(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
血清又は血漿である検体を、非イオン性界面活性剤及びデオキシコール酸ナトリウムから選択される界面活性剤によるエピトープを露出させるための処理の後、該血清又は血漿と、実質的にアポＢ−１００とは反応せず、アポＢ−４８を特異的に認識するモノクローナル抗体とを反応させることを特徴とするアポＢ−４８及び／又はアポＢ−４８含有リポ蛋白の免疫測定方法。
【請求項２】
非イオン性界面活性剤が、トライトンＸ−１００（登録商標）、トライトンＸ−１１４（登録商標）、ツィーン−２０（登録商標）及びＮＰ−４０（登録商標）からなる群から選択される界面活性剤である請求項１に記載の免疫測定方法。
【請求項３】
非イオン性界面活性剤が、トライトンＸ−１１４（登録商標）、ツィーン−２０（登録商標）及びＮＰ−４０（登録商標）からなる群から選択される界面活性剤である請求項１に記載の免疫測定方法。
【請求項４】
モノクローナル抗体が、実質的にアポＢ−１００とは反応せず、アポＢ−４８を特異的に認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ（寄託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−６４７３）から得られるモノクローナル抗体である請求項１〜３のいずれかに記載の免疫測定方法。
【請求項５】
測定方法が、ＥＬＩＳＡ法である請求項４に記載の免疫測定方法。
【請求項６】
非イオン性界面活性剤及び／又はデオキシコール酸ナトリウムを含有してなる血清又は血漿用処理液と、実質的にアポＢ−１００とは反応せず、アポＢ−４８を特異的に認識するモノクローナル抗体とを含む免疫測定試薬。
【請求項７】
非イオン性界面活性剤が、トライトンＸ−１００（登録商標）、トライトンＸ−１１４（登録商標）、ツィーン−２０（登録商標）及びＮＰ−４０（登録商標）からなる群から選択される界面活性剤である請求項６に記載の免疫測定試薬。
【請求項８】
非イオン性界面活性剤が、トライトンＸ−１１４（登録商標）、ツィーン−２０（登録商標）及びＮＰ−４０（登録商標）からなる群から選択される界面活性剤である請求項６に記載の免疫測定試薬。
【請求項９】
モノクローナル抗体をＥＬＩＳＡ用固相に結合させてなる請求項６〜８のいずれかに記載の免疫測定試薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、アポ蛋白の１種であるアポＢ−４８（ＡｐｏＢ−４８）を特異的に認識するモノクローナル抗体、これを産生するハイブリドーマ、これを利用するアポＢ−４８及び／又はアポＢ−４８含有リポ蛋白の測定に関する。アポＢ−４８は、ヒト血中にあって高脂血症と密接に関連しているリポ蛋白の構成蛋白であり、その測定は、高脂血症や動脈硬化症の診断及び治療に有用である。
【０００２】
【従来の技術】
動脈硬化症は、典型的な現代病の一つとして、その効果的な診断法及び治療法の確立が待望されている。動脈硬化症の病因の一つとして、体内を循環する血液中に存在するリポ蛋白のうち、血管内壁へのコレステロールの沈着を促進する種々のリポ蛋白が増加し、又は、当該コレステロールの沈着を防止する種々のリポ蛋白が減少することが挙げられている。そこで、これらのリポ蛋白の血中量を測定し、高脂血症や動脈硬化症の診断及び治療に役立てることが望まれている。
【０００３】
高脂血症に関与する代表的なリポ蛋白としては、カイロミクロン（ＣＭ）、ＣＭの血中での中間代謝産物であるカイロミクロンレムナント（ＣＭレムナント）、超低比重リポ蛋白（ＶＬＤＬ）、ＶＬＤＬの血中での中間代謝産物である超低比重リポ蛋白レムナント（ＶＬＤＬレムナント）、低比重リポ蛋白（ＬＤＬ）、高比重リポ蛋白（ＨＤＬ）等が知られている。
【０００４】
脂質代謝の面からは、例えば、ＣＭレムナントやＶＬＤＬレムナント〔これらはレムナント様リポ蛋白（ｒｅｍｎａｎｔ−ｌｉｋｅ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ；ＲＬＰ）と呼ばれている〕、及び、ＬＤＬ等は、コレステロールを血管壁に運び込むリポ蛋白であり、これらの血中濃度を減少させることが動脈硬化症の治療に直結することとなる。また、例えば、ＨＤＬは、動脈硬化巣からコレステロールを引き抜く機能を有することから、その血中濃度を上昇させることが動脈硬化症の治療に役立つこととなる。
【０００５】
これらのうち、ＲＬＰは、食後高脂血症の動脈硬化病変発現に関与していることが指摘され、動脈硬化症の危険因子の一つとして重要と考えられ始めている。ＲＬＰを構成する部分蛋白（アポ蛋白）として、アポＣ、アポＥ、アポＡ−Ｉ、アポＢ−１００、アポＢ−４８等が知られている。
【０００６】
ＲＬＰの血中濃度測定方法の一つとして、現在、ＲＬＰ−Ｃ（ｒｅｍｎａｎｔｌｉｋｅ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ）測定法が知られている。このＲＬＰ−Ｃ法は、抗アポＡ−Ｉモノクローナル抗体と抗アポＢ−１００モノクローナル抗体とを固相化して混合ゲルを調製し、これと検体とを反応させ、これらの抗体に結合したリポ蛋白を遠心除去し、上清中に存在する結合しなかったリポ蛋白の量をコレステロールの量として測定するものである。
