(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂質含有量、成長速度及び食物消費の代謝形質を示す遺伝子型を有するブタを特定する方法において、
ａ）ブタより核酸サンプルを獲得し、そして
ｂ）前記サンプルのMC4R遺伝子中のヌクレオチド位置678における多型を特定し、ここで、該多型が、脂質含有量、成長速度及び食物消費から成る群から選択された１又は複数の代謝形質に関連するものである；
ことを含んで成る方法。
【請求項２】
前記ヌクレオチド位置678の多型が脂質含有量と関連している請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ヌクレオチド位置678のグアニンが低い食物摂取と関連している請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ヌクレオチド位置678のアデニンが体重増加のより早い速度に関連している請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記多型を同定する段階が対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドを用いる方法である請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記多型を同定する段階が、制限断片長多型（RFLP）分析、ヘテロデュープレックス分析、単鎖コンホーメーション多型（SSCP）分析、変性勾配ゲル電気泳動（DGGE）、温度勾配ゲル電気泳動（TGGE）、及び連関遺伝的マーカーの使用から成る群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記多型を同定する段階がRFLP分析を含む請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記MC4R遺伝子配列を増幅する段階を更に含む請求項１に記載の方法。
【請求項９】
増幅された領域を制限エンドヌクレアーゼTaqIにて消化する段階を更に含む請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
増幅に使用されるプライマーが、配列番号６，配列番号７，配列番号８、配列番号９、配列番号10及び配列番号11から成る群から選択される、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１１】
ブタMC4R遺伝子のPCR産物のヌクレオチド位置678のヌクレオチドを検出するのに有用な単鎖型オリゴヌクレオチドプライマーであって、当該オリゴヌクレオチドプライマーは、配列番号：６〜10から成る群から選択されたヌクレオチド配列を含んで成り且つブタNC4R遺伝子の配列に沿って連続する30個以下のヌクレオチドから成る、ブタMC4R遺伝子のヌクレオチド位置678を含む領域を増幅するものであるオリゴヌクレオチドプライマー。
【請求項１２】
脂質含有量、成長速度及び食物摂取の代謝形質のいずれかを表す遺伝子型を有するブタの同定方法において、
ａ）ブタからゲノムDNAのサンプルを獲得し；
ｂ）前記サンプルをTaqIにて消化して断片を得；
ｃ）得られた断片を消化物から分離し；そして
ｄ）ブタMC4R遺伝子のPCR生成物のヌクレオチド位置678の塩基におけるTaqI部位の有無を同定する；
ことを含んで成る方法。
【請求項１３】
育種のために前記の遺伝子型を有するブタを選別する段階を更に含む請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
同一認識部位を切断する制限酵素としてTaqIを使用する時、塩基678にグアニンが存在する場合には466、225及び76bpの断片により同定可能であり、アデニンが存在する場合には542及び225bpの断片にて同定可能である請求項12に記載の方法。
【請求項１５】
前記同定の段階が、増幅によりTaqI部位を検出することを含む請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
配列番号６〜10から成る群から選択された配列を含んで成り且つブタMC4R遺伝子に沿って連続する30個以下のヌクレオチドから成り、ヌクレオチド位置678のヌクレオチドを含むブタMCR4遺伝子の領域を増幅する、MC4R遺伝子内の多型性TaqI部位の存在をアッセイする為のプライマー。
【請求項１７】
より低い脂質含有量、より早い成長速度及びより低い食物消費のいずれかの形質に関しブタを選別する方法において、
ａ）ブタより核酸サンプルを獲得し；
ｂ）ブタMC4R遺伝子のPCR産物に於けるヌクレオチド位置678より特徴付けられる多型を同定し；そして
ｃ）ブタを選別する；
ことを含んで成る方法において、前記多型が、低い脂質含有量、高い成長速度及び低い食物消費から成る群から選択された１又は複数に関連する、前記の方法。
【請求項１８】
脂質含有量、成長速度及び食物消費の代謝形質のいずれかの遺伝子型を有するブタを同定する方法において
ａ）注目の系統又は品種からのブタのサンプル得ることにより、MC4R遺伝子中のヌクレオチド位置678におけるMC4R遺伝子型と、脂質含有量、成長速度及び食物消費から成る群から選択された１又は複数の代謝形質との関連を決定し；
ｂ）各ブタからサンプル中にゲノムDNAを調製し；
ｃ）MC4R遺伝子中のヌクレオチド位置678におけるMC4R遺伝子の遺伝子型を決定し；そして
ｄ）MC4R遺伝子中のヌクレオチド位置678におけるMC4R遺伝子の遺伝子型と前記形質との関連性を計算する；
ことを含んで成る方法。
【請求項１９】
脂質含有量、成長速度及び食物消費の代謝形質のいずれかのMC4R遺伝子型を有するブタを選別する方法において、
ａ）ブタから核酸サンプルを獲得し；
ｂ）ブタのヌクレオチド位置678のMC4R遺伝子の遺伝子型を同定し；そして
ｃ）脂質含有量、成長速度及び食物消費から成る群から選択された１又は複数の代謝形質と関連する遺伝子型を有するブタを選別する；
ことを含んで成る方法。
【請求項２０】
脂質含有量、成長速度及び食物消費の代謝形質のいずれかの遺伝子型を有するブタの同定方法において、
ａ）ブタから核酸サンプルを獲得し；そして
ｂ）MC4Rタンパク質のアミノ酸位置298 におけるAsp(GAU)マドンが、Asn(AAU)コドンへの変化を有する多形の存在についてアッセイし、ここで該多型は、脂質含有量、成長速度及び食物消費から成る群から選択された１又は複数の代謝形質と関連するものである；
