(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルカリゲネス属に属し、多糖類および色素を生成する能力を併有する菌株を親株として変異処理により、色素を生成する能力が低下または欠失した微生物を培地に培養し、培養物中に多糖類を生成蓄積させ、該培養物より多糖類を採取することを特徴とする多糖類の製造法。
【請求項２】
微生物が、アルカリゲネス・レータスＷＢ−１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４６５１）またはアルカリゲネス・レータスＷＰ−１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４６５０）である請求項１記載の方法。
【請求項３】
アルカリゲネス・レータスに属し、多糖類および色素を生成する能力を併有する菌株を親株として変異処理により、色素を生成する能力が低下または欠失した、アルカリゲネス・レータスＷＢ−１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４６５１）またはアルカリゲネス・レータスＷＰ−１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４６５０）である微生物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、多糖類の製造法に関するものである。多糖類は、食品、化粧品、衛生用品、土壌改良剤またはコンクリート混和剤などに利用できる。
【０００２】
【従来の技術】
多糖類および色素を生成する能力を有する微生物を培養すると、培養物中に生成蓄積する多糖類に色素が混入するため、該培養物から多糖類を採取する場合に色素を除去する必要がある。
多糖類から色素を除去するには、有機溶媒などを用いて色素を抽出するなどの工程が必要となる上に、該工程において多糖類のもつ有用な物性が低下することがある。
キサントモナス属に属し、かつ黄色の色素を生成する能力を有しない微生物を用いて多糖類を製造する方法（ＤＤ７７−１９６８０９）は知られている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、微生物による多糖類の製造に際して、培養物中に色素を含まない多糖類を蓄積させることにより、多糖類の精製工程を容易とするなど、多糖類を効率よく製造する方法を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明によれば、アルカリゲネス属に属し、多糖類および色素を生成する能力を併有する菌株を親株として変異処理により、色素を生成する能力が低下または欠失した微生物を培地に培養し、培養物中に多糖類を生成蓄積させ、該培養物より多糖類を採取することを特徴とする、多糖類の製造法を提供することができる。
以下に本発明を詳細に説明する。
本発明における多糖類としては、アカリゲネス属に属する微生物が生産する多糖類であれば、同一種類の単糖類から構成される単純多糖類（ホモ多糖類）、複数の単糖類から構成される複合多糖類（ヘテロ多糖類）、または単純多糖類もしくは複合多糖類にウロン酸もしくはエステル硫酸などを構成成分として含む、酸性多糖類などいずれでもよい。これらの多糖類は、糖タンパク質、プロテオグリカンまたは糖脂質などを構成する糖鎖として複合糖質を形成していてもよい。
【０００５】
単糖類としては、グルコース、フラクトース、マンノース、ガラクトース、フコース、アラビノース、ラムノース、キシロースもしくはプシコースなどの中性糖類またはグルコサミンもしくはガラクトサミンなどのアミノ糖類が、ウロン酸としては、グルクロン酸、ガラクツロン酸またはマンヌロン酸などが、エステル硫酸としては、アリル硫酸、糖硫酸またはコリン硫酸などがあげられる。
単純多糖類としては、セルロースまたはβ-1,3- グルカンなどが、複合多糖類としては、ウエランガム、サクシノグリカンまたは特開昭５６−４５９０１号、特開昭５７−２０６３８２号、特開昭５８−７８５９７号、特開平２−２９１２９２号もしくは特開平５−３０１９０４号の公報に記載の多糖類などが、酸性多糖類としては、ヒアルロン酸、ペクチンまたはコンドロイチン硫酸などがあげられる。
【０００６】
本発明に用いられる微生物は、アルカリゲネス属に属し、多糖類および色素を生成する能力を併有する微生物から誘導され、かつ色素を生成する能力が低下または欠失した変異株であれば、いずれの微生物でもよい。