【０００７】
アポＡ−Ｉは、ＣＭ、ＨＤＬの主要なアポ蛋白として存在し、アポＢ−１００は、ＶＬＤＬ、ＶＬＤＬレムナント、ＬＤＬの主要なアポ蛋白として存在するものである。従って、理論的には、Ａ−Ｉモノクローナル抗体には、ＣＭとＨＤＬとが結合し、抗アポＢ−１００モノクローナル抗体には、ＶＬＤＬとＶＬＤＬレムナントとＬＤＬとが結合するので、上述したＲＬＰ−Ｃ測定法によれば、これらのリポ蛋白が結合されて除去される。
【０００８】
ＲＬＰ−Ｃ測定法に用いられる抗アポＢ−１００モノクローナル抗体は、アポＢ−１００の２２９１番目から２３１８番目のアミノ酸領域を特異的に認識し、アポＢ−１００の２１５２番目までのアミノ酸配列からなるアポＢ−４８を認識することがないので、アポＢ−４８をアポ蛋白として含有するがアポＢ−１００をアポ蛋白として含有しないリポ蛋白が、ＲＬＰ−Ｃ測定法の対象となる。
【０００９】
しかしながら、ＲＬＰ−Ｃ測定法は、吸着除去操作が必須であり、作業が煩雑であると同時に、完全な吸着が行われる必要があり、測定状況により測定値にばらつきを生じる等の欠点があった。
【００１０】
アポＢ−４８は、ＣＭ、ＣＭレムナントにアポ蛋白として含有されている。ＣＭは、食後速やかにリポ蛋白リパーゼによりＣＭレムナントに変換され、ＣＭレムナントは、肝臓に存在するレムナントリセプターにより肝臓に取り込まれることとなる。従って、空腹時等においては、血中にＣＭは存在しないこととなるので、アポＢ−４８を特異的に認識することができるモノクローナル抗体を得ることができれば、このような時期の血液を検体とすることにより、ＣＭレムナントのみの量を直接測定することができることとなる。このことにより、より確実な高脂血症の診断が可能となり、従って、動脈硬化症の診断及び治療に役立たせることができることとなる。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
上記の現状に鑑み、本発明は、アポＢ−４８を特異的に認識することができるモノクローナル抗体を取得し、これにより、正確かつ簡易に動脈硬化症の危険因子の量を測定し、診断及び治療方法を提供することを目的とするものである。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、鋭意研究の結果、アポＢ−４８由来ペプチドを哺乳動物に免疫することにより得られるリンパ球と、ミエローマ細胞とを、融合することによってハイブリドーマを樹立し、これを培養することによりアポＢ−４８を特異的に認識することができるモノクローナル抗体を取得することに成功し、本発明を完成した。以下に本発明を詳述する。
【００１３】
本発明は、アポＢ−４８を特異的に認識することができるモノクローナル抗体を取得する方法を確立することにより初めて成立した発明である。当該方法は、本発明者らが抗アポＢ−４８モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを初めて樹立したことにより確立されたものである。
【００１４】
アポＢ−４８は、アポＢ−１００のアミノ酸配列の一部と同一のアミノ酸配列を有するペプチドであり、アポＢ−１００のアミノ酸配列もアポＢ−４８のアミノ酸配列も、すでに公知である〔ネイチャー（Nature）３２３巻、７３８頁。１９８６年１０月〕。また、抗アポＢ−４８特異抗血清も、既に公知である〔ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J. Biol. Chem., ）、２６５巻、１５号、８３５８頁、１９９０年。ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J. Biol. Chem., ）、２６７巻、２号、１１７５頁、１９９２年。クリニカル・サイエンス（Clinical Science）、８５巻、５２１頁、１９９３年等〕。
【００１５】
しかしながら、アポＢ−４８のみに特異的に反応するモノクローナル抗体については、これまで取得されたとの報告はなく、文献（臨床検査。４０巻、９号（１９９６年）、１０２５頁、左欄下から８行）には、アポＢ−４８のみに特異的に反応する抗体の産生は理論上困難である旨が記載されている。本発明に係る抗アポＢ−４８モノクローナル抗体は、これらの従来の考え方を、根本から覆すものである。
【００１６】
以下に本発明に係るハイブリドーマの樹立方法について説明する。本発明においては、まず、アポＢ−４８由来のペプチドを合成する。アポＢ−４８由来のペプチドは、好ましくはアポＢ−４８のＣ−末端から２０個のアミノ酸配列、より好ましくは１０個のアミノ酸配列、更に好ましくは６個のアミノ酸配列を含むペプチドである。本発明においては、例えば、既に公知のアポＢ−４８のアミノ酸配列のうち、Ｃ−末端から数えて４個のアミノ酸配列に相当するペプチドのＮ−末端にシステインを結合させたCys Thr Tyr Met Ile を合成する（以下、本明細書において、このペプチドを「Ｃ４」という）。このようなアミノ酸配列の合成は、公知のペプチド合成装置を用いることにより極めて容易に行うことができる。