ことを含んで成る方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は脂質含有量、成長速度及び食物消費量の特性の１つ又はそれ以上の指標である、少なくとも１種類の遺伝的マーカーの存在をアッセイすることにより、遺伝的に動物を評価する方法に関する。具体的には、本法は上記特性の指標であるメラノコルチン−４レセプター（MC4R）遺伝子内にある多様性を分析する。さらに具体的には、本法はMC4R遺伝子内の多形を分析する。
【０００２】
発明の背景
低脂肪含有の肉製品に対する消費者の需要が増しつつある。動物性脂肪、特に飽和脂肪酸の割合の高い脂肪の多量消費が心臓血管病に関するリスクを含む重大な健康危機を表す証拠が科学文献中に集まりつつあることから、更にこの需要は助長されている。その他高脂肪肉に関係した健康上の問題としては、その高いコレステロール含有量、及び塩が肉から未変性水結合性結合成分であるミオシンの抽出を助けることから、結合特性の改良の為に加えられる塩分量が比較的高いことがある。更に、リン酸、乳化添加物、及び酸化防止剤の様な化学添加物を含む肉製品を受け入れない消費者の数が増えている。
【０００３】
より健康的な肉製品を求める消費者に接し、肉生産者はより安価かつ健康的な製品を供給し続ける様圧力を受けている。
もちろんより安価な製品は生産コストの軽減により生ずる。生産者は常にかれら家畜の成長と食物摂取を改善することに興味を持っている。より低い生産コストは出荷までの時間の短縮、及び動物への給餌コストの軽減より生ずる。これにより家畜産業に於ける利益幅の増加、及び／又は消費者への低価格が実現できる。
上記特質を持つ動物を選別することができれば、生産者はこれら所望特性を持つ動物を調達することができる。
【０００４】
個々の肉製造動物及びこれら所望特性を持つ動物を得るための育種技術により開発される品種の間には遺伝的な差が存在している。例えば中国種は若年時に思春期を迎えるとともに一腹の子供の数が多いことが知られているのに対し、米国種は成長速度が早く脂肪が少ないことが知られている。即ち、これら両タイプの品種の最も優れた特性を合わせ、それにより豚生産を改良することが望ましいだろう。
【０００５】
しかし、所望特性の遺伝性は低いことが多く、例えば一腹子の数に関する遺伝性は約10％〜15％である。表現形の多様性に基づき個体を選別する標準的な育種法は、存在する遺伝的変異性又は複雑な遺伝子相互作用を十分に考慮してはいない。従って、細胞又はDNAレベルで低脂肪度、成長速度及び食物消費に関する選択を対象とする方法に関する需要は無い。本法は、所望特性を表現形的に発現しているだけでなく好ましい基礎的遺伝的基準も発現している動物を飼育家がより正確に選別できる様に、動物を遺伝的に評価するための方法を提供する。従来この作業はその大部分がマーカーに支援された選別を利用して達成されてきた。
【０００６】
幾つかのグループは制限断片長多形（RFLP）分析を利用しブタDNAを研究している。Jungら、参照されここに取り込まれているThero.Appl.Genet, 77:271-274(1989),  は２ブタ品種間にある遺伝的変異性を示すRFLP法の利用を開示している。多形性はこれら品種のブタ白血球抗原（SLA）クラスI遺伝子について示されている。Hogansonら、参照されここに取り込まれているAbstract for Annual Meeting of Midwestern Section of the American Society of Animal Science, March 26-28, 1990, もRFLPを利用し中国種に関するブタ腫瘍組織適合性複合体（MHC）遺伝子の多形を報告している。
【０００７】
Jungら、参照されここに取り込まれているAnimal Genetics, 26: 79-91(1989)は、特定の雄ブタに於けるSLAクラスI遺伝子のRFLP分析について報告している。著者は、結果がブタSLA/MHCクラスＩ遺伝子と生産性及び性能特性との間に相関性があることを示唆していると述べている。更に彼らは、遺伝的マーカーとしてSLAクラスＩ制限断片を利用すれば、将来ブタの成長性能を改善できる可能性があるとも述べている。
【０００８】
具体的な好ましい対立遺伝子を追跡する能力は、主な実効的遺伝子に関するDNA分子マーカーを特定する新規かつ長大なプロセスを含む。マーカーは主要効果を持つ単一遺伝子と結びついており、あるいは付加的な効果を持つ複数の遺伝子と結びついているだろう。DNAマーカーは複数の有意点を持っている；分離は測定が容易かつ明白であり、またDNAマーカーは共優性であり、即ちヘテロ接合性及びホモ接合性動物を明瞭に特定することができる。一度マーカーシステムが確立されれば、DNAマーカーは組織又は血液サンプルを個々の乳児動物より集めることができればいつの時点でもアッセイできることから、選別の決定は極めて容易にできる。
【０００９】
レセプター遺伝子内の遺伝的な差を利用することは、選別に関する価値あるマーカーシステムになりつつある。例えば、Rothschildらに交付された米国特許第5,550,024号及び第5,374,526号は、その開示内容は参照されここに取り込まれているが、より大きな一腹子数に関連しているブタエストロゲンレセプター遺伝子中の多形を開示している。米国出願連続番号08/812,208は、より大きな一腹子数及び全体的な生殖効率と関連しているブタプロラクチンレセプター遺伝子に於ける多形マーカーを開示している。
WO-A-07/47316には、非常に肥満のヒトの患者にMC4Rタンパク質の変異が存在すること及び体重異常の素因がMC4R遺伝子中の変異についてのテストにより確認できることが記載されている。しかしながら、Gotodaら、Diabetologia 40 (1997) 976には、MC4R遺伝子中の特定の無変異（Val 103 Ile）と白人男性の肥満との間に相関関係がないことが記載されている。従って、MC4R遺伝子と、改良された代謝形質を有する動物の選択のための手段との間の相関関係を示すものは従来技術中に存在しない。
上記より、脂質含有量、成長速度及び食物消費に関し改良された代謝特性を持つ動物を選別する方法に関する需要が存在していることが分かる。
【００１０】
発明の要約
本発明の目的は、脂質含有量、成長速度及び／又は食物消費の指標であるMC4R遺伝子上又は内にある遺伝的マーカーを提供することである。
発明の別の目的は、所望特質に関する選別及び育種法の正確性を上げる動物を評価する方法を提供することである。
発明のさらに別の目的は、マーカーの存在の決定を大きく促進するであろうPCR増幅試験を提供することである。
発明の追加目的は特定遺伝子マーカーに関し動物のDNAサンプルを評価するためのきっとを提供することである。
