(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のプラスミド２）及び３）、または１）〜３）を酵母の染色体上に組み込んでなることを特徴とする形質転換体。
１）大腸癌Colon6由来の抗原に対するマウスモノクローナル抗体のアミノ酸配列：
0003739009.tif 000017
からなるＬ鎖Ｖ領域をコードするDNA配列を有するマウス抗体Ｌ鎖Ｖ領域遺伝子断片及びヒト抗体Ｌ鎖Ｃ領域遺伝子断片を含むキメラＬ鎖ＤＮＡおよび
大腸癌Colon6由来の抗原に対するマウスモノクローナル抗体のアミノ酸配列：
0003739009.tif 000018
からなるＨ鎖Ｖ領域をコードするDNA配列を有するマウス抗体Ｈ鎖Ｖ領域遺伝子断片及びヒト抗体Ｈ鎖Ｃ領域遺伝子断片を含むキメラＨ鎖ＤＮＡからなるキメラ抗体ＤＮＡ並びにＰＧＫプロモーターおよびＬＥＵ２遺伝子を担持するプラスミド。
２）前記１）に記載のキメラ抗体ＤＮＡ、ＰＧＫプロモーターおよびＵＲＡ３遺伝子を担持するプラスミド。
３）前記１）に記載のキメラ抗体ＤＮＡ、ＰＧＫプロモーターおよびＨＩＳ４遺伝子を担持するプラスミド。
【請求項２】
酵母がサッカロマイセス属であることを特徴とする請求項１記載の形質転換体。
【請求項３】
酵母がサッカロマイセス・セレビシエであることを特徴とする請求項１又は２記載の形質転換体。
【請求項４】
酵母がサッカロマイセス・セレビシエＡＨ２２又はその変異株であることを特徴とする請求項１〜３の何れか１項に記載の形質転換体。
【請求項５】
酵母がサッカロマイセス・セレビシエＡＨ２２のウラシル栄養要求性変異株であることを特徴とする請求項１〜４の何れか１項に記載の形質転換体。
【請求項６】
該Ｌ鎖Ｖ領域をコードするDNA配列を有するマウス抗体Ｌ鎖Ｖ領域遺伝子断片が、
0003739009.tif 000019
で示され、該Ｈ鎖Ｖ領域をコードするDNA配列を有するマウス抗体Ｈ鎖Ｖ領域遺伝子断片が、
0003739009.tif 000020
で示されることを特徴とする請求項１〜５の何れか１項に記載の形質転換体。
【請求項７】
請求項１〜６の何れか１項に記載の形質転換体を培養し、キメラ抗体を発現させることを特徴とするキメラ抗体の調製方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は大腸癌Colon6由来の抗原に対するマウスモノクローナル抗体のＶ領域遺伝子断片およびその遺伝子断片を用いたキメラ抗体の調製方法に関する。
背景技術
モノクローナル抗体の開発は、マウス・モノクローナル抗体からヒト・モノクローナル抗体に急速に移行しつつある。しかし、ヒト・モノクローナル抗体を細胞融合で自在に産生するにはまだ抗原感作の段階で困難が多い。そのため最近では、遺伝子工学手法でマウス・モノクローナル抗体の可変領域（抗原認識部位）とヒト抗体の定常領域を組み合わせたキメラ・モノクローナル抗体の産生研究が活発に行われている（特開昭60-155132他）。
抗体分子の大部分を占める定常領域がヒト蛋白であるキメラ抗体は、特異抗体の作製が容易で且つマウス抗体に比べて抗原性等の面でより高い安全性を示すと期待される。従って診断・治療薬としての有用性は高い。しかし、遺伝子工学手法によるキメラ抗体の開発では効率的な産生系の開発が必須であり、その成果を左右する。
ところで、大腸癌Colon6由来の抗原に対して特異的であるマウスモノクローナル抗体Ａ７の存在が知られている（特開昭63-207396）。
このＡ７は、ヒト大腸癌（Colon6）を免疫原とする。Colon6はＳ状結腸癌の肝転移巣由来であり、組織型は高分化型線癌である。
また、下記の性質を有するヒト大腸癌由来の抗原
(1)  分子量
約38,000〜42,000（SDS-ポリアクリルアミド  ゲル電気泳動法、ウエスタンイムノブロット分析）
(2)  抗体との反応性
ノイラミニダーゼ処理、プロナーゼ処理、過ヨウ素酸カリウム処理によって抗体との反応性が消失する。
に対して特異的である。抗体との反応性から、本発明に用いられる抗原は糖タンパク質であり、抗体の結合部位は糖部分にあると考えられる。
得られたモノクローナル抗体は、ヒト大腸癌にのみ反応し、胃癌、乳癌、胃悪性リンパ腫等の他の癌細胞と反応しない。また正常組織、例えば正常大腸粘膜、正常小腸粘膜、正常胃粘膜等とほとんど反応しない。
そこで、本発明者らは上記事情に鑑み、種々研究を重ねた結果、このマウスモノクローナル抗体Ａ７のＶ領域遺伝子断片を単離し、その断片のアミノ酸配列および塩基配列を確認した。さらにこの遺伝子断片を用いて遺伝子工学的にＡ７キメラ抗体を調製することに成功して本発明を完成した。
発明の開示
（ｉ）マウスモノクローナル抗体Ａ７のＶ領域遺伝子断片
本発明のマウス抗体Ｖ領域遺伝子断片を取得するための原料細胞は特定の大腸癌Colon6由来の抗原に対して特異的であるモノクローナル抗体Ａ７を産生するハイブリドーマが挙げられる（特開昭63-207396）。
本発明の遺伝子断片を調製する方法としては公知の手法を用いればよい。具体的には以下に挙げた方法が利用できる。
原料細胞から公知の手法（例えば、Anal.Bioc-hem.,162，156(1987)等）に準じてRNAを抽出し、ノーザンハイブリダイゼーション（Northern Hybridization）法等により適当なプローブ（例えば抗体Ｃ領域に対するオリゴヌクレオチド等）を用いて目的とするRNAの存在を確認する。
得られたRNAから逆転写酵素とDNAポリメラーゼを用いてcDNAを調製し、適当はファージベクター（例えば、λgt10，EMBL3）に導入した後、適当な宿主（例えば、大腸菌C600，C600hflなど）を形質転換してcDNAライブラリーを得る。合成プローブによるスクリーニングによって陽性クローンを得、目的とするファージDNAを回収する。ファージDNAを適当な制限酵素（EcoRI、BamHI，HindIIIなど）によって消化し、適当なプラスミドベクター（例えばpUC19，M13mp18など）に導入して宿主（例えば大腸菌JM109株、TG1株）を形質転換し目的とするクローンを得る（第３図及び第４図参照）。
本発明の抗体Ｈ鎖Ｖ領域遺伝子断片を組込んだプラスミドとしては、pIG001、pIG002、ｐKT101，pTK020等が挙げられる（第４図参照）。
また、抗体Ｌ鎖Ｖ領域遺伝子断片を組込んだプラスミドとしては、pIG004、pIG005、pTK021等が挙げられる（第３図参照）。DNAの塩基配列は公知の方法（例えば、ダイデオキシ法、マキサム・ギルバート法）によって行なわれる。
本発明の遺伝子断片の内、Ｌ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ配列をアミノ酸配列で表すと第１図中、アミノ酸番号２１番目Aspから１３１番目Lysまでである。また、このDNA配列を塩基配列で示す場合、上記のアミノ酸配列を公知の遺伝暗号に従って構成しうるものであれば特に制限されないが、好ましくは、第１図中、塩基番号８１番目Ｇから４１３番目Ａまでである。
また、Ｈ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ配列をアミノ酸配列で示すと第２図中、アミノ酸番号２０番目Gluから１３６番目Serまでである。また、このDNA配列を塩基配列で示す場合、上記のアミノ酸配列を公知の遺伝暗号に従って構成しうるものであれば特に制限されないが、好ましくは、第１図中、塩基番号９５番目Ｇから４４５番目Ａまでである。
（ii）  抗体Ｃ領域遺伝子断片
本発明ではマウス以外の哺乳動物（例えば、ヒト）の抗体Ｃ領域遺伝子断片を用いる。抗体Ｃ領域遺伝子断片は、Ｌ鎖Ｃ領域、Ｈ鎖Ｃ領域とも公知のものを用いることができる。
（iii）  キメラ抗体の調製
大腸癌Colon6由来の抗原に対するマウスモノクローナル抗体のＬ鎖Ｖ領域遺伝子断片とマウス以外の哺乳動物の抗体Ｌ鎖Ｃ領域遺伝子断片とを連結させて（キメラ化）Ｌ鎖遺伝子断片を構築する。
また、大腸癌Colon6由来の抗原に対するマウスモノクローナル抗体のＨ鎖Ｖ領域遺伝子断片とマウス以外の哺乳動物の抗体Ｈ鎖Ｃ領域遺伝子断片とを連結させて（キメラ化）Ｈ鎖遺伝子断片を構築する。
これらの遺伝子断片は別々のプラスミドに担持させてＨ鎖とＬ鎖を各々発現させた後に両者を組み合わせてキメラ抗体を調製することもできるが、好ましくは、Ｈ鎖遺伝子断片とＬ鎖遺伝子断片を同一プラスミド上に担持させることによりキメラ抗体を発現させることができる。この場合、Ｌ鎖遺伝子断片とＨ鎖遺伝子断片の配列方向は、順方向でも逆方向でもよい。
