(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロテオグリカン型受容型プロテインチロシンホスファターゼ（ＰＴＰζ）をコードする遺伝子ＤＮＡの機能が染色体上で欠損した非ヒト動物と、野生型の非ヒト動物とに、被検物質を投与し、これら非ヒト動物におけるＰＴＰζ活性を比較・評価することを特徴とするＰＴＰζ活性促進又は抑制物質のスクリーニング方法であって、ＰＴＰζ活性の比較・評価が、中枢モノアミン神経系の機能の比較・評価であることを特徴とするＰＴＰζ活性促進又は抑制物質のスクリーニング方法。
【請求項２】
中枢モノアミン神経系の機能の比較・評価が、中枢モノアミン代謝レベルの変化、覚醒剤に対する感受性、中脳−辺縁ドーパミン神経系の機能的障害の有無、新しい環境に対する慣れの程度、又はストレス応答性の比較・評価であることを特徴とする請求項１記載のＰＴＰζ活性促進又は抑制物質のスクリーニング方法。
【請求項３】
プロテオグリカン型受容型プロテインチロシンホスファターゼ（ＰＴＰζ）をコードする遺伝子ＤＮＡの機能が染色体上で欠損した非ヒト動物と、野生型の非ヒト動物とに、被検物質を投与し、これら非ヒト動物におけるＰＴＰζ活性を比較・評価することを特徴とするＰＴＰζ活性促進又は抑制物質のスクリーニング方法であって、ＰＴＰζ活性の比較・評価が、ヘパリン結合性分泌タンパク質プレイオトロフィンによる胃粘膜障害の程度の比較・評価であることを特徴とするＰＴＰζ活性促進又は抑制物質のスクリーニング方法。
【請求項４】
ＰＴＰζをコードする遺伝子ＤＮＡの機能が染色体上で欠損した非ヒト動物が、４世代以上の戻し交配により純化された非ヒト動物であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載のＰＴＰζ活性促進又は抑制物質のスクリーニング方法。
【請求項５】
非ヒト動物がマウスであることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載のＰＴＰζ活性促進又は抑制物質のスクリーニング方法。
【請求項６】
プロテオグリカン型受容型プロテインチロシンホスファターゼ（ＰＴＰζ）をコードする遺伝子ＤＮＡの機能が染色体上で欠損した非ヒト動物と、野生型の非ヒト動物とに、被検物質を投与し、これら非ヒト動物におけるＰＴＰζ活性を比較・評価することを特徴とするＰＴＰζ活性の比較・評価法であって、ＰＴＰζ活性の比較・評価が、中枢モノアミン神経系の機能の比較・評価であることを特徴とするＰＴＰζ活性の比較・評価法。
【請求項７】
プロテオグリカン型受容型プロテインチロシンホスファターゼ（ＰＴＰζ）をコードする遺伝子ＤＮＡの機能が染色体上で欠損した非ヒト動物と、野生型の非ヒト動物とに、被検物質を投与し、これら非ヒト動物におけるＰＴＰζ活性を比較・評価することを特徴とするＰＴＰζ活性の比較・評価法であって、ＰＴＰζ活性の比較・評価が、ヘパリン結合性分泌タンパク質プレイオトロフィンによる胃粘膜障害の程度の比較・評価であることを特徴とするＰＴＰζ活性の比較・評価法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子相同組換え技術により作出した受容体型プロテインチロシンホスファターゼ（ＰＴＰζ／ＲＰＴＰβ）の遺伝子を欠損させたマウス等の非ヒト動物を用いた、中枢モノアミン神経系の機能障害の治療薬や、ヘリコバクター・ピロリ等による胃潰瘍の治療薬のスクリーニングや、中枢興奮剤（依存性薬剤）に対して低感受性の非ヒトモデル動物やピロリ菌毒素ＶａｃＡ等に対して低感受性の非ヒトモデル動物に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞に外界から刺激が加わると、細胞内のシグナル伝達経路が活性化され、細胞に増殖、分化、細胞死などが誘導される。細胞内蛋白質のチロシンリン酸化は、このシグナル伝達経路の種々の局面においてきわめて重要な役割を果たしており、蛋白質のチロシンリン酸化状態はチロシンキナーゼ（ＰＴＫ）とチロシンホスファターゼ（ＰＴＰ）両酵素の精巧なバランスによって常に動的平衡状態が保たれている。この蛋白チロシンリン酸化は、脳においては神経回路形成や神経伝達の効率の制御に関与すること（生体の科学第４８巻第６号５３４−５３８頁（１９９７）；蛋白質核酸 酵素 Ｖｏｌ．４３，Ｎｏ．８，１１３６−１１４３（１９９８））や、免疫系やその他の臓器においても、その機能の形成や維持に重要であることが知られている（蛋白質核酸 酵素 Ｖｏｌ．４３，Ｎｏ．８，１１３１−１１３５（１９９８））。一方、これら蛋白チロシンリン酸化の異常は、神経回路形成の不良、記憶・学習の阻害、異常なアポトーシス、腫瘍形成等に関与することが報告されている（蛋白質核酸 酵素 Ｖｏｌ．４３，Ｎｏ．８，１１８６−１１９２（１９９８））。
【０００３】
ＰＴＰは現在までに８０種以上が同定され、ヒトではその遺伝子は５００にも及ぶと推定されている。かかるＰＴＰには、ＰＴＫと同様にレセプター型と非レセプター型が存在し、レセプター型は、細胞内に２個あるいは１個の酵素領域をもち、細胞外領域の特徴によりいくつかのグループに分類され、Ｎ末端に炭酸脱水酵素領域を有するＰＴＰζは中枢神経系に特異的なレセプター型チロシンホスファターゼとして同定され、本発明者らはＰＴＰζがプレイオトロフィン、ミドカインといった増殖因子の受容体であることを報告している（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１，２１４４６−２１４５２，１９９６；Ｊ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．１４２，２０３−２１６，１９９８；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４，１２４７１−１２４７９，１９９９）。また、ＰＴＰζはＮ−ＣＡＭを初めとするイムノグロブリンスーパーファミリーに属する細胞接着分子と相互作用することが知られており、神経細胞の分化、移動、神経伝達において重要な機能を担うとされている。本発明者らは、既にＰＴＰζ遺伝子欠損マウスを作製し、ＰＴＰζが神経細胞とアストロサイトの両方に発現することを報告している（Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２７４，１３５−１３８，１９９８）。ＰＴＰζ遺伝子欠損型マウスは正常に発育・繁殖し、形態学的にも大きな異常所見は同定されていない。しかし、ＰＴＰζの生理的役割はほとんど分かっていないのが現状である。
最近、平山によりＰＴＰζが胃潰瘍の原因として有名なヘリコバクター・ピロリ菌が分泌する細胞外毒素、ＶａｃＡの受容体として機能している可能性が細胞株を使った実験系によって示された（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４，３６６９３−３６６９９，１９９９）。ピロリ菌毒素ＶａｃＡは急性胃炎及び胃潰瘍患者の約９０％で検出されており、ピロリ菌細胞外分泌毒素ＶａｃＡを経口投与されたマウスは急性胃炎を引き起こすことが報告されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
従来、その生理機能が不明であったＰＴＰζの生体内における役割が明確になると、ＰＴＰζの生理機能に関連した疾病等の発症機構の解明、その治療薬の開発に繋がる知見や実験材料の提供が可能となる。本発明の課題は、ＰＴＰζ遺伝子の欠損マウスを用いて同定されたＰＴＰζの生理的機能を利用することにより、中枢モノアミン神経系の機能障害の治療薬や、ヘリコバクター・ピロリ等による胃潰瘍の治療薬として有用なＰＴＰζ活性促進又は抑制物質のスクリーニング方法や、中枢興奮剤（依存性薬剤）に対して低感受性の非ヒトモデル動物やピロリ菌毒素ＶａｃＡ等に対して低感受性の非ヒトモデル動物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