【００１７】
同様にして、アポＢ−４８のアミノ酸配列のうち、Ｃ−末端から数えて５個のアミノ酸配列、及び、６個のアミノ酸配列についても合成する（それぞれ、「Ｃ５」及び「Ｃ６」という）。これらのペプチドは、常法に従って精製することができる。その後、これらのペプチドとヘモシアニン等との複合体を合成する。
【００１８】
一方、食後２時間を経過したヒトから採取した血液をプールし、このヒト血清を遠心分離操作することにより、ＶＬＤＬフラクション、ＬＤＬフラクションを取得し、スクリーニング等の抗原とする。
【００１９】
一方、抗アポＢ−４８モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、上記方法により合成したＣ４−ＫＬＨ、Ｃ５−ＫＬＨ及びＣ６−ＫＬＨ複合体を哺乳動物に免疫し、そのリンパ球とミエローマ細胞とを融合することにより樹立することができる。
【００２０】
例えば、ＢＡＬＢ／Ｃマウス等の哺乳動物に、フロイント完全アジュバントでエマルジョン化したＣ４−ＫＬＨ、Ｃ５−ＫＬＨ及びＣ６−ＫＬＨ複合体のアポＢ−４８由来ペプチドを免疫し、当該動物の血清の一部を用い、ウエスタンブロッティング（ＷＢ）法にてネイティブアポＢ−４８に反応する抗体の確認を行う。ＷＢ法で最も濃いバンドが確認された免疫動物に、遊離の複合体を静脈内投与し、その３〜４日後に当該動物から脾臓を取り出し脾細胞を調製する。
【００２１】
別途、培地で培養していたミエローマ細胞と上記の脾細胞とを混合し、公知の手法により細胞融合を行う。融合した細胞は、例えば、培地に浮遊した後、培養プレート等に分注し、培養する。培養した細胞について、ＶＬＤＬフラクションを抗原として、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ等を行った後、泳動した抗原をニトロセルロース膜に転写し、転写膜をブロッキングした後、短冊状に細く切り、これと培養プレートの一部を１グループとしてプールした培養液を入れて反応させる。その後、洗浄用緩衝液で５分間の振盪洗浄を行った後、ＰＯＤ標識抗マウスイムノグロブリン抗体を入れ、反応させ、アポＢ−４８に相当する位置のバンドの確認を行う。
【００２２】
バンドが見られた場合、抗体を産生しているウエルの選択を行う。目的の抗体を産生しているウエルの細胞は、限界希釈法によりクローニングを行いクローン化する。抗アポＢ−４８モノクローナル抗体を産生する細胞は、大量に培養しマウス腹腔に投与し、抗アポＢ−４８モノクローナル抗体を含む腹水を回収する。更にプロテインＡ−セファロース等を用い、腹水より抗体を精製しモノクローナル抗体を得る。
【００２３】
後に実施例で詳述するように、上記の方法により、本発明者らは、抗アポＢ−４８モノクローナル抗体を取得することに成功し、モノクローナル抗体Ｂ４８−１５１と命名した。また、このモノクローナル抗体Ｂ４８−１５１を産生する細胞をハイブリドーマＢ４８−１５１と命名した。ハイブリドーマＢ４８−１５１は、工業技術院生命工学工業技術研究所〔あて名；日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号３０５−００４６）〕に、識別表示Ｂ４８−１５１、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６４７３（原寄託日；平成９年７月４日、ブダペスト条約に基づく寄託への移管請求；平成１０年８月２６日）として寄託した。
【００２４】
得られた抗アポＢ−４８モノクローナル抗体の反応特異性は、例えば、ＣＭ、ＶＬＤＬ及びＬＤＬフラクションを抗原としたＷＢ法で確認することができる。抗アポＢ−４８モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマから得られる抗アポＢ−４８モノクローナル抗体は、アポＢ−４８を特異的に認識することができ、かつ、アポＢ−１００とは全く反応しないものであり、極めて良好に、検体中のアポＢ−４８及び／又はアポＢ−４８含有リポ蛋白を検出するのに利用することができる。上記アポＢ−４８含有リポ蛋白とは、リポ蛋白であって、そのアポ蛋白のアミノ酸配列中にアポＢ−４８と同一のアミノ酸配列を含有するものを意味し、このようなアポＢ−４８含有リポ蛋白も、アポＢ−４８と同様に、アポＢ−４８を特異的に認識することができる本発明の抗アポＢ−４８モノクローナル抗体により特異的に認識されうるものである。
【００２５】
更にまた、上記抗アポＢ−４８モノクローナル抗体の反応特異性は、ＥＬＩＳＡ測定法によっても確認することができる。抗アポＢ−４８モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマから得られる抗アポＢ−４８モノクローナル抗体は、後の実施例で詳述するように、これを固相としたＥＬＩＳＡ測定法においてアポＢ−４８を特異的に認識することできることが明らかであり、従来用いられていたＷＢ法等の膜固定による測定方法ばかりでなく、固相ＥＬＩＳＡ法にも応用することができるものである。
