経てデジタル値としてインタフェース５６に入力される。そして、コマ落としタイミング信号ＦＳに同期して、ＭＰＵ５０は、インタフェース５６，バス５８を介してこのデジタル値を受けて、これをＭＰＵ５０が波形メモリ５２に順次測定データとして記憶する。
その結果、波形メモリ５２には、タイミング信号ＦＳをサンプルタイミングとして時間対蛍光強度のデータがデジタル値でそれぞれの測定時点（１／３０秒間隔）においてそれぞれ検出された蛍光強度が順次記憶されていき、結果として、例えば、図４に示すような波形信号が記憶される。なお、横軸は時間（秒）であり、縦軸は蛍光強度である。また、コマ落としタイミング信号ＦＳは、ビデオ信号の各フレームに対応して発生するので、インターレースをしない場合には、その周期は１／３０秒となる。そこで、図２に示すようなタイミングで、観測画像データと測定データ（蛍光強度の時間的な変化）とが採取されることになる。
一方、画像メモリ５１には、図５に示すような蛍光による画像が記憶される。
【００１４】
さて、メモリ５３には、観測画像表示処理プログラム５３ａ、領域設定・データ抽出プログラム５３ｂと、蛍光強度特性表示プログラム５３ｃ、作業領域５３ｄ、パラメータ領域５３ｅ、そして各種の処理プログラム（図示せず）が格納されている。
観測画像表示処理プログラム５３ａは、ＭＰＵ５０により実行されて、ＭＰＵ５０は、ＶＴＲ６から記録されたビデオ信号を読出す制御信号ＳＲを発生して画像メモリ５１に各フレームの画像データを順次受けてそれを表示データに展開して観測画像としてＣＲＴ５４に表示する処理をする（図５参照）。
領域設定・データ抽出プログラム５３ｂは、領域設定の機能キー入力に応じてＭＰＵ５０により実行されて、ＭＰＵ５０は、シャッター３１２を開き、バンドパスフィルタ３１３と、ロングパスフィルタ３２２を光路から外して（これらフィルタの移動機構は図示せず）、マイクロチップ２の視野範囲の画像を画像メモリ５１に採取し、それを画像メモリ５１から読出して、表示データに展開し、ＣＲＴ５４の画面上に表示する。このとき白色光がマイクロチップ２に照射されて、図６（ａ）に示すようなキャピラリ画像が表示され、これに加えて矩形の設定領域６０を測定画面上に重ね表示する。そして、重ね表示された設定領域６０の大きさをマウス操作に応じて変更する制御をする。このとき、マウス５５ａの操作で決定された矩形枠の大きさのデータをパラメータ領域５３ｄに領域設定データとして記憶する。なお、このときには蛍光強度測定部４は動作していない。
また、領域設定・データ抽出プログラム５３ｂは、所定測定開始機能キーに応じてメインプログラムからコールされて、パラメータ領域５３ｄに記憶されている、観測画像データにおいて図６（ａ）に示す領域６０の範囲を示す領域設定データを読出してこれに従って、タイミング信号ＦＳの立下がり信号（１／３０秒）に同期して動作して１／３０秒ごとに画像メモリ５１に記憶された観測画像データ（ビデオ信号処理回路３３から得られるビデオ信号のＡ／Ｄ変換データからなる画像データ）から指定された領域６０内のデータのみを抽出する。そして、その領域６０内のデータ値の平均値（蛍光強度の平均値）を明るさの平均値として算出して作業領域５３ｃに時間経過（１／３０秒ごと）に対応して順次記憶していく。さらに、作業領域５３ｃに記憶された新規の平均値を時間経過対応の測定データとしてＨＤＤ５８に転送して特定データの所定の領域に順次記憶する。そして、蛍光強度特性表示プログラム５３ｃをコールする。
【００１５】
蛍光強度特性表示プログラム５３ｃは、ＭＰＵ５０により実行されて、所定の機能キー入力により、波形データメモリ５５のデータを読出して表示データを生成して、ＣＲＴ５４の画面上に表示する。これにより図４に示すような波形信号を表示する。
