(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）配列番号１：
0003747063.tif 000049
で示されるＮ−末端部分アミノ酸配列を含み１０−１２ｋＤａの範囲の分子量を有する、ＦＫ−５０６に対する特異的結合親和性を有する単離精製された均質細胞ゾル結合蛋白質、ＦＫＢＰ１２．６、または
（ｉｉ）配列番号１に示すアミノ酸配列において１乃至数個のアミノ酸が置換、欠失または付加されている上記蛋白質由来のＦＫ−５０６に対する特異的結合親和性を有する蛋白質であって、比結合活性が蛋白質１ｍｇ当りＦＫ−５０６約４．８μｇであり、プロリン含有ペプチド結合のシス−トランス異性化の触媒能によって特徴付けられる酵素活性を有し、ＦＫ−５０６の存在下において、カルシニューリンに結合し、これを阻害する蛋白質。
【請求項２】
比結合活性がＦＫＢＰ１２．６蛋白質１ｍｇ当りＦＫ−５０６約４．８μｇである請求項１記載のＦＫＢＰ１２．６蛋白質。
【請求項３】
プロリン含有ペプチド結合のシス−トランス異性化の触媒能によって特徴付けられる酵素活性を有する請求項１記載のＦＫＢＰ１２．６蛋白質。
【請求項４】
ＦＫ−５０６の存在下において、カルシニューリンに結合し、これを阻害する請求項１記載のＦＫＢＰ１２．６蛋白質。
【請求項５】
ＦＫ−５０６型の免疫抑制剤または請求項１記載のＦＫＢＰ１２．６蛋白質に対する抗体である生物学的に有用なリガンドと請求項１記載のＦＫＢＰ１２．６蛋白質とで形成される、精製された複合体。
【請求項６】
請求の範囲第１項記載のＦＫＢＰ１２．６蛋白質に対する親和性を有する生物学的に有用なリガンドのサンプル中の存在又は量を決定する方法であって、サンプルを請求項１記載のＦＫＢＰ１２．６蛋白質と接触させることを包含する方法。
【請求項７】
サンプル中のリガンドの存在の決定に用いられる請求項６記載の方法であって、サンプルが発酵ブロス、体液又は薬剤候補物質である化学物質である方法。
【請求項８】
ＦＫＢＰ１２．６蛋白質に特異的に結合する抗体であって、該ＦＫＢＰ１２．６蛋白質が請求項１記載の蛋白質である抗体。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
発明の分野
本発明は、ＦＫ−５０６とは結合するがシクロスポリンＡとは結合せず、５６℃で３０分間の加熱に対して不安定であり、かつ約１０−１２キロダルトンの分子量を有する、（“ＦＫＢＰ１２．６”と命名される）新規均質細胞質ゾル結合蛋白質に関する。このＦＫＢＰ１２．６蛋白質は、ペプチジル−プロリン・イソメラーゼ酵素活性を有している。さらに、ＦＫＢＰ１２．６は、ＦＫ−５０６の存在下において、ホスファターゼ・カルシニューリンに結合し、かつこれを阻害する。
当該技術分野における開示の簡単な説明
全身性エリテマトーデス、慢性リューマチ様関節炎、１型真正糖尿病、２型成人発症糖尿病、炎症性腸疾患、胆汁性肝硬変、ブドウ膜炎、多発性硬化症、並びに他の疾患、例えば、クローン病、潰瘍性大腸炎、水疱性類天疱瘡、サルコイドーシス、乾癬、魚鱗癬、及びグレーブス眼球障害（Ｇｒａｖｅｓ  ｏｐｈｔｈａｌｍｏｐａｔｈｙ）を含む多様な“自己免疫”及び慢性炎症性疾患において、免疫調節異常が存在することが示されている。これらの状態の各々の根底をなす病因は非常に異なっているかもしれないが、これらには様々な自己抗体及び自己反応性リンパ球の出現が共通して見られる。このような自己反応性は、部分的には、その下で正常な免疫システムが機能するホメオスタシス制御の欠如によるものである可能性がある。
同様に、骨髄または臓器移植に続いて、ホストのリンパ球は外来組織抗原を認識し、移植片拒絶に繋がる抗体の産生を開始する。
１９８３年に米国ＦＤＡによって認可されたシクロスポリンＡは、現在、移植臓器の拒絶の防止に用いられる最有力の薬剤である。この薬剤は、生体の免疫システムが移植片を外来蛋白質として拒絶する天然の防御因子の巨大な貯えを動員することを妨げることにより作用する。シクロスポリンＡは移植片拒絶との戦いに有効ではあるが、腎毒性があり、腎不全、肝機能異常及び胃腸不快を含む幾つかの望まざる副作用を引き起こすことが知られている。
フジサワの米国、欧州及び日本特許及び出願（米国特許４，８９４，３６６号、ＥＰＯ公開０，１８４，１６２号及び特開昭６３−１７８８４）並びに刊行物（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０９，５０３１（１９８７）、及びＪ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，４０，１２４９（１９８７））は、シクロスポリンの１００倍の能力があると評される、“ＦＫ−５０６”、１７−アリル−１，１４−ジヒドロキシ−１２−［２′−（４″−ヒドロキシ−３″−メトキシシクロヘキシル）−１′−メチルビニル］−２３，２５−ジメトキシ−１３，１９，２１，２７−テトラメチル−１１，２８−ジオキサ−４−アザトリシクロ−［２２．３．１．０4,9］オクタコス−１８−エン−２，３，１０，１６−テトラオン、ＦＲ−９００５０６、タクロリムスを開示している。このマクロライドは、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｔｓｕｋｕｂａｅｎｓｉｓの特定の株を発酵することにより生成される。
臓器移植に対する抵抗の治療において、ＦＫ−５０６を用いた広範な臨床研究がなされている（例えば、Ｇ．Ｌ．Ｂｕｍｇａｒｄｎｅｒら，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．Ｃｌｉｎら，４２１−４４９（１９９３）を参照）。加えて、ＦＫ−５０６及び関連化合物は、閉塞性気道疾患、特に喘息（ＰＣＴ公開ＷＯ９０／１４８２６）、男性部分脱毛症もしくは老人性脱毛症（ＥＰＯ公開０，４２３，７１４）、リューマチ様関節炎（Ｃ．Ａｒｉｔａら，Ｃｌｉｎｃｉａｌ  ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９０，８２，４５６−４６１；Ｎ．Ｉｎａｍｕｒａら，Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．１９８８，４６，８２−９０）、後発性糖尿病（Ｎ．Ｍｕｒａｓｅら，Ｄｉａｂｅｔｅｓ，１９９０，３９，１５８４−８６；Ｎ．Ｍｕｒａｓｅら，Ｌａｎｃｅｔ，１９９０，３３６，３７３−７４）、後部ブドウ膜炎（Ｈ．Ｋａｗａｓｈｉｍａ，Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．，１９８８，２９，１２６５−７１）、虚血に関連する肝損傷（Ｍ．Ｓａｋｒら，Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．，１９９０，４７，６８７−９１）、アレルギー性脳脊髄炎（Ｋ．Ｄｅｇｕｃｈｉら，Ｂｒａｉｎ  Ｎｅｒｖｅ，１９９０，４２，３９１−９７）、糸球体腎炎（Ｊ．ＭｃＣａｕｌｅｙら，Ｌａｎｃｅｔ，１９９０，３３５，６７４）、全身性エリテマトーデス（Ｋ．Ｔａｋａｂａｙａｓｈｉら，Ｃｈｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．，１９８９，５１，１１０−１１７）、多重薬物耐性（Ｍ．Ｎａｉｔｏら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９９２，２９，１９５−２００）、粘膜及び血管の炎症（ＰＣＴ公開ＷＯ９２／１７７５４）、サイトメガロウイルス感染（ＵＫ公開ＧＢ２，２４７，６２０Ａ）、突発性血小板減少性紫斑病及びバセドー病（ＰＣＴ公開ＷＯ９１／１９４９５）の治療に有用であることが示唆されている。また、これらの化合物は、炎症性及び過増殖性皮膚病並びに免疫学的に介在される疾患の皮膚への発現の治療における局所活性を有すると評されている（ＥＰＯ公開０，３１５，９７８）。
ＦＫ−５０６は上記障害及び疾患の幾つかの治療に用いられてはいるが、嗜眠、頃眠、振顫及び攻撃性を含む神経毒性（Ｏｈａｒａ，Ｋ．ら，Ｔａｎｓｐｌａｎｔ．Ｐｒｏｃ．，２２，８３−８６（１９９０）；Ｋ．Ｋｕｍａｎｏら，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．Ｐｒｏｃ．，２３，５１２−５１５（１９９１））がその広範な使用を制限している。したがって、ＦＫ−５０６がその免疫抑制性及び毒性効果を発現する機構を理解することが、生物学的流体中のその濃度を測定する検定法を開発することと同様に望ましい。
ＦＫ−５０６は、１０−１００倍能力が高くはあるが、多数の免疫抑制特性をシクロスポリンＡと共有する。これらの類似性は、両薬剤が生化学的レベルで類似の作用機構を共有し得ることを示唆している（Ｓ．Ｌｉｎら，Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１３３，２６９−２８４（１９９１）を参照）。例えば、シクロスポリンＡは、細胞ゾル蛋白質、シクロフィリンに結合することが知られている（Ｒ．Ｅ．Ｈａｎｄｓｃｈｕｍａｃｈｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２６，５４４−５４６（１９８４））。シクロフィリン・シクロスポリンＡ複合体は、Ｔ細胞活性化及び免疫システム機能に必要なホスファターゼカルシニューリン（ＣａＮ）に結合し、これを阻害する（Ｓ．Ｏ’Ｋｅｅｆｅら，Ｎａｔｕｒｅ，３５７，６９２−６９４（１９９２））。また、シクロフィリンは、ペプチジルプロリル結合のシス−トランス異性化を触媒する酵素活性を有することも示されている（Ｎ．Ｔａｋａｈａｓｈｉら，Ｎａｔｕｒｅ，３３７，４７３−４７５；及びＦｉｓｃｈｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ，３３７，４７６−４７８）。
ＦＫ−５０６は、組織の間にあまねく、真核細胞系統発生を通して発現する、ＦＫ−５０６結合蛋白質（ＦＫＢＰ１２）と呼ばれる多量の細胞質１１．８ｋＤａ蛋白質に結合する（Ｊ．Ｓｉｅｋｉｅｒｋａら，Ｎａｔｕｒｅ，３４１，７５５−７５７（１９８９）；Ｍ．Ｈａｒｄｉｎｇら，Ｎａｔｕｒｅ，３４１，７５８−７６０（１９８９）；米国特許５，１０９，１１２号）。シクロフィリン・シクロスポリンＡ複合体と同様に、ＦＫＢＰ１２・ＦＫ−５０６複合体は、早期リンホカイン遺伝子転写を結果として生じるシグナル変換経路を極めて重要な成分であるカルシニューリン、カルシウム依存性セリン−トレオニン・ホスファターゼを阻害する（Ｊ．Ｌｉｕら，Ｃｅｌｌ，６６，８０７−８１５（１９９１）；Ｊ．Ｆｒｉｅｄｍａｎら，Ｃｅｌｌ，６６，７９９−８０６（１９９１）；Ｎ．Ｃｌｉｐｓｔｏｎｅら，Ｎａｔｕｒｅ，３５７，６９５−６９７（１９９２）；Ｓ．Ｏ’Ｋｅｅｆｅら，Ｎａｔｕｒｅ，３７５，６９２−６９４（１９９２））。ヒトＦＫＢＰ１２はクローン化されており（Ｎ．Ｍａｋｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８７，５４４０−５４４３（１９９０）；Ｒ．Ｓｔａｎｄａｅｒｔら，Ｎａｔｕｒｅ，３４６，６７１−６７４（１９９０）；Ｇ．Ｗｉｅｄｅｒｒｅｃｈｔら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７（２１），７５３−７６０（１９９２））、ウシＦＫＢＰ１２のアミノ酸配列が報告されている（Ｎ．Ｍｏｚｉｅｒら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９４，１９−２３（１９９０）；Ｊ．Ｓｉｅｋｉｅｒｋａら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５，２１０１１−２１０１５（１９９０））。
ＦＫＢＰ１２はリンパ球系特異蛋白質ではなく、組織中に分類上の門を通して広く分布する。ＦＫＢＰ１２蛋白質は、ペプチド及び蛋白質におけるＸａａ−Ｐｒｏのシス及びトランス形態の間の異性化を触媒するペプチジル−プロリル・イソメラーゼ（ＰＰＩａｓｅ）類と呼ばれる新種の酵素の一員である。周知のＦＫ−５０６結合蛋白質（ＦＫＢＰ類）には：ＦＫＢＰ１２（米国特許５，１０９，１１２号）；ＦＫＢＰ１３（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８８，６６７７−６６８１（１９９１）；ＦＫＢＰ２５（Ｇ．Ｗｉｅｄｄｅｒｅｃｈｔら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１８５，２９８−３０３（１９９２））；及びＦＫＢＰ５２（Ｇ．Ｗｉｅｄｄｅｒｅｃｈｔら，Ｊ．Ｂｉｏｌ，Ｃｈｅｍ．，２６７，２１７５３−２１７６０（１９９２））が含まれる（一般的には、Ａ．Ｇａｌａｔ，ＦＥＢＳ，２１６，６８９−７０７（１９９３）を参照）。それらが偏在し、かつ多量に存在することは、ＦＫＢＰ類が細胞生理に、おそらくは変性され、もしくは新しく合成された蛋白質の回転型の交換の促進に重要な役割を果たしていることを示唆している。しかしながら、ＦＫＢＰ１２とは異なり、他の報告されているＦＫＢＰ類はＦＫ−５０６と複合体を形成した場合にカルシニューリンと結合しない。したがって、他のＦＫＢＰ類の単離及び同定が、細胞における治療作用及び毒性のＦＫ−５０６機構を説明する助けとなる。
発明の要約
本発明は、“ＦＫＢＰ１２．６”と称する、ＦＫ−５０６の均質細胞質ゾル結合蛋白質に関する。ＦＫＢＰ１２．６蛋白質は、（ゲル濾過による測定で）１０−１２キロダルトンの分子量を有し、５６℃で３０分間の加熱に際して不安定であり、かつシクロスポリンＡ（ＣｓＡ）とは結合しない。また、この新しく見出された蛋白質は、上記参考文献に記載されるＣｓＡ結合蛋白質、シクロフィリンと対照をなす。この文献には、シクロフィリンが熱安定性であり、１５−１７Ｋｄの分子量を有することが記載されている。ＦＫＢＰ１２とは異なり、ＦＫＢＰ１２．６は５６℃で３０分間の加熱に際して不安定である。加えて、この蛋白質はアミノ酸配列がＦＫＢＰ１２とは異なる。それにもかかわらず、ＦＫＢＰ１２．６は、ＦＫ−５０６の存在下においてカルシニューリンに結合し、これを阻害することが確認されているようやく２つ目のＦＫＢＰである。本発明によると、ＦＫ−５０６に対する特異的結合親和性を有する均質結合蛋白質ＦＫＢＰ１２．６が提供される。
このＦＫＢＰ１２．６蛋白質のさらなる性質は、それがシクロスポリンＡに対する特異的結合親和性を有しておらず；１０−１２キロダルトンの範囲の分子量を有し；ＦＫＢＰ１２．６蛋白質１ｍｇ当り約４．８ｍｇのＦＫ−５０６と特異的結合親和性を有し；５６℃、３０分間で不安定であり；例えば、ウシ又はヒトの脳組織を含む様々な供給源から誘導され；かつプロリン含有ペプチド結合のシス−トランス異性化を触媒する酵素活性を有することである。
ウシＦＫＢＰ１２．６は下記の部分的Ｎ−末端アミノ酸配列（配列番号１）を有する。
0003747063.tif 000002
これとは異なり、ウシＦＫＢＰ１２は下記アミノ酸配列（配列番号２）を有する。
