(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
スーパーオキシドジスムターゼと、プロラミンおよびプロラミンベースのポリマーフイルムからなる群から選択される少なくとも１つの化合物との組み合わせと、及び任意に１以上の薬理学的に受容し得る賦形剤からなることを特徴とする経口投与用の医薬組成物。
【請求項２】
プロラミンが植物起源であり、小麦、ライ麦、大麦、エンバク、米、キビ及びトウモロコシからなる群から選択される種々の穀類から誘導されることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
プロラミンベースのポリマーフィルムが、好ましくは
−少なくとも１つの植物起源のプロラミン、
−炭水化物とエステル類からなる群から選択され、プロラミンとの比が２：１〜２：０．５である、少なくとも１つの可塑剤、及び
−モノオール、ジオール及び水から選択される５〜３０％の少なくとも１つの溶媒、からなる疎水性ポリマーからなり、
−それらが、アルコール力値４０〜８０％の水性アルコール溶媒に溶解した４０〜８０％の少なくとも１つのプロラミンと、アルコールプロラミン溶液との比が０．１０：１〜０．５０：１である少なくとも１つの可塑剤からなる原料組成物の存在する溶媒の少なくとも一部を、より濃い又は薄い濃度の均一溶液が得られるまで蒸発させて得ることができることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
結合賦形剤としてリポソームを含むことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１つに記載の組成物。
【請求項５】
炎症治療用医薬の製造のための、請求項１〜４のいずれか１つに記載の組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
本発明は、良好な生体利用性及び治療効力を確実にするスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）の経口投与に特に好適な新規医薬組成物に関する。
マッコードとフリードビーク（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９６９，２４４，６０４９−６０５５）による１９６８年の特性化決定以来、スーパーオキシドジスムターゼは多くの疾病で研究されている。スーパーオキシドジスムターゼは実際には不均化によりスーパーオキシドラジカル（・Ｏ2-）除去を促進する酵素であり、このために大気中の酸素から生体内で生成しうるこのラジカルの心身に有害な作用からの保護を供する系を構成する。この結果、この酵素は、細胞や生物が、酸素（ビラジカル）が不対電子を失っている（還元）酸素化された大気に暴露され、その結果生じる毒性作用を防ぐのに基本的な役割を果たしている。
フリーラジカルは多くの疾病に関与しているので、治療におけるＳＯＤの使用が、異なる炎症性作用（特にリューマチや線維症）、ウイルス性作用（特にＨＩＶ感染）、及び多量の酸素の存在と関連している毒性症状（中枢神経系、虚血、非血管性胃腸障害、眼性障害又は抗癌治療の望ましくない効果抑制）で推奨されている（グリーンウォールド  Ｒ．Ａ．，Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃａｌ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，１９９０，８，２０１−２０９）。