これら及びその他の目的、特徴、及び利点は、以下の発明の記述及びクレームを概観することで明らかになるだろう。
【００１１】
本発明は、動物の脂質含有量、成長速度及び食物消費特性と関係するメラノコルチン−４レセプター（MC4R）遺伝子内での多形の発見に関係する。発明によれば、MC4R多形と特質との関連性より特定品種（breed）又は遺伝的系統（line）に関する遺伝的マーカーを特定できる。多形を特定するTaq1制限パターンを利用し、所望代謝特性と関連するマーカーの有無がアッセイされる。
【００１２】
品種依存的マーカー遺伝子型（即ち、幾つかの品種ではマーカーであり、別の品種ではマーカーではないもの）はMC4R内の多形、PCR産物の位置678に於けるグアニンからアデニンへの変化を含んでいる（MC4R蛋白質の298アミノ酸部位のアスパラギン酸コドン（GAU）がアスパラギンのコドン（AAU）に変化するミスセンス突然変異）。発明は多形に特徴的なマーカー及び配列を検出するためのアッセイを含んでおり、またこの様なアッセイに適した増幅プライマーの設計に利用されるMC4R遺伝子内の新規配列を含む。更に、発明は動物の選別に適した交配プログラムでのアッセイの利用に関する方法、及びアッセイを実施するためのキットを含む。
【００１３】
定義
ここで使用する”低脂質含有量”または”低脂肪”とは、特定集団の平均値に対し生物学的に顕著な体脂肪の減少を意味する。
【００１４】
好ましい実施態様の詳細な説明
肥満はエネルギーバランスに関する病気である。エネルギー代謝のコントロールは単純である：過剰エネルギーは脂質として保存され、余剰のエネルギー蓄積、即ち肥満を避けるようにエネルギーは管理される。肥満には複数の遺伝子及びシグナル伝達系が関与しているが、エネルギー恒常性メカニズムと遺伝的多形との関連性については殆ど分かっていない。メラノコルチン-4-レセプター（MC4R)は長期間の体重恒常性の重要な介在因子であることが示されている。MC4Rアンタゴニストは、慢性投与すると食物摂取及び体重を増加させる。Skuladottir, G. Vら、"Long term orexigenic effect of a novel melanocortin 4 receptor selective antagonist", British J. of Pharm., 126(1) :27-34(1999)。
【００１５】
Luら（1994）は、アグーチ肥満症候群に対する拮抗作用の研究を通じてメラノコルチンレセプターが食物摂取及びエネルギーバランスの制御に関与していることを示唆した。Huszarら（1997）は、メラノコルチン-4レセプター遺伝子（MC4R）の不活性化が、マウスでは成人期発症型肥満症候群を引き起こすこと、そしてエネルギーバランスの制御に於けるMC4R蛋白質の主な役割がアグーチ肥満症候群に関係していることを示した。更に、MC4R蛋白質はエネルギー恒常性の重要なシグナル伝達分子の一つであるレプチンの作用も伝達する（Seeleyら、1997）。
【００１６】
本発明によれば、MC4R遺伝子の変位又は多形は局在しており、その遺伝的変位性は脂質含有量、成長速度及び／又は食物消費の代謝特質の表現上の差と関連している。
発明の実施態様の一つでは、アッセイは所望遺伝子型の存在の検出に供される。アッセイは、血液、組織、精液、又はその他遺伝物質の適当な供給源より精製されたゲノムＤＮＡを、プライマー及びポリメラーゼチェインリアクション（PCR）の様な標準的方法にて増幅すること、続いてDNAを制限酵素（例えばTaqI）にて消化し各種長さの遺伝的断片を生じせしめること、及び少なくとも幾つかの断片をその他のものから分離すること（例えば電気泳動を利用し）を含む。
【００１７】
断片はMC4R遺伝子cDNA配列の全て、又は少なくとも一部を含むヌクレオチドプローブ（例えば放射線標識cDNAプローブ）を使い分離した断片にハイブリダイゼーションすること、そしてハイブリダイゼーションの結果をマーカーを持つことが既知である遺伝子配列又はマーカーを持たないことが既知である配列に関するアッセイ結果と比較することによっても検出される。既知及び開示のMC4R配列に基づくMC4R配列の検出に適したプローブの分別及び利用は、一般に当業者既知である。プローブは、分離された消化産物とハイブリダイズし、検出を可能とするいずれの配列でもよい。
【００１８】
発明の別の実施態様は、遺伝的マーカーのMC4R遺伝子配列の存在をアッセイするためのキットを提供する。マーカーは脂質含有量、成長速度、及び／又は食物消費の遺伝的特質の指標となる。好ましい実施態様のキットは、PCR及びPCR産物のTaqI消化によるTaqI多形の検出を可能とする増幅系を提供する、多形の何れかの端部にある4-30連続塩基を含む新規PCRプライマーも含む。好ましいプライマーは配列番号８及び配列番号９である。
別の実施態様は、上記タイプのアッセイを結果に基づき選別される各種動物又は動物胚より得た複数の遺伝子配列について実施し、特定の動物を選別する、又は交配プログラムより排除する育種方法を具備する。
【００１９】
本発明によれば、TaqI制限パターンにより特定されるMC4R遺伝子の多形が開示されている。当分野で知られている如く、制限パターンは断片のサイズの正確な決定ではなく、おおよそを決定するだけである。１つのホモ接合体遺伝子型（対立遺伝子１）はPCR産物のTaqI消化より生ずる３本のバンド、466、225及び76塩基対（bp）により；別のホモ接合体遺伝子型（対立遺伝子２）は２本のバンド542及び225bpにより；そしてヘテロ接合体遺伝子型（542、466、225及び76bp）については４本のバンドよりその多形が特定できる。低脂質性及び低食物摂取のマーカーは、中国種のブタを除き466/225/76バンドにより特定できるが、中国種ブタの低脂質性マーカーは542/225バンドである。早い成長速度獲得のマーカーは、542/225バンドにより特定できる。
【００２０】
更に、このパターンに関連した多形はヌクレオチドのレベルでも特定されている。多形性のTaqI部位は、共通する周辺域を含め配列決定されている。配列番号１参照。多形部位周辺の配列は、多形部位直近の配列に由来する約４〜30連続塩基のプライマーをポリメラーゼチェインリアクションと共に用い、TaqI制限酵素により処理の前に当該領域を大きく増幅するPCR試験の開発を促進する。プライマーは正確に相補的である必要はない；本質的に等価な配列は受け入れ可能である。
【００２１】
