(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
インターロイキン６中和抗体を有効成分として含有する肺高血圧症の予防及び治療薬。
【請求項２】
インターロイキン６中和抗体を有効成分として含有する肺性心の予防及び治療薬。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、肺における類線維素形成又は血栓形成に起因する疾患の予防及び治療薬並びに該疾患のモデル動物に関する。
背景技術
肺性心は、肺実質疾患、肺血管疾患あるいは肺胞低換気をきたす肺外疾患により肺血管抵抗が増大して、右室圧負荷から右室機能不全に至った状態である。臨床経過と病態により急性肺性心、亜急性肺性心および慢性肺性心の３つに分類され、それぞれの原因疾患も異なる。急性肺性心の原因の代表は肺血栓塞栓症であり、右室が肥大を来す間もなく著明に拡張し、右心不全に陥る。亜急性肺性心の原因としては、多発性・反復性に起こる小肺塞栓症などがあるが、病態は急性肺性心と似ている。慢性肺性心の原因としては、慢性閉塞性肺疾患、肺高血圧症などがあり、右室心筋の肥厚を伴い、体動時の呼吸困難、心悸亢進、浮腫を訴え、予後が悪い。これらの病態の形成には、肺における類線維素形成または血栓形成が大きく関与している。
肺性心の治療方法としては、原疾患の治療と管理が基礎となっており、有効な治療法がなく、対症療法が行われている。
このような疾患の病態の解明、有効な治療法等を検討するためのモデル動物としては、肺高血圧症モデル動物としてモノクロタリン・ラットモデルが利用されている。本モデルは病理学的に筋性肺動脈の中膜肥厚、肺細動脈の筋性化、肺胞隔壁の肥厚を主な特徴としている。
しかしながら、従来のモノクロタリン・ラットモデル動物は、病態として肺における類線維素形成または血栓形成は病態の形成過程にはほとんど見られておらず、肺高血圧症と間質性肺炎とを合併する、いわゆる二次性肺高血圧症モデルと位置づけられており、肺性心の病態の解明や重症度による治療方法の検討には不十分である。また肺性心に対する有望な治療法は現在のところない。
発明の開示
本発明の目的は、肺性心のような、肺における類線維素形成又は血栓形成に起因する疾患の予防及び治療薬を提供することである。また、本発明の目的は、肺における類線維素形成又は血栓形成に起因する疾患のモデル動物を提供することである。
本願発明者らは、鋭意研究の結果、ラットにインターロイキン６（以下、「ＩＬ−６」ということがある）を投与することにより、肺における類線維素形成又は血栓形成が引き起こされて肺性心となること及びＩＬ−６阻害剤を投与することにより、肺における類線維素形成又は血栓形成に起因する疾患の予防及び治療を行うことができることを見出し本発明を完成した。
すなわち、本発明は、インターロイキン６阻害剤を有効成分として含有する肺における類線維素形成又は血栓形成に起因する疾患の予防及び治療薬を提供する。また、本発明は、インターロイキン６による誘発により、肺に類線維素形成又は血栓形成が起きている、肺における類線維素形成又は血栓形成に起因する疾患のモデル用ラットを提供する。
本発明により、肺における類線維素形成又は血栓形成に起因する疾患の予防及び治療を行うことができる薬剤が初めて提供された。また、本発明により、肺における類線維素形成又は血栓形成に起因する疾患のモデル用動物が提供された。本発明のモデル動物は、従来のモノクロタリンモデル動物に比べて発症メカニズムが異なる上に、ＩＬ−６の投与量に相関して類線維素形成又は血栓形成が起き、右室肥大が増大することから肺性心の病態の解明、有効な治療法等を検討するのに適する。
【図面の簡単な説明】
図１は、実施例１における右室／（左室＋中隔）の重量比及びＩＬ−６中和抗体量を示す。
図２は、実施例２における各グループの右室／（左室＋中隔）の重量比を示す図である。
発明を実施する最良の形態
本願発明者らは、ＩＬ−６をラットに投与すると肺において類線維素形成及び血栓形成が起こり右室肥大を生じ、肺性心を発症することを見出した。一方、ＩＬ−６をラットに投与するとともにＩＬ−６中和抗体を投与すると、右室肥大を生じず、肺性心の発症が抑制されることを見出した。また、ラットにＩＬ−６を連続投与するとこれに対する中和抗体が産生され、中和抗体の産生量の増加に伴い右室肥大が抑制されることを確認し、さらに、ラット体内にて産生された抗ＩＬ−６抗体量の増加に伴って肺性心の進展が阻止されることから抗ＩＬ−６抗体の治療効果を、また、ＩＬ−６と同時に抗ＩＬ−６抗体を投与することで肺性心の発症を抑制する予防効果を見出すことで本発明を完成した。