試験されているＳＯＤの遊離型は、Ｃｕ、Ｚｎ−ＳＯＤ（植物起源又は動物起源：ウシ、ラット又はヒト）、Ｍｎ−ＳＯＤ（ヒト、植物、藻類起源）、Ｆｅ−ＳＯＤ及び組換えＳＯＤである。
天然ＳＯＤの血漿半減期は、非常に様々である（例えば、Ｃｕ、Ｚｎ−ＳＯＤは数分のオーダー、Ｍｎ−ＳＯＤは数時間のオーダーである）。
非経口投与のための別の改変型が、これらＳＯＤの血漿半減期を増加させるために提案されている。改変型には、ポリエチレングリコールとの結合ＳＯＤ（ＳＯＤ−ＰＥＧ）、ヘパリンとの結合ＳＯＤ（ＳＯＤ−ヘパリン）、アルブミンとの結合ＳＯＤ（ＳＯＤ−アルブミン）、ＳＯＤポリマー又はＳＯＤコポリマー及びリポソームＳＯＤが挙げられる。
しかし、これらの種々のＳＯＤは経口投与時に吸収性が非常に低いという大きな欠点を有している。
それ故、出願者は、治療されるべき上述の疾病の大部分に特に価値のある投与形態である経口投与で、ＳＯＤの効果的な吸収を可能にし得るガレヌス型の開発を計画した。
本発明は、本質的にスーパーオキシドジスムターゼと、脂質及びタンパク質からなる群から選択される少なくとも１つの化合物との組み合わせと、任意に一以上の薬理学的に受容し得る賦形剤からなることを特徴とし、経口投与に特に好適な医薬組成物に関する。
該組成物の１つの有利な具体例では、脂質は植物脂質、好ましくはセラミド、リン脂質、チラコイド及びジアシルグリセロールからなる群より選択される。
該組成物の別の有利な具体例では、タンパク質は植物タンパク質、好ましくはプロラミン及びプロラミンベースのポリマーフィルムよりなる群から選択される。
リポソームは組成物と関連し得る好ましい賦形剤として挙げられる。
該組成物の有利な具体例では、セラミド（又はＮ−アシルスフィンゴシン）は合成、動物又は植物起源、好ましくは植物起源であり、下式；
0003856825.tif 000002
〔式中、ｎは５〜１５、好ましくは１２〜１５であり、
Ｘは−ＣＨ＝ＣＨ−又は−ＣＨＯＨ−であり、
Ｒは水素原子又は糖（グルコース、ガラクトース）であり、かつ、Ｒ’はＣ3−Ｃ30アルキル基である〕
のスフィンゴシンのＮ−アシル脂肪酸誘導体である。
前記の植物起源のセラミドは、好ましくは穀類（穀粉）、特に小麦より有利に誘導され、下式；
0003856825.tif 000003
〔式中、Ｒは水素原子又はグルコースであり、かつ
Ｒ’は上述の通り〕を有する。
このような（グリコシル化又は非グリコシル化された）植物セラミドは、特にＩＮＯＣＯＳＭ研究所の名において国際特許出願ＰＣＴ  ＷＯ  第９２／００１８２号に記載の方法で得ることがきる。
該組成物の別の有利な具体例では、プロラミンは植物起源が好ましく、種々の穀類、特に小麦、ライ麦、大麦、エンバク、米、キビ及びトウモロコシ、好ましくは小麦から得ることができ（グリアジン）、かつ好ましくは小麦粉又は上記穀類の一つである新鮮なグルテンのどちらかから誘導される天然（すなわち、非変性）プロラミンである。
該組成物の更に別の有利な具体例としては、プロラミンベースのポリマーフィルムは、好ましくは
−少なくとも１つの植物起源のプロラミン、
−炭水化物、好ましくはポリオール類と、フタル酸エステル、アジピン酸エステル、セバシン酸エステル、リン酸エステル、クエン酸エステル、酒石酸エステル及びリンゴ酸エステルのようなエステル類からなる群から選択され、プロラミンとの比が２：１〜２：０．５である少なくとも１つの可塑剤、
−モノオール、ジオール及び水より選択される５〜３０％の少なくとも１つの溶媒
を含む疎水性ポリマーからなり、