上記の遺伝子断片は、発現ベクター系に挿入して、発現用宿主・ベクター系を構築する。宿主・ベクター系は一般に宿主細胞とコンパーチブルな種から由来するレプリコンと制御配列を有するプラスミドベクターと、この宿主を組み合わせて使用する。ベクターは一般に複製部位を有しており、また形質転換細胞中で表現型の選択が可能となるマーカーの配列を有している。例えば大腸菌は通常pBR322を用いて形質転換されるが、このプラスミドは大腸菌株由来である〔Boliver et al.Gene, 2，95(1977)〕。pBR322はアンピシリン耐性及びテトラサイクリン耐性の遺伝子を持っているので形質転換した細胞を検出する簡単な方法を与える。pBR322プラスミドや、他の微生物プラスミドは微生物体が利用できて、それが支配する蛋白質を発現させることが可能なプロモーターを有するか、あるいはプロモーター配列を挿入してある。組み換えＤＮＡの構成に通常使われるプロモーターとしてはβ−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）やラクトースプロモーター系〔Chang et al.Nature, 275，615(1978)；Itakura et al. Science,198，1056(1977)；Goeddle et al. Nature,281，544(1979)〕あるいはトリプトファン（Trp）プロモーター系〔Goeddle et al., Nucl. Acids Res., 8, 4057(1979)；ヨーロッパ特許出願公開第0036776号明細書〕がある。これらは最も一般的に使われているが、他の微生物プロモーターも発見され、使用されている。それらの塩基配列の詳細も発表されており、それらをプラスミドベクターに機能的に導入することが可能である〔Siebenlist et al. Cell, 20，269(1980)〕。そして宿主としては、大腸菌ＨＢ１０１株、Ｃ６００株、Ｗ３１１０株などが用いられる。酵母ベクターにおける適当なプロモーターとして３−ホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）のプロモーター〔Hitzeman et al. J. Biol. Chem., 255,2073(1968)〕や他の解糖系酵素〔Hess et al. J. Adv., Enzyme・Reg., 7, 149(1968)；Holland et al. Biochemistry, 17, 4900(1978)〕であるエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰ−ＤＨ）、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリルリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、グルコキナーゼの様な酵素のプロモーターである。これらの中でも、小型化ＧＡＰ−ＤＨプロモーター（特開昭62-175180号明細書）、PGKプロモーター［NucleicAcid Res., 10(8), 2625(1982)］は有用である。適当な発現ベクターを作成する場合、これらの遺伝子に存在する転写終結配列も又発現したい遺伝子の3'側に挿入し、転写終結が生じるようにする。増殖条件により、転写の制御ができるような利点を有するプロモーターとして、アルコールデヒドロゲナーゼ2、イソチトクロームC、酸性ホスファターゼ、あるいは窒素代謝に関連した分解酵素、前述のグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、あるいはマルトースやガラクトースを使用するのに関連した酵素のプロモーターも使える。酵母のコンパーチブルプロモーター、複製起点及び転写終結配列を含むすべてのプラスミドベクターが使える。そして宿主としては、Saccharomyces cerevisiae GRF18株（特開昭59-48082号明細書）、AH22株（ATCC No.38626）などを用いる。
さらに枯草菌の分泌発現ベクターとしては、プラスミドｐＵＢ１１０の複製起点をもち、かつ、α−アミラーゼ遺伝子のプロモーター、シグナルペプチド、ターミネーターを有するプラスミドが利用でき、この宿主としてはB. natto、B. subtilisなどが使用できる。近年脊椎動物の細胞を培養して（組織培養）増やすことがルーチン化している。〔Tissue Culture, Academic Press, Kruse and Patterson, editors(1973)］宿主細胞株として有用な例としてVERO、HeLa細胞、Chinese hamster ovary(CHO)cell line, W138, BHK, COS-7, MDCH cell line, C127, HKG, Human kidney cell lineなどがある。これらの細胞の発現ベクターは通常、複製起点、発現する予定の遺伝子上流に位置するプロモーター、リボソーム結合部位、RNAスプライス部位、ポリA付加部位、転写終結配列を有する。
哺乳動物細胞を使用する場合、発現ベクター上の制御機能はウィルス由来であることが多い。例えば、一般的に使われるプロモーターはポリオーマ、アデノウィルス２、あるいは最も多用されているシミアンウィルス４０（ＳＶ４０）由来である。ＳＶ４０ウィルスの初期及び後期プロモーターは特に有用である。というのはこれらはＳＶ４０の複製起点を含む断片として容易にウィルスから得られるからである。〔Fiers et al. Nature, 273，113(1978)］ウィスルのHindIII部位から複製起点中のBglＩ部位までの約250bpを含む断片も使用できる。更に目的とする遺伝子に関連したプロモーターや制御配列（エンハンサー）も宿主とコンパーチブルならば使用できる。
動物細胞発現ベクターに用いるプロモーター・エンハンサーとしては、ＳＶ４０初期遺伝子又は後期遺伝子のプロモーター・エンハンサーやアデノウィルスメジャーレート・プロモーター領域、グロブリンエンハンサー・プロモーター領域、ＲＮＡウィルスのＬＴＲ、メタロチオネインプロモーター領域、β−アクチンプロモーターなどが使用できる。複製起点はＳＶ４０や他のウィルス（ポリオーマ、アデノ、ＶＳＶ、ＢＰＶ等）由来のものをベクターに組み込んでもよいし、宿主細胞染色体の複製機構を用いてもよい。ベクターが宿主細胞の染色体に組み込まれるならば後者で十分である。また、これ以外の高産生系として、ＤＨＦＲ遺伝子を利用して遺伝子の増幅系を用いることが可能である。
宿主として酵母を用いる場合、発現系としてプロモーター、シグナル配列、ターミネーター等を含む。
プロモーターは酵母、好適にはサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）のゲノムDNAに由来する。好ましくは、高発現酵母遺伝子のプロモーターをキメラ抗体の発現のために使用する。即ち、ＴＲＰＩ遺伝子、ＡＤＨＩもしくはＡＤＨII遺伝子、酸性ホスファターゼ（ＰＨＯ３もしくはＰＨＯ５）遺伝子、またはイソチトクロームＣ遺伝子のプロモーター、ガラクトース代謝系のプロモーター（ＧＡＬ１、ＧＡＬ１０もしくはＧＡＬ７）、インベルターゼのプロモーター（ＳＵＣ２）あるいは解糖系酵素をコードする遺伝子のプロモーター、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、３−ホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）、ヘキソキナーゼ、ピルベートデカルボキシラーゼ、ホスホフラクトキナーゼ、グルコース−６−ホスフェートイソメラーゼ、３−ホスホグリセレートムターゼ、ピルベートキナーゼ、トリホスフェートイソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼおよびグルコキナーゼの遺伝子のプロモーター、あるいはａ−ファクターまたはα−ファクターをコードする酵母接合フェロモン遺伝子のプロモーターを使用することができる。
他の好ましい態様においては、構成物中にシグナル配列を導入する。シグナル配列は、酵母インベルターゼ、α−ファクター遺伝子のような酵母由来のシグナル配列を使用することができる。また、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）のシグナル配列は好適であり、好ましくは酵母での分泌発現のために特に合成されたシグナル配列（ＥＰ公開３１９６４１号または特開平１−２４０１９１号）を用いることもできる。
このシグナル配列の導入により、キメラ抗体遺伝子の発現後、遺伝子産物は分泌経路に入り、そしてペリプラズム空間に輸送される。さらに細胞壁を通しての培地中への分泌を達成することができる。これはより収量の相当な増加が可能となる。さらに、細胞を破壊する必要がないので回収工程を単純化することが可能である。
また、プラスミドは転写停止のための適当なターミネーター、例えばＰＨＯ５もしくはＧＡＰ−ＤＨターミネーターを含有する。
本発明において、宿主としては酵母、特にサッカロマイセス属もしくはピキア属が使用される。好ましくは、栄養要求性株や抗生物質感受性株が使用できる。栄養要求性株でかつＧ４１８感受性株であるサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）ＡＨ２２株（a, his 4, leu 2, can 1）又はAH22由来の栄養要求変異株UNHB（a, lue2,his4,ura3,can1）等が好適に用いられる。
形質転換法としては、プラスミドを直接宿主細胞内に導入する方法と、プラスミドを酵母染色体に組み込む方法等が挙げられる。
前者は公知の手法により行われる。具体的には、プロトプラストポリエチレングリコール法、エレクトロポレーション法等が例示される。
後者は、例えば下記の方法によって行われ、本発明においては、このようにプラスミドが酵母染色体に組み込まれたキメラ抗体産生酵母がより好適に使用される。
後者の方法においてプラスミドは、宿主酵母染色体中に存在する遺伝子の一部のＤＮＡ配列（例えば、ＬＥＵ２、ＨＩＳ４、ＴＲＰ１、ＵＲＡ３、ribosomeDNA遺伝子等）を含有する。相同な配列により、全プラスミドまたはその線状断片は相同組み換えにより宿主染色体に安定に導入することができる。即ち、増殖中、子孫細胞は選択圧が存在しない場合でも導入された遺伝物質を安定に保持する。
例えば、酵母染色体遺伝子中の天然に存在する配列およびキメラ抗体遺伝子を含むプラスミドは、前記染色体遺伝子の座に安定に組み込まれ得る。
宿主酵母染色体配列に相同な配列は、特にアミノ酸または核酸合成系遺伝子、ribosomeDNA、Ty因子等が使用できる。特に、アミノ酸または核酸合成系遺伝子は、宿主酵母がアミノ酸または核酸栄養要求性株である時、すなわち、該アミノ酸または核酸合成系遺伝子が欠損している株においては、宿主の変異を補完する遺伝子であるので、形質転換体の選択マーカーとして使用することができる。この際、宿主酵母の栄養要求性に原栄養性をもたらすアミノ酸または核酸合成系遺伝子としては例えばLEU2、HIS4、URA3またはTRP1がある。
