(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）ヌクレオチドの前駆物質からヌクレオシド−５’−三リン酸（以下、ＮＴＰと略す）を生産する能力を有するエシェリヒア属またはコリネバクテリウム属に属する微生物の培養液または該培養液の処理物、ｂ）グルコース、フルクトース、ガラクトース、グルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、マンノース、フコース、Ｎ−アセチルマンノサミンおよびアセチルノイラミン酸からなる群より選ばれる糖とＮＴＰから糖ヌクレオチドを生産する能力を有するエシェリヒア属またはコリネバクテリウム属に属する１種類ないしそれ以上の微生物の培養液または該培養液の処理物、およびｃ）糖転移酵素を発現する微生物、動物細胞あるいは昆虫細胞の培養液または該培養液の処理物、を酵素源として用い、これら酵素源、ヌクレオチドの前駆物質、グルコース、フルクトース、ガラクトース、グルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、マンノース、フコース、Ｎ−アセチルマンノサミンおよびアセチルノイラミン酸からなる群より選ばれる糖および複合糖質前駆物質を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中に複合糖質を生成蓄積させ、該水性媒体中から複合糖質を採取することを特徴とする複合糖質の製造法。
【請求項２】
ａ）ヌクレオチドの前駆物質からＮＴＰを生産する能力を有する微生物の培養液または該培養液の処理物、ｂ）グルコース、フルクトース、ガラクトース、グルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、マンノース、フコース、Ｎ−アセチルマンノサミンおよびアセチルノイラミン酸からなる群より選ばれる糖とＮＴＰから糖ヌクレオチドを生産する能力を有するエシェリヒア属またはコリネバクテリウム属に属する１種類ないしそれ以上の微生物の培養液、該培養液の濃縮物、該培養上清の濃縮物、該培養液を遠心分離して得られる細胞、該細胞の界面活性剤処理物、該細胞の溶媒処理物、該細胞の酵素処理物、または該細胞の固定化物、およびｃ）糖転移酵素を発現する微生物、動物細胞あるいは昆虫細胞の培養液または該培養液の処理物、を酵素源として用い、これら酵素源、ヌクレオチドの前駆物質、グルコース、フルクトース、ガラクトース、グルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、マンノース、フコース、Ｎ−アセチルマンノサミンおよびアセチルノイラミン酸からなる群より選ばれる糖並びに複合糖質前駆物質を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中に複合糖質を生成蓄積させ、該水性媒体中から複合糖質を採取することを特徴とする複合糖質の製造法。
【請求項３】
糖転移酵素を発現する微生物、動物細胞あるいは昆虫細胞の培養液または該培養液の処理物を酵素源として用い、該酵素源、複合糖質前駆物質および下記［１］の製造法により得られた糖ヌクレオチドを水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中に複合糖質を生成蓄積させ、該水性媒体中から複合糖質を採取することを特徴とする複合糖質の製造法。
［１］ａ）ヌクレオチドの前駆物質からＮＴＰを生産する能力を有する微生物の培養液または該培養液の処理物、およびｂ）グルコース、フルクトース、ガラクトース、グルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、マンノース、フコース、Ｎ−アセチルマンノサミンおよびアセチルノイラミン酸からなる群より選ばれる糖とＮＴＰから糖ヌクレオチドを生産する能力を有するエシェリヒア属またはコリネバクテリウム属に属する微生物から選ばれる１種類ないしそれ以上の微生物の培養液、該培養液の濃縮物、該培養上清の濃縮物、該培養液を遠心分離して得られる細胞、該細胞の界面活性剤処理物、該細胞の溶媒処理物、該細胞の酵素処理物または該細胞の固定化物、を酵素源として用い、これら酵素源、ヌクレオチドの前駆物質およびグルコース、フルクトース、ガラクトース、グルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、マンノース、フコース、Ｎ−アセチルマンノサミンおよびアセチルノイラミン酸からなる群より選ばれる糖を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中に糖ヌクレオチドを生成蓄積させ、該水性媒体中から糖ヌクレオチドを採取することを特徴とする糖ヌクレオチドの製造法。
【請求項４】
培養液の処理物が、培養液の濃縮物、培養液の乾燥物、培養液を遠心分離して得られる培養上清、該培養上清の濃縮物、培養上清から得られる酵素標品、培養液を遠心分離して得られる細胞、該細胞の乾燥物、該細胞の凍結乾燥物、該細胞の界面活性剤処理物、該細胞の超音波処理物、該細胞の機械的摩砕処理物、該細胞の溶媒処理物、該細胞の酵素処理物、該細胞の蛋白質分画物、該細胞の固定化物あるいは該細胞より抽出して得られる酵素標品であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造法。
【請求項５】
ヌクレオチドの前駆物質が、オロット酸、ウラシル、オロチジン、ウリジン、シトシン、シチジン、アデニン、アデノシン、グアニン、グアノシン、ヒポキサンチン、イノシン、キサンチン、キサントシン、イノシン−５’−一リン酸、キサントシン−５’−一リン酸、グアノシン−５’−一リン酸、ウリジン−５’−一リン酸またはシチジン−５’−一リン酸である請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造法。
【請求項６】
糖ヌクレオチドが、ウリジン二リン酸化合物、グアノシン二リン酸化合物またはシチジン一リン酸化合物である請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造法。
【請求項７】
ウリジン二リン酸化合物、グアノシン二リン酸化合物またはシチジン一リン酸化合物が、ウリジン二リン酸グルコース、ウリジン二リン酸ガラクトース、ウリジン二リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミン、ウリジン二リン酸−Ｎ−アセチルガラクトサミン、ウリジン二リン酸グルクロン酸、グアノシン二リン酸マンノース、グアノシン二リン酸フコース、シチジン一リン酸−Ｎ−アセチルノイラミン酸およびこれらの誘導体から選ばれる化合物である請求項６記載の製造法。
【請求項８】
複合糖質が、グルコース、ガラクトース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、グルクロン酸、マンノース、Ｎ−アセチルマンノサミン、フコース、シアル酸、ラクトース、Ｎ−アセチルラクトサミン、ラクト−Ｎ−ビオース、ＧｌｃＮＡcβ1-3Ｇａｌβ1-4Ｇｌｃ、ＧｌｃＮＡｃβ1-4Ｇａｌβ1-4Ｇｌｃ、グロボトリオース、Ｇａｌα1-4Ｇａｌβ1-4ＧｌｃＮＡｃ、2’-フコシルラクトース、3-フコシルラクトース、3’-シアリルラクトース、6’-シアリルラクトース、3’-シアリル−Ｎ−アセチルラクトサミン、6’-シアリル−Ｎ−アセチルラクトサミン、シアリルラクト−Ｎ−ビオース、ルイスＸ、ルイスａ、ラクト−Ｎ−テトラオース、ラクト−Ｎ−ネオテトラオース、ラクトジフコテトラオース、3’-シアリル3-フコシルラクトース、シアリルルイスＸ、シアリルルイスａ、ラクト−Ｎ−フコペンタオースI、ラクト−Ｎ−フコペンタオースII、ラクト−Ｎ−フコペンタオースIII、ラクト−Ｎ−フコペンタオースV、LS-テトラサッカライドａ、LS-テトラサッカライドｂ、LS-テトラサッカライドｃ、（α２，３）シアリルラクト−Ｎ−ネオテトラオース、ラクト−Ｎ−ジフコヘキサオースI、ラクト−Ｎ−ジフコヘキサオースII、ラクト−Ｎ−ヘキサオース、ラクト−Ｎ−ネオヘキサオース、ジシアリルラクト−Ｎ−テトラオースおよびこれらの誘導体から選ばれる糖を１あるいはそれ以上含有する複合糖質または該複合糖質を含む複合糖質である請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造法。
【請求項９】
複合糖質が、Ｇａｌβ1-3Ｇｌｃ、Ｇａｌβ1-4Ｇｌｃ、Ｇａｌβ1-3ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌβ1-4ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌβ1-3Ｇａｌ、Ｇａｌβ1-4Ｇａｌ、Ｇａｌβ1-3ＧａｌＮＡｃ、Ｇａｌβ1-4ＧａｌＮＡｃ、Ｇａｌα1-3Ｇｌｃ、Ｇａｌα1-4Ｇｌｃ、Ｇａｌα1-3ＧｌｃＮＡｃ，Ｇａｌα1-4ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌα1-3Ｇａｌ、Ｇａｌα1-4Ｇａｌ、Ｇａｌα1-3ＧａｌＮＡｃ、Ｇａｌα1-4ＧａｌＮＡｃ、ＧｌｃＮＡｃβ1-3Ｇａｌ、ＧｌｃＮＡｃβ1-4Ｇａｌ、ＧｌｃＮＡｃβ1-6Ｇａｌ、ＧｌｃＮＡｃβ1-3Ｇｌｃ、ＧｌｃＮＡｃβ1-4Ｇｌｃ、ＧｌｃＮＡｃβ1-3ＧｌｃＮＡｃ、ＧｌｃＮＡｃβ1-4ＧｌｃＮＡｃ、ＧｌｃＮＡｃβ1-6ＧａｌＮＡｃ、ＧｌｃＮＡｃβ1-2Ｍａｎ、ＧｌｃＮＡｃβ1-4Ｍａｎ、ＧｌｃＮＡｃβ1-6Ｍａｎ、ＧａｌＮＡｃβ1-3Ｇａｌ、ＧａｌＮＡｃβ1-4Ｇａｌ、ＧａｌＮＡｃβ1-4ＧｌｃＮＡｃ、ＧａｌＮＡｃα1-3ＧａｌＮＡｃ、Ｍａｎβ1-4ＧｌｃＮＡｃ、Ｍａｎα1-6Ｍａｎ，Ｍａｎα1-3Ｍａｎ，Ｍａｎα1-2Ｍａｎ，ＧｌｃＵＡβ1-4ＧｌｃＮ、ＧｌｃＵＡβ1-3Ｇａｌ、ＧｌｃＵＡβ1-3ＧｌｃＮＡｃ、ＧｌｃＵＡβ1-3ＧａｌＮＡｃ、ＮｅｕＡｃα2-3Ｇａｌ、ＮｅｕＡｃα2-6Ｇａｌ、ＮｅｕＡｃα2-3ＧｌｃＮＡｃ、ＮｅｕＡｃα2-6ＧｌｃＮＡｃ、ＮｅｕＡｃα2-3ＧａｌＮＡｃ、ＮｅｕＡｃα2-6ＧａｌＮＡｃ、ＮｅｕＡｃα2-8ＮｅｕＡｃ、Ｆｕｃα1-3Ｇｌｃ、Ｆｕｃα1-4Ｇｌｃ、Ｆｕｃα1-3ＧｌｃＮＡｃ、Ｆｕｃα1-4ＧｌｃＮＡｃ、Ｆｕｃα1-2ＧａｌおよびＦｕｃα1-6ＧｌｃＮＡｃから選ばれる結合を有する糖を含む複合糖質または該複合糖質を含む複合糖質である請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造法。
【請求項１０】
複合糖質に含まれる糖が１０個以下である請求項８または９記載の方法。
【請求項１１】
複合糖質に含まれる糖が６個以下である請求項８または９記載の方法。
【請求項１２】
複合糖質前駆物質が、単糖、オリゴサッカライド、蛋白質、ペプチド、脂質、糖蛋白質、糖脂質、グリコペプチドおよびステロイド化合物から選ばれる複合糖質前駆物質である請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造法。
【請求項１３】
複合糖質前駆物質が、グルコース、ガラクトース、マンノース、シアル酸、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、ラクトース、Ｎ−アセチルラクトサミン、ラクト−Ｎ−ビオース、ＧｌｃＮＡｃβ1-3Ｇａｌβ1-4Ｇｌｃ、ＧｌｃＮＡｃβ1-4Ｇａｌβ1-4Ｇｌｃ、グロボトリオース、Ｇａｌα1-4Ｇａｌβ1-4ＧｌｃＮＡｃ、2’-フコシルラクトース、3-フコシルラクトース、3’-シアリルラクトース、6’-シアリルラクトース、3’-シアリル−Ｎ−アセチルラクトサミン、6’-シアリル−Ｎ−アセチルラクトサミン、シアリルラクト−Ｎ−ビオース、ルイスＸ、ルイスａ、ラクト−Ｎ−テトラオース、ラクト−Ｎ−ネオテトラオース、ラクトジフコテトラオース、3’-シアリル-3-フコシルラクトース、シアリルルイスＸ、シアリルルイスａ、ラクト−Ｎ−フコペンタオースI、ラクト−Ｎ−フコペンタオースII、ラクト−Ｎ−フコペンタオースIII、ラクト−Ｎ−フコペンタオースV、LS-テトラサッカライドａ、LS-テトラサッカライドｂ、LS-テトラサッカライドｃ、（α２，３）シアリルラクト−Ｎ−ネオテトラオースおよびこれらの誘導体、セリン、スレオニン、アスパラギンおよび該アミノ酸を含有するペプチドおよびその誘導体、セラミドおよびその誘導体から選ばれる複合糖質前駆物質または該複合糖質前駆物質を含む複合糖質前駆物質である請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造法。
【請求項１４】
ヌクレオチドの前駆物質からＮＴＰを生産する能力を有する微生物が、エシェリヒア属またはコリネバクテリウム属に属する微生物であることを特徴とする請求項２または３記載の製造法。
【請求項１５】
請求項１記載のヌクレオチドの前駆物質からＮＴＰを生産する能力を有するエシェリヒア属に属する微生物、または請求項１４記載のエシェリヒア属に属する微生物が、エシェリヒア・コリであることを特徴とする請求項１または１４記載の製造法。
【請求項１６】
請求項１記載のヌクレオチドの前駆物質からＮＴＰを生産する能力を有するコリネバクテリウム属に属する微生物、または請求項１４記載のコリネバクテリウム属に属する微生物が、コリネバクテリウム・アンモニアゲネスであることを特徴とする請求項１または１４記載の製造法。
【請求項１７】
糖とＮＴＰから糖ヌクレオチドを生産する能力を有するエシェリヒア属に属する微生物が、エシェリヒア・コリである請求項１〜３のいずれか1項に記載の製造法。
【請求項１８】
糖とＮＴＰから糖ヌクレオチドを生産する能力を有するコリネバクテリウム属に属する微生物が、コリネバクテリウム・アンモニアゲネスである請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造法。
【請求項１９】
糖とＮＴＰから糖ヌクレオチドを生産する能力を有するエシェリヒア属またはコリネバクテリウム属に属する微生物が、グルコキナーゼ（以下、ｇｌｋと略す）、ホスホグルコムターゼ（以下、ｐｇｍと略す）、グルコース−１−リン酸ウリジルトランスフェラーゼ（以下、ｇａｌＵと略す）およびピロフォスファターゼ（以下、ｐｐａと略す）から選ばれる１つ以上の酵素の活性の強い微生物であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造法。
【請求項２０】
糖ヌクレオチドが、ウリジン二リン酸グルコースである請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造法。
【請求項２１】
ｇｌｋ、ｐｇｍ、ｇａｌＵおよびｐｐａから選ばれる１つ以上の酵素の活性の強い微生物が、ｇｌｋをコードする遺伝子、ｐｇｍをコードする遺伝子、ｇａｌＵをコードする遺伝子およびｐｐａをコードする遺伝子から選ばれる１種類以上の遺伝子を含むＤＮＡ断片とベクターとの組換え体ＤＮＡを保有する１種類以上の微生物から構成されることを特徴とする請求項１９記載の製造法。
【請求項２２】
ｇｌｋをコードする遺伝子、ｐｇｍをコードする遺伝子、ｇａｌＵをコードする遺伝子およびｐｐａをコードする遺伝子が、エシェリヒア・コリ由来の遺伝子であることを特徴とする請求項２０記載の製造法。
【請求項２３】
糖とＮＴＰから糖ヌクレオチドを生産する能力を有するエシェリヒア属またはコリネバクテリウム属に属する微生物が、ｇｌｋ、ｐｇｍ、ｇａｌＵ、ｐｐａおよびウリジン二リン酸グルコースデヒドロゲナーゼ（以下、ｕｇｄと略す）から選ばれる１つ以上の酵素の活性の強い微生物である請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造法。
【請求項２４】
糖ヌクレオチドが、ウリジン二リン酸グルクロン酸である請求項１〜３および２３のいずれか１項に記載の製造法。
【請求項２５】
ｇｌｋ、ｐｇｍ、ｇａｌＵ、ｐｐａおよびｕｄｇから選ばれる１つ以上の酵素の活性の強い微生物が、ｇｌｋをコードする遺伝子、ｐｇｍをコードする遺伝子、ｇａｌＵをコードする遺伝子、ｐｐａをコードする遺伝子およびｕｄｇをコードする遺伝子から選ばれる１種類以上の遺伝子を含むＤＮＡ断片とベクターとの組換え体ＤＮＡを保有する１種類以上の微生物から構成されることを特徴とする請求項２３記載の製造法。
【請求項２６】
ｇｌｋをコードする遺伝子、ｐｇｍをコードする遺伝子、ｇａｌＵをコードする遺伝子、ｐｐａをコードする遺伝子およびｕｄｇをコードする遺伝子が、エシェリヒア・コリ由来の遺伝子であることを特徴とする請求項２５記載の製造法。
【請求項２７】
糖とＮＴＰから糖ヌクレオチドを生産する能力を有するエシェリヒア属またはコリネバクテリウム属に属する微生物が、ガラクトキナーゼ（以下、ｇａｌＫと略す）およびガラクトース−１−リン酸ウリジルトランスフェラーゼ（以下、ｇａｌＴと略す）から選ばれる１つ以上の酵素の活性の強い微生物であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造法。
【請求項２８】
糖ヌクレオチドが、ウリジン二リン酸ガラクトースである請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造法。
【請求項２９】
ｇａｌＫおよびｇａｌＴから選ばれる１つ以上の酵素の活性の強い微生物が、ｇｌｋ、ｐｇｍ、ｇａｌＵおよびｐｐａから選ばれる１つ以上の酵素の活性の強い微生物であることを特徴とする請求項２７記載の製造法。
【請求項３０】
ｇａｌＫおよびｇａｌＴから選ばれる１つ以上の酵素の活性の強い微生物が、ｇａｌＫをコードする遺伝子およびｇａｌＴをコードする遺伝子から選ばれる１種類以上の遺伝子を含むＤＮＡ断片とベクターとの組換え体ＤＮＡを保有する１種類以上の微生物から構成されることを特徴とする請求項２７記載の製造法。
【請求項３１】
ｇｌｋ、ｐｇｍ、ｇａｌＵおよびｐｐａから選ばれる１つ以上の酵素の活性の強い微生物が、ｇａｌＫをコードする遺伝子およびｇａｌＴをコードする遺伝子から選ばれる１種類以上の遺伝子を含むＤＮＡ断片とベクターとの組換え体ＤＮＡ、並びにｇｌｋをコードする遺伝子、ｐｇｍをコードする遺伝子、ｇａｌＵをコードする遺伝子およびｐｐａをコードする遺伝子から選ばれる１種類以上の遺伝子を含むＤＮＡ断片とベクターとの組換え体ＤＮＡを保有する１種類以上の微生物から構成されることを特徴とする請求項２９記載の製造法。
【請求項３２】
ｇａｌＫをコードする遺伝子、ｇａｌＴをコードする遺伝子、ｇｌｋをコードする遺伝子、ｐｇｍをコードする遺伝子、ｇａｌＵをコードする遺伝子およびｐｐａをコードする遺伝子が、エシェリヒア・コリ由来の遺伝子であることを特徴とする請求項３０または３１記載の製造法。
【請求項３３】
糖とＮＴＰから糖ヌクレオチドを生産する能力を有するエシェリヒア属またはコリネバクテリウム属に属する微生物が、ｐｐａ、ｇｌｋ、ホスホグルコサミンムターゼ（以下、ｇｌｍＭと略す）、グルコサミン−１−リン酸アセチルトランスフェラーゼおよびＮ−アセチルグルコサミン−１−リン酸ウリジルトランスフェラーゼ（以下、両者を併せてｇｌｍＵと略す）から選ばれる１つ以上の酵素の活性の強い微生物であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造法。
【請求項３４】
糖とＮＴＰから糖ヌクレオチドを生産する能力を有するエシェリヒア属またはコリネバクテリウム属に属する微生物が、ｇａｌＫの活性の強い微生物であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造法。
【請求項３５】
糖ヌクレオチドが、ウリジン二リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミンである請求項１〜３、３３および３４のいずれか１項の記載の製造法。
【請求項３６】
ｐｐａ、ｇｌｋ、ｇｌｍＭおよびｇｌｍＵから選ばれる１つ以上の酵素の活性の強い微生物が、ホスホグルコムターゼ（以下ｐｇｍと略す）およびホスホフルクトキナーゼ（以下、ｐｆｋＢと略す）活性の強い微生物であることを特徴とする請求項３３記載の製造法。
【請求項３７】
ｐｐａ、ｇｌｋ、ｇｌｍＭおよびｇｌｍＵから選ばれる１つ以上の酵素の活性の強い微生物が、ｐｐａをコードする遺伝子、ｇｌｋをコードする遺伝子、ｇｌｍＭをコードする遺伝子およびｇｌｍＵをコードする遺伝子から選ばれる１種類以上の遺伝子を含むＤＮＡ断片とベクターとの組換え体ＤＮＡを保有する１種類以上の微生物から構成されることを特徴とする請求項３３記載の製造法。
【請求項３８】
ｐｇｍおよびｐｆｋＢの活性の強い微生物が、ｐｐａをコードする遺伝子、ｇｌｋをコードする遺伝子、ｇｌｍＭをコードする遺伝子およびｇｌｍＵをコードする遺伝子から選ばれる１種類以上の遺伝子を含むＤＮＡ断片とベクターとの組換え体ＤＮＡ、並びにｐｇｍをコードする遺伝子およびｐｆｋＢをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片とベクターとの組換え体ＤＮＡを保有する１種類以上の微生物から構成されることを特徴とする請求項３６記載の製造法。
【請求項３９】
ｐｐａをコードする遺伝子、ｇｌｋをコードする遺伝子、ｇｌｍＭをコードする遺伝子、ｇｌｍＵをコードする遺伝子、ｐｇｍをコードする遺伝子およびｐｆｋＢをコードする遺伝子が、エシェリヒア・コリ由来の遺伝子であることを特徴とする請求項３７または３８記載の製造法。
【請求項４０】
ｇａｌＫの活性の強い微生物が、ｇａｌＫをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片とベクターとの組換え体ＤＮＡを保有する微生物であることを特徴とする請求項３４記載の製造法。
【請求項４１】
ｇａｌＫをコードする遺伝子が、エシェリヒア・コリ由来である請求項４０記載の製造法。
【請求項４２】
糖とＮＴＰから糖ヌクレオチドを生産する能力を有するエシェリヒア属またはコリネバクテリウム属に属する微生物が、ｐｐａ、ｇｌｋ、ｇｌｍＭ、ｇｌｍＵおよびウリジンジホスホ−Ｎ−アセチルグルコサミン  ４−エピメラーゼから選ばれる１つ以上の酵素の活性の強い微生物であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造法。
【請求項４３】
糖とＮＴＰから糖ヌクレオチドを生産する能力を有するエシェリヒア属またはコリネバクテリウム属に属する微生物が、ｇａｌＫおよびウリジンジホスホ−Ｎ−アセチルグルコサミン  ４−エピメラーゼの活性の強い微生物であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造法。
【請求項４４】
糖ヌクレオチドが、ウリジン二リン酸−Ｎ−アセチルガラクトサミンである請求項１〜３、４２および４３のいずれか１項に記載の製造法。
【請求項４５】
ｐｐａ、ｇｌｋ、ｇｌｍＭ、ｇｌｍＵおよびウリジンジホスホ−Ｎ−アセチルグルコサミン  ４−エピメラーゼから選ばれる１つ以上の酵素の活性の強い微生物が、ｐｇｍおよびｐｋｆＢの活性が強い微生物であることを特徴とする請求項４２記載の製造法。
【請求項４６】
ｐｇｍおよびｐｆｋＢの活性の強い微生物が、ｐｐａをコードする遺伝子、ｇｌｋをコードする遺伝子、ｇｌｍＭをコードする遺伝子、ｇｌｍＵをコードする遺伝子およびウリジンジホスホ−Ｎ−アセチルグルコサミン  ４−エピメラーゼをコードする遺伝子から選ばれる１種類以上の遺伝子を含むＤＮＡ断片とベクターとの組換え体ＤＮＡ、並びにｐｇｍをコードする遺伝子およびｐｆｋＢをコードする遺伝子から選ばれる１種類以上の遺伝子を含むＤＮＡ断片とベクターとの組換え体ＤＮＡを保有する１種類以上の微生物から構成されることを特徴とする請求項４５記載の製造法。
【請求項４７】
ｐｐａをコードする遺伝子、ｇｌｋをコードする遺伝子、ｇｌｍＭをコードする遺伝子、ｇｌｍＵをコードする遺伝子、ｐｇｍをコードする遺伝子およびｐｆｋＢをコードする遺伝子が、エシェリヒア・コリ由来の遺伝子であることを特徴とする請求項４６記載の製造法。
【請求項４８】
ｇａｌＫおよびウリジンジホスホ−Ｎ−アセチルグルコサミン  ４−エピメラーゼの活性の強い微生物が、ｇａｌＫをコードする遺伝子およびウリジンジホスホ−Ｎ−アセチルグルコサミン  ４−エピメラーゼをコードする遺伝子から選ばれる１種類以上の遺伝子を含むＤＮＡ断片とベクターとの組換え体ＤＮＡを保有する１種類以上の微生物から構成されることを特徴とする請求項４３記載の製造法。
【請求項４９】