前記のように、本発明者らが相同組換え技術を用いて既に作出しているが、このマウスは、２系統のマウス種、すなわち１２９／ＳｖとＣ５７ＢＬ／６Ｊの染色体が混ざった雑種であったため、他の遺伝子による影響を除外することが困難であった。そこで、ＰＴＰζの生理的機能の解析に適するように、純系のマウスに十分な戻し交配（４世代）を行い、他の遺伝子の影響を排除したＰＴＰζ遺伝子欠損マウスを作製した。このＰＴＰζをコードする遺伝子ＤＮＡの機能が染色体上で欠損したマウスと野生型マウスの比較解析により、正常に発育・繁殖しており、形態学的にも大きな異常所見が同定されていないＰＴＰζ欠損マウスが、中枢モノアミン代謝レベルの変化、覚醒剤（メタンフェタミン）に対する感受性の低下、中脳−辺縁ドーパミン神経系の機能的障害、新しい環境に対する慣れの遅滞、ストレス応答性の増大などの中枢モノアミン神経系に機能的な障害を持っていることを初めて見い出し、また、マウスの胃上皮細胞層に、ピロリ菌毒素ＶａｃＡの受容体と考えられるＰＴＰζが発現していることを確認し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち本発明は、（１）プロテオグリカン型受容型プロテインチロシンホスファターゼ（ＰＴＰζ）をコードする遺伝子ＤＮＡの機能が染色体上で欠損した非ヒト動物と、野生型の非ヒト動物とに、被検物質を投与し、これら非ヒト動物におけるＰＴＰζ活性を比較・評価することを特徴とするＰＴＰζ活性促進又は抑制物質のスクリーニング方法であって、ＰＴＰζ活性の比較・評価が、中枢モノアミン神経系の機能の比較・評価であることを特徴とするＰＴＰζ活性促進又は抑制物質のスクリーニング方法や、（２）中枢モノアミン神経系の機能の比較・評価が、中枢モノアミン代謝レベルの変化、覚醒剤に対する感受性、中脳−辺縁ドーパミン神経系の機能的障害の有無、新しい環境に対する慣れの程度、又はストレス応答性の比較・評価であることを特徴とする上記（１）記載のＰＴＰζ活性促進又は抑制物質のスクリーニング方法や、（３）プロテオグリカン型受容型プロテインチロシンホスファターゼ（ＰＴＰζ）をコードする遺伝子ＤＮＡの機能が染色体上で欠損した非ヒト動物と、野生型の非ヒト動物とに、被検物質を投与し、これら非ヒト動物におけるＰＴＰζ活性を比較・評価することを特徴とするＰＴＰζ活性促進又は抑制物質のスクリーニング方法であって、ＰＴＰζ活性の比較・評価が、ヘパリン結合性分泌タンパク質プレイオトロフィンによる胃粘膜障害の程度の比較・評価であることを特徴とするＰＴＰζ活性促進又は抑制物質のスクリーニング方法や、（４）ＰＴＰζをコードする遺伝子ＤＮＡの機能が染色体上で欠損した非ヒト動物が、４世代以上の戻し交配により純化された非ヒト動物であることを特徴とする上記（１）〜（３）のいずれか記載のＰＴＰζ活性促進又は抑制物質のスクリーニング方法や、（５）非ヒト動物がマウスであることを特徴とする上記（１）〜（４）のいずれか記載のＰＴＰζ活性促進又は抑制物質のスクリーニング方法に関する。
【０００７】
また本発明は、（６）プロテオグリカン型受容型プロテインチロシンホスファターゼ（ＰＴＰζ）をコードする遺伝子ＤＮＡの機能が染色体上で欠損した非ヒト動物と、野生型の非ヒト動物とに、被検物質を投与し、これら非ヒト動物におけるＰＴＰζ活性を比較・評価することを特徴とするＰＴＰζ活性の比較・評価法であって、ＰＴＰζ活性の比較・評価が、中枢モノアミン神経系の機能の比較・評価であることを特徴とするＰＴＰζ活性の比較・評価法や、（７）プロテオグリカン型受容型プロテインチロシンホスファターゼ（ＰＴＰζ）をコードする遺伝子ＤＮＡの機能が染色体上で欠損した非ヒト動物と、野生型の非ヒト動物とに、被検物質を投与し、これら非ヒト動物におけるＰＴＰζ活性を比較・評価することを特徴とするＰＴＰζ活性の比較・評価法であって、ＰＴＰζ活性の比較・評価が、ヘパリン結合性分泌タンパク質プレイオトロフィンによる胃粘膜障害の程度の比較・評価であることを特徴とするＰＴＰζ活性の比較・評価法に関する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、ＰＴＰζが中枢モノアミン神経系、特にドパミン神経系で生理学的に重要であることが初めて示され、ＰＴＰζのチロシンホスファターゼ活性を特異的に調節する薬剤はまだ開発されていないことから、ＰＴＰζ欠損マウスを用いて特異的な薬剤をスクリーニングすることにより、神経性疾患の新規治療薬の開発に繋がる可能性が大きい。また、本発明により、ピロリ菌が分泌する毒素ＶａｃＡの宿主側受容体として同定されたＰＴＰζが実際に胃で発現していることを組織学的に始めて明らかにして、また、ピロリ菌毒素ＶａｃＡによる胃潰瘍形成にＰＴＰζが重大な関与をしていることをマウス個体レベルで明確に示した。これらの結果は、ピロリ菌感染による胃潰瘍の発生メカニズムの解明や新規な胃潰瘍や胃炎の治療薬の開発に繋がる可能性が大きい。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明のＰＴＰζ活性促進又は抑制物質のスクリーニング方法としては、ＰＴＰζをコードする遺伝子ＤＮＡの機能が染色体上で欠損した非ヒト動物と、野生型の非ヒト動物とに、被検物質を投与し、これら非ヒト動物におけるＰＴＰζ活性を比較・評価（解析）するスクリーニング方法であれば特に制限されるものではなく、ＰＴＰζをコードする遺伝子ＤＮＡの機能が染色体上で欠損した非ヒト動物とは、例えばＰＴＰζをコードする非ヒト動物の内在性遺伝子の一部もしくは全部が破壊・欠損・置換等の遺伝子変異により不活性化され、野生型においてＰＴＰζを発現する機能を失なった非ヒト動物等をいう。また本発明における非ヒト動物としては、マウス、ラット、モルモット等の齧歯目動物を具体的に挙げることができるが、これらに限定されるものではない。以下、ＰＴＰζをコードする遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物の作製方法を、ＰＴＰζ遺伝子機能が染色体上で欠損したマウスを例にとって説明する。
【００１０】
ＰＴＰζ遺伝子機能が染色体上で欠損したマウス、すなわちＰＴＰζノックアウトマウスは、本発明者らの前掲の文献（Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｅｔｔｅｒｓ２７４，１３５−１３８，１９９８）に記載する方法等によって作製することができる。具体的には、マウス遺伝子ライブラリーからＰＣＲ等の方法により得られた遺伝子断片を用いて、ＰＴＰζ遺伝子をスクリーニングし、スクリーニングされたＰＴＰζ遺伝子の一部又は全部を、例えばＬａｃ−Ｚ遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等マーカー遺伝子で置換し、必要に応じて、５′末端側にジフテリアトキシンＡフラグメント（ＤＴ−Ａ）遺伝子や単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）遺伝子等の遺伝子を導入してターゲティングベクターを作製し、この作製されたターゲッティングベクターを線状化し、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション（電気穿孔）法等によってＥＳ細胞に導入し、相同的組換えを行い、その相同的組換え体の中から、Ｘ−ｇａｌによる染色あるいはＧ４１８やガンシクロビア（ＧＡＮＣ）等の抗生物質に抵抗性を示すＥＳ細胞を選択する。この選択されたＥＳ細胞が目的とする組換え体かどうかをサザンブロット法等により確認することが好ましい。
【００１１】
上記組換えＥＳ細胞をマウスの胚盤胞中にマイクロインジェクションし、かかる胚盤胞を仮親のマウスに戻し、キメラマウスを作製する。このキメラマウスを野生型のマウスとインタークロスさせると、ヘテロ接合体マウスを得ることができ、また、このヘテロ接合体マウスをインタークロスさせることによって、ＰＴＰζノックアウトマウスを得ることができる。また、得られたノックアウトマウスを純系マウスに戻し交配することにより、ＰＴＰζ以外の遺伝的背景が均一なＰＴＰζノックアウトマウスを得ることができる。かかる純系マウスとしてはどのような純系マウスを用いてもよいが、例えばＣ５７ＢＬ／６Ｊを具体的に挙げることができる。そして、かかるＰＴＰζノックアウトマウスにＰＴＰζが生起しているかどうかを確認する方法としては、例えば、上記の方法により得られたマウスの尾端の一部からＤＮＡを分離してサザンブロット法等により調べたり、このマウスの神経細胞等からＲＮＡを単離してノーザンブロット法等により調べたり、またこのマウスのＰＴＰζの発現をウエスタンブロット法等により調べる方法がある。
【００１２】
本発明におけるＰＴＰζ活性促進又は抑制物質のスクリーニング方法としては、ＰＴＰζをコードする遺伝子の機能が染色体上で欠損した非ヒト動物、例えば、ＰＴＰζノックアウトマウスと野生型マウス、好ましくは同腹の野生型マウスにそれぞれ被検物質を投与し、該ノックアウトマウスにおけるＰＴＰζ活性と野生型マウスにおけるＰＴＰζ活性とを比較・評価する方法を挙げることができる。また、上記ＰＴＰζ活性の比較・評価としては、実施例に詳しく説明されている、中枢モノアミン代謝レベルの変化、覚醒剤に対する感受性、中脳−辺縁ドーパミン神経系の機能的障害の有無、新しい環境に対する慣れの程度、又はストレス応答性の比較・評価等の中枢モノアミン神経系の機能の比較・評価や、ピロリ菌毒素ＶａｃＡとの結合の程度、特にＰＴＰζとピロリ菌毒素ＶａｃＡとの間の結合の阻害の程度の比較・評価や、ヘパリン結合性分泌タンパク質プレイオトロフィンとの結合の程度、特にＰＴＰζとヘパリン結合性分泌タンパク質プレイオトロフィンとの間の結合の阻害の程度の比較・評価を挙げることができる。
【００１３】