酵母用の選択遺伝子マーカーとしては、上記のように、宿主酵母が栄養要求株である時、アミノ酸または核酸合成系遺伝子のようなものが使用できるほか、宿主が抗生物質感受性株である時は、該抗生物質耐性を発現する遺伝子が使用できる。例えばシクロヘキシド、G418、クロラムフェニコール、ブレオマイシンまたはハイグロマイシンB等の抗生物質に対して耐性を付与する遺伝子が挙げられる。
本発明に関するプロモーターは酵母、好適にはサッカロマイセス・セレビシエー（Saccharomyces cerevisiae）のゲノムＤＮＡに由来する。好ましくは、高発現酵母遺伝子のプロモーターをキメラ抗体の発現のために使用する。即ち、ＴＲＰＩ遺伝子、ＡＤＨＩもしくはＡＤＨII遺伝子、酸性ホスファターゼ（ＰＨＯ３もしくはＰＨＯ５）遺伝子、またはイソチトクロームＣ遺伝子のプロモーター、ガラクトース代謝系のプロモーター（ＧＡＬ１、ＧＡＬ10もしくはＧＡＬ７）、インベルターゼのプロモーター（ＳＵＣ２）あるいは解糖系酵素をコードする遺伝子のプロモーター、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、３−ホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）、ヘキソキナーゼ、ピルベートデカルボキシラーゼ、ホスホフラクトキナーゼ、グルコース−６−ホスフェートイソメラーゼ、３−ホスホグリセレートムターゼ、ピルベートキナーゼ、トリホスフェートイソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼおよびグルコキナーゼの遺伝子のプロモーター、あるいはａ−ファクターまたはα−ファクターをコードする酵母接合フェロモン遺伝子のプロモーターを使用することができる。
また、プラスミドは、宿主酵母内で自律的に複製できない。すなわち、宿主酵母内での自律複製開始領域、例えば２μｍＤＮＡの複製開始領域やＡＲＳ領域（Autonomous replicating sequence）を実質的に含まない。
本発明における遺伝子操作の他の好ましい態様においては、構成物プラスミド中にシグナル配列を導入することもできる。シグナル配列は、酵母インベルターゼ、α−ファクター遺伝子のような酵母由来のシグナル配列を使用することができる。また、ＨＳＡのシグナル配列は好適であり、好ましくは酵母での分泌発現のために特に合成されたシグナル配列（ＥＰ公開３１９６４１号または特開平１-２４０１９１号）を用いることもできる。
このシグナル配列の導入により、キメラ抗体遺伝子の発現の後、遺伝子産物は分泌経路に入り、そしてペリプラズム空間に輸送される。さらに細胞壁を通しての培地中への分泌を達成することができる。これはより収量の相当な増加が可能となる。さらに、細胞を破壊する必要がないので回収工程を単純化することが可能である。
また、本発明に関するプラスミドは転写停止のための適当なターミネーター、例えばＰＨＯ５もしくはＧＡＰ−ＤＨターミネーターを含有する。
このプラスミドはプロモーター、キメラ抗体コード領域および宿主染色体相同領域とは別に、細菌宿主、特に大腸菌のための複製開始点および遺伝的選択マーカーを含有することもできる。大腸菌複製開始点および大腸菌のための選択マーカーを酵母ハイブリドベクター中に使用することに関して有用な特徴が存在する。まず、大腸菌における増殖および複製により大量のハイブリドベクターＤＮＡを得ることができ、そして第２に、大腸菌に基礎を置くクローニング技法のすべてを用いてハイブリドベクターの構築を容易に行うことができる。大腸菌プラスミド、例えばｐＢＲ３２２等は大腸菌複製開始点、および抗生物質、例えばテトラサイクリンおよびアンピシリンに対する耐性をもたらす大腸菌遺伝マーカーを含有し、そして酵母ハイブリドベクターの部分として有利に使用される。
従って、該プラスミドは、プロモーター、該プロモーターに制御されるキメラ抗体コード領域、それに続く転写停止のためのターミネーターを含み、かつ宿主酵母染色体配列に相同な配列を含むものである。また、該プラスミドは、所望により、分泌生産のためのシグナル配列、酵母用の選択遺伝子マーカー、大腸菌の複製開始領域、大腸菌用選択遺伝子マーカーを含有することができる。そして、酵母の複製開始領域は実質的に含まないものである。
本発明において、宿主としては酵母、特にサッカロマイセス属もしくはピキア属が使用される。好ましくは、栄養要求性株や、抗生物質感受性株が使用できる。
この組換えプラスミドを用いて形質転換体を作製する方法、ひいてはキメラ抗体を製造する方法は以下の通りである。
組換えプラスミドを宿主酵母細胞の染色体上に導入する。具体的には、挿入するプラスミドの有する、宿主酵母細胞の染色体に相同な配列中の任意の部位を制限酵素処理により切断し、直線化したプラスミドを宿主に導入することが望ましい。直線化されたプラスミドは、宿主酵母細胞染色体上のプラスミドに組み込まれた領域と相同な領域に組み込まれる。直線化されたプラスミドは環状プラスミドより、宿主染色体上に組み込まれる頻度が上昇する。この時使用する宿主酵母は、挿入されるプラスミドが担持する酵母用選択マーカー遺伝子によって相補する変異を持った変異株、例えば、ロイシンおよびヒスチジン要求性変異株でかつＧ４１８感受性株であるサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）ＡＨ２２株（a, his 4, leu 2, can 1）、又はAH22由来のロイシン、ヒスチジン、ウラシル要求変異株であるUNHB（a,lue2,his4,ura3,can1）等が好適に用いられる。
宿主酵母細胞の形質転換は公知の方法、例えばプロトプラストポリエチレングルコース法、エレクトロポレーション法などにより行う。
次に期待した部位へプラスミドが導入されているか否か、および導入した遺伝子が安定であるか否かを調べる。具体的には、サザンプロッティング法により、形質転換に利用した宿主酵母細胞の染色体配列に相同な配列をプローブとして、期待通りの部位へプラスミドが導入されていることを確認する。またキメラ抗体をコードする遺伝子の安定性を、キメラ抗体産生量および栄養要求性の回復維持を指標に調べ、形質転換体を非選択培地で数十代培養した後でも、変化しないことを確認する。
以上、確認試験を行った株は、確かにキメラ抗体コード領域を含むプラスミドが、宿主酵母細胞染色体の所望の部位に組み込まれた形質転換体である。この形質転換体を宿主として使用し、再度、キメラ抗体コード領域を含むプラスミドで形質転換させることができる。この場合、酵母細胞染色体相同領域としては、初めの形質転換で使用した領域以外の相同領域も使用できる。
この他、宿主酵母細胞の染色体配列に相同な配列として、ribosome DNAやＴｙ因子（Transposon of Yeast element）も挙げられる。これらの遺伝子は細胞当り、複数個存在するので、１回の形質転換で、複数個の目的遺伝子を宿主染色体に組み込むことができる。
以下、具体的に組み込み方法を例示するが本例示は好適な一手段を示すものであり、この手法に限定されるものではない。相同配列部位は、選択的繰り返しにより代替え可能である。
宿主としては、ロイシンおよびヒスチジン要求性変異株でかつＧ４１８感受性株であるサッカロマイセス・セレビシエSaccharomyces cerevisiae）ＡＨ２２株（ロイシン合成系遺伝子のＬＥＵ２およびヒスチジン合成系遺伝子のＨＩＳ４に変異を持つ株）又はAH22由来のウラシル栄養要求性変異株を用いる。
まず、ウラシル非要求性とするための遺伝子、ＵＲＡ３を宿主酵母細胞の染色体配列と相同の配列として持つプラスミドで形質転換する。得られた形質転換体は、染色体上のＵＲＡ３遺伝子部位にキメラ抗体コード領域を含むプラスミドが挿入されたものであり、ウラシル非要求性、すなわちウラシル不含培地でも増殖できる株である。
次に、この形質転換体を宿主とし、ヒスチジン非要求性とするための遺伝子、ＨＩＳ４を宿主酵母細胞の染色体配列と相同の配列として持つプラスミド（もちろん、キメラ抗体コード領域も含有する）で形質転換する。得られた形質転換体は染色体上のＨＩＳ４遺伝子部位にキメラ抗体コード領域を含むプラスミドが挿入されたものであり、ヒスチジン非要求性、すなわちヒスチジン不含培地でも増殖できる株である。この時点で、発現のための目的遺伝子であるキメラ抗体は、ＵＲＡ３およびＨＩＳ４の２箇所に導入されている。
次に、上記ウラシルおよびヒスチジン非要求性になった形質転換体を宿主として、ＬＥＵ２を宿主酵母細胞の染色体配列と相同の配列として持つプラスミドで形質転換する。このプラスミドは、キメラ抗体コード領域を含有するものである。得られた形質転換体は染色体上のＬＥＵ２遺伝子部位にキメラ抗体コード領域を含むプラスミドが挿入されたものであり、ロイシン非要求性となる。従って、この形質転換体は、キメラ抗体遺伝子を染色体上のＵＲＡ３、ＨＩＳ４およびＬＥＵ２遺伝子部位の計３箇所に含有するものである。この時、挿入の順序は特に問題ではない。
宿主として、何種類もの栄養要求変異株が取得できれば、または何種類もの抗生物質に対して感受性を示す株が取得できれば、それに応じた領域に有用遺伝子を複数導入することができる。
このように、宿主染色体上の複数領域に目的遺伝子を挿入することができる。これら染色体に組み込まれた遺伝子は、脱落することなく、安定に維持され、かつ複数の遺伝子を組み込むことにより、目的生産物を多量に取得することが可能となる。
形質転換株は、公知の培地で培養する。ＹＰＤ液体培地〔１％イーストエキストラクト（Difco社）、２％バクトペプトン（Difco社）、２％グルコース〕などが例示される。培養は通常15〜43℃（好適には30℃程度）で20〜100時間程度行い、必要により通気や撹拌を加えることもできる。