【００２６】
本発明の抗アポＢ−４８モノクローナル抗体は、いわゆるサンドイッチアッセイ法にも適用することができる。例えば、サンドイッチＥＬＩＳＡを行うため、ＥＬＩＳＡプレートに希釈した抗アポＢ−４８モノクローナル抗体を入れ、放置して吸着させた後、マスキングを行い、洗浄後に、適切に調製したアポＢ−４８を抗原として入れて反応させる。
【００２７】
反応特異性を確認するため、アポＢ−１００を同様の方法にて抗原として測定する。洗浄後、標識抗ヒトアポＢ抗体を入れ、反応させた後、洗浄し、基質を入れて放置後、吸収波長を測定する等して反応量を測定することにより、アポＢ−４８が特異的に認識されることを確認することができる。
【００２８】
本発明の抗アポＢ−４８モノクローナル抗体は、血清を直接検体とするアッセイ法に適用することもできる。例えば、上記したＥＬＩＳＡ法をヒト血清を検体として適用することによりアポＢ−４８の測定を行うことができる。
【００２９】
本発明のモノクローナル抗体を用いたアポＢ−４８及び／又はアポＢ−４８含有リポ蛋白の測定は、本発明のモノクローナル抗体をヒト由来の種々の検体に適用することにより行うことができる。上記検体としては、ヒト由来の種々の体液を挙げることができ、例えば、血清及び血漿等を挙げることができる。これらの検体に対する測定方法もまた、本発明の一つである。
【００３０】
上記検体は、アポＢ−４８のエピトープを露出させるような処理を行うことが好ましい。本発明のモノクローナル抗体のエピトープは、アポＢ−４８のＣ末端部分であるが、この部分は生体液中では露出していないので免疫反応を行った際モノクローナル抗体が結合しにくいと考えられるため、エピトープを露出させるような処理を行うことによって、モノクローナル抗体への結合を容易にする必要がある。上記エピトープを露出させる処理は、測定前に行ってもよく、又は、測定と同時に行ってもよい。
【００３１】
上記エピトープを露出させるような処理としては、例えば、検体を界面活性剤で処理する方法や、凍結融解を繰り返す方法等を挙げることができる。検体を界面活性剤で処理する方法としては、第３０回日本動脈硬化学会総会抄録集〔平成１０年６月１１日、１２日開催、帝京大学内科、筑波記念病院内科、木下誠ら、１３３頁、「アポ蛋白Ｂ４８含有リポ蛋白の測定法の開発」〕には、アポＢ−４８を特異的に認識するモノクローナル抗体を作成し、それを用いたＥＬＩＳＡプレートに２％ＳＤＳを含むＰＢＳで希釈した血清を添加して、アポＢ−４８を測定することが記載されている。しかし、本発明においては、２％ＳＤＳ中では血清中のアポＢ−４８の測定を行うことはできず、ＳＤＳは界面活性剤として好ましくない。
【００３２】
本発明において、上記界面活性剤は、非イオン性界面活性剤が好ましく、ＳＤＳでは逆に免疫反応を阻害するため好ましくない。より好ましくは、トライトンＸ−１００、トライトンＸ−１１４、ツィーン−２０、ＮＰ−４０である。上記界面活性剤は、単独でも、混合しても用いることができる。実際の使用においては、エピトープ露出効果は高いが室温では溶けにくい界面活性剤（トライトンＸ−１１４等）を用いる場合には、免疫反応を阻害せず溶けやすい界面活性剤（ツィーン−２０等）を混合して使用することが好ましい。
【００３３】
本発明において、界面活性剤は、エピトープを露出させるために用いるものであるが、一般に界面活性剤は免疫反応を阻害するので、エピトープの露出効果と免疫反応の阻害作用とのバランスによって使用濃度を適宜選択することができる。上記界面活性剤は、検体とモノクローナル抗体との免疫反応を行う際の溶液に共存させることもでき、０．０１〜２％、好ましくは、０．０２〜０．５％の濃度で使用する。上記界面活性剤の処理溶液及び処理時間としては特に限定されず、例えば、通常免疫反応を行う際に用いる緩衝液中において、４〜４０℃で５分〜４８時間行うことができる。
【００３４】
本発明においては、検体を凍結融解を繰り返すことによって、リポ蛋白の構造を破壊し、エピトープを露出させることも可能である。上記凍結融解は、１回以上行えば、その効果が得られる。
【００３５】
本発明のモノクローナル抗体を用いたアポＢ−４８及び／又はアポＢ−４８含有リポ蛋白の測定方法を用いることにより、アポＢ−４８及び／又はアポＢ−４８含有リポ蛋白を測定する免疫測定試薬を製造することができ、このような免疫測定試薬もまた、本発明の一つである。このような免疫測定試薬として、例えば、本発明のモノクローナル抗体を結合させたゼラチン粒子やラテックス粒子等を含有させた凝集免疫測定試薬は、通常の公知の方法により製造することができる。また、同様にして、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）試薬、ＥＬＩＳＡ試薬、放射免疫測定法（ＲＩＡ）試薬を、固相として、例えば、ポリスチレン等のポリマー、ガラスビーズ、磁性粒子、マイクロプレート、イムノクロマトグラフィー用濾紙、グラスフィルター等を用いることにより、通常の公知の方法により製造することができる。