ＰＴＰζ活性促進又は抑制物質のスクリーニング方法における被検物質の投与方法としては、経口投与、静脈投与等特に制限されるものでなく、被検物質を投与後、ＰＴＰζノックアウトマウスと野生型マウスにおけるＰＴＰζ活性を測定し、その比較・評価が行われる。モノアミン神経系が関係する脳高次機能は多岐にわたっており、その機能的障害や変性は多様な病態に結びつくことが知られていることから、ＰＴＰζノックアウトマウスにおける中枢モノアミン神経系の機能障害が野生型マウスの機能と同程度まで改善・治癒された場合、かかる被検物質はＰＴＰζのアゴニストなどのＰＴＰζ活性促進物質であり、かかるＰＴＰζ活性促進物質は中枢モノアミン神経系機能障害の治療薬、例えば重篤な神経変性疾患であるパーキンソン病やハンチントン舞踏病、自閉症等に加えて、躁鬱病、多動症、薬物依存症などの神経性疾患の新規な治療薬として期待できる。また、中枢モノアミン神経系の機能の比較・評価により見出されたＰＴＰζ活性抑制物質は、以下に述べるピロリ菌毒素ＶａｃＡやヘパリン結合性分泌タンパク質プレイオトロフィンによる胃潰瘍や胃炎の治療薬として有用である可能性がある。
【００１４】
胃潰瘍の原因として有名なヘリコバクター・ピロリ菌が分泌する細胞外毒素、ＶａｃＡは急性胃炎及び胃潰瘍患者の約９０％以上で検出されており、ピロリ菌細胞外分泌毒素ＶａｃＡを経口投与されたマウスは急性胃炎を引き起こすことが知られていることから、野生型マウスにおけるピロリ菌毒素ＶａｃＡとの結合の程度がＰＴＰζノックアウトマウスのそれと同程度まで改善された場合、かかる被検物質はＰＴＰζのアンタゴニストや、ＰＴＰζとピロリ菌毒素ＶａｃＡとの間の結合阻害物質などのＰＴＰζ活性抑制物質であり、かかるＰＴＰζ活性抑制物質・ＰＴＰζ活性阻害剤は新規な胃潰瘍や胃炎の治療薬として期待できる。上記、ピロリ菌毒素ＶａｃＡとの結合の程度の比較・評価により見出されたＰＴＰζ活性促進物質は、中枢モノアミン神経系機能障害の治療薬として有用である可能性がある。ＰＴＰζとの結合により胃潰瘍を起こすことが本発明者らにより初めて明らかとなったプレイオトロフィンの胃潰瘍形成における関与は、これまで全く知られていない知見であり、ＰＴＰζ欠損マウスがプレイオトロフィンによる胃潰瘍形成の陰性コントロールである。
【００１５】
また、１８ｋＤのヘパリン結合性分泌タンパク質プレイオトロフィンは、本発明者らにより、ＰＴＰζとの結合により胃潰瘍を起こすことが初めて明らかとなったことから、野生型マウスにおけるプレイオトロフィンとの結合の程度がＰＴＰζノックアウトマウスのそれと同程度まで改善された場合、かかる被検物質はＰＴＰζのアンタゴニストや、ＰＴＰζとプレイオトロフィンとの間の結合阻害物質などのＰＴＰζ活性抑制物質であり、かかるＰＴＰζ活性抑制物質・ＰＴＰζ活性阻害剤は新規な胃潰瘍や胃炎の治療薬として期待できる。上記、プレイオトロフィンとの結合の程度の比較・評価により見出されたＰＴＰζ活性促進物質は、中枢モノアミン神経系機能障害の治療薬として有用である可能性がある。
【００１６】
本発明の興奮剤（依存性薬剤）に対して低感受性の非ヒトモデル動物としては、プロテオグリカン型受容型プロテインチロシンホスファターゼ（ＰＴＰζ）をコードする遺伝子ＤＮＡの機能が染色体上で欠損した、ＰＴＰζノックアウトマウス等であれば特に制限されるものではないが、４世代以上の戻し交配により純化したノックアウトマウスが好ましい。ＰＴＰζノックアウトマウスの有用性、特に興奮剤（依存性薬剤）に対して低感受性であることは全く知られておらず、かかる有用性は本発明により初めて明らかにされたものである。またここで、低感受性とは野生型非ヒト動物に比較して興奮剤に対する応答の程度が低いものをいい、本発明の興奮剤（依存性薬剤）に対して低感受性の非ヒトモデル動物には、感受性の程度が少し低いものから全く応答しない不応答性のものまで含まれる。また、上記興奮剤（依存性薬剤）としては、覚醒剤メタンフェタミン及び同様の作用を有するアンフェタミン、ドーパミントランスポーター阻害剤ＧＢＲ１２９０９と同様な作用を有するコカイン及び大麻類、セロトニン遊離剤のｐ−クロロ−アンフェタミンと同様な作用を有するＬＳＤ、ｆｌｕｏｘｅｔｉｎｅ、ｆｌｕｏｘａｍｉｎｅ、ｐａｒｏｘｅｔｉｎｅ、ｓｅｒｒｔｒａｌｉｎｅ等の抗うつ病剤として用いられるセロトニン再取込み選択的阻害剤（ＳＳＲＩ）などを挙げることができる。本発明の中枢興奮剤（依存性薬剤）に対して低感受性の非ヒトモデル動物は、覚醒剤（依存性薬剤）に対して低感受性であるほか、以下の実施例で詳細に述べられているように、中枢モノアミン代謝レベルの変化、中脳−辺縁ドーパミン神経系の機能的障害、新しい環境に対する慣れの遅滞、ストレス応答性の増大など、異常な神経学的性状を備えていることから、中枢興奮剤（依存性薬剤）に対する応答のメカニズムなど中枢神経系におけるシグナル伝達機構の解明に有用な実験モデル動物となるばかりか、上記のように、薬物中毒や神経性疾患の新規な治療薬のスクリーニングにも用いることができる。
【００１７】
本発明のピロリ菌毒素ＶａｃＡやヘパリン結合性分泌タンパク質プレイオトロフィンに対して低感受性の非ヒトモデル動物としては、プロテオグリカン型受容型プロテインチロシンホスファターゼ（ＰＴＰζ）をコードする遺伝子ＤＮＡの機能が染色体上で欠損した、ＰＴＰζノックアウトマウス等であれば特に制限されるものではないが、４世代以上の戻し交配により純化したノックアウトマウスが好ましい。ＰＴＰζノックアウトマウスの有用性、特にピロリ菌毒素ＶａｃＡやヘパリン結合性分泌タンパク質プレイオトロフィンに対して低感受性であることは全く知られておらず、かかる有用性は本発明により初めて明らかにされたものである。本発明のピロリ菌毒素ＶａｃＡやヘパリン結合性分泌タンパク質プレイオトロフィンに対して低感受性の非ヒトモデル動物は、ピロリ菌毒素ＶａｃＡやヘパリン結合性分泌タンパク質プレイオトロフィンによる胃潰瘍の発生メカニズムの解明に有用な実験モデル動物となるばかりか、上記のように、新規な胃潰瘍の治療薬のスクリーニングにネガティブコントロールとして有利に用いることができる。
【００１８】
以下、本発明を実施例により詳細の説明するが、本発明はかかる実施例により制限されるものではない。
【００１９】
［実施例１：中枢ドパミン神経系及びモノアミン神経系におけるＰＴＰζの生理的役割とＰＴＰζ欠損マウスの有用性］
ＰＴＰζは中枢神経系に大量に発現しているが、その神経生理学的な役割はわかっていない。そこで、ＰＴＰζ遺伝子欠損マウスと野生型マウスを行動学及び神経薬理学的に比較・解析することで、ＰＴＰζ分子の脳高次機能における重要性を個体レベルで調べた。
【００２０】
［実施例１−１：方法］
（Ａ−１ 動物）
ＰＴＰζ欠損マウスは、本発明者らの前掲の文献（Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２７４，１３５−１３８，１９９８）記載の方法で作製した。変異体マウスに、ＰＴＰζ遺伝子のエキソン１の翻訳開始コドンの直後にＬａｃＺ遺伝子を挿入し、従って、ＰＴＰζ遺伝子の発現調節ユニットのコントロールのもと、ＬａｃＺ遺伝子が発現する。本実験において、ノックアウトマウスを、同系交配Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系と４世代戻し交配し、同腹子のオスを生後２〜５ヶ月で使用した。２５℃の動物管理設備内、明暗１２／１２時間の周期で動物を保持し、無制限に餌と水を与えた。動物管理は、制度化されたガイドラインに基づき行った。
【００２１】
（Ａ−２ 行動実験）
午前７：００〜午後７：００の間の明周期において行動試験を行った。
Ａ−２−１
オープンフィールド試験において、格子状２５区分に同等に区切った灰色円形フィールド（内部直径８０ｃｍ、高さ４０ｃｍ）中央にマウスを配置した。５分間に跨いだ格子の区切り線の数を数え、これを自発運動として測定した。
Ａ−２−２
赤外線受動センサーシステム（ＡＢシステム２４Ａ、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，ｉｎｃ．製）を用いて日周期運動性を測定した。無制限に餌と水を与えながら７日間動物を個別に収容した通常サイズのマウスケージ（３０×２０×１３ｃｍ）の上部にセンサーを取り付け測定した。最後の３日間の測定データを用いて解析・評価を行った。
Ａ−２−３
強制遊泳試験においては、深さ８ｃｍまで２２℃の水を入れた円筒状容器（直径８ｃｍ、高さ２０ｃｍ）中でマウスを１５分間強制的に２日間連続で泳がせた。赤外線モニター装置（ＳＣＡＮＥＴＭＶ−１０、Ｔｏｙｏ Ｓａｎｇｙｏ Ｃｏ．Ｌｔｄ製）を用いて５分ごとに運動量を測定した。
Ａ−２−４
高架式十字迷路は、中央エリア（６×６ｃｍ）及び４本のアームを有し、床から５０ｃｍの高さに設置されている。２つの「暗路」は壁（３０ｃｍ）の覆いがあり、もう２つの「明路」には低い縁（１ｃｍ）が設けられている。マウスを迷路の中央に配置し、ほの暗い状態（約８０ルクス）で５分間に明路及び暗路に入った回数及びその中での滞在時間を測定した。
Ａ−２−５
オープンフィールドの容器とプラスチック製の立方体（一片＝９ｃｍ）を用いて、新規物体に対する探索行動の評価を行った。試験前日、マウスを１０分間ほどオープンフィールド内に入れ、事前にその環境に慣らしておき、試験当日、何も置いていないフィールド内にマウスを入れて９分間の観察を行い、次に、フィールド中央の領域の中心点に立方体型のプラスチック製積み木を静かに置き、さらに９分間の観察を行った。なお、観察の結果については、マウスがオープンフィールドの区切り線を横切った回数をカウントし、移動度として評価し、フィールド全域及び、フィールド中央の一定領域の区画線に対する横切り回数をそれぞれ評価した。
【００２２】
