(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（i）第VIII：Ｃ因子；
（ii）アルギニンまたはその塩；
(iii）スクロース；
を含有し、第VIII：Ｃ因子比活性が少なくとも１０００ＩＵ／mgである第VIII：Ｃ因子活性を有する安定化された溶液。
【請求項２】
さらにグリシンを含む請求項１に記載の溶液。
【請求項３】
第VIII：Ｃ因子比活性が少なくとも２０００ＩＵ／mgである請求項１または２に記載の溶液。
【請求項４】
容量ベースの比活性が少なくとも２００ＩＵ／mlである請求項１または請求項２に記載の溶液。
【請求項５】
請求項１または２に記載の溶液を含有する医薬。
【請求項６】
アルギニンまたはその塩およびスクロースを少なくとも１０００ＩＵ／mgの比活性を有する第VIII：Ｃ因子の溶液に加えることからなる請求項１に記載の溶液の調製方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、Ｆ VIII凝血活性を有する安定化溶液、その調製方法およびその使用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
第VIII：Ｃ凝血因子（Ｆ VIII：Ｃ）は血漿タンパクでありそして血液凝固の内在経路の過程に不可欠である。第VIII：Ｃ凝血因子の不足または欠陥は生命にかかわる血液凝固障害である血友病Ａを招く。ヒト血漿からのＦ VIII：Ｃ濃縮物または遺伝子工学によるＦ VIII：Ｃは血友病Ａの治療に用いられている。
これらのＦ VIII生成物は純度、すなわち活性物質であるＦ VIII：Ｃに加えての凝血活性を持たないタンパクの有無によって異なる。アルブミンで安定化させる前に１０００Ｕ／mgを超えるＦ VIIIを極めて高純度のＦ VIII（very high purity Ｆ VIII；ＶＨＰ Ｆ VIII：Ｃ）と呼ばれる（ＷＨＯの生物学標準化に関する専門家委員会（Expert Committee on Biological Standardization))。
【０００３】
かかるＶＨＰ Ｆ VIII：Ｃは血友病治療に潜在的利点を有する。これらの利点とはウイルスを含まないこと、および異タンパク含量が極めて少ないことであり、このことは、これらの濃縮物を投与した後の患者の免疫系に対するストレスが低下することを意味する。しかしながら、高い比活性を有するＦ VIII調製物を投与することによる血友病患者の免疫系に対するストレス低下というそれ自体あり得る利点はＶＨＰ Ｆ VIIIを安定化するために高濃度アルブミンを高純度生成物に添加することによって打ち消されてしまう。このアルブミン添加は高純度Ｆ VIII濃縮物がその最終組成物において３〜１０Ｕ／mgという比活性にしか至らないことを意味している。
【０００４】
アルブミンの添加はウイルス安全性に関してはほんのわずかなリスクしか伴わないが、平均９５％の純度のアルブミンを用いるときは、やはり望ましくない随伴タンパクが患者に投与されそして患者の免疫系にストレスをかける可能性があることに留意すべきである。
【０００５】
Ｆ VIIIの安定化のためにアルブミンを添加しなくてもすむ高純度Ｆ VIII生成物が知られている（Schwinn, Smith & Wolter, Drug. Res. 39(1989), 1302)。これらの生成物は約１００Ｕ／mg（タンパク）の比活性に達する。達成可能な最大のＦ VIII活性は約５０００Ｕ／mgであるから、このことは、これら調製物のタンパク含量のわずか約２％しかＦ VIII：Ｃタンパクを構成しないことを意味している。この場合、この２％Ｆ VIII：Ｃは９８％の随伴タンパクによって安定化されていると推定される。何故ならば、これら随伴タンパクの大部分はフォンウィルブランド因子（ｖＷＦ）より成る傾向にあるからである。フォンウィルブランド因子がＦ VIII：Ｃに対し安定化作用を有していることは知られている。
【０００６】