また、領域設定・データ抽出プログラム５３ｂの実行後にコールされて、このプログラムがＭＰＵ５０に実行されたときには、ＭＰＵ５０は、ＨＤＤ５８から前記の記憶された測定データを所定の領域から読出して、リアルタイムで平均値のデータを追加したグラフとして縦軸と横軸を加えた形でＣＲＴ５４に表示する。その結果、図６（ｂ）に示すような蛍光強度の時間に対する明るさのグラフがＣＲＴ５４の画面上に表示される。
なお、こでの領域設定・データ抽出プログラム５３ｂは、キャピラリ上の複数箇所に設定領域６０を設定することが可能である。また、リアルタイムで時間対蛍光強度の特性表示が可能である。この領域設定・データ抽出プログラム５３ｂのＭＰＵ５０の処理を除いて、全体的なプログラム処理については、所定の機能キーの押下に応じて前記した各プログラムがメインプログラムからコールされて順次実行されていくだけでの単純な流れとなるので、その説明は割愛する。
【００１６】
図７は、ＭＰＵ５０による領域設定・データ抽出プログラム５３ｂの実行による指定領域内の蛍光強度測定処理のフローチャートである。以下、これについて具体的に説明する。
所定の領域設定の機能キーの入力により、まず、領域設定・データ抽出プログラム５３ｂがＭＰＵ５０に実行されて、シャッター３１２を開き、バンドパスフィルタ３１３と、ロングパスフィルタ３２２を光路から外す（ステップ１０１）。これにより光源３１１からの光がマイクロチップ２に照射される。そして、マイクロチップ２の視野範囲の画像を画像メモリから読込み、画面上に表示する（ステップ１０２）。次に、マウスの操作に応じて設定領域６０の位置と大きさの設定待ちに入り（ステップ１０３、１０４）、設定が終了すると、ステップ１０４でＹＥＳとなり、設定領域６０の位置と面積（大きさ）のデータが読込まれ、パラメータ領域５３ｅに記憶される（ステップ１０５）。次に、次の領域設定あるか否かの判定をして（ステップ１０６）。視野範囲で別の箇所に領域を設定する場合（設定領域６０を２個以上する場合）には、ここでＹＥＳとなり、ステップ１０３へと戻る。そして、ステップ１０５でパラメータ領域５３ｅにさらに別に設定領域の位置と面積とが記憶される。
【００１７】
ステップ１０６の判定でＮＯとなると、所定の測定開始キー入力待ちに入り（ステップ１０７）、測定開始キーが押下された時点で、シャッター３１２を閉じて、バンドパスフィルタ３１３と、ロングパスフィルタ３２２を光路に挿入する（ステップ１０８）。次に、実際の測定に入り、シャッター３１２をタイミング信号ＦＳに応じて１／３０秒おきに開閉制御して、タイミング信号ＦＳの立下がり信号の入力待ちに入り（ステップ１０９）、タイミング信号ＦＳの立下がり信号を受けた時点で画像メモリ５１から設定領域６０のデータを抽出する（ステップ１１０）。そして、抽出したデータ値の平均値を算出して（ステップ１１１）、その平均値を作業領域５３ｃに記憶する（ステップ１１２）。作業領域５３ｃに記憶された新規の平均値データは、時間経過対応の測定データ（特性データ）としてＨＤＤ５８の所定の領域に転送されて追加記憶される（ステップ１１３）。ここで、蛍光強度特性表示プログラム５３ｃをコールして、ＨＤＤ５８の所定の領域に記憶された測定データを読出して図６（ｂ）に示す波形をＣＲＴ５４上の画面上に表示する（ステップ１１４）。そして、次に所定の終了キーの入力の有無により、処理終了かの判定をして（ステップ１１５）、ここでＮＯのときにはステップ１０９へと戻り、次の平均値を算出して作業領域５３ｃに記憶する。そして、ステップ１１４においては、図６（ｂ）のグラフに新しく測定したデータが加えられ、そのグラフが画面上に表示されていく。
ここで、測定としてある時間が経過して所定量の平均値が測定データとしてグラフ表示された時点で、ステップ１１５において、測定終了判定がなされ、ステップ１１５の判定でＹＥＳとなると、ここでの処理が終了する。
【００１８】
このような処理によりリアルタイムで順次図６（ｂ）に示す波形がＣＲＴ５４上の画面上に表示されていく。