（Ａ−３ 薬理実験）
透明アクリルチャンバー（４０×４０×４０ｃｍ）内で電磁気運動モニターシステム（センサーユニット０６０３、スキャナー１０９９、Ｐａｎｌａｂ製）を用いて動物の動きを測定し、自発運動における精神刺激薬剤の作用を測定した。薬を投与する前に、動物は少なくとも９０分間測定環境に馴らされた。その後、動物に覚醒剤メタンフェタミン（ＭＥＴＨ）（１ｍｇ／ｋｇ，ｓ．ｃ．）、ＧＢＲ１２９０９（２ｍｇ／ｋｇ，ｉ．ｐ．）、アポモルヒネ（１ｍｇ／ｋｇ，ｓ．ｃ．）、又はｐ−クロロ−アンフェタミン（２ｍｇ／ｋｇ，ｉ．ｐ．）を与え、また、コントロールには生理食塩水を与え、その後６０分間自発運動を観察した。
【００２３】
（Ａ−４−１ ドーパミン及びその代謝産物の定量化）
氷上で脳組織を切除し、１０ｍＭ ＨＣｌＯ４、０．１ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ｐｙｒｏｓｕｌｆｉｔｅ、２０μＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ及び（±）イソプロテレノール１０ｐｇ／ｍｌを内部標準として含む溶液中で超音波処理により抽出し、１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清中のドーパミン及びその代謝産物を、電気化学検知器を用いた自動ＨＰＬＣ（ＣｏｕｌｏｃｈｅｍＩＩ、ＭＣｍｅｄｉｃａｌ，ｉｎｃ．製）により次の条件で測定した。ＭＣＭ Ｃ−１８カラム（４．６×１５０ｍｍ、ＭＣ ｍｅｄｉｃａｌ，ｉｎｃ．製）、３．１％アセトニトリル、７．６％メタノール、４．４ｍＭ１−スルホン酸ヘプタンナトリウム、及び０．１ｍＭＥＤＴＡ・２Ｎａを含む５０ｍＭ酢酸−クエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）を用い、３７℃に保ったカラムチャンバー内で流速１．０ｍｌ／分で分離した。作用電極は、＋４５０ｍＶにセットした。
【００２４】
（Ａ−４−２ インビボマイクロダイアリシス試験）
マウスにペントバルビタールナトリウム（８０ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｐ．）で麻酔をかけ、定位装置内に固定した。頭蓋骨にドリルで穴を開け、側坐核（ＮＡＣ）内に大脳内ガイドカニューレ（ＣＭＡ１１、ＣＭＡ／ＭｉｃｒｏｄｉａｌｙｓｉｓＡＢ製）を挿入し、歯科用セメントで固定した。野生型及びＰＴＰζ欠損マウスにおけるガイドカニューレの移植定位は、頭蓋プレグマ表面から前側＋１．１ｍｍ、腹側＋３．６ｍｍ、側側＋１．０ｍｍであった。手術後２４時間において、自発運動チャンバー（３０×３０ｃｍ）に設置された赤外線モニター装置（ＳＣＡＮＥＴ ＬＣ−１０、Ｔｏｙｏ Ｓａｎｇｙｏ Ｃｏ．Ｌｔｄ製）を設けた平衡レバーアームにマウスを拘束した。ガイドカニューレを通して透析プローブ（膜長１ｍｍ、外部直径０．２４ｍｍ、ｃｕｐｒｏｐｈａｎｅ ＣＵＰ１１、ＣＭＡ／Ｍｉｃｒｏｄｉａｌｙｓｉｓ ＡＢ製）を挿入し、ｐＨ７．４の人工大脳脊髄液（ＡＣＳＦ）（１４５．０ＮａＣｌ、２．７ＫＣｌ、１．２ＣａＣｌ２、１．０ＭｇＣｌ２、及び２．０ＮａＨ２ＰＯ４、いずれもｍＭ）を用いて流速２μｌ／分で潅流した。自由に動いている動物から２０分ごとに潅流水を、０．４Ｍ ＨＣｌＯ４２０μｌを含むチューブ内（ＣＭＡ１７０）に採取した。上記のようにＨＰＬＣ−ＥＣＤを用いてサンプルを回収し分析した。変更点として、カラムはＭＣＭＣ−１８（４．６×１５０ｍｍ）を用い、バッファーは７５ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、１．７ｍＭ １−オクタンスルホン酸ナトリウム塩、０．１ｍＭトリエチルアミン、２５μＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ及び１０％アセトニトリルを含み、３０℃で、流速は０．５５ｍｌ／分とした。電極は、＋３２０ｍＶにセットした。ＭＥＴＨの投与（１ｍｇ／ｋｇｓ．ｃ．）、又は高Ｋ＋溶液（４７．７ＮａＣｌ、１００．０ＫＣＬ、及び１．２ＣａＣｌ２、１．０ＭｇＣｌ２、及び２．０ＮａＨ２ＰＯ４、いずれもｍＭ、ｐＨ７．４、）の局所注入は定常状態になった後、微細透析プローブを通して行った。
【００２５】
（Ａ−５ 免疫組織化学）
ペントバルビトールナトリウムでマウスに麻酔をかけ、４％パラホルムアルデヒド溶液を潅流固定した。脳を切除し、３０％スクロースを含む４℃の０．１Ｍリン酸バッファー（ＰＢ）中で一晩インキュベートした。クリオスタット上で、前記脳を４０μｍ切片に切断した。前記切片を、３％Ｈ２Ｏ２及び０．０５％ＮＰ−４０を含む２０ｍＭＰＢ食塩水（ＰＢＳ）で３０分間処理し、ＰＢＳ中１０％正常ヤギ血清及び０．０５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００でブロックした。その後、ウサギ抗チロシンヒドロキシラーゼ（１：１０００）（ＡＢ１５２、Ｃｈｅｍｉｃｏｎｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ．製）を用いて前記切片を一晩インキュベートした。３，３ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）及びＨ２Ｏ２を基質として用いるとともに、ＡＢＣペルオキシダーゼキット（Ｖｅｃｔｏｒｓｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を製造者による使用説明書に基づき用い、特定抗体の結合を検出した。免疫組織化学分析前に、ヘテロ接合変異体マウスから得た組織切片をＸ−ｇａｌ染色し、ＰＴＰζ遺伝子発現を反映するβ−ガラクトシダーゼを検知した（Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ｌｅｔｔｅｒｓ ２７４，１３５−１３８，１９９８）。
【００２６】
（Ａ−６ ドーパミン取り込み試験）
以下の方法によりドーパミン（ＤＡ）取り込み量を測定した。線条体シナプトソーム（ｓｔｒｉａｔａｌ）組織プール（３個体／プール）を、テフロン（登録商標）ガラスホモジナイザーを用い１００ｖｏｌｕｍｅ（ｖ／ｗ）の０．３２Ｍスクロース中で均質化し、１２，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。未処理シナプトソームペレットを、３０ｍｇ／ｍｌ（元湿重量）の濃度の０．３２Ｍスクロース中で再懸濁し、各３０μｌの部分に分割した。［３Ｈ］ＤＡの濃度を増しながら（最終１〜１０ｎＭ、８８．５Ｃｉ／ｎｍｏｌ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＵＫ Ｌｔｄ．製）、Ｋｒｅｂｓ−Ｒｉｎｇｅｒリン酸バッファー２７０μｌと共に各部分に加えた。３分間、３０℃でのインキュベーション後、Ｗｈａｔｍａｎ ＧＦ／Ｃガラスフィルターを用いて濾過し、摂取を急速に終了させた。氷冷した０．３２Ｍスクロース２．５ｍｌでフィルターを３回濯ぎ、リキッドシンチレーション計数器を用いて５０％効率で測定した。１０μＭ ＧＢＲ１２９０９存在下において、ブランク値を測定した。
【００２７】
（Ａ−７ 単一細胞からのｃＤＮＡ合成）
前報の方法（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ １８，３１２４−３１３７，１９９８）でシングルセルからのｃＤＮＡを作製した。断頭後速やかにマウス脳を切除し、低Ｃａ２＋ＨＥＰＥＳバッファー食塩水（１４０．０Ｎａイセチオン酸塩、２．０ＫＣｌ、４．０ＭｇＣｌ２、０．１ＣａＣｌ２、２３．０グルコース、及び１５．０ＨＥＰＥＳ、いずれもｍＭ）中で、４００μｍの厚さの頭頂中脳切片になるようにマイクロスライサーで切断した。前記切片を、ＮａＨＣＯ３バッファー食塩水（１２６．０ＮａＣｌ、２．５ＫＣｌ、２．０ＭｇＣｌ２、２６．０ＮａＨＣＯ３、１．２５ＮａＨ２ＰＯ４、１．０ピルビン酸、０．２アスコルビン酸、０．１ＮＧ−ニトロ−Ｌ−アルギニン、１．０キヌレイン酸、及び１０．０グルコースを有し、ＮａＯＨでｐＨ７．４に調整、いずれもｍＭ）中室温で１時間保存した。腹側被蓋領域及び黒質を、低Ｃａ２＋中に取り出し、酸素処理セルスターチャンバー（Ｃｅｌｌ−ｓｔｉｒｃｈａｍｂｅｒ；Ｗｈｅａｔｏｎ，Ｉｎｃ．製）内において、３５℃のＨＥＰＥＳバッファーＨＢＳＳ中１ｍｇ／ｍｌプロナーゼで３０分間処理した。この組織を、低Ｃａ２＋ＨＥＰＥＳバッファー食塩水で３回濯ぎ、パステュールピペットで、繰り返しピペッティングすることにより細胞を分離した。細胞懸濁液を、顕微鏡上の、ＨＥＰＥＳバッファーＨＢＳＳが入った３５ｍｍルクスペトリ皿に注ぎ入れた。細胞が安定した後、溶液をＨＥＰＥＳバッファーに変更した。ジエチルピロ炭酸塩（ＤＥＰＣ）処理水で満たした電極ピペット中に細胞内容物を吸引した。該内容物を直ちに回収し、ＤＥＰＣ処理水（Ｈ２Ｏ）５μｌ、ＲＮＡｓｉｎ（２８，０００Ｕ／ｍｌ、Ｐｒｏｍｅｇａ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製）０．５μｌ、ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ（ＤＴＴ、０．１Ｍ）０．５μｌ、及びランダムヘキサマープライマー０．１μｌ（５０ｎｇ／μｌ）混合物中に加えた。該混合物を７０℃で１０分間熱した後、速やかに５分間氷冷却した。細胞ｍＲＮＡにＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（２００Ｕ／μｌ）（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）１μｌ、５×反応バッファー４μｌ、及び１０ｍＭ ｄＮＴＰ１μｌを加えることによりｃＤＮＡを合成した。総量２０μｌで、４２℃で５０分間反応後、７０℃で１５分間の処理を行った。