配列データより、対立遺伝子２ではPCR産物の678の位置にあるグアニンがアデニンに置換、又はMC4R蛋白質の298位置のアミノ酸ではアスパラギン酸コドン（GAU）がアスパラギンコドン（AAU）に変化することが観察された。多形に関するPCR試験は、5'- TGG CAA TAG CCA AGA ACA AG-3'（配列番号６）の前方向プライマー及び5'-CAG GGG ATA GCA ACA GAT GA-3'（配列番号７）の逆方向プライマーを利用した。使用したブタ特異的プライマーは、5'-TTA AGT GGA GGA AGA AGG-3'（配列番号８）の前方向プライマーと5'-CAT TAT GAC AGT TAA GCG G-3'（配列番号９）の逆方向プライマーである。約750bpの得られた増幅産物は、TqaIにより消化すると466,225及び76bp（対立遺伝子Ｉ）又は542及び225bp（対立遺伝子２）の対立遺伝子断片を生ずる。
【００２２】
マーカーは、例えばMC4R遺伝子の１本鎖立体構造多形分析（SSCP）、RFLP分析、ヘテロデュープレックス分析、変性勾配ゲル電気泳動、及び温度勾配電気泳動を含むマーカーの有無を特定する当業者既知のいずれかの方法、リガーゼチェインリアクション（Ligase chain reaction）又はMC4R遺伝子の配列を直接決定し、TaqIRFLP認識パターンに関し検証することで特定されるだろう。
１またはそれ以上の追加の制限酵素、及び／又はプローブ、及び／又はプライマーが利用できる。追加の酵素、構築されたプローブ及びプライマーは、当業者による通常の実験により決定できる。
【００２３】
その他の技術はTaqMan（商標）（パーキンエルマー（Perkin Elmer））の様な非ゲルシステムを含む。このシステムでは、オリゴヌクレオチドPCRプライマーは問題の変位側方に接し、そしてその領域のPCR増幅が可能になる様設計される。次に、遺伝子の別の対立遺伝子間の変化を受けた塩基を含む領域にハイブリダイズする様に第３のオリゴヌクレオチドプローブが設計される。このプローブは5'及び3'両末端について蛍光色素で標識される。
【００２４】
これら色素は、互いが近接した状態にあるった場合に一方の蛍光が別の蛍光を消光し、その結果検出できなくなる様に選択される。TaqDNAポリメラーゼによるプローブに比し鋳型上5'位置に存在するPCRプライマーからの伸長は、そのTaqDNAポリメラーゼの5'ヌクレアーゼ活性を通し、アニーリングしたプローブの5'末端に結合している色素を開裂する。これにより消光作用が除かれ、プローブの3'末端にある色素からの蛍光が検出可能となる。
【００２５】
もしプローブの鋳型分子へのハイブリダイゼーションが不完全な場合、即ち幾つかの形のミスマッチが存在する場合には色素の開裂は起こらないという事実より、異なるDNA配列間の差を識別する。即ち、もしオリゴヌクレオチドプローブのヌクレオチド配列が結合する鋳型分子と完全に相補的であるときのみ消光作用は除かれる。反応混合液は、実存する、即ち反応により両対立遺伝子の検出が可能である異なる対立遺伝子それぞれについて設計された２種類のプローブ配列を含むことができる。
【００２６】
RFLPの利用は多形を検出する１方法ではあるが、当業者公知の他の方法も利用されるだろう。この様な方法には、多形性遺伝子産物を分析し、遺伝子産物中に生じた差を検出することで多形を検出する方法が含まれる。
制限断片を分離する好ましい方法はゲル電気泳動であるが、当業者既知のその他代替法も制限断片の分離及びサイズ決定に利用されるだろう。
別のDNAマーカーを利用し多形を関節的に選択することも可能である。別のDNAの特異的対立遺伝子と、特定特質との関連性が既に示されているMC4R遺伝子との関連性が既知であるDNAマーカーの対立遺伝子間の連鎖を確立することができる。MC4R遺伝子と結びつく、公開PiGMaP染色体マップ上のマーカーの例にはS0331、BHT0433及びS0313がある。
【００２７】
本発明の方法の適用に好適な試薬は、通常のキットに包装されるだろう。キットは必要な材料を、好適容器内に包装し提供する。最低限キットは、対象となる特質、脂質含有量、成長速度及び食物消費と関係するMC4R遺伝子中の多形を特定する試薬を含む。好ましくは、多形を特定する試薬はMC4R遺伝子又はその断片とハイブリダイズするPCRセット（プライマー、DNAポリメラーゼ、及び４種類のヌクレオシド３リン酸）である。
【００２８】
好ましくは、PCRセット及び少なくとも１カ所でMC4R遺伝子を切断する制限酵素がキットに含まれる。好ましくは、キットは更に、検出可能成分を検出又は測定する、あるいはコントロールを提供するための試薬の様な追加手段を含む。ハイブリダイゼーション、プレハイブリダイゼーション、DNA伸長、視覚化、及び同様の目的に利用されるその他の試薬も随意含まれるだろう。
【００２９】
発明の遺伝的マーカー、方法及びキットは、品種、系統、または動物集団内に於ける脂質含有量、成長速度及び食物消費特性を改良するための交配プログラムに有用である。特定特質に関連する所望の多形に関し少なくともヘテロ接合性であり、好ましくはホモ接合体である動物を連続的に選択し、及び交配することによりこれら所望特質を持つ品種、系統、または集団を導くことができるだろう。即ち、マーカーは選択道具である。
【００３０】
以下実施例は例示を目的とするものであり、発明を制限しない。
実施例１．メラノコルチン４レセプターPCR-RFLP試験−MC4R遺伝子のTaqI多形及び遺伝子連鎖地図
プライマー：
プライマーはヒト及びラットMC4R配列（それぞれ遺伝子バンク登録番号s77415及びu67863）の相同領域より設計された。これらプライマーを用い、ブタMC4R遺伝子の750bp配列が増幅された。
MC4R1：5'TGG CAA TAG CCA AGA ACA AG3'（配列番号６）
MC4R4：5'CAG GGG ATA GCA ACA GAT GA3'（配列番号７）
【００３１】
0003790102.tif 000002
【００３２】
10μLの混合液１及びDNAを反応チューブ内で一つにし、続いてミネラルオイルを重層した。以下のPCRプログラムを実施した；94℃２分間；94℃30秒；58℃１分間、及び72℃１分30秒を35サイクル；続けて72℃15分間の最終伸長。
５μｌのPCR産物を標準的な１％アガロースゲル上で調べ、増幅の成功と陰性コントロールが清浄であることを確認した。産物の大きさは約750塩基対である。消化は以下の方法にて実施された。
【００３３】
TaqI消化反応 10μL反応液
PCR産物                                      5.0μL
10×TaqINE緩衝液                             1.0μL
BSA（10mg/ml）                               0.1μL