−アルコール力価（titre）４０〜８０％の水性アルコール溶媒に溶解した４０〜８０％の少なくとも１つのプロラミンと、アルコール性プロラミン溶液に対する比が０．１０：１〜０．５０：１、好ましくは０．２０：１〜０．２３：１である少なくとも１つの可塑剤からなる原料組成物の存在する溶媒の少なくとも一部を、より濃い又は薄い濃度の均一溶液が得られるまで蒸発させて得ることができる。
このようなプロラミンベースのポリマーフィルムは、溶媒の蒸発の程度により、ゲル又は柔軟性もしくは脆化性乾燥フィルム、すなわち大なり小なりプラスチックフィルムのいずれかの形態をとることができる。
予期しなかったことであるが、本発明の組成物は、先行技術のＳＯＤ組成物で得られる生体利用性と比べて、ＳＯＤの生体利用性が著しく増加しているのでＳＯＤの経口投与に特に適している。
また予期しないことであるが、本反応の組成物、すなわちＳＯＤ＋プロラミン（好ましくはグリアジン）ベースのポリマーフィルムは、酸性ｐＨ（胃の媒質）中でＳＯＤを保護し、かつ持続放出型を構成する。
前述の条項に加えて、本発明は、本発明の対象物の生成方法をどのように行うかの実施例と以下の添付図を引用する以下の記載から明らかになるであろう他の記載も含む。
図１〜３は、ＳＯＤの種々の型（遊離型、リポソーム型、本発明のセラミドを有する型）の皮下投与後に得られる赤血球濃度を示す。
図４〜７は、ＳＯＤの種々の型の経口投与後に得られる赤血球濃度を示す。
図８〜１５は、ラット足浮腫（paw oedema)（炎症標準）の容量における本発明の組成物の治療結果（経口投与後に生じる抗炎症特性）をＳＯＤ投与量の関数として示す。
図１６と１７は、経口投与したＳＯＤの量と抗炎症作用の関係（摂取（gavage）数の関数としてのＳＯＤの阻害割合）を表す。足浮腫は、摂取から４、５及び６時間後に測定した。
図１８〜２０は、顆粒球活性化におけるＳＯＤの経口投与の阻害作用と、本発明の組成物の生体利用性の有為な増加を表す。
しかしながら、これら実施例は本発明の対象を表すためのものにすぎず、制限を意味しないことは、理解されるべきである。
実施例１：本発明による組成物：ＳＯＤ＋グリアジンベースのポリマー
１．グリアジンへのＳＯＤの組込み方法：
＊グリアジン＋ＳＯＤ配合組成物：
0003856825.tif 000004
＊製造方法
水性アルコール溶媒を、４０℃に温度調節した浴中に置いた小さなビーカーに攪拌しながら導入する。次いで、順に化合物有２、３、４及び５を加える。それぞれ添加した後に、化合物が完全に溶解するまで攪拌する。
グリアジン−グリアジン疎水相互作用を減少させ、それによりグリアジンの可溶性を増大させるために、その混合物を加熱し、攪拌する。
グリセロールを加湿剤として用い、ソルビトールを安定化剤ならびに可塑剤として用いる。得られる混合物は、粘性で、褐色がかっている。
２．１で得た混合物の配合：
例えば錠剤の形態で本発明の組成物を得るために、得られたペースト状混合物を適当な支持体（テフロン、ポリプロピレン、ガラス又はステンレススチールの支持体）上に広げ、溶媒を２４℃かつ相対湿度６０％で約４０時間、又は６０℃かつ相対湿度２％で約２０時間、又は３７℃のいずれかで蒸発させる。ランプは、フィルムから２０ｃｍ離して数時間（２〜１０時間）置く。
次に、錠剤を製造するために、得られた乾燥フィルムを切断して粉砕する。
実施例２及び３：
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この表において、略語ＤＳＰＣは、ジステアロイホスファチジルコリンを示し、略語ＣＨＯはコレステロールを示し、略語ＰＣは植物セラミドを示す。
実施例２は、先行技術の組成物に対応しており、実施例３は大部分がリポソームでカプセル化された本発明の組成物ＳＯＤ＋セラミドに対応している（ＤＳＰＣ／ＣＨＯ／ステアリルアミン）。