0003747063.tif 000003
また、生物学的に有用なリガンドと上記ＧＫＢＰ１２．６蛋白質とで形成される精製複合体であって、前記リガンドがＦＫＢＰ１２．６蛋白質に対する特異的結合親和性を有する複合体も提供される。このリガンドは、免疫抑制物質、例えば、ＦＫ−５０６型マクロライド、又はＦＫＢＰ１２．６蛋白質に対する抗体であり得る。
さらに、サンプル中、例えばＦＫ−５０６治療で免疫抑制された個体の体液又は発酵ブロスにおける、上記ＦＫＢＰ１２．６蛋白質に対する親和性を有する生物学的に有用なリガンド、例えばＦＫ−５０６の存在又は量を測定する方法であって、前記サンプルをＦＫＢＰ１２．６蛋白質と接触させることを包含し、前記ＦＫＢＰ１２．６蛋白質が、好ましくは、例えば臭化シアン活性化セファロース型アフィニティカラムに、固定化され得るものである方法が提供される。
さらにまた、生物学的に有用なリガンドを精製する方法の態様であって、前記リガンドが発酵ブロス、生物学的流体、例えばヒト血液、を含むサンプル中に存在するものであり、又は薬物特性があるかもしれぬ化学物質であり、かつ前記リガンドが好ましくは免疫抑制物質、例えばＦＫ−５０６、であり、又はＦＫＢＰ１２．６蛋白質に対する抗体である態様が提供される。
加えて、本発明は、ＦＫＢＰ１２．６蛋白質をコードする単離精製ＤＮＡ分子、ＦＫＢＰ１２．６をコードするＤＮＡを有する組換えホスト細胞におけるＦＫＢＰ１２．６蛋白質の発現のための発現ベクター、及び組換えホスト細胞におけるＦＫＢＰ１２．６蛋白質の発現方法を指向する。
本発明及び好ましい態様の説明
本発明は、有力な免疫抑制剤であるＦＫ−５０６に対する、熱感受性、低分子量細胞質ゾル結合蛋白質ＦＫＢＰ１２．６に関する。このＦＫＢＰ１２．６はウシの脳から単離精製されたものである。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、ＦＫＢＰ１２．６がヒトの脳組織にも存在することが示されている。ＦＫＢＰ１２．６蛋白質は、分子量、熱安定性、リガンド特異性及びアミノ酸配列を含む多くの基準により、シクロフィリンとは別のものであると思われる。ＦＫＢＰ１２．６蛋白質は、独特のアミノ酸配列を有することでＦＫＢＰ１２とに相違する。加えて、ＦＫＢＰ１２．６は、細胞質ゾル中の豊富な存在量に欠け、粗製抽出物段階での熱処理に続く復元が不可能であり、非偏在組織分布であるように思われる。
有力な免疫抑制剤であるシクロスポリンＡは、同種異系移植片拒絶の予防及び移植片対ホスト疾患の治療において広範な臨床用途が見出されている（Ｂ．Ｄ．Ｋａｈａｎ，Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎ：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｇｒｕｎｅ  ＆  Ｓｔｒａｔｔｏｎ，Ｏｒｌａｎｄｏ，ＦＬ，１９８３）。ＣｓＡは、限られた早期Ｔ細胞活性化遺伝子の組（ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、γ−ＩＦＮ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ及びｃ−ｍｙｓ）の転写を阻害することにより、Ｔリンパ球活性化の間に特異的に作用するように思われる（Ｊ．Ｆ．Ｅｌｌｉｏｔら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２６，１４３９（１９８４）；Ｍ．Ｋｒｏｎｋｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１，５２１４（１９８４））。Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｔｓｕｋｕｂａｅｎｓｉｓから得られるマクロライドであるＦＫ−５０６は、全く同じではないにしても、生体内及び生体外の両者において、ＣｓＡの１０−１００倍強力ではあるが、類似の免疫抑制特性を、有することが示されている（Ｓ．Ｓａｗａｄａら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３９，１７９７（１９８７））。ＣｓＡによって影響を受ける免疫抑制経路の生化学的性質に対する研究は、シクロフィリンと呼ばれる特異的ＣｓＡ結合蛋白質の精製及び特徴付けに繋がった（Ｒ．Ｅ．Ｈａｎｄｓｃｈｕｍａｃｈｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２６，５４４（１９８４）；Ｍ．Ｗ．Ｈａｒｄｉｎｇら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６１，８５４７（１９８６））。ＣｓＡと同等の親和性で結合し、免疫抑制において役割を果たすことと合致する構造−機能特徴を示す、シクロフィリンの２つの異性体が単離されている。近年、ＦＫ−５０６が、細胞質受容体に結合し、これを介して機能し得ることが報告されている（Ｖ．Ｗａｒｔｙら，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，４６，ｐ．４５３（１９８８））。
ＦＫ−５０６は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｔｓｕｋｕｂａｅｎｓｉｓ９９９３号の培養物から単離された。ＣｓＡのＭｅＢｍｔ二重結合を、トリチウムガスで、ジメチルホルムアミド中において、１０％Ｐｄ／Ｃ触媒を用いて、室温、１気圧、振盪装置内で１時間接触還元し、次いで、Ｗｈａｔｍａｎ  Ｐａｒｔｉｓｉｌ  ＯＤ３カラムを用いる逆相高圧液体クロマトグラフィーで精製することにより、［3Ｈ］−ジヒドロＣｓＡが作製された。得られた［3Ｈ］−ジヒドロＣｓＡの比活性は４４ｍＣｉ／ｍｇであった。ＦＫ−５０６を、酢酸エチル溶媒中において、１気圧、室温で、１０％Ｐｄ／Ｃ触媒の存在下において２０分間、トリチウムガスと接触させることによりＦＫ−５０６のアリル二重結合を接触還元し、次いで、逆相高圧液体クロマトグラフィーにより物質を単離精製して生成物を得ることにより、［3Ｈ］−ジヒドロＦＫ−５０６を調製した。この生成物は、４９ｍＣｉ／ｍｇの比活性を有していた。ジヒドロ−［3Ｈ］ＦＫ−５０６は、親化合物よりも５倍能力に劣るものの、フォルボール−１２−ミリステート−１３−アセテート（ＰＭＡ）及びイオノマイシンで刺激されたＪＵＲＫＡＴ細胞におけるＩＬ−２分泌の強力な阻害剤であった。
ウシ脳抽出物における交差反応蛋白質の同定
ヒトＦＫＢＰ１２アミノ酸配列から誘導される３種類のチログロブリン接合ペプチド（Ｍａｋｉ，Ｎ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，５４４０−５４４３（１９９０）；Ｓｔａｎｄａｅｒｔ，Ｒ．ら，Ｎａｔｕｒｅ，３４６，６７１−６７４（１９９０））に対するウサギ抗−ペプチド抗体を開発した。この３種類のペプチドには、Ｃ−末端（１００−１０７位アミノ酸）の配列（配列番号３）：
0003747063.tif 000004
（“Ｃ−末端ペプチド”）、ほとんどのＦＫ−５０６結合蛋白質中によく保存されたトリプトファン残基をまたがる配列（５８−６８位アミノ酸）（配列番号４）：
0003747063.tif 000005
及び、３８ないし４８位アミノ酸に亘る配列（配列番号５）：
0003747063.tif 000006
が含まれていた。
この抗体を、ＦＫ−５０６の免疫抑制効果又は薬剤の毒性副作用のいずれかに関連する、組織及び細胞抽出物の調査に用いた。したがって、ヒトＴリンパ細胞株、Ｊｕｒｋａｔ、ラット脾臓、ラット腎臓、及びウシ脳から調製された粗製抽出物を用いて、ウェスタン・ブロットを行った。ＦＫＢＰ−１２は一般によく保存されており、それ故、この抗血清は他種のＦＫＢＰ１２と反応する。Ｃ−末端配列に対して開発された抗血清は、真正ウシＦＫＢＰ１２よりも僅かにゆっくりと移動する、ウシ脳由来のさらなる蛋白質と非常に強く反応した。移動度が低下していることから、我々は、この蛋白質が約１２．６ｋＤａの分子量を有するものと推定し、ＦＫＢＰ１２．６と命名する。この抗血清によると、脾臓、腎臓又はＪｕｒｋａｔからの粗製抽出物中にはＦＫＢＰ１２．６は検出されなかった。これは、これらの組織中にはＦＫＢＰ１２．６が大量には存在していないことを示している。他の２種類のペプチドに対して開発された抗血清は、ＦＫＢＰ１２とは抗−Ｃ−末端ペプチド血清と同程度の強さで反応したが、ウシ脳中のＦＫＢＰ１２．６とはより弱い程度の強さで、再現性をもって反応した。ペプチド競合実験では、この抗血清はＣ−末端ペプチド配列に特異的であることが示された。
ウシ脳からのＦＫＢＰ１２．６の精製
上記交差反応性蛋白質は真正ＦＫＢＰ１２よりも移動が遅いので、我々の抗血清のサブセットとの交差反応性が減少していることと合わせて、ＦＫＢＰ１２．６が新規タンパク質もしくはＦＫＢＰ１２の変性物であることを示唆していた。それ故、ウシ脳から調製された細胞ゾル抽出物からそれを均質に精製する手段を開発した。ＦＫＢＰ１２の精製（Ｓｉｅｋｉｅｒｋａ，Ｊ．ら，Ｎａｔｕｒｅ，３４１，７５５−７５７（１９８９））と同様の加熱処理工程はＦＫＢＰ１２．６を完全に消失させるため、これは用いなかった。一般には、ＦＫＢＰ１２．６の精製は次の手順で達成した：（１）粗製ウシ脳抽出物を得る；（２）ＣＭイオン交換カラムクロマトグラフィー（重力流動）；（３）ＴＳＫ１２５サイズ排除ＨＰＬＣ；（４）ＣＭイオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）；（５）フェニルＴＳＫ  ＨＰＬＣ；（６）Ｇ２０００ＳＷサイズ排除ＨＰＬＣ；及び（７）ＦＫ−５０６アフィニティクロマトグラフィー。
表ＩはＦＫＢＰ１２．６の精製の一覧を示す。
0003747063.tif 000007
比較的精製の粗い抽出物には多量の真正ＦＫＢＰ１２を含むため、ＦＫＢＰ１２．６のＦＫ−５０６結合比活性は測定することができなかった。しかしながら、ＦＫＢＰ１２．６は、工程IIにおいて、ＣＭ−４５０Ｍカラムでのクロマトグラフィーにより、真正ＦＫＢＰ１２から完全に分離された。ＦＫＢＰ１２．６は、充填及び洗浄の間にＦＫＢＰ１２が流出するに対して、ＣＭカラムに結合したままである。ＦＫＢＰ１２．６は１００ないし２００ｍＭの間のＮａＣｌでカラムから流出し、この勾配画分の抗−Ｃ−末端ペプチド抗体を用いるウェスタンにより、ＦＫＢＰ１２．６画分中には痕跡量のＦＫＢＰ１２も存在しないことが確認される。Ｓ−２００中にＦＫＢＰ１２が存在するため、ＦＫＢＰ１２．６の回収率は、先に標準ＨＬ−２０結合検定（Ｈａｎｄｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ，Ｒ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２６，５４４−５４７（１９８４））を用いるＣＭ−４５０工程以降のみ算出できた。
粗製細胞ゾル脳抽出物中約６０ｇの蛋白質から開始して、精製後の均質ＦＫＢＰ１２．６の典型的な収量は約５０μｇである（表Ｉを参照）。精製の最終工程は、ＦＫ−５０６アフィニティ樹脂への蛋白質の結合である。４Ｍグアニジン−ＨＣｌを用いてこの樹脂からＦＫＢＰ１２．６を溶出し、透析により再生した。最も高度に精製された物質は、１６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで単一のバンドを、ＡＢＩ  Ｃ４逆相カラムで単一ピークを示す。再生された物質はＦＫ−５０６への結合性を保持している。精製されたＦＫＢＰ１２．６は、蛋白質１ｍｇ当り４．８μｇの［3Ｈ］ジヒドロＦＫ−５０６の比結合活性を有する。これは、ＣＭ−４５０Ｍ工程と比べ３，２７１倍精製されたことになる。ＣＭ−４５０Ｍ工程では９４％の蛋白質が粗製抽出物から除去されるので、Ｓ２００からの全体の精製は実際にはより高いものである。したがって、ウシ脳細胞ゾル中においては、ＦＫＢＰ１２．６は明らかにウシ胸腺中に存在するＦＫＢＰ１２よりも豊富さにおいて大きく劣る。ウシ胸腺中に存在するＦＫＢＰ１２は、ほぼ同等の回収率で、この組織から３３７倍で均質に精製された（Ｓｉｅｋｉｅｒｋａ，Ｊ．ら，Ｎａｔｕｒｅ，３４１，７５５−７５７（１９８９））。ＦＫＢＰ１２．６の分子量を１２．６ｋＤａ、結合化学量論をこの蛋白質１モル当り１モルのＦＫ−５０６と仮定すると、理論的な比結合活性は、蛋白質１ｍｇ当り６４ｍｇの［3Ｈ］ジヒドロＦＫ−５０６（分子量＝８０５ｇ／モル）である。期待される［3Ｈ］ジヒドロＦＫ−５０６のＦＫＢＰ類への結合を下回る多くの先例がある（Ｓｉｅｋｉｅｒｋａ，Ｊ．ら，Ｎａｔｕｒｅ，３４１，７５５−７５７（１９８９）；Ｗｉｅｄｅｒｒｅｃｈｔ，Ｇ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７，２１７５３−２１７６０（１９９２））。期待される比結合活性を下回ることについての１つの説明は、蛋白質濃度の見積りに用いられるブラッドフォード検定が、アミノ酸分析等の方法と比較すると、ＦＫＢＰ及びシクロフィリン濃度の両者を過量に見積ることである（Ｓｉｅｋｉｅｒｋａ，Ｊ．ら，Ｎａｔｕｒｅ，３４１，７５５−７５７（１９８９）；Ｈａｒｄｉｎｇ，Ｍ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６１，８５４７−８５５５（１９８６））。期待される結合を下回ることについての第２の説明は、結合の評価に用いられるＬＨ−２０検定が平衡結合検定ではなく、リガンド・オフ−レートがより低い算出比結合活性を生じる結果となることである。第３の説明は、全てのＦＫＢＰ１２．６が適切に展開されることがなく、展開された蛋白質が有効に結合しないことである。
［3Ｈ］ジヒドロＦＫ−５０６のＦＫＢＰ１２．６への結合は飽和を示し、高親和性のものである。スキャチャード形式を用いる直接結合データの再プロットにより、０．５５ＭのＫd値が得られる。この値は、直接結合により０．４と測定された、ＦＫＢＰ１２への［3Ｈ］ジヒドロＦＫ−５０６の結合について決定されたものに類似する。