本発明の薬剤による予防及び治療対象としては、肺において類線維素又は血栓形成されることを特徴とする疾患であれば、全て含まれる。すなわち、肺性心の原因疾患も含まれる。このような疾患の例として、肺血栓塞栓症、小肺塞栓症、慢性閉塞性肺疾患、じん肺、各種間質性肺疾患及び肺高血圧症等が挙げられるがこれらに限定されるものではない。
本発明の薬剤は、ＩＬ−６阻害剤を有効成分として含有するものである。ＩＬ−６阻害剤は、ＩＬ−６の作用を中和するかあるいはＩＬ−６の産生を抑制又は阻害する物質であり、例としてＩＬ−６中和抗体、ＰＧＥ1及びその誘導体、ＰＧＩ2及びベラプロスト等の誘導体、シクロホスファミド等の免疫抑制剤等が挙げられる。
ＩＬ−６中和抗体としては、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよいが、モノクローナル抗体が好ましい。ＩＬ−６の中和能を有する抗ＩＬ−６モノクローナル抗体の例として、特開平３−１３９２９２及び欧州公開特許公報0 399 429 A1に記載されたＩＧ６１を挙げることができるがもちろんこれに限定されるわけではない。なお、ＩＧ６１は、ブダペスト条約に基づいて１９９０年４月２７日に日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号の工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されており、その受託番号はＦＥＲＭ  ＢＰ−２８７８である。
本発明の薬剤は、ＩＬ−６阻害剤のみを含むものであってもよいが、医薬品として容認し得る担体や医薬添加物を含んでいてもよい。このような担体及び医薬添加物の例としては、水、エタノールのような有機溶媒、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、ポリエチレングリコール、ジグリセリン、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール、ラクトースおよび界面活性剤などが挙げられる。
実際の添加物は本発明治療剤の剤形に応じて上記の中から適宜あるいは組み合わせて選ばれるが、もちろんこれらに限定されるものではない。
本発明には上記の治療剤と他の薬剤との同時もしくは逐次的併用投与も包含される。他の薬剤としては、原疾患の治療薬のほか、ジギタリス、利尿剤などの右心不全に対する治療剤、抗凝固剤、血管拡張剤、セロトニン拮抗剤、免疫抑制剤あるいは本発明の目的である活性を増強もしくは補助するような薬剤の中から選ばれる。
投与方法としては、特に限定されるものではない。本発明の目的に応じて投与方法が適宜選ばれる。投与形態として外用剤、注射剤などが好ましく用いられる。外用剤としては、例えば、粉剤、噴霧剤などで経肺投与するものなどが含まれるが、もちろんこれに限定されるものではない。注射剤の投与方法としては、静脈注射、皮下注射、筋肉注射、点滴静脈内注入、腹腔内注射などのうち適当な一つが選ばれる。また浸透圧ポンプなど体内留置型の徐放性製剤も変法の１つとして選ばれる。
ＩＬ−６中和抗体等のＩＬ−６阻害剤の有効薬効量としては、好ましくは１日につき体重１Ｋｇ当たり０．００１ｍｇから１００ｍｇの範囲で選ばれる。さらに好ましくは体重１Ｋｇ当たり０．０１ｍｇから１０ｍｇの範囲で選ばれる。前述の投与量は症状によっても異なり、これらの値に限定されるものではもちろんない。投与回数としては通常１日１回ないし２回、もしくは２ないし数日に１回の範囲で選ばれるが、これに限定されるものではない。
本発明の薬剤の具体的な組成の一例を下記に示すが、もちろんこれに限定されるものではない。
ＩＬ−６中和抗体  ５０ｍｇ
生理食塩水  １ｍｌ