アルブミンによる安定化前にあっては通常高純度の生成物より２５倍以上高い比活性を有する極めて高純度の生成物の場合は状況が異なり、そのｖＷＦ含量は極めて低い。この低いｖＷＦ含量ではもはや十分なＦ VIII安定化を保証することができないため、アルブミンで安定化されていない溶液中でのＦ VIII活性は急減する。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
したがって本発明の課題は、安定化のためにタンパクを添加する必要のないＶＨＰ Ｆ VIII：Ｃ生成物の高度に濃縮され生理学的に許容される溶液の調製を可能にする方法を提供することであった。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
この課題は本発明にしたがってＶＨＰ Ｆ VIII：Ｃ調製物にアミノ酸またはその塩、誘導体または同族体（homolog）を添加することにより達成される。Ｌ−および／またはＤ−アミノ酸を添加することができる。特に適しているのはアルギニン、リジン、オルニチン、グアニジノ酢酸または共通の特徴として塩基性基がアミノおよび／またはグアニジノ基の形をとるその他のものである。
【０００９】
したがって、本発明はアミノ酸またはその塩、誘導体、そして適切な場合には洗剤または有機ポリマーを含む第VIII：Ｃ因子活性を有する溶液に関する。
【００１０】
好ましい態様は次のとおりである：
アミノ酸が天然アミノ酸である溶液；
アミノ酸が塩基性アミノ酸である溶液；
アルギニンおよびグリシンを含む溶液；
アミノ酸の濃度が０.００１〜１mol／リットルである溶液；
付加的に有機ポリマーまたは非イオン系洗剤を含む溶液；
Ｆ VIII：Ｃ活性が血漿中に存在する形のヒト第VIII因子、遺伝子工学による第VIII：Ｃ因子またはこれらの誘導体に由来する溶液；および
Ｆ VIII：Ｃ比活性が少なくとも１０００IU／mgである溶液。
【００１１】
安定化向上は、アミノ酸またはそれらの誘導体の組み合わせによりあるいは非イオン系洗剤例えばRPolysorbate 20またはRPolysorbate 80または有機ポリマー例えばポリエチレングリコール １５００を用いて達成される。
【００１２】
アミノ酸アルギニンおよびグリシン（好ましくは０.０１〜１mol／リットル）と非イオン系洗剤RTween 80（好ましくは０.００１〜０.５％(v/v)）および天然糖例えばスクロース（好ましくは０.１〜１０％）との組み合わせが安定でアルブミン不含のＶＨＰ Ｆ VIII：Ｃ溶液の調製に特に適していることが判明した。
【００１３】
このタイプの溶液のpHは有機酸、好ましくは１０％濃度酢酸によりpH５.５〜８.５、好ましくはpH６.５〜７.５に調節される。
【００１４】
さらに本発明はこのタイプの溶液を含む医薬に関する。この医薬はこのタイプの溶液のほかに、慣用の薬学的にコンパチブルな安定化および／または緩衝化物質、特に炭水化物を含むことができる。
【００１５】
同様に、本発明はアミノ酸またはその塩または誘導体、そして適切な場合には有機ポリマーまたは洗剤を第VIII：Ｃ活性を有する溶液に添加することより成るこのタイプの溶液の調製方法に関する。
【００１６】
本発明による方法の有利な効果は、例えばモノクローナル抗−Ｆ VIII：Ｃ抗体に対するクロマトグラフィーにより精製されたＦ VIII：Ｃ調製物について示すことができるが、該Ｆ VIII：Ｃは血漿から得ることも、また例えばＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞で遺伝子工学によって得ることもできる。これは例えば前記物質の溶液を等部ずつモノクローナル抗体カラムからの溶出液に添加し次いで後者をこの溶液に対して透析することによって行われる。このようにして得られた安定化Ｆ VIII：Ｃ調製物は濾過により滅菌でき、そして方法関連ロスを低く保ちつつビン詰めできる。このようにして得られたこの調製物の凍結乾燥物は溶解後も変わらず高いＦ VIII：Ｃ活性を有している。
【００１７】
本発明による方法を用いれば、容量ベースの比活性が少なくとも２００IU／ml（２０００IU／mg以上の比活性）であるＶＨＰ Ｆ VIII：Ｃ調製物を調製できる。この濃度は少量の投与ですむことから操作上の問題がないことを保証する。