ｇａｌＫをコードする遺伝子が、エシェリヒア・コリ由来の遺伝子であることを特徴とする請求項４８記載の製造法。
【請求項５０】
糖とＮＴＰから糖ヌクレオチドを生産する能力を有するエシェリヒア属またはコリネバクテリウム属に属する微生物が、ホスホマンノムターゼ（以下、ｍａｎＢと略す）、マンノース−１−リン酸グアニルトランスフェラーゼ（以下、ｍａｎＣと略す）およびｇｌｋから選ばれる１つ以上の酵素の活性の強い微生物であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造法。
【請求項５１】
糖ヌクレオチドが、グアノシン二リン酸マンノースである請求項１〜３および５０のいずれか１項に記載の製造法。
【請求項５２】
ｍａｎＢ、ｍａｎＣおよびｇｌｋから選ばれる１つ以上の酵素の活性の強い微生物が、ｐｇｍおよびｐｆｋＢの活性の強い微生物であることを特徴とする請求項５０記載の製造法。
【請求項５３】
ｍａｎＢ、ｍａｎＣおよびｇｌｋから選ばれる１つ以上の酵素の活性の強い微生物が、ｍａｎＢをコードする遺伝子、ｍａｎＣをコードする遺伝子およびｇｌｋをコードする遺伝子から選ばれる１種類以上の遺伝子を含むＤＮＡ断片とベクターとの組換え体ＤＮＡを保有する１種類以上の微生物から構成されることを特徴とする請求項５０記載の製造法。
【請求項５４】
ｐｇｍおよびｐｆｋＢの活性の強い微生物が、ｍａｎＢをコードする遺伝子、ｍａｎＣをコードする遺伝子およびｇｌｋをコードする遺伝子から選ばれる１種類以上の遺伝子を含むＤＮＡ断片とベクターとの組換え体ＤＮＡ、並びにｐｇｍをコードする遺伝子およびｐｆｋＢをコードする遺伝子から選ばれる１種類以上の遺伝子を含むＤＮＡ断片とベクターとの組換え体ＤＮＡを保有する１種類以上の微生物から構成されることを特徴とする請求項５２記載の製造法。
【請求項５５】
ｍａｎＢをコードする遺伝子、ｍａｎＣをコードする遺伝子、ｇｌｋをコードする遺伝子、ｐｇｍをコードする遺伝子およびｐｆｋＢをコードする遺伝子が、エシェリヒア・コリ由来の遺伝子であることを特徴とする請求項５３または５４記載の製造法。
【請求項５６】
糖とＮＴＰから糖ヌクレオチドを生産する能力を有するエシェリヒア属またはコリネバクテリウム属に属する微生物が、ｍａｎＢ、ｍａｎＣ、ｇｌｋ、ＧＤＰ-４,６-マンノースデヒドラターゼ（以下、ｇｍｄと略す）およびＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシマンノース エピメラーゼ／レダクターゼ（以下、ｗｃａＧと略す）から選ばれる１つ以上の酵素の活性の強い微生物であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造法。
【請求項５７】
糖ヌクレオチドが、グアノシン二リン酸フコースである請求項５６記載の製造法。
【請求項５８】
ｍａｎＢ、ｍａｎＣ、ｇｌｋ、ｇｍｄおよびｗｃａＧから選ばれる１つ以上の酵素の活性の強い微生物が、ｐｇｍおよびｐｆｋＢの活性の強い微生物である請求項５６記載の製造法。
【請求項５９】
ｍａｎＢ、ｍａｎＣ、ｇｌｋ、ｇｍｄおよびｗｃａＧから選ばれる１つ以上の酵素の活性の強い微生物が、ｍａｎＢをコードする遺伝子、ｍａｎＣをコードする遺伝子、ｇｌｋをコードする遺伝子、ｇｍｄをコードする遺伝子およびｗｃａＧをコードする遺伝子から選ばれる１種類以上の遺伝子を含むＤＮＡ断片とベクターとの組換え体ＤＮＡを保有する１種類以上の微生物から構成されることを特徴とする請求項５６記載の製造法。
【請求項６０】
ｐｇｍおよびｐｆｋＢの活性の強い微生物が、ｍａｎＢをコードする遺伝子、ｍａｎＣをコードする遺伝子、ｇｌｋをコードする遺伝子、ｇｍｄをコードする遺伝子およびｗｃａＧをコードする遺伝子から選ばれる１種類以上の遺伝子を含むＤＮＡ断片とベクターとの組換え体ＤＮＡ、並びにｐｇｍをコードする遺伝子およびｐｆｋＢをコードする遺伝子から選ばれる１種類以上の遺伝子を含むＤＮＡ断片とベクターとの組換え体ＤＮＡを保有する１種類以上の微生物から構成されることを特徴とする請求項５８記載の製造法。
【請求項６１】
ｍａｎＢをコードする遺伝子、ｍａｎＣをコードする遺伝子、ｇｌｋをコードする遺伝子、ｇｍｄをコードする遺伝子、ｗｃａＧをコードする遺伝子、ｐｇｍをコードする遺伝子およびｐｆｋＢをコードする遺伝子が、エシェリヒア・コリ由来の遺伝子であることを特徴とする請求項５９または６０記載の製造法。
【請求項６２】
糖とＮＴＰから糖ヌクレオチドを生産する能力を有するエシェリヒア属またはコリネバクテリウム属に属する微生物が、ＧｌｃＮＡｃ ２−エピメラーゼ、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼ（以下、ｎｅｕＡと略す）、ＮｅｕＡｃアルドラーゼ（以下、ｎａｎＡと略す）、ＮｅｕＡｃシンセターゼ（以下、ｎｅｕＢと略す）およびＣＴＰシンセターゼ（以下、ｐｙｒＧと略す）から選ばれる１つ以上の酵素の活性の強い微生物であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造法。
【請求項６３】
糖ヌクレオチドが、シチジン一リン酸−Ｎ−アセチルノイラミン酸である請求項６２記載の製造法。
【請求項６４】
ＧｌｃＮＡｃ ２−エピメラーゼ、ｎｅｕＡ、ｎａｎＡ、ｎｅｕＢおよびｐｙｒＧから選ばれる１つ以上の酵素の活性の強い微生物が、ＧｌｃＮＡｃ ２−エピメラーゼをコードする遺伝子、ｎｅｕＡをコードする遺伝子、ｎａｎＡをコードする遺伝子、ｎｅｕＢをコードする遺伝子およびｐｙｒＧをコードする遺伝子から選ばれる１種類以上の遺伝子を含むＤＮＡ断片とベクターとの組換え体ＤＮＡを保有する１種類以上の微生物から構成されることを特徴とする請求項６２記載の製造法。
【請求項６５】
ｎｅｕＡをコードする遺伝子、ｎａｎＡをコードする遺伝子、ｎｅｕＢをコードする遺伝子およびｐｙｒＧをコードする遺伝子が、エシェリヒア・コリ由来の遺伝子であることを特徴とする請求項６４記載の製造法。
【請求項６６】
糖転移酵素を発現する微生物が、エシェリヒア・コリ、サッカロマイセス・セレビシエまたはコリネバクテリウム・アンモニアゲネスであることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造法。
【請求項６７】
糖転移酵素が、グルコシルトランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、グルクロノシルトランスフェラーゼ、マンノシルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼおよびフコシルトランスフェラーゼから選ばれるトランスフェラーゼであることを特徴とする請求項１〜３および６６のいずれか１項に記載の製造法。
【請求項６８】
請求項１〜３記載の糖転移酵素を発現する微生物、あるいは請求項６６記載のエシェリヒア・コリ、サッカロマイセス・セレビシエまたはコリネバクテリウム・アンモニアゲネスが、グルコシルトランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、グルクロノシルトランスフェラーゼ、マンノシルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼおよびフコシルトランスフェラーゼから選ばれるトランスフェラーゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片とベクターとの組換え体ＤＮＡを保有する微生物であることを特徴とする請求項１〜３および６６のいずれか１項に記載の製造法。
【請求項６９】
グルコシルトランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、グルクロノシルトランスフェラーゼ、マンノシルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼおよびフコシルトランスフェラーゼから選ばれるトランスフェラーゼをコードする遺伝子が、微生物由来であることを特徴とする請求項６８記載の製造法。
【請求項７０】
動物細胞が、ＣＯＳ−７細胞またはナマルバＫＪＭ−１細胞であり、昆虫細胞がＳｆ９細胞であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造法。
【請求項７１】
請求項１〜３記載の動物細胞または昆虫細胞、あるいは請求項７０記載のＣＯＳ−７細胞、ナマルバＫＪＭ−１細胞またはＳｆ９細胞が、グルコシルトランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、グルクロノシルトランスフェラーゼ、マンノシルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼおよびフコシルトランスフェラーゼから選ばれるトランスフェラーゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片とベクターとの組換え体ＤＮＡを保有する動物細胞あるいは昆虫細胞であることを特徴とする請求項１〜３および７０のいずれか１項に記載の製造法。
【請求項７２】
グルコシルトランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、グルクロノシルトランスフェラーゼ、マンノシルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼおよびフコシルトランスフェラーゼから選ばれるトランスフェラーゼをコードする遺伝子が、動物細胞由来であることを特徴とする請求項７１記載の製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、細菌・ウィルス等の感染防御、心血管障害への適応および免疫治療等に有用な複合糖質の製造方法および該複合糖質の合成基質として重要である糖ヌクレオチドの製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
糖ヌクレオチドの製造方法として、１）化学合成法（非特許文献１〜４参照）、２）酵素を用いた製造方法（非特許文献５〜７および特許文献１〜３参照）、３）酵母等の微生物菌体を用いる方法（特許文献４〜９参照）、４）耐塩性酵母の微生物菌体からの抽出法（特許文献１０参照）等が知られている。
【０００３】
１）の方法においては、高価なヌクレオシド−５’−一リン酸（以下、ＮＭＰと略す）のモルフォリデート誘導体や糖リン酸等が必要であり、２）の方法においては、ヌクレオシド−５’−二リン酸（以下、ＮＤＰと略す）、ヌクレオシド−５’−三リン酸（以下、ＮＴＰと略す）、ホスホエノールピルビン酸、糖リン酸等の高価な原料やピルビン酸キナーゼ等多数の酵素が必要であり、３）の方法においては菌体の乾燥処理等が必要である。４）の方法を含め、上記いずれの方法においても、原料として高価なヌクレオチドや糖リン酸等が用いられていたり、操作的に大量生産が困難であるため、今日に至るまで、糖ヌクレオチドの工業的規模での製造法は確立されていない。
複合糖質の製造法としては、１）化学合成法（非特許文献８〜１０参照）、２）加水分解酵素（非特許文献１１および１２参照）を用いる方法、および３）糖転移酵素（特許文献１１〜１６参照）を利用した方法が知られている。
【０００４】
１）の方法では立体選択的合成のためには保護基の導入が必須であり、２）の方法では収率・選択性が十分でなく、３）の方法においてはＮＤＰ、ＮＴＰ、ホスホエノールピルビン酸、糖リン酸、あるいは糖ヌクレオチド等の高価な原料やピルビン酸キナーゼ等多数の酵素が必要であり、いずれの方法においても複合糖質の安価な工業的製造方法は確立されていない。また、安価なヌクレオチドの前駆物質および糖および複合糖質前駆物質のみを原料として、直接複合糖質を工業的に製造する方法は知られていない。
【０００５】
コリネバクテリウム属に属する微生物において、オロット酸を添加することによりＵＭＰが生産されるとの報告がある（非特許文献１３参照）。また、オロット酸を原料にしてシチジン二リン酸コリンを生成する方法も知られている（特許文献１７参照）。
【０００６】
【特許文献１】
特表平7-508413号公報
【０００７】
【特許文献２】
特表平7-500248号公報
【０００８】
【特許文献３】
国際公開第96/27670号パンフレット
【０００９】
【特許文献４】
特公昭45-2073号公報
【００１０】
【特許文献５】
特公昭46-40756号公報
【００１１】
【特許文献６】
特公昭47-1837号公報
【００１２】
【特許文献７】
特公昭47-26703号公報
【００１３】
【特許文献８】
特公昭49-8278号公報
【００１４】
【特許文献９】
特開平2-268692号公報
【００１５】
【特許文献１０】
特開平8-23993号公報
【００１６】
【特許文献１１】
特開平7-79792号公報
【００１７】
【特許文献１２】
特表平7-500248号公報
【００１８】
【特許文献１３】
特公平5-82200号公報
【００１９】
【特許文献１４】
国際公開第94/25614
【００２０】
【特許文献１５】
特表平9-503905号公報
【００２１】
【特許文献１６】
米国特許第5,583,042号明細書
【００２２】
【特許文献１７】
特開平5-276974号公報
【００２３】
【非特許文献１】
Adv. Carbohydr. Chem. Biochem., 28, 307 (1973)
【００２４】
【非特許文献２】
Bull. Chem. Soc. Japan, 46, 3275 (1973)
【００２５】
【非特許文献３】
J. Org. Chem., 57, 146 (1992)
【００２６】
【非特許文献４】
Carbohydr. Res., 242, 69 (1993)
【００２７】
【非特許文献５】
J. Org. Chem., 55, 1834 (1990)
【００２８】
【非特許文献６】
J. Org. Chem., 57, 152 (1992)
【００２９】
【非特許文献７】
J. Am. Chem. Soc., 110, 7159 (1988)
【００３０】
【非特許文献８】
Methods in Enzymol., 247, 193 (1994)
【００３１】
【非特許文献９】
Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 21, 155 (1982)
【００３２】
【非特許文献１０】
Carbohydr. Res., 211, c1 (1991)
【００３３】
【非特許文献１１】
Anal. Biochem., 202, 215 (1992)
【００３４】
【非特許文献１２】
Trends Biotechnol., 6, 256 (1988)
【００３５】
【非特許文献１３】
Amino Acid Nucleic Acid, 23, 107 (1971)
【００３６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、細菌・ウィルス等の感染防御、心血管障害への適応および免疫治療等に有用な複合糖質の製造方法および該複合糖質の合成基質として重要である糖ヌクレオチドの安価で効率的な製造方法を提供することにある。
【００３７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、微生物を用いて、ヌクレオチドの前駆物質を原料とした複合糖質および糖ヌクレオチドの生産について鋭意検討を行った結果、ヌクレオチドの前駆物質および糖のみを原料として糖ヌクレオチドが効率的に生産できること、糖ヌクレオチドの生成に関与する遺伝子の発現を強化することにより、その生産性が向上することを見いだし、さらに、該糖ヌクレオチドを生産可能な微生物、および、糖ヌクレオチドと複合糖質前駆物質から複合糖質を生産する能力を有する微生物あるいは動物細胞あるいは昆虫細胞を利用し、ヌクレオチドの前駆物質および糖および複合糖質前駆物質のみを原料として効率的に複合糖質を生産できることを見いだし本発明を完成するに至った。
【００３８】
本発明は、ａ）ヌクレオチドの前駆物質からＮＴＰを生産する能力を有する微生物の培養液または該培養液の処理物、ｂ）糖とＮＴＰから糖ヌクレオチドを生産する能力を有する微生物の培養液または該培養液の処理物、およびｃ）糖ヌクレオチドと複合糖質前駆物質から複合糖質を生産する能力を有する微生物、動物細胞あるいは昆虫細胞の培養液または該培養液の処理物、を酵素源として用い、これら酵素源、ヌクレオチドの前駆物質、糖および複合糖質前駆物質を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中に複合糖質を生成蓄積させ、該水性媒体中から複合糖質を採取することを特徴とする複合糖質の製造法、ａ）ヌクレオチドの前駆物質からＮＴＰを生産する能力を有する微生物の培養液または該培養液の処理物、およびｂ）糖とＮＴＰから糖ヌクレオチドを生産する能力を有する微生物の培養液または該培養液の処理物、を酵素源として用い、これら酵素源、ヌクレオチドの前駆物質および糖を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中に糖ヌクレオチドを生成蓄積させ、該水性媒体中から糖ヌクレオチドを採取することを特徴とする糖ヌクレオチドの製造法、および糖ヌクレオチドと複合糖質前駆物質から複合糖質を生産する能力を有する微生物、動物細胞あるいは昆虫細胞の培養液または該培養液の処理物を酵素源として用い、該酵素源、複合糖質前駆物質および上記に記載の糖ヌクレオチドの製造法により得られた糖ヌクレオチドを水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中に複合糖質を生成蓄積させ、該水性媒体中から複合糖質を採取することを特徴とする複合糖質の製造法を提供する。更に、ガラクトキナーゼ活性の強い微生物の培養液または該培養液の処理物を酵素源として用い、該酵素源およびＮ−アセチルグルコサミンを水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にＮ−アセチルグルコサミン−１−リン酸を生成蓄積させ、該水性媒体中からＮ−アセチルグルコサミン−１−リン酸を採取することを特徴とするＮ−アセチルグルコサミン−１−リン酸の製造法を提供する。
【００３９】
表１および表２に本発明に用いる略号および該略号の説明を記す。
【００４０】
【表１】
0003739352.tif 000002
【００４１】
【表２】
0003739352.tif 000003
【００４２】
本発明によれば、１）ＮＴＰや糖リン酸等の高価な原料を必要とせず、オロット酸等の安価なヌクレオチドの前駆物質および糖のみを原料とする、２）ＮＭＰあるいはＮＤＰからＮＴＰへの転換において高価なホスホエノールピルビン酸とピルビン酸キナーゼの添加を必要としない、さらに、３）酵素の単離操作を必要としない等の特徴を有する糖ヌクレオチドの新規な製造法および該糖ヌクレオチド製造法を利用した新規な複合糖質の製造法を提供できる。
【００４３】
本発明の製造法で製造される糖ヌクレオチドとしては、ヌクレオシド−５’−二リン酸残基の末端リン酸基と糖残基の還元基とがエステル結合をした一般構造を有する化合物をあげることができ、更に、ヌクレチド残基がシチジン−５’−一リン酸のもの、糖残基がポリオールのものも本発明により製造される糖ヌクレオチドに含まれる。
【００４４】
本発明の製造法で製造される複合糖質としては、単糖、オリゴサッカライド、担体等に結合した単糖またはオリゴサッカライド、蛋白質、ペプチド、脂質、糖蛋白質、糖脂質、グリコペプチドあるいはステロイド化合物等に糖質が結合した化合物をあげることができる。
以下に本発明を詳細に説明する。
【００４５】
１）  本発明で用いられるヌクレオチドの前駆物質からＮＴＰを生産する能力を有する微生物としては、ヌクレオチドの前駆物質からＮＴＰを生産する能力を有する微生物であればいずれも用いることができ、例えば、エシェリヒア属またはコリネバクテリウム属に属する微生物等をあげることができる。
エシェリヒア属に属する微生物としてはエシェリヒア・コリ等をあげることができる。
【００４６】
コリネバクテリウム属に属する微生物としてはコリネバクテリウム・アンモニアゲネス等をあげることができる。
２）本発明で用いられる糖とＮＴＰから糖ヌクレオチドを生産する能力を有する微生物としては、目的とする糖ヌクレオチドを生成する活性を有する生物であればいずれでも用いることができ、例えば、
２）−▲１▼  ＵＤＰ−Ｇｌｃの生産に関しては、下記、式１に示した（１）から（４）の酵素活性の強い微生物を用いることが好ましい。
【００４７】
具体的には、エシェリヒア属に属する微生物およびコリネバクテリウム属に属する微生物をあげることができ、好ましい具体例としては、エシェリヒア・コリまたはコリネバクテリウム・アンモニアゲネスをあげることができる。
また、（１）、（２）、（３）および（４）から選ばれる一つ以上の酵素の活性を遺伝子組換え技術により増強した形質転換株を用いることもできる。該形質転換体の具体例として、エシェリヒア・コリ由来のｇａｌＵおよびｐｐａ遺伝子を含む組換え体ＤＮＡ（ｐＮＴ１２）を保有するエシェリヒア・コリKY8415（FERM BP-408）株等をあげることができる。
【００４８】
【化１】
0003739352.tif 000004
【００４９】
(1):ヘキソキナーゼ(EC 2.7.1.1)あるいはグルコキナーゼ(EC 2.7.1.2)
(2):ホスホグルコムターゼ(EC 2.7.5.1)
(3):グルコース−１−リン酸ウリジルトランスフェラーゼ(EC 2.7.7.9)
(4):（イノーガニック）ピロホスファターゼ(EC 3.6.1.1)
２）−▲２▼  ＵＤＰ−Ｇａｌの生産に関しては、下記、式２に示した（５）および（６）の酵素活性の強い微生物を、また、好ましくは、式１に示した（１）から（４）の酵素活性の強い性質をもあわせ持つような微生物を用いることが好ましい。
【００５０】
具体的には、エシェリヒア属に属する微生物およびコリネバクテリウム属に属する微生物をあげることができ、好ましい具体例としては、エシェリヒア・コリおよびコリネバクテリウム・アンモニアゲネスをあげることができる。
また、（５）および（６）から選ばれる一つ以上の酵素の活性を、あるいは、（５）および（６）から選ばれる一つ以上の酵素と（１）から（４）から選ばれる一つ以上の酵素の活性を、遺伝子組換え技術により増強した形質転換株を用いることもできる。該形質転換体の具体例として、エシェリヒア・コリ由来のｇａｌＴおよびｇａｌＫ遺伝子を含む組換え体ＤＮＡ（ｐＮＴ２５）を保有するエシェリヒア・コリNM522株およびエシェリヒア・コリ由来のｇａｌＴおよびｇａｌＫ遺伝子を含む組換え体ＤＮＡ（ｐＴＫ７）を保有するコリネバクテリウム・アンモニアゲネスATCC21170をあげることができる。
【００５１】
【化２】
0003739352.tif 000005
【００５２】
(5):ガラクトキナーゼ(EC 2.7.1.6)
(6):ガラクトース-1-リン酸ウリジルトランスフェラーゼ(EC 2.7.7.12)
２）−▲３▼  ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃの生産に関しては、下記、式３に示した（７）から（１２）および式１に示した（４）の酵素活性の強い微生物、あるいは式３に示した（１３）および（１０）の酵素活性の強い微生物を用いることが好ましい。
【００５３】
具体的には、エシェリヒア属およびコリネバクテリウム属に属する微生物をあげることができ、好ましい具体例としては、エシェリヒア・コリおよびコリネバクテリウム・アンモニアゲネスをあげることができる。
また、（４）、（７）、（８）、（９）、（１０）、および（１３）から選ばれる一つ以上の酵素の活性を遺伝子組換え技術により増強した形質転換株を用いることもできる。該形質転換体の具体例として、エシェリヒア・コリ由来のｇｌｍＭ遺伝子を含む組換え体ＤＮＡ（ｐＮＴ４４）を保有するエシェリヒア・コリNM522株、エシェリヒア・コリ由来のｇｌｍＵおよびｐｐａ遺伝子を含む組換え体ＤＮＡ（ｐＮＴ１４）を保有するエシェリヒア・コリKY8415株、エシェリヒア・コリ由来のｇｌｋ遺伝子を含む組換え体ＤＮＡ（ｐＮＴ４６）を保有するエシェリヒア・コリNM522株、エシェリヒア・コリ由来のｇａｌＫ遺伝子を含む組換え体ＤＮＡ（ｐＮＴ５４）を保有するエシェリヒア・コリNM522株等をあげることができる。
【００５４】