【００２８】
（Ａ−８ マルチプレックス及びネスティド（ｎｅｓｔｅｄ）ＰＣＲ）
前報の方法（ＥＭＢＯ Ｊ．１８，８３３−８４６，１９９９）を改良し、マルチプレックス及びネスティドＰＣＲを行った。単細胞由来のｃＤＮＡを３７℃のＲＮａｓｅ（１μｌ、２Ｕ／μｌ）で２０分間処理した。マーカー遺伝子のプライマーセットである、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッションス番号Ｍ６９２００）、グルタミン酸ジカルボキシラーゼ６７（ＧＡＤ６７、アクセッションス番号Ｚ４９９７６）、膠酸繊維タンパク質（ｇｌｉａｌ ａｃｉｄｉｃ ｆｉｂｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ；ＧＦＡＰ、アクセッションス番号Ｋ０１３４７）については、Ｌｉｓｓらの文献（ＥＭＢＯＪ．１８，８３３−８４６，１９９９）に報告され、ＰＴＰζを増幅するプライマーセット（アクセス番号Ｕ０９３５７）は本実験で作製された。ＴＨ、ＧＡＤ６７、ＧＦＡＰ、及びＰＴＰζのｃＤＮＡを、ファーストプライマー混合物（５′〜３′のＰＴＰζに対し、センス［配列番号１］：ＧＧＴ ＣＣＡ ＣＴＧ ＡＡＧ ＴＣＣ ＡＣＡ ＧＣ；ポジション５５１２〜５５３１、アンチセンス［配列番号２］：ＴＣＴ ＡＧＴ ＡＣＡ ＡＴＧ ＴＡＴ ＧＴＧ ＣＣＣ Ｇ；ポジション５９４８〜５９２７）を用いたマルチプレックスＰＣＲにより１本のチューブ内で同時に増幅した。最初のマルチプレックスＰＣＲは、シングルセルｃＤＮＡ５μｌ、各プライマー２０ｐｍｏｌ、ｄＮＴＰ２００μＭ、１０×ＰＣＲバッファー２μｌ、ＥＸ−Ｔａｑ（Ｔａｋａｒａ Ｓｈｕｚｏｃｏ．，ｌｔｄ．製）１Ｕを含み、最終量２０μｌになるように行った。ＰＣＲは、サーマルサイクラーＭＰ（Ｔａｋａｒａ）を用い、以下の条件で行った。９４℃で５分間の後、９５℃で３０秒間、６２℃で３秒間、７２℃で２分間の条件で２５サイクル行い、７２℃で５分間の処理を行った。４つの個別反応について、最初のＰＣＲ生成物０．１μｌ、ｄＮＴＰ２００μＭ、１０×ＰＣＲバッファー２μｌ、ＥＸ−Ｔａｑ０．５Ｕ、及び各プライマーペア１０ｐｍｏｌ（ＰＴＰζに対する、センス［配列番号３］：ＣＧＧ ＧＡＧ ＣＴＴ ＣＣＴ ＧＧＴ ＣＡＡ ＣＣＡ Ｇ；ポジション５６５５〜５６７７、アンチセンス［配列番号４］：ＡＧＣ ＡＣＧ ＧＧＴ ＡＧＧ ＧＡＧ ＴＡＣ ＴＣ；ポジション５８７３〜５８２４）を含み最終量２０μｌになるように、ネスティドＰＣＲを行った。ＰＣＲ生成物のうち５μｌ部分を、３％Ｎｕｓｉｖｅ３：１アガロースゲル（ＦＭＣ ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ、Ｒｏｃｋｌａｎｄ）上で電気泳動分離し、臭化エチジウム染色で明視化し、増幅断片の存在及びそのサイズについて調査した。ＰＣＲにより生成した８断片の予想サイズ（ｂｐ）は、１８９（ＰＴＰζ）、３７７（ＴＨ）、５１７（ＧＦＡＰ）、及び７０２（ＧＡＤ６７）であった。ＰＴＰζのプライマーは、ＰＴＰζ−Ａ及び−Ｂイソフォームの配列中にのみ存在し、ｐｈｏｓｐｈａｃａｎ（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（Ｔｏｋｙｏ），１２３，４５８−４６７，１９９８）としても知られているＰＴＰζ−Ｓには存在しない細胞内ホスファターゼドメインＤ１のみを増幅することができる。
【００２９】
[実施例１−２：結果］
（ＰＴＰζ欠損マウスの行動学的な表現型）
ＰＴＰζ欠損マウスの行動学的な表現型を明らかにするために、オープンフィールド試験によって行動観察を行った（前記方法Ａ−１及びＡ−２−１）。野生型マウス（ＰＴＰζ＋／＋、ｎ＝１０）及びＰＴＰζ欠損マウス（ＰＴＰζ−／−、ｎ＝１２）における（Ａ）自発運動及び（Ｂ）後ろ足立ちについて、オープンフィールド試験により連続２日間測定した結果が、それぞれ図１Ａ及び図１Ｂに示されている。図中のデータは、平均値±ＳＥＭ（＊ｐ＜０．０５）として示されている。その結果、初日のオープンフィールドにおいて、ＰＴＰζ欠損マウスは野生型マウスに比べてより多くの自発運動を示し、有意に高い運動性を示すといえるが、２４時間後のテストでは、その変化が消失していた（図１Ａ）。一方、探索行動の後ろ足立ち（ｒｅａｒｉｎｇ）値に有意な変化は認められなかった（図１Ｂ）。ＰＴＰζ欠損マウスは新規環境に対する自発運動の応答性が亢進していることが示された。
【００３０】
ホームケージ条件における、連日の自発運動を調べた（前記方法Ａ−２−２）。マウスを、個別に７日間飼育し、最後の３日間において赤外線受動センサーにより自発的運動を分析した（ＰＴＰζ＋／＋、ｎ＝１４及びＰＴＰζ−／−、ｎ＝１４）。結果を図１Ｃに示す。図中のデータは各３０分間間隔ごとの平均値±毎ＳＥＭデータを示す（＊ｐ＜０．０５）。ＰＴＰζ−／−マウスでは、野生型と比べ早暗期中において概日運動の最高点が著しく低下し、活動リズムは正常であるが、消灯直後（１９時から２４時）の活動ピークが野生型マウスに比べて有意に低いことが示された。
【００３１】
（脳内モノアミン代謝の異常）
自発運動やサーカディアンリズムは、脳内モノアミン神経と深く関係することが知れている。そこで、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）と電気化学検出器（ＥＣＤ）により、脳内のドパミン（ＤＡ）、ノルエピネフリン（ＮＥ）、セロトニン（５−ＨＴ）とそれらの代謝産物（ＤＡ代謝物ＤＯＰＡＣ，ＨＶＡ；ＮＥ代謝物ＭＨＰＧ；５−ＨＴ代謝物５−ＨＩＡＡ）の組織内含量を測定した（前記方法Ａ−４−１）。結果を図２に示す。図中のデータは、ＰＴＰζ＋／＋マウス（ｎ＝７）及びＰＴＰζ−／−マウス（ｎ＝７）からの平均値±ＳＥＭとして示されている（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１）。その結果、ＰＴＰζ欠損マウスの脳内ではモノアミン代謝が明らかに異常であることが判明した。ＤＡの組織含量は、両遺伝子型においてほぼ同様であった（Ａ）。しかし、ＤＯＰＡＣ／ＤＡ（Ｂ）、ＨＶＡ／ＤＡ（Ｃ）、５−ＨＩＡＡ／５−ＨＴ（Ｇ）の比率は、ＰＴＰζ欠損マウス脳の数領域において野生型マウスと比べて著しく低下した。ＮＥ含量は、ＰＴＰζ欠損マウスにおいて野生型マウスと比べて上昇していた。
【００３２】
（ＤＡ神経系の免疫組織学的解析）
次にＤＡ神経細胞のマーカー酵素となるチロシンハイドロキシラーゼに対する特異抗体を用いて、ＰＴＰζ欠損マウスのＤＡ神経系に組織学的な変化が生じていないか免疫組織学的に解析した（方法、Ａ−５）。結果を図３に示す。野生型マウス（＋／＋、左側）及びＰＴＰζ欠損マウス（−／−、右側）における黒質及び腹側被蓋領域（低倍率写真、ａ及びｂ、高倍率写真、ｃ及びｄ）を通る部分、及びｓｔｒｉａｔｕｍ（ｅ及びｆ）を、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）特異的ポリクローナル抗体を用いた免疫組織化学な分析結果によると、ＰＴＰζ欠損マウスと野生型マウスのＤＡ神経系に有意な相異は同定されず、ＰＴＰζ欠損後もＤＡ神経系は免疫組織学的に正常であると判断された。なお、図中の縮尺バーは、５００μｍ（ａ、ｂ、ｅ、及びｆ）、並びに５０μｍ（ｃ及びｄ）を示す。
【００３３】
（覚醒剤に対する感受性の低下）
覚醒剤であるメタンフェタミン（ＭＥＴＨ）は、ＤＡ神経系に働いてマウスの運動量を著しく増加させる。ＰＴＰζ欠損マウスのＤＡ神経系が機能的に変化している可能性を予想して、ＭＥＴＨに対する感受性を電磁場方式の運動量測定装置を用いて解析した（前記方法Ａ−３）。結果を図４に示す。マウスを、アクリルチャンバーに配置し、電磁気センサー計数により運動量を測定した。薬物投与前においてＰＴＰζ−／−マウス（ｎ＝９）及びＰＴＰζ＋／＋マウス（ｎ＝９）は、同じ時間経過における自発運動で示した。十分に慣れさせた後（少なくとも９０分間）、メタンフェタミン（ＭＥＴＨ、１ｍｇ／ｋｇ，ｓ．ｃ．）又は食塩水（矢印点）の注射により、野生型マウスと比べＰＴＰζ−／−マウスが著しく弱い自発運動応答を示すことが明らかとなった（図４Ａ）。コントロールの生理食塩水投与群に変化は認められなかった。データは、２０分間隔毎の平均値±ＳＥＭとして示されている（表現型に対しｐ＜０．００１）。
【００３４】