リポソームは、ヨーロッパ特許出願第０  ２７４  ９６１号又は同０  ３４９  ４２９号に記載の方法で得られ、重分散性の欄に示すように良好な均質性を有する。
実施例４：ＳＯＤベース組成物の皮下及び経口投与後の薬物動態比較研究
血漿性ＳＯＤのキネティクスは、麻酔にかけたラットで本発明の組成物の形態の遊離型ＳＯＤ、リポソーム型ＳＯＤ又はＳＯＤの経口もしくは皮下投与後に分析する。
−材料：
＊動物：
用いたラットは、体重３００〜４００ｇで、病原性形質でなく、同じ血液型ではない雄のＯＦＡ、スプローク−ドーレイ（Sprague-Dawley）ラットである（IFAA CREDO品種）。それらは、環境の変化に関連したあらゆるストレスを避けるために、飼育小屋に到着した後３週間そのままにし、実験前の１６〜１８時間に水のみ与えた。
＊用いた装置：
・摂取（１投与当たり１つ）、皮下注射及び麻酔用の５ｍｌの使い捨て目盛り付プラスチックシリンジ
・麻酔用１ｍｌシリンジ
・ストレートの胃管カニューレ  ８５／１４（１投与当たり１つ）
・麻酔用使い捨て針２５／０．５
・無意識のラットの隔離用クリスタライザー（crystallizer）
・カテーテル用の外科用備品：
ＰＥ５０  カテーテル（Becton-Dickinson）
１方向タップ（tap）の呼吸補助用導管カニューレ（Vygo）
＊麻酔溶液：
用いた麻酔は、チオペンタールである（Nesdonal（登録商標））。それを５０ｍｇ／ｋｇ体重の速度で投与する。
溶液は、使用直前に調製する。
＊ヘパリン溶液：
ヘパリンＰＶＰ（ポリビニルピロリドン）５００ｍｇ／ｍｌ＋０．９％ＮａＣｌ中ヘパリン２００ＩＵ
＊研究に用いた溶液：
・経口投与：
０．９％ＮａＣｌ中牛赤血球ＳＯＤ（Allerbiodose（登録商標））１−２−４ｍｇ／ｍｌ、
０．９％ＮａＣｌ（対照）、
本発明による０．９％ＮａＣｌ中牛赤血球ＳＯＤ  １−２−４ｍｇ／ｍｌ＋植物セラミド１％（Inocosm）、
０．９％ＮａＣｌ中植物セラミド１％（対照）、
リポソーム牛赤血球ＳＯＤ  １−２−４ｍｇ／ｍｌ、
リポソーム（対照）、
小麦からのグリアジン抽出物（対照）、
本発明による牛赤血球ＳＯＤ＋グリアジン、
・皮下投与：
０．９％ＮａＣｌ中牛赤血球ＳＯＤ（Allerbiodose）０．５−１−２ｍｇ／ｍｌ、
０．９％ＮａＣｌ（対照）、
本発明による０．９％ＮａＣｌ中牛赤血球ＳＯＤ  ０．５−１−２ｍｇ／ｍｌ＋植物セラミド１％（Inocosm）、
０．９％ＮａＣｌ中植物セラミド１％（対照）、
リポソーム牛赤血球ＳＯＤ  ０．５−１−２ｍｇ／ｍｌ、
リポソーム（対照）、
本発明による牛赤血球ＳＯＤ＋グリアジン
・方法：
＊動物の予備処置：
経口投与による胃管：
動物（ｎ＝４）に、０．９％ＮａＣｌ溶液中に研究される溶液又は懸濁液１ｍｌ容量をＴ０で摂取させる。この摂取は、１ｍｌのシリンジで固定したカニューレを用いて行い、ラットの口腔に導入する。
皮下投与：
研究される溶液又は懸濁液を、動物の後頭部（ｎ＝４）に（０．９％ＮａＣｌ溶液中）０．３ｍｌ容量を注射してＴ０で投与する。
実験は、各系とも１投与当たり４匹の動物で行い、各実験で対照の群を常に平行して処理する。
＊頸動脈のカテーテル：
動物に摂取（又は皮下注射）させ、チオペンタール（０．１ｍｌ／１００ｇ）をゆっくり腹腔内注射して麻酔にかける。
頸動脈にカテーテルができるように、眠った動物を置く。一対の鋏を用いて、注意深く動物の首の皮膚を切断する。
筋肉を鉗子で分離し、頸動脈に自由に接触できるようにする。