TaqI酵素（20U/μL）                          0.5μL
dd滅菌水                                     3.4μL
【００３４】
緩衝液、酵素、BSA及び水のカクテルが作製された。DNAを含む反応チューブそれぞれに５μLが加えられた。次に混合液は65℃にて、少なくとも４時間から一晩インキュベーションされた。ローディング色素を消化反応液と混合し、全量を３％アガロースゲルに負荷した。対立遺伝子Ｉの主要バンドは約466、225、及び76bpである。対立遺伝子２遺伝子型バンドは542及び255bpである。ヘテロ接合体の遺伝子型は対立遺伝子Ｉと対立遺伝子２の両方を有する。
【００３５】
結果
増幅PCR産物は約750bpである。PCR産物の配列は、PCR産物がMC4R遺伝子がアミノ酸レベル及びDNAレベルそれぞれについて、対応するヒト配列と97.6%及び92.2％の同一性を持つことを確認した（図２及び３参照）。
PCR産物のTaqI消化は、466、225及び76bp（対立遺伝子１）又は542及び255bp（対立遺伝子２）の対立遺伝子断片を生じた。ヘテロ接合体遺伝子型は両方の対立遺伝子の型を有する。本遺伝子の連鎖分析に用いられた３世代にわたる国際標準３系統については、メンデル型の遺伝が観察された。
【００３６】
PCR産物の678位置に於けるＧからＡへの変化を生じた対立遺伝子１及び対立遺伝子２間の多形は、MC4R蛋白質の298位置のアミノ酸に於けるアスパラギン酸コドン（GAU）からアスパラギンコドン（AAU）へのミスセンス変位を表した（図１、配列番号１参照）。
【００３７】
対立遺伝子頻度は様々な品種の小数の動物より得たDNAサンプルの遺伝子型を調べることで決定された（表１）。対立遺伝子１はメイシャン（Meishan）では１の頻度で観察されたが、ハンプシャー（Hampshire）及びヨークシャー（Yorkshire）では観察されないか、又は極めて低頻度に観察された。ランドレース（Landrace）及びチェスターホワイト（Chester White）での対立遺伝子１の頻度はそれぞれ0.5であった。
図２及び３は、ヒトとブタMC4R遺伝子のDNA及びアミノ酸配列間の違いを例示している（配列番号２−５）。
【００３８】
【表１】
0003790102.tif 000003
【００３９】
連鎖分析
国際標準系統の遺伝子型について、２点及び多点連鎖分析を実施した。図４ａ−４ｃ参照。データはCR1-MAPプログラムを用いて分析された。MC4Rは有意にブタ染色体（SSC）１上の複数のマーカーと連鎖していた。２点連鎖分析で最も強く連鎖したマーカー（カッコ内に組換え分画及びLODスコアを示す）はSO331（0.02、21.97）、BHT0433（0.02、21.32）及びSO313（0.00、17.76）であった。多点連鎖分析の結果、マーカーとMC4R（Losambi cM距離で示す）の最適マップ配置：KGF-5、8-CAPN3-2、5-MEF2A-6.1、1-MC4R-5、6-SO313を得た。
【００４０】
ブタ及び齧歯類の体細胞ハイブリッドパネルを使い、MC4Rを細胞遺伝学的領域に割り付けた。ブタ特異的プライマーによるPCR産物はクローン７，８，16、18及び19で増幅された。MC4RはSSC1q22-27に位置確認された。
【００４１】
実施例２．ブタ特異的プライマーを用いたMC4RレセプターPCR-RFLP試験、及びブタMC4R遺伝子の遺伝子連鎖地図
ブタ特異的プライマー配列
正方向プライマー：5'-TTA AGT GGA GGA AGA AGG-3'（配列番号８）
逆方向プライマー：5'-CAT TAT GAC AGT TAA GCG G-3'（配列番号９）
【００４２】
検出法
PCR反応は10μL最終容積中に、
ブタゲノムDNA                   12.5ng
１×PCR緩衝液
MgCl2                            1.5mM
dNTP                             0.124mM
前方向プライマー                 0.3μM
逆方向プライマー                 0.3μM
TaqDNAポリメラーゼ（5U/μL）     0.35U
を用い実施された。
【００４３】
PCRプロフィールはロボサイクラー（スタタジーン社（Statagene）、La Jolla, CA）での94℃２分間；94℃30秒；56℃１分間、72℃１分30秒を35サイクル；続けて72℃15分間を含んだ。５μｌのPCR産物が、10ＵのTaqIを含む総量10μｌの中で一晩、65℃にて消化された。消化産物は３％アガロースゲル上で電気泳動された。
【００４４】
多形性の記述
PCR産物のTaqI消化は、対立遺伝子１では466、225及び76bpの断片を、対立遺伝子２では542及び225bpの断片を生じた。ヘテロ接合体の遺伝子型は対立遺伝子１及び２両方の断片を有した。
【００４５】
遺伝のパターン
３系統、３世代のヨーロッパPiGMaP系統にてメンデル型遺伝の常染色体分離が観察された（Archibaldら、1995）。
対立遺伝子頻度
対立遺伝子頻度は、ヨーロッパPiGMaP系統及びISU標準系統に由来する無関係な動物について、２世代前動物の遺伝子型を決定することにより決定された。観察された対立遺伝子１の頻度は以下の通りである。
【００４６】
【表２】
0003790102.tif 000004
【００４７】
染色体上の局在
３系統のPiGMaPの遺伝子型について、CRI-MAPプログラム（Greenら、1990）を用いて２点及び多点連鎖分析を実施した。MC4Rは有意にブタ染色体１（SSC1）上の複数のマーカーと連鎖していた。２点連鎖分析によれば、最も強く連鎖したマーカー（カッコ内に組換え分画及びLODスコアを示す）はSO331（0.02、21.97）、BHT0433（0.02、21.32）及びSO313（0.00、17.76）であった。多点連鎖分析により得られた他連鎖マーカーに関するMC4Rの最適マップ配置は以下の通りであった（Losambi cM距離で示す）：KGF-5、8-CAPN3-2、5-MEF2A-6.1、1-MC4R-5、6-SO313。
【００４８】
コメント
メラノコルチン-4レセプターは脳内に発現されているＧ蛋白質共役型の７膜貫通レセプターである。Huszarら（1997）は、MC4R遺伝子の不活性化がマウスに於いて成体発症型肥満症候群を誘導することを見いだし、MC4R蛋白質のエネルギーバランス制御に於ける主要な役割を示した。MC4R遺伝子は、ヒト染色体18q21.3（Gantzら、1993）にマップされている。
【００４９】