また、自発運動におけるＭＥＴＨ（１ｍｇ／ｋｇ，ｓ．ｃ．）、ＧＢＲ１２９０９（２ｍｇ／ｋｇ，ｉ．ｐ．）、アポモルヒネ（２ｍｇ／ｋｇ，ｓ．ｃ．）、ｐ−クロロ−アンフェタミン（２ｍｇ／ｋｇ，ｉ．ｐ．）及び食塩水の作用を、薬物投与後６０分間隔の運動量の総カウント数として図４Ｂに示す。自発運動測定は、上記と同様に行った。図中のデータは、平均値±ＳＥＭとして示されている（＊ｐ＜０．０５、＊＊＜０．０１）。ＰＴＰζ欠損マウスはＤＡＴの特異的な阻害剤であるＧＢＲ１２９０９に対しても同様に低感受性であった（図４Ｂ）。一方、ＤＡレセプターの非特異的アゴニストであるアポモルヒネは、ポスト側の神経細胞を刺激して同様の効果を発揮するが、アポモルヒネに対する応答性は正常であった（図４Ｂ）。以上の結果からはＰＴＰζ欠損マウスのＤＡ神経系ではプレ側の神経伝達機能が異常になっていることが示唆される。ＰＴＰζ欠損マウスは、プレ側シナプスから５−ＨＴを遊離させるｐ−クロロ−アンフェタミンに対しても低感受性を示した（図４Ｂ）。
【００３５】
［３Ｈ］ＤＡを線条体シナプトソームと混合して組織内への［３Ｈ］ＤＡ取り込み量を測定した（前記方法Ａ−６−１）。線条体シナプトソームのホモジネートを［３Ｈ］ＤＡ存在下（１〜１０ｎＭ）３０℃で２分間インキュベートした。Ｅａｄｉｅ−ＨｏｆｓｔｅｅプロットによりＤＡ摂取量を分析し、最高速度（Ｖｍａｘ、ｐｍｏｌ／２分間／ｍｇタンパク質）及び親和性（Ｋｍ、ｎＭ）を、３回の測定値の平均値±ＳＥＭを表１に示す（＊Ｐ＜０．０５）。表１から、ＤＡ取り込み量の、最大速度（Ｖｍａｘ）、親和性（Ｋｍ）、いずれも動力学的に変化していることが判明したが、ＤＡＴの数に変化は認められなかった。
【表１】
0003785460.tif 000002
【００３６】
（側坐核におけるＤＡ神経伝達の異常）
ＭＥＴＨやＧＢＲ１２９０９投与による自発運動の賦活効果は、主に側坐核（ＮＡＣ）で細胞外ＤＡ濃度が増加することにより誘導される。ＭＥＴＨ投与後の側坐核の細胞外ＤＡ濃度の変化をマイクロダイアリシス法によって解析した（前記方法Ａ−４−２）。ＮＡＣにおけるＭＥＴＨ誘導ＤＡ放出を、マイクロダイアリシスにより分析した結果を図５Ａに示す。各値は、ＰＴＰζ＋／＋マウス（ｎ＝７）及びＰＴＰζ−／−マウス（ｎ＝６）の平均値±ＳＥＭであり、ＭＥＴＨ刺激する前の２サンプルの平均をパーセントとして示している。野生型マウスと比べ（表現型に対しｐ＜０．００１）ＰＴＰζ欠損マウスは、ＭＥＴＨ（１ｍｇ／ｋｇ，ｓ．ｃ．）投与により起こるＤＡ放出の著しい減少を示した。野生型マウスの側坐核の細胞外ＤＡは、ＭＥＴＨ（１ｍｇ／ｋｇ，ｓ．ｃ）の投与により明瞭に増加していたが、一方、ＰＴＰζ欠損マウスでは、ＭＥＴＨ刺激による細胞外ＤＡ亢進応答が野生型に比べて明らかに減弱していた（図５Ａ）。
【００３７】
この細胞外ＤＡ濃度に対応して、ＭＥＴＨ投与後の自発運動はＰＴＰζ欠損マウスで低下していることが確認された。図５Ｂに、自由に移動している動物の運動量の赤外線モニター装置を用いた分析により、ＭＥＴＨ刺激後、野生型マウスと比べＰＴＰζ−／−マウスが統計的に低いＭＥＴＨ誘導運動を示すことが確認された結果を示す（＊ｐ＜０．０５）。すなわち、覚醒剤に対する低応答性の原因は、前側シナプスからのＤＡ放出・取り込み過程にあることが同定された。一方、側坐核に挿入したマイクロ透析プローブを通じて１００ｍＭＫＣｌ溶液を局所投与し脱分極を起こさせることによってシナプス小胞ドパミンＤＡ遊離を誘導した場合、ＰＴＰζ欠損マウスのＤＡ遊離応答は野生型マウスと同等のレベルで成立していた（図５Ｃ）。加えて、定常状態における細胞外ＤＡ濃度も変化していないことから（図５Ｄ）、ＰＴＰζはＤＡシナプス小胞の放出機構自体には必須でないことが示された。
【００３８】
（ＤＡ神経系におけるＰＴＰζの役割）
ＤＡ神経系におけるＰＴＰζの役割を知る上で、ＰＴＰζの発現領域を明らかにすることは非常に重要である。成熟脳におけるＰＴＰζの詳細な発現パターンは判っておらず、今回、ＰＴＰζ遺伝子のレポーター遺伝子であるＬａｃＺ遺伝子の発現パターンから本分子の発現領域の同定を行った。すなわち、Ｘ・ｇａｌで青く染色される細胞はＰＴＰζの発現細胞と同定される。成体マウスのＤＡサーキットにおいてＰＴＰζプロモーター活性を示す細胞の局所分布を、成体ヘテロ接合マウスにおいてＸ−ｇａｌ染色（青色シグナル）、次いでＴＨ染色（茶色シグナル）により調べた結果を図６Ａ，Ｂに示す。ＤＡ神経系の起始核である黒質（ＳＮ）や腹側被蓋（ＶＴＡ）には、多くの陽性細胞が認められたが、一方、ＤＡ神経の主要な投射領域である線条体（ＳＴ）や側坐核（ＮＡＣ）には検出されなかった。この結果はＰＴＰζ欠損によってＤＡ神経系のプレ側に機能的変化が同定された薬理学的な解析結果と一致している。
【００３９】
次に、ＰＴＰζがＤＡ神経細胞で直接機能している可能性を確かめるために、シングルセルから調製したＲＮＡを鋳型にしたＲＴ−ＰＣＲ解析であるシングルセルＲＴ−ＰＣＲ法による解析を試みた（前記方法Ａ−７及びＡ−８）。マウス脳由来のｃＤＮＡを鋳型としたシングルセルＲＴ−ＰＣＲを行い、アガロースゲル電気泳動により分析し、臭化エチジウムで染色した結果を図６Ｃの上段に示す。ＰＴＰζのホスファターゼＤ１領域、更にマーカー遺伝子、チロシンハイドロキラーゼ（ＴＨ、ドパミン神経細胞マーカー）、グルタミン酸脱炭酸酵素（ＧＡＤ６７，ＧＡＢＡ神経細胞マーカー）及びＧｌｉａｌ ｆｉｂｒａｒｙ ａｃｉｄｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＧＦＡＰ、アステログリア細胞マーカー）のＰＣＲ産物が、そのｍＲＮＡの塩基配列から予想される位置、すなわちＰＴＰζ（１８９）、ＴＨ（３７７）、ＧＡＤ６７（７０２）及びＧＦＡＰ（５１７）にそれぞれ検出された。これらのＰＣＲ産物の正当性はクローニング後、ＤＮＡシークエンスによって確認した。プライマーはイントロンを挟むように設定してあるのでゲノムＤＮＡ由来のＰＣＲ増幅はおこらない。また、逆転写酵素を加えないコントロールではＰＣＲ増幅は認められなかった。図６Ｃの下段は、ＴＨ陽性（ＤＡ細胞）とＧＡＤ陽性（ＧＡＢＡ細胞）と同定された代表例を示している。マウス４匹分の黒質及び腹側被蓋から４６個の細胞を採取・解析した結果、ＴＨ陽性のドパミン神経細胞２８個及びＧＡＤ６７陽性のＧＡＢＡ神経細胞６個が同定された。この際、ＴＨもしくはＧＡＤのどちらも増幅しない８例、ＧＦＡＰの増幅が認められた４例は解析から除外している。ＰＴＰζのＰＣＲ産物は８３％のＤＡ細胞において増幅が認められた（図６Ｄ）。すなわち、マウス成熟脳においては、ほとんどのＤＡ神経細胞において蛋白チロシン脱リン酸化の活性を有したレセプター型ＰＴＰζが発現していることが証明された。
【００４０】
（強制遊泳ストレスに対する応答性の変化）
ＤＡ及び５−ＨＴ神経系は、自発運動だけでなく情動やストレス応答に関係することが知られている。強制遊泳ストレス試験では、逃げられない状況下の狭いプールにマウスを投入して、その泳動時間を経時的に評価・解析した（前記方法方法Ａ−２−３）。すなわち、動物は当初、ストレス刺激から逃れようと盛んに泳ぐが、逃避不可能な状況に対して絶望し、次第に無動状態になると考えられている。初日の１５分間の試験はうつ状態を誘導するために行う実験である。このテストにおいて、欠損マウスと野生型マウスの泳動時間に有意な違いは認められない（図７Ａ）。しかし、２４時間後のテストにおいては、ＰＴＰζ欠損マウスは野生型よりも長い時間泳ぎ回っていることが示された（図７Ｂ）。１５分間のテスト中、マウスの運動量は徐々に減少し、最後１０分間中の運動レベルは、野生型コントロール（ｎ＝８）と比べＰＴＰζ欠損マウス（ｎ＝８）において有意に高かった。すなわち、ＰＴＰζ欠損マウスはストレス刺激に対して慣れにくいことが判った。
【００４１】
次に情動行動、特に不安の評価法として一般的な高架式十字迷路試験を行った（前記方法Ａ−２−４）。本テストでは、マウスは明るいと不安になるため明路を避けようとするが、同時にこの場所を探索したいという葛藤的な条件にさらされている。すなわち、不安になりやすい動物は明路を避けて暗路に長く滞在するようになる。一方、探索意欲が強いマウスでは、探索行動が増加し明路−暗路への出入りが増加する。ＰＴＰζ欠損マウス（ｎ＝９）及び野生型コントロール（ｎ＝１２）の間で高架迷路における挙動に明らかな差異は見られなかった（図７Ｃ）。さらに、探検挙動測定値である迷路のアーム部に入った総回数においても、２表現型間で差異は見られなかった（図７Ｄ）。これらの２つの因子、明路−暗路の滞在時間（不安行動）及び全入路回数（探索行動）はどちらのマウスも同等と評価された。
【００４２】
（新規物体に対する探索行動の変化）