【００３６】
【実施例】
以下に、実施例を掲げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれらのみに限定されるものではない。
実施例１ アポＢ−４８由来ペプチドの合成
アポＢ−４８のＣ−末端から４残基のアミノ酸配列に相当する部分に、そのＮ−末端にシステインを結合したペプチドを合成した（以下、本明細書中では「Ｃ４」という。配列表の配列番号１に示す）。また、アポＢ−４８のＣ−末端から５残基のアミノ酸配列に相当する部分に、そのＮ−末端にシステインを結合したペプチドを合成した（以下、本明細書中では「Ｃ５」という。配列表の配列番号２に示す）。更に、アポＢ−４８のＣ−末端から６残基のアミノ酸配列に相当する部分に、そのＮ−末端にシステインを結合したペプチドを合成した（以下、本明細書中では「Ｃ６」という。配列表の配列番号３に示す）。
【００３７】
合成には、島津製作所製多種品目同時固相法自動ペプチド合成装置ＰＳＳＭ−８を用いた。アミノ酸はすべてＬ−体を用い、α−アミノ基は９−フルオレニルメトキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ基）で保護し、システインのβ−スルフヒドリル基とグルタミンのγ−カルボキサミド基はトリチル基で保護し、スレオニンのβ−水酸基とチロシンのフェノール性水酸基はｔ−ブチル基で保護した。
【００３８】
ペプチド合成を開始するための固相担体は、あらかじめＣ−末端イソロイシンが０．６５ｍｍｏｌ／ｇの割合で導入されたＨＭＰイソロイシンレジン（パーキンエルマー社製）３０ｍｇを用いた。縮合には、２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロフォスフェイト、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、及び、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンを用いた。Ｆｍｏｃ基の除去には３０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液を用い、溶媒はＤＭＦを用い、ＰＳＳＭ−８添付の標準的なプログラムを使用して３種類同時に合成を行った。
【００３９】
合成終了後、得られた保護基を含むペプチド担体を塩化メチレンで洗い、乾燥した。収量は、Ｃ４が４１．０ｍｇ、Ｃ５が４８．４ｍｇ、Ｃ６が５２．６ｍｇであった。上記ペプチド担体を、それぞれ、添加物を含むトリフルオロ酢酸溶液（トリフルオロ酢酸１ｍｌ、水５０μｌ、フェノール７５ｍｇ、チオアニソール５０μｌ、エタンジチオール５０μｌ）で室温２時間処理し、遊離のペプチド鎖を取り出した。ペプチドをジエチルエーテルで沈殿させ、濾取し、水に溶解して凍結乾燥した。こうして得られた粗ペプチドの収量は、Ｃ４が１２．２３ｍｇ、Ｃ５が１６．１７ｍｇ、Ｃ６が１７．０４ｍｇであった。
【００４０】
次に、上記粗ペプチドを逆相高速液体クロマトグラフィで精製した。カラムはコスモシル５Ｃ１８−ＡＲ−３００ ２０ｍｍＩ．Ｄ．ｘ１５０ｍｍＬ．（ナカライテスク社製）を用い、０．１％トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリル水溶液の１８〜２８％直線濃度勾配で溶出した。凍結乾燥後得られた精製ペプチドの収量は、Ｃ４が７．１２ｍｇ、Ｃ５が１１．７５ｍｇ、Ｃ６が１０．７１ｍｇであった。これらのペプチドは、その一部をプロテインシーケンサ（パーキンエルマー社製、Ｐｒｏｃｉｓｅ４９４）にかけて、その構造を確認した。
【００４１】
実施例２ ペプチド−ＫＬＨ複合体の合成
ヘモシアニン（ＫＬＨ）（カルビオケム社製）５ｍｇを４００μｌの０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解し、ＤＭＦ１００μｌに溶解したＧＭＢＳ（同人化学研究所製）１ｍｇを加え、室温で１時間撹拌した。反応液を１ｍＭのＥＤＴＡを含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＰＤ−１０カラム（ファルマシア社製）にかけ、同緩衝液で溶出した。はじめの２．５ｍｌを棄て、続く２．０ｍｌを集めた。
【００４２】
これに、実施例１で合成したＣ４約１ｍｇを水１ｍｌに溶解して加え、室温で２時間撹拌した。反応液を透析チューブに移し、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）に対して一夜透析した。同様の操作をＣ５及びＣ６についても行い、それぞれ約５ｍｌのＫＬＨ複合体溶液を得た。蛋白定量値は、Ｃ４のＫＬＨ複合体（Ｃ４−ＫＬＨ）が７６８μｇ／ｍｌ、Ｃ５のＫＬＨ複合体（Ｃ５−ＫＬＨ）が８６１μｇ／ｍｌ、Ｃ６のＫＬＨ複合体（Ｃ６−ＫＬＨ）が１１４０μｇ／ｍｌであった。
【００４３】
実施例３ ヒト血清からのリポ蛋白の調製