遺伝子操作を経てキメラ抗体を発現する菌体（例えば、大腸菌、酵母、枯草菌、動物細胞など）を、例えば菌体内発現であれば凍結融解法、ガラスビーズ法、高圧法、超音波処理法、酵素処理法等の公知の方法で処理しキメラ抗体を含む抽出画分として回収できる。また、菌体外発現（分泌発現）であれば培養上清からキメラ抗体を得ることができる。
当該キメラ抗体は公知の方法により精製を行うことができる。例えば、分画処理、限外濾過、ゲル濾過、イオン交換クロマト、アフィニティクロマト、吸着クロマト、密度勾配遠心分離法、透析等が挙げられる。
また、公知の製剤化技術を施すことによりキメラ抗体製剤を調製することができる。
【図面の簡単な説明】
第１図はＡ７抗体Ｌ鎖タイプIIのＶ−Ｊ−Ｃ領域のcDNA塩基配列およびアミノ酸配列を示すと共に、制限酵素認識部位を示す。尚、矢印「↑」は各領域の境界を示している。
第２図はＡ−７抗体Ｈ鎖のＶ−Ｊ−CH1領域の塩基配列およびアミノ酸配列を示すと共に制限酵素認識部位を示す。尚、矢印「↑」は各領域の境界を示している。
第３図はＬ鎖のcDNAのＶ領域のカセット化の手法を示す。
第４図はＨ鎖のcDNAのＶ領域のカセット化の手法を示す。
第５図は、Ａ７抗体Ｈ鎖のγ1-cDNAの制限酵素地図を示し、BamHIは、J/Cジャンクションの下流約150bpのCH1領域にある。
第６図は、Ａ７抗体Ｌ鎖のκ−cDNAタイプIIの制限酵素地図を示し、矢印は、シークエンシングの方向を示す。
第７図は、pIG001の制限酵素地図とシークエンシングストラテジーを示し、矢印はシークエンシングの方向を示す。
第８図は、pKT103の作製過程を示す図、第９図はpMB001の作製過程を示す図、第10図は、pKT103のEco RI〜HpaI間の塩基配列及びアミノ酸配列を示すと共にＬ／Ｍ結合部位にHincIIが、JK1領域にHindIIIサイトが導入されたことを示す。第11図は、pMB001のEco RI〜NcoI間のシークエンシングの結果を示すと共にＬ／Ｍ結合部位にBsmIサイトが、JH2領域にBstEIIサイトが導入されたことを示す。Eco RI〜PstI間においてはpKT102で、PstI〜NcoI間においてはpTK023でそれぞれ各塩基およびアミノ酸の配列を決定した。
第12図はpMB008の作製過程を説明する図である。第13図はpMB008に含まれるキメラκ鎖遺伝子の配列とアミノ酸配列を示す。
第14図はpMB007の作製を説明する図である。
第15図は、pMB007に含まれるキメラFd鎖の配列とアミノ酸配列を示す。
第16図は、pMB009の作製を説明する図である。
第17図は、pMB012の作製を説明する図である。
第18図は、pMB010の作製を説明する図である。
第19図は、pMB011の作成を説明する図である。
第20図は、エピソーマルFabベクターであるpMB023の構築手順を説明する図である。
第21図は、インテグレイティブFabベクターであるpMB025の構築手順を説明する図である。
第22図は、pMB032の作製を説明すると共にその制限酵素サイトを示す図である。
第23図は、pMB033の作製を説明すると共にその制限酵素サイトを示す図である。
第24図は、pMB036の作製を説明すると共にその制限酵素サイトを示す図である。
第25図は、pMB035の作成を説明すると共に、その制限酵素サイトを示す図である。
第26図は、キメラA-7抗体Fab発現ベクターであるpMB042とpMB043の構築を示す図である。
第27図は、キメラA-7 Fab発現ベクターであるpMB051とpMB052の構築を示す図である。
第28図は、キメラA-7 Fab発現ベクターであるpMB045とpMB046の構築を示す図である。
符号の説明：
第６図中、RVは明細書第25頁８行記載のM13 reverse primer、M4は同書第25頁７行記載のM13 universal primer、Ｃκは同書第23頁３〜４行記載のＣκ-プローブ、FR3-ASは同書第25頁12〜13行記載のκ-cDNAのFR3アンチセンス、FR2-Sは同書第25頁12行記載のκ-cDNAのFR2センス、第７図中、M4とRVは上記と同じ、CH1は同書第２３頁３行記載のＣγ1-プローブ、FR2-Sは同書第２５頁１０〜１１行記載のγ1-cDNAのFR2センス、FR3-ASは同書第25頁１１行記載のγ1-cDNAのFR3アンチセンスを示す。
制限酵素の略号
AccＩ：Ac，AflII：Af，BamHI：Bm，BsmI：Bsm，BstEII：Bst，ClaI：C1，EcoRI：R1，EcoRV：Rv，HpaI：Hp，HincII：H2，HindIII：H3，KpnI：Kp，NcoI：N，NdeI：Nde，NotI：Not，PstI：Ps，Pvu  II：P2 PvuI：P1，SmaI：Sm，Sac：Sc，SalI：S1，SphI：Sph，XhoI：Xh，XbaI：Xb
その他の略号
GAP-T：GAP-DHターミネーター
GAL1P：GAL1プロモーター
GAP-DH P：GAP-DHプロモーター
PHO5-T：PHO5ターミネーター
PGK-P：PGKプロモーター
ori：複製開始点
Amp：アンピシリン耐性遺伝子
CIP：牛腸アルカリフォスファターゼ
Vκ：Ｌ鎖可変領域、VH：Ｈ鎖可変領域
発明を実施するための最良の形態
本発明をより詳細に説明するために実施例を挙げるが、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない。
実施例１
cDNAクローニング
材料と方法
１．細胞
大腸癌・胃癌に対するモノクローナル抗体産生マウス・ハイブリドーマ、Ａ−７を用いた（特開昭63-207396参照）。細胞は培養後遠心によって集め、使用時まで−70℃で凍結保存した。
２．RNAの抽出
酸グアニジン−フェノール−クロロホルム（AGPC）法で全細胞RNAを抽出した（Chomczynski,P.and Sacchi,N.(1987),Anal.Biochemistry, 162, 156参照）。RNA量は1 OD260単位＝40μg/mlとして測定した。
ポリ(A)+ RNAはオリゴd(T)セルロースミニ−カラムクロマトグラフィーで精製した。オリゴd(T)セルロースはCRI社製タイプIII（結合能力：112.6 OD260単位／gm）を用いた。カラムはPRI社製Select４mlカラム（DEPC処理）を用いた。mRNAの精製では１mgの全RNAに対して0.2gのオリゴd(t)セルロース樹脂を用いた。バッファーは成着（Maniatis,T.et al.,in Molecular Cloning：A Laboratory manual,（Maniatis,T.et al. eds），Cold Spring Harbor Laboratory,NY,1982参照）に従った。
３．ノーザンハイブリダイゼーション
RNAの電気泳動を行った。分子量マーカーはRNAラダー（ladder）（BRL）及びヒトＴ細胞系株化細胞、CCRF-CEMのrRNAを用いた。電気泳動終了後RNAをナイロンフィルター（GenScreen Plus,Dupon）にキャピラリーブロッティングした。ブロッティング後フィルターを2X SSCで洗って風乾した後80℃で２hr減圧加熱乾燥し、プラスチック・バックに封入した使用時まで−20℃で保存した。
Kabatらのデータベース（Kabat,E.A.et al.,(1987), Sequences of proteins of immunological interest,U.S.Dept.of Health and human services,Public health Service,Natl.Institute of Health参照）に従ってマウスγ1-及びκ-cDNAのＣ領域に対応する17-merのオリゴヌクレオチドを合成しハイブリダイゼーションプローブとした。プローブの塩基配列は、Ｃγ1-プローブ：5'-GTCACTGGCTCAGGGAA、Ｃκ-プローブ：5'-AAGCACACGACTGAGGC。プローブDNAは〔γ−32P〕ATP（Amerasham，PB10218）とポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造）とでラベルした後、Nensorb-20(NAN)で精製した。プローブの放射活性はPackard Tri-Carb 406液体シンチレーションカウンターでチエレンコフcpm（以下単にcpmと表記する）を求めて算定した。
陰性コントロールとして、CCRF-CEM細胞のポリ(A)+ RNA及びヒト腎由来株化細胞（HKG）のポリ(A)+ RNAを用いた。
４．cDNA合成
１st−及び２nd−ストランドcDNAの合成とT4−DNAポリメラーゼによるcDNAの末端の平滑化はAmersham社製cDNA合成システムで行った。プライマーはオリゴd(T)12-18を用いた。合成手順等はキットの添付資料（Amersham社、cDNA合成システム（RPN1265Y）添付資料参照）に従った。
合成した二本鎖cDNA（dscDNA）をEco RIメチラーゼ（宝酒造）で処理してcDNA内部のEco RIサイトをメチル化し、Eco RIリンカー（pdGGAATTCC,NEB）を付加した。リンカー連結反応終了後Eco RI（宝酒造）で37℃、５−８時間消化し、エタノール沈澱でDNAを回収してリンカー及び低分子夾雑物を除去する為ゲル濾過に供した。ゲル濾過はセファクリルS400のSpun Column（Quick SpinTM, Linker5：Boehringer,〜300bp以下カット）で行った。
５．cDNAライブラリー