遺伝子組換えによる（８）のホスホグルコサミンムターゼ活性の発現および増強には、Ｇｌｃ−１，６−Ｐ２の添加が必要とされるが[J. Biol. Chem., 271, 32 (1996)]、（１１）および（１２）の酵素の活性を遺伝子組換え技術により増強した形質転換株を用いることにより、Ｇｌｃ−１，６−Ｐ２を添加することなく、Ｇ−６−ＰおよびＦ−６−ＰからＧｌｃ−１，６−Ｐ２を供給することが可能である。
【００５５】
このような形質転換体の具体例として、エシェリヒア・コリ由来のｐｇｍ遺伝子を含む組換え体ＤＮＡ（ｐＮＴ２４）を保有するエシェリヒア・コリNM522株、エシェリヒア・コリ由来のｐｆｋＢ遺伝子を含む組換え体ＤＮＡ（ｐＮＴ４７）を保有するエシェリヒア・コリNM522株、エシェリヒア・コリ由来のｐｇｍおよびｐｆｋＢ遺伝子を含む組換え体ＤＮＡ（ｐＮＴ５５）を保有するエシェリヒア・コリNM522株等をあげることができる。
【００５６】
（１１）および（１２）の酵素活性を用いてＧ−６−ＰおよびＦ−６−ＰからＧｌｃ−１，６−Ｐ２を供給することにより、（８）のホスホグルコサミンムターゼ活性の発現を増強する方法は本発明で初めて開示された方法である。
（１３）のガラクトキナーゼ(EC 2.7.1.6)を用いＧｌｃＮＡｃからＧｌｃＮＡｃ−１−Ｐを製造する方法は本発明で初めて開示された製造法である。該製造法を用いてＧｌｃＮＡｃ−１−Ｐを製造することが可能である。即ち、ガラクトキナーゼ活性の強い微生物、例えば、ｇａｌＫをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片とベクターとの組換え体ＤＮＡを保有する微生物の培養液または該培養液の処理物を酵素源として用い、該酵素源およびＧｌｃＮＡｃを水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にＧｌｃＮＡｃ−１−Ｐを生成蓄積させ、該水性媒体中からＧｌｃＮＡｃ−１−Ｐを採取することによりＧｌｃＮＡｃ−１−Ｐを製造することができる。
【００５７】
水性媒体より、ＧｌｃＮＡｃ−１−Ｐの採取は、活性炭やイオン交換樹脂等を用いる通常の方法によって行うことができる。
【００５８】
【化３】
0003739352.tif 000006
【００５９】
(7):ヘキソキナーゼ(EC 2.7.1.1)あるいはグルコキナーゼ(EC 2.7.1.2)
(8):ホスホグルコサミンムターゼ
(9):グルコサミン-1-リン酸アセチルトランスフェラーゼ
(10):N-アセチルグルコサミン-1-リン酸ウリジルトランスフェラーゼ(EC 2.7.7.23)
(11):ホスホフルクトキナーゼ(EC 2.7.1.11)
(12):ホスホグルコムターゼ(EC 2.7.5.1)
(13):ガラクトキナーゼ(EC 2.7.1.6)
２）−▲４▼  ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃの生産に関しては、式３に示した（７）から（１２）、式４に示した（１４）および式１に示した（４）の酵素活性の強い微生物、あるいは式３に示した（１０）、（１３）および式４に示した（１４）の酵素活性の強い微生物を用いることが好ましい。
【００６０】
具体的には、エシェリヒア属およびコリネバクテリウム属に属する微生物をあげることができ、好ましい具体例としては、エシェリヒア・コリおよびコリネバクテリウム・アンモニアゲネスをあげることができる。
また、（７）から（１４）および（４）から選ばれる一つ以上の酵素の活性を遺伝子組換え技術により増強した形質転換株を用いることもできる。
【００６１】
【化４】
0003739352.tif 000007
【００６２】
(14):ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ ４−エピメラーゼ(EC 5.1.3.7)
２）−▲５▼  ＵＤＰ−ＧｌｃＵＡの生産に関しては、式１に示した（１）から（４）および式５に示した（１５）の酵素活性の強い微生物を用いることが好ましい。
【００６３】
具体的には、エシェリヒア属およびコリネバクテリウム属に属する微生物をあげることができ、好ましい具体例としては、エシェリヒア・コリおよびコリネバクテリウム・アンモニアゲネスをあげることができる。
また、（１）、（２）、（３）、（４）および（１５）から選ばれる一つ以上の酵素の活性を遺伝子組換え技術により増強した形質転換株を用いることもできる。
【００６４】
【化５】
0003739352.tif 000008
【００６５】
(15):ＵＤＰ−Ｇｌｃデヒドロゲナーゼ(EC 1.1.1.22)
２）−▲６▼  ＧＤＰ−Ｍａｎの生産に関しては、下記、式６に示した（１６）から（１８）および式３に示した（１１）および（１２）の酵素活性の強い微生物を用いることが好ましい。
【００６６】
具体的には、エシェリヒア属またはコリネバクテリウム属に属する微生物をあげることができ、好ましい具体例としては、エシェリヒア・コリまたはコリネバクテリウム・アンモニアゲネスをあげることができる。
また、（１６）、（１７）および（１８）から選ばれる一つ以上の酵素の活性を遺伝子組換え技術により増強した形質転換株を用いることもできる。該形質転換体の具体例として、エシェリヒア・コリ由来のｍａｎＢおよびｍａｎＣ遺伝子を含む組換え体ＤＮＡ（ｐＮＫ７）を保有するエシェリヒア・コリNM522株、エシェリヒア・コリ由来のｇｌｋ遺伝子を含む組換え体ＤＮＡ（ｐＮＴ４６）を保有するエシェリヒア・コリNM522株等をあげることができる。
【００６７】
遺伝子組換え技術による（１７）のホスホマンノムターゼ活性の発現および増強には、Ｇｌｃ−１，６−Ｐ２の添加が必要とされるが、（１１）および（１２）の酵素の活性を遺伝子組換え技術により増強した形質転換株を用いることにより、Ｇｌｃ−１，６−Ｐ２を添加することなく、Ｇ−６−ＰおよびＦ−６−ＰからＧｌｃ−１，６−Ｐ２を供給することが可能である。このような形質転換体の具体例として、エシェリヒア・コリ由来のｐｇｍ遺伝子を含む組換え体ＤＮＡ（ｐＮＴ２４）を保有するエシェリヒア・コリNM522株、エシェリヒア・コリ由来のｐｆｋＢ遺伝子を含む組換え体ＤＮＡ（ｐＮＴ４７）を保有するエシェリヒア・コリNM522株、エシェリヒア・コリ由来のｐｇｍおよびｐｆｋＢ遺伝子を含む組換え体ＤＮＡ（ｐＮＴ５５）を保有するエシェリヒア・コリNM522株等をあげることができる。
【００６８】
（１１）および（１２）の酵素活性を用いてＧ−６−ＰおよびＦ−６−ＰからＧｌｃ−１，６−Ｐ２を供給することにより、（１７）のホスホマンノムターゼ活性の発現を増強する方法は本発明で初めて開示された方法である。
【００６９】
【化６】
0003739352.tif 000009
【００７０】
(16):ヘキソキナーゼ(EC 2.7.1.1)あるいはグルコキナーゼ(EC 2.7.1.2)
(17):ホスホマンノムターゼ(EC 2.7.5.7)
(18):マンノース-1-リン酸グアニルトランスフェラーゼ(EC 2.7.7.13)
２）−▲７▼  ＧＤＰ−Ｆｕｃの生産に関しては、下記、式７に示した（１９）および（２０）および式６に示した（１６）から（１８）および式３に示した（１１）および（１２）の酵素活性の強い微生物を用いることが好ましい。
【００７１】
具体的には、エシェリヒア属またはコリネバクテリウム属に属する微生物をあげることができ、好ましい具体例としては、エシェリヒア・コリまたはコリネバクテリウム・アンモニアゲネスをあげることができる。
また、（１６）、（１７）、（１８）、（１９）および（２０）から選ばれる一つ以上の酵素の活性を遺伝子組換え技術により増強した形質転換株を用いることもできる。該形質転換体の具体例として、エシェリヒア・コリ由来のｍａｎＢおよびｍａｎＣ遺伝子を含む組換え体ＤＮＡ（ｐＮＫ７）を保有するエシェリヒア・コリNM522株、エシェリヒア・コリ由来のｇｍｄおよびｗｃａＧ遺伝子を含む組換え体ＤＮＡ（ｐＮＫ８）を保有するエシェリヒア・コリNM522株、エシェリヒア・コリ由来のｇｌｋ遺伝子を含む組換え体ＤＮＡ（ｐＮＴ４６）を保有するエシェリヒア・コリNM522株等をあげることができる。
【００７２】
遺伝子組換え技術による（１７）のホスホマンノムターゼ活性の発現および増強には、Ｇｌｃ−１，６−Ｐ２の添加が必要とされるが、（１１）および（１２）の酵素の活性を遺伝子組換え技術により増強した形質転換株を用いることにより、Ｇｌｃ−１，６−Ｐ２を添加することなく、Ｇ−６−ＰおよびＦ−６−ＰからＧｌｃ−１，６−Ｐ２を供給することが可能である。
【００７３】
このような形質転換体の具体例として、エシェリヒア・コリ由来のｐｇｍ遺伝子を含む組換え体ＤＮＡ（ｐＮＴ２４）を保有するエシェリヒア・コリNM522株、エシェリヒア・コリ由来のｐｆｋＢ遺伝子を含む組換え体ＤＮＡ（ｐＮＴ４７）を保有するエシェリヒア・コリNM522株、エシェリヒア・コリ由来のｐｇｍおよびｐｆｋＢ遺伝子を含む組換え体ＤＮＡ（ｐＮＴ５５）を保有するエシェリヒア・コリNM522株等をあげることができる。
【００７４】
【化７】
0003739352.tif 000010
【００７５】
(19):GDP-Man-4,6-デヒドラターゼ(EC4.2.1.47)
(20):GDP-4-keto-6-deoxymannnoseエピメラーゼ／レダクターゼ
２）−▲８▼  ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃの生産に関しては、下記、式８に示した（２１）、（２２）または（２３）、（２４）および（２５）の酵素活性の強い微生物を用いることが好ましい。
【００７６】
具体的には、エシェリヒア属またはコリネバクテリウム属に属する微生物をあげることができ、好ましい具体例としては、エシェリヒア・コリまたはコリネバクテリウム・アンモニアゲネスをあげることができる。
また、（２１）、（２２）、（２３）、（２４）および（２５）から選ばれる一つ以上の酵素の活性を遺伝子組換え技術により増強した形質転換株を用いることもできる。該形質転換体の具体例として、エシェリヒア・コリ由来のｎａｎＡ遺伝子を含む組換え体ＤＮＡ（ｐＮＡＬ１）を保有するエシェリヒア・コリC600株［Appl. Environ. Microbiol., 51, 562 (1986)］、エシェリヒア・コリ由来のｎｅｕＡ遺伝子を含む組換え体ＤＮＡ（ｐＴＡ１４）を保有するエシェリヒア・コリNM522株等をあげることができる。
【００７７】
【化８】
0003739352.tif 000011
【００７８】
(21):GlcNAc 2-エピメラーゼ(EC 5.1.3.8)
(22):NeuAcアルドラーゼ(EC 4.1.3.3)
(23):NeuAcシンセターゼ(EC 4.1.3.19)
(24):CMP-NeuAcシンセターゼ(EC 2.7.7.43)
(25):CTPシンセターゼ(EC 6.3.4.2)
微生物が１）に記載の微生物の性質および２）に記載の微生物の性質を同時に有する場合には、該微生物を利用し、ヌクレオチドの前駆物質と糖より糖ヌクレオチドを生産することが可能である。
【００７９】
微生物が１）に記載の微生物の性質および２）−▲１▼に記載の性質を同時に有する場合には、該微生物を利用し、オロット酸等のＵＴＰ前駆物質とグルコースよりＵＤＰ−Ｇｌｃを、１）に記載の微生物の性質および２）−▲２▼に記載の微生物の性質を同時に有する場合には、該微生物を利用し、オロット酸等のＵＴＰ前駆物質とガラクトースよりＵＤＰ−Ｇａｌを、１）に記載の微生物の性質および２）−▲３▼に記載の性質を同時に有する場合には該微生物を利用し、オロット酸等のＵＴＰ前駆物質とグルコサミンまたはＮ−アセチルグルコサミンよりＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを、１）に記載の微生物の性質および２）−▲４▼に記載の性質を同時に有する場合には該微生物を利用し、オロット酸等のＵＴＰ前駆物質とグルコサミンまたはＮ−アセチルグルコサミンよりＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃを、１）に記載の微生物の性質および２）−▲５▼に記載の性質を同時に有する場合には該微生物を利用し、オロット酸等のＵＴＰ前駆物質とグルコースよりＵＤＰ−ＧｌｃＵＡを、１）に記載の微生物の性質および２）−▲６▼に記載の性質を同時に有する場合には、該微生物を利用し、ＧＭＰ等のＧＴＰ前駆物質とマンノースよりＧＤＰ−Ｍａｎを、１）に記載の微生物の性質および２）−▲７▼に記載の性質を同時に有する場合には、該微生物を利用し、ＧＭＰ等のＧＴＰ前駆物質とマンノースよりＧＤＰ−Ｆｕｃを、１）に記載の微生物の性質および２）−▲８▼に記載の性質を同時に有する場合には、該微生物を利用し、オロット酸等のＣＴＰ前駆物質とＮ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルマンノサミンよりＣＭＰ−ＮｅｕＡｃを生産することが可能である。
【００８０】
このような微生物の具体例としては、エシェリヒア・コリ由来のｇａｌＴおよびｇａｌＫ遺伝子を発現するコリネバクテリウム・アンモニアゲネスをあげることができる。
また、上記の菌株とは異なり、１菌株中に糖ヌクレオチドの製造に必要な活性の一部しか有していない微生物の場合、それぞれの活性を有する微生物を適宜組み合わせ、糖ヌクレオチドの製造を行うことができる。
【００８１】
１）に記載の性質を有する微生物も１種類である必要はなく、２種類以上で１）に記載する性質を構成する場合にも１）に記載の性質を有する微生物として利用できる。具体的には、エシェリヒア・コリ由来のｐｙｒＧ遺伝子を発現するエシェリヒア・コリとコリネバクテリウム・アンモニアゲネスとの組み合わせを例示することができる（特開平5-276974）。
【００８２】
同様に２）に記載の性質を有する微生物も１種類である必要はなく、２種類以上で構成することができる。該微生物群を適宜組み合わせることにより、目的とする糖ヌクレオチドを生産することができる。
例えば、１）に記載の性質を有する微生物および２）−▲１▼に記載の性質を有する一種類以上の微生物を用い、オロット酸等のＵＴＰ前駆物質とグルコースよりＵＤＰ−Ｇｌｃを、１）に記載の性質を有する微生物および２）−▲２▼に記載の性質を有する一種類以上の微生物を用い、オロット酸等のＵＴＰ前駆物質とガラクトースよりＵＤＰ−Ｇａｌを、１）に記載の性質を有する微生物および２）−▲３▼に記載の性質を有する一種類以上の微生物を用い、オロット酸等のＵＴＰ前駆物質とグルコサミンまたはＮ−アセチルグルコサミンよりＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを、１）に記載の性質を有する微生物および２）−▲４▼に記載の性質を有する一種類以上の微生物を用い、オロット酸等のＵＴＰ前駆物質とグルコサミンまたはＮ−アセチルグルコサミンよりＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃを、１）に記載の性質を有する微生物および２）−▲５▼に記載の性質を有する一種類以上の微生物を用い、オロット酸等のＵＴＰ前駆物質とグルコースよりＵＤＰ−ＧｌｃＵＡを、１）に記載の性質を有する微生物および２）−▲６▼に記載の性質を有する一種類以上の微生物を用い、ＧＭＰ等のＧＴＰ前駆物質とマンノースよりＧＤＰ−Ｍａｎを、１）に記載の性質を有する微生物および２）−▲７▼に記載の性質を有する一種類以上の微生物を用い、ＧＭＰ等のＧＴＰ前駆物質とマンノースよりＧＤＰ−Ｆｕｃを、１）に記載の性質を有する微生物および２）−▲８▼に記載の性質を有する一種類以上の微生物を用い、オロット酸等のＣＴＰ前駆物質とＮ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルマンノサミンよりＣＭＰ−ＮｅｕＡｃを生産することが可能である。
【００８３】
上述のように、糖ヌクレオチドの製造において、遺伝子組換え微生物を利用することが可能であるが、該製造に関与する、表３に記載した遺伝子は、エシェリヒア・コリの染色体よりクローン化され、その全塩基配列が決定されている。
【００８４】
【表３】
0003739352.tif 000012
【００８５】
該遺伝子を含有するプラスミドを保有するエシェリヒア・コリからのプラスミドＤＮＡの単離精製、プラスミドＤＮＡの制限酵素による切断、切断したＤＮＡ断片の単離精製、ＤＮＡ断片の酵素的結合、組換え体ＤＮＡを用いたエシェリヒア・コリの形質転換等、遺伝子組換えに関する種々の操作は公知の方法［例えばJ. Sambrook らの成書；Molecular Cloning, A Laboratory Manual Second edition Cold Spring Harbor Laboratory (1989)］に準じて行うことができる。またポリメラーゼ・チェイン・リアクション（以下、ＰＣＲと略す）はパーキン・エルマー・シータス社製のサーマル・サイクラー等を用いて行うことができる。
【００８６】
糖ヌクレオチドの製造に関与する遺伝子を宿主中で発現させるためには、該遺伝子を含むＤＮＡ断片を、制限酵素類あるいはＰＣＲで、該遺伝子を含む適当な長さのＤＮＡ断片とした後に、発現ベクター中プロモーターの下流に挿入し、次いで上記ＤＮＡを挿入した発現ベクターを、発現ベクターに適合した宿主中に導入することにより達成できる。
【００８７】
宿主としては、目的とする遺伝子を発現できるものは全て用いることができる。例えば、エシェリヒア属、セラチア属、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、シュードモナス属、バチルス属、等に属する微生物の他、サッカロマイセス属、キャンディダ属等に属する酵母等をあげることができる。
発現ベクターとしては、上記宿主に於いて自立複製可能ないしは染色体中への組込みが可能で、糖ヌクレオチドの製造に関与する遺伝子を転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。
【００８８】
上記の微生物を宿主として用いる場合は、糖ヌクレオチドの製造に関与する遺伝子の発現ベクターは微生物中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、糖ヌクレオチドの製造に関与する遺伝子、転写終結配列より構成されていることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
【００８９】
発現ベクターとしては、例えば、ｐＢＴｒｐ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２（いずれもベーリンガーマンハイム社製）、ｐＫＹＰ１０（特開昭58-110600）、ｐＫＹＰ２００［Agric. Biol. Chem., 48, 669 (1984)］、ｐＬＳＡ１［Agric. Biol. Chem., 53, 277 (1989)］、ｐＧＥＬ１［Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 82, 4306 (1985)］、pBluescriptＩＩ SK+（STRATAGENE社製）、ｐＴｒＳ３０［エシェリヒア・コリJM109/pTrS30（FERM BP-5407）より調製］およびｐＴｒＳ３２［エシェリヒア・コリJM109/pTrS32（FERM BP-5408）より調製］、ｐＵＣ１９［Gene, 33, 103 (1985)］、ｐＳＴＶ２８（宝酒造社製 ）、ｐＰＡ１（特開昭63-233798）、ｐＣＧ１１（特公平6-91827）等を例示することができる。
【００９０】
プロモーターとしては、上記の宿主中で発現できるものであればいかなるものでもよい。例えば、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ＰLプ ロモーター、ＰRプロモーター等の、エシェリヒア・コリやファージ等に由来するプロモーターをあげることができる。またｔｒｐプロモーターを２つ直列させたプロモーター、tacプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。
【００９１】
リボソーム結合配列としては、上記の宿主中で発現できるものであればいかなるものでもよいが、リボソーム結合配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６〜１８塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。
糖ヌクレオチドの製造に関与する遺伝子の発現には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、好適には構造遺伝子の下流に転写終結配列を配置することが望ましい。
【００９２】
宿主としては、組換え体ＤＮＡが発現でき、糖ヌクレオチドの生成反応に利用できるものならいかなる微生物も使用でき、具体的には、Escherichia coli XL1-Blue、Escherichia coli XL2-Blue、Escherichia coli DH1、Escherichia coli MC1000、Escherichia coli KY3276、Escherichia coli W1485、Escherichia coli JM109、Escherichia coli HB101、Escherichia coli No.49、Escherichia coli W3110、Escherichia coli NY49、Escherichia coli KY8415、Escherichia coli NM522、Bacillus subtilis、Bacillus brevis、Bacillus amyloliquefacines、Brevibacterium immariophilum ATCC14068、Brevibacterium saccharolyticum ATCC14066、Brevibacterium flavum ATCC14067、Brevibacterium lactofermentum ATCC13869、Corynebacterium ammoniagenes ATCC21170、Corynebacterium glutamicum ATCC13032、Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870、Microbacterium ammoniaphilum ATCC15354、Pseudomonas putida、Serratia marcescens等をあげることができる。
【００９３】
酵母菌株を宿主として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ＹＥｐ１３（ATCC37115）、ＹＥｐ２４（ATCC37051）、ＹＣｐ５０（ATCC37419）等を例示することができる。
プロモーターとしては、酵母菌株の宿主中で発現できるものであればいかなるものでもよい。例えば、ヘキソキナーゼ等の解糖系の遺伝子のプロモーター、ｇａｌ １プロモーター、ｇａｌ １０プロモーター、ヒートショック蛋白質プロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＣＵＰ １プロモーター等のプロモーターをあげることができる。
【００９４】
宿主としては、組換え体ＤＮＡが発現でき、糖ヌクレオチドの生成反応に利用できるものならいかなる酵母も使用でき、具体的には、Saccharomyces cerevisiae、Candida utilis、Candida parapsilosis、Candida krusei、Candida versatilis、Candida lipolytica、Candida zeylanoides、Candida guilliermondii、Candida albicans、Candida humicola、Pichia farinosa、Pichia ohmeri、Torulopsis candida、Torulopsis sphaerica、Torulopsis xylinus、Torulopsis famata、Torulopsis versatilis、Debaryomyces subglobosus、Debaryomyces cantarellii、Debaryomyces globosus、Debaryomyces hansenii、Debaryomyces japonicus、Zygosaccharomyces rouxii、Zygosaccharomyces bailii、Kluyveromyces lactis、Kluyveromyces marxianus、Hansenula anomala、Hansenula jadinii、Brettanomyces lambicus、Brettanomyces anomalus、Schizosaccharomyces pombe、Trichosporon pullulansおよびSchwanniomyces alluvius等をあげることができる。