また、前記のステップ１０６では、次の領域を設定するようにしているので、複数の領域を設定したときには、それぞれの領域に対応して画像メモリ５１に記憶された観測画像からデータを抽出してそれぞれに平均値を算出することができる。このときには、それぞれ別の測定データとしてＨＤＤ５８の各領域にそれぞれ記憶するようにし、それぞれ別の特性グラフとして順次表示する。このことで、効率よく、キャピラリの泳動路の複数の箇所から蛍光特性を採取でき、かつ、比較判定できる。
さらに、設定領域６０の大きさが自由に選択できることにより、ゴミ，ほこりなどから発する蛍光のバックグランドノイズを排除することができる。また、ＤＮＡ等のサンプルの泳動速度に合わせた大きさを設定領域６０として選択することが可能になる。さらに、この設定領域６０は、その位置が選択できるので、測定位置を適正な位置に設定できる。これによりキャピラリの側壁に発生する蛍光ノイズを排除して精度の高い測定ができる。
実施例では、タイミング信号ＦＳに応じてピンポイント蛍光強度の測定と観察画像による設定領域における蛍光強度の平均値の測定とを交互に行っているが、このような切換えを行うと、測定タイミングが一定の周期となるので、蛍光強度の測定が連続的にできない問題がある。そこで、蛍光強度の平均値を算出する場合に、設定領域の大きさによっては１個分に対応した検出ができなくなることがある。このような場合においては、特に、泳動速度が速いときには、進行方向に長い設定領域を設定するとよい。逆に、狭い間隔で連続して流れて来るサンプルに対しては、進行方向に短い設定領域として、必要に応じてキャピラリの横断方向に長く領域を設定するとよい。
【００１９】
さて、一般的にゴミ等は、強い蛍光および反射光を発生する。そのため設定領域６０として指定された領域あるいはその近傍にゴミ等がある場合には、的確な蛍光強度が測定できない。図８は、このような問題に対処する実施例である。図８の実施例では、オペレータが指定した設定領域６０あるいはこれの近傍にゴミ等がある場合に設定領域６０を移動させる処理を行う。
図８の画像処理・制御装置５のメモリ５３にはゴミ等の検出・指定領域移動プログラム５３ｆが設けられている。画像処理・制御装置５の内部は、図１の実施例ほど詳細に説明していないが、前記のゴミ等の検出・指定領域移動プログラム５３ｆとパラメータ領域５３ｅに記憶するデータを除いては、図１の構成と同一であるので、同一の符号で示してある。その他の構成要素も図１に示す構成要素と同一のものは同一の符号で示してある。それらの説明はここでは割愛する。
図９は、ゴミと設定領域６０との関係を示すものである。図９において、点線枠で示す７は、マイクロチップ２のキャピラリ２ａ上に設定されたイメージセンサ３２３の視野であり、８は、キャピラリ２ａ上に付着したゴミである。指定された設定領域６０は、図示するように、ゴミ８がある場所か、その近傍に位置している。この状態をゴミ等の検出・指定領域移動プログラム５３ｆの処理により検出して、設定領域６０（指定領域）を視野７内のキャピラリ２ａ上において、一定距離Ｄだけ別の場所に移動させて、例えば、点線で示す位置に設定領域６０を設定して、この領域のデータを撮像した画像データから抽出して蛍光強度を検出する。
【００２０】
ゴミ等の検出・指定領域移動プログラム５３ｆは、図７に示す蛍光強度測定処理のフローチャートにおいて、ステップ１０６の、領域設定あるか否かの判定でＮＯとなったときに、ＭＰＵ５０によりコールされてＭＰＵ５０により実行される。そして、点線で示すように、この処理の終了後にステップ１０７の所定の測定開始キー入力待ちに入ることはせずに、ステップ１０８の処理に移る。これにより画像データを採取してこのデータから設定領域６０において視野に試料が入っていない状態で蛍光強度を測定するモードに入る。