ＦＫＢＰ１２．６は、ＦＫ−５０６及びラパマイシンによって阻害されるＰＰＩａｓｅ活性を有する。再生された物質はＰＰＩａｓｅ活性を有していないので、ＰＰＩａｓｅ検定は、精製における前の工程（工程VI）からの部分的に精製されたＦＫＢＰ１２．６を用いて行った。基質は、ＦＫＢＰ１２の好ましいペプチド基質であるＮ−スクシニル−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｐ−ニトロアニリドであった（Ｈａｒｒｉｓｏｎ，Ｒ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２９，３８１３−３８１６（１９９０））。ＦＫＢＰ１２．６はこの段階で純度約２５％であり（表Ｉを参照、工程VI及び工程VIIの物質の比結合活性を比較のこと）、ウェスタン分析は、精製のこの時点で他の既知のＦＫＢＰ類は存在しないことを示した。工程VIからの物質はＰＰＩａｓｅ活性を有しており、これは再生後にＦＫ−５０６結合活性は回復するにもかかわらず、ＰＰＩａｓｅ活性は回復し得ないことを示している。部分的に純粋なＦＫＢＰ１２．６のＰＰＩａｓｅ活性は、酵素濃度の関数として増加する速度κ（秒-1）を示す均質ＦＫＢＰ１２の活性に比肩するものであった。ＦＫＢＰ１２の速度の傾きは、ＦＫＢＰ１２．６の速度の傾きの４．１倍大きいものである。ＦＫＢＰ１２．６の純度２５％を計算に入れると、ＦＫＢＰ１２．６はＦＫＢＰ１２と実質的に等しいＰＰＩａｓｅ活性を有する。ラパマイシン及びＦＫ−５０６の両者はＦＫＢＰ１２．６のＰＰＩａｓｅ活性の有力な阻害物質であるが、ラパマイシンはＦＫ−−５０６よりも幾らか良好な阻害物質である。これらの薬剤及びペプチドがＦＫＢＰ１２において行うのと同様に同じ部位に結合するものと仮定すると、この結果は、ラパマイシンがＦＫ−５０６よりもいくらか大きいＦＫＢＰ１２．６に対する親和性を有することを示唆している。ＰＰＩａｓｅ検定に用いられる多量の蛋白質（４００ｎＭ）は、ＦＫＢＰ１２．６の阻害に要するＩＣ50とＦＫ−５０６の上記Ｋd値との比較を妨げている。しかしながら、この検定は、薬剤親和性の比較について有効である。
ＦＫＢＰ１２．６・ＦＫ−５０６複合体はカルシニューリンと結合する。ＦＫＢＰ１２・ＦＫ−５０６とＣａＮとの複合体形成を監視するＨＰＬＣサイズ排除放射性同位体クロマトグラフィー検定が以前に記述されている（Ｗｉｅｄｅｒｒｅｃｈｔ，Ｇ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７，２１７５３−２１７６０（１９９２））。この検定において、ＦＫＢＰ１２・ＦＫ−５０６複合体は、分析選別カラム（ＳＥＣ４００）から後半の画分に溶出される。ＣａＮ及びＣａＭを添加すると、ＦＫＢＰ・ＦＫ−５０６複合体から良好に分離される、より早期の画分に溶離される高分子量のＦＫＢＰ１２・ＦＫ−５０６・ＣａＮ・ＣａＭ複合体が形成される。ＦＫ−５０６の存在下においてＦＫＢＰ１２．６がＣａＮに結合することを示すために、この検定の変形を用いた。この変形検定においては、様々なクロマトグラフィー画分におけるＦＫＢＰ１２とＦＫＢＰ１２．６とを識別するために、抗−Ｃ−末端ペプチド抗体を用いるウェスタン分析によりサンプルを検定した。
最初の実験において、Ｂｉｏ−Ｓｉｌ  ＴＳＫ−１２５カラムを用いる調製ＨＰＬＣゲル濾過クロマトグラフィーにより、ＦＫＢＰ１２及びＦＫ１２．６を部分的に精製した。これらの部分的に精製されたＦＫＢＰ類（ＦＫＢＰ１２及びＦＫＢＰ１２．６を含む）はＣａＮを全く含んでおらず、ＣａＮはこのカラムによりそれから完全に分離された。ＦＫＢＰ１２及びＦＫＢＰ１２．６は、いずれも、この実験に用いられる分析選別カラム（Ｇ２０００ＳＷ）で、画分２６及び２７に流出する。最初に、粗製ＣａＮ−枯渇ＦＫＢＰ類を用いる“陽性対照”実験を行い、ウェスタン分析が放射性同位体クロマトグラフィー分析に取って代わり、ＣａＮ、ＣａＭ、Ｃａ2+、Ｍｇ2+、およびＦＫ−５０６が外部から添加された場合にＦＫＢＰ１２の高分子量画分へのシフトを検出することが可能であることを確認した。期待された通り、外因性ＣａＮの存在下において、ＦＫＢＰ１２の有意の画分がＦＫＢＰ１２・ＦＫ−５０６・ＣａＮ複合体の形で高分子量画分（＃２０−２３）に見出され、かつ幾らかの複合体非形成ＦＫＢＰ１２が画分２６及び２７に留まり、これによりこの検定の正当性が実証される。この粗製ＦＫＢＰ材料はＦＫＢＰ１２．６も含むため、図４ＡにおいてＦＫＢＰ１２を僅かに上回る移動も観察することができる。ＦＫＢＰ１２．６のほとんどは、ＣａＮ、ＣａＭ、Ｃａ2+、Ｍｇ2+、及びＦＫ−５０６の存在下において、高分子量複合体に変化する。
ＣａＮとのＦＫＢＰ１２．６の複合体形成の必要条件をより注意深く調べるため、精製ＦＫＢＰ１２．６を用いる実験を行った。上に記述したように、ＣａＮの非存在下においては、ＦＫＢＰ１２．６・ＦＫ−５０６複合体は選別カラムから画分２６及び２７に溶出する。ＦＫＢＰ１２．６をＣａＮ、ＣａＭ及びＣａ2+、Ｍｇ2+と共に（しかし、ＦＫ−５０６はなしで）インキュベートし、この混合物をカラム検定で検定すると、ＦＫＢＰ１２．６は引き続き画分２６及び２７に溶出する。しかしながら、ＦＫＢＰ１２．６をＣａＮ、ＣａＭ、Ｃａ2+、Ｍｇ2+と及びＦＫ−５０６と共にインキュベートし、この混合物を検定すると、全ての免疫反応性ＦＫＢＰ１２．６は画分（２０−２２）に移動する。これは、ＦＫＢＰ１２．６がＣａＮと複合体を形成したことを示している。ＦＫＢＰ１２と同様に、ＦＫＢＰ１２．６のＣａＮとの複合体形成は薬剤ＦＫ−５０６の存在下でのみ起こる。
ＦＫＢＰ１２．６がＣａＮと結合するという我々の観察をさらに確認するため、ＦＫ−５０６の存在下においてカルシニューリンホスファターゼ活性を阻害するそれらの能力について試験した。この実験に用いたＦＫＢＰ１２．６は、ＦＫ−５０６アフィニティカラム工程（工程VII）により精製し、再生した均質な材料であった。並列比較のため、ＦＫＢＰ１２も、薬剤の存在下においてカルシニューリンを阻害するその能力について試験した。用いたＦＫＢＰ１２は、組換えヒトＦＫＢＰ１２を過剰発現する細菌から均質に精製したものであった（Ｗｉｅｄｅｒｒｅｃｈｔ，Ｇ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７，２１７５３−２１７６０（１９９２））。ＦＫ−５０６、ＣａＮ、ＣａＭ、Ｃａ2+、及びＭｇ2+を含有するカクテルに、ＦＫＢＰ１２．６及びＦＫＢＰ１２を濃度を増加させながら添加した。図５は、ＣａＮホスファターゼ活性をブロックする能力において、ＦＫＢＰ１２．６がＦＫＢＰ１２とほぼ等しいことを示している。ＣａＮ阻害のＩＣ50は、ＦＫＢＰ１２．６及びＦＫＢＰ１２に対して、それぞれ、１６．０ｎＭおよび９．９ｎＭである。
ＦＫＢＰ１２．６はＮ−末端がブロックされておらず、それ故、エドマン分解によりＮ−末端アミノ酸配列を得ることが可能であった。ＦＫＢＰ１２．６の蛋白質消化及び臭化シアン（ＣＮＢｒ）開裂から誘導されるペプチドの配列決定による推測から、以下に記述される部分的Ｎ−末端アミノ酸配列（配列番号１）が得られた。
0003747063.tif 000008
示されるＣ−末端の３１アミノ酸を除いて、ペプチド生成物及びＮ−末端の配列は２ないし３回確認した。ウシＦＫＢＰ１２（Ｈａｒｄｉｎｇ，Ｍ．ら，Ｎａｔｕｒｅ，３４１，７５８−７６０（１９８９）；Ｓｉｅｋｉｅｒｋａ，Ｊ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５，２１０１１−２１０１５（１９９０）；Ｍｏｚｉｅｒ，Ｎ．ら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９４，１９−２３（１９９０））と対比すると、ＦＫＢＰ１２．６は約８４％のアミノ酸相同性でＦＫＢＰ１２に非常に類似し、２つの配列の相違のほとんどがよく保存された変化であることが示される。
今のところ検出された非保存変化は、４９位のＶａｌからＡｒｇへの置換、５９位でのＴｒｐからＰｈｅへの置換、６３位でのＶａｌからＡｌａへの置換、８０位でのＴｙｒからＶａｌへの置換及び７６位でのＩｌｅからＣｙｓへの変化のみである。この独特のアミノ酸配列は、ＦＫＢＰ１２．６が新規遺伝子産物であり、ＦＫＢＰ１２の翻訳後の変性物ではないことを示している。ＦＫＢＰ１２とＦＫＢＰ１２．６との幾つかのアミノ酸の相違を利用して、ウシ脳ｃＤＮＡを鋳型として用いてネステッドＰＣＲが成功裡に行われ、開放読み枠（ＯＲＦ）の一部をコードする核酸プローブが得られている。残基Ｇ１９ないしＧ５８をコードするこのＰＣＲ産生物の翻訳により、この領域内のアミノ酸情報が確認されている。
ＦＫＢＰ１２．６蛋白質の利用及び用途
ＦＫＢＰ１２．６は、それ自体で又は固定化されて、診断、精製又は調査方法の様々な結合リガンドに特異的な結合パートナーとして用いることができる。好ましい固定化マトリックスは、ＦＫＢＰ１２．６蛋白質が共有結合し、アフィニティクロマトグラフィーカラムを形成することが可能な、臭化シアン活性化セファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）である。
ＦＫＢＰ１２．６蛋白質は、結合活性形態の免疫抑制剤、ＦＫ−５０６に対する高い特異性の故に、生理学的に重要である。複合体中のＦＫ−５０６を反対に結合し、これをイオン強度を増加させつつ水生バッファ試薬で溶出することが可能な、上記固定化アフィニティマトリックスを調製することができる。形成されたアフィニティマトリックスは、トリチウム化（3Ｈ）−ＦＫ−５０６の置換によるＦＫ−５０６様マクロライド基質の検出に用いることもできる。これらの化合物には、ＦＫ−５２０、ＦＫ−５２３、ＦＫ−５２５及びＥＰＯ公開０，１８４，１６２号に開示される他のＦＫ−５０６類似体が含まれる。
また、このマトリックスは、天然のリガンドであり得るＦＫ−５０６様細胞成分の検出方法に加え、血清及び他の体液中のＦＫ−５０６の同定及び／又は定量方法を提供する。
さらにまた、このマトリックスは、ＦＫ−５０６と同様に免疫抑制活性を有する可能性のある候補化学物質のスクリーニングに有用であり、したがって、この蛋白質の作用により機能する他のクラスの薬剤の開発に有用である。
ＦＫＢＰ１２．６蛋白質が均質に精製されているので、周知の組換えＤＮＡ手法によるこの蛋白質の生成を可能にする遺伝子の同定にオリゴヌクレオチドプローブを用いることが可能である。ＦＫＢＰ１２．６蛋白質の精製の典型的な方法は、下記実施例に記述されている。
ＦＫＢＰ１２．６タンパク質が免疫抑制剤ＦＫ−５０６、及びその活性類似体に対する親和性を有しているため、全蛋白質のサブフラグメントを含めて、それ自体もしくはそれらの特定の派生化学物質及び／又は天然誘導体を、当該技術分野において周知の多くの受容体結合法におけるこれらのリガンドに対する特異的結合パートナーとして用いることができる。
同様に、リガンドを含有する組成物からの所望のリガンドの精製に用いることも可能である。例えば、ＦＫＢＰ１２．６蛋白質を、ＦＫ−５０６が産生される酵母発酵ブロスからのＦＫ−５０６又は関連構造物の精製に用いることができる。さらに、新規免疫抑制剤を識別するスクリーニング試験として、ＦＫＢＰ１２．６蛋白質に結合する化合物の選別に用いることができる。これらの様々な方法において、必須なことではないが、ＦＫＢＰ１２．６蛋白質を固定化することが好ましい。これは、当該技術分野において周知のいかなる方法によっても達成することができる。蛋白質の固定化に特に有用な支持体は、臭化シアン処理セファロース（ＣＮＢＲ−活性化セファロース４Ｂ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）である。固定化ＦＫＢＰ１２．６蛋白質は、この蛋白質を塩基性条件下で臭化シアン−活性化セファロースと混合することにより調製される。このマトリックスにＦＫＢＰ１２．６が結合する結果として、ＦＫＢＰ１２．６蛋白質のアミノ基による多数の結合によって達成される顕著な安定性が生じる。
また、この好ましい固定化ＦＫＢＰ１２．６蛋白質を、生理学的流体、例えば体液、及び、例えばＦＫ−５０６免疫抑制療法が施されている患者の、組織抽出物からのＦＫ−５０６及びその代謝物の濃度の測定に診断として用いることも可能である。
また、この蛋白質を、ＦＫ−５０６型マクロライド化合物及び生物学的に有用なリガンドを結合させる検定に、ＦＫＢＰ１２．６蛋白質及びＦＫ−５０６型マクロライド／リガンドにマクロライド過剰で複合体を形成させ、次いでこの混合物をカラムを通して溶出させ、純粋な複合体の濃度を分光光度計により、またはシンチレーション計数によって分析することにより、用いることが可能である。この方法論により、例えば強イオン性塩溶液で結合を妨げ、次いで通常のクロマトグラフィー分離を行うことにより、マクロライドまたは生物学的に有用なリガンドを単離することが可能な、複合体の純粋なサンプルを形成することができる。
ＦＫＢＰ１２．６蛋白質のクローン化及び発現
様々な方法をＦＫＢＰ１２．６ｃＤＮＡのクローン化に用いることができる。これらの方法には、適切な発現ベクター系におけるＦＫＢＰ１２．６含有ｃＤＮＡライブラリーの構築に続くＦＫＢＰ１２．６ｃＤＮＡの直接機能的発現が含まれるが、これに限定されるものではない。別の方法は、ＦＫＢＰ１２．６蛋白質のアミノ酸配列から設計された標識オリゴヌクレオチドプローブで、バクテリオファージまたはプラスミド・シャトル・ベクター中に構築されたＦＫＢＰ１２．６含有ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることである。好ましい方法は、ＦＫＢＰ１２．６蛋白質をコードする部分長ｃＤＮＡで、バクテリオファージまたはプラスミド・シャトル・ベクター中に構築されたＦＫＢＰ１２．６含有ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることからなる。この部分長ｃＤＮＡは、他のＦＫ−５０６結合蛋白質について既知のアミノ酸配列から縮重オリゴヌクレオチド・プライマーを設計することを通して、ＦＫＢＰ１２．６ＤＮＡ断片を特異的にＰＣＲ増幅することにより得られる。
他の細胞又は細胞種から構築されるライブラリーと同様に、他の種類のライブラリーがＦＫＢＰ１２．６をコードするＤＮＡの単離に有用であり得ることは、当業者に容易に理解される。他の種類のライブラリーには、ウシ又はヒト脳細胞以外の他の細胞又は細胞系から誘導されるｃＤＮＡライブラリー及びゲノムＤＮＡライブラリーが含まれるが、これらに限定されるものではない。
適切なｃＤＮＡライブラリーをＦＫＢＰ１２．６活性を有する細胞又は細胞系から調製し得ることは、当業者に容易に理解される。ＦＫＢＰ１２．６ｃＤＮＡを単離するためのｃＤＮＡライブラリーの調製に用いられる細胞又は細胞系の選別は、最初に、上に引用され、ここで用いられる周知の標識リガンド結合検定を用いてＦＫＢＰ１２．６活性に関連する細胞を測定することにより行うことができる。
ｃＤＮＡライブラリーの調製は、当該技術分野において周知の標準手法により行うことができる。周知のｃＤＮＡライブラリー構築手法は、例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８２）に見出すことができる。
また、ＦＫＢＰ１２．６をコードするＤＮＡは適切なゲノムＤＮＡライブラリーから単離できることも、当業者に容易に理解される。
ゲノムＤＮＡライブラリーの構築は、当該技術分野において周知の標準手法により行うことができる。周知のゲノムＤＮＡライブラリー構築手法は、Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８２）に見出すことができる。
好ましい方法のいずれかによりＦＫＢＰ１２．６遺伝子をクローン化するためには、ＦＫＢＰ１２．６又は相同蛋白質のアミノ酸配列又はＤＮＡ配列が必要である。これを達成するため、ＦＫＢＰ１２．６蛋白質又は相同蛋白質を精製し、その部分的アミノ酸配列を自動化シーケンサーで決定することができる。全アミノ酸配列を決定する必要はないが、６ないし８個のアミノ酸の２つの領域の線形配列を部分的ＦＫＢＰ１２．６ＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅のために決定することができる。
一度適切なアミノ酸配列が同定されたら、それらをコードすることが可能なＤＮＡ配列を合成する。遺伝子暗号が縮重するため、特定のアミノ酸の暗号化に１以上のコドンを用いることが可能であり、したがって、アミノ酸配列は類似のＤＮＡオリゴヌクレオチドのいかなる組によっても暗号化することが可能である。これらの組のうちの１構成要素のみがＦＫＢＰ１２．６の配列と等しいが、これらの組の他のものも、不整合を有するＤＮＡオリゴヌクレオチドの存在下においてさえも、ＦＫＢＰ１２．６ＤＮＡにハイブリダイズすることが可能である。不整合ＤＮＡオリゴヌクレオチドでも、ＦＫＢＰ１２．６をコードするＤＮＡの同定及び単離を可能にするのに十分な程度にＦＫＢＰ１２．６ＤＮＡにハイブリダイズする。
好ましい方法のいずれかを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）をベースとする手法及びｃＤＮＡライブラリー・スクリーニングを用いる２段階アプローチにおいて、ＦＫＢＰ１２．６をコードするｃＤＮＡクローンを単離する。第１段階において、精製ＦＫＢＰ１２．６又は相同蛋白質からのＮＨ2−末端及び内部アミノ酸配列情報を、ＦＫＢＰ１２．６−特異的ＤＮＡ断片を増幅するための縮重オリゴヌクレオチド・プライマーの設計に用いる。第２段階において、ウシ又はヒト脳細胞から誘導されるｃＤＮＡライブラリーから完全長ｃＤＮＡを単離するためのプローブとして役立てるため、これらの断片をクローン化する。
ウシＦＫＢＰ１２．６をコードする部分的ｃＤＮＡの配列を以下に記す（配列番号２０）。
0003747063.tif 000009
ヒトＦＫＢＰ１２．６をコードする部分的ｃＤＮＡの配列を以下に記す（配列番号２１）。
0003747063.tif 000010
当業者には明らかなように、縮重のため、ウシＦＫＢＰ１２．６をコードするＤＮＡ分子の配列は、ヒトＦＫＢＰ１２．６をコードするＤＮＡ分子の配列とは異なる。
上記方法により得られるクローン化ＦＫＢＰ１２．６ｃＤＮＡは、適切なプロモーター及び他の適切な転写制御要素を含む発現ベクターへ分子クローニングし、原核又は真核ホスト細胞に移して組換えＦＫＢＰ１２．６を産生させて組換え発現せしめることが可能である。このような操作の手法は、前出のＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔらに記述されているものに見出すことができ当該技術分野においては周知である。
発現ベクターとは、ここでは、適切なホストにおけるクローン化ＤＮＡの転写及びそれらのｍＲＮＡの翻訳に必要なＤＮＡ配列であると定義される。そのようなベクターを、細菌、ラン藻、植物細胞、昆虫細胞及び動物細胞のような様々なホストにおける真核細胞ＤＮＡの発現に用いることができる。
特別に設計されたベクターは、細菌−酵母又は細菌−動物細胞のようなホスト間でのＤＮＡの往復搬送を可能にする。適切に構築された発現ベクターは、ホスト細胞における自律複製のための複製起源、選別可能なマーカー、制限された数の有用な制限酵素部位、高コピー数に対する能力、及び活性プロモーターを含むべきである。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼにＤＮＡと結合するように指示し、ＲＮＡ合成を開始させるＤＮＡ配列であると定義される。強力なプロモーターは、高い頻度で開始されるｍＲＮＡを生じるものである。発現ベクターには、クローニングベクター、変性クローニングベクター、特別に設計されたプラスミド又はウイルスが含まれるが、これらに限定されるものではない。
哺乳動物細胞における組換えＦＫＢＰ１２．６の発現に様々な哺乳動物発現ベクターを用いることができる。組換えＦＫＢＰ１２．６の発現に適する市販の哺乳動物ベクターには、ｐＭＣ１ネオ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＸＴ１（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐｃＤＮＡＩ、ｐｃＤＮＡＩａｍｐ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＥＢＯ−ｐＳＶ２−ネオ（ＡＴＣＣ３７５９３）、ｐＢＰＶ−１（８−２）（ＡＣＴＴ３７１１０）、ｐｄＢＰＶ−ＭＭＴネオ（３４２−１２）（ＡＴＣＣ３７２２４）、ｐＲＳＶｇｐｔ（ＡＴＣＣ３７１９９）、ｐＲＳＶネオ（ＡＴＣＣ３７１９８）、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ３７１４６）、ｐＵＣＴａｇ（ＡＴＣＣ３７４６０）、及び１ＺＤ３５（ＡＴＣＣ３７５６５）が含まれるが、これらに限定されるものではない。
ＦＫＢＰ１２．６をコードするＤＮＡを、ホスト細胞における発現のための発現ベクターにクローン化することもできる。ホスト細胞は原核細胞であっても真核細胞であってもよく、これらには、細菌、酵母、ヒト、ウシ、ブタ、サル及び齧歯類起源の細胞系を含むがこれらに限定されるものではない哺乳動物細胞、及びショウジョウバエ誘導細胞を含むがこれらに限定されるものではない昆虫細胞が含まれるが、これらに限定されるものではない。適切であり、かつ市販されている、哺乳動物種から誘導される細胞系には、ＣＶ−１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ７０）、ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５０）、ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５１）、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ６１）、３Ｔ３（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ９２）、ＮＩＨ／３Ｔ３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５８）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ２）、Ｃ１２７Ｉ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６１６）、ＢＳ−Ｃ−１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ２６）及びＭＲＣ−５（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ１７１）が含まれるが、これらに限定されるものではない。
発現ベクターは、形質転換、形質移入、原形質融合、及びエレクトロポレーションを含むがこれらに限定されるものではない手法の構成要素により、ホスト細胞に導入することができる。発現ベクター含有細胞を個々に分析し、それらがＦＫＢＰ１２．６蛋白質を産生しているかどうかを決定する。ＦＫＢＰ１２．６発現細胞の同定は、抗−ＦＫＢＰ１２．６抗体を用いる免疫学的反応性及びホスト細胞関連ＦＫＢＰ１２．６活性の存在を含むがこれらに限定されるものではない幾つかの手段により行うことができる。
ＦＫＢＰ１２．６ＤＮＡの発現は、生体外において生成した合成ｍＲＮＡを用いて行うこともできる。合成ｍＲＮＡは、カエル卵母細胞への微量注入を含むがこれに限定されるものではない細胞ベースの系において効率的に翻訳される他に、小麦胚芽抽出物及び網状赤血球抽出物を含むがこれらに限定されるものではない様々な非細胞系において効率的に翻訳され得るが、カエル卵母細胞への微量注入が好ましい。
最適レベルのＦＫＢＰ１２．６蛋白質を生じるＦＫＢＰ１２．６ｃＤＮＡ配列を決定するため、以下のものを含むがそれらに限定されるものではないＦＫＢＰ１２．６ｃＤＮＡ分子を構築することができる：ＦＫＢＰ１２．６ｃＤＮＡの完全長開放読み枠及び受容体蛋白質の特定のドメイン又は蛋白質の再配置ドメインのみをコードするｃＤＮＡの一部を含む様々な構築物。全ての構築物は、ＦＫＢＰ１２．６ｃＤＮＡの５′及び／又は３′非翻訳領域を含まないように、あるいはこれらの全てもしくは一部を含むように設計することができる。ＦＫＢＰ１２．６活性及び蛋白質発現のレベルは、これらの構築物の適切なホスト細胞への導入に続いて、単独で、及び組み合わせて決定することができる。一時的な検定において最適な発現を生じるＦＫＢＰ１２．６ｃＤＮＡカセットを決定した後、このＦＫＢＰ１２．６ｃＤＮＡ構築物を、哺乳動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、卵母細胞、大腸菌、及び酵母細胞の発現ベクターを含むがこれらに限定されるものではない様々な発現ベクター（組換えウイルスを含む）に移す。
哺乳動物形質移入体を、以下の方法により、ＦＫＢＰ１２．６活性のレベル及びＦＫＢＰ１２．６蛋白質のレベルの両者について分析する。ＦＫＢＰ１２．６活性の評価は、細胞への標識リガンドの直接導入及びＦＫＢＰ１２．６発現細胞へのリガンドの特異的結合の量の測定を包含する。受容体活性についての結合検定は当該技術分野において周知である（Ｆｒｅｙら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，２４４，２３９−２５０（１９９３））。
ホスト細胞におけるＦＫＢＰ１２．６蛋白質のレベルは、イムノアフィニティ及び／又はリガンドアフィニティ手法を含むがこれらに限定されるものではない様々な手法により定量する。ＦＫＢＰ１２．６−特異的アフィニティ・ビーズ又はＦＫＢＰ１２．６−特異抗体が、35Ｓ−メチオニン標識又は非標識ＦＫＢＰ１２．６蛋白質の単離に用いられる。標識ＦＫＢＰ１２．６蛋白質はＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析する。非標識ＦＫＢＰ１２．６蛋白質は、ＦＫＢＰ１２．６特異抗体を用いるウェスタン・ブロット、ＥＬＩＳＡ又はＲＩＡ検定により検出する。
ホスト細胞におけるＦＫＢＰ１２．６の発現の後、ＦＫＢＰ１２．６蛋白質を回収して、ＦＫＢＰ１２．６−特異的リガンドを結合することが可能な活性形態のＦＫＢＰ１２．６を提供することが可能である。幾つかのＦＫＢＰ１２．６精製法が利用可能であり、使用に適している。組換えＦＫＢＰ１２．６は、細胞溶解物及び抽出物から、又は調製培養培地から、塩分画、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイト吸着クロマトグラフィー及び疎水性相互作用クロマトグラフィーの様々な組合せ、又は個別の適用により精製することができる。
加えて、組換えＦＫＢＰ１２．６は、完全長未成熟ＦＫＢＰ１２．６又はＦＫＢＰ１２．６のポリペプチド断片に特異的なモノクローナルもしくはポリクローナル抗体で作製されたイムノ−アフィニティカラムを用いることにより、他の細胞性蛋白質から分離することが可能である。
ＦＫＢＰ１２．６に対する単一特異性抗体は、ＦＫＢＰ１２．６に反応する抗体を含む哺乳動物抗血清から精製され、あるいはＫｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−４９７（１９７５）の手法を用いてＦＫＢＰ１２．６と反応するモノクローナル抗体として調製される。ここで用いられる単一特異性抗体は、ＦＫＢＰ１２．６に対する相同結合特性を有する単一の抗体種又は複数の抗体種であると定義される。ここで用いられる相同結合は、ＦＫＢＰ１２．６に関連するもののような上述の特定の抗原又はエピトープに結合する抗体種の能力を指す。ＦＫＢＰ１２．６特異抗体は、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ、ウマ等の動物を、適切な濃度のＦＫＢＰ１２．６を免疫アジュバントと共に、もしくは免疫アジュバントを伴わずに用いて免疫することにより生じる。
第１の免疫に先立って免疫前血清を採取する。各動物に、約０．１μｇないし約１０００μｇのＦＫＢＰ１２．６を許容可能な免疫アジュバントと一緒に投与する。このような許容可能なアジュバントには、フロイント完全、フロイント不完全、ミョウバン沈殿、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍを含む油中水型エマルジョン及びｔＲＮＡが含まれるが、これらに限定されるものではない。初期免疫は、皮下（ＳＣ）、腹腔内（ＩＰ）もしくは両者のいずれかでの複数の部位での、好ましくはフロイント完全アジュバント中の酵素からなるものであった。各動物から規則的な間隔で、好ましくは毎週、採血し、抗体力価を測定する。これらの動物に、初期免疫に続いて追加免疫注射を施し、あるいは施さずにおく。追加免疫注射を施した動物には、一般に、フロイント不完全アジュバント中の等量のＦＫＢＰ１２．６を同じ経路で与える。追加免疫注射は、約３週間の間隔で、最大力価が得られるまで行う。各追加免疫の約７日後、又は単一免疫の約１週間後に、動物から採血し、血清を採取してアリコートを約−２０℃で保存する。
ＦＫＢＰ１２．６と反応するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を、純血マウス、好ましくはＢａｌｂ／ｃ、をＦＫＢＰ１２．６で免疫することにより調製する。これらのマウスを、ＩＰもしくはＳＣ経路により、上に示される等容量の許可可能なアジュバント中に含まれる約０．５ｍｌのバッファもしくは生理食塩水中の約１μｇないし約１００μｇ、好ましくは約１０μｇ、のＦＫＢＰ１２．６で免疫する。フロイント完全アジュバントが好ましい。第０日にマウスに初期免疫を施し、約３ないし約３０週間安静にさせた。免疫したマウスに、リン酸緩衝生理食塩水のようなバッファ溶液中約１ないし約１００μｇのＦＫＢＰ１２．６での１回以上の追加免疫を、静脈内（ＩＶ）経路により施した。抗体陽性マウスから、リンパ球、好ましくは脾臓リンパ球を、当該技術分野において周知の標準法によって免疫マウスから脾臓を取り出すことにより得る。この脾臓リンパ球を適切な融合相手、好ましくはミエローマ細胞と、安定なハイブリドーマの形成が可能な条件下で混合することによりハイブリドーマ細胞を生成する。融合相手には、マウスミエローマＰ３／ＮＳ１／Ａｇ４−１；ＭＰＣ−１１；Ｓ−１９４及びＳｐ２／０が含まれるがこれらの限定されるものではなく、Ｓｐ２／０が好ましい。抗体産生細胞及びミエローマ細胞を、分子量約１０００のポリエチレングリコール中において、約３０％ないし約５０％の濃度で融合させる。融合ハイブリドーマ細胞を、ヒポキサンチン、チミジン及びアミノプテリンを補足したダルベッコ変性イーグル培地（ＤＭＥＭ）における増殖により、当該技術分野において周知の方法によって選別する。大凡第１４日、第１８日及び第２１日に増殖陽性ウェルから上清を採取し、ＦＫＢＰ１２．６を抗原として用いる固相免疫放射性同位体検定（ＳＰＩＲＡ）のような免疫検定により抗体産生についてスクリーニングする。また、培養液をオークターロニー沈殿検定で試験して、ｍＡｂのイソタイプを測定する。抗体陽性ウェルからのハイブリドーマ細胞を、ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｓｏｆｔ  Ａｇａｒ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ｉｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｋｒｕｓｅ及びＰａｔｅｒｓｏｎ，編，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９７３の軟寒天手法のような手法でクローン化する。