このような変異株は、アルカリゲネス属に属し、多糖類および色素を生成する能力を併有する微生物を寒天培地上で単集落分離（single colony isolaion）してコロニーの色調が白色に変化した菌株を選択するか、あるいは該微生物を液体培地中で培養し、多糖類を培養物中に蓄積しても培養物または培養液が着色しないような変異株を選択することにより分離することができる。
【０００７】
変異株を分離する際に、アルカリゲネス属に属し、多糖類および色素を生成する能力を併有する微生物に、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン処理、紫外線照射など、通常の変異手段によって、変異させた後に単集落分離を行うと、コロニーの形態の多様性が増し、目的の菌株を見いだす頻度が向上する。
本発明で用いられる微生物の、好適な例としては、アルカリゲネス・レータス（Alcaligenes latus）Ｂ−１６株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２０１５）より分離したアルカリゲネス・レータスＷＢ−１株、あるいはアルカリゲネス・レータスＰ−１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４４５９）より分離したアルカリゲネス・レータスＷＰ−１株があげられる。これらの菌株は、ブダペスト条約に基づいて平成６年４月２１日付で工業技術院生命工学工業技術研究所にそれぞれＦＥＲＭ  ＢＰ−４６５１およびＦＥＲＭ  ＢＰ−４６５０として寄託されている。
【０００８】
本発明の微生物による多糖類の生産は、通常の微生物の培養法にて実施可能であるが、好適な例として特開平２−２９１２９２号公報または特開平４−２００３８９号公報に記載されている培養法が用いられる。
本発明の微生物に用いられる培地としては、炭素源、窒素源、無機物、その他使用菌株の必要とする栄養素を程よく含有するものならば、合成培地または天然培地いずれも使用可能である。
炭素源としては、グルコース、フラクトース、シュクロース、マルトース、ラクトース、糖蜜、セルロース加水分解物、粗糖加水分解物もしくは澱粉加水分解物などの炭水化物、ピルビン酸、酢酸、フマル酸、リンゴ酸もしくは乳酸などの有機酸など、ヘミセルロース、澱粉もしくはコーンスターチなどの天然高分子またはオリーブなどの油類などが用いられる。
【０００９】
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウムもしくは硫酸アンモニウムなどの各種無機塩類、尿素などの有機酸のアンモニウム塩、アミン、その他の窒素化合物、ペプトン、トリプトン、酵母エキス、肉エキス、麦芽エキス、コーンスティープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕加水分解物または、各種発酵菌体もしくはその消化物などが用いられる。
無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、硫酸マグネシウム、リン酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅または炭酸カルシウムなどが用いられる。
【００１０】
その他の栄養素としては、必要に応じてアミノ酸、微量金属塩などが用いられる。
培養は、振盪培養または通気攪拌培養などの好気的条件下にて、温度１５〜４０℃、ｐＨ４〜１０で、通常１〜１０日間行う。
培養終了後、培養物をそのまま用いてもよいし、培養物を遠心分離または濾過などにより分離し、菌体および多糖類を含む混合物（以下、混合物という）として用いてもよい。さらに必要に応じて、培養物または混合物をアルカリ処理や熱処理などによって溶解した後、エタノール沈澱法など通常の多糖類の分離精製法を用いることにより溶解液から多糖類を回収し、これを用いてもよい。
【００１１】
本発明における培養物または混合物は色素をほとんど、あるいはまったく含まない。すなわち、本発明における微生物を培養して得られる混合物をロータリーエバポレーターなどで乾燥させ、さらに１００メッシュ以下に粉砕して得られる乾燥粉末標品のエタノール抽出物（以下、本発明の微生物由来のエタノール抽出物という）は、該微生物の親株から同様の方法で得られるエタノール抽出物（以下、親株由来のエタノール抽出物という）が吸光極大をとる波長において、実質的に光を吸収しない。たとえば、目的とする色素について、吸光極大を示す波長のうち最大の吸光度を示す波長（以下、最大吸光極大を示す波長という）付近、好ましくは最大吸光極大を示す波長から−１０〜１０ｎｍの範囲内の波長、さらに好ましくは最大吸光極大を示す波長における吸光度を色素量として表した場合、本発明の微生物由来のエタノール抽出物の色素量は親株由来のエタノール抽出物の色素量と比べて、１／１０以下の値しか示さない。