初めて見る対象物に対する探索行動を調べた（前記方法Ａ−２−５）。結果を図８に示す。ＰＴＰζ欠損マウス（ＰＴＰζ−／−、ｎ＝９）及び野生型コントロール（ＰＴＰζ＋／＋、ｎ＝９）について、オープンフィールド全域（図８Ａ）及び、オープンフィールド中央領域（図８Ｂ）における移動度を各３分毎の平均値±標準誤差で示す（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１）。測定１回目（Ｔｒｉａｌ．１）では、最初の９分間はフィールド内には何も置かれていない。この環境下では、両マウスとも中央領域内にほとんど滞在していないことがわかる。続いて、積み木（初めて見る物体）をフィールド中央に置くと、マウスは積み木に対する探索行動をとり、中央領域への侵入・退出頻度が著しく増加する。全体的な移動度もそれに伴い増加した。また、グラフからは、積み木に対する探索行動は時間経過とともに減少していることが示された。両マウスを比較すると、積み木を置いた中央領域での最初の３分間の移動量は、ＰＴＰζ−／−マウスが野生型マウスの２倍以上高値であり、６分間まで有意に高値を維持した。２４時間後、同条件の２回目の試行（Ｔｒｉａｌ．２）を行った。野生型マウス（ＰＴＰζ＋／＋）は、移動量がほとんど増加しないことから、もはや積み木に対する探索行動していないと判断されるが、ＰＴＰζ−／−マウスでは、同様に探索行動によると考えられる移動度の亢進が示された。さらに３回目の試行（Ｔｒｉａｌ．３）を行ったところ、両マウスに有意な差異は認められなくなった。以上の結果より、ＰＴＰζ−／−マウスは、新しい環境に対する慣れが遅延していることが示された。
【００４３】
［実施例２：ピロリ菌毒素ＶａｃＡによる胃潰瘍形成におけるＰＴＰζの役割］
ヘリコバクターピロリ菌による胃潰瘍形成におけるＰＴＰζの役割、特に胃におけるＰＴＰζの免疫組織学的同定、ヘリコバクター・ピロリ菌が分泌する細胞外毒素ＶａｃＡの受容体としてＰＴＰζが実際に胃潰瘍形成に関与していること、また、その陰性コントロールとしてのＰＴＰζ欠損マウスの有用性について検討した。
【００４４】
［実施例２−１：方法］
（Ｂ−１ マウスの胃におけるＰＴＰζの免疫組織化学染色）
ホルマリン固定及びパラフィン包埋した野生型及びＰＴＰζ欠損マウスの胃組織切片を、ＰＴＰζの細胞外領域を認識する抗６Ｂ４プロテオグリカンポリクローナル抗体で免疫染色した。組織切片をキシレン中で脱パラフィン化し、エタノール系列中で脱水した。前記切片を、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．６）で洗浄し、１０ｍＭクエン酸バッファー（ｐＨ６．０）中で１５分間マイクロ波をかけた。０．３％過酸化水素を用い、脱パラフィン化切片を１０分間インキュベートし、内在性ペルオキシダーゼをブロックした後、ＰＢＳ中で洗浄した。その後、前記切片をウシ血清アルブミンで１０分間ブロックし、ＰＢＳで洗浄した。処理済み組織切片を、キャリアータンパク質及び１５ｍＭアジ化ナトリウムを含む４℃のＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー中、抗６Ｂ４プロテオグリカンポリクローナル抗体（１：２０００）で一晩インキュベートした。ＰＢＳで洗浄後、製造者説明書に基づきＤＡＢ及びＨ２Ｏ２を基質としてＤＡＫＯＥｎｖｉｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＤＡＫＯ Ｃｏｒｐ．）で特異抗体結合を調べた。前記切片を、ヘマトキシリンでわずかに対比染色した。
【００４５】
（Ｂ−２ マウスの胃におけるＰＴＰζのＲＴ−ＰＣＲ及びウエスタンブロット）
マウスの胃におけるＰＴＰζのＲＴ−ＰＣＲは以下の方法で行った。マウス胃組織からのＲＮＡ抽出には、ＴＲＩｚｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、ｃＤＮＡの合成には、ＴｒｕｅＳｃｒｉｐｔＩＩ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ｋｉｔ（サワデーテクノロジー）とｏｌｉｇｏ ｄＴ ｐｒｉｍｅｒ（ｄＴ）３０を用いた。１０ｎｇのＲＮＡ由来のｃＤＮＡを鋳型として、１０ｐｍｏｌのプライマー、０．５ＵのＥＸ−Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造株式会社）及びＥＸ−Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ付属の反応バッファー類で計２０μｌでＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応では、９４℃５分間を１サイクル、９５℃３０秒、６２℃３秒、７２℃２分間を３５サイクル、最後に、７２℃５分間を１サイクル行った。さらに、ＰＣＲ増幅産物の配列の正当性は、ＤＮＡシークエンスを調べることを行って確認した。ＰＴＰζのそれぞれのアイソフォームに対するＰＣＲ領域はＰＴＰζ−Ａタイプ（ヌクレオチド番号４８６１−５４９９）、ＰＴＰζ−Ｂタイプ（２３２１−２８７５）、ＰＴＰζ−Ｓタイプ（４９１３−５７０４）である。
【００４６】
マウスの胃におけるＰＴＰζの検出のためのウエスタンブロットは以下の方法で行った。胃組織を１％ＮＰ−４０とタンパク分解酵素阻害剤を含むＴｒｉｓバッファーで懸濁・抽出を行い、その抽出物の遠心分離上清に、コンドロイチナーゼＡＢＣを添加、又は無添加で３７℃で１時間静置した。さらにタンパクは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（６％アクリルアミドゲル）により分離、セミドライ方式でＰＶＤＦ膜に転写した。また、免疫染色にはウサギ抗６Ｂ４ポリクローナル抗体（１μｇ／ｍｌ）と、ペルオキシダーゼ標識した抗ウサギ抗体を２次抗体として用い、ＰＴＰζの検出を行った。反応基質には、ＥＣＬ Ｐｌｕｓ ｒｅａｇｅｎｔ（アマシャムファルマシア）を用いた。
【００４７】
（Ｂ−３ ピロリ菌毒素ＶａｃＡによる胃潰瘍形成）
４週齢のマウス（メス）を２４時間絶食させた後（飲水は自由）、ピロリ菌毒素ＶａｃＡ又は生理食塩水をゾンデによって経口的に投与した。４８時間後に胃標本を作製して、実体顕微鏡下で胃内部の表面を観察した後、ヘマトキシレン・エオジン染色法によって病理標本を作製・解析した。
【００４８】
（Ｂ−４ ＶａｃＡによる胃潰瘍形成の病理評価）
ＶａｃＡによる胃潰瘍形成の病理評価については、胃粘膜障害スコアー（ＥＤＳ）の評価（１＝障害なし。２＝上皮カラム構造の乱れ。３＝微小領域でのびらん形成及び上皮細胞の剥離。４＝浸食性の障害、基底膜の露出及び潰瘍形成。）を行った。また、炎症スコアー（ＩＳ）の評価（１＝炎症細胞浸潤なし、２＝胃腺管の間（ｌａｍｉｎａ ｐｒｏｐｉａ）と粘膜下層における散発的な単核球の浸潤、３＝ｌａｍｉｎａ ｐｒｏｐｉａの上皮層への浸潤細胞の明瞭な増加、４＝ｌａｍｉｎａ ｐｒｏｐｒｉａへの著しい細胞浸潤。）についても行った。
【００４９】
（Ｂ−５ ＡＺ−５２１細胞におけるＰＴＰζの基質分子ＧＩＴ１のリン酸化レベル及び細胞空胞化の解析）
ＡＺ−５２１細胞におけるＰＴＰζの基質分子ＧＩＴ１（Ｇｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｋｉｎａｓｅ−ｉｎｔｅｒａｃｔｏｒ １）（ＰＮＡＳ，９８，６５９３−６５８９，２００１）のリン酸化レベル及び細胞空胞化の解析をするために、以下のニュートラルレッドの取り込み、及び免疫沈降法行った。まず、ＶａｃＡ高感受性のヒト胃由来の癌化細胞株ＡＺ−５２１（ヒューマンサイエンス研究資源バンク）を用いて、細胞密度が３５０，０００／ｃｍ２となるようにプレートに接種し、２４時間培養後に酸活性化処理したＶａｃＡを１００ｎｇ／ｍｌのＥＧＦと共に添加した。刺激３０分後、細胞空胞化（ニュートラルレッド取り込み）及びＧＩＴ１のチロシンリン酸化レベル（免疫沈降法）を解析した。
【００５０】
ニュートラルレッドの色素取り込み試験は以下の方法で行った。培地成分を除いた後、０．０５％のニュートラルレッドと０．５％のＢＳＡを含むリン酸バッファーを添加して、５分間細胞に取り込ませた。そして０．５％のＢＳＡを含むリン酸バッファーで細胞を３度洗浄した後、細胞内に取り込まれた色素を０．０５％の塩酸を含む７０％エタノールで抽出し、吸光度（５４０ｎＭ）を測定した。
次にＧＩＴ１のチロシンリン酸化試験は以下の方法で行った。１．９×１０６個の細胞に、３００ｕｌの溶解バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、１％ＮＰ−４０、１ｍＭｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ ｆｌｕｏｒｉｄｅ、１０μｇ／ｍｌ ｐｅｐｓｔａｔｉｎＡ、１ｍＭｓｏｄｉｕｍ ｏｒｔｈｏｖａｎａｄａｔｅ、及び１ｍＭ ＮａＦ）を加え、氷上で３０分間放置した。この抽出物を遠心分離後、上清のタンパク濃度を１００μｇ／ｍｌに調整した。２５μｇのサンプルを、２５μｌのＰｒｏｔｅｉｎ Ｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ＦＦ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）と２時間混合し、ゲルと非特異的吸着する成分を除去した上清を調整した。この上清に２μｌのウサギ抗ＧＩＴ１抗血清を加え、１時間の反応後、２５μｌのＰｒｏｔｅｉｎ Ｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ＦＦを添加し、さらに３時間の反応を行った。反応後のビーズは、溶解バッファーで３回洗浄した後、特異的に吸着している成分をＳＤＳ−ＰＡＧＥのサンプルバッファーで抽出した。このサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離後、セミドライ方式でＰＶＤＦ膜に転写し免疫沈降に用いた。なお、ＧＩＴ１のチロシンリン酸化の検出には、抗チロシンリン酸化マウスモノクローナル抗体ＰＹ２０を用い、ＧＩＴ１の検出には、ヤギ抗ＧＩＴ１抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）を用いた。