マウス当り約０．５ｍｌのプリスタンで処置したＢａｌｂ／ｃマウスを、処置の約４日後に約２×１０6ないし約６×１０6個のハイブリドーマ細胞で免疫することにより、モノクローナル抗体を生体内で生成させる。細胞移入の大凡８−１２日後に腹水を採取し、当該技術分野において周知の手法により抗体を精製する。
抗−ＦＫＢＰ１２．６ｍＡｂの生体外生成を約２％のウシ胎児血清を含有するＤＭＥＭにおいてハイブリドーマを増殖させることにより行い、十分な量の特異ｍＡｂを得る。このｍＡｂを当該技術分野において周知の手法により精製する。
腹水またはハイブリドーマ培養液の抗体力価を、沈殿、受動凝集反応、酵素結合免疫吸着抗体（ＥＬＩＳＡ）法及び放射性同位元素標識免疫測定（ＲＩＡ）法を含むがこれらに限定されるものではない、様々な血清学的または免疫学的検定により測定する。同様の検定が、体液または組織及び細胞抽出物中のＦＫＢＰ１２．６の存在の検出に用いられる。
上述の単一特異性抗体を生成する方法を、ＦＫＢＰ１２．６ポリペプチド断片または完全長ＦＫＢＰ１２．６ポリペプチドに特異的な抗体の生成に利用可能であることは、当業者に容易に理解される。
抗体をアフィゲル−１０（Ｂｉｏｒａｄ）に添加することによりＦＫＢＰ１２．６抗体アフィニティカラムを作製する。このアフィゲル−１０は、抗体がこのアガロースゲル・ビーズ支持体と共有結合を形成するように予めＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルで活性化されたゲル支持体である。次いで、抗体を、スペーサー・アーム所在のアミド結合により、ゲルに結合させる。その後、残りの活性化エステルを１ＭエタノールアミンＨＣｌ（ｐＨ８）で失活させる。このカラムを水、次いで０．２３ＭグリシンＨＣｌ（ｐＨ２．６）で洗浄して、非結合抗体又は無関係の蛋白質を除去する。次に、このカラムをリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．３）で平衡化し、ＦＫＢＰ１２．６又はＦＫＢＰ１２．６断片を含有する細胞培養上清または細胞抽出物をゆっくりとカラムに通す。その後、光学密度がバックグランドに低下するまでカラムをリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、次に、０．２３Ｍグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．６）で蛋白質を溶出させる。次いで、精製されたＦＫＢＰ１２．６蛋白質をリン酸緩衝液に対して透析する。
本発明のＦＫＢＰ１２．６受容体をコードするＤＮＡの単離に適する１つの方法は、他のＦＫ−５０６結合蛋白質から得られたアミノ酸及び／又はＤＮＡ配列情報の利用を包含する。ＦＫ−５０６結合蛋白質類は一緒に分類されており、トランスメンブラン及び／又は細胞質ドメインのような特定の領域は、新規タンパク質を単離するためのプローブの生成に十分なある程度の相同性を有しているものと期待される。
本発明の生成物及び方法において、それらの精神及び範囲から離れることなく、様々な変更及び修正を行うことが可能である。ここに示される様々な態様及び実施例は本発明を説明するためのものであり、本発明の範囲及び精神に対する限定であると解釈されるものではない。
例  １
ウシ脳細胞ゾルの調製
１２個のウシ脳を、５ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５ｍＭ  ２−メルカプトエタノール及び１ｍＭ  ＰＭＳＦを含有するバッファ２．４リットル中にホモジナイズした。均質化は、ワーリング（Ｗａｒｉｎｇ）ブレンダー内において４℃で３分間行った。ブレンダー・ホモジネートのうちの５００ｍｌを、４℃で、最大速度に設定したポリトロン（Ｐｏｌｙｔｒｏｎ）装置の３０秒バーストを３回行うことにより、さらにホモジネートした。このホモジネートをＪＡ−１０ローターで遠心（１０，０００ｒｐｍで１５分間）した。ホモジネートをＴｉ４５ローターで遠心（４０，０００ｒｐｍで１時間）することによりさらに清澄化した。このホモジネートを、ＰＭＳＦを含有しない均質化バッファ２８リットルに対して２４時間透析した。
例  ２
ウシ脳からの新規ＦＫＢＰの精製
透析したホモジネートを、５ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、及び５ｍＭ  ２−メルカプトエタノール（ＣＭバッファ）で平衡化したトーソーハース（ＴｏｓｏＨａａｓ）ＣＭ−６５０Ｍ樹脂のカラム（５ｃｍ×３０ｃｍ）にかけた。このカラムを６カラム容積のＣＭバッファで次に洗浄した。結合蛋白質を、ＣＭバッファ中０→１Ｍ  ＮａＣｌの直線勾配（総容積２リットル）で溶出させた。流速１２５ｍｌ／時で画分（２１ｍｌ）を集めた。ＦＫ−５０６結合活性は、１００ないし２００ｍＭ  ＮａＣｌで溶出した。活性画分を合わせ、ＹＭ３濾過膜を有するアミコン（Ａｍｉｃｏｎ）撹拌圧力セルにおいて５０ｍｌに濃縮した。１回の注入当り４．５ｍｌの濃縮蛋白質を、ＳＷガード・カラム（２１．５ｍｍ×７．５ｃｍ）を備えたバイオ−シル（Ｂｉｏ−Ｓｉｌ）ＴＳＫ−１２５ゲル濾過ＨＰＬＣカラム（２１．５ｍｍ×６０ｃｍ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）にかけた。蛋白質を、流速４ｍｌ／分で、１００ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、５０ｍＭ  Ｎａ2ＳＯ4、５ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、及び１ｍＭ  ＥＤＴＡを含有するバッファ（ＴＳＫバッファ）で溶出させた。画分（３ｍｌ）を集めたところ、画分５２ないし５９に活性分が溶出した。ＨＰＬＣゲル濾過を１０ないし１５回実施して得られた活性画分を合わせ、アミコン撹拌セル内で４０ｍｌに濃縮し、ＣＭバッファに対して一晩透析した。１回の注入当り４．５ｍｌの濃縮蛋白質を、全ての蛋白質を処理するまで、流速６ｍｌ／分、ＣＭバッファでのトーソーハースＣＭ−３ＳＷ  ＨＰＬＣカラム（２１．５ｍｍ×１５ｃｍ）にかけた。蛋白質を、ＣＭバッファ中→３００ｍＭ  ＮａＣｌの直線１時間勾配で溶出させた。流速６ｍｌ／分で画分（６ｍｌ）を集めたところ、１００ないし１５０ｍＭ  ＮａＣｌで活性が溶出した。活性画分を合わせ、アミコン撹拌セルを用いて約２５ｍｌに濃縮し、１００ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）、０．９Ｍ（ＮＨ4）2ＳＯ4、及び５ｍＭ  ２−メルカプトエタノールを含有するバッファに対して一晩透析した。
この蛋白質を、流速３ｍｌ／分、透析バッファでのトーソーハース・フェニル−５ＰＷ  ＨＰＬＣカラム（２１．５ｍｍ×１５ｃｍ）に、４．５ｍｌずつ（全ての蛋白質を処理するまで）注入した。蛋白質を、１００ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）及び０．９Ｍ（ＮＨ4）2ＳＯ4に始まり、ＣＭバッファで終わる直線４５分間勾配で溶出させた。３ｍｌ／分の流速で１分ごとに画分を集めた。ＦＫ−５０６結合活性は、３００ないし６０ｍＭ（ＮＨ4）2ＳＯ4に溶出した。これらの画分を合わせ、アミコン撹拌セル内で２ｍｌに濃縮し、トーソーハースＧ２０００ＳＷゲル濾過ＨＰＬＣカラム（７．５ｍｍ×６０ｃｍ）にかけた。蛋白質を、流速１ｍｌ／分、ＴＳＫバッファで溶出させた。０．５ｍｌ画分を集めたところ、画分４２ないし４９にＦＫ／５０６結合活性分が溶出した。この新規ＦＫＢＰは、この時点で約２５％の純度である。活性画分を合わせ、開示される（Ｈａｒｄｉｎｇ，Ｍ．ら，Ｎａｔｕｒｅ，３４１，７５８−７６０（１９８９））通りに調製したＦＫ−５０６アフィニティ樹脂１００ｍｌと共にインキュベートした。洗浄後、１ｍｌの４Ｍグアニジン−ＨＣｌ中において沸騰させることによりＦＫ−５０６結合活性を溶出させた。その後、蛋白質を、５ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）及び５ｍＭ  ２−メルカプトエタノールを含有するバッファ中で一晩透析した。
例  ３
ＦＫＢＰ１２．６に結合する［3Ｈ］ジヒドロＦＫ−５０６
基本的なＬＨ−２０結合検定を、Ｓｉｅｋｉｅｒｋａ，Ｊ．ら，Ｎａｔｕｒｅ，３４１，７５５−７５７（１９８９）に注記される修正を加えて、Ｈａｎｄｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ，Ｒ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２６，５４４−５４７（１９８４）に記載される通りに行った。
例  ４
ペプチジル−プロリル・シス−トランス・イソメラーゼ検定
ＰＰＩａｓｅ検定を、以下の変更を加えて、開示される通りに行った（Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｇ．ら，Ｎａｔｕｒｅ，３３７，４７６−４７８（１９８９））：ペプチド基質にはＮ−スクシニル−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｐ−ニトロアニリド（ＢＡＣＨＥＭ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を最終濃度７２μＭで用い、検定においてキモトリプシン（Ｓｉｇｍａ）が６μＭの濃度で存在した。総反応容積は１．５ｍｌであった。キモトリプシンによるｐ−ニトロアニリドの放出を、ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）ＤＵ６８分光光度計を用いて４０５ｎｍでの吸光度の増加を追跡することにより測定した。トランス・ペプチドの加水分解による吸光度の初期の急激な増加の後、ＰＰＩａｓｅによるペプチドのシス−トランス転移を反映する吸光度のゆっくりとした第２の増加が、３秒間隔で１．５分まで、測定された。これらのデータは、単純な一次速度式に適合しており、一次速度定数、ｋ（秒-1）を算出した。
ＦＫＢＰ１２．６蛋白質は、低いが有意のＰＰＩａｓｅ活性を示す。異性化速度の増加は、ＦＫＢＰ１２．６蛋白質濃度に比例する。シクロフィリンのＰＰＩａｓｅ活性は、ＦＫＢＰ１２．６蛋白質よりも２５倍高い。活性におけるこの相違の原因は、基質特異性または反応条件を反映している可能性がある。
提示されたデータは、ＦＫＢＰ１２．６蛋白質が、シクロフィリン及びＦＫＢＰ１２と同様に、ペプチジル−プロリン・イソメラーゼ活性を有することを示している。ＦＫＢＰ１２．６蛋白質に関連する活性はシクロフィリンに大きく劣るが、これはＦＫ−５０６によって阻害されるもののＣｓＡによっては阻害されない。これは、シクロフィリン混入を表していないことを示唆している。ＰＰＩａｓｅ活性とシクロフィリン及びＦＫＢＰ１２．６蛋白質の両者との関連は、この活性がＴ細胞活性化の過程において重要であることを暗示している。さらに、上述の検定を用いて、当業者がスクリーニング検定を案出し、新規免疫抑制剤である特異的な阻害物質を同定することが可能である。
例  ５
ウェスタン・ブロット
ウシ脳、ラット腎臓、ラット脾臓、及びＪｕｒｋａｔ細胞の細胞質ゾルから調製された粗製抽出物２０μｇを、Ｎｏｖｅｘから入手した１６％トリス−グリシンゲルでの変性電気泳動にかけた。ミニ・トランス−ブロット・セル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）において、１５０ボルトで９０分間、蛋白質を、４℃で、０．４５μｍイムモビロン−Ｐ（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ）転写膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に転写した。この膜を、４℃で一晩、１０％カーネーション脱脂乾燥ミルク、０．９％ＮａＣｌ、１０ｍＭトリス（ｐＨ７．５）及び０．２％ＮａＮ3を含有するバッファ中のロッカー・プラットホーム上でブロックした。この膜を、トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）で２回、計１０分間洗浄した。この膜を、ＴＢＳ−０．５％ツィーン（ＴＢＳＴ）、２０％熱不活性化ウシ胎児血清、０．０４％ＮａＮ3及び１：１０，０００に希釈されたウサギ抗−ペプチド抗血清を含有するバッファ３０ｍｌ中において、室温で２時間インキュベートした。この膜を、ＴＢＳＴ（洗浄１回当り１０分間）で３回、室温で洗浄した。この膜を、１：１０，０００に希釈されたＨＲＰ−結合ロバ抗−ウサギ二次抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を含有するＴＢＳＴ中において、室温で１時間インキュベートした。この膜を、ＴＢＳＴで１５分間室温で、次いでＴＢＳＴでさらに３回（各洗浄について５分間）洗浄し、ＥＣＬウェスタンブロッティング検出システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて発色させた。
例  ６
ＦＫＢＰ・ＦＫ−５０６・ＣａＮ複合体形成検定
インキュベーション（総容積５００μｌ）を３０℃で１５分間行った。これには、以下の成分の様々な組合せが含まれていた：３８μｇのウシカルシニューリン、８μｇのウシカルモジュリン、ＦＫＢＰ１２を含まない５μｇの精製ＦＫＢＰ１２．６又は４０μｇのカルシニューリン欠除ウシ脳抽出物（ＦＫＢＰ１２及びＦＫＢＰ１２．６の両者を含む）及び３．２μｇのＦＫ−５０６。インキュベーションバッファには、２０ｍＭトリス（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、６ｍＭ  ＭｇＣｌ2、０．１ｍＭ  ＣａＣｌ2、０．１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、及び０．５ｍＭジチオトレイトールが含まれていた。このインキュベーション反応物を、Ｂｉｏ−Ｓｉｌ  ＳＥＣ４００  ＨＰＬＣカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて流速１ｍｌ／分でクロマトグラフィー処理し、１分ごとに画分を集めた。クロマトグラフィーバッファは、ＢＳＡが省略されていることを除いて、インキュベーションバッファと同じであった。画分１９−２９の３０μｌを、上に記載されるように、１６％Ｎｏｖｅｘトリス−グリシンゲルでの電気泳動にかけ、ウェスタン分析を行った。