【００９５】
本発明に用いる微生物の培養は、通常の培養方法に従って行うことができる。該微生物を培養する培地は、該微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、該微生物の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれでもよい。
炭素源としては、それぞれの微生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フルクトース、シュークロース、ラクトース、マルトース、マンニトール、ソルビトール、糖蜜、澱粉あるいは澱粉加水分解物等の炭水化物、ピルビン酸、乳酸、クエン酸、フマル酸等の各種有機酸、グルタミン酸、メチオニン、リジン等の各種アミノ酸、エタノール、プロパノール、グリセロール等のアルコール類が用いられる。また、白糠、キャッサバ、バガス、コーン・スティープ・リカー等の天然有機栄養源も用いることができる。
【００９６】
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の各種無機および有機アンモニウム塩類、グルタミン酸、グルタミン、メチオニン等のアミノ酸、ペプトン、NZアミン、コーン・スティープ・リカー、肉エキス、酵母エキス、麦芽エキス、カゼイン加水分解物、大豆粕、大豆粕加水分解物、フィッシュミールあるいはその消化物等が用いられる。
【００９７】
無機物としては、リン酸一カリウム、リン酸二カリウム、リン酸一ナトリウムリン酸二ナトリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、硫酸亜鉛、炭酸カルシウム等が用いられる。ビタミン、アミノ酸、核酸等を必要に応じて添加してもよい。
【００９８】
培養は、振盪培養または通気攪拌培養等の好気的条件下で行う。培養温度は１５〜４５℃がよく、培養時間は、通常５〜９６時間である。培養中ｐＨは、３．０〜９．０に保持する。ｐＨの調整は、無機あるいは有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行う。また培養中必要に応じてアンピシリン、カナマイシンまたはクロラムフェニコール等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００９９】
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、lacプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）等を、trpプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸（ＩＡＡ）等を培地に添加してもよい。
【０１００】
本発明の糖ヌクレオチドの製造において、２種以上の微生物を用いる場合、該微生物それぞれを個別に培養し、該培養液を利用して糖ヌクレオチドの製造に用いてもよいし、一つの培養器に同時に植菌し、混合培養した後、該培養液を利用して糖ヌクレオチドの製造に用いてもよい。また、いずれかの微生物の培養中もしくは培養終了時に残りの微生物を植菌し、培養した後、該培養液を利用して糖ヌクレオチドの製造に用いてもよい。更に、上述１）に記載の性質を有する微生物と２）に記載の性質を有する微生物とを別々に培養し、各々の培養液を利用して糖ヌクレオチドの製造に用いてもよい。
【０１０１】
該培養により得られた微生物の培養液および該培養液を種々処理した培養液の処理物を酵素源として用い、水性媒体中で糖ヌクレオチドの生成に用いることができる。
培養液の処理物としては、培養液の濃縮物、培養液の乾燥物、培養液を遠心分離して得られる培養上清、該培養上清の濃縮物、培養上清から得られる酵素標品、培養液を遠心分離して得られる細胞（菌体を含む）、該細胞の乾燥物、該細胞の凍結乾燥物、該細胞の界面活性剤処理物、該細胞の超音波処理物、該細胞の機械的摩砕処理物、該細胞の溶媒処理物、該細胞の酵素処理物、該細胞の蛋白質分画物、該細胞の固定化物あるいは該細胞より抽出して得られる酵素標品等を挙げることができる。
【０１０２】
糖ヌクレオチドの生成において用いられる酵素源の量は、湿菌体として、１〜５００ｇ／ｌであり、好ましくは５〜３００ｇ／ｌである。また、同時に２種以上の微生物を用いて水性媒体中で反応を行う場合には、水性媒体中の該微生物の全湿菌体量は２〜５００ｇ／ｌであり、好ましくは５〜４００ｇ／ｌである。
糖ヌクレオチドの生成において用いられる水性媒体としては、水、リン酸塩、炭酸塩、酢酸塩、ホウ酸塩、クエン酸塩、トリス等の緩衝液、メタノール、エタノール等のアルコール類、酢酸エチル等のエステル類、アセトン等のケトン類、アセトアミド等のアミド類等をあげることができる。また、酵素源として用いた微生物の培養液を水性媒体として用いることができる。
【０１０３】
糖ヌクレオチドの生成において用いられるヌクレオチドの前駆物質としては、オロット酸、ウラシル、オロチジン、ウリジン、シトシン、シチジン、アデニン、アデノシン、グアニン、グアノシン、ヒポキサンチン、イノシン、キサンチン、キサントシン、イノシン−５’−一リン酸、キサントシン−５’−一リン酸、グアノシン−５’−一リン酸、ウリジン−５’−一リン酸およびシチジン−５’−一リン酸等をあげることができ、好ましくはオロット酸およびグアノシン−５’−一リン酸をあげることができる。該ヌクレオチドの前駆物質は、純品および該前駆物質の塩並びに夾雑物が反応を阻害しない限り、微生物により発酵生産された該前駆物質含有培養液および該培養液の該前駆物質粗精製物を用いることができる。ヌクレオチドの前駆物質は０．１ｍＭ〜１．０Ｍ、好ましくは０．０１〜０．３Ｍの濃度で用いられる。
【０１０４】
糖ヌクレオチドの生成において用いられる糖としては、グルコース、フルクトース、ガラクトース、グルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、マンノース、フコース、Ｎ−アセチルマンノサミン、アセチルノイラミン酸およびこれらの誘導体等をあげることができる。該糖は、純品を用いてもよいし、これらを含有するもので、夾雑物が反応を阻害しないものであればいずれも用いることができる。糖は、反応開始時に一括して添加しても良いし、あるいは反応中分割して、あるいは連続して添加することもでき、０．１ｍＭ〜２．０Ｍの濃度で用いられる。
【０１０５】
糖ヌクレオチドの生成において、必要に応じて、ＡＴＰ再生に必要なエネルギー供与体、補酵素、リン酸イオン、マグネシウムイオン、フィチン酸等のキレート剤、界面活性剤および有機溶剤を添加してもよい。
エネルギー供与体としては、グルコース、フルクトース、シュークロース、ラクトース、マルトース、マンニトール、ソルビトール等の炭水化物、ピルビン酸、乳酸、酢酸等の有機酸、グリシン、アラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸等のアミノ酸、糖蜜、澱粉加水分解物等をあげることができ、１．０ｍＭ〜２．０Ｍの濃度で用いられる。
【０１０６】
リン酸イオンとしては、正リン酸、ピロリン酸、トリポリリン酸、テトラポリリン酸、ポリリン酸、メタリン酸、トリメタリン酸、リン酸一カリウム、リン酸二カリウム、リン酸一ナトリウム、リン酸二ナトリウム等の無機のリン酸塩等をあげることができ、１．０ｍＭ〜１．０Ｍの濃度で用いることができる。
マグネシウムイオンとしては、硫酸マグネシウム、硝酸マグネシウム、塩化マグネシウム等の無機のマグネシウム塩、クエン酸マグネシウム等の有機のマグネシウム塩等をあげることができ、通常１〜１００ｍＭの濃度で用いられる。
【０１０７】
界面活性剤としては、ポリオキシエチレン・オクタデシルアミン等の非イオン系界面活性剤（例えばナイミーンS-215、日本油脂社製）、セチルトリメチルアンモニウム・ブロマイドやアルキルジメチル・ベンジルアンモニウムクロライド等のカチオン系界面活性剤（例えばカチオンF2-40E、日本油脂社製）、ラウロイル・ザルコシネート等のアニオン系界面活性剤、アルキルジメチルアミン等の三級アミン類（例えば三級アミンFB、日本油脂社製）等、各種糖ヌクレオチドの生成を促進するものであればいずれでも良く、１種または数種を混合して使用することもできる。界面活性剤は、通常０．１〜５０ｇ／ｌの濃度で用いられる。
【０１０８】
有機溶剤としては、キシレン、トルエン、脂肪族アルコール、アセトン、酢酸エチル等が挙げられ、通常０．１〜５０ｍｌ／ｌの濃度で用いられる。
糖ヌクレオチドの生成反応は、水性媒体中、ｐＨ５〜１０、好ましくはｐＨ６〜９、２０〜５０℃の条件で２〜９６時間行う。
該方法により糖ヌクレオチドを生成することができ、例えば、ウリジン二リン酸化合物、グアノシン二リン酸化合物およびシチジン一リン酸化合物等をあげることができる。具体的には、ＵＤＰ−Ｇｌｃ、ＵＤＰ−Ｇａｌ、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ、ＵＤＰ−ＧｌｃＵＡ、ＧＤＰ−Ｍａｎ、ＧＤＰ−Ｆｕｃ、ＣＭＰ-ＮｅｕＡｃおよびこれらの誘導体から選ばれる糖ヌクレオチド等をあげることができる。
【０１０９】
水性媒体中に生成した糖ヌクレオチドの定量は公知の方法に準じて行うことができ、例えば、ＵＤＰ−ＧｌｃとＵＤＰ−Ｇａｌの分離定量はAnal. Biochem., 216, 188 (1994)記載の高速液体クロマトグラフィー（以下、ＨＰＬＣと略す）による方法で行うことができる。また、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ、ＧＤＰ−Ｍａｎ、ＧＤＰ−Ｆｕｃ、ＣＭＰ-ＮｅｕＡｃの分離定量は以下の条件のＨＰＬＣにより行うことができる。
【０１１０】
溶出液：０．１Ｍ  ＫＨ2ＰＯ4（Ｈ3ＰＯ4を用いてｐＨ３．２に調整）
流速  ：１ｍｌ／ｍｉｎ
カラム：Partisil-10 SAX（ワットマン社製）
検出  ：ＵＶ２６２ｎｍ
定量  ：スタンダードの吸光度値の比較により算出
反応液中に生成した糖ヌクレオチドの採取は、活性炭やイオン交換樹脂等を用いる通常の方法によって行うことができ、例えば、ＵＤＰ−ＧａｌおよびＵＤＰ−ＧｌｃにおいてはJ. Org. Chem., 57, 152 (1992)、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃにおいてはJ. Org. Chem., 57, 146 (1992)に記載の方法に準じて行うことができる。
【０１１１】
本発明の複合糖質の製造に用いることのできる微生物あるいは動物細胞あるいは昆虫細胞としては、糖ヌクレオチドと複合糖質前駆物質から複合糖質を生産する能力を有する微生物あるいは動物細胞あるいは昆虫細胞であればいずれも用いることができる。例えば、グルコシルトランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、グルクロノシルトランスフェラーゼ、マンノシルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼおよびフコシルトランスフェラーゼ等の活性を有する微生物あるいは動物細胞あるいは昆虫細胞をあげることができる。
【０１１２】
また、前述の糖ヌクレオチドの製造の場合と同様に、遺伝子組換え技術により造成された微生物あるいは動物細胞あるいは昆虫細胞を利用することもできる。例えば、ヒト・メラノーマ細胞SK-Mel-28細胞由来のセラミドグルコシルトランスフェラーゼ遺伝子を発現するエシェリヒア・コリ［Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 93, 4638 (1996)］、β1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼを産生するヒト・メラノーマ細胞WM266-4株（ATCC CRL1676）、およびヒト・メラノーマ細胞WM266-4由来β1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子を含有するナマルバ細胞KJM-1株等の組換え株（特開平6-181759）、ヒトＨｅｌａ細胞由来のβ1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子を発現するエシェリヒア・コリ［EMBO J., 9, 3171 (1990)］あるいはSaccharomyces cerevisiae［Biochem. Biophys. Res. Commun., 201, 160 (1994)］、ラット由来のβ1,6-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ遺伝子を発現するＣＯＳ−７細胞（ATCC CRL1651）［J. Biol. Chem., 268, 15381 (1993)］、ヒト由来のN-アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ遺伝子を発現するＳｆ９細胞［J. Biochem., 118, 568 (1995)］、ヒト由来のグルクロノシルトランスフェラーゼを発現するエシェリヒア・コリ［Biochem. Biophys. Res. Commun., 196, 473 (1993)］、ヒト由来のα1,3-フコシルトランスフェラーゼを発現するナマルバ細胞［J. Biol. Chem., 269, 14730 (1994)］、ヒト由来のα1,3/1,4-フコシルトランスフェラーゼを発現するＣＯＳ−１細胞［Genes Dev., 4, 1288 (1990)］、ヒト由来のα1,2-フコシルトランスフェラーゼを発現するＣＯＳ−１細胞［Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 87, 6674 (1990)］、チキン由来のα2,6-シアリルトランスフェラーゼを発現するＣＯＳ−７細胞［Eur. J. Biochem., 219, 375 (1994)］、ヒト由来のα2,8-シアリルトランスフェラーゼを発現するＣＨＯ細胞［Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 91, 7952 (1994)］、ナイセリア由来のβ1,3-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼあるいはβ1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼあるいはβ1,3-N-アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼあるいはα1,4-ガラクトシルトランスフェ ラーゼを発現するエシェリヒア・コリ(WO96/10086)、ナイセリア由来のα2,3-シアリルトランスフェラーゼを発現するエシェリヒア・コリ［J. Biol. Chem., 271, 28271 (1996)］、ヘリコバクター・ピロリ由来のα1,3-フコシルトランスフェラーゼを発現するエシェリヒア・コリ［J. Biol. Chem., 272, 21349および21357 (1997)］、酵母由来のα1,２-マンノシルトランスフェラーゼを発現するエシェリヒア・コリ［J. Org. Chem., 58, 3985 (1993)］等の微生物あるいは動物細胞あるいは昆虫細胞をあげることができる。
【０１１３】
本発明の複合糖質の製造に微生物を用いる場合には、該微生物を、上記ヌクレオチドの前駆物質と糖から糖ヌクレオチドを生産する能力を有する微生物の培養と同様の培地、培養条件により培養することができる。
本発明の複合糖質の製造に動物細胞を用いる場合には、該動物細胞を培養する培地として、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地またはこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等が用いられる。培養は、５％ＣＯ2存在下等の条件下で行う。培養温度は２０〜４０℃がよく、培養時間は、通常３〜１４日間である。また必要に応じて、抗生物質を培地に添加してもよい。
【０１１４】
本発明の複合糖質の製造に昆虫細胞を用いる場合には、該昆虫細胞の培養を公知の方法[J. Biol. Chem., 268, 12609 (1993)]に準じて行うことができる。
該培養により得られた微生物あるは動物細胞あるいは昆虫細胞の培養液および該培養液を種々処理した培養液の処理物を酵素源として用い、水性媒体中で複合糖質の生成に用いることができる。培養液の処理物としては、培養液の濃縮物、培養液の乾燥物、培養液を遠心分離して得られる培養上清、該培養上清の濃縮物、培養上清から得られる酵素標品、培養液を遠心分離して得られる細胞（菌体を含む）、該細胞の乾燥物、該細胞の凍結乾燥物、該細胞の界面活性剤処理物、該細胞の超音波処理物、該細胞の機械的摩砕処理物、該細胞の溶媒処理物、該細胞の酵素処理物、該細胞の蛋白質分画物、該細胞の固定化物あるいは該細胞より抽出して得られる酵素標品等を挙げることができる。
【０１１５】
複合糖質の生成において用いられる酵素源の量は、酵素の活性を、３７℃で１分間に１μmoleの複合糖質を生成することのできる活性を１単位（Ｕ）として、０．１ｍＵ／ｌ〜１００００Ｕ／ｌであり、好ましくは１ｍＵ／ｌ〜１０００Ｕ／ｌの濃度で用いることができる。
複合糖質の生成において用いられる水性媒体としては、水、リン酸塩、炭酸塩、酢酸塩、ホウ酸塩、クエン酸塩、トリス等の緩衝液、メタノール、エタノール等のアルコール類、酢酸エチル等のエステル類、アセトン等のケトン類、アセトアミド等のアミド類等をあげることができる。また、酵素源として用いた微生物、動物細胞あるいは昆虫細胞の培養液を水性媒体として用いることができる。
【０１１６】
複合糖質の生成において、必要に応じて、フィチン酸等のキレート剤、ＭｎＣｌ2等の無機塩、β−メルカプトエタノール等を添加することができる。
複合糖質の生成において用いられる糖ヌクレオチドとしては、上記糖ヌクレオチドの生成で得られた反応液あるいは該反応液から精製した糖ヌクレオチドを用いることができ、０．０１ｍＭ〜２．０Ｍの濃度で用いることができる。
【０１１７】
また、複合糖質の生成反応液中で、上述の方法により糖ヌクレオチドを生成させることにより、糖ヌクレオチドを供給することもできる。
複合糖質の生成において用いられる複合糖質前駆物質としては、単糖、オリゴサッカライド、担体等に結合した単糖およびオリゴサッカライド、蛋白質、ペプチド、脂質、糖蛋白質、糖脂質、グリコペプチドあるいはステロイド化合物等糖転移酵素の基質となるものであればいかなるものでも用いることができる。
【０１１８】
具体的にはグルコース、ガラクトース、マンノース、シアル酸、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、ラクトース、Ｎ−アセチルラクトサミン、ラクト−Ｎ−ビオース、ＧｌｃＮＡｃβ1-3Ｇａｌβ1-4Ｇｌｃ、ＧｌｃＮＡｃβ1-4Ｇａｌβ1-4Ｇｌｃ、グロボトリオース、Ｇａｌα1-4Ｇａｌβ1-4ＧｌｃＮＡｃ、2'-フコシルラクトース、3-フコシルラクトース、3'-シアリルラクトース、6'-シアリルラクトース、3'-シアリル−Ｎ−アセチルラクトサミン、6'-シアリル−Ｎ−アセチルラクトサミン、シアリルラクト−Ｎ−ビオース、ルイスＸ、ルイスａ、ラクト−Ｎ−テトラオース、ラクト−Ｎ−ネオテトラオース、ラクトジフコテトラオース、3'-シアリル-3-フコシルラクトース、シアリルルイスＸ、シアリルルイスａ、ラクト−Ｎ−フコペンタオースＩ、ラクト−Ｎ−フコペンタオースＩＩ、ラクト−Ｎ−フコペンタオースＩＩＩ、ラクト−Ｎ−フコペンタオースＶ、LS-テトラサッカライドａ、LS-テトラサッカライドｂ、LS-テトラサッカライドｃ、（α２，３）シアリルラクト−Ｎ−ネオテトラオースおよびこれらの誘導体、セリン、スレオニン、アスパラギンおよび該アミノ酸を含有するぺプチドおよびその誘導体、セラミドおよびその誘導体等を例示することができる。該複合糖質前駆物質は０．０１ｍＭ〜２．０Ｍの濃度で用いることができる。
【０１１９】
本発明の複合糖質としては、グルコース、ガラクトース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、グルクロン酸、マンノース、Ｎ−アセチルマンノサミン、フコース、シアル酸、ラクトース、Ｎ−アセチルラクトサミン、ラクト−Ｎ−ビオース、ＧｌｃＮＡcβ1-3Ｇａｌβ1-4Ｇｌｃ、ＧｌｃＮＡｃβ1-4Ｇａｌβ1-4Ｇｌｃ、グロボトリオース、Ｇａｌα1-4Ｇａｌβ1-4ＧｌｃＮＡｃ、2’-フコシルラクトース、3-フコシルラクトース、3’-シアリルラクトース、6’-シアリルラクトース、3’-シアリル−Ｎ−アセチルラクトサミン、6’-シアリル−Ｎ−アセチルラクトサミン、シアリルラクト−Ｎ−ビオース、ルイスＸ、ルイスａ、ラクト−Ｎ−テトラオース、ラクト−Ｎ−ネオテトラオース、ラクトジフコテトラオース、3’-シアリル3-フコシルラクトース、シアリルルイスＸ、シアリルルイスａ、ラクト−Ｎ−フコペンタオースI、ラクト−Ｎ−フコペンタオースII、ラクト−Ｎ−フコペンタオースIII、ラクト−Ｎ−フコペンタオースV、LS-テトラサッカライドａ、LS-テトラサッカライドｂ、LS-テトラサッカライドｃ、（α２，３）シアリルラクト−Ｎ−ネオテトラオース、ラクト−Ｎ−ジフコヘキサオースI、ラクト−Ｎ−ジフコヘキサオースII、ラクト−Ｎ−ヘキサオース、ラクト−Ｎ−ネオヘキサオース、ジシアリルラクト−Ｎ−テトラオースおよびこれらの誘導体から選ばれる糖を１あるいはそれ以上含有する複合糖質または該複合糖質を含む複合糖質をあげることができ、例えば、Ｇａｌβ1-3Ｇｌｃ、Ｇａｌβ1-4Ｇｌｃ、Ｇａｌβ1-3ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌβ1-4ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌβ1-3Ｇａｌ、Ｇａｌβ1-4Ｇａｌ、Ｇａｌβ1-3ＧａｌＮＡｃ、Ｇａｌβ1-4ＧａｌＮＡｃ、Ｇａｌα1-3Ｇｌｃ、Ｇａｌα1-4Ｇｌｃ、Ｇａｌα1-3ＧｌｃＮＡｃ，Ｇａｌα1-4ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌα1-3Ｇａｌ、Ｇａｌα1-4Ｇａｌ、Ｇａｌα1-3ＧａｌＮＡｃ、Ｇａｌα1-4ＧａｌＮＡｃ、ＧｌｃＮＡｃβ1-3Ｇａｌ、ＧｌｃＮＡｃβ1-4Ｇａｌ、ＧｌｃＮＡｃβ1-6Ｇａｌ、ＧｌｃＮＡｃβ1-3Ｇｌｃ、ＧｌｃＮＡｃβ1-4Ｇｌｃ、ＧｌｃＮＡｃβ1-3ＧｌｃＮＡｃ、ＧｌｃＮＡｃβ1-4ＧｌｃＮＡｃ、ＧｌｃＮＡｃβ1-6ＧａｌＮＡｃ、ＧｌｃＮＡｃβ1-2Ｍａｎ、ＧｌｃＮＡｃβ1-4Ｍａｎ、ＧｌｃＮＡｃβ1-6Ｍａｎ、ＧａｌＮＡｃβ1-3Ｇａｌ、ＧａｌＮＡｃβ1-4Ｇａｌ、ＧａｌＮＡｃβ1-4ＧｌｃＮＡｃ、ＧａｌＮＡｃα1-3ＧａｌＮＡｃ、Ｍａｎβ1-4ＧｌｃＮＡｃ、Ｍａｎα1-6Ｍａｎ，Ｍａｎα1-3Ｍａｎ，Ｍａｎα1-2Ｍａｎ，ＧｌｃＵＡβ1-4ＧｌｃＮ、ＧｌｃＵＡβ1-3Ｇａｌ、ＧｌｃＵＡβ1-3ＧｌｃＮＡｃ、ＧｌｃＵＡβ1-3ＧａｌＮＡｃ、ＮｅｕＡｃα2-3Ｇａｌ、ＮｅｕＡｃα2-6Ｇａｌ、ＮｅｕＡｃα2-3ＧｌｃＮＡｃ、ＮｅｕＡｃα2-6ＧｌｃＮＡｃ、ＮｅｕＡｃα2-3ＧａｌＮＡｃ、ＮｅｕＡｃα2-6ＧａｌＮＡｃ、ＮｅｕＡｃα2-8ＮｅｕＡｃ、Ｆｕｃα1-3Ｇｌｃ、Ｆｕｃα1-4Ｇｌｃ、Ｆｕｃα1-3ＧｌｃＮＡｃ、Ｆｕｃα1-4ＧｌｃＮＡｃ、Ｆｕｃα1-2ＧａｌおよびＦｕｃα1-6ＧｌｃＮＡｃから選ばれる結合を有する糖を含む複合糖質または該複合糖質を含む複合糖質をあげることができる。また、該糖を有する複合糖質に含まれる糖の数としては、１０個以下あるいは６個以下のものをあげることができる。
【０１２０】
具体的な複合糖質製造法としては、
（１）ナイセリア由来のβ1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼ（WO96/10086）を発現する微生物、ＵＴＰの前駆物質からＵＴＰを生産する能力を有する微生物、糖とＵＴＰからＵＤＰ−Ｇａｌを生産する能力を有する微生物の培養液または該培養液の処理物とを酵素源とした酵素反応を行うことにより、オロット酸とガラクトースとグルコースからラクトースを生成させることができる。