上述のように、本発明はまた、インターロイキン６による誘発により、肺に類線維素形成又は血栓形成が起きている、肺における類線維素形成又は血栓形成に起因する疾患のモデル用ラットを提供するものである。ＩＬ−６はＢ細胞が抗体産生細胞へと成熟するための分化因子として初めて同定され、１９８６年にそのｃＤＮＡがクローニングされて以来（Ｈｉｒａｎｏ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．：Ｎａｔｕｒｅ，３２４，７３−７６，１９８６）、ＩＬ−６が種種の疾患の病因、病態に関与することが明らかになってきている（Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏ，Ｔ．：Ｂｌｏｏｄ  ７４：１−１０，１９８９，Ｋａｗａｎｏ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．：Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：８３−８５，１９８８，Ｙｅｅ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．：Ｂｌｏｏｄ  ７４：７９８−８０４，１９８９，Ｅｖｅｒｓｏｎ，Ｍ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．：Ｂｌｏｏｄ  ７４：１４７２−１４７６，１９８９，Ｙｏｓｈｉｚａｋｉ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．：Ｂｌｏｏｄ  ７４：１３６０−１３６７，１９８９，Ｎａｊｉｍａ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．：Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４２：５３１−５３６，１９８９，Ｈｏｒｉｉ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．：Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３：３９４９−３９５５，１９８９）。しかし、これまでにＩＬ−６が肺において類線維素および血栓を形成し右室肥大を引き起こし、肺性心の発症に関与しているとの報告はない。
本発明者らは、ＩＬ−６を実際にラットに投与することによって、肺において類線維素形成および血栓形成が起こり右室肥大を引き起こし、肺性心を発症することを確認し、本発明を完成した。右室肥大の程度はモノクロタリン・ラットモデルとほぼ等しかったが、モノクロタリン・ラットモデルの場合、病理学的に筋性肺動脈の中膜肥厚、肺細動脈の筋性化、肺胞隔壁の肥厚が見られるのに対し、本モデルは肺において類線維素形成および血栓形成が起こり、その発症メカニズムが異なることが明らかになった。しかもモノクロタリン・ラットモデルでは間質性肺炎を合併するのに対し本モデルでは見られないことを特徴とする。さらにモノクロタリンを投与した場合その投与量に関係なく右室肥大が見られるが、本モデルではＩＬ−６の投与量に相関して右室肥大が増大し、肺性心の病態の解明、有効な治療法などを検討するのに適したモデルと言える。
本発明のモデル用ラットは、肺における類線維素形成又は血栓形成に起因するいずれの疾患のモデルとしても用いることができ、これらの疾患の例としては、上記のものを挙げることができる。
本発明のモデル用ラットは、ラットにＩＬ−６を投与することにより作出することができる。ここで用いるＩＬ−６には特に制限はなく、既知の方法で得られる哺乳動物ＩＬ−６が好ましく用いられる。例えば、ＩＬ−６産生細胞を培養して得られたＩＬ−６、あるいは遺伝子組換え法により得られた組換え型ＩＬ−６でもよい。ＩＬ−６産生細胞を培養して得られるＩＬ−６とは、動物由来の細胞を培養することによって得られるＩＬ−６を意味し、動物細胞として、特に線維芽細胞、内皮細胞、ストローマ細胞などが好ましく用いられるが、特にこれらに限定されるものではない。これら培養および精製法については特開平５−１７６７８８に示されているが、もちろんこれに限定されるものではない。
一方、組換え型ＩＬ−６は、大腸菌を用いた既知の方法（例えば、特開昭６３−１５７９９６））により製造することができる。大腸菌以外に、例えば、枯草菌などの原核細胞、酵母、ハムスター細胞・マウス細胞・サル細胞・ヒト細胞などの動物細胞、昆虫細胞、昆虫体にＩＬ−６遺伝子を導入することによっても組換え型ＩＬ−６を製造できる。ＩＬ−６遺伝子は、ＩＬ−６遺伝子をその宿主で機能するプロモーターなどの下流に連結してＤＮＡもしくはウイルスなどの形で前記宿主に導入することができる。