【００５１】
［実施例２−２：結果］
（マウス胃上皮細胞層におけるＰＴＰζの発現）
ＰＴＰζの細胞外ドメインを特異的に認識する、ウサギポリクロナール抗体を用いて、マウス胃上皮細胞層にＰＴＰζが発現しているかどうかを調べた結果を図９（参考資料３参照）に示す。野生型マウス（図９Ａ）及びＰＴＰζ欠損マウス（図９Ｂ）からもわかるように、野生型マウスの胃上皮細胞層にＰＴＰζが発現していることが始めて明らかになった。元来、ＰＴＰζは中枢神経系のみで発現しているとされていたが、胃での発現は脳に比べて非常に低レベルでバックグラウンドとの識別ができなかったためと思われる。本発明では、ＰＴＰζ欠損マウスを陰性コントロールとして用いた結果、非常に高感度な免疫染色の条件を設定することができた。
【００５２】
（マウス胃上皮細胞層におけるＰＴＰζアイソフォームの発現）
ＲＴ−ＰＣＲの結果から、胃組織においてＰＴＰζ−Ａタイプ、ＰＴＰζ−Ｂタイプ、ＰＴＰζ−Ｓタイプの全てのスプライスバリアントが発現していることが確認された（図１０Ａ）。一方、ウエスタンブロット解析からは、実際のタンパク成分としては、レセプター型のＰＴＰζ−Ｂタイプが主要であること、また、コンドロイチナーゼＡＢＣ処理によって電気泳動上の移動度が変化しないことから、ＰＴＰζ−Ｂタイプは、コンドロイチン硫酸修飾を受けていない性状であることが示された（図１０Ｂ）。
【００５３】
（マウス胃表皮における潰瘍の発生）
ＶａｃＡ投与後４８時間のマウス胃表皮における潰瘍の発生を実体顕微鏡を用いて調べた。結果を図１１に示す。ＶａｃＡを投与した野生型マウスの胃には７匹中３匹において顕著な潰瘍状の障害が認められ（矢印部分、図１１Ａ）、残り４匹についても程度は軽いが、びらん形成や胃表層に明瞭な脱落が認められた。一方、ＶａｃＡを経口投与したＰＴＰζ欠損マウスの胃（７匹）には有意な障害は認められなかった（図１１Ｂ）。ＶａｃＡを投与した野生型マウス標本のヘマトキシレン・エオジン染色の結果では、明らかに潰瘍が形成されており（図１１Ｃ低倍率及び図１１Ｄ高倍率の矢印部分）、ヘリコバクター・ピロリ菌感染によるヒトの病態と非常に酷似している様子が認められたが、一方、ＰＴＰζ欠損マウスは全く正常であることから（図１１Ｅ）、ＶａｃＡによる潰瘍形成にＰＴＰζが必須の役割を担っていることが個体レベルで初めて明らかになった。生理食塩水投与群は野生型マウス（図１１Ｆ）及びＰＴＰζ欠損マウスはどちらも正常であった。
【００５４】
（マウス胃表皮の潰瘍形成の病理評価）
胃粘膜障害（ＥＤＳ）及び炎症（ＩＳ）の程度を上記（Ｂ−４）の方法に従って評価した。ＥＤＳ及びＩＳの平均値±標準誤差を表２に示す。野生型マウス（ＰＴＰζ＋／＋）においては、ＶａｃＡ投与用量に依存した胃粘膜障害及び炎症が認められたが、ＰＴＰζ欠損マウス（ＰＴＰζ−／−）では、全く異常が認められなかった。なお、表中の＃、Ｐ＜０．０５：＃＃、Ｐ＜０．００１は、生理食塩水を投与した野生型マウスとの比較、＊＊、Ｐ＜０．００１は、ＶａｃＡ（０．５ｍｇ／ｋｇ）を投与した野生型マウスとの比較をＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ’ｓ Ｕ ｔｅｓｔで行った結果である。また、ｎｄの記述は解析を行っていないことを意味する。
【表２】
0003785460.tif 000003
【００５５】
（ＡＺ−５２１細胞におけるＰＴＰζの基質分子ＧＩＴ１のリン酸化レベル及び細胞空胞化の解析）
ＶａｃＡ刺激によるＰＴＰζの基質分子ＧＩＴ１のチロシンリン酸化を調べた結果を図１２に示す。ＶａｃＡ高感受性株ＡＺ−５２１細胞において、ＶａｃＡ刺激によりＰＴＰζの基質分子であるＧＩＴ１のチロシンリン酸化レベルが用量依存的に減少していること（図１２Ａ）、ＧＩＴ１リン酸化の減少は、細胞へのニュートラルレッドの取り込み（空胞形成の指標）（図１２Ｂ）と相関関係にあることが示された。ＶａｃＡの細部毒性は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて細胞空胞化能として評価され、ＶａｃＡはＰＴＰζの活性を亢進させ、ＧＩＴ１のチロシンリン酸化を低下させることによって空胞形成に関与している可能性が示された。
【００５６】
［実施例３：プレイオトロフィンによる胃潰瘍形成におけるＰＴＰζの役割］
プレイオトロフィンは、１８ｋＤのヘパリン結合性分泌タンパク質で、神経栄養因子様活性、神経細胞の接着、突起伸長、血管新生への関与が知られている（ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ用語ライブラリー：「サイトカイン・増殖因子」、羊土社、ｐ１２６−１２７，１９９８）。また、ＰＴＰζの細胞外領域と結合し（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１，２１４４６−２１４５２，１９９６）、ＰＴＰζの活性を変化させることが示されている（ＰＮＡＳ，９７，２６０３−２６０８．２０００）。そこで、プレイオトロフィンが胃潰瘍形成に関与しているかどうかについて調べてみた。
【００５７】
［実施例３−１：方法］
プレイオトロフィンによる胃潰瘍形成におけるＰＴＰζの役割は以下の方法で調べた。４週齢のマウス（メス）を２４時間絶食させて後（飲水は自由）、プレイオトロフィン（ペプチド研究所）をゾンデによって経口投与した。４８時間後に胃標本を作製して、実体顕微鏡下で胃内部の表面を観察した後、ヘマトキシレン・エオジン染色法により病理標本を作製・解析した。
【００５８】
［実施例３−２：結果］
プレイオトロフィン投与後、４８時間のマウス胃上皮における胃粘膜障害の程度を実体顕微鏡下で調べた。結果を図１３に示す。プレイオトロフィンを投与した野生型マウスの胃には、著しい出血が認められた（図１３Ａ）。一方、プレイオトロフィンを投与したＰＴＰζ−／−マウスの胃には障害が認められなかった（図１３Ｂ）。プレイオトロフィンを投与した野生型マウス標本のヘマトキシレン・エオジン染色の結果、胃上皮に明らかな障害が認められた（図１３Ｃ）。一方、ＰＴＰζ欠損マウスは全く正常であった（図１３Ｄ）。以上の結果、ＰＴＰζとリガンド分子の結合により潰瘍を惹起することが初めて明らかとなった。プレイオトロフィンの胃潰瘍形成における関与は、これまで全く知られていない知見であり、ＰＴＰζ欠損マウスがプレイオトロフィンによる胃潰瘍形成の陰性コントロールとして非常に有用であることが示された。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】第１図は、オープンフィールド試験及び概日リズムにおけるＰＴＰζ欠損マウスの性質表現型を調べた結果を示す図である。
【図２】第２図は、ＰＴＰζ欠損マウス脳におけるモノアミンの代謝変化を示す図である。
【図３】第３図は、ＰＴＰζ欠損マウスにおけるドーパミン神経系の免疫組織化学の結果を調べた結果を示す図である。
【図４】第４図は、ＰＴＰζ欠損マウスにおけるメタンフェタミン及びＧＢＲ１２９９０９に対する自発運動応答性の低下を示す図である。
【図５】第５図は、ＰＴＰζ欠損マウスの側坐核におけるＤＡ神経伝達の異常を示す図である。
【図６】第６図は、成体マウス脳のドーパミン神経系におけるＰＴＰζの発現特性を調べた結果を示す図である。
【図７】第７図は、ＰＴＰζ欠損マウスにおけるストレス及び恐怖行動の結果を示す図である。
【図８】第８図は、野生型マウスとＰＴＰζ欠損マウスの新規物体に対する探索行動の結果を示す図である。
【図９】第９図は、野生型マウスとＰＴＰζ欠損マウスの胃上皮細胞層におけるＰＴＰζの発現を調べた結果を示す図である。
【図１０】第１０図は、マウス胃上皮細胞層におけるＰＴＰζの転写（ＲＴ−ＰＣＲ）及び発現（ウエスタンブロット）を調べた結果を示す図である。
【図１１】第１１図は、ピロリ菌毒素ＶａｃＡを経口投与した野生型マウスとＰＴＰζ欠損マウスにおける胃潰瘍形成の結果を示す図である。
【図１２】第１２図は、ＶａｃＡ刺激によるＰＴＰζの基質分子ＧＩＴ１のチロシンリン酸化を調べた結果を示す図である。
【図１３】第１３図は、プレイオトロフィン投与によるマウス胃上皮における胃粘膜障害の結果を示す図である。
【配列表】
0003785460.tif 000004
0003785460.tif 000005
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
0003785460.tif 000013
【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
0003785460.tif 000018