頸動脈を離し、次いで心臓の端にクランプし、そこに細い糸でつなぐ。次に、一方向タップを備えた針で固定したカテーテルを（約１．５ｃｍ離して）挿入できるように、一対の鋏で頸動脈をわずかに切開する。カテーテルを心臓の端に二本の結紮糸で保持する。次に、連続的にサンプルを採取する時の血液凝固を避けるために、それをヘパリン溶液でヘパリン化する。
次いで、過剰な乾燥を避けるために、ＮａＣｌ  ０．９％溶液の湿布を傷上に置く。
置いた２つのランプで、実験の間中動物をあたためる。
＊血液サンプル：
一方向タップを介してサンプルを６時間のあいだ毎時間ごとに採取する（４００μｌ）。血液は、ヘパリンエッペンドルフチューブに回収する（２０μｌのヘパリン１０００  ＩＵ／ｍｌ）。次いで、それを４０００ｒｐｍで５分間遠心分離する。次に、血漿を捨て、０．９％ＮａＣｌで置換する。チューブを４０００ｒｐｍで５分間再遠心分離する。このように、赤血球を連続的に３回洗浄する。
＊赤血球アッセイ：ＳＯＤ活性測定
（各形態の）赤血球ＳＯＤの酵素活性のアッセイを各対照又は処理サンプルで行う。
赤血球は、試験中のチューブで生じる阻害が、対照のチューブの阻害の約５０％となるように、蒸留水（＋０．５ｍｌの１％トリトン溶液）で適宜希釈する。
ＩＵ  ＳＯＤ／ｍｌで得られる結果は、ＩＵ  ＳＯＤ／ｍｇヘモグロビンで示す。ヘモグロビンは、４０５ｎｍの分光光度計でアッセイする。
−結果：
皮下投与ＳＯＤの赤血球のキネティクスの結果を、図１〜３に示す。
図１は、遊離型ＳＯＤで得られる赤血球濃度に対応し、
図２は、リポソーム型ＳＯＤで得られる赤血球濃度に対応し、
図３は、本発明のＳＯＤ＋セラミド組成物で得られる結果に対応する。
経口投与ＳＯＤの赤血球のキネティクスの結果を、図４〜７に示す。
図４は、遊離型ＳＯＤで得られる赤血球濃度に対応し、
図５は、リポソーム型ＳＯＤで得られる赤血球濃度に対応し、
図６は、本発明のＳＯＤ＋セラミド組成物で得られる赤血球濃度に対応し、
図７は、本発明のＳＯＤ＋グリアジン組成物で得られる赤血球濃度に対応する。
表は、示された種々の曲線に対して得られるキネティクスータを示す。
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５．結果：
＊皮下投与：
Ｔmaxは、ＳＯＤの４形態に対して約５時間である。
Ｃmaxは、遊離型でわずかに低く、リポソーム型及びセラミドとの型で同一である。
ＳＯＤ＋グリアジンで得られるＣmaxは、濃度２５μｇ／ｍｌで６．５２、濃度５０μｇ／ｍｌで７．４８、及び濃度１００μｇ／ｍｌで６５．６８である。
＊経口投与：
Ｔmaxは、遊離型ＳＯＤ及び実施例２と３の組成物に対して約５時間であるが、グリアジンベースの配合物（実施例１）に対するＴmaxは、６時間以上である。
Ｃmaxは、遊離型で低く、リポソーム型（実施例２）で中間であり、セラミド又はグリアジンとの配合物（実施例３）に対してはより高い。
したがって、ＳＯＤは経口投与時に高濃度に達し、本発明の組成物を用いるときに、その移動（passage）は非常に好ましい。
実施例５：経口投与によるスーパーオキシドジスムターゼの抗炎症特性
Ａ．足浮腫
１）研究対照：
異なる濃度における、遊離型ＳＯＤと本発明の組成物の抗炎症作用キネティクスの比較研究
２）試験される溶液又は懸濁液（実施例４参照）：
＊遊離型ＳＯＤ
＊対照ＮａＣｌ
＊ＳＯＤ＋セラミド（実施例３）
＊対照セラミド
３）技術：
＊ＳＯＤでの動物の処置
実施例５に記載のように、ラットの口腔に挿入した０．５ｍｌのシリンジ上の固定したカニューレを用いて動物に摂取させる。
一日当たり２回摂取させる（朝及び夕方）。
＊浮腫の誘導：
足の肉趾にλカラギーナン１％を０．１ｍｌ注射する。