（２）ナイセリア由来のβ1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼ（WO96/10086）を発現する微生物、ＵＴＰの前駆物質からＵＴＰを生産する能力を有する微生物、糖とＵＴＰからＵＤＰ−Ｇａｌを生産する能力を有する微生物の培養液または該培養液の処理物とを酵素源とした酵素反応を行うことにより、オロット酸とガラクトースとＮ−アセチルグルコサミンからＮ−アセチルラクトサミンを生成させることができる。
（３）ナイセリア由来のα2,3-シアリルトランスフェラーゼ［J．Biol．Chem., 271, 28271 (1996)］を発現する微生物、ＣＴＰの前駆物質からＣＴＰを生産する能力を有する微生物、糖とＣＴＰからＣＭＰ−ＮｅｕＡｃを生産する能力を有する微生物の培養液または該培養液の処理物とを酵素源とした酵素反応を行うことにより、オロット酸とＮ−アセチルマンノサミンとピルビン酸とラクトースから3'-シアリルラクトースを生成させることができる。
（４）ナイセリア由来のα2,3-シアリルトランスフェラーゼ［J．Biol．Chem., 271, 28271 (1996)］を発現する微生物、ＣＴＰの前駆物質からＣＴＰを生産する能力を有する微生物、糖とＣＴＰからＣＭＰ−ＮｅｕＡｃを生産する能力を有する微生物の培養液または該培養液の処理物とを酵素源とした酵素反応を行うことにより、オロット酸とＮ−アセチルマンノサミンとピルビン酸とＮ−アセチルラクトサミンから3'-シアリル−Ｎ−アセチルラクトサミンを生成させることができる。
【０１２１】
（５）チキン由来のα2,6-シアリルトランスフェラーゼを発現するＣＯＳ−７細胞［Eur. J. Biochem., 219, 375 (1994)］、 ＣＴＰの前駆物質からＣＴＰを生産する能力を有する微生物、糖とＣＴＰからＣＭＰ−ＮｅｕＡｃを生産する能力を有する微生物の培養液または該培養液の処理物とを酵素源とした酵素反応を行うことにより、オロット酸とＮ−アセチルマンノサミンとピルビン酸とＮ−アセチルラクトサミンから６'-シアリル−Ｎ−アセチルラクトサミンを生成させることができる。
（６）ナイセリア由来のβ1,3-Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（WO96/10086）を発現する微生物、ＵＴＰの前駆物質からＵＴＰを生産する能力を有する微生物、糖とＵＴＰからＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを生産する能力を有する微生物の培養液または該培養液の処理物とを酵素源とした酵素反応を行うことにより、オロット酸とＮ−アセチルグルコサミンとラクトースからＧｌｃＮＡｃβ1-3Ｇａｌβ1-4Ｇｌｃを生成させることができる。
（７）β1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼを産生するヒト・メラノーマ細胞WM266-4株（ATCC CRL1676）、あるいはヒト・メラノーマ細胞WM266-4由来β1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子を発現するナマルバ細胞KJM-1株等の組換え株（特開平6-181759）、 ＵＴＰの前駆物質からＵＴＰを生産する能力を有する微生物、糖とＵＴＰからＵＤＰ−Ｇａｌを生産する能力を有する微生物の培養液または該培養液の処理物とを酵素源とした酵素反応を行うことにより、オロット酸とガラクトースとＧｌｃＮＡｃβ1-3Ｇａｌβ1-4Ｇｌｃからラクト−Ｎ−テトラオースを生成させることができる。
（８）ヒトＨｅｌａ細胞由来のβ1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子を発現するエシェリヒア・コリ[EMBO J., 9, 3171 (1990)]あるいはSaccharomyces cerevisiae［Biochem. Biophys. Res. Commun., 201, 160 (1994)］、ＵＴＰの前駆物質からＵＴＰを生産する能力を有する微生物、糖とＵＴＰからＵＤＰ−Ｇａｌを生産する能力を有する微生物の培養液または該培養液の処理物とを酵素源とした酵素反応を行うことにより、オロット酸とガラクトースとＧｌｃＮＡｃβ1-3Ｇａｌβ1-4Ｇｌｃからラクト−Ｎ−ネオテトラオースを生成させることができる。
（９）ナイセリア由来のβ1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼ（WO96/10086）を発現する微生物、ＵＴＰの前駆物質からＵＴＰを生産する能力を有する微生物、糖とＵＴＰからＵＤＰ−Ｇａｌを生産する能力を有する微生物の培養液または該培養液の処理物とを酵素源とした酵素反応を行うことにより、オロット酸とガラクトースとＧｌｃＮＡｃβ1-3Ｇａｌβ1-4Ｇｌｃからラクト−Ｎ−ネオテトラオースを生成させることができる。
【０１２２】
（１０）ナイセリア由来のβ1,3-Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（WO96/10086）を発現する微生物、ナイセリア由来のβ1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼ（WO96/10086）を発現する微生物、ＵＴＰの前駆物質からＵＴＰを生産する能力を有する微生物、糖とＵＴＰからＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを生産する能力を有する微生物、糖とＵＴＰからＵＤＰ−Ｇａｌを生産する能力を有する微生物の培養液または該培養液の処理物とを酵素源とした酵素反応を行うことにより、オロット酸とＮ−アセチルグルコサミンとガラクトースとラクトースからラクト−Ｎ−ネオテトラオースを生成させることができる。
（１１）ナイセリア由来のα2,3-シアリルトランスフェラーゼ［J．Biol．Chem., 271, 28271 (1996)］を発現する微生物、ＣＴＰの前駆物質からＣＴＰを生産する能力を有する微生物、糖とＣＴＰからＣＭＰ−ＮｅｕＡｃを生産する能力を有する微生物の培養液または該培養液の処理物とを酵素源とした酵素反応を行うことにより、オロット酸とＮ−アセチルマンノサミンとピルビン酸とラクト−Ｎ−ネオテトラオースから（α２，３）シアリルラクト−Ｎ−ネオテトラオースを生成させることができる。
（１２）ヒト由来のα1,3-フコシルトランスフェラーゼを発現するナマルバ細胞［J. Biol. Chem., 269, 14730 (1994)］、 ＧＴＰの前駆物質からＧＴＰを生産する能力を有する微生物、糖とＧＴＰからＧＤＰ−Ｆｕｃを生産する能力を有する微生物の培養液または該培養液の処理物とを酵素源とした酵素反応を行うことにより、ＧＭＰとマンノースとラクト−Ｎ−ネオテトラオースからラクト−Ｎ−フコペンタオースIIIを生成させることができる。
（１３）ヘリコバクター・ピロリ由来のα1,3-フコシルトランスフェラーゼ［J．Biol．Chem., 272, 21349および21357 (1997)］を発現する微生物、ＧＴＰの前駆物質からＧＴＰを生産する能力を有する微生物、糖とＧＴＰからＧＤＰ−Ｆｕｃを生産する能力を有する微生物の培養液または該培養液の処理物とを酵素源とした酵素反応を行うことにより、ＧＭＰとマンノースとラクト−Ｎ−ネオテトラオースからラクト−Ｎ−フコペンタオースIIIを生成させることができる。
（１４）ナイセリア由来のα1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼ（WO96/10086）を発現する微生物、ＵＴＰの前駆物質からＵＴＰを生産する能力を有する微生物、糖とＵＴＰからＵＤＰ−Ｇａｌを生産する能力を有する微生物の培養液または該培養液の処理物とを酵素源とした酵素反応を行うことにより、オロット酸とガラクトースとラクトースからグロボトリオースを生成させることができる。
【０１２３】
（１５）ナイセリア由来のβ1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼ（WO96/10086）を発現する微生物、ナイセリア由来のα1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼ（WO96/10086）を発現する微生物、ＵＴＰの前駆物質からＵＴＰを生産する能力を有する微生物、糖とＵＴＰからＵＤＰ−Ｇａｌを生産する能力を有する微生物の培養液または該培養液の処理物とを酵素源とした酵素反応を行うことにより、オロット酸とガラクトースとグルコースからグロボトリオースを生成させることができる。
（１６）ナイセリア由来のα1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼ（WO96/10086）を発現する微生物、ＵＴＰの前駆物質からＵＴＰを生産する能力を有する微生物、糖とＵＴＰからＵＤＰ−Ｇａｌを生産する能力を有する微生物の培養液または該培養液の処理物とを酵素源とした酵素反応を行うことにより、オロット酸とガラクトースとＮ−アセチルラクトサミンからＧａｌα1-4Ｇａｌβ1-4ＧｌｃＮＡｃを生成させることができる。
（１７）ヒト由来のβ1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ（特開平6-181759）を発現する動物細胞、ＵＴＰの前駆物質からＵＴＰを生産する能力を有する微生物、糖とＵＴＰからＵＤＰ−Ｇａｌを生産する能力を有する微生物の培養液または該培養液の処理物とを酵素源とした酵素反応を行うことにより、オロット酸とガラクトースとＮ−アセチルグルコサミンからラクト−Ｎ−ビオースを生成させることができる。
（１８）ナイセリア由来のα2,3-シアリルトランスフェラーゼ［J．Biol．Chem., 271, 28271 (1996)］を発現する微生物、ＣＴＰの前駆物質からＣＴＰを生産する能力を有する微生物、糖とＣＴＰからＣＭＰ−ＮｅｕＡｃを生産する能力を有する微生物の培養液または該培養液の処理物とを酵素源とした酵素反応を行うことにより、オロット酸とＮ−アセチルマンノサミンとピルビン酸とラクト−Ｎ−ビオースからシアリルラクト−Ｎ−ビオースを生成させることができる。
（１９）ヒト由来のα1,3-フコシルトランスフェラーゼ［J. Biol. Chem., 269, 14730 (1994)］を発現する動物細胞、ＧＴＰの前駆物質からＧＴＰを生産する能力を有する微生物、糖とＧＴＰからＧＤＰ−Ｆｕｃを生産する能力を有する微生物の培養液または該培養液の処理物とを酵素源とした酵素反応を行うことにより、ＧＭＰとマンノースと3'-シアリルＮ−アセチルラクトサミンからシアリルルイスＸを生成させることができる。
【０１２４】
（２０）ヒト由来のα1,3/1,4-フコシルトランスフェラーゼ［Carbohydrate Research, 190, 1 (1989)］、ＧＴＰの前駆物質からＧＴＰを生産する能力を有する微生物、糖とＧＴＰからＧＤＰ−Ｆｕｃを生産する能力を有する微生物の培養液または該培養液の処理物とを酵素源とした酵素反応を行うことにより、ＧＭＰとマンノースとシアリルラクト−Ｎ−ビオ−スからシアリルルイスａを生成させることができる。
（２１）酵母由来のα1,２-マンノシルトランスフェラーゼを発現するエシェリヒア・コリ［J. Org. Chem., 58, 3985 (1993)］、 ＧＴＰの前駆物質からＧＴＰを生産する能力を有する微生物、糖とＧＴＰからＧＤＰ−Ｍａｎを生産する能力を有する微生物の培養液または該培養液の処理物とを酵素源とした酵素反応を行うことにより、ＧＭＰとマンノースからＭａｎα1-2Ｍａｎを生成させることができる。
等をあげることができる。
【０１２５】
複合糖質の製造法は、上記に記載された例に限定されるものではなく、本特許に記載された糖ヌクレオチド製造法と組み合わせることができる糖転移酵素、および該酵素が許容する基質特異性の範囲において、どのような糖鎖でも、ヌクレオチドの前駆物質、糖、複合糖質前駆物質のみを原料として工業的に製造することが可能である。
【０１２６】
本発明の製造方法により製造される複合糖質として、例えば、
（１）病原性微生物やウィルスの感染に関与する複合糖質類、例えば、病原性微生物やウィルスの受容体として認識される複合糖質類、
（２）病原性微生物やウィルスが生産する毒素の受容体として認識される複合糖質類、
（３）生体内で、細胞接着、異物の認識、各種リンフォカインの結合等に関与する複合糖質類、
等の、グルコース、ガラクトース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、グルクロン酸、マンノース、Ｎ−アセチルマンノサミン、フコース、シアル酸等の糖を、単独あるいは複数、化学的に許容される結合形式で含有する複合糖質をあげることができ、より具体的には、
【０１２７】
（１）ヒトや動物のミルク中に含有される乳幼児の微生物感染防御に関与する複合糖質類、例えば、ラクト−Ｎ−テトラオース、ラクト−Ｎ−ネオテトラオース等の複合糖質、
（２）Escherichia coli、Propionibacterium granulosium、Mycobacterium tuberculosis、Moraxella catarahlis、Candida albicans、Staphylococcus saprophyticus、Streptococcus pneumoniae、Streptococcus agalactiae、Pseudomonas aeruginosa、Actinomyces naeslundii、Neisseria gonorrhoeae、Helicobacter pylori、Haemophilus influenzae等の微生物を認識する受容体複合糖質、
（３）インフルエンザウィルス、コロナウィルス、センダイウィルス、ニューカッスル病ウィルス、レオウィルス、ロタウィルス、エイズウィルス、等のウィルスの受容体複合糖質、
（４）クリプトスポリジウム、トリパノゾーマなどの原虫の受容体複合糖質
（５）コレラ毒素、大腸菌易熱性毒素、ボツリヌス毒素、クロストリジウムδ毒素、クロストリジウムＡ毒素、志賀毒素、ベロ毒素、志賀毒素様毒素、腸炎ビブリオ耐熱性毒素、破傷風毒素、等の毒素が結合する受容体複合糖質、
【０１２８】
（６）ＧＤ３，ＧＭ３等のガングリオシドやグロボ系糖脂質等の、ガン関連複合糖質、
（７）シアリルルイスｘ糖鎖等の、白血球の炎症部位への接着や機能修飾に関与する複合糖質類、
（８）慢性関節リュウマチやIgA腎症等の自己免疫疾患に関与する複合糖質類、
（９）異物認識やガン細胞の認識に関与する各種のレクチン様物質が認識する複合糖質類等をあげることができる。
【０１２９】
水性媒体中に生成した複合糖質の定量は公知の方法に準じて行うことができる。［Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 85, 3289 (1988)、Anal. Biochem., 174, 459 (1988)］。
反応液中に生成した複合糖質の採取は、活性炭やイオン交換樹脂等を用いる通常の方法によって行うことができ、例えば、Ｎ−アセチルラクトサミンにおいてはJ. Org. Chem., 47, 5416 (1982)記載の方法に準じて行うことができる。
【０１３０】
以下に本発明の実施例を示すが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【０１３１】
【実施例】
以下に本発明の実施例を示す。
実施例１  ｇａｌＵ、ｐｐａを発現する組換え体プラスミドの造成
ｇａｌＵ、ｐｐａを発現する組換え体プラスミドｐＮＴ１２の造成方法について以下に述べる（図１、図２）。
１）ＰLプロモーターを含む発現ベクターの造成
ＰLプロモーターを含む発現ベクターであるｐＰＡ３１およびｐＰＡＣ３１は以下に示す方法で造成した（図１）。
【０１３２】
トリプトファンプロモーターを含むプラスミドｐＴｒＳ３０を保有するエシェリヒア・コリJM109/pTrS30（FERM BP-5407）およびＰLプ ロモーターを含むプラスミドｐＰＡ１（特開昭63-233798）、ＰLプロモーターおよびｃＩ８５７リプレッサーを含むプラスミドｐＰＡＣ１（FERM BP-6054）を保有するエシェリヒア・コリを、それぞれＬＢ培地［バクトトリプトン（ディフコ社製）１０ｇ／ｌ、酵母エキス（ディフコ社製）５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ ５ｇ／ｌ、ｐＨを７．２］に植菌し、３０℃で１８時間培養した。
【０１３３】
該培養により得られた菌体から前述の公知の方法により、ｐＴｒＳ３０、ｐＰＡ１およびｐＰＡＣ１プラスミドＤＮＡを単離精製した。
精製したｐＴｒＳ３０ ＤＮＡ０．２μｇを制限酵素ＰｓｔＩおよびＣｌａＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、ジーンクリーンＩＩキット（Ｂｉｏ１０１社製）により３．４ｋｂの断片を回収した。精製したｐＰＡ１ ＤＮＡ ０．５μｇを制限酵素ＰｓｔＩおよびＣｌａＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、同様に１．０ｋｂの断片を回収した。
【０１３４】
該３．４ｋｂの断片および１．０ｋｂの断片をライゲーションキット（TAKARA ligation Kit、宝酒造社製）を用いて、１６℃で１６時間、連結反応を行った。
該連結反応液を用いてエシェリヒア・コリNM522株を前述の公知の方法に従って形質転換し、該形質転換体をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布後、３７℃で一晩培養した。
【０１３５】
生育してきた形質転換体のコロニーより前述の公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、ＰLプロモーターによる発現ベクターであるｐＰＡ３１を得た。該プラスミドの構造を制限酵素消化により確認した（図１）。
精製したｐＰＡ３１ ＤＮＡ ０．２μｇを制限酵素ＰｓｔＩおよびＣｌａＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、ジーンクリーンＩＩキットにより３．４ｋｂの断片を回収した。精製したｐＰＡＣ１ ＤＮＡ ０．５μｇを制限酵素ＰｓｔＩおよびＣｌａＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、同様に２．３ｋｂの断片を回収した。
【０１３６】
該３．４ｋｂの断片および２．３ｋｂの断片をライゲーションキットを用いて、１６℃で１６時間連結反応を行った。
該連結反応液を用いてエシェリヒア・コリNM522株を前述の公知の方法に従って形質転換し、該形質転換体をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布後、３７℃で一晩培養した。
【０１３７】
生育してきた形質転換体のコロニーより前述の公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、ｃＩ８５７リプレッサーを含むＰLプロモーターによる発現ベクターであるｐＰＡＣ３１を取得した。該プラスミドの構造を制限酵素消化により確認した（図１）。
２）ｇａｌＵ発現プラスミドの造成
エシェリヒア・コリW3110株の染色体ＤＮＡを公知の方法［例えばCurrent Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons Inc.(1994)］により単離精製した。
【０１３８】
配列番号１記載のセンス鎖ＤＮＡプライマーと、配列番号２記載のアンチセンス鎖ＤＮＡプライマーをアプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）社製３８０Ａ・ＤＮＡ合成機を用いて合成した。
該合成ＤＮＡをプライマーとして、W3110株の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。ＰＣＲはW3110染色体ＤＮＡ ０．０４μｇ、プライマー各０．５μＭ、ＴＡＫＡＲＡ Ｅｘ Ｔａｑ（宝酒造社製）１．０ｕｎｉｔ、１０×Ｅｘ Ｔａｑ緩衝液（宝酒造社製）４μｌ、deoxyＮＴＰ各２００μＭを含む反応液４０μｌを用い、９４℃―１分、４２℃―２分、７２℃―３分の工程を３０回繰り返すことにより行った。
【０１３９】
該反応液の１／１０量をアガロースゲル電気泳動にかけ、目的の断片が増幅されていることを確認後、残りの反応液と等量のＴＥ〔１０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ〕飽和フェノール／クロロホ ルム（１ｖｏｌ／１ｖｏｌ）を添加し、混合した。該混合液を遠心分離後、得られた上層に２倍容量の冷エタノールを加えて混合し、−８０℃に３０分放置した。該放置液を遠心分離しＤＮＡの沈殿を得た。該沈殿を７０％冷エタノールで洗浄し、真空乾燥して沈殿を得た。以後、ＴＥ飽和フェノール／クロロホルムを添加し、エタノールで洗浄したＤＮＡの沈殿を得るまでの操作をエタノール沈殿法と呼ぶ。
【０１４０】
該ＤＮＡの沈殿を２０μｌのＴＥに溶解した。該溶解液５μｌを用い、ＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで切断し、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離した後、ジーンクリーンＩＩキットにより０．９ｋｂの断片を回収した。実施例１−１）で取得したｐＰＡ３１ ＤＮＡ ０．２μｇを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、同様に４．２ｋｂの断片を回収した。
【０１４１】
該０．９ｋｂの断片および４．２ｋｂの断片をライゲーションキットを用いて１６℃で１６時間、連結反応を行った。
該連結反応液を用いてエシェリヒア・コリKY8415株を前述の公知の方法に従って形質転換し、該形質転換体をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布後、３０℃で一晩培養した。
【０１４２】
生育してきた形質転換体のコロニーより前述の公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、ｇａｌＵ発現プラスミドであるｐＮＴ９を得た。該プラスミドの構造を制限酵素消化により確認した（図２）。
３）ｇａｌＵ，ｐｐａ同時発現プラスミドの造成
配列番号３記載のセンス鎖ＤＮＡプライマーと、配列番号４記載のアンチセンス鎖ＤＮＡプライマーを合成し、該合成ＤＮＡをプライマーとして、W3110株の染色体ＤＮＡを鋳型として前述と同一の条件でＰＣＲを行った。
【０１４３】
ＰＣＲ終了後、エタノール沈殿法により、ＤＮＡの沈殿を取得した。該沈殿を２０μｌのＴＥに溶解した。該溶解液５μｌを用い、ＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩで切断し、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離した後、ジーンクリーンＩＩキットにより１．０ｋｂの断片を回収した。実施例１−２）で取得したｐＮＴ９ ＤＮＡ０．２μｇを制限酵素ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、同様に４．９ｋｂの断片を回収した。
【０１４４】
該１．０ｋｂの断片および４．９ｋｂの断片をライゲーションキットを用いて１６℃で１６時間、連結反応を行った。
該連結反応液を用いてエシェリヒア・コリKY8415株を前述の公知の方法に従って形質転換し、該形質転換体をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布後、３０℃で一晩培養した。
【０１４５】
生育してきた形質転換体のコロニーより前述の公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、ｇａｌＵ，ｐｐａ同時発現プラスミドであるｐＮＴ１２を得た。該プラスミドの構造を制限酵素消化により確認した（図２）。