食後２時間のヒトプール血清４ｍｌにトリスヒドロキシメチル・アミノメタン１．２１ｇ、塩化ナトリウム９．０ｇ、ＥＤＴＡ２ナトリウム０．３７２ｇを蒸留水１ｌに溶かしｐＨを７．４に調整した溶液（以下、「ｄ＝１．００６溶液」という）を４ｍｌ重層し、ベックマン超高速遠心機で２６０００×ｇにて１時間遠心した。上層部分をカイロミクロン（ＣＭ）フラクションとしてプールし、下層部は更にｄ＝１．００６溶液を重層し、１１４０００×ｇにて２０時間遠心後、上層部分をＶＬＤＬフラクションとしてプールした。更に下層部分は臭化ナトリウム溶液によりｄ＝１．０６３に調整し１１４０００×ｇにて２０時間遠心し、その上清部分をＬＤＬフラクションとしてプールした。それぞれのプール分画を濃縮して、免疫反応の抗原として用いた。
【００４４】
実施例４ 抗アポＢ−４８モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの樹立及び抗アポＢ−４８モノクローナル抗体の調製
抗アポＢ−４８モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを、実施例２で合成したＣ４−ＫＬＨ、Ｃ５−ＫＬＨ及びＣ６−ＫＬＨをＢＡＬＢ／Ｃマウスに免疫し、その脾臓リンパ球とミエローマ細胞を融合することにより樹立した。
【００４５】
すなわち、ＢＡＬＢ／Ｃマウスに、フロイント完全アジュバントでエマルジョン化したＣ４−ＫＬＨ、Ｃ５−ＫＬＨ及びＣ６−ＫＬＨをそれぞれ２５〜１００μｇ／マウスで免疫し、２〜３週間後、フロイント不完全アジュバントでエマルジョン化した同複合体２５〜１００μｇ／マウスで追加免疫を行った。マウス血清の一部を用い、ウエスタンブロッティング（ＷＢ）法にてネイティブアポＢ−４８に反応する抗体の確認を行った。ＷＢの測定方法は後に示すスクリーニング法と同様の方法にて行った。ＷＢ法で最も濃いバンドが確認されたＣ６−ＫＬＨ免疫マウスに、遊離のＣ６−ＫＬＨ２５〜１００μｇを静脈内投与し、その３〜４日後、マウスから脾臓を取り出し脾細胞を調製した。
【００４６】
前もってＲＰＭＩ−１６４０培地で培養していたマウスミエローマ細胞（Ｐ３Ｕ１）と上記の脾細胞とを１：２〜１：５の比率で混合し、ＰＥＧ（ベーリンガー社製）を用い細胞融合を行った。融合した細胞はＨＡＴ培地に浮遊した後、９６ウエル培養プレートに分注し、３７℃二酸化炭素インキュベーターで培養した。
【００４７】
培養した細胞の培養上清をＷＢ法にてスクリーニングした。すなわち、実施例３で調製したＶＬＤＬフラクションを抗原として、３〜１５％グラジエントのＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を行った後、泳動した抗原をニトロセルロース膜に転写しＷＢ用転写膜を作製した。転写膜をスキムミルクでブロッキングした後、短冊状に細く切った。アキュトランインキュベートトレイ（Accutran Incubation Tray）（Ｓ＆Ｓ社製）の各溝に、短冊状の転写膜と９６ウエル培養プレートの６ウエル分を１グループとしてプールした培養液を入れ、室温で１時間振盪し反応を行った。
【００４８】
０．０５％ツィーン２０を含むＰＢＳ（以下、「洗浄用緩衝液」という）で５分間の振盪洗浄を３回行った後、各溝にＰＯＤ標識抗マウスイムノグロブリン抗体（ダコ社製）を入れ、更に室温で１時間反応させた。同様に、洗浄用緩衝液で４回洗浄後、基質４−クロロナフトール溶液を加え、アポＢ−４８に相当する位置のバンドの確認を行った。
【００４９】
バンドが見られた場合、６ウエルを更に１ウエルづつに分け同様の方法で目的の抗体を産生しているウエルの選択を行った。目的の抗体を産生しているウエルの細胞は、限界希釈法によりクローニングを行いクローン化した。抗アポＢ−４８モノクローナル抗体を産生する細胞は、大量に培養しマウス腹腔に投与し、抗アポＢ−４８モノクローナル抗体を含む腹水を回収した。更にプロテインＡ−セファロースを用い、腹水より抗体を精製しモノクローナル抗体を得た。この抗アポＢ−４８モノクローナル抗体をモノクローナル抗体Ｂ４８−１５１と命名し、このモノクローナル抗体Ｂ４８−１５１を産生する細胞をハイブリドーマＢ４８−１５１と命名した。
【００５０】
実施例５ モノクローナル抗体Ｂ４８−１５１の反応特異性の確認
モノクローナル抗体Ｂ４８−１５１の反応特異性を、ＣＭ、ＶＬＤＬ及びＬＤＬフラクションを抗原としたＷＢ法で確認した。すなわち、実施例３で調製したそれぞれのフラクションを抗原として、３〜１５％グラジエントＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った後、泳動した抗原をニトロセルロース膜に転写しＷＢ用転写膜を作製した。転写膜をスキムミルクでブロッキングした後、抗体との反応を行った。反応にはモノクローナル抗体Ｂ４８−１５１、コントロールとして抗アポＢ−１００モノクロナール抗体ＭＡＢ０１４（ケミコン社製）及び抗アポＢ山羊抗血清（ケミコン社製）を用いた。更に反応特異性確認のため遊離の免疫ペプチドＣ６による抑制試験も行った。なお、ＷＢ用転写膜の一部は、ＣＣＢ染色により蛋白質位置の確認を行った。
【００５１】