＊足の容量の測定：
測定は、６時間のあいだ毎時間ごとに行う。
図８〜１５は、ラット足浮腫の容量（炎症標準）における本発明の組成物の治療結果（抗炎症特性）をＳＯＤ投与量の関数として表す。
図８は、０．５ｍｇ／ＳＯＤｋｇで得られる結果（摂取２回）に対応し、
図９は、０．５ｍｇ／ＳＯＤｋｇで得られる結果（摂取４回）に対応し、
図１０は、０．５ｍｇ／ＳＯＤｋｇで得られる結果（摂取６回）に対応し、
図１１は、０．５ｍｇ／ＳＯＤｋｇで得られる結果（摂取８回）に対応し、
図１２は、５ｍｇ／ＳＯＤｋｇで得られる結果（摂取２回）に対応し、
図１３は、５ｍｇ／ＳＯＤｋｇで得られる結果（摂取３回）に対応し、
図１４は、５ｍｇ／ＳＯＤｋｇで得られる結果（摂取４回）に対応し、
図１５は、２０ｍｇ／ＳＯＤｋｇで得られる結果（摂取２５回）に対応する。
同じ方法の範囲内で、図１６と１７は、ＳＯＤの阻害割合を摂取数の関数として表す。
図１６は、０．５ｍｇ／ＳＯＤｋｇで得られる阻害割合に対応し、
図１７は、０．５ｍｇ／ＳＯＤ＋セラミドｋｇで得られる阻害割合に対応する。
抗炎症作用が遊離型ＳＯＤの場合の４又は６回の摂取と同一の投与で決定されるとしても、得られる結果から、経口投与による薬理活性の観点でＳＯＤのカプセル化の利点が示される。
ＳＯＤのカプセル形態は、摂取数に関わらず、抗炎症作用を常に示す。
Ｂ．顆粒球活性の研究
１）研究対象：
顆粒球活性に関して異なるＳＯＤ形態の阻害作用の比較
２）研究される溶液又は懸濁液：
実施例５Ａと同じ溶液又は懸濁液を用いた。
３）技術：
＊サンプル：
サンプルは、胸膜炎の３時間後に回収した。
＊アッセイ：
−対照試薬：ＰＢＳ+（０．６５ｍｌ）＋チトクロームＣ  ５ｍｇ／ｍｌ（０．１５ｍｌ）
−対照細胞：ＰＢＳ+（０．６５ｍｌ）＋チトクロームＣ  ５ｍｇ／ｍｌ（０．１５ｍｌ）十Ｇ  １０Ｍ／ｍｌ（０．２ｍｌ）
−試験：対照ＮａＣｌ（第１欄）、ＳＯＤ（第２欄）、対照セラミド（第３欄）、ＳＯＤ＋セラミド（第４欄）、対照リポソーム（第５欄）、リポソームＳＯＤ（第６欄）を有する、ＰＢＳ+（０．４５ｍｌ）＋チトクロームＣ  ５ｍｇ／ｍｌ（０．１５ｍｌ）＋Ｚ０又はＰＭＡ（０．２ｍｌ）。
振動させながら、３７℃の水浴中で１５分間インキュベートし、氷浴中で１０分間反応を停止し、２０００ｒｐｍで５分間遠心分離する。
４）結果：
図１８〜２０は、得られた結果を表す。
図１８は、刺激後の顆粒球によるスーパーオキシドアニオンの産生を示し、
図１９は、ザイモサンでの刺激後の顆粒球によるスーパーオキシドアニオンの産生を示し（分光光度計技術）、
図２０は、ＰＭＡでの刺激後の顆粒球によるスーパーオキシドアニオンの産生を示す（分光光度計技術）。
結果は、経口投与による、遊離型ＳＯＤ（Ｐ＜０．０５）、リポソーム中のカプセルＳＯＤ（Ｐ＜０．０７）及びセラミド中のカプセルＳＯＤ（Ｐ＜０．００１）の抗炎症性の役割を示している。
図１７は、０．５ｍｇ／ｋｇの投与量において、遊離型ＳＯＤの抗炎症作用は、４回の摂取から認められることを決定づけているが、図１８の結果は、セラミド中のカプセルＳＯＤは、２回の摂取で抗炎症作用を有していることを決定づけている。
本発明は、上述の記載から明らかになるであろうが、より明確に記載する実施例、具体例及び応用形態のいずれにも制限されない。逆に、本発明は、本発明の構成又は範囲から逸脱せずに、当業者に生じ得るすべてのバリエーションを含むものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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