該ｐＮＴ１２ ＤＮＡ ０．５μｇを制限酵素ＥｃｏＲＩお よびＳａｌＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離しジーンクリーンＩＩキットにより２．２ｋｂの断片を回収した。一方、ｐＳＴＶ２８ ＤＮＡ（宝酒造社製）０．２μｇを制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、同様に３．０ｋｂの断片を回収した。
【０１４６】
該２．２ｋｂの断片および３．０ｋｂの断片をライゲーションキットを用いて１６℃で１６時間連結反応を行った。該連結反応液を用いてエシェリヒア・コリNM522株を常法に従って形質転換し、該形質転換体をクロラムフェニコール10μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布後、３０℃で一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーより常法に従ってプラスミドを抽出し、ｇａｌＵ，ｐｐａ遺伝子発現プラスミドであるｐＮＴ３２を得た。該プラスミドの構造を制限酵素消化により確認した（図２）。
【０１４７】
実施例２  ＵＤＰ−Ｇｌｃの生産
実施例１で得たエシェリヒア・コリKY8415/pNT12株を、アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地１２５ｍｌの入った１Ｌ容バッフル付き三角フラスコに接種し、３０℃で２２０ｒｐｍの条件で１７時間培養した。該培養液１２５ｍｌをグルコース１０ｇ／ｌ、バクトトリプトン（ディフコ社製）１２ｇ／ｌ、酵母エキス（ディフコ社製）２４ｇ／ｌ、ＫＨ2ＰＯ4 ２．３ｇ／ｌ（別殺菌）、Ｋ2ＨＰＯ4 １２．５ｇ／ｌ（別殺菌）、アンピシリン ５０μｇ／ｍｌの組成からなる液体培地（ｐＨ無調整）２．５Ｌの入った５Ｌ容培養槽に接種し、３０℃で４時間、更に、４０℃で３時間、６００ｒｐｍ、通気量２．５Ｌ／分の条件で培養を行った。
【０１４８】
該培養中、２８％アンモニア水を用いて、培養液のｐＨを７．０に維持した。また、培養途中で必要に応じてグルコースを添加した。該培養液を遠心分離し、湿菌体を取得した。該湿菌体は必要に応じて−２０℃で保存することが可能で、使用前に解凍して用いることができる。
コリネバクテリウム・アンモニアゲネスATCC21170株を、グルコース５０ ｇ／ｌ、ポリペプトン（日本製薬社製）１０ｇ／ｌ、酵母エキス（オリエンタル酵母社製）１０ｇ／ｌ、尿素 ５ｇ／ｌ、(ＮＨ4)2ＳＯ4 ５ｇ／ｌ、ＫＨ2ＰＯ4 １ｇ／ｌ、Ｋ2ＨＰＯ4 ３ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １ｇ／ｌ、ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ ０．１ｇ／ｌ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １０ｍｇ／ｌ、ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １０ｍｇ／ｌ、ＭｎＳＯ4・４〜６Ｈ2Ｏ ２０ｍｇ／ｌ、Ｌ−システイン ２０ｍｇ／ｌ、Ｄ−パントテン酸カルシウム １０ｍｇ／ｌ、ビタミンＢ１ ５ｍｇ／ｌ、ニコチン酸 ５ｍｇ／ｌ 、およびビオチン ３０μｇ／ｌ（１０Ｎ ＮａＯＨでｐＨ７．２に調整）の組成からなる液体培地２０ｍｌの入った３００ｍｌ容バッフル付き三角フラスコに接種し、２８℃で２２０ｒｐｍの条件で、２４時間培養した。
【０１４９】
該培養液２０ｍｌを上記と同一組成の液体培地２５０ｍｌの入った２Ｌ容バッフル付き三角フラスコに接種し、２８℃で２２０ｒｐｍの条件で、２４時間培養した。得られた培養液を種培養液として用いた。
該種培養液２５０ｍｌを、グルコース １５０ｇ／ｌ、肉エキス（極東製薬社製） ５ｇ／ｌ、ＫＨ2ＰＯ4 １０ｇ／ｌ、Ｋ2ＨＰＯ4 １０ｇ／ｌ 、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １０ｇ／ｌ、ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ ０．１ｇ／ｌ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ２０ｍｇ／ｌ、ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １０ｍｇ／ｌ、ＭｎＳＯ4・４〜６Ｈ2Ｏ２０ｍｇ／ｌ（別殺菌）、β−アラニン １５ｍｇ／ｌ（別殺菌）、Ｌ−システイン ２０ｍｇ／ｌ、ビオチン １００μｇ／ｌ、尿素 ２ｇ／ｌ、およびビタミンＢ１ ５ｍｇ／ｌ（別殺菌）（１０Ｎ ＮａＯＨでｐＨ７．２に調整）の組成からなる液体培地２．２５Ｌの入った５Ｌ容培養槽に接種し、３２℃で６００ｒｐｍ、通気量２．５Ｌ／ｍｉｎの条件で２４時間培養を行った。培養中、２８％アンモニア水を用いて、培養液のｐＨを６．８に維持した。
【０１５０】
該培養液を遠心分離し、湿菌体を取得した。該湿菌体は必要に応じて−２０℃で保存することが可能で、使用前に解凍して用いることができる。
エシェリヒア・コリKY8415/pNT12株湿菌体 ４０ｇ／ｌ、コリネバクテリウ ム・アンモニアゲネスATCC21170株湿菌体 １５０ｇ／ｌ、グルコ ース １００ｇ／ｌ、ＫＨ2ＰＯ4 ２０ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ５ ｇ／ｌ、フィチン酸 ５ｇ／ｌ、オロット酸（カリウム塩）２１．２ｇ／ｌ、ナイミーンＳ−２１５ ４ｇ／ｌ、キシレン １０ｍｌ／ｌの組成からなる反応液３０ｍｌを２００ｍｌ容ビーカーに入れ、該反応液をマグネティック・スターラーにて攪拌（９００ｒｐｍ）し、３２℃で２１時間反応を行った。
【０１５１】
反応中、４Ｎ ＮａＯＨを用いて、該反応液のｐＨを７．２に維持し、必要に応じてグルコース、ＫＨ2ＰＯ4を添加した。
該反応により、反応液中に４３．９ｇ／ｌのＵＤＰ−Ｇｌｃ（２Ｎａ塩）が生成した。
【０１５２】
実施例３  ｇａｌＴ、ｇａｌＫを発現する組換え体プラスミドの造成
ｇａｌＴ、ｇａｌＫを発現する組換え体プラスミドｐＮＴ２５の造成方法について以下に述べる（図３）。
【０１５３】
配列番号５記載のセンス鎖ＤＮＡプライマーと、配列番号６記載のアンチセンス鎖ＤＮＡプライマーを合成し、該合成ＤＮＡをプライマーとして、W3110株の染色体ＤＮＡを鋳型として前述と同一の条件でＰＣＲを行った。
ＰＣＲ終了後、エタノール沈殿法によりＤＮＡの沈殿を取得した。該ＤＮＡ沈殿を２０μｌのＴＥに溶解した。該溶解液５μｌを用い、ＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＨｉｎｃＩＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離した後、ジーンクリーンＩＩキットにより２．３ｋｂの断片を回収した。pBluescriptＩＩSK+ ＤＮＡ ０．２μｇを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＶで切断し、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、同様に３．０ｋｂの断片を回収した。
【０１５４】
該２．３ｋｂの断片および３．０ｋｂの断片をライゲーションキットを用いて１６℃で１６時間連結反応を行った。
該連結反応液を用いてエシェリヒア・コリNM522株を前述の公知の方法に従って形質転換し、該形質転換体をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布後、３０℃で一晩培養した。
【０１５５】
生育してきた形質転換体のコロニーより前述の公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、ｇａｌＴ、ｇａｌＫ遺伝子を含むプラスミドであるｐＮＴ１９を得た。該プラスミドの構造を制限酵素消化により確認した（図３）。
該ｐＮＴ１９ ＤＮＡ０．５μｇを制限酵素ＣｌａＩおよびＢａｍＨＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、同様に２．３ｋｂの断片を回収した。実施例１−１）で取得したｐＰＡＣ３１ ＤＮＡ ０．２μｇを制限酵素ＣｌａＩおよびＢａｍＨＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、同様に５．５ｋｂの断片を回収した。
【０１５６】
該２．３ｋｂの断片および５．５ｋｂの断片をライゲーションキットを用いて１６℃で１６時間、連結反応を行った。
該連結反応液を用いてエシェリヒア・コリNM52株を前述の公知の方法に従って形質転換し、該形質転換体をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布後、３０℃で一晩培養した。
【０１５７】
生育してきた形質転換体のコロニーより前述の公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、ｇａｌＴ、ｇａｌＫ同時発現プラスミドであるｐＮＴ２５を得た。該プラスミドの構造を制限酵素消化により確認した（図３）。
【０１５８】
実施例４  ＵＤＰ−Ｇａｌの生産
１）ｇａｌＴ、ｇａｌＫ、ｇａｌＵ、ｐｐａ発現株の造成
実施例１−３）で得たｐＮＴ３２ ＤＮＡを用いてエシェリヒア・コリNM522/pNT25株を常法に従って形質転換し、該形質転換体をアンピシリン５０μｇ／ｍｌおよびクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布後、３０℃で一晩培養した。生育してきた形質転換体を選択することにより、ｇａｌＴ、ｇａｌＫ、ｇａｌＵ、ｐｐａ発現株であるエシェリヒア・コリNM522/pNT25/pNT32株を得た。
２）ＵＤＰ−Ｇａｌの生産
実施例４−１）で得たエシェリヒア・コリNM522/pNT25/pNT32株を実施例２と同様の方法で培養し、得られた各々の培養物を遠心分離し、湿菌体を取得した。また、コリネバクテリウム・アンモニアゲネスATCC21170株を実施例２と同様の方法で培養し、得られた培養物を遠心分離し、湿菌体を取得した。該湿菌体は必要に応じて−２０℃で保存することが可能で、使用前に解凍して用いることができる。
【０１５９】
エシェリヒア・コリNM522/pNT25/pNT32株湿菌体 ５０ｇ／ｌ、コリネバクテリウム・アンモニアゲネスATCC21170株湿菌体 １５０ｇ／ｌ、グルコース ８０ｇ／ｌ、ガラクトース ２０ｇ／ｌ、ＫＨ2ＰＯ4 １５ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ５ｇ／ ｌ、フィチン酸 ５ｇ／ｌ、オロット酸（カリウム塩） ２１．２ｇ／ｌ、ナイミーンＳ−２１５ ４ｇ／ｌ、キシレン１０ｍｌ／ｌの組成からなる反応液２Ｌを５Ｌ容培養槽に入れ、該反応液を６００ｒｐｍにて攪拌し、１Ｌ／ｍｉｎにて通気し、３２℃で２６時間反応を行った。
【０１６０】
反応中、４Ｎ ＮａＯＨを用いて、該反応液のｐＨ７．２に維持し、必要に応じて、グルコース、ガラクトース、ＫＨ2ＰＯ4を添加した。
該反応により、反応液中に４７．４ｇ／ｌのＵＤＰ−Ｇａｌ（２Ｎａ塩）が生成した。
【０１６１】
実施例５  ｇａｌＴ、ｇａｌＫをコリネバクテリウム・アンモニアゲネスで発現する組換え体プラスミドの造成
エシェリヒア・コリ由来のｇａｌＴ、ｇａｌＫをコリネバクテリウム・アンモニアゲネスで発現する組換え体プラスミドｐＴＫ７の造成方法について以下に述べる（図４）。
１）ｐＣＧ１１６の造成
コリネバクテリウム・アンモニアゲネスで複製できるプラスミドｐＣＧ１１６の造成を以下のように行った。
【０１６２】
プラスミドｐＣＧ１１(特公平6-91827) ＤＮＡ０．５μｇを制限酵素ＰｓｔＩおよびＳｔｕＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、ジーンクリーンＩＩキットにより６．５ｋｂの断片を回収した。
一方、プラスミドｐＵＣ１９ ＤＮＡ１．０μｇを制限酵素ＥｃｏＲＩで 切断後、DNA Blunting Kit(宝酒造社製)により平滑末端化した。平滑末端化した該ＤＮＡをＰｓｔＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、MERmaid Kit（Ｂｉｏ１０１社製）により４３ｂｐの断片を回収した。
【０１６３】
該６．５ｋｂの断片および４３ｂｐの断片をライゲーションキットを用いて、１６℃で１６時間、連結反応を行った。
該連結反応液を用いてコリネバクテリウム・アンモニアゲネスATCC21170 株をエレクトロポーレーション法[FEMS Microbiol. Lett., 65, 299 (1989)]で形質転換し、該形質転換体をスペクチノマイシン１００μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布後、３０℃で2日間培養した。
【０１６４】
生育してきた形質転換体のコロニーより公知の方法[J. Bacteriol., 159 306 (1984)]に従ってプラスミドを抽出し、プラスミドｐＣＧ１１６を得た。該プラスミドの構造を制限酵素消化により確認した（図４）。
２）ｇａｌＴ、ｇａｌＫを発現するプラスミドｐＴＫ７の造成
実施例３で造成したｇａｌＴ、ｇａｌＫを発現するプラスミドｐＮＴ２５ＤＮＡ１．０μｇを制限酵素ＸｈｏＩおよびＢａｍＨＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、ジーンクリーンＩＩキットにより３．５ｋｂの断片を回収した。
【０１６５】
一方、実施例５−１）で造成したプラスミドｐＣＧ１１６ ＤＮＡ０．５μｇを制限酵素ＳａｌＩおよびＢａｍＨＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、同様に６．５ｋｂの断片を回収した。
該３．５ｋｂの断片および６．５ｋｂの断片をライゲーションキットを用いて１６℃で１６時間、連結反応を行った。
【０１６６】
該連結反応液を用いてコリネバクテリウム・アンモニアゲネスATCC21170株をエレクトロポーレーション法で形質転換し、該形質転換体をスペクチノマイシン１００μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布後、３０℃で2日間培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーより公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、ｇａｌＴ、ｇａｌＫ同時発現プラスミドであるｐＴＫ７を得た。該プラスミドの構造を制限酵素消化により確認した（図４）。
【０１６７】
実施例６  ＵＤＰ−Ｇａｌの生産
実施例５で得たコリネバクテリウム・アンモニアゲネスATCC21170/pTK7株を実施例２と同様の方法で３２℃で２０時間培養した後、４０℃で４時間培養し、得られた培養物を遠心分離し、湿菌体を取得した。該湿菌体は必要に応じて−２０℃で保存することが可能で、使用前に解凍して用いることができる。
【０１６８】
コリネバクテリウム・アンモニアゲネスATCC21170/pTK7株湿菌体 １５０ｇ／ｌ、フルクトース ４０ｇ／ｌ、ガラクトース ２０ｇ／ｌ 、ＫＨ2ＰＯ4 １５ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ５ｇ／ｌ、フィチン酸 ５ｇ／ｌ、オロット酸（カリウム塩）１０．６ｇ／ｌ、ナイミーンＳ−２１５ ４ｇ／ｌ、キシレン １０ｍｌ／ｌの組成からなる反応液３０ｍｌを２００ｍｌ容ビーカーに入れ、該反応液をマグネティック・スターラーにて攪拌（９００ｒｐｍ）し、３２℃で２２時間反応を行った。
【０１６９】
反応中、４Ｎ ＮａＯＨを用いて、該反応液のｐＨ７．２に維持し、必要に応じて、フルクトース、ガラクトース、ＫＨ2ＰＯ4を添加した。
該反応により、反応液中に７．２ｇ／ｌのＵＤＰ−Ｇａｌ（２Ｎａ塩）が生成した。
【０１７０】
実施例７  ｇｌｍＵ、ｐｐａ、ｐｇｍ、ｇｌｍＭ、ｇｌｋ、ｐｆｋＢ発現プラスミドの造成
１）ｇｌｍＵ、ｐｐａ発現プラスミドの造成
配列番号７記載のセンス鎖ＤＮＡプライマーと、配列番号８記載のアンチセンス鎖ＤＮＡプライマーを合成した。該合成ＤＮＡをプライマーとして、W3110株の染色体ＤＮＡを鋳型として前述と同一の条件でＰＣＲを行った。
【０１７１】
ＰＣＲ終了後、エタノール沈殿法によりＤＮＡの沈殿を取得した。該ＤＮＡ沈殿を２０μｌのＴＥに溶解した。該溶解液５μｌを用い、ＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、ジーンクリーンＩＩキットにより１．４ｋｂの断片を回収した。実施例１−１）で取得したｐＰＡ３１ ＤＮＡ０．５μｇを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、同様に４．２ｋｂの断片を回収した。
【０１７２】
該１．４ｋｂの断片および４．２ｋｂの断片をライゲーションキットを用いて１６℃で１６時間、連結反応を行った。
該連結反応液を用いてエシェリヒア・コリKY8415株を前述の公知の方法に従って形質転換し、該形質転換体をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布後、３０℃で一晩培養した。
【０１７３】
生育してきた形質転換体のコロニーより前述の公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、ｇｌｍＵ発現プラスミドであるｐＮＴ１０を得た。該プラスミドの構造を制限酵素消化により確認した（図５）。
実施例１−３）で取得したｐＮＴ１２ ＤＮＡ０．５μｇを制限酵素ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し同様に１．０ｋｂの断片を回収した。上記ｐＮＴ１０ ＤＮＡ ０．２μｇを制限酵素ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、同様に５．３ｋｂの断片を回収した。
【０１７４】
該１．０ｋｂの断片および５．３ｋｂの断片をライゲーションキットを用いて１６℃で１６時間、連結反応を行った。
該連結反応液を用いてエシェリヒア・コリKY8415株を前述の公知の方法に従って形質転換し、該形質転換体をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布後、３０℃で一晩培養した。
【０１７５】
生育してきた形質転換体のコロニーより前述の公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、ｇｌｍＵ、ｐｐａ同時発現プラスミドであるｐＮＴ１４を得た。該プラスミドの構造を制限酵素消化により確認した（図５）。
２）ｐｇｍ発現プラスミドの造成
配列番号９記載のセンス鎖ＤＮＡプライマーと、配列番号１０記載のアンチセンス鎖ＤＮＡプライマーを合成した。該合成ＤＮＡをプライマーとして、W3110株の染色体ＤＮＡを鋳型として前述と同一の条件でＰＣＲを行った。
【０１７６】
ＰＣＲ終了後、エタノール沈殿法により、ＤＮＡの沈殿を取得した。該沈殿を２０μｌのＴＥに溶解した。該溶解液５μｌを用い、ＤＮＡを制限酵素ＣｌａＩおよびＢａｍＨＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、ジーンクリーンＩＩキットにより１．８ｋｂの断片を回収した。実施例１−１）で取得したｐＰＡＣ３１ ＤＮＡ０．２μｇを制限酵素ＣｌａＩおよびＢａｍＨＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、同様に５．５ｋｂの断片を回収した。
【０１７７】
該１．８ｋｂの断片および５．５ｋｂの断片をライゲーションキットを用いて１６℃で１６時間、連結反応を行った。
該連結反応液を用いてエシェリヒア・コリNM522株を前述の公知の方法に従って形質転換し、該形質転換体をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布後、３０℃で一晩培養した。
【０１７８】
生育してきた形質転換体のコロニーより前述の公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、ｐｇｍ発現プラスミドであるｐＮＴ２４を得た。該プラスミドの構造を制限酵素消化により確認した（図６）。
３）ｇｌｍＭ発現プラスミドの造成
配列番号１１記載のセンス鎖ＤＮＡプライマーと配列番号１２記載のアンチセンス鎖ＤＮＡプライマーを合成した。該合成ＤＮＡをプライマーとし、エシェリヒア・コリW3110株の染色体ＤＮＡを鋳型として前述と同一の条件でＰＣＲを行った。
【０１７９】
ＰＣＲ終了後、エタノール沈殿法によりＤＮＡの沈殿を取得した。該沈殿を２０μｌのＴＥに溶解した。該溶解液５μｌを用い、ＤＮＡを制限酵素ＣｌａＩおよびＢａｍＨＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、ジーンクリーンＩＩキットにより１．６ｋｂの断片を回収した。実施例１−１）で取得したｐＰＡＣ３１ ＤＮＡ ０．２μｇを制限酵素ＣｌａＩおよびＢａｍＨＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、同様に５．５ｋｂの断片を回収した。
【０１８０】
該１．６ｋｂの断片および５．５ｋｂの断片をライゲーションキットを用いて１６℃で１６時間連結反応を行った。
該連結反応液を用いてエシェリヒア・コリNM522株を常法に従って形質転換し、該形質転換体をアンピシリン５０μｇ／ｌを含むＬＢ寒天培地に塗布後、３０℃で一晩培養した。
【０１８１】
生育してきた形質転換体のコロニーより常法に従ってプラスミドを抽出し、ｇｌｍＭ発現プラスミドであるｐＮＴ４４を得た。該プラスミドの構造を制限酵素消化により確認した（図７）。
４）ｇｌｋ発現プラスミドの造成
配列番号１３記載のセンス鎖ＤＮＡプライマーと配列番号１４記載のアンチセンス鎖ＤＮＡプライマーを合成した。該合成ＤＮＡをプライマーとし、エシェリヒア・コリW3110株の染色体ＤＮＡを鋳型として前述と同一の条件でＰＣＲを行った。
【０１８２】
ＰＣＲ終了後、エタノール沈殿法によりＤＮＡの沈殿を取得し、該沈殿を２０μlのＴＥに溶解した。該溶解液５μｌを用い、ＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、ジーンクリーンＩＩキットにより０．５ｋｂの断片を回収した。
実施例１−１）で取得したｐＰＡ３１ ＤＮＡ ０．２μｇを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、同様に４．２ｋｂの断片を回収した。
【０１８３】
該０．５ｋｂの断片および４．２ｋｂの断片をライゲーションキットを用いて１６℃で１６時間連結反応を行った。該連結反応液を用いてエシェリヒア・コリNM522株を常法に従って形質転換し、該形質転換体をアンピシリン５０μｇ／ｌを含むＬＢ寒天培地に塗布後、３０℃で一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーより常法に従ってプラスミドを抽出し、ｇｌｋの一部を有するプラスミドであるｐＮＴ４５を得た。該プラスミドの構造を制限酵素消化により確認した（図８）。
【０１８４】
上述と同一の条件でＰＣＲを行い、得られたＤＮＡ溶解液5μｌを用い、ＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、同様に０．５ｋｂの断片を回収した。上に記した方法で取得したｐＮＴ４５ ＤＮＡ ０．２μｇを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで切断後アルカリホスファターゼにより脱リン酸化処理を行い、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、同様に４．７ｋｂの断片を回収した。
【０１８５】
該０．５ｋｂの断片および４．７ｋｂの断片をライゲーションキットを用いて１６℃で１６時間連結反応を行った。
該連結反応液を用いてエシェリヒア・コリNM522株を常法に従って形質転換し、該形質転換体をアンピシリン５０μｇ／ｌを含むＬＢ寒天培地に塗布後、３０℃で一晩培養した。
【０１８６】