MC4R遺伝子がSSC1に位置決定されたことは、この染色体とHSA18及び15の間に同一染色性があることを示したこれまでの染色体ペインティングのデータ（Goureauら、1996）と一致する。しかし、CAPN3、KGF及びMEF2Aを含むHSA18及び15を元にこれまでSSC1にマップされていた複数の遺伝子の遺伝子配置はMC4Rでは保存されていない。従って、MC4RのSSC1へのマッピングは、SSC1に関連したHSA18及び15間の進化的切断点を特定するかもしれない。
【００５０】
実施例３．増強された代謝特性とマーカーとの関連性
どの対立遺伝子が特質と関連し、また品種内に存在するかを決める予備実験では、動物の複数の系統の遺伝子型が体重110kgに達する日数、背部脂肪量、試験日増加量、及び平均日食物摂取量に相関した。試験に用いたブタはピッグインプルーブメント社（Pig Improvement Company）（PIC）より得た系統を使用した。
データはMC4R遺伝子の対立遺伝子１及び２に関する上記PCR試験を利用し集めた。集めたデータは下表３−８にまとめる。
【００５１】
結果より、対立遺伝子１は、それが富脂質性対立遺伝子である中国産ブタを除き、全ての系統にて顕著な低脂質対立遺伝子であった（P2の背部脂質値を参照）。対立遺伝子２は試験した市販系統に於いて顕著な早い成長速度の獲得（日増加の試験）と関連していた。全体として対立遺伝子１はより低い食物摂取に関連する
【００５２】
【表３】
0003790102.tif 000005
【００５３】
【表４】
0003790102.tif 000006
【００５４】
【表５】
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【００５５】
【表６】
0003790102.tif 000008
【００５６】
【表７】
0003790102.tif 000009
【００５７】
【表８】
0003790102.tif 000010
【００５８】
実施例４．ブタメラノコルチン−４レセプター（MC4R）遺伝子のミスセンス変位は脂肪率、成長、及び食物摂取特性に関連する
MC4R多形と表現形上の変位との関連性があるか調べるために、複数の種類のブタ系統の多数の動物固体について変異体の試験を行った。成長及び性能試験記録の分析は、複数の系統に於いて背側脂肪量、成長速度及び食物摂取とMC4R遺伝子型とが有意に関連することを示した。MC4R突然変異体の変位アミノ酸残基がMC4R機能に大きな変化をもたらすと考えられる。これらの結果は、ブタMC4Rミスセンス突然変異の機能上の意義を支持すると同時に、モデル種に基づくゲノム比較がヒト医薬品に関すると同様に家畜への応用にとっても重要であることを示唆している。
【００５９】
レプチン及びレプチンレセプター内の突然変異の特定は、エネルギーバランスの制御に関与する遺伝的要素に関する情報を提供している（Zhangら、1994；Tartagliaら、1995）。動物モデルを用いた遺伝的研究は、肥満の主要な遺伝的原因の同定を促進している（Andersson 1996；Pomp 1997；Giridharan 1998）。更に、エネルギー恒常性の神経シグナル伝達経路に関係する複数のその他遺伝子も同定されている（FilerとMaratons-Filer 1998;Schwartzら、1999）。エネルギー恒常性の制御に関与するシグナル伝達分子の候補の中で特に興味深いものは、メラノコルチン−４レセプター（MC4R）である。レプチンシグナルに反応するMC4Rは、食物摂取と体重との間の連絡である（Seeleyら、1997；Marshら、1999）。
【００６０】
中枢神経系での神経ペプチドＹ（NPY）シグナル伝達は、MC4R蛋白質によっても伝達される（Kaskら、1998）。フレームシフト及びナンセンス変位を含むMC4R中の複数の変位がヒトでの優性遺伝肥満と関連している（Vaisseら、1998；Yeoら、1998）。ヒトに於けるその他MC4Rミスセンス変位も同定されている（Gotodaら、1997；Hinneyら、1999）が、これら変位の機能的意義については特定されていない。
【００６１】
成長特性に基づく選別は、給餌に伴うコスト及び低脂肪肉に対する消費者の嗜好から養豚産業にとって極めて重要である。これらの定量的特質の効率的な遺伝的改良は、高密度遺伝子マップを利用したマーカー支援選別（MAS）の利用を通じ増大されるだろう（Dekkersとvan Arendonk 1998；Rothschild及びPlastow1999）。良く開発されているヒト及びマウスの遺伝子マップを使った比較マッピングは、このプロセスの重要な道具であり、それはブタに於いて成長及び性能特質をコントロールしている該当遺伝子領域又は主要遺伝子の特定を支援する。
【００６２】
ヒト又はモデル種に於ける複雑な特質を生物学的に理解することは、家畜に於ける経済的に有益な特質を担う遺伝子を特定する別の方法を提供する。肥満及び成長特質に関しては、表現形的に変位した品種及び候補遺伝子の分析を利用した定量的特質座（QTL）連鎖が幾つか成功裏に実施されている（Yuら、1995；Casas-Carrilloら、1997；Knorrら、1997；Knottら、1998；Rohrerら、1998；Wangら、1998；Paszekら、1999）が、商業種に関しては成長と性能に主要な影響を及ぼす個別遺伝子はまだ確立されていない。食物摂取及び肥満に於けるMC4Rの役割は、それがブタに於ける成長関連特質に関し重要な遺伝的マーカーであることを示唆している。
【００６３】
材料と方法
動物
ブタは米国及び欧州内の基幹農園に於いて、PIC従業員の世話の下、通常生産条件下に飼育された。ブタは約70日齢時に性能試験を受け、13週後に試験から外された。試験終了時に、背の脂質量を超音波を使い、中央線から2cmの位置にある第10肋骨について、リアルタイム（Ｂモード）にて測定された。平均の日体重（成長）増加量は、得られた体重増加量を試験日数で除し計算した。市場体重である110kgに至るまでの日数は通常の方法を使い算定し、食物摂取量は個別の電子測定装置を使い測定した。
【００６４】
ブタMC4R遺伝子断片のPCR増幅
プライマーはヒト及びラットMC4R（それぞれ遺伝子バンク登録番号s77415及びu67863）の相同域より設計された。プライマーは；前方向プライマー：5'-TGG CAA TAG CCA AGA ACA AG-3'（配列番号６）及び逆方向プライマー：5'-CAG GGG ATA GCA ACA GAT GA-3'（配列番号７）。PCR反応は12.5mgのブタゲノムDNA、１×PCR緩衝液、1.5mMMgCl2、0.125mMdNTPs、0.2mMの各プライマー、及び0.35UのTaqDNAポリメラーゼ（プロメガ社）を含む最終容積10mLにて実施された。PCR条件は以下の通りである：ロボサイクラー（ストラタジーン社（Stratagene）、La Jolla, CA）での94℃２分間；94℃30秒；56℃１分間、92℃１分30秒を35サイクル；続けて72℃15分間。