以下に本発明の実施例を示す。
【００１２】
【実施例】
実施例１  変異株の分離
ブイヨン寒天培地（粉末ブイヨン２％、寒天２％）（極東製薬製）に生育したアルカリゲネス・レータスＢ−１６株（以下、Ｂ−１６株という）を、グルコース１％を含むブイヨン培地３０ｍｌを入れた３００ｍｌ容三角フラスコに植菌し、３０℃で２４時間振盪培養を行った。培養終了後、遠心分離により菌体を回収し、これを希釈してブイヨン寒天培地に塗布し、細胞の９０％程度が死滅するような処理条件で紫外線を照射した。紫外線照射後、３０℃で２〜５日間培養して生じたコロニーのうち、Ｂ−１６株の特徴である黄色のコロニーではなく、白色のコロニーを形成した菌株を選択し、釣菌分離した。このようにして得た変異株をＧＹ培地〔グルコース 20g/Ｌ、KH2PO4 4.5g/Ｌ、K2HPO4 1.5g/Ｌ 、NaCl 0.1g/Ｌ 、MgSO4 ・7H2O 0.2g/Ｌ、尿素 1.0g/Ｌ 、酵母エキス（シグマ社製）0.5g/Ｌ、(pH7.2) 〕５０ｍｌを入れた３００ｍｌ容三角フラスコに植菌し、３０℃で３日間振盪培養し、培養物が白色を呈する菌株であるアルカリゲネス・レータスＷＢ−１株（以下、ＷＢ−１株という）を選抜した。
また、Ｂ−１６株に代えて黄色のコロニーを形成するアルカリゲネス・レータスＰ−１株（以下、Ｐ−１株という）を用いること以外は上記と同様に行って、アルカリゲネス・レータスＷＰ−１株（以下、ＷＰ−１株という）を選抜した。
【００１３】
実施例２  多糖類の生産
ＷＢ−１株およびＷＰ−１株を、ＦＧ培地〔グルコース 20g/Ｌ、グリシン 0.6g/Ｌ 、KH2PO4 4.5g/Ｌ 、K2HPO4 1.5g/Ｌ 、NaCl 0.1g/Ｌ 、MgSO4 ・7H2O 0.2g/Ｌ、尿素 1.0g/Ｌ 、FeSO4 10mg/Ｌ、(pH7.2) 〕１０ｍｌを入れた６０ｍｌ容太型試験管（直径２５ｍｍ×長さ２００ｍｍ）に植菌し、３０℃で３日間、振盪培養した。Ｂ−１６株およびＰ−１株も同様な方法で培養した。
培養終了後、それぞれの菌株について、以下の方法を用いて多糖類の生産量および色素量を測定した。
多糖類の生産量は培養液の全量を可溶化後、硫酸カルバゾール法にて測定し、グルクロン酸量として表した。
色素量は培養液１０ｍｌにエタノール２０ｍｌを加えて攪拌して抽出を行った後、遠心分離によって上清を回収し、回収した上清を減圧濃縮し、濃縮物をエタノールで５ｍｌになるように希釈した。このエタノール溶液を４５０ｎｍにて吸光度を測定し、色素量をＯＤ450 値として表した。
【００１４】
結果を第１表に示す。
【００１５】
【表１】
0003731010.tif 000002
なお、Ｂ−１６株およびＷＢ−１株の培養液から色素量の測定で用いた方法と同じ方法で得られたエタノール溶液の吸光スペクトルを、それぞれ図１（Ａ）および図１（Ｂ）に示す。図１（Ａ）と（Ｂ）に示されるように、Ｂ−１６株の培養液から得られるエタノール溶液では、４３３ｎｍ、４５７ｎｍおよび４８８ｎｍで吸光極大が認められ、４５７ｎｍで最大の吸光極大が認められたのに対して、ＷＢ−１株の培養液から得られるエタノール溶液では、これらの波長で吸光極大が認められなかった。
【００１６】
実施例３  多糖類の乾燥粉末標品の製造
ＷＢ−１株およびＷＰ−１株を、それぞれＧＹ培地１０ｍｌを入れた６０ｍｌ容太型試験管（直径２５ｍｍ×長さ２００ｍｍ）に植菌し、３０℃、２４時間振盪培養した。この培養液全量をＦＧ培地３００ｍｌを入れた１Ｌ三角フラスコに移し、３０℃で２４時間振盪培養した。ＦＧ培地２．７Ｌを入れた５Ｌ容培養槽（ミツワバイオシステム社製）に、上記種培養液３００ｍｌ全量をそれぞれ植菌し、３０℃、通気量３．０Ｌ／分、攪拌５００ｒｐｍの条件で５日間培養した。Ｂ−１６株およびＰ−１株も同様な方法で培養した。
培養終了後、多糖類の生産量は実施例２と同様な方法を用いて測定した。
それぞれの菌株が生産する多糖類の乾燥粉末標品として、培養物の直接乾燥粉末標品および培養物のエタノール処理乾燥粉末標品を以下の方法を用いて調製した。
【００１７】
培養液３００ｍｌをロータリーエバポレーターで乾燥し、乾燥物を乳鉢で粉砕して１００メッシュ以下の粉末を１〜１．６ｇ取得し、これらを培養物の直接乾燥粉末標品（以下、直接乾燥標品という）とした。