生育してきた形質転換体のコロニーより常法に従ってプラスミドを抽出し、ｇｌｋを発現するプラスミドであるｐＮＴ４６を得た。該プラスミドの構造を制限酵素消化により確認した（図８）。
５）ｐｆｋＢ発現プラスミドの造成
配列番号１５記載のセンス鎖ＤＮＡプライマーと配列番号１６記載のアンチセンス鎖ＤＮＡプライマーを合成した。該合成ＤＮＡをプライマーとし、W3110株の染色体ＤＮＡを鋳型として前述と同一の条件でＰＣＲを行った。
【０１８７】
ＰＣＲ終了後、エタノール沈殿法によりＤＮＡの沈殿を取得した。該沈殿を２０μｌのＴＥに溶解した。該溶解液5μｌを用い、ＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＶで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、ジーンクリーンＩＩキットにより１．３ｋｂの断片を回収した。pBluescriptＩＩSK+ ＤＮＡ ０．２μｇを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ およびＥｃｏＲＶで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、同様に３．０ｋｂの断片を回収した。
【０１８８】
該１．３ｋｂの断片および３．０ｋｂの断片をライゲーションキットを用いて１６℃で１６時間連結反応を行った。
該連結反応液を用いてエシェリヒア・コリNM522株を常法に従って形質転換し、該形質転換体をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布後３０℃で一晩培養した。
【０１８９】
生育してきた形質転換体のコロニーより常法に従ってプラスミドを抽出し、ｐｆｋＢ遺伝子を保有するプラスミドｐＮＴ４３を得た。該プラスミドの構造を制限酵素消化により確認した（図９）。
ｐＮＴ４３ ＤＮＡ ０．５μｇを用い、ＤＮＡを制限酵素ＣｌａＩおよびＳａｃＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、同様に１．３ｋｂの断片を回収した。
【０１９０】
実施例１−１）で取得したｐＰＡＣ３１ ＤＮＡ ０．２μｇを制限酵素ＣｌａＩおよびＳａｃＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し同様に５．７ｋｂの断片を回収した。
該１．３ｋｂの断片および５．７ｋｂの断片をライゲーションキットを用いて１６℃で１６時間連結反応を行った。
【０１９１】
該連結反応液を用いてエシェリヒア・コリNM522株を常法に従って形質転換し、該形質転換体をアンピシリン５０μｇ／ｌを含むＬＢ寒天培地に塗布後、３０℃で一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーより常法に従ってプラスミドを抽出し、ｐｆｋＢ発現プラスミドであるｐＮＴ４７を得た。該プラスミドの構造を制限酵素消化により確認した（図９）。
【０１９２】
実施例８  ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃの生産
実施例７で得たエシェリヒア・コリKY8415/pNT14株、NM522/pNT24株、NM522/pNT44株、NM522/pNT47株を実施例２と同様の方法で培養し、得られた各々の培養物を遠心分離し、湿菌体を取得した。該湿菌体は必要に応じて−２０℃で保存することが可能で、使用前に解凍して用いることができる。
【０１９３】
エシェリヒア・コリNM522/pNT24株湿菌体６ｇ／ｌ、NM522/pNT47株湿菌体６ｇ／ｌ、１００ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、６ｍＭ ＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏ 、１０ｍＭ グルコース-6-リン酸、２．５ｍＭ フルクトース6-リン酸、２．５ｍＭ ＡＴＰ、ナイミーンＳ−２１５ ４ｇ／ｌの組成からなる反応液０．１ｍｌを１．５ｍｌ容チューブに入れ、３７℃で１時間反応を行った。反応液を６５℃で５分間処理後、エシェリヒア・コリKY8415/pNT14株湿菌体０．３ｇ／ｌ、NM522/pNT44株湿菌体６ｇ／ｌ、５ｍＭ グルコサミン-6-リン酸、５ｍＭ アセチルＣｏＡ、５ｍＭ ＵＴＰとなるように菌体および基質を添加し、さらに３７℃で３０分間反応させたところ、反応液中に２．５ｍＭ（１．６ｇ／ｌ）のＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ（２Ｎａ塩）が生成した。この際、エシェリヒア・コリNM522/pNT24株湿菌体あるいはNM522/pNT47株湿菌体を添加しなかった場合のＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ生成量はそれぞれ０．０８ｍＭ、０．１６ｍＭであった。
【０１９４】
このことは、ｐｇｍ発現株とｐｆｋＢ発現株の組み合わせにより、ｇｌｍＭの活性発現に必要なＧｌｃ−１，６−Ｐ２が供給できることを示している。
【０１９５】
実施例９  ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃの生産
実施例７で得たエシェリヒア・コリKY8415/pNT14株、NM522/pNT24株、NM522/pNT44株、NM522/pNT46株、NM522/pNT47株を実施例２と同様の方法で培養し、得られた各々の培養物を遠心分離し湿菌体を取得した。また、コリネバクテリウム・アンモニアゲネスATCC21170株を実施例２と同様の方法で培養し、得られた培養物を遠心分離し湿菌体を取得した。該湿菌体は必要に応じて−２０℃で保存することが可能で、使用前に解凍して用いることができる。
【０１９６】
エシェリヒア・コリKY8415/pNT14株、NM522/pNT24株、NM522/pNT44株、NM522/pNT47株、NM522/pNT46株湿菌体を各１０ｇ／ｌ、コリネバクテリウム・アンモニアゲネスATCC21170株湿菌体 １５０ｇ／ｌ、フルクトース ５０ｇ／ｌ、グルコサミン塩酸塩８０ｇ／ｌ、ＫＨ2ＰＯ4 １５ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ５ｇ／ｌ、フィチン酸 ５ｇ／ｌ、オロット酸（カリウム塩） １０ｇ／ｌ、ナイミーンＳ−２１５ ４ｇ／ｌ、キシレン １０ｍｌ／ｌの組成からなる反応液３０ｍｌを２００ｍｌ容ビーカーに入れ、この反応液をマグネティック・スターラーにて攪拌（９００ｒｐｍ）し、３２℃で１０時間反応を行った。
【０１９７】
反応中４Ｎ ＮａＯＨを用いて、該反応液のｐＨを７．２に維持し、必要に応じてフルクトース、ＫＨ2ＰＯ4を添加した。
該反応により、反応液中に６．２ｇ／ｌのＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ（２Ｎａ 塩）が生成した。
【０１９８】
実施例１０  ｇａｌＫ発現プラスミドの造成
実施例３−１）で取得したｐＮＴ２５ ＤＮＡ ０．５μｇを制限酵素ＣｌａＩおよびＥｃｏＲＶで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、ジーンクリーンＩＩキットにより６．７ｋｂの断片を回収した。回収したＤＮＡをDNA Blunting Kitにより平滑末端化した後、ライゲーションキットを用いて１６℃で１６時間連結反応を行った。
【０１９９】
該連結反応液を用いてエシェリヒア・コリNM522株を常法に従って形質転換し、該形質転換体をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布後３０℃で一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーより常法に従ってプラスミドを抽出し、ｇａｌＫ発現プラスミドであるｐＮＴ５４を得た。該プラスミドの構造を制限酵素消化により確認した（図１０）。
【０２００】
実施例１１  ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃの生産
実施例１０で得たエシェリヒア・コリNM522/pNT54株を実施例２と同様の方法で培養し、得られた培養物を遠心分離し湿菌体を取得した。また、コリネバクテリウム・アンモニアゲネスATCC21170株を実施例２と同様の方法で培養し、得られた培養物を遠心分離し湿菌体を取得した。該湿菌体は必要に応じて−２０℃で保存することが可能で、使用前に解凍して用いることができる。
【０２０１】
エシェリヒア・コリNM522/pNT54株湿菌体５０ｇ／ｌ、コリネバクテリウム・アンモニアゲネスATCC21170株湿菌体１５０ｇ／ｌ、フルクトース４０ｇ／ｌ、Ｎ−アセチルグルコサミン６７ｇ／ｌ、ＫＨ2ＰＯ4 １５ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ５ｇ／ｌ、フィチン酸５ｇ／ｌ、オロット酸（カリウム塩）１０ ｇ／ｌ、ナイミーンＳ−２１５ ４ｇ／ｌ、キシレン１０ｍｌ／ｌの組成からなる反応液３０ｍｌを２００ｍｌ容ビーカーに入れ、この反応液をマグネティック・スターラーにて攪拌（９００ｒｐｍ）し、３２℃で２７時間反応を行った。
【０２０２】
反応中４Ｎ ＮａＯＨを用いて、該反応液のｐＨを７．２に維持し、必要に応じてフルクトース、ＫＨ2ＰＯ4を添加した。
該反応により、反応液中に１７．１ｇ／ｌのＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ（２Ｎａ塩）が生成した。
【０２０３】
実施例１２  ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃとＵＤＰ−Ｇａｌの同時生産
実施例３で得たNM522/pNT25株を実施例２と同様の方法で培養し、得られた培養物を遠心分離し湿菌体を取得した。また、コリネバクテリウム・アンモニアゲネスATCC21170株を実施例２と同様の方法で培養し、得られた培養物を遠心分離し湿菌体を取得した。該湿菌体は必要に応じて−２０℃で保存することが可能で、使用前に解凍して用いることができる。
【０２０４】
エシェリヒア・コリNM522/pNT25株湿菌体２５ｇ／ｌ、コリネバクテリウム・アンモニアゲネスATCC21170株湿菌体 １５０ｇ／ｌ、フルクトース ６０ｇ／ｌ、Ｎ−アセチルグルコサミン ５０ｇ／ｌ、ガラクトース ４０ｇ／ｌ、ＫＨ2ＰＯ4  １５ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ５ｇ／ｌ、フィチン酸 ５ｇ／ｌ、オロット酸（カリウム塩） １０ｇ／ｌ、ナイミーンＳ−２１５ ４ｇ／ｌ、キシレン１０ｍｌ／ｌの組成からなる反応液３０ｍｌを２００ｍｌ容ビーカーに入れ、この反応液をマグネティック・スターラーにて攪拌（９００ｒｐｍ）し、３２℃で２４時間反応を行った。
【０２０５】
反応中４Ｎ ＮａＯＨを用いて、該反応液のｐＨを７．２に維持し、必要に応じてＫＨ2ＰＯ4を添加した。
該反応により、反応液中に１１．４ｇ／ｌのＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ（２Ｎａ塩）および１８ｇ／ｌのＵＤＰ−Ｇａｌ（２Ｎａ塩）が生成した。
実施例１３  ｍａｎＢ、ｍａｎＣ、ｐｇｍ、ｐｆｋＢ発現プラスミドの造成
１）ｍａｎＢ、ｍａｎＣ発現プラスミドの造成
配列番号１７記載のセンス鎖ＤＮＡプライマーと配列番号１８記載のアンチセンス鎖ＤＮＡプライマーを合成した。該合成ＤＮＡをプライマーとし、エシェリヒア・コリW3110株染色体ＤＮＡを鋳型として前述と同一の条件でＰＣＲを行った。
【０２０６】
ＰＣＲ終了後、エタノール沈殿法によりＤＮＡの沈殿を取得した。該沈殿を２０μlのＴＥに溶解した。該溶解液5μｌを用い、ＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、ジーンクリーンＩＩキットにより３．０ｋｂの断片を回収した。pBluescriptＩＩSK+ ＤＮＡ ０．２μｇを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩお よびＢａｍＨＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、同様に３．０ｋｂの断片を回収した。
【０２０７】
該３．０ｋｂの両断片をライゲーションキットを用いて１６℃で１６時間連結反応を行った。該連結反応液を用いてエシェリヒア・コリNM522株を常法に従って形質転換し、該形質転換体をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布後、３０℃で一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーより常法に従ってプラスミドを抽出し、ｍａｎＣおよびｍａｎＢを含むプラスミドであるｐＮＫ６を得た。該プラスミドの構造を制限酵素消化により確認した（図１１）。
【０２０８】
該ｐＮＫ６ ＤＮＡ ０．５μｇを制限酵素ＣｌａＩおよびＢａｍＨＩで切断後アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し３．０ｋｂの断片を回収した実施例１−１）で取得したｐＰＡＣ３１ ＤＮＡ ０．２μｇを制限酵素ＣｌａＩおよびＢａｍＨＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し同様に５．５ｋｂの断片を回収した。
【０２０９】
該３．０ｋｂの断片および５．５ｋｂの断片をライゲーションキットを用いて１６℃で１６時間連結反応を行った。該連結反応液を用いてエシェリヒア・コリNM522株を常法に従って形質転換し、該形質転換体をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布後、３０℃で一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーより常法に従ってプラスミドを抽出し、ｍａｎＣおよびｍａｎＢ発現プラスミドであるｐＮＫ７を得た。該プラスミドの構造を制限酵素消化により確認した（図１１）。
２）ｐｇｍ、ｐｆｋＢ同時発現プラスミドの造成
実施例７で取得したｐＮＴ２４ ＤＮＡ ０．５μｇを制限酵素ＸｈｏＩおよびＢａｍＨＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離しジーンクリーンＩＩキットにより３．０ｋｂの断片を回収した。一方、ｐＳＴＶ２８ ＤＮＡ（宝酒造社製）０．２μｇを制限酵素ＳａｌＩおよびＢａｍＨＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、同様に３．０ｋｂの断片を回収した。
【０２１０】
該３．０ｋｂの両断片をライゲーションキットを用いて１６℃で１６時間連結反応を行った。該連結反応液を用いてエシェリヒア・コリNM522株を常法に従って形質転換し、該形質転換体をクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布後、３０℃で一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーより常法に従ってプラスミドを抽出し、ｐｇｍ遺伝子を有するプラスミドであるｐＮＴ５３を得た。該プラスミドの構造を制限酵素消化により確認した（図１２）。
【０２１１】
配列番号１９記載のセンス鎖ＤＮＡプライマーを合成し、該センス鎖ＤＮＡプライマーおよび配列番号１６記載のアンチセンス鎖ＤＮＡプライマーを用い、実施例７で取得したプラスミドｐＮＴ４７ ＤＮＡを鋳型として前述と同一の条件でＰＣＲを行った。
ＰＣＲ終了後、エタノール沈殿法によりＤＮＡの沈殿を取得した。該沈殿を２０μｌのＴＥに溶解した。該溶解液5μｌを用い、ＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＶおよびＢｇｌＩＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、同様に１．３ｋｂの断片を回収した。ｐＮＴ５３ ＤＮＡ ０．２μｇを制限酵素ＳｍａＩおよびＢａｍＨＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、同様に６．０ｋｂの断片を回収した。
【０２１２】
該１．３ｋｂの断片および６．０ｋｂの断片をライゲーションキットを用いて１６℃で１６時間連結反応を行った。
該連結反応液を用いてエシェリヒア・コリNM522株を常法に従って形質転換し、該形質転換体をクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布後、３０℃で一晩培養した。
【０２１３】
生育してきた形質転換体のコロニーより常法に従ってプラスミドを抽出し、ｐｇｍおよびｐｆｋＢ発現プラスミドであるｐＮＴ５５を得た。該プラスミドの構造を制限酵素消化により確認した（図１２）。
【０２１４】
実施例１４  ＧＤＰ−Ｍａｎの生産
１）ｍａｎＢ、ｍａｎＣ、ｐｇｍ、ｐｆｋＢ発現株の造成
実施例１３−２）で得たｐＮＴ５５ ＤＮＡを用いてエシェリヒア・コリNM522/pNK7株を常法に従って形質転換し、該形質転換体をアンピシリン５０μｇ／ｍｌおよびクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布後、３０℃で一晩培養した。生育してきた形質転換体を選択することにより、ｍａｎＢ、ｍａｎＣ、ｐｇｍ、ｐｆｋＢ発現株であるエシェリヒア・コリNM522/pNK7/pNT55株を得た。
２）ＧＤＰ−Ｍａｎの生産
上記１）で得たエシェリヒア・コリNM522/pNK7/pNT55株および実施例７で得たエシェリヒア・コリNM522/pNT46を実施例２と同様の方法で培養し、得られた各々の培養物を遠心分離し湿菌体を取得した。また、コリネバクテリウム・アンモニアゲネスATCC21170株を実施例２と同様の方法で培養し、得られた培養物を遠心分離し湿菌体を取得した。該湿菌体は必要に応じて−２０℃で保存することが可能で、使用前に解凍して用いることができる。
【０２１５】
エシェリヒア・コリNM522/pNK7/pNT55株湿菌体２５ｇ／ｌ、NM522/pNT46株湿菌体２５ｇ／ｌ、コリネバクテリウム・アンモニアゲネスATCC21170株湿菌体 １５０ｇ／ｌ、フルクトース ６０ｇ／ｌ、マンノース ５０ｇ／ｌ、ＫＨ2ＰＯ4 １５ｇ／ｌ、 ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ５ｇ／ｌ、フィチン酸 ５ｇ／ｌ、ＧＭＰ（２Ｎａ，７Ｈ2Ｏ塩） ６０ｇ／ｌ、ナイミーンＳ−２１５ ４ｇ／ｌ、キシレン１０ｍｌ／ｌの組成からなる反応液３０ｍｌを２００ｍｌ容ビーカーに入れ、この反応液をマグネティック・スターラーにて攪拌（９００ｒｐｍ）し、２４時間反応を行った。
【０２１６】
反応中４Ｎ ＮａＯＨを用いて、該反応液のｐＨを７．２に維持し、必要に応じてＫＨ2ＰＯ4を添加した。
該反応により、反応液中に１４．６ｇ／ｌのＧＤＰ−Ｍａｎ（２Ｎａ，１Ｈ2Ｏ塩）が生成した。
【０２１７】
実施例１５  ｇｍｄ、ｗｃａＧ発現プラスミドの造成
配列番号２０記載のセンス鎖ＤＮＡプライマーと配列番号２１記載のアンチセンス鎖ＤＮＡプライマーを合成した。該合成ＤＮＡをプライマーとし、エシェリヒア・コリW3110株染色体ＤＮＡを鋳型として前述と同一の条件でＰＣＲを行った。
【０２１８】
ＰＣＲ終了後、エタノール沈殿法によりＤＮＡの沈殿を取得した。該沈殿を２０μlのＴＥに溶解した。該溶解液5μｌを用い、ＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｈｏＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離しジーンクリーンＩＩキットにより２．３ｋｂの断片を回収した。
実施例１−１）で取得したｐＰＡ３１ ＤＮＡ ０．２μｇを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＳａｌＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、同様に３．９ｋｂの断片を回収した。
【０２１９】
該２．３ｋｂおよび３．９ｋｂの断片をライゲーションキットを用いて、１６℃で１６時間連結反応を行った。
該連結反応液を用いてエシェリヒア・コリNM522株を常法に従って形質転換し、該形質転換体をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布後、３０℃で一晩培養した。
【０２２０】
生育してきた形質転換体のコロニーより常法に従ってプラスミドを抽出し、ｇｍｄおよびｗｃａＧを含むプラスミドであるｐＮＫ８を得た。該プラスミドの構造を制限酵素消化により確認した（図１３）。
【０２２１】
実施例１６  ＧＤＰ−Ｆｕｃの生産
実施例１４で得たエシェリヒア・コリNM522/pNK7/pNT55株、実施例１５で得たNM522/pNK8株および実施例７で得たNM522/pNT46を実施例２と同様の方法で培養し得られた各々の培養物を遠心分離し湿菌体を取得した。また、コリネバクテリウム・アンモニアゲネスATCC21170株を実施例２と同様の方法で培養し、得られた培養物を遠心分離し湿菌体を取得した。該湿菌体は必要に応じて−２０℃で保存することが可能で、使用前に解凍して用いることができる。
【０２２２】
エシェリヒア・コリNM522/pNK7/pNT55株湿菌体 ２５ｇ／ｌ、エシェリヒア・コリNM522/pNK8株湿菌体 ２５ｇ／ｌ、エシェリヒア・コリNM522/pNT46株湿菌体２５ｇ／ｌ、コリネバクテリウム・アンモニアゲネスATCC21170株湿菌体  １５０ｇ／ｌ、フルクトース ４０ｇ／ｌ、マンノース ６０ｇ／ｌ、ＫＨ2ＰＯ4 1５ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ５ｇ／ｌ、フィチン酸 ５ｇ／ｌ、ＧＭＰ（２Ｎａ/７Ｈ2Ｏ塩） ６０ｇ／ｌ、ナイミーンＳ−２１５ ４ｇ／ｌ、キシレン１０ｍｌ／ｌの組成からなる反応液３０ｍｌを２００ｍｌ容ビーカーに入れ、この反応液をマグネティック・スターラーにて攪拌（９００ｒｐｍ）し、３２℃で２４時間反応を行った。
【０２２３】
反応中４Ｎ ＮａＯＨを用いて、該反応液のｐＨを７．２に維持し、必要に応じてＫＨ2ＰＯ4を添加した。
該反応により、反応液中に１．０ｇ／ｌのＧＤＰ−Ｆｕｃ（２．５Ｎａ，１Ｈ2Ｏ塩）が生成した。
【０２２４】
実施例１７  ｎｅｕＡ発現プラスミドの造成
エシェリヒア・コリK235株（ATCC13027）染色体ＤＮＡを実施例１と同様の方法で調製した。
【０２２５】
配列番号２２記載のセンス鎖ＤＮＡプライマーと配列番号２３記載のアンチセンス鎖ＤＮＡプライマーを合成した。該合成ＤＮＡをプライマーとし、エシェリヒア・コリK235株（ATCC13027）染色体ＤＮＡを鋳型として前述と同一の条件でＰＣＲを行った。
ＰＣＲ終了後、エタノール沈殿法によりＤＮＡの沈殿を取得した。該沈殿を２０μlのＴＥに溶解した。該溶解液５μｌを用い、ＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、ジーンクリーンＩＩキットにより１．３ｋｂの断片を回収した。pBluescriptＩＩSK+ ＤＮＡ ０．２μｇを制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、同様に３．０ｋｂの断片を回収した。
【０２２６】
該１．３ｋｂおよび３．０ｋｂの断片をライゲーションキットを用いて１６℃で１６時間連結反応を行った。該連結反応液を用いてエシェリヒア・コリNM522株を常法に従って形質転換し、該形質転換体をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布後、３０℃で一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーより常法に従ってプラスミドを抽出し、ｎｅｕＡ遺伝子を含むプラスミドであるｐＴＡ１２を得た。該プラスミドの構造を制限酵素消化により確認した（図１４）。
【０２２７】
該ｐＴＡ１２ ＤＮＡ ０．５μｇを制限酵素ＣｌａＩおよびＢａｍＨＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、同様に１．３ｋｂの断片を回収した。実施例１−１）で取得したｐＰＡＣ３１ ＤＮＡ ０．２μｇを制限酵素ＣｌａＩおよびＢａｍＨＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、同様に５．５ｋｂの断片を回収した。