ファージ・ベクター、λgt10をクローニングベクターとしてcDNAライブラリーを作製した。λgt10 Arm DNAはPromega Biotech社製（500μg/ml）を用いた。In VitroパッケージングキットはStratagene社製  Gigapack Goldを用いた。Arm DNAとcDNAの連結を行った。ライブラリーの力価は、E.coli C600とC600hflを指示菌として測定した。指示菌の調製は成書（Experiments with Gene Fusion参照）に従った。
６．プラークハイブリダイゼーション
直径15cmのプラスチックプレート（Falcon）に3.0 X 103pfu／プレートの密度でファージを撒いてマスタープレートとした。培地はTB10（10g/ｌトリプトン-5g/ｌ  NaCl-10mM MgSO4）、1.5%高品位寒天（Gibco）、上層寒天は0.7%アガロース（Sigma，Type I Loe EEO）をそれぞれ用いた（Phillips,S.L.et al.,(1985)，Nucleic Acids res,.8，2699参照）。培養細菌はE.coli C600を用いた。フィルターはWooらの報告（Woo,S.L.C.,(1979)，Methods in Enzymol., 68，389参照）に従って作製した。
フィルターはColony-Plaque Screen(NEN)を用いてプラークハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーションプローブはノーザンハイブリダイゼーションに用いたオリゴヌクレオチドを用いた。
第２次スクリーニングはプラーク−ドット法（Powell,R.et al.,(1986),Nuclieic Acid Res.，14，1541参照）で行った。
７．DNA塩基配列解析
プラスミドによる塩基配列解析は榊らの方法（榊  佳之、ベクターDNA、（1986）、pp68-74、講談社サイエンティフィク参照）に従った。M13 ssDNAの塩基配列解析（シークエンシング）は成書に従った。シークエンシングキットはU.S.B.社SequenaseTM（東洋紡取り扱い、dCTPタイプ）を用いた。
［α−32P］dCTPはAmarsham製（〜800 Ci/mmol）を用いた。
シークエンシングプライマーは、(1)スクリーニングに用いた17-merのオリゴヌクレオチド、(2)M13 universal primer（M4：宝酒造）、(3)M13 reverse primer（RV：宝酒造）及び(4)cDNAのシークエンシングによって得られた塩基配列に基づいて合成した17-merのオリゴヌクレオチド（γ1-cDNA,FR2センス：5'CTGGACAGGGCCTGGAA；FR3アンチセンス：5'GTTGGAGGATGAGACTG、κ-cDNA，FR2センス：5'TTCCAACAGAAACCAGG；FR3アンチセンス：5'CCATAGGATGGATGTTG）の５種類を用いた。
８．その他
λgt10ファージDNAのミニプレップは文献（Experiments with Gene Fusion）に準拠した。M13ファージのssDNAとRF DNAのミニプレップは文献に従った。プラスミドDNAはこれを含む大腸菌JM 109からアルカリ溶解法で抽出した。すべてのDNAは抽出後TEバッファー（10mM Tris. Cl, pH8.0-1mM EDTA）に溶解して−20℃で保存した。
2X TY培地、2X TYプレート，Hトップアガー（topagar）はAmersham社のIn Vitroミュータジェネシスキット（Mutagenesis Kit）添付資料（Amersham社、Oligonucleotide-Directed In Vitro Mutagenesis System（Ver.2,RPN1523）添付資料）に従った。その他一般的な手法は成書（Maniatis,T.et al.,in Molecular Cloning：前述）に従った。
結果
１．mRNAの調製
AGPC法で約7.8×108の細胞から4.6mgの全RNAを抽出した。得られた全RNAの内1.3mgをオリゴd(T)セルロースカラムクロマトグラフィーで精製し、約21μｇのポリ(A)+RNAを得た。ポリ(A)+RNAの回収率は約1.5%であった。
２．ノーザンハイブリダイゼーション
臭化エチジウム（EtBr）で染色したRNAの泳動パターンでは、調製したポリ(A)+RNAは＞9.5kbの高分子量領域から約0.1kbの低分子量領域まで均一に分布し、分解等は認められなかった。又、18S及び28S rRNAの混入も殆ど認められなかった。
一方ノーザンハイブリダイゼーションでは、Ａ−７の全RNAとポリ(A)+RNAのレーンにのみκ−プローブでは約1.0kb、γ−プローブでは約1.6kbのバンドがそれぞれ観察された。この結果から、今回調製したポリ(A)+RNAは殆ど分解もなく、目的とするＡ−７抗体のcDNAクローニングに充分使用可能であると判断し、cDNA合成に供した。
３．cDNA合成
前項で調製したポリ(A)+RNAの内５μｇを用いてcDNAを合成した。１stストランドcDNAの合成量は約650ngであった。一部をアルカリ・アガロースゲル電気泳動で調べた結果、１stストランドcDNAは約0.1kbから約6.5kbの範囲に分布していた。
合成した１stストランドcDNA全量を用いた約２μｇの２ndストランドcDNAを合成し、その全量をT4DNAポリメラーゼで処理して末端を平滑末端とした。定法によりEco RIサイトのメチレーション、Eco RIリンカー連結そしてEco RI消化と順次反応を進め、フェノール抽出・EtOH沈澱を行って最終的に約1.7μｇのリンカー連結dscDNAを回収した。
Eco RIリンカーを付加したcDNAをEco RIで消化した後スパンカラムクロマトグラフィーで精製し約300bp以下のDNAを除去した。その結果約550ng（回収率31％）のcDNAが回収された。得られたcDNAをλgt10のEco RIサイトにクローニングしてcDNAライブラリーを作製した。
４．cDNAライブラリー
ゲル濾過で得られた約550ngのcDNAの内、50ng及び100ngのcDNAを１μｇのλgt10Arm DNAと連結してcDNAライブラリーを作製した（表１）。
0003739009.tif 000002
E.Coli C600を指示菌とした場合、50ngのcDNAを用いて約2.2×106pfu/mlのライブラリーが得られた。今回の実験ではインサート保有率やそのサイズ等を調べなかったが、C600を指示菌とした場合95％以上が鮮明なプラークであり、非組み換え体である混濁したプラークは２−３％以下であったので、作製したライブラリーは目的とするκ−及びγ1-cDNAをクローニングするに充分なライブラリーと判断した。
５．cDNAのスクリーニング
50ngのcDNAを用いて作製したライブラリーの一部をオリゴヌクレオチドプローブでスクリーニングした。約3,000pfu/プレート（φ15cm）の密度でファージをまいて４枚のマスタープレートを作製し、それぞれのマスタープラートより２枚のレプリカフィルターを取ってそれぞれＣγ1-又はＣκ−プローブでスクリーニングした。その結果Ｃγ1-プローブでは1.27％、Ｃκ−プローブでは1.76％の頻度で明確な、強いシグナルが観られた（表２）。
0003739009.tif 000003
６．cDNAの性状
プラークドット法で２ndスクリーニングを行ってＣγ1-プローブとハイブリッドするクローン（γ1-クローンと略す）を７クローン、Ｃκ−プローブとハイブリッドするクローン（κ−クローンと略す）を10クローン単離した。これらのクローンからミニプレップでファージDNAを抽出し、Eco RIで消化してcDNAのサイズを調べた。EtBrによる染色ではκ−クローンで0.8〜1.0kb、γ1-クローンで1.5〜1.7kbの単一バンドのインサートcDNAが観察された。
EtBrによる染色後定法に従ってサザーンブロッティングを行いプローブとハイブリッドするcDNAのサイズを確認した。サザーン解析ではγ1-及びκ−クローンの全てのクローンで単一のバンドが観察され、そのサイズはκ−クローンが0.8〜1.0kb、γ1-クローンが1.5〜1.7kbであり、EtBrによる染色結果と一致した。
ノーザン解析の結果Ａ−７のγ1-及びκ-mRNAのサイズはそれぞれ約1.6kbと約1.0kbである事が明らかである。クローンのうち、γ1では３クローン（#1、２と４）、κでは４クローン（#1、４、９と10）がそれぞれ約1.6kbと約1.0kbのcDNAインサートであり、ノーザン解析の結果とほぼ一致していたので、これらのクローンのcDNAインサートをpUC 19にサブクローニングしてその性状を調べた（第３図及び第４図参照）。
７．cDNAの制限酵素地図
cDNAをpUC19のEco RIサイトにサブクローニングして制限酵素地図を作製した。γ1-cDNAではＣ領域にPst I，Bam HI，Pvu II，Sma I等のユニークサイトがある。又κ−cDNAではＣ領域に一個所Hpa Iがある。そこで得られたサブクローンをこれらの酵素で消化して制限酵素地図を作製した。
7-1.γ1-cDNA
前項６で選出した３クローン（#1,2&4）の制限酵素地図を作製した（第５図）。３つのクローンの制限酵素地図は同一であった。cDNAのサイズはクローン２と４が約1.6kbでクローン１はこれより約５０bp短かった。そこでクローン#2をpIG001、クローン#4をpIG002とそれぞれ命名してＶ領域のシークエンシングに供した。
7-2.κ-cDNA
サブクローンのκ−cDNAのサイズは約1.0kbであり、何れのクローンでもEco RIとHpa Iの二重消化で約550bpのＣκ断片と約420bpのＶ断片の二本のバンドが観察された。ところがこれらのクローンを数種の制限酵素で消化して比較した結果、３クローンではＶ領域にBam HIとPst Iの二つのユニークサイトがあったが、他の３クローンではこれらのサイトが観られなかった。この結果から、Ａ−７細胞のκ−鎖cDNAは二種類あると判断し、それぞれTypeIとTypeII（第６図参照）と命名してＶ領域のシークエンシングを行った。