【００６５】
配列決定及び突然変異検出
各種品種の複数のブタ固体より得たPCR産物の配列決定を実施し、配列を比較してヌクレオチドの変化を検出した。配列決定はABIシークエンサー377（Applied Biosystems）にて実施された。ブタMC4R配列は遺伝子バンクに提出され、受付番号AF087937を得た。配列分析は、TaqI制限酵素認識部位内に存在する１ヌクレオチド置換を示した（Kimら、1999）。次に、多形部位を特定しPCR-RFLP試験を促進するために、情報を提供するTaqI制限酵素部位をただ１つ含むMC4R遺伝子断片を得られる様にプライマーセットを設計した。これらプライマーは：前方向5'-TAC CCT GAC CAT CTT GAT TG-3'（配列番号10）及び逆方向5'-ATA GCA ACA GAT GAT CTC TTT G-3'（配列番号11）であった。
【００６６】
統計分析
分散手順の解析を、農場、試験期間、動物の性別、MC4R遺伝子型、及び部位（無作為）の固定効果に関する混合モデルと共に利用した。米国／欧州系統の全ての動物（系統Ａ−Ｄ）を全体分析様にプールし、起源のこの分析系統内に加えた。平均効果は各遺伝子型について算出され、表９−15に示された。全体にＦ試験を用い有意差レベルを決定した。
【００６７】
結果
ブタMC4R遺伝子のミスセンス変位の同定
MC4R遺伝子は単一エクソン内に含まれる約1kbのコーディング配列より成る。約750pのブタMC4R遺伝子断片がPCRにより作製された（Kimら、1999）。PCR産物の配列は、PCR産物がヌクレオチド及びアミノ酸レベルそれぞれについてヒトMCR4R配列に対し92.2％及び97.6％の同一性を持つMC4R遺伝子であることを確認した。複数の系統の動物個体より得た配列を複数整列した結果、単一のヌクレオチド置換を同定した（ＧからＡ；図５）。
【００６８】
多形は、ヒトMC4R蛋白質のアミノ酸298と同一位置にあるアスパラギン酸（GAU）がアスパラギン（AAU）に置換するISUセンス変位を表した。この塩ｋに変化を確認するために、我々は多形部位に近接するブタ特異的プライマーを設計し、TaqIPCR-RFLPゲルとして多形を解析した（図６）。図６はアガロースゲル電気泳動により分析されたPCR産物のTaqI消化を示す。対立遺伝子１は156及び170bp断片を、対立遺伝子２は226bp断片をPCR-RFLPとして生じた。ヘテロ接合体は対立遺伝子１及び２の断片を両方有していた。各レーンの頂部には、分子量マーカー（M)及びMC4R遺伝子型を示した。
【００６９】
MC4Rミスセンス突然変異はメラノコルチンレセプター（MCR）間の高度に保存された領域内にある。
MCRは、多くの他のＧ蛋白質共役レセプター（GPCR）に共通する特定の保存構造要素を含むGPCRのサブファミリーであるが、MCRと他のGPCRsとの間の全体としてのアミノ酸同一性は低い（Tatro 1996）。ブタMC4Rの推定アミノ酸配列を他種由来MC4R蛋白質、他のMCR蛋白質、又は代表的GPCRsと並列させたところ、MCR蛋白質では第７膜貫通ドメインの298番目の位置にあるアスパラギン酸が極めて高く保存されていることが示された（図７）。
【００７０】
しかし他のGPCRsでは、この位置はアスパラギンにより占められていた。MCR蛋白質は互い40−80％アミノ酸同一性を示す（Tatro 1996）が、第２細胞内ドメインループ及び第７膜貫通ドメインはMCR蛋白質間で高く保存されている（Gantzら、1993）。MCR構造と機能との関連性の幾つかはヒト及びマウスに於ける中立的及び実験的変位の研究により発見された（Robbinsら、1993；Valverdeら、1995；Frandbergら、1998）。
【００７１】
これら研究は、高く保存された領域内の幾つかの変位が構造変化をもたらし、レセプター機能を変化させることを示した。Asp298Asn置換変位はレセプターの機能に影響を及ぼすだだろう。しかし、これには更なる検証が必要ではあるが、MC1R中の相同残基の変化（Asp294His）がヒトに於ける白色皮膚及び赤毛に関連していることが知られている（Valverdeら、1995） 。
【００７２】
MC4Rミスセンス変位は肥満関連特質と関連する。
このミスセンス変位の作用を研究するために、PIC、インターナショナルピッグブリーディング社（international pig breeding company）より得た複数の商業ブタ系統の動物1,800匹について、成長速度、背部脂肪、及び食物消費の変動へ及ぼす作用とMC4R遺伝子型との相関性について分析した。動物は欧州／米国品種の非公開商業系統（系統Ａ−Ｄ）と及び欧州及び中国品種間の交配により生じた系統（系統Ｅ）より得た。
【００７３】
系統Ａ−Ｄでは、全ての性能特質についてMC4R遺伝子型との顕著な相関性が認められた。対立遺伝子１に関するホモ接合体の動物は、ホモ接合体22遺伝子型動物に比べると、平均して背部脂肪（ｐ＜.001）、日増加量（Ｐ＜.001）及び食物摂取量（Ｐ＜.01）が有意に低かった（表11、13及び15）。全体として、11遺伝子型のブタは22遺伝子型のブタに比べ背部脂肪は約９％少なかった（表11）が、一方22遺伝子型のブタは11遺伝子型のブタに比べ顕著に成長が早かった（37g/日）（表13）。
【００７４】
これらの結果は、22遺伝子型動物がより多くの摂食をするために、食欲の関係を表しているだろう（表15）。MC4R遺伝子のミスセンス変位と関連性能特質との間の関連性は、欧州／米国品種に於いて明確に確立されている。試験した動物数はより少ないが、より肥満体である中国種交配系統（系統Ｅ）ではこの様な結果は認められなかった。興味深いことに、背部脂肪については系統Ｅは他の系統に関する観察と反対の傾向を示した（表11）。
【００７５】
考察
本研究は、ブタMC4Rミスセンス変異がブタの複数の性能特質と有意に関連していることを明瞭に示した。他のMCRサブタイプ及び他種MC4Rで良く保存されているアミノ酸であるAsp298を示す対立遺伝子１は、低背部脂肪、遅い成長速度及び低食物摂取量と関係し、Asn298である対立遺伝子２は、肥満、高食物摂取及び早い動物成長に関係した。メラノコルチンレセプター蛋白質中の高度に保存された残基はリガンド結合、又は細胞内シグナル伝達に関して重要な役割を持つことから（Tatro 1996）、MC4R変位は食物摂取及び体重の制御に於いて機能的に明瞭な能力を発揮するだろう。この仮説の更なる検証により、MCR機能の構造的基礎及びヒトの肥満の治療に関する分子標的について重要な治験が提供されるだろう。