例  ７
カルシニューリン・ホスファターゼ検定
カルシニューリン・ホスファターゼ検定は、従来の検定（Ｌｉｕ，Ｊ．ら，Ｃｅｌｌ，６６，８０７−８１５（１９９１）；Ｍａｎａｌａｎ，Ａ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８０，４２９１−４２９５（１９８３））の修正版である。反応混合物（６０μｌ）には：４０ｍＭトリス（ｐＨ８）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、６ｍＭ  Ｍｇ（ＯＡｃ）2、０．１ｍＭ  ＣａＣｌ2、０．１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、０．５ｍＭジチオトレイトール、１９０ｎＭウシ脳カルモジュリン（Ｓｉｇｍａ）、３ｎＭウシ脳カルシニューリン（Ｓｉｇｍａ）、及び４０μｍ［33Ｐ］ＲIIペプチド（Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）（６００ｃｐｍ／ピコモル）が含まれていた。標識ペプチドの添加に先立って、反応混合物を３０℃で３０分間予備インキュベートした。ペプチドを添加することにより反応を開始させ、脱リン酸化反応を３０℃で１０分間進行させた。１００ｍＭリン酸ナトリウムを含有する５％三塩化酢酸（停止バッファ）０．５ｍｌを添加することにより反応を停止させ、０．５ｍｌ  Ｄｏｗｅｘ５０Ｗ−Ｘ８、Ｈ+カラムにかけた。０．５ｍｌの停止バッファ、次いで０．５ｍｌの水で遊離［33Ｐ］リン酸塩をカラムから溶出させた。
例  ８
ペプチドの合成、精製、及び解析
Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ４３０Ａペプチド合成機で、標準Ｆｍｏｃ保護アミノ酸及びｐ−ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂へのＨＢＴＵ介在結合について、使用説明書どおりメリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ）固相手法によりペプチドを合成した。室温で２時間、９０％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、５％チオアニソール、３％エタンジチオール、２％アニソールを用いて、ペプチドの脱保護と樹脂からの開裂を同時に行った。エチルエーテルで粗製ペプチドを沈殿させた後、１０％酢酸に溶解し、凍結乾燥した。得られた粗製ペプチドを、０．１％ＴＦＡ水溶液中５ないし５０％アセトニトリルの４５分間勾配を用いるウォーターズＣ１８デルタパック（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃ１８  Ｄｅｌｔａｐａｋ）カラムでの逆相ＨＰＬＣにより精製した。ペプチドの純度を、０．１％ＴＦＡ水溶液中５→５０％アセトニトリルの４５分間勾配を用いるブラウンリー・スフェリ−５０ＤＳ（Ｂｒｏｗｎｌｅｅ  Ｓｐｈｅｒｉ−５  ＯＤＳ）カラムでの逆相ＨＰＬＣにより評価した。全てのペプチドは純度＞９５％であった。ＥＳＩ−ＭＳにより分子イオンを得、各ペプチドの構造を確認した。
例  ９
結合化学
ウシチログロブリン（３３ナノモル）を脱気した２０ｍＭリン酸バッファ（ｐＨ８）２．５ｍｌに溶解し、１０マイクロモルのスルホ−ＭＢＳ（Ｐｉｅｒｃｅ）と共に、室温で３０分間インキュベートした。この活性化チログロブリン結合混合液をＰＤ−１０カラムにかけ、活性化チログロブリンを、３．５ｍｌの５０ｍＭリン酸バッファ（ｐＨ７）で、６マイクロモルの凍結乾燥ペプチドを収容するバイアルに溶出させた。この混合物を穏やかに攪拌しながら４℃で一晩インキュベートし、ＰＢＳで平衡化したＰＤ−１０でのクロマトグラフィーにより、ペプチド−チログロブリン複合体を遊離のペプチドまたは反応副生物から分離した。結合の程度を決定するため、５０μｌのサンプルを、減圧下で２４時間、１１０℃に維持される０．１％フェノールを含有する６Ｎ  ＨＣｌを用いて加水分解した。ベックマン・モデル６３００アミノ酸解析機を用いて、サンプルのアミノ酸分析を行った。
例  １０
抗血清の生成
ニュージーランドシロウサギに、フロイント完全アジュバント１ｍｌ中に３３３μｇの免疫原を筋肉内注射した。第７日及び第３５日に、ウサギに、フロイント完全アジュバント中に３３３μｇの免疫原を、６−１０個所に再度腹腔内注射した。第４５日にこれらの動物から採血し、同量の抗原を追加投与した。第５５日に動物に再度追加抗原投与し、１０日後に採血した。この追加免疫投与及び採血スケジュールを３−５回続け、抗血清の適当な供給を得た。一晩凝血させることにより血清を生成させ、この血清を−２０℃で保存した。
例  １１
ＦＫＢＰ１２．６蛋白質配列決定
Ｌｙｓ−Ｃ及び化学消化物のＨＰＬＣ分離を、ＵＶダイオード・アレイ検出器を備えたＨｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ  １０９０Ｍシステムを用いて行った。自動化エドマン分解を、モデル１２０Ａイン・ラインＰＴＨアナライザーを備えたアプライド・バイオシステムズ・モデル４７７Ａシーケンサーを用いて行った。配列決定に用いた全ての化学薬品及び標準はアプライド・バイオシステムズから購入した。ペプチド精製に用いたＨＰＬＣグレードの溶媒は、ＥＭサイエンスから購入した。配列決定グレードのエンドプロテイナーゼＬｙｓ−ＣはＰｒｏｍｅｇａから入手した。ＣＮＢｒはＰｉｅｒｃｅから入手した。水素化トリトンＸ−１００はＣａｌＢｉｏｃｈｅｍから入手した。重炭酸ナトリウム、４−ビニルピリジン、及び２−メルカプトエタノールはＳｉｇｍａから入手した。
以前の開示（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ，Ｊ．ら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２０１，２５５−２６４（１９９２））に下記の幾つかの修正を加えて、酵素的消化を行った。ＰＶＰ−４０でのブロッキング工程は省略した。ポンソー染色ＦＫＢＰ１２．６ＰＶＤＦ蛋白質バンド（４００ピコモル）を１×１ｍｍ片に切断し、エッペンドルフ管に入れた。このＰＶＤＦ片を５０μｌの消化バッファ（１００ｍＭ  ＮａＨＣＯ3、１０％アセトニトリル、１％水素化トリトンＸ−１００、ｐＨ８．０）に浸漬した。２μｌの２５ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）及び１ｍＭ  ＥＤＴＡ中の配列決定グレード・エンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃをこの管に添加した。３７℃で一晩消化を行った。上清に放出されたペプチドを集め、ＰＶＤＦ片を消化バッファの５０μｌアリコートで１回洗浄した。合わせた上清（〜１００μｌ）を１．５ｍｌエッペンドルフ管に入れ、１μｌの１０％２−メルカプトエタノール水溶液で処理した。この管を３７℃で３０分間インキュベートした。その後、サンプルを、０．１％ＴＦＡ（溶媒Ａ）で平衡化したブラウンリー・アクアポアＣ８マイクロポア（Ｂｒｏｗｎｌｅｅ  Ａｑｕａｐｏｒｅ  Ｃ８  ｍｉｃｒｏｂｏｒｅ）カラム（１．０×２５０ｍｍ）に直接注入した。このカラムを、溶媒Ａで、１００ｍｌ／分で２０分間洗浄した。０％（１００％溶媒Ａ）からアセトニトリル／水（７０：３０ｖ／Ｖ）中に０．０８％ＴＦＡ（溶媒Ｂ）５５％までの直線勾配（９０分間）を用いて、流速５０μｌ／分で、ペプチドを溶出させた。ペプチドピークを、１．５ｍｌエッペンドルフ管に手で集めた。
凍結乾燥ＦＫＢＰ１２．６及びＰＶＤＦ膜にブロットしたＦＫＢＰ１２．６に対するＣＮＢｒ消化を、以下に概要を示す分離方法により行った。ＦＫＢＰ１２．６の凍結乾燥サンプルを５０μｌの７０％ギ酸に溶解した。次いで、７０％ギ酸に新しく溶解した約４０μｇのＣＮＢｒを添加した。この混合物を、室温で２４時間、暗所においてインキュベートした。この混合物を水で０．５ｍｌに希釈し、スピードＶａｃ（Ｓｐｅｅｄ  Ｖａｃ）において乾燥させた。サンプルを２５μｌの２５％トリフルオロ酢酸に再溶解し、溶媒Ａで平衡化したバイダックＣ１８マイクロボア（Ｖｙｄａｃ  Ｃ１８  ｍｉｃｒｏｂｏｒｅ）カラム（１．０×２５０ｍｍ）に注入した。０％から１００％溶媒Ｂまでの直線勾配で、６０分間に亘り、流速５０μｌ／分で展開した。ペプチドピークの１つ、ＣＢ２（残基３０−６６）を手で集めた。逆相ＨＰＬＣではＣＢ１（残基１−２９）又はＣＢ３（残基６７−１０７）を単離することは不可能であった。
ＣＢ３の配列を得るため、ＦＫＢＰ１２．６（４００ピコモル）をＰＶＤＦ膜上にブロットし、以下のようにペプチドＣＢ１配列を妨げるために無水酢酸でブロックした。ＦＫＢＰ１２．６蛋白質を有する部分のＰＶＤＦ膜をメタノールで洗浄して水を除去し、風乾した。その後、この膜を、室温で１分間、１．５ｍｌエッペンドルフ管において、２００μｌのメタノール：トリエチルアミン（３：１ｖ／ｖ）で処理した。過剰の液体を膜から除去した後、２００μｌのメタノール：無水酢酸（３：１ｖ／Ｖ）中において、室温で１０分間インキュベートした。次いで、等
容量の水を添加して過剰の無水酢酸を除去した。次に、この膜を１ｍｌのメタノール：水（１：１ｖ／Ｖ）で４回洗浄し、その場でのＣＮＢｒ消化に先立って風乾させた。ＰＶＤＦ膜を１×１ｍｍ片に切断し、１０ｍｌビーカーの底部のポリブレン予備処理反応カートリッジ・フィルターの頂部に載置した。ＰＶＤＦ片及びフィルターを、７０％ギ酸中６０μｌの７０ｍｇ／ｍｌ  ＣＮＢｒの溶液に浸漬した。このビーカーをパラフィルム、次いでアルミニウム箔で密封し、反応を室温で一晩進行させた。ＣＮＢｒ及びギ酸を窒素流で留去した。その後、ＰＶＤＦ片及び反応カートリッジ・フィルターをシーケンサー内に入れ、ＣＢ２及びＣＢ３を一緒に配列決定した。上述の溶液ＣＮＢｒ消化により既知のＣＢ２配列を差し引くことにより、ＣＢ３の配列が得られた。
ＦＫＢＰ１２．６のキモトリプシンまたはトリプシン開裂のため、蛋白質を５０μｌの０．１Ｍ重炭酸アンモニウム、ｐＨ９．０に溶解した。キモトリプシン（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を１：２００（ｗ／ｗ）の酵素：基質比で添加し、室温で１８時間インキュベートした。アプライド・バイオシステムズＣ４カラム（２．１×１００ｍｍ）で、２００μｌ／分の流速で、ＴＦＡ−アセトニトリルの直線勾配を用いて、ペプチドを分画した。ピークを手で集め、ポリブレン含浸ＰＶＤＦストリップに吸着させ、開示されている（Ｓｈｉｖｅｌｙ，Ｊ．ら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１６３，５１７−５２９（１９８９））連続流動反応器を備えた修正アプライド・システムズ４７７Ａ気相シーケンサーに入れた。
例  １２
プライマー調製及びＦＫＢＰ１２．６ｃＤＮＡのクローン化
ウシ脳ＦＫＢＰ１２．６をコードする完全なｃＤＮＡをクローン化するため、我々は、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）により全ウシ脳ｃＤＮＡから、ウシ脳ＦＫＢＰ１２．６をコードするｃＤＮＡの断片を得るように、Ｔａｑポリメラーゼを用いた。我々は、３′末端が鋳型にアニールされていない場合にはＴａｑポリメラーゼはプライマーを伸長しないという事実を用いた。したがって、ＰＣＲプライマーの３′末端は、常に、ＦＫＢＰ１２とＦＫＢＰ１２．６とで相違するアミノ酸をコードしていた。
４組の縮重オリゴヌクレオチドプライマー（２組のセンスプライマー及び２組のアンチセンスプライマー）を合成した。我々は、ウシ脳ＦＫＢＰ１２．６が開始コドンのメチオニンを有しているものと仮定した。
実際のセンスプライマーの第１の組を以下に示す。これらのヌクレオチド配列において、Ｎは（Ｇ、Ａ、Ｔ又はＣ）、Ｙは（Ｔ又はＣ）、Ｒは（Ａ又はＧ）、Ｍは（Ａ又はＣ）である。
（配列番号６）：
0003747063.tif 000011
（配列番号７）：
0003747063.tif 000012
（配列番号８）：
0003747063.tif 000013
アンチセンスプライマーの第１の組を以下に示す。
（配列番号９）：
0003747063.tif 000014
（配列番号１０）：
0003747063.tif 000015
（配列番号１１）：
0003747063.tif 000016
（配列番号１２）：
0003747063.tif 000017
センスプライマーの各々は３２倍に縮重されていた。アンチセンスの各々は１２８倍に縮重されていた。これらを、可能な組合せ（１２）の全てで、１ｎｇの全ウシ脳ｃＤＮＡからのウシ脳ＦＫＢＰ１２．６をコードする断片のＰＣＲに用いた。
センスプライマーの第２の組は第１の組に対して内側であり、これを以下に示す。
（配列番号１３）：
0003747063.tif 000018
（配列番号１４）：
0003747063.tif 000019
アンチセンスプライマーの第２の組は第１の組に対して内側であり、これを以下に示す。
（配列番号１５）：
0003747063.tif 000020
（配列番号１６）：
0003747063.tif 000021
このセンスプライマーは１２８倍に縮重されており、アンチセンスプライマーは６４倍に縮重されていた。これらを、可能な組合せ（４）の全てで、１２種類の一次ＰＣＲ反応生成物と共に用いた。ＰＣＲ反応物の総数は４８であった。
各ＰＣＲ反応物の一部をアガロースゲル電気泳動にかけ、約１５０ｂｐの生成物を生じる反応物のみを以後の研究対象とした。１５０ｂｐ生成物を生じるＰＣＲ反応物は全て、上記センスオリゴ：
（配列番号１３）：
0003747063.tif 000022
から誘導された。このオリゴのＥｃｏＲＩ−リンカー処理版を合成し、センスプライマーとして用いた。
（配列番号１７）：
0003747063.tif 000023
アンチセンスオリゴマーの第２の組のＢａｍＨＩ−リンカー処理版を合成し、アンチセンスプライマーとして用いた。
（配列番号１８）：
0003747063.tif 000024
（配列番号１９）：
0003747063.tif 000025
ＰＣＲ産生物をＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで消化して末端を除去し、ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで消化したｐＵＣ１９にサブクローン化した。形質転換体の配列決定を行った。ＦＫＢＰ１２．６の両プライマー間の部分をコードするウシ脳ＦＫＢＰ１２．６ｃＤＮＡの配列が明らかになり、これを以下に示す（配列番号２０）