ＩＬ−６を用いて本疾患をラットに誘発する方法としては、ＩＬ−６をラットに投与する方法が好ましく、具体的には静脈注射、皮下注射、筋肉注射、点滴静脈内注入、腹腔内注射などのうち適当な一つが選ばれる。また既知の方法を用いて作製されるＩＬ−６トランスジェニック動物も本発明において用いることができる。その作製方法としては、Ｓｕｅｍａｔｓｕ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：７５４７−７５５１，１９８９）、特開平５−４８０９３に示されているが、もちろんこれに限定されるものではない。
ＩＬ−６を動物に投与する有効薬効量としては、１日につき体重１Ｋｇ当たり０．０００１から５００μｇの範囲で選ばれる。好ましくは、１日につき体重１Ｋｇ当たり０．０１から３００μｇの範囲で選ばれる。前記の投与量は、実験条件によっても異なり、これらの値に限定されるものではもちろんない。投与回数としては通常１日１回ないし２回、もしくは２ないし数日に１回の範囲で選ばれるがこれに限定されるものではない。通常、上記投与を７〜１４日間続けることにより、肺における類線維素形成又は血栓形成が起きる。
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、下記実施例は例示のためにのみ示すものであり、いかなる意味においても限定的に解釈してはならない。
実施例１
ＩＬ−６投与による肺性心モデルの作製：
１．方法：
１）Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｒｅｙ系ラット（６週齢、雄、体重１５０〜２００ｇ  船橋農場、日本国宮城県仙台市）を使用した。６０匹のラットを下記の通り各グループ１５匹ずつになるように任意に分けた。なお、ＩＬ−６は、特開平５−１７６７８８に従いヒト線維芽細胞を培養、精製して得た。
グループ１：ＩＬ−６（２００μｇ／Ｋｇ／ｄａｙ，１６日間、ｓｃ）投与群。
グループ２：モノクロタリン（４０ｍｇ／Ｋｇ，初日のみ、ｓｃ）投与群。
グループ３：コントロール（生理食塩水，１６日間，ｓｃ）群。
２）観察日を０、４、８および１６日とし、各観察日に各グループより任意に５匹ずつ選び、下記項目について測定した。
３）観察項目：
（１）肺高血圧症の程度は、Ｆｕｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂｒｉｔ．Ｈｅａｒｔ  Ｊ．１４：４１３−４２０、１９５２）に従い、右室／（左室＋中隔）の重量比を求め、これにより評価した。
（２）肺組織病理学的観察は、通常の方法により標本を作製しヘマトキシリン・エオシンあるいはＭａｓｓｏｎ−Ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ染色を施したものを用いた。また血管の内皮、中腔の増殖制の変化の有無を見るため、免疫病理学的観察は、Ｇｒａｔｚｎｅｒ（Ｓｃｉｅｎｃｅ２１８：４７４−４７５，１９８２）に従いＢｒｄＵ染色を施したものを用いた。
（３）ＩＬ−６中和抗体量の測定
▲１▼  ＥＬＩＳＡプレート（Ｄｙｎａｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．，米国）にＩＬ−６（１μｇ／ｍｌ，０．０５Ｍ  ｃａｒｂｏｎａｔｅ  ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ  ｐＨ９．６）をコーティングし、３７℃で３時間、４℃で１昼夜インキュベートした。
▲２▼  プレートを、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するリン酸緩衝液（０．１Ｍ  ＰＢＳ−Ｔ，ｐＨ７．４）で３回洗浄した後、３％牛血清（ＢＳＡ）を含有するＰＢＳ（ＰＢＳ−ＢＳＡ）を加えた。
▲３▼  ＰＢＳ−ＢＳＡで１：５０に希釈した血清サンプルをウェルに分注し、３７℃、１時間インキュベートした後、ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した。
▲４▼  ＰＢＳ−ＢＳＡで１：１０００に希釈した、アルカリ・ホスファターゼ結合抗ラットＩｇＧウサギ抗体Ｆ（ａｂ′）2をウェルに分注し、１時間インキュベートした。