【００７６】
対立遺伝子１は系統Ｅでは、中国産のラージホワイト品種とメイシャン由来の系統との掛け合わせに由来する最も肥満した動物に関連した。これは、変位が良く保存された領域内に有意なアミノ酸の変化をもたらすという驚くべきことである。結果はサンプリングに依存したものであろう。しかし、もしより多くの結果を加えた場合でも結果が同様に有意であるならば、幾つかの説明が可能である。一つの可能性は背景遺伝子効果（エピスタシス）の差に拠るものであろう。成長及び肥満は複雑な多遺伝子性の特質であることから、数百年間の選択によって中国品種が別の対立遺伝子相互作用を有する様になり、これらの予想相互作用が広範囲の系統との交配に於いて多遺伝子性特質に多様性を生じる可能性はあるだろう（FrankelとSchork 1996）。
【００７７】
分岐した系統を用いた肥満性と増殖特質に関するQTL試験が実施された（Cases-Carrillら、1997；Knottら、1998；Rohrerら、1998ｌWangら、1998；Paszekら、1999）が、第１染色体上にあり、連鎖地図上約80cmのところにマップされる（データ未提示）C4R座近傍についてQTLは報告されていない。系統Ｅに提案されているMC4R対立遺伝子のエピスティック効果が、中国系統及び欧州／米国系統間の交配を含む大部分のQTL実験に於いて、MC4R座の観察を困難にしている。幾つかの対立遺伝子の効果は背景の違いにより変動すること、そして遺伝的に分岐した品種を含むQTL事件で検出することは困難であると考えられる。
【００７８】
MC4R変異の効果はおそらく、本変異により他のブタ品種及び系統に引き起こされる生物学的作用に関する今後の研究により説明されるだろう。しかし、MC4R変異が低脂質性、成長及び食物摂取と強く相関しているのであれば、本変位を利用することで特定の消費者の要求を満足するブタ系統を開発する生産者の選別を支援することができるだろう（Meuwissen及びGoddard 1996）。例えば、分娩後に食欲が一般に減少する幾つかの系統では、MC4Rの２対立遺伝子について選択することで食物摂取を改善できるだろう。
【００７９】
更に、過度の肥満と考えられる幾つかの系統では、対立遺伝子１に関する選別が利用でき、成長が過度に遅いと考えられる系統では対立遺伝子２に関する選別も利用できた。従って、ブタの交配系統でのMC4R変位に関する遺伝子型判定は、成長及び低脂肪性を含む食物と関連した生産性特質の選別効率を改善するだろう。ブタレプチン遺伝子の役割の研究には候補遺伝子法も利用されている（Jiang及びGibson 1999）。しかし、レプチンの場合、商業品種と未改良系統との間の交配ではレプチン多形と背部脂肪の厚さとの間の関連性に関する証拠はあるものの、試験された別の商業系統については明瞭な関連性はなかった（Jiang及びGibson 1999）。
【００８０】
従って、相関性の存在を推測できる遺伝子を見つけたと考えるべきではない。これに対し、MC4Rに関して我々はこの候補遺伝子内の変位が、ブタの商業系統に於ける背部脂肪、成長速度及び食物摂取に関する顕著な変化を説明することができることを確定した。これらMC4Rに関する結果は、家畜遺伝学に於ける候補遺伝子を利用した比較遺伝分析の潜在的価値を例示する。
ブタに於ける複数の生殖特質に及ぼすMC4R遺伝子型の作用
【００８１】
【表９】
0003790102.tif 000011
【００８２】
【表１０】
0003790102.tif 000012
【００８３】
【表１１】
0003790102.tif 000013
【００８４】
【表１２】
0003790102.tif 000014
【００８５】
【表１３】
0003790102.tif 000015
【００８６】
【表１４】
0003790102.tif 000016
【００８７】
【表１５】
0003790102.tif 000017
【００８８】
具体的な組成物、有効性の理論等を参照し本発明を記しているが、それが発明がこれら例示された実施態様又はメカニズムにより制限されることを意味しないこと、及び添付請求項により規定される発明の範囲又は精神より逸脱することなく変更が可能であることが当業者に対し明らかであろう。請求項は、文脈が具体的矛盾を示さない限りに於いて、そこに意図される目的への適合に有効な何れかの順番にある請求構成要素及び段階を包含することを意味する。
【００８９】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  図１はブタのMC4Rに関掲載されている配列（配列番号１）である。”Ｘ”は多形の位置を示す。
【図２】  図２はヒト（配列番号２）及びブタ（配列番号３）のMC4R遺伝子間のDNA配列の比較を表す。
【図３】  図３はヒト（配列番号４）及びブタ（配列番号５）のMC4R遺伝子間のアミノ酸配列の比較を表す。
【図４ａ】  図４ａはCR1-MAPによるMC4Rに関する連鎖報告を表す。
【図４ｂ】  図４ｂはCR1-MAPによるMC4Rに関する連鎖報告を表す。
【図４ｃ】  図４ｃはCR1-MAPによるMC4Rに関する連鎖報告を表す。
【図５】  図５は、ブタMC4R遺伝子の部分的ヌクレオチド及びアミノ酸配列（配列番号１２）の描く。
【図６】  図６はPCR産物のTaqI消化物の電気泳動ゲルである。各レーンの上部に分子量マーカー（Ｍ）及びMC4R遺伝子型を示した。
【図７】  図７は、ブタMC4Rの推定第７膜貫通ドメインと他のMCRs及びGPCRsとの複数並列配置を示す。”*”はブタMC4Rの推定配列位置を示す。その他のアミノ酸配列は遺伝子バンクデータベース（登録番号P32245、P70596、P41983、P56451、P34974、P41968、P33033、Q01718、Q01726、Q28031、AF011466、P21554、P18089、P30680、P47211）より得た。ブタMC4Rのミスセンス変位体は、矢印で示す位置のアミノ酸ＮをＤに置換した。Asp(D)残基はMCRs間で良く保存されており、またAsn(N)残基は大部分の他GPCRsで良く保存されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図４ｃ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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