培養液３００ｍｌに精製水２００ｍｌを加え、これに塩化ナトリウムを０．５Ｍになるように加えて攪拌の後、エタノールを０．７容加えて攪拌し、沈澱物を遠心分離によって回収し、ロータリーエバポレーターで乾燥した。乾燥物を乳鉢で粉砕して、１００メッシュ以下の粉末を０．６〜１．１ｇ取得し、これらを培養物のエタノール処理乾燥粉末標品（以下、エタノール処理標品という）とした。
【００１８】
直接乾燥標品およびエタノール処理標品について、精製水を加えてそれぞれ２ｇ／Ｌ水溶液を調製し、各々の水溶液１０ｍｌにエタノール２０ｍｌを加え、攪拌して抽出した後、遠心分離して上清を回収し、回収した上清を減圧濃縮した。濃縮物をエタノールで５ｍｌになるようにそれぞれ希釈し、このエタノール溶液を４５０ｎｍにて吸光度を測定し、色素量をＯＤ450 値として表した。
多糖類の生産量ならびに直接乾燥標品およびエタノール処理標品に含まれる色素量を第２表に示す。
【表２】
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【００１９】
実施例４  多糖類の物理化学的性質
実施例３で調製したＷＢ−１株、ＷＰ−１株、Ｂ−１６株およびＰ−１株が生産する培養物に由来するエタノール処理標品について、それぞれ吸水率および粘性を測定した。
吸水率は、特開平２ー２９１２９２号公報に記載のティーバックテスト法に従い、以下の方法を用いて測定した。まず、不織布で作った容器に４０ｍｇのエタノール処理標品を入れ、精製水に２時間浸漬した後、１時間静置して水切りし、吸水後の重量を測定した。次に、１０５℃で２４時間乾燥して水分を完全に除去した後、乾燥重量を測定した。エタノール処理標品の吸水後の重量と乾燥重量との差を吸水量とし、吸水率は吸水量の乾燥重量に対する倍率として表した。
【００２０】
粘性は、エタノール処理標品を１ｇ／Ｌに溶かした水溶液の粘度を、Ｂ型粘度計で測定した。
結果は第３表に示すとおり、ＷＢ−１株およびＷＰ−１株が生産する培養物に由来するエタノール処理標品は、それぞれＢ−１６株およびＰ−１株が生産する培養物に由来するエタノール処理標品と同様の吸水率および粘性を有していた。
【表３】
0003731010.tif 000004
【００２１】
実施例３で調製したＷＢ−１株、ＷＰ−１株、Ｂ−１６株およびＰ−１株が生産する培養物に由来するエタノール処理標品について、それぞれ５ｇ／Ｌの１０ｍｌ水溶液になるように、７０℃で攪拌しながら溶解した。室温に冷却した後、エタノール３０ｍｌを加え、沈澱物を回収した。回収した沈澱物を、０．０２５％水酸化ナトリウム水溶液１０ｍｌに懸濁し、１２１℃で１５分間加熱した後、７０℃で３０分間攪拌しながら処理を行い、固形物をできるだけ溶解させた。溶解液は４０，０００ｇ×４０分の遠心分離を行って沈澱物を除去した後、０．１Ｎ塩酸で中和し、ロータリーエバポレーターを用いて濃縮した。濃縮物に純水を加えて１０ｍｌとした後、７０℃で再び溶解させた。溶解液にエタノール３０ｍｌを加え、再び沈澱物を得た。上記の溶解操作および沈澱操作を３回ずつ繰り返し、多糖類を精製した。最後に得られた沈澱物を常温にて真空乾燥し、これを乳鉢で粉砕して１００メッシュ以下の粉末を取得し、これを多糖類の精製乾燥粉末標品（以下、精製標品という）とした。
【００２２】
精製標品を２Ｎ硫酸により構成糖に加水分解した後、ＣａｒｂｏＰａｃ  ＰＡ１を装着したダイオネクス４５００ｉ型イオンクロマトグラフィーを用いて分離し、パルスドアンペロメトリーにより構成糖の検出および定量を行った。
多糖類の定量は、特開平２−２９１２９２号公報に記載のエタノール沈澱法によるものと、硫酸カルバゾール法により定量したグルクロン酸の値を４倍した数値のいずれかを用いた。
結果は第４表に示すとおり、ＷＢ−１株およびＷＰ−１株が生産する培養物に由来する精製標品は、それぞれＢ−１６株およびＰ−１株が生産する培養物に由来する精製標品と同様な構成糖の組成を有していた。
【表４】
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【００２３】
【本発明の効果】
本発明により、微生物による多糖類の製造に際して培養物中に色素を含まない多糖類を蓄積させることにより、多糖類の精製工程を容易とするなど、多糖類を効率よく製造する方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【図１】（Ａ）は、Ｂ−１６株の培養液から得られるエタノール溶液の吸光スペクトルを示す。
（Ｂ）は、ＷＢ−１株の培養液から得られるエタノール溶液の吸光スペクトルを示す。
【図１】
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