すなわち、ＭＰＵ５０は、このプログラム５３ｆを実行して、図７のステップ１０８からステップ１０９へと入り、ステップ１１１の処理に至り、点線で示すステップ１１１ａの処理へと移る。ここで、ステップ１１１で算出された設定領域６０における平均値が所定値Ｋ以上か否かの判定をする。この判定の結果、平均値が所定値Ｋ未満であるときには、点線で示すステップ１０７の測定キーの入力待ち処理に入り、本来の測定モードとなる。
ここで、所定値Ｋは、試料が発する蛍光光の強度の平均値の最大値を越える値であり、ゴミ等からの受光と区分けできる値である。ここで検出される設定領域６０内での蛍光光の強度は、平均値に限定されるものではなく、ピーク値あるいは合計値等であってもよい。この場合には、ステップ１１１で平均値を算出するのではなく、ピーク値あるいは合計値を算出することになる。また、ステップ１１１ａの判定処理のときには、試料はキャピラリ上（あるいは設定領域６０）を流れていないので、ゴミ等からの受光強度が測定できる。
ステップ１１１ａの判定で平均値が所定値Ｋ以上であるときには、設定領域６０を所定の距離Ｄだけキャピラリ２ａ上において上流側あるいは下流側に移動した後に、図７のステップ１０９からステップ１１１の処理を再び行う。そして、設定領域６０における平均値が所定値Ｋ以上か否かの判定をする（ステップ１１１ａ）。この判定においても前記の判定で平均値が所定値Ｋ以上であるときには、さらに所定の距離Ｄだけキャピラリ２ａ上において、例えば、流れを横断する方向へ移動した後に、同じ処理する。このようにして、平均値が所定値Ｋ未満になる位置を探し出して、設定領域６０を指定された位置の近傍の位置に再設定する。
なお、前記距離Ｄの値と前記所定値Ｋの値は、キーボード５５から入力されてパラメータ領域５３ｅにあらかじめ記憶されているものである。
【００２１】
さて、図８では、ロングパスフィルタ３２２とＣＣＤイメージセンサ３２３との間にイメージインテンシファイア（ＩＩＦ，これは映像増倍管，マイクロチャネルプレート型映像増倍装置など）３２４が設けられている。このイメージインテンシファイア３２４の増倍率をコントローラ３２６からの制御信号Ｓiで制御することで、撮像できる画像のダイナミックレンジを拡大することができる。
ところで、３μｍ〜１０μｍ角程度のピンポイント測定点を持つＡＰＤセンサ４２３を備える蛍光強度測定部４は、例えば、１．２ｍｍ×１．０ｍｍ程度の所定の視野を持つＣＣＤイメージセンサ３２３等のいわゆるＣＣＤカメラよりも撮像対象の明暗に対する検出ダイナミックレンジが広い。そこで、この蛍光強度測定部４の広いダイナミックレンジの蛍光強度検出を利用して観察画像撮像部３が撮像できる画像の明暗の範囲を広げる撮像感度制御をイメージインテンシファイア３２４の制御で行う。そのために、画像処理・制御装置５は、１／３０秒ごとに蛍光強度測定部４により検出され、波形メモリ５２に記憶された蛍光強度に応じてコントローラ３２６を制御して制御信号Ｓiを発生させる。この制御信号Ｓiの値に応じてイメージインテンシファイア３２４は、蛍光強度に応じて適正な映像を撮影できる増幅率に設定される。
なお、前記の撮像感度制御の制御は、ＣＣＤイメージセンサ３２３において行ってもよい。
【００２２】
先に説明したように、図８の実施例においては、ステップ１１１ａにおいて比較基準とされる所定値Ｋは、試料が発する蛍光光の強度の平均値の最大値を越える値であり、ゴミ等からの受光と区分けできる値である。
ここで、試料をＤＮＡとした場合に、ほとんどの物質は、蛍光を発し、ＤＮＡより明るい光が検出されるが、中にはＤＮＡより暗い異物もある。このような場合には、所定値Ｋを前記した値より小さくする必要がある。
ところで、所定値と比較対象とされる平均値の測定は、前記したように、設定領域６０において視野に試料が入っていない状態で行われる。言い換えれば、これは、試料、例えば、ＤＮＡがキャピラリの視野に流れてくる前に行われる。この状態で異物がないときには、泳動液や外乱ノイズなどにより発生するそのときのバックグランドノイズによる蛍光強度が検出される。そこで、ＤＮＡより暗い異物に対処するためには、前記の所定値Ｋは、そのときのバックグランドノイズによる蛍光強度とＤＮＡより暗い異物の蛍光強度との間の値に設定するとよい。