▲５▼  ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄後、ニトロフェニールホスフェイト溶液（Ｓｉｇｍａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，米国．ｃａｒｂｏｎａｔｅ  ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ０．０５Ｍ，ｐＨ９．８）をウェルに加え、吸光度４０５ｎｍでＯＤを測定した。
２．結果
１）右室／（左室＋中隔）の重量比：
図１に示したように、グループ１はいずれの観察日においても右室／（左室＋中隔）の重量比がグループ３に比べ有意に増加し、グループ２との間には有意差はなかった。
２）肺における組織学的観察
グループ１では４日目以降肺小動脈血管、毛細血管に類線維形成、血栓形成を認めたが、グループ２では筋性肺動脈の中膜肥厚や外膜への細胞の浸潤が見られた。ＢｒｄＵ（＋）細胞の増殖は、グループ２のみに見られ、グループ１はグループ３と差がなかった。
３）ＩＬ−６中和抗体量
グループ２ではいずれの測定日においても検出限界以下であったが、グループ１においては８日目以降増加した（図１）。
図１において、１６日間ＩＬ−６を連日投与した過程で、４日、７日と経時的に右室／（左室＋中隔）比は増大し、病状の進行が認められた。しかしながら、８日目から１６日目にかけ、病状進行の停止又は改善が認められる。一方、モノクロタリン投与群においては投与後１６日目までほぼ直線的に病状の進展悪化が見られる。投与したＩＬ−６はヒトのＩＬ−６であり、異種動物への投与による抗ヒトＩＬ−６抗体の産生が理論的に予想された。そこで、各実験群の保存血清中の抗ＩＬ−６抗体量を測定したところ、正しく８日目から１６日目にかけて抗ヒトＩＬ−６抗体の血清中力価上昇が確認された。以上より、上記の症状進行の停止又は改善は抗ヒトＩＬ−６抗体産生に連動していることが明らかである。発症後であっても有効であることはＩＬ−６の産生あるいはその作用を抑制する化合物の治療効果を明確に示している。
実施例２
抗ＩＬ−６抗体による中和実験
次に我々はＩＬ−６の産生又は作用を抑制する化合物に発症予防作用があるか否か、ＩＬ−６投与と同時に抗ＩＬ−６抗体をラットに投与する実験を行った。抗ヒトＩＬ−６ラット抗体の調製は以下のようにして行った。すなわち、実施例１で用いたＩＬ−６をラットに２００μｇ／ｋｇの投与量で皮下投与した。２週間後、ラットから採血し、血清に硫安を３０％濃度に加えて硫安沈殿を採取し、ＰＢＳに対して透析した。得られた分画（抗ＩＬ−６ポリクローナル抗体含有）を以下、ＩｇＧ分画と言う。このＩｇＧ分画２０μｇは組換えＩＬ−６  ２５ＩＵ活性を十分に中和することを確認した。
ラット１１匹を下記の５グループに分け、ＩＬ−６及び／又は上記ＩｇＧ分画を投与した。ＩＬ−６は７日間連日皮下投与し、ＩｇＧ分画は７日間静脈内投与した。なお、ＩｇＧ分画は、ＩＬ−６と並行して投与した。また、対照として、ＩＬ−６もＩｇＧも投与しなかった群（グループＡ）及び上記ＩｇＧに代えて正常ラット（ＩＬ−６で免疫していないラット）の血清のＩｇＧ分画を投与した群（グループＥ）も設けた。開始後７日目に心臓を摘出し、右室／（左室＋中隔）重量比を求めた。なお、ＩＬ−６を投与したグループでは、ＩＬ−６の投与量はいずれも２００μｇ／ｋｇ／日であった。
グループＡ：非処置群（ＩＬ−６投与もＩｇＧ投与も行わなかった個体）
グループＢ：ＩＬ−６単独投与群
グループＣ：ＩＬ−６とＩｇＧ分画併用群（ＩｇＧ分画投与量は２０ｍｇ／ｋｇ／日）
グループＤ：ＩＬ−６とＩｇＧ分画併用群（ＩｇＧ分画投与量は２ｍｇ／ｋｇ／日）
グループＥ：ＩＬ−６と正常ラット血清ＩｇＧ分画併用群（正常ラット血清ＩｇＧ分画投与量は２０ｍｇ／ｋｇ／日）
結果を図２に示す。図２に示されるように、７日目の判定において、ＩＬ−６単独投与群（グループＢ）は非投与群（グループＡ）に対し明らかに肺高血圧症を誘発した。これは実施例１の成績を再現するものである。このＩＬ−６の皮下投与に並行した抗ＩＬ−６抗体含有ＩｇＧ分画の２０ｍｇ／ｋｇ／日を投与すると肺高血圧症の発症は完全に抑制された（グループＣ）。また抗ＩＬ−６抗体量を１／１０にしても有効であった（グループＤ）。一方、ＩＬ−６に正常ラット血清ＩｇＧ分画を併用した群（グループＥ）では肺高血圧症発症は抑制されなかった。
【図１】
0003783873.tif 000002
【図２】
0003783873.tif 000003