抗体と各種抗原との反応は以下のとおりであった。それぞれの抗体を１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）含有リン酸緩衝液（１％ＢＳＡ−ＰＢＳ）（ｐＨ７．４）を用いて１μｇ／ｍｌの濃度に調整し、抗原転写ＷＢ膜と室温で１時間振盪し反応を行った。洗浄用緩衝液で５分間の振盪洗浄を３回行った後、ＰＯＤ標識抗マウスイムノグロブリン抗体（ダコ社製）を加え、更に室温で１時間反応させた。同様に、洗浄用緩衝液で４回洗浄後、基質４−クロロナフトール溶液を加え、バンドの確認を行った。結果を図１に示す。抑制試験は、ＷＢ膜と抗体との反応時に５μｇ／ｍｌのＣ６を共存させて行った。結果を図２に示す。
【００５２】
図１に示すようにモノクローナル抗体Ｂ４８−１５１は分子量２０万強のアポＢ−４８に相当する位置にのみバンドを生じ、分子量約５５万のアポＢ−１００相当位置にはバンドは見られなかった。また、図２に示すように、モノクローナル抗体Ｂ４８−１５１のアポＢ−４８に相当する位置のバンドは、Ｃ６の共存で消失した。この結果から、モノクローナル抗体Ｂ４８−１５１は、アポＢ−４８を特異的に認識するモノクローナル抗体であることが明白となった。なお、ＶＬＤＬフラクションでアポＢ−４８に相当するバンドが最も濃く出ているのは、ＶＬＤＬフラクションにＣＭレムナントが含まれているからだと考えられる。
【００５３】
実施例６ モノクローナル抗体Ｂ４８−１５１固相ＥＬＩＳＡによるアポＢ−４８の測定
ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルより抽出調製したアポＢ−４８を抗原としてサンドイッチＥＬＩＳＡを行った。すなわち、実施例５と同様の方法により、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで泳動したＶＬＤＬフラクションのアポＢ−４８バンド部分を切り取り、エレクトロエリューター（バイオラッド社製）によりゲルから抽出して抗原を精製した。一方、ヌンク社製ＥＬＩＳＡプレート（マキシソーブ）に、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で１０μｇ／ｍｌの濃度に希釈したモノクローナル抗体Ｂ４８−１５１を１ウェルに７５μｌづつ入れ、４℃一晩放置して吸着させた後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳ（ｐＨ７．４）を１５０μｌ／ウェルづつ入れ、３７℃で５時間放置してマスキングを行った。抗体吸着プレートを洗浄用緩衝液で３回洗浄後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳで５μｇ／ｍｌから２ｎ希釈した精製アポＢ−４８を７５μｌ／ウェルづつ入れ、３７℃で１時間反応させた。
【００５４】
洗浄用緩衝液で３回洗浄後、ＰＯＤ標識抗ヒトアポＢ抗体（ケミコン社製）を７５μｌ／ウェルづつ入れ、３７℃で１時間反応させた。洗浄用緩衝液で充分洗浄し、基質ＡＢＴＳを７５μｌ／ウェルづつ入れ室温で１５分放置後、４０５ｎｍの波長を測定した。反応特異性を確認するため、アポＢ−１００（ケミコン社製）を４０μｇ／ｍｌから同様の希釈方法にて抗原として測定した。結果を図３に示す。図３に示すように、モノクローナル抗体Ｂ４８−１５１を固相としたＥＬＩＳＡでアポＢ−４８が特異的に測定できることが確認された。
【００５５】
実施例７ モノクローナル抗体Ｂ４８−１５１固相ＥＬＩＳＡによる血清アポＢ−４８の測定
１％ＢＳＡ−ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で２０倍希釈した血清を検体として、実施例６と同様の方法でアポＢ−４８の測定を行った。検体には、健常者の空腹時及び食後１時間の凍結保存血清の各８例（検体番号１〜８）を用いた。結果を図４に示す。図４に示すように、どの検体も食後１時間でアポＢ−４８が高値となり、ＣＭの挙動と一致することが確認された。
【００５６】
実施例８ 新鮮血清の界面活性剤処理
固相抗体と新鮮血清との反応時の緩衝液に各種界面活性剤を添加し、モノクローナル抗体Ｂ４８−１５１固相ＥＬＩＳＡでの反応性を検討した。界面活性剤は、陰イオン性界面活性剤としてＳＤＳ（ナカライテスク社製）、デオキシコール酸ナトリウム（和光純薬社製）、非イオン性界面活性剤としてトライトンＸ−１００（ナカライテスク社製）、トライトンＸ−１１４（ナカライテスク社製）、ツィーン−２０（ナカライテスク社製）、ツィーン−８０（ナカライテスク社製）、ＮＰ−４０（シグマ社製）、ＭＥＧＡ−８（同仁化学研究所製）、Ｂｒｉｊ−３５（シグマ社製）を用いた。
【００５７】