0003747063.tif 000026
この配列がＦＫＢＰ１２ではなくＦＫＢＰ１２．６をコードすることは、翻訳生成物がウシＦＫＢＰ１２．６であってウシＦＫＢＰ１２ではないという事実により示された。
我々は、上記プライマーを全ヒト脳ｃＤＮＡに用いて、ヒトにおいて同じ蛋白質が発現されているかどうかを探った。ヒトｃＤＮＡ断片の単離に用いたＰＣＲプライマー及び方法は上記方法と同じである。
両プライマー間の領域のヒトＦＫＢＰ１２．６ｃＤＮＡ配列を以下に示す（配列番号２１）。
0003747063.tif 000027
単離されたヒトｃＤＮＡの翻訳生成物のアミノ酸配列はウシの配列のものと同じであり、ヒトＦＫＢＰ１２のものとは異なっている。したがって、ヒトの脳にはＦＫＢＰ１２．６をコードする蛋白質が含まれる。
例  １３
大腸菌発現ベクターへのＦＫＢＰ１２．６ｃＤＮＡのクローン化
ｐＥＴシリーズ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を含むがこれに限定されるものではない大腸菌発現ベクターへのＦＫＢＰ１２．６発現カセットの移入に続いて、大腸菌中で組換えＦＫＢＰ１２．６を生成した。厳密に調節されたバクテリオファージＴ７プロモーターの制御の下で、ｐＥＴベクターはＦＫＢＰ１２．６を発現する。この構築物を、誘発可能なｌａｃプロモーターによって機能するＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子の染色体コピーを有する大腸菌ホストに移入した後、培養物に適当なｌａｃ基質（ＩＰＴＧ）を添加するとＦＫＢＰ１２．６の発現が誘発される。発現したＦＫＢＰ１２．６のレベルは、上述の検定により決定する。
ＦＫＢＰ１２．６のための全開放読み枠をコードするｃＤＮＡを、ｐＥＴ１１ａのＮｄｅＩ部位に挿入する。正方向にある構築物を配列決定分析により同定し、発現ホスト株ＢＬ２１の形質転換に用いる。次いで、形質転換体をＦＫＢＰ１２．６蛋白質の生成のための培地への接種に用いる。培養物はＭ９又はＺＢ培地において増殖可能であり、これらの培地の処方は当業者には周知である。大凡ＯＤ600＝１．５に増殖した後、１ｍＭ  ＩＰＴＧを用いて、３７℃、３時間、ＦＫＢＰ１２．６の発現を誘発する。これらの細胞からの不溶性封入体画分に真正ＦＫＢＰ１２．６酵素活性を見出すことができる。この封入体画分から、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８）及び１００ｍＭジチオトレイトールを含有するバッファ中の５Ｍグアニジン−ＨＣｌを用いて、可溶性ＦＫＢＰ１２．６を抽出する。この抽出物から、１００容量の２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、５ｍＭジチオトレイトール、１０％ショ糖に対して透析した後、活性ＦＫＢＰ１２．６が生成される。
例  １４
ツメガエル卵母細胞微量注入ベクターによるＦＫＢＰ１２．６ｍＲＮＡの生体外翻訳及び哺乳動物細胞における発現
合成ｍＲＮＡの生成のため、ＦＫＢＰ１２．６ｃＤＮＡ構築物を生体外転写ベクター（ｐＧＥＭシリーズ、Ｐｒｏｍｅｇａ）中に接続する。
ＦＫＢＰ１２．６ｍＲＮＡをコードする二本鎖ＤＮＡをバクテリオファージプロモーターを含むプラスミドベクターにクローン化し、クローン化ＦＫＢＰ１２．６をコードするＤＮＡを含むプラスミドを直線化し、プラスミドベクター上のバクテリオファージプロモーターを特異的に認識するバクテリオファージ由来のＤＮＡ−依存性ＲＮＡポリメラーゼを用いてクローン化ＤＮＡを生体外で転写することにより、合成ｍＲＮＡを生体外で十分な量生成させる。
バクテリオファージＤＮＡ−依存性ＲＮＡポリメラーゼによって認識されるバクテリオファージプロモーターを有する様々なプラスミドベクターが利用可能であり、これらにはｐＳＰ６４、ｐＳＰ６５、ｐＳＰ７０、ｐＳＰ７１、ｐＳＰ７２、ｐＳＰ７３、ｐＧＥＭ−３Ｚ、ｐＧＥＭ−４Ｚ、ｐＧＥＭ−３Ｚｆ、ｐＧＥＭ−５Ｚｆ、ｐＧＥＭ−７Ｚｆ、ｐＧＥＭ−９Ｚｆ、及びｐＧＥＭ−１１Ｚｆが含まれ、これら一連のプラスミドの全てプロメガから市販されているが、これらに限定されるものではない。
二本鎖のＦＫＢＰ１２．６をコードするＤＮＡを、ＦＫＢＰ１２．６ＤＮＡのクローン化に都合がよく、かつ適当である、ベクターの利用可能な制限エンドヌクレアーゼ・クローン化部位の１以上を用いて、バクテリオファージプロモーター含有ベクター中に適切な方向にクローン化する。接続されたＦＫＢＰ１２．６ＤＮＡを有するベクターを細菌の形質転換に用い、適正な方向にあるＦＫＢＰ１２．６ＤＮＡを有するベクターの存在についてクローン単離体を分析する。
適正な方向にあるＦＫＢＰ１２．６ＤＮＡをコードするＤＮＡを含むベクターが同定され、単離されたら、ＦＫＢＰ１２．６転写単位よりも下流で、この転写単位を破壊することのない制限エンドヌクレアーゼを用いて開裂させることにより、ベクターを直線化する。直線化されたプラスミドを単離精製し、ＦＫＢＰ１２．６ｍＲＮＡの生体外転写の鋳型として用いる。
次に、この鋳型ＤＮＡを、反応混合物中において、ＤＮＡ鋳型の転写を可能にしてＦＫＢＰ１２．６ｍＲＮＡを形成するバクテリオファージ特異的ＤＮＡ−依存性ＲＮＡポリメラーゼと混合する。Ｔ３、Ｔ７、及びＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼを含むがこれらに限定されるものではない、幾つかのバクテリオファージ特異的ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼが利用可能である。その後、合成ＦＫＢＰ１２．６ｍＲＮＡを単離精製する。
ｍＲＮＡの安定性を改善するため、５′末端キャップ構造及び３′ポリＡテール部を有するｍＲＮＡを合成することが有利である。キャップ構造、すなわち７−メチルグアノシンは、単にＤＮＡ鋳型と共に反応混合物に７−メチルグアノシンを添加することにより、ｍＲＮＡの５′末端に組込むことが可能である。ＤＮＡ−依存性ＲＮＡポリメラーゼは、ｍＲＮＡを合成する際に、キャップ構造を５′末端に組込む。ポリＡテールは多くのｃＤＮＡにおいて自然に発生することが見出されるが、単にポリＡテールをコードするＤＮＡ配列をＤＮＡ鋳型の３′末端に挿入することによりｍＲＮＡの３′末端に付加することが可能である。
単離精製されたＦＫＢＰ１２．６ｍＲＮＡを、ウサギ網状赤血球溶解物及び小麦胚芽抽出物（両者ともプロメガ及びＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａから市販されている）を含むがこれらに限定されるものではない非細胞系、もしくは、ツメガエル卵母細胞への微量注入を含むがこれに限定されるものではない細胞ベースの系のいずれか、好ましくはツメガエル卵母細胞への微量注入、を用いて翻訳する。
ツメガエル卵母細胞に、ＦＫＢＰ１２．６蛋白質の生成に十分な量の合成ＦＫＢＰ１２．６ｍＲＮＡを微量注入する。この微量注入した卵母細胞をインキュベートしてＦＫＢＰ１２．６ｍＲＮＡの翻訳を可能とし、ＦＫＢＰ１２．６蛋白質を形成させる。
これらの合成ｍＲＮＡは標準法（Ｇｕｒｄｏｎ，Ｊ．Ｂ．及びＷｉｃｋｅｎｓ，Ｍ．Ｄ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１０１，３７０−３８６（１９８３））によりツメガエル卵母細胞（５−６期）に注入される。卵母細胞を回収し、上述の通りＦＫＢＰ１２．６の発現について分析する。
例  １５
ツメガエル卵母細胞におけるｐｃＤＮＡ−ＦＫＢＰ１２．６の発現
標準的な外科的手段（Ｃｏｌｍａｎ，Ａ．，１９８４：Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ−Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ）を用いて、Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓの雌成体から卵母細胞を取り出す。卵胞細胞を除去するため、新たに作製された、Ｃａ2+非含有ＮＤ９６溶液（ＮＤ９６、ｍＭで：ＮａＣｌ  ９６、ＫＣｌ  ２、ＭｇＣｌ2  １、ＨＥＰＥＳ  ５、Ｎａ−ピルベート２．５、テオフィリン０．５、ゲンタマイシン５０ｍｇ／ｍｌ、＋１．８ＣａＣｌ2、ｐＨ７．６）中のコラゲナーゼ（２ｍｇ／ｍｌ、２型、Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ．、Ｆｒｅｅｈｏｌｄ、ＮＪ）で卵母細胞を処理する。脱卵胞化した５−６期の卵母細胞を選別し、ＮＤ９６溶液中に保持する。卵母細胞の核に、１−５ｎｇのｐｃＤＮＡ−ＦＫＢＰ１２．６もしくはｐｃＤＮＡ−ＦＫＢＰ１２．６（Ｂａｍ）を注入した後、アゴニストでの攻撃の前に１８℃で４８時間インキュベートする。アゴニスト誘発Ｃａ2+−依存性Ｃｌ−電流又はＣａ2+特異的発光蛋白質エクオリン（Ｊ．Ｂｌｉｎｋｓ，Ｆｒｉｄａｙ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｈｏｔｏｐｒｏｔｅｉｎｓ，ＷＡ）を注入した卵母細胞における発光のいずれかを測定することにより、機能的活性を決定する（Ｇｉｌａｄｉ及びＳｐｉｎｄｅｌ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１０，７４４−７４７（１９９１））。電気生理学的検定については、卵母細胞を０．５ｍｌ灌流チャンバーに入れ、ターボＴＥＣ０１Ｃ（Ｔｕｒｂｏ  ＴＥＣ１０Ｃ）増幅器（ＮＰＩ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて（３Ｍ  ＫＣｌを充填した０．５−２．０ＭΩ抵抗の微小電極で）電圧を−６０ｍＶに固定する。リガンド含有溶液を灌流させ、応答電流を記録する。発光測定検定（ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｒｉｃ  ａｓｓａｙ）については、エクオリン注入卵母細胞（１００ｎｇ／卵母細胞）を０．４ｍｌに  ＮＤ９６を収容するキュベットに個別に入れ、リガンド添加により刺激される発光をバイオ−オービット１２５１ルミノメーター（Ｂｉｏ−Ｏｒｂｉｔ  １２５１  ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ）（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉ．Ｌｔｄ．）を用いて記録する。
例  １６
哺乳動物発現ベクターのＦＫＢＰ１２．６ｃＤＮＡのクローン化
ＦＫＢＰ１２．６ｃＤＮＡ発現カセットを、適当な制限エンドヌクレアーゼ部位で、強力な汎用哺乳動物プロモーターを有する下記ベクター内に接続する：ｐＢＣ１２ＢＩ（Ｃｕｌｌｅｎ，Ｂ．Ｒ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５２，６８４−７０４（１９８８））及びｐＥＥ１２（Ｃｅｌｌ  ＴｅｃｈのＥＰ０、３３８、８４１号）並びにその派生体ｐＳＺ９０１６−１及びｐ９０１９。ｐ９０１９は、ｈＣＭＶＩＥプロモーター、ポリリンカー及びＳＶ４０ポリＡ成分を有し、ＳＶ４０早期プロモーターによって機能するジヒドロ葉酸レダクターゼの変異遺伝子（ｍＤＨＦＲ）（Ｓｉｍｏｎｓｅｎ，Ｃ．Ｃ．及びＬｅｖｉｎｓｏｎ，Ａ．Ｄ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８０，２４９５−２４９９（１９８３））を含んでなる選別可能なマーカー／増幅システムを備えた哺乳動物発現ベクターの構造を示す。ｐＤ５（Ｂｅｒｋｅｒ及びＳｈａｒｐ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，１３，８４１−８５７（１９８５））を鋳型として用いる、プライマー１３９７８−１２０及び１３９７７８−１２１によるＰＣＲ反応により、ＳＶ４０ポリアデニル化配列を生成する。得られた０．２５ＫｂのＰＣＲ産生物をＣｌａＩ及びＳｐｅＩで消化し、同様に消化されたｐＥＥ１２の６．７ｋｂ断片に接続する。得られたプラスミドをＢｇ１II及びＳｆｉＩで消化し、ＳＶ４０早期プロモーターの３′部分及びベクターからのＧＳｃＤＮＡを接続する。プラスミドｐＦＲ４００（Ｓｉｍｏｎｓｅｎ，Ｃ．Ｃ．及びＬｅｖｉｎｓｏｎ，Ａ．Ｄ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８０，２４９５−２４９９（１９８３））から単離される０．７ｋｂのＳｆｉＩ−ＸｈｏII断片を上記５．６ｋｂベクターに接続し、これによりＳＶ４０早期プロモーターを再構築し、ｍＤＨＦＲ遺伝子を挿入する。このプラスミドをｐ９０１９と呼ぶ。ｐＳＺ９０１６−１は、ｈｕＣＭＶＩＥプロモーターをＨＩＶ  ＬＴＲに置き換えること以外はｐ９０１９と同一である。このベクターは、ｐ９０１９をＸｂａＩ及びＭｌｕＩで消化してｈｕＣＭＶＩＥプロモーターを除去することにより構築される。残基−１１７ないし＋８０のＨＩＶＬＴＲプロモーター（ＨＩＶ−１  ＬＴＲの一部を有するベクターｐＣＤ２３中に見出される（Ｃｕｌｌｅｎ，Ｃｅｌｌ，４６，９７３（１９８６））を、オリゴヌクレオチドプライマーを用いてプラスミドｐＣＤ２３からＰＣＲ増幅する。このオリゴヌクレオチドプライマーは、生成物の末端に付加しているものであり、３′側にはＨｉｎｄIII及びＸｂａＩ部位が付加しているのに対して５′側はＭｌｕＩ及びＳｐｅＩ制限部位である。得られた０．２ｋｂのＰＣＲ産物を酵素ＭｌｕＩ及びＸｂａＩで消化した後、断片をゲル精製し、４．３ｋｂのプロモーターのないＤＮＡ断片に接続してベクターｐＳＺ９０１６−１を生成させる。
プロモーターに対して正方向にＦＫＢＰ１２．６ｃＤＮＡを含むカセットをプロモーターの３′側の適当な制限部位に接続し、制限部位マッピング及び／または配列決定によって同定する。これらのｃＤＮＡ発現ベクターを、ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ１６５１）、ＣＶ−１ｔａｔ（（Ｓａｃｋｅｕｉｔｚら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３８，１５７５（１９８７））、２９３、Ｌ（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ６３６２）を含むがこれらの限定されるものではない様々なホスト細胞に、エレクトロポレーション又は化学的方法（陽イオン性リポソーム、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム）を含むがこれらに限定されるものではない標準法により導入する。形質移入細胞及び細胞培養抽出物を回収し、以下に記すようにＦＫＢＰ１２．６の発現について分析することができる。