８．cDNAの塩基配列
8-1．κ−cDNA
pIG004とpIG005を用いてセンス−及びアンチセンス−ストランドのシークエンシングを行った。3'末端のシークエンシングは行わなかった。
pIG004では5'非コード領域からリーダー配列にかけてほぼ全長のcDNAが含まれていたが、pIG005はこれより29bp短いcDNAであった。
pIG004のcDNA塩基配列と、推定したＶ−Ｊκ−Ｃκ領域のアミノ酸配列を第１図に示す。タイプIIcDNAでは、最初のATG（ヌクレオチド#21-23）からのオープンリーディングフレーム（ORF）がＶ〜Ｃκまでインフレームで繋がった。Ｖ−Ｊ−Ｃの再配列は正常であり、Ｊ領域はＪκ1であった。以上の結果よりＬ鎖cDNAはタイプIIと判断した。
8-2．γ1-cDNA
第７図にpIG001の制限酵素地図とシークエンシングストラトジーを示した。pIG001ではＶ−Ｊ−CH１領域のシークエンシングをセンス及びアンチセンスストランドで行った。
第２図にEco RIからNco IまでのＶ領域の配列を示す。図の配列からORFを調べた結果、最初のATG（ヌクレオチド#38-40）からのORFがインフレームでマウスγ1-鎖のCH１領域の配列に繋がった。Ｖ−Ｊ−Ｃの配列は正常であった。又配列は示さないが、RVプライマーのシークエンシングではγ1-鎖の終止コドンからポリ（A）テールまでの配列が読み取れた。従ってpIG0015'非コード領域からポリ（Ａ）テールまでのほぼ全長のcDNAを含んでいると考えられた。一方pIG002の5'末端をシークエンシングしたが、pIG001に較べて２bp(CT)5'非コード領域が長い事以外に差は観られなかった。
９．アミノ酸配列との比較
Ａ−７抗体のアミノ末端のアミノ酸配列を求め、cDNA塩基配列から類推したアミノ酸配列と比較した。表３に求めた蛋白質配列を示す。
0003739009.tif 000004
cDNA塩基配列から推定したアミノ酸配列（第１図と第２図）とＡ−７抗体のアミノ末端アミノ酸配列とを比較した。その結果Ｌ−鎖では、蛋白配列とタイプIIcDNAのアミノ酸配列が一致し、Ｌ−鎖cDNAがタイプIIである事が確認された。
一方蛋白配列の結果から、Ｈ−及びＬ−鎖のアミノ末端はＨ−鎖でGlu、Ｌ−鎖ではAspである事が確認された。
実施例２
In Vitro Mutagenesis
クローニングしたcDNAを用いてヒト−マウス・キメラ抗体の発現を行う為には、(1)  発現する宿主細胞に好適な分泌シグナルとcDNAを結合し、(2)  Ｊ領域でヒト抗体のcDNAとインフレーム（in frame）で結合することが必須である。そこでインビトロミュータジェネシス（In Vitro Mutagenesis）を行ってcDNAのJ領域とリーダー／成熟結合部位（Leader/Mature Junction、以下L/M結合部位と略記する。）に制限酵素サイトを導入した。
Ｊ領域にＨ−鎖ではBst EIIサイトをＬ−鎖ではHind IIIサイトをそれぞれ導入した。
ミュータジェニックプライマー（Mutagenic primer）は、JH2-Bst EIIとJK1-Hind IIIを用いた。
又L/M結合部位には、アミノ末端のコドンの最初の塩基の部位を容易に平滑末端と出来る様な制限酵素サイトを導入した。下記にミュータジェニックプライマーの配列を、第８図にＬ−鎖に対するストラテジーを、第９図にＨ−鎖に対するストラテジーをそれぞれ示す。
Ｈ−鎖ミュータジェニックプライマー：
JH2-Bst EIIプライマー：
0003739009.tif 000005
L/M Bsm Iプライマー：
0003739009.tif 000006
Ｌ−鎖ミュータジェニックプライマー：
JK1-Hind IIIプライマー：
0003739009.tif 000007
L/M Hinc IIプライマー：
0003739009.tif 000008
Bsm Iの切断サイトは、GAATGC(1/-1)である。Bsm Iサイト導入後、Bsm I消化-T4-DNAポリメラーゼ処理で突出する3'の塩基を除去する。
第９図のストラテジーに従って、Ｈ−鎖ではpIG002をEco RIとBam HIで消化し、約560bpのV-J断片を回収してM13mp18のEco RI〜Bam HIサイトにサブクローニングした。得られたサブクローンをpTK020及びpKT101としてインビトロミュータジェネシスに用いた。Ｌ−鎖では第８図に従ってpIG005をEco RIとHpa Iで消化し、V-J断片（約500bp）をM13mp18のEco RI〜Sma Iサイトにサブクローニングし、得られたサブクローンをpTK021としてインビトロミュータジェネシスに用いた。J領域のミュータジェネシスでJH2-BstEII及びJK1-HindIIIをそれぞれ導入して得られたクローンをＨ−鎖でpTK023、Ｌ−鎖でpTK022と命名し、L/M結合部位のMutagenesisを行った。L/M結合部位のMutagenesisではＬ−鎖ではpTK022のL/M結合部位にHincIIサイトを導入してpKT103を得た。pKT103のHincII〜HindIIIサイト間のッシークエンシングを行った結果、このクローンのV-J領域には不本意な塩基の置換、欠失等は認められなかった（第10図参照。）
Ｈ−鎖ではJH2-Bst EIIサイトを導入したpTK023とL/M JunctionにBsm Iサイトを導入したpKT102を別個に作製し、両者のＶ領域をPst Iサイトで結合してpMB001を得た。pMB001でシークエンシングを行ったが、不本意な塩基の置換・挿入等は認められなかった（第11図参照）。
実施例３
キメラ抗体遺伝子の作製
ｉ．マウスＶκとヒトＣκのキメラ遺伝子の作製
実施例２で作製した、インヴィトロ・ミュータジェネシスを施したマウスκ鎖cDNAのＶ領域（Ｖκ）と、ヒトκ鎖Ｃ領域cDNA（Ｃκ）とを結合してキメラκ鎖遺伝子を作製した。
ヒトＣκ鎖cDNAを含むpMB005では、Jκ1領域にKpnIサイトとHindIIIサイトがあり、これらのサイトで任意のマウスＶκと結合できる。実施例２で述べたｐＫＴ１０３では、Ｊ領域にHindIIIが導入されているので、HindIIIサイトでマウスＶκとヒトＣκを結合してキメラκ鎖cDNAを作製した。ベクターの作製手順を第１２図に示す。即ち、pKT103をEcoRIとHindIIIで消化後、Ｖκ断片を単離した。この断片と、pMB005をHindIIIとSalIで消化して単離したＣκ断片とを結合してpUC19のEcoRI-SalI間にクローニングしてpMB008を作製した。
pMB008はEcoRI〜SalI間のDNAシークエンスを調べた結果、作製したキメラκ鎖cDNAはJ領域で正常に結合している事が確認された（第13図）。
ii．マウスＶＨとヒトＣＨ１のキメラ遺伝子の作製
実施例２で作製した、インヴィトロ・ミュータジェネシスを施したマウスＨ−鎖cDNAのＶ領域（ＶＨ）とヒトＨ−鎖（γ1）Ｃ領域cDNAのＣＨ１とを結合して、キメラFd鎖遺伝子を作製した。ベクターの作製手順を第14図に示す。
ヒトγ1cDNAのJ領域とＣＨ１領域を含むpMB006をEcoRIとBstEIIで消化し、ベクターDNAを単離した。このDNAと、pMB001をEcoRIとBstEIIで消化して単離したマウスＶＨ断片を結合してpMB007を作製した。pMB007のEcoRI〜SalIまでのDNA塩基配列を第15図に示すが、作製したキメラFd cDNAはJ領域のBstEIIサイトで正常に結合している事が確認された。
実施例４
酵母ＧＡＬ１プロモーターを用いたキメラ抗体発現ユニットの作製
ｉ．キメラκ鎖発現ユニットの作製
実施例３で作製したキメラκ鎖cDNAの5'側に酵母GAL1プロモーターとシグナル配列（特開昭1-240191）を、3'側に酵母GAPDHターミネーターをそれぞれ連結してキメラκ鎖の発現ユニットを作製した（第16図と第17図）。
即ち、pKT103をHincIIとHindIIIで消化してＶκ断片を単離した。一方特開平1-240191号で開示したシグナル配列をコードする合成DNA1と2をアニーリングして5'側がBamHIサイトに、3'側が平滑末端となるDNA断片を調製した。配列を以下に示す。
上段に合成したDNA1とDNA2の配列を、下段にDNA1をアニーリングして得られる合成シグナル配列DNAとアミノ酸配列を示す。
0003739009.tif 000009
これらのDNA断片と、酵母GAL1プロモーターを含むpGAL19をBamHIとHindIIIで消化して調製したベクターDNAを混合後、T4-DNAリガーゼで連続してpMB009を作製した。pMB009では、酵母ＧAL1プロモーターの下流に合成シグナルを介してマウスＶκが連結されている。
次に、このpMB009をHindIIIで消化し、CIP処理してベクターDNAを調製した。一方、酵母GAP-DHターミネーターを含むpMM016をHindIIIとSalIで消化して単離した約120bpの酵母GAP-DHターミネーター断片と、pMB008をHindIIIとXhoIで消化して単離した約340bpのＣκ断片を調製した。調製した3種の断片を混合してT4-DNAリガーゼで連結してpMB012を作製した。作製したpMB012では、酵母GAL1プロモーターの下流に、合成シグナル配列を介してマウス・ヒトキメラκ鎖cDNAが配置し、その下流にGAP-DHターミネーターが結合されている。従って、pMB012は酵母菌体内で機能するキメラκ鎖の転写ユニットを含んでいる。
ii．キメラFd鎖発現ユニットの作製
実施例3-iiで述べたpMB007をHindIIIとSalIで消化してベクターDNAを調製した。これと前述のpMM016より調製したGAP-DHターミネーター断片を連結してpMB010を作製した。作製手順を第18図と第19図に示す。