ヌンク社製ＥＬＩＳＡプレート（マキシソーブ）にＰＢＳ（ｐＨ７．４）で１０μｇ／ｍｌの濃度に希釈したモノクローナル抗体Ｂ４８−１５１抗体を７５μｌ／ウェルづつ入れ、４℃一晩放置し吸着させた。次に１％ＢＳＡ−ＰＢＳ（ｐＨ７．４）を１５０μｌ／ウェルづつ入れ、３７℃で５時間放置しマスキングを行った。抗体吸着プレートを洗浄用緩衝液で３回洗浄後、それぞれ２％、０．４％、０．０８％、０．０１６％の濃度で各種界面活性剤を含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）を用い、２０倍希釈した血清を７５μｌ／ウェルづつ入れ、３７℃で１時間反応させた。洗浄用緩衝液で３回洗浄後、ヨシタケらの方法でアルカリフォスファターゼ（以下、Ａｌｐともいう）標識した抗ヒトアポＢ−１００モノクロナール抗体（Ｂ１００−２２８；自家製）を７５μｌ／ウェルづつ入れ、３７℃で１時間反応させた。洗浄用緩衝液で充分洗浄し、基質４−ニトロフェノールリン酸（以下、ｐＮＰＰともいう）を７５μｌ／ウェルづつ入れ３７℃で３０分放置後、４０５ｎｍの波長を測定した。検体には、高脂血清及び空腹時血清を用いた。結果を図５、図６に示す。
【００５８】
図５に示すように、界面活性剤を含まないＰＢＳ（ｐＨ７．４）で血清を希釈した場合は、全く発色が見られず、アポＢ４８Ｃ末エピトープが露出されていないと判断した。界面活性剤を含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）を用いた場合は、０．１％付近のトライトンＸ−１００、ツィーン２０、ＮＰ−４０等の非イオン性界面活性剤で強い発色がみられた。これら界面活性剤処理では、アポＢ４８Ｃ末エピトープが露出されたと判断した。これに対し、ＭＥＧＡ−８、Ｂｒｉｊ−３５、ＳＤＳ等の界面活性剤では、発色が弱いかまたはほとんど見られなかった。実施例９の結果も考慮すると、ＭＥＧＡ−８はアポＢ４８Ｃ末エピトープ露出効果が弱く、ＳＤＳ、特に０．１％以上のＳＤＳは免疫反応を阻害し、Ｂｒｉｊ−３５は両方に関与している可能性が考えられた。
【００５９】
実施例９ 界面活性剤の免疫反応への影響
固相化ペプチドＣ６とモノクローナル抗体Ｂ４８−１５１との反応時に実施例８と同様の各種界面活性剤を添加し、反応性を検討した。ヌンク社製ＥＬＩＳＡプレート（マキシソーブ）にＰＢＳ（ｐＨ７．４）で１μｇ／ｍｌの濃度に希釈したペプチドＣ６を７５μｌ／ウェルづつ入れ、４℃一晩放置し吸着させた。次に１％ＢＳＡ−ＰＢＳ（ｐＨ７．４）を１５０μｌ／ウェルづつ入れ、３７℃で５時間放置しマスキングを行った。洗浄用緩衝液で３回洗浄後、それぞれ２％、０．４％、０．０８％、０．０１６％の濃度で各種界面活性剤を含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）を用い、２．５μｇ／ｍｌに希釈したモノクローナル抗体Ｂ４８−１５１を７５μｌ／ウェルづつ入れ、３７℃で１時間反応させた。洗浄用緩衝液で３回洗浄後、ＰＯＤ標識抗マウスイムノグロブリン抗体（ダコ社製）を７５μｌ／ウェルづつ入れ、３７℃で１時間反応させた。洗浄用緩衝液で充分洗浄し、基質ＡＢＴＳを７５μｌ／ウェルづつ入れ室温で１５分放置後、４０５ｎｍの波長を測定した。結果を図７に示す。
【００６０】
図７に示すように、トライトンＸ−１００、ツィーン２０、ＮＰ−４０等の非イオン性界面活性剤では、免疫反応に対する影響はみられなかった。これに対し、Ｂｒｉｊ−３５、ＳＤＳでは、免疫反応に対する影響がみられた。特に、ＳＤＳは、０．１％以上では免疫反応は完全に阻害された。
【００６１】
【発明の効果】
本発明は、上述の構成よりなり、抗アポＢ−４８モノクローナル抗体を取得することが可能となったので、アポＢ−４８を特異的に認識することにより、簡易で確実な動脈硬化症の診断及び治療が可能となった。
【００６２】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】実施例５で行った本発明に係るＢ４８−１５１モノクローナル抗体の各リポ蛋白フラクションに対する反応を示す図である。
【図２】実施例５で行った本発明に係るＢ４８−１５１モノクローナル抗体の各リポ蛋白フラクションに対する反応の、Ｃ６ペプチドによる抑制を示す図である。
【図３】実施例６で行った本発明に係るＢ４８−１５１モノクローナル抗体を固相としたＥＬＩＳＡ測定法による試験結果を示す図である。
【図４】実施例７で行った本発明に係るＢ４８−１５１モノクローナル抗体を固相としたＥＬＩＳＡ測定法による試験結果を示す図である。
【図５】実施例８で行った、界面活性剤で処理した高脂血清を用いた場合の、本発明に係るＢ４８−１５１モノクローナル抗体を固相としたＥＬＩＳＡ測定法による試験結果を示す図である。Ｔｘ−１００はトライトンＸ−１００、Ｔｘ−１１４はトライトンＸ−１１４、Ｔｗ−２０はツィーン−２０、Ｔｗ−８０はツィーン−８０、Ｄｅｏｘｙ−ｃｈ．はデオキシコール酸ナトリウムを表す。ＰＢＳは界面活性剤を添加せずに試験を行ったことを表す。
【図６】実施例８で行った、界面活性剤で処理した空腹時血清を用いた場合の、本発明に係るＢ４８−１５１モノクローナル抗体を固相としたＥＬＩＳＡ測定法による試験結果を示す図である。
【図７】実施例９で行った本発明に係るＢ４８−１５１モノクローナル抗体を固相としたＥＬＩＳＡ測定法に対する界面活性剤の影響の試験結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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