すなわち、このような所定値Ｋの設定は、測定される試料よりも暗い蛍光を発生し、測定に影響を与える異物の蛍光強度を別途測定して、それをメモリに記憶しておくか、入力する。そして、蛍光強度の測定に当たってキャピラリの視野におけるバックグランドノイズによる蛍光強度の平均値を測定する。このノイズの平均値と、入力されたあるいはメモリ記憶してある前記の異物の蛍光強度との間の値を前記所定値Ｋとして算出してメモリに記憶し、ステップ１１１ａの比較基準とするものである。
なお、試料よりも暗い蛍光を発生し、測定に影響を与える異物の蛍光強度がバックグランドノイズよりも比較的大きいときには、別途測定することは不要であり、単にバックグランドノイズによる蛍光強度の平均値あるいはその最大値よりも少し多きな値を所定値Ｋ、言い換えれば、バックグランドノイズを排除できるような値を設定するだけであってもよい。
【００２３】
以上説明してきたが、実施例においては、観測画像は、蛍光光をロングパスフィルタ３２２を通して観測しているが、ロングパスフィルタ３２２を削除して直接蛍光光をＣＣＤにより受光して蛍光光の観測画像を採取してもよい。
また、領域設定・データ抽出プログラム５３ｂをＭＰＵ５０が実行したときには、シャッター３１２を開き、バンドパスフィルタ３１３と、ロングパスフィルタ３２２を光路から外すことができ、このときには、マイクロチップ２の視野範囲の画像を白色光を照射した形で画像メモリ５１に採取することができる。
これによりキャピラリ内にゲルが正常に入っているかどうか、キャピラリ内にあわが入っていないかどうかなどの観察映像を蛍光強度測定系の励起光に影響されることなく、判定することができる。さらに、一点蛍光測定系の位置が適正な位置にあるか否かの判定も可能である。このような観測をする場合には白色照射が非常に有効になるが、白色照射ではなく、励起光を照射して領域設定等をすることができることはもちろんである。
また、実施例では、ＣＣＤ３２３にシャッタがある場合に言及していないが、ＣＣＤ３２３にシャッタがある場合には、このシャッタをタイミング信号ＦＳに同期させて、シャッタ３１２の開閉動作とは逆になるように開閉動作をさせるとよい。さらに、蛍光映像をＣＣＤイメージセンサ３２３（撮像するカメラ）は、ＣＣＤのイメージセンサに限定されるものではなく、ＭＯＳ型ＢＢＤ等のイメージセンサ等を用いることができることはもちろんである。
またさらに、実施例では、領域設定６０の選択設定の後に蛍光強度測定に入り、設定領域の蛍光強度の平均値を得て、時間−蛍光強度特性を画面上に表示しているが、領域設定６０の設定と蛍光強度の測定とは、切り離して、それぞれ独立に行ってもよいことはもちろんである。なお、ここでの平均値には、設定領域の合計値として算出されたものも含むものである。設定領域の平均値と合計値は、算出して得た結果を割り算して算出するか、否かの相違でしかないからである。
【００２４】
実施例では、波形メモリ、画像メモリをプログラムを格納したメモリと独立に設けているが、波形メモリ、画像メモリをプログラムを格納したメモリに領域として確保し、これらメモリを一体的に形成してもよい。
実施例において、観測画像の採取と蛍光強度の測定を切換える周期は、ビデオ信号の各フレームに対応して発生するようにしているが、インターレースをする場合には、１フィールドが１／６０秒となるので、採取画像がインターレースとなように、奇数番目のフィールドと次の偶数番目のフィールドとの連続する２フィールドを１／３０秒で採取し、次の奇数番目のフィールドと次の偶数番目のフィールドとの連続する２フィールドをコマ落としするようにすればよい。採取画像や一点蛍光測定の期間は、１／３０秒のうちのある一定期間で行われてもよいことはもちろんである。