次に、pMB010をBsmIで消化し、T4-DNAポリメラーゼで処理してBsmI切断末端を平滑末端に変えた後、EcoRIで消化してベクターDNAを調製した。このベクターDNAと、前項で述べた合成シグナル断片及びpGAL19より調製した酵母GAL1プロモーター断片を混合後、T4-DNAリガーゼで連結してpMB011を作製した。pMB011では、酵母GAL1プロモーターの下流に合成シグナル配列を介してマウスＶＨとヒトＨ−鎖（γ1鎖）cDNAのＣＨ１領域からなるキメラFd鎖遺伝子が配置し、その下流に酵母GAP-DHターミネーターが結合されている。従ってpMB011には酵母菌体で機能するキメラFd鎖遺伝子の発現ユニットが含まれている。
実施例５
GAL1プロモーターを用いたエピゾーマルタイプの発現ベクターによるキメラFabの発現
ｉ．pMB023とpMB024の作製
第20図にエピゾーマルFabベクターの作製手順を示す。第一段階としてpYI016をPstIで消化し、T4-DNAポリメラーゼで突出する3'の塩基を除去して平滑末端とした後、HindIIIで消化して約1.8kbのPstI-HindIII断片を単離した。一方、pYI016をHindIII消化して約7.0kbのHindIII-HindIII断片を単離した。これらの断片と、pMB012をEcoRIで消化し、T4-DNAポリメラーゼでフィルインした後にHindIIIで部分消化して単離した約1.4kbのＬ−鎖転写ユニットとを連結した。アンピシリンとカナマイシンで選択してえられた3コロニーは全てpYI016のPstI-HindIII間にＬ−鎖の転写ユニット（Ｌ−ユニット）がクローニングされていた。そこで1クローンをpMB015と名付けた。
pMB015のユニークサイトであるSphIサイトにＨ−鎖の転写ユニット（Ｈ−ユニット）を挿入した。pMB015をSphIで消化し、T4-DNAポリメラーゼで平滑末端とした後CIP処理した。一方pMB011をEcoRIとHindIIIで消化後、T4-DNAポリメラーゼでフィルインして約1.4kbのＨ−鎖転写ユニットを単離し、これを前述のSphI→T4→CIP処理したpMB015と連結してFab発現ベクターを作製した。
トランスフォーメーションで得られたコロニーをスクリーニングして、Ｈ−鎖転写ユニットがＬ−鎖転写ユニットと逆の転写方向に挿入されたクローン（pMB023）と、同方向に挿入されたクローン（pMB024）の二種類が得られた。得られた発現ベクターを用いて酵母の形質転換を行った。
ii．形質転換
宿主、培地は以下のものを用いた。
宿主酵母：
Saccharomyces cerevisiae AH22株を使用した。
AH22（a, his4, leu2, can1）
培地：
YNB；Bacto-Yeast Nitrogen Base(Difco)6.7gを100mlの蒸留水に溶解し除菌濾過したものと、グルコース20gを900mlの蒸留水に溶解しオートクレーブしたものを混合した。
YPD；Bacto-Pepton(Difco)20gとBacto-Yeast Extract(Difco)10gを800mlの蒸留水に溶解したものと、グルコース20gを200mlの蒸留水に溶解したものを別々にオートクレーブした後、混合した。必要な場合、終濃度100μg/mlとなるようにG4 18(Gibco)を加えた。
TPG；YPDのグルコースをガラクトースに変えたもので、調製方法はYPDと同様に行った。
GAL1プロモーターを有するエピゾーマル型酵母用キメラ抗体Fab産生プラスミド（pMB023、pMB024）を酵母AH22株にプロトプラスト法により導入した。
酵母形質転換（プロトプラスト法）の手順
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出現した形質転換体数は以下の通りであった。
プラスミドpMB023で出現コロニー総数46、プラスミドpMB024で122コロニーであった。
iii．培養
1．酵母クローン
Saccharomyces cerevisiae AH22をpMB024で形質転換してスクリーニングされたEH-9と、pMB024で形質転換しスクリーニングされたET-9の2クローンを用いた。
2．培地
YNB：除菌濾過した7% Bacto-Yeast Nitrogen Base(Difco)とオートクレーブイ滅菌した２％グルコースを1:9で混合し、使用時まで4℃で保存した。
YPG：Bacto Peptone(Difco)20gとBacto Yeast Extract(Difco)10gを900mlのdH2Oに溶解したYPブロースと、20%ガラクトースを別個にオートクレーブ滅菌し、使用直前に両者を9:1の比率で混合して調製した。
3．培養
種菌：YNB培地で培養後集菌してＡ540=約50になるように20%グリセロールに懸濁して-80℃で保存している冷凍貯蔵物の1白金耳を2mlのYNB培地に植菌し、30℃で2日培養して培養の種菌とした。この種菌は使用時まで1〜2週間4℃で保存した。
前培養：上記の種菌50μｌを5mlのYNB培地に植菌し（1%植菌）、30℃で20〜24時間前培養した後、この全量を45ml/300mlフラスコのYNB培地に加えて更に48hr培養した。培養終了後遠心（2500rpm、10分、日立卓上型遠心機05-P）で集菌して本培養に用いた。
本培養：500ml/3ｌフラスコのYPG培地に集菌した菌を加えて30℃で約72時間培養した。
4．OD測定
経時的にサンプリングした培養液をdH2Oで10〜100倍に希釈して540nmの吸収を測定して、培養液のOD540（A540）とした。
5．ELISAによる定量
培養過程で経時的に培養液の一部（10ml）をコーニング15ml遠心チューブに取り、卓上型低速遠心機（日立05-P）で2,500rpm、10分遠心してその上清中のFab量をELISA法で測定した。
ELISA法
(1)  第１抗体（固相に被覆する抗体）
ヒトκ抗体：ヤギポリクローナル抗体（TAGO社）
(2)  第２抗体
Fd抗体：ビオチン化マウスモノクロナール抗体およびアビジン-POD（Vector研）
(3)  標準品：ヒトFab
(4)  実験手順
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尚、本検量線から検体中のFab濃度の算出には、log-losit変換により算出した。
６．結果
菌の増殖は培養開始後48時間でほぼプラトーに達し、培養72時間ではA540=68〜75であった。48時間目での培養上清中のFab濃度は、ET-9では1.6mg/L、EH-9では1.3mg/Lであった。
iv．精製
(1)  形質転換酵母（ET-9）の培養上清から限外濾過、陽イオン交換体、ゲル濾過および抗体カラムによりキメラ抗体A7 Fabを精製した。
(2)  本精製に使った材料
限外濾過；分子量1万以下をカット
陽イオン交換体；CM Sepharose Fast Flow(Pharmacia)、φ2.5cm×2cm、3ml/分、pH6、0.05M→0.5MのNaCl密度勾配で溶出
ゲル濾過（GPC）；G3000SW(THK)、φ2.15cm×67.5cm、3ml/分、50mM CH3COOH、0.3M Na Cl、pH6.7
アフィニティクロマトグラフィー；抗-ヒトIgG（H＋L）ヤギIgGゲル（Cappel）、φ0.8cm×4cm、酸溶出
プロテインGクロマトグラフィー（Mabtrap G，Pharmacia）
(3)  純度分析の方法
1．GPC：
カラム；TSKゲルG3000SWXL（φ0.75cm×30cm）×1本
緩衝液；50mM CH3COONa、0.3M NaCl、pH6.7流速；0.5/分
2．SDS-PAGE：
ゲル；SDS-PAGEプレート4/20（第一化学）
電極緩衝液；0.025M Tris、0.192Mグリシン、0.1%SDS
分子量マーカー；LMWキットE（Pharmacia）
泳動条件；60mA/ゲル、1時間
3．逆相クロマトグラフィー（RPC）：
カラム；214P415204（VYDAC）
溶出液；A，0.1%TFA
B，0.02%TFA、80%AcCN
流速；1.0ml/分
勾配（B%）；０→100%（15min）
(4)  活性測定法
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上記の系で、抗原に対する検体の反応曲線を描き、この曲線の直線部分の吸光度が同じ所の各検体の希釈倍率を求め、活性とする。出発原料の活性値を100U/mlと定義し、この出発原料の活性に対する相対値を各検体の活性値とした。
(5)  結果
表３に結果を示す。蛋白および活性の回収率は各々0.003%および21%であった。最終産物の比活性は上清のそれの約7000倍であった。得られた標品は、GPC分析、RPC分析で単一ピークを示し、電気泳動での純度は95%以上であった。
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実施例６
ＧＡＬ１プロモーターを用いた組み込み型発現ベクターによるFabの産生
ｉ．pMB025の調製（第21図参照）
pYI016をHindIIIで部分消化した後T4-DNAポリメラーゼでフィルインし、次いでHpaIで消化してCIP処理した。約7.3kbのベクター断片を単離し、これとEcoRIとHindIIIで二重消化後T4-DNAポリメラーゼでフィルインして単離したpMB011のＨ−鎖転写ユニットとをライゲーションした。その結果、Ｈ−鎖転写ユニットがLEU2dの転写方向と同一方向に挿入されたクローンが3クローン、逆方向に挿入されたクローンが1クローン得られた。前者の内1クローンをpMB016と命名した。
pMB016をSphIで消化後T4-DNAポリメラーゼで平滑末端に変え、ここにpMB012より単離したＬ−鎖転写ユニットを挿入した。その結果、Ｌ−鎖転写ユニットがＨ−鎖転写ユニットと同一転写方向に挿入されたpMB025が得られた。