【０２２８】
該１．３ｋｂの断片および５．５ｋｂの断片をライゲーションキットを用いて１６℃で１６時間連結反応を行った。
該連結反応液を用いてエシェリヒア・コリNM522株を常法に従って形質転換し、該形質転換体をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布後、３０℃で一晩培養した。
【０２２９】
生育してきた形質転換体のコロニーより常法に従ってプラスミドを抽出し、ｎｅｕＡ発現プラスミドであるｐＴＡ１４を得た。該プラスミドの構造を制限酵素消化により確認した（図１４）。
【０２３０】
実施例１８  ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃの生産
実施例１７で得たエシェリヒア・コリNM522/pTA14株、C600/pNAL1株［Appl. Environ. Micribiol., 51 562 (1986)］およびJF646/pMW5株［J. Biol. Chem., 261, 5568 (1986)］を実施例２と同様の方法で培養し、得られた各々の培養物を遠心分離し湿菌体を取得した。また、コリネバクテリウム・アンモニアゲネスATCC21170株を実施例２と同様の方法で培養し、得られた培養物を遠心分離し湿菌体を取得した。該湿菌体は必要に応じて−２０℃で保存することが可能で、使用前に解凍して用いることができる。
【０２３１】
エシェリヒア・コリNM522/pTA14株湿菌体 ５０ｇ／ｌ、エシェリヒア・コリC600/pNAL1株湿菌体 １５ｇ／ｌ、エシェリヒア・コリJF646/pMW5株湿菌体 ２５ｇ／ｌ、コリネバクテリウム・アンモニアゲネスATCC21170株湿菌体 １５０ｇ／ｌ、オロット酸（カリウム塩） １０ｇ／ｌ、ピルビン酸（Ｎａ塩） ２０ｇ／ｌ、フルクトース ４０ｇ／ｌ、Ｎ−アセチルマンノサミン １０ｇ／ｌ、ＫＨ2ＰＯ4１５ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ５ｇ／ｌ、フィチン酸 ５ｇ／ｌ、ナイミーンＳ−２１５ ４ｇ／ｌ、キシレン１０ｍｌ／ｌの組成からなる反応液３０ｍｌを２００ｍｌ容ビーカーに入れ、この反応液をマグネティック・スターラーにて攪拌（９００ｒｐｍ）し、３２℃で２４時間反応を行った。
【０２３２】
反応中４Ｎ ＮａＯＨを用いて、該反応液のｐＨを７．２に維持し、必要に応じてＫＨ2ＰＯ4を添加した。
該反応により、反応液中に２．７ｇ／ｌのＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ（Ｎａ塩）が生成した。
【０２３３】
実施例１９  ラクト−Ｎ−テトラオースの生産
１）β1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼの調製
プロテインＡのＩｇＧ結合領域とβ1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼとの融合蛋白質をコードしている遺伝子を含むプラスミドpAMoERSAW1（特開平6-181759）で形質転換したナマルバＫＪＭ−１株をＧ４１８（ギブコ社製）を０．５ｍｇ／ｍｌ含むＲＰＭＩ６４０・ＩＴＰＳＧＦ培地３０ｍｌに５ｘ１０4ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるように懸濁し、ＣＯ2インキュベーター中で３７℃で８日間培養した。
【０２３４】
該培養液から遠心分離により細胞を除き上清を回収した。該上清は、必要に応じて−８０℃で保存可能であり、使用前に解凍して使用することができる。
該プロテインＡのＩｇＧ結合領域とβ1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼとの融合蛋白質が生成された培養上清にアジ化ナトリウムを最終濃度０．１％になるように添加した後、製品説明書に従って前処理したＩｇＧセファロース（ファルマシア社製）を５０μｌ添加し、４℃で一晩緩やかに攪拌した。
【０２３５】
攪拌後、遠心分離によりβ1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼの結合したＩｇＧセファロースを回収し、ＲＰＭＩ６４０・ＩＴＰＳＧＦ培地１ｍｌで３回洗浄後、該ＩｇＧセファロースをβ1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼの酵素源として用いた。
２）ラクト−Ｎ−テトラオースの生産
ラクト−Ｎ−ネオテトラオース（オックスフォード・グライコシステムズ社製）を公知の方法により［Agric. Biol. Chem., 54, 2169 (1990)］に従って２−アミノピリジンにより蛍光標識した後、０．１Ｕのβ−ガラクトシダーゼ（生化学工業社製）を加えて３７℃で１６時間反応させ、非還元末端のガラクトースを除去した。
【０２３６】
該反応液を、５分間、１００℃で加熱し、β−ガラクトシダーゼを失活させた。
該反応により得られたＧｌｃＮＡｃβ1-3Ｇａｌβ1-4Ｇｌｃを複合糖質前駆体として用いた。
該複合糖質前駆物質 ０．５ｍＭ、上記１）で取得したＩｇＧセファロース結合β1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ ０．５Ｕ、実施例４で取得したＵＤＰ−Ｇａｌを含む反応液６μｌ（５ｍＭ）、１００ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．９） １０ｍＭ ＭｎＣｌ2、２ｍＭ β−メルカプトエタノールの組成からなる反応液３６μｌを、３２℃で６５時間放置し、反応を行った。
【０２３７】
反応終了後、該反応液に蓄積された生成物を下記条件でＨＰＬＣを用いて定量した。
カラム：TSKgel  ODS-80TMカラム(4.6mm x 30cm、TOSOH社製)
液相  ：０．０２Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ４．０）
温度  ：５０℃
流速  ：１ｍｌ／ｍｉｎ
検出  ：蛍光検出器（励起波長３２０ｎｍ、放射波長４００ｎｍ）
生成物の同定はアミノピリジンで標識したラクト−Ｎ−テトラオースと標識された生成物の溶出時間を比較することにより行った。
該反応により０．１７ｍＭ（０．１２ｇ／ｌ）のラクト−Ｎ−テトラオースが生成した。
【０２３８】
実施例２０  ラクト−Ｎ−ネオテトラオースの生産
実施例１９と同様な方法で、ラクト−Ｎ−ネオテトラオースからＧｌｃＮＡｃβ1-3Ｇａｌβ1-4Ｇｌｃを調製し、複合糖質前駆体として用いた。
【０２３９】
該複合糖質前駆体０．５ｍＭ、β1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼ（シグマ社製）０．５Ｕ、実施例４で取得したＵＤＰ−Ｇａｌを含む反応液６μｌ（５ｍＭ）、１００ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．９）、１０ｍＭ ＭｎＣｌ2、２ｍＭ β-メルカプトエタノールの組成からなる反応液３６μｌを、３２℃で６５時間放置し、反応を行った。
【０２４０】
反応終了後、該反応液に蓄積された生成物を、実施例１９−２）と同様の条件で、ＨＰＬＣを用いて定量した。なお、生成物の同定はアミノピリジンで標識したラクト−Ｎ−ネオテトラオースと生成物の溶出時間を比較することにより行った。
該反応により、０．１５ｍＭ（０．１１ｇ／ｌ）のラクト−Ｎ−ネオテトラオースが生成した。
【０２４１】
実施例２１  ラクト−Ｎ−フコペンタオースＩＩＩの生産
α1,3-フコシルトランスフェラーゼの結合したＩｇＧセファロースはプロテインＡのＩｇＧ結合領域とα1,3-フコシルトランスフェラーゼとの融合蛋白質をコードしている遺伝子を含むプラスミドpAMoA-FT6［J. Biol. Chem., 269, 14730 (1994)］で形質転換したナマルバＫＪＭ−１株から実施例１９−１）と同様な方法で調製し、α1,3-フコシルトランスフェラーゼの酵素源として用いた。
【０２４２】
ラクト−Ｎ−ネオテトラオース（オックスフォード・グライコシステムズ社製）０．２５ｍＭ、ＩｇＧセファロース結合α1,3-フコシルトランスフェラーゼ１．０Ｕ、実施例１６で取得したＧＤＰ−Ｆｕｃを含む反応液６μｌ（０．２５ｍＭ）、１００ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．９）、１０ｍＭ ＭｎＣｌ2の組成からなる反応液５０μｌを、３７℃で２４時間放置し、反応を行った。
【０２４３】
反応終了後、該反応液に蓄積された生成物をダイオネックス社製の糖分析装置（ＤＸ−５００）にて定量した。なお、生成物の同定はラクト−Ｎ−フコペンタオースＩＩＩ（オックスフォード・グライコシステムズ社製）と生成物の溶出時間を比較することにより行った。
該反応により、０．２１ｍＭ（０．１８ｇ／ｌ）のラクト−Ｎ−フコペンタオースＩＩＩが生成した。
【０２４４】
実施例２２  α1,-4ガラクトシルトランスフェラーゼ（ｌｇｔＣ）発現プラスミドの造成
Neisseria gonorrhoeae（ATCC33084株）染色体ＤＮＡを実施例１と同一の方法で調製した。
【０２４５】
配列番号２４記載のセンス鎖ＤＮＡプライマーと、配列番号２５記載のアンチセンス鎖ＤＮＡプライマーを合成した。該合成ＤＮＡをプライマーとし、Neisseria gonorrhoeae（ATCC33084株）染色体ＤＮＡを鋳型として前述と同一の条件でＰＣＲを行った。
ＰＣＲ終了後、エタノール沈殿法によりＤＮＡの沈殿を取得した。該沈殿を２０μlのＴＥに溶解した。該溶解液5μｌを用い、ＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで切断後、アガロースゲル電気泳動により
ＤＮＡ断片を分離し、ジーンクリーンＩＩキットにより１．０ｋｂの断片を回収した。実施例１―１）で取得したｐＰＡ３１ ＤＮＡ ０．２μｇを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、同様に４．２ｋｂの断片を回収した。
【０２４６】
該１．０ｋｂの断片および４．２ｋｂの断片をライゲーションキットを用いて１６℃で１６時間連結反応を行った。該連結反応液を用いてエシェリヒア・コリNM522株を常法に従って形質転換し、該形質転換体をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布後、３０℃で一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーより常法に従ってプラスミドを抽出し、ｌｇｔＣ発現プラスミドであるｐＧＴ３を得た。該プラスミドの構造を制限酵素消化により確認した（図１５）。
【０２４７】
実施例２３  グロボトリオースの生産
実施例４で得たエシェリヒア・コリNM522/pNT25/pNT32株、実施例２２で得たエシェリヒア・コリNM522/pGT3株を実施例２と同様の方法で培養し、得られた各々の培養物を遠心分離し湿菌体を取得した。また、コリネバクテリウム・アンモニアゲネスATCC21170株を実施例２と同様の方法で培養し、得られた培養物を遠心分離し湿菌体を取得した。該湿菌体は必要に応じて−２０℃で保存することが可能で、使用前に解凍して用いることができる。
【０２４８】
エシェリヒア・コリNM522/pNT25/pNT32株湿菌体 ５０ｇ／ｌ、エシェリヒア・コリNM522/pGT3株湿菌体 ５０ｇ／ｌ、コリネバクテリウム・アンモニアゲネスATCC21170株湿菌体 １５０ｇ ／ｌ、フルクトース １００ｇ／ｌ、ガラクトース １００ｇ／ｌ、ラクトース １００ｇ／ｌ、ＫＨ2ＰＯ4 １５ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ５ｇ／ｌ、フィチン酸 ５ｇ／ｌ、オロット酸（カリウム塩） １０ｇ／ｌ、ナイミーンＳ−２１５ ４ｇ／ｌ、キシレン １０ｍｌ／ｌの組成からなる反応液３０ｍｌを２００ｍｌ容ビーカーに入れ、この反応液をマグネティック・スターラーにて攪拌（９００ｒｐｍ）し、３２℃で３６時間反応を行った。
【０２４９】
反応中は４Ｎ ＮａＯＨを用いて該反応液のｐＨを７．２に維持し、必要に応じてガラクトース、ラクトース、フルクトース、ＫＨ2ＰＯ4を添加した。
該反応により、反応液中に１８８ｇ／ｌのグロボトリオースが生成した。
該反応液から遠心分離により菌体を除去し、得られた上清１０ｍｌから、活性炭を用いる方法により精製を行い、グロボトリオースの白色粉末１．５ｇを得た。
【０２５０】
実施例２４． Ｇａｌα1-4Ｇａｌβ1-4ＧｌｃＮＡｃの生産
実施例４で得たエシェリヒア・コリNM522/pNT25/pNT32株、実施例２２で得たエシェリヒア・コリNM522/pGT3株を実施例２と同様の方法で培養し、得られた各々の培養物を遠心分離し湿菌体を取得した。また、コリネバクテリウム・アンモニアゲネスATCC21170株を実施例２と同様の方法で培養し、得られた培養物を遠心分離し湿菌体を取得した。該湿菌体は必要に応じて−２０℃で保存することが可能で、使用前に解凍して用いることができる。
【０２５１】
エシェリヒア・コリNM522/pNT25/pNT32株湿菌体 ５０ｇ／ｌ、エシェリヒア・コリNM522/pGT3株湿菌体 ５０ｇ／ｌ、コリネバクテリウム・アンモニアゲネスATCC21170株湿菌体 １５０ｇ ／ｌ、フルクトース ５０ｇ／ｌ、ガラクトース ５０ｇ／ｌ、Ｎ−アセチルラクトサミン ９６ｇ／ｌ、ＫＨ2ＰＯ4 １５ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ５ｇ／ｌ、フィチン酸 ５ｇ／ｌ、オロット酸（カリウム塩）１０ｇ／ｌ、ナイミーンＳ−２１５ ４ｇ／ｌ、キシレン １０ｍｌ／ｌの組成からなる反応液３０ｍｌを２００ｍｌ容ビーカーに入れ、この反応液をマグネティック・スターラーにて攪拌（９００ｒｐｍ）し、３２℃で２３時間反応を行った。
反応中は４Ｎ ＮａＯＨを用いて該反応液のｐＨを７．２に維持し、必要に応じてガラクトース、フルクトース、ＫＨ2ＰＯ4を添加した。
【０２５２】
該反応により、反応液中に１０ｇ／ｌのＧａｌα1-4Ｇａｌβ1-4ＧｌｃＮＡｃが生成した。
該反応液から遠心分離により菌体を除去し、得られた上清３０ｍｌから、活性炭を用いる方法により生成物を精製し、Ｇａｌα1-4Ｇａｌβ1-4ＧｌｃＮＡｃの白色粉末０．２ｇを得た。
【０２５３】
実施例２５  β1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼ（ｌｇｔＢ）発現プラスミドの造成
配列番号２６記載のセンス鎖ＤＮＡプライマーと配列番号２７記載のアンチセンス鎖ＤＮＡプライマーを合成した。該合成ＤＮＡをプライマーとし、N. gonorrhoeae（ATCC33084株）染色体ＤＮＡを鋳型として前述と同一の条件でＰＣＲを行った。
【０２５４】
ＰＣＲ終了後、エタノール沈殿法によりＤＮＡの沈殿を取得した。該沈殿を２０μlのＴＥに溶解した。該溶解液5μｌを用い、ＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、ジーンクリーンＩＩキットにより０．８ｋｂの断片を回収した。pBluescriptII SK+ ＤＮＡ ０．2μｇを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、同様に３．０ｋｂの断片を回収した。
【０２５５】
該０．８ｋｂおよび３．０ｋｂの断片をライゲーションキットを用いて１６℃、１６時間連結反応を行った。該連結反応液を用いてエシェリヒア・コリNM522株を常法に従って形質転換し、該形質転換体をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布後、３０℃で一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーより常法に従ってプラスミドを抽出し、ｌｇｔＢ遺伝子を含むプラスミドであるｐＮＴ６０Ｐを得た。該プラスミドの構造を制限酵素消化により確認した（図１６）。
【０２５６】
該ｐＮＴ６０Ｐ ＤＮＡ ０．５μｇを制限酵素ＣｌａＩおよびＢａｍＨＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し０．８ｋｂの断片を回収した。実施例１−１）で取得したｐＰＡＣ３１ ＤＮＡ ０．２μｇを制限酵素ＣｌａＩおよびＢａｍＨＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、同様に５．５ｋｂの断片を回収した。
【０２５７】
該０．８ｋｂの断片および５．５ｋｂの断片をライゲーションキットを用いて１６℃、１６時間連結反応を行った。該連結反応液を用いてエシェリヒア・コリNM522株を常法に従って形質転換し、該形質転換体をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布後、３０℃で一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーより常法に従ってプラスミドを抽出し、ｌｇｔＢ発現プラスミドであるｐＮＴ６０を得た。該プラスミドの構造を制限酵素消化により確認した（図１６）。
【０２５８】
実施例２６  Ｎ−アセチルラクトサミンの生産
実施例２５で得たエシェリヒア・コリNM522/pNT60株、実施例３で得たエシェリヒア・コリNM522/pNT25株を実施例２と同様の方法で培養し、得られた各々の培養物を遠心分離し湿菌体を取得した。また、コリネバクテリウム・アンモニアゲネスATCC21170株を実施例２と同様の方法で培養し、得られた培養物を遠心分離し湿菌体を取得した。該湿菌体は必要に応じて−２０℃で保存することが可能で、使用前に解凍して用いることができる。
【０２５９】
エシェリヒア・コリNM522/pNT25株湿菌体 ５０ｇ／ｌ、エシェリヒア・コリNM522/pNT60株湿菌体 ５０ｇ／ｌ、コリネバクテリウム・アンモニアゲネスATCC21170株湿菌体 １５０ｇ／ｌ、オロット酸（カリウム塩） １０ｇ／ｌ、フルクトース １００ｇ／ｌ、Ｎ−アセチルグルコサミン １００ｇ／ｌ、ガラクトース １００ｇ／ｌ、ＫＨ2ＰＯ4 １５ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ５ｇ／ｌ、フィチン酸 ５ｇ／ｌ、ナイミーンＳ−２１５ ４ｇ／ｌ、キシレン １０ｍｌ／ｌの組成からなる反応液３０ｍｌを２００ｍｌ容ビーカーに入れ、この反応液をマグネティック・スターラーにて攪拌（９００ｒｐｍ）し、３２℃で３４時間反応を行った。
【０２６０】
反応中４Ｎ ＮａＯＨを用いて、該反応液のｐＨを７．２に維持し、必要に応じてガラクトース、フルクトース、ＫＨ2ＰＯ4を添加した。
該反応により、反応液中に１１４ｇ／ｌのＮ−アセチルラクトサミンが生成した。
【０２６１】
実施例２７  ラクトースの生産
実施例２５で得たエシェリヒア・コリNM522/pNT60株、実施例３で得たエシェリヒア・コリNM522/pNT25株を実施例２と同様の方法で培養し、得られた各々の培養物を遠心分離し湿菌体を取得した。また、コリネバクテリウム・アンモニアゲネスATCC21170株を実施例２と同様の方法で培養し、得られた培養物を遠心分離し湿菌体を取得した。該湿菌体は必要に応じて−２０℃で保存することが可能で、使用前に解凍して用いることができる。
エシェリヒア・コリNM522/pNT25株湿菌体 ５０ｇ／ｌ、エシェリヒア・コリNM522/pNT60株湿菌体 ５０ｇ／ｌ、コリネバクテリウム・アンモニアゲネスATCC21170株湿菌体 １５０ｇ／ｌ、オロット酸（カリウム塩） １０ｇ／ｌ、グルコース １１５ｇ／ｌ、ガラクトース １１５ｇ／ｌ、ＫＨ2ＰＯ4 １５ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ５ｇ／ｌ、フィチン酸 ５ｇ／ｌ、ナイミーンＳ−２１５ ４ｇ／ｌ、キシレン １０ｍｌ／ｌの組成からなる反応液３０ｍｌを２００ｍｌ容ビーカーに入れ、この反応液をマグネティック・スターラーにて攪拌（９００ｒｐｍ）し、３２℃で１５時間反応を行った。
【０２６２】
反応中４Ｎ ＮａＯＨを用いて、該反応液のｐＨを７．２に維持し、必要に応じてＫＨ2ＰＯ4を添加した。
該反応により、反応液中に４９ｇ／ｌのラクトースが生成した。
【０２６３】
実施例２８  グロボトリオースの生産
実施例２５で得たエシェリヒア・コリNM522/pNT60株、実施例３で得たエシェリヒア・コリNM522/pNT25株および実施例２２で得たエシェリヒア・コリNM522/pGT3を実施例２と同様の方法で培養し、得られた各々の培養物を遠心分離し湿菌体を取得した。また、コリネバクテリウム・アンモニアゲネスATCC21170株を実施例２と同様の方法で培養し、得られた培養物を遠心分離し湿菌体を取得した。該湿菌体は必要に応じて−２０℃で保存することが可能で、使用前に解凍して用いることができる。
エシェリヒア・コリNM522/pNT25株湿菌体 ５０ｇ／ｌ、エシェリヒア・コリNM522/pNT60株湿菌体 ５０ｇ／ｌ、エシェリヒア・コリNM522/pGT3株湿菌体 ５０ｇ／ｌ、コリネバクテリウム・アンモニアゲネスATCC21170株湿菌体 １５０ｇ／ｌ、オロット酸（カリウム塩） １０ｇ／ｌ、グルコース １１５ｇ／ｌ、ガラクトース １１５ｇ／ｌ、ＫＨ2ＰＯ4 １５ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ５ｇ／ｌ、フィチン酸 ５ｇ／ｌ、ナイミーンＳ−２１５ ４ｇ／ｌ、キシレン １０ｍｌ／ｌの組成からなる反応液３０ｍｌを２００ｍｌ容ビーカーに入れ、この反応液をマグネティック・スターラーにて攪拌（９００ｒｐｍ）し、３２℃で１３時間反応を行った。
【０２６４】
反応中４Ｎ ＮａＯＨを用いて、該反応液のｐＨを７．２に維持し、必要に応じてＫＨ2ＰＯ4を添加した。
該反応により、反応液中に５ｇ／ｌのグロボトリオースが生成した。
【０２６５】
【発明の効果】
本発明により、ヌクレオチドの前駆物質および糖のみを原料にして糖ヌクレオチドを、該糖ヌクレオチドおよび複合糖質前駆物質から複合糖質を工業的に効率よく製造できる。
【０２６６】
【配列表フリーテキスト】
配列番号１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
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【０２６７】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は発現プラスミドｐＰＡ３１およびｐＰＡＣ３１の造成工程を示す。
【図２】  図２はｇａｌＵ、ｐｐａ遺伝子発現プラスミドｐＮＴ１２およびｐＮＴ３２の造成工程を示す
【図３】  図３はｇａｌＴ、ｇａｌＫ遺伝子発現プラスミドｐＮＴ２５の造成工程を示す。
【図４】  図４はｇａｌＴ、ｇａｌＫ遺伝子をコリネバクテリウム・アンモニアゲネスで発現するプラスミドｐＴＫ７の造成工程を示す。
【図５】  図５はｇｌｍＵ、ｐｐａ遺伝子発現プラスミドｐＮＴ１４の造成工程を示す。
【図６】  図６はｐｇｍ遺伝子発現プラスミドｐＮＴ２４の造成工程を示す。
【図７】  図７はｇｌｍＭ遺伝子発現プラスミドｐＮＴ４４の造成工程を示す。
【図８】  図８はｇｌｋ遺伝子発現プラスミドｐＮＴ４６の造成工程を示す。
【図９】  図９はｐｆｋＢ遺伝子発現プラスミドｐＮＴ４７の造成工程を示す。
【図１０】  図１０はｇａｌＫ遺伝子発現プラスミドｐＮＴ５４の造成工程を示す。
【図１１】  図１１はｍａｎＢ、ｍａｎＣ遺伝子発現プラスミドｐＮＫ７の造成工程を示す。
【図１２】  図１２はｐｇｍ、ｐｆｋＢ遺伝子発現プラスミドｐＮＴ５５の造成工程を示す。
【図１３】  図１３はｇｍｄ、ｗｃａＧ遺伝子発現プラスミドｐＮＫ８の造成工程を示す。
【図１４】  第１４図はｎｅｕＡ遺伝子発現プラスミドｐＴＡ１４の造成工程を示す。
【図１５】  図１５はｌｇｔＣ遺伝子発現プラスミドｐＧＴ３の造成工程を示す。
【図１６】  図１６はｌｇｔＢ遺伝子発現プラスミドｐＮＴ６０の造成工程を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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