また、１フレームの画像をより高速に採取する場合には、切換える周期は、１／３０秒に限定されないことはもちろんである。さらに、実施例でのコマ落としは、１フレームおきにしているが、泳動速度が遅いサンプルの場合には、コマ落としフレームを数フレームとして観測画像を数フレームおきに採取してもよい。逆に、泳動速度が速いサンプルの場合には、コマ落としフレームを数フレームに１回として観測画像のフレームを増加させてもよい。
さらに、ＶＴＲ６は、ＨＤＤを内蔵するデジタルの録画再生装置であってもよく、ビデオテープに記憶するものに限定されない。
また、実施例では、設定領域６０を矩形として説明しているが、これは、矩形に限定されるものではなく、例えば、キャピラリの泳動路が湾曲している場合などにはそれに併せて湾曲させてもよい。
【００２５】
【発明の効果】
以上の説明のとおり、この発明にあっては、キャピラリ内を泳動するサンプルに励起光を照射してサンプルが発する蛍光光の画像を採取して、キャピラリ画像の所定の位置に所定の大きさで設定された領域内での蛍光光の平均値を算出して時間−蛍光強度の特性を測定するようにしている。このように、ある限定された領域における平均値を算出して蛍光強度を得るようにしているので、ゴミやほこりなどからの蛍光光が検出データに混在していてもほとんど影響されないで所望の測定値を得ることができる。
その結果、蛍光強度の時間変化特性を精度よく測定することができる蛍光強度測定方法および装置を容易に実現できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、この発明の蛍光強度測定方法を適用したＤＮＡ蛍光強度測定装置の一実施例のブロック図である。
【図２】図２は、その処理のタイミングチャートである。
【図３】図３は、その外観説明図である。
【図４】図４は、蛍光強度の測定波形の説明図である。
【図５】図５は、観測画像の説明図である。
【図６】図６（ａ）は、観測画像における領域設定の説明図、図６（ｂ）は、泳動時間対蛍光特性の説明図である。
【図７】図７は、指定領域内の蛍光強度測定処理のフローチャートである。
【図８】図８は、この発明の蛍光強度測定方法を適用したＤＮＡ蛍光強度測定装置の他の実施例のブロック図である。
【図９】図９は、キャピラリにおける指定領域とゴミとの関係の説明図である。
【符号の説明】
１…ＤＮＡ蛍光強度測定装置、
２…マイクロチップ、
３…観察画像撮像部、４…一点蛍光強度測定部、
５…画像処理・制御装置、６…ＶＴＲ、
３１，４１…励起光照射系、３２，４２…受光系、
３３…ビデオ信号処理回路、
３４…シャッタ駆動回路、
５０…マイクロプロセッサ（ＭＰＵ）、
５１…画像メモリ（フレームメモリ）、
５２…波形メモリ、５３…メモリ、５４…ＣＲＴディスプレイ（ＣＲＴ）、
５５…キーボード、５６…インタフェース、５７…バス、
５８…外部記憶装置、
５３ａ…観測画像表示処理プログラム、
５３ｂ…領域設定・データ抽出プログラム、
５３ｃ…蛍光強度特性表示プログラム、
５３ｄ…作業領域、５３ｅ…パラメータ領域、
５３ｆ…ゴミ等の検出・指定領域移動プログラム５３ｆ、
３１２…シャッター、３１３，４１２…ショートパスフィルタ、
３１４，４１３…ダイクロイックミラー、３２１，４２１…対物レンズ、
３２２，４２２…ロングパスフィルタ、３２３…ＣＣＤイメージセンサ、
３２４…ビデオ信号生成回路、３２５…Ａ／Ｄ変換器、
３２６…制御回路、４１１…青色ＬＥＤの光源、
４２３…ＡＰＤセンサ、４２４…バッファアンプ、
４２５…Ａ／Ｄ変換回路（Ａ／Ｄ）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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