ii．形質転換
GAL1プロモーターを有する組み込み型の酵母用キメラ抗体Fab産生プラスミド（pMB025）をLeu2d遺伝子内に1ケ所存在するEcoRVで消化して酵母AH22株にプロトプラスト法により導入した。
即ち、Fab鎖発現ベクターをインテグレーション法に基づく方法で染色体中に組み込んだ。
プラスミド
pMB025のEcoRVシングルカットを用いた。
培地
YPD及びYPGを用いた。G418（GENETICIN，483.3mcg/g，GIBCO社製）は50μg/mlの濃度で用いた。
形質転換
次の方法に従って行った。選択マーカーとしてはG418耐性遺伝子を用いた。
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出現した形質転換体数は225であった。
iii．培養
形質転換株の培養
プロトプラスト再生用寒天培地から50μg/mlG418を含むＹＰＤ培地2mlに形質転換体100株を爪楊枝を用いて接種し、30℃で3日間培養した。遠心により菌体を集め2mlのYPG培地に交換後2日間培養し、上清を得た。Fabの産生量は0.12〜0.2μg/mlであった。
実施例７．酵母染色体の複数部位へのベクターの組み込みによるFabの産生
１．酵母ＰＧＫプロモーターを用いたキメラＦａｂ転写ユニットの作製
酵母ＰＧＫプロモーター領域を含むpMB030からPGKプロモーター断片を単離し、これとＨ−鎖およびＬ−鎖転写ユニットを結合してpMB032とpMB033を作製した。ベクターの作製手順を第22図と第23図に示す。
即ち、pMB011（実施例4）をEcoRIで消化してクレノーpolIでフィルインした後、BamHIで消化してベクターDNAを調製した。
また、pMB012（実施例4）をEcoRIで消化してクレノーpolIでフィルインし、BamHIで部分消化してベクターDNAを回収した。一方、pMB030をClaIで消化してクレノーpolIでフィルインした後BamHIで消化して約0.8kbのPGKプロモーター断片を回収した。このプロモーター断片と前述のベクターDNAとを連結し、大腸菌HB101を形質転換してPGKプロモーターを用いたＬ−鎖の発現ベクター、pMB032と、Ｈ−鎖の発現ベクター、pMB033を作製した。
次にpMB032のＬ−鎖転写ユニットとpMB033のＨ−鎖転写ユニットを連結してpMB036を作製した（第24図）。即ち、pMB032をVspIとSspIで消化して約1.8kbの断片を回収した。この断片をクレノーpolIでフィルインした。一方、pMB033をEcoRIで消化してクレノーpolIでフィルインした後CIP処理した。このベクターDNAと単離した約1.8kbのＬ−鎖転写ユニット断片を連結してpMB036を作製した。pMB036では、PGKプロモーターを用いたＬ−鎖の転写ユニットとＨ−鎖の転写ユニットが同一方向に配置している。
２．発現ベクターの作製
２−１．  HIS4遺伝子をマーカーとした発現ベクターの作製
HIS4遺伝子はGene，18，47〜59(1982)に開示されている。His4遺伝子を含むプラスミド、pYeHis4、をNcoIとSphIで消化し、T4-DNAポリメラーゼで処理して両末端を平滑末端に変えた後約4.5kbのHis4遺伝子断片を単離した。この断片と、EcoRIとSmaIで消化後クレノーpolIでフィルインしたpUC19とを連結してpUCHISを得た（第25図）。
pUCHISにはNdeIサイトがユニークサイトとして存在する。そこでpUCHISをNdeIで消化して直鎖とし、クレノーpolIでフィルインしてNotIリンカー（NEB，＃1125，d（pAGCGGCCGCT））を付加してpMB035を作製した（第25図）。
一方pMB036をEaeIで消化してクレノーpolIでフィルインした後NotIリンカーを付加して約3.7kbのFab断片を単離した。この断片とNotI消化し、CIP処理したpMB035とを連結してFabの転写方向とHIS4遺伝子のそれが同一に配置されたpMB043と、逆に配置されたpMB042を作製した（第26図）。
２−２．  ＬＥＵ２遺伝子をマーカーとした発現ベクターの作製
ＬＥＵ２遺伝子を含むｐＢＴ−１（ベーリンガーマンハイム社）の、XhoI〜SalIサイトまでの約2.2kbのLEU2遺伝子をクローニングしたpMB050をNotI消化してCIP処理した。一方pMB042をNotI消化して約3.7kbのFab断片を単離した。このFab断片とNotI消化したpMB050を連結してLeu2遺伝子の転写方向とFabのそれが逆に配置したpMB051と、同一方向に配置したpMB052を得た（第27図）。
２−３．  ＵＲＡ３遺伝子をマーカーとした発現ベクターの作製
酵母ＵＲＡ３遺伝子（Gene，29，113-124，1984）を含むプラスミドpMB041をNotIで消化してCIP処理したベクターDNAと、前項2-1で調製したNotIリンカーを付加したFab断片を連結して、URA3遺伝子の転写方向とFabのそれが逆に配置されたpMB046と、同一方向に配置されたpMB045を作製した（第28図）。
３．  インテグレーション法による酵母の形質転換
酵母、Saccharomyces cerevisiae AH22（a, leu2, his4, can1）由来のウラシル栄養要求性変異株であるUNHB（a, leu2, his4, ura3, can1）の染色体にFab発現ベクターをインテグレーション法で導入してFab産生酵母株を得た。酵母の形質転換は実施例6で述べたプロトプラスト法で行った。形質転換酵母の選択は、ロイシン栄養要求性、ウラシル栄養要求性またはヒスチジン栄養要求性を指摘として行った。
３−１．  Fab産生株、U60の取得
宿主酵母にpMB046を実施例6で述べたプロトプラスト法で導入した。即ち、実施例6に述べた方法でプロトプラストを作製し、これにEcoRVで消化して直鎖としたpMB046を導入した。形質転換体の選択は、ウラシル非栄養要求性で行った。得られたトランスフォーマントのうち60クローンを任意に選んで3mlのYPD培地で培養してその培養上清を実施例5に述べたELISA法でスクリニーングしてFab産生を調べた。スクリーニングの結果得られた2クローン、U33とU60株は、YPD培地での培養で1.2〜2.2mg／ｌのFabを産生した。U33とU60株のFab産生は極めて安定で、非選択内地での継代を繰り返しても産生量の低下は認められなかった。
３−２．  プラスミドpMB042によるU33とU60株の形質転換
UNHBのURA3遺伝子部位にpMB046を導入して得た形質転換酵母、U33とU60のFab産生を増強する為、これらの株のHIS4遺伝子部位にpMB042を導入した。即ちU33とU60を宿主として、そのHIS4遺伝子部位にClaIで消化して直鎖としたpMB042を導入した。
得られた形質転換酵母の内、U33由来の60クローンとU60由来の60クローンをそれぞれ任意に選んで3mlのYPD培地で培養し、その培養上清のELISAを行ってスクリーニングした。その結果、6クローンで元のU33とU60に較べて1.3〜22.2倍にFab産生量が増加したクローンが得られた。このうちU60H03と名付けたクローンは、YPD培地での培養で4.8〜6.5mg／ｌのFab産生を示した。U60H03のFab産生は極めて安定で、非選択培地で継代を続けてもそのFab産生量は低下しなかった。
３−３．  プラスミドpMB051によるU60H03株の形質転換
U60H03のLEU2遺伝子部位にpMB051を導入してFab産生の増加を試みた。即ち、EcoRVで消化して直鎖としたpMB051をU60H03のLEU2遺伝子部位に導入して形質転換酵母を得た。
得られた形質転換酵母から任意に120クローンを選んでYPD培地で培養した。その培養上清をELISAでスクリニーングした結果、2クローンでは8〜10mg／ｌのFab産生が認められた。このうち1クローンをUHL1と名付けた。UHL1のFab産生は極めて安定で、非選択培地で継代を続けてもそのFab産生量は低下しなかった。
４．Fab産生酵母UHLの性状
サザンブロット法によりFab転写ユニットがUHL1株の染色体のどの部位に組み込まれたかを調べた所、確かに染色体のURA3領域、HIS4領域及びLEU2領域に導入されていることが確認できた。またFab転写ユニットの安定性をFab産生量とウラシル、ヒスチジンおよびロイシンの栄養要求性を指摘として調べたところ、非選択培地で50世代以上培養した後でも100%のFab転写ユニットが保持されていた。
従って、UHL1は宿主酵母サッカロマイセス・セレビシエUNHBの染色体の3ケ所、即ち、URA3領域、HIS4領域およびLEU2領域にFab転写ユニットが導入されたものである事が確認できた。
産業上の利用可能性
本発明のマウス抗体Ｖ領域遺伝子断片は適当な発現用ベクターに組込むことができる。
こうして得られたプラスミドは適当な宿主細胞に導入され、マウス抗体Ｖ領域を産生することができる。また、本発明のマウス抗体Ｖ領域遺伝子断片は他動物（例えば、ヒト）抗体Ｃ領域遺伝子断片と組合せることにより、キメラ抗体を効率良く産生できる。そして該キメラ抗体は抗イディオタイプ抗体産生を抑制した治療を可能とし、あるいは信頼性の高い診断等に用いることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１４】
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【図１３】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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