哺乳動物一過性発現に用いられるベクターの全ては、ＦＫＢＰ１２．６を発現する安定な細胞系の確立に用いることが可能である。発現ベクターにクローン化された未変化ＦＫＢＰ１２．６ｃＤＮＡ構築物は、細胞内ＦＫＢＰ１２．６蛋白質を生成するようにホスト細胞を設定することが期待される。形質移入ホスト細胞には、ＣＶ−１Ｐ（Ｓａｃｋｅｖｉｔｚ，ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３８，１５７５（１９８７））、ｔｋ−Ｌ（Ｗｉｇｌｅｒ，ら，Ｃｅｌｌ，１１，２２３（１９７７））、ＮＳ／０、及びｄＨＦｒ−ＣＨＯ（Ｋａｕｆｍａｎ及びＳｈａｒｐ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５９，６０１（１９８２））が含まれるが、これらに限定されるものではない。
ＦＫＢＰ１２．６ｃＤＮＡを含むベクターと、Ｇ４１８、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ、ｐＬＮＣＸ（Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．，及びＲｏｓｍａｎ  Ｇ．Ｊ．，Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｎｅｗｓ，７，９８０−９９０（１９８９））；ハイグロマイシン、ハイグロマイシン−Ｂホスホトランスフェラーゼ、ｐＬＧ９０（Ｇｒｉｔｚ．Ｌ．及びＤａｖｉｅｓ，Ｊ．，Ｇｅｎｅ，２５，１７９（１９８３））；ＡＰＲＴ、キサンチン−グアニンホスホリボシル−トランスフェラーゼ、ｐＭＡＭ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）（Ｍｕｒｒａｙ，ら，Ｇｅｎｅ，３１，２３３（１９８４））を含むがこれらに限定されるものではない薬剤選別プラスミドとの同時形質移入は、安定に形質移入されたクローンの選別を可能にする。ＦＫＢＰ１２．６のレベルは上記検定により定量する。
できるだけ高いレベルのＦＫＢＰ１２．６を合成する哺乳動物細胞クローンを生成するため、ＦＫＢＰ１２．６ｃＤＮＡ構築物を、増幅可能な薬剤耐性マーカーを有するベクターに接続する。これらの構築物を細胞に導入した後、適当な試薬でプラスミドを有するクローンを選別し、試薬の用量を増加しつつ高コピー数のプラスミドを有する過剰発現クローンの単離を達成する。以下のシステムを利用する：ＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞に形質移入され、メトトレキセートにおいて選別される、変異ＤＨＦＲ遺伝子を有する９０１６又は９０１９プラスミド（Ｓｉｍｏｎｓｏｎ，Ｃ．及びＬｅｖｉｎｓｏｎ，Ａ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８０，２４９５（１９８３））；ＮＳ／Ｏ細胞に形質移入され、メチオニンスルホキシミンにおいて選別される、グルタミンシンセターゼ遺伝子を有するｐＥＥ２１プラスミド、（セル・テックの国際特許出願２０８９／１０４０４）；及び、チミジンキナーゼ遺伝子を有するｐＤＬＡＴ−３（Ｃｏｌｂｅｒｅ及びＧａｒｏｐｉｎ，Ｆ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，７６，３７５５（１９７９））と共にＡＰＲＴ及びＴＫ欠乏Ｌ細胞に形質移入され、ＡＰＲＴ（０．０５Ｍアザセリン、０．１ｍＭアデニン、４μｇ／ｍｌアデノシン）において選別され、ＨＡＴ（１００μＭヒポキサンチン、０．４μＭアミノプテリン、１６μＭチミジン）で増幅される、９０１６又は他のＣＭＶプロモーターベクター。
例  １７
昆虫細胞における発現のためのバキュロウイルス発現ベクターへのＦＫＢＰ１２．６ｃＤＮＡのクローン化
昆虫細胞のＳｆ９系（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ＃１７１１）におけるｃＤＮＡの高レベルの発現を提供するため、ＡｃＮＰＶウイルスのゲノムから誘導されるバキュロウイルスベクターを設計する。ＦＫＢＰ１２．６ｃＤＮＡを発現する組換えバキュロウイルスを以下の標準法（Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｍａｘｂａｃ  Ｍａｎｕａｌ）により生成させる：ＦＫＢＰ１２．６ｃＤＮＡ構築物を、ｐＡＣ３６０及びＢｌｕｅＢａｃベクター（Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む様々なバキュロウイルス転移ベクター中のポリヘドリンプロモーターの下流に接続する。Ｓｆ９細胞にバキュロウイルス転移ベクター及び直線化ＡｃＮＰＶゲノムＤＮＡ（Ｋｉｔｔｓ，Ｐ．Ａ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．，１８，５６６７（１９９０））を同時形質移入した後、相同組換えにより組換えバキュロウイルスを生成させる。昆虫細胞中に封入体が存在しないことから組換えｐＡＣ３６０ウイルスを同定し（Ｓｕｍｍｅｒｓ，Ｍ．Ｄ．及びＳｍｉｔｈ，Ｇ．Ｅ．，Ｔｅｘａｓ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ  Ｅｘｐ．Ｓｔａｔｉｏｎ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  Ｎｏ．１５５５）、β−ガラクトシダーゼの発現に基づいてｐＢｌｕｅＢａｃウイルスを同定する（Ｖｉａｌａｒｄら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６４，３７−５０（１９９０））。プラーク精製及びＦＫＢＰ１２．６組換えバキュロウイルスでのｓｆ９細胞の感染の後、ＦＫＢＰ１２．６の発現を上記検定により測定する。
ＦＫＢＰ１２．６の全開放読み枠をコードするｃＤＮＡをｐＢｌｕｅＢｅｃIIのＢａｍＨＩ部位に挿入する。ポリヘドリンプロモーターに対して正方向にある構築物を配列決定により同定し、直線状ＡｃＮＰＶマイルド型ＤＮＡの存在下におけるＳｆ９細胞の形質移入に用いる。
真正の活性ＦＫＢＰ１２．６が昆虫細胞の膜に関連して見出される。標準法により昆虫細胞から膜調製品を調製する。
例  １８
酵母発現ベクターへのＦＫＢＰ１２．６ｃＤＮＡのクローン化
異種蛋白質の細胞内発現を指向するように設計された発現ベクターに最適化ＦＫＢＰ１２．６ｃＤＮＡ構築物を挿入した後、酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて組換えＦＫＢＰ１２．６を生成させる。細胞内発現のため、ＥｍＢＬｙｅｘ４等のベクターをＦＫＢＰ１２．６シストロンに接続する（Ｒｉｎａｓ，Ｕ．ら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８，５４３−５４５（１９９０）；Ｈｏｒｏｗｉｔｚ，Ｂ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５，４１８９−４１９２（１９８９））。発現したＦＫＢＰ１２．６のレベルは上記検定により決定する。
例  １９
組換えＦＫＢＰ１２．６の精製
組換えにより生成したＦＫＢＰ１２．６は、抗体アフィニティクロマトグラフィーにより精製することができる。ＦＫＢＰ１２．６抗体アフィニティカラムは、アフィゲル−１０（Ｂｉｏｒａｄ）に抗−ＦＫＢＰ１２．６抗体を添加することにより作製する。アフィゲル−１０は、抗体がこのアガロースゲル・ビーズ支持体と共有結合を形成するようにＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルで予め活性化されたゲル支持体である。次いで、抗体を、スペーサー・アーム所在のアミド結合により、ゲルに結合させる。その後、残りの活性化エステルを１ＭエタノールアミンＨＣｌ（ｐＨ８）で失活させる。このカラムを水、次いで０．２３ＭグリシンＨＣｌ（ｐＨ２．６）で洗浄して、非結合抗体又は無関係の蛋白質を除去する。次に、このカラムを、洗浄剤のような適当な膜可溶化剤と共にリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．３）で平衡化し、可溶化ＦＫＢＰ１２．６又はＦＫＢＰ１２．６サブユニットを含有する細胞培養上清又は細胞抽出物をゆっくりとカラムに通す。その後、光学密度がバックグランドに低下するまでカラムをリン酸緩衝生理食塩水及び洗浄剤で洗浄し、次に、０．２３Ｍグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．６）及び洗浄剤で蛋白質を溶出させる。次いで、精製されたＦＫＢＰ１２．６蛋白質をリン酸緩衝液に対して透析する。
本発明を、それらの特定の態様を参照しながら記述し、説明したが、当業者は、本発明の精神及び範囲から離れることなく、手順及びプロトコルの様々な翻案、変更、修正、置換、削除又は追加が可能であることを認識するであろう。例えば、ここに上述される特定の実験手順以外の手順を、上に示される本発明の蛋白質及びＤＮＡの配列における縮重及び変化の結果として適用することが可能である。同様に、観察される特徴付けデータは、用いられる特定の検定または特徴付け法により、及びそれらに依存して、僅かに変動することがあり、結果におけるそのような予想される変動又は相違は本発明の目的及び実施に従って考慮される。したがって、下記請求の範囲によって本発明が定義され、この請求の範囲が合理的な広さで解釈されることが意図されている。
配列表
配列番号１
配列の長さ：１０３
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：蛋白質
ハイポセティカル：ＮＯ
アンチセンス：ＮＯ
配列：
0003747063.tif 000028
配列番号２
配列の長さ：１０７
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：蛋白質
ハイポセティカル：ＮＯ
アンチセンス：ＮＯ
配列：
0003747063.tif 000029
配列番号３
配列の長さ：８
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：蛋白質
ハイポセティカル：ＮＯ
アンチセンス：ＮＯ
配列：
0003747063.tif 000030
配列番号４
配列の長さ：１１
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：蛋白質
ハイポセティカル：ＮＯ
アンチセンス：ＮＯ
配列：
0003747063.tif 000031
配列番号５
配列の長さ：１１
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：蛋白質
ハイポセティカル：ＮＯ
アンチセンス：ＮＯ
配列：
0003747063.tif 000032
配列番号６
配列の長さ：１７
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ
ハイポセティカル：ＮＯ
アンチセンス：ＮＯ
配列：
0003747063.tif 000033
配列番号７
配列の長さ：１７
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ
ハイポセティカル：ＮＯ
アンチセンス：ＮＯ
配列：
0003747063.tif 000034
配列番号８
配列の長さ：１７
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ
ハイポセティカル：ＮＯ
アンチセンス：ＮＯ
配列：
0003747063.tif 000035
配列番号９
配列の長さ：１７
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ
ハイポセティカル：ＮＯ
アンチセンス：ＹＥＳ
配列：
0003747063.tif 000036
配列番号１０
配列の長さ：１７
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ
ハイポセティカル：ＮＯ
アンチセンス：ＹＥＳ
配列：
0003747063.tif 000037
配列番号１１
配列の長さ：１７
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ
ハイポセティカル：ＮＯ
アンチセンス：ＹＥＳ
配列：
0003747063.tif 000038
配列番号１２
配列の長さ：１７
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ
ハイポセティカル：ＮＯ
アンチセンス：ＹＥＳ
配列：
0003747063.tif 000039
配列番号１３
配列の長さ：１７
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ
ハイポセティカル：ＮＯ
アンチセンス：ＮＯ
配列：
0003747063.tif 000040
配列番号１４
配列の長さ：１７
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ
ハイポセティカル：ＮＯ
アンチセンス：ＮＯ
配列：
0003747063.tif 000041
配列番号１５
配列の長さ：１６
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ
ハイポセティカル：ＮＯ
アンチセンス：ＹＥＳ
配列：
0003747063.tif 000042
配列番号１６
配列の長さ：１６
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ
ハイポセティカル：ＮＯ
アンチセンス：ＹＥＳ
配列：
0003747063.tif 000043
配列番号１７
配列の長さ：３２
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ
ハイポセティカル：ＮＯ
アンチセンス：ＮＯ
配列：
0003747063.tif 000044
配列番号１８
配列の長さ：３２
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ
ハイポセティカル：ＮＯ
アンチセンス：ＹＥＳ
配列：
0003747063.tif 000045
配列番号１９
配列の長さ：３２
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ
ハイポセティカル：ＮＯ
アンチセンス：ＹＥＳ
配列：
0003747063.tif 000046
配列番号２０
配列の長さ：１２０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ
ハイポセティカル：ＮＯ
アンチセンス：ＮＯ
配列：
0003747063.tif 000047
配列番号２１
配列の長さ：１２０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ
ハイポセティカル：ＮＯ
アンチセンス：ＮＯ
配列：
0003747063.tif 000048