【００１８】
このタイプの調製物はタンパクによりさらに安定化する必要はなく、これによってウイルス汚染のリスクが回避される。同時に高タンパク負荷の低下は医薬としての作用上は不必要なアルブミンおよびそれに含まれる望ましくない不純物の添加による患者の免疫系に対するストレスが相当に低下することを意味している。
【００１９】
安定化には生理学的に許容される物質が添加されるので、本発明による溶液を投与しても許容されない反応はおこらない。
【００２０】
実施例１
二つのＶＨＰ Ｆ VIII：Ｃ調製物をモノクローナル抗−ｖＷＦ Ｉｇに対するアフィニティークロマトグラフィー（Fulcher & Zimmermann PNAS(1982), 79, 1649の方法）および０.１Ｍアセテート、０.１Ｍリジン、pH６.８に３００mMのＣａＣｌ2 濃度を有する溶液（溶出液Ｉ）によるｖＷＦ／Ｆ VIII：Ｃ複合体の解離により、およびモノクローナル抗−Ｆ VIII：Ｃ Ｉｇに対するクロマトグラフィーおよび０.１Ｍアセテート、０.１Ｍリジン、pH６.８中の５０％エチレングリコール（溶出液II）によるＦ VIII：Ｃの溶出により調製した。測定されたＦ VIII：Ｃ比活性は溶出液Ｉ中では２５００IU／mgおよび４１９IU／ml、そして溶出液II中では３２８０IU／mgおよび４５４IU／mlであった。それら二つの溶出液をそれぞれについて分割した。それぞれの一部に０.７５％スクロース、３％グリシンおよび０.１mol／リットル ＮａＣｌ中の１％強度ヒトアルブミン溶液を１：１容量比で添加した（溶出液ＩHSA、溶出液IIHSA）。同じく安定化緩衝液（０.７５％スクロース、３％グリシン、３％アルギニン、０.０５％ RTween 80、 pH６.８）をそれぞれの他の半分の方に１：１比で添加した（溶出液ＩS、溶出液IIS）。アルブミン含有サンプルを０.７５％スクロース、３％グリシン、０.１mol／リットル ＮａＣｌ、pH６.８に対して、そしてその他のものは安定化緩衝液に対して透析した。透析は１０００倍容量変化をもって４℃で１６時間行った。Ｆ VIII：Ｃ活性を透析の前および後に測定した。表１は透析前の各サンプル中の全Ｆ VIII：Ｃ活性に対するＦ VIII：Ｃ活性を％で示したものである。
【００２１】
【表１】
0003809501.tif 000002
【００２２】
これらの結果は本発明の安定化溶液によるＶＨＰ Ｆ VIII：Ｃ溶出液の安定化が調製方法の如何にかかわらずしかもアルブミン添加による場合と同程度に達成される。
【００２３】
実施例２
モノクローナル抗−Ｆ VIII：Ｃ抗体に対するイムノアフィニティークロマトグラフィー後に、３８６０IU／mg（タンパク）および４６２IU／mlのＦ VIII：Ｃ比活性を有するＦ VIII：Ｃ溶出液を得た。これに様々な安定化溶液を１：１容量比でこれに添加し、そしてそれを実施例１に記載の関連の安定化溶液に対して透析した。すべての溶液について適切な場合には１０％酢酸を用いてpHを６．８に調節した。
【００２４】
以下の安定化溶液を用いた：
I：  ０.７５％スクロース、０.４Ｍグリシン、０.１５Ｍ塩化ナトリウム
II：  ０.０１Ｍクエン酸ナトリウム、０.０８Ｍグリシン、０.０１６Ｍリジン、０.００２５Ｍ塩化カルシウム、０.４Ｍ塩化ナトリウム
III：  １％スクロース、０.１４Ｍアルギニン、０.１Ｍ塩化ナトリウム
IV：  １％スクロース、０.４Ｍグリシン、０.１４Ｍアルギニン、０.１Ｍ塩化ナトリウム、０.０５％ Tween 80
【００２５】
透析の前および後にＦ VIII：Ｃ活性を測定した。表２においては、透析後のＦ VIII：Ｃ活性を透析前の関連活性に対する％としてプロットされている。
【００２６】
【表２】
0003809501.tif 000003
【００２７】
ＩおよびIIに用いた溶液は１００〜２００IU／mgのＦ VIII：Ｃ比活性を有するアルブミン不含ＨＰ Ｆ VIII生成物をアルブミン添加なしに安定化するのに用いることができる。溶液IIIおよびIVは１０００IU／mg以上のＦ VIII：Ｃ比活性を有するＶＨＰ Ｆ VIII調